(57)【要約】  ＰＣＳＫ９に結合する抗体（例えば、ｓｄＡｂ）が記載される。かかるＡｂをコードする核酸、かかるＡｂを発現する宿主細胞、および同様のものを含む医薬組成物が記載される。低比重リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベルを低下させるため、および心血管障害の治療のための、これらのＰＣＳＫ９結合Ａｂの使用もまた記載される。【選択図】  図１１Ａ
2015503905.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体であって、前記抗体は、
（ｉ）式Ｉ、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（配列番号１）（Ｉ）
（式中、
Ｘ１は、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｖ、Ａ、Ｉ、またはＳであり、
Ｘ２は、Ｙ、Ｐ、またはＡであり、
Ｘ３は、Ｉ、Ａ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｘ４は、Ｌ、Ｖ、Ｔ、またはＭであり、
Ｘ５は、Ｇ、Ｓ、またはＡである）
のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）１領域および、
（ｉｉ）式ＩＩ、
Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６−Ｚ７−Ｚ８−Ｚ９−Ｚ１０−Ｚ１１−Ｚ１２−Ｚ１３−Ｚ１４−Ｚ１５−Ｚ１６−Ｙ−Ｚ１７−Ｚ１８−Ｚ１９−Ｚ２０−Ｚ２１−Ｇ（配列番号２）（ＩＩ）
（式中、
Ｚ１は、Ａ、Ｑ、Ｔ、Ｇ、またはＳであり、
Ｚ２は、Ｉ、Ｖ、またはＡであり、
Ｚ３は、Ｒ、Ｔ、Ａ、またはＳであり、
Ｚ４は、Ｇ、Ｅ、Ｓ、Ｑ、Ａ、またはＤであり、
Ｚ５は、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｒ、Ｈ、またはＧであり、
Ｚ６は、Ｇ、Ａ、またはＤであり、
Ｚ７は、Ａ、Ｓ、Ｄ、Ｇ、またはＴであり、
Ｚ８は、Ｉ、Ｖであるか、または非存在であり、
Ｚ９は、Ｒ、Ｔであるか、または非存在であり、
Ｚ１０は、Ｇ、Ａであるか、または非存在であり、
Ｚ１１は、Ｒ、Ｄであるか、または非存在であり、
Ｚ１２は、Ｅ、Ｖであるか、または非存在であり、
Ｚ１３は、Ｇ、Ｅであるか、または非存在であり、
Ｚ１４は、Ｓ、Ｒ、Ｆであるか、または非存在であり、
Ｚ１５は、Ｔ、Ｉ、またはＳであり、
Ｚ１６は、Ｆ、Ｙ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ａ、またはＮであり、
Ｚ１７は、Ｖ、Ａ、Ｓ、Ｅ、またはＴであり、
Ｚ１８は、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｅ、Ｒ、またはＶであり、
Ｚ１９は、Ｓ、Ｎ、またはＦであり、
Ｚ２０は、ＶまたはＡであり、
Ｚ２１は、ＫまたはＲである）のアミノ酸配列、もしくはそれと実質的に同一の配列を含む、ＣＤＲ２領域、および／または、
（ｉｉｉ）式ＩＩＩ、
Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３−Ｂ４−Ｂ５−Ｂ６−Ｂ７−Ｂ８−Ｂ９−Ｂ１０−Ｂ１１−Ｂ１２−Ｂ１３−Ｂ１４−Ｂ１４−Ｂ１５−Ｂ１６−Ｂ１７−Ｂ１８（配列番号３）（ＩＩＩ）
（式中、
Ｂ１は、Ｄ、Ｔ、Ａ、Ｐ、Ｒ、またはＹであり、
Ｂ２は、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｙ、Ｐ、Ａ、またはＳであり、
Ｂ３は、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｇ、またはＭであり、
Ｂ４は、Ｐ、Ｇ、Ｙ、Ｓ、Ｆであるか、または非存在であり、
Ｂ５は、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｙであるか、または非存在であり、
Ｂ６は、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｉ、Ｇ、Ｒであるか、または非存在であり、
Ｂ７は、Ｅ、Ｎ、Ｒ、Ｄ、Ｔであるか、または非存在であり、
Ｂ８は、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖであるか、または非存在であり、
Ｂ９は、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｐ、Ｙであるか、または非存在であり、
Ｂ１０は、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｈ、またはＳであり、
Ｂ１１は、Ｑ、Ｐ、Ｔ、Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｖ、またはＥであり、
Ｂ１２は、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｈ、Ｓ、Ｆ、またはＴであり、
Ｂ１３は、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｈ、Ｒ、Ｓ、またはＭであり、
Ｂ１４は、Ｋ、Ｎ、Ｅ、Ｗ、Ｖであるか、または非存在であり、
Ｂ１５は、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｔ、Ｇ、Ｎ、またはＳであり、
Ｂ１６は、Ｙ、Ｓ、またはＱであり、
Ｂ１７は、Ｄ、Ｈ、Ｖ、Ｅ、Ａであるか、または非存在であり、
Ｂ１８は、Ｙ、Ｌ、Ｈ、Ｖであるか、または非存在である）
のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む、ＣＤＲ３領域、
を含む、抗体。
【請求項２】
前記ＣＤＲ１領域は、次のアミノ酸配列：
ＤＹＩＬＧ（配列番号４）、
ＮＹＩＶＧ（配列番号５）、
ＨＹＩＬＧ（配列番号６）、
ＶＹＡＭＧ（配列番号７）、
ＤＹＡＭＧ（配列番号８）、
ＮＹＡＭＧ（配列番号９）、
ＡＹＡＭＧ（配列番号１０）、
ＩＡＹＭＡ（配列番号１１）、
ＳＰＴＭＡ（配列番号１２）、
ＨＹＩＶＧ（配列番号１３）、
ＨＹＶＴＳ（配列番号１４）、
のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記ＣＤＲ２領域は、次のアミノ酸配列：
ＡＩＲＧＳＧＡＩＲＧＲＥＧＳＴＦＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号１５）、
ＡＩＲＧＳＧＡＩＲＧＲＥＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）、
ＡＩＲＥＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１７）、
ＡＩＴＳＰＧＤＳＩＰＹＡＨＳＶＫＧ（配列番号１８）、
ＡＩＴＳＳＧＤＳＩＰＹＡＨＳＶＫＧ（配列番号１９）、
ＡＡＡＱＳＧＤＳＳＡＹＡＲＳＶＫＧ（配列番号２０）、
ＱＩＳＱＶＤＧＦＴＹＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号２１）、
ＴＩＲＤＳＤＡＳＩＹＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号２２）、
ＳＩＳＳＧＧＴＴＮＹＡＶＦＡＫＧ（配列番号２３）、
ＡＩＲＳＲＤＤＳＴＹＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号２４）、
ＡＩＲＥＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号２５）、
ＡＶＲＥＳＧＳＳＴＥＹＡＥＮＶＫＧ（配列番号２６）、
ＡＶＲＥＰＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２７）、
ＧＶＴＡＨＡＧＶＴＡＤＶＥＳＴＤＹＳＤＳＶＫＧ（配列番号２８）、
のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
前記ＣＤＲ３領域は、次のアミノ酸配列：
ＤＲＦＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号２９）、
ＤＲＦＰＴＰＥＦＴＴＱＶＧＨＹＤＶ（配列番号３０）、
ＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号３１）、
ＴＫＳＧＮＹＮＹＭＧＰＤＰＫＫＹＨＹ（配列番号３２）、
ＴＴＳＧＴＹＮＹＭＧＰＤＰＫＥＹＶＹ（配列番号３３）、
ＴＴＲＧＳＹＥＹＭＧＰＤＰＫＫＹＥＹ（配列番号３４）、
ＡＬＡＦＰＴＴＳＳＮＴＹＡＹ（配列番号３５）、
ＲＱＹＹＳＧＲＶＹＳＴＦＲＥＥＹＤＹ（配列番号３６）、
ＹＡＭＳＴＥＴＭＶＳＱＤＹ（配列番号３７）、
ＴＹＳＧＴＹＮＹＭＧＡＤＰＫＥＹＶＹ（配列番号３８）、
ＤＰＲＴＩＤＬＳＳＲＬＬＷＧＳ（配列番号３９）、
ＤＱＹＰＴＴＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号４０）、
ＤＲＦＰＴＰＥＦＳＤＲＶＧＨＹＤＬ（配列番号４１）、
ＤＰＹＰＴＰＥＦＴＴＨＶＧＨＹＤＹ（配列番号４２）、
ＰＳＧＦＹＲＴＩＰＨＶＨＳＮＹＤＨ（配列番号４３）、
のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＤＹＩＬＧ（配列番号４）、ＡＩＲＧＳＧＡＩＲＧＲＥＧＳＴＦＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号１５）、およびＤＲＦＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号２９）、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＮＹＩＶＧ（配列番号５）、ＡＩＲＧＳＧＡＩＲＧＲＥＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）、およびＤＲＦＰＴＰＥＦＴＴＱＶＧＨＹＤＶ（配列番号３０）、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＤＹＩＬＧ（配列番号４）、ＡＩＲＥＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１７）、およびＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号３１）、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＨＹＩＬＧ（配列番号６）、ＡＩＲＥＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１７）、およびＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号３１）、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＶＹＡＭＧ（配列番号７）、ＡＩＴＳＰＧＤＳＩＰＹＡＨＳＶＫＧ（配列番号１８）、およびＴＫＳＧＮＹＮＹＭＧＰＤＰＫＫＹＨＹ（配列番号３２）、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＶＹＡＭＧ（配列番号７）、ＡＩＴＳＳＧＤＳＩＰＹＡＨＳＶＫＧ（配列番号１９）、およびＴＴＳＧＴＹＮＹＭＧＰＤＰＫＥＹＶＹ（配列番号３３）、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＤＹＡＭＧ（配列番号８）、ＡＡＡＱＳＧＤＳＳＡＹＡＲＳＶＫＧ（配列番号２０）、およびＴＴＲＧＳＹＥＹＭＧＰＤＰＫＫＹＥＹ（配列番号３４）、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＮＹＡＭＧ（配列番号９）、ＱＩＳＱＶＤＧＦＴＹＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号２１）、およびＡＬＡＦＰＴＴＳＳＮＴＹＡＹ（配列番号３５）、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＡＹＡＭＧ（配列番号１０）、ＴＩＲＤＳＤＡＳＩＹＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号２２）、およびＲＱＹＹＳＧＲＶＹＳＴＦＲＥＥＹＤＹ（配列番号３６）、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＩＡＹＭＡ（配列番号１１）、ＳＩＳＳＧＧＴＴＮＹＡＶＦＡＫＧ（配列番号２３）、およびＹＡＭＳＴＥＴＭＶＳＱＤＹ（配列番号３７）、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＮＹＡＭＧ（配列番号９）、ＱＩＳＱＶＤＧＦＴＹＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号２１）、およびＴＹＳＧＴＹＮＹＭＧＡＤＰＫＥＹＶＹ（配列番号３８）、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＳＰＴＭＡ（配列番号１２）、ＡＩＲＳＲＤＤＳＴＹＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号２４）、およびＤＰＲＴＩＤＬＳＳＲＬＬＷＧＳ（配列番号３９）、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１７】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＨＹＩＬＧ（配列番号６）、ＡＩＲＥＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号２５）、およびＤＱＹＰＴＴＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号４０）、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１８】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＨＹＩＶＧ（配列番号１３）、ＡＶＲＥＳＧＳＳＴＥＹＡＥＮＶＫＧ（配列番号２６）、およびＤＲＦＰＴＰＥＦＳＤＲＶＧＨＹＤＬ（配列番号４１）、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１９】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＨＹＩＬＧ（配列番号６）、ＡＩＲＥＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号２５）、およびＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号３１）、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２０】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＨＹＩＬＧ（配列番号６）、ＡＶＲＥＰＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２７）、およびＤＰＹＰＴＰＥＦＴＴＨＶＧＨＹＤＹ（配列番号４２）、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２１】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＨＹＶＴＳ（配列番号１４）、ＧＶＴＡＨＡＧＶＴＡＤＶＥＳＴＤＹＳＤＳＶＫＧ（配列番号２８）、およびＰＳＧＦＹＲＴＩＰＨＶＨＳＮＹＤＨ（配列番号４３）、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２２】
式ＩＶ、
Ｑ−Ｖ−Ｘ６−Ｌ−Ｘ７−Ｅ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｘ８−Ｖ−Ｑ−Ａ−Ｇ−Ｘ９−Ｓ−Ｘ１０−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｃ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８（配列番号４４）（ＩＶ）
（式中、
Ｘ６は、Ｋ、またはＱであり、
Ｘ７は、ＥまたはＶであり、
Ｘ８は、ＬまたはＰであり、
Ｘ９は、ＧまたはＤであり、
Ｘ１０は、ＬまたはＭであり、
Ｘ１１は、Ｖ、Ｌ、Ｓ、またはＡであり、
Ｘ１２は、ＡまたはＰであり、
Ｘ１３は、ＳまたはＰであり、
Ｘ１４は、Ｇ、Ｄ、またはＲであり、
Ｘ１５は、Ｒ、Ｌ、またはＳであり、
Ｘ１６は、Ｔ、Ｆ、Ｉ、またはＧであり、
Ｘ１７は、Ｉ、Ｖ、Ｐ、またはＦであり、
Ｘ１８は、Ｎ、Ｒ、Ｓ、またはＶである）
のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む、フレームワーク領域（ＦＲ）１をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２３】
Ｘ６は、Ｋであり、Ｘ７は、Ｅであり、Ｘ８は、Ｌであり、Ｘ９は、Ｇであり、Ｘ１０は、Ｌであり、Ｘ１１は、Ａであり、Ｘ１２は、Ａであり、Ｘ１３は、Ｓであり、Ｘ１４は、Ｇであり、Ｘ１５は、Ｒであり、Ｘ１６は、Ｔであり、Ｘ１７は、Ｆであり、および／またはＸ１８は、Ｎである、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
前記ＦＲ１は、次のアミノ酸配列：
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＴＩＮ（配列番号４５）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＬＡＳＤＲＴＶＮ（配列番号４６）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲ（配列番号４７）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳ（配列番号４８）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳ（配列番号４９）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＮ（配列番号５０）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＬＴＦＳ（配列番号５１）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＳＰＳＤＲＴＦＳ（配列番号５２）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＰＲＳＧＶＶ（配列番号５３）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＰＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＬＡＳＧＲＦＶＮ（配列番号５４）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＭＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲ（配列番号５５）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲ（配列番号５６）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＤＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＩＦＮ（配列番号５７）、
のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２５】
式Ｖ、
Ｘ１９−Ｘ２０−Ｒ−Ｑ−Ｘ２１−Ｐ−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｖ−Ｘ２８（配列番号５８）（Ｖ）
（式中、
Ｘ１９は、ＷまたはＹであり、
Ｘ２０は、ＦまたはＹであり、
Ｘ２１は、ＡまたはＶであり、
Ｘ２２は、Ｇ、Ｄ、またはＥであり、
Ｘ２３は、Ｋ、Ｔ、Ｒ、Ａ、Ｅ、またはＱであり、
Ｘ２４は、Ｋ、Ｅ、Ｑ、またはＬであり、
Ｘ２５は、ＲまたはＰであり、
Ｘ２６は、ＥまたはＫであり、
Ｘ２７は、ＦまたはＬであり、
Ｘ２８は、Ａ、Ｔ、またはＧである）
のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む、ＦＲ２をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２６】
Ｘ１９は、Ｗであり、Ｘ２０は、Ｆであり、Ｘ２１は、Ａであり、Ｘ２２は、Ｇであり、Ｘ２３は、Ｋであり、Ｘ２４は、Ｅであり、Ｘ２５は、Ｒであり、Ｘ２６は、Ｅであり、Ｘ２７は、Ｆであり、および／またはＸ２８は、Ａである、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
前記ＦＲ２は、次のアミノ酸配列：
ＷＦＲＱＡＰＧＫＫＲＥＦＶＡ（配列番号５９）、
ＹＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡ（配列番号６０）、
ＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡ（配列番号６１）、
ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡ（配列番号６２）、
ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＴ（配列番号６３）、
ＷＦＲＱＡＰＧＴＥＲＥＦＶＧ（配列番号６４）、
ＷＦＲＱＶＰＧＲＥＲＥＦＶＡ（配列番号６５）、
ＷＹＲＱＡＰＥＫＱＲＥＬＶＡ（配列番号６６）、
ＷＦＲＱＡＰＧＡＥＲＥＦＶＧ（配列番号６７）、
ＷＦＲＱＡＰＧＥＥＲＫＦＶＡ（配列番号６８）、
ＷＦＲＱＡＰＧＫＬＰＥＦＶＡ（配列番号６９）、
ＷＦＲＱＡＰＤＱＥＲＥＦＶＡ（配列番号７０）、
のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２８】
式ＶＩ、
Ｒ−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｓ−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｋ−Ｘ３６−Ｘ３７−Ｘ３８−Ｘ３９−Ｌ−Ｘ４０−Ｍ−Ｘ４１−Ｓ−Ｌ−Ｘ４２−Ｐ−Ｘ４３−Ｄ−Ｘ４４−Ａ−Ｘ４５−Ｙ−Ｘ４６−Ｃ−Ｘ４７−Ｘ４８（配列番号７１）（ＶＩ）
（式中、
Ｘ２９は、Ｙ、Ｆ、またはＤであり、
Ｘ３０は、Ｔ、Ｓ、またはＶであり、
Ｘ３１は、ＩまたはＶであり、
Ｘ３２は、Ｋ、Ｒ、Ａ、またはＬであり、
Ｘ３３は、ＤまたはＮであり、
Ｘ３４は、Ｎ、Ｇ、Ｈ、またはＹであり、
Ｘ３５は、Ａ、Ｔ、Ｖ、またはＳであり、
Ｘ３６は、ＮまたはＳであり、
Ｘ３７は、ＴまたはＡであり、
Ｘ３８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、またはＧであり、
Ｘ３９は、Ｙ、Ｄ、またはＦであり、
Ｘ４０は、ＱまたはＲであり、
Ｘ４１は、Ｎ、Ｄ、またはＳであり、
Ｘ４２は、Ｋ、Ｉ、またはＱであり、
Ｘ４３は、ＥまたはＤであり、
Ｘ４４は、ＳまたはＴであり、
Ｘ４５は、Ｔ、Ｖ、またはＡであり、
Ｘ４６は、ＹまたはＩであり、
Ｘ４７は、ＡまたはＮであり、
Ｘ４８は、Ａ、Ｖ、Ｌ、またはＧである）
のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む、ＦＲ３をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２９】
Ｘ２９は、Ｆであり、Ｘ３０は、Ｔであり、Ｘ３１は、Ｉであり、Ｘ３２は、Ｒであり、Ｘ３３は、Ｄであり、Ｘ３４は、Ｎであり、Ｘ３５は、Ａであり、Ｘ３６は、Ｎであり、Ｘ３７は、Ｔであり、Ｘ３８は、Ｖであり、Ｘ３９は、Ｙであり、Ｘ４０は、Ｑであり、Ｘ４１は、Ｎであり、Ｘ４２は、Ｋであり、Ｘ４３は、Ｅであり、Ｘ４４は、Ｔであり、Ｘ４５は、Ｖであり、Ｘ４６は、Ｙであり、Ｘ４７は、Ａであり、および／またはＸ４８は、Ａである、請求項２１に記載の抗体。
【請求項３０】
前記ＦＲ３は、次のアミノ酸配列：
ＲＹＴＩＳＫＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶ（配列番号７２）、
ＲＦＳＩＳＫＤＮＡＫＮＴＩＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＡＬ（配列番号７３）、
ＲＹＴＩＳＲＮＮＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶ（配列番号７４）、
ＲＹＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶ（配列番号７５）、
ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＡ（配列番号７６）、
ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＡ（配列番号７７）、
ＲＦＴＩＳＲＤＧＡＫＮＴＡＹＬＱＭＤＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＡ（配列番号７８）、
ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号７９）、
ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＩＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号８０）、
ＲＦＴＩＳＡＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＩＣＮＡ（配列番号８１）、
ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＳＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号８２）、
ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＫＮＴＡＹＬＲＭＤＳＬＱＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧ（配列番号８３）、
ＲＤＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＧＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶ（配列番号８４）、
ＲＦＶＩＳＫＤＮＶＫＳＴＶＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＡＬ（配列番号８５）、
ＲＤＴＩＳＫＤＨＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶ（配列番号８６）、
ＲＦＴＶＳＲＤＹＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号８７）、
のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項２１に記載の抗体。
【請求項３１】
式ＶＩＩ、
Ｘ４９−Ｇ−Ｘ５０−Ｇ−Ｔ−Ｘ５１−Ｖ−Ｔ−Ｘ５２−Ｓ−Ｓ（配列番号８８）（ＶＩＩ）
（式中、
Ｘ４９は、Ｗ、またはＳであり、
Ｘ５０は、Ｒ、またはＱであり、
Ｘ５１は、Ｑ、またはＥであり、
Ｘ５２は、ＶまたはＩである）、
のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む、ＦＲ４をさらに含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３２】
Ｘ４９は、Ｗであり、Ｘ５０は、Ｑであり、Ｘ５１は、Ｑであり、および／またはＸ５２は、Ｖである、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３３】
前記ＦＲ４は、次のアミノ酸配列：
ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号８９）、
ＷＧＲＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９０）、
ＳＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９１）、
ＷＧＱＧＴＥＶＴＩＳＳ（配列番号９２）、
のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３４】
次のアミノ酸配列：
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＴＩＮＤＹＩＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＫＲＥＦＶＡＡＩＲＧＳＧＡＩＲＧＲＥＧＳＴＦＹＶＤＳＶＫＧＲＹＴＩＳＫＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶＤＲＦＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９３）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＬＡＳＤＲＴＶＮＮＹＩＶＧＹＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＲＧＳＧＡＩＲＧＲＥＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＫＤＮＡＫＮＴＩＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＡＬＤＲＦＰＴＰＥＦＴＴＱＶＧＨＹＤＶＷＧＲＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９４）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＴＩＮＤＹＩＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＫＲＥＦＶＡＡＩＲＥＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＹＴＩＳＲＮＮＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９５）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲＨＹＩＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡＡＩＲＥＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＹＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９６）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＶＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＴＳＰＧＤＳＩＰＹＡＨＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＡＴＫＳＧＮＹＮＹＭＧＰＤＰＫＫＹＨＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９７）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＶＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＴＡＩＴＳＳＧＤＳＩＰＹＡＨＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＡＴＴＳＧＴＹＮＹＭＧＰＤＰＫＥＹＶＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９８）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＮＤＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＡＡＱＳＧＤＳＳＡＹＡＲＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＧＡＫＮＴＡＹＬＱＭＤＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＡＴＴＲＧＳＹＥＹＭＧＰＤＰＫＫＹＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９９）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＬＴＦＳＮＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＴＥＲＥＦＶＧＱＩＳＱＶＤＧＦＴＹＹＥＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＬＡＦＰＴＴＳＳＮＴＹＡＹＳＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１００）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＳＰＳＤＲＴＦＳＡＹＡＭＧＷＦＲＱＶＰＧＲＥＲＥＦＶＡＴＩＲＤＳＤＡＳＩＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＩＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＱＹＹＳＧＲＶＹＳＴＦＲＥＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０１）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＰＲＳＧＶＶＩＡＹＭＡＷＹＲＱＡＰＥＫＱＲＥＬＶＡＳＩＳＳＧＧＴＴＮＹＡＶＦＡＫＧＲＦＴＩＳＡＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＩＣＮＡＹＡＭＳＴＥＴＭＶＳＱＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０２）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＬＴＦＳＮＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＡＥＲＥＦＶＧＱＩＳＱＶＤＧＦＴＹＹＥＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＳＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＹＳＧＴＹＮＹＭＧＡＤＰＫＥＹＶＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０３）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＰＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＬＡＳＧＲＦＶＮＳＰＴＭＡＷＦＲＱＡＰＧＥＥＲＫＦＶＡＡＩＲＳＲＤＤＳＴＹＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＬＤＮＡＫＮＴＡＹＬＲＭＤＳＬＱＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＤＰＲＴＩＤＬＳＳＲＬＬＷＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０４）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＭＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲＨＹＩＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡＡＩＲＥＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＲＧＲＤＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＧＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶＤＱＹＰＴＴＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹＷＧＱＧＴＥＶＴＩＳＳ（配列番号１０５）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲＨＹＩＶＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＶＲＥＳＧＳＳＴＥＹＡＥＮＶＫＧＲＦＶＩＳＫＤＮＶＫＳＴＶＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＡＬＤＲＦＰＴＰＥＦＳＤＲＶＧＨＹＤＬＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０６）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＭＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲＨＹＩＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡＡＩＲＥＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＲＧＲＹＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０７）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲＨＹＩＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＬＰＥＦＶＡＡＶＲＥＰＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＤＴＩＳＫＤＨＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶＤＰＹＰＴＰＥＦＴＴＨＶＧＨＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０８）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＤＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＩＦＮＨＹＶＴＳＷＦＲＱＡＰＤＱＥＲＥＦＶＡＧＶＴＡＨＡＧＶＴＡＤＶＥＳＴＤＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＹＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＳＧＦＹＲＴＩＰＨＶＨＳＮＹＤＨＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０９）、
のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３５】
前記抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の抗体のうちの少なくとも１つを含む、医薬組成物。
【請求項３７】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの他の抗体をさらに含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
医薬担体または賦形剤をさらに含む、請求項３６または３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
薬として使用するための、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の抗体、または請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
薬の製造のための、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の抗体、または請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記薬は、対象において低比重脂質コレステロール関連疾患を予防するまたは治療するためのものである、請求項３９または４０に記載の抗体または組成物。
【請求項４２】
前記低比重脂質コレステロール関連疾患は、高コレステロール血症である、請求項４１に記載の抗体または組成物。
【請求項４３】
必要性のある対象に、有効量の請求項１〜３５のいずれか１項に記載の抗体または請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、低比重脂質コレステロール関連疾患を予防するまたは治療するための方法。
【請求項４４】
前記低比重脂質コレステロール関連疾患は、高コレステロール血症である、請求項４３に記載の方法。薬としての、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の抗体または請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項４５】
対象において低比重脂質コレステロール関連疾患を予防するまたは治療するための、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の抗体または請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項４６】
対象において低比重脂質コレステロール関連疾患を予防するまたは治療するための薬の製造のための、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の抗体または請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項４７】
前記低比重脂質コレステロール関連疾患は、高コレステロール血症である、請求項４６または４７に記載の使用。
【請求項４８】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項４９】
請求項４９に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項５０】
請求項４９に記載の核酸または請求項５０に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項５１】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の抗体のうちの少なくとも２つを含む、対象において低比重脂質コレステロール関連疾患を予防するまたは治療するためのキット。
【請求項５２】
前記低比重脂質コレステロール関連疾患は、高コレステロール血症である、請求項５２に記載のキット。
【請求項５３】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の抗体のうちの少なくとも２つを含む、生体試料中のＰＣＳＫ９を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、心血管障害に関し、より具体的には、低比重リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の循環レベルの減少に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、それ自体が、２０１１年１２月２０日に出願された米国仮出願第６１／５７８，０００号の利益を主張する、２０１２年１２月２０日に出願され、ＰＣＴ第２１条（２）の下に英語で公開された、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／＊号である。上の全ての文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
配列表への参照
３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１（ｃ）に従って、配列表が、１２８１０＿４５８＿ＳＴ２５．ＴＸＴと名付けられ、２０１２年１２月１９日に作成され、９２Ｋｂキロバイトのサイズを有する、ＡＳＣＩＩに準拠したテキストファイルとして、本明細書と共に提出される。前述のファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
心血管障害からもたらされる合併症は、種々の形態の癌に起因する１年当たり約６００万人と比較して、１年当たり約１３００万人の個人に影響を及ぼす、世界中の主要な死亡の原因である。最も有力な心血管系危険因子のうちの１つは、ＬＤＬ−Ｃの亢進したレベルである。心血管病理の発生率は、今後２０年間で劇的に増加することが予想される。臨床治験データは、ＬＤＬコレステロールレベルの低減が冠動脈イベントの比率に関連することを実証した（Law et al., 2003 BMJ 326:1423-1427）。血漿ＬＤＬコレステロールレベルの生涯にわたる適度な低減は、脂質と無関連の心血管危険因子の有病率が高い集団においてさえ、冠動脈イベントの発生率の有意な低減に有意に相関することが示されている（Cohen et al., N. Engl. J. Med. 354:1264-1272）。したがって、ＬＤＬコレステロールレベルの管理された制御から得られる便益は多大である。重要なコレステロール低下薬の中には、スタチンがある（Briel, M., Nordmann, A.J., and Bucher, H.C. Curr. Opin. Lipidol., 16:601-605, 2005）。患者の大多数による耐用性は良好であるが、有害な副作用がまとめられている（https://www.statineffects.com/info/）。スタチンと、腸内ステロールトランスポーター遮断薬であるエゼチミブとの組み合わせは、ＬＤＬ−Ｃを２０％以下だけさらに低減する。
【０００５】
故に、循環ＬＤＬ−Ｃのレベルを減少させるための効率的な戦略の開発に対する必要性が存在する（Brown, M.S. and Goldstein, J.L. Science, 311:1721-1723, 2006、Tall, A.R. N. Engl. J Med., 354:1310-1312, 2006）。
【０００６】
本明細書は、いくつかの文書を参照し、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００７】
第１の態様において、本発明は、ヒトＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体を提供し、該抗体は、
（ｉ）式Ｉ、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（配列番号１）（Ｉ）
（式中、
Ｘ１は、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｖ、Ａ、Ｉ、またはＳであり、
Ｘ２は、Ｙ、Ｐ、またはＡであり、
Ｘ３は、Ｉ、Ａ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｘ４は、Ｌ、Ｖ、Ｔ、またはＭであり、
Ｘ５は、Ｇ、Ｓ、またはＡである）
のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）１領域および、
【０００８】
（ｉｉ）式ＩＩ、
Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６−Ｚ７−Ｚ８−Ｚ９−Ｚ１０−Ｚ１１−Ｚ１２−Ｚ１３−Ｚ１４−Ｚ１５−Ｚ１６−Ｙ−Ｚ１７−Ｚ１８−Ｚ１９−Ｚ２０−Ｚ２１−Ｇ（配列番号２）（ＩＩ）
（式中、
Ｚ１は、Ａ、Ｑ、Ｔ、Ｇ、またはＳであり、
Ｚ２は、Ｉ、Ｖ、またはＡであり、
Ｚ３は、Ｒ、Ｔ、Ａ、またはＳであり、
Ｚ４は、Ｇ、Ｅ、Ｓ、Ｑ、Ａ、またはＤであり、
Ｚ５は、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｒ、Ｈ、またはＧであり、
Ｚ６は、Ｇ、Ａ、またはＤであり、
Ｚ７は、Ａ、Ｓ、Ｄ、Ｇ、またはＴであり、
Ｚ８は、Ｉ、Ｖであるか、または非存在であり、
Ｚ９は、Ｒ、Ｔであるか、または非存在であり、
Ｚ１０は、Ｇ、Ａであるか、または非存在であり、
Ｚ１１は、Ｒ、Ｄであるか、または非存在であり、
Ｚ１２は、Ｅ、Ｖであるか、または非存在であり、
Ｚ１３は、Ｇ、Ｅであるか、または非存在であり、
Ｚ１４は、Ｓ、Ｒ、Ｆであるか、または非存在であり、
Ｚ１５は、Ｔ、Ｉ、またはＳであり、
Ｚ１６は、Ｆ、Ｙ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ａ、またはＮであり、
Ｚ１７は、Ｖ、Ａ、Ｓ、Ｅ、またはＴであり、
Ｚ１８は、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｅ、Ｒ、またはＶであり、
Ｚ１９は、Ｓ、Ｎ、またはＦであり、
Ｚ２０は、ＶまたはＡであり、
Ｚ２１は、ＫまたはＲである）のアミノ酸配列、もしくはそれと実質的に同一の配列を含む、ＣＤＲ２領域、および／または、
【０００９】
（ｉｉｉ）式ＩＩＩ、
Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３−Ｂ４−Ｂ５−Ｂ６−Ｂ７−Ｂ８−Ｂ９−Ｂ１０−Ｂ１１−Ｂ１２−Ｂ１３−Ｂ１４−Ｂ１４−Ｂ１５−Ｂ１６−Ｂ１７−Ｂ１８（配列番号３）（ＩＩＩ）
（式中、
Ｂ１は、Ｄ、Ｔ、Ａ、Ｐ、Ｒ、またはＹであり、
Ｂ２は、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｙ、Ｐ、Ａ、またはＳであり、
Ｂ３は、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｇ、またはＭであり、
Ｂ４は、Ｐ、Ｇ、Ｙ、Ｓ、Ｆであるか、または非存在であり、
Ｂ５は、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｙであるか、または非存在であり、
Ｂ６は、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｉ、Ｇ、Ｒであるか、または非存在であり、
Ｂ７は、Ｅ、Ｎ、Ｒ、Ｄ、Ｔであるか、または非存在であり、
Ｂ８は、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖであるか、または非存在であり、
Ｂ９は、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｐ、Ｙであるか、または非存在であり、
Ｂ１０は、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｈ、またはＳであり、
Ｂ１１は、Ｑ、Ｐ、Ｔ、Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｖ、またはＥであり、
Ｂ１２は、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｈ、Ｓ、Ｆ、またはＴであり、
Ｂ１３は、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｈ、Ｒ、Ｓ、またはＭであり、具体的な実施形態において、Ｂ１３は、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、またはＭであり、
Ｂ１４は、Ｋ、Ｎ、Ｅ、Ｗ、Ｖであるか、または非存在であり、
Ｂ１５は、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｔ、Ｇ、Ｎ、またはＳであり、
Ｂ１６は、Ｙ、Ｓ、またはＱであり、
Ｂ１７は、Ｄ、Ｈ、Ｖ、Ｅ、Ａであるか、または非存在であり、
Ｂ１８は、Ｙ、Ｌ、Ｈ、Ｖであるか、または非存在である）
のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む、ＣＤＲ３領域、を含む。
【００１０】
別の実施形態において、上述のＣＤＲ１領域は、次のアミノ酸配列：ＤＹＩＬＧ（配列番号４）、ＮＹＩＶＧ（配列番号５）、ＨＹＩＬＧ（配列番号６）、ＶＹＡＭＧ（配列番号７）、ＤＹＡＭＧ（配列番号８）、ＮＹＡＭＧ（配列番号９）、ＡＹＡＭＧ（配列番号１０）、ＩＡＹＭＡ（配列番号１１）、ＳＰＴＭＡ（配列番号１２）、ＨＹＩＶＧ（配列番号１３）、ＨＹＶＴＳ（配列番号１４）のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００１１】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ２領域は、次のアミノ酸配列：ＡＩＲＧＳＧＡＩＲＧＲＥＧＳＴＦＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号１５）、ＡＩＲＧＳＧＡＩＲＧＲＥＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）、ＡＩＲＥＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１７）、ＡＩＴＳＰＧＤＳＩＰＹＡＨＳＶＫＧ（配列番号１８）、ＡＩＴＳＳＧＤＳＩＰＹＡＨＳＶＫＧ（配列番号１９）、ＡＡＡＱＳＧＤＳＳＡＹＡＲＳＶＫＧ（配列番号２０）、ＱＩＳＱＶＤＧＦＴＹＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号２１）、ＴＩＲＤＳＤＡＳＩＹＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号２２）、ＳＩＳＳＧＧＴＴＮＹＡＶＦＡＫＧ（配列番号２３）、ＡＩＲＳＲＤＤＳＴＹＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号２４）、ＡＩＲＥＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号２５）、ＡＶＲＥＳＧＳＳＴＥＹＡＥＮＶＫＧ（配列番号２６）、ＡＶＲＥＰＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２７）、ＧＶＴＡＨＡＧＶＴＡＤＶＥＳＴＤＹＳＤＳＶＫＧ（配列番号２８）のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む。ある実施形態において、上述のＣＤＲ３領域は、次のアミノ酸配列：ＤＲＦＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号２９）、ＤＲＦＰＴＰＥＦＴＴＱＶＧＨＹＤＶ（配列番号３０）、ＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号３１）、ＴＫＳＧＮＹＮＹＭＧＰＤＰＫＫＹＨＹ（配列番号３２）、ＴＴＳＧＴＹＮＹＭＧＰＤＰＫＥＹＶＹ（配列番号３３）、ＴＴＲＧＳＹＥＹＭＧＰＤＰＫＫＹＥＹ（配列番号３４）、ＡＬＡＦＰＴＴＳＳＮＴＹＡＹ（配列番号３５）、ＲＱＹＹＳＧＲＶＹＳＴＦＲＥＥＹＤＹ（配列番号３６）、ＹＡＭＳＴＥＴＭＶＳＱＤＹ（配列番号３７）、ＴＹＳＧＴＹＮＹＭＧＡＤＰＫＥＹＶＹ（配列番号３８）、ＤＰＲＴＩＤＬＳＳＲＬＬＷＧＳ（配列番号３９）、ＤＱＹＰＴＴＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号４０）、ＤＲＦＰＴＰＥＦＳＤＲＶＧＨＹＤＬ（配列番号４１）、ＤＰＹＰＴＰＥＦＴＴＨＶＧＨＹＤＹ（配列番号４２）、ＰＳＧＦＹＲＴＩＰＨＶＨＳＮＹＤＨ（配列番号４３）のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００１２】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＤＹＩＬＧ（配列番号４）、ＡＩＲＧＳＧＡＩＲＧＲＥＧＳＴＦＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号１５）、およびＤＲＦＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号２９）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００１３】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＮＹＩＶＧ（配列番号５）、ＡＩＲＧＳＧＡＩＲＧＲＥＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）、およびＤＲＦＰＴＰＥＦＴＴＱＶＧＨＹＤＶ（配列番号３０）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００１４】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＤＹＩＬＧ（配列番号４）、ＡＩＲＥＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１７）、およびＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号３１）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００１５】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＨＹＩＬＧ（配列番号６）、ＡＩＲＥＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１７）、およびＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号３１）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００１６】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＶＹＡＭＧ（配列番号７）、ＡＩＴＳＰＧＤＳＩＰＹＡＨＳＶＫＧ（配列番号１８）、およびＴＫＳＧＮＹＮＹＭＧＰＤＰＫＫＹＨＹ（配列番号３２）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００１７】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＶＹＡＭＧ（配列番号７）、ＡＩＴＳＳＧＤＳＩＰＹＡＨＳＶＫＧ（配列番号１９）、およびＴＴＳＧＴＹＮＹＭＧＰＤＰＫＥＹＶＹ（配列番号３３）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００１８】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＤＹＡＭＧ（配列番号８）、ＡＡＡＱＳＧＤＳＳＡＹＡＲＳＶＫＧ（配列番号２０）、およびＴＴＲＧＳＹＥＹＭＧＰＤＰＫＫＹＥＹ（配列番号３４）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００１９】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＮＹＡＭＧ（配列番号９）、ＱＩＳＱＶＤＧＦＴＹＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号２１）、およびＡＬＡＦＰＴＴＳＳＮＴＹＡＹ（配列番号３５）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００２０】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＡＹＡＭＧ（配列番号１０）、ＴＩＲＤＳＤＡＳＩＹＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号２２）、およびＲＱＹＹＳＧＲＶＹＳＴＦＲＥＥＹＤＹ（配列番号３６）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００２１】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＩＡＹＭＡ（配列番号１１）、ＳＩＳＳＧＧＴＴＮＹＡＶＦＡＫＧ（配列番号２３）、およびＹＡＭＳＴＥＴＭＶＳＱＤＹ（配列番号３７）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００２２】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＮＹＡＭＧ（配列番号９）、ＱＩＳＱＶＤＧＦＴＹＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号２１）、およびＴＹＳＧＴＹＮＹＭＧＡＤＰＫＥＹＶＹ（配列番号３８）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００２３】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＳＰＴＭＡ（配列番号１２）、ＡＩＲＳＲＤＤＳＴＹＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号２４）、およびＤＰＲＴＩＤＬＳＳＲＬＬＷＧＳ（配列番号３９）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００２４】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＨＹＩＬＧ（配列番号６）、ＡＩＲＥＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号２５）、およびＤＱＹＰＴＴＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号４０）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００２５】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＨＹＩＶＧ（配列番号１３）、ＡＶＲＥＳＧＳＳＴＥＹＡＥＮＶＫＧ（配列番号２６）、およびＤＲＦＰＴＰＥＦＳＤＲＶＧＨＹＤＬ（配列番号４１）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００２６】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＨＹＩＬＧ（配列番号６）、ＡＩＲＥＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号２５）、およびＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号３１）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００２７】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＨＹＩＬＧ（配列番号６）、ＡＶＲＥＰＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２７）、およびＤＰＹＰＴＰＥＦＴＴＨＶＧＨＹＤＹ（配列番号４２）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００２８】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＨＹＶＴＳ（配列番号１４）、ＧＶＴＡＨＡＧＶＴＡＤＶＥＳＴＤＹＳＤＳＶＫＧ（配列番号２８）、およびＰＳＧＦＹＲＴＩＰＨＶＨＳＮＹＤＨ（配列番号４３）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００２９】
別の実施形態において、上述の抗体は、式ＩＶ、
Ｑ−Ｖ−Ｘ６−Ｌ−Ｘ７−Ｅ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｘ８−Ｖ−Ｑ−Ａ−Ｇ−Ｘ９−Ｓ−Ｘ１０−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｃ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８（配列番号４４）（ＩＶ）
（式中、
Ｘ６は、Ｋ、またはＱであり、
Ｘ７は、ＥまたはＶであり、
Ｘ８は、ＬまたはＰであり、
Ｘ９は、ＧまたはＤであり、
Ｘ１０は、ＬまたはＭであり、
Ｘ１１は、Ｖ、Ｌ、Ｓ、またはＡであり、
Ｘ１２は、ＡまたはＰであり、
Ｘ１３は、ＳまたはＰであり、
Ｘ１４は、Ｇ、Ｄ、またはＲであり、
Ｘ１５は、Ｒ、Ｌ、またはＳであり、
Ｘ１６は、Ｔ、Ｆ、Ｉ、またはＧであり、
Ｘ１７は、Ｉ、Ｖ、Ｐ、またはＦであり、
Ｘ１８は、Ｎ、Ｒ、Ｓ、またはＶである）
のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む、フレームワーク領域（ＦＲ）１をさらに含む。
【００３０】
ある実施形態において、Ｘ６は、Ｋであり、Ｘ７は、Ｅであり、Ｘ８は、Ｌであり、Ｘ９は、Ｇであり、Ｘ１０は、Ｌであり、Ｘ１１は、Ａであり、Ｘ１２は、Ａであり、Ｘ１３は、Ｓであり、Ｘ１４は、Ｇであり、Ｘ１５は、Ｒであり、Ｘ１６は、Ｔであり、Ｘ１７は、Ｆであり、および／またはＸ１８は、Ｎである。
【００３１】
さらなる実施形態において、上述のＦＲ１は、次のアミノ酸配列：
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＴＩＮ（配列番号４５）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＬＡＳＤＲＴＶＮ（配列番号４６）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲ（配列番号４７）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳ（配列番号４８）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳ（配列番号４９）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＮ（配列番号５０）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＬＴＦＳ（配列番号５１）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＳＰＳＤＲＴＦＳ（配列番号５２）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＰＲＳＧＶＶ（配列番号５３）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＰＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＬＡＳＧＲＦＶＮ（配列番号５４）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＭＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲ（配列番号５５）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲ（配列番号５６）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＤＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＩＦＮ（配列番号５７）、
のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００３２】
別の実施形態において、上述の抗体は、式Ｖ、
Ｘ１９−Ｘ２０−Ｒ−Ｑ−Ｘ２１−Ｐ−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｖ−Ｘ２８（配列番号５８）（Ｖ）
（式中、
Ｘ１９は、ＷまたはＹであり、
Ｘ２０は、ＦまたはＹであり、
Ｘ２１は、ＡまたはＶであり、
Ｘ２２は、Ｇ、Ｄ、またはＥであり、
Ｘ２３は、Ｋ、Ｔ、Ｒ、Ａ、Ｅ、またはＱであり、
Ｘ２４は、Ｋ、Ｅ、Ｑ、またはＬであり、
Ｘ２５は、ＲまたはＰであり、
Ｘ２６は、ＥまたはＫであり、
Ｘ２７は、ＦまたはＬであり、
Ｘ２８は、Ａ、Ｔ、またはＧである）
のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む、ＦＲ２をさらに含む。
【００３３】
ある実施形態において、Ｘ１９は、Ｗであり、Ｘ２０は、Ｆであり、Ｘ２１は、Ａであり、Ｘ２２は、Ｇであり、Ｘ２３は、Ｋであり、Ｘ２４は、Ｅであり、Ｘ２５は、Ｒであり、Ｘ２６は、Ｅであり、Ｘ２７は、Ｆであり、および／またはＸ２８は、Ａである。
【００３４】
ある実施形態において、上述のＦＲ２は、次のアミノ酸配列：
ＷＦＲＱＡＰＧＫＫＲＥＦＶＡ（配列番号５９）、
ＹＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡ（配列番号６０）、
ＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡ（配列番号６１）、
ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡ（配列番号６２）、
ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＴ（配列番号６３）、
ＷＦＲＱＡＰＧＴＥＲＥＦＶＧ（配列番号６４）、
ＷＦＲＱＶＰＧＲＥＲＥＦＶＡ（配列番号６５）、
ＷＹＲＱＡＰＥＫＱＲＥＬＶＡ（配列番号６６）、
ＷＦＲＱＡＰＧＡＥＲＥＦＶＧ（配列番号６７）、
ＷＦＲＱＡＰＧＥＥＲＫＦＶＡ（配列番号６８）、
ＷＦＲＱＡＰＧＫＬＰＥＦＶＡ（配列番号６９）、
ＷＦＲＱＡＰＤＱＥＲＥＦＶＡ（配列番号７０）、
のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００３５】
別の実施形態において、上述の抗体は、式ＶＩ、
Ｒ−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｓ−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｋ−Ｘ３６−Ｘ３７−Ｘ３８−Ｘ３９−Ｌ−Ｘ４０−Ｍ−Ｘ４１−Ｓ−Ｌ−Ｘ４２−Ｐ−Ｘ４３−Ｄ−Ｘ４４−Ａ−Ｘ４５−Ｙ−Ｘ４６−Ｃ−Ｘ４７−Ｘ４８（配列番号７１）（ＶＩ）
（式中、
Ｘ２９は、Ｙ、Ｆ、またはＤであり、
Ｘ３０は、Ｔ、Ｓ、またはＶであり、
Ｘ３１は、ＩまたはＶであり、
Ｘ３２は、Ｋ、Ｒ、Ａ、またはＬであり、
Ｘ３３は、ＤまたはＮであり、
Ｘ３４は、Ｎ、Ｇ、Ｈ、またはＹであり、
Ｘ３５は、Ａ、Ｔ、Ｖ、またはＳであり、
Ｘ３６は、ＮまたはＳであり、
Ｘ３７は、ＴまたはＡであり、
Ｘ３８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、またはＧであり、
Ｘ３９は、Ｙ、Ｄ、またはＦであり、
Ｘ４０は、ＱまたはＲであり、
Ｘ４１は、Ｎ、Ｄ、またはＳであり、
Ｘ４２は、Ｋ、Ｉ、またはＱであり、
Ｘ４３は、ＥまたはＤであり、
Ｘ４４は、ＳまたはＴであり、
Ｘ４５は、Ｔ、Ｖ、またはＡであり、
Ｘ４６は、ＹまたはＩであり、
Ｘ４７は、ＡまたはＮであり、
Ｘ４８は、Ａ、Ｖ、Ｌ、またはＧである）
のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む、ＦＲ３をさらに含む。
【００３６】
ある実施形態において、Ｘ２９は、Ｆであり、Ｘ３０は、Ｔであり、Ｘ３１は、Ｉであり、Ｘ３２は、Ｒであり、Ｘ３３は、Ｄであり、Ｘ３４は、Ｎであり、Ｘ３５は、Ａであり、Ｘ３６は、Ｎであり、Ｘ３７は、Ｔであり、Ｘ３８は、Ｖであり、Ｘ３９は、Ｙであり、Ｘ４０は、Ｑであり、Ｘ４１は、Ｎであり、Ｘ４２は、Ｋであり、Ｘ４３は、Ｅであり、Ｘ４４は、Ｔであり、Ｘ４５は、Ｖであり、Ｘ４６は、Ｙであり、Ｘ４７は、Ａであり、および／またはＸ４８は、Ａである。
【００３７】
ある実施形態において、上述のＦＲ３は、次のアミノ酸配列：ＲＹＴＩＳＫＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶ（配列番号７２）、
ＲＦＳＩＳＫＤＮＡＫＮＴＩＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＡＬ（配列番号７３）、
ＲＹＴＩＳＲＮＮＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶ（配列番号７４）、
ＲＹＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶ（配列番号７５）、
ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＡ（配列番号７６）、
ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＡ（配列番号７７）、
ＲＦＴＩＳＲＤＧＡＫＮＴＡＹＬＱＭＤＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＡ（配列番号７８）、
ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号７９）、
ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＩＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号８０）、
ＲＦＴＩＳＡＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＩＣＮＡ（配列番号８１）、
ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＳＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号８２）、
ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＫＮＴＡＹＬＲＭＤＳＬＱＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧ（配列番号８３）、
ＲＤＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＧＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶ（配列番号８４）、
ＲＦＶＩＳＫＤＮＶＫＳＴＶＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＡＬ（配列番号８５）、
ＲＤＴＩＳＫＤＨＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶ（配列番号８６）、
ＲＦＴＶＳＲＤＹＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号８７）、
のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００３８】
別の実施形態において、上述の抗体は、式ＶＩＩ、
Ｘ４９−Ｇ−Ｘ５０−Ｇ−Ｔ−Ｘ５１−Ｖ−Ｔ−Ｘ５２−Ｓ−Ｓ（配列番号８８）（ＶＩＩ）
（式中、
Ｘ４９は、Ｗ、またはＳであり、
Ｘ５０は、Ｒ、またはＱであり、
Ｘ５１は、Ｑ、またはＥであり、
Ｘ５２は、ＶまたはＩである）
のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む、ＦＲ４をさらに含む。
【００３９】
ある実施形態において、Ｘ４９は、Ｗであり、Ｘ５０は、Ｑであり、Ｘ５１は、Ｑであり、かつ／またはＸ５２は、Ｖであるか、もしくはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００４０】
ある実施形態において、上述のＦＲ４は、次のアミノ酸配列：ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号８９）、ＷＧＲＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９０）、ＳＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９１）、ＷＧＱＧＴＥＶＴＩＳＳ（配列番号９２）のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００４１】
ある実施形態において、上述の抗体は、次のアミノ酸配列：
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＴＩＮＤＹＩＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＫＲＥＦＶＡＡＩＲＧＳＧＡＩＲＧＲＥＧＳＴＦＹＶＤＳＶＫＧＲＹＴＩＳＫＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶＤＲＦＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９３）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＬＡＳＤＲＴＶＮＮＹＩＶＧＹＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＲＧＳＧＡＩＲＧＲＥＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＫＤＮＡＫＮＴＩＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＡＬＤＲＦＰＴＰＥＦＴＴＱＶＧＨＹＤＶＷＧＲＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９４）、
【００４２】
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＴＩＮＤＹＩＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＫＲＥＦＶＡＡＩＲＥＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＹＴＩＳＲＮＮＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９５）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲＨＹＩＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡＡＩＲＥＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＹＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９６）、
【００４３】
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＶＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＴＳＰＧＤＳＩＰＹＡＨＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＡＴＫＳＧＮＹＮＹＭＧＰＤＰＫＫＹＨＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９７）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＶＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＴＡＩＴＳＳＧＤＳＩＰＹＡＨＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＡＴＴＳＧＴＹＮＹＭＧＰＤＰＫＥＹＶＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９８）、
【００４４】
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＮＤＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＡＡＱＳＧＤＳＳＡＹＡＲＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＧＡＫＮＴＡＹＬＱＭＤＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＡＴＴＲＧＳＹＥＹＭＧＰＤＰＫＫＹＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９９）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＬＴＦＳＮＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＴＥＲＥＦＶＧＱＩＳＱＶＤＧＦＴＹＹＥＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＬＡＦＰＴＴＳＳＮＴＹＡＹＳＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１００）、
【００４５】
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＳＰＳＤＲＴＦＳＡＹＡＭＧＷＦＲＱＶＰＧＲＥＲＥＦＶＡＴＩＲＤＳＤＡＳＩＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＩＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＱＹＹＳＧＲＶＹＳＴＦＲＥＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０１）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＰＲＳＧＶＶＩＡＹＭＡＷＹＲＱＡＰＥＫＱＲＥＬＶＡＳＩＳＳＧＧＴＴＮＹＡＶＦＡＫＧＲＦＴＩＳＡＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＩＣＮＡＹＡＭＳＴＥＴＭＶＳＱＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０２）、
【００４６】
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＬＴＦＳＮＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＡＥＲＥＦＶＧＱＩＳＱＶＤＧＦＴＹＹＥＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＳＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＹＳＧＴＹＮＹＭＧＡＤＰＫＥＹＶＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０３）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＰＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＬＡＳＧＲＦＶＮＳＰＴＭＡＷＦＲＱＡＰＧＥＥＲＫＦＶＡＡＩＲＳＲＤＤＳＴＹＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＬＤＮＡＫＮＴＡＹＬＲＭＤＳＬＱＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＤＰＲＴＩＤＬＳＳＲＬＬＷＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０４）、
【００４７】
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＭＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲＨＹＩＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡＡＩＲＥＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＲＧＲＤＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＧＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶＤＱＹＰＴＴＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹＷＧＱＧＴＥＶＴＩＳＳ（配列番号１０５）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲＨＹＩＶＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＶＲＥＳＧＳＳＴＥＹＡＥＮＶＫＧＲＦＶＩＳＫＤＮＶＫＳＴＶＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＡＬＤＲＦＰＴＰＥＦＳＤＲＶＧＨＹＤＬＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０６）、
【００４８】
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＭＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲＨＹＩＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡＡＩＲＥＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＲＧＲＹＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０７）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲＨＹＩＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＬＰＥＦＶＡＡＶＲＥＰＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＤＴＩＳＫＤＨＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶＤＰＹＰＴＰＥＦＴＴＨＶＧＨＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０８）、
【００４９】
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＤＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＩＦＮＨＹＶＴＳＷＦＲＱＡＰＤＱＥＲＥＦＶＡＧＶＴＡＨＡＧＶＴＡＤＶＥＳＴＤＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＹＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＳＧＦＹＲＴＩＰＨＶＨＳＮＹＤＨＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０９）、
のうちの１つ、もしくはそれと実質的に同一の配列を含むか、またはそれからなる。例えば、上述の配列（例えば、配列９３〜１０９）のうちの１つとの少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体は、その配列と実質的に同一である。別の実施形態において、該実質的に同一なアミノ酸配列は、上述の配列のうちの１つとの少なくとも８０．９５％の同一性を有し、他の実施形態においては、少なくとも８１％、８２％、８３％、８３．４６％、８４％、８５％、８６％、８７％、８７．３０％、８８％、８９％、９０％、９１、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【００５０】
ある実施形態において、上述の抗体は、単一ドメイン抗体である。
【００５１】
別の態様において、本発明は、上述の抗体を含む、医薬組成物を提供する。別の態様において、医薬組成物は、上述の抗体のうちの少なくとも１つの他の抗体をさらに含む。
【００５２】
さらなる実施形態において、医薬組成物は、薬剤的に許容される担体、賦形剤、および／または希釈剤をさらに含む。
【００５３】
別の態様において、本発明は、薬として使用するための、上述の抗体または組成物を提供する。
【００５４】
別の態様において、本発明は、薬の製造のための、上述の抗体または組成物を提供する。ある実施形態において、上述の薬は、対象において高コレステロール血症を予防するまたは治療するためのものである。
【００５５】
別の態様において、本発明は、必要性のある対象に、有効量の上述の抗体または組成物を投与することを含む、高コレステロール血症を予防するまたは治療するための方法を提供する。
【００５６】
別の態様において、本発明は、薬としての上述の抗体または組成物の使用を提供する。
【００５７】
別の態様において、本発明は、対象において高コレステロール血症を予防するまたは治療するための、上述の抗体または組成物の使用を提供する。
【００５８】
別の態様において、本発明は、対象において高コレステロール血症を予防するまたは治療するための薬の製造のための、上述の抗体または組成物の使用を提供する。
【００５９】
別の態様において、本発明は、上述の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸を提供する。
【００６０】
別の態様において、本発明は、上述の核酸を含む、ベクターを提供する。
【００６１】
別の態様において、本発明は、上述の核酸またはベクターを含む、細胞を提供する。
【００６２】
別の態様において、本発明は、上述の抗体のうちの少なくとも２つを含む、対象において高コレステロール血症を予防するまたは治療するためのキットを提供する。
【００６３】
別の態様において、本発明は、上述の抗体のうちの少なくとも２つを含む、生体試料中のＰＣＳＫ９を検出するためのキットを提供する。
【００６４】
本発明の他の目的、利点、および特徴は、添付の図面を参照して例のみとして示される、それらの具体的な実施形態の次の非制限的な説明を読むときにより明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１Ａ】プロセグメント（アミノ酸３１〜１５２）および触媒サブユニット（アミノ酸１５３〜６９２）で形成される、ヒトＰＣＳＫ９ヘテロ二量体複合体のバキュロウイルス発現および精製を示す。
【図１Ｂ】［Ｂ］ＥＬＩＳＡによって示され、４５０ｎｍで保持されたタンパク質の光学密度（ＯＤ４５０）によって推定される、抗原で免疫されたラマによる、ヒト精製ＰＣＳＫ９に対する免疫応答を。５μｇ／ｍＬのＰＣＳＫ９を使用して、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。［Ｃ］ＥＬＩＳＡによって示される、免疫化を異なる回数反復した後のラマによる、ヒトＰＣＳＫ９に対する差次的免疫応答。約１μｇ／ｍＬのＰＣＳＫ９を使用して、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。
【図２Ａ】本発明の代表的な単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）キメラ構築物、つまりＰＫＥ２（配列番号１１０）、ＰＫＦ８（配列番号１１１）、ＰＫＦ１（配列番号１１２）、ＰＫＧ１（配列番号１１３）、Ｐ１．７０（配列番号１１４）、ＰＫＥ１（配列番号１１５）、Ｐ２．５７（配列番号１１６）、Ｐ２．５５（配列番号１１７）、Ｐ１．４０（配列番号１１８）、およびＰＫＥ９（配列番号１１９）の、アミノ酸アライメントを示す。最初の３０残基は、ヒトＰＣＳＫ９のシグナルペプチド配列に対応する。Ｖ５タグは、太字にされ、下線を引かれている。最後の６残基は、ヘキサヒスチジンタグに対応し、Ｐ２．５５およびＰ２．５７において、そのヘキサヒスチジンタグには、１０個のアミノ酸ｃ−Ｍｙｃタグおよび１個のリンカー残基が先行する。
【図２Ｂ】本発明の他の代表的な単一ドメイン抗体キメラ構築物、つまりＰ２．２０（配列番号１２０）、ＰＫＣ２（配列番号１２１）、ＰＫＧ１−２（配列番号１２２）、ＰＫＡ６（配列番号１２３）、ＰＫＡ１１（配列番号１２４）、ＰＫＣ１（配列番号１２５）、およびＰＫＤ８（配列番号１２６）の、アミノ酸配列。
【図３Ａ】図２Ａに図示される、単一ドメイン抗体、つまりＰＫＥ２（配列番号１２７）、ＰＫＦ８（配列番号１２８）、ＰＫＦ１（配列番号１２９）、ＰＫＧ１（配列番号１３０）、Ｐ１．７０（配列番号１３１）、ＰＫＥ１（配列番号１３２）、Ｐ２．５７（配列番号１３３）、Ｐ２．５５（配列番号１３４）、Ｐ１．４０（配列番号１３５）、ＰＫＥ９（配列番号１３６）に対応する配列。
【図３Ｂ】図２Ｂに図示される、単一ドメイン抗体、つまりＰ２．２０（配列番号１３７）、ＰＫＣ２（配列番号１３８）、ＰＫＧ１−２（配列番号１３９）、ＰＫＡ６（配列番号１４０）、ＰＫＡ１１（配列番号１４１）、ＰＫＣ１（配列番号１４２）、およびＰＫＤ８（配列番号１４３）に対応する配列。
【図３Ｃ】相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）に対応する領域が示されている、［Ａ］および［Ｂ］に示される全ての配列の、アライメントを示す。
【図３Ｄ】ｓｄＡＢ断片の下位群（すなわち、ＣＤＲおよびＦＲ領域を含有する）、つまり１）ＰＫＧ１−２（配列番号１０５）、ＰＫＡ１１（配列番号１０７）、ＰＫＧ１（配列番号９６）、ＰＫＦ１（配列番号９５）、およびＰＫＣ１（配列番号１０８）、２）Ｐ１．７０（配列番号９７）、ＰＫＥ１（配列番号９８）、およびＰ２．５７（配列番号９９）、ならびに３）ＰＫＧ１−２（配列番号１０５）、ＰＫＡ１１（配列番号１０７）、ＰＫＧ１（配列番号９６）、およびＰＫＦ１（配列番号９５）についての、３つのアライメントおよび対応する配列同一性百分率を提示する。
【図３Ｅ】１７個のｓｄＡＢ断片（すなわち、全てのＣＤＲＳおよびＦＲ領域）の各対について、Ｂｌａｓｔ（商標）ベーシックローカルアライメント（Basic Local Alignment）サーチツールにより算出された、配列同一性百分率を提示する。１７個の表の各々は、特定のｓｄＡＢ断片の配列の、１６個の他のｓｄＡＢ断片の配列との比較を提示する。
【図４】図３Ａに図示される１０個のｓｄＡｂのタンパク質配列のアライメントから推定される系統解析を示す。
【図５】Ａｂｎｕｍ抗体アミノ酸付番ツールを使用した、本明細書で「ＰＫＥ２」として特定される配列（配列番号９３）のＫａｂａｔ付番を示す。
【図６Ａ】ウェスタンブロットによって評価した、種々の単一ドメイン抗体とのインキュベーション後のＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬＲ発現を示す。
【図６Ｂ】ウェスタンブロットによって評価した、種々の単一ドメイン抗体とのインキュベーション後のＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬＲ発現を示す。
【図７】ウェスタンブロットによって評価した、単一ドメイン抗体とのインキュベーション後のＨｕＨ７細胞におけるＬＤＬＲ発現を示す。
【図８Ａ】ヒストグラムとして提示される、図６および７のウェスタンブロット分析による最も有効な抗体を図示する。
【図８Ｂ】ＬＤＬＲ発現倍率として提示される、図６および７のウェスタンブロット分析による最も有効な抗体を図示する。
【図９】野生型（ＷＴ）ＰＣＳＫ９誘導性ＬＤＬＲ分解に及ぼすｓｄＡｂの影響を示す。天然ＨｕＨ７細胞を、１μｇ／ｍＬの精製ＷＴ  ＰＣＳＫ９と共に２４時間、ＰＣＳＫ９に対する１００μｇ／ｍＬの種々のｓｄＡｂの非存在下（対照）または存在下でインキュベートした。細胞を次いで取り外し、フローサイトメトリーによって、細胞表面ＬＤＬＲ（ＬＤＬＲ陽性細胞％）について分析した。
【図１０Ａ】ＷＴ  ＰＣＳＫ９誘導性ＬＤＬＲ分解に及ぼすｓｄＡｂの影響を示す。天然ＨｕＨ７細胞を、１μｇ／ｍＬの精製ＷＴ  ＰＣＳＫ９と共に２４時間、ＰＣＳＫ９に対する５０μｇ／ｍＬの種々のｓｄＡｂの非存在下（対照）または存在下でインキュベートした。細胞を次いで取り外し、フローサイトメトリーによって、細胞表面ＬＤＬＲ（ＬＤＬＲ陽性細胞％）について分析した。数字は、β−アクチン対照と比較したＬＤＬＲレベルの比率を表す。
【図１０Ｂ】ＷＴ  ＰＣＳＫ９誘導性ＬＤＬＲ分解に及ぼすｓｄＡｂの影響を示す。天然ＨｕＨ７細胞を、１μｇ／ｍＬの精製ＷＴ  ＰＣＳＫ９と共に２４時間、ＰＣＳＫ９に対する５０μｇ／ｍＬの種々のｓｄＡｂの非存在下（対照）または存在下でインキュベートした。細胞を次いで取り外し、ウェスタンブロットによって、β−アクチン対照と比較した総ＬＤＬＲについて分析した。数字は、β−アクチン対照と比較したＬＤＬＲレベルの比率を表す。
【図１０Ｃ】細胞表面ＬＤＬＲ（ＬＤＬＲ発現のレベル（Ａ．Ｕ．））のフローサイトメトリー。
【図１０Ｄ】天然ＨｕＨ７細胞を１８時間、示されるように、０．７μｇ／ｍＬ（約９ｎＭ）のＷＴ  ＰＣＳＫ９タンパク質の非存在下［Ｃｎｔ（−）］もしくは存在下で単独で［Ｃｎｔ（＋）］、または５０μｇ／ｍＬ（約３μＭ）の種々の精製ラマｓｄＡｂと混合して、インキュベートした。ＷＴ  ＰＣＳＫ９タンパク質を、一過性でトランスフェクトされたＨｕｈ７細胞からの馴化培地として使用し、それをＥＬＩＳＡによって定量した。Ｈｕｈ７細胞への添加前に、混合物を３７℃で２時間プレインキュベートした。細胞表面におけるＬＤＬＲのレベルを、ＦＡＣＳによって、抗ヒトＬＤＬＲ抗体、およびａｌｅｘａ６４７で標識された好適な二次抗体を使用して、測定した。細胞表面ＬＤＬＲは、Ｃｎｔ（−）と比べて報告される。ＰＣＳＫ９活性の阻害％は、［ｓｄＡｂ−Ｃｎｔ（＋）］／［Ｃｎｔ（−）−Ｃｎｔ（＋）］×１００として算出した。
【図１１Ａ】機能獲得型ＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙ誘導性ＬＤＬＲ分解に及ぼすｓｄＡｂの影響を示す。［Ａ］天然Ｈｕｈ７細胞を１８時間、示されるように、０．５μｇ／ｍＬ（約６ｎＭ）のＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙタンパク質の非存在下［Ｃｎｔ（−）］もしくは存在下で単独で［Ｃｎｔ（＋）］、または５０μｇ／ｍＬ（約３μＭ）の種々の精製ラマｓｄＡｂと混合して、インキュベートした。データは、繰り返して行われた３つの独立した実験の平均を表す。
【図１１Ｂ】機能獲得型ＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙ誘導性ＬＤＬＲ分解に及ぼすｓｄＡｂの影響を示す。［Ｂ］天然Ｈｕｈ７細胞を１８時間、示されるように、０．５μｇ／ｍＬ（約６ｎＭ）のＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙタンパク質の非存在下［Ｃｎｔ（−）］もしくは存在下で単独で［Ｃｎｔ（＋）］、または漸増濃度のＰＫＥ２、Ｐ１．４０、またはＰＫＦ８と混合して、インキュベートした。データは、繰り返して行われた２つの独立した実験の平均を表す。細胞への添加前に、混合物を３７℃で２時間プレインキュベートした。細胞表面におけるＬＤＬＲのレベルを、ＦＡＣＳによって、抗ヒトＬＤＬＲ抗体、およびａｌｅｘａ６４７で標識された好適な二次抗体を使用して、測定した。細胞表面ＬＤＬＲは、Ｃｎｔ（−）と比べて報告される。ＰＣＳＫ９活性の阻害％は、［ｓｄＡｂ−Ｃｎｔ（＋）］／［Ｃｎｔ（−）−Ｃｎｔ（＋）］×１００として算出した。機能獲得型ＰＣＳＫ９タンパク質を、一過性でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの馴化培地として使用し、それをＥＬＩＳＡによって定量した。
【図１２Ａ】ＰＫＦ８およびＰ１．４０  ｓｄＡｂを使用した機能獲得型ＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙタンパク質プルダウン実験を示す。３０ｎｇ（０．５μｇ／ｍＬ）のＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙを含有する（ＨＥＫ２９３細胞からの馴化培地として）６０μＬの混合物を、単独でまたは３．５μｇ（５０μｇ／ｍＬ）の精製ｓｄＡｂ（６Ｈｉｓ）と共に、のいずれかで、３７℃で２時間プレインキュベートし、続いて６．６μｇの抗Ｈｉｓ  Ａｂ−アガロースビーズを用いて４℃で一晩免疫沈降させた。上清およびビーズから溶出された物質を、抗ｈＰＣＳＫ９  Ａｂと共にＰＡＧＥ−ＳＤＳ（６％）およびウェスタンブロット分析に供した。プルダウンされたＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙの百分率を、ＩｍａｇｅＪ（商標）プログラムを使用して、検出されたバンドの定量によって推定した。
【図１２Ｂ】使用された方法の略図。
【図１３】ＨｕＨ７細胞の表面におけるＬＤＬＲに及ぼすｓｄＡｂの影響を示す。細胞を１８時間、示されるように、０．５μｇ／ｍＬ（約６ｎＭ）のＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙタンパク質の非存在下（陰性ＣＴＲＬ）もしくは存在下で単独で（陽性ＣＴＲＬ）、または５０μｇ／ｍＬ（約３μＭ）の種々の精製ラマｓｄＡｂと混合して、インキュベートした。ＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙタンパク質を、一過性でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの馴化培地として使用し、それをＥＬＩＳＡによって定量した。細胞への添加前に、混合物を３７℃で２時間プレインキュベートした。透過処理済または透過処理なしＨｕＨ７細胞を免疫蛍光法によって分析した。細胞核をＤＡＰＩ（青色標識）で染色し、ＬＤＬＲを抗ＬＤＬＲ  Ａｂ（緑色標識）で染色した。
【図１４】ＤｉＩ−ＬＤＬ取り込みアッセイにより測定した、ＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙ機能獲得型突然変異誘導性ＬＤＬＲ分解に及ぼすｓｄＡｂの影響を示す。天然ＨｅｐＧ２細胞を、０．５μｇ／ｍＬの精製ＰＣＳＫ９突然変異体Ｄ３７４Ｙの非存在下［Ｃｎｔ（−）］または存在下［Ｃｎｔ（＋）］で、４時間インキュベートした。５０μｇ／ｍＬの種々のｓｄＡｂの添加が下に示される（ＰＫＥ１〜Ｐ２−５７）。
【図１５】ＰＣＳＫ９のインビボ阻害を示す。選択された阻害剤は、「ヒト化」ＬＤＬｃプロフィール（ＬＤＬｃ×２〜３）を示し、ＷＴバックグラウンドおよびＬｄｌｒ−／−バックグラウンドを有するマウスを交雑させることによって生成される、ヘテロ接合体Ｌｄｌｒ＋／−マウスにおいて試験される。これらのマウスは、正常なレベルのマウスＰＣＳＫ９（Ｐｃｓｋ９＋／＋）、ＰＣＳＫ９なし（Ｐｃｓｋ９−／−）、および／またはその独自のヒトプロモーターからのヒトＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙをコードする導入遺伝子（ＴｇＤＹ）の１つもしくは５つのコピーのいずれかを発現する。ＰＣＳＫ９のヒトＷＴ型もまた試験される。
【発明の開示】
【００６６】
神経アポトーシス調節転換酵素１（ＮＡＲＣ−１）としても知られる、プロタンパク質転換酵素スブチリシン−ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）は、ヒト（ＮＰ＿７７７５９６．２）における６９２個のアミノ酸のタンパク質分解酵素Ｋ−Ｈｋｅスブチラーゼであり、シグナルペプチド（１〜３０）、続いてプロセグメント（残基３１〜１５２）、触媒ドメイン（残基１５３〜４５４）、およびＣ末端Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−リッチドメイン（ＣＨＲＤ、残基４５５〜６９２）を含む。ＰＣＳＫ９は、肝細胞、腎間葉系細胞、回腸、結腸上皮、および胚脳の終脳ニューロン等の、増殖および分化が可能な細胞において発現される（Seidah et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:928-933）。
【００６７】
ＥＲにおける転位置に続いて、ＰＣＳＫ９のプロセグメントは、ＶＦＡＱ１５２↓ＳＩＰ部位において自己触媒的に開裂される。ＰＣにおいて、プロセグメント（プロ）は、完全に活性なプロテアーゼを産生するために通常は細胞内で除去される、分子内シャペロン／阻害因子である。他のＰＣとは異なり、ＰＣＳＫ９は、安定した非共有結合性の複合体［プロ≡ＰＣＳＫ９］として分泌される。したがって、ＰＣＳＫ９によって誘導されるＬＤＬＲの増大した分解は、成熟ＰＣＳＫ９型の触媒活性を必要としない。ヒトおよびマウス血漿中で、完全長ＰＣＳＫ９（１５３〜６９２）および切断型ＰＣＳＫ９−ΔＮ２１８（２１９〜６９２）の両方が検出され得る。ＬＤＬＲに対する活性を何ら有しない、後者は、フーリンおよび／またはＰＣ５によって生成される可能性が高く、これは、それらがＰＣＳＫ９をＲＦＨＲ２１８↓においてエクスビボで開裂するためである。
【００６８】
本明細書に開示される研究において、本願発明者らは、ヒトＰＣＳＫ９に対して単一ドメイン抗体を生成し、これらの抗体がＨｕＨ７肝細胞癌（hepatocarcinoma）およびＨｅｐＧ２細胞株においてＰＣＳＫ９誘導性ＬＤＬＲ分解を阻害することを示した。
【００６９】
したがって、第１の態様において、本発明は、ヒトＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体を提供し、該抗体は、
（ｉ）式Ｉ、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（配列番号１）（Ｉ）
（式中、
Ｘ１は、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｖ、Ａ、Ｉ、またはＳであり、
Ｘ２は、Ｙ、Ｐ、またはＡであり、
Ｘ３は、Ｉ、Ａ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｘ４は、Ｌ、Ｖ、Ｔ、またはＭであり、
Ｘ５は、Ｇ、Ｓ、またはＡである）
のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）１領域および、
【００７０】
（ｉｉ）式ＩＩ、
Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６−Ｚ７−Ｚ８−Ｚ９−Ｚ１０−Ｚ１１−Ｚ１２−Ｚ１３−Ｚ１４−Ｚ１５−Ｚ１６−Ｙ−Ｚ１７−Ｚ１８−Ｚ１９−Ｚ２０−Ｚ２１−Ｇ（配列番号２）（ＩＩ）
（式中、
Ｚ１は、Ａ、Ｑ、Ｔ、Ｇ、またはＳであり、
Ｚ２は、Ｉ、Ｖ、またはＡであり、
Ｚ３は、Ｒ、Ｔ、Ａ、またはＳであり、
Ｚ４は、Ｇ、Ｅ、Ｓ、Ｑ、Ａ、またはＤであり、
Ｚ５は、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｒ、Ｈ、またはＧであり、
Ｚ６は、Ｇ、Ａ、またはＤであり、
Ｚ７は、Ａ、Ｓ、Ｄ、Ｇ、またはＴであり、
Ｚ８は、Ｉ、Ｖであるか、または非存在であり、
Ｚ９は、Ｒ、Ｔであるか、または非存在であり、
Ｚ１０は、Ｇ、Ａであるか、または非存在であり、
Ｚ１１は、Ｒ、Ｄであるか、または非存在であり、
Ｚ１２は、Ｅ、Ｖであるか、または非存在であり、
Ｚ１３は、Ｇ、Ｅであるか、または非存在であり、
Ｚ１４は、Ｓ、Ｒ、Ｆであるか、または非存在であり、
Ｚ１５は、Ｔ、Ｉ、またはＳであり、
Ｚ１６は、Ｆ、Ｙ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ａ、またはＮであり、
Ｚ１７は、Ｖ、Ａ、Ｓ、Ｅ、またはＴであり、
Ｚ１８は、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｅ、Ｒ、またはＶであり、
Ｚ１９は、Ｓ、Ｎ、またはＦであり、
Ｚ２０は、ＶまたはＡであり、
Ｚ２１は、ＫまたはＲである）のアミノ酸配列、もしくはそれと実質的に同一の配列を含む、ＣＤＲ２領域、および／または、
【００７１】
（ｉｉｉ）式ＩＩＩ、
Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３−Ｂ４−Ｂ５−Ｂ６−Ｂ７−Ｂ８−Ｂ９−Ｂ１０−Ｂ１１−Ｂ１２−Ｂ１３−Ｂ１４−Ｂ１４−Ｂ１５−Ｂ１６−Ｂ１７−Ｂ１８（配列番号３）（ＩＩＩ）
（式中、
Ｂ１は、Ｄ、Ｔ、Ａ、Ｐ、Ｒ、またはＹであり、
Ｂ２は、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｙ、Ｐ、Ａ、またはＳであり、
Ｂ３は、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｇ、またはＭであり、
Ｂ４は、Ｐ、Ｇ、Ｙ、Ｓ、Ｆであるか、または非存在であり、
Ｂ５は、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｙであるか、または非存在であり、
Ｂ６は、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｉ、Ｇ、Ｒであるか、または非存在であり、
Ｂ７は、Ｅ、Ｎ、Ｒ、Ｄ、Ｔであるか、または非存在であり、
Ｂ８は、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖであるか、または非存在であり、
Ｂ９は、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｐ、Ｙであるか、または非存在であり、
Ｂ１０は、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｈ、またはＳであり、
Ｂ１１は、Ｑ、Ｐ、Ｔ、Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｖ、またはＥであり、
Ｂ１２は、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｈ、Ｓ、Ｆ、またはＴであり、
Ｂ１３は、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｈ、Ｒ、Ｓ、またはＭであり、具体的な実施形態において、Ｂ１３は、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、またはＭであり、
Ｂ１４は、Ｋ、Ｎ、Ｅ、Ｗ、Ｖであるか、または非存在であり、
Ｂ１５は、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｔ、Ｇ、Ｎ、またはＳであり、
Ｂ１６は、Ｙ、Ｓ、またはＱであり、
Ｂ１７は、Ｄ、Ｈ、Ｖ、Ｅ、Ａであるか、または非存在であり、
Ｂ１８は、Ｙ、Ｌ、Ｈ、Ｖであるか、または非存在である）
のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む、ＣＤＲ３領域、を含む。
【００７２】
別の実施形態において、上述のＣＤＲ１領域は、次のアミノ酸配列：ＤＹＩＬＧ（配列番号４）、ＮＹＩＶＧ（配列番号５）、ＨＹＩＬＧ（配列番号６）、ＶＹＡＭＧ（配列番号７）、ＤＹＡＭＧ（配列番号８）、ＮＹＡＭＧ（配列番号９）、ＡＹＡＭＧ（配列番号１０）、ＩＡＹＭＡ（配列番号１１）、ＳＰＴＭＡ（配列番号１２）、ＨＹＩＶＧ（配列番号１３）、ＨＹＶＴＳ（配列番号１４）のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００７３】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ２領域は、次のアミノ酸配列：ＡＩＲＧＳＧＡＩＲＧＲＥＧＳＴＦＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号１５）、ＡＩＲＧＳＧＡＩＲＧＲＥＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）、ＡＩＲＥＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１７）、ＡＩＴＳＰＧＤＳＩＰＹＡＨＳＶＫＧ（配列番号１８）、ＡＩＴＳＳＧＤＳＩＰＹＡＨＳＶＫＧ（配列番号１９）、ＡＡＡＱＳＧＤＳＳＡＹＡＲＳＶＫＧ（配列番号２０）、ＱＩＳＱＶＤＧＦＴＹＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号２１）、ＴＩＲＤＳＤＡＳＩＹＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号２２）、ＳＩＳＳＧＧＴＴＮＹＡＶＦＡＫＧ（配列番号２３）、ＡＩＲＳＲＤＤＳＴＹＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号２４）、ＡＩＲＥＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号２５）、ＡＶＲＥＳＧＳＳＴＥＹＡＥＮＶＫＧ（配列番号２６）、ＡＶＲＥＰＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２７）、ＧＶＴＡＨＡＧＶＴＡＤＶＥＳＴＤＹＳＤＳＶＫＧ（配列番号２８）のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む。ある実施形態において、上述のＣＤＲ３領域は、次のアミノ酸配列：ＤＲＦＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号２９）、ＤＲＦＰＴＰＥＦＴＴＱＶＧＨＹＤＶ（配列番号３０）、ＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号３１）、ＴＫＳＧＮＹＮＹＭＧＰＤＰＫＫＹＨＹ（配列番号３２）、ＴＴＳＧＴＹＮＹＭＧＰＤＰＫＥＹＶＹ（配列番号３３）、ＴＴＲＧＳＹＥＹＭＧＰＤＰＫＫＹＥＹ（配列番号３４）、ＡＬＡＦＰＴＴＳＳＮＴＹＡＹ（配列番号３５）、ＲＱＹＹＳＧＲＶＹＳＴＦＲＥＥＹＤＹ（配列番号３６）、ＹＡＭＳＴＥＴＭＶＳＱＤＹ（配列番号３７）、ＴＹＳＧＴＹＮＹＭＧＡＤＰＫＥＹＶＹ（配列番号３８）、ＤＰＲＴＩＤＬＳＳＲＬＬＷＧＳ（配列番号３９）、ＤＱＹＰＴＴＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号４０）、ＤＲＦＰＴＰＥＦＳＤＲＶＧＨＹＤＬ（配列番号４１）、ＤＰＹＰＴＰＥＦＴＴＨＶＧＨＹＤＹ（配列番号４２）、ＰＳＧＦＹＲＴＩＰＨＶＨＳＮＹＤＨ（配列番号４３）のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００７４】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＤＹＩＬＧ（配列番号４）、ＡＩＲＧＳＧＡＩＲＧＲＥＧＳＴＦＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号１５）、およびＤＲＦＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号２９）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００７５】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＮＹＩＶＧ（配列番号５）、ＡＩＲＧＳＧＡＩＲＧＲＥＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）、およびＤＲＦＰＴＰＥＦＴＴＱＶＧＨＹＤＶ（配列番号３０）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００７６】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＤＹＩＬＧ（配列番号４）、ＡＩＲＥＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１７）、およびＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号３１）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００７７】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＨＹＩＬＧ（配列番号６）、ＡＩＲＥＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１７）、およびＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号３１）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００７８】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＶＹＡＭＧ（配列番号７）、ＡＩＴＳＰＧＤＳＩＰＹＡＨＳＶＫＧ（配列番号１８）、およびＴＫＳＧＮＹＮＹＭＧＰＤＰＫＫＹＨＹ（配列番号３２）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００７９】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＶＹＡＭＧ（配列番号７）、ＡＩＴＳＳＧＤＳＩＰＹＡＨＳＶＫＧ（配列番号１９）、およびＴＴＳＧＴＹＮＹＭＧＰＤＰＫＥＹＶＹ（配列番号３３）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００８０】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＤＹＡＭＧ（配列番号８）、ＡＡＡＱＳＧＤＳＳＡＹＡＲＳＶＫＧ（配列番号２０）、およびＴＴＲＧＳＹＥＹＭＧＰＤＰＫＫＹＥＹ（配列番号３４）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００８１】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＮＹＡＭＧ（配列番号９）、ＱＩＳＱＶＤＧＦＴＹＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号２１）、およびＡＬＡＦＰＴＴＳＳＮＴＹＡＹ（配列番号３５）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００８２】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＡＹＡＭＧ（配列番号１０）、ＴＩＲＤＳＤＡＳＩＹＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号２２）、およびＲＱＹＹＳＧＲＶＹＳＴＦＲＥＥＹＤＹ（配列番号３６）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００８３】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＩＡＹＭＡ（配列番号１１）、ＳＩＳＳＧＧＴＴＮＹＡＶＦＡＫＧ（配列番号２３）、およびＹＡＭＳＴＥＴＭＶＳＱＤＹ（配列番号３７）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００８４】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＮＹＡＭＧ（配列番号９）、ＱＩＳＱＶＤＧＦＴＹＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号２１）、およびＴＹＳＧＴＹＮＹＭＧＡＤＰＫＥＹＶＹ（配列番号３８）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００８５】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＳＰＴＭＡ（配列番号１２）、ＡＩＲＳＲＤＤＳＴＹＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号２４）、およびＤＰＲＴＩＤＬＳＳＲＬＬＷＧＳ（配列番号３９）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００８６】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＨＹＩＬＧ（配列番号６）、ＡＩＲＥＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号２５）、およびＤＱＹＰＴＴＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号４０）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００８７】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＨＹＩＶＧ（配列番号１３）、ＡＶＲＥＳＧＳＳＴＥＹＡＥＮＶＫＧ（配列番号２６）、およびＤＲＦＰＴＰＥＦＳＤＲＶＧＨＹＤＬ（配列番号４１）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００８８】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＨＹＩＬＧ（配列番号６）、ＡＩＲＥＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号２５）、およびＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹ（配列番号３１）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００８９】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＨＹＩＬＧ（配列番号６）、ＡＶＲＥＰＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２７）、およびＤＰＹＰＴＰＥＦＴＴＨＶＧＨＹＤＹ（配列番号４２）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００９０】
ある実施形態において、上述のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＨＹＶＴＳ（配列番号１４）、ＧＶＴＡＨＡＧＶＴＡＤＶＥＳＴＤＹＳＤＳＶＫＧ（配列番号２８）、およびＰＳＧＦＹＲＴＩＰＨＶＨＳＮＹＤＨ（配列番号４３）、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００９１】
別の実施形態において、上述の抗体は、式ＩＶ、
Ｑ−Ｖ−Ｘ６−Ｌ−Ｘ７−Ｅ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｘ８−Ｖ−Ｑ−Ａ−Ｇ−Ｘ９−Ｓ−Ｘ１０−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｃ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８（配列番号４４）（ＩＶ）
（式中、
Ｘ６は、Ｋ、またはＱであり、
Ｘ７は、ＥまたはＶであり、
Ｘ８は、ＬまたはＰであり、
Ｘ９は、ＧまたはＤであり、
Ｘ１０は、ＬまたはＭであり、
Ｘ１１は、Ｖ、Ｌ、Ｓ、またはＡであり、
Ｘ１２は、ＡまたはＰであり、
Ｘ１３は、ＳまたはＰであり、
Ｘ１４は、Ｇ、Ｄ、またはＲであり、
Ｘ１５は、Ｒ、Ｌ、またはＳであり、
Ｘ１６は、Ｔ、Ｆ、Ｉ、またはＧであり、
Ｘ１７は、Ｉ、Ｖ、Ｐ、またはＦであり、
Ｘ１８は、Ｎ、Ｒ、Ｓ、またはＶである）
のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む、フレームワーク領域（ＦＲ）１をさらに含む。
【００９２】
ある実施形態において、Ｘ６は、Ｋであり、Ｘ７は、Ｅであり、Ｘ８は、Ｌであり、Ｘ９は、Ｇであり、Ｘ１０は、Ｌであり、Ｘ１１は、Ａであり、Ｘ１２は、Ａであり、Ｘ１３は、Ｓであり、Ｘ１４は、Ｇであり、Ｘ１５は、Ｒであり、Ｘ１６は、Ｔであり、Ｘ１７は、Ｆであり、および／またはＸ１８は、Ｎである。
【００９３】
さらなる実施形態において、上述のＦＲ１は、次のアミノ酸配列：
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＴＩＮ（配列番号４５）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＬＡＳＤＲＴＶＮ（配列番号４６）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲ（配列番号４７）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳ（配列番号４８）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳ（配列番号４９）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＮ（配列番号５０）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＬＴＦＳ（配列番号５１）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＳＰＳＤＲＴＦＳ（配列番号５２）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＰＲＳＧＶＶ（配列番号５３）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＰＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＬＡＳＧＲＦＶＮ（配列番号５４）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＭＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲ（配列番号５５）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲ（配列番号５６）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＤＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＩＦＮ（配列番号５７）、
のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００９４】
別の実施形態において、上述の抗体は、式Ｖ、
Ｘ１９−Ｘ２０−Ｒ−Ｑ−Ｘ２１−Ｐ−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｖ−Ｘ２８（配列番号５８）（Ｖ）
（式中、
Ｘ１９は、ＷまたはＹであり、
Ｘ２０は、ＦまたはＹであり、
Ｘ２１は、ＡまたはＶであり、
Ｘ２２は、Ｇ、Ｄ、またはＥであり、
Ｘ２３は、Ｋ、Ｔ、Ｒ、Ａ、Ｅ、またはＱであり、
Ｘ２４は、Ｋ、Ｅ、Ｑ、またはＬであり、
Ｘ２５は、ＲまたはＰであり、
Ｘ２６は、ＥまたはＫであり、
Ｘ２７は、ＦまたはＬであり、
Ｘ２８は、Ａ、Ｔ、またはＧである）
のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む、ＦＲ２をさらに含む。
【００９５】
ある実施形態において、Ｘ１９は、Ｗであり、Ｘ２０は、Ｆであり、Ｘ２１は、Ａであり、Ｘ２２は、Ｇであり、Ｘ２３は、Ｋであり、Ｘ２４は、Ｅであり、Ｘ２５は、Ｒであり、Ｘ２６は、Ｅであり、Ｘ２７は、Ｆであり、および／またはＸ２８は、Ａである。
【００９６】
ある実施形態において、上述のＦＲ２は、次のアミノ酸配列：
ＷＦＲＱＡＰＧＫＫＲＥＦＶＡ（配列番号５９）、
ＹＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡ（配列番号６０）、
ＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡ（配列番号６１）、
ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡ（配列番号６２）、
ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＴ（配列番号６３）、
ＷＦＲＱＡＰＧＴＥＲＥＦＶＧ（配列番号６４）、
ＷＦＲＱＶＰＧＲＥＲＥＦＶＡ（配列番号６５）、
ＷＹＲＱＡＰＥＫＱＲＥＬＶＡ（配列番号６６）、
ＷＦＲＱＡＰＧＡＥＲＥＦＶＧ（配列番号６７）、
ＷＦＲＱＡＰＧＥＥＲＫＦＶＡ（配列番号６８）、
ＷＦＲＱＡＰＧＫＬＰＥＦＶＡ（配列番号６９）、
ＷＦＲＱＡＰＤＱＥＲＥＦＶＡ（配列番号７０）、
のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【００９７】
別の実施形態において、上述の抗体は、式ＶＩ、
Ｒ−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｓ−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｋ−Ｘ３６−Ｘ３７−Ｘ３８−Ｘ３９−Ｌ−Ｘ４０−Ｍ−Ｘ４１−Ｓ−Ｌ−Ｘ４２−Ｐ−Ｘ４３−Ｄ−Ｘ４４−Ａ−Ｘ４５−Ｙ−Ｘ４６−Ｃ−Ｘ４７−Ｘ４８（配列番号７１）（ＶＩ）
（式中、
Ｘ２９は、Ｙ、Ｆ、またはＤであり、
Ｘ３０は、Ｔ、Ｓ、またはＶであり、
Ｘ３１は、ＩまたはＶであり、
Ｘ３２は、Ｋ、Ｒ、Ａ、またはＬであり、
Ｘ３３は、ＤまたはＮであり、
Ｘ３４は、Ｎ、Ｇ、Ｈ、またはＹであり、
Ｘ３５は、Ａ、Ｔ、Ｖ、またはＳであり、
Ｘ３６は、ＮまたはＳであり、
Ｘ３７は、ＴまたはＡであり、
Ｘ３８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、またはＧであり、
Ｘ３９は、Ｙ、Ｄ、またはＦであり、
Ｘ４０は、ＱまたはＲであり、
Ｘ４１は、Ｎ、Ｄ、またはＳであり、
Ｘ４２は、Ｋ、Ｉ、またはＱであり、
Ｘ４３は、ＥまたはＤであり、
Ｘ４４は、ＳまたはＴであり、
Ｘ４５は、Ｔ、Ｖ、またはＡであり、
Ｘ４６は、ＹまたはＩであり、
Ｘ４７は、ＡまたはＮであり、
Ｘ４８は、Ａ、Ｖ、Ｌ、またはＧである）
のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む、ＦＲ３をさらに含む。
【００９８】
ある実施形態において、Ｘ２９は、Ｆであり、Ｘ３０は、Ｔであり、Ｘ３１は、Ｉであり、Ｘ３２は、Ｒであり、Ｘ３３は、Ｄであり、Ｘ３４は、Ｎであり、Ｘ３５は、Ａであり、Ｘ３６は、Ｎであり、Ｘ３７は、Ｔであり、Ｘ３８は、Ｖであり、Ｘ３９は、Ｙであり、Ｘ４０は、Ｑであり、Ｘ４１は、Ｎであり、Ｘ４２は、Ｋであり、Ｘ４３は、Ｅであり、Ｘ４４は、Ｔであり、Ｘ４５は、Ｖであり、Ｘ４６は、Ｙであり、Ｘ４７は、Ａであり、および／またはＸ４８は、Ａである。
【００９９】
ある実施形態において、上述のＦＲ３は、次のアミノ酸配列：ＲＹＴＩＳＫＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶ（配列番号７２）、
ＲＦＳＩＳＫＤＮＡＫＮＴＩＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＡＬ（配列番号７３）、
ＲＹＴＩＳＲＮＮＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶ（配列番号７４）、
ＲＹＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶ（配列番号７５）、
ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＡ（配列番号７６）、
ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＡ（配列番号７７）、
ＲＦＴＩＳＲＤＧＡＫＮＴＡＹＬＱＭＤＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＡ（配列番号７８）、
ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号７９）、
ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＩＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号８０）、
ＲＦＴＩＳＡＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＩＣＮＡ（配列番号８１）、
ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＳＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号８２）、
ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＫＮＴＡＹＬＲＭＤＳＬＱＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧ（配列番号８３）、
ＲＤＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＧＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶ（配列番号８４）、
ＲＦＶＩＳＫＤＮＶＫＳＴＶＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＡＬ（配列番号８５）、
ＲＤＴＩＳＫＤＨＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶ（配列番号８６）、
ＲＦＴＶＳＲＤＹＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号８７）、
のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【０１００】
別の実施形態において、上述の抗体は、式ＶＩＩ、
Ｘ４９−Ｇ−Ｘ５０−Ｇ−Ｔ−Ｘ５１−Ｖ−Ｔ−Ｘ５２−Ｓ−Ｓ（配列番号８８）（ＶＩＩ）
（式中、
Ｘ４９は、Ｗ、またはＳであり、
Ｘ５０は、Ｒ、またはＱであり、
Ｘ５１は、Ｑ、またはＥであり、
Ｘ５２は、ＶまたはＩである）
のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む、ＦＲ４をさらに含む。
【０１０１】
ある実施形態において、Ｘ４９は、Ｗであり、Ｘ５０は、Ｑであり、Ｘ５１は、Ｑであり、および／またはＸ５２は、Ｖであるか、またはそれと実質的に同一の配列である。
【０１０２】
ある実施形態において、上述のＦＲ４は、次のアミノ酸配列：ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号８９）、ＷＧＲＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９０）、ＳＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９１）、ＷＧＱＧＴＥＶＴＩＳＳ（配列番号９２）のうちの１つ、またはそれと実質的に同一の配列を含む。
【０１０３】
ある実施形態において、上述の抗体は、次のアミノ酸配列：
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＴＩＮＤＹＩＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＫＲＥＦＶＡＡＩＲＧＳＧＡＩＲＧＲＥＧＳＴＦＹＶＤＳＶＫＧＲＹＴＩＳＫＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶＤＲＦＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９３）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＬＡＳＤＲＴＶＮＮＹＩＶＧＹＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＲＧＳＧＡＩＲＧＲＥＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＫＤＮＡＫＮＴＩＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＡＬＤＲＦＰＴＰＥＦＴＴＱＶＧＨＹＤＶＷＧＲＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９４）、
【０１０４】
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＴＩＮＤＹＩＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＫＲＥＦＶＡＡＩＲＥＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＹＴＩＳＲＮＮＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９５）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲＨＹＩＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡＡＩＲＥＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＹＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９６）、
【０１０５】
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＶＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＴＳＰＧＤＳＩＰＹＡＨＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＡＴＫＳＧＮＹＮＹＭＧＰＤＰＫＫＹＨＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９７）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＶＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＴＡＩＴＳＳＧＤＳＩＰＹＡＨＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＡＴＴＳＧＴＹＮＹＭＧＰＤＰＫＥＹＶＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９８）、
【０１０６】
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＮＤＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＡＡＱＳＧＤＳＳＡＹＡＲＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＧＡＫＮＴＡＹＬＱＭＤＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＡＴＴＲＧＳＹＥＹＭＧＰＤＰＫＫＹＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９９）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＬＴＦＳＮＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＴＥＲＥＦＶＧＱＩＳＱＶＤＧＦＴＹＹＥＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＬＡＦＰＴＴＳＳＮＴＹＡＹＳＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１００）、
【０１０７】
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＳＰＳＤＲＴＦＳＡＹＡＭＧＷＦＲＱＶＰＧＲＥＲＥＦＶＡＴＩＲＤＳＤＡＳＩＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＩＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＱＹＹＳＧＲＶＹＳＴＦＲＥＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０１）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＰＲＳＧＶＶＩＡＹＭＡＷＹＲＱＡＰＥＫＱＲＥＬＶＡＳＩＳＳＧＧＴＴＮＹＡＶＦＡＫＧＲＦＴＩＳＡＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＩＣＮＡＹＡＭＳＴＥＴＭＶＳＱＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０２）、
【０１０８】
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＬＴＦＳＮＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＡＥＲＥＦＶＧＱＩＳＱＶＤＧＦＴＹＹＥＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＳＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＹＳＧＴＹＮＹＭＧＡＤＰＫＥＹＶＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０３）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＰＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＬＡＳＧＲＦＶＮＳＰＴＭＡＷＦＲＱＡＰＧＥＥＲＫＦＶＡＡＩＲＳＲＤＤＳＴＹＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＬＤＮＡＫＮＴＡＹＬＲＭＤＳＬＱＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＤＰＲＴＩＤＬＳＳＲＬＬＷＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０４）、
【０１０９】
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＭＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲＨＹＩＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡＡＩＲＥＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＲＧＲＤＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＧＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶＤＱＹＰＴＴＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹＷＧＱＧＴＥＶＴＩＳＳ（配列番号１０５）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲＨＹＩＶＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＶＲＥＳＧＳＳＴＥＹＡＥＮＶＫＧＲＦＶＩＳＫＤＮＶＫＳＴＶＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＡＬＤＲＦＰＴＰＥＦＳＤＲＶＧＨＹＤＬＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０６）、
【０１１０】
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＭＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲＨＹＩＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡＡＩＲＥＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＲＧＲＹＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶＤＱＹＰＴＰＥＦＳＴＱＶＧＨＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０７）、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＰＲＨＹＩＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＬＰＥＦＶＡＡＶＲＥＰＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＤＴＩＳＫＤＨＴＫＮＡＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＴＹＹＣＡＶＤＰＹＰＴＰＥＦＴＴＨＶＧＨＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０８）、
【０１１１】
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＤＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＩＦＮＨＹＶＴＳＷＦＲＱＡＰＤＱＥＲＥＦＶＡＧＶＴＡＨＡＧＶＴＡＤＶＥＳＴＤＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＹＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＳＧＦＹＲＴＩＰＨＶＨＳＮＹＤＨＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０９）、
のうちの１つ、もしくはそれと実質的に同一の配列を含むか、またはそれからなる。
【０１１２】
本明細書で言及される「抗体」という用語は、全抗体、およびそれらの任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）、１本鎖、ならびに単一ドメイン抗体を含む。従来の抗体は典型的に、ジスルフィド結合によって相互接続される少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖、またはそれらの抗原結合部分を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＶＨと略記される）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶＬと略記される）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域と共に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に、さらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと、次の順序で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。一般に、Fundamental Immunology Ch.7（Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)）を参照されたい。
【０１１３】
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合部分」（または単純に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ＰＣＳＫ９）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって行われ得ることが示されてきた。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわち、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価の断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アーム（single arm）のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組み換え法を使用して、それらが単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、接合することができ、そのＶＬおよびＶＨ領域は対となって、一価の分子（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成する。かかる１本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技法を含む、任意の好適な技法を使用して得られてもよく、その断片は、インタクトな抗体の場合と同じ様態で、実用性についてスクリーニングされてもよい。
【０１１４】
ある実施形態において、上述の抗体は、単一ドメイン抗体である。本明細書で使用される単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、その相補性決定領域（ＣＤＲ）が単一ドメインポリペプチドの一部である、抗体を指す。例としては、重鎖抗体、軽鎖を天然に欠いている抗体、従来の４本鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体、および抗体に由来するもの以外の単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は、当該技術分野における任意のものであっても、または任意の将来的な単一ドメイン抗体であってもよい。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、アルパカ、グアナコ、ヤギ、ウサギ、ウシを含むが、これらに限定されない任意の種に由来してもよい。本発明の一態様によれば、本明細書で使用される単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠いている重鎖抗体として知られる、天然に生じる単一ドメイン抗体である。明確さの理由で、軽鎖を天然に欠いている重鎖抗体に由来するこの可変ドメインは、４つの鎖免疫グロブリンの従来のＶＨから識別するために、本明細書でＶＨＨまたはナノボディとして知られる。かかるＶＨＨ分子またはｓｄＡｂは、ラクダ科の種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、およびグアナコにおいて産生される、抗体に由来し得る。ラクダ科以外の他の種が、軽鎖を天然に欠いている重鎖抗体を産生することもあり、かかるＶＨＨは、本発明の範囲内にある。それらはまた、サメにおいても観察されており、ＶＮＡＲと称され、それらがヒト重鎖配列に基づいて操作されてもよい。本明細書で使用されるとき、ｓｄＡｂには、ファージディスプレイまたは他のディスプレイ技術を通じて任意の起源のＶＨ、ＶＨＨまたはＶＮＡＲ保有宿主（reservoir）から直接単離されたもの、ならびにヒト化、親和性成熟、安定化、および抗体操作の他の方式による、かかるｓｄＡｂのさらなる修飾を通じて生成されたものが含まれる。この用語にはまた、単一ドメイン抗体ドメインとして機能することが可能であり、生物活性（例えば、ＰＣＳＫ９に結合する）を示す、相同体、誘導体、または断片も含まれる。
【０１１５】
本明細書にさらに記載されるように、ｓｄＡｂのアミノ酸配列および構造は、限定するものではないが、当該技術分野でおよび本明細書で、それぞれ「フレームワーク領域１または「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」；および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と称される、４つのフレームワーク領域または「ＦＲ」からなると見なされ得、そのフレームワーク領域は、当該技術分野で、それぞれ「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」；および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と称される、３つの相補性決定領域または「ＣＤＲ」によって分断される。単一ドメイン抗体におけるアミノ酸残基の総数は、約１１０〜１４０、または約１１０〜１３０であり得る。しかしながら、単一ドメイン抗体の部分、断片、または類似体は、かかる部分、断片、または類似体が、本明細書に概説されるさらなる要件を満たし、また好ましくは、本明細書に記載される目的に好適である限り、それらの長さおよび／またはサイズに関して特に限定されないことに留意すべきである。
【０１１６】
単一ドメイン抗体のアミノ酸残基は、Riechmann and Muyldermansの論文（Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 1999 Dec 10;231(1-2):25-38、例えば、該参考文献の図２を参照されたい）におけるラクダ科由来のＶＨＨドメインに適用されるように、Kabat et al.（"Sequence of proteins of immunological interest（免疫学的に重要なタンパク質の配列"）、アメリカ公衆衛生局、メリーランド州、ベセスダ、アメリカ国立衛生研究所（NIH）、出版物番号９１）によって与えられる、ＶＨドメインに対する一般的な付番にしたがって付番される。この付番によれば、単一ドメイン抗体のＦＲ１は、約１〜３０位のアミノ酸残基で構成され、ＣＤＲ１は、約３１〜３５位のアミノ酸残基で構成され、ＦＲ２は、約３６〜４９位のアミノ酸残基で構成され、ＣＤＲ２は、約５０〜６５位のアミノ酸残基で構成され、ＦＲ３は、約６６〜９４位のアミノ酸残基で構成され、ＣＤＲ３は、約９５〜１０２位のアミノ酸残基で構成され、ＦＲ４は、約１０３〜１１３位のアミノ酸残基で構成される。当該技術分野で周知であるが、ＶＨドメインについて、およびＶＨＨドメインについて、ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は変動し得、Ｋａｂａｔ付番によって示されるアミノ酸残基の総数に対応しない場合がある（つまり、Ｋａｂａｔ付番による１つ以上の位置が、実際の配列において占有されない場合があるか、または実際の配列が、Ｋａｂａｔ付番によって許容される数よりも多いアミノ酸残基を含有する場合がある）ことに留意すべきである。これは、一般に、Ｋａｂａｔによる付番が、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際の付番に対応する場合も、しない場合もあることを意味する。一般に、しかしながら、Ｋａｂａｔの付番により、およびＣＤＲにおけるアミノ酸残基の数に関わりなく、Ｋａｂａｔ付番による１位は、ＦＲ１の起点に対応し、Ｋａｂａｔ付番による３６位は、ＦＲ２の起点に対応し、Ｋａｂａｔ付番による６６位は、ＦＲ３の起点に対応し、Ｋａｂａｔ付番による１０３位は、ＦＲ４の起点に対応すると言える。Ｋａｂａｔ付番スキーム（numbering scheme）を使用して、所与の抗体配列を付番するためのソフトウェアおよびオンラインツール（例えば、Abnum, http://www.bioinf.org.uk/abs/abnum/）が利用可能である（Abhinandan, K.R. and Martin, A.C.R. (2008) Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains, Molecular Immunology, 45, 3832-3839を参照されたい）。Ａｂｎｕｍ抗体アミノ酸付番ツールを使用した、本明細書で「ＰＫＥ２」として特定される配列のＫａｂａｔ付番が、図５に図示される。
【０１１７】
実質的に同一の配列は、１つ以上の保存的アミノ酸突然変異を含んでもよい。参照配列に対する１つ以上の保存的アミノ酸突然変異は、参照配列と比較して、生理的、化学的、または機能的特性の実質的な変化を何ら伴わない突然変異体ペプチドを産生し得ることが当該技術分野で知られており、かかる場合、参照および突然変異体配列は、「実質的に同一な」ポリペプチドと見なされるであろう。保存的アミノ酸突然変異には、アミノ酸の付加、欠失、または置換が含まれてもよく、保存的アミノ酸置換は、本明細書で、アミノ酸残基と、同様の化学特性（例えば、サイズ、電荷、または極性）を有する別のアミノ酸残基との置換として定義される。
【０１１８】
非限定的な例において、保存的突然変異は、アミノ酸置換であり得る。かかる保存的アミノ酸置換は、塩基性、中性、疎水性、または酸性アミノ酸を、同じ基の別のアミノ酸と置換し得る。「塩基性アミノ酸」という用語は、生理的ｐＨで典型的に正電荷である、７超の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を意味する。塩基性アミノ酸には、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、およびリジン（ＬｙｓまたはＫ）が含まれる。「中性アミノ酸」（また、「極性アミノ酸」）という用語は、生理的ｐＨで無電荷であるが、２個の原子により共有される電子対がそれらの原子のうちの１個により近接して保有される、少なくとも１つの結合を有する、親水性アミノ酸を有する側鎖を意味する。極性アミノ酸には、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、およびグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）が含まれる。「疎水性アミノ酸」（また、「非極性アミノ酸」）という用語は、Eisenberg (1984)の標準化コンセンサス疎水性尺度に従って、ゼロよりも大きい疎水性を示すアミノ酸を含むことが意図される。疎水性アミノ酸には、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、イソロイシン（ＨｅまたはＩ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、バリン（ＶａＩまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、およびグリシン（ＧｌｙまたはＧ）が含まれる。「酸性アミノ酸」は、生理的ｐＨで典型的に負電荷である、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸には、グルタミン酸塩（ＧｌｕまたはＥ）、およびアスパラギン酸塩（ＡｓｐまたはＤ）が含まれる。
【０１１９】
配列同一性は、２つの配列の類似性を評価するために使用され、それは、２つの配列が残基位置間で最大限に一致するようにアライメントされるときに、同一である残基のパーセントを算出するによって決定される。任意の既知の方法を使用して、配列同一性を算出してもよく、例えば、コンピュータソフトウェアが配列同一性を算出するために利用可能である。限定することを望むものではないが、配列同一性は、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＣＯＢＡＬＴ、もしくはＦＡＳＴＡ−Ｎ等のソフトウェア、または当該技術分野で既知の任意の他の適切なソフトウェア／ツールによって算出することができる（Johnson M, et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36:W5-W9、 Papadopoulos JS and Agarwala R (2007) Bioinformatics 23:1073-79）。
【０１２０】
本発明の実質的に同一の配列は、少なくとも７５％同一であり得、別の例において、実質的に同一の配列は、本明細書に記載される配列とアミノ酸レベルで少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であり得る。実質的に同一の配列は、参照配列の活性および特異性を実質的に保持する。
【０１２１】
本発明のｓｄＡｂはまた、組み換え抗体またはそれらの断片の発現、検出、または精製を補助するための追加の配列も含んでもよい。例えば、限定することを望むものではないが、抗体またはその断片は、標的もしくはシグナル配列（例えば、ｏｍｐＡまたはＰＣＳＫ９であるが、これらに限定されない）、検出および／もしくは精製タグ（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈｉｓタグ、またはＶ５タグであるがこれらに限定されない）、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【０１２２】
本発明のｓｄＡｂはまた、多価ディスプレイの下にあってもよい。多量体化は、当該技術分野で既知の任意の好適な方法によって達成されてもよい。例えば、いずれの様態でも限定することを望むものではないが、多量体化は、自己組織化分子を使用して達成されてもよい（ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２００３／０４６５６０号に記載される、Zhang, J.et al. J Mol. Biol 341, 161-169 (2004)、 Zhang, J.et al., J MoI Biol 335, 49-56 (2004)）。記載される方法は、抗体またはその断片および五量体化ドメインを含む、融合タンパク質を発現させ、それが五量体へと組織化し、それを通じて抗体またはその断片の多価ディスプレイが達成されることによって、五重特異性抗体を産生する。五量体の各サブユニットは、同じであっても、異なってもよい。多価ディスプレイの他の形態もまた、本発明によって包含される。例えば、限定することを望むものではないが、抗体またはその断片は、二量体、三量体、または任意の他の好適なオリゴマーとして提示されてもよい。これは、当該技術分野で既知の方法、例えば、直接連結結合（direct linking connection）、（Nielsen et al. Cancer research 60, 6434-6440 (2000))、ｃ−ｊｕｎ／Ｆｏｓ相互作用（de Kruif, J. & Logtenberg, T. J Biol Chem 271, 7630-7634(1996)）、または「ノブ・イントゥ・ホール（knob into hole）」相互作用（Ridgway et al. Protein Eng 9, 617-621 (1996)）によって、達成されてもよい。
【０１２３】
本発明のｓｄＡｂはまた、例えば、その安定性／半減期を増加させるために、ならびに／または特定の細胞、臓器、および／または組織へのそのターゲティングを促進するために、ならびに／または細胞移入を促進するために、特定の部分に複合体化またはそれと融合されてもよい。ある実施形態において、単一ドメイン抗体は、抗体のＦｃ領域と融合され、さらなる実施形態においては、ヒトＩｇＧ４−Ｆｃ領域に融合される。
【０１２４】
ある実施形態において、上述のｓｄＡｂは、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの上皮成長因子様反復Ａ（ＥＧＦ−Ａ）ドメインとの間の相互作用を遮断するか、または干渉する。ある実施形態において、上述のｓｄＡｂは、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインを対象にし、さらなる実施形態においては、ＰＣＳＫ９の残基１５３〜１５６および／または３６７〜３８１に対応する領域を対象にする。
【０１２５】
ある実施形態において、上述の単一ドメイン抗体は、１×１０−７以下、またはそれよりも低い解離定数（ＫＤ）を有し、さらなる実施形態において、上述の単一ドメイン抗体は、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、もしくは１×１０−１２Ｍ、またはそれよりも低い解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１２６】
ｓｄＡｂの機能的特徴付け
本発明のｓｄＡｂの機能的特性は、インビトロおよびインビボで試験することができる。例えば、ＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂは、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの相互作用を阻害する、ｓｄＡｂの細胞中への移入を誘発する、能力について試験することができ、また、インビボでの、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９依存性の影響（例えば、ＬＤＬ−ＣのＬＤＬＲ媒介取り込み）の阻害、ＰＣＳＫ９のタンパク質分解活性の阻害、ＰＣＳＫ９依存性ＬＤＬＲ分解の阻害、およびＬＤＬ−Ｃの減少によって測定することもできる。ＬＤＬＲと結合するＰＣＳＫ９は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）を使用する）によって、ＬＤＬＲを固体支持体に固定化し、ＬＤＬＲに結合する可溶性ＰＣＳＫ９を検出することにより、検出することができる。代替的に、ＰＣＳＫ９を固定化することができ、ＬＤＬＲ結合を検出することができる。ＰＣＳＫ−９／ＬＤＬＲ結合はまた、ＥＬＩＳＡによって（例えば、固定化されたＬＤＬＲと結合するＰＣＳＫ９を検出することによって）、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）により、またはファージディスプレイにより、分析することができる。ＦＲＥＴを行うために、溶液中のＬＤＬＲと結合するフルオロフォア標識ＰＣＳＫ９を検出することができる（例えば、米国特許第５，６３１，１６９号を参照されたい）。ＰＣＳＫ９結合ＬＤＬ−Ｒは、免疫共沈降によって検出されてきた（Lagace et al., 2006 J. Clin. Inv. 116 (11):2995-3005）。この様態でＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲ結合を検査するために、ＨｅｐＧ２細胞を、ステロール欠乏培地中で１８時間培養する。精製ＰＣＳＫ９を、０．１ｍＭのクロロキンの存在下で培地に添加し、細胞を１時間インキュベートする。細胞を穏やかな界面活性剤（１％ジギトニン（ｗ／ｖｏｌ））中に溶解させる。ＰＣＳＫ９またはＬＤＬＲを細胞可溶化物から免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、免疫ブロットして、それぞれ免疫共沈降したＬＤＬＲまたはＰＣＳＫ９の存在を検出する（上記の Lagace et al., 2006）。
【０１２７】
これらのアッセイは、ＬＤＬＲにより高い結合活性で結合するＰＣＳＫ９の突然変異型と共に行われてもよい（例えば、上記のｈＰＣＳＫ９  Ｄ３７４Ｙ、Lagace et al. 2006）。肝細胞は、細胞表面上でＬＤＬＲを発現する。精製ＰＣＳＫ９の、培養された肝細胞（例えば、ＨｅｐＧ２細胞、ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６５、ＨｕＨ７細胞、初代ヒトまたはマウス肝細胞）への添加は、用量依存的および時間依存的様式でＬＤＬＲ発現の減少をもたらす（上記のLagace et al., 2006）。ＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂを、肝細胞においてＬＤＬＲレベルを増加させる能力について試験することができる。例えば、ＨｅｐＧ２細胞を、ステロール欠乏培地（１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン、および１ｇ／Ｌのグルコース、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）新生仔ウシリポタンパク質欠乏血清（ＮＣＬＰＤＳ）、１０μＭのコンパクチンナトリウム、および５０μＭのメバロン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ）中で１８時間培養して、ＬＤＬＲ発現を誘導する。精製ＰＣＳＫ９（５μｇ／ｍＬ）を培地に添加する。ＰＣＳＫ９の添加の０、０．５、１、２、および４時間後に採取された細胞中のＬＤＬＲレベルを決定する（上記のLagace et al., 2006）。ＬＤＬＲレベルは、フローサイトメトリー、ＦＲＥＴ、免疫ブロッティング、または他の手段によって決定することができる。細胞（例えば、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｕＨ７細胞）によるＬＤＬ−Ｃ取り込みは、蛍光標識ＬＤＬ−ＣであるＤｉＩ−ＬＤＬ（３，３’−ジオクタデシルインドカルボシアニン−低比重リポタンパク質）を使用して、Stephan and Yurachek (1993, J. Lipid Res. 34:325-330）によって記載されるように、測定することができる。手短に言えば、細胞を、培養物中でＤｉＩ−ＬＤＬ（２０〜１００μｇタンパク質／ｍＬ）と共に３７℃で２時間インキュベートする。細胞を洗浄し、溶解させ、内部移行したＤｉＩ−ＬＤＬの濃度を、分光蛍光計を使用して定量する。ＬＤＬ−Ｃ取り込みは、ＰＣＳＫ９結合剤と接触させた細胞において測定することができる（ＤｉＩ−ＬＤＬが細胞培養液中に存在する期間の前、および／またはその期間中）。
【０１２８】
肝臓内でヒトＰＣＳＫ９を過剰発現するトランスジェニックマウスは、非トランスジェニックマウスと比べて血漿ＬＤＬ−Ｃのレベルを増加させた（上記のLagace et al., 2006）。また、マウスにおけるアデノウイルスベクターを使用したＰＣＳＫ９の過剰発現を記載する、Maxwell and Breslow, 2004 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:7100も参照されたい。ＰＣＳＫ９−／−マウスが生み出された（Rashid et al., 2005 Proc. Natl. Acad. Sci. 102(5):5374-5379）。これらのマウスは、ｈＰＣＳＫ９導入遺伝子を発現するように遺伝子改変され得る。ＰＣＳＫ９結合分子は、これらのモデルのうちの任意のものにおいて、または遺伝子改変されていない動物において、総コレステロールおよび／またはＬＤＬ−Ｃを取り除くまたは低減する能力について試験することができる。
【０１２９】
血漿からのＬＤＬクリアランスの動態は、動物に［１２５Ｉ］−標識ＬＤＬを注射し、血液試料を注射の０、５、１０、１５、および３０分後に得て、試料中の［１２５Ｉ］−ＬＤＬを定量することによって、決定することができる（上記のRashid et al., 2005）。ＬＤＬクリアランスの速度は、野生型マウスと比べて、ＰＣＳＫ９−／−マウスにおいて増加する（上記のRashid et al., 2005）。ＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂを投与された動物において増加したＬＤＬクリアランスは、その薬剤がインビボでＰＣＳＫ９活性を阻害することを示す。
【０１３０】
ＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂでの処置に反応した総血漿コレステロール、血漿トリグリセリド、および／またはＬＤＬ−Ｃの減少は、ＰＣＫＳ９結合分子の治療効果を示す。コレステロールおよび脂質プロフィールは、比色分析、ガス−液体クロマトグラフィー、または酵素手段によって、市販のキットを使用して決定することができる。
ＰＣＳＫ９活性を決定するための方法／アッセイが下に記載される。
【０１３１】
ＰＣＳＫ９依存性ＬＤＬＲ分解のインビトロ分析。
化合物を、ヒト肝細胞株ＨｅｐＧ２またはＨｕＨ７上で、ＰＣＳＫ９によるＬＤＬＲの増大した分解を阻害するその能力について試験する。このアッセイとは、トランスフェクトまたは精製のいずれかをした、野生型（ＷＴ）、突然変異体またはキメラＰＣＳＫ９を、培養液の上清に、試験化合物の存在または非存在下で直接添加することである。各「用量反応」実験は、４〜６つの異なる投薬量につき、三通り行う。ＰＣＳＫ９活性の阻害は、次のものによって明らかとなる、ＬＤＬＲタンパク質発現の増加によって、および／または細胞表面において、明らかとなる：
・総ＬＤＬＲについての細胞可溶化物のウェスタンブロット分析、
・ＬＤＬＲについての細胞表面のＦＡＣＳ分析、
・ＬＤＬＲの細胞表面活性を監視する蛍光ＤｉＩ−ＬＤＬ組み込み。
【０１３２】
Ｄｉｌ−ＬＤＬ蛍光取り込みアッセイとは、ＬＤＬＲ内部移行を介したＤｉＩ−ＬＤＬ細胞組み込みの蛍光測定（細胞表面ＬＤＬＲ活性の測定）である。細胞を、９６ウェル形式で、異なる用量の試験化合物の存在または非存在下で２時間、次いでＤｉＩ−ＬＤＬを添加してさらに２時間、インキュベートする。ＰＣＳＫ９活性の阻害は、ＤｉＩ−ＬＤＬ蛍光の増加によって検出される。
【０１３３】
ａ．ＷＴ  ＰＣＳＫ９。このアッセイとは、試験化合物の存在または非存在下で、トランスフェクトされた細胞からの馴化培地として、または精製し、培養液の上清に添加してのいずれかで、野生型（ＷＴ）ＰＣＳＫ９の添加を行うことである。細胞外で添加されるＰＣＳＫ９のために日常的に選定される用量は、１μｇ／ｍＬである。
【０１３４】
ｂ．突然変異体ＰＣＳＫ９（機能獲得型）。試験化合物が機能獲得型突然変異の機能を阻害し得るかどうかをさらに特徴付けるために、細胞を、精製変異タンパク質と共に、異なる用量の試験化合物の存在または非存在下でインキュベートする。精製ＰＣＳＫ９突然変異体は、例えばＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙ（ＬＤＬＲへの約２５倍高い親和性を示す）またはＳ１２７Ｒ（ＰＣＳＫ９の向上した安定性を示す）である。細胞外で添加される、ＰＣＳＫ９およびその機能獲得型自然突然変異体Ｄ３７４Ｙのために日常的に選定される用量は、１μｇ／ｍＬおよび０．２μｇ／ｍＬである。他のＰＣＳＫ９突然変異体が同様に使用される。アッセイはまた、機能獲得型ＰＣＳＫ９突然変異体でトランスフェクトされた細胞から採取された培地を使用して、行うことができる。
【０１３５】
ｃ．ｓｄＡｂ。アッセイは、培養物の上清に直接添加された精製ｓｄＡｂ（６Ｈｉｓ）を使用して、またはＰＣＳＫ９と共にプレインキュベートして行なわれる。これらのアッセイはまた、Ｖ５タグを付けられている、ｓｄＡｂの分泌可能形態（例えば、ｓｄＡｂのアミノ末端にシグナルペプチドを含有するキメラ構築物）でトランスフェクトされた細胞から収集された培地を使用して行われる。
【０１３６】
ｄ．アッセイの説明―キメラＰＣＳＫ９。ＰＣＳＫ９と、細胞表面アンジオテンシン変換酵素２の膜貫通およびサイトゾルドメインとを融合する、キメラタンパク質（ＰＣＳＫ９−ＡＣＥ２）を、ＰＣＳＫ９細胞外経路活性に対する試験化合物の活性を測定するために試験する。代替的に、ＰＣＳＫ９と、タンパク質をエンドソーム／リソソームへと直接輸送するＬａｍｐ−１の膜貫通およびサイトゾルドメインとを融合する、キメラタンパク質（ＰＣＳＫ９−Ｌａｍｐ１）を、ＰＣＳＫ９細胞内経路活性に対する試験化合物の活性を測定するために試験する。キメラＰＣＳＫ９−ＡＣＥ２またはＰＣＳＫ９−Ｌａｍｐ１を発現する安定した細胞が利用可能であり、それらを異なる用量の試験化合物の存在または非存在下でインキュベートする。
【０１３７】
ｅ．アッセイの説明―初代ヒト肝細胞。ＰＣＳＫ９阻害性化合物を、細胞表面ＬＤＬＲに対するそれらの効果を測定するために、マウスおよびヒト初代肝細胞上で試験する。マウス初代肝細胞を使用する利点は、それがまた、それぞれＰＣＳＫ９を発現するまたはＰＣＳＫ９を欠いている野生型またはノックアウトマウスと関連して、化合物の特異性を測定することである。ＰＣＳＫ９を内因的に（例えば、ｓｈＲＮＡノックダウン下において）もはや発現しないＨｅｐＧ２およびＨｕＨ７細胞もまた、同様の薬物特異性目的に使用される。
【０１３８】
ＰＣＳＫ９プロセシングおよび分泌のインビトロ分析。
プロＰＣＳＫ９からＰＣＳＫ９へのプロセシングおよび分泌を、細胞中および培地中でのＰＣＳＫ９の生合成アプローチおよび／またはウェスタンブロットを使用して試験する。化合物（複数可）をＨＥＫ２９３（ＰＣＳＫ９を安定して発現する）およびＨｕＨ７（ＰＣＳＫ９を内因的に発現する）と共にインキュベートする。統計的有意性のために、各実験を三通り行う。化合物（複数可）の「用量依存的」反応を行う。
【０１３９】
プロトコル
トランスフェクトされた細胞の培地中に含有されるＰＣＳＫ９。ヒト野生型ＰＣＳＫ９（ＰＣＳＫ９−ＷＴ）および機能獲得型（ＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙ）タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞またはＨｕｈ７細胞における過剰発現によって産生される。手短に言えば、ＨＥＫ  ２９３またはＨｕｈ７細胞株を、１０％ウシ胎仔血清（Invitrogen）を有するダルベッコ変法イーグル培地中で成長させ、５％ＣＯ２下で、３７℃で維持する。製造業者のプロトコルに従って、ＨＥＫ２９３細胞を、ｊｅｔＰＲＩＭＥ（商標）（Polyplus トランスフェクション）でトランスフェクトし、Ｈｕｈ７細胞を、リポフェクタミン  ２０００（Invitrogen）でトランスフェクトする。トランスフェクションの２４時間後、細胞を洗浄し、無血清培地中でインキュベートする。分泌されたヒトＰＣＳＫ９−Ｄ３７４ＹまたはＰＣＳＫ９−ＷＴタンパク質を含有する馴化培地を、２４時間後に収集する。馴化培地中のＰＣＳＫ９タンパク質のレベルを、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって、以前に記載されたように定量する（Dubuc G, Tremblay M, Pare G, Jacques H, Hamelin J, Benjannet S, Boulet L, Genest J, Bernier L, Seidah NG, Davignon J. 2010. A new method for measurement of total plasma PCSK9: clinical applications. J Lipid Res. 51:140-149.）。
【０１４０】
トランスフェクトされた細胞の培養培地中に分泌されたＳｄＡｂ。３’末端にヘキサヒスチジン（６Ｈｉｓ）タグ、または６Ｈｉｓタグおよびｃ−Ｍｙｃタグを含有する、ｓｄＡｂ  ｃＤＮＡを、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰバックボーンベクター（Clonetech）中にクローニングする。トランスフェクトされた細胞からのｓｄＡｂの分泌を確実にするために、ヒトＰＣＳＫ９のシグナルペプチド（ＳＰ）をｓｄＡｂ配列のアミノ末端に導入する（図２）。ＳＰにはＶ５タグが続く。対照ベクターｐＩＲＥＳ２は、シグナルペプチド、Ｖ５タグ、およびヘキサヒスチジンタグ配列を含有する。ｓｄＡｂをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の培地から収集する。手短に言えば、ＨＥＫ  ２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Invitrogen）を有するダルベッコ変法イーグル培地中で成長させ、５％ＣＯ２下で、３７℃で維持する。８０〜９０％の集密状態で、製造業者のプロトコルに従って、ＨＥＫ２９３細胞を、ｊｅｔＰＲＩＭＥ（商標）（Polyplus トランスフェクション）でトランスフェクトする。トランスフェクションの２４時間後、細胞を洗浄し、無血清培地中でインキュベートする。ｓｄＡｂを含有する馴化培地を、２４時間後に収集する。馴化培地中のｓｄＡｂ（Ｖ５）のレベルを、ＥＬＩＳＡによって、Ｖ５タグに対する抗体を使用して定量する。
【０１４１】
ウェスタンブロットによる検出。細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄し、１倍の Complete Protease Inhibitor Mixture（Roche Applied Science）を補充した完全ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１％（ｖ／ｖ）ノニデット  Ｐ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．１％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ）中に溶解させる。タンパク質を８％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、５％脱脂粉乳を含有するＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％  Ｔwｅｅｎ−２０）中で１時間ブロッキングした、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ、Perkin Elmer）膜（GE Healthcare）上にブロットする。膜を次いで、１％脱脂粉乳中で、ポリクローナルｈＰＣＳＫ９抗体（１：２５００）およびヒトＬＤＬＲ抗体（１：１０００、R&D Systems）と共に３時間インキュベートする。適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ複合二次抗体（１：１０，０００、Ｓｉｇｍａ）を、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓキット（GE Healthcare）を使用した高感度化学発光による検出に使用する。
【０１４２】
細胞表面ＬＤＬＲレベルの蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）定量化。ＨｕＨ７細胞を、３７℃で１〜４時間、種々のＰＣＳＫ９構築物と共に、添加化合物（複数可）の存在または非存在下でインキュベートし、次いで、０．５％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）および１ｇ／Ｌのグルコースを含有するカルシウム／マグネシウム不含ダルベッコ リン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）（溶液Ａ）で３回洗浄する。細胞を次いで、３７℃で５分間、５００μＬの１倍Ｖｅｒｓｅｎｅ（商標）溶液（Invitrogen）と共にインキュベートし、５ｍＬの溶液Ａ上に重ねる。細胞を次いで、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ヒトＬＤＬＲに対する１：１００のモノクローナルＬＤＬＲ抗体Ｃ７（ｍＡｂ−Ｃ７、Santa Cruz Biotechnology）を含有する１ｍＬの溶液Ａ中に４０分間再懸濁させる。細胞を５ｍＬの溶液Ａで１回洗浄し、遠心分離し、１：２５０のAlexa Fluor  ６４７ロバ抗マウス（Molecular Probes）を含有する１ｍＬのＰＢＳ中で２０分間再懸濁させる。細胞を洗浄し、３００μＬのＰＢＳ  ０．２％ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）中に再懸濁させる。生存細胞（ＰＩ陰性）を次いで、ＦＡＣＳによって、ＰＩおよびAlexa Fluor  ６４７の両方について、ＦＡＣＳ  ＢＤ  ＬＳＲ（BD Biosciences）を使用して分析する。
【０１４３】
ヒトＨｕｈ７細胞中のＬＤＬＲの免疫蛍光法。Ｈｕｈ７細胞を、２４ウェルの細胞培養プレート上に配置されるポリ−Ｌ−リジンコーティング（５０μｇ／ｍＬ）丸型顕微鏡カバースリップ（１．１２ｍｍ厚）（Fisherbrand  １２ＣＩＲ  ＃１）上に蒔く。ＤＭＥＭ完全培地中で播種を行い、６時間後、培地を、無血清インキュベーション混合物（３００μＬ／ウェル）と交換する。細胞を次いで、１８時間、０．５μｇ／ｍＬ（約６ｎＭ）のＰＣＳＫ９タンパク質（ＷＴまたは変異体、例えば、Ｄ３７４Ｙ）を欠いているまたはそれを含有する混合物と共に、単独でまたは５０μｇ／ｍＬ（約３μＭ）の精製ラマｓｄＡｂと共にのいずれかでインキュベートする。ＰＣＳＫ９を、精製タンパク質として、またはトランスフェクトされた細胞から収集された馴化培地として使用する。Ｈｕｈ７細胞への添加前に、ＰＣＳＫ９およびｓｄＡｂを含有する混合物を３７℃で２時間プレインキュベートする。１８時間のインキュベーションの終わりに、Ｈｕｈ７細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで３．７％パラホルムアルデヒドで１０分間固定する。細胞内染色のために、細胞を０．７％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で５分間透過処理する。ＰＢＳでのさらなる３回の洗浄後、透過処理済または透過処理なし細胞を１％ＢＳＡで３０分間ブロッキングし、続いて４℃で一晩、一次抗体（１％ＢＳＡ中、１：２００のヤギポリクローナル抗ｈＬＤＬＲ、R&D Systems）と共にインキュベートする。ＰＢＳでの最後の３回の洗浄後、抗原−抗体複合体を、Alexa fluor タグ二次抗体（緑色標識）での室温で１時間のインキュベーションによって明らかにし、ＤＡＰＩ（青色標識）（Molecular Probes，Invitrogen）を含有するProLong Gold Antifade Reagentに乗せる。免疫蛍光分析を共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ−７１０）により行う。
【０１４４】
ｓｄＡｂ内部移行を免疫蛍光法によってヒトＨｕｈ７細胞中で試験する。Ｈｕｈ７細胞を、１８時間、ｉ）ＰＣＳＫ９の異なる構築物を含有するもしくは含有しない馴化培地、ｉｉ）種々のＶ５タグｓｄＡｂを含有するもしくは含有しない馴化培地と共に、またはｉｉｉ）ＰＣＳＫ９馴化培地およびｓｄＡｂ（Ｖ５）馴化培地の両方の混合物と共に、インキュベートする。Ｖ５タグｓｄＡｂの存在を、免疫蛍光法分析（上述される）によって、透過処理なし（ｓｄＡｂの細胞表面局在）または透過処理済（ｓｄＡｂの細胞内局在）条件下で、ｍＡｂ−Ｖ５（Invitrogen）（４℃で一晩インキュベートされた１％ＢＳＡ中、１：２００）を使用して明らかにする。
【０１４５】
プルダウン実験。単独のまたは精製ｓｄＡｂ（６Ｈｉｓ）と混合した、ＰＣＳＫ９トランスフェクト細胞（例えば、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２３９細胞）から採取された培地を３７℃で２時間プレインキュベートし、続いて４℃で一晩、６．６μｇの抗Ｈｉｓ  Ａｂ−アガロースビーズを使用して免疫沈降させる。上清およびビーズから溶出された物質を、抗ｈＰＣＳＫ９  Ａｂと共にＰＡＧＥ−ＳＤＳ（６％）およびウェスタンブロット分析に供する。
【０１４６】
ＰＣＳＫ９活性についてのＤｉＩ−ＬＤＬ取り込み細胞ベースアッセイ。蛍光標識ＬＤＬの取り込みとして細胞ＬＤＬＲ活性を測定する、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９機能的活性をアッセイするための細胞培養方法を開発した。ＨｅｐＧ２細胞を、９６ウェル形式により２０，０００細胞／ウェルでＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中に蒔き、２日目に、培地を、１００ｎＭのスタチンを含むＲＰＭＩ＋１０％ＬＰＤＳに１６時間変更する。細胞を次いで、組み換えヒトＰＣＳＫ９タンパク質と共に、示されるレベルで２時間プレインキュベートし、続いて５μｇ／ｍＬのＤｉＩ−ＬＤＬを添加し、３７℃でさらに２時間インキュベートする。１０μＭのＨｏｅｃｈｓｔ−３３３４２中の４％ホルムアルデヒドを２０℃で２０分間添加することによって、取り込みを停止する。細胞を次いでＰＢＳで２回洗浄し、蛍光を励起／発光３６０／４６０ｎｍでＨｏｅｓｃｈｓｔ（ＤＮＡ含量）について測定し（ダイクロイックミラー＝４００ｎｍ）、それを読み取る。ＤＮＡ読み取り後、細胞を０．１Ｎ  ＮａＯＨ、０．１％ＳＤＳ中に溶解させ、１０分間振盪し、続いてＬＪＬ  Ａｎａｌｙｓｔ器具により、５３０／５８０ｎｍ（ダイクロイックミラー＝５６１ｎｍ）でＤｉＩ−ＬＤＬ励起／発光についての蛍光読み取りを行う。データ分析のために、ＤｉＩ−ＬＤＬ／Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２の蛍光比を使用して、ＤｉＩ−ＬＤＬ取り込み値を細胞数に対して正規化する。
【０１４７】
ＰＣＳＫ９のトランスフェクション、生合成分析、免疫沈降。トランスフェクションを３×１０５ＨＥＫ２９３細胞により、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Qiagen）および総計０．５μｇのｃＤＮＡを使用して行う。代替的に、５×１０５ＨｕＨ７または６×１０５ＨｅｐＧ２細胞を、リポフェクタミン（商標）２０００（Invitrogen）中、総計４μｇのｃＤＮＡでトランスフェクトする。トランスフェクションの２日後、ＨＥＫ２９３細胞を洗浄し、次いで２５０μＣｉ／ｍＬの［３５Ｓ］Ｍｅｔ／Ｃｙｓ（PerkinElmer Life Sciences）のいずれかと共に種々の回数インキュベートする。細胞を改変ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））、１％  ノニデット  Ｐ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、およびプロテアーゼ阻害剤混合物（Roche Applied Science）中に溶解させ、その後、溶解物および培地を免疫沈降のために調製する。使用される抗体は、抗Ｖ５  ｍＡｂ（Invitrogen、１：５００）、および専売のウサギ抗ＰＣＳＫ９  ３１−４５４（Ａ−０３）である。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって８％トリシンゲル上で分解し、オートラジオグラフィー解析する。これらの実験を少なくとも３回反復する。定量を、Ｓｔｏｒｍ  Ｉｍａｇｅｒ（商標）（Amersham Biosciences）により、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）バージョン５．２ソフトウェアを使用することによって行う。この高感度法とは、化合物が、小胞体におけるプロＰＣＳＫ９からＰＣＳＫ９への活性化、およびプロセグメントと複合体化された活性ＰＣＳＫ９の、細胞から培地中への分泌に影響を及ぼすかどうかを試験することである。
【０１４８】
ＰＣＳＫ９またはその自然突然変異体を内因的および安定して発現するように操作された細胞を、化合物（複数可）と共にインキュベートし、培地および細胞可溶化物中に存在する異なるＰＣＳＫ９型を、ウェスタンブロットによって、高感度ヒトＰＣＳＫ９抗体を使用して分析する。
【０１４９】
核酸、宿主細胞
本発明はまた、上述のＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸にも関する。核酸は、コドン最適化されてもよい。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。核酸配列は、当業者によって、開示されるアミノ酸配列に基づいて推定することができる。
【０１５０】
本発明はまた、上述の核酸を含む、ベクター（プラスミド）も包含する。ベクターは、例えば、該ポリペプチドの発現、または特定の生物における該ポリペプチドをコードする遺伝子の伝播に好適な、任意の種類のものであり得る。生物は、真核生物起源のものであっても、または原核生物起源のものであってもよい。ベクターの具体的な選定は、宿主生物に依存し、当業者に知られている。ある実施形態において、ベクターは、本発明のＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂをコードする配列を含む核酸に作動可能に連結される、転写調節配列またはプロモーターを含む。第１の核酸配列は、第１の核酸配列が第２の核酸配列との機能的関係へと配置されるとき、第２の核酸配列と「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結されるＤＮＡ配列は、リーディングフレームにおいて、隣接しており、必要な場合、２つのタンパク質コード領域を繋げるためのものである。しかしながら、例えば、エンハンサーは、一般に、プロモーターから数キロベース隔てられるときに機能し、イントロンの配列は、可変長のものであり得るので、いくつかのポリヌクレオチド要素は、作動可能に連結されるが、隣接していない場合がある。「転写調節配列」または「転写調節要素」は、開始および終結シグナル、エンハンサー、およびプロモーター等のＤＮＡ配列、それらが作動可能に連結されているタンパク質コード配列の転写を誘導または制御するスプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル等を指す、総称である。
【０１５１】
本発明の核酸配列を含む組み換え発現ベクターは、細胞、例えば、宿主細胞中に導入されてもよく、その細胞には、規定の組み換え発現ベクターからタンパク質コード領域を発現することが可能な生細胞が含まれてもよい。したがって、本発明はまた、上述される核酸および／またはベクターを含む、細胞（宿主細胞）にも関する。好適な宿主細胞は、例えば、ｓｄＡｂの発現、または該ｓｄＡｂをコードする遺伝子／核酸の伝播に好適な、真核生物または原核生物（細菌性）起源の任意の細胞であってもよい。真核性細胞株は、哺乳類のもの、酵母のもの、または無脊椎動物起源であってもよい。細胞株の具体的な選定は、当業者に知られている。細菌種の選定は、手元の課題に依存することになり、当業者に知られている。「宿主細胞」および「組み換え宿主細胞」という用語は、本明細書で交換可能に使用される。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫または潜在的な子孫も指す。突然変異または環境的影響のいずれかに起因して、後続の世代においてある特定の修飾が起こる場合があるため、かかる子孫は、実際には、親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用される用語の範囲内に依然として含まれる。ベクターは、従来の形質転換またはトランスフェクション技法を介して、細胞中に導入することができる。「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、微量注射、およびウイルス媒介性トランスフェクションを含む、外来核酸を宿主細胞中に導入するための技法を指す。宿主細胞を形質転換するまたはトランスフェクトするための好適な方法は、例えば、Sambrook et al.（上記）、Sambrook and Russell（上記）、および他の実験マニュアルに見出すことができる。核酸をインビボで哺乳類細胞中に導入するための方法もまた知られており、遺伝子療法のために本発明のベクターＤＮＡを対象に送達するのに使用され得る。
【０１５２】
上述の核酸またはベクターは、ＤＮＡの直接注射、受容体媒介性ＤＮＡ取り込み、ウイルス媒介性トランスフェクションまたは非ウイルス性トランスフェクション、および脂質ベースのトランスフェクション等の、当該技術分野で周知の方法を使用して、インビボで（単一ドメイン抗体の発現を誘導するために）細胞に送達されてもよく、それらの全てが遺伝子療法ベクターの使用を伴ってもよい。裸のＤＮＡをインビボで細胞中に導入するために、直接注射が使用されてきた。ＤＮＡをインビボで細胞中に注射するための送達装置（例えば、「遺伝子銃」）が使用されてもよい。かかる装置は、市販のもの（例えば、ＢｉｏＲａｄから）であってもよい。裸のＤＮＡはまた、ＤＮＡをポリリジン等の陽イオンに複合体化し、それを細胞表面受容体のためのリガンドにカップリングすることによって、細胞中に導入されてもよい。ＤＮＡ−リガンド複合体の受容体への結合は、受容体媒介性エンドサイトーシスによるＤＮＡの取り込みを促進し得る。エンドソームを破壊し、それによって物質を細胞質中へと放出するアデノウイルスカプシドに連結された、ＤＮＡ−リガンド複合体をまた使用して、細胞内リソソームによる複合体の分解を回避してもよい。
【０１５３】
欠陥レトロウイルスは、遺伝子療法ベクターとして使用するためによく特徴付けられている（概説についてはMiller, A.D. (1990) Blood 76:271を参照されたい）。組み換えレトロウイルスを産生するため、および細胞をインビトロまたはインビボでかかるウイルスに感染させるためのプロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14および他の標準的な実験マニュアルに見出すことができる。好適なレトロウイルスの例としては、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭが挙げられ、それらは当業者に周知である。好適なパッケージングウイルス系統の例としては、ｐｓｉＣｒｉｐ、ｐｓｉＣｒｅ、ｐｓｉ２、およびｐｓｉＡｍが挙げられる。レトロウイルスは、多様な遺伝子を、インビトロおよび／またはインビボで、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む多くの異なる細胞型に導入するために使用されてきた。
【０１５４】
遺伝子療法ベクターとして使用するために、アデノウイルスのゲノムは、それが本発明の核酸（例えば、ＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂをコードする核酸）をコードおよび発現するが、溶菌ウイルス性の生活環において複製するその能力の点では不活性化されるように、操作されてもよい。アデノウイルス株Ａｄ型５  ｄｌ３２４またはアデノウイルスの他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）に由来する好適なアデノウイルスベクターが、当業者に周知である。組み換えアデノウイルスは、それらが、遺伝子送達ビヒクルとして有効であるために分裂細胞を必要とせず、それらを使用して、気道上皮、内皮細胞、肝細胞、および筋肉細胞を含む、多種多様な細胞型を感染させることができるという点で有利である。
【０１５５】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子療法目的でのＤＮＡの送達のための遺伝子療法ベクターとして使用されてもよい。ＡＡＶは、効率的な複製および生産的な生活環のためのヘルパーウイルスウイルスとして、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス等の別のウイルスを必要とする、天然に生じる欠陥ウイルスである。ＡＡＶを使用して、ＤＮＡを非分裂細胞中に組み込んでもよい。レンチウイルス遺伝子療法ベクターもまた、本発明において使用するために適合され得る。
【０１５６】
本発明はまた、上述の宿主細胞を、ｓｄＡｂの発現を可能にする条件下で培養することと、（例えば、培地中で）細胞集団から発現されたｓｄＡｂを収集することとを含む、本発明のＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂを産生する方法にも関する。ある実施形態において、本方法は、収集されたｓｄＡｂを、１つ以上の濃縮／精製ステップに供することをさらに含む。
【０１５７】
医薬組成物
別の態様において、本発明は、薬剤的に許容される担体および／または賦形剤と一緒に製剤化された、本発明のＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂのうちの１つまたはその組み合わせを含有する、組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
【０１５８】
かかる組成物は、（例えば、２つ以上の異なる）ｓｄＡｂのうちの１つまたはその組み合わせを含んでもよい。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合する、および／または相補的活性を有する、ＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂの組み合わせを含むことができる。
【０１５９】
本発明の医薬組成物はまた、併用療法において、すなわち、他の薬剤と組み合わせて、投与することができる。例えば、併用療法は、少なくとも１つの他のコレステロール低減剤と組み合わせて、ＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂを含み得る。併用療法において使用され得る治療剤の例は、下により詳細に記述される。
【０１６０】
本明細書で使用されるとき、「薬剤的に許容される担体」または「薬剤的に許容される賦形剤」には、生理的に適合性である、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌薬剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。担体は、（例えば、注射または吸入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または上皮投与に好適であるべきである。投与経路に応じて、活性ｓｄＡｂは、化合物を、酸の作用および化合物を不活性化し得る他の天然の条件から保護する物質でコーティングされてもよい。
【０１６１】
本発明の医薬品は、１つ以上の薬剤的に許容される塩を含んでもよい。「薬剤的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物活性を保持し、いずれの所望されない毒性効果をも付与しない、塩を指す。（例えば、Berge, S. M. et al., 1977 J.Pharm.Sci. 66:1-19を参照されたい）。かかる塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等の非毒性の無機酸に由来するもの、ならびに脂肪族モノ−およびジ−カルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロシキアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸等の非毒性有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属に由来するもの、ならびにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等の非毒性有機アミンに由来するものが含まれる。
【０１６２】
本発明の医薬組成物はまた、薬剤的に許容される酸化防止剤を含んでもよい。薬剤的に許容される酸化防止剤の例としては、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等の水溶性酸化防止剤；アスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロシキトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等の油溶性酸化防止剤；およびクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等の金属キレート剤が挙げられる。
【０１６３】
本発明の医薬組成物において用いられ得る好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびそれらの好適な混合物、オリーブ油等の植物油、ならびにオレイン酸エチル等の注射用有機エステルが挙げられる。適正な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング材の使用によって、分散の場合には要求される粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【０１６４】
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤等のアジュバントも含有し得る。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順によって、ならびに、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の種々の抗菌剤および抗真菌剤の包含によっての両方で、確実にされ得る。糖類、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物中に含むこともまた望ましい場合がある。加えて、注射用剤形の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の吸収を遅延させる薬剤の包含によって、もたらされ得る。
【０１６５】
薬剤的に許容される担体または賦形剤には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。薬学的活性物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で知られている。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である限りを除いて、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。補足的な活性化合物もまた、化合物中に組み込むことができる。
【０１６６】
治療用組成物は、典型的に、製造および保管条件下で、滅菌性および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として、処方することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散の場合には必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことができる。
注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含むことによって、もたらすことができる。
【０１６７】
滅菌注射液は、必要な量の活性化合物（例えば、ＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂ）を、必要に応じて、上に列挙された成分のうちの１つまたはその組み合わせを有する適切な溶媒中に組み込み、続いて精密濾過滅菌することによって、調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒および上で列挙されたものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって、調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、活性成分に、その事前に滅菌濾過された溶液からの任意の追加的な所望の成分を添加した粉末をもたらす、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０１６８】
担体材料と組み合わせて、単一剤形をもたらすことができる活性成分（例えば、ＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂ）の量は、治療されている対象、および特定の投与様式に応じて変動するであろう。担体材料と組み合わせて、単一剤形をもたらすことができる活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらすような組成物の量であろう。一般に、１００パーセントのうち、この量は、薬剤的に許容される担体と組み合わせて、約０．０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、約０．１パーセント〜約７０パーセント、または約１パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲であろう。
【０１６９】
投薬レジメンは、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するために調整される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、複数の分割用量が経時的に投与されてもよく、またはその用量は、治療状況の緊急の要件によって指示されるように、比例的に低減されるか、もしくは増加されてもよい。投与の容易性および投薬量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形で処方することがとりわけ有利である。本明細書で使用される単位剤形は、対象を治療するための単位の投薬（unitary dosagess）として適した、物理的に別々の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体に関連して所望の治療効果をもたらすように算出された、既定量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物の固有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体における高感度の治療のためにかかる活性化合物を調合する技術分野の本質的な制限によって決定付けられ、またそれに直接依存する。
【０１７０】
ＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂの投与に関して、投薬量は、宿主の体重の、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、およびより通常では０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投薬量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重であるか、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例となる治療計画は、１週間当たり１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月に１回、３ヶ月に１回、または３〜６ヶ月に１回の投与を伴う。本発明のＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂについての投薬レジメンには、静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重が含まれ、このうち抗体は、次の投薬スケジュールのうちの１つを使用して与えられる：６回の投薬について４週間毎、次いで３ヶ月毎；３週間毎；３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、続いて３週間毎に１ｍｇ／ｋｇ体重。
【０１７１】
いくつかの方法において、異なる結合親和性および／または特異性を有する２つ以上のｓｄＡｂが同時に投与され、その場合、投与される各ｓｄＡｂの投薬量は、指示される範囲内に入る。ｓｄＡｂは、通常、複数の機会に投与される。単回の投薬の合間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３ヶ月毎、または毎年であり得る。間隔はまた、患者のｄＡｂの血中レベルを測定することによって指定される場合、不定期でもあり得る。いくつかの方法において、投薬量は、約１〜１０００μｇ／ｍＬのｓｄＡｂの血漿中濃度、およびいくつかの方法においては、約２５〜３００μｇ／ｍＬのｓｄＡｂの血漿中濃度を達成するように、調整される。
【０１７２】
代替的に、ＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂは、持続放出製剤として投与することができ、その場合、必要とされる投与の頻度はより低い。投薬量および頻度は、患者におけるｓｄＡｂの半減期に応じて変動する。投薬量および投与の頻度は、治療が予防的であるか、または治療的であるかに応じて変動し得る。予防的適用においては、比較的低い投薬量が、比較的低頻度の間隔で長い期間にわたって投与される。一部の患者は、残りの彼らの生涯にわたって治療を受け続ける。治療的適用においては、比較的短い間隔での比較的高い投薬量が、疾患の進行が低減されるかもしくは終止されるまで、または患者が疾患の症状の部分的なもしくは完全な寛解を示すまで、ときに必要とされる。それ以降、患者は、予防的投与計画を施与され得る。
【０１７３】
本発明の医薬組成物における活性成分の実際の投薬量レベルは、患者にとって毒性であることなく、特定の患者、組成物、および投与様式のために所望の治療反応（例えば、減少した血漿ＬＤＬ／コレステロールレベル）を達成するのに有効である活性成分の量を得るように、変化に富んでもよい。選択される投薬量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物、またはそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられている特定の化合物の排泄率、治療の持続期間、用いられる特定の組成物と併用される他の薬物、化合物、および／または物質を含む、多様な薬物動態学的要因、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態、ならびに医療分野において周知の同様の要因に依存するであろう。
【０１７４】
本発明のＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂの「治療的有効量」または「有効量」または「治療上有効な投薬量」は、対象におけるＬＤＬ−Ｃレベルの低下、少なくとも１つの疾患症状の重症度の減少（例えば、血漿ＬＤＬコレステロールの減少、またはＬＤＬコレステロール関連障害の症状の減少）、疾患症状のない期間の頻度および持続期間の増加、または対象における疾患の苦痛に起因する機能障害もしくは身体障害の予防をもたらすことができる。
【０１７５】
本発明の組成物は、当該技術分野で既知の多様な方法のうちの１つ以上を使用した、１つ以上の投与経路によって、投与することができる。当業者によって理解されるであろうが、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて変動するであろう。本発明のｓｄＡｂのための投与経路には、例えば、注射または吸入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、または他の非経口投与経路が含まれる。本明細書で使用される「非経口投与」という表現は、通常は注射により、限定なしに、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内（intrastemal）注射ならびに吸入を含む、経腸および局所投与以外の投与様式を意味する。代替的に、本発明のＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂは、局所、上皮、または粘膜投与経路等の非経口的でない（nonparenteral）経路によって、例えば、鼻腔内に、経口で、膣内に、直腸に、舌下で、または局所的に、投与することができる。
【０１７６】
活性化合物は、化合物を、埋め込み物、経皮パッチ、およびマイクロカプセル封入送達系を含む放出制御製剤等の、急速な放出から保護する担体と共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤の調製のための多くの方法は、特許権を有するか、または当業者に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。治療用組成物は、当該技術分野で既知の医療機器により投与することができる。例えば、一実施形態において、本発明の治療用組成物は、無針皮下注射機器により投与することができる。
【０１７７】
ある特定の実施形態において、本発明のｓｄＡｂは、適正なインビボの分布を確実にするように処方することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療用化合物が、ＢＢＢを横断することを確実にするために（所望される場合）、それらは、例えば、リポソーム中に処方することができる。リポソームは、特定の細胞、組織、または臓器中へと選択的に輸送され、そのようにして標的化された薬物送達を増強させる、１つ以上の部分を含み得る（例えば、V.V. Ranade, 1989 J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい）。ある実施形態において、本発明のｓｄＡｂは、肝臓に（すなわち、肝細胞に）送達されるように処方することができる。
【０１７８】
ｓｄＡｂの使用
ＰＣＳＫ９は、それがコレステロール生合成または取り込みにおいて特定の役割を有するようであるため、コレステロール恒常性に関連付けられている。コレステロール食給餌ラットの研究において、ＰＣＳＫ９が、コレステロール生合成に関与する他の遺伝子と同様の様式で下方制御されることが報告された（Maxwell et al., 2003 J Lipid Res. 44:2109-2119）。ＰＣＳＫ９発現は、スタチンによって、その薬物のコレステロール低下効果に起因する様式で上方制御されることが見出されている（Dubuc et al., 2004, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24:1454-1459）。ＰＣＳＫ９のアデノウイルス発現は、循環低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の時間依存的増加をもたらし（Benjannet et al., 2004 J. Biol. Chem. 279:48865-48875）、ＰＣＳＫ９遺伝子が欠失したマウスは、肝ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の増加したレベルを有し、ＬＤＬ−Ｃを血漿からより急速に取り除く（上記のRashid et al., 2005）。ＰＣＳＫ９で一過性にトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞からの培地は、トランスフェクトされていないＨｅｐＧ２細胞に移されるとき、細胞表面ＬＤＬＲの量およびＬＤＬ−Ｃの内部移行を低減することが見出されている（Cameron et al., 2006 Human Mol. Genet. 15:1551-1558）。さらに、ＨｅｐＧ２細胞の培地に添加された精製ＰＣＳＫ９は、細胞表面ＬＤＬＲの数を、用量依存的および時間依存的様式で低減した（上記のLagace et al., 2006）。
【０１７９】
遺伝子ＰＣＳＫ９におけるいくつかの突然変異は、若年性心血管不全につながり得る血漿中のＬＤＬ−Ｃ粒子の顕著な亢進によって特徴付けられる遺伝性代謝障害である、常染色体優性高コレステロール血症（ＡＤＨ）に関連付けられてきた（例えば、Abifadel et al, 2003 Nat. Genetics 34:154-156、Tirnms et al, 2004 Hum. Genetics 114:349-353、Leren, 2004 Clin.Genet. 65:419-422）。
【０１８０】
ＰＣＳＫ９の発現または上方制御は、ＬＤＬ−Ｃの増加した血漿中レベルに関連付けられ、ＰＣＳＫ９の発現の阻害または欠如は、低ＬＤＬ−Ｃ血漿中レベルに関連付けられ、ＰＣＳＫ９の配列変異に関連するＬＤＬ−Ｃのより低いレベルは、冠動脈心疾患からの保護作用を付与する（Cohen, et al, 2006 N. Engl. J. Med. 354:1264-1272）。
【０１８１】
本明細書に記載されるＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂは、インビトロおよびインビボでの診断的および治療的有用性を有する。例えば、これらの分子は、ＰＣＳＫ９活性／機能に関連する多様な障害を治療する、予防する、または診断するために、培養中の細胞に、例えば、インビトロもしくはエクスビボで、または必要性のある対象において、例えば、インビボで、投与することができる。
【０１８２】
ＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂは、脂質障害（例えば、高脂血症、高コレステロール血症、黄色腫症）を含む、亢進したコレステロールもしくは亢進したコレステロール（例えば、ＬＤＬコレステロール）に関連する病態を有するか、またはその危険性があるヒト患者を治療するのに特に好適である。
【０１８３】
ＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂはまた、動脈硬化性（ateriosclerotic）病態（例えば、アテローム性動脈硬化症）、冠動脈疾患、心血管疾患、脳卒中、虚血、末梢血管疾患を有するヒト患者を治療するために、ならびに例えば、１つ以上の危険因子（例えば、高血圧、喫煙、糖尿病、肥満、または高ホモシステイン血症）の存在に起因して、これらの障害の危険性がある患者のために予防的にも好適でもある。
【０１８４】
本明細書で使用されるとき、「ＬＤＬコレステロール関連疾患または障害」という用語は、血流中の高レベルの循環ＬＤＬコレステロールから部分的にもたらされる疾患または病態を指す。限定されることなく、ＬＤＬコレステロール関連疾患または障害には、高脂血症、高コレステロール血症、黄色腫症、および動脈硬化性病態（例えば、アテローム性動脈硬化症）等の心血管疾患、冠動脈疾患、心血管疾患、脳卒中、虚血、末梢血管疾患が含まれる。
【０１８５】
ＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂが別の薬剤と一緒に投与されるとき、それらの２つは、いずれの順序で順次に、または同時に（同じ組成物中または異なる組成物中で）投与することができる。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂは、疾患／病態を治療するのに有用な第２の薬剤（例えば、第２のコレステロール低減剤）での療法もまた受容している対象に投与される。コレステロール低減剤には、スタチン、胆汁酸捕捉剤、ナイアシン、フィブリン酸誘導体、および長鎖α、オメゴ（omego）−ジカルボン酸が含まれる。スタチンは、コレステロール生合成における主要な酵素であるＨＭＧＣｏＡを妨害することによって、コレステロール合成を阻害する。胆汁酸捕捉剤は、腸から肝臓への胆汁酸の再循環を中断する。本発明のものと組み合わせて投与され得る活性成分の例としては、（ａ）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（例えば、ロバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン、プラバススタチン、リバスタチン、アトルバスタチン、イタバスタチン、ピタバスタチン、セリバスタチン、および他のスタチンを含む、スタチン）、（ｂ）スタノールエステル、β−シトステロール、チクエシド（tiqueside）等のステロールグリコシド；およびエゼチミブ等のアゼチジノン等の、コレステロール吸収阻害剤、（ｃ）ＨＤＬを増加させ、ＬＤＬコレステロールを減少させるために現在臨床治験中である、コレステロールエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）の阻害剤（例えば、アナセトラピブまたはダルセトラピブ）、（ｄ）ニコチニルアルコール、ニコチンアミド、およびニコチン酸、またはそれらの塩等の、ナイアシンおよび関連する化合物、（ｅ）胆汁酸捕捉剤（コレスチラミン、コレスチポール（例えば、コレスチポール塩酸塩）、架橋結合デキストランのジアルキルアミノアルキル誘導体、Ｃｏｌｅｓｔｉｄ（登録商標）、ＬｏＣｈｏｌｅｓｔ（登録商標）、（ｆ）アバシミベおよびメリナミド等、ならびに選択的ＡＣＡＴ−１およびＡＣＡＴ−２阻害剤および二重阻害剤を含む、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、（ｇ）クロフィブラート、フェノフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラート、およびエトフィブラートを含む、ゲムフィブロジルおよびフェノフィブリン酸誘導体（フィブラート）等の、ＰＰＡＲｙ作動薬、（ｈ）ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）／ＡｐｏＢ分泌阻害剤、（ｉ）ビタミンＣおよびＥならびにβカロテン等の、抗酸化ビタミン、（ｋ）甲状腺ホルモン模倣体（thyromimetics）、（ｌ）ＬＤＬ受容体誘導剤、（ｍ）血小板凝集阻害剤、例えば、糖タンパク質Ｉｌｂ／ＩＩＩａフィブリノーゲン受容体拮抗薬およびアスピリン、（ｎ）ビタミンＢ１２（シアノコバラミンとしても知られる）、（ｏ）葉酸またはナトリウム塩およびメチルグルカミン塩等のその薬剤的に許容される塩もしくはエステル、（ｐ）阻害剤および作動薬の両方を含むＦＸＲおよびＬＸＲリガンド、（ｑ）ＡＢＣＡ１遺伝子発現を増強する薬剤、ならびに（ｒ）回腸胆汁酸輸送体等の、患者の脂質プロフィールを改善する他の化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８６】
併用療法レジメンは、相加的であり得、またはそれは、相乗的結果をもたらし得る（例えば、２つの薬剤の組み合わせた使用に対する予想を上回る、コレステロールの低減）。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂおよびコレステロール低減剤（例えば、スタチン、フィブラート、エゼチミブ、またはそれらの組み合わせ）による併用療法は、相乗的結果（例えば、コレステロールの相乗的低減）をもたらす。いくつかの対象において、これは、所望のコレステロールレベルを達成するためのコレステロール低減剤の投薬量の低減を可能にすることができる。ＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂは、別のコレステロール低減剤での療法に不耐性の対象に、または別のコレステロール低減剤での療法が不適当な結果をもたらした対象（例えば、スタチン療法で不十分なＬＤＬ−Ｃ低減を経験する対象）に、有用であり得る。
【０１８７】
本明細書に記載されるＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂは、亢進したコレステロール（例えば、ＬＤＬコレステロール）を有する対象（例えば、２００ｍｇ／ｄｌ以上の総血漿コレステロールレベルを有するヒト対象、１６０ｍｇ／ｄｌ以上のＬＤＬ−Ｃレベルを有するヒト対象）に投与することができる。
【０１８８】
ある実施形態において、本発明のＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂを使用して、ＰＣＳＫ９のレベルを検出することができる。これは、例えば、試料（例えば、血液、血清、血漿、または細胞試料等の生体試料）をＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂと、ＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂとＰＣＳＫ９との間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させることによって、達成することができる。その分子とＰＣＳＫ９との間で形成される任意の複合体が、試料中および対照試料中で検出され、比較される。例えば、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーアッセイ等の、当該技術分野で周知の標準的な検出方法を、本発明のＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂを使用して行うことができる。
【０１８９】
したがって、一態様において、本発明は、試料を本発明のＰＣＳＫ９結合ｓｄＡｂと、ｓｄＡｂとＰＣＳＫ９との間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させることを含む、試料中のＰＣＳＫ９（例えば、ｈＰＣＳＫ９）の存在を検出する、またはＰＣＳＫ９（例えば、ＰＣＳＫ９の活性型）の量を測定するための方法をさらに提供する。複合体の形成が次いで検出され、ここで対照試料と比較した試料の間の複合体形成における差異が、試料中のＰＣＳＫ９の存在を示す。
【０１９０】
また、本発明のｓｄＡｂ、または本発明の組成物および使用のための指示書を含むキットも、本発明の範囲内である。キットは、少なくとも１つの追加の試薬、または１つ以上の追加の本発明のｓｄＡｂをさらに含有することができる。キットは、典型的に、キットの内容物の意図される使用を示すラベルを含む。ラベルという用語には、キット上にもしくはキットと共に供給される、または他の方法でキットに付随する、あらゆる書面または記録物が含まれる。キットは、１つ以上の容器（複数可）、試薬（複数可）、投与デバイス（複数可）（例えば、シリンジ）をさらに含むことができる。
【０１９１】
本発明は十分に説明されてきたが、それは次の実施例および特許請求の範囲によってさらに例示され、これらは例証となるものであり、さらに限定するものとしては意図されない。当業者であれば、ほんの日常的な実験を使用して、本明細書に記載される具体的な手順に対する多数の均等物を認識するか、または確認することができるであろう。かかる均等物は、本発明および特許請求の範囲の範囲内にある。本明細書全体を通じて引用される、発行済み特許および公開済み特許出願を含む全ての参考文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【発明を実施するための形態】
【０１９２】
本発明は、次の非限定的な実施例によってさらに詳細に例示される。
【実施例１】
【０１９３】
組み換えＰＣＳＫ９タンパク質の産生および精製
ＰＣＳＫ９−（Ｈｉｓ）６を、３５ＬバキュロウイルスＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）細胞から大量に産生し、Ｎｉ２＋−親和性クロマトグラフィー、続いてｍｏｎｏ−Ｑ（商標）陰イオン交換クロマトグラフィー、および最後にゲル濾過クロマトグラフィーを含む、精製の複数のステップに供した。非還元条件下で、ＭＥＳ緩衝液ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中４〜１２％勾配で分離された、各調製物からの１８μｇの総タンパク質のクマシーブルー染色が、図１Ａに示される。分子サイズマーカーの位置（Ｍ）、精製前のＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）上清中の総タンパク質（Ｓ）、Ｎｉ２＋−親和性クロマトグラフィーによる精製（Ｎｉ）、ＳＯＵＲＣＥ（商標）１５Ｑ陰イオン交換（Ｑ）、およびＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ゲル濾過（ＧＦ）。Ｍ：マーク１２（２５μＬ）；Ｓ、上清（１０μＬ）；Ｎｉ、Ｎｉ−ＮＴＡプール（１８μｇ）；Ｑ、ＳＯＵＲＣＥ  Ｑプール（１８μｇ）；ＧＦ、バッチ７のゲル濾過プール（１８μｇ）；ＧＦＢ：バッチ７Ｂのゲル濾過プール（１８μｇ）；ＧＦＣＰ、バッチ７ＣＰのゲル濾過プール（１８μｇ）。
【実施例２】
【０１９４】
精製ＰＣＳＫ９タンパク質でのラマの免疫化
免疫ファージディスプレイライブラリからの単離は、高親和性ｓｄＡｂを生成するための最も容易な方式である。これは、ラマの抗原での免疫化；免疫応答の監視；ファージディスプレイライブラリの構築およびその後のファージディスプレイパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）を伴う。プロセグメント（アミノ酸３１〜１５２）および触媒サブユニット（アミノ酸１５３〜６９２）で形成された、ヒト精製ＰＣＳＫ９ヘテロ二量体複合体の数回の注射を使用して、ラマを免疫した。免疫化応答を監視し、ＰＣＳＫ９に対する反応性を使用して特徴付けた。図１Ｂおよび１Ｃは、ラマにおける免疫応答を示す。［Ｂ］において、４回および８回の免疫化後のラマによる免疫応答が明白であるが、［Ｃ］において、結果は、より低い濃度の抗原（ＰＣＳＫ９）を使用したとき、４回および８回の免疫化が実際に異なることを示唆し、つまり、８週間の免疫化後に非常に高い親和性Ａｂが存在し得ることを示す。ラマを、４回の免疫化にわたって総計１ｍｇの純ヒトＰＣＳＫ９で免疫した後、２×１０８リンパ球を、それぞれ、動物から収集し、ライブラリ構築のための出発物質として使用した。ｃＤＮＡをリンパ球から単離されたＲＮＡから合成した。
【実施例３】
【０１９５】
ＰＳＣＫ９に特異的なＶＨＨドメイン（ｓｄＡｂ）についてのスクリーニング
ＶＨ／ＶＨＨの両方に特異的なプライマー、およびラクダ科ＩｇＧｓのヒンジ領域を使用して、ＶＨならびにＶＨＨをコードするＤＮＡを増幅した。ＶＨＨ断片をＶＨから、それらのサイズに基づいて分離した。ＶＨＨ遺伝子を、ＶＨＨに特異的なプライマーを使用して増幅し、ファージミドベースのファージディスプレイベクター中にクローニングした。より具体的には、ＭＪ１（ＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＳＭＫＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＫＴＣＴＧＧＧＧＧＡ（配列番号１４４））、ＭＪ２（ＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡ（配列番号１４５））、およびＭＪ３（ＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴ（配列番号１４６））を含む、３つの異なるセンスプライマー（Ｊ’と呼ばれ、ＩｇＧの５’末端に対応する）、ならびにＣＨ２ドメインＤＮＡ配列、ＣＨ２（ＣＧＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧＴＴＧＡ（配列番号１４７））およびＣＨ２ｂ３（ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＧＴＣＡＴＣＣＡＣＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＡ（配列番号１４８））に対応する、２つのアンチセンスプライマーを使用して、従来のＩｇＧのＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２領域またはＶＨＨ−ヒンジ−ＣＨ２を増幅した。プライマー組み合わせＪ’−ＣＨ２から、増幅されたおよそ６００ｂｐのＶＨＨ産物を１％アガロースゲルから抽出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、プライマーＪ’−ＣＨ２ｂ３から増幅された産物をＰＣＲ精製した。第２のＰＣＲ反応において、２つのプライマーＭＪ７ＢＡＣＫ（ＣＡＴＧＴＧＴＡＧＡＣＴＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣ（配列番号１４９））およびＭＪ８ＦＯＲ（ＣＡＴＧＴＧＴＡＧＡＴＴＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧ（配列番号１５０））を使用して、Ｓｆｉｌ制限部位を導入し、最終ｓｄＡｂ断片を、組み合わせたＪ’−ＣＨ２およびＪ’−ＣＨ２ｂ３増幅産物から増幅した。最終ＰＣＲ産物をＳｆｉｌで消化し、ｐＭＥＤ１中に連結反応させ（A. Bell, et al. Cancer Letters 289:81-90）、大腸菌ＴＧ１（マサチューセッツ州、イプスウィッチ、New England Biolabs）中に、エレクトロポレーションによって形質転換した。多数の形質転換を行って、高度に多様なライブラリを作製した。ライブラリの実際のサイズを、ライブラリ構築に使用されたリンパ球の数を超える、２×１０８個の独立した形質転換体として測定した。ファージを「レスキュー」するために、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（ＮＥＢ）を付加して、ファージミドライブラリを指数関数的に成長させたが、これは、大腸菌細胞が、ファージミド構築物において欠損しているほとんどの必要とされる構成要素を提供することによって、ファージ粒子自動組織化のために、全ての必要なタンパク質を産生することを可能にすることを意味する。総計２．３×１０８個を超える候補ラマｓｄＡｂをスクリーニングし、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する５０個のｓｄＡｂを選択し、さらに特徴付けた。
【実施例４】
【０１９６】
ＰＣＳＫ９に特異的なｓｄＡｂの発現および精製
それらの選択に続いて、４７個のｓｄＡｂからのＤＮＡを発現ベクター中にサブクローニングし、組み換えタンパク質（ｒ−タンパク質）を精製した。哺乳類細胞のトランスフェクションは、マイクログラム量のｒ−タンパク質の産生のために小規模に幅広く使用される周知の技法であるが、つい最近、この技法が大規模で可能にされた。ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）の大規模なトランスフェクション、およびより低い程度のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へのトランスフェクションは、十分に確立された実現技術となってきており、適切な発現ベクター中へのｃＤＮＡクローニング後の数日以内にミリグラムからグラム量のｒ−タンパク質を産生することが可能となっている（Atkinson, A., Jack, G.W. (1973). Biochimica et Biophysica Acta, 308(7):41-52、Baldi, L., et al. (2007). Biotechnology Letters, 29(5):677-684、Wurm, F., Bernard, A. (1999). Current Opinion in Biotechnology, 10(2):156-159）。エプスタイン・バー・ウイルス複製起源（ｏｒｉＰ）を担持する発現ベクターの使用と組み合わせると、同様の非ｏｒｉＰベクターを上回る、ｒ−タンパク質収率の３倍の改善が一般に得られる（Berntzen, G. et al. (2005). Journal of Immunological Methods, 298(1-2):93-104、Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. (2002). Nucleic Acids Research, 30(2):E9）。無血清培地中の懸濁培養液に適合されたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞株を、高度に強力な発現プラスミドベクターと組み合わせて使用するとき、組み換えタンパク質の高レベルの発現が通常得られる。
【実施例５】
【０１９７】
ＰＣＳＫ９依存性ＬＤＬＲ分解を阻害するｓｄＡｂの選択および特徴付け
６×ＨｉｓタグｓｄＡｂを、約１ｍｇ／Ｌの量でＨＥＫ２９３細胞から過剰発現させ、精製した。いくつかの実験において、ｓｄＡｂ−Ｖ５トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞から収集された培地を、ｓｄＡｂの源として使用した。各ｓｄＡｂを、ヒト肝細胞株ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ７の細胞外環境に付加された１μｇ／ｍＬの野生型ＰＣＳＫ９の、ＬＤＬＲの増大した分解を阻害するその能力について試験した。Benjannet S. et al. J. Biol. Chem. 285:40965-40978, 2010に記載されるようにウェスタンブロット分析を使用して、ＨｅｐＧ２（図６および８）およびＨｕｈ７（図７、８、および１０Ｂ）細胞株において例として示されるように、いくつかの試験されたｓｄＡｂが、ＰＣＳＫ９依存性ＬＤＬＲ分解を阻害する。ＰＣＳＫ９機能の阻害は、ＬＤＬＲ発現の増加によって検出される。
【０１９８】
Ｈｕｈ７細胞に例として示されるように、選択されたｓｄＡｂの存在もまた、上記のBenjannet S. et al., 2010に記載されるようにフローサイトメトリー分析を使用することによって、細胞表面におけるＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９の活性を防止することが示された。これらのアッセイにおけるＰＣＳＫ９機能の阻害は、細胞表面におけるＬＤＬＲの増加した発現と相関した、増加した数の陽性細胞によって検出される。ＰＣＳＫ９−ＷＴタンパク質の精製型（図９、１０Ａ、および１０Ｃ）、またはそれぞれＷＴ（図１０Ｄ）もしくはＤ３７４Ｙ（図１１）ＰＣＳＫ９トランスフェクトＨｕｈ７細胞およびＨＥＫ２９３細胞に由来する培地のいずれかを使用して、分析を行った。
【０１９９】
図１０Ｄにおいて、天然ＨｕＨ７細胞を１８時間、０．７μｇ／ｍＬ（約９ｎＭ）のＰＣＳＫ９−ＷＴタンパク質（トランスフェクトされたＨｕｈ７細胞からの馴化培地として）の非存在下［Ｃｎｔ（−）］もしくは存在下で、単独で［Ｃｎｔ（＋）］または５０μｇ／ｍＬ（約３μＭ）の種々の精製ラマｓｄＡｂと混合して、インキュベートした。細胞への添加前に、混合物を３７℃で２時間プレインキュベートした。細胞表面におけるＬＤＬＲのレベルを、ＦＡＣＳによって、抗ヒトＬＤＬＲ抗体、およびＡｌｅｘａ６４７で標識された好適な二次抗体を使用して、測定した。細胞表面ＬＤＬＲは、Ｃｎｔ（−）と比べて報告される。ＰＣＳＫ９活性の阻害％は、［ｓｄＡｂ−Ｃｎｔ（＋）］／［Ｃｎｔ（−）−Ｃｎｔ（＋）］×１００として算出した。示されるように、４つのｓｄＡｂが、ＰＣＳＫ９−ＷＴの活性を５４〜８８％阻害することが可能であった。
【０２００】
天然ＨｕＨ７細胞をまた、１８時間、０．５μｇ／ｍＬ（約６ｎＭ）のＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙ（トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの馴化培地として）の非存在下［Ｃｎｔ（−）］もしくは存在下で、単独で［Ｃｎｔ（＋）］または５０μｇ／ｍＬ（約３μＭ）の種々の精製ラマｓｄＡｂと混合して、インキュベートした（図１１Ａ）。図１１Ｂにおいて、漸増濃度のＰＫＥ２、Ｐ１．４０、またはＰＫＦ８  ｓｄＡｂを使用した。これらのｓｄＡｂは、ＬＤＬＲ分解に対するＰＣＳＫ９の機能獲得型突然変異（Ｄ３７４Ｙ）の活性を用量依存的様式で阻害し、１０μｇ／ｍＬで最大６０〜７０％の阻害に到達している。
【０２０１】
３０ｎｇ（約６ｎＭ）のＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙを含有するＨＥＫ２９３細胞からの馴化培地を、単独でまたは３．５μｇ（約３μＭ）の精製ｓｄＡｂ（６Ｈｉｓ）と混合して、３７℃で２時間プレインキュベートし、続いて６．６μｇの抗Ｈｉｓ  Ａｂ−アガロースビーズを用いて４℃で一晩免疫沈降させた。上清およびビーズから溶出された物質を、抗ｈＰＣＳＫ９  Ａｂと共にＰＡＧＥ−ＳＤＳ（６％）およびウェスタンブロット分析に供した。プルダウン分析は、ＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙを上回るおよそ５００倍モル過剰のＰＫＦ８およびＰ１．４０  ｓｄＡｂが、ＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙタンパク質のおよそ９０％に結合可能であることを示す（図１２）。
【０２０２】
Ｈｕｈ７細胞を、０．５μｇ／ｍＬ（約６ｎＭ）のＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙタンパク質（トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの馴化培地として）の非存在下もしくは存在下でインキュベートし、続いて５０μｇ／ｍＬ（約３μＭ）の種々の精製ラマｓｄＡｂを添加した。細胞への添加前に、混合物を３７℃で２時間プレインキュベートした。透過処理済または透過処理なしＨｕＨ７細胞を免疫蛍光法によって分析した。細胞核をＤＡＰＩ（青色標識）で染色し、ＬＤＬＲを抗ＬＤＬＲ  Ａｂ（緑色標識）で染色した。図１３に示されるように、ＰＫＥ２、ＰＫＦ８、ＰＫＧ１、およびＰ１．４０は、透過処理なしＨｕＨ７細胞の細胞表面におけるＬＤＬＲのレベルを増加させた。透過処理済細胞のＬＤＬＲ免疫蛍光法は、ある特定のｓｄＡｂ（例えば、Ｐ２．５５およびＰ２．５７）がまた、ＬＤＬＲの細胞表面レベルの増加をほぼ全く伴わずに、ＬＤＬＲを細胞内で遮断し得ることを示す。
【０２０３】
ｓｄＡｂ内部移行分析もまた、免疫蛍光法によって行う。Ｈｕｈ７細胞を、１８時間、ｉ）対照Ｖ５−ＣＴＬ＋６Ｈｉｓベクターで、ｉｉ）Ｖ５タグを欠いているＰＣＳＫ９（Ｄ３７４ＹまたはＷＴ）で、またはｉｉｉ）Ｖ５タグｓｄＡｂで、のいずれかによりトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から収集された馴化培地と共に、インキュベートした。Ｈｕｈ７細胞をまた、１８時間、ｉｉ）およびｉｉｉ）の２時間プレインキュベートされた種々の混合物と共にインキュベートした。Ｖ５タグｓｄＡｂの内部移行に続いて、Ｖ５タグの免疫蛍光法分析を、透過処理なし（ｓｄＡｂの細胞表面局在化）または透過処理済（ｓｄＡｂの細胞内局在化）条件下で、ｍＡｂ−Ｖ５（Invitrogen）を使用して行う。
【０２０４】
ｓｄＡｂをまた、Poirier et al., J.Biol.Chem. 284:28856-28864, 2009に記載されるように、Ｄｉｌ−ＬＤＬ蛍光取り込みアッセイを使用して特徴付けた。方法は、ＰＣＳＫ９精製タンパク質の存在下または非存在下での、ヒト肝細胞由来ＨｕＨ７またはＨｅｐＧ２細胞株中への、ＬＤＬＲ内部移行を介したＤｉＩ−ＬＤＬ細胞組み込みの蛍光測定（細胞表面ＬＤＬＲ活性の測定）からなる。細胞を、９６ウェル形式で、１０μｇ／ｍＬのｓｄＡｂを用いてまたは用いずに２時間、次いでＤｉＩ−ＬＤＬを添加してさらに２時間、インキュベートした。ＤｉＩ−ＬＤＬの細胞取り込みを、蛍光プレートリーダーを使用して測定する。ＰＣＳＫ９≡ＬＤＬＲ機能的相互作用の阻害は、ＤｉＩ−ＬＤＬ蛍光の増加によって検出される。
【０２０５】
これらのｓｄＡｂがまたＰＣＳＫ９の機能獲得型突然変異体Ｄ３７４Ｙの機能を阻害し得るかどうかをさらに試験するために、細胞を、精製ＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙタンパク質と共にインキュベートし、抗体活性を、Ｄｉｌ−ＬＤＬ蛍光取り込みアッセイを使用することによって分析した。Ｐ１．４０  ｓｄＡｂもまた、ＨｅｐＧ２細胞においてＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙの活性を完全に遮断することが可能であった（図１４）。
【０２０６】
最後に、ｓｄＡｂをまた、細胞表面ＬＤＬＲに対するそれらの効果を測定するために、初代ヒト肝細胞上で試験する。
【０２０７】
ｓｄＡｂ  ＤＮＡを配列決定した。図２および３は、ＰＣＳＫ９依存性ＬＤＬＲ分解を阻害する１７個のｓｄＡｂのアミノ酸アライメントを示す。特に、ｓｄＡｂの下位群についてのアライメントが図３Ｄ（３〜５つの下位群）およびＥ（対）に提示され、それらの多くは、８０％以上（例えば、８０、８０．９５％、８１、８３、８３．４６％、８４、８５、８６、８７、８７．３０％、８８、９０、９１、９３、９４、９６、９８％）の配列同一性を示す。図４は、図２Ａおよび３Ａに図示されるｓｄＡｂの配列の系統樹を提供する。
【実施例６】
【０２０８】
ｓｄＡｂ≡ＰＣＳＫ９相互作用の特徴付け（Characterisation）およびｓｄＡｂ特性
Ｐ１．４０を含む、各ｓｄＡｂと相互作用するＰＣＳＫ９ドメインを、削除および突然変異分析を行うことによって決定する。これは、例えば、１）各ｓｄＡｂをコードするｃＤＮＡを、２）特異的ＰＣＳＫ９ドメイン（例えば、プロセグメント−Ｖ５、触媒サブユニット−Ｖ５、ＣＨＲＤ−Ｖ５等）、その細断片、またはＶ５タグ配列を担持するＰＣＳＫ９突然変異体の発現を可能にする構築物のそれらと、共発現させることによって、達成してもよい。ＰＣＳＫ９≡ｓｄＡｂ複合体を、Ｖ５配列に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ−Ｖ５）を担持する磁気ビーズによりプルダウンする。ｓｄＡｂを、ＰＣＳＫ９ドメイン、細断片または突然変異体とのその相互作用を通じてプルダウンする。選択されたｓｄＡｂの生化学的および生物物理学的特性を分析する。表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）は、ｓｄＡｂのＰＣＳＫ９への親和性を測定する。異なるＰＣＳＫ９ドメイン（例えば、プロセグメント、触媒およびＣＨＲＤドメイン）を抗原として使用して、ドメイン特異性を評価した。
【０２０９】
生物物理学的特性は、薬物候補の他の重要な特長である。ｓｄＡｂの特性を、１）凝集体の形成、および２）タンパク質分解への耐性について、評価する。凝集体の形成は、試料の分子ふるいクロマトグラフィーを行うことによって評価する。凝集体の分子量は、同じ条件下でのタンパク質の標準泳動に基づいて推定する。かかる質量と、それらの算出された分子量との比較は、それらが単量体、オリゴマー、または複数の形式の混合物として存在するかどうかを示すであろう。単量体ｓｄＡｂが、さらなる発達のために優先的に選定される。
【０２１０】
単離されたｓｄＡｂのタンパク質分解安定性は、ｓｄＡｂを、ヒト血漿の３つの主要なプロテアーゼである、カテプシンＢ、トロンビン、またはトリプシン様プロテアーゼで処理することによって、評価してもよい。
【実施例７】
【０２１１】
選択されたＰＣＳＫ９特異的ｓｄＡｂの可能性のある修飾
新たなタンパク質スクリーニングアプローチである、FAst Screening of Expression, biological-properties and Affinities（ＦＡＳＥＢＡ）が、最近確立された（米国仮特許出願第６１／２７２，１１９号、その優先権は国際公開第ＷＯ／２０１１／０２０１８３号において主張される）。この方法は、タンパク質アンカーを用いて、スクリーニング予定のタンパク質候補を担体タンパク質に付着させ、いかなるタンパク質精製も伴わずにタンパク質の複数の特性の推定を可能にし、非常に多数のタンパク質候補をスクリーニングできるようにする。この新たなアプローチを用いて、ｓｄＡｂの特性をさらに改善してもよい。
【０２１２】
ｓｄＡｂの親和性亢進：ｓｄＡｂ−抗体複合体の解析された構造は、ＣＤＲ３が抗原結合に優勢的に関与することを明らかにした。ｓｄＡｂ親和性の改善は、ＣＤＲ３および他のＣＤＲ（ＣＤＲ１およびＣＤＲ２）の両方を突然変異させることによって達成される。ＣＤＲ３については、各位置で、残基の約５０％が元々の残基であるように、突然変異を導入する。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２については、この割合は約２５％まで低減される。これらの領域の差次的処理は、抗原結合におけるＣＤＲの重要性に基づく。ＣＤＲ３において多数の残基を保存して、高率の結合要素を有するライブラリを生成する一方で、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２においていっそうの無作為性を導入して、ＣＤＲ３によって主に媒介される結合を増強させる。全てのＣＤＲを同時に操作するときの莫大な理論上のライブラリサイズを考慮すると、ＣＤＲ３およびＣＤＲ１／ＣＤＲ２を順次に操作することがよりよい戦略である。かかる突然変異ライブラリを、最初にＦＡＳＥＢＡ法を使用してスクリーニングして、不十分な特長を有する高率のｓｄＡｂを除外する。残存するｓｄＡｂを、タンパク質精製を伴わずに、それらの親和性について直接、ＳＰＲによって分析する。改善された親和性を有したものを精製し、それらの生物物理学的特性について評価する。
【０２１３】
ｓｄＡｂのヒト化：ヒト化を、親和性亢進におけるものと同様に行うが、異なるライブラリ構築戦略を用いる。十分な親和性を有するｓｄＡｂの配列を、ヒトＶＨのコンセンサス配列と比較し、ラクダ科ｓｄＡｂおよびヒトｓｄＡｂにおいて異なる主要な残基を選択する。ヒト化ライブラリを、ラクダ科残基をヒト残基で置換することによって構築し、ＦＡＳＥＢＡ法を使用してスクリーニングして、不十分な特性を有するｓｄＡｂを除去する。親和性スクリーニングは、ＣＤＲが同じままであるので、必要とされない。
【０２１４】
操作されたｓｄＡｂのＩｇＧ４−Ｆｃへの融合および融合タンパク質の産生：ｓｄＡｂのインビボの血清半減期は、それらをヒトＩｇＧ４−Ｆｃに融合することにより、ＩｇＧ４型を生成して、延長される。大量のかかる融合タンパク質（ＨＣＡｂ−Ｆｃ）を、一過性哺乳類発現系において産生する。ＨＣＡｂ−Ｆｃを、そのｓｄＡｂ対応物と、機能的親和性、生物物理学的特長、およびＰＣＳＫ９機能を阻害することにおける能力／有効性において比較する。
【実施例８】
【０２１５】
動物モデルにおけるＰＣＳＫ９誘導性ＬＤＬＲ分解の阻害の特徴付け（Characterisation）
薬物候補を次いで、ヒトＰＣＳＫ９を発現するマウスモデルにおいて使用して、インビボで血漿コレステロールレベルを低下させることにおけるそれらの能力を評価した。
【０２１６】
ＰＣＳＫ９  ｓｄＡｂ阻害剤を、ヒトＰＣＳＫ９を過剰発現するマウスにおいて試験した。独自のプロモーターからヒトＰＣＳＫ９（ＷＴ、Ｄ３７４Ｙ低またはＤ３７４Ｙ高）を発現する約１９０ｋｂのヒトゲノムＤＮＡを担持する、遺伝子導入系（Herbert, B., et al. (2010). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 30(7):1333-1339）を構築する。さらなる交雑により、Ｐｃｓｋ９−／−Ｌｄｌｒ＋／−バックグラウンド（Ｌｄｌｒヘテロ接合体）において、ヒトＰＣＳＫ９導入遺伝子を発現するマウス株を生成する。これは、マウスＰＣＳＫ９遺伝子の内因性発現を通じた干渉を排除し、それらのＬＤＬｃレベルを増加させる（図１５）。分析の均一性および再現性のために、複数回の戻し交雑によって、これらのモデルマウスを純Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドで得る。特異性についての対照として、Ｌｄｌｒ−／−バックグラウンドにおける導入遺伝子の効果を試験する。
【０２１７】
マウス注射：阻害剤（１０ｍｇ／ＫｇのｓｄＡｂおよび０．１〜１ｍｇ／Ｋｇのペプチド）を、ＷＴ、Ｐｃｓｋ９−／−、Ｌｄｌｒ−／−、およびＰｃｓｋ９−Ｔｇマウスに、６匹のマウス／遺伝子型において、静脈内注射する（図１５）。総コレステロール（ＴＣ）、ＬＤＬｃ、およびＰＣＳＫ９レベルを、最初の週の間、毎日測定し、次の２週間にわたって３日毎に測定する。血漿中に残存する複合体化されていないＰＣＳＫ９のレベルもまた、免疫沈降によって、以前に記載された抗体（Zaid, A., et al. (2008). Hepatology, 48(2):646-65）を使用して測定する。別の組の実験において、最も低いＬＤＬｃの時点（注射の４〜７日後）で６匹のマウスを屠殺し、それらのＦＰＬＣ血漿脂質プロフィール、ならびに肝臓ＬＤＬＲタンパク質を分析する。関連性のある場合、インビボ最適化の前段階として、１２５Ｉ標識ｓｄＡｂまたはペプチドの半減期を評価する。あらゆる顕性な毒性および／または罹患影響も注意深く監視する。Ｐｃｓｋ９−／−、Ｌｄｌｒ−／−マウスの対照は、観察される効果がＰＣＳＫ９依存性であることを検証可能にする。
【０２１８】
スタチン＋ｓｄＡｂの効果：スタチンがＬＤＬＲの発現を低下する一方でＰＣＳＫ９発現を増加させるため、アトルバスタチンと最良のｓｄＡｂとの組み合わせを評価し（Dubuc, G., et al. (2004). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 24(8):1454-1459、Lakoski, S.G., et al. (2009). The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 94(7):2537-2543）、スタチンがＰｃｓｋ９−／−マウスのＬＤＬｃをさらに減少させることが示された（Rashid, S., et al.(2005).Proc Natl Acad Sci USA102(15):5374-5379）。
【０２１９】
脂肪肝：Ｐｃｓｋ９−／−マウスは、高コレステロール飼料の後、脂肪肝に対して保護される（Zaid, A., et al. (2008). Hepatology, 48(2):646-65）。したがって、０．２％コレステロールを含有する飼料を２週間給餌されたマウスに、次いで、ｓｄＡｂまたは食塩水を注射し、ＬＤＬｃが最も低くなる最適な注射後時点で、それらの肝臓を、Ｏｉｌ−Ｒｅｄ−Ｏを使用して中性脂質の蓄積（またはその欠如）について分析する（Zaid, A., et al. (2008). Hepatology, 48(2):646-65）。
【０２２０】
本発明は、その具体的な実施形態として以上に記載されたが、添付の特許請求の範囲において規定される本発明の趣旨および性質から逸脱することなく、それを修正することができる。特許請求の範囲において、「含むこと」という単語は、「を含むが、これらに限定されない」という表現と実質的に同等の、制限のない用語として使用される。単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、対応する複数の参照物を含む。
【配列表フリーテキスト】
【０２２１】
配列番号１：  Xaaはいかなる天然アミノ酸でもよい。
配列番号２：  Xaaはいかなる天然アミノ酸でもよい。
配列番号３：  Xaaはいかなる天然アミノ酸でもよい。
配列番号４４：  Xaaはいかなる天然アミノ酸でもよい。
配列番号５８：  Xaaはいかなる天然アミノ酸でもよい。
配列番号７１：  Xaaはいかなる天然アミノ酸でもよい。
配列番号８８：  Xaaはいかなる天然アミノ酸でもよい。
【図１Ａ】
2015503905.tif 000003
【図１Ｂ】
2015503905.tif 000004
【図２Ａ】
2015503905.tif 000005
【図２Ｂ】
2015503905.tif 000006
【図３Ａ】
2015503905.tif 000007
【図３Ｂ】
2015503905.tif 000008
【図３Ｃ−１】
2015503905.tif 000009
【図３Ｃ−２】
2015503905.tif 000010
【図３Ｄ】
2015503905.tif 000011
【図３Ｅ−１】
2015503905.tif 000012
【図３Ｅ−２】
2015503905.tif 000013
【図３Ｅ−３】
2015503905.tif 000014
【図３Ｅ−４】
2015503905.tif 000015
【図３Ｅ−５】
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【図３Ｅ−６】
2015503905.tif 000017
【図３Ｅ−７】
2015503905.tif 000018
【図３Ｅ−８】
2015503905.tif 000019
【図３Ｅ−９】
2015503905.tif 000020
【図４】
2015503905.tif 000021
【図５】
2015503905.tif 000022
【図６Ａ】
2015503905.tif 000023
【図６Ｂ】
2015503905.tif 000024
【図７】
2015503905.tif 000025
【図８Ａ】
2015503905.tif 000026
【図８Ｂ】
2015503905.tif 000027
【図９】
2015503905.tif 000028
【図１０Ａ】
2015503905.tif 000029
【図１０Ｂ】
2015503905.tif 000030
【図１０Ｃ】
2015503905.tif 000031
【図１０Ｄ】
2015503905.tif 000032
【図１１Ａ】
2015503905.tif 000033
【図１１Ｂ】
2015503905.tif 000034
【図１２Ａ】
2015503905.tif 000035
【図１２Ｂ】
2015503905.tif 000036
【図１３】
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【図１４】
2015503905.tif 000038
【図１５】
2015503905.tif 000039
【配列表】
2015503905000001.app
【国際調査報告】
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2015503905.tif 000041
2015503905.tif 000042
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