(57)【要約】本発明は、ワクチン抗原または組換えタンパク質のような、宿主細胞で産生される生物学的産物を含む組成物の、安全性試験の改善された方法を提供する。１つの実施態様において、本発明は、以下の工程を含む、宿主細胞において産生された生物学的産物を含む組成物のＤＮＡ安全係数を決定するための方法を提供する：ａ）宿主細胞の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅する；ｂ）増幅したＤＮＡを用いて、その反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定する；ｃ）その反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を用いて、組成物の用量中の癌遺伝子の数を計算する；およびｄ）ＤＮＡ安全係数（ＳＦ）を決定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞において産生された生物学的産物を含む組成物のＤＮＡ安全係数を決定するための方法であって、以下：
ａ）該宿主細胞の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅する工程；
ｂ）増幅したＤＮＡを用いて、該反復エレメントまたは該ハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定する工程；
ｃ）該反復エレメントまたは該ハウスキーピング遺伝子のコピー数を用いて、該組成物の用量中の癌遺伝子の数、
【数１０１】
2015526062.tif 000035
を計算する工程；および
ｄ）該ＤＮＡ安全係数（ＳＦ）を決定する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ安全係数を、式
【数１０２】
2015526062.tif 000036
によって決定する、
式中、
【数１０３】
2015526062.tif 000037
は、前記組成物の用量中に存在し得る、用量当たりの癌遺伝子の最大数である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物の用量は、前記宿主細胞に由来するｘ  ｎｇの細胞ＤＮＡを含むと仮定され、前記安全係数ＳＦは、式
【数１０４】
2015526062.tif 000038
によって計算される、
式中、
【数１０５】
2015526062.tif 000039
は、腫瘍を産生するために必要な癌遺伝子の数であり、ｃｏｎｃｏは、モノバルク中の癌遺伝子の濃度［癌遺伝子／ｍＬ］であり、そしてｃＤＮＡは、該組成物中の該宿主細胞のＤＮＡの濃度［ｎｇ／ｍＬ］である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、前記宿主細胞に由来する１０ｎｇの細胞ＤＮＡを含むと仮定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物の用量が、該組成物の体積によって規定され、前記安全係数ＳＦは、式
【数１０６】
2015526062.tif 000040
によって計算される、
式中、
【数１０７】
2015526062.tif 000041
は、腫瘍を産生するために必要な癌遺伝子の数であり、ｃｏｎｃｏは、モノバルク中の癌遺伝子の濃度［癌遺伝子／ｍＬ］であり、そしてＶｄｏｓｅは、該組成物の用量の体積［ｍＬ］である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物の用量は、前記生物学的産物の量によって規定され、前記安全係数ＳＦは、式、
【数１０８】
2015526062.tif 000042
によって計算される、
式中、
【数１０９】
2015526062.tif 000043
は、腫瘍を産生するために必要な癌遺伝子の数であり、ｃｏｎｃｏは、モノバルク中の癌遺伝子の濃度［癌遺伝子／ｍＬ］であり、ｃｄｏｓｅは、用量当たりの活性成分の濃度［μｇ／用量］であり、そしてｃａｃｔｕａｌは、該組成物中の該活性成分の実際の濃度［μｇ／ｍＬ］である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）で増幅される前記断片は、７００〜１３００ｂｐのサイズを有する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）で増幅される前記断片は、８００〜１２００ｂｐのサイズを有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）で増幅される前記断片は、９００〜１１００ｂｐのサイズを有する、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）で増幅される前記断片は、約１０００ｂｐのサイズを有する、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
生物学的産物を含む組成物を作製する方法であって、以下：
ａ）宿主細胞を培養して該生物学的産物を産生する工程；
ｂ）（ａ）において産生された該生物学的産物から組成物を調製する工程；および
ｃ）前記請求項のいずれかに記載の方法によって、該組成物のＤＮＡ安全係数を決定する工程
を含む、方法。
【請求項１２】
ワクチン組成物を作製する方法であって、以下：
ａ）宿主細胞を培養してウイルスを産生する工程；
ｂ）（ａ）において産生された該ウイルスからワクチンを調製する工程；および
ｃ）前記請求項のいずれかに記載の方法によって、該ワクチンのＤＮＡ安全係数を決定する工程
を含む、方法。
【請求項１３】
前記安全係数が１０７未満の場合、前記組成物は却下される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記反復エレメントまたは前記ハウスキーピング遺伝子のコピー数を用いて、前記組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡの量を計算する工程をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
宿主細胞において産生された生物学的産物を含む組成物であって、ｎ個より少ない反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子を含み、ここでｎは式
【数１１０】
2015526062.tif 000044
によって計算され、
式中、
Ｒは、該宿主細胞における反復エレメント／ハウスキーピング遺伝子に対する癌遺伝子の割合であり、
ｏｎｃｏは、癌遺伝子である、
組成物。
【請求項１６】
前記反復エレメントはレトロトランスポゾンである、前記請求項のいずれかに記載の方法または組成物。
【請求項１７】
前記レトロトランスポゾンはＬＩＮＥエレメントである、前記請求項のいずれかに記載の方法または組成物。
【請求項１８】
前記産物は、１ｍＬあたり５．１６×１０７未満のＬＩＮＥエレメントを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記レトロトランスポゾンは、ＳＩＮＥエレメント、ＳＶＡエレメントまたは偽遺伝子である、前記請求項のいずれかに記載の方法または組成物。
【請求項２０】
前記ハウスキーピング遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、β−アクチン、チューブリン、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、およびリボソームタンパク質からなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物はワクチンである、前記請求項のいずれかに記載の方法または組成物。
【請求項２２】
前記ワクチンは、インフルエンザウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ロスリバーウイルス、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、風疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、ロタウイルス、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、狂犬病および黄熱からなる群から選択されるウイルスに由来する抗原を含む、請求項２１に記載の方法または組成物。
【請求項２３】
前記ワクチンはモノバルクワクチンである、請求項２１または請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ワクチンはインフルエンザワクチンである、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項２５】
前記ワクチン中の赤血球凝集素（ＨＡ）濃度は、用量あたり０．１〜５０μｇである、請求項２４に記載の組成物の組成物。
【請求項２６】
前記ワクチン中の赤血球凝集素（ＨＡ）濃度は、用量あたり０．１〜２０μｇである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ワクチン中の赤血球凝集素（ＨＡ）濃度は、用量あたり約１５μｇまたは約７．５μである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
生ウイルスワクチンである、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項２９】
不活性化ウイルスワクチンである、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項３０】
全ウイルスワクチン、スプリットウイルスワクチン、またはウイルスサブユニットワクチンである、請求項２９に記載の方法または組成物。
【請求項３１】
３価のインフルエンザワクチンである、請求項２４〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項３２】
３価のインフルエンザワクチンである、請求項２４〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項３３】
パンデミックインフルエンザウィルス株を含む、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項３４】
前記宿主細胞は、ＭＤＣＫ細胞系、ＣＨＯ細胞系、ベロ細胞系、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞系である、前記請求項のいずれかに記載の方法または組成物。
【請求項３５】
前記組成物は、オボアルブミンおよびニワトリＤＮＡを含まない、前記請求項のいずれかに記載の方法または組成物。
【請求項３６】
前記組成物の用量は、０．１〜１ｍＬの体積を有する、前記請求項のいずれかに記載の方法または組成物。
【請求項３７】
前記組成物の用量は、約０．５ｍＬの体積を有する、請求項３６に記載の方法または組成物。
【請求項３８】
細胞を特徴付ける方法であって、以下
ａ）該細胞の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅する工程；
ｂ）増幅したＤＮＡを用いて、該細胞における該反復エレメントまたは該ハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定する工程；および
ｃ）反復エレメント／ハウスキーピング遺伝子に対する癌遺伝子の割合Ｒを計算する工程
を含む、方法。
【請求項３９】
反復エレメント／ハウスキーピング遺伝子に対する癌遺伝子の割合Ｒを、式
【数１１１】
2015526062.tif 000045
によって計算する、
式中、
Ｎｏｎｃｏ：ゲノムあたりの癌遺伝子の数
Ｎｒｅｐ：反復エレメント／ハウスキーピング遺伝子の数［ｒｅｐ／ｍＬ］
ｃＤＮＡ：テストサンプル中の細胞ＤＮＡの濃度［ｐｇ／ｍＬ］
ｍｈａｐ．ｇｅｎ．：前記細胞の一倍体ゲノムの質量
である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞は、ワーキングセルバンクまたはマスターセルバンクに由来する、請求項３８または請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
生物学的産物を調製する方法であって、以下：
ａ）請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法によって宿主細胞を特徴づける工程；および
ａ）該宿主細胞において該生物学的産物を産生する工程
を含む、方法。
【請求項４２】
（ｂ）において産生された前記生物学的産物を含む組成物を調製する工程をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法によって、前記組成物のＤＮＡ安全係数を決定する工程をさらに含む、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞は、工程（ａ）と工程（ｂ）との間に少なくとも２回継代される、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の方法であって、前記組成物はワクチンであり、該方法は以下：
ａ）請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法によって宿主細胞を特徴付ける工程；
ｂ）該細胞にウイルスを感染させる工程；
ｃ）該細胞を培養して、ウイルスを産生する工程；および
ｄ）（ｃ）において産生された該ウイルスからワクチンを調製する工程
を含む、方法。
【請求項４６】
前記細胞は、ＭＤＣＫ細胞系、ＣＨＯ細胞系、ベロ細胞系、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞系である、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
宿主細胞で産生された生物学的産物を含む組成物において、残留宿主細胞ＤＮＡの量を決定する方法であって、以下：
ａ）該宿主細胞の反復エレメントのまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅する工程；
ｂ）増幅したＤＮＡを用いて、該反復エレメントまたは該ハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定する工程；および
ｃ）該反復エレメントまたは該ハウスキーピング遺伝子のコピー数を用いて、該組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡの量を計算する工程
を含む、方法。
【請求項４８】
前記反復エレメントは、ＬＩＮＥエレメント、ＳＶＡエレメントまたは偽遺伝子である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
生物学的産物を作製するための方法であって、（ａ）請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法によって宿主細胞を特徴付ける工程；および（ｂ）該宿主細胞の培養物を用いて、該生物学的産物を調製する工程を含む、方法。
【請求項５０】
生物学的産物を含む組成物を調製するための方法であって、（ａ）請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法によって宿主細胞を特徴付ける工程；（ｂ）該宿主細胞の培養物を用いて、該生物学的産物を調製する工程；および（ｃ）（ｉ）工程（ｂ）で産生された該生物学的産物または（ｉｉ）工程（ｂ）で産生された該生物学的産物から作製された化合物を含む組成物を調製する工程を含む、方法。
【請求項５１】
工程（ｂ）で使用される前記細胞は、工程（ａ）で使用される前記細胞の子孫であり、および／または工程（ａ）で使用される前記細胞のクローンであり、および／または工程（ａ）および（ｂ）の間に少なくとも１回、工程（ａ）で使用される前記細胞から継代された細胞である、請求項４９または請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
生物学的産物を作製するための方法であって、（ａ）請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法によって、セルバンク由来の細胞を特徴付けるか、または請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法によって特徴付けられたセルバンク由来の細胞を提供する工程；および（ｂ）該細胞バンク由来の細胞を用いて、該生物学的産物を調製する工程を含む、方法。
【請求項５３】
生物学的産物を含む組成物を作製するための方法であって、（ａ）請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法によって細胞バンク由来の細胞を特徴付けるか、または請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法によって特徴付けられた細胞バンク由来の細胞を提供する工程；（ｂ）該細胞バンク由来の細胞を用いて、該生物学的産物を調製する工程；および（ｃ）（ｉ）工程（ｂ）で産生された該生物学的産物、または（ｉｉ）工程（ｂ）で産生された該生物学的産物から作製された化合物を含む組成物を調製する工程を含む、方法。
【請求項５４】
工程（ａ）および工程（ｂ）で使用される前記細胞は、異なる細胞バンクに由来する、請求項５２または請求項５３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２０１２年６月４日に出願された米国特許仮出願第６１／６５５，１７８号の優先権の利益を請求し、その内容は、本開示に参照によって組み込まれる。
【０００２】
本発明は、助成金番号ＨＨＳＯ１００２００６０００１２Ｃによる国庫支出金より部分的になされた。政府は本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、生物学的産物の安全性試験の分野である。
【背景技術】
【０００４】
細胞由来ワクチンにおける残留ＤＮＡのリスクを特徴付けるために、ＤＮＡ安全係数を決定し得る。安全係数は、少なくとも５％の可能性で腫瘍原性の事象を引き起こすために個人に注射しなければならない、ワクチン用量の数を示す。２００５年、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、哺乳類細胞培養において調製された抗原を含むワクチンに関して、＞１０７の安全係数を推奨した［１］。
【０００５】
以前に、細胞培養に基づく生物学的産物の安全性を、キャピラリーゲル電気泳動によって残留ＤＮＡサイズ分布を決定することによって評価した。規定の長さのＤＮＡ断片の数を評価することによって、ヒトの用量当たりの癌遺伝子の潜在的な数、およびその結果としてのＤＮＡ安全係数を計算した。しかし、この方法は、非機能的な長いＤＮＡ断片（例えばアルキル化またはニックの入ったＤＮＡ）を計算から除外せず、そしてサンプル中の機能的な癌遺伝子の実際の数を過大に評価する。
【０００６】
参考文献２は、癌遺伝子の推定数を、サンプル中のＤＮＡの全量と関連付けることによって、安全係数を決定する方法を開示する。それは、酵素の不活性化のために、安全係数は多くの場合不正確であることを教示し、そして酵素の不活性化を考慮する代替の計算を示唆する。
【０００７】
ワクチンのような、細胞培養由来の生物学的産物の安全性を評価するための、さらなる、およびより正確なアッセイを提供することが、本発明の目的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｈｅｎｇ−Ｆｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ；  ６（２）：１５１−１６２
【非特許文献２】Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２８（１９）：３３０８−１１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（本発明の開示）
本発明者らは、細胞培養由来生物学的産物の安全性を評価するための改善されたアッセイを提供し、それはＤＮＡ安全係数をより正確に評価することを可能にする。
【００１０】
１つの実施態様において、本発明は、以下の工程を含む、宿主細胞において産生された生物学的産物を含む組成物のＤＮＡ安全係数を決定するための方法を提供する：
ａ）宿主細胞の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅する；
ｂ）増幅したＤＮＡを用いて、その反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定する；
ｃ）その反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を用いて、組成物の用量中の癌遺伝子の数、
【数１】
2015526062.tif 000002
を計算する；および
ｄ）ＤＮＡ安全係数（ＳＦ）を決定する。
【００１１】
ＤＮＡ安全係数ＳＦを、好ましくは式
【数２】
2015526062.tif 000003
によって決定し、式中、
【数３】
2015526062.tif 000004
は、組成物の用量中に存在し得る、用量当たりの癌遺伝子の最大数である。
【００１２】
増幅工程に起因して、例えばニックの入った、またはアルキル化された非機能的ＤＮＡ断片は、そのようなＤＮＡ分子は増幅のための良くない鋳型であるので、分析から除外される。よってＤＮＡ安全係数を計算する場合に、機能的ＤＮＡのみが考慮され、それはその方法の正確性を改善する。
【００１３】
本発明はさらに、宿主細胞において産生された生物学的産物を含む組成物を提供し、ここでその組成物は、１ｍＬあたりｎ個より少ない反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子を含み、ここでｎは式
【数４】
2015526062.tif 000005
によって計算され、式中、Ｒは宿主細胞における反復エレメント／ハウスキーピング遺伝子に対する癌遺伝子の割合である。
【００１４】
生物学的産物を含む組成物を作製する方法も提供され、それは（ａ）宿主細胞を培養してその生物学的産物を産生する；（ｂ）（ａ）において産生された生物学的産物から組成物を調製する；および（ｃ）本発明による方法によって、その組成物のＤＮＡ安全係数を決定する工程を含む。その組成物はワクチン組成物であり得、そしてその方法は、（ａ）宿主細胞を培養してウイルスを産生する；（ｂ）（ａ）において産生されたウイルスからワクチンを調製する；および（ｃ）本発明による方法によって、そのワクチン組成物のＤＮＡ安全係数を決定する工程を含み得る。
【００１５】
本発明はさらに、細胞を特徴付ける方法を提供し、それは
（ａ）その細胞の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅する；
（ｂ）その増幅したＤＮＡを用いて、その細胞におけるその反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定する；および
（ｃ）反復エレメント／ハウスキーピング遺伝子に対する癌遺伝子の割合Ｒを計算する工程を含む。
【００１６】
その割合Ｒを、好ましくは式
【数５】
2015526062.tif 000006
によって計算し、
式中、
Ｎｏｎｃｏ：ゲノムあたりの癌遺伝子の数
Ｎｒｅｐ：反復エレメント／ハウスキーピング遺伝子の数［ｒｅｐ／ｍＬ］
ｃＤＮＡ：テストサンプル中の細胞ＤＮＡの濃度［ｐｇ／ｍＬ］
ｍｈａｐ．ｇｅｎ．：細胞の一倍体ゲノムの質量
である。
【００１７】
安全係数
ワクチンの安全係数（ＳＦ）を、式
【数６】
2015526062.tif 000007
によって計算し、
式中、
【数７】
2015526062.tif 000008
は、組成物の用量中に安全に存在し得る癌遺伝子の最大数であり、そして
【数８】
2015526062.tif 000009
は、組成物の用量あたりの計算された癌遺伝子数である。
【００１８】
腫瘍を誘発する発癌性ＤＮＡの臨界用量が、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって決定された。２つの癌遺伝子をコードする、直鎖状ＤＮＡ断片の８００ｐｇの量が、テスト動物において腫瘍を引き起こすために十分であることが見出された。この量は、研究において使用された発現プラスミドの長さに基づいて、８．０×１０７の二重癌遺伝子と同等である［３］。両方の遺伝子が同じＤＮＡ断片に位置するその構築物のデザインは、癌遺伝子が別のプラスミドにあるよりも、腫瘍の誘発においてより有効であることが以前に示された。効率の増加は、約２０の係数であった、すなわち、２つの癌遺伝子が同じプラスミドに位置する場合、それらが別々のプラスミドにある場合よりも、腫瘍を誘発するために必要な全ＤＮＡが約２０倍少ない。この情報に基づいて、腫瘍を誘発するために必要な癌遺伝子断片の臨界数を、式
【数９】
2015526062.tif 000010
によって計算し得る。
【００１９】
組成物中の反復エレメントおよび／またはハウスキーピング遺伝子の数に基づいてＤＮＡ安全係数を評価するために、宿主細胞のゲノムにおける、癌遺伝子および反復エレメント／ハウスキーピング遺伝子の間の割合を知ることも必要である。この割合を、例えばその生物学的産物を産生する宿主細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、必要に応じてその抽出ＤＮＡを希釈し、そしてその抽出ＤＮＡの希釈系列を提供することによって決定し得る。その希釈サンプルを、反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅するプライマーを用いて、ＤＮＡ増幅（例えばＰＣＲによる）にかける。次いでそのサンプルを、例えばアガロースゲル電気泳動によって分析し、そして増幅産物が検出できない最も高い希釈を決定する。反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数（Ｎｒｅｐ）を、以下の式によって決定し得、ここで「ＤＬ」は所定の条件下における特定の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の検出限界であり（反復エレメント／ｍＬ）、「ＰＣＲ（−）」は最初の陰性増幅シグナルの希釈係数を示し、そして「希釈」は必要に応じてＤＮＡ抽出の後に行い得る任意の最初の希釈の希釈係数を指す：
【数１０】
2015526062.tif 000011
【００２０】
特定の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の検出限界ＤＬは、使用する増幅条件によって変動する。それを、アッセイにおいて増幅する反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の断片を発現ベクターにクローニングし、そして既知の量のプラスミドを有するベクターの希釈系列を調製することによって決定し得る。そのベクターを、アッセイにおいて使用することが意図される特定の増幅条件を用いたＤＮＡ増幅の鋳型として使用し、そしてこれらの条件下で最も低い検出可能なベクターの量を、例えばアガロースゲルにおいて増幅産物が検出できない希釈係数を決定することによって決定する。コピー数を計算するために、ベクター中のヌクレオチドの数を決定し、そして１．１×１０−９ｐｇ／ｂｐの係数をかける。この計算から、全増幅ＤＮＡの重量を、個々のベクターの重量で割ることによって、ベクターのコピー数を決定し得る。それぞれのベクターは単一の断片しか含んでいないので、増幅産物が依然として検出可能な最も低い希釈におけるベクターの数は、その断片の検出限界と同等である。この技術を用いて、本発明者らは、例えばＬＩＮＥエレメントの検出限界は、Ｔｒｉｓ緩衝液において１ｍＬあたり１０，０００  ＬＩＮＥであることを示すことができた。
【００２１】
反復エレメント／ハウスキーピング遺伝子に対する癌遺伝子の割合Ｒを、以下のように計算し得る：
【数１１】
2015526062.tif 000012
式中、Ｎｏｎｃｏ：ゲノムあたりの癌遺伝子の数
Ｎｒｅｐ：反復エレメント／ハウスキーピング遺伝子の数［ｒｅｐ／ｍＬ］
ｃＤＮＡ：テストサンプル中の宿主細胞ＤＮＡの濃度［ｐｇ／ｍＬ］
ｍｈａｐ．ｇｅｎ．：一倍体ゲノムの質量
【００２２】
宿主細胞の一倍体ゲノムの質量は、通常当該分野において公知であり、そして例えばＡｎｉｍａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｉｚｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ［４］において見出し得る。例えば、ＭＤＣＫ細胞の一倍体ゲノムは、一倍体ゲノムあたり３．０９ｐｇの質量を有し、そしてＣＨＯ細胞は、一倍体ゲノムあたり２．７３ｐｇの質量を有すると推定される。同様に、ゲノム中の癌遺伝子の数を、文献から得ることができる。例えば、ＭＤＣＫ細胞は、ゲノムあたり１０個の癌遺伝子を有すると推定される。
【００２３】
これらの値を用いて、本発明者らは、例えばＭＤＣＫ細胞におけるＬＩＮＥエレメントの値は、ＬＩＮＥエレメントあたり６．２×１０−６個の癌遺伝子であることを計算した。
【００２４】
その割合Ｒを、各宿主細胞に関して個々に決定し得る。しかし、生物学的産物は、多くの場合医薬品組成物の産生に適切な、特定の細胞系において増殖する。そのような細胞系の例は、ＭＤＣＫ細胞（ＭＤＣＫ３３０１６［３３］のような）、ＣＨＯ細胞、ベロ細胞（例えば、カタログ番号ＣＣＬ８１、ＣＣＬ８１．２、ＣＲＬ１５８６およびＣＲＬ−１５８７Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクションの下で得られるもの）、２９３Ｔ細胞、およびＰＥＲ．Ｃ６細胞を含む。これらの細胞を、ワーキングセルバンクまたはマスターセルバンク（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［５］、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［６］、またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から入手可能なもののような）から得ることができ、そしてそのようなセルバンク由来の細胞において割合Ｒを決定することが可能である。各宿主細胞を個々に試験する必要を回避するので、これは好ましい。従って、本発明は、細胞を特徴付ける方法を提供し、それは（ａ）細胞の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅する；（ｂ）その増幅したＤＮＡを用いて、その細胞におけるその反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定する；および上記で議論した式によってＲの割合を計算する工程を含む。
【００２５】
本発明の方法によって特徴付けられた宿主細胞を、生物学的産物を作製するための方法において使用し得る。従って、本発明は、（ａ）本発明の方法によって宿主細胞を特徴付ける；および（ｂ）その宿主細胞の培養物を用いて、生物学的産物を調製する工程を含む、生物学的産物を作製するための方法を提供する。その生物学的産物は、ウイルスであり得、その場合、その方法は、（ａ）本発明の方法によって宿主細胞を特徴付ける；および（ｂ）その宿主細胞の培養物を用いて、ウイルスを調製する（例えば、宿主細胞にウイルスを感染させる、または逆遺伝学のための１つまたは複数の発現構築物でそれをトランスフェクトすることによって）工程を含み得る。そのウイルスを調製する工程は、宿主細胞培養物にウイルスを感染させる、または逆遺伝学のための１つまたは複数の発現構築物でそれをトランスフェクトする、およびその宿主細胞培養物を培養してウイルスを産生する工程を含み得る。宿主細胞培養物にウイルスを感染させる工程は、培養物中のあらゆる単一細胞が感染することを必要としないことが理解される。そうではなく、培養物中の１つまたは複数の細胞が感染すれば十分である。
【００２６】
（ａ）本発明の方法によって、宿主細胞を特徴付ける；（ｂ）その宿主細胞の培養を用いて、生物学的産物を調製する；および（ｃ）（ｉ）工程（ｂ）で産生した生物学的産物または（ｉｉ）工程（ｂ）で産生した生物学的産物から作製した化合物を含む組成物を調製する工程を含む、組成物を作製する方法も提供される。その組成物がワクチンである場合、その方法は、（ａ）本発明の方法によって宿主細胞を特徴付ける；（ｂ）その宿主細胞の培養を用いてウイルスを産生する（例えば、その宿主細胞にウイルスを感染させる、または１つまたは複数の逆遺伝学のための発現構築物でトランスフェクトすることによって）；（ｃ）その細胞を培養してウイルスを産生する；および（ｄ）（ｃ）で産生したウイルスを用いてワクチンを調製する工程を含み得る。
【００２７】
生物学的産物を細胞において産生する場合、セルバンクシステム（細胞シードシステムとしても公知である）を用いるのが、一般的な方法である。これらのシステムは、当該分野において周知である。簡単には、これらのシステムは、マスターセルバンク（マスター細胞シード）由来の細胞において、その生物学的産物を産生することを含む。マスターセルバンクから、１つまたは複数の作業用セルバンク（作業用細胞シード）を産生し得る（例えば希釈、継代等によって）。本発明の方法を用いて、マスターセルバンク、または特定のマスターセルバンク由来のあらゆるセルバンク由来の細胞を特徴付け得る。従って、本発明は、生物学的産物を産生するための方法を提供し、それは（ａ）本発明の方法によって、セルバンク由来の細胞を特徴付ける、または本発明の方法によって特徴付けられたセルバンク由来の細胞を提供する；および（ｂ）そのセルバンク由来の細胞を用いて、生物学的産物を調製する工程を含む。その生物学的産物はウイルスであり得、その場合本方法は、（ａ）本発明の方法によってセルバンク由来の細胞を特徴付ける、または本発明の方法によって特徴付けたセルバンク由来の細胞を提供する；および（ｂ）そのセルバンク由来の細胞を用いてウイルスを調製する工程を含む。ウイルスを調製する工程は、その細胞にウイルスを感染させ、そしてその細胞を培養してウイルスを産生する工程を含み得る。これらの方法の工程（ａ）において特徴付けられた細胞は、工程（ｂ）において生物学的産物を産生するために使用される、同じセルバンク由来の細胞であり得る。その細胞はまた、特徴付けられる細胞および生物学的産物を産生するために使用される細胞が、同じマスターセルバンクのクローンまたは子孫であるなら、異なるセルバンク由来であり得る。
【００２８】
組成物を作製する方法も提供され、それは（ａ）本発明の方法によってセルバンク由来の細胞を特徴付ける、または本発明の方法によって特徴付けられたセルバンク由来の細胞を提供する；（ｂ）そのセルバンク由来の細胞を用いて、生物学的産物を調製する；および（ｃ）（ｉ）工程（ｂ）で産生された生物学的産物、または（ｉｉ）工程（ｂ）で産生された生物学的産物から産生された化合物を含む組成物を調製する工程を含む。その組成物がワクチンである場合、その方法は、（ａ）本発明の方法によってセルバンク由来の細胞を特徴付ける、または本発明の方法によって特徴付けられたセルバンク由来の細胞を提供する；（ｂ）そのセルバンク由来の細胞を用いてウイルスを調製する；および（ｃ）（ｂ）において産生されたウイルスからワクチンを調製する工程を含み得る。
【００２９】
工程（ｂ）で使用される細胞は、工程（ａ）で使用される細胞の子孫であり得る、および／またはそれは工程（ａ）で使用される細胞のクローンであり得る、および／またはそれは工程（ａ）および（ｂ）の間に少なくとも１回、工程（ａ）で使用される細胞から継代された細胞であり得る。細胞を特徴付ける方法をまた、ワクチンを調製するための方法において使用し得、ここで（ａ）細胞を本発明の方法によって特徴付ける；（ｂ）その細胞にウイルスを感染させる；（ｃ）その細胞を培養して、ウイルスを産生する；および（ｄ）（ｃ）において産生されたウイルスからワクチンを調製する。
【００３０】
例えば、宿主細胞を特徴付ける工程は通常細胞を損傷する、または破壊するので、前の段落の方法の工程（ａ）および（ｂ）において使用される細胞は、通常同一ではない。従って、工程（ｂ）で使用する細胞は、工程（ａ）で使用する細胞の子孫であり得る、および／またはそれは工程（ａ）で使用する細胞のクローンであり得る、および／またはそれは工程（ａ）および（ｂ）の間に少なくとも１回、工程（ａ）で使用する細胞から継代された細胞であり得る。その細胞は、工程（ａ）および（ｂ）の間に、少なくとも２回（例えば５回より多く、１０回より多く、２０回より多く、または４０回より多く）継代され得る。これらの方法において使用される細胞は、例えばＭＤＣＫ、ＣＨＯ、Ｐｅｒ．Ｃ６またはベロ細胞のような細胞系由来であり得る。
【００３１】
一旦割合Ｒが既知となったら、組成物中の癌遺伝子の濃度（ｃｏｎｃｏ）を、式
【数１２】
2015526062.tif 000013
によって計算し得、
式中、「ＤＬ」は所定の条件下における特定の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の検出限界であり（反復エレメント／ｍＬ）、そして「ＰＣＲ（−）」は、最初の陰性ＰＣＲシグナルの希釈係数を示す。
【００３２】
ＰＣＲの代わりに、任意の公知のＤＮＡ増幅技術を用いて、本発明を実施することも可能である。次いで記載された方法および計算を、使用した特定の増幅技術に適合させる。例えば、ＤＮＡを、ローリングサークル型（ＲＣＬ）増幅を用いて増幅する場合、上記の計算を、最初の陰性ＲＣＬシグナルの希釈係数を参照するよう適合させる。
【００３３】
用量中の癌遺伝子の実際の数
【数１３】
2015526062.tif 000014
は、理論的な考察であり、それは異なる因子に依存して計算し得る。例えば、ＤＮＡ安全係数を、組成物の用量は、ｘ  ｎｇ、例えば１０ｎｇのＤＮＡ含有量を有するという仮定を用いて計算し得る。この場合、その安全係数は、組成物の用量の仮定ＤＮＡ含有量（例えば１０ｎｇ）に対して算出され、そして式
【数１４】
2015526062.tif 000015
によって計算され、
式中、ｃｏｎｃｏは、モノバルク（ｍｏｎｏｂｕｌｋ）中の癌遺伝子の濃度であり［癌遺伝子／ｍＬ］、そしてｃＤＮＡはモノバルク中のＤＮＡ濃度である［ｎｇ／ｍＬ］。ＤＮＡ含有量を、定量的ＤＮＡアッセイによって、例えばピコグラムレベルの全ＤＮＡのための定量的アッセイであり、生物学的産物中の混入ＤＮＡのレベルをモニタリングするために使用されるＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭアッセイによって測定し得る［７］。典型的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質、標識化（例えばウレアーゼコンジュゲート化）抗ｓｓＤＮＡ抗体、およびＤＮＡの間の反応複合体の非配列特異的な形成を含む。ＤＮＡを定量する別の方法も当該分野において公知であり、そしてサザンブロットまたはスロットブロット［８］のようなハイブリダイゼーション法、および定量的ＰＣＲ［９］を含む。様々な商業的製造会社、例えばＡｐｐＴｅｃＴＭ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅＴＭ、Ａｌｔｈｅａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ等が、残留宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイを提供している。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡの混入を測定するための、化学発光ハイブリダイゼーションアッセイおよび全ＤＮＡ  ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭシステムの比較を、参考文献１０において見出し得る。
【００３４】
あるいは、安全係数ＳＦを、組成物の用量体積に関して計算し得る。この実施態様において、ＤＮＡ安全係数を、式
【数１５】
2015526062.tif 000016
によって計算し、式中、Ｖｄｏｓｅは、組成物の用量の体積である［ｍＬ］。
【００３５】
組成物の用量は多くの場合有意に１０ｎｇ未満のＤＮＡを含み、そして従ってこのＤＮＡ含有量に対して安全係数を外挿することは、その安全係数は組成物の実際の用量体積を有意に超える理論的用量に関して計算されることを意味し得るので、（ＤＮＡ含有量とは対照的に）用量体積に関連して安全係数ＳＦを計算することは、より現実的な安全係数の値を提供するという利点を有する。
【００３６】
ＤＮＡ安全係数の最も現実的な評価は、用量あたりの生物学的産物の濃度（ｃｄｏｓｅ）、例えばワクチンの抗原含有量または組換えタンパク質の量に関して計算することである。その安全係数を、式
【数１６】
2015526062.tif 000017
によって計算し、式中、ｃｄｏｓｅは、用量当たりの生物学的産物の濃度［μｇ／用量］であり、そしてｃａｃｔｕａｌは、組成物中の活性成分の実際の濃度［μｇ／ｍＬ］である。例えば、三価の季節性インフルエンザワクチンは、典型的には用量あたり４５μｇの赤血球凝集素（ＨＡ）のＨＡ濃度を有し、この場合その安全係数を式
【数１７】
2015526062.tif 000018
によって計算する。
【００３７】
サンプル中の活性成分の実際の濃度を測定する方法は、当該分野で公知である。例えば、ワクチンのＨＡ含有量を、一元放射免疫拡散（「ＳＲｉＤ」）アッセイ［１１、１２］によって決定し得、そして全タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ［１３］によって測定し得る。
【００３８】
１０７未満の安全係数を有する組成物を却下し得る。
【００３９】
組成物
本発明の組成物は、宿主細胞において産生し得るあらゆる産物であり得る生物学的産物を含む。適切な生物学的産物は、細胞培養において増殖したウイルス由来のワクチン抗原、および組換えタンパク質を含む。
【００４０】
本発明の組成物は、単一の生物学的産物を含み得るが、２つまたはそれ以上の生物学的産物、例えば２つまたはそれ以上の異なる抗原または組換えタンパク質も含み得る。その２つまたはそれ以上の生物学的産物は、好ましくは全て宿主細胞において産生された。しかし、本発明の組成物はまた、それが宿主細胞において産生された少なくとも１つの生物学的産物を含むという条件で、宿主細胞において産生されていない生物学的産物を含み得る。
【００４１】
その組成物は、好ましくは卵由来物質を含まない（例えば、オボアルブミンを含まない、オボムコイドを含まない、ニワトリＤＮＡを含まない）。組成物中の生物学的産物は、好ましくは、ＭＤＣＫのような哺乳類細胞系（例えば本明細書中で記載された細胞系）における増殖から得られるグリカンでグリコシル化されている。
【００４２】
その組成物は、細胞培養物中で増殖し得るウイルス由来の抗原である生物学的産物を含むワクチン組成物であり得る。そのようなウイルスは、当該分野で公知であり、そして例えば、インフルエンザウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ロスリバーウイルス、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、風疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、ロタウイルス、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、狂犬病および黄熱を含む。
【００４３】
本組成物は、好ましくはヒトにおいて使用することが意図される組成物、特にワクチン組成物である。安全係数を正確に決定することが、そのようなワクチンにおいて最も重要であるので、これは好ましい。そのようなワクチンの例は、インフルエンザワクチン（例えばＯｐｔａｆｌｕＴＭ）、狂犬病ワクチン（例えばＲａｂＡｖｅｒｔＴＭ）、Ｂ型肝炎ワクチン（ＧｅｎＨｅｖａｃＢＴＭ）、麻疹ワクチン（例えばＡｔｔｅｎｕｖａｘＴＭ）、流行性耳下腺炎ワクチン（例えばＭｕｍｐｓｖａｘ）、風疹ワクチン（例えばＭｅｒｕｖａｘＩＩＴＭ）、および麻疹、流行性耳下腺炎および風疹併用ワクチン（例えばＭ−Ｍ−Ｒ  ＩＩＴＭ）である。
【００４４】
卵においてこれらのウイルスを増殖させる従来の方法に関連する欠点に起因して、細胞培養におけるインフルエンザワクチンの増殖は、特に有利であると考えられるので、本発明は、インフルエンザワクチン組成物に特に適切である。例えば、インフルエンザウイルスは迅速な変異を起こすためインフルエンザワクチンは頻繁に変更する必要があり、そしてワクチンは多くの場合、特にパンデミックの間、早急に利用可能である必要があるので、卵におけるインフルエンザウイルスの増殖が、最大６ヶ月までの長い準備期間が必要であることは、問題であり得る。
【００４５】
ワクチン組成物、特にインフルエンザワクチンは一般的に、生ウイルス、または不活性化ウイルスのどちらかに基づく。不活性化ワクチンは、全ビリオン、「スプリット」ビリオン、または精製された表面抗原に基づき得る。抗原をまた、ビロソームの形式で提示し得る。本発明を、これらの型のワクチンのいずれにも使用し得る。
【００４６】
不活性化ウイルスを用いる場合、そのワクチンは、ビリオン全体、スプリットビリオン、または精製された表面抗原（赤血球凝集素を含む、および通常ノイラミニダーゼも含む）を含み得る。ウイルスを不活性化する化学的な手段は、有効な量の１つまたは複数の以下の薬剤による処理を含む：界面活性剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン（ｂｉｎａｒｙ  ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、アセチルエチレンイミン、またはその組み合わせ。例えばＵＶ光またはガンマ線照射のような、ウイルス不活性化のための非化学的方法が、当該分野で公知である。
【００４７】
ビリオンを、ウイルスを含む液体、例えば尿膜液または細胞培養上清から、様々な方法によって回収し得る。例えば、精製過程は、ビリオンを破壊するための界面活性剤を含む、線形ショ糖勾配溶液を用いたゾーン遠心分離を含み得る。次いで抗原を、任意で希釈した後、ダイアフィルトレーションによって精製し得る。
【００４８】
「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」スプリット過程を含む、精製ビリオンを界面活性剤（例えばエチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、セチルトリメチルアンモニウム臭化物、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ９等）で処理してサブビリオン調製物を産生することによって、スプリットビリオンを得る。例えば、インフルエンザウイルスをスプリットする方法は、当該分野で周知であり、例えば参考文献１４〜１９等を参照のこと。ウイルスのスプリットを、典型的には、感染性または非感染性に関わらず、破壊濃度のスプリット剤で、ウイルス全体を破壊または断片化することによって行う。その破壊は、完全なまたは部分的なウイルスタンパク質の可溶化を引き起こし、ウイルスの完全性を変化させる。好ましいスプリット剤は、非イオン性およびイオン性（例えば陽イオン性）界面活性剤（例えばアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、ＮＰ９、４級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウム臭化物）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、セタブロン、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ）、オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１のようなＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステル等である。１つの有用なスプリット手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続的な効果を用い、そしてスプリットは最初のビリオンの精製の間に起こり得る（例えばショ糖密度勾配溶液において）。従って、スプリット過程は、ビリオンを含む物質の清澄化（非ビリオン物質を除去する）、回収したビリオンの濃縮（例えばＣａＨＰＯ４吸着のような吸着方法を用いて）、全ビリオンの非ビリオン物質からの分離、密度勾配遠心工程における、スプリット剤を用いたビリオンのスプリット（例えばデオキシコール酸ナトリウムのようなスプリット剤を含むショ糖勾配を用いて）、および次いで望ましくない物質を除去するためのろ過（例えば限外ろ過）を含み得る。スプリットビリオンを、リン酸ナトリウム緩衝化等張塩化ナトリウム溶液中に有用に再懸濁し得る。スプリットインフルエンザワクチンの例は、ＢＥＧＲＩＶＡＣＴＭ、ＦＬＵＡＲＩＸＴＭ、ＦＬＵＺＯＮＥＴＭ、およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤＴＭ製品である。
【００４９】
別の形式の不活性化抗原は、ビロソーム［２０］（核酸を含まないウイルス様のリポソーム粒子）である。ウイルスの界面活性剤による可溶化、続くヌクレオカプシドの除去およびウイルス糖タンパク質を含む膜の再構築によって、ビロソームを調製し得る。ビロソームを調製するための代替の方法は、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に加えて、その膜にウイルスタンパク質を有するリポソームを生じることを含む。
【００５０】
精製インフルエンザウイルス表面抗原ワクチン組成物は、表面抗原赤血球凝集素、および典型的にはノイラミニダーゼも含む。精製した形式でこれらのタンパク質を調製するための過程は、当該分野で周知である。ＯＰＴＡＦＬＵＴＭ、ＣＥＬＴＵＲＡＴＭ、ＦＬＵＶＩＲＩＮＴＭ、ＡＧＲＩＰＰＡＬＴＭおよびＩＮＦＬＵＶＡＣＴＭ製品は、インフルエンザサブユニットワクチンである。
【００５１】
現在の不活性化インフルエンザワクチン組成物において、ＨＡは主な免疫原であり、そしてワクチン用量は、典型的にはＳＲｉＤによって測定されるＨＡレベルを参照して標準化される。既存のワクチンは、典型的には株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、例えば小児、またはパンデミックの状況において、またはアジュバントを使用する場合には、より低い用量を使用し得る。より高い用量（例えば３×または９×の用量［２１、２２］）と同様、１／２（すなわち株あたり７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８のような分画の用量が使用された。従って、ワクチンは、ワクチン用量あたりインフルエンザ株あたり０．１および１５０μｇの間、好ましくは０．１および５０μｇの間、例えば０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇ等のＨＡを含み得る。特定の用量は、用量あたり株あたり、例えば約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５等を含む。
【００５２】
本発明をまた、生インフルエンザ抗原のような、生ウイルス抗原を含む組成物で実施し得る。そのような組成物を、通常ビリオンを含む液体からビリオンを精製することによって調製する。例えば、その液体を遠心分離によって清澄化し、そして緩衝液（例えばショ糖、リン酸カリウム、およびグルタミン酸ナトリウムを含む）で安定化し得る。現在、様々な形式のインフルエンザウイルスワクチンが利用可能である（例えば参考文献２３の第１７および１８章を参照のこと）。生ウイルスワクチンは、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＦＬＵＭＩＳＴＴＭ製品（３価の生ウイルスワクチン）を含む。
【００５３】
インフルエンザワクチン組成物において、そのインフルエンザウイルスを弱毒化し得る。そのインフルエンザウイルスは、温度感受性であり得る。そのインフルエンザウイルスは、低温順応であり得る。これらの３つの特徴は、生ウイルスを抗原として使用する場合に特に有用である。
【００５４】
生ワクチンに関して、投薬は、ＨＡ含有量ではなく、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）によって測定され、そして株あたり１０６および１０８の間（好ましくは１０６．５〜１０７．５の間）のＴＣＩＤ５０が典型的である。
【００５５】
本発明で使用されるインフルエンザ株は、野生型ウイルスで見出されるような天然ＨＡ、または修飾ＨＡを有し得る。例えば、ウイルスを鳥類の種において高度に病原性にする決定基（例えばＨＡ１／ＨＡ２切断部位周辺の高度に塩基性の領域）を除去するためにＨＡを修飾することが公知である。逆遺伝学の使用が、そのような修飾を促進する。
【００５６】
ワクチンにおいて使用するためのインフルエンザウイルス株は、シーズンごとに変化する。パンデミックの間の時期には、ワクチンは典型的には２つのＡ型インフルエンザ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１つのＢ型インフルエンザ株を含み、そして３価のワクチンが典型的である。本発明はまた、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９サブタイプ株のような、パンデミックウイルス株（すなわち、ワクチンレシピエントおよび一般的なヒト集団が免疫学的にナイーブである株、特にＡ型インフルエンザウイルス）を使用し得、そしてパンデミック株のインフルエンザワクチンは、１価であり得る、またはパンデミック株によって補足された通常の３価のワクチンに基づき得る。しかし、シーズン、およびワクチンに含まれる抗原の性質に依存して、本発明は、１つまたは複数のＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６に対して保護し得る。本発明は、１つまたは複数のＡ型インフルエンザウイルスＮＡサブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、またはＮ９に対して保護し得る。
【００５７】
パンデミックの間の株に対して免疫するために適切であるのと同様に、本発明の組成物は、パンデミックまたは潜在的なパンデミック株に対して免疫するために特に有用である。従って、その組成物は、パンデミックまたは潜在的なパンデミックインフルエンザ株由来の抗原を含み得る。パンデミックの発生を引き起こす可能性のあるインフルエンザ株の特徴は：（ａ）それは現在流布しているヒト株の赤血球凝集素と比較して新しい赤血球凝集素、すなわち１０年以上の間ヒト集団において明らかでなかったもの（例えばＨ２）、またはヒト集団において以前に全く見られなかったもの（例えば一般的に鳥類集団においてのみ見出されるＨ５、Ｈ６、またはＨ９）を含み、その結果、ヒト集団がその株の赤血球凝集素に対して免疫学的にナイーブである；（ｂ）ヒト集団において水平に伝染し得る；および（ｃ）ヒトに対して病原性であることである。Ｈ５Ｎ１株のような、Ｈ５赤血球凝集素タイプを有するウイルスが、パンデミックインフルエンザに対して免疫するために好ましい。他の可能性のある株は、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、およびＨ７Ｎ７、およびあらゆる他の出現しつつある潜在的なパンデミック株を含む。本発明は、非ヒト動物集団からヒトへ広がり得る、または広がった、潜在的なパンデミックウイルス株、例えばブタ起源のＨ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２インフルエンザ株に対して保護するために特に適切である。次いで本発明の組成物は、非ヒト動物と同様、ヒトにワクチン接種するために適切である。
【００５８】
抗原を組成物中に有用に含み得る他の株は、耐性パンデミック株［２５］を含む、抗ウイルス治療に耐性である（例えばオセルタミビル［２４］および／またはザナミビルに耐性である）株である。
【００５９】
本発明の組成物は、Ａ型インフルエンザウイルスおよび／またはＢ型インフルエンザウイルスを含む、１つまたは複数（例えば１、２、３、４、またはそれ以上）のインフルエンザウイルス株由来の抗原を含み得る。ワクチンが１つ以上のインフルエンザ株を含む場合、異なる株を典型的には別々に増殖させ、そしてウイルスを回収し、そして抗原を調製した後に混合する。従って、本発明の過程は、１つ以上のインフルエンザ株由来の抗原を混合する工程を含み得る。２つのＡ型インフルエンザウイルス株および１つのＢ型インフルエンザウイルス株由来の抗原を含む、３価のワクチンが典型的である。２つのＡ型インフルエンザウイルス株および２つのＢ型インフルエンザウイルス株、または３つのＡ型インフルエンザウイルス株および１つのＢ型インフルエンザウイルス株由来の抗原を含む、４価のワクチンも有用である［２６］。
【００６０】
本発明の組成物は、組換えタンパク質を含み得る。その組換えタンパク質は、好ましくは哺乳類細胞培養物中に産生される。組換えタンパク質は、多くの場合治療薬として使用され、そして哺乳類細胞における増殖は、適切なタンパク質フォールディング、集合、および翻訳後修飾を可能にするので、これは好ましい［２７］。従って、タンパク質の質および有効性は、細菌、植物および酵母のような他の宿主に対して、哺乳類細胞において発現した場合により優位であり得る。多くの場合細胞培養物において産生され、そして従ってその産生過程が本発明から利益を得ることができる組換えタンパク質を含む組成物は、抗癌薬（ＶｅｃｔｉｂｉｘＴＭ、ＣａｍｐａｔｈＴＭ、またはＲｉｔｕｘａｎＴＭのような）、成長ホルモン、インスリン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、エリスロポエチン（ＡｒａｎｅｓｐＴＭ）、および血液因子（第ＶＩＩＩ因子（ＲｅＦａｃｔｏＴＭ）および第ＩＸ因子（ＢｅｎｅｆｉｘＴＭ）のような）を含む。
【００６１】
細胞培養物において組換えタンパク質を産生する方法は、当該分野で公知である［２８］。その組換えタンパク質を、宿主細胞内に含まれるベクター中にコードされる核酸分子の発現によって、組換え形式で調製し得る。一般的に、組換えタンパク質を産生するために、核酸分子を維持、増殖または発現するために適切な任意のシステムまたはベクターを使用し得る。適切なヌクレオチド配列を、例えば、参考文献２８において記載されるもののような、様々な周知の、および慣例的な技術のいずれかによって、発現システムに挿入し得る。一般的に、形質転換した宿主細胞において望ましいポリペプチドをコードするＤＮＡ配列がＲＮＡに転写されるように、コードする遺伝子を、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌の発現のために）、および必要に応じてオペレーターのような、調節エレメントの調節下に置き得る。
【００６２】
細胞
本発明を、目的の生物学的産物の産生を可能にする、あらゆる真核細胞または原核細胞で実施し得る。本発明は、典型的には細胞系を使用するが、例えば代替として初代細胞を使用し得る。その細胞は典型的には哺乳類である。適切な哺乳類細胞は、ハムスター、ウシ、霊長類（ヒトおよびサルを含む）、およびイヌ細胞を含むがこれに限らない。腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞等のような、様々な細胞型を使用し得る。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣの名前を有する細胞系である。適切なサル細胞は、例えばベロ細胞系における腎細胞のような、アフリカミドリザル細胞である［２９〜３１］。適切なイヌ細胞は、例えばＣＬＤＫおよびＭＤＣＫ細胞系におけるような、腎細胞である。
【００６３】
さらなる適切な細胞は、ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；ＭＲＣ５；ＰＥＲ．Ｃ６［３２］；ＦＲｈＬ２；ＷＩ−３８等を含むがこれに限らない。適切な細胞は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［５］から、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［６］から、またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ８１、ＣＣＬ８１．２、ＣＲＬ１５８６、およびＣＲＬ−１５８７で、様々な異なるベロ細胞を供給し、そしてカタログ番号ＣＣＬ３４でＭＤＣＫ細胞を供給する。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０でＥＣＡＣＣから入手可能である。
【００６４】
本発明で使用するための好ましい細胞（特にインフルエンザウイルスを増殖させるための）は、Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞である［３３〜３５］。もとのＭＤＣＫ細胞は、ＣＣＬ３４としてＡＴＣＣから入手可能である。これらの細胞の誘導体または他のＭＤＣＫ細胞を使用することが好ましい。そのような誘導体は、例えば参考文献３３において記載され、それは懸濁培養における増殖に適合したＭＤＣＫ細胞を開示する（ＤＳＭ  ＡＣＣ２２１９として寄託された、「ＭＤＣＫ３３０１６」または「３３０１６−ＰＦ」；参考文献３３も参照のこと）。さらに、参考文献３６は、血清を含まない培養において懸濁液中で増殖するＭＤＣＫ由来細胞を開示する（「Ｂ−７０２」、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として寄託された）。いくつかの実施態様において、使用したＭＤＣＫ細胞系は、腫瘍原性であり得る。非腫瘍原性ＭＤＣＫ細胞を使用することも想定される。例えば、参考文献３７は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）、および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０３）を含む、非腫瘍原性ＭＤＣＫ細胞を開示する。参考文献３８は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １２０４２）を含む、感染に対して高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞を開示する。
【００６５】
本発明の方法を実施するために１つより多くの細胞型の混合物を使用することが可能である。しかし、本発明の方法を、単一の細胞型で、例えばモノクローナル細胞で実施することが好ましい。好ましくは、本発明の方法において使用される細胞は、単一の細胞系由来である。
【００６６】
好ましくは、一般的な混入源を回避するために、その細胞を血清の非存在下で培養する。真核細胞培養のための様々な血清を含まない培地が当業者に公知である（例えばイスコフ培地、ウルトラＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。さらに、タンパク質を含まない培地を使用し得る（例えばＰＦ−ＣＨＯ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。そうでなければ、複製のための細胞をまた、慣例的な血清を含む培地で培養し得る（例えば０．５％から１０％のウシ胎児血清を含むＭＥＭまたはＤＭＥＭ培地）。
【００６７】
その細胞は、接着培養または懸濁培養であり得る。マイクロキャリア培養を使用し得る。いくつかの実施態様において、その細胞を、懸濁液中での増殖に適合させ得る。
【００６８】
細胞の増殖を、当業者に公知の方法によって行い得る。例えば、細胞を、遠心分離またはろ過のような通常の補助的方法を用いて、灌流システムにおいて培養し得る。さらに、細胞を、感染の前に、フェドバッチシステムで本発明によって増殖させ得る。本発明の関係において、細胞を最初にバッチシステムにおいて培養し、そして培地中の栄養分（または栄養分の一部）の欠乏が、濃縮された栄養分の制御された供給によって補填される培養システムは、フェドバッチシステムと呼ばれる。感染前の細胞の増殖の間、培地のｐＨ値をｐＨ６．６およびｐＨ７．８の間、および特にｐＨ７．２およびｐＨ７．３の間の値に調節することが有利であり得る。細胞の培養は、好ましくは３０および４０℃の間の温度で起こる。工程（ｉｉｉ）において、細胞を、好ましくは３０℃および３６℃の間、または３２℃および３４℃の間、または３３℃の温度で培養する。この温度範囲における感染細胞のインキュベーションは、ワクチンに処方した場合に改善された有効性を生じるウイルスの産生を引き起こすことが示されたので、本発明の方法を、インフルエンザウイルスを産生するために使用する場合、これは特に好ましい［３９］。
【００６９】
感染前の培養の間、酸素分圧を、好ましくは２５％および９５％の間の値に、および特に３５％および６０％の間の値に調節し得る。本発明の関係において述べられた酸素分圧の値は、空気の飽和に基づく。細胞の感染は、好ましくはバッチシステムにおいて約８〜２５×１０５細胞／ｍＬ、または好ましくは灌流システムにおいて約５〜２０×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で起こる。その細胞を、１０−８および１０の間、好ましくは０．０００１および０．５の間のウイルス用量（ＭＯＩ値、「感染効率」；感染時の細胞あたりのウイルスユニットの数に対応する）で感染させ得る。
【００７０】
本発明による方法はまた、組換えタンパク質またはウイルスあるいはウイルスによって産生されたタンパク質の回収および単離を含み得る。タンパク質またはウイルスの単離の間に、その細胞を、分離、ろ過、または限外ろ過のような標準的な方法によって、培養培地から分離する。次いでそのタンパク質またはウイルスを、勾配遠心分離、ろ過、沈殿、クロマトグラフィー等のような、当業者に十分公知である方法によって濃縮し、次いで精製する。ウイルスを、精製の間またはその後に不活性化することも、本発明によれば好ましい。ウイルスの不活性化は、例えばβ−プロピオラクトン、またはホルムアルデヒドによって、精製過程内のいずれかの時点で起こり得る。
【００７１】
組換えタンパク質の発現のためのシステムは、当該分野で公知である（例えば参考文献２８を参照のこと）。組換えタンパク質を通常、プロモーター（ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）、または単純ヘルペスウイルスプロモーターのような）、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む発現システムを用いて、細胞において発現させる。エンハンサー、機能的スプライスドナー部位およびアクセプター部位を含むイントロン、およびリーダー配列も、発現構築物に含み得る。組換えタンパク質を、哺乳類細胞において細胞内で発現し得る。あるいは、哺乳類細胞における外来性タンパク質の分泌を提供するリーダー配列断片から成る融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作り出すことによって、その組換えタンパク質をまた、細胞から増殖培地中に分泌し得る。
【００７２】
反復エレメント
本発明は、原則として、細胞のゲノムに存在するあらゆる反復エレメントによって実施し得る。しかし、本発明を、宿主細胞のゲノムに１コピー数より多く（例えば１０コピー数より多く、１００コピー数より多く、５００コピー数より多く、または１０００コピー数より多く）存在する反復エレメントで実施することが好ましい。高いコピー数で存在するゲノムセグメントは、増幅反応においてより容易に検出可能であり、そのため本発明の方法の感受性を改善し得るので、これは好ましい。
【００７３】
好ましくは、増幅される反復エレメントおよび／またはハウスキーピング遺伝子の断片は、宿主細胞における既知の癌遺伝子の長さと同等の長さを有する。癌遺伝子は、全長遺伝子として存在する場合、ワクチンの安全性に対して最も大きな問題を提起するが、ワクチン製造の間に使用されるＤＮＡ除去工程は、多くの場合ＤＮＡを断片化する。既知の癌遺伝子とおよそ同じ長さの反復エレメントの断片を増幅することによって、本発明の方法はまた、当業者が、全長癌遺伝子が存在する可能性を評価することを可能にする。例えば、反復エレメントの断片が増幅されなかった場合、全長癌遺伝子をコードするために十分長い宿主細胞ＤＮＡは細胞内に存在しない可能性がある。増幅されるＤＮＡ断片は、７００〜１３００ｂｐ、８００〜１２００ｂｐ、９００〜１１００ｂｐ、または約１０００ｂｐの長さを有し得る。
【００７４】
高いコピー数で存在し、そして従って本発明において使用するために特に適切であるゲノムセグメントは、末端反復配列（ＬＴＲ）レトロトランスポゾンおよび非ＬＴＲレトロトランスポゾンのようなレトロトランスポゾンを含む。
【００７５】
長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）、短鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ）、ＳＶＡまたは偽遺伝子は、最も豊富なゲノムエレメントの１つであり、そして広く様々な種において見出されるので、本発明において、これらを使用することが特に好ましい。
【００７６】
ＬＩＮＥは、約６ｋｂの長さであり、そして一倍体哺乳類ゲノムあたり約１０，０００〜１００，０００コピーの頻度で存在する（ゲノムの５％から１７％）。特に、ＬＩＮＥ１（Ｌ１）は、ゲノムにおいて最も豊富な自己複製トランスポゾンであり、そしてヒトゲノム中に約８０，０００コピーを有する。これらのＬＩＮＥエレメントの１０，０００近くは、全長であり、そして２つの長いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１およびＯＲＦ２）を含み、それらはどちらもレトロトランスポジションに必要なタンパク質をコードする。ＬＩＮＥ１エレメントのＯＲＦ２配列の配列を、配列番号３で示す。ＬＩＮＥは、高いコピー数で存在するので、本発明で使用するために特に好ましい。さらに、それらは多くの場合１０００ｂｐを超える長さを有し、そのため既知の癌遺伝子のおよそのサイズを有する断片を増幅することが可能である。
【００７７】
ＳＩＮＥエレメントは、その長さに基づいてＬＩＮＥエレメントと区別され、そしてその名の通り長さ５００ｂｐ未満である。最も豊富なＳＩＮＥは、Ａｌｕエレメントである［４０］。Ａｌｕエレメントは、約３００ｂｐの長さを有し、そして５００，０００コピー数より多く存在すると推定される。構造的に、Ａｌｕエレメントは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む５’領域および５’領域よりわずかに長い３’領域の２部構造を有する。５’領域および３’領域は、配列５’−Ａ５ＴＡＣＡ６−３’（配列番号４）から成る、介在、中央Ａリッチ領域によって分けられる。典型的なＡｌｕエレメントは、ポリ（Ａ）テールで終わる。
【００７８】
ＳＶＡエレメント［４１］は、ＳＩＮＥ−Ｒ、ＶＮＴＲ、およびＡｌｕエレメントの組み合わせから生じていると考えられる。ＳＶＡは、ｅｎｖ遺伝子の３’末端由来のＳＩＮＥ−Ｒ配列の４９０ｂｐの部分、ヒト内因性レトロウイルスＫ−１０（ＨＥＲＶ−Ｋ１０）の３’末端反復配列の部分、それぞれ３５〜５０ヌクレオチドから成る可変数のタンデムリピート（ＶＮＴＲ）を含む領域、およびＡｌｕ様配列を含む。ＳＶＡエレメントは、ヒトに約２７００コピー存在する。
【００７９】
偽遺伝子は、ゲノム中の機能的遺伝子に相同性を有する、非機能的遺伝子である。ヒトゲノムには、約２０，０００の偽遺伝子が存在する。例えば、リボソームタンパク質偽遺伝子は、ゲノム中に約２０００コピーを有する偽遺伝子の大きなファミリーを含む。
【００８０】
ＬＴＲレトロトランスポゾンは、最も豊富なゲノムエレメントの１つであり、そしてゲノム中に一倍体ゲノムあたり最大で数百万コピーまで存在し得る。ヒトゲノムの約８％は、そのようなＬＴＲレトロトランスポゾンから成る。ＬＴＲレトロトランスポゾンを、ｃｏｐｉａ／Ｔｙ１およびｇｙｐｓｙ／Ｔｙ３ファミリーに大きく分け得る。ＬＴＲレトロトランスポゾンは、全長エレメントが一般的に、５’および３’末端における末端反復配列（ＬＴＲ）の存在によって特徴付けられるサイズにおいて、長さが１００ｂｐから５ｋｂの範囲である。
【００８１】
ハウスキーピング遺伝子
本発明をまた、細胞のゲノムに存在するあらゆるハウスキーピング遺伝子で実施し得る。宿主細胞のゲノムに１コピー数より多く（例えば２コピー数より多く、５コピー数より多く、または１０コピー数より多く）存在するハウスキーピング遺伝子で、本発明を実施することが好ましい。高いコピー数で存在するゲノムセグメントは、増幅反応においてより容易に検出可能であり、そのため本発明の方法の感受性を改善し得るので、これは好ましい。
【００８２】
ハウスキーピング遺伝子は、細胞において構成的に発現し、そして通常細胞の機能のために重要な遺伝子をコードする遺伝子である。使用し得る適切なハウスキーピング遺伝子の例は、ＧＡＰＤＨ、β−アクチン、チューブリン、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、およびリボソームタンパク質（ＲＰＬ７およびＲＰＬ３２のような）を含む。
【００８３】
反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定する
反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を、その反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅し、その増幅産物を希釈系列で希釈し、そしてその増幅産物を、例えばアガロースゲル上の分離によって検出することによって決定し得る。反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数（Ｎｒｅｐ）を、以下の式によって決定し得、ここで「ＤＬ」は所定の条件下における特定の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の検出限界であり（反復エレメント／ｍＬ）、「ＰＣＲ（−）」は、最初の陰性増幅シグナルの希釈係数を示し、そして「希釈」は、ＤＮＡ抽出後に必要に応じて行い得る任意の最初の希釈の希釈係数を指す：
【数１８】
2015526062.tif 000019
【００８４】
増幅反応の検出限界をどのように決定し得るのかは、既に上記で説明した。
【００８５】
ＤＮＡ増幅のために使用し得る核酸増幅技術（ＮＡＡＴ）は、熱サイクル技術および等温技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）［４２］、ブーメランＤＮＡ増幅（ＢＤＡ）［４３］、Ｑｂレプリカーゼシステム、修復連鎖反応（ＲＣＲ）、自続式配列複製（３ＳＲ）、鎖置換アッセイ（ＳＤＡ）等を含む。
【００８６】
これらの増幅技術は一般的に、二本鎖標的の反対の鎖にハイブリダイズする、１つまたは複数のプライマーのペアの使用を含む。使用する反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅するように、これらのプライマーをデザインする必要がある。全長反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子を増幅する方法も使用し得る。適切なプライマーを提供する方法は、当業者に公知である。
【００８７】
その増幅産物を、ＤＮＡの検出を可能にするあらゆる方法によって検出し得る。例えば、その産物を、アガロースゲルで分離することによって検出し得る。それをまた、ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭシステムまたはＡｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎのようなアッセイによって検出し得る。それをまた、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇのような他の方法によって検出し得る。
【００８８】
医薬品組成物
本発明の組成物は、薬剤学的に許容可能である。それらは通常、抗原に加えて成分を含む、例えばそれらは典型的には１つまたは複数の薬剤学的担体および／または賦形剤を含む。下記で記載するように、アジュバントも含み得る。そのような成分の詳細な議論が、参考文献４４において入手可能である。
【００８９】
組成物、特にワクチン組成物は、一般的に水性形式である。しかし、いくつかのワクチンは、乾燥形式、例えば注射用固体、またはパッチ上の乾燥またはポリマー化調製物の形式であり得る。
【００９０】
ワクチン組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールのような保存剤を含み得る。しかし、ワクチンは、実質的に水銀物質を含まない（すなわち５μｇ／ｍｌ未満）、例えばチオメルサールを含まないことが好ましい［４５］。水銀を含まないワクチンがより好ましい。コハク酸α−トコフェロールを、水銀化合物の代わりとして含み得る。保存剤を含まないワクチンが、特に好ましい。
【００９１】
浸透圧を調節するために、ナトリウム塩のような生理学的塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、それは１および２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。存在し得る他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等を含む。
【００９２】
ワクチン組成物は一般的に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇおよび４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間のオスモル濃度を有し、そしてより好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内にある。オスモル濃度は、ワクチン接種によって引き起こされる疼痛に影響を与えないことが以前に報告された［４６］が、それでもこの範囲にオスモル濃度を維持することは好ましい。
【００９３】
ワクチン組成物は、１つまたは複数の緩衝液を含み得る。典型的な緩衝液は、リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液（特に水酸化アルミニウムアジュバントを含む）；またはクエン酸緩衝液を含む。緩衝液は、典型的には５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。
【００９４】
ワクチン組成物のｐＨは、一般的に５．０および８．１の間、そしてより典型的には６．０および８．０の間、例えば６．５および７．５、または７．０および７．８の間である。従って、本発明の過程は、包装の前に、バルクワクチンのｐＨを調節する工程を含み得る。
【００９５】
そのワクチン組成物は、好ましくは無菌である。そのワクチン組成物は、好ましくは非発熱性である、例えば用量あたり＜１ＥＵ（エンドトキシンユニット、標準的な基準）、および好ましくは用量あたり＜０．１ＥＵを含む。そのワクチン組成物は、好ましくはグルテンを含まない。
【００９６】
本発明のワクチン組成物は、特にスプリットまたは表面抗原ワクチンに関して、界面活性剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として知られている）、オクトキシノール（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールのような）、セチルトリメチルアンモニウム臭化物（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウムを含み得る。その界面活性剤は、微量しか存在し得ない。従って、そのワクチンは、それぞれ１ｍｇ／ｍｌ未満のオクトキシノール−１０およびポリソルベート８０を含み得る。他の微量の残留成分は、抗生物質（例えばネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。
【００９７】
ワクチン組成物は、単回免疫のための物質を含み得る、または複数回の免疫のための物質を含み得る（すなわち、「複数回投与」キット）。複数回投与の配合では、保存剤を含むことが好ましい。複数回投与の組成物において、保存剤を含む代替として（またはそれに加えて）、その組成物を、物質を除去するための無菌アダプターを有する容器に入れ得る。
【００９８】
その組成物は、０．１〜１ｍＬ、例えば０．２〜０．８ｍＬ、０．３〜０．７ｍＬ、０．４〜０．６ｍ、または約０．５ｍＬの体積を有し得る。インフルエンザワクチンを、典型的には約０．５ｍｌの投与体積で投与するが、半分の用量（すなわち約０．２５ｍｌ）を小児に投与し得る。
【００９９】
組成物およびキットを、好ましくは２℃および８℃の間で保存する。それらを凍結するべきではない。それらは、理想的には直接光を避けるべきである。
【０１００】
宿主細胞ＤＮＡ
ウイルスのような生物学的産物を細胞系において産生、単離、および／または増殖した場合、ＤＮＡのあらゆる発癌活性を最小限にするために、最終的な組成物中の残留細胞系ＤＮＡの量を最小限にすることが、標準的なやり方である。
【０１０１】
従って、本発明による組成物（特にワクチン組成物）は、用量あたり好ましくは１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満、およびより好ましくは１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含むが、微量の宿主細胞ＤＮＡが存在し得る。
【０１０２】
あらゆる残留宿主細胞ＤＮＡの平均長さは、５００ｂｐ未満、例えば４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満等であることが好ましい。
【０１０３】
混入ＤＮＡを、標準的な精製手順、例えばクロマトグラフィー等を用いて、ワクチン調製の間に除去し得る。残留宿主細胞ＤＮＡの除去を、例えばＤＮＡ分解酵素を用いることによる、ヌクレアーゼ処理によって増強し得る。宿主細胞ＤＮＡの混入を減少させる簡便な方法が、参考文献４７および４８において開示されており、それは２段階の処理を含み、最初はウイルス増殖の間に用い得るＤＮＡ分解酵素（例えばＢｅｎｚｏｎａｓｅ）を、そして次いでビリオン破壊の間に用い得る、陽イオン性界面活性剤（例えばＣＴＡＢ）を用いる。β−プロピオラクトンのようなアルキル化剤による処理も、宿主細胞ＤＮＡを除去するために使用し得、そしてビリオンを不活性化するためにも有利に使用し得る［４９］。
【０１０４】
残留宿主細胞ＤＮＡの量を測定し得る。従って、さらなる局面において、本発明は、宿主細胞で産生された生物学的産物を含む組成物において、残留宿主細胞ＤＮＡの量を決定するために、反復エレメント（特にＬＩＮＥエレメント、ＳＶＡエレメント、または偽遺伝子）またはハウスキーピング遺伝子を使用する方法を提供する。これらの方法は、（ａ）宿主細胞の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅する；（ｂ）その増幅ＤＮＡを用いて、その反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定する；および（ｃ）その反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を用いて、組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡの量を計算する工程を含み得る。
【０１０５】
組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡの量を計算するために、反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数およびＤＮＡの全量の間の相関を知る必要がある。細胞中の全ＤＮＡから反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子を増幅し、その反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定し、そしてその反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数および細胞中のＤＮＡの全量の間の割合を計算することによって、これを決定し得る。
【０１０６】
アジュバント
本発明の組成物は、有利にアジュバントを含み得、それはその組成物を投与された患者において誘発された免疫応答（体液性および／または細胞性）を増強するよう機能し得る。好ましいアジュバントは、水中油型エマルションを含む。様々なそのようなアジュバントが公知であり、そしてそれらは典型的には少なくとも１つの油および少なくとも１つの界面活性剤を含み、その油および界面活性剤は、生物分解性（代謝可能）および生体適合性である。エマルション中の油滴は、一般的に直径５μｍ未満であり、そして理想的にはμｍ未満の直径を有し、これらの小さいサイズは、安定なエマルションを提供するために、マイクロフルイダイザーによって達成される。２２０ｎｍ未満のサイズの液滴が、ろ過滅菌にかけ得るので好ましい。
【０１０７】
そのエマルションは、動物（魚のような）または植物供給源由来のものなど油を含み得る。植物油の供給源は、ナッツ、種子、および穀物を含む。最も一般的に入手可能な、ピーナッツ油、ダイズ油、ココナッツ油、およびオリーブ油が、ナッツ油を例示する。例えば、ホホバ豆から得たホホバオイルを使用し得る。種子油は、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油等を含む。穀物グループにおいて、コーン油が最も容易に入手可能であるが、コムギ、カラスムギ、ライ、コメ、テフ、ライコムギ等のような他の穀物の油も使用し得る。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルを、種子油に天然には存在しないが、ナッツおよび種子油から出発する適切な物質の加水分解、分離、およびエステル化によって調製し得る。哺乳類乳由来の脂肪および油は、代謝可能であり、そして従って本発明の実施において使用し得る。分離、精製、けん化、および動物供給源から純粋な油を得るために必要な他の手段のための手順は、当該分野で周知である。ほとんどの魚は、容易に回収し得る代謝可能な油を含む。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨蝋などの鯨油は、本明細書中で使用し得るいくつかの魚油を例示する。多くの分岐鎖油が、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、そして一般的にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンとして知られている分岐不飽和テルペノイドを含み、それは本明細書中で特に好ましい。スクアレンの飽和アナログであるスクアランも、好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販の供給源から容易に入手可能である、または当該分野で公知の方法によって得ることができる。別の好ましい油は、α−トコフェロールである（下記を参照のこと）。
【０１０８】
油の混合物を使用し得る。
【０１０９】
界面活性剤を、その「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類し得る。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、そしてより好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明を、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーのような、ＤＯＷＦＡＸＴＭの商品名で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；反復するエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得るオクトキシノール（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に目的のものである）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）のようなリン脂質；ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭＮＰシリーズのような、ノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）のような、ラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られている）；およびソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウレートのような、ソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして知られている）を含むがこれに限らない界面活性剤と共に使用し得る。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルションに含めるために好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【０１１０】
界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物を使用し得る。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）のようなポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）のようなオクトキシノールの組み合わせも適切である。別の有用な組み合わせは、ラウレス９ならびにポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
【０１１１】
好ましい界面活性剤の量（重量％）は：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ８０のような）０．０１から１％、特に約０．１％；オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤のような）０．００１から０．１％、特に０．００５から０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９のような）０．１から２０％、好ましくは０．１から１０％、および特に０．１から１％または約０．５％である。
【０１１２】
そのワクチンがスプリットウイルスを含む場合、水相に遊離界面活性剤を含むことが好ましい。遊離界面活性剤が、抗原に対して「スプリット効果」を発揮し、それによって、そうでなければ存在し得る、あらゆる非スプリットビリオンおよび／またはビリオンの凝集を破壊し得るので、これは有利である。これは、スプリットウイルスワクチンの安全性を改善し得る［５０］。
【０１１３】
好ましいエマルションは、＜１μｍ、例えば≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍ、またはより小さい平均液滴サイズを有する。これらの液滴サイズを、マイクロフルイダイゼーションのような技術によって、簡便に達成し得る。
本発明で有用な特定の水中油型エマルションアジュバントは、以下のものを含むがこれに限らない：
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＳｐａｎ８５のμｍ未満のエマルション。体積によるそのエマルションの組成は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のＳｐａｎ８５であり得る。重量に関しては、これらの割合は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のＳｐａｎ８５になる。このアジュバントは「ＭＦ５９」［５１〜５３］として知られており、参考文献５４の第１０章および参考文献５５の第１２章でより詳細に説明される。ＭＦ５９エマルションは、クエン酸イオン、例えば１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を有利に含む。
・スクアレン、トコフェロール、およびポリソルベート８０を含むエマルション。そのエマルションは、リン酸緩衝化生理食塩水を含み得る。これらのエマルションは、体積で、２から１０％のスクアレン、２から１０％のトコフェロール、および０．３から３％のポリソルベート８０を有し得、そして、より安定なエマルションを生じ得るので、スクアレン：トコフェロールの重量比は好ましくは＜１（例えば０．９０）である。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の体積比で、または約１１：５の重量比で存在し得る。従って、３つの成分（スクアレン、トコフェロール、ポリソルベート８０）は、１０６８：１１８６：４８５または約５５：６１：２５の重量比で存在し得る。そのようなエマルションの１つ（「ＡＳ０３」）を、Ｔｗｅｅｎ８０をＰＢＳに溶解して２％の溶液を生じ、次いで９０ｍｌのこの溶液を、（５ｇのＤＬ  αトコフェロールおよび５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合し、次いでその混合物をマイクロフルイダイゼーションすることによって作製し得る。生じたエマルションは、μｍ未満の油滴、例えば１００および２５０ｎｍの間、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径を有し得る。そのエマルションはまた、３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３ｄ  ＭＰＬ）を含み得る。この型の別の有用なエマルションは、ヒト用量あたり、０．５〜１０ｍｇのスクアレン、０．５〜１１ｍｇのトコフェロール、および０．１〜４ｍｇのポリソルベート８０を、例えば上記で議論した割合で含み得る。
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）のエマルション。そのエマルションはまた、３ｄ−ＭＰＬも含み得る（下記を参照のこと）。そのエマルションは、リン酸緩衝液を含み得る。
・ポリソルベート（例えばポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、およびトコフェロール（例えばコハク酸α−トコフェロール）を含むエマルション。そのエマルションは、これら３つの成分を、約７５：１１：１０の質量比で含み得（例えば７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１００μｇ／ｍｌのコハク酸α−トコフェロール）、そしてこれらの濃度は、抗原由来のこれらの成分のあらゆる寄与も含む。そのエマルションはまた、スクアレンを含み得る。そのエマルションはまた、３ｄ−ＭＰＬを含み得る（下記を参照のこと）。その水相は、リン酸緩衝液を含み得る。
・スクアレン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭＬ１２１」）のエマルション。そのエマルションを、リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４中に処方し得る。このエマルションは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、そして「ＳＡＦ−１」アジュバント［５６］においてスレオニル−ＭＤＰと共に使用された（０．０５〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアレン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。それをまた、「ＡＦ」アジュバント［５７］のように、Ｔｈｒ−ＭＤＰ無しで使用し得る（５％のスクアレン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。マイクロ流動化が好ましい。
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）、および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンモノオレエートまたは「Ｓｐａｎ８０」のようなソルビタンエステルまたはマンニドエステル）を含むエマルション。そのエマルションは、好ましくは熱可逆性である、および／または少なくとも９０％の油滴が（体積で）、２００未満のサイズを有する［５８］。そのエマルションはまた、１つまたは複数のアルジトール；凍結保護剤（例えばドデシルマルトシドおよび／またはスクロースのような糖）；および／またはアルキルポリグリコシドを含み得る。そのエマルションは、ＴＲＬ４アゴニスト［５９］を含み得る。そのようなエマルションを、凍結乾燥し得る。
・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅ［６０］のエマルション。アジュバントワクチンにおけるこれらの成分の最終的な濃度（重量）は、５％のスクアレン、４％のポロキサマー１０５（ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール）、および２％のＡｂｉｌ−Ｃａｒｅ８５（Ｂｉｓ−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルション。参考文献６１で記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。μｍ未満の液滴サイズが有利である。
・非代謝性油（軽油のような）および少なくとも１つの界面活性剤（レシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８０のような）のμｍ未満の水中油型エマルション。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性コンジュゲート（参考文献６２に記載されており、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、脂肪族アミンをデスアシルサポニンに加えることによって産生されるＧＰＩ−０１００のような）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物、および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンのような添加物を含み得る。
・サポニン（例えばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えばコレステロール）が、らせん状ミセル［６３］として会合しているエマルション。
・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤を含むエマルション（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）［６４］。
・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤を含むエマルション（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）［６４］。
【０１１４】
いくつかの実施態様において、エマルションを、送達時に、その場で抗原と混合し得、そして従ってアジュバントおよび抗原は、包装された、または分配されたワクチンにおいて、使用時の最終的な処方に備えて、別々に維持され得る。他の実施態様において、製造の間に、エマルションを抗原と混合し、そして従って、その組成物は、液体アジュバント形式で包装される。その抗原は一般的に、水性形式であり、その結果、そのワクチンを最終的に２つの液体を混合することによって調製する。混合するための２つの液体の体積比は、変動し得る（例えば５：１および１：５の間）が、一般的に約１：１である。成分の濃度が特定のエマルションの上記の説明で与えられる場合、これらの濃度は、典型的には未希釈の組成物のものであり、そして従って抗原溶液と混合した後の濃度は減少する。
【０１１５】
ワクチン組成物の包装
本発明の組成物（またはキット成分）のために適切な容器は、バイアル、シリンジ（例えば使い捨てシリンジ）、鼻腔内スプレー等を含む。これらの容器は、無菌であるべきである。
【０１１６】
組成物／成分がバイアル中に有る場合、そのバイアルは好ましくはガラスまたはプラスチック材料製である。そのバイアルを、好ましくは、組成物を加える前に滅菌する。ラテックス感受性の患者の問題を回避するために、好ましくはバイアルを、ラテックスを含まない栓で密封し、そして全ての包装材料においてラテックスが存在しないのが好ましい。そのバイアルは、単回投与のワクチンを含み得る、またはそれは１回より多い投与（「複数回投与」バイアル）、例えば１０回の投与を含み得る。好ましいバイアルは、無色のガラス製である。
【０１１７】
バイアルは、充填済みのシリンジをそのキャップに挿入し得、シリンジの内容物をバイアル中に放出し得（例えばそこで凍結乾燥物質を再構成するために）、そしてバイアルの内容物をシリンジに戻し得るように適合させた、キャップ（例えばＬｕｅｒロック）を有し得る。バイアルからシリンジを除去した後、次いで針をつけ得、そしてその組成物を患者に投与し得る。そのキャップは、好ましくはシールまたはカバーの内側にあり、その結果、キャップに接近し得る前にそのシールまたはカバーを除去しなくてはならない。バイアルは、特に複数回投与バイアルに関して、その内容物の無菌的な除去を可能にするキャップを有し得る。
【０１１８】
成分がシリンジに包装される場合、そのシリンジは、それに取り付けられた針を有し得る。針が取り付けられていない場合、組み立ておよび使用のために分離した針をシリンジと共に供給し得る。そのような針は、鞘付きであり得る。安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージ、および５／８インチ２５ゲージ針が典型的である。記録を促進するために、シリンジを、ロット番号、インフルエンザシーズン、および内容物の有効期限を印字し得る、剥離ラベルと共に提供し得る。シリンジのプランジャーは、好ましくは、プランジャーが吸引の間に偶発的に取れることを防止するために、ストッパーを有する。シリンジは、ラテックスゴムのキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨てのシリンジは、単回投与のワクチンを含む。そのシリンジは一般的に、針を取り付ける前に先端を密封するための先端キャップを有し、そしてその先端キャップは、好ましくはブチルゴム製である。シリンジおよび針が別々に包装されていない場合、その針は好ましくはブチルゴムのシールドが装着されている。好ましいシリンジは、商品名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭで販売されているものである。
【０１１９】
例えば、小児への送達を促進するために、容器に、半分の用量の体積を示す印を付け得る。例えば、０．５ｍｌの用量を含むシリンジは、０．２５ｍｌの体積を示す印を有し得る。
【０１２０】
ガラス容器（例えばシリンジまたはバイアル）を使用する場合、ソーダ石灰ガラスではなくホウケイ酸ガラスでできた容器を有することが好ましい。
【０１２１】
キットまたは組成物を、ワクチンの詳細、例えば投与の説明書、ワクチン中の抗原の詳細等を含むリーフレットと共に包装し得る（例えば同じ箱に）。その説明書はまた、例えばワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合に、アドレナリン溶液を容易に利用可能なようにしておく等の警告を含み得る。
【０１２２】
処置の方法、およびワクチンの投与
本発明は、本発明によって製造されたワクチンを提供する。これらのワクチン組成物は、ヒトまたはブタのような非ヒト動物被験体への投与に適切であり、そして本発明は、本発明の組成物をその被験体に投与する工程を含む、被験体において免疫反応を引き起こす方法を提供する。本発明はまた、医薬として使用するための本発明の組成物を提供し、そして被験体において免疫反応を引き起こすための医薬の製造のために本発明の組成物を使用することを提供する。
【０１２３】
これらの方法および使用によって引き起こされた免疫反応は、一般的に抗体反応、好ましくは保護的抗体反応を含む。インフルエンザウイルスのワクチン接種後の抗体反応、中和能力および保護を評価する方法は、当該分野で周知である。ヒト研究は、ヒトインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体力価が、保護と相関することを示した（約３０〜４０の血清サンプル赤血球凝集素−阻害力価は、相同的なウイルスによる感染から約５０％の保護を与える）［６５］。抗体反応を、典型的には、赤血球凝集阻害によって、マイクロ中和試験によって、一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）によって、および／または一元放射状拡散溶血反応（ＳＲＨ）によって測定する。これらのアッセイ技術は、当該分野で周知である。
【０１２４】
本発明の組成物を、様々な方法で投与し得る。最も好ましい免疫化経路は、筋肉内注射による（例えば腕または脚）が、他の利用可能な経路は、皮下注射、鼻腔内［６６〜６８］、経口［６９］、皮内［７０、７１］、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［７２］等を含む。
【０１２５】
本発明によって調製されたワクチンを、小児および成人の両方を処置するために使用し得る。インフルエンザワクチンは現在、６ヶ月の年齢から、小児および成人の免疫化における使用に推奨される。従って、ヒトの被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。そのワクチンを投与する好ましい被験体は、高齢者（例えば≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは≧６５歳）、若年（例えば≦５歳）、入院被験体、医療従事者、軍隊および軍人、妊娠中の女性、慢性的な病気、免疫不全被験体、ワクチンを投与される前７日以内に抗ウイルス化合物（例えばオセルタミビルまたはザナミビル化合物；下記を参照のこと）を投与されている被験体、卵アレルギーを有する人々、および海外旅行者である。しかし、そのワクチンはこれらのグループ単独に適切ではなく、そして集団においてより一般的に使用し得る。パンデミック株に関して、全ての年齢グループへの投与が好ましい。
【０１２６】
本発明の好ましい組成物は、有効性のＣＰＭＰ基準の１、２、または３つを満足させる。成人（１８〜６０歳）において、これらの基準は：（１）≧７０％の抗体保有率；（２）≧４０％の抗体陽転；および／または（３）≧２．５倍のＧＭＴ増加である。高齢者（＞６０歳）において、これらの基準は：（１）≧６０％の抗体保有率；（２）≧３０％の抗体陽転；および／または（３）≧２倍のＧＭＴ増加である。これらの基準は、少なくとも５０人の患者による非盲検試験に基づく。
【０１２７】
処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールにより得る。一次免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールにおいて、複数回投与を使用し得る。複数回投与スケジュールにおいて、様々な用量を、同じまたは異なる経路によって、例えば非経口一次追加免疫および粘膜追加免疫、粘膜一次追加免疫および非経口追加免疫等によって投与し得る。１回より多くの投与（典型的には２回投与）が、免疫学的にナイーブな患者、例えば前にインフルエンザワクチンを投与されたことのない人々において、または新しいＨＡサブタイプに対するワクチン接種のために（パンデミックの発生におけるように）、特に有用である。複数回投与は、典型的には、少なくとも１週あけて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間等）投与する。
【０１２８】
本発明によって産生されたワクチンを、他のワクチンと実質的に同じ時に（例えば医療専門家またはワクチン接種センターへの同じ受診または訪問の間に）、例えば麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、コンジュゲート化Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型ワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌コンジュゲートワクチン（４価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチンのような）、呼吸器合抱体ウイルスワクチン、肺炎球菌コンジュゲートワクチン等と実質的に同時に、患者に投与し得る。高齢者の患者において、肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時に投与することが特に有用である。
【０１２９】
同様に、本発明のワクチンを、抗ウイルス化合物、および特にインフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物（例えばオセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同時に（例えば医療専門家への同じ受診または訪問の間に）、患者に投与し得る。これらの抗ウイルス剤は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸のような、ノイラミニダーゼ阻害剤を含み、そのエステル（例えばエチルエステル）およびその塩（例えばリン酸塩）を含む。好ましい抗ウイルス薬は、リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵＴＭ）としても知られている、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、エチルエステル、ホスフェート（１：１）である。
【０１３０】
一般
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「〜から成る」を包含し、例えばＸを「含む」組成物は、排他的にＸから成り得る、またはさらに何か、例えばＸ＋Ｙを含み得る。
【０１３１】
「実質的に」という用語は、「完全に」を排除しない、例えばＹを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含み得ない。必要な場合、「実質的に」という用語を、本発明の定義から省略し得る。
【０１３２】
数値ｘに関連して「約」という用語は、任意選択であり、そして例えばｘ±１０％を意味する。
【０１３３】
明確に述べなければ、２つまたはそれ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、いかなる特定の混合の順番も必要でない。従って、成分を、あらゆる順番で混合し得る。３つの成分が存在する場合、２つの成分をお互いに組み合わせ、そして次いでその組み合わせを３番目の成分と組み合わせる等し得る。
【０１３４】
異なる工程を、実質的に同時に行い得る、または別々に行い得る。それらを同じ場所で、または異なる場所で、異なる国でさえ行い得る（例えばワクチンを、ある場所で調製し得、そこはＤＮＡ安全係数を決定する場所とは異なる、および／またはそれをある人が調製し、その人は安全係数を決定する人とは異なる）。
【０１３５】
動物（および特にウシ）材料を、細胞の培養において使用する場合、それらを、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、および特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得るべきである。全体として、動物由来材料が全く存在しない中で細胞を培養することが好ましい。
【０１３６】
（配列リストの簡単な説明）
配列番号１は、ＬＩＮＥ  ＯＲＦ２の断片を増幅するために使用するフォワードプライマーである。
配列番号２は、ＬＩＮＥ  ＯＲＦ２の断片を増幅するために使用するリバースプライマーである。
配列番号３は、ＬＩＮＥ−ＯＲＦ２の２０７８ｂｐの断片である。
配列番号４は、ＳＩＮＥエレメントの、中央のＡリッチ領域である。
【発明を実施するための形態】
【０１３７】
ＬＩＮＥ断片の増幅
サンプル中のＬＩＮＥ断片を決定するためのＰＣＲアッセイに関して、プライマー配列ＡＣＴＧＴＡＧＴＧＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧ（配列番号１）およびＧＧＣＧＴＡＴＡＣＣＴＧＴＴＣＡＴＡＡＴ（配列番号２）を使用し、それはＯＲＦ２（配列番号３）の１００２ｂｐの断片を増幅する。
【０１３８】
１０００ｂｐの断片サイズは、１９２５ｂｐと報告されたヒト癌遺伝子の平均サイズの半分である［７３］。Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓという会社の、ロングレンジポリメラーゼを、ポリメラーゼとして使用する。９４℃で２分の最初の変性工程、続く３５サイクルのＤＮＡ増幅（９４℃で３０秒；５３℃で３０秒、７２℃で１分）、および７２℃で４分の最終的な伸長工程を用いて、ＬＩＮＥ断片を増幅する。
【０１３９】
ＰＣＲ産物の希釈系列を産生し、そしてそのＰＣＲ産物を、アガロースゲルで分析する。その結果の評価を、エンドポイント評価によって行う。希釈系列において、最初の陰性ＰＣＲシグナルを、計算のために取る。モノバルクマトリックス中の１００２ｂｐの断片の検出限界（ＤＬ）、およびＭＤＣＫゲノム中の癌遺伝子に対するＬＩＮＥ断片の割合（Ｒ）を、次のサンプル中の癌遺伝子の計算に組み込む。
【０１４０】
９つのモノバルクを、ＰＣＲ法で、ｔｗｏ−ｆｏｌｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎで測定した。希釈系列で最初の陰性ＰＣＲシグナル（ＰＣＲ（−））を、計算のために取る。この希釈係数、モノバルクマトリックス中の１００２ｂｐの断片の検出限界およびＬＩＮＥあたりの癌遺伝子の割合によって、モノバルク中の癌遺伝子の濃度を、以下のように計算し得る：
【数１９】
2015526062.tif 000020
式中、「ＤＬ」は、所定の条件下における、特定の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の検出限界であり（反復エレメント／ｍＬ）、そして「ＰＣＲ（−）」は、最初の陰性ＰＣＲシグナルの希釈係数を示す。その結果は以下の通りである：
【表１】
2015526062.tif 000021
【０１４１】
ＤＮＡ安全係数の決定
ＤＮＡ安全係数を１０ｎｇのＤＮＡまでスケールアップする
ＤＮＡ安全係数を、以下の式を用いて、ワクチン用量中の最大許容ＤＮＡ含有量に関して計算する：
【数２０】
2015526062.tif 000022
式中、Ｎｃｒｉｔｉｃａｌ：腫瘍を産生するために必要な用量あたりの癌遺伝子の数［癌遺伝子］、Ｃｏｎｃｏ：モノバルク中の癌遺伝子の濃度［癌遺伝子／ｍＬ］、ｃＤＮＡ：閾値によるモノバルク中のＤＮＡ濃度［ｎｇ／ｍＬ］
【０１４２】
腫瘍を産生するための必要な癌遺伝子の数は、１．６×１０９であり、そしてモノバルク中の癌遺伝子の濃度は、表１によってＰＣＲにより与えられる。従って、Ｈ１Ｎ１株に関する計算の例は：
【数２１】
2015526062.tif 000023
【０１４３】
モノバルクワクチンの安全係数を、表２に示す：
【表２】
2015526062.tif 000024
【０１４４】
ＤＮＡ安全係数を、１０ｎｇのＤＮＡまでスケールアップする
ＤＮＡ安全係数の２番目の考慮する点は、１回用量の体積に関連する。インフルエンザワクチンの場合、１回用量は、通常０．５ｍＬと同等である。
【０１４５】
ＤＮＡ安全係数は、以下
【数２２】
2015526062.tif 000025
によって計算され、
式中、Ｎｃｒｉｔｉｃａｌ：腫瘍を産生するために必要な用量あたりの癌遺伝子の数［癌遺伝子］
Ｃｏｎｃｏ：モノバルク中の癌遺伝子の濃度［癌遺伝子／ｍＬ］
【０１４６】
腫瘍を産生するための必要な癌遺伝子の数は、１．６×１０９であり、そしてモノバルク中の癌遺伝子の濃度は、ＰＣＲによって与えられる。従って、Ｈ１Ｎ１株に関する計算の例は以下である：
【数２３】
2015526062.tif 000026
【０１４７】
モノバルクワクチンの安全係数を、表３に示す：
【表３】
2015526062.tif 000027
【０１４８】
ＤＮＡ安全係数を、用量あたりの活性成分（ＨＡ）までスケールアップする
このＤＮＡ安全係数の考慮する点は、モノバルクのＨＡ含有量に関連する。１つの最終的なワクチン用量は、５０μｇのＨＡの全量を含む。
【０１４９】
ＤＮＡ安全係数を、以下によって計算する
【数２４】
2015526062.tif 000028
式中、Ｎｃｒｉｔｉｃａｌ：腫瘍を産生するために必要な用量あたりの癌遺伝子の数［癌遺伝子］
Ｃｏｎｃｏ：モノバルク中の癌遺伝子の濃度［癌遺伝子／ｍＬ］
ｃＨＡ：モノバルク中のＨＡ濃度（μｇ／ｍＬ）
【０１５０】
腫瘍を産生するために必要な癌遺伝子の数は、１．６×１０９であり、そしてモノバルク中の癌遺伝子の濃度は、ＰＣＲによって与えられる。ＨＡ抗原の量は、ＳＲＩＤによって２４５μｇ／ｍＬと決定される。
【０１５１】
従って、Ｈ１Ｎ１株の計算の例は、以下である：
【数２５】
2015526062.tif 000029
モノバルクワクチンの安全係数を、表４に示す。
【表４】
2015526062.tif 000030
【０１５２】
本発明を、実施例のみによって説明し、そして本発明の範囲および精神の範囲内に留まりながら、改変を行い得ることが理解される。
【表５−１】
2015526062.tif 000031
【表５−２】
2015526062.tif 000032
【表５−３】
2015526062.tif 000033
【表６】
2015526062.tif 000034
【配列表】
2015526062000001.app
【国際調査報告】
2015526062.tif 000046
2015526062.tif 000047
2015526062.tif 000048