(57)【要約】  本発明は、上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor：EGFR）上のエピトープおよびその用途に関するもので、本発明で提供されるエピトープは高度に保存されており、上皮成長因子（epidermal growth factor：EGF）との結合に密接な関連のある領域内に位置しているので、前記エピトープを含むワクチン組成物または前記エピトープに対する抗体を含む組成物は、ＥＧＦとＥＧＲＦとの結合によるシグナル伝達を効率的に遮断して、がんなど、さまざまな疾患の治療において非常に有用に利用可能であり、本発明に係るエピトープに結合する抗体は、ＥＧＦだけでなく、ＴＧＦ−α、ＡＲ、ＢＴＣ、ＥＰＲおよびＨＢ−ＥＧＦなどの多様なＥＧＦＲリガンドの、ＥＧＦＲとの結合を効率的に阻害することができるので、ＥＧＦだけでなく、他のＥＧＦＲリガンドとの結合によるＥＧＦＲの活性化に伴って発生するさまざまな疾患の治療に利用することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＧＤＳＦＴＨ（配列番号２）で表されるアミノ酸配列を含むＥＧＦＲ上のエピトープ。
【請求項２】
ＲＧＤＳＦＴＨＴＰ（配列番号３）の配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のエピトープ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のエピトープと担体（ｃａｒｒｉｅｒ）が結合された複合体。
【請求項４】
前記担体は、ペプチド、血清アルブミン、免疫グロブリン、ヘモシアニン、および多糖体から選ばれる１つ以上であることを特徴とする、請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
請求項１または２に記載のエピトープをエンコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
【請求項７】
前記エピトープが微生物細胞またはウイルス表面に発現するよう誘導するプロモーターまたはシグナルタンパク質をコードする配列を含むことを特徴とする、請求項６に記載の組み換えベクター。
【請求項８】
請求項６または７に記載の組み換えベクターにより形質転換された組み換え微生物またはウイルス。
【請求項９】
前記形質転換された組み換え微生物またはウイルスは、組み換え大腸菌、組み換え酵母、組み換えバクテリオファージから選ばれることを特徴とする、請求項８に記載の組み換え微生物またはウイルス。
【請求項１０】
請求項６乃至９のいずれか1項に記載の組み換えベクター、組み換え微生物またはウイルスを培養する段階を含む、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープを生産する方法。
【請求項１１】
請求項１乃至５のいずれか1項に記載のエピトープ、前記エピトープを含む複合体、または前記エピトープをエンコードするポリヌクレオチドを含むがんワクチン組成物。
【請求項１２】
体内に注入の際、抗体形成を増進する役割をする、薬学的に許容可能な免疫補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）をさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載のがんワクチン組成物。
【請求項１３】
前記免疫補助剤は、アルミニウム塩（Ａｌ（ＯＨ）３，  ＡＬＰＯ４）、スクアレン（ｓｑｕａｌｅｎｅ）、ソルビタン（ｓｏｒｂｉｔａｎｅ）、ポリソルベート８０（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０）、ＣｐＧ、リポソーム、コレステロール、ＭＰＬ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）およびＧＬＡ（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）から選ばれる１つ以上であることを特徴とする、請求項１２に記載のがんワクチン組成物。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドは、薬学的に許容可能なベクターに含まれた形態であることを特徴とする、請求項１１に記載のがんワクチン組成物。
【請求項１５】
前記薬学的に許容可能なベクターは、ウイルス性ベクターまたは非ウイルス性ベクターであることを特徴とする、請求項１４に記載のがんワクチン組成物。
【請求項１６】
配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープ、前記エピトープを含む複合体、または前記エピトープをエンコードするポリヌクレオチドを用いた配列番号２または配列番号３に基づくエピトープに特異的に結合する抗体、またはその抗体の断片を生産する方法。
【請求項１７】
前記抗体は、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープ、前記エピトープを含む複合体、または前記エピトープをエンコードするポリヌクレオチドを動物に接種して、接種された動物から配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体を選別して生産することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ヒト型化(humanization)段階または脱免疫化(deimmunization)段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヒト型化段階は、ヒト抗体のＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に動物から生産された抗体のＣＤＲ配列を移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）する段階を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を高めたり、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｃｉｔｙ）を低下させるために、１つ以上のアミノ酸配列を置換、挿入、欠失する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記動物は、ヒト有来の配列と同一の抗体を生産できるように形質転換された動物であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記形質転換された動物は、形質転換されたマウスであることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ディスプレイ技術を利用することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記ディスプレイ技術は、ファージディスプレイ（phage display）、細菌ディスプレイ（bacteria display）、またはリボソームディスプレイ（ribosome display）の中から選択されるいずれかであることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ディスプレイに用いられるライブラリ（ｌｉｂｒａｒｙ）は、ヒト有来抗体の配列を有するように設計されたことを特徴とする、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープ、または前記エピトープを含む複合体を利用して、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体のみを選別（ｐａｎｎｉｎｇ）する段階を含むことを特徴とする、請求項２４乃至２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１項乃至５項のいずれか一項の記載によるエピトープ、前記エピトープを含む複合体、または前記エピトープをエンコードするポリヌクレオチドを含むがん診断用組成物。
【請求項２９】
請求項１項乃至５項のいずれか一項の記載によるエピトープ、前記エピトープを含む複合体、または前記エピトープをエンコードするポリヌクレオチドを含むがん診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下「ＥＧＦＲ」という。）上のエピトープおよびその用途に関するもので、本発明で提供されるエピトープは、高度に保存されており、上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、以下「ＥＧＦ」という。）との結合に密接に関連している領域内に位置しているので、前記エピトープを含むワクチン組成物、または前記エピトープに対する抗体およびこれを含む組成物は、ＥＧＦとＥＧＦＲとの結合によるシグナル伝達を効率的にブロックして、がんなど、様々な疾患の治療に非常に有用利用が可能である。さらに、前記エピトープに結合する抗体は、ＥＧＦだけでなく、トランスフォーミング成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−α：ＴＧＦ−α）、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ：ＡＲ）、ベタセルリン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ：ＢＴＣ）、エピレグリン（ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ：ＥＰＲ）およびヘパリン結合性ＥＧＦ様成長因子（ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＢ−ＥＧＦ）などのさまざまなＥＧＦＲリガンド（ｌｉｇａｎｄ）のＥＧＦＲとの結合を効率的に阻害することができるので、ＥＧＦＲの活性化に起因するさまざまな疾患の治療に使用することができる。
【０００２】
また、本発明は、前記エピトープに特異的な抗体を生産する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
がんの免疫療法的な治療方法は、手術や放射線療法および化学療法に比べて、患者に病気の標的に対する特異性を高め、抗がん効果を上昇させ、副作用は減少させる利点を持たす。腫瘍特異的なモノクローナル抗体は、さまざまな癌種に応じて特異的に過剰発現される特定のタンパク質を標的にして抗がん効果を得ることで、腫瘍の治療において非常に有用な治療剤として使用されている。
【０００４】
上皮成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＧＦＲ）は、１７０ｋＤａの第１型膜タンパク質であって、さまざまな種類の腫瘍において過剰発現することが知られている。このような上皮成長因子受容体は、長い間研究課題となっており、最近では、細胞のドメイン（非特許文献１）、および細胞内キナーゼドメイン（非特許文献２）の構造決定の研究が成功を収めた。この研究は、受容体およびそのリガンドの挙動に大きい情報を提供した。上皮成長因子受容体は、細胞表面に関連する分子としてリガンドであるＥＧＦとＴＧＦ−αとの結合を介して活性化される。リガンド結合後、受容体は二量体化されて、細胞内チロシンキナーゼ領域がリン酸化される。これにより、サブシグナルカスケード反応を活性化させ、正常な細胞成長および増殖の腫瘍細胞の成長を誘導することが証明された。特に腫瘍細胞がその機能を主に上皮成長因子受容体に依存すれば、上皮成長因子受容体の調節機能を抑制する可能性の範囲により、受容体は治療の共通の目標として認識されている。
【０００５】
上皮成長因子受容体の過剰発現は、例えば、特定のがんである、肺がん、乳がん、結腸がん、胃がん、脳腫瘍、膀胱がん、頭部および頸部がん、卵巣がん、並びに前立腺がんにおいて観察された。上皮成長因子受容体に対する抗体を使用して、上皮成長因子受容体に上皮成長因子（ＥＧＦ）が結合するのを阻害すると、がん細胞の成長を抑制してがんを治療することができ、これは、上皮成長因子受容体に対するモノクローナル抗体を対象にして、すでに実験的に証明された。
【０００６】
一方、ＥＧＦと結合するＥＧＦＲの各ドメインの位置を特定しようとする試みもあったが（非特許文献３）、直接、当該ＥＧＦＲドメインをエピトープとする抗体を作製して、実際ＥＧＦによるＥＧＦＲシグナル伝達経路の活性化を阻害することができるかに対する結果は確認されていない状況である。
【０００７】
現在、臨床分野において転移性大腸がんの治療に使用されているセツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）（Ｃ２２５抗体、商品名：Ｅｒｂｉｔｕｘ(登録商標);ＩｍＣｌｏｎｅ社、米国）は、キメラ抗体として、マウスの可変領域とヒト抗体のＩｇＧ１不変領域を結合したもの（マウスのアミノ酸配列の約３０％を含む）で、試験管内においてＥＧＦによる腫瘍細胞の成長およびＥＧＦＲのリン酸化を抑制し、ヌードマウスにおいてヒト腫瘍が形成されることを抑制する。また、前記抗体は、特定の化学治療剤と相乗作用して、異種移植片マウスモデルにおいてヒト腫瘍を根絶させることが明らかになった。しかし、セツキシマブは、患者に免疫反応を誘発（〜１０％）するという問題点があり、単一療法（ｓｔａｎｄ  ａｌｏｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）としては満足のいく治療効果を上げられず、化学療法剤との併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）としてのみ使用が可能である。
【０００８】
転移性大腸がんの治療に使用されている別の抗体であるパニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）（商品名：Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）;Amgen社、米国）は、完全にヒト抗体として試験管内でＥＧＦによる腫瘍細胞の成長および上皮成長因子受容体のリン酸化を抑制し、ヌードマウスにおいてヒト腫瘍が形成されることを抑制する。また、前記抗体は、特定の化学治療剤と相乗作用して、異種移植片マウスモデルにおいてヒト腫瘍を根絶させることが明らかになった。セツキシマブ対比差別性は完全ヒト抗体であり、抗原結合能が１０倍強化されていて、ＩｇＧ２タイプの抗体としてセツキシマブの免疫反応誘発の問題を減少させ、結合能を強化させて副作用を減らし、効果を向上させようとしたが、ＩｇＧ２が持つ限界のため、単にＥＧＦとＥＧＦＲとの結合によるシグナル伝達の抑制効果のみを示すので、既存のセツキシマブが持つ信号転移の抑制とＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）効能のうちＡＤＣＣ効果がなく、臨床において総効能はセツキシマブと類似のものとして報告されている。
【０００９】
また、Ｍｅｒｃｋ  ＳｅｒｏｎｏとＴａｋｅｄａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが共同開発中であるマツズマブ（ｍａｔｕｚｕｍａｂ、ｍＡｂ４２５）も、単一療法では未だ満足のいく治療効果を上げられずにいる状況である。
【００１０】
何よりもＥＧＦＲを標的とする従来の抗体治療剤はすべてＫ−ｒａｓ変異型大腸がんには処方することができないことになっている。２００９年報告されたデータを見ると、両方の抗体が治療効果を示す患者の割合は、全体で２１％程度であり、残り７９％は、治療効果が現れないことが確認されており、効果が現れない患者群のうちＫ−ｒａｓ変異型を持つ患者は４３％、つまり全体で約３０％程度がこのようなＫ−ｒａｓ変異型大腸がん群であり、既存の抗体治療剤であるセツキシマブとパニツムマブは約１．５％程度のＫ−ｒａｓ変異型にのみ効果を示している。
【００１１】
したがって、ＥＧＦとＥＧＦＲの結合をより効率的に阻害して、既存のＥＧＦＲ抗体の問題点および限界を克服できる差別化と優秀性を持つ新しい抗−ＥＧＦＲ抗体に対する需要は持続的に増加している状況である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Garrett TP etal. Cell 2002, 110:763-773
【非特許文献２】Stamos J et al.J. Biol. Chem.2002, 277:46265-46272
【非特許文献３】S. Yokoyama et al., Cell, 2002, 110:775-787
【発明の概要】
【００１３】
上記のような問題を解決しようと、本発明は、ＲＧＤＳＦＴＨ（配列番号２）のアミノ酸配列、またはそれを含むＥＧＦＲ上のエピトープを提供し、特にＲＧＤＳＦＴＨＴＰ（配列番号３）のアミノ酸配列を有するエピトープを提供することを目的とする。
【００１４】
本発明はまた、前記エピトープを生産する方法および前記エピトープを含むがんワクチン用組成物またはがんワクチン、前記エピトープを用いて、前記エピトープに特異的に結合する特性を持つ抗体を生産する方法およびそのような方法で生産された抗体を含むがんの予防および/または治療用組成物または治療剤を提供することを目的とする。
【００１５】
本発明は、さらに、前記エピトープまたは前記エピトープをエンコードするポリヌクレオチド配列およびこれを含む、がん診断用組成物およびキットを提供することを他の目的とする。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＧＣ１１１８抗体とＥＧＦＲとの結合特性を３次元的に示す図である。
【図２】図２は、ＥＧＦとＥＧＦＲとの結合特性を３次元的に示す図である。
【図３】図３は、ＥＧＦが結合されたＥＧＦＲにＧＣ１１１８抗体の結合特性をオーバーラップして３次元的に示す図である。
【図４】図４は、セツキシマブとＥＧＦＲとの結合特性を３次元的に示す図である。
【図５】図５は、ＥＧＦＲ変異体の遺伝子合成および酵母細胞の形質転換の過程を示す図である。
【図６】図６は、各ＥＧＦＲ変異体がきちんと合成されたことを、ＤＮＡ塩基配列から決められたアミノ酸配列を用いて確認したことを示す図である。
【図７】図７は、ＥＧＦＲ変異体の発現率を示す図である。
【図８】図８は、各ＥＧＦＲ突然変異体に対する抗体の結合能を示す図であり、（Ａ）はＧＣ１１１８、（Ｂ）はセツキシマブ(対照群)を示す。
【図９】図９は、ＧＣ１１１８とＥＧＦＲリガンドの競争的結合能を示す図であり、（Ａ）はＧＣ１１１８、（Ｂ）はセツキシマブ(対照群)を示す。
【図１０】図１０は、ＧＣ１１１８による細胞増殖の誘導抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１８】
本発明では、ＲＧＤＳＦＴＨ（配列番号２）のアミノ酸配列、またはそれを含むアミノ酸配列、特にＲＧＤＳＦＴＨＴＰ（配列番号３）で表されるアミノ酸配列がＥＧＦＲのアミノ酸配列の中でＥＧＦとの結合に必須で作用するという点を究明し、そのようなアミノ酸配列をエピトープとして有する抗体がＥＧＦとＥＧＦＲとの結合を非常に効率的に阻害して、それによるシグナル伝達を遮断することにより、がんの治療に優れた効能を示すことを確認することにより、本発明を完成した。
【００１９】
前記配列番号２で表示されるＲＧＤＳＦＴＨのアミノ酸配列は、配列番号１で表示されるＥＧＦＲの細胞外ドメイン（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｏｍａｉｎ）のアミノ酸配列の３５３番から３５９番目のアミノ酸残基に該当し、配列番号３で表示されるＲＧＤＳＦＴＨＴＰのアミノ酸配列は、配列番号１で表示されるＥＧＦＲの細胞外ドメインの３５３番から３６１番目のアミノ酸残基に該当する。
【００２０】
本発明において提供されるアミノ酸配列の中に存在するアミノ酸残基は、それらの公知の３文字または１文字の略語により表示される。また、本発明における「ｘＡ」は、配列番号１で表示されるＥＧＦＲ配列のＡ番目のアミノ酸ｘを意味し、「ｘＡｚ」はＡ番目アミノ酸ｘがｚに置換されたことを意味する。例えば、Ｒ３５３は、配列番号１のアミノ酸配列３５３番目のアミノ酸残基であるアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ａｒｇ）を意味し、Ｒ３５３Ｇは、配列番号１のアミノ酸配列３５３番目のアミノ酸残基であるアルギニンがグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇｌｙ）に置換されたことを意味する。
【００２１】
配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープは、その３次元構造を維持するか、がんワクチン等の組成物として利用する際、効率を向上させるために担体（ｃａｒｒｉｅｒ）と結合した形態で利用可能である。本発明による担体は生体に適合し、本発明で目的とする効果を得られるものであれば全て使用可能であって、ペプチド、血清アルブミン、免疫グロブリン、ヘモシアニン、および多糖体等から選択することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２２】
配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープそのもの、もしくは担体と結合した形態の複合体は、がんワクチン組成物として利用可能である。この際、前記ワクチン組成物には、薬学的に許容可能な免疫補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）または賦形剤がさらに含まれてもよい。免疫補助剤として、体内注入の際に抗体形成を増進する役割をして、本発明における目的達成が可能なものであれば、いかなるものでも使用可能であり、特にアルミニウム塩（Ａｌ（ＯＨ）３、ＡＬＰＯ４）スクアレン（ｓｑｕａｌｅｎｅ）、ソルビタン（ｓｏｒｂｉｔａｎｅ）、ポリソルベート８０（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０）、ＣｐＧ、リポソーム、コレステロール、ＭＰＬ-Ａ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）およびＧＬＡ（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）から選ばれる１つ以上が好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２３】
本発明において提供される配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープをインコードするポリヌクレオチドは、それ自体で遺伝子がんワクチンとして利用可能である。この際、前記ポリヌクレオチドは、ベクターなしでそのまま利用することもでき、ウイルス性または非ウイルス性ベクターに担持され体内に運ばれることができる。ウイルス性または非ウイルス性ベクターは、本発明が属する技術分野において通常利用可能であると知られているものであれば、いかなるものでも利用することができる。具体的に、ウイルス性ベクターとしては、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス（ｌｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）などが好ましく、非ウイルス性ベクターとしては、陽イオン性ポリマー、非イオン性ポリマー、リポソーム、脂質、リン脂質、親水性ポリマー、疎水性ポリマーおよびこれらの中から選ばれる１つ以上の複合体等が利用可能であるが、これに限定されるものではない。
【００２４】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープをエンコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター、それを含む宿主細胞、および前記組換えベクターまたは宿主細胞を用いて、本発明に係る配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープを生産する方法を提供する。
【００２５】
本発明において、「組換えベクター」とは、適切な宿主細胞においてターゲットタンパク質を発現することができる発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現するよう作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子作製物を指す。本発明において、「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、通常の機能を果たすように核酸の発現調節配列と、目的とするタンパク質をコードする核酸配列が機能的に連結されていることを指す。組換えベクターとの作動的連結は、本発明が属する技術分野で公知の遺伝子組換え技術を利用して行うことができ、部位特異的ＤＮＡの切断および連結は、本発明が属する技術分野で一般的に知られている酵素などを用いて容易に行うことができる。
【００２６】
本発明において使用できる適合な発現ベクターは、プロモーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーのような発現調節エレメントの外にも、膜標的化または分泌のためのシグナル配列を含むことができる。開始コドンおよび終結コドンは、一般的に免疫原性の標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部とみなされ、遺伝子作製物が投与されたとき、オブジェクトにおいて必ず作用を示す必要があり、コーディング配列とインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）にあらねばならない。一般プロモーターは、構成的または誘導性でもよい。原核細胞には、ｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３およびＴ７プロモーターがあるが、これに限定されることはない。真核細胞には、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、例えばＨＩＶの長い末端反復部（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、ラウスサルコーマウィルス（ＲＳＶ）プロモーターだけでなく、β−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトメタロチオネイン由来のプロモーターがあるが、これに限定されることはない。
【００２７】
前記発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ）を含むことができる。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別するためのもので、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような、選択可能な表現型を付与するマーカーを使用してもよい。選択制（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）が処理された環境において選別マーカーを発現する細胞のみが生存するので、形質転換された細胞が選別可能である。また、ベクターは、複製可能な発現ベクターである場合、複製が開始される特定の核酸配列である複製起点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ）を含むことができる。組換え発現ベクターとしては、プラスミド、ウイルス、コスミドなど、さまざまな形のベクターが使用され得る。組換えベクターの種類は、原核細胞および真核細胞の各種宿主細胞から所望の遺伝子を発現し、目的のタンパク質を生産する機能をする限り特に限定はされないが、強力な活性を示すプロモーターと強い発現力を有しながら、自然の状態と類似した形態の外来タンパク質を大量に生産できるベクターが好ましい。
【００２８】
特に、本発明に係る配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープを発現させるために、さまざまな発現宿主／ベクターの組み合わせを用いることができる。真核宿主に適した発現ベクターとして、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス、レンチウイルスおよびレトロウイルス由来の発現調節配列などが用いられるが、これに限定されるものではない。細菌宿主に使用できる発現ベクターには、ｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、およびこれらの誘導体とともに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から得られる細菌性プラスミド、ＲＰ４のように、より広い宿主範囲を持つプラスミド、λｇｔ１０やλｇｔ１１、ＮＭ９８９のような非常に多様なファージラムダ（ｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ）誘導体で例えられるファージＤＮＡ、およびＭ１３やフィラメント性一本鎖ＤＮＡファージのような、その他異なるＤＮＡファージが含まれる。昆虫細胞に有用なベクターは、ｐＶＬ９４１である。
【００２９】
前記組換えベクターは、宿主細胞に挿入されて形質転換体を形成するが、適合な宿主細胞は、大腸菌、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、プロテウス・ミラビリーズ（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）またはスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）のような原核細胞、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）のような真菌、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）およびアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）などの酵母、その他の下等真核細胞、および昆虫からの細胞のような高等真核生物の細胞のような真核生物の細胞でもよい。また、前記宿主細胞は、好ましくは、植物、哺乳動物から由来してもよいが、サル腎臓細胞７（ＣＯＳ７：ｍｏｎｋｅｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ：ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、仔ハムスター腎（ＢＨＫ：ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞およびＨＥＫ２９３細胞などが利用可能であり、これに限定されない。特に好ましくは、ＣＨＯ細胞である。
【００３０】
本発明において、宿主細胞への「形質転換」は、核酸を有機体、細胞、組織または器官に導入するいかなる方法も含まれ、当分野において公知のように、宿主細胞に応じて適切な標準技術を選択し行うことができる。このような方法には、電気ショックによる遺伝子取込法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌、アグロバクテリウム媒介形質転換、ＰＥＧ、デキストラン硫酸、リポフェクタミンおよび乾燥／抑制媒介形質転換方法などが含まれるが、これらに限定されない。組換えベクターが発現される形質転換体を栄養培地で培養することにより、本発明による配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープを大量に生産することができ、培地と培養条件は、宿主細胞に応じて慣用するものを適当に選択、利用することができる。培養時の細胞の生育とタンパク質の大量生産に適合するように、温度、培地のｐＨおよび培養時間などの条件を適切に調節することができる。上記のように組換えによる配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープは、培地または細胞分解物から回収することができ、通常の生化学分離技術によって分離、精製が可能である（Sambrook et al., Molecular Cloning:A laborarory Manual, 2nd Ed., ColdSpringHarbor Laboratory Press(1989); Deuscher,M.,Guide to Protein PurificationMethods Enzymology, Vol.182. Academic Press.Inc., San Diego, CA(1990)）。これには、電気泳動、遠心分離、ゲルろ過、沈殿、透析、クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、免疫吸着クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど）、等電点フォーカシングおよびそのさまざまな変化および複合方法などが利用可能であるが、これに限定されない。
【００３１】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープを微生物またはウイルスの表面に発現する方法を提供する。このとき、誘導するプロモーターまたはシグナルタンパク質をコードする配列を含むことを特徴とする、組換えベクター及び前記組換えベクターを含むさまざまな微生物またはウイルスを使用することができ、特に適合な微生物またはウイルスは、組換え大腸菌、組換え酵母および組換えバクテリオファージなどがあるが、これに限定されるものではない。前記微生物またはウイルスの表面に、前記配列番号２または配列番号３によるエピトープを、微生物またはウイルスの表面に発現させるためには、本発明が属する技術分野において公知のディスプレイ（ｄｉｓｐｌａｙ）技術を利用することができ、特に微生物細胞またはウイルスの表面に発現されるように誘導するプロモーターまたはシグナルタンパク質をエンコードする配列に、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープをエンコードするポリヌクレオチド配列を結合させて発現するか、元の表面に発現されるタンパク質をインコードする遺伝子部位の一部を欠損させ、これに、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープをエンコードするポリヌクレオチド配列を挿入する方法などが利用可能であるが、これに限定されるものではない。このような方法により微生物またはウイルス表面に発現された配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープは、それ自体で分離、精製され、本発明に係る特定の用途に使用することができ、表面に発現された状態で配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体をスクリーニングして得る用途にも利用可能である。
【００３２】
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープ、前記エピトープを含む複合体、または前記エピトープをエンコードするポリヌクレオチドを用いた配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体、またはそのような抗体の断片を生産する方法を提供する。このような抗体は、ポリクローナル抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）またはモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよく、前記抗体の断片も配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープに結合する特性を保持する限り、本発明の権利範囲に含まれる。特に、本発明における抗体または抗体の断片は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープに対する結合機能を保有しているモノボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ(ａｂ’)２断片、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ドメイン抗体、二重特異抗体、ミニボディ、スキャップ、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、抗体不変領域の誘導体、タンパク質スキャフォールド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）に基づく人工抗体などが全て含まれるが、これらに限定されるものではない。また、本発明の抗体の特性が維持される限り、可変領域内における変化が起こった抗体も本発明の権利範囲に含まれる。そのような例として、可変領域でのアミノ酸の保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）が挙げられる。保存的置換は、元のアミノ酸配列と類似の特性を持つ他のアミノ酸残基への置換を意味するが、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンは、塩基の側鎖を有して類似の特性を持っていて、アスパラギン酸とグルタミン酸は、酸の側鎖を有するという点で類似の特性を有する。また、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、チロシン、システイン、トリプトファンは非電荷極性の側鎖を有するという点で特徴が類似しており、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンは、非極性側鎖を持っているという点で類似の特性を有し、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンは、芳香族の側鎖を持っているという点で類似した特性を有する。したがって、上記のように類似の特性を持つグループ内におけるアミノ酸置換が起こっても特に特性の変化を見せないであろうということは、通常の技術者にとっては明らかなので、本発明に係る抗体の特性が維持される限り、可変領域内における保存的置換による変異が起きた抗体を生産する方法も本発明の権利範囲に含まれる。
【００３３】
本発明に係る配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープに結合する抗体は、本発明が属する技術分野において公知の方法を用いて製造することができる。具体的には、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープ、前記エピトープを含む複合体、または前記エピトープをエンコードするポリヌクレオチドを動物に接種し、接種した動物から配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体を生産して選別することにより得られる。
【００３４】
この際、前記動物は、ヒト由来の配列と同じ抗体を生産できるように形質転換された動物、特に形質転換されたマウスであることが好ましいが、形質転換されたマウスを利用した免疫原性が低下している、いわゆるヒト抗体（ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、米国登録特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第７，５０１，５５２号などに記載の方法を用いて製造することができる。もし前記動物が、ヒト由来配列と同じ抗体を生産できるように形質転換されたものではない場合は、前記動物から得られた抗体を用いて、米国特許第５，２２５，５３９号、米国特許第５，８５９，２０５号、米国特許第６，６３２，９２７号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第６，０５４，２９７号、米国特許第６，４０７，２１３号、国際公開特許第１９９８／５２９７６号に記載の方法のように、ヒト型化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）段階または脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）段階をさらに行い、治療用として体内に適するようにすることができる。具体的に、前記ヒト型化または脱免疫化は、ヒト抗体のＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に動物から生産された抗体のＣＤＲ配列を移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）するＣＤＲ移植（ＣＤＲ  ｇｒａｆｔｉｎｇ）段階および追加で親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を高めたり、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｃｉｔｙ）を低下させるために、１つ以上のアミノ酸配列を置換、挿入、欠失するＣＤＲウォーキング（ＣＤＲ−ｗａｌｋｉｎｇ）段階を含んでもよい。
【００３５】
もし、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープ、前記エピトープを含む複合体、または前記エピトープをエンコードするポリヌクレオチドではなく、ＥＧＦＲ全体を免疫原として利用する場合には、ＥＧＦＲに対する結合能を有する抗体を優先的に選別する段階および前記選別された抗体の中から配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープを特異的に認識する抗体を選別する方法を用いることもできる。この際、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープの重要な結合部位に突然変異を誘発し、1次で選別されたＥＧＦＲに結合する抗体の中から配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープの重要な結合部位に突然変異が起こったＥＧＦＲに、結合能が欠けたか、低下された抗体を選別する方法も利用可能である。
【００３６】
また、本発明が属する技術分野において公知のディスプレイ（ｄｉｓｐｌａｙ）技術を用いて、配列番号２または配列番号３に基づくエピトープに結合するヒト抗体を生産、選別することができる。前記ディスプレイ技術は、ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）、イーストディスプレイ（ｙｅａｓｔ  ｄｉｓｐｌａｙ）、細菌ディスプレイ（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｄｉｓｐｌａｙ）、またはリボソームディスプレイ（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）の中から選択されるいずれかであることが好ましいが、これに限定されるものではない。ライブラリの製造およびディスプレイは、米国特許第５，７３３，７４３号、米国特許第７０６３９４３号、米国特許第６１７２１９７号、米国特許第６，３４８，３１５号、米国特許第６，５８９，７４１号などに記載されたことにより、容易に実施することができる。特に、前記ディスプレイに使用されるライブラリ（ｌｉｂｒａｒｙ）は、ヒト由来抗体の配列を有するように設計されたものが好ましい。具体的に、前記方法は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープ、または前記エピトープを含む複合体を用いて、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体のみを選別（ｐａｎｎｉｎｇ）する段階を含むことを特徴とする。
【００３７】
最後に、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープ、前記エピトープを含む複合体、または前記エピトープをエンコードするポリヌクレオチドを含むがんワクチン用組成物を提供する。
【００３８】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためだけのものであって、本発明の要旨に基づいて、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないことは、当該技術分野において通常の知識を有する者にとっては明らかである。
【００３９】
（実施例１）
［ＥＧＦＲとＧＣ１１１８のＦａｂとの結合構造の究明］
本研究グループで開発したＧＣ１１１８（ＫＲ  １０−２０１１−００３４９１４Ａ  参照）のＦａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）とＥＧＦＲとの結合構造を究明するため、ＥＧＦＲ／ＧＣ１１１８  Ｆａｂ結合体結晶のＸ線回折データはＢＬ２６Ｂ２  ｂｅａｍｌｉｎｅ（Ｓｐｒｉｎｇ−８  ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ、日本）を利用して獲得し、ＨＫＬ２０００ソフトウェア（ＨＫＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、米国)により指標付け（ｉｎｄｅｘｉｎｇ）およびスケーリング（ｓｃａｌｉｎｇ）して、分子置換（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ：ＭＲ）法によりＥＧＦＲ／ＧＣ１１１８結合体の初期電子密度マップを得た。ＭＲ方法を利用するためには、ＥＧＦＲと標的抗体との結合体と類似の構造を有するタンパク質の３次元構造データが必要であるが、ＥＧＦＲ／ＧＣ１１１８結合体構造の場合、ＥＧＦＲ／セツキシマブ結合体構造を利用した（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＹＹ９）。ＥＧＦＲ／ＧＣ１１１８結合体の初期位相情報は、Ｍｏｌｒｅｐプログラム(http://www.ysbl.york.ac.uk/~alexei/molrep.html)を用いて得て、得た初期位相情報に基づいてＣｏｏｔ(Crystallographic Object-Oriented Toolkit,http://www.biop.ox.ac.uk/coot/)を用いてモデルビルディング作業を行い、Ｒｅｆｍａｃ５(http://www.ccp4.ac.uk/html/refmac5.html)およびＰＨＥＮＩＸ(Python-basedHierarchical ENvironment for Integrated Xtallography, http://www.phenix-online.org/)ソフトウェアを用いて精製を完了した。
【００４０】
その結果、ＧＣ１１１８のＥＧＦＲ上のエピトープは、ＥＧＦＲの３番ドメインに位置していることが分かった。特に前記エピトープは、３番ドメインの短いｌｏｏｐ部分であって、アミノ酸配列３５３番から３６１番までと９個のアミノ酸からなる部分である（配列番号１および図１参照）。この部分は、外部に突出している部分であって抗体のＣＤＲにより囲まれており、特にＧＣ１１１８とＥＧＦＲとの間の結合に最も重要な役割をするアミノ酸残基は、ＥＧＦ受容体のＦ３５７とＨ３５９である。この２つのアミノ酸残基は、ＧＣ１１１８抗体のＣＤＲ部分のアミノ酸に囲まれており、このアミノ酸と、疎水性結合および水素結合が成されて、ＥＧＦＲとＧＣ１１１８の結合を堅く維持させている。また、Ｒ３５３は、ＧＣ１１１８抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）とのイオン結合により、さらに抗体との結合に寄与している（図1参照）。
【００４１】
一方、ＥＧＦが結合する部分は、ＥＧＦＲの１番ドメインと３番ドメインの間であるが、ＥＧＦは、最初にＥＧＦＲの１番ドメインに結合して（図２参照）ＥＧＦＲドメインの構造的変化を誘導した後、３番ドメインに結合することになる（図３参照）。このときＥＧＦとの結合に関与する重要なＥＧＦＲアミノ酸残基は、３番ドメインのＤ３５５（Ferguson et al.,Molecular Cell、2003,11：507-517）であるが、このアミノ酸残基は、ＧＣ１１１８のエピトープであるＲ３５３、Ｆ３５７、Ｈ３５９を含むループ内に位置している。つまり、ＧＣ１１１８が結合するＥＧＦＲ上のエピトープは、ＥＧＦが結合する部位と同じ領域内に存在しているので、ＧＣ１１１８のエピトープに結合する抗体は、ＥＧＦがＥＧＦＲの３番ドメインに結合することを直接に阻害することができる。これは、ＥＧＦと結合されたＥＧＦＲの構造と比較すると、より確実になるが、ＥＧＦが結合して活性化したＥＧＦＲの構造とＧＣ１１１８とをオーバーラップしてみると、ＧＣ１１１８のＶＨ部分とＥＧＦが互いにオーバーラップしていることが確認できる（図３参照）。
【００４２】
現在使用されているセツキシマブのＥＧＦＲとの結合形態と比較してみると、セツキシマブもＥＧＦＲの３番ドメインに位置するエピトープを持っているが、セツキシマブの結合部位は、３番ドメインの表面に広く位置しており、そのエピトープの一部のみＥＧＦの結合に間接的影響を与えている（図４（Ａ）参照）。別の抗体であるマツズマブもやはり、ＥＧＦＲの３番ドメインに位置するエピトープを持っているが、マツズマブのエピトープは、本発明に係るエピトープとは異なる領域に位置しており、ＥＧＦが結合する領域以外の場所に位置して直接ＥＧＦの結合を阻害することはできない（図４（Ｂ）参照）。
【００４３】
（実施例２）
[酵母細胞表面発現法を用いたＧＣ１１１８のＥＧＦＲ上のエピトープの検証]
構造モデルによって明らかになったＧＣ１１１８に対するＥＧＦＲのエピトープ（Ｒ３５３番、Ｆ３５７番、Ｈ３５９番アミノ酸）を検証しようと、当該アミノ酸残基を、結合反応性のないグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）に置換された変異体を作製した後、酵母細胞表面に発現させた。以後、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ(登録商標)、米国）を使用して、ＧＣ１１１８と酵母細胞の表面に発現させたＥＧＦＲ変異体との結合を確認した結果、全てのＥＧＦＲ変異体においてＧＣ１１１８との結合力が減少したことを確認した。
【００４４】
２．１  上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）変異体作製
ヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）をエンコードする遺伝子配列を鋳型とし、オーバーラップＰＣＲ方法を用いてＥＧＦＲアミノ酸配列（配列番号１を参照）のＲ３５３、Ｆ３５７、Ｈ３５９のいずれか１つ以上をグリシンに置換した表１に記載の変異体を作製した。
【００４５】
【表１】
2015519875.tif 000003
【００４６】
２．１．１  ＥＧＦＲ変異体の合成のためのＰＣＲ反応
ヒトＥＧＦＲ遺伝子配列を鋳型とし、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ(登録商標)ＴＬＡ  ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社、韓国）とＥＧＦＲ遺伝子変異を誘導するように設計されたプライマーセット（表２）を使用してＰＣＲ反応をさせ、それぞれの変異体を共通に含む遺伝子片２つを合成した（約１１５０ｂｐ、７２０ｂｐ）。合成された２つの遺伝子を１％のアガロースゲルで電気泳動により分離した後、各ＤＮＡをキアゲンキット（Ｑｉａｇｅｎ２８７０６、ドイツ）で精製した。続いて、精製された２つの遺伝子セットを１つの鋳型として使用し、配列番号４〜１９の配列を有するプライマー（表２参照）を用いて上記と同様の方法でオーバーラップＰＣＲ反応をさせ最終ＥＧＦＲ変異体の遺伝子を合成した（図５参照）。合成された遺伝子は、制限酵素ＮｈｅＩ／ＭｌｕＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、米国）を使用して切断した。表２のプライマー名の後のＦｏｒは順方向プライマーを、Ｒｅｖは逆方向プライマーを意味する。
【００４７】
【表２】
2015519875.tif 000004
【００４８】
２．１．２  ＥＧＦＲ変異体のライゲーションおよび形質転換
酵母表面の発現ベクターｐＣＴＣＯＮ（Boder、ET et al. Nat Biotechnol1997、15（6）：553-7）を、制限酵素ＮｈｅＩ／ＭｌｕＩを使用して切断し、１％アガロースゲル電気泳動およびキアゲンキットで精製した。実施例２．１．１において準備したＥＧＦＲ変異体のＤＮＡとｐＣＴＣＯＮとを混合し、Ｔ４  ＤＮＡｌｉｇａｓｅ（New England BioLabs社、米国）を添加して、２５℃で２時間反応させた。前記ライゲーション混合物（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ）を大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）にＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、米国）を用いた電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）により形質転換させて、合計２ｍＬの培地で1時間育てた後、カーベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）（Ｓｉｇｍａ社、米国）が含まれているＬＢアガー（ａｇａｒ）プレートに拡散した。以後、３７℃において一晩培養した。
【００４９】
２．１．３  ＥＧＦＲ変異体の塩基配列分析
上記実施例２．１．２において培養したプレートにおいて、コロニーを５０μｇ／ｍＬのカーベニシリンが含まれているＬＢ培地２ｍＬにて一晩培養した後、キアゲンプラスミドミニキット（Ｑｉａｇｅｎ２７１０６、ドイツ）を用いて組換えプラスミドを分離し、プラスミドに挿入されたＥＧＦＲ変異体のＤＮＡ塩基配列を確認した。塩基配列の決定に用いられたシーケンスプライマーは、配列番号２０〜２２で表示される配列を有するものを使用し（表３参照）、塩基配列の決定は、公知の方法に基づいてＧｅｎｏｔｅｃｈ社（大田、韓国）に依頼して分析した。対照群として、ｈｕｍａｎ  ＥＧＦＲの塩基配列を用いた。ＥＧＦＲ変異体のＤＮＡ塩基配列を決定した後、決定されたＤＮＡ塩基配列をアミノ酸配列に翻訳するＷｅｂベースのプログラム（www.expasy.org：DNA to Protein translate tool）を使用して、アミノ酸配列に翻訳した。翻訳結果は、図６に示し、表１に記載された全てのＥＧＦＲ変異体の遺伝子がｐＣＴＣＯＮベクターに正しく挿入されていることを確認した。
【００５０】
【表３】
2015519875.tif 000005
【００５１】
２．２  ＥＧＦＲ変異体の酵母細胞の表面発現および抗体との結合分析
２．２．１  ＥＧＦＲ変異体の酵母細胞の表面発現の過程
実施例２．１において確認されたｐＣＴＣＯＮ−ＥＧＦＲを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを用いた電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）により、ＥＢＹ１００（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母菌株に形質転換した（図１）。形質転換されたコロニーを選別培地であるＳＤ−ＣＡＡ（２０ｇ／Ｌのグルコース、６．７ｇ／Ｌのアミノ酸のない酵母窒素原礎培地（yeast nitrogen base without amino acids）、５．４ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、８．６ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌカザミノ酸）において３０℃で２０時間液状培養した。以降ＥＧＦＲ変異体の酵母表面発現は、選別培地であるＳＧ−ＣＡＡ（２０ｇ／Ｌのガラクトース、６．７ｇ／Ｌのアミノ酸のない酵母窒素原礎培地、５．４ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、８．６ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌのカザミノ酸）で３０℃にて２０時間の液状培養することにより誘導した。
【００５２】
２．２．２  ＥＧＦＲ変異体の酵母細胞の表面発現の確認
ＥＧＦＲ変異体の酵母細胞の表面発現の有無は、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ(登録商標)(Becton Dickinson社）を用いて確認した。約１ｘ１０７個の発現された酵母を０．１ｍｌのＰＢＳＢ（りん酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）においてａｎｔｉ−ｃ−ｍｙｃ  ９Ｅ１０  ｍＡｂ（１：１００希釈）と反応させて（２５℃、３０分）、ＰＢＳＢで洗浄した。再び、Ｒ−フィコエリトリン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：２５希釈）と氷にて１５分間反応させＰＢＳＢにより洗浄した後、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）を利用して分析した。分析の結果、ＥＧＦＲ変異体が酵母細胞表面によく発現していることを確認した（図７参照）。
【００５３】
２．２．３  フローサイトメトリーを用いたＥＧＦＲ変異体とＧＣ１１１８間結合の分析
酵母細胞の表面に発現されたＥＧＦＲ変異体とＧＣ１１１８間の結合をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Becton Dickinson社）を用いて確認した。対照群の抗体としてセツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）を使用した。約１ｘ１０７個の発現された酵母を０．１ｍｌのＰＢＳＢ（りん酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）で各抗体１ｕｇと反応させて（２５℃、３０分）、ＰＢＳＢで洗浄した。次に、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ（１：５０希釈）と氷にて１５分間反応させＰＢＳＢで洗浄した後、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを利用して、平均蛍光強度を測定した。測定結果は、表４および図８に示した。表４から分かるように、構造によって明らかにした本発明のエピトープであるＲ３５３、Ｆ３５７、Ｈ３５９をグリシンに置換した変異体においてＧＣ１１１８の結合が阻害され、この部位がＧＣ１１１８のエピトープであることが証明された。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
（実施例３）
[ＥＧＦＲに対するＧＣ１１８とリガンドの競合的結合の分析]
ＧＣ１１１８および表５に記載の６種のＥＧＦＲリガンドがＥＧＦＲに対する結合部位が同一かまたは類似であるかを調べるために競合的結合の試験を行った。比較群の抗体としてセツキシマブを使用した。まず、２μｇ／ｍｌでＥＧＦＲがコーティングされたプレートに一定濃度の抗体（１．５ｎＭ）と、さまざまな濃度のリガンドを同時に反応させる。この際、リガンドの濃度は、抗体：リガンドのモル比が１：１、１：１０、１：１０２、１：１０３、１：１０４、１：１０５になるようにする。常温で３０分間反応後、ＰＢＳＴ（りん酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄する。その後、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ペルオキシダーゼ結合（Ｓｉｇｍａ  Ａ０１７０、米国）を室温で３０分間反応させ、ＰＢＳＴにより５回洗浄した後、ＴＭＢ（３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン）マイクロウェルペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ５０−７６−０３、米国）溶液を１００μＬずつ各ウェルに添加した後、４０５ｎｍでＯＤ値を測定した。リガンド濃度を高めることによりＧＣ１１１８のＥＧＦＲに対する結合力が減少すると、両反応物（抗体、リガンド）が競争しているということであり、これは両反応物のＥＧＦＲに対するエピトープが一致するか、非常に近接していることを意味する。抗体とリガンドとの競争状況を図９および表６に示した。その結果、ＧＣ１１１８がセツキシマブに比べＥＧＦ、ＴＧＦ−ａ、ＢＴＣ、ＥＰＲ、ＨＢ−ＥＧＦの結合を阻害する能力が優れていることが分かる。
【００５６】
【表５】
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【００５７】
【表６】
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【００５８】
（実施例４）
[上皮成長因子受容体リガンドによる細胞増殖の誘導抑制効果]
本発明のＧＣ１１１８およびセツキシマブの上皮成長因子受容体リガンドによって誘導されたがん細胞の増殖抑制能を比較するために、大腸がん細胞株であるＬＳ１７４Ｔ細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＬ−１８８）を、細胞数が３，０００になるように９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ社）に播いた。１日が経過した後、培養培地を除去した後、ＧＣ１１１８と比較抗体セツキシマブを、ウシ血清を含まない培養培地にそれぞれ０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの濃度で処理した。抗体処理と同時にＥＧＦＲリガンドを種類別に濃度（ＥＧＦ；５０ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦ−ａ；１００ｎｇ／ｍｌ、アンフィレグリン；１００ｎｇ／ｍｌ、エピレグリン；３００ｎｇ／ｍｌ、ＨＢ−ＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ、βセルリン；１００ｎｇ／ｍｌ）により処理した後、３日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。３日後、がん細胞の増殖程度を測定するためにＭＴＳ溶液（CellTiter96 Aqueous One solution Reagent、Promega）を９６ウェルプレートにて培養されたがん細胞に４０μｌずつ添加してから、３７℃のＣＯ２インキュベーターで３時間の反応後、４９０ｎｍにおいてＯＤ値を測定した。
【００５９】
その結果、ＧＣ１１１８がセツキシマブと比較して、ＥＧＦ、ＴＧＦ−ａ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＴＣなどに誘導されるがん細胞の増殖をはるかに効果的に抑制していて、この結果は、実施例３の結果と一致することが分かる。
【００６０】
このような結果から、本発明に係るエピトープを有する抗体は、セツキシマブとは差別されるエピトープを有していて、リガンド結合の抑制能が優れているので、細胞増殖の抑制効能もより優れており（図１０参照）、特に、本発明に係るエピトープに結合する抗体は、ＥＧＦだけでなく、ＴＧＦ−α、ＡＲ、ＢＴＣ、ＥＰＲおよびＨＢ−ＥＧＦなどの多様なＥＧＦＲリガンドのＥＧＦＲとの結合を効率的に阻害することができるので、ＥＧＦだけでなく、他のＥＧＦＲリガンドとの結合に起因するＥＧＦＲの活性化により発生するがんなど、さまざまな疾患の治療に利用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明に係るＥＧＦＲ上のエピトープは、非常に高度に保存されており、ＥＧＦとの結合に密接に関連している領域内に位置しているので、前記エピトープに対する抗体を含む組成物、または前記エピトープを含むワクチン組成物は、ＥＧＦとＥＧＲＦとの結合によるシグナル伝達を効率的に遮断して、がんなどのさまざまな疾患の治療において非常に有効利用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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