(57)【要約】熱発生の調節のための新規な方法および組成物を提供する。このような方法は、対象が食事制限によりカロリー摂取を調整する必要がなく、身体活動を修正する必要がなく、または肥満手術を受ける必要がなく、対象において体脂肪の減少を可能にするという点で、特に有益である。したがって、本発明の方法は、肥満の治療または予防に特に有用である。熱発生制御因子の活性を調節する新規薬剤をスクリーニングする方法もまた提供する。2015518485.tif 000084
2015518485.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞における呼吸鎖脱共役を調節する方法であって、細胞を、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤の活性を調節するmiRNA剤と接触させる段階を含む、方法。
【請求項２】
細胞が、前脂肪細胞、脂肪細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、肝細胞、筋細胞、またはそれらの前駆体である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
組織における熱発生を調節する方法であって、組織を、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤の活性を調節するmiRNA剤と接触させる段階を含む、方法。
【請求項４】
組織が、褐色脂肪、白色脂肪、皮下脂肪組織、肝臓、または筋肉である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
組織をエクスビボでmiRNA剤と接触させる、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
その治療を必要とするヒト対象において肥満を治療する方法であって、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤の活性または発現を調節するmiRNA剤の有効量をヒト対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項７】
治療のために選択されるヒト対象が、肥満に対する遺伝的素因または後成的素因を有する、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
ミトコンドリア脱共役剤がUCP1またはUCP2である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
miRNA剤が、
2015518485.tif 000081
からなる群より選択されるmiRNAである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
miRNA剤が、表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択されるmiRNAである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
miRNA剤が、
2015518485.tif 000082
からなる群より選択されるmiRNAのアゴミア(agomir)またはアンタゴミア(antagomir)である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
miRNA剤が、表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択されるmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
miRNA剤が、hsa-miR-19b-2-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-211、hsa-miR-325、hsa-miR-382-3p/5p、hsa-miR-543、hsa-miR-515-3p、およびhsa-miR-545からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
miRNA剤が、hsa-miR-331-5p、hsa-miR-552、hsa-miR-620、およびhsa-miR-1179からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
miRNA剤が標的指向部分に連結される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
標的指向部分がアプタマーである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
標的指向部分がmiRNA剤を特定の細胞型または組織に送達する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
miRNA剤が、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
miRNA剤が、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
miRNA剤が、ミトコンドリア脱共役タンパク質の活性化因子または抑制因子の活性を調節する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
活性化因子または抑制因子が、表2に記載される活性化因子または抑制因子からなる群より選択される、請求項18に記載の方法。
【請求項２２】
miRNA剤が、活性化因子または抑制因子のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する、請求項20または21に記載の方法。
【請求項２３】
miRNA剤が、活性化因子または抑制因子のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する、請求項20または21に記載の方法。
【請求項２４】
ミトコンドリア脱共役タンパク質のmRNAまたはタンパク質発現が上方制御される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ミトコンドリア脱共役タンパク質のミトコンドリア脱共役活性が上方制御される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
以下を含む、熱発生を調節するmiRNA剤をスクリーニングする方法：
a) ヒトゲノムを含む指標細胞を提供する段階；
b) 該指標細胞を試験miRNA剤と接触させる段階；ならびに
c) 該miRNA剤の存在下および非存在下において、該指標細胞における少なくとも1つの熱発生制御因子の細胞活性を決定する段階であって、試験miRNA剤の存在下における熱発生制御因子の活性の変化により、その試験miRNA剤が熱発生を調節するmiRNA剤として同定される、段階。
【請求項２７】
細胞が、脂肪細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、肝細胞、筋細胞、またはそれらの前駆体である、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
段階 (c) において決定される熱発生制御因子の細胞活性が、熱発生制御因子のmRNA発現レベル、タンパク質発現レベル、またはミトコンドリア脱共役活性である、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
熱発生制御因子がUCP1である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
細胞における少なくとも1つの熱発生制御因子の活性を調節する、アゴミアまたはアンタゴミア。
【請求項３１】
表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択されるmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアである、請求項30に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
【請求項３２】
以下：
2015518485.tif 000083
からなる群より選択されるmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアである、請求項30に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
【請求項３３】
hsa-miR-19b-2-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-211、hsa-miR-325、hsa-miR-382-3p/5p、hsa-miR-543、hsa-miR-515-3p、およびhsa-miR-545からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである、請求項30に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
【請求項３４】
hsa-miR-331-5p、hsa-miR-552、hsa-miR-620、およびhsa-miR-1179からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである、請求項30に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
【請求項３５】
標的指向部分に連結される、請求項30〜34のいずれか一項に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
【請求項３６】
標的指向部分がアプタマーである、請求項35に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
【請求項３７】
標的指向部分がアゴミアまたはアンタゴミアを特定の細胞型または組織に送達する、請求項35または36に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
【請求項３８】
少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する、請求項28〜33のいずれか一項に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
【請求項３９】
少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する、請求項30〜37のいずれか一項に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
【請求項４０】
ミトコンドリア脱共役タンパク質の活性化因子または抑制因子の活性を調節する、請求項30〜37のいずれか一項に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
【請求項４１】
活性化因子または抑制因子が、表2に記載される活性化因子または抑制因子からなる群より選択される、請求項30〜37のいずれか一項に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
【請求項４２】
活性化因子または抑制因子のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する、請求項30〜37のいずれか一項に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
【請求項４３】
活性化因子または抑制因子のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する、請求項30〜37のいずれか一項に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
【請求項４４】
hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される2つ以上のmiRNAを含む、薬学的組成物。
【請求項４５】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項44に記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
2つ以上のmiRNAが組換えベクターから発現される、請求項44に記載の薬学的組成物。
【請求項４７】
組換えベクターが、DNAプラスミド、ウイルスベクター、およびDNAミニサークルからなる群より選択される、請求項47に記載の薬学的組成物。
【請求項４８】
hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される2つ以上のmiRNAを含む、請求項44に記載の薬学的組成物。
【請求項４９】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項48に記載の薬学的組成物。
【請求項５０】
2つ以上のmiRNAが組換えベクターから発現される、請求項48に記載の薬学的組成物。
【請求項５１】
組換えベクターが、DNAプラスミド、ウイルスベクター、およびDNAミニサークルからなる群より選択される、請求項48に記載の薬学的組成物。
【請求項５２】
hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを前脂肪細胞の集団に投与する段階を含む、前脂肪細胞を誘導して脂肪細胞に分化させる方法。
【請求項５３】
前脂肪細胞を脂肪細胞に分化させる誘導が、前脂肪細胞を100 nMロシグリタゾンに2日間曝露した後に維持培地に曝露した場合の、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化よりも大きい、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
1つまたは複数のmiRNAが、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、請求項52に記載の方法。
【請求項５５】
hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを脂肪細胞の集団に投与する段階を含む、脂肪細胞の脂質含量を減少させる方法。
【請求項５６】
脂肪細胞の脂質含量が、100 nMロシグリタゾンに2日間曝露した後に維持培地に曝露した脂肪細胞の脂質含量よりも低い、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
脂肪細胞の脂質含量が、培養期間中100 nMロシグリタゾンに曝露した脂肪細胞の脂肪含量よりも低い、請求項55に記載の方法。
【請求項５８】
培養期間が8〜16日である、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
培養期間が10〜14日である、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
培養期間が14日である、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
1つまたは複数のmiRNAが、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、請求項55に記載の方法。
【請求項６２】
hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを対象に投与する段階を含む、それを必要とする対象においてインスリン感受性を高める方法。
【請求項６３】
対象が哺乳動物である、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
哺乳動物がヒトである、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
1つまたは複数のmiRNAが、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、請求項62に記載の方法。
【請求項６６】
hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを細胞に投与する段階を含む、細胞における1つまたは複数の脱共役タンパク質の発現または活性を増加させる方法。
【請求項６７】
細胞が、褐色脂肪細胞、白色脂肪細胞、皮下脂肪細胞、肝臓細胞、または筋細胞からなる群より選択される、請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
1つまたは複数の脱共役タンパク質がUCP-1またはUCP-2を含む、請求項66に記載の方法。
【請求項６９】
hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを対象に投与する段階を含む、それを必要とする対象において脂肪消失を引き起こす方法。
【請求項７０】
対象が哺乳動物である、請求項69に記載の方法。
【請求項７１】
哺乳動物がヒトである、請求項70に記載の方法。
【請求項７２】
肥満を治療するための医薬の製造における、表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアの使用。
【請求項７３】
1つまたは複数のmiRNAが、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、請求項72に記載の使用。
【請求項７４】
アゴミアまたはアンタゴミアが標的指向部分に連結される、請求項72に記載の使用。
【請求項７５】
標的指向部分がアプタマーである、請求項74に記載の使用。
【請求項７６】
肥満を治療するための、表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアを含む組成物。
【請求項７７】
1つまたは複数のmiRNAが、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、請求項76に記載の組成物。
【請求項７８】
アゴミアまたはアンタゴミアが標的指向部分に連結される、請求項76に記載の組成物。
【請求項７９】
標的指向部分がアプタマーである、請求項76に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2012年4月20日に出願された米国特許出願第61/636,059号；2012年8月10日に出願された米国特許出願第61/681,750号；および2013年3月14日に出願された米国特許出願第61/782,838号の優先権を主張し、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
肥満は蔓延の域に達し、すべての年齢層および社会経済的集団に影響を及ぼしている。世界保健機関は、2008年には、20歳以上の成人15億人が過体重であり、2億人を超える男性および3億人を超える女性が肥満であると推定した。これらの数値は、2030年までに、過体重の人が21億6千万人および肥満症の人が11億2千万人にまで増加すると推定されている。肥満は、所得の喪失、活動日の制限、長期欠勤、仕事での低生産性（プレゼンティーイズム）、生活の質の低下、永久的な能力障害、著しい罹患率および死亡率、ならびに寿命の短縮の源である。実際に、医療費、過剰な死亡率および能力障害によってもたらされる、米国およびカナダにおける過体重および肥満の年間の総経済コストは、2009年には約$3000億であると推定された。肥満の経済コストに関する国際的調査により、それらは総ヘルスケアコストの2%〜10%を占めることが示された。
【０００３】
肥満は、エネルギーの摂取と消費との間の慢性的な不均衡の結果である。これによって過剰なエネルギーが脂肪細胞に貯蔵され、脂肪細胞は典型的に肥大（細胞サイズの増加）および過形成（細胞数または脂肪生成の増加）の両方を示す。肥満の最近の悪化は、飽和脂肪および糖が多い高エネルギー食品の過剰消費と身体活動の減少との組み合わせによるものである。
【０００４】
肥満の現在の対症療法は、主に薬物有効性の限界、ならびに生活様式の変更および治療法の患者の順守の低さのために、長期治療目標を達成することができない。いくつかの肥満治療薬は安全性の理由で市場から除去され、また現在開発中の小分子は、短期有効性が中程度であり、安全性プロファイルが未知であるために、規制当局の承認を得るのに苦心している。現在、制限および吸収阻害肥満手術のみが、いくらかの好ましい心血管利点を伴って、体重過剰の顕著な長期的低下を達成することができる。
【０００５】
したがって、当技術分野において肥満の新規治療法が必要である。
【発明の概要】
【０００６】
肥満は、エネルギーの摂取が消費を上回る慢性的な不均衡の結果であり、この不均衡は白色脂肪細胞内に過剰なエネルギーの貯蔵をもたらす。本開示は、エネルギー貯蔵性の、脂質で満たされた白色脂肪細胞 (WAT) およびエネルギー消費性の、ミトコンドリアリッチな褐色脂肪細胞 (BAT) を含む末梢脂肪細胞を標的化する、肥満の新規治療法に注目する。加えて、本開示は、マイクロRNA (miRNA) 剤を用いて熱発生（生物における熱産生の過程）を調節する方法を提供する。本明細書に記載される方法は概して、単離されたmiRNA剤を用いた、細胞、組織、および／または対象における少なくとも1つの熱発生制御因子（例えばミトコンドリア脱共役剤、例えば脱共役タンパク質1（UCP1、サーモゲニンとしても知られる）または脱共役タンパク質2 (UCP2) など）の直接的および／または間接的調節を含む。UCPは、ATP合成から酸化的リン酸化を脱共役させる。場合によっては、この脱共役反応はエネルギーを熱として消散させる。このような方法は、対象が食事制限によりカロリー摂取を調整する必要がなく、身体活動を修正する必要がなく、または肥満手術を受ける必要がなく、対象において体脂肪の減少を可能にするという点で、特に有益である。したがって、本発明の方法は、肥満の治療または予防に特に有用である。
【０００７】
本発明はまた、熱発生制御因子の活性を調節することができる新規miRNA剤組成物（例えば、miRNA、アゴミア(agomir)、およびアンタゴミア(antagomir)）を提供する。なおさらに、本発明は、熱発生制御因子の活性を調節する新規miRNA剤をスクリーニングする方法を提供する。さらになお、本発明は、miRNA剤の細胞／組織特異的送達を提供する新規薬剤組成物（例えば、アプタマー‐miRNA複合体または「アプタミア(aptamir)」を提供する。
【０００８】
したがって、1つの局面において、本発明は、細胞における呼吸鎖脱共役を調節する方法であって、細胞を、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤の発現レベルおよび／または活性を調節する単離されたmiRNA剤と接触させる段階を含む方法を提供する。いくつかの局面において、本方法は、呼吸鎖脱共役の調節を必要とする対象（例えば、肥満患者）を選択する段階をさらに含む。1つの態様において、miRNA剤は、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤の発現レベルおよび／または活性を上昇させる。ある種の態様において、ミトコンドリア脱共役剤はUCP1またはUCP2である。いくつかの態様において、本方法は、インビボにおいて、細胞における呼吸鎖脱共役を増加させる。他の態様において、本方法は、エクスビボにおいて、細胞における呼吸鎖脱共役を増加させる。ある種の態様において、本方法は、ミトコンドリア脱共役剤の発現（mRNAまたはタンパク質）のレベルまたは活性を決定する段階をさらに含む。ある種の態様において、細胞は、前脂肪細胞、脂肪細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、肝細胞、筋細胞、またはそれらの前駆体である。任意に、脂肪細胞は白色脂肪脂肪細胞または褐色脂肪脂肪細胞であってよい。
【０００９】
別の局面において、本発明は、組織における熱発生を調節する方法であって、組織を、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤の発現レベルおよび／または活性を調節する単離されたmiRNA剤と接触させる段階を含む方法を提供する。いくつかの局面において、本方法は、熱発生の調節を必要とする対象（例えば、肥満患者）を選択する段階をさらに含む。1つの態様において、miRNA剤は、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤の発現レベルおよび／または活性を上昇させる。ある種の態様において、ミトコンドリア脱共役剤はUCP1またはUCP2である。ある種の態様において、本方法は、熱発生を増加させる段階を含む。ある種の態様において、本方法は、ミトコンドリア脱共役剤の発現（mRNAまたはタンパク質）のレベルまたは活性を決定する段階をさらに含む。ある種の態様において、組織は、褐色脂肪、白色脂肪、皮下脂肪組織、肝臓、または筋肉である。ある種の態様では、組織をエクスビボでmiRNA剤と接触させる。
【００１０】
別の局面において、本発明はその治療を必要とするヒト対象において肥満を治療する方法であって、概して、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤の活性を調節するmiRNA剤の有効量をヒト対象に投与する段階を含む方法を提供する。ある種の態様において、治療のために選択されるヒト対象は、肥満に対する遺伝的素因または後成的素因を有する。ある種の態様において、ミトコンドリア脱共役剤はUCP1、UCP2、またはUCP3である。
【００１１】
上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は、hsa-miR-1-1、hsa-miR-1-2、miR-19a-b、hsa-miR-105、hsa-miR-1283、hsa-mir-129、hsa-miR-133a-1、hsa-miR-133a-2、hsa-miR-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-miR-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-22、hsa-mir-22-3p、hsa-mir-22-5p、hsa-mir-24-2、hsa-miR-30a-e、hsa-miR-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-miR-3658、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsa-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-miR-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-miR-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556、およびhsa-miR-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-miR-7a-g、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96、およびhsa-mir-99aからなる群より選択される単離されたmiRNAである。上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は、上記のmiRNAの配列と80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である単離されたmiRNAである。上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は上記のmiRNAのシード配列である。
【００１２】
上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は、表1に記載される536個のmiRNAからなる群より選択される単離されたmiRNAである。上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は、表1に記載されるmiRNAの配列と80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である単離されたmiRNAである。上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は、表1に記載されるmiRNAのシード配列である。
【００１３】
（表１）昇順に記載された脂肪細胞miRNA（miRBase 19命名法）
2015518485.tif 000003
2015518485.tif 000004
2015518485.tif 000005
2015518485.tif 000006
【００１４】
上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は、表11、13、および14に記載される単離されたmiRNAからなる群より選択されるmiRNAである。上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は、表1、11、13、および14に記載されるmiRNAの配列と80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である単離されたmiRNAである。上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は、表11、13、および14に記載されるmiRNAのシード配列である。
【００１５】
上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は、表1に記載されるmiRNAからなる群より選択されるmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアである。
【００１６】
上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は、
2015518485.tif 000007
からなる群より選択されるmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアである。
【００１７】
上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は、表11に記載されるmiRNAからなる群より選択されるmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアである。
【００１８】
上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は、hsa-miR-19b-2-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-211、hsa-miR-325、hsa-miR-382-3p/5p、hsa-miR-543、hsa-miR-515-3p、およびhsa-miR-545からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである。
【００１９】
上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は、hsa-miR-331-5p、hsa-miR-552、hsa-miR-620、およびhsa-miR-1179からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである。
【００２０】
上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は標的指向部分（例えば、アプタマー）に連結される。1つの態様において、標的指向部分は、miRNA剤を、特定の細胞型または組織に送達する。
【００２１】
上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する。
【００２２】
上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する。
【００２３】
上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAの3'UTRに直接結合する。
【００２４】
上記局面のすべてのある種の態様において、miRNA剤は、ミトコンドリア脱共役タンパク質の活性化因子または抑制因子の活性を調節する。1つの態様において、miRNA剤は、活性化因子または抑制因子のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する。1つの態様において、miRNA剤は、活性化因子または抑制因子のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する。1つの態様において、miRNA剤は、活性化因子または抑制因子のmRNAの3'UTRに直接結合する。1つの態様において、活性化因子または抑制因子は、表2に記載される群より選択される。
【００２５】
上記局面のすべてのある種の態様において、ミトコンドリア脱共役タンパク質のmRNAまたはタンパク質発現は上方制御される。
【００２６】
上記局面のすべてのある種の態様において、ミトコンドリア脱共役タンパク質のミトコンドリア脱共役活性は上方制御される。
【００２７】
別の局面において、本発明は、概して以下を含む、熱発生を調節するmiRNA剤をスクリーニングする方法を提供する：指標細胞を提供する段階；該指標細胞を試験miRNA剤と接触させる段階；ならびに該miRNA剤の存在下および非存在下において、該指標細胞における少なくとも1つの熱発生制御因子の細胞活性を決定する段階であって、試験miRNA剤の存在下における熱発生制御因子の活性の変化により、その試験miRNA剤が熱発生を調節するmiRNA剤として同定される段階。指標細胞は哺乳動物細胞であってよい。ある種の態様において、指標細胞は、ヒトゲノムの少なくとも一部を含むヒト細胞である。
【００２８】
ある種の態様において、細胞は、前脂肪細胞、脂肪細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、肝細胞、筋細胞、またはそれらの前駆体である。
【００２９】
ある種の態様において、本方法において決定される熱発生制御因子の細胞活性は、熱発生制御因子のmRNA発現レベル、タンパク質発現レベル、またはミトコンドリア脱共役活性である。
【００３０】
ある種の態様において、試験miRNA剤は、該試験miRNA剤の非存在下における熱発生制御因子の活性のレベルと比較して、熱発生制御因子の活性を上昇させる。
【００３１】
ある種の態様において、熱発生制御因子はUCP1またはUCP2である。
【００３２】
別の局面において、本発明は、細胞における少なくとも1つの熱発生制御因子の活性を調節するアゴミアまたはアンタゴミアを提供する。
【００３３】
ある種の態様において、アゴミアまたはアンタゴミアは、表11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択されるmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアである。
【００３４】
ある種の態様において、アゴミアまたはアンタゴミアは、表1に記載されるmiRNAからなる群より選択されるmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアである。
【００３５】
ある種の態様において、アゴミアまたはアンタゴミアは、
2015518485.tif 000008
からなる群より選択されるmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアである。
【００３６】
ある種の態様において、アゴミアまたはアンタゴミアは、hsa-miR-19b-2-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-211、hsa-miR-325、hsa-miR-382-3p/5p、hsa-miR-543、hsa-miR-515-3p、およびhsa-miR-545からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである。
【００３７】
ある種の態様において、アゴミアまたはアンタゴミアは、hsa-miR-331-5p、hsa-miR-552、hsa-miR-620、およびhsa-miR-1179からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである。
【００３８】
ある種の態様において、アゴミアまたはアンタゴミアは標的指向部分に連結される。
【００３９】
ある種の態様において、標的指向部分はアプタマーである。
【００４０】
ある種の態様において、標的指向部分は、アゴミアまたはアンタゴミアを特定の細胞型または組織に送達する。
【００４１】
ある種の態様において、アゴミアまたはアンタゴミアは、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する。
【００４２】
ある種の態様において、アゴミアまたはアンタゴミアは、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する。
【００４３】
ある種の態様において、アゴミアまたはアンタゴミアは、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAの3'UTRに直接結合する。
【００４４】
ある種の態様において、アゴミアまたはアンタゴミアは、ミトコンドリア脱共役タンパク質の活性化因子または抑制因子の活性を調節する。
【００４５】
ある種の態様において、活性化因子または抑制因子は、表2に記載される群より選択される。
【００４６】
ある種の態様において、アゴミアまたはアンタゴミアは、活性化因子または抑制因子のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する。
【００４７】
ある種の態様において、アゴミアまたはアンタゴミアは、活性化因子または抑制因子のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する。他の態様において、アゴミアまたはアンタゴミアは、活性化因子または抑制因子のmRNAの3'UTRに直接結合する。
【００４８】
本開示はまた、hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアより選択される2つ以上のmiRNAを含む薬学的組成物を提供する。ある種の態様において、薬学的組成物はまた、薬学的に許容される賦形剤を含む。ある種の態様において、2つ以上のmiRNAは組換えベクターから発現される。組換えベクターは、DNAプラスミド、ウイルスベクター、およびDNAミニサークルより選択され得る。
【００４９】
本開示はまた、hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアより選択される1つまたは複数のmiRNAを前脂肪細胞の集団に投与する段階を含む、前脂肪細胞を誘導して最初に白色脂肪細胞に、次に褐色脂肪細胞に分化させる方法を提供する。1つまたは複数のmiRNAはまた、hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアより選択され得る。ある種の態様において、前脂肪細胞を脂肪細胞に分化させるこの誘導は、前脂肪細胞を100 nMロシグリタゾンに2日間曝露した後に維持培地に曝露した場合の、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化よりも大きい。ある種の態様において、脂肪細胞は褐色脂肪細胞である。他の態様において、脂肪細胞は白色脂肪細胞である。分化の付加的基準は、以下の実施例において見出すことができる。
【００５０】
本開示はまた、hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを脂肪細胞の集団に投与する段階を含む、脂肪細胞の脂質含量を減少させる方法を提供する。ある種の態様において、脂肪細胞のこの脂質含量は、100 nMロシグリタゾンに2日間曝露した後に維持培地に曝露した脂肪細胞の脂質含量よりも低いか、または培養期間中100 nMロシグリタゾンに曝露した脂肪細胞の脂肪含量よりも低い。培養期間は、8〜16日、10〜14日、または14日であってよい。培養期間はまた、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20日であってよい。脂肪細胞の脂質含量の付加的基準は、以下の実施例において見出すことができる。
【００５１】
本開示はまた、hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを対象に投与する段階を含む、それを必要とする対象においてインスリン感受性を高める方法を提供する。
【００５２】
ある種の態様において、対象は哺乳動物である。
【００５３】
本開示はまた、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される1つもしくは複数、2つ以上、または3つ以上のmiRNAを細胞に投与する段階を含む、細胞における1つまたは複数の脱共役タンパク質の発現または活性を増加させる方法を提供する。ある種の態様において、細胞は、褐色脂肪細胞、白色脂肪細胞、皮下脂肪細胞、肝臓細胞、または筋細胞からなる群より選択される。他の態様において、1つまたは複数の脱共役タンパク質はUCP1またはUCP2を含む。ある種の態様において、本方法はエクスビボ方法である。他の態様において、本方法はインビボ方法である。ある種の態様において、本方法は、1つまたは複数の脱共役タンパク質（例えば、UCP1、UCP2）の発現レベルまたは活性を上昇させる必要がある対象（例えば、ヒト）を選択する段階を含む。いくつかの態様において、対象は肥満を有するか、または肥満を発症するリスクがある。ある種の態様において、対象は糖尿病を有するか、または糖尿病を発症するリスクがある。ある種の態様において、本方法は、1つまたは複数の脱共役タンパク質の発現レベル（mRNAまたはタンパク質）または活性を決定することをさらに含む。
【００５４】
本開示はまた、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを対象に投与する段階を含む、それを必要とする対象において脂肪消失を引き起こす方法を提供する。ある種の態様において、対象は哺乳動物である。他の態様において、哺乳動物はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１Ａ】2つの異なるレベルのストリンジェンシーでSTRING 9.0データベースを用いて決定された、83個の熱発生制御因子の相互作用の模式図である。
【図１Ｂ】2つの異なるレベルのストリンジェンシーでSTRING 9.0データベースを用いて決定された、83個の熱発生制御因子の相互作用の模式図である。
【図２Ａ】Ingenuity Pathway Analysisソフトウェアプログラムを用いて決定された、83個の熱発生制御因子の相互作用の模式図である。
【図２Ｂ】Reactome Functional Interaction Networkプログラムを用いて決定された、83個の熱発生制御因子の相互作用の模式図である。
【図３】ヒトUCP1遺伝子の5'UTR、プロモーター領域、コード配列、および3'UTR中のmiRNA結合部位を予測する複数のmiRNA予測プログラムによる結果の重複の模式図である。
【図４】83個の熱発生制御因子の遺伝子の5'UTR、プロモーター領域、コード配列、および3'UTR中のmiRNA結合部位を予測する複数のmiRNA予測プログラムによる結果の重複の模式図である。
【図５】ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化の模式図であり、熱を発生させるためのUCP1によるATP合成からの酸化的リン酸化の脱共役を示している。
【図６】他の例示的な熱発生制御因子によるUCP1の転写制御を示す。
【図７】UCP1遺伝子転写の例示的な正 (a) および負 (b) の転写制御因子を示す。
【図８Ａ】ヒトUCP1遺伝子（NCBI参照配列：gi|237858805|ref|NG_012139.1｜ヒト (Homo sapiens) 脱共役タンパク質1（ミトコンドリア、プロトン担体) (UCP1)、第4染色体上のRefSeqGene）の15,910塩基対 (bp) 配列における転写開始部位（5,001位）に関する様々な調節エレメントの位置を示す。
【図８Ｂ】第11染色体上の5,000 bp 5'UTRおよび2,000 bp 3'UTRを含むヒトUCP2遺伝子 (ENSG00000175567) の15,174 bp配列における転写開始部位（5,001位）に関する様々な調節エレメントの位置を示す。
【図９】非標識の前脂肪細胞、またはDy547標識された非標的指向miRNA模倣物またはヘアピン阻害剤をトランスフェクトした前脂肪細胞における相対蛍光を示す棒グラフである。
【図１０】図10Aは、トランスフェクションの4日後の、siRNA対照およびGAPDH siRNAをトランスフェクトした前脂肪細胞におけるGAPDH遺伝子発現の減少を示す棒グラフである。図10Bは、トランスフェクションの12日後の、siRNA対照およびGAPDH siRNAをトランスフェクトした前脂肪細胞におけるGAPDH遺伝子発現の減少を示す棒グラフである。
【図１１】図11Aは、維持培地単独中で2週間培養して、オイルレッドOで染色した前脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。図11Bは、インスリン、トリヨードチロニン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、およびロシグリタゾンの存在下で2日間培養し、その後維持培地中で12日間培養して、オイルレッドOで染色した前脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。図11Cは、実験を通してインスリン、トリヨードチロニン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、およびロシグリタゾンの存在下で培養して、オイルレッドOで染色した前脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。図11Dは、hsa-miR-30b模倣物の存在下で培養して、オイルレッドOで染色した前脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。図11Eは、非標的指向miRNA模倣物の存在下で培養して、オイルレッドOで染色した前脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。図11Fは、非標的指向miRNA阻害剤の存在下で培養して、オイルレッドOで染色した前脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１２Ａ】ロシグリタゾンの存在下における熱発生標的のmRNA発現を示す棒グラフである。
【図１２Ｂ】hsa-let-7a阻害剤の存在下における熱発生標的のmRNA発現を示す棒グラフである。
【図１２Ｃ】hsa-miR-1模倣物の存在下における熱発生標的のmRNA発現を示す棒グラフである。
【図１２Ｄ】hsa-miR-19b模倣物の存在下における熱発生標的のmRNA発現を示す棒グラフである。
【図１２Ｅ】hsa-miR-30b模倣物の存在下における熱発生標的のmRNA発現を示す棒グラフである。
【図１２Ｆ】未処理の前脂肪細胞における熱発生標的のmRNA発現を示す棒グラフである。
【図１３】x軸に平均遺伝子発現を示し、y軸に対数尺度での対間の差を示しているM-Aプロットである。
【図１４】miRNA類似体hsa-let-7a阻害剤、hsa-miR-1模倣物、hsa-miR-19b模倣物、およびhsa-miR-30b模倣物の存在下で有意に上方制御される遺伝子の数が、それぞれ305個、247個、255個、および267個であったことを示すベン図を示す略図である。リストに記載されたmiRNA類似体によって、一組の127個の遺伝子が共通して上方制御された。
【図１５】miRNA類似体hsa-let-7a阻害剤、hsa-miR-1模倣物、hsa-miR-19b模倣物、およびhsa-miR-30b模倣物の存在下で有意に下方制御される遺伝子の数が、それぞれ143個、177個、115個、および165個であったことを示すベン図を示す略図である。リストに記載されたmiRNA類似体によって、一組の60個の遺伝子が共通して下方制御された。
【図１６】非標識の脂肪細胞、またはDy547標識された非標的指向miRIDIAN模倣物またはヘアピン阻害剤をトランスフェクトした脂肪細胞における相対蛍光を示す棒グラフである。
【図１７】図17Aは、トランスフェクションの4日後の、siRNA対照およびGAPDH siRNAをトランスフェクトした細胞におけるGAPDH遺伝子発現の減少を示す棒グラフである。図17Bは、トランスフェクションの12日後の、siRNA対照およびGAPDH siRNAをトランスフェクトした細胞におけるGAPDH遺伝子発現の減少を示す棒グラフである。
【図１８】図18Aは、維持培地単独中で2週間培養して、オイルレッドOで染色した成熟脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。図18Bは、ロシグリタゾンの存在下で2週間培養して、オイルレッドOで染色した成熟脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。図18Cは、非標的指向miRNAの存在下で培養して、オイルレッドOで染色した成熟脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。図18Dは、hsa-miR-30b模倣物の存在下で培養して、オイルレッドOで染色した成熟脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１９】様々なmiRNA類似体またはロシグリタゾンに曝露した成熟脂肪細胞における脂質の量（ナイルレッド蛍光色素）を示す棒グラフである。
【図２０】様々なトランスフェクション剤に曝露した成熟脂肪細胞から抽出された全RNAの量を示す棒グラフである。
【図２１】様々なトランスフェクション剤を用いてGAPDH特異的miRNA模倣物をトランスフェクトした成熟脂肪細胞におけるGAPDH遺伝子発現の減少を示す棒グラフである。
【図２２−１】維持培地単独（対照）、50 nM hsa-let-7a阻害剤、10μM β3アドレナリン受容体アゴニストCL316,243、50 nM hsa-miR-1模倣物中で2週間培養した成熟脂肪細胞の明視野顕微鏡写真を示す。
【図２２−２】10 nMの甲状腺ホルモンであるトリヨードチロニン、50 nM hsa-miR-19b模倣物、100 nMロシグリタゾン、または50 nM hsa-miR-30b模倣物中で2週間培養した成熟脂肪細胞の明視野顕微鏡写真を示す。
【図２３】ヒト細胞の表面における特有の標的に対して特異的に指向されるアプタマーを単離するために用いられるCell-SELEX過程の模式図である。
【図２４−１】選択された蛍光アプタマーのヒト肝細胞および脂肪細胞に対する結合を評価するFACS実験の結果を示す。
【図２４−２】選択された蛍光アプタマーのヒト肝細胞および脂肪細胞に対する結合を評価するFACS実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
発明の詳細な説明
I. 定義
別段の規定がない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されている意味と同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含め、本出願が優先する。
【００５７】
本明細書で用いられる場合、「miRNA剤」という用語は、熱発生制御因子（例えば、ミトコンドリア脱共役剤またはその活性化因子もしくは抑制因子）の活性を直接的または間接的に調節するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド模倣物を指す。miRNA剤は、標的遺伝子または標的miRNAに作用し得る。
【００５８】
本明細書で用いられる場合、「miRNA」という用語は、標的遺伝子（mRNAまたはDNAのいずれか）に結合し、その遺伝子の発現を調節することができる一本鎖RNA分子（またはその合成誘導体）を指す。ある種の態様において、miRNAは生物において天然に発現される。
【００５９】
本明細書で用いられる場合、「シード配列」という用語は、標的特異性の重要な決定基である、miRNAの5'末端における最初の8 ヌクレオチド (nt)（すなわち、シード配列）内の6〜8nt長部分列を指す。
【００６０】
本明細書で用いられる場合、「アゴミア」という用語は、miRNAを機能的に模倣する合成のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド模倣物を指す。アゴミアは、miRNAまたはmiRNAの一部と同じまたは類似の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであってよい。ある種の態様において、アゴミアは、それが模倣するmiRNAとの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドの違いを有する。さらに、アゴミアは、それが模倣するmiRNAと同じ長さ、それよりも長い長さ、またはそれよりも短い長さを有し得る。ある種の態様において、アゴミアは、それが模倣するmiRNAの5'末端における6〜8ヌクレオチドと同じ配列を有する。他の態様において、アゴミアは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17 18、19、20、21、22、23、24、25、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチド長であってよい。他の態様において、アゴミアは、5〜10、6〜8、10〜20、10〜15、または5〜500ヌクレオチド長であってよい。ある種の態様において、アゴミアは、表1、11、13、および14に示される配列のいずれかを含む。これらの化学修飾された合成RNA二重鎖は、miRISC複合体への効率的な負荷を可能にするために、関心対象のmiRNAと同一であるかまたは実質的に同一であるガイド鎖を含むのに対して、パッセンジャー鎖は、miRISC複合体中のアルゴノートタンパク質へのその負荷を妨げるように化学修飾される（Thorsen SB et al., Cancer J., 18(3):275-284 (2012)；Broderick JA et al., Gene Ther., 18(12):1104-1110 (2011))。
【００６１】
本明細書で用いられる場合、「アンタゴミア」という用語は、特定のマイクロRNAに対する相補性を有し、かつそのmiRNAの活性を阻害する合成のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド模倣物を指す。ある種の態様において、アンタゴミアは、それが阻害するmiRNAとの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドの違いを有する。さらに、アンタゴミアは、それが阻害するmiRNAと同じ長さ、それよりも長い長さ、またはそれよりも短い長さを有し得る。ある種の態様において、アンタゴミアは、それが阻害するmiRNAの5'末端における6〜8ヌクレオチドとハイブリダイズする。他の態様において、アンタゴミアは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17 18、19、20、21、22、23、24、25、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチド長であってよい。他の態様において、アンタゴミアは、5〜10、6〜8、10〜20、10〜15、または5〜500ヌクレオチド長であってよい。ある種の態様において、アンタゴミアは、表1、11、13、および14に示される配列のいずれかと相補的なヌクレオチドを含む。アンタゴミアは、特定のmiRNAに堅固に結合し、それを不活化する合成逆相補体である。ヌクレアーゼ耐性および結合親和性を改善するために、様々な化学修飾が用いられる。効力を高めるために最も一般的に用いられる修飾には、2'-O-Me、2'-O-メトキシエチル (2'-MOE)、または2'-フルオロ (2'-F) などの2'糖修飾が含まれる。miRNAの核酸構造はまた、核酸のA型高次構造においてリボースを3'-エンド (North) 高次構造に固定するための、2'酸素と4'炭素との間のメチレン架橋を有するロック核酸 (LNA) となるように修飾することもできる（Lennox KA et al.. Gene Ther. Dec 2011;18(12):1111-1120；Bader AG et al. Gene Ther. Dec 2011;18(12):1121-1126）。この修飾により、その分子の標的特異性およびハイブリダイゼーション特性の両方が顕著に向上する。
【００６２】
本明細書で用いられる場合、「アプタミア」という用語は、アプタマー（特定の標的分子に結合するオリゴ核酸またはペプチド分子）と上記で定義したアゴミアまたはアンタゴミアの組み合わせを指し、これによってmiRNA剤の細胞または組織特異的送達が可能になる。
【００６３】
本明細書で用いられる場合、「干渉RNA」という用語は、RNA干渉を媒介することによって遺伝子発現を阻害または下方制御することができる任意の二本鎖または一本鎖RNA配列を指す。干渉RNAには、低分子干渉RNA（「siRNA」）および低分子ヘアピン型RNA（「shRNA」）が含まれるが、これらに限定されない。「RNA干渉」とは、配列適合性のメッセンジャーRNA転写物の選択的分解を指す。
【００６４】
本明細書で用いられる場合、「低分子干渉RNA」または「siRNA」という用語は、配列特異的様式でRNA干渉を媒介することにより遺伝子発現を阻害または下方制御することができる任意の低分子RNAを指す。低分子RNAは、例えば約16〜21ヌクレオチド長であってよい。
【００６５】
本明細書で用いられる場合、「shRNA」（低分子ヘアピン型RNA）という用語は、アンチセンス領域、ループ部分、およびセンス領域を含むRNA分子であって、そのセンス領域が、二重鎖ステムを形成するためにアンチセンス領域と塩基対合する相補的ヌクレオチドを有する、RNA分子を指す。転写後プロセシングの後、低分子ヘアピン型RNAは、RNase IIIファミリーのメンバーである酵素ダイサーによって媒介される切断事象により、低分子干渉RNA (siRNA) に変換される。
【００６６】
本明細書で用いられる場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、DNAまたはmRNA配列（例えば、miRNA）と相補的な合成のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド模倣物を指す。
【００６７】
本明細書で用いられる場合、「miR-マスク」という用語は、標的mRNA中のmiRNA結合部位と相補的であり、かつmRNA結合部位へのmiRNAの結合を阻害するのに役立つ一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。例えば、その全体が本明細書に組み入れられる、Xiao, et al. 「Novel approaches for gene-specific interference via manipulating actions of microRNAs: examination on the pacemaker channel genes HCN2 and HCN4,」 Journal of Cellular Physiology, vol. 212, no. 2, pp. 285-292, 2007を参照されたい。
【００６８】
本明細書で用いられる場合、「miRNAスポンジ」という用語は、関心対象のmiRNAに対する複数のタンデム結合部位を含み、かつ関心対象の内因性miRNAを滴定除去し、それによって関心対象のmiRNAのその内因性標的への結合を阻害するのに役立つ合成核酸（例えば、mRNA転写物）を指す。例えば、その全体が本明細書に組み入れられる、Ebert et al., 「MicroRNA sponges: competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells,」 Nature Methods, vol. 4, no. 9, pp. 721-726, 2007を参照されたい。
【００６９】
本明細書で用いられる場合、「呼吸鎖脱共役」という用語は、ミトコンドリア内膜のプロトン勾配の消散を指し、これによって酸化的リン酸化によるミトコンドリアにおけるATPの合成が妨げられる。
【００７０】
本明細書で用いられる場合、「ミトコンドリア脱共役剤」という用語は、ミトコンドリア内膜のプロトン勾配を消散させることができるタンパク質（またはコード核酸）を指し、これによって酸化的リン酸化によるミトコンドリアにおけるATPの合成が妨げられる。例示的なミトコンドリア脱共役剤には、UCP1およびUCP2が含まれる。
【００７１】
本明細書で用いられる場合、ミトコンドリア脱共役剤の「活性化因子」または「抑制因子」という用語は、ミトコンドリア脱共役剤の活性をそれぞれ上方制御または下方制御するのに役立つタンパク質を指す。
【００７２】
本明細書で用いられる場合、「熱発生制御因子」という用語は、熱発生を直接的または間接的に調節するタンパク質（またはコード核酸）を指す。本用語は、ミトコンドリア脱共役剤、ならびにまたミトコンドリア脱共役剤の活性化因子および抑制因子を包含する。例示的な熱発生制御因子は、本明細書の表2に記載される。
【００７３】
本明細書で用いられる場合、「調節する」という用語は、あるパラメータを増加または減少させることを指す。例えば、あるタンパク質の活性を調節するために、そのタンパク質の活性を増加または減少させることができる。
【００７４】
本明細書で用いられる場合、ミトコンドリア脱共役剤または熱発生制御因子の「活性」という用語は、非限定的に、mRNA発現、タンパク質発現、または呼吸鎖脱共役を含む、任意の測定可能な生物活性を指す。
【００７５】
miRNA剤組成物の「有効量」とは、ヒトにおいて障害を治療もしくは予防する上で効果的であるために、または生理的状態を調節するために十分な量である。ある種の態様において、この生理的状態は肥満である。
【００７６】
「対象」とは、ヒト、飼育動物および家畜、動物園の動物、運動動物、または愛玩動物、例えば、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、および高等霊長類などを含む、哺乳綱の任意のメンバーを含む脊椎動物である。
【００７７】
「哺乳動物」という用語は、齧歯類、霊長類、イヌ、ネコ、ラクダ類、および有蹄動物を含む、哺乳綱のメンバーである任意の種を指す。「齧歯類」という用語は、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、およびウサギを含む、齧歯目のメンバーである任意の種を指す。「霊長類」という用語は、サル、類人猿、およびヒトを含む、霊長目のメンバーである任意の種を指す。「ラクダ類」という用語は、ラクダおよびラマを含む、ラクダ科のメンバーである任意の種を指す。「有蹄動物」という用語は、ウシ、ウマ、およびラクダ類を含む、有蹄上目のメンバーである任意の種を指す。いくつかの態様によれば、哺乳動物はヒトである。
【００７８】
本明細書で用いられる「治療」または「治療すること」とは、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患に対する素因を治癒させる、治す、軽減する、緩和する、変化させる、改善する、回復させる、好転させる、またはそれらに作用することを目的とした、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害に対する素因を有する患者への治療薬（例えば、miRNA剤またはそれをコードするベクターもしくは導入遺伝子）の適用もしくは投与、またはそのような患者由来の単離された組織もしくは細胞株への治療薬の適用もしくは投与と定義される。
【００７９】
本明細書で用いられる場合の「薬理ゲノミクス」とは、臨床開発中および市販の薬物に対する、遺伝子配列決定、統計遺伝学、および遺伝子発現解析などのゲノミクス技術の適用を指す。より具体的には、本用語は、患者の遺伝子が、薬物に対するその患者の反応をどのように決定するかに関する研究を指す（例えば、患者の「薬物反応表現型」または「薬物反応遺伝子型」）。
【００８０】
miRNA剤組成物の「有効量」とは、ヒトにおいて障害を治療もしくは予防する上で効果的であるために、または生理的状態を調節するために十分な量である。
【００８１】
II. 熱発生および肥満
ある種の態様において、本発明は、熱発生を調節する方法を提供する。これらの方法は概して、細胞または組織を、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤（例えば、UCP1および／またはUCP2）の活性を調節するmiRNA剤と接触させる段階を含む。このような方法および組成物は、肥満の治療に特に有用である。
【００８２】
哺乳動物の脂肪細胞は、それらの機能プロファイルに基づいて2つの主要なカテゴリーに分類され得る：1) エネルギー貯蔵および放出性の、脂質で満たされた白色脂肪細胞 (WAT)、ならびに；2) エネルギー消費性かつ熱産生性の、ミトコンドリアリッチな褐色脂肪細胞 (BAT)。最近まで、BATは幼児期早期に急速に退縮し、成人では痕跡量のみが残っていると考えられていた。しかしながら、トレーサー18F-フルオロデオキシグルコース (18F-FDG) を用いてヒトで行われたポジトロン放出断層撮影 (PET) 研究により、1) BATの複数の貯蔵所が、成人対象の頸部、鎖骨上部、腋窩部、および傍脊椎部になお存在していること；2) 成人におけるBATが、低温への曝露により迅速に活性化され得ること；3) BATの活性と、年齢、肥満度指数 (BMI)、体脂肪率、空腹時血糖値、β遮断薬の使用、および戸外温度との間に逆相関があること；ならびに4) BATの増殖が、カテコールアミン産生褐色細胞腫に付随する体重減少を駆動し得るのに対して、受容体機能の低下を招くβ3アドレナリン受容体多型が、体重増加および2型糖尿病の早期発症と関連していることが実証された。
【００８３】
WATおよびBATは間葉系幹細胞に由来するが、それらは異なる系譜を有し、Myf5（筋原性制御因子5）（筋骨格細胞前駆体と共有される）、PGC-1α、およびPRDM16（PRドメイン含有16）の発現が、褐色脂肪細胞前駆体と白色脂肪細胞前駆体とを区別する。古典的な褐色脂肪細胞に加えて、WATが優勢である組織において、異なる種類の褐色脂肪細胞が誘導され得る。「ブライト (brite)」（白色中の褐色）脂肪細胞という用語が作り出され、WAT貯蔵所内の褐色様脂肪細胞の出現は、代謝表現型の改善と関連がある。BATの量および／または活性を増加させることで、肥満からのある程度の防御がもたらされる。BATによる熱産生は、他のすべての組織では1 W/gであるのに対して300 W/gである。わずか50 gほどのBATが1日のエネルギー消費量の20%を占めるため、エネルギーバランスに大きな影響を与えるためには、比較的限られた量のBATが必要である。対象1人の鎖骨上／傍頸部貯蔵所に見出される推定63 gのBATは、1年間で4.1 kgのWATに相当するエネルギーを燃焼し得ると推測された。
【００８４】
ミトコンドリア脱共役タンパク質 (UCP) は、ミトコンドリア陰イオン担体タンパク質 (MACP) のファミリーのメンバーである。UCPはATP合成から酸化的リン酸化を切り離し、エネルギーを熱として消散させる（「ミトコンドリアプロトン漏出」とも称される）。UCPは、ミトコンドリ膜の内側から外側への陰イオンの移動、およびミトコンドリア膜の外膜から内側へのプロトンの還流移動を促進し、その過程で熱が生じる。UCPは、熱発生および熱消散を担う主要なタンパク質である。脱共役タンパク質1 (UCP1) はサーモゲニンとも称され、熱発生および熱消散を担うBAT特異的タンパク質である。UCP2は、やはり脂肪細胞で発現される別の脱共役タンパク質である。UCPは、熱発生制御因子タンパク質のネットワークの一部である（図1を参照されたい）。例示的な熱発生制御因子は表2に記載される。
【００８５】
BATの分化および／またはミトコンドリア脱共役タンパク質を誘導するための熱発生制御因子の調節は、対象において熱産生を誘導し、ひいては肥満を治療する方法を提供する。しかしながら、これらの分子は、伝統的な創薬の「創薬標的となり得る領域」を占める古典的な「標的クラス」（キナーゼ、イオンチャネル、Gタンパク質共役受容体など）に属さないため、化学薬理学的アプローチはこれらの分子を標的化することができない。したがって、本発明は、miRNA剤を用いて、これらの熱産生制御因子を調節するための新規な方法および組成物を提供する。
【００８６】
ある種の態様において、miRNA剤は、ミトコンドリア脱共役剤の活性（例えば、mRNA発現レベル、タンパク質発現レベル、またはミトコンドリア脱共役活性）を上方制御するために使用される。ミトコンドリア脱共役剤の上方制御は、いくつかの方法で達成することができる。1つの態様において、miRNA剤は、ミトコンドリア脱共役剤の活性（例えば、mRNA発現レベル、タンパク質発現レベル）の下方制御を担う天然のmiRNAの活性を直接阻害する。別の態様において、miRNA剤は、ミトコンドリア脱共役剤の活性化因子の活性（例えば、mRNA発現レベルまたはタンパク質発現レベル）を上方制御する。この上方制御は、例えば、活性化因子の発現の下方制御を担う天然のmiRNAの活性を直接阻害することによって達成することができる。さらに別の態様において、miRNA剤は、ミトコンドリア脱共役剤の抑制因子の活性（例えば、mRNA発現レベルまたはタンパク質発現レベル）を下方制御する。この下方制御は、例えば、miRNA剤を用いて、ミトコンドリア脱共役剤の抑制因子の発現を直接阻害することによって達成することができる。
【００８７】
ある種の態様では、複数の熱発生制御因子の活性を同時に調節することができるmiRNA剤が使用される（ユニバーサルmiRNA剤とは対照的に経路特異的miRNA剤）。例えば、複数の熱発生制御因子に結合する単一のmiRNA、アゴミア、またはアンタゴミアを用いることができる。このアプローチは、これによって、単一のmiRNA剤を用いて全シグナル伝達経路の複数のメンバーの調節が可能になるという点で、特に有益である。
【００８８】
ある種の態様では、複数の阻害性miRNA剤（例えば、アンタゴミアまたはmiR-マスク）が使用される。これらの阻害性miRNA剤は、同じまたは異なるmiRNA標的を有し得る。
【００８９】
III. miRNA剤
ある種の態様において、本発明は、熱発生制御因子（例えば、UCP1および／またはUCP2などのミトコンドリア脱共役剤）の調節のためにmiRNA剤を使用する。本明細書に開示される方法において使用するのに適したmiRNA剤には、非限定的に、miRNA、アゴミア、アンタゴミア、miR-マスク、miRNA-スポンジ、siRNA（一本鎖または二本鎖）、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、または標的核酸の少なくとも一部とハイブリダイズし、その機能を調節するその他のオリゴヌクレオチド模倣物が含まれる。
【００９０】
ある種の態様において、miRNA剤はmiRNA分子またはその合成誘導体（例えば、アゴミア）である。1つの特定の態様において、miRNA剤はmiRNAである。miRNAは、哺乳動物を含む種々の生物に存在し、進化において保存されている低分子（例えば、18〜24ヌクレオチド）非コードRNAのクラスである。miRNAは、RNAseIII酵素ドローシャおよびダイサーによる連続的切断により、一次転写物に由来する約70ヌクレオチドのヘアピン型前駆体からプロセシングされる。多くのmiRNAは、プレmRNAのイントロン内またはncRNA遺伝子内に受け入れられる遺伝子間領域においてコードされ得る。多くのmiRNAはまた、クラスター化され、ポリシストロンとして転写される傾向があり、類似した時空間的発現パターンを有する場合が多い。一般的に、miRNAは、標的遺伝子（mRNAまたはDNA）上の相補的配列に結合し、例えば翻訳抑制または標的分解によって遺伝子サイレンシングをもたらす転写後制御因子である。1つのmiRNAが、多くの異なる遺伝子を同時に標的化し得る。開示される方法において使用するための例示的なmiRNA分子には、非限定的に、
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が含まれる。他の態様において、開示される方法において使用するための例示的なmiRNA分子には、本明細書の表1、11、13、および14に開示されているmiRNAが含まれる。1つの特定の態様において、miRNA剤は、ヒトmiR-22またはその機能的誘導体である。 
【００９１】
別の特定の態様において、miRNA剤はアゴミアである。特定のmiRNAのアゴミアは、本明細書に開示されるスクリーニング方法を用いて同定することができる。1つの特定の態様において、アゴミアは、ヒトmiR-22の機能的模倣物である (Davidson BL et al., Nat. Rev. Genet., 12(5):329-340 (2011)。
【００９２】
ある種の態様において、miRNA剤は、1つまたは複数のmiRNAの活性を阻害するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド模倣物である。このような分子の例には、非限定的に、アンタゴミア、干渉RNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイザイム、miRNAスポンジ、およびmiR-マスクが含まれる。1つの特定の態様において、miRNA剤はアンタゴミアである。一般的に、アンタゴミアは、標的miRNAに結合し、該miRNAのその同族遺伝子標的への結合を妨げることによってmiRNA機能を阻害する、化学修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンタゴミアは、当技術分野で公知の任意の塩基修飾を含み得る。1つの特定の態様において、アンタゴミアはヒトmiR-22の活性を阻害する（van Rooij E et al., Circ. Res., 110(3):496-507 (2012)；Snead NM et al., Nucleic Acid Ther., 22(3):139-146 (2012)；Czech MP et al., Nat. Rev. Endocrinol., 7(8):473-484 (2011)。
【００９３】
ある種の態様において、miRNA剤は10〜50ヌクレオチド長である。当業者は、これが、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50ヌクレオチド長、またはその中の任意の範囲のアンチセンス部分を有するオリゴヌクレオチドを具体化することを認識するであろう。
【００９４】
ある種の態様において、miRNA剤は、それぞれが少なくとも1つのヌクレオチドで構成されている、2つ以上の化学的に別個の領域を含むキメラオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型的に、1つまたは複数の有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増加、細胞内への取り込みの増加、標的に対する結合親和性の増加など）を付与する修飾ヌクレオチドの少なくとも1つの領域、およびRNA:DNAハイブリッドまたはRNA:RNAハイブリッドを切断し得る酵素の基質である領域を含む。本発明のキメラ阻害性核酸は、上記の2つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および／またはオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造として形成され得る。このような化合物はまた、当技術分野においてハイブリッドまたはギャップマー(gapmer)と称されている。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,013,830号；第5,149,797号；第5, 220,007号；第5,256,775号；第5,366,878号；第5,403,711号；第5,491,133号；第5,565,350号；第5,623,065号；第5,652,355号；第5,652,356号；および第5,700,922号が含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
ある種の態様において、miRNA剤は、糖の2'位で修飾された少なくとも1つヌクレオチド、最も好ましくは2'-O-アルキル、2'-O-アルキル-O-アルキル、または2'-フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。他の好ましい態様において、RNA修飾には、ピリミジン、塩基性残基、またはRNAの3'末端の逆位塩基のリボース上の2'-フルオロ、2'-アミノ、および2' O-メチル修飾が含まれる。そのような修飾は、通常通りにオリゴヌクレオチドに組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して2'-デオキシオリゴヌクレオチドよりもより高いTm（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することが示されている。
【００９６】
多くのヌクレオチドおよびヌクレオシド修飾により、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ消化に対してより耐性となり、それによってインビボ半減期が延びることが示されている。修飾オリゴヌクレオチドの具体例には、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環糖間結合を含む骨格を含むものが含まれる。最も好ましいのは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド、ならびにヘテロ原子骨格、特にCH2-NH-O-CH2、CH2-N(CH3)-O-CH2（メチレン(メチルイミノ)またはMMI骨格として知られる）、CH2-O-N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2、およびO-N(CH3)-CH2-CH2骨格、ここで天然のホスホジエステル骨格はO-P-O-CHと表される；アミド骨格（De Mesmaeker et al. Ace. Chem. Res. 1995, 28:366-374を参照されたい）；モルホリノ骨格構造（Summerton and Weller、米国特許第5,034,506号を参照されたい）；ペプチド核酸 (PNA) 骨格（この場合、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格がポリアミド骨格で置換され、ヌクレオチドがポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合している、Nielsen et al., Science 1991, 254, 1497を参照されたい）を有するオリゴヌクレオチドであり、これらの文献はそれぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる。リン含有結合には、通常の3'-5'結合を有するホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3'-アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェート、これらの2'-5'結合類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接対が3'-5'から5'-3'にまたは2'-5'から5'-2'に結合した逆の極性を有するものが含まれるが、これらに限定されない；それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第3,687,808号；第4,469,863号；第4,476,301号；第5,023,243号；第5, 177,196号；第5,188,897号；第5,264,423号；第5,276,019号；第5,278,302号；第5,286,717号；第5,321, 131号；第5,399,676号；第5,405,939号；第5,453,496号；第5,455,233号；第5,466,677号；第5,476,925号；第5,519,126号；第5,536,821号；第5,541,306号；第5,550,111号；第5,563,253号；第5,571,799号；第5,587,361号；および第5,625,050号を参照されたい。モルホリノベースのオリゴマー化合物は、Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510)；Genesis, volume 30, issue 3, 2001；Heasman, J., Dev. Biol., 2002, 243, 209-214；Nasevicius et al., Nat. Genet., 2000, 26, 216-220；Lacerra et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 9591-9596；および1991年7月23日に発行された米国特許第5,034,506号に記載されており、これらはそれぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる。シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣物は、Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602に記載されており、その内容は全体として本明細書に組み入れられる。
【００９７】
その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成された骨格を有する。これらには、モルホリノ結合を有するもの（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合N、O、S、およびCH2成分部分を有するその他のものが含まれる；それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,034,506号；第5,166,315号；第5, 185,444号；第5,214,134号；第5,216, 141号；第5,235,033号；第5,264,562号；第5,264,564号；第5,405,938号；第5,434,257号；第5,466,677号；第5,470,967号；第5,489,677号；第5,541,307号；第5,561,225号；第5,596, 086号；第5,602,240号；第5,610,289号；第5,602,240号；第5,608,046号；第5,610,289号；第5,618,704号；第5,623, 070号；第5,663,312号；第5,633,360号；第5,677,437号；および第5,677,439号を参照されたい。
【００９８】
ある種の態様において、miRNA剤は、1つまたは複数の置換された糖部分、例えば、2'位に以下：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3 OCH3、OCH3 O(CH2)n CH3、O(CH2)n NH2、もしくはO(CH2)n CH3、式中、nは1〜約10である；Ci〜CIO低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリル、もしくはアラルキル；CI；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-、もしくはN-アルキル；O-、S-、もしくはN-アルケニル；SOCH3；SO2 CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；RNA切断基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬物動態／薬力学特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基のうちの1つを含む。好ましい修飾には、2'-メトキシエトキシ［2'-O-CH2CH2OCH3、2'-O-(2-メトキシエチル)としても知られる］が含まれる (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486)。その他の好ましい修飾には、2'-メトキシ (2'-O-CH3)、2'-プロポキシ (2'-OCH2 CH2CH3)、および2'-フルオロ (2'-F) が含まれる。同様の修飾はまた、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に3'末端ヌクレオチドの糖の3'位および5'末端ヌクレオチドの5'位でも作製され得る。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣物を有してもよい。
【００９９】
ある種の態様において、miRNA剤は、1つまたは複数の塩基修飾および／または置換を含む。本明細書で用いられる場合、「未修飾」または「天然」塩基には、アデニン (A)、グアニン (G)、チミン (T)、シトシン (C)、およびウラシル (U) が含まれる。修飾塩基には、非限定的に、天然核酸において稀にまたは一時的にしか見られない塩基、例えば、ヒポキサンチン、6-メチルアデニン、5-Meピリミジン、特に、5-メチルシトシン（5-メチル-2'-デオキシシトシンとも称され、当技術分野においては5-Me-Cと称される場合が多い)、5-ヒドロキシメチルシトシン (HMC)、グリコシルHMCおよびゲントビオシルHMC、ならびに合成塩基、例えば、2-アミノアデニン、2-(メチルアミノ)アデニン、2-(イミダゾリルアルキル)アデニン、2-(アミノアルキルアミノ)アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン、2-チオウラシル、2-チオチミン、5-ブロモウラシル、5-ヒドロキシメチルウラシル、8-アザグアニン、7-デアザグアニン、N6(6-アミノヘキシル)アデニン、および2,6-ジアミノプリンが含まれる。Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1980, pp75-77；Gebeyehu, G., et al. Nucl. Acids Res. 1987, 15:4513)。当技術分野において公知の「ユニバーサル」塩基、例えばイノシンもまた含まれ得る。5-Me-C置換もまた含まれ得る。これらは、核酸酸二重鎖の安定性を0.6〜1.2℃だけ増加させることが示されている (Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)。さらなる適切な修飾塩基は、米国特許第3,687,808号、ならびに第4,845,205号；第5,130,302号；第5,134,066号；第5,175, 273号；第5, 367,066号；第5,432,272号；第5,457,187号；第5,459,255号；第5,484,908号；第5,502,177号；第5,525,711号；第5,552,540号；第5,587,469号；第5,596,091号；第5,614,617号；第5,750,692号；および第5,681,941に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
【０１００】
所与のオリゴヌクレオチドにおけるすべての位置が一様に修飾される必要はなく、実際、前述の修飾のうちの2つ以上が単一のオリゴヌクレオチド中に、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシド中にさえ組み込まれ得る。
【０１０１】
ある種の態様では、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合、すなわち骨格の両方が新たな基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。1つのこのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸 (PNA) と称される。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、例えばアミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接的または間接的に結合している。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,539,082号；第5,714,331号；および第5,719,262号が含まれるが、これらに限定されない。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500において見出すことができる。
【０１０２】
ある種の態様において、miRNA剤は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強する1つまたは複数の部分または複合物に連結される（共有結合的または非共有結合的）。このような部分には、非限定的に、コレステロール部分 (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556)、コール酸 (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060)、チオエーテル、例えばヘキシル-S-トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309；Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538)、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330；Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54）、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスノネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654；Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖 (Mancharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973)、またはアダマンタン酢酸 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654)、パルミチル部分 (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237)、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-tオキシコレステロール部分 (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937) などの脂質部分が含まれ、これらの文献はそれぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる。それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,828,979号；第4,948,882号；第5,218,105号；第5,525,465号；第5,541,313号；第5,545,730号；第5,552, 538号；第5,578,717号、第5,580,731号；第5,580,731号；第5,591,584号；第5,109,124号；第5,118,802号；第5,138,045号；第5,414,077号；第5,486, 603号；第5,512,439号；第5,578,718号；第5,608,046号；第4,587,044号；第4,605,735号；第4,667,025号；第4,762, 779号；第4,789,737号；第4,824,941号；第4,835,263号；第4,876,335号；第4,904,582号；第4,958,013号；第5,082, 830号；第5,112,963号；第5,214,136号；第5,082,830号；第5,112,963号；第5,214,136号；第5, 245,022号；第5,254,469号；第5,258,506号；第5,262,536号；第5,272,250号；第5,292,873号；第5,317,098号；第5,371,241号、第5,391, 723号；第5,416,203、第5,451,463号；第5,510,475号；第,512,667号；第5,514,785号；第5, 565,552号；第5,567,810号；第5,574,142号；第5,585,481号；第5,587,371号；第5,595,726号；第5,597,696号；第5,599,923号；第5,599, 928号、および第5,688,941号もまた参照されたい。
【０１０３】
1つの特定の態様において、miRNA剤は核酸アプタマーに連結される（共有結合的または非共有結合的）。アプタマーとは、特定の標的分子に結合する合成オリゴヌクレオチドまたはペプチド分子である。本明細書において提供されるmiRNA剤との使用に適したアプタマーは、8/31/2012に出願され、全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国仮特許出願第61/695,477号に記載されている。
【０１０４】
したがって、第1の局面において、本発明は、I) ヒトにおける脂肪標的細胞上の細胞表面マーカーに選択的に結合する標的指向部分と、II) 熱発生miRNA調節剤部分とを含む脂肪細胞特異的miRNA調節剤組成物を提供し、この場合、該標的指向部分によって、標的細胞によるmiRNA調節部分の取り込みが促進され、miRNAが標的細胞において熱発生経路を標的化し、熱発生を上方制御できるようになる。
【０１０５】
1つの態様において、該組成物は、標的指向部分としてアプタマーを含むアプタミアを含む。
【０１０６】
ある種の態様において、本明細書に開示されるmiRNAと共に用いられるアプタマーは、脂肪組織間葉系幹細胞 (ATMSC)、白色脂肪組織 (WAT) 脂肪細胞、および褐色脂肪組織 (BAT) 脂肪細胞上の細胞表面マーカータンパク質に特異的に結合する。ATMSCの細胞表面マーカーには、CD9、CD10、CD13、CD29、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD55、CD59、CD73、CD90、CD91、CD105、CD137、CD146、CD166、およびHLA-ABCが含まれる。WAT脂肪細胞の細胞表面マーカーには、アディポネクチン、カベオリン1、カベオリン2、CD36 (FAT)、CLH-22（クラスリン重鎖Chr 22）、FABP4（脂肪細胞タンパク質2、aP2）、SLC27A1 (FATP1)、SLC27A2 (FATP2)、GLUT4（グルコース輸送体4）、ペリリピン2、またはレジスチンが含まれる。すべての脂肪細胞の細胞表面マーカーには、ネプリライシン (CD10)、FAT (CD36)、Thy-1 (CD90)、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1（LRP1またはCD91）、カベオリン1、カベオリン2、脂肪酸結合タンパク質4 (FABP4)、細胞表面糖タンパク質MUC18 (CD 146)、活性化白血球細胞接着分子 (CD166)、およびナトリウム利尿ペプチド受容体A (NPR1) が含まれる。他の態様によれば、本明細書に開示されるmiRNAと共に使用するためのアプタマーはまた、アディポネクチン、レプチン、レジスチン、FGF 17、FGF 19、BMP7、PYY、MetAP2、RBP4、エンドスタチン、およびアンジオスタチンを含む、脂肪組織のマーカーに特異的に結合し得る。
【０１０７】
ある種の態様において、アプタマーは、生細胞全体を標的として使用するCell-SELEX技術によって選択され、この技術により、増幅および生細胞への結合の繰り返しによって、無傷細胞の表面上の自然環境において天然高次構造にある特定分子を認識するアプタマーが選択される。この細胞ベースの選択では、特定の細胞表面分子または未知の膜受容体でさえも、それらの天然環境において直接標的化することができ、細胞特異的アプタマーの直接的な濃縮が可能になる。
【０１０８】
ある種の例示的な態様において、miRNA調節剤は、「アプタミア」組成物を作製するためにアプタマーと結合される。アプタマーとmiRNA類似体を結合してアプタミアを作製するための多くの異なる方法が存在する。それらには、例えば、アプタマー‐miRNA類似体キメラ、アプタマー‐スプライススイッチオリゴヌクレオチドキメラ、およびmiRNA類似体を含むナノ粒子またはリポソームに複合化されたアプタマーが含まれる。それぞれが多くのmiRNA類似体を保有し得る機能的ポリマー、リポソーム、およびナノ粒子の表面に、「エスコートアプタマー (Escort Aptamer)」を挿入することができる。例えば、チオアプタマー複合化リポソームのサイズは約120 nmである。ナノ粒子アプローチは、例えば、細胞取り込み、膜を通過する能力、およびナノ粒子分解の誘発を含むいくつかの機能利点を有する。
【０１０９】
1つの態様において、アプタミア組成物は、miRNA調節剤に直接連結または融合されたアプタマーを含む。このようなアプタミアは完全に化学合成され、これによって複合物の組成のさらなる制御が提供される。例えば、化学量論（アプタマー当たりのmiRNA類似体の割合）および付着部位が正確に規定され得る。複合物の結合部分は、アプタマーとmiRNA類似体の反応付着部分として役立つ、複数（2つ以上）の求核および／または求電子部分を示す。加えて、アプタミアは、アプタマーとmiRNA類似体との間にリンカーをさらに含み得る。いくつかの態様において、リンカーは、ポリアルキレングリコール、特にポリエチレングリコールである。他の態様において、リンカーは、リポソーム、エキソソーム、デンドリマー、または櫛形ポリマーである。ビオチンストレプトアビジン架橋またはリボ核酸を含む他のリンカーも、アプタマーとmiRNA類似体との間の複合化を媒介し得る。例示的な非共有結合リンカーには、miRNA部分の一本鎖部分またはオーバーハングと、アプタマー部分の相補的な一本鎖部分またはオーバーハングとの塩基対合によって形成されるリンカーが含まれる。
【０１１０】
別の特定の態様において、アプタマーは、リポソームベースのアプタミアの形態でmiRNA類似体と結合される。リポソームは、miRNAなどの医薬品を負荷することができる、脂質二重層で作られた球状ナノ構造である。さらに、リポソーム表面において、ポリエチレングリコール（それらの全身半減期を延ばす）、または標的化細胞への特異的結合のためのアプタマーのような分子認識部分などの、異なる物質を負荷することもできる。例えば、アプタマーで修飾されたリポソームが開発されており、各リポソームは、標的結合を促進するためにその表面に繋留されたおよそ250個のアプタマーを提示する。好ましい態様において、リポソームは、miRNA類似体を封入し、かつ脂肪細胞およびATMSCの表面において高度に発現される分子（例えば、脂質輸送体）に高い親和性および特異性で特異的に結合するアプタマーをそれらの表面において提示するように作製される。リポソームと標的化細胞の融合により、miRNA類似体の細胞質中への放出が起こり、これによって次に特定の細胞内経路が変化する。あるいは、標的化ATMSCおよび脂肪細胞へのリポソームmiRNA類似体負荷物の送達を導くために、安定したチオアプタマーをリポソームの表面において挿入することもできる。
【０１１１】
さらなる特定の態様において、アプタマーは、担体ベースのアプタミアの形態でmiRNA類似体と結合される。例示的な担体には、ナノ粒子、リポソーム、またはエキソソームが含まれる。そのような担体ベースのアプタミア組成物は、単一の担体で、複数のmiRNA調節剤の積荷を標的細胞に送達する能力を有する。標的指向および蓄積を達成するために、担体はそれらの外部表面上に標的指向部分を提示するように製剤化され、そうして担体は、脂肪標的細胞上の選択された細胞表面抗原または受容体と反応／結合することができるようになる。一例として、担体は、脂肪細胞およびATMSCの表面において高度に発現される分子（例えば、脂質輸送体）に高い親和性および特異性で特異的に結合するアプタマーをそれらの表面において提示しつつ、miRNA調節剤を封入するように作製することができる。内部移行したエキソソームは、細胞質内でmiRNA類似体負荷物を放出し、これによって特定の細胞内経路が変化する。
【０１１２】
1つの態様において、担体はエキソソームである。後期エンドソームに由来するエキソソームは、タンパク質、mRNA、またはmiRNAが特異的に負荷される天然のナノ粒子であり、細胞によって内因的に分泌される。エキソソームは、宿主細胞によって放出され、細胞毒性はなく、それらの組成およびエキソソーム内／上の物質に基づいて特定の細胞に情報を伝達し得る。エキソソームは直径およそ20〜100 nmの粒子であるため、エキソソームは単核食細胞系（> 100 nmのサイズの循環粒子を排除する）による排除を回避し、標的組織に非常に効率的に送達される。
【０１１３】
さらに、合成エキソソームは、他の担体に勝るいくつかの利点をもたらし得る。例えば、エキソソームは、それらが不活性であることで細胞外環境において攻撃および排除を回避しつつ、それらの積荷をサイトゾル中に直接送達することができる。エキソソームの構造成分は、数ある中でも、シグナル伝達、膜輸送、抗原提示、標的指向／接着のような過程を担う小分子を含み得る。
【０１１４】
miRNA剤は、所望の効果をもたらすために、標的mRNAと十分に相補的でなければならない、すなわち十分な特異性で十分に良好にハイブリダイズしなければならない。「相補的」とは、天然または非天然の塩基またはその類似体を含む2つの配列間の、水素結合を介した対合の能力を指す。例えば、miRNA剤のある位置の塩基が、標的核酸配列の対応する位置の塩基と水素結合することができる場合、それらの塩基はその位置で互いに相補的であると見なされる。ある種の態様において、100%の相補性は必要ではない。他の態様においては、100%の相補性が必要である。
【０１１５】
本明細書に開示される方法において使用するためのmiRNA剤は、通常の方法を用いて設計することができる。ある種の例示的な標的核酸配列およびmiRNA剤の特定の配列を本明細書において記載するが、当業者は、これらが本発明の範囲内にある特定の態様を説明し記載するのに役立つことを認識するであろう。付加的な標的セグメントは、本開示を考慮して、当業者により容易に同定可能である。シード配列内にあるかまたはそれに直接隣接する少なくとも5個(5)の連続したヌクレオチドのひと続きを含む、5、6、7、8、9、10ヌクレオチド長、またはそれ以上の標的セグメントが、遺伝子を標的化するのに適していると考えられる。いくつかの態様において、標的セグメントは、シード配列の1つの5'末端からの少なくとも5個の連続したヌクレオチドを含む配列を含み得る（残りのヌクレオチドは、シード配列の5'末端のすぐ上流から始まり、miRNA剤が約5〜約30ヌクレオチドを含むまで続く、同じRNAの連続したひと続きである）。いくつかの態様において、標的セグメントは、シード配列の1つの3'末端からの少なくとも5個の連続したヌクレオチドを含むRNA配列によって表される（残りのヌクレオチドは、標的セグメントの3'末端のすぐ下流から始まり、miRNA剤が約5〜約30ヌクレオチドを含むまで続く、同じmiRNAの連続したひと続きである）。本明細書において提供される配列を有する当業者は、過度の実験を行うことなく、miRNA剤を用いて標的化するためのさらなる好ましい領域を同定することができるであろう。1つまたは複数の標的領域、セグメント、または部位が同定されたならば、所望の効果をもたらすために、標的と十分に相補的である、すなわち十分な特異性で（すなわち、他の非標的核酸配列に実質的に結合しない）十分に良好にハイブリダイズする阻害核酸化合物が選択される。
【０１１６】
ある種の態様において、本発明を実施するために用いられるmiRNA剤は、組換えベクターから発現される。適切な組換えベクターには、非限定的に、DNAプラスミド、ウイルスベクター、またはDNAミニサークルが含まれる。ベクター構築物の作製は、非限定的に、例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (1989)、Coffin et al. (Retroviruses. (1997)、および「RNA Viruses: A Practical Approach」 (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)) に記載されているような、PCR、オリゴヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、およびDNA配列決定の標準的技法を含む、当技術分野で周知の任意の適切な遺伝子操作技法を用いて達成され得る。当業者に明らかであるように、種々の適切なベクターが、本発明の核酸を細胞に導入するのに利用可能である。核酸を送達するのに適したベクターの選択、および選択された発現ベクターを細胞に挿入するための条件の最適化は、過度の実験を必要とせずに、当業者の技術の範囲内である。ウイルスベクターは、パッケージング細胞において組換えウイルスの産生のための配列を有するヌクレオチド配列を含む。本発明の核酸を発現するウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、またはアルファウイルスを含むがこれらに限定されないウイルス骨格に基づいて構築することができる。組換えベクターは、本明細書に記載されるように送達することができ、標的細胞中に存続する（例えば、安定した形質転換体）。
【０１１７】
ある種の態様において、本発明を実施するために用いられるmiRNA剤は、例えば、それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる、Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661；Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444；Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380；Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896；Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90；Brown (1979) Meth. Enzymol. 68: 109；Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22: 1859；米国特許第4,458,066号に記載されているような化学合成技法を用いて、インビトロで合成される。
【０１１８】
IV. 治療方法
1つの局面において、本発明は、ヒト対象において肥満を治療する方法を提供する。本方法は概して、少なくとも1つの熱発生制御因子（例えば、UCP1および／またはUCP2などのミトコンドリア脱共役剤）の活性を調節するmiRNA剤の有効量をヒト対象に投与する段階を含む。
【０１１９】
このような治療方法は、薬理ゲノミクスの分野から得られた知識に基づいて、特異的に個別に調整するかまたは修正することができる。したがって、本発明の別の局面は、本発明の標的遺伝子分子または標的遺伝子調節剤のいずれかによる個体の予防的または治療的処置を、その個体の薬物応答遺伝子型に応じて個別に調整する方法を提供する。薬理ゲノミクスにより、臨床医または内科医は、予防的または治療的処置から最も恩恵を受ける患者をその処置の標的とし、毒性の薬物関連副作用を経験する患者の処置を回避することができるようになる。
【０１２０】
miRNA剤は、適切な動物モデル、例えばob/obマウス (Lindstrom P., Scientific World Journal, 7:666-685 (2007) およびdb/dbマウス (Sharma K et al., Am J Physiol Renal Physiol., 284(6):F1138-1144 (2003)) を含む肥満モデルにおいて試験することができる。例えば、本明細書に記載されるmiRNA剤（またはそれをコードする発現ベクターまたは導入遺伝子）を動物モデルにおいて使用して、該薬剤による治療の効率、毒性、または副作用を決定することができる。あるいは、治療薬を動物モデルにおいて使用して、そのような薬剤の作用機序を決定することができる。例えば、miRNA剤を動物モデルにおいて使用して、そのような薬剤による治療の効率、毒性、または副作用を決定することができる。あるいは、薬剤を動物モデルにおいて使用して、そのような薬剤の作用機序を決定することができる。
【０１２１】
本開示はまた、hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアより選択される1つまたは複数のmiRNAを前脂肪細胞の集団に投与する段階を含む、前脂肪細胞を誘導して白色脂肪細胞に、そして白色脂肪細胞を誘導して褐色脂肪細胞に分化させる方法を提供する。ある種の態様において、前脂肪細胞を脂肪細胞に分化させるこの誘導は、前脂肪細胞を100 nMロシグリタゾンに2日間曝露した後に維持培地に曝露した場合の、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化よりも大きい。ある種の態様において、脂肪細胞は褐色脂肪細胞である。他の態様において、脂肪細胞は白色脂肪細胞である。
【０１２２】
本開示はまた、hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを対象に投与する段階を含む、それを必要とする対象においてインスリン感受性を高める方法を提供する。ある種の態様において、対象は哺乳動物である。
【０１２３】
本開示はまた、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを対象に投与する段階を含む、それを必要とする対象において脂肪消失を引き起こす方法を提供する。ある種の態様において、対象は哺乳動物である。他の態様において、哺乳動物はヒトである。
【０１２４】
細胞（例えば、脂肪細胞）内への取り込みを増加させるために修飾されたmiRNA剤は、kg体重当たり約15 mg未満、またはkg体重当たり10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005、もしくは0.00001 mg未満、およびkg体重当たり200 nモル未満のmiRNA剤（例えば、約4.4 x 1016コピー）、またはkg体重当たり1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015 nモル未満のRNAサイレンシング剤の単位用量で投与することができる。例えば、単位用量は、注射（例えば、静脈内または筋肉内）、吸入投与、または局所適用によって投与することができる。特に好ましい投薬量は、2、1、または0.1 mg/kg体重未満である。
【０１２５】
miRNA剤の器官または組織への直接的な（例えば、脂肪組織への直接的な）送達は、おおよそ、器官／組織当たり約0.00001 mg〜約3 mg、または好ましくは器官／組織当たり約0.0001〜0.001 mg、器官／組織当たり約0.03〜3.0 mg、器官／組織当たり約0.1〜3.0 mg、もしくは器官／組織当たり約0.3〜3.0 mgの投薬量におけるものであってよい。投薬量は、肥満を治療もしくは予防するのに、またはインスリン感受性を高めるのに効果的な量であってよい。1つの態様では、単位用量を、1日に1回よりも低い頻度で、例えば2、4、8、または30日に1回よりも少なく投与する。別の態様では、単位用量を頻度で投与しない（例えば、規則正しい頻度で投与しない）。例えば、単位用量を単回投与することができる。1つの態様では、有効量を他の伝統的な治療様式で投与する。
【０１２６】
ある種の態様では、対象にmiRNA剤の初回用量および1回または複数回の維持用量を投与する。1回または複数回の維持用量は、一般に初回用量よりも少なく、例えば初回用量の半分未満である。維持投与計画は、1日当たり0.01 mg/kg〜1.4 mg/kg体重の範囲、例えば、1日当たり10、1、0.1、0.01、0.001、または0.00001 mg/kg体重の1回または複数回の用量で対象を治療することを含み得る。維持用量は、5、10、または30日に1回以下で投与することが好ましい。さらに、治療投与計画はある期間にわたって続いてよく、その期間は、特定の疾患の性質、その重症度、および患者の全身状態に応じて変わる。好ましい態様において、投薬量は、1日に1回以下、例えば、24、36、48時間、またはそれを超える時間に1回以下、例えば、5日または8日に1回以下で送達することができる。治療後、状態の変化、例えば体脂肪率の変化について、患者をモニターすることができる。患者が現在の投薬量レベルに対して有意に応答しない場合には、化合物の投薬量を増量してもよく、または体脂肪の減少が認められる場合、もしくは望ましくない副作用が認められる場合には、用量を減量してもよい。
【０１２７】
特定の状況下で所望されるか、または適切と見なされる場合には、有効量を単回用量または2回以上の用量で投与することができる。反復注入または頻回注入を容易にすることが望ましい場合には、送達装置、例えば、ポンプ、半永久ステント（例えば、皮下、静脈内、腹腔内、大槽内、または関節内）、
またはリザーバーの埋め込みが賢明と考えられる。1つの態様において、薬学的組成物は複数のmiRNA剤種を含む。別の態様において、miRNA剤種は、天然の標的配列に関して、別の種と重複せずかつ隣接しない配列を有する。別の態様において、複数のmiRNA剤種は、天然の異なる標的遺伝子に特異的である。別の態様において、miRNA剤は対立遺伝子特異的である。別の態様において、複数のmiRNA剤種は、2つ以上のSNP対立遺伝子（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれを超える数のSNP対立遺伝子）を標的化する。
【０１２８】
治療が奏効した後は、患者に維持療法を行って疾患状態の再発を予防することが望ましいと考えられ、その場合、本発明の化合物を0.01 mg/kg〜100 mg/kg体重の範囲の維持用量で投与する（米国特許第6,107,094号を参照されたい）。
【０１２９】
投与されるmiRNA剤の濃度または量は、該薬剤について決定されたパラメータ、および例えば経鼻、頬側、または経肺などの投与方法に依存する。例えば、経鼻製剤は、鼻腔通過の刺激または熱傷を避けるために、一部の成分の濃度をかなり低くする必要がある傾向がある。適切な経鼻製剤を提供するために、経口製剤を10〜100倍まで希釈することが望ましい場合もある。
【０１３０】
ある種の要因が、対象を効果的に治療するために必要な投薬量に影響を及ぼす場合があり、こうした要因には、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の全身の健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患が含まれるが、これらに限定されない。さらに、miRNA剤の治療有効量を用いた対象の治療は、単回治療を含んでよく、または好ましくは一連の治療を含んでもよい。治療のためのmiRNA剤の有効な投薬量が、特定の治療の期間中に増減可能であることもまた、認識されるであろう。投薬量の変更が起こる場合があり、これは本明細書に記載されるような診断アッセイの結果から明らかになると考えられる。例えば、miRNA剤組成物を投与した後に、対象をモニターすることができる。このモニタリングからの情報に基づいて、miRNA剤組成物の追加量を投与することができる。
【０１３１】
投与は治療される疾患状態の重症度および反応性に依存し、治療期間は数日間から数カ月間、または治癒が達成されるまで、もしくは疾患状態の縮小が達成されるまで続く。最適な投与スケジュールは、患者の体内の薬物蓄積の測定値から見積もることができる。通常の技術を有する人であれば、最適な投薬量、投与方法、および反復率を容易に決定することができる。最適な投薬量は、個々の化合物の相対的効力によって異なると考えられ、一般的にインビトロおよびインビボ動物モデルで有効であることが見出されたEC50に基づいて推定することができる。いくつかの態様において、動物モデルには、ヒト遺伝子、例えば標的mRNAを産生する遺伝子（例えば、熱発生制御因子）を発現するトランスジェニック動物が含まれる。トランスジェニック動物は、対応する内因性mRNAが欠損していてもよい。別の態様において、試験のための組成物は、動物モデルにおける核酸配列とヒトにおける標的核酸配列との間で保存されている配列に、少なくとも内部領域において相補的であるmiRNA剤を含む。
【０１３２】
いくつかの研究により、miRNA剤を用いて奏効した哺乳動物の投与が報告されている。例えば、Esau C, et al., Cell Metabolism, 3(2): 87-98 (2006) は、12.5〜75 mg/kgの範囲のmiR-122アンチセンスオリゴヌクレオチドの4週間にわたる週に2回の腹腔内投与による正常マウスの投与を報告した。マウスは、体重が減少することもまたは食物摂取が減少することもなく、治療の終了時に健康でかつ正常であるように見えた。血漿トランスアミナーゼレベルは、ALTレベルおよびASTレベルの非常に軽度の増加を示した75 mg/kg用量のmiR-122 ASOを除いて、すべての用量について正常範囲内（AST 3/4 45、ALT 3／4 35）であった。著者らは、50 mg/kgが有効で非毒性の用量であると結論づけた。Krutzfeldt J., et al., Nature, 438, 685-689 (2005) による別の研究では、マウスにおいてmiR-122をサイレンシングするため、80、160、または240 mg/kg体重の総用量を用いてアンタゴミアを注射した。最も高い用量によって、miR-122シグナルが完全に消失した。さらなる別の研究では、miR-122をサイレンシングするために、霊長類においてロック核酸（「LNA」）が首尾よく適用された。Elmen J., et al., (2008) Nature 452, 896-899は、10 mg/kg LNA-抗miRの3回用量によって、霊長類においてmiR-122の効果的なサイレンシングが達成され、実験動物においてLNA関連毒性または組織病理学的変化についてのいかなる形跡もなく、総血漿コレステロールの持続的かつ可逆的低下をもたらしたことを報告している。
【０１３３】
ある種の態様において、本発明を実施するために用いられるmiRNA剤は、組換えベクターからの発現を通して投与される。適切な組換えベクターには、非限定的に、DNAプラスミド、ウイルスベクター、またはDNAミニサークルが含まれる。ベクター構築物の作製は、非限定的に、例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (1989))、Coffin et al. (Retroviruses. (1997))、および「RNA Viruses: A Practical Approach」 (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)) に記載されているような、PCR、オリゴヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、およびDNA配列決定の標準的技法を含む、当技術分野で周知の任意の適切な遺伝子操作技法を用いて達成され得る。当業者に明らかであるように、種々の適切なベクターが、本発明の核酸を細胞に導入するのに利用可能である。核酸を送達するのに適したベクターの選択、および選択された発現ベクターを細胞に挿入するための条件の最適化は、過度の実験を必要とせずに、当業者の技術の範囲内である。ウイルスベクターは、パッケージング細胞において組換えウイルスの産生のための配列を有するヌクレオチド配列を含む。本発明の核酸を発現するウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、またはアルファウイルスを含むがこれらに限定されないウイルス骨格に基づいて構築することができる。組換えベクターは、本明細書に記載されるように送達することができ、標的細胞中に存続する（例えば、安定した形質転換体）。
【０１３４】
miRNA剤は、細胞（例えば、脂肪細胞）中に直接導入するか；または空洞、間質腔中へ、生物の循環中へと細胞外に導入するか、経口的に導入するか、もしくは核酸を含む溶液中に細胞もしくは生物を浸すことにより導入することができる。血管または血管外の循環、血液系またはリンパ系、および脳脊髄液が、核酸を導入することができる部位である。
【０１３５】
本発明のmiRNA剤は、核酸を含む溶液の注射、核酸によって被覆された粒子による衝突、核酸の溶液中に細胞もしくは生物を浸漬すること、または核酸の存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを含む、当技術分野で公知の核酸送達方法を用いて導入することができる。脂質媒介性の担体輸送、化学物質媒介性の輸送、およびリン酸カルシウムなどの陽イオン性リポソームトランスフェクションなどのような、核酸を細胞に導入するための当技術分野において公知の他の方法を用いてもよい。miRNA剤は、他の成分、例えば細胞によるmiRNA剤の取り込みを増強する化合物と共に導入することもできる。
【０１３６】
ある種の態様において、本明細書に記載される方法は、miRNA剤と、他の薬物または医薬品、例えば、熱発生を調節するための組成物、糖尿病を治療するための組成物、肥満を治療するための組成物との同時投与を含む。熱発生を調節するための組成物には、β3アドレナリン受容体アゴニスト、甲状腺ホルモン、PPARGアゴニスト、レプチン、アディポネクチン、およびオレキシンが含まれる。
【０１３７】
V. スクリーニング方法
別の局面において、本発明は、熱発生を調節する、肥満を減少させる、またはインスリン感受性を高めるmiRNA剤をスクリーニングする方法を提供する。本方法は概して、指標細胞を提供する段階；該指標細胞を試験miRNA剤と接触させる段階；ならびに該miRNA剤の存在下および非存在下において、該指標細胞における少なくとも1つの熱発生制御因子の発現レベルおよび／または細胞活性を決定する段階であって、試験miRNA剤の存在下における熱発生制御因子の活性の変化により、その試験miRNA剤が熱発生を調節する、肥満を減少させる、またはインスリン感受性を高めるmiRNA剤として同定される段階を含む。ある種の態様において、本方法は、熱発生制御因子（例えば、UCP1、UCP2）の発現レベルおよび／または活性の増加を判定する段階を含む。指標細胞は哺乳動物細胞であってよい。ある種の態様において、哺乳動細胞は、ヒトゲノムの少なくとも一部を含むヒト細胞である。
【０１３８】
本明細書に開示される方法において、任意の熱発生制御因子をアッセイすることができる。例示的な熱発生制御因子は表2に記載される。好ましい態様において、熱発生制御因子は、ミトコンドリア脱共役タンパク質、例えばUCP1および／またはUCP2である。
【０１３９】
熱発生制御因子の活性を測定することができる任意の細胞は、本明細書に開示される方法における使用に適している。例示的な細胞には、前脂肪細胞、脂肪細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、肝細胞、筋細胞、またはそれらの前駆体が含まれる。
【０１４０】
非限定的に、熱発生制御因子のmRNA発現レベル、タンパク質発現レベル、またはミトコンドリア脱共役活性を含む、熱発生制御因子の任意の活性をアッセイすることができる。このような活性を決定する方法は、当技術分野で周知である。
【０１４１】
非限定的に、miRNA、アゴミア、アンタゴミア、アプタミア、miR-マスク、miRNAスポンジ、siRNA（一本鎖または二本鎖）、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、または標的核酸の少なくとも一部とハイブリダイズし、その機能を調節するその他のオリゴヌクレオチド模倣物を含む、任意のmiRNA剤をスクリーニングすることができる。
【０１４２】
VI. 薬学的組成物
1つの局面において、本明細書に開示される方法は、少なくとも1つの熱発生制御因子の活性を調節することができるmiRNA剤を含む薬学的組成物および製剤の投与を含み得る。
【０１４３】
ある種の態様において、本組成物は薬学的に許容される担体と共に製剤化される。薬学的組成物および製剤は、非経口的に、局所的に、胃腸管への直接投与により（例えば、経口的にまたは直腸に）、またはエアロゾルによるかもしくは経皮的などの局所投与により投与することができる。薬学的組成物は任意の方法で製剤化することができ、状態または疾患および疾病の程度、各患者の全身の医学的状態、もたらされる好ましい投与方法などに応じて、種々の単位剤形で投与することができる。医薬品の製剤化および投与の技法に関する詳細は、科学文献および特許文献に十分に記載されている、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005を参照されたい。
【０１４４】
miRNA剤は、単独で、または薬学的製剤（組成物）の成分として投与することができる。化合物は、ヒトおよび獣医薬における使用のための任意の簡便な方法で、投与のために製剤化することができる。湿潤剤、乳化剤、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および芳香剤、保存剤、ならびに抗酸化剤もまた、組成物中に存在し得る。
【０１４５】
本発明の組成物の製剤には、皮内、吸入、経口／経鼻、局所、非経口、直腸、および／または膣内投与に適したものが含まれる。製剤は簡便に単位剤形で提供されてよく、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製することができる。単一の剤形を生成するために担体材料と混合され得る有効成分（例えば、本発明の核酸配列）の量は、治療される宿主、特定の投与様式、例えば皮内または吸入によって異なる。単一の剤形を生成するために担体材料と混合され得る有効成分の量は、一般的に、治療効果、例えば、抗原特異的T細胞または液性応答を生じる化合物の量である。
【０１４６】
本発明の薬学的製剤は、医薬品の製造に関する分野に公知の任意の方法に従って調製することができる。このような薬物は、甘味剤、香味剤、着色剤、および防腐剤を含み得る。製剤は、製造に適した非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合することができる。製剤は、1つまたは複数の希釈剤、乳化剤、保存剤、緩衝剤、賦形剤などを含んでよく、液剤、散剤、乳剤、凍結乾燥粉末、スプレー剤、クリーム剤、ローション剤、放出制御製剤、錠剤、丸剤、ゲル剤、パッチ剤上、植込錠中などの形態で提供され得る。
【０１４７】
経口投与用の薬学的製剤は、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体を用いて、適正かつ適切な投薬量で製剤化することができる。そのような担体により、医薬品が、患者による摂取に適した錠剤、丸剤、散剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ロゼンジ剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして単位剤形で製剤化されることが可能になる。経口使用のための薬学的調製物は、固体賦形剤として製剤化し、任意に、得られた混合物を粉砕し、必要に応じて適切な付加的化合物を添加した後に顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。適切な固体賦形剤は、炭水化物またはタンパク質充填剤であり、これには、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；ならにアラビアおよびトラガントを含むゴム；ならびにタンパク質、例えばゼラチンおよびコラーゲンが含まれる。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤または可溶化剤を添加してもよい。押し込み型カプセル剤は、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意に安定剤と混合した活性薬剤を含み得る。軟カプセル剤では、活性薬剤を、安定剤と共に、または安定剤を含めずに、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解または懸濁することができる。
【０１４８】
水性懸濁剤は、活性薬剤（例えば、本発明の核酸配列）を、例えば水性皮内注射用の水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合して含み得る。そのような賦形剤には、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアゴムなど、ならびに分散剤または湿潤剤、例えば、天然のホスファチド（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が含まれる。水性懸濁剤はまた、1つまたは複数の保存剤、例えばp-ヒドロキシ安息香酸エチルまたはp-ヒドロキシ安息香酸n-プロピルなど、1つまたは複数の着色剤、1つまたは複数の香味剤、および1つまたは複数の甘味剤、例えば、スクロース、アスパルテーム、またはサッカリンなどを含み得る。製剤は、モル浸透圧濃度について調整することができる。
【０１４９】
ある種の態様において、miRNA剤の投与には油性の医薬品が用いられる。油性懸濁剤は、活性薬剤を、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはヤシ油などの植物油中、または流動パラフィンなどの鉱物油中；またはこれらの混合物中に懸濁することによって製剤化することができる。例えば、経口投与した疎水性薬学的化合物の生体利用能を増加させ、個体間および個体内の変動性を減少させるための精油または精油成分の使用を記載している、米国特許第5,716,928号を参照されたい（米国特許第5,858,401号もまた参照されたい）。油懸濁剤は、蜜蝋、固体パラフィン、またはセチルアルコールなどの増粘剤を含み得る。口当たりのよい経口調製物を提供するために、グリセロール、ソルビトール、またはスクロースなどの甘味剤を添加することができる。これらの製剤は、アスコルビン酸などの抗酸化剤を添加することによって保存することができる。注射用油媒体の例としては、Minto (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther. 281:93-102を参照されたい。
【０１５０】
ある種の態様において、薬学的組成物および製剤は、水中油型乳剤の形態である。油性相は、上記の植物油もしくは鉱物油またはそれらの混合物であってよい。適切な乳化剤には、天然のゴム、例えばアカシアゴムおよびトラガカントゴムなど、天然のホスファチド、例えばダイズレシチンなど、脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来するエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレエートなど、ならびにこれらの部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどが含まれる。乳剤はまた、シロップ剤およびエリキシル剤の製剤と同様に、甘味剤および香味剤を含み得る。このような製剤はまた、粘滑剤、保存剤、または着色剤を含み得る。代替の態様において、本発明のこれらの注射用水中油型乳剤は、パラフィン油、ソルビタンモノオレエート、エトキシ化ソルビタンモノオレエート、および／またはエトキシ化ソルビタントリオレートを含む。
【０１５１】
ある種の態様において、薬学的組成物および製剤は、坐剤、吹送法、散剤、およびエアロゾル製剤をはじめとして、鼻腔内、眼内、および膣内経路により投与される（ステロイド吸入剤の例については、例えば、Rohatagi (1995) J. Clin. Pharmacol. 35: 1 187-1193；Tjwa (1995) Ann. Allergy Asthma Immunol. 75: 107-1 11) を参照されたい）。坐剤製剤は、薬物を、常温では固体であるが体温で液体であり、したがって体内で融解して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合することによって、調製することができる。そのような材料は、カカオバターおよびポリエチレングリコールである。
【０１５２】
ある種の態様において、薬学的組成物および製剤は、塗布棒、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、ペースト剤、ゼリー剤、ペイント剤、散剤、およびエアロゾル剤として製剤化され、局所経路により経皮的に送達される。
【０１５３】
ある種の態様において、薬学的組成物および製剤は、体内での徐放のためにミクロスフェアとして送達される。例えば、ミクロスフェアは、皮下にゆっくりと放出する薬物の皮内注射により；Rao (1995) J. Biomater Sci. Polym. Ed. 7:623-645を参照されたい；生分解性の注射用ゲル製剤として、例えば、Gao (1995) Pharm. Res. 12:857-863 (1995) を参照されたい；または経口投与用のミクロスフェアとして、例えば、Eyles (1997) J. Pharm. Pharmacol. 49:669-674を参照されたい、投与することができる。
【０１５４】
ある種の態様において、薬学的組成物および製剤は、静脈内 (IV) 投与、または体腔もしくは器官の管腔への投与などにより、非経口投与される。これらの製剤は、薬学的に許容される担体中に溶解した活性薬剤の溶液を含み得る。使用され得る許容される媒体および溶媒は、水およびリンゲル液、等張塩化ナトリウムである。加えて、滅菌不揮発性油を溶媒または懸濁媒として使用することができる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無菌性不揮発性油を使用することができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸も、注射剤の調製において同様に使用することができる。これらの溶液は滅菌されており、通常は望ましくない物質を含まない。これらの製剤は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌することができる。製剤は、pH調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどのような、生理的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質を含み得る。これらの製剤中の活性薬剤の濃度は、大きく異なってよく、選択される特定の投与様式および患者の必要性に従って、主に液量、粘性、体重などに基づいて選択される。IV投与のために、製剤は、滅菌注射用水性懸濁剤または油性懸濁剤などの滅菌注射用調製物であってよい。この懸濁剤は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて製剤化することができる。滅菌注射用調製物はまた、1,3-ブタンジオール溶液のような非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の懸濁剤であってもよい。投与は、ボーラスまたは持続注入（例えば、特定の期間にわたる血管内への実質的に中断することのない導入）によるものであってよい。
【０１５５】
ある種の態様において、薬学的化合物および製剤は凍結乾燥される。阻害性核酸を含む安定した凍結乾燥製剤は、本発明の医薬品、および充填剤、例えば、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、およびスクロース、またはそれらの混合物を含む溶液を凍結乾燥することによって作製することができる。安定した凍結乾燥製剤を調製するための工程は、約2.5 mg/mLの核酸、約15 mg/mLのスクロース、約19 mg/mLのNaCl、および5.5より高いが、6.5未満のpHを有するクエン酸ナトリウム緩衝剤の溶液を凍結乾燥することを含み得る。例えば、U.S. 20040028670を参照されたい。
【０１５６】
ある種の態様において、薬学的組成物および製剤は、リポソームを用いて送達される。リポソームを使用することにより、特にリポソーム表面が標的細胞に特異的なリガンドを保有するか、または別の方法で特定の器官に優先的に指向される場合、インビボにおいて活性薬剤の送達を標的細胞に集中させることができる。例えば、米国特許第6,063,400号；第6,007,839号；Al-Muhammed (1996) J. Microencapsul. 13 :293-306；Chonn (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6:698-708；Ostro (1989) Am. J. Hosp. Pharm. 46: 1576-1587を参照されたい。
【０１５７】
本発明の製剤は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。ある種の態様では、治療適用のために、障害またはその合併症の臨床症状を治癒させる、軽減する、または部分的に停止させるのに十分な量；これは治療有効量と称され得る、の組成物が、トリグリセリドレベルの低下を必要とする、または本明細書に記載される障害のリスクがあるかもしくはその障害を有する対象に投与される。例えば、ある種の態様において、本発明の薬学的組成物は、対象において肥満を治療するのに十分な量で投与される。
【０１５８】
これを達成するのに適切な薬学的組成物の量が治療有効量である。この使用に有効な投薬のスケジュールおよび量、すなわち投与計画は、疾患または状態の段階、疾患または状態の重症度、患者の健康の一般状態、患者の身体状況、年齢などを含む種々の要因に依存する。患者のための投薬計画を見積もる際には、投与様式も考慮される。
【０１５９】
投薬計画また、当技術分野において周知の薬物動態パラメータ、すなわち、活性薬剤の吸収速度、生物学的利用能、代謝、クリアランスなども考慮に入れる（例えば、Hidalgo-Aragones (1996) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 58:611-617；Groning (1996) Pharmazie 51:337-341；Fotherby (1996) Contraception 54:59-69；Johnson (1995) J. Pharm. Sci. 84: 1 144-1 146；Rohatagi (1995) Pharmazie 50:610-613；Brophy (1983) Eur. J. Clin. Pharmacol. 24: 103-108；Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005を参照されたい）。最新技術により、臨床医は、個々の患者、活性薬剤、および治療される疾患または状態の各々について、投薬計画を決定することができる。医薬品として用いられる類似組成物について提供される指針を手引きとして用いて、本発明の方法を実施する際に行われる投薬計画、すなわち投与スケジュールおよび投薬量レベルが正確かつ適切であると判断することができる。例えば、患者に必要とされかつ許容される投薬量および頻度、各投与後に生じるコレステロール恒常性の程度および量などに応じて、製剤の単回または複数回投与を実施することができる。製剤は、状態、疾患、または症状を効果的に治療する、予防する、もしくは回復させるのに、例えば肥満を治療するのに十分な量の活性薬剤を提供するべきである。
【０１６０】
ある種の態様において、経口投与用の薬学的製剤は、1日当たり体重1キログラムにつき約1〜100 mgまたはそれを超える1日量である。経口投与とは対照的に、血流、体腔、または器官の管腔内には、より低い投薬量を用いることができる。局所もしくは経口投与、または散剤、スプレー剤、もしくは吸入剤による投与においては、実質的により高い投薬量を用いることができる。非経口または経口投与が可能な製剤を調製するための実際の方法は、当業者に公知または明らかであり、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005などの出版物により詳細に記載されている。
【実施例】
【０１６１】
VII.例証
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、実施例はさらなる限定と解釈されるべきではない。本出願を通じて引用した配列リスト、図面、ならびにすべての参考文献、特許、および公開済み特許出願の内容は、参照により本明細書に明確に組み入れられる。
【０１６２】
さらに、本発明においては、従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技法を、当業者の技術の範囲内で使用することができる。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York（本明細書では「Sambrook et al, 1989」と表示）；DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]；Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, Eds. (1984)]；Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]；Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994) を参照されたい。
【０１６３】
実施例1. 熱発生制御因子のインシリコ解析
利用可能な科学情報および本発明者ら自身の実験データの批判的評価および再検討に基づいて、熱発生の調節に関与する83個のタンパク質を選択した。これらのタンパク質は、それらの機能に基づいて、熱発生の活性化因子または抑制因子として分類した。これらの熱発生制御因子タンパク質を表2に記載する。
【０１６４】
（表２）熱発生制御因子タンパク質
2015518485.tif 000010
2015518485.tif 000011
2015518485.tif 000012
【０１６５】
既知および予測のタンパク質相互作用のSTRING 9.0データベース (string-db.org/) を用いて、これら83個の候補分子を試験した。相互作用には、直接的（物理的）関係および間接的（機能的）関係が含まれる；これらは、4つの情報源：ゲノム状況；ハイスループット実験；同時発現；および以前の知識から導き出される。STRINGは、多数の生物についてこれらの情報源からの相互作用データを定量的に統合し、適用できる場合には、これらの生物間で情報を伝達する。このデータベースは、現在、1,133種の生物からの5,214,234個のタンパク質を網羅している。一例として、83個の熱発生制御因子分子間の関係はUCP1を中心とし、UCP1と直接的関係を有する分子と間接的関係を有する分子は、0.90という最も高い信頼スコアを用いて識別することができる。この関係を図1Aに模式形式で記載する。この解析から、9個の分子（CEBPB、CIDEA、KDM3A、NRIP1、PRDM16、PPARG、PPARGC1A、PPKAA2、および UCP2）がUCP1と直接関係があり、多くのさらなる分子がUCP1と二次的にまたはそれに続く度合いで関係があることが見出された。
【０１６６】
信頼度をスコア0.70の高さに設定した場合、8個の付加的なタンパク質がUCP1と直接関係あることが見出された（AZGP1、DI02、KLF11、KLF15、NR1H3、PPARA、PPARD、およびPPARGC1B）、図1B。
【０１６７】
同様に、これら83個の熱発生制御因子分子間の相互作用を、他のソフトウェアプログラムを用いて独立して評価した。Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ソフトウェアプログラム (www.ingenuity.com) によって予測された相互作用を図2Aに示す（UCP1は黄色、活性化因子は緑色、および抑制因子は紫色で表示）。Reactome Functional Interaction (Reactome IF) ソフトウェアプログラム (http://wiki.reactome.org) によって予測された相互作用を図2Bに示す（UCP1は黄色、活性化因子は緑色、および抑制因子は紫色で表示）。IPAネットワークおよびReactome IFネットワークは、STRINGプログラムで得られた図1Aおよび1Bに記載されるものとは異なる。これらのアルゴリズムは、異なる所定のパラメータ、情報源、および選択基準に依存しているため、それらの結果が異なることは、驚くことではない。
【０１６８】
実施例2. 関連miRNA標的のインシリコ選択
miRNA剤の標的として適切な熱発生制御因子を選択するために、いくつかのインターネットベースの資源を使用して、miRNAとそれらの標的を一致させた（「マイクロノーム (micronome)」）。例示的なツールを表3に記載する。
【０１６９】
（表３）miRNAおよびそれらの標的を選択するために用いられた例示的なバイオインフォマティクスツール
2015518485.tif 000013
2015518485.tif 000014
2015518485.tif 000015
2015518485.tif 000016
2015518485.tif 000017
【０１７０】
具体的には、これらのツールを用いて、1) 統合データマイニング（8ツール）；2) miRNAマイニングおよびマッピング（6ツール）；3) miRNA標的標的および発現（21ツール）；4) 統合miRNA標的および発現（13ツール）；5) miRNA二次構造予測および比較（5ツール）；6) ネットワーク検索および解析（8ツール）；7) 分子可視化（4ツール）；ならびに8) 情報統合および利用（1ツール）を実施した。
【０１７１】
単一の遺伝子標的はいくつかのmiRNAによって制御され得る一方で、単一のmiRNはいくつかの遺伝子標的を制御し得る。標的疾患に最も関連のあるmiRNAを選択するために、精巧なバイオインフォマティクス資源が開発された（Gallagher IJ, et al. Genome medicine. 2010；Fujiki K, et al. BMC Biol. 2009；Okada Y, et al., J Androl. 2010；Hao T, et al., Mol Biosyst. 2012；Hao T, et al., Mol Biosyst. 2012）。しかしながら、これらのアルゴリズムの結果は実際に所定のパラメータに依存し、これらのアルゴリズム間の収束の程度はかなり限定される。したがって、miRNA／標的関係の同定に関する感度、特異性、および選択性が改善された、より良く実行できるバイオインフォマティクスツールを開発する必要がある。
【０１７２】
miRNAとそれらの標的との相互作用は、そのドライバー鎖のシード領域（5'側塩基2〜7）が標的mRNAの3' UTR領域における相補的配列に結合し、通常は翻訳抑制または標的分解および遺伝子サイレンシングをもたらすという、転写後制御因子としてのmiRNAの元の説明を超える。この相互作用はまた、miRNAのドライバー鎖またはパッセンジャー鎖の様々な領域、ならびにmRNAの5'UTR、プロモーター、およびコード領域を含み得る。
【０１７３】
利用可能なデータの解析に際しては、多くのシグナル伝達経路、機能、または過程に関与するユニバーサルmiRNAよりも、1つの分離したシグナル伝達経路内の複数の遺伝子を標的化する経路特異的miRNAを優遇することに決定した。miRNA標的を予測する34の公的に利用可能なインターネットツールを用いて、実施例1で選択された83個の熱発生制御因子分子（36個の転写因子を含む）の中のいくつかの標的を潜在的に調節し得る特異的ヒトmiRNAを検索した。
【０１７４】
いくつかのパラダイムを考慮した。
【０１７５】
A) 1マイクロRNA‐複数mRNAの経路特異的パラダイム
A1. 1マイクロRNA‐複数mRNAの経路特異的パラダイムの第1例
ヒストンのメチル化状態は、ヒストンメチルトランスフェラーゼおよびデメチラーゼによって動的に調節され得る。ヒトリジン (K) 特異的デメチラーゼ3A (KDM3A) は、代謝遺伝子の発現を調節するのに極めて重要である。その機能喪失は、マウスにおいて肥満および高脂血症をもたらす。UCP1遺伝子のPPAR応答エレメント (PPRE) へのKDM3A結合のβアドレナリン刺激は、PPREにおけるH3K9me2（ヒストンH3のリジン9のジメチル化）のレベルを低下させるのみならず、PPREへのPPARGおよびRXRAならびにそれらのコアクチベーターPPARGC1A、CREBBP、およびNCOA1の動員を促進する。TargetScan Humanデータベース（リリース6.0）の問い合わせにより、ヒトKDM3A 3' UTR 29〜35領域がhsa-miR-22の保存された標的であることが明らかになった。いくつかの他のmiRNA標的データベースからも、hsa-miR-22とKDM3Aとのこの一致が確認された。したがって、hsa-miR-22アンタゴミアによるデメチラーゼKDM3Aの産生増加は、UCP1遺伝子プロモーター領域の脱メチル化をもたらし、よっていくつかの調節エレメントの結合およびUCP1産生の増加を促進するはずである。
【０１７６】
加えて、本発明者らは、34のmiRNA標的および発現ツール（表4）を用いて、所与のmiRNAのmRNA標的を同定した。
【０１７７】
（表４）miRNAおよびそれらの標的を選択するために用いられたバイオインフォマティクスツール
2015518485.tif 000018
メタツールは太字で表示 (13)
メタツールによってコールされるエンジンはイタリック体で表示 (13)
【０１７８】
上記のインシリコ戦略を適用したところ、hsa-miR-22-3pおよびhsa-miR-22-5pがそれぞれ、選択された83個の熱発生標的のうちの合計42個および8個と相互作用することが見出された。このデータを表5に記載する。
【０１７９】
（表５）hsa-miR-22の予測されたおよび／または検証された標的として同定された熱発生制御因子
2015518485.tif 000019
【０１８０】
A2. 1マイクロRNA‐複数mRNAの経路特異的パラダイムのその他の例
本発明者らはまた、34のmiRNA標的および発現ツール（表4）を用いて、脂肪細胞の536個のmiRNA（表1）のうちのいずれかと83個の熱発生標的（表2）との間の潜在的関係を探索した。
【０１８１】
多くの脂肪細胞miRNAが、83個の熱発生標的のうちの少なくとも1つと相互作用すると考えられる（予測および／または検証）。例えば、miR-17-3pおよびhsa-miR-17-5pはそれぞれ、選択された熱発生の83個の標的のうちの合計23個および65個と相互作用する。このデータを表6に記載する。
【０１８２】
（表６）hsa-miR-17の予測されたおよび／または検証された標的として同定された熱発生制御因子
2015518485.tif 000020
【０１８３】
関心対象のmiRNAとそれらのmRNA標的のリストが作成された時点で、以下のフィルターをかけてその結果を精緻化した：
パラメータ
1 関心対象の組織／細胞におけるmiRNAの発現
2 所与の遺伝子または遺伝子セットに対して1つのmiRNAを予測するアルゴリズムの数
3 アルゴリズムからのスコア／パーセント
4 1つのmiRNAによって標的化される好ましい遺伝子の数
5 標的遺伝子における1つのmiRNAに対する結合部位の数
6 標的遺伝子におけるいくつかのmiRNAに対する結合部位の数
7 標的遺伝子の間での1つのmiRNAのシード相補的配列の過剰提示（miRvestigator）
8 検証されたmiRNA-mRNA標的対
9 miRNA結合部位のゲノム位置（5'UTR‐プロモーター‐CDS‐3'UTR）
10 miRNAのイントロン位置
11 miRNAのクラスター化
12 関心対象の特定の組織／細胞におけるmiRNAの存在量
【０１８４】
上記のパラメータを適用したところ、229個のmiRNAがこれらの基準のうちの少なくとも2つを満たすことが見出された。このデータを表7に記載する。
【０１８５】
（表７）選択基準の数の減少によるmiRNAの順位
2015518485.tif 000021
2015518485.tif 000022
【０１８６】
B) 複数マイクロRNA‐1 mRNAのパラダイム
B1. UCP1を含む1つの例示的な複数miRNA‐1 mRNAのパラダイム
脂肪細胞において、重要な熱発生制御因子は最終的にはUCP1（サーモゲニンとも命名された）であり、したがってすべての熱発生制御因子は最終的にUCP1活性に影響を及ぼさなくてはならない。UCP1は、ミトコンドリア内膜を介してプロトン漏出を生じ、ひいてはATP合成から酸化的リン酸化を切り離すミトコンドリア輸送タンパク質である。結果として、エネルギーは熱という形で消散される（適応熱発生）（図5を参照されたい）Lowell et al., Nature (2000)；Friedman et al., Bioinformatics (2010)；Hsu et al., Nucleic acids research (2011)；Rieger et al., Frontiers in Genetics (2011))。
【０１８７】
UCP1生合成は、主に転写レベルで制御される。図6は、他の例示的な熱発生制御因子によるUCP1の転写制御を示す。UCP1遺伝子のプロモーター領域は多くの異なる調節部位を含み、広範なタンパク質がその転写に正（図7aを参照されたい）および負（図7bを参照されたい）の両方の影響を及ぼすことが可能となる。
【０１８８】
メンデルランダム化とは、非実験研究において、機能公知の遺伝子における測定された変異を用いて、疾患に対する変更可能な曝露の因果効果を調べる方法である。メンデルランダム化は、「天然の」ランダム化臨床試験と考えられる。
【０１８９】
UCP1のエキソン2内のプロモーターにおける-3826 A/G一塩基多型などのUCP1遺伝子の遺伝子多型は、mRNA発現の減少および肥満と関連することが報告されている。G/G遺伝子型を有する健常小児は、高脂肪食および急性寒冷曝露に応答した熱発生に関してより低い能力を有した。若年女性では、この同じ-3826 A/G UCP1遺伝子多型により、安静時エネルギー消費量および体温調節交感神経系活動が減少する。367名の韓国人女性の試験において、-3826 A>GのG対立遺伝子および-412 A>CのC対立遺伝子は、優性モデルにおいて腹部皮下脂肪のより大きな領域と有意に関連していた（それぞれ、p<0.001およびp<0.0004）；それらを共に組み合わせると (ht2[GC])、この有意性は向上した (p<0.00005)。100名の重度肥満成人 (BMI > 40 kg/m2) および100名の標準体重対照対象（BMI範囲＝19〜24.9 kg/m2）の試験により、プロモーター領域における7つの変異が同定され、4つはUCP1遺伝子のイントロン領域に、および4つはエキソン領域に存在した。これらの変異は肥満の発生に寄与し得、特にg.-451C>T、g.940G>A、およびg.IVS4-208T>Gは、エネルギー貯蔵を促進する「倹約」因子を表し得る。最後に、UCP1遺伝子の上流プロモーター領域に位置する2つの多型（A-3826GおよびC-3740A）は、遺伝子発現に影響を及ぼし、ヒトの長寿命と関連づけられる。
【０１９０】
前述の情報はすべて、適応熱発生に変化を起こし、その結果としてヒト肥満を治療するための有意義な方法として、UCP1の発現および活性を標的化することを支持する。この目的を果たすために多くの戦略を実行することができるが、本発明の方法で使用される戦略では、miRNA剤を用いて熱発生経路内のいくつかのエレメントを同時に調節して、UCP1の合成および活性を増加させる。miRNAとUCP1遺伝子との間の直接的相互作用および間接的相互作用の両方が考慮される。直接的相互作用とは、UCP1遺伝子の様々な領域に対するmiRNAの直接結合を意味し、これによってUCP1 mRNAの転写、翻訳、安定性、および／または分解の変化が起こる。間接的相互作用とは、miRNAが熱発生mRNAの転写、翻訳、安定性、および／または分解を変化させ、その熱発生mRNAの発現されたタンパク質がUCP1遺伝子の転写を変化させることを意味する。さらに、間接的相互作用とは、miRNAが、UCP1遺伝子の転写を変更する他のmiRNAの転写、翻訳、安定性、および／または分解を変化させることを意味する。
【０１９１】
ヒトUCP1遺伝子（gi|237858805|ref|NG_012139.1｜ヒト脱共役タンパク質1（ミトコンドリア、プロトン担体) (UCP1)、第4染色体上のRefSeqGene）のプロモーター領域は、特に調節エレメントモチーフが豊富である（表8）。
【０１９２】
（表８）UCP1遺伝子調節エレメント
2015518485.tif 000023
2015518485.tif 000024
2015518485.tif 000025
【０１９３】
図8Aは、15,910塩基対ヒトUCP-1遺伝子（FASTAアクセッション番号：>gi|237858805|ref|NG_012139.1｜ヒト脱共役タンパク質1（ミトコンドリア、プロトン担体) (UCP1)、第4染色体上のRefSeqGene；NCBI参照配列：NG_012139.1）のヌクレオチド5,001位のUCP1転写開始部位に関するこれらの様々な調節エレメントの位置を示す。
【０１９４】
miRNAによるこれらの調節エレメントの直接的または間接的な活性化または抑制は、UCP1遺伝子の発現および活性の変化をもたらす。通常の状態では、UCP1遺伝子の発現および活性は、エネルギー浪費を回避するために、調節エレメントの豊かなネットワークによって抑制されている。寒冷環境への曝露などのストレス下では、UCP1遺伝子の発現は、いくつかのmiRNAの制御下にある様々な活性化因子および抑制因子を介して上方制御される。
【０１９５】
microRNA.orgを含むいくつかのプログラムを用いて、ヒトUCP1 3'UTRを標的化するmiRNAを最初に調査したところ、陰性であった。しかしながら、UCP1 Ensembl 1,462塩基対転写物ENST00000262999を標的として用いて、MicroCosm Targetsを含む他のプログラムにより、表9に示されるような、UCP1 3'UTRの28の位置における27個のmiRNAに対する結合部位が明らかになった。
【０１９６】
（表９）MicroCosm Targets を用いて決定された、UCP1（NCBI参照配列NG_012139.1）の3'UTRにおけるmiRNAの結合部位
2015518485.tif 000026
【０１９７】
UCP1 Ensembl 1,462塩基対転写物 (ENST00000262999)、UCP1 Ensembl 9,371塩基対遺伝子配列 (ENSG00000109424)、または15,910塩基対UCP1配列（NCBI参照配列：NG_012139.1)を標的として用いて、miRWalk、miRGen、miRGator-miRanda、およびDIANA microTなどの他のプログラムにより、表10に示されるような、UCP1 3'UTRの69の位置における合計50個のmiRNAに対する結合部位が明らかになった。
【０１９８】
（表１０）いくつかのプログラムによる、UCP1（NCBI参照配列、NG_012139.1）の3'UTRにおけるmiRNAの結合部位
2015518485.tif 000027
2015518485.tif 000028
2015518485.tif 000029
【０１９９】
ヒトUCP1遺伝子の配列といくつかのmiRNA配列とのアラインメントにより、UCP1遺伝子の5'UTR、プロモーター領域、およびコード領域における一致が得られた。UCP1遺伝子の様々な領域を標的化するmiRNAを予測する公的に利用可能なインターネットツールの問い合わせにより、いくつかのヒットが導き出された。驚いたことに、これらの予測ツール間の重複は、図3に示されるようにゼロであった。
【０２００】
それにもかかわらず、アラインメントプログラムGeneiousを用いてmiRNAデータベースをスクリーニングした。UCP1遺伝子配列において相補的な450個の結合部位を有する合計191個のヒトマイクロRNAが見出された（表11）。一致の長さは、7塩基〜12塩基（例えば、hsa-miR-24-2-5pおよびhsa-miR-192-5p）である。miRNA当たりのヒットの数は1個から数個まで様々である（例えば、hsa-miR-19b2（豊富な脂肪細胞miRNA）については9個、hsa-miR-26a-2-3pについては14個、hsa-miR-181cについては11個、およびhsa-miR-620については12個）。
【０２０１】
（表１１）UCP1遺伝子配列（NCBI参照配列：NG_012139.1）中に予測される結合部位を有するmiRNA
2015518485.tif 000030
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2015518485.tif 000041
【０２０２】
B2. UCP2を含む別の例示的な複数miRNA‐1 mRNAのパラダイム
UCP2は、WAT、骨格筋、膵島、および中枢神経系において発現されるミトコンドリア輸送タンパク質である。UCP1と同様に、これはミトコンドリア内膜を介してプロトン漏出を生じ、ひいてはATP合成から酸化的リン酸化を切り離す（適応熱発生、図5を参照されたい）(Lowell et al., Nature (2000))。
【０２０３】
2つの最近のメタ解析は、UCP2のプロモーター領域における多型と肥満との関連性を報告している（Liu et al., Gene (2013)；Andersen et al., Int. J. Obes. (2013)）。第1のメタ解析は14の試験（7,647例の症例および11,322例の対照）を含み、特にヨーロッパ人集団において、UCP2 -866G/A多型のA対立遺伝子と肥満のリスク低下との有意な関連性があると結論づけた。12,984名の対象を含む第2のメタ解析において、一般的なUCP2 -866G対立遺伝子は肥満と関連している。この同じUCP2 -866G対立遺伝子は、17,636名のデンマーク人対象においてインスリン感受性の低下と関連している。ある試験において、内臓脂肪におけるUCP2 mRNAレベルは、GG表現型を有する対象において低下していた (Esterbauer et al., Nat. Genet. (2001))。別の試験において、皮下脂肪細胞UCP2 mRNAと体脂肪率との負の相関関係の傾向が見出された (Wang et al., American Journal of Physiol. (2004))。この情報は、適応熱発生に変化を起こし、その結果としてヒト肥満を治療するための有意義な方法として、UCP2の発現および活性を標的化することを支持する。この目的を果たすために多くの戦略を実行することができるが、本発明の方法で使用される戦略では、miRNA剤を用いて熱発生経路内のいくつかのエレメントを同時に調節して、UCP2の合成および活性を増加させる。miRNAとUCP2遺伝子との間の直接的相互作用および間接的相互作用の両方が考慮される。直接的相互作用とは、UCP2遺伝子の様々な領域に対するmiRNAの直接結合を意味し、これによってUCP1 mRNAの転写、翻訳、安定性、および／または分解の変化が起こる。間接的相互作用とは、miRNAが熱発生mRNAの転写、翻訳、安定性、および／または分解を変化させ、その熱発生mRNAの発現されたタンパク質がUCP2遺伝子の転写を変化させることを意味する。さらに、間接的相互作用とは、miRNAが、UCP2遺伝子の転写を変更する他のmiRNAの転写、翻訳、安定性、および／または分解を変化させることを意味する。
【０２０４】
ヒトUCP2遺伝子（ENSG00000175567、ヒト脱共役タンパク質2（ミトコンドリア、プロトン担体) (UCP2)、第11染色体上のRefSeqGene）のプロモーター領域は、調節エレメントモチーフが豊富である（表12）。
【０２０５】
（表１２）UCP2遺伝子調節エレメント
2015518485.tif 000042
【０２０６】
図8Bは、15,174塩基対ヒトUCP2遺伝子のヌクレオチド5,001位のUCP2転写開始部位に関するこれらの様々な調節エレメントの位置を示す。miRNAによるこれらの調節エレメントの直接的または間接的な活性化または抑制は、UCP2遺伝子の発現および活性の変化をもたらす。
【０２０７】
UCP2 Ensembl 2,113塩基対転写物ENST00000310473を標的として用いて、いくつかの予測プログラムにより、ヒトUCP2 3'UTRを標的化するmiRNAを調査したところ、表13に示されるような、161個のmiRNAに対する結合部位が明らかになった。
【０２０８】
（表１３）UCP2転写物配列の3'UTR中に予測される結合部位を有するmiRNA
2015518485.tif 000043
2015518485.tif 000044
【０２０９】
さらに、5,000 bp 5'UTRを含むヒトUCP2遺伝子（ENSG00000175567、15,174塩基対 (bp) を標的として用いて、いくつかの予測プログラムにより、ヒトUCP2 5'UTRを標的化するmiRNAを調査したところ、表14に示されるような、UCP2 5'UTRにおける54個のmiRNAに対する結合部位が明らかになった。
【０２１０】
（表１４）UCP2遺伝子配列の5'UTR中に予測される結合部位を有するmiRNA
2015518485.tif 000045
2015518485.tif 000046
【０２１１】
C) 複数マイクロRNA‐複数mRNAのパラダイム
表2において選択された83個の熱発生制御因子分子を、高ストリンジェンシーの複数miRNA‐複数mRNA関連性についてスクリーニングした。7つの主要な予測ツールによるこれらの解析の結果を図4に示す。これら7つのツールを併せることで、4439個のmiRNA‐遺伝子対が得られた。これらのツール間の重複は、ツール数が増加するにつれて減少していき、7つのツールを考慮した場合には、わずか15個のmiRNA‐遺伝子対に達した。
【０２１２】
D) 同時調節されるmRNA標的の間での1つのマイクロRNAシード配列モチーフの過剰提示のパラダイム
いくつかのアプローチを用いて、経路特異的miRNAを同定することができる。例えば、推定的に同時調節される遺伝子の3'-UTRを、miRNAシード領域に由来する過剰提示される配列について検索することにより、共通の調節性miRNAを同定することができる。特定のmiRNAシード配列が、選択された83個の熱発生標的の3' UTRの間で過剰提示されるかどうかを判定するために、miRvestigatorウェブアプリケーション (miRvestigator. systemsbiology.net/) を使用した。以下のパラメータ（モチーフサイズ8 bp、デフォルトWeederモデル、シードモデル8mer、100%の相補性相同性、および0.25のゆらぎ塩基対許容）を用いて、hsa-miR-19a/19bによって認識されるモチーフ5'-UUUGUACA-3'が、表15に示されるように1.7 x 10-04の相補性p値を有して、83個の熱発生標的のうちの15個の間で過剰提示されると判断された。注目すべきことは、hsa-miR-19が豊富なヒト脂肪細胞miRNAとして報告されていることである。
【０２１３】
（表１５）共通モチーフUUUGUACAとhsa-miR-19a/19bとの間の相補性
2015518485.tif 000047
【０２１４】
miRvestigatorによって同定されたhsa-miR-19 mRNA/miRNA二重鎖の最小自由エネルギーは極めて低く、堅固な結合を支持する。したがって、相補性のより低いストリンジェントレベルを用いて、miRvestigator解析を繰り返した。この解析により、コンセンサスhsa-miR-19モチーフと95%の類似性を有するさらなる10個の付加的な標的（CEBPD、PRKAA1、TWIST1、IRS1、NCOA1、NCOA2、NCOA3、KLF5、RPS6KB1、NRIP1）が同定された。興味深いことに、hsa-miR-19は、脂肪組織中で最も豊富なmiRNAの中の1つである。hsa-miR-19シード領域と相補的な配列を含むとして同定された遺伝子を、表16に記載する。
【０２１５】
（表１６）hsa-miR-19の標的として同定された熱発生制御因子
2015518485.tif 000048
【０２１６】
したがって、相補性のより低いストリンジェントレベルを用いて、miRvestigator解析を繰り返した（モチーフサイズ8 bp、デフォルトWeederモデル、シードモデル8mer、95%の相補性相同性、および0.25のゆらぎ塩基対許容）。この解析により、コンセンサスhsa-miR-19モチーフと95%の類似性を有するさらなる10〜12個の付加的な標的（CEBPD、CREB1、PRKAA1、TWIST1、INSR、IRS1、NCOA1、NCOA2、NCOA3、KLF5、RPS6KB1、NRIP1）が同定された。興味深いことに、hsa-miR-19は、脂肪組織中で最も豊富なmiRNAの中の1つである。hsa-miR-19シード領域と相補的な配列を含むとして同定された遺伝子を、表17に記載する。
【０２１７】
（表１７）コンセンサスモチーフと95%〜100%の類似性を有する、hsa-miR-19a/bの標的として同定された熱発生制御因子
2015518485.tif 000049
2015518485.tif 000050
【０２１８】
ゆらぎがない場合には、この同じモチーフ5'-UUUGUACA-3'は、1.4 x 10-4の相補性p値を有して、hsa-miR-1283の標的の間で過剰提示される。さらに、hsa-miR-1283は、ABCA1（コレステロール輸送体）、アディポネクチン受容体、および遺伝性ヒト肥満に関与する転写因子TCF7L2のような関心対象の他のmRNAに結合する。
【０２１９】
同様に、脂肪細胞において発現されるmiRNAについて、その他のmiRNA過剰提示シード配列が同定された。数例を挙げると、それらには、ユニバーサルhsa-let-7ファミリー（配列CUAUACAA、p値 = 7.5e-04）および脂肪細胞リッチhsa-miR-30ファミリー（配列UGUAAACA、p値 = 1.9 x 10-3）が含まれる。
【０２２０】
STRINGソフトウェアパッケージに準じてUCP1と直接関係があるPRDM16、CIDEA、NRIP1、KDM3A、CEPPB、PPARG、PPARGC1A、およびPPKAA2に関して、それらはすべて、以下のようにhsa-miR-3658（p値 = 1.9e-003）およびhsa-miR-30ファミリー（p値 = 6.3e-003）を含むいくつかのmiRNAとコンセンサス配列を共有する（モチーフサイズ8 bp、デフォルトWeederモデル、シードモデル8mer、95%の相補性相同性、および0.25のゆらぎ塩基対許容において）と考えられる。
2015518485.tif 000051
【０２２１】
E) イントロンmiRNA‐複数mRNAの経路特異的パラダイム
多くの哺乳動物miRNAは、それら自体の特有の転写単位よりもむしろ、タンパク質コード遺伝子のイントロン内に位置する。イントロンmiRNAは典型的に、それらが属する前駆体mRNAと共に発現され、プロセシングされる。イントロンmiRNAおよびそれらの宿主遺伝子は独立して調節され得るが、イントロンmiRNAは、宿主遺伝子のUTRを標的化することによって、それ自体の宿主タンパク質コード遺伝子を下方制御することができる。宿主タンパク質コード遺伝子に対するフィードバック調節は、miRNA標的である転写因子を選択することによって、またはイントロンmiRNA宿主遺伝子産物とmiRNA標的遺伝子産物とのタンパク質間相互作用によって達成することができる。一例として、miR-33はSREBP宿主遺伝子と協調して作用してコレステロール恒常性を制御し、miR-33aおよびmiR-33bの薬理学的阻害は、脂質異常症の治療のために血漿HDLレベルを上昇させかつ血漿VLDLトリグリセリドレベルを低下させるための有望な治療戦略である。
【０２２２】
83個の熱発生標的遺伝子の調査により、2つのイントロンmiRNA：PPARGC1B遺伝子中に位置するmiR-378およびPRDM16遺伝子中に位置するmiR-4251が明らかになった。
【０２２３】
miRNA標的を予測するインターネットツールのマイニングによって、miR-378標的には、BMP2、PPARA、PPARGC1A、PRDM16、STAT5、およびWNT10A、ならびにADIPOQおよびIGFR1が含まれること；ならびにmiR-4251標的には、BMP2、CTBP1、CTBP2、MAPK14、NCOA3、PLAC8、PPARA、PPARD、TRPM8、ならびにABCA5、ABCA13、ADIPOQR2、KDM5B、KLF-12、KLF-14、およびTCF7L2が含まれることが示される。
【０２２４】
実施例3. ハイコンテント細胞表現型スクリーニング
ハイコンテントスクリーニング法を用いて、熱発生制御因子（例えば、UCP1およびUCP2）の活性を調節する新規miRNA剤をスクリーニングする。ハイコンテントスクリーニングは、分子の発見を容易にするために生細胞の画像を使用する、薬物発見の方法である。このような自動画像ベースのスクリーニング法は、細胞表現型を変化させる薬剤を同定するのに特に適している。
【０２２５】
WAT細胞は大きな脂肪滴を含むのに対して、BAT細胞は多くのより小さな液滴およびはるかにより多くのミトコンドリアを含み、BAT細胞は鉄を含むために褐色に見える。BAT中の多数のミトコンドリアは、WATと比較して酸素消費の増加を招く。したがって、それらの細胞表現型に基づいて、BAT細胞とWAT細胞を識別することが可能である。
【０２２６】
したがって、ハイコンテントスクリーニング法を用いて、熱発生制御因子の活性を調節する新規miRNA剤をスクリーニングした。具体的には、miRNAアゴニストまたはアンタゴニストの存在下および非存在下で増殖させた培養ヒト脂肪細胞および脂肪組織由来間葉系幹細胞の表現型の様子を、培養細胞の位相差顕微鏡観察、細胞脂質含量（オイルレッドO染色またはナイルレッド蛍光を使用）；ミトコンドリア含量（例えば、Life Technologies Mito-Tracker Red FMを使用）、および／またはインビトロでの酸素消費（例えば、Seahorse Bioscience Extra-Cellular Flux Instrumentを使用）の測定により、2週間にわたって評価した。mRNA発現は、標的化q-RT-PCR、NanoString、およびユニバーサルRNA‐配列決定によって測定する。タンパク質発現は、標的化ウェスタンブロッティングおよびユニバーサルプロテオミクスプロファイリングによって測定する。
【０２２７】
A. ヒト前脂肪細胞の脂肪細胞への分化
1. 分化プロトコール
ヒト前脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化に及ぼすmiRNA類似体の効果を評価するために、ヒト皮下前脂肪細胞（8匹の雌ドナー由来のSuperLot 0048、ZenBio、NC）を0日目に96ウェルプレートにプレーティングし、前脂肪細胞培地（DMEM/Ham's F-12（1:1、v/v）、HEPES緩衝液、ウシ胎仔血清、および抗生物質）中で一晩付着させた。翌日（1日目）、培地を除去し、分化培地（DMEM/Ham's F-12（1:1、v/v）、100μMアスコルビン酸、0.85μMインスリン、20 nM亜セレン酸ナトリウム、0.2 nMトリヨードチロニン、1μMデキサメタゾン、100μMイソブチルメチルキサンチン、100 nMロシグリタゾン、および抗生物質と交換した。細胞を37℃、5% C02にて2日間インキュベートした。2日後（3日目）、培地を除去し、新鮮な維持培地（DMEM/Ham's F-12（1:1、v/v）、100μMアスコルビン酸、0.85μMインスリン、20 nM亜セレン酸ナトリウム、0.2 nMトリヨードチロニン、および抗生物質）と交換した。3日目に、トランスフェクション剤Dharmafect1を用いて、細胞にmiRNA類似体（Dharmacon特異的miRIDIAN模倣物およびヘアピン阻害剤）をトランスフェクトした。処理はすべて3つ組で行った。トランスフェクション後、陰性対照は維持培地のみであり、陽性対照は、100 nMのPPARGアゴニストであるロシグリタゾンを含む維持培地であった。2日後、培地を除去し、新鮮な維持培地と交換した。その後、処理期間の終了時（15日目）まで2日ごとに維持培地を交換した。処理（合計15日間の培養）の終了時に、表現型決定および遺伝子型決定スクリーニングのために細胞を処理した。
【０２２８】
2. 前脂肪細胞のトランスフェクション
miRNA類似体の標的細胞への浸透を促進するために、トランスフェクション試薬を使用する。一例として、本発明者らがトランスフェクション剤Dharmafect 1（Dharmacon、CO）を用いて前脂肪細胞において達成したトランスフェクション効率の程度を、本明細書に示す。トランスフェクション効率は2つの方法で評価した：
a. 蛍光miRNA類似体を用いたトランスフェクション後の細胞の落射蛍光の測定
Dy547標識された非標的指向miRIDIAN模倣物およびヘアピン阻害剤 (100 nM) を3日目にトランスフェクトした細胞において、15日目に蛍光を測定した（540励起／590放射）。図9に示されるように、トランスフェクションの12日後でさえ、蛍光miRNA類似体をトランスフェクトした細胞の有意により高い蛍光が認められた：
b. 対照遺伝子発現の減少
前脂肪細胞のトランスフェクションの成功を確認するために、対照遺伝子GAPDH（「ハウスキーピング遺伝子」）の発現の減少を、GAPDH特異的siRNAを前脂肪細胞にトランスフェクトしてから4日後（7日目）（図10A）および12日後（15日目）（図10B）に測定した。細胞溶解物を得て、Cells-to-Ct試薬によって得られた純粋RNAを用いてRT-PCRを行った。図10Aおよび10Bに示されるように、トランスフェクション後の4日目および12日目に、GAPDH mRNA発現の91%および86%のノックダウンが観察され、いずれも高度に有意であった。
【０２２９】
3. ヒト前脂肪細胞が脂肪細胞に分化する過程における表現型変化
処理（15日間の培養）の終了時に、脂質含量を評価するために細胞をオイルレッドOで染色した。図11A〜Fに示されるように、ロシグリタゾンを含まない培地の存在下では、前脂肪細胞は、脂質を負荷した成熟脂肪細胞への分化をほとんど示さなかった。2日間にわたり100 nMロシグリタゾンを含む分化培地、およびその後12日間にわたり維持培地が存在した場合（陰性対照）、脂質を負荷した成熟脂肪細胞へのいくらかの分化が認められる。実験を通して100 nMロシグリタゾンが存在した場合（陽性対照）、細胞の大部分が、脂質を負荷した成熟脂肪細胞になった。一例として、25 nM hsa-miR-30b模倣物の存在下では、細胞の約半数が、脂質を負荷した成熟脂肪細胞になった。非標的指向miRNA模倣物および阻害剤は、陰性対照と同様のパターンを示した。
【０２３０】
4. ヒト前脂肪細胞が脂肪細胞に分化する過程における遺伝子型変化
ロシグリタゾンまたはmiRNA類似体によって誘導されるヒト前脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化中に起こるmRNA変化のプロファイリングを、RNA-Seq技術により行った。低分子RNA配列決定 (RNA-Seq) は、現在、事前の配列情報も二次構造情報も必要とせずに、公知および未知の全低分子RNAのトランスクリプトーム全域にわたるプロファイリングを可能にするハイスループット次世代配列決定プラットフォームである。
【０２３１】
前脂肪細胞（前脂肪細胞陰性対照）から、および100 nMロシグリタゾン（分化陽性対照）または25 nM miRNA模倣物もしくは阻害剤の存在下で12日間培養した前脂肪細胞から、RNA試料を抽出した。Illumina Hi-Seq 2000装置において、RNA配列決定を実施した。その結果をヒトゲノム19 (http://genome.ucsc.edu/) に対してマッピングした。miRNA類似体の存在下では、前脂肪細胞を参照した場合に313〜449個のmRNAが有意に差次的に発現されると考えられる。ロシグリタゾンを参照した場合、有意に差次的に発現される遺伝子の数は111〜216個減少し、よってmiRNAとPPARG類似体との間の脂肪細胞分化の活性化の共通経路が示唆される。
【０２３２】
本発明者らの83個の熱発生活性化因子および阻害因子に関して、それらのうちの73個の発現が、ロシグリタゾンまたはmiRNA類似体の存在下で変化する。ロシグリタゾン（図12A）、またはmiRNA類似体hsa-let-7a阻害剤、hsa-miR-1模倣物、hsa-miR-19b模倣物、hsa-miR-30b模倣物の存在下、または対照脂肪細胞における熱発生標的のmRNA発現の変化をそれぞれ図12B〜Fに示す）。
【０２３３】
以下の表18に示されるように、UCP1、2、および3のmRNA発現の変化もまた、ロシグリタゾンまたはmiRNA類似体の存在下で測定した。
【０２３４】
（表１８）熱発生mRNA発現の変化
2015518485.tif 000052
【０２３５】
3つの脱共役タンパク質の発現レベルは、前脂肪細胞において低かった。UCP1の発現は、1日おきに培地と共に新しくした100 nMロシグリタゾンの存在下で有意に増加した。miRNA類似体によるUCP1 mRNA上昇の大きさは、ロシグリタゾンの場合よりも低かったが、使用したmiRNA類似体濃度 (25 nM)、およびRNA抽出の12日前にトランスフェクションを1回だけ行ったという事実に留意されたい。主な発見は、ロシグリタゾンおよびmiRNA類似体の存在下におけるUCP2発現の劇的な増加である。UCP3の発現は、主に筋細胞で発現される遺伝子に関して予測される通り、いずれの条件においても変化しなかった。UCP1およびUCP2発現のこの増加から、これらのmiRNAの投与により、熱発生の大きな可能性を有する脂肪細胞への細胞分化が生じ、よっておそらくは肥満およびその他の代謝疾患および障害を治療するための有効な医薬品であることが示唆される。
【０２３６】
さらに、本発明者らは、miRNA類似体の存在下における前脂肪細胞の培養中に差次的に発現される遺伝子を調べた。図13に示される一例として、M-Aプロットを作成して、維持培地中で増殖させた前脂肪細胞とhsa-miR-19b模倣物の存在下で増殖させせた前脂肪細胞とのmRNAの発現の差を可視化した。x軸は平均遺伝子発現であり、y軸は対数尺度での対間の差である。赤色ドットは、差次的に発現される遺伝子である（ゼロを超えて上方制御されるおよびゼロを下回って下方制御される）。灰色ドットは、対照とhsa-miR-19b模倣物との間で差次的に発現されない遺伝子である（ゼロを超えて上方制御されるおよびゼロを下回って下方制御される）。
【０２３７】
図14に示される一例として、維持培地のみで培養した前脂肪細胞を参照した場合、miRNA類似体hsa-let-7a阻害剤、hsa-miR-1模倣物、hsa-miR-19b模倣物、およびhsa-miR-30b模倣物の存在下で有意に差次的に発現される遺伝子の数は、それぞれ406個、382個、370個、および433個であった。これら4つのmiRNA類似体によって、一組の127個の遺伝子が共通して上方制御された（ベン図、図14）。
【０２３８】
それらには、ALDH1A1、AZGP1、CEBPA、PPARGC1A、UCP1、およびUCP2のような、本発明者らの83個の熱発生標的のうちのいくつかのみならず、脂質代謝および脂肪細胞分化に関与する多くの遺伝子が含まれる（表19）。
【０２３９】
（表１９）4つのmiRNA類似体によって共通して上方制御される一組の127個の遺伝子
2015518485.tif 000053
【０２４０】
これら4つのmiRNA類似体によって、一組の60個の遺伝子が共通して下方制御された（ベン図、図15）。
【０２４１】
それらには、多くのケモカイン遺伝子、ならびに細胞増殖およびに関与する遺伝子が含まれる（表20）。
【０２４２】
（表２０）4つのmiRNA類似体によって共通して下方制御される一組の60個の遺伝子
2015518485.tif 000054
【０２４３】
B. ヒト白色脂肪細胞の褐色脂肪細胞への分化
1. 分化プロトコール
ヒト白色脂肪細胞の褐色脂肪細胞への分化に及ぼすmiRNA類似体の効果を評価するために、ヒト皮下前脂肪細胞（8匹の雌ドナー由来のSuperLot 0048、ZenBio、NC）を0日目に96ウェルプレートにプレーティングし、前脂肪細胞培地（DMEM/Ham's F-12（1:1、v/v）、HEPES緩衝液、ウシ胎仔血清、および抗生物質）中で一晩付着させた。翌日（1日目）、培地を除去し、分化培地-2（DMEM/Ham's F-12（1:1、v/v）、HEPES緩衝液、ウシ胎仔血清、ビオチン、パントテン酸、ヒトインスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、専売PPARGアンタゴニスト、および抗生物質と交換した。細胞を37℃、5% C02にて7日間インキュベートした。7日後（7日目）、AM-1脂肪細胞維持培地（DMEM/Ham's F-12（1:1、v/v）、HEPES緩衝液、ウシ胎仔血清、ビオチン、パントテン酸、ヒトインスリン、デキサメタゾン、および抗生物質）との部分的培地交換を行った。細胞を37℃、5% C02にてさらに7日間インキュベートした。17日目に、トランスフェクション剤Dharmafect 3を用いて、細胞にmiRNA類似体（Dharmacon特異的miRIDIAN模倣物およびヘアピン阻害剤）をトランスフェクトした。処理はすべて3つ組で行った。トランスフェクション後、陰性対照は維持培地のみであり、陽性対照は、100 nMのPPARGアゴニストであるロシグリタゾンを含む維持培地であった。2日後、培地を除去し、新鮮な維持培地と交換した。その後、処理期間の終了時（30日目）まで2〜3日ごとに維持培地を交換した。処理（合計30日間の培養）の終了時に、表現型決定および遺伝子型決定スクリーニングのために細胞を処理した。
【０２４４】
2. 脂肪細胞のトランスフェクション
miRNA類似体の標的細胞への浸透を促進するために、トランスフェクション試薬を使用する。
【０２４５】
一例として、本発明者らがトランスフェクション剤Dharmafect 3（Dharmacon、CO）を用いて脂肪細胞において達成したトランスフェクション効率の程度を、本明細書に示す。トランスフェクション効率は2つの方法で評価した：
a. 蛍光miRNA類似体を用いたトランスフェクション後の細胞の落射蛍光の測定
Dy547標識された非標的指向miRIDIAN模倣物およびヘアピン阻害剤 (100 nM) を17日目にトランスフェクトした細胞において、30日目に蛍光を測定した（540励起／590放射）。図16に示されるように、トランスフェクションの12日後でさえ、蛍光miRNA類似体をトランスフェクトした細胞の有意により高い蛍光が認められた。
b. 対照遺伝子発現の減少
脂肪細胞のトランスフェクションの成功を確認するために、対照遺伝子GAPDH（「ハウスキーピング遺伝子」）の発現の減少を、GAPDH特異的siRNAによる脂肪細胞のDharmafect 3（Dharmacon、CO）媒介性トランスフェクトションの4日後（22日目）および12日後（30日目）に測定した。細胞溶解物を得て、Cells-to-Ct試薬によって得られた純粋RNAを用いてRT-PCRを行った。トランスフェクション剤Dharmafect 3を用いて、成熟脂肪細胞（トランスフェクトすることが難しいことが知られている細胞型）の効率的なトランスフェクションが達成された。図17に示されるように、トランスフェクション後の4日目および12日目に、GAPDH mRNA発現の54%および73%のノックダウンが観察され、いずれも高度に有意であった。
【０２４６】
3. 30日間の培養におけるヒト脂肪細胞の維持中の表現型変化
処理（30日間の培養）の終了時に、脂質含量を評価するために細胞をオイルレッドOで染色した（図18）。16日目から30日目まで維持培地のみが存在した場合（対照）、脂肪細胞には大きな脂肪滴が負荷されているようである。実験を通して100 nMロシグリタゾンが存在した場合（陽性対照）、赤色染色の強度は減少しているように見え、脂肪滴はより小さいようである。一例として、25 nM hsa-miR-30b模倣物の存在下では、赤色染色の強度は同様に減少しているように見え、脂肪滴はより小さいようである。非標的指向miRNA類似体の存在下では、このような変化は認められなかった。
【０２４７】
蛍光ナイルレッド色素を用いて、30日目の成熟脂肪細胞中に存在する脂質の量を測定した。図19に示されるように、15日目から30日目までロシグリタゾンに曝露しなかった脂肪細胞において、最も高い蛍光が認められた。同様の蛍光レベルは、非標的指向miRNA模倣物および阻害剤をトランスフェクトした細胞においても認められた。細胞をロシグリタゾンに2日間曝露した場合、蛍光は有意に低下し、15日目から30日目までロシグリタゾンが存在した場合にはさらに低下した。試験したmiRNA阻害剤の存在下では、蛍光レベルは、2日間から全期間中のロシグリタゾンで観察された範囲の中にある。miRNA模倣物の存在下では、蛍光レベルはより低いようであり、脂質含量がより低いことが示唆される。
【０２４８】
4. ヒト成熟脂肪細胞トランスフェクションの最適化
成熟脂肪細胞の効率的なトランスフェクションは達成が難しいことが知られているため、本発明者らは11種の異なるトランスフェクション剤を試験し、対照遺伝子GAPDHのmRNA発現の減少の程度を評価した。上記のプロトコールに従って、ヒト皮下前脂肪細胞を6ウェルプレートにプレーティングし、2週間かけて分化させた。その後、トランスフェクション剤をそれらの製造業者のプロトコールに従って使用して、GAPDHを標的化するmiRNA模倣物 (50 nM) を分化した脂肪細胞に導入した。トランスフェクトした細胞を試薬およびmiRNA模倣物と共に72時間インキュベートし、その後維持培地に切り換えた。トランスフェクションの14日後に、RNeasyミニキットを用いてRNAを単離し、対照遺伝子GAPDHおよび参照遺伝子18SについてのRT-PCR反応を、ウェル当たり100 ngのcDNAを用いて3つ組で行った。
【０２４９】
ウェル当たり抽出されたRNAの量は、この実験条件において潜在的細胞毒性を生じ得るトランスフェクション剤TransIT TKOおよびTransIT siQuestを除いて、非常に類似していた（図20）。
【０２５０】
Dharmafect 1およびsiPORT NeoFXを用いてトランスフェクトした細胞は、18S発現のレベルが有意に低下しており、RT-PCR実験解析から除外した。解析した残りの7種のトランスフェクション剤の中で、頻繁に使用されるトランスフェクション剤であるLipofectamine RNAiMAXは、トランスフェクション後の14日目にGAPDH発現の66%の減少をもたらし、Dharmafect 3およびDharmafect 4はそれぞれ、GAPDH発現の60%および75%の減少をもたらした（図21）。
【０２５１】
5. miRNA類似体または脂肪生成および／もしくは熱発生の公知の活性化因子の存在下で2週間培養したヒト成熟脂肪細胞の表現型変化
上記の通りに、ヒト皮下脂肪細胞をウェル当たり391,000個細胞の密度で6ウェルプレートにプレーティングした。Dharmafect 4を用いて、14日目にこれらの脂肪細胞に以下のものをトランスフェクトした：
1. 以下のmiRNA類似体のうちの1つ (50 nM)：
‐hsa-let-7a阻害剤（hsa-let-7aは、脂肪生成を調節することが報告されているユニバーサルmiRNAである）
‐hsa-miR-1模倣物（hsa-miR-1は、PRDM16およびUCP1を調節することが報告されている）
‐hsa-miR-19b模倣物（hsa-miR-19bは、本発明者らのインシリコ研究に従って、本発明者らの83個のmRNA標的のうちの多くと相互作用することが予測される、豊富な脂肪細胞miRNAである）、または
‐hsa-miR-30b模倣物（hsa-miR-30bは、本発明者らのインシリコ研究に従って、本発明者らの83個のmRNA標的のうちの多くと相互作用することが予測され、その過剰発現が脂質生成を促進するmiRNAである）
2. 陰性対照（模擬トランスフェクション）
3. 3つの陽性対照（脂肪生成および／または適応熱発生を変化させることが知られている、PPARGアゴニストであるロシグリタゾン (100 nM)、β3アドレナリン受容体アゴニストCL316,243 (10μM)、または甲状腺ホルモンであるトリヨードチロニン (10 nM)）。
【０２５２】
17日目に細胞を維持培地に切り換え、その後28日目まで2〜3日ごとにその培地を交換し、28日目に細胞の明視野顕微鏡観察写真を撮影した。
【０２５３】
図22に示されるように、対照条件を参照すると、陽性対照CL316,243およびロシグリタゾンの存在下で、ならびにhsa-let-7a阻害剤、has-miR-19b模倣物、およびhsa-miR-30b模倣物の存在下で、細胞密度の増加および「褐色化」の様子が認められる。異なる薬剤の細胞密度、脂質含量、脂肪滴の数およびサイズに及ぼす影響を表21に要約する。
【０２５４】
（表２１）
2015518485.tif 000055
【０２５５】
実施例4. ルシフェラーゼ活性およびqRT-PCRによるハイスループットmiRNA標的スクリーニング
ルシフェラーゼレポーターアッセイ構築物を使用するハイスループットスクリーニングを用いて、熱発生に関与する新規miRNA標的を同定する。
【０２５６】
ルシフェラーゼは、関心対象のプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ遺伝子を含む遺伝子構築物をトランスフェクトした細胞におけるその転写活性を評価するためのレポーターとしてよく用いられる。SwitchGear Genomicsは、LightSwitch（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムの成分としての、SwitchGearのRenSPレポーターカセットを含む最適化ルシフェラーゼレポーターベクターシステム中にクローニングされた、18,000個を上回るヒトプロモーターおよび12,000個を上回るヒト3' UTR領域のゲノム全域にわたるライブラリー（GoClone（商標））を作製した。この改変型のルシフェラーゼによって、そうでなければレポータータンパク質の蓄積によって曖昧になる可能性のある詳細な動態研究、特に抑制に焦点を当てた詳細な動態研究が著しく促進される。
【０２５７】
UCP1を単一の熱発生標的遺伝子として用いて、SwitchGear Genomic GoCloneシステムによって、複数マイクロRNA‐1 mRNAのパラダイムを試験した。Hela細胞およびHepG2細胞において、様々なヒトmiRNAとヒトUCP1遺伝子の3'UTR領域、5'UTR領域、およびプロモーター／エンハンサー領域との相互作用の可能性を探索するために、3つのレポーター構築物を作製した：
1. レポーター遺伝子の3'UTR領域にヒトUCP1配列の2,218 bp 3'UTR断片がクローニングされている、強力な構成的プロモーター (RPL10-prom) によって駆動されるレポーター遺伝子を含むヒトUCP1 3'UTR構築物。推定上のUCP1 3'UTR構築物に特異的な効果を同定するために、このレポーター活性に及ぼす特異的miRNA模倣物、阻害剤、または非標的指向対照の効果を、空‐3'UTRおよびアクチンβ‐3'UTRのものと比較する。
2. ヒトUCP1遺伝子配列のメチル化領域およびエンハンサー領域を網羅する転写開始部位および上流領域に及ぶ、ヒトUCP1配列の4,147 bp 5'UTR断片によって駆動されるレポーター遺伝子を含むヒトUCP1プロモーター構築物。推定上のUCP1 5'UTR構築物に特異的な効果を同定するために、このレポーター活性に及ぼす特異的miRNA模倣物、阻害剤、または非標的指向対照の効果を、アクチンβ‐プロモーターのものと比較する。
3. HSV-TK遺伝子座由来の短い最小プロモーターと、ヒトUCP1遺伝子配列のエンハンサー領域に及ぶヒトUCP1配列の601 bp 5'UTR断片とによって駆動されるレポーター遺伝子を含むヒトUCP1エンハンサー領域構築物。推定上のUCP1 5'エンハンサー構築物に特異的な効果を同定するために、このレポーター活性に及ぼす特異的miRNA模倣物、阻害剤、または非標的指向対照の効果を、空5'エンハンサー領域のものと比較する。
【０２５８】
加えて、miRNAxxx_3'UTR構築物を作製した。それらは、レポーター遺伝子の3'UTR領域にmiRNAxxxの標的配列との完全一致物がクローニングされている、強力なプロモーター (RPL10_prom) によって駆動されるレポーター遺伝子を含む。miRNA模倣物または阻害剤の活性がこの実験用細胞型において合理的に検出され得るかどうかを判定するために、このレポーター活性に及ぼすmiRNA模倣物、阻害剤、または非標的指向対照の効果を、空_3'UTRおよびアクチンB‐3'UTRのものと比較することができる。この細胞型が問題のmiRNAの内因性発現を有さない場合には、模倣物の添加はこのレポーターの活性をノックダウンするはずであり、阻害剤の添加は有意な影響を及ぼさないはずである。この細胞型が問題のmiRNAの内因性発現を有する場合には、阻害剤の添加はこのレポーターの活性を増加させるはずであり、模倣物の添加は有意な影響を及ぼさないはずである。Hela細胞型およびHepG2細胞型における内因性miRNA発現の範囲は広く、よって合成標的の活性変化はこの変動性を反映する可能性が高い。
【０２５９】
それぞれのmiRNA候補（合計38個）について、以下の条件を試験した。
‐Hela細胞においてmiRNA模倣物（特異的） * レポーター構築物8個
‐HepG2細胞においてmiRNA模倣物（特異的） * レポーター構築物8個
‐Hela細胞においてmiRNA模倣物非標的指向対照 * レポーター構築物8個
‐HepG2細胞においてmiRNA模倣物非標的指向対照 * レポーター構築物8個
‐Hela細胞においてmiRNA阻害剤（特異的） * レポーター構築物8個
‐HepG2細胞においてmiRNA阻害剤（特異的） * レポーター構築物8個
‐Hela細胞においてmiRNA阻害剤非標的指向対照 * レポーター構築物8個
‐HepG2細胞においてmiRNA阻害剤非標的指向対照 * レポーター構築物8個
【０２６０】
UCP1配列に結合し得るmiRNAの広範なリストに対して、試験するためのmiRNA候補の数を減らすために、10件のフィルターをかけた（UCP1 3'UTR領域への結合の必要性に加えて）。これらのフィルターは、結合部位の長さ、結合部位の数、5'UTR領域への結合、他のmiRNAとの染色体クラスター化、イントロン位置、ゆらぎ、種を超えた発現、エンハンサー領域への結合、メチル化領域への結合、およびUCP1との関係の実験的証拠の証明であった。これらの基準のうちの少なくとも3つを満たした38個のmiRNAを試験した（表22）。
【０２６１】
（表２２）UCP1遺伝子配列中に推定結合部位を有するmiRNA
2015518485.tif 000056
2015518485.tif 000057
【０２６２】
これらのルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ実験において、阻害剤／模倣物比≧1.5およびまたはp値 < 0.05で、特異的miRNA阻害剤がルシフェラーゼシグナルを増加させる場合、および特異的miRNA模倣物がルシフェラーゼシグナルを減少させる場合の両方について、miRNA候補はUCP1と相互作用すると見なされた。これらの選択基準によって、9個のmiRNA（hsa-miR-19b-2-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-211、hsa-miR-325、hsa-miR-382-3p/5p、hsa-miR-543、hsa-miR-515-3p、およびhsa-miR-545）が同定される（表23）。さらに数個が、これらの選択基準にわずかに届かなかった；それらは、hsa-miR-331-5p、hsa-miR-552、hsa-miR-620、およびhsa-miR-1179である。
【０２６３】
（表２３）Hela細胞および／またはHepG2細胞におけるルシフェラーゼレポーターアッセイによってUCP1遺伝子発現の制御因子であると同定されたmiRNA
2015518485.tif 000058
【０２６４】
選択されたこれら9個のmiRNAのうち、3個は、試験されたUCP1の3つの領域に結合すると考えられ（hsa-miR-21-5p、hsa-miR-211、およびhsa-miR-515-3p）；3個はUCP1の2つの領域に結合すると考えられ（hsa-miR-19b-2-5p、hsa-miR-130b-5p、およびhsa-miR-325）、および3個はUCP1の単一の領域に結合する（hsa-miR-331-5p、hsa-miR-543、およびhsa-miR-545）。hsa-miR-331-5pを除くすべてが、UCP1の3'UTR領域に結合すると考えられる（表24）。
【０２６５】
（表２４）ルシフェラーゼレポーターアッセイによってUCP1遺伝子発現の制御因子であると同定されたmiRNA
2015518485.tif 000059
【０２６６】
細胞培養下のヒト脂肪細胞または脂肪由来間葉系幹細胞へのプロモーター／3'UTRライブラリーのトランスフェクション、およびその後の細胞培養物へのmiRNA剤（例えば、アゴミアまたはアンタゴミア）の添加により、さらなるスクリーニングを行う。トランスフェクションおよびmiRNA剤の添加の24時間後に、ルシフェラーゼ活性の測定およびmRNAの同定を行う。
【０２６７】
より長い時間枠で上記のトランスフェクション実験の結果を確認するために、関心対象のmiRNA剤を含むレンチウイルスベクターを用いて、レンチウイルス形質導入実験を行う（copGFP蛍光マーカーの発現を可能にするpMIRNA1 SBIベクターにおいて発現されるmiRNA前駆体のSystem Biosciences (SBI) 収集物による）。具体的には、供給業者の説明書に従って、プロモーター／3'UTRライブラリーを含む細胞に1:10のMOIでレンチウイルス粒子を形質導入し、GFP陽性細胞をFACSによって選別する。対照細胞（HEK293細胞）、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞、ヒト皮下前脂肪細胞、およびヒト増殖皮下脂肪細胞において、成熟miRNAおよびそれらの標的化mRNAの発現レベルを、Taqman定量的リアルタイムPCRによりいくつかの時点（0、3、および6時間；1、4、および7日）で評価する。形質導入後の5つの異なる時点に由来するRNAを任意にプールして、検出感度を維持したまま、qRT-PCRベースのスクリーニングアプローチの複雑さを軽減する。
【０２６８】
実施例5. プロテオミクスプロファイリング
熱発生に関与する新規miRNA標的を同定するために、プロテオミクスプロファイリングもまた使用する。
【０２６９】
ショットガンプロテオミクスとは、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を質量分析 (MS) と組み合わせて用いて、複雑な混合物中のタンパク質を同定する方法である。miRNA剤およびプロモーター／3'UTRライブラリーをトランスフェクトおよび形質導入した細胞（実施例4に記載される）を回収して溶解し、粗製可溶性（サイトゾル）画分および不溶性（核）画分を得る。次にこれらの画分に由来するペプチドをHPLCによって分離し、タンパク質存在量を定量するために同位体標識技法SILACを用いて、ナノエレクトロスプレーイオン化タンデムMSを使用して解析する。Sequest（Bioworksバージョン3.3.1、Thermo Scientific）を用いて、スペクトルをEnsembleリリース54ヒトタンパク質コード配列データベースに対して検索する。
【０２７０】
存在量の少ないタンパク質を見逃さないようにするために、標的化プロテオミクスアプローチもまた使用して、脂質生成、脂肪細胞分化、およびBAT機能の公知の制御因子である一組のタンパク質を正確に定量する。いくつかの例には、UCP1、KDM3A、PRDM16、PPARA、PPARGC1A、CEBPB、CIDEA、BMP7、COX7A1、SIRT1、SIRT3、DI02、FABP4、およびADIPOQが含まれる。これらのタンパク質は、市販の抗体を用いて、ELISAベースまたはLuminexベースの免疫測定法により解析する。
【０２７１】
任意に、プロテオミクスプラットフォームにおいて多重反応モニタリング‐質量分析を用いてタンパク質画分を解析し、これにより熱発生経路の1個のタンパク質（例えば、UCP1）のみがLC-MS-MSを用いて正確に定量される。
【０２７２】
実施例6. ヒト脂肪細胞を特異的に標的化するクローンDNAアプタマーの開発および特徴づけ
本発明者らは、Cell-SELEX技術を用いて、成熟ヒト皮下脂肪細胞を特異的に認識するDNAアプタマーを開発し、特徴づけた。Cell-SELEXにより、増幅および生細胞への結合の繰り返しによって、無傷細胞の表面上の自然環境において天然高次構造にある特定分子を認識するアプタマーが選択される。図23に図示されるこの細胞ベースの選択では、特定の公知および未知の細胞表面マーカーまたは膜受容体を、それらの天然環境において直接標的化することができ、細胞特異的アプタマーの直接的な濃縮が可能になる。Cell-SELEXは、標的細胞を用いた陽性選択と非標的化細胞を用いた陰性選択の組み合わせからなる。本発明の場合には、新たに単離されたヒト肝細胞を用いて陰性選択を行い、陽性選択ではヒト皮下脂肪細胞の初代培養物を使用した。32 merライブラリーからの2ラウンドの陰性選択および5ラウンドの陽性選択を完了した。単離されたアプタマーを配列決定し、結合試験のために合成し、6-フルオレセインアミダイト (FAM) で標識した。ヒト肝細胞（陰性細胞）および脂肪細胞（陽性細胞）を飽和濃度 (1μM) のFAM結合アプタマーで室温にて15分間標識し、蛍光活性化細胞選別 (FACS) によって解析した。図24に示されるように、いくつかのアプタマー（例えば、アプタマー974）は脂肪細胞にも肝細胞にも結合せず、いくつかのアプタマー（例えば、アプタマー975は脂肪細胞と肝細胞の両方に結合する、比：2.69）および他のアプタマーは、脂肪細胞に優先的に結合する（例えば、アプタマー972および973、それぞれ非：4.76および5.40）。これらの脂肪細胞特異的アプタマーのさらなる特徴づけは進行中である。
【０２７３】
実施例7. 表現型、遺伝子型、およびプロテオミクスデータセットの照合
本明細書の実施例3〜5に記載されるインビトロ実験の結果を照合する。具体的には、マイクロRNA、mRNA、および標的タンパク質、ならびに経路の最初のセットを、関連性がありさらに管理可能な数の標的にさらに絞るために、ネットワーク検索および解析パッケージ（DAVID、Ingenuity Systems IPA、およびARIADNE Pathway Studioを用いて実験データを統合する。
【０２７４】
本明細書の実施例3〜5に記載されるインビトロ実験の結果の網羅的解析は、ビジネスインテリジェンスツールTIBCO Spotfireを用いて行う。これによって、miRNA剤と標的遺伝子との関係の可視化が可能になる。
【０２７５】
実施例8. 肥満の動物モデル
肥満のいくつかの動物モデルが開発され、検証されている（Kanasaki K et al., J. Biomed. Biotechnol., 2011:197636 (2011)；Speakman J et al., Obesity reviews : an official journal of the International Association for the Study of Obesity, 8 Suppl 1:55-61 (2007)）。最もよく用いられるのは、レプチンシグナル伝達欠損Lepob/obマウスモデルおよびLeprdb/dbマウスモデル、ならびにC57BL/6Jマウスにおける高脂肪食モデルである (Wang CY et al., Methods in molecular biology, 821:421-433 (2012)。この食事誘導性肥満 (DIO) モデルは、現代社会における高脂肪食／高密度食の利用可能性の増加を密接に模倣している。
【０２７６】
DIOマウスモデルは、熱発生の増加ならびに／または肥満および他の代謝障害の治療に対する、本明細書に記載されるmiRNA類似体の有効性のインビボ検証に用いられる (Yin H et al., Cell Metab.,17(2):210-224 (2013))。
【０２７７】
DIOマウスに、hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアのうちの1つまたは複数を投与する。ロシグリタゾンを陽性対照として使用する。処置の前および後に、マウスにおいて、食物摂取、血液代謝パラメータ、体組成（体重、体脂肪、骨塩、および除脂肪体重、体脂肪分布、体温、O2消費およびCO2生成、運動誘発性熱発生、寒冷誘発性熱発生、ならびに安静時熱発生を測定する。体重もしくは体脂肪の減少または体温もしくは任意の種類の熱発生の増加により、投与された組成物のインビボ有効性が示される。
【０２７８】
実施例9. ヒトUCP1およびUCP2の遺伝子および転写物の核酸配列
【０２７９】
（表２５）ヒトUCP1遺伝子の1,462塩基対 (bp) 転写物ENST00000262999の核酸配列（6つのエキソンは大文字で表示）
2015518485.tif 000060
2015518485.tif 000061
【０２８０】
（表２６）ヒトUCP1遺伝子 (ENSG00000109424) の9,371塩基対 (bp)の核酸配列、（エキソンは太字で表示）：
＞染色体：GRCh37:4:141479988:141490559:-1
2015518485.tif 000062
2015518485.tif 000063
2015518485.tif 000064
2015518485.tif 000065
【０２８１】
（表２７）ヒトUCP1遺伝子（NCBI参照配列：NG _012139.1、第4染色体上のRefSeqGene）の15,910塩基対 (bp) の核酸配列
2015518485.tif 000066
2015518485.tif 000067
2015518485.tif 000068
2015518485.tif 000069
2015518485.tif 000070
【０２８２】
（表２８）ヒトUCP2遺伝子の2,113塩基対 (bp) 転写物ENST00000310473の核酸配列（8つのエキソンは大文字で表示）
2015518485.tif 000071
2015518485.tif 000072
2015518485.tif 000073
2015518485.tif 000074
【０２８３】
（表２９）5,000 bp 5'UTRおよび2,000 bp 3'UTRを含むヒトUCP2遺伝子 (ENSG00000175567) の15,174塩基対 (bp) の核酸配列、（8箇所のエキソンは強調表示）
2015518485.tif 000075
2015518485.tif 000076
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2015518485.tif 000079
2015518485.tif 000080
【図１Ａ】
2015518485.tif 000085
【図１Ｂ】
2015518485.tif 000086
【図２Ａ】
2015518485.tif 000087
【図２Ｂ】
2015518485.tif 000088
【図３】
2015518485.tif 000089
【図４】
2015518485.tif 000090
【図５】
2015518485.tif 000091
【図６】
2015518485.tif 000092
【図７】
2015518485.tif 000093
【図８Ａ】
2015518485.tif 000094
【図８Ｂ】
2015518485.tif 000095
【図９】
2015518485.tif 000096
【図１０】
2015518485.tif 000097
【図１１】
2015518485.tif 000098
【図１２Ａ】
2015518485.tif 000099
【図１２Ｂ】
2015518485.tif 000100
【図１２Ｃ】
2015518485.tif 000101
【図１２Ｄ】
2015518485.tif 000102
【図１２Ｅ】
2015518485.tif 000103
【図１２Ｆ】
2015518485.tif 000104
【図１３】
2015518485.tif 000105
【図１４】
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【図１５】
2015518485.tif 000107
【図１６】
2015518485.tif 000108
【図１７】
2015518485.tif 000109
【図１８】
2015518485.tif 000110
【図１９】
2015518485.tif 000111
【図２０】
2015518485.tif 000112
【図２１】
2015518485.tif 000113
【図２２−１】
2015518485.tif 000114
【図２２−２】
2015518485.tif 000115
【図２３】
2015518485.tif 000116
【図２４−１】
2015518485.tif 000117
【図２４−２】
2015518485.tif 000118
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月2日(2015.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
本開示はまた、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを対象に投与する段階を含む、それを必要とする対象において脂肪消失を引き起こす方法を提供する。ある種の態様において、対象は哺乳動物である。他の態様において、哺乳動物はヒトである。
[本発明1001]
細胞における呼吸鎖脱共役を調節する方法であって、細胞を、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤の活性を調節するmiRNA剤と接触させる段階を含む、方法。
[本発明1002]
細胞が、前脂肪細胞、脂肪細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、肝細胞、筋細胞、またはそれらの前駆体である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
組織における熱発生を調節する方法であって、組織を、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤の活性を調節するmiRNA剤と接触させる段階を含む、方法。
[本発明1004]
組織が、褐色脂肪、白色脂肪、皮下脂肪組織、肝臓、または筋肉である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
組織をエクスビボでmiRNA剤と接触させる、本発明1004の方法。
[本発明1006]
その治療を必要とするヒト対象において肥満を治療する方法であって、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤の活性または発現を調節するmiRNA剤の有効量をヒト対象に投与する段階を含む、方法。
[本発明1007]
治療のために選択されるヒト対象が、肥満に対する遺伝的素因または後成的素因を有する、本発明1006の方法。
[本発明1008]
ミトコンドリア脱共役剤がUCP1またはUCP2である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1009]
miRNA剤が、
2015518485.tif 000119
からなる群より選択されるmiRNAである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
miRNA剤が、表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択されるmiRNAである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1011]
miRNA剤が、
2015518485.tif 000120
からなる群より選択されるmiRNAのアゴミア(agomir)またはアンタゴミア(antagomir)である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
miRNA剤が、表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択されるmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
miRNA剤が、hsa-miR-19b-2-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-211、hsa-miR-325、hsa-miR-382-3p/5p、hsa-miR-543、hsa-miR-515-3p、およびhsa-miR-545からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1014]
miRNA剤が、hsa-miR-331-5p、hsa-miR-552、hsa-miR-620、およびhsa-miR-1179からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1015]
miRNA剤が標的指向部分に連結される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1016]
標的指向部分がアプタマーである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1017]
標的指向部分がmiRNA剤を特定の細胞型または組織に送達する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1018]
miRNA剤が、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1019]
miRNA剤が、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1020]
miRNA剤が、ミトコンドリア脱共役タンパク質の活性化因子または抑制因子の活性を調節する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1021]
活性化因子または抑制因子が、表2に記載される活性化因子または抑制因子からなる群より選択される、本発明1018の方法。
[本発明1022]
miRNA剤が、活性化因子または抑制因子のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する、本発明1020または1021の方法。
[本発明1023]
miRNA剤が、活性化因子または抑制因子のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する、本発明1020または1021の方法。
[本発明1024]
ミトコンドリア脱共役タンパク質のmRNAまたはタンパク質発現が上方制御される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1025]
ミトコンドリア脱共役タンパク質のミトコンドリア脱共役活性が上方制御される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1026]
以下を含む、熱発生を調節するmiRNA剤をスクリーニングする方法：
a) ヒトゲノムを含む指標細胞を提供する段階；
b) 該指標細胞を試験miRNA剤と接触させる段階；ならびに
c) 該miRNA剤の存在下および非存在下において、該指標細胞における少なくとも1つの熱発生制御因子の細胞活性を決定する段階であって、試験miRNA剤の存在下における熱発生制御因子の活性の変化により、その試験miRNA剤が熱発生を調節するmiRNA剤として同定される、段階。
[本発明1027]
細胞が、脂肪細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、肝細胞、筋細胞、またはそれらの前駆体である、本発明1026の方法。
[本発明1028]
段階 (c) において決定される熱発生制御因子の細胞活性が、熱発生制御因子のmRNA発現レベル、タンパク質発現レベル、またはミトコンドリア脱共役活性である、本発明1026の方法。
[本発明1029]
熱発生制御因子がUCP1である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1030]
細胞における少なくとも1つの熱発生制御因子の活性を調節する、アゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1031]
表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択されるmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアである、本発明1030のアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1032]
以下：
2015518485.tif 000121
からなる群より選択されるmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアである、本発明1030のアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1033]
hsa-miR-19b-2-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-211、hsa-miR-325、hsa-miR-382-3p/5p、hsa-miR-543、hsa-miR-515-3p、およびhsa-miR-545からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである、本発明1030のアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1034]
hsa-miR-331-5p、hsa-miR-552、hsa-miR-620、およびhsa-miR-1179からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである、本発明1030のアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1035]
標的指向部分に連結される、本発明1030〜1034のいずれかのアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1036]
標的指向部分がアプタマーである、本発明1035のアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1037]
標的指向部分がアゴミアまたはアンタゴミアを特定の細胞型または組織に送達する、本発明1035または1036のアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1038]
少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する、本発明1028〜1033のいずれかのアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1039]
少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する、本発明1030〜1037のいずれかのアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1040]
ミトコンドリア脱共役タンパク質の活性化因子または抑制因子の活性を調節する、本発明1030〜1037のいずれかのアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1041]
活性化因子または抑制因子が、表2に記載される活性化因子または抑制因子からなる群より選択される、本発明1030〜1037のいずれかのアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1042]
活性化因子または抑制因子のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する、本発明1030〜1037のいずれかのアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1043]
活性化因子または抑制因子のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する、本発明1030〜1037のいずれかのアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1044]
hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される2つ以上のmiRNAを含む、薬学的組成物。
[本発明1045]
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、本発明1044の薬学的組成物。
[本発明1046]
2つ以上のmiRNAが組換えベクターから発現される、本発明1044の薬学的組成物。
[本発明1047]
組換えベクターが、DNAプラスミド、ウイルスベクター、およびDNAミニサークルからなる群より選択される、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1048]
hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される2つ以上のmiRNAを含む、本発明1044の薬学的組成物。
[本発明1049]
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、本発明1048の薬学的組成物。
[本発明1050]
2つ以上のmiRNAが組換えベクターから発現される、本発明1048の薬学的組成物。
[本発明1051]
組換えベクターが、DNAプラスミド、ウイルスベクター、およびDNAミニサークルからなる群より選択される、本発明1048の薬学的組成物。
[本発明1052]
hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを前脂肪細胞の集団に投与する段階を含む、前脂肪細胞を誘導して脂肪細胞に分化させる方法。
[本発明1053]
前脂肪細胞を脂肪細胞に分化させる誘導が、前脂肪細胞を100 nMロシグリタゾンに2日間曝露した後に維持培地に曝露した場合の、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化よりも大きい、本発明1052の方法。
[本発明1054]
1つまたは複数のmiRNAが、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、本発明1052の方法。
[本発明1055]
hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを脂肪細胞の集団に投与する段階を含む、脂肪細胞の脂質含量を減少させる方法。
[本発明1056]
脂肪細胞の脂質含量が、100 nMロシグリタゾンに2日間曝露した後に維持培地に曝露した脂肪細胞の脂質含量よりも低い、本発明1055の方法。
[本発明1057]
脂肪細胞の脂質含量が、培養期間中100 nMロシグリタゾンに曝露した脂肪細胞の脂肪含量よりも低い、本発明1055の方法。
[本発明1058]
培養期間が8〜16日である、本発明1057の方法。
[本発明1059]
培養期間が10〜14日である、本発明1058の方法。
[本発明1060]
培養期間が14日である、本発明1059の方法。
[本発明1061]
1つまたは複数のmiRNAが、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、本発明1055の方法。
[本発明1062]
hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを対象に投与する段階を含む、それを必要とする対象においてインスリン感受性を高める方法。
[本発明1063]
対象が哺乳動物である、本発明1062の方法。
[本発明1064]
哺乳動物がヒトである、本発明1063の方法。
[本発明1065]
1つまたは複数のmiRNAが、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、本発明1062の方法。
[本発明1066]
hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを細胞に投与する段階を含む、細胞における1つまたは複数の脱共役タンパク質の発現または活性を増加させる方法。
[本発明1067]
細胞が、褐色脂肪細胞、白色脂肪細胞、皮下脂肪細胞、肝臓細胞、または筋細胞からなる群より選択される、本発明1066の方法。
[本発明1068]
1つまたは複数の脱共役タンパク質がUCP-1またはUCP-2を含む、本発明1066の方法。
[本発明1069]
hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを対象に投与する段階を含む、それを必要とする対象において脂肪消失を引き起こす方法。
[本発明1070]
対象が哺乳動物である、本発明1069の方法。
[本発明1071]
哺乳動物がヒトである、本発明1070の方法。
[本発明1072]
肥満を治療するための医薬の製造における、表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアの使用。
[本発明1073]
1つまたは複数のmiRNAが、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、本発明1072の使用。
[本発明1074]
アゴミアまたはアンタゴミアが標的指向部分に連結される、本発明1072の使用。
[本発明1075]
標的指向部分がアプタマーである、本発明1074の使用。
[本発明1076]
肥満を治療するための、表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアを含む組成物。
[本発明1077]
1つまたは複数のmiRNAが、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、本発明1076の組成物。
[本発明1078]
アゴミアまたはアンタゴミアが標的指向部分に連結される、本発明1076の組成物。
[本発明1079]
標的指向部分がアプタマーである、本発明1076の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９２】
（表８）UCP1遺伝子調節エレメント
2015518485.tif 000122
2015518485.tif 000123
2015518485.tif 000124
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
（表９）MicroCosm Targets を用いて決定された、UCP1（NCBI参照配列NG_012139.1）の3'UTRにおけるmiRNAの結合部位
2015518485.tif 000125
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９８】
（表１０）いくつかのプログラムによる、UCP1（NCBI参照配列、NG_012139.1）の3'UTRにおけるmiRNAの結合部位
2015518485.tif 000126
2015518485.tif 000127
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
（表１１）UCP1遺伝子配列（NCBI参照配列：NG_012139.1）中に予測される結合部位を有するmiRNA
2015518485.tif 000128
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【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１０】
（表１４）UCP2遺伝子配列の5'UTR中に予測される結合部位を有するmiRNA
2015518485.tif 000140
2015518485.tif 000141
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７９】
（表２５）ヒトUCP1遺伝子の1,462塩基対 (bp) 転写物ENST00000262999の核酸配列（6つのエキソンは大文字で表示）
2015518485.tif 000142
2015518485.tif 000143
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８０】
（表２６）ヒトUCP1遺伝子 (ENSG00000109424) の9,371塩基対 (bp)の核酸配列、（エキソンは太字で表示）：
＞染色体：GRCh37:4:141479988:141490559:-1
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2015518485.tif 000148
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８１】
（表２７）ヒトUCP1遺伝子（NCBI参照配列：NG _012139.1、第4染色体上のRefSeqGene）の15,910塩基対 (bp) の核酸配列: (SEQ ID NO: 637)
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【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８２】
（表２８）ヒトUCP2遺伝子の2,113塩基対 (bp) 転写物ENST00000310473の核酸配列（8つのエキソンは大文字で表示）
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2015518485.tif 000156
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８３】
（表２９）5,000 bp 5'UTRおよび2,000 bp 3'UTRを含むヒトUCP2遺伝子 (ENSG00000175567) の15,174塩基対 (bp) の核酸配列、（8箇所のエキソンは強調表示）
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【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2015518485000001.app
【国際調査報告】
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2015518485.tif 000165
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