(57)【要約】  本発明は、パクタマイシンに耐性である哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化する合成または単離ポリヌクレオチドを提供する。パクタマイシン耐性は、１８Ｓ ｒＲＮＡ配列における１またはそれ以上の単一残基の置換、該置換を含有するそのフラグメント、それに相補的な配列、または、それらと実質的に同一の配列によってもたらされる。関連するシステム、方法およびキットもまた、記載される。
2015519899.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パクタマイシンに耐性である哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化する合成または単離ポリヌクレオチド（ここで、該パクタマイシン耐性は、１８Ｓ ｒＲＮＡ配列における１またはそれ以上の１塩基置換によりもたらされる。）、該置換基を含有するそのフラグメント、それと相補的な配列、または、それらと実質的に同一の配列。
【請求項２】
１塩基置換が、マウス１８Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号：２３）のＧ９６３、Ａ９６４、Ｃ１０６５またはＣ１０６６に対応する位置である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
１塩基置換が、配列番号：２３の位置Ｇ９６３に対応する位置である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
１塩基置換が、配列番号：２３のＧ９６３Ａ置換に対応する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ポリヌクレオチドが、ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡまたはマウス１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ポリヌクレオチドが、Ｇ９６３Ａ置換を有しない配列番号：２３を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコード化される哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡ。
【請求項８】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを発現する、発現ベクター。
【請求項９】
ポリヌクレオチドが、ｒＤＮＡ配列の５’ ＥＴＳおよびＩＴＳ１をさらに含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
ｐｏｌ−Ｉプロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターをさらに含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項１１】
３’ ＥＴＳまたはＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルをさらに含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項８ないし１１のいずれか一項に記載の発現ベクターおよび／または該発現ベクターを含む細胞を含む、キット。
【請求項１４】
組み換えｍＲＮＡを優先的に翻訳する方法であって、
哺乳動物細胞中で請求項１に記載の合成ポリヌクレオチド（ここで、合成ポリヌクレオチドは、１８Ｓ ｒＲＮＡの組み換えｍＲＮＡへの優先的な結合をもたらす１またはそれ以上の変異を導入するために改変されている。）を発現させ、
組み換えｍＲＮＡを該細胞に提供し、そして
該細胞を、細胞の内在性４０Ｓ リボソームサブユニットからのタンパク質合成を低減または排除するのに充分な量のパクタマイシンに暴露し、それ故に、該細胞におけるタンパク質合成を、主として請求項１に記載の合成ポリヌクレオチドにより発現される１８Ｓ ｒＲＮＡを含む４０Ｓ リボソームサブユニットに限定し、組み換えｍＲＮＡを優先的に翻訳すること
を含む、方法。
【請求項１５】
リボソーム機能を改変する１８Ｓ ｒＲＮＡにおける変異を同定する方法であって、
（ａ）パクタマイシンに耐性である、哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化する合成ポリヌクレオチドにさらなる変異を導入し（ここで、該パクタマイシン耐性は、１８Ｓ ｒＲＮＡ配列における１またはそれ以上の１塩基置換によりもたらされる。）、
（ｂ）宿主細胞において、該さらなる変異を有する合成ポリヌクレオチドをパクタマイシン存在下で発現させ、そして、
（ｃ）該さらなる変異をしていない合成ポリヌクレオチドを発現する対照細胞と比較して、宿主細胞のリボソームにおける変化を検出し、それ故に、１つの変化したリボソーム機能として該さらなる変異を同定すること
を含む、方法。
【請求項１６】
合成ポリヌクレオチドが、宿主細胞に導入された発現ベクター中に存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
パクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡが、マウス１８Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号：２３）のＧ９６３、Ａ９６４、Ｃ１０６５またはＣ１０６６に対応する位置に１塩基置換を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
１塩基置換が、配列番号：２３におけるＧ９６３Ａ置換に対応する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
合成ポリヌクレオチドが、Ｇ９６３Ａ置換を有しない配列番号：２３を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物細胞における増強された翻訳効率を有するリボソームを製造する方法であって、
（ａ）パクタマイシン耐性の哺乳動物１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化する合成ポリヌクレオチドにさらなる変異を導入し（ここで、該パクタマイシン耐性は、１８Ｓ ｒＲＮＡ配列における１またはそれ以上の１塩基置換によりもたらされる。）、
（ｂ）哺乳動物宿主細胞において該さらなる変異を有する合成ポリヌクレオチドを発現させ、
（ｃ）該細胞をパクタマイシン存在下で培養し、そして、
（ｄ）該さらなる変異をしていない合成ポリヌクレオチドを発現する対照細胞と比較して、細胞における増強された翻訳効率を検出し、それ故に、増強された翻訳効率を有するリボソームを製造すること
を含む、方法。
【請求項２１】
合成ポリヌクレオチドが、宿主細胞に導入された発現ベクター中に存在する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
パクタマイシン耐性の１８Ｓ ｒＲＮＡが、マウス１８Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号：２３）のＧ９６３、Ａ９６４、Ｃ１０６５またはＣ１０６６に対応する位置に１塩基置換を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
１塩基置換が、配列番号：２３におけるＧ９６３Ａ置換に対応する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
合成ポリヌクレオチドが、Ｇ９６３Ａ置換を有しない配列番号：２３を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
翻訳効率が、宿主細胞における特定のポリペプチドのレベルを測定することにより決定される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
引用する優先権文献
本出願は、２０１２年５月２１日出願の米国仮特許出願第６１／６４９，４５３号および２０１３年３月１２日出願の米国仮特許出願第６１／７７８，１９４号に基づいて、米国特許法第１１９条（ｅ）に規定される優先権の利益を主張する。上記出願日の優先権は、本出願により主張され、これらの仮特許出願の開示は、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
【０００２】
配列表の挿入
本出願は、ＥＦＳウェブを介して電子的に本明細書と共に提出された配列表の電子的に同等のコピー、およびＥＦＳウェブを介して電子的に本明細書と共に提出された配列表のコンピューターで読み出し可能な形式を含み、３０，８７４バイトの、２０１３年５月２０日に作成された、“37651506001WO Sequence＿Listing.txt,”と称されるファイルを含む。それは、引用によりその全体を本明細書中に包含させる。
【０００３】
政府支援に関する報告
本明細書に記載のされる発明は、米国国立衛生研究所(ＮＩＨ)から、助成金番号ＧＭ０７８０７１号により助成を受けて行った。米国政府は、本発明において一定の権利を保有する。
【背景技術】
【０００４】
背景
リボソームは、細胞におけるタンパク質合成を触媒する巨大分子構造である。それらは、一般的に、多数のタンパク質および数種のＲＮＡからなる２つのサブユニットで構成される。タンパク質は、サブユニットの構造、安定性、および活性に関与している。しかしながら、概して、多くがリボソーム機能に必須ではないか、または付加的なリボソーム外での機能を有するため、特定の機能を個々のリボソームタンパク質に割り当てることは困難であった。対照的に、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は、リボソームサブユニットの全体の形状に関与し、かつタンパク質合成を触媒する酵素活性に関与する。ｒＲＮＡは、ｍＲＮＡ動員、特定のｍＲＮＡの翻訳効率の調節、およびリボソームの入れ替え（shunting）の円滑化を含む、タンパク質合成の他の面にも影響を与え得るという証拠が相次いでいる。
【０００５】
リボソームの集積（assembly）におけるｒＲＮＡの役割、タンパク質合成、およびｒＲＮＡ機能の非規範的（non-canonical）な面を研究するためは、ｒＲＮＡ配列を変更し、修飾リボソームサブユニットの活性をインビボでモニターすることができることを要する。ｒＲＮＡプロセシング、リボソーム集積、および高等真核生物ｒＲＮＡの機能の分析は、ｒＲＮＡを改変し、次いでその機能的に研究することを可能にする発現系がないことにより妨げられてきた。
【０００６】
本技術分野において、改変型ｒＲＮＡを発現し、とりわけ哺乳動物系で機能分析を行うための効果的なシステムが強く必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
概要
一面において、パクタマイシンに耐性である哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化する合成または単離ポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドにおいて、パクタマイシン耐性は、１８Ｓ ｒＲＮＡ配列における１またはそれ以上の１塩基置換により提供される。該置換を有するかかるポリヌクレオチドのフラグメント、相補的配列、および実質的に同一の配列もまた提供される。ある態様において、パクタマイシン耐性を提供するポリヌクレオチドにおける１塩基置換は、マウス１８Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号：２３）のＧ９６３、Ａ９６４、Ｃ１０６５またはＣ１０６６に対応する位置である。ある好ましい態様において、１塩基置換は、配列番号：２３の位置Ｇ９６３に対応する位置である。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、配列番号：２３におけるＧ９６３Ａ置換に対応する、１塩基置換を含む。
【０００８】
ある態様において、ポリヌクレオチドは、パクタマイシン耐性のヒト １８Ｓ ｒＲＮＡまたはマウス １８Ｓ ｒＲＮＡをコード化する。ある態様において、ポリヌクレオチドは、Ｇ９６３Ａ置換を有しない配列番号：２３を包含する。ある関連する面において、合成または単離ポリヌクレオチドによりコード化される哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡ分子を提供する。別の面において、パクタマイシン耐性の１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化するポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。これらのベクターのいくつかにおいて、ポリヌクレオチドはさらに、ｒＤＮＡ配列の５’ＥＴＳ（外部転写スペーサー領域）およびＩＴＳ１（内部転写スペーサー領域）を含み得る。ある態様において、ベクターはさらに、ｐｏｌ−Ｉプロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。ある態様において、ベクターはさらに、３’ＥＴＳまたはＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルを含む。別の関連する面において、発現ベクターを含む宿主細胞が本明細書中に記載される。
【０００９】
別の面において、リボソーム機能を改変する１８Ｓ ｒＲＮＡにおける変異を同定する方法を提供する。該方法は、（ａ）パクタマイシンに対して耐性である哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化する合成ポリヌクレオチドにさらなる変異を導入すること（ここで、パクタマイシン耐性は、１８Ｓ ｒＲＮＡ配列における１またはそれ以上の１塩基置換により提供される）、（ｂ）宿主細胞において、パクタマイシンの存在下、該さらなる変異を有する合成ポリヌクレオチドを発現すること、そして（ｃ）該さらなる変異をしていない合成ポリヌクレオチドを発現する対照細胞と比較して、宿主細胞のリボソームにおける変化を検出することを伴う。これらの工程は、該さらなる変異を、１つの改変されたリボソーム機能として同定することを可能にする。典型的に、合成ポリヌクレオチドは、宿主細胞に導入される発現ベクター中に存在する。ある態様において、パクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡは、マウス１８Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号：２３）のＧ９６３、Ａ９６４、Ｃ１０６５またはＣ１０６６に対応する位置に１塩基置換を有する。例えば、１８Ｓ ｒＲＮＡは、配列番号：２３におけるＧ９６３Ａ置換に対応する置換を有し得る。ある方法は、Ｇ９６３Ａ置換を有しない配列番号：２３を含む合成ポリヌクレオチドを用いる。
【００１０】
別の面において、哺乳動物細胞における増強された翻訳効率を有するリボソームを製造する方法を提供する。これらの方法は、（ａ）パクタマイシン耐性の哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化する合成ポリヌクレオチドにさらなる変異を導入すること（ここで、パクタマイシン耐性は、１８Ｓ ｒＲＮＡ配列における１またはそれ以上の１塩基置換により提供される）、（ｂ）宿主哺乳動物細胞に、該さらなる変異を有する合成ポリヌクレオチドを導入すること、（ｃ）パクタマイシンの存在下で該細胞を培養すること、そして（ｄ）該さらなる変異をしていない合成ポリヌクレオチドを発現する対照細胞と比較して、該細胞における増強された翻訳効率を検出することを伴う。これらの方法により、増強された翻訳効率を有するリボソームを得ることができる。典型的に、これらの方法に用いる合成ポリヌクレオチドは、宿主細胞に導入する発現ベクター中に存在する。ある態様において、パクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡは、マウス１８Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号：２３）のＧ９６３、Ａ９６４、Ｃ１０６５またはＣ１０６６に対応する位置に１塩基置換を有する。該方法のいくつかは、配列番号：２３におけるＧ９６３Ａ置換に対応する１塩基置換を有する合成ポリヌクレオチドをコード化する１８Ｓ ｒＲＮＡを用いる。例えば、該方法は、Ｇ９６３Ａ置換を有しない配列番号：２３を含む合成ポリヌクレオチドを利用し得る。種々の態様において、翻訳効率は、宿主細胞における特定のポリペプチドのレベルを測定することにより決定され得る。
【００１１】
別の面において、本明細書に記載の通り、パクタマイシンに耐性である哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化する合成ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含むキットを提供する（ここで、パクタマイシン耐性は、１８Ｓ ｒＲＮＡ配列における１またはそれ以上の１塩基置換により提供される。）。一態様において、該キットは、発現ベクターを含む細胞をさらに含む。
【００１２】
別の面において、組み換えｍＲＮＡを優先的に翻訳する方法であって、該方法は、パクタマイシンに耐性である哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化するポリヌクレオチドを哺乳動物細胞中で発現することを含み（ここで、１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化するポリヌクレオチドは、１またはそれ以上のさらなる変異を導入してさらに改変されており、該１またはそれ以上のさらなる変異が、ポリヌクレオチドによりコード化される１８Ｓ ｒＲＮＡへの組み換えｍＲＮＡの優先的結合を提供する。）、該方法は、細胞に組み換えｍＲＮＡを提供し、該細胞を、細胞の内在性４０Ｓリボソームサブユニットからのタンパク質合成を低減または排除するのに充分な量のパクタマイシンに暴露し、それ故に、細胞におけるタンパク質合成を、主としてポリヌクレオチドによりコード化される１８Ｓ ｒＲＮＡを含む４０Ｓリボソームサブユニットに限定し、そして組み換えｍＲＮＡが優先的に翻訳されることをさらに含む。
【００１３】
本明細書に記載の発現系、方法およびキットの性質と利点のさらなる理解は、本明細書の残りの部分および特許請求の範囲を参照することにより明らかになり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１ａ〜１ｃは、一実施態様による、ｒＲＮＡ転写プロセシング経路およびｒＲＮＡ発現系を示す。（ａ）ｒＲＮＡ発現プラットフォームの略図である。黒色の囲いは、細胞を示し、黒い線で示されたｍＲＮＡおよび円で示されたリボソームサブユニット（６０Ｓサブユニットが大きい円；４０Ｓサブユニットが小さい円）を含むポリソームを含む。より暗色の４０Ｓサブユニットは、抗生物質感受性の内在性サブユニットであり、白色の４０Ｓサブユニットは、合成１８Ｓ ｒＲＮＡを含み、抗生物質耐性である。サブユニットが物理的に区別可能であることを示すために、異なる色を用いる。細胞透過性抗生物質を、内在性４０Ｓサブユニットに結合させ、その活性を阻害する。合成４０Ｓサブユニットは影響を受けず、これらの条件下で翻訳が可能である。（ｂ）マウス４７Ｓの一次ｒＲＮＡ転写産物。４７Ｓ ｒＲＮＡは、横線として図示される。種々のセクションが、コード化されたｒＲＮＡを示す。１８Ｓ ｒＲＮＡは、４０Ｓ リボソームサブユニットのＲＮＡ構成成分であり、２８Ｓおよび５．８Ｓ ｒＲＮＡは、６０ＳサブユニットのＲＮＡ構成成分である。黒色線は、外部転写スペーサー領域（５’ ＥＴＳおよび３’ ＥＴＳ）および内部転写スペーサー領域（ＩＴＳ１およびＩＴＳ２）を示す。転写スペーサー中の切断部位は、縦線およびラベルで示される。（ｃ）ｒＲＮＡ転写プロセシング経路。転写産物前駆体のプロセシングは、多数のタンパク質およびＲＮＡファクターと関係し、種々の生物において広く研究されてきた。マウス４７Ｓ ｒＲＮＡ前駆体は、核内でＲＮＡ ポリメラーゼＩにより転写され、続いて、２つの可能性のある経路によりプロセシングされる。切断は、４７Ｓ ｒＲＮＡから１８Ｓ、５．８Ｓおよび２８Ｓ ｒＲＮＡへの方向へ進む；４５Ｓ ｒＲＮＡは、記載の通り、２つの経路により１８Ｓ ｒＲＮＡへプロセシングされ得て、ここで、種々の中間体産物が生成される。プロセシング部位および１８Ｓ ｒＲＮＡの成熟の結果生じる主要な切断産物は、各切断工程で示される。５．８Ｓおよび２８Ｓ ｒＲＮＡのプロセシングは、さらなる切断工程および中間体産物を伴い、それらは記載されていない。
【図２】図２ａ〜２ｃは、ｒＲＮＡコンストラクトのプロセシングの分析を示す。（ａ）ｐ１８Ｓ．１〜Ｓ．６コンストラクトから発現されるＲＮＡの略図。コンストラクトは、ｐｏｌ−Ｉプロモーターおよび３’ＥＴＳ、またはＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルの何れかを含む。５’ＥＴＳおよびＩＴＳ１を太い黒線で示し、１８Ｓ ｒＲＮＡを黄色バーで示し、欠失スペーサー配列を細い点線で示す。切断部位が示される。（ｂ）１８Ｓ ｒＲＮＡプロセシングのノーザンブロット分析。Ｎ２ａ細胞を記載のコンストラクトでトランスフェクトし、ＲＮＡを方法(実施例７)に記載のノーザンブロッティング法により分析した。一本鎖ＲＮＡサイズラダーのヌクレオチド部位を、ブロットの左側に示す。このブロットは、次のコントロール(対照)を含む：Ａ：１８Ｓ ＷＴ転写産物１００ｎｇ、Ｂ：１８Ｓ タグ付けした転写産物１００ｎｇ、Ｃ：タグ付けしていないｐ１８Ｓ．１（Ｐｏｌ−１）を用いてトランスフェクトしたＮ２ａ細胞からの全ＲＮＡ２μｇ、Ｄ：モック（mock）をトランスフェクトしたＮ２ａ細胞からの全ＲＮＡ２μｇ、Ｅ：Ｎ２ａ細胞からの全ＲＮＡ２μｇ。合成ｒＲＮＡを、α−タグプローブを用いて挿入したタグ配列にハイブリダイゼーションすることにより検出した。上方のバンド（アスタリスク）は完全長および部分的にプロセシングされた転写産物に相当する。成熟１８Ｓ ｒＲＮＡの位置が示される。（ｃ）ｐ１８Ｓ．１コンストラクト（Ｐｏｌ−１）からの１８Ｓ ｒＲＮＡ集積の経時変化。これらの実験に関して、Ｎ２ａ細胞をトランスフェクトし、記載の通り、トランスフェクション後の種々の時間にＲＮＡを採取した。コントロールは（ｂ）のものと同一である。
【００１５】
【図３】図３ａ〜３ｃは、１８Ｓ ｒＲＮＡプロセシングに対する５’ＥＴＳ配列の寄与度の分析を示す。（ａ）図２に示したコンストラクトの略図。コンストラクトは、ｐｏｌ−Ｉプロモーターおよび３’ＥＴＳを含む。（ｂ）１８Ｓ ｒＲＮＡプロセシングのノーザンブロット分析。Ｎ２ａ細胞を記載のコンストラクトでトランスフェクトし、ＲＮＡを方法に記載のノーザンブロッティング法により分析した。合成ｒＲＮＡを、α−タグプローブを用いて挿入したタグ配列にハイブリダイゼーションすることにより検出した。アスタリスクは、完全長および部分的にプロセシングされた転写産物を示す。成熟１８Ｓ ｒＲＮＡの位置を示す。このブロットのコントロールは、図２に記載の通りである。（ｃ）上：Ｕ３ ｓｎｏＲＮＡ ５’ヒンジ領域（配列番号：２５）と、ｐ１８Ｓ．１（配列番号：２６）、ｐ１８Ｓ．８Δ（配列番号：２７）、およびｐ１８Ｓ．８ｍ（配列番号：２８）との比較を示す図；ｐ１８Ｓ．１と合致する相補的配列を強調表示する。中：記載のコンストラクトを用いてトランスフェクトしたＮ２ａ細胞からの合成ｒＲＮＡ発現を示すノーザンブロッティング法。このブロットは、パネル（ｂ）と同様、α−タグプローブを用いてハイブリダイゼーションした。このブロットのコントロールは、図２に記載の通りである。
【図４】図４ａ〜４ｄは、Ｎ２ａ細胞におけるパクタマイシン耐性変異体の分析を示す。（ａ）野生型または変異１８Ｓ ｒＲＮＡコンストラクトを発現する細胞におけるタンパク質発現。細胞を、トランスフェクトしない（ＮＴ）か、または野生型（ＷＴ）１８Ｓ ｒＲＮＡまたは記載の点変異を含む１８Ｓ ｒＲＮＡを発現するコンストラクトを用いてトランスフェクトした。その後、細胞を、方法に記載の通り、示した１００ｎｇ／ｍｌ パクタマイシンの不存在または存在下で３５Ｓパルス標識し、細胞を溶解し、等量の細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。代表的なオートラジオグラムを示す。（ｂ）野生型または変異型１８Ｓ ｒＲＮＡおよびｐＧＬ４．１３（Promega）を用いてトランスフェクトした細胞からの細胞溶解物における相対的ルシフェラーゼ活性。Ｎ２ａ細胞を、示した１８Ｓ ｒＲＮＡコンストラクトおよび蛍ルシフェラーゼコンストラクト（ｐＧＬ４．１３）を用いて同時トランスフェクトし、ルシフェラーゼ発現を細胞溶解物からモニターした。ルシフェラーゼ活性を、ＷＴコンストラクトを用いてトランスフェクトした細胞から得られた溶解物（それを１．０とする）と比較する。同時トランスフェクションおよびアッセイ法の詳細は、実施例７に記載する。（ｃ）ＷＴまたは変異ｒＲＮＡコンストラクトを用いてトランスフェクトした細胞についてのノーザンブロッティング法による合成ｒＲＮＡレベルの定量。合成ｒＲＮＡを、α−タグプローブを用いるハイブリダイゼーションにより検出した。シグナルを、Molecular Dynamics ホスフォイメージャーを用いて定量し、ＷＴを１００％として、ＷＴと比較して示す。（ｄ）細胞を、野生型またはＧ６９３Ａ変異含有１８Ｓ ｒＲＮＡコンストラクトの何れかを用いてトランスフェクトし、示した種々の量のパクタマイシンを用いてインキュベートした。細胞を、３５Ｓパルス標識し、細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。代表的なオートラジオグラムを示す。パネル（ｃ）および（ｄ）において、エラーバーは、３つの独立した実験からの標準偏差を示す。
【００１６】
【図５】図５ａ〜５ｅは、合成１８Ｓ ｒＲＮＡを含むリボソームサブユニットのショ糖密度勾配分布を示す。（ａ）ｄｄＣＴＰプライマー伸張アッセイ。野生型の部分配列（配列番号：２９）および変異１８Ｓ ｒＲＮＡを示す。マウス１８Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド９６３に位置する、パクタマイシン耐性変異（Ｇ６９３Ａ）の位置を、強調表示する（配列番号：３０）。オリゴヌクレオチドプライマー６９３ＲＴ（配列番号：３１）の配列を、１８Ｓ ｒＲＮＡに相補的に合致するように整列させて示す。ｄｄＣＴＰの存在下で行ったプライマー伸張反応は、プライマーの上流に位置する最初のＧで終了し得る。これは、野生型１８Ｓ ｒＲＮＡテンプレートからの４ｎｔ−伸張産物（配列番号：３２）およびＧ６９３Ａ変異１８Ｓ ｒＲＮＡからの６ｎｔ−伸張産物（配列番号：３３）をもたらし得る。それぞれの場合に、伸張ヌクレオチドは３’末端に示される。（ｂ）上：ｐ１８Ｓ．１（Ｇ６９３Ａ）を用いてトランスフェクトしたシクロヘキシミド処理したＮ２ａ細胞からの溶解物を、１０−５０％（ｗ／ｖ）線形スクロース勾配中で画分化した。ピーク（左から右）は、４０Ｓリボソームサブユニット、６０Ｓリボソームサブユニット、８０Ｓ単一リボソーム、およびポリソームを示す。ＲＮＡ分析用に集められた画分（Ａ−Ｈ）を示す。下：画分Ａ−Ｈから調製されたＲＮＡを、エチジウムブロマイドで染色したアガロースゲルにおいて可視化した。２８Ｓおよび１８Ｓ ｒＲＮＡが示される。（ｃ）上：ＥＤＴＡにより解離されるリボソームを、１０−３５％（ｗ／ｖ）線形スクロース勾配中で画分化した。ピーク（左から右）は、４０Ｓおよび６０Ｓリボソームサブユニットを示す。中：パネル（ｂ）に記載のＲＮＡ分析。（ｄ）３３Ｐ標識されたオリゴヌクレオチドプライマー６９３ＲＴを用いてｄｄＣＴＰプライマー伸張された、パネル（ｂ）におけるスクロース勾配の画分から調製されたＲＮＡのＰＡＧＥ分析。配列決定反応（レーンｃ，ｔ，ａ，ｇ）は、同じプライマーとテンプレートとしての全ＲＮＡを用いた。上部バンドは、合成１８Ｓ ｒＲＮＡ（Ｐａｃｔｒ）から生じ、下部バンドは、内在性１８Ｓ ｒＲＮＡ（ＷＴ）から生じる。レーン１−３はコントロールである。コントロール１は、パクタマイシン耐性変異を含むか、または欠く、インビトロ転写産物の等モル混合物である。コントロール２は、野生型１８Ｓ ｒＲＮＡのみを含む、トランスフェクトしていないＮ２ａ細胞からの全ＲＮＡである。コントロール３は、テンプレートなしのコントロールである。種々の画分からのプライマー伸張産物の濃度を、ホスフォイメージャー露出から定量し、２つのバンドの比（ＷＴ：Ｐａｃｔｒ）を、挿入して示す。（ｅ）パネル（ｃ）の勾配の画分からのｄｄＣＴＰプライマー伸張。
【図６】図６ａ〜６ｂは、５’ＥＴＳまたはＩＴＳ１における欠失を含む合成１８Ｓ ｒＲＮＡの機能の分析を示す。（ａ）最適化された蛍ルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ２）を発現するモノシストロニックレポーターコンストラクトおよび上記の種々の１８Ｓ ｒＲＮＡコンストラクトで同時トランスフェクションしたＮ２ａ細胞のレポーターアッセイ。モノシストロニックコンストラクトの略図を上に示す。各実験に用いた合成ｒＲＮＡを、グラフの下に示す：ｐ１８Ｓ．１は、全長５’ＥＴＳおよびＩＴＳ１を含み、ｐ１８Ｓ．７は、５’ＥＴＳの３’領域の欠失を含み、そしてｐ１８Ｓ．２は、ＩＴＳ１を欠く。ルシフェラーゼ活性を、方法に記載の通りに決定した。種々のトランスフェクションの結果を、Ｆｌｕｃ２のFold Induction（誘導倍）として記載し、それは、野生型（パクタマイシン感受性）リボソーム（ｐ１８Ｓ．１）で得られたバックグラウンドを超えるルシフェラーゼ活性である。（ｂ）Ｆｌｕｃ２および最適化ヒトRenillaルシフェラーゼ（ｈＲｅｎ）を発現するジシストロニックなレポーターコンストラクトを用いてトランスフェクトしたＮ２ａ細胞のレポーターアッセイ。コントロールコンストラクトは、シストロン間領域中に多数のクローニング部位（ＭＣＳ）を含んだ；他のコンストラクトは、ＥＭＣＶまたはＰＶ ＩＲＥＳの何れかを含んだ。各実験に用いた１８Ｓ ｒＲＮＡコンストラクトおよびレポーターコンストラクトを、グラフ下に示す。結果は、ＩＲＥＳ活性有しないＭＣＳコンストラクトに対して標準化されたｈＲｅｎとＦｌｕｃ２の比として記載する。エラーバーは、３つの独立した実験からの標準偏差を示す。
【００１７】
【図７】図７ａ〜７ｅは、１８Ｓ ｒＲＮＡ変異の分析を示す。（ａ）コンストラクトの略図。コンストラクトは、ｐｏｌ−Ｉプロモーターおよび３’ＥＴＳを含む。パネルｂ〜ｅにおけるノーザンブロッティング法は、種々の１８Ｓ ｒＲＮＡコンストラクトを用いてトランスフェクトしたＮ２ａ細胞からのＲＮＡおよび上記のトランスフェクトしていない（コントロール）細胞からのＲＮＡを含む。（ｂ）α−タグプローブを用いる合成１８Ｓ ｒＲＮＡのノーザンブロット分析。（ｃ）パネルｂからのノーザンブロットを、α−１８Ｓ ｒＲＮＡプローブで再プローブして、同じサンプルにおける内在性１８Ｓ ｒＲＮＡを検出した。（ｄ）部位１の５’直後に位置する配列にハイブリダイズするα−５’ＥＴＳプローブを用いる、５’ＥＴＳ含有ｐｒｅ−ｒＲＮＡのノーザンブロット分析。（ｅ）部位２の３’直前に位置する配列にハイブリダイズするα−ＩＴＳ１プローブを用いる、ＩＴＳ１含有ｐｒｅ−ｒＲＮＡのノーザンブロット分析。パネルｄおよびｅにおけるサイズは、公知のｐｒｅ−ｒＲＮＡについて示され、それは図１に示されたものと一致する。
【図８】図８ａ〜８ｃは、合成ｒＲＮＡ種の沈降分析を示す。（ａ）Ｓ１００およびＰ１００画分に遠心により分別された細胞画分からの全ＲＮＡ（全）およびＲＮＡのノーザンブロット分析。ＲＮＡは、トランスフェクトしていない（Ｎ２ａ）か、または上記のｐ１８Ｓ．１（ｐｏｌ−１）もしくはｐ１８Ｓ．１（ＣＭＶ）コンストラクトを用いてトランスフェクトした細胞に由来した。野生型１８Ｓ ｒＲＮＡ（ｗｔ）およびハイブリダイゼーションタグ（タグ）を含む１８Ｓ ｒＲＮＡのインビトロ転写産物を、ハイブリダイゼーションおよびサイズコントロールとして同時に電気泳動した。ブロットを、α−１８Ｓ ｒＲＮＡプローブを用いてハイブリダイズした。右側の画像は、コントラスト調節してバンドを明確にした、アスタリスクにより示される左側のイメージの一部を示し、それは、完全長および部分的にプロセシングされた転写産物に相当する。（ｂ）このブロットを、α−タグプローブを用いてハイブリダイズした。右側のイメージは、コントラスト調節した左側のイメージの一部に相当する。内在性ｒＲＮＡのα−タグプローブを用いるバックグラウンドハイブリダイゼーションが、Ｎ２ａサンプルにおいて見られる。（ｃ）細胞を、ＩＴＳ１またはｐ１８Ｓ．２（ｐｏｌ−Ｉ）を含むか、または上記の通りＩＴＳ１を欠く何れかのｐ１８Ｓ．１（ｐｏｌ−Ｉ）を用いてトランスフェクトした。このブロットを、α−タグプローブを用いてハイブリダイズした。
【図９】図９は、希釈したプラスミドトランスフェクションからの成熟１８Ｓ ｒＲＮＡ産物の分析を示す。種々のプラスミド希釈物を用いてトランスフェクトされた細胞からの合成１８Ｓ ｒＲＮＡのノーザンブロット分析。成熟４０Ｓサブユニット由来の３つのベクターを試験した：完全長５’ＥＴＳおよびＩＴＳ１配列を含むｐ１８Ｓ．１、５’ＥＴＳ中に欠失を含むｐ１８Ｓ．７、およびＩＴＳ１中に欠失を含むｐ１８Ｓ．２。ノーザンブロッティングは、α−１８Ｓタグを用いてプローブされ、主要バンドは成熟１８Ｓ ｒＲＮＡに相当する。トランスフェクションを、トランスフェクション効率を保つために、フィラープラスミドとしてｐＢＳ ＫＳを用いて行った。合成１８Ｓ ｒＲＮＡレベルを、ｐ１８Ｓ．１コンストラクトについて１μｇのプラスミド／トランスフェクションを１００として標準化された任意のスケールで示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
Ｉ．概要
ここに記載するのは、マウス１８Ｓ ｒＲＮＡ発現系および使用方法である。このｒＲＮＡは、小分子（４０Ｓ）リボソームサブユニットのＲＮＡ構成成分であり、大分子（６０Ｓ）サブユニットの構成成分である５．８Ｓおよび２８Ｓ ｒＲＮＡと共により大きな転写前駆体の一部として同時に転写される（図１ｂ）。配列タグを、合成ｒＲＮＡを含む４０Ｓサブユニットの転写、プロセシング、および細胞内分布の実験を可能にするために、ハイブリダイゼーションにより検出され得る１８Ｓ ｒＲＮＡ中に導入した。リボソームサブユニットの翻訳をモニターするために、抗生物質パクタマイシンによる阻害に耐性を与える変異が、１８Ｓ ｒＲＮＡ中に同定された。パクタマイシンは、４０Ｓリボソームサブユニット中のＥ部位に結合し、エロンゲーション中のリボソームを介するｍＲＮＡ−ｔＲＮＡ複合体の移動を阻害することにより、翻訳を阻害すると考えられる。従って、細胞におけるパクタマイシン耐性変異を有する１８Ｓ ｒＲＮＡの発現により、該薬物は、細胞の内在性４０Ｓサブユニットからの翻訳を特異的に阻害し、そしてパクタマイシン耐性変異を含むサブユニットからの翻訳をモニターするために用いられ得る。
【００１９】
本発明において、哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡ発現系を提供する。該発現系は、マウス１８Ｓ ｒＲＮＡの伸張セグメント（expansion segment）３に挿入されている配列タグを提供し、ハイブリダイゼーションによる発現および切断をモニターすることができる。該発現系は、典型的に、内在性（パクタマイシン感受性）サブユニットからの翻訳を選択的に阻害することにより、合成１８Ｓ ｒＲＮＡを含む４０Ｓリボソームサブユニットの機能分析を可能にする、パクタマイシン耐性を提供するｒＲＮＡをコードする領域における１塩基置換もまた提供できる。そのような発現系によって、ｒＲＮＡコンストラクトは、トランスフェクトされた細胞中で好適に発現されて、正しくプロセシングされ、４０Ｓサブユニットのおよそ１５％に取り込まれ、種々の基準に基づき正常に機能することが示され得る。
【００２０】
本明細書に記載の発現系における修飾１８Ｓ ｒＲＮＡの正しいプロセシングは、１８Ｓ ｒＲＮＡ配列における突然変異または自然変異のｒＲＮＡプロセシングおよびリボソーム機能に及ぼす影響を試験する方法を提供することができ、また、転写産物前駆体における１８Ｓ ｒＲＮＡの隣接(flanking)配列の重要性を調査するためにも使用できる。例えば、以下の実施例に詳述の通り、例えば、１８Ｓ ｒＲＮＡ発現系における５’外部転写スペーサー（ＥＴＳ）および第一内部転写スペーサー（ＩＴＳ１）の効果を分析した。具体的には、欠失分析は、Ｕ３ ｓｎｏＲＮＡのための結合部位の必要性を支持するが、５’外部転写スペーサーの大セグメントおよび第一内部転写スペーサー全体(両者は、１８Ｓ ｒＲＮＡに隣接する)が、成熟サブユニットからの翻訳またはその集積に必要ではないことを示した。
【００２１】
これらの研究により、本発明は、合成ポリヌクレオチドおよび、哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡを発現し、リボソーム機能を分析するのに有用な関連する発現ベクターを提供する。本発明はまた、異常なリボソーム機能を引き起こす、ｒＲＮＡまたはリボソームタンパク質における変異を同定する方法を提供する。さらに、本発明は、改変された特性、例えば、増強された翻訳活性を有するリボソームを製造するためにリボソームｒＲＮＡ配列を改変する方法を提供する。本明細書に記載の本発明の目的は、基礎研究および合成生物学における種々の応用を見出す。
【００２２】
本明細書に記載の目的が、特定の方法、プロトコル、および試薬（それらは変更され得ることが記載されている）に限定されるべきではないことが理解されるべきである。特に断らない限り、記載されている方法の実施には、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を用いる。例えば、例示的方法は、以下の文献に記載される。Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3rd ed., 2001); Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003); Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, Wiley-Liss, Inc. (4th ed., 2000); and Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp.  42 1-463, 1988。
【００２３】
ＩＩ．定義
別段の定めがない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者に通常理解されるのと同様の意味を有する。以下の文献は、本明細書で用いる用語の多くの一般的定義を当業者に提供している。Academic Press Dictionary of Science and Technology, Morris (Ed.), Academic Press (1st ed., 1992);  Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al. (Eds.), Oxford University Press (revised ed., 2000); Encyclopaedic Dictionary of Chemistry, Kumar (Ed.), Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al. (Eds.), John Wiley & Sons (3rd ed., 2002); Dictionary of Chemistry, Hunt (Ed.), Routledge (1st ed., 1999); Dictionary of Pharmaceutical Medicine, Nahler (Ed.), Springer-Verlag Telos (1994); Dictionary of Organic Chemistry, Kumar and Anandand (Eds.), Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002); and A Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.), Oxford University Press (4th ed., 2000)。それらが本明細書に特別に適用されるように、これらの用語のいくつかのさらなる明確化が本明細書に提供される。
【００２４】
本明細書で用いる単数形“ａ”、“ａｎ”、および“ｔｈｅ”は、特に断りがなければ、複数を包含する。従って、例えば、“ａ ｃｅｌｌ”は、かかる細胞の複数を含み、“ａ ｐｒｏｔｅｉｎ”は、１またはそれ以上のタンパク質および当業者に公知のその等価物などを含む。
【００２５】
真核生物のリボソームは８０Ｓであり、小サブユニット（４０Ｓ）および大サブユニット（６０Ｓ）からなる。その４０Ｓサブユニットは、１８Ｓ ｒＮＡ（１９００ヌクレオチド）および約３３種のタンパク質を有する。大サブユニットは、５Ｓ ＲＮＡ（およそ１２０ヌクレオチド）、２８Ｓ ＲＮＡ（およそ４７００ヌクレオチド）、５．８Ｓ ＲＮＡ（およそ１６０ヌクレオチド）サブユニットおよび約４９種のタンパク質からなる。リボソームは、ｍＲＮＡにコード化される情報によりタンパク質を合成する。このプロセスの間、供給されるアミノ酸および新生ペプチドの両者がｔＲＮＡ分子に結合される。リボソームは、３つのＲＮＡ結合部位を含み、それぞれＡ、ＰおよびＥと称される。Ａ部位は、アミノアシル−ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡはアミノ酸に結合した）を結合する。Ｐ部位は、ペプチジル−ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡは、合成されているペプチドに結合した）を結合する。そして、Ｅ部位は、リボソームの外に出される前に遊離ｔＲＮＡを結合する。通常、タンパク質合成は、ｍＲＮＡの５’末端近くの開始コドンＡＵＧで始まる。ｍＲＮＡの翻訳開始コドンは、リボソームのＰ部位に最初に結合する。
【００２６】
リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）は、非転写スペーサー（ＮＴＳ）、５’外部転写スペーサー（５’ＥＴＳ）、１８Ｓ、内部転写スペーサー１（ＩＴＳ１）、５．８Ｓ、内部転写スペーサー２（ＩＴＳ２）、２８Ｓ、および３’外部転写スペーサー（３’ＥＴＳ）配列からなる、転写単位であるオペロンのタンデムリピート配列から構成される。ｒＤＮＡは、最初に、ポリシストロニックなｒＲＮＡ転写前駆体に転写される。ｒＲＮＡ成熟の間に、ＥＴＳおよびＩＴＳ断片が取り除かれ、機能しない成熟副生成物として迅速に分解される。５’外部転写スペーサー（５’ＥＴＳ）は、１８Ｓ ｒＲＮＡ形成に不可欠であり、それは、高等真核生物におけるリボソームＲＮＡ転写の最長の非翻訳領域である。
【００２７】
用語“目的のポリヌクレオチド”（または、“目的の遺伝子”もしくは“標的遺伝子”）は、シストロン、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、またはポリペプチドもしくはタンパク質産物（“目的のポリペプチド”もしくは“標的ポリペプチド”）をコード化するポリヌクレオチド配列を包含することを意図する。目的のポリペプチドの増強された発現のために、ポリペプチドをコード化する目的のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の修飾１８Ｓ ｒＲＮＡ発現系を担持する宿主細胞に導入され得る。特に、１８Ｓ ｒＲＮＡは、目的のポリペプチドの増強された翻訳をもたらす改変された１８Ｓ ｒＲＮＡを同定するために、修飾される（例えば、ランダム変異または標的とする変異）。ポリペプチドの発現のために、目的のポリヌクレオチドは、典型的に、コーディング配列と操作可能に結合した好適な転写調節エレメント（例えば、プロモーター配列）をさらに含む、発現ベクター中に存在する。ある実験法に従い、目的の種々のポリペプチド、例えば、治療用タンパク質、栄養用タンパク質および産業上有用なタンパク質が、本明細書に記載の方法での増強された発現に好適である。
【００２８】
本明細書で用いる用語“内在性”は、野生型宿主に通常見出されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味し、他方、用語“外因性”は、野生型宿主に通常見出されないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。
【００２９】
“宿主細胞”とは、異種のポリヌクレオチド配列が導入されるか、または導入されている生細胞を意味する。生細胞とは、培養細胞および生きている生物内の細胞の両方を含む。異種のポリヌクレオチド配列の細胞への導入法は公知であり、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション法、形質転換、ウイルス感染などがある。しばしば、細胞に導入される異種のポリヌクレオチド配列は、複製可能な発現ベクターまたはクローニングベクターである。ある態様において、宿主細胞は、所望の遺伝子をその染色体上またはそのゲノム上に含むように設計され得る。宿主として用いられ得る多くの宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）が、当技術分野で公知である。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3rd ed., 2001); and Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)を参照のこと。ある好ましい態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。
【００３０】
用語“ヌクレオチド配列”、“核酸配列”、“核酸”または“ポリヌクレオチド配列”は、一本鎖または二本鎖の何れかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し、他に特記されない限り、天然に生じるヌクレオチドと同様に核酸とハイブリダイズする天然ヌクレオチドの公知の類縁体も包含される。核酸配列は、例えば、真核生物配列、真核ｍＲＮＡ配列、真核ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ配列、真核ＤＮＡ（例えば、哺乳動物ＤＮＡ）からのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡまたはＲＮＡ配列であり得るが、これらに限定されない。
【００３１】
用語“操作可能に結合された”または“操作可能に連結された”とは、遺伝子要素間の機能的な結合であって、それらを、その正常な機能の実行を可能にする方法で連結させる結合を意味する。例えば、遺伝子は、その転写がプロモーターの制御下にあるとき、プロモーターに操作可能に結合されて、生産された転写産物は、遺伝子により通常コード化されるタンパク質に正常に翻訳される。同様に、翻訳エンハンサーエレメント（translational enhancer element）は、それが、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの上方制御された翻訳を可能にするとき、目的の遺伝子と操作可能に連結されている。
【００３２】
スクリーニングは、一般的に、まず初めに、どの細胞がスクリーニングマーカーを発現する、もしくは発現しないか、または機能的特徴もしくは表現型の特徴を有する、もしくは有しないかを決定し、その後、所望の特徴を有する細胞を物理的に分離する、２工程法である。選択は、同定および物理的分離が、選択マーカーの発現および／または機能的特性／表現型の特徴の検出により同時に達成されるスクリーニング形態である。例えば、ある遺伝的条件下において、選択は、他の細胞は死滅するが、マーカーを発現する細胞が生存するのを可能にする（逆もまた同様）。本明細書で用いる、スクリーニングおよび選択は、参照分子（例えば、１８Ｓ ｒＤＮＡ）の１またはそれ以上の候補変異体（例えば、そのライブラリー）を製造し、その後、該候補変異体から、所望の構造または機能（例えば、増強された翻訳効率）を有する１またはそれ以上の特定の変異体を同定する工程を意味する。
【００３３】
“実質的に同一の”核酸またはアミノ酸配列とは、標準的パラメーターを用いて、本明細書に記載の公知のプログラムの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴ）により測定される、対照配列と少なくとも７５％、８０％または９０％の配列同一性を有する配列を含み得るポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列を意味する。配列同一性は、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％である。ある態様において、目的の配列は、対照配列と比較しておよそ同じ長さであり、すなわち、およそ同じ数の連続したアミノ酸残基（ポリペプチド配列の場合）またはヌクレオチド塩基（ポリヌクレオチド配列の場合）からなる。
【００３４】
配列同一性は、当技術分野で公知の種々の方法で容易に決定可能である。例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ） １１、期待値（Ｅ） １０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムでは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ） ３、期待値（Ｅ） １０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いる（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照のこと）。配列同一性パーセントは、比較ウィンドウ中で２つの最適に整列された配列を比較することにより決定され、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列部分は、２つの最適に整列された配列のための対照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失を含み得る。パーセンテージは、マッチする位置の数を得るために、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列に存在する位置の数を決定することにより計算され、マッチする位置の数を比較するウィンドウ中の全位置数で割り、それに１００を乗算することにより、配列同一性パーセントが得られる。
【００３５】
細胞は、外因性または異種のポリヌクレオチドが細胞内に導入されたとき、かかるポリヌクレオチドにより“形質転換されている”または“トランスフェクトされている”。形質転換用ポリヌクレオチドは、細胞のゲノム中に(共有結合により)組み込まれ得るか、または組み込まれ得ない。原核生物において、例えば酵母および哺乳動物細胞において、形質転換用ポリヌクレオチドは、プラスミドのようなエピソームの構成要素上に維持され得る。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、形質転換用ポリヌクレオチドが、染色体複製を介して娘細胞に遺伝されるように、染色体中に組み込まれているものである。この安定性は、形質転換用ポリヌクレオチドを含む娘細胞の集団を有する細胞株またはクローンを確立するための真核細胞の能力により証明される。“クローン”とは、単細胞または有糸分裂による共通の先祖に由来する細胞の集団である。“細胞株”とは、何世代もインビトロで安定に増殖可能な初代細胞のクローンである。
【００３６】
用語“ベクター”または“コンストラクト”は、ポリヌクレオチド配列構成要素に操作可能に連結された遺伝子／遺伝子産物の発現が、予測可能に制御され得るように、一定のパターンで整列された配列要素を意味する。典型的に、それらは、宿主細胞中に外部のＤＮＡを導入して、その複製および／または転写を促進するために挿入され得る、外部のポリヌクレオチド配列部分中の遺伝性のポリヌクレオチド配列（例えば、プラスミドまたはウイルス）である。
【００３７】
クローニングベクターは、宿主細胞中で自律的に複製可能であり、１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼの認識部位により特徴付けられる、ポリヌクレオチド配列（典型的に、プラスミドまたはファージ）である。外部のポリヌクレオチド配列フラグメントは、フラグメントの複製およびクローニングを行うために、これらの部位でベクター中に挿入され得る。ベクターは、形質転換された細胞の同定における使用に適する１またはそれ以上のマーカーを含み得る。例えば、マーカーは、テトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を提供し得る。
【００３８】
発現ベクターは、クローニングベクターと同様であるが、宿主にトランスフォーメーション後に、そこにクローニングされたポリヌクレオチド配列の発現を誘導することが可能である。クローニングされたポリヌクレオチド配列は、通常、プロモーターまたはエンハンサーのような任意の制御配列の制御下にある（すなわち、それに操作可能に連結されている）。プロモーター配列は、構成的、誘導性または抑制性であり得る。
【００３９】
ＩＩＩ．哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡを発現するためのリボソームポリヌクレオチド
本発明は、哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡ発現および関連するリボソーム活性を研究するための合成（単離または修飾）リボソームポリヌクレオチドまたは核酸分子を提供する。本明細書に記載のリボソームポリヌクレオチドは、本明細書に記載のｒＤＮＡおよびｒＲＮＡヌクレオチド配列、ならびにそれらの組み合わせまたは実質的に同一の変異体を含む。ある態様において、ポリヌクレオチドは、完全長もしくは一部の哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）１８Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列、またはその実質的に同一の変異体をコード化するか（ＤＮＡ配列について）、または含む（ＲＮＡ配列について）。ある態様において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の１またはそれ以上の特定の置換を有する完全長または一部の配列番号：２３、またはその実質的に同一の変異体をコード化するか、または含む。これらの態様のいくつかにおいて、合成ポリヌクレオチドは、完全長１８Ｓ ｒＤＮＡまたはｒＲＮＡ配列のフラグメントを含み、１またはそれ以上の特定の置換を有し得る。故に、本明細書に記載のリボソームポリヌクレオチドは、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）ｒＲＮＡヌクレオチド配列、ｒＤＮＡヌクレオチド配列、またはプレ−ｒＲＮＡヌクレオチド配列、それらのフラグメント、またはそれらの実質的に同一の変異体を含み得る。
【００４０】
一面において、パクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡまたはそのフラグメントを含むか、またはコード化し得る、単離または合成リボソームポリヌクレオチドを提供する。いくつかの好ましい態様において、コード化されたパクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡは、哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡである。パクタマイシン耐性は、典型的に、コード化された１８Ｓ ｒＲＮＡのＥ部位のいくつかの特定の保存された塩基での１またはそれ以上の１塩基置換により提供される。マウス１８Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号：２３）（受託番号ＪＱ２４７６９８）を対照配列として用いて、これらの塩基は、Ｇ９６３、Ａ９６４、Ｃ１０６５およびＣ１０６６を含む。本明細書に記載のいくつかの態様は、パクタマイシン耐性哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡを含むか、またはコード化する、リボソームポリヌクレオチドまたは“合成ポリヌクレオチド”に関する。これらのポリヌクレオチドは、典型的に、マウス１８Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号：２３）、それと実質的に同一の配列、またはその置換もしくは変異を含む配列中の位置Ｇ９６３、Ａ９６４、Ｃ１０６５およびＣ１０６６に対応する位置に１またはそれ以上の変異を有する哺乳動物の１８Ｓ ｒＤＮＡ配列を含む。
【００４１】
上記の通り、置換のための塩基は、異なる哺乳動物種間で保存されており、他の哺乳動物種におけるこれらの塩基の正確な位置を（例えば、配列アライメントにより）容易に決定することができる。故に、本明細書で用いる、マウス１８Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号：２３）におけるＧ９６３、Ａ９６４、Ｃ１０６５およびＣ１０６６に対応するヌクレオチド塩基または位置は、哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡまたは相補的配列をコード化する何れかのポリヌクレオチド配列中に存在するこれらの保存された塩基を含む。例えば、別のマウス１８Ｓ ｒＤＮＡ配列、受託番号Ｘ００６８６（配列番号：３４； Raynal et al., FEBS Lett. 167:263-268, 1984）における対応する塩基は、それぞれＧ９６２、Ａ９６３、Ｃ１０６４およびＣ１０６５である。同様に、ヒト１８Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号：２４）（McCallum et al. Biochem. J. 1985; 232:725-733, 1985; 受託番号Ｘ０３２０５）の対応する塩基は、それぞれＧ９６１、Ａ９６２、Ｃ１０６３およびＣ１０６４である。種々の他の哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ配列におけるこれらの保存された塩基の正確な位置もまた、容易に決定され得る。これらには、例えば、マウス１８Ｓ ｒＤＮＡ配列（受託番号ＮＲ＿００３２７８；配列番号：３５）、ラット１８Ｓ ｒＤＮＡ配列（受託番号Ｘ０１１１７、配列番号：３６；および、Ｍ１１１８８、配列番号：３７）、ウサギ１８Ｓ ｒＤＮＡ配列（受託番号Ｘ０６７７８、配列番号：３８）、およびヒト１８Ｓ ｒＤＮＡ配列（受託番号Ｋ０３４３２、配列番号：３９；およびＭ１００９８、配列番号：４０）が含まれる。
【００４２】
ある態様において、本明細書に記載のリボソームポリヌクレオチドは、本明細書に記載のパクタマイシン耐性を提供する１またはそれ以上の特定の置換を有する完全長の哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡを含むか、またはコード化し得る。ある他の態様において、合成ポリヌクレオチドは、パクタマイシン耐性を提供する１またはそれ以上の特定の置換を含む哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡの５０またはそれ以下の連続するヌクレオチドを含むか、またはコード化し得る。ある他の態様において、ポリヌクレオチドは、１またはそれ以上の特定の置換を含む哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡの１００またはそれ以下の連続するヌクレオチドを含むか、またはコード化する。さらに他の態様において、ポリヌクレオチドは、パクタマイシン耐性を提供する１またはそれ以上の上記の特定の置換を含む哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡの２５０、５００、７５０、１０００、１５００またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含むか、またはコード化する。これらの態様の何れかにおいて、合成ポリヌクレオチドはまた、本明細書に記載の完全長１８Ｓ ｒＲＮＡ配列またはフラグメント配列の実質的に同一の配列または相補的配列も含み得る。
【００４３】
ある他の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号：２３と少なくとも８０％、９０％、９５％または９９％同一であり、配列番号：２３の位置Ｇ９６３、Ａ９６４、Ｃ１０６５およびＣ１０６６に対応する位置に１またはそれ以上の置換を含む配列を含むか、またはそれと相補的である。これらの態様のいくつかにおいて、変異は、配列番号：２３の位置Ｇ９６３に対応する位置にある。例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号：２３のＧ９６３に対応する位置にＧ→Ａ置換を有する１８Ｓ ｒＲＮＡ配列を含むか、またはコード化し得る。ある態様において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の１またはそれ以上の特定の置換を含まないマウス１８Ｓ ｒＤＮＡまたはヒト１８Ｓ ｒＤＮＡ配列と同一または相補的な配列を含む。上記の通り、本明細書に記載の合成ポリヌクレオチドはまた、１またはそれ以上の特定の置換を有するこれらの配列のフラグメントを含む。
【００４４】
本明細書に記載のリボソームポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、三重鎖(トリプレックス)、直鎖または円形であり得る。それらは、上記の１またはそれ以上のヌクレオチド誘導体または類縁体（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の類縁体または誘導体ヌクレオチド）を含み得る。ある態様において、ポリヌクレオチドは、全体的に１またはそれ以上の類縁体または誘導体ヌクレオチドからなり、時には、ポリヌクレオチドは、約５０％もしくはそれ以下、約２５％もしくはそれ以下、約１０％もしくはそれ以下または約５％もしくはそれ以下の類縁体または誘導体ヌクレオチド塩基からなる。類縁体または誘導体核酸における１またはそれ以上のヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオチドと比較して、リボースまたはリン酸修飾（例えば、リボースペプチド核酸（ＰＮＡ）またはホスホロチオエート結合）のような核酸塩基修飾または骨格修飾を含み得る。ヌクレオチド類縁体および誘導体は、当業者に公知であり、そのような修飾の限定されない例は、米国特許番号第４，４６９，８６３号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，６３７，６８３号；同第５，６３７，６８４号；同第５，７００，９２２号；同第５，７１７，０８３号；同第５，７１９，２６２号；同第５，７３９，３０８号；同第５，７７３，６０１号；同第５，８８６，１６５号；同第５，９２９，２２６号；同第５，９７７，２９６号；同第６，１４０，４８２号；同第６，４５５，３０８号；およびＷＩＰＯ公開番号ＷＯ００／５６７４６およびＷＯ０１／１４３９８に記載される。かかる類縁体または誘導体を含む核酸の合成法もまた、例えば、上記の引用した特許文献、および米国特許番号第６，４５５，３０８号；同第５，６１４，６２２号；同第５，７３９，３１４号；同第５，９５５，５９９号；同第５，９６２，６７４号；同第６，１１７，９９２号；およびＷＯ００／７５３７２に記載される。
【００４５】
ＩＶ．パクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡを発現するためのベクター
本明細書に記載の哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化するポリヌクレオチドは、哺乳動物宿主細胞中に導入するために発現ベクター中に挿入され得る。これらのベクターは、典型的に円形であり、１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化するポリヌクレオチドに加えて、選択可能マーカー、複製起点（origin of replication）、および他の要素も含み得る。例えば、該ベクターは、選択マーカーを含み得る。選択マーカーは、ベクターが導入され、および／または案的に組み込まれた細胞を選択するのを可能にする。ある態様において、選択マーカーは、細胞に視覚的に識別可能な特徴を提供するタンパク質または酵素をコード化するポリヌクレオチドであり得る。例えば、本明細書中例示として、ベクターは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポーター酵素をコード化する選択マーカーを有し得る。他の例としては、クラゲ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および細菌β−ガラクトシダーゼが挙げられる。いくつかの他の態様において、ベクターが導入され、かつ／または安定にくみこまれた宿主細胞を同定するための選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子であり得る。そのようなマーカーの例としては、ネオマイシン、クロラムフェニコール、ブラストサイジン、ハイグロマイシン、およびゼオシンに対する抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【００４６】
パクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化する配列に加えて、ベクターは、好適なｒＲＮＡ転写およびプロセシング、ならびに好適なリボソーム集積および機能に必要とされ得る他のｒＤＮＡ配列も有し得る。例えば、本明細書に記載のあるベクターは、前駆体ｒＲＮＡ配列の５’−ＥＴＳおよびＩＴＳ要素に対応する配列をさらに有し得る。パクタマイシン耐性哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡを発現するための特定のベクターは、以下の実施例において例示される（例えば、実施例４）。
【００４７】
発現ベクターのもう１つの構成成分は、複製起点である。複製起点は、該起点に結合する多量体タンパク質により認識され、ＤＮＡ複製酵素を該起点部位に集合させるのに重要な役割を果たす、複数の短鎖反復配列を含む独特のＤＮＡセグメントである。本明細書に記載のベクターに私用するための好適な複製起点には、例えば、ＥＢＶ ｏｒｉＰ、ＳＶ４０、Ｅ. ｃｏｌｉ ｏｒｉＣ、ｃｏｌＥ１ プラスミドオリジン、ＡＲＳなどが含まれる。発現ベクターにおいて別の有用な要素は、複数のクローニング部位またはポリリンカーである。一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位をコード化する合成ＤＮＡは、プラスミドベクター中に、例えば、プロモーターエレメントの下流に挿入される。これらの部位は、ベクター中の特定の位置にＤＮＡを都合よくクローニングするために設計される。
【００４８】
本明細書に記載の修飾１８Ｓ ｒＲＮＡを発現するためのポリヌクレオチドまたはベクターは、本明細書の記載を考慮して、分子生物学分野で公知の方法に従い、容易に構築可能である。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3rd ed.,2001); Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003); および、Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, Wiley-Liss, Inc. (4th ed., 2000)を参照のこと。一般に、発現ベクターは、好適なベクター骨格中にパクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化するポリヌクレオチド、選択マーカーをコード化する配列、および本明細書に記載の他の任意の要素を挿入することにより構築される。ベクターを製造するために、上記のポリヌクレオチドは、哺乳動物宿主細胞を形質転換するための種々の公知のプラスミド中に挿入され得る。かかる公知のプラスミドには、例えば、ｐＲＬ−ＣＭＶ（Promega）、ＢＰＶ、ＥＢＶ、ワクシニアウイルスベースのベクター、ＳＶ４０、２−ミクロンサークル、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１／ＧＳ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＭＴ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ（Ｓｐ１）、ｐＶｇＲＸＲ（Invitrogen）など、またはそれらの誘導体が含まれる。これらのプラスミドは全て記載され、当技術分野で公知である（Botstein et al., Miami Wntr. SyTnp. 19:265-274, 1982; Broach, In: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., p. 445-470, 1981; Broach, Cell 28:203-204, 1982; Dilon et at., J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39-48, 1980; および、Maniatis, In: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, pp. 563-608, 1980）。
【００４９】
Ｖ．パクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡを発現する宿主細胞
パクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡを発現する構築された哺乳動物細胞を提供する。上記のポリヌクレオチド分子または発現ベクターを使用することにより、種々の哺乳動物細胞は、本明細書に記載の発現ベクターを導入するか、または本明細書に記載のｒＤＮＡを宿主ゲノムに安定に組み込むことにより用いられ得る。パクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡまたは上記の発現ベクターをコード化するポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の何らかの手段により、適当な宿主細胞（例えば、マウスＮ２ａ細胞またはＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞）中に導入され得る。細胞は、パクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡを一時的に、または安定に発現し得る。
【００５０】
好ましくは、本明細書に記載の哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡを発現するための宿主細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞である。真核ベクター／宿主系、好ましくは、哺乳動物発現系は、発現された哺乳動物タンパク質の好適な翻訳後修飾を可能にし、例えば、一次転写産物の好適なプロセシング、グリコシル化、リン酸化、および有利には、発現産物の分泌が起こる。故に、哺乳動物細胞のような真核細胞は、上記のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを導入するための好ましい宿主細胞である。１つの具体的な例は、以下の実施例に詳述するマウスニューロ２ａ（Ｎ２ａ）細胞である。他の好適な細胞としては、動物細胞（例えば、昆虫、齧歯類、ウシ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ヒト以外の霊長類、ヒトなど由来の細胞）および植物細胞（例えば、米、トウモロコシ、綿、たばこ、トマト、ジャガイモなど）の両方が含まれる。そのような宿主細胞株の他の具体的な例としては、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、およびＷ１３８が含まれる。
【００５１】
哺乳動物細胞以外の、本明細書に記載の合成１８Ｓ ｒＲＮＡを発現するための宿主細胞は、酵母細胞または植物細胞であってもよい。導入遺伝子の安定な組み込みおよび発現に好適な酵母または植物細胞は、１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化するポリヌクレオチドを酵母または植物発現ベクターにより宿主に導入することにより、これらの適用に用いられ得る。好適な昆虫細胞の例としては、ショウジョウバエ幼虫由来の細胞が含まれる。昆虫細胞を用いるとき、ポリヌクレオチドは、好適な発現ベクターにより該細胞中に導入され得る。例えば、バキュロウイルスベクターは、当技術分野で既報のものを用い得る（Jasny, Science 238:1653, 1987; and Miller et al., In: Genetic Engineering (1986), Setlow, J. K., et al., eds., Plenum, Vol. 8, pp. 277-297）。昆虫細胞を宿主として用いるとき、ショウジョウバエ−アルコールデヒドロゲナーゼプロモーターが、任意に、ポリヌクレオチドを導入するための発現ベクターにおいて使用され得る（Rubin, Science 240:1453-1459, 1988）。
【００５２】
何れかの便利なプロトコルが、宿主細胞の位置によって、パクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡを発現するベクターのインビトロまたはインビボでの宿主細胞への導入に用いられ得る。ある態様において、発現ベクターは、以下の実施例に例示の通り、宿主細胞（例えば、Ｎ２ａのような培養細胞株）に一過性にトランスフェクトされる。これは、例えば、本明細書に例示の以下のプロトコルにより、常套方法を用いて達成され得る。ある他の態様において、発現ベクターは、宿主ゲノム中に安定に組み込まれ得る。一般的に、適当な制限酵素消化されて宿主染色体に相同性の遊離末端を生じた後、ポリヌクレオチドは宿主細胞にトランスフェクトされ得る。発現ベクターは、当技術分野で常用される標準的プロトコルにより宿主細胞中に導入され得る。例えば、ベクターは、リン酸カルシウム共沈殿、マイクロインジェクションまたはエレクトロポレーションのような従来の機械的手法、リポソームに入れられたプラスミドの挿入、およびウイルスベクターにより宿主細胞にトランスフェクトされ得る。これらの技術は全て公知であり、当技術分野で常用されている。例えば、上記の、Freshney,;Sambrook et al.,;および、Brent et al.,）。トランスフェクトされた組み換え発現ベクターを有する宿主細胞は、ベクター上に存在する選択マーカーを用いて同定および単離され得る。多くの受容細胞が、ベクターを含む細胞を選択する媒体中で増殖され得る。
【００５３】
ある態様において、宿主細胞が単離された細胞であるとき、発現ベクターは、例えば、標準的形質転換技術を用いて、宿主細胞の生存性を許容する細胞培養条件下で、該細胞に直接導入され得る。そのような技術としては、ウイルス感染、トランスフェクション、接合、原形質融合、エレクトロポレーション、パーティクル・ガン法、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ウイルスベクター送達などが含まれるが、必ずしもそれらに限定されない。方法の選択は、一般的に、形質転換される細胞種および形質転換が生じる条件（すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）によって変わる。  これらの方法の一般的議論は、例えば、上記のBrent et alに見出され得る。
【００５４】
あるいは、宿主細胞または細胞が多細胞生物の一部であるとき、標的ベクターは、例えば、インビボまたはエクスビボのプロトコルにより、標的ベクターが宿主細胞に入り得るような方法で、生物または宿主に投与され得る。“インビボ”とは、標的コンストラクトが、動物体内に投与されることを意味する。“エクスビボ”とは、細胞または組織が、体外で改変されることを意味する。そのような細胞または組織は、一般的に、生体に戻される。核酸コンストラクトの投与方法は、当技術分野で公知である。例えば、核酸コンストラクトは、ウイルスベクターを用いて（Monahan et al., Gene Therapy 4:40-49, 1997; Onodera et al., Blood 91:30-36, 1998）、“裸の(naked)ＤＮＡ”などの取り込みにより、陽イオン性脂質と共に送達され得る（Goddard, et al, Gene Therapy, 4:1231-1236, 1997; Gorman et al., Gene Therapy 4:983-992, 1997; Chadwick et al., Gene Therapy 4:937-942, 1997; Gokhale et al., Gene Therapy 4:1289-1299, 1997; Gao and Huang, Gene Therapy 2:710-722, 1995）。細胞のトランスフェクションについて当技術分野で周知の技術（上記参照）は、核酸コンストラクトのエクスビボ投与に用いられ得る。正確な剤形化、投与経路および投与量は、経験的に選択され得る。例えば、Fingl et al., 1975, in The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1 p 1を参照のこと。
【００５５】
ＶＩ．増強された翻訳効率または改変されたリボソーム機能のためのｒＲＮＡの改変
本明細書に記載の合成哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化するポリヌクレオチドまたは関連する発現ベクターは、改善または改変されたリボソーム機能および翻訳活性をもたらす変異（例えば、１８Ｓ ｒＤＮＡ配列における）を同定するのに有用である。本明細書に記載の１８Ｓ ｒＲＮＡ発現系はまた、１８Ｓ ｒＲＮＡに自然に生じる変異体の機能分析にも使用され得る。それらはまた、ｒＲＮＡ配列を改変して、改善された特性、例えば、増強された翻訳効率を有するリボソームを生じるのに好適である。例えば、目的の特定のポリペプチドの発現を増強するために、特定の変異が、目的のポリペプチドをコード化するｒＲＮＡとｍＲＮＡの間の増強された塩基対相互作用のために１８Ｓ ｒＲＮＡ中に導入され得る。内在性１８Ｓ ｒＲＮＡ機能を停止させることにより、本明細書に記載のパクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡ発現系は、目的のタンパク質の発現を増大させ得る１８Ｓ ｒＲＮＡにおける変異をスクリーニングおよび選択するのを可能にする。同様に、ｒＲＮＡ配列、とりわけ１８Ｓ ｒＲＮＡは、何れかの特定のｍＲＮＡに限定されない改変された集積活性または増強された翻訳活性（例えば、ｔＲＮＡとの相互作用）を有するリボソームをもたらす修飾配列のために改変および選択され得る。
【００５６】
従って、変異の機能的結果または１８Ｓ ｒＲＮＡ配列における天然に生じる変異を研究する方法を提供する。ある態様において、１８Ｓ ｒＲＮＡ配列に天然に生じる変異の効果は、本明細書に記載の発現系の使用により試験される。典型的に、天然に生じる変異体（例えば、本明細書に記載のマウスまたはヒト変異体１８Ｓ ｒＲＮＡ配列）を有するポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載のパクタマイシン耐性を導入するため、例えば、配列番号：２３におけるＧ９６３Ａに対応する置換を導入するために修飾される。次いで、発現ベクター中に存在する修飾ポリヌクレオチドは、パクタマイシン存在下でのｒＲＮＡプロセシングおよびリボソーム機能の機能分析のために宿主細胞中に導入される。野生型または対照１８Ｓ ｒＲＮＡ配列（例えば、配列番号：２３）の活性と比較して試験した活性における何れかの相違は、配列の変異とｒＲＮＡプロセシングおよび／またはリボソーム活性における観察された変化との間の構造−機能相関関係を示し得る。
【００５７】
いくつかの他の態様において、１８Ｓ ｒＲＮＡ発現系は、改変されたリボソーム機能および／または翻訳活性をもたらす１８Ｓ ｒＲＮＡ配列における変異をスクリーニングするために用いられる。これらの態様において、パクタマイシン耐性哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡ配列またはそのフラグメントをコード化するポリヌクレオチド配列は、ランダムまたは部位特異的変異により候補１８Ｓ ｒＤＮＡ配列を作製するためにさらに修飾される。宿主細胞に導入されると、該候補または変異１８Ｓ ｒＤＮＡ配列は、増強された翻訳効率または改変されたリボソーム機能を提供する変異を同定するためにスクリーニングおよび選択される。変異誘発およびその後の選択は、本明細書に記載の標準的分子生物学的技術を用いて行われ得る。
【００５８】
本明細書に記載のさらに他の態様は、目的の特定のポリペプチドの増強された発現のために１８Ｓ ｒＲＮＡ配列を改変させることに向けられる。これらの態様において、ランダムまたは部位特異的変異は、該変異が、コード化された１８Ｓ ｒＲＮＡのパクタマイシン耐性活性に影響を与えない場合、パクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化するポリヌクレオチド配列中に導入される。ｒＲＮＡをコード化する配列のランダム変異は、当技術分野で公知の方法を用いて生成され得る。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（Nature 370:389-391, 1994）に記載のＤＮＡシャフリング（DNA Shuffling）は、ｒＤＮＡ配列中にランダム変異を導入するために容易に用いられ得る。あるいは、エラープローン（error prone）増幅は、例えば、Bartell and Szostak, Science 261:1411, 1993に記載の通り、ランダム変異を導入するために用いられ得る。ランダム変異を生じるためのさらなる技術もまた、使用され得る。例えば、１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化する配列はまた、カセット変異導入（Hutchison et al., Methods Enzymol. 202:356-390, 1991）、再帰的アンサンブル変異導入法(recursive ensemble 変異誘発)（Arkin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815, 1992)、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入（exponential ensemble 変異誘発）(Delegrave et al., Biotechnol. Res. 11:1548-1552, 1993）、およびセクシャルＰＣＲ突然変異誘発（sexual PCR 変異誘発）（Stemmer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751, 1994）により変異導入され得る。
【００５９】
増強された翻訳活性または改変されたリボソーム機能について選択およびスクリーニングされる、ランダム変異導入以外の候補１８Ｓ ｒＤＮＡ配列変異体はまた、標的化または部位特異的変異導入により作製され得る。１８Ｓ ｒＤＮＡ配列における部位指向性変異導入は、当技術分野で公知の方法、例えば、Arnold Curr. Opinion Biotechnol 4:450-455, 1993に記載の方法により実行され得る。ある態様において、１８Ｓ ｒＤＮＡ配列変異体は、オリゴヌクレオチド指向性変異導入を用いて、部位特異的変異を生じさせて作製される。オリゴヌクレオチド変異導入は、例えば、Reidhaar-Olson, Science 241:53-57, 1988に記載される。簡単には、クローニングされたＤＮＡ中に導入されるべき１またはそれ以上の変異を有する多数の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、変異誘発されるべきクローニングされたＤＮＡに挿入する。突然変異誘発されたＤＮＡを含むクローンを回収し、その後、それらがコード化するｒＲＮＡの活性を評価する。変異体１８Ｓ ｒＤＮＡ配列を作製する別の方法は、アセンブリＰＣＲである。アセンブリＰＣＲは、ＤＮＡの小断片の混合物からのＰＣＲ産物のアセンブリを伴う。多数の種々のＰＣＲ反応が、同じバイアル中で並行して起こり、１つの反応の産物が別の反応の産物をもたらす。アセンブリＰＣＲは、例えば、米国特許番号第５，９６５，４０８号に記載される。
【００６０】
所望の表現型を有する変異のスクリーニングおよび選択のために、パクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化し、部位特異的変異またはランダム変異をさらに有する変異体１８Ｓ ｒＤＮＡ配列が、本明細書に記載の発現ベクターを介して宿主細胞中に導入される。次いで、該細胞をパクタマイシン存在下で培養し、目的のポリペプチドの発現レベルまたは集積されたリボソームの他の翻訳活性を評価する。特定のポリペプチドの増強された発現に関して修飾１８Ｓ ｒＲＮＡを同定するために、細胞における特定のポリペプチドの発現レベルを試験し、パクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡを発現するが、１８Ｓ ｒＲＮＡ中に他の変異を含まない対照細胞における同じポリペプチドの発現レベルを比較する。目的のポリペプチドの増強された翻訳レベルをもたらす１８Ｓ ｒＲＮＡ中の変異は、変異のないものと比較して、宿主細胞が、目的のポリペプチドの増強された発現を有するリボソームを産生したことを示す。以下に詳述するように、本明細書に記載の方法は、目的の種々のポリペプチドまたはタンパク質の発現レベルを増強するのに好適である。目的のポリペプチドは、宿主細胞に対して内在性または外因性のどちらでもよい。
【００６１】
目的のポリペプチドの増強された発現レベルを提供する修飾１８Ｓ ｒＲＮＡ配列を選択する以外に、本明細書に記載の１８Ｓ ｒＲＮＡ発現系はまた、他の改変された機能を有するリボソームを生じるためにも用いられ得る。これらの態様において、パクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡをコード化し、上記の部位特異的変異またはランダム変異を有するポリヌクレオチドは、宿主細胞において、変異から生じる何らかの改変されたリボソーム活性について試験され得る。モニターされ得るリボソーム活性には、例えば、リボソーム集積、ｔＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡとの相互作用、翻訳の開始、および延長および終了が含まれる。種々のリボソーム機能が、当技術分野で常用される技術またはアッセイを用いてモニターされ得る。例えば、哺乳動物細胞についてのｒＲＮＡ成熟およびリボソーム集積は、例えば、Pestov et al., Curr. Protoc. Cell Biol. 2008, Chapter 22:Unit 22.11; Champney, Methods Mol. Med. 142:63-73, 2008;および、Klostermeier et al., Nucleic Acids Res. 32:2707-15, 2004に記載の技術を用いて試験され得る。ｍＲＮＡへのリボソームの結合は、例えば、Day et al., J. Bacteriol. 186:6864-6875, 2004に記載の方法と同様のアッセイを用いて試験され得る。タンパク質転移の間のＥＲ膜へのリボソーム結合は、例えば、Prinz et al., EMBO J. 19:1900-1906, 2000;および、 Kalies et al., J. Cell Biol. 126:925-934, 1994に記載のアッセイを用いてモニターされ得る。リボソームへのアミノアシル−ｔＲＮＡの結合は、当技術分野で周知の標準的結合アッセイに従い試験され得る、例えば、Agafonov et al., EMBO Rep. 2:399-402, 2001; Ashraf et al., RNA. 5:188-194, 1999, and Lill et al., Methods Enzymol. 164:597-611, 1988。タンパク質合成の他の面における１８Ｓ ｒＲＮＡ変異の可能性のある影響（例えば、翻訳の開始、延長、終了およびペプチド放出）はまた、常套のアッセイを用いてモニターされ得る。例えば、Burakovsky et al., RNA. 16:1848-53, 2010; Sternberg et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 16:861-8, 2009; Van Dyke et al., Nucleic Acids Res. 37:6116-25, 2009; Sunohara et al., J. Biol Chem. 279:15368-75, 2004; Khan et al., Biochim. Biophys. Acta. 1779:622-7, 2008; Anderson et al., J. Biol. Chem. 282:14752-60, 2007; Merill et al., J. Virol. 80:6936-42, 2006; Brunelle et al., RNA. 14:1526-31, 2008; Rawat et al., J. Mol. Biol. 357:1144-53, 2006; and Gong et al., J Bacteriol. 189:3147-55, 2007を参照のこと。
【００６２】
ＶＩＩ．増強された翻訳のためのポリペプチドまたはタンパク質
発現ベクターおよびパクタマイシン耐性１８Ｓ ｒＲＮＡを発現する宿主細胞は、目的の重要なポリペプチドまたはタンパク質の発現レベルを増強するのに有用である。目的のタンパク質は、医学または産業上の適用を有するポリペプチドであり得る。ある態様において、目的のポリペプチドまたはタンパク質は、治療用タンパク質をコード化するものである。治療用タンパク質の例には、ファクターＶＩＩＩ、ファクターＩＸ、β−グロビン、低密度リポタンパク質受容体、アデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子、α−抗トリプシン、ＣＤ−１８、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンセターゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、分枝鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、グルコース ６−ホスファターゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ガラクトース １−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、インターロイキン、サイトカイン、小分子ペプチドなどが含まれる。本明細書に記載の作製した宿主細胞において挿入された目的ポリヌクレオチドから発現され得る他の治療用タンパク質には、例えば、ハーセプチン（登録商標）、細菌またはウイルス（例えば、大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、マラリア、ＨＩＶ、狂犬病ウイルス、ＨＢＶ、およびサイトメガロウイルス）を原因とする疾患のような種々の病原菌由来のポリペプチド抗原、ならびにラクトフェリン、チオレドキシンおよびベータ−カゼインワクチンのような他のタンパク質が含まれる。
【００６３】
目的のタンパク質のさらなる例には、インスリン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ)、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、好中球産生（neutropoiesis）刺激タンパク質（フィルガスチムまたは顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）としても公知）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、成長ホルモン、ヘモグロビン、インスリン分泌因子、イミグルセラーゼ、サルグラモスチム、内皮性因子、可溶性ＣＤ４、ならびにその抗体および／または抗原結合フラグメント（例えば、ＦＡｂ）（例えば、オルソクローンＯＫＴ−ｅ（抗ＣＤ３）、ＧＰＩＩｂ／ＩＩａモノクローナル抗体）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）−様ホルモン、インスリン分泌性ホルモン、インシュリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、酸性の線維芽細胞増殖因子、塩基性の線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β、神経増殖因子（ＮＧＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）（例えば、ＩＦＮ−α２ｂ、ＩＦＮ−α２ａ、ＩＦＮ−αＮ１、ＩＦＮ−β１ｂ、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β）、トランスフォーミング増殖因子−αおよび−β、カタラーゼ、カルシトニン、アルギナーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ペプシン、ウリカーゼ、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、ラクターゼ、スクラーゼ、内因性因子、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、カルシトニン、Ｏｂ遺伝子産物、コレシストキニン（ＣＣＫ）、セロトニン、およびグルカゴンが含まれるが、これらに限定される必要はない。
【００６４】
目的の好適なポリペプチドには、特定の膜タンパク質または他の細胞内タンパク質も含まれる。膜タンパク質の例には、アドレナリン受容体、セロトニン受容体、低密度リポタンパク質受容体、ＣＤ−１８、サルコグリカン（筋ジストロフィーにおいて欠失している）などが含まれるが、これらに限定される必要はない。有用な細胞内タンパク質には、細胞内コンパートメント内に主に局在するか、または細胞内で所望の生物学的活性を示すタンパク質が含まれる。かかる細胞内タンパク質には、遺伝的なチロシン血症タイプ１を有する対象において欠失しているフマリルアセト酢酸加水分解酵素（ＦＡＨ）が含まれ得る。細胞内タンパク質の他の具体的な例には、抗ウイルス性のタンパク質（例えば、ウイルスの複製の阻害または感染細胞の選択的細胞死を提供し得るタンパク質）、コラーゲン、すなわち劣性栄養障害性表皮水疱症（ＲＤＥＢ）にて欠失するタイプＶＩＩコラーゲンＣＯＬ７Ａ１遺伝子のような構造タンパク質、ならびに筋ジストロフィーにて欠失するジストロフィンが含まれる。
【実施例】
【００６５】
実施例
以下の実施例は、さらに説明するために提供されるが、本発明の範囲を限定するものではない。他の変形は、当業者に容易に理解され、添付の特許請求の範囲に包含される。
【００６６】
実施例１  大量の１８Ｓ ｒＲＮＡ変異体の同定
哺乳動物細胞は、同一ではない数百のｒＤＮＡ遺伝子を含む。これらの配列変異体は、リボソームの多様性を提供し、機能的な影響をもたらし得る。いくつかの配列は、マウスＮ２ａゲノムＤＮＡからクローニングされた。ｒＤＮＡフラグメントを、それぞれ１８Ｓ ｒＤＮＡの約７００ヌクレオチド上流および７０ヌクレオチド下流に位置する、ｒＤＮＡ．１およびｒＤＮＡ．２（表１）をプライマーとして用いてＰＣＲ増幅した。６つの独立したクローンを配列決定し、互いに＞９９％の同一性であることを見出した。しかしながら、これらの配列は何れも、互いに、またはＮＣＢＩヌクレオチドデータベースの２つの異なる１８Ｓ ｒＤＮＡ配列（Ｘ８２５６４、ＮＲ＿００３２７８、Ｘ００６８６；配列Ｘ８２５６４およびＮＲ＿００３２７８は、同一の１８Ｓ配列を含む）と完全に同一ではない。公開された配列と異なるいくつかのユニークな変異形に加えて、本実験で同定された配列は、ヘリックスＨ４１ａ中に１つのヌクレオチド相違、および２つの単一ヌクレオチド挿入（１つは、伸張セグメント（Expansion segment）３中に、もう１つは、ヘリックスＨ３０中に）を共有する。
【００６７】
【表１】
2015519899.tif 000003
【表２】
2015519899.tif 000004
【００６８】
発現系に関して、各ヌクレオチドの位置に最も多く共通配列変異を含む１８Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子配列を、より少ない共通配列変異を含むｒＲＮＡ配列の将来の研究のための対照を提供するために用いた。クローニング配列を１８Ｓ ｒＤＮＡ配列の集団と比較して評価するために、それらを、集めたゲノムＰＣＲ産物をテンプレートとして用いて、得られた配列と比較した。ＰＣＲ反応の重大なバイアスを除けば、集めたゲノム配列のシークエンスは、各ヌクレオチドにおける主なゲノム変異を表しているはずである。２つの独立したＰＣＲ反応（ＰＣＲ１およびＰＣＲ２）を行い、産物を直接配列決定した。集めたゲノム配列をこの実験において単離されたクローンの配列と比較することにより、該クローンのうち１つが、集めたゲノム配列と同じ配列を含むことが明らかにされた。このクローン（受託番号ＪＱ２４７６９８；配列番号：２３）を、その後の実験のために選択した。それは、１，８７１ヌクレオチド長であり、上記の３つの共通の変異を含むが、公開された配列Ｘ００６８６．１（配列番号：３４）からの他の変異は含んでいなかった。
【００６９】
実施例２  １８Ｓ ｒＲＮＡ発現コンストラクトの構築
１８Ｓ ｒＲＮＡ発現系を、４０Ｓリボソームサブユニットの生合成、および翻訳開始プロセスにおけるこのＲＮＡの役割を実験するために開発した。マウスｒＤＮＡゲノムフラグメントは、位置Ａ’、Ａ０、１、および２で適当なプロセシングが必要であり得ることが予期された（図１ｂ）。上記で同定された１８Ｓ ｒＤＮＡクローンを、５’ＥＴＳ、１８Ｓ ｒＤＮＡ、およびＩＴＳ１を含む発現コンストラクトを作製するために用い、それらは、これらの位置の全てを含む（図２ａ）。コンストラクトを、ｐｏｌ−Ｉプロモーターおよび３’ＥＴＳ、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルを用いて作製した。また、５’ＥＴＳの５’末端およびＩＴＳ１の３’末端に欠失を有する、すなわち、１８Ｓ ｒＲＮＡのプロセシングされた（成熟）末端に隣接する真正性が劣る（less authentic）スペーサー配列を有する、コンストラクトも試験した。これらの種々のコンストラクトは、Ｎ２ａ細胞にトランスフェクトされ、合成１８Ｓ ｒＲＮＡの発現を、１８Ｓ ｒＤＮＡの伸張セグメント３中にクローニングされた２４ｎｔ ハイブリダイゼーションタグに対してオリゴヌクレオチドプローブを用いるノーザンブロットにより決定された。結果は、位置Ａ’およびＡ０を含む完全長５’ＥＴＳを有するコンストラクトのみが、インビトロで１８Ｓ ｒＲＮＡ転写産物とサイズを比較することにより立証された、適切にプロセシングされた１８Ｓ ｒＲＮＡ（ｐ１８Ｓ．１および１８Ｓ．２（Ｐｏｌ−１およびＣＭＶ）；図２ｂ）に対応するバンドを示すことを明らかにした。これに対して、３’プロセシング部位２ｂおよび２ｃを含むＩＴＳ１は、大部分のＩＴＳ１がコンストラクトｐ１８Ｓ．２（Ｐｏｌ−１およびＣＭＶ）において欠失されたとしても、このコンストラクトが成熟１８Ｓ ｒＲＮＡに対応するバンドを生成するため、必要がないように思われる。
【００７０】
成熟１８Ｓ ｒＲＮＡの発現は、ｐｏｌ−ＩおよびＣＭＶプロモーターの両方で起こることが観察された。しかしながら、その発現レベルは、転写がｐｏｌ−Ｉにより仲介されるとき、より高かった（図２ｂ）。結果は、５’ＥＴＳ中のプロセシング部位が、１８Ｓ ｒＲＮＡのプロセシングに充分であり、プロセシングは、ＲＮＡポリメラーゼＩによって起こるために転写を必要としないことを示す。１８Ｓ ｒＲＮＡのｐｏｌ−ＩＩ転写で低収量が観察されたため、全てのその後の実験にはｐｏｌ−Ｉベクターが専ら用いられた。
【００７１】
コンストラクトｐ１８Ｓ．１およびｐ１８Ｓ．２からの合成１８Ｓ ｒＲＮＡ前駆体転写産物の正しいプロセシングは、これらの１８Ｓ ｒＲＮＡを同定するためにα−タグプローブを有するブロットを測定することにより示された。同じブロットを、合成および内在性１８Ｓ ｒＲＮＡの両方を認識する低比放射性オリゴヌクレオチドプローブ（α−１８Ｓ）を用いて再プローブ化した（図７ａ、ｂ、ｃ）。結果は、成熟合成および内在性１８Ｓバンドを重ね合わせることができることを示す。プロセシングされたＲＮＡからのスペーサー領域の除去を証明するために、ノーザンブロッティング法を、それぞれ部位１および２の５’および３’直後に位置する、５’ＥＴＳ（α−５’ＥＴＳ）およびＩＴＳ１（α−ＩＴＳ１）中の配列に相補的なプローブを用いて行った（図７ｄ、ｅ）。両ブロットは、成熟タグ付加転写産物を用いるハイブリダイゼーションで検出不可能であったが、より長い少量の前駆体転写産物とハイブリダイズし、成熟１８Ｓ ｒＲＮＡからのスペーサー領域の除去と一致する結果を示した。スペーサー領域における欠失を有するコンストラクトに関して、プロセシングされていない、かつ部分的にプロセシングされた転写産物のサイズは、ｐｒｅ−ｒＲＮＡ種と比較したとき、予期されるサイズと一致している。
【００７２】
トランスフェクション後の合成１８Ｓ ｒＲＮＡの相対レベルをモニターするために、経時的実験を行った。これらの実験に関して、プロセシングされた１８Ｓ ｒＲＮＡを生じる完全長ｐｏｌ−Ｉコンストラクト（ｐ１８Ｓ．１）を細胞にトランスフェクトし、１８Ｓ ｒＲＮＡ発現を、トランスフェクションの７２時間後までの種々の時間点で細胞を採取してモニターし、その後、ハイブリダイゼーションタグについてプローブ化した（図２ｃ）。このコンストラクトについて、合成１８Ｓ ｒＲＮＡの最大発現が、全１８Ｓ ｒＲＮＡの割合として、トランスフェクションの３６〜４８時間後に観察された。全てのその後の実験を、他に特記されない限り、トランスフェクションの４８時間後に行った。
【００７３】
プロセシングされた合成１８Ｓ ｒＲＮＡがリボソームと結合するかどうかを決定するために、ノーザンブロット分析を、１００，０００ ｘ ｇで遠心して調製されたｐ１８Ｓ．１をトランスフェクトされた細胞の全細胞溶解物ならびに細胞溶解物のペレット（Ｐ）および上清（Ｓ）画分で行った（図８ａ、ｂ）。上記の通り、未プロセシングおよびプロセシングされた合成１８Ｓ ｒＲＮＡは、全細胞溶解物から調製された全ＲＮＡ中に存在した（図８ａ、ｂ；右）。しかしながら、分画された物質において、プロセシングされたｒＲＮＡのみが、沈殿したリボソームを含むＰ１００ペレット中に見出された。プロセシングされたＲＮＡは、より低密度の細胞質物質を含む上清画分には見出されなかった。これらの分画されたＲＮＡサンプルを、相対存在量を決定するために、α−タグおよびα−１８Ｓプローブの両方でプローブ化することにより、合成のインビトロで転写されたｒＲＮＡとも比較した。トランスフェクションの４８時間後の細胞中の合成１８Ｓ ｒＲＮＡは、全１８Ｓ ｒＲＮＡの約１０〜１５％であると推定された。ｐ１８Ｓ．２（ｐｏｌ−Ｉ）を用いてトランスフェクトした細胞からの溶解物の分画により、同様の結果が得られ（図８ｃ）、ＩＴＳ１を欠く合成１８Ｓ ｒＲＮＡがリボソームサブユニット中に組み込まれていることが示唆された。これらを纏めると、これらの実験は、ｐ１８Ｓ．１およびｐ１８Ｓ．２由来の合成１８Ｓ ｒＲＮＡが正しくプロセシングされ、４０Ｓサブユニット中に組み込まれたことを示す。それらはまた、ＩＴＳ１が、成熟１８Ｓ ｒＲＮＡの形成に不必要であることも示す。
【００７４】
実施例３  ５’ＥＴＳ配列の分析
Ａ’およびＡ０プロセシング部位を含む５’ＥＴＳの５’領域は、１８Ｓ ｒＲＮＡのプロセシングに必要であることが明らかである（図１ｂ）；しかしながら、哺乳動物ｒＤＮＡ遺伝子のこれらの部位の３’に位置する配列の重要性についてはほとんど知られていない。哺乳動物遺伝子におけるこれらの３’配列の長さは、実質的により短い他の真核ｒＤＮＡ遺伝子とは異なる。哺乳動物におけるこれらの付加的配列の潜在的寄与を調べるために、位置Ａ’およびＡ０を除去するために、個々に、および組み合わせて欠失を含む、いくつかの内部欠失を作製した（図３ａ）。
【００７５】
内部欠失コンストラクトを用いてトランスフェクトした細胞から抽出したＲＮＡのノーザンブロットを、ハイブリダイゼーションタグに対するオリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイズさせた。結果は、切断位置Ａ’またはＡ０を除く欠失が、プロセシングを阻止することを立証した（ｐ１８Ｓ．９、Ｓ．１０、およびＳ．１１；図３ｂ）。しかしながら、５’ＥＴＳの伸張３’領域の欠失は、１８Ｓ ｒＲＮＡの成熟にほとんど影響を与えなかった（ｐ１８Ｓ．７）。この結果は、この領域が、重要な切断位置およびｒＲＮＡプロセシング因子との他の相互作用点を欠くことを示唆する。
【００７６】
位置Ａ’、Ａ０、および１での切断は、Ｕ３ ｓｎｏＲＮＡを必要とし、マウスにおいて、Ｕ３ ｓｎｏＲＮＡのための推定結合部位は、３’および５’ヒンジ領域と呼ばれる、ｓｎｏＲＮＡ中の２つの領域に一致する相補的配列に基づいて仮定された。これらの予測および観察に基づき、ｐ１８Ｓ．９、Ｓ．１０およびＳ．１１における欠失は、ヌクレオチド６６７−６７３、１０３２−１０３８および１１１７−１１２３でのＵ３ ｓｎｏＲＮＡ ３’ヒンジのためのいくつかの可能性のある結合部位を除去し、ｐ１８Ｓ．８、ｐ１８Ｓ．９およびｐ１８Ｓ．１０における欠失は、ヌクレオチド１５５２−１５６０での５’ヒンジのための可能性のある結合部位を除去した。これらのコンストラクト全てにおいて、欠失はプロセシングを阻止した。ｐ１８Ｓ．８中の欠失は、Ｕ３ ｓｎｏＲＮＡの５’ヒンジのための９−ｎｔ 推定結合部位を除くが、切断位置Ａ’およびＡ０の両方は含む。プロセシングのためのこの推定結合部位の必要性を具体的に試験するために、コンストラクト  ｐ１８Ｓ．８Δおよびｐ１８Ｓ．８ｍそれぞれにおける５’ＥＴＳ中の９−ｎｔ配列を、欠失または変異させた（図３ｃ）。これらのコンストラクトを用いてトランスフェクトされた細胞からのＲＮＡのノーザンブロット分析により、両コンストラクトにおける９−ｎｔ配列の破壊は、プロセシングを殆ど完全に阻止したことを示す。この結果は、この９−ｎｔ配列が、Ｕ３ ｓｎｏＲＮＡ ５’ヒンジ領域に結合することを支持する。
【００７７】
Ａ’切断がＵ３ ｓｎｏＲＮＡに依存するため、コンストラクトｐ１８Ｓ．８およびｐ１８Ｓ．９中の推定５’ヒンジ領域の除去が、Ａ’での不完全な切断を示す、複数の成熟していないｒＲＮＡバンドを生じることが特記される（図３ｂ）。いくつかのＡ’切断は、Ｕ３ ｓｎｏＲＮＡ  ５’ヒンジに相補的な配列を生じることなく起こり得ることが明らかである。それに対して、位置Ａ’および可能性のある３’ヒンジ結合部位を欠くｐ１８Ｓ．１１、および両ヒンジ領域のための結合部位を欠くｐ１８Ｓ．１０は、切断されていない一次転写産物を生じ、Ａ’、３’ヒンジ領域、またはこれらの部位の組み合わせが存在しないとき、Ａ０での識別可能な切断がないことを示す。
【００７８】
実施例４  パクタマイシン耐性変異の同定およびサブユニット機能の確認
合成１８Ｓ ｒＲＮＡを含むサブユニットからの翻訳をインビボで選択的にモニターする能力は、修飾および内在性リボソームサブユニットの活性を区別するために、内在性サブユニットを妨げることが可能であることが要求される（図１ａ）。合成ｒＲＮＡのみを含むリボソームサブユニットが、トランスフェクションの約４８時間後の、全細胞４０Ｓリボソームサブユニットのごく一部（約１０−１５％まで）で示されることが示唆されたため、この方法が必要である。
【００７９】
高等真核生物に抗生物質耐性を提供するヌクレオチド変化の機能的試験例は報告されていなかった。パクタマイシンは、小サブユニットのＥ部位中でｒＲＮＡと結合し、この部位でのｍＲＮＡの位置決めを妨害することにより翻訳に影響を及ぼす。パクタマイシン結合の結果は、伸張の阻止、および中止された翻訳開始事象の結果もたらされるジペプチドの集積である。配列番号：２３における４つの塩基、Ｇ９６３、Ａ９６４、Ｃ１０６５およびＣ１０６６でのマウス１８Ｓ ｒＲＮＡの変異の効果を分析した。これらの塩基は、それぞれ、結晶構造から同定された大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのＥ部位での位置６９３、６９４、７９５および７９６に対応する。異なる指示がない限り、哺乳動物の１８Ｓ ｒＲＮＡ配列におけるこれらの部位の番号付けは、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのそれに基づく。変異は、タグ付けされていないマウス１８Ｓ ｒＲＮＡを発現し、完全長５’ＥＴＳおよびＩＴＳ１スペーサー領域を含むコンストラクト（ｐ１８Ｓ．１（Ｐｏｌ−１））中に導入された。パクタマイシン耐性を、１００ｎｇ／ｍｌの抗生物質の存在下、トランスフェクトした細胞の３５Ｓ−Ｍｅｔ／Ｃｙｓパルス標識により評価した。パクタマイシンと結合すると考えられる各ヌクレオチド部位にて、プリン−プリン（Ｇ６９３Ａ、Ａ６９４Ｇ）およびピリミジン−ピリミジン（Ｃ７９５Ｕ、Ｃ７９６Ｕ）塩基転位型変異が生じていた。細胞溶解物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、トランスフェクトされていない細胞と、合成１８Ｓ ｒＲＮＡ、および合成変異１８Ｓ ｒＲＮＡを発現する細胞（図４ａ）を比較した。成熟リボソームもまた、ルシフェラーゼレポータープラスミドを用いてトランスフェクトした細胞（ｐＧＬ４．１３）を、１００ｎｇ／ｍｌパクタマイシン存在下で培養し、それらのルシフェラーゼｍＲＮＡの翻訳能力について分析した（図４ｂ）。両実験セットの結果は、全ての４つの変異が、ある程度のパクタマイシン耐性を提供することを示す。Ｇ６９３ＡおよびＡ６９４Ｇ変異は、最高レベルの耐性を示すが、Ｃ７９５ＵおよびＣ７９６Ｕ変異は、バックグラウンドをわずかに超えた結果を与えた。ラベリング結果（図４ａ）は、変異体の何れも、野生型リボソームと比較して、タンパク質結合パターンを顕著に変化しなかったことを示唆する。
【００８０】
最高レベルのパクタマイシン耐性を提供したＧ６９３Ａ変異を、さらなる実験のために専ら用いた。各変異を有するコンストラクトについての合成１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルを、ハイブリダイゼーションタグを用いてモニターし、Ｇ６９３Ａと他の変異体の翻訳における相違をもたらし得る実質的な相違はなかったことが見出された（図４ｃ）。Ｇ６９３Ａ変異をさらに特徴付けるため、野生型または変異リボソームを発現する細胞を、パクタマイシンの増加濃度下で培養した。結果は、野生型４０Ｓサブユニットからの翻訳が、１００ｎｇ／ｍｌのパクタマイシンにより実質的に阻害されたが、より高濃度でさらに阻害され得ることを示した。これに対して、変異サブユニットからの翻訳は、６，４００ｎｇ／ｍｌの高濃度で試験されたときでも、影響を受けないことが明らかとなった（図４ｄ）。
【００８１】
サブユニット機能のさらなる証拠は、Ｇ６９３Ａ変異を含むリボソームの分布のスクロース密度分析から得られた。これらの実験において、野生型（内在性）および合成（Ｇ６９３Ａ）１８Ｓ ｒＲＮＡを含むリボソームサブユニットの分布は、オリゴヌクレオチドプライマー（６９３ＲＴ）を用いて、Ｇ６９３Ａ変異およびターミネーターとしてのｄｄＣＴＰの下流にハイブリダイズさせて比較した（図５ａ）。これらの反応条件下で、変異１８Ｓ ｒＲＮＡは、内在性ｒＲＮＡから生じたものより２ヌクレオチド長いプライマー伸張産物を生成する。このプライマー伸張反応は、同じサンプル内でのこれらのｒＲＮＡの存在および不存在の分析を可能にする。これらの実験に関して、溶解物は、Ｇ６９３Ａコンストラクトを用いてトランスフェクトされ、シクロヘキシミドまたはＥＤＴＡで処理されたＮ２ａ細胞から調製された。その後、溶解物をスクロース密度勾配により分画し（図５ｂ，ｃ）、得られる画分をプライマー伸張により分析した（図５ｄ，ｅ）。シクロヘキシミドプロファイルによるプライマー伸張産物の分布の分析（図５ｂ，ｄ）は、変異ｒＲＮＡが、ポリソームを通して内在性１８Ｓ ｒＲＮＡの分布と同様の相対分布を有することを示した。ＷＴおよびＧ６９３Ａプライマー伸張産物の定量およびそれらの相対比の比較は、勾配によって相対的に等しい分布を示し（図５ｄ内）、合成１８Ｓ ｒＲＮＡを含むリボソームサブユニットが、内在性サブユニットの機能と同様の機能を有することを示唆する。同様に、ＥＤＴＡで処理した溶解物、４０Ｓピークとの共局在を介して、４０Ｓサブユニットにおける変異１８Ｓ ｒＲＮＡの存在を確認した（図５ｃ，ｅ）。
【００８２】
実施例５  スペーサー領域欠失を有するｒＲＮＡ前駆体由来の４０Ｓサブユニットの機能
サイズに基づき、適切にプロセシングされた成熟１８Ｓ ｒＲＮＡを産すると考えられるいくつかの欠失コンストラクトが同定された（図２および３）。しかしながら、正しい部位での切断は、スペーサー領域と１８Ｓ ｒＲＮＡとの相互作用が正確な折り畳みに必要であり得るため、これらのｒＲＮＡの適切な折り畳み、および機能的サブユニットへの組み込みを確実にするのに充分ではないかもしれない。５’ＥＴＳおよびＩＴＳ１における欠失を有するｒＲＮＡが、４０Ｓリボソームサブユニットについて機能的構造を採り得るかどうかを決定するために、方法部分に記載の通り、Ｇ６９３Ａ変異をコンストラクトｐ１８Ｓ．７および．２のそれぞれに導入し、モノシストロニックルシフェラーゼレポーターコンストラクト（図６ａ）、またはジシストロニック二重ルシフェラーゼベクター（図６ｂ）の何れかを用いてコトランスフェクトした細胞にてそれらを試験した。個々のケースにおける発現を、内在性４０Ｓサブユニットからの翻訳を阻害するために、パクタマイシンの存在下で測定した。欠失コンストラクトにおける誤ったリボソーム形成または折り畳みに起因する構造的変化が、これらのｍＲＮＡの翻訳に種々の影響を与え得ることが予期され、それは、キャップ依存性翻訳およびそれぞれが翻訳能について種々の開始因子を必要とする２クラスのＩＲＥＳ依存性翻訳を表す。
【００８３】
モノシストロニックルコンストラクトについて、リボソーム間で顕著な相違は観察されず、スペーサー配列における欠失が、リボソーム集積を破壊しないか、またはキャップ依存性翻訳と関連する翻訳因子を捕捉するサブユニットの能力に影響を与えないことが示唆された（図６ａ）。ジシストロニックコンストラクトについて、２番目のシストロンの発現が測定され、既知のＩＲＥＳ活性を有しないコントロール配列と比較して、シストロン間領域中のＥＭＣＶまたはＰＶ ＩＲＥＳの何れかにより促進された。結果は、２つのシストロンの発現比（ｈＲｅｎ／ｌｕｃ２；図６ｂ）が、コントロールと、スペーサー欠失ｒＲＮＡコンストラクトとで同様であったことを示し、各ケースにおけるリボソームサブユニットは、これらのＩＲＥＳを介してｍＲＮＡを翻訳する能力において野生型と区別がつかないことが示唆される。これらの結果はさらに、短いｒＲＮＡ転写産物由来のリボソームサブユニットが活性であり、５’ＥＴＳおよびＩＴＳ１から欠失された配列を必要としないという結論を支持する。
【００８４】
実施例６  サブユニット形成の全体効率に対する５’ＥＴＳおよびＩＴＳ１の効果
５’ＥＴＳおよびＩＴＳ１における欠失は、４０Ｓサブユニットの翻訳能力に影響を与えないようだが、これらの隣接配列が、リボソームサブユニットの産生効率に影響を与え得るかどうかは不明であった。本実験のトランスフェクション条件を、リボソームサブユニット産生を最大化するために、個々のコンストラクトからのサブユニットの相対的存在量の相違をマスキングして、最適化した。従って、実験を、希釈したプラスミドコンストラクトを用いてトランスフェクトされた細胞により、細胞当たりの合成ｒＲＮＡの発現を減少するために行われた。これらの実験は、トランスフェクション当たりの同量の全プラスミドによって標準のトランスフェクション条件を用いて行われた。しかしながら、ｐ１８Ｓ ｒＲＮＡ発現プラスミドの量（１μｇ、０．１μｇ、および０．０１μｇ）は、別のプラスミド（ｐＢＳ ＫＳ）をフィラー（filler）として用いることにより変えられた。
【００８５】
この実験で試験された３つの発現コンストラクトは、完全長５’ＥＴＳおよびＩＴＳ１配列（ｐ１８Ｓ．１））、５’ＥＴＳにおける欠失（ｐ１８Ｓ．７）、およびＩＴＳ１における欠失（ｐ１８Ｓ．２）を含む。３つ全てのコンストラクトが、成熟１８Ｓ ｒＲＮＡの検出のためのハイブリダイゼーションタグを含む。異なる希釈率の種々のプラスミドでトランスフェクトした細胞は、ノーザンブロットにより比較したとき、実質的な相違を示さなかった（図９）。まとめると、結果は、隣接するスペーサー領域の欠失が、成熟サブユニットからの翻訳またはその集積に影響を与えないことを示す。しかしながら、この研究は、隣接する領域がわずかな効果を有し得るという可能性は除かれない。結果はまた、フィラープラスミドを有するｐ１８Ｓ．１ ベクターの対数希釈が、成熟４０Ｓサブユニットのレベルの対数的減少をもたらさないことを示し、実験に用いた標準的条件（１．０μｇプラスミド）が、４０Ｓリボソームサブユニットを発現する細胞の能力を飽和させていることを示唆する。
【００８６】
実施例７  材料および方法
ｒＤＮＡクローニングおよび変異誘発：１８Ｓ ｒＤＮＡおよび隣接領域を、マウスＮ２ａ細胞から作製したゲノムＤＮＡならびにオリゴヌクレオチドプライマーｒＤＮＡ．１およびｒＤＮＡ．２を用いてＰＣＲにより増幅させた（表１）。プラスミド ｐＲＬ−ＣＭＶ（Promega）へのクローニングは、それぞれｒＤＮＡ．１およびｒＤＮＡ．２の５’末端に導入された、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限酵素認識部位を用いた。ＰＣＲ産物およびプラスミドコンストラクトの全ての配列決定を、標準的サンガー法を用いて行った。合成１８Ｓ ｒＲＮＡの検出のため、２４ｎｔ配列を、伸張セグメント３中のＳａｃＩ部位を用いて、ハイブリダイゼーションタグとして、１８Ｓ ｒＤＮＡ中にクローニングした。ハイブリダイゼーションタグを、ランダム配列ジェネレーター（www.faculty.ucr.edu/~mmaduro/random.htm）を用いて作製し、最小限の予測された自己相補性およびオリゴ計算（Oligo Calc）（www.basic.northwestern.edu/biotools/OligoCalc.html）を用いて決定されるような二次構造に基づき選択した。ハイブリダイゼーションタグを含むコンストラクトは、‘タグ’伸張、例えば、ｐＰｏｌ−Ｉ（１８Ｓ−タグ）によって明示される。
【００８７】
５’ ＳａｌＩ−ｂｏｘおよび最小限のｐｏｌ−Ｉプロモーターを含む短いＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ−Ｉ）プロモーター要素を、プライマーＰｏｌ−Ｉ．１およびＰｏｌ−Ｉ．２を用いて４５Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子（−１６９ないし＋１）の遺伝子間スペーサーからクローニングした。Ｐｏｌ−Ｉ．１中のＢｌｇＩＩ部位およびＰｏｌ−Ｉ．２中のＮｈｅＩ部位を、ＣＭＶプロモーターおよびキメライントロンを含むＢｌｇＩＩ−ＮｈｅＩフラグメントを置き換えて、ｐＲＬ−ＣＭＶ中にＰＣＲフラグメントをクローニングするために用いた。ｐｏｌ−Ｉターミネーターを、プライマーＰｏｌ−Ｉ．３およびＰｏｌ−Ｉ．４を用いて、１０個の ＳａｌＩ−ｂｏｘ ｐｏｌ−Ｉターミネーターを含む４５Ｓ ｒＤＮＡの３’外部転写スペーサー（３’ＥＴＳ）からクローニングした。プライマーＰｏｌ−Ｉ．３中のＮｏｔＩ部位およびプライマーＰｏｌ−Ｉ．４中のＭｆｅＩ部位を、ＳＶ４０ ポリＡシグナルを含むＮｏｔＩ−ＭｆｅＩフラグメントを置き換えて、ｐＲＬ−ＣＭＶ中にＰＣＲフラグメントをクローニングするために用いた。
【００８８】
３つの５’ＥＴＳおよび２つのＩＴＳ１フラグメントをこれらの実験のためにクローニングした。５’ＥＴＳフラグメントは、全体の４，０１４ｎｔ配列、および部位１の上流を１，１８８および７０３ヌクレオチド伸張する２つのより短いフラグメントである。２つのより大きなフラグメントを、部位１の３’直後に存在する３’部位としてＮｄｅＩを用いてクローニングした。４，０１４ｎｔ配列を、ｐｏｌ−Ｉプロモーターを含むＰＣＲ産物から、プライマーとして、５’ＢｇｌＩＩ部位を含むｒＤＮＡ．３、およびｒＤＮＡ．４を用いて増幅させて得た。１，１８８ｎｔフラグメントを、プライマーとしてｒＤＮＡ．４およびｒＤＮＡ．５を用いて増幅させたＰＣＲ産物から得て、５’ＥＴＳ内に含まれるＮｈｅＩ部位を用いてクローニングした。７０３ｎｔフラグメントを、オリゴヌクレオチドプライマーｒＤＮＡ．１およびｒＤＮＡ．２を用いて行うＰＣＲ反応において、１８Ｓ ｒＤＮＡと共にクローニングした。２つのＩＴＳ１フラグメントは、プライマーｒＤＮＡ．６およびｒＤＮＡ．７を用いて増幅させた１ｋｂのフラグメント、および１８Ｓ ｒＤＮＡと共にクローニングした７０ｎｔフラグメントである。１ｋｂフラグメントを、ｒＤＮＡ．７中に導入されたＮｏｔＩ部位および１８Ｓ ｒＤＮＡの３’末端に存在するＥｃｏＮＩ部位を用いてサブクローニングした。上記の種々のフラグメントを、６つのコンストラクトを作製するために用いた。完全長５’ＥＴＳを含むコンストラクトを、下記の制限酵素フラグメント組み合わせを用いて構築した。ＭｆｅＩ−ＢｇｌＩＩ−ＮｄｅＩ−ＥｃｏＮＩ−ＮｏｔＩ−ＭｆｅＩ。他のコンストラクトを、制限酵素フラグメント組み合わせＭｆｅＩ−ＢｇｌＩＩ−ＮｈｅＩ−ＮｄｅＩ−ＥｃｏＮＩ−ＮｏｔＩ−ＭｆｅＩを用いて構築した。
【００８９】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ−ＩＩ）プロモーターを介する転写に関して、完全長５’ＥＴＳ挿入物以外の上記の挿入物を、ＮｈｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントを置き換えて、プラスミドｐＲＬ−ＣＭＶ中に組み込んだ。完全長５’ＥＴＳ挿入物は、初めに、５’末端のＮｈｅＩ部位を導入するためにオリゴヌクレオチドｒＤＮＡ．１２を用いて再増幅された。ｐＲＬ−ＣＭＶのキメライントロンを除去し、オリゴヌクレオチドｒＤＮＡ．８およびｒＤＮＡ．９をアニーリングすることにより生じたＳａｃＩ−ＮｈｅＩフラグメントに置き換えた。
【００９０】
欠失コンストラクトを、以下の酵素群を用いてプラスミドｐＰｏｌ−Ｉ（１８Ｓ−タグ）を消化し、その後再連結することにより作製した。ＰｖｕＩＩ−ＡｆｅＩ（ｐ１８Ｓ．１１）、ＰｖｕＩＩ−ＺｒａＩ（ｐ１８Ｓ．１０）、ＡｖｒＩＩ−ＮｈｅＩ（ｐ１８Ｓ．９）、ＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ（ｐ１８Ｓ．８）、およびＡａｔＩＩ（ｂｌｕｎｔ）−ＢｇｌＩ（ｂｌｕｎｔ）（ｐ１８Ｓ．７）。ｐ１８Ｓ．７を、プラスミドが付加部位を含むため、ＢｇｌＩを用いる部分消化を用いて作製した。
【００９１】
変異を、変異を含む相補的４５ｎｔプライマーならびにクローニングに用いられる制限酵素部位の外側に位置する５’および３’隣接プライマーを用いてＰＣＲにより作製した。その後、各ＰＣＲ反応によるフラグメントを、発現コンストラクト中にサブクローニングした：抗生物質耐性変異のための１８ＳのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、または５’ヒンジ変異のための５’ＥＴＳのＡｖｒＩＩ−ＡａｔＩＩフラグメント。
【００９２】
レポーター遺伝子：ｐＧＬ４．１３（Promega）を、モノシストロンコントロールとして用いた。ジシストロンコントロールを、合成蛍ルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｃ２の３’ 二重挿入によりｐＧＬ４．１３からコンストラクトした。第一のフラグメント、ＸｂａＩ−ＮｃｏＩフラグメントは、複数のクローニング部位（ＭＣＳ）、脳心筋炎ウイルス（EMCV）に由来する内部リボソーム結合部位（IRES）、またはポリオウイルス（ＰＶ）ＩＲＥＳ（１０）を含む上記コンストラクトに由来した。第二のフラグメントは、ヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子ｈＲｌｕｃを含む、ｐｈＲＧ−Ｂ（Promega）由来のＮｃｏＩ−ＸｂａＩフラグメントであった。
【００９３】
ｒＲＮＡ発現およびプロセシングの分析：これらの実験における全てのコンストラクトを、一時的にトランスフェクトしたニューロ２ａ（Ｎ２ａ）細胞にて試験した。細胞を、６ウェルディッシュに１００，０００細胞／ウェルで播種し、次の日、１μｇＤＮＡ／ウェルおよび３μｌ Fugene 6 (Roche)（トランスフェクション試薬）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの約４８時間後、全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（Life Technologies）を用いて抽出した。ＲＮＡを定量し、２μｇの全ＲＮＡおよび記載の量jのｒＲＮＡインビトロ転写産物を、ノーザンブロット分析のためにアガロースゲルに変性状態で電気泳動した。各サンプルセットに関して、ゲルは、一本鎖ＲＮＡマーカー（１μｇのｓｓＲＮＡマーカー；ＮＥＢ）を含んだ。バンドの位置を、エチジウムブロマイド染色を用いてトランスファー後に膜上にマークした。ノーザンブロット分析のため、膜を、３７℃にて一晩、Ultrahyb 溶液（Ambion）中、３２Ｐ−または３３Ｐ−５’標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイズした。ブロットを、Molecular Dynamicsホスホイメージャーシステムを用いて分析した。種々のオリゴヌクレオチドプローブ（表１）を、種々の配列を含むＲＮＡを検出するために用いた。２４−ｎｔハイブリダイゼーションタグを含むＲＮＡ用のα−タグプローブ；部位１の直ぐ上流に５’ＥＴＳ配列を含むＲＮＡ用のα−５’ＥＴＳプローブ、部位２の３’直後のＩＴＳ１配列を含むＲＮＡ用のα−ＩＴＳ１プローブ、および１８Ｓ ｒＲＮＡ用のα−１８Ｓ ｒＲＮＡプローブ。
【００９４】
サイズコントロール転写産物を、１８Ｓ ｒＤＮＡの最初の２４ヌクレオチドに融合したＴ７ ＲＮＡ ポリメラーゼプロモーターおよび１８Ｓ ｒＤＮＡの３’末端にてヌクレオチドに相補的な３’プライマーｒＤＮＡ．１１を含む、５’プライマーｒＤＮＡ．１０を含むプラスミドテンプレートを用いて増幅させたＰＣＲにより作製したフラグメントからＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔインビトロ転写キットを用いて作製した。得られた転写産物は、内在性１８Ｓ ｒＲＮＡと比較して、３つのさらなる５’グアニンヌクレオチドを含む。タグ付けしていない転写産物は１，８７４ヌクレオチドである。タグ付けした転写産物は１，８９８ヌクレオチドである。
【００９５】
合成リボソームの分析：パクタマイシン耐性リボソームからのタンパク質発現の分析のため、細胞を、２０，０００細胞／ウェルで２４ウェルディッシュに播種し、２４時間後にトランスフェクトした。０．５μｇ ＤＮＡ／ウェルを、１．５μｌ  Fugene 6 (Roche)を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの約４０時間後、細胞培養培地を、Ｌ−メチオニンおよびＬ−システイン欠乏培地に交換した。細胞を、培地を図に記載の新鮮なパクタマイシン含有飢餓培地に交換する３０分前に飢餓状態にし、さらに３０分間培養し、その後、１．２μｌのＴＲＡＮ３５Ｓラベル（MP Biomedicals, Ohio）／ウェルを用いて４時間の間、３５Ｓ−Ｍｅｔ／３５Ｓ−Ｃｙｓで標識付けした。標識付け後、内地を取り除き、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した。細胞を、３５μｌの氷冷ＲＩＰＡバッファー（１０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ７．３、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ  １％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６０３、０．１％ ＳＤＳ、１％ デオキシコール酸ナトリウム、および１ｘ完全プロテアーゼ阻害剤（Roche））を用いてロッカーテーブル（rocker table）上で３０分間、氷上で溶解させた。細胞溶解物を、残渣およびペレットゲノムＤＮＡを取り除くために、１５分間、１２，０００ ｘ ｇにて遠心した。１９μｌの溶解物を、１μｌの１Ｍ ＤＴＴおよび４ｘＬＤＳローディングバッファー（Invitrogen）を用いて新しいチューブに移した。サンプルを５分間９０℃で熱し、氷上に置き、４−１２％ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ ＮｕＰａｇｅ ゲル上でＭＯＰＳ−ＳＤＳバッファーを用いて電気泳動した。ゲルを３０％メタノールに浸し、５％グリセロールに３０分間浸し、真空乾燥させて、Molecular Dynamicsのホスホイメージャーシステムまたはフィルムを用いて分析した。
【００９６】
ポリソーム分析のために、細胞を、６ウェルプレートに１００，０００／ウェルで播種し、２４時間後に、１８Ｓ ｒＤＮＡ発現プラスミドおよび６μｌ Fugene 6／μｇ ＤＮＡを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、サンプルを４℃で処理した。培養培地を吸引し、細胞を、０．１ｍｇ／ｍｌ シクロヘキシミドを含む氷冷ＰＢＳで洗浄した。６つのウェルを、３００μｌの冷溶解バッファーＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、１％ トライトンＸ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌ シクロヘキシミド、０．０５ｘ Ｍｕｒｉｎｅ ＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、１ｘ 完全プロテアーゼ阻害剤（Roche））を用いて集めた。その後、集めた細胞および溶解バッファーをチューブに移し、受動的溶解のために、氷上で１０分間、時折混合しながらインキュベートした。チューブを、１０分間、１６，０００ ｘ ｇで遠心し、細胞残渣を分離させた。約１のＯＤ２６０の上清を、１２ｍｌ １０％−５０％スクロース勾配（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌシクロヘキシミド）にロードした。勾配を、ＳＷ４０Ｔｉローター中で３５，０００ｒｐｍ（１５５，０００ ｘ ｇ）にて３時間遠心し、次いで、ＩＳＣＯフラクショネーターを用いて分画した。ＲＮＡを、これらの画分からエタノール沈殿させ、得られたペレットをフェノール／クロロホルムで抽出した。集めた画分それぞれについて、全量の１／１０を、内在性ｒＲＮＡとパクタマイシン耐性変異を含む合成ｒＲＮＡとを区別するために、ｄｄＣＴＰを用いてプライマー伸張することにより分析した。プライマー伸張反応のためのコントロールは、２００ｎｇの１：１ １８Ｓ ｗｔ／１８Ｓ６９３変異転写産物ミックス（コントロール１）および６００ｎｇのＮ２ａ全ＲＮＡ（コントロール２）を含んだ。ＲＮＡ配列ラダーを、２００ｎｇの同じ１：１転写産物ミックスを用いて生成させた。
【００９７】
ＥＤＴＡにより分離したリボソームに関して、トランスフェクションの４８時間後に、細胞を１ｍＬ温ＰＢＳで洗浄し、１８ウェルを、８００μｌの氷冷溶解バッファーＢ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．３％ Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、０．０５ｘ Murine RNase阻害剤（ＮＥＢ）、１ｘ完全プロテアーゼ阻害剤（Roche））を用いて溶解した。溶解物を、dounce ホモジナイザー（１００パス）を用いて更に処理し、次いで、１５分間、１６，０００ ｘ ｇで回転させて、残渣を沈殿させた。それぞれの溶解物上清のＯＤ２６０を決定し、１／５容量のＥＤＴＡバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＫＣｌ、１５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５ｘ Ｍｕｒｉｎｅ ＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、１ｘ完全プロテアーゼ阻害剤（Roche））を添加して、ＥＤＴＡの終濃度を３０ｍＭに合わせた。約４．５ ＯＤ２６０の各溶解物を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＥＤＴＡ中、１２ｍＬの１０−３５％スクロース勾配上にロードした。勾配を、ＳＷ４０Ｔｉローター中で４０，０００ｒｐｍ（２００，０００ ｘ ｇ）で５時間回転させた。分画サンプルからのＲＮＡを、リボソームサブユニットのより効率的な溶解および濃縮のために、集めた画分それぞれの１／６０を用いたこと以外、上記の通りに分析した。
【００９８】
Ｐ１００ペレットおよびＳ１００上清画分を、核の溶解を最小化するために穏やかな溶解条件を用いて調製した。トランスフェクションの４８時間後、ペレットを１ｍｌの温ＰＢＳで洗浄し、次いで、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および２ｍＭ ＤＴＴを含む２５０μｌの氷冷溶解バッファーＢを各ウェルに添加した。上記の通り、ウェルをかき集めた。細胞溶解物を能動的に溶解させ、遠心して残渣を沈殿させた。その後、上清を、３時間、１００，０００ ｘ ｇで遠心した。ＲＮＡを、上記の分画について記載の通りに上清から単離した。Ｐ１００ペレット、一晩、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２を用いて柔らかくし、ＲＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出した。
【００９９】
１８Ｓ ｒＤＮＡおよびルシフェラーゼレポーターコンストラクトを用いるコトランスフェクション実験に関して、細胞を６ウェルプレートに播種し、上記の通り、１μｇ  ベクター：３μｌ Fugene 6／ウェルを用いて、１８Ｓ ｒＤＮＡ発現コンストラクトでトランスフェクトした。パクタマイシン処理のために、細胞培地をトランスフェクションの４８時間後に取り除き、１００ｎｇ／ｍｌ パクタマイシンを含む培地と交換した。細胞を約３０分間培養し、次いで、１μｇ プラスミドおよび２μｌ Lipofectamine 2000（Invitrogen）を用いてレポーターコンストラクトでトランスフェクションした。細胞を一晩培養し、温ＰＢＳで洗浄し、受動的な溶解バッファー（Promega）で溶解させた。それぞれ独立したトランスフェクション実験のために、等容量の細胞溶解物（２５０μｌのうちの２０μｌ）を、E&G Berthold 96ウェルフォーマットデュアルインジェクタールミノメーターを用いてアッセイした。
【０１００】
本明細書は多くの具体例を含むが、これらは、特許請求されているか、または特許請求され得る本発明の目的の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、むしろ、特定の態様に固有の特徴を記載するものである。別個の態様の文脈で本明細書中に記載されるある特徴が、単一の態様の組み合わせにおいても与えられ得る。逆に言えば、単一の態様の文脈で本明細書中に記載される種々の特徴が、別個に、または何れかの好適な組み合わせで、複数の態様においても与えられ得る。さらに、特徴は、一定の組み合わせの実施、および最初に特許請求されたもの自体として記載され得るが、特許請求された組み合わせからの１またはそれ以上の特徴は、ある場合に、組み合わせから除かれてもよく、特許請求される組み合わせが、下位の組み合わせまたは下位の組み合わせの変形に向けられ得る。わずかな実施例および手段のみが記載される。記載の実施例および手段ならびに他の手段の変形、修飾および改良が、本明細書の記載に基づき行われ得る。
【０１０１】
本明細書に記載される全ての文献、データベース、GenBank配列、特許、および特許出願は、それぞれが具体的かつ個別に引用により包含されることが示されるように、引用により本明細書中に組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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