(57)【要約】  本発明は、細胞系を用いた炎症反応のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を用いてグルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発汚染分子の存在または性質に対する製造工程または精製工程の影響を決定するための方法に関する。それはさらに、グルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発汚染分子の分析と、炎症誘発汚染分子の存在および性質に対して最適化された製造工程または精製工程の選択と、を含む、グルコースポリマーまたはその加水分解物を製造または精製するための最適化された方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子の存在または性質に対する１つもしくは複数の製造工程の効果または１つもしくは複数の精製工程の有効性を試験する方法であって、
ａ）グルコースポリマーまたはその加水分解物を提供することと、
ｂ）任意選択で、工程ａ）で提供された前記グルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を検出またはアッセイすることと、
ｃ）工程ａ）で提供された前記グルコースポリマーまたはその加水分解物に対して１つまたは複数の製造工程または精製工程を行うことと、
ｄ）工程ｃ）の後に得られた前記グルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を検出またはアッセイすることと、
ｅ）前記炎症誘発分子の存在または性質に対する工程ｃ）の有効性または影響を決定することと、
を含み、前記グルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を検出またはアッセイするための工程が、細胞系を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験を含み、前記細胞系が、マクロファージもしくはマクロファージ分化細胞系、または１種以上のＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様レセプター）もしくはＮＯＤ（ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン含有タンパク質）レセプター、たとえば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、もしくはＮＯＤ２を発現して１種もしくは複数種のレセプターの反応の検出を可能にする細胞、あるいはそれらの組合せのいずれかである、方法。
【請求項２】
グルコースポリマーまたはその加水分解物を製造または精製するための最適化された方法であって、
ａ）グルコースポリマーまたはその加水分解物を提供することと、
ｂ）工程ａ）で提供された前記グルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を検出またはアッセイすることと、
ｃ）前記グルコースポリマーまたはその加水分解物中に存在する炎症誘発分子に適した、前記グルコースポリマーまたはその加水分解物を製造または精製するための１つまたは複数の工程を選択することと、
ｄ）任意選択で、工程ａ）で提供された前記グルコースポリマーまたはその加水分解物に対して、前記選択された１つまたは複数の製造工程または精製工程を行うことと、
ｅ）任意選択で、工程ｄ）の後に得られた前記グルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を検出またはアッセイすることと、
を含み、前記グルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を検出またはアッセイするための工程が、細胞系を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験を含み、前記細胞系が、マクロファージもしくはマクロファージ分化細胞系、または１種以上のＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様レセプター）もしくはＮＯＤ（ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン含有タンパク質）レセプター、たとえば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、もしくはＮＯＤ２を発現して１種もしくは複数種のレセプターの反応の検出を可能にする細胞、あるいはそれらの組合せのいずれかである、方法。
【請求項３】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験が、前記グルコースポリマーまたはその加水分解物を、ＭＤＰまたはＬＰＳで感作されたマクロファージ分化ＴＨＰ−１細胞系に、接触させることを含み、前記炎症誘発分子が、前記細胞系により産生されたＲＡＮＴＥＳまたはＴＮＦ−αの量を測定することにより検出またはアッセイされる、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験が、前記グルコースポリマーまたはその加水分解物を、転写が炎症シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子でトランスフェクトされたマクロファージ系、たとえば、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）系に、接触させることを含み、前記炎症誘発分子が、前記レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験が、前記グルコースポリマーまたはその加水分解物を、ＴＬＲ２レセプターおよび転写がＴＬＲ２シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系に、接触させることを含み、前記炎症誘発分子が、前記レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験が、前記グルコースポリマーまたはその加水分解物を、ＴＬＲ４レセプターおよび転写がＴＬＲ４シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４系に、接触させることを含み、前記炎症誘発分子が、前記レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験が、前記グルコースポリマーまたはその加水分解物を、ＮＯＤ２レセプターおよび転写がＮＯＤ２シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２系に、接触させることを含み、前記炎症誘発分子が、前記レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験が、前記グルコースポリマーまたはその加水分解物を、
ａ．ＭＤＰまたはＬＰＳで感作されたマクロファージ分化ＴＨＰ−１細胞系であって、前記炎症誘発分子は、前記細胞系により産生されたＲＡＮＴＥＳまたはＴＮＦ−αの量を測定することにより検出またはアッセイされる、細胞系、および／または
ｂ．転写が炎症シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子でトランスフェクトされたマクロファージ系、たとえば、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）系であって、前記炎症誘発分子は、前記レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、マクロファージ系、および／または
ｃ．ＴＬＲ２レセプターおよび転写がＴＬＲ２シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系であって、前記炎症誘発分子は、前記レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、細胞系、および／または
ｄ．ＮＯＤ２レセプターおよび転写がＮＯＤ２シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２系であって、前記炎症誘発分子は、前記レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、細胞系、および／または
ｅ．ＴＬＲ４レセプターおよび転写がＴＬＲ４シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４系であって、前記炎症誘発分子は、前記レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、細胞系、および／または
ｆ．免疫レセプターでトランスフェクトされていない対照系、
に、接触させることを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験が、前記グルコースポリマーまたはその加水分解物を、
ａ．転写が炎症シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子でトランスフェクトされたマクロファージ系、たとえば、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）系であって、前記炎症誘発分子は、前記レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、マクロファージ系、
ｂ．ＴＬＲ２レセプターおよび転写がＴＬＲ２シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系であって、前記炎症誘発分子は、前記レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、細胞系、および／または
ｃ．ＴＬＲ４レセプターおよび転写がＴＬＲ４シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４系であって、前記炎症誘発分子は、前記レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、細胞系、および／または
ｄ．ＮＯＤ２レセプターおよび転写がＮＯＤ２シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２系であって、前記炎症誘発分子は、前記レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、細胞系、および
ｅ．免疫レセプターでトランスフェクトされていない対照系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２系、
に、接触させることを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記炎症誘発分子が、細菌起源の分子、好ましくは、ＰＧＮ、ＬＰＳ、リポペプチド、ＰＧＮ解重合生成物とくにＭＤＰ、ホルミル化微生物ペプチドたとえばｆ−ＭＬＰ、およびβ−グルカンから選択されるものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つまたは複数の製造工程または精製工程が、熱処理、酸性化、活性炭上の通過、吸着樹脂上の通過、限外濾過、濾過、または化学加水分解もしくは酵素加水分解、あるいはそれらの組合せ、の工程から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記グルコースポリマーが、イコデキストリンおよびマルトデキストリン、特定的には、分岐状または非分岐状のマルトデキストリンから選択され、かつ前記グルコースポリマー加水分解物が、完全加水分解の生成物、たとえば、デキストロース一水和物である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記グルコースポリマーまたはその加水分解物のサンプルが、特定的には３０ｋＤａのカットオフ閾値で、あらかじめ濾過され、かつその濾液が、前記試験で使用される細胞系に接触される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースポリマー、より特定的には食品分野（繊維リッチ健康成分）および医学分野（腹膜透析）を対象としたもの、またはグルコースポリマー加水分解物、より特定的には医学分野（注入可能な非発熱グルコース）を対象としたもの、の製造回路または精製回路の除染方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願人会社は、グルコースポリマーの製造回路またはその加水分解物の製造回路で発生する可能性のある微生物起源の汚染物質の危険性があることで知られる分野で、その発明を開発することを選択してきた。ただし、前記汚染物質は、
・食中毒、
・ヒトの健康に非常に有害な炎症反応、
の可能性の原因である。
【０００３】
したがって、食品安全性への取組みとの関連では、健康安全性への取組みの場合と同様に、あらゆる適切な技術的手段により、特定的には、
・適切な精製装置および精製技術を構成することにより安全な製造回路を規定すること、
・汚染物質の有効な同定方法およびアッセイ方法を規定すること、
により、生細胞の形態および細胞デブリの形態の両方で、微生物起源の汚染物質の不在を確認することが重要である。
【０００４】
たとえば、腹膜透析の場合、一定数の成分は、最も厳しい純度条件下で調製されなければならない。
【０００５】
腹膜透析は、実際上、腎臓により血漿からうまく精製されないまたはもはやうまく精製されない尿素、クレアチニン、過剰のカリウム、過剰の水などの廃物を除去することを目的とした透析の一種である。この医学的治療は、末期慢性腎不全の場合に必要とされる。
【０００６】
最も一般的に使用される透析液は、電解質（ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、塩素）およびとくに浸透圧剤（グルコースまたはグルコースポリマー、たとえば、ＢＡＸＴＥＲ社により販売されているＥＸＴＲＡＮＥＡＬ（登録商標）携行式腹膜透析液中に存在する「イコデキストリン」）が添加された、酸性ｐＨ（５．２〜５．５）または生理的ｐＨ（７．４）の緩衝液（乳酸塩または重炭酸塩の）で構成される。
【０００７】
グルコースは、そのサイズが小さいため、２〜４時間の注入で急速に腹膜を通過して浸透圧勾配の低下をもたらすので、以上に挙げたイコデキストリンなどのグルコースポリマーは、浸透圧剤としてグルコースよりも好ましい。
【０００８】
連続携行式腹膜透析用のグルコースポリマーのより特定の使用分野では、これらのデンプン加水分解物（グルコースとグルコースオリゴマーおよびグルコースポリマーとの混合物）は、そのままでは使用できないことがすぐに明らかになった。
【０００９】
欧州特許第２０７６７６号明細書には、水中１０％で無色透明溶液を形成し、５０００〜１０００００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）を有し、かつ８０００ダルトン未満の数平均分子量（Ｍｎ）を有するグルコースポリマーが好ましいと教示されている。
【００１０】
そのようなグルコースポリマーはまた、好ましくは、分子量が５０００〜５００００ダルトンであるグルコースポリマーを少なくとも８０％含み、グルコースやＤＰが３（分子量５０４）以下であるグルコースポリマーをほとんどまたはまったく含まず、かつ分子量が１０００００（ＤＰ約６００）超であるグルコースポリマーをほとんどまたはまったく含まない。
【００１１】
言い換えれば、好ましいグルコースポリマーは、低多分散性指数（Ｍｗ／Ｍｎ比を計算することにより得られる値）を有するグルコースポリマーである。
【００１２】
低多分散性指数を有するこれらのグルコースポリマーをデンプン加水分解物から得るための前記欧州特許第２０７６７６号明細書に提案された方法は、
・水混和性溶媒を用いてマルトデキストリンの分別沈殿を行うこと、
・または適切なカットオフもしくは排除閾値を有する種々の膜を介して上述のマルトデキストリンの分子濾過を行うこと、のいずれか
で構成される。
【００１３】
２つの場合、これらの方法は、非常に高分子量のポリマーと低分子量のモノマーまたはオリゴマーとを除去することをめざしている。
【００１４】
しかしながら、これらの方法では、それらの実現の観点からも、取得可能になる生成物の収率および品質の観点からも、満足すべきものは得られない。
【００１５】
優先的に２．５未満の低多分散性指数を有し、好ましくは８０００ダルトン未満のＭｎを有しかつ１２０００〜２００００ダルトンのＭｗを有する完全水溶性グルコースポリマーの製造方法（前記方法は先行技術の欠点がない）の開発を期して、本出願人会社は、マルトデキストリンからではなく加水分解デンプンから出発してその欧州特許第６６７３５６号でこの問題を解決すべく努力した。
【００１６】
その場合、クロマトグラフィー分別により得られるグルコースポリマーは、好ましくは、グルコースおよび３以下のＤＰを有するグルコースポリマーを３％未満、かつ６００超のＤＰを有するグルコースポリマーを０．５％未満含有する。
【００１７】
浸透圧能のために使用されるこれらのグルコースポリマーが完全に満足すべきものであることは、最終的には今後、腹膜透析分野の専門家により承認される。
【００１８】
しかしながら、腹膜透析を意図したこれらの調製物の微生物汚染のリスクは、悲しむべきことである。
【００１９】
グルコースポリマーの製造回路は、微生物によりまたは前記微生物中に含有される炎症誘発物質により汚染される可能性のあることが、実際に知られている。
【００２０】
たとえば、酵母類、カビ類、および細菌類の微生物による、より特定的にはアリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）類の好酸好熱性細菌（回路の高温酸性ゾーンで増殖する好極限性細菌）によるトウモロコシデンプンまたはコムギデンプンの汚染が、デンプン業界で報告されている。
【００２１】
その場合、これらの汚染製品を摂取した患者の主要なリスクは、腹膜炎である。
【００２２】
これらの腹膜炎エピソードは、腹腔内細菌感染により引き起こされ、その診断は、通常、陽性透析液培養を介して容易に確定される。
【００２３】
無菌性（ａｓｅｐｔｉｃ）腹膜炎、化学性腹膜炎、または培養陰性腹膜炎として記述される「無菌性（ｓｔｅｒｉｌｅ）腹膜炎」は、それ自体は、典型的には、化学刺激物または異物により引き起こされる。
【００２４】
腹膜透析液調製用のイコデキストリンの導入以来、種々の原因、特定的には、潜在的に存在する炎症誘発物質による誘発に関連付けられうる無菌性腹膜炎の孤立症例が報告されてきた。
【００２５】
したがって、無菌性炎症エピソードは、透析液の注入後に観測される主要な合併症である。
【００２６】
これらの炎症エピソードのいくつかは、化学性の問題（化学汚染物質の誤注入または特定の化合物の不適正用量）に関連付けられるが、症例の大多数は、透析液の調製に使用される溶液中に存在する微生物起源の汚染物質の存在に直接関連付けられる。
【００２７】
リポ多糖（ＬＰＳ）およびペプチドグリカン（ＰＧＮ）は、痕跡量で存在する場合でさえも、炎症を誘発する高いリスクを呈する微生物起源の主要な汚染物質である。
【００２８】
さらに、これらの汚染物質により誘発される炎症反応を増悪する可能性のある分子、たとえば、ＰＧＮ解重合生成物（依然として生物活性のあるその最小構造はムラミルジペプチド（ＭＤＰ）である）の存在をも考慮に入れたことは、本出願人会社の功績である。
【００２９】
これらの誘導体は、孤立状態とみなされる場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれほど炎症性がなく、１μｇ／ｍｌ超の値で有意な反応を示す。
【００３０】
ＰＧＮ解重合生成物に加えて、ホルミル化微生物ペプチド（そのプロトタイプはｆ−ＭＬＰ（ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅトリペプチド）である）もまた、実質的な相乗活性を有する。当初、これらのペプチドは、白血球に及ぼすそれらの化学誘引活性に関して同定されたが、それら自体では、サイトカイン反応を誘発することができない。
【００３１】
したがって、痕跡量のＰＧＮおよび／またはＬＰＳの作用を増悪することにより無菌性炎症エピソードの間接的原因となりうるので、これらの「小分子」を無視しないことが重要である。
【００３２】
薬局方には、発熱物質を検出するための一組の試験、すなわち、
・細菌内毒素（グラム陰性細菌の主要成分）検出試験（ＬＡＬ試験）、
・ウサギ発熱原試験、
が提案されている。
【００３３】
一般的には信頼性があるが、これらの２つ試験には、それなりの限界がある。ウサギ発熱原試験は、これらの物質を含有する製品が注入されているウサギの体温の上昇（発熱反応）を測定することにより、発熱物質を間接的に検出することに基づく。
【００３４】
望ましくない物質が、あまりにも弱い生物学的活性またはあまりにも低い濃度を有していて全身発熱反応を誘発できない場合、この試験は、偽陰性を生じる可能性がある。
【００３５】
さらに、この物質は、局所炎症反応を引き起こすのに十分な生物学的活性または濃度を有する可能性がある。
【００３６】
ＬＡＬ試験は、それ自体は、菌類叢の壁の成分である細菌内毒素（ＬＰＳ）さらにはβ−グルカンのみを検出するにすぎない。他の生物学的不純物（ＤＮＡ、ペプチドグリカンなど）は、検出されない。
【００３７】
したがって、特定の場合、イコデキストリンを含有する腹膜透析液で観測される無菌性腹膜炎の発症は、いくつかの物質が薬局方に記載の試験を回避しうるかつ望ましくない臨床作用の原因となりうる仕組みがあることの証拠となる。
【００３８】
この状況を改善するために、ＢＡＸＴＥＲ社は、グラム陽性微生物汚染物質の検出に努力することを提案してきた。
【００３９】
特定的には、ＢＡＸＴＥＲ社は、その欧州特許第１７２０９９９号明細書で、グラム陽性細菌膜の主要成分であるペプチドグリカン、とくに、腹膜透析液を調製するためのグルコースポリマー中のペプチドグリカンの検出に基づく方法を開発することを提案している。
【００４０】
言い換えれば、無菌性腹膜炎のこれらのエピソードの発生を予防するために、ＢＡＸＴＥＲ社は、腹膜透析液の製造および使用に関して、腹膜透析液中のペプチドグリカンを検出するためのプロトコルを提案した。
【００４１】
さらに、この欧州特許第１７２０９９９号明細書にはグルコースポリマーの上流処理について言及されているが、この処理は、ペプチドグリカンをそのままトラップ可能な親和性樹脂を利用したものにすぎない。
【００４２】
したがって、最終生成物がアリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）類の好酸好熱性細菌によりまたはこれらの特定の細菌の膜デブリにより汚染されないようにグルコースポリマーの製造方法に変更を加えることは、想定されていなかった。
【００４３】
一方、本出願人会社は、その国際公開第２０１０／１２５３１５号パンフレットで、検討対象のグルコースポリマーに関して、この物質が実質的に汚染物質を含まないことを保証するために、安全な調製・精製方法により、より良好な品質の腹膜透析用物質を提供した。
【００４４】
本出願人会社は、活性炭／顆粒状ブラックカーボンを用いた処理と、濾過（精密濾過および限外濾過）と、いかなる汚染をも防止するのに適するように構成された熱処理と、の一定数の工程を組み合わせて、注目すべき精製方法を実現した。
【００４５】
しかしながら、この方法は改良可能であり、本出願人会社は、製造ラインとくにグルコースポリマーの製造ラインの最適安全性を確保すべく実施される主要な方法工程をより良好に規定するために、先行技術で到達可能なものよりも効果的な検出方法およびアッセイ方法の開発に専念してきた。
【００４６】
以上に述べたことすべてから判断して、検討対象のグルコースポリマーおよびその加水分解物に関して、これらの物質が実質的に汚染物質を含まないことを保証するために、安全な調製・精製方法により、より良好な品質の治療用途の物質を提供する必要性が、依然として満たされないまま存在する。
【００４７】
したがって、本出願人会社は、適切な精製工程を実現することにより、この必要性を満たしうることを見いだしてきた。その有効性は、完全に特異的な汚染物質を検出およびアッセイする方法により測定可能である。
【００４８】
過去数年間にわたり、炎症反応試験で動物モデルを置き換えるために、初代細胞を用いた多く試験が開発されてきた。
【００４９】
しかしながら、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、実験の偏りの原因となりうるかなりの個体間変動を受けやすい。
【００５０】
反対に、単球細胞系は一定した反応を示すので、現在開発中の試験でなぜこのタイプの細胞が培養でますます使用されるようになっているかがわかる。しかしながら、これらの試験は、溶液中に混合物として存在するすべての汚染物質に対する全炎症反応を与えるという欠点を有するので、汚染物質の性質を特徴付けることができない。
【００５１】
増悪した炎症反応は、炎症の急性期のサイトカイン、たとえば、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、ＩＬ−１β（インターロイキン１β）、およびＣＣＬ５（ケモカイン（Ｃ−Ｃユニット）リガンド５）／ＲＡＮＴＥＳ（活性化により調節されて正常Ｔ細胞により発現分泌される）などのケモカインでは見られるが、ＩＬ−６（インターロイキン６）ではまったくまたはほとんど見られないことにも留意することが重要である。
【００５２】
したがって、後者の産生に基づく方法（米国特許出願公開第２００９／０２３９８１９号明細書および米国特許出願公開第２００７／０１８４４９６号明細書）は、溶液中の混合物として汚染物質を検出するのに適していない。
【００５３】
本出願人会社は、以下の結論に達した。
（ｉ）生物学的溶液中に痕跡量で存在する細菌汚染物質を検出するのは困難であり、
（ｉｉ）相乗効果があるのでＰＧＮおよびＬＰＳの検出に限定しないことが重要であり、
（ｉｉｉ）感度の高いかつ再現性のある新しい検出方法を開発することが必要であり、かつ
（ｉｖ）汚染物質の性質を特徴付けうる感度の高いかつ再現性のある検出方法を用いることが有利である。
【００５４】
したがって、現在使用されているおよび／または文献に記載されている手順の感度の閾値未満の炎症誘発作用を有する微生物汚染物質を検出するための感度の高いかつ効果的な方法を開発したこと、ひいては製造回路に由来するバッチ中に痕跡量で存在する炎症誘発分子のファミリーさらには性質を同定したことは、本出願人会社の功績となっている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００５５】
本発明は、グルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子の存在または性質に対する１つもしくは複数の製造工程の効果または１つもしくは複数の精製工程の有効性を試験する方法に関する。この方法は、
ａ）グルコースポリマーまたはその加水分解物を提供することと、
ｂ）任意選択で、工程ａ）で提供されたグルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を検出またはアッセイすることと、
ｃ）工程ａ）で提供されたグルコースポリマーまたはその加水分解物に対して１つまたは複数の製造工程または精製工程を行うことと、
ｄ）工程ｃ）の後に得られたグルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を検出またはアッセイすることと、
ｅ）炎症誘発分子の存在または性質に対する工程ｃ）の有効性または影響を決定することと、
を含み、グルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を検出またはアッセイするための工程は、細胞系を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験を含み、この細胞系は、マクロファージもしくはマクロファージ分化細胞系、または１種以上のＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様レセプター）もしくはＮＯＤ（ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン含有タンパク質）レセプター、たとえば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、もしくはＮＯＤ２を発現して１種もしくは複数種のレセプターの反応の検出を可能にする細胞、あるいはそれらの組合せのいずれかである。
【００５６】
本発明はまた、グルコースポリマーまたはその加水分解物を製造または精製するための最適化された方法に関する。この方法は、
ａ）グルコースポリマーまたはその加水分解物を提供することと、
ｂ）工程ａ）で提供されたグルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を検出またはアッセイすることと、
ｃ）グルコースポリマーまたはその加水分解物中に存在する炎症誘発分子に適した、グルコースポリマーまたはその加水分解物を製造または精製するための１つまたは複数の工程を選択することと、
ｄ）任意選択で、工程ａ）で提供されたグルコースポリマーまたはその加水分解物に対して、選択された１つまたは複数の製造工程または精製工程を行うことと、
ｅ）任意選択で、工程ｄ）の後に得られたグルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を検出またはアッセイすることと、
を含み、グルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を検出またはアッセイするための工程は、細胞系を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験を含み、この細胞系は、マクロファージもしくはマクロファージ分化細胞系、または１種以上のＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様レセプター）もしくはＮＯＤ（ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン含有タンパク質）レセプター、たとえば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、もしくはＮＯＤ２を発現して１種もしくは複数種のレセプターの反応の検出を可能にする細胞、あるいはそれらの組合せのいずれかである。
【００５７】
第１の態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験は、グルコースポリマーまたはその加水分解物を、ＭＤＰまたはＬＰＳで感作されたマクロファージ分化ＴＨＰ−１細胞系に、接触させることを含みうる。炎症誘発分子は、この細胞系により産生されたＲＡＮＴＥＳまたはＴＮＦ−αの量を測定することにより検出またはアッセイされる。
【００５８】
第２の態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験は、グルコースポリマーまたはその加水分解物を、転写が炎症シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子でトランスフェクトされたマクロファージ系、たとえば、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）系に、接触させることを含みうる。炎症誘発分子は、レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる。
【００５９】
第３の態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験は、グルコースポリマーまたはその加水分解物を、ＴＬＲ２レセプターおよび転写がＴＬＲ２シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系に、接触させることを含みうる。炎症誘発分子は、レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる。
【００６０】
第４の態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験は、グルコースポリマーまたはその加水分解物を、ＮＯＤ２レセプターおよび転写がＮＯＤ２シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２系に、接触させることを含みうる。炎症誘発分子は、レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる。
【００６１】
第５の態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験は、グルコースポリマーまたはその加水分解物を、ＴＬＲ４レセプターおよび転写がＴＬＲ４シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４系に、接触させることを含みうる。炎症誘発分子は、レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる。
【００６２】
第６の態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験は、グルコースポリマーまたはその加水分解物を、
ａ．ＭＤＰまたはＬＰＳで感作されたマクロファージ分化ＴＨＰ−１細胞系であって、炎症誘発分子は、細胞系により産生されたＲＡＮＴＥＳまたはＴＮＦ−αの量を測定することにより検出またはアッセイされる、細胞系、および／または
ｂ．転写が炎症シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子でトランスフェクトされたマクロファージ系、たとえば、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）系であって、炎症誘発分子は、レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、マクロファージ系、および／または
ｃ．ＴＬＲ２レセプターおよび転写がＴＬＲ２シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系であって、炎症誘発分子は、レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、細胞系、および／または
ｄ．ＮＯＤ２レセプターおよび転写がＮＯＤ２シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２系であって、炎症誘発分子は、レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、細胞系、および／または
ｅ．ＴＬＲ４レセプターおよび転写がＴＬＲ４シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４系であって、炎症誘発分子は、レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、細胞系、および／または
ｆ．免疫レセプターでトランスフェクトされていない対照系、
に、接触させることを含みうる。
【００６３】
第７の態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験は、グルコースポリマーまたはその加水分解物を、
ａ．転写が炎症シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子でトランスフェクトされたマクロファージ系、たとえば、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）系であって、炎症誘発分子は、レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、マクロファージ系、
ｂ．ＴＬＲ２レセプターおよび転写がＴＬＲ２シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系であって、炎症誘発分子は、レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、細胞系、および／または
ｃ．ＴＬＲ４レセプターおよび転写がＴＬＲ４シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４系であって、炎症誘発分子は、レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、細胞系、および／または
ｄ．ＮＯＤ２レセプターおよび転写がＮＯＤ２シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２系であって、炎症誘発分子は、レポーター遺伝子の活性またはシグナルを測定することにより検出またはアッセイされる、細胞系、および
ｅ．免疫レセプターでトランスフェクトされていない対照系、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２系、
に、接触させることを含みうる。
【００６４】
好ましくは、炎症誘発分子は、細菌起源の分子、好ましくは、ＰＧＮ、ＬＰＳ、リポペプチド、ＰＧＮ解重合生成物とくにＭＤＰ、ホルミル化微生物ペプチドたとえばｆ−ＭＬＰ、およびβ−グルカンから選択されるものである。
【００６５】
好ましくは、１つまたは複数の製造工程または精製工程は、熱処理、酸性化、活性炭上の通過、吸着樹脂上の通過、限外濾過、濾過、または化学加水分解もしくは酵素加水分解、の工程から選択される。
【００６６】
好ましくは、グルコースポリマーは、イコデキストリンおよびマルトデキストリン、特定的には、分岐状または非分岐状のマルトデキストリンから選択され、かつグルコースポリマー加水分解物は、完全加水分解の生成物、たとえば、デキストロース一水和物である。
【００６７】
グルコースポリマーまたはその加水分解物のサンプルを、特定的には３０ｋＤａのカットオフ閾値で、あらかじめ濾過し、濾液を試験で使用される細胞系に接触させる。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
したがって、本発明は、グルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子の存在または性質に対する１つもしくは複数の製造工程の影響もしくは効果または１つもしくは複数の精製工程の有効性を試験する方法に関する。この方法は、
ａ）グルコースポリマーまたはその加水分解物を提供することと、
ｂ）任意選択で、工程ａ）で提供されたグルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を検出またはアッセイすることと、
ｃ）工程ａ）で提供されたグルコースポリマーまたはその加水分解物に対して１つまたは複数の製造工程または精製工程を行うことと、
ｄ）工程ｃ）の後に得られたグルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を検出またはアッセイすることと、
ｅ）炎症誘発分子の存在または性質に対する工程ｃ）の有効性または影響を決定することと、
を含み、グルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を検出またはアッセイするための工程は、細胞系を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験を含み、この細胞系は、マクロファージもしくはマクロファージ分化細胞系、または１種以上のＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様レセプター）もしくはＮＯＤ（ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン含有タンパク質）レセプター、たとえば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、もしくはＮＯＤ２を発現して１種もしくは複数種のレセプターの反応の検出を可能にする細胞、あるいはそれらの組合せのいずれかである。
【００６９】
本方法は、とくに工程ｅ）との関連では、工程ｂ）およびｄ）で検出またはアッセイされたグルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を比較することを含みうる。したがって、炎症誘発分子またはこれらの分子のいくつかの量の減少は、グルコースポリマーまたはその加水分解物の除染のための製造工程または精製工程の有効性の指標となる。炎症誘発分子の量および性質は、以下に詳述される方法により決定されるであろう。
【００７０】
本方法の目的は、特定的には、グルコースポリマーまたはその加水分解物とくに腹膜透析液調製用のグルコースポリマーを除染するための最適化された方法を開発することである。本方法は、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験により炎症誘発分子を検出またはアッセイすることを含む。
【００７１】
特定的には、炎症誘発分子に対する精製工程または製造工程の影響または有効性をとくにその存在およびその性質に基づいて特徴付けた後、当業者であれば、グルコースポリマーまたはその加水分解物中に存在する炎症誘発分子を考慮して、最も適した工程を選択することが可能である。したがって、最適化された方法は、
ａ）グルコースポリマーまたはその加水分解物を提供することと、
ｂ）工程ａ）で提供されたグルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を検出またはアッセイすることと、
ｃ）グルコースポリマーまたはその加水分解物中に存在する炎症誘発分子に適した、グルコースポリマーまたはその加水分解物を製造または精製するための１つまたは複数の工程を選択することと、
ｄ）任意選択で、工程ａ）で提供されたグルコースポリマーまたはその加水分解物に対して、選択された１つまたは複数の製造工程または精製工程を行うことと、
ｅ）任意選択で、工程ｄ）の後に得られたグルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を検出またはアッセイすることと、
を含み、グルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症誘発分子を検出またはアッセイするための工程は、細胞系を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験を含み、この細胞系は、マクロファージもしくはマクロファージ分化細胞系、または１種以上のＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様レセプター）もしくはＮＯＤ（ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン含有タンパク質）レセプター、たとえば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、もしくはＮＯＤ２を発現して１種もしくは複数種のレセプターの反応の検出を可能にする細胞、あるいはそれらの組合せのいずれかである。
【００７２】
グルコースポリマーまたはその加水分解物は、腹膜透析、経腸栄養および非経口栄養、ならびに新生児栄養のためのものでありうる。
【００７３】
好ましい一実施形態では、本発明との関連で調製されるであろうグルコースポリマーは、イコデキストリンまたはマルトデキストリン（後述されるように分岐状または非分岐状）である。
【００７４】
本明細書で参照されるグルコースポリマー加水分解物としては、とくに、完全加水分解の生成物、たとえば、本出願人会社によりＬＹＣＡＤＥＸ（登録商標）ＰＦというブランドで販売されている非発熱デキストロース一水和物が挙げられる。
【００７５】
それらは、それらの調製の１つ以上の段階で、特定的には原材料のレベルで、それらの調製方法の任意の工程で、および／または本方法の最終生成物のレベルで、除染可能である。
【００７６】
したがって、本発明に係る方法で提供されるグルコースポリマーまたはその加水分解物は、原材料に、調製方法の任意のレベルの生成物に、または最終生成物に対応する。
【００７７】
炎症誘発汚染物質は、特定的には、細菌起源の分子である。それは、特定的には、ＰＧＮ、ＬＰＳ、リポペプチド、ＰＧＮ解重合生成物とくにＭＤＰ、ホルミル化微生物ペプチドたとえばｆ−ＭＬＰ、β−グルカンなどでありうる。
【００７８】
ヒトにおける治療的使用（たとえば腹膜透析液）に供されるグルコースポリマーを調製するための方法の除染工程の有効性をモニターするために本発明との関連で使用されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応を測定するための方法は、単球／マクロファージ類の系（ＴＨＰ−１および／またはＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標））および自然免疫の特異的レセプターを発現するトランスフェクト系（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標））を用いた細胞試験（「バイオアッセイ」）に基づく。
【００７９】
ＴＨＰ−１系（８８０８１２０１、ＥＣＡＣＣ）は、ヒト前単球系である。炎症誘発反応試験では、細胞は、ホルボールエステル（ＰＭＡ）の存在下で単球／マクロファージに分化される。
【００８０】
本発明に従って行われる試験では、マクロファージまたはマクロファージ分化細胞とくにマクロファージ分化ＴＨＰ−１細胞は、ＭＤＰとくにＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭＤＰの存在下で感作される。この理由は、ＭＤＰが弱い炎症誘発物質であるが、他の炎症性分子と相乗的に作用することが知られていることにある。この性質は、この分子がＭＤＰレセプター以外のレセプター（本質的にはＴＬＲ）の介入により作用するという事実に基づく。したがって、ＭＤＰの存在は、グルコースポリマーまたはその加水分解物の溶液中に存在する汚染物質により誘発される炎症反応を増悪するので、低用量の汚染物質の検出を可能にする。好ましくは、ＭＤＰは、１μｇ／ｍｌ超の濃度、好ましくは１〜１００μｇ／ｍｌの濃度でサンプルに添加される。なかでもとくに好ましい一実施形態では、ＭＤＰは、１０μｇ／ｍＬの濃度でサンプルに添加される。
【００８１】
他の選択肢として、マクロファージまたはマクロファージ分化細胞とくにマクロファージ分化ＴＨＰ−１細胞は、ＭＤＰ以外の分子の存在下で感作されうる。実際に、ＬＰＳとくにＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＬＰＳもまた、使用可能である。それは、少なくとも１０ｐｇ／ｍｌの濃度で、たとえば、２５ｐｇ／ｍｌの濃度で、サンプルに添加可能である。
【００８２】
好ましい一実施形態では、マクロファージまたはマクロファージ分化細胞とくにマクロファージ分化ＴＨＰ−１細胞は、０．５〜１×１０６細胞／ｍｌ培養培地、好ましくは０．７〜０．８×１０６細胞／ｍｌ、さらにより好ましくは約０．７５×１０６細胞／ｍｌの密度で使用される。
【００８３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験は、感作ＴＨＰ−１細胞によるＲＡＮＴＥＳ産生の測定に基づく。この理由は、このケモカインのアッセイがグルコースポリマー溶液中の低用量の汚染物質とくに内毒素の検出に適していることが、先行研究により示されたことにある。他の選択肢として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験はまた、感作ＴＨＰ−１細胞によるＴＮＦ−α産生の測定に基づきうる。サイトカインのアッセイは、当業者に周知の任意の手段により、特定的にはＥＬＩＳＡにより、行うことが可能である。好ましい一実施形態では、試験は、８時間の刺激後のＴＮＦ−α産生の測定を含む。他の好ましい実施形態では、試験は、２０時間の刺激後のＲＡＮＴＥＳ産生の測定、特定的にはＥＬＩＳＡアッセイによる測定を含む。
【００８４】
この第１の試験は、ＰＧＮおよび／またはＬＰＳによる、好ましくは中サイズ（特定的には約１２０ｋＤａ）のＰＧＮおよび／またはＬＰＳによる、さらにより特定的にはＬＰＳによるグルコースポリマーまたはその加水分解物の汚染を検出することを可能する。
【００８５】
Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）系は、転写が炎症シグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子でトランスフェクトされた、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ：分泌型胎盤アルカリホスファターゼ）を産生するマウスマクロファージ系である。この系の利点は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＮＯＤ２レセプターをはじめとする実質上すべての先天性免疫レセプターを天然で発現することである。したがって、これらの細胞は、炎症性汚染物質の大部分に反応するであろう。また、その反応は、産生されたＳＥＡＰの酵素活性を測定することによりモニターされるであろう。好ましくは、この系は、約０．５×１０６細胞／ウェルの細胞密度で試験に使用される。グルコースポリマーまたはその加水分解物の調製物を細胞に接触させる処理は、約１６〜２４時間にわたり継続される。
【００８６】
細胞系とくにＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）は、先天性免疫レセプターとくにヒト（ｈ）レセプターをコードするベクターを用いた安定なトランスフェクションにより改変された系である。それらはまた、合成が過剰発現されるレセプターに関連付けられるシグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子、特定的にはＳＥＡＰを産生するレポーター遺伝子で共トランスフェクトされる。好ましくは、このレポーター遺伝子は、着色タンパク質もしくは蛍光タンパク質または基質を用いてもしくは用いずに活性の測定が可能なタンパク質をコードする。レポーター遺伝子の活性またはシグナルのの検出は、１種以上の先天性免疫レセプターを活性化して炎症反応を引き起こしうる汚染物質がサンプルに含有されることの指標となる。これらの系の使用により、発現されたレセプターに基づいて微生物起源の特定のファミリーの分子を標的とすることが可能である。好ましくは、ｈＴＬＲ２またはｈＴＬＲ４またはｈＮＯＤ２のいずれかを発現する細胞系が使用される。それに加えて、先天性免疫レセプターを発現しない対照系も使用される。この対照系の使用は、グルコースポリマーまたはその加水分解物の溶液が毒性機序などの寄生機序を介してレポーター遺伝子の産生を誘発しないことを検証するのに有用である。
【００８７】
本発明に係る試験では、好ましくは、以下の４つの系が使用される。
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系：  ｈＴＬＲ２レセプターを発現するこの系は、ＴＬＲ２アゴニスト（特定的にはＰＧＮおよびリポペプチド）に特異的に反応する。したがって、その使用により、炎症反応を引き起こすときのこれらの汚染物質の寄与レベルを知ることが可能である。
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４系：  ｈＴＬＲ４レセプターを発現するこの系は、ＬＰＳに特異的に反応する。したがって、その使用により、炎症反応を引き起こすときのこれらの汚染物質の寄与レベルを知ることが可能である。
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２系：  ｈＮＯＤ２レセプターを発現するこの系は、ＮＯＤ２アゴニストに特異的に反応する。したがって、その使用により、炎症反応を引き起こすときのＭＤＰおよび関連分子の寄与レベルを知ることが可能である。
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２系：  それは、免疫レセプターでトランスフェクトされていない対照系である。その使用は、グルコースポリマーまたはその加水分解物の溶液が毒性機序を介してＳＥＡＰ産生を誘発しないことを検証するために必要である。
【００８８】
しかしながら、当業者であれば他の市販の系（Ｉｍｇｅｎｅｘ）を使用することも可能であるかまたは系を調製することが可能であることに留意すべきである。
【００８９】
好ましい一実施形態では、細胞系は、０．５〜１×１０６細胞／ｍｌ培養培地の密度で使用され、グルコースポリマーまたはその加水分解物の調製物を細胞に接触させる処理は、約１６〜２４時間にわたり継続される。
【００９０】
汚染物質の定量は、用量−反応曲線を利用して行うことが可能である。この用量−反応曲線は、特定的には、漸増用量の汚染物質を用いて同一条件下で同一細胞を用いて作成することが可能である。用量−反応曲線は、特定的には、ＬＰＳ、ＰＧＮ、リポペプチド、β−グルカン、およびＭＤＰを標準として用いて作成される。好ましくは、そのような用量−反応曲線は、ＴＬＲ４を発現する細胞（たとえば、ＴＨＰ−１、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４、およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標））では漸増用量のＬＰＳを用いて、ＴＬＲ２を発現する細胞（たとえば、ＴＨＰ−１、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２、およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標））では漸増用量のＰＧＮを用いて、そしてＮＯＤ２を介して反応する細胞（たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２）では漸増用量のＭＤＰを用いて、作成することが可能である。
【００９１】
特定の実施形態では、ＴＨＰ−１系、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）系、およびＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）系は、漸増濃度の標準と共にインキュベートされ、そして細胞反応は、ＴＨＰ−１系では、ＥＬＩＳＡによりＲＡＮＴＥＳ産生を定量することにより、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）系およびＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）系では、レポーター遺伝子の測定により、特定的にはＳＥＡＰの酵素活性の測定により、測定される。
【００９２】
本発明に係る試験により、炎症反応を引き起こしうる１種または複数種の汚染物質を同定することが可能である。したがって、ＮＯＤ２を発現する系とくにＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２により、なかでもとくにＰＧＮ解重合生成物およびＭＤＰ、好ましくはＭＤＰを検出することが可能である。ＴＬＲ２を発現する系、とくに、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２および／またはＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）により、なかでもとくにＰＧＮによる汚染を検出することが可能である。さらに、マクロファージとくにＴＨＰ−１マクロファージおよびＴＬＲ４を発現する系とくにＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４により、なかでもとくにＬＰＳによる汚染を検出することが可能である。
【００９３】
好ましい一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症反応試験は、以下の細胞系を用いた試験を含む。
・マクロファージ、特定的にはＴＨＰ−１マクロファージ、ＴＬＲ２レセプターの活性の検出を可能する細胞系、特定的にはＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系、ＴＬＲ４レセプターの活性の検出を可能する細胞系、特定的にはＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４系、ＮＯＤ２レセプターの活性の検出を可能する細胞系、特定的にはＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２系、および任意選択であるが好ましくは対照系、特定的にはＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２系、または
・レポーター遺伝子でトランスフェクトされたマクロファージ系、特定的にはＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）系、ＴＬＲ２レセプターの活性の検出を可能する細胞系、特定的にはＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系、ＴＬＲ４レセプターの活性の検出を可能する細胞系、特定的にはＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４系、ＮＯＤ２レセプターの活性の検出を可能する細胞系、特定的にはＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２系、および任意選択であるが好ましくは対照系、特定的にはＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２系。
【００９４】
好ましい実施形態では、種々のサンプル中の汚染物質の存在は、炎症反応の全体像がわかるように、さらには特定の汚染物質に特異的な反応がわかるように、以上に提示された５つの細胞型を用いて試験される。
・ＭＤＰ感作ＴＨＰ−１系：  任意の汚染物質、ＬＰＳに対して強い反応性を有する、
・Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）系：  任意の汚染物質、ＰＧＮに対して強い反応性を有する、
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系：  ＰＧＮおよび他のＴＬＲ２リガンド（リポペプチドなど）、
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４系：  ＬＰＳ、
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２系：  ＭＤＰおよびＰＧＮ解重合生成物、
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２系：  陰性対照。
【００９５】
本発明に係る方法では、１つまたは複数の製造工程または精製工程は、熱処理、酸性化、活性炭上の通過、吸着樹脂上の通過、限外濾過、濾過、または化学加水分解もしくは酵素加水分解、あるいはそれらの組合せ、の工程から選択される。各工程で種々のパラメーターを試験することにより、最も有効なものを選択することが可能である。たとえば、活性炭上の通過の場合、活性炭およびその組合せの種々の品質を試験することが可能である。限外濾過の場合、種々のカットオフ閾値を試験してそれらを組み合わせることが可能である。熱処理の場合、処理の温度および時間を変化させることが可能であろう。酵素治療の場合、使用される１種または複数種の酵素、それらの濃度、およびそれらの処理条件を変化させることが可能であろう。
【００９６】
非常に特定の一実施形態では、非発熱水（注入用）中３２％（重量／体積）で調製されたサンプルで処理を行い、次いで、溶液を０．２２μｍに通して濾過する。細胞試験では、サンプルを細胞培養培地中に１／１０希釈する（最終濃度：３．２％（ｗ／ｖ））。
【００９７】
それに加えて、炎症誘発分子を検出またはアッセイするための試験の前に、グルコースポリマーまたはその加水分解物のサンプルを酵素処理工程もしくは化学処理工程または濾過工程に付すことが可能である。任意選択で、これらの処理工程または濾過工程の前後で得られた結果を比較することが可能である。
【００９８】
したがって、グルコースポリマーまたはその加水分解物のサンプルを試験前にムタノリシンで処理することが可能である。この酵素は、そのムラミダーゼ活性によりＰＧＮを解重合することが可能である。たとえば、オプションとして７．５〜３７．５％（重量／体積）のグルコースポリマー濃度を有するように希釈されていてもよいサンプルの存在下に、６〜１６時間、好ましくは約１６時間にわたり、約２５００Ｕ／ｍｌの濃度の酵素を配置することが可能である。次いで、こうして処理されたサンプルは、本発明に従って１種以上の細胞系を用いた試験に付されるであろう。
【００９９】
他の選択肢として、グルコースポリマーまたはその加水分解物の調製物のサンプルを試験前に濾過することが可能である。この濾過の目的は、本質的には、高分子量ＰＧＮなどの高分子量分子を除去して、なかでもとくに小サイズの汚染物質を分析するために濾液の試験を行うことである。濾過のカットオフ閾値は、たとえば３０ｋＤ〜１５０ｋＤ、好ましくは３０〜１００ｋＤまたは３０〜５０ｋＤ、特定的には約３０ｋＤでありうる。好ましい一実施形態では、細胞試験は、特定的には３０ｋＤａおよび１００ｋＤａのカットオフ閾値で限外濾過により得られた画分で行われる。好ましくは、濾過は、限外濾過により行われる。それはまた、当業者に公知の任意の手段により行うことが可能である。したがって、こうして濾過されたサンプルすなわち濾液は、本発明に従って細胞試験に付されるであろう。濾過なしでまたは濾過前に得られた結果との比較により、小サイズの分子の特異的炎症寄与を推定することが可能であろう。さらに、これにより、製造工程または精製工程が汚染物質のサイズを変化させるか（凝集と比較される加水分解）および／または規定サイズの特定の汚染物質を除去しないかを検証することが可能である。
【０１００】
さらに、リゾチームおよび／またはβ−グルカナーゼでサンプルを処理することにより、ＰＧＮおよび／またはβ−グルカンを除去して、汚染バッチ中に存在しうる他のＴＬＲ２アゴニスト（糖脂質およびリポペプチド）の有意性を決定することが可能である。
【０１０１】
本発明に係る方法の好ましい一実施形態では、細胞試験の第１のシリーズは、分子サイズを考慮せずに反応を測定するためにおよびこれらの分子間の可能な相乗効果を保存するために、未濾過のサンプルで行われる。次いで、第２のシリーズでは、細胞試験は、処理が汚染物質のサイズを変化させるか（凝集と比較される加水分解）および／または規定サイズの特定の汚染物質を除去しないかを検証するために、限外濾過（カットオフ閾値：３０ｋＤａおよび１００ｋＤａ）により得られた画分で行われる。
【０１０２】
本発明に係る方法を例示するために、種々の異なるグルコースポリマーマトリックスおよびグルコースポリマー加水分解物のバッチで、種々の除染工程を行う。
・イコデキストリンの原材料であるグルコースポリマー（欧州特許第６６７３５６号明細書の教示に係るクロマトグラフィー分別の前）、
・イコデキストリンのバッチ、
・ＮＵＴＲＩＯＳＥ（登録商標）ＦＢ０６というブランド名で本出願人会社により販売されている分岐状マルトデキストリンのバッチ、
・ＬＹＣＡＤＥＸ（登録商標）ＰＦというブランド名で本出願人会社により販売されている、注入可能な溶液での使用に適するように調製されたデキストロース一水和物のバッチ、
・本出願人会社が所有権者である国際公開第２００７／０９９２１２号パンフレットの教示に従って調製された高分岐状可溶性グルコースポリマーのバッチ、
・市販のマルトデキストリン。
【０１０３】
継続される処理は、以下のとおりである。
・熱処理、たとえば、
・７０℃および／または
・１２０℃、
・酸性化、
・種々の品質の活性炭上の通過、たとえば、
・ＮＯＲＩＴ社製のＳＸ＋、
・ＮＯＲＩＴ社製のＳＸ２、
・ＮＯＲＩＴ社製のＣ  ＥＸＴＲＡ  ＵＳＰ、
・ＮＯＲＩＴ社製のＡ  ＳＵＰＲＡ  ＥＵＲ、
・ＣＥＣＡ社製のＥＮＯ−ＰＣ、
・ＣＥＣＡ社製のＬ４Ｓ、
・ＣＥＣＡ社製のＬ３Ｓ、
・ＣＥＣＡ社製のＣＳＡ、
・吸着樹脂上の通過、
・Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａａｓ社製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−４、
・Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａａｓ社製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−７６１、
・Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａａｓ社製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−１６００、
・Ｄｏｗ社製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−１６ＨＰ（＝ＦＰＸ６６）、
・Ｄｏｗ社製のＤｏｗｅｘ  ＳＤ２、
・Ｐｕｒｏｌｉｔｅ社製のＭａｃｒｏｎｅｔ  ＭＮ−１００、
・Ｐｕｒｏｌｉｔｅ社製のＭａｃｒｏｎｅｔ  ＭＮ−１５０、
・異なるカットオフ閾値を有する限外濾過、たとえば、
・５ｋＤａ、
・３０ｋＤａ、
・特異的酵素を用いた酵素加水分解、たとえば、
・β−１，３−グルカナーゼ、
・プロテアーゼ、
・マンナナーゼ活性を有する酵素調製物（たとえば、洗浄性および清澄化性のために使用される、ＮＯＶＯＺＹＭＥＳ社により販売されているＭａｎｎａｗａｙ（登録商標））、
・エンド−β−グルカナーゼ活性を有する酵素調製物（たとえば、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏ．社により製造されてＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．により販売されているＳＥＢｆｌｏ（登録商標）Ｔｌ）、
・酸性プロテアーゼ活性を有する酵素調製物（たとえば、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏ．社により製造されてＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．により販売されているＳＥＢＰｒｏ（登録商標）ＦＬ１００）。
【０１０４】
本発明は、以下の実施例を利用すれば、より明確に理解されるであろうが、これらの実施例は、例示を意図したものであり、限定を意図したものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】標準的アゴニストに対するＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞反応。
【図２】標準的アゴニストに対するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ２細胞反応。
【図３】標準的アゴニストに対するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ４細胞反応。
【図４】標準的アゴニストに対するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＯＤ２細胞反応。
【図５】標準的アゴニストに対するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ細胞反応。
【図６】未濾過のマトリックスによりならびに１００ｋＤａおよび３０ｋＤａのフィルターを通過した後で誘発されたＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞反応。
【図７】未濾過のマトリックスによりならびに１００ｋＤａおよび３０ｋＤａのフィルターを通過した後で誘発されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ２細胞反応。
【図８】未濾過のマトリックスによりならびに１００ｋＤａおよび３０ｋＤａのフィルターを通過した後で誘発されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ４細胞反応。
【図９】未濾過のマトリックスによりならびに１００ｋＤａおよび３０ｋＤａのフィルターを通過した後で誘発されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＯＤ２細胞反応。
【図１０】マトリックスにより誘発されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ細胞反応。
【図１１】種々のマトリックスの炎症活性の評価。
【図１２】炭素ＳＸ＋を通過した後のマトリックスにより誘発された細胞反応。
【図１３】種々の炭素を通過した後のＥ３０６３マトリックスにより誘発された細胞反応。
【図１４】種々の炭素を通過した後のＥ１５６５マトリックスにより誘発された細胞反応。
【図１５】種々の炭素を通過した後のＥ１２４２マトリックスにより誘発された細胞反応。
【図１６】種々の炭素を通過した後のＬａｂ３９４３マトリックスにより誘発された細胞反応。
【図１７】５ｋＤａの限外濾過による処理の後のＥ１５６５マトリックスにより誘発された細胞反応。
【図１８】５ｋＤａの限外濾過による処理の後のＬａｂ３９４３マトリックスにより誘発された細胞反応。
【図１９】Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）による処理の後のＥ３０６３およびＥ５２５０マトリックスにより誘発された細胞反応。
【図２０】ＳＥＢｆｌｏ（登録商標）ＴＬによる処理の後のＥ５２５０マトリックスにより誘発された細胞反応。
【図２１】ＳＥＢＰｒｏ（登録商標）ＦＬ１００による処理の後のＥ３０６３マトリックスにより誘発された細胞反応。
【図２２】工業用樹脂による処理の後のＥ１５６５マトリックスにより誘発された細胞反応。
【実施例】
【０１０６】
実施例１：  用量−反応曲線の作成
標準的アゴニスト分子、すなわち、ＬＰＳ、ＰＧＮ、ＬＴＡ、ザイモサン、およびＭＤＰを用いて、用量−反応曲線を作成する。Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）系ならびにＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＮＯＤ２、およびＮｕｌｌ系を漸増濃度のアゴニストと共にインキュベートし、ＳＥＡＰ活性を定量することにより細胞反応を測定する（図１〜５）。細胞活性化の陽性対照としてＴＮＦ−αを使用する。
・Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）系：  細胞は、グルコースポリマーマトリックスおよび誘導体中に存在しうる主要炎症性分子（ＰＧＮ、ＬＰＳ、ザイモサン、ＬＴＡ）に反応する。特定的には、ＰＧＮに対して強い反応性を有するが、その解重合生成物（ＭＤＰ）に反応しない。
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系：  ＰＧＮに対して強い反応性。細胞は、他のＴＬＲ２リガンド（ＬＴＡ、ザイモサン）に対してより弱く反応し、ＬＰＳおよびＭＤＰに対して反応性を示さない。
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４系：  ＬＰＳに対して強い反応性。細胞は、ザイモサンに対して非常に弱く反応し、ＰＧＮ、ＬＴＡ、およびＭＤＰに対して反応性を示さない。
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２系：  ＭＤＰに対して強い反応性。
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２系：  細胞毒性不在の対照。
【０１０７】
実施例２：  種々の異なるグルコースポリマーマトリックスおよびグルコースポリマー加水分解物のバッチの調製
上述したように、マトリックスは、以下のとおりである。
・本明細書ではＥ１５６５、Ｅ３０６３、Ｅ１２４２、Ｅ５２４８、およびＥ５２５０として参照される、イコデキストリンの原材料である５種のグルコースポリマー（欧州特許第６６７３５６号明細書の教示に係るクロマトグラフィー分別の前）。これらの５種のポリマーの調製は、国際公開第２０１２／０５９６８５号パンフレットの教示に従って行われる。
・イコデキストリンの汚染バッチ（本明細書ではＥ２０９Ｊとして参照される）およびイコデキストリンの「標準」バッチ、すなわち、細胞試験での非汚染対照（本明細書ではＰ１１−１１として参照される）。これらのバッチは、国際公開第２０１０／１２５３１５号パンフレットの実施例１に詳述されている欧州特許第６６７３５６号明細書の教示に従って調製される。
・ＮＵＴＲＩＯＳＥ（登録商標）ＦＢ０６というブランド名で本出願人会社により販売されている分岐状マルトデキストリンのバッチ、
・ＬＹＣＡＤＥＸ（登録商標）ＰＦというブランド名で本出願人会社により販売されている、注入可能な溶液での使用に適するように調製されたデキストロース一水和物のバッチ、
・本明細書ではＬＡＢ３９４３として参照される腹膜透析用の高分岐状可溶性グルコースポリマーのバッチ。
このバッチは、国際公開第２００７／０９９２１２号パンフレットの実施例２に従って分岐酵素およびアミログルコシダーゼを用いて二重酵素処理により調製される。
・本明細書ではＣａｒｇｉｌｌとして参照される市販のマルトデキストリン（ＣａｒｇｉｌｌマルトデキストリンＣ＊Ｄｒｙ  ＭＤ０１９１５、バッチ０２０４４７７０）。
【０１０８】
実施例３：  未処理のサンプルによりならびに１００ｋＤａまたは３０ｋＤａのフィルターを通過した後で誘発された細胞反応の解析
この試験の目的は、グルコースポリマーマトリックスおよびグルコースポリマー加水分解物のバッチ中に存在する汚染物質の炎症誘発反応性および性質を決定することである。
【０１０９】
非発熱水（注入用）中３２％（重量／体積）で実施例２に係るサンプルを調製する。
【０１１０】
細胞試験の前に、ＳＬＰ−ＨＳアッセイおよびＬＡＬアッセイを用いて、ＬＰＳレベルおよびＰＧＮレベルのアッセイを行った（データは以下に示される）。
【０１１１】
【表１】
2015520616.tif 000002
【０１１２】
細胞試験では、サンプルを細胞培養培地中に１／１０希釈する（最終濃度：３．２％（ｗ／ｖ））
【０１１３】
以下の系で解析を行う。
・Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）系：  任意の汚染物質、ＰＧＮに対して高い反応性を有する、
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系：  ＰＧＮに対して高い反応性、
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４系：  ＬＰＳに対して高い反応性、
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２系：  ＭＤＰおよびＰＧＮ解重合生成物、
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２系：  細胞毒性不在の対照。
【０１１４】
細胞型別の結果を図６〜１０に示す。
【０１１５】
Ｒａｗ細胞反応（図６）：
非汚染対照Ｐ１１−１１の存在下で観測されるものと等価な反応を与えるＣａｒｇｉｌｌマトリックスを除いて、他方サンプルはすべて、マクロファージ系との接触により炎症反応を引き起こす。最も反応性の高いマトリックスは、Ｅ−３０６３（細胞反応の飽和）であり、次にＥ−１２４２およびＥ−１５６５である。
【０１１６】
汚染物質は、本質的には、高分子量の分子（たとえば、ＰＧＮ、ザイモサン）または凝集体を形成可能な分子（たとえば、ＬＰＳ、ＬＴＡ）である。実際に、１００ｋＤａの濾過は、サンプルにより誘発される反応を大幅に低減させたことから、この処理は、それらをかなりの程度まで除去したことが示唆される。Ｅ−１２４２マトリックスおよびＥ−５２５０マトリックスのみは、依然としてＰ１１−１１のものよりも有意に高い活性を有することから、それらは、おそらくより大きい汚染物質の分解に由来するサイズ＜１００ｋＤａを有する汚染物質を含有することが示唆される。３０ｋＤａの濾過は、処理後に種々のサンプルがそれらの炎症誘発活性を実質的にすべて失うので、さらにより効果的である。
【０１１７】
ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞反応（図７）：
ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞を用いて得られた結果から、前の結果が確認される。
【０１１８】
Ｅ−３０６３マトリックスは、飽和反応を誘発することから、非常に高いＴＬＲ２インデューサー汚染レベルであることが示唆される。また、Ｅ−１２４２、Ｅ−１５６５、Ｌａｂ３９４３、およびＩｃｏ−Ｅ２０９Ｊマトリックスは、Ｒａｗ細胞で観測されたものよりも大きい高反応を与える。この差は、ＴＬＲ２の強いインデューサー（ＰＧＮまたはリポペプチド）が負荷されているという事実から説明される。
【０１１９】
１００ｋＤａおよび３０ｋＤａの濾過は、これらのサンプルにより誘発される炎症反応を中和することから、汚染物質は、主に高分子量ＰＧＮであることが示唆される。しかしながら、Ｅ−３０６３マトリックスおよびＥ−１５６５マトリックスは、濾過後、依然として有意な活性を呈する。これらのデータから、これらの化合物は、ＰＧＮ分解生成物および／またはリポペプチドを含有することが示される。実際に、ＰＧＮとは対照的に、ＴＬＲ２の他の強いインデューサーは、重量＜３０ｋＤａを有し、したがって、濾過後、依然として細胞反応を与えるであろう。
【０１２０】
Ｅ−５２５０マトリックスおよびＥ−５２４８マトリックスおよびＮＵＴＲＩＯＳＥ（登録商標）は、Ｒａｗ細胞で観測されたものと等価な強度の弱い反応を与えることから、これらの３つのサンプルは、ＴＬＲ２の弱いインデューサー（たとえば、ザイモサン、β−グルカン、またはＬＴＡ）を含有することが示唆される。
【０１２１】
以上と同様に、ＣａｒｇｉｌｌマトリックスおよびＬＹＣＡＤＥＸ（登録商標）は、反応を引き起こさないことから、ＴＬＲ２誘導汚染物質の不在が示唆される。
【０１２２】
ＨＥＫ−ＴＬＲ４細胞反応（図８）：
Ｅ１５６５、Ｅ３０６３、Ｌａｂ３９４３、Ｃａｒｇｉｌｌ、およびＮＵＴＲＩＯＳＥ（登録商標）マトリックスは、ＨＥＫ−ＴＬＲ４細胞で中強度の反応を引き起こすことから、ＬＰＳの存在が確認される。濾過は、細胞の反応を部分的に低減する。このことは、ＬＰＳが凝集体を形成可能でありかつ非凝集分子のみが除去されたという事実により説明可能である。
【０１２３】
Ｅ１２４２、ＩｃｏＥ２０９Ｊ、Ｅ５２４８、Ｅ５２５０、およびＬＹＣＡＤＥＸ（登録商標）マトリックスは、有意な反応を引き起こさないことから、ＬＰＳレベルは、炎症反応を引き起こしうる閾値未満であることが示唆される。最初の２つマトリックスは、Ｒａｗ細胞で炎症反応を与える。これは、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞での強い反応性と相関する。これらのデータから、これらの２つマトリックスは、ＰＧＮで本質的に汚染されていることが示唆される。また、Ｅ５２４８マトリックスおよびＥ５２５０のマトリックスおよびＬＹＣＡＤＥＸ（登録商標）は、Ｒａｗ細胞で炎症反応を引き起こす。しかしながら、それらは、ＴＬＲ２に対してごくわずかに活性であるかまたはまったく活性でないことから、これらの３つのサンプル中にＰＧＮおよびＬＰＳ以外の汚染物質が存在することが示される。
【０１２４】
ＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞反応（図９）：
ＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞は、すべてのサンプルに反応するが、Ｅ−１５６５、Ｌａｂ３９４３、およびＣａｒｇｉｌｌマトリックスのみは、ＮＯＤ２のインデューサーが強く負荷されている。このレセプターは、ＰＧＮ解重合の最終生成物（ＭＤＰ）に反応するが、それだけでなくその低分子量分解生成物にも反応する。したがって、サンプルは、多かれ少なかれ進行した分解プロセスを受けたＰＧＮで汚染されることおよび／または汚染されたことが、観測された反応の強度から示唆される。予想どおり、１００ｋＤａおよび３０ｋＤａの濾過は、問題の化合物（ＭＤＰおよび分解ＰＧＮ）が小サイズであるので、細胞の反応に有意な効果を及ぼさない。
【０１２５】
ＨＥＫ−Ｎｕｌｌ細胞反応（図１０）：
最後に、ＨＥＫ−Ｎｕｌｌ細胞は、種々のサンプルの存在下で有意な反応を与えないことから、他の細胞系で観測された反応性は、毒性作用に関連付けられるのではなく、実際には炎症型の反応に関連付けられることが実証される。
【０１２６】
サンプル別の評価（図１１）：
・Ｅ１２４２：  微分解ＰＧＮによる強い汚染に関連付けられる中強度の炎症活性。
・Ｅ１５６５：  部分分解ＰＧＮによる汚染およびＬＰＳの存在に関連付けられる中強度の炎症活性。
・Ｅ３０６３：  微分解ＰＧＮによる非常に強い汚染および痕跡量のＬＰＳに関連付けられる高強度の炎症活性。
・Ｅ５２４８：  ＰＧＮによる弱い汚染ならびにＰＧＮおよびＬＰＳ以外の炎症性分子の存在に関連付けられる低強度の炎症活性。
・Ｅ５２５０：  ＰＧＮによる弱い汚染ならびにＰＧＮおよびＬＰＳ以外の炎症性分子の存在に関連付けられる低強度の炎症性活性。
・Ｌａｂ３９４３：  部分分解ＰＧＮおよびＬＰＳによる中程度の汚染に関連付けられる中強度の炎症活性。
・ＩｃｏＥ２０９Ｊ：  微分解ＰＧＮによる強い汚染に関連付けられる中強度の炎症活性。
・Ｃａｒｇｉｌｌ：  検出可能な炎症活性の不在、ただし、ＰＧＮ分解生成物の存在。
・ＮＵＴＲＩＯＳＥ（登録商標）：  痕跡量の部分分解ＰＧＮおよびＬＰＳによる中程度の汚染に関連付けられる中強度の炎症活性。
・ＬＹＣＡＤＥＸ（登録商標）：  ＰＧＮ分解生成物による弱い汚染ならびにＰＧＮおよびＬＰＳ以外の炎症性分子の存在に関連付けられる低強度の炎症性活性。
【０１２７】
実施例４：  活性炭上の通過による処理の効果
実験の第１のシリーズでは、すべてのサンプルを同一の炭素による２つの連続する処理に付した（１％のＮＯＲＩＴ  ＳＸ＋炭素、８０℃で１時間）。
【０１２８】
図１２は、細胞系別に得られた結果を示している。
【０１２９】
第１の炭素処理は、Ｒａｗ細胞およびＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞で炎症反応を引き起こすＥ１２４２、Ｅ−５６５、Ｅ３０６３、およびＩｃｏＥ２０９Ｊサンプルの能力を劇的に減少させる。いずれにせよ、第２の処理は、炎症反応の原因となる分子の除去をさらに改善する。処理の効果は、Ｅ５２４８、Ｅ５２５０、およびＬａｂ３９４３サンプルならびにＮＵＴＲＩＯＳＥ（登録商標）では、それほど顕著でない。ＳＸ＋炭素による処理は、微分解ＰＧＮの除去に有効であるので、これらの汚染物質が支配的であるマトリックスの炎症活性を低減することが、これらのデータから示唆される。
【０１３０】
ＨＥＫ−ＴＬＲ４細胞では、反応は、ＬＰＳで最も汚染されているＥ１５６５、Ｌａｂ３９４３、およびＮＵＴＲＩＯＳＥ（登録商標）マトリックスに対して非常に低減される。しかしながら、効果は、ＰＧＮに起因する反応に対するときと同程度に顕著でないことから、ＬＰＳに特異的な動態が示唆される。
【０１３１】
ＳＸ＋炭素による処理は、ＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞の反応にほとんど影響を及ぼさないことから、ＰＧＮ分解生成物は適正に除去されていないことが示唆される。最後に、ＨＥＫ−Ｎｕｌｌ細胞は、処理されたサンプルに対して反応性がないことから、炭素に関連付けられるいかなる毒性作用も除外される。
【０１３２】
サンプルは、異なる分子的性質の汚染物質を含有することが、以上の試験により示されるので、活性炭上の通過による処理の後で観測された差は、予想された。この実験により提供された重要な情報は、汚染物質のサイズに応じて有効性に差を生じることが実証されたことである。したがって、ＳＸ＋炭素による処理は、特定のカテゴリーの汚染物質とくに高分子量ＰＧＮの除去に対してより顕著な効果を有するであろう。
【０１３３】
この仮説を確認するために、Ｅ３０６３、Ｅ１５６５、Ｅ１２４２、およびＬａｂ３９４３マトリックスを除染するときの有効性に関して、異なる多孔度のいくつかの炭素を試験した。
【０１３４】
主に大サイズのＰＧＮで汚染されているＥ３０６３マトリックスおよびＥ１２４２マトリックス（強いＴＬＲ２反応）とは対照的に、Ｅ１５６５マトリックスおよびＬａｂ３９４３マトリックスは、部分分解ＰＧＮ（ＴＬＲ２反応およびＮＯＤ２反応）およびＬＰＳ（ＴＬＲ４反応）を含有する。
【０１３５】
最適化処理条件は、次のとおりである。すなわち、０．５％の炭素、４．５に調整されたｐＨ、８０℃で１時間のインキュベーションである。処理後、サンプルを０．２２μｍフィルターに通して濾過し、次いで、細胞試験に使用する。
【０１３６】
Ｅ３０６３マトリックスでの結果を図１３に示す。
【０１３７】
ＨＥＫ−Ｎｕｌｌ細胞の反応の不在から、炭素が細胞毒性を示さないことが確認される。
【０１３８】
試験された炭素はすべて、Ｒａｗ細胞およびＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞の反応を劇的に低減するのに有効であることから、このマトリックスの主要な汚染物質である大きいＰＧＮを除去するのに有効であることが証明される。
【０１３９】
ニューカーボンは、ＳＸ＋と等価であるかまたはそれよりも有効であることが、留意すべき点である。
【０１４０】
したがって、Ｌ４Ｓ、Ｌ３Ｓ、ＥＮＯ−ＰＣ、Ｃ−ｅｘｔｒａ  ＵＳＰ、およびＳＸ２で処理されたサンプルは、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞でバックグラウンドノイズに近い細胞反応を誘発することから、これらの炭素は、ＰＧＮを除去するのにより有効であることが示唆される。
【０１４１】
それほど有効でない炭素に関して、３０ｋＤａおよび１００ｋＤａの濾過は、処理後の残留反応を低減する。これは、本質的に痕跡量の除去されないＰＧＮに起因することの証拠である。
【０１４２】
それほど有効でないと思われるＬ４Ｓおよびそれとは対照的にＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞のときよりも有効であることが見いだされているＡ−Ｓｕｐｒａ−Ｅｕｒを除いて、Ｒａｗ細胞で同一の結果が観測される。したがって、後者の炭素は、より広範にわたる作用を有し、ＬＰＳなどの他の分子を除去しうる。
【０１４３】
炭素は、Ｅ３０６３マトリックスに対してＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞およびＨＥＫ−ＴＬＲ４細胞の反応性を有意に低減するとはいえ、２つの細胞型でこのマトリックスにより誘発される反応が小さいので、処理間の有効性の差を識別することは困難である。
【０１４４】
Ｅ１５６５マトリックスでの結果を図１４に示す。
【０１４５】
Ｅ３０６３マトリックスのときと同様に、同一の炭素が、Ｅ１５６５により誘発されるＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞およびＲａｗ細胞の反応を低減するのに有効である。
【０１４６】
しかしながら、おそらくＰＧＮのサイズひいてはその性質の差に起因して、いくつかのわずかな差異が認められうる。３０ｋＤａの濾過は、汚染物質をごくわずかに保持するかまたはまったく保持ないので、実質上すべてのＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞反応は、明らかにＰＧＮ分解生成物の存在に起因する。一方、炭素は、この細胞の反応を低減するのにそれほど有効ではない。実際に、ＭＤＰタイプの汚染物質の負荷の低減により引き起こされる反応の減少は、細胞の最大反応の５０％を超えない。
【０１４７】
最後に、炭素は、ＴＬＲ４反応に対して中程度の効果を有する。すべての形態のＬＰＳを除去するのに非常に有効なＳＸ＋を除いて、他の炭素による処理により引き起こされる低減は、処理されていない同一のサンプルにより誘発される反応の５０％を超えない。しかしながら、Ｌ４Ｓ炭素およびＡ−Ｓｕｐｒａ−Ｅｕｒ炭素ならびにそれほどでもないがＣ−ｅｘｔｒａ  ＵＳＰ炭素およびＥＮＯ−ＰＣ炭素は、サイズ＜１００ｋＤａの分子により誘発される反応を低減するのにより有効であることが認められうることから、これらの炭素は、優先的に非凝集ＬＰＳに作用することが示唆される。
【０１４８】
Ｅ１２４２マトリックスでの結果を図１５に示す。
【０１４９】
試験された炭素はすべて、Ｒａｗ細胞およびＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞でＥ１２４２マトリックスにより誘発される反応を低減するのに有効である。バックグラウンドノイズに近いまたは等しい得られた反応は、３０ｋＤａおよび１００ｋＤａの濾過の前後で同一である。これは、ＰＧＮに対応する大分子が除去されたことの証拠である。
【０１５０】
Ｅ１２４２マトリックスは、ＬＰＳで非常に弱く汚染されている。しかしながら、ＥＮＯ−ＰＣおよびＡ−Ｓｕｐｒａ−Ｅｕｒは、ＨＥＫ−ＴＬＲ４細胞反応をバックグラウンドノイズのレベルに減少させるのに他の炭素よりも有効であることが認められうる。この観測から、これらの２種の炭素は、広範にわたる作用を有し、ＬＰＳなどのＰＧＮ以外の分子を除去するのに有効であることが確認される。
【０１５１】
最後に、炭素は、ＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞反応を約５０％低減するＥＮＯ−ＰＣおよびＳＸ２を除いて、ＰＧＮ分解生成物を除去するのに有効でない。
【０１５２】
Ｌａｂ３９４３マトリックスでの結果を図１６に示す。
【０１５３】
このマトリックスは、広範にわたるさまざまな分子で汚染されている。予想どおり、炭素はすべて、Ｒａｗ細胞で引き起こされる反応を低減するが、異なる有効性を有する。ＳＸ＋、ＣＳＡ、Ｌ４Ｓ、およびそれほどでもないがＡ−Ｓｕｐｒａ−Ｅｕｒは、最も有効であることが認められうることから、これらの炭素は、広範にわたる作用を有することが確認される。ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞では、炭素はすべて、ＰＧＮを除去するのに有効であることが見いだされるが、残留反応は、依然として濾過の前後で同一であることから、ＰＧＮ分解生成物は、除去がより困難であることが示唆される。
【０１５４】
また、ＬＰＳの除去における炭素の挙動は、さまざまである。たとえば、ＳＸ＋、ＥＮＯ−ＰＣ、Ｌ４Ｓ、およびＡ−Ｓｕｐｒａ−Ｅｕｒ炭素は、依然としてＨＥＫ−ＴＬＲ４細胞反応を低減するのに最も有効である。最後に、ＥＮＯ−ＰＣ、Ｃ−Ｅｘｔｒａ−ＵＳＰ、およびＳＸ２炭素のみは、ＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞反応を強く低減するのに比較的有効であることが見いだされる。これは、このマトリックス中に存在するＰＧＮ分解産物を除去するのに有効であることの証拠である。
・Ｃ−ｅｘｔｒａ−ＵＳＰおよびＳＸ２：  ＰＧＮおよびその分解生成物を除去するのに有効である。
・Ａ−Ｓｕｐｒａ−Ｅｕｒ：  高分子量分子（たとえば、凝集したＬＰＳおよびＰＧＮ）に対して広範にわたりより高い有効性を有する。
・ＥＮＯ−ＰＣ：  分子量＜１００ｋＤａを有する分子（たとえば、ＬＰＳおよびＰＧＮ分解生成物）に対して広範にわたりより高い有効性を有する。
・他の炭素：  作用範囲および有効性は、最大でもＳＸ＋炭素のものと等価である。
【０１５５】
実施例５：  ５ｋＤａの限外濾過による処理の効果
限外濾過による処理の目的は、直接的作用によるかまたは他の汚染性分子との相乗現象によるかにかかわらず、炎症反応を引き起こすことへの関与を相殺するために、小サイズの分子による汚染を低減さらには除去することである。
【０１５６】
両方とも部分分解ＰＧＮ（ＴＬＲ２反応およびＮＯＤ２反応）およびＬＰＳ（ＴＬＲ４反応）で汚染されているＥ１５６５マトリックスおよびＬａｂ３９４３マトリックスで実験を行った。
【０１５７】
２５ｍｌ／ｍｉｎの平均流量で５ｋＤａの濾過を行った。濾液流量は、それぞれ、Ｅ１５６５では５５ｍｌ／ｈおよびＬａｂ３９４３では６５ｍｌ／ｈである。
【０１５８】
限外濾過の有効性を検証するために、最初に、出発溶液（１００ｍｌ）の通過後に回収された保持液画分および濾液画分に由来するサンプルを用いて、細胞反応を測定した。
【０１５９】
その際、保持液を出発サンプルに連続的に注入しながら、閉回路で限外濾過を行った。濾液の除去に起因する液体の損失を補償するために、注入用の水を添加することにより、サンプルの体積を出発体積になるように連続的に調整した。この際、１時間、２時間、および３時間の限外濾過の後のサンプルから採取された試料を用いて、細胞試験を行った。
【０１６０】
Ｅ１５６５マトリックスでの結果を図１７に示す。
【０１６１】
保持液画分により誘発された反応は、４つの細胞試験で未濾過のサンプルで観測されたものと依然として同様である。しかしながら、Ｒａｗ細胞およびＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞で濾液画分に反応して、有意な炎症反応が観測される。これらのデータは、ＰＧＮ解重合生成物は通過させるがＰＧＮおよびＬＰＳは通過させない（とくに後者が凝集体の形態である場合）フィルターのカットオフ閾値（５ｋＤａ）に対応する。一方、保持液で炎症反応の減少が見られないことから、フィルターに１回通過させてもマトリックスの炎症反応性を低減するのに有効でないことが示唆される。この理由は、保持液画分／濾液画分間の分割が２５対１であり、小さい炎症性分子を除去するのに不十分であることにある。
【０１６２】
連続限外濾過は、ＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞で引き起こされる反応を減少させるのに有効であるが（予測可能であった）、それだけでなく、Ｒａｗ細胞およびＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞でも有効である。ＰＧＮおよびＬＰＳによるＥ１５６５の汚染を考えると、最後の２つの細胞型での反応の減少は、間違いなく、小さい炎症性分子の相乗活性の低減に関連付けられる。
【０１６３】
Ｌａｂ３９４３マトリックスでの結果を図１８に示す。
【０１６４】
予想どおり、ＭＤＰに関連付けられる炎症活性は、濾液中に見いだされる（ＨＥＫ−ＮＯＤ２）。有意な反応はまた、ＨＥＫ−ＴＬＲ４細胞でも観測される。この結果から、ＬＰＳは、Ｅ１５６５マトリックス中に存在するときほど凝集していない構造配置をとることにより、フィルターを通り抜けることが可能であることが示される。
【０１６５】
Ｅ１５６５のときと同様に、連続濾過は、ＰＧＮ解重合生成物負荷を減少させるのに有効であり、これは、ＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞反応（直接的影響）の明らかな低減により、ならびにＲａｗ細胞およびＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞の反応性（相乗作用）のより小さいただし有意な減少により、認識可能である。
【０１６６】
実施例６：  酵素処理の効果
この試験の目的は、グルコースポリマーマトリックス中に存在する汚染物質の炎症誘発反応性を減少させる工業用酵素の能力を試験することである。
【０１６７】
サンプルを３２％（重量／体積）で調製し、以下に記載の条件に従って酵素の存在下で処理する。処理後、酵素を加熱により脱活性化し、溶液を無菌０．２２μｍフィルターに通して濾過し、次いで、細胞試験に使用する。
【０１６８】
汚染物質負荷を低減する能力に関して、以下の３種の工業用酵素調製物を試験した。
・Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）：  ０．４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、ｐＨ１０、５０℃で４時間および２４時間のインキュベーション。
・ＳＥＢｆｌｏ（登録商標）Ｔｌ：  ０．３５ｍｇ／ｇのマトリックス、５０℃、ｐＨ５で３０分間〜２４時間のインキュベーション。
・ＳＥＢＰｒｏ（登録商標）ＦＬ１００：  ４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、ｐＨ３、５５℃で１時間〜２４時間のインキュベーション。
【０１６９】
試験のために選択された２種のマトリックスは、次のとおり、すなわち、Ｅ３０６３（微分解ＰＧＮおよび痕跡量のＬＰＳによる強い汚染）およびＥ５２５０（弱いＰＧＮ汚染ならびにＰＧＮおよびＬＰＳ以外の炎症性分子の存在）である。
【０１７０】
Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）による２種のマトリックスの処理の効果を図１９に示す。
【０１７１】
Ｐ−１１．１１マトリックス（非汚染対照）への酵素溶液の添加は、Ｒａｗ、ＨＥＫ−ＴＬＲ２、ＨＥＫ−ＴＬＲ４のいずれの細胞でも炎症反応を誘発しない。ＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞でわずかな増加が観測されることから、痕跡量のＰＧＮ分解生成物の存在が示唆される。しかしながら、これらの結果から、実験条件下で使用される酵素は、主要な炎症誘発汚染物質を導入しないことが示される。
【０１７２】
Ｅ３０６３マトリックスで行われた試験から、Ｒａｗ細胞およびＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞の反応の減少が観測されるので、酵素は、おそらく、ＰＧＮに対して弱い破壊作用を有する。処理は、ＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞反応の増加を引き起こす。これは、ＰＧＮの部分分解に対応する。一方、ＨＥＫ−ＴＬＲ４細胞反応の増加もまた、観測される。酵素調製物がいかなる汚染をも導入しないことを考えると、ＬＰＳの出現は、おそらく、マトリックス自体からのこの汚染物質の放出に起因する。
【０１７３】
Ｅ５２５０マトリックスの酵素処理は、４種の細胞型で炎症反応の増加を誘発する。最初は、このマトリックスは、弱い炎症反応を引き起こした。したがって、酵素は、マトリックスからＰＧＮ型およびＬＰＳ型の汚染物質を放出したことが、ＴＬＲ２反応およびＴＬＲ４反応の増加から示唆される。
【０１７４】
Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）は、通常、食品加工製品の清澄化剤として使用される。酵素は、おそらく、通常０．２２μｍフィルターを介する濾過工程により除去されるマクロ複合体（細菌デブリ）を解離させたことが、得られた結果から示唆される。これらの炎症性分子を可溶化させることにより、酵素は、細胞試験で反応の誘発を達成した。
【０１７５】
ＳＥＢｆｌｏ（登録商標）ＴＬによるＥ５２５０マトリックスの処理の効果を図２０に示す。
【０１７６】
Ｐ−１１．１１マトリックスへの酵素溶液の添加は、４種の細胞型で炎症反応を誘発しない。これは、実験条件下で使用される酵素が汚染物質を導入しないことの証拠である。
【０１７７】
Ｅ５２５０マトリックスの処理は、Ｒａｗ細胞およびＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞で炎症反応のわずかな減少を誘発する。酵素は、本質的にそのβ−グルカナーゼ性に関して記載される。しかしながら、観測された細胞反応の減少は、ＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞反応の増加を伴う。これらのデータから、酵素調製物はまた、ＰＧＮを分解可能な活性を含有することが示唆される。
【０１７８】
ＰＧＮ分解生成物の出現と並行して、酵素の存在下でＴＬＲ４反応のわずかな増加が観測されるが、とはいえ、後者は汚染されていない。以上と同様に、酵素は、おそらく、炎症性汚染物質を放出したが、Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）を用いて観測されたものよりも程度が低い。
【０１７９】
ＳＥＢＰｒｏ（登録商標）ＦＬ１００によるＥ３０６３マトリックスの処理の効果を図２１に示す。
【０１８０】
Ｐ−１１．１１マトリックスへの酵素調製物の添加は、ＨＥＫ−ＴＬＲ４細胞で強い炎症反応を誘発し、さらには、Ｒａｗ細胞およびＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞で弱いただし有意な反応を誘発する。これらのデータから、酵素はＬＰＳおよび痕跡量のＰＧＮで汚染されていることが示唆される。
【０１８１】
Ｅ３０６３マトリックスへの酵素の添加は、ＴＬＲ２反応のわずかな減少を誘発し、ＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞反応の増加が伴う。これらのデータから、ＳＥＢＰｒｏ（登録商標）ＦＬ１００は、ＰＧＮに対して弱い破壊作用を有することが示唆される。しかしながら、その使用は、必然的に、ＬＰＳを除去するために先行する除染工程を必要とするであろう。
【０１８２】
実施例７：  樹脂上の通過による処理の効果
この試験の目的は、グルコースポリマーマトリックス中に存在する汚染物質を保持する、したがって、このマトリックスの炎症誘発反応性を低減する、工業用樹脂の能力を試験することである。
【０１８３】
Ｅ１５６５マトリックス（３２％重量／体積で無菌水中に可溶化されたもの）を用いて試験を行った。なぜなら、それは、製造回路で見いだされうる種々のタイプの炎症誘発分子で汚染されているからである（ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＮＯＤ２反応）。
【０１８４】
実験では、２０ｍｌの各樹脂（ベッド体積）を含有するカラムを用いて、除染される溶液を連続的に溶出させた。カラムを通過させる前の溶液（汚染対照）を用いて、次いで、４体積（５回通過）および１０体積（１１回通過）の溶液を通過させた後で回収されたサンプルを用いて、炎症反応性に関する細胞試験を行った。この手順により、グルコースポリマーの存在が樹脂飽和現象を引き起こさなかったかを検証することが可能である。
【０１８５】
結果を図２２に示す。
【０１８６】
種々の樹脂上の溶液の通過は、Ｒａｗ細胞と接触したときにＥ１５６５マトリックスの炎症反応性の減少を引き起こす。ＦＰＸ６６を除いて、反応の減少は、他の樹脂では少なくとも５０％に達する。ＳＤ２樹脂を通過した後、減少は、７０％にも達することから、この樹脂は、Ｅ１５６５マトリックス中に含有される炎症誘発活性を有する汚染性分子の除去に最も有効であることが示唆される。いずれにせよ、５回通過と１１回通過との間で有意差が観測されないことから、いかなる基質飽和現象も除外される。
【０１８７】
Ｅ５２５０マトリックスに対するＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞の反応性は、種々の樹脂を通過した後で有意に変化しないことから、これらの処理は、汚染ＰＧＮ負荷の低減に有効でないことが示唆される。
【０１８８】
ＭＮ−１００樹脂およびＸＡＤ−１６００樹脂は、それ自体で、Ｅ１５６５マトリックスに対するＨＥＫ−ＴＬＲ４反応を低減するのに非常に有効であることが見いだされた。これらのデータから、これらの２種の樹脂は、ＬＰＳ型の分子を保持する高い容量を有することが示唆される。反対に、他の樹脂は、この汚染物質を保持するのにほとんどさらにはまったく有効でない。
【０１８９】
最後に、まったく有効でないＦＰＸ６６を除いて、種々の樹脂は、マトリックスに対するＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞反応を中程度に低減する。しかしながら、観測された効果は、依然として弱いことから、樹脂は、ＰＧＮ分解生成物を保持する弱い能力を有することが実証される。
【０１９０】
痕跡量のＬＰＳの存在以外に、Ｅ１５６５マトリックスは、ＰＧＮおよびその分解生成物で強く汚染されている。後者は、それ自体は、ほとんど炎症反応性を有していない。一方、それらは、ＴＬＲと相互作用するＰＧＮやＬＰＳなどの他の炎症性分子と相乗的に作用して、全免疫反応を増悪しうる。
【０１９１】
この実施例で行われた試験から、種々の樹脂を通過した後でＲａｗ細胞の反応性の有意な減少が示される。樹脂上の通過がＴＬＲ２反応を変化させないので、全炎症反応のこの減少は、ＰＧＮの保持の結果ではない。
【０１９２】
７種の樹脂のうち２種のみ（ＭＮ−１００、ＸＡＤ−１６００）は、ＴＬＲ４反応の低減に明らかに有効である。したがって、そのことから、Ｒａｗ細胞で観測された炎症反応の減少は、少なくとも部分的には、これらの２種の樹脂上をマトリックスが通過した後のＬＰＳの保持の結果であると推定することが可能である。
【０１９３】
ＦＰＸ６６を除いて、樹脂はすべて、ＰＧＮ分解生成物を中程度に保持する。炎症反応の増悪に及ぼすこれらの低分子の影響を考えると、樹脂の主要効果は、これらの低分子に関連付けられる相乗効果を除去することであることが、これらの結果から示唆される。
【０１９４】
ＦＰＸ６６マトリックスのときと同様に、その効果は、おそらく、ＬＰＳ以外の炎症性分子およびＰＧＮおよびその分解生成物の除去に関連付けられる。この仮説は、この樹脂が、全炎症反応を低減するのに最も有効でないという事実と矛盾しない。
【０１９５】
全体として、特定の賢明に選択された工業用樹脂によるマトリックスの処理は、ＰＧＮ以外の炎症性汚染物質を除去するのに有効であるが、それだけでなく、これらの分子間で観測される相乗作用を低減するのに有効であることが証明されうることが、これらのデータから示唆される。いくつかの工業用炭素は、ＰＧＮを除去するのにとくに有効であることが、本研究の実施例４から示される。したがって、２つの型の処理を組み合わせる手順により、種々のファミリーの汚染物質を標的として、炎症反応性を含まないマトリックスを提供することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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