(57)【要約】  修飾型胎盤組織を用いて内因性および外因性治療効果を達成するための組成物および方法について本明細書に記載する。本修飾型胎盤組織は、損傷または疾患した臓器または体の一部に施用すると、施用部位に直接、またはその近くにおいて幹細胞動員および／または局在化を誘発する。新規な真空乾燥装置およびその使用についても記載する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の幹細胞動員因子を誘発する修飾型胎盤組織を含む組成物であって、前記胎盤組織は、生体内で体の一部の近くに配置されると、前記体の一部への幹細胞動員を促進するような十分な量で存在する組成物。
【請求項２】
前記体の一部は、骨、軟骨、腱、網膜、末梢神経、末梢神経鞘、小腸、大腸、胃、骨格筋、心臓、肝臓、肺および腎臓からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記生物学的物質によって動員される前記幹細胞は、多能性幹細胞である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
前記胎盤組織は、幹細胞を治療される体の一部に動員するのに十分な質量を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記体の一部は罹患または損傷している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
（ｉ）乾燥室を画定し、かつ流入および流出開口部を画定する乾燥ハウジングと、（ｉｉ）前記乾燥室内に、バキュームテーブルの上に配置される多孔乾燥板であって、脱水される物体を受け入れる第１の表面と、前記第１の表面に対向し、かつ前記バキュームテーブルに吸着する第２の表面とを有する乾燥板と、を備える真空脱水装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第１３／８１５，８７３号の一部継続出願であり、かつ２０１２年１０月１２日に出願された米国仮出願第６１／７１３，３５２号の優先権を主張するものである。両出願の開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一つとして、幹細胞を動員および／または局在化するための組成物に関する。一実施形態では、幹細胞動員は、幹細胞が長期間にわたって罹患または損傷した臓器および／または体の一部の部位に局在化されるような、そのような部位への動員である。幹細胞動員および／または局在化は、十分な量の修飾型胎盤組織の使用によって達成される。幹細胞動員および局在化の達成方法も提供する。関連する態様では、本発明は、新規な真空脱水装置およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
これまで、罹患または損傷した臓器を治療するために、修飾型胎盤組織が使用されてきた。しかし、そのような使用は、入手可能な組織の量および臓器の大きさによって制限されている。通則として、所望の結果を引き出すために、最小量の修飾型胎盤組織が使用されている。例えば、胎盤組織は、癒着形成を防止するために、臓器間の障壁層として使用される。例えば、米国特許出願第２０１０／０１０４５３９号を参照されたい。そのような場合、修飾型胎盤組織により、外因性治療効果が上手く得られる。
【０００４】
治療計画が外因性治療効果だけでなく内因性治療効果を含むと、治療結果がより上手く達成されることが十分に分かっている。すなわち、外因性治療薬と自身の体の治癒能力とを協力的に結び付けることができる患者であれば、より良好な結果が達成される。内因性治癒の機序の１つは、損傷または疾患した臓器部位への幹細胞動員および／または局在化である。しかし、そのような生体内での動員および／または局在化は、達成が非常に難しい。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、一つとして、患者の罹患または損傷した体の一部の近くに十分な量の修飾型胎盤組織を施用すると、驚くべきことに、罹患または損傷した体の一部の部位への幹細胞動員および／または局在化が誘発されるという発見に基づく。そのような発見により、修飾型胎盤組織によって与えられる外因性治療効果だけでなく、動員および／または局在化された幹細胞によって与えられる内因性治療効果も得られる。
【０００６】
従って、本発明の一態様では、損傷または疾患した体の一部に直接、またはその近くに施用すると、生体内での幹細胞動員および／または局在化を誘発するような十分な量の修飾型胎盤組織を含む組成物が提供される。
【０００７】
本発明の別の態様では、損傷または疾患した体の一部に直接、あるいはその近くに施用すると、生体内での幹細胞動員および／または局在化を促進する有効量の幹細胞動員因子を誘発するような十分な量の修飾型胎盤組織を含む組成物が提供される。
【０００８】
別の態様では、幹細胞を含む生物学的供給源内で幹細胞動員および／または局在化を誘発する方法であって、修飾型胎盤組織の近くで幹細胞動員および／または局在化を生じさせる条件下で前記生物学的供給源を十分な量の修飾型胎盤組織と接触させる工程を含む方法が提供される。一実施形態では、動員される幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。別の実施形態では、動員される幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。好ましい一実施形態では、生物学的供給源は、ヒトを含む哺乳類などの動物である。別の好ましい実施形態では、生物学的供給源は、分娩後に回収された臍帯血などの生体外供給源である。
【０００９】
関連する態様では、胎盤組織への最小の損傷、エンボスの品質の向上、乾燥時間の顕著な減少、および脱水された胎盤組織の生成に関連するコストの低下などの向上した特性を有する胎盤組織を脱水するための革新的な真空脱水装置が提供される。当該脱水装置は、乾燥室を画定し、かつ流入および流出開口部を画定する乾燥ハウジングと、乾燥室内に、バキュームテーブルの上に配置される多孔乾燥板とを備える。上記乾燥板は、脱水される胎盤組織などの物体を受け入れる第１の表面と、第１の表面に対向し、かつバキュームテーブルに吸着する第２の表面とを有する。いくつかの実施形態では、上記乾燥板の第１の表面は、その表面の１つ以上の形状部により、脱水された胎盤組織にエンボスを与えることができる。さらに別の態様では、本発明はさらに、真空脱水装置で胎盤組織を脱水することにより胎盤組織を修飾することに関する。
【００１０】
本明細書に組み込まれ、かつその一部を構成する添付の図面は、以下に説明するいくつかの態様を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例３に記載されている幹細胞遊走アッセイのための細胞培養インサートの概略図である。
【図２】様々な量のＥｐｉＦｉｘ（登録商標）の存在下で培養されたヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）における細胞遊走率の棒グラフである。詳細は実施例３に記載されている。
【図３】図３Ａは、移植後３、７、１４および２８日目の正常な皮膚、偽の移植組織、無細胞皮膚基質およびＥｐｉＦｉｘ（登録商標）における生存／Ｌｉｎ−マウス造血幹細胞の割合の棒グラフである。示されている値は、平均値＋／−標準偏差であり、検体数ｎ＝４である。＊＊は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によりＥｐｉＦｉｘ（登録商標）または対照ＡＤＭを正常な皮膚および偽の移植組織と比較した場合にｐ＜０．０５であることを示す。††は、両側ｔ−試験によりＥｐｉＦｉｘ（登録商標）を対照ＡＤＭと比較した場合にｐ＜０．０５であることを示す。図３Ｂは、移植後３、７、１４および２８日目の正常な皮膚、偽の移植組織、無細胞皮膚基質およびＥｐｉＦｉｘ（登録商標）における生存／Ｌｉｎ−マウス間葉細胞の割合の棒グラフである。示されている値は、平均値＋／−標準偏差であり、検体数ｎ＝４である。＊＊は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によりＥｐｉＦｉｘ（登録商標）または対照ＡＤＭを正常な皮膚および偽の移植組織と比較した場合にｐ＜０．０５であることを示す。詳細は実施例４に記載されている。
【図４Ａ】ＣＤ４５およびＳｃａ−１のフローサイトメトリーおよび蛍光検出を用いて検出された細胞の代表的なＦＡＣＳドットプロットである。詳細は実施例５に記載されている。
【図４Ｂ】細胞体を染色するＤＡＰＩで染色された皮膚組織および造血幹細胞のマーカーであるＣＤ３４の顕微鏡写真である。詳細は実施例５に記載されている。
【図５】循環および濾過した熱風サイクルの間に、真空源が胎盤組織および乾燥板を抑えるための吸引を行う脱水装置の概念図である。
【図６】脱水室に取り付けられたバキュームテーブルを示す。
【図７】シリコーンによって完全に取り囲まれた１／４インチの厚さのポリカーボネートインサートからなるポリカーボネート／シリコーン複合板を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明を開示および説明する前に、以下に説明する態様は、特定の組成物、合成法または使用に限定されず、故に、変更可能であることを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、単に特定の態様を記述するためのものであり、本発明を限定するものではないことも理解されたい。
【００１３】
本発明は、一つとして、罹患または損傷した体の一部を治療する際に十分な量の修飾型胎盤組織を使用することにより、外因性治療計画が得られるだけでなく、驚くべきことに、治療される体の一部への幹細胞動員および／または局在化を引き起こす内因性応答も促進するという発見に基づいている。
【００１４】
Ｉ．定義
本明細書および以下の特許請求の範囲では、多くの用語に触れるが、それらは以下の意味を有するものとする。
【００１５】
なお、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する単数形の「１つ（種）の（ａ）」「１つ（種）の（ａｎ）」および「前記（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別の意を示していない限り、複数の指示物を含む。
【００１６】
「任意の」または「任意に」とは、その後に記載されている事象または状況が生じても生じなくてもよいことを意味し、その記載は、事象または状況が生じる場合およびそれらが生じない場合を含む。例えば、「任意の洗浄工程」という語句は、洗浄工程を行っても行わなくてもよいことを意味する。
【００１７】
本明細書で使用する「対象」または「患者」という用語は、限定されるものではないが、ヒト、家畜、飼いならされたペットなどの哺乳類対象を含む任意の脊椎動物生物を指す。
【００１８】
本明細書で使用する「羊膜」という用語は、中間組織層がそのままの羊膜またはそれらが実質的に除去された羊膜を含む。
【００１９】
本明細書で使用する「体の一部」という用語は、組織および臓器などの対象の体の任意の部分を指し、幹細胞による治療に適している限り、一般に臓器とは呼べない体の部分も指す。例示的な体の一部としては、骨、軟骨、腱、靱帯、網膜、末梢神経、末梢神経鞘、小腸、大腸、胃、骨格筋、心臓、肝臓、肺および腎臓が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
本明細書で使用する「罹患した」という用語は、その疾患が幹細胞による治療に適している疾患状態にあるかその状態になりやすいものとして特徴づけられる臓器および／または体の一部を指す。
【００２１】
本明細書で使用する「損傷した」という用語は、当該技術分野における通常の意味を有するように使用し、その損傷が幹細胞による治療に適している臓器および／または体の一部へのありとあらゆる種類の損傷を含む。
【００２２】
「修飾型胎盤組織」という用語は、当該組織の洗浄、殺菌および／またはセグメント化により修飾された全胎盤組織を含む胎盤組織のありとあらゆる成分ならびに羊膜、絨毛膜、中間層、臍帯などの胎盤組織の分離された成分を指す。修飾型組織は、上皮層および／または線維芽細胞層などの細胞層を維持していてもよい。修飾型胎盤組織は、胎盤組織の１つ以上の層の積層、胎盤組織の微粉化、小分子、タンパク質（例えば、増殖因子、抗体）、核酸（例えば、アプタマー）、ポリマーまたは他の物質の化学吸着または物理吸着などのさらなる修飾を含んでいてもよい。
【００２３】
「十分な量」という用語は、生体内または生体外のいずれかで、修飾型胎盤組織の近くまたはその場において長い期間をかけて幹細胞動員を誘発するのに十分な修飾型胎盤組織の量を指す。修飾型胎盤組織の「十分な量」は、限定されるものではないが、使用される胎盤組織の種類および／または量、治療される目的の臓器および／または体の一部の種類および／または大きさ、治療される臓器および／または体の一部に対する疾患または損傷の重症度ならびに投与経路などの様々な因子によって変わる。「十分な量」は、本明細書に提供されている開示内容に基づいて、当業者が決定することができる。
【００２４】
「幹細胞動員因子」という用語は、幹細胞を動員し、かつそれらの細胞をそのような因子の供給源に向かって遊走させることができるありとあらゆる因子を指す。幹細胞動員因子の非限定的な例は、１種以上のＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣケモカインまたはＣＸ３Ｃケモカインであり得る。
【００２５】
「幹細胞動員および／または局在化」という用語は、修飾型胎盤組織が施用される体の一部への幹細胞の直接的もしくは間接的走化性を指す。本出願の文脈において、「動員」という用語は、本発明によって包含される修飾型胎盤組織の施用によって誘発される、損傷または疾患した臓器または体の一部への幹細胞の遊走を指す。
【００２６】
動員は、修飾型胎盤組織中の幹細胞動員因子（例えば、細胞走化性を誘発するケモカイン）が胎盤組織から放出され、この因子が、幹細胞を誘発して修飾型胎盤組織が施用される体の一部に向かって遊走させる直接的なものであってもよい。一態様では、動員は、修飾型胎盤組織中の幹細胞動員因子が胎盤組織から放出され、この因子が近くの細胞を誘発して因子（例えばケモカイン）を放出させ、次いで、この因子が、幹細胞を誘発して修飾型胎盤組織が施用される体の一部に向かって遊走させる間接的なものであってもよい。さらに、幹細胞動員は、直接的および間接的因子の両方を体現してもよい。
【００２７】
「局在化」という用語は、動員された幹細胞が、修飾型組織が施用された損傷または疾患した臓器または体の一部に長期間留まることを意味する。局在化は、修飾型胎盤組織および／または以下の各種実施形態に詳述されている増粘剤および揺変剤などの局在化を促進する他の薬剤の存在によって達成される。
【００２８】
局在化または動員することができる幹細胞は、患者の体内に既に存在する内因性幹細胞であってもよい。あるいは、幹細胞は、外因性供給源からのものであってもよく、患者の体内の罹患または損傷した部位のすぐ近くに投与してもよい。いずれの場合も、修飾型胎盤組織は、既にその近くにある幹細胞を保持して、それらの幹細胞を局在化するように働くと同時に、幹細胞をそこに対してより遠くに動員して、罹患または損傷した部位に遊走させる。
【００２９】
本明細書で使用する「〜に近い」という用語は、体の一部に隣接しているかそこにあることを意味する。例えば、心臓に近い修飾型胎盤組織とは、胎盤組織が心臓にあっても、心臓から１〜２ｃｍ以内にあるが、幹細胞動員効果を与えるのに十分になお近くにあってもよいことを意味する。一般に、「〜に近い」とは、修飾型胎盤組織が、幹細胞を罹患または損傷した臓器および／または体の一部に動員するのに十分に近くに置かれていることを意味する。そのような距離は一般に、当業者によって決定されるが、臓器または体の一部から約５ｃｍ以内、約４ｃｍ以内、約３ｃｍ以内、約２ｃｍ以内または約１ｃｍ以内であることが好ましい。
【００３０】
「外因性」という用語は、修飾型胎盤組織などの同種移植片組織および幹細胞を含む天然に生じない物質を指す。本発明の文脈において、外因性治療効果は、損傷または疾患した臓器または体の一部に塗布されると、例えば、癒着形成を防止するために臓器または体の一部の間の物理的障壁として機能する修飾型胎盤組織によって生じる治療効果を指す。
【００３１】
「内因性」という用語は、対象からの自己の生物学的物質を指す。本発明の文脈において、内因性治療効果は、治療される対象の体が治療に対して自己応答を生じた場合に達成される。例えば、幹細胞は、治療される対象の体によって生成される自己応答として、修飾型胎盤組織が施用される部位において動員および／または局在化される。
【００３２】
「生物学的供給源」という用語は、動員される利用可能な幹細胞集団（例えば骨髄）を含む臓器または組織を指す。生物学的供給源は、生体内または生体外にあってもよい。
【００３３】
ＩＩ．胎盤組織の修飾
一実施形態では、米国特許出願第６１／６８３，６９８に記載されているように、羊膜および絨毛膜の洗浄、分離または上皮細胞層の除去、維持、除染および脱水などで胎盤組織を修飾してもよい。米国特許出願第６１／６８３，７００号に記載されているような乾燥装置を用いて、脱水を達成してもよい。その両出願の開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのプロセスの各態様により、単独または組み合わせのどちらであるかに関わらず、本発明の目的のための修飾型胎盤組織が生成される。但し、修飾型胎盤組織は、少なくとも洗浄および除染工程を含むことが好ましい。従って、修飾型胎盤組織は、洗浄および除染された胎盤組織を含み、かつ、羊膜および絨毛膜の分離、上皮細胞層の除去、および脱水のうちの１つ以上を行った胎盤組織も含むことが好ましい。
【００３４】
いくつかの実施形態では、修飾型胎盤組織は、羊膜、絨毛膜または羊膜および絨毛膜の両方から選択される。一実施形態では、修飾型胎盤組織は臍帯を含み、別の実施形態では、臍帯を含まない。
【００３５】
修飾型胎盤組織を層に形成することもでき、それを別々に乾燥して互いに積層するか一緒に乾燥して多層積層体を形成してもよい。一実施形態では、２つ以上の羊膜層を積層する。別の実施形態では、２つ以上の絨毛膜層を積層する。さらに別の実施形態では、羊膜層および絨毛膜層を積層する。任意に、積層前に、羊膜層をさらに修正して、上皮層を実質的に除去する。上皮層の除去後に、線維芽細胞層を実質的にそのままにすることが好ましい。
【００３６】
また、修飾型胎盤組織を、様々な大きさの粒子に微粉化してもよい。微粉化胎盤組織は、多層積層体の１つ以上の層の間にあっても積層体の上にあってもよい。また、微粉化胎盤組織を、修飾型胎盤組織の単層に添加してもよい。例えば、米国仮出願第６１／５４３，９９５号を参照されたく、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３７】
修飾型胎盤組織をさらに処理して、生物学的因子の抽出物の水溶液を得てもよい。そのような抽出物の調製および使用については、米国特許出願第１３／７４４，３３１号に記載されており、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３８】
特定の実施形態では、本明細書に記載されている修飾型胎盤組織を、自己統合型の真空源と接触する機能的乾燥板を含めることにより米国特許出願第１３／７４４，３３２号（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている乾燥装置を修正したものである革新的な脱水装置で脱水する。より具体的には、この脱水装置は、（ｉ）乾燥室を画定し、かつ流入および流出開口部を画定する乾燥ハウジングと、（ｉｉ）乾燥室内に、バキュームテーブルの上に配置される多孔乾燥板とを備える。多孔乾燥板は、脱水される胎盤組織を受け入れる第１の表面と、第１の表面に対向し、かつバキュームテーブルと直接もしくは間接的に接触する第２の表面とを有する。そのような構成では、上記脱水装置により、脱水プロセスの間に、乾燥板の表面に配置された胎盤組織を真空吸引で適所に保持することができる。
【００３９】
特定の実施形態では、乾燥板は、乾燥プロセスの間に胎盤組織を引き伸ばした状態でしっかりと保持して胎盤組織が移動および／または収縮するのを防止するように、胎盤組織のその表面へのちょうど十分な接着を可能にする材料で作られている。一方、過度に接着性のある材料は、脱水された胎盤組織をその表面から取り外すのを難しくし、それにより、脱水された胎盤組織に望ましくない引裂または他の損傷を引き起こす。乾燥板の材料は、疎水性表面および所望の弾性を有することが好ましい。一実施形態では、乾燥板の材料は、シリコーンまたはポリカーボネートである。乾燥板は、望ましい剛性および疎水性を与えるようにシリコーンによって完全に取り囲まれたポリカーボネートインサートを含むことが好ましい。乾燥板は、望ましい剛性を与えるために、少なくとも１／８インチ、少なくとも１／４インチ、少なくとも３／８インチ、少なくとも１／２インチ、少なくとも５／８インチ、少なくとも３／４インチ、少なくとも７／８インチまたは少なくとも１インチの厚さを有し、それにより、真空乾燥中の屈曲／曲げを防止することがより好ましい。
【００４０】
乾燥板にとって適当な剛性の材料を選択することは、当業者の技能の範囲内である。例えば、ステンレス鋼製の乾燥板を使用してもよい。そのような材料を使用する場合、特殊な表面処理または被覆を乾燥板に施して、湿った胎盤組織の取り扱いならびに脱水された胎盤組織の分離を容易にし、損傷を回避する。そのような被覆材料としては、ポリカーボネートおよびポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる被覆材料は、例えば約３２℃への温度変化に伴って親水性から疎水性に表面特性を変化させることができる、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）などのヒドロゲルであってもよい。このように、温度を調整することにより、胎盤組織の乾燥板への制御された接着を達成することができる。
【００４１】
乾燥板を、他の望ましい特徴を有するようにさらに改良してもよい。例えば、乾燥板は、組織移植片にエンボスを形成するために凹部、凸部またはその両方を含む。乾燥板は、乾燥プロセス中にそのエンボスが胎盤組織に押し付けられるように、ポジ型またはネガ型エンボスを有する。例示的なエンボスとしては、字、文字、デザイン、ロゴ、画像、パターンなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、胎盤組織に押し付けられるエンボスにより、最終使用者は、例えば、一方の面から可視化した場合に他方の面とは異なるように現れる非対称的な形状部により、脱水された胎盤組織の一方の面を他方の面から肉眼で容易に識別することができる。
【００４２】
いくつかの実施形態では、乾燥板は、半透明であっても不透明であってもよい。乾燥板は、ミントグリーンまたはメディカルブルーカラーなどの胎盤組織の天然の色とは対照的な色を有し、この板の上に置いた場合に胎盤組織の目視検査を容易にするものが好ましい。いくつかの実施形態では、乾燥板は、滑らかな表面を有する。他の実施形態では、乾燥板は、ざらざらした表面を有する。さらに他の実施形態では、乾燥板は、それが脱水された胎盤組織上に「ウォーターマーク」を与えるように、滑らかな表面の領域とざらざらした表面の領域との組み合わせを有する。当業者であれば、胎盤組織と接触する乾燥板の表面の質感を変えて、所望の質感を有する脱水された胎盤組織を得ることができるであろう。
【００４３】
乾燥板は多孔性であり、この乾燥板の領域全体に広がった穴または穿孔を有し、真空圧の印加が可能である。胎盤組織を乾燥板の表面に置いたら、真空吸引を行って、胎盤組織をこの板の乾燥表面に押し当てる。胎盤組織およびこの板が曲げ、屈曲および／または収縮するのを防止しながら、エンボスが胎盤組織にはっきりと押し付けられるように、真空圧を調整する。
【００４４】
望ましい結果を達成するために、穴の数および大きさを変えることができる。いくつかの実施形態では、これらの穴を望ましいパターンで配置してもよい。全ての穴が胎盤組織によって覆われて、均等かつ一貫した真空圧が与えられるように、これらの穴が乾燥板の表面全体に均等に広がっていることが好ましい。これらの穴のパターンは、対称的なデザインであってもそうでなくてもよい。これらの穴を四角形の対称的なパターンで配置することが好ましい。より具体的には、これらの穴の幾何学的形状は、字および／または他のデザインまたはアートワークを含んでいてもよい。また、これらの穴は、乾燥板の厚さにわたって変化する幾何学形状を有していてもよい。例えば、これらの穴の深さおよび大きさを制御することにより、胎盤組織へのエンボスが特定のデザインを有するように、５ｍｍの直径および１ｍｍの深さを有する穴が、１ｍｍの直径および０．１ｍｍの深さを有する穴のすぐ隣にあってもよい。望ましいデザインだけでなく一貫した望ましい真空圧も達成するために、これらの穴の数、直径および深さを変える必要性のバランスを取ることは、当業者の技能の範囲内である。
【００４５】
一実施形態では、約１００ｃｍ２、約１５０ｃｍ２、約２００ｃｍ２、約２５０ｃｍ２、約３００ｃｍ２、約３５０ｃｍ２、約４００ｃｍ２、約４５０ｃｍ２または約５００ｃｍ２の面積に、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個の穴がある。別の実施形態では、穴の大きさは、直径が０．１ｍｍ〜１０ｍｍの範囲、例えば、０．１ｍｍ未満、０．５ｍｍ未満、１ｍｍ未満、２ｍｍ未満、３ｍｍ未満、４ｍｍ未満、５ｍｍ未満、６ｍｍ未満、７ｍｍ未満、８ｍｍ未満、９ｍｍ未満または１０ｍｍ未満であってもよい。穴の大きさは、直径が４ｍｍ〜８ｍｍであることが好ましい。乾燥板の穴は、同じ大きさであってもそうでなくてもよい。穴の数および穴の大きさを変えて、望ましい結果を達成してもよい。例えば、穴の数は、５０個未満または３００個超であってもよく、穴の直径は、０．１ｍｍ未満または１０ｍｍ超であってもよい。一般的な原理では、穴の数が多くなる程、穴の大きさは小さくなる。本発明の開示内容に従って、日常的な実験により、穴の数および大きさを決定することができる。
【００４６】
真空源は、乾燥室内に配置されたバキュームテーブルに減圧を供給する。次いで、バキュームテーブルならびに、拡大解釈すれば、乾燥板および胎盤組織を、真空源からの可変かつ制御可能な量の減圧に供して胎盤組織に機械力を加え、それにより、胎盤組織を適所に保持する。胎盤組織が乾燥プロセス中に移動および／または収縮するのを防止し、かつ鮮明なエンボスを胎盤組織に押し付けるのに十分でありながらも、組織への損傷を回避するために最小の圧力が胎盤組織に印加されるように真空圧を調整することは、当業者の技能の範囲内である。
【００４７】
あまりに高い真空圧で脱水を行うと、「気泡」形成などの凹凸な表面を有する組織移植片が生成され、あまりに低い真空圧で脱水を行うと、胎盤組織は、当該プロセス中に十分に安定せず、その結果、この組織は、収縮し、皺が寄り、かつ／または不鮮明なエンボスを有してしまうことがある。
【００４８】
従って、当業者であれば、脱水装置は、乾燥室内のプレナムからの循環空気流の僅かな陽圧と、乾燥用固定具の内側流路により移植片に加えられる真空からの僅かな陰圧との差により生じる圧力勾配差によって制御されることが分かるであろう。この勾配は、以下の公式に従って計算し、これを操作して組織の分離を容易にし、かつこの真空乾燥装置の設計特性により乾燥を促進することができる。これは、少なくとも４つのパラメータ、すなわち、乾燥板表面に接触している穴の数、穴の大きさまたは直径、真空圧および乾燥板の総表面積の制御によって達成される。
Ｆ＝Ｐｖ×Ａｈ／Ａｂ
（式中、Ｆは保持圧力であり、Ｐｖは真空圧であり、Ａｈは、胎盤組織との境界面における穴の表面積の合計（板全体）であり、Ａｂは乾燥板の表面積である）
【００４９】
円形の断面を有する穴が同じ大きさを有する場合、以下の式を使用してもよい。
Ａｈ＝Ｐｉ×Ｒ２×Ｎ
（式中、Ｐｉは真空圧であり、Ｒ２は穴の二乗半径であり、Ｎは板全体の穴の数である）
【００５０】
好適なバキュームテーブルの選択は、当業者の技能の範囲内である。多くの市販されているバキュームテーブルは、本発明の目的に適している。例えば、Systematic Automation社からバキュームテーブルを入手してもよい。
【００５１】
いくつかの実施形態では、乾燥板を、乾燥プロセスを促進するのに十分に高いが、胎盤組織を損傷するほどに高くはない温度に加熱する。あるいは、乾燥室内のプレナムを通って移動する空気を、２０℃〜４５℃の一定の温度に加熱する。空気または乾燥板あるいはその両方の温度を４５℃に一定に保って、乾燥室内の湿度を低下させ、乾燥プロセスを速めることが好ましい。加熱した空気を濾過し、乾燥室全体に循環させて、胎盤組織および室内の雰囲気から水分を除去する。さらに他の実施形態では、乾燥剤を空気流の流入および流出ラインの一方または両方のライン上であって、なお乾燥室の外側に配置することにより、空気流から水分を除去する。加熱した空気を乾燥剤を通して再循環させることにより、コストをさらに低下させ、かつ乾燥プロセスを促進させる。加熱した気流を、胎盤組織の表面に対して４５°の角度にすることが好ましい。
【００５２】
他の様態では、複数の胎盤組織移植片を乾燥板の上に配置して、脱水装置で２つ以上の胎盤組織移植片を同時に乾燥することができる。脱水装置は、本明細書に記載されている組織移植片を脱水するのに有用であるが、胎盤組織以外の物体を脱水するために使用することができる。
【００５３】
ＩＩＩ．修飾型胎盤組織の使用
本出願の発明者らは、驚くべきことに、本発明によって包含される修飾型胎盤組織の使用により、２重の治療効果が達成されること、すなわち、対象の損傷または疾患した臓器または体の一部への修飾型胎盤組織の施用により、外因性治療効果が生じるだけでなく、施用部位への幹細胞動員および／または局在化により得られる内因性治療効果も生じることを発見した。
【００５４】
修飾型胎盤組織を損傷または疾患した臓器または体の一部に施用すると、幹細胞が正常な生理的条件下での幹細胞の濃度よりも高い濃度でその部位に蓄積するように、幹細胞が、その損傷または罹患した部位に遊走することを予期せずに発見した。このような幹細胞動員は、施用されるとケモカインなどの幹細胞動員因子を放出する当該部位に施用される修飾型胎盤組織によって直接誘発される。あるいは、幹細胞動員は、当該部位に施用される修飾型胎盤組織により間接的に誘発される。すなわち、修飾型胎盤組織の施用は、近くの細胞に対する誘発効果を有し、次いで、この細胞が、幹細胞動員因子を放出して、幹細胞を損傷または疾患した部位に引き付ける。好ましい実施形態では、幹細胞動員は、修飾型胎盤組織によって果たされる直接的および間接的効果の組み合わせによって誘発される。
【００５５】
いくつかの態様では、幹細胞の走化性および／または動員を高める１種以上の幹細胞動員因子を、本技術の微粉化胎盤組織または修飾型胎盤組織の抽出物もしくは水溶液などの修飾型胎盤組織に添加してもよい。あるいは、幹細胞動員因子を組織移植片積層体の層に添加してもよい。このように、例えば、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、細胞外基質成分および他の生物活性物質を修飾型胎盤組織に添加して、天然の幹細胞動員を高めることができる。幹細胞動員因子の具体的かつ非限定的な例としては、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣケモカインまたはＣＸ３Ｃケモカインのうちの１種以上が挙げられる。他の幹細胞動員因子としては、ｃｃ−線維芽細胞増殖因子（αＦＧＦまたはαＦＧＦ−１）、β−線維芽細胞増殖因子（βＦＧＦ−１またはβＦＧＦ−２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥ）、アンジオポエチン−１および−２、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２および−７）、形質転換増殖因子−αおよび−β（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１α）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などの増殖因子ならびに当該技術分野で知られている他の因子がさらに挙げられる。
【００５６】
損傷または疾患した臓器または体の一部に幹細胞が動員されると、長期間にわたる幹細胞の当該部位における局在化により、治療効果が高められる。幹細胞の局在化は、長期間にわたって幹細胞動員因子を絶えず放出する修飾型胎盤組織の存在によって達成される。従って、胎盤組織をさらに修飾して幹細胞動員因子の放出が異なる相を組み込むことは当業者の技能の範囲内である。例えば、微粉化胎盤組織を修飾型胎盤組織と併用して、幹細胞動員因子の即時、遅延および持続放出を達成する。別の実施形態では、修飾型胎盤組織の抽出物または水溶液が幹細胞動員因子の迅速放出により幹細胞の即時動員を誘発することができるように、その抽出物または水溶液を修飾型胎盤組織の他の形態と組み合わせ、ここでは、修飾型胎盤組織の他の形態は、幹細胞が長期間にわたって当該部位に動員および／または局在化されるように、幹細胞動員因子の遅延放出を有し、それにより治療効果を高める。
【００５７】
さらなる薬剤を修飾型胎盤組織と共に、損傷または疾患した臓器または体の一部に同時投与して、当該部位に動員される幹細胞の局在化を促進してもよい。例えば、修飾型胎盤組織を、局所部位における粘度を増加させる薬剤と同時投与してもよい。医薬用途に適したゲル化剤、揺変剤、相変化剤などの任意の増粘剤は、本発明の範囲内である。修飾型胎盤組織と同時送達される場合、これらの薬剤は、粘性またはゲル状の生体侵食性または生分解性の塊を生体内に形成し、これにより、送達部位から遠くへの輸送を制限し、かつ長期間にわたって、幹細胞動員因子を形成された塊から拡散させることができる。
【００５８】
生体適合性揺変剤は、単なる一例として、ヒアルロン酸、コラーゲン、トロンビンゲル、フィブリンゲルおよびフィブリン接着剤から選択される。別の実施形態では、相変化剤は、プルロニック（登録商標）（例えば、オキシエチレンおよびオキシプロピレンのコポリマー）などのゲル形成剤である。ゲル化剤、揺変剤または相変化剤として使用される任意のポリマーは生体侵食性であることが好ましい。さらに別の実施形態では、臓器または体の一部は、皮膚、粘膜、歯に隣接する歯肉、骨、軟骨、腱、網膜、末梢神経、末梢神経鞘、小腸、大腸、胃、骨格筋、心臓、肝臓、肺および腎臓からなる群から選択される。
【００５９】
他の実施形態では、対象への送達前に、揺変性組成物または相変化組成物を形成する。そのような組成物は、修飾型胎盤組織および増粘剤を含む。揺変性組成物とは、剪断力の不存在下で、当該組成物が高い粘度を有し（この組成物は移動しない）、かつ剪断力の存在下で、当該組成物の粘度は、剪断力下で送達可能なように、大きく低下する組成物である。揺変性組成物の例は、練り歯磨き粉である。相変化組成物は、温度の上昇、光活性化、電磁気刺激、相変化捕因子（例えば、アルギン酸塩＋カルシウム）の添加などの好適な誘因に基づいて液体からゲルまたは固体の塊に変化する水性組成物である。そのような組成物は当該技術分野でよく知られている。これらの組成物は、注射により送達可能であるが、必要に応じて局所的にも送達可能であることが好ましい。当該組成物の粘度により従来の注射が不可能な場合、高圧注射器を使用することができ、これは当該技術分野でよく知られている。そのような高圧注射器の非限定的な例としては、米国特許第６，５０３，２４４号（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものなどが挙げられる。
【００６０】
従って、修飾型胎盤組織を損傷または疾患した臓器または体の一部に施用することを必要とするいくつかの治療法により、外因性治療効果に加えて、幹細胞動員および／または局在化による内因性治療効果が生じる。そのような治療法は、本発明を限定しないように、以下に例示されている。さらなる例示的な治療法は、米国特許出願第１３／８１５，８７３号および第６１／７１３，３５２号に記載されており、それらの開示内容は、参照により明確に本明細書に組み込まれる。
【００６１】
Ａ．損傷治癒
例えば、修飾型胎盤組織は、数多くの損傷治癒用途で使用されている。羊膜は、損傷治癒および再上皮化を促進するＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＰＤＧＦなどの増殖因子を含む。本発明は、十分な量で使用されると、そのような修飾型胎盤組織が、施用部位の近くで幹細胞動員を直接または間接的に誘発するという発見にも基づいている。一態様では、皮膚の上皮層が分断されている場所への本明細書に記載されている修飾型胎盤組織の施用は、増殖因子を損傷した部位に直接送達して、治癒ならびに幹細胞動員を促進するのに有効であり得る。羊膜は、羊膜を水に結合させて膨潤させることができるＩＶ型、Ｖ型およびＶＩＩ型コラーゲンの存在により、独特なＥＣＭである。修飾型胎盤組織の損傷治癒態様は、外因性治療効果を有し、修飾型胎盤組織から直接的および／または間接的に生じる幹細胞動員は、内因性治療効果を有することが理解される。
【００６２】
同様に、胎盤組織の中間組織層は、主として糖タンパク質およびプロテオグリカンからなり、それらは、中間組織層を水に結合させることもできる。従って、修飾型胎盤組織は、罹患または損傷した臓器または体の一部に施用された場合、その部位に水を保持するのを助け、それにより治癒が促進される。例えば、治癒カスケード内の幹細胞動員を含む細胞遊走は、親水性環境において促進される。当該中間層も、Ｉ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型コラーゲンからなる。Ｉ型コラーゲンは、細胞接着および巨大分子の固定のために主要な生物力学的足場を提供することにより、皮膚に機械的強度を与える。ＩＩＩ型コラーゲンは弾性を与える。
【００６３】
医師が日常的に遭遇する創傷の種類は様々である。急性創傷は、外科的介入、外傷および火傷によって生じる。慢性創傷は、そうでない健康な個体における治癒と比較して塞がりが遅い創傷である。患者を悩ませる慢性創傷の種類の例としては、糖尿病性足潰瘍、静脈性下腿潰瘍、褥瘡性潰瘍、動脈性潰瘍および感染性外科的創傷が挙げられる。
【００６４】
外傷性創傷を治療する際の医師の目標は、瘢痕形成および感染を最小限に抑えると共に、患者が創傷領域における自然の機能を保持できるようにしながら、創傷を治癒することにある。創傷部位が感染した場合、肢または命を失う恐れがある。ほとんどの場合、医師は、何事もなくこれらの患者を治療する。但し、慢性創傷を処置する医師は、肢または命を失う恐れのある感染のリスクを最小限に抑えるために、可能な限り素早く創傷を塞ぐことを主に気にかけている。慢性創傷は、治癒カスケードを悪化させたり遅らせたりする共存症を有する患者における創傷である。一態様では、本明細書に記載されている修飾型胎盤組織は、必須損傷治癒因子、細胞外基質タンパク質、炎症性メディエータを送達し、かつその部位への幹細胞動員および／または局在化を誘発して、炎症の減少、治癒の向上および瘢痕組織形成の減少を助ける組織再生テンプレートとして機能することができる。この態様では、本明細書に記載されている微粉化胎盤組織を含む修飾型胎盤組織を、火傷および慢性潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡性潰瘍などの潰瘍を含む、陰圧術に適した創傷を治療する際に使用する。別の態様では、修飾型胎盤組織を、限定されるものではないが、陰圧療法などの従来の治療と併用し、かつコラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチンまたはそれらの組み合わせなどの生体適合性材料からなる基質または足場とも併用することができる。
【００６５】
Ｂ．瘢痕形成の防止
別の態様では、本明細書に記載されている修飾型胎盤組織を使用して、外科的切開による瘢痕形成を防止することができる。修飾型胎盤組織は、外科手術により大きな切開部が生じた場合に非常に有用である。特に、修飾型胎盤組織は、外科手術後に生じる脊椎およびその周囲領域への合併症に対処するかそれを緩和するのに有用である。一態様では、修飾型胎盤組織は、脊椎または脊椎近傍における瘢痕形成を防止または減少させ、かつ硬膜裂傷を封着するのに有用である。外科手術後の脊椎またはその近傍における瘢痕形成は、対象を非常に衰弱させ、場合により、上に記載した症状に対処するためにその後の手術が必要となることもある。「抗接着」という用語も、脊椎またはその近傍における瘢痕組織の予防を指すために当該技術分野で使用される。外因性療法として、修飾型胎盤組織を保護障壁として使用して、脊髄硬膜をその周囲の手術部位からの外科手術後外傷から保護することができる。例えば、本組成物は、椎骨などの新しく切断された骨からの鋭いエッジによって生じる脊髄硬膜への損傷を防止することができる。他の様態では、修飾型胎盤組織を、前方椎体間固定術、後方椎体間固定術、経椎間孔腰椎椎体間固定術、頸椎前方除圧固定術、顕微鏡下椎間板切除術、脊髄硬膜修復のため、および、脳脊髄液漏を防止するための硬膜シーラントとして使用することができる。各態様では、修飾型胎盤組織の当該部位への施用により、体の他の部分から当該部位への幹細胞動員および／または局在化による自己応答を誘発し、それにより治療効果を高める。
【００６６】
Ｃ．整形外科用途
他の様態では、本明細書に記載されている修飾型胎盤組織を、整形外科用途（すなわち、スポーツ医学）で使用することができる。スポーツ医学としては、外傷または活動的な個体および運動選手における繰り返しの動きによって生じる慢性疾患によって引き起こされる、関節またはその周囲における様々な軟組織傷害の修復および再建が挙げられる。例えば、スポーツ医学としては、限定されるものではないが、肩、肘、足、足首、手および手首に関連する様々な異なる損傷の治療が挙げられる。一態様では、修飾型胎盤組織を使用して、炎症（例えば、テニス肘、手根管症候群など）を緩和させることができる。他の様態では、医学的な利点を得るために、修飾型胎盤組織を関節面に施用することができる。例えば、修飾型胎盤組織は、関節面の炎症または腫れを軽減するのを助けることができる。他の様態では、修飾型胎盤組織は、軟骨細胞の修復および／または再増殖を助けることができる。さらなる態様では、本明細書に記載されている修飾型胎盤組織を、骨膜の修復の支援、破裂／損傷した滑液嚢の修復の支援、骨修復中の空洞充填材料の確保の支援などの他の整形外科用途、または、対象の四肢に関わる用途（例えば、小骨の固定のための抗接着障壁、金属板または金属製品が使用されている場所における抗接着障壁、または破裂／損傷した滑液嚢の修復支援）で使用することができる。各事例において、幹細胞動員および／または局在化のさらなる利点により、罹患および／または損傷した臓器および／または体の一部に対するさらなるレベルの内因性療法が得られる。
【００６７】
Ｄ．他の治療法
他の様態では、修飾型胎盤組織を使用して、歯肉炎、歯周炎、粘膜炎およびインプラント周囲炎に関連する炎症を減少させ、骨縁下欠損を治療して新しい骨を再生させ、組織／器官を修復および再生させ、歯周靭帯およびセメント質を再生させ、歯科インプラトの周囲の失われた骨を再生させ、骨欠損部修復後のクリニカルアタッチメント量を増加させ、歯肉退縮を治療し、大きさおよび厚さを増加させるための外科的再建または乳頭への直接的注射のいずれかにより歯間乳頭を再生させ、垂直性および水平性歯槽骨増大術において障壁膜または生体適合性網目組織の上方に施用し、治癒を助けるために一次縫合後に手術部位の上方に施用し、歯肉退縮の治療における軟組織移植片の配置前、間または後のいずれかに、自家移植片、異種移植片、人工移植片、同種移植片または胎盤の同種移植軟組織移植片の上に施用し、歯および歯科インプラトの周囲におけるクリニカルアタッチメント量および歯肉を増大させ、角化組織の領域を拡大させ、骨再生誘導において上を覆う歯肉組織を肥厚させ、骨再生誘導において、新しい骨、歯周靭帯およびセメント質を再生するための骨縁下欠損の治療に使用するために配置する前、間または後のいずれかに、人工移植片、異種移植片および／または骨移植片と混合し、インプラントの周囲の失われた骨を再生させると共に、部位保存、開窓術および裂開による欠損の治療、一次および二次歯槽堤増大術、上顎洞底挙上術ならびに歯肉弁の穿孔の治療を行うことができる。象牙質および歯髄組織に関わる用途では、歯髄組織の炎症を減少させ、歯内病変部を治療し、歯髄を再生させ、歯内療法における閉塞前にくり抜かれた髄室に注射することができる。経口粘膜組織に関わる用途では、口腔病変部における炎症を減少させ、口腔病変部を治療し、疾患または外傷により失われた大量の粘膜組織を置換するために、軟組織移植片を配置する前、間または後のいずれかに、自家移植片、異種移植片、人工移植片、同種移植片または胎盤の同種移植軟組織移植片の上に施用することができる。
【００６８】
上記各用途では、修飾型胎盤組織を、幹細胞を引き付けて内因性治癒を促進するのに十分な量で、罹患および／または損傷した体の一部に直接、またはその近くもしくはその内部に施用する。各種態様では、幹細胞を損傷した体の一部に引き付けるために、幹細胞が標的の体の一部に遊走する前に、十分な量の胎盤組織が必要となる。例えば、実施例３に記載されているように、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）に応答して、濃度依存的に幹細胞遊走が生じた。１．５ｍｍの直径のディスク状ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）修飾型胎盤組織では、生体外での幹細胞の顕著な遊走が生じないことが分かった。しかし、４ｍｍの直径のディスク状ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）修飾型胎盤組織および１２×１３ｍｍの四角形のＥｐｉＦｉｘ（登録商標）パッチは、対照細胞と比較して、幹細胞の遊走における統計的に有意な増加を示す。１平方センチメートルのＥｐｉＦｉｘ（登録商標）の重量は４ｍｇである。驚くべきことに、幹細胞遊走は、生体外であっても、遊走を誘発するには修飾型胎盤組織の最小の質量、すなわち１．５ｍｍ超のディスク状のＥｐｉＦｉｘ（登録商標）修飾型胎盤組織の質量を必要とする。別の言い方をすると、十分な量の修飾型胎盤組織の存在は、幹細胞動員および／または局在化が達成される十分な濃度の幹細胞動員因子に相関する。
【００６９】
さらに、実施例４は、移植から約２週間後に開始するマウスにおける幹細胞動員の統計的に有意な増加を生じさせる５×５ｍｍ四方のＥｐｉＦｉｘ（登録商標）修飾型胎盤組織パッチの生体内移植について記載している。この点に関しては、より多量のＥｐｉＦｉｘ（登録商標）修飾型胎盤組織の使用により、幹細胞動員を達成するための時間枠の減少および／または所与の期間にわたって動員される幹細胞数のいずれかにおいて幹細胞動員がさらに向上すると考えられる。各種実施形態では、幹細胞動員の向上は、修飾型胎盤組織を移植されていない対象と比較した場合に、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、９０％、１００％以上である。それにも関わらず、少なくともこの実施例では、データから、幹細胞動員および／または局在化を達成するために最小量を超えるＥｐｉＦｉｘ（登録商標）修飾型胎盤組織が必要であることが分かる。
【００７０】
さらに、微粉化された修飾型胎盤組織は、特定の体の一部において幹細胞動員率を向上させることができるとも考えられる。これらの態様では、微粉化された修飾型胎盤組織を、単層の修飾型胎盤組織または多層の胎盤組織積層体の間のいずれかの修飾型胎盤組織に添加する。
【実施例】
【００７１】
以下の実施例は、本明細書に記載され、かつ特許請求される化合物、組成物および方法の製造および評価方法に関する完全な開示および記載を当業者に提供するために示されており、純粋に例示的なものであって、本発明者らが彼らの発明であるとみなしているものの範囲を限定するものではない。数（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証するように努めたが、若干の誤差および偏差を考慮すべきである。特に明記しない限り、部とは重量部であり、温度は、摂氏温度または周囲温度であり、圧力は、大気圧またはその前後の圧力である。反応条件、例えば、成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力およびその他の反応範囲ならびに本記載の方法で得られる生成物純度および収率を最適化するために使用することができる条件の数多くの変形および組み合わせが存在する。そのようなプロセス条件を最適化するために、合理的かつ日常的な実験法のみが必要とされる。
【００７２】
実施例１：微粉化胎盤組織の調製
微粉化された粒子を生成するためにここで使用される羊膜／絨毛膜組織移植片を、米国特許出願公開第２００８／００４６０９５号に記載されている方法（その開示内容全体が参照により組み込まれる）で生成した。組織移植片（４ｃｍ×３ｃｍ）および２つの９．５ｍｍのスチール粉砕ボールを５０ｍＬのバイアルの中に入れ、このバイアルをその後に密閉した。このバイアルを凍結ブロックの中に入れ、凍結ブロックをクライオラックの中に置いた。クライオラックを、液体窒素保持デュアー瓶の中に入れた。組織試料を僅か３０〜６０分間の気相冷却に供した。クライオラックをデュアー瓶から取り出し、凍結ブロックをクライオラックから取り出した。凍結ブロックを粉砕機(SPEX Sample Prep GenoGrinder 2010)の中に入れ、１，５００ｒｐｍおよび２０分間に設定した。２０分が経過した後、この組織を、確実に微粉化されているか調べた。必要であれば、この組織をデュアー瓶に戻してさらに３０〜６０分間置き、粉砕機に移動させてさらに２０分間かけて十分に微粉化する。この組織が十分に微粉化されたら、一連の米国規格ＡＳＴＭ篩を用いて分別する。これらの篩を、３５５μｍ、３００μｍ、２５０μｍ、１５０μｍおよび１２５μｍの順に置いた。微粉化された材料を、５０ｍＬのバイアルから３５５μｍの篩に移した。微粉化された粒子を徹底的に分離するために、各篩を個々に撹拌した。微粉化された粒子が篩を用いて有効に分離されたら、３５５μｍ、３００μｍ、２５０μｍ、１５０μｍおよび１２５μｍの粒径を有する微粉化された粒子を別個のバイアルに回収した。
【００７３】
実施例２：微粉化胎盤組織を含む組織移植片の調製
本明細書に記載されている化合物、組成物および方法には様々な修正および変形を加えることができる。本明細書に記載されている化合物、組成物および方法の他の態様は、本明細書を検討し、かつ本明細書に開示されている化合物、組成物および方法を実施することにより明らかになるであろう。本明細書および実施例は、例示的なものとみなすものとする。
【００７４】
好適な架橋剤および架橋手順の詳細な説明は、「PLACENTAL TISSUE GRAFTS MODIFIED WITH A CROSS-LINKING AGENT AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME（架橋剤で修飾された胎盤組織移植片ならびにその製造および使用方法）」という発明の名称の代理人整理番号１０２７４１−０２５０として同時に出願された米国特許出願第６１／６８３，６９７号（その出願の開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。
【００７５】
強化された胎盤組織移植片の詳細な説明は、「REINFORCED PLACENTAL TISSUE GRAFTS AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME（強化された胎盤組織移植片ならびにその製造および使用方法）」という発明の名称の代理人整理番号１０２７４１−０３５０として同時に出願された米国特許出願第６１／６８３，６９９号（その出願の開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。
【００７６】
微粉化胎盤組織の製造および使用ならびにその抽出物の詳細な説明は、「MICRONIZED PLACENTAL TISSUE COMPOSITIONS AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME（微粉化胎盤組織組成物ならびにその製造および使用方法）」という発明の名称の代理人整理番号１０２７４１−０４００として同時に出願された米国特許出願第６１／６８３，７００号（その出願の開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。
【００７７】
実施例３：ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）の存在下での細胞遊走
ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）試料の存在下での細胞培養液中のヒト間葉系幹細胞（ヒトＭＳＣ）を評価して、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）がヒトＭＳＣの遊走を誘発するか否かを判定した。ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）は、そのままの上皮層を含む羊膜および絨毛膜の層である。
【００７８】
材料および方法
インサートの底に８μｍ細孔膜フィルタを備えた２４ウェル細胞培養インサート（図１を参照、BD Biosciences社）で標準的な遊走アッセイを行った。実験開始の２４時間前に、ヒトＭＳＣ（１人の提供者、３継代）を無血清培地で培養し、５μｇ／ｍＬフィブロネクチンを含む３００μＬのＰＢＳを各細胞培養インサートの中に入れ、フィブロネクチンを細胞培養インサート表面に一晩吸着させた。
【００７９】
実験の当日、７００μＬの無血清培地をプレートの底のウェルの中に充填し、次いで、異なる大きさの滅菌したＥｐｉＦｉｘ（登録商標）部分（低群：直径１．５ｍｍのディスク、中群：直径４ｍｍのディスク、高群：３〜４ｍｍ四方の断片に切り揃えた１２×１３ｍｍの四角形のパッチ、ｎ＝６のＥｐｉＦｉｘ（登録商標）組織提供者を試験）（図２）を添加した。１平方センチメートルのＥｐｉＦｉｘ（登録商標）の重量は４ｍｇである。無血清培地および１０％ウシ胎児血清を含む培地（ｎ＝６）をそれぞれ、陰性および陽性対照とした。次いで、ヒトＭＳＣ（３００μＬ中に４０，０００個の細胞）を細胞培養インサートに充填し、２４時間培養した。次いで、細胞培養インサートの両側をＰＢＳですすぎ、上部インサート中の非遊走細胞を綿棒で除去した。膜フィルタを備えたインサートの下側にある細胞を１０％ホルマリンで２０分間固定した後すすいで、ヘマトキシリンで５分間染色した。倒立顕微鏡（Nikon TE2000、ＳＰＯＴソフトウェア４．６）で膜の下面において、その膜を通って遊走する細胞の数を数えた。
【００８０】
データを、１０％ＦＢＳ陽性対照に対して正規化し、各試料ウェルについて、１００倍視野の顕微鏡写真当たりで計数した遊走細胞の平均値±標準偏差として表す。正規化したデータ分散へのＢｏｘ−Ｃｏｘ変換を用い、次いで、チューキーのＨＳＤ事後検定と共に一因子分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、統計比較を行った。
【００８１】
結果
最少のＥｐｉＦｉｘ（登録商標）試料を含む低群（直径１．５ｍｍのディスク）は、無血清陰性対照とは有意に異なっていなかった（図２の棒グラフを参照）。中群（直径４ｍｍのディスク）および高群（３〜４ｍｍ四方の断片に切り揃えた１２×１３ｍｍの四角形のパッチ）はどちらも、無血清対照よりも統計的に高く（対照に対して約６０％および７５％の遊走、図２を参照）、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）が細胞遊走を刺激したことを示した。高群は、中群とは有意に異なっていなかった。これらの結果は、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）製品は、ヒト間葉系幹細胞を引き付ける１つ以上の因子を含むことを示している。
【００８２】
実施例４：ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植組織を移植したマウスにおける幹細胞動員
マウス造血幹細胞（ＨＳＣ）およびマウス間葉系幹細胞（マウスＭＳＣ）に焦点を当てて、正常なマウスに移植されたＥｐｉＦｉｘ（登録商標）が幹細胞／前駆細胞の動員を引き起こすか否かを判定するための研究を行った。
【００８３】
材料および方法
正常なマウスへの移植のために、６人の提供者からのＥｐｉＦｉｘ（登録商標）製品を使用した。５×５ｍｍの四角形のＥｐｉＦｉｘ（登録商標）を、４月齢のＦＶＢ／ＮＪマウス（体重：約２３．５０ｇ〜約３０ｇ）の皮下に外科的に配置した。時点ごとに１つの試料当たり４匹のマウスに移植を行った。時点は、３、７、１４および２８日であった。陰性対照は、正常な皮膚および偽の手術をしたマウス（外科的切開を行ったが移植は行わなった）であった。脱細胞化皮膚基質（無細胞皮膚基質、ＡＤＭ）を、比較用移植組織（Ｉ型コラーゲンあり、サイトカインなし）として使用した。移植組織およびその上を覆う皮膚を、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）のために採取した。
【００８４】
移植組織およびその上を覆う皮膚を採取し、１ｍｍ２の切片に切断し、０．１５％ディスパーゼ／０．０７５％コラゲナーゼの溶液中で３７℃で１時間インキュベートした。遠心分離後、試料を、以下に記載するようにＬｉｎ抗体カクテルで染色した。ＣＤ３１抗体を添加し、次いで、Alexa Fluor 647抗ラット二次抗体を添加した。フィコエリトリン−Ｃｙ７結合抗ＣＤ４５抗体を最後にインキュベートした。以下に記載するように、試料を調製および分析した。
【００８５】
試料を、Ｌｉｎ陰性（Ｌｉｎ−）抗体カクテル（Ｔｅｒ１１９／ＣＤ４／ＣＤ８ａ／Ｇｒ−１／ＣＤ４５Ｒ／ＣＤ１１ｂ）、次いでフィコエリトリン−Ｃｙ５抗ラット二次抗体と共にインキュベートした。間葉系幹細胞分析のために、結合抗体を、ＣＤ４５（フィコエリトリン−Ｃｙ７）およびＳｃａ−１（フルオレセインイソチオシアネート）に対して添加した。造血幹細胞分析のために、結合抗体を、ＣＤ４５（フィコエリトリン−Ｃｙ７）、ｃ−Ｋｉｔ（フィコエリトリン）、およびＳｃａ−１（フルオレセインイソチオシアネート）に対して添加した。試料を抗体と共に３０分間インキュベートし、次いで、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含むリン酸緩衝食塩水に入れた５体積の２％ウシ胎児血清を添加して、洗浄した。細胞を遠心分離し、次いで、ヨウ化プロピジウムに４℃で１分間再懸濁した。ＬＳＲフローサイトメーターを用いて試料を分析した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて、試料をｌｉｎ−／Ｓｃａ−１＋／ＣＤ４５−にゲートをかけて間葉系幹細胞を定め、ｌｉｎ−／Ｓｃａ−１＋／ｃ−Ｋｉｔ＋／ＣＤ４５＋にゲートをかけて造血幹細胞を定めた。
【００８６】
結果
マウスＨＳＣは、７、１４および２８日目に陰性対照と比較して、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植後に有意に増加した（図３Ａを参照）。マウスＨＳＣは、ＡＤＭと比較して２８日目もＥｐｉＦｉｘ（登録商標）試料中で有意に増加し続けた。
【００８７】
マウスＭＳＣは、７日目に陰性対照と比較して、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植後に有意に増加した（図３Ｂを参照）。マウスＭＳＣの平均比率は、陰性対照と比較して全ての時点で増加した。
【００８８】
このように、上記データから、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植組織は、正常なマウスの生体内において、ＨＳＣおよびＭＳＣの両方を有効に動員することが分かる。このデータから、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）により、無細胞皮膚基質（ＡＤＭ）よりも長期間のＨＳＣ動員が生じることも分かり、これは、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）のサイトカイン媒介効果についての仮説を支持している。
【００８９】
実施例５：ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植組織を移植したマウスにおける幹細胞の特性評価
フローサイトメトリーおよび免疫組織化学を用いて、マウスにおけるＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植部位に動員される幹細胞の特性を評価するための研究を行った。
【００９０】
材料および方法
５×５ｍｍ四方の無菌のＰｕｒｉｏｎ（登録商標）処理済みＥｐｉＦｉｘ（登録商標）パッチを、１６匹の４月齢のＦＶＢ／ＮＪマウスの背中の皮膚切開部から皮下に移植した。対照治療（偽）として使用するために、別の１６匹のマウスにも同じ皮膚切開部を形成した。コラーゲン足場と比較するために、５×５ｍｍ四方の脱細胞化ヒト真皮（無細胞皮膚基質、ＡＤＭ）パッチを、１６匹のマウスの背中の皮下に移植した。分析のために、手術していないマウスを「正常な」背中の皮膚の提供源として使用した。
【００９１】
幹細胞の分析のために、移植から３、７、１４および２８日目に、手術部位を取り除いた。各時点で４匹の動物／群を使用した。２つの異なる方法すなわち蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）で幹細胞を同定した。ＦＡＣＳ分析では、全ての細胞を羊膜および関連する再生した組織から単離した。これらの細胞を、特異的な幹細胞マーカーに対する抗体で蛍光標識した。各細胞の種類の同一性および数をフローサイトメーターで決定した。
【００９２】
免疫組織化学分析では、当該膜および関連する再生した組織を固定し、スライドのために薄片にし、幹細胞に特異的な抗体で染色した。免疫組織化学では、造血前駆細胞（ＨＰＣ）を特異的に検出し、かつ皮膚前駆細胞、内皮細胞、樹状細胞と反応する抗ＣＤ３４および内皮細胞を検出する抗ＣＤ３１の２種類の抗体を使用した。染色された組織薄片を顕微鏡で調べ、特異的な幹細胞の種類の存在および数を測定した。実験解析では、各細胞の種類の相対数を数えた。これらの結果を各細胞の種類の割合（免疫染色した細胞の数／細胞の総数）として計算した。細胞動員について２つの領域、すなわち移植組織を取り囲んでいる組織および移植組織そのものを免疫組織化学的に解析した。
【００９３】
結果
ＦＡＣＳ分析からの代表的なデータを図４Ａに示す。左側のパネルは、試料中の細胞の総数を示す。中央のパネルは、ＣＤ４５陽性細胞（赤い箱の中）の数を示す。右側のパネルは、Ｓｃａ−１陽性細胞（赤い箱の中）の数を示す。ＣＤ４５およびＳｃａ−１は、造血幹細胞に特異的なマーカーである。
【００９４】
図４Ｂは、例示的な免疫組織化学画像を示す。左下の角にある灰色のバーは、５０μｍを表す。当該薄片をＤＡＰＩ（青色−全ての細胞を染色）および抗ＣＤ３４（赤色）で染色した。組織が実験マウスに移植された場所を参考のために示す。
【００９５】
造血前駆細胞（ＨＰＣ）レベルは、陰性対照と比較して、１４および２８日目にＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植組織を取り囲んでいる組織において有意に上昇した。造血前駆細胞は、コラーゲン足場ＡＤＭ対照と比較して、１４および２８日目にＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植組織を取り囲んでいる組織において有意に増加した。
【００９６】
前駆細胞は、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植組織の中に動員された。移植組織内造血前駆細胞は、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植組織において１４日目にピークに達し、２８日目にも増加し続けた。移植組織内造血前駆細胞の平均数は、対照ＡＤＭと比較して、１４および２８日目にＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植組織において増加した。前駆細胞は、ＡＤＭ対照移植組織の中に動員されなかった。
【００９７】
ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植組織の血管新生は、１４日目から２８日目まで着実に増加した。ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植組織における新血管形成の量は、２８日目では、ＡＤＭ対照における量よりも有意に多かった。
【００９８】
これらのデータにより、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）が、造血幹細胞および間葉系幹細胞の両方を損傷部位に動員する１つ以上の因子を含むことが立証されている。これらの幹細胞の大部分は、偽の移植組織または、より重量なことに、対照のコラーゲン足場よりもＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜および関連する再生した組織に存在した。ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）は、移植組織部位に前駆細胞を動員してコロニーを形成するのに、対照の脱細胞化コラーゲン足場よりも有意に有効であった。対照コラーゲン足場よりも多くの前駆細胞がＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜に存在していた。
【００９９】
ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）は、関連する再生した組織およびＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜それ自体において新血管形成も誘発した。ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜における血管新生は、対照のコラーゲン足場よりも有意に高かった。
【０１００】
実施例６：可変真空圧および乾燥板の穴の大きさの試験
この研究は、望ましい組織の外観を達成するための真空圧の操作および乾燥板の穴の大きさを実証する。
【０１０１】
脱水中に羊膜組織を抑えるために必要な板の面積当たりの最小量の圧力を決定するために、様々な真空圧および板の穴の大きさを試験した。最小の圧力を使用することにより、システム効率を上げ、乾燥した胎盤組織移植片上の「気泡」の大きさを減少させる。一連の４つの実験にわたって、組織がもはや保持されず、かつ平らのままではなくなり、その代わり、脱水により収縮して皺が寄るまで、乾燥中の組織にかけられる真空圧を、１６インチの水から５インチの水になるまで徐々に減少させた。各実験のために、同じ複合板を使用し、温度を４５℃に一定に保った。穴の大きさは、一連の試験の途中で、直径６ｍｍから４ｍｍに変わった。以下の表は、記録した測定値および板の面積当たりの得られた圧力の計算値を詳細に示す。組織保持閾値を定めるために、「はい／いいえ」の二択の結果も挿入した。
【表１】
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【０１０２】
真空保持強度実験から得られたデータから、５．８９Ｐａ未満のどの圧力でも、脱水プロセス中に乾燥板の上に胎盤組織を安定させるのに不十分であることが分かる。各パラメータの閾値を、この実験により確立してもよい。
【０１０３】
本出願の全体を通して、様々な文献が参照されている。これらの文献の開示内容全体が、本明細書に記載されている化合物、組成物および方法をより完全に記載するために、参照により本出願に組み込まれる。
【０１０４】
本明細書に記載されている化合物、組成物および方法には様々な修正および変形を加えることができる。本明細書に記載されている化合物、組成物および方法の他の態様は、本明細書を検討し、かつ本明細書に開示されている化合物、組成物および方法を実施することにより明らかになるであろう。本明細書および実施例は、例示的なものとみなすものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年8月8日(2014.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の幹細胞動員因子を含む修飾型胎盤組織を含む組成物であって、前記胎盤組織は、生体内で体の一部の近くに配置されると、前記体の一部への幹細胞動員を促進するような十分な量で存在する組成物。
【請求項２】
前記体の一部は、骨、軟骨、腱、網膜、末梢神経、末梢神経鞘、小腸、大腸、胃、骨格筋、心臓、肝臓、肺および腎臓からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記胎盤組織によって動員される前記幹細胞は、多能性幹細胞である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
前記胎盤組織は、幹細胞を治療される体の一部に動員するのに十分な質量を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記体の一部は罹患または損傷している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
（ｉ）乾燥室を画定し、かつ流入および流出開口部を画定する乾燥ハウジングと、（ｉｉ）前記乾燥室内に、バキュームテーブルの上に配置される多孔乾燥板であって、脱水される胎盤組織を受け入れる第１の表面と、前記第１の表面に対向し、かつ前記バキュームテーブルに吸着する第２の表面とを有する乾燥板と、を備える真空脱水装置。
【請求項７】
前記胎盤組織は羊膜を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
生体内での幹細胞動員を促進するための、請求項１〜５または７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【国際調査報告】
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