(57)【要約】  遺伝子改変されて、ＮＡＤＰＨ存在下におけるキシロースからキシリトールへの変換のためのアルドース還元酵素活性が９０％を超えて低下するようにアルドース還元酵素遺伝子が妨害され、かつキシロース利用代謝経路を発現するように改変された、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、キシロース含有培地中での適応なしに、唯一の糖としてキシロースを含有する培地上で増殖する（ｇｒｏ  ｏｎ）能力を有することが分かった。
2015506169.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）宿主細胞を提供するステップと；
ｂ）ＮＡＤＰＨの存在下で、キシロースをキシリトールに変換する能力を有するＥＣ  １．１．１．２１のアルドース還元酵素酵素をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子中で、前記細胞中に遺伝子修飾を施すステップと；
ｃ）前記細胞にキシロース利用代謝経路を導入するステップと
を含んでなるキシロース資化能力があるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を作成する方法であって、
ステップ（ｂ）および（ｃ）の順序は規定されず、前記キシロース資化能力があるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、ステップ（ｂ）の遺伝子修飾を欠くザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞と比較して、アルドース還元酵素活性に９０％を超える低下がある、方法。
【請求項２】
唯一の糖としてキシロースを含有する培地を使用して、前記キシロース資化能力があるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を選択するステップをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）宿主細胞が野性型細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）宿主細胞が、あらかじめキシロースに曝露されていないザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）および（ｃ）が同時に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アルドース還元酵素をコードする内在性遺伝子が、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アルドース還元酵素をコードする内因性遺伝子が、配列番号１に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の同一性を有するコード領域配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）の遺伝子修飾が、変異、挿入、欠失、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記キシロース利用代謝経路が、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼ、またはトランスアルドラーゼ酵素活性をそれぞれ有するポリペプチドをコードする、一連のポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
キシロースイソメラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、グループＩキシロースイソメラーゼであり、ＥＣ  ５．３．１．５で同定される酵素クラスに含まれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記キシロースイソメラーゼポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）から単離される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記キシロースイソメラーゼポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、変異グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターと作動可能に連結して、前記変異プロモーターが、天然プロモーターよりも高い活性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記キシロース資化能力があるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が、グルコースフルクトース酸化還元酵素活性を低下させる少なくとも１つの遺伝子修飾をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記キシロース資化能力があるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が、内在性ｈｉｍＡ遺伝子の発現を低下させる遺伝子修飾をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記キシロース資化能力があるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ活性、Ｌ−リブロキナーゼ活性、またはＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ活性をそれぞれ有する、アラビノース利用のためのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでなり、アラビノース−プロトン共輸送体であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを任意選択的に含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記キシロース資化能力があるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が、リボース−５−リン酸イソメラーゼ活性を増大させる遺伝子修飾をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記キシロース資化能力があるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞をキシロース含有培地中で適応させ、その中でキシロース利用が改善されるステップをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ａ）細胞が、唯一の糖としてキシロースを含有する培地上における即事増殖のために、キシロース適応ステップを必要とせず；
ｂ）前記細胞が、ＮＡＤＰＨの存在下で、９０％を超えて低下している、キシロースからキシリトールへの変換のためのアルドース還元酵素活性を有し；
ｃ）前記細胞が、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼ、またはトランスアルドラーゼ酵素活性をそれぞれ有する、ポリペプチドをコードする一連のポリヌクレオチドを含んでなるキシロース利用代謝経路を含んでなる
特性を有する、キシロース資化能力があるエタノール産生ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞。
【請求項１９】
エタノールが生産される条件下で、請求項１８に記載のキシロース資化能力があるエタノール産生ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を培養するステップを含んでなる、エタノールを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容全体を参照によって援用する、２０１１年１２月２０日に出願された、米国仮特許出願第６１／５７７８７９号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、微生物学および遺伝子工学分野に関する。より具体的には、アルド／ケト還元酵素をコードするとアノテートされる、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ゲノム中の遺伝子の不活性化が、キシロース利用経路を発現するように改変されたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）による、キシロース適応段階なしのキシロース上での即事増殖を可能にすることが分かった。
【背景技術】
【０００３】
微生物によるエタノール生産は、化石燃料の代替エネルギー源を提供し、したがって最近の重要な研究領域である。キシロースは加水分解リグノセルロース系バイオマス中の主要な五炭糖であることから、エタノール、ならびにその他の有用な生成物を産生する微生物が、炭素源としてキシロースを利用できることが望ましい。バイオマスは、豊富に入手できる低コストの炭素基質を提供し得る。１）キシロースのキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ；２）キシルロースをリン酸化してキシルロース−５−リン酸を形成するキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；および４）トランスアルドラーゼをコードする遺伝子の導入によって、キシロースを天然で利用しない、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）およびその他の細菌エタノロジェンが、キシロース利用のために遺伝子改変されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、非特許文献１、非特許文献２）。典型的に、使用されたコード領域は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子からのものであった。
【０００４】
しかしこのキシロース利用経路の発現があっても、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の改変株は、通常は、キシロースが唯一の炭素源である場合、その上で増殖できる前に、キシロース含有培地中における適応期間を必要とする。特許文献５および特許文献６に記載されるように、キシロース利用経路の発現について改変された株が、キシロース含有培地上での連続継代培養によって適応され、キシロース利用が改善された株がもたらされている。特許文献７で開示されるのは、適応中に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼを発現するザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターが変異してより高い活性形態になり、これまでキシロース代謝の律速酵素であったキシロースイソメラーゼの活性レベルを増大させた、という発見である。
【０００５】
特許文献８はまた、グルコースとキシルロースの双方が利用できる場合に、キシリトールを生成できる酵素であるグルコース−フルクトース酸化還元酵素をコードする、ｇｆｏｒ遺伝子座の不活性化による、改善されたキシロース利用も開示する。したがってグルコースおよびキシロースを含有する増殖培地中では、キシロースをキシルロースに変換するキシロースイソメラーゼを発現するザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞によって、キシロースイソメラーゼを欠く細胞との比較で、約３倍多いキシリトールが生成される（特許文献８）。さらにこの増大は、ＧＦＯＲ遺伝子が不活性化された場合には起こらず、したがって生体内キシリトール生成における、この酵素の重要性が示された。
【０００６】
無細胞抽出物を使用して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）野性型株（ＣＰ４）が、Ｄ−キシロースをキシリトールに直接変換する、ＮＡＤＰＨ依存性アルドース還元酵素活性を有することが、確立されている（非特許文献１）。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の別の野性型株（ＺＭ４）もまた、ＮＡＤＰＨ依存性アルドース還元酵素活性を有することが報告された（非特許文献３）。この研究では、キシロース代謝に必要な４つの遺伝子を全て含有するプラスミドがＺＭ４に導入されて、得られた形質転換体は、適応段階なしにはキシロース上で増殖し得なかった。この手順（Ａ１）から生じた適応株は、キシロース上で増殖できたが、非常に緩慢であった。キシロース利用を改善するために、Ａ１は、キシロースを唯一の炭素源として、８０日間と３０回の連続移動を要する工程で、さらに適応された。新しい適応株（Ａ３）は、キシロース上でＡ１親よりも良く増殖した。それはまたより少ないキシリトールも生産し、より高いキシリトール耐性と、より高いキシロースイソメラーゼ活性を有した。したがってＡ３株の漸進的変化中に、少なくとも３つの異なる変異が起きた。（不完全ではあるがキシロース上で増殖できた）Ａ１株をもたらした、最初の適応期間内に出現した変異の数は判定されなかったが、著者らは、適応されたＡ１およびＡ３株の双方が、空のプラスミドを保有する野性型ＺＭ４と比較して、「辛うじて検出可能な」ＮＡＤＰＨ依存性アルドース還元酵素活性を有したと記述した。Ａ３株は、キシロースをキシリトールに変換できる、ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性を有する酵素をコードするＺＭＯ０９７６遺伝子のコード領域中に点変異を有することが、引き続いて報告された（非特許文献４）。精製変異タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での発現に基づいて、野性型酵素の５％未満の活性を有する。またキシロースよりも、ベンズアルデヒドおよびフルフラールが、ＺＭＯ０９７６遺伝子産物の好ましい基質であることも、同研究で示された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５５１４５８３号明細書
【特許文献２】米国特許第５７１２１３３号明細書
【特許文献３】米国特許第６５６６１０７号明細書
【特許文献４】国際公開第９５／２８４７６号パンフレット
【特許文献５】米国特許第７，２２３，５７５号明細書
【特許文献６】米国特許第７，７４１，１１９号明細書
【特許文献７】米国特許第７，９８９，２０６号明細書
【特許文献８】米国特許第７，７４１，１１９号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｆｅｌｄｍａｎｎら（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：３５４−３６１
【非特許文献２】Ｚｈａｎｇら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２４０−２４３；Ｙａｎａｓｅら（２００７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｒｏｂｉｏｌ．７３：２５９２−２５９９
【非特許文献３】Ａｇｒａｗａｌら  ２０１１  １０８：７７７−７８５
【非特許文献４】Ａｇｒａｗａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３３：２１２７−２１３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
キシロース利用のための遺伝子を含有し、予備適応段階なしに、キシロースを唯一の炭素源として含有する培地上で増殖できる、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびその他のエタノール産生細菌の改変株と、これらの株を使用してエタノールを生産する方法とに対する必要性が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、改変されて、適応なしに、唯一の糖としてキシロースを含有する培地上で増殖する能力を有するようになったザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞、前記細胞を作成する方法、およびエタノールを生産するために前記細胞を使用する方法を提供する。
【００１１】
したがって本発明は、
ａ）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）宿主細胞を提供するステップと；
ｂ）ＮＡＤＰＨの存在下で、キシロースをキシリトールに変換する能力を有するＥＣ  １．１．１．２１のアルドース還元酵素酵素をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子中で、前記細胞中に遺伝子修飾を施すステップと；
ｃ）前記細胞に、キシロース利用代謝経路を導入するステップと
を含んでなる、キシロース資化能力があるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を作成する方法を提供し、
ステップ（ｂ）および（ｃ）の順序は規定されず、前記キシロース資化能力があるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、ステップ（ｂ）の遺伝子修飾を欠くザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞と比較して、アルドース還元酵素活性に９０％を超える低下がある。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、以下の特性を有する、キシロース資化能力があるエタノール産生ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を提供する：
ａ）細胞は、キシロース含有培地上の即事増殖のためのキシロース適応段階を必要としない；
ｂ）細胞は、ＮＡＤＰＨの存在下におけるキシロースからキシリトールへの変換のためのアルドース還元酵素活性が、９０％を超えて低下している；
ｃ）細胞は、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼ、またはトランスアルドラーゼ酵素活性をそれぞれ有する、ポリペプチドをコードする一連のポリヌクレオチドを含んでなるキシロース利用代謝経路を含んでなる。
【００１３】
さらに発明は、エタノールが生成する条件下で、キシロース資化能力があるエタノール産生ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を培養する、エタノールを生産する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】キシロース利用およびエタノール生成の代謝経路の略図を示す。
【図２】改変されたキシロース利用経路の最初の２段階（囲み内）、キシリトール合成、キシリトール−５−リン酸生成（毒性行き止まり中間体）、およびキシリトールによるキシロースイソメラーゼ阻害の略図を示す。
【図３Ａ】ｐＺＸ２１（Ａ）のプラスミドマップを示す。
【図３Ｂ】ｐＺＸ５２（Ｂ）のプラスミドマップを示す。
【図３Ｃ】ｐＺＸ６（Ｃ）のプラスミドマップを示す。
【図４Ａ】ｍＲＭ３−Ｘ１０内で増殖させた、ＺＷ１−１０９（Ａ）の培養について、増殖、キシロース消費、およびエタノール生成のグラフを示す。
【図４Ｂ】ｍＲＭ３−Ｘ１０内で増殖させた、ＺＷ１−２１０（Ｂ）の培養について、増殖、キシロース消費、およびエタノール生成のグラフを示す。
【図４Ｃ】ｍＲＭ３−Ｘ１０内で増殖させた、対照ＺＷ１（Ｃ）の培養について、増殖、キシロース消費、およびエタノール生成のグラフを示す。
【図５】ｐＭＯＤｌｉｎｋｅｒ−Ｃｍのプラスミドマップを示す。
【図６】（Ａ）はｐＡＲ−ｃｍのプラスミドマップを示し、（Ｂ）はＺＭＯ０９７６  ＯＲＦを含むＺＷ６５８染色体部分中のプライマー結合部位の略図を示す。
【図７】ｐＡＲ−ｃｍ自殺コンストラクトとの二重交差事象に続く、ＺＭＯ０９７６  ＯＲＦを含むＺＷ１染色体領域の略図を示し、プライマー結合部位およびＰＣＲ産物が標識される。
【図８】２つのＺＭＯ０９７６ノックアウト変異株（ＡＲ１、ＡＲ２）および対照野性型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ１による、キシリトール産生のグラフを示す。
【図９】ＺＭＯ０９７６遺伝子ノックアウト（ＡＲ１；３つの単離株：−１、−２、−３）、または天然ＺＭＯ０９７６遺伝子（ＺＷ１；３つの単離株：−Ａ、−Ｂ、−Ｃ）のいずれかによって、キシロース利用経路（ｐＺＢ４上）を発現するように改変されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、唯一の糖として１００ｇ／Ｌキシロースを含有する培地中でＯＤ６００によってモニターした、増殖のグラフを示す。黒塗り記号は、全て重なっている。
【図１０】４５ｇ／Ｌキシロースおよび５ｇ／Ｌグルコース含有培地、次に唯一の糖として１００ｇ／Ｌキシロースを含有する培地中での適応後に、キシロース利用経路（ｐＺＢ４上）を発現するように改変された８つのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）単離株を、唯一の糖として１００ｇ／Ｌのキシロースを含有する培地中でＯＤ６００によってモニターした、増殖のグラフを示す。単離された３タイプの適応変異株（グループ１〜３）は、楕円で示される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、本明細書の一部を構成する、以下の詳細な説明、および添付の配列説明からより完全に理解され得る。
【００１６】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含有する特許出願の要件−配列の規則」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（２００９）、ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、ならびに実施細則の第２０８節および付録Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に示される規則に従う。
【００１７】
配列番号１は、ＺＭＯ０９７６コード領域のヌクレオチド配列である。
【００１８】
配列番号２は、ＺＭＯ０９７６コード領域によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列である。
【００１９】
配列番号３は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株からのＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号４は、８０１ＧＡＰプロモーターまたはＳｕｐｅｒ  ＧＡＰプロモーターまたはＰｇａｐＳと称される、ＺＷ６５８株からの改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号５は、８ｂ株からの改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号６は、ＰｇａｐのｐＺＢ４変異体中の位置１１６（ＺＷ６５８）および位置２１７（８ｂ）の双方に変異がある、改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号７は、ＰｇａｐのＣＰ４変異体中のＺＷ６５８からの位置１１６変異を有する、改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号８は、ＰｇａｐのＣＰ４変異体中の８ｂからの位置２１７変異を有する、改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号９は、ＰｇａｐのＣＰ４変異体中の位置１１６（ＺＷ６５８）および位置２１７（８ｂ）の双方に変異がある、改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号１０は、ＰｇａｐのＺＭ４変異体中のＺＷ６５８からの位置１１６変異を有する、改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号１１は、ＰｇａｐのＺＭ４変異体中の８ｂからの位置２１７変異を有する、改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号１２は、ＰｇａｐのＺＭ４変異体中の位置１１６（ＺＷ６５８）および位置２１７（８ｂ）の双方に変異がある、改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号１３は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のためにコドン最適化された、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｎｅｓｉｓ）キシロースイソメラーゼのコーディング領域である。
【００３０】
配列番号１４は、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８株からの７８ヌクレオチド欠失がある、ＺＭＯ０９７６コード領域のヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号１５は、プラスミドｐＺＸ２１のヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号１６は、ＧＦＯ−Ｌ断片のヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号１７は、ｇｆｏｒコード配列のヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号１８は、ＧＦＯ−Ｒ断片のヌクレオチド配列である。
【００３５】
配列番号１９は、３０４ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｓｕｐｅｒ  ＧＡＰプロモーター、１，１８５ｂｐのＡ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ｘｙｌＡコード配列、および１６６ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＤ  ３’ＵＴＲを含有し、５’ＸｂａＩ部位がある、１，６６１ｂｐのキメラｘｙｌＡ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００３６】
配列番号２０は、１９１ｂｐのＰｅｎｏ、１，４５５ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＢコード配列、および３１４ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＢ  ３’ＵＴＲを含有する、１，９６０ｂｐのキメラｘｙｌＢ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号２１は、ｌｏｘ部位と境を接する、１，０１４ｂｐのａａｄＡマーカー（スペクチノマイシン耐性；Ｓｐｅｃ−Ｒ）のヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号２２は、シャトルベクターｐＺＸ５２のヌクレオチド配列である。
【００３９】
配列番号２３は、ＬＤＨ−Ｌ断片のヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号２４は、ＬＤＨ−Ｒ断片のヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列番号２５は、ｌｄｈＡコード配列のヌクレオチド配列である。
【００４２】
配列番号２６は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＧＡＰプロモーター（ＰｇａｐＴ）の３０４ｂｐのＴ変異、９５４ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔａｌコード領域、１，９９２ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｋｔコード領域、および６８ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｋｔ  ３’ＵＴＲを含有する、３，３３９ｂｐのＰｇａｐＴ−Ｔａｌ−Ｔｋｔオペロンのヌクレオチド配列である。
【００４３】
配列番号２７は、ＰｇａｐＴプロモーターのヌクレオチド配列である。
【００４４】
配列番号２８は、１９１ｂｐのＰｅｎｏ、４７１ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｒｐｉコード配列、６６３ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｒｐｅコード配列、および３５ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＡ  ３’ＵＴＲを含有する、１，４４３ｂｐのＰｅｎｏ−Ｒｐｉ−Ｒｐｅオペロンのヌクレオチド配列である。
【００４５】
配列番号２９は、ＤＣＯシャトルベクターｐＺＸ６のヌクレオチド配列である。
【００４６】
配列番号３０は、ＰＮＰ−Ｌ断片のヌクレオチド配列である。
【００４７】
配列番号３１は、ＰＮＰ−Ｒ断片のヌクレオチド配列である。
【００４８】
配列番号３２〜４１は、ＰＣＲプライマーである。
【００４９】
配列番号４２は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４株からのｐｎｐコード領域のヌクレオチド配列である。
【００５０】
配列番号４３は、開始コドンがＡＴＧに変異している、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩタンパク質からのコード領域のヌクレオチド配列である。
【００５１】
配列番号４４および４５は、プライマーである。
【００５２】
配列番号４６は、２つの野性型ｌｏｘＰ部位で挟まれるＣｍｒカセットを含有する、断片２のヌクレオチド配列である。
【００５３】
配列番号４７〜７２は、プライマーである。
【００５４】
特許請求の範囲および明細書の解釈のために、以下の定義を使用してもよい。
【００５５】
本明細書の用法では、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ））」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、またはそれらのあらゆるその他の変化形は、非排他的包含をカバーすることが意図される。例えば要素の一覧を含んでなる組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもこれらの構成要件のみに限定されず、明示的に列挙されない、またはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有のその他の要素を含んでもよい。さらに特に断りのない限り、「または（ｏｒ）」は排他的またはでなく包括的またはを指す。例えば条件ＡまたはＢは、以下のいずれかによって満たされる：Ａが真で（または存在し）Ｂが偽であり（または存在せず）、Ａが偽で（または存在せず）Ｂが真であり（または存在する）、ＡおよびＢの双方が真である（または存在する）。
【００５６】
さらに本発明の構成要件または構成要素に先立つ不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、構成要件または構成要素の事例数（すなわち発生率）に関して非制限的であることが意図される。したがって「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈すべきであり、構成要件または構成要素の単数語形は、数が単数であることを明らかに意味する場合を除いて、複数もまた含む。
【００５７】
「発明」または「本発明」という用語は、本明細書の用法では非限定的用語であり、特定の発明のいずれかの単一の実施形態を指すことは意図されず、本明細書および特許請求の範囲に記載される全ての可能な実施形態を包含する。
【００５８】
本明細書の用法では、本発明で用いられる成分または反応物質の量を修飾する「約」という用語は、例えば実際の濃縮物または調製溶液の作成で使用される、典型的な測定および液体取り扱い手順を通じて；これらの手順における不注意による誤りを通じて；組成物作成または方法実施で用いられる成分の、製造、供給元または純度の差異などを通じて、生じ得る数量の変動を指す。「約」という用語はまた、特定の最初の混合物から生じる組成物の異なる平衡条件のために、異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されるか否かを問わず、特許請求の範囲には量の同等物が含まれる。一実施形態では、「約」という用語は、報告された数値の１０％以内、好ましくは報告された数値の５％以内を意味する。
【００５９】
「遺伝子」は、コード配列に先行する（５’非コード配列）および後続の（３’非コード配列）制御配列が任意選択的に含まれてもよい、特異的タンパク質または機能的ＲＮＡ分子を発現する、核酸断片を指す。「天然遺伝子」または「野性型遺伝子」とは、それ自体の制御配列と共に天然に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界では一緒に見られない調節およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列およびコード配列、または同一起源に由来するが、天然に見られるのと異なる様式で配列される制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその自然な位置にある天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子とは、常態では宿主生物に見られないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなり得る。
【００６０】
「プロモーター」または「開始制御領域」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列は、プロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえよい。当業者は、異なる組織または細胞タイプ中で、または異なる発達段階で、または異なる環境条件に答えて、異なるプロモーターが遺伝子発現を指示してもよいことを理解する。ほとんどの場合にほとんどの細胞型中で遺伝子が発現されるようにするプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。
【００６１】
「発現」という用語は、本明細書の用法では、遺伝子に由来する、コード（ｍＲＮＡ）または機能性ＲＮＡの転写と安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもよい。「過剰発現」は、標準または非形質転換生物中の生成レベルを超える、遺伝子組換え生物中における遺伝子産物の生成を指す。
【００６２】
「形質転換」という用語は、本明細書の用法では、遺伝的に安定した遺伝形質がもたらされる、宿主生物への核酸断片の移入を指す。移入核酸は、宿主細胞中で維持されるプラスミドの形態であってもよく、またはいくつかの移入核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」生物と称される。
【００６３】
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、本明細書の用法では、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる起源に由来する一本または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、直鎖または環の、自己複製配列、ゲノム一体化配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、その中でいくつかのヌクレオチド配列は連結または組換えされて、適切な３’非翻訳配列と共に、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片とＤＮＡ配列とを細胞に導入できる、独自の構造になる。
【００６４】
「作動的に結合する」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターは、コード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動的に結合する（すなわちコード配列は、プロモーターの転写調節下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンスオリエンテーションで、制御配列に作動的に結合し得る。
【００６５】
「選択可能なマーカー」という用語は、通常はマーカー遺伝子の効果、すなわち抗生物質耐性に基づいて選択できる、抗生物質または耐薬品性遺伝子である識別因子を意味し、効果は、対象核酸の遺伝形質を追跡し、および／または対象核酸を引き継いだ細胞または生物を同定するために使用される。
【００６６】
本明細書の用法では、「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド配列の多様性を可能にする、遺伝子コードの性質を指す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドン使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」について良く知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００６７】
様々な宿主の形質転換のための、遺伝子または核酸分子のコード領域に言及する「コドン最適化」という用語は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変更することなく、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映する、遺伝子または核酸分子コード領域のコドンの変更を指す。
【００６８】
「遺伝子修飾」という用語は、それらが表現型の変化を生じるかどうかに関わりなく、宿主細胞または細菌系統の遺伝要素に対する任意の修飾、変異、塩基欠失、塩基付加、コドン改変、遺伝子過剰発現、遺伝子抑制、プロモーター修飾または置換、遺伝子付加（単一またはマルチコピーのいずれか）、アンチセンス発現または抑制、またはその他の任意の変化を非包括的に指す。
【００６９】
「組換え細菌宿主細胞」という用語は、少なくとも１つの非相同遺伝子または遺伝子コンストラクトまたは核酸断片を含んでなる、細菌細胞を指す。
【００７０】
「ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性」という用語は、ＮＡＤＰＨの存在下でキシロースをキシリトールに変換する、アルドース還元酵素活性を指す。
【００７１】
「キシロース資化能力があるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞」という用語は、キシロース上での増殖への適応なしに、唯一の糖としてキシロースを含有する培地中で増殖するザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を指す。
【００７２】
「キシロース上での増殖に適応した」という用語は、キシロース含有培地中における長期の増殖後に単離された、細胞または株を指す。適応は、キシロースおよびグルコース含有培地中における増殖期間、次にキシロースのみを含有する培地中における増殖期間を含んでもよく、各培地はキシロース含有培地である。典型的に、長期間の増殖は少なくとも約４日間である。
【００７３】
「キシロース代謝経路」または「キシロース利用代謝経路」という用語は、フルクトース−６−リン酸および／またはグリセルアルデヒド−６−リン酸を経由してキシロースを代謝する一連の酵素（遺伝子によってコードされる）を指し、１）キシロースのキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ；２）キシルロースをリン酸化してキシルロース−５−リン酸を形成するキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；および４）トランスアルドラーゼを含む。
【００７４】
「キシロースイソメラーゼ」という用語は、Ｄ−キシロースとＤ−キシルロースの相互変換を触媒する酵素を指す。キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）は、ＥＣ  ５．３．１．５に分類される酵素群に属する。
【００７５】
「リボース−５−リン酸イソメラーゼ」または「ＲＰＩ」という用語は、リブロース−５−リン酸とリボース−５−リン酸の相互変換を触媒する酵素を指す。リボース−５−リン酸イソメラーゼは、ＥＣ  ５．３．１．６に分類される酵素群に属する。
【００７６】
「リブロース−リン酸３−エピメラーゼ」または「ＲＰＥ」という用語は、Ｄ−リブロース５−リン酸とＤ−キシルロース−５−リン酸の相互変換を触媒して、ＥＣ  ５．１．３．１に分類される酵素を指す。
【００７７】
「炭素基質」または「発酵性炭素基質」という用語は、微生物が代謝できる炭素源を指す。炭素基質の一種は「発酵性糖類」であり、それは発酵プロセスにおいて、微生物によって炭素源として使用され得る、オリゴ糖類および単糖類を指す。
【００７８】
「リグノセルロース系」という用語は、リグニンとセルロースの双方を含んでなる組成物を指す。リグノセルロース系物質はまた、ヘミセルロースを含んでなってもよい。
【００７９】
「セルロース系」という用語は、セルロースと、ヘミセルロースを含む追加的な成分とを含んでなる、組成物を指す。
【００８０】
「糖化」という用語は、多糖類からの発酵性糖類生成を指す。
【００８１】
「前処理バイオマス」という用語は、熱、物理的および／または化学的前処理に曝露させて、糖化酵素に対する、バイオマス中の多糖類の可用性を増大させたバイオマスを意味する。
【００８２】
「バイオマス」は、セルロースを含んでなり、任意選択的に、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および／または単糖類をさらに含んでなる材料をはじめとする、あらゆるセルロース系またはリグノセルロース系材料を指す。バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質などの追加的な成分を含んでなってもよい。バイオマスは単一起源に由来してもよく、またはバイオマスは２種以上の原料に由来する混合物を含んでなり得る；例えばバイオマスは、トウモロコシ穂軸とトウモロコシ茎葉の混合物、または草と葉の混合物を含んでなることもあり得る。バイオマスとしては、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙業汚泥、庭ごみ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これに限定されるものではない。バイオマスの例としては、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉などの作物残渣、トウモロコシ茎葉、牧草、コムギ、麦藁、大麦藁、乾草、稲藁、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガム、穀物製粉から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木片、おがくず、灌木および低木、野菜、果実、花卉、および家畜糞尿が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８３】
「バイオマス加水分解物」は、バイオマスの糖化から得られる生成物を指す。バイオマスはまた、糖化に先だって前処理または予備加工されてもよい。
【００８４】
「異種」という用語は、天然では対象位置に見られないことを意味する。例えば異種遺伝子は、天然では宿主生物中に見られないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。例えばキメラ遺伝子中に存在する異種核酸分子は、天然で互いに結合しないコード領域とプロモーター部分を有する核酸分子などの、天然ではキメラ遺伝子のその他の部分に結合して見られない核酸分子である。
【００８５】
本明細書の用法では、「単離核酸分子」は、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を任意選択的に含有する、一本または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマーの形態の単離核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数の部分を含んでなってもよい。
【００８６】
核酸断片は、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で、核酸断片の一本鎖形態が、その他の核酸断片とアニールし得る場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子などの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）、特にその中の第１１章および表１１．１（その内容全体を参照によって本明細書に援用する）で例示される。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件を調節して、（遠縁の生物からの相同的な配列などの）中程度に類似した断片から、（近縁関係にある生物からの機能酵素を複製する遺伝子などの）類似性の高い断片までをスクリーニングし得る。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。好ましい一組の条件では、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを室温で１５分間に始まり、次に２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを４５℃で３０分間を繰り返し、次に０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを５０℃で３０分間を２回繰り返す一連の洗浄が使用される。より望ましいストリンジェントな条件の組は、より高い温度を使用し、洗浄は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中の２回の３０分間の洗浄温度が６０℃に増大されたことを除いて、上と同じである。別の好ましい高度にストリンジェントな条件の組は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃の２回の最後の洗浄を使用する。追加的なストリンジェントな条件の組としては、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃のハイブリダイゼーションと、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳとそれに続く０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄が挙げられる。
【００８７】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要するが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で周知の変数である核酸の長さと相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸がハイブリダイズするためのＴｍ値は、より大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに相当する）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順で低下する。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する方程式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出，９．５０−９．５１を参照されたい）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出，１１．７−１１．８を参照されたい）。一実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小長さは、少なくとも約１５ヌクレオチドであり；より好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチドであり；最も好ましくは、長さは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに当業者は、プローブ長などの要素次第で、必要に応じて温度および洗浄液塩濃度を調節してもよいことを認識する。
【００８８】
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係性を記述するために使用される。例えばＤＮＡに関しては、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。
【００８９】
「％同一性」と言う用語は、当該技術分野で公知のように、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。当該技術分野では「同一性」はまた、場合によっては、このような一連の配列間の一致によって測定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は、１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない公知の方法によって、容易に計算され得る。
【００９０】
同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良の整合を与えるようにデザインされる。同一性および類似性を判定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムで体系化されている。配列アラインメントおよび％同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎプログラムを使用して実施してもよい。
【００９１】
配列の多重アラインメントは、（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２））によって記載され、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ  ｖ８．０プログラムにある、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖと標識されたアラインメント法に相当する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法」をはじめとする、アルゴリズムのいくつかの変種を包含する、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を使用して実施される。複数のアラインメントでは、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列の％同一性の計算のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸では、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを使用した配列のアラインメント後、同プログラムの「配列距離」表を見ることで、「％同一性」を得ることが可能である。
【００９２】
さらに「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法」が利用でき、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗと標識されるアラインメント法に相当する（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇら．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３−４６８０，１９９４）によって記載され、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ  ｖ８．０プログラムにある。多重アラインメントのデフォルトパラメータ（タンパク質／核酸で表される（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０／１５、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２／６．６６、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０／３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを使用した配列のアラインメント後、同プログラムの「配列距離」表を見ることで、「％同一性」を得ることが可能である。
【００９３】
その他の種からの同一または同様の機能または活性を有するポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることを当業者は良く理解している。％同一性の有用な例としては、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が挙げられるが、これに限定されるものではなく、または５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５０％〜１００％の任意の整数百分率が、対象ポリペプチドを同定する上で有用なこともある。適切な核酸断片は、上の同一性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、およびより好ましくは少なくとも１２５個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００９４】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用なあらゆるコンピュータアルゴリズム、またはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販されることもあり、または独立して開発されることもある。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２．）ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））；３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；および５．）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本出願の文脈内では、特に断りのない限り、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、分析結果は、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。本明細書での用法では、「デフォルト値」とは、ソフトウェアを初期化した際に、初めからロードされる値またはパラメータのあらゆる組を意味する。
【００９５】
本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈＥｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，２００２に記載される。
【００９６】
本発明は、キシロース利用経路の導入に続いてすぐ、キシロース含有培地への適応期間なしに、唯一の糖としてキシロースを含有する培地中で増殖し得る、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を作り出す方法に関する。キシロースは、加水分解リグノセルロース系材料中の優勢なペントース糖類の１つであり、バイオマス加水分解物の発酵のためにキシロース利用を望ましいものにする。バイオマス加水分解物は、生体触媒による標的生成物生産のために、大量の再生可能な炭水化物資源を提供し得る。時間がかかり、複数の不確定変異が生じることもある、キシロース含有培地中の適応段階の排除は、キシロース利用生体触媒の開発を大幅に促進する。
【００９７】
改変キシロース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、グルコース、フルクトースおよび／またはスクロースを発酵基質として利用して、エタノールを自然に産生するが、キシロースは代謝しない。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）などのエタノール産生ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株が、キシロースを発酵してエタノールにするために改変されている。米国特許第５，５１４，５８３号明細書、米国特許第５，７１２，１３３号明細書、米国特許第６，５６６，１０７号明細書、国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、Ｆｅｌｄｍａｎｎら（（１９９２）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３８：３５４−３６１）、およびＺｈａｎｇら（（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２４０−２４３）に記載されるように、キシロース代謝に関与する４種の酵素の発現のために、典型的に４つの遺伝子がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入され、キシロース利用代謝経路（図１）が作り出されている。これらとしては、キシロースのキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼと、キシルロースをリン酸化してキシルロース−５−リン酸を形成するキシルロキナーゼとをコードする、遺伝子が挙げられる。ペントースリン酸経路の２つの酵素であるトランスケトラーゼとトランスアルドラーゼもさらに発現され、これらはキシルロース−５−リン酸を中間体に変換し、それはペントース代謝を解糖エントナー・ドウドロフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ）経路に連結して、キシロースのエタノールへの代謝を可能にする（図１を参照されたい）。これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、腸内細菌、およびある種の酵母や真菌などのキシロースを代謝できる多数の微生物のいずれかから得られてもよい。コード領域起源としては、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）、およびザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコード領域が、典型的に使用される。
【００９８】
コードＤＮＡ配列は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰプロモーター）、およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）エノラーゼ（ＥＮＯプロモーター）プロモーターなどの、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中で発現されるプロモーターと作動可能に連結する。参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，９８９，２０６号明細書で開示される発現が増大された変異ＧＡＰプロモーターもまた、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中での発現に有用である。コード領域は、プロモーターから個別に発現されてもよく、または２つ以上のコード領域がオペロン中で連結して、同一プロモーターから発現されてもよい。結果として生じるキメラ遺伝子は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞に導入されてプラスミド上に保たれ、または例えば、相同的組換え、部位特異的組み込み、またはランダム組み込みを使用して、ゲノムに組み込まれてもよい。キシロース利用代謝経路を発現するように改変された株の例としては、ＣＰ４（ｐＺＢ５）（米国特許第５，５１４，５８３号明細書）、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５（米国特許第６，５６６，１０７号明細書）、８ｂ（米国特許第２００３０１６２２７１号明細書；Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｉら（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５；３２１−３２５）、およびＺＷ６５８（ＡＴＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８）が挙げられる。
【００９９】
上述したようなキシロース利用代謝経路を発現するように改変された株は、典型的に、キシロースを唯一の糖として含有する培地中で、即座に増殖できない。これらの株にとって１つの代謝問題は、図２に示される副経路（囲み外）であり、それはキシロースからのエタノール生成（囲み内部分）効率を低下させるだけでなく、特にキシロースが唯一の炭素源である場合、キシロース存在下における細胞生存度に対する有害効果も有することがある。この経路中では、キシロースがキシリトールに変換され、それは次に改変キシロース利用代謝経路中の第２の酵素であるキシルロースキナーゼによって、キシリトール５−リン酸に変換される。キシリトール５−リン酸は、細菌増殖を阻害する有毒化合物であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシルロキナーゼは、キシリトールのキシリトール５−リン酸への変換を通じて、キシリトール阻害効果に直接関与することが、明らかに実証されている（Ａｋｉｎｔｅｒｉｎｗａら（２００９）Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４８−５５）。さらに、キシロースのキシリトールへの変換は、エタノールへの基質流量も低下させ、キシリトールは、キシロース利用の改変経路の最初の酵素であるキシロースイソメラーゼの阻害剤でもある。実験は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中におけるキシリトール生成について、１）グルコースフルクトース酸化還元酵素（米国特許第７，７４１，１１９号明細書）、および２）ＮＡＤＰＨ依存性アルドース還元酵素活性による少なくとも２つの異なる経路があることを確立している（Ｆｅｌｄｍａｎｎら前出；Ａｇｒａｗａｌら（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１０８：７７７−７８５）。
【０１００】
キシロース利用代謝経路の発現のために改変されたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、唯一の糖としてキシロースを含有する培地中で増殖できる前に、一般にキシロース含有培地中における適応期間を必要とする。典型的にキシロース含有培地内の長期連続移動である適応段階中には、ゲノムに複数の変異が生じ得る。キシロース利用のために改変された異なる株の適応中に出現するいくつかの特定の変異は同定されているが、唯一の炭素源としてのキシロース上で増殖する初期能力にとって、いずれが重要および／または必要であるのかは明らかでない。確かにこの研究以前に、唯一の糖としてキシロースを含有する培地中で、キシロース利用代謝経路を発現するザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株が、即事増殖ができるようにする変異は一つも確認されていなかった。
【０１０１】
キシロース培地中の即事増殖を操作する
本発明は、キシロース利用のための改変もされているザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中において、単一酵素活性の発現に影響を及ぼす遺伝子修飾を施して、適応段階なしに、唯一の糖としてキシロースを含有する培地中で即事増殖できるようにし得るという新しい知見に関する。これらの細胞は、キシロース資化能力があるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞である。遺伝子修飾は、キシロースをキシリトールに変換できるＮＡＤＰＨ依存性アルドース還元酵素をコードする、少なくとも１つの内在性遺伝子発現を妨害し、その結果、無細胞抽出物中におけるＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性に、９０％を超える低下を引き起こす。活性は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えて低下してもよい。ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性は、本明細書の一般方法に記載されるように、キシロース存在下で３４０ｎｍにおいて、ＮＡＤＰＨのＮＡＤＰへの変換をモニターすることで、無細胞抽出物中で測定される。
【０１０２】
推定上のアルド／ケト還元酵素（Ｓｅｏら（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：６３−６８によって命名された）をコードする内在性遺伝子の発現を妨害することで、その他の点では野性型であるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中のＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性を９０％を超えて低下させることは、キシロース含有培地中での増殖時に、細胞によるキシリトール生成を低下させることが、本明細書で分かった。しかしこの遺伝子操作によってさえも、細胞によるキシリトールの生成は、ほぼ３分の１に低下しても、完全には排除されなかった（図８に示される）。
【０１０３】
引き続いてこの妨害がある細胞に、キシロース利用（キシロース利用代謝経路）に必要な４種の酵素を提供すると、適応段階を必要とせずに、唯一の糖としてキシロースを含有する培地中で、即座に増殖できることが本明細書（実施例６）で示された。したがってこれらは、炭素源としてキシロースのみを含有する培地の使用のために選択され得る、キシロース資化能力があるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞である。代案としては、キシロース利用に必要な４種の酵素を既に有するが、キシロース上での増殖に適応されていないザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞では、炭素源としてキシロースのみを含有する培地の使用のために、ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性の意図的不活性化を選択し得る。
【０１０４】
野性型グルコースフルクトース酸化還元酵素（ＧＦＯＲ）活性存在下であってさえも、適応段階のない、キシロースのみを含有する培地上での即事増殖が可能になった。ＧＦＯＲはキシロースをキシルロースに変換するので、それはキシロース代謝経路の最初の酵素であるキシロースイソメラーゼを発現するように改変された、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中における、キシリトール生成に大きく寄与する。参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，７４１，１１９号明細書で開示されるように、ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素によるキシロースからキシリトールへの直接還元とは対照的に、ＧＦＯＲによるキシリトール生成は、キシルロース源もまた存在する場合、グルコース含有培地の存在下のみで起きる。
【０１０５】
本方法では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ゲノムの１つまたは複数の内在性アルドース還元酵素をコードする遺伝子の発現が、妨害される。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の完全に配列決定されたゲノム中には、アルド／ケト還元酵素をコードするとアノテートされた、複数遺伝子がある。例えば野性型ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＥ００８６９２；Ｓｅｏら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１），６３−６８（２００５））の配列決定ゲノム中には、ＺＭＯ０９７６、ＺＭＯ１３４４、ＺＭＯ１６７３、およびＺＭＯ１７７３と命名された、推定上のアルド／ケト還元酵素をコードする、少なくとも４つの遺伝子がある。ＺＭＯ１３４４、ＺＭＯ１６７３、およびＺＭＯ１７７３遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＺＭＯ０９７６がコードするタンパク質（配列番号２）に対して、それぞれ２４％、２９％、および３８％のアミノ酸配列同一性を有する。アルド／ケトース還元酵素として最近再アノテートされた、２つの追加的な遺伝子（ＺＭＯ０６２およびＺＭＯ１９８４）は、ＺＭＯ９７６がコードするタンパク質と約３２％の同一性があるタンパク質をコードする。アルド／ケト還元酵素は、その主要目的が、アルデヒドおよびケトンを一級および二級アルコールに還元することである、可溶性ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ酸化還元酵素スーパーファミリーに属する。アルデヒド還元酵素とも称されるアルドース還元酵素は、ＥＣ  １．１．１．２１に分類される。本方法および株は、本明細書でＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性と称される酵素活性である、（ＮＡＤＰに変換される）ＮＡＤＰＨの存在下で、キシロースをキシリトールに変換できるアルドース還元酵素酵素に関与する。
【０１０６】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ１株中のＺＭＯ０９７６遺伝子のみに妨害を引き起こす遺伝子修飾は、ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性を９０％を超えて低下させることが、本明細書の実施例５で示される。したがって本方法では、野性型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４株（ＡＴＣＣ＃３１８２１；ＺＷ１はＺＭ４の別の名称である）およびその誘導体は、ＺＭＯ０９７６遺伝子を妨害する遺伝子修飾によって改変され、それはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＥ００８６９２のＺＭ４ゲノム配列中で確認された。これは４種のキシロース経路酵素を野性型ＺＭ４に導入した場合に、唯一の糖としてキシロースを含有する培地上での増殖能力を提供するのに必要な唯一の遺伝子修飾であり、キシロース適応段階に対する必要性が排除される。ＺＭ４ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＥ００８６９２）中でアルド／ケト還元酵素をコードするとアノテートされた別の遺伝子、ＺＭＯ１３４４、ＺＭＯ１６７３、ＺＭＯ１７７、ＺＭ００６２、およびＺＭＯ１９８４は、本明細書の実施例５で示されるように、無細胞抽出物中でキシロース存在下におけるＮＡＤＰＨ依存性アルドース還元酵素活性に顕著に寄与しなかった。
【０１０７】
ＺＭＯ０９７６遺伝子は、本明細書でＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性を有することが示される、配列番号２のタンパク質をコードする、配列番号１のコード配列を有する。野性型株Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＮＣＩＭＢ  １１１６３およびＡＴＣＣ  １０９８８は、配列番号１に対して１００％のヌクレオチド配列同一性を有するコード領域がある遺伝子を有し、配列番号２に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードする。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＮＣＩＭＢ  １１１６３株およびＡＴＣＣ  １０９８８株中の同一ヌクレオチド配列がある遺伝子は、本方法で妨害され、キシロース上での適応なしに、唯一の糖としてキシロースを含有する培地上での増殖能力が提供される。
【０１０８】
本方法で遺伝子修飾されてもよいザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の異なる株中で、ＺＭＯ０９７６に相当する遺伝子配列に変動があってもよい。したがって配列番号１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド配列同一性があるコード配列が、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の異なる株中で、ＺＭＯ０９７６遺伝子に相当してもよい。さらに配列番号２と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性があるタンパク質が、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の異なる株中で、ＺＭＯ０９７６遺伝子産物に相当してもよい。本方法および株においては、これらの同一性があるコード領域を有する遺伝子、またはこれらの同一性があるタンパク質をコードする遺伝子が妨害される。
【０１０９】
他のザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）種または株中では、キシロース上で即事増殖できるようにする、全ＮＡＤＰＨ依存性アルドース還元酵素酵素活性の９０％を超える低下を達成するのに、ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードする複数遺伝子の不活性化が必要なこともある。当業者は、下述の遺伝子修飾方法、および当該技術分野で公知の修飾方法を使用して、実験によって、ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性の９０％を超える低下を得るために、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ゲノム配列中でアルド／ケト還元酵素としてアノテートされる、いずれの遺伝子または遺伝子群を妨害すべきかを容易に判定し得る。
【０１１０】
本方法における標的遺伝子である、上述のＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素をコードする遺伝子を妨害する遺伝子修飾は、そのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現、あるいはコードされたタンパク質の機能または安定性に影響を及ぼす方法などの当業者に知られているいずれの方法を使用してもよい。遺伝子修飾は、例えば、遺伝子のコード領域内の、またはプロモーターなどの別の領域内の変異、挿入、または欠失であってもよい。方法としては、遺伝子の全体または一部の欠失；コードされたタンパク質が発現し得ないように、（プロモーターまたはコード領域のいずれかの中の）遺伝子にＤＮＡ断片を挿入する；機能性タンパク質が発現されないように、停止コドンまたはフレームシフトを付加する変異をコード領域に導入する；そしてコード領域に１つまたは複数の変異を導入してアミノ酸を変質させ、非機能性タンパク質を発現させることが挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの方法は全て、（配列番号１などの）既知の標的ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素コード配列、ならびに完全なＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＥ００８６９２）中で利用できるものなどの標的ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素コード配列を取り囲むザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ＤＮＡ配列を利用して、当業者によって容易に実施されてもよい。
【０１１１】
ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素をコードする標的遺伝子中に遺伝子修飾を施す特に適切な方法は、本明細書の実施例３および４で例示されるように、クロラムフェニコール耐性またはその他のマーカー遺伝子と境を接する、ＺＭＯ０９７６側面に位置するＤＮＡ配列によって媒介される、二重交差相同的組換えを使用して、機能性タンパク質が発現されないように、標的アルドース還元酵素コード領域内へのマーカー遺伝子挿入をもたらすことである。さらに、マーカー遺伝子は、対応する部位特異的リコンビナーゼ発現に続いて、耐性遺伝子が遺伝子から切除されるように、部位特異的組換え部位と境を接してもよい。部位特異的組換えは、アルドース還元酵素をコードする遺伝子の発現を妨害する組換え部位を後に残す。当業者には周知のように、相同的組換えベクターを構築して、マーカーの切除に続いて、アルドース還元酵素をコードする遺伝子中に欠失を残してもよい。
【０１１２】
一実施形態では、キシロース利用代謝経路の１つまたは複数の遺伝子を、ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素をコードする内在性標的遺伝子に組み込み、それによってその発現を妨害することで、本方法のステップ（ｂ）および（ｃ）が同時に実施される。別の実施形態では、キシロース利用代謝経路の１つまたは複数の遺伝子組み込みが、別の遺伝子中にあってもよく、それによって追加的な上述の遺伝子修飾を施す。
【０１１３】
改変キシロース代謝経路が、増殖を維持するのに十分な炭素流を提供すれば、本方法のいずれの宿主細胞にも、いかなる段階においても、キシロースを唯一の炭素源として含有する培地上で、即事増殖を達成するための予備適応過程を必要としない。キシロース利用代謝経路が改変された宿主細胞中において、９０％を超えて活性を低下させる、ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性（ａｃｉｔｉｖｉｔｙ）をコードする内在性遺伝子の少なくとも１つの妨害以外の追加的な変異は、前記増殖特性を提供するために必要でない。しかし前記妨害があっても、キシロース含有培地中でのさらなる適応は、改変キシロース経路を通じて炭素流を増大させる他の変異の自然淘汰を通じて、キシロース上でのより良い増殖をもたらし得る。一実施形態では、前記妨害は、ＺＭＯ０９７６遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＥ００８６９２など；配列番号１など）のみにある。
【０１１４】
追加的な遺伝子修飾
一実施形態では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の野性型株が、キシロース利用代謝経路と、ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素をコードする内在性遺伝子の少なくとも１つの発現を妨害する遺伝子修飾とを導入するための宿主細胞として使用される。様々な実施形態では、宿主細胞またはキシロース資化能力があるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、本方法のステップ（ｂ）および／または（ｃ）の前に、それと同時に、またはその後に施される、１つまたは複数の追加的な遺伝子修飾を有する。追加的な遺伝子修飾としては、増殖速度および／または細胞量を増大させる、キシロース利用を増大させる、および／またはその他の糖類を利用できるようにする、酢酸エステルなどの阻害化合物に対する耐性を増大させる、またはエタノールの生産を増大させるものなど、株を改善するあらゆる修飾が挙げられる。これらの遺伝子修飾は、合理的設計を通じて導入し得て、またはそれらは、様々なキシロース含有増殖培地中における、株のさらなる適応によるランダム変異と自然淘汰を通じて自然発生的に生じ得る。
【０１１５】
一実施形態では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，８４３，７６０号明細書に記載されるアラビノース利用のために、さらに改変されてもよい。アラビノース利用を可能にするために、キシロース利用経路の遺伝子に加えて発現される遺伝子としては、１）Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースに変換するＬ−アラビノースイソメラーゼ、２）Ｌ−リブロースをＬ−リブロース−５−リン酸に変換するＬ−リブロキナーゼ、および３）−リブロース−５−リン酸をＤ−キシルロースに変換するＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ（米国特許第５，８４３，７６０号明細書）が挙げられる。参照によって本明細書に援用する、米国特許第２０１１／０１４３４０８号明細書で開示されるように、改善されたアラビノース利用は、ａｒａＥ遺伝子からのコード領域発現などによって、アラビノースプロトン共輸送体をさらに発現することで達成されてもよい。
【０１１６】
別の実施形態では、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，８９７，３９６号明細書に記載されるように、組み込み宿主要素のサブユニットをコードする内在性ｈｉｍＡ遺伝子を遺伝子修飾してその発現を低下させ、それは酢酸エステル含有培地中における増殖を改善する。酢酸はバイオマス加水分解物中に存在し、したがってバイオマス加水分解物を含有する培地を使用する場合、この成分に対する耐性を増大させることが所望される。
【０１１７】
別の実施形態では、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載されるように、グルコースフルクトース酸化還元酵素（ＧＦＯＲ）活性を低下させる遺伝子修飾を施す。ＧＦＯＲならびにｈｉｍＡ遺伝子の発現低下は、アルドース還元酵素活性低下について上で記載されるものなどのあらゆる方法によってもよい。
【０１１８】
別の実施形態では、参照によって本明細書に援用する、米国特許公開公報第２０１２０１５６７４６Ａ１号明細書として公開された、同一譲受人同時係属米国特許出願公開第１３／１６１７３４号明細書で開示されるように、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）活性を増大させる遺伝子修飾が施される。ＲＰＩの発現増大は、天然プロモーターよりも高活性のプロモーターなどによって、内在性ＲＰＩをコードする遺伝子の発現を増大させることで、またはザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中のリボース−５−リン酸イソメラーゼ活性によって、任意選択のタンパク質またはポリペプチドをコードする異種遺伝子を発現させることで、達成されてもよい。米国特許出願第１３／１６１７３４号明細書、米国特許公開公報第２０１２０１５６７４６Ａ１号明細書に記載されるように、ＲＰＩ−ＡおよびＲＰＩ−Ｂと称される２つのリボース−５−リン酸イソメラーゼ酵素群があり、そのいずれが発現されてもよい。
【０１１９】
別の実施形態では、キシロース利用代謝経路の一部として発現されるキシロースイソメラーゼが、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，９８９，２０６号明細書および米国特許第７，９９８，７２２号明細書で開示される、変異高度活性プロモーターを使用して発現される。その中で開示されている変異プロモーターは、配列番号３のプロモーターの位置１１６のＧからＴへの、または位置２１７のＣからＴへの変異を有する、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｐｇａｐ）のプロモーターである。より高活性の変異プロモーターとしては、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２が挙げられる。これらは、配列番号３中の１１６および２１７に相当する位置における変異の片方または双方がある、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の異なる株からの変異プロモーター配列を含む。
【０１２０】
別の実施形態では、キシロース利用代謝経路の一部として発現されるキシロースイソメラーゼは、同一譲受人同時係属米国特許出願公開第２０１１−０３１８８０１号明細書で開示されるように、ＥＣ  ５．３．１．５によって同定される酵素クラスに含まれる、Ｉ群キシロースイソメラーゼである。その中では、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）から単離されたコード領域から発現されるものなどのＩ群キシロースイソメラーゼ（ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）についてコドン最適化されたコード領域：配列番号１３）が、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中において、２群キシロースイソメラーゼよりも高活性であることが開示されている。その中でＩ群キシロースイソメラーゼは、分子系統学的バイオインフォマティクス解析（ＰＨＹＬＩＰ（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅパッケージバージョン３．５ｃ；Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ（１９８９）Ｃｌａｄｉｓｔｉｃｓ  ５：１６４−１６６）に実装されるＰＨＹＬＩＰ近隣結合アルゴリズムを使用する）、ＧｒｏｕｐＳｉｍ解析（Ｃａｐｒａ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ（２００８）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２４：１４７３−１４８０）、およびプロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージのｈｍｍｓｅａｒｃｈアルゴリズム；Ｊａｎｅｌｉａ  Ｆａｒｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｍｐｕｓ，Ａｓｈｂｕｒｎ，ＶＡを使用する）によって定義される。
【０１２１】
ＮＡＤＰＨの存在下においてキシロースをキシリトールへに変換する、アルドース還元酵素活性の９０％を超える低下を与える変異以外の変異は、キシロース上での即事増殖に必須ではないが、一実施形態では、炭素源としてキシロースを含有する培地中における、本明細書に記載されるキシロース資化能力がある細胞の連続移動（キシロース含有培地への適応）を使用して、キシロース代謝に有益な他の遺伝子中における変異蓄積を通じた自然淘汰の結果として、キシロース上でより良く増殖する新しい株を作成してもよい。キシロース含有培地への適応は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，２２３，５７５号明細書および米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載される。
【０１２２】
本細胞の特性
本ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、エタノールを生成する天然能力を有する。さらに株を提供するように増殖させた細胞は、ＮＡＤＰＨ存在下におけるキシロースからキシリトールへの変換のために、天然アルドース還元酵素活性に９０％を超える低下を有する。さらに細胞は、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼ、またはトランスアルドラーゼ酵素活性をそれぞれ有する、ポリペプチドをコードする一連のポリヌクレオチドを含んでなるキシロース利用代謝経路を含んでなる。
【０１２３】
様々な実施形態において、本株は、成長速度または細胞量生成の増大、またはキシロース利用および／またはその他の糖類利用の増大、酢酸エステルなどの阻害化合物に対する耐性増大、またはエタノール生成の増大など、株の改善である１つまたは複数の特性をさらに有する。これらの特性は、上で記載されるものなどの遺伝子修飾によってもたらされる。
【０１２４】
エタノール生産のための発酵
キシロース利用経路と、アルドース還元酵素をコードする少なくとも１つの妨害された遺伝子とを有して、ＮＡＤＰＨ存在下におけるキシロースのキシリトールへの変換のためのアルドース還元酵素活性が９０％を超えて低下している、改変ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、エタノール生産のための発酵で使用してもよい。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）は、天然エタノロジェン（ｅｔｈａｎｏｌａｇｅｎ）である。一例として、発明のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株によるエタノールの生産が記載される。
【０１２５】
エタノール生産のために、キシロースを含む混合糖類を含有する培地に、組換えキシロース利用Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を接触させる。典型的に培地は、アラビノース、キシロース、およびグルコースを含む混合糖を含有する。培地は、加工セルロース性またはリグノセルロース性バイオマスに由来する糖を含む、バイオマス加水分解産物を含有してもよい。
【０１２６】
混合糖類濃度が、増殖を阻害するように高い場合、米国特許第７，６２９，１５６号明細書で開示されるように、培地は、ソルビトール、マンニトール、またはその混合物を含む。ガラクチトールまたはリビトールが、ソルビトールまたはマンニトールを置き換えてもよく、またはそれと組み合わせられてもよい。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株は培地中で増殖して発酵が起きて、エタノールが生産される。（嫌気性、微有酸素性、または微好気性発酵などの条件を含んでもよい）発酵は、空気、酸素、またはその他のガスの補足なしに、少なくとも約２４時間実施され、３０時間以上実施されてもよい。最大エタノール生産に達するタイミングは、発酵条件次第で変動する。典型的に、培地中に抑制物質が存在する場合、より長い発酵時間を要する。発酵は、約４．５〜約７．５のｐＨで、約３０℃〜約３７℃の温度で実施されてもよい。
【０１２７】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞は、実験室規模発酵槽内において、および商業的量のエタノールが生産されるスケールアップ発酵中でキシロースを含む混合糖類を含む培養されてもよい。エタノールの商業生産が所望される場合、多様な培養手順が適用されてもよい。例えば本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株からの大規模生産は、バッチおよび連続培養手順の双方で生産されてもよい。古典的バッチ培養法は、培地組成物が培養開始時に設定されて、培養工程において人為的変更を受けない閉鎖系である。したがって培養工程開始時に所望の生物を培地に接種して、系に何も添加せずに、増殖または代謝活性を生じさせる。しかし典型的に、「バッチ」培養は、炭素源添加に関してバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの要素を制御する試みが頻繁になされる。バッチ系では、システムの代謝産物およびバイオマス組成は、培養を停止させる時点まで常に変化する。バッチ培養内では、細胞は、静的な遅滞期から高い対数増殖期へ、そして最後に、増殖速度が減退または停止する静止期へと減速する。処置を施さない場合、静止期にある細胞はやがて死滅する。いくつかのシステムでは、対数期にある細胞が、往々にして最終産物または中間体の生産の大半に関与する。その他のシステムでは、静止期または対数期後期の生産が得られ得る。
【０１２８】
標準バッチ系の変法は、流加系である。流加培養工程もまた、本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の増殖に適し、培養の進行と共に基材が徐々に添加されることを除いては、典型的なバッチ系を構成する。流加バッチ系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があって、培地中に限定量の基質を有することが望ましい場合に、有用である。流加バッチ系の実際の基質濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、およびＣＯ２のような排ガスの分圧などの測定可能要素の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加培養法は一般的で、当該技術分野で周知であり、例は、参照によって本明細書に援用する、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，ａｎｄ  Ｂｒｏｃｋ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７，（１９９２）にある。
【０１２９】
エタノールの商業生産はまた、連続培養で達成されてもよい。連続培養は、バイオリアクターに定められた培養液が継続的に添加される開放系であり、同時に等量の馴化培地が、加工のために取り出される。連続培養は、概して細胞が主に対数増殖期にある、一定の高い液相密度に細胞を維持する。代案としては、固定化細胞を用いて連続培養を実施してもよく、その中では炭素および栄養素が継続的に添加されて、有価生成物、副産物または老廃物が細胞集団から継続的に取り出される。細胞固定化は、当業者に知られているように、天然および／または合成材料から構成される幅広い固体支持体を使用して、実施されてもよい。
【０１３０】
連続または半連続培養は、細胞増殖または最終産物濃度に影響を及ぼす、１つの要素またはいくつもの要素の調節を可能にする。例えば１つの方法は、炭素源または窒素レベルなどの制限的栄養物質を定率に保ち、全てのその他のパラメータを加減させる。その他の系では、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼすいくつかの要素を継続的に変更し得る。連続系は、定常状態増殖条件を維持するように努め、したがって培地の抜き取りに起因する細胞損失は、培養中の細胞増殖率と平衡状態になくてはならない。連続培養工程のために栄養素と増殖因子を調節する方法、ならびに産物生成率を最大化する技術は、工業微生物学の技術分野で周知であり、多様な方法が前出のＢｒｏｃｋに詳述される。
【０１３１】
エタノール生産に特に適するのは、以下のような発酵計画である。軌道振盪機内で約１５０ｒｐｍで振盪しながら、約３０℃〜約３７℃において、振盪フラスコ内の半天然培地中で、本発明の所望のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を増殖させて、次に同様の培地を含有する１０Ｌの種発酵槽に移す。種培養は、ＯＤ６００が３〜６になるまで種発酵槽内で嫌気的に培養されて、発酵パラメータがエタノール生産のために最適化される生産発酵槽に移される。種培養タンクから生産タンクに移される典型的な種菌体積は、約２％〜約２０％ｖ／ｖの範囲である。典型的な発酵培地は、リン酸カリウム（１．０〜１０．０ｇ／ｌ）、硫酸アンモニウム（０〜２．０ｇ／ｌ）、硫酸マグネシウム（０〜５．０ｇ／ｌ）などの最少培地成分と、酵母抽出物または大豆ベースの製品などの複合窒素源（０〜１０ｇ／ｌ）とを含有する。ソルビトールまたはマンニトールが、約５ｍＭの最終濃度で培地中に存在する。バッチ添加された最初の炭素源（５０〜２００ｇ／ｌ）の枯渇に際し、炭素源を提供する、キシロースと、グルコース（またはスクロース）などの少なくとも１つの追加的な糖とを含む混合糖類を、発酵容器に絶えず添加して、エタノールの割合と力価を最大化する。炭素源供給速度を動的に調節して、培養が、酢酸などの有毒副産物の蓄積をもたらし得る過剰なグルコースを蓄積していないことを確実にする。利用基質から生成するエタノール収量を最大化するために、最初にバッチ添加される、あるいは発酵工程において供給される、リン酸量によって、バイオマス成長を制限する。発酵は、（水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、または水酸化ナトリウムなどの）苛性溶液と、硫酸またはリン酸のいずれかを使用して、ｐＨ５．０〜６．０に制御される。発酵槽の温度は、３０℃〜３５℃に制御される。起泡を最小化するために、消泡剤（シリコーンベース、有機ベースなどの任意のクラス）を必要に応じて容器に添加する。それに対する抗生物質耐性マーカーが株中にある、カナマイシンなどの抗生物質を任意選択的に使用して、汚染を最小化してもよい。
【０１３２】
任意の上述の条件の組、およびさらに当該技術分野で周知の条件のバリエーションが、キシロース利用組換えザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株によるエタノール生産のための適切な条件である。
【実施例】
【０１３３】
一般方法
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の形質転換
本質的に米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載されるようにして、電気穿孔を使用して、自己複製型および非複製型プラスミドＤＮＡをＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入した。簡単に述べると、５０μｌの形質転換反応は、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中に、約１０１０個の細胞／ｍｌと、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０から単離された１〜２μｇの非メチル化プラスミドＤＮＡとを含有した。対照反応は同じように処理されたが、いかなるプラスミドＤＮＡも導入されなかった。電気穿孔装置の設定は、１．６ｋｖ／ｃｍ、２００Ω、および２５μＦであり、キュベットのギャップ幅は０．１ｃｍであった。電気穿孔に続いて、ＭＭＧ培地（５０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）  ２ＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、および１ｍＭのＭｇＳＯ４）で希釈して、細胞を３０℃で回収してから、示されるように抗生物質添加または無添加の１．５％寒天（ＭＭＧ寒天プレート）を含有するＭＭＧ培地上に、形質転換反応を播種した。ＭＭＸ寒天プレートは、ＭＭＧ寒天プレートと同一であるが、グルコースの代わりに５０ｇ／Ｌのキシロースを含有する。３０〜３３℃において嫌気性チャンバー内で、コロニーが出現するまでプレートを培養した。追加的な詳細は、実施例セクションに記載される。
【０１３４】
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ６４１およびＺＷ６５８株の構築
野性型親株ＺＷ１から開始する、キシロース利用組換え株ＺＷ６５８の構築の詳細な説明は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，７４１，０８４号明細書に提供される。ＺＷ６５８は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，９８９，２０６号明細書で開示されるように、キシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）、キシルロキナーゼ（ｘｙｌＢ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌ）、およびトランスケトラーゼ（ｔｋｔ）をコードする、４つのキシロース利用遺伝子を含有する、２つのオペロンＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔを、逐次遺伝子転位事象を通じて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子からのコード領域と共に、ＺＷ１ゲノム（ＺＭ４株の改名；ＡＴＣＣ３１８２１）に組み込み、引き続いてキシロース含有増殖培地上で適応させてＸ１３Ｌ３株を作成し、それを引き続いてＺＷ６４１と改名することで構築された。キシロース含有増殖培地上におけるＺＷ６４１のさらなる適応からはＺＷ６５８が生じ、それはキシロース中ではるかにより良く増殖して、ブダペスト条約の下にＡＴＣＣＰＴＡ−７８５８として寄託された。米国特許第７，９８９，２０６号明細書でさらに開示されるように、ＺＷ６５８は、染色体性に組み込まれた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンを駆動するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｐｇａｐプロモーター中の点変異のために、ＺＷ６４１よりも高いキシロースイソメラーゼ活性を有する。本明細書で、８０１ＧＡＰプロモーターまたはＳｕｐｅｒ  ＧＡＰプロモーターまたはＰｇａｐＳのいずれかと称されるこの変異プロモーター（配列番号４）は、ＺＷ６４１中の天然Ｐｇａｐ  （６４１ＧＡＰプロモーター）との比較で、位置１１６において「Ｇ」の代わりに「Ｔ」を有する。８０１Ｇａｐプロモーターは、６４１Ｇａｐプロモーターよりも３〜４倍強力であり、ＺＷ６４１中のキシロース代謝の律速段階は、キシロースイソメラーゼである。
【０１３５】
振盪フラスコ実験
特に断りのない限り、下述する全ての実験は、３３℃において、炭素源としてグルコースおよび／またはキシロースを含有する合成培地を使用して、振盪フラスコ（１５ｍｌの緩く栓をした円錐型試験管）内で実施した。ｍＲＭ３−Ｇ１０培地は、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４  （７Ｈ２Ｏ）、および１００ｇ／Ｌのグルコースを含有する。ｍＲＭ３−Ｘ１０培地は同一であるが、それはグルコースの代わりに１００ｇ／Ｌのキシロースを含有する。細胞成長は、時間の関数として、６００ｎｍにおける光学濃度変化を追跡して分光光度法でモニターした。本文および図の説明で、「ＯＤ」または「ＯＤ６００」は、６００ｎｍにおける光学濃度を意味する。振盪フラスコ増殖実験中の表示される時点において、屈折率検出器を装着したＨＰ  １１００（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用したＨＰＬＣ分析のために、培養物の１．０ｍｌアリコートを取り出して、発酵ブロス中に存在するグルコース、キシロース、キシリトール、リブロース、グリセロール、酢酸エステル、およびエタノールの濃度を測定した。ＨＰＬＣ分析に先だって、遠心分離によって細胞を取り出し、０．２２μｍ酢酸セルロースＳｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルター（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号８１６０）を通して上清を濾過し、小型粒子を除去した。０．６ｍｌ／分の流速、および移動相として０．０１ＮのＨ２ＳＯ４を使用して、均一濃度条件下、５５℃で稼働するＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で化合物を分離した。既知濃度の標品を使用して対象ピークを定量化し、全ての結果をｇ／Ｌで表した。
【０１３６】
無細胞抽出物の調製
２５ｍｌのｍＲＭ３−Ｇ１０中で、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ１株およびＺＷ１−ＡＲ１株を約２．８のＯＤに増殖させて、３，０００×ｇ（４℃）で遠心分離して収集し、細胞ペレットを迅速に凍結して、後で使用するために−８０℃で保存した。Ｂｉｏ１０１  ＦａｓｔＰｒｅｐ  ＦＰ１２０  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＳａｖａｎｔ）を使用して、機械的破壊によって無細胞抽出物を作成し；下述するように、室温で実施された機械的破壊ステップを除く全ての手順は、０〜４℃で実施した。凍結細胞ペレットを解凍し、１２．５ｍＭのトリエタノールアミン塩酸塩（ＫＯＨでｐＨ７．５に調節）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのジチオスレイトールを含有する、１．０ｍｌの溶解緩衝液で３回洗浄して、最後に０．８ｍｌの同一溶液に再懸濁した。０．１ｍｍのシリカ球（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、カタログ番号９９１１−１００）を含有する２．０ｍｌのＬｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂ管に、再懸濁細胞を移して、ＦａｓｔＰｒｅｐ  ＦＰ１２０内で３サイクルの細胞破壊を実施し；各サイクルは、６ｍ／秒で２０秒間の撹拌期間と、それに続く氷上で３分間の冷却期間からなった次に溶解産物を２０，８００×ｇで１０分間遠心分離して、得られた上清を新鮮な遠心管に移し、同一速度でさらに６０分間再度遠心分離した。第２の遠心分離ステップからの上清は、下述のＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性試験において、下で「細胞抽出物」と称される。無細胞抽出物のタンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準物質として、クーマシー（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号２３２００）を使用して測定した。
【０１３７】
ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性の測定
キシロースを基質とする、無細胞抽出物中のＮＡＤＰＨ依存性アルドース還元酵素活性は、本質的に説明される（Ｆｅｌｄｍａｎｎら（１９９２）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：３５４−３６１）ようにして、わずかな修正を加えて測定した。アッセイは、以下の成分を含有する０．５ｍｌの石英キュベット内で、３２℃で実施した：４００μｌの反応緩衝液（５０ｍＭのトリエタノールアミン塩酸塩（ｐＨ７．５）および５ｍＭのＭｇＳＯ４）、４０μｌの無細胞抽出物（８〜１０ｍｇのタンパク質／ｍｌを含有する）、１０μｌの１０ｍＭＮＡＤＰＨテトラ（シクロヘキシルアンモニウム）塩、および５０μｌの２ＭＤ−キシロース。「キシロース非含有対照」反応は全く同じであるが、キシロースを省き、その代わりに５０μｌの反応緩衝液を添加した。酵素活性は、６２２０Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、分光光度法で３４０ｎｍにおいて時間の関数として測定し、ＮＡＤＰＨのＮＡＤＰへの変換をモニターした。酵素活性は、キシロース不在下におけるＮＡＤＰＨ酸化速度について補正した後に、ｍＵ／ｍｇの無細胞抽出物タンパク質として表した；１ｍＵ＝毎分１ナノモルのキシリトールが形成される。ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性の信号対雑音比（すなわち「キシロース非含有対照」反応と比較した、キシロース存在下におけるＮＡＤＰＨ消失速度）は、野性型ＺＷ１株では約３．５であった。
【０１３８】
実施例１
適応されたキシロース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株中におけるＺＭＯ０９７６変異の発見
野性型ＺＭ４株（ＡＴＣＣ＃３１８２１）と遺伝的に同一である、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）野性型ＺＷ１株、および２つの適応されたキシロース利用ＺＷ１誘導株であるＺＷ６４１およびＺＷ６５８（株構築の一般方法を参照されたい）の比較ゲノム配列分析を実施して、キシロース上での適応中に起きた遺伝子修飾（変異）を同定した。全ゲノム配列分析は、ＺＷ６４１株およびＺＷ６５８株の適応中に、複数変異が出現したことを示した。これらの変異中に、ＺＷ１コード領域内の７８ヌクレオチドの欠失があり、それはＺＷ６４１およびＺＷ６５８の双方に存在した。欠失を有するコード領域は、ＺＭ４株のゲノム配列中で、ＺＭＯ０９７６と命名された（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＥ００８６９２）。このＺＭＯ０９７６コード領域は、アルド／ケト還元酵素をコードするとアノテートされる。欠失は、ＺＭＯ０９７６（配列番号１）の（停止コドンを含む）１０２３ヌクレオチド完全コード領域の大部分（開始コドンの始めに対するヌクレオチド５４７〜６２４）を除去して、配列番号１４をもたらす。
【０１３９】
実施例２
ＺＭＯ０９７６変異がある追加的なキシロース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株
キシロース利用経路およびキシロース含有培地上での適応のための遺伝子を導入することで、２つの追加的なキシロース利用株が以下のように得られた。
【０１４０】
標的組み込みを使用するキシロース利用Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株構築のためのベクターコンストラクト
ＺＷ１株に、キメラｘｙｌＡ、ｘｙｌＢ、ｔａｌ、およびｔｋｔ遺伝子を導入することによって、新しいキシロース利用Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を構築した。ｘｙｌＢ、ｔａｌ、およびｔｋｔコード領域は、一般方法に記載されるＺＷ６５８株と同じく、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子からのものである。ｘｙｌＡコード領域は、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）からのものであり（ＡＭｘｙｌＡ）、それはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼよりも高活性を有する酵素をコードするとして、参照によって本明細書に援用する、同一譲受人同時係属米国特許出願公開第２０１１−０３１８８０１号明細書で開示される。ＡＭｘｙｌＡのコード領域は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中での発現のためにコドン最適化された（配列番号１３）。リボース−５−リン酸−イソメラーゼ（ＲＰＩ）およびリブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ＲＰＥ）活性を増大させるために、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ｒｐｉおよびｒｐｅ遺伝子の追加的なコピーもまた導入された。二重乗換え（ＤＣＯ）変換ベクターをデザインして、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムの標的領域に、キメラ遺伝子を特異的に組み込んだ。
【０１４１】
標準分子組換え方法を使用して、ＤＣＯ（二重乗換え）自殺組み込みベクターを構築した。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中でキシロースイソメラーゼおよびキシルロースキナーゼを発現するために、１０，２５０ｂｐのＤＣＯ自殺ベクターｐＺＸ２１（配列番号１５；図３Ａ）を構築した。このベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点を含有するが、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）複製起点を含有しないｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ主鎖を有し、したがってそれはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中で増殖し得ず、自殺ベクターとなる。それは、組み込まれる配列の側面に位置して、グルコースフルクトース酸化還元酵素をコードする、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）遺伝子からのＤＮＡ配列、ＧＦＯ−ＬおよびＧＦＯ−Ｒを含有する。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、ＰＣＲによって双方の断片を合成した。１，１８６ｂｐのＧＦＯ−Ｌ断片（配列番号１６）は、ｇｆｏｒコード配列（配列番号１７）の最初の６５４ｂｐ（ｎｔ−１〜ｎｔ−６５３）と、５３３ｂｐの上流ゲノム配列とを含む。１，４４６ｂｐのＧＦＯ−Ｒ断片（配列番号１８）は、ＧＦＯＲコード配列の最後の４８０ｂｐ（ｎｔ−８２３〜ｎｔ−１３０２）と、９６６ｂｐの下流ゲノム配列とを含む。ＧＦＯ−ＬおよびＧＦＯ−Ｒ配列は、ｇｆｏｒ位置への組み込みを誘導して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム中のｇｆｏｒコード配列の断片（ｎｔ−６５５〜ｎｔ−８２２）を置換する。参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，７４１，１１９号明細書で開示されるように、これはグルコースフルクトース酸化還元酵素の発現を妨害し、それはキシリトール生成を低下させてエタノール生成を増大させる。
【０１４２】
ＧＦＯ−ＬとＧＦＯ−Ｒの間のｐＺＸ２１中の領域は、３つのキメラ遺伝子を含む。１つは３０４ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＳｕｐｅｒＧＡＰプロモーター（ＰｇａｐＳ；米国特許第７，９８９，２０６号明細書に記載される）、１，１８５ｂｐのＡ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ｘｙｌＡコード配列（ＡＭｘｙｌＡ）、および５’ＸｂａＩ部位（ＥＣａｒａＤ  ３’ＵＴＲ）がある１６６ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＤ  ３’ＵＴＲを含有する、１，６６１ｂｐのキメラｘｙｌＡ遺伝子（配列番号１９）である。ＡＭｘｙｌＡコード領域は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４（配列番号１３）のコドンバイアスに従って、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中での発現のために最適化された。ＥＣａｒａＤ  ３’ＵＴＲは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＢＡＤオペロンからのものである。第２の遺伝子は、１９１ｂｐのＰｅｎｏ、１，４５５ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＢコード配列（ＥＣｘｙｌＢ）、および３１４ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＢ３’ＵＴＲ（ＥＣｘｙｌＢ  ３’ＵＴＲ）を含有する１，９６０ｂｐのキメラｘｙｌＢ遺伝子（配列番号２０）である。Ｐｅｎｏは、Ｐｇａｐのほぼ２８％の活性を有する、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡからの強力な構成的プロモーターである。第３の遺伝子は、ｌｏｘ部位と境を接する、１，０１４ｂｐのａａｄＡマーカー（スペクチノマイシン耐性に対する；Ｓｐｅｃ−Ｒ）  （配列番号２１）である。マーカーは、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現することで、組み込み後に除去し得る。
【０１４３】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中でトランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−Ｐ−イソメラーゼ、およびＤ−リブロース−Ｐ−３−エピメラーゼを発現するために、１２，１９８ｂｐのＤＣＯシャトルベクターｐＺＸ５２（配列番号２２；図３Ｂ）を構築した。このベクターは、ベクターｐＺＢ１８８に基づく、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクター（Ｚｈａｎｇら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３；ＵＳ５，５１４，５８３）であり、それは、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中でベクターが自己複製できるようにする複製起点を含有する２，５８２ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ断片と、９０９ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点（Ｏｒｉ）とを含む。それは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）形質転換体のいずれかの選択のための、９１１ｂｐのクロラムフェニコール耐性マーカー（Ｃｍ−Ｒ）を有する。ｐＺＸ５２は、組み込まれる配列の側面に位置する、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ｌｄｈＡ遺伝子、ＬＤＨ−Ｌ（８７５ｂｐ；配列番号２３）およびＬＤＨ−Ｒ（１，１４９ｂｐ；配列番号２４）からのＤＮＡ配列を含有する。これらの配列は、ヌクレオチド＃４９３と＃４９４の間で、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム中のｌｄｈＡコード配列（配列番号２５）への組み込みを誘導し、したがって乳酸デヒドロゲナーゼの発現を妨害する。
【０１４４】
ＬＤＨ−ＬとＬＤＨ−Ｒの間のｐＺＸ５２中の領域は、２つのキメラオペロンを含む。第１のものは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＧＡＰプロモーター（ＰｇａｐＴ）の３０４ｂｐのＴ−変異、９５４ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔａｌコード領域（ＥＣＴａｌ）、１，９９２ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｋｔコード領域、および６８ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｋｔ  ３’ＵＴＲ（ＥＣＴｋｔ  ３’ＵＴＲ）を含有する、３，３３９ｂｐのＰｇａｐＴ−Ｔａｌ−Ｔｋｔオペロン（配列番号２６）である。このオペロンは、天然Ｐｇａｐ  （配列番号３）との比較で、位置８３の「Ｇ」から「Ａ」への変化と位置２８５の「Ｔ」欠損があるＰｇａｐであるＰｇａｐＴプロモーター（配列番号２７）以外は、天然の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔａｌ−Ｔｋｔオペロンと同一である。別のキメラオペロンは、１９１ｂｐのＰｅｎｏ、第１のコドンがＡＴＧに変化した４７１ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｒｐｉコード配列（配列番号４３）（ＺＭＲｐｉ）、６６３ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｒｐｅコード配列（ＺＭＲｐｅ）、および３５ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＡ３’ＵＴＲ（ＥＣｘｙｌＡ  ３’ＵＴＲ）を含有する、１，４４３ｂｐのＰｅｎｏ−Ｒｐｉ−Ｒｐｅオペロン（配列番号２８）である。
【０１４５】
ｐＺＸ６と命名された別のＤＣＯシャトルベクター（配列番号９；図３Ｃ）が、構築された。この１２，７０４ｂｐのベクターは、ポリヌクレオチドホスホリラーゼをコードするＺ．モビリス（Ｚ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ｐｎｐ遺伝子からの配列で、ＬＤＨ−ＬおよびＬＤＨ−Ｒ配列が置換された、ｐＺＸ５２の修飾である。１，３１８ｂｐのＰＮＰ−Ｌ断片（配列番号３０）が、ｎｔ−７６７〜ｎｔ−２，０８４のｐｎｐコード配列（配列番号４２）の断片である一方で、１，２２５ｂｐのＰＮＰ−Ｒ断片（配列番号３１）は、ｐｎｐコード配列の最後の５９ｂｐ（ｎｔ−２１８９〜ｎｔ−２２４７）と、１，１６６ｂｐの下流ゲノム配列とを含む。したがってｐＺＸ６は、ｐｎｐコード配列末端近くの内在性ｐｎｐ遺伝子へのＰｇａｐＴ−Ｔａｌ−ＴｋｔオペロンおよびＰｅｎｏ−Ｒｐｉ−Ｒｐｅオペロンの組み込みを誘導して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム中のｐｎｐコード配列（ｎｔ−２，０８４〜ｎｔ−２，１８８）断片を置き換えることができる。
【０１４６】
キシロース利用Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の開発
ＺＷ１株は、２つのプラスミドによって２段階で形質転換された。１５０ｒｐｍで振盪しながら、ｍＲＭ３−Ｇ５（１％酵母抽出物、１５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、４ｍＭのＭｇＳＯ４、および５０ｇ／Ｌのグルコース）中で、ＯＤ６００値が５に近くなるまで、種細胞を３０℃で一晩培養して、ＺＷ１のコンピテント細胞を作成した。細胞を収集して、新鮮培地に０．０５のＯＤ６００値に再懸濁した。初期から中期対数期（０．５に近いＯＤ６００）と同一条件下で、細胞を培養した。細胞を収集して、氷冷水で２回、次に氷冷１０％グリセロールで１回洗浄した。得られたコンピテント細胞を収集し、氷冷１０％グリセロールに、ＯＤ６００値が１００近くになるよう再懸濁した。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の形質転換には、非メチル化ＤＮＡが必要であるため、ＤＣＯプラスミドｐＺＸ２１、ｐＺＸ５２、およびｐＺＸ６を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にそれぞれ形質転換した。各形質転換では、１個の形質転換細胞コロニーを１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ１００（１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有するＬＢブロス）中で一晩３７℃で培養した。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、１０ｍＬの培養物からＤＮＡを調製した。
【０１４７】
１ＭＭ電気穿孔キュベット（ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）内で、およそ１μｇの非メチル化ｐＺＸ２１  ＤＮＡを５０μＬのＺＷ１コンピテント細胞と混合した。ＢＴ７２０  Ｔｒａｎｓｐｏｒａｔｅｒ  Ｐｌｕｓ（ＢＴＸ−Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、プラスミドＤＮＡを２．０ＫＶで細胞中に電気穿孔した。１ｍＬのＭＭＧ５培地（１０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）  ２ＳＯ４、２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、および１ｍＭのＭｇＳＯ４）中で形質転換細胞を３０℃において４時間で回収し、ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｇａｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を入れた嫌気ジャー内で、ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート（２５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンおよび１５ｇ／Ｌ寒天添加ＭＭＧ５）上で３日間、３０℃で増殖させた。
【０１４８】
ｐＺＸ２１はＤＣＯ自殺ベクターであるので、生き残ったＳｐｅｃＲコロニーは、ｇｆｏｒ遺伝子座に組み込まれたＰｇａｐＳ−ＡＭｘｙｌＡ：：Ｐｅｎｏ−ＥＣｘｙｌＢ：：Ｓｐｅｃ−Ｒ断片を有した。コロニーを新鮮ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート上に画線塗抹して増殖させ、次にＰＣＲを実施して、キメラ遺伝子の組み込みを検査した。第１のＰＣＲは、順方向プライマーａｒａ２８５（配列番号３２）と逆方向プライマーａｒａ１２０（配列番号３３）を使用して、ｐＺＸ２１中でＧＦＯ−Ｌ断片によって媒介される二重交差型組換えを調べた。ａｒａ２８５プライマーは、ゲノム中のＧＦＯ−Ｌ断片の４９４ｂｐ上流であるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム配列の断片に一致した一方で、ａｒａ１２０はｐＺＸ２１中のＰｇａｐＳの最後の１８ｂｐとＡＭｘｙｌＡの最初の１７ｂｐを補完した。組み込みが設計通りに起きたならば、ＰＣＲは、形質転換体からの１，９０３ｂｐの断片を増幅する。第２のＰＣＲは、順方向プライマーａｒａ４６（配列番号３４）と逆方向プライマーａｒａ２７４（配列番号３５）を使用して、ｐＺＸ２１中でＧＦＯ−Ｒ断片によって媒介される二重交差型組換えを調べた。ａｒａ４６プライマーは、ｐＺＸ２１中のＳｐｅｃＲ遺伝子の末端近くの配列である一方で、ａｒａ２７４は、ＧＦＯ−Ｒ断片の８３ｂｐ下流のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ断片を補完する。このＰＣＲは、成功裏の組み込みを有するコロニーからの１，８６４ｂｐの断片を増幅する。どちらの検査も予測されたＰＣＲ産物を生じ、したがって正確な導入遺伝子組み込みが確認された。得られた株は、ＺＷ１−ｐＺＸ２１と命名された。
【０１４９】
第２のステップでは、ＺＷ１−ｐＺＸ２１をｐＺＸ５２で形質転換して、ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０−ＣＭ１２０（１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール添加ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０）プレート上で選択した。ｐＺＸ５２は、プラスミド選択のためのＣｍＲマーカーと、マーカーのない組み込み断片（ＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅ）とを有するＤＣＯシャトルベクターであるので、回収されたコロニーは、増殖したｐＺＸ５２プラスミド中に、先にモビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム中に組み込まれたコンストラクトＰｇａｐＳ−ＡＭｘｙｌＡ：：Ｐｅｎｏ−ＥＣｘｙｌＢ：：Ｓｐｅｃ−ＲｉｎｔｈｅＺだけでなく、組み込まれないコンストラクトＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅもまた含有するはずである。これらの形質転換体は、キシロース利用経路に必要な全ての遺伝子を有するはずである。導入遺伝子が全てＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中で機能することを示すために、キシロース中で１０個の選択コロニーに４８時間増殖アッセイを実施した。アッセイでは、１４ｍＬのＦａｌｃｏｎポリプロピレン丸底管内の２ｍＬのｍＲＭ３−Ｇ５−Ｓｐｅｃ２００−ＣＭ１２０（２００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンおよび１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール添加ｍＲＭ３−Ｇ５）に、選択コロニーを接種して、１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩培養した。管にはきっちり栓をしたが、細胞増殖および発酵中の圧力放出のために、２３Ｇ１針を使用して蓋の上部に孔を開けた。細胞を収集して、ＭＲＭ３Ｘ１０（１００ｇ／Ｌキシロース添加ＭＲＭ３）で洗浄し、ｍＲＭ３−Ｘ１０−Ｓｐｅｃ２００−ＣＭ１２０（２００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンおよび１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含有するｍＲＭ３−Ｘ１０）に再懸濁して、０．１の開始ＯＤ６００にした。５ｍＬの懸濁液を新しい１４ｍＬのＦａｌｃｏｎポリプロピレン丸底管に
入れた。管に栓をして、上部に孔を開けた。１５０ｒｐｍで振盪しながら、細胞を３０℃で４８時間増殖させ、島津ＵＶ−１２０１分光光度計上でＯＤ６００を測定した。次に、１ｍＬの培養物を１０，０００×ｇで遠心分離して、細胞を除去した。０．２２μｍのＣｏｓｔａｒＳｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を通して上清を濾過し、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）上で、５５℃で速度０．６ｍＬ／分の０．０１ＮのＨ２ＳＯ４と共に、ＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−Ａ７Ｈイオン排除カラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に通過させて、キシロースおよびエタノールについて分析した。結果は、１０個の形質転換体が全て、エタノール生成のためのキシロース利用経路を獲得したことを示唆した。新しい株は、ＺＷ１−ｐＺＸ２１−ｐＺＸ５２と命名され、培養物の１つをさらなる実験で使用した。
【０１５０】
次にＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅコンストラクト組み込みのために、ＺＷ１−ｐＺＸ２１−ｐＺＸ５２に３つの形質転換後手順を順次実施した。
【０１５１】
（１）株は、キシロース上で適応させた。この手順では、５ｍＬのｍＲＭ３−Ｇ１Ｘ９−Ｓｐｅｃ２００−ＣＭ１２０培地（１０ｇ／Ｌグルコース、９０ｇ／Ｌキシロース、２００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、および１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール添加ＭＲＭ３）に、ＺＷ１−ｐＺＸ２１−ｐＺＸ５２を懸濁して、０．２のＯＤ６００値から開始して、３０℃で３〜４倍（０．２〜２のＯＤ６００値；１代の継代）に増殖させた。次に培養を開始ＯＤ６００値に希釈して、さらなる継代のために増殖させた。全部で４代の継代（約１５倍の増加）を完了した。
【０１５２】
（２）１０μＬの適応細胞プールを２ｍＬのｍＲＭ３−Ｇ５−Ｓｐｅｃ２００培地中において、より高温（３７℃）で一晩培養することにより、プラスミドキュアリングおよびＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅコンストラクトの組み込みを実施した。次に１０μＬの培養物を２ｍＬのｍＲＭ３−Ｇ５−Ｓｐｅｃ２００培地中で希釈して、さらなる継代のために増殖させた。３７℃でグルコース培地中において、全部で５代の継代を実施した。高温増殖の結果として、集団の大部分は、もはやｐＺＰ５２プラスミドを保有するはずはないが、ＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅコンストラクト（選択的マーカーを欠く）が、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムのｌｄｈＡ遺伝子に組み込まれたはずである。集団の少数が、ｐＺＸ５２を組み込まずに保持することもある。
【０１５３】
（３）集団は、２ｍＬのｍＲＭ３−Ｘ１０−Ｓｐｅｃ２００中で、５０μＬの細胞プールを３０℃で一晩培養して濃縮した。濃縮された集団は、ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート上で一晩３０℃で増殖させた。個々のコロニーを選択して、ＭＭＧ５プレートおよびＭＭＧ５−ＣＭ１２０プレート上に、複製で画線塗抹した。３０℃で一晩の培養後、ＭＭＧ５上で増殖したがＭＭＧ５−ＣＭ１２０上では増殖しなかったコロニーを、さらなるＰＣＲ検査のために選択した。第１のＰＣＲは、順方向プライマーａｒａ４５（配列番号３６）と逆方向プライマーａｒａ３５６（配列番号３７）を使用して、ｐＺＸ５２中でＬＤＨ−Ｌ断片によって媒介される二重交差型組換えを調べた。ａｒａ４５プライマーは、ゲノム中のＬＤＨ−Ｌ断片の８６ｂｐ上流のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ断片と一致し、ａｒａ３５６はｐＺＸ５２中のＥＣＴａｌコード領域断片（ｎｔ−９１〜ｎｔ−１１２）を補完した。組み込みが設計通りに起きたならば、ＰＣＲは、コロニーからの１，３８３ｂｐの断片を増幅する。第２のＰＣＲは、順方向プライマーａｒａ３５４（配列番号３８）と逆方向プライマーａｒａ４３（配列番号３９）を使用して、ｐＺＸ５２中でＬＤＨ−Ｒ断片によって媒介される二重交差型組換えを調べた。ａｒａ３５４プライマーは、ｐＺＸ５２中のＺＭＲｐｅの３’末端近くの配列である。ａｒａ４３プライマーは、ＬＤＨ−Ｒ断片の１２２ｂｐ下流のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ断片を補完する。組換えが予測されたようであれば、このＰＣＲは、コロニーからの１，４６８ｂｐ断片を増幅する。どちらのＰＣＲも予測されたサイズのＤＮＡ断片を生じ、それはＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅコンストラクトが、検査されたコロニーの全てに、設計通りに正確に組み込まれたことを立証した。得られたコロニーは、ＺＷ１−Ｘ１０９と命名された。
【０１５４】
第２のアプローチでは、ＺＷ１−ｐＺＸ２１株をｐＺＸ６ＤＣＯシャトルベクターによって形質転換し、適応が１０代でなく４代の継代であったこと以外は、ＺＷ１−Ｘ１０９について上述されたキシロース適応段階を含む、３つの形質転換後手順を実施した。したがってＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅコンストラクトは、内在性ｐｎｐ遺伝子の標的とされる。ＺＷ１−Ｘ１０９の構築で説明されるように、３つの形質転換後手順に先だって４８時間増殖アッセイを実施して、全ての導入遺伝子が予測されたように機能することを確実にした。３つの形質転換後手順の後、組み込みはまた、ＰＣＲによっても検査した。第１のＰＣＲは、順方向プライマーａｒａ３４０（配列番号４０）と逆方向プライマーａｒａ３５６（配列番号３７）を使用して、ｐＺＸ６中でＰＮＰ−Ｌ断片によって媒介される二重交差型組換えを調べた。ａｒａ３４０プライマーは、ＰＮＰ−Ｌ断片の７５ｂｐ上流であるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡに一致する。本明細書で使用されるａｒａ３５６プライマーは、ｐＺＸ６中のＥＣＴａｌの断片（ｎｔ−９１〜ｎｔ−１１２）を補完する。ＰＣＲは、正確な組み込み事象に対して予測されたように、１，８１５ｂｐの断片を形質転換体から生じた。第２のＰＣＲは、順方向プライマーａｒａ３５４（配列番号３８）と逆方向プライマーａｒａ３３９（配列番号４１）を使用して、ｐＺＸ６中でＰＮＰ−Ｒ断片によって媒介される二重交差型組換えを調べた。この場合、ａｒａ３５４プライマーは、ｐＺＸ６中のＺＭＲｐｅの３’末端近くの配列に一致し、ａｒａ３３９プライマーは、ＰＮＰ−Ｒ断片配列の５９ｂｐ下流のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ断片を補完する。このＰＣＲは、成功裏の組み込みに期待されるサイズである、１，５４９ｂｐの断片を形質転換体から増幅した。したがってＰＣＲ検査は、ＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅコンストラクトが、検査されたコロニーの全てに正確に組み込まれたことを立証した。この新しい株は、ＺＷ１−Ｘ２１０と命名された。
【０１５５】
要約すれば、２つのキシロース利用Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株が、野性型ＺＷ１から新規に再構築された。これらはどちらも、ｇｆｏｒ遺伝子座に組み込まれたＰｇａｐＳ−ＡＭｘｙｌＡ：：Ｐｅｎｏ−ＥＣｘｙｌＢ：：Ｓｐｅｃ−Ｒコンストラクトを有した。ＺＷ１−Ｘ１０９株が、ｌｄｈＡ遺伝子座に組み込まれたＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅコンストラクトを有した一方で、ＺＷ１−Ｘ２１０株は、内在性ｐｎｐ遺伝子に組み込まれた同一コンストラクトを有した。どちらの株も、組み込まれたＰｇａｐＳ−ＡＭｘｙｌＡ：：Ｐｅｎｏ−ＥＣｘｙｌＢ：：Ｓｐｅｃ−Ｒコンストラクト中に、１つのマーカー遺伝子を有し、それはＣｒｅリコンビナーゼの導入によって除去し得た。
【０１５６】
新しいキシロース利用Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の特性解析
各株がキシロースを利用する能力を測定するために、２０ｍＬのｍＲＭ３−Ｘ１０中で振盪フラスコ発酵を実施した。ＯＤ６００値と、キシロースおよびエタノール双方の濃度とを０、２４、４８、および７２時間目に測定した。図４は、ＺＷ１−Ｘ１０９（Ａ）、ＺＷ１−２１０（Ｂ）、およびＺＷ１（Ｃ）についての結果の要約である。結果は、新しい株が、どちらもキシロースを発酵できることを裏付ける。７２時間の発酵後、ＺＷ１−Ｘ１０９は、約６４．２％のキシロースを利用して（１０５．６ｇ／Ｌから３７．８ｇ／Ｌへの低下）、３１．５ｇ／Ｌのエタノール力価と、３．５１のＯＤ６００値へのバイオマス成長を維持し；ＺＷ１−Ｘ２１０は、ほぼ全ての利用可能キシロースを利用して（１０５．６ｇ／Ｌから１．６ｇ／Ｌへの低下）、４８．５ｇ／Ｌのエタノール力価と、５．２２のＯＤ６００値へのバイオマス成長を維持した。しかしＺＷ１は、キシロース代謝経路を欠くために、ｍＲＭ３−Ｘ１０中で増殖し得なかった。したがって新しい株の中では、ＺＷ１−Ｘ２１０は、キシロース含有単一糖培地中で、ＺＷ１−Ｘ１０９よりも迅速にキシロースを発酵し得た。ＺＷ１−Ｘ１０９とＺＷ１−Ｘ２１０の間の大きな違いは、ＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅコンストラクトが、ＺＷ１−Ｘ１０９ではｌｄｈＡ遺伝子座に挿入され、ＺＷ１−Ｘ２１０では内在性ｐｎｐ遺伝子に挿入されたことであった。この結果は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中のｐｎｐ遺伝子の中断が、キシロース代謝に利益をもたらし得ることを示唆する。
【０１５７】
ＺＷ１−Ｘ１０９およびＺＷ１−Ｘ２１０株のゲノムは、実施例１に記載されるように配列決定してＺＷ１ゲノム配列と比較した。違いの中には、双方の株のＺＭＯ０９７６コード領域における配列変化があった。ＺＷ１−Ｘ１０９では、コード領域配列（配列番号１天然ＺＭＯ０９７６配列）の位置９１７に、ＧからＡへの変異があった。この変異は、コドン３０６をＴＧＧ（トリプトファンをコードする）からタグ停止コドンに変化させ、それはＣ末端の３５個のアミノ酸を排除することによって、常態では３４０個のアミノ酸がコードするタンパク質（配列番号２）を短縮する。ＺＷ１−Ｘ２１０株では、ＺＭＯ０９７６プロモーター領域の１２５ヌクレオチドを含む大型の欠失と、コード領域の４７５ヌクレオチドからの延長がある。
【０１５８】
実施例３
ＺＷ１中のＺＭＯ０９７６遺伝子をノックアウトする自殺コンストラクトの作成
野性型ＺＷ１株中のキシリトール生成に対する、ＺＭＯ０９７６の単独変異の効果を直接評価するために、この遺伝子を挿入不活性化し得る自殺コンストラクトを下述するように作成した。
【０１５９】
ｐＭＯＤｌｉｎｋｅｒ−Ｃｍの構築
ｐＭＯＤｌｉｎｋｅｒ−Ｃｍ（図５）は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中でＺＭＯ０９７６遺伝子を挿入不活性化（「ノックアウト」）するようにデザインされた、自殺コンストラクト（ｐＡＲ−ｃｍ）の作成において、重要なプラスミド中間体であった（Ｓｅｏら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：６３−６８）。米国特許第７，９８９，２０６号明細書で詳述されるｐＭＯＤ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＳｐｅｃプラスミドのＮｏｔＩおよびＰａｃＩ部位の間に、クロラムフェニコール（Ｃｍｒ）に対する耐性を与えるＤＮＡ断を挿入して、スペクチノマイシン（Ｓｐｅｃｒ）に対する耐性を与えるＤＮＡ断片を以下のように置換した。ｐＭＯＤ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＳｐｅｃをＰａｃＩおよびＮｏｔＩで順次消化して、２．６ｋｂベクターＤＮＡ断片を１％アガロースゲルから精製した。次にプライマーＣｍ−Ｆ−ＮｏｔＩ（配列番号４４；ＮｏｔＩ部位を下線で示す）およびプライマーＣｍ−Ｒ−ＰａｃＩ（配列番号２；ＰａｃＩ部位を下線で示す）を使用して、市販されるプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（Ｂｏｃａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）からＣｍｒ遺伝子を、付随するプロモーターと共にＰＣＲ増幅した。
【０１６０】
プライマーＣｍ−Ｆ−ＮｏｔＩ（配列番号４４）：
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＡＧ
プライマーＣｍ−Ｒ−ＰａｃＩ（配列番号４５）：
ＴＣＡＣＴＣＡＴＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＴＡＴＴＣＡＧＧＣＧＴＡＧＣＡＣＣＡＧ
０．９ｋｂのＰＣＲ産物はまた、ＰａｃＩおよびＮｏｔＩで切断して、精製ＤＮＡ断片を上述のＰａｃＩ／ＮｏｔＩ−ｃｕｔベクター断片にライゲートして、ｐＭＯＤｌｉｎｋｅｒ−Ｃｍを得た（図５）。この３５２５ｂｐのプラスミドは、２つのモザイク末端（ＭＥ）の間に位置する、ｌｏｘＰが側面に位置するＣｍｒ−カセットを有し、Ｔｎ５トランスポサーゼがそれと相互作用してトランスポソームを形成する。
【０１６１】
プラスミドｐＡＲ−ｃｍの構築
宿主媒介二重交差相同的組換えによって、自殺コンストラクト（ｐＡＲ−ｃｍ）を使用して、ＺＷ１中のＺＭＯ０９７６遺伝子をノックアウトした。この操作のために使用されたプラスミドは、ＺＷ８０１−４中のｈｉｍＡ遺伝子をノックアウトするために先に使用された自殺コンストラクト（ｐＨｉｍＡ）と類似している。ｐＨｉｍＡの構築は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，８９７，３９６号明細書に詳述される。本発明で使用されたｐＡＲ−ｃｍ自殺コンストラクト（図６Ａ）を作成するために、ｐＨｉｍＡ中の５’−および３’−ｈｉｍＡが側面に位置するＤＮＡ断片を、５’−および３’−ＺＭＯ０９７６が側面に位置するＤＮＡ断片で置換して、選択可能なマーカーおよび二重交差事象を染色体のＺＭＯ０９７６遺伝子に標的化した。さらに、ｐＨｉｍＡ中のｌｏｘＰが側面に位置するスペクチノマイシン耐性（Ｓｐｅｃｒ）カセットを、ｌｏｘＰが側面に位置するクロラムフェニコール耐性（Ｃｍｒ）カセットで置換した。下述するようにｐＡＲ−ｃｍを作成するために、４つの精製ＤＮＡ断片が必要であった。
【０１６２】
断片１は、４種の異なる制限酵素ＮｏｔＩ、ＢｓａＩ、ＳｂｆＩ、およびＡｓｃＩによってプラスミドを切断することで、以前米国特許第７，８９７，３９６号明細書に記載されたｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷから得られた。ＮｏｔＩはｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷをｎｔ２６４７で切断し、ＢｓａＩはプラスミドをｎｔ１８１６で切断する。プラスミドＤＮＡを４種の制限酵素で完全に消化した後、１％アガロースゲルおよびＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キット（カタログ番号４００１、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、電気泳動によって２６６６ｂｐのＳｂｆＩ−ＡｓｃＩＤＮＡ断片を精製した。断片１と命名されたこの断片は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中で機能しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点と、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にアンピシリン耐性をもたらす遺伝子とを含有する。
【０１６３】
断片２は、ｐＭＯＤｌｉｎｋｅｒ−ＣｍのＦｓｅＩとＡｓｉＳＩ部位の間に位置する、１００２ｂｐの一続きのＤＮＡに相当する（図５）。上述の通り、このＤＮＡ断片は、両端に１つずつの２つの野性型ｌｏｘＰ部位で挟まれた、Ｃｍｒカセットを含有する。断片２の完全なＤＮＡ配列は、配列番号４６に記載される。
【０１６４】
断片３は、３’−ＺＭＯ０９７６が側面に位置するＤＮＡを含有する、この約１．２ＫｂのＤＮＡ断片は、プライマーＡ（配列番号４７）およびＢ（配列番号４８）を使用して、ＰＣＲによって作成された。ＰＣＲ増幅のためのテンプレートは、ＷｉｚａｒｄゲノムＤＮＡ精製キット（カタログ番号Ａ１１２５、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＺＷ６５８（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８）から単離されたゲノムＤＮＡであった。
【０１６５】
プライマーＡ（配列番号４７）：
ＣＴＡＣＴＣＡＴｃｃｔｇｃａｇｇＣＴＴＣＴＣＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＴＴＧＣ
プライマーＢ（配列番号４８）：
ＴＣＡＣＴＣＡＴｇｇｃｃｇｇｃｃＧＡＡＣＡＧＡＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＴＧＡＴＧ
【０１６６】
プライマーＡ（順方向プライマー）の下線付き塩基は、ＺＭＯ０９７６コード領域下流の機能未知タンパク質（ＺＭＯ０９７５遺伝子の産物）のコード領域中央で結合する一方、小文字はプライマーの５’末端に付加されたＳｂｆＩ部位に相当する。プライマーＢ（逆方向プライマー）の下線付き塩基は、ＺＭＯ０９７６読み取り枠３’末端とハイブリダイズする一方、小文字はプライマーの５’末端に付加されたＦｓｅＩ部位に相当する。プライマーＡおよびＢの染色体結合部位、および生成されたＰＣＲ産物は、図６Ｂに示される。ＰＣＲ産物をＳｂｆＩおよびＦｓｅＩで消化して、次に上述したように、得られた１１６８ｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した。
【０１６７】
断片４は、５’−ＺＭＯ０９７６が側面に位置するＤＮＡを含有する、この約１．１ｋｂのＤＮＡ断片は、プライマーＣ（配列番号４９）およびＤ（配列番号５０）を使用して、ＰＣＲによって作成された。ＰＣＲ増幅のためのテンプレートは、ＷｉｚａｒｄゲノムＤＮＡ精製キット（カタログ番号Ａ１１２５、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＺＷ６５８（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８）から単離されたゲノムＤＮＡであった。
【０１６８】
プライマーＣ（配列番号４９）：
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴｇｃｇａｔｃｇｃＧＡＴＣＡＡＴＣＧＣＣＣＧＡＴＧＡＡＴＧ
プライマーＤ（配列番号５０）：
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴｇｇｃｇｃｇｃｃＴＣＧＣＣＧＴＡＴＴＧＴＡＴＣＧＣＴＧ
【０１６９】
プライマーＣ（順方向プライマー）の下線付き塩基は、ＺＭＯ０９７６読み取り枠５’末端でハイブリダイズする一方、小文字はプライマーの５’末端に付加されたＡｓｉＳＩ部位に相当する。プライマーＤ（逆方向プライマー）の下線付き塩基は、ＺＭＯ０９７６遺伝子上流の推定上の「ペリプラズム結合タンパク質」をコードする遺伝子の読み取り枠の中央でハイブリダイズする一方、小文字はプライマーの５’末端に付加されたＡｓｃＩ部位に相当する。プライマーＣおよびＤの染色体結合部位、および作成されたＰＣＲ産物は、図６Ｂに示される。ＰＣＲ産物をＡｓｉＳＩおよびＡｓｃＩで消化して、得られた１０８６ｂｐの断片を１％アガロースゲルを使用して、電気泳動によって精製した。
【０１７０】
次に上述の４つのＤＮＡ断片に、４方向ライゲーションを実施して、図６Ａに示されるＺＭＯ０９７６ノックアウトコンストラクト（ｐＡＲ−ｃｍ）をアセンブルした。この反応のために使用された断片＃１〜＃４のモル比は、約１：１：１：１であった。ライゲーション反応混合物のアリコートを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに電気穿孔して、形質転換細胞をクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上に播種した。次にプレートを３７℃で培養した。プライマーＡ／プライマーＤを使用して、コロニーＰＣＲによって、正しいサイズの挿入断片があるプラスミドを含有するクロラムフェニコール耐性形質転換体を最初に同定した。引き続く陽性クローンの確認は、ＰＣＲ陽性クローンからのｐＡＲ−ｃｍプラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列分析から得られた。
【０１７１】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の形質転換に必要な非メチル化プラスミドＤＮＡを得るために、ｐＡＲ−ｃｍを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０（ｄｃｍ−、ｄａｍ−）に導入し、形質転換細胞をクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上に播種して；３７℃で増殖させた。この操作で使用される化学的コンピテント細胞は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カタログ番号２００２４７）から得られ、供給業者のプロトコルに従った。ＤＨ１０Ｂのような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野性型株から単離されたメチル化プラスミドＤＮＡは、宿主の制限／修飾系によって容易に破壊されるので、ＺＭ４に由来するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株形質転換のための非メチル化プラスミドＤＮＡの使用が成功の鍵であることに、留意することが重要である。最後のステップでは、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号１２９４３）を使用して、プラスミドＤＮＡをＳＣＳ１１０形質転換体の１つから単離し、ＤＮＡの最終濃度は約１．５μｇ／μｌであった。
【０１７２】
実施例４
ＺＷ１  ＺＭＯ０９７６ノックアウト変異株の作成
ＺＷ１の中でＺＭＯ０９７６遺伝子を不活性化するために、一般方法セクションに記載されるように電気穿孔を使用して、非メチル化ｐＡＲ−ｃｍプラスミドＤＮＡ（Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中で自己複製しない）をＺＷ１コンピテント細胞に導入した。１．０ｍｌのＭＭＧ培地中で３時間の回復期間後、遠心分離（１３，０００×ｇで１分間）によって形質転換細胞を収集し、細胞ペレットを３００μＬのＭＭＧ培地に再懸濁した。次に１２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（ＭＭＧ／Ｃｍ１２０プレート）を含有するＭＭＧ寒天プレート上に、細胞懸濁液のアリコートを播種して、プレートを嫌気性条件下で３日間にわたり３３℃で培養した。さらなる操作のために、得られたクロラムフェニコール耐性コロニーの内２つを無作為に選択した。上述したように双方のコロニーをＭＭＧ／Ｃｍ１２０プレート上に画線塗抹して、２４時間培養した。次に新しいパッチを新鮮ＭＭＧ／Ｃｍ１２０プレート上に再度画線塗抹し、同一条件下で２４時間の増殖期間後、下述するようにして、得られた細胞パッチにさらなる分析を実施した。
【０１７３】
米国特許第７，８９７，３９６号明細書に記載されるように、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）染色体と自殺コンストラクト間の最初の相互作用は、２つの側面に位置するＤＮＡ配列の１つで起きる単一乗換え事象であり、単一乗換え事象は最終的に二重交差事象を引き起こす。二重交差への移行は、（この事象が致死性であったり、あるいはより緩慢な増殖速度をもたらす場合を除いて）常態では非常に迅速であり、この場合はクロラムフェニコールである、自殺コンストラクトに対する選択作用物質を含有する、液体または固体培地中における数回の連続移動後に通常起きる。選択された２つの株のＺＷ１染色体中の正しい位置で、ｐＡＲ−ｃｍ自殺コンストラクトが二重交差事象を確かに起こしたことを確認するために、異なる３対のプライマー（プライマーＥ／プライマーＦ、プライマーＧ／プライマーＨ、プライマーＩ／プライマーＪ）を使用して、コロニーＰＣＲ実験を実施した。
【０１７４】
プライマーＥ（配列番号５１）：
ＣＴＡＣＴＴＣＡＣＴＴＣＡＴＧＡＣＣＧＧ
プライマーＦ（配列番号５２）：
ＡＧＴＣＡＴＧＣａｇｇｃｃｔＣＴＧＡＴＧＡＡＴＧＣＴＣＡＴＣＣＧＧＡＡ
プライマーＧ（配列番号５３）：
ＧＴＣＴＧＡＣＧＴＴＧＡＴＣＣＴＧＡＴＣ
プライマーＨ（配列番号５４）：
ＴＣＡＣＴＣＡＴｇｇｃｃｇｇｃｃＴＧＣＧＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＧＣＣＣＡＴＧＧ
プライマーＩ（配列番号５５）：
ＧＴＴＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＧ
プライマーＪ（配列番号５６）：
ＣＣＣＧＧＡＡＧＣＴＡＴＣＡＡＡＡＴＴＴＴＧ
【０１７５】
プライマーＥ、Ｉ、Ｊ、およびＧは、図７に示される位置で、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）染色体にハイブリダイズする。プライマーＦおよびＨの下線付き塩基は、所望の二重交差事象が起きた後に染色体に挿入されたクロラムフェニコール耐性（Ｃｍｒ）カセットに、ハイブリダイズする（図７）。プライマーＥおよびＦを使用した１９２１ｂｐのＰＣＲ産物は、ＺＭＯ０９７６遺伝子の一端で正しい単一乗換え事象が起きたことを示す一方、プライマーＧおよびＨを使用した１９４２ｂｐのＰＣＲ産物は、他端で正しい単一乗換え事象が起きたことを示す。正しい二重交差事象が起きた場合、プライマーＩおよびＪは、１７６３ｂｐの単一ＰＣＲ産物のみを生じ得る。対照的にこのプライマー対は、野性型ＺＷ１株では、または単一乗換え事象から二重交差事象への移行がなおも完了していない形質転換体の混合集団では、１４６８ｂｐのＰＣＲ産物を生じる。プライマーＩおよびＪによる１７６３ｂｐのＰＣＲ産物の存在、および１４６８ｂｐのＰＣＲ産物の不在は、所望の二重乗換え事象を有するＺＭＯ０９７６ノックアウト変異株の均質集団を示す。上述のＰＣＲストラテジーを使用して、さらなる分析のために選択されたコロニーは、どちらも真の二重交差事象であることが示され、これらの２つの株はＡＲ１およびＡＲ２と命名された。
【０１７６】
実施例５
生体内キシリトール生成と、無細胞抽出物内ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性とに対する、ＺＭＯ０９７６挿入不活性化の効果
野性型ＺＭＯ９７６遺伝子が、生きている細胞中でＤ−キシロースをキシリトールに変換できる酵素をコードする可能性を試験するために、野性型ＺＷ１および２つのＺＷ１／ＺＭＯ０９７６ノックアウト変異株（ＡＲ１およびＡＲ２）で、グルコースおよびキシロースの双方を含有する合成培地中での増殖中のキシリトール生成をモニターした。この実験のための種培養は、３３℃において７ｍｌの８０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、および１ｇ／ＬのＭｇＳＯ２  （７Ｈ２Ｏ）中で、約１．８のＯＤ６００に増殖させた。次に種培養のアリコートを使用して、６０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌのキシロース、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、６ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ２  （７Ｈ２Ｏ）、および２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）  ２ＳＯ４を含有する１０ｍｌの培養物に接種し；最終ｐＨを濃水酸化カリウムでｐＨ５．９に調節した。培養物を３３℃で増殖させ、初期ＯＤ６００値は約０．１１であった。０、１５．５、３９、６０、および１１２時間の増殖後、屈折率検出器（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）を装着したＨＰ  １１００を使用したＨＰＬＣ分析のために、培養物の１．０ｍｌアリコートを取り出して、一般方法セクションに記載される手順を使用して、発酵ブロス中に存在するキシリトールの濃度を測定した。
【０１７７】
図８に示されるように、キシリトール生成の速度および程度は、２つのＺＷ１／ＺＭＯ０９７６ノックアウト変異株よりも、野性型ＺＷ１ではるかにより大きかった。例えば実験の最初の４０時間中に、ＡＲ１およびＡＲ２双方の発酵ブロス中のキシリトールの量は、約０．１ｇ／ＬのＨＰＬＣ検出レベル未満であった。そして実験の終わりには、野性型ＺＷ１は、ＺＷ１／ＺＭＯ０９７６ノックアウト変異株のどちらと比較しても、約３〜４倍より多くのキシリトールを産生し；ＡＲ１およびＡＲ２がそれぞれ０．２５４ｇ／Ｌおよび０．１９ｇ／Ｌであったのに対し、０．７３６ｇ／Ｌであった。ＡＲ１およびＡＲ２によって産生されたより少ないキシリトール量は、より低い細胞密度の帰結でないことに留意すべきであり、全てのグルコースが消費された３９時間後の時点におけるＯＤ６００値は、野性型ＺＷ１の６．２５に対して、ＡＲ１およびＡＲ２では７．２９および６．９８であった。
【０１７８】
上の実験において、野性型ＺＷ１によって産生されたキシリトールの量は、同等の実験条件下で、対照プラスミドｐＺＢ１８８／Ｋａｎを持つ同一株について以前報告された値と同様であった（米国特許第７，７４１，０８４号明細書の図１４Ａ）。しかしこれらの値は、キシロースイソメラーゼ発現プラスミドｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡを野性型ＺＷ１に導入した場合に生成したキシリトール量よりも、少なくとも３倍低かった（米国特許第７，７４１，０８４号明細書の図１４Ｂ）。キシロースイソメラーゼによってキシロースがキシルロースに変換され得る場合に観察されるより大量のキシリトールは、グルコースフルクトース酸化還元酵素（ＧＦＯＲ）の帰結であり、それは次にキシルロースをキシリトールに変換できる。米国特許第７，７４１，０８４号明細書に記載されるように、ＧＦＯＲは、生体内キシリトール生成の大きな要因であるが、グルコースが存在して、キシルロース源が利用できる場合に限られる。図８の結果は、ＺＭＯ０９７６遺伝子産物もまた、生体内キシリトール生成の顕著な要因であることを明らかに示す。しかし野性型株ＺＷ１中のキシロースイソメラーゼ不在が原因で、ＧＦＯＲが媒介するキシリトール経路が動作不能である条件でさえも、この遺伝子の不活性化が、生体内キシリトール生成を完全に排除しないこともまた明らかである。ＺＭＯ０９７６遺伝子産物が、キシロースからキシリトールへの変換を触媒できることの直接的実証を提供するために、野性型ＺＷ１とＡＲ１の無細胞抽出物を調製し、ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性を評価した。この実験で使用された無細胞抽出物の調製および分光光度法酵素アッセイは、一般方法セクションに記載される。野性型ＺＷ１のＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性の比活性は、用いられた条件下で１４ｍＵ／ｍｇであった。それと大いに異なって、ＺＷ１／ＺＭＯ０９７６ノックアウト変異株では、ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性は、検出不能であった。実際に、ＡＲ１株から調製された無細胞抽出物中のＮＡＤＰＨ消失の評価は、キシロースの存在下よりも、キシロース不在下でわずかにより迅速であった。したがってこの実験から、ＺＷ１中のＺＭＯ０９７６遺伝子産物除去が、ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性を９０％を超えて低下させると結論して間違いない。
【０１７９】
実施例６
ＺＭＯ０９７６不活性化はキシロース上における適応とキシロース利用経路の直接選択なしでキシロース上の即事増殖を可能にする
機能性ＺＭＯ０９７６遺伝子が、キシロース代謝に必要な４つの遺伝子を保有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）組換え株について、キシロース上での増殖に対する非許容条件を構成するという仮説を試験するために、プラスミドｐＺＢ４を野性型ＺＷ１と、ＺＷ１／ＺＭＯ９７６ノックアウト変異株ＡＲ１とに導入した。参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，５１４，５８３号明細書の実施例３に記載されるように、ｐＺＢ４は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中で自己複製する多コピーシャトルベクターである。選択可能なマーカーの役割を果たすテトラサイクリン耐性カセットに加えて、このプラスミドは、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のキシロース代謝経路の完成に必要な４つの遺伝子を含有し、それは２つの合成キメラオペロンから発現される。オペロンの１つは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｐｇａｐプロモーター（Ｐｇａｐ−ｘｙｌＡ／ｘｙｌＢオペロン）制御下にある、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼコード領域を含有する一方、もう一方は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｐｅｎｏプロモーター（ＰＥＮＯ−ｔａｌ／ｔｋｔオペロン）によって駆動される、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼコード領域からなる。
【０１８０】
一般方法セクションに記載されるように、非メチル化ｐＺＢ４プラスミドＤＮＡをＺＷ１およびＡＲ１に電気穿孔した。電気穿孔後、５０μｌの変換反応を全て１０ｍｌのＭＭＧ培地に添加して、細胞を静止条件下で５時間３０℃で回収した。次に細胞を遠心分離によって収集し、８ｍｌの上清を取り出して、２５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する等容積のＭＭＧ培地（ＭｇＳＯ４なし）で置き換えた。次に得られた培養物を３３℃で約１８時間培養して、プラスミド保有形質転換体を濃縮した。恐らくはこのプラスミドの大型サイズのために、変換効率は極めて低いので、この濃縮ステップは非常に重要である。濃縮過程に続いて、細胞を遠心分離によって収集し、細胞ペレットを８００μｌのＭＭＧ（ＭｇＳＯ４なし）に再懸濁した。次に、各細胞懸濁液の１００μｌアリコートをテトラサイクリン（２０μｇ／ｍｌ）を含有するＭＭＧ寒天プレート（ＭｇＳＯ４なし）上に播種して、プレートを嫌気性チャンバー内で３３℃で培養した。４８時間後、ＺＷ１およびＡＲ１形質転換体双方のプレート上には約１００個のコロニーがあり、それらは双方の株で同様のサイズ（２〜３ｍｍ）であった。次にいかなる追加的操作もない、下述する実験におけるさらなる特性解析のために、３つのＺＷ１／ｐＺＢ４コロニー（−Ａ、−Ｂ、および−Ｃ）および３つのＡＲ１／ｐＺＢ４コロニー（−１、−２、および−３）を無作為に選択した。ｐＺＢ４プラスミドを保有する６つの株は全て、プライマーＴＦ−２およびプライマーＴＲ−９（配列番号５７および５８）を使用した再懸濁細胞のＰＣＲ解析によって確認された。これらのオリゴヌクレオチドは、ｐＺＢ４中に存在するＰｅｎｏ−Ｔａｌ／Ｔｋｔオペロンにハイブリダイズして、１６８１ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し、６つの株は全て正しいサイズのＤＮＡ断片を産生した。
【０１８１】
図９は、２０ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを添加した（１００ｇ／Ｌのキシロースを唯一の糖として含有する）ｍＲＭ３−Ｘ１０を試験培地として使用した、振盪フラスコ実験を示す。この試験で使用された接種菌液は、先にキシロースに曝露されていない、上述のグルコース／テトラサイクリン寒天プレートからの６個のコロニーであった。培養物を３３℃で増殖させ、初期ＯＤ６００は約０．０３５であった。野性型ＺＭＯ０９７６遺伝子を有した３つのＺＷ１／ｐＺＢ４形質転換体は、それらがキシロース代謝に必要な４つの遺伝子を全て含有したという事実にもかかわらず、キシロース上で増殖できなかった（図９）。実際に、３日間の培養期間の後でさえも、これらの培養物のＯＤ６００は、約６０％のみ増大し、それは倍加を下回る。それと著しい対照を成して、ｐＺＢ４プラスミドを保有する３つのＺＷ１／ＺＭＯ９７６ノックアウト変異株コロニーをＭＭＧ／テトラサイクリンプレートからキシロース含有培地に移した場合は、予備キシロース適応段階の必要なく、増殖が即座に開始した（図９）。
【０１８２】
上の結果を考慮して、実験を実施して、ＡＲ１／ｐＺＢ４形質転換体をテトラサイクリンなしのキシロースを唯一の炭素源として含有する固体培地に直接播種することで、それらを回収できるかどうかを試験した。ｐＺＢ４プラスミドＤＮＡは、テトラサイクリンなしの１８時間の濃縮ステップを含む、上で説明した同一プロトコルを使用して、ＺＷ１およびＡＲ１に導入したこの処置に続いて、細胞を遠心分離によって収集し、１．０ｍｌのＭＭＸ培地（ＭＭＧ培地と同一であるがグルコースの代わりに５０ｇ／Ｌのキシロースを含有する）で２回洗浄し、最後に８００μｌの同一培地に再懸濁した。次に得られた細胞懸濁液の１００μｌアリコートをＭＭＸ寒天プレートと、テトラサイクリン（２０μｇ／ｍｌ）を含有するＭＭＧ寒天プレート（ＭｇＳＯ４なし）との上に伸ばして塗り、プレートを嫌気性条件下において３３℃で培養した。２４時間の培養期間後、ＭＭＧ／テトラサイクリンプレート上には、１３２個のＺＷ１コロニーと１１８個のＡＲ１コロニーがあった。したがってｐＺＢ４プラスミドＤＮＡによる形質転換効率は、双方の株で実質的に同一であった。しかしテトラサイクリンを欠くＭＭＸ寒天プレート上に、同一細胞懸濁液を直接播種した場合は、非常に異なる結果が得られた。１００時間の培養期間後、ＡＲ１では８５個のコロニー（約１ｍｍ）があり、野性型ＺＭＯ０９７６遺伝子を有するＺＷ１親株ではコロニーがなかった。
【０１８３】
上の結果は、機能性ＺＭＯ０９７６遺伝子産物が、キシロース代謝のために遺伝子改変されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）組換え株のキシロース上での増殖に対して、大きな障害を与えることを明らかに示す。この酵素は、キシロースをキシリトールに変換できるＮＡＤＰＨ依存性アルドース還元酵素である。キシリトールそれ自体は、細菌増殖を抑制せず、あるいは細胞死を引き起こさないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシルロキナーゼの周知の代案の基質であり、この酵素は、ＡＴＰ存在下でそれをリン酸化して、有毒化合物キシリトール５−リン酸を形成する。しかし図８に示されるように、ＺＭＯ０９７６遺伝子の不活性化は、生体内キシリトール生成に３〜４倍の低下をもたらし、これは、キシロース利用経路が導入された場合に、ＡＲ１／ｐＺＢ４形質転換体がキシロース上で即座に増殖できるようにした。換言すれば、ＡＲ１／ｐＺＢ４形質転換体は、ＺＷ１／ｐＺＢ４形質転換体よりも少ないキシリトールを産生し、したがってより少ないキシリトール５−リン酸を形成するので、それらは適応段階なしにキシロース上で増殖できる。上述の実験は、導入されたキシロース経路酵素が、キシロースが唯一の利用可能な炭素源である場合に、細菌増殖を維持するのに十分な炭素流を提供し得るという条件で、ＺＭＯ０９７６遺伝子の不活性化が、キシロース上での直接選択を可能にし得ることをさらに実証する。
【０１８４】
実施例７
ＺＷ１／ｐＺＢ４形質転換体の適応は少なくとも３つの異なるタイプの変異をもたらす
図９に示されるように、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＲＭ３−Ｘ１０培地に、グルコースプレート上のテトラサイクリン選択を通じて得られたＺＷ１／ｐＺＢ４−Ａ形質転換体を接種した場合、それはキシロース上で増殖しなかった。テトラサイクリンを欠くＭＭＸ１０培地（ＭＭＸ培地と同一であるが５０ｇ／Ｌのキシロースの代わりに１００ｇ／Ｌのキシロースを含有する）にこの株を接種した場合にも増殖は、観察されなかった。実際に、後者の実験は約０．２の初期ＯＤを使用して、８回にわたり実施したが、３３℃で６日間の培養期間の後でさえも、いずれの培養物にも濁度の増大はなかった。しかし下でより詳細に記載されるように、グルコースとキシロースの混合物を使用することで、我々は、ＺＷ１／ｐＺＢ４−Ａ株をキシロース上での増殖に適応させることができた。
【０１８５】
２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する１０ｍｌのｍＲＭ３−Ｇ５培地に、ＺＷ１／ｐＺＢ４−Ａグリセロール保存株を接種して、初期ＯＤは０．１であった；ｍＲＭ３−Ｇ５はｍＭＲ３−Ｇ１０と同一であるが、１００ｇ／Ｌの代わりに５０ｇ／ｌのグルコースを含有する。３３℃で９時間の培養期間後、ＯＤは約２．０に増大し、細胞を遠心分離によって収集した。２５０ｍｌの４５ｇ／Ｌのキシロース、５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）  ２ＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、および０．１ｍＭのＭｇＳＯ４および２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンに、細胞ペレットを０．０８の初期ＯＤで再懸濁した。次に再懸濁細胞の２３ｍｌアリコートを、緩く栓をした８本の５０ｍｌ試験管に分配し、培養物を３３℃で８６時間穏やかに浸透した。培養期間中にＯＤ値は約１．０に増大し、次に各培養のアリコートを５ｍｌのｍＲＭ３−Ｘ１０培地に添加した。新しい培養物を３３℃で２８．５時間培養し、その間にそれらのＯＤ値は、約０．０４から０．７〜１．１に増大した。次に２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＭＭＧ寒天プレート（ＭｇＳＯ４なし）上に、８つの各培養物のアリコートを個々に播種して、単一コロニーを単離した。３３℃で２日間の培養期間後、さらなる特性解析のために、各プレートから２個のコロニーを無作為に選択し；これらのコロニーは、元の８つの培養物にちなんで命名され、下で１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、８Ａ、および８Ｂ株と称される。
【０１８６】
予備実験を実施して、様々な株がキシロース上でいかに良く増殖するかを見た。１６個の各コロニーを５ｍｌのｍＲＭ３−Ｘ１０培地別々に接種して、培養物を３３℃で２１．５時間培養した。この実験中の増殖程度（ＯＤ増大）に基づいて、さらなる特性解析のために、各プレートから１個のコロニーを選択し、それは最適にキシロース中で増殖したものであった。選択された株は、１Ａ、２Ｂ、３Ｂ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂ、７Ａ、および８Ｂであり、元の８つの培養物の内の７つに相当した。４Ａおよび４Ｂ株は、予備実験中にキシロース上でほとんど増殖しなかっため、それらは下述の試験に含めず、６Ａおよび６Ｂの双方を含めた。
【０１８７】
増殖培地としてｍＲＭ３−Ｘ１０を用いた振盪フラスコ実験を、上で選択した８つの適応株を使用して実施した。培養物の初期ＯＤは約０．０５であり、温度は３３℃であった；この実験のために接種菌液として使用された予備培養物は、ｍＲＭ３−Ｘ１０中でもまた増殖した。キシロース中の増殖と、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析とに基づいて、株は、図１０に示されるように、３つの異なるグループに分類されるようであった。グループ１の株（１Ａ、３Ｂ、６Ａ、および８Ｂ）は全て同様に挙動して、キシロース上でその他の４株よりも迅速に増殖した。それらはまた、より高い最終ＯＤに増殖した。グループ２の株（２Ｂ、５Ｂ、および６Ｂ）は同様の動態で増殖したが、それらの増殖速度および最終ＯＤ値は、グループ１の株よりもはるかに低かった。グループ３の株（７Ａ）は最も緩慢に増殖したが、それは最終的に、グループ２の株よりも高いＯＤに達した。
【０１８８】
表１は、ＨＰＬＣ分析による測定で、上述の８つの培養物の発酵ブロス中のキシロース、キシルロース、リブロース、キシリトール、グリセロール、酢酸エステル、およびエタノールの終点値（１０２時間）を示す。グループ１の４つの株は全て、大量のキシリトール（＞３ｇ／Ｌ）を産生し、これはまた、グループ３の株である７Ａにも当てはまったことに留意されたい。それと大いに異なって、２Ｂ、５Ｂ、および６Ｂ株の発酵ブロス中に存在するキシリトールの量は検出レベル未満であり、定量化され得なかった。３つのグループはまた、キシリトールを除く他の副産物についても、異なるパターンとレベルを有した。例えばグループ１およびグループ３の株は、大量の酢酸エステルを産生したが、リブロースおよびグリセロールの産生は比較的低レベルであった。他方、グループ２の株は、大量のリブロースおよびグリセロールを産生したが、酢酸エステルはほとんど産生しなかった。最後に、グループ３の株（７Ａ）のみが大量のキシルロース（約４ｇ／Ｌ）を産生したが、それは改変キシロース経路中の第２の酵素、すなわちキシルロキナーゼの天然基質である。グループ１の株は、キシロース中でグループ２の株よりも迅速により高い最終ＯＤに増殖したが、それらのエタノール産生速度は、その他の２グループよりも顕著に緩慢であったこともまた興味深かった。
【０１８９】
【表１】
2015506169.tif 000003
【０１９０】
８つの適応株のいずれかにＺＭＯ０９７６中の変異があったかどうかを判定するために、Ｐｒｉｍｅｒ  ＩおよびＰｒｉｍｅｒ  Ｇ（配列番号５５および５３）およびテンプレートとして再懸濁細胞を使用して、遺伝子をＰＣＲ増幅した。生じたＤＮＡ断片は、ＺＭＯ０９７６コード領域全体に加えて、開始コドンから約９００ヌクレオチド上流、および停止コドンから約２００ヌクレオチド下流を含有した。得られたＰＣＲ産物に、６つの異なるプライマー（配列番号５９〜６４）を使用して、ＤＮＡ配列分析を実施した。
【０１９１】
グループ２の株のみが、ＺＭＯ０９７６遺伝子に変異を有した。株＃５Ｂは、読み取り枠内に８ｂｐの欠失を有し、それはフレームシフトをもたらした。欠失の始点は、開始コドンの第１のヌクレオチドから８５８ヌクレオチド下流であった。グループ２の他の２つの株（２Ｂおよび６Ｂ）は同胞種であり、ヌクレオチド３４９の読み取り枠内に、アミノ酸残基Ｅ１１７を停止コドンに変換する、ＧからＴへの点変異を有した。グループ２の株は、痕跡量のキシリトールのみを産生するものであったので、これらの結果は、表１に示されるＨＰＬＣデータと一致する。
【０１９２】
グループ１およびグループ３株の発酵ブロス中に見られた大量のキシリトールは、これらの株が、キシリトール毒性に対処する異なる機序を発達させたことを強く示唆した。既に指摘したように、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖と生存に対する阻害効果に関与するのは、キシリトールでなくキシリトール５−リン酸であり、キシリトール５−リン酸は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシルロキナーゼによって、ＡＴＰおよびキシリトールを必要とする反応中で産生される。したがってグループ１およびグループ３の株が、これらの株に導入されたｐＺＢ４プラスミドＤＮＡ中に存在する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシルロキナーゼ遺伝子（ｘｙｌＢ）中に、変異を獲得したことは可能だったと思われた。この仮説を検証するために、２つのＰＣＲプライマー（配列番号６５および６６）およびテンプレートとして再懸濁細胞を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＢ遺伝子（ＮＣＢＩ受入番号ＮＣ＿０００９１３、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４８１３３）を８つの適応株から増幅した。
【０１９３】
生じたＤＮＡ断片は、ｘｙｌＢコード領域全体と、停止コドンから約３００ヌクレオチド下流とを含有した。得られたＰＣＲ産物に、６つの異なるプライマー（配列番号６７〜７２）を使用して、ＤＮＡ配列分析を実施した。配列決定の結果は、グループ１の全ての株（１Ａ、３Ｂ、６Ａ、および８Ｂ）が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシルロキナーゼ読み取り枠内に点変異を有したことを示し、それは全く同じ変異であり、それらが同胞種であったことが示唆された。４つの株は全て、（開始コドンの第１のヌクレオチドに対して）ヌクレオチド２２４にＧからＡへの置換を有し、それは単一アミノ酸置換であるＧ７５Ｄ変異をもたらした。おそらくこの変異は、キシルロキナーゼ比活性を低下させるか、あるいはキシリトールに対するその基質特異性を低下させるかのいずれかである。いずれの展開も、より少ないキシルロース−５−リン酸の生成をもたらし、進行中のＺＭＯ０９７６媒介キシリトール生成中に、これらの株がキシロース中で増殖することを可能にするであろう。
【０１９４】
キシルロキナーゼ酵素活性に対するｘｙｌＢ点変異の効果を判定するために、グループ１の株の１つ（３Ｂ）と、野性型キシルロキナーゼ遺伝子を有する未適応ＺＷ１／ｐＺＢ４株の１つ（ＺＷ１／ｐＺＢ４−Ｂ）とから、無細胞抽出物を調製した。抽出物は、本質的に一般方法セクションに記載されるように調製したが、細胞は約１．０のＯＤで収集した。得られた抽出物を使用して、乳酸デヒドロゲナーゼおよびピルビン酸キナーゼとの酵素共役反応における、キシルロキナーゼ活性を測定した。１．０ｍｌの反応は、２０℃で石英キュベット内で実施され、以下の成分を含有した：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、２０単位の乳酸デヒドロゲナーゼ、８０単位のピルビン酸キナーゼ、１．５ｍＭのホスホエノールピルビン酸、０．２ｍＭのＮＡＤＨ、５ｍＭのＤ−キシルロース、および２．５〜１０μｌの無細胞抽出物同等物。キシルロースは、基線条件の確立後、最後に添加した。対照反応は同一であったが、キシルロースが添加されなかった。酵素活性は、６２２０Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、分光光度法で３４０ｎｍにおいて時間の関数として測定し、ＮＡＤＨのＮＡＤへの変換をモニターした。酵素活性は、キシルロース不在下のＮＡＤＨ酸化速度について補正した後に、Ｕ／ｍｇの無細胞抽出物タンパク質として表され；１Ｕ＝毎分１マイクロモルのキシルロース５−リン酸が形成される。キシルロース依存性ＮＡＤＨ酸化の信号対雑音比は、アッセイのために、未適応ＺＷ１／ｐＺＢ４株からの１０μｌの無細胞抽出物を使用した場合、６０を超える（すなわち対照反応に対する、キシルロース存在下のＮＡＤＨ消失速度）。
【０１９５】
未適応ＺＷ１／ｐＺＢ４株の平均キシルロキナーゼ比活性は、７％未満の変動があった三重反復測定に基づいて、用いられた条件下で３．６７Ｕ／ｍｇであった。それと大いに異なって、適応された３Ｂ株の平均比活性は、１６％の変動があった二重反復測定に基づいて、わずか０．２１Ｕ／ｍｇであった。したがって適応株３Ｂ中のＧ７５Ｄ点変異は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシルロキナーゼの比活性を野性型遺伝子と比較して約９５％低下させた。この変異は、明らかに、進行中のＺＭＯ０９１６媒介キシリトール中で細胞生存できるようにするが、図１０に示されるキシロース振盪フラスコ実験から、それはまた、キシロース利用およびエタノール産生速度に対する有害効果も有することが明らかである。さらに重要なのは、この変異を有する４つの株が全て、大量のキシリトール（表Ｉ）を産生することであり、それはエタノール産生の代謝収率を大幅に低下させる。
【０１９６】
グループ３の株である７Ａの変異の性質は、まだ判定されていない。プラスミド由来大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＢ読み取り枠内には変異はなかったが、表Ｉおよび図１０に示されるデータは、この適応株が、非常に低レベルのキシルロキナーゼ酵素活性もまた有することを強く示唆する。実際に、大量のキシリトールの蓄積に加えて、７Ａは、検出可能量のキシルロースを産生した唯一の株であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシルロキナーゼは、キシロースイソメラーゼがそれを生成し得る程に迅速には、キシルロースをリン酸化できないことが示唆される。
【０１９７】
要約すると、ＺＭＯ０９７６遺伝子の不活性化は、キシリトール生成および有毒キシリトール５−リン酸蓄積を大幅に低下させる。このストラテジーはまた、予備適応段階に対する必要性も排除して、キシロース代謝経路を有する組換えＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株が、キシロース上で即事増殖できるようにする。さらに重要なのは、ＺＭＯ０９７６の意図的な不活性化が、キシロース適応過程において生じ得る、他の自然突然変異を獲得する可能性を最小化することであり、それは上述の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＢ変異株などの生物が、キシリトール毒性に対処するのを助ける。
【図１】
2015506169.tif 000004
【図２】
2015506169.tif 000005
【図３Ａ】
2015506169.tif 000006
【図３Ｂ】
2015506169.tif 000007
【図３Ｃ】
2015506169.tif 000008
【図４Ａ】
2015506169.tif 000009
【図４Ｂ】
2015506169.tif 000010
【図４Ｃ】
2015506169.tif 000011
【図５】
2015506169.tif 000012
【図６】
2015506169.tif 000013
【図７】
2015506169.tif 000014
【図８】
2015506169.tif 000015
【図９】
2015506169.tif 000016
【図１０】
2015506169.tif 000017
【配列表】
2015506169000001.app
【国際調査報告】
2015506169.tif 000018
2015506169.tif 000019
2015506169.tif 000020
2015506169.tif 000021