(57)【要約】本発明は、消化酵素を生産し、アンモニアと亜硝酸の酸化能力を有する新たなバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＣＪＭＰＢ２８３；寄託番号ＫＣＣＭ１１２７０Ｐ）及びその用途に関するものである。【選択図】図５
2015517807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化酵素を生産し、アンモニアと亜硝酸の酸化能力を有する、バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３（Bacillus licheniformis ＣＪＭＰＢ２８３；寄託番号ＫＣＣＭ１１２７０Ｐ）。
【請求項２】
バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３（寄託番号ＫＣＣＭ１１２７０Ｐ）の培養液、その濃縮液、及びその乾燥物からなる群より選択された少なくとも一つの、バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３の培養物。
【請求項３】
請求項１に記載のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３（寄託番号ＫＣＣＭ１１２７０Ｐ）、又は請求項２に記載の培養物を含む、プロバイオティクス製剤。
【請求項４】
請求項３に記載のプロバイオティクス製剤を含む、水産養殖用の飼料添加剤。
【請求項５】
バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３（bacillus licheniformis ＣＪＭＰＢ２８３；寄託番号ＫＣＣＭ１１２７０Ｐ）、その培養液、その濃縮液、又はその乾燥物を含む、水産養殖用の水質改善剤。
【請求項６】
養殖場において養殖前、又は養殖段階中に、請求項５に記載の水質改善剤を撒布する、前記養殖場の水質改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たなプロバイオティクス及びその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
養殖業は多くの国で主要な経済的手段であり、養殖魚類の疾病発生は経済的発展に大きく影響を及ぶ（非特許文献１）。
【０００３】
一般的に、養殖魚類に発病する疾病と水質改善のために抗生剤、抗菌剤、化工薬品を使用するが、これらの過度な使用により耐性菌の増加と体内残留をはじめ、周辺の水質汚染のどの問題が発生し、その使用を制限している現状である。また、水産食品の抗生剤使用有無に関する消費者の関心が高まることに従い、抗生剤の使用を根源的に遮断するため、有機酸、生菌剤、非特異免疫増強剤、天然物質などの代替物質が開発が盛んに行われている（魚類疾病の診断と治療対策、海洋水産部、２００１）。
【０００４】
養殖においてのプロバイオティクスは、飼料に添加したり、水に付随的に投与している。最近、海老などの養魚において、プロバイオティクスを与えることで病原性への免疫力増強と水質改善による疾病改善効果に関する研究が盛んに行われている（非特許文献２）。
【０００５】
プロバイオティクスは、抗生物質を意味する抗生剤（antibiotics）と反対の語源的意味を有するものであり、腸内微生物の均衡に役立つ微生物製剤、又は微生物成分と定義され、ラクトバチルス菌とビフィズス菌などの乳酸菌と称される菌種が代表的である。
【０００６】
プロバイオティクス  として使用されているバチルスはグラム陽性の桿菌であり、内生胞子を形成し、プロバイオティクスとして用いられる菌の中で独特な形態を有する。バチルスは、内生胞子を形成しないラクトバチルスより耐熱性が優秀である。また、胃壁の低いｐＨにも生存するため、投与したほとんどの菌が小腸まで達することができる（非特許文献３）。
【０００７】
水質改善の目的で用いられている物質と微生物に関する先行技術を調べると、特許文献１には亜硝酸塩−酸化バクテリアを利用し水生環境で亜硝酸塩の蓄積を予防・緩和する方法が開示されている。前記亜硝酸塩−酸化バクテリアはニトロコッカス（Nitrococcus）とニトロスピラ（Nitrospira）である。また、特許文献２には、従属栄養アンモニア酸化バクテリアを利用して廃水から炭素と窒素汚染物質を除去する方法を開示し、前記文献で開示された栄養アンモニア酸化バクテリアは、バチルス・シュードファーマスＮＨ−２（Bacillus pseudofimus NH-2）、アルスロバクター・グロビフォルミスＷＲ−２（Arthrobacter globiformis ER-2）を意味する。上記の文献で開示されたニトロコッカスとニトロスピラはＧＲＡＳ菌株ではないためプロバイオティクスとして使用できず、古細菌に属するため生産が非常に難しいので、産業上の利用が不可能である。また、ＧＲＡＳ菌株と知られているバチルス・シュードファーマスＷＲ−２はプロバイオティクスとして登録されてない菌株である。
【０００８】
本発明者らは、韓国の伝統的発酵食品であるテンジャンから、消化酵素活性を有してアンモニアと亜硝酸を酸化させる菌株を分離し、当該菌株の形態学的、生化学的、遺伝的特性を確認し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国特許出願公開第２００７−００３６０１６号明細書
【特許文献２】韓国特許出願公開第２０１０−００４０９６０号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Jose Luis Balcazar et al., Veter. Microbio. 114 (206): 173-186
【非特許文献２】Jiqiu Li et al. Aquaculture 291 (2009) 35-40
【非特許文献３】Barbosa, T. M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 71 (2005) 968-978; Spinosa, M. R. et al. Res. Microbiol. 151 (2000) 361-368
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、消化酵素の生産、アンモニアと亜硝酸の酸化能力を有する、新たなバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３の培養液、その濃縮液及びその乾燥物からなる群より選択される培養物を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、前記バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３、又は培養物を含むプロバイオティクス製剤を提供することである。
本発明の他の目的は、前記プロバイオティクス製剤を含む飼料添加剤を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３、その培養液、その濃縮液、又はその乾燥物を含む水産養殖用の水質改善剤を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、養殖場の養殖前又は養殖段階において、前記水質改善剤を撒布し前記養殖場の水質改善方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明のある実施様態において、消化酵素を生産し、アンモニアと亜硝酸の酸化能力を有する新たなバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３が提供される。
【００１７】
具体的に、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３は、韓国の伝統食品であるテンジャンから分離して得られたものである。本発明の菌株の形態学的特徴は、グラム陽性桿菌であり（図６）、配列番号１の１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を有する。前記塩基配列の分析結果、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）と９７％の相同性を有していた。よって、本発明者らは、新たに分離したバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３を２０１２年３月２２日に、韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms、ソウル市西大門区弘濟１洞３６１−２２１）に寄託番号ＫＣＣＭ１１２７０Ｐとして寄託した。
【００１８】
具体的に、塩漬（メジュを食塩液に漬けること）して４０日目の韓国の伝統食品であるメジュから菌株を採取し、ＢＨＩ（Brain heart infusion）固体培地から分離した。分離菌株は、アミラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼなどの有用な消化酵素活性が優秀であり、アンモニアと亜硝酸を酸化させる特徴を有した。また、通性嫌気と嫌気的条件での生長が可能であり、１０％塩化ナトリウムに対する耐塩性があるため、様々な水質環境で生長が可能である。また、ヒラメの稚魚を対照として水質浄化能力を評価した結果、ヒラメの飼育水槽内のアンモニア制御効率が優秀であり、低い斃死率を示した。
【００１９】
また他の実施様態において、本発明の新たに分離した菌株の培養液、その濃縮液、及びその乾燥物からなる群より選択される培養物が提供される。
【００２０】
本発明の新たに分離した菌株は、通常的なバチルス菌株の培養方法により培養することができる。培地は、天然培地、又は合成培地を用いることができる。培地の炭素原は、例えば、グルコース、スクロース、デキストリン、グリセロール、デンプンなどがあり、窒素原としてペプトン、肉類抽出物、酵母抽出物、乾燥された酵母、大豆、アンモニウム塩、硝酸塩、及びその他の有機・無機窒素含有化合物などがあるが、これらの成分に限らない。培地に含まれる無機塩は、マグネシウム、マンガン、カルシウム、鉄、カルシウムなどがあるが、これらの成分に限らない。前記炭素原、窒素原、及び無機塩の成分以外に、アミノ酸、ビタミン、核酸、及びそれに関わる化合物が培地に添加され得る。本発明の新たに分離した菌株は、２０〜４０℃の温度条件範囲で１２時間〜４日間培養することができる。
【００２１】
具体的に、新たに分離した菌株の培養液は菌体を含む培養原液であることもできるし、前記培養原液から培養上澄液を除去した液、及び／又は、それの濃縮液であり得る。前記培養液の組成には通常のバチルス培養に必要な成分だけでなく、バチルスの生長に上昇的に作用する成分をされに含むこともでき、それによる組成は当該技術分野において通常の知識を有する者により容易に選択できる。
【００２２】
また、菌株の状態は、液状状態、又は乾燥状態であり得る。乾燥方法は、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥ができるが、これらに限らない。
【００２３】
また他の実施様態において、本発明の新たに分離した菌株、又は培養物を有効成分として含むプロバイオティクス製剤が提供される。
【００２４】
プロバイオティクスは、腸内の消化管の壁に定着し、有害菌の定着と病原菌の増殖を抑制する。また、プロバイオティクスが生産する有益な消化酵素は栄養素の吸収と利用を容易にすることで飼料要求率を改善する。
【００２５】
本発明のプロバイオティクス製剤は、５×１０４ないし５×１０１０ＣＦＵ／ｍｌのバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３を含み、好ましくは１×１０６ないし１×１０９ＣＦＵ／ｍｌのバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３を含む。
【００２６】
本発明の前記プロバイオティクス製剤は薬学的に許容される担体をさらに含むことができ、前記担体と共に製剤化されて、食品及び飼料添加剤として提供できる。
【００２７】
本発明において用語“薬学的に許容される担体”は、生物体を刺激せず投与化合物の生物学的活性・特性を阻害しない担体、又は希釈剤をいう。
【００２８】
液状溶液として製剤化されるプロバイオティクス製剤に許容できる薬学的担体として、滅菌と生体に適合するものは、食塩水、滅菌水、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、及びこれらの成分の一つ以上を混合して用いることができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒、又は錠剤に製剤化することができる。また、プロバイオティクス製剤の品質低下を防止するため添加する決着剤、乳化剤、保存剤、効用増大のため飼料に添加するアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、香味剤、非タンパク質態窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、抽出剤、オリゴ糖などがある。その他、飼料混合剤などをさらに含むこともできるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明のプロバイオティクス製剤を有効成分として含む経口投与用剤形は、例えば、錠剤、トローチ、ローゼンジ、水溶性又は油性懸濁液、調剤粉末、又は顆粒、エマルション、ハード又はソフトカプセル、シロップ、又はエリキシル剤に製剤化することができる。錠剤、及びカプセルなどの剤形として製剤化するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロース、又はゼラチンなどの結合剤、ジカルシウムホスフェートなどの賦形剤、トウモロコシ澱粉、又はサツマイモ澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ナトリウムステアリルフマラート、又はポリエチレングリコールワックスなどの潤滑剤を含むことができ、カプセル剤形の場合上述した物質以外にも脂肪油などの液体担体をさらに含むことができる。
【００３０】
さらに他の実施様態において、本発明は前記プロバイオティクス製剤を有効成分として含む水産養殖用の飼料添加剤に関するものである。
【００３１】
通常的に、バチルス種は、内生胞子を形成し熱に非常に安定的特徴を有する。したがって、新たに分離した前記バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３は、飼料添加剤形態に別に製造して飼料に混合するか、飼料製造のときに直接添加して製造することができる。本発明の飼料内のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３は、液状、又は乾燥状態であることができ、好ましくは乾燥された粉末形態である。乾燥方法は、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥ができるが、これらに限定されない。本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３は粉末形態で、飼料重量の０．０５ないし１０重量％、好ましくは０．１ないし１重量％の成分比で混合できる。また、前記水産養殖用の飼料添加剤は、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３の他に飼料の保存性を高められる通常の添加剤をさらに含むことができる。
【００３２】
本発明の飼料には、植物性として、穀物類、根果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、油脂類、澱粉類、フクベ類、穀物副産物類など、動物性としてタンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、油脂類、単細胞タンパク質、動物性プランクトン類、魚粉などがあり、これらに限定されない。
【００３３】
本発明における水産養殖用の飼料添加剤は、浸漬、噴霧、又は混合して、前記水産養殖用飼料に添加して利用することができる。本発明の飼料添加剤が添加された飼料が使用できる魚種は、魚類、甲殻類などがあり、より具体的に、ヒラメ、鯛、海老、ティラピア、サケ、ウナギ、マスなどの養殖魚類が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明の飼料添加剤を含む水産養殖用飼料の配合方法は、前記飼料添加剤を動物飼料に乾燥重量を基準として０．０５ないし０．５重量％混合する。
【００３５】
また他の実施様態において、前記バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３を有効成分として含む水産養殖用の水質改善剤；及び養殖場で養殖前、又は養殖段階で前記水質改善剤を撒布し、前記養殖場の水質を改善する方法に関するものである。
【００３６】
本発明の新たに分離したバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３は、水産養殖環境内に存在するアンモニアと亜硝酸の含量を減少させるこちに利用できる。
【００３７】
本発明の水質改善剤が利用できる養殖場の魚種は、魚類、甲殻類などがあり、より具体的に、ヒラメ、鯛、海老、ティラピア、サケ、ウナギ、マスなどの養殖魚類が含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明の水質改善剤は新たに分離したバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３を水質改善剤の形態として別に製造したり、前記菌株、及び／又は、プロバイオティクス製剤を直接撒布したりすることもできる。本発明の水質改善剤内のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３は、液状、又は乾燥状態であることができ、好ましくは乾燥された粉末形態である。乾燥方法は、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥ができるが、これらに限定されない。本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３は粉末形態で、飼料重量の０．０５ないし１０重量％、好ましくは０．１ないし１重量％の成分比で混合できる。
【００３９】
水質改善剤において許容される担体は、滅菌と生体に適合するものは、食塩水、滅菌水、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、及びこれらの成分から一つの成分以上を混合して使用でき、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒、又は錠剤に製剤化することができる。
【発明の効果】
【００４０】
本発明において、新たに分離したバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３は、アミラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼなどの消化酵素の活性が優秀で、アンモニア、及び亜硝酸に対する酸化能が優秀であり、養魚と海老の養殖段階で水質を改善できる効用を有する。
【００４１】
したがって、新たに分離したバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３は、プロバイオティクスとして利用可能であるだけでなく、水質改善剤として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】アンモニア含有培地において、本発明の１次選抜された菌株のアンモニア消耗量を定量評価した図である。
【図２】本発明の１次選抜菌株の亜硝酸含有培地での亜硝酸消耗量を定量評価した図である。
【図３】本発明の２次選抜菌株の通性嫌気と嫌気的条件での生長性を評価した図である。
【図４】本発明の２次選抜菌株の耐塩性を評価した図である。
【図５】本発明の２次選抜菌株のヒラメ稚魚水槽において、水質改善評価によるアンモニア低減効果を評価した図である。
【図６】本発明の最終選抜菌株であるバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３菌株を電子顕微鏡で撮影した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
下記において、実施例により本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限られることではない。
【００４４】
実施例１：アンモニアと亜硝酸の酸化菌株を分離
（１）試料の用意と菌株の分離
韓国の伝統食品であるテンジャン、メジュ、醤油などから名品醤類由来菌株を用意した。用意した試料を３％塩化ナトリウムが添加されたＢＨＩ個体培地（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）に塗抹した後、３７℃の条件で２４時間培養した。各試料から分離された菌株は、コロニー観察によりグループ化して菌株を分離した。選別されたコロニーは３回にわたって新しい培地に移して培養する方法により分離し、純粋培養した菌を２０％グリセロールが添加された培地に入れ、−７０℃以下で保存した。
【００４５】
（２）アンモニアと亜硝酸の酸化の評価
水質汚染の主要原因であるアンモニアと亜硝酸を酸化させる微生物を１次選抜するため、アンモニアと亜硝酸に対する酸化評価を行った。
【００４６】
アンモニア酸化の評価をするため、アンモニアが添加されたイオン培地（（ＮＨ４）２ＳＯ４４．９５ｇ／Ｌ、 Ｋ２ＨＰＯ４ ８．８２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４（１Ｍ溶液）１．１ｍｌ／Ｌ、ＣａＣｌ２（１Ｍ溶液） ０．３ｍｌ／Ｌ、ＦｅＳＯ４（３０ｍＭ溶液） ０．５ｍｌ／Ｌ、ＣｕＳＯ４（５０ｍＭ溶液） ０．０４ｍｌ／Ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４０．７ｇ／Ｌ、５％（Ｗ／Ｖ） Ｎａ２ＣＯ３ ａｎｈｙｄｒｏｕｓ １２ｍｌ／Ｌ）と、亜硝酸が添加されたイオン培地（ＣａＣｌ２０．０１ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／Ｌ、ＥＤＴＡ １．４ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｍｇ／Ｌ、Ｈ２ＳＯ４ ０．５ μｌ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０５ｍｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．００１ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０１ｍｇ／Ｌ、ＮａＮＯ２０．２１ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．３ｍｇ／Ｌ）を製造した。前記製造された二つの培地５ｍｌに選抜菌株を０．０１％接種した後、３０℃で１４日間培養した。培養液を遠心分離して培養上澄液を１ｍｌずつ各々採取した後、亜硝酸が存在するとき色反応を表す指示薬（sulanilic acid、N、N-Dimethyl-1-naphylamine）を１００μｌずつ添加した。指示薬が添加された培養上澄液を、２５℃で１０分間反応した後に色変化有無を観察した。亜硝酸の存在や生成があった場合は培養液の色が濃い紫色に変わり、亜硝酸が存在しないか消耗された場合は培養液の色変化が観察されなかった。
【００４７】
約１０００種くらいの分離菌株を評価した結果、表１に示したとおり、アンモニアと亜硝酸の両方を酸化させる菌株７種、アンモニア分解の優秀な菌株２種、亜硝酸分解菌株１種を１次選抜した。
【００４８】
【表１】
2015517807.tif 000003
【００４９】
実施例２：アンモニアと亜硝酸酸化のin vitro評価
（１）１次選抜菌株のアンモニア定量評価
１次選抜菌株のアンモニア酸化による低減効果を評価するため、前記選抜菌株１０種に対し、アンモニアの添加培地でのアンモニア消耗量を定量した。
【００５０】
１次選抜された１０種の菌株をＢＨＩ液体培地に０．１％ずつ接種した後、３７℃、２００ｒｐｍで１５時間培養し、菌株を活性化させた。アンモニア含有培地（（ＮＨ４）２ＳＯ４０．５ｇ／Ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４ １３．５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．７ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１８ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３ ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ０．０１４ｇ／Ｌ、ｇｌｕｃｏｓｅ ０．５ｇ／Ｌ）に、活性化された菌を１％接種し、３７℃、２００ｒｐｍで培養した。培養過程中、６時間、１２時間、２４時間、３６時間の培養液を採取して遠心分離した後、培養上澄液だけを回収した。回収された培養上澄液においてのアンモニア残余量を定量した。
【００５１】
その結果、図１のとおり、アンモニア含有培地で選抜菌株１０種すべて培養上澄液内のアンモニア含量が減少したことを確認でき、特に２８３番、２９６番、３０３番、３９６番の菌株は培養初期である６時間目からアンモニアの含量が急激に減っていくことを確認した。アンモニアの酸化により亜硝酸が生成されたかを確認するため、亜硝酸が存在するとき色反応を表す指示薬を添加して色反応を観察した結果、アンモニアを含む初期培地からは色変化観察されなく、培養が終了したとき採取した各サンプルでは、培養上澄液の色が全て濃い紫色に変わった。これによって、１次選抜菌株は全てアンモニアを亜硝酸に酸化させることをわかった。
【００５２】
（２）１次選抜菌株における亜硝酸の定量評価
１次選抜菌株の亜硝酸酸化による低減効果を評価するため、前記選抜菌株１０種に対して、亜硝酸が添加が培地から定量して亜硝酸の消耗量を定量した。
【００５３】
１次選抜された１０種の菌株をＢＨＩ液体培地に０．１％ずつ接種した後、３７℃、２００ｒｐｍで１５時間培養して菌株を活性化させた。亜硝酸含有培地（ＮａＮＯ２０．５ｇ／Ｌ、 ＮａＨ２ＰＯ４ １３．５ｇ／Ｌ、 Ｋ２ＨＰＯ４ ０．７ｇ／Ｌ、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／Ｌ、 ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１８ｇ／Ｌ、 ＮａＨＣＯ３ ０．５ｇ／Ｌ、 ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ０．０１４ｇ／Ｌ、 ｇｌｕｃｏｓｅ ０．５ｇ／Ｌ）に活性化された菌を１％接種し、３７℃、２００ｒｐｍで培養した。培養過程中、６時間、９時間、１２時間、２４時間、３０時間の培養液を採取して遠心分離した後、培養上澄液だけを回収した。回収された培養上澄液の亜硝酸の残余量を定量した。
【００５４】
その結果、図２に示したとおり、亜硝酸含有培地で選抜菌株１０種は全て培養上澄液内の亜硝酸含量が減少されたことを確認でき、特に１０２番、１０９番、２５１番、２５３番、２６８番の菌株は培養初期の６時間目から亜硝酸の含量が急激に減っていくことを確認した。亜硝酸の酸化有無をするため、亜硝酸が存在するとき色反応を表す指示薬を添加して色反応を観察した結果、亜硝酸を含有する初期培地では濃い紫色が観察され、培養が終了して採取した各サンプルでは培養上澄液の変色がなかった。即ち、次選抜菌株が亜硝酸を酸化させることにより、亜硝酸が酸化されて存在しないことを分かった。
【００５５】
（３）生長性の評価
水質環境は、好気、通性嫌気、嫌気的条件が共存し、特に嫌気的条件でアンモニアが硝酸に酸化するアナモックス（Anammox、嫌気的条件でアンモニアが硝酸に酸化する過程）が行われるため選抜菌株が多様な条件で生長することは重要な因子の一つである。そして、１次選抜菌株１０種に対し、通性嫌気と嫌気条件においての生長性を評価した。
【００５６】
１次選抜菌株１０種をＢＨＩ液体培地に０．１％ずつ接種した後、３７℃の通性嫌気、嫌気的条件で２４時間培養を行った。選抜菌株の大部分は通性嫌気、嫌気的条件で全て生長することを確認し、特に２５３番と３６８番の菌株が嫌気的条件における生長性が優秀であり、２８３番の菌株は通性嫌気的条件における生長性が最も優秀であった（図３）。そして、通性嫌気と嫌気的条件においての生長性が優秀であった２５３番、２６８番、２８３番の菌株を２次選抜した。
【００５７】
（４）耐塩性の評価
淡水条件と海水条件における菌株の活性を評価するため、塩化ナトリウムが添加された培地で２次選抜された菌株の生長性評価を行った。
【００５８】
塩化ナトリウムが０％、３％、５％、１０％添加されたＢＨＩ液体培地に、選抜された候補菌株３種を０．１％ずつ接種し、３７℃、２００ｒｐｍで培養した。培養過程中、８時間、１０時間、２２時間目の各サンプルを採取し、吸光度を測定した。
【００５９】
その結果、図４に示したとおり、菌株３種全て３％塩化ナトリウム添加培地で菌が増殖することを確認し、２８３番の菌株は５％の塩化ナトリウム添加培地で他の菌株より生長性が優秀であった。したがって、２次選抜された３種の菌株、即ち、２５３、２６８、２８３は、淡水条件だけでなく、海水条件でもその適用が可能であることを確認した。
【００６０】
実施例３：in vivo評価と最終菌株選抜
２次選抜された菌株３種に対する水質浄化能力をヒラメ稚魚をに評価した。ヒラメ稚魚に市販飼料を満腹で供給した後、実験水槽（６４Ｌ）でランダムに配置した。実験魚を鉢した後、全ての実験飼育水槽の飼育水を綺麗に換水し、０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９２時間、１２０時間目に各々５０ｍｌずつ飼育水をサンプリングした。２次選抜菌株の投与の２４時間の間隔で約３ｍｌに１ｘ１０５ＣＦＵ菌数になるよう希釈した後、水槽に５日間投与した。対照区の場合は同量の海水を投与した。サンプルを採取してアンモニアの濃度を分析し、分析して残った海水サンプルは−２０℃で保管した後、亜硝酸塩と硝酸塩の分析に用いた。水質分析は、アンモニア、亜硝酸塩、硝酸塩の３つの項目を分析した。これらの分析は水質分析器（RQflex 10、Merck、ドイツ）を利用し、キットの試薬と各々反応した後分析した。
【００６１】
実験結果、７２時間目からアンモニアの除去効果が表れ（図５）、１２０時間目はもっと大きな差を見せた。１４０時間後には全体水槽でアンモニア毒性による斃死が起こり始めた。２次選抜された菌株３種中、２５３番と２８３番の菌株が対照区に比べて有意的に高いアンモニア除去効果を示し、斃死率も対照区より低い斃死率を示し、飼育水（ヒラメ（魚）を飼育する際用いる水）内のアンモニアと亜硝酸の酸化菌株の添加はヒラメの生存率を高めることがわかった。したがって、ヒラメ飼育において、アンモニア除去効果が優秀で、通性嫌気と嫌気条件における生長性が優秀であった２８３番菌株を最終選抜した。
【００６２】
実施例４：選抜菌株の同定と生理・生化学的特性の調査
（１）形態学的、生化学的特性の調査
最終選抜された菌株の種定のため、１次的に形態学的、生化学的調査を行った。形態的特徴において、グラム染色結果グラム陽性であり、電子顕微鏡撮影の結果桿菌であることを確認した（図６）。生化学的特性を分析するためＡＰＩ５０ ＣＨＢ system（Biomerieux、フランス）で菌株の糖発酵パターンを分析した（表２）。
【００６３】
【表２】
2015517807.tif 000004
【００６４】
（１）菌株の同定
正確な菌株同定をするため、ＤＮＡ塩基配列による分子系統分類学的方法を行った。塩基配列分析はＰＣＲ premix（バイオニア、韓国）とユニバーサルプライマー２７Ｆ（５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣMＴＧＧＣＴＣＡＧ３’：配列番号２）、及び１４９２Ｒ（５’ＧＧYＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ ３’：配列番号３）を用いて、１６ｓ ｒＤＮＡの遺伝子を増幅した。遺伝子増幅の際、総反応液は２０μｌに合わせて、９４℃で１分、５６℃で１分、７２℃で１分を３０回繰り返し、増幅されたＤＮＡ塩基配列を分析した。分離菌株の分析された１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列は配列番号１に示す。前記分析結果、バチルス・リケニフォルミスと９６％の相同性を有する微生物として同定された。よって、選抜された前記菌株をバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３に命名し、前述の方法により同定された本発明の新たな微生物は、２０１２年３月２２日、韓国微生物保存センターに、"Bacillus licheniformis ＣＪＭＰＢ２８３"として寄託された（寄託番号ＫＣＣＭ１１２７０Ｐ）。
【００６５】
実施例５：バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３菌株のプロバイオティクス特性を分析
（１）分離菌株の消化酵素活性
１）助酵素液の採取
前記分離した菌株をＢＨＩ液体培地で、２４時間培養した後、培養液を酵素活性の分析のための助酵素液にして、下記の通り各酵素別に各々の基質が入っている培地を用いて基質分解の程度を判定した。
【００６６】
２）プロテアーゼ（Protease）活性
脱脂粉乳（skim milk、Sigma、USA）を２％添加したＹＭ（Difco、USA）培地を製造した。上記で採取した助酵素液２μｌを基質培地に分株し、３７℃で１５時間反応した後、透明環（clear zone）形成の程度により酵素活性能力を測定した。
【００６７】
３）セルラーゼ（Cellulase）活性
１％ＣＭＣ（carboxyl methyl cellulose）基質が添加されたＹＭ培地を製造した。上記で採取した助酵素液を２μｌずつ基質培地に分株し、３７℃で１５時間反応した後、０．２％のコンゴーレッド（Congo red）水溶液で３０分間染色し、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液で脱色した。助酵素液周囲の基質が分解されて生じる透明環（clear zone）の形成程度により酵素の活性能力を測定した。
【００６８】
４）アミラーゼ（Amylase）活性
１％の可溶性デンプン（soluble starch）基質が添加されたＹＭ培地を製造した。上記で採取した助酵素液を３μｌずつ基質培地に分株したし、３７℃で１５時間反応した。Ｉ２とＫＩが各々０．１％、２％添加された水溶液で染色した後、助酵素液周囲の基質が分解されて生じる透明環（clear zone）の形成程度により酵素の活性能力を測定した。
【００６９】
最終選抜された前記菌株バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３は、表３に示したとおり、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼに対する消化酵素活性を有した。特に、プロテアーゼに対する活性が優秀であった。
【００７０】
【表３】
2015517807.tif 000005
【００７１】
（２）内生胞子の形成能
バチルスは、必須栄養源の中で一つ以上の栄養源が枯渇するなどのストレスを受けると生存のため内生胞子を形成する。内生胞子は、紫外線、高温、低温、乾燥、及び高圧などの極限環境に抵抗性を有するため、内生胞子の形成はバチルスの生存率を維持することにおいて非常に重要である。よって、バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３を長時間培養し、内生胞子の形成能を確認した。
【００７２】
ＢＨＩ液体培地に菌を０．１％接種し、３７℃、２００ｒｐｍで２４時間、４８時間培養した。各時間帯別に培養液をＢＨＩ固体培地に塗抹して総菌数を測定し、９５℃で１０分間熱処理した培養液をＢＨＩアガー（Agar）培地に塗抹して、内生胞子の数を測定した。
【００７３】
上記表４に示した通り、バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３を２４時間培養したとき約２４．５％が内生胞子を形成し、４８時間培養したときには１００％が内生胞子を形成した。本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３は、４８時間以上培養するとき、高い内生胞子形成能を有し、プロバイオティクスとして使用したら、高い生存率の特性を維持することができる。
【００７４】
【表４】
2015517807.tif 000006
【００７５】
本発明新たに分離したバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３は、アミラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼなどの消化酵素生産が優秀で、アンモニアと亜硝酸に対する酸化効果が優秀であり、養魚と海老の養殖段階で、プロバイオティクスと水質改善の効果がある。したがって、新たに分離したバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３は、プロバイオティクスとして利用できるだけでなく、水質改善剤としても利用できる。
【図１】
2015517807.tif 000007
【図２】
2015517807.tif 000008
【図３】
2015517807.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年10月9日(2014.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化酵素を生産し、アンモニアと亜硝酸の酸化能力を有する、バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３（Bacillus licheniformis ＣＪＭＰＢ２８３）。
【請求項２】
バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３の培養液、その濃縮液、及びその乾燥物からなる群より選択された少なくとも一つの、バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３の培養物。
【請求項３】
請求項１に記載のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３、又は請求項２に記載の培養物を含む、プロバイオティクス製剤。
【請求項４】
請求項３に記載のプロバイオティクス製剤を含む、水産養殖用の飼料添加剤。
【請求項５】
バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３（bacillus licheniformis ＣＪＭＰＢ２８３）、その培養液、その濃縮液、又はその乾燥物を含む、水産養殖用の水質改善剤。
【請求項６】
養殖場において養殖前、又は養殖段階中に、請求項５に記載の水質改善剤を撒布する、前記養殖場の水質改善方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
養殖業は多くの国で主要な経済的手段であり、養殖魚類の疾病発生は経済的発展に大きく影響を及ぼす（非特許文献１）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
一般的に、養殖魚類に発病する疾病と水質改善のために抗生剤、抗菌剤、化工薬品を使用するが、これらの過度な使用により耐性菌の増加と体内残留をはじめ、周辺の水質汚染のどの問題が発生し、その使用を制限している現状である。また、水産食品の抗生剤使用有無に関する消費者の関心が高まることに従い、抗生剤の使用を根源的に遮断するため、有機酸、生菌剤、非特異免疫増強剤、天然物質などの代替物質の開発が盛んに行われている（魚類疾病の診断と治療対策、海洋水産部、２００１）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
水質改善の目的で用いられている物質と微生物に関する先行技術を調べると、特許文献１には亜硝酸塩−酸化バクテリアを利用し水生環境で亜硝酸塩の蓄積を予防・緩和する方法が開示されている。前記亜硝酸塩−酸化バクテリアはニトロコッカス（Nitrococcus）とニトロスピラ（Nitrospira）である。また、特許文献２には、従属栄養アンモニア酸化バクテリアを利用して廃水から炭素と窒素汚染物質を除去する方法を開示し、前記文献で開示された栄養アンモニア酸化バクテリアは、バチルス・シュードファーマスＮＨ−２（Bacillus pseudofimus NH-2）、アルスロバクター・グロビフォルミスＷＲ−２（Arthrobacter globiformis ER-2）を意味する。上記の文献で開示されたニトロコッカスとニトロスピラはＧＲＡＳ菌株ではないためプロバイオティクスとして使用できず、古細菌に属するため生産が非常に難しいので、産業上の利用が不可能である。また、ＧＲＡＳ菌株と知られているバチルス・シュードファーマスＮＨ−２はプロバイオティクスとして登録されてない菌株である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明者らは、韓国の伝統的発酵食品であるテンジャンから、消化酵素活性を有してアンモニアと亜硝酸を酸化させる菌株を分離し、当該菌株の形態学的、生化学的、遺伝的特性を確認し、本発明を完成させた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明の新たに分離した菌株は、通常的なバチルス菌株の培養方法により培養することができる。培地は、天然培地、又は合成培地を用いることができる。培地の炭素原は、例えば、グルコース、スクロース、デキストリン、グリセロール、デンプンなどがあり、窒素原としてペプトン、肉類抽出物、酵母抽出物、乾燥された酵母、大豆、アンモニウム塩、硝酸塩、及びその他の有機・無機窒素含有化合物などがあるが、これらの成分に限らない。培地に含まれる無機塩は、マグネシウム、マンガン、カルシウム、鉄、燐などがあるが、これらの成分に限らない。前記炭素原、窒素原、及び無機塩の成分以外に、アミノ酸、ビタミン、核酸、及びそれに関わる化合物が培地に添加され得る。本発明の新たに分離した菌株は、２０〜４０℃の温度条件範囲で１２時間〜４日間培養することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
具体的に、新たに分離した菌株の培養液は菌体を含む培養原液であることもできるし、前記培養原液から培養上澄液を除去した液、及び／又は、それの濃縮液であり得る。前記培養液の組成には通常のバチルス培養に必要な成分だけでなく、バチルスの生長に上昇的に作用する成分をさらに含むこともでき、それによる組成は当該技術分野において通常の知識を有する者により容易に選択できる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
通常的に、バチルス種は、内生胞子を形成し熱に非常に安定的特徴を有する。したがって、新たに分離した前記バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３は、飼料添加剤形態に別に製造して飼料に混合するか、飼料製造のときに直接添加して製造することができる。本発明の飼料内のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３は、液状、又は乾燥状態であることができ、好ましくは乾燥された粉末形態である。乾燥方法は、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥ができるが、これらに限定されない。本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３は粉末形態で、飼料重量の０．０５ないし１０重量％、好ましくは０．１ないし１重量％の成分比で混合できる。また、前記水産養殖用の飼料添加剤は、本発明の他に飼料の保存性を高められる通常の添加剤をさらに含むことができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
本発明の飼料には、植物性として、穀物類、根果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、油脂類、澱粉類、フクベ類、穀物副産物類など、動物性としてタンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、単細胞タンパク質、動物性プランクトン類、魚粉などがあり、これらに限定されない。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
本発明の飼料添加剤を含む水産養殖用飼料の配合組成物は、前記飼料添加剤を動物飼料に乾燥重量を基準として０．０５ないし０．５重量％混合する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
本発明の新たに分離したバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３は、水産養殖環境内に存在するアンモニアと亜硝酸の含量を減少させることに利用できる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
実施例１：アンモニアと亜硝酸の酸化菌株を分離
（１）試料の用意と菌株の分離
韓国の伝統食品であるテンジャン、メジュ、醤油などから名品醤類由来菌株を用意した。用意した試料を３％塩化ナトリウムが添加されたＢＨＩ個体培地（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）に塗抹した後、３７℃の条件で２４時間培養した。各試料から分離された菌株は、コロニー観察によりグループ化して菌株を分離した。選別されたコロニーは３回にわたって新しい培地に移して培養する方法により再分離し、純粋培養した菌を２０％グリセロールが添加された培地に入れ、−７０℃以下で保存した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
その結果、図１のとおり、アンモニア含有培地で選抜菌株１０種すべて培養上澄液内のアンモニア含量が減少したことを確認でき、特に２８３番、２９６番、３０３番、３９６番の菌株は培養初期である６時間目からアンモニアの含量が急激に減っていくことを確認した。アンモニアの酸化により亜硝酸が生成されたかを確認するため、亜硝酸が存在するとき色反応を表す指示薬を添加して色反応を観察した結果、アンモニアを含む初期培地からは色変化観察されず、培養が終了したとき採取した各サンプルでは、培養上澄液の色が全て濃い紫色に変わった。これによって、１次選抜菌株は全てアンモニアを亜硝酸に酸化させることがわかった。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
（２）１次選抜菌株における亜硝酸の定量評価
１次選抜菌株の亜硝酸酸化による低減効果を評価するため、前記選抜菌株１０種に対して、亜硝酸が添加された培地から定量して亜硝酸の消耗量を定量した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
その結果、図２に示したとおり、亜硝酸含有培地で選抜菌株１０種は全て培養上澄液内の亜硝酸含量が減少したことを確認でき、特に１０２番、１０９番、２５１番、２５３番、２６８番の菌株は培養初期の６時間目から亜硝酸の含量が急激に減っていくことを確認した。亜硝酸の酸化有無をするため、亜硝酸が存在するとき色反応を表す指示薬を添加して色反応を観察した結果、亜硝酸を含有する初期培地では濃い紫色が観察され、培養が終了して採取した各サンプルでは培養上澄液の変色がなかった。即ち、次選抜菌株が亜硝酸を酸化させることにより、亜硝酸が酸化されて存在しないことが分かった。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
（３）生長性の評価
水質環境は、好気、通性嫌気、嫌気的条件が共存し、特に嫌気的条件でアンモニアが硝酸に酸化するアナモックス（Anammox、嫌気的条件でアンモニアが硝酸に酸化する過程）が行われるため選抜菌株が多様な条件で生長することは重要なのである。そして、１次選抜菌株１０種に対し、通性嫌気と嫌気条件においての生長性を評価した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
１次選抜菌株１０種をＢＨＩ液体培地に０．１％ずつ接種した後、３７℃の通性嫌気、嫌気的条件で２４時間培養を行った。選抜菌株の大部分は通性嫌気、嫌気的条件で全て生長することを確認し、特に２５３番と２６８番の菌株が嫌気的条件における生長性が優秀であり、２８３番の菌株は通性嫌気的条件における生長性が最も優秀であった（図３）。そして、通性嫌気と嫌気的条件においての生長性が優秀であった２５３番、２６８番、２８３番の菌株を２次選抜した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
実施例３：in vivo評価と最終菌株選抜
２次選抜された菌株３種に対する水質浄化能力をヒラメ稚魚で評価した。ヒラメ稚魚に市販飼料を満腹で供給した後、実験水槽（６４Ｌ）でランダムに配置した。実験魚を鉢した後、全ての実験飼育水槽の飼育水を綺麗に換水し、０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９２時間、１２０時間目に各々５０ｍｌずつ飼育水をサンプリングした。２次選抜菌株の投与の２４時間の間隔で約３ｍｌに１ｘ１０５ＣＦＵ菌数になるよう希釈した後、水槽に５日間投与した。対照区の場合は同量の海水を投与した。サンプルを採取してアンモニアの濃度を分析し、分析して残った海水サンプルは−２０℃で保管した後、亜硝酸塩と硝酸塩の分析に用いた。水質分析は、アンモニア、亜硝酸塩、硝酸塩の３つの項目を分析した。これらの分析は水質分析器（RQflex 10、Merck、ドイツ）を利用し、キットの試薬と各々反応した後分析した。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
実施例４：選抜菌株の同定と形態学的・生化学的特性の調査
（１）形態学的、生化学的特性の調査
最終選抜された菌株の種定のため、１次的に形態学的、生化学的調査を行った。形態的特徴において、グラム染色結果グラム陽性であり、電子顕微鏡撮影の結果桿菌であることを確認した（図６）。生化学的特性を分析するためＡＰＩ５０ ＣＨＢ system（Biomerieux、フランス）で菌株の糖発酵パターンを分析した（表２）。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
（２）菌株の同定
正確な菌株同定をするため、ＤＮＡ塩基配列による分子系統分類学的方法を行った。塩基配列分析はＰＣＲ premix（バイオニア、韓国）とユニバーサルプライマー２７Ｆ（５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣMＴＧＧＣＴＣＡＧ３’：配列番号２）、及び１４９２Ｒ（５’ＧＧYＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ ３’：配列番号３）を用いて、１６ｓ ｒＤＮＡの遺伝子を増幅した。遺伝子増幅の際、総反応液は２０μｌに合わせて、９４℃で１分、５６℃で１分、７２℃で１分を３０回繰り返し、増幅されたＤＮＡ塩基配列を分析した。分離菌株の分析された１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列は配列番号１に示す。前記分析結果、バチルス・リケニフォルミスと９６％の相同性を有する微生物として同定された。よって、選抜された前記菌株をバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ２８３に命名し、前述の方法により同定された本発明の新たな微生物は、２０１２年３月２２日、韓国微生物保存センターに、"Bacillus licheniformis ＣＪＭＰＢ２８３"として寄託された（寄託番号ＫＣＣＭ１１２７０Ｐ）。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
４）アミラーゼ（Amylase）活性
１％の可溶性デンプン（soluble starch）基質が添加されたＹＭ培地を製造した。上記で採取した助酵素液を３μｌずつ基質培地に分株し、３７℃で１５時間反応した。Ｉ２とＫＩが各々０．１％、２％添加された水溶液で染色した後、助酵素液周囲の基質が分解されて生じる透明環（clear zone）の形成程度により酵素の活性能力を測定した。
【国際調査報告】
2015517807.tif 000013
2015517807.tif 000014
2015517807.tif 000015
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