(57)【要約】  本開示は、バイオマーカーとしてのヘパラン硫酸の使用による移植片拒絶の同定方法を提供する。ヘパラン硫酸阻害剤を被験体に投与してそれにより移植後の免疫媒介性傷害を処置かつ／若しくはその発症予防することを含んでなる、被験体における移植片拒絶の処置および／若しくは予防方法もまた含んでなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植片レシピエント被験体において血清ヘパラン硫酸を治療上有効なレベルに低下させる阻害剤および製薬学的に許容できる担体を含んでなる組成物。
【請求項２】
阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
セリンプロテアーゼ阻害剤がα１−アンチトリプシンである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
阻害剤がヘパラナーゼである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
血清ヘパラン硫酸を治療上有効なレベルに低下させる阻害剤を、移植された臓器、組織若しくは細胞のレシピエントであった被験体に投与することを含んでなる、上昇されたヘパラン硫酸を伴う傷害性状態の処置若しくは寛解方法。
【請求項６】
血清ヘパラン硫酸を治療上有効なレベルに低下させる阻害剤を、移植された臓器、組織若しくは細胞のレシピエントであった被験体に投与することを含んでなる、上昇されたヘパラン硫酸を伴う傷害性状態の予防方法。
【請求項７】
阻害剤がヘパラナーゼである、請求項５〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害剤である、請求項５〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
セリンプロテアーゼ阻害剤がα１−アンチトリプシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
移植片が、心、肺、腎、肝、膵、胸腺および腸よりなる群から選択される実質臓器である、請求項５〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
実質臓器移植片が心である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
実質臓器移植片が腎である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
移植片が、骨、腱、角膜、皮膚、心臓弁および静脈よりなる群から選択される組織である、請求項５〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
移植片が、骨髄、末梢血および臍帯血由来の造血幹細胞よりなる群から選択される細胞である、請求項５〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
移植される細胞が同種造血幹細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
傷害性状態が自然免疫傷害である、請求項５〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
自然免疫傷害が、炎症、移植片対宿主病若しくは急性移植片拒絶を含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
自然免疫傷害が移植片対宿主病である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
自然免疫傷害が急性心臓同種移植片拒絶である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
セルセプト（ｃｅｌｌｃｅｐｔ）、カルシニューリン阻害剤、プレドニゾンおよびシロリムスよりなる群から選択される免疫抑制剤が阻害剤とともに投与される、請求項５〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
破壊、非破壊／強度低減、および全身照射よりなる群から選択される前処置レジメンが阻害剤とともに投与される、請求項５〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
治療上有効なレベルの血清ヘパラン硫酸が約２μｇ／ｍＬないし約６μｇ／ｍＬの濃度にある、請求項５〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
治療上有効なレベルの血清ヘパラン硫酸が約６．５μｇ／ｍＬないし約１５μｇ／ｍＬの濃度にある、請求項５〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
被験体から生物学的サンプルを収集すること、およびヘパラン硫酸の血清濃度を測定することによる、移植された臓器、組織若しくは細胞のレシピエントであった被験体における上昇されたヘパラン硫酸を伴う傷害性状態の診断方法であって、ヘパラン硫酸の濃度がヘパラン硫酸媒介性免疫傷害の重症度と直接相関する、上記診断方法。
【請求項２５】
ヘパラン硫酸媒介性免疫傷害が移植片対宿主病であり、かつ、移植片対宿主病の重症度が約２μｇ／ｍＬないし約６μｇ／ｍＬの血清ヘパラン硫酸濃度により確認される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ヘパラン硫酸媒介性免疫傷害が移植片対宿主病であり、かつ、移植片対宿主病の重症度が約６．５μｇ／ｍＬないし約１５μｇ／ｍＬの血清ヘパラン硫酸濃度により確認される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ヘパラン硫酸媒介性免疫傷害が移植片対宿主病であり、かつ、移植片対宿主病の重症度が約１５．５μｇ／ｍＬないし約３０μｇ／ｍＬの血清ヘパラン硫酸濃度により確認される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
ヘパラン硫酸媒介性免疫傷害が急性心臓同種移植片拒絶であり、かつ、急性心臓同種移植片拒絶の重症度が約１０μｇ／ｍＬないし約４０μｇ／ｍＬの血清ヘパラン硫酸濃度により確認される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
生物学的サンプルが、同種造血幹細胞移植を含んでなる細胞移植７〜１００日後に被験体から収集される、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の交差引用
本出願は、２０１２年５月１日出願の米国仮出願第６１／６４１，０４３号明細書および２０１２年６月１８日出願の同第６１／６６０，９１４号明細書（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
連邦の資金提供の説明
本発明は、部分的に、ＮＩＨ助成第ＣＡ１３６９３４およびＣＡ０４７７４１号のもとで連邦政府からの資金を使用して生じられた。従って、連邦政府は本発明にある種の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
同種造血幹細胞移植（Ａｌｌｏ−ＨＳＣＴ）は、多くの種類の血液学的悪性病変および非悪性血液学的疾患に対する潜在的に治癒的な治療である。（非特許文献１）。しかしながら、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）はこの治療の有効性を制限する一般的かつ重篤な副作用のままである（非特許文献２；非特許文献３）。骨髄移植片のＴ細胞枯渇（ＴＣＤ）はＧＶＨＤの減少された率をもたらす（非特許文献４；非特許文献５）とは言え、それは、レシピエントにより高い率のウイルスおよび真菌感染症（非特許文献６）ならびに増大された腫瘍再発率（非特許文献７）を受けやすくする全身性免疫不全を伴う。事実、若干のレベルのＧＶＨＤは、これらの患者におけるより低い腫瘍再発率により示されるところのより確実な移植片対腫瘍（ＧＶＴ）応答を伴うことにより、レシピエントに有益でありうる。（非特許文献８）。
【０００４】
自然免疫は、それにより宿主が感染若しくは組織傷害を認識しかつそれに応答し得る迅速応答系である。該自然応答の迅速性は、天然に豊富でありかつ即時応答の用意をされている固定パターン認識受容体（ＰＲＲ）による。ＰＲＲの最良の特徴付けられているファミリー、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、元は、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）、細菌のジアシル化およびトリアシル化リポペプチド、細菌のフラジェリン、細菌およびウイルスの未メチル化ＣｐＧ含有ＤＮＡモチーフ、ならびにウイルスの一本および二本鎖ＲＮＡを包含する、外因性の「病原体関連分子パターン」すなわちＰＡＭＰに応答するそれらの能力について特徴付けられた。（非特許文献９）。ＰＡＭＰに加え、ＴＬＲは内因性の「損傷関連分子パターン」すなわちＤＡＭＰもまた認識する。例は、熱ショックタンパク質６０（Ｈｓｐ６０）、Ｈｓｐ７０、肺サーファクタントタンパク質Ａ、高移動度グループボックス１（ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ  １）（ＨＭＧＢ１）、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンのようなタンパク質、ならびにヒアルロナンおよびヘパラン硫酸のような多糖を包含する。（非特許文献１０；非特許文献１１）。
【０００５】
ＴＬＲが、感染症、癌および自己免疫のような多様な状態における効果的な適応免疫応答の形成において決定的に重要な役割を演じていることがますます明らかになっている。（非特許文献１２；非特許文献１３）。ＴＬＲ４およびＭｙＤ８８欠損が臓器移植の状況における急性拒絶に対し保護的であることもまた示されている。（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。同様に、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）でのＴＬＲ９の刺激はＧＶＨＤの致死性を顕著に促進し（非特許文献１７）、ＧＶＨＤの調節におけるＴＬＲ経路の役割を示唆している。ＧＶＨＤの発生は通常細菌若しくはウイルス感染のような明らかな外因性刺激の非存在下で起こるため、ＧＶＨＤの発症における内因性ＴＬＲアゴニストの役割が検討された。
【０００６】
細胞外マトリックスの偏在性成分ヘパラン硫酸（ＨＳ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞アロ反応性の強力な刺激物質であることが確認された。ＨＳの刺激効果は、樹状細胞（ＤＣ）の成熟および機能を促進することにより、ＤＣ中のしかしアロ反応性Ｔ細胞中ではない無傷のＴＬＲ４経路に依存した。Ａｌｌｏ−ＨＳＣＴのマウスモデルにおけるアロ反応性Ｔ細胞応答に対するＨＳの観察された影響のｉｎ  ｖｉｖｏ関連性を試験した場合に、ＨＳの血清レベルはＧＶＨＤの臨床症状の発生時に高度に上昇された。血清プロテアーゼインヒビターα１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）によるＨＳ遊離の抑制は、血清ＨＳのレベルを低下させ、ｉｎ  ｖｉｖｏでドナー由来Ｔ細胞の活性化を阻害し、そしてＧＶＨＤの有意の改善および生存をもたらした。逆に、ＨＳ模倣物を使用してＧＶＨＤの間のＨＳの血清レベルを増大させることは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのドナーＴ細胞増殖およびＧＶＨＤの重症度を増大させた。Ａｌｌｏ−ＨＳＣＴのヒトレシピエントにおいて、増大された血清ＨＳレベルはＧＶＨＤの重症度に直接相関した。
【０００７】
同様に、ＨＳは、マウス心移植（ｔｘ）モデルで同種免疫の内因性刺激物質としておよび免疫傷害の早期マーカーとしてのその役割について検討された。リンパ球組織浸潤は移植臓器の免疫媒介性傷害の特徴である。血管外漏出およびリンパ球の細胞間遊走は細胞外マトリックスの破綻を必要とする。
【０００８】
本明細書の研究は、ＨＳがアロ反応性Ｔ細胞応答を促進しかつＧＶＨＤの重症度を増大させ得ることを示し、かつ、ＨＳ遊離を阻害するための戦略がＧＶＨＤの予防において治療的可能性を有しうることを示唆する。加えて、本明細書の結果は、自然免疫経路の内因性活性化物質としてはたらくことによる、臓器移植の状況でのおよび同種免疫の促進における組織傷害のマーカーとしてのＨＳの役割を示す。血清若しくは尿ＨＳの上昇は急性細胞拒絶の早期バイオマーカーとしてはたらくかもしれない。細胞外マトリックス破綻を阻害することは、リンパ球組織浸潤を阻害しかつＴ細胞活性化を低下させるかもしれない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｏｐｅｌａｎ，Ｅ．Ａ．（２００６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３５４：１８１３−２６
【非特許文献２】Ｆｅｒｒａｒａ，Ｊ．Ｌ．ら（２００９）Ｌａｎｃｅｔ．３７３：１５５０−６１
【非特許文献３】Ｗｅｌｎｉａｋ，Ｌ．Ａ．，Ｂｌａｚａｒ，Ｂ．Ｒ．，＆  Ｍｕｒｐｈｙ，Ｗ．Ｊ．（２００７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１３９−１７０
【非特許文献４】Ｄｅｖｉｎｅ，Ｓ．Ｍ．ら  Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（２０１１）
【非特許文献５】Ｈａｌｅ，Ｇ．＆  Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｈ．（１９９４）Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １３：５９７−６１１
【非特許文献６】ｖａｎ  Ｂｕｒｉｋ，Ｊ．Ａ．ら（２００７）Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １３：１４８７−９８
【非特許文献７】Ｚｈａｎｇ，Ｐ．，Ｃｈｅｎ，Ｂ．Ｊ．＆  Ｃｈａｏ，Ｎ．Ｊ．（２０１１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．４９：４９−５５
【非特許文献８】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｃ．＆  Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．（２０１０）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３：３０１−１４
【非特許文献９】Ａｋｉｒａ  Ｓ．，Ｕｅｍａｔｓｕ，Ｓ．，＆  Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｏ．（２００６）Ｃｅｌｌ  １２４：７８３−８０１
【非特許文献１０】Ｂｅｇ，Ａ．Ａ．（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：５０９−１２
【非特許文献１１】Ｔｓａｎ，Ｍ．Ｆ．＆  Ｇａｏ，Ｂ．（２００４）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７６：５１４−１９
【非特許文献１２】Ｋａｗａｉ，Ｔ．＆  Ａｋｉｒａ，Ｓ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：３７３−８４
【非特許文献１３】Ｈｕａｎｇ，Ｘ，＆  Ｙａｎｇ，Ｙ．（２０１０）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ  １４：７８７−９６
【非特許文献１４】Ｃｈｅｎ，Ｌ．ら（２００６）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ６：２２８２−９１
【非特許文献１５】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｒ．ら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１：１５７１−７８
【非特許文献１６】Ｐａｌｍｅｒ，Ｓ．Ｍ．ら（２００３）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１６８：６２８−３２
【非特許文献１７】Ｔａｙｌｏｒ，Ｐ．Ａ．（２００８）Ｂｌｏｏｄ  １１２：３５０８−１６
【発明の概要】
【００１０】
［発明の要約］
本開示は、部分的に、ヘパラン硫酸（ＨＳ）が、樹状細胞（ＤＣ）成熟およびアロ反応性Ｔ細胞応答の増強につながる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＣ上のＴｏｌｌ様受容体４を活性化し得るという驚くべき発見に基づく。セリンプロテアーゼ阻害剤でＨＳを阻害することは、移植後のアロ反応性Ｔ細胞応答の低下および移植片対宿主病の重症度の低減につながる。
【００１１】
本開示の一局面は、本明細書に記述されるところのヘパラン硫酸阻害剤を被験体に投与してそれにより自然免疫傷害を処置することを含んでなる、よりなる、若しくはより本質的になる、被験体における臓器、組織若しくは細胞移植後の自然免疫傷害の処置若しくは寛解方法を提供する。別の局面において、本開示は、移植された臓器、組織若しくは細胞のレシピエントであった被験体に血清ヘパラン硫酸を治療上有効なレベルに低下させる阻害剤を投与することを含んでなる、よりなる、若しくはより本質的になる、上昇されたヘパラン硫酸を伴う傷害性状態の処置若しくは寛解方法を提供する。
【００１２】
本開示の別の局面は、本明細書に記述されるところのヘパラン硫酸阻害剤を被験体に投与してそれにより自然免疫傷害が発生することを予防することを含んでなる、よりなる、若しくはより本質的になる、被験体において臓器、組織若しくは細胞移植後の自然免疫傷害が発生することの予防方法を提供する。別の局面において、本開示は、移植された臓器、組織若しくは細胞のレシピエントであった被験体に、血清ヘパラン硫酸を治療上有効なレベルに低下させる阻害剤を投与することを含んでなる、よりなる、若しくはより本質的になる、上昇されたヘパラン硫酸を伴う傷害性状態の予防方法を提供する。
【００１３】
本開示のなお別の局面は、本明細書に記述されるところのヘパラン硫酸阻害剤を被験体に投与してそれにより移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置することを含んでなる、よりなる、若しくはより本質的になる、被験体におけるＧＶＨＤの処置若しくは予防方法を提供する。
【００１４】
本開示のなお別の局面は、本明細書に記述されるところのセリンプロテアーゼ阻害剤を被験体に投与することを含んでなる、よりなる、若しくはより本質的になる、被験体におけるＧＶＨＤの治療および／若しくはＧＶＨＤが発症することの予防方法を提供し、該阻害剤はヘパラン硫酸の血清レベルを低下させることが可能である。いくつかの態様において、セリンプロテアーゼ阻害剤はα１−アンチトリプシンである。
【００１５】
いくつかの態様において、自然免疫傷害はヘパラン硫酸の増大された血清濃度を特徴とする。なお他の態様において、自然免疫傷害は、炎症、移植片拒絶、ＧＶＨＤおよび急性心臓同種移植片拒絶よりなる群から選択される。ある態様において、自然免疫傷害はＧＶＨＤを含んでなる。
【００１６】
本開示はまた、移植片レシピエント被験体において血清ヘパラン硫酸を治療上有効なレベルに低下させる阻害剤および製薬学的に許容できる担体を含んでなる組成物も提供する。
【００１７】
本開示の別の局面は、被験体から生物学的サンプルを収集すること、およびヘパラン硫酸の血清濃度を測定することであって、ヘパラン硫酸の濃度はヘパラン硫酸媒介性免疫傷害の重症度と直接相関すること、による、移植された臓器、組織若しくは細胞のレシピエントであった被験体における上昇されたヘパラン硫酸を伴う傷害性状態の診断方法である。
【００１８】
本開示の別の局面は本明細書に開示かつ具体的に説明される全部を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
前述の局面および本発明の他の特徴は、付随する図面に関連して解釈される以下の記述で説明され、ここで、
【図１】数種の細胞外マトリックス成分がｔｏｌｌ様受容体を活性化することを示していることを示す図解である。
【図２】ＨＳが、ＤＣのＴＬＲ４およびＭｙＤ８８依存性の活性化によるアロ反応性Ｔ細胞応答の強力な刺激物質であることを示す。図２Ａは、ＴＬＲおよびＮＬＲアゴニストを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの精製されたＴ細胞（２×１０5／ウェル）と骨髄由来ＢＡＬＢ／ｃ  ＤＣ（２．５×１０4／ウェル）の間の同種Ｔ細胞増殖アッセイでアッセイしたことを示すグラフである。細胞は、単独（培地）、またはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（２μｇ／ｍＬ）、ヒアルロナン（ＨＡ）（１００μｇ／ｍＬ）、超音波処理されたＨＡ（ｓＨＡ）（１００μｇ／ｍＬ）、フィブロネクチン（ＦＮ）（１００μｇ／ｍＬ）、フィブリノーゲン（Ｆｂｎ）（１００μｇ／ｍＬ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）（１００μｇ／ｍＬ）、ＨＳＰ７０（５μｇ／ｍＬ）、ＨＭＧＢ１（１μｇ／ｍＬ）、Ｃ１２−ｉＥ−ＤＡＰ（１μｇ／ｍＬ）若しくはＬ１８−ＭＤＰ（１μｇ／ｍＬ）の存在下のいずれかで７２時間共培養し、そしてその後3Ｈ−チミジンを１６時間パルスした。増殖を3Ｈ取り込みにより測定し、そして結果をｃｐｍ±ＳＥＭとして表す。ベースラインアロ反応性は点線により示し；＊培地単独と比較してｐ＜０．０５。図２Ｂは、ＬＰＳ阻害剤ポリミキシンＢ（ＰＭＢ；１０μｇ／ｍＬ）の添加を伴う若しくは伴わずに（Ａ）でのとおり実施された増殖を示すグラフである。＊ｐ＜０．０５。図２Ｃは、ＷＴ（＋）若しくはＭｙＤ８８-/-（−）いずれかのＣ５７ＢＬ／６マウスからの精製された応答体（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）Ｔ細胞（Ｒ）を用いて（Ａ）でのとおり実施された増殖アッセイを、ＷＴ（＋）若しくはＭｙＤ８８-/-（−）いずれかのＢＡＬＢ／ｃマウスからのＤＣ刺激体（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）（Ｓ）と共培養したことを示すグラフであり；＊Ｓ＋／Ｒ＋群での培地単独と比較してｐ＜０．０５。図２Ｄおよび２Ｅは、刺激体としてＷＴ、ＴＬＲ４-/-およびＭｙＤ８８-/-  ＢＡＬＢ／ｃ  ＤＣならびに反応体として精製されたＣ５７ＢＬ／６  Ｔ細胞を使用して（Ａ）でのとおり実施された増殖アッセイにおける増殖およびＩＦＮ−γ産生を示すグラフである（＊ｐ＜０．０５）。結果は３回の独立した実験を代表する。
【図３】ＨＳが、ＴＬＲ４−ＭｙＤ８８経路を介してＤＣ成熟および炎症前サイトカインの産生を促進することを示す。図３Ａは、ＷＴ、ＴＬＲ４-/-若しくはＭｙＤ８８-/-  ＢＡＬＢ／ｃ  ＤＣ（２×１０5／ウェル）を、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＨＳ（１００μｇ／ｍＬ）若しくはＰａｍ３ＣＳＫ４（２μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激したかまたは刺激されない（培地）ままとし、そして共刺激分子ＣＤ４０およびＣＤ８０の表面発現についてＦＡＣＳ分析により測定したことを示すグラフである。図３Ｂおよび３Ｃは、ＷＴ、ＭｙＤ８８-/-およびＴＬＲ４-/-  ＢＡＬＢ／ｃの培養されたＤＣを、（Ａ）でのとおり培地単独、ＬＰＳ、ＨＳ若しくはＰａｍ３ＣＳＫ４と共培養し、そして培養上清をＥＬＩＳＡによりＩＬ−６（Ｂ）およびＩＬ−１２（Ｃ）について試験したことを示すグラフである。データは３回の独立した実験を代表し；＊培地単独と比較してｐ＜０．０５。図３Ｄおよび３Ｅは、ならびに培地、ＨＳ若しくはＬＰＳでの刺激後のＬＰＳ阻害剤ＰＭＢ（１０μｇ／ｍＬ）の添加を伴う若しくは伴わないＩＬ−６およびＩＬ−１２のＤＣ産生のアッセイを示すグラフであり；＊ｐ＜０．０５。
【図４】細胞内アダプター分子ＴＲＩＦが、ＤＣによるＩＬ−６発現のＨＳ誘導で小さな役割を有することを示すグラフである。ＨＳ（２５μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）若しくはＣｐＧ（１０μｇ／ｍＬ）と２４ｈｒインキュベートされたＷＴ、ＴＬＲ４-/-、ＴＲＩＦ-/-およびＭｙＤ８８-/-の培養されたＣ５７ＢＬ／６  ＤＣ（２×１０５／ウェル）によるＩＬ−６産生のＥＬＩＳＡ分析、＊ｐ＜０．０５。
【図５】ＴＬＲ４がＮＦ−κＢおよびＩＬ−８発現のＨＳに誘発される活性化に十分であることを示す。ＣＤ１４およびＭＤ２のみを安定に発現する（ＨＥＫ  ＭＤ２−ＣＤ１４）またはヒトＴＬＲ２（ＨＥＫ  ＴＬＲ２−ＭＤ２−ＣＤ１４）若しくはヒトＴＬＲ４（ＨＥＫ  ＴＬＲ４−ＭＤ２−ＣＤ１４）と共発現されるＨＥＫ細胞株を、トランスフェクション対照としてのチミジンキナーゼプロモーターの制御下にウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒ）を発現するプラスミドと一緒に、ＮＦ−κＢプロモーターの制御下にホタルルシフェラーゼ（Ｆ）をコードするプラスミドでトランスフェクトした。細胞株を、培地単独、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＨＳ（１００μｇ／ｍＬ）若しくはＰａｍ３ＣＳＫ４（２μｇ／ｍＬ）とともに６時間培養した。図５Ａは、Ｆ／Ｒの比を二重ルシフェラーゼレポーターアッセイにより測定して、溶解された細胞のＮＦ−κＢ活性化を測定したことを示すグラフであり、＊培地単独と比較してｐ＜０．０５。図５Ｂは、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−８産生について分析された結果上清を示すグラフである。図５Ｃは、ＨＥＫ  ＴＬＲ４−ＭＤ２−ＣＤ１４細胞中のＰＭＢを伴い若しくは伴わずＬＰＳおよびＨＳに応答したＩＬ−８産生を示すグラフであり、＊ｐ＞０．０５。図５Ｄは、ＨＥＫ  ＴＬＲ４−ＭＤ２−ＣＤ１４細胞中のヘパラナーゼ（Ｈｐアーゼ）あり若しくはなしを示すグラフであり、＊ｐ＜０．０５。実験は３重若しくは４重で実施した。結果は２ないし３回の独立した実験を代表する。
【図６】血清ＨＳがＧＶＨＤの発生時に高度に上昇されていることを示す。致死的に照射されたＢＡＬＢ／ｃレシピエントが、１×１０7  Ｂ１０．Ｄ２  ＴＣＤ−ＢＭのみ（Ａｌｌｏ−ＢＭ）、１×１０7  Ｂ１０．Ｄ２  ＴＣＤ−ＢＭおよび５×１０6  Ｂ１０．Ｄ２  ＬＣ（Ａｌｌｏ−ＢＭ＋ＬＣ）、若しくは１×１０7  ＢＡＬＢ／ｃ  ＴＣＤ−ＢＭおよび５×１０6  ＢＡＬＢ／ｃ  ＬＣ（Ｓｙｎ−ＢＭ＋ＬＣ）いずれかを受領した。図６Ａは、示される時間点でＥＬＩＳＡにより測定されたところの移植後のＨＳ濃度を示すグラフであり；ｎ＝時間点につき２〜５サンプル；＊示される時間点でＡｌｌｏ−ＢＭ＋ＬＣおよびＡｌｌｏ−ＢＭを比較してｐ＜０．０５。図６Ｂは、ＤＣ刺激に対するＨＳの半最大有効濃度（ＥＣ50）を示すグラフであり、三重の異なる濃度のＨＳとの２４ｈｒの培養後のＢＡＬＢ／ｃ  ＤＣ（２×１０5／ウェル）およびＩＬ−６産生をＥＬＩＳＡにより試験した。結果は３回の独立した実験を代表する。
【図７】Ａ１ＡＴがＡｌｌｏ−ＨＳＣＴ後の血清ＨＳレベルを低下させかつＧＶＨＤの転帰を改善することを示す。図７Ａは、移植１日前に開始するｉ．ｐ．注入により３日ごとにＡ１ＡＴ（２ｍｇ）若しくはＰＢＳで処置されたＡｌｌｏ−ＨＳＣＴ（Ｂ１０．Ｄ２→ＢＡＬＢ／ｃ；１×１０7  Ｂ１０．Ｄ２  ＴＣＤ−ＢＭおよび５×１０6  Ｂ１０．Ｄ２  ＬＣ）後の示される時間点での血清ＨＳ濃度を示すグラフであり；ｎ＝ＥＬＩＳＡアッセイにより測定されるところのデータ点あたり３；＊ｐ＜０．０５。図７Ｂは、生存を示すグラフであり、そして、図７Ｃは、Ａｌｌｏ−ＢＭのみ（ｎ＝５）またはＡ１ＡＴ（ｎ＝８）若しくはＰＢＳ（ｎ＝５）で処置されたＡｌｌｏ−ＢＭ＋ＬＣのＧＶＨＤ臨床スコアを示すグラフである。データは同一の結果を伴う２回の独立した実験の一方からである。図７Ｄは、ＧＶＨＤ病理学スコアを示すグラフであり、そして、図７Ｅは、ＰＢＳ若しくはＡ１ＡＴで処置されたＢ１０．Ｄ２（Ａｌｌｏ）ＴＣＤ−ＢＭ＋ＬＣのＢＡＬＢ／ｃレシピエントの代表的ヘマトキシリン・エオシン組織学である（ｎ＝群あたり６；バーは１００μＭに等しい；＊ｐ＝０．０５）。図７Ｆは、Ａ１ＡＴ（ｎ＝１０）若しくはＰＢＳ（ｎ＝９）を投与された、１×１０7  Ｃ３Ｈ．ＳＷ  ＴＣＤ−ＢＭ（Ａｌｌｏ−ＢＭ）および５×１０6  Ｃ３Ｈ．ＳＷ  ＬＣを致死的に照射されたＣ５７ＢＬ／６レシピエントの生存を示すグラフである。図７Ｇは、Ａ１ＡＴによるＧＶＨＤ生存の改善が宿主ＴＬＲ４発現に依存することを示すグラフである。Ｂ１０．Ｄ２ドナーからのＡｌｌｏ−ＢＭ＋ＬＣのＢＡＬＢ／ｃレシピエント（ｎ＝１１）、および移植１日前に開始する腹腔内注入により３日ごとにＡ１ＡＴ（ｎ＝８）若しくはＰＢＳ（ｎ＝１４）を投与されたＢ１０．Ｄ２ドナーからのＡｌｌｏ−ＢＭ＋ＬＣのＴＬＲ４-/-ＢＡＬＢ／ｃレシピエントの生存。
【図８】Ａ１ＡＴ処置がＡｌｌｏ−ＨＳＣＴレシピエントにおけるアロ反応性Ｔ細胞応答を低下させることを示す。Ｂ１０．Ｄ２  Ｔｈｙ１．１  Ａｌｌｏ−ＢＭ＋ＬＣのＢＡＬＢ／ｃ  Ｔｈｙ１．２レシピエントを、ＨＳＣＴ１日前に開始する３日ごとのＡ１ＡＴ（ＰＢＳ中２ｍｇ）若しくはＰＢＳ対照のｉ．ｐ．注入で処置した。図８Ａは、移植およびＢｒｄＵでパルスされた６日後のＢｒｄＵ取り込みおよびＩＦＮ−γ産生についてＦＡＣＳ分析された脾細胞を示すグラフである。陽性のＦＡＣＳゲートをアイソタイプ抗体染色により設定し、そしてプロットは５マウスを代表する。図８Ｂは、ＢｒｄＵについて陽性のＴｈｙ１．１．+Ｔ細胞の平均およびＳＥＭを示すグラフであり、＊ｐ＜０．０５。図８Ｃは、ＩＦＮ−γについて陽性のＴｈｙ１．１．+Ｔ細胞の平均およびＳＥＭを示すグラフであり、＊ｐ＜０．０５。
【図９】ＨＳ模倣物がＡｌｌｏ−ＨＳＣＴレシピエントで血清ＨＳレベルを増大させかつＣＤ８  Ｔ細胞増殖を増大させることを示す。Ｂ１０．Ｄ２  Ａｌｌｏ−ＢＭ＋ＬＣのＢＡＬＢ／ｃレシピエントを、Ａｌｌｏ−ＨＳＣＴ１日前に開始して週１回ＨＳ模倣物ＰＧ５４５（ＰＢＳ中２０ｍｇ／ｋｇ）若しくはＰＢＳ対照の皮下注入で処置した。図９Ａは、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定されるところの移植後の示される日の血清ＨＳレベルを示すグラフであり；ｎ＝それぞれ２〜４サンプル、＊ｐ＜０．０５。図９Ｂは、Ａｌｌｏ−ＨＳＣＴ６日後のＣＤ８  Ｔ細胞によるＢｒｄＵ取り込みを示すグラフである。平均およびＳＥＭをプロットし；ｎ＝群あたり３；＊ｐ＜０．０５。図９Ｃは、Ａｌｌｏ−ＢＭ＋ＬＣ＋ＰＢＳ（ｎ＝１０）と比較したＡｌｌｏ−ＢＭ＋ＬＣ＋ＰＧ５４５（ｎ＝１０）の生存分析を示すグラフである。
【図１０】同種ＨＳＣＴ後のレシピエントのＭＨＣクラスＩＩ発現細胞の持続性を示す。致死的に照射されたＣ５７ＢＬ／６レシピエントが、同種ＢＡＬＢ／ｃドナー若しくは同系Ｃ５７ＢＬ／６ドナーいずれかから１０7  ＴＣＤ−ＢＭ＋１０6  ＬＣを受領した。移植１４日後に、レシピエントマウスに、Ｌｙ５．１コンジェニックバックグラウンドであった４Ｃ  ＴＣＲ−ｔｇマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ＭＨＣクラスＩＩ分子Ｉ−Ａdに対する直接的アロ特異性）からの２×１０6  ＣＦＳＥ標識リンパ球を注入した。レシピエントの肝内リンパ球を３日後に収集しかつＦＡＣＳ分析した。図１０Ａは、実験の図解である。図１０Ｂは、４Ｃ  ＴＣＲ−ｔｇ  Ｔ細胞の検出およびＣＦＳＥ分析のためのＦＡＣＳゲートを示すグラフである。示される結果は各群の４マウスを代表する。
【図１１】ＨＳが、ＧＶＨＤを伴うヒトＡｌｌｏ−ＨＳＣＴレシピエントの血清サンプル中で上昇されていることを示す。図１１Ａは、Ａｌｌｏ−ＨＳＣＴレシピエントからの血清サンプルをＥＬＩＳＡによりＨＳについて試験したことを示すグラフである。患者を３群、すなわちＧＶＨＤなし（グレード０、ｎ＝８）、軽度ＧＶＨＤ（グレードＩ〜ＩＩ、ｎ＝１７）および中ないし重度ＧＶＨＤ（グレードＩＩＩ〜ＩＶ、ｎ＝１１）に分割し、＊ｐ＝０．００３、＊＊ｐ＝０．０００９、＊＊＊ｐ＝０．０１。図１１Ｂは、グレードＩ〜ＩＩおよびグレードＩＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤを伴う患者におけるＧＶＨＤの診断の時点に関する血清ＨＳレベルを示すグラフである。平均±ＳＥＭをプロットし、＊ｐ＝０．０１。
【図１２】心移植後の急性心拒絶を示す。図１２Ａは、血清ＨＳがマウスにおける急性心拒絶の発生時に増大されていることを示すグラフである。図１２Ｂは、血清ＨＳがヒトにおける急性心拒絶の発生時に増大されていることを示すグラフである。図１２Ｃは、ＨＳがリンパ球（ＬＣ）浸潤の部位で分解されていることを示す組織学画像である。
【図１３】培地単独、ＬＰＳ、ＨＳ若しくはＰａｍ３ＣＳＫ４と共培養されかつＥＬＩＳＡアッセイにより測定されるところのＴＮＦ−αについて試験された、ＷＴ、ＭｙＤ８８-/-およびＴＬＲ４-/-  ＢＡＬＢ／ｃの培養されたＤＣを示すグラフである。
【００２０】
［発明の詳細な記述］
本開示の原理の理解を促進する目的上、言及が今や、好ましい態様に対しなされることができ、そして、特殊な用語をそれを記述するのに使用することができる。にもかかわらず、本開示の範囲の制限をそれにより意図していないことが理解されることができ、本明細書に具体的に説明されるような本開示の変更およびさらなる改変は、本開示が関する技術分野の当業者に通常思い浮かぶであろうとおり企図している。
【００２１】
冠詞「ａ」および「ａｎ」（ある）は、該冠詞の文法上の目的語の１つ若しくは１つ以上（すなわち最低１つ）を指すのに本明細書で使用する。例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ある要素）」は、最低１個の要素を意味しており、かつ、１個以上の要素を包含し得る。
【００２２】
別の方法で定義されない限り、本明細書で使用される全部の技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者により普遍的に理解されると同一の意味するところを有する。
【００２３】
本明細書で使用されるところの「被験体」という用語はヒトおよびヒト以外の動物を包含することを意図している。例示的ヒト被験体は、障害例えば本明細書に記述される障害を有するヒト患者、若しくは正常被験体を包含する。「ヒト以外の動物」という用語は、全部の脊椎動物、例えば哺乳動物以外（ニワトリ、両生類、は虫類のような）、ならびにヒト以外の霊長類、家畜化されかつ／若しくは農業で有用な動物（ヒツジ、イヌ、ネコ、乳牛、ブタなどのような）およびげっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのような）のような哺乳動物を包含する。
【００２４】
本開示の一局面は、移植片レシピエント被験体において血清ヘパラン硫酸を治療上有効なレベルに低下させる阻害剤および製薬学的に許容できる担体を含んでなる組成物を提供する。
【００２５】
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる」は、十分な医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比にふさわしい、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題若しくは合併症を伴わず被験体（例えばヒト）の組織と接触する使用に適する化合物、物質、組成物および／若しくは剤形に関する。各担体、賦形剤などは、製剤の他成分と適合性であるという意味でもまた「許容でき」なければならない。
【００２６】
本開示の別の局面は、被験体にヘパラン硫酸阻害剤を投与してそれにより自然免疫傷害を処置することを含んでなる、よりなる、若しくはより本質的になる、被験体における臓器、組織若しくは細胞移植後の自然免疫傷害の処置若しくは寛解方法を提供する。本明細書で特許請求される方法は、移植片レシピエント被験体における血清ヘパラン硫酸を治療上治療上有効なレベルに低下させる阻害剤および製薬学的に許容できる担体を含んでなる組成物の使用を包含する。
【００２７】
本開示のなお別の局面は、被験体にヘパラン硫酸阻害剤を投与してそれにより自然免疫傷害を処置することを含んでなる、よりなる、若しくはより本質的になる、被験体における臓器、組織若しくは細胞移植後の自然免疫傷害の予防方法を提供する。本明細書で特許請求される方法は、移植片レシピエント被験体における血清ヘパラン硫酸を治療上有効なレベルに低下させる阻害剤および製薬学的に許容できる担体を含んでなる組成物の使用を包含する。
【００２８】
本明細書で使用されるところの「有効量」は、所望の効果を導き出すのに有効な化合物若しくは組成物の投薬量を指す。本明細書で使用されるところの本用語は、癌細胞の増殖を低下させることのような、動物、哺乳動物若しくはヒトで所望のｉｎ  ｖｉｖｏ効果をもたらすことにおいて有効な量もまた指すことができる。ある態様において、有効量は血清ヘパラン硫酸の濃度により評価される。一態様において、血清ヘパラン硫酸の濃度は、自然免疫傷害がＧＶＨＤである場合、自然免疫傷害の重症度に直接相関する。
【００２９】
本明細書で使用されるところの、障害を有する被験体を「処置する」若しくは「処置すること」という用語は、障害の少なくとも１症状が治癒（ｃｕｒｅ）、治癒（ｈｅａｌ）、軽減、救済、変化、治療、寛解若しくは改善されるような、ある投与計画を被験体に投与すること、例えばヘパラン硫酸阻害剤に基づく治療薬の投与を指す。処置することは、障害若しくは障害の症状を軽減、救済、変化、治療、寛解、改善する若しくはそれに影響するのに有効な量を投与することを含んでなる。処置は、障害の症状の悪化（ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ）すなわち悪化（ｗｏｒｓｅｎｉｎｇ）を阻害しうる。
【００３０】
本明細書で使用されるところの「上昇されたヘパラン硫酸」という用語は、被験体のベースライン濃度の若しくはそれより上の血清ヘパラン硫酸濃度を有する被験体を指す。「上昇されたヘパラン硫酸」の一例は、限定されるものでないが、約６．５μｇ／ｍＬないし約１５μｇ／ｍＬ、若しくは約６．５μｇ／ｍＬないし約１４μｇ／ｍＬ、若しくは約６．５μｇ／ｍＬないし約１３μｇ／ｍＬ、若しくは約６．５μｇ／ｍＬないし約１２μｇ／ｍＬ、若しくは約６．５μｇ／ｍＬないし約１１μｇ／ｍＬ、若しくは約６．５μｇ／ｍＬないし約１２μｇ／ｍＬ、若しくは約６．５μｇ／ｍＬないし約１０μｇ／ｍＬ、若しくは約６．５μｇ／ｍＬないし約９μｇ／ｍＬ、若しくは約７μｇ／ｍＬないし約１４μｇ／ｍＬ、若しくは約７．５μｇ／ｍＬないし約１４μｇ／ｍＬ、若しくは約７．５μｇ／ｍＬないし約１３μｇ／ｍＬ、若しくは約８μｇ／ｍＬないし約１３μｇ／ｍＬ、若しくは約８．５μｇ／ｍＬないし約１４μｇ／ｍＬ、若しくは約８μｇ／ｍＬないし約１４μｇ／ｍＬ、若しくは約９μｇ／ｍＬないし約１３μｇ／ｍＬ、若しくは約９μｇ／ｍＬないし約１４μｇ／ｍＬ、若しくは約９μｇ／ｍＬないし約１５μｇ／ｍＬ、若しくは約１０μｇ／ｍＬないし約１５μｇ／ｍＬ、若しくは約１１μｇ／ｍＬないし約１５μｇ／ｍＬ、若しくは約１２μｇ／ｍＬないし約１５μｇ／ｍＬ、若しくは約１３μｇ／ｍＬないし約１５μｇ／ｍＬ、若しくは約１４μｇ／ｍＬないし約１５μｇ／ｍＬ（グレードＩ〜ＩＩのＧＶＨＤすなわち軽度ＧＶＨＤを示す）の血清濃度、または約１５．５μｇ／ｍＬないし約３０μｇ／ｍＬ、若しくは約１６μｇ／ｍＬないし約２９μｇ／ｍＬ、若しくは約１６μｇ／ｍＬないし約２７μｇ／ｍＬ、若しくは約１６μｇ／ｍＬないし約２５μｇ／ｍＬ、若しくは約１７μｇ／ｍＬないし約３０μｇ／ｍＬ、若しくは約１８μｇ／ｍＬないし約３０μｇ／ｍＬ、若しくは約１８μｇ／ｍＬないし約２７μｇ／ｍＬ、若しくは約１８μｇ／ｍＬないし約２５μｇ／ｍＬ、若しくは約１８μｇ／ｍＬないし約２３μｇ／ｍＬ、若しくは約１８μｇ／ｍＬないし約２０μｇ／ｍＬ、若しくは約２０μｇ／ｍＬないし約２３μｇ／ｍＬ、若しくは約２３μｇ／ｍＬないし約２５μｇ／ｍＬ、若しくは約２５μｇ／ｍＬないし約３０μｇ／ｍＬ、または３０μｇ／ｍＬ以上（グレードＩＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤを包含する疾患すなわち重度ＧＶＨＤを示す）の血清ヘパラン硫酸濃度を挙げることができる。「上昇されたヘパラン硫酸」の別の例は、限定されるものでないが、約１０μｇ／ｍＬないし約４０μｇ／ｍＬ、若しくは約２０μｇ／ｍＬないし約４０μｇ／ｍＬ、若しくは約３０μｇ／ｍＬないし約４０μｇ／ｍＬ、または１０μｇ／ｍＬ以上、若しくは２０μｇ／ｍＬ以上、若しくは３０μｇ／ｍＬ、若しくは４０μｇ／ｍＬ以上（被験体における急性心臓同種移植片拒絶の発生を示す）の血清濃度を挙げることができる。
【００３１】
本明細書で使用されるところの「予防」という用語は、全般に、上昇されたレベルの血清ヘパラン硫酸により引き起こされる免疫媒介性傷害の確立の予防を意味している。予防は一次、二次若しくは三次であることができる。例えば、一次予防は疾患の確立の予防を指す。二次予防は、上昇されたレベルの血清ヘパラン濃度により引き起こされる免疫媒介性傷害の発症のリスクが高いがしかし該疾患を未だ発症していない被験体における介入を指す。これら被験体はいくつかの生理学的症状を表していても若しくはいなくてもよい。三次予防は、上昇されたレベルの血清ヘパラン濃度により引き起こされる免疫媒介性傷害の悪化を予防すること、および該被験者により経験される症状を低下させることを指す。予防の一例は、限定されるものでないが、限定されるものでないが同種造血幹細胞移植を挙げることができる細胞移植後のグレード０のＧＶＨＤすなわち疾患の証拠なしを指す、２μｇ／ｍＬ未満、若しくは約２μｇ／ｍＬないし約６μｇ／ｍＬ、若しくは約２μｇ／ｍＬないし約５．５μｇ／ｍＬ、若しくは約２μｇ／ｍＬないし約５μｇ／ｍＬ、若しくは約２μｇ／ｍＬないし約４．５μｇ／ｍＬ、若しくは約２μｇ／ｍＬないし約４μｇ／ｍＬ、若しくは約３μｇ／ｍＬないし約６μｇ／ｍＬ、若しくは約３μｇ／ｍＬないし約６μｇ／ｍＬ、若しくは約３μｇ／ｍＬないし約５．５μｇ／ｍＬ、若しくは約３μｇ／ｍＬないし約５μｇ／ｍＬ、若しくは約３μｇ／ｍＬないし約４．５μｇ／ｍＬ、若しくは約３μｇ／ｍＬないし約４μｇ／ｍＬ、若しくは約３．５μｇ／ｍＬないし約６μｇ／ｍＬ、若しくは約３．５μｇ／ｍＬないし約６μｇ／ｍＬ、若しくは約３．５μｇ／ｍＬないし約５．５μｇ／ｍＬ、若しくは約３．５μｇ／ｍＬないし約５μｇ／ｍＬ、若しくは約３．５μｇ／ｍＬないし約４．５μｇ／ｍＬ、若しくは約３．５μｇ／ｍＬないし約４μｇ／ｍＬ、若しくは約３μｇ／ｍＬ、若しくは約３．５μｇ／ｍＬ、若しくは約４μｇ／ｍＬ、若しくは約４．５μｇ／ｍＬの血清ヘパラン硫酸濃度を維持する被験体を挙げることができる。予防の別の例は、限定されるものでないが心臓同種移植片移植後の１０μｇ／ｍＬ未満の血清ヘパラン硫酸濃度を維持する被験体を挙げることができる。
【００３２】
一態様において、ヘパラン硫酸阻害剤はセリンプロテアーゼ阻害剤である。セリンプロテアーゼ阻害剤の例は、限定されるものでないが、フッ化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニル塩酸塩、α１−アンチトリプシン、α２−アンチトリプシン、アンチトロンビン、Ｃ１−インヒビター、カモスタット、マスピン、メトキシアラキドニルフルオロホスホネート、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２、フッ化フェニルメチルスルホニル、プロテインＣインヒビター、およびプロテインｚ関連阻害剤を挙げることができる。ある態様において、セリンプロテアーゼ阻害剤はα１−アンチトリプシンである。
【００３３】
一態様において、ヘパラン硫酸阻害剤はヘパラン硫酸を分解する酵素である。こうした酵素の一例は、限定されるものでないがヘパラナーゼを挙げることができる。
【００３４】
一態様において、臓器移植は固形臓器移植である。固形臓器移植の例は、限定されるものでないが心、腎、肝、肺、膵および腸を挙げることができる。ある態様において、固形臓器移植は心および腎を包含する。ある態様において、固形臓器移植は心を包含する。別の態様において、臓器移植は組織移植を包含する。組織移植の例は、限定されるものでないが骨、腱、角膜、皮膚、心臓弁および静脈を挙げることができる。なお別の態様において、臓器移植は細胞移植である。細胞移植の例は、限定されるものでないが幹細胞、骨髄、腹部および膵島細胞を挙げることができる。ある態様において、幹細胞は同種造血幹細胞である。
【００３５】
本明細書で使用されるところの「投与」若しくは「投与すること」という用語は、所望の効果を達成するためにいずれかの適切な経路により化合物（１種若しくは複数）を提供することすなわち接触させることを指す。ある態様において、「投与」という用語はヘパラン硫酸阻害剤のような化合物の送達もまた包含しうる。これらの化合物は、限定されるものでないが経口、舌下、非経口（例えば静脈内、皮下、皮内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、くも膜下腔内、病変内若しくは頭蓋内注入）、経皮、局所、頬側、直腸、膣、鼻、眼、吸入を介して、および埋込物を挙げることができる多数の方法で被験体に投与しうる。
【００３６】
本明細書に記述される製薬学的組成物を調合する場合、臨床家は、処置されている被験体の状態により保証されるところの好ましい投薬量を利用しうる。
【００３７】
使用されるヘパラン硫酸阻害剤および／またはいずれかの付加的な免疫抑制剤若しくは前処置レジメンの実際の投薬量は、被験体の要件および処置されている状態の重症度に依存して異なることができる。特定の状況について適正な投薬量の決定は当業者の熟練内にある。一般に、処置は化合物の最適用量未満であるより小さい投薬量で開始する。その後、投薬量を、該環境下の最適効果が達せられるまで少量ずつ増加する。
【００３８】
いくつかの態様において、ヘパラン硫酸阻害剤を１種若しくはそれ以上の付加的な免疫抑制剤とともに投与する場合、該付加的な免疫抑制剤（１種若しくは複数）は標準用量で投与する。免疫抑制剤の例は、限定されるものでないがコルチコステロイド、カルシニューリン阻害剤、増殖抑制剤およびｍ−ＴＯＲ阻害剤を挙げることができる。免疫抑制剤として使用されるコルチコステロイドの例は、限定されるものでないがプレドニゾロンおよびヒドロコルチゾンを挙げることができる。免疫抑制剤として使用されるカルシニューリン阻害剤の例は、限定されるものでないがシクロスポリンおよびタクロリムスを挙げることができる。免疫抑制剤として使用される増殖抑制剤の例は、限定されるものでないがアザチオプリンおよびミコフェノール酸を挙げることができる。ｍＴＯＲ阻害剤の例は、限定されるものでないがシロリムスおよびエベロリムスを挙げることができる。ある態様において、免疫抑制剤は、セルセプ（ｃｅｌｌｃｅｐ）、カルシニューリン阻害剤、プレドニゾンおよびシロリムスを含んでなる。
【００３９】
他の態様において、ヘパラン硫酸阻害剤を１種若しくはそれ以上の付加的な前処置レジメンとともに投与する場合、該付加的な前処置レジメン（１種若しくは複数）は標準用量で投与する。前処置レジメンの例は、限定されるものでないが化学療法、モノクローナル抗体療法、全身照射、破壊、および非破壊／強度低減を挙げることができる。一態様において、前処置レジメンは破壊、非破壊／強度低減、若しくは全身照射を含んでなる。
【００４０】
経験および知識に従って、実践する医師は、処置が進行する際に、個々の被験体の必要性に従って処置の成分（ヘパラン硫酸阻害剤および免疫抑制剤の組成物ならびに／若しくは前処置レジメン）の投与のための各プロトコルを変更し得る。主治医は、処置が投与される投薬量で有効であるかどうかの判断において、該被験者の全般的な健康状態ならびに疾患関連症状の救済のようなより決定的な徴候を考慮することができる。疼痛のような疾患関連症状の救済および全体的な状態の改善もまた使用して、処置の有効性を判断するのに役立て得る。
【００４１】
一態様において、被験体から生物学的サンプルを収集すること、およびヘパラン硫酸の血清濃度を測定することによる、移植された臓器、組織若しくは細胞のレシピエントであった被験体における上昇されたヘパラン硫酸を伴う傷害性状態の診断方法、ここでヘパラン硫酸の濃度はヘパラン硫酸媒介性免疫傷害の重症度と直接相関する。代替の態様において、診断方法は、治療上有効な量のヘパリン硫酸を包含する阻害剤を投与することをさらに含んでなる。付加的な一態様は、ヘパラン硫酸媒介性免疫傷害が移植片対宿主病であり、および移植片対宿主病の重症度が血清ヘパラン硫酸濃度により確認される一診断方法を含んでなる。２μｇ／ｍＬ未満、若しくは約２μｇ／ｍＬないし約６μｇ／ｍＬ、若しくは約２μｇ／ｍＬないし約５．５μｇ／ｍＬ、若しくは約２μｇ／ｍＬないし約５μｇ／ｍＬ、若しくは約２μｇ／ｍＬないし約４．５μｇ／ｍＬ、若しくは約２μｇ／ｍＬないし約４μｇ／ｍＬ、若しくは約３μｇ／ｍＬないし約６μｇ／ｍＬ、若しくは約３μｇ／ｍＬないし約６μｇ／ｍＬ、若しくは約３μｇ／ｍＬないし約５．５μｇ／ｍＬ、若しくは約３μｇ／ｍＬないし約５μｇ／ｍＬ、若しくは約３μｇ／ｍＬないし約４．５μｇ／ｍＬ、若しくは約３μｇ／ｍＬないし約４μｇ／ｍＬ、若しくは約３．５μｇ／ｍＬないし約６μｇ／ｍＬ、若しくは約３．５μｇ／ｍＬないし約６μｇ／ｍＬ、若しくは約３．５μｇ／ｍＬないし約５．５μｇ／ｍＬ、若しくは約３．５μｇ／ｍＬないし約５μｇ／ｍＬ、若しくは約３．５μｇ／ｍＬないし約４．５μｇ／ｍＬ、若しくは約３．５μｇ／ｍＬないし約４μｇ／ｍＬ、若しくは約３μｇ／ｍＬ、若しくは約３．５μｇ／ｍＬ、若しくは約４μｇ／ｍＬ、若しくは約４．５μｇ／ｍＬの血清ヘパラン硫酸濃度は、グレード０のＧＶＨＤすなわち疾患の証拠なしを示す。約６．５μｇ／ｍＬないし約１５μｇ／ｍ、若しくは約６．５μｇ／ｍＬないし約１４μｇ／ｍＬ、若しくは約６．５μｇ／ｍＬないし約１３μｇ／ｍＬ、若しくは約６．５μｇ／ｍＬないし約１２μｇ／ｍＬ、若しくは約６．５μｇ／ｍＬないし約１１μｇ／ｍＬ、若しくは約６．５μｇ／ｍＬないし約１２μｇ／ｍＬ、若しくは約６．５μｇ／ｍＬないし約１０μｇ／ｍＬ、若しくは約６．５μｇ／ｍＬないし約９μｇ／ｍＬ、若しくは約７μｇ／ｍＬないし約１４μｇ／ｍＬ、若しくは約７．５μｇ／ｍＬないし約１４μｇ／ｍＬ、若しくは約７．５μｇ／ｍＬないし約１３μｇ／ｍＬ、若しくは約８μｇ／ｍＬないし約１３μｇ／ｍＬ、若しくは約８．５μｇ／ｍＬないし約１４μｇ／ｍＬ、若しくは約８μｇ／ｍＬないし約１４μｇ／ｍＬ、若しくは約９μｇ／ｍＬないし約１３μｇ／ｍＬ、若しくは約９μｇ／ｍＬないし約１４μｇ／ｍＬ、若しくは約９μｇ／ｍＬないし約１５μｇ／ｍＬ、若しくは約１０μｇ／ｍＬないし約１５μｇ／ｍＬ、若しくは約１１μｇ／ｍＬないし約１５μｇ／ｍＬ、若しくは約１２μｇ／ｍＬないし約１５μｇ／ｍＬ、若しくは約１３μｇ／ｍＬないし約１５μｇ／ｍＬ、若しくは約１４μｇ／ｍＬないし約１５μｇ／ｍＬの血清ヘパラン硫酸濃度はグレードＩ〜ＩＩのＧＶＨＤすなわち軽度ＧＶＨＤを示す。約１５．５μｇ／ｍＬないし約３０μｇ／ｍＬ、若しくは約１６μｇ／ｍＬないし約２９μｇ／ｍＬ、若しくは約１６μｇ／ｍＬないし約２７μｇ／ｍＬ、若しくは約１６μｇ／ｍＬないし約２５μｇ／ｍＬ、若しくは約１７μｇ／ｍＬないし約３０μｇ／ｍＬ、若しくは約１８μｇ／ｍＬないし約３０μｇ／ｍＬ、若しくは約１８μｇ／ｍＬないし約２７μｇ／ｍＬ、若しくは約１８μｇ／ｍＬないし約２５μｇ／ｍＬ、若しくは約１８μｇ／ｍＬないし約２３μｇ／ｍＬ、若しくは約１８μｇ／ｍＬないし約２０μｇ／ｍＬ、若しくは約２０μｇ／ｍＬないし約２３μｇ／ｍＬ、若しくは約２３μｇ／ｍＬないし約２５μｇ／ｍＬ、若しくは約２５μｇ／ｍＬないし約３０μｇ／ｍＬ、または３０μｇ／ｍＬ以上の血清ヘパラン硫酸濃度はグレードＩＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤすなわち重度ＧＶＨＤを示す。ヘパラン硫酸媒介性免疫傷害が急性心臓同種移植片拒絶であるなお他の態様において、約１０μｇ／ｍＬないし４０μｇ／ｍＬ、若しくは約２０μｇ／ｍＬないし約４０μｇ／ｍＬ、若しくは約３０μｇ／ｍＬないし約４０μｇ／ｍＬ、または１０μｇ／ｍＬ以上、若しくは２０μｇ／ｍＬ以上、若しくは３０μｇ／ｍＬ以上、若しくは４０μｇ／ｍＬ以上の血清ヘパラン硫酸濃度は急性心臓同種移植片拒絶の発生を示す。
【００４２】
一態様において、生物学的サンプルを被験体から収集しかつアッセイしてヘパラン硫酸の血清濃度を測定する。生物学的サンプルの例は限定されるものでないが血液および血漿を挙げることができる。
【００４３】
一態様において、生物学的サンプルは同種造血幹細胞移植７〜１００日後に被験体から収集する。別の態様において、生物学的サンプルは同種造血幹細胞移植１４〜１００日後に被験体から収集する。ある態様において、生物学的サンプルは同種造血幹細胞移植３０〜１００日後に被験体から収集する。ある態様において、生物学的サンプルは造血幹細胞移植６０〜１００日後に被験体から収集する。
【００４４】
以下の実施例は具体的説明としてかつ制限としてでなく提供される。
【実施例】
【００４５】
実施例１：ＨＳは樹状細胞上のＴＬＲ４を刺激することによりアロ反応性Ｔ細胞増殖を促進する
同種免疫応答への大きな寄与を伴う内因性自然免疫活性化物質を同定するため、アロ反応性Ｔ細胞応答の促進においてＴＬＲ経路を活性化することに関与している多様なＤＡＭＰを検査した。（図１）。
【００４６】
マウス：ＢＡＬＢ／ｃマウスはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（米国メリーランド州フレデリック）から購入した。Ｂ１０．Ｄ２およびＴＬＲ４-/-  ＢＡＬＢ／ｃマウスはＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（米国メーン州バーハーバー）からそれぞれ購入した。ＭｙＤ８８-/-マウスはＳｈｉｚｕｏ  Ａｋｉｒａ博士（大阪・大阪大学）により恵与され、そしてＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドで１０世代以上の間戻し交配した。ドナーマウスは８と１２の間の週齢の雄性であり、また、レシピエントマウスは１２と１６の間の週齢の雄性（約２２〜２６グラム）であった。マウスの使用を伴う全部の実験手順は、デューク大学の動物保護および使用委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により承認されたプロトコルに従って行った。
【００４７】
試薬および細胞株：以下の試薬を使用した。すなわち、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏ１１１：Ｂ４からのＬＰＳ（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州キャンベル）、エンドトキシンフリーＰａｍ３ＣＳＫ４（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、米国サンディエゴ）、ウシ腎ヘパラン硫酸（生化学工業株式会社、東京）、ヒアルロナンＳｅｌｅｃｔ  ＨＡ  １５０Ｋ（Ｓｉｇｍａ、米国セントルイス；Ｓ−０２０１）、フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ；Ｆ−２００６）、フィブリノーゲン（Ｈｙｐｈｅｎ  ＢｉｏＭｅｄ、仏国ヌーヴィル  シュル  オワーズ）、ＨＭＧＢ１（Ａｂｎｏｖａ、台湾台北市）、Ｈｓｐ７０（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ、米国ミシガン州アナーバー）、Ｃ１２  ＩＥ−ＤＡＰおよびＬ１８−ＭＤＰ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、プロタミン硫酸（Ｓｉｇｍａ）ならびにマウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州ミネアポリス）。Ｓｔａｖｒｏｓ  Ｇａｒａｎｔｚｉｏｔｉｓ博士（ＮＩＥＨＳ、米国リサーチトライアングルパーク）からの贈品である超音波処理されたヒアルロナンは以前に記述されたとおり調製した。（Ｇａｒａｎｔｚｉｏｔｉｓ、Ｓ．ら（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７：１１３０９−１７）。
【００４８】
ヒトＣＤ１４、ＭＤ２およびＴＬＲ４若しくはＴＬＲ２を共発現するＨＥＫ２９３細胞
株はＭｉｃｈａｅｌ  Ｆｅｓｓｌｅｒ博士（ＮＩＥＨＳ、米国ノースカロライナ州リサーチトライアングルパーク）からの恵与品であった。いくつかのアッセイは、ポリミキシンＢ（Ｓｉｇｍａ、米国セントルイス）の存在下、若しくはフラボバクテリウム  ヘパリヌム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）からのへパリナーゼＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ、米国セントルイス）とのプレインキュベーション後に実施した。１単位のヘパリナーゼを２５μＬの培地中で５０μｇのＨＳ若しくは５０ｎｇのＬＰＳとともに３２℃で６ｈｒインキュベートした。
【００４９】
Ｔ細胞増殖アッセイ：ＤＣは以前に記述されたとおり骨髄から生成させた。（Ｙａｎｇ，Ｙ．（２００４）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５０８−１５）。ＣＤ３+  Ｔ細胞をＣＤ３陰性選択磁性ビーズキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カールズバッド）を使用してＢ６マウスから単離した。増殖アッセイは以前に記述されたとおり実施した。（Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｔ．Ｖ．ら（２００８）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ８５：２４７−５５）。
【００５０】
統計学的解析：結果は平均±ＳＥＭとして表した。群間の比較は、連続変数についてＫｒｕｓｋａｌ−ＷａｌｌｉｓおよびＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定、カテゴリー変数についてＦｉｓｈｅｒの正確性検定、ならびに生存データについてログランク検定により実施した。全部の統計学的解析はＰｒｉｓｍ  ｖ５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、米国ラホヤ）を使用して実施した。差違はｐ≦０．０５で有意であると報告した。
【００５１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの精製されたＴ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスからの骨髄由来ＤＣで刺激し、そしてそれらの増殖を3Ｈ−チミジンの取り込みにより測定した。試験されたＤＡＭＰは、タンパク質すなわちフィブロネクチン（ＦＮ）、フィブリノーゲン（Ｆｂｎ）、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）および高移動度タンパク質Ｂ１（ＨＭＧＢ１）；ならびにグルコサミノグリカンすなわちヘパラン硫酸（ＨＳ）およびヒアルロナン（ＨＡ）を包含した。比較のため、２種の十分に記述されているＰＡＭＰ、すなわちそれぞれＴＬＲ４ホモ二量体およびＴＬＲ１／２ヘテロ二量体のリガンドであるリポ多糖（ＬＰＳ）および合成トリパルミトイル化リポペプチド（Ｐａｍ３ＣＳＫ４）を試験した。ヌクレオチド結合ドメインとして、ロイシン豊富な反復配列を含有する受容体（ＮＬＲ）は自然免疫受容体の別のファミリーであり、ＮＬＲ１（Ｃ１２−ｉＥ−ＤＡＰ）およびＮＬＲ２（Ｌ１８−ＭＤＰ）のリガンドをさらに試験した。ＤＭＡＰの間で、ＨＳおよびＨＳＰ７０のみが培地単独と比較してアロ反応性Ｔ細胞増殖を有意に増大させた（図２Ａ）。ＨＳによる刺激はＬＰＳおよびＰａｍ３ＣＳＫ４のようなＰＡＭＰにより達成されるものに匹敵した。試験されたＮＬＲリガンドのいずれも、アロ反応性Ｔ細胞増殖の有意の増大を生じなかった。
【００５２】
ＨＳの刺激効果の原因としてのＬＰＳ汚染の可能性を排除するため、増殖アッセイをＬＰＳ阻害剤ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）の存在若しくは非存在下でＨＳを用いて実施した（図２Ｂ）。ＰＭＢはＬＰＳ誘発性増殖の大きな低下を引き起こしたがしかしＨＳ誘発性増殖ではせず、ＬＰＳ汚染がＨＳ処置で観察された反応体Ｔ細胞増殖の増大の原因でなかったことを示した。
【００５３】
次に、同種Ｔ細胞のＨＳに高められる増殖がＤＣ若しくはＴ細胞上のＴＬＲの刺激によったかどうかを検討するため（ＭｙＤ８８はＴＬＲ３9を除く全ＴＬＲのシグナル伝達に関与している普遍的アダプタータンパク質であるため）、ＨＳを、ＭｙＤ８８について欠損であったＤＣ若しくはＴ細胞に対し試験した。この目的上、ＷＴ若しくはＭｙＤ８８-/-  Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのＴ細胞を、ＨＳ、ＬＰＳ、Ｐａｍ３ＣＳＫ４の存在下若しくは培地単独での同種増殖アッセイで、ＷＴ若しくはＭｙＤ８８-/-  ＢＡＬＢ／ｃマ
ウスからのＤＣで刺激した。図２Ｃに示されるとおり、ＤＣ（しかし同種Ｔ細胞でなく）におけるＭｙＤ８８の欠如はＨＳによる高められた増殖を無効にし、それは、ＬＰＳが、刺激物質としてのＭｙＤ８８-/-  ＤＣを用いて増殖の低下されたがしかし有意の増大をなお生じたことを除き、ＬＰＳおよびＰａｍ３ＣＳＫ４で見出されたものと同様であった。これらの結果はＨＳがＤＣ（しかしＴ細胞でない）上のＴＬＲを刺激してＴ細胞増殖を高めることを示唆する。
【００５４】
ＨＳはＴＬＲ４リガンドとして示されており、（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．Ｂ．ら（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：５２３３−３９；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．Ｂ．，Ｂｒｕｎｎ，Ｇ．Ｊ．＆  Ｐｌａｔｔ，Ｊ．Ｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：２０−２４）。刺激するＤＣ上のＴＬＲ４発現の非存在がＭｙＤ８８欠損と同等のＨＳ誘発性のアロ反応性Ｔ細胞増殖を低下させるかどうかを確認するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの精製されたＴ細胞を、照射されたＷＴ、ＴＬＲ４-/-およびＭｙＤ８８-/-  ＢＡＬＢ／ｃ  ＤＣと共培養し、そして増殖を3Ｈ−チミジンの取り込みにより測定した。事実、ＨＳは、ＴＬＲ４-/-  ＤＣを使用した場合に、ＭｙＤ８８-/-  ＤＣを使用した場合と同様、同種Ｔ細胞の増殖をベースラインより上に増大させる（図２Ｄ）若しくはＩＦＮ−γ産生を増大させる（図２Ｅ）ことが可能でなかった。これらの結果は、ＤＣ中の（しかしＴ細胞中でない）無傷のＴＬＲ４−ＭｙＤ８８経路がアロ反応性Ｔ細胞応答を促進するためにＨＳにとって必要であることを示す。
【００５５】
実施例２：ＨＳはＴＬＲ４依存性のＤＣの成熟および機能を刺激する
ＨＳによるＤＣの活性化がアロ反応性Ｔ細胞応答をどのように促進したかを検討するため、ＤＣ成熟および炎症前サイトカインの産生としてが適応免疫応答の誘発における重要な初期事象であり、共刺激分子ＣＤ４０およびＣＤ８０ならびに炎症前サイトカインＩＬ−６およびＩＬ−１２のＤＣ発現を上方制御するＨＳの能力を試験した。
【００５６】
抗体およびフローサイトメトリー：抗ＣＤ４０（ＨＭ４０−３）、抗ＣＤ８０（１６−１０Ａ１）、抗Ｔｈｙ１．１（ＯＸ−７）、抗Ｌｙ５．１（Ａ２０）抗ＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）、ラットＩｇＧ１アイソタイプ（Ｒ３−３４）およびＢｒｄＵフローキット（ＦＩＴＣ標識）は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国カリフォルニア州サンノゼ）からであった。細胞内ＩＦＮ−γ染色は以前に記述されたとおり実施した。（Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｔ．Ｖ．ら（２００８）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ８５：２４７−５５）。ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢｒｄＵ標識のため、マウスに分析１時間前に５０μｇ  ＢｒｄＵ／ｇｍをｉ．ｐ．注入した。フローサイトメトリーデータの収集物はＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して取得し、そして事象はＦｌｏＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．、米国アッシュランド）を使用して解析した。
【００５７】
サイトカイン分析：細胞培養物上清をＤＣ培養物若しくはＴ細胞増殖アッセイから得、そしてＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γについて製造元の標準的プロトコルに従ったＥＬＩＳＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりアッセイした。ＨＥＫ２９３上清をＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、米国サンディエゴ）によりヒトＩＬ−８について試験した。
【００５８】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ：ルシフェラーゼ活性は、製造元の推奨されるプロトコルに従ってＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用して測定した。発光はＬＭａｘ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国サニーベール）を使用して測定した。
【００５９】
ＨＳ  ＥＬＩＳＡ：血清サンプルを、製造元の推奨されるプロトコルに従ってＥＬＩＳＡ（Ａｍｓｂｉｏ  ＬＬＣ、米国レイクフォレスト）によりＨＳ濃度についてアッセイした。ＨＳレベルは、施設に後援されるＩＲＢ（Ｐｒｏ０００３１６０７）のもとでＡｌｌｏ−ＨＳＣＴを受けている患者でもまた測定した。患者データは医学記録レビューにより得た。血清サンプルをＧＶＨＤに関して多様な時間点で患者から収集し、そして上述されたところのＥＬＩＳＡによりＨＳレベルについてアッセイした。
【００６０】
ＬＰＳと同様、ＨＳは、ＷＴ  ＤＳ（しかしＴＬＲ４-/-若しくはＭｙＤ８８-/-  ＤＣでなく）上のＣＤ４０およびＣＤ８０の上方制御を引き起こした（図３Ａ）。比較して、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（ＴＬＲ１／２リガンド）は、ＷＴおよびＴＬＲ４-/-  ＤＣ（しかしＭｙＤ８８-/-  ＤＣでなく）上のＣＤ４０およびＣＤ８０を上方制御することが可能であった。同様に、ＨＳは、ＷＴ  ＤＣ（しかしＴＬＲ４-/-若しくはＭｙＤ８８-/-  ＤＣでなく）から炎症前サイトカインＩＬ−６およびＩＬ−１２を産生させるようにＤＣを刺激し（図３Ｂおよび３Ｃ）、それはＰＭＢにより阻害されなかった（図３Ｄおよび３Ｅ）。
【００６１】
ＴＲＩＦは、ＭｙＤ８８非依存性のＴＬＲ４シグナル伝達に関与する十分に記述された細胞内シグナル伝達アダプター分子である。（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．ら（２００３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：６４０−４３）。従って、ＷＴ、ＴＬＲ４-/-、ＭｙＤ８８-/-およびＴＲＩＦ-/-  Ｃ５７ＢＬ／６  ＤＣからのＩＬ−６産生のＨＳ刺激を試験した。ＭｙＤ８８欠損はＨＳ誘発性のＩＬ−６産生の大半を予防した一方、ＴＲＩＦ欠損は、ＨＳおよびＬＰＳ（しかしＣｐＧでなく）での刺激に際してＩＬ−６の産生に対するより小さいがしかし有意の影響を有した（図４）。
【００６２】
多様なＴＬＲのヘテロ二量体が数種のＰＡＭＰに必要とされる。従って、ＴＬＲ４がＨＳ活性に十分であったかどうかを確認するため、共受容体ＣＤ１４およびＭＤ２に加えてヒトＴＬＲ４若しくはヒトＴＬＲ２を発現するよう安定にトランスフェクトされたヒト上皮腎臓（ＨＥＫ）細胞株を活性化するＨＳの能力を試験した。これらの細胞株を、トランスフェクション対照としてのチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターに駆動されるウミシイタケルシフェラーゼレポータープラスミドと一緒に、ＮＦ−κＢプロモーターに駆動されるホタルルシフェラーゼレポータープラスミドでトランスフェクトした。ウミシイタケルシフェラーゼに対するホタルルシフェラーゼにより産生される発光の比（Ｆ／Ｒ）をその後、培地単独、ＬＰＳ、ＨＳおよびＰａｍ３ＣＳＫ４に反応して測定した。ＥＬＩＳＡによる、ＮＦ−κＢ活性化の下流であるＩＬ−８の産生もまた測定した。ＬＰＳと同様に、われわれは、ＨＳが、ＴＬＲ４発現細胞株においてＮＦ−κＢ活性化（図５Ａ）ならびにＩＬ−８発現（図５Ｂ）を引き起こしたことを見出した。従って、ＴＬＲ４はＨＳ誘発性のＮＦ−κＢ活性化およびＩＬ−８産生に十分である。
【００６３】
潜在的ＬＰＳ汚染を制御するため、ＰＭＢを培地に添加した。ＰＭＢでの処理はＬＰＳ処理（しかしＨＳ処理でない）から生じるＩＬ−８発現を阻害した（図５Ｃ）。ＨＳの直接的役割を示すため、ヘパラナーゼで前処理されたＨＳを次に試験した。ヘパラナーゼはＨＳ刺激（しかしＬＰＳ刺激でない）を有意に低下させ、ＨＳ誘発性のＩＬ−８発現がＨＳに特異的であったことを示した（図５Ｄ）。
【００６４】
実施例３：ＨＳの血清レベルはＡｌｌｏ−ＨＳＣＴのマウスモデルにおいてＧＶＨＤの発生時に上昇されている
同種免疫の状況におけるＨＳのｉｎ  ｖｉｖｏ関連性を検討するため、ＨＳの血清レベルを、Ａｌｌｏ−ＨＳＣＴの状況のＧＶＨＤのマウスモデルで試験した（図６Ａ）。
【００６５】
Ａｌｌｏ−ＨＳＣＴ：Ａｌｌｏ−ＨＳＣＴのため、野生型（ＷＴ）およびＴＬＲ４−／−  ＢＡＬＢ／ｃマウスが、骨髄破壊的全身照射（８．５Ｇｙ）次いで１×１０7のＢ１
０．Ｄ２若しくはＢＡＬＢ／ｃ  Ｔ細胞枯渇骨髄（ＴＣＤ−ＢＭ）の静脈内注入を受領した。骨髄は以前にのとおり調製し（Ｙａｎｇ，Ｙ．ら（２００４）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５０８−１５）、そして、Ｔ細胞を、製造元の説明書に従ってＴｈｙ１．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カールズバッド）若しくはＣＤ５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、米国オーバーン）複合磁性ビーズを使用して枯渇させた。ＧＶＨＤを誘発するため、Ｂ１０．Ｄ２若しくはＢＡＬＢ／ｃマウスの鼠径部、腋窩、頸部および腸間膜リンパ節からの５×１０6リンパ節細胞を、ＴＣＤ−ＢＭに加えて静脈内注入した。
【００６６】
急性ＧＶＨＤの別のモデルにおいて、Ｃ３Ｈ．ＳＷからの５×１０6リンパ節細胞および１×１０7ＴＣＤ  ＢＭを、１０Ｇｙで照射されたＣ５７ＢＬ／６レシピエントに移入した。これら２種のＧＶＨＤモデルのＨＳＣＴレシピエントはその後、示された間隔で、２００μＬ滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁された２ｍｇのα１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ、ＡｒａｌａｓｔTM、Ｂａｘｔｅｒ、米国ディアフィールド）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注入、２００μＬのＰＢＳ中の２０ｍｇ／ｋｇのＰＧ５４５（Ｐｒｏｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、豪州クイーンズランド）の皮下（ｓ．ｃ．）注入、若しくは２００μＬのＰＢＳ単独いずれかを受領した。
【００６７】
このモデルにおいて、致死的に照射されたＢＡＬＢ／ｃマウスに、Ｂ１０．Ｄ２マウスからの１×１０7Ｔ細胞枯渇骨髄（ＴＣＤ−ＢＭ）および５×１０6リンパ球（ＬＣ）を移植した（Ａｌｌｏ−ＢＭ＋ＬＣ）。対照マウスはＢ１０．Ｄ２  ＴＣＤ−ＢＭのみ（Ａｌｌｏ−ＢＭのみ）若しくは同系ＢＡＬＢ／ｃ  ＴＣＤ−ＢＭおよび５×１０6ＢＡＬＢ／ｃ  ＬＣ（Ｓｙｎ−ＢＭ＋ＬＣ）を受領した。血清ＨＳレベルは移植後第９および１４日にＡｌｌｏ−ＢＭ＋ＬＣのレシピエントで有意に上昇し、そして移植後第２２日までにベースラインに戻った。注目すべきは、ＨＳの増大はＧＶＨＤの症状の発生前に発生した。
【００６８】
ＨＳのｉｎ  ｖｉｖｏ濃度がＤＣ活性化を引き起こすのに十分であったかどうかを確認するため、ある範囲のＨＳ濃度に応答しての培養されたＤＣによるＩＬ−６の産生を試験した（図６Ｂ）。これらの条件下で、最大応答は１２．５μｇ／ｍＬのＨＳ濃度により達成され、かつ、ＨＳの半最大有効濃度（ＥＣ50）はおよそ４μｇ／ｍＬであったこと。
【００６９】
実施例４：Ａ１ＡＴはＴＬＲ４依存性の様式で血清ＨＳレベルを低下させかつＧＶＨＤの転帰を改善する
ＧＶＨＤの発症におけるＨＳ上昇の意義を検査した。Ａ１ＡＴは、好中球エラスターゼ誘発性の肺傷害に対し保護するためにα１−アンチトリプシン欠損を伴う患者で使用される強力な血清プロテアーゼ阻害剤である。（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｅ．Ｋ．＆  Ｓａｎｈａｕｓ  Ｒ．Ａ．（２００９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６０：２７４９−５７）。細胞外マトリックス内のＨＳを含有するプロテオグリカンを切断するプロテアーゼ、エラスターゼでのマウスの静脈内処置が、ＨＳが直接注入される場合に発生するものに類似である全身性炎症反応症候群を引き起こすことが以前に示されている。（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．Ｂ．，Ｂｒｕｎｎ，Ｇ．Ｊ．＆  Ｐｌａｔｔ，Ｊ．Ｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：２０−２４）。
【００７０】
ＧＶＨＤの評価：ＧＶＨＤの重症度は、５個のパラメータ、すなわち重量減少、毛皮の質感、皮膚の完全性、丸める姿勢、および活動性を説明する、以前に記述された臨床採点体系を使用して評価した。（Ｃｏｏｋｅ，Ｋ．Ｒ．ら（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８８：３２３０−３９）。生存についてのエンドポイントは、死亡、瀕死状態、若しくは３０％を越える重量減少であった。ＧＶＨＤの組織学的分析を全層耳組織で実施した。新鮮中性緩衝ホルマリン中での２４時間の固定後に耳組織を慣例に処理し、パラフィンに包埋しかつ５μｍ厚切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。これらの脱同定された（ｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）スライドを、実験群に対し盲検化された単一の病理医（ＤＭＣ）により評価し、そして皮膚線維症、脂肪減少、炎症、表皮界面の変化、および毛胞脱落（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｄｒｏｐ−ｏｕｔ）に基づき半定量的様式で等級付けした（各カテゴリーについて０〜２）。（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｅ．ら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１２：１０１−１０８）。
【００７１】
従って、Ａ１ＡＴの投与がＡｌｌｏ−ＨＳＣＴ後の血清ＨＳレベルを低下させるかどうかを確認するため、Ａ１ＡＴ（２ｍｇ）を、膵島移植の状況での寛容誘導のためのＡ１ＡＴ療法の使用について以前に記述されたとおり、移植１日前に開始する３日ごとのｉ．ｐ．注入によりＡｌｌｏ−ＢＭ＋ＬＣレシピエントに投与した。（Ｌｅｗｉｓ，Ｅ．Ｃ．ら（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：１６２３６−４１）。
【００７２】
ＰＢＳ単独の注入に比較して、Ａ１ＡＴ処置されたレシピエントはＨＳＣＴ後第９および１４日に有意により低い血清ＨＳレベルを有した（図７Ａ）。Ａ１ＡＴ処置されたおよびＰＢＳ処置されたレシピエント間の生存の比較において、Ａ１ＡＴ療法はＰＢＳ処置された対照と比較して有意により長い生存をもたらした（ＭＳＴ  ４８．５対２８．０日；ｐ＜０．００１）（図７Ｂ）。
【００７３】
ＧＶＨＤの臨床スコアを、１０段階評価を使用して実験群間で比較した。（Ｃｏｏｋｅ，Ｋ．Ｒ．ら（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８８：３２３０−３２３９）。全群が、放射線曝露に関して移植後３〜７日の間の臨床スコアの上昇を有した（図７Ｃ）。臨床スコアの該上昇は、同種ＴＣＤ−ＢＭ単独を受領したコホートでその後ベースラインに迅速に戻った。しかしながら、同種ＴＣＤ−ＢＭおよびＬＣを受領したコホート（Ａｌｌｏ−ＢＭ＋ＬＣ）は、それらがそれらの臨床エンドポイント（死亡若しくは３０％ｗｔ減少）に達するまで、移植２０日後に開始する臨床スコアの漸進的増大を有した。Ａ１ＡＴで処置されたＡｌｌｏ−ＢＭ＋ＬＣレシピエントは有意により低い臨床スコア曲線を有した（ｐ＝０．０３）。
【００７４】
ＧＶＨＤの重症度もまた組織学により検査した。耳皮膚を、Ａ１ＡＴ若しくはＰＢＳ処置されたレシピエントからの移植後３週にＡｌｌｏ−ＢＭ＋ＬＣマウスから得、そしてＧＶＨＤの重症度につき採点した。Ａ１ＡＴ処置されたマウスは有意により低いＧＶＨＤ病理学スコアを示した（図７Ｄ〜Ｅ）。
【００７５】
Ａｌｌｏ−ＨＳＣＴの状況でＡ１ＡＴ投与による改善された生存がアロ反応性Ｔ細胞応答の抑制によりうるかどうかを検討するため、ドナーＴ細胞を、Ａｌｌｏ−ＨＳＣＴ後のＢｒｄＵ取り込みによりｉｎ  ｖｉｖｏ増殖についておよびＩＦＮ−γ産生により機能について試験した。アロ反応性Ｔ細胞の挙動をｉｎ  ｖｉｖｏで監視するため、同種ＴＣＤ−ＢＭおよびＴｈｙ１．１+  Ｂ１０．Ｄ２ドナーマウスから単離されたＬＣを利用した。レシピエントを移植６日後にＢｒｄＵでパルスし、そしてそれらの脾細胞を１時間後にＦＡＣＳ分析した。ドナーＴｈｙ１．１+  Ｔ細胞によるＢｒｄＵ取り込みおよびＩＦＮ−γ産生は、Ａ１ＡＴで処置されたレシピエントマウスで有意に低下された（図８Ａ〜Ｃ）。
【００７６】
Ａ１ＡＴ療法から得られる生存の利益をさらに裏付けるために第二のＧＶＨＤモデルを実施した。致死的に照射されたＣ５７ＢＬ／６レシピエントに１０7  Ｃ３Ｈ．ＳＷ  ＴＣＤ−ＢＭおよび５×１０6  Ｃ３Ｈ．ＳＷ  ＬＣを移植した。１群は上述されたとおりＡ１ＡＴ注入を受領し、そして他方はＰＢＳ対照注入を受領した。再度、Ａ１ＡＴ処置されたレシピエントはＰＢＳ処置された群と比較して有意の生存の利益を示した（ｐ＝０．０３２）（図７Ｆ）。
【００７７】
われわれのｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果に基づき、アロ特異的Ｔ細胞活性化へのＨＳの寄与はＴＬＲ４依存性である。Ｂ１０．Ｄ２  ＴＣＤ  ＢＭおよびＬＣのＷＴ  ＢＡＬＢ／ｃレシピエントの生存を、Ａ１ＡＴ注入若しくはＰＢＳ対照注入いずれかを受領したＴＬＲ４-/-  ＢＡＬＢ／ｃレシピエントと比較した。ＷＴ  ＢＡＬＢ／ｃレシピエントと比較して、ＴＬＲ４-/-レシピエントは有意により長い生存を有した（５７対２９日、ｐ＜０．００１）。しかしながら、さらなる生存の利益は、Ａ１ＡＴで処置されたＴＬＲ４-/-レシピエントにおいて、ＰＢＳ処置されたＴＬＲ４-/-マウスと比較して観察されず（ｐ＝０．３０、図７Ｇ）、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡ１ＡＴの効果もまたＴＬＲ４に依存することを示唆した。
【００７８】
実施例５：ＨＳ模倣物ＰＧ５４５は血清ＨＳレベルを増大させかつＡｌｌｏ−ＨＳＣＴ後のＧＶＨＤを悪化させる
ＨＳの増大する血清レベルがアロ反応性Ｔ細胞応答を増大させかつＧＶＨＤを加速し得るかどうかを確認するため、２０ｍｇ／ｋｇのＰＧ５４５を、移植１日前に開始する皮下注入により週あたり１回投与した。この目的上、ヘパラナーゼの競争阻害剤として機能しうるＨＳ模倣物ＰＧ５４５（Ｐｒｏｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、豪州クイーンズランド）を使用した。（Ｄｒｅｄｇｅ，Ｋ．ら（２０１１）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １０４：６３５−４２）。ＰＧ５４５療法はより高い移植後血清ＨＳレベルをもたらした（図９Ａ）。移植後第６日のＢｒｄＵ取り込みの分析は、ＰＢＳ処置された群と比較してＰＧ５４５処置された群におけるより高い比率の増殖するドナーＣＤ８  Ｔ細胞（２３．２±２．３対１２．９±２．０；ｎ＝群あたり３；ｐ＜０．０５）ことを表した（図９Ｂ）。ＰＧ５４５処置はＰＢＳ対照注入と比較してＧＶＨＤの速度もまた加速した（２１対２９日、ｐ＜０．００１）（図９Ｃ）。これらのデータはＨＳがｉｎ  ｖｉｖｏでアロ反応性Ｔ細胞応答を調節し得ることを示す。
【００７９】
実施例６：レシピエントの抗原提示細胞はＨＳ上昇の時点で存在する
ＨＳ上昇の時点でのレシピエントのＤＣの持続性を示すため、致死的照射および１０7  ＴＣＤ−ＢＭ＋１０6  ＬＣの移入よりなるＧＶＨＤのＢ６→ＢＡＬＢ／ｃ  ＨＳＣＴモデルを使用した。
【００８０】
Ｔ細胞受容体トランスジェニック（ＴＣＲ−ｔｇ）養子移入：Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．１バックグラウンドの４Ｃ−ＴＣＲ−ｔｇマウスから精製されたリンパ節（ＬＮ）細胞を、以前に記述されたとおりカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国グランドアイランド）で標識した。（Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｔ．Ｖ．ら（２００８）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ８５：２４７−５５）。Ｃ５７ＢＬ／６  ＨＳＣＴ（１０7  ＴＣＤ−Ｃ５７ＢＬ／６  ＢＭおよび１０６  Ｃ５７ＢＬ／６  ＬＮ細胞）のＢＡＬＢ／ｃレシピエントに、移植１４日後に２×１０6  ＣＦＳＥ標識ＬＮ細胞を静脈内注入した。３日後にマウスを殺し、それらの肝を収集し、そして、肝内リンパ球を、機械的破壊後に不連続Ｆｉｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、米国セントルイス）勾配で精製した。
【００８１】
このモデルは３０日以内に致死性ＧＶＨＤを生じる。移植後１４日に、１０6  ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞受容体トランスジェニック（ＴＣＲ−ｔｇ）Ｔ細胞を４Ｃ  ＴＣＲ−ｔｇマウスから養子移入した。４ＣマウスはＢ６バックグラウンドにあり、かつ、ＢＡＬＢ／ｃ  ＭＨＣクラスＩＩ分子Ｉ−Ａd22に対する直接的アロ特異性をもつＴＣＲ−ｔｇ  ＣＤ４+  Ｔ細胞を有する。ＴＣＲ−ｔｇ  Ｔ細胞は、潜在的にリンパ球減少性の宿主での恒常的増殖の対照としてＤ１４での同系ＨＳＣＴのレシピエントにもまた移入した（図１０Ａ）。図１０Ｂに示されるとおり、ＴＣＲ−ｔｇ  Ｔ細胞の確実な増殖が存在し、ピーク血清ＨＳレベルの期間中のレシピエント抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在を示した。
【００８２】
実施例７：血清ＨＳ上昇はＡｌｌｏ−ＨＳＣＴを受けている患者でＧＶＨＤを伴う
ＧＶＨＤのマウスモデル観察される血清ＨＳレベルの上昇が臨床状況で見出されるものと相関したかどうかを検討するため、血清サンプルを、グレード０（ＧＶＨＤの証拠なし）、グレードＩ〜ＩＩ（軽度ＧＶＨＤ）若しくはグレードＩＩＩ〜ＩＶ（重度ＧＶＨＤ）の尺度で評価されるところの急性ＧＶＨＤ（ＨＳＣＴの１００日以内）の臨床および／若しくは病理学的証拠を伴うおよび伴わないヒトＡｌｌｏ−ＨＳＣＴレシピエントから得た。患者の人口統計学、ＨＳＣＴの適応症、ドナーＭＨＣ適合、前処置レジメン、維持免疫抑制および移植後感染症を比較し、そして群間で類似であることを見出した（表１）。ＧＶＨＤ診断の時点近くのＨＳレベルの比較は、ＧＶＨＤの重症度と相関した血清ＨＳ上昇を示した（グレード０、［ＨＳ］＝４．２２±０．３９μｇ／ｍＬ、ｎ＝８；グレードＩ〜ＩＩ、［ＨＳ］＝１０．８９±２．０７μｇ／ｍＬ、ｎ＝１７；グレードＩＩＩ〜ＩＶ、［ＨＳ］＝２３．７４±４．６６μｇ／ｍＬ、ｎ＝１１）（図１１Ａ）。ＧＶＨＤの時点に関する血清ＨＳの比較は、ＧＶＨＤ診断の時点と時間的に相関した血清ＨＳレベルのピークを表した（図１１Ｂ）。
【００８３】
【表１】
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【００８４】
実施例８：ＨＳはマウス心移植モデルにおける同種免疫の内因性刺激物質かつ免疫傷害の早期バイオマーカーである
同種心移植をＣ５７ＢＬ／６ドナーと（ＢＡＬＢ／ｃ×ＤＢＡ．１）Ｆ１レシピエントの間で実施した。血清ＨＳをＥＬＩＳＡにより測定した。ＨＳおよびＣＤ３についての免疫組織学的染色を心ｔｘ組織で実施した。ＷＴ、ＭｙＤ８８若しくはＴＬＲ４欠損マウスからの骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）および精製されたＴ細胞をＭＬＲアッセイで使用して、ＨＳに応答しての増殖およびサイトカイン産生について試験した。刺激されたＤＣ上のＣＤ４０およびＣＤ８０発現をＦＡＣＳにより測定した。Ｔ細胞増殖は3Ｈ−チミジン取り込みおよびＣＦＳＥ色素希釈アッセイにより測定した。ＣＤ１４、ＭＤ２、およびＴＬＲ４若しくはＴＬＲ２を安定に発現するＨＥＫ２９３  ＮＦ−ｋＢ−ルシフェラーゼレポーター細胞株をＨＳ活性のアッセイで使用した。
【００８５】
ＨＳは急性心臓同種移植片拒絶を受けているマウスの血清中で増大されたがしかし同系対照ではされなかった（９．８０．５対０．７０．１μｇ／ｍｌ、ｐ＝．００３）。（図１２Ａ）。これらの結果はヒトでも同様に観察された。（図１２Ｂ）。組織ＨＳは限局的（ｆｏｃａｌ）Ｔ細胞浸潤の領域で低下されたか若しくは非存在であった。（図１２Ｃ）。ＨＳは、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αのＤＣ発現をＴＬＲ４およびＭｙＤ８８依存性の様式で上方制御することが見出された。（図１３）。ＭＬＲアッセイにおいて、ＨＳは同種ＬＣ増殖（ＣＤ４およびＣＤ８）ならびにＩＦＮｇ産生を増大させた。ＬＣの刺激はＡＰＣ（しかしＴ細胞でない）のＭｙＤ８８の発現に依存した。ＨＳ刺激はＰＩ３Ｋ活性に依存しかつＮＦ−ｋＢ活性化を引き起こした。ＣＤ１４／ＭＤ２／ＴＬＲ４を発現するＨＥＫ２９３細胞によるＩＬ−８産生のＨＳ刺激はヘパラナーゼにより（しかしＬＰＳ阻害剤ポリミキシンＢによってでなく）特異的に阻害された。
【００８６】
これらの結果は、ＨＳが同種免疫を促進するＡＰＣの自然免疫刺激であることを示す。加えて、細胞外マトリックス破綻を阻害することは、リンパ球組織浸潤を阻害しかつＴ細胞活性化を低下させうる。
【００８７】
本明細書の結果は、内因性のＴＬＲ４リガンドＨＳがＧＶＨＤの発生の間に遊離されかつＧＶＨＤを促進することができることを示し、それは明らかな外因性ＴＬＲ刺激の非存在下で通常発生する。Ａ１ＡＴによるＨＳ遊離の阻害がマウスにおいてＧＶＨＤおよび生存の有意の改善をもたらした、また、血清ＨＳレベルがヒトにおいてＧＶＨＤの重症度と直接相関したという観察結果は、Ａｌｌｏ−ＨＳＣＴ後のＨＳ遊離の阻害が臨床的ＧＶＨＤの制御のための有効かつ新規の戦略を提供することを示す。
【００８８】
アロ反応性Ｔ細胞応答の状況で、ＨＳで刺激されたＭｙＤ８８-/-  Ｔ細胞の増殖のＷＴ  Ｔ細胞対照と比較して有意の差違は存在しなかった。代わりに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアロ反応性のＨＳ依存性の増強はＡＰＣ中のＴＬＲ４−ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ経路を活性化することにより媒介された。
【００８９】
造血系統のレシピエントＡＰＣはＡｌｌｏ−ＨＳＣＴ後に迅速に枯渇される。これらの研究は、いずれかのレシピエントＡＰＣがＧＶＨＤにおけるＨＳ上昇の時点で存在するかどうかを確認した。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩに対する直接的アロ反応性をもつアロ反応性のドナー系統ＴＣＲ−ｔｇ  Ｔ細胞をＡｌｌｏ−ＨＳＣＴレシピエントに移入する養子移入モデルを使用して、ドナーＡＰＣは、以前の研究がレシピエント造血ＡＰＣの完全近くの枯渇を示した場合に存在する。この実験は、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ発現細胞がＨＳ上昇の時点で存在するという証拠を提供する。
【００９０】
あるいは、ＨＳは間接的抗原提示によりドナーＴ細胞にレシピエントアロ抗原を提示することが可能であるドナーＡＰＣを活性化しうる。化学療法および照射のような骨髄破壊性前処置レジメンが腸に対する傷害を引き起こし得ることが示唆されており、これはＤＡＭＰを遊離し得かつ腸上皮を横断する移行にＰＡＭＰを産生する細菌のを許し得る。しかしながら、臨床的ＧＶＨＤはしばしば移植後数週若しくは数か月で発生し、そして前処置レジメンからの組織損傷の寄与はこれらエピソードに明確に連結可能でない。本研究において、該結果は、ＨＳが、照射、骨髄移植の結果として、若しくは同系リンパ球集団の再構成から、血清中で上昇されたようにならなかったことを示す。代わりに、それは、同種リンパ球を受領したレシピエントの血清中で臨床的ＧＶＨＤの発生時に高度に上昇されたようになった。これらの観察結果は、ＨＳ遊離がＧＶＨＤに関与するアロ反応性Ｔ細胞応答に関連することを示す。
【００９１】
結論として、該結果は、ＨＳがｉｎ  ｖｉｔｒｏでアロ反応性Ｔ細胞応答を促進することを示す。マウスにおいて、血清ＨＳレベルはＡｌｌｏ−ＨＳＣＴ後の臨床的ＧＶＨＤの発生時に急性に上昇する。Ａ１ＡＴでの処置はＨＳレベルを低下させて、アロ反応性Ｔ細胞応答の低下およびＧＶＨＤの改善につながる。逆に、血清ＨＳレベルを増大させるＨＳ模倣物はＧＶＨＤを加速する。血液学的悪性病変のためＡｌｌｏ−ＨＳＣＴを受ける患者において、血清ＨＳレベル上昇はＧＶＨＤの重症度と相関する。これらの結果は、Ａｌｌｏ−ＨＳＣＴ後の急性ＧＶＨＤの促進、およびＨＳ遊離の調節による臨床ＧＶＨＤの制御における、ＨＳの新たな役割を特定する。
【００９２】
本明細で挙げられるいかなる特許若しくは刊行物も本発明が関する技術分野の当業者の水準を示す。これら特許および刊行物は、各個々の刊行物が引用することにより組み込まれることをとりわけかつ個々に示された場合と同一の程度まで、引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００９３】
当業者は、本発明が、該目的を実施しかつ挙げられた目標および利点ならびにその中で固有のものを得るように十分に翻案されることを容易に認識するであろう。本明細書に記述される方法と一緒になった本実施例は、好ましい態様を現在代表し、例示的であり、そして本発明の範囲に対する制限として意図していない。請求の範囲の範囲により定義されるところの本発明の技術思想内に包含されるその中の変更および他の用途が、当業者に思いつくであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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