(57)【要約】  本発明は、清麹醤エタノール溶解抽出物を有効成分として含む全身免疫及び腸管免疫補強剤に関するものであって、本発明の清麹醤エタノール溶解抽出物を含む免疫補強剤は、安全性が確保された食品素材を使うことによって、毒性及び副作用がなく、安価の生産コストと使用の便宜性とを提供することができる。また、本発明の免疫補強剤は、免疫原と経口投与時、経口感染性病原性微生物はもとより、非経口感染性病原性微生物やウイルス、癌抗原、一般抗原などに対しても、Ｔｈ１及びＴｈ２反応を誘導し、効果的な特異抗体（血中ＩｇＧ及び小腸ＩｇＡ）を生産することができる。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
清麹醤抽出物を有効成分として含む全身免疫又は腸管免疫補強剤において、
前記清麹醤抽出物が、エタノールを用いて抽出されたエタノール溶解成分を含むことを特徴とする全身免疫又は腸管免疫補強剤。
【請求項２】
前記エタノールが、５０％〜９９％エタノールである請求項１に記載の補強剤。
【請求項３】
前記清麹醤抽出物は、ＰＧＡが除去された抽出物である請求項１又は２に記載の補強剤。
【請求項４】
前記清麹醤抽出物は、ＰＧＡ及びレバンが除去された抽出物である請求項１又は２に記載の補強剤。
【請求項５】
前記清麹醤が、バチルス・アミロリケファシエンスを用いて製造された請求項１又は２に記載の補強剤。
【請求項６】
前記補強剤が、免疫原タンパク質と共に経口投与される場合、血中での免疫原特異的ＩｇＧ及び小腸での免疫原特異的ＩｇＡの生成を促進する請求項１又は２に記載の補強剤。
【請求項７】
前記補強剤が、免疫原タンパク質と共に経口投与される場合、脾臓内ＩＬ−１２の生成を増加させる請求項１又は２に記載の腸管免疫補強剤。
【請求項８】
前記補強剤は、免疫原タンパク質と共に経口投与される場合、脾臓内ＩＬ−４及びＩＬ−５の生成を増加させる請求項１又は２に記載の腸管免疫補強剤。
【請求項９】
前記補強剤が、免疫原タンパク質と共に経口投与される場合、免疫原タンパク質の単独経口投与と比較して、脾臓内ＩＬ−４／ＩＦＮ−γの相対的生産比率が５〜３０倍増加する請求項８に記載の腸管免疫補強剤。
【請求項１０】
（ａ）免疫原タンパク質及び（ｂ）全身免疫又は腸管免疫補強剤としての清麹醤抽出物を有効成分として含み、前記清麹醤抽出物が、エタノールを用いて抽出されたエタノール溶解成分を含むことを特徴とする全身免疫又は腸管免疫を誘発するための経口投与用ワクチン組成物。
【請求項１１】
前記エタノールが、５０％〜９９％エタノールである請求項１０に記載の経口投与用ワクチン組成物。
【請求項１２】
前記全身免疫又は腸管免疫補強剤としての清麹醤抽出物が、ＰＧＡが除去された抽出物である請求項１０又は１１に記載の経口投与用ワクチン組成物。
【請求項１３】
前記全身免疫又は腸管免疫補強剤としての清麹醤抽出物が、ＰＧＡ及びレバンが除去された抽出物である請求項１０又は１１に記載の経口投与用ワクチン組成物。
【請求項１４】
前記補強剤が、免疫原タンパク質と共に経口投与される場合、血中での免疫原特異的ＩｇＧ及び小腸での免疫原特異的ＩｇＡの生成を促進する請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記補強剤が、免疫原タンパク質と共に経口投与される場合、脾臓内ＩＬ−１２の生成を増加させる請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記補強剤が、免疫原タンパク質と共に経口投与される場合、脾臓内ＩＬ−４及びＩＬ−５の生成を増加させる請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記補強剤が、免疫原タンパク質と共に経口投与される場合、免疫原の単独経口投与と比較して、脾臓内ＩＬ−４／ＩＦＮ−γの相対的生産比率が５〜３０倍増加する請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
清麹醤のエタノール抽出物のうちからエタノール溶解成分を含む組成物を対象に投与する段階を含む全身免疫又は腸管免疫反応誘導方法。
【請求項１９】
（ａ）免疫原タンパク質及び（ｂ）清麹醤のエタノール抽出物のうちからエタノール溶解成分を含む経口投与用ワクチン組成物を対象に投与する段階を含む特定免疫原タンパク質に対する全身免疫又は腸管免疫反応誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大韓民国農村振興庁の支援下で課題番号ＰＪ００８３２５によってなされたものであって、前記課題の研究管理専門機関は、農村振興庁、研究事業名は、“次世代バイオグリーン２１事業”、研究課題名は、“Ａ型肝炎ワクチン用免疫補強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）の最適化”、主管機関は、韓国食品研究院、研究期間は、２０１１．０８．０１〜２０１２．１２．３１である。
【０００２】
また、本発明は、大韓民国知識経済部の支援下で課題番号Ｅ０１２１５０１によってなされたものであって、前記課題の研究管理専門機関は、韓国食品研究院、研究事業名は、“韓国食品研究院主要事業”、研究課題名は、“天然物素材のＴ細胞制御活性を利用した抗アレルギー食品開発研究”、主管機関は、韓国食品研究院、研究期間は、２０１２．０１．０１〜２０１２．１２．３１である。
【０００３】
本特許出願は、２０１２年３月２８日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１２−００３１７４９号及び２０１３年２月２１日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１３−００１８８９５号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として挿入される。
本発明は、清麹醤抽出物を有効成分として含む全身免疫又は腸管免疫補強剤に関する。
【背景技術】
【０００４】
安定性を考慮してワクチンの開発時、免疫効果が減るという問題点が表れ、免疫反応の効果を増進させるワクチンの製造に問題点を発生させる。このような問題の解決策として、少量の免疫原に迅速かつ強力に、そして、長期間保持させて抗原に対する免疫反応を増進させる免疫補強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）の開発がなされている。
【０００５】
現在まで知られた免疫補強剤としては、無機物塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びリン酸カルシウム）、免疫刺激剤；サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１８）、生体分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ１５４、ＭＨＣタイプ１不変部環（ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ｃｈａｉｎ）及びＬＦＡ（（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）３）、サポニン（例えば、ＱＳ２１）、ＭＤＰ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕｔａｍｉｎｅ）誘導体、ＣＰＧ−ＤＮＡ（ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、ＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、ＭＰＬ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａ）、ポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｓｅｎｅｓ）、脂肪質粒子（例えば、Ｆｒｅｕｎｄ、ＳＡＦ（Ｓｙｎｔｅｘ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）及びＭＦ５９）；リポソーム、ビロソーム、イスコム（ｉｓｃｏｍｓ、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）、共同−キレーター；ＰＬＧ（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅｓ）微粒子、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒｓ）、ウイルス（例えば、ＨＢｃＡｇ、ＨＣｃＡｇ及びＨＢｓＡｇ）、表面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ）及びフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）免疫補強剤又はビブリオコレラトキシン、突然変異トキシン（例えば、ＬＴＫ６３  ｙ  ＬＴＲ７２）及び大腸菌エンテロトキシン（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ）のような多様なバクテリア産物を含み、これらに限定されるものではない。
【０００６】
現在、アルミニウム塩、カルシウム塩、ＣｐＧ−ＤＮＡ、ＬＰＳ、ＭＰＬなど多くの免疫補強剤の開発及び研究がなされているが、多様な副作用を誘発することによって、安全性に問題点がある。即ち、免疫補強剤は、免疫補強の効果以外にも、安全性の側面で毒性があってはならず、生体分解性に優れて安定的であり、安価であり、使うのに便利ではなければならない。現在使われる免疫補強剤のうち、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔは、最も広く利用されているが、人体に使うことができず、アルミニウム塩は、人体に使うことができるが、その効果が、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔよりも落ちる（非特許文献１及び非特許文献２参照）。
【０００７】
小腸を中心とする腸管の免疫機能を腸管免疫と言い、初乳や肉汁を通じる新生児の免疫機能の強化又は乳酸菌の摂取で腸内免疫機能の増進のように簡便に口腔投与で免疫増進を活性化させることができるために、最近、多くの脚光を浴びている。１次及び２次に分けられるリンパ組織系で２次リンパ組織系に分類される腸管免疫は、粘膜リンパ器官のうち、腸管の粘膜部位に存在し、腸管免疫系内ＩｇＡ反応を含めて生体防御に非常に重要な役割を担当する（非特許文献３参照）。
【０００８】
また、経口免疫補強剤として使われるＣＴ（Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｉｎ）、ＬＴ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）などは、自体的に毒性を表すのに安定性及び効率性を備えている免疫補強剤の開発が必要である（非特許文献４参照）。
【０００９】
本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｆｒｅｕｎｄｓ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．３７，５０９（１９３７）
【非特許文献２】Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １１，２９３−３０６（１９９３）
【非特許文献３】Ｂｉｅｎｅｓｔｏｃｋ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４１，２４９−２７０（１９８０）
【非特許文献４】Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３７，２８３−２９１（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、安全性に優れながらも、安価の生産コスト及び使用の便宜性を有する経口用腸管免疫補強剤を開発するために鋭意努力した。その結果、清麹醤抽出物を免疫補強剤として利用する場合、効果的にＴｈ１及びＴｈ２免疫反応を誘導、特に、Ｔｈ２免疫反応を効果的に誘導して、免疫原特異的な免疫反応を誘導して、ワクチン効能を大きく向上させることができるということを知見して、本発明を完成した。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、全身免疫又は腸管免疫補強剤を提供することである。
本発明の他の目的は、経口投与用ワクチン組成物を提供することである。
本発明の更に他の目的は、全身免疫又は腸管免疫反応を誘導する方法を提供することである。
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一様態によれば、本発明は、清麹醤抽出物を有効成分として含む全身免疫又は腸管免疫補強剤において、前記清麹醤抽出物は、エタノールを用いて抽出されたエタノール溶解（ｅｔｈａｎｏｌ−ｓｏｌｕｂｌｅ）成分を含むことを特徴とする全身免疫又は腸管免疫補強剤を提供する。
本発明の他の様態によれば、本発明は、清麹醤のエタノール抽出物のうちからエタノール溶解成分を含む組成物を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む全身免疫又は腸管免疫反応誘導方法を提供する。
【００１４】
本発明者らは、安全性に優れながらも、安価の生産コスト及び使用の便宜性を有する経口用腸管免疫補強剤を開発するために鋭意努力した。その結果、エタノールを用いて抽出されたエタノール溶解成分を含む清麹醤抽出物を免疫補強剤として利用する場合、効果的にＴｈ１及びＴｈ２免疫反応を誘導、特に、Ｔｈ２免疫反応を効果的に誘導して、免疫原特異的な免疫反応を誘導して、ワクチン効能を大きく向上させることができるということを究明した。
【００１５】
本発明で利用される清麹醤（Ｃｈｅｏｎｇｇｕｋｊａｎｇ）は、清麹醤菌、例えば、バチルス（例えば、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・メチロトロフィカス、バチルス・アトロファエウス、バチルス・テクィレンシス、バチルス・サブティリス及びバチルス・メチロトロフィカス）又はコクリア（例えば、コクリアサルシッチャ）を蒸煮大豆に接種して、発酵熟成させて製造された大韓民国の伝統発酵食品である。清麹醤は、大韓民国の他の伝統発酵食品と類似しているが、味噌が蒸煮大豆を発酵するに当って、塩を使って４０〜６０日間発酵するのに比べて、清麹醤は、塩を使わずに約４０℃で単に２〜３日間の短い発酵期間を通じて製造する。清麹醤は、大韓民国で日常的に摂取する食品であって、免疫補強剤として開発するに当って、安定性の問題及び摂取量による副作用がなく、使用が便利であり、安価であるだけではなく、免疫増強効果に優れて、免疫補強剤としての開発に非常に適した特徴を有している。
【００１６】
本発明で利用される有効成分は、清麹醤（例えば、清麹醤粉末）にエタノールを処理して抽出されたエタノール溶解成分である。したがって、本発明で利用される有効成分を“清麹醤エタノール溶解抽出物”と略して記載する。
本発明の組成物で利用される清麹醤エタノール溶解抽出物は、エタノール溶媒を処理して得た結果物で沈殿ではないエタノール溶解成分を含む分画である。例えば、エタノール溶媒を清麹醤に処理し、遠心分離を行えば、エタノール溶解成分と沈殿物とが形成され、前記沈殿物が除去されたエタノール抽出物が、本発明の最も望ましい清麹醤エタノール溶解抽出物である。
本発明の望ましい具現例によれば、清麹醤エタノール溶解抽出物を製造するために利用されるエタノールは、５０％〜９９％エタノールである。使われるエタノールの濃度が５０％未満であれば、前記エタノール溶解成分が、エタノールに十分に溶解されることができない問題があり、エタノールの濃度が９９％を超過すれば、エタノール溶媒の価格があまりにも高価であり、濃度の増加による抽出効率がほとんど変化がないという問題点がある。より望ましくは、利用されるエタノールの濃度は、５０％〜８５％、５０％〜８０％、５０％〜７５％、５０％〜７０％、５０％〜９９％、６０％〜８５％、６０％〜８０％、６０％〜７５％又は６０％〜７０％である。
【００１７】
本明細書で使われる用語‘抽出物’は、上述したように、当業者で粗抽出物（ｃｒｕｄｅ  ｅｘｔｒａｃｔ）として通用される意味を有するが、広義的には、抽出物を追加的に分画（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）した分画物も含む。即ち、清麹醤エタノール溶解抽出物は、エタノール溶媒を用いて得たものだけではなく、これに精製過程を追加的に適用して得たものも含む。例えば、前記抽出物を一定の分子量カットオフ値を有する限外濾過膜を通過させて得た分画、多様なクロマトグラフィー（サイズ、電荷、疎水性又は親和性による分離のために製作されたもの）による分離など、追加的に実施された多様な精製方法を通じて得られた分画も、本発明の清麹醤エタノール溶解抽出物に含まれるものである。
【００１８】
本発明の望ましい具現例によれば、本発明で有効成分として利用される清麹醤エタノール溶解抽出物は、ＰＧＡ（ｐｏｌｙ−γ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）が除去された抽出物であり、より望ましくは、ＰＧＡ及びレバン（Ｌｅｖａｎ）が除去された抽出物である。
【００１９】
本明細書で、ＰＧＡを言及しながら使われる用語“除去（ｒｅｍｏｖａｌ）”は、清麹醤エタノール溶解抽出物でＰＧＡが実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）検出されない状態を意味する。例えば、清麹醤エタノール溶解抽出物をゲルで電気泳動し、このゲルをＰＧＡ染色ダイ（ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｄｙｅ）であるメチレンブルーで染色した場合、染色される帯（ｂａｎｄ）が肉眼で観察されなければ、清麹醤エタノール溶解抽出物は、ＰＧＡが除去されたと定義（ｄｅｆｉｎｅ）することができる。
【００２０】
本明細書で、レバンを言及しながら使われる用語“除去”は、清麹醤抽出物でレバンが実質的に検出されない状態を意味する。例えば、清麹醤エタノール溶解抽出物を過ヨード酸で酸化させた後、シッフ（Ｓｃｈｉｆｆ）試薬と反応させて、赤色又は赤紫色に発色されることが肉眼で観察されなければ、清麹醤エタノール溶解抽出物は、レバンが除去されたと定義することができる。
【００２１】
本発明で最も望ましい有効成分としての清麹醤エタノール溶解分画の利用は、本発明者らが知っている限り（ｔｏ  ｏｕｒ  ｂｅｓｔ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ）、既存の従来技術とは反対である接近方式である。従来技術によれば、清麹醤抽出物の免疫増強有効成分は、ポリγ−グルタミン酸（ＰＧＡ）及びレバンにより公知にされており、このような有効成分を得るために、７０％エタノールを清麹醤などの試料に処理し、これより形成された沈殿物を追加的に精製して、ＰＧＡ又はレバンを得ている。しかし、本発明では、これとは完全に反対である接近方式として、清麹醤のエタノール溶解分画を利用する。
【００２２】
本発明で利用される清麹醤は、多様な微生物を用いて製造可能であるが、最も望ましくは、バチルス・アミロリケファシエンスを用いて製造されたものである。下記の実施例で立証されたように、バチルス・アミロリケファシエンスを用いて清麹醤を製造する場合、清麹醤の粗酵素液のうち、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ及びプロテアーゼの酵素活性が非常に優れるだけではなく、脾臓細胞増殖活性が非常に優れている。
【００２３】
本明細書で、用語‘免疫補強剤’は、医薬（ｄｒｕｇ）又はワクチン（ｖａｃｃｉｎｅ）のような物質の効果に変化を加える薬剤学的又は免疫学的物質であって、免疫補強剤自身は、如何なる直接的な効果を有さない。ほとんどワクチン組成物に含まれて感染された外部物質を最小に保護しながら提供された抗原に対する受容者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）の免疫反応を増加させる役割を果たす。免疫補強剤は、ワクチンに添加されて抗原をターゲットする免疫系の反応を刺激し、自身は兔疫性を有さない。免疫補強剤は、免疫系に抗原の提示に多様な方式として作用する。
【００２４】
本明細書で、用語‘免疫原’は、受容者の免疫反応を誘導する物質であって、‘抗原’と同じ意味を有する。本発明で利用されるウイルス病原体抗原の例としては、インフルエンザウイルスのようなＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ；ＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、ＳＩＶ（ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）及びＨＩＶのようなレトロウイルス；ＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）のようなＨｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ；ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）又はＨＳＶ（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）；Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ；狂犬病（ｒａｂｉｅｓ）のようなＲｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｅｓ；ポリオウイルスのようなＰｉｃｏｍｏｖｉｒｕｓｅｓ；ワクシニアのようなＰｏｘｖｉｒｕｓｅｓ；Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ；及びＰａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ由来の抗原を含む。より具体的に、ウイルス病原体抗原の例として、ＨＰＶ抗原の例は、ＨＰＶのＬ１、Ｌ２、Ｅ６又はＥ７タンパク質；ＨＩＶの抗原の例は、ｎｅｆ、ｐ２４、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｐｏｌ、ｅｎｖ及びｇｐ１２０のＴ細胞とＢ細胞エピトープ（Ｐａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：３６１２−３６１９（１９８９））を含む。ＨＢＶの表面抗原の例は、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６：４７２６−４７３０（１９８９）に開示されている。ロタウイルスの抗原の例は、ＶＰ４（Ｍａｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８７：５１８−５２２（１９９０））及びＶＰ７（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１８１９−１８２３（１９８８）を含み；、インフルエンザウイルス抗原は、ヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＨＡ）及びヌクレオタンパク質を含み；ＨＳＶ抗原は、チミジンキナーゼを含み（Ｗｈｉｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎ：Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｐａｇｅｓ  ８２５−８５４）；鳥インフルエンザウイルス抗原は、ヘマグルチニンを含み；豚コレラウイルス抗原は、エンベロープ；口蹄疫ウイルス抗原は、エンベルロプ；そして、ニューカッスルウイルス抗原は、ＨＮ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）、Ｆ（Ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む。
【００２５】
本発明に利用されるバクテリア病原体抗原の例としては、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．及びＢｏｒｅｌｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ由来の抗原を含む。具体的に、本発明に利用されるバクテリア病原体抗原の例は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉのｆｏｒｍ−１抗原（Ｆｏｒｍａｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，３４：７４６−７５０（１９８１））；Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのＯ−抗原（Ｆｏｒｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５９：１４５−１４６（１９８９）；Ｅ．ｃｏｌｉのＦＡ／Ｉ線毛抗原（ｆｉｍｂｒｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５０：９２５−９２８（１９８５））と熱敏感性毒素の非毒性Ｂサブユニット（Ｋｌｉｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，４０：８８８−８９３（１９８３））；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのパータクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃ．，１０：４３−４８（１９９２））；Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのアデニル酸シクラーゼ−ヘモリジン（Ｇｕｉｓｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｃｒｏ．Ｐａｔｈ．，１１：４２３４３１（１９９１））；及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉのテタヌス毒素の断片Ｃ（Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５８：１３２３−１３２６（１９９０））を含む。
【００２６】
本発明に利用される寄生虫抗原の例は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ  ｓｐｐ．、Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｐ．、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｓｐｐ．、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｌａｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｅ  ｓｐｐ．、Ｂｒｕｇｉａ  ｓｐｐ．、Ｆａｓｃｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｓｐｐ．、及びＯｎｃｈｏｃｅｒｅａ  ｓｐｐ．由来の抗原を含む。より具体的に、本発明に利用される寄生虫抗原の例は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｅｒｉｉのｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ抗原及びＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ抗原のようなＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．のｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ抗原（Ｓａｄｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉ．，２４０：３３６−３３７（１９８８））；Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．のｍｅｒｏｚｏｉｔｅ表面抗原（Ｓｐｅｔｚｌｅｒ  ｅｔａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，４３：３５１−３５８（１９９４））；Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａのガラクトース特異レクチン（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：３２４８−３２５２（１９９１））；Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．のｇｐ６３（Ｒｕｓｓｅｌｌｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：１２７４−１２７８（１９８８））；Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉのパラミオシン（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，４９：３１５−３２３（１９９１））；及びＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉのトリオースホスフェートイソメラーゼ（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１８４２−１８４６（１９９２））を含む。
【００２７】
本発明に利用される癌抗原の例は、前立腺特異抗原（Ｇａｔｔｕｓｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．，２６：１２３−１２６（１９９５））、ＴＡＧ−７２及びＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）  （Ｇｕａｄａｇｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒｓ，９：５３−６０（１９９４））、ＭＡＧＥ−１及びチロシナーゼ（Ｃｏｕｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａ．，１４：１０４−１０９（１９９３））、ｐ５３（国際公開ＷＯ第９４／０２１６７号パンフレット）、ＮＹ−ＥＳＯ１（ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＡＦＰ（α−ｆｅｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及び癌抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ＥＰＣＡ（Ｅａｒｌｙ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ）を含む。
【００２８】
生体内免疫反応は、大きくＴｈ１免疫反応及びＴｈ２免疫反応に分けることができる。
本明細書で、用語“Ｔｈ１免疫反応”は、細胞免疫反応を誘導する反応を意味し、“Ｔｈ２免疫反応”は、体液免疫反応を促進する反応を意味する。
本発明で免疫化された動物での免疫反応測定は、例えば、免疫原を投与した対象動物から血清を採取して抗免疫原抗体（総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ）の力価を確認する方法を通じてなされうる。抗体の力価を確認する方法は、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、側面移動分析法（Ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ  ｔｅｓｔ）、ＭＩＡ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、免疫沈降法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）などを利用することができるが、これに制限されず、当業者に知られた多様な免疫分析（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）方法によってなされ、望ましくは、ＥＬＩＳＡ分析法を利用する。
望ましくは、本発明の腸管免疫補強剤は、免疫原と共に経口投与される場合、血中での免疫原特異的ＩｇＧと小腸での免疫原特異的ＩｇＡとの生成を促進する。
【００２９】
本発明の望ましい具現例によれば、マウスに免疫原及び清麹醤エタノール溶解抽出物を投与し、眼窩静脈叢で採血し、その血清を分離してＩｇＧの数値を分析し、小腸を摘出して小腸細胞化して、ＩｇＡの数値を分析した結果、免疫原（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ）のみ単独投与したものと比較して、免疫原及び清麹醤エタノール溶解抽出物を投与した場合、免疫原特異的ＩｇＧが増加し（図６）、また、免疫原特異的ＩｇＡの生成が増加する（図９）。本発明の清麹醤エタノール溶解抽出物は、ＣＴ（コレラトキシン）と類似した程度に強いＩｇＡ生産活性を有することによって、病源菌やウイルスに対する腸管免疫反応を効果的に誘導することができるということはもとより、ＣＴの場合に表れなかった血中ＩｇＧ生産と全身免疫反応もよく誘導するということを示す。
【００３０】
望ましくは、本発明の腸管免疫補強剤は、免疫原と共に経口投与される場合、脾臓内ＩＬ−１２の生成を増加させる。これは、活性化されたＴｈ１反応で細胞性免疫反応を効果的に誘導する。
望ましくは、本発明の腸管免疫補強剤は、免疫原と共に経口投与される場合、脾臓内ＩＬ−４及びＩＬ−５の生成を増加させる。これは、活性化されたＴｈ２反応で免疫原特異的な抗体を生産する体液性免疫反応を効果的に誘導する。
望ましくは、本発明の腸管免疫補強剤は、免疫原と共に経口投与される場合、免疫原の単独経口投与と比較して、脾臓内ＩＬ−４／ＩＦＮ−γの相対的量が５〜３０倍増加し、より望ましくは、６〜２０倍、最も望ましくは、７〜１０倍増加する。
望ましい具現例によれば、免疫原及び清麹醤エタノール溶解抽出物を投与した場合、免疫原のみ単独投与したものと比較して、Ｔｈ２反応を誘導するＩＬ−４の生産が増加する結果を表す（図４）。
【００３１】
本発明の免疫補強剤は、薬剤学的組成物及び食品組成物として提供されうる。
本発明の免疫補強剤が、薬剤学的組成物として提供される場合、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微小結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。
本発明の薬剤学的組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを更に含みうる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
【００３２】
本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口投与し、非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができる。
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方されうる。
本発明の薬剤学的組成物の投与量は、成人基準で０．００００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【００３３】
本発明の薬剤学的組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されるか、又は多容量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤型は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤、又は乳液の形態であるか、エクストラクト剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、又はカプセル剤の形態でもあり、分散剤又は安定化剤を更に含みうる。
本発明の免疫補強剤が食品組成物として提供される場合、本発明の免疫補強剤は、“免疫増強用食品組成物”と表現される。
【００３４】
本発明の組成物が食品組成物として製造される場合、有効成分として清麹醤エタノール溶解抽出物だけではなく、食品製造時に通常添加される成分を含み、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味剤、及び香味剤を含む。前述した炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、葡萄糖、果糖など；ジサッカライド、例えば、マルトース、スクロース、オリゴ糖など；及びポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンのような通常の糖及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。香味剤として、天然香味剤［タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウディオサイドＡ、グリチルリチンなど］）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を使うことができる。
例えば、本発明の食品組成物がドリンク剤として製造される場合には、本発明の清麹醤エタノール溶解抽出物以外に、クエン酸、液状果糖、砂糖、葡萄糖、酢酸、リンゴ酸、果汁、トチュウ抽出液、ナツメ抽出液、甘草抽出液などを更に含ませることができる。
【００３５】
本発明の他の様態によれば、本発明は、免疫原タンパク質及び腸管免疫補強剤としての清麹醤エタノール溶解抽出物を有効成分として含む全身免疫及び腸管免疫を誘発するための経口投与用ワクチン組成物を提供する。
【００３６】
本発明の他の様態によれば、本発明は、（ａ）免疫原タンパク質及び（ｂ）清麹醤のエタノール抽出物のうちからエタノール溶解成分を含む経口投与用ワクチン組成物を対象に投与する段階を含む全身免疫又は腸管免疫反応誘導方法を提供する。
【００３７】
本明細書で、用語‘免疫原タンパク質’は、受容者の免疫反応を誘導するエピトープ、ペプチド又はタンパク質であり、これは、前述した本発明の‘免疫原’に記載の内容と共通するので、過度な重複を避けるために、その記載を省略する。
【００３８】
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方されうる。一方、本発明の薬剤学的組成物の経口投与量は、望ましくは、１日当たり０．００１〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。
【００３９】
本発明のワクチンに含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微小結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。
本発明の薬剤学的組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを更に含みうる。
【００４０】
本発明によるワクチン組成物は、薬剤学的で一般的に使われる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を使って製剤化することができる。望ましくは、経口投与用製剤として製剤化することがより望ましい。例えば、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などの経口投与用固型製剤又は懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などの液状製剤として製剤化することが望ましい。固型製剤として製剤化する場合には、本発明によるワクチン組成物に１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉（ｓｔａｒｃｈ）、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）などを混合することができる。液状製剤として製剤化する場合には、本発明によるワクチン組成物に水又はリキッドパラフィン以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを混合することができる。
【発明の効果】
【００４１】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明は、清麹醤エタノール溶解抽出物を有効成分として含む全身免疫及び腸管免疫補強剤、ワクチン又は前記補強剤又はワクチンを対象に投与する段階を含む全身免疫及び腸管免疫反応誘導方法を提供する。
（ｂ）本発明の清麹醤エタノール溶解抽出物を含む免疫補強剤は、安全性が確保された食品素材を使うことによって、毒性及び副作用がなく、安価の生産コストと使用の便宜性とを提供することができる。
（ｃ）本発明の免疫補強剤は、抗原と経口投与時、経口感染性病原性微生物はもとより、非経口感染性病原性微生物やウイルス、癌抗原、一般抗原などに対しても、Ｔｈ２反応を誘導して、効果的な特異抗体（血中ＩｇＧ及び小腸ＩｇＡ）を生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】免疫原（ＫＬＨ）及び免疫補強剤（清麹醤又はＣＴ）を経口投与したＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの脾臓細胞をＫＬＨの存在下で培養時、ＩＦＮ−γ生成を示すグラフである。ａ、ａｂ及びｂは、Ｐ＜０．０５レベルで各実験区の統計的有意性を表したものである。ａとｂのように文字が互いに異なって表示された数値は、統計的にＰ＜０．０５（エラーを犯す確率が５％以下）のレベルで互いに異なることを意味する。
【図２】免疫原（ＫＬＨ）及び免疫補強剤（清麹醤又はＣＴ）を経口投与したＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの脾臓細胞をＫＬＨの存在下で培養時、ＩＬ−１２生成を示すグラフである。ａ、ｂ及びｃは、Ｐ＜０．０５レベルで各実験区の統計的有意性を表す。
【図３】免疫原（ＫＬＨ）及び免疫補強剤（清麹醤又はＣＴ）を経口投与したＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの脾臓細胞をＫＬＨの存在下で培養時、ＩＬ−４生成を示すグラフである。ａ及びｂは、Ｐ＜０．０５レベルで各実験区の統計的有意性を表す。
【図４】免疫原（ＫＬＨ）及び免疫補強剤（清麹醤又はＣＴ）を経口投与したＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの脾臓細胞をＫＬＨの存在下で培養時、ＩＬ−５生成を示すグラフである。ａ、ｂ及びｃは、Ｐ＜０．０５レベルで各実験区の統計的有意性を表す。
【図５】免疫原（ＫＬＨ）及び免疫補強剤（清麹醤又はＣＴ）を経口投与したＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの血清のうち、総ＩｇＧ抗体を分析したグラフである。ａ及びｂは、Ｐ＜０．０５レベルで各実験区の統計的有意性を表す。
【図６】免疫原（ＫＬＨ）及び免疫補強剤（清麹醤又はＣＴ）を経口投与したＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの血清のうち、抗原特異的ＩｇＧ抗体を分析したグラフである。ａ、ａｂ及びｂは、Ｐ＜０．０５レベルで各実験区の統計的有意性を表す。
【図７】免疫原（ＫＬＨ）及び免疫補強剤（清麹醤又はＣＴ）を経口投与したＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの小腸から生産された総ＩｇＡ抗体を分析したグラフである。ａ及びｂは、Ｐ＜０．０５レベルで各実験区の統計的有意性を表す。
【図８】免疫原（ＫＬＨ）及び免疫補強剤（清麹醤又はＣＴ）を経口投与したＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの小腸から生産された抗原特異的ＩｇＡ抗体を分析したグラフである。ａ及びｂは、Ｐ＜０．０５レベルで各実験区の統計的有意性を表す。
【図９】免疫原（ＫＬＨ）及び免疫補強剤（清麹醤又はＣＴ）を経口投与したＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの脾臓細胞をＫＬＨの存在下で培養時、Ｔ細胞増殖活性を分析したグラフである。ａ及びｂは、Ｐ＜０．０５レベルで各実験区の統計的有意性を表す。
【図１０】マウスの脾臓細胞に対するＭＴＴ分析結果を示すグラフである。（ａ）蒸煮された豆の水又は７０％エタノール抽出物、（ｂ）清麹醤の水又は７０％エタノール抽出物を使用した。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下、実施例を通じて本発明を更に詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。
【００４４】
実施例
実施例１．天然物試料の準備
補強剤としての活用可能性を検討するために、食品及び天然物２０点余りを確保し、これらの粉砕物を準備して、それぞれ１ｇずつに７０％エタノールを２５ｍｌ加えた後、９０Ｗで５分間マイクロウエーブ処理して抽出し、１２時間後、１０℃、８，０００ｒｐｍの条件下で２０分間遠心分離して上澄み液を回収した。引き続き、前記上澄み液を蒸発濃縮し、膜濾過した後、活性実験に用いた。
【００４５】
実施例２．天然物から脾臓細胞増殖活性素材の選抜
実験方法
補強剤としての活用可能性を検討するために、２０余種の天然物から免疫増強効果が期待される素材をエキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）実験系で選抜した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雄）の脾臓を摘出し、該摘出した脾臓細胞の初代培養系を用いて免疫活性を増加させる素材を探索した。即ち、総２２種の素材（甘草、姜黄、黒ゴマ、エンジュ、ハリグワ、緑茶、ナツメ、ワカメ、タンポポ、松葉、ニガナ、薬豆、硫黄、シソ、清麹醤、クロレラ、エゴマ、小豆、コロハ、黄ごん（オウゴン）及びコショウ）の７０％エタノール抽出物をそれぞれ１０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートに各ウェル当たり１．０×１０６細胞／ウェルになるように処理群別に細胞をシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。この際、培養培地にＣｏｎＡ（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ、１μｇ／ｍｌ）及びＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ、２５μｇ／ｍｌ）又は天然物抽出物などを添加して、ＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％  ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン）で培養した。培養４４時間後、２ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌ−２）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ）を各ウェル当たり２０μｌずつ処理し、３７℃のＣＯ２培養器で４時間静置した。４時間後、１０％  ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）が含まれた０．０１Ｍ  ＨＣｌをウェル当たり１００μｌずつ入れた後、３７℃のＣＯ２培養器に一晩放置し、５７０ｎｍで吸光度を測定した。
ＭＴＴ試験の結果、試料処理による脾臓細胞増殖活性は、清麹醤で最も高く表れて、免疫補強剤としての活用可能性が推測された（表１）。
【００４６】
【表１】
2015511634.tif 000003
【００４７】
実施例３．脾臓細胞増殖活性に優れた清麹醤の選抜の実施例
市中で購入した清麹醤１２種を実施例１と同じ方法で抽出して試料を準備し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雄）の脾臓細胞を用いて実施例２と同じ方法で各試料の活性を比較した。実験の結果、１０番の清麹醤が１０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌの濃度で相対的に最も高い活性を表した（表２）。
【００４８】
【表２】
2015511634.tif 000004
【００４９】
実施例４．清麹醤菌株の分離及び特性
市中で購入した１０番の清麹醤で表３のような菌株を分離同定し、それぞれの菌株を用いて清麹醤を製造した。製造方法は、精選した豆５００ｇを１２時間常温で浸漬させ、１１４℃で５０分間蒸煮した後、５０℃に冷却した後、ＴＢＳ（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ）で培養（３７℃、２４時間）した菌株培養液を大豆量の１％（ｖ／ｗ）に接種して、３７℃で４８時間発酵し、各菌株のα−アミラーゼ、β−アミラーゼ及びプロテアーゼの酵素活性を測定した。酵素活性の測定のために、清麹醤１０ｇに蒸溜水を１０倍量加えた後、６０分間撹拌し、抽出した。これを３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液を取り、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．２で濾過したものを粗酵素液として用いた。
【００５０】
実施例４−１．α−アミラーゼの酵素活性の測定
α−アミラーゼの場合、ｂｌｕｅ  ｖａｌｕｅ法（Ｆｕｗａ，Ｈ．，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４１：５８３−６０３（１９５４））を変形して測定した。０．５％澱粉溶液５ｍｌに０．０４Ｍ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．９）５ｍｌと粗酵素液１ｍｌとを加えた後、２５℃で１０分間反応させた。反応液１ｍｌを０．５％ヨード溶液が１０ｍｌ入っている試験管に入れて発色させた後、６６０ｎｍで吸光度（Ａ６６０）を測定した。酵素活性の単位（Ｕｎｉｔ）は、ｐＨ５．９、２５℃で１分間澱粉−ヨード溶液のＡ６６０を１％減少させるのに必要な酵素量と定義した。
【００５１】
実施例４−２．β−アミラーゼの酵素活性の測定
β−アミラーゼ活性の測定は、ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ法（Ｂｅｒｎｆｅｌｄ，Ｐ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １：１４９−１５８（１９５５））で測定した。１％ｓｏｌｕｂｌｅ  ｓｔａｒｃｈを基質として用いた、粗酵素液と１：１（ｖ：ｖ）比率で混ぜて、２０℃で１０分間反応させた後、ＤＮＳ試薬同量を添加して、１５分間沸湯で加熱した。加熱反応後、冷水で冷却した後、蒸溜水を添加して、５４０ｎｍで吸光度を測定し、標準物質としてｍａｌｔｏｓｅを用いた。酵素活性の単位は、ｐＨ４．８、２０℃で３分間１ｍｇ  ｍａｌｔｏｓｅの生産に必要な酵素量と定義した。
【００５２】
実施例４−３．プロテアーゼの酵素活性の測定
プロテアーゼ活性の測定は、Ａｎｓｏｎの方法（Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２２：７９−８９（１９３８））を一部変形して測定した。０．１Ｍ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．８）１ｍｌに０．６％ｃａｓｅｉｎ  １．５ｍｌと粗酵素液０．５ｍｌとを入れて、３７℃で３０分間反応させた。反応後、０．４Ｍ  ＴＣＡを３ｍＬ添加して、常温で１０分間放置させて酵素反応を停止させた。反応液は、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分）した後、上澄み液１ｍｌに０．４Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３  ５ｍｌと１Ｎ  ｐｈｅｎｏｌ  １ｍｌとを添加して、４０℃で３０分間発色させて、６６０ｎｍで吸光度を測定した。標準物質としては、ｔｙｒｏｓｉｎｅを用い、酵素活性の単位は、１分間ｔｙｒｏｓｉｎｅ  １μｇの遊離に必要な酵素量と定義した。
酵素活性の測定の実験の結果、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑａｕｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株を用いて製造した清麹醤の粗酵素液のうち、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ及びプロテアーゼの酵素活性がいずれも最も高く表れた（表４）。
【００５３】
【表３】
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【００５４】
【表４】
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【００５５】
実施例５．分離菌株で製造した清麹醤の脾臓細胞増殖活性の比較
清麹醤から同定されたそれぞれの菌株で製造した清麹醤７種を実施例１と同じ方法で抽出して試料を準備し、実施例２と同じ方法で抽出物試料の脾臓細胞増殖活性を比較した。
実験の結果、試料処理による細胞増殖活性は、バチルス・アミロリケファシエンスで製造した清麹醤抽出物の脾臓細胞増殖活性が最も高く表れて、免疫補強剤としての活用可能性が高かった（表５）。
【００５６】
【表５】
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【００５７】
実施例６．動物実験による清麹醤の免疫補助効果
動物実験
バチルス・アミロリケファシエンスで製造した清麹醤エタノール溶解抽出物（７０％エタノール抽出物）の免疫増強効能を確認するために、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ（６週齢、雄）マウスに免疫原と共に補強剤として清麹醤エタノール溶解抽出物を経口免疫した。Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを５匹ずつ４グループに分けて、それぞれのグループに抗原と補強剤とを経口投与した。免疫原としては、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）を、補強剤は、清麹醤エタノール溶解抽出物又はＣＴ（Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｉｎ）を用いた。したがって、１番グループは、生理食塩水、２番グループは、ＫＬＨ（５０μｇ／Ｈ）と生理食塩水、３番グループは、ＫＬＨ（５０μｇ／Ｈ）と清麹醤エタノール溶解抽出物（２．８ｍｇ／Ｈ）、４番グループには、ＫＬＨ（５０μｇ／Ｈ）とＣＴ（１０μｇ／Ｈ）（μｇ／Ｈｅａｄ）とを一週間に２回ずつ４週間８回経口投与し、その次の週は、５日間毎日経口投与した後、眼窩静脈叢で採血し、その血清を分離して、分析前まで−７０℃に保管した。最後に、採血した血清中のＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）で分析した。また、小腸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）で総ＩｇＡ及び免疫原特異ＩｇＡを分析するために、マウスの小腸を摘出した後、上部１０ｃｍを均質機（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で１分間均質化して、４℃で１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。遠心分離後、上澄み液を回収して、ＥＬＩＳＡでＩｇＡを分析した。また、Ｔｈ１及びＴｈ２サイトカインの変化を確認するために、脾臓細胞を免疫原（ＫＬＨ）と共に培養した後、上澄み液を回収して、ＥＬＩＳＡでサイトカインを分析した。
【００５８】
サイトカインの分析
Ｔｈ１及びＴｈ２サイトカインの分析のために、清麹醤エタノール溶解抽出物と共にＫＬＨを経口投与した後、マウスの脾臓を摘出して、処理群別に集めて単細胞化した脾臓細胞を培養した。細胞培養は、２４ウェルプレートにウェル当たり５×１０６細胞／ｍｌの濃度で１ｍｌずつ培養し、この際、免疫原を添加していない培地及び免疫原を添加した培地に分けて、その差を観察することによって、免疫反応を誘導したかを分析した。免疫原は、ＫＬＨの場合、ウェル当たり１００μｇ／ｍｌを入れた。サイトカインの分析のために、細胞を４８時間（Ｔｈ１サイトカイン）及び７２時間（Ｔｈ２サイトカイン）培養して、細胞を除去した培養液を収得し、分析前まで−７０℃に保管した。サイトカインの分析は、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、アメリカ）社のサイトカイン分析キットを用いてキットのプロトコル通りに実施した。
簡単に説明すれば、抗サイトカイン抗体を９６ウェルプレートに入れて、４℃で一晩放置した後、ＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ−Ｔｗｅｅｎ２０添加）で３回洗浄し、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）が添加されたＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）で１時間ブロッキングした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、細胞培養液を入れて、常温で２時間反応した。２時間後、ＰＢＳＴで５回洗浄し、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）が結合された抗サイトカイン及びストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）が結合されたＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を処理し、１時間反応した。ウェルをＰＢＳＴで７回洗浄した後、前記のＥＬＩＳＡのような方法で基質を処理して吸光度を測定した。
【００５９】
その結果、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２を分析した結果、ＩＦＮ−γは、ＫＬＨと共に免疫補強剤を経口投与したマウスの脾臓細胞培養液でＩＦＮ−γの数値的差はほとんどなかったが、ＩＬ−１２の数値は、清麹醤エタノール溶解抽出物とＫＬＨとを共に経口投与した処理群で増加した（図１及び図２）。Ｔｈ２サイトカインである場合、ＫＬＨを経口投与したマウスと比較して、清麹醤エタノール溶解抽出物及びＫＬＨを共に処理したマウスの脾臓細胞で高いＩＬ−４及びＩＬ−５数値を表した（図３及び図４）。これは、Ｔｈ１反応を誘導するＩＦＮ−γの生産は大きな増加がないが、Ｔｈ１反応を誘導するＩＬ−１２の生産が増加し、Ｔｈ２反応を誘導するＩＬ−４及びＩＬ−５の生産が増加したことを意味する。
また、代表的なＴｈ２及びＴｈ１サイトカインとして、それぞれＩＬ−４及びＩＦＮ−γに注目して、ＩＬ−４／ＩＦＮ−γの相対的な生産比率を算出した結果、清麹醤エタノール溶解抽出物又はＣＴを経口用免疫補強剤として投与した場合、対照群に比べて、８．２倍高く表れた。これは、本発明において、特に、活発なＴｈ２反応の結果、特異抗体の生産が増加する体液性免疫が非常に活発に進められ、特に、ＩＬ−５による小腸でのＩｇＡ抗体生産が効果的に誘導されたということが分かる。これは、実際に後述する結果から確認することができる（図８）。
【００６０】
総ＩｇＧの分析
抗マウスＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ、大韓民国）を２μｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートに入れて、４℃で一晩放置した後、ＰＢＳＴで１／１０，０００希釈した血清をウェル当たり１００μｌずつ添加した後、常温で１時間反応した。そして、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＳＩＧＭＡ  Ａ−２３０４）をＰＢＳＴで１／３０，０００希釈して、プレートにウェル当たり１００μｌずつ添加した後、常温で１時間反応した。最後に、遮光状態でＴＭＢ（３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）及び３％  Ｈ２Ｏ２を処理して、３０分間反応し、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で反応を中止させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
結果的に、清麹醤エタノール溶解抽出物を免疫増強剤として経口投与した実験群で高い数値の総ＩｇＧ抗体が有意的に表れたが、ＣＴを免疫増強剤として処理した場合には、対照群と比較時、有意性がなかった（図５）。
【００６１】
免疫原特異的ＩｇＧの分析
免疫原を２μｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートに入れて、４℃で一晩反応した後、ＰＢＳＴで１／３，０００希釈した各血清をウェル当たり１００μｌずつ添加した後、常温で１時間反応した。反応後、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（ＳＩＧＭＡ、アメリカ）をＰＢＳＴで１／１０，０００希釈して、ウェル当たり１００μｌずつ添加した後、常温で１時間反応した。最後に、遮光状態でＴＭＢ及び３％  Ｈ２Ｏ２を添加して、３０分間反応させ、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を中止させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
清麹醤エタノール溶解抽出物を免疫増強剤として経口投与した場合には、対照群に比べて、免疫原特異的ＩｇＧ抗体の数値が有意的に高く表れたが、ＣＴ処理群の場合には、対照群と比較時、有意性がなかった（図６）。これは、前の総ＩｇＧ抗体分析の結果とほとんど類似した傾向を見せることによって、清麹醤抽出物を腸管免疫増強剤として免疫原と共に経口投与すれば、血液中にＩｇＧ抗体が効果的に生成され、これは、清麹醤エタノール溶解抽出物が、ＣＴよりも優れた免疫増強活性を有するということが分かる。また、この活性は、経口で感染されず、血液で感染される病源菌や、更には癌関連抗原などでも、清麹醤エタノール溶解抽出物と共に経口投与すれば、血液中に特異的なＩｇＧ抗体生産の誘導が可能であるということを意味し、その利用可能性が期待される。
【００６２】
総ＩｇＡの分析
９６ウェルプレートに抗マウスＩｇＡ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、アメリカ）を２μｇ／ｍｌの濃度で添加し、４℃で一晩反応した。これに小腸サンプル（均質化した小腸の遠心分離後、上澄み液）を１０％  ＦＢＳが含まれたＰＢＳＴで１／１，０００希釈して、ウェル当たり１００μｌずつ添加し、常温で１時間反応した。反応後、抗マウスＩｇＡ−ビオチンコンジュゲート（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、アメリカ）を０．５μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳＴに希釈して、ウェル当たり１００μｌずつ添加した後、常温で１時間反応した。反応後、アビジン−ペルオキシダーゼ（ａｖｉｄｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＳＩＧＭＡ、アメリカ）を２００ｎｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳＴに希釈して、ウェル当たり１００μｌずつ添加し、常温で１時間反応した。遮光状態でＴＭＢ及び３％  Ｈ２Ｏ２を処理して、常温で３０分間反応し、反応中止のために、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４をウェル当たり５０μｌずつ添加した。結果は、４５０ｎｍで吸光度を測定して分析した。
その結果、ＫＬＨと清麹醤エタノール溶解抽出物とを共に経口投与したマウスの総ＩｇＡの数値は、ＫＬＨのみを経口投与した実験群と差がなかったが、ＣＴを免疫補強剤として経口投与した処理群では、対照群に比べて微弱であるが、有意的な増加を表した（図７）。
【００６３】
免疫原特異的ＩｇＡの分析
９６ウェルプレートに兔疫した免疫原（ＫＬＨ）を２μｇ／ｍｌの濃度で添加し、４℃で一晩反応した。均質化した小腸の遠心分離後、上澄み液である小腸サンプルを１０％  ＦＢＳが含まれたＰＢＳＴに１／１，０００に希釈し、ウェル当たり１００μｌずつ添加して、常温で１時間反応した。反応後、抗マウスＩｇＡ−ビオチンコンジュゲート（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、アメリカ）を０．５μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳＴに希釈して、ウェル当たり１００μｌずつ添加した後で、常温で１時間反応した。アビジン−ペルオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ、アメリカ）を２００ｎｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳＴに希釈して、ウェル当たり１００μｌずつ添加した後で、常温で１時間反応した。遮光状態でＴＭＢ及び３％  Ｈ２Ｏ２を処理して、常温で３０分間反応し、反応中止のために、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４をウェル当たり５０μｌずつ添加した。結果は、４５０ｎｍで吸光度を測定して分析した。
その結果、ＫＬＨと共に清麹醤エタノール溶解抽出物を共に経口投与した処理群の免疫原特異的ＩｇＡ抗体の数値は、対照群と比較して、有意的に高い数値を表し、ＣＴを免疫補強剤として処理した群でも、類似した傾向を表した（図８）。したがって、清麹醤エタノール溶解抽出物は、ＣＴと類似した程度に強いＩｇＡ生産活性を有することによって、腸管に侵入する病源菌やウイルスに対応する免疫反応を効果的に誘導することができるということが分かる。
【００６４】
細胞増殖活性の実験
細胞増殖活性の実験のために、マウスの脾臓を摘出した後、処理群別に集めて単細胞化し、脾臓細胞を培養した後、ＭＴＴ分析を実施した。９６ウェルプレートに各ウェル当たり５×１０６細胞／ｍｌになるようにシーディングした。この際、ＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％  ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン）にＯＶＡ、ＣｏｎＡ又は天然物抽出物などを添加して培養した。培養４４時間後、２ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを各ウェル当たり２０μｌずつ処理し、３７℃のＣＯ２培養器で４時間静置した。１０％  ＳＤＳを含む０．０１Ｍ  ＨＣｌをウェル当たり１００μｌずつ入れた後、３７℃のＣＯ２培養器に一晩反応し、５７０ｎｍで吸光度を測定した。
その結果、図９に示すように、清麹醤エタノール溶解抽出物を免疫増進剤として用いた処理群の脾臓細胞増殖が有意的に最も高い数値を表した。これは、清麹醤エタノール溶解抽出物がインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で抗原提示細胞の抗原提示能を向上させ、その結果、抗原に特異的なＴ細胞が増殖され、それによって、免疫反応が増進されたということを意味する。
【００６５】
実施例７．免疫増強効能を有する清麹醤エタノール溶解抽出物の成分確認
実施例７−１．清麹醤抽出物の製造
前記実施例で免疫増強効能が最も優れたものと究明されたバチルス・アミロリケファシエンスで製造した清麹醤を製造した。粉末化した清麹醤１００ｇに蒸溜水又は７０％エタノール１，０００ｍｌを加えた後、９０Ｗで５分間マイクロウエーブ処理して抽出し、１２時間後、１０℃、８，０００ｒｐｍの条件下で２０分間遠心分離して、上澄み液を回収した。回収した上澄み液を凍結乾燥して試料として用いた。
本明細書の全体的に言及される清麹醤エタノール溶解抽出物は、清麹醤の成分のうち、エタノールに溶解される成分であるために、ポリγ−グルタミン酸（ＰＧＡ）及びレバンなどの成分が除去された抽出物である。従来技術によれば、ＰＧＡ又はレバンを分離するために、７０％エタノールを試料に処理し、これより形成された沈殿物を追加的に精製して、ＰＧＡ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ  ６５，５１６−５２１，２００１）又はレバン（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｌｌｅｒｇｙ，Ｖｏｌ  ３６，９４−１０１）を得る。
一方、本発明では、前記従来技術とは反対に、清麹醤の７０％エタノール溶解分画を利用するために、本発明で利用される清麹醤エタノール抽出物は、ＰＧＡ及びレバンが実質的に除去されたと言える。
【００６６】
実施例７−２．免疫増強効能の測定
清麹醤抽出物の免疫増強効能は、前記実施例２と同様に、ＭＴＴ分析を用いて測定した。このために、マウスの脾臓を摘出した後、単細胞化させ、脾臓細胞を培養した。細胞培養は、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で調節し、９６ウェルプレートに細胞を２００μｌずつ分取し、清麹醤抽出物がある培地、又はない培地に分けて培養した。清麹醤抽出物は、ウェル当たり１００μｇ／ｍｌを入れて培養した。培養７２時間後、２ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを各ウェル当たり２０μｌずつ入れて、３７℃、ＣＯ２培養器で４時間置いた。４時間経過後、１０％  ＳＤＳが含まれた０．０１ＭのＨＣｌをウェル当たり１００μｌずつ入れた後、３７℃、ＣＯ２培養器に一晩放置し、５９５ｎｍで吸光度を測定した。
図１０で確認できるように、７０％エタノール清麹醤抽出物で免疫増強活性効果を観察することができた。これは、従来の免疫増強活性を有すると知られたＰＧＡ又はレバンなどが実質的に除去された状態の新たな清麹醤抽出物によって発揮された効果であるということが分かる。
【００６７】
実施例７−３．ゲル電気泳動による分子量の測定
分子量の測定は、濃度勾配ＳＤＳ−ページを利用した方法で清麹醤抽出物を５００μｇ／ｍｌの溶液で作って試料として用いた。清麹醤抽出物（５００μｇ／ｍｌ）６．５μｌを４×サンプルバッファ３．５μｌと混合した後、４〜１２％の濃度勾配ＳＤＳ−ゲルで電気泳動した。電気泳動後、ゲルは、クマシーブリリアントブルー（Ｇ−２５０）で標準タンパク質を染色した後、脱色し、０．５％メチレンブルー／３％酢酸でＰＧＡを染色して、分子量を比較した。
実験の結果、水抽出物でのみ特異的にメチレンブルーで染色される物質が検出され、これが、大きな分子量を有するＰＧＡであるものと考えられる。したがって、７０％エタノール清麹醤抽出物から得られた免疫増進物質は、前記ＰＧＡ以外の物質であるということが分かった。
【００６８】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したので、当業者にとって、このような具体的な技術は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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