(57)【要約】  熱安定性セルラーゼをコードし、その増大した発現をもたらすポリヌクレオチド配列、およびそのような熱安定性セルラーゼを含む水圧破砕組成物が提供される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1のヌクレオチド配列。
【請求項２】
前記配列がタンパク質をコードする、請求項1に記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
以下の突然変異：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、G39C、T40C、G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1箇所の突然変異を含む、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）由来のセルラーゼをコードするヌクレオチド配列。
【請求項４】
以下の突然変異：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、G39C、T40C、G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1箇所の突然変異を含む、配列番号3のヌクレオチド配列。
【請求項５】
少なくとも1箇所の突然変異がサイレント変異である、請求項3または4に記載のヌクレオチド配列。
【請求項６】
少なくとも1箇所の突然変異が、少なくとも1箇所の突然変異を有さず、かつ他の点では請求項3または4のヌクレオチド配列と異ならないヌクレオチド配列よりも高レベルで前記セルラーゼの発現を生じさせる少なくとも1箇所の突然変異を保持するヌクレオチド配列をもたらす、請求項3または4に記載のヌクレオチド配列。
【請求項７】
サーモトガ・マリティマゲノム配列と比較してそのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の発現レベルを増大させる少なくとも1箇所の突然変異を有する、サーモトガ・マリティマ由来のヌクレオチド配列。
【請求項８】
前記突然変異がサイレント変異である、請求項7に記載のヌクレオチド配列。
【請求項９】
配列番号2のポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列であって、タンパク質の発現レベルが第2のヌクレオチド配列によりコードされる該タンパク質のものと比較して増大するように、配列番号2をコードする第2の配列に関して突然変異させている、上記ヌクレオチド配列。
【請求項１０】
配列番号2に対して少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％もしくは100％同一であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその断片であって、該ヌクレオチド配列が、以下の突然変異：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、G39C、T40C、G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1箇所の突然変異を含む、上記ヌクレオチド配列またはその断片。
【請求項１１】
セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10に記載のヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドが組み換え細菌発現系で生成される、上記ヌクレオチド配列。
【請求項１２】
前記細菌発現系がグラム陰性細菌発現系である、請求項11に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１３】
前記グラム陰性細菌が、シュードモナス属、大腸菌、ラルストニア属、またはカウロバクター属発現系である、請求項12に記載のグラム陰性細菌発現系。
【請求項１４】
前記シュードモナス発現系が蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）発現系である、請求項12に記載のグラム陰性細菌発現系。
【請求項１５】
前記セルラーゼが、少なくとも1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L、5.0g/L、6.0g/L、7.0g/L、8.0g/L、9.0g/L、10.0g/L、11.0g/L、12.0g/L、13.0g/L、14.0g/L、15.0g/L、16.0g/L、17.0g/L、18.0g/L、19.0g/L、20.0g/L、21.0g/L、22.0g/L、23.0g/L、24.0g/L、25.0g/L、26.0g/L、27.0g/L、28.0g/L、29.0g/L、30.0g/L、31.0g/L、32.0g/L、33.0g/L、34.0g/L、または35.0g/Lで生成される、請求項12に記載の発現系。
【請求項１６】
アミノ酸配列がシグナル配列、プロタンパク質配列、プロモーター配列、またはそれらのいずれかの組み合わせを含まない、配列番号2のポリペプチド。
【請求項１７】
配列が異種配列をさらに含む、配列番号2のポリペプチド。
【請求項１８】
前記異種配列が、シグナル配列、タグ、エピトープ、プロモーター配列、N末端伸長、C末端伸長、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される、請求項17に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号2のポリペプチドを含み、かつ第2の酵素をさらに含む、組成物。
【請求項２０】
前記第2の酵素が、以下の酵素：ラクターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、マンナナーゼ、アミラーゼ、アミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、トランスアミナーゼ、アミンオキシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、アンモニアリアーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される、請求項19に記載の組成物。
【請求項２１】
配列番号1を含む核酸配列を有する単離された、組み換え、または合成ヌクレオチドであって、該核酸配列がセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、上記ヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号1の核酸配列を含む単離された、組み換え、または合成ヌクレオチドであって、該核酸配列がセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、該ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列、または酵素として活性なその断片を含む、上記ヌクレオチド。
【請求項２３】
セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号1を含む単離された、組み換え、または合成核酸配列であって、該ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列を含み、該ポリペプチドが組み換え蛍光菌発現系で生成される、上記核酸配列。
【請求項２４】
ポリマー系増粘性物質、界面活性剤、熱安定化剤、および超好熱性細菌由来の野生型セルラーゼまたはその突然変異体を含む酵素破壊剤を含む、組成物。
【請求項２５】
前記増粘性物質が、直鎖型グアー、架橋型グアー、またはそれらの混合物を含むグアーゲルである、請求項24に記載の組成物。
【請求項２６】
前記酵素破壊剤が、前記グアーゲル中のβ-1,4-グリコシド結合を特異的に加水分解する、請求項25に記載の組成物。
【請求項２７】
前記酵素破壊剤が、前記グアーゲル中のα-1,6-グリコシド結合を特異的に加水分解しない、請求項25に記載の組成物。
【請求項２８】
前記酵素破壊剤が、約275°Fまでの温度で前記グアーゲル中のβ-1,4-グリコシド結合を加水分解するその能力を保持する、請求項24〜27のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記酵素破壊剤が、約11までのpHで前記グアーゲル中のβ-1,4-グリコシド結合を加水分解するその能力を保持する、請求項24〜28のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記酵素破壊剤が、野生型セルラーゼと比較して12箇所の突然変異を含む突然変異体である、請求項24〜29のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記12箇所の突然変異が、以下の突然変異：F38Y、Y61Q、M69E、D70P、R71S、I94Q、I166V、S183R、S191A、E212P、L231V、M276A、E277S、R280G、T297PおよびT301Qからなる群より選択される、請求項30に記載の組成物。
【請求項３２】
前記酵素破壊剤が配列番号2を有する、請求項24に記載の組成物。
【請求項３３】
前記酵素破壊剤が、配列番号1を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項24に記載の組成物。
【請求項３４】
前記酵素破壊剤が、野生型セルラーゼの突然変異体であり、約pH6.5にて野生型セルラーゼの融解温度よりも少なくとも20°F高く、かつ約pH10.5にて野生型セルラーゼの融解温度よりも少なくとも10°F高い融解温度を有する、請求項24〜29のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記酵素破壊剤が、配列番号3によりコードされるセルラーゼの突然変異体である、請求項24に記載の組成物。
【請求項３６】
β-1,4-グリコシド結合を含む多糖ゲルの粘度を低下させる方法であって、許容条件下で、セルラーゼが該多糖ゲル中のβ-1,4-グリコシド結合を加水分解することを可能にするのに十分な時間、該多糖ゲルをセルラーゼ変異体と接触させて、それにより、グアーゲルの粘度を低下させるステップを含み、該セルラーゼ変異体は、超好熱性細菌由来の野生型セルラーゼと比較して少なくとも12箇所の突然変異を含み、かつ、該セルラーゼ変異体は、野生型セルラーゼと比較して増大した温度およびpH耐性を示す、上記方法。
【請求項３７】
少なくとも12箇所の突然変異が、減少性遺伝子再集合（reductive reassortment）、組み換え、および選択の反復サイクルを含むGene Site Saturation Mutagenesisにより作製される、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記多糖ゲルが、直鎖型グアー、架橋型グアー、またはそれらの混合物を含む、請求項36に記載の方法。
【請求項３９】
前記セルラーゼ変異体が配列番号2を有する、請求項36に記載の方法。
【請求項４０】
前記セルラーゼ変異体が、配列番号1を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項36に記載の方法。
【請求項４１】
許容条件が、約180°F〜約275°Fの温度範囲を含む、請求項36に記載の方法。
【請求項４２】
許容条件が、約9〜約11のpH範囲を含む、請求項36に記載の方法。
【請求項４３】
地下層を処理する方法であって、多糖ゲルおよびセルラーゼ変異体を含む破砕流体を地下層に導入するステップ；ならびに許容条件下で、セルラーゼ変異体が該ゲル中のβ-1,4-グリコシド結合の少なくとも一部を加水分解するが、α-1,6-グリコシド結合を加水分解しないことを可能にするのに十分な時間、該ゲルと該セルラーゼ変異体とを反応させて、それにより低粘度破砕流体を生成させるステップを含み；該セルラーゼ変異体は、超好熱性細菌由来の親野生型セルラーゼと比較して少なくとも12箇所の突然変異を含み、かつ、該セルラーゼ変異体は、該野生型セルラーゼと比較して増大した温度およびpH耐性を示す、上記方法。
【請求項４４】
前記セルラーゼ変異体により生成された低粘度破砕流体は、化学的破壊剤により生成された同等な低粘度破砕流体よりも少ない残留物を含み、セルラーゼ変異体および化学的破壊剤の投入量が、実質的に同じ粘度低下をもたらす、請求項36に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第119条(e)項（35 U.S.C. §119(e)）により、2012年3月30日出願の米国特許仮出願第61/618,610号および2012年6月15日出願の同第61/660,556号に基づく優先権を主張するものであり、該出願のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
セルラーゼをコードするポリヌクレオチド配列が提供される。特に、提供される配列は、極限井戸条件下でグアー破砕流体を加水分解するためのセルラーゼなどの、特異的、熱安定性、耐熱性、圧力安定性セルラーゼの増大した発現をもたらし得る。
【０００３】
配列表
本出願は、米国特許審査便覧第502.05条（MPEP §502.05）で認定されかつ記載された通りに、USPTO EFS-WEBサーバを介して電子的に出願されており、この電子出願は、電子的に提出される配列表を含み；本配列表の内容全体が、本出願の明細書中に参照によりここで組み入れられる。配列表は、以下の電子的に提出されたASCII（.txt）テキストファイルにて特定される：
【表１】
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【背景技術】
【０００４】
O-グリコシルヒドロラーゼ（EC 3.2.1.-）は、2個以上の炭水化物の間、または炭水化物部分と非炭水化物部分との間のグリコシド結合を加水分解する、天然に存在する酵素の広範なグループである。グリコシルヒドロラーゼ（またはグリコシラーゼ）の国際生化学・分子生物学連合（IUBMB）酵素命名法は、原則としてそれらの基質特異性に基づき、それらの分子メカニズムに基づく場合もある（国際生化学・分子生物学連合命名法委員会（NC-IUBMB）、2011年10月24日アクセス）。
【０００５】
IUBMB酵素命名法EC 3.2.1.4は、「セルラーゼ」と称されるグリコシラーゼ型酵素のサブグループに対して指定されている。このグループに属する酵素に対して用いられる他の名称としては、エンドグルカナーゼ、エンド-1,4-β-グルカナーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、およびβ-1,4-グルカナーゼが挙げられる。このグループに属する酵素により触媒される反応は、セルロース、リケニン、および穀類β-D-グルカン（オオムギβ-グルカンなど）中の1,4-β-D-グリコシド結合のエンド型加水分解（endo-hydrolysis）である。本発明の開示されるセルラーゼの主な活性はオオムギβ-グルカンおよびカルボキシメチルセルロースのエンド型加水分解であるので、IUBMB酵素命名法EC 3.2.1.4であると適切にみなされる。
【０００６】
グリコシルヒドロラーゼの別の分類は、アミノ酸配列類似性に基づく（Henrissat, B.、UniProtにて2011年10月26日にアクセス）。この分類スキームによれば、グリコシルヒドロラーゼは70種類を超えるファミリーに分けられる。公開されたデータベースに含まれる他のグリコシルヒドロラーゼの配列との、本発明の開示されるセルラーゼの一次アミノ酸配列の比較に基づくと、本発明の開示されるセルラーゼは、グリコシルヒドロラーゼ第5ファミリーに割り当てることができる。このファミリーは、20種類超のエンドグルカナーゼを含み（IUBMB酵素命名法EC 3.2.1.4）、その主な触媒活性はセルロース系基質中のβ-1,4-グリコシド結合のエンド型加水分解である。酵素分類のこの第2の方法の使用は、本発明の開示されるセルラーゼがIUBMB酵素命名法EC 3.2.1.4であるとみなされるべきであるとの結論をさらに支持する。
【０００７】
セルラーゼは、限定するものではないが、石油・ガス探査、食物および飲料、飲用または燃料用アルコール製造（例えば、醸造、エタノール、ワイン）、香味料、香料、布地、洗剤、紙、パルプ、環境、および農業をはじめとする種々の工業および商業目的のために、ならびに研究目的で用いられる（Rebecca S. Bryant, Erle C. Donaldson, Teh Fu Yen, George V. Chilingarian, Chapter 14 Microbial Enhanced Oil Recovery, In: Erle C. Donaldson, George V. Chilingarian および Teh Fu Yen 編, Developments in Petroleum Science, Elsevier, 1989, Volume 17, Part B, Pages 423-450；M. Karmakar および R.R. Ray, 2011. Current Trends in Research and Application of Microbial Cellulases. Research Journal of Microbiology, 6: 41-53）。
【０００８】
酵素破壊剤（enzyme breaker）は、ポリマー系増粘性物質（polymeric viscosifier）を加水分解するために1990年代前半から水ベースの破砕流体で成功裏に用いられてきた（Brannon HD, Tjon-Joe-Pin RM, Carman PS, Wood WD, “Enzyme breaker technology: a decade of improved well stimulation”, paper SPE 84213, the SPE Annual Technical Conference and Exhibition in Denver, Colorado, USA, 5-8 October 2003で発表）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
酵素は、多くの破砕操作で存在する高温および高アルカリ条件に対して感受性である3次元構造を有するタンパク質である。厳しい地中条件（down-hole condition）（例えば、高温および高pH）下で触媒活性を保持する酵素の同定および/またはエンジニアリングは、水ベースの破砕での酵素破壊剤の応用を拡大するであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ポリマー系増粘性物質、界面活性剤、熱安定化剤、および超好熱性細菌由来の野生型セルラーゼまたはその突然変異体を含む酵素破壊剤を含有する組成物が開示される。
【００１１】
一部の実施形態では、増粘性物質は、直鎖型グアー、架橋型グアー、またはそれらの混合物を含むグアーゲルである。一部の実施形態では、酵素破壊剤は、グアーゲル中のβ-1,4-グリコシド結合を特異的に加水分解する。一部の実施形態では、酵素破壊剤は、グアーゲル中のα-1,6-グリコシド結合を特異的に加水分解しない。一部の実施形態では、酵素破壊剤は、約275°Fまでの温度でグアーゲル中のβ-1,4-グリコシド結合を加水分解するその能力を保持する。一部の実施形態では、酵素破壊剤は、約11までのpHでグアーゲル中のβ-1,4-グリコシド結合を加水分解するその能力を保持する。
【００１２】
一部の実施形態では、組成物中の酵素破壊剤は、野生型セルラーゼと比較して12箇所の突然変異を含む突然変異体である。12箇所の突然変異は、F38Y、Y61Q、M69E、D70P、R71S、I94Q、I166V、S183R、S191A、E212P、L231V、M276A、E277S、R280G、T297P、およびT301Qからなる群より選択することができる。一部の実施形態では、酵素破壊剤は配列番号2を有する。一部の実施形態では、酵素破壊剤は、配列番号1を有するポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態では、酵素破壊剤は、野生型セルラーゼの突然変異体であり、約pH6.5にて野生型セルラーゼの融解温度よりも少なくとも20°F高く、かつ約pH10.5にて野生型セルラーゼの融解温度よりも少なくとも10°F高い融解温度を有する。
【００１３】
β-1,4-グリコシド結合を含む多糖ゲルの粘度を低下させるための方法が開示される。該方法は、許容条件下で、セルラーゼが多糖ゲル中のβ-1,4-グリコシド結合を加水分解することを可能にするのに十分な時間、多糖ゲルをセルラーゼ変異体と接触させて、それにより、グアーゲルの粘度を低下させるステップを含む。セルラーゼ変異体は、超好熱性細菌由来の野生型セルラーゼと比較して少なくとも12箇所の突然変異を含み、セルラーゼ変異体は、野生型セルラーゼと比較して増大した温度およびpH耐性を示す。
【００１４】
該方法の一部の実施形態では、セルラーゼ変異体中の少なくとも12箇所の突然変異は、減少性遺伝子再集合（reductive reassortment）、組み換え、および選択の反復サイクルを含むGene Site Saturation Mutagenesisにより作製された。
【００１５】
該方法の一部の実施形態では、多糖ゲルは、直鎖型グアー、架橋型グアー、またはそれらの混合物を含む。
【００１６】
該方法の一部の実施形態では、セルラーゼ変異体は配列番号2を有する。該方法の一部の実施形態では、セルラーゼ変異体は、配列番号1を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００１７】
該方法の一部の実施形態では、許容条件は、約180°F〜約275°Fの温度範囲を含む。該方法の一部の実施形態では、許容条件は、約9〜約11のpH範囲を含む。
【００１８】
地下層（subterranean formation）を処理する方法もまた開示される。該方法は、多糖ゲルおよびセルラーゼ変異体を含む破砕流体を地下層に導入するステップ；ならびに許容条件下で、セルラーゼ変異体がゲル中のβ-1,4-グリコシド結合の少なくとも一部を加水分解するが、α-1,6-グリコシド結合を加水分解しないことを可能にするのに十分な時間、ゲルとセルラーゼ変異体とを反応させて、それにより低粘度破砕流体を生成させるステップを含む。セルラーゼ変異体は、超好熱性細菌由来の親野生型セルラーゼと比較して少なくとも12箇所の突然変異を含むことができ、セルラーゼ変異体は、野生型セルラーゼと比較して増大した温度およびpH耐性を示すことができる。
【００１９】
該方法の一部の実施形態では、セルラーゼ変異体により生成された低粘度破砕流体は、化学的破壊剤により生成された同等な低粘度破砕流体よりも少ない残留物を含み、ここで、セルラーゼ変異体および化学的破壊剤の投入量は、実質的に同じ粘度低下をもたらす。
【００２０】
該方法の一部の実施形態では、セルラーゼ変異体により生成された低粘度破砕流体は、化学的破壊剤により生成された同等な低粘度破砕流体よりも大きな透水係数（conductivity）を保持し、ここで、セルラーゼ変異体および化学的破壊剤の投入量は、実質的に同じ粘度低下をもたらす。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は配列番号1を含み、ここで、該配列は、タンパク質をコードする。さらなる実施形態では、本発明は、以下の突然変異：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、G39C、T40C、G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1箇所の突然変異を含む、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）由来のセルラーゼをコードするヌクレオチド配列、または配列番号3を含み、ここで、任意により、いずれかのそのような突然変異はサイレントである。本発明のさらなる実施形態では、少なくとも1箇所のそのようなサイレント突然変異は、少なくとも1箇所のそのような突然変異を有しないヌクレオチド配列よりも高レベルでの該セルラーゼの発現を生じさせる。
【００２２】
本発明の別の実施形態では、本発明は、少なくとも1箇所の突然変異を有し、かつサーモトガ・マリティマ野生型ゲノム配列と比較して該ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の増大した発現レベルを有するサーモトガ・マリティマ由来のヌクレオチド配列を含み、ここで、任意により、該突然変異（単数/複数）はサイレントである。
【００２３】
本発明の別の実施形態では、本発明は、配列番号2のポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列を含み、ここで、該ヌクレオチド配列は、配列番号2をコードする第2の配列に対して突然変異されており、それにより該タンパク質の発現レベルが、該第2のヌクレオチド配列によりコードされる該タンパク質のものと比較して増大する。
【００２４】
配列番号2のポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は配列番号2をコードする第2の配列に対して突然変異されており、それにより該タンパク質の発現レベルが、該第2のヌクレオチド配列によりコードされる該タンパク質のものと比較して増大する、第1のヌクレオチド配列。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、本発明は、配列番号2に対して少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％または100％同一なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその断片を含み、該ヌクレオチド配列は、以下の突然変異：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、G39C、T40C、G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1箇所の突然変異を含む。
【００２６】
本発明の別の実施形態では、本発明のタンパク質のうちのいずれかは、細菌発現系で発現され、ここで、細菌発現系は、グラム陰性細菌発現系、例えば、シュードモナス属、大腸菌、ラルストニア属、またはカウロバクター属（Caulobacter）発現系である。
【００２７】
本発明の別の実施形態では、本発明のセルラーゼの発現は、少なくとも1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L、5.0g/L、6.0g/L、7.0g/L、8.0g/L、9.0g/L、10.0g/L、11.0g/L、12.0g/L、13.0g/L、14.0g/L、15.0g/L、16.0g/L、17.0g/L、18.0g/L、19.0g/L、20.0g/L、21.0g/L、22.0g/L、23.0g/L、24.0g/L、25.0g/L、26.0g/L、27.0g/L、28.0g/L、29.0g/L、30.0g/L、31.0g/L、32.0g/L、33.0g/L、34.0g/L、または35.0g/L、生成される。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、本発明のセルラーゼは第2の酵素と組み合わせられ、ここで第2の酵素は、ラクターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、マンナナーゼ、アミラーゼ、アミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、トランスアミナーゼ、アミンオキシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、アンモニアリアーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、本発明は、配列番号1を含む核酸配列を有する、単離された、組み換え、または合成ヌクレオチドを含み、ここで、該核酸配列は、セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、本発明は、配列番号1の核酸配列を含む単離された、組み換え、または合成ヌクレオチドを含み、ここで、該核酸配列はセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、該ポリペプチドは配列番号2のアミノ酸配列または酵素として活性なその断片を含む。
【００３１】
本発明の別の実施形態では、本発明は、セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号1を含む単離された、組み換え、または合成核酸配列を含み、ここで、該ポリペプチドは配列番号2のアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドは組み換え蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）発現系で生成される。
【００３２】
本発明の別の実施形態では、本発明は、セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該ポリペプチドは、組み換え細菌発現系で生成される。
【００３３】
本発明の別の実施形態では、本発明は、配列番号1によりコードされるポリペプチドを含む組成物を含み、ここで、任意により、組成物は少なくとも第2の酵素をさらに含み、任意により、第2の酵素は、ラクターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、マンナナーゼ、アミラーゼ、アミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、トランスアミナーゼ、アミンオキシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、アンモニアリアーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される。
【００３４】
本発明の別の実施形態では、本発明は、配列番号1を含む核酸配列を有する単離された、組み換え、または合成ヌクレオチドを含み、ここで、該核酸配列は、セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、本発明は、配列番号1の核酸配列を含む単離された、組み換え、または合成ヌクレオチドを含み、ここで、該核酸配列はセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、該ポリペプチドは配列番号2のアミノ酸配列または酵素として活性なその断片を含む。さらなる実施形態では、配列番号1を含む単離された、組み換え、または合成核酸配列は、セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、ここで、該ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドは組み換え蛍光菌発現系で生成される。
【００３６】
本発明の別の実施形態では、本発明は、ポリマー系増粘性物質、界面活性剤、熱安定化剤、および超好熱性細菌由来の野生型セルラーゼまたはその突然変異体を含む酵素破壊剤を含有する組成物を含む。組成物のさらなる実施形態では、増粘性物質は、直鎖型グアー、架橋型グアー、またはそれらの混合物を含むグアーゲルである。組成物のさらなる実施形態では、酵素破壊剤は、グアーゲル中のβ-1,4-グリコシド結合を特異的に加水分解する。組成物のさらなる実施形態では、酵素破壊剤は、グアーゲル中のα-1,6-グリコシド結合を特異的に加水分解しない。組成物のさらなる実施形態では、酵素破壊剤は、約275°Fまでの温度でグアーゲル中のβ-1,4-グリコシド結合を加水分解する能力を保持する。組成物のさらなる実施形態では、酵素破壊剤は、約11までのpHでグアーゲル中のβ-1,4-グリコシド結合を加水分解する能力を保持する。組成物のさらなる実施形態では、酵素破壊剤は配列番号2を有する。組成物のさらなる実施形態では、酵素破壊剤は、配列番号1を有するポリヌクレオチドによりコードされる。上記の組成物のうちのいずれかのさらなる実施形態では、酵素破壊剤は、野生型セルラーゼの突然変異体であり、約pH6.5にて野生型セルラーゼの融解温度よりも少なくとも20°F高く、かつ約pH10.5にて野生型セルラーゼの融解温度よりも少なくとも10°F高い融解温度を有する。さらなる実施形態では、酵素破壊剤は、野生型セルラーゼと比較して12箇所の突然変異を含む突然変異体である。さらなる実施形態では、変異型セルラーゼは、以下の突然変異：F38Y、Y61Q、M69E、D70P、R71S、I94Q、I166V、S183R、S191A、E212P、L231V、M276A、E277S、R280G、T297PおよびT301Qのうちの少なくとも1種類を含む。
【００３７】
さらなる実施形態では、前記酵素破壊剤は、配列番号3によりコードされるセルラーゼの突然変異体である。
【００３８】
さらなる実施形態では、本発明は、β-1,4-グリコシド結合を含む多糖ゲルの粘度を低下させる方法を含み、該方法は、許容条件下で、セルラーゼが多糖ゲル中のβ-1,4-グリコシド結合を加水分解することを可能にするのに十分な時間、多糖ゲルをセルラーゼ変異体と接触させて、それにより、グアーゲルの粘度を低下させるステップを含み、ここで、セルラーゼ変異体は、超好熱性細菌由来の野生型セルラーゼと比較して少なくとも12箇所の突然変異を含み、セルラーゼ変異体は、野生型セルラーゼと比較して増大した温度およびpH耐性を示す。さらなる実施形態では、該12箇所の突然変異は、減少性遺伝子再集合（reductive reassortment）、組み換え、および選択の反復サイクルを含むGene Site Saturation Mutagenesisにより作製された。代替的な実施形態では、該多糖ゲルは、直鎖型グアー、架橋型グアー、またはそれらの混合物を含む。代替的な実施形態では、前記セルラーゼ変異体は、配列番号1を有するポリヌクレオチドによりコードされる。代替的な実施形態では、許容条件は、約180°F〜約275°Fの範囲の温度を含む。代替的な実施形態では、許容条件は、約9〜約11のpH範囲を含む。
【００３９】
本発明の一実施形態では、本発明は、地下層（subterranean formation）を処理する方法を含み、該方法は、多糖ゲルおよびセルラーゼ変異体を含む破砕流体を地下層に導入するステップ；ならびに許容条件下で、セルラーゼ変異体がゲル中のβ-1,4-グリコシド結合の少なくとも一部を加水分解するが、α-1,6-グリコシド結合を加水分解しないことを可能にするのに十分な時間、ゲルとセルラーゼ変異体とを反応させて、それにより低粘度破砕流体を生成させるステップを含み、ここで、セルラーゼ変異体は、超好熱性細菌由来の親野生型セルラーゼと比較して少なくとも12箇所の突然変異を含み、セルラーゼ変異体は、野生型セルラーゼと比較して増大した温度およびpH耐性を示す。
【００４０】
上記の方法のさらなる実施形態では、前記セルラーゼ変異体を用いる加水分解は、化学的破壊剤により生成された同等な低粘度破砕流体よりも少ない残留物を含み、ここで、セルラーゼ変異体および化学的破壊剤の投入量は、実質的に同じ粘度低下をもたらす。
【００４１】
上記の方法のさらなる実施形態では、セルラーゼ変異体により生成された低粘度破砕流体は、化学的破壊剤により生成された同等な低粘度破砕流体よりも大きな透水係数を保持し、ここで、セルラーゼ変異体および化学的破壊剤の投入量は、実質的に同じ粘度低下をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】実施例2に記載されるタンパク質発現の様々なレベルを表わすSDS-PAGEゲル電気泳動の画像である。
【図２】実施例3に記載されるタンパク質調製物の活性のレベルを示す棒グラフである。
【図３】配列番号3と比較して以下の14箇所のサイレント突然変異：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84Cを有するポリヌクレオチドである配列番号1を示す図である。
【図４】配列番号1、3および4によりコードされるポリペプチドである配列番号2を示す図である。
【図５】配列番号1および4の非改変親ポリヌクレオチド配列である配列番号3を示す図である。
【図６】配列番号3と比較して以下の14箇所のサイレント突然変異：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84Cと、開始コドンの上流の1箇所の追加の点突然変異を有するポリヌクレオチドである配列番号4を示す図である（追加の上流配列が示される）。
【図７】野生型セルラーゼおよび選択されたセルラーゼ変異体のDSC試験を、表示した算出Tm値を用いて実施した。野生型セルラーゼと比較した場合、セルラーゼ変異体を用いてTmの24°Fの上昇が観察された。
【図８Ａ】pNP-β-D-ラクトピラノシドの化学構造を示す図である。
【図８Ｂ】種々の温度（70°F〜200°F）でpNP吸光度アッセイ（405nm）により測定されたセルラーゼの温度プロファイルを示す図である。活性は、180°Fでの活性のパーセンテージとして算出した。沸点超（＞212°F）での活性は、残存活性アッセイ（図8C）を用いてさらに評価することができる。
【図８Ｃ】セルラーゼ変異体の残存活性を、加熱チャレンジ（heat challenged）サンプルを用いて評価した。相対活性は、225°Fにて得られた活性のパーセンテージとして算出した。
【図９】蛍光アッセイを用いたセルラーゼ変異体のpHプロファイリングを示す図である。相対活性は、pH9.5での活性のパーセンテージにより算出した。
【図１０Ａ】HPLC研究のための2種類の化合物の構造を示す図である。1,4-β-D-マンノペンタオースは、1,4-β結合を介して連結された5単位のマンノースを含む化合物である。63,64-α-D-ガラクトシル-マンノペンタオースは、1,4-β-D-マンノペンタオース（Mannopentanose）に対してα-1,6-結合を介して連結された2個のガラクトース単位を含むグアーガム構造の模倣体化合物であり、セルラーゼ処理からの加水分解生成物の分析を可能にする。
【図１０Ｂ】オリゴ糖標準（M1〜M6、およびガラクトース）のHPLC分析を示す図である。マンノース単一単位（M1、赤色ピーク）は、HPLCの溶出プロファイルにて単一単位ガラクトース（青色ピーク）から十分に分離されることに留意されたい。
【図１０Ｃ】マンノース処理後の1,4-β-D-マンノペンタオースおよび63-64-α-D-ガラクトシル-マンノペンタオース由来の加水分解生成物のHPLC分析を示す図である。(a) 1,4-β-D-マンノペンタオースの酵素消化。酵素処理を用いない対照サンプルのHPLC溶出プロファイルを赤色で、セルラーゼ変異体処理した1,4-β-D-マンノペンタオースを青色で示す。(b) 63-64-y-D-ガラクトシル-マンノペンタオースの酵素消化。O-GGM5は、赤色で示したセルラーゼ処理サンプルおよび青色で示した酵素不含サンプルを含む63,64-α-D-ガラクトシル-マンノペンタオースを表わす。単一単位のマンノース（ピンク色で示す）およびガラクトース（緑色で示す）が参照として含まれる。セルラーゼ処理O-GGM5のHPLC溶出プロファイルには、ガラクトースピークはないが、マンノースピークのみはあり、セルラーゼ変異体が、マンノース単位の間のβ-1,4-グリコシド結合を特異的に切断することが確認されることに留意されたい。
【図１１】180°Fでの80lbmグアー/1000 gal USの粘度に対するpHの影響を示す図である。明確にするために、せん断ランプ（shear ramp）は除去してある。
【図１２】pH＝10.5、200°Fでのボレート架橋グアーについてのセルラーゼ変異体のレオロジー試験を示す図である。すべての流体は粘土安定化剤および界面活性剤を含有し、遅延型架橋剤を用いた。
【図１３】pH＝10、225°Fでのボレート架橋グアーについてのセルラーゼ変異体のレオロジー試験を示す図である。すべての流体は10lbmの熱安定化剤/1000gal USを含有し、遅延型架橋剤を用いた。
【図１４】10lbmの熱安定化剤/1000gal US を含む、225°FおよびpH＝9.9でのジルコニウム架橋CMHPGを用いたセルラーゼ変異体のレオロジー試験を示す図である。
【図１５】過硫酸アンモニウムとセルラーゼとを比較する残留物分析を示す図である。両方の場合で、より高い破壊剤レベルが残留物を減少させるが、酸化的破壊剤はより多量の残留物を示す。
【図１６】直鎖型グアー調合物およびホウ素架橋型グアー調合物の両方に対するセルラーゼと過硫酸アンモニウムについての透水係数結果の比較を示す図である。直鎖型：セルラーゼまたは生の過硫酸アンモニウムを用いた80lbmグアー/1000gal US；架橋型：セルラーゼまたはカプセル化過硫酸アンモニウムを用いた30lbmグアー/1000gal US。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
酵素は、触媒として作用するタンパク質である。タンパク質は、ペプチド結合による脱水反応で連結されたアミノ酸のポリマーである。アミノ酸の素性およびタンパク質を形成するためにそれらが連結されている順番が、所与のタンパク質の活性を決定する。アミノ酸がタンパク質に組み立てられているこの順番（タンパク質「配列」）は、最終的にはタンパク質を「コードする」DNA鎖の配列により決定される。
【００４４】
タンパク質に組み立てられる対象の所定のアミノ酸を特定する3個のヌクレオチド配列は、「コドン」と呼ばれる。タンパク質へと組み立てられる20種類のアミノ酸は、64種類の三ヌクレオチドコドン配列により集合的にコードされる。タンパク質を特定する一連のコドンは「オープンリーディングフレーム」と称される。アミノ酸は、最小で1種類、最大で6種類の異なるコドンにより特定することができる。特定されるアミノ酸に影響しないコドンの三ヌクレオチド配列での変化（または突然変異）は、「サイレント」突然変異と称される。
【００４５】
結果として、DNA配列が「サイレント」突然変異のみを通して互いに異なるので、同じタンパク質をコードすることができる多数のDNA配列がある。所与のタンパク質をコードする1つ以上のコドンを変化させることにより、コードされるタンパク質の配列に影響することなく、遺伝子が産生するタンパク質の量を多大に増加させることが可能であり得る。
【００４６】
一部の実施形態では、本発明は配列番号1を含む。一部の実施形態では、本発明は、配列番号1のポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、この配列はタンパク質をコードする。一部の実施形態では、このタンパク質は、セルラーゼ活性を有する酵素である。
【００４７】
本明細書中で開示される改良型ヌクレオチド配列が配列番号1として与えられ、該配列は、サーモトガ・マリティマMSB8株由来のDNAライブラリーから単離された親セルラーゼ酵素から進化させた、以前に開示されたセルラーゼ酵素（配列番号2）をコードする。開示されたセルラーゼは、PCT公開第2009/020459号に配列番号9として記載されている（本明細書中では配列番号3として記載される該文献中のポリヌクレオチド配列番号8によりコードされる）。一部の実施形態では、本発明は、配列番号1のポリヌクレオチド配列、またはその断片を含む。一部の実施形態では、これらの配列はタンパク質をコードする。一部の実施形態では、タンパク質はセルラーゼ活性を有する酵素である。
【００４８】
本発明は、配列番号3に対して複数のヌクレオチド塩基の変化を含む。これらの変化は、コードされるタンパク質に関してサイレントである。14の塩基変化を、以下に記載する。「位置」とは、最初のコドンの最初のヌクレオチドを1と番号付けして、オープンリーディングフレーム内のヌクレオチドの番号を示す。配列番号1のオープンリーディングフレームが、オープンリーディングフレームがその5’末端で別の核酸配列に連結されて配列番号1の5’末端を越えて伸長する場合、「位置」は、配列番号1のオープンリーディングフレームの5’末端から数えた塩基を引き続き意味するであろう。同様に、配列番号1のオープンリーディングフレームが末端切断されて、オープンリーディングフレームが配列番号1に関する配列の5’末端で始まらない場合、ナンバリングシステムは、配列番号1の5’末端に対応する該配列の5’末端から引き続き始まるであろう。
【００４９】
ヌクレオチド塩基の変化、すなわち突然変異は、以下の表記法を用いて特定される：(以前のヌクレオチド)(位置)(新たなヌクレオチド)。突然変異は、以下の通りである：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84C、またはそれらのいずれかの組み合わせ。
【００５０】
開示されるセルラーゼをコードする、以前に報告されている配列と配列番号1とを区別する塩基変化は、集合的かつ個別に、同じタンパク質をコードする、以前に用いられたヌクレオチド配列よりも高レベルのタンパク質発現をもたらすオープンリーディングフレームを生じさせる。
【００５１】
一部の実施形態では、サーモトガ・マリティマ由来のセルラーゼをコードするヌクレオチド配列が開示され、ここで、該ヌクレオチド配列は、以下の突然変異：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、G39C、T40C、G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1箇所の突然変異を含む。これらの実施形態の一部の態様では、少なくとも1箇所の突然変異は、コードされるタンパク質の配列に関してサイレントである。他の態様では、少なくとも1箇所の突然変異が、該少なくとも1箇所の突然変異を有さず、その他の点では上記のヌクレオチド配列と異ならないヌクレオチド配列よりも高レベルでのセルラーゼの発現を生じさせる少なくとも1箇所の突然変異を保持するヌクレオチド配列をもたらす。
【００５２】
一部の実施形態では、セルラーゼをコードするヌクレオチド配列が開示され、ここで、ヌクレオチド配列は配列番号3を含み、以下の突然変異：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、G39C、T40C、G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1箇所の突然変異を有する。
【００５３】
一部の実施形態では、サーモトガ・マリティマのゲノム配列と比較して、そのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の発現レベルを増大させる少なくとも1箇所の突然変異を有する、サーモトガ・マリティマ由来のヌクレオチド配列が開示される。一部の態様では、少なくとも1箇所の突然変異はサイレントである。
【００５４】
一部の実施形態では、配列番号2のポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列が開示され、ここで、該ヌクレオチド配列は、配列番号2のポリペプチドをコードする第2の配列に対して突然変異されており、それにより、第2のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のものと比較してタンパク質の発現レベルが増大する。
【００５５】
サーモトガ・マリティマは、極端な塩条件（すなわち、0.25％NaCl〜6.00％NaCl）で増殖する能力を特徴とする好熱性真正細菌である。サーモトガ・マリティマはサーモトガ目に属し、サーモトガ目のメンバーは、好熱性嫌気性グラム陰性桿菌である。増殖のための最低温度は55℃付近であり、至適温度は80〜85℃であり、最高温度は約90℃である。一部の実施形態では、最低温度は55℃未満であり、最高温度は90℃超である。これらの細菌は、真正細菌界の最も深い枝の1つからゆっくりと進化してきた。サーモトガ目のメンバーは、「広範かつ汎存種」（wide-spread and cosmopolitan）（Huber, R. et al., 2006）と記載されており、活動的地熱地帯でよく育つ。サーモトガ・マリティマは、サーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）、サーモトガ・ペトロフィラ（Thermotoga petrophila）、およびサーモトガ・ナフソフィラ（Thermotoga naphthophila）の菌種と近縁関係にある。サーモトガ・マリティマの標本は、ブルカノ（イタリア）；リベイラ・クエンテ（Riberia Quente）およびサン・ミゲル島（アゾレス諸島）；サンゲアン島（インドネシア）；ならびにフィジー島の海底から取得されている（Huber, R. et al., 2006）。
【００５６】
MSB8株は、ブルカノ（イタリア）の地熱で加熱された海底堆積物から単離された（Huber, 1986）。採取地の温度は、70〜100℃の範囲であり、pH6.5〜7.0であった。該菌株は、Deutsche Sammlung von MikroorganismenにDSM 3109として、かつATCCにATCC43589として寄託されている（Huber, R. et al., 2006）。
【００５７】
サーモトガ・マリティマMSB8株は、それが産生する酵素の並外れた熱安定性により、その酵素コード遺伝子について研究されてきた。Liebl（Liebl, W. et al., 1996）は、「Analysis of a Thermotoga maritima DNA fragment encoding two similar thermostable cellulases, CelA and CelB, and characterization of the recombinant enzymes.」を公表している。さらに、デンプン分解性酵素（Bibel, M. et al., 1998）、リバースジャイレース（Bouthier de la Tour, C. et al., 1998）、α-アミラーゼ（Liebl, W. et al., 1997）、α-グルクロニダーゼ（Ruile, P. et al., 1997）、キシラナーゼ（Winterhalter, C. et al., 1995）、β-グルコシダーゼ（Liebl, W. et al., 1994）、グルカノトランスフェラーゼ（Liebl, W. et al., 1992）に対する遺伝子が単離され、分析されている。Bronnenmeierによる研究（Bronnenmeier, K. et al., 1995）、「Purification of Thermotoga maritima enzymes for the degradation of cellulosic materials」は、これらの酵素が、セルロースおよびキシランを分解するために有用であることを示している。
【００５８】
発現系
一部の実施形態では、本発明のセルラーゼをコードするDNAを、プラスミドに導入するか、または例えば、大腸菌、シュードモナス属の種（蛍光菌、シュードモナス・プチダ、緑膿菌など）、ラルストニア属の種、またはカウロバクター属の種などのいずれかの数のグラム陰性細菌系のゲノムへと安定的に形質転換することができる。同様に、バチルス属の種（枯草菌（Bacillus subtilis）、巨大菌（Bacillus megaterium）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）など）、ラクトコッカス属の種（ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）など）、ラクトバチルス属の種、ストレプトマイセス属の種（ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）など）などのいずれかの数のグラム陽性細菌発現系へとセルラーゼを導入することができる。他のグラム陰性細菌、グラム陽性細菌または近縁でない真正細菌もしくは古細菌発現系を用いて、セルラーゼを発現させてもよい。
【００５９】
一部の実施形態では、開示されるセルラーゼタンパク質を発現させることができる複数の系での発現レベルを増大させるために、配列番号1を用いる。配列番号1は、向上した蓄積レベルで開示されるセルラーゼを発現させるために、いずれかの数の発現系へと導入することができる。例えば、配列番号1を、プラスミドに導入するか、または例えば、大腸菌、シュードモナス属の種（蛍光菌、シュードモナス・プチダ、緑膿菌など）、ラルストニア属の種、またはカウロバクター属の種などのいずれかの数のグラム陰性細菌系のゲノムへと安定的に形質転換することができる。同様に、バチルス属の種（枯草菌（Bacillus subtilis）、巨大菌（Bacillus megaterium）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）など）、ラクトコッカス属の種（ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）など）、ラクトバチルス属の種、ストレプトマイセス属の種（ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）など）などのいずれかの数のグラム陽性細菌発現系へと配列番号1を導入することができる。他のグラム陰性細菌、グラム陽性細菌または近縁でない真正細菌もしくは古細菌発現系を用いて配列番号1を発現させてもよい。さらなる実施形態では、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ピチア・パストリス、およびハンサヌエラ・ポリモルファなどのいずれかの数の真核生物発現系へと配列番号1を導入することができる。
【００６０】
より具体的には、配列番号1を、その発現を生じさせるためにプラスミドに導入することができる。配列番号1を導入することができるプラスミドとしては、例えば、pQE、pET、およびpASKファミリーの大腸菌発現ベクター；pCN51 LT8、RSF1010、pWZ112T、およびpMYCファミリーのシュードモナス属発現ベクター；pBAX、pHT01、およびpHIS1525ファミリーのバチルス属発現ベクター；pIJ6021およびpIJ2460ファミリーのストレプトマイセス属発現ベクター；ならびにpNZ9530およびpNZ8148ファミリーのラクトコッカス属発現ベクターが挙げられる。これらの例は例示目的のためのものであり、配列番号1のポリヌクレオチド配列を発現させることができるベクターの完全なセットを表わすものではない。
【００６１】
一部の実施形態では、発現系は、当技術分野で公知のいずれかの蛍光菌発現系、例えば、Dow Global Technologies社から市販されている蛍光菌発現系であるDC454株（米国特許出願公開第20050130160号および同第20050186666号）であり得る。セルラーゼ酵素またはポリペプチドをコードする核酸配列は、pMYCベクター（Dow Global Technologies社、米国特許出願公開第20050130160号）またはpDOW1169ベクター（Dow Global Technologies社、米国特許出願公開第20080058262号）のいずれかに挿入され、続いて、エレクトロポレーションにより蛍光菌宿主へと導入される。当業者であれば、本発明の実施形態として用いることができる代わりのベクターが分かるであろう。
【００６２】
一部の実施形態では、セルラーゼは、少なくとも以下の発現レベルで発現されるであろう：1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L、5.0g/L、6.0g/L、7.0g/L、8.0g/L、9.0g/L、10.0g/L、11.0g/L、12.0g/L、13.0g/L、14.0g/L、15.0g/L、16.0g/L、17.0g/L、18.0g/L、19.0g/L、20.0g/L、21.0g/L、22.0g/L、23.0g/L、24.0g/L、25.0g/L、26.0g/L、27.0g/L、28.0g/L、29.0g/L、30.0g/L、31.0g/L、32.0g/L、33.0g/L、34.0g/L、35.0g/Lまたはそれ以上。
【００６３】
核酸
本発明は、本発明の核酸配列に完全に相補的な配列を含む、単離された、合成、または組み換え核酸を提供する（相補的（非コード）およびコード配列は、本明細書中で以下、本発明の核酸配列とも総称される）。
【００６４】
本発明は、セルロース分解活性を有する少なくとも1種のポリペプチドをコードする核酸を含む、単離された、合成、または組み換え核酸を提供し、ここで、該核酸は、配列番号1の配列を含む本発明の例示的核酸に対して、少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の、または完全な（100％）配列同一性（相同性）を有する配列を含む。例えば、本発明は、配列番号1の核酸配列（本発明の例示的ポリヌクレオチド配列）を含む、単離された、合成、または組み換え核酸を提供する。本発明は、配列番号2（本発明の例示的ポリペプチド配列）に表わされる配列を含むポリペプチド、および酵素として活性なその断片をコードする、単離された、合成、または組み換え核酸を提供する。
【００６５】
ポリペプチド
本発明のポリペプチドおよびペプチドは、単離された、合成、または組み換えポリペプチドである。ペプチドおよびタンパク質は、in vitroまたはin vivoで組み換え的に発現させることができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドは、当技術分野で公知のいずれかの方法を用いて作製し、かつ単離することができる。本発明のポリペプチドおよびペプチドはまた、当技術分野で周知の方法を用いて、全体または一部分を合成することもできる。例えば、セルラーゼポリペプチドは、標準的な組み換え発現系（本明細書中で説明される通り）で産生させるか、化学的に合成するか、またはそれらが天然に発現される生物から精製することができる。
【００６６】
本発明は、本発明の例示的アミノ酸配列（例えば、配列番号2）に対して、少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の、または100％の（完全な）配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、セルロース分解活性を有する、単離された、合成、または組み換えポリペプチド、あるいは酵素として活性なその断片を提供する。
【００６７】
本発明は、配列番号2に表わされる配列を含む、単離された、合成、または組み換えポリペプチド、ならびに酵素として活性なその断片、およびその変異体を提供する。
【００６８】
代替的な実施形態では、本発明は、セルロース分解活性を有するが、シグナル配列、プレプロドメイン、ドッケリンドメイン、および/または炭水化物結合性モジュール（CBM）を有しないポリペプチド（およびそれらをコードする核酸）を提供し；一態様では、炭水化物結合性モジュール（CBM）は、セルロース結合性モジュール、リグニン結合性モジュール、キシラン結合性モジュール、キシロース結合性モジュール、マンノース結合性モジュール、キシログルカン特異的モジュール、および/もしくはアラビノフラノシド結合性モジュールを含むか、またはそれらからなる。
【００６９】
代替的な実施形態では、本発明は、セルロース分解活性を有し、異種配列をさらに含むポリペプチド（およびそれらをコードする核酸）を提供し；一態様では、異種配列は、以下の配列：(i)異種シグナル配列、異種炭水化物結合性モジュール、異種ドッケリンドメイン、異種触媒ドメイン（CD）、もしくはそれらの組み合わせ；(ii)異種シグナル配列、炭水化物結合性モジュールもしくは触媒ドメイン（CD）が異種酵素に由来する、(i)の配列；あるいは(iii)タグ、エピトープ、ターゲティングペプチド、切断可能配列、検出可能部分もしくは酵素、をコードする配列を含むか、またはそれらからなり；一態様では、異種炭水化物結合性モジュール（CBM）は、セルロース結合性モジュール、リグニン結合性モジュール、キシラン結合性モジュール、キシロース結合性モジュール、マンノース結合性モジュール、キシログルカン特異的モジュール、および/もしくはアラビノフラノシド結合性モジュール、を含むか、またはそれらからなり；一態様では、異種シグナル配列は、コードされるタンパク質を、液胞、小胞体、葉緑体またはデンプン顆粒へと標的化する。
【００７０】
酵素活性
開示されるセルラーゼによるpNP-β-D-ラクトピラノシドの酵素的加水分解を、酵素の活性の指標として用いることができる。p-ニトロフェノールの放出を、405nmにて分光光度計により追跡することができる。405nmでの吸光度の増大は、所定の条件で標準吸光度を用いることにより、p-ニトロフェノールのマイクロモルへと変換することができる。1単位の活性は、pH7.00および80℃にて1分間の間に2mM pNP-β-D-ラクトピラノシドから0.42マイクロモルのp-ニトロフェノールを放出するのに必要な酵素量であると定義される（Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Academic Press, 1999）。
【００７１】
熱安定性
一部の態様では、本発明の組み換え核酸は、熱安定性であるセルロース分解活性を有するポリペプチドをコードする。例えば、本発明のポリペプチドである配列番号2、または本発明の変異体進化酵素（variant evolved enzyme）は、熱安定性であり得る。本発明の熱安定性ポリペプチドは、37℃超〜約95℃、または約55℃〜約85℃、または約70℃〜約75℃、または約70℃〜約95℃、約90℃〜約95℃、約95℃〜約105℃、または約95℃〜約110℃の範囲の温度を含む条件下で、結合活性および/または酵素活性（例えば、セルロース分解活性）を保持することができる。一部の態様では、ポリペプチドは、1℃〜約5℃、約5℃〜約15℃、約15℃〜約25℃、約25℃〜約37℃を含む条件下で、結合活性および/または酵素活性（例えば、セルロース分解活性）を保持することができる。一部の態様では、本発明のポリペプチドは、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、103.5℃、104℃、105℃、107℃、108℃、109℃もしくは110℃、またはそれ以上を含む条件下で、結合活性および/または酵素活性（例えば、セルロース分解活性）を保持することができる。一部の実施形態では、本発明の熱安定性ポリペプチドは、上記の範囲の温度で、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5もしくはpH4、またはそれ以下（より酸性）を含む酸性条件下で、活性（例えば、セルロース分解活性）を保持し、あるいは、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5もしくはpH4、またはそれ以下（より酸性）を含む酸性条件への曝露後にセルロース分解活性を保持し；あるいは、約pH7、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5、pH11、pH11.5、pH12、pH12.5もしくはそれ以上（より塩基性）を含む塩基性条件下で活性を保持し、あるいは、約pH7、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5、pH11、pH11.5、pH12、pH12.5もしくはそれ以上（より塩基性）を含む塩基性条件への曝露後にセルロース分解活性を保持する。
【００７２】
耐熱性
一部の態様では、本発明の組み換え核酸は、耐熱性であるセルロース分解活性を有するポリペプチドをコードする。例えば、本発明のポリペプチドである配列番号2、または本発明の変異体進化酵素は、耐熱性であり得る。一部の態様では、セルロース分解活性が耐熱性であり、例えばここで、ポリペプチドは、37℃超〜約95℃、または約55℃〜約85℃、または約70℃〜約75℃、または約70℃〜約95℃、約90℃〜約95℃、約95℃〜約105℃、または約95℃〜約110℃の範囲の温度への曝露後にセルロース分解活性を保持する。一部の態様では、ポリペプチドは、約1℃〜約5℃、約5℃〜約15℃、約15℃〜約25℃、約25℃〜約37℃の温度範囲を含む条件への曝露後に、セルロース分解活性を保持する。一部の態様では、本発明のポリペプチドは、最高で90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、107℃、108℃、109℃もしくは110℃、またはそれ以上の温度への曝露後に、セルロース分解活性を保持することができる。一部の態様では、本発明の核酸によりコードされるポリペプチドは、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5もしくはpH4またはそれ以下（より酸性）を含む酸性条件下でセルロース分解活性を保持し、あるいは、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5もしくはpH4またはそれ以下（より酸性）を含む酸性条件への曝露後にセルロース分解活性を保持し；あるいは、約pH7、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5、pH11、pH11.5、pH12、pH12.5またはそれ以上（より塩基性）を含む塩基性条件下でセルロース分解活性を保持する。
【００７３】
セルロース消化
一部の態様では、本発明の組成物および方法は、バイオマスの酵素的消化で用いられ、セルラーゼおよびヘミセルラーゼを含む多数の異なる酵素の使用を含み得る。本発明を実施するために用いられるセルラーゼは、セルロースをグルコースへと消化することができる。一部の態様では、本発明を実施するために用いられる組成物は、酵素、例えば、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えば、β-キシロシダーゼ）、セロビオヒドロラーゼ、および/もしくはアラビノフラノシダーゼ、またはヘミセルロース、セルロース、およびリグノセルロース系材料を発酵可能な糖および/もしくは単量体糖へと消化できる他の酵素の混合物を含むことができる。
【００７４】
本発明の酵素（例えば、エンドグルカナーゼ）は、いずれかの植物材料中に見出されるものを含む、セルロースもしくはいずれかのβ-1,4-結合グルカン含有合成または天然材料を消化するために用いられる。本発明の酵素（例えば、エンドグルカナーゼ）は、すべての生物学的供給源（植物バイオマス、例えば、トウモロコシ、穀類、草（例えば、ソルガストルム・ヌータンス（Sorghastrum nutans）などのインディアングラス；または、スイッチグラス、例えばパニクム・ビルガツムなどのキビ属（Panicum）の種）、または、木材もしくは木材加工副生成物（例えば、木材加工、パルプおよび/もしくは紙工業で、布地製造にて、ならびに家庭用および工業的洗浄剤にて、ならびに/またはバイオマス廃棄物処理で）など）を含むいずれかの供給源由来のセルロースを消化するために、市販の酵素として用いられる。
【００７５】
食餌
一部の実施形態では、本発明のセルラーゼは、動物もしくはヒト用の食品、食品添加物、または補助食品を前処理、改質、消化、またはそれらの消化を強化するために用いることができる。一部の実施形態では、本発明のセルラーゼは、動物もしくはヒト用の食品、食品添加物、または補助食品として用いることができる。一部の態様では、セルラーゼは、消化障害を治療するか、または消化障害のための予防薬として機能するであろう。本発明の別の態様では、セルラーゼは、消化を変化させるかまたは強化するであろう。本発明の別の態様では、セルラーゼは、食糧の消化を強化し、変化させ、または補助するであろう。本発明のさらなる態様では、セルラーゼは、食糧の栄養価を強化し、補助し、または変化させるであろう。さらなる態様では、セルラーゼは、消化管で、例えば、胃および/または腸で活性である。
【００７６】
一部の実施形態では、本発明のセルラーゼは、動物飼料または動物飼料添加物として用いることができる。一部の実施形態では、セルラーゼの熱安定性および/または耐熱性が、塩またはワックスなどの補助剤（secondary agent）に対する必要性なしに、ペレットの形成を可能にする。セルラーゼを含む動物飼料は、当業者に公知のいずれかの製剤で動物に与えることができる。動物飼料製剤の例としては、限定するものではないが、送達マトリックス（delivery matrix）、ペレット剤、錠剤、ゲル剤、液剤、噴霧剤、粉砕穀物、または粉剤が挙げられる。
【００７７】
本発明は、熱安定性組み換えセルラーゼ酵素（例えば、本発明のポリペプチド）を含む、食用酵素送達マトリックスを提供する。本発明は、動物にセルラーゼ補助食品を送達するための方法を提供し、該方法は、顆粒状食用担体および熱安定性組み換えセルラーゼ酵素を含むペレットの形態で、食用酵素送達マトリックスを調製するステップであって、ペレットはその中に含有されるセルラーゼ酵素を水性媒体中に容易に分散させるものであるステップ、ならびに動物に該食用酵素送達マトリックスを投与するステップを含む。組み換えセルラーゼ酵素は、本発明のポリペプチドを含むことができる。顆粒状食用担体は、穀物胚芽、油を搾ったあとの穀物胚芽、干し草、アルファルファ、オオアワガエリ、ダイズ皮、ヒマワリ種子粉およびコムギミドリング粉（wheat midd）からなる群より選択される担体を含むことができる。食用担体は、油を搾ったあとの穀物胚芽を含むことができる。セルラーゼ酵素は、ペレット化条件で熱安定性を与えるために、グリコシル化することができる。送達マトリックスは、穀物胚芽およびセルラーゼを含む混合物をペレット化することにより形成することができる。ペレット化条件は、蒸気の適用を含むことができる。ペレット化条件は、約5分間の約80℃以上の温度の適用を含むことができ、酵素は、1ミリグラムの酵素あたり少なくとも350〜約900単位の比活性を保持する。
【００７８】
エタノールの製造方法
本発明は、デンプン含有組成物を、セルロース分解活性を有するポリペプチドであって、本発明の配列を有するか、もしくは本発明の配列を含む核酸によりコードされるポリペプチド、または酵素として活性なその断片と接触させるステップを含む、エタノールを製造するための方法を提供する。本発明は、デンプン、およびセルロース分解活性を有するポリペプチドであって、本発明の配列を有するか、もしくは本発明の配列を含む核酸によりコードされるポリペプチド、または酵素として活性なその断片を含む組成物を提供する。
【００７９】
醸造および発酵
本発明は、本発明のセルラーゼを含むビールを醸造する（brewing）（例えば、発酵させる（fermenting））方法を提供する。1つの例示的なプロセスでは、デンプン含有原材料を崩壊（disintegrate）させ、加工して、麦芽を形成させる。本発明の酵素は、発酵プロセス中のいずれかの時点で用いることができる。本発明のセルラーゼは、β-グルカンの分解のために醸造業で用いることができる。一部の態様では、本発明のセルラーゼは、飲料の清澄化のために醸造業で用いることができる。本発明の酵素は、例えば、米国特許第4,746,517号に記載される通り、麦汁またはビールのろ過性を改善する際に、飲料産業で用いることができる。
【００８０】
一部の態様では、本発明のセルラーゼは、摩砕（mushing）および転換プロセスで用いられる。醸造および発酵工業では、摩砕および転換プロセスは、水溶性グルカン、マンナン、アラビノキシランもしくはキシラン、または他の多糖の十分な分解を促進するのには低すぎる温度で行なわれる。これらのポリマーは、摩砕麦汁中の粘度を上昇させ得るガム状物質を形成し、それにより、不十分なろ過および低い抽出収率によって、最終ビール製品での、より長い摩砕物流出（longer mash run-off）、残留する濁りおよび沈殿をもたらす。
【００８１】
一部の態様では、本発明のセルラーゼは、麦芽製造所の作業で用いられ、例えば、発芽時間を短縮するためかつ/または低品質のオオムギから許容可能な麦芽への転換を促すために、グルカナーゼを処理水に添加する。一部の態様では、本発明の酵素は摩砕ステップのために用いられ、例えば、麦汁のろ過性を増大させ、かつ/またはろ過（lautering）（摩砕物から麦汁を分離する）を改善するために、それらを添加する。一部の態様では、本発明の酵素は、例えば、濁りの清澄化を助け、かつ/またはろ過を改善するために、発酵槽および/または沈殿槽で用いられる。一部の態様では、本発明の酵素は、補助醸造で用いられ、例えば、本発明のグルカナーゼは、麦芽中のグリカンを含む、オオムギ、コムギ、および/または他の穀類由来のグルカン、マンナン、アラビノキシラン、もしくはキシラン、または他の多糖を分解するために添加される。一部の態様では、本発明の酵素は麦芽醸造で用いられ、例えば、本発明のグルカナーゼは、高グルカン含量を有する品質のよくない麦芽を改質させるために添加される。
【００８２】
本発明のセルラーゼは、例えば、米国特許第5,762,991号；同第5,536,650号；同第5,405,624号；同第5,021,246号；同第4,788,066号に記載される通り、いずれかのビールまたはアルコール飲料製造プロセスで用いることができる。
【００８３】
食品の処理および食品加工
本発明のセルラーゼは、食品加工業での多数の応用を有する。例えば、一態様では、本発明の酵素は、油分の多い植物材料、例えば、油分の多い種子からの油の抽出（例えば、ダイズ由来のダイズ油、オリーブ由来のオリーブ油、ナタネ由来の菜種油および/またはヒマワリ種子由来のヒマワリ油）を改善するために用いられる。
【００８４】
本発明のセルラーゼは、植物細胞材料の成分の分離のために用いることができる。例えば、本発明の酵素は、グルカンに富む材料（例えば、植物細胞）から成分への分離で用いることができる。一部の態様では、本発明の酵素は、グルカンが豊富であるかまたは油分の多い作物から有益なタンパク質および油と外皮部分とに分離するために用いることができる。分離プロセスは、当技術分野で公知の方法を用いることにより行なうことができる。
【００８５】
本発明のセルラーゼは、収量を増加させるために、果実および野菜ジュース、シロップ、エキスなどの調製で用いることができる。本発明の酵素は、種々の植物細胞壁由来材料または廃棄材料（例えば穀類（cereal、grain）、ワインもしくはジュース製造、または野菜外皮、豆外皮、サトウダイコンパルプ、オリーブパルプ、ジャガイモパルプなどの農業残留物由来のもの）の酵素処理（例えば、グルカン含有植物材料の加水分解）で用いることができる。本発明の酵素は、加工済み果実または野菜の稠度および外観を変化させるために用いることができる。本発明の酵素は、食品を含む植物材料の加工を促進し、植物成分の精製または抽出を促進する目的で、植物材料を処理するために用いることができる。本発明のセルラーゼは、食料価値を改善し、水結合容量を減少させ、廃棄水生植物の分解性を向上させ、かつ/または植物材料からエンシレージ（ensilage）への転換を改善するなどのために用いることができる。本発明のセルラーゼはまた、設備清掃およびメンテナンスのためにも、果実および醸造産業で用いることができる。
【００８６】
洗剤組成物
本発明は、本発明の1種以上のポリペプチドを含む洗剤組成物ならびにそれらの組成物の製造方法および使用方法を提供する。本発明は、洗剤組成物のすべての製造方法および使用方法を組み入れ、例えば、米国特許第6,413,928号；同第6,399,561号；同第6,365,561号；同第6,380,147号を参照されたい。洗剤組成物は、一層式および二層式の水性組成物、非水性液体組成物、キャスティング固体、顆粒形態、粒子形態、圧縮錠剤、ゲルおよび/またはペーストならびにスラリー形態であり得る。本発明はまた、これらの洗剤組成物を用いた、粗洗浄食品の汚れ（gross food soil）、食品残留物の膜および他の微量の食品組成物の迅速な除去が可能な方法も提供する。本発明の酵素は、デンプン多糖の触媒的加水分解によって、デンプン質の染みの除去を促進することができる。本発明の酵素は、食器用洗剤および布地洗濯用洗剤で用いることができる。実際の活性酵素含有量は、洗剤組成物の製造方法に依存し、該洗剤溶液が所望の酵素活性を有するとすれば、重要ではない。一部の態様では、最終的な溶液中に存在するグルコシダーゼの量は、洗剤組成物1グラムあたり約0.001mg〜0.5mgの範囲である。本発明のプロセスおよび製品中での使用のために選択される特定の酵素は、物理的な製品形態、使用pH、使用温度、および分解または変更する対象の汚れ（soil）のタイプを含む最終的な利用の条件に依存する。酵素は、利用条件のいずれかの所与の設定にとって最適の活性および安定性をもたらすように選択することができる。本発明の洗剤は、カチオン性、半極性非イオン性（semi-polar nonionic）、もしくは両性イオン性界面活性剤；またはそれらの混合物を含むことができる。
【００８７】
本発明は、硬表面の清浄化用の洗剤組成物、布の清浄化用の洗剤組成物、食器洗浄用組成物、口内清浄化組成物、義歯清浄化組成物、およびコンタクトレンズ清浄化溶液を含む清浄化組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、洗浄に十分な条件下で、対象物を本発明のポリペプチドと接触させるステップを含む、対象物を洗浄するための方法を提供する。本発明のポリペプチドは、洗剤添加物として含めることができる。本発明の洗剤組成物は、例えば、本発明のポリペプチドを含む、手洗い用または洗濯機用洗剤組成物として製剤化することができる。染みになった布の前処理のために好適な洗濯用添加物が、本発明のポリペプチドを含むことができる。布柔軟化組成物が、本発明のポリペプチドを含むことができる。あるいは、本発明のポリペプチドは、一般的な家事用硬表面清浄化作業での使用のための洗剤組成物として製剤化することができる。
【００８８】
石油・ガス探査およびクリーンアップ
油井およびガス井、ならびにシェールガス貯留層の生産性を増大させるために、「水圧破砕」と呼ばれる非常に専門的な技術が徐々に用いられるようになってきている。典型的な水圧破砕作業では、大量のグアーベースの流体（ゲル状であり、「破砕流体」と称される）を、非常に高い静水圧下で裸孔に注ぎ込む。加圧された流体は、裸孔周囲の地層に新たな亀裂および裂け目をつくり出す。破砕流体に含有される砂粒子は、この新たにつくり出された裂け目へと移動して落ち着き、それらの溝を開いたままにするように機能し、したがって石油およびガス流を増大させる。砂が裂け目に堆積すると、ゲルは分解されて（すなわち、壊れて）地表に戻り、石油またはガスの流れに対するいかなる妨害物も取り除かれるようにしなければならない。破砕流体を分解し、かつ亀裂および裂け目からいかなる固体ゲル残留物も除去するために、産業では粘度破壊剤（viscosity breaker）（酸化剤、酸、および酵素など）を用いる。
【００８９】
一部の実施形態では、開示されるセルラーゼは、石油・ガス操業を増強するための高温粘度破壊剤として用いられるであろう。より具体的には、本発明の開示されるセルラーゼは、油井またはガス井で水圧破砕が行なわれる際に、破砕流体に適用されるであろう。
【００９０】
配列番号1によりコードされる酵素、ならびに本明細書中に開示される他のポリヌクレオチドによりコードされるか、または本明細書中に開示される方法により取得可能なセルラーゼは、広範なスペクトルの多糖を加水分解するために用いることができる可能性があり、それらのうちの多数が石油およびガスの掘削、破砕および井戸クリーンアップ作業で有用である。開示されるセルラーゼは、例えば、グアー、ヒドロキシプロピルグアー、カルボキシメチルグアー、カルボキシメチルヒドロキシプロピルグアー、カルボキシメチルセルロース、オオムギβ-グルカン、およびローカストビーンガムに対する、広範なスペクトルのβ-グリコシダーゼ活性を示す。酵素活性パターンは、好ましくは、エンド型およびエキソ型の両方であり、長い多糖鎖内で切断し、またポリマーの末端からも二糖単位を切断することにより、多糖（例えば、グアーおよび誘導体化グアー溶液）の効率的な粘度低下を可能にする。上述の多糖に加えて、開示される酵素の他の基質としては、直鎖型または架橋型ゲルを形成することが可能なものが挙げられる。好適な多糖基質の例としては、ガラクトマンナンガム（glactomannan gum）、グアー、誘導体化グアー、セルロースおよびセルロース誘導体、デンプン、デンプン誘導体、キサンタン、誘導体化キサンタンならびにそれらの混合物が挙げられる。具体的な例としてはまた、限定するものではないが、グアーガム、グアーガム誘導体、ローカストビーンガム、カラヤガム、キサンタンガム、セルロースおよびセルロース誘導体等も挙げられる。開示される酵素が対象とし得る典型的なポリマーまたはゲル化剤としては、グアーガム、ヒドロキシプロピルグアー、カルボキシメチルヒドロキシプロピルグアー、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ジアルキルカルボキシメチルセルロース等が挙げられる。ポリマーの他の例としては、限定するものではないが、ホスホマンナン、スクレログルカン、デキストランおよび他のタイプのポリマーが挙げられる。一部の実施形態では、ポリマー基質は、カルボキシメチルヒドロキシプロピルグアーである。一部の実施形態では、開示される酵素はまた、バイオガム（例えば、ナツメヤシシロップまたはスクロースから作製されるスクシノグリカンバイオガム）の加水分解でも有効であり得る。一部の実施形態では、開示される酵素は、セルロース含有ポリマーまたは誘導体化セルロース含有ポリマーを加水分解するために用いることができ、典型的には、該酵素は、セルロース骨格のグルコシド結合を攻撃する。開示される酵素は、一部の場合には、単糖単位間のエキソ(1,4)-β-D-グルコシド結合およびエンド(1,4)-β-D-グルコシド結合とセルロース骨格のいずれかのセロビオース断片の(1,4)-β-D-グルコシド結合を特異的に加水分解することにより、ポリマーを、大部分は単糖単位へと分解するために好適であり得る。
【００９１】
開示されるセルラーゼを用いるそれぞれの破砕業務では、現場のオペレータ（field operator）が、一般的に、産業研究所で酵素用量最適化研究を最初に行なうであろう。そのような研究は、10〜400ppmの濃度にセルラーゼを希釈すること、および直鎖型または架橋型グアーガム（25〜60lb/1000gal）と混合することを含み得る。適用条件に応じて、特に高温、高圧および高pH条件が存在する井戸に対して、グアーガムは架橋剤を用いて架橋され得る。そのような最適化研究から得られた酵素用量情報は、次に、実際の破砕業務に用いられる。
【００９２】
開示されるセルラーゼの固有の活性は、高温および高pH条件が存在する深井戸で、円滑かつ制御された様式での、グアーベースの破砕流体の加水分解を可能にする。化学的破壊剤と比較して、本発明の開示されるセルラーゼは、強烈かつ非選択的な化学的破壊剤に対して、非腐食性で環境的に無害な代替品を提供する。
【００９３】
本発明の一部の実施形態では、セルラーゼは、石油・ガス探査活動で用いられる流体を処理し、清浄化し、または変化させるために用いることができる。さらなる態様では、本発明のセルラーゼは、該流体が、さらなる石油・ガス探査活動での使用のために、または環境に優しい方法で廃棄されるために、再使用されるかまたはリサイクルできるように、該流体を、部分的もしくは完全に処理するかまたは変化させるであろう。
【００９４】
石油およびガス破砕手順を含む使用のための組成物が、本明細書中に記載される。一部の実施形態では、組成物は、ポリマー系増粘性物質と組み合わせて、超好熱性細菌由来の1種以上のセルラーゼ酵素および/または天然に存在しないその変異体を含む。一部の実施形態では、組成物は、流体損失を制御し、地層ダメージを低減し、pHを調整し、微生物増殖を制御し、および温度安定性を改善するための薬剤を含む追加成分を、任意により含むことができる。一部の典型的な追加成分としては、酸、抗細菌剤、粘土安定化剤、腐食阻害剤、架橋剤、摩擦低減剤、鉄制御剤（iron control）、スケール阻害剤、界面活性剤および熱安定化剤（例えば、チオ硫酸ナトリウム）が挙げられる。
【００９５】
一部の実施形態では、本明細書中に記載されるセルラーゼ酵素は、グルカナーゼ活性、例えば、エンドグルカナーゼ活性、マンナナーゼ活性、キシラナーゼ活性またはそれらの活性の組み合わせを有する。一部の態様では、グルカナーゼ活性は、エンドグルカナーゼ活性（例えば、エンド-1,4-β-D-グルカン4-グルカノヒドロラーゼ活性）であり、セルロース、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース）リケニン中の1,4-β-D-グリコシド結合、穀類β-D-グルカンまたはキシログルカンおよびセルロース性部分を含有する他の植物材料などの混合β-1,3-グルカン中のβ-1,4-結合の加水分解を含む。代替的な態様では、これらのグルカナーゼ（例えば、エンドグルカナーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ）は、高または低pHおよび温度での、耐熱性または熱安定性を含む増大した活性および安定性を有する。
【００９６】
一部の実施形態では、記載される酵素破壊剤は、酵素を安定化し、熱安定性およびアルカリpH耐性を向上させ、かつ制御放出を提供するために、カプセル封入することができる。加水分解的に分解するコーティングまたはメンブレンを有するカプセル封入された破壊剤は、以前には可能でなかった放出時間のよりよい制御および取扱いの容易さを可能にし得るので、先行技術の酵素破壊剤系よりも優れている可能性がある。例えば、破壊剤は、単に水中で溶解または分散するのではなく、水と反応する材料中にカプセル封入されるので、コーティングの水との反応速度を通して、放出を制御することができる。同様に、一定時間、厳しい地中条件（高温および高pH）から酵素を隔離することにより、遅延しかつ完全な粘度破壊をもたらすことができる。当業者は、利用するカプセル封入ポリマー化学に応じて、コーティングの反応速度（およびしたがって破壊剤放出プロファイル）を広範囲に変化させることができることを理解するであろう。破壊剤カプセル封入組成物および方法の例は、米国特許第5,164,099号、同第6,163,766号、同第5,373,901号、同第5,437,331号、および同第6,357,527号に提供されており、それらのそれぞれの開示は、それらに対する参照により本明細書中に組み入れられる。
【００９７】
DNA配列およびコードされるセルラーゼ配列
超好熱性細菌由来の一部のセルラーゼおよび/または天然に存在しないそれらの変異体が、PCT公開第2009/02049号に記載されており；その開示全体が、それに対する参照により本明細書中に組み入れられる。WO 2009/02049公報の明細書全体（その全体が参照により本明細書中に組み入れられる）に含まれるのは、以下に列挙したDNAおよびアミノ酸配列番号である。それらは以下を含む：
・WO 2009/02049  配列番号1、2（野生型「親」T.マリティマセルラーゼ）、本明細書中では配列番号5および6として開示されている。
・WO 2009/02049  配列番号3（野生型DNA、代わりの開始コドンを除去するために変化させてある）、本明細書中では配列番号7として開示されている。
・WO 2009/02049  配列番号6、7（「7X」組み合わせGene Site Saturation Mutagenesis（「GSSM」）突然変異）、本明細書中では配列番号8および9として開示されている。
・WO 2009/02049  配列番号8、9（「12X-6」組み合わせGSSM突然変異）、本明細書中では配列番号3および2として開示されている。
・WO 2009/02049  配列番号10、11（「13X-1」組み合わせGSSM突然変異）、本明細書中では配列番号10および11として開示されている。
・WO 2009/02049  配列番号12、13（「12X-1」組み合わせGSSM突然変異）、本明細書中では配列番号12および13として開示されている。
・WO 2009/02049  配列番号16、17（サーモトガ属の種由来の代替的セルラーゼ破壊剤）、本明細書中では配列番号14および15として開示されている。
・WO 2009/02049  配列番号18、19（「7X」トウモロコシ発現のためにコドン最適化した型のT.マリティマセルラーゼ）、本明細書中では配列番号16および17として開示されている。
・WO 2009/02049  配列番号20、21（「12X-6」トウモロコシ発現のためにコドン最適化した型のT.マリティマセルラーゼ）、本明細書中では配列番号18および19として開示されている。
【００９８】
サーモトガ・マリティマMSB8株由来のセルラーゼの野生型および進化させた変異体に関連する上記で列挙したヌクレオチドおよびアミノ酸配列に加えて、表2および実施例5に列挙されている追加の突然変異体（WO 2009/02049から、抜粋または以下で再現してある）もまた、本明細書中に記載される組成物の成分として、かつ/またはそれらの組成物の製造方法で有用であるとみなされる。
【００９９】
酵素活性アッセイ（WO 2009/02049からの実施例5）
以下の例は、例示的酵素である、WO 2009/02049で配列番号2として特定されている「親」または「野生型」タンパク質の変異体、およびそれらの活性を実証するデータを記載し；図面およびデータは参照により組み入れられる。
【０１００】
上記の表1、ならびに以下の表2および3に（一部）まとめられている通り、例えば、配列番号5（WO 2009/02049の配列番号1に対応）によりコードされる、「親」（または「野生型」）配列番号6（WO 2009/02049の配列番号2に対応）に対して特異的な残基変化を有する配列が提供される。
【０１０１】
【表２】
2015519877.tif 000004
【０１０２】
【表３】
2015519877.tif 000005
図9および図10に示す通り、変異体の耐熱性は、精製酵素を用いて、親「野生型」配列番号6（WO 2009/02049の配列番号2）、および表2の酵素変異体のサブセット（いわゆる「7X変異体」）と比較して測定した；そこに示したデータは、96℃〜100℃での、試験した例示的ポリペプチド（「親」または「野生型」配列番号6、WO 2009/02049の配列番号2の変異体）の耐熱性を表わす。これらの図面では、精製酵素を図中に示した温度で30分間加熱し、残存（耐熱性）活性を37℃で測定した。
【０１０３】
84℃〜95℃の加熱温度は、「耐熱性」変異体（「親」または「野生型」配列番号2の変異体）を若干活性化し、それにより、初期活性レベルよりも高い（すなわち、100％を超える）残存（耐熱性）活性を有せしめる（おそらくは冷却時に改善されたフォールディングによる）。そのように、残存活性は100％に対して標準化した。図9は、野生型に加えて、「10X-1」、「12X-1」、「13X-1」、「12X-6」、「11X-1」、「11X-2」および「7X」と特定される本発明の酵素に関するこれらの耐熱性試験からのデータの概略図を示し；図10は図9の一部分の「詳細」である。
【０１０４】
したがって、一態様では、開示されるセルラーゼは耐熱性および/または熱安定性であり；例えば、該酵素は95℃での2分間の後に少なくとも75％の残存活性（例えば、グルカナーゼ活性）を保持することができ；別の態様では、95℃での30分間の加熱後に100％の活性を保持する。また別の態様では、該酵素は、96℃、97℃、98℃または99℃での30分間の加熱後に100％の活性を保持する。また別の態様では、開示されるセルラーゼは、100℃での30分間の加熱後に少なくとも90％の活性を保持する。
【０１０５】
一部の実施形態では、開示されるセルラーゼによるpNP-β-D-ラクトピラノシドの酵素的加水分解を、該酵素の活性の指標として用いることができる。p-ニトロフェノールの放出を、405nmにて分光光度計により追跡することができる。405nmでの吸光度の増大は、所定の条件で標準吸光度を用いることにより、p-ニトロフェノールのマイクロモルへと変換することができる。1単位の活性は、pH7.00および80℃にて1分間の間に2mM pNP-β-D-ラクトピラノシドから0.42マイクロモルのp-ニトロフェノールを放出するのに必要な酵素量であると定義される。
【０１０６】
配列番号2（WO 2009/02049の配列番号9に対応）のセルラーゼをコードする改良されたヌクレオチド配列は、2012年3月30日出願の米国特許仮出願第61/618,610号（その開示の全体がそれに対する参照により本明細書中に組み入れられる）に開示された。配列番号2のこのセルラーゼは、サーモトガ・マリティマMSB8株由来のDNAライブラリーから単離された親セルラーゼ酵素から進化させた。開示されるセルラーゼの増強された発現は、配列番号1（下記）を生じる、以前に報告されたオープンリーディングフレームに関する14塩基の変化を含んだ。これらの変化は、コードされるタンパク質に関してサイレントである。14塩基の変化を、以下に記載する。「位置」とは、最初のコドンの最初のヌクレオチドを1と番号付けして、オープンリーディングフレーム内のヌクレオチドの番号を示す。突然変異は、以下の表記法を用いて特定される：(以前のヌクレオチド)(位置)(新たなヌクレオチド)。突然変異は、以下の通りである：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84C。
【０１０７】
開示されるセルラーゼをコードする、以前に報告されている配列と配列番号1とを区別する塩基変化は、集合的かつ個別に、同じタンパク質をコードする、以前に用いられたヌクレオチド配列よりも高レベルのタンパク質発現をもたらすオープンリーディングフレームを生じさせる。
【０１０８】
開示されるセルラーゼタンパク質（配列番号2）を発現させることができる複数の系での発現レベルを増大させるために、配列番号1を用いる。配列番号1は、向上した蓄積レベルで開示されるセルラーゼを発現させるために、いずれかの数の発現系へと導入することができる。例えば、配列番号1を、プラスミドに導入するか、または例えば、大腸菌、シュードモナス属の種（蛍光菌、シュードモナス・プチダ、緑膿菌など）、ラルストニア属の種、またはカウロバクター属の種などのいずれかの数のグラム陰性細菌系のゲノムへと安定的に形質転換することができる。同様に、バチルス属の種（枯草菌、巨大菌、バチルス・ブレビスなど）、ラクトコッカス属の種（ラクトコッカス・ラクチスなど）、ラクトバチルス属の種、ストレプトマイセス属の種（ストレプトマイセス・リビダンスなど）などのいずれかの数のグラム陽性細菌発現系へと配列番号1を導入することができる。他のグラム陰性細菌、グラム陽性細菌もしくは近縁でない真正細菌または古細菌発現系を用いて配列番号1を発現させてもよい。
【０１０９】
より具体的には、配列番号1を、その発現を生じさせるためにプラスミドに導入することができる。配列番号1を導入することができるプラスミドとしては、例えば、pQE、pET、およびpASKファミリーの大腸菌発現ベクター；pCN51 LT8、RSF1010、pWZ112T、およびpMYCファミリーのシュードモナス属発現ベクター；pBAX、pHT01、およびpHIS1525ファミリーのバチルス属発現ベクター；pIJ6021およびpIJ2460ファミリーのストレプトマイセス属発現ベクター；ならびにpNZ9530およびpNZ8148ファミリーのラクトコッカス属発現ベクターが挙げられる。これらの例は例示目的のためのものであり、配列番号1のポリヌクレオチド配列を発現させることができるベクターの完全なセットを表わすものではない。
【０１１０】
増粘性物質および他の添加剤
一部の実施形態では、ポリマー系増粘性物質は、グアー、架橋型グアー、ヒドロキシプロピルグアー、カルボキシメチルグアー、カルボキシメチルヒドロキシプロピルグアー、カルボキシメチルセルロース、オオムギβ-グルカン、およびローカストビーンガムのうちの1種以上から選択することができる。一部の実施形態では、開示されるセルラーゼの加水分解パターンは、エンド型およびエキソ型の両方であり、これは、長い多糖鎖内で切断し、またポリマーの末端から二糖単位を切断することにより、多糖（例えば、グアーおよび誘導体化グアー溶液）の効率的な粘度低下を可能にする。上述の多糖に加えて、開示される酵素の他の基質としては、直鎖型または架橋型ゲルを形成することが可能なもの（例えば、ボレート架橋グアー）が挙げられる。好適な多糖基質の例としては、ガラクトマンナンガム、グアー、誘導体化グアー、セルロースおよびセルロース誘導体、デンプン、デンプン誘導体、キサンタン、誘導体化キサンタンならびにそれらの混合物が挙げられる。具体的な例としてはまた、限定するものではないが、グアーガム、グアーガム誘導体、ローカストビーンガム、カラヤガム、キサンタンガム、セルロースおよびセルロース誘導体等も挙げられる。開示される酵素が対象とし得る典型的なポリマー系増粘性物質またはゲル化剤としては、グアーガム、ヒドロキシプロピルグアー、カルボキシメチルヒドロキシプロピルグアー、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ジアルキルカルボキシメチルセルロース等が挙げられる。ポリマーの他の例としては、限定するものではないが、ホスホマンナン（phosphomannon）、スクレログルカン（scerolglucon）、デキストランおよび他のタイプのポリマーが挙げられる。一部の実施形態では、ポリマー基質は、カルボキシメチルヒドロキシプロピルグアーである。一部の実施形態では、開示される酵素はまた、バイオガム（例えば、ナツメヤシシロップまたはスクロースから作製されるスクシノグリカンバイオガム）の加水分解でも有効であり得る。一部の実施形態では、開示される酵素は、セルロース含有ポリマーまたは誘導体化セルロース含有ポリマーを加水分解するために用いることができ、典型的には、該酵素は、セルロース骨格のグルコシド結合を攻撃する。開示される酵素は、一部の場合には、単糖単位間のエキソ(1,4)-β-D-グルコシド結合およびエンド(1,4)-β-D-グルコシド結合およびセルロース骨格のいずれかのセロビオース断片の(1,4)-β-D-グルコシド結合を特異的に加水分解することにより、ポリマーを、大部分は単糖単位へと分解するために好適であり得る。
【０１１１】
本明細書中に記載される破砕流体組成物はまた、流体損失を制御し、地層ダメージを低減し、pHを調整および/または緩衝し、微生物増殖を制御し、および温度安定性を改善するための薬剤を含む追加成分も含むことができる。架橋剤としては、ボレート、チタネート、ジルコネート、およびアルミニウム化合物が挙げられる。典型的な水圧破砕混合物は、約98％の水および砂と、酸、抗細菌剤、破壊剤（酵素または化学的/酸化的）、粘土安定化剤、腐食阻害剤、架橋剤、摩擦低減剤、ゲル化剤（増粘性物質）、鉄制御剤（iron control）、pH調整剤、スケール阻害剤および界面活性剤から選択される約2％の他の添加剤とを含む。
【０１１２】
破砕流体中の開示されるセルラーゼの性能
開示されるセルラーゼを使用するそれぞれの破砕業務では、現場のオペレータ（field operator）が、産業研究所で酵素用量最適化研究を最初に行なうであろう。開示されるセルラーゼは、10〜400ppmの濃度に希釈され、かつ、多糖ゲル形成性化合物（例えば、直鎖型または架橋型グアーガム（25〜60lb/1000gal））と混合されるであろう。適用条件に応じて、特に高温、高圧および高pH条件が存在する井戸に対して、グアーガムまたは誘導体化グアーは、多くの場合にボレート架橋剤を用いて架橋される。そのような最適化研究から得られた酵素用量情報が、実際の破砕業務に用いられるであろう。
【０１１３】
開示されるセルラーゼの固有の活性プロファイルは、高温および高pH条件が存在する深井戸で、円滑かつ制御された様式での、グアーベースの破砕流体の完全な加水分解を可能にする。化学的破壊剤と比較して、本発明の開示されるセルラーゼは、強烈かつ非選択的な化学的破壊剤に対して、非腐食性で環境的に無害な代替品を提供する。
【０１１４】
酵素破壊剤は、長年にわたって、150°F以下の温度で、例えばグアーゲルを含む多糖増粘性物質を加水分解するために用いられてきた。しかしながら、より高温（例えば、200〜250°F）および極端なpH（≧10.5）条件で機能することができる酵素破壊剤に対する業界全体の要求がある。この要求に対処するために、本発明者らは、並外れて熱安定性のセルラーゼを含む破砕流体を開発した。PCT公開第2009/02049号も参照されたく、該文献には、とりわけ、前記タンパク質および該タンパク質をコードするDNAが記載されている。親酵素から進化させた開示されるセルラーゼは、ガスシェール（gas shale）および比較的深い油井/ガス井で遭遇する極端な地中条件下で、十分に区別される性能を示すことが明らかにされている。
【０１１５】
開示されるセルラーゼは、広範囲の温度（80°Fから250°Fまで）およびpH（3.0から10.5まで）で直鎖型およびボレート架橋型グアーを効率的に破壊することができる。レオロジー試験の結果は、完全破壊を達成するために、ほんの少量（100ppm以下）しか必要とされないことを示す。酵素反応は、破砕作業中の温度およびpHの変化により引き起こすことができる。開示されるセルラーゼはまた、優良な用量応答を示し、このことは、オペレータが、酵素投入量を調整することにより理想的な粘度-時間プロファイルを生成することを可能にする。用量依存的挙動は、これが早過ぎる粘度喪失および望ましくないプロパントの目詰まり（proppant screen-out）を回避するので、非常に有益であることを証明するであろう。緩衝剤、塩、安定化剤、架橋剤などの流体添加剤の存在下でさえ、開示されるセルラーゼは有効な粘度低下に対して活性であり続ける。
【０１１６】
開示されるセルラーゼ破壊剤は、グアー中のマンノース単位同士の間のβ-1,4-グリコシド結合を特異的に標的化することにより、ゲル粘度を低下させる。炭水化物プロファイリング試験により、この酵素が、長いグアーポリマーを、ゲル再形成（gel re-healing）を排除するであろう小さな可溶性断片へと有効かつ効率的に破壊することが実証された。透水係数試験により、グアーの完全な加水分解および地層ダメージを引き起こしかつ井戸の透水係数を低下させるポリマー残留物の除去が実証される。
【０１１７】
グアー破壊反応に対する生体触媒として、マンナナーゼ活性を示す開示されるセルラーゼは、従来の酸化的化学的破壊剤に対していくつかの顕著な利点を有する。第1に、該酵素は、裸孔、地層または破砕設備に対して望ましくない反応なしに、エンドまたはエキソ-βマンナナーゼ活性を介して、長鎖グアーガムポリマーを特異的に破壊する。第2に、酵素は反応で消費されず、その寿命の間、他のグアーポリマーに対して作用し続けることができ、したがって、長時間かつ制御された破壊プロファイルを提供する。第3に、該酵素は、グアーポリマーをはるかに小さな断片へと破壊することができ、したがって、残留物がより少ないより完全なグアー破壊をもたらす。結果として、極限天然環境由来の超熱安定性セルラーゼを発見および特性決定するために、科学者による努力がなされてきた。熱水噴出孔サンプルから同定された超好熱性細菌であるサーモトガ・マリティマsp.は、エンド-マンナナーゼ活性を有するセルラーゼを有し、長鎖グアーガムのβ-1,4-結合連結多糖を特異的に切断することができる。Mathur EJ, Lam DE, “Carboxymethyl cellulase from Thermotoga maritima”、米国特許第5,962,258号（1999）、同第6,008,032号（1999）および同第6,245,547号（2001）。具体的には、この酵素は、180°Fの至適温度を示し、これはグリコシドヒドロラーゼファミリーの中の他の公知のエンド-マンナナーゼよりも著明に高い。Pereira JH, Chen ZW, McAndrew RP, Sapra R, Chhabra SR, Sale KL, Simmons BA, Adams PD, “Biochemical characterization and crystal structure of endoglucanase Cel5A from the hyperthermophilic Thermotoga maritima”, Journal of Structure Biology, 2010, 172; 372-379；Wu TH, Huang CH, Ko TP, Lai HL, Ma YH, Chen CC, Cheng YS, Liu JR, Gup RT, “Diverse substrate recognition mechanism revealed by Thermotoga maritima Cel5A structures in complex with cellotetraose, cellobiose and mannotriose”, Biochimica et Biophysica Acta, 2011, 1814; 1832-1840。
【０１１８】
示差走査熱量測定（DSC）を用いて評価されるセルラーゼの熱安定性
酵素は、その触媒機能に重要な3次元構造を有する。特定の条件（熱、変性剤、極端なpH）下では、酵素は脱フォールディングし、それらの触媒として活性な3次元構造を失う場合がある。融解温度（Tm）は、タンパク質のうちの50％が脱フォールディング状態になる温度である。このパラメータは、酵素またはタンパク質の熱安定性の評価のために広く用いられている。Tmは、示差走査熱量測定（DSC）により測定することができる。
【０１１９】
DSC試験は、セルラーゼ野生型タンパク質および選択されたセルラーゼ変異体を用いて行われた。すべてのタンパク質サンプルを、1mg/mLの濃度および1℃/分のスキャン速度で分析した。各スキャンの温度範囲は、160〜250°Fであった。加熱に際しての溶液の考えられる脱気を防ぐために、すべてのDSC実験の間、4.6atmの定圧を維持した。Tmは、利用可能なソフトウェアパッケージを用いて算出した。図7は、野生型および選択されたセルラーゼ変異体のTm結果を示す。野生型酵素と比較して、最終的なセルラーゼ候補を用いて、24°FのTm値上昇が観察された。TmはpH依存性である。変異体と野生型とのTmの差異はpH6.5で24°Fであり、該差異はpH10.5で13°Fである。
【０１２０】
化学的代理物（surrogate）を用いたセルラーゼ変異体の温度プロファイリング
その1-4結合切断活性について、種々の温度でセルラーゼ変異体をさらに評価した。分子pNP-β-D-ラクトピラノシド（図8A）を代理基質として用いた。セルラーゼによるpNP-β-D-ラクトピラノシドの酵素的加水分解は、遊離のp-ニトロフェノールを生成し、これは405nmにて分光光度計により測定することができる。図8Bは、分光光度計の温度限界である194°Fまでのセルラーゼ変異体の温度プロファイルを示す。図8Bに示される通り、このセルラーゼ変異体は、180°Fの至適温度を有する。
【０１２１】
沸点超（＞212°F）でのセルラーゼ活性を評価するために、セルラーゼ変異体の残存活性を定量的に測定するためのアッセイを開発した。それぞれ225°F、250°F、および275°Fにて10、20、および30分間の加熱チャレンジ前に、1：1の比で酵素を25lbグアー/1000gal（ppt）と混合した。その後に、3000μLの2mM pNP-B-D-ラクトピラノシドに30μLの熱処理酵素を添加し、続いて10分間、405吸光度を測定することによるpNP吸光度アッセイを用いて、加熱チャレンジした酵素の活性を測定した。図8Cは、225°F、250°F、および275°Fでのセルラーゼ変異体の残存活性を示す。酵素を10〜30分間熱処理した場合、225°Fでの堅牢なセルラーゼ活性が観察された。熱処理セルラーゼをボレート架橋グアー（25lb/1000gal）に適用した場合に、少量（20gpt）で完全なゲル破壊が観察された。セルラーゼ活性は250°Fおよび275°Fでは損なわれ、225°Fでの活性の11〜14％の相対的残存活性を有し（図8C）、このことは、小さなパーセンテージのセルラーゼは、高温（＞250°F）処理後でさえも、測定可能な触媒反応をまだ行なうことができることを示唆する。
【０１２２】
蛍光性代理物を用いたセルラーゼ変異体のpHプロファイリング
分子4-メチルウンベリフェリルβ-D-セロビオシドは、高pH条件でセルラーゼにより切断され得る代理基質である（図8A）。切断生成物である4-メチルウンベリフェロンは、365nmおよび455nmの励起および発光波長を用いて、蛍光分析により定量することができる。2ミリモルの4-メチルウンベリフェリルβ-D-セロビオシドを、9.5〜10.5の範囲のpH値を有するバッファーシステム中に溶解させた。3000μLの2mM 4-メチルウンベリフェリルβ-D-セロビオシドへの30μLのセルラーゼの添加により、様々なpH条件でのセルラーゼ活性を分光光度計で速度論的に測定した。各反応曲線の勾配は、線形曲線フィッティング（linear curve fitting）により得た。相対活性は、pH9.5で取得した結果に従って算出した。ボレート架橋グアー流体に非常に関連があるpH条件であるpH10.5では、セルラーゼは妥当な活性を示す（図9）。
【０１２３】
HPLCによるα-1,6-結合多糖ではなくβ-1,4-結合多糖の酵素的破壊の確認
マンノース糖およびガラクトース糖から構成される長鎖多糖であるグアーは、水性破砕作業での主要な増粘性物質である。ポリマンノースがβ-1,4-結合を介して長鎖骨格を形成し、ガラクトース単位はα-1,6-結合を介してマンノース単位に結合する。マンノース糖とガラクトース糖との比率は、1.6：1〜1.8：1であり得る。重要なことに、グアーのポリマンノース骨格は水に可溶性でなく、ガラクトース枝が著しく水溶性を高める。しかしながら、わずか6個の連続した枝分かれのないマンノース単位が、完全に不溶性の局所的らせん構造を形成することができることが報告されている（11）。したがって、セルラーゼがグアー分子のα-1,6-結合を切断すると、著しい量の不溶性残留物が生成される可能性がある。結果として、プロパント（proppant）パックの透水係数が損なわれ得る。
【０１２４】
セルラーゼ変異体の酵素活性が多糖のβ-1,4-グリコシド結合を特異的に標的にすることを確認するために、順相HPLC法を2種類の代理基質である1,4-β-D-マンノペンタオースおよび63,64-α-D-ガラクトシル-マンノペンタオースの分析に採用した（図10A）。3単位/mLのセルラーゼ変異体を、pH7.0にて80℃で1時間、1mg/mLの基質とともにインキュベートした。アミドカラム、移動相としてアセトニトリル（actonitrile）/H2O/トリエチルアミン、およびELSD検出器を用いて、HPLCによるマンナンオリゴ糖についてのベースライン分離を得た。図10Bは、M1、M2、M3、M4、M6を含む様々なマンナンオリゴ糖、およびガラクトース標準のHPLC溶出プロファイルを示す（M1〜M6は、マンナンオリゴ糖鎖長を表わす）。図4Cは、その構造中にβ-1,4-結合のみを有するマンナンオリゴ糖であるβ-1,4-D-マンノペンタオースが、どのようにセルラーゼ変異体により消化されるかの例を示す。HPLCプロファイルは、M1、M2およびM4の生成に加えてM3オリゴ糖の好ましい生成を含むβ-1,4-結合切断を実証し、マンナンオリゴ糖を分解する際に、セルラーゼ変異体がβ-1,4-結合を特異的に攻撃することが確認される（図10C(a)〜(b)）。一方で、β-1,4-結合およびα-1,6-結合の両方を含む化合物である63,64-α-D-ガラクトシル-マンノペンタオースについては、HPLCプロファイルは、セルラーゼ変異体がβ-1,4-結合のみを破壊し、OGGM4ピークおよび単一単位のマンノースピークを生成することを示す（図10C(a)）。参照としてガラクトースを用いると、酵素処理した63,64-α-D-ガラクトシル-マンノペンタオースからの単一単位ガラクトースについてはピークが観察されず、α-1,6-結合がマンナナーゼ（mananase）処理後に無傷のままであることが確認される（図10C(b)）。
【０１２５】
破壊剤を含む架橋型グアー流体の調製
乾燥ポリマーを水に添加し、渦をつくるのに（to generate a vortex）十分に混合器中で撹拌することにより、直鎖型グアー流体を調製した。完全な水和のために、約30分間、撹拌を継続した。水酸化ナトリウム溶液を用いてpHを調整した。架橋型流体に関しては、用いる場合には、粘土安定化剤およびクリーンアップ用界面活性剤を、グアーの完全水和後に添加した。次に、腐食剤を添加し、それに続いて酵素を添加した。架橋剤は最後に加えた。ボレート架橋剤は、活性ホウ素分子種の緩慢な溶解により、作用が遅れた。ジルコニウム架橋剤もまた、6pptで用いたセスキ炭酸塩緩衝剤の存在によって、遅延した。
【０１２６】
ボトル試験
グアーまたは架橋型グアーの瓶（jar）を、過硫酸アンモニウム（APS）またはセルラーゼ破壊剤を用いて調製した。瓶を水浴中で熟成させ、破壊のレベルを、ボトルを傾けて流体の動きを観察することにより、目視で評価した。ボトル試験は、所与の破砕流体の破壊に対する濃度、pHおよび温度の影響を評価するための迅速な方法を可能にした。該試験は定性的な性質なので、結果は示さない。
【０１２７】
レオロジー
粘度計は、400psiの窒素圧にて、50型の仕様を有する、カップおよびボブ技術（ローター1およびボブ5）を用いて、粘度を測定する。流体温度を、油浴により所望の値まで上昇させた。所望の温度に達するまでに、加熱は約20分間を要し、試験時間中はその温度を維持した。100、75、50、25、50、75、および100s-1の周期的せん断ランプを用いて、100s-1の壁せん断速度をもたらす回転速度で、継続的な粘度測定を行う。せん断ランプデータを、破砕で通常見られるより低いせん断速度での粘度の予測のために、べき乗パラメータ（n’およびK’）を算出するために用いた。
【０１２８】
図11は、180°Fにて80lb/1000ガロンの直鎖型グアー溶液を破壊する活性の範囲を表わす。セルラーゼの濃度は、200ppmで一定に保った。pHが9から11に上昇するにつれて、破壊の目立った遅延が観察され、このことは、高いpHレベルでの酵素の比較的低い活性と辻褄が合った。pH11でさえ、溶液は、酵素を含まない対照と比較して緩慢な破壊作用を示す。
【０１２９】
図12は、200°FおよびpH10.5での、ボレート架橋グアー流体についての破壊に対する酵素濃度の影響を示す。セルラーゼ投与量の増加は、より著明な粘度の破壊をもたらす。このレオロジー結果は、経時的な粘度の継続的低下を示すために、数時間行った。架橋型ゲルについて明らかに、より高濃度のグアーを含有する直鎖型ゲルに対して、より多くの酵素が必要である。50ppmセルラーゼのレベルを有する架橋型流体の粘度は架橋型流体対照のものと区別がつかなかったが、より高い酵素レベルは破壊活性を示した。
【０１３０】
重要なことに、10pptのレベルで熱安定化剤が含まれる場合には、225°FおよびpH10で酵素はまだ活性である（図13）。対照は漸進的な熱劣化を示すが、酵素は明らかに粘度の低下を加速させる。図14は、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース（CMHPG）を用いたジルコニウム架橋流体についての、225°FおよびpH10でのセルラーゼとカプセル封入過硫酸アンモニウムとの比較データを表わす。100ppmの濃度は過硫酸アンモニウムと同様の破壊プロファイルを与えるが、200ppmは粘度の即時喪失をもたらす。カプセル封入過硫酸アンモニウムは、カプセル化材料の熱分解および/またはカプセル化材料を介した拡散を通じて活性物質の一部分を放出し、それにより遅延した破壊を生じることに留意されたい。
【０１３１】
残留物分析
グアーまたは架橋型グアーの瓶（jar）を、過硫酸アンモニウムまたはセルラーゼ破壊剤のいずれかを用いて調製した。瓶を、180°Fにて一晩、水浴中で熟成させた。内容物を3000rpmで5分間遠心し、公称5ミクロンの秤量した紙を通して真空ろ過した。紙を110°Fにて一晩乾燥させ、再秤量して、回収された残留物の量を算出した。この値を、溶液中のポリマーの元の重量のパーセンテージとして表わす。残留物を含むろ紙を、続いてさらに16時間乾燥させ、水分が除去されていることを確認するために再秤量した。しかしながら、データは、追加の16時間の乾燥時間は不必要であるように見えることを示唆する。試験した流体は、pH10にて80pptの直鎖型グアーを含んでいた。セルラーゼは200および400ppmで試験し、過硫酸アンモニウムは1および5pptで用いた。
【０１３２】
結果は、驚いたことに、セルラーゼを含有する溶液が、過硫酸アンモニウムを含む対応する溶液よりも少量の残留物を有したことを示す（図15）。対照的に、酸化的破壊剤はより無秩序に切断するようであり、残留物として捕捉される、より高レベルの不溶性断片を生じる。瓶を一定温度（すなわち、180°F）でさらに長時間放置すると、酵素処理流体ではさらにまた残留物が減少するであろうが、酸化的破壊剤を含有する流体では減少しない可能性がある。過硫酸アンモニウムに関して、残留物は破壊剤の濃度に影響を受けるが、酵素濃度の感受性ははるかに低い。
【０１３３】
透水係数研究
破砕透水係数は、固定された底部ピストンを有する、改変型APIセルを用いて測定した。条件は、180°F、3000psiの閉鎖応力、2lbm/ft2のプロパント投入量（20/40メッシュオタワ砂）およびリークオフ（leakoff）に続いて約5×濃度の破砕流体であった。流体を一定温度で一晩静置し、その後に4時間のクリーンアップと、それに続く最低でも1時間のパックフローを行なった。クリーンアップは、2wt％KCl溶液を用いて、1時間ごとに、パックを通る流れとコアを通る流れとを交代させる。1時間に4％以内で安定であった最終的な透水係数の測定は、3mL/分の速度で2wt％KClを用いて行なった。保持された透水係数は、破砕流体の代わりに2wt％KClを用いて同じ条件について測定された透水係数との比較により算出した。
【０１３４】
過硫酸アンモニウムまたはセルラーゼを含む直鎖型グアーおよびホウ素架橋グアー、ならびに両方の破壊剤を用いる架橋型グアーを含む1つの試験を調査に供した。直鎖型グアーについては、過硫酸アンモニウムを用いた場合よりもセルラーゼを用いてより高いレベルの残留透水係数が達成された。同様に、カプセル封入過硫酸アンモニウムは、架橋型ボレート流体について、200ppmのセルラーゼがなしたのよりも低い残留透水係数をもたらした（図16）。セルラーゼとカプセル封入過硫酸塩との組み合わせは、いずれか一方の破壊剤のみよりもさらに高い残留透水係数を有した。しかしながら、最も高い結果は、400ppmの酵素投入量を用いて得られた。透水係数試験は一晩閉鎖して行なう（shut-in）ので、セルラーゼは超過時間にグアーの分子量を低下させることが可能である。このことは、プロパントパックについての増強された透水係数を直接的にもたらすであろう。
【０１３５】
まとめると、進化したセルラーゼ変異体は、ボレート架橋グアーゲル流体中で様々な添加剤と適合する。特に、このセルラーゼ変異体は、180〜225°Fの温度範囲および最大で10.5までのpH範囲での堅牢なグアーゲル破壊プロファイルを示す。pH限界が、より高温範囲でのボレート架橋グアー流体を用いてこの酵素を試験することを妨げる。しかしながら、225°Fの温度でジルコニウム架橋CMHPGを用いて肯定的なグアー破壊プロファイルが観察された。注目すべきことに、残留物分析から、マンナナーゼ（mannase）処理流体が、過硫酸アンモニウム処理流体よりも有意に少ない残留物を生成することが実証される。より重要なことには、セルラーゼ処理は、過硫酸アンモニウム処理がなしたよりも著しく高い残留透水係数を達成し、酵素が化学的酸化剤と比較してより完全なグアー破壊および改善された井戸条件を提供し得るという考えが確認される。さらに、セルラーゼの使用は過硫酸アンモニウムの添加と適合し、このことは、一部の油田応用で有用なはずである。
【０１３６】
用語の定義
「セルラーゼ」とは、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、および/またはオリゴメラーゼ活性を有する酵素である。
【０１３７】
「セルロース分解活性」とは、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、および/またはオリゴメラーゼ活性を有する酵素である。
【０１３８】
「コドン」とは、タンパク質に付加されるアミノ酸が何であるかを特定する3個のポリヌクレオチド配列である。
【０１３９】
「サイレント突然変異」とは、異なるアミノ酸の特定をもたらさない、コドン中の突然変異である。
【０１４０】
「オープンリーディングフレーム」とは、タンパク質中のアミノ酸の配列を特定する一連のコドンである。
【０１４１】
塩基の「位置」とは、オープンリーディングフレームの開始から、または何らかの他の参照マーカーから連続的に計数した、ポリヌクレオチド配列中の数字で表わした塩基位置である。
【０１４２】
タンパク質を「コードする」とは、そのタンパク質のアミノ酸配列を特定することを意味する。
【０１４３】
「突然変異」とは、参照と比較した、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列中の変化である。
【０１４４】
「ヌクレオチド」とは、DNA配列を構成する4種類の塩基（アデニン（A）、チミジン（T）、グアニジン（G）およびシトシン（C））のうちの1つを指す。
【０１４５】
「サーモトガ・マリティマゲノム配列」とは、GenBank登録番号AE000512により特定されるサーモトガ・マリティマMSB8株ゲノム配列を指す。
【０１４６】
所与のタンパク質についての「発現レベル」とは、細胞培養物の単位体積あたりに測定される、形質転換細胞培養物などの発現系により生成されるタンパク質の量である。
【０１４７】
所与の酵素についての「発現レベル」とは、細胞培養物の単位体積あたりに測定される、形質転換細胞培養物などの発現系により生成される酵素活性の量である。
【０１４８】
「野生型」とは、天然に取得することができるタンパク質または核酸配列を指す。
【実施例】
【０１４９】
実施例1−発現が増強された変異体の作製方法
遺伝子発現を向上させる目的で、DNAレベルで突然変異させるために、配列番号3に基づいて2種類の変異体（配列番号1および4）を設計した。設計は、遺伝子発現に影響し得る多数の因子を考慮する。当業者に公知のPCR技術を用いて、PCRプライマーに突然変異を導入した。両方の遺伝子をPCR増幅し、標準的な分子クローニング技術を用いてシュードモナス属ベクターpDOW1169（DOW AgroSciences, IN）にクローニングした。得られた発現構築物を、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）DC454（DOW AgroSciences, IN）に形質転換した。最も増強された発現を示したので、配列番号1を含む形質転換体をリードに指定した。
【０１５０】
実施例2−配列番号1、3および4を含む構築物により発現される配列番号2のポリペプチドの発現レベルを可視化するための、SDS-PAGEゲル電気泳動および非特異的タンパク質染色の使用
CriterionTMプレキャストTris-HClポリアクリルアミドゲル（Bio-rad Laboratories, Inc.）を用いて、タンパク質を分離した。ゲルを、Tris-グリシンバッファーを用いて150Vで泳動した（図1を参照されたい）。タンパク質ロード量を標準化して、各レーンに0.33 OD600の細胞からのタンパク質をロードした。SeeBlue(登録商標)染色済みタンパク質標準を用いた（Life Technologies）。非特異的色素を用いてゲルを染色し、各レーンを、約37キロダルトンの配列番号2のサイズのバンドの存在について、目視で評価した。
【０１５１】
結果は、サンプル毎に異なる蓄積レベルを有し、かつ陰性対照には存在しない、単独バンドがあることを示す。このバンドは、配列番号2に対して予想されるサイズを有する。
【０１５２】
このバンドの蓄積レベルは、配列番号3または陰性対照と比較して、配列番号1を含む構築物を保有する細胞からのタンパク質抽出物に対応するレーンで著しく高く、配列番号4についてはそれより低い程度で高かった。
【０１５３】
実施例3−変異体についての相対的発現レベルの決定方法
配列番号1、配列番号3および配列番号4遺伝子を含む核酸配列を、配列番号2のタンパク質の発現に好適な宿主細胞に形質転換した。細胞をフラスコ中で培養し、コードされたタンパク質が発現されるようにした。培養物を、設計された複合培地中で、約0.9のOD600まで、30℃、220rpmで増殖させ、0.3mM IPTG（イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド）を用いて24時間誘導した。細胞を回収し、超音波処理または80℃にて1時間の熱処理のいずれかにより溶解させた。セルラーゼ活性は、基質としてpNP-β-D-ラクトピラノシドを用いるp-ニトロフェニル（pNP）ベースのアッセイにより測定した（Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Academic Press, 1999）。活性レベルは、図2に示す通りにU/mLにて測定し、各培養物からの相対的発現レベルを決定した。
【０１５４】
結果は、配列番号1を含む構築物を保有する細胞が、配列番号4を保有するものよりも著しく高い配列番号2活性を明らかにしたこと、および配列番号1および4の両方が、配列番号3を保有する細胞よりも大きな発現タンパク質の活性量を生じさせたことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年12月2日(2014.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー系増粘性物質、界面活性剤、熱安定化剤、および超好熱性細菌由来の野生型セルラーゼまたはその突然変異体を含む酵素破壊剤を含有する組成物。
【請求項２】
前記増粘性物質が、直鎖型グアー、架橋型グアー、またはそれらの混合物を含むグアーゲルである、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記酵素破壊剤が、前記グアーゲル中のβ-1,4-グリコシド結合を特異的に加水分解する、請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
前記酵素破壊剤が、前記グアーゲル中のα-1,6-グリコシド結合を特異的に加水分解しない、請求項2に記載の組成物。
【請求項５】
前記酵素破壊剤が、約275°Fまでの温度で前記グアーゲル中のβ-1,4-グリコシド結合を加水分解するその能力を保持する、請求項2〜4のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項６】
前記酵素破壊剤が、約11までのpHで前記グアーゲル中のβ-1,4-グリコシド結合を加水分解するその能力を保持する、請求項2〜4のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項７】
前記酵素破壊剤が、
(a) 野生型セルラーゼと比較して12箇所の突然変異を含む変異型セルラーゼ；
(b) 以下の突然変異：F38Y、Y61Q、M69E、D70P、R71S、I94Q、I166V、S183R、S191A、E212P、L231V、M276A、E277S、R280G、T297P、T301Q、もしくはそれらのいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1箇所の突然変異を含む変異型セルラーゼ；
(c) 以下の突然変異：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、G39C、T40C、G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、もしくはそれらのいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1箇所の突然変異を含む、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）由来のセルラーゼ；
(d) 以下の突然変異：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、G39C、T40C、G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、もしくはそれらのいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1箇所の突然変異を含む配列番号3のヌクレオチド配列によってコードされるセルラーゼ；
(e) サーモトガ・マリティマゲノム配列と比較してそのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の発現レベルを増大させる少なくとも1箇所の突然変異を有する、サーモトガ・マリティマ由来のヌクレオチド配列によってコードされるセルラーゼ；
(f) 配列番号2のポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列によってコードされるセルラーゼであって、前記第1のヌクレオチド配列が、セルラーゼの発現レベルが第2のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のものと比較して増大するように、配列番号2をコードする第2の配列に関して突然変異されている、上記セルラーゼ；
(g) 配列番号2に対して少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％もしくは100％同一であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその断片によってコードされるセルラーゼであって、前記ヌクレオチド配列が、以下の突然変異：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、G39C、T40C、G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1箇所の突然変異を含む、上記セルラーゼ；
(h) 配列番号6、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、もしくは配列番号21のアミノ酸配列を含むセルラーゼ；または
(i) 配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、もしくは配列番号20の核酸配列によってコードされるセルラーゼ
である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項８】
前記酵素破壊剤が配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の組成物。
【請求項９】
前記酵素破壊剤が、配列番号1の核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる、請求項7に記載の組成物。
【請求項１０】
前記酵素破壊剤が、配列番号3の核酸配列によりコードされるセルラーゼである、請求項7に記載の組成物。
【請求項１１】
前記変異型セルラーゼが、少なくとも1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L、5.0g/L、6.0g/L、7.0g/L、8.0g/L、9.0g/L、10.0g/L、11.0g/L、12.0g/L、13.0g/L、14.0g/L、15.0g/L、16.0g/L、17.0g/L、18.0g/L、19.0g/L、20.0g/L、21.0g/L、22.0g/L、23.0g/L、24.0g/L、25.0g/L、26.0g/L、27.0g/L、28.0g/L、29.0g/L、30.0g/L、31.0g/L、32.0g/L、33.0g/L、34.0g/L、または35.0g/Lで発現される、請求項7〜10のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記酵素破壊剤が、野生型セルラーゼの突然変異体であり、約pH6.5にて野生型セルラーゼの融解温度よりも少なくとも20°F高く、かつ約pH10.5にて野生型セルラーゼの融解温度よりも少なくとも10°F高い融解温度を有する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１３】
β-1,4-グリコシド結合を含む多糖ゲルの粘度を低下させる方法であって、許容条件下で、セルラーゼ変異体が該多糖ゲル中のβ-1,4-グリコシド結合を加水分解することを可能にするのに十分な時間、該多糖ゲルをセルラーゼ変異体と接触させて、それにより、多糖ゲルの粘度を低下させるステップを含み、該セルラーゼ変異体は超好熱性細菌由来であり、かつ、該セルラーゼ変異体は、野生型セルラーゼと比較して増大した温度およびpH耐性を示す、上記方法。
【請求項１４】
前記多糖ゲルが、直鎖型グアー、架橋型グアー、またはそれらの混合物を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記許容条件が、
(a)約180°F〜約275°Fの温度範囲、(b)約9〜約11のpH範囲、またはその双方、を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
地下層を処理する方法であって、多糖ゲルおよびセルラーゼ変異体を含む破砕流体を地下層に導入するステップ；ならびに許容条件下で、セルラーゼ変異体が該多糖ゲル中のβ-1,4-グリコシド結合の少なくとも一部を加水分解するが、α-1,6-グリコシド結合を加水分解しないことを可能にするのに十分な時間、該多糖ゲルと該セルラーゼ変異体とを反応させて、それにより低粘度破砕流体を生成させるステップを含み；該セルラーゼ変異体は超好熱性細菌由来であり、かつ、該セルラーゼ変異体は、野生型セルラーゼと比較して増大した温度およびpH耐性を示す、上記方法。
【請求項１７】
前記セルラーゼ変異体により生成された低粘度破砕流体は、化学的破壊剤により生成された同等な低粘度破砕流体よりも少ない残留物を含み、セルラーゼ変異体および化学的破壊剤の投入量が、実質的に同じ粘度低下をもたらす、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記セルラーゼ変異体が、
(a) 野生型セルラーゼと比較して12箇所の突然変異を含む変異型セルラーゼ；
(b) 以下の突然変異：F38Y、Y61Q、M69E、D70P、R71S、I94Q、I166V、S183R、S191A、E212P、L231V、M276A、E277S、R280G、T297P、T301Q、もしくはそれらのいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1箇所の突然変異を含む変異型セルラーゼ；
(c) 以下の突然変異：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、G39C、T40C、G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、もしくはそれらのいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1箇所の突然変異を含む、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）由来のセルラーゼ；
(d) 以下の突然変異：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、G39C、T40C、G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、もしくはそれらのいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1箇所の突然変異を含む配列番号3のヌクレオチド配列によってコードされるセルラーゼ；
(e) サーモトガ・マリティマゲノム配列と比較してそのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の発現レベルを増大させる少なくとも1箇所の突然変異を有する、サーモトガ・マリティマ由来のヌクレオチド配列によってコードされるセルラーゼ；
(f) 配列番号2のポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列によってコードされるセルラーゼであって、前記第1のヌクレオチド配列が、セルラーゼの発現レベルが第2のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のものと比較して増大するように、配列番号2をコードする第2の配列に関して突然変異されている、上記セルラーゼ；
(g) 配列番号2に対して少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％もしくは100％同一であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその断片によってコードされるセルラーゼであって、前記ヌクレオチド配列が、以下の突然変異：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、G39C、T40C、G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、もしくはそれらのいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1箇所の突然変異を含む、上記セルラーゼ；
(h) 配列番号2、配列番号6、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、もしくは配列番号21のアミノ酸配列を含むセルラーゼ；または
(i) 配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、もしくは配列番号20の核酸配列によってコードされるセルラーゼ
である、請求項13〜17のいずれか1項に記載の方法。
【国際調査報告】
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