(57)【要約】  本発明は、注射用水により２０ｍｇ／ｍＬの量に再構成した際に１５ｍＰａｓ以下の粘度を示す凍結乾燥デガレリクス製剤を製造する方法を提供する。本発明はまた、２０ｍｇ／ｍＬの量で水に溶解した際に３．２ｍＰａｓ以下の粘度を示す凍結乾燥デガレリクス原薬及びこの凍結乾燥デガレリクス原薬を生成する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
デガレリクス、酢酸及び残存量の水から本質的に成る凍結乾燥デガレリクス原薬であって、２．５重量％のマンニトールを含有する水１ｍＬあたりデガレリクス遊離塩基２０ｍｇの量で水に溶解した際に３．２ｍＰａｓ以下の粘度を示す、凍結乾燥デガレリクス原薬。
【請求項２】
２．５重量％のマンニトールを含有する水１ｍＬあたりデガレリクス遊離塩基２０ｍｇの量で水に溶解した際に１．１５〜２．０ｍＰａｓの粘度を示す、請求項１に記載の凍結乾燥デガレリクス原薬。
【請求項３】
４．５〜１０．０％（ｗ／ｗ）の酢酸含量を有する、請求項１又は２に記載の凍結乾燥デガレリクス原薬。
【請求項４】
１０％（ｗ／ｗ）以下の水分含量を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の凍結乾燥デガレリクス原薬。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のデガレリクス原薬を製造する方法であって、
ａ．液相又は固相ペプチド合成によって得られたデガレリクスを精製して、少なくとも９５％の純度を有するデガレリクス溶液を得るステップと、
ｂ．デガレリクス溶液を濃縮するために溶媒を蒸発させて、凝集したデガレリクスを得るステップと、
ｃ．凝集したデガレリクスを酢酸で脱凝集させるステップと、
ｄ．脱凝集したデガレリクスを凍結乾燥して、デガレリクス原薬を生成するステップと
を含む、方法。
【請求項６】
ステップｃの最後における酢酸濃度が、１５〜３５％（ｖ／ｖ）の範囲にある、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップｃにおける温度が、−５〜３０℃の範囲にある、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
デガレリクス（遊離塩基）濃度が、１０〜３５ｇ／Ｌの範囲にある、請求項５から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１から４のいずれか一項に記載のデガレリクス原薬を製造する方法であって、
ａ．液相又は固相ペプチド合成によって得られたデガレリクスを精製して、少なくとも９５％の純度を有するデガレリクス溶液を得るステップと、
ｂ．デガレリクス溶液をクロマトグラフィーカラムに装填するステップと、
ｃ．酢酸によりカラムからデガレリクスを溶出して、溶出したデガレリクスを提供するステップと、
ｄ．溶出したデガレリクスを凍結乾燥して、デガレリクス原薬を生成するステップと
を含む、方法。
【請求項１０】
ステップｃにおける酢酸濃度が、２７〜３７重量％の範囲にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
溶出したデガレリクスが、凍結乾燥の前にろ過される、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれか一項に記載のデガレリクス原薬を製造する方法であって、
ａ．液相又は固相ペプチド合成によって得られたデガレリクスを精製して、少なくとも９５％の純度を有するデガレリクス溶液を得るステップと、
ｂ．精製したデガレリクス溶液の酢酸濃度を、必要に応じて、６〜４０％（ｗ／ｗ）に調整するステップと、
ｃ．デガレリクス溶液を噴霧乾燥して、デガレリクス原薬を生成するステップと
を含む、方法。
【請求項１３】
注射用水によりデガレリクス遊離塩基２０ｍｇ／ｍＬの量に再構成した際に１５ｍＰａｓ以下、好ましくは２〜１２ｍＰａｓの範囲内の粘度を示すデガレリクス原薬及びマンニトールを含むデガレリクス製剤を製造する方法であって、
ａ．請求項１から４のいずれか一項に記載の凍結乾燥デガレリクス原薬を用意するステップと、
ｂ．凍結乾燥デガレリクス原薬をマンニトール含有水に溶解して、水性デガレリクス−マンニトール混合物を生成するステップと、
ｃ．水性デガレリクス−マンニトール混合物を凍結乾燥して、デガレリクス製剤を生成するステップと
を含む、方法。
【請求項１４】
溶解ステップが、水性デガレリクス−マンニトール混合物の粘度が３．２ｍＰａｓ以下に保持されるように実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
凍結乾燥デガレリクス製品の粘度を、注射用水によりデガレリクス遊離塩基２０ｍｇ／ｍＬの量に再構成して決定される粘度が１５ｍＰａｓ以下、好ましくは２〜１２ｍＰａｓの範囲内となるように制御する方法であって、
ａ．請求項１から４のいずれか一項に記載の凍結乾燥デガレリクス原薬を用意するステップと、
ｂ．凍結乾燥デガレリクス原薬をマンニトール含有水に溶解して、水性デガレリクス−マンニトール混合物を生成するステップと、
ｃ．水性デガレリクス−マンニトール混合物を凍結乾燥して、デガレリクス製剤を生成するステップと
を含む、方法。
【請求項１６】
再構成のための液体によりデガレリクス遊離塩基２０ｍｇ／ｍＬの量に再構成した際に１５ｍＰａｓ以下、好ましくは２〜１２ｍＰａｓの範囲内の粘度を示すデガレリクス原薬及びマンニトールを含む凍結乾燥デガレリクス製剤並びに前記液体を含むデガレリクス製剤を製造する方法であって、
ａ．マンニトール含有水溶液中に凍結乾燥デガレリクス原薬を溶解して、デガレリクス−マンニトール混合物を生成するステップと、
ｂ．デガレリクス−マンニトール混合物を凍結乾燥して、デガレリクス製剤を生成するステップと
を含み、凍結乾燥前に非イオン性界面活性剤がデガレリクス−マンニトール混合物に添加される、方法。
【請求項１７】
粘度低下剤が、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０又はトコフェリル−ポリエチレン−グリコール−１０００−スクシネートである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
非イオン性界面活性剤が、再構成した製剤中におけるその濃度が０．１〜５ｍｇ／ｍＬの範囲となるような量で使用される、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
凍結乾燥デガレリクス原薬が、マンニトール（２．５重量％）を含有する水にデガレリクス遊離塩基２０ｍｇ／ｍＬの量で溶解した際に３．２ｍＰａｓ超の粘度を示す、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
溶解ステップに続いて、ろ過ステップ及び充填ステップが行われてから、凍結乾燥前が行われる、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
凍結乾燥ステップが、崩壊温度未満の昇華ステップを含む、請求項１３から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
再構成用流体によりデガレリクス遊離塩基２０ｍｇ／ｍＬの量に再構成する際に１５ｍＰａｓ以下、好ましくは、２〜１２ｍＰａｓの範囲内の粘度を示す凍結乾燥デガレリクス製剤と再構成用流体とを含むデガレリクス製剤であって、０．００１〜５ｍｇ／ｍＬの量の非イオン性界面活性剤を含む、デガレリクス製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デガレリクス（Degarelix）を調製するための製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、工業社会における男性の罹患及び死亡の主要原因である。ＦＥ２００４８６としても知られるデガレリクスは、アンドロゲン除去療法を必要とする前立腺癌患者のために開発され、承認された第三世代ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）受容体アンタゴニスト（ＧｎＲＨブロッカー）である（Ｄｏｅｈｎら、Ｄｒｕｇｓ  ２００６，  ｖｏｌ．９，Ｎｏ，８，ｐｐ．５６５−５７１；ＷＯ０９８４６６３４）。デガレリクスは、脳下垂体におけるＧｎＰＨ受容体を即時かつ競合的に遮断することにより作用し、他のＧｎＲＨアンタゴニストのように視床下部−下垂体−生殖腺軸を介する黄体形成ホルモン産生の初期刺激を起こさず、したがって、テストステロンサージ又は臨床的紅斑をもたらさない（Ｖａｎ  Ｐｏｐｐｅｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０１０：２  ３９−５２；Ｖａｎ  Ｐｏｐｐｅｌら、  Ｕｒｏｌｏｇｙ，  ２００８，  ７１（６），  １００１−１００６）；Ｊａｍｅｓ，Ｅ．Ｆ．ら、Ｄｒｕｇｓ，  ２００９，６９（１４），１９６７−１９７６）。
【０００３】
デガレリクスは、そのうちの５つがＤ−アミノ酸である７つの非天然アミノ酸を含む、
合成直鎖デカペプチドである。それは、デカペプチド主鎖内に１０個のキラル中心を有する。配列内の５位のアミノ酸残基は、置換側鎖内にさらなるキラル中心を有し、キラル中心は全部で１１個となっている。そのＣＡＳ登録番号は、２１４７６６−７８−６（遊離塩基）であり、商標Ｆｉｒｍａｇｏｎ（商標）で市販されている。原薬は、Ｄ−アラニナミド、Ｎ−アセチル−３−（２−ナフタレニル）−Ｄ−アラニル−４−クロロ−Ｄ−フェニルアラニル−３−（３−ピリジニル）−Ｄ−アラニル−Ｌ−セリル−４−［［［（４Ｓ）−ヘキサヒドロ−２，６−ジオキソ−４−ピリミジニル］カルボニル］アミノ］−Ｌ−フェニルアラニル−４−［（アミノカルボニル）アミノ］−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシル−Ｎ６−（１−メチルエチル）−Ｌ−リジル−Ｌ−プロリル−として化学的に設計され、（以下、式Ｉとも呼ばれる）化学構造により表される：
【０００４】
【化１】
2015518866.tif 000002
【０００５】
デガレリクスの構造は、
Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2
［式中、Ａｃは、アセチル、２Ｎａｌは、２−ナフチルアラニン、４Ｃｐａは、４−クロロフェニルアラニン、３Ｐａｌは、３−ピリジルアラニン、Ｓｅｒは、セリン、４Ａｐｈは、４−アミノフェニルアラニン、Ｈｏｒは、ヒドロオロチル、Ｃｂｍは、カルバモイル、Ｌｅｕは、ロイシン、Ｌｙｓ（ｉＰｒ）は、Ｎ６−イソプロピルリジン、Ｐｒｏは、プロリン及びＡｌａは、アラニンである］
と表すこともできる。
【０００６】
本発明の記載においては、デガレリクス中の各アミノ酸は、以下の略記法で示す：
ＡＡ1は、Ｄ−２Ｎａｌ、ＡＡ2は、Ｄ−４Ｃｐａ、ＡＡ3は、Ｄ−３Ｐａｌ、ＡＡ4は、Ｓｅｒ、ＡＡ5は、４Ａｐｈ（Ｌ−Ｈｏｒ）、ＡＡ6は、Ｄ−Ａｐｈ（Ｃｂｍ）、ＡＡ7は、Ｌｅｕ、ＡＡ8は、Ｌｙｓ（ｉＰｒ）、ＡＡ9は、Ｐｒｏ及びＡＡ10は、Ｄ−Ａｌａである。
【０００７】
したがって、デガレリクスは、Ａｃ−ＡＡ1−ＡＡ10−ＮＨ2と表されることができる。
【０００８】
デガレリクスは以前は、ＷＯ９８／４６６３４及びＪｉａｎｇら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００１，４４，４５３−４６７中に報告されたＢｏｃ−固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法を用いて調製されていた。
【０００９】
ＷＯ２０１０／１２８３５及びＷＯ２０１１／０６６３８６は、Ｆｍｏｃストラテジーを用いるデガレリクスの調製を記載している。ＷＯ２０１２／０５５９０５及びＷＯ２０１２／０５５９０３は、デガレリクスの液相合成を記載している。
【発明の概要】
【００１０】
デガレリクスの物理化学的特性決定により、このデカペプチドが自己会合する能力を有し、最終的に水溶液中でゲルを形成することが示された。皮下又は筋肉内に注射した場合、この化合物はインサイチュで自己凝集によりデポーになる。デガレリクスデポーは、用量に応じて活性成分（active）の数か月にわたる持続放出を提供することが示された。現在、この薬物は、初回注射のために１２０ｍｇ（４０ｍｇ／ｍＬ）の、及び１カ月にわたる持続放出のために８０ｍｇ（２０ｍｇ／ｍＬ）の用量で投与されている。
【００１１】
驚くべきことに、発明者らは、再構成した製剤の粘度、ひいては持続放出特性及びバイオアベイラビリティーが、（例えば、Ｆｍｏｃストラテジー、液相合成又は別のルートにより得られた）粗ペプチドの原薬への加工を通して制御可能であることを見出した。驚くべきことに、原薬に関連する粘度は、さらなる再構成及び凍結乾燥の後でさえ、製剤に関連する粘度と相関する。所望のデポー形成、したがって持続放出を得るために、製剤の粘度は１５ｍＰａｓ以下の範囲内、好ましくは、２〜１２ｍＰａｓの範囲内に制御しなくてはならない。本発明は、再構成用流体により再構成用流体１ｍＬあたり２０ｍｇのデガレリクス濃度に再構成して決定した場合にこの粘度を示す製剤の製造を可能とする方法を提供する。
【００１２】
したがって、第１の態様において、本発明は、デガレリクス製品の粘度を、注射用水によりデガレリクス遊離塩基２０ｍｇ／ｍＬの量に再構成する際に決定される粘度が１５ｍＰａｓ以下、好ましくは２〜１２ｍＰａｓの範囲内となるように制御する方法であって、
１．デガレリクス遊離塩基２０ｍｇ／ｍＬの量でマンニトールを含有する水（２．５％ｗ／Ｖ）に溶解して決定される粘度が３．２ｍＰａｓ以下である凍結乾燥デガレリクス原薬を用意するステップと、
２．凍結乾燥デガレリクス原薬をマンニトール含有水に溶解して、水性デガレリクス−マンニトール混合物を生成するステップと、
３．水性デガレリクス−マンニトール混合物を凍結乾燥して、デガレリクス製剤を生成するステップと
を含む、方法を提供する。
【００１３】
第２の態様において、本発明は、注射用水によりデガレリクス遊離塩基２０ｍｇ／ｍＬの量に再構成する際に決定される粘度が、１５ｍＰａｓ以下、好ましくは２〜１２ｍＰａｓの範囲内の粘度である凍結乾燥デガレリクス製品を製造する方法であって、
１．デガレリクス遊離塩基２０ｍｇ／ｍＬの量でマンニトールを含有する水（２．５％ｗ／Ｖ）に溶解して決定される粘度が３．２ｍＰａｓ以下である凍結乾燥デガレリクス原薬を用意するステップと、
２．凍結乾燥デガレリクス原薬を、マンニトール含有水に溶解して、水性デガレリクス−マンニトール混合物を生成するステップと、
３．水性デガレリクス−マンニトール混合物を凍結乾燥して、デガレリクス製剤を生成するステップと
を含む、方法を提供する。
【００１４】
第３の態様において、本発明は、再構成のための液体（再構成用流体）によりデガレリクス遊離塩基２０ｍｇ／ｍＬの量に再構成する際に１５ｍＰａｓ以下、好ましくは２〜１２ｍＰａｓの範囲内の粘度を示す凍結乾燥デガレリクス製剤及び前記液体を含むデガレリクス製剤を製造する方法であって、
１．マンニトール含有水溶液中に凍結乾燥デガレリクス原薬を溶解して、デガレリクス−マンニトール混合物を生成するステップと、
２．デガレリクス−マンニトール混合物を凍結乾燥して、デガレリクス製剤を生成するステップと
を含み、凍結乾燥前に粘度低下剤がデガレリクス−マンニトール混合物に添加される、方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、２．５重量％マンニトールを含有する水に溶解する際に、デガレリクス遊離塩基２０ｍｇ／ｍＬの量で３．２ｍＰａｓ以下の粘度を示す凍結乾燥デガレリクス原薬、及びこの凍結乾燥デガレリクス原薬を生成する方法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、再構成用流体によりデガレリクス遊離塩基２０ｍｇ／ｍＬの量に再構成する際に１５ｍＰａｓ以下、好ましくは、２〜１２ｍＰａｓの範囲内の粘度を示す凍結乾燥デガレリクス製剤と再構成用流体とを含むデガレリクス製剤であって、０．００１〜５ｍｇ／ｍＬの量の粘度低下剤を含む、デガレリクス製剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】原薬の粘度と製剤の粘度の間の関係を示すグラフである。
【図２】３日目における、デガレリクス投与用懸濁液（２０ｍｇ／ｍＬ）の動的粘度とデガレリクス血漿濃度（ラット）の間の関係を示すグラフである。
【図３】２８日目における、デガレリクス投与用懸濁液（２０ｍｇ／ｍＬ）の動的粘度とデガレリクス血漿濃度（ラット）の間の関係を示すグラフである。
【発明の詳細な説明】
【００１８】
第１及び第２の態様による凍結乾燥デガレリクス製品を製造する方法は、より詳細に記述されるデガレリクス原薬から開始する。
【００１９】
デガレリクス原薬
デカペプチドであるデガレリクスは、ＷＯ９８／４６６３４、ＷＯ２０１０／１２８３５及びＷＯ２０１１／０６６３８６に開示された固相ペプチド合成により、又はＷＯ２０１２／０５５９０５若しくはＷＯ２０１２／０５５９０３に開示された液相ペプチド合成により調製可能である。このペプチド合成は、さらに精製され、次いで凍結乾燥されて、デガレリクス、酢酸、残存量の水、及び製造方法に起因する微量の不純物があればそれから成る凍結乾燥生成物を提供する、粗デガレリクスを提供する。この生成物は、本発明においてデガレリクス原薬、又は単に原薬と呼ばれる。デガレリクス原薬は、好ましくは、デガレリクス、４．５〜１０重量％の酢酸（ｗ／ｗ）及び１０重量％以下の水（ｗ／ｗ）から成る。
【００２０】
原薬の製造は、溶液中の精製デガレリクスを生成する第１のステップ（Ａ）とデガレリクス原薬を生成する第２のステップ（Ｂ）とに分割することができる。
【００２１】
ステップ（Ａ）：精製
ステップ（Ａ）は、１つ又は複数のステップ、好ましくは２つのステップと、場合によりそれに続くカラム濃縮及び／又は塩交換ステップとで粗デガレリクスを精製することを含む。
【００２２】
ＬＰＰＳ又はＳＰＰＳにより得られた粗デガレリクスは、最初に精製に供される。精製は、ＳＰＰＳ又はＬＰＰＳにより得られたペプチド溶液を、好ましくは緩衝液で予備平衡化した逆相材料を含むカラムに加えることによって実施されることが好ましい。この第１の精製ステップは、ＨＰＬＣにより決定した少なくとも９５％の純度を提供することが好ましい。
【００２３】
好ましい実施形態において、ＨＰＬＣにより決定した少なくとも９７．５％の純度を有する生成物を得るために、逆相カラムクロマトグラフィーが繰り返される。
【００２４】
特に好ましい実施形態において、デガレリクス溶液を予備濃縮するため及び／又は塩交換（特に、最終精製ステップにおいて溶出液のｐＨ調整のために酢酸が使用される場合）のために、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９７．５％の純度を有する精製デガレリクス溶液がさらなるカラムクロマトグラフィーステップに供される。
【００２５】
この予備濃縮及び／又は塩交換ステップも、逆相カラムにおいて実施されることが好ましく：精製デガレリクス溶液が（好ましくは１．５〜２．５倍に）水で希釈され、緩衝液で予備平衡化したカラムに加えられる。このカラムは、最初にエタノール（低濃度、一般に、２０％未満）及び水性酢酸アンモニウム、次にエタノール（低濃度、一般に、２０％未満）／酢酸／水で洗浄されることが好ましい。次いで、精製ステップ（複数可）後の溶液に比べてより濃縮されたデガレリクス溶液を得るために、例えば、エタノール（高濃度、一般に、２０〜６０％）／酢酸／水でカラムが溶出される。このプロセスは、溶出液中の有機修飾剤としてはエタノールに限られない。アセトニトリルなどの他の溶媒も使用可能である。
【００２６】
ステップ（Ａ）は、溶液中の精製デガレリクスを提供する。
【００２７】
ステップ（Ｂ）
デガレリクス原薬を得るための、溶液中の精製デガレリクスのその後の処理は、様々な方法で実施可能である。以下において、４つの好ましい方法が例示される（ステップ（Ｂ１）、（Ｂ２）、（Ｂ３）及び（Ｂ４））。
【００２８】
ステップ（Ｂ１）：濃縮−脱凝集−凍結乾燥
溶液中の精製デガレリクスは、最初に、エタノール又はアセトニトリルのような別の有機修飾剤が蒸発により除去される濃縮ステップに供される。このステップは、ロータリーエバポレーターを用いて実施されることが好ましい。蒸発の間の好ましい最大温度は、４０℃である。結果として生じる、高度に濃縮された粘稠なデガレリクス生成物（通常ゲル形態である凝集した生成物）は、次いで、酢酸で処理され（脱凝集ステップ）、好ましくは、ろ過されてもよいが、凍結乾燥される。
【００２９】
脱凝集ステップは、原薬の粘度を制御するために重要である。したがって、脱凝集ステップは、好ましくは、以下の条件のうちの１つ又は複数、最も好ましくは、すべてにより実施される：
・最終酢酸濃度：６〜４０％、好ましくは、１５〜３５％（ｖ／ｖ）
・温度  ０〜３５℃、好ましくは、２〜３０℃、最も好ましくは、５〜１５℃
・デガレリクス濃度（遊離塩基）  ５〜３５ｇ／Ｌ、好ましくは、１０〜２０ｇ／Ｌ
・時間  １〜１５時間
【００３０】
これらの制限内で、好適なプロセスパラメータの組合せが単純な実験によって見出され得る。
【００３１】
凍結乾燥ステップは、１．２〜２．４ｃｍの氷の厚さ及び１〜１７時間の二次乾燥時間で実施されることが好ましい。二次乾燥温度は、通常、約２０℃（１５〜２５℃）である。
【００３２】
好ましい実施形態において、ステップ（Ｂ１）は、このようにして、３．２ｍＰａｓ未満、好ましくは、１．１５から２ｍＰａｓまでの間の粘度（２．５％（ｗ／Ｖ）マンニトールを含有する水１ｍＬにデガレリクス遊離塩基２０ｍｇの量で溶解して決定）を示す凍結乾燥原薬を提供する。粘度を測定する方法は、実験セクションに記載される。この粘度の要件を満たす原薬は、さらに原薬（１）と呼ばれるが、この粘度の要件を満たさない原薬は、さらに原薬（２）と呼ばれる。原薬（２）は、１ｍＬの水に２０ｍｇの量で溶解した際に、３．２〜１５ｍＰａｓの好ましい粘度を有する。原薬（２）は、３．２ｍＰａｓを顕著に超える状態においては、その粘度を正確に測定不可能であるにもかかわらず、ゲル様でさえあることができる。
【００３３】
この点で、「１ｍＬの水に２０ｍｇの量で溶解した際に」は、粘度を測定するための条件を単に指すのであって、原薬が２０ｍｇ／ｍＬの溶液中に存在することを意味するのではない。最も好ましくは、原薬は凍結乾燥形態で存在する。
【００３４】
原薬、特に、原薬（１）は、さらに４．５〜１０．０％（ｗ／ｗ）の酢酸含量及び／又は１０％（ｗ／ｗ）以下の水分含量を特徴とすることが好ましい。さらに、原薬、特に原薬（１）は、（２．５％マンニトール（水溶液）中、２０ｍｇのデガレリクス遊離塩基／ｍＬの濃度で）０．１０ＡＵ以下の光学密度を示すことが好ましい。光学密度を測定する方法は実験セクションに記載される。
【００３５】
したがって、本発明は、デガレリクス原薬（１）を製造する方法であって、
ａ．液相又は固相ペプチド合成によって得られたデガレリクスを精製して、少なくとも９５％の純度を有するデガレリクス溶液を得るステップと、
ｂ．デガレリクス溶液を濃縮するために溶媒を蒸発させて、凝集したデガレリクスを得るステップと、
ｃ．凝集したデガレリクスを酢酸で脱凝集させるステップと、
ｄ．脱凝集したデガレリクスを凍結乾燥して、デガレリクス原薬を生成するステップと
を含む、方法を提供する。
【００３６】
本発明はさらに、凍結乾燥及び水による再構成後に、２．５％ｗ／Ｖマンニトール中２０ｍｇ／ｍＬのデガレリクス溶液の粘度が１５ｍＰａｓ以下であるようにデガレリクスの粘度を調節する方法であって、
凝集したデガレリクスを酢酸で処理することと、
デガレリクスと酢酸の混合物を凍結乾燥することと
を含む、方法を提供する。
【００３７】
特定の実施形態において、酢酸の添加及び凍結乾燥のための条件は、上記の通りである。特別な実施形態において、凍結乾燥後の酢酸含量は、４．５〜１０．０％（ｗ／ｗ）である。
【００３８】
ステップ（Ｂ２）：カラム濃縮−凍結乾燥
（好ましくは、例えば、予備濃縮／塩交換を含まない、１つ又は２つのステップの精製法の後、）ステップＡにおいて得られたデガレリクス溶液が、クロマトグラフィーカラムに装填され、イオン交換が実施され、カラムが希酢酸（約１％）ですすがれる（洗浄される）。２０〜５０重量％、好ましくは、２３〜３７重量％、好ましくは、２３〜２７重量％、好ましくは、２７〜３７重量％、好ましくは、３３〜３７重量％、好ましくは、３５重量％のＡｃＯＨ濃度で水性酢酸を用いて、デガレリクスがカラムから溶出され、その後、場合により、適切なＡｃＯＨ濃度まで希釈され、ろ過される。次いで、デガレリクスのＡｃＯＨ／水溶液が凍結乾燥される。カラム内の固定相は、様々なタイプであることができる。固定相は、（脂肪族及び芳香族）炭化水素、アルコール、ニトリル、適切な酸／塩基特性を有する基及びイオン交換基のような、しかしこのタイプの基に限定されない官能基を含むことができる。このプロセスは、原薬、好ましくは、原薬（１）を生成する。
【００３９】
したがって、本発明はまた、デガレリクス原薬を製造する方法であって、
ａ．液相又は固相ペプチド合成によって得られたデガレリクスを精製して、少なくとも９５％の純度を有するデガレリクス溶液を得るステップと、
ｂ．デガレリクス溶液をクロマトグラフィーカラムに装填するステップと、
ｃ．酢酸によりカラムからデガレリクスを溶出して、溶出したデガレリクスを提供するステップと、
ｄ．溶出したデガレリクスを凍結乾燥して、デガレリクス原薬を生成するステップと
を含む、方法を提供する。
【００４０】
ステップ（Ｂ３）：凍結乾燥を介する単離−ＡｃＯＨ／水中での再構成−凍結乾燥
ステップＡの後に得られた溶液中の精製デガレリクスが凍結乾燥を介して単離され、結果として生じた凍結乾燥生成物が２％酢酸に１０から２０ｇ／Ｌまでの間の濃度で溶解され、再度凍結乾燥されて、デガレリクス原薬（１）を生じる。
【００４１】
ステップ（Ｂ４）：噴霧乾燥
溶液（ステップＡ後に得られた、又は凍結乾燥を除くステップＢ１若しくは凍結乾燥を除くステップＢ２に記載された、ＥｔＯＨ／ＡｃＯＨを含有する水又はＡＣＮ／ＡｃＯＨを含有する水）中の精製デガレリクスが、噴霧乾燥を介して単離されて、デガレリクス原薬（１）を生じる。
【００４２】
好ましい実施形態において、ステップＡにおいて得られた精製デガレリクス溶液が、直接、噴霧乾燥プロセスに供される。噴霧乾燥に供される前記水性デガレリクス溶液のＡｃＯＨ濃度は、６〜４０％（ｖ／ｖ）、好ましくは、１５〜３５％（ｖ／ｖ）に調整される。
【００４３】
原薬の製造を記載した後、発明者らはここに、デガレリクス製剤の製造を記載する。凍結乾燥デガレリクス製剤は、デガレリクス原薬及びマンニトールを含み、すなわち、デガレリクス、酢酸、マンニトール、残存量の水、及び製造方法に起因する微量の不純物があればそれを含む（好ましくは、これらから成る）。
【００４４】
デガレリクス製剤の製造方法Ａ
製造方法Ａは、上記の発明の第１の態様、すなわち、注射用水によりデガレリクス遊離塩基２０ｍｇ／ｍＬの量に再構成する際の粘度が１５ｍＰａｓ以下、好ましくは２〜１２ｍＰａｓの範囲内であるデガレリクス製剤を製造する方法であって、
ａ．凍結乾燥デガレリクス原薬、好ましくは、デガレリクス原薬（１）を用意するステップと、
ｂ．凍結乾燥デガレリクス原薬をマンニトール含有水に溶解して、水性デガレリクス−マンニトール混合物を生成するステップと、
ｃ．水性デガレリクス−マンニトール混合物を凍結乾燥して、デガレリクス製剤を生成するステップと
を含む、方法である。
【００４５】
本発明において、「注射用水により２０ｍｇ／ｍＬの量に再構成して」は、粘度を測定するための条件を指すのであって、製剤が２０ｍｇ／ｍＬの溶液中に存在することを意味するのではない。最も好ましくは、製剤は、場合により再構成用液体とともに、凍結乾燥形態で存在する。バイアルあたりの好ましい量は、（１２０ｍｇ、８０ｍｇ及び２４０ｍｇなどの）６０〜３００ｍｇの範囲にある。或いは、それは、２〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲、好ましくは（４０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ及び６０ｍｇ／ｍＬなどの）１０〜７０ｍｇ／ｍＬの範囲にある好ましい濃度を有する再構成した製剤として提供されることができる。
【００４６】
ステップｂは、配合ステップと呼ぶこともできる。好ましい実施形態においては、配合後かつ凍結乾燥前にろ過及びバイアル充填が実施されるため、好ましい製造方法Ａ全体は、
・未ろ過のバルク製剤を生成するための配合ステップと、
・ろ過（滅菌）ステップと、
・バイアル充填ステップと、
・凍結乾燥（freeze-drying）／凍結乾燥（lyophilization）ステップと
を含む。
【００４７】
バルク製剤を生成するための配合
原薬が配合ステップに供され、これは一般に以下のように実施される。
【００４８】
未ろ過のバルク製剤の製造のために、原薬及びマンニトールが、１０００ｇのバッチサイズあたり、それぞれ１０〜６０ｇの量で水（純水；一般にＭｉｌｌｉ−Ｑ水）中に溶解される。典型的な量は、１０００ｇあたり、（ＨＰＬＣにより決定したデガレリクス遊離塩基含量として）２０〜５０ｇの原薬及び１０〜５０ｇのマンニトールである。実際の量は、製剤中のデガレリクスの最終濃度及び再構成用液体の容量（好ましくは、３００ｍＯｓｍ±３０ｍＯｓｍのモル浸透圧濃度を有する等張液が再構成後に得られるように、マンニトールが添加される）に依存する。
【００４９】
製造のために、水（通常、水の総量の約８０％）が配合槽に添加される。マンニトールが添加され、撹拌することによって溶解される。次いで、原薬が撹拌されたマンニトール溶液に添加され、残りの水を添加することによって、調合したバルク（バッチ）がその最終重量に導かれる。この配合は、顕著な粘度の増大が回避されるようなやり方で実施される。こうして、バルク生成物の粘度（１ｍＬの２．５％（ｗ／Ｖ）水性マンニトール溶液に２０ｍｇの量で溶解して、ろ過後に決定された粘度）は、配合ステップの間、５ｍＰａｓ未満、好ましくは、３．２ｍＰａｓ未満にとどまる。これは、高い撹拌速度において比較的短時間（３０分以下）ペプチドを湿らせ、次いで、発泡及び凝集を回避するために撹拌速度を低下させて前記ペプチドを溶解する（一般に、３０〜９０分間）ことによって達成可能である。温度は、通常、６〜１５℃の範囲内に維持される。スターラーは、ボルテックスを伴わない乱流混合を起こすものであることが好ましい。
【００５０】
ろ過
次いで、バルク製剤は、例えば、調合したバルクに窒素で加圧することによって連続して設置された２つの滅菌グレードのフィルターを通って、滅菌ろ過されることが好ましい。
【００５１】
充填
滅菌されたバイアルが、ろ過されたバルク製剤で充填され、無菌状態で緩く蓋をされる（semi-stoppered）（凍結乾燥位置）。
【００５２】
凍結乾燥
凍結乾燥機は、使用前に蒸気滅菌されることが好ましい。バイアルが凍結乾燥機の棚に置かれる。その後の凍結乾燥プロセスは、凍結ステップ、主要乾燥（昇華）ステップ及び二次乾燥ステップを含むことが好ましい。好ましい条件は以下の通りである：
【００５３】
凍結乾燥プロセスは、３つの主要ステップ、すなわち、凍結、主要乾燥（昇華）及び二次乾燥を含むか又はそれらから成ることが好ましい。
【００５４】
・凍結
バイアルは、５℃などの、２〜１０℃に維持された冷蔵棚に置かれる。
【００５５】
棚は、例えば、５℃から、−３５℃などの、−３０℃〜−４０℃までの温度に冷却される。棚の温度は、一次乾燥開始前のバッチ全体の完全な凍結を保証するために、例えば、−３５℃において、最短で２時間維持される。
【００５６】
・主要乾燥（昇華）
主要乾燥は、（好ましくは、０．１００ｍＢａｒ以下に）チャンバー圧を低下させ、（好ましくは、＋１７℃などの、１０〜２０℃に）棚の温度を上昇させることによって実施される。
【００５７】
主要乾燥時間は、少なくとも１５時間続行する。
【００５８】
・二次乾燥
一次乾燥プロセスが完了後、（好ましくは０．０１ｍＢａｒ以下まで）チャンバー圧を低下させ、（好ましくは、２５℃などの、２０〜３０℃まで）棚の温度を上昇させる。二次乾燥は、典型的に７時間以内に完了する。
【００５９】
次いで、凍結乾燥製剤は、ラベル付けされ、包装され、適切な量の再構成用液体と組み合わされる。
【００６０】
再構成用液体は、原薬の粘度に応じて選択される。原薬（１）が製造方法Ａのための出発材料、すなわち、３．２ｍＰａｓ未満、好ましくは１．１５から２ｍＰａｓまでの間の粘度（１ｍＬの２．５（ｗ／ｖ）％水性マンニトール溶液に２０ｍｇの量で溶解した際）を示す凍結乾燥原薬として使用される場合、結果として生じる凍結乾燥製剤は、再構成用液体としての注射用水（ＷＦＩ）と組み合わせることが好ましい。凍結乾燥製剤をＷＦＩにより再構成する場合、粘度（１ｍのＷＦＩに２０ｍｇのデガレリクス（遊離塩基）を溶解して測定）は、一般に、２〜１５ｍＰａｓの範囲にある。この範囲内の粘度を有する製剤は、インビボでデガレリクスの十分なデポー放出を提供することが見出された。
【００６１】
デガレリクス製剤の製造方法Ｂ
製造方法Ｂは、再構成のための液体（再構成用流体）によりデガレリクス遊離塩基２０ｍｇ／ｍＬの量に再構成した際の粘度が１５ｍＰａｓ以下、好ましくは、２〜１２ｍＰａｓの範囲内である凍結乾燥デガレリクス製剤及び前記液体を含むデガレリクス製剤を製造する方法であって、
ａ．凍結乾燥デガレリクス原薬をマンニトール含有水溶液に溶解して、デガレリクス−マンニトール混合物を生成するステップと、
ｂ．デガレリクス−マンニトール混合物を凍結乾燥して、デガレリクス製剤を生成するステップと
を含み、凍結乾燥前に粘度低下剤がデガレリクス−マンニトール混合物に添加される、方法である。
【００６２】
ステップａは、配合ステップと呼ぶこともできる。好ましい実施形態においては、配合後かつ凍結乾燥前にろ過及びバイアル充填が実施されるため、好ましい製造方法Ｂ全体が、
・未ろ過のバルク製剤を生成するための配合ステップと、
・ろ過（滅菌）ステップと、
・バイアル充填ステップと、
・凍結乾燥（freeze-drying）／凍結乾燥（lyophilization）ステップと
を含む。
【００６３】
配合ステップにおいて、粘度低下剤、好ましくは非イオン性界面活性剤が凍結乾燥前に添加される以外は、製造方法Ｂは製造方法Ａと同一である。非イオン性界面活性剤は、好ましくは、再構成した製剤中、０．００１〜５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、０．１〜１ｍｇ／ｍＬ（例えば、再構成した場合、６０ｍｇのデガレリクス遊離塩基／ｍＬのデガレリクス濃度）に相当する、０．０００３〜１．５ｍｇ／ｍＬの量でバルク溶液に添加される。好ましい非イオン性界面活性剤は、（好ましくは、二重結合を含まない）少なくとも８個の炭素原子を有する直鎖アルキル及び炭化水素部分を含むものである。特に好ましいのは、Ｔｗｅｅｎ  ２０（ポリソルベート２０）のような皮下注射のために承認されたものである。他の好適な非イオン性界面活性剤は、トコフェリル−ポリエチレン−グリコール−１０００−スクシネート（ＴＰＧＳ）及び他のＴｗｅｅｎである。
【００６４】
製造方法Ｂの出発材料として、原薬（２）、すなわち、少なくとも３．２ｍＰａｓの粘度（１ｍＬの２．５重量％水性マンニトール溶液にデガレリクス遊離塩基２０ｍｇの量で溶解した際）を示す凍結乾燥原薬が使用されることが好ましい。結果として生じる凍結乾燥製剤は、典型的に、再構成用液体としてのＷＦＩと合わされる。凍結乾燥製剤がＷＦＩにより再構成される場合、粘度は一般に、（１ｍＬのＷＦＩに２０ｍｇのデガレリクス遊離塩基を溶解して測定した）２〜１５ｍＰａｓの範囲内にある。この範囲内の粘度を有する製剤は、インビボのデガレリクスの遅延放出に十分なデポー形成を提供することが見出された。
【００６５】
製造方法Ｂは、再構成した際にデガレリクス遊離塩基５０ｍｇ／ｍＬ以上、例えば、デガレリクス遊離塩基６０ｍｇ／ｍＬ（２４０ｍｇの製剤）などの比較的高いデガレリクス濃度を有するデガレリクス製剤のために特に好ましい。
【００６６】
新規デガレリクス製剤
製造方法Ｂは、再構成した製剤が粘度低下剤を含むという点で既知の製剤と異なる、新規デガレリクス製剤を提供する。粘度低下剤は、ステップＢにおいて使用されるものであり、好ましくは、非イオン性界面活性剤である。
【００６７】
したがって、本発明は、再構成のための液体によりデガレリクス遊離塩基２０ｍｇ／ｍＬの量に再構成した際に１５ｍＰａｓ以下、好ましくは、２〜１２ｍＰａｓの範囲内の粘度を示す凍結乾燥デガレリクス製剤と前記液体とを含むデガレリクス製剤であって、０．００１〜５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、０．１〜１ｍｇ／ｍＬの量の粘度低下剤を含有するデガレリクス製剤を提供する。
【実施例】
【００６８】
実施例１：精製、脱凝集及び凍結乾燥
粗デガレリクスを、ＷＯ２０１２／０５５９０５Ａ１の実施例５のステップ１２までに記載の通りに合成した。ＷＯ２０１２／０５５９０５Ａ１に開示されたステップ１３を、以下のステップで置き換えた。要約すると、最後の脱保護ステップの後に得られた粗デガレリクス原薬の精製プロセスは、３つの分取逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）ステップから成り、第３のＲＰＣステップは主として脱塩ステップである。
【００６９】
ステップ１３（精製ステップ）：
ＷＯ２０１２／０５５９０５Ａ１中のステップ１２からの粗デガレリクス溶液を、緩衝液（９０％の０．１２％ＴＦＡ及び１０％のＥｔＯＨ）で予備平衡化した逆相材料を充填したカラムに添加した。装填：３０ｇ／Ｌカラム容積以下。カラムを洗浄し、勾配：緩衝液（ＥｔＯＨ２９％〜５０及び０．１２％ＴＦＡ（水溶液）７１％〜５０％）によって溶出した。得られた分画を分析し、主要プールの純度がプロセス制御のための合格基準を満たすような方法で組み合わされた。
ＨＰＬＣにより溶出をチェックすると、純度は９５％以上であった。
【００７０】
ステップ１４（精製ステップ）：
ステップ１３で得られた主要プールを水で２倍に希釈し、逆相材料を充填して緩衝液（９０％の１％ＡｃＯＨ及び１０％のＥｔＯＨ）で予備平衡化したカラムに添加した。装填：２５ｇ／Ｌカラム容積以下。カラムを最初に第１の緩衝液（１０％のＥｔＯＨ及び９０％の０．５モル／Ｌ  ＡｃＯＮＨ４）で、次いで、第２の緩衝液（９０％の１％ＡｃＯＨ及び１０％のＥｔＯＨ）で洗浄した。
【００７１】
次いで、緩衝液とエタノールの混合物（７６％の１％ＡｃＯＨ及び２４％のＥｔＯＨ）でカラムを溶出した。得られた分画を分析し、主要プールの純度がプロセス制御のための合格基準を満たすような方法で組み合わされる。
「ＨＰＬＣ法」により溶出をチェックすると、純度は９７．５％以上であった。
【００７２】
ステップ１５（予備濃縮／塩交換）：
ステップ１４で得られた主要プールを水で２倍に希釈し、逆相材料を充填して緩衝液（９０％の１％ＡｃＯＨ及び１０％のＥｔＯＨ）で予備平衡化したカラムに添加した。装填：１８ｇ／Ｌカラム容積以下。カラムを最初に第１の緩衝液（１０％のＥｔＯＨ及び９０％の０．５モル／ＬのＡｃＯＮＨ４）で、次いで、第２の緩衝液（９０％の１％ＡｃＯＨ及び１０％のＥｔＯＨ）で洗浄した。次いで、緩衝液とエタノールの混合物（５０％の１％ＡｃＯＨ及び５０％のＥｔＯＨ）でカラムを溶出した。
或いは、デガレリクスは、ＡｃＯＨ／ＭｅＣＮ／水の溶液、例えば、水中１２％ＡｃＯＨ及び２２％ＭｅＣＮで溶出可能である。
【００７３】
ステップ１６（濃縮−脱凝集−凍結乾燥）：
凍結乾燥の前に、ステップ１５からの純粋なデガレリクス溶液のプールを４０℃未満で濃縮した。濃縮した溶液に水性酢酸及び水を添加して、１５ｇ／Ｌ未満の濃度及び３０％の酢酸濃度とした。次いで、この溶液をろ過し、凍結乾燥して、デガレリクス原薬を得た。
圧力：  一次乾燥及び二次乾燥の期間を通じて、０．５ｍｂａｒ以下
温度：  凍結終了温度：−３０℃以下
一次乾燥終了温度：２０℃
二次乾燥終了温度：２０℃
時間：  ５日間
【００７４】
結果
一連のステップにより得られた原薬の粘度は、２．５（ｗ／Ｖ）％マンニトール溶液中、２０ｍｇ／ｍＬの濃度で決定して、２．５ｍＰａｓ未満であった。
【００７５】
実施例２：原薬及び製剤の粘度を測定する方法
原薬及び製剤溶液の粘度の決定は、Ｄ＝６０ｍｍ及び１°の円錐平板測定システムを備えた回転粘度計を用いるヨーロッパ薬局方（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）及びＵＳＰの現行版の手順に基づく。２０±０．２℃の一定温度で制御速度（ＣＲ）回転ステッププログラムを用いて、せん断速度は２０ステップのうちに０から５００ｓ-1まで増加し、粘度が５００ｓ-1のせん断速度において記録される前にシステムが平衡に到達することを確認した。
【００７６】
実施例３：原薬及び製剤の光学密度を測定する方法
機器及び材料
・ＵＶ分光光度計
・ＵＶ光透過キュベット、光路長（path）１０ｍｍ
・キュベットの蓋
・注射用水（デガレリクス製剤の再構成のため、及び参照セル中で使用される）
【００７７】
分析の実施
再構成から測定までの間、再構成したサンプルを２２℃±１℃に保持しなくてはならない。
【００７８】
原薬バイアルは、水中２．５％水性マンニトール溶液（ｗ／Ｖ）で再構成される。製剤バイアルは、注射用水により再構成する。溶媒をバイアル中に分注し、再構成が完了するまでバイアルを旋回させるか、又は数秒間、ボルテックスを使用する。液体は透明に見えなくてはならず、溶解しない粉末又は粒子が見えてはならない。バイアルを上向きに保持し、振とうしてはならない。溶媒添加の１２０分後に、サンプルを３５０ｎｍにおいて測定する。
【００７９】
測定の４分前に、穏やかに５回、約１８０°にわたってキュベットを前後に回転させることによって、サンプルを均一化しなくてはならない。この４分の猶予は、読み取り前に任意の気泡が分散することを可能とする。
【００８０】
キュベットに起因する及び注射用水に起因する吸収は、サンプルの読み取りから控除しなければならない。
【００８１】
実施例４：噴霧乾燥
供給材料の調製
供給材料の調製において、以下の表に示す計量したデガレリクスを、磁性スターラーを用いて溶解した。以下のやり方でMilli-Q水又は純粋な氷酢酸（９９．９％）を添加することによって、異なる供給材料溶液、Ｗ−ＶＩ及びＡＩ〜ＩＶを調製した：
ａ．バッチＷ−ＩＶ：計量したデガレリクスに適量の水を添加した。
ｂ．バッチＡ−Ｉ〜Ａ−ＩＩＩ：各実験のために、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で９９．０％の氷酢酸を希釈することによって、酢酸溶液を調製し、３０、５、２パーセント溶液を得て、これに計量したデガレリクスを添加した。
【００８２】
すべての噴霧乾燥を実施する前に、０．２０μｍのSartoriuos Ministarフィルターを通して再構成したペプチドをメスフラスコ中へろ過した。
【００８３】
噴霧乾燥
噴霧乾燥の前に、入口温度及び供給速度を調整する。ポンプの管を供給材料溶液中に配置し、乾燥を開始した。乾燥が完了したら、粉末収集のためにサイクロンと捕集容器を分解する前に入口温度を７００℃まで低下させた。粉末をブラシでペトリ皿中に集め、収率を決定するために、これを収集の前後で計量した。
【００８４】
噴霧乾燥のために適用した設定の概要
【００８５】
【表１】
2015518866.tif 000003
【００８６】
水から噴霧乾燥した１つのバッチのデガレリクス（Ｗ−ＩＶ）に比較した、４つの異なる濃度の酢酸溶液から噴霧乾燥したデガレリクス（Ａ−Ｉ〜Ａ−ＩＩＩ）を再構成したものの粘度
【００８７】
【表２】
2015518866.tif 000004
【００８８】
実施例５：カラム濃縮−凍結乾燥
実施例１のステップ１４からのプールを水で希釈して、逆相材料を充填したカラムに添加した。水中１％のＡｃＯＨでカラムをすすいだ後、水中３５％のＡｃＯＨでデガレリクスを溶出させた。３５ｇのデガレリクス／L、２７％ＡｃＯＨ（サンプル１）及び１５ｇのデガレリクス／Ｌ、３０％ＡｃＯＨ（サンプル２）を含むように分画を調整した。調整した分画を凍結乾燥し、分析した。結果：以下の表を参照のこと：
【００８９】
【表３】
2015518866.tif 000005
【００９０】
実施例６：デガレリクス原薬の製造及び脱凝集試験
材料
精製した粗原薬の脱凝集試験
−粗製の精製デガレリクスを５７．４ｍｇ／ｍＬの濃度で供給した
−１００％酢酸はメルク社により供給された
−脱凝集装置：
・配合槽：３００ｍＬの二重壁ガラス容器
・ブルーキャップボトル、５０又は１００ｍＬ
・磁石
・磁性スターラー
−一次包装：    ・無色の２０Ｒガラスバイアル。バイアルを洗浄し、加熱室中で乾燥した。
・ヨーロッパ薬局方／ＵＳＰによる２０ｍｍのＩ型凍結乾燥ストッパー  ２０ｍｍのフリップオフキャップ
【００９１】
脱凝集した原薬を用いる製剤の製造
−２つの実験用原薬を使用した。対照として、市販の原薬を使用する。
−マンニトール：Ｄ（−）マンニトール（ＰＦ−０５−０２３２）
【００９２】
−一次包装：
・（ＤＩＮ  ＩＳＯ８３６２による）無色の１０Ｒガラスバイアル。バイアルを洗浄し、加熱室中で乾燥した。
・ヨーロッパ薬局方／ＵＳＰによる２０ｍｍのＩ型凍結乾燥ストッパー（１３１９型、ゴムＷ４４１６／５０／グレイ、Ｔｈｅ  Ｗｅｓｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）
・２０ｍｍのフリップオフキャップ（Ｔｈｅ  Ｗｅｓｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）
【００９３】
方法
原薬原液を用いる脱凝集実験
実験の間の温度：
脱凝集試験の間、温度を５、２０、２５又は３５℃に設定した。
【００９４】
実験の間の原液中デガレリクス原薬濃度：
デガレリクス原薬の濃度は、５、１５、２５、又は３５ｍｇ／ｍＬである。
【００９５】
実験の間の酢酸濃度：
酢酸の濃度は、１３、１５、１８、２０、２２、２６、３０、３５又は４０％であった。
【００９６】
実験の間に実施した分析：
粘度：Ｔ＝１、６０、１２０及び２４０分に、約１．２ｍＬを取り出す。
別の時点でサンプルを採取するスケジュールによりよく適合する場合、正確な時間が製剤記録に書き込まれるという条件でこれを実行することができる。しかしながら、Ｔ＝１分におけるサンプリングポイントは維持しなくてはならない。
【００９７】
光学密度（ＯＤ）：最終的な光学密度の測定のために、各実験の終了時にサンプル（約１ｍＬ）を採取しなければならない。
【００９８】
脱凝集実験プロトコール、総容量２０又は６９ｍＬ：
１．必要量の原液をビーカー中に計量する。所望の温度に平衡化する。
２．必要量の酢酸（１００％）をビーカー中に計量する。
３．上記酢酸（１００％）を、３又は１０ｍＬのmilli-Q水と混合し、所望の温度に平衡化する。
４．上記デガレリクス原液を上記酢酸／milli-Q水溶液と混合する。
５．milli-Q水を２０又は６９ｍＬまで満たす。
６．完全に混合する。
７．粘度及び光学密度のためのサンプルを上記の通り採取する。実験の間の上記溶液の外観を書き留める。
【００９９】
２つの６９ｍＬのデガレリクス原液の脱凝集のための設定：
デガレリクス原薬の濃度は、両実験において２５ｍｇ／ｍＬ
酢酸：１０％又は１３％
温度：５℃
【０１００】
２つの試験用の脱凝集した原薬（６９ｍＬ）のバイアルへの充填及び凍結乾燥：
脱凝集した溶液を直ちに２０Ｒバイアルに充填した。５ｍＬを各バイアルに充填した。充填する間、バイアル及びバルクを低温（好ましくは、５から１０℃までの間）に保持しなければならない。バイアルを充填したらすぐに、それらを凍結乾燥状態とし、プログラムを開始した。
【０１０１】
凍結乾燥及びバイアルの閉鎖の後、取り出し（de-loading）までバイアルを凍結乾燥機中に５℃で貯蔵した。
【０１０２】
上記２つの凍結乾燥原薬を以下の分析に供した：
２０ｍｇ／ｍＬの遊離塩基のサンプルにおいて粘度を測定した。
２０ｍｇ／ｍＬの遊離塩基のサンプルにおいて光学密度を測定した。
デガレリクス含量
酢酸含量
【０１０３】
結果
【０１０４】
【表４】
2015518866.tif 000006
【０１０５】
実施例７：粘度低下剤を含まない製剤の製造
２つの脱凝集した原薬を用いる実験室スケールの製剤バッチの配合
以下に表１に列挙する賦形剤を、すべての配合実験で使用する。
【０１０６】
【表５】
2015518866.tif 000007
【０１０７】
配合装置：
配合槽：３００ｍＬの二重壁ガラス容器
ブルーキャップボトル、１００ｍＬ
磁石
磁性スターラー
【０１０８】
一次包装：
・無色の１０Ｒガラスバイアル。バイアルを洗浄し、加熱室中で乾燥した。
・２０ｍｍのＩ型凍結乾燥ストッパー
・２０ｍｍのフリップオフキャップ
【０１０９】
試験の説明
異なる原薬バッチ及び異なる温度設定を用いて、２０ｍｇ／ｇのデガレリクス及び２５ｍｇ／ｇのマンニトールを含むデガレリクスバルク溶液を配合した。
【０１１０】
バルク溶液の粘度を、配合の間／後に２回（溶解後及びｔ＝１２０分）測定した。
【０１１１】
バルク組成：
２つのバルク溶液のバッチサイズ及び組成を、表２に示す。
【０１１２】
【表６】
2015518866.tif 000008
【０１１３】
実験計画：
配合パラメータを以下の表２に示す。
【０１１４】
【表７】
2015518866.tif 000009
【０１１５】
配合：
中心に置いたスターラーによって配合を実施する。実験を開始する前に、中心位置を決定しなくてはならない。
【０１１６】
１．必要な成分を計量する
・配合槽中への４０ｇのMilli-Q水
・好適な容器中への１．２５ｇのマンニトール
・好適な容器中への正確な量のデガレリクス原薬（表２を参照のこと）の計量
・好適な容器中への残りの量のＭilli-Q水の計量
２．Milli-Q水を含む二重壁配合槽を冷却サーキュレーターへ接続する。第２の二重壁容器を連続して接続する。バルクに添加する前に正確な温度に平衡化するように、残りの水を入れた容器を第２の二重壁容器中に置く（ステップ９）。
３．配合槽中に撹拌磁石を注意深く置く。タコメーターを用いて撹拌速度を５０ｒｐｍに設定する。
４．冷却器を正確な温度に設定し、撹拌を開始し、マンニトールを配合槽に添加する。マンニトールが溶解するまで撹拌する。
５．設定温度まで系を平衡化させる。
６．マンニトール溶液中で温度を測定する。
７．スターラーを除去する。タイマーを始動させ、直ちに原薬を添加する。次いで、スターラーを再挿入する。
８．ｔ＝５分において、ガラスパスツールピペットを用いて、残りのMilli-Q水を原薬の表面上に均一に添加する。
９．残りが少数の塊のみになったら、溶解溶媒によって槽の側面から原薬をすすぎ落す。
１０．原薬が完全に溶解したら、時間を書き留め、温度を測定する。バルクの粘度測定のためにサンプルを取り出す。
１１．ｔ＝１２０分まで実験を継続する。バルクの粘度測定のためにサンプルを取り出す。
【０１１７】
ろ過
バルクはろ過しない。これは、バッチのうちの少なくとも１つは高度に凝集し、したがって、ろ過が非常に困難だからである。また、バッチは無菌状態が必要な目的のためには使用されない。
【０１１８】
充填
６．４０ｇのバルクを１０Ｒバイアルに充填する。充填する間、バイアル及びバルクを低温（好ましくは、５から１０℃までの間）に保持しなければならない。バイアルを充填したらすぐに、それらを凍結乾燥状態とし、プログラムを開始しなければならない。各バルクは、約６〜７個のバイアルを生じさせなければならない。
【０１１９】
結果
以下の表に示す異なる粘度を有する１８個の異なる原薬バッチを上記の通りに加工した。対応する製剤の粘度を以下の通りに決定した：
【０１２０】
【表８】
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【０１２１】
これらの結果を、図１に図示する。図１は、原薬の粘度と製剤の粘度の間の相関を示す。
【０１２２】
実施例８：粘度低下剤を含む製剤の製造
実験１：試験した界面活性剤（ＷＦＩ／界面活性剤溶液を用いる再構成）
手順：
・ＷＦＩを用いて（対照として）及び界面活性剤を含むＷＦＩを用いて再構成したデガレリクスバッチ。バイアルを、６０ｍｇ／ｍＬのデガレリクスに再構成する。これらの実験に使用した製剤バッチは、約３．８ｍＰａｓのバルク粘度を有した。
・１ｍｇ／ｍＬを含む溶液（０．１％溶液）中でＴＰＧＳ及びＴｗｅｅｎ  ２０を調製した。
・ＯＤ（吸収）を３５０ｎｍにおいて測定した。
・３０分、６０分、１２０分及び２４時間後に吸収を記録した。
【０１２３】
結果：
ＴＰＣＧ及びＴｗｅｅｎ  ２０はどちらも、光学密度を対照未満のレベルに低下させた。
【０１２４】
実験２：［ＷＦＩ＋Ｔｗｅｅｎ  ２０］によるデガレリクスバイアルの再構成は、４０ｍｇ／ｍＬのデガレリクスにおけるインビトロの放出プロフィール（ＩＶＤアッセイ）を変更しない
試験したＴｗｅｅｎ  ２０濃度：
１ｍｇ／ｍＬ；０．５ｍｇ／ｍＬ；０．２５ｍｇ／ｍＬ；
対照：ＷＦＩ
結果：インビトロの放出プロフィールは、Ｔｗｅｅｎ  ２０の添加によって変化しない。
【０１２５】
実施例９：製剤の粘度及び生物学的利用性
概略
インビボの薬物動態データ（ラットモデル）を含む、ｎ＝３８のバッチのデガレリクス製剤からのデータセットについて多変量データ解析を行った。
【０１２６】
物理化学的特徴及びラットモデルにおけるインビボの薬物動態の間の関係を確立した。試験は、再構成したデガレリクス製品の粘度が、デポーのインビボ性能を予測する何らかの能力を有する、卓越した唯一のパラメータであるように見えることを明らかにした。
【０１２７】
導入
デガレリクス製剤を、マンニトールを含有する凍結乾燥製品として製造する。これらの製品を、臨床試験における治験医薬品として使用する。バイアルあたり多様な量のデガレリクス、すなわち、１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、８８ｍｇ、１２８ｍｇ、１２０ｍｇ（４０ｍｇ／ｍＬ）、１８０ｍｇ（６０ｍｇ／ｍＬ）及び２４０ｍｇ（６０ｍｇ／ｍＬ）、並びに多様な比率のデガレリクス／マンニトールを含む数種の製剤を製造した。
【０１２８】
材料
デガレリクス原薬の異なるバッチ及び処方を用いて、デガレリクスの約４０の異なるバッチを製造した。特段の定めのない限り、バルク中の標準的なデガレリクス濃度は２０ｇ／Ｌである。
【０１２９】
方法
・物理化学的方法
凝集特性を決定するための異なる方法を、多変量データ解析から選択した。ｎ＝３８のバッチからのデータを集計した。しかしながら、より小さな集団を、いくつかの処方（例えば、２０ｍｇ製剤について実施しない４０ｍｇ／ｍＬにおける測定）についてのみ実施したいくつかの方法のために使用した。
【０１３０】
・ラットバイオアッセイ
２８日間にわたってデガレリクスの薬物動態プロフィールを追跡する標準化ラットアッセイを使用した。局所的な副作用を避けるために、デガレリクスを２０ｍｇ／ｍＬ懸濁液として１００μＬの注入量でラットに与えた。ｎ＝８のラットの群を使用し、単一のバイアル由来の再構成懸濁液ですべて処置した。２時間、１日、７日及び２８日に血漿濃度を最初に測定し、ＡＵＣ０〜７日及びＡＵＣ７〜２８日として部分ＡＵＣを計算した。次いで、血漿濃度（Ｃｐ）−２時間をとばし、Ｃｐ−３日の測定に置き換えることによって、計画を変更した。同様に、ＡＵＣ０〜７日をＡＵＣ１〜７日に置き換えた。これは、インビボ変数のうちのいくつかの集団サイズにおける不連続性を説明する。
【０１３１】
・多変量データ解析
データセットのサイズを考えて、Ｓｉｍｃａ−Ｐ，ｖｅｒｓｉｏｎ１０ソフトウエア（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ  ＡＢ，  ＳＥ−Ｕｍｅａ）を用いる多変量データ解析（ＰＣＡ及びＰＬＳ）によるアプローチを実施した。ソフトブロックスケーリング（soft block scaling）（１／４ルート）、単位分散（ＵＶ）へのスケーリング及びセンタリングを含み、先の通りにデータを処理した。濁度データは、データ分散を改善するためにログ変換した。インビボＣｐデータも、分散を安定化するためにログ変換した。
【０１３２】
製剤の物理化学及びラットモデルにおけるインビボ性能の間の関係
・物理化学とインビボ性能の間の関係
第１のモデルを、２つのコンポーネントに基づいて計算した。適合度（Ｒ２＝０．５８）は、生物学データの高い可変性（２０〜３０％）を考えると比較的低いが、予測性の良さ（Ｑ２＝０．３５）は、満足のいくものであった（Ｒ２−Ｑ２は、０．２〜０．３の範囲内になければならない）。負荷量散布図（掲載省略）から、２０ｍｇ／ｍＬにおいて測定した濁度及び酢酸含量などの変数は影響を及ぼすものではなかったことがわかる。
【０１３３】
したがって、これら３つの変数（２０ｍｇ／ｍＬにおいて測定した２つの濁度変数及び酢酸）を除く２つの重要なコンポーネントに基づいて、類似するデータ記述（Ｒ２＝０．５３）に従うが、予測性が改善された（Ｑ２＝０．４２）、新しいモデルを作り出した。最もよく説明され、予測されたラット変数は、３日及び２８日における血漿濃度（Ｃｐ−３ｄ、Ｃｐ−２８ｄ）及び１日目から７日目までの間の曲線下面積（ＡＵＣ１−７ｄ）であった。
係数の概略プロットは、２０ｍｇ／ｍＬ、次いで４０ｍｇ／ｍＬそれぞれにおける粘度データが、より大きな影響を伝え、すべてが０．９５の信頼水準で各生物学的変数に関して有意であったことを示す。比表面積及び濁度は、明らかに影響がより小さく、０．９０の信頼水準でも有意でなかった。
【０１３４】
２０ｍｇ／ｍＬにおいて測定した動的粘度及び最も良くあてはめられた生物学的変数の間の関係を図２及び３に示す。
【０１３５】
・結論
形成した製品の粘度とラットモデルで調べたインビボ性能との間に、揺るぎない関係（Ｒ２＝０．５３）を確立した。どちらも場合も、得られる粘度がより高いほど、デポーからの放出が減少した。インビトロの溶解に関する酢酸含量以外の他の物理化学的変数は、関連性がなかった。したがって、形成したデガレリクス製品の粘度は、デポーのインビトロの放出及びインビボ性能を予測する何らかの能力を有する優れたパラメータであるようである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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