(57)【要約】  ネオニコチノイドおよびピメトロジンに対する動植物害虫の抵抗性の識別のための、迅速、簡便かつ高度に感度の高い検出系が本明細書中に記載される。さらに、有害昆虫、とりわけ抵抗性の害虫を防除する方法が提供される。【選択図】図１
2015520381.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
ａ．有害昆虫の検体を得ること、
ｂ．ＣＹＰファミリーから選択される抵抗性マーカーの抗体に基づく検出を行うこと、
ｃ．抵抗性マーカーが検出された場合、カルバメート系、有機リン酸エステル系、シクロジエン有機塩素系、ピレスロイド系、スルホキシイミン系、ピリプロキシフェン、ジアフェンチウロン、ベンゾイル尿素系、ブプロフェジン、ＭＥＴＩ、テトロン酸およびテトラミン酸系、ブテノリド系、ジアミド系、ピリフルキナゾンよりなるリストＡ）から殺虫剤を選択すること、
ｄ．抵抗性マーカーが存在しない場合、リストＡ）またはイミダクロプリド、チアクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ニテンピラムおよびジノテフラン、ピメトロジンよりなるリストＢ）のいずれかから殺虫剤を選択すること
を含む、有害昆虫を防除する方法。
【請求項２】
有害昆虫がベミシア属、好ましくはベミシア・タバキ種に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抵抗性マーカーがＣＹＰ  ６ＣＭ１である、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
リストＡ）がスピロテトラマト、スピロメシフェンおよびフルピラジフロンよりなる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
リストＡ）がスピロテトラマトおよびスピロメシフェンよりなる、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
以下の構成成分：
ａ．可溶化溶液
ｂ．チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼに特異的な抗体
ｃ．ステップｂの抗体の検出系
を含む、特異的な殺虫剤に対する有害昆虫種の抵抗性の決定のためのキット。
【請求項７】
コナジラミにおける抵抗性管理のためのＣＹＰ  ６ＣＭ１検出の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、昆虫における殺虫剤抵抗性を容易に識別するための検出キットに関する。本キットは、数匹の昆虫を含む検体サイズを使用した抵抗性マーカーの素早くかつ簡単な識別を可能にすることから、圃場における抵抗性の検出にとりわけ適している。さらに、本発明は、ある種の殺虫剤に抵抗性である昆虫において抵抗性を管理する方法に関する。本方法およびキットは、とりわけワタコナジラミ、ベミシア・タバキ（Ｂｅｍｉｓｉａ  ｔａｂａｃｉ）（半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）：コナジラミ科（Ａｌｅｙｒｏｄｉｄａｅ））に適している。
【背景技術】
【０００２】
ワタコナジラミ（ベミシア・タバキ）におけるネオニコチノイド殺虫剤のイミダクロプリドに対する抵抗性は、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ６ＣＭ１の高い発現レベルと関連していることが公知である（Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３８，（２００８），６３４−６４４）。
【０００３】
問題
農業において重要性が高まっている問題は、経済的な関連のある種々の有害昆虫において広く用いられるある種の殺虫剤に対する抵抗性の発達である（Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇ  Ｓｃｉ  ２００９；６５：３１３−３２２）。殺虫剤に対するある一定のレベルの抵抗性を発達させた有害昆虫へのこれらの殺虫剤の施用は、作物の損失をもたらし、これらの害虫集団における付加的な抵抗性の増進に対するさらなる選択圧を加える。
【０００４】
コナジラミ害虫を防除するのに好ましい殺虫剤の１つは、ネオニコチノイド殺虫剤である。ネオニコチノイド殺虫剤は、以下の商業化された活性成分：イミダクロプリド、チアクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ニテンピラムおよびジノテフランを含む。それらはまた、殺虫剤抵抗性対策委員会（Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＲＡＣ；ｗｗｗ．ｉｒａｃ−ｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ）によるＩＲＡＣ作用機構分類（ＭｏＡ分類）４Ａとも呼ばれる。
【０００５】
農業者はコナジラミ害虫をネオニコチノイド化学で好ましく処理するであろうが、彼らは、これらの活性成分に対して少なくとも何らかの抵抗性を発達させたますます多くの昆虫集団に直面する。異なる化学または異なるＩＲＡＣ  ＭｏＡ分類からの他の殺虫剤への完全な切り替えは、おそらく、同様にこれらの殺虫剤に抵抗性である害虫集団の発達をもたらすであろう。加えて、他の化学は、その殺虫活性が劣っている可能性がある。
【０００６】
特異的な殺虫剤に対する害虫の抵抗性を標準的に決定するには、現在、実験室環境を必要とする。圃場または温室条件下では、農業者は殺虫剤を試用し、次いでそれが目的の特定害虫を防除できるかを観察しなければならないであろう。しかしながら、抵抗性の昆虫は作物の少なくとも一部をとうに破壊してしまうため、結果が得られるのは遅すぎるであろう。加えて、抵抗性管理を既に必要とする弱い抵抗性は、これらの条件下で視認できない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３８，（２００８），６３４−６４４
【非特許文献２】Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇ  Ｓｃｉ  ２００９；６５：３１３−３２２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、農業者が圃場においてすぐに作業することができる使いやすい系を持つことは実用上大いに重要であって、これはさらに高い感度および信頼性を達成し、農業者に結果を数分で提供するであろうから、農業者は抵抗性メカニズムに影響されない異なる作用機構分類を輪番で使用することに基づいて、適切な抵抗性管理戦略を実行することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
原理
驚くべきことに、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、とりわけＣＹＰ６ＣＭ１のレベルは、使いやすい抗体検出系との組み合わせで、ネオニコチノイドおよびピメトロジン化学に対する昆虫、とりわけベミシア・タバキの抵抗性を速く、信頼でき、かつ非常に感度良く検出することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図1は、ＥＬＩＳＡアッセイを通じた、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ、好ましくはＣＹＰ６ＣＭ１の免疫学的検出を示す図である。
【図２】図２は、検出キットの利用により、一組のベミシア・タバキ系統を試験し、感受性／抵抗性を実験室内で検出した図である。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡに基づくストリップ（ラテラルフロー）による検出系のデザインを示す図である。
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡに基づくストリップ（ラテラルフロー）による検出系のデザインを示す図である。
【図５】図５は、ストリップ上でＥＬＩＳＡに基づいて抵抗性マーカーを検出するための３つの異なる構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
テストキット（図１もまた参照のこと）
試験の原理は、好ましくはＥＬＩＳＡアッセイを通じた、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ、好ましくはＣＹＰ６ＣＭ１の免疫学的検出である。Ｐ４５０モノオキシゲナーゼタンパク質は、１の、または好ましくは２の異なるポリクローナル抗体（溶液Ａ１およびＡ２）により認識される。とりわけ好ましいのは、ビオチンで標識された抗体およびジゴキシゲニンで標識された追加の抗体の組み合わせである。Ｐ４５０抗原の存在下で、ビオチン化抗体は、ストレプトアビジン−金溶液（溶液Ｂ）に付加的に結合して複合体を形成し、これが今度はテストストリップ上にラインとしてスポットされた抗ジゴキシゲニン抗体により検出される。
【００１２】
キットは、典型的に、３つの溶液（Ａ１、Ａ２およびＢ）、使い捨てのホモジナイゼーションバイアル、使い捨てのホモジナイゼーションペッスルおよび密封されたテストストリップを伴って届けられる。
【００１３】
ネオニコチノイドまたはピメトロジン抵抗性の存在は、典型的に、以下の試験手順中に記載される１回のコナジラミ試験において１〜２０匹のコナジラミを処理することにより観察することができる。最適なのは、４匹前後のコナジラミであり；２０匹を超える虫はシグナルの消失をもたらすであろうから、それ故により好ましくない。
【００１４】
コナジラミは、水および１〜１０滴の洗剤（商用の食器洗い用洗剤またはキットが供給する１０％  Ｔｗｅｅｎ２０のいずれかを用いる）を満たした水ボウル、例として植物の受け皿（理想的には濃い色のもの）の中に収集され得る。寄生した植物からボウル内へとコナジラミを軽くたたいて落とすことでコナジラミが収集され、液体の表面上に浮く。ホモジナイゼーションペッスルをボウル内に浸すと、コナジラミはその表面にくっつく。
【００１５】
一般的な試験手順は、１〜２滴の各溶液Ａ１およびＡ２（各々、十分な量の対応するビオチンまたはジゴキシゲニン化された標識抗体をリン酸バッファーおよび洗剤中に有する）をホモジナイゼーションバイアル内に加えることを含む（図１、絵１）。次に、コナジラミをボウルの水面から上記のように「釣る」。１〜２０匹のコナジラミがその先端にくっついたペッスルを、液体（前もって滴下した溶液Ａ１およびＡ２）が入ったホモジナイゼーションバイアル内に挿入し、コナジラミをホモジナイズするために慎重に回転させる（図１、絵２）。溶液が黄色がかって濁ってきたら、ホモジナイゼーションが完了する。溶液は、最終的な結果を変えることなく次のステップのためにすぐに用いることができる；しかしながら、１〜５分のインキュベーション時間は最終的なシグナルを増加させる。
【００１６】
ホモジナイゼーション後、２滴の溶液Ｂ（リン酸バッファーおよび洗剤中のストレプトアビジン−金の液体を含有する）をバイアルに加え、バイアルを３〜４回反転させることにより、結果として得られた溶液を穏やかに混合する（図１、絵３）。再び、次のステップに進む前に１〜５分待機することでシグナルは増加するが、全体的な結果は変わらない。
【００１７】
抵抗性検出のため、全溶液をバイアルからテストストリップ（コナジラミキットと共に届けられるテストストリップは密封されており、初めに包装を取り除かなくてはならない）のサンプルキャビティ内に注ぐ（図１、絵４）。液体がストリップの上の方に流れると、遅くとも５分後に、（ハウジング上にマークされた「Ｃ」の位置に）赤色のコントロールラインが現れる。このラインが存在する場合のみ、ストリップは適切に動作した。
【００１８】
コントロールラインが存在するが（ハウジング上にマークされた「Ｔ」の位置に）追加のテストラインがない場合、試験されたベミシア・タバキ集団は、ＣＹＰ６ＣＭ１の過剰発現に基づくネオニコチノイドまたはピメトロジンに対する抵抗性はない。
【００１９】
「Ｔ」（図１）において明瞭なラインが視認できる場合、集団はネオニコチノイド（およびピメトロジン）抵抗性であり、それらの集団を防除するために異なる作用機構分類の別の活性成分を施用しなければならない。
【００２０】
抵抗性マーカーの検出は、典型的に、任意の抗体または抗体から派生する検出系を使用して行うことができる。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体もしくは１より多いモノクローナル抗体の組み合わせのいずれかであることができる。あるいは、例としてアプタマーといった任意の他の分子の高アフィニティー系を、本発明を行うのに用いることができる。好ましくは、ポリクローナル抗体が用いられる。好ましくは、１より多い抗体の組み合わせが検出のために用いられる。
【００２１】
抵抗性マーカー−抗体複合体の検出は、典型的に、例としてジゴキシゲニン検出系またはビオチン−ストレプトアビジン系といった、適度に簡便かつ素早いシグナル生成を可能にする任意の抗体検出系を使用して行うことができる。他の好適な検出系は、プラズモン共鳴原理に基づくものである。好ましくは、ジゴキシゲニンおよびビオチン化された抗体の組み合わせが好ましい。ＥＬＩＳＡに基づくストリップ（ラテラルフロー）による検出系のデザインが図３および４中に例示される。
【００２２】
説明の目的のため、ストリップ上でＥＬＩＳＡに基づいて抵抗性マーカーを検出するための３つの異なる構成が図５中に表示される。好ましくは抗体−抵抗性マーカーコンジュゲートの検出は、ラテラルフロー分析により行われる。
【００２３】
害虫防除の方法
本発明のさらなる実施形態は、有害昆虫、好ましくは抵抗性系統を防除する方法であり、これは、以下のステップ：
ａ．有害昆虫の検体を得ること、
ｂ．ＣＹＰファミリーから選択される抵抗性マーカーの抗体に基づく検出を、好ましくはＥＬＩＳＡアッセイによって行うこと、
ｃ．抵抗性マーカーが検出された場合、カルバメート系、有機リン酸エステル系、シクロジエン有機塩素系、ピレスロイド系、スルホキシイミン系、ピリプロキシフェン、ジアフェンチウロン、ベンゾイル尿素系、ブプロフェジン、ＭＥＴＩ、テトロン酸およびテトラミン酸系、ブテノリド系、ジアミド系、ピリフルキナゾンよりなるリストＡ）から殺虫剤を選択すること、
ｄ．抵抗性マーカーが存在しない場合、リストＡ）またはイミダクロプリド、チアクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ニテンピラムおよびジノテフラン、ピメトロジンよりなるリストＢ）のいずれかから殺虫剤を選択すること
を含む。
【００２４】
カルバメート系、有機リン酸エステル系、シクロジエン有機塩素系、ピレスロイド系、スルホキシイミン系、ピリプロキシフェン、ジアフェンチウロン、ベンゾイル尿素系、ブプロフェジン、ＭＥＴＩ、テトロン酸およびテトラミン酸系、ジアミド系の分類に属する、本発明を実施するためのリストＡ）の好ましい殺虫剤は：
カルバメート系：アラニカルブ（Ｉ１）、アルジカルブ（Ｉ２）、ベンジオカルブ（Ｉ３）、ベンフラカルブ（Ｉ４）、ブトカルボキシム（Ｉ５）、ブトキシカルボキシム（Ｉ６）、カルバリル（Ｉ７）、カルボフラン（Ｉ８）、カルボスルファン（Ｉ９）、エチオフェンカルブ（Ｉ１０）、フェノブカルブ（Ｉ１１）、ホルメタネート（Ｉ１２）、フラチオカルブ（Ｉ１３）、イソプロカルブ（Ｉ１４）、メチオカルブ（Ｉ１５）、メソミル（Ｉ１６）、メトルカルブ（Ｉ１７）、オキサミル（Ｉ１８）、ピリミカルブ（Ｉ１９）、プロポキスル（Ｉ２０）、チオジカルブ（Ｉ２１）、チオファノックス（Ｉ２２）、トリアザメート（Ｉ２３）、トリメタカルブ（Ｉ２４）、ＸＭＣ（Ｉ２５）およびキシリルカルブ（Ｉ２６）；
有機リン酸エステル系：アセフェート（Ｉ２７）、アザメチホス（Ｉ２８）、アジンホス−エチル（Ｉ２９）、アジンホス−メチル（Ｉ３０）、カズサホス（Ｉ３１）、クロルエトキシホス（Ｉ３２）、クロルフェンビンホス（Ｉ３３）、クロルメホス（Ｉ３４）、クロルピリホス（Ｉ３５）、クロルピリホス−メチル（Ｉ３６）、クマホス（Ｉ３７）、シアノホス（Ｉ３８）、デメトン−Ｓ−メチル（Ｉ３９）、ダイアジノン（Ｉ４０）、ジクロルボス／ＤＤＶＰ（Ｉ４１）、ジクロトホス（Ｉ４２）、ジメトエート（Ｉ４３）、ジメチルビンホス（Ｉ４４）、ジスルホトン（Ｉ４５）、ＥＰＮ（Ｉ４６）、エチオン（Ｉ４７）、エトプロホス（Ｉ４８）、ファムフール（Ｉ４９）、フェナミホス（Ｉ５０）、フェニトロチオン（Ｉ５１）、フェンチオン（Ｉ５２）、ホスチアゼート（Ｉ５３）、ヘプテノホス（Ｉ５４）、イミシアホス（Ｉ５５）、イソフェンホス（Ｉ５６）、イソプロピル  Ｏ−（メトキシアミノチオ−ホスホリル）サリチレート（Ｉ５７）、イソキサチオン（Ｉ５８）、マラチオン（Ｉ５９）、メカルバム（Ｉ６０）、メタミドホス（Ｉ６１）、メチダチオン（Ｉ６２）、メビンホス（Ｉ６３）、モノクロトホス（Ｉ６４）、ナレド（Ｉ６５）、オメトエート（Ｉ６６）、オキシデメトン−メチル（Ｉ６７）、パラチオン（Ｉ６８）、パラチオン−メチル（Ｉ６９）、フェントエート（Ｉ７０）、ホレート（Ｉ７１）、ホサロン（Ｉ７２）、ホスメット（Ｉ７３）、ホスファミドン（Ｉ７４）、ホキシム（Ｉ７５）、ピリミホス−メチル（Ｉ７６）、プロフェノホス（Ｉ７７）、プロペタムホス（Ｉ７８）、プロチオホス（Ｉ７９）、ピラクロホス（Ｉ８０）、ピリダフェンチオン（Ｉ８１）、キナルホス（Ｉ８２）、スルホテップ（Ｉ８３）、テブピリムホス（Ｉ８４）、テメホス（Ｉ８５）、テルブホス（Ｉ８６）、テトラクロルビンホス（Ｉ８７）、チオメトン（Ｉ８８）、トリアゾホス（Ｉ８９）、トリクロルホン（Ｉ９０）およびバミドチオン（Ｉ９１）；
シクロジエン有機塩素系：クロルデン（Ｉ９２）およびエンドスルファン（Ｉ９３）；
ピレスロイド系：アクリナトリン（Ｉ９６）、アレトリン（Ｉ９７）、ｄ−ｃｉｓ−ｔｒａｎｓアレトリン（Ｉ９８）、ｄ−ｔｒａｎｓアレトリン（Ｉ９９）、ビフェントリン（Ｉ１００）、ビオアレトリン（Ｉ１０１）、ビオアレトリン  Ｓ−シクロペンテニル異性体（Ｉ１０２）、ビオレスメトリン（Ｉ１０３）、シクロプロトリン（Ｉ１０４）、シフルトリン（Ｉ１０５）、ベータ−シフルトリン（Ｉ１０６）、シハロトリン（Ｉ１０７）、ラムダ−シハロトリン（Ｉ１０８）、ガンマ−シハロトリン（Ｉ１０９）、シペルメトリン（Ｉ１１０）、アルファ−シペルメトリン（Ｉ１１１）、ベータ−シぺルメトリン（Ｉ１１２）、シータ−シペルメトリン（Ｉ１１３）、ゼータ−シペルメトリン（Ｉ１１４）、シフェノトリン［（１Ｒ）−ｔｒａｎｓ異性体］（Ｉ１１５）、デルタメトリン（Ｉ１１６）、エムペントリン［（ＥＺ）−（１Ｒ）異性体）（Ｉ１１７）、エスフェンバレレート（Ｉ１１８）、エトフェンプロックス（Ｉ１１９）、フェンプロパトリン（Ｉ１２０）、フェンバレレート（Ｉ１２１）、フルシトリネート（Ｉ１２２）、フルメトリン（Ｉ１２３）、タウ−フルバリネート（Ｉ１２４）、ハルフェンプロックス（Ｉ１２５）、イミプロトリン（Ｉ１２６）、カデトリン（Ｉ１２７）、ペルメトリン（Ｉ１２８）、フェノトリン［（１Ｒ）−ｔｒａｎｓ異性体）（Ｉ１２９）、プラレトリン（Ｉ１３０）、ピレトリン（除虫菊）（Ｉ１３１）、レスメトリン（Ｉ１３２）、シラフルオフェン（Ｉ１３３）、テフルトリン（Ｉ１３４）、テトラメトリン（Ｉ１３５）、テトラメトリン［（１Ｒ）異性体）］（Ｉ１３６）、トラロメトリン（Ｉ１３７）およびトランスフルトリン（Ｉ１３８）；またはＤＤＴ（Ｉ１３９）；またはメトキシクロル（Ｉ１４０）；
ベンゾイル尿素系：ビストリフルロン（Ｉ１９１）、クロルフルアズロン（Ｉ１９２）、ジフルベンズロン（Ｉ１９３）、フルシクロクスロン（Ｉ１９４）、フルフェノクスロン（Ｉ１９５）、ヘキサフルムロン（Ｉ１９６）、ルフェヌロン（Ｉ１９７）、ノバルロン（Ｉ１９８）、ノビフルムロン（Ｉ１９９）、テフルベンズロン（Ｉ２００）およびトリフルムロン（Ｉ２０１）；
ＭＥＴＩ：フェナザキン（Ｉ２１２）、フェンピロキシメート（Ｉ２１３）、ピリミジフェン（Ｉ２１４）、ピリダベン（Ｉ２１５）、テブフェンピラド（Ｉ２１６）およびトルフェンピラド（Ｉ２１７）；またはロテノン（デリス）（Ｉ２１８）；
テトロン酸およびテトラミン酸系：例としてスピロジクロフェン（Ｉ２２１）、スピロメシフェン（Ｉ２２２）およびスピロテトラマト（Ｉ２２３）；
（２５）ミトコンドリア複合体ＩＩ電子伝達阻害剤、例えばベータ−ケトニトリル誘導体、例としてシエノピラフェン（Ｉ２２９）およびシフルメトフェン（Ｉ２３０）；
ジアミド系：クロラントラニリプロール（Ｉ２３１）、シアントラニリプロール（Ｉ２３２）およびフルベンジアミド（Ｉ２３３）；
ブテノリド系：４−｛［（６−ブロモピリジン−３−イル）メチル］（２−フルオロエチル）アミノ｝フラン−２（５Ｈ）−オン（Ｉ２５８）（ＷＯ２００７／１１５６４４から公知）、４−｛［（６−フルオロピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ｝フラン−２（５Ｈ）−オン（Ｉ２５９）（ＷＯ２００７／１１５６４４から公知）、４−｛［（２−クロロ−１，３−チアゾール−５−イル）メチル］（２−フルオロエチル）アミノ｝フラン−２（５Ｈ）−オン（Ｉ２６０）（ＷＯ２００７／１１５６４４から公知）、４−｛［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２−フルオロエチル）アミノ｝フラン−２（５Ｈ）−オン（Ｉ２６１）（ＷＯ２００７／１１５６４４から公知）、フルピラジフロン（Ｉ２６２）、４−｛［（６−クロル−５−フルオロピリジン−３−イル）メチル］（メチル）アミノ｝フラン−２（５Ｈ）−オン（Ｉ２６３）（ＷＯ２００７／１１５６４３から公知）、４−｛［（５，６−ジクロロピリジン−３−イル）メチル］（２−フルオロエチル）アミノ｝フラン−２（５Ｈ）−オン（Ｉ２６４）（ＷＯ２００７／１１５６４６から公知）、４−｛［（６−クロロ−５−フルオロピリジン−３−イル）メチル］（シクロプロピル）アミノ｝フラン−２（５Ｈ）−オン（Ｉ２６５）（ＷＯ２００７／１１５６４３から公知）、４−｛［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（シクロプロピル）アミノ｝フラン−２（５Ｈ）−オン（Ｉ２６６）（ＥＰ−Ａ−０５３９５８８から公知）、４−｛［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（メチル）アミノ｝フラン−２（５Ｈ）−オン（Ｉ２６７）（ＥＰ−Ａ−０５３９５８８から公知）、
スルホキシミン系：｛［１−（６−クロロピリジン−３−イル）エチル］（メチル）オキシド−λ４−スルファニリデン｝シアナミド（Ｉ２６８）（ＷＯ２００７／１４９１３４から公知）ならびにそのジアステレオマー｛［（１Ｒ）−１−（６−クロロピリジン−３−イル）エチル］（メチル）オキシド−λ４−スルファニリデン｝シアナミド（Ａ）（Ｉ２６９）および｛［（１Ｓ）−１−（６−クロロピリジン−３−イル）エチル］（メチル）オキシド−λ４−スルファニリデン｝シアナミド（Ｂ）（Ｉ２７０）（これらもまたＷＯ２００７／１４９１３４から公知）、同様にジアステレオマーＡの群と呼ばれるジアステレオマー［（Ｒ）−メチル（オキシド）｛（１Ｒ）−１−［６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル］エチル｝−λ４−スルファニリデン］シアナミド（Ａ１）（Ｉ２７１）および［（Ｓ）−メチル（オキシド）｛（１Ｓ）−１−［６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル］エチル｝−λ４−スルファニリデン］シアナミド［スルホキサフロルとしても公知］（Ａ２）（Ｉ２７２）（ＷＯ２０１０／０７４７４７、ＷＯ２０１０／０７４７５１から公知）、［（Ｒ）−メチル（オキシド）｛（１Ｓ）−１−［６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル］エチル｝−λ４−スルファニリデン］シアナミド（Ｂ１）（Ｉ２７３）および［（Ｓ）−メチル（オキシド）｛（１Ｒ）−１−［６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル］エチル｝−λ４−スルファニリデン］シアナミド
である。
【００２５】
より好ましくは、リストＡ）は、スピロテトラマト、スピロメシフェンおよびフルピラジフロンからなる。非常に好ましくは、リストＡ）は、スピロテトラマトおよびスピロメシフェンからなる。
【００２６】
好ましくは、リストＢ）は、イミダクロプリドまたはピメトロジンからなる。
【００２７】
好ましい抵抗性マーカーは、ＣＹＰ６ＣＭ１である。
【００２８】
好ましい有害昆虫は、ベミシア属に属する。非常に好ましい有害昆虫は、ワタコナジラミ（ベミシア・タバキ）である。
【００２９】
本明細書中でその「一般名」により特定される活性成分は公知であり、例えば、駆除剤マニュアル（”Ｔｈｅ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｍａｎｕａｌ”，１４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ２００６）中に記載されているか、またはインターネット（例としてｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌａｎｗｏｏｄ．ｎｅｔ／ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ）上で検索することができる。
【実施例】
【００３０】
試薬の調製および組成：
ウサギの免疫：
４羽のウサギにＰＢＳ中のＨｉｓ６−ＣＹＰ６ＣＭ１（注射１回あたり５００μｇ）を免疫した。
【００３１】
ＳＰＦウサギ（ＳＰＦ＝特定病原体不在（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｆｒｅｅ）；系統：Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ）の免疫は、以下を包含する：
・免疫の標準プロトコール（０、２８、４２、５６日目に４回注射）、２回の対照（４０および５４日後）
・採血前（ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ）（最初の注射前）の血清
・免疫は、アジュバント（最初の注射はＣＦＡ、２回目以降の注射はＩＦＡ）と組み合わせて皮下注射により実施する
・血清の供出（１．および２．は各々３〜５ｍＬを採血、７０日目に各々約２０ｍｌを採血、その後は毎月各ウサギの約２０ｍｌを採血）
抗体の精製：
抗体は、正の免疫吸着によって血清から精製した。カラムマトリックスを調製するため、製造業者の説明書に従って抗原のＭＢＰ−ＣＹＰ６ＣＭ１をＮＨＳ活性化セファロース４ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にカップリングした。精製は、ＭＢＰ−ＣＹＰ６ＣＭ１−セファロースを充填したカラムにポンプで血清を通すことによりＣＹＰ６ＣＭ１に特異的な抗体の一部を結合させることによって行った。（１）０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０および（２）３０ｍＭ  ＮａＣｌを使用した２回の洗浄ステップの後、特異的な抗体を、酸性条件下、１００ｍＭグリシン、０，５Ｍ  ＮａＣｌを含有するｐＨ２．７のバッファーを使用して溶出した。抗体はＰＢＳに対して透析し、限外濾過により濃縮した。
【００３２】
抗体の修飾：
抗体は、第一級アミノ基（−ＮＨ２）と効率的に反応して安定なアミド結合を形成するＮＨＳ活性化された標識試薬をカップリングすることにより標識した。抗体は、リジン（Ｋ）残基の側鎖および各ポリペプチドのＮ−末端中に、ＮＨＳ活性化試薬を使用した標識のための標的として利用可能な数個の第一級アミンを持つ。これらの利用可能なアミノ基から、いくつかの残基が反応中にランダムにカップリングされる。標識の程度は、コンジュゲーション反応中に用いられるモル比に依存する。
【００３３】
ビオチン化は、１００ｍＭリン酸バッファー  ｐＨ８．５中で、２から８倍のモル過剰量のビオチン化試薬（スクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート）を使用して、２５℃で２時間行った。１０ｍＭリジンを加えることにより反応を停止した。ＰＢＳに対する透析により過剰なビオチン化試薬および副産物からコンジュゲートを精製した。標識の程度は、ＨＡＢＡアッセイにより決定した。
【００３４】
ジゴキシゲニンとのコンジュゲーションは、１００ｍＭリン酸バッファー  ｐＨ８．５中で、８倍のモル過剰量の標識試薬（ジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を使用して、２５℃で２時間行った。１０ｍＭリジンを加えることにより反応を停止した。ＰＢＳに対する透析により過剰な標識試薬および副産物からコンジュゲートを精製した。
【００３５】
ホモジナイゼーションバッファー：
【表１】
2015520381.tif 000003
【００３６】
ランニングバッファー：
【表２】
2015520381.tif 000004
【００３７】
抗体：５０ｎｇ〜５００ｎｇ、好ましくは各々１５０ｎｇ（抗体ビオチンおよび抗体ジゴキシゲニンのコンジュゲート）
ストレプトアビジン−金（４０ｎｍ）：１００ｍＯＤ  ５０〜３００ｍＯＤ
ラテラルフロー用途のためのテストストリップ（図３および４も参照のこと）：
メンブレンカード：例としてＨＦ１２０  Ｐｌｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
排液パッド（ｗａｓｔｅ  ｐａｄ）：Ｃ０８３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または任意の他の類似のセルロースパッド。
【００３８】
サンプルパッド：以下を含む溶液で処理されたＣ０８３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
ａ）１００〜４００ｍＭホウ酸含有バッファー、ｐＨ８．０〜１０．０、好ましくは２５０ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０；
ｂ）０．１〜３重量％  ＢＳＡ、好ましくは１重量％  ＢＳＡ；
ｃ）０．０１〜０．２重量％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、好ましくは０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
例：
検出キットの利用により、一組のベミシア・タバキ系統を試験し、感受性／抵抗性を実験室内で検出した：
１）ＥＳＰ−０７Ｍ：抵抗性、Ｑ型、スペイン
２）ＥＳＰ−００：抵抗性、１）より弱い抵抗性、Ｑ型、スペイン
３）ＳｕＳ：感受性、Ｂ型でもＱ型でもない、スーダン
４）Ｂ−Ｒｅｆ：感受性、Ｂ型、イスラエル
５）Ｃｒｅｔｅ：抵抗性、１）および２）より弱い抵抗性、Ｑ型、ギリシャ
６）ＥＡＥ：抵抗性、Ｂ型、ブラジル
この試験系統中、１、２、５および６は、キットを用いることにより抵抗性マーカーについて陽性と試験された（図２）。全ての場合において、抵抗性マーカーの検出はイミダクロプリドに対する抵抗性と相関した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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