(57)【要約】  本発明は、ヒトにおける骨量減少を予防するのに効果的な乳酸菌株を選択するための方法、及び示した方法にしたがって選択された株を含む。選択方法は、変更された微生物群落を正常に再建し、且つ／又は特異的な４つのＳＮＰ（ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＪＣＭ１１１２のゲノムに対して、塩基対２７１  ３９１におけるＣ、塩基対４５３  ５３８におけるＧ、塩基対５２９  ２２８におけるＧ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣ）の少なくとも１つを保持している株の能力に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９５％の同一性を有し、以下の４つの位置：塩基対２７１  ３９１におけるＣ、塩基対４５３  ５３８におけるＧ、塩基対５２９  ２２８におけるＧ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣの少なくとも１つにおいて、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対して同一のヌクレオチドを保持している乳酸菌株を選択することを含む、骨量減少の予防又は処置に用いるための乳酸菌株を選択するための方法。
【請求項２】
以下の４つの位置：塩基対２７１  ３９１におけるＣ、塩基対４５３  ５３８におけるＧ、塩基対５２９  ２２８におけるＧ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣの少なくとも１つにおいて、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対して同一のヌクレオチドを保持しているラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）を選択することを含む、骨量減少の予防又は処置に用いるための乳酸菌株を選択するための方法。
【請求項３】
乳酸菌株が、前記４つのヌクレオチドのうち少なくとも２つを保持している、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
乳酸菌株が、前記４つのヌクレオチドのうち少なくとも３つを保持している、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
乳酸菌株が、前記ヌクレオチド４つ全てを保持している、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
乳酸菌株が、塩基対２７１  ３９１におけるＣからＴ、塩基対４５３  ５３８におけるＧからＡ、塩基対５２９  ２２８におけるＧからＡ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣからＴからなる４つの変異の群から選択される、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対する少なくとも１つの変異を保持していないという条件で、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９５％の同一性を有する乳酸菌株を選択することを含む、骨量減少の予防又は処置に用いるための乳酸菌株を選択するための方法。
【請求項７】
乳酸菌株が、前記４つの変異のうち少なくとも２つを保持していない、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
乳酸菌株が、前記４つの変異のうち少なくとも３つを保持していない、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
乳酸菌株が、前記４つの変異のいずれも保持していない、請求項６から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
骨量減少の予防又は処置に用いるための、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法にしたがって選択される、乳酸菌株。
【請求項１１】
骨量減少の予防又は処置に用いるための、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９５％の同一性を有し、以下の４つの位置：塩基対２７１  ３９１におけるＣ、塩基対４５３  ５３８におけるＧ、塩基対５２９  ２２８におけるＧ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣの少なくとも１つにおいて、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対して同一のヌクレオチドを保持している乳酸菌株。
【請求項１２】
ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５である、請求項１１に記載の乳酸菌株。
【請求項１３】
請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法にしたがって選択される乳酸菌株を含む組成物。
【請求項１４】
ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９５％の同一性を有し、以下の４つの位置：塩基対２７１  ３９１におけるＣ、塩基対４５３  ５３８におけるＧ、塩基対５２９  ２２８におけるＧ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣの少なくとも１つにおいて、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対して同一のヌクレオチドを保持している乳酸菌株を含む組成物。
【請求項１５】
乳酸菌株がラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
骨量減少の予防又は処置に用いるための、請求項１３から１５までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
閉経期の女性、子宮摘出を受けた女性、糖尿病患者、骨減少性の個体、骨粗鬆症の個体、及び代謝障害を有する個体における骨量減少の予防に用いるための、請求項１３から１５までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
骨折後の骨修復の改善に用いるための、請求項１３から１５までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
骨量減少の予防又は処置に用いるための、ビタミンＤと組み合わされた、請求項１３から１５までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
骨量減少の予防又は処置に用いるための、ホルモンと組み合わされた、請求項１３から１５までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
組成物が、医薬組成物、食品製品、又は食品サプリメントである、請求項１３から２０までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９５％の同一性を有し、以下の４つの位置：塩基対２７１  ３９１におけるＣ、塩基対４５３  ５３８におけるＧ、塩基対５２９  ２２８におけるＧ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣの少なくとも１つにおいて、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対して同一のヌクレオチドを保持している乳酸菌株の、骨量減少の予防又は処置のための医薬組成物を製造するための使用。
【請求項２３】
乳酸菌株がラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９５％の同一性を有し、以下の４つの位置：塩基対２７１  ３９１におけるＣ、塩基対４５３  ５３８におけるＧ、塩基対５２９  ２２８におけるＧ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣの少なくとも１つにおいて、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対して同一のヌクレオチドを保持している乳酸菌株を個体に投与することを含む、骨量減少の処置又は予防のための方法。
【請求項２５】
乳酸菌株がラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、医薬、薬理学、及び食品サプリメントに関する。より詳細には、本発明は、哺乳動物における骨量減少を予防するための乳酸菌の選択及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
５０歳を超えた、４０００万人超のアメリカ人（そのうち１４００万人は男性である）が、低骨密度又は骨粗鬆症、及びそれに付随する骨折のリスクの増大に苦しんでいる。骨粗鬆症性の骨折を有する個体は、うつ病、依存性、及び死亡率増大の傾向がある。加齢は、骨粗鬆症の主な原因であるが、疾患、廃用性、及びある種の薬物も、人生のあらゆる段階で骨量減少を引き起こし得る。
【０００３】
骨格は、身体の重さを支え、間葉幹細胞及び造血幹細胞を収容し、カルシウムの貯蔵所として働く、高度に組織化されたシステムである。骨の構造は、外側の皮質性の高密度シェル（ｓｈｅｌｌ）及び内側の骨梁の網目構造を含む。運動により海綿骨の骨塩量（ＢＭＤ）及び骨体積率（ＢＶＦ）、骨梁幅、並びに皮質のＢＭＤ及び厚さが増大し得る。これとは対照的に、疾患、廃用、及びある種の薬物（例えば、糖質コルチコイド）はこれらのパラメータを低減し、男女両方に骨粗鬆症を引き起こし得る。骨粗鬆症は、骨質量の低下（平均を２．５標準偏差（ＳＤ）を超えて下回る）、及び骨の微小構造の変更（骨梁幅の低下など）と規定される。骨質量が低下すると骨折のリスクが増大する。このように、骨粗鬆症と診断された時点で、患者は、正常の骨密度を有する者に比べて骨折のリスクが１６倍増大している。骨折は、うつ病、依存性、及び死亡率増大（高齢者では１２か月以内で２５％を超える）に関連し、股関節骨折の死亡は毎年５００００人を超える（米国骨粗鬆症財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）（ＮＯＦ）の統計）。骨粗鬆症は男性ではあまり蔓延していないが、３０％を超える股関節骨折は男性に生じ、死亡率は女性に比べて男性に高い。現在、骨粗鬆症の直接費をカバーするのに米国では２００億ドル以上が、欧州連合では３００億ドルが費やされている。さらに気がかりなことに、２０２０年までに米国で６１００万人を超える５０歳を超える男女が低骨密度又は骨粗鬆症を有するであろうと推定され（ＮＯＦ統計）、したがって効果的な新規な処置を見つけることは優先事項である。実際、５０歳を超える女性の３人に１人が、生涯のうちに骨粗鬆症に関連する骨折を経験するであろう。骨折のリスクが骨粗鬆症に付随して上昇するのに加え、骨量減少は代謝及びインスリン分泌に負の効果を有し得る。市場で入手できる全ての処置にかかわらず、骨粗鬆症患者の数は米国及び世界中で増加中である。これには、年少期の危険に注意が欠如していたこと、高齢人口の増大、及び不要な薬物療法の副作用による患者のノンコンプライアンスなど、いくつかの理由がある。さらに、従来の骨量減少処置は必ずしも効果的とは限らない。現在、低骨密度又は骨粗鬆症を有する人々用の骨粗鬆症薬に代わって用いることができる、代替処置又は自然の処置は存在しない。したがって、医師は、自分たちの患者の骨密度を増大する新たな取組みを求めており、企業は薬理学的な骨治療薬を改善するよう研究中である。
【０００４】
ある種の人々は他者よりも骨粗鬆症を発症しやすく、リスク因子には以下のものがある：
女性である
高齢
骨粗鬆症又は骨折の家族歴
小型及び痩せ型である
コーカサス人、アジア人、又はヒスパニック／ラテン系などのある種の人種／民族性であるが、アフリカ系アメリカ人もリスクがある
骨折の病歴
性ホルモンが低レベルである
女性における低エストロゲンレベル、閉経を含む
月経がない（無月経）
男性において、テストステロン及びエストロゲンの低レベル
食餌制限
−カルシウムの摂取量が低い
−ビタミンＤ摂取量が低い
−タンパク質、ナトリウム、及びカフェインが摂取過剰である
不活動性の生活様式
喫煙
アルコール乱用
ステロイド薬物療法、ある種の抗痙攣薬、及びその他など、ある種の薬物療法
神経性食欲不振症、関節リウマチ、消化器疾患、及びその他などのある種の疾患及び状態
【０００５】
閉経期の女性は、エストロゲンレベルの低下により、閉経期の間、骨が減少する傾向にある。閉経期前後の間でも（閉経期の２年から８年前の期間）、エストロゲンレベルが低下し始めることがある。経時的に、非常に多くの骨量減少は最初に骨減少症（低骨質量）を、次いで骨粗鬆症を引き起こし得る。
【０００６】
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の診断が小児及び成人において増加している。医学の進歩により患者の寿命が延びる一方で、治療的に警戒していても正常血糖の維持は依然として難しい。このようにより多くのＴ１Ｄ患者（男性及び女性）が、骨量減少を含めた合併症に苦しんでいる。これは、すでに骨折のリスクの増大した患者が加齢／閉経を始めていることを意味する。いったん骨折が生じると、治癒が困難であり、長期入院が必要とされ、生活の質は低下し、死亡率は上昇し得る。骨の健康状態が悪いと、身体全体にも負の影響を及ぼす。Ｔ１Ｄ糖尿病を有する閉経後の女性は、糖尿病ではない女性よりも、骨粗鬆症性骨折の発生頻度が高い。Ｔ１Ｄを有する小児は、糖尿病ではない小児よりも、骨塩量が低い。このように骨の健康状態の維持は、Ｔ１Ｄ患者の全体的な生活の質に不可欠であり、骨髄細胞と骨細胞とは通じているため、骨髄の免疫／前駆細胞に関与する治療／治癒的な処置を最大にするのに重要である。
【０００７】
２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）患者も、非糖尿病患者より骨粗鬆症性の骨折のリスクが高い。 
【０００８】
骨を強化し、骨粗鬆症を予防する２つの主要な構成成分は、１）最大の骨密度を達成すること、並びに２）成人及び加齢の間の骨量減少を予防することである。骨は動的であり、骨を形成又は再吸収するように環境信号に対して絶えず適応するため、骨再形成が生じる。骨芽細胞（骨を形成する細胞）及び破骨細胞（骨を再吸収する細胞）の活動性を通した、標的化された骨再形成が、血中カルシウムレベルを臨界範囲内に維持する一方で、支持が必要とされる部位で骨を強力に保つ。形成と再吸収との活動性のバランスが取れている場合は、骨の正味の増加又は減少はないが、形成が低下し、且つ／又は再吸収が増大すると骨量減少が結果的に起こる。
【０００９】
破骨細胞の活動性が増大すると骨吸収が起こる。破骨細胞は造血幹細胞に由来する。これらの細胞は、単球／マクロファージ系列の細胞を生じ、これらは正しい条件下で、破骨細胞の前駆体に発達する。ＲＡＮＫＬ（骨芽細胞表面上に位置する）などの因子によるさらなるシグナリングが破骨細胞の成熟を刺激する。成熟破骨細胞は、骨基質の分解に関与する酵素（カテプシンＫ及びＴＲＡＰ５ｂを含む）を発現する。
【００１０】
骨芽細胞の活動性の増大は骨形成をもたらすが、これは、１）系列の選択、２）成熟、及び３）死滅を含めたいくつかのレベルで制御することができる。骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）は骨芽細胞、脂肪細胞、及び他の細胞型を生じるので、１系列（脂肪細胞）を選択すると別のもの（骨芽細胞）が犠牲にされ得る。これは、加齢、肢の負荷除去、細胞培養モデル、及びＩ型（Ｔ１）糖尿病で認識される、骨の脂肪過多と骨塩量との間の相互関係によって支持される。骨芽細胞の活動性は、死滅／アポトーシスによりさらに制御され得る。骨芽細胞の死滅が増大すると、骨を作る細胞の数が低下し、したがって骨量減少となる。例として廃用／負荷除去に対する速やかな骨の適応が含まれ、これにより骨量減少し、骨髄の脂肪過多は増大し、骨細胞の死滅は増大する。加齢により骨細胞のアポトーシスも増大する。骨芽細胞の制御のいくつかの、又は全ての態様（系列、成熟、死滅）の変調には、ＴＧＦβ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、及びＷｎｔなどのポジティブ因子、並びにサイトカインなどのネガティブ因子を含めた多くの因子が寄与する。
【００１１】
ビスホスホナートは、骨粗鬆症に対する最も一般的な処置の１つである。これらの化合物は、骨塩中に組み入れられ、破骨細胞による骨の異化作用を阻害し、骨折を低減するのに効果的である。しかし、これらの化合物の多くは、空腹時に服用する必要があり、胃の逆流及び吐き気を引き起こすことがあり、患者のコンプライアンスの低下をもたらす。これらの化合物が骨に存在する時間の長さ、並びに骨の再形成及び強度に対する長期間の影響に関する懸念もある。別の治療薬に選択的エストロゲン受容体修飾因子（ＳＥＲＭＳ）があるが、これらは癌に関するいくらかの懸念を未だにはらんでいる。骨粗鬆症の発症を予防又は遅延するのに有用であるとしてホルモン補充療法が研究されているが、長年にわたりホルモン補充を持続して用いると、女性の乳癌のリスクを増大し得、静脈血栓症（血液凝固）の発生率を増大し得、既存の肝疾患を増悪し得、子宮体癌及び高血圧のリスクを増大し得る。Ａｍｇｅｎには、ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ系を修飾することによって働き、したがって破骨細胞の活動性を抑制する、開発中の薬物（オステオプロテグリンに類似する）がある。間欠的なＰＴＨ処置はタンパク同化性の処置であるが、この静脈内処置は費用が高く、重症の骨粗鬆症患者に指示されるにすぎない。まとめると、低骨密度と診断される多くの人々がどうするべきか混乱しているのは驚くにあたらない。多くの人々は長期間の影響を恐れて、薬物療法を受けるのを望まない。体重負荷運動及び十分なカルシウム摂取が自然な２つの取組みであるが、これらは疾患、薬物療法、及び加齢の影響に常に打ち勝てるわけではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の主な目的は、特に閉経後の女性における、糖尿病患者における、大量にエネルギー摂取し、運動頻度の低い若い男性などを含む骨減少症患者における、骨量減少を予防し得る乳酸菌株を見出す方法を提供することである。
【００１３】
本発明の一目的は、このような株を含む生成物を、骨量減少を予防するために、閉経後の女性に用いることである。
【００１４】
本発明の一目的は、このような株を含む生成物を、骨量減少を予防するために、子宮摘出を受けた女性に用いることである。
【００１５】
別の一目的は、このような株を含有する生成物を、骨量減少を予防するために、それだけには限定されないが、糖尿病患者、代謝障害を有する若い男性、及び骨減少症の男性を含めた男性に用いることである。
【００１６】
別の一目的は、骨量減少又は骨形成に対する治療の薬物の投与量を低減して副作用を最小にすることができるように、このような生成物を骨量減少又は骨形成に対する治療と組み合わせて用いることである。
【００１７】
別の一目的は骨折後の骨修復を改善することである。
【００１８】
したがって、本発明の第１の態様は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９５％の同一性を有し、以下の４つの位置：塩基対２７１  ３９１におけるＣ、塩基対４５３  ５３８におけるＧ、塩基対５２９  ２２８におけるＧ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣの少なくとも１つにおいて、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対して同一のヌクレオチドを保持している乳酸菌株を選択することを含む、骨量減少の予防又は処置に用いるための乳酸菌株を選択するための方法を提供する。
【００１９】
第１の態様による一実施形態において、方法は、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に、少なくとも９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％の同一性を有し、以下の４つの位置：塩基対２７１  ３９１におけるＣ、塩基対４５３  ５３８におけるＧ、塩基対５２９  ２２８におけるＧ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣの少なくとも１つにおいて、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対して同一のヌクレオチドを保持している乳酸菌株を選択することを含む。
【００２０】
本発明の第２の態様は、以下の４つの位置：塩基対２７１  ３９１におけるＣ、塩基対４５３  ５３８におけるＧ、塩基対５２９  ２２８におけるＧ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣの少なくとも１つにおいて、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対して同一のヌクレオチドを保持しているラクトバチルス・ロイテリを選択することを含む、骨量減少の予防又は処置に用いるための、ラクトバチルス・ロイテリ株などの乳酸菌株を選択するための方法を提供する。
【００２１】
第１の態様又は第２の態様による方法の一実施形態において、乳酸菌株は、前記４つのヌクレオチドのうち少なくとも２つ、例えば、前記４つのヌクレオチドのうち少なくとも３つ、例えば、前記ヌクレオチドの４つ全てを保持している。
【００２２】
本発明の第３の態様は、乳酸菌株が、塩基対２７１  ３９１におけるＣからＴ、塩基対４５３  ５３８におけるＧからＡ、塩基対５２９  ２２８におけるＧからＡ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣからＴからなる４つの変異の群から選択される、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対する少なくとも１つの変異を保持していないという条件で、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９５％の同一性を有する乳酸菌株を選択することを含む、骨量減少の予防又は処置に用いるための乳酸菌株を選択するための方法を提供する。
【００２３】
第３の態様の一実施形態において、方法は、乳酸菌株が、塩基対２７１  ３９１におけるＣからＴ、塩基対４５３  ５３８におけるＧからＡ、塩基対５２９  ２２８におけるＧからＡ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣからＴからなる４つの変異の群から選択される、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対する少なくとも１つの変異を保持していないという条件で、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％の同一性を有する乳酸菌株を選択することを含む。
【００２４】
第３の態様による方法の一実施形態において、乳酸菌株は、前記４つの変異のうち少なくとも２つ、例えば、前記４つの変異のうち少なくとも３つ、例えば、前記４つの変異のいずれも保持していない。
【００２５】
本発明の第４の態様は、骨量減少の予防又は処置に用いるための、第１、第２、又は第３の態様による方法にしたがって選択された乳酸菌株を提供する。
【００２６】
第４の態様の一実施形態において、選択された乳酸菌株は、骨量減少の予防又は処置に用いるための、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５である。この株は、公的に、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（１０８０１  Ｕｎｉｖ．Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）で入手でき、２００４年１２月２１日ブダペスト条約の下に寄託されている。
【００２７】
第５の態様によると、本発明は、骨量減少の予防又は処置に用いるための、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９５％の同一性を有し、以下の４つの位置：塩基対２７１  ３９１におけるＣ、塩基対４５３  ５３８におけるＧ、塩基対５２９  ２２８におけるＧ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣの少なくとも１つにおいて、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対して同一のヌクレオチドを保持している乳酸菌株を提供する。
【００２８】
第５の態様の一実施形態において、乳酸菌株は、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％の同一性を有し、以下の４つの位置：塩基対２７１  ３９１におけるＣ、塩基対４５３  ５３８におけるＧ、塩基対５２９  ２２８におけるＧ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣの少なくとも１つにおいて、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対して同一のヌクレオチドを保持している。
【００２９】
第５の態様の一実施形態において、乳酸菌株は、前記４つのヌクレオチドのうち少なくとも２つ、例えば、前記４つのヌクレオチドのうち少なくとも３つ、例えば、前記ヌクレオチドの４つ全てを保持している。
【００３０】
第６の態様によると、本発明は、乳酸菌株が、塩基対２７１  ３９１におけるＣからＴ、塩基対４５３  ５３８におけるＧからＡ、塩基対５２９  ２２８におけるＧからＡ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣからＴからなる４つの変異の群から選択される、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対する少なくとも１つの変異を保持していないという条件で、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９５％の同一性を有する乳酸菌株を提供する。
【００３１】
第６の態様の一実施形態において、乳酸菌株は、乳酸菌株が、塩基対２７１  ３９１におけるＣからＴ、塩基対４５３  ５３８におけるＧからＡ、塩基対５２９  ２２８におけるＧからＡ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣからＴからなる４つの変異の群から選択される、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対する少なくとも１つの変異を保持していないという条件で、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％の同一性を有する。
【００３２】
第６の態様の一実施形態において、乳酸菌株は、前記４つの変異のうち少なくとも２つ、例えば、前記４つの変異のうち少なくとも３つ、例えば、前記４つの変異のいずれも保持していない。
【００３３】
第５又は第６の態様の本発明の好ましい一実施形態によると、乳酸菌株はラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５である。
【００３４】
本発明の第７の態様は、本発明の第１、第２、又は第３の態様による方法にしたがって選択された乳酸菌株を含む組成物を提供する。
【００３５】
第８の態様によると、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９５％の同一性を有し、以下の４つの位置：塩基対２７１  ３９１におけるＣ、塩基対４５３  ５３８におけるＧ、塩基対５２９  ２２８におけるＧ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣの少なくとも１つにおいて、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対して同一のヌクレオチドを保持している乳酸菌株を含む組成物を提供する。
【００３６】
第８の態様の一実施形態において、乳酸菌株は、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％の同一性を有し、以下の４つの位置：塩基対２７１  ３９１におけるＣ、塩基対４５３  ５３８におけるＧ、塩基対５２９  ２２８におけるＧ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣの少なくとも１つにおいて、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対して同一のヌクレオチドを保持している。
【００３７】
第８の態様の一実施形態において、乳酸菌株は、前記４つのヌクレオチドのうち少なくとも２つ、例えば、前記４つのヌクレオチドのうち少なくとも３つ、例えば、前記ヌクレオチドの４つ全てを保持している。
【００３８】
第９の態様によると、本発明は、乳酸菌株が、塩基対２７１  ３９１におけるＣからＴ、塩基対４５３  ５３８におけるＧからＡ、塩基対５２９  ２２８におけるＧからＡ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣからＴからなる４つの変異の群から選択される、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対する少なくとも１つの変異を保持していないという条件で、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９５％の同一性を有する乳酸菌株を含む組成物を提供する。
【００３９】
第９の態様の一実施形態において、乳酸菌株は、乳酸菌株が、塩基対２７１  ３９１におけるＣからＴ、塩基対４５３  ５３８におけるＧからＡ、塩基対５２９  ２２８におけるＧからＡ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣからＴからなる４つの変異の群から選択される、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対する少なくとも１つの変異を保持していないという条件で、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％の同一性を有する。
【００４０】
第９の態様の一実施形態において、乳酸菌株は、前記４つの変異のうち少なくとも２つ、例えば前記４つの変異のうち少なくとも３つ、例えば、前記４つの変異のいずれも保持していない。
【００４１】
第８又は第９の態様の本発明の好ましい一実施形態において、乳酸菌株は、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５である。
【００４２】
第８又は第９の態様の一実施形態において、組成物は、骨量減少の予防又は処置に用いるためのものである。
【００４３】
第８又は第９の態様の別の実施形態において、組成物は、閉経期の女性、子宮摘出を受けた女性、糖尿病患者、骨減少性の個体、骨粗鬆症の個体、及び代謝障害を有する個体における骨量減少を予防するのに用いるためのものである。
【００４４】
第８又は第９の態様のさらに別の実施形態において、組成物は、骨折後の骨修復の改善に用いるためのものである。
【００４５】
第８又は第９の態様の一実施形態において、ビタミンＤと組み合わせた上記に記載する組成物は、骨量減少の予防又は処置に用いるためのものである。
【００４６】
第８又は第９の態様の別の実施形態において、ホルモン（ホルモン補充療法に用いるための）と組み合わせた上記に記載する組成物は、骨量減少の予防又は処置に用いるためのものである。
【００４７】
第８又は第９の態様の一実施形態において、上記に記載する組成物は、医薬組成物（任意選択により、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む）、又は食品製品若しくは食品サプリメント（当業者には知られている通り、任意選択により、少なくとも１つの食品グレードの賦形剤を含む）である。
【００４８】
第１０の態様によると、本発明は、骨量減少の予防又は処置のための医薬組成物を製造するための、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９５％の同一性を有し、以下の４つの位置：塩基対２７１  ３９１におけるＣ、塩基対４５３  ５３８におけるＧ、塩基対５２９  ２２８におけるＧ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣの少なくとも１つにおいて、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対して同一のヌクレオチドを保持している乳酸菌株の使用を提供する。
【００４９】
第１０の態様の一実施形態において、乳酸菌株は、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％の同一性を有し、以下の４つの位置：塩基対２７１  ３９１におけるＣ、塩基対４５３  ５３８におけるＧ、塩基対５２９  ２２８におけるＧ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣの少なくとも１つにおいて、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対して同一のヌクレオチドを保持している。
【００５０】
第１０の態様の一実施形態において、乳酸菌株は、前記４つのヌクレオチドのうち少なくとも２つ、例えば、前記４つのヌクレオチドのうち少なくとも３つ、例えば、前記ヌクレオチド４つ全てを保持している。
【００５１】
第１１の態様によると、本発明は、乳酸菌株が、塩基対２７１  ３９１におけるＣからＴ、塩基対４５３  ５３８におけるＧからＡ、塩基対５２９  ２２８におけるＧからＡ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣからＴからなる４つの変異の群から選択される、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対する少なくとも１つの変異を保持していないという条件で、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９５％の同一性を有する乳酸菌株の、骨量減少の予防又は処置のための医薬組成物を製造するための使用を提供する。
【００５２】
第１１の態様の一実施形態において、乳酸菌株は、乳酸菌株が、塩基対２７１  ３９１におけるＣからＴ、塩基対４５３  ５３８におけるＧからＡ、塩基対５２９  ２２８におけるＧからＡ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣからＴからなる４つの変異の群から選択される、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対する少なくとも１つの変異を保持していないという条件で、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％の同一性を有する。
【００５３】
第１１の態様の一実施形態において、乳酸菌株は、前記４つの変異のうち少なくとも２つ、例えば、前記４つの変異のうち少なくとも３つ、例えば、前記４つの変異のいずれも保持していない。
【００５４】
第１０又は第１１の態様の本発明の好ましい一実施形態において、乳酸菌株は、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５である。
【００５５】
本発明の第１２の態様は、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９５％の同一性を有し、以下の４つの位置：塩基対２７１  ３９１におけるＣ、塩基対４５３  ５３８におけるＧ、塩基対５２９  ２２８におけるＧ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣの少なくとも１つにおいて、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対して同一のヌクレオチドを保持している乳酸菌株を個体に投与することを含む、骨量減少の予防又は処置のための方法を提供する。
【００５６】
第１２の態様による方法の一実施形態において、乳酸菌株は、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％の同一性を有し、以下の４つの位置：塩基対２７１  ３９１におけるＣ、塩基対４５３  ５３８におけるＧ、塩基対５２９  ２２８におけるＧ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣの少なくとも１つにおいて、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対して同一のヌクレオチドを保持している。
【００５７】
第１２の態様の一実施形態において、乳酸菌株は、前記４つのヌクレオチドのうち少なくとも２つ、例えば、前記４つのヌクレオチドのうち少なくとも３つ、例えば、前記ヌクレオチド４つ全てを保持している。
【００５８】
第１３の態様によると、本発明は、乳酸菌株が、塩基対２７１  ３９１におけるＣからＴ、塩基対４５３  ５３８におけるＧからＡ、塩基対５２９  ２２８におけるＧからＡ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣからＴからなる４つの変異の群から選択される、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対する少なくとも１つの変異を保持していないという条件で、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９５％の同一性を有する乳酸菌株を個体に投与することを含む、骨量減少の処置又は予防のための方法を提供する。
【００５９】
第１３の態様の一実施形態において、乳酸菌株は、乳酸菌株が、塩基対２７１  ３９１におけるＣからＴ、塩基対４５３  ５３８におけるＧからＡ、塩基対５２９  ２２８におけるＧからＡ、及び塩基対５９９  ３３８におけるＣからＴからなる４つの変異の群から選択される、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に対する少なくとも１つの変異を保持していないという条件で、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２のゲノム（配列番号１）に少なくとも９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％の同一性を有する。
【００６０】
第１３の態様の一実施形態において、乳酸菌株は、前記４つの変異のうち少なくとも２つ、例えば前記４つの変異のうち少なくとも３つ、例えば、前記４つの変異のいずれも保持していない。
【００６１】
第１２又は第１３の態様の本発明の好ましい一実施形態において、乳酸菌株は、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】空腸及び回腸における微生物群落のクラスター形成を示す図である。
【図２】ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５による骨量減少の抑制を示す図である。
【図３】様々なラクトバチルス・ロイテリ株における、骨量減少に対する効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
慢性炎症性疾患は、全身性の骨量減少に付随することが頻繁にある。ＮＩＨ助成金の抄録の助成番号１Ｒ２１ＡＴ００５４７２−０１Ａ１において、ＭｃＣａｂｅは、腸管全体の健康状態を改善する治療法は、骨の健康状態に有益である可能性があることを示唆している。ＭｃＣａｂｅ及びＢｒｉｔｔｏｎは、メスマウスではなく健常オスマウスにおいて、ラクトバチルス・ロイテリ処置は回腸におけるＴＮＦレベルを低減し、骨体積を増大したことを見出し、ラクトバチルス・ロイテリは、腸の炎症を抑制し、骨形成を上方制御することにより、性別依存的に骨密度を増大することを示唆している。彼らは、腸の炎症を減弱するプロバイオティクス細菌の使用により、骨質量を増大する新規な方法があることを示唆している。これは、ラクトバチルス・ロイテリの抗炎症の性質に付随する骨量減少の予防ではなく、骨形成の性別依存的な上方制御であり、ある種の特異的に選択された株を用いてオスメス両方において骨量減少を予防する本発明とは異なる。
【００６４】
プロバイオティクスは、ニワトリの皮質骨の厚さを増大し、加齢マウスにおける骨量減少を低減することができる。Ｎａｒｖａらは、「生理活性ペプチドであるバリル−プロリル−プロリン（ＶＰＰ）、及びラクトバチルス・ヘルベティカス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）が発酵したＶＰＰを含むミルクの卵巣切除ラットにおける骨量減少に対する効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ｖａｌｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ（ＶＰＰ），ａｎｄ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ  ｍｉｌｋ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＶＰＰ  ｏｎ  ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ  ｒａｔｓ．）」において、ラクトバチルス・ヘルベティカスが発酵したミルクは骨量減少を予防し、その効果はペプチドのバリル−プロリル−プロリンによる可能性があると記載した。Ｎａｒｖａらはさらに、「ラクトバチルス・ヘルベティカスが発酵したミルクの、閉経後の女性におけるカルシウム代謝における急性の変化に対する効果（Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ  ｍｉｌｋ  ｏｎ  ａｃｕｔｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍｅｎ）」において、ラクトバチルス・ヘルベティカスでミルクを発酵させるとカルシウム代謝に対してポジティブな急性効果があったと記載した。
【００６５】
Ｙｅｏらは、「プレバイオティクスを補った豆乳における、プロバイオティクスによるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性及びイソフラボンの生物変換（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ  ｂｙ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  ｉｎ  ｓｏｙｍｉｌｋ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ）」において、プレバイオティクスを補った豆乳中に組み入れられたプロバイオティクスを、骨粗鬆症などにおける食事療法として潜在的に用いてもよいことを示唆している。
【００６６】
Ｋｉｍらは、「ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）３９３が発酵したミルク生成物の、卵巣切除ラットにおける骨代謝に対する効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ３９３  ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ  ｍｉｌｋ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｎ  ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｓｅｄ  ｒａｔｓ）」において、ラクトバチルス・カゼイ３９３ＦＭＰは、卵巣切除ラットにおける骨量減少に対して予防効果があったことを示した。
【００６７】
しかし、上記に言及した先行技術のどれも、単独で、又は組み合わせて、骨量減少を予防するのに効果的である特異的なプロバイオティクス株を選択することができる方法を教示していない。
【００６８】
本発明は、本明細書において、ヒトにおける骨量減少を予防するのに効果的な乳酸菌株を選択するための方法、及び示された方法にしたがって選択された株を含む。食品、栄養上の添加物、及び製剤、これらの株に由来する全細胞若しくは構成成分を含有する医薬品又は医療機器などの生成物は、当技術分野において知られている通りに調合することができ、知られている摂取可能な補助物に加えて乳酸菌株、又はその派生構成成分を全般的に含む。
【００６９】
先行技術に基づいて、骨量減少を予防する株の能力は、腸の健康に対する全般的な効果又はその抗炎症性の性質に付随すると考えるのが自然であるが、本発明者らは、驚くべきことに、これらの性質は骨量減少の予防に対する効率に対して予測的ではないことを見出した。ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５及びラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９は殆ど同一の２株であり、両方とも抗炎症性であり、腸全体の健康状態を改善する。したがって、これらの株は、骨量減少に対しても同じ効果があると想定するのが自然である。しかし、本発明者らは、これらの株は、骨量減少の予防に対して同じ影響があるわけではないことを示し、この観察に基づき、本発明者らは、例えば、骨量減少の処置及び／又は予防に効果的であるラクトバチルス・ロイテリなどの乳酸菌株を選択する新規な方法を発明した。
【００７０】
本明細書に示す方法により特異的に選択された乳酸菌を、骨量減少を予防するためにヒトに投与してもよい。
【００７１】
ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９は、４つのＳＮＰが異なっており、これらは骨量減少を予防する細菌の能力にとって重要である。これらのＳＮＰはＷａｌｔｅｒらにおいて示されており（Ｗａｌｔｅｒら、「脊椎動物の消化管における宿主−微生物の共生及びラクトバチルス・ロイテリのパラダイム（Ｈｏｓｔ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ｐａｒａｄｉｇｍ）」、ＰＮＡＳ、１０８巻、４６４５〜４６５２頁）、これは全文が本明細書に参照により組み入れられる。ＳＮＰ分析に対して、シークエンシングの結果を基準のゲノム（ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ  １１１２、ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＡＰ００７２８１、配列番号１）上にマッピングした。ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９に７つのＳＮＰが見出され、このうち３つはラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５にも見出された（基準のゲノムであるラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ  １１１２、ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＡＰ００７２８１、配列番号１に関して、ｂｐ５６７  ３６８に位置するＳＮＰ４、ｂｐ９６８  ０８８に位置するＳＮＰ６、及びｂｐ１  ３５８  ４６０に位置するＳＮＰ８）。残りの独特な４つのＳＮＰ（本テキストの目的で、本明細書以降それぞれＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３、及びＳＮＰ５と呼ぶ）は、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５とラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９との間のゲノムの相違を構成する。前記４つのＳＮＰは、以下に位置する：
ｂｐ  ２７１  ３９１（ＳＮＰ１）、
ｂｐ  ４５３  ５３８（ＳＮＰ２）、
ｂｐ  ５２９  ２２８（ＳＮＰ３）、及び
ｂｐ  ５９９  ３３８（ＳＮＰ５）
（基準ゲノムであるラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ  １１１２、ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＡＰ００７２８１、配列番号１に関して）。
【００７２】
ＳＮＰ１は、保存されている仮定上のタンパク質をコードする遺伝子に位置し（ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ  １１１２：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／１８３２２４２２５）、ＳＮＰ２は、クロライドチャネルタンパク質をコードする遺伝子に位置し（ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ  １１１２：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／１８３２２４３８６）、ＳＮＰ３はＡＴＰ合成酵素ガンマサブユニットをコードする遺伝子に位置し（ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ  １１１２：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／１８３２２４４５５）、ＳＮＰ５はＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ＨｅｘＢをコードする遺伝子に位置する（ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ  １１１２：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／１８３２２４５１１）。本発明に関与するＳＮＰは、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５に適合するものであり、その配列は、ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３、及びＳＮＰ５の位置にラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２と同一のヌクレオチドを有する）。以下に列挙するのは、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５と４６５９との株間で異なるヌクレオチドである：
ＳＮＰ１）ヌクレオチド２６７がＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９においてＣから（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５及びＪＣＭ  １１１２同様）Ｔに変わっている、仮定上のタンパク質をコードする遺伝子。
ＳＮＰ２）ヌクレオチド３７３がＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９においてＧから（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５及びＪＣＭ  １１１２同様）Ａに変わっている、クロライドチャネルタンパク質をコードする遺伝子。
ＳＮＰ３）ヌクレオチド２９６がＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９においてＧから（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５及びＪＣＭ  １１１２同様）Ａに変わっている、ＡＴＰ合成酵素ガンマサブユニットをコードする遺伝子。
ＳＮＰ５）ヌクレオチド１９６６がＣから（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５及びＪＣＭ  １１１２同様）Ｔに変わっている、ＨｅｘＢタンパク質をコードする遺伝子。
【００７３】
本発明の選択方法において、これらＳＮＰの少なくとも１つにおいて、上記に言及したＳＮＰに対してラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５と同じヌクレオチドを保持している株が探求される。
【００７４】
微生物は骨量減少において重要な役割を果たし、骨量減少に悩む患者の多くは、腸管の微生物叢の障害を有する。ＧＩ管における正常の微生物群落を再建することができる乳酸菌は、驚くべきことに、骨量減少の予防においてより効果的である。
【００７５】
本発明は、骨量減少を予防するのに効果的な株を選択する、独特な選択方法を開示する。腸全体の微生物組成を再建する能力は、驚くべきことに、骨量減少を予防する機能にも重要である。本発明者らは、変更された微生物群落を正常に再建し、且つ／又は４つの特異的なＳＮＰのうち少なくとも１つを保持していることができる株は、骨量減少を予防するのに効果的であることを見出した。
【００７６】
骨量減少を予防する能力は、ある株に独特であり、全ての乳酸菌に全く共通しない。効果的な株を選択する場合、抗炎症効果は抗炎症性の特徴に依存しないことを本発明者らは明らかに示しているため、抗炎症能力を選択基準として用いるのは十分ではない。ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５及びラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９は両方とも抗炎症性の株であるが、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５を骨量減少の予防に用いるとはるかに効果的であり、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９は、本発明にしたがって選択されない。本発明にしたがって選択される特異的な乳酸菌株は、全般的に骨量減少を予防するのに用いることができ、以下の実施形態は、本発明の範囲を限定しようとするものではなく、好ましい実施形態を例示しようとするものである。
【００７７】
ビタミンＤは骨の健康状態に極めて重大であり、ビタミンＤレベルが低い人々は、骨密度又は骨質量が低い。ビタミンＤはカルシウムを吸収するのに必要とされるため、十分なビタミンＤを得ていない人々は骨量が減少することがある。本発明者らは、変更された微生物叢はビタミンＤ欠乏症及び骨量減少をまねき、本発明にしたがって選択される乳酸菌を投与すると微生物叢を再建し、それにより腸のビタミンＤ吸収が増大し、ビタミンＤレベルが回復することを認めた。骨量減少を予防するのにさらに効果的な方法／生成物を得るために、ビタミンＤを選択された株と組み合わせるのも任意である。
【００７８】
Ｔ１Ｄ患者は骨量減少などの合併症に悩んでいる。Ｔ１Ｄに罹患している患者は、病状の結果として変更された微生物叢を有する。本発明にしたがって選択される乳酸菌の投与は、微生物叢を再建し、骨量減少を予防する。
【００７９】
若年及び成人期の間に骨密度が高いと、後年、骨粗鬆症などの疾患を予防する助けとなり得る。これは、骨密度が高ければ、骨密度が骨粗鬆症ゾーン内に到達する前に、高度の骨量減少が許容されるという事実による。したがって、本発明の一目的は、本発明にしたがって選択される乳酸菌株を若年者及び成人に投与することにより骨量減少を予防することであり、これにより個体が最大の骨密度を得て、後年、骨粗鬆症が生じるのを予防する助けとなる。本発明にしたがって選択される特異的な乳酸菌は、健常受容者及び骨量減少に悩む受容者において骨量減少を予防する。
【００８０】
選択された乳酸菌の投与は、ホルモン補充療法と組み合わせてもよい。このような組合せにより、ホルモンの量を低減し、それにより癌のリスクを低減するなど、副作用を低減するのが可能となる。
【００８１】
骨量減少を予防するために選択された乳酸菌は、骨粗鬆症を発症する傾向がある、閉経後の女性及び骨減少症の男性に投与するのが好ましく、選択された乳酸菌の投与は骨量減少を予防し、したがって低骨密度及び骨粗鬆症を予防する。
【００８２】
本発明者らは、エストロゲン欠乏により腸の微生物叢が変更し、本発明にしたがって選択される乳酸菌での処置により、それだけには限定されないが、閉経期の女性及び子宮摘出を受けた女性を含む、エストロゲンレベルの低下に悩む人々における微生物叢が再建され、その結果骨量減少が予防されることを認めた。
【００８３】
本発明にしたがって選択される乳酸菌株を、骨折の修復を改善するのにも用いてもよい。
【００８４】
骨量減少を処置するのに用いられる、例えば、ビスホスホナート及びホルモン補充療法などの薬物の副作用を減らすために、選択された乳酸菌の投与と薬物を組み合わせ、それにより投与量を低減することが可能であり、これにより副作用は最少になる。
【実施例】
【００８５】
（例１）
ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５がｏｖｘマウスにおいて変更された微生物群落を再建する能力の試験
対照（非ｏｖｘ）、ｏｖｘ、及びラクトバチルス・ロイテリを摂取させたｏｖｘの腸管微生物群落において、著しい変化が存在する。
【００８６】
実験群及び組織採取
卵巣切除（ｏｖｘ）、及びｏｖｘマウスのラクトバチルス・ロイテリ６４７５処置の効果を測定するために、本発明者らは３つの実験群の動物を比較した。対照のマウスは、１週間に３回、ビヒクル対照の胃管栄養法を与えた非ｏｖｘマウスであった。ｏｖｘマウスには、ビヒクル対照の胃管栄養法を１週間に３回与えた。ｏｖｘ＋ラクトバチルス・ロイテリ６４７５は、１週間に３回、４週間、一夜ラクトバチルス・ロイテリ６４７５  ３００μｌを与えたマウスであった。実験の終わりにマウスを安楽死させ、胃、十二指腸、空腸、回腸、近位及び遠位の結腸から組織試料を単離し、微生物生態学分析に供した。
【００８７】
ＤＮＡ抽出
マウス腸組織を、バッファーＡＴＬ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号１９０７６）３６０μｌを含有するＭｏＢｉｏ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｌｅａｎ  Ｆｅｃａｌ  ＤＮＡ  Ｂｅａｄ  Ｔｕｂｅｓ（カタログ番号１２８１１−１００−ＤＢＴ）中に配置し、Ｍｉｎｉ−Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ−８（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）上、１分間最高速度で溶解させた。ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（カタログ番号６９５０４）を用いてマウス腸組織から抽出した。プロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１９１３３）４０μｌを加え、５５℃で１時間インキュベートすることにより組織をさらに破壊した。ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（カタログ番号６９５０４）を用いて抽出した。ＤＮＡの収率を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００を用いて定量した。
【００８８】
ＰＣＲ増幅
細菌の１６Ｓ配列を、Ｖ３−Ｖ５バーコード化プライマーセット、及びＢｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔにより開発された増幅プロトコールを用いて、マウス腸組織からの４５４シークエンシングに対して増幅した。バーコード化フォワードプライマーは、ＩＤＴ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより合成されたものであり、リバースプライマーはＳｉｇｍａにより合成されたものであった。バーコード化フォワードプライマーを、９６ウエルプレート中、作業濃度４μＭに希釈し、各ウエルにリバースプライマーを加えて最終濃度４μＭとした。１×Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２３４６０８６）中、マウス腸ＤＮＡ４００μｇ、４μＭプライマー２μｌ、及びＡｃｃｕｐｒｉｍｅ  ＨｉＦｉ  Ｔａｑポリメラーゼ０．１５μｌを含有する体積２５μｌ中三重反復反応を調製した。反応を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｐｒｏアルミニウムプレートサーマルサイクラー中、変性９５℃２分、その後９５℃×２０秒、５０℃×３０秒、７２℃×５分を３０サイクル増幅した。
【００８９】
増幅生成物の精製
１６Ｓ増幅生成物を、Ａｍｐｕｒｅ  Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号Ａ６３８８０）を用いて精製した。最初に、各試料三重反復反応を１．７ｍｌマイクロチューブ中に合わせ、０．７×体積率のＡｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズを加えた。ボルテックスにかけた後、混合した試料を室温で１０分間インキュベートし、次いで、磁気スタンド上に配置してビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２３−２１Ｄ）を分離した。ビーズを、製造元のプロトコールにしたがって、７０％エタノール２００μｌで２回洗浄した。ビーズを３７℃で５分間乾燥させ、ＤＮＡを１０μＭ  Ｔｒｉｓバッファー／０．１μＭ  ＥＤＴＡ２０μｌで溶出した。溶出液を磁気スタンド上でビーズから分離し、新たな１．７ｍｌマイクロチューブに移し、Ｑｕａｎｔ−Ｉｔ  ｄｓＤＮＡ高感度アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｑ３３１２０）を用いて定量した。次いで、各試料を等量、４５４シークエンシング用に１本のチューブ中にプールした。
【００９０】
４５４シークエンシング及び配列分析
Ｔｉｔａｎｉｕｍケミストリを用い、ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて４５４シークエンシングを行った。通過したリードを同定するためにＧＳ  Ｊｒが利用した標準のフィルターに加えて、本発明者らは不正確に廃棄された配列の数を低減するために修飾アンプリコンプロセシングアルゴリズム（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｍｐｌｉｃｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を利用した。１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を、ＭＳＵのリボゾームデータベースプロジェクト（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）のスタッフにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の１６Ｓ配列にアラインし、大腸菌の１６Ｓヌクレオチド６１７位から９００位を切り取った。引き続きプロセシング及び分析（多様性測定法（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｍｅｔｒｉｃｓ）を含む）を、ＭＯＴＨＵＲ  ｖ．１．２１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｔｈｕｒ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／）を用いて行った。ソフトウエアパッケージＰＡＳＴを用いて、ＡＮＯＳＩＭ（類似性分析）及び主座標分析を行った。添付の図及び表は、２つ以上の微生物群落間の相違レベルを測定するのにＢｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ方法を利用したものである。これらの分析において、本発明者らは、種レベルで群落を見ると考えられている、操作的分類単位（ＯＵＴ）のカットオフ０．０３を選択した。これらのデータから、本発明者らは、卵巣切除したマウスをラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５で処置すると、回腸及び空腸両方の微生物群落における著しい移行を引き起こし、これは骨の健康の改善に相関すると結論付ける。
（表１におけるｏｖｘ＋ｌａｃｔｏ）
【表１】
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【００９１】
野生型、ｏｖｘ、及びラクトバチルス・ロイテリで処置したｏｖｘの三元（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ）比較により、微生物群落における著しい移行が示された（表１）。この違いは、ラクトバチルス・ロイテリ処置後の群落における実質的な移行により主に駆り立てられるものである。野生型対照群（三角、△）、ｏｖｘ群（丸、●）、及びラクトバチルス・ロイテリで処置したｏｖｘ群（四角、■）からの微生物群落の主座標分析を用いて、空腸及び回腸で群落がどのようにクラスター化するかを視覚化した。図１は、ラクトバチルス・ロイテリで処置したｏｖｘマウスが、空腸及び回腸の両方で、野生型及びｏｖｘの群落と異なる群落のクラスターを形成することを示す。クロストリジア目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｒｉａｌｅｓ）と分類されたＯＴＵのいくつかは、ラクトバチルス・ロイテリ処置したＯｖｘの群落の、他の２群からの分離を駆り立てる主な細菌群である。
【００９２】
（例２）
ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９がｏｖｘマウスにおいて変更された細菌群落を再建する能力の試験
実験は実施例１における通りに行うが、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５の代わりにラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９を用いる。
【００９３】
ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９処置は、ｏｖｘ群落を対照に向けて再建することができない。
【００９４】
（例３）
ある種のＳＮＰの同定
ラクトバチルス・ロイテリゲノムのＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシング
この試験で用いたラクトバチルス・ロイテリ株は、ＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ）中で増殖させたＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９及び６４７５であり、ゲノムＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ−Ｔｉｐ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて調製した。２０分間超音波処理（１３０Ｗ）によりＤＮＡをフラグメント化して平均フラグメントサイズ５００ｂｐを得、次いでさらに精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ）で濃縮した。３’オーバーハングを除去し、５’オーバーハングに充填する処置により、平滑末端のゲノムフラグメントを得た。ターミナルトランスフェラーゼにより３’末端にアデニン残基を付加し、得られたフラグメントをＳｏｌｅｘａアダプターにライゲーションした。生成物をアガロースゲル電気泳動により分離し、１５０ｂｐから２００ｂｐの間のバンドをゲルから切り取った。ＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてアガロースのスライスから抽出した。アダプター修飾されたＤＮＡフラグメントを、Ｓｏｌｅｘａユニバーサルアダプタープライマーを用いて１８サイクルのＰＣＲにより濃縮した。ＤＮＡフラグメントライブラリーを定量化し、次いで、希釈してクラスター産生用の１０ｎＭ作業用貯蔵液にした。アダプターをライゲートしたフラグメント（２ｎＭ）を０．１Ｍ  ＮａＯＨ中で５分間変性させ、次いでさらに希釈して、予め冷却したハイブリダイゼーションバッファー１ｍＬ中最終濃度９ｐＭにし、Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓｔａｔｉｏｎを用いてＳｏｌｅｘａフローセル上に導入した。等温増幅後、０．１Ｍ  ＮａＯＨ変性によりクラスターを一本鎖にし、Ｓｏｌｅｘａ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓｔａｔｉｏｎによりフローセルにわたって計量した。Ｓｏｌｅｘａアダプターの１つに相補的なシークエンシングプライマーを加えて、各クラスターの一本鎖をプライムした。ハイブリダイズし、過剰のプライマーを洗浄により除去した後、フローセルをシークエンシング用に準備した。Ｓｏｌｅｘａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩを、蛍光標識し、３’−ＯＨブロックしたヌクレオチド及びポリメラーゼの最高３６回の逐次的なフローをフローセルの表面に供給するようにプログラムし、このようにして固定された３６ｂｐリード長を生成した。塩基を組み入れる各ステップの後、フローセルの表面を洗浄して反応物を除去し、次いで、顕微鏡対物レンズにより画像化した。実験によりフローセル１レーンあたり３００タイル化した画像（「タイル（ｔｉｌｅｓ）」）を収集し、各々が平均３００００個のクラスターを含有していた。
【００９５】
ＳＮＰ分析
２レーンのシークエンシング結果を、基準ゲノムのラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２Ｔ（ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＡＰ００７２８１）上に別々にマッピングした。マッピングソフトウエアＭａｑバージョン０．６．６（ｈｔｔｐ：／／ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｍａｑ−ｍａｎ．ｓｈｔｍｌ）を用いてマッピングを行った（デフォルトパラメータ）。ＳＮＰを同定し、ＭＡＱソフトウエアにより検証し、コードＳＮＰと遺伝子間（ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｔｉｃ）ＳＮＰとに分類した。コードＳＮＰを同義及び非同義と同定した。ＳＮＰを、周囲領域をＰＣＲ増幅し、その後Ｓａｎｇｅｒ配列決定により最終的に検証した。
【００９６】
（例４）
株の選択方法
骨量減少を予防するのに効果的な株の選択は、変更された微生物群落を回復する能力に基づく。実施例１及び２の結果に基づき、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５が、この株が変更された微生物群落を回復する能力を有するという事実に基づき選択される。ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９は実施例２の結果に基づき選択されない。
【００９７】
（例５）
株の選択方法
骨量減少を予防するのに効果的な株の選択は、ある種のＳＮＰの存在に基づく。実施例３の結果の成り行きとして、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５は、探し求められるＳＮＰ４つ全てを保持しているため選択される。ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９にはこれらのＳＮＰがないため選択されない。
【００９８】
（例６）
株の選択方法
骨量減少を予防するのに効果的な株の選択は実施例３、及び４、及び５に基づき、探し求められる４つのＳＮＰＳのうち少なくとも１つ、及び変更された微生物群落を回復する能力を保持している株が選択される。これらの選択基準に基づき、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５が選択される。
【００９９】
（例７）
ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５はｏｖｘ誘導性骨量減少を抑制する
この試験において、卵巣切除した（ｏｖｘ）ＢＡＬＢ／ｃマウスを、骨量減少に対するマウスモデルとして用いた。マウス（１２週齢）を卵巣切除し、２群に分け、第１群を４週間の間、１週間に３回ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５で処置した。卵巣切除しなかったＢＡＬＢ／ｃを対照群として用いた。大腿部遠位骨体積率（ＢＶ／ＴＶ）及び骨ＴＲＡＰ５  ＲＮＡ（ＨＰＲＴに対して）を測定した。ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５で処置したマウスは、対照群と同じ骨体積率を示した。さらに、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５処置するとＴＲＡＰ５（破骨細胞機能のマーカー）がベースライン（対照群）に戻ることが認められた。
【０１００】
図２は、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５による骨量減少の抑制はほぼ１００％であり、ＴＲＡＰ５の発現はベースラインに戻ることを示すものである。
【０１０１】
（例８）
選択されたラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５は非選択のラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９よりも骨量減少を抑制する上で優れている
この実験では、本発明者らは、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５及びラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９株で１週間に３回、動物に胃管栄養法を行う一方、飲料水に入った株を２８日間継続的に与えた。大腿部位骨体積率（ＢＶ／ＴＶ）をμＣＴにより測定した。ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５は骨量減少を抑制し、対照マウスと識別不能であった（図３）。ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９は骨量減少を、統計学的有意差に至る十分なレベルに抑制しなかった（ｐ＜．０１）。ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ４６５９は、選択された株であるラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ６４７５ほど効果的ではない。
【図１】
2015526389.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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