(57)【要約】  Ｒ１及びＲ２が本明細書に記載された通りである式（Ｉ）2015520205.tif 000044の化合物が提供される。本化合物は、がんの治療におけるタンキラーゼの阻害剤として有用である。
2015520205.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
2015520205.tif 000041
［上式中、Ｒ１はＣ１−６アルキル、ハロ、シアノ、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、
2015520205.tif 000042
からなる群から選択され；
Ｒ２は(ｉ)アリール、(ii)ヘテロアリール、ここで、前記アリール又はヘテロアリールが、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ハロアルキル若しくはハロゲンから独立して選択される１又は３の基で置換されていてもよく、（iii)ピペラジニル又は（iv)ピペリジニル、ここで、前記ピペラジニル又はピペリジニルが、上記のように置換されていてもよいアリールで置換されていてもよく、かつ、前記ヘテロアリールがピリジニルである］の化合物；又は、
その薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｒ２が
2015520205.tif 000043
であり；
ＡはＣＨ又はＮであり；
Ｒ３は置換されていてもよいアリールであり；且つ
Ｒ４はトリフルオロメチル又はメトキシである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２が置換されていてもよいピリジニルである、請求項１から２の何れか一項に記載の化合物。
【請求項４】
６−ブロモ−３−(４−メトキシ−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン、
１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボニトリル、
Ｎ−ヒドロキシ−１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボキサミジン、
１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボン酸アミド、
１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボキサミジン、
６−(４,５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル)−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン、
６−メチル−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン、
６−ヒドロキシメチル−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン、
３−[４−(２−フルオロ−フェニル)−ピペラジン−１−イル]−６−メチル−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン及び
６−ブロモ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オンからなる群から選択される、請求項１から３の何れか一項に記載の化合物。
【請求項５】
治療的活性物質として使用するための、請求項１から４の何れか一項に記載の化合物。
【請求項６】
がんの治療的及び／又は予防的処置のための治療的活性物質として使用するための、請求項１から４の何れか一項に記載の化合物。
【請求項７】
請求項１から４の何れか一項に記載の化合物及び治療的に不活性な担体を含む薬学的組成物。
【請求項８】
がんの治療のための、請求項１から４の何れか一項に記載の化合物の使用。
【請求項９】
がんの治療のための医薬を製造するための、請求項１から４の何れか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１０】
請求項１から４の何れか一項に記載の化合物の有効量を投与することを含む、がんの治療のための方法。
【請求項１１】
上記に記載した発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１２年６月２０日に出願された米国仮出願番号第６１／６６１９１３号の優先権の利益を主張し、参照によりその全文が本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、タンキラーゼの阻害剤として作用し、がんの改善又は治療において有用なピロロピラゾンに関する。
【背景技術】
【０００３】
がんは、細胞増殖に対して適切な制御を喪失したことを特徴とする疾患である。米国がん協会は、２０１０年にアメリカ合衆国内で１５０万を超えるがんの新しい症例があり、その年のおよそ５７万の死亡はがんに起因するであろうと推定している。世界保健機関は、がんが２０１０年の世界で第１位の死因であり、がんによる死亡数は２０３０年までに毎年１２００万まで増加すると推定している。
【０００４】
がん性病変の形成をもたらすために細胞が発達させる必要がある６種の能力が存在することが示唆されている。これらの特性は、増殖シグナルの自給、抗増殖シグナルに対する非感受性、組織浸潤及び転移、無限の複製可能性、持続的な血管新生及びアポトーシスの回避である。細胞が休止状態から活性な増殖状態に移行するには、増殖シグナル伝達が必要とされる。これらのシグナルは、典型的には、最終的には細胞内の核レベルでの遺伝子発現の変化を生じる多数の細胞内キナーゼが関与するシグナル伝達カスケードを通じて、膜貫通受容体から伝達される。近年、シグナル伝達阻害剤、特にキナーゼ阻害剤、及びがんを治療するためのそれらの使用の分野に多くの関心が持たれている。このクラスの化合物の数種の例が臨床現場で成功裏に評価されており、がんの特定の形態の治療のために商業的に入手可能であり、販売されており、例えばイマチニブトシレート（フィラデルフィア染色体陽性の慢性骨髄性白血病の治療のためにノバルティスによりＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）として販売）、ラパチニブジトシレート（他の化学療法剤との併用でＨＥＲ２陽性乳がんの治療のためにグラクソスミスクライン社によりＴｙｋｅｒｂ（登録商標）として販売）、スニチニブマレート（ファイザー社によりＳｕｔｅｎｔ（登録商標）として販売され、腎臓がんの治療について承認）及びソラフェニブ（腎臓がんの治療のためにバイエル社によりＮｅｘａｖａｒとして販売）である。
【０００５】
シグナル伝達経路の重要な成分としてリン酸基のキナーゼ触媒化転移を主として利用する増殖因子関連シグナル伝達経路に加えて、多数の他のシグナル伝達経路がまた細胞内に存在し、それらの適切な調節が、細胞増殖及び複製の正確なレベルを維持するために重要である。がん幹細胞阻害の新興分野において、Ｗｎｔ、Ｎｏｔｃｈ及びヘッジホッグ経路は、腫瘍再発及び転移を防ぐための潜在的な方法として多くの関心を受けている。
Ｗｎｔ経路は、厳しい調節下で経路内にある個々の成分の活性を有する成人における胚発生と組織維持において役に立つ。がん及び他の疾病細胞においては、シグナル伝達経路はもはや適切なレベルの制御を示さない。Ｗｎｔ経路の場合、シグナル伝達は２タンパク質、アキシン及びβ−カテニンの相対的安定性によって制御される。β−カテニンが過剰に存在すると、Ｗｎｔシグナル伝達の増大と関連した核転写因子の活性化をもたらす一方、過剰なアキシンは細胞内β−カテニンの分解とシグナル伝達の減少をもたらす。カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路の調節不全は、例えば結腸がん、肝細胞がん、子宮内膜卵巣がん、毛母腫皮膚がん、前立腺がん、メラノーマ及びウィルムス腫瘍などの、ある範囲のヒトがんに関与している。
【０００６】
カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路において、シグナル伝達は、フリッツルドファミリーメンバーと低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質を含む受容体複合体とのＷｎｔリガンドの相互作用によって開始される。これはディシブルド−フリッツルド複合体の形成と破壊複合体から細胞膜へのアキシンの再配置をもたらす。アキシンは破壊複合体の濃度制限成分であり、大腸腺腫症タンパク質、カゼインキナーゼ１α及びβ−カテニンの細胞内レベルの制御の原因であるグリコーゲンシンターゼキナーゼ３βと共に形成されるのはこの複合体である。機能的破壊複合体の存在下で、β−カテニンはアミノ末端のセリン及びトレオニン残基の保存セット上のカゼインキナーゼ１α及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ３βにより順次リン酸化される。リン酸化はβ−カテニンのβ−トランスデューシンリピート含有タンパク質への結合を容易にし、これが次いでユビキチン化とβ−カテニンのその後のプロテアソーム分解を仲介する。十分に高濃度の破壊複合体が無い場合は、非リン酸化β−カテニンが細胞核に移動し、Ｔ−細胞因子タンパク質と相互作用し、コアクチベータータンパク質の動員を通じて、それらを強力な転写活性化因子に転換させることができる。
【０００７】
細胞内アキシンレベルは、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ酵素ファミリーメンバーである、タンキラーゼ−１及びタンキラーゼ−２（ＰＡＲＰ５ａ及びＰＡＲＰ５ｂとしても知られている）によって影響されることが最近報告されている（Nature Chemical Biology 2009, 5, 100及びNature 2009, 461, 614）。タンキラーゼ酵素は、アキシンをポリ−ＡＤＰリボシル化（ＰＡＲ化）することができ、その後のユビキチン化及びプロテアソーム分解のためにこのタンパク質をマークする。従って、タンキラーゼ触媒活性の阻害剤の存在下で、アキシンタンパク質濃度を増加させると、破壊複合体の濃度が高くなり、非リン酸化細胞内β−カテニンの濃度が減少し、Ｗｎｔシグナル伝達を減じることが予期される。タンキラーゼ−１及び−２の阻害剤はまた、タンキラーゼタンパク質の他の生物学的機能、例えば、染色体末端保護（テロメア）、インスリン応答性及び有糸分裂中の紡錘体集合に影響を与えることが予期される（Biochimie 2009, 5, 100）。
【０００８】
Ｗｎｔシグナル伝達経路に向けられ、その調節不全を修復できる治療薬は、骨密度の欠陥、冠動脈疾患、遅発性アルツハイマー病、家族性滲出性硝子体網膜症、網膜血管新生、無四肢症、ミュラーダクト回帰及び男性化、ＳＥＲＫＡＬ症候群、２型糖尿病、フールマン症候群、骨格形成異常、巣状皮膚低形成及び神経管欠損のような症状に関連している。上記の前書きは、がんにおけるＷｎｔシグナル伝達の関連性に焦点を当てたが、Ｗｎｔシグナル伝達経路は、基本的に重要であり、例示目的で上に提供された例に必ずしも限らない、広範囲のヒト疾患に潜在的な関連性を有している。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の一態様は、式Ｉ
2015520205.tif 000003
［上式中、Ｒ１はＣ１−６アルキル、ハロ、シアノ、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、
2015520205.tif 000004
からなる群から選択され；
Ｒ２は(i)アリール、(ii)ヘテロアリール、ここで、前記アリール又はヘテロアリールが、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ハロアルキル若しくはハロゲンから独立して選択される１又は３の基で置換されていてもよく、(iii)ピペラジニル又は(iv)ピペリジニル、ここで、前記ピペラジニル又はピペリジニルが、上記のように置換されていてもよいアリールで置換されていてもよく、かつ、前記ヘテロアリールがピリジニルである]の化合物；又は、その薬学的に許容される塩である。
【００１０】
本発明はまた、一又は複数の本発明の化合物、又は薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体若しくは賦形剤を含む薬学的組成物に関する。
【００１１】
本発明は更に、哺乳動物に、治療的有効量の本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む、前記哺乳動物、好ましくはヒトにおけるがんを治療する、改善させる、又は予防する方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ここで使用される「a」又は「an」実体なる語句は、その実体の一又は複数を指す；例えば、化合物（a compound）は、一若しくは複数の化合物又は少なくとも一の化合物を指す。同様に、「a」（又は「an」）、「一又は複数」、及び「少なくとも一」なる用語は、ここでは互換的に使用することができる。
【００１３】
「上記で定義されたように」なる語句は、発明の概要又は広範な請求項に提供される各群についての広範な定義を指す。以下に提供される他の全ての実施態様において、各実施態様で示すことができ、かつ、明示的に定義されていない置換基は、発明の概要において提供される広範な定義を保持する。
【００１４】
本明細書において使用される場合、請求項の移行句においてであれ本文においてであれ、「含む（comprise(s)）」及び「含む（comprising）」なる用語は、オープンエンドの意味を有していると解釈されるべきである。すなわち、該用語は、「少なくとも有する」又は「少なくとも含む」なる語句と同義的に解釈されるべきである。方法の文脈で使用される場合、「含む」なる用語は、その方法が記載された工程を少なくとも含むが、追加の工程を含んでもよいことを意味する。化合物又は組成物の文脈で使用される場合、「含む」なる用語は、その化合物又は組成物が、記載された特徴又は成分を少なくとも含むが、追加の特徴又は成分も含んでもよいことを意味する。
【００１５】
「独立して」なる用語は、ここでは、ある変数が、何れか一つの場合に、同じ化合物内に同じ又は異なる定義を有する変数があるなしにかかわらず適用されることを示すために使用される。従って、Ｒ”が２回現れ、「独立して炭素又は窒素」のように定義されている化合物においては、両方のＲ”が炭素であり得、両方のＲ”が窒素であり得、あるいは一方のＲ”が炭素で他方が窒素であり得る。
【００１６】
任意の変数（例えば、Ｒ１、Ｒ４ａ、Ａｒ、Ｘ１又はＨｅｔ）が、本発明において用いられる又は請求される化合物を示し記述する任意の部分又は式に複数回出現する場合、各出現におけるその定義は、他の各出現におけるその定義とは無関係である。
また、置換基及び／又は変数の組合せは、そのような化合物が安定な化合物を生じる場合のみ許容される。
【００１７】
結合の端部の記号「＊」又は結合を貫いて引かれた「――――」は、各々、官能基又は他の化学部分が、それが一部分である分子の残りに結合する点を指す。従って、例えば、
2015520205.tif 000005
である。
【００１８】
（明確な頂点に連結されているのと異なり）環系に引かれている結合は、結合がその適切な環原子の何れかに結合され得ることを示している。
【００１９】
ここで使用される「任意成分の（optional）」又は「〜してもよい（optionally）」なる用語は、続いて記載される事象又は状況が、起こってもよいが起こる必要はないことを意味し、その記載は、事象又は状況が起こる場合とそれが起こらない場合とを含んでいることを意味する。例えば、「置換されていてもよい」は、置換されていてもよい部分に、水素又は置換基を含め得ることを意味する。
【００２０】
「約」なる用語は、ここでは、およそ、〜の辺り、大体、又は、〜前後を意味するために使用される。「約」なる用語が、ある数値範囲と共に使用される場合、記載された数値の上下にその境界を拡張することにより、その範囲を修正する。一般に、「約」なる用語は、ここでは、２０％の分散で、述べられた値の上下に数値を修正するために使用される。ここで使用される場合、ある変数の数値範囲の記載は、本発明をその範囲内の値の何れかに等しい変数で実施し得ることを伝達することを意図している。従って、本質的に離散的である変数の場合、変数は、範囲の終点を含む数値範囲の任意の整数値に等しいものとすることができる。同様に、本質的に連続的である変数の場合、変数は、範囲の終点を含む数値範囲の任意の実数値に等しいものとすることができる。
【００２１】
一例として、０と２の間の値を有するものとして記載されている変数は、本質的に離散的である変数では、０、１、又は２とすることができ、あるいは本質的に連続的である変数では、０.０、０.１、０.０１、０.００１、又は任意の他の実数値とすることができる。
【００２２】
本発明の一実施態様において、
Ｒ１はＣ１−６アルキル、ハロ、シアノ、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、
2015520205.tif 000006
からなる群から選択され、
Ｒ２は(i)アリール、(ii)ヘテロアリール、ここで、前記アリール又はヘテロアリールが、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ハロアルキル若しくはハロゲンから独立して選択される１又は３の基で置換されていてもよく、(iii)ピペラジニル又は(iv)ピペリジニル、ここで、前記ピペラジニル又はピペリジニルが、上記のように置換されていてもよいアリールで置換されていてもよく、かつ、前記ヘテロアリールがピリジニルである、式Ｉ
2015520205.tif 000007
の化合物；又は、
その薬学的に許容される塩が提供される。
【００２３】
本発明の一実施態様において、式Ｉ
［ここで、Ｒ１はアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシアルキル、カルボキサミド、
2015520205.tif 000008
からなる群から選択され、
Ｒ２はアリール、置換アリール、ヘテロアリール又は置換ヘテロアリールである]の化合物
又はその薬学的に許容される塩が提供される。
【００２４】
本発明の一実施態様において、式Ｉ
［ここで、Ｒ１はＣ１−６アルキル、ハロ、シアノ、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、
2015520205.tif 000009
からなる群から選択され、
Ｒ２は(i)アリール、(ii)ヘテロアリール、ここで、前記アリール又はヘテロアリールが、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ハロアルキル若しくはハロゲンから独立して選択される１又は３の基で置換されていてもよく、(iii)ピペラジニル又は(iv)ピペリジニル、ここで、前記ピペラジニル又はピペリジニルが、ハロゲン−アリールで置換されていてもよいピペリジニルである]の化合物、又は
その薬学的に許容される塩が提供される。
【００２５】
本発明の一実施態様において、式Ｉ
［ここで、Ｒ２は
2015520205.tif 000010
であり；
ＡはＣＨ又はＮであり；
Ｒ３は置換されていてもよいアリールであり；及び
Ｒ４はトリフルオロメチル又はメトキシである］の化合物が提供される。
【００２６】
本発明の一実施態様において、式Ｉ
［ここで、Ｒ２は
2015520205.tif 000011
であり；
ＡはＣ又はＮであり；
Ｒ３はアリール又は置換アリールであり；及び
Ｒ４はトリフルオロメチル又はメトキシである］の化合物が提供される。
【００２７】
本発明の一実施態様において、Ｒ２が置換されていてもよいピリジニルである、式Ｉの化合物が提供される。
【００２８】
本発明の一実施態様において、Ｒ１がＢｒ、カルボキサミド、ＣＮ、ヒドロキシメチル、
2015520205.tif 000012
からなる群から選択される、式Ｉの化合物が提供される。
【００２９】
本発明の一実施態様において、Ｒ１がＢｒ、カルボキサミド、ＣＮ、ヒドロキシメチル、メチル、
2015520205.tif 000013
からなる群から選択され、Ｒ２が４−(トリフルオロメチル)フェニルである、式Ｉの化合物が提供される。
【００３０】
本発明の一実施態様において、Ｒ１はＢｒであり、Ｒ２は４−(トリフルオロメチル)フェニルである、式Ｉの化合物が提供される。
【００３１】
本発明の一実施態様において、Ｒ１はカルボキサミドであり、Ｒ２は４−(トリフルオロメチル)フェニルである、式Ｉの化合物が提供される。
【００３２】
本発明の一実施態様において、Ｒ１はヒドロキシメチルであり、Ｒ２は４−(トリフルオロメチル)フェニルである、式Ｉの化合物が提供される。
【００３３】
本発明の一実施態様において、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２は４−(トリフルオロメチル)フェニルである、式Ｉの化合物が提供される。
【００３４】
本発明の一実施態様において、Ｒ１は
2015520205.tif 000014
からなる群から選択され、Ｒ２は４−(トリフルオロメチル)フェニルである、式Ｉの化合物が提供される。
【００３５】
本発明の別の実施態様において、式Ｉ
［ここで、Ｒ１はアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシアルキル、カルボキサミド、
2015520205.tif 000015
からなる群から選択され；
Ｒ２はアリール、置換アリール、ヘテロアリール又は置換ヘテロアリールである］の化合物；又はその薬学的に許容される塩が提供される。
【００３６】
本発明の別の実施態様において、式Ｉ
［ここで、Ｒ１はアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシアルキル、カルボキサミド、
2015520205.tif 000016
からなる群から選択され；
Ｒ２はアリール、置換アリール、ヘテロアリール又は置換ヘテロアリールである］の化合物；又はその薬学的に許容される塩が提供される。
【００３７】
本発明の別の実施態様において、式Ｉ
［ここで、Ｒ２は
2015520205.tif 000017
であり；
ＡはＣＨ又はＮであり；
Ｒ３は置換されていてもよいアリールであり；及び
Ｒ４はトリフルオロメチル又はメトキシである］の化合物が提供される。
【００３８】
本発明の別の実施態様において、式Ｉ
［ここで、Ｒ２は
2015520205.tif 000018
であり；
ＡはＣ又はＮであり；
Ｒ３はアリール又は置換アリールであり；及び
Ｒ４はトリフルオロメチル又はメトキシである］の化合物が提供される。
【００３９】
本発明の別の実施態様において、Ｒ２は置換されていてもよいピリジニルである、式Ｉの化合物が提供される。
【００４０】
本発明の別の実施態様において、
６−ブロモ−３−(４−メトキシ−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン、
１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボニトリル、
Ｎ−ヒドロキシ−１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボキサミジン、
１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボン酸アミド、
１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボキサミジン、
６−(４,５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル)−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン、
６−メチル−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン、
６−ヒドロキシメチル−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン、
３−[４−(２−フルオロ−フェニル)−ピペラジン−１−イル]−６−メチル−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン及び
６−ブロモ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オンからなる群から選択される、式Ｉの化合物が提供される。
【００４１】
本発明の別の実施態様において、Ｒ１及びＲ２はがんの治療において使用するための、上記に定義された通りである、式Ｉの化合物が提供される。
【００４２】
本発明の別の実施態様において、Ｒ１及びＲ２はがんの治療に用いる医薬を調製するための、上記に定義された通りである、式Ｉの化合物が提供される。
【００４３】
本発明の別の実施態様において、Ｒ１及びＲ２は上記に定義された通りである式Ｉの化合物及び少なくとも一の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む薬学的組成物が提供される。
【００４４】
本発明の別の実施態様において、Ｒ１及びＲ２は上記に定義された通りである式Ｉの化合物及び少なくとも一の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤の使用が提供される。
【００４５】
本発明の別の実施態様において、治療的活性物質として使用するための、ここに記載された通りである、式Ｉの化合物が提供される。
【００４６】
本発明の別の実施態様において、がんの治療的及び／又は予防的処置のための治療的活性物質として使用するための、ここに記載された通りである式Ｉの化合物が提供される。
【００４７】
本発明の別の実施態様において、ここに記載された通りである式Ｉの化合物及び治療的に不活性な担体を含む、ここに記載された通りである薬学的組成物が提供される。
【００４８】
本発明の別の実施態様において、がんの治療のための、ここに記載された通りである式Ｉの化合物の使用が提供される。
【００４９】
本発明の別の実施態様において、がんの治療に用いる医薬の調製のための、ここに記載された通りである式Ｉの化合物の使用が提供される。
【００５０】
本発明の別の実施態様において、ここに記載された通りである式Ｉの化合物の有効量を投与することを含む、がんの治療のための方法が提供される。
【００５１】
ここで使用される場合、以下の用語は以下の定義を有するものとする。
【００５２】
「アルキル」なる用語は、１から約７の炭素原子を有する基を含む、１から約１２の炭素原子を有する、直鎖状又は分枝鎖状の飽和水素基を指す。ある実施態様では、アルキル置換基は低級アルキル置換基であり得る。「低級アルキル」なる用語は、１から６の炭素原子、好ましくは１から４の炭素原子を有するアルキル基を指す。アルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、及びｓ−ペンチルを含むが、これらに限定されない。
【００５３】
ここで使用される「アルケニル」なる用語は、少なくとも一つの二重結合を含み、２から６、好ましくは２から４の炭素原子を有する不飽和の直鎖状又は分枝鎖状の脂肪族炭化水素基を意味する。このような「アルケニル基」の例は、ビニル、エテニル、アリル、イソプロペニル、１−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−エチル−１−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、４−メチル−３−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル及び５−ヘキセニルである。
【００５４】
「アルコキシ、アルコキシル又は低級アルコキシ」とは、酸素原子（ＲＯ−）による分子の残りの部分に結合した上記の低級アルキル基の何れかを指す。典型的な低級アルコキシ基は、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、プロポキシ、ブチルオキシ等を含む。アルコキシの意味に更に含まれるものは、多アルコキシ側鎖、例えば、エトキシエトキシ、メトキシエトキシ、メトキシエトキシエトキシ等、及び置換アルコキシ側鎖、例えば、ジメチルアミノエトキシ、ジエチルアミノエトキシ、ジメトキシ−ホスホリルメトキシ等である。
【００５５】
ここで使用される「アルキニル」なる用語は、一つの三重結合を含み、２から６、好ましくは２から４の炭素原子を有する不飽和の直鎖状又は分枝鎖状の脂肪族炭化水素基を意味する。このような「アルキニル基」の例は、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル及び５−ヘキシニルである。
【００５６】
アミノとは、−ＮＨ２の基を意味する。
【００５７】
「アリール」とは、一価の、単環又は二環の、芳香族カルボキシル炭化水素基を意味し、好ましくは６−１０員の芳香族環系である。好ましいアリール基は、フェニル、ナフチル、トリル及びキシリルを含むが、これらに限定されない。
【００５８】
カルボキシル又はカルボキシとは、一価の基−ＣＯＯＨを意味する。カルボキシ低級アルキルとは、Ｒが低級アルキルである、−ＣＯＯＲを意味する。カルボキシ低級アルコキシとは、Ｒが低級アルキルである、−ＣＯＯＲＯＨを意味する。
【００５９】
カルボニルとは、Ｒ’及びＲ’’が独立してアルキルを含む任意の数字の化学基であり得る、ＲＣ（＝Ｏ）Ｒ’を意味する。
【００６０】
ここで使用される「シクロアルキル」なる用語は、炭素原子のみからなる任意の安定した単環系又は多環系で、その任意の環が飽和しているものを指すことを意味し、「シクロアルケニル」なる用語は、炭素原子のみからなる任意の安定した単環系又は多環系で、その少なくとも一つの環が部分的に不飽和であるものを指すことを意図している。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、アダマンチル、シクロオクチル、ビシクロアルキルを含み、[２.２.２]ビシクロオクタン又は[３.３.０]ビシクロオクタン等のビシクロオクタン、[４.３.０]ビシクロノナン等のビシクロノナン、[４.４.０]ビシクロデカン（デカリン）等のビシクロデカン、又はスパイロ化合物を含むが、これらに限定されない。シクロアルケニルの例は、シクロペンテニル又はシクロヘキセニルを含むが、これらに限定されない。
【００６１】
ここで使用される「ハロゲン」なる用語は、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素を意味し、好ましくはフッ素及び塩素である。
【００６２】
「ヘテロアリール」とは、２つまでの環を含む芳香族複素環を意味する。好ましいヘテロアリール基は、チエニル、フリル、インドリル、ピロリル、ピリジニル、ピラジニル、オキサゾリル、チアゾリル、キノリニル、ピリミジニル、イミダゾール、置換若しくは未置換トリアゾリル及び置換若しくは未置換テトラゾリルを含むが、これらに限定されない。
【００６３】
二環式であるアリール又はヘテロアリールの場合、一つの環がアリールで他方がヘテロアリールであり得、双方が置換又は未置換であると理解される。
【００６４】
「ヘテロ原子」とは、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される原子を意味する。
【００６５】
「複素環」とは、置換又は未置換の５から８員の、単環又は二環式の、非芳香族炭化水素を意味し、ここで１から３の炭素原子が、窒素、酸素又は硫黄原子から選択されるヘテロ原子によって置換される。例としては、ピロリジン−２−イル；ピロリジン−３−イル；ピペリジニル；モルホリン−４−イル等を含み、これらは順に置換され得る。
【００６６】
ヒドロキシ又はヒドロキシルとは、一価の−Ｏ−Ｈ基の存在を示す接頭辞である。
【００６７】
「低級アルケニル」にあるような「低級」とは、１から６の炭素原子を有する基を意味する。
【００６８】
「ニトロ」とは、−ＮＯ２を意味する。
【００６９】
オキソとは、＝Ｏの基を意味する。
【００７０】
薬学的に許容される担体、賦形剤等、「薬学的に許容される」とは、特定の化合物が投与される対象に対して薬理学的に許容され、実質的に非毒性であることを意味する。
【００７１】
「薬学的に許容される塩」とは、本発明の化合物の生物学的効果及び特性を保持し、適切な非毒性の有機若しくは無機酸又は有機若しくは無機塩基から形成される、一般的な酸付加塩又は塩基付加塩を指す。例となる酸付加塩は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸及び硝酸等に由来するもの、並びに、有機酸、例えばｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、トリフルオロ酢酸等に由来するものを含む。例となる塩基付加塩は、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、及び水酸化第４級アンモニウム、例えば水酸化テトラメチルアンモニウム等に由来するものを含む。薬学的化合物（すなわち薬物）の塩への化学修飾は、化合物の改善された物理的及び化学的安定性、吸湿性、流動性及び溶解性を得るために、薬化学者にとってよく知られた技術である。例えば、Ansel等, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems（1995）p. 456−457を参照のこと。
【００７２】
置換アルキルにあるような「置換」とは、一又は複数の位置で置換が起こり得、別記されていない限り、各置換位置での置換基が明記された選択肢から独立して選択されることを意味する。「置換されていてもよい」なる用語は、（一又は複数の水素原子を有する）化学基の一又は複数の複数の水素原子が、別の置換基で置換されることができるが、必ずしもその必要はないということを指す。好ましくはＨ、カルボキシル、アミド、ヒドロキシル、アルコキシ、置換アルコキシ、硫化物、スルホン、スルホンアミド、スルホキシド、ハロゲン、ニトロ、アミノ、置換アミノ、低級アルキル、置換低級アルキル、低級シクロアルキル、置換低級シクロアルキル、低級アルケニル、置換低級アルケニル、低級シクロアルケニル、置換低級シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環又は置換複素環からなる群から独立して選択される１−３の置換基により置換され得る種々の基が、本明細書で示される。
【００７３】
一般に、本願で使用される命名法は、ＩＵＰＡＣ体系名を作出するためのBeilstein Instituteのコンピューター化システムであるAUTONOMTM v.4.0に基づいている。図示された構造と構造に与えられた名前に矛盾がある場合、図示された構造により重きを与えられるべきである。
【００７４】
一般反応スキーム
2015520205.tif 000019
【００７５】
Ｒ１がハロゲン化物、低級アルキル又はニトリルである式Ｉの化合物は、商業的に入手可能であり得るか、又はよく知られた合成法により調製することができる。
【００７６】
Ｒ２がアリール、置換アリール、ヘテロアリール又は置換ヘテロアリールである式IIの化合物は、商業的に入手可能であり得るか、又はよく知られた合成法により調製することができる。
【００７７】
Ｒ１がハロゲン化物、低級アルキル又はニトリルであり、Ｒ２がアリール、置換アリール、ヘテロアリール又は置換ヘテロアリールである式IIIの化合物は、塩基性条件下で、式XIの化合物のピロール窒素による式IIの化合物の脱離基（ＬＧ）の求核置換を通じて、Ｒ１がハロゲン化物、低級アルキル又はニトリルである式IIIの化合物及びＲ２がアリール、置換アリール、ヘテロアリール又は置換ヘテロアリールである式IIの化合物から調製することができる（例えば、Wang, F., Wang, J., Zhang, S., Molecules 2004 9:574-582; Temple, D. L., Yevich, J. P., Covington, R. R., Hanning, C. A., Seidehamel, R. J., Mackey, H. K., Bartek, M. J., J. Med.Chem.(1979) 22(5): 505-510を参照のこと）。
【００７８】
Ｒ１がハロゲン化物、低級アルキル又はニトリルであり、Ｒ２がアリール、置換アリール、ヘテロアリール又は置換ヘテロアリールである式IVの化合物は、環化とその後のアンモニア等価体での処理を通じて、Ｒ１がハロゲン化物、低級アルキル又はニトリルであり、Ｒ２がアリール、置換アリール、ヘテロアリール又は置換ヘテロアリールである式IIIの化合物から調製することができる（例えば、Temple, D. L., Yevich, J. P., Covington, R. R., Hanning, C. A., Seidehamel, R. J., Mackey, H. K., Bartek, M. J., J. Med.Chem.1979 22(5):505-510; Butler, R.N., Gavin, H.A., Cunningham, D., McArdle, P., J. Chem.Soc.Perkin Trans.1993:883-884を参照のこと）。
【００７９】
Ｒ１がハロゲン化物、低級アルキル又はニトリルであり、Ｒ２がアリール、置換アリール、ヘテロアリール又は置換ヘテロアリールである式Ｖの化合物は、Ｒ１がハロゲン化物、低級アルキル又はニトリルであり、Ｒ２がアリール、置換アリール、ヘテロアリール又は置換ヘテロアリールであり、ここでＲ１及び／又はＲ２は、標準的な化学処理を通じて、Ｒ１及び／又はＲ２がＲ１’及び／又はＲ２’である式Ｖの化合物に更に合成されることのできる官能基を統合する、式IVの化合物から調製することができる（例えば、Lange, U.E.W., Baucke, D., Hornberger, W., Mack, H., Seitz, W., Hoffken, H.W., Bioorg.
Med.Chem.Lett.2003 13(12):2029-2033; Chapleo, C.B., Fagen, G.P., WO1992006972 A1; Beigelman, L., Buckman, B., Wang, G., Matulic-Adamic, J., Stoycheva, A.D., Andrews, S.W., Misialek, S.M., Rajagopalin, P.T., Fryer, A.M., Gunawardana, I., Haas, J., Huang, L., Madduru, M.R., Zhang, G., Kossen, K., Serebryany, V., WO 2008/100867 A2を参照のこと）。
【００８０】
2015520205.tif 000020
【００８１】
Ｒ１がハロゲン化物、低級アルキル又はニトリルである式Ｉの化合物は、商業的に入手可能であり得るか、又はよく知られた合成法により調製することができる。
【００８２】
Ｒ１がハロゲン化物、低級アルキル又はニトリルである式VIの化合物は、塩基性条件下で、Ｒ１がハロゲン化物、低級アルキル又はブロモアセトニトリルを伴うニトリルである式Ｉの化合物を処理することにより調製することができる（例えば、Roy, S., Eastment, A., Gribble, G. W., Tetrahedron 2006 62:7838−7845を参照のこと）。
【００８３】
Ｒ１がハロゲン化物、低級アルキル又はニトリルである式VIIの化合物は、適切なイミド酸エステルを形成するためのアルコールの存在中の酸性条件下で、Ｒ１がハロゲン化物、低級アルキル又はニトリルである式VIの化合物を処理することにより調製することができる（例えば、McElvain, S. M., Stevens, C. L., J. Amer.Chem.Soc.1946(7) (68) 1917-1921を参照のこと）。
【００８４】
Ｒ３がアリール、置換アリール、ヘテロアリール又は置換ヘテロアリールであり、Ａが窒素、炭素又は置換炭素（Ｃ−Ｒ４；ここで、Ｒ４は低級アルキル、ヒドロキシル又はニトリルである）である式VIIIの化合物は、商業的に入手可能であり得るか、又はよく知られた合成法により調製することができる。 
【００８５】
Ｒ１がハロゲン化物、低級アルキル又はニトリルであり、Ｒ３がアリール、置換アリール、ヘテロアリール又は置換ヘテロアリールであり、Ａが窒素、炭素又は置換炭素（Ｃ−Ｒ４；ここで、Ｒ４は低級アルキル、ヒドロキシル又はニトリルである）である式IXの化合物は、Ｒ１がハロゲン化物、低級アルキル又はニトリルである式VIIの化合物及びＲ３が窒素、炭素又は置換炭素（Ｃ−Ｒ４；ここで、Ｒ４は低級アルキル、ヒドロキシル又はニトリルである）である式VIIIの化合物から、それらを一緒に加熱することにより、調製することができる（例えば、McCarthy, J. R., Wright, D. L., Schuster, A. J., Abdallah, A. H., Shea, P. J., Eyster, R., J. Med.Chem.13(1985) (28) 1721-1727を参照のこと）。
【００８６】
Ｒ１がハロゲン化物、低級アルキル又はニトリルであり、Ｒ３がアリール、置換アリール、ヘテロアリール又は置換ヘテロアリールであり、Ａが窒素、炭素又は置換炭素（Ｃ−Ｒ４；ここで、Ｒ４は低級アルキル、ヒドロキシル又はニトリルである）である式Ｘの化合物は、Ｒ１がハロゲン化物、低級アルキル又はニトリルであり、Ｒ３が窒素、炭素又は置換炭素（Ｃ−Ｒ４；ここで、Ｒ４は低級アルキル、ヒドロキシル又はニトリルである）である式IXの化合物から、環化に影響を及ぼす塩基性条件下で（熱的に又はマイクロ波で）加熱することにより、調製することができる（例えば、Sakamoto, T., Kondo, Y., Yamanaka, H., Chem.Pharm.Bull.(1985) 33(11): 4764-4768を参照のこと）。
【００８７】
以下の調製及び実施例は、当業者が本発明をより明確に理解し、実施できるようにするために与えられる。これらは、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではなく、単にそれらを説明及び表現するものである。
【００８８】
2015520205.tif 000021
【００８９】
一般条件
本発明の化合物は、以下の実施例の項に記載する例となる合成反応に示す様々な方法により作製することができる。
【００９０】
これらの化合物の調製に使用される出発物質及び試薬は、一般的にAldrich Chemical Co.等の商業的供給源から入手することができるか、又は、Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis; Wiley & Sons:New York, 1991, 第1-15巻; Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Elsevier Science Publishers, 1989, 第1-5巻 及びSupplementals; 及びOrganic Reactions, Wiley & Sons:New York, 1991, 第1-40巻等の参考文献に記載の手順に従って、当業者によく知られた方法により調製される。実施例の項に示す合成反応スキームは、本発明を合成することができるいくつかの方法を単に説明するものであること、及び、これらの合成反応スキームに対するさまざまな変更がなされ得、当業者に対してそれらの変更は本願に含まれる開示を参照していると示唆するであろうことが認識される。
【００９１】
合成反応スキームの出発物質及び中間体は、必要に応じて、濾過、蒸留、結晶化、クロマトグラフィー等を含むが、これらに限定されない従来の技術を使用して、単離及び精製することができる。このような物質は、物理定数及びスペクトルデータを含む従来の手段を使用して特徴づけることができる。
【００９２】
別段の記載がない限り、ここに記載される反応は、典型的には、不活性雰囲気下で、大気圧における反応温度範囲が約−７８℃から約１５０℃、しばしば約０℃から約１２５℃、より頻繁かつ簡便には室温（又は周囲温度）、例えば約２０℃で実施される。
【００９３】
分取逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ ＨＰＬＣ）は、以下のシステムの一つを使用して実行された：それらのシステムとは、（Ａ）Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  ｐｒｅｐ  ４０００ポンプ/コントローラー、２１５ｎｍに設定した４８６検出器、及びＬＫＢ Ｕｌｔｒｏｒａｃフラクション・コレクター；又は（Ｂ）１５０ＥＸシングル四重極質量分析計を備えたＳｃｉｅｘ ＬＣ／ＭＳシステム、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣシステム、ＬＥＡＰオートインジェクター、及びＧｉｌｓｏｎフラクション・コレクター。サンプルを、アセトニトリル／２０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液又はアセトニトリル／水／ＴＦＡの混合物中に溶解し、Ｐｕｒｓｕｉｔ Ｃ−１８ ２０ｘ１００ｍｍカラムに適用し、１０％−９０％Ｂの直線勾配を用いて２０ｍＬ／分で溶出した。ここで、（Ａ）：２０ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ７.０）及び（Ｂ）：アセトニトリル又は（Ａ）：０.０５％ＴＦＡを含んだ水及び（Ｂ）：０.０５％ＴＦＡを含んだアセトニトリルであった。
【００９４】
フラッシュクロマトグラフィーは、標準シリカゲルクロマトグラフィー、Ａｎａｌｏｇｉｘ ＢＳＲポンプシステムを備えたプレパックシリカゲルカラム（Ａｎａｌｏｇｉｘ）又はＡｎａＬｏｇｉｘ ＩｎｔｅｌｌｉＦｌａｓｈ Ａｕｔｏｍａｔｅｄシステムを使用して実行された。マイクロ波で加熱した反応物は、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ ６０マイクロウェーブ又はＣＥＭ Ｅｘｐｌｏｒｅマイクロウェーブを使用して実行された。
【実施例】
【００９５】
実施例１
６−ブロモ−３−(４−メトキシ−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン
2015520205.tif 000022
Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）に５−ブロモ−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸エチル（０.１３ｇ、０.６４ｍｍｏｌ）、２−ブロモ−１−(４−メトキシフェニル）エタノン（１６０ｍｇ、０.６９ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（１３２ｍｇ、０.９５ｍｍｏｌ）が入った混合物を、室温で一晩撹拌した。この時点で、淡褐色の反応混合物を水でクエンチした。得られた沈殿物を濾過により収集し、真空で乾燥させた。得られた固体を塩化メチレンに溶解させ、真空で濃縮し、次いでジエチルエーテルで粉砕した。得られた固体を濾過により収集し、真空で乾燥させ、５−ブロモ−１−[２−(４−メトキシ−フェニル)−２−オキソ−エチル]−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸メチルエステル（１５５ｍｇ、６９％）を淡褐色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（クロロホルム−ｄ）δｐｐｍ８.００（ｄ,Ｊ＝８.８Ｈｚ,２Ｈ）,６.９６−７.０７（ｍ,３Ｈ）,６.８５（ｄ,Ｊ＝１.８Ｈｚ,１Ｈ）,５.７１（ｓ,２Ｈ）,３.９１（ｓ,３Ｈ）,３.７５（ｓ,３Ｈ）。
【００９６】
氷酢酸（２ｍＬ）に５−ブロモ−１−[２−(４−メトキシ−フェニル)−２−オキソ−エチル]−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸メチルエステル（０.１５ｇ、０.４３ｍｍｏｌ）及び酢酸アンモニウム（１７０ｍｇ、２.２１ｍｍｏｌ）が入った混合物を１３０℃で一晩加熱した。反応を停止させ、回収した出発物質を１,４−ジオキサン（２ｍＬ）中に懸濁させ、酢酸アンモニウム（１７０ｍｇ、２.２１ｍｍｏｌ）で処理し、次いで、シールド管中で１２０℃で５時間加熱した。この時点で、反応物を追加の酢酸アンモニウムで処理し、混合物を１２０℃で一晩続けて撹拌した。この時点で、反応物を水で処理した。得られた沈殿物を濾過により収集し、水（２ｘ）で洗浄し、真空で乾燥させ、６−ブロモ−３−(４−メトキシ−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン（７８ｍｇ、５５％）を赤色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ ７.５４−７.６３（ｍ,４Ｈ）,７.０３（ｄ,Ｊ＝９.０Ｈｚ,２Ｈ）,６.９６（ｄ,Ｊ＝１.３Ｈｚ,１Ｈ）,３.８０（ｓ,３Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１４Ｈ１２ＢｒＮ２Ｏ２[(Ｍ＋Ｈ)＋]についての計算値：３１９、実測値：３１９.０。
【００９７】
実施例２
１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボニトリル
2015520205.tif 000023
アルゴン下で、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（１.５ｍＬ）中に、６−ブロモ−３−(４−(トリフルオロメチル−フェニル)−２Ｈ−ピロロ [１,２−ａ]ピラジン−１−オン（実施例１２８）（０.１０５ｇ、０.２９ｍｍｏｌ）、シアン化亜鉛（２１.０ｍｇ、０.１８ｍｍｏｌ）及び２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’,４’,６’−トリイソプロピルビフェニル（１４.０ｍｇ、２９.４μｍｏｌ）の混合物を懸濁させた。次いで、反応物をトリス(ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（１３.５ｍｇ、１４.７μｍｏｌ）で処理した。反応混合物中で、アルゴンを５分間泡立てた。次いで、混合物を密封したバイアル中で１００℃で２４時間加熱した。この時点で、反応混合物をマイクロ波バイアルへ移した（固形の残留物が残った）。次いで、反応物をシアン化亜鉛（２１.０ｍｇ、０.１８ｍｍｏｌ）、２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’,４’,６’−トリイソプロピルビフェニル（１４.０ｍｇ、２９.４μｍｏｌ）及びトリス(ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（１３.５ｍｇ、１４.７μｍｏｌ）で処理した。反応混合物を撹拌し、マイクロ波で１３０℃で１時間加熱した。この時点で、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通じて混合物を濾過した。濾液を水（５ｍＬ）で希釈した。得られた沈殿物を濾過により収集し、真空で乾燥させた。フラッシュクロマトグラフィー（１２ｇシリカカラム、３−４０％ 酢酸エチル／ヘキサン）により、１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボニトリル（６３ｍｇ、６９％）を黄色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（メタノール−ｄ４）δｐｐｍ８.０２（ｄ,Ｊ＝１.５Ｈｚ,９Ｈ）,７.８０−７.９０（ｍ,４Ｈ）,７.７４（ｓ,１Ｈ）,７.４１（ｄ,Ｊ＝０.８Ｈｚ,１Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１５Ｈ７Ｆ３Ｎ３Ｏ[(Ｍ−Ｈ)−]についての計算値：３０２、実測値：３０２.０。
【００９８】
実施例３
Ｎ−ヒドロキシ−１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボキサミジン
2015520205.tif 000024
１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボニトリル（実施例２）、（０.０５ｇ、０.１６ｍｍｏｌ）、ヒドロキシルアミン塩酸塩（１５ｍｇ、０.２２ｍｍｏｌ）及びＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８６.４μＬ、０.４９ｍｍｏｌ）の混合物を、塩化メチレン（０.５ｍＬ）、メタノール（０.５ｍＬ）及びＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（０.２ｍＬ）中で４５℃で２日間加熱した。この時点で、得られた固体を濾過により収集し、Ｎ−ヒドロキシ−１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボキサミジン（４０ｍｇ、７０％）をオフホワイト色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（メタノール−ｄ４）δｐｐｍ７.８３（ｑ,Ｊ＝８.４Ｈｚ,４Ｈ）,７.７３（ｓ,２Ｈ）,７.３７（ｓ,１Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１５Ｈ１２Ｆ３Ｎ４Ｏ２[(Ｍ＋Ｈ)＋]についての計算値：３３７、実測値：３３７.０。
【００９９】
実施例４
１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボン酸アミド
2015520205.tif 000025
テトラヒドロフラン（１ｍＬ）中に懸濁した１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボニトリル（実施例２）、（０.０３ｇ、９８.９μｍｏｌ）の混合物を、水（５００μＬ）及び３０ｗｔ％の過酸化水素水（４０.４μＬ、０.３９ｍｍｏｌ）中の水酸化リチウム溶液（７.１１ｍｇ、０.２９ｍｍｏｌ）で処理した。反応物を室温で一晩撹拌した。この時点で、反応物を真空で濃縮した。得られた残留物を水で粉砕した。得られた固体を濾過により収集し、次いで、真空で乾燥させ、１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボン酸アミド（２０ｍｇ、６１％）を淡黄色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（メタノール−ｄ４）δｐｐｍ７.９４（ｄ,Ｊ＝１.５Ｈｚ,１Ｈ）,７.８５−７.９０（ｍ,２Ｈ）,７.８０−７.８４（ｍ,２Ｈ）,７.７７（ｓ,１Ｈ）,７.５２（ｄ,Ｊ＝０.８Ｈｚ,１Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１５Ｈ１１Ｆ３Ｎ３Ｏ２[(Ｍ＋Ｈ)＋]についての計算値：３２２、実測値：３２２.０。
【０１００】
実施例５
１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボキサミジン
2015520205.tif 000026
メタノール（１.５ｍＬ）及び氷酢酸（０.１５ｍＬ）中に懸濁したＮ−ヒドロキシ−１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボキサミジン（実施例３）（０.０３ｇ、８９.２μｍｏｌ）の混合物を、１０％のパラジウム炭素（５ｍｇ）で処理した。反応物を水素下（１気圧）で室温で、５０℃で２時間撹拌した。反応物をギ酸アンモニウム（１６.９ｍｇ、０.２７ｍｍｏｌ）で処理し、次いで、還流で５時間加熱した。反応混合物を水（〜０.２ｍＬ）にラネーニッケルが入ったスラリーで処理した。得られた混合物を水素下（１気圧）で室温で一晩撹拌した。この時点で、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通じて反応物を濾過した。濾液を真空で濃縮し、淡黄色の半固体を得た。固体をジエチルエーテルで粉砕し、濾過により収集し、次いで、真空で乾燥させ、淡緑色の固体を得た。この固体を重炭酸ナトリウム飽和水溶液でさらに粉砕し、濾過により収集し、真空で乾燥させ、１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボキサミジン（１３ｍｇ、４４％）を淡褐色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（メタノール−ｄ４）δｐｐｍ８.１１（ｓ,１Ｈ）,７.９２（ｄ,Ｊ＝８.８Ｈｚ,２Ｈ）,７.７８−７.８４（ｍ,３Ｈ）,７.５０−７.５６（ｍ,１Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１５Ｈ１１Ｆ３Ｎ４Ｏ[(Ｍ＋Ｈ)＋]についての計算値：３２１、実測値：３２１.０。
【０１０１】
実施例６
６−(４,５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル)−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン
2015520205.tif 000027
密閉したバイアル中の１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボニトリル（実施例２）（０.０３ｇ、９８.９μｍｏｌ）、五硫化リン（８ｍｇ、３６.０μｍｏｌ）及びエタン−１,２−ジアミン（０.５ｍＬ、７.４８ｍｍｏｌ）の混合物を、１２０℃で２時間加熱した。この時点で、緑色／黄色の反応混合物を室温まで冷却させるようにし、次いで、氷水に注いだ。得られた固体を濾過により収集し、水で洗浄し、真空で乾燥させ、６−(４,５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル)−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン（２８ｍｇ、８１％）を淡黄色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（メタノール−ｄ４）δｐｐｍ７.８６−７.９１（ｍ,３Ｈ）,７.７７−７.８４（ｍ,３Ｈ）,７.４４（ｄ,Ｊ＝０.８Ｈｚ,１Ｈ）,３.８１（ｓ,４Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１７Ｈ１４Ｆ３Ｎ４Ｏ[(Ｍ＋Ｈ)＋]についての計算値：３４７、実測値：３４７.０。
【０１０２】
実施例７
６−メチル−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン
2015520205.tif 000028
テトラヒドロフラン（１.５ｍＬ）に６−ブロモ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン（実施例１２８）（０.１ｇ、０.２８ｍｍｏｌ）、１,１’−ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセンジクロロパラジウム（II）ジクロロメタン複合体（６１.５ｍｇ、８４.０μｍｏｌ）及びＮ,Ｎ−ジメチルエタノールアミン（１４.１μＬ、１４０μｍｏｌ）が入った混合物を、アルゴン下で、１.２Ｍジメチル亜鉛が入ったトルエン（２８０μＬ、０.３３ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を密封したバイアル中で５０℃で一晩撹拌した。この時点で、反応物を追加のジメチル亜鉛（０.１４ｍＬ）で処理した。反応混合物を５０℃で週末にかけて撹拌した。この時点で反応混合物を室温まで冷却し、塩化アンモニウム飽和水溶液でクエンチし、次いで、酢酸エチルで抽出した。メタノール（０.５ｍＬ）を添加し、混合物を濾過し、層を分離させた。有機層をシリカゲルに吸収させた。フラッシュクロマトグラフィー（１２ｇシリカカラム、０−４０％酢酸エチル／ヘキサン）の後に塩化メチレンで粉砕し、６−メチル−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン（１４ｍｇ、１７％）を白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（メタノール−ｄ４）δｐｐｍ７.７６−７.８６（ｍ,４Ｈ）,７.６９（ｓ,１Ｈ）,７.２８（ｓ,１Ｈ）,６.９５（ｓ,１Ｈ）,２.２８（ｓ,３Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１５Ｈ１２Ｆ３Ｎ２Ｏ[(Ｍ＋Ｈ)＋]についての計算値：２９３、実測値：２９３.１。
【０１０３】
実施例８
６−ヒドロキシメチル−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン
2015520205.tif 000029
−７５℃に冷却した塩化メチレン（１ｍＬ）に１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルボニトリル（実施例２）（５５ｍｇ、０.１８ｍｍｏｌ）が入った混合物を、１Ｍ水素化ジイソブチルアルミニウムが入った塩化メチレン（２７５μＬ、０.２７ｍｍｏｌ）で滴下処理した。反応物を−７５℃で１.５時間撹拌した。この時点で、反応物を追加の１Ｍ水素化ジイソブチルアルミニウムが入った塩化メチレン（０.１ｍＬ、０.１ｍｍｏｌ）で処理し、−７５℃で更に１時間撹拌するようにした。この時点で、反応物をロッシェル塩溶液で処理し、混合物を室温まで温めるようにし、一晩撹拌した。この時点で、得られた懸濁液をシリカゲルに吸収させた。フラッシュクロマトグラフィー（４ｇシリカカラム、０−５０％ 酢酸エチル／ヘキサン）により、１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルバルデヒド（２２ｍｇ、４０％）を淡黄色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（アセトン−ｄ６）δｐｐｍ１０.０２（ｓ,１Ｈ）,８.１１（ｄ,Ｊ＝１.５Ｈｚ,１Ｈ）,８.０３（ｄ,Ｊ＝８.０Ｈｚ,２Ｈ）,７.８９（ｄ,Ｊ＝８.５Ｈｚ,２Ｈ）,７.８５（ｓ,１Ｈ）,７.４２（ｓ,１Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１５Ｈ１０Ｆ３Ｎ２Ｏ２[(Ｍ＋Ｈ)＋]についての計算値：３０７、実測値：３０６.８。
【０１０４】
０℃に冷却したエタノール（０.２５ｍＬ）及びテトラヒドロフラン（０.２５ｍＬ）に１−オキソ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−１,２−ジヒドロ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−６−カルバルデヒド（０.０２ｇ、６５.３μｍｏｌ）が入った混合物を、水素化ホウ素ナトリウム（３ｍｇ、７９.３μｍｏｌ）で処理した。反応物を０℃で１時間撹拌し、次いで、冷蔵庫で一晩保管した。この時点で、反応物を真空で濃縮した。残った固体を水で粉砕し、濾過により収集し、水で洗浄し、真空で乾燥させ、６−ヒドロキシメチル−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン（１０ｍｇ、５０％）をオフホワイト色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ７.８７−７.９６（ｍ,３Ｈ）,７.７９−７.８７（ｍ,２Ｈ）,７.４０（ｓ,１Ｈ）,６.８７（ｓ,１Ｈ）,５.０３（ｔ,Ｊ＝５.４Ｈｚ,１Ｈ）,４.５０（ｄ,Ｊ＝５.０Ｈｚ,２Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１５Ｈ１２Ｆ３Ｎ２Ｏ２[(Ｍ＋Ｈ)＋]についての計算値：３０９、実測値：３０９.０。
【０１０５】
実施例９
３−[４−(２−フルオロ−フェニル)−ピペラジン−１−イル]−６−メチル−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン
2015520205.tif 000030
窒素下の０℃の無水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）に５−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸エチル（１ｇ、６.５３ｍｍｏｌ）が入った溶液を、鉱油（３９２ｍｇ、９.７９ｍｍｏｌ）中６０％分散の水素化ナトリウムで処理した。沸騰が終わった後、反応物をＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に２−ブロモアセトニトリル（１.１７ｇ、９.７９ｍｍｏｌ）が入った溶液で処理した。得られた混合物を室温まで温めるようにし、室温で３０分間撹拌した。この時点で、反応物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈し、水（２ｘ１００ｍＬ）及び飽和塩化ナトリウム水溶液（２ｘ１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（８０ｇシリカゲルカラム、０−２０％酢酸エチル／ヘキサン）により、１−(シアノメチル)−５−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸エチル（０.５ｇ、３９.８％）を得た。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１０Ｈ１３Ｎ２Ｏ２[(Ｍ＋Ｈ)＋]についての計算値：１９３、実測値：１９３.１。
【０１０６】
０℃に冷却した１−(シアノメチル)−５−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸エチル（８４８ｍｇ、４.４１ｍｍｏｌ）を充填した高圧反応ベッセルを、塩酸が入ったジエチルエーテル（３０ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）及び無水エタノール（４０６ｍｇ、８.８２ｍｍｏｌ）の２Ｍ溶液で処理した。混合物を０℃で１０分間撹拌し、次いで、室温まで温め、週末にかけて撹拌した。この時点で、混合物をヘキサンで希釈した。得られた沈殿物を濾過により収集し、１−(２−エトキシ−２−イミノエチル)−５−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸エチル塩酸塩（１.１６ｇ、９５.７％）を白色の固体として得た。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ１９Ｎ２Ｏ３[(Ｍ＋Ｈ)＋]についての計算値：２３９、実測値：２３９.０。
【０１０７】
エタノール（５ｍＬ）に１−(２−エトキシ−２−イミノエチル)−５−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸エチル塩酸塩（９５０ｍｇ、３.４６ｍｍｏｌ）及び１−(２−フルオロフェニル)ピペラジン（１.８７ｇ、１０.４ｍｍｏｌ）が入った混合物を５５℃で一晩加熱した。この時点で、反応物を真空で濃縮した。逆相カラムクロマトグフラフィー（０−１００％アセトニトリル／水）により、１−(２−(４−(２−フルオロフェニル)ピペラジン−１−イル)−２−イミノエチル)−５−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸エチル（１.１ｇ、８５.４％）を白色の固体として得た。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ２０Ｈ２６Ｎ４Ｏ２[(Ｍ＋Ｈ)＋]についての計算値：３７３、実測値：３７３.０。
【０１０８】
テトラヒドロフラン（４ｍＬ）に１−(２−(４−(２−フルオロフェニル)ピペラジン−１−イル)−２−イミノエチル)−５−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸エチル（１５０ｍｇ、０.４ｍｍｏｌ）及びＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１.４１ｍＬ、８ｍｍｏｌ）が入った混合物を、マイクロ波反応器において１５０℃で３時間加熱した。この時点で、この溶液を室温まで冷却した。得られた沈殿物を濾過により収集し、最小限の酢酸エチルで洗浄し、空気乾燥させ、３−[４−(２−フルオロ−フェニル)−ピペラジン−１−イル]−６−メチル−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン（１１５ｍｇ、８７.５％）を白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ１０.５５（ｓ,１Ｈ）,７.２１−７.０６（ｍ,３Ｈ）,７.０５−６.９６（ｍ,１Ｈ）,６.７３（ｄ,１Ｈ）,６.５３（ｓ,１Ｈ）,６.２６（ｄ,１Ｈ）,３.１５（ｓ,８Ｈ）,２.２６（ｓ,３Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１８Ｈ２０ＦＮ４Ｏ[(Ｍ＋Ｈ)＋]についての計算値：３２７、実測値：３２６.９。
【０１０９】
実施例１０
６−ブロモ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン
2015520205.tif 000031
Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）に２−ブロモ−１−(４−(トリフルオロメチル)フェニル)エタノン（１６０ｍｇ、０.５９ｍｍｏｌ）、２−ブロモ−１−(４−(トリフルオロメチル)フェニル)エタノン（１６０ｍｇ、０.５９ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（１００ｍｇ、０.７２ｍｍｏｌ）が入った溶液を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水でクエンチし、ジエチルエーテルで抽出した。有機層を混ぜ合わせ、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮した。残った褐色油をフラッシュクロマトグラフィー（１２ｇカラム、０−１５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、５−ブロモ−１−[２−オキソ−２−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−エチル]−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸メチルエステル（１２５ｍｇ、６４％）を淡黄色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（クロロホルム−ｄ）δｐｐｍ８.１３（ｄ,Ｊ＝８.０Ｈｚ,２Ｈ）,７.８２（ｄ,Ｊ＝８.３Ｈｚ,２Ｈ）,７.０５（ｄ,Ｊ＝１.８Ｈｚ,１Ｈ）,６.８７（ｄ,Ｊ＝１.８Ｈｚ,１Ｈ）,５.７３（ｓ,２Ｈ）,３.７５（ｓ,３Ｈ）。
【０１１０】
氷酢酸（３ｍＬ）に５−ブロモ−１−[２−オキソ−２−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−エチル]−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸メチルエステル（０.０９ｇ、０.２３ｍｍｏｌ）及び酢酸アンモニウム（９０ｍｇ、１.１７ｍｍｏｌ）が入った混合物を１３０℃で一晩加熱した。この時点で、反応物を水で処理した。得られた沈殿物を濾過により収集し、水で洗浄し、真空で乾燥させ、６−ブロモ−３−(４−トリフルオロメチル−フェニル)−２Ｈ−ピロロ[１,２−ａ]ピラジン−１−オン（８０ｍｇ、９７％）を淡褐色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（クロロホルム−ｄ）δｐｐｍ７.７５−７.８３（ｍ,７Ｈ）,７.６８−７.７４（ｍ,２Ｈ）,７.２７（ｄ,Ｊ＝１.５Ｈｚ,１Ｈ）,７.２３（ｓ,１Ｈ）,７.２０（ｓ, １Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１４Ｈ７ＢｒＦ３Ｎ２Ｏ[(Ｍ−Ｈ)−]についての計算値：３５６、実測値：３５４.９。
【０１１１】
実施例１１
μＨＴＳ−ＴＮＫＳ−ＩＷＲ２  ＴＲ−ＦＲＥＴ結合アッセイ
（ＢＤ１５３６−ウェルプレート中１０μＬ／ウェル、シングルポイント）
【０１１２】
試薬及びストック溶液
タンキラーゼ１（ＴＮＫＳ１）：２０ｍＭのトリスｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール及び０.５ｍＭのＴＣＥＰ中、１８４.３μＭ＝５.２ｍｇ／ｍＬ Ｈｉｓ６−ＴＮＫＳ１、ＭＷ＝２８.２ＫＤａ（コンストラクト：１０８８−１３２７、Ｉ２６６Ｍ）
【０１１３】
別法として、Ｈｉｓ６−ＴＮＫＳ１の代わりにＨｉｓ６−タンキラーゼ２（コンストラクト：９３４−１１６６）（Ｈｉｓ６−ＴＮＫＳ２）又はＨｉｓ６−ＰＡＲＰ１（全長）が使用可能。
【０１１４】
ビオチン−ＩＷＲ２：ＤＭＳＯ中１０ｍＭのビオチン−ＩＷＲ２ストック、−２０℃で保存
【０１１５】
ポジティブコントロール：ＤＭＳＯ中１０ｍＭのＸＡＶ９３９、−２０℃で保存
【０１１６】
Ｅｕ−ストレプトアビジン：３８.１μＭ（２.１ｍｇ／ｍＬ）Ｅｕ−ＳＡ（Ｂｉｏ＃Ｅｕ−２２１２、ロット＃Ｎ１８００１−ＢＤＨＯ２）
【０１１７】
ＡＰＣ−抗ＨｉｓＡｂ：８.５０μＭのＳＬ−ＡＰＣ、８.２６μＭの抗６Ｈｉｓ抗体−ＳｕｒｅＬｉｇｈｔ ＡＰＣ（Ｃｏｌｕｍｉａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ＃Ｄ３−１７１１、ロット＃Ｎ０１０１０−ＡＡＨ０４）
【０１１８】
アッセイプレート：ＢＤ１５３６−ウェル、透明／黒プレート（カタログ＃３５３２５５）
【０１１９】
ＮＰ−４０：１０％のＮＰ−４０溶液（ＰＩＥＲＣＥ、カタログ＃２８３２４、ロット＃９７１０１６７１）
【０１２０】
アッセイバッファーの調製
ＴＮＫＳ希釈用アッセイバッファー１ａ（ＡＢ１ａ）：５０ｍＭのトリス、ｐＨ７.４、１００ｍＭの塩化ナトリウム溶液、１ｍＭの塩化マグネシウム溶液、１ｍＭのＤＬ−ジチオスレイトール溶液、０.２ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン溶液、０.０２５％のＮＰ−４０。
【０１２１】
ビオチン−ＩＷＲ２希釈用アッセイバッファー１ｂ（ＡＢ１ｂ）：５０ｍＭのトリス、ｐＨ７.４、１００ｍＭの塩化ナトリウム溶液、１ｍＭの塩化マグネシウム溶液、１ｍＭのＤＬ−ジチオスレイトール溶液、０.２ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン溶液、０.０５％のＮＰ−４０。
【０１２２】
化合物希釈用のアッセイバッファー１ｃ（ＡＢ１ｃ）：５０ｍＭのトリス、ｐＨ７.４、１００ｍＭの塩化ナトリウム溶液、１ｍＭの塩化マグネシウム溶液、１ｍＭのＤＬ−ジチオスレイトール溶液、０.２ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン溶液。
【０１２３】
Ｅｕ／ＡＰＣ用のアッセイバッファー２（ＡＢ２）：５０ｍＭのトリス、ｐＨ７.４、１００ｍＭの塩化ナトリウム溶液、１ｍＭの塩化マグネシウム溶液、０.２ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン溶液。
【０１２４】
ＴＯＴＡＬ及びｃｐｄウェル用のビオチン化ＩＷＲ２ストック溶液（３.３３ｘストック）を調製：５％のＤＭＳＯ／ＡＢ１ｂバッファー中の２００ｎＭのビオチン−ＩＷＲ２。
【０１２５】
ＢＬＡＮＫウェルストック溶液を調製：５％のＤＭＳＯ／ＡＢ１ｂバッファー。
【０１２６】
ＰＯＳＩＴＩＶＥ  ＣＯＮＴＲＯＬウェルストック溶液（３.３３ｘストック）を調製：２００ｎＭのビオチン−ＩＷＲ２／５％のＤＭＳＯ／ＡＢ１ｂバッファー中の２００ｎＭのＸＡＶ９３９。
【０１２７】
ＴＮＫＳ１ストック溶液（５ｘストック）を調製：ＡＢ１ａバッファー中の３００ｎＭのＴＮＫＳ
【０１２８】
（別法としては、ＴＮＫＳ２又はＰＡＲＰ１ストック溶液を使用。）
【０１２９】
Ｅｕ／ＡＰＣストック溶液（５ｘストック）を調製：ＡＢ２バッファー中の３.５ｎＭのＥｕ−ＳＡ／５０ｎＭのＡＰＣ−Ｈｉｓ６Ａｂ。
【０１３０】
アッセイ手順
化合物の調製：
化合物プレートにおいて、８.８％のＤＭＳＯ／ＡＢ１ｃバッファー又は２μＬのＤＭＳＯコントロールウェル（ＢＬＡＮＫ、ＴＯＴＡＬ及びＰＯＳＩＴＩＶＥウェル）で７４μＭの化合物の濃度になるように、各化合物中に２５μＬ／ウェルの１.５％のＤＭＳＯ／ＡＢ１ｃバッファーを添加する。
【０１３１】
以下のように、空のアッセイプレート（ＢＤ１５３６−ウェルプレート）へ３μＬ／ウェルの上記溶液（溶液１、２、３）を移す。
【０１３２】
2015520205.tif 000032
【０１３３】
３μＬ／ウェルの上記希釈化合物溶液又は化合物希釈バッファーを上記アッセイプレートへ移す。
【０１３４】
上記アッセイプレート中の全てのウェルに２μＬ／ウェルの３００ｎＭのＴＮＫＳストック溶液（４）を添加する。
【０１３５】
アッセイプレートを２１００ｒｐｍで２分間遠心分離する。
【０１３６】
アッセイプレートを２６℃で３０分間インキュベートする。
【０１３７】
上記アッセイプレートの全てのウェルに２μＬ／ウェルの３.５ｎＭＥｕ／５０ｎＭのＡＰＣ溶液（５）を添加する。
【０１３８】
アッセイプレートを２１００ｒｐｍで２分間遠心分離する。
【０１３９】
アッセイプレートを２６℃で６０分間インキュベートする。
【０１４０】
時間分解蛍光で３３０ｎＭの励起波長並びに６１５及び６６５ｎＭの発光波長で直ぐにアッセイプレートを読む。
【０１４１】
最終アッセイ条件
2015520205.tif 000033
【０１４２】
アッセイのための代表的な化合物データを以下の表１に列挙する。
2015520205.tif 000034
【０１４３】
実施例１２
複数の経路を介して投与される対象化合物の薬学的組成物は、本実施例に記載するように調製することができる。
【０１４４】
2015520205.tif 000035
【０１４５】
成分を混合し、それぞれを約１００ｍｇ含むカプセルに分注する。１カプセルは１日の総服用量と見積もられるであろう。
【０１４６】
2015520205.tif 000036
【０１４７】
成分を、メタノール等の溶媒を使用して結合し、粒状にする。次いで、製剤を乾燥させ、適切な錠剤機を用いて錠剤へと形成する（２０ｍｇの活性化合物を含む）。
【０１４８】
2015520205.tif 000037
【０１４９】
成分を混合して、経口投与用の懸濁液を形成させる。
【０１５０】
2015520205.tif 000038
【０１５１】
活性成分を注射用の水の一部に溶解する。次いで、十分な量の塩化ナトリウムを撹拌しながら添加し、等張液を作製する。残りの注射用の水を加えて溶液を作製し、０.２ミクロンのメンブランフィルターを通して濾過し、無菌状態下で包装する。
【０１５２】
2015520205.tif 000039
【０１５３】
成分を共に融解させ、蒸気浴上で混合し、全量２.５ｇを収容するように型に注ぐ。
【０１５４】
2015520205.tif 000040
【０１５５】
水を除く全ての成分を撹拌しながら、混合し、約６０℃まで加熱する。次いで、約６０℃の十分な量の水を力強く撹拌しながら添加し、成分を乳化させ、次いで水を適量、約１００ｇ添加する。
【０１５６】
前述の記載、又は以下の特許請求の範囲において開示され、特定の形態で、又は開示された機能を実行する手段、又は適切であれば、開示された結果を達成する方法若しくはプロセスに関して表わされた特徴は、別個に、又は、このような特徴の任意の組み合わせで、その多様な形態において本発明を実現するために利用され得る。
【０１５７】
前述の発明は、明瞭さと理解を目的として、例示及び実施例によっていくらか詳細に記載した。添付の特許請求の範囲内で変更及び修正が実施され得ることが当業者には明らかであろう。従って、上記の説明は例示的なものであって制限的なものではないことを意図していることが理解される。従って、本発明の範囲は、上記の説明を参照して決定されるべきではなく、以下に添付の特許請求の範囲並びにそのような特許請求の範囲が付与される等価物の全範囲を参照して決定されるべきである。
【０１５８】
ここで言及される特許、公開出願及び科学文献は、当業者の知識を確立し、あたかも各々が具体的かつ個別に参照により援用されることが示されるのと同程度に、本明細書にその全体が参照により援用される。ここで引用された任意の参考文献と本明細書の具体的な説明との間のいかなる矛盾も、後者を支持して決定されるものとする。同様に、ある用語又は語句の当技術分野で理解される定義と本明細書において具体的に説明されるその用語又は語句の定義との間のいかなる矛盾も、後者を支持して決定されるものとする。
【国際調査報告】
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