(57)【要約】２つの物体間の所望の定常状態の温度差を維持しなければ、熱的定常状態を回復させるよう熱伝達が発生し得る２つの物体間の所望の定常状態の温度差を維持するための新規のシステムおよび方法について記載する。１つの用途において、超分解能画像化の達成のための冷却顕微鏡アセンブリおよびその従来の光学顕微鏡との使用が記載される。このアセンブリにより、循環システムおよび結合流体をサンプルと対物レンズとの間に用いることにより、対物レンズの温度を凍結を上回る温度で維持しつつ、低温におけるサンプルの高分解能の画像化を行うことが可能になる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡のための冷却アセンブリであって、
（ａ）対物レンズのための第１の循環システムであって、
光透過部と、
カラーであって、
対物レンズと密閉係合することが可能な上面および前記光透過部と密閉係合する下面であって、前記カラーの前記上面および前記光透過部により、液浸流体を収容する領域が画定される、上面および下面と、
前記領域内外からの液浸流体の移動のための１つ以上のポートと
を含む、カラーと
を含む、第１の循環システムと、
（ｂ）サンプルステージのための第２の循環システムであって、
絶縁筺体であって、
サンプル配置のための低温ブロックと、
前記絶縁筺体内外からの冷却流体の移動のための１つ以上のポートと
を含む、絶縁筺体と
を含む、第２の循環システムと、
（ｃ）前記光透過部をサンプルへ光学的に結合させる結合流体と
を含む、冷却アセンブリ。
【請求項２】
前記冷却流体が、冷却窒素ガスおよび液体窒素のうち少なくとも１つを含む、請求項１に記載の冷却アセンブリ。
【請求項３】
前記液浸流体が、水およびアルコール水混合物のうち少なくとも１つである、請求項１に記載の冷却アセンブリ。
【請求項４】
前記液浸流体の流量が、約１ｍＬ／分〜１０ｍＬ／分である、請求項１に記載の冷却アセンブリ。
【請求項５】
前記光透過部の厚さは、約０．１５ｍｍ〜０．１９ｍｍである、請求項１に記載の冷却アセンブリ。
【請求項６】
前記結合流体の氷結温度が−１３５℃よりも低い、請求項１に記載の冷却アセンブリ。
【請求項７】
前記結合流体が、４−メチル−１−ペンテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、２−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセンおよび２−ペンテンからなる群から選択される、請求項１に記載の冷却アセンブリ。
【請求項８】
対物レンズをさらに含む、請求項１に記載の冷却アセンブリ。
【請求項９】
前記光透過部と前記対物レンズとの間の距離が、約０．１ｍｍ〜１ｍｍである、請求項８に記載の冷却アセンブリ。
【請求項１０】
前記カラーが、前記対物レンズを実質的に包囲するようなサイズの上側環状リングをさらに含み、前記上側環状リングは、前記カラーへ任意選択的に一体化される、請求項８に記載の冷却アセンブリ。
【請求項１１】
前記第１の循環システムが、前記対物レンズを実質的に包囲するようなサイズにされたクランプリングと、前記上側環状リングを前記クランプリングへ固定する接合部材をさらに含む、請求項１０に記載の冷却アセンブリ。
【請求項１２】
前記カラーの前記上面と前記対物レンズとの間のガスケット、および前記カラーの前記下面と前記光透過部との間のガスケットのうち少なくとも１つをさらに含む、請求項８に記載の冷却アセンブリ。
【請求項１３】
前記光透過部の下側に配置された下側環状リングをさらに含み、前記下側環状リングが前記カラーへ固定される、請求項１に記載の冷却アセンブリ。
【請求項１４】
少なくとも前記カラーがポリスルホンプラスチックを含む、請求項１に記載の冷却アセンブリ。
【請求項１５】
高分解能の顕微鏡アセンブリであって、
前記液浸流体の氷結よりも高い温度で維持される液浸対物レンズと、
氷の非晶質−結晶転移温度よりも低い温度で維持されるサンプルステージと、
前記液浸対物レンズを前記サンプルステージと光学的に結合させる結合流体と
を含む、顕微鏡アセンブリ。
【請求項１６】
前記顕微鏡の分解能が、約２００ナノメートル〜３００ナノメートルである、請求項１５に記載の顕微鏡アセンブリ。
【請求項１７】
前記対物レンズの開口数が、約０．４〜１．４である、請求項１５に記載の顕微鏡アセンブリ。
【請求項１８】
サンプルを観察する方法であって、
（ａ）顕微鏡アセンブリを提供することであって、
前記液浸流体の氷結温度よりも高い温度で維持される液浸対物レンズと、
氷の非晶質−結晶転移温度よりも低い温度で維持されるサンプルステージと
を含む、顕微鏡アセンブリを提供することと、
（ｂ）前記サンプルステージ上にサンプルを配置することと、
（ｃ）前記対物レンズを前記サンプルと光学的に結合させる結合流体を導入することと、
（ｄ）前記サンプルを、前記対物レンズを通じて視認することと
を含む、方法。
【請求項１９】
視認時における前記ステージのドリフトは５ミクロン未満である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
視認時における振幅は２０ナノメートル未満である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルの温度は、約−１３５℃〜１５５℃で維持される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
２つの物体間の熱伝達が可能となる距離に配置された前記物体間の温度差を維持するためのアセンブリであって、
第１の物体を第１の温度以上で維持することが可能な液浸流体のための第１の循環システムと、
第２の物体を第２の温度以下で維持することが可能な、冷却流体のための第２の循環システムであって、前記２つの物体間で温度差が維持されるように、前記第２の温度が前記第１の温度を下回る、第２の循環システムと、
前記第１の循環システムを前記第２の循環システムと結合させる接触媒質と
を含む、アセンブリ。
【請求項２３】
前記第１の温度が、前記液浸流体の氷点を上回る、請求項２２に記載のアセンブリ。
【請求項２４】
前記第２の温度が、氷の非晶質−結晶転移温度を下回る、請求項２２に記載のアセンブリ。
【請求項２５】
前記液浸流体の流量が、約１ｍＬ／分〜１０ｍＬ／分である、請求項２２に記載のアセンブリ。
【請求項２６】
前記接触媒質が外気である、請求項２２に記載のアセンブリ。
【請求項２７】
前記２つの物体間の前記距離が、約０．１ｍｍ〜１ｍｍである、請求項２２に記載のアセンブリ。
【請求項２８】
前記第１の物体が液浸対物レンズであり、前記第２の物体が対象サンプルである、請求項２２に記載のアセンブリ。
【請求項２９】
２つの物体間の熱伝達が可能となる距離に配置された前記物体間の温度差を維持する方法であって、
アセンブリを提供することであって、
第１の物体を第１の温度以上で維持することが可能な第１の循環システムと、
第２の物体を第２の温度以下で維持することが可能な第２の循環システムであって、前記第２の温度が前記第１の温度よりも低い、第２の循環システムと、
前記第１の循環システムを前記第２の循環システムと結合させる接触媒質と
を含む、アセンブリを提供することと、
前記２つの物体間で温度差が維持されるように、液浸流体を前記第１の循環システム中に循環させ、冷却流体を前記第２の循環システム中に循環させることと
を含む、方法。
【請求項３０】
顕微鏡のための冷却アセンブリであって、
（ａ）対物レンズのための第１の循環システムであって、
光透過部と、
カラーであって、
対物レンズと密閉係合することが可能な上面および前記光透過部と密閉係合する下面であって、前記カラーの前記上面および前記光透過部により、液浸流体を収容する領域が画定される、上面および下面と、
前記領域内外からの液浸流体の移動のための１つ以上のポートと
を含む、カラーと
を含む、第１の循環システムと、
（ｂ）サンプルステージのための第２の循環システムであって、試料低温搬送装置カートリッジを受容するように構成され、前記カートリッジ内外への冷却流体の移動のための１つ以上のポートを含む、第２の循環システムと、
（ｃ）前記光透過部をサンプルと光学的に結合させる結合流体と
を含む、冷却アセンブリ。
【請求項３１】
顕微鏡冷却アセンブリを用いたサンプルの保存、移動および／または視認のうちの少なくとも１つのための試料低温搬送装置カートリッジであって、前記カートリッジは、
絶縁筺体であって、
サンプル配置のための低温ブロックと、
前記絶縁筺体内外からの冷却流体の移動のための１つ以上のポートと
を含む絶縁筺体
を含み、
前記低温ブロックが、前記サンプルの前記温度を維持しつつ前記サンプルを顕微鏡冷却アセンブリで保存、移動および／または視認のうちの少なくとも１つのために前記サンプルが装填されるように構成される、
試料低温搬送装置カートリッジ。
【請求項３２】
前記カートリッジが銅フォームを含む、請求項３１に記載の試料低温搬送装置カートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年９月１３日に出願した米国仮特許出願第６１／７００，５０１号の内容全体に対する優先権を主張し、その内容全体を参照により援用する。
【０００２】
本技術は、短距離における温度差の維持に概して関する。より詳細には、本技術は、顕微鏡法に関する。詳細には、本技術は、低温高分解能光学顕微鏡法に関する。
【背景技術】
【０００３】
分解能が約２００ｎｍである従来の光学顕微鏡法は、寸法が概して１０ｎｍ未満である生体分子（例えば、タンパク質）の組織の調査には不適切である。超分解能の蛍光顕微鏡法方法を用いれば、従来の分解能を蛍光色素分子のために収集された光子数の平方根で除算した値に主に依存する誤差で、蛍光光子の分布中心を決定することにより、分離された切り換え可能な蛍光色素分子（対象サンプルをラベル付けする際に用いられる蛍光化合物）の位置を特定することが可能になる。よって、１００個の光子を収集すれば、分離された蛍光色素分子を約２０ｎｍへ局所化することができる。光子数が多いほど、誤差が低減するかまたは「分解能」が高くなる。
【０００４】
超分解能蛍光顕微鏡法のプロセスは、限られた数の光切り換え可能な蛍光タグを活性化すること（すなわち、蛍光をオンにすること）と、その位置をマッピングすることと、その後全蛍光色素分子が活性化されかつその蛍光が測定されるまでサイクルを繰り返すこととからなる。収集された光子の合計数に依存する局所化の精度は、励起数の関数である、蛍光色素分子が漂白される（すなわち、破壊される）確立に依存する。１組のサンプル分子の位置を全画像から決定し、疑似画像上にプロットすることにより、超分解能画像を生成する。
【０００５】
収集された光子数に加えて、活性化およびマッピングを繰り返すサイクルにおける蛍光色素分子の動きにより、分解能が制限される。局所化の精度を最高にする（分解能を最大化する）ためには、サンプル分子間の相対運動を排除する必要がある。理論的分解能としては数ナノメートルが理論的に可能であるものの、現在、平均的にはわずか約２０ｎｍの分解能しか可能になっていない。
【０００６】
例えば−１３５℃を下回る低温において顕微鏡法を用いる場合、画像分解能の向上に関連していくつかの有益な効果が得られる。このような温度においては、分子の動きが室温の場合に比べて鈍くなる。サンプルが高速または高圧で凍結された場合、−１３５℃を下回って（例えば、アモルファス氷中において）保存されれば自然構造を保持する。さらに、蛍光色素分子が漂白される速度も大幅に低下する。観測温度を室温から−１３５℃まで低下させることにより、漂白速度を約５０倍低下させることができ、その結果分解能が約７倍増加する。
【０００７】
サンプルを光学顕微鏡中で視認しつつ低温で保持するために、いくつかの異なるアプローチがとられている。市販のデバイス（例えば、Ｉｎｓｔｅｃ  Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）またはＬｉｎｋａｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ，Ｓｕｒｒｅｙ，Ｕ．Ｋ．）から入手可能なもの）は、標準的な光学顕微鏡上に適合して、空隙によって分離された１組の窓部によって対物レンズを低温サンプルから隔離する。このようなデバイスの場合、試料から対物レンズへ送られる光の角度が窓部（すなわち、カバースリップ）と空気界面との間の全内面反射によって制限されるため、比較的低い開口数（ＮＡ）（システムが光を受容または発光することが可能な角度範囲を特徴付ける無次元数）で対物レンズを用いる必要がある。従来の分解能は、ＮＡに逆比例して変化し、収集された光子数の平方根はＮＡと共に変化する。そのため、超分解能は、ＮＡの２乗に逆比例して変化する。市販の低温ステージの場合のように数ミリメートルの隙間が必要な場合、最高のＮＡのレンズのＮＡは約０．４となるため、ＮＡが約１．２である液浸レンズと比較して、分解能が約９倍低下する。液浸レンズは、標準的な超分解能顕微鏡法において室温で用いられるため、この標準を設定する。そのため、低ＮＡの対物レンズの使用を用いることにより、低温によって達成される約７倍の増加が完全に相殺される。隙間が１ミリメートル未満に低下すると、より高ＮＡのレンズの使用が可能になるものの、それでも損失は液浸対物レンズと比較して約３〜４倍になる。
【０００８】
空気結合レンズを用いた他のデバイスの場合、場合によっては、より高ＮＡ（例えば、０．７５）のレンズの利用が可能になるように、作動距離が短くなっている。このようなシステムの場合でも、約６０％の光子の損失が発生する。
【０００９】
低温でサンプルホルダを提供するための別の報告されている試行によれば、ほぼ水の屈折率を有する低温流体中に対物レンズを浸漬することにより、サンプルを高ＮＡの対物レンズで視認しつつ低温で保持することが可能になる。このデバイスは、２つの欠陥を有する：すなわち、このデバイスは従来の光学顕微鏡と共に用いることができないため、対物レンズを同一の極めて低温で作動させる必要がある。この後者の条件は、最高の性能を提供するように設計された距離および寸法が低温中の対物レンズの部分の収縮によって変化することを意味する。高ＮＡ対物レンズは接合ダブレットを有するため、収縮および膨張のサイクルが繰り返されるうちにダブレットを保持する接着剤が機能しなくなると、対物レンズに不具合が発生し得る。
【００１０】
そのため、現時点では、顕微鏡の画像化分解能または性能に妥協をきたすこと無く従来の光学顕微鏡と共に用いることが可能な超分解能低温顕微鏡アセンブリは存在しない。
【００１１】
標準〜高性能を可能にする作動温度で維持された対物レンズでサンプルを視認しつつ低温で維持するための試行は全て、小さな作動距離において温度差を維持するというより大きな問題に対処する必要がある。熱（すなわち、物質の作動または移動以外による、システムと周囲物との間で移動するエネルギー）は、（例えば、伝導、対流および／または放射を介して）より高温のシステムからより低温のシステムへ自然流動する。例えば２つ以上のシステムまたは物体が有る場合、サンプルおよび従来の光学顕微鏡が熱接触し、構成粒子の微視的相互作用を通じてエネルギーを交換する。これらのシステムが異なる温度にある場合、システムが熱的に安定する（例えば、温度が等しくなる）まで続くエネルギーの正味の流れが自然発生する。熱伝達の速度は、システム間の距離に逆比例する（すなわち、距離が小さいほど、伝達が速くなる）。特に相互間の作動距離が比較的小さい２つ以上のシステム間（例えば、顕微鏡法サンプルと液浸液体との間）の温度差を安定して維持することは、いまだに困難なままである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
物体間の熱伝達が可能となる距離に配置された２つの物体間の温度差を維持するためのアセンブリおよび方法が記載される。
【００１３】
超分解能画像化の達成のための、冷却顕微鏡アセンブリと、従来の光学顕微鏡とのその利用とについても記載される。
【００１４】
１つの態様において、物体間の熱伝達が可能となる距離に配置された２つの物体間の温度差を維持するためのアセンブリは、第１の物体を第１の温度以上に維持することが可能な液浸流体のための第１の循環システムと、２つの物体間で温度差が維持されるように第２の物体を第１の温度よりも低い第２の温度以下で維持することが可能な冷却流体のための第２の循環システムと、第１の循環システムを第２の循環システムと接続させる接触媒質とを含む。
【００１５】
１つ以上の実施形態において、第１の温度は、液浸流体の氷点よりも高い。
【００１６】
１つ以上の実施形態において、第２の温度は、氷の非晶質−結晶転移温度よりも低い。
【００１７】
１つ以上の実施形態において、液浸流体の流量は、約１ｍＬ／分〜１０ｍＬ／分である。
【００１８】
１つ以上の実施形態において、接触媒質は外気である。
【００１９】
１つ以上の実施形態において、２つの物体間の距離は約０．１ｍｍ〜１ｍｍである。
【００２０】
１つ以上の実施形態において、第１の物体は液浸対物レンズであり、第２の物体は対象サンプルである。
【００２１】
別の態様において、物体間の熱伝達が可能となる距離に配置された２つの物体間の温度差を維持する方法は、アセンブリを提供することであって、アセンブリは、第１の物体を第１の温度以上で維持することが可能な第１の循環システムと、第２の物体を第１の温度よりも低い第２の温度以下で維持することが可能な第２の循環システムと、第１の循環システムを第２の循環システムと接続させる接触媒質とを含む、提供することと、２つの物体間で温度差が維持されるように、液浸流体を第１の循環システム中に循環させ、冷却流体を第２の循環システム中に循環させることとを含む。
【００２２】
別の態様において、顕微鏡のための冷却アセンブリは、対物レンズのための第１の循環システムであって、この第１の循環システムは、光透過部およびカラーを含み、カラーは、対物レンズと密閉係合することが可能な上面および光透過部と密閉係合する下面を備え、カラーの上面および光透過部により、液浸流体を収容する領域が画定され、カラーは、領域内外からの液浸流体の移動のための１つ以上のポートとを含む第１の循環システムと、サンプルステージのための第２の循環システムであって、サンプル配置のための低温ブロックを含む絶縁筺体と、絶縁筺体内外からの冷却流体の移動のための１つ以上のポートを含む第２の循環システムと、光透過部をサンプルへ光学的に結合させる結合流体とを含む。
【００２３】
１つ以上の実施形態において、冷却流体は、冷却窒素ガスおよび液体窒素のうち少なくとも１つを含む。
【００２４】
１つ以上の実施形態において、液浸流体は、水およびアルコール水混合物のうち少なくとも１つである。
【００２５】
１つ以上の実施形態において、液浸流体の流量は、約１ｍＬ／分〜１０ｍＬ／分である。
【００２６】
１つ以上の実施形態において、光透過部の厚さは、約０．１５ｍｍ〜０．１９ｍｍである。
【００２７】
１つ以上の実施形態において、光透過部と対物レンズとの間の距離は、約０．１ｍｍ〜１ｍｍである。
【００２８】
１つ以上の実施形態において、結合流体の氷結温度は１３５℃未満である。
【００２９】
１つ以上の実施形態において、結合流体は、４−メチル−１−ペンテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、２−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセンおよび２−ペンテンからなる群から選択される。
【００３０】
１つ以上の実施形態において、冷却アセンブリは、対物レンズを含む。
【００３１】
１つ以上の実施形態において、光透過部と対物レンズとの間の距離は、約０．１ｍｍ〜１ｍｍである。
【００３２】
１つ以上の実施形態において、カラーは、対物レンズを実質的に包囲するようなサイズの上側環状リングも含み、上側環状リングは、任意選択的にカラーと一体化される。
【００３３】
１つ以上の実施形態において、第１の循環システムは、対物レンズを実質的に包囲するようなサイズにされたクランプリングと、上側環状リングをクランプリングへ固定する接合部材も含む。
【００３４】
１つ以上の実施形態において、冷却アセンブリは、カラーの上面と対物レンズとの間のガスケットおよび／またはカラーの下面と光透過部との間のガスケットも含む。
【００３５】
１つ以上の実施形態において、冷却アセンブリは、光透過部の下側に配置された下側環状リングも含み、下側環状リングは、カラーへ固定される。
【００３６】
１つ以上の実施形態において、少なくともカラーは、ポリスルホンプラスチックを含む。
【００３７】
別の態様において、高分解能の顕微鏡アセンブリは、液浸流体の氷結よりも高い温度で維持される液浸対物レンズと、氷の非晶質−結晶転移温度よりも低い温度で維持されるサンプルステージと、液浸対物レンズをサンプルステージと光学的に結合させる結合流体とを含む。
【００３８】
１つ以上の実施形態において、顕微鏡の分解能は、約２００ナノメートル〜３００ナノメートルである。
【００３９】
１つ以上の実施形態において、対物レンズの開口数は、約０．４〜１．４である。
【００４０】
別の態様において、サンプルを観察する方法は、顕微鏡アセンブリを提供することであって、顕微鏡アセンブリは、液浸流体の氷結温度よりも高い温度で維持される液浸対物レンズおよび氷の非晶質−結晶転移温度よりも低い温度で維持されるサンプルステージを含む、ことと、サンプルステージ上にサンプルを配置することと、対物レンズをサンプルと光学的に結合させる結合流体を導入することと、サンプルを対物レンズを通じて視認することとを含む。
【００４１】
１つ以上の実施形態において、視認時におけるステージのドリフトは、５ミクロン未満である。
【００４２】
１つ以上の実施形態において、視認時における振幅は２０ナノメートル未満である。
【００４３】
１つ以上の実施形態において、サンプルの温度は、約−１３５℃〜１５５℃で維持される。
【００４４】
別の態様において、顕微鏡のための冷却アセンブリは、対物レンズのための第１の循環システムであって、この第１の循環システムは、光透過部およびカラーを含み、カラーは、対物レンズと密閉係合することが可能な上面および光透過部と密閉係合する下面を備え、カラーの上面および光透過部により、液浸流体を収容する領域が画定され、カラーは、領域内外からの液浸流体の移動のための１つ以上のポートを含む、第１の循環システムと、試料低温搬送装置カートリッジを受容するように構成された、サンプルステージのための第２の循環システムであって、カートリッジ内外への冷却流体の移動のための１つ以上のポートを含む、第２の循環システムと、光透過部をサンプルへ光学的に結合させる結合流体とを含む。
【００４５】
別の態様において、顕微鏡冷却アセンブリを用いたサンプルの保存、移動および／または視認のための試料低温搬送装置カートリッジは、サンプル配置のための低温ブロックおよび絶縁筺体内外からの冷却流体の移動のための１つ以上のポートを有する絶縁筺体を含み、低温ブロックは、サンプルの温度を維持しつつサンプルを顕微鏡冷却アセンブリで保存、移動および／または視認するためにサンプルが装填されるように、構成される。
【００４６】
１つ以上の実施形態において、試料低温搬送装置カートリッジは、銅フォームを含む。
【００４７】
本開示のこれらおよび他の態様ならびに実施形態について、以下に例示および記載する。他のシステム、プロセス、および特徴は、以下の図面および詳細な記載を鑑みれば、当業者にとって明らかである。全てのこのようなさらなるシステム、プロセスおよび特徴が本記載に含まれ、本発明の範囲内であり、また添付の特許請求の範囲によって保護されることが意図される。
【００４８】
本発明について、以下の図面を参照して説明する。以下の図面は、ひとえに例示目的のためのものであり、限定的なものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】１つ以上の実施形態による、光学顕微鏡と共に用いられる低温ステージおよび対物レンズアセンブリの模式図である。
【図２】１つ以上の実施形態による、光学顕微鏡と共に用いられる冷却アセンブリの詳細な模式図である。
【図３】１つ以上の実施形態による、対物レンズのための閉型再循環システム（「カラー」）の写真である。
【図４】１つ以上の実施形態による、閉型再循環システム（「カラー」）および対物レンズアセンブリの模式図である。
【図５】１つ以上の実施形態による低温ステージアセンブリの写真である。
【図６】１つ以上の実施形態による、光学顕微鏡と共に用いられる低温ステージアセンブリの一部の写真である。
【図７】１つ以上の実施形態による、光学顕微鏡と共に用いられる冷却アセンブリの一部の写真である。
【図８】１つ以上の実施形態による、低温ステージアセンブリの一部の模式図である。
【図９】１つ以上の実施形態による、低温ステージアセンブリのｘ方向およびｙ方向における空間ドリフト（単位：ミクロン）を時間（単位：分）の関数としてプロットしたものである。
【図１０】１つ以上の実施形態による、冷却アセンブリにおいて用いられるサンプルの温度安定性（単位：℃）を時間（単位：秒）の関数としてプロットしたものである。
【図１１】１つ以上の実施形態による、冷却アセンブリと共に使用されるように構成された試料低温搬送装置の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
他に明記無き限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載の方法および材料と同様のまたはそのような方法および材料に相当するものを本発明の実践または試験において利用することが可能であるが、適切な方法および材料について以下に述べる。本明細書において言及される全ての公開文献、特許出願、特許および他の参考文献全体を参照により援用する。記載に矛盾が有る場合、定義を含む本明細書が優先される。加えて、材料、方法および例はあくまで例示的なものであり、制限的なものではない。
【００５１】
本開示は、２つのシステムまたは物体間の所望の温度差を維持しなければ、熱的定常状態をもたらす熱伝達が発生し得る２つのシステムまたは物体間の所望の温度差を維持するための新規のシステム、アセンブリおよび方法を導入する。いくつかの実施形態において、アセンブリは、第１の物体の少なくとも一部を収容する筺体を備えた第１の循環システムと、液浸流体をリザーバ内外から循環させるためのポートを備えたリザーバとを含む。いくつかの実施形態において、第１の循環システムは、第２の物体とずっと低温（例えば、氷の非晶質−結晶転移温度）以下で接触および／または比較的近接しているのにも関わらず、第１の物体を所望の温度（例えば、液浸流体の氷点）以上に維持する。いくつかの実施形態において、アセンブリは、第２の物体の少なくとも一部を収容する絶縁筺体ハウジングを備えた第２の循環システムと、低温ブロックと、リザーバ内外から冷却流体を循環させるためのポートを備えたリザーバとを含む。いくつかの実施形態において、第２の循環システムは、第１の物体とずっと高温（例えば、液浸流体の氷点）以上で接触および／または比較的近接しているのにも関わらず、第２の物体を所望の温度（例えば、氷の非晶質−結晶転移温度）以下で維持する。いくつかの実施形態において、アセンブリは、接触媒質を含む。この接触媒質は、第１の物体および／または第１の循環システムならびに第２の物体および／または第２の循環システムが接触および／または比較的近接しているにも関わらず２つの物体の温度が異なるように、２つの物体を光学的に結合させる。
【００５２】
よって、本開示の実施形態は、２つのシステムまたは物体（特に、短距離だけで分離されているため熱伝達が発生し易い物体）間において所望の温度差を維持する。
【００５３】
さらなる実施形態によれば、冷却顕微鏡アセンブリと、超分解能画像化の達成のための従来の光学顕微鏡とのその使用とが記載される。いくつかの実施形態において、顕微鏡の分解能を約２０ｎｍから約２ｎｍへ増加させることができ、これにより、タンパク質分子の分子分解能が達成される。いくつかの実施形態において、高分解能の高開口数（ＮＡ）対物レンズを備えた従来の顕微鏡をこのアセンブリにおいて用いることができる。よって、本開示の冷却顕微鏡アセンブリは、従来の光学顕微鏡と共に機能する他のデバイスよりも達成可能な分解能を増加させる。
【００５４】
図１は、１つ以上の実施形態による、光学顕微鏡と共に用いられる低温ステージおよび対物レンズアセンブリ１００の模式図である。アセンブリにおいて用いられる低熱伝導率の結合流体は、比較的高温（例えば、室温）で維持された液浸層と低温で維持された低温冷却サンプルとの間に配置される。透明な光学要素（例えば、カバースリップ）により、これら２つの流体が分離される。少なくとも１つの実施形態において、凍結サンプル１０２は、高熱伝導率を有する表面（例えば、銅表面１０４）に隣接して配置される。高熱伝導率表面を、１つ以上の低温流体（例えば、液体窒素または低温窒素ガス１０６）によって氷の非晶質−結晶転移温度（約−１３５℃）よりも低い温度まで冷却することができる。約−１４０℃〜約−１５０℃の範囲が最適である。サンプルを、液浸流体（例えば、液浸水１１０）中において（例えば、凍結を超える温度で）動作する液体（例えば、水）液浸レンズ１０８を用いて視認することができる。液浸レンズは、標準的な超分解能顕微鏡法において室温において（いくつかの実施形態において約１．２のＮＡで）用いられる従来のレンズであり得る。従来の光学顕微鏡法の典型的な実施形態において、水液浸対物レンズのＮＡは、０．３よりも大きいかまたは０．５よりも大きいかまたは０．８よりも大きいかまたは１．０よりも大きいかまたは１．１よりも大きいかまたは１．２よりも大きいかであり、１．４を上限とする。結合流体１１２（例えば、低温流体）を用いて、光学的に透明な要素（例えば、カバースリップ１１４）を介して低温サンプルを液体浸潤対物レンズを接続させる。よって、デバイスは、標準的な市販の光学顕微鏡上に適合し得る。本実施形態において、約２００℃の温度降下のうちほとんどすべては、約０．２５ミリメートル未満の距離にわたって発生する。
【００５５】
レンズの液浸流体は典型的には水であるが、単純なアルコールまたはアルコール水混合物であってもよく、その場合、液浸流体の氷結温度が必要ならば低下させられる。
【００５６】
本明細書において用いられる「低温流体」という用語は、サンプルのために典型的に用いられる温度において液体状態に留まる流体を指し、液浸流体に典型的に用いられる温度においては沸騰せず、カバースリップとサンプルとの間の光学的結合を維持する。すなわち、流体の屈折率は、水（または液浸流体）の屈折率に近い。顕微鏡アセンブリ中における使用に適切な低温流体は液体であり、すなわち、顕微鏡アセンブリの作動範囲（例えば、約−１３５℃〜−１５０℃）において沸点を下回り、氷点を上回る。加えて、低温流体は、水に合理的に適合する屈折率を有する。屈折率は、約１．３〜１．４の範囲に収まるべきである。水の屈折率から不整合がある場合、ＰＳＦ（従来の光学顕微鏡の分解能にほぼ等しい点広がり関数）が若干広がり、その結果レンズの分解能が低下する。加えて、低温流体は、液浸水からサンプルへの熱伝達の低下を支援するように低い熱伝導率を持つべきである。１つ以上の実施形態において、低温流体の熱伝導率は、０．２２（Ｗ／Ｍ＊°Ｋ）未満であるかまたは０．１（Ｗ／Ｍ＊°Ｋ）未満である。他の実施形態において、低温流体の熱伝導率は、０．３（Ｗ／Ｍ＊°Ｋ）の範囲である。例示的な低温流体を挙げると、伝導率が約０．１〜０．３の４−メチル−１−ペンテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、２−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセンおよび２−ペンテンである。
【００５７】
以下の方程式は、（図１中に模式体に示す）デバイスの層中を熱が流れ、温度が層間の界面において計算される例示的な定常状態を記述する。液浸流体（例えば、水）の層は、２０℃で保持されているものと仮定し、銅ブロックの底部は、低温窒素ガスによって−１５５℃に冷却される。ｉ番目の層上の温度降下は、以下によって得られる。
【数１】
2015529858.tif 000003
式中、ΔＴは温度降下合計であり、Δｘｉはｉ番目の層の厚さであり、ｋｉはｉ番目の層の伝導率である。以下のように、表１は、典型的な層厚さおよび伝導率における各層上における予測される温度降下を方程式（１）を用いて計算した値である。
【表１】
2015529858.tif 000004
（表１）
【００５８】
よって、この計算により、サンプル構造を保存するのに必要な最低温度よりも低い、サンプルの下部が−１５５＋３＝−１５２℃にあり、サンプルの上部が−１５２＋６＝１４６℃にあることが予測される。また、この計算により、最大温度勾配が低温流体上に確立されることも予測される。この温度勾配を保持する能力は、低温流体の低熱伝導率およびサンプルの厚さの関数である。
【００５９】
図２は、光学顕微鏡と共に用いられる冷却アセンブリ２００の少なくとも１つの実施形態の詳細な模式図である。図２は、アセンブリの２つのコンポーネントを示す。
【００６０】
いくつかの実施形態によれば、第１のコンポーネントは、閉型再循環システムまたは「カラー」２０２であり、従来の液浸顕微鏡対物レンズ（例えば、水液浸対物レンズ２０４）へ取り付けられる。水液浸対物レンズは、顕微鏡の分解能を高めるために用いられる対物レンズである。これは、レンズおよび試料双方を空気よりも屈折率が高い液体中に浸漬することにより達成され、これにより、対物レンズのＮＡが増加する。カラー２０２は、ポリスルホンプラスチックを含み得、対物レンズ２０５と透明な要素（例えば、カバースリップ２０８）との間に隙間を画定する。液浸流体（例えば、水）２０６は、隙間を通じて流れて、対物レンズ２０５を透明な要素（例えば、カバースリップ）２０８の上部へ光学的に結合させる。いくつかの実施形態において、対物レンズと透明な要素との間の隙間は約０．０５ｍｍであり、典型的には約０．０５ｍｍ〜約０．１ｍｍであり得る。いくつかの実施形態において、１ｍｍまでの隙間が可能である。液浸流体２０６を（例えば、ポンプおよびリザーバの設定により）対物レンズ２０４と透明な要素２０８の上部との間に循環させて、温度を凍結を上回る温度に維持する。水の熱流および熱容量に基づいた計算によれば、流量が約１０ｃｃ／分または１０ｍＬ／分であれば、液浸水の凍結を回避するのに十分であり得ることが示される。いくつかの実施形態において、アルコールを循環する液浸流体２０６へ付加して、その氷点を低下させる。いくつかの実施形態において、単純な抵抗ヒーターをカラー２０２と接触した様態で配置することにより、対物レンズ２０４の過冷却を回避する。カラー２０２の下部を対物レンズ２０５の高さよりも低い位置で伸張させることにより、分離用「シュラウド」２０９をサンプル２１２の周囲に形成して、サンプル２１２を外気（例えば、放射熱伝達）から隔離する。
【００６１】
いくつかの実施形態によれば、アセンブリの第２のコンポーネントは低温ステージ２１０であり、試料（例えば、凍結サンプル２１２）が載置される隆起低温ブロック２１１（例えば、窒素ガスで冷却された銅ブロック）を含む。少なくとも１つの実施形態において、隆起低温ブロック２１１の下面は、冷却流体（例えば、低温窒素ガス２１４）によって冷却されて、隆起低温ブロック（例えば、銅ブロック）２１１を正確な温度で保持する。低熱伝導率の断熱材（例えば、箱）（例えば、閉型気泡フォーム、真空デュワー、他の高抵抗筺体）２１６を包囲することにより、冷却流体流れのための配管を環境（例えば、外気）から隔離する。温度制御を可能にするため、サンプル２１２の近隣に設けられたサーモカップル２１８により、温度を記録することができる。いくつかの実施形態において、サンプル温度を１３５℃未満に維持することにより、サンプル２１２が埋設されたアモルファス氷の結晶化が回避される。（−１３５℃を超える温度において、アモルファス氷中の水が結晶化し得、サンプルの構造を変化させ得る）。いくつかの実施形態によれば、サンプル２１２は、結合流体（例えば、低温流体）２２０により、透明な要素（例えば、カバースリップ）２０８の下部へ光学的に結合される。いくつかの実施形態において、透明な要素２０８および結合流体２２０が接触しかつ／またはサンプル視認時においてサンプルの焦点が合うまで、結合流体２２０はサンプル２１２上に配置され、顕微鏡の焦点（例えば、高さ）が調節される。好適な実施形態において、接触および焦点双方が十分に得られるまで、顕微鏡の焦点が調節される。
【００６２】
図３は、対物レンズのための閉型再循環システムまたはカラー３００の少なくとも１つの実施形態の写真である。いくつかの実施形態によれば、カラーは、多数の形状（およびサイズを持ち得る。いくつかの実施形態において、異なるサイズの対物レンズに適合するように、内径を調節することができる。好適な実施形態において、カラーは環状であり、従来の光学顕微鏡中の液浸対物レンズを包囲し得、この液浸対物レンズへ固定され得る。図示の実施形態において、カラー３００は、クランプリングにより、対物レンズへ取り付けられる。このクランプリングは、対物レンズのいかなる変更を必要としないが、カラーおよび対物レンズを接合するための任意の方法が用いられ得る。いくつかの実施形態において、他の取り付け方法も可能であり、例えば、カラーがねじにより対物レンズの本体内に取り付けることが可能なように、対物レンズを変更することができる。好適な実施形態において、使用時において、カラーおよび対物レンズは、固定ユニットとしてサンプル（およびステージ）に対して移動して、サンプルに対して焦点および画像化を達成する。
【００６３】
（例えば、ゴムまたは他の材料の薄片から構成された）１つ以上のガスケットを用いて、対物レンズと透明な要素（例えば、カバースリップ）との間に水密シールを形成することができる。対物レンズと透明な要素との間の隙間は、任意のガスケットの厚さに応じて約０．０５ｍｍ〜約０．１ｍｍであればよい。いくつかの実施形態において、この隙間は、約１ｍｍまで増加させられる。いくつかの実施形態において、材料３０６（例えば、耐水プラスチックまたはラミネート（例えば、Ｇａｒｏｌｉｔｅ（登録商標）（Ｏｍｙａ  ＵＫ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｈａｄｄｅｓｄｅｎ，Ｄｅｒｂｙ，Ｕ．Ｋ．）から市販）の一片（例えば、リング）をカラー３００の下部へ取り付けて、透明な要素および任意のガスケットを対物レンズ（少なくとも１つの実施形態によるより詳細については、図４中の例示的なガスケット４０６および４０９ならびに固定材料４１０を参照）へ固定する。
【００６４】
カラー３００上の入力３０２および出力３０４のポートは、いくつかの実施形態に従って、循環している液浸流体を供給および除去する。液浸流体は典型的には水であるが、他の液体（例えば、水−アルコール混合物）が利用可能である。アルコール（例えば、エタノール、メタノールまたはプロパノール）がいくつかの実施形態において用いられ得る。水−アルコール混合物の体積百分率は、０％から１００％まで変化し得る。ポンプおよび／または他の方法／デバイス（例えば、自重送り）を用いて、液浸流体をカラーを通じて押し出すまたは引き出すことができる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、カラーの下部（すなわち、対物レンズから最も離隔位置にある部分）を伸張させることにより、保護バリアまたは「シュラウド」をサンプル周囲に形成して、サンプルを環境（例えば、外気）から保護することができる。カラーのシュラウド部分は、さらに低温ブロックを包囲して、サンプル空洞を画定することができる。カラー２０２をサンプル２１２の上方に配置した場合、図２に示すように、低温（例えば、−１５５℃）の乾性ガス２１４をサンプル空洞中に供給することができる。
【００６６】
図４は、１つ以上の実施形態における閉型再循環システムまたはカラーおよび対物レンズアセンブリ４００の模式図である。本例において、カラー４０２は、１つ以上の締結具（例えば、ねじ４０５）を用いたクランプリング４０４により、対物レンズ４０３へ取り付けられる。いくつかの実施形態において、１つ以上のねじ４０５は、クランプリング４０４中の開口部（図示せず）を通過し、カラー４０２中の１つ以上の補完穴部４１６中へねじこまれることにより、カラーを対物レンズ上へ固定する。
【００６７】
（例えばゴムまたは他の薄い材料から構成された）１つ以上のガスケットを用いて、水密シールを例えばカラー４１２の中間部分の下面と透明な要素４０７（例えば、カバースリップ）（すなわち、下側ガスケット４０６）との間および／またはカラー４１２の中間部分の内面と対物レンズ４０３（すなわち、上側ガスケット４０９）との間に構成することができる。対物レンズ４０３と透明な要素４０７（例えば、ガラスカバースリップ）との間の隙間４０８は、ガスケット４０６および４０９の厚さに応じて約０．０５ｍｍ〜約０．１ｍｍである。いくつかの実施形態において、この隙間は、約１ｍｍまで増加させられる。図４に示す実施形態において、耐水プラスチックのリングまたはラミネート（例えば、Ｇａｒｏｌｉｔｅ（登録商標））４１０を用いて、カバースリップ４０７および下側ガスケット４０６を第２の１組の１つ以上の締結具（例えば、ねじ４１４）を介してカラー４１２の中間部分へ固定する。いくつかの実施形態によれば、ねじ４１４は、ラミネート４１０をラミネート４１０および／またはカラーを貫通する開口部４１６を通じてカラー４１２の中間部分へ固定する。いくつかの実施形態において、ラミネート４１０は、中空の環状領域４１８を中間部内に有するように設計される。ある特定の実施形態において、カラーアセンブリ４００が冷却ステージの上方にアライメントされた場合（例えば図２を参照）、ラミネート４１０中の中空領域４１８により、結合流体（すなわち、図２中のサンプル２１２と接触する結合流体２２０）が透明な要素４０７（すなわち、図２中のカバースリップ２０８）と直接接触することが可能になる。加えて、リングは、低温ブロックを包囲しかつ低温ステージを雰囲気温度から隔離することを支援するように、構成され得る。よって、いくつかの実施形態によれば、リングは、上記したシュラウドとして機能することができる。
【００６８】
図５は、１つ以上の実施形態による低温ステージアセンブリの写真である。低温ブロックは、高熱伝導率（例えば、銅）である。図５に示す実施形態において、低温ステージ５００は、サンプル（例えば、サンプル５０５）が台座上に載置されるように構成された銅低温ブロックまたは台座５０１を有する。いくつかの実施形態において、小型キャップ５０４は、サンプル５０５を低温ブロック５０１上に保持する。キャップ５０４の端部は、薄く（例えば、約０．０５ｍｍ）かつ／またはサンプル５０５への光通過を可能にするための穴部を画定し得る。
【００６９】
台座５０１は、冷却流体５０２により下側から冷却される。加えて、冷却流体は、サンプルの冷却、カラー上のカバースリップの冷却、および水蒸気によるサンプルの汚染の回避（すなわち、サンプル上の外気水の凝縮の回避）を行うように機能し得る。いくつかの実施形態によれば、−１３５℃よりも低い温度において循環し得る任意の流体（例えば、窒素ガス）を冷却流体として用いることができる。さらなる実施形態において、流体は、−１５５℃の温度において循環する。冷却流体のための配管は、低熱伝導率の周囲の筺体（例えば、箱）（例えば、閉型気泡フォーム、真空デュワーまたは他の低伝導率の筺体）によって外気から遮蔽され得る。他の標準的な既存のおよび／または将来の絶縁材料も利用可能である。冷却流体の源（例えば、低温窒素ガス）は、流体を通過させる液体窒素のコイルであり得る。冷却流体を大型の液体ガス容器から直接供給してもよい。いくつかの実施形態によれば、冷却流体は、低温に耐えるように構成された管（例えば、シリコンゴム管）により、低温ステージアセンブリへおよび／または低温ステージアセンブリ内へ移動させることができる。この管は、フォームまたは低熱伝導率の他の材料によって遮蔽することもできる。冷却流体の流量を調節して、低温ブロックまたは台座（およびこれによりサンプル）の温度を制御することができる。いくつかの実施形態において、流れ制御器を用いて、ガス流量を制御することができる。温度を例えばサーモカップル５０６によって記録することができる。サーモカップル５０６は、いくつかの実施形態において、温度調節の支援のために試料の下側に配置される。いくつかの実施形態によれば、第２の冷却流体の流れは、例えばさらなる出口５０８を通じてサンプルの周囲の空間中へ送られる。
【００７０】
いくつかの実施形態によれば、低温ステージアセンブリは、実験時において最小のドリフト（例えば、約１０ミクロン未満）および／または露出時において最小の振動（例えば、約２０ｎｍ未満）を有する。ある特定の実施形態において、液体窒素ではなく窒素ガスを冷却流体として用いて、約１５分間の実験時において低温ステージのドリフト速度を数ミリメートルからわずか数ミクロンまで低下させる。いくつかの実施形態において、低温ステージを締結具（例えば、ねじ）により顕微鏡アセンブリの１つ以上の部分へ係合（例えば、固定取り付け）することによっても、ドリフトおよび／または振動を低減させることができる。いくつかの実施形態において、低温ステージを約３０分間以上の期間にわたって温度定常状態のために約２５℃から約−１４０℃へ冷却することにより、ドリフトおよび／または振動を低減させることができる。
【００７１】
いくつかの実施形態によれば、結合流体（例えば、低温液体）の層により、光透過部（例えば、カバースリップ）がサンプルへ光学的に結合される。この結合により、高分解能が得られる。いくつかの実施形態において、結合流体は液体であり、対物レンズの焦点決めの間の透明な要素とサンプルとの間の隙間の変化に対応することができる。いくつかの実施形態において、結合流体は、４−メチル−１−ペンテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、２−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセンおよび２−ペンテンからなり得る。好適な実施形態において、結合流体は、−１３５℃よりも低い氷結温度およびできるだけ高い沸点を有する。
【００７２】
図６は、例えば図５に示すようないくつかの実施形態による、低温ステージアセンブリ６００の一部の写真である。図６中の写真は、サンプルまたは試料６０４が視認のために載置される低温ブロック（例えば、円筒型銅ブロック）６０２を示す。いくつかの実施形態によれば、試料６０４は、キャップ６０６によって所定位置に保持される。キャップ６０４は、試料６０４を保持している低温ブロック６０２上の下方スライドを回避するためのリップを備えた金属円筒であり得る。さらなる実施形態において、リップは、薄く（例えば、厚さ約０．０５ｍｍ）あり得る。いくつかの実施形態において、試料６０４は、金属ディスク（例えば、電子顕微鏡法グリッド）上にキャップ６０４と共に取り付けられ得る。キャップ６０４は、試料を保持する金属ディスクの外側を被覆し得、試料の上方に穴を画定し得る。いくつかの実施形態において、この穴の直径は、約２．８ｍｍであり得る。いくつかの実施形態において、試料は、顕微鏡分析の後に例えば任意選択の光学顕微鏡からのさらなる取り付けおよび／または例えば相関調査のための電子顕微鏡への移動無しに試料を送ることが可能なように、グリッド上に配置され得る。
【００７３】
いくつかの実施形態によれば、結合流体（例えば、低温流体）のためのリザーバ６０８は、ベローズ６１０によって画定される。ベローズ６１０と低温ブロック６０２との間の環状空間６０８は、結合流体によって充填され得る。いくつかの実施形態において、例えばリザーバ中に管を付加することにより、結合流体の補給を行うことができる。いくつかの実施形態において、ベローズ６１０の上部は、試料の上方に突き出し得る。対物レンズを接触および／または焦点を達成するために下降させる場合、ベローズは、結合流体リザーバを維持しつつカラーおよび／または透明な光学要素（例えば、カバースリップ）によって圧縮されるように構成され得、これにより、流体変位を制限する。いくつかの実施形態による、ガス冷却のための出口ポート６１２も図示される。
【００７４】
図７は、１つ以上の実施形態による、光学顕微鏡と共に用いられる冷却アセンブリ７００の写真である。対物レンズ７０２およびカラーアセンブリ７０４がサンプルステージ７０６との垂直アライメントから離隔方向に傾斜される様子が図示されている。本例において、カラー７０４は、クランプリング７０８によって対物レンズへ取り付けられる。流れる液浸流体は、カラー７０４上の出力ポート７１０および入力ポート７１２それぞれによって除去および供給される。図７はまた、サンプルまたは試料７１６が視認のために載置される低温ブロック７１４を示す。試料７１６は、キャップ７１８によって所定位置に保持され得る。温度制御を通知するように試料７１６の下側に配置されたサーモカップル７２０により、温度記録を行うことができる。
【００７５】
図８は、１つ以上の実施形態による、光学顕微鏡と共に用いられる低温ステージアセンブリ８００の部分の模式図である。サンプル８０１がベローズ８０２によって包囲されている様子が図示されている。ベローズ８０２は、結合流体のためのリザーバ８０３を形成する。ベローズ８０２は、低温ブロック８０６（例えば、銅ブロック）を収容する（例えばＴｅｆｌｏｎ（登録商標）を含む）絶縁シールド８０４へ直接取り付けられ、冷却ガス配管８０８をサンプルの下側に封入して、冷却ガスの均等な分布を可能にする。
【００７６】
図９は、１つ以上の実施形態による、光学顕微鏡と共にｘ方向およびｙ方向において用いられる低温ステージアセンブリの空間ドリフト（単位：ミクロン）を時間（単位：分）の関数としてプロットしたものである。いくつかの実施形態によれば、蛍光ビード懸濁液を低温ステージ上に配置し、ステージを冷却した。対物レンズおよび低温流体を、懸濁液の顕微鏡分析のために配置した。温度定常状態になって約３０分後、同一領域の一連の数百枚の蛍光写真を１５分間キャプチャした。相互相関アルゴリズムにより、全画像の平均からの各画像のｘ方向およびｙ方向における変位を決定した。平均変位に相対する各画像の変位（すなわち、ドリフト）を図９中にプロットした。視野中のサンプルの領域内の超分解能データを収集するのに十分な１５分間の期間では、ｘ方向およびｙ方向における変位範囲は１ミクロン未満であった。よって、図９中にプロットした例は、いくつかの実施形態による冷却アセンブリによって優れた空間安定性が達成されることを示す。
【００７７】
図１０は、１つ以上の実施形態による、光学顕微鏡と共に用いられる冷却アセンブリにおいて用いられるサンプルの温度安定性（℃）を時間（単位：秒）の関数としてプロットしたものである。低温ステージを冷却し、少なくとも３０分にわたって定常状態にさせた。次に、サンプルの下側に配置されたプローブ（すなわち、サーモカップル）の温度と、サンプルを被覆するキャップ中に配置されたプローブ（すなわち、サーモカップル）とを約６０分間（すなわち、視野内のサンプルの領域中の超分解能データの収集に十分な期間）にわたって測定した。各プローブの精度は１度であった。温度は、＋／−１℃の範囲内において安定していた。よって、図１０中にプロットする例は、いくつかの実施形態による冷却アセンブリによる優れた温度安定性を示す。
【００７８】
冷却アセンブリの部分は、他の目的を達成しつつ類似の空間および温度安定性を達成するように、異なる様態で製造され得る。例えば、光学顕微鏡と共に用いられる冷却アセンブリは、サンプルの装填、移動および／または保存のための取り外し可能な試料低温搬送装置を持ち得る。試料低温搬送装置は、試料を冷却アセンブリ中へ取り付けるユーザの能力を向上させ得る。また、カートリッジと同様に、顕微鏡法調査を簡素化するために、１つよりも多くの試料低温搬送装置（すなわち、複数のサンプル）をあらかじめ作製しておくことが可能になる。いくつかの実施形態において、試料低温搬送装置は使い捨て型であるが、他の実施形態において、試料低温搬送装置は再利用可能である。
【００７９】
図１１は、１つ以上の実施形態による冷却アセンブリと共に用いられるように構成された、取り外し可能な試料低温搬送装置１１００の切り欠き図である。取り外し可能な試料低温搬送装置１１００は、試料が例えば位置１１０２に載置される低温ブロック１１０１を含み得る。試料低温搬送装置中の低温ブロックは、銅製であり得るが、高熱伝導率を有する他の任意の材料によって構成してもよい。いくつかの実施形態において、試料低温搬送装置（特に低温ブロック）の全てまたは一部は、銅フォームを含む。いくつかの実施形態において、低温ブロック１１０１の下面を冷却流体１１０３によって冷却して、低温ブロックを所望の温度で維持する。低温ブロック１１０１および冷却流体１１０３は、低熱伝導率の周囲の断熱材１つ以上の層（例えば、閉型気泡フォーム、真空デュワー、他の高抵抗筺体）１１０４および１１０５により、環境（例えば、外気）から遮蔽される。
【００８０】
１つ以上の実施形態によれば、低温搬送装置に調査対象試料を装填した後、低温搬送装置を冷却ステージアセンブリへ挿入または差し込む。試料は、低温伝達ステーション中において遠隔に低温搬送装置中に装填してもよいし、あるいは、冷却ステージアセンブリの場所で装填してもよい。装填後、低温搬送装置は、事前冷却されたステージ（例えば、カートリッジ）中に挿入または差し込まれて、試料が載置された絶縁および隆起低温ブロックとして機能する。１つ以上の実施形態によれば、低温搬送装置／ブロックの温度（すなわち、冷たさ）は、冷却流体（例えば、窒素ガス）を循環させることにより、維持され得る。
【００８１】
本開示の発明の用途は、本記載中に記載されたまたは図面中に例示された構成要素の構成および配置の詳細に限定されないことが理解されるべきである。説明目的のため特定の順序のステップを図示および記載してきたが、所望の構成を得つつ、この順序を特定の点において変更することが可能であるかまたはステップを組み合わせることが可能であることが理解されるべきである。本開示の発明は、他の実施形態が可能であり、多様な様態で実行され得る。また、本明細書において用いられる表現および用語は、説明目的のためのものであり、制限的なものとして解釈されるべきではないことが理解されるべきである。
【００８２】
よって、当業者であれば、本開示を元にする概念は、本開示の発明のいくつかの目的の実行のために他の構造、方法およびシステムを設計する際の基盤として用いることが可能であることを理解する。よって、特許請求の範囲は、本開示の発明の意図および範囲から逸脱しない限り、このような均等の構造を含むものとしてみなされることが重要である。
【００８３】
本開示の発明について上記の例示的な実施形態において記載および例示してきたが、本開示はひとえに例示目的のためのものであり、特許請求の範囲のみによって限定される本開示の発明の意図および範囲から逸脱することなく本開示の発明の実行の詳細において多数の変更が可能であることが理解される。
【図１】
2015529858.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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