(57)【要約】  本発明は多能性細胞を処理するための方法を目的とし、ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤で多能性細胞を処理することによって、多能性細胞を培養において効果的に増殖させ、かつ分化させることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性細胞を増殖及び分化させるための方法であって、
ａ．多能性細胞を培養する工程と、
ｂ．該多能性細胞をＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤で処理する工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記多能性細胞が、胚性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多能性細胞が、胚性幹細胞由来の多能性マーカーを発現している細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
多能性マーカーを発現している前記細胞が、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦｏｘＤ３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４５、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ−２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、及びＴｒａ１−８１からなる群から選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記多能性細胞が、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記多能性細胞が、約１〜約７２時間、前記ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤で処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記多能性細胞が、約１２〜約４８時間、前記ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤で処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記多能性細胞が、約４８時間、前記ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤で処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤が、約１００ｎＭ〜約１００μＭの濃度で使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤が、約１μＭ〜約１０μＭの濃度で使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤が、約１０μＭの濃度で使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤が、式（Ｉ）の化合物である、請求項１に記載の方法。
【化１】
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【請求項１３】
Ｒ1が、フェニル、フェニル置換基がＣ1〜5アルキル、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル及びニトリルからなる群から選択される置換フェニル、又はピリミジニルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ2が、フェニル、フェニル置換基がＣ1〜5アルキル、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル及びニトリルからなる群から選択される置換フェニル、又は任意にＣ1〜4アルキル置換されたピリミジニルであり、Ｒ1及びＲ2の少なくとも１つが、ピリミジニルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ3が、水素、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、Ｃ1〜5アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アリールＣ1〜5アルキルオキシカルボニル、アリールＣ1〜5アルキル、１つ以上のアリール置換基が独立してＣ1〜5アルキル、Ｃ1〜5アルコキシ、ハロゲン、アミノ、Ｃ1〜5アルキルアミノ、及びジＣ1〜5アルキルアミノからなる群から独立して選択される置換アリールＣ1〜5アルキル、フタルイミドＣ1〜5アルキル、アミノＣ1〜5アルキル、ジアミノＣ1〜5アルキル、スクシンイミドＣ1〜5アルキル、Ｃ1〜5アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ1〜5アルキルカルボニルＣ1〜5アルキル及びアリールオキシカルボニルＣ1〜5アルキルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ4が、−（Ａ）−（ＣＨ2）q−Ｘである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
Ａが、ビニレン、エチニレン又は
【化２】
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である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒ5が、水素、Ｃ1〜5アルキル、フェニル及びフェニルＣ1〜5アルキルからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ｑが、０〜９である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
Ｘが、水素、ヒドロキシ、ビニル、１つ以上のビニル置換基がそれぞれフッ素、臭素、塩素及びヨウ素からなる群から選択される置換ビニル、または、エチニル、エチニル置換基がフッ素、臭素、塩素及びヨウ素からなる群から選択される置換エチニル、または、Ｃ1〜5アルキル、１つ以上のアルキル置換基がそれぞれ、Ｃ1〜5アルコキシ、トリハロアルキル、フタルイミド及びアミノからなる群から選択される置換Ｃ1〜5アルキル、または、Ｃ3〜7シクロアルキル、Ｃ1〜5アルコキシ、アルキル置換基が、フタルイミド及びアミノからなる群から選択される置換Ｃ1〜5アルコキシ、または、フタルイミドオキシ、フェノキシ、１つ以上のフェニル置換基がそれぞれＣ1〜5アルキル、ハロゲン及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択される置換フェノキシ、または、フェニル、１つ以上のフェニル置換基がそれぞれ、Ｃ1〜5アルキル、ハロゲン及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択される置換フェニル、または、アリールＣ1〜5アルキル、１つ以上のアリール置換基がそれぞれＣ1〜5アルキル、ハロゲン及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択される置換アリールＣ1〜5アルキル、または、アリールオキシＣ1〜5アルキルアミノ、Ｃ1〜5アルキルアミノ、ジＣ1〜5アルキルアミノ、ニトリル、オキシム、ベンジルオキシイミノ、Ｃ1〜5アルキルオキシイミノ、フタルイミド、スクシンイミド、Ｃ1〜5アルキルカルボニルオキシ、フェニルカルボニルオキシ、１つ以上のフェニル置換基がそれぞれ、Ｃ1〜5アルキル、ハロゲン及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択される置換フェニルカルボニルオキシ、または、１つ以上のフェニル置換基がそれぞれ、Ｃ1〜5アルキル、ハロゲン及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択されるフェニルＣ1〜5アルキルカルボニルオキシ、または、アミノカルボニルオキシ、Ｃ1〜5アルキルアミノカルボニルオキシ、ジＣ1〜5アルキルアミノカルボニルオキシ、Ｃ1〜5アルコキシカルボニルオキシ、１つ以上のアルキル置換基がそれぞれメチル、エチル、イソプロピル及びヘキシルからなる群から選択される置換Ｃ1〜5アルコキシカルボニルオキシ、または、フェノキシカルボニルオキシ、１つ以上のフェニル置換基がそれぞれＣ1〜5アルキル、Ｃ1〜5アルコキシ及びハロゲンからなる群から選択される置換フェノキシカルボニルオキシ、または、Ｃ1〜5アルキルチオ、アルキル置換基がヒドロキシ及びフタルイミドからなる群から選択される置換Ｃ1〜5アルキルチオ、または、Ｃ1〜5アルキルスルホニル、フェニルスルホニル、１つ以上のフェニル置換基がそれぞれ、臭素、フッ素、塩素、Ｃ1〜5アルコキシ及びトリフルオロメチルからなる群から選択される置換フェニルスルホニル（Ａが、
【化３】
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ｑが、０、Ｘが、Ｈである場合に、Ｒ3が２−（トリメチルシリル）エトキシメチルでなくてもよいという条件で）、並びに製薬的に許容可能なそれらの塩からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
Ｒ1が、置換フェニルであり、Ｒ2が、ピリミジン−３−イルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
Ｒ1が、４−フルオロフェニルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
Ｒ3が、水素、アリールＣ1〜5アルキル、又は置換アリールＣ1〜5アルキルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｒ3が、水素又はフェニルＣ1〜5アルキルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
Ａが、エチニレンであり、ｑが、０〜５である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
Ｘが、スクシンイミド、ヒドロキシ、メチル、フェニル、Ｃ1〜5アルキルスルホニル、Ｃ3〜6シクロアルキル、Ｃ1〜5アルキルカルボニルオキシ、Ｃ1〜5アルコキシ、フェニルカルボニルオキシ、Ｃ1〜5アルキルアミノ、ジＣ1〜5アルキルアミノ又はニトリルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
式Ｉの前記化合物が、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシブチン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジル）イミダゾールである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤が、式（ＩＩ）の化合物である、請求項１に記載の方法。
【化４】
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【請求項２９】
Ｒが、Ｒa、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒa、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒa、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒa及びシアノからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｒaが、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
Ｒ1が、水素、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（アリール−Ｒ8）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−ＳＯ2（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−シクロアルキル−Ｒ6、−ヘテロシクリル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6、及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から選択され、ヘテロシクリル及びヘテロアリールは、ヘテロシクリル又はヘテロアリール環炭素原子を介して１つの位置でアザインドール窒素原子に接続する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
Ｒ5が、水素、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨ、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＳＯ2−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＣＯ2Ｈ、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル）、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ2、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−シクロアルキル−Ｒ6、−ヘテロシクリル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から独立して選択される１〜２つの置換基である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｒ6が、炭素原子に接続する場合に、Ｒ6が、−Ｃ1〜8アルコキシ、−（Ｃ1〜8）アルコキシ−（ハロ）1〜3、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から更に選択される、という条件で、Ｒ6が、水素、−Ｃ1〜8アルキル、−Ｃ2〜8アルケニル、−Ｃ2〜8アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8)アルキル）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ−Ｒ7、−（Ｃ1〜8）アルキル−（ハロ）1〜3、−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨ、−アリール−Ｒ8、−（Ｃ1〜8）アルキル−アリール−Ｒ8及び−（Ｃ1〜8）アルキル−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される、炭素又は窒素原子に接続した１〜４つの置換基である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
Ｒ7が、水素、−Ｃ1〜8アルキル、−Ｃ2〜8アルケニル、−Ｃ2〜8アルキニル、−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨ、−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ2、−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｃ（Ｎ）−ＮＨ2、−シクロアルキル−Ｒ8、−（Ｃ1〜8）アルキル−ヘテロシクリル−Ｒ8、−アリール−Ｒ8、−（Ｃ1〜8）アルキル−アリール−Ｒ8及び−（Ｃ1〜8）アルキル−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される２つの置換基である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
Ｒ8が、炭素原子に接続する場合に、Ｒ8が、−Ｃ1〜8アルコキシ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、シアノ、ハロ、−（Ｃ1〜8）アルコキシ−（ハロ）1〜3、ヒドロキシ及びニトロからなる群から更に選択されるという条件で、水素、−Ｃ1〜8アルキル、−（Ｃ1〜8）アルキル−（ハロ）1〜3及び−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨからなる群から独立して選択される、炭素又は窒素原子に接続した１〜４つの置換基である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
Ｒ9が、水素、−Ｃ1〜8アルコキシ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、シアノ、（ハロ）1〜3、ヒドロキシ及びニトロからなる群から独立して選択される１〜２つの置換基である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
Ｒ2が、Ｒ2が炭素原子に接続する場合、Ｒ2が、−Ｃ1〜8アルコキシ−Ｒ5、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−ヘテロシクリル−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から更に選択されるという条件で、水素、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（アリール−Ｒ8）、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロシクリル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−シクロアルキル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ−Ｒ7からなる群から選択される、炭素又は窒素原子に接続した１つの置換基である、実施例２８に記載の方法。
【請求項３８】
Ｒ3が、水素、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜8アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロシクリル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−Ｒ8、−ヘテロシクリル−Ｒ8、−アリール−Ｒ8及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される、炭素原子に接続した１〜３つの置換基である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
Ｒ10が、水素、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、シアノ、（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、ニトロ及びオキソからなる群から独立して選択される１〜２つの置換基である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
Ｒ4が、水素、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜8アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロシクリル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ10、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−Ｒ8、−ヘテロシクリル−Ｒ8、−アリール−Ｒ8及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される、炭素原子に接続した１〜４つの置換基である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
Ｒ10が、水素、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、シアノ、（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、ニトロ及びオキソからなる群から独立して選択される１〜２つの置換基である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
Ｙ及びＺが、Ｏ、Ｓ、（Ｈ，ＯＨ）及び（Ｈ，Ｈ）（Ｙ及びＺの一方が、Ｏであり、他方が、Ｏ、Ｓ、（Ｈ，ＯＨ）及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から選択されるという条件で）、並びに製薬的に許容可能なそれらの塩からなる群から独立して選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
Ｒが、Ｒa、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒa、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒa、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒa及びシアノからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４４】
Ｒaが、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４５】
Ｒaが、ジヒドロ−ピラニル、フェニル、ナフチル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、アザインドリル、インダゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ジベンゾフリル及びジベンゾチエニルからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４６】
Ｒ1が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（アリール−Ｒ8）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−シクロアルキル−Ｒ6、−ヘテロシクリル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から選択され、ヘテロシクリル及びヘテロアリールが、ヘテロシクリル又はヘテロアリール環炭素原子を介して１つの位置でアザインドール窒素原子に接続する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４７】
Ｒ1が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5、−アリール−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から選択され、ヘテロアリールが、ヘテロアリール−環炭素原子を介して、１つの位置でアザインドール窒素原子に接続する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４８】
Ｒ1が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5及び−ナフチル−Ｒ6からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４９】
Ｒ5が、水素、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨ、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＳＯ2−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＣＯ2Ｈ、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ2、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−シクロアルキル−Ｒ6、−ヘテロシクリル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から独立して選択される１〜２つの置換基である、請求項３１に記載の方法。
【請求項５０】
Ｒ5が、水素、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｎ−Ｒ7、ヒドロキシ及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から独立して選択される１〜２つの置換基である、請求項３１に記載の方法。
【請求項５１】
Ｒ5が、水素、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｎ−Ｒ7、ヒドロキシ、−イミダゾリル−Ｒ6、−トリアゾリル−Ｒ6及び−テトラゾリル−Ｒ6からなる群から独立して選択される１〜２つの置換基である、請求項３１に記載の方法。
【請求項５２】
Ｒ6が、炭素原子に接続する時に、Ｒ6が、−Ｃ1〜4アルコキシ、−（Ｃ1〜4）アルコキシ−（ハロ）1〜3、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から更に選択されるという条件で、Ｒ6が、水素、−Ｃ1〜4アルキル、−Ｃ2〜4アルケニル、−Ｃ2〜4アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ−Ｒ7、−（Ｃ1〜4）アルキル−（ハロ）1〜3、−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨ、−アリール−Ｒ8、−（Ｃ1〜4）アルキル−アリール−Ｒ8及び−（Ｃ1〜4）アルキル−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される、炭素又は窒素原子に接続した、１〜４つの置換基である、請求項３１に記載の方法。
【請求項５３】
Ｒ6が、水素である、請求項３１に記載の方法。
【請求項５４】
Ｒ7が、水素、−Ｃ1〜4アルキル、−Ｃ2〜4アルケニル、−Ｃ2〜4アルキニル、−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨ、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ2、−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｃ（Ｎ）−ＮＨ2、−シクロアルキル−Ｒ8、−（Ｃ1〜4）アルキル−ヘテロシクリル−Ｒ8、−アリール−Ｒ8、−（Ｃ1〜4）アルキル−アリール−Ｒ8及び−（Ｃ1〜4）アルキル−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される２つの置換基である、請求項３３に記載の方法。
【請求項５５】
Ｒ7が、水素、−Ｃ1〜4アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）及び−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2からなる群から独立して選択される２つの置換基である、請求項３３に記載の方法。
【請求項５６】
Ｒ8が、炭素原子に接続する時に、Ｒ8が、−Ｃ1〜4アルコキシ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ、ハロ、−（Ｃ1〜4）アルコキシ−（ハロ）1〜3、ヒドロキシ及びニトロからなる群から更に選択されるという条件で、Ｒ8が、水素、−Ｃ1〜4アルキル、−（Ｃ1〜4）アルキル−（ハロ）1〜3及び−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨからなる群から独立して選択される、炭素又は窒素原子に接続した、１〜４つの置換基である、請求項３１に記載の方法。
【請求項５７】
Ｒ8が、水素である、請求項３１に記載の方法。
【請求項５８】
Ｒ9が、水素、−Ｃ1〜4アルコキシ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ、（ハロ）1〜3、ヒドロキシ及びニトロからなる群から独立して選択される１〜２つの置換基である、請求項３１に記載の方法。
【請求項５９】
Ｒ9が、水素である、請求項３１に記載の方法。
【請求項６０】
Ｒ2が、炭素原子に接続する場合、Ｒ2が、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ5、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−ヘテロシクリル−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から更に選択されるという条件で、Ｒ2が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（アリール−Ｒ8）、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）ヘテロシクリル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）ヘテロアリール−Ｒ8、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−シクロアルキル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ−Ｒ7からなる群から選択される、炭素又は窒素原子に接続した１つの置換基である、請求項２８に記載の方法。
【請求項６１】
Ｒ2が窒素原子に接続する場合に、クオタニウム塩が形成されないという条件、及びＲ2が炭素原子に接続する場合に、Ｒ2が、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ5、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−ヘテロシクリル−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から更に選択されるという条件で、Ｒ2が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ5、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−シクロアルキル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ−Ｒ7からなる群から選択される、炭素又は窒素原子に接続した１つの置換基である、請求項２８に記載の方法。
【請求項６２】
Ｒ2が窒素原子に接続する場合に、クオタニウム塩が形成されないという条件、及びＲ2が炭素原子に接続する場合、Ｒ2が、−Ｎ−Ｒ7、ハロゲン、ヒドロキシ及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から更に選択されるという条件で、Ｒ2が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5及び−アリール−Ｒ6からなる群から選択される、炭素又は窒素原子に接続した１つの置換基である、請求項２８に記載の方法。
【請求項６３】
Ｒ3が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）ヘテロシクリル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）ヘテロアリール−Ｒ8、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−Ｎ−Ｒ7、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−Ｒ8、−ヘテロシクリル−Ｒ8、−アリール−Ｒ8及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される、炭素原子に接続した１〜３つの置換基である、請求項２８に記載の方法。
【請求項６４】
Ｒ3が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−ＣＯ2Ｈ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ及びニトロからなる群から選択される、炭素原子に接続した１つの置換基である、請求項２８に記載の方法。
【請求項６５】
Ｒ3が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、ハロゲン及びヒドロキシからなる群から選択される、炭素原子に接続した１つの置換基である、請求項２８に記載の方法。
【請求項６６】
Ｒ4が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）ヘテロシクリル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ10、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−Ｒ8、−ヘテロシクリル−Ｒ8、−アリール−Ｒ8及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される、炭素原子に接続した１〜４つの置換基である、請求項２８に記載の方法。
【請求項６７】
Ｒ4が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−ＣＯ2Ｈ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル、−ヘテロシクリル、−アリール及び−ヘテロアリールからなる群から独立して選択される、炭素原子に接続した１〜４つの置換基である請求項２８に記載の方法。
【請求項６８】
Ｒ4が、水素、Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、ハロゲン及びヒドロキシからなる群から独立して選択される、炭素原子に接続した１〜４つの置換基である、請求項２８に記載の方法。
【請求項６９】
Ｒ4が、水素、Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、塩素、フッ素及びヒドロキシからなる群から独立して選択される、炭素原子に接続した１〜４つの置換基である、請求項２８に記載の方法。
【請求項７０】
Ｒ10が、水素、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ、（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、ニトロ及びオキソからなる群から独立して選択される１〜２つの置換基である、請求項３８及び４１に記載の方法。
【請求項７１】
Ｒ10が、水素及び（ハロ）1〜3からなる群から独立して選択される１〜２つの置換基である、請求項３８及び４１に記載の方法。
【請求項７２】
Ｒ10が、水素及び（フルオロ）3からなる群から独立して選択される１〜２つの置換基である、請求項３８及び４１に記載の方法。
【請求項７３】
Ｙ及びＺの一方が、Ｏであり、他方が、Ｏ、Ｓ、（Ｈ，ＯＨ）及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から選択されるという条件で、Ｙ及びＺが、Ｏ、Ｓ、（Ｈ，ＯＨ）及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から独立して選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項７４】
Ｙ及びＺの一方が、Ｏであり、他方が、Ｏ及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から選択されるという条件で、Ｙ及びＺが、Ｏ及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から独立して選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項７５】
Ｙ及びＺが、Ｏから独立して選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項７６】
式ＩＩの前記化合物が、３−［１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−［２−（トリフルオロメチル）フェニル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項７７】
式ＩＩの前記化合物が、３−［１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾ−ル−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項７８】
式ＩＩの前記化合物が、３−［１−（３−ヒドロキシ−プロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項７９】
式ＩＩの前記化合物が、３−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−４−［１−（３−ヒドロキシ−プロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−ピロール−２，５−ジオンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項８０】
式ＩＩの前記化合物が、４−｛３−［４−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル］−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル｝−ブチロニトリルである、請求項２８に記載の方法。
【請求項８１】
式ＩＩの前記化合物が、４−｛３−［４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾ−ル−３−イル）−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル］−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル｝−ブチロニトリルである、請求項２８に記載の方法。
【請求項８２】
式ＩＩの前記化合物が、３−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−４−（１−フェニチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−ピロール−２，５−ジオンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項８３】
前記ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤が、式（ＩＩＩ）の前記化合物である、請求項１に記載の方法。
【化５】
2015519085.tif 000077
【請求項８４】
Ａ及びＥが、水素置換炭素原子及び窒素原子からなる群から独立して選択され、
【化６】
2015519085.tif 000078
が、１Ｈ−インドール、１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン、１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン及び１Ｈ−インダゾールからなる群から独立して選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
Ｚが、Ｏから選択され、あるいはＺが、ジヒドロから選択され、それぞれの水素原子が、単結合によって接続する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
Ｒ4及びＲ5が、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ2〜8アルケニル及びオキソによって任意に置換されたＣ2〜8アルキニルから独立して選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
Ａ及びＥが、水素置換された炭素原子から選択される場合に、Ｒ2が、−Ｃ2〜8アルキニル−、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ2〜8）アルケニル−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ2〜8）アルキニル−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−（任意の前述のアルキル、アルケニル及びアルキニル連結基が、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ1〜8アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル及びオキソからなる群から独立して選択される１〜４つの置換基で任意に置換された直鎖炭素鎖であり、任意の前述のアルキル、アルケニル及びアルキニル連結基が、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル、ヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル、スピロシクロアルキル及びスピロヘテロシクリル（任意の前述のシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリール置換基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及び−Ｃ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択される、１〜４つの置換基で任意に置換され、任意の前述のヘテロシクリル置換基は、オキソで任意に置換される）からなる群から独立して選択される１〜２つの置換基で任意に置換される）、シクロアルキル（シクロアルキルは、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル）からなる群から独立して選択される、１〜４つの置換基で任意に置換される）、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）1〜5−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）1〜5−ＮＲ6−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）0〜5−Ｓ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6���Ｓ−、−ＮＲ6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ8−、−ＮＲ9−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ9−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）0〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）0〜6−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）0〜6−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）1〜6−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）0〜6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ7−、−ＮＲ6−Ｃ（ＮＲ7）−ＮＲ8−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−、−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−及び−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−（Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、水素、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される、置換基で置換される）、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル、ヘテロシクリル（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル及びヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル（前述のヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリール置換基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択される、１〜４つの置換基で任意に置換され、ヘテロシクリルはオキソで任意に置換される）、そしてＲ9が、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル、ヘテロシクリル（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル及びヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル（前述のヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリール置換基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択される１〜４つの置換基で任意に置換される）からなる基から選択され、ヘテロシクリルはオキソで任意に置換される）からなる群から独立して選択される）からなる群から選択される、という条件で、Ｒ2が、−Ｃ1〜8アルキル−、−Ｃ2〜8アルケニル−、−Ｃ2〜8アルキニル−、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ2〜8）アルケニル−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ2〜8）アルキニル−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−（任意の前述のアルキル、アルケニル及びアルキニル連結基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ1〜8アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル及びオキソからなる群から独立して選択される１〜４つ
の置換基で任意に置換された直鎖炭素鎖であり、任意の前述のアルキル、アルケニル及びアルキニル連結基は、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル、ヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル、スピロシクロアルキル及びスピロヘテロシクリル（任意の前述のシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリール置換基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及び−Ｃ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及び−Ｃ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択される１〜４つの置換基によって任意に置換され、任意の前述のヘテロシクリル置換基は、任意にオキソで置換される）からなる群から独立して選択される、１〜２つの置換基から任意に置換される）、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール（シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールは、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択される１〜４つの置換基で任意に置換され、ヘテロシクリルは、オキソで任意に置換される）、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）0〜5−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）0〜5−ＮＲ6−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）0〜5−Ｓ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−、−ＮＲ6−、−ＮＲ6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ8−、−ＮＲ6−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ6−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）0〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）0〜6−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）0〜6−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）1〜6−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）0〜6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ7−、−ＮＲ6−Ｃ（ＮＲ7）−ＮＲ8−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−、−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−及び−ＳＯ2−（Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、水素、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、���素及び−Ｃ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル、ヘテロシクリル（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル及びヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル（前述のヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリール置換基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択される１〜４つの置換基で任意に置換され、ヘテロシクリルはオキソで任意に置換される）からなる群から独立して選択される）からなる群から選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
Ｒ1及びＲ3が、水素、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ2〜8アルケニル、Ｃ2〜8アルキニル（アルキル、アルケニル及びアルキニルは、Ｃ1〜8アルコキシ、アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、（ハロ）1〜3、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル及びオキソからなる群から独立して選択される置換基で任意に置換される）、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシカルボニル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、Ｃ1〜8アルキルチオ、アリール、ヘテロアリール（アリール及びヘテロアリールはＣ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から選択される置換基で任意に置換される）、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ及びニトロ、並びに製薬的に許容可能なそれらの塩からなる群から独立して選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８９】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、６，７，９，１０，１２，１３，１５，１６−オクタヒドロ−２３Ｈ−５，２６：１７，２２−ジメテノ−５Ｈ−ジピリド［２，３−ｋ：３’，２’−ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０，１９］トリオキサジアザシクロヘンイコシン−２３，２５（２４Ｈ）−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項９０】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、１０，１１，１３，１４，１６，１７，１９，２０，２２，２３−デカヒドロ−９，４：２４，２９−ジメテノ−１Ｈ−ジピリド［２，３−ｎ：３’，２’−ｔ］ピロロ［３，４−ｑ］［１，４，７，１０，１３，２２］テトラオキサジアザシクロテトラコシン（−１，３（２Ｈ）−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項９１】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、１０，１１，１３，１４，１６，１７，１９，２０，２２，２３，２５，２６−ドデカヒドロ−９，４：２７，３２−ジメテノ−１Ｈ−ジピリド［２，３−ｑ：３’，２’−ｗ］ピロロ［３，４−ｔ］［１，４，７，１０，１３，１６，２５］ペンタオキサジアザシクロヘプタコシン−１，３（２Ｈ）−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項９２】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、６，７，９，１０，１２，１３−ヘキサヒドロ−２０Ｈ−５，２３：１４，１９−ジメテノ−５Ｈ−ジベンゾ［ｈ，ｎ］ピロロ［３，４−ｋ］［１，４，７，１６］ジオキサジアザシクロオクタデシン−２０，２２（２１Ｈ）−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項９３】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、６，７，９，１０、１２，１３，１５，１６−オクタヒドロ−２３Ｈ−５，２６：１７，２２−ジメテノ−５Ｈ−ジベンゾ［ｋ，ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０，１９］トリオキサジアザシクロヘネイコシン−２３，２５（２４Ｈ）−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項９４】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、１０，１１，１３，１４，１６，１７，１９，２０，２２，２３−デカヒドロ−９，４：２４，２９−ジメテノ−１Ｈ−ジベンゾ［ｎ，ｔ］ピロロ［３，４−ｑ］［１，４，７，１０，１３，２２］テトラオキサジアザシクロテトラコシン−１，３（２Ｈ）−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項９５】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、化合物１ａである、請求項８３に記載の方法。
【請求項９６】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、３−［１−［３−［（２−ヒドロキシエチル）メチルアミノ］プロピル］−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−４−［１−（３−ピリジニル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項９７】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、３，５−ジクロロ−Ｎ−［３−クロロ−４−［（３，４，１２，１２ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−［１，４］チアジノ［３，４−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１１（６Ｈ）−イル）カルボニル］フェニル］−ベンズアミドである、請求項８３に記載の方法。
【請求項９８】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、３−［１−（２−ヒドロキシ−エチル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−４−（１−ピリジン−３−イル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項９９】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、３−（２−メトキシ−フェニル）−４−（１−ピリジン−３−イル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１００】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、６−［［２−［［４−（２−４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリルである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１０１】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、３−（５−クロロ−１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−［１−（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−ピロール−２，５−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１０２】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、３−（５−クロロ−１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−［１−（３−［１，２，３］トリアゾール−１−イル−プロピル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−ピロール−２，５−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１０３】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、３−［１−（３−ヒドロキシ−プロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾ−ル−３−イル）−ピロール−２，５−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１０４】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、化合物１０ａである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１０５】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、３−［１−（３−ヒドロキシ−３−メチル−ブチル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−４−（１−ピリジン−３−イル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１０６】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、３−［１−（２−ヒドロキシ−エチル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−４−（１−ピリミジン−５−イル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１０７】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、３−［１−（２−ヒドロキシ−エチル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−４−（１−ピリミジン−５−イル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１０８】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、（１１Ｚ）−８，９，１０，１３，１４，１５−ヘキサヒドロ−２，６：１７，２１−ジ（メテノ）ピロロ［３，４−ｈ］［１，１５，７］ジオキサザシクロトリコシン−２２，２４（１Ｈ，２３Ｈ）−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１０９】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、３−（５−クロロ−１−ピリジン−３−イル−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−［１−（３−ヒドロキシ−プロピル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−ピロール−２，５−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１１０】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、３−（２−メトキシ−フェニル）−４−［１−（３−メトキシ−プロピル）−１Ｈ−ピロロ［３，２−ｃ］ピリジン−３−イル］−ピロール−２，５−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１１１】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、３−［１−（３−ヒドロキシ−プロピル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−４−［１−（テトラヒドロ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−ピロール−２，５−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１１２】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、２−｛３−［４−（５−クロロ−１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル］−インダゾール−１−イル｝−Ｎ−（２−ヒドロキシ−エチル）−アセトアミドである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１１３】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、４−（３−クロロ−フェニル）−６−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−２，４，６−トリアザ−シクロペンタ［ｃ］フッ素−１，３−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１１４】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、１４−エチル−６，７，９，１０，１３，１４，１５，１６−オクタヒドロ−１２Ｈ，２３Ｈ−５，２６：１７，２２−ジメテノジベンゾ［ｋ，ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０，１９］ジオキサトリアザシクロヘネイコシン−２３，２５（２４Ｈ）−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１１５】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、１４−ベンジル−６，７，９，１０，１３，１４，１５，１６−オクタヒドロ−１２Ｈ，２３Ｈ−５，２６：１７，２２−ジ（メテノ）ジベンゾ［ｋ，ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０，１９］ジオキサトリアザシクロヘンイコシン−２３，２５（２４Ｈ）−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１１６】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、３−（１−｛２−［２−（２−ヒドロキシ−エトキシ）−エトキシ］−エチル｝−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−［１−（２−ヒドロキシ−エチル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−ピロール−２，５−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１１７】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、６，７，８，９，１０，１１，１２，１３−オクタヒドロ−８，１１−ジメチル−５，２３：１４，１９−ジメテノ−２０Ｈ−ジベンゾ［ｋ，ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０］テトラアザシクロオクタデシン−２０，２２（２１Ｈ）−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１１８】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、７，８，９，１０，１２，１３，１６，１７，１８，１９−デカヒドロ−８，１７−ジメチル−１５Ｈ，２６Ｈ−５，２９：２０，２，５−ジメテノ−６Ｈ−ジベンゾ［ｋ，ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０，１９，２２］ジオキサテトラアザシクロテトラコシン−２６，２８（２７Ｈ）−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１１９】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、１４−（２−フリルメチル）−６，７，９，１０，１３，１４，１５，１６−オクタヒドロ−１２Ｈ，２３Ｈ−５，２６：１７，２２−ジ（メテノ）ジベンゾ［ｋ，ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０，１９］ジオキサトリアザシクロヘンイコシン−２３，２５（２４Ｈ）−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１２０】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、１４−（２−チエニルメチル）−６，７，９，１０，１３，１４，１５，１６−オクタヒドロ−１２Ｈ，２３Ｈ−５，２６：１７，２２−ジ（メテノ）ジベンゾ［ｋ，ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０，１９］ジオキサトリアザシクロヘンイコシン−２３，２５（２４Ｈ）−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１２１】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、１４−（１−ナフチルメチル）−６，７，９，１０，１３，１４，１５，１６−オクタヒドロ−１２Ｈ，２３Ｈ−５，２６：１７，２２−ジ（メテノ）ジベンゾ［ｋ，ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０，１９］ジオキサトリアザシクロヘンイコシン−２３，２５（２４Ｈ）−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１２２】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、１４−（ピリジン−４−イルメチル）−６，７，９，１０，１３，１４，１５，１６−オクタヒドロ−１２Ｈ，２３Ｈ−５，２６：１７，２２−ジ（メテノ）ジベンゾ［ｋ，ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０，１９］ジオキサトリアザシクロヘンイコシン−２３，２５（２４Ｈ）−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１２３】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、３−［１−（２−｛２−［２−（１，２，３，４−テトラヒドロ−ナフタレン−１−イルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−４−｛１−［２−（１，２，３，４−テトラヒドロ−ナフタレン−１−イルアミノ）−エチル］−１Ｈ−インドール−３−イル｝−ピロール−２，５−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１２４】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、３−［１−（３−ジメチルアミノ−フェニル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−４−［１−（２−ヒドロキシ−エチル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−ピロール−２，５−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１２５】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、３−［５−クロロ−１−（６−ジメチルアミノ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−４−［１−（２−ヒドロキシ−エチル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−ピロール−２，５−ジオンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１２６】
式（ＩＩＩ）の前記化合物が、５−（５−クロロ−３−｛４−［１−（２−ヒドロキシ−エチル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル｝−インドール−１−イル）−ニコチン酸メチルエステルである、請求項８３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、全ての目的のためにその全てが参照により本明細書に組み込まれている、２０１２年６月１４日に出願された、米国特許仮出願第６１／７４１，７７６号の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、多能性細胞を処理する方法に関し、本方法により、ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤で多能性細胞を処理することによって、多能性細胞を、培養において効率的に増殖させ、分化させることができる。
【背景技術】
【０００３】
Ｉ型真性糖尿病の細胞置換療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、インスリン産生細胞、または移植に適したβ細胞の供給源の開発に興味の焦点が当てられている。１つの手法として、例えば、胚性幹細胞のような多能性細胞から機能性β細胞を生成することがある。
【０００４】
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓等の組織は、内胚葉から中間段階を経て発達する。このプロセスにおける中間段階は、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞は、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ４、Ｍｉｘｌ１、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ−１７などの多くのマーカーを発現する。
【０００５】
膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により起こる。膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子、ＰＤＸ−１を発現する。ＰＤＸ−１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって、ＰＤＸ−１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程をマークしている。成熟した膵臓は、他の細胞型の中でも、外分泌組織及び内分泌組織を含む。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じる。
【０００６】
移植に十分な量の細胞物質を生成するには、培養において効率的に増殖することができ、かつ関心対象の組織、例えば、機能性β細胞に効率的に分化することができる、細胞物質の供給源が必要である。
【０００７】
ヒト胚性幹細胞を培養するための現在の方法は複雑であり、それらは、細胞がその多能性を失うことなく増殖するために、外生要因、つまり合成培地を利用する必要がある。更に、胚性幹細胞の分化により、培養中に細胞増殖の減少をもたらす場合が多い。
【０００８】
１つの例では、Ｃｈｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ  ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９，２００５）は、胚性幹細胞の自己複製を誘発することができる様々な成長因子で補充された無調整（unconditioned）血清代替（ＳＲ）培地中で胚性幹細胞が維持される無フィーダー、無血清培養システムを開示している。
【０００９】
別の例では、米国特許第２００５０２３３４４６号は、未分化の霊長類始原幹細胞を含む幹細胞の培養に有用な合成培地を開示している。溶液中、培地は、培養されている幹細胞と比較して実質的に等張である。所与の培養において、特定の培地は、基本培地と、実質的に未分化の始原幹細胞の増殖の支持に必要な、それぞれある量のｂＦＧＦ、インスリン、及びアスコルビン酸を含有する。
【００１０】
別の例では、国際公開第２００５０８６８４５号は、未分化の幹細胞を維持するための方法であって、幹細胞を、細胞を未分化の状態に維持するうえで充分な量のトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）ファミリーのメンバー、タンパク質の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバー、またはニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を得るうえで充分な時間暴露することを含む方法を開示している。
【００１１】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）の阻害剤が、成人幹細胞の繁殖と増殖を促進することが既知である。１つの例において、Ｔａｔｅｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２００７）３５２：６３５）は、ＧＳＫ−３の阻害によって、新生児または成人の心臓から回収され、間葉系の特性を有するヒト心性幹細胞（ｈＣＳＣ）の増殖と生存を亢進させることを示している。
【００１２】
例えば、Ｒｕｌｉｆｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ  １４４，６２４７〜６２５２，（２００７））は「Ｗｎｔシグナルが、島β細胞の増殖を刺激する」と記載している。
【００１３】
他の例において、国際公開第２００７０１６４８５号は、多能性成体前駆細胞を含む非胚性幹細胞の培養物にＧＳＫ−３阻害剤を添加すると、増殖中の多能性表現型を維持させ、その結果よりロバストな分化反応をもたらすことを報告している。
【００１４】
他の例において、米国特許第２００６０３００４２号は、フィーダー細胞層を利用せずに、胚性幹細胞を維持するために、ＷｎｔまたはＧＳＫ−３酵素活性の小分子阻害剤のいずれかの添加によって、ＧＳＫ−３を阻害する方法を使用している。
【００１５】
他の例において、国際特許第２００６０２６４７３号は、ｃ−ｍｙｃの転写活性化及びｃ−ｍｙｃタンパク質の安定化により、多能性細胞を安定化するために、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の添加を報告している。
【００１６】
他の例において、国際特許第２００６１００４９０号は、マウスまたはヒト胚性幹細胞を含む、多能性幹細胞の自己複製集団を維持するために、ＧＳＫ−３阻害剤及びｇｐ１３０アゴニストを含む幹細胞用培養培地の利用を報告している。
【００１７】
他の例において、Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００４）１０：５５〜６３）は、特定の薬理化合物を有するＧＳＫ−３の阻害により、胚性幹細胞の未分化の表現型を維持可能であり、Ｏｃｔ−３／４、Ｒｅｘ−１及びＮａｎｏｇのような多能性状態特異的転写因子の発現を持続可能であることを示している。
【００１８】
他の例において、Ｍａｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７）６：１１９８〜１２０８）は、ＧＳＫ−３阻害剤で処理された成人神経幹細胞が、特に、β−カテニン標的遺伝子の転写を促進し、アポトーシスを減少させることによって、神経分化を亢進させることを示している。
【００１９】
他の例において、Ｇｒｅｇｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２００５）１０４９：９７〜１０６）は、ＧＳＫ−３Ｂの阻害剤により、インビトロでの骨形成を亢進させることを報告している。
【００２０】
他の例において、Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２００４〜３２４：１３３３〜１３３９）は、胚性幹細胞からの造血分化は、Ｗｎｔが、ＧＳＫ３の天然阻害剤である場合にはＷｎｔ／β−カテニン経路の抑制を伴うことを示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
したがって、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞または膵臓ホルモン分泌細胞に分化する可能性を維持する一方で、現在の臨床上の必要性に対処するよう増殖できるよう多能性幹細胞を処理するための方法を開発する有意な必要性が今尚存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤で多能性細胞を処理することによって、多能性細胞を増殖及び分化するための方法を提供する。
【００２３】
一実施形態において、本発明は、多能性細胞を増殖及び分化させるための方法であって、
ａ．多能性細胞を培養する工程と、
ｂ．該多能性細胞をＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤で処理する工程と、を含む、方法を提供する。
【００２４】
一実施形態において、多能性細胞は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化する。
【００２５】
多能性細胞は、ヒト胚性幹細胞であってもよく、第６０／９１３４７５号に開示された方法に従って、ヒト胚性幹細胞由来の多能性マーカーを発現する細胞であってもよい。
【００２６】
一実施形態において、ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤は、式（Ｉ）の化合物である。
【００２７】
【化１】
2015519085.tif 000003
【００２８】
一実施形態において、ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤は、式（ＩＩ）の化合物である。
【００２９】
【化２】
2015519085.tif 000004
【００３０】
一実施形態において、ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤は、式（ＩＩＩ）の化合物である。
【００３１】
【化３】
2015519085.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】化合物＃２２１の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（図１Ａ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるＳｏｘ−１７の発現（図１Ｂ）に与える影響を示す。結果は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞（白色バー）、またはヒト胚性幹細胞株Ｈ９細胞（黒色バー）から得た。
【図２】化合物＃２０６の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（図２Ａ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるＳｏｘ−１７の発現（図２Ｂ）に与える影響を示す。結果は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞（白色バー）、またはヒト胚性幹細胞株Ｈ９細胞（黒色バー）から得た。
【図３】化合物＃２２３の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（図３Ａ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるＳｏｘ−１７の発現（図３Ｂ）に与える影響を示す。結果は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞（白色バー）、またはヒト胚性幹細胞株Ｈ９細胞（黒色バー）から得た。
【図４】化合物＃４７の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（図４Ａ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるＳｏｘ−１７の発現（図４Ｂ）に与える影響を示す。結果は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞（白色バー）、またはヒト胚性幹細胞株Ｈ９細胞（黒色バー）から得た。
【図５】化合物＃１０３の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（図５Ａ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるＳｏｘ−１７の発現（図５Ｂ）与える影響を示す。結果は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞（白色バー）、またはヒト胚性幹細胞株Ｈ９細胞（黒色バー）から得た。
【図６】化合物＃１３３の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（図６Ａ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるＳｏｘ−１７の発現（図６Ｂ）に与える影響を示す。結果は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞（白色バー）、またはヒト胚性幹細胞株Ｈ９細胞（黒色バー）から得た。
【図７】化合物＃１３６の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（図７Ａ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるＳｏｘ−１７の発現（図７Ｂ）に与える影響を示す。結果は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞（白色バー）、またはヒト胚性幹細胞株Ｈ９細胞（黒色バー）から得た。
【図８】化合物＃１９８の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（図８Ａ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるＳｏｘ−１７の発現（図８Ｂ）に与える影響を示す。結果は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞（白色バー）、またはヒト胚性幹細胞株Ｈ９細胞（黒色バー）から得た。
【図９】実施例８に記載した方法に従って、示される化合物で処理した細胞における、免疫蛍光染色法及びフローサイトメトリー分析によって測定された細胞の表面上のＣＸＣＲ４の発現を示す。
【図１０】実施例８に記載した方法に従って、示される化合物で処理した細胞における、リアルタイムＰＣＲによって測定されたＣＸＣＲ４（図１０Ａ）、ＨＮＦ−３β（図１０Ｂ）及びＳｏｘ−１７（図１０Ｃ）の発現を示す。
【図１１】ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、示される化合物の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（図１１Ａ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるＰｄｘ−１の発現（図１１Ｂ）に与える影響を示す。細胞を、実施例９に記載した方法に従って処理した。
【図１２】リアルタイムＰＣＲによって測定された、示される化合物の濃度範囲が、Ｐｄｘ−１の発現（白色バー）及びＨＮＦ−６（黒色バー）に与える影響を示す。細胞を、実施例９に記載した方法に従って処理した。
【図１３】ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、示される化合物の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（図１３Ａ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるインスリンの発現（図１３Ｂ）に与える影響を示す。細胞を、実施例１０に記載した方法に従って処理した。
【図１４】リアルタイムＰＣＲによって測定された、示される化合物の濃度範囲が、Ｐｄｘ−１の発現（白色バー）及びインスリン（黒色バー）に与える影響を示す。細胞を、実施例１０に記載した方法に従って処理した。
【図１５】ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、示される化合物の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（図１５Ａ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるインスリンの発現（図１５Ｂ）に与える影響を示す。細胞を、実施例１１に記載した方法に従って処理した。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、本発明の詳細な説明を、本発明の特定の特徴、実施形態、または用途を説明または図示した以下の小項目に分けて説明する。
【００３４】
定義
幹細胞は、単独の細胞レベルで自己複製し、分化して後代細胞を生成するという、これらの両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非複製前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉層（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞へと分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉層の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全てではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
【００３５】
幹細胞は、それらの発達能力により、（１）全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能性、（２）全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性、（３）細胞系列の小集合を生じるが、全て特定の組織、器官または生理的システム内で生じる能力を有することを意味する多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己複製）、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素（例えば、血小板）を含む子孫を産生できる）、（４）多能性幹細胞と比較して限定された細胞系列の小集合を生じる能力を有することを意味する寡能性、並びに（５）１つの細胞系列を生じる能力を有することを意味する単能性（例えば、精子形成幹細胞）に分類される。
【００３６】
分化は、専門化されていない（「中立の」）または比較的専門化されていない細胞が、例えば、神経細胞または筋細胞などの専門化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化細胞または分化を誘導された細胞は、細胞系列内でより専門化された（「傾倒した」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「傾倒した」は、通常の環境下で特定の細胞型または細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、またはより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系列内で比較的特殊化されて（または傾倒して）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用される場合、細胞系列は、細胞の遺伝、即ちその細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。ある細胞の系統とは、所定の発生及び分化の遺伝体系内にその細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、傾倒していない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。
【００３７】
「β−細胞系列」は、転写因子ＰＤＸ−１と、以下の転写因子、ＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、及びＰａｘ６の少なくとも１つとに関する遺伝子発現が陽性の細胞を指す。β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞を含む。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形（Brachyury）、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質（Mix-like homeobox protein）、ＦＧＦ４  ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９またはＯＴＸ２の少なくとも１つを発現する細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」は、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ−１α、ＨＮＦ−６、またはＨＢ９のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内胚葉細胞が挙げられる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞」は、ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、またはＰＴＦ−１αのマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す。膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞には、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、及び膵臓ホルモン分泌細胞、並びにβ−細胞系列の細胞を含む。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保有している細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわち、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ−１７、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭｉｘｌ１を発現する。
【００４２】
本明細書で言うところの「胚体外内胚葉」とは、以下のマーカー、すなわち、ＳＯＸ−７、ＡＦＰ、及びＳＰＡＲＣのうちの少なくとも１つを発現する細胞の集団を指して言う。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「マーカー」は、対象とする細胞での発現の仕方が異なる核酸またはポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸またはポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いかまたは低いことから、当該技術分野において知られる各種の方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「中内胚葉細胞」は、以下のマーカー、すなわち、ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ−１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６の少なくとも１つを発現する細胞を指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「膵臓内分泌細胞」または「膵臓ホルモン発現細胞」は、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの少なくとも１つを発現することができる細胞を指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「膵臓ホルモン分泌細胞」は、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを分泌できる細胞を指す。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「前原始線条細胞」は、以下のマーカー、すなわち、Ｎｏｄａｌ、またはＦＧＦ８の少なくとも１つを発現する細胞を指す。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「原始線条細胞」は、以下のマーカー、すなわち、短尾奇形（Brachyury）、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質またはＦＧＦ４のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。
【００４９】
一実施形態において、本発明は、多能性細胞をＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤で処理することを含む、多能性細胞の増殖及び分化のための方法を提供する。
【００５０】
一実施形態において、本発明は、多能性細胞を増殖及び分化させるための方法であって、
ｃ．多能性細胞を培養する工程と、
ｄ．該多能性細胞をＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤で処理する工程と、を含む、方法を提供する。
【００５１】
一実施形態において、多能性細胞は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化する。
【００５２】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形（Brachyury）、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４  ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。本発明において、胚体内胚葉系に特徴的な少なくとも１つのマーカーを発現する多能性細胞から由来する細胞が想到される。本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原始線条前駆細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【００５３】
多能性細胞を、約１〜７２時間、ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤で処理してもよい。あるいは、多能性細胞を、約１２〜約４８時間、ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤で処理してよい。あるいは、多能性細胞を、約４８時間、ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤で処理してよい。
【００５４】
一実施形態において、ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤を、約１００ｎＭ〜約１００μＭの濃度で使用する。あるいは、ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤を、約１μＭ〜約１０ｎＭの濃度で使用する。あるいは、ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤を、約１０μＭの濃度で使用する。
【００５５】
本発明の方法での使用に好適な化合物
一実施形態において、ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤は、式（Ｉ）の化合物
【００５６】
【化４】
2015519085.tif 000006
（式中、
Ｒ1は、フェニル、フェニル置換基がＣ1〜5アルキル、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル及びニトリルからなる群から選択される置換フェニル、またはピリミジニルであり、
Ｒ2は、フェニル、フェニル置換基がＣ1〜5アルキル、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル及びニトリルからなる群から選択される置換フェニル、または任意にＣ1〜4アルキル置換されるピリミジニルであり、Ｒ1及びＲ2の少なくとも１つが、ピリミジニルであり、
Ｒ3は、水素、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、Ｃ1〜5アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アリールＣ1〜5アルキルオキシカルボニル、アリールＣ1〜5アルキル、１つ以上のアリール置換基が独立してＣ1〜5アルキル、Ｃ1〜5アルコキシ、ハロゲン、アミノ、Ｃ1〜5アルキルアミノ及びジＣ1〜5アルキルアミノからなる群から独立して選択される置換アリールＣ1〜5アルキル、フタルイミドＣ1〜5アルキル、アミノＣ1〜5アルキル、ジアミノＣ1〜5アルキル、スクシンイミドＣ1〜5アルキル、Ｃ1〜5アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ1〜5アルキルカルボニルＣ1〜5アルキル及びアリールオキシカルボニルＣ1〜5アルキルであり、
Ｒ4は、−（Ａ）−（ＣＨ2）q−Ｘであり、
Ａが、ビニレン、エチニレン、または
【００５７】
【化５】
2015519085.tif 000007
であり、
Ｒ5は、水素、Ｃ1〜5アルキル、フェニル及びフェニルＣ1〜5アルキルからなる群から選択され、
ｑが、０〜９であり、
Ｘが、水素、ヒドロキシ、ビニル、１つ以上のビニル置換基がそれぞれフッ素、臭素、塩素及びヨウ素からなる群から選択される置換ビニル、または、エチニル、エチニル置換基がフッ素、臭素、塩素及びヨウ素からなる群から選択される置換エチニル、または、Ｃ1〜5アルキル、１つ以上のアルキル置換基がそれぞれ、Ｃ1〜5アルコキシ、トリハロアルキル、フタルイミド及びアミノからなる群から選択される置換Ｃ1〜5アルキル、または、Ｃ3〜7シクロアルキル、Ｃ1〜5アルコキシ、アルキル置換基が、フタルイミド及びアミノからなる群から選択される置換Ｃ1〜5アルコキシ、または、フタルイミドオキシ、フェノキシ、１つ以上のフェニル置換基がそれぞれＣ1〜5アルキル、ハロゲン及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択される置換フェノキシ、または、フェニル、１つ以上のフェニル置換基がそれぞれ、Ｃ1〜5アルキル、ハロゲン及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択される置換フェニル、または、アリールＣ1〜5アルキル、１つ以上のアリール置換基がそれぞれＣ1〜5アルキル、ハロゲン及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択される置換アリールＣ1〜5アルキル、または、アリールオキシＣ1〜5アルキルアミノ、Ｃ1〜5アルキルアミノ、ジＣ1〜5アルキルアミノ、ニトリル、オキシム、ベンジルオキシイミノ、Ｃ1〜5アルキルオキシイミノ、フタルイミド、スクシンイミド、Ｃ1〜5アルキルカルボニルオキシ、フェニルカルボニルオキシ、１つ以上のフェニル置換基がそれぞれ、Ｃ1〜5アルキル、ハロゲン及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択される置換フェニルカルボニルオキシ、または、１つ以上のフェニル置換基がそれぞれ、Ｃ1〜5アルキル、ハロゲン及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択されるフェニルＣ1〜5アルキルカルボニルオキシ、または、アミノカルボニルオキシ、Ｃ1〜5アルキルアミノカルボニルオキシ、ジＣ1〜5アルキルアミノカルボニルオキシ、Ｃ1〜5アルコキシカルボニルオキシ、１つ以上のアルキル置換基がそれぞれメチル、エチル、イソプロピル及びヘキシルからなる群から選択される置換Ｃ1〜5アルコキシカルボニルオキシ、または、フェノキシカルボニルオキシ、１つ以上のフェニル置換基がそれぞれＣ1〜5アルキル、Ｃ1〜5アルコキシ及びハロゲンからなる群から選択される置換フェノキシカルボニルオキシ、または、Ｃ1〜5アルキルチオ、アルキル置換基がヒドロキシ及びフタルイミドからなる群から選択される置換Ｃ1〜5アルキルチオ、または、Ｃ1〜5アルキルスルホニル、フェニルスルホニル、１つ以上のフェニル置換基がそれぞれ、臭素、フッ素、塩素、Ｃ1〜5アルコキシ及びトリフルオロメチルからなる群から選択される置換フェニルスルホニル（Ａが、
【００５８】
【化６】
2015519085.tif 000008
であり、ｑが、０、Ｘが、Ｈである場合に、Ｒ3は２−（トリメチルシリル）エトキシメチルでなくてもよいという条件で）、並びに製薬的に許容可能なそれらの塩からなる群から選択される。）
【００５９】
本発明の実施例は、式（Ｉ）の化合物を含み、式中、Ｒ1が、置換フェニルであり、Ｒ2は、ピリミジン−３−イルである。
【００６０】
本発明の実施例は、式（Ｉ）の化合物を含み、式中、Ｒ1が、４−フルオロフェニルである。
【００６１】
本発明の実施例は、式（Ｉ）の化合物を含み、式中、Ｒ3が、水素、アリールＣ1〜5アルキル、または置換アリールＣ1〜5アルキルである。
【００６２】
本発明の実施例は、式（Ｉ）の化合物を含み、式中、Ｒ3は、水素またはフェニルＣ1〜5アルキルである。
【００６３】
本発明の実施例は、式（Ｉ）の化合物を含み、式中、Ａが、エチニレンであり、ｑが、０〜５である。
【００６４】
本発明の実施例は、式（Ｉ）の化合物を含み、式中、Ｘが、スクシンイミド、ヒドロキシ、メチル、フェニル、Ｃ1〜5アルキルスルホニル、Ｃ3〜6シクロアルキル、Ｃ1〜5アルキルカルボニルオキシ、Ｃ1〜5アルコキシ、フェニルカルボニルオキシ、Ｃ1〜5アルキルアミノ、ジＣ1〜5アルキルアミノまたはニトリルである。
【００６５】
式（Ｉ）の化合物は、完全な開示が参考文献によって本明細書に組み込まれている、本願と同一出願人に譲渡された米国特許第６，２１４，８３０号に開示されている。
【００６６】
本発明の実施例は、式（Ｉ）の化合物を含み、化合物は、以下の表Ａにて列記された化合物からなる群から選択される。
【００６７】
【表１】
2015519085.tif 000009
【００６８】
【表２】
2015519085.tif 000010
【００６９】
本発明の実施例は、式（Ｉ）の化合物を含み、化合物は、式の化合物Ａ−５である。
【００７０】
【化７】
2015519085.tif 000011
【００７１】
一実施形態において、ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤は、式（ＩＩ）の化合物であり、
【００７２】
【化８】
2015519085.tif 000012
（式中、
Ｒが、Ｒa、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒa、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒa、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒa及びシアノからなる群から選択され、
Ｒaは、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、
Ｒ1は、水素、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（アリール−Ｒ8）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−ＳＯ2（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−シクロアルキル−Ｒ6、−ヘテロシクリル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6、及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から選択され、ヘテロシクリル及びヘテロアリールは、ヘテロシクリルまたはヘテロアリール環炭素原子を介して１つの位置でアザインドール窒素原子に接続し、
Ｒ5は、水素、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨ、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＳＯ2−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＣＯ2Ｈ、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル）、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ2、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−シクロアルキル−Ｒ6、−ヘテロシクリル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から独立して選択される１〜２つの置換基であり、
Ｒ6は、Ｒ6が炭素原子に接続する場合、Ｒ6が−Ｃ1〜8アルコキシ、−（Ｃ1〜8）アルコキシ−（ハロ）1〜3、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から更に選択されるという条件で、水素、−Ｃ1〜8アルキル、−Ｃ2〜8アルケニル、−Ｃ2〜8アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8）アルキル）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ−Ｒ7、−（Ｃ1〜8）アルキル−（ハロ）1〜3、−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨ、−アリール−Ｒ8、−（Ｃ1〜8）アルキル−アリール−Ｒ8及び−（Ｃ1〜8）アルキル−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される、炭素または窒素原子に接続した１〜４つの置換基であり、
Ｒ7は、水素、−Ｃ1〜8アルキル、−Ｃ2〜8アルケニル、−Ｃ2〜8アルキニル、−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨ、−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ2、−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｃ（Ｎ）−ＮＨ2、−シクロアルキル−Ｒ8、−（Ｃ1〜8）アルキル−ヘテロシクリル−Ｒ8、−アリール−Ｒ8、−（Ｃ1〜8）アルキル−アリール−Ｒ8及び−（Ｃ1〜8）アルキル−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される２つの置換基であり、
Ｒ8は、Ｒ8が炭素原子に接続する場合、Ｒ8は、−Ｃ1〜8アルコキシ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、シアノ、ハロ、−（Ｃ1〜8）アルコキシ−（ハロ）1〜3、ヒドロキシ及びニトロからなる群から更に選択されるという条件で、水素、−Ｃ1〜8アルキル、−（Ｃ1〜8）アルキル−（ハロ）1〜3及び−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨからなる群から独立して選択される、炭素または窒素原子に接続する１〜４つの置換基であり、
Ｒ9は、水素、−Ｃ1〜8アルコキシ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、シアノ、（ハロ）1〜3、ヒドロキシ及びニトロからなる群から独立して選択される１〜２つの置換基であり、
Ｒ2は、Ｒ2が炭素原子に接続する場合、Ｒ2は、−Ｃ1〜8アルコキシ−Ｒ5、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−ヘテロシクリル−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から更に選択されるという条件で、水素、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（アリール−Ｒ8）、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロシクリル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−シクロアルキル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ−Ｒ7からなる群から選択される炭素または窒素原子に接続した１つの置換基であり、
Ｒ3は、水素、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜8アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロシクリル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−Ｒ8、−ヘテロシクリル−Ｒ8、−アリール−Ｒ8及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択された、炭素原子に接続した１〜３つの置換基であり、
Ｒ4は、水素、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜8アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロシクリル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ10、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−Ｒ8、−ヘテロシクリル−Ｒ8、−アリール−Ｒ8及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される、炭素原子に接続した１〜４つの置換基であり、Ｒ10は、水素、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、シアノ、（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、ニトロ及びオキソからなる群から独立して選択される１〜２つの置換基であり、
Ｙ及びＺが、Ｏ、Ｓ、（Ｈ，ＯＨ）及び（Ｈ，Ｈ）（Ｙ及びＺの一方が、Ｏであり、他方が、Ｏ、Ｓ、（Ｈ，ＯＨ）及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から選択されるという条件で）、並びに製薬的に許容可能なそれらの塩からなる群から独立して選択される。）
【００７３】
本発明の実施形態は、Ｒが、Ｒa、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒa、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒa、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒa及びシアノからなる群から選択される、式（ＩＩ）の化合物を含む。
【００７４】
本発明の実施形態は、Ｒaが、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択される、式（ＩＩ）の化合物を含む。
【００７５】
一実施形態において、Ｒaは、ジヒドロ−ピラニル、フェニル、ナフチル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、アザインドリル、インダゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ジベンゾフリル及びジベンゾチエニルからなる群から選択される。
【００７６】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含む。（式中、Ｒ1は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（アリール−Ｒ8）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−シクロアルキル−Ｒ6、−ヘテロシクリル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から選択され、ヘテロシクリル及びヘテロアリールは、ヘテロシクリルまたはヘテロアリール環炭素原子を介して１つの位置でアザインドール窒素原子に接続する。）
【００７７】
一実施形態において、Ｒ1が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5、−アリール−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から選択され、ヘテロアリールは、ヘテロアリール環炭素原子を介して、１つの位置でアザインドール窒素原子に接続する。
【００７８】
一実施形態において、Ｒ1は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5及び−ナフチル−Ｒ6からなる群から選択される。
【００７９】
本発明の実施形態には、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ5は、水素、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨ、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＳＯ2−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＣＯ2Ｈ、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ2、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−シクロアルキル−Ｒ6、−ヘテロシクリル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から独立して選択される１〜２つの置換基である。）
【００８０】
一実施形態において、Ｒ5は、水素、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｎ−Ｒ7、ヒドロキシ及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から独立して選択される、１〜２つの置換基である。
【００８１】
一実施形態において、Ｒ5は、水素、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｎ−Ｒ7、ヒドロキシ、−イミダゾリル−Ｒ6、−トリアゾリル−Ｒ6及び−テトラゾリル−Ｒ6からなる群から独立して選択される、１〜２つの置換基である。
【００８２】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ6が、炭素原子に接続する場合、Ｒ6が、−Ｃ1〜4アルコキシ、−（Ｃ1〜4）アルコキシ−（ハロ）1〜3、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から更に選択されるという条件で、Ｒ6は、水素、−Ｃ1〜4アルキル、−Ｃ2〜4アルケニル、−Ｃ2〜4アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ−Ｒ7、−（Ｃ1〜4）アルキル−（ハロ）1〜3、−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨ、−アリール−Ｒ8、−（Ｃ1〜4）アルキル−アリール−Ｒ8及び−（Ｃ1〜4）アルキル−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される、炭素または窒素原子に接続した、１〜４つの置換基である。
【００８３】
一実施形態において、Ｒ6は、水素である。
【００８４】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ7は、水素、−Ｃ1〜4アルキル、−Ｃ2〜4アルケニル、−Ｃ2〜4アルキニル、−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨ、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ2、−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｃ（Ｎ）−ＮＨ2、シクロアルキル−Ｒ8、−（Ｃ1〜4）アルキル−ヘテロシクリル−Ｒ8、−アリール−Ｒ8、−（Ｃ1〜4）アルキル−アリール−Ｒ8及び−（Ｃ1〜4）アルキル−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される、２つの置換基である。
【００８５】
一実施形態において、Ｒ7は、水素、−Ｃ1〜4アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）及び−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2からなる群から独立して選択される２つの置換基である。
【００８６】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ8が、炭素原子に接続する場合、Ｒ8は、−Ｃ1〜4アルコキシ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ、ハロ、−（Ｃ1〜4）アルコキシ−（ハロ）1〜3、ヒドロキシ及びニトロからなる群から更に選択される、という条件で、Ｒ8は、水素、−Ｃ1〜4アルキル、−（Ｃ1〜4）アルキル−（ハロ）1〜3及び−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨからなる群から独立して選択される、炭素または窒素原子に接続した、１〜４つの置換基である。
【００８７】
一実施形態において、Ｒ8は、水素である。
【００８８】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ9は、水素、−Ｃ1〜4アルコキシ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ、（ハロ）1〜3、ヒドロキシ及びニトロからなる群から独立して選択される、１〜２つの置換基である。
【００８９】
一実施形態において、Ｒ9は、水素である。
【００９０】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ2が、炭素原子に接続する場合、Ｒ2は、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ5、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−ヘテロシクリル−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から更に選択される、という条件で、Ｒ2は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（アリール−Ｒ8）、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）ヘテロシクリル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）ヘテロアリール−Ｒ8、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−シクロアルキル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ−Ｒ7からなる群から選択される、炭素または窒素原子に接続した１つの置換基である。
【００９１】
一実施形態において、Ｒ2が、窒素原子に接続する場合、クオタニウム塩が形成されないという条件、及びＲ2が炭素原子に接続する場合、Ｒ2が、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ5、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−ヘテロシクリル−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から更に選択されるという条件で、Ｒ2は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ5、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−シクロアルキル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ−Ｒ7からなる群から選択される、炭素または窒素原子に接続した１つの置換基である。
【００９２】
一実施形態において、Ｒ2が窒素原子に接続する場合、クオタニウム塩が形成されないという条件、及びＲ2が炭素原子に接続する場合、Ｒ2が、−Ｎ−Ｒ7、ハロゲン、ヒドロキシ及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から更に選択される、という条件で、Ｒ2は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5及び−アリール−Ｒ6からなる群から選択される、炭素または窒素原子に接続する１つの置換基である。
【００９３】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ3は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）ヘテロシクリル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）ヘテロアリール−Ｒ8、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−Ｎ−Ｒ7、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−Ｒ8、−ヘテロシクリル−Ｒ8、−アリール−Ｒ8及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される、炭素原子に接続した１〜３つの置換基である。
【００９４】
一実施形態において、Ｒ3は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−ＣＯ2Ｈ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ及びニトロからなる群から選択される、炭素原子に接続した１つの置換基である。
【００９５】
一実施形態において、Ｒ3は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、ハロゲン及びヒドロキシからなる群から選択される、炭素原子に接続した１つの置換基である。
【００９６】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ4は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）ヘテロシクリル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ10、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−Ｒ8、−ヘテロシクリル−Ｒ8、−アリール−Ｒ8及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される、炭素原子に接続した１〜４つの置換基である。
【００９７】
一実施形態において、Ｒ4は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−ＣＯ2Ｈ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル、−ヘテロシクリル、−アリール及び−ヘテロアリールからなる群から独立して選択される、炭素原子に接続した１〜４つの置換基である。
【００９８】
一実施形態において、Ｒ4は、水素、Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、ハロゲン及びヒドロキシからなる群から独立して選択される、炭素原子に接続した１〜４つの置換基である。
【００９９】
一実施形態において、Ｒ4は、水素、Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、塩素、フッ素及びヒドロキシからなる群から独立して選択される、炭素原子に接続した１〜４つの置換基である。
【０１００】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ10は、水素、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ、（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、ニトロ及びオキソからなる群から独立して選択される、１〜２つの置換基である。
【０１０１】
一実施形態において、Ｒ10は、水素及び（ハロ）1〜3からなる群から独立して選択される、１〜２つの置換基である。
【０１０２】
一実施形態において、Ｒ10は、水素及び（フルオロ）3からなる群から独立して選択される、１〜２つの置換基である。
【０１０３】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｙ及びＺの一方が、Ｏであり、他が、Ｏ、Ｓ、（Ｈ，ＯＨ）及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から選択される、という条件で、Ｙ及びＺは、Ｏ、Ｓ、（Ｈ，ＯＨ）及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から独立して選択される。
【０１０４】
一実施形態において、Ｙ及びＺの一方が、Ｏであり、他方が、Ｏ及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から選択される、という条件で、Ｙ及びＺは、Ｏ及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から独立して選択される。
【０１０５】
一実施形態において、Ｙ及びＺは、独立してＯから選択される。
【０１０６】
式（ＩＩ）の化合物は、完全な開示が参考により本明細書に組み込まれる、本願と同一出願人に譲渡された米国特許第７，１２５，８７８号に開示されている
【０１０７】
本発明の実施例は、式（ＩＩ）の化合物を含み、化合物は、以下の表Ｂ中で列記された化合物からなる群から選択される。
【０１０８】
【表３】
2015519085.tif 000013
【０１０９】
【表４−１】
2015519085.tif 000014
【０１１０】
【表４−２】
2015519085.tif 000015
【０１１１】
本発明の実施例は、式（ＩＩ）の化合物を含み、化合物は、以下からなる群から選択される。
【０１１２】
【表５】
2015519085.tif 000016
【０１１３】
一実施形態において、ＧＳＫ−３Ｂ酵素活性の阻害剤は、式（ＩＩＩ）
【０１１４】
【化９】
2015519085.tif 000017
（式中、
Ａ及びＥは、水素置換炭素原子、及び窒素原子からなる群から独立して選択され、
【０１１５】
【化１０】
2015519085.tif 000018
は、１Ｈ−インドール、１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン、１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン及び１Ｈ−インダゾールからなる群から独立して選択され、
Ｚは、Ｏから選択され、あるいはＺは、ジヒドロから選択され、各水素原子は単結合によって接続し、
Ｒ4及びＲ5は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ2〜8アルケニル及びオキソによって任意に置換されたＣ2〜8アルキニルから独立して選択され、
Ａ及びＥが、水素置換された炭素原子から選択される場合、Ｒ2が、−Ｃ2〜8アルキニル−、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ2〜8）アルケニル−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ2〜8）アルキニル−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−（任意の前述のアルキル、アルケニル及びアルキニル連結基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ1〜8アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル及びオキソからなる群から独立して選択される１〜４つの置換基で任意に置換された直鎖炭素鎖であり、任意の前述のアルキル、アルケニル及びアルキニル連結基は、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル、ヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル、スピロシクロアルキル及びスピロヘテロシクリル（任意の前述のシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリール置換基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択される、１〜４つの置換基で任意に置換され、任意の前述のヘテロシクリル置換基は、オキソで任意に置換される）からなる群から独立して選択される１〜２つの置換基で任意に置換される）、シクロアルキル（シクロアルキルは、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル）からなる群から独立して選択される、１〜４つの置換基で任意に置換される）、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）1〜5−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）1〜5−ＮＲ6−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）0〜5−Ｓ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ���、−ＮＲ6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ8−、−ＮＲ9−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ9−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）0〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）0〜6−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）0〜6−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）1〜6−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）0〜6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ7−、−ＮＲ6−Ｃ（ＮＲ7）−ＮＲ8−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−、−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−及び−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−（Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、水素、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される、置換基で置換される）、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル、ヘテロシクリル（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル及びヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル（前述のヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリール置換基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択される、１〜４つの置換基で任意に置換され、ヘテロシクリルはオキソで任意に置換される）、Ｒ9は、Ｃ1〜8アルキル、−Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル、ヘテロシクリル（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル及びヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル（前述のヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリール置換基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択される１〜４つの置換基で任意に置換される）からなる基から選択され、ヘテロシクリルはオキソで任意に置換される）からなる群から独立して選択される）からなる群から選択される、という条件で、Ｒ2は、−Ｃ1〜8アルキル−、−Ｃ2〜8アルケニル−、−Ｃ2〜8アルキニル−、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ2〜8）アルケニル−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ2〜8）アルキニル−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−（任意の前述のアルキル、アルケニル及びアルキニル連結基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ1〜8アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル及びオキソからなる群から独立して選択される、１〜４つの置換
基で任意に置換された、直鎖炭素鎖であり、任意の前述のアルキル、アルケニル及びアルキニル連結基は、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル、ヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル、スピロシクロアルキル及びスピロヘテロシクリル（任意の前述のシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリール置換基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択される１〜４つの置換基で任意に置換され、任意の前述のヘテロシクリル置換基は、任意にオキソで置換される）からなる群から独立して選択される、１〜２つの置換基で任意に置換される）、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール（シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールは、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルから独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択される１〜４つの置換基で任意に置換され、ヘテロシクリルは、オキソで任意に置換される）、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）0〜5−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）0〜5−ＮＲ6−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）0〜5−Ｓ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−、−ＮＲ6−、−ＮＲ6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ8−、−ＮＲ6−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ6−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）0〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）0〜6−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）0〜6−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）1〜6−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）0〜6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ7−、−ＮＲ6−Ｃ（ＮＲ7）−ＮＲ8−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−、−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−及び−ＳＯ2−（Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、水素、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルから��る群から独立して選択される置換基で置換される）、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル、ヘテロシクリル（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル及びヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル（前述のヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリール置換基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択される１〜４つの置換基で任意に置換され、ヘテロシクリルはオキソで任意に置換される）からなる群から独立して選択される）からなる群から選択され、
Ｒ1及びＲ3は、水素、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ2〜8アルケニル、Ｃ2〜8アルキニル（アルキル、アルケニル及びアルキニルは、Ｃ1〜8アルコキシ、アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、（ハロ）1〜3、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル及びオキソからなる群から独立して選択される置換基で任意に置換される）、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシカルボニル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、Ｃ1〜8アルキルチオ、アリール、ヘテロアリール（アリール及びヘテロアリールはＣ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換される）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から選択される置換基で任意に置換される）、（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択される置換基で置換された）アミノ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ及びニトロ、並びに製薬的に許容可能なそれらの塩からなる群から独立して選択される。
【０１１６】
一実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、
【０１１７】
【表６−１】
2015519085.tif 000019
【０１１８】
【表６−２】
2015519085.tif 000020
【０１１９】
（ここで、全ての他の変形例はすでに定義された通りであり）、並びにそれらの製薬的に許容可能な塩からなる群から選択される化合物である。
【０１２０】
一実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、
【０１２１】
【表７】
2015519085.tif 000021
【０１２２】
（ここで、全ての他の変形例はすでに定義された通りであり）、並びにそれらの製薬的に許容可能な塩からなる群から選択される化合物である。
【０１２３】
式（ＩＩＩ）の化合物は、完全な開示が参考により本明細書に組み込まれている、本願と同一出願人に譲渡された米国特許第６，８２８，３２７中に開示されている。
【０１２４】
本発明の実施例は、式（ＩＩＩ）の化合物を含み、化合物は、以下の表Ｃに列記された化合物からなる群から選択される
【０１２５】
【表８】
2015519085.tif 000022
【０１２６】
【表９−１】
2015519085.tif 000023
【０１２７】
【表９−２】
2015519085.tif 000024
【０１２８】
本発明の実施例は、式（ＩＩＩ）の前記化合物を含み、化合物は、
【０１２９】
【表１０】
2015519085.tif 000025
【０１３０】
からなる群から選択される。
【０１３１】
本発明の他の例は、以下の表Ｄ中で列記した化合物からなる群から選択される化合物を含む。
【０１３２】
【表１１】
2015519085.tif 000026
【０１３３】
【表１２−１】
2015519085.tif 000027
【０１３４】
【表１２−２】
2015519085.tif 000028
【０１３５】
本発明の他の例は、
【０１３６】
【表１３−１】
2015519085.tif 000029
【０１３７】
【表１３−２】
2015519085.tif 000030
【０１３８】
【表１３−３】
2015519085.tif 000031
【０１３９】
からなる群から選択される化合物を含む。
【０１４０】
本発明の方法による処理に好適な細胞
本発明での使用に好適な多能性細胞は、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦｏｘＤ３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４５、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ−２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０及びＴｒａ１−８１からなる群から選択される多能性マーカーの少なくとも１つを発現する。
【０１４１】
一実施形態において、多能性細胞は胚性幹細胞である。代替的な実施形態において、多能性細胞は、胚性幹細胞由来の多能性マーカーを発現する細胞である。一実施形態において、胚性幹細胞はヒトである。
【０１４２】
ヒト胚性幹細胞の単離、増殖、及び培養
ヒト胚性幹細胞の特徴付け：ヒト胚性幹細胞は、発生段階特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）３及び４の１つ以上、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体を用いて検出可能なマーカーを発現し得る（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロでのヒト胚性幹細胞の分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現（存在する場合）を消失させ、ＳＳＥＡ−１の発現を増加させる。未分化のヒト胚性幹細胞は、通常、アルカリホスファターゼ活性を有し、この活性は、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  Ｃａｌｉｆ．）によって述べられるようにＶｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄを基質として現像することによって検出することができる。未分化の多能性幹細胞は、典型的には、ＲＴ−ＰＣＲによって検出されるようにＯｃｔ−４及びＴＥＲＴも発現している。
【０１４３】
増殖したヒト胚性幹細胞の他の望ましい表現型は、３つの全胚葉、すなわち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する能力である。ヒト胚性幹細胞の多能性は、例えば、細胞をＳＣＩＤマウスに注入し、４％パラホルムアルデヒドを使用して、形成された奇形腫を固定した後、それらを３つの胚葉層からの細胞型の痕跡に関して組織学的に検査することにより確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。
【０１４４】
増殖させたヒト胚性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を用いて核型を決定し、対応する霊長類種の公表されている核型と比較することができる。「正常な核型」を有する細胞を得ることが望ましい。これは、細胞が、ヒトの染色体が全て揃っており、かつ目立った変化のない正倍数体であることを意味する。
【０１４５】
ヒト胚性幹細胞の供給源：使用できるヒト胚性幹細胞の種類は、妊娠後に形成された組織由来のヒト胚性幹細胞の樹立株を含み、この組織には、前胚組織（例えば胚盤胞）、胚組織、または妊娠中の任意の時点、必ずしもそうではないが典型的には妊娠約１０〜１２週の前に採取された胎児組織が含まれる。非限定的な例は、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）などのヒト胚性幹細胞またはヒト胚生殖細胞の樹立株である。更に、こうした細胞の初期の樹立または安定化の際に本開示の組成物を使用することも考えられるが、その場合は、供給源となる細胞は供給源の組織から直接採取される一次多能性細胞であろう。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）などの変異型ヒト胚性幹細胞株も好適である。
【０１４６】
一実施形態において、ヒト胚性幹細胞を、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，８４３４，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８、１３３  ｆｆ．，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４，１９９５）によって記載されるように調製する。
【０１４７】
ヒト胚性幹細胞の培養：一実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、本質的にフィーダー細胞を含まないにもかかわらず、実質的に分化を受けることなくヒト胚性幹細胞の増殖を支持する培養システムで培養される。分化をともなわない無フィーダー細胞培養中でのヒト胚性幹細胞の増殖は、別の細胞種と予め培養することによって調整した培地を用いることで支持される。代替的に、分化をともなわない無フィーダー細胞培養中でのヒト胚性幹細胞の増殖は、合成培地を用いることによって支持される。
【０１４８】
代替的な実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、種々の方法でヒト胚性幹細胞を支持するフィーダー細胞の最初に培養された層である。次いで、ヒト胚を、本質的にフィーダー細胞を含まないにもかかわらず、実質的に分化を受けることなくヒト胚性幹細胞の増殖を支持する培養システムに移す。
【０１４９】
本発明で用いるのに好適な調整培地の例は、米国特許出願公開第２００２００７２１１７号、米国特許第６６４２０４８号、国際公開第２００５０１４７９９号、及びＸｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２：９７２〜９８０，２００４）に開示されている。
【０１５０】
本発明で用いるのに好適な合成培地の例は、米国特許出願公開第２００７００１００１１号中に見出すことができる。
【０１５１】
好適な培地は以下の構成要素、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ  ＃  １１９６５−０９２）、ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ  ＃  １０８２９−０１８）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２／５０％  ＤＭＥＭ基本培地、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＃  １５０３９−０２７）、非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ  １１１４０−０５０）、β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ  ＃  Ｍ７５２２）、ヒト遺伝子組換え型塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（Ｇｉｂｃｏ  ＃  １３２５６−０２９）から作製されてもよい。
【０１５２】
一実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、本発明の方法に従って処理する前に処理される好適な培養基質上に播かれる。一実施形態において、処理は、例えば基底膜から誘導されたもの、または接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るもの等の細胞外マトリックス成分である。一実施形態において、好適な培養基質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞から得られる可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。
【０１５３】
他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物は代替物として好適である。これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩などを、単独または様々な組合せで含んでもよい。
【０１５４】
ヒト胚性幹細胞は、好適な分布で、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、基質上に播かれる。この特徴の全部は、播種分布に細心の注意を払うことから利益を得、当業者は容易に決定することができる。
【０１５５】
ヒト胚性幹細胞から由来する多能性マーカーを発現する細胞の単離、増殖、及び培養
一実施形態において、多能性マーカーを発現する細胞は、
ａ．ヒト胚性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．ヒト胚性幹細胞を、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ．細胞を取り除き、続いて、細胞を培養する前に、タンパク質または細胞外マトリックスで前処理していない組織培養基質上で、低酸素状態下、細胞を培養する工程と、を含む、方法によって、ヒト胚性幹細胞から誘導される。
【０１５６】
一実施形態において、多能性マーカーを発現する細胞は、
ａ．ヒト胚性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．細胞を取り除き、続いて、タンパク質または細胞外マトリックスで前処理しない組織培養基質上で、低酸素状態下で、細胞を培養する工程と、を含む、方法によって、ヒト胚性幹細胞から誘導される。
【０１５７】
タンパク質または細胞外マトリックスで前処理されていない組織培養基質上における低酸素状態下での細胞培養
一実施形態では、細胞は、細胞外マトリックスでコーティングされていない組織培養基質上で、低酸素状態下で約１〜約２０日間培養される。代替的な実施形態では、細胞は、細胞外マトリックスでコーティングされていない組織培養基質上で、低酸素状態下で約５〜約２０日間培養される。代替的な実施形態では、細胞は、細胞外マトリックスでコーティングされていない組織培養基質上で、低酸素状態下で約１５日間培養される。
【０１５８】
一実施形態では、低酸素状態は、約１％  Ｏ2〜約２０％  Ｏ2である。代替的な実施形態では、低酸素状態は、約２％  Ｏ2〜約１０％  Ｏ2である。代替的な実施形態では、低酸素状態は、約３％  Ｏ2である。
【０１５９】
細胞は、血清、アクチビン−Ａ、及びＷｎｔリガンドを含有している培地で、タンパク質または細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素状態下で培養されてもよい。あるいは、培地はまた、ＩＧＦ−１を含有していてもよい。
【０１６０】
培地は、約２％〜約５％の範囲内の血清濃度を有してもよい。代替的な実施形態において、血清濃度は、約２％であってもよい。
【０１６１】
Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａは、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬの濃度で使用されてよい。代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【０１６２】
Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−５ａ及びＷｎｔ−７ａからなる群から選択されてもよい。一実施形態において、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１である。代替的な実施形態において、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−３ａである。
【０１６３】
Ｗｎｔリガンドは、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用されてもよい。代替的な実施形態では、Ｗｎｔリガンドは、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用されてもよい。一実施形態では、Ｗｎｔリガンドの濃度は、約２０ｎｇ／ｍＬである。
【０１６４】
ＩＧＦ−１は、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用されてもよい。代替的な実施形態では、ＩＧＦ−１は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用されてもよい。一実施形態では、ＩＧＦ−１の濃度は約５０ｎｇ／ｍＬである。
【０１６５】
本発明の方法により誘導される多能性マーカーを発現する細胞は、タンパク質または細胞外マトリックスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素状態下にて、培養物中で増殖することができる。
【０１６６】
本発明の方法により誘導される多能性マーカーを発現する細胞は、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦｏｘＤ３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４５、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ−２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、及びＴｒａ１−８１からなる群から選択される多能性マーカーの少なくとも１つを発現する。
【０１６７】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の更なる分化
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、当該技術分野における任意の方法により、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化することができる。
【０１６８】
例えば、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化することができる。
【０１６９】
例えば、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、繊維芽細胞成長因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンで処理した後、繊維芽細胞成長因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地を除去し、続いて細胞をレチノイン酸、繊維芽細胞成長因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地中で培養することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化される。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている。
【０１７０】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、Ｐｄｘ１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ１ａ、ＨＮＦ−６、ＨＢ９及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。膵臓内胚葉系に特徴的なこれらのマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞である。
【０１７１】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の更なる分化
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、当該技術分野における任意の方法により、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化することができる。
【０１７２】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法に従って、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化することができる。
【０１７３】
膵内分泌系に特徴的なマーカーは、以下からなる群から選択される：ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、Ｐｄｘ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、及びＰＴＦ−１α。一実施形態では、膵臓内分泌細胞は、以下のホルモンのうちの少なくとも１つを発現することができる：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。本発明での使用に好適なものは、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを少なくとも１つ発現する細胞である。本発明の一態様において、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってもよい。代替的に、膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
【０１７４】
本発明の一態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｐｄｘ１、並びに以下の転写因子うちの少なくとも１つを発現する：ＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４及びＰａｘ６。本発明の一態様では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。
【０１７５】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の検出
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより判定することができる。多能性幹細胞は、典型的にはそのようなマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がそれらの発現を開始した際に検出されることになる。
【０１７６】
分化の効率は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に、処理した細胞集団を暴露することにより測定することができる。
【０１７７】
培養または単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。この方法としては、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイチューハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．２００１年付録）参照）、並びに切片材料の免疫組織学的解析等の免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞で利用できるマーカーについてのフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。
【０１７８】
特定のタンパク質マーカーを検出するために有用な抗体の例を、表ＩＡ及び表ＩＢに列記する。尚、表ＩＡ及び表ＩＢに列記した抗体によって認識される同一のマーカーを指向する代替的な抗体が利用可能であり、簡単に開発可能であることが留意されるべきである。それらの代替的な抗体を、本発明に従って単離された細胞内のマーカーの発現を評価するために、使用してもよい。
【０１７９】
例えば、多能性幹細胞の特徴は、当業者に周知であり、多能性幹細胞の追加の特徴は、継続して同定されている。例えば、多能性幹細胞マーカーとしては以下の１種以上の発現が挙げられる。ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦｏｘＤ３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１。
【０１８０】
多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現される、例えばＣＸＣＲ４等のタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に暴露することにより、分化した細胞を精製することができる。
【０１８１】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の検出
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、膵臓内胚葉系に特徴的な追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵臓内胚葉系に特徴的な性質を獲得したことを確認するために使用されてもよい。膵臓内胚葉系に特異的なマーカーとしては、例えば、Ｈｌｘｂ９、ＰＴＦ−１ａ、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−６、ＨＮＦ−１βなどの１つ以上の転写因子の発現が挙げられる。
【０１８２】
分化の効率は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に、処理した細胞集団を暴露することにより測定することができる。
【０１８３】
培養または単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。この方法としては、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイチューハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．２００１年付録）参照）、並びに切片材料の免疫組織学的解析等の免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞で利用できるマーカーについてのフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。
【０１８４】
特定のタンパク質マーカーを検出するために有用な抗体の例を、表ＩＡ及び表ＩＢに列記する。尚、表ＩＡ及び表ＩＢに列記した抗体によって認識される同一のマーカーを指向する代替的な抗体が利用可能であり、簡単に開発可能であることが留意されるべきである。それらの代替的な抗体を、本発明に従って単離された細胞内のマーカーの発現を評価するために、使用してもよい。
【０１８５】
膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞の検出
膵臓内分泌系の細胞に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、膵臓内分泌系に特徴的な追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵臓内分泌系に特徴的な性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵臓内分泌系に特異的なマーカーとしては、例えば、ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１などの１つ以上の転写因子の発現が挙げられる。
【０１８６】
β細胞系の細胞に特徴的なマーカーは当業者に周知であり、β細胞系に特徴的な追加のマーカーが継続して同定されている。これらのマーカーを、本発明に従って処理した細胞が、β−細胞系に特徴的な特性を獲得するために分化したことを確認するために使用可能である。β細胞系に特異的な特徴としては、例えば、Ｐｄｘ１（膵臓及び十二指腸のホメオボックス遺伝子−１）、Ｎｋｘ２、Ｎｋｘ６、Ｉｓｌ１、Ｐａｘ６、Ｐａｘ４、ＮｅｕｒｏＤ、Ｈｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ−６、Ｈｎｆ−３β及びＭａｆＡなどのような、１つ以上の転写因子の発現が挙げられる。これらの転写因子は、内分泌細胞の確認に関して当技術分野にて定着している。例えば、Ｅｄｌｕｎｄ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：５２４〜６３２（２００２年））を参照されたい。
【０１８７】
分化の効率は、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に、処理した細胞集団を暴露することにより測定することができる。代替的に、分化の効率は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に、処理した細胞集団を暴露することにより測定することができる。
【０１８８】
培養または単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。この方法としては、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイチューハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．２００１年付録）を参照）、並びに切片材料の免疫組織学的解析等の免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞で利用できるマーカーについてのフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。
【０１８９】
特定のタンパク質マーカーを検出するために有用な抗体の例を、表ＩＡ及び表ＩＢに列記する。尚、表ＩＡ及び表ＩＢに列記した抗体によって認識される同一のマーカーを指向する代替的な抗体が利用可能であり、簡単に開発可能であることが留意されるべきである。それらの代替的な抗体を、本発明に従って単離された細胞内のマーカーの発現を評価するために、使用してもよい。
【０１９０】
本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０１９１】
（実施例１）
ヒト胚性幹細胞の培養
幹細胞は、単独の細胞レベルで自己複製し、分化して後代細胞を生成するという、これらの両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非複製前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉層（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞へと分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉層の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全てではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
【０１９２】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７及びＨ９をＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から獲得し、供給元の研究所から提供された取扱説明書に従って培養した。手短には、細胞を、２０％ノックアウト血清代替、１００ｎＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、４ｎｇ／ｍＬヒト塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を有する２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯより）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン／ＧＩＢＣＯ）からなるＥＳ細胞培地中にてマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞上で培養した。Ｅ１３〜１３．５マウス胚由来のＭＥＦ細胞をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入した。ＭＥＦ細胞を、１０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭグルタミン、及び１００ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸で補充したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。サブコンフルエントなＭＥＦ細胞培養物を、１０μｇ／ｍＬマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））で３時間処理して細胞分裂を停止させた後、トリプシン処理し、０．１％ウシゼラチンコーティング皿に２×１０4／ｃｍ2で播いた。継代２〜４からのＭＥＦ細胞をフィーダー層として使用した。ＭＥＦ細胞のフィーダー層上に播いたヒト胚性幹細胞を、加湿した組織培養インキュベータ内の５％  ＣＯ2雰囲気内で３７℃で培養した。コンフルエントとなった際（播いてから約５〜７日後）、ヒト胚性幹細胞を１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼタイプＩＶ（インビトロジェン／ＧＩＢＣＯ）により５〜１０分間処理し、次に５ｍＬピペットを使用して表面を穏やかに擦り落とした。細胞を９００ｒｐｍで５分間回転させ、ペレットを再懸濁し、１：３〜１：４の細胞の比で新鮮培地に再び播いた。
【０１９３】
並行して、成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１：３０の希釈液でコーティングされたプレート上にＨ１、Ｈ７、及びＨ９ヒド胚性幹細胞を播種し、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補充されたＭＥＦ−調整培地で培養した。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上で培養した細胞を、コラゲナーゼＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）、Ｄｉｓｐａｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＬｉｂｅｒａｓｅ酵素（Ｓｏｕｒｃｅ）でルーチン的に継代させた。ヒト胚性幹細胞培養物の一部を低酸素状態（およそ３％  Ｏ2）下でインキュベートした。
【０１９４】
（実施例２）
ヒト胚性幹細胞由来の多能性マーカーを発現する細胞の誘導と培養
種々の継代数（３０〜５４継代）のヒト胚性幹細胞株Ｈ１及びＨ９由来の細胞を、少なくとも３継代の間、低酸素状態下（約３％  Ｏ2）で培養した。細胞を８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補充されたＭＥＦ−ＣＭ中で培養し、実施例１に従ってＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングされたプレート上に播いた。
【０１９５】
次いで、細胞を０．５％  ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（Ｃａｔａｌｏｇ  ＃  １３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、及び１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ−Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２日間処理し、続いて２％  ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ−Ａ（ＡＡ）で補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２で更に３〜４日間処理した。このプロトコルにより、胚体内胚葉マーカーの有意な増加をもたらした。
【０１９６】
次に、細胞は、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で５分間処理された。遊離した細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ培地に再懸濁させ、遠心分離により回収し、血球計を用いて計数した。遊離した細胞を１０００〜１０，０００細胞／ｃｍ2で、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）処理フラスコ上に播種し、標準的な組織培養インキュベータ内で、３７℃、低酸素状態下（約３％  Ｏ2）にてＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ中で培養した。ＴＣＰＳフラスコは、ＭＡＴＲＩＧＥＬでも他の細胞外マトリックスタンパク質でもコーティングしなかった。培地は毎日交換した。幾つかの培養物では、培地を１０〜５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮのインスリン成長因子−Ｉ）または１Ｘ  ＩＴＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａのインスリン、トランスフェリン、及びセレニウム）で更に補充した。幾つかの培養条件では、基本培地（ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ）に０．１ｍＭのメルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）及び非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡの１Ｘ，ＮＥＡＡ、）で更に補充した。
【０１９７】
５〜１５日間培養後、老化していると思われる多数の巨細胞に取り囲まれている明確な細胞コロニーが出現した。約５０〜６０％のコンフルエンシーの時点で、室温で５分間、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液に曝露することにより培養物を継代した。遊離した細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ培地に再懸濁させ、遠心分離により回収し、１０，０００細胞／ｃｍ2で、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）で処理されたフラスコに播種し、ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ＋／−５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ中で培養した。この培地を以降「成長培地」と称する。
【０１９８】
（実施例３Ａ）
ヒト胚性幹細胞の単一細胞懸濁液からの多能性マーカーを発現する細胞の誘導
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１  Ｐ３３及びＨ９  Ｐ４５由来細胞を、少なくとも３継代低酸素状態下（約３％  Ｏ2）で培養した。細胞を８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補充されたＭＥＦ−ＣＭ中で培養し、実施例１に従ってＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングされたプレート上に播いた。約６０％のコンフルエンシーの時点で、培養物をＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に５分間曝露した。遊離した細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ培地に再懸濁させ、遠心分離により回収し、血球計を用いて計数した。遊離した細胞を１０００〜１０，０００細胞／ｃｍ2の密度で組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）処理フラスコ上に播種し、標準的な組織培養インキュベータ内で、３７℃低酸素状態下（約３％  Ｏ2）にて、ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ＋０．１ｍＭのメルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）及び非必須アミノ酸（１Ｘ，ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡより）中で培養した。ＴＣＰＳフラスコは、ＭＡＴＲＩＧＥＬでも他の細胞外マトリックスタンパク質でもコーティングしなかった。培地は毎日交換した。第１継代細胞をＰ１と称する。
【０１９９】
（実施例３Ｂ）
ヒト胚性幹細胞由来の多能性マーカーを発現する細胞の増殖に有用な種々の成長培地
ヒト胚性幹細胞由来の多能性マーカーを発現する細胞は、少なくとも２〜３０継代の間、以下の培地成分中で首尾よく培養された。
１．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ
２．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ
３．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ
４．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ
５．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ
６．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ
７．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ
８．ＨＥＳｃＧＲＯ合成培地（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＣＡ）
【０２００】
上に列挙した培地の基本成分は、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、ＣＲＭＬ、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）ＤＭＥＭ、及びＦ１２等の同様の培地に置き換えてもよい。
【０２０１】
（実施例４）
ＧＳＫ−３β酵素活性の阻害剤が多能性マーカーを発現する細胞の生存率に与える影響
多能性マーカーを発現する細胞の誘導及び維持を、実施例２に記載された通りに実施した。細胞を、２％  ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａ及び５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２中で増殖させた。細胞を、Ｆａｌｃｏｎポリスチレンフラスコ上に１０，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種し、３７℃、５％  ＣＯ2、低酸素において単層培養で増殖させた。６０〜７０％のコンフルエンスに達した後、ＰＢＳで単層を洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３〜５分間インキュベートし、剥離及び単一細胞分散させることによって細胞を継代させた。
【０２０２】
小分子の商標ライブラリーからＧＳＫ−３Ｂ酵素活性を阻害するそれらの能力に関して選定された試験化合物を使用してスクリーニングを実施した。このライブラリーからの化合物は、９６ウェルプレートフォーマットの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３０％  ＤＭＳＯ中の１ｍＭのストックとして利用することができた。アッセイのために、多能性マーカーを発現する細胞を洗浄し、計数し、９６ウェルの底が透明で色の濃いウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）にウェルあたり２０，０００細胞の播種密度で通常の培養培地に播いた。この播種密度は、一晩培養物で最適な単層形成を得るために事前に決定された。翌日、培養培地を取り除き、細胞単層をＰＢＳで３回すすぎ、試験化合物を、最終アッセイ濃度１０μＭとなるようにそれぞれアッセイ培地で希釈した８０μＬ分液にてウェルに加えた。アッセイ２日目に、培地をそれぞれのウェルから取り除き、アッセイ培地で希釈した試験化合物の新しい分液で置換した。１日目及び２日目のアッセイ培地は、０．５％  ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２で構成された。培養３日目及び４日目に、培地を各ウェルから取り除き、２％  ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２（試験化合物なし）と交換した。アッセイ４日目に、１５μＬのＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加え、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）装置によって４９０ｎｍの光学密度を読み取る前に、プレートを、１．５〜４時間、３７℃でインキュベートした。平均、標準偏差、及び変動計数からなる統計学的測定値を二重セット毎に算出した。陽性対照（培養１日目及び２日目に、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ及びＷｎｔ３ａで処理したウェル）に対する各試験ウェルの毒性が算出された。
【０２０３】
表ＩＩは、全スクリーニング結果を集めたものである。このアッセイでは、多能性マーカーを発現する細胞は、当初コンフルエント単層として播かれたので、この結果は、４日間の培養期間にわたる毒性測定を表している。結果は、対照の生存率の割合として表され、１０μＭスクリーニング濃度で使用された一部の化合物の可変毒性を表している。この細胞に基づくアッセイでは、化合物の割合が多いと、毒性は最小、または測定不能となる。
【０２０４】
選択した化合物の小さなパネルを、上述のように同様のアッセイにおいて、多能性マーカーを発現する細胞を再び使用して、狭い用量漸増範囲にわたって繰り返し試験した。表ＩＩＩはこれらの結果をまとめたものであり、様々な毒性及び非毒性化合物に対する可変用量漸増効果を示している。
【０２０５】
（実施例５）
高含量スクリーニングアッセイを用いて測定したＧＳＫ−３β酵素活性の阻害剤がヒト胚性幹細胞の分化及び増殖に与える影響
ヒト胚性幹細胞（Ｈ９株）を、実施例１に記載の通り実施した。細胞コロニーを、平均して４日毎に継代させて、未分化多能性状態に維持した。継代を、３７℃で、１０〜３０分間、コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液に細胞培養物を曝露し、続いて、ピペットの先端で穏やかに掻き取り、細胞塊を回収することによって実施した。塊は重力により沈降させ、洗浄して残留コラゲナーゼを除去した。ルーチン維持培養用に１：３の比、あるいは直接アッセイ用に１：１の比で細胞塊を分割した。使用したヒト胚性幹細胞株を、５０継代未満で維持し、正常核型の表現型と、マイコプラズマ汚染がないことに関してルーチン的に評価した。
【０２０６】
アッセイで用いる細胞塊を、通常の培養培地で均一に再懸濁し、ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングされた９６ウェルＰａｃｋａｒｄ  ＶＩＥＷＰＬＡＴＥＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に１００μＬ／ウェルの容量で播いた。８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補充されたＭＥＦ調整培地を、初期播種及び回収に使用した。使用済みの培養培地を各ウェルから吸引し、同量の新しい培地と交換することで毎日の栄養補給を実施した。アッセイ期間中ずっと、プレートは、加湿したボックスの中に入れられて３７℃、５％  ＣＯ2に保たれた。
【０２０７】
小分子の商標ライブラリーからＧＳＫ−３Ｂ酵素活性を阻害する能力に関して選択された試験化合物を用いてスクリーニングを実施した。本ライブラリーからの化合物は、９６ウェルプレートのフォーマットの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３０％  ＤＭＳＯ中の１ｍＭのストックとして利用することができた。スクリーニング化合物は三重又は二重セットで試験された。各ウェルから培養培地を吸引し、続いてＰＢＳで３回洗浄して残留成長因子及び血清を除去して一次スクリーニングアッセイを開始した。０．５％  ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、１０μＭの試験化合物と、を含有する、ウェルあたり８０〜１００μＬの試験容量を加え戻した。陽性対照ウェルは、同一の基本培地を含有したが、試験化合物を１０〜２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で置き換えた。陰性対照ウェルは、０．５％  ＦＣＳ及びアクチビンＡのみ（ＡＡのみ）を有する、あるいは、アクチビンＡまたはＷｎｔ３ａを有さない、０．５％  ＦＣＳ（未処理）を有する基本培地を含有した。アッセイ２日目に、ウェルを吸引し、同一溶液を再度供給した。３日目及び４日目に、全アッセイウェルを吸引し、２％  ＦＣＳと１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで補充された（試験化合物またはＷＮｔ３ａなし）ＤＭＥＭ：Ｆ１２に変更され、一方、並行陰性対照ウェルは、２％  ＦＣＳ及びアクチビンＡ（ＡＡのみ）を有する、あるいは、アクチビンＡを有さない２％  ＦＣＳ（未処理）を有する、ＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地中に保たれた。
【０２０８】
培養の最後に、９６ウェルプレート中の細胞を、室温で２０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、室温で２０分間、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理した。あるいは、細胞を、一晩−２０℃で、氷冷７０％エタノールで固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で５分間、４℃で透過処理した。固定及び透過処理後、細胞をＰＢＳで再び３回洗浄し、次いで、室温で３０分間、ＰＢＳ中において４％ニワトリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でブロックした。一次抗体（ヤギ抗ヒトＳｏｘ１７及びヤギ抗ヒトＨＮＦ−３β、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、４％ニワトリ血清で１：１００に希釈し、室温で１時間、細胞に加えた。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８共役二次抗体（ニワトリ抗ヤギＩｇＧ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、ＰＢＳで１：２００に希釈し、ＰＢＳで細胞を３回洗浄した後に加えた。細胞核を対比染色するために、５ｍＭのＤｒａｑ５（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を、室温で５分間加えた。細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、画像化のために、１００ｍＬ／ウェルのＰＢＳ中に放置した。
【０２０９】
Ｄｒａｑ５及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で染色した細胞用の５１００８ｂｓ二色性を利用するＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い細胞を撮像した。暴露時間は、陽性対照ウェル、及び未処理の陰性対照のみに関しては二次抗体を有するウェルを使用して最適化された。処理及び染色手順の間のあらゆる細胞消失を補償するために、１ウェルあたり１２の領域を得た。Ｓｏｘ−１７とＨＮＦ−３βに関する全細胞数と全細胞強度を、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．６（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを用いて測定した。グレイスケール・レベル（基準線範囲１００〜３００）及び核サイズに基づいて、細胞核のセグメンテーションを決定した。平均値及び標準偏差を複製に関して計算した。全タンパク質の発現は、細胞面積掛ける全蛍光量値として定義される全強度または積分強度として記録された。３００〜３０００のグレイスケール範囲、及び０．４以上の形状因子の判定基準に基づいて背景を消去した。全強度データは、ウェル毎の全強度をＷｎｔ３ａ／アクチビンＡ陽性対照の平均全強度で割って正規化された複製セット毎の平均値及び標準偏差に関する正規化データを算出した。
【０２１０】
表ＩＶは、全スクリーニング結果をまとめて示している。表Ｖは、このスクリーニングのヒットの一覧である。強いヒットは、対照値の１２０％以上と定義され、中程度のヒットは、対照値の６０〜１２０％の範囲内であると定義されている。有意な数の化合物が、このアッセイにおいて、両方の増幅反応を誘発している。同時に、Ｓｏｘ１７及びＨｎｆ−３ｂ転写因子のタンパク質の発現量で測定した場合、有意な数の化合物がこのアッセイにおいて分化を誘発している。
【０２１１】
（実施例６）
プレートリーダーアッセイを用いて測定されたＧＳＫ−３β酵素活性の阻害剤がヒト胚性幹細胞の増殖に与える影響
ヒト胚性幹細胞（Ｈ９及びＨ１株）が実施例１に記載の通り維持された。平均して４日毎に継代させて、細胞コロニーを未分化多能性状態に維持した。継代を、３７℃で、１０〜３０分間、コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液に細胞培養物を曝露し、続いて、ピペットの先端で穏やかに掻き取り、細胞塊を回収することによって実施した。塊を沈殿させ、洗浄して、残留コラゲナーゼを除去した。ルーチン維持培養用に１：３の単層面積比、あるいは、直接アッセイ用に１：１の比で細胞塊を分割した。これらの実施例で使用したヒト胚性幹細胞株を５０継代未満で維持し、正常核型の表現型と、マイコプラズマ汚染がないことに関してルーチン的に評価した。
【０２１２】
アッセイで用いる細胞塊を、通常の培養培地中で均一に再懸濁させ、ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングされた９６ウェルＰａｃｋａｒｄ  ＶＩＥＷＰＬＡＴＥＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に１００μＬ／ウェルの容量で播いた。８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補充されたＭＥＦ調整培地を、初期播種及び回収のために使用した。使用済みの培養培地を各ウェルから吸引し、同量の新しい培地と交換することで毎日の栄養補給を実施した。アッセイ期間中ずっと、プレートは加湿したボックスの中に入れられて３７℃、５％  ＣＯ2に保たれた。
【０２１３】
各ウェルから培養培地を吸引し、続いてＰＢＳで３回洗浄して、残留成長因子及び血清を除去して一次スクリーニングアッセイを開始した。０．５％  ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）と１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、１０μＭの試験化合物とを含有する、ウェルあたり８０〜１００μＬの試験容量を加え戻した。陽性対象ウェルは、同じ基本培地を含有したが、１０〜２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で置換した。陰性対照ウェルは、アクチビンＡまたはＷｎｔ３ａを有さない０．５％  ＦＣＳを有する基本培地を含有した。スクリーニング化合物を三重で試験した。アッセイ２日目に、ウェルを吸引し、同一の溶液を再度供給した。３日目及び４日目に、２％ＦＣＳを有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地に維持された陰性対照ウェルを除いて、全アッセイウェルを吸引し、２％  ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２に変更された。
【０２１４】
アッセイ４日目に、１５〜２０μＬのＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加え、プレートを３７℃で、１．５〜４時間インキュベートした。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅの光分析装置のプレートリーダーを用いて、ＯＤ４９０での濃度測定値を測定した。複製セットの平均測定値を、標準偏差及び変動計数とともに算出した。実験ウェルを、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ／Ｗｎｔ３ａ陽性対照と比較し、増殖の目安として、対照値の割合を計算した。
【０２１５】
表ＶＩは、全スクリーニング結果をまとめて示している。表ＶＩＩは、本スクリーニングのヒットの一覧である。強いヒットは、対照値の１２０％以上と定義され、中程度のヒットは、対照値の６０〜１２０％の範囲内であると定義される。有意な数の化合物が、本アッセイ中、増幅反応を誘発している。
【０２１６】
（実施例７）
ＧＳＫ−３β酵素阻害剤がヒト胚性幹細胞の分化及び増殖に与える影響：リード化合物の用量漸増
一次スクリーニングで同定されたヒットの活性を確認し、用量漸増によって活性の範囲を更に分析することが重要であった。一次スクリーニングヒットの選択的なサブセットの新しいサンプルを乾燥粉末として入手し、可溶化して新しいストック試薬を作り、二次確認アッセイで希釈し、ヒト胚性幹細胞への影響を評価した。
【０２１７】
２つのヒト胚性幹細胞（Ｈ１及びＨ９）の培養を実施例１に記載の通り培養した。細胞コロニーを、ＤＭＥＭ：Ｆ１２で１：３０に希釈されたＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を用いてＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングされたポリスチレンプラスチック上で未分化多能性状態のまま維持した。平均して４日毎に、酵素継代によって細胞を分割した。継代は、３７℃で１０〜６０分間、コラゲナーゼ溶液（１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に細胞単層を曝露し、ピペットの先端で穏やかに掻き集めて細胞塊を回収することによって実施した。塊を重力により沈降させ、次いで洗浄して残留コラゲナーゼを除去した。細胞塊を、維持培養用に１：３の比で、またはその後のアッセイ用に１：１の比で分割した。ヒト胚性幹細胞株を、５０継代未満で維持し、正常核型の表現型、及びマイコプラズマ汚染がないことに関してルーチン的に評価した。
【０２１８】
アッセイ用の細胞の調製：アッセイで用いるＨ１またはＨ９ヒト胚性幹細胞株の細胞塊を、培養培地において均一に再懸濁し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングされた９６ウェルＰａｃｋａｒｄ  ＶＩＥＷＰＬＡＴＥＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に１００μＬ／ウェルの容量で播いた。８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＭＥＦ調整培地を初期播種及び増殖に使用した。使用済みの培養培地を各ウェルから吸引し、同量の新しい培地と交換することで毎日の栄養補給を実施した。アッセイ開始の前に播種後１〜３日間、培養物を増殖させた。アッセイ期間中、プレートは加湿したボックスの中に入れられて３７℃、５％  ＣＯ2に保たれた。
【０２１９】
化合物及びアッセイ培地の調製：一次スクリーニングで得たヒットのサブセットを、追跡調査及び後続の二次アッセイのために使用した。乾燥粉末として入手可能な２０個の化合物を、ＤＭＳＯ中１０ｍＭのストックとして可溶化し、−２０℃で脱水して使用するまで保管した。アッセイ直前に、化合物ストックを、０．５％  ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）及び１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１：１０００に希釈して１０μＭの試験化合物を作った。これを更に、０．５％  ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａを有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地で連続して倍数希釈し、化合物毎に、７点希釈曲線を作製した。
【０２２０】
二次スクリーニングアッセイ：アッセイは、各ウェルにおける細胞単層から培養培地を吸引し、続いてＰＢＳで３回洗浄して残留成長因子及び血清を除去して開始された。０．５％  ＦＣＳと、１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａを有し、Ｗｎｔ３ａを有さない、異なる濃度の阻害剤化合物とを有する培地を含有するウェルあたり１００μＬの試験容量を加え戻した。陽性対照ウェルは、０．５％  ＦＣＳ及び２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を有するが、試験化合物のない状態の同一の基本培地を含有した。陰性対照ウェルは、０．５％  ＦＣＳを有するが、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、Ｗｎｔ３ａまたは試験化合物のない状態の同一の基本培地を含有した。アッセイ２日目に、アッセイウェルを吸引し、同一濃度の試験化合物または対照溶液を再度供給した。３日及び４日目に、全アッセイウェルを吸引し、試験化合物またはＷｎｔ３ａの両方が存在しない状態で、２％  ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２が供給された。並行陰性対照ウェルは、３日目及び４日目は２％  ＦＣＳを有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地に維持された。
【０２２１】
アッセイ評価：培養の最後に、９６ウェルプレート中の細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで室温で２０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで更に３回洗浄し、次いで、室温で２０分間、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理した。固定及び透過処理の後、細胞を再びＰＢＳで３回洗浄し、次いで室温で３０分間、ＰＢＳ中において４％ニワトリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でブロックした。一次抗体（ヤギ抗ヒトＳｏｘ１７、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、４％ニワトリ血清で１：１００に希釈し、室温で１時間、細胞に加えた。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８共役二次抗体（ニワトリ抗ヤギＩｇＧ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）をＰＢＳで１：２００に希釈し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、各ウェルに加えた。細胞核を対比染色するために、２μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で１０分間加えた。細胞をＰＢＳで一度洗浄し、画像化のために、１００μＬ／ウェルのＰＢＳ中に放置した。
【０２２２】
細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で染色した細胞用の５１００８ｂｓ二色性を利用するＩｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて撮像した。曝露時間を、陽性対照ウェルと、未処理陰性対照として、二次抗体のみ染色したウェルとを用いて最適化した。処理及び染色手順の間のあらゆる細胞消失を補償するために、１ウェルあたり１５の領域を得た。ウェル毎の全細胞の数及び全Ｓｏｘ−１７強度の測定値を、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを使用して得た。グレイスケール・レベル（基準線範囲１００〜３００）及び核サイズに基づいて、細胞核のセグメンテーションを決定した。複製データセット毎の平均値及び標準偏差を算出した。全Ｓｏｘ１７タンパク質の発現は、細胞面積掛ける細胞の全蛍光量として定義される全強度又は積分強度として記録された。３００〜３０００のグレイスケール範囲、及び０．４以上の形状因子の判定基準に基づいて背景を消去した。全強度データは、ウェル毎の全強度をＷｎｔ３ａ／Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ陽性対照の平均全強度で割って正規化された複製セット毎の平均値及び標準偏差に関する正規化データを算出した。
【０２２３】
結果
この二次アッセイにおける用量漸増によって活性が確認され、かつ作用強度が測定された８つのＧＳＫ−３Ｂ酵素阻害剤に関する結果が示されている。示したデータは、細胞の数及びＳｏｘ１７に与える化合物の影響を示しており、それぞれのデータ点は二重セットからの平均であり、同一領域及びウェルからパラメータ毎に見つけ出された。本実施例において、Ｓｏｘ１７の発現は、胚体内胚葉分化を示している。Ｈ１ヒト胚性幹細胞株を用いた、細胞数とＳｏｘ１７強度に関する結果をそれぞれ表ＶＩＩＩ及びＩＸで示す。Ｈ９ヒト胚性幹細胞株に関する結果を表Ｘ及びＸＩで示す。陽性対照値は、細胞数とＳｏｘ１７強度に関して１．０００に正規化された。陰性対照値は、両方の細胞株で、細胞数は０．３８８未満であり、Ｓｏｘ１７強度は０．０６５未満であった。両方のヒト胚性幹細胞株を比較し、各化合物の用量漸増を含む、これらのデータの図式表現が、図１〜８に示されている。細胞数をパネルＡに示し、Ｓｏｘ１７強度をパネルＢに示す。これらのデータは、各化合物が、ｈＥＳ細胞増殖及び胚体内胚葉分化を促進し、最適な範囲の活性を同定可能であることを確認している。
【０２２４】
（実施例８）
ＧＳＫ−３β酵素阻害剤が胚体内胚葉に関連した追加のマーカーの発現に与える影響
リード化合物は、転写因子Ｓｏｘ１７に加えて、胚体内胚葉分化を示す他のマーカーも誘導可能であることを例証することが重要であった。ＣＸＣＲ４、表面受容体タンパク質、及び、胚体内胚葉分化にも関連した転写因子であるＨＮＦ−３βの発現を促進する能力に関して、ヒットの選択サブセットを試験した。
【０２２５】
アッセイ用の細胞の調製：アッセイで使用するＨ１ヒト胚性幹細胞株からの細胞塊を、培養培地で均等に再懸濁し、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングされた（１：３０希釈物）６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２ｍＬ／ウェルの容量で播いた。８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＭＥＦ調整培地を最初の播種及び増殖に使用した。使用済みの培養培地を各ウェルから吸引し、同量の新しい培地と交換することで毎日の栄養補給を実施した。アッセイ開始前に、播種後１〜３日間、培養物を増殖させた。プレートは、アッセイ期間中、３７℃、５％  ＣＯ2に保たれた。
【０２２６】
化合物とアッセイ培地の調製：一次スクリーニングで得た７つのヒットのサブセットを、追跡調査及び後続の二次アッセイに使用した。適切な化合物を、ＤＭＳＯ中１０ｍＭのストックとして可溶化し、使用まで−２０℃で脱水し保管した。アッセイ直前に、０．５％  ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）及び１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、化合物のストックを１μＭ〜５μＭの範囲の最終濃度に希釈した。
【０２２７】
アッセイ：アッセイは、各ウェルの細胞単層から培養培地を吸引して、続いてＰＢＳで３回洗浄して、残留成長因子と血清を除去して開始した。０．５％  ＦＣＳと、１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａを有し、Ｗｎｔ３ａを有さない異なる濃度の阻害化合物とで補充された培地を含有するウェルあたり２ｍＬの試験容量を加え戻した。陽性対照ウェルは、１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａと２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と０．５％  ＦＣＳとを有するが試験化合物の存在しない状態の同一の基本培地を含有した。陰性対照ウェルは、０．５％  ＦＣＳを有するが、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、Ｗｎｔ３ａまたは試験化合物が存在しない状態の基本培地を含有した。アッセイ２日目に、アッセイウェルを吸引し、同一濃度の試験化合物または対照溶液を再度供給した。３日及び４日目に、全アッセイウェルを吸引し、試験化合物またはＷｎｔ３ａの両方が存在しない状態で、２％  ＦＣＳと１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２が供給された。並行陰性対照ウェルは、３日及び４日目は、２％ＦＣＳを有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地に維持された。
【０２２８】
アッセイ評価：培養の最後に、細胞単層をＰＢＳで洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で５分間インキュベートすることによって、培養プレートから回収した。細胞をＭＥＦ調整培地で再懸濁し、２つの等しいサンプルに分割した。サンプルの１セットを種々の蛍光標識化抗体で更に染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を施した。サンプルの第２の並列セットに定量ＰＣＲを施した。
【０２２９】
ＦＡＣＳ分析を受けた細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ及びＢＤ  ＦＡＣＳ染色緩衝液で希釈した０．１２５％ヒトγ−グロブリン（Ｓｉｍｇａ  ｃａｔ＃  Ｇ−４３８６）の中で４℃で１５分間ブロックした。細胞の分液（それぞれおよそ１０5細胞）を、蛍光タグに直接結合され、かつＣＤ９  ＰＥ（ＢＤ＃５５５３７２）、ＣＤ９９  ＰＥ（Ｃａｌｔａｇ＃ＭＨＣＤ９９０４）またはＣＸＣＲ−４  ＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｃａｔ＃  ＦＡＢ１７３Ａ）に対する特異性を有する抗体で、４℃で３０分間染色した。ＢＤ  ＦＡＣＳ染色緩衝液中の一連の洗浄の後、生存率を評価するために、細胞を７−ＡＡＤ（ＢＤ＃５５９９２５）で染色して、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で、少なくとも１０，０００の事象を回収して分析した。ＰＥ及びＡＰＣの両方に対するマウスＩｇＧ1ｋイソタイプ対照抗体を使用して、陽性細胞の割合をゲートした。
【０２３０】
定量ＰＣＲ用の細胞を、ＲＮＡを抽出し、精製し、かつｃＤＮＡ合成するために処理した。ＲＮＡサンプルを、エタノール−含有、高塩濃度緩衝液の存在下、シリカゲル膜（Ｒｎｅａｓｙミニキット、Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）に結合させた後、洗浄して混入物を除去することにより精製した。ＲＮＡを、ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−フリーキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を用いて更に精製し、高品質ＲＮＡを水中に溶出した。収率及び純度を分光光度計のＡ２６０及びＡ２８０の測定値によって評価した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＡＢＩ，ＣＡ）製の大容量ｃＤＮＡアーカイブキットを用いて精製したＲＮＡからｃＤＮＡコピーを作製した。
【０２３１】
特に明記しない限り、リアルタイムＰＣＲ増幅及び定量化のための全ての試薬はＡＢＩから購入した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてリアルタイムＰＲ反応を行った。２０ｎｇの逆転写ＲＮＡと共に、ＴＡＱＭＡＮ  ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＰＣＲ  ＭＡＳＴＥＲ  ＭＩＸ（ＡＢＩ，ＣＡ）を、２０μＬの全反応容量で使用した。各ｃＤＮＡサンプルを２回使用して、ピペッティング誤差に関して補正した。プライマーとＦＡＭ−標識ＴＡＱＭＡＮプローブを、２００ｎＭの濃度にて使用した。各標的遺伝子に対する発現レベルを、ＡＢＩによって先に開発された、ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）内在性対照を用いて正規化した。プライマー及びプローブの組合せを次に示す。ＣＸＣＲ４（Ｈｓ００２３７０５２）、ＧＡＰＤＨ（４３１０８８４Ｅ）、ＨＮＦ３ｂ（Ｈｓ００２３２７６４）、ＳＯＸ１７（ｐｒｏｂｅ  ｐａｒｔ  ＃  ４５００２５、ｆｏｒｗａｒｄ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐａｒｔ  ＃  ４３０４９７１）。
【０２３２】
最初５０℃で２分間、次いで９５℃で１０分間のインキュベーションの後、サンプルを２段階、即ち、９５℃で１５秒間の変性工程と、その後６０℃で１分間のアニーリング／伸張工程と、で４０回サイクルした。ＧＥＮＥＡＭＰ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアを用いてデータ解析を実施した。各プライマー／プローブの組合せについて、増幅の指数関数領域の中央において蛍光強度が特定の値に到達したサイクル数としてのＣｔ値を決定した。比較Ｃｔ法を使用して、相対的な遺伝子発現レベルを算出した。簡潔に述べると、各ｃＤＮＡサンプルに関して、対象とする遺伝子のＣｔ値から内在性対照Ｃｔ値を減算して、デルタＣｔ値（ΔＣｔ）を得た。増幅は１００％効率であると仮定し、標的の正規化した量を２−ΔＣｔとして算出した。最終的なデータを、標準物質サンプルに関して表した。
【０２３３】
結果
図９は、種々のＧＳＫ３阻害剤で処理した後に、ＣＸＣＲ４表面受容体を発現している陽性細胞の割合のＦＡＣＳ分析を示している。未処理の細胞集団（陰性対照）、またはＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ及びＷｎｔ３で処理した細胞（陽性対照）に対する各化合物の１μＭ〜５μＭの範囲の２種類の濃度が示されている。図１０のパネルａ、ｂ及びｃは、胚体内胚葉のマーカーであるとも考えられる、ＣＸＣＲ４、Ｓｏｘ１７及びＨＮＦ３βに関するリアルタイムＰＣＲデータを示している。ＦＡＣＳ及びリアルタイムＰＣＲ分析は、未処理の対照細胞に関して、分化した細胞ではこれらのマーカーのそれぞれの有意な増加が観察されることを実証している。一部の例では、これらの胚体内胚葉マーカーの発現レベルは、陽性対照と同等であり、分化のこの段階において、ＧＳＫ３阻害剤がＷｎｔ３ａの代わりになり得ることを実証している。
【０２３４】
（実施例９）
ＧＳＫ−３β酵素阻害剤が膵臓内胚葉の形成に与える影響
胚体内胚葉の誘導の間にＧＳＫ３β阻害剤で処理することが、例えば、膵臓内胚葉のような他の細胞型のその後の分化を阻害しないことを実証することが重要であった。ヒットの選択サブセットを、膵臓内胚葉に関連する鍵となる転写因子であるＰＤＸ１とＨＮＦ６の発現を促進する能力に関して試験した。
【０２３５】
ヒト胚性幹細胞（Ｈ１及びＨ９株）の維持を実施例１に記載の通り実施した。細胞コロニーを、平均して４日毎に継代させて、未処理多能性状態に維持した。継代を、細胞培養物を、３７℃で１０〜３０分間、コラゲナーゼ溶液（１ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に曝露することと、続いてピペットの先端で穏やかに掻き取り、細胞塊を回収することと、によって実施した。塊は重力により沈降させ、洗浄して残留コラゲナーゼを除去した。細胞塊を、常用維持培養用に１：３の比で、または後続アッセイ用に１：１の比で分割した。ヒト胚性幹細胞株を、５０継代未満で維持し、正常核型の表現型と、マイコプラズマ汚染がないことに関してルーチン的に評価した。
【０２３６】
アッセイの細胞調製：アッセイで使用するＨ１ヒト胚性幹細胞株の細胞塊を培養培地中で均一に再懸濁し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングされた（１：３０希釈）２４ウェルプレート（黒色ウェル：Ａｒｃｔｉｃ  Ｗｈｉｔｅ）に１ｍＬ／ウェルの容量で播いた。８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＭＥＦ調整培地を最初の播種及び増殖に使用した。２回目の実験において、Ｈ９株からのｈＥＳ細胞の塊を、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）で処理することによって予め不活化したマウス胚性フィーダー（ＭＥＦ）層上の９６ウェルプレートに播いた。ＭＥＦ単層上のｈＥＳ細胞の培養培地は、最小必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−グルタミン及び２−メルカプトエタノールで補充された２０％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＤＭＥＭ：Ｆ１２で構成された。使用済みの培養培地を各ウェルから吸引し、同量の新しい培地と交換することで毎日の栄養補給を実施した。培養物を、アッセイを開始する前に、播種後１〜３日増殖させた。プレートは、アッセイ期間中、３７℃、５％  ＣＯ2にて保たれた。
【０２３７】
化合物及びアッセイ培地の調製：一次スクリーニングで得た８つのヒットのサブセットを、追跡調査及び後続の二次アッセイに使用した。適切な化合物を、ＤＭＳＯ中１０ｍＭのストックとして可溶化し、−２０℃で脱水して使用まで保管した。アッセイ直前、化合物ストックを添加物を有する基本培地で１μＭ〜５μＭの範囲の最終濃度に希釈した。
【０２３８】
アッセイ：本アッセイにおいて、ＧＳＫ３阻害剤は、胚体内胚葉分化工程の１日及び２日目のみにＷｎｔ３ａの代わりに含められた。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上の胚性幹細胞培養物を、各ウェルの細胞単層から培養培地を吸引し、続いてＰＢＳで３回洗浄して残留成長因子と血清を除去することによって、実施例７及び８に記載の通りに開始した。胚体内胚葉へ分化させるために、０．５％  ＦＣＳを有するＤＭＥＭ：Ｆ１２培地と、１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａを有しＷｎｔ３ａを有さない異なる濃度の阻害化合物とを含有する試験容量（２４ウェルプレートに関してはウェルあたり０．５ｍＬ、９６ウェルプレートに関してはウェルあたり１００μＬ）を加え戻した。陽性対照ウェルは、０．５％  ＦＣＳと１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａと２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを有するが試験化合物がない状態の同じ基本培地を含有した。陰性対照ウェルは、０．５％  ＦＣＳを有するが、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、Ｗｎｔ３ａ、又は試験化合物のない状態の同じ基本培地を含有した。アッセイ２日目に、アッセイウェルを吸引し、同一濃度の試験化合物または対照溶液を再度供給した。３日及び４日目に、全アッセイウェルを吸引し、試験化合物またはＷｎｔ３ａの両方の存在しない状態で、２％  ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２が供給された。並行陰性対照ウェルは、３日及び４日目は、２％  ＦＣＳを有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地に維持された。膵臓内胚葉へ分化させるために、細胞を３日間処理し、２％  ＦＣＳと、０．２５μＭのＫＡＡＤシクロパミン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地を毎日供給した。その後、細胞を更に４日間処理し、１％  Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、０．２５μＭのＫＡＡＤシクロパミンと、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７と、を含有する、ＤＭＥＭ：Ｆ１２を毎日供給した。並行陰性対照ウェルは、２％  ＦＣＳ（段階２）または１％  Ｂ２７（段階３）を有し、任意の他の添加物を有さないＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地にずっと維持された。
【０２３９】
Ｈ９ヒト胚性細胞の並行培養物をＭＥＦフィーダー層の上で増殖させ、膵臓内胚葉に分化させた。胚体内胚葉分化は、異なる濃度の阻害剤化合物と１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａと共に、１日目は血清を含有せず、２日及び３日目は０．２％  ＦＣＳを含油するＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる培地で細胞を培養することによって達成された。陽性対照ウェルは、１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ及び２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を有するが、試験化合物が存在しない状態の（血清を有する、または有さない）同一の基本培地を含有した。陰性対照ウェルは、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、Ｗｎｔ３ａまたは試験化合物の存在しない状態で、血清を有する、または有さない同一の基本培地を含有した。アッセイ２日目に、アッセイウェルを吸引し、同一濃度の試験化合物または対照溶液を再度供給した。３日目に、全アッセイウェルを吸引し、試験化合物及びＷｎｔ３ａの両方が存在しない状態で、２％  ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａで補充されたＲＰＭＩ−１６４０が供給された。並行陰性対照ウェルは、３日目は２％  ＦＣＳを有するＲＰＭＩ−１６４０基本培地に維持された。細胞を４日間処理し、２％  ＦＣＳと０．２５ｍＭのＫＡＡＤシクロパミン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを含有するＲＰＭＩ−１６４０基本培地を毎日供給することによって、細胞を膵臓内胚葉に分化させた。続いて、細胞を３日間処理し、１％  Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、０．２５ｍＭのＫＡＡＤシクロパミンと、２ｍＭのレチノイン酸（ＲＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０と、を含有する、ＲＰＭＩ−１６４０を毎日供給した。並行陰性対照ウェルは、２％  ＦＣＳ（段階２）または１％  Ｂ２７（段階３）を有するが、任意の他の添加物を有さないＲＰＭＩ−１６４０基本培地にずっと維持された。
【０２４０】
アッセイ評価：分化の最後に、細胞を、リアルタイムＰＣＲによって、実施例８に記載の通り遺伝子発現に関して試験した。高含量蛍光染色のため、９６ウェルプレートの細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで室温で２０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで更に３回洗浄し、次いで室温で２０分間、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理した。固定及び透過処理後、細胞を再びＰＢＳで３回洗浄し、室温で３０分間、ＰＢＳ中において４％ニワトリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でブロックした。一次抗体（ヤギ抗ヒトＰｄｘ１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を、４％ニワトリ血清で１：１００に希釈し、室温で２時間細胞に加えた。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８共役二次抗体（ニワトリ抗ヤギＩｇＧ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）をＰＢＳで１：２００に希釈し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、各ウェルに加えた。細胞核を対比染色するために、２μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で１０分間加えた。細胞をＰＢＳで一度洗浄し、画像化のために、１００μＬ／ウェルのＰＢＳ中に放置した。
【０２４１】
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で染色した細胞の５１００８ｂｓ二色性を利用するＩｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて細胞を撮像した。曝露時間を、陽性対照ウェルと、二次抗体のみで染色したウェルを用いて最適化した。処理及び染色手順の間のあらゆる細胞消失を補償するために、１ウェルあたり１５の領域を得た。ウェル毎の全細胞数及び全Ｐｄｘ１強度の測定値を、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを使用して得た。グレイスケール・レベル（基準線範囲１００〜３００）及び核サイズに基づいて、細胞核のセグメンテーションを決定した。各複製データセットに関して平均値及び標準偏差を算出した。全Ｐｄｘ１タンパク質の発現は、細胞面積掛ける細胞の全蛍光量値として定義される全強度または積分強度として記録された。３００〜３０００のグレイスケール範囲の判定基準に基づいて背景を消去した。全強度データは、ウェル毎の全強度をＷｎｔ３ａ／Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ陽性対照の平均全強度で割って正規化された。複製セット毎の平均値及び標準偏差に関する正規化データを算出した。
【０２４２】
定量ＰＣＲ用の細胞をＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）に溶解し、次いでＲＮＡを抽出し、精製し、かつｃＤＮＡ合成のために処理した。ＲＮＡサンプルを、エタノール−含有、高塩濃度緩衝液の存在下、シリカゲル膜（Ｒｎｅａｓｙミニキット、Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）に結合させた後、混入物を洗浄することにより精製した。ＲＮＡを、ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−フリーキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を用いて更に精製し、次いで高品質ＲＮＡを水中に溶出した。収率及び純度を、分光光度計のＡ２６０及びＡ２８０測定値によって評価した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＡＢＩ，ＣＡ）製の大容量ｃＤＮＡアーカイブキットを用いて、精製したＲＮＡからｃＤＮＡコピーを作製した。
【０２４３】
特に明記しない限り、リアルタイムＰＣＲ増幅及び定量化のための全ての試薬をＡＢＩから購入した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてリアルタイムＰＲ反応を実施した。ＴＡＱＭＡＮ  ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＰＣＲ  ＭＡＳＴＥＲ  ＭＩＸを、２０ｎｇの逆転写ＲＮＡとともに２０μＬの総反応容量にて使用した。各ｃＤＮＡサンプルを２回使用して、ピペッティング誤差に関して補正した。プライマーとＦＡＭ−標識ＴＡＱＭＡＮプローブを、２００ｎＭの濃度で使用した。各標的遺伝子に関する発現レベルを、ＡＢＩによって以前開発された、ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）内在性対照を用いて正規化した。プライマーとプローブの組合せを以下の通り記載する。ＰＤＸ１（Ｈｓ００２３６８３０＿ｍ１）、ＧＡＰＤＨ（４３１０８８４Ｅ）及びＨＮＦ６（Ｈｓ００４１３５５４＿ｍ１）。
【０２４４】
最初５０℃で２分間、次に９５℃で１０分間のインキュベーションの後、サンプルを２段階、すなわち、９５℃で１５秒間の変性工程と、その後の６０℃で１分間のアニーリング／伸張工程とで、４０回サイクルした。ＧＥＮＥＡＭＯ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアを用いてデータ解析を実施した。各プライマー／プローブの組合せについて、増幅の指数関数領域の中央において蛍光強度が特定の値に到達したサイクル数としてのＣｔ値を決定した。比較Ｃｔ法を使用して、相対的な遺伝子発現レベルを算出した。簡潔に述べると、各ｃＤＮＡサンプルに関して、対象とする遺伝子のＣｔ値から内在性対照のＣｔ値を減算して、デルタＣｔ値（ΔＣｔ）を得た。増幅は１００％効率であると仮定し、標的の正規化した量を２−ΔＣｔとして算出した。最終的なデータを、標準物質サンプルに関して表した。
【０２４５】
結果
８つのＧＳＫ−３β酵素阻害剤に関する結果が示されている。高含量分析からの図１１に示されたデータは、Ｈ１  ｈＥＳ細胞株の細胞数（パネルＡ）とＰｄｘ１強度（パネルＢ）に与える影響を示しており、それぞれのデータ点は、二重サンプルセットからの平均であり、同一領域及びウェルから、パラメータ毎に見つけ出された。リアルタイムＰＣＲからの図１２に示されたデータは、これらの小分子阻害剤が２つの転写因子であるＰｄｘ１及びＨＮＦ６の誘導発現に与える影響を示している。これらの実施例において、Ｐｄｘ１及びＨＮＦ６の発現は、膵臓内胚葉分化を示している。これらのアッセイのＧＳＫ３β阻害剤化合物が、細胞系列へのコミットメントの早期段階中にＷｎｔ３ａの代替となることができ、得られた細胞は、分化の続いて起こる後期段階中に膵臓内胚葉を形成する能力を維持する。
【０２４６】
（実施例１０）
ＧＳＫ−３β酵素阻害剤が膵臓内胚葉細胞の形成に与える影響
胚体内胚葉の誘導の間にＧＳＫ３β阻害剤で処理することが、例えば、膵臓内分泌細胞、またはインスリン産出細胞のような、他の細胞型のその後の分化を阻害しなかったことを実証することが重要であった。ヒットの選択サブセットを、膵臓ホルモンの発現を促進する能力に関して試験した。
【０２４７】
アッセイ用の細胞調製：（９６ウェルプレート及び２４ウェルプレート上で培養した）実施例９に記載した方法に従って得た膵臓内胚葉細胞を、続いて、細胞を膵臓ホルモン発現細胞に分化させる薬剤にさらした。
【０２４８】
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上のＨ１ヒト胚性幹細胞株の培養物のアッセイを、各ウェルの細胞単層から培養培地を吸引し、続いて、ＰＢＳで３回洗浄して、残留成長因子及び血清を除去することによって、実施例７〜９に記載の通り開始した。胚体内胚葉へ分化させるために、０．５％  ＦＣＳを有する培地と、１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａを有し、Ｗｎｔ３ａを有さない、異なる濃度の阻害剤化合物とを含有する試験容量（２４ウェルプレートに関してはウェルあたり０．５ｍＬ、９６ウェルプレートに関してはウェルあたり１００μＬ）を加えた。陽性対照ウェルは、０．５％  ＦＣＳと１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ及び２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を有するが、試験化合物が存在しない状態の同一の基本培地を含有した。陰性対照ウェルは、０．５％  ＦＣＳを有するが、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、Ｗｎｔ３ａまたは試験化合物が存在しない状態の同一の基本培地を含有した。アッセイ２日目に、アッセイウェルを吸引し、同一濃度の試験化合物または対照溶液を再度供給した。３日、４日及び５日目に、全アッセイウェルを吸引し、試験化合物またはＷｎｔ３ａの両方が存在しない状態で、２％ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２が供給された。並行陰性対照ウェルは、３日、４日及び５日目は、２％  ＦＣＳを有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地に維持された。膵臓内胚葉へ分化させるために、細胞を３日間処理し、０．２５μＭのＫＡＡシクロパミン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を有する２％  ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地を毎日供給した。続いて、細胞を４日間処理し、１％  Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、０．２５μＭのＫＡＡＤシクロパミンと、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７と、を含有する、ＤＭＥＭ：Ｆ１２を毎日供給した。段階２及び３の間の並行陰性対照ウェルは、２％  ＦＣＳまたは１％  Ｂ２７を有するが、任意の他の添加物を有さないＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地にずっと維持された。膵臓内胚葉の形成の後、細胞を更に６日間継続して処理し、１％  Ｂ２７と、１μＭのＤＡＰＴ（ガンマセクレターゼ阻害剤、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と５０ｎｇ／ｍＬのＥｘｅｎｄｉｎ  ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地を毎日供給した。次に、細胞を別の３日間継続して処理し、１％  Ｂ２７と、５０ｎｇ／ｍＬのＥｘｅｎｄｉｎ  ４と、５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、を含有する、ＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地を毎日供給した。並行陰性対照ウェルは、１％  Ｂ２７を有するが、任意の他の添加物を有さない、ＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地にずっと維持された。
【０２４９】
アッセイ評価：培養の最後に、高含量分析またはリアルタイムＰＣＲによって評価するために、上述の実施例７及び８と同様に細胞を処理した。
【０２５０】
高含量蛍光染色のために、９６ウェルプレートの細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで室温で２０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで更に３回洗浄し、次いで室温で２０分間、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理した。固定及び透過処理後、細胞をＰＢＳで再び３回洗浄し、室温で３０分間、ＰＢＳにおいて４％ニワトリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でブロックした。一次抗体（モルモット抗ブタインスリン、ヒトインスリンとの交差反応性、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を、４％ヤギ血清で１：５００に希釈し、室温で１時間細胞に加えた。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで４％ヤギ血清で１：１００に希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８共役二次抗体（ヤギ抗モルモットＩｇＧ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。細胞核を対比染色するために、２μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温で１０分間加えた。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、画像化のために、１００μＬ／ウェルのＰＢＳ中に放置した。
【０２５１】
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で染色した細胞用５１００８ｂｓ二色性を利用するＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて細胞を画像化した。曝露時間を、陽性対照ウェルと、二次抗体のみで染色したウェルを用いて最適化した。処理及び染色手順の間のあらゆる細胞消失を補償するために、１ウェルあたり１５の領域を得た。ウェル毎の全細胞数及び全インスリン強度の測定値を、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを使用して得た。グレイスケール・レベル（基準線範囲１００〜３００）及び核サイズに基づいて、細胞核のセグメンテーションを決定した。複製データセット毎の平均値及び標準偏差を算出した。全インスリンタンパク質の発現は、細胞の全蛍光量掛ける細胞面積として定義される全強度または積分強度として報告された。３００〜３０００のグレイスケール範囲の判定基準に基づいて背景を消去した全強度データは、ウェル毎の全強度をＷｎｔ３ａ／Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ陽性対照の平均全強度で割ることによって正規化された。三重セット毎の平均値及び標準偏差に関する正規化データが計算された。
【０２５２】
定量ＰＣＲ用の細胞をＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）で溶解し、次いでＲＮＡを抽出し、精製し、かつｃＤＮＡを合成するために処理した。ＲＮＡサンプルを、エタノール−含有、高塩濃度緩衝液の存在下、シリカゲル膜（ＲＮｅａｓｙミニキット、Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）に結合させた後、混入物を洗浄することにより精製した。ＲＮＡを、ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−フリーキット（Ａｍｂｉｏｎ，ＩＮＣ）を用いて更に精製し、高品質ＲＮＡを水中に溶出した。収率と純度を、分光光度計のＡ２６０とＡ２８０測定値によって評価した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＡＢＩ，ＣＡ）製の大容量ｃＤＮＡアーカイブキットを用いて精製ＲＮＡからｃＤＮＡコピーを作製した。
【０２５３】
特に明記しない限り、リアルタイムＲＣＲ増幅と定量化のための全ての試薬をＡＢＩより購入した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、リアルタイムＰＣＲ反応を行った。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＰＣＲ  ＭＡＳＴＥＲ  ＭＩＸ（登録商標）（ＡＢＩ，ＣＡ）を、２０ｎｇの逆転写ＲＮＡと共に、２０μＬの全反応容量で使用した。各ｃＤＮＡサンプルを２回使用して、ピペッティング誤差に関して補正した。プライマー及びＦＡＭ−標識ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブを２００ｎＭの濃度で使用した。各標的遺伝子に対する発現レベルを、ＡＢＩによって以前開発されたヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）内在性対照を用いて正規化した。プライマー及びプローブの組合せを以下の通り記載する。ＰＤＸ１（Ｈｓ００２３６８３０＿ｍ１）、インスリン（Ｈｓ００３５５７７３）及びＧＡＰＤＨ（４３１０８８４Ｅ）。
【０２５４】
最初５０℃で２分間、次いで９５℃で１０分間でのインキュベーションの後、サンプルを２段階、すなわち、９５℃で１５秒間の変性工程と、続いて６０℃で１分間のアニーリング／伸張工程とで、４０回サイクルした。ＧＥＮＥＡＭＰ（登録商標）７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアを使用してデータ解析を行った。プライマー／プローブの組合せ毎に、増幅の指数関数領域の中央において蛍光強度が特定の値に到達したサイクル数としてのＣt値を決定した。比較Ｃt法を使用して、相対的な遺伝子発現レベルを算出した。簡潔に述べると、各ｃＤＮＡサンプルに関して、対象とする遺伝子のＣt値から内在性対照のＣt値を減算して、デルタＣt値（ΔＣｔ）を得た。増幅は１００％効率であると仮定し、標的の正規化した量を２-ΔCtとして算出した。最終的なデータを、標準物質サンプルに関して表した。
【０２５５】
結果
８つのＧＳＫ−３Ｂ酵素阻害剤に関する結果が示されている。高含量分析からの図１３に示されるデータは、Ｈ１  ｈＥＳ細胞株の細胞数（パネルＡ）及びインスリン強度（パネルＢ）に与える化合物の影響を示しており、それぞれのデータ点は、三重セットからの平均である、同一領域及びウェルからパラメータ毎に見つけ出された。リアルタイムＰＣＲからの図１４に示されるデータは、Ｐｄｘ１及びインスリンに対する化合物の影響を示している。これらの実施例において、Ｐｄｘ１とインスリン発現は、膵臓内胚葉分化と、ホルモン陽性細胞の生成を示している。これらのアッセイの選択ＧＳＫ３β阻害剤化合物が、インスリン免疫染色とリアルタイムＰＣＲの両方から明らかなように、細胞系列へのコミットメントの早期段階中に、Ｗｎｔ３ａの代替となることができ、分化の続いて起こる後期段階中に、膵臓β細胞の形成を誘導し維持することが可能である。
【０２５６】
（実施例１１）
膵臓内分泌細胞の形成に与えるＧＳＫ−３β酵素阻害剤の相加効果
細胞運命決定の複数段階の間に添加される場合は、ＧＳＫ３β阻害剤で処理することにより膵臓β細胞の分化を改善することができることを証明することが重要であった。ヒットの選択サブセットを、膵臓ホルモン陽性細胞と関連したインスリンの発現を促進するために逐次定期的な添加によって試験した。
【０２５７】
アッセイ用の細胞の調製：アッセイ用の細胞調製：（９６ウェルプレート上で培養した）実施例９及び１０で記載した方法に従って得た膵臓内胚葉細胞を、続いて、細胞を膵臓ホルモン発現細胞へ分化させる薬剤にさらした。
【０２５８】
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上のＨ１ヒト胚性幹細胞株の培養物のアッセイを、各ウェルの細胞単層から培養培地を吸引し、続いてＰＢＳで３回洗浄して残留成長因子と血清を除去することによって、実施例７〜９に記載の通り開始した。胚体内胚葉へ分化させるために、０．５％  ＦＣＳを有する培地と、１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａを有し、Ｗｎｔ３ａを有さない異なる濃度の阻害剤化合物と、を含有する、試験容量（９６ウェルプレートに関してはウェルあたり１００μＬ）を添加した。陽性対照ウェルは、試験化合物が存在しない状態で、１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ及び２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を有する、同一の基本培地と、０．５％  ＦＣＳと、を含有した。陰性対照ウェルは、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、Ｗｎｔ３ａまたは試験化合物の存在しない状態で、０．５％  ＦＣＳを有する同一の基本培地を含有した。アッセイ２日目に、アッセイウェルを吸引し、同一濃度の試験化合物または対照溶液を再度供給した。３日、４日及び５日目に、全アッセイウェルを吸引し、試験化合物またはＷｎｔ３ａの両方の存在しない状態で、２％  ＦＣＳと１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２が供給された。並行陰性対照ウェルは、３日、４日及び５日目は２％  ＦＣＳを有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地に維持された。膵臓内胚葉へ分化させるために、細胞を３日間処理し、２％  ＦＣＳと、０．２５μＭのＫＡＡＤシクロパミン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、を含有する、ＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地を毎日供給した。続いて、細胞を４日間処理し、１％  Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、０．２５μＭのＫＡＡＤシクロパミンと、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７と、を含有する、ＤＭＥＭ：Ｆ１２を毎日供給した。並行陰性対照ウェルは、２％  ＦＣＳまたは１％  Ｂ２７を有するが、任意の他の添加物を有さないＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地にずっと維持された。膵臓内胚葉の形成後、細胞を更に６日間継続して処理し、１％  Ｂ２７と、１μＭのＤＡＰＴ（ガンマセクレターゼ阻害剤：ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、５０ｎｇ／ｍＬのＥｘｅｎｄｉｎ  ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、１μＭのＴＧＦβ  Ｒ１阻害剤ＩＩ（ＡＬＫ５阻害剤；ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、を含有する、ＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地を隔日で供給した。この６日間、ＧＳＫ３β阻害剤を、分化の開始時の前回の処理と同一濃度を用いてそれぞれのウェルに加え戻した。次いで、細胞を別の３日間連続して処理し、１％Ｂ２７と、５０ｎｇ／ｍＬのＥｘｅｎｄｉｎ  ４と、５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、２０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、１μＭのＴＧＦβ  Ｒ１阻害剤ＩＩ（ＡＬＫ５阻害剤；ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、を含有する、ＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地を隔日で供給した。この３日間、ＧＳＫ３β阻害剤を、分化の開始時の前回の処理と同一濃度を用いて、それぞれのウェルに加え戻した。陽性対照ウェルの並行セットを２０ｎｇ／���ＬのＷｎｔ３ａの存在下または非存在下で処理した。並行陰性対照ウェルは、１％  Ｂ２７を有するが、任意の他の添加物を有さないＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地でずっと維持された。
【０２５９】
アッセイ評価：培養の最後に、高含量分析による評価のために、細胞を上記実施例１０と同様に処理した。
【０２６０】
高含量蛍光染色のために、９６ウェルプレートの細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで室温で２０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで更に３回洗浄し、次いで室温で２０分間、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理した。固定及び透過処理後、細胞を再びＰＢＳで３回洗浄し、室温で３０分間、ＰＢＳ中において４％ニワトリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でブロックした。一次抗体（モルモット抗ブタインスリン、ヒトインスリンとの交差反応性、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を、４％ヤギ血清で１：５００に希釈し、室温で１時間、細胞に加えた。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで４％ヤギ血清で１：１００に希釈した、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８共役二次抗体（ヤギ抗モルモットＩｇＧ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。細胞核を対比染色するために、２μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で１０分間加えた。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、画像化のために、１００μＬ／ウェルのＰＢＳ中に放置した。
【０２６１】
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で染色した細胞用５１００８ｂｓ二色性を利用するＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて細胞を撮像した。曝露時間を、陽性対照ウェルと、二次抗体のみで染色したウェルを用いて最適化した。処理及び染色手順の間のあらゆる細胞消失を補償するために、１ウェルあたり１５の領域を得た。ウェル毎の全細胞数と全インスリン強度の測定値をＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを用いて得た。グレイスケール・レベル（基準線範囲１００〜３００）及び核サイズに基づいて、細胞核のセグメンテーションを決定した。複製データセット毎に平均値及び標準偏差を算出した。全インスリンタンパク質の発現が、細胞の全蛍光量掛ける細胞面積として定義される全強度または積分強度として報告された。３００〜３０００のグレイスケール範囲の判定基準に基づいて背景を消去した。全強度データは、ウェル毎の全強度をＷｎｔ３ａ／Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ陽性対照の平均全強度で割ることによって正規化した。三重セット毎の平均値及び標準偏差に関する正規化データを計算した。
【０２６２】
結果
８つのＧＳＫ−３Ｂ酵素阻害剤に関する結果が示されている。高含量分析からの図１５に示されるデータは、Ｈ１  ｈＥＳ細胞株の細胞数（パネルＡ）及びインスリン強度（パネルＢ）に与える化合物の影響を示しており、それぞれのデータ点を三重セットより平均化し、同一領域及びウェルからのパラメータ毎に見つけ出された。この実施例において、インスリンの発現は、ホルモン陽性膵臓細胞への分化を示している。これらのアッセイの選択ＧＳＫ３β阻害剤化合物が、細胞系列へのコミットメントの早期段階中にＷｎｔ３ａの代替となることができ、分化の後期段階で加えられる場合、陽性対照サンプルに比べて高度のインスリンの発現を促進すると思われる。
【０２６３】
本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適宜解釈される以下の「特許請求の範囲」によって定義されるものである点は認識されるであろう。
【０２６４】
【表１４】
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【０２６５】
【表１５】
2015519085.tif 000033
【０２６６】
【表１６】
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【０２６７】
【表１７】
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【０２６８】
【表１８】
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【０２６９】
【表１９】
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【０２７０】
【表２０】
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【０２７１】
【表２１】
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【０２７２】
【表２２】
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【０２７３】
【表２３】
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【０２７４】
【表２４】
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【０２７５】
【表２５】
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【０２７６】
【表２６】
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【０２７７】
【表２７】
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【０２７８】
【表２８】
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【０２７９】
【表２９】
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【０２８０】
【表３０】
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【０２８１】
【表３１】
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【０２８２】
【表３２】
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【０２８３】
【表３３】
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【０２８４】
【表３４】
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【０２８５】
【表３５】
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【０２８６】
【表３６】
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【０２８７】
【表３７】
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【０２８８】
【表３８】
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【０２８９】
【表３９】
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【０２９０】
【表４０】
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【０２９１】
【表４１】
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【０２９２】
【表４２】
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【０２９３】
【表４３】
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【０２９４】
【表４４】
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【０２９５】
【表４５】
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【０２９６】
【表４６】
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【０２９７】
【表４７】
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【０２９８】
【表４８】
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【０２９９】
【表４９】
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【０３００】
【表５０】
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【０３０１】
【表５１】
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【０３０２】
【表５２】
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【０３０３】
【表５３】
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【０３０４】
【表５４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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