(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つの水溶性活性成分と、１つまたは複数の植物タンパク質と、１つまたは複数の大豆可溶性多糖とを含むナノゲル組成物に関する。これらの組成物は食品、飲料、動物飼料および／または化粧品の富化および／または強化のために使用することができ、活性成分の安定化を可能にし得る。また本発明は、このようなナノゲル組成物の調製方法にも言及する。本発明はさらに、本組成物を飲料の成分と混合することによる、飲料の製造方法に言及する。また本発明は、この方法によって得ることができる飲料にも言及する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）組成物の乾燥重量を基準として０．１〜５重量％の、アスコルビン酸、ビオチン、葉酸、ニコチン酸、チアミン、およびビタミンＢ６から選択される少なくとも１つの水溶性活性成分と、
ｂ）組成物の乾燥重量を基準として９〜４０重量％の、食品用途に適したタンパク質の群から選択される１つまたは複数の植物タンパク質と、
ｃ）組成物の乾燥重量を基準として５０〜９０重量％の、１つまたは複数の大豆可溶性多糖と
を含むナノゲル組成物であって、乾燥物質の組成を基準として前記タンパク質の前記多糖に対する重量比が１：ｂであるように選択されるが、ただしｂが１〜６に含まれることを条件とするナノゲル組成物。
【請求項２】
前記水溶性活性成分が葉酸である、請求項１に記載のナノゲル組成物。
【請求項３】
前記１つまたは複数の植物タンパク質が、大豆タンパク質、ルピナスタンパク質、エンドウ豆タンパク質およびジャガイモタンパク質からなる群から選択される、請求項１または２に記載のナノゲル組成物。
【請求項４】
前記１つまたは複数の植物タンパク質が大豆および／またはエンドウ豆タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノゲル組成物。
【請求項５】
動的光散乱により測定される場合の平均粒径が１２０〜２５０ｎｍである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
アスコルビン酸、ビオチン、葉酸、ニコチン酸、チアミン、およびビタミンＢ６から選択される少なくとも１つの水溶性活性成分を含有する安定ナノゲルの製造方法であって、以下のステップ：
Ｉ）ｐＨ約７．４の溶液としての１つまたは複数の大豆可溶性多糖と、アスコルビン酸、ビオチン、葉酸、ニコチン酸、チアミン、およびビタミンＢ６から選択される少なくとも１つの水溶性活性成分の溶液と、植物タンパク質の溶液とを水中で混合するステップであって、大豆タンパク質の濃度が１〜１０ｇ／ｌであり、前記タンパク質の前記多糖に対する重量比が１：１〜１：６であり、前記水溶性活性成分の濃度が０．００１〜０．２ｇ／ｌであるステップと、
ＩＩ）任意選択で、前記ステップＩ）の混合物を１分間〜８時間攪拌するステップと、
ＩＩＩ）前記ステップＩ）またはＩＩ）からの混合物のｐＨをｐＨ約４に調整し、２〜３時間後にｐＨ調整を繰り返すステップと、
ＩＶ）当業者に知られている従来の均質化プロセスにより前記ステップＩＩＩ）の混合物を均質化した後、９０℃で１時間加熱するステップと、
Ｖ）７０〜９５℃に含まれる温度で少なくとも４５分間、前記ナノゲルを加熱するステップと
ＶＩ）任意選択で、前記ステップＶ）の得られたナノゲルを乾燥させるステップと
を含む方法。
【請求項７】
前記植物タンパク質の濃度が４〜６ｇ／ｌである、請求項６に記載の安定ナノゲルの製造方法。
【請求項８】
前記タンパク質の前記多糖に対する重量比が１：２〜１：４である、請求項６または７に記載の安定ナノゲルの製造方法。
【請求項９】
前記活性成分の濃度が０．０１〜０．１５ｇ／ｌである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の安定ナノゲルの製造方法。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるナノゲル。
【請求項１１】
前記植物タンパク質が大豆タンパク質またはエンドウ豆タンパク質であり、前記活性成分が葉酸である、請求項１０に記載のナノゲル。
【請求項１２】
食品、飲料、動物飼料、化粧品組成物の富化および／または強化のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノゲル組成物の使用。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノゲル組成物を、さらなる通常の飲料成分と混合するステップを含む、飲料の製造方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法によって得ることができる飲料。
【請求項１５】
前記飲料のｐＨが３〜５．５である、請求項１４に記載の飲料。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの水溶性活性成分と、１つまたは複数の植物タンパク質と、１つまたは複数の大豆可溶性多糖とを含むナノゲル組成物に関する。これらの組成物は食品、飲料、動物飼料および／または化粧品の富化および／または強化のために使用することができ、活性成分の安定化を可能にし得る。また本発明は、このようなナノゲル組成物の調製方法にも言及する。本発明はさらに、本組成物を飲料の成分と混合することによる、飲料の製造方法に言及する。また本発明は、この方法によって得ることができる飲料にも言及する。
【０００２】
水溶性活性成分（例えば、葉酸）を含有する食品、飲料、動物飼料または化粧品を富化または強化するための組成物は、当該技術分野において知られている（Ｓ．Ｍ．Ｌｏｐｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｖｉｔａｅ  １６，ｐ５５−６５）。アルギン酸ビーズは実験室規模で調製するのが容易であり、それは穏やかなヒドロゲル化プロセスであり、食品配合物への使用が比較的安全であるために、葉酸塩のマイクロカプセル化において使用されている（Ｋ．Ｋａｓｉｐａｔｈｙ，２００８，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｆｏｏｄｓ  ａｎｄ  ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １３，ｐ．３３１−３４１）。しかしながら、アルギン酸マイクロカプセルは葉酸の漏出に通じる多孔性を有し、光にさらされたとき、そして飲料に特有の酸性条件（ｐＨ３〜５）下で、中程度の葉酸の安定性を有する。実際、葉酸は、紫外線放射に暴露されたときに不安定なこと（Ｃ９−Ｎ１０結合の切断）でよく知られている。さらに、葉酸は、ｐＨ２〜４の範囲の酸性飲料のｐＨ範囲において溶解し難い。
【０００３】
従って、上記の問題を示さない、食品、飲料、動物飼料、または化粧品の富化および／または強化のための水溶性活性成分を含む組成物が依然として必要とされている。
【０００４】
従って、本発明の目的は、上記のような所望の特性、例えば、酸性ｐＨ（３〜５）における活性成分の安定性、光にさらされたときの活性成分の安定性（光安定性）、および飲料において使用される場合の光学的透明度に関して非常に良好な特性を有する水溶性活性成分の組成物を提供することであった。また、水溶性活性成分の組成物の調製方法を改善することも本発明の目的であった。
【０００５】
この目的は、
ａ）組成物の乾燥重量を基準として０．１〜５重量％の、アスコルビン酸、ビオチン、葉酸、ニコチン酸、チアミン、およびビタミンＢ６から選択される少なくとも１つの水溶性活性成分と、
ｂ）組成物の乾燥重量を基準として９〜４０重量％の、食品用途に適したタンパク質の群から選択される１つまたは複数の植物タンパク質と、
ｃ）組成物の乾燥重量を基準として５０〜９０重量％の、１つまたは複数の大豆可溶性多糖と
を含むナノゲル組成物によって解決されており、乾燥物質の組成を基準としたタンパク質の多糖に対する重量比は１：ｂであるように選択されるが、ただしｂは１〜６に含まれることを条件とする。
【０００６】
本発明における「ナノゲル」という用語は、架橋された親水性ヘテロポリマーネットワーク（ヒドロゲル）で構成されたナノ粒子を指す。
【０００７】
本発明に従う組成物に適した水溶性活性成分は、４〜６の範囲のｐＫａを有する水溶性活性成分であり、好ましくは、アスコルビン酸（ビタミンＣ、ｐＫａ４．１７）、ビオチン（ビタミンＢ８、ｐＫａ５．３３）、葉酸（ビタミンＢ９、ｐＫａ４．７）、ニコチン酸（ナイアシンまたはビタミンＢ３、ｐＫａ４．９）、チアミン（ビタミンＢ１、ｐＫａ４．８）、ビタミンＢ６（ｐＫａ５．３３）、およびこれらの混合物から選択される。本発明の実施形態全てに対して最も好ましい水溶性活性成分は葉酸である。
【０００８】
本発明によると、好ましい植物タンパク質は、大豆、ルピナス（例えば、Ｌ．アルブス（Ｌ．ａｌｂｕｓ）、Ｌ．アングスチフォリウス（Ｌ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）またはこれらの変種）、エンドウ豆および／またはジャガイモに由来する。タンパク質は、果実（例えば、大豆の豆のような）、種子（調理または加工された種子を含む）などを含む植物の任意の部分から、あるいは全粒粉または脱脂製品、例えば断片、フレークなどから単離され得る。
【０００９】
本発明の組成物のために、特に好ましいのは大豆およびエンドウ豆タンパク質であり、さらにより好ましくは、大豆タンパク質は「酸可溶性の大豆タンパク質」（６０重量％以上のタンパク質含量を有するＳｏｙａｓｏｕｒ  ４０００Ｋ）である。最も好ましいのは、８０重量％以上のタンパク質含量、７．５重量％以下の水分、１．５重量％以下の脂肪、ｐＨ３．６〜６．４を有するＳｏｙａｓｏｕｒ  ４０００Ｋである。これは、Ｊｉｌｉｎ  Ｆｕｊｉ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．から供給され得る。好ましいエンドウ豆タンパク質の供給元は、Ｃｏｓｕｃｒａ  ＳＡ（Ｗａｒｃｏｉｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）である。
【００１０】
本明細書で使用される場合の「大豆可溶性多糖」という用語は、６０重量％以上の多糖含量を有する大豆可溶性多糖を指す。最も好ましい大豆可溶性多糖は、７０重量％以上の多糖含量、１０重量％以下のタンパク質、１重量％以下の脂肪、８重量％以下の水分、８重量％以下の灰分、および３〜６に含まれるｐＨを有する大豆可溶性多糖である。これは、Ｆｕｊｉ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から供給され得る。
【００１１】
本発明に従う組成物のために、乾燥物質の組成を基準としたタンパク質の多糖に対する重量比は１：ｂであるように選択するが、ただしｂは１〜５に含まれることが好ましく、特に好ましくはｂは２〜４に含まれ、さらにより好ましくは、ｂは３である。
【００１２】
本発明の特に好ましい実施形態では、動的光散乱により測定される場合、ナノゲルの平均粒径は１２０〜２５０ｎｍである。
【００１３】
また本発明は、以下のステップ：
Ｉ）ｐＨ約７．４の溶液としての１つまたは複数の大豆可溶性多糖と、アスコルビン酸、ビオチン、葉酸、ニコチン酸、チアミン、およびビタミンＢ６から選択される少なくとも１つの水溶性活性成分の溶液と、植物タンパク質の溶液とを水中で混合するステップであって、大豆タンパク質の濃度が１〜１０ｇ／ｌであり、タンパク質の多糖に対する重量比が１：１〜１：６であり、水溶性活性成分の濃度が０．０２〜０．２ｇ／ｌであるステップと、
ＩＩ）任意選択で、ステップＩ）の混合物を１分間〜８時間攪拌するステップと、
ＩＩＩ）ステップＩ）またはＩＩ）からの混合物のｐＨをｐＨ約４に調整し、２〜３時間後にｐＨ調整を繰り返すステップと、
ＩＶ）当業者に知られている従来の均質化プロセスによりステップＩＩＩ）の混合物を均質化した後、９０℃で１時間加熱するステップと、
Ｖ）７０〜９５℃に含まれる温度で少なくとも４５分間、ナノゲルを加熱するステップと、
ＶＩ）任意選択で、ステップＶ）の得られたナノゲルを乾燥させるステップと
を含む、上記のような安定ナノゲル組成物の製造方法（本方法は、本明細書において指定される量の成分を用いて実行することができる）にも関する。
【００１４】
本発明によると、好ましいタンパク質は、上記のような植物タンパク質である。
【００１５】
好ましい実施形態では、植物タンパク質の濃度は４〜６ｇ／ｌである。タンパク質の多糖に対する好ましい重量比は１：２〜１：４であり、さらにより好ましくは１：３である。水溶性活性成分の濃度は、好ましくは、０．０１〜０．１５ｇ／ｌであり、好ましい水溶性活性成分は葉酸である。
【００１６】
ステップＩＩＩ）において繰り返されるｐＨ約４へのｐＨ調整は、食品において許可されている任意の酸によって実施することができ、好ましくは塩酸が使用される。
【００１７】
ステップＩＶ）の均質化は、超音波処理または高圧均質化のような当業者に知られている任意の均質化プロセスによって実施することができる。
【００１８】
超音波処理は液体中で交互の低圧および高圧波を発生し、小さい真空泡の形成および激しい崩壊をもたらす。キャビテーションと呼ばれるこの現象は、圧縮、加速、圧力降下、および衝撃と組み合わされて高速衝突液体ジェットおよび強力な流体力学的せん断力を生じ、製品全体にわたって粒子および分散体の崩壊が生じると共に、反応物の混合が生じる（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８３，Ｖｏｌ  １，Ｐ．Ｗａｌｓｔｒａ，ｐａｇｅ  ５７，Ｅｄ  Ｐ．Ｂｅｃｈｅｒ，ＩＳＢＮ：０−８２４７−１８７６−３）。
【００１９】
高圧均質化プロセスの場合、混合物は均質化バルブ内の間隙を通過され、これは、圧縮、加速、圧力降下、および衝撃と組み合わされて高乱流およびせん断の条件を形成し、製品全体にわたって粒子および分散体の崩壊が生じる。粒子のサイズは、プロセス中で使用される動作圧力と、選択される間隙のタイプとに依存する（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄａｉｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，Ｈ．Ｇ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｅｄ  Ａ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，ＩＳＢＮ３−９８０２３７８−５−０）。
【００２０】
本発明を実行するために最も好ましい均質化は、ナノエマルションを製造するためのこの技術の効率およびハイスループットを考慮して、（Ｄｏｎｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２０１０，５８：１０６５３−１０６６０）に従う高圧均質化である。より好ましくは、５００〜７００バールで少なくとも１分間、さらにより好ましくは６００バールで少なくとも２分間実施される。
【００２１】
ステップＶ）のナノゲルはそのままで使用されてもよいし、後で使用するために乾燥されてもよい。乾燥ステップは、当業者に知られている任意の従来の乾燥プロセスにより実行され得るが、好ましいのは、スプレー乾燥および／またはパウダーキャッチプロセス（スプレーされた懸濁液滴がデンプンまたはケイ酸カルシウムまたはケイ酸または炭酸カルシウムまたはこれらの混合物などの吸着剤床内に捕捉され、その後乾燥される）である。
【００２２】
また本発明は、上記のプロセスによって得ることができるナノゲルにも関し、好ましくは、植物タンパク質は大豆またはエンドウ豆タンパク質であり、水溶性活性成分は葉酸である。
【００２３】
また本発明は、食品、飲料、動物飼料および／または化粧品の富化および／または強化のため、好ましくは、飲料、さらにより好ましくは酸性飲料（ｐＨ３〜５）の富化および／または強化のための、上記のようなナノゲルの使用にも関する。
【００２４】
本発明のその他の態様は、上記のような組成物を含有する食品、飲料、動物飼料、化粧品である。
【００２５】
本発明の製品形態を添加剤成分として使用することができる飲料は、炭酸飲料、例えば、フレーバーセルツァ―水、ソフトドリンクまたはミネラルドリンク、ならびに非炭酸飲料、例えば、フレーバー水、果実ジュース、フルーツポンチおよびこれらの飲料の濃縮形態であり得る。これらは、天然果実もしくは野菜ジュースまたは人工フレーバーに基づくことができる。また、アルコール飲料およびインスタント飲料粉末も含まれる。加えて、糖含有飲料、ノンカロリーおよび人口甘味料を含むダイエット飲料も含まれる。
【００２６】
さらに、天然源または合成から得られる乳製品も、本発明の製品形態を栄養成分として使用することができる食品の範囲内に入る。このような製品の典型的な例は、ミルクドリンク、アイスクリーム、チーズ、ヨーグルトなどである。豆乳ドリンクなどの代用乳製品および豆腐製品もこの用途の範囲内に含まれる。
【００２７】
また、菓子製品、キャンディ、ガム、デザート、例えば、アイスクリーム、ゼリー、プディング、インスタントプディング粉末などの、本発明の製品形態を添加剤成分として含有する甘味も含まれる。
【００２８】
また、本発明の製品形態を着色剤または栄養成分として含有するシリアル、スナック、クッキー、パスタ、スープおよびソース、マヨネーズ、サラダドレッシングなども含まれる。さらに、乳製品およびシリアルのために使用される果実調製物も含まれる。
【００２９】
本発明の組成物を介して食品に添加される１つまたは複数の水溶性活性成分（好ましくは、葉酸）の最終濃度は、好ましくは、食品組成物の全重量を基準として、そして強化すべき特定の食品および意図される強化レベルに応じて、０．１〜５０ｐｐｍ、特に１〜３０ｐｐｍ、より好ましくは３〜２０ｐｐｍ、例えば約６ｐｐｍであり得る。
【００３０】
本発明の食品組成物は、好ましくは、本発明の組成物の形態の水溶性活性成分を食品に添加することによって得られる。食品の強化のために、本発明の組成物は、水分散性の固体製品形態の適用のためにそれ自体知られている方法に従って使用することができる。
【００３１】
一般に、組成物は、水性保存溶液、乾燥粉末混合物、または特定の用途に従う他の適切な食品成分とのプレブレンドのいずれかで添加され得る。混合は、例えば、最終用途の配合に応じて乾燥粉末ブレンダー、低せん断ミキサー、高圧ホモジナイザーまたは高せん断ミキサーを用いて行うことができる。容易に明らかになるように、このような専門的な事項は、専門家の技能の範囲内である。
【００３２】
また本発明は、本発明に従う組成物を均質化するステップと、水溶性活性成分含量に基づいて１〜５０ｐｐｍ、好ましくは５ｐｐｍのエマルションをさらなる通常の飲料成分と混合するステップとを含む飲料の製造方法にも関する。
【００３３】
さらに、本発明は、上記の飲料の製造方法によって得ることができる飲料に関する。好ましくは、飲料は、２〜８、より好ましくは３〜５．５に含まれるｐＨを有する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】限外ろ過後の個々のタンパク質（Ａｓｓｐ）、個々の多糖（ＳＳＰ）およびタンパク質／多糖複合体ナノゲル（Ｎｐｓ）溶液のＵＶスペクトルを示す。
【図２】ｐＨ７．４における葉酸／タンパク質／多糖ナノゲル、葉酸／多糖ナノゲル、および葉酸／タンパク質ナノゲルから放出された葉酸のＵＶスペクトルを示す。放出された葉酸を限外ろ過により単離した。直接ｐＨ７．４で調製した葉酸溶液を対照として使用した。
【００３５】
本発明は、限定を意図しない以下の実施例によってさらに説明される。
【００３６】
［実施例］
［実施例１：葉酸と、大豆タンパク質、大豆多糖、または大豆タンパク質／大豆多糖複合体ナノゲルとのｐＨ７．４における相互作用］
大豆タンパク質は、Ｊｉｌｉｎ  Ｆｕｊｉ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．から得られ（Ｓｏｙａｓｏｕｒ  ４０００Ｋ、酸可溶性大豆タンパク質、ＡＳＳＰ）、タンパク質含量は８８％（乾燥基準）である。これは、およそｐＨ４．７の等電点を有する。７０〜８０重量％の多糖を有する大豆可溶性多糖（ＳＳＰ）は、Ｆｕｊｉ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から供給された。
【００３７】
葉酸の溶解度を考慮して、ｐＨ７．４における相互作用を調査した。個々のタンパク質溶液、個々の多糖溶液、およびタンパク質／多糖複合体ナノゲル溶液を初めにｐＨ７．４に調整した。次に、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解した葉酸を添加し、混合物を室温で一晩、攪拌下でインキュベートした。混合物中の最終タンパク質濃度は４ｍｇ／ｍｌであり、多糖濃度は１２ｍｇ／ｍｌであった。高流量限外ろ過膜（カットオフ分子量３ｋＤａ、ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３，Ｍｉｌｉｉｐｏｒｅ）により、混合物中の遊離葉酸を単離し、限外ろ過液中に捕集した。また個々の葉酸溶液を限外ろ過膜に通過させた。限外ろ過液中の９７％の葉酸（表１）により、葉酸の回収が確認される。個々のタンパク質、個々の多糖、およびタンパク質／多糖複合体ナノゲル溶液も限外ろ過膜を通過させた。これらの限外ろ過液のＵＶスペクトル（図１）はＵＶ領域において吸光度を示し、限外ろ過液中の少量のペプチドが示される。限外ろ過液中のＦＡ濃度は、限外ろ過液の２８０ｎｍ吸光度から図１に示される２８０ｎｍｍｐ吸光度を差し引くことによって計算した。表１は、ｐＨ７．４において、ＦＡの約１０％がタンパク質またはナノゲルに結合し、葉酸は多糖にほとんど結合しないことを示す。
【００３８】
【表１】
2015529448.tif 000002
【００３９】
［実施例２：葉酸と、大豆タンパク質、大豆多糖、または大豆タンパク質／大豆多糖複合体ナノゲルとのｐＨ４における相互作用］
ナノゲルは、ｐＨ４において比較的疎水性であり、ピレン蛍光を特徴とし、葉酸もｐＨ４において疎水性化合物である。従って、ナノゲルは疎水性相互作用によって葉酸に結合し得る。ｐＨ依存性の溶解度を考慮して、以下のような３つの異なる方法で、葉酸を重量比１：３のナノゲル溶液に添加した。
（１）重量比１：３のナノゲル溶液をｐＨ７．４に調整し、次に、最終の葉酸濃度１ｍＭ、タンパク質濃度４ｍｇ／ｍｌ、および多糖濃度１２ｍｇ／ｍｌに達するように固体葉酸を添加した。一晩攪拌して葉酸を溶解させた後、混合物はｐＨ４．０に変化した。
（２）葉酸を１０ｍＭのｐＨ７．４リン酸緩衝液中に溶解させた。葉酸濃度０．２５、０．５、または１ｍＭに達するように、葉酸溶液をｐＨ４．０のナノゲル溶液に液滴状で添加した後、一晩攪拌した。混合物のｐＨは約４．０であった。
（３）葉酸を１０ｍＭのｐＨ７．４リン酸緩衝液中に溶解させた。ナノゲル溶液をｐＨ７．４に調整した。葉酸濃度０．１、０．５、または１ｍＭに達するように葉酸溶液をナノゲル溶液と混合し、一晩攪拌した後、混合物のｐＨを４．０に調整した。
【００４０】
上記の混合物全てについて、ｐＨ４．０において、短期間の貯蔵後に葉酸の黄色の沈殿物が出現した。葉酸と個々のタンパク質および個々の多糖との混合物の場合も同じ黄色の沈殿物が観察された。個々のタンパク質の場合、上澄みは黄色を示すが、他方は無色である。これらの結果によって、ｐＨ４．０において、タンパク質は葉酸の一部を結合／安定化することができ、ナノゲルおよび大豆多糖はほとんど葉酸を結合／安定化できないことが示された。
【００４１】
［実施例３：葉酸／大豆タンパク質／大豆多糖ナノゲルの調製］
大豆タンパク質はｐＨ４において葉酸の一部と結合することができるがナノゲルはできないので、葉酸と、タンパク質および多糖とをｐＨ７．４で混合した後、ｐＨ調整、高圧均質化、および加熱を行うことによって、葉酸／タンパク質／多糖ナノゲルを調製した。以下は調製の詳細である：５０ｍｇ／ｍｌの濃度の７．８８ｇの大豆多糖溶液を５ｍｌの水中に添加した後、６．２５ｍｌの１ｍＭのｐＨ７．４葉酸溶液および２０ｍｇ／ｍｌの濃度の６．２５ｍｌの大豆タンパク質溶液を攪拌下で添加した。混合物中、最終タンパク質濃度は５ｍｇ／ｍｌであり、多糖濃度は１５ｍｇ／ｍｌであり、葉酸濃度は０．２５ｍＭであり、体積は２５ｍｌであった。混合物のｐＨを４．０に調整し、３時間の攪拌後、ｐＨを再度４．０に調整した。６００バールで２分間の高圧均質化によって混合物を均質化してから、９０℃で１時間加熱して、葉酸カプセル化大豆タンパク質／大豆多糖ナノゲルを得た。またこの方法を用い、個々のタンパク質および個々の多糖を使用して葉酸／タンパク質ナノゲルおよび葉酸／多糖ナノゲルも調製した。
【００４２】
得られた葉酸／タンパク質／多糖ナノゲル溶液、葉酸／タンパク質ナノゲル溶液、および葉酸／多糖ナノゲル溶液をｐＨ７．４に変化させ、葉酸をナノゲルから放出させた。放出された葉酸を限外ろ過により単離した。限界ろ過液中の葉酸濃度を上記のように測定し、直接ｐＨ７．４で調製した０．２５および０．５ｍＭの葉酸溶液を対照として使用した。図２の結果は、混合、ｐＨ調整、均質化、および加熱プロセス後に葉酸スペクトルが変化しないことを示す。タンパク質またはナノゲルを含有する混合物については強度が低下し、葉酸がｐＨ７．４で結合する（表１）、すなわち、約１０％のＦＡがタンパク質およびナノゲルと結合するという結果に一致する。
【００４３】
［実施例４：葉酸／大豆タンパク質／大豆多糖ナノゲルの安定性］
動的光散乱（ＤＬＳ）を実施して、ｐＨ４．０における葉酸／タンパク質／多糖ナノゲルのサイズを測定した。表２のデータは、０．２５および０．５ｍＭの葉酸濃度を有するナノゲルが、葉酸を含まないナノゲルと同様のサイズを有することを示す。１か月の貯蔵の後、ナノゲルはその大きさが変化しない。
【００４４】
【表２】
2015529448.tif 000003
【００４５】
［実施例５：葉酸／大豆タンパク質／大豆多糖ナノゲルにおける葉酸のＵＶ分解からの保護］
上記のように、葉酸はＵＶ線放射に対して感受性がある。分子内蛍光消光のために、葉酸は、約０．００５の極めて低い蛍光量子収率を有する。葉酸分子内のＣ９−Ｎ１０結合の切断後に形成されるプテリンは、４４５ｎｍ付近に増大した蛍光ピークを有する。６−ホルミルプテリン（ＦＰＴ）の蛍光量子収率はほぼ０．１であり、プテリン−６−カルボン酸（ＰＣＡ）は約０．２である。Ｃ９−Ｎ１０結合の切断の結果としてのＦＰＴの形成と、その後のＦＰＴからＰＣＡへの光誘起転換とによって、４４５ｎｍの領域の蛍光が増大する［Ｍ．Ｋ．Ｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８０（２００５）４７−５５］。
【００４６】
この研究では、葉酸のＵＶ分解を調査した。０．２５または０．５ｍＭの葉酸を含有するｐＨ４．０の葉酸／タンパク質／多糖ナノゲル溶液を７ｍｌのガラスビンに入れ、ＵＶラジオメータ（５００ｗ、ピークλ＝３６５ｎｍ）から３０ｃｍの距離に１時間置いた。０．２５または０．５ｍＭのＦＡ濃度で１０ｍＭのｐＨ７．４リン酸緩衝液中に溶解した個々の葉酸も調査した。５ｍｇ／ｍｌのタンパク質および０．２５ｍＭの葉酸のｐＨ７．４の混合物、ならびに１５ｍｇ／ｍｌの多糖および０．２５ｍＭの葉酸のｐＨ７．４の混合物も調査した。ＵＶ放射の後、葉酸／タンパク質／多糖ナノゲル溶液をｐＨ７．４に調整して、葉酸を放出させた。溶液中の放出された葉酸を限外ろ過により単離し、以下に記載されるように分析した。０．２５および０．５ｍＭの葉酸についてそれぞれ１０倍および２０倍希釈した後、３４８ｎｍで励起された限界ろ過液の４５０ｎｍの蛍光強度を測定した。葉酸分解の調査のためのサンプルは全て任意のアジ化ナトリウムを含有しない。
【００４７】
表３は、ＵＶ線放射の前後の葉酸の蛍光強度比を示す。個々の葉酸溶液について、ＵＶ線放射の後、４５０ｎｍにおける蛍光強度は、葉酸濃度が０．２５および０．５ｍＭである場合にそれぞれ８９および８５倍増大する。ＵＶ線放射後の蛍光強度の平均８７倍の増大は、ガラスビン内部の葉酸の分解を示す。０．２５から０．５ｍＭへの葉酸濃度の増大は分解に有意な影響を与えない。ｐＨ７．４において、個々のタンパク質は葉酸の約１０％にしか結合することができず、個々の多糖は葉酸と結合することができない（表１）が、表３の結果は、個々のタンパク質および個々の多糖が葉酸の分解を大きく低減し得ることを示す。個々の葉酸と比較して、ｐＨ７．４において、多糖およびタンパク質の存在下では葉酸の分解はそれぞれ３０％および２２％に低減する。葉酸／タンパク質／多糖ナノゲルは、ｐＨ４．０において葉酸を分解から有効に保護することができ、同じＵＶ線放射の後、負荷された葉酸の１２％しか分解しなかった。我々は、１か月の貯蔵後の葉酸／タンパク質／多糖ナノゲルも調査した。新しく調製された葉酸／タンパク質／多糖ナノゲルと比較して、葉酸が放出および単離された後の葉酸の蛍光強度は変化しない。葉酸／タンパク質／多糖ナノゲルから放出および単離した葉酸をＵＶ光で放射した。同じ放射の後、ｐＨ７．４で直接調製した葉酸溶液のように、葉酸の蛍光は変化した。この結果はさらに、葉酸／タンパク質／多糖ナノゲルが、ｐＨ４．０において葉酸をＵＶ分解から有効に保護できることを実証する。
【００４８】
【表３】
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【００４９】
［実施例６：葉酸／エンドウ豆タンパク質／大豆多糖ナノゲルの調製およびＵＶ分解からの葉酸の保護］
エンドウ豆タンパク質を水中に溶解させ、ｐＨをｐＨ３．２５に調整した。一晩の平衡の後、溶液を５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、非溶解タンパク質を除去した。上澄みは、１５ｍｇ／ｍｌのエンドウ豆タンパク質を含有した。大豆多糖溶液を葉酸溶液およびエンドウ豆タンパク質溶液とｐＨ７．４において攪拌下で混合することによって葉酸／エンドウ豆タンパク質／大豆多糖ナノゲルを調製した。混合物中、最終のエンドウ豆タンパク質濃度は５ｍｇ／ｍｌであり、多糖濃度は１５ｍｇ／ｍｌであり、葉酸濃度は０．２５ｍＭであり、体積は２５ｍｌであった。混合物のｐＨを４．０に調整し、３時間の攪拌後、ｐＨを再度４．０に調整した。６００バールで２分間の高圧均質化によって混合物を均質化してから、９０℃で１時間加熱して、葉酸カプセル化エンドウ豆タンパク質／大豆多糖ナノゲルを得た。得られたナノゲルは、サイズ２０３ｎｍおよびＰＤＩ０．２３を有した（表５）。
【００５０】
葉酸のＵＶ分解を調査した。個々の葉酸と比較して、エンドウ豆タンパク質の存在下で葉酸の分解は１９％に低減する（表４）。葉酸／エンドウ豆タンパク質／多糖ナノゲルは、ｐＨ４．０において、葉酸を分解から有効に保護することができ、同じＵＶ線放射の後、負荷された葉酸の１３％しか分解しなかった。
【００５１】
【表４】
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【００５２】
［実施例７：ｐＨ３．０、３．５、および４．０における葉酸／エンドウ豆タンパク質／大豆多糖ナノゲル溶液および葉酸／大豆タンパク質／大豆多糖ナノゲル溶液の安定性、ならびに凍結乾燥後のナノゲルの再分散能力］
ｐＨ４．０で調製した葉酸／エンドウ豆タンパク質／大豆多糖ナノゲル溶液および葉酸／大豆タンパク質／大豆多糖ナノゲル溶液を別々にｐＨ３．５および３．０に変化させ、安定性を調査した。表５のデータは、ｐＨ３および３．５媒体において１週間の貯蔵後にナノゲルのサイズが変化しないことを示し、ナノゲルが飲料ｐＨ条件において安定であることが示される。さらに、ナノゲルを凍結乾燥してから、水中に再分散させた。再分散の後、ナノゲルのサイズは有意に変化しなかった。これにより、ナノゲルを乾燥粉末形態で貯蔵および使用できることが示唆される。
【００５３】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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