(57)【要約】  本発明は、シュマーレンベルグウイルス（ＳＢＶ）の単離されたタンパク質又はペプチド、好ましくは、ＳＢＶヌクレオカプシドタンパク質の５〜５０個のアミノ酸、好ましくは５〜４０個のアミノ酸、更に好ましくは５〜２０個のアミノ酸、更に一層好ましくは１２〜１６個のアミノ酸、更に一層好ましくは５〜７個のアミノ酸を含む又はそれらからなる、好ましくは、配列番号２〜１４４又はそのフラグメントを含む又はそれらからなる部分を形成する、又は配列番号２〜１４４のうちの１つ少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する、単離されたタンパク質又はペプチド、ＳＢＶの検出方法及びＳＢＶ検出に用いるキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＢＶヌクレオカプシドタンパク質の５〜５０個のアミノ酸、好ましくは５〜４０個のアミノ酸、更に好ましくは５〜２０個のアミノ酸、更に一層好ましくは１２〜１６個のアミノ酸、更に一層好ましくは５〜７個のアミノ酸を含む又はそれらからなる、好ましくは配列番号２〜１３８又はそのフラグメントの一部を形成する又はそれらを含む又はそれらからなる、又は配列番号２〜１３８のうちの１つと少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する、単離されたペプチド。
【請求項２】
ペプチドが、図１（配列番号１）のアミノ酸位置１６〜５８、好ましくは、ＳＢＶのヌクレオカプシドタンパク質（Ｎｐ）のアミノ酸位置１６〜３２、１６〜２４、１８〜３５、２０〜３６、３５〜５０、６１〜８５、又は１７０〜２０５、好ましくは１７０〜１９０をカバーする、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
配列ＮＰＥＶＧＹＶＡＦＩＧＫＹＧＱＱＬＮＦＧＶＡ、ＮＰＥＶＧＹＶＡＦＩＧＫＹＧＱＱ、ＶＧＹＶＡＦＩＧＫＹＧＱＱＬＮＦ、ＶＡＦＩＧＫＹＧＱＱＬＮＦＧＶＡ、ＮＰＥＶＧＹＶ、ＥＶＧＹＶＡＦ、ＶＡＦＩＧＫＹ、ＦＩＧＫＹＧＱ、ＧＫＹＧＱＱＬ、ＹＧＱＱＬＮＦ、ＱＱＬＮＦＧＶ、ＱＬＮＦＧＶＡ、ＮＦＧＶＡ、ＬＮＦＧＶ、ＱＬＮＦＧ、ＱＱＬＮＦ、ＧＱＱＬＮ、ＹＧＱＱＬ、ＫＹＧＱＱ、ＧＫＹＧＱ、ＩＧＫＹＧ、ＦＩＧＫＹ、ＡＦＩＧＫ、ＶＡＦＩＧ、ＹＶＡＦＩ、ＧＹＶＡＦ、ＶＧＹＶＡ、ＥＶＧＹＶ、ＰＥＶＧＹ、ＮＰＥＶＧ、ＬＲＱＲＹＧＴＭＴＡＥＥＷＭＴＱＫＩＴ、ＧＦＳＰＡＡＲＴＦＬＱＱＦＧＩＮ、ＬＲＱＲＹＧＴ、ＱＲＹＧＴＭＴ、ＹＧＴＭＴＡＥ、ＴＭＴＡＥＥＷ、ＴＡＥＥＷＭＴ、ＥＥＷＭＴＱＫ、ＷＭＴＱＫＩＴ、ＧＦＳＰＡＡＲ、ＳＰＡＡＲＴＦ、ＡＡＲＴＦＬＱ、ＲＴＦＬＱＱＦ；及びＬＱＱＦＧＩＮからなる群から選択される、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の少なくとも２つのペプチドを含む単離されたペプチド混合物。
【請求項５】
ペプチドが、ＳＢＶ又はシンブ血清群ウイルスで感染した動物によって産生された抗体、好ましくは、ポリクローナル又はモノクローナル抗体と特異的に結合するエピトープを含む又はそれらからなる、請求項１から４までのいずれか１項に記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
ペプチドがウシ及びヒツジ由来の抗体に特異的に結合する、請求項５に記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
５〜５０個のアミノ酸を含み且つそこに含まれる配列番号２〜１３８のうち少なくとも１つを有する、単離されたペプチド。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項９】
ＳＢＶ又はシンブ血清群ウイルスで感染した非ヒト動物の同定方法であって、
ｉ．試料と、請求項１から７までのいずれか１項に記載のペプチドとを、試料中のＳＢＶに対して又はシンブ血清群ウイルスに対して特異的な抗体とペプチドとの複合体が形成し得る条件下で接触させる工程；
ｉｉ．こうして形成された複合体を、複合体の抗体に対して特異的な抗体又は請求項１から７までのいずれか１項に記載の標識されたペプチドを用いて検出する工程
を含み、その際、複合体の検出がＳＢＶ又はシンブ血清群ウイルスによる感染の指標である、前記方法。
【請求項１０】
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、好ましくは多段階工程又は一段階工程の方法である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＳＢＶ感染の検出方法で使用される請求項１から７までのいずれか１項に記載の１つ以上のペプチド。
【請求項１２】
試料中のＳＢＶ感染又はシンブ血清群ウイルスの検出用のキットであって、
ｉ．請求項１から７までのいずれか１項に記載の１つ以上のペプチド；及び
ｉｉ．ペプチドとＳＢＶ又はシンブ血清群ウイルスに対して特異的な抗体との間に形成された複合体の検出手段
を含む、前記キット。
【請求項１３】
２３３アミノ酸の、好ましくは、配列番号２〜１３８、又は配列番号１３９〜１４４（図３〜８）による、又はそのフラグメントのヌクレオカプシドタンパク質、又はシュマーレンベルグウイルス（ＳＢＶ）検出アッセイ又はシンブ血清群アッセイに使用されるそれらと９５％の同一性を有するタンパク質を含む、単離されたＳＢＶタンパク質。
【請求項１４】
試料中のＳＢＶに対する、好ましくはシンブ血清群ウイルスに対する抗体の特異的同定に有用なエピトープを含む単離されたペプチドであって、エピトープが、少なくとも５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも７個のアミノ酸、更に好ましくは１２個のアミノ酸、更に一層好ましくは５〜２５個の間の配列番号２〜１３８の又は配列番号１３９〜１４４（図３〜８）のアミノ酸を含む、前記単離されたペプチド。
【請求項１５】
請求項１又は請求項１３に記載のペプチド又はタンパク質又は請求項１４に記載のペプチドの製造方法。
【請求項１６】
ＳＢＶ又はシンブ血清群ウイルスで感染した非ヒト動物の同定方法であって、
ｉ．試料と、ＳＢＶのタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド又はペプチドとを、試料中のＳＢＶに対して又はシンブ血清群ウイルスに対して特異的な抗体と配列番号２〜１３８、又は配列番号１３９〜１４４（図３〜８）のＳＢＶのタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド又はペプチドとの複合体が形成し得る条件下で接触させる工程；
ｉｉ．こうして形成された複合体を、複合体の抗体に対して特異的な抗体を用いて検出する工程
を含み、
その際、複合体の検出がＳＢＶ又はシンブ血清群ウイルスによる感染の指標である、前記方法。
【請求項１７】
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、好ましくは多段階工程又は一段階工程の方法である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
試料中のＳＢＶ感染又はシンブ血清群ウイルスの検出用のキットであって、
ｉ．配列番号２〜１３８又は配列番号１３９〜１４４（図３〜８）のＳＢＶのタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド又はペプチド；及び
ｉｉ．ＳＢＶのタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド又はペプチドとＳＢＶ又はシンブ血清群ウイルスに対して特異的な抗体との間に形成された複合体の検出手段
を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、シュマーレンベルグウイルス（ＳＢＶ）タンパク質又は切断タンパク質、ＳＢＶウイルスのペプチドのクローニング及び発現、及びそれらをオルソブニヤウイルス（Orthobunyavirus）、特に試料中でのＳＢＶ感染を同定するための診断試験に用いる使用、並びにそれらの検出用キットに関する。
【０００２】
発明の背景
２０１１年には様々な欧州諸国のウシの群れが疾患を発症し、その発生源と原因は、最初、既知の原因又は疾患に関連付けられなかった。
【０００３】
欧州の反芻動物におけるこの疾患の発生は、発熱、下痢、ウシの乳量の低下並びに、流産、ミイラ変性胎児、早産又は死産、弱った又は奇形の子ヒツジや子ウシ（ヤギ、ヒツジ、ウシ）の誕生を特徴とする。
【０００４】
フリードリッヒ−レフラー−インスティテュート（ＦＬＩ）の研究者達は、欧州においてこれまで知られていなかった新種のウイルスを分離することができた。この分離株は、シュマレンベルク（ノルトライン−ヴェストファーレン（独国）のホッホシュアウアーラントクライスの小さな村）においてウシの群れの試料で同定された。従って、このウイルスをシュマレンベルクウイルス（ＳＢＶ）と名付けた。ＳＢＶは配列決定され、この配列データは、受託番号ＨＥ６４９９１２、ＨＥ６４９９１３及びＨＥ６４９９１４（ホフマンら、２０１２年）の下で欧州ヌクレオチドアーカイブ（https://www.ebi.ac.uk/ena/）を介してアクセス可能である。
【０００５】
このウイルスは、エンベロープの、マイナスセンスの、セグメント化された、一本鎖ＲＮＡウイルスであり且つＳ、Ｍ、Ｌセグメントから構成されている。
【０００６】
その他の機関は、仏国と蘭国で流産した子ヒツジの脳組織からウイルスを分離した。
【０００７】
ＳＢＶは、ブニヤウイルス科のオルソブニヤウイルス族に属しており、これはシンブ血清群ウイルス（シャモンダ、アカバネ、アイノウイルス）（ホフマンら、２０１２年；ゴラー（Goller）ら、２０１２年）に関連している。
【０００８】
オルソブニヤウイルスは、アジア、オーストラリア、アフリカ、南アメリカなどの世界の他の地域において反芻動物と人間に対するよく知られた病原体である。それらは、これらは節足動物（ベクター媒介疾患）によって流行する。
【０００９】
ＳＢＶは、おそらく昆虫、例えば、ユスリカ類（キュリコイデス種）によって最も移入されている。
【００１０】
感染した施設は、欧州（独国、仏国、ベルギー、蘭国、英国、伊国、ルクセンブルク、スイス、スペイン）全体にわたって見られる。確認された症例は、おそらく殆どが数ヶ月前に起きた感染の結果である（ウシの妊娠時間約３００日、ヒツジやヤギ約１５０日）。この疾患は、気象条件とベクターの活性に応じて流行する。
【００１１】
ＳＢＶは、ＲＴ−ＰＣＴによって試料中で検出され得る。しかしながら、ウイルス感染後のウイルス血症期は非常に短い。従って、ウイルスのゲノム配列は、数日間だけ末梢血中で検出され得る。更に、ＲＴ−ＰＣＴは、非常に時間がかかり、分析を実行するために特別な実験室及び訓練されたスタッフを必要とする。従って、この試験は、使い易い診断テストであるとは見なすことができない。別の欠点は、ＲＴ−ＰＣＴが、いずれのハイスループット分析も提供することができないことである。従って、群れ全体のハイスループット試験は大きな財源の投資でしか実施することができず、しかも、これは非常に時間がかかる。従って、これはＳＢＶ分析や大型動物の群れの文脈におけるスクリーニングツールとしての役割を果たすことができない。
【００１２】
ウイルス核酸の代わりにＳＢＶタンパク質に対する抗体の検出は、感染動物の免疫記憶を使用する利点を有する。抗体は、感染後１０日以内に、ウイルスタンパク質に対して生じ、それらは長期間にわたって検出され得る。特異的な抗ＳＢＶ抗体の存在は、ＳＢＶ感染の間接的な証拠である。
【００１３】
近年、抗原として組換えＳＢＶ核タンパク質を用いる間接ＥＬＩＳＡは、“ＩＤ  Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｓｃｈｍａｌｌｅｎｂｅｒｇ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｄｉｒｅｃｔ”の名称でＩＤ−Ｖｅｔ（167, rue Mehdi Barka, F-34070モンペリエ）によって市販されている。この試験はウシ、ヒツジ、ヤギについて記載されている。この試験は、間接的な試験形式を使用し、示された種のＳＢＶのみ認識する。
【００１４】
代替法として且つおそらく改善された特徴と用途を有するＳＢＶ感染スクリーニングのための高速で且つ信頼性の高い試験を未だ世界中に提供する必要がある。
【００１５】
更に、これらの感染症のための高速で且つ容易な群れのスクリーニングを実施することができるシンブ血清群ウイルス及びｐａｎ−シンブ群試験のための診断テストを提供する必要がある。動物の世界的な輸送を考慮して、感染した動物が非感染群に移されていないことを確認するために、高速で且つ信頼性の高いスクリーニング試験が必要とされている。他方では、購入者は、動物の購入の過程で、健康な動物を購入することに関心をもつが、動物を受け取った後でしか、それらがＳＢＶ又は別のシンブ血清群ウイルスに感染していることを学ばない。このような感染は、新生子ウシ及びヒツジと最終的な利益に影響を与える。
【００１６】
従って、本発明の課題は、信頼性の高いＳＢＶ試験を提供することか、あるいは、改善された且つ信頼性の高い、好ましくは高感度及び高選択性を有する、ＳＢＶ診断試験を提供するために、公知のＳＢＶ試験を改善することである。
【００１７】
更に本発明の別の課題は、ＳＢＶを検出するために検証された診断試験を提供することである。
【００１８】
本発明の更に別の課題は、シンブ血清ウイルス試験及び／又はトランス種試験を提供することである。
【００１９】
発明の要旨
Ｉ．一態様において、本発明は、ＳＢＶ構造及び非構造タンパク質、及びこれらのタンパク質の切断型、特にＳＢＶのヌクレオカプシド（Ｎタンパク質）の増殖及び精製に関するものである。
【００２０】
更に別の態様では、本発明は、非ヒト動物がシンブ血清群ウイルス、特にＳＢＶに感染しているかどうかを同定する方法に関する。
【００２１】
更に別の態様では、本発明は、試料中のシンブ血清群ウイルス、特にＳＢＶ感染の検出用のキットに関する。
【００２２】
更に別の態様では、本発明は、試料中のＳＢＶを同定するための一段階の試験形式に関し、好ましくは又はあるいは、シンブ血清群試験を提供するための、好ましくは一段階の試験形式におけるシンブ血清群試験として提供するための一段階の試験形式に関する。
【００２３】
更に別の態様では、本発明は、シンブ血清群ウイルス、好ましくは試料中のＳＢＶ感染の検出のためのＥＬＩＳＡに関する。
【００２４】
更に別の態様では、本発明は、シンブ血清群ウイルス、好ましくは試料中のＳＢＶ感染の検出のために検証された診断試験に関する。
【００２５】
更に別の態様では、本発明は、獣医学的に重要なバンヤウイルスを検出するためのアッセイ、特にシンブ血清群アッセイに関する。
【００２６】
更に別の態様では、本発明は、獣医学的に重要なバンヤウイルスを検出するためのキット、特にＳＢＶを検出するキット、好ましくはシンブ血清群ウイルスを検出するキットに関する。
【００２７】
ＩＩ．一態様では、本発明は、特定のＳＢＶ又はシンブ血清群感染検出に有用な少なくとも１つ以上のエピトープを含むＳＢＶヌクレオカプシド（Ｎタンパク質；Ｎｐ）の単離されたペプチドに関する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、非ヒト動物がシンブ血清群ウイルス、特にＳＢＶに感染しているかどうかを同定する方法に関する。
【００２９】
更に別の態様では、本発明は、ＳＢＶを検出するための方法及びキット、好ましくはシンブ血清群に有用なエピトープを含むｐａｎ種（pan-species）のペプチドに関する。
【００３０】
更に別の態様では、本発明は、シンブ血清群ウイルス、特に試料中のＳＢＶ感染を検出するためのキットに関する。
【００３１】
更に別の態様では、本発明は、試料中のＳＢＶを同定するための一段階の試験形式に関し、好ましくは又はあるいはシンブ血清群ウイルス感染を同定するための一段階の試験形式を提供することに関する。
【００３２】
更に別の態様では、本発明は、シンブ血清群ウイルス、好ましくは試料中のＳＢＶ感染の検出用のＥＬＩＳＡに関し、好ましくは、試料はウシ及び／又はヒツジ由来のものである。
【００３３】
更に別の態様では、本発明は、シンブ血清群ウイルス、好ましくは試料中のＳＢＶ感染の検出用の検証された診断試験に関し、好ましくは、試料はウシ及び／又はヒツジ由来のものである。
【００３４】
更に別の態様では、本発明は、獣医学的に重要なバンヤウイルスを検出するためのアッセイ、特にシンブ血清群ウイルスアッセイに関する。
【００３５】
更に別の態様では、本発明は、獣医学的に重要なバンヤウイルスを検出するためのキット、特にＳＢＶ、好ましくはシンブ血清群ウイルスを検出するためのキットに関する。
【００３６】
図面の簡単な説明
Ｉ．本発明の一態様を以下に記載する。
図１は、マキシソーププレートに被覆された標的抗原（精製されたＳＢＶヌクレオカプシドタンパク質又はヌクレオタンパク質又はＮタンパク質）及び１つのポジティブ試料、１つのネガティブ試料及び試料なしで試験された３つの異なるコーティング緩衝液中での抗原滴定を示す。
【００３７】
図２は、３つのポジティブ試料と１つのポジティブ試料を用いて試験されたタンパク質の減量を伴うビオチン化Ｎタンパク質でインキュベートされたストレプトアビジンのプレコーティングされたプレートを示す。
【００３８】
図３は、ＳＢＶ（配列番号１）のヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質）の配列を示す。
【００３９】
図４は、ＨｉｓタグＣ−末端を含む、好ましくはバキュロウイルス発現系において使用される、ＳＢＶ（配列番号２）のヌクレオカプシドタンパク質（ＨｉｓＮタンパク質）のアミノ酸配列を示す。
【００４０】
図５は、図４による６×Ｈｉｓタグアミノ酸配列を有するヌクレオカプシドタンパク質を示し、その際、太字のアミノ酸（ａａ）は、シンブ群ウイルス性Ｎタンパク質の重要なアミノ酸を示す。
【００４１】
図６は、ｐＥＴ２８ａベクター（配列番号３）中の６×ＨｉｓタグＤＮＡ配列を有するＳＢＶヌクレオカプシドタンパク質の全長を示す。
【００４２】
図７は、コンセンサスコドン（配列番号４）を有するヌクレオカプシドタンパク質ＤＮＡ配列を示す。
【００４３】
図８は、ヌクレオカプシド欠損（protein-protein int. domain deleted）：１８２  ａａ  Ｈｉｓ−タグＣ−末端（配列番号５）を示す。
【００４４】
図９は、本発明による間接ＥＬＩＳＡ形式を示す。
【００４５】
図１０は、本発明による２つの一段階ＥＬＩＳＡ形式を示す；上部パネルでは、ポジティブ試料中に存在する抗体が、上記のようにＳＢＶウイルスタンパク質のうちの１つで捕捉されている。このタンパク質は、固体支持体に被覆されている。検出のために、第２の抗種特異的又は他の方法で有用な抗体が適用される。この検出抗体は、検出手段と一体となっているか、又は他の方法で視覚化され得る。特定の図面では、ＳＢＶ捕捉タンパク質は、配列表に記載されるようなヌクレオカプシドタンパク質である。
【００４６】
下のパネルは、様々な試験のセットアップを示し、その際、ＳＢＶタンパク質は、感染した試料中の抗ＳＢＶ抗体を捕捉するために使用され；このタンパク質は固相に被覆され；検出は、試料中の抗ＳＢＶ抗体の第２の腕によって結合された第２のＳＢＶ抗原によって行われる。
【００４７】
一段階ＥＬＩＳＡの本発明のこの第２の変法では、抗反芻動物ＩｇＧ−ＨＲＰＯコンジュゲートが、好適な実施形態においてＨＲＰＯに結合されたＳＢＶヌクレオカプシドタンパク質によって置き換えられている。このように、感染した動物の試料の抗ＳＢＶ抗体は、１つの腕を用いて１つのタンパク質と結合し、且つそれの他の抗体の腕を用いて他のＳＢＶタンパク質と結合し、従って、これを検出することができる。
【００４８】
ＩＩ．本発明の別の態様が以下に記載されている。
図１Ｂは、ＳＢＶ（配列番号１）のＳＢＶヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質；Ｎｐ）のアミノ酸配列を示す。
図２Ｂは、本発明によるＮｐペプチドに対するウシ血清の反応性を示す。
図３Ｂは、本発明によるＮｐペプチドに対するウシ血清の反応性を示す。
図４Ｂは、本発明によるＮｐペプチドに対するヒツジ血清の反応性を示す。
図５Ｂは、本発明によるＮｐペプチドに対するヒツジ血清の反応性を示す。
図６Ｂは、Ｎｐアミノ酸配列を摸式的に示し、且つコンセンサス（Ｃｏｎｓ）、本発明のウシのエピトープ（ウシＥｐ）及び本発明のヒツジのエピトープ（ヒツジＥｐ）のストレッチの順に並べている。ＳＢＶ核タンパク質（Ｎｐ）アミノ酸配列は、図面の１行目のラインに表されており、その際、シンブ血清群が高度に保存された領域は、２行目のラインで示された「Ｃｏｎｓ」を指す（出典、Saeedら（２００１年）によって提供された情報に基づくSavjiら（２０１１年））。診断試験に有用な好ましいウシエピトープを含む領域は、３行目に示されており、「ウシＥｐ」を指す。診断試験に有用な好ましいヒツジエピトープを含む領域は、先のラインに示されており、「ヒツジＥＰ」を指す。
【００４９】
発明の詳細な説明
Ｉ．本発明の一態様は、以下に詳細に記載されている。
本発明の様々な態様は、以下に更に詳細に記載されている。
【００５０】
本発明の以下の重要な用語の定義は、明細書、図面、実施例及び特許請求の範囲全体にわたり適用される。更なる用語は、当該技術分野の一般的な知識に従って当業者によって理解されている。
【００５１】
本願明細書で使用される単数形“ａ”、“ａｎ”、及び“ｔｈｅ”は、文脈が明確に別のものを規定しない限り複数形の指示対象も含む。
【００５２】
本願明細書で使用される「ＳＢＶ」とは、ＦＬＩ（Friedrich-Loeffler-Institut）によって単離され且つ上記の配列を有するシュマレンベルクウイルスを意味する。ＳＢＶは配列決定されており、配列データは、受託番号ＨＥ６４９９１２、ＨＥ６４９９１３及びＨＥ６４９９１４の下で欧州ヌクレオチドアーカイブを介して入手可能である（ホフマンら、２０１２年）。ウイルスは、エンベロープされた、ネガティブセンスの、セグメント化された、一本鎖ＲＮＡウイルスであり且つＳ、Ｍ、Ｌセグメントから構成されている。
【００５３】
ＳＢＶはブニヤウイルス科のオルソブニヤウイルス属に属し、これはシンブ血清群ウイルスに関連している。
【００５４】
本願明細書で使用される「シンブ群ウイルス」又は「シンブ血清群ウイルス」又は「ｐａｎ−シンブ群ウイルス」は、オルソブニヤウイルスの群を含み、これは交差反応性分析（補体結合、赤血球凝集、及びウイルス中和）に基づいて血清学的に同類である。補体結合活性は、ウイルス性ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質）を介して行われるが、ウイルス性糖タンパク質は中和抗体と赤血球凝集反応性抗体の誘導に関与している。従って、高程度のＮタンパク質におけるアミノ酸配列の相同性は、シンブ血清群のメンバーの特徴の１つである。シンブ血清群ウイルスの一部は、獣医学的に重要であり、アジア、オーストラリア、アフリカ、南アメリカで発見され、現在ではヨーロッパでも同様に発見され得る。オルソブニヤウイルスとシンブ血清群ウイルスとの境界が困難であると判明したが、ＳＢＶを含む血清群の少なくとも１８個のメンバーは、異なるウイルス種、例えば、シンブウイルス、サシュペリ（Sathuperi）ウイルス、ダグラスウイルス、シャモンダ（Shamonda）ウイルス、ピートン（Peaton）ウイルス、サンゴウイルス、アカバネウイルス、サボ（Sabo）ウイルス、ティナルー（Tinaroo）ウイルス、ヤバ７ウイルス、アイノウイルス、カイカラー（Kaikalur）ウイルス、シュニウイルス、フェイシーのパドックウイルス、オロプーシェウイルス、ウティンガ（Utinga）ウイルス及びウティブ（Utive）ウイルスに属すると認識されている（ニコルら、２００５年）。
【００５５】
「アミノ酸」とは、天然のアミノ酸と合成のアミノ酸を意味する。アミノ酸残基は次のように省略されている：アラニンはＡ又はＡｌａであり；アルギニンはＲ又はＡｒｇであり；アスパラギンはＮ又はＡｓｎであり；アスパラギン酸はＤ又はＡｓｐであり；システインはＣ又はＣｙｓであり；グルタミン酸はＥ又はＧｌｕであり；グルタミンはＱ又はＧｌｎであり；グリシンはＧ又はＧｌｙであり；ヒスチジンはＨ又はＨｉｓであり；イソロイシンはＩ又はＩｌｅであり；ロイシンはＬ又はＬｅｕであり；リジンはＫ又はＬｙｓであり；メチオニンはＭ又はＭｅｔであり；フェニルアラニンはＦ又はＰｈｅであり；プロリンは、Ｐ又はＰｒｏであり；セリンはＳ又はＳｅｒであり；スレオニンはＴ又はＴｈｒであり；トリプトファンはＷ又はＴｒｐであり；チロシンはＹ又はＴｙｒであり；且つバリンはＶ又はＶａｌである。本願明細書で別に規定された場合を除いて、Ｘ又はＸａａは任意のアミノ酸を表す。他の関連するアミノ酸としては、限定されずに、４−ヒドロキシプロリン、及び５−ヒドロキシリシンが挙げられる。全ての場合において、本願明細書に記載された又は他のものを指すポリペプチドのアミノ酸配列は、配列の最も左の、又は第１の、アミノ酸残基がＮ末端残基であり且つ配列の最も右の、又は最後のアミノ酸残基がＣ末端残基である従来の形で存在する。
【００５６】
任意の特定の核酸配列の「保存的変異体」は、特定の核酸配列への１つ以上の縮重コドン置換を有する任意の配列を含み、任意の配列は、その特定の核酸配列、及びその特定の核酸の相補配列及びその相補配列の保存的変異体への１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入、及び該配列からの欠失を有する。特定の核酸配列の保存的変異体は、好ましくは、特定の核酸配列に対して、少なくとも約７８％の同一性、更に好ましくは少なくとも約９０％の同一性、更に一層好ましくは少なくとも約９５〜９９％の同一性を有する。特定の核酸配列の保存的変異体は、人工的に合成されるか又は生物体から天然の形態で単離され得る。
【００５７】
任意の特定のポリペプチド配列の「保存的変異体」は、アミノ酸配列を有する任意のポリペプチドであり、これは特定のポリペプチドのアミノ酸配列から変化するが、特定のポリペプチドの特定の結合特性を未だ保持するので、特定のポリペプチドに対して生じた本発明の抗体は、変異体ポリペプチドを特異的に結合することが可能である。従って、例えば、特定のポリペプチドの保存的変異体は、特定のポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、追加、及び挿入を有し得る。例えば、特定のポリペプチドの保存された変異体は、３０よりも少ない、２５よりも少ない、２０よりも少ない、１５よりも少ない、１０よりも少ない、又は５よりも少ない、特定のポリペプチドへの保存されたアミノ酸置換を有し得る。特定のポリペプチドの保存的変異体は、好ましくは、しかしながら実質的に、特定のポリペプチドに対して、少なくとも約７８％の同一性、更に好ましくは少なくとも約９０％の同一性、更に一層好ましくは少なくとも約９１〜９９％の同一性を有する。別の「標的」核酸又はアミノ酸配列に対する任意の対象の核酸配列又はアミノ酸配列（本願明細書に記載されたポリペプチドのいずれか）の同一性パーセンテージは、以下の通り決定され得る。第１に、本発明の標的核酸又はアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰを含むＢＬＡＳＴＺのスタンドアロンバージョン（例えば、バージョン２．０．１４）からのＢＬＡＳＴ２配列（Ｂ１２ｓｅｑ）プログラムを用いて、比較され且つ対象の核酸又はアミノ酸配列に整列され得る。ＢＬＡＳＴＺのスタンドアロンバージョンはwww.ncbi.nlm.nih.govで得られる。ＢＬＡＳＴＺ、特にＢ１２ｓｅｑプログラムをどのように使用するか説明する指示書は、ＢＬＡＳＴＺを含む“ｒｅａｄｍｅ”ファイルに見出され得る。このプログラムはまた、Karlinら(1990年) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 2264; Karlinら(1990年) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873;及びAltschulら(1997年) Nucl. Acids Res. 25:3389によって詳細に記載されている。
【００５８】
本願明細書で使用される「ポリペプチド」との用語は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基の一本鎖の化合物を意味する。この鎖は任意の長さであってよい。タンパク質はポリペプチドであり、この用語は同義に使用されている。ポリペプチドは、ＳＢＶポリペプチドの様々なエピトープに特異的な１つ以上の抗体を結合し、好ましくは、シンブ群ウイルスを認識し、更に好ましくは前記群のウイルスの単一のメンバーの間で区別することが可能である。
【００５９】
本願明細書で使用される「ペプチド」又は「オリゴペプチド」との用語は、３〜２５個の間のアミノ酸、好ましくは５〜１２個の間のアミノ酸からなるアミノ酸の一本鎖を意味する。
【００６０】
本発明のタンパク質及びポリペプチドは、宿主動物において免疫応答を誘発可能である及び／又は感染後の免疫応答により感染した動物の試料中に存在する抗体に結合可能である。
【００６１】
更に、本発明の一部として「抗体（antibody）」又は「抗体（antibodies）」とは、モノクローナル及び／又はポリクローナル抗体及び抗血清を意味し、これは本発明の方法、アッセイ及び試験キットに適用され得る。これらの抗体は、一次又は二次検出抗体として機能する。これらの抗体は、試験結果の視覚化のために標識され得る。抗体は、検出法の文脈において当業者に知られた濃度で適用される。好ましくは、抗体は０．１μｇ／ｍｌ〜５．０μｇ／ｍｌの濃度で適用される。
【００６２】
本発明に適用される抗体は、任意の抗体クラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥに属し、且つ当業者に知られた様々な技術のいずれかによって調製され得る（例えば、Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998年); Dean, Methods Mol. Biol. 32:361-79 (1994年); Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88 (1994年); Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994年); Drenckhahnら、Alethods Cell. Biol. 37:7-56 (1993年); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992年); Wrightら、Crit. Rev. Immunol. 12: 125-68(1992年); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988年); 及びMaking and Using Antibodies: A Practical Handbook, Howard及びKaser編、CRC Press(2006年)を参照のこと、これらはそれぞれその全体が本願明細書に援用されている）。
【００６３】
「エピトープ」とは、ＳＢＶのポリペプチド又はシンブ群ウイルス上の又は前記ＳＢＶポリペプチドに特異的な抗体上のパラトープによる結合が認識されているこの群の１ウイルス上の抗原決定基である。本発明の文脈における抗体は、３〜１１個、好ましくは５〜７個のアミノ酸の配列を有する特定のエピトープを認識する。抗体は更に、本発明の方法及びキットに適用されたタンパク質、ポリペプチド又はペプチドに対するその結合親和性によって特徴付けられてよく、結合親和性は、１０−９〜１０−１０ｎＭの範囲である。本発明に使用される特定の抗体は、抗体に対して向けられたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり且つ検出抗体として適用されている。
【００６４】
本願明細書で使用される「標識」との用語は、検出可能な化合物、組成物、又は固体支持体を指し、これは直接的又は間接的にモノクローナル抗体にコンジュゲートされ得る（例えば、共有結合又は非共有結合手段を介して、単独の又はカプセル化された）。標識はそれ自体によって検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識、化学発光色素、電気化学的標識、金属キレート、ラテックス粒子、又は蛍光標識）又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素）の化学変化を触媒し得る。本発明において使用される標識は、アルカリホスファターゼ；グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）；西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）；化学発光物質、例えば、イソルミノール、蛍光剤、例えば、フルオレセイン及びローダミン化合物；リボザイム；及び染料であってよいが、これらに限定されない。標識は、それ自体が検出可能であり得る特異的結合分子（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン（digioxigenin）、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４−ジニトロベンゼン、フェニルヒ酸（phenylarsenate）、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ等）であってもよい。標識の使用は、電磁放射又は直接可視化の検出などの手段によって検出され、場合により測定され得る信号を生じる。
【００６５】
モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法を用いて、標識に連結され得る（例えば、Immunochemical Protocols; Methods in Molecular Biology, 第295巻, R. Bumsにより編集 (2005年)）。検出可能なモノクローナル抗体結合体は、試験試料中のＳＢＶ特異的抗体の存在又は量に関連する信号を生成するためにＥＬＩＳＡ又は競合アッセイ形式のような任意の公知の診断試験形式で使用されてよい。
【００６６】
「実質的な結合」又は「実質的に結合する」とは、特定のアッセイ条件下でアッセイ混合物中の分子間の特定の結合又は認識の量を意味する。その最も広い態様では、実質的な結合は、第２分子を結合又は認識できない第１分子の能力と、第３分子を結合又は認識できる第１分子の能力との間の違いに関係しており、この違いは、分子の相対濃度、及びインキュベーションの時間と温度を含む特定の一連のアッセイ条件の下で、意味のあるアッセイを実行させて特異的な結合を区別するのに十分である。別の態様では、ある１つの分子は、交差反応性の意味において、別の分子を結合又は認識することが実質的にできず、その際、第１分子は、分子の相対濃度及びインキュベーションを含む、特定の一連のアッセイ条件の下で、第３分子に対して示された反応性の２５％未満、好ましくは１０％未満、更に好ましくは５％未満の反応性を第２分子に対して示す。特異的結合は、多くの広く知られている方法、例えば、免疫組織化学的アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、又はウエスタンブロットアッセイを用いて試験され得る。
【００６７】
「生体試料」とは、唾液、全血、血清、血漿、乳汁又は抗ＳＢＶ抗体を含むことが知られている他の試料由来の試料を意味する。生体試料は、本発明の方法で試験されるべき試料の能力に影響しない任意の便利な手段によって収集されて保存され得る。本発明の方法で使用される試料は、本方法で使用される前に調製する必要があり得る。例えば、試料は、沈殿、希釈、濾過又は遠心分離されて不要な成分を除去する必要があるか、又はこれらの成分は塩、洗浄剤又は追加のタンパク質などの試料に添加され得る。
【００６８】
「固体支持体」又は「固相」との用語は、ＳＢＶ又はシンブ群ウイルスポリペプチドが共有結合又は非共有結合により付着され得る、非水性マトリックスを意味する。固体支持体の例としては、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、合成及び天然ポリマー、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーン、磁性粒子、ラテックス粒子、クロマトグラフィーストリップ、マイクロタイターポリスチレンプレート、又は洗浄若しくは未結合物質から分離されるべき抗原の結合を可能にする任意の他の物質で部分的又は完全に形成された支持体が挙げられる。特定の実施態様では、用途に応じて、固体支持体は、アッセイプレートのウェルであってよいか、又は精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）であってよい。
【００６９】
本願明細書で使用される「キット」又は「アッセイキット」との用語（例えば、製造物品）は、有用な化合物の集まりを意味し、他には、哺乳動物、好ましくは反芻動物の試料中のＳＢＶ感染又はシンブ群ウイルスを検出するための固体支持プレート又は試験ストリップを意味する。従って、キットは、本発明の１つ以上のデバイス及び／又は組成物を含み得る。ある特定の例では、かかるキットは、固定ＳＢＶタンパク質、それらのフラグメント又はペプチドを有し、且つ１つ以上の捕捉抗体及び他の有用な試薬、例えば、洗浄試薬、並びに、所望又は適切であれば、検出試薬及び陽性及び陰性の対照試薬を含むデバイスを含む。当業者に知られた、他の成分、例えば、緩衝液、対照等は、かかる試験キットに含まれ得る。様々な試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬溶液の濃度を提供するために、変化され得る。特に、試薬は、乾燥粉末として、通常、凍結乾燥された粉末として提供されてよく、これは溶解時に試料と組み合わせるために適切な濃度を有する試薬溶液を提供する。本発明のキットは更に、本発明の１つ以上の方法を実施するための指示書、例えば、キットと一緒に含まれる本発明の任意のデバイス及び／又は組成物を使用するための指示書を含む。
【００７０】
本発明の特定の態様を以下に更に詳細に説明する。
【００７１】
本発明の一態様では、ＳＢＶ単一タンパク質及びポリペプチドを発現させて精製した。ヌクレオカプシド（Ｎ）の全長及び様々な切断型を、当業者に知られた標準的な手順に従ってクローニングし、異なる発現系で産生した。当業者によく知られているように、かかる発現系は大腸菌を使用した。従って、詳細は本願明細書に記載する必要がなく、文献からよく知られている。使用され得る別の発現系は、当該技術分野でも知られたバキュロウイルス系である（Sambrook and Russell, 2001年）。
【００７２】
特定の詳細も、実施例の段落から明らかである。
【００７３】
一態様において、本発明は、２３３ａａを有するヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質）；９１ａａを有する非構造タンパク質ＮＳｓ（Ｓセグメント）；８４６ａａを有する、好ましくは配列番号１３８〜１４４による糖タンパク質（Ｇｃタンパク質）（図３〜８）、又はそれらのフラグメント、又はＳＢＶ又はシンブ血清群ウイルスの検出に使用するためにそれらと９５％の同一性を有するタンパク質を含む又はそれらからなる単離されたＳＢＶタンパク質である。
【００７４】
好ましい実施態様では、単離されたタンパク質は、単離されたＳＢＶタンパク質、ポリペプチド又は配列番号１３９〜１４４を含む又はそれらからなるペプチド又はそれと９５％の同一性を有するペプチドである。
【００７５】
好ましくは、単離されたペプチドは、試料中のＳＢＶ感染の特異的同定に有用なエピトープを含む又はそれらからなり、その際、エピトープは、少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸、更に好ましくは少なくとも７個のアミノ酸及び更に一層好ましくは１２個のアミノ酸、更に一層好ましくは５〜２５個の配列番号１３９〜１４４のアミノ酸を含む又はそれらからなる（図３〜８）。
【００７６】
別の態様では、本発明は、上記のタンパク質又はポリペプチドの製造方法に関する。
【００７７】
本発明のタンパク質及びポリペプチドは、当該技術分野で良く知られた方法に従ってクローニングし、発現させて、精製することができる。
【００７８】
異なる発現系の使用は、方法の容易さに関して及び達成され得る収量並びに汚染の可能性の制御のような二次的な側面に関して利点を有する。タンパク質又はペプチドが、診断用途のための方法で適用される場合、製造方法は、特定の用途におけるそれらの有用性にも影響を与え得る。本発明では、大腸菌発現系で発現したＳＢＶヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質は、診断用途にとって好ましい。バキュロウイルス発現したタンパク質は、本発明の診断用途によく適用され得るが、大腸菌発現タンパク質が好ましい。
【００７９】
本発明は、完全長のＳＢＶ  Ｎタンパク質又はその切断型、並びに配列修飾を示す、例えば、限定されずに、アミノ酸修飾、置換、欠失、挿入又は配列の追加を示すかかるタンパク質のいずれかを使用することができる。好ましい実施態様は、図面及び配列表に記載されている。好ましい実施態様では、完全長のタンパク質として又は配列修飾を含むＮタンパク質はＣ末端Ｈｉｓタグを含む。好ましい実施態様では、Ｎタンパク質は、タンパク質−タンパク質相互作用ドメインの欠失を有し且つ更に好ましくは１８０〜２００個のアミノ酸のアミノ酸長さを有し、好ましくは、Ｎ切断配列は１８２個のアミノ酸を有する。特定の配列は、配列表に記載されており且つ図面から明らかである。
【００８０】
特定のＳＢＶタンパク質及びポリペプチドは、組換え発現させて、当業者に良く知られた標準的な診断試験の形式で適用することができる。本発明では、間接ＥＬＩＳＡ形式が特に好ましく、更に好ましいのは、一段階ＥＬＩＳＡ形式である。
【００８１】
好ましくはＳＢＶ感染、更に好ましい実施態様ではシンブ血清群ウイルスを検出するために、本発明による試験及び方法において上記のようなＳＢＶタンパク質が特に有用であることが示され得る。
【００８２】
特に有用なのは、配列番号１３９の時点で完全長のＳＢＶ  Ｎタンパク質である。更に好ましいのは、配列番号１４４に記載されるような切断されたＮタンパク質である。
【００８３】
前記タンパク質の適用は、特異性及び選択性に関して特に良好な結果を示していることが示され得る。全ての公知の検出形式は原則として試験に適用できるが、特定の試験形式は、それらの実施の容易さと試験キットの提供のような実用面の観点で好ましい。好ましい実施態様では、有利には、良好な結果が、図に示すような間接ＥＬＩＳＡ形式で達成された。更に好ましいのは、全ての試薬と試料を一段階プロセスで混合することができる利点を有する一段階ＥＬＩＳＡである。様々な好ましい実施態様を図１０に記載する。
【００８４】
タンパク質の配列及び産生についての更なる詳細を図面及び配列表に記載する。
【００８５】
好ましい実施態様では、本発明は、ＳＢＶ又はシンブ血清群ウイルスで感染した非ヒト動物の同定方法であって、ｉ．試料と、ＳＢＶのタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド又はペプチドとを、試料中のＳＢＶに対して特異的な抗体とＳＢＶのタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド又はペプチドとの複合体が形成し得る条件下で、接触させる工程；ｉｉ．複合体の抗体に対して特異的な抗体との形成された複合体を検出する工程を含み、その際、複合体の検出がＳＢＶによる感染の指標である、前記方法に関する。
【００８６】
好ましい実施態様では、同定方法は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）であり、好ましくは多段階、更に好ましくは一段階の方法である。
【００８７】
かかる方法では、ＳＢＶのタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド又はペプチドが適用されてよく、好ましくは、これは配列番号１３９〜１４４（図３〜８）、又はそれらのフラグメントからなる群から選択される。
【００８８】
別の態様では、本発明は、試料中のＳＢＶ又はシンブ血清群ウイルス感染を検出するためのキットであって、ｉ．図面及び配列表に記載されるような１つ以上のＳＢＶのタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド又はペプチド；及びｉｉ．ＳＢＶの１つ以上のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド又はペプチドとＳＢＶに対して特異的な抗体との間で形成された複合体を検出するための手段を含む、前記キットに関する。
【００８９】
ＳＢＶのタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド又はペプチドは、好ましくは、配列番号１３９〜１４４（図３〜８）からなる群から選択される。
【００９０】
別の態様では、本発明は、生体試料中のＳＢＶに対する抗体の検出方法であって、生体試料と配列番号１３９〜１４４のＳＢＶポリペプチドとを接触させること、及び試料中の抗体が配列番号１３９〜１４４と結合するためのモノクローナル抗体と競合するかどうかを検出し、それによって、試料がＳＢＶに対する抗体の含有を決定することを含み、その際、自然に感染した動物由来の試料中のＳＢＶ抗体は、配列番号１３９〜１４４と結合するためのモノクローナル抗体と競合するが、感染していない動物又は試料が得られる４週間より前にＳＢＶに対して予防接種された動物由来の試料中の抗体は、配列番号１３９〜１４４と結合するためのモノクローナル抗体と競合していない、前記方法である。好ましい実施態様では、本方法は、シンブ群ウイルスの検出に使用され得る。
【００９１】
本発明は、配列番号１３９〜１４４による切断Ｎタンパク質との、９５％を上回る、好ましくは９６％を上回る、更に一層好ましくは９７％を上回る感度及び９７％を上回る、好ましくは９８％を上回る、更に一層好ましくは９９％を上回る特異性を達成する。
【００９２】
本発明の方法、アッセイ及び試験キットで使用され得る試料は、好ましくは、反芻動物の血清、血漿又は乳汁由来であり且つウシ、ヒツジ又はヤギでの感染を検出するのに特に有用である。
【００９３】
キットは、すぐに使用できる試薬を含有し、試験の結果は、有利には、数時間以内に、好ましくは６時間未満で、好ましくは５時間未満で、更に好ましくは４時間未満で得られる。
【００９４】
試料の希釈係数は、好ましくは、５０×以下、好ましくは３０×以下、好ましくは２０×以下、好ましくは１０×以下であり、有利には、更なる希釈工程を回避する。
【００９５】
キットは好ましくは、すぐに使用できる試薬、例えば、被覆プレート、陰性及び陽性の対照、洗浄溶液、試料希釈液、複合体、ＴＭＢ及び停止液を含有する。
【００９６】
適用される抗原は、好ましくは、シンブ群ウイルスの間で保存された抗原であり、従って、有利には、試料中の感染のｐａｎ−シンブ群の検出を可能にする。
【００９７】
好ましい実施態様では、試験の固相は、上記のように抗原で被覆されている。抗原は大腸菌で発現され得る。特に好ましいのは、バキュロウイルス発現系において発現される抗原である。本方法及び試験キットでは、公知で且つ有用な固相が使用されてよく、好ましくは、マキシソープ（MaxiSorp）又はポリソープ（PolySorp）（Thermo Fisher Scientific）が使用され、且つ好ましくはｐＨ５、ｐＨ７又はｐＨ９．５を有するコーティング緩衝液を適用することによって被覆されている。抗原は、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、又は４μｇ／ｍｌの量で適用される。当該技術分野で知られたブロッキング溶液を適用することが有利であり得るが、ブロッキング溶液を避けることが好ましい。
【００９８】
試料希釈液として、０．１４ＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、０．０３％のＫａｔｈｏｎ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０が使用されてよい。本発明による有用な別の希釈剤は、２％のＭｇＣｌ２、６％のＴｗｅｅｎ２０及び６％のＡＯ、０．５％のカゼインナトリウム塩である。
【００９９】
検出抗体は、１：１００００、好ましくは１：２００００に希釈される。
【０１００】
本方法の工程は、必要に応じて適用され、適用される特定の試薬に応じて変更され得る。好ましい実施態様では、条件及び方法工程は次の通りである：
試料希釈剤（２％のＭｇＣｌ２、６％のＡＯ、６％のＴｗｅｅｎ２０、０．５％のカゼイン）中の試料（１：１０）、１００ｕｌ／ウェル
湿潤チャンバ内にて室温で１時間のインキュベート、
３×洗浄（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を有するリン酸緩衝生理食塩水）
すぐに使用できる複合体、１００μｌ／ウェル
湿潤チャンバ内にて室温で１時間のインキュベート
３×洗浄（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を有するリン酸緩衝生理食塩水）
ＴＭＢ１００μｌ／ウェル、室温で１０分間のインキュベート
停止液の添加（１００μｌ／ウェル）及び
４５０ｎｍで読み取る
【０１０１】
特に好ましい実施態様では、試料希釈液は、カゼインナトリウム塩を、０．１〜０．５５％、好ましくは０．１％、更に好ましくは０．５５％の濃度で含有する。好ましい実施態様では、試料希釈液は、０．５％のカゼインナトリウム塩とＭｇＣｌ２を含有し、好ましくは、ＭｇＣｌ２は２％の濃度を有する。
【０１０２】
好ましい実施態様では、検出方法、好ましくはキットも、特定の化合物の包含、抗原を捕捉する特定の希釈液の使用及び／又は本発明の検出方法及びキットで使用される固体支持体上に被覆された抗原を捕捉する特定の量及び性質によって特徴付けられる。
【０１０３】
好ましくは精製条件及び／又は希釈条件及び／又は検出方法に含まれる特定の成分及びキットの特定の組み合わせによって、ＳＢＶ検出方法及び好ましくはシンブ血清群ウイルスの改善された性能が達成され得ることが示され得る。
【０１０４】
この群の全てのメンバーは、本発明の方法によって検出され得る。好ましくは、以下の特定のウイルスが検出される：シュマーレンベルグウイルス、シャモンダ（Shamonda）ウイルス、ダグラスウイルス、ピートン（Peaton）ウイルス、アカバネウイルス、アイノウイルス、オロプーシェウイルス、ティナルー（Tinaroo）ウイルス、シュニウイルス。特に好ましい及び特に良好な結果が、以下の種によって達成された：ピートン、アカバネ、アイノ、ティナルー。特に好ましい実施態様では、ウシ科、シカ科及びラクダ科のシンブ血清群ウイルスが検出される。
【０１０５】
特に好ましい実施態様では、ＳＢＶタンパク質、好ましくはヌクレオカプシドタンパク質の希釈は、コーティング溶液中で０．５〜５μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜３μｇ／ｍｌの濃度であるように選択された。ＳＢＶタンパク質が被覆される固体支持体は、０．２５〜１μｇ／ウェル、好ましくは０．５〜１μｇ／ウェルの抗原を含有する。その特定の希釈液中での本発明のヌクレオカプシドタンパク質の調製が有利であると判明した。
【０１０６】
従って、溶液中にＳＢＶコーティングタンパク質を相当に有することが達成され、上記のような及び配列番号１３９〜１４４におけるコーティングタンパク質、好ましくはヌクレオカプシドタンパク質のアグリゲートの形成又は存在が回避され得る。従って、試験の特異性を増加させることができ、試験のこの態様が有利な特異性及び／又は感度につながり得ることは明らかではなかった。肯定的な結果は、それ自体がＳＢＶ感染症に関して確認された陽性試料と陰性試料による試験の実施から明らかである。
【０１０７】
更に、本願明細書に記載されるような本発明による試験及びキットの利点は、そのような試験で達成できる肯定的な試験結果から明らかであるだけではない。これは、今現在、即ち、２０１２年９月の市場での試験キットとの比較において更に一層明白である。特に、本発明及び好ましい実施態様の検出方法は、従来技術のＳＢＶ試験、例えば、ＩＤｖｅｔ試験及び背景技術の段落に上記されたキットよりも優れている。
【０１０８】
検出方法及び好ましくはキットにおける別の好ましい実施態様の使用はカゼインである。市場で利用可能な任意のカゼインは、試験の良好な検出結果を達成するために他の化合物の必要性に応じて使用可能な濃度で適用され得る。好ましくは、試験溶液の濃度は、０．１〜１％、好ましくは０．２５〜０．７５％、更に好ましくは０．５％である。好ましい実施態様では、カゼインは、抗原が固体支持装置に被覆される被覆工程の洗浄溶液中に存在する。
【０１０９】
被覆工程は、好ましくは、ｐＨ５〜１０、好ましくは約ｐＨ５、７又はｐＨ９．５で実施される。
【０１１０】
被覆タンパク質、即ち、好ましくは、明細書及び実施例に記載されるようなＳＢＶヌクレオカプシドタンパク質であり得る抗原は、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、又は４μｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌの量で使用される。
【０１１１】
別の好ましい実施態様は、単独で又はそれに加えてアミンオキシド（ＡＯ）を使用する。好ましくは、使用される濃度は、本方法の溶液中で３〜１０％、好ましくは５〜８％、更に好ましくは６％の量である。
【０１１２】
検出方法及びキットの別の好ましい実施態様は、Ｔｗｅｅｎ、好ましくはＴｗｅｅｎ２０、又は比較物質、好ましくは比較可能な特性を有する洗浄剤を含有する。この物質は、０．０５〜０．５％、好ましくは０．１〜０．２％の量で含有される。
【０１１３】
特に好ましい実施態様では、被覆工程の洗浄溶液は、好ましくは、０．１４ＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ；０．０３％のＫａｔｈｏｎ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有し、試料希釈液は２％のＭｇＣｌ２、６％のアミンオキシド（ＡＯ）、６％のＴｗｅｅｎ２０及び０．５％のカゼインを含む。
【０１１４】
好ましい実施態様では、抗反芻動物コンジュゲートは、すぐに使用できるフォーマット（ＲＴＵ）としてコンジュゲート安定緩衝液中で１：１００００〜１：３００００、好ましくは１：２００００の希釈度で使用される。
【０１１５】
別の好ましい実施態様では、上記の化合物は、組み合わせることができて、特に良好な試験結果につながる。かかる実施態様では、様々な化合物が、キット化合物の調製に使用される又は試験の実施中に使用される溶液のいずれかに含有され、且つ本発明によるキットに含有され得る。
【０１１６】
本発明者らは、驚くことに、上記の好ましい実施態様のうちの１つ又は組み合わせを用いて、特異性及び選択性に関して非常に良好な結果を達成した。このような良好な結果が、特定の抗原調製物を使用することによって得られ、その際、その特定の希釈液が特に有利であることは予見されなかった。更に有利なのは、カゼイン、アミンオキシド及び／又はＴｗｅｅｎのような他の添加剤と関連した、好ましくは上記の濃度の抗原希釈液である。
【０１１７】
試験は、好ましくは、シンブ血清群ウイルスを検出し、これは好ましくは、ウシ、ヤギ及びヒツジ試料中のＳＢＶを検出できる。
【０１１８】
カットオフは、感度と特異性の必要性に応じて選択され得る。分布はこれを目的の適合性に適合させるように考えられている。これは試験の必要性によって変わる。ＲＯＣが分析に使用されている。カットオフは、陽性及び陰性の対照、当業者に知られた各計算及び診断試験の開発用の文献に関して標準的な手順に従って選択される。
【０１１９】
特異性を最適化するために、カットオフは、好ましくは３０％以上、４０％以上、５０％以上、又は６０％以上で選択される。
【０１２０】
感度を最適化するために、カットオフは、好ましくは１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上で選択される。
【０１２１】
本発明による試験のための最適なカットオフは、好ましくは４０％、更に好ましくは３０〜４０％の間である。
【０１２２】
本発明の試験の利点は、好ましい実施態様において、９７％を上回る、好ましくは９８％を上回る、更に好ましくは９９％を上回る特異性、及び９４％を上回る、更に好ましくは９５％を上回る、更に好ましくは９６％を上回る感度が達成され得ることである。特定の実施態様は、約９９．８％の特異性と約９５．８％の感度を達成する。特定の種に関して、以下の特異性と感度がそれぞれ達成され得る：ウシ：９９．５％及び９５．７％；ヒツジ：１００％及び９９％；ヤギ：１００％及び９９％。
【０１２３】
従って、本方法及び試験キットは、特に、ＳＢＶの検出のためにヤギ、ヒツジ及びウシについて信頼性が高い。好ましい実施態様では、良好な結果がシンブ血清群にも適用される。特に良好な結果が、アカバネ、ピートン、アイノ及びティナルーウイルスを検出するために達成され得る。
【０１２４】
ＩＩ．本発明の別の態様が以下に詳細に記載されている。
本発明の様々な態様が、以下に更に詳細に記載される。
【０１２５】
以下の本発明の重要な用語の定義が、明細書、図面、実施例及び特許請求の範囲の全体にわたって適用される。更なる用語は、該当する場合、当該技術分野の一般的な知識に従って当業者によって理解されている。
【０１２６】
本願明細書で使用されるように、単数形の形、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の対象を含む。
【０１２７】
本願明細書で使用される「ＳＢＶ」は、ＦＬＩ（フリードリッヒ−レフラー−インスティテュート）によって単離されるような及び上記の配列を有するシュマーレンベルグウイルスを指す。ＳＢＶは配列決定されており、配列データは、受託番号ＨＥ６４９９１２、ＨＥ６４９９１３及びＨＥ６４９９１４の下で欧州ヌクレオチドアーカイブを介して入手可能である（ホフマンら、２０１２年）。ウイルスは、エンベロープされた、ネガティブセンスの、セグメント化された、一本鎖ＲＮＡウイルスであり且つＳ、Ｍ、Ｌセグメントから構成されている。
【０１２８】
ＳＢＶはブニヤウイルス科のオルソブニヤウイルス属に属し、これはシンブ血清群ウイルスに関連している。
【０１２９】
本願明細書で使用される「シンブ群ウイルス」又は「シンブ血清群ウイルス」又は「ｐａｎ−シンブ群ウイルス」は、オルソブニヤウイルスの群を含み、これは交差反応性分析（補体結合、赤血球凝集、及びウイルス中和）に基づいて血清学的に同類である。補体結合活性は、ウイルス性ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質）を介して行われるが、ウイルス性糖タンパク質は中和抗体と赤血球凝集反応性抗体の誘導に関与している。従って、高程度のＮタンパク質におけるアミノ酸配列の相同性は、シンブ血清群のメンバーの特徴の１つである。シンブ血清群ウイルスの一部は、獣医学的に重要であり、アジア、オーストラリア、アフリカ、南アメリカで発見され、現在ではヨーロッパでも同様に発見され得る。オルソブニヤウイルスとシンブ血清群ウイルスとの境界が困難であると判明したが、ＳＢＶを含む血清群の少なくとも１８個のメンバーは、異なるウイルス種、例えば、シンブウイルス、サシュペリウイルス、ダグラスウイルス、シャモンダウイルス、ピートンウイルス、サンゴウイルス、アカバネウイルス、サボウイルス、ティナルーウイルス、ヤバ７ウイルス、アイノウイルス、カイカラーウイルス、シュニウイルス、フェイシーのパドックウイルス、オロプーシェウイルス、ウティンガウイルス及びウティブウイルスに属すると認識されている（ニコルら、２００５年）。
【０１３０】
「アミノ酸」とは、天然のアミノ酸と合成のアミノ酸を意味する。アミノ酸残基は次のように省略されている：アラニンはＡ又はＡｌａであり；アルギニンはＲ又はＡｒｇであり；アスパラギンはＮ又はＡｓｎであり；アスパラギン酸はＤ又はＡｓｐであり；システインはＣ又はＣｙｓであり；グルタミン酸はＥ又はＧｌｕであり；グルタミンはＱ又はＧｌｎであり；グリシンはＧ又はＧｌｙであり；ヒスチジンはＨ又はＨｉｓであり；イソロイシンはＩ又はＩｌｅであり；ロイシンはＬ又はＬｅｕであり；リジンはＫ又はＬｙｓであり；メチオニンはＭ又はＭｅｔであり；フェニルアラニンはＦ又はＰｈｅであり；プロリンは、Ｐ又はＰｒｏであり；セリンはＳ又はＳｅｒであり；スレオニンはＴ又はＴｈｒであり；トリプトファンはＷ又はＴｒｐであり；チロシンはＹ又はＴｙｒであり；且つバリンはＶ又はＶａｌである。本願明細書で別に規定された場合を除いて、Ｘ又はＸａａは任意のアミノ酸を表す。他の関連するアミノ酸としては、限定されずに、４−ヒドロキシプロリン、及び５−ヒドロキシリシンが挙げられる。全ての場合において、本願明細書に記載された又は他のものを指すポリペプチドのアミノ酸配列は、配列の最も左の、又は第１の、アミノ酸残基がＮ末端残基であり且つ配列の最も右の、又は最後のアミノ酸残基がＣ末端残基である従来の形で存在する。
【０１３１】
任意の特定の核酸配列の「保存的変異体」は、特定の核酸配列への１つ以上の縮重コドン置換を有する任意の配列を含み、任意の配列は、その特定の核酸配列、及びその特定の核酸の相補配列及びその相補配列の保存的変異体への１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入、及び該配列からの欠失を有する。特定の核酸配列の保存的変異体は、好ましくは、特定の核酸配列に対して、少なくとも約７８％の同一性、更に好ましくは少なくとも約９０％の同一性、更に一層好ましくは少なくとも約９５〜９９％の同一性を有する。特定の核酸配列の保存的変異体は、人工的に合成されるか又は生物体から天然の形態で単離され得る。
【０１３２】
任意の特定のポリペプチド配列の「保存的変異体」は、アミノ酸配列を有する任意のポリペプチド（ペプチド）であり、これは特定のポリペプチドのアミノ酸配列から変化するが、特定のポリペプチドの特定の結合特性を未だ保持するので、特定のポリペプチドに対して生じた本発明の抗体は、変異体ポリペプチドを特異的に結合することが可能である。従って、例えば、特定のポリペプチドの保存的変異体は、特定のポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、追加、及び挿入を有し得る。例えば、特定のポリペプチドの保存された変異体は、３０よりも少ない、２５よりも少ない、２０よりも少ない、１５よりも少ない、１０よりも少ない、又は５よりも少ない、特定のポリペプチドへの保存されたアミノ酸置換を有し得る。特定のポリペプチドの保存的変異体は、好ましくは、しかしながら実質的に、特定のポリペプチドに対して、少なくとも約７８％の同一性、更に好ましくは少なくとも約９０％の同一性、更に一層好ましくは少なくとも約９１〜９９％の同一性を有する。別の「標的」核酸又はアミノ酸配列に対する任意の対象の核酸配列又はアミノ酸配列（本願明細書に記載されたポリペプチドのいずれか）の同一性パーセンテージは、以下の通り決定され得る。第１に、本発明の標的核酸又はアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰを含むＢＬＡＳＴＺのスタンドアロンバージョン（例えば、バージョン２．０．１４）からのＢＬＡＳＴ２配列（Ｂ１２ｓｅｑ）プログラムを用いて、対象の核酸又はアミノ酸配列と比較され且つ整列され得る。ＢＬＡＳＴＺのスタンドアロンバージョンはwww.ncbi.nlm.nih.govで得られる。ＢＬＡＳＴＺ、特にＢ１２ｓｅｑプログラムをどのように使用するか説明する指示書は、ＢＬＡＳＴＺを含む“ｒｅａｄｍｅ”ファイルに見出され得る。これらのプログラムも、Karlinら(1990年) Proc. Natl. Acad. Sci. 87 : 2264; Karlinら(1990年) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873;及びAltschulら(1997年) Nucl. Acids Res. 25 : 3389によって詳細に記載されている。
【０１３３】
本願明細書で使用される「ペプチド」との用語は、５〜５０個の間のアミノ酸、好ましくは５〜４０個の間のアミノ酸、更に好ましくは５〜２０個の間のアミノ酸、更に好ましくは１２〜１６個の間のアミノ酸、更に好ましくは５〜７個の間のアミノ酸からなるアミノ酸の一本鎖を意味する。
【０１３４】
本発明のペプチドは、好ましくは、宿主動物において免疫応答を誘発可能である及び／又は感染後の免疫応答により感染した動物の試料中に存在する抗体に結合可能である。
【０１３５】
更に、本発明の一部として「抗体（antibody）」又は「抗体（antibodies）」とは、モノクローナル及び／又はポリクローナル抗体及び抗血清を意味し、これは本発明の方法、アッセイ及び試験キットに適用され得る。これらの抗体は、一次又は二次検出抗体として機能する。これらの抗体は、試験結果の視覚化のために標識され得る。抗体は、検出法の文脈において当業者に知られた濃度で適用される。好ましくは、抗体は０．１μｇ／ｍｌ〜５．０μｇ／ｍｌの濃度で適用される。
【０１３６】
本発明に適用される抗体は、任意の抗体クラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥに属し、且つ当業者に知られた様々な技術のいずれかによって調製され得る（例えば、Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998年); Dean, Methods Mol. Biol. 32:361-79 (1994年); Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88 (1994年); Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994年); Drenckhahnら、Alethods Cell. Biol. 37:7-56 (1993年); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992年); Wrightら、Crit. Rev. Immunol. 12: 125-68(1992年); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988年); 及びMaking and Using Antibodies: A Practical Handbook, Howard及びKaser編、CRC Press(2006年)を参照のこと。これらはそれぞれその全体が本願明細書に援用されている）。
【０１３７】
「エピトープ」とは、ＳＢＶの配列を含むペプチド又はシンブ群ウイルス又は前記ＳＢＶポリペプチドに特異的な抗体上のパラトープによる結合が認識されているこの群の１ウイルス上の抗原決定基である。本発明の文脈における抗体は、３〜１１個、好ましくは５〜７個のアミノ酸の配列を有する特定のエピトープを認識する。抗体は、本発明の方法及びキットに適用されるペプチドに対するその結合親和性によって更に特徴付けられてよく、結合親和性は、１０−９〜１０−１０ｎＭの範囲である。本発明に使用される特定の抗体は、抗体に対して向けられたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり且つ検出抗体として適用されている。「エピトープ」とは、免疫優勢領域（immuno dominant region）（ＩＤＲ）を指す。本発明における、「エピトープ」は、本発明によるペプチド上に配置されている。
【０１３８】
本願明細書で使用される「標識」との用語は、検出可能な化合物、組成物、又は固体支持体を指し、これは直接的又は間接的にモノクローナル抗体にコンジュゲートされ得る（例えば、共有結合又は非共有結合手段を介して、単独の又はカプセル化された）。標識はそれ自体によって検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識、化学発光色素、電気化学的標識、金属キレート、ラテックス粒子、又は蛍光標識）又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素）の化学変化を触媒し得る。本発明において使用される標識は、アルカリホスファターゼ；グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）；西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）；化学発光物質、例えば、イソルミノール、蛍光剤、例えば、フルオレセイン及びローダミン化合物；リボザイム；及び染料であってよいが、これらに限定されない。標識は、それ自体が検出可能であり得る特異的結合分子（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン（digioxigenin）、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４−ジニトロベンゼン、フェニルヒ酸（phenylarsenate）、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ等）であってもよい。標識の使用は、電磁放射又は直接可視化の検出などの手段によって検出されてよく、場合により測定され得る信号を生じる。
【０１３９】
モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法を用いて、標識に連結され得る（例えば、Immunochemical Protocols; Methods in Molecular Biology, 第295巻, R. Bumsにより編集 (2005年)）。検出可能なモノクローナル抗体結合体は、試験試料中のＳＢＶ特異的抗体の存在又は量に関連する信号を生成するためにＥＬＩＳＡ又は競合アッセイ形式のような任意の公知の診断試験形式で使用されてよい。
【０１４０】
「実質的な結合」又は「実質的に結合する」とは、特定のアッセイ条件下でアッセイ混合物中の分子間の特定の結合又は認識の量を意味する。その最も広い態様では、実質的な結合は、第２分子を結合又は認識できない第１分子の能力と、第３分子を結合又は認識できる第１分子の能力との間の違いに関係しており、この違いは、分子の相対濃度、及びインキュベーションの時間と温度を含む特定の一連のアッセイ条件の下で、特異的な結合を区別するために実行されるべき意味のあるアッセイを可能にするのに十分である。別の態様では、ある１つの分子は、交差反応性の意味において、別の分子を結合又は認識することが実質的にできず、その際、第１分子は、分子の相対濃度及びインキュベーションを含む、特定の一連のアッセイ条件の下で、２５％未満、好ましくは１０％未満、更に好ましくは５％未満の反応性である第２分子の反応性を第３分子に対して示す。特異的結合は、多くの広く知られている方法、例えば、免疫組織化学的アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、又はウエスタンブロットアッセイを用いて試験され得る。
【０１４１】
「生体試料」とは、唾液、全血、血清、血漿、乳汁又は抗ＳＢＶ抗体を含むことが知られている他の試料由来の試料を意味する。生体試料は、本発明の方法で試験されるべき試料の能力に影響しない任意の便利な手段によって収集されて保存され得る。本発明の方法で使用される試料は、本方法で使用される前に調製する必要があり得る。例えば、試料は、沈殿、希釈、濾過又は遠心分離されて不要な成分を除去する必要があるか、又はこれらの成分は塩、洗浄剤又は追加のタンパク質などの試料に添加され得る。
【０１４２】
「固体支持体」又は「固相」との用語は、ＳＢＶ又はシンブ群ウイルスポリペプチドが共有結合又は非共有結合により付着され得る、非水性マトリックスを意味する。固体支持体の例としては、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、合成及び天然ポリマー、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーン、磁性粒子、ラテックス粒子、クロマトグラフィーストリップ、マイクロタイターポリスチレンプレート、又は洗浄若しくは未結合物質から分離されるべき抗原の結合を可能にする任意の他の物質で部分的又は完全に形成された支持体が挙げられる。特定の実施態様では、用途に応じて、固体支持体は、アッセイプレートのウェルであってよいか、又は精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）であってよい。
【０１４３】
本願明細書で使用される「キット」又は「アッセイキット」との用語（例えば、製造物品）は、有用な化合物の集まりを意味し、他には、哺乳動物、好ましくは反芻動物の試料中のＳＢＶ感染又はシンブ群ウイルスを検出するための固体支持プレート又は試験ストリップを意味する。従って、キットは、本発明の１つ以上のデバイス及び／又は組成物を含み得る。ある特定の例では、かかるキットは、固定ＳＢＶタンパク質、それらのフラグメント又はペプチドを有し、且つ１つ以上の捕捉抗体及び他の有用な試薬、例えば、洗浄試薬、並びに、所望又は適切であれば、検出試薬及び陽性及び陰性対照試薬を含むデバイスを含む。当業者に知られた、他の成分、例えば、緩衝液、対照等は、かかる試験キットに含まれ得る。様々な試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬溶液の濃度を提供するために、変化され得る。特に、試薬は、乾燥粉末として、通常、凍結乾燥された粉末として提供されてよく、これは溶解時に試料と組み合わせるために適切な濃度を有する試薬溶液を提供する。本発明のキットは更に、本発明の１つ以上の方法を実施するための指示書、例えば、キットと一緒に含まれる本発明の任意のデバイス及び／又は組成物を使用するための指示書を含む。
【０１４４】
本発明の特定の態様を以下に更に詳細に説明する。
【０１４５】
一態様では、本発明は、ＳＢＶヌクレオカプシドタンパク質の５〜５０個のアミノ酸、好ましくは５〜４０個のアミノ酸、更に好ましくは５〜２０個のアミノ酸、更に一層好ましくは１２〜１６個のアミノ酸、更に一層好ましくは５〜７個のアミノ酸を含む又はそれらからなる、好ましくは配列番号２〜１３８（第１表）、又はそれらのフラグメントによる、又は配列番号２〜１３８のうちの１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する単離されたペプチドである。
【０１４６】
本発明の好ましい実施態様では、単離されたペプチドは、図１のアミノ酸位置１６〜５８（配列番号１）、好ましくは１６〜３２、１６〜２４、１８〜３５、２０〜３６、３５〜５０、６１〜８５、又は１７０〜２０５、好ましくは１７０〜１９０のＳＢＶのヌクレオカプシドタンパク質（Ｎｐ）、更に好ましくは２５〜５０、６１〜８５、１０３〜１１８又は１６６〜２３２、好ましくは１６６〜２０５又は１７０〜１９０のＳＢＶのヌクレオカプシドタンパク質（Ｎｐ）をカバーする。
【０１４７】
本発明の更なる好ましい単離されたペプチドは、実施例、図面及び／又は配列表に記載されている。かかるペプチドは、適切な試験形式で、単独のペプチドとして又は２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は多数のペプチドの組み合わせで適用され得る。このようなペプチドの組み合わせは、本発明の要旨の範囲内であり、且つ選択性及び特異性に関して肯定的な試験結果をもたらす。
【０１４８】
更には、これらのペプチドは、種変異のために変化し得る。好ましい実施態様では、これらのペプチドは、実施例、図面、表及び配列表に記載されているペプチドと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に少なくとも９５％、更に一層好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する。
【０１４９】
別の好ましい実施態様では、本発明は、本発明による少なくとも２つのペプチドを含むペプチド混合物である。
【０１５０】
本発明のペプチドは、該ペプチドが、ＳＢＶ又はシンブ血清群ウイルスで感染した動物によって産生された抗体に特異的に結合するエピトープを含む又はそれらからなることを特徴とする。
【０１５１】
好ましい実施態様では、本発明による単離されたペプチドは、ウシ及びヒツジ由来の抗体に特異的に結合する。
【０１５２】
単独の又は組み合わされた本発明のペプチドは、有利には、ＳＢＶ感染を同定するためのペプチドアッセイに使用され得る。ペプチドは、特異性及び選択性に関して優れた結果を示す。
【０１５３】
特に良好な結果は、配列番号２〜１３８によるペプチドを用いて達成され得る。
【０１５４】
本発明の特に好ましいペプチドは、以下の配列番号１のペプチドである：ＮＰＥＶＧＹＶＡＦＩＧＫＹＧＱＱＬＮＦＧＶＡ、ＮＰＥＶＧＹＶＡＦＩＧＫＹＧＱＱ、ＶＧＹＶＡＦＩＧＫＹＧＱＱＬＮＦ、ＶＡＦＩＧＫＹＧＱＱＬＮＦＧＶＡ、ＮＰＥＶＧＹＶ、ＥＶＧＹＶＡＦ、ＶＡＦＩＧＫＹ、ＦＩＧＫＹＧＱ、ＧＫＹＧＱＱＬ、ＹＧＱＱＬＮＦ、ＱＱＬＮＦＧＶ、ＱＬＮＦＧＶＡ、ＮＦＧＶＡ、ＬＮＦＧＶ、ＱＬＮＦＧ、ＱＱＬＮＦ、ＧＱＱＬＮ、ＹＧＱＱＬ、ＫＹＧＱＱ、ＧＫＹＧＱ、ＩＧＫＹＧ、ＦＩＧＫＹ、ＡＦＩＧＫ、ＶＡＦＩＧ、ＹＶＡＦＩ、ＧＹＶＡＦ、ＶＧＹＶＡ、ＥＶＧＹＶ、ＰＥＶＧＹ、ＮＰＥＶＧ、ＬＲＱＲＹＧＴＭＴＡＥＥＷＭＴＱＫＩＴ、ＧＦＳＰＡＡＲＴＦＬＱＱＦＧＩＮ、ＬＲＱＲＹＧＴ、ＱＲＹＧＴＭＴ、ＹＧＴＭＴＡＥ、ＴＭＴＡＥＥＷ、ＴＡＥＥＷＭＴ、ＥＥＷＭＴＱＫ、ＷＭＴＱＫＩＴ、ＧＦＳＰＡＡＲ、ＳＰＡＡＲＴＦ、ＡＡＲＴＦＬＱ、ＲＴＦＬＱＱＦ、及びＬＱＱＦＧＩＮ。１つ以上のペプチドが、診断試験に使用されるか、又はより長い配列中に含まれてよく、好ましいのは、このリストの４つのペプチドのうち少なくとも２つのペプチド、２つ、３つのペプチドである。
【０１５５】
本発明の更に好ましい実施態様は、５〜５０個のアミノ酸、好ましくは５〜４０個のアミノ酸、更に好ましくは５〜３０個のアミノ酸、３５個又は４０個のアミノ酸を含み且つそこに含まれる配列番号２〜１３８のうち少なくとも１つを有する、単離されたペプチドに関する。
【０１５６】
本発明の実施態様は、本願明細書に記載されるような１つ以上の単離されたペプチドに関し、その際、ペプチドは、ＳＢＶ又はシンブ血清群ウイルスによって感染した動物によって産生される抗体、好ましくはポリクローナル又はモノクローナル抗体と特異的に結合するエピトープを含む又はそれらからなる。単離されたペプチドは好ましくはウシ及びヒツジ由来の抗体に特異的に結合する。
【０１５７】
全ての公知の検出形式が、原則として試験に適用することができるが、特定の試験形式が、それらの実施と試験キットの提供の容易さ等の実用面の観点から好ましい。好ましい実施態様では、有利には、当業者に公知の間接ＥＬＩＳＡ形式で良好な結果が得られるので、本願明細書に詳細に記載される必要はない。更に好ましいのは、全ての試薬及び試料が一段階プロセスで混合され得る利点を有する一段階ＥＬＩＳＡである。本発明及び記載された形式による試験に有用な様々な好ましいペプチドを、図３Ｂ及び４Ｂに記載する。
【０１５８】
ペプチドの配列及び産生に関する更なる詳細を、本願明細書に記載され且つ配列表にまとめられている実施例、表、図面及び／又は配列表に記載する。
【０１５９】
別の態様では、本発明は、上記の１つ以上のペプチドの製造方法に関する。
【０１６０】
好ましい実施態様では、本発明は、ＳＢＶ又はシンブ血清群ウイルスで感染した非ヒト動物の同定方法であって、以下の工程：
ｉ．試料中のＳＢＶに対して又はシンブ血清群ウイルスに対して特異的な抗体とペプチドとの複合体が形成し得る条件下でＳＢＶの本発明の１つ以上のペプチドと、試料とを接触させる工程；
ｉｉ．こうして形成された複合体を、複合体の抗体に対して特異的な抗体又は本発明による標識されたペプチドを用いて検出する工程、その際、複合体の検出はＳＢＶ又はシンブ血清群ウイルスによる感染の指標である
を含む、前記同定方法に関する。
【０１６１】
好ましい実施態様では、同定方法は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、好ましくは多段階工程、更に好ましくは一段階工程の方法である。
【０１６２】
本発明は、本発明によるペプチド、好ましくは配列番号２〜１３８のもの、更に好ましくは配列番号２〜７５のものを用いて、９５％を上回る、好ましくは９６％を上回る、更に一層好ましくは９７％を上回る感度と、９７％を上回る、好ましくは９８％を上回る、更に一層好ましくは９９％を上回る特異性を達成する。
【０１６３】
本発明の方法、アッセイ及び試験キットで使用され得る試料は、好ましくは反芻動物の、血清、血漿又は乳汁由来であり、特に、ウシ、ヒツジ又はヤギでの感染を検出するのに有用である。
【０１６４】
別の態様では、本発明は、試料中のＳＢＶ感染又はシンブ血清群ウイルスを検出するためのキットであって、
ｉ．上記のような本発明の１つ以上のペプチド；及び
ｉｉ．ペプチドとＳＢＶ又はシンブ血清群ウイルスに対して特異的な抗体との間に形成された複合体を検出するための手段
を含む、前記キットに関する。
【０１６５】
キットは、すぐに使用できる試薬を含有し、試験結果は、有利には数時間以内、好ましくは６時間未満で、好ましくは５時間未満で、更に好ましくは４時間未満で得られる。
【０１６６】
試料の希釈係数は、好ましくは、５０ｘ以下、好ましくは３０ｘ以下、好ましくは２０ｘ以下、好ましくは１０ｘ以下であり、有利には、更なる希釈工程を避けている。
【０１６７】
キットは好ましくは全てすぐに使用できる試薬、例えば、被覆プレート、陰性及び陽性の対照、洗浄溶液、試料希釈液、複合体、ＴＭＢ及び停止液を含有する。
【０１６８】
適用されるペプチド抗原は、好ましくは、シンブ群ウイルスの中で保存された抗原であり、従って、有利には試料中でのｐａｎ−シンブ群の感染の検出を可能にする。
【０１６９】
好ましい実施態様では、試験の固相は、上記のようにペプチド抗原で被覆されている。ペプチド抗原は、大腸菌で化学的に合成されるか又は発現され得る。本方法及び試験キットでは、公知で且つ有用な固相が使用されてよく、好ましくは、マキシソープ又はポリソープ（Thermo Fisher Scientific）が使用され、且つ好ましくはｐＨ５、ｐＨ７又はｐＨ９．５を有するコーティング緩衝液を適用することによって被覆されている。抗原は、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ又は４μｇ／ｍｌの量で適用される。当該技術分野で知られたブロッキング溶液を適用することが有利であり得るが、ブロッキング溶液を避けることが好ましい。
【０１７０】
試料希釈液として、０．１４ＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、０．０３％のＫａｔｈｏｎ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０が使用されてよい。本発明により有用な別の希釈液は、２％のＭｇＣｌ２、６％のＴｗｅｅｎ２０及び６％のＡＯ、０．５％のカゼインナトリウム塩である。
【０１７１】
検出抗体は１：１００００、好ましくは１：２００００に希釈される。
【０１７２】
方法工程は、必要に応じて適用され、適用される特定の試薬に応じて変化し得る。好ましい実施態様では、条件及び方法工程は以下の通りである：
試料希釈液（２％のＭｇＣｌ２、６％のＡＯ、６％のＴｗｅｅｎ２０及び０．５％のカゼイン）中の試料（１：１０）、１００μｌ／ウェル
湿潤チャンバ内にて室温で１時間のインキュベート、
３×洗浄（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を有するリン酸緩衝生理食塩水）
すぐに使用できる複合体、１００μｌ／ウェル
湿潤チャンバ内にて室温で１時間のインキュベート
３×洗浄（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を有するリン酸緩衝生理食塩水）
ＴＭＢ１００μｌ／ウェル、室温で１０分間のインキュベート
停止液の添加（１００μｌ／ウェル）及び
４５０ｎｍで読み取る
【０１７３】
特に好ましい実施態様では、試料希釈液は、０．１〜０．５５％の間、好ましくは０．１％、更に好ましくは０．５５％の濃度でカゼインナトリウム塩を含有する。好ましい実施態様では、試料希釈液は、０．５％のカゼインナトリウム塩とＭｇＣｌ２を含有し、好ましくは、ＭｇＣｌ２は２％の濃度を有する。
【０１７４】
好ましい実施態様では、検出方法、好ましくはキットも、特定の化合物の包含、抗原を捕捉する特定の希釈液の使用及び／又は本発明の検出方法及びキットで使用される固体支持体上に被覆された抗原を捕捉する特定の量及び性質によって特徴付けられる。
【０１７５】
好ましくは精製条件及び／又は希釈条件及び／又は検出方法に含まれる特定の成分及びキットの特定の組み合わせによって、ＳＢＶ検出方法及び好ましくはシンブ血清群ウイルスの改善された性能が達成され得ることが示され得る。
【０１７６】
この群の全てのメンバーが本発明の方法で検出可能である。好ましくは、以下の特定のウイルスが検出される：シュマーレンベルグウイルス、シャモンダウイルス、ダグラスウイルス、ピートンウイルス、アカバネウイルス、アイノウイルス、オロプーシェウイルス、ティナルーウイルス、シュニウイルス。特に好ましい及び特に良好な結果が、以下の種によって達成された：ピートン、アカバネ、アイノ、ティナルー。特に好ましい実施態様では、ウシ科、シカ科及びラクダ科のシンブ血清群ウイルスが検出される。
【０１７７】
特に好ましい実施態様では、本発明のペプチドの希釈は、コーティング溶液中で０．２５〜５μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜１μｇ／ｍｌの濃度であるように選択された。その特定の希釈液中での本発明のペプチドの調製が有利であると判明した。
【０１７８】
更には、本願明細書に記載されるような本発明による試験及びキットの利点は、そのような試験で達成できる肯定的な試験結果から明らかであるだけではない。これは、今現在、即ち、２０１３年８月の市場での試験キットとの比較において更に一層明白である。特に、本発明及び好ましい実施態様の検出方法は、従来技術のＳＢＶ試験、例えば、ＩＤｖｅｔ試験及び背景技術の段落に上記されたキットよりも優れている。
【０１７９】
別の好ましい実施態様は、検出方法及び好ましくはキットにおいてカゼインを使用している。市場で利用可能な任意のカゼインは、試験の良好な検出結果を達成するために他の化合物の必要性に応じて使用可能な濃度で適用され得る。好ましくは、試験溶液の濃度は、０．１〜１％、好ましくは０．２５〜０．７５％、更に好ましくは０．５％である。好ましい実施態様では、カゼインは、試料の希釈液中に存在する。
【０１８０】
被覆工程は、好ましくはｐＨ５〜ｐＨ１０、好ましくは約ｐＨ５、ｐＨ７、又はｐＨ９．５で実施される。
【０１８１】
本明細書及び実施例に記載されるような被覆ペプチドは、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、又は４μｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌの量で使用される。
【０１８２】
別の好ましい実施態様は、単独で又はそれに加えてアミンオキシド（ＡＯ）を使用する。好ましくは、使用される濃度は、本方法の溶液中で３〜１０％、好ましくは５〜８％、更に好ましくは６％の量である。
【０１８３】
検出方法及びキットの別の好ましい実施態様は、Ｔｗｅｅｎ、好ましくはＴｗｅｅｎ２０、又は比較物質、好ましくは比較可能な特性を有する洗浄剤を含有する。この物質は、０．０５〜０．５％、好ましくは０．１〜０．２％の量で含有される。
【０１８４】
特に好ましい実施態様では、被覆工程の洗浄溶液は、好ましくは、０．１４ＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ；０．０３％のＫａｔｈｏｎ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有し、試料希釈液は２％のＭｇＣｌ２、６％のアミンオキシド（ＡＯ）、６％のＴｗｅｅｎ２０及び０．５％のカゼインを含む。
【０１８５】
好ましい実施態様では、抗反芻動物コンジュゲートは、すぐに使用できるフォーマット（ＲＴＵ）としてコンジュゲート安定緩衝液中で１：１００００〜１：３００００、好ましくは１：２００００の希釈度で使用される。
【０１８６】
別の好ましい実施態様では、上記の化合物は、組み合わせることができて、特に良好な試験結果につながる。かかる実施態様では、様々な化合物が、キット化合物の調製に使用される又は試験の実施中に使用される溶液のいずれかに含有され、且つ本発明によるキットに含有され得る。
【０１８７】
本発明者らは、驚くことに、上記の好ましい実施態様のうちの１つ又は組み合わせを用いて、特異性及び選択性に関して非常に良好な結果を達成した。このような良好な結果が、特定の抗原調製物を使用することによって得られ、その際、その特定の希釈液が特に有利であることは予見されなかった。更に有利なのは、他の添加剤、例えば、カゼイン、アミンオキシド及び／又はＴｗｅｅｎと関係する、好ましくは上記の濃度の、ペプチド抗原希釈液である。
【０１８８】
試験は、好ましくは、シンブ血清群ウイルスを検出し、これは好ましくは、ウシ、ヤギ及びヒツジ試料中のＳＢＶを検出できる。
【０１８９】
カットオフは、感度と特異性の必要性に応じて選択され得る。分布はこれを目的の適合性に適合させるように考えられている。これは試験の必要性によって変わる。ＲＯＣが分析に使用されている。カットオフは、陽性及び陰性の対照、当業者に知られた各計算及び診断試験の開発用の文献に関して標準的な手順に従って選択される。
【０１９０】
特異性を最適化するために、カットオフは、好ましくは３０％以上、４０％以上、５０％以上、又は６０％以上で選択される。
【０１９１】
感度を最適化するために、カットオフは、好ましくは１０％以上、２０％以上、３０％以上、又は４０％以上で選択される。
【０１９２】
本発明による試験のための最適なカットオフは、好ましくは４０％、更に好ましくは３０〜４０％の間である。
【０１９３】
本発明の試験の利点は、好ましい実施態様において、９７％を上回る、好ましくは９８％を上回る、更に好ましくは９９％を上回る特異性、及び９４％を上回る、更に好ましくは９５％を上回る、更に好ましくは９６％を上回る感度が達成され得ることである。特定の実施態様は、約９９．８％の特異性と約９５．８％の感度を達成する。特定の種に関して、以下の特異性と感度がそれぞれ達成され得る：ウシ：９９．５％及び９５．７％；ヒツジ：１００％及び９９％；ヤギ：１００％及び９９％。
【０１９４】
従って、本方法及び試験キットは、特に、ＳＢＶの検出のためにヤギ、ヒツジ及びウシについて信頼性が高い。好ましい実施態様では、良好な結果がシンブ血清群にも適用される。特に良好な結果が、アカバネ、ピートン、アイノ及びティナルーウイルスを検出するために達成され得る。
【０１９５】
以下において本発明は好ましい実施例によって例示されており、これはいかなる意味においても限定的であることを意味するものではない。
【０１９６】
Ｉ．本発明の一態様が以下の実施例に記載されている。
【０１９７】
実施例
実施例１
シュマーレンベルグウイルス（シンブ血清群ＥＬＩＳＡ）に対する抗体を検出するための第一世代スクリーニング試験の開発
【０１９８】
第１工程では、様々なバンヤウイルスの配列を比較し、これは以下の第１表から明らかである。シンブ血清群のメンバーは、少なくとも７８％のＳＢＶのＮタンパク質との配列類似性を示した。
【表１】
2015535841.tif 000002
【０１９９】
Ｎタンパク質クローンの配列は、以下の第２表に示された配列ＳＢＶ／１〜８４６と同一である。クローンは更なるＨｉｓタグを含有する。
【０２００】
発現、精製及びビオチン化
プラスミドＤＮＡは、細菌宿主細胞の形質転換のために使用され、ウイルス性のＮ（ヌクレオカプシド）タンパク質を発現した。標準的なアフィニティー精製システムを、Ｎｉカラム（ＨｉｓタグＮタンパク質）を使用して確立した。Ｎタンパク質は、緩衝溶液中に沈殿する強い傾向を示すだけでなく、緩衝液溶解性フラクションが更なる精製に使用された。結合及び洗浄緩衝液は、混入している大腸菌タンパク質のＮｉカラムへの非特異的結合を防ぐために、１０ｍＭのイミダゾールを含有した。Ｎタンパク質は、溶出緩衝液中の０．５Ｍのイミダゾール濃度を増加させることによってカラムから放出された。溶出したタンパク質を、ｐＨ９の炭酸塩緩衝液に対する透析によりイミダゾールを除去した後に直接コーティング実験に使用した。
【０２０１】
Ｎタンパク質のビオチン化は、アルカリ炭酸塩緩衝液中で行った。活性化ビオチンを添加し、Ｎタンパク質に結合させた。ビオチン化プロセスは、トリス緩衝液を添加することによって停止させ、遊離ビオチンを、ビオチンを含まない炭酸緩衝液に対する透析によって除去した。この物質を、ストレプトアビジンで予備被覆されたプレート（米国、メイン州、ウェストブルックのＩＤＥＸＸ  ＣｏＥ社製のプレート）を使用して被覆実験に使用した。
【０２０２】
プレートへのタンパク質の直接コーティング：
精製したＮタンパク質（ビオチン化されていない）を、標準的な手順（リン酸緩衝液、４℃で一晩インキュベーション）を使用して、マキシソーププレート上に被覆した。プレートを乾燥させ、抗体陽性及び陰性試料を試験した。
【０２０３】
コーティングプロトコール：
−  ｐＨ７のリン酸緩衝液中の精製されたＮタンパク質の希釈
−  １５μｇ／ｍｌの最終濃度までの洗浄剤の添加
−  振盪しながら２０分間室温でのインキュベーション
−  洗浄剤処理された抗原の、リン酸塩緩衝液中で１〜４μｇ／ｍｌの最終濃度までの更なる希釈
−  マキシソーププレートを１００μｌ／ウェルでコーティング
−  湿潤チャンバ内にて４℃で一晩のインキュベーション
−  コーティング溶液の吸引及びプレートの乾燥
【０２０４】
図１は、実験の結果を示し且つ１つの陽性（Pos. Bov FLI）、１つの陰性（NEG Bov. Sample）及び試料／ブランクなしを用いて試験された３つの異なるコーティング緩衝液（ｐＨ５のＰＢＳ；ｐＨ７のＰＢＳ；ｐＨ９．３の炭酸ナトリウム緩衝液）中での抗原（ビオチン化されていない精製されたＮタンパク質）滴定の例である。
【０２０５】
実施例２
ストレプトアビジン予備被覆プレート及び該プレートへのビオチン化Ｎタンパク質の結合
プレートをストレプトアビジンで予備被覆した。ストレプトアビジンプレートを、ビオチン化Ｎタンパク質で一晩インキュベートし、３回洗浄し、且つＥＬＩＳＡプロトコールが実行される前に乾燥しなかった。図６は、２：１（ビオチン：タンパク質）のモル比を用いてビオチン化されたＮタンパク質の例を示す。３つの陽性試料と１つの陰性試料を試験した。陰性試料（ＩＤ７９２）を同様に直接被覆実験で使用した（実施例１を参照）。陽性試料は、実施例１のものとは異なる。ＥＬＩＳＡプロトコールは、直接被覆について実施例１に上記されたプロトコールと同一である。
【０２０６】
図２は、両方の場合において、様々な抗原濃度の範囲にわたって陽性試料と陰性試料との間に明確な違いがあることを示す。
【０２０７】
実施例３
ＥＬＩＳＡ形式Ｉ
この形式において、組み換えＳＢＶヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質の直接被覆を使用する。コーティングタンパク質は、配列番号１３９〜１４４による完全長のヌクレオカプシドタンパク質であるか又は切断型のいずれかであってよい。配列表に記載されるように他のＳＢＶタンパク質も試験に適用することができる。
【０２０８】
形式は間接的で且つ単相であり、試料の種類は、血清、血漿又は乳汁であってよい。
【０２０９】
被覆されたプレートを、室温で血清、血漿又は乳汁を用いてインキュベートする。試料は、単一ウェル中の個別の試料として、希釈系列で、好ましくは重複又は三重複として適用することができる。試料希釈液は、好ましくは１：１０又は１：２０である。約１０分〜９０分、好ましくは約３０〜６０分のインキュベーション後、プレートを好ましくはＰＢＳを用いて３回洗浄する。検出のために、抗反芻動物ＨＲＰコンジュゲート抗体を、プレートに塗布し、約１０〜９０分間、好ましくは約３０〜６０分間インキュベートする。３回の洗浄後、基質、好ましくはＴＭＢを、約５〜１５分間、好ましくは１０分間添加し、結果を４５０ｎｍで読み取る。プレートを、試料用のウェル並びに陽性及び陰性の対照用のウェルを含むように配置する。
【０２１０】
組み換えヌクレオカプシドタンパク質は、大腸菌又はバキュロウイルス系で産生することができる。本発明によって使用されるヌクレオカプシドタンパク質についての詳細は、配列表に記載されている。本願明細書に列記されたヌクレオカプシドタンパク質はいずれも試験に適用され得る。
【０２１１】
コーティングは、ブロッキングの有無に関わらず、約ｐＨ５、ｐＨ７又はｐＨ９．５で、好ましくはｐＨ７で実施する。コーティングタンパク質を、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ又は４μｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌの量で適用する。
【０２１２】
洗浄溶液は、好ましくは、０．１４ＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ；０．０３％のカトン（Ｋａｔｈｏｎ）、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有し、試料希釈液は、２％のＭｇＣｌ２、６％のアミンオキシド（ＡＯ）、６％のＴｗｅｅｎ２０及び０．５％のカゼインを含む。
【０２１３】
抗反芻動物コンジュゲートは、すぐに使用できるフォーマット（ＲＴＵ）としてコンジュゲート安定緩衝液中で１：１００００〜１：３００００、好ましくは１：２００００の希釈度で使用される。
【０２１４】
試験は、ウシ、ヤギ及びヒツジ試料中のＳＢＶを検出できる。
【０２１５】
実施例４
ＥＬＩＳＡ形式ＩＩ−一段階ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ形式Ｉの下で記載されるように、組み換えＳＢＶタンパク質、好ましくは、ヌクレオカプシドタンパク質は、ストレプトアビジン−ビオチンを介して固体支持体に結合されている。好ましくは、ストレプトアビジンは固体支持体に結合され、ＳＢＶタンパク質はビオチンと結合されるので、形成するストレプトアビジン−ビオチン複合体を介して固体支持体への被覆が可能である。
【０２１６】
固体支持体、例えば、多層板は、ストレプトアビジンで被覆されている。ストレプトアビジンで被覆されたプレートは、一段階工程で、ビオチン化ＳＢＶタンパク質（上記の通り；本願明細書のＳＢＶタンパク質の配列表を参照のこと）、試料（好ましくは、上記のような希釈されたもの）及びＨＲＰとコンジュゲートされた抗反芻動物モノクローナル抗体を用いてインキュベートされる。ＨＲＰ抗体は好ましくはＩｇＧである。約３０〜９０分間のインキュベート後、好ましくは１時間後に、プレートを上記のように洗浄し、読み取りを４５０ｎｍで行う。
【０２１７】
ストレプトアビジンで予備被覆されたマイクロタイタープレートが供給される。オールインワン（all-in-one）緩衝液は、ビオチン化ヌクレオカプシドタンパク質、及び抗ＩｇＧコンジュゲートを含有する。試験されるべき試料の希釈物は、これらのプレートのウェル内のオールインワン緩衝液中でインキュベートされる。ＳＢＶに特異的な任意の抗体は、オールインワン緩衝液中の抗原に結合し、ストレプトアビジンプレートのウェル表面上の抗原／抗体／抗ＩｇＧコンジュゲート複合体を形成する。未結合物質は洗浄によりウェルから除去される。ＴＭＢ含有基質をウェルに加える。発色の程度（４５０ｎｍで測定した光学密度）は、試料中に存在するＳＢＶの特異的な抗体の量に正比例する。
【０２１８】
従来技術のＩＤｖｅｔ試験と比較した、本発明による一段階ＥＬＩＳＡの結果を、第５表に例示する。
【０２１９】
実施例５
ＥＬＩＳＡ（ｐａｎ−シンブ群ＥＬＩＳＡ）によるシンブ血清群の認識
本発明による好ましい試験形式は、シンブ血清群の異なるメンバーで感染された後に形成される抗体を認識することが可能である、即ち、試験はｐａｎ−シンブ群試験である。第６表も参照されたい。
【表２】
2015535841.tif 000003
【０２２０】
好ましい実施態様では、試験は、シンブ血清群のウイルスを検出可能であり、更に好ましい実施態様ではシンブ及びブンヤムウェラのウイルスを、更に好ましい実施態様ではカリフォルニア血清群のウイルスを加えて、あるいは１つの試験用設定においてシンブ及びカリフォルニア血清群のウイルスを検出可能である。
【表３】
2015535841.tif 000004
【０２２１】
第５表は、ＩＤｖｅｔにより市販される試験に対して本発明による試験において検証された試料の比較を記載する。
【０２２２】
試験結果は、試験と本発明による方法の優れた性能を示す。
【表４】
2015535841.tif 000005
【０２２３】
第６表は、本発明による試験で使用された確認されたウシの試料を示す。これは、様々なシンブ血清群ウイルスの検出を確認し、従って、ｐａｎ−シンブ血清群試験としてのその有用性が認められる。
【図面の簡単な説明】
【０２２４】
【図１】図１は、３つの異なるコーティング緩衝液中での抗原滴定を示す。
【図２】図２は、ビオチン化Ｎタンパク質でインキュベートされたストレプトアビジンのプレコーティングされたプレートを示す
【図３】図３は、ＳＢＶ（配列番号１）のヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質）の配列を示す。
【図４】図４は、ＨｉｓタグＣ−末端を含む、ＳＢＶ（配列番号２）のヌクレオカプシドタンパク質（ＨｉｓＮタンパク質）のアミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、図４による６×Ｈｉｓタグアミノ酸配列を有するヌクレオカプシドタンパク質を示す。
【図６】図６は、ｐＥＴ２８ａベクター（配列番号３）中の６×ＨｉｓタグＤＮＡ配列を有するＳＢＶヌクレオカプシドタンパク質の全長を示す。
【図７】図７は、コンセンサスコドン（配列番号４）を有するヌクレオカプシドタンパク質ＤＮＡ配列を示す。
【図８】図８は、ヌクレオカプシド切断：１８２  ａａ  Ｈｉｓ−タグＣ−末端（配列番号５）を示す。
【図９】図９は、本発明による間接ＥＬＩＳＡ形式を示す。
【図１０】図１０は、本発明による２つの一段階ＥＬＩＳＡ形式を示す。
【０２２５】
ＩＩ．本発明の別の態様を以下の実施例に記載する。
【０２２６】
実施例
実施例１
ペプチド診断試験の確立に有用なエピトープを含むペプチドの同定
ＳＢＶ  Ｎｐウイルスタンパク質でのエピトープ領域のＰｅｐＳｃａｎマッピング
目標
エピトープマッピング研究はＳＢＶ  Ｎｐタンパク質で実施した。目標は、ＳＢＶに関連する３種の動物：ウシ、ヒツジ及びヤギについてのこれらのウイルスタンパク質の殆どの免疫原性領域を同定することであった。
【０２２７】
プロトコール
重複するペプチドが、全てのタンパク質配列にわたって合成された場合に、ＰｅｐＳｃａｎ法を使用した。ビオチン化ペプチドの合成を、ＮＥＰ（ニューイングランドペプチド、米国）によって行った。ビオチン化ペプチドは１６アミノ酸長さであり、その際、１２アミノ酸及び１３アミノ酸はＮｐとそれぞれ重複している（配列情報については第１表〜第４表を参照のこと）。合成は、分析から除外されたペプチド数Ｂ１０、Ｄ０８、Ｇ０５、Ｈ０６及びＨ０７を除いて、全ての必要なペプチドについて成功した。
【０２２８】
ビオチン化ペプチドは、標準的なプロトコールを使用して、ストレプトアビジンプレート上にコーティングされた。３種のＳＢＶ関連動物種由来の特徴付けられたＳＢＶ陽性及び陰性血清試料を、各ペプチドで反応性について試験した。更に、完全長の組み換えＮｐ（ｒＮＰ）との対照反応性を、各試料について同じプレートで評価した。予備的最適化の研究は、実験条件の同定につながり、これは限定されたバックグラウンド（試料希釈度、試料希釈液及びコンジュゲート希釈度）を有する陽性試料と陰性試料との間の明確な区別を可能にする。使用されるＥＬＩＳＡ形式は従来の間接ＥＬＩＳＡ形式であった。簡単に説明すると、室温（ＲＴ）で１時間のペプチドコーティング後、ストレプトアビジンプレートを洗浄した。試験されるべきウシ、ヒツジ又はヤギの血清を、その後、各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを洗浄し、抗反芻動物ＨＲＰコンジュゲート抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、ＴＭＢ基質の添加前に、プレートを再度洗浄した。発色を１０分後に停止し、光学濃度（ＯＤ）を、分光光度計を用いて４５０ｎｍで測定した。
【０２２９】
血清を、ＵＳ由来の陰性試料として使用する。それらは、ＩＤＥＸＸシュマーレンベルグ抗体検査（２０１３に市販されたもの）で明確に陰性を示し、また、完全長ｒＮＰで被覆されたストレプトアビジンプレートで非常に低い反応性も示した。
【表５】
2015535841.tif 000006
【０２３０】
ウシの試料で得られた結果
まず、ウシ血清に焦点を合わせた。最初のスクリーニング実験では、合計で４つのＳＢＶ陽性（色付きの線）と５つのＳＢＶ陰性ウシ血清（黒線）を、全てのペプチドで並びに完全長の核タンパク質（ｒＮＰ）で試験した。結果を図１にまとめる。
【０２３１】
全ての陽性試料は、ｒＮＰ完全長の対照で強い反応性を示すが、陰性試料は、予想通り、非常に低い反応性を示す。陽性試料のサブセットが全ての陰性試料（例えば、Ａ０９、Ａ１０、Ｂ０３、Ｂ１１、Ｂ１２、Ｃ１１、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｆ０４）よりも遙かに強く結合する場合に、複数のＮｐペプチド又はエピトープ領域が同定され得る。全てのウシ試料と反応性を示す同定された単一のエピトープは存在しなかった。
【０２３２】
その後、選択されたペプチドを、確認のために、より強いコンジュゲート濃度を使用して、より多くの血清を用いて再度試験した（図３）。
【０２３３】
ヒツジ試料で得られた結果
次に、ヒツジの血清を、同じ手順に従って、全てのＮＰペプチドで試験した（図４）。合計でｎ＝６のＳＢＶ陽性とｎ＝６の陰性のヒツジ血清を、最初に全てのペプチドの反応性に関してスクリーニングした。複数の潜在的なヒットがこの最初の画面で確認された。単一のヒットは全ての陽性試料に合わなかったが、幾つかのヒットは、陰性血清（例えば、Ｅ０９）と比較して複数の陽性血清に関して強い反応性を示した。Ｃ末端領域（Ｅ０７で始まる）は、より高い潜在的ヒットの集中を示した。
【０２３４】
次に、Ｅ０７で始まるＮｐのＣ末端領域由来のペプチドを、より多くの血清を用いて再度試験した（図４、ｎ＝７の陰性及びｎ＝９のＳＢＶタンパク質血清）。複数の陽性血清は、陰性血清と比較して、ペプチドＥ０８−Ｅ０９、Ｅ１１、Ｆ０１−Ｆ０２、Ｆ０４、及びＦ１２−Ｇ０１で確認された強い反応性を示した。
【０２３５】
同定されたエピトープの概要
診断の有用性を示す潜在的なＮｐエピトープを有する複数の有用なペプチドは、特にウシ及びヒツジで同定された（すぐ下の第２表及び第３表を参照のこと）。同定されたエピトープ領域も図６Ｂにまとめる。
【０２３６】
特に有用なのは、ペプチドＡ０９〜Ａ１１及びＢ０３である。これは、位置２５〜５８のＮｐタンパク質におけるアミノ酸位置を有するペプチドが、特に、本発明による診断試験に有用であることを示す。
【０２３７】
好ましいのは、７〜２０個の間のアミノ酸長さを有する１つのペプチド又は好ましくはアミノ酸位置１６〜３２、２５〜４５、３０〜５０、３５〜５５又は３８〜５８をカバーする複数のペプチドを含むペプチド混合物、又は７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個のアミノ酸を含有するそれらのフラグメントである。
【０２３８】
第１表に示された配列は、有蹄類の、好ましくは、ウシ及びヒツジのＳＢＶ感染を同定するための診断試験において有用な可能性を有するペプチドを表し、更に好ましくは、かかるペプチドは、ウシ及びヒツジの試料を同様に処理して同定するために使用できる。別の好ましい実施態様では、かかるペプチドを適用する試験は、シンブ血清群ウイルスで感染した動物を同定するために使用され得る。
【０２３９】
それらの特に好ましいペプチド及びフラグメントは、ペプチドＡ０６〜Ａ１１、更に好ましくはペプチドＡ０７、Ａ０８、Ａ０９である。試験において特に良好な結果を示すペプチドは、第１表に示された全配列又は該配列のフラグメント、特にペプチドＡ０７及びＡ０８のものである。他の好ましいペプチドは、第１表のＦ０１〜Ｆ１２及びＧ０１〜Ｇ０２、更に好ましくはＦ０１、Ｆ０３及びＧ０１である。
【０２４０】
当業者は、第１表に記載されるペプチドが１６個のアミノ酸を示すが、これは、例えば、ＳＢＶ又はシンブ血清群ウイルス感染後に動物で形成された抗体に対して陽性の及び特異的な結合特性を示す、例えば、Ａ０７又はＡ０８の、かなりの部分のエピトープの、エピトープを表す少なくとも５〜７個のアミノ酸のストレッチが含まれる限り、より短いペプチドを使用するには十分であることを理解している。
【０２４１】
本願明細書に記載されるような診断ペプチド試験において特に好ましく且つ有用なペプチドは、配列ＮＰＥＶＧＹＶＡＦＩＧＫＹＧＱＱＬＮＦＧＶＡ、好ましくはＮＰＥＶＧＹＶＡＦＩＧＫＹＧＱＱ（配列番号７６）、ＶＧＹＶＡＦＩＧＫＹＧＱＱＬＮＦ（配列番号７７）、又はＶＡＦＩＧＫＹＧＱＱＬＮＦＧＶＡ（配列番号７８）、更に好ましくはＮＰＥＶＧＹＶ（配列番号７９）、ＥＶＧＹＶＡＦ（配列番号８０）、ＶＡＦＩＧＫＹ（配列番号８１）、ＦＩＧＫＹＧＱ（配列番号８２）、ＧＫＹＧＱＱＬ（配列番号８３）、ＹＧＱＱＬＮＦ（配列番号８４）、ＱＱＬＮＦＧＶ（配列番号８５）、又はＱＬＮＦＧＶＡ（配列番号８６）、及び更に一層好ましくはＮＦＧＶＡ（配列番号８７）、ＬＮＦＧＶ（配列番号８８）、ＱＬＮＦＧ（配列番号８９）、ＱＱＬＮＦ（配列番号９０）、ＧＱＱＬＮ（配列番号９１）、ＹＧＱＱＬ（配列番号９２）、ＫＹＧＱＱ（配列番号９３）、ＧＫＹＧＱ（配列番号９４）、ＩＧＫＹＧ（配列番号９５）、ＦＩＧＫＹ（配列番号９６）、ＡＦＩＧＫ（配列番号９７）、ＶＡＦＩＧ（配列番号９８）、ＹＶＡＦＩ（配列番号９９）、ＧＹＶＡＦ（配列番号１００）、ＶＧＹＶＡ（配列番号１０１）、ＥＶＧＹＶ（配列番号１０２）、ＰＥＶＧＹ（配列番号１０３）、又はＮＰＥＶＧ（配列番号１０４）を含む又はそれらからなるペプチドである。
【０２４２】
本願明細書に記載される診断ペプチド試験において特に好ましく且つ有用なペプチドは、配列ＬＲＱＲＹＧＴＭＴＡＥＥＷＭＴＱＫＩＴ及びＧＦＳＰＡＡＲＴＦＬＱＱＦＧＩＮ、好ましくはそのフラグメント、例えば、ＬＲＱＲＹＧＴ（配列番号１０５）、ＱＲＹＧＴＭＴ（配列番号１０６）、ＹＧＴＭＴＡＥ（配列番号１０７）、ＴＭＴＡＥＥＷ（配列番号１０８）、ＴＡＥＥＷＭＴ（配列番号１０９）、ＥＥＷＭＴＱＫ（配列番号１１０）、ＷＭＴＱＫＩＴ（配列番号１１１）、ＧＦＳＰＡＡＲ（配列番号１１２）、ＳＰＡＡＲＴＦ（配列番号１１３）、ＡＡＲＴＦＬＱ（配列番号１１４）、又はＲＴＦＬＱＱＦ（配列番号１１５）、ＬＱＱＦＧＩＮ（配列番号１１６）を含む又はそれらからなるペプチドである。
【０２４３】
更に、本発明者らは、適用の意味におけるウイルス感染、例えば、ＳＢＶ感染の同定に有用なアミノ酸配列を表すＮｐタンパク質の幾つかのコアモチーフを同定することができる。
【０２４４】
かかる配列のモチーフは、好ましくは、ＦＦＬＮ（Ｂｏｖ４３−４６）（配列番号１１７）又はＶＦＦＬＮ（Ｂｏｖ４２−４６）（配列番号１１８）又はＦＦＬＮＱ（Ｂｏｖ４３−４７）（配列番号１１９）、ＭＤＶＮＰＭＫＫＶＬＲＱＲ（Ｂｏｖ／Ｏｖ１７２−１８４）（配列番号１２０）、ＭＫＫＶＬＲＱＲ（Ｂｏｖ／Ｏｖ１７７−１８４）（配列番号１２１）、ＬＲＱＲ（Ｂｏｖ／Ｏｖ１８１−１８４）（配列番号１２２）又はＬＲＱＲＹＧＴＭＴＡ（Ｂｏｖ／Ｏｖ１８１−１９０）（配列番号１２３）である。
【０２４５】
上記の配列モチーフを含む又はそれらからなるペプチド又は５０個未満のアミノ酸、好ましくは４〜４０個、好ましくは４〜２５個、好ましくは４〜１６個のアミノ酸を有する前記配列モチーフを含むアミノ酸配列は、試料中のＳＢＶ感染検出の同定に有用である。通常の試験は、ＳＢＶ感染又は他のシンブ群ウイルス感染の検出、最も好ましくはＳＢＶ検出に対して有利な有用性を示すために適用され得る。
【０２４６】
別の好ましい実施態様では、本発明は、５〜５０個のアミノ酸を含み且つそこに含有される配列番号２〜１３８のうち少なくとも１つを有する単離されたペプチドに関する。
【０２４７】
有用なエピトープを含む他の好ましいアミノ酸配列及びエピトープ及び／又はアミノ酸配列を、以下の第２表及び第３表に記載する。
【表６】
2015535841.tif 000007
【表７】
2015535841.tif 000008
【０２４８】
図６Ｂは、表の他に、本発明の有用なアミノ酸ストレッチの同定されたエピトープのコンセンサス領域をまとめている。
【０２４９】
ペプチドＥＬＩＳＡ形式又は比較可能な試験形式においてＳＢＶの検出に有用な更なる好ましい実施態様である追加の有用な配列が以下に記載されているか、又は好ましい実施態様において、これらのペプチドはｐａｎ−シンブ群試験において有用である。
【０２５０】
ＳＢＶ感染動物由来のウシ及びヒツジ血清によって認識されたヌクレオカプシドタンパク質配列（本発明の好ましい実施態様）：
Ｂｏｖ  ２５−８５（配列番号１２４）
ＶＡＦＩＧＫＹＧＱＱＬＮＦＧＶＡＲＶＦＦＬＮＱＫＫＡＫＭＶＬＨＫＴＡＱＰＳＶＤＬＴＦＧＧＶＫＦＴＶＶＮＮＨＦＰＱＹＶＳＮＰ
Ｂｏｖ  ２５−５８（配列番号１２５）
ＶＡＦＩＧＫＹＧＱＱＬＮＦＧＶＡＲＶＦＦＬＮＱＫＫＡＫＭＶＬＨＫＴＡ
Ｂｏｖ  ２５−４６（配列番号１２６）
ＶＡＦＩＧＫＹＧＱＱＬＮＦＧＶＡＲＶＦＦＬＮ
Ｂｏｖ  ４３−５８（配列番号１２７）
ＦＦＬＮＱＫＫＡＫＭＶＬＨＫＴＡ
Ｂｏｖ  ６１−８５（配列番号１２８）
ＳＶＤＬＴＦＧＧＶＫＦＴＶＶＮＮＨＦＰＱＹＶＳＮＰ
Ｂｏｖ  １０３−１１８（配列番号１２９）
ＷＩＡＤＴＣＫＡＳＶＬＫＬＡＥＡ
Ｂｏｖ＋  Ｏｖ  １６６−２３２（配列番号１３０）
ＲＶＬＫＤＮＭＤＶＮＦＭＫＫＶＬＲＱＲＹＧＴＭＴＡＥＥＷＭＴＱＫＩＴＥＩＫＡＡＦＮＳＶＧＱＬＡＷＡＫＳＧＦＳＰＡＡＲＴＦＬＱＱＦＧＩＮ
Ｂｏｖ＋Ｏｖ  １６６−２０５（配列番号１３１）
ＲＶＬＫＤＮＭＤＶＮＦＭＫＫＶＬＲＱＲＹＧＴＭＴＡＥＥＷＭＴＱＫＩＴＥＩＫＡＡＦ
Ｂｏｖ＋Ｏｖ  １６６−１８４（配列番号１３２）
ＲＶＬＫＤＮＭＤＶＮＦＭＫＫＶＬＲＱＲ
Ｂｏｖ＋Ｏｖ  １７２−２０５（配列番号１３３）
ＭＤＶＮＦＭＫＫＶＬＲＱＲＹＧＴＭＴＡＥＥＷＭＴＱＫＩＴＥＩＫＡＡＦ
Ｂｏｖ＋Ｏｖ  １７２−１９０（配列番号１３４）
ＭＤＶＮＦＭＫＫＶＬＲＱＲＹＧＴＭＴＡ
Ｂｏｖ＋Ｏｖ  １７５−１９０（配列番号１３５）
ＮＦＭＫＫＶＬＲＱＲＹＧＴＭＴＡ
Ｂｏｖ＋Ｏｖ  １８１−１９９（配列番号１３６）
ＬＲＱＲＹＧＴＭＴＡＥＥＷＭＴＱＫＩＴ
Ｂｏｖ＋Ｏｖ  １９０−２０５（配列番号１３７）
ＥＥＷＭＴＱＫＩＴＥＩＫＡＡＦ
Ｏｖ  ２１４−２３２（配列番号１３８）
ＫＳＧＦＳＰＡＡＲＴＦＬＱＱＦＧＩＮ
【０２５１】
上記のペプチドは、本発明の好ましい実施態様を表し、その配列は本願明細書に記載されるような試験形式において単独で又は組み合わせて適用される時に有利な結果を示す。特に、免疫学的検定法に適用される時に、好ましく且つ良好な試験結果を示すものは、以下のペプチドである。
【０２５２】
実施例２
シュマーレンベルグウイルスに対する抗体の検出のためのスクリーニング試験（シンブ血清群ＥＬＩＳＡ）
ペプチドのプレートへの直接被覆：
本発明の精製されたペプチド（ビオチン化されていない）を、標準的な手順（リン酸緩衝液、４℃で一晩インキュベーション）を用いてマキシソーププレート上に被覆した。プレートを乾燥させ、抗体の陽性試料と陰性試料を試験した。
【０２５３】
コーティングプロトコール：
−  ｐＨ７のリン酸緩衝液中の精製されたペプチドの希釈
−  １５μｇ／ｍｌの最終濃度までの洗浄剤の添加
−  振盪しながら２０分間室温でのインキュベーション
−  洗浄剤処理された抗原の、リン酸塩緩衝液中で１〜４μｇ／ｍｌの最終濃度までの更なる希釈
−  マキシソーププレートを１００μｌ／ウェルでコーティング
−  湿潤チャンバ内にて４℃で一晩のインキュベーション
−  コーティング溶液の吸引及びプレートの乾燥
【０２５４】
ストレプトアビジン予備被覆プレート及び該プレートへのビオチン化ペプチドの結合
プレートをストレプトアビジンで予備被覆した。ストレプトアビジンプレートを、本発明のビオチン化ペプチドで一晩インキュベートし、３回洗浄し、且つＥＬＩＳＡプロトコールが実行される前に乾燥しなかった。３つの陽性試料と１つの陰性試料を試験した。陰性試料（ＩＤ７９２）を同様に直接被覆実験で使用した。
【０２５５】
実施例３
ＥＬＩＳＡ形式Ｉ
この形式において、本発明のペプチドの直接被覆を使用する。コーティングペプチドは、本発明による単一のペプチドであるか又はペプチドの組み合わせであってよい。ペプチドは第１表と配列表に記載されている。
【０２５６】
形式は間接的で且つ単相であり、試料の種類は、血清、血漿又は乳汁であってよい。
【０２５７】
被覆されたプレートを、室温で血清、血漿又は乳汁を用いてインキュベートする。試料は、単一ウェル中の個別の試料として、希釈系列で、好ましくは重複又は三重複として適用することができる。試料希釈液は、好ましくは１：１０又は１：２０である。約１０〜９０分間のインキュベート後、好ましくは約３０〜６０分後に、プレートを好ましくはＰＢＳで３回洗浄する。検出のために、抗反芻動物ＨＲＰコンジュゲート抗体を、プレートに塗布し、約１０〜９０分間、好ましくは約３０〜６０分間インキュベートする。３回の洗浄後、基質、好ましくはＴＭＢを、約５〜１５分間、好ましくは１０分間添加し、結果を４５０ｎｍで読み取る。プレートを、試料用のウェル並びに陽性及び陰性の対照用のウェルを含むように配置する。
【０２５８】
コーティングは、ブロッキングの有無に関わらず、約ｐＨ５、ｐＨ７又はｐＨ９．５で、好ましくはｐＨ７で実施する。コーティングタンパク質を、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ又は４μｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌの量で適用する。
【０２５９】
洗浄溶液は、好ましくは、０．１４ＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ；０．０３％のカトン、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有し、試料希釈液は、２％のＭｇＣｌ２、６％のアミンオキシド（ＡＯ）、６％のＴｗｅｅｎ２０及び０．５％のカゼインを含む。
【０２６０】
抗反芻動物コンジュゲートは、すぐに使用できるフォーマット（ＲＴＵ）としてコンジュゲート安定緩衝液中で１：１００００〜１：３００００、好ましくは１：２００００の希釈度で使用される。
【０２６１】
試験は、ウシ及びヒツジ試料中のＳＢＶを検出できる。
【０２６２】
実施例４
ＥＬＩＳＡ形式ＩＩ−一段階ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ形式Ｉの下で記載されるように、本発明のペプチドは、ストレプトアビジン−ビオチンを介して固体支持体に結合されている。好ましくは、ストレプトアビジンは固体支持体に結合され、ペプチドはビオチンと結合されるので、形成するストレプトアビジン−ビオチン複合体を介して固体支持体への被覆が可能である。
【０２６３】
固体支持体、例えば、多層板は、ストレプトアビジンで被覆されている。ストレプトアビジンで被覆されたプレートは、一段階工程で、ビオチン化ペプチド（上記の通り；本願明細書のペプチドの配列表を参照のこと）、試料（好ましくは、上記のような希釈されたもの）及びＨＲＰとコンジュゲートされた抗反芻動物モノクローナル抗体を用いてインキュベートされる。ＨＲＰ抗体は好ましくはＩｇＧである。約３０〜９０分間のインキュベート後、好ましくは１時間後に、プレートを上記のように洗浄し、読み取りを４５０ｎｍで行う。
【０２６４】
ストレプトアビジンで予備被覆されたマイクロタイタープレートが供給される。オールインワン緩衝液は、ビオチン化ペプチド、及び抗ＩｇＧコンジュゲートを含有する。試験されるべき試料の希釈物は、これらのプレートのウェル内のオールインワン緩衝液中でインキュベートされる。ＳＢＶに特異的な任意の抗体は、オールインワン緩衝液中の抗原に結合し、ストレプトアビジンプレートのウェル表面上の抗原／抗体／抗ＩｇＧコンジュゲート複合体を形成する。未結合物質は洗浄によりウェルから除去される。ＴＭＢ含有基質をウェルに加える。発色の程度（４５０ｎｍで測定した光学密度）は、試料中に存在するＳＢＶの特異的な抗体の量に正比例する。
【０２６５】
実施例５
ＥＬＩＳＡ（ｐａｎ−シンブ群ＥＬＩＳＡ）によるシンブ血清群の認識
本発明による好ましい試験形式は、シンブ血清群の異なるメンバーで感染された後に形成される抗体を認識することが可能である、即ち、試験はｐａｎ−シンブ群試験である。
【表８】
2015535841.tif 000009
【０２６６】
好ましい実施態様では、試験は、シンブ血清群のウイルスを検出可能であり、更に好ましい実施態様ではシンブ及びブンヤムウェラのウイルスを、更に好ましい実施態様ではカリフォルニア血清群のウイルスを加えて、あるいは１つの試験用設定においてシンブ及びカリフォルニア血清群のウイルスを検出可能である。
【０２６７】
実施例６
代替的なペプチドＥＬＩＳＡ形式
二重認識ＳＢＶ  ＥＬＩＳＡ抗体試験及び試験キット
代替的なＥＬＩＳＡ試験形式は次のように使用できる：ＳＢＶ二重認識抗体試験は、ＳＢＶまでの抗体レベルを測定するために適用できる。試験は、本発明による合成ＳＢＶペプチド、好ましくは、上記のようなコアモチーフ配列を含むペプチド又は本発明の好ましい実施態様として指摘された他のペプチドを利用し、これは診断抗原として本発明によるＳＢＶ  Ｎｐタンパク質を模倣する。
【０２６８】
ＳＢＶペプチドが９６ウェルマイクロタイタープレート上に被覆されたマイクロタイター形式が考案され得る。予め希釈された試験試料を、被覆されたマイクロタイターウェル中でインキュベートする。ＳＢＶペプチドに特異的な抗体（存在する場合）は被覆されたウェルに結合する。未結合成分を洗い流し、ワサビペルオキシダーゼに結合された第２のＳＢＶペプチドをマイクロタイターウェル中でインキュベートする。ＳＢＶペプチドコンジュゲートを、ＳＢＶペプチドに予め結合された抗体の第２結合部位に結合し、従って、特定の免疫複合体を形成する。未結合成分を洗い流し、酵素基質（Ｈ２Ｏ２）／クロモゲン溶液（テトラメチルベンジジン、ＴＭＢ）を加える。その後の発色は、試料中に存在する特異的な抗体の量に比例している。
【０２６９】
当業者は、軽微な試験設定の変更が、試験に適用されたＳＢＶペプチドに応じて必要であり得ることを理解している。これらの変更は当業者の通常技術の範囲内である。
【表９】
2015535841.tif 000010
【０２７０】
文献リスト
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【図１−１】
2015535841.tif 000011
【図１−２】
2015535841.tif 000012
【図２−１】
2015535841.tif 000013
【図２−２】
2015535841.tif 000014
【図３−１】
2015535841.tif 000015
【図３−２】
2015535841.tif 000016
【図４−１】
2015535841.tif 000017
【図４−２】
2015535841.tif 000018
【図５−１】
2015535841.tif 000019
【図５−２】
2015535841.tif 000020
【図６−１】
2015535841.tif 000021
【図６−２】
2015535841.tif 000022
【図７】
2015535841.tif 000023
【図８】
2015535841.tif 000024
【図９】
2015535841.tif 000025
【図１０】
2015535841.tif 000026
【配列表】
2015535841000001.app
【国際調査報告】
2015535841.tif 000027
2015535841.tif 000028
2015535841.tif 000029
2015535841.tif 000030