(57)【要約】1つの態様において、本発明は、脂肪組織を分解して成熟脂肪細胞を溶解させ、それによって生存能力のある間質／幹細胞を含む間質血管画分を得るために、超音波キャビテーションによって脂肪組織を処理する工程を含む、脂肪組織から幹細胞を単離するための非酵素的方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
間質／幹細胞の生存能力を維持しつつ脂肪組織を分解して成熟脂肪細胞を溶解させるのに十分な、時間、振幅、およびサイクルの超音波キャビテーションによって、脂肪組織を処理する工程を含む、脂肪組織から、生存能力のある間質／幹細胞を含む間質血管画分を単離する方法。
【請求項２】
超音波キャビテーション中の脂肪組織の温度が、間質／幹細胞の生存能力を保証する温度で維持される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
脂肪組織の温度が、約43℃〜約45℃を超えない、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項４】
振幅が約20〜約90％およびサイクルが約0.2〜約0.9に設定された超音波装置を用いる約10秒間〜約10分間の超音波キャビテーションによって脂肪組織が処理される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
脂肪組織の温度が約43℃〜約45℃を超えないよう時間、振幅、およびサイクルが選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
振幅が約50％およびサイクルが約0.4〜約0.5に設定された超音波プローブを用いる約1分30秒間〜約1分40秒間の超音波キャビテーションによって脂肪組織が処理される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
超音波キャビテーションによって生じる脂質層が、等張液の添加前に除去される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか一項記載の方法によって単離された、生存能力のある間質／幹細胞を含む間質血管画分。
【請求項９】
請求項8記載の生存能力のある間質／幹細胞を含む間質血管画分を対象に投与する工程を含む、対象における変形性関節症、関節関連炎症障害、炎症性関節炎障害、軟組織損傷もしくは裂傷、軟骨障害、骨障害、自己免疫障害、筋ジストロフィー、慢性疲労、肺障害、肺炎症障害、神経系障害、脊椎障害または神経学的障害を処置する方法。
【請求項１０】
生存能力のある間質／幹細胞を含む間質血管画分を対象に投与する工程を含み、生存能力のある間質／幹細胞を含む該間質血管画分が請求項1〜7のいずれか一項記載の方法によって単離されたものである、対象における変形性関節症、関節関連炎症障害、炎症性関節炎障害、軟組織損傷もしくは裂傷、軟骨障害、骨障害、自己免疫障害、筋ジストロフィー、慢性疲労、肺障害、肺炎症障害、神経系障害、脊椎障害または神経学的障害を処置する方法。
【請求項１１】
変形性関節症、関節関連炎症障害、炎症性関節炎障害、軟組織損傷もしくは裂傷、軟骨障害、骨障害、自己免疫障害、筋ジストロフィー、慢性疲労、肺障害、肺炎症障害、神経系障害、脊椎障害または神経学的障害を処置するための医薬の製造のための、請求項8記載の生存能力のある間質／幹細胞を含む間質血管画分の使用。
【請求項１２】
生存能力のある間質／幹細胞を含む間質血管画分が請求項1〜7のいずれか一項記載の方法によって単離されたものである、変形性関節症、関節関連炎症障害、炎症性関節炎障害、軟組織損傷もしくは裂傷、軟骨障害、骨障害、自己免疫障害、筋ジストロフィー、慢性疲労、肺障害、肺炎症障害、神経系障害、脊椎障害または神経学的障害を処置するための医薬の製造のための、生存能力のある間質／幹細胞を含む該間質血管画分の使用。
【請求項１３】
変形性関節症、関節関連炎症障害、炎症性関節炎障害、軟組織損傷もしくは裂傷、軟骨障害、骨障害、自己免疫障害、筋ジストロフィー、慢性疲労、肺障害、肺炎症障害、神経系障害、脊椎障害または神経学的障害の処置に使用するための、請求項8記載の生存能力のある間質／幹細胞を含む間質血管画分。
【請求項１４】
生存能力のある間質／幹細胞を含む間質血管画分が請求項1〜7のいずれか一項記載の方法によって単離されたものである、変形性関節症、関節関連炎症障害、炎症性関節炎障害、軟組織損傷もしくは裂傷、軟骨障害、骨障害、自己免疫障害、筋ジストロフィー、慢性疲労、肺障害、肺炎症障害、神経系障害、脊椎障害または神経学的障害の処置に使用するための、生存能力のある間質／幹細胞を含む該間質血管画分。
【請求項１５】
脂肪組織の温度が約43℃〜約45℃を超えないことを保証する振幅およびサイクルに設定された超音波装置を用いる約1分30秒間〜約1分40秒間の超音波キャビテーションにより脂肪組織を処理する工程を含む、脂肪組織から生存能力のある間質／幹細胞を含む間質血管画分を単離する方法。
【請求項１６】
振幅が約50％に設定された超音波装置を用いて脂肪組織を処理する工程を含む方法であって、該装置が、脂肪組織の温度が約43℃〜約45℃を超えないことを保証するサイクルに設定され、かつそれを保証する時間にわたって適用される、脂肪組織から生存能力のある間質／幹細胞を含む間質血管画分を単離する方法。
【請求項１７】
サイクルが約0.4〜約0.5に設定された超音波装置を用いて脂肪組織を処理する工程を含む方法であって、該装置が、脂肪組織の温度が約43℃〜約45℃を超えないことを保証する振幅に設定され、かつそれを保証する時間にわたって適用される、脂肪組織から生存能力のある間質／幹細胞を含む間質血管画分を単離する方法。
【請求項１８】
振幅が約50％およびサイクルが約0.4〜約0.5に設定された超音波プローブを用いる約1分30秒間〜約1分40秒間の超音波キャビテーションによって脂肪組織を処理する工程を含む、脂肪組織から生存能力のある間質／幹細胞を含む間質血管画分を単離する方法。
【請求項１９】
間質／幹細胞が48時間の細胞培養後に生存能力があるように、超音波キャビテーションの時間、振幅、およびサイクルが選択される、超音波キャビテーションによって脂肪組織から単離された間質血管画分中の間質／幹細胞の生存能力を維持するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2012年6月26日に出願されたオーストラリア国仮出願第2012902719号からの優先権を主張し、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、幹細胞調製物を利用する方法に関する。
【０００３】
本発明は主として脂肪組織からの間質／幹細胞の非酵素的単離のために開発され、そしてこの用途に関連して本明細書中以降で説明されている。しかし、本発明はこの特定の使用分野に限定されないことを理解されたい。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
本明細書を通してなされる先行技術の議論は、どのような形であれ、そのような先行技術が広く公知となっていることまたは当技術分野の共通の一般知識の一部を形成していることに関する承認とみなされるべきではない。
【０００５】
脂肪組織は、成熟脂肪細胞を含むことに加えて、様々な細胞系統に分化させることができる幹細胞も含んでいる（Zuk et al. Tissue Eng. 2001; 7: 211-228（非特許文献1）; Hicok et al. Tissue Eng. 2004; 10: 371-380（非特許文献2）; Erickson et al. Biochem Biophys Res Commun. 2002; 290: 763-769（非特許文献3）; Cousin et al. Biochem Biophys Res Commun. 2003; 301: 1016-1022（非特許文献4）; Safford et al. Biochem Biophys Res Commun. 2002: 294: 371-379（非特許文献5）; Miranville et al. Circulation. 2004; 1 10: 349-355（非特許文献6）; Planat-Benard et al. Circ Res. 2004; 94: 223-229（非特許文献7）; Planat-Benard et al. Circulation. 2004; 1 09: 656-663（非特許文献8））。幹細胞は接着性であり、培養下で増殖させることができる。したがって、少量の脂肪組織から多数の幹細胞を得ることができる。
【０００６】
現在は、脂肪組織から幹細胞を単離するために、典型的にコラゲナーゼ等の酵素を使用し、脂肪組織をひとかたまりの状態で保持しているコラーゲンの結合を解消させる（例えば、Zuk, et al. Mol Biol Cell. 2002; 13: 4279-4295（非特許文献9）; Zuk, et al. Tissue Eng. 2001; 7: 211-228（非特許文献1）を参照のこと）。コラゲナーゼが有効である間、それは以下の理由から幹細胞の調製に不適切であり得る：
・酵素処理により細胞死が高いレベルで起こり、それによって単離される幹細胞の数が減少し、細胞の残骸が増える；
・酵素は特有の細胞型に損傷を与え、それを破壊し得る；
・単離される幹細胞への酵素の混入は、それらを移植に適さないものにし得る；および
・規制当局は、幹細胞の単離における酵素の使用が薬物承認を必要とする細胞製品を生成するとみなす可能性がある。
【０００７】
先行技術の欠点の少なくとも1つを克服もしくは軽減することまたは有用な代替法を提供することが、本発明の目的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Zuk et al. Tissue Eng. 2001; 7: 211-228
【非特許文献２】Hicok et al. Tissue Eng. 2004; 10: 371-380
【非特許文献３】Erickson et al. Biochem Biophys Res Commun. 2002; 290: 763-769
【非特許文献４】Cousin et al. Biochem Biophys Res Commun. 2003; 301: 1016-1022
【非特許文献５】Safford et al. Biochem Biophys Res Commun. 2002: 294: 371-379
【非特許文献６】Miranville et al. Circulation. 2004; 1 10: 349-355
【非特許文献７】Planat-Benard et al. Circ Res. 2004; 94: 223-229
【非特許文献８】Planat-Benard et al. Circulation. 2004; 1 09: 656-663
【非特許文献９】Zuk, et al. Mol Biol Cell. 2002; 13: 4279-4295
【発明の概要】
【０００９】
驚くべきことに、本発明者らは、超音波キャビテーションによる脂肪組織の処理が脂肪組織を分解して成熟脂肪細胞を溶解させ、それによって生存能力のある幹／間質細胞および細胞外マトリクスを含む間質血管画分をもたらすことを見出した。
【００１０】
1つの局面において、本発明は、脂肪組織からの、生存能力のある間質／幹細胞および細胞外マトリクスを含む間質血管画分の単離に関し、この方法は、間質／幹細胞の生存能力を維持しつつ脂肪組織を分解して成熟脂肪細胞を溶解させるのに十分な、時間、振幅、およびサイクルの超音波キャビテーションによって、脂肪組織を処理する工程を含む。
【００１１】
超音波キャビテーションの振幅およびサイクルの設定は変更可能であり得、それは脂肪組織の量および細胞の生存能力を維持するためのプロセスのタイミングに依存する。細胞の生存温度範囲を超過すべきではない。
【００１２】
別の局面において、超音波キャビテーション中の脂肪組織の温度は、間質／幹細胞の生存能力を保証する温度で維持される。
【００１３】
別の局面において、脂肪組織の温度は、約43℃〜約45℃を超えない。
【００１４】
別の局面において、脂肪組織は、振幅が約20〜約75％およびサイクルが約0.2〜約0.9に設定された超音波装置を用いる約10秒間〜約10分間の超音波キャビテーションによって処理される。
【００１５】
別の局面において、超音波キャビテーション装置用プローブが脂肪組織に配置され、振幅が約50％に設定され、サイクルが約0.4〜約0.5に設定され、そしてこのプローブを、約1分30秒間〜約1分40秒間、脂肪組織中を上下させ；そしてここで、脂肪組織の温度は約43℃〜約45℃より低い温度で維持される。
【００１６】
別の局面において、本発明は、本発明の方法にしたがい単離される生存能力のある幹細胞を含む間質血管画分に関する。
【００１７】
別の局面において、間質血管画分は、幹細胞以外の生存能力のある細胞を含む。
【００１８】
別の局面において、本発明は、本発明の方法にしたがい単離される脂肪組織由来幹細胞に関する。
【００１９】
別の局面において、本発明は、本発明にしたがう脂肪組織由来間質／幹細胞調製物を対象に投与する工程を含む、対象における変形性関節症、関節関連炎症障害、炎症性関節炎障害、軟組織損傷もしくは裂傷、軟骨障害、骨障害、自己免疫障害、筋ジストロフィー、慢性疲労、肺障害、肺炎症障害、神経系障害、脊椎障害または神経学的障害を処置する方法に関する。
【００２０】
別の局面において、本発明は、変形性関節症、関節関連炎症障害、炎症性関節炎障害、軟組織損傷もしくは裂傷、軟骨障害、骨障害、自己免疫障害、筋ジストロフィー、慢性疲労、肺障害、肺炎症障害、神経系障害、脊椎障害または神経学的障害を処置するための医薬の製造のための、本発明にしたがう脂肪組織由来間質／幹細胞調製物の使用に関する。
【００２１】
別の局面において、本発明は、変形性関節症、関節関連炎症障害、炎症性関節炎障害、軟組織損傷もしくは裂傷、軟骨障害、骨障害、自己免疫障害、筋ジストロフィー、慢性疲労、肺障害、肺炎症障害、神経系障害、脊椎障害または神経学的障害の処置に使用するための、本発明にしたがう脂肪組織由来間質／幹細胞調製物に関する。
【００２２】
別の局面において、本発明は、脂肪組織の温度が約43℃〜約45℃を超えないことを保証する振幅およびサイクルに設定された超音波装置を用いる約1分30秒間〜約1分40秒間の超音波キャビテーションにより脂肪組織を処理する工程を含む、脂肪組織から生存能力のある間質／幹細胞を含む間質血管画分を単離する方法に関する。
【００２３】
別の局面において、本発明は、振幅が約50％に設定された超音波装置を用いて脂肪組織を処理する工程を含み、該装置が、脂肪組織の温度が約43℃〜約45℃を超えないことを保証するサイクルに設定され、かつそれを保証する時間にわたって適用される、脂肪組織から生存能力のある間質／幹細胞を含む間質血管画分を単離する方法に関する。
【００２４】
別の局面において、本発明は、サイクルが約0.4〜約0.5に設定された超音波装置を用いて脂肪組織を処理する工程を含み、該装置が、脂肪組織の温度が約43℃〜約45℃を超えないことを保証する振幅に設定され、かつそれを保証する時間にわたって適用される、脂肪組織から生存能力のある間質／幹細胞を含む間質血管画分を単離する方法に関する。
【００２５】
別の局面において、本発明は、振幅が約50％およびサイクルが約0.4〜約0.5に設定された超音波プローブを用いる約1分30秒間〜約1分40秒間の超音波キャビテーションによって脂肪組織を処理する工程を含む、脂肪組織から生存能力のある間質／幹細胞を含む間質血管画分を単離する方法に関する。
【００２６】
別の局面において、本発明は、超音波キャビテーションによって脂肪組織から単離された間質血管画分中の間質／幹細胞の生存能力を維持するための方法であって、間質／幹細胞が48時間の細胞培養後に生存能力があるように、超音波キャビテーションの時間、振幅、およびサイクルが選択される方法に関する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「脂肪組織」という用語は、任意の脂肪組織を表す。脂肪組織は、褐色または白色脂肪組織であり得る。好ましくは、脂肪組織は、皮下白色脂肪組織である。脂肪組織は、脂肪組織を有する任意の生物由来であり得る。好ましくは、脂肪組織は哺乳動物、最も好ましくは脂肪組織はヒトの脂肪組織である。ヒト脂肪組織の便利な供給源は、脂肪吸引手術またはその他の手術から得られるものである。しかし、脂肪組織の供給源または脂肪組織の単離方法は、本発明にとって重要ではない。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「間質血管画分」という用語は、脂肪組織中で見られる血管および周辺組織から得られる細胞を含む画分を表す。この画分は、例として間葉系幹細胞、初期間葉／間質前駆細胞、脂肪組織由来幹細胞、Muse-AT細胞、造血細胞、造血幹細胞、血小板、クッパー細胞、破骨細胞、巨核球、顆粒球、NK細胞、内皮前駆（precursorまたはprogenitor）細胞、多能性細胞、CD34+細胞、Stro-1+細胞、Stro-3+細胞、CD29+細胞、CD166+細胞、Thy-1+またはCD90+幹細胞、CD44+細胞、免疫細胞、例えば単球、白血球、リンパ球、Band T細胞、NK細胞、マクロファージ、好中性白血球、好中球、好中性顆粒球等を含む異なる細胞型を含み得る。間質血管画分はまた、本明細書に開示されるマーカーのいずれかまたはその任意の組み合わせを発現する細胞を含む。本明細書で使用される場合、「間質血管画分」という用語は、「間葉血管画分」、「間葉画分」、「間質画分」等の用語をその範囲内に含む。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「間葉系幹細胞」という用語は、多能性であり、多種の異なる細胞型、例えば非限定的に脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋肉およびニューロン／グリア細胞系統への幹細胞様前駆体として機能し得る、間質もしくは間葉細胞または初期間葉／間質前駆体または脂肪組織由来間質／幹細胞を表す。
【００３０】
間葉系幹細胞は、例えば脂肪組織および骨髄から得ることができる部分集合を構成する。本明細書で使用される場合、「間葉系幹細胞」という用語は、「間質幹細胞」、「骨髄間質細胞」、「多能性間質細胞」、「間葉前駆細胞」、「Muse-AT」、脂肪組織由来間質／幹細胞等の用語をその範囲内に含む。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「分化した」という用語は、十分に発達しそして特定の環境および／または機能への生物学的特化および／または適合を示すよう最終的な成熟状態に達した細胞を表す。典型的に、分化した細胞は、その細胞における分化関連タンパク質をコードする遺伝子の発現によって特徴づけられる。例えば、白血球におけるGALCの発現は、最終分化した白血球の典型例である。
【００３２】
「前駆細胞（precursor cell、progenitor cell）」および「幹細胞」という用語は、当技術分野および本明細書で言い換え可能に使用され、自身を再生するかまたは所望の細胞型に分化するであろう子孫細胞を生じるかのいずれかのために潜在的に無制限の有糸分裂を行うことができる、多能性または系統未決定のいずれかの前駆細胞を表す。多能性幹細胞と異なり、系統決定された前駆細胞は、一般に、表現型が相互に異なる多数の細胞型を生じることができないと考えられている。その代わり、前駆細胞は、1つまたはおそらく2つの系統決定された細胞型を生じる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「多能性（multipotent、multipotentialまたはmultipotentiality）」という用語は、複数の細胞型に分化する幹細胞の能力を指すことが意図される。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「同種異系」という用語は、同一種の異なる哺乳動物から得られる任意の物質を指すことが意図される。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「自己由来」という用語は、ある個体から得られその個体に再導入される任意の物質を指すことが意図される。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「細胞調製物（cell preparationまたはcell preparations）」という用語は、細胞を含むが他の物質、例えば成長因子、細胞外マトリクス等も含み得る調製物を指すことが意図される。
【００３７】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、文脈が明らかにそれ以外のことを必要としていない限り、「含む（comprise、comprising）」等の語は、排他的な意味と対照的な内包的な、または網羅的な意味で、すなわち「〜を含むがこれらに限定されない」の意味で、解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】P層。
【図２】超音波キャビテーション処理した脂肪組織から成長させた間質血管画分由来のプラスチック接着細胞のギムザ染色コロニー。
【図３】超音波キャビテーション処理した脂肪組織から成長させた間葉系幹細胞の細胞培養物。
【図４】脂肪組織の温度に対する超音波キャビテーションの振幅設定の効果  -  20グラムの脂肪組織をサイクル設定0.4で1 1/2分間処理した。
【図５】脂肪組織の温度に対する超音波キャビテーションのサイクル設定の効果  -  20グラムの脂肪組織を振幅設定50％で1 1/2分間処理した。
【図６】間質血管画分の細胞の生存能力に対する超音波キャビテーションの振幅の効果  -  20グラムの脂肪組織をサイクル設定0.4で1 1/2分間処理した。
【図７】超音波キャビテーション処理した脂肪組織から得られた細胞のフローサイトメトリー分析  -  超音波キャビテーションによって分離された40グラムの脂肪組織の、発蛍光性の核による細胞の計数。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
好ましい態様の詳細な説明
1つの態様において、本発明の方法は、脂肪組織中の脂肪細胞を破裂または溶解させて間質血管画分を放出させるよう脂肪組織に配置して接触させるプローブを有する超音波キャビテーション装置を使用する。使用される個別の超音波キャビテーション装置は本発明にとって重要ではない。1つの適当な選択は、最先端の高出力超音波プロセッサである、HIELSCHLER超音波プロセッサである。この装置は、マイクロリットルからリットルまでの広範囲の有機および無機物質を安全に処理することができる。使用され得る他の装置は、Vibra-Cell（商標）装置（Sonics）、VASER（SoltaMedical）またはQSonica超音波プロセッサを含む。
【００４０】
別の態様において、生物学的溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液または標準生理食塩水溶液）中の脂肪組織は、冷却環境に置かれ得る（組織／細胞は約2℃より低くすべきでない）。超音波キャビテーション装置用プローブが脂肪組織に配置され、そして約10秒間、約20秒間、約30秒間、約40秒間、約50秒間、約60秒間、約1分10秒間、約1分20秒間、約1分30秒間、約1分40秒間、約1分50秒間、約2分間、約3分間、約4分間、約5分間、約6分間、約7分間、約8分間、約9分間、約10分間、振幅が約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％に、サイクルが約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9に設定される。好ましくは振幅が約50％に、サイクルが約0.4〜0.5に設定される。プローブは、操作中、チューブ内の異なる位置に調節され得る。この作業は、冷却環境下でまたは室温で行われ得、振幅、サイクルおよび時間は、脂肪組織の温度が約43℃〜約45℃を超えて上昇しないように、好ましくは約37℃を超えて上昇しないように調整される。超音波キャビテーションの時間は、脂肪組織の量に依存する順序の決められた時間で運用され得、例えば、多量の脂肪組織の場合、プローブはチューブ内の2つの異なる位置で約1分間次いで約40秒間上下させ、または少量の脂肪組織の場合は、プローブはチューブの上部で約1分間次いで約30秒間上下させ、もしくはプローブは約30秒間脂肪組織に挿入し、約10秒間停止させ、次いで繰り返し、次いで約30秒間脂肪組織の上部に持ち上げる。超音波キャビテーション（特にその振幅、サイクルおよび適用時間）の順序およびタイミングは、様々であり得るが、脂肪組織の温度が理想的には37℃を超えないようにまたは約43℃〜約45℃以下となるようにすることによって間質血管画分における幹細胞の最適な細胞数および生存能力が保証されるよう決定され得る。これらのパラメータは、簡単な試行錯誤によって容易に決定され得る。典型的に、振幅は約50％であり、サイクルは約0.4〜約0.5であり、そして時間は約1分30秒間である。振幅を増大させる場合、脂肪組織の温度が約43℃〜約45℃を超えて上昇しないことを保証するために、その結果としてサイクルまたは時間が減らされ得る（逆も同様）。記載されているように、この処理は、代わりに超音波キャビテーションによって細胞の解離が達成されるため、コラゲナーゼ、またはコラーゲンを破壊することが意図される同等の酵素の添加を含まない。超音波処理の後、チューブ内には濃溶液が存在し（これは濾過することや間質血管画分に容易に分離させることができない）、遠心分離され得る。
【００４１】
遠心分離により、3つの層 - 上部脂質層、細胞外マトリクス、脂肪細胞および間質血管細胞を含む中間浮動層（P層と呼ばれる）ならびに底部液体層、が形成される。上部脂質層は除去され（脂質層を除去することにより、等張液を添加したときに細胞の分離が可能になる）そして廃棄され、チューブの残りの内容物が十分に混合され、そして溶液、典型的には0.9％生理食塩水、PBSまたは任意の他の等張溶液がチューブに添加される。さらなる遠心分離が、細胞および細胞外マトリクスを底部に降下させてペレット化させ、残りの脂肪細胞がチューブの上側に上昇する。このペレットは、細胞外マトリクスおよび生存能力があり機能的な間質／幹細胞（間葉系幹細胞を含む）を含む間質血管画分を含む。ペレットは、任意の大きな残骸を除去するためにフィルターを通して濾過され得る。この細胞溶液はそのまま使用することができ、またはさらなる遠心分離および過剰な液体の除去によってさらに濃縮することができる。細胞計数のためにサンプルが採取される。細胞の生存能力および機能性は、当技術分野で知られている細胞培養技術によって決定され得る。細胞は、FACs機器および蛍光核結合染色、すなわちGuava PCAシステムおよびGuava Viacountを用いて計数され得る。
【００４２】
典型的に、この方法を用いて20gの脂肪組織から得られる細胞数は、約4千万〜2億細胞、すなわち1グラムあたり約2百万〜1千万細胞であり、これは典型的に脂肪組織1グラムあたり約50万細胞が得られるコラゲナーゼ分離のそれよりも多い。
【００４３】
別の態様において、この方法は、以下の工程を含む：
（a）超音波キャビテーション装置用プローブを約40gの脂肪組織に配置し、振幅を約50％に設定しサイクルを約0.4〜0.5に設定する；
（b）プローブを、脂肪組織の2つの異なる位置で、約1分間次いで約40秒間脂肪組織中を上下させる；
（c）脂肪組織を800g/5分間遠心分離する；
（d）上部脂質層を廃棄し、脂肪組織を混合する；
（e）等張溶液を添加し、脂肪組織を800g/5分間遠心分離する；
（f）得られる細胞ペレットが、細胞外マトリクスおよび生存能力のある幹細胞を含む間質血管画分を含んでいる。
【００４４】
別の態様において、この方法は、以下の工程を含む；
（a）超音波キャビテーション装置用プローブを約40gの脂肪組織に配置し、振幅を約50％に設定しサイクルを約0.4〜0.5に設定する；
（b）プローブを、脂肪組織の上部で、約1分間次いで約30秒間脂肪組織中を上下させる；
（c）脂肪組織を800g/5分間遠心分離する；
（d）上部脂質層を廃棄し、脂肪組織を混合する；
（e）等張溶液を添加し、脂肪組織を800g/5分間遠心分離する；
（f）得られる細胞ペレットが、細胞外マトリクスおよび生存能力のある幹細胞を含む間質血管画分を含んでいる。
【００４５】
別の態様において、幹細胞は、自己由来または同種異系である。
【００４６】
間質血管画分または間質／幹細胞は、従来的な投与経路、例えば静脈内注射もしくは関節内注射によりそれを必要とする対象に直接注入され得、またはそれは投与の前に所望の細胞型、例えば間葉系幹細胞もしくはSTRO-1+細胞を精製（および所望の場合は培養下で増幅）するためにさらに処理され得る。
【００４７】
いくつかの態様において、幹細胞は、インビトロ増幅のために、特有の細胞表面抗原および蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いる分画により間質血管画分から単離、精製または濃縮され得る。
【００４８】
いくつかの態様において、間質血管画分または間質／幹細胞は、標準的な細胞培養技術を用いて、分化させつつまたは分化させずに培養され得る。細胞は、適切な点まで培養され、そして生存能力および収量が標準的な方法によって評価され得る。
【００４９】
他の態様において、間質血管画分または間質／幹細胞は、後の移植／注入のために（例えば凍結保存により）保管され得る。細胞バンクにおける中〜長期間の保管もまた、本発明の範囲内である。
【００５０】
処理の最後に、間質血管画分または間質／幹細胞は、皮下、静脈内、筋内または腹腔内のいずれかの技術によるレシピエントへの投与のために、送達装置、例えば注射器または静注バッグに充填され得る。換言すると、細胞は、当業者に公知の任意の手段によって患者に配置され得る、例えば、それらは全身もしくは局所送達のために血管に、組織（例えば、心筋もしくは骨格筋）に、真皮（皮下）に、組織空間（例えば、心膜もしくは腹膜）に、または組織（例えば、尿路周囲配置）に、または他の部位に、注射され得る。好ましい態様は、添加物、例えばプレフォームマトリックスまたは脂肪組織由来もしくは間質由来細胞外マトリクスと共に針もしくはカテーテルによりまたは直接的な外科移植により配置することを含む。
【００５１】
間質血管画分または間質／幹細胞は、単独でまたは他の細胞、組織、組織片、脱灰骨（demineralized bone）、例えばインスリンなどの成長因子、または例えばチアグリタゾン（thiaglitazone）ファミリーのメンバーなどの薬物、生物学的に活性もしくは不活性な化合物、吸収性プラスチックスキャホールド、脂肪組織由来もしくは間質由来格子（lattice）および／もしくは細胞外マトリクス、またはその集団の送達、効能、耐容性もしくは機能を増強することが意図されるその他の添加物と組み合わせて適用され得る。本発明の特定の態様において、細胞は、1つまたは複数の細胞分化剤、例えばサイトカインおよび成長因子と共に患者に投与される。他の態様において、細胞は多血小板血漿（platelet-rich plasma）で処理される。
【００５２】
別の態様において、間質血管画分または間質／幹細胞は、対象において疾患または障害を処置または予防するために対象に投与される。
【００５３】
別の態様において、疾患または障害は、変形性関節症、関節関連炎症障害、炎症性関節炎障害、軟組織損傷もしくは裂傷、軟骨障害、骨障害、自己免疫障害、筋ジストロフィー、慢性疲労、肺障害、肺炎症障害、神経系障害、脊椎障害または神経学的障害である。
【００５４】
本発明は、ここから、特定の組成物および使用方法に関する特定の、しかし非限定的な実施例を参照してより詳細に説明される。しかしながら、特定の手順、組成物および方法の詳細な説明は、単に本発明を例示する目的で含まれるにすぎないことを理解されたい。いかなるかたちであれ、上記の本発明のコンセプトの広義的な説明に対する限定と理解されるべきではない。
【実施例】
【００５５】
実施例1 - 脂肪吸引による脂肪組織の調製
脂肪吸引術の前に、吸引される吸引脂肪量を超える過剰量のチューメセント溶液（1リットルの標準生理食塩水中に、1mgのアドレナリン、400mg〜800mgのリグノカインおよび10mLの8.4%炭酸水素ナトリウム溶液を含む）を、皮下脂肪層に注入し（チューメセント法）、その後に、例えば2〜3mmの内径を有するカニューレ（アスピレータを有する金属製のもの）を脂肪吸引術に使用した。脂肪吸引術は当技術分野で周知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるBiyo Seikei Shujutsu Practice 2（Cosmetic Operation Practice 2）, ed. Masanari ICHIDA, Ryusaburo TANINO, and Yoshiaki HOSAKA, published by BUNKODO, pp.429-469を参照することができる。
【００５６】
吸引した脂肪を生理食塩水で洗浄した。約50ml〜10リットルの洗浄済吸引物が生じ得、得られた脂肪組織由来細胞物質を、間質血管画分の取得のために使用した。
【００５７】
実施例2 - 手術による脂肪組織の調製
脂肪組織は、インフォームドコンセントを得たヒト対象から手術によって取得される。分離は、当技術分野で周知の技術を用いて行った。簡単に説明すると、ヒト脂肪組織を、インフォームドコンセントを得たヒト対象から吸引した脂肪組織から無菌的に分離した。得られた脂肪組織由来細胞物質を、間質血管画分の取得のために使用した。
【００５８】
実施例3 - 超音波キャビテーション（振幅40％およびサイクル0.5で1分40秒間の超音波キャビテーション）による生存能力のある幹細胞を含む間質血管画分の調製
1）脂肪組織を脂肪吸引物から入手し、45mlを50mlチューブに入れる。
2)過剰な液体を、200g/2分間の遠心分離により過剰な液体と脂肪組織を分離することによって除去する。チューブの下部にある過剰な液体を除去し、これにより典型的には40mlの脂肪組織が残る。
3）（任意）チューブを冷却環境下に置き、組織／細胞の温度が2℃を下回らないよう注意する。
4）超音波キャビテーション装置用プローブHielschler UP200Sを脂肪組織に配置し、振幅を50％、サイクルを0.5に設定する。プローブを、チューブ内の2つの異なる位置（すなわち、チューブの底部および上部）で、1分間次いで40秒間上下させ、3分間静止し、そして任意でこの処理を繰り返す。脂肪組織の温度が43℃を超えて、好ましくは37℃を超えて上昇しないよう注意する。
5）超音波処理後に濃溶液がチューブ内で観察され、これを300g/5分間遠心分離する。
6）遠心分離後、3つの層 - 上部脂質層、細胞外マトリクスおよび間質血管細胞を含む中間浮動層、ならびに底部液体層が存在する。
7）上部脂質層を、混合用カニューレおよび注射器を用いて除去および廃棄し（脂質層を除去することにより、等張液を添加したときに細胞の分離が可能になる）そしてチューブの残りの内容物を十分に混合してさらに細胞外マトリクスを分断する。
8）等張溶液（典型的には0.9％生理食塩水またはPBS）をチューブに添加して50mlにし、そしてチューブを600g/5分間遠心分離することにより、細胞および細胞外マトリクスの降下を開始させ、底部でペレット化させる。
9）細胞外マトリクスおよび生存能力があり機能的な幹細胞を含む間質血管画分を含む大きなペレットがチューブの底部で観察される。次いでこのペレットを、混合用カニューレおよび注射器を用いておよそ15mlの液体にて取り出し、そして任意の大きな残骸を除去するために100umフィルターを通して濾過する。
10）この細胞溶液はそのまま使用することができ、またはさらなる遠心分離および過剰な液体の除去によってさらに濃縮することができる。
【００５９】
単離された間質血管画分のフローサイトメトリー分析は、生存能力のある細胞の存在を示している（図1）。
【００６０】
実施例4 - 超音波キャビテーション（振幅50％およびサイクル0.5で1分30秒間の超音波キャビテーション）による生存能力のある幹細胞を含む間質血管画分の調製
1）脂肪組織を脂肪吸引物から入手し、25mlを2 x 50ml遠心チューブに入れる。
2)過剰な液体を、200g/2分間の遠心分離により過剰な液体と脂肪組織を分離することによって除去する。チューブの下部にある過剰な液体を除去し、これにより典型的には20mlの脂肪組織が残る。
3）（任意）チューブを冷却環境下または室温下に置き、組織／細胞の温度が2℃を下回らないよう注意する。
4）超音波キャビテーション装置用プローブHielschler UP200Sを脂肪組織に配置し、振幅を50％、サイクルを0.5に設定する。プローブを、各チューブの上部で1分間次いで30秒間上下させる。脂肪組織の温度が43℃を超えて、好ましくは37℃を超えて上昇しないよう注意する。
5）超音波処理後に濃溶液がチューブ内で観察され、これを300g/5分間遠心分離する。
6）遠心分離後、3つの層 - 上部脂質層、細胞外マトリクスおよび間質血管細胞を含む中間浮動層、ならびに底部液体層が存在する。
7）上部脂質層を、混合用カニューレおよび注射器を用いて除去および廃棄し（脂質層を除去することにより、等張液を添加したときに細胞の分離が可能になる）そしてチューブの残りの内容物を十分に混合してさらに細胞外マトリクスを分断する。
8）等張溶液（典型的には0.9％生理食塩水またはPBS）をチューブに添加して50mlにし、そしてチューブを600g/5分間遠心分離することにより、細胞および細胞外マトリクスの降下を開始させ、底部でペレット化させる。
9）細胞外マトリクスおよび生存能力があり機能的な幹細胞を含む間質血管画分を含む大きなペレットがチューブの底部で観察される。次いでこのペレットを、混合用カニューレおよび注射器を用いておよそ15mlの液体にて取り出し、そして任意の大きな残骸を除去するために100umフィルターを通して濾過する。
10）この細胞溶液はそのまま使用することができ、またはさらなる遠心分離および過剰な液体の除去によってさらに濃縮することができる。
【００６１】
実施例5 - 超音波キャビテーション（振幅50％およびサイクル0.4で1分40秒間の超音波キャビテーション）による生存能力のある幹細胞を含む間質血管画分の調製
1）脂肪組織を脂肪吸引物から入手し、45mlを50mlチューブに入れる。
2)過剰な液体を、200g/2分間の遠心分離により過剰な液体と脂肪組織を分離することによって除去する。チューブの下部にある過剰な液体を除去し、これにより典型的には40mlの脂肪組織が残る。
3）超音波キャビテーション装置用プローブHielschler UP200Sを脂肪組織に配置し、振幅を50％、サイクルを0.4に設定する。プローブを、チューブ内の2つの異なる位置（すなわち、チューブの中間部および上部）で、1分間次いで40秒間上下させ、脂肪組織の温度が43℃を超えて、好ましくは37℃を超えて上昇しないよう注意する。
4）超音波処理後に濃溶液がチューブ内で観察され、これを800g/5分間遠心分離する。
5）遠心分離後、3つの層 - 上部脂質層、細胞外マトリクスおよび間質血管細胞を含む中間浮動層、ならびに底部液体層が存在する。
6）上部脂質層を、混合用カニューレおよび注射器を用いて除去および廃棄し（脂質層を除去することにより、等張液を添加したときに細胞の分離が可能になる）そしてチューブの残りの内容物を十分に混合してさらに細胞外マトリクスを分断する。
7）等張溶液（典型的には0.9％生理食塩水またはPBS）をチューブに添加して50mlにし、そしてチューブを800g/5分間遠心分離することにより、細胞および細胞外マトリクスの降下を開始させ、底部でペレット化させる。
8）細胞外マトリクスおよび生存能力があり機能的な幹細胞を含む間質血管画分を含む大きなペレットがチューブの底部で観察される。次いでこのペレットを、混合用カニューレおよび注射器を用いておよそ15mlの液体にて取り出し、そして任意の大きな残骸を除去するために100umフィルターを通して濾過する。
9）この細胞溶液はそのまま使用することができ、またはさらなる遠心分離および過剰な液体の除去によってさらに濃縮することができる。
【００６２】
実施例6 - 超音波キャビテーション（振幅50％およびサイクル0.4で1分30秒間の超音波キャビテーション）による生存能力のある幹細胞を含む間質血管画分の調製
1）脂肪組織を脂肪吸引物から入手し、25mlを2 x 50mlの遠心チューブに入れる。
2)過剰な液体を、200g/2分間の遠心分離により過剰な液体と脂肪組織を分離することによって除去する。チューブの下部にある過剰な液体を除去し、これにより典型的には20mlの脂肪組織が残る。
3）超音波キャビテーション装置用プローブHielschler UP200Sを脂肪組織に配置し、振幅を50％、サイクルを0.4に設定する。プローブを、各チューブの上部で1分間次いで30秒間上下させる。脂肪組織の温度が43℃を超えて、好ましくは37℃を超えて上昇しないよう注意する。
4）超音波処理後に濃溶液がチューブ内で観察され、これを800g/5分間遠心分離する。
5）遠心分離後、3つの層 - 上部脂質層、細胞外マトリクスおよび間質血管細胞を含む中間浮動層、ならびに底部液体層が存在する。
6）上部脂質層を、混合用カニューレおよび注射器を用いて除去および廃棄し（脂質層を除去することにより、等張液を添加したときに細胞の分離が可能になる）そしてチューブの残りの内容物を十分に混合してさらに細胞外マトリクスを分断する。
7）等張溶液（典型的には0.9％生理食塩水またはPBS）をチューブに添加して50mlにし、そしてチューブを800g/5分間遠心分離することにより、細胞および細胞外マトリクスの降下を開始させ、底部でペレット化させる。
8）細胞外マトリクスおよび生存能力があり機能的な幹細胞を含む間質血管画分を含む大きなペレットがチューブの底部で観察される。次いでこのペレットを、混合用カニューレおよび注射器を用いておよそ15mlの液体にて取り出し、そして任意の大きな残骸を除去するために100umフィルターを通して濾過する。
9）この細胞溶液はそのまま使用することができ、またはさらなる遠心分離および過剰な液体の除去によってさらに濃縮することができる。
【００６３】
実施例7 - 超音波キャビテーションによるP層の調製
1）脂肪組織を脂肪吸引物から入手し、25mlを2 x 50mlの遠心チューブに入れる。
2)過剰な液体を、200g/2分間の遠心分離により過剰な液体と脂肪組織を分離することによって除去する。チューブの下部にある過剰な液体を除去し、これにより典型的には20mlの脂肪組織が残る。
3）超音波キャビテーション装置用プローブHielschler UP200Sを脂肪組織に配置し、振幅を50％、サイクルを0.4に設定する。プローブを、各チューブの上部で1分間次いで30秒間上下させる。脂肪組織の温度が43℃を超えて、好ましくは37℃を超えて上昇しないよう注意する。
4）超音波処理後に濃溶液がチューブ内で観察され、これを800g/5分間遠心分離する。
5）遠心分離後、3つの層 - 上部脂質層、細胞外マトリクスおよび間質血管細胞を含む中間浮動層（P層）ならびに底部液体層、が存在する（図1）。
9）上部脂質層および底部液体層を除去し、混合用カニューレを用いて中間P層を回収する。
【００６４】
P層溶液は、そのまま使用することができ、またはさらなる遠心分離および過剰な液体の除去によってさらに濃縮もしくは等張液によって希釈することができる。
【００６５】
実施例8 - 増幅された幹細胞の調製
実施例3または実施例4の方法によって得た細胞を、標準的な細胞培養培地（例えば、典型的にはウシ胎仔血清、ヒト血清を補充されたアルファMEMまたは無血清培地）を用いて分化させずに培養した。初代培養物を1 x 106/100mmとなるようプレーティングし、そして細胞を5％ CO2または低酸素環境下で1〜2継代増幅した。
【００６６】
実施例3由来の単離された間質血管画分の培養物は、間葉系幹細胞の形態を有する（図3）生存能力のある細胞が成長および増幅され得る（図2）ことを示している。
【００６７】
実施例9 - 脂肪組織の温度および細胞の生存能力に対する超音波キャビテーションの振幅およびサイクルの効果
脂肪組織の温度に対する超音波キャビテーションの振幅およびサイクルの効果を評価する実験を行った（図4および5）。その結果は、脂肪組織の温度が以下の際に43℃を超えて上昇することを示した：
・（サイクル0.4および時間1分30秒間で）50％を超える振幅 - 図4参照；ならびに
・（振幅50％および時間1分30秒間で）0.5を超えるサイクル - 図5参照。
【００６８】
キャビテーション直後および48時間培養後の細胞の生存能力に対する超音波キャビテーションの振幅の効果を評価する実験も行った。振幅の増加はキャビテーション直後の細胞の生存能力に対して顕著な効果を有さなかったが（図6および7）、48時間培養細胞の生存能力は50％を超える振幅によって有意に低下した（図6）。
【００６９】
実施例10 - 多血小板血漿および多成長因子血漿の調製
1）麻酔前に血液を回収する。2 x 9mLのクエン酸デキストロース（ACD-A）血液回収チューブ（BDバキュテナー）に、（減圧により）血液を満たす。せん断による血小板の活性化を回避するために、血液を18G針またはそれより大きいものを用いて吸い込む。血液チューブの内容物を、チューブを3〜4回ひっくり返すことによって混合する。
2）ACD-A血液充填チューブを450g x 10分間遠心分離する。
3）同じ移動用ピペットを用いて血漿層（上層）を各チューブから取り出し、15mL滅菌チューブに移す。血液はかき乱すべきではなく、血液の上にのっている白血球の薄い層は避けるべきである。赤血球の上に5mmの血漿層を残すのが最も良い。この濃縮血小板含有血漿（PRP）は、そのまま使用することができ、または以下のようにしてさらに処理することができる。
4）この血漿を含むチューブを2000g/10分間遠心分離する - チューブの底部に血小板の小さなペレットが形成されるはずである。
5）上部の低血小板血漿（platelet poor plasma）は、移動用ピペットで1.5mLになるまで除去しそして廃棄するべきである。ペレットは、同じ移動用ピペットを用いて残りの1.5mL中で再懸濁するべきである。これが、多血小板血漿（PRP）である。
6）PRPはそのまま使用してもよく、または所望の場合、150μlのグルコン酸カルシウム（1mL注射器および針）をPRPに添加しよく混合することによって凝固処理してもよい。チューブは温水槽（37℃ - 振盪なし）内に置くかまたはより長い時間室温で静置すべきである。PRPは、固形のゲルを形成するはずである。
7）固化の後、それを細胞に添加する準備ができた時のために、PRPは、37℃（処理を速めるため）または室温のいずれかで静置させて、次の1〜2時間かけて部分的に溶解させる - これは、現在、多成長因子血漿（PRGF）として公知である。
【００７０】
実施例11 - 注射用の間質血管画分またはP層の調製
実施例3〜9の方法によって得られる細胞は、注射前にPRPまたはPRGFで処理され得る。PRGFは、典型的に2.5mlが、注射前に細胞ペレットに直接添加される。細胞およびPRGFは、実施例12のようにして適用される。PRPが間質／幹細胞（典型的に5ml）と共に使用される場合、それは、固形ゲルの形成が開始し得る場合は注射直前に細胞に添加され得、またはそれは間質血管画分の投与の直後に別個に注射され得る。
【００７１】
実施例12 - 変形性関節症患者への脂肪組織の間質血管画分の投与
ウェスタンオンタリオ大学およびマクマスター大学の関節炎インデックス（Western Ontario and McMaster Universities Arthritis Index：WOMAC）は、痛み、こわばりおよび関節の物理的機能を含む膝および股関節の変形性関節症を有する患者の状態を評価するために医療専門家によって使用される、広く使用されている独自の標準化された質問集である。
【００７２】
WOMACは、関節炎の研究において最も広く使用されている評価法である。WOMACは、痛みに関する5項目（スコア範囲0〜20）、こわばりに関する2項目（スコア範囲0〜8）および機能的制約に関する17項目（スコア範囲0〜68）を測定する。関節痛スコア化システムは、0 - 痛み／機能障害なし  〜  96 - 最も重度の痛み／機能障害あり、の範囲に及ぶ。
【００７３】
WOMACは、3つのサブスケールに分けられる24項目からなる：
・痛み（5項目）：歩いている間、階段を使用するとき、ベッド上にいるとき、座っているまたは横になっているとき、および立っているとき
・こわばり（2項目）：最初の歩行の後およびその日の遅い段階
・物理的機能（17項目）：階段を使用するとき、座っている状態から立つとき、立っているとき、曲げるとき、歩いているとき、車の乗り／降りのとき、買い物のとき、靴下を履く／脱ぐとき、ベッドから立ち上がるとき、ベッドに横になっているとき、風呂に入る／風呂から出るとき、座っているとき、トイレに入る／トイレから出るとき、重い家事を行うとき、軽い家事を行うとき。
【００７４】
股関節機能不全および変形性関節症の転帰スコア（Hip dysfunction and Osteoarthritis Outcome Score：HOOS）は、股関節の変形性関節症（OA）または人工股関節全置換（THR）患者を評価する尺度を含む。HOOSは、変形性関節症（OA）を伴うまたは伴わない股関節の機能障害のために使用されることが意図されている。HOOSは、5つのサブスケール：痛み、他の症状、日常生活上の機能（ADL）、スポーツおよびレクリエーション上の機能（Sport/Rec）ならびに股関節に関連する生活の質（QOL）、からなる。
【００７５】
患者1 - 股関節の変形性関節症
脂肪組織の間質血管画分を、実施例3にしたがい調製し、PRGFで処理し、そして各々の股関節への関節内注射（84 x 106細胞）および静脈内注射（130 x 106細胞）により投与した。患者の処置前HOOSスコアは処置前102点であり、処置5週間後のHOOSスコアは23点に減少した - 77％の改善。
【００７６】
患者2 - 膝の変形性関節症
脂肪組織の間質血管画分を、実施例3にしたがい調製し、PRGFで処理し、そして各々の膝への関節内注射（100 x 106細胞）および静脈内注射（79 x 106細胞）により投与した。患者の処置前WOMACスコアは59点であり、処置4週間後のWOMACスコアは28点に減少した - 61％の改善。
【００７７】
患者3 - 膝の変形性関節症
脂肪組織の間質血管画分を、設定を振幅90％およびサイクル0.9で3分間とした（温度が43℃を超えて上昇するのを防ぐため脂肪組織を20℃のゲルパックで冷却した）ことを除いて実施例3にしたがい調製し、PRGFで処理し、そして各々の膝への関節内注射（100 x 106細胞）および静脈内注射（236 x 106細胞）により投与した。患者の処置前WOMACスコアは37点であり、処置11週間後のWOMACスコアは7点に減少した - 81％の改善。
【００７８】
患者4 - 膝の変形性関節症
脂肪組織の間質血管画分を、実施例4にしたがい調製し、PRPで処理し、そして各々の膝への関節内注射（86 x 106細胞）および静脈内注射（86 x 106細胞）により投与した。患者の処置前WOMACスコアは39点であり、処置6週間後のWOMACスコアは17点に減少した - 56％の改善。
【００７９】
患者5 - 膝の変形性関節症
脂肪組織の間質血管画分を、実施例6にしたがい調製し、そして各々の膝への関節内注射（175 x 106細胞）および静脈内注射（150 x 106細胞）により投与した。患者の処置前WOMACスコアは38点であり、処置2ヶ月後のWOMACスコアは8点に減少した - 78％の改善。
【００８０】
患者6 - 膝の変形性関節症
脂肪組織の間質血管画分を、実施例5にしたがい調製し、そして各々の膝への関節内注射（85 x 106細胞）および静脈内注射（85 x 106細胞）により投与した。患者の処置前WOMACスコアは56点であり、処置7ヶ月後のWOMACスコアは28点に減少した - 50％の改善。
【００８１】
実施例13 - 変形性関節症患者へのP層の投与
患者7 - 膝の変形性関節症
P層細胞（5ml）を、実施例7にしたがい調製し、そして膝への関節内注射および静脈内注射（170 x 109細胞）によって投与した。患者の処置前WOMACスコアは58点であり、処置3ヶ月後のWOMACスコアは10点に減少した - 82％の改善。
【００８２】
患者8 - 膝の変形性関節症
P層細胞（2.5ml）を、実施例7にしたがい調製し、そして左膝への関節内注射および静脈内注射（200 x 106細胞）によって投与した。患者の処置前WOMACスコアは37点であり、処置2ヶ月後のWOMACスコアは2点に減少した - 94％の改善。
【００８３】
実施例14 - 他の疾患を有する患者への脂肪組織の間質血管画分の投与
患者9 - 関節リウマチ
脂肪組織の間質血管画分を、実施例5にしたがい調製し（以下の変更を加える - 振幅90%、サイクル0.2、4分間）、そして静脈内注射（276 x 107細胞）によって投与した。最初の週は、患者は良い感じであったがその後関節リウマチが再燃した。患者はより多くの警告を感じるようになった。
【００８４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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