(57)【要約】  解決すべき問題：本発明は、物質が抗体以外の分子である場合でさえも解離を引き起こす可能性がより低い協同的結合により物質を捕捉することができる親和性支持体ならびにその同じものを用いる捕捉法を提供する。問題を解決するための手段：捕捉すべき対象を親和性物質に結合させるために、捕捉すべき対象を支持体、その支持体に結合したスペーサーおよびそのスペーサーに結合した親和性物質を含む親和性支持体と接触させる工程を含む、物質を捕捉する方法であって、捕捉すべき対象のそれぞれの１つが複数の親和性部位を有し、その親和性物質がその親和性部位の少なくとも２つに同時に結合する、前記方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
捕捉すべき対象を親和性物質に結合させるために、捕捉すべき対象を支持体、該支持体に結合したスペーサーおよび該スペーサーに結合した親和性物質を含む親和性支持体と接触させる工程を含む、物質を捕捉する方法であって、捕捉すべき対象のそれぞれの１つが複数の親和性部位を有し、該親和性物質が該親和性部位の少なくとも２つに同時に結合する、前記方法。
【請求項２】
スペーサーに結合した１種類の親和性物質が親和性支持体上に存在する、請求項１に記載の物質を捕捉する方法。
【請求項３】
スペーサーがオキシアルキレン基を含む、請求項１または２に記載の物質を捕捉する方法。
【請求項４】
スペーサーがポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、多糖類、生分解性ポリマー、およびリポポリマーからなる群から選択される、請求項１または２に記載の物質を捕捉する方法。
【請求項５】
捕捉すべき対象のそれぞれの１つが複数の分子を含む１つの多量体または１つの凝集体であり、該複数の親和性部位のそれぞれが該複数の分子のそれぞれの上に存在する、請求項１〜４のいずれかに記載の物質を捕捉する方法。
【請求項６】
捕捉すべき対象のそれぞれの１つが１個の分子である、請求項１および３〜５のいずれかに記載の物質を捕捉する方法。
【請求項７】
捕捉すべき対象が生物学的物質または非生物学的物質である、請求項１〜６のいずれかに記載の物質を捕捉する方法。
【請求項８】
生物学的物質がバイオマーカー、バイオマーカー候補分子、およびバイオマーカーまたはバイオマーカー候補分子からスプライシングにより生成した断片からなる群から選択される、請求項７に記載の物質を捕捉する方法。
【請求項９】
バイオマーカーが癌、脳疾患、心疾患、免疫疾患、肝疾患、腎疾患、および眼疾患からなる群から選択される疾患に関連する、請求項８に記載の物質を捕捉する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は２０１２年７月１７日に出願された日本特許出願第2012-158647号の優先権を主張し、その全開示を本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、生物学的試料等中に含有される分子の高感度測定および／または構造分析に関する。本発明は、疾患の初期診断、疾患の追跡調査、および／または化学療法感受性を評価するための技法に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物学的試料、例えば細胞抽出物、組織抽出物、または体液（例えば血液、尿、または脊髄液）から特定のポリペプチド（ペプチドまたはタンパク質）を単離するための方法として、クロマトグラフィーを用いる方法および特異的な結合の能力を有する分子、すなわち親和性分子を用いる方法が用いられている。
【０００４】
クロマトグラフィーを用いる方法の例には、逆相クロマトグラフィーを用いる方法およびイオン交換クロマトグラフィーを用いる方法が含まれる。
【０００５】
親和性分子を用いる方法の例には、親和性支持体を用いる方法が含まれる。
【０００６】
例えば、特許文献１（JP 7-268000 A）は担体およびその担体に結合した抗体からなる免疫吸着体を開示しており、その免疫吸着体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を抗体として用いて、そしてその抗体をその担体に結合させるためにＮ，Ｎ’−ヘキサメチレンビスマレイミドのような架橋剤を用いて調製することができる。
【０００７】
一般に、標的タンパク質を生物学的試料から単離するための方法として、プロテインＡ／Ｇビーズを用いた免疫沈降法が用いられる。例えば、非特許文献１（Analytical Biochemistry 1999 Nov 15; 275 (2): 262-5）は、免疫沈降およびＭＡＬＤＩ質量分析の組み合わせを用いたアミロイドβペプチドの半定量分析を開示している。
【０００８】
さらに、例えば、非特許文献２（Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, Physical and Biological Sciences 2011; 87(9): 603-16）は、抗体Ｆｃ断片、その抗体Ｆｃ断片に結合しており、ポリエチレングリコールを有するヒンジ領域、およびそのヒンジ領域に結合したアミロイドβからなる柔軟な抗体様分子の調製を記載している。
【０００９】
非特許文献２は、２個のアミロイドβペプチドを有する分子（すなわち、手が２つの分子）および１個のアミロイドβペプチドを有する分子（すなわち、手が１つの分子）がその調製により得られることを記載している。さらに、非特許文献２は、抗アミロイドβ抗体が捕捉すべき対象である場合、手が２つの分子および抗アミロイドβ抗体の間の結合は手が１つの分子および抗アミロイドβ抗体の間の結合よりも低い解離定数ＫＤを達成することを記載している。
【００１０】
特許文献２（国際公開第2005/037881号）は、その中に挿入された親水性スペーサーを有する単量体構成要素の重合により得られた樹脂に結合基を固定することにより調製される担体を用いてその担体への非特異的吸着を低減することを記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】JP 7-268000 A
【特許文献２】国際公開第2005/037881号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Analytical Biochemistry 1999 Nov 15; 275 (2): 262-5
【非特許文献２】Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, Physical and Biological Sciences 2011; 87(9): 603-16
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
クロマトグラフィーを用いる方法は標的ポリペプチドの数種類の担体を用いた段階的な様式での分離および濃縮を実施し、従って必然的に大量の生物学的試料を必要とする。
【００１４】
親和性分子を用いる方法は、分子間の親和性により達成される特異的な結合のため、単一の処理で標的ポリペプチドを単離することができ、従って微量の生物学的試料しか必要としない。そのような観点から、親和性分子を用いる方法は必要とされる生物学的試料の量の点でクロマトグラフィーを用いる方法の欠点を補う。さらに、親和性分子を用いる方法はより少ない時間しか必要とせず、汎用性がある。
【００１５】
しかし、特許文献１および非特許文献１において開示されている親和性分子を用いる方法の場合、標的分子（例えばポリペプチド）の収集率および取り込まれる不純物の量は親和性担体（例えば免疫吸着体またはタンパク質Ａ／Ｇビーズ）の特性に依存する。例えば、その親和性担体が抗体を用いる親和性担体である場合、標的分子を捕捉する効率または非特異的に吸着される不純物の量はその抗体の力価に依存する。その親和性キャリヤーの特性により必然的に課されるそのような限界は、その親和性担体により収集される標的分子の質量分析計またはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分析の感度または特異性の限界をもたらす。そのような問題はしばしば結果として特に微量の生体分子の研究における分析において困難をもたらす。
【００１６】
特許文献２において開示されている方法は結合基を用いる適用に限られており、単に非特異的吸着を低減するにすぎず、従って特定の標的分子を特異的に捕捉することはできない。
【００１７】
非特許文献２において開示されている親和性分子を用いる方法の場合、抗体のヒンジ領域中に挿入されているＰＥＧは２個のアミロイドβペプチド（１−１５）の間に適切な間隔を提供し、それはその２個のアミロイドβペプチド（１−１５）をそれぞれ６Ｅ１０の２個のＦ（ａｂ）領域に同時に結合させることを可能にする。従って、１個の手が２つの分子の前記の手が２つの分子の両方の２つの手による１個の分子への結合（本明細書において“協同的結合”と呼ばれる）により、１個の手が１つの分子の前記の手が１つの分子のただ１つの手による１個の分子への結合よりも解離を引き起こす可能性がより低い（１００〜１００，０００倍低い解離定数ＫＤでの）結合が達成されると考えられる。１個の手が１つの分子が前記の手が１つの分子の１つだけの手により１個の分子に結合する結合方式は、通常の抗体がその抗体により捕捉されるべき対象に結合する方式と同じである。そのような観点から、低い解離定数ＫＤでの結合、すなわち非特許文献２において開示されている方法により達成される協同的結合は、特許文献１および非特許文献１において開示されている方法の欠点を抗体の力価の点で補うことが予想される。
【００１８】
しかし、非特許文献２において開示されている方法において、その抗体様分子に協同的結合により結合することができる捕捉すべき対象は、その抗体様分子に大きさおよび形状において類似している抗体分子（抗アミロイドβ抗体分子（６Ｅ１０））のみである。。すなわち、非特許文献２は、その抗体様分子ならびに大きさおよび形状において異なっており一般に親和性担体により捕捉されるべき対象であり得る抗体以外の様々な分子、特にポリペプチドの間の協同的結合を達成する可能性を示唆していない。
【００１９】
質量分析計は、生体分子の構造分析のための強力な道具である。しかし、質量分析計を用いて生物学的試料中に含有される分子の構造分析を実施するために、その生物学的試料中に含有される分析されるべき対象としての生体分子を濃縮する必要がある。これは、質量分析計がその検出可能なレベルにおいて限界を有し、従って質量分析を行う試料中の分析されるべき対象を検出可能なレベルまで濃縮する必要があるためである。分析すべき対象を濃縮する必要性に加えて、分析すべき対象以外の不純物を除去する必要がある。これは、質量分析を行う試料中に含有される不純物がデータのバックグラウンドにおける増大または分析すべき対象の検出に干渉するイオン抑制を引き起こすためである。
【００２０】
従って、試料中に含有される捕捉すべき対象が抗体以外の分子である場合でさえもその対象を協同的結合により捕捉することにより単離および濃縮する（すなわちその対象をその試料から濃縮された状態で単離する）ことができる親和性支持体ならびにその同じものを用いる捕捉法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明には以下の発明が含まれる。
【００２２】
（１）支持体、その支持体に結合したスペーサーおよびそのスペーサーに結合した親和性物質を含む親和性支持体であって、そのスペーサーに結合した２〜５種類の親和性物質が混合状態で存在する、前記親和性支持体。
【００２３】
上記の（１）に従う親和性支持体の１つの具体的な例が実施例２に関して記載されるであろう。
【００２４】
（２）そのスペーサーの長さが１〜１００ｎｍである、上記の（１）に記載の親和性支持体。
【００２５】
（３）そのスペーサーがオキシアルキレン基を含む、上記の（１）または（２）に従う親和性支持体。
【００２６】
（４）そのスペーサーがポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、多糖類、生分解性ポリマー、およびリポポリマーからなる群から選択される、上記の（１）または（２）に従う親和性支持体。
【００２７】
（５）そのスペーサーが分枝状であり、その支持体がそのスペーサーの主鎖に結合しており、そしてその親和性物質がそのスペーサーの分枝鎖に結合している、上記の（１）〜（４）のいずれかに従う親和性支持体。
【００２８】
（６）その親和性物質に結合したスペーサーの支持体上の結合位置の間の間隔が１〜５０オングストローム（Å）である、上記の（１）〜（５）のいずれかに従う親和性支持体。
【００２９】
（７）その支持体がアガロース、セファロース、デキストラン、シリカゲル、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、（メタ）アクリル酸ポリマー、フッ化炭素樹脂、金属錯体樹脂、ガラス、金属、および磁性体からなる群から選択される材料で作製されている、上記の（１）〜（６）のいずれかに従う親和性支持体。
【００３０】
その親和性物質がアミノ酸または２〜５０アミノ酸残基を有するペプチドである、上記に従う親和性支持体。
【００３１】
（８）親和性物質が免疫グロブリン、免疫グロブリンＦ（ａｂ’）断片、免疫グロブリンＦ（ａｂ）断片、免疫グロブリンＦｖ断片、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー、受容体タンパク質、および生理活性物質からなる群から選択される、上記の（１）〜（７）のいずれかに従う親和性支持体。
【００３２】
（９）捕捉すべき対象を親和性物質に結合させるために、捕捉すべき対象を支持体、その支持体に結合したスペーサーおよびそのスペーサーに結合した親和性物質を含む親和性支持体と接触させる工程を含む、物質を捕捉する方法であって、捕捉すべき対象のそれぞれの１つが複数の親和性部位を有し、その親和性物質がその親和性部位の少なくとも２つに同時に結合する、前記方法。
【００３３】
本明細書において、少なくとも２個の親和性物質の捕捉すべき物質中に存在する少なくとも２個の親和性部位（すなわち親和性物質が特異的に結合する部位）への同時結合が達成される結合方式は、協同的結合と呼ばれる。協同的結合の間、その少なくとも２つの親和性部位への同時結合が常に達成されるべきであることは必要とされず、そして例えば、その少なくとも２つの親和性部位の１つのみがその親和性物質に結合している瞬間があってよい。すなわち、協同的結合は、捕捉すべき物質の２つ以上の親和性部位のいずれか１つが実質的に常に親和性物質に結合しており、従って捕捉すべき物質および親和性物質の間の完全な解離が起こる可能性がより低い状態にある。
【００３４】
さらに捕捉すべき物質に結合した親和性物質が結合している支持体の表面を０．１〜２００ＭＰａの流体圧力で洗浄する工程を含む、上記に従う物質を捕捉するための方法。
【００３５】
最大解離定数ＫＤが１０−７Ｍである、上記に従う物質を捕捉するための方法。
【００３６】
（１０）そのスペーサーに結合した１種類の親和性物質がその親和性支持体上に存在する、上記の（９）に従う物質を捕捉する方法。
【００３７】
上記の（１０）に従う方法の１つの具体的な例が実施例１に関して記載されるであろう。
【００３８】
（１１）そのスペーサーに結合した２〜５種類の親和性物質がその親和性支持体上に混合状態で存在する、上記の（９）に従う物質を捕捉する方法。
【００３９】
上記の（１１）に従う方法の１つの具体的な例が実施例２に関して記載されるであろう。
【００４０】
そのスペーサーが１〜１００ｎｍの長さを有する、上記に従う物質を捕捉するための方法。
【００４１】
（１２）スペーサーがオキシアルキレン基を含む、上記の（９）〜（１１）のいずれかに記載の物質を捕捉する方法。
【００４２】
（１３）そのスペーサーがポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、多糖類、生分解性ポリマー、およびリポポリマーからなる群から選択される、上記の（９）〜（１１）のいずれかに記載の物質を捕捉する方法。
【００４３】
そのスペーサーが分枝状であり、その支持体がそのスペーサーの主鎖に結合しており、そしてその親和性物質がそのスペーサーの分枝鎖に結合している、上記に従う物質を捕捉するための方法。
【００４４】
その親和性物質に結合したスペーサーの支持体上の結合位置の間の間隔が１〜５０オングストローム（Å）である、上記に従う物質を捕捉するための方法。
【００４５】
その支持体がアガロース、セファロース、デキストラン、シリカゲル、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、（メタ）アクリル酸ポリマー、フッ化炭素樹脂、金属錯体樹脂、ガラス、金属、および磁性体からなる群から選択される材料で作製されている、上記に従う物質を捕捉するための方法。
【００４６】
その親和性物質がアミノ酸または２〜５０アミノ酸残基を有するペプチドである、上記に従う物質を捕捉するための方法。
【００４７】
親和性物質が免疫グロブリン、免疫グロブリンＦ（ａｂ’）断片、免疫グロブリンＦ（ａｂ）断片、免疫グロブリンＦｖ断片、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー、受容体タンパク質、および生理活性物質からなる群から選択される、上記に従う物質を捕捉するための方法。
【００４８】
（１４）捕捉すべき対象のそれぞれの１つが複数の分子を含む１つの多量体または１つの凝集体であり、その複数の親和性部位のそれぞれがその複数の分子のそれぞれの上に存在する、上記の（９）〜（１３）のいずれかに記載の物質を捕捉する方法。
【００４９】
（１５）捕捉すべき対象のそれぞれの１つが１個の分子である、上記の（９）および（１１）〜（１３）のいずれかに従う物質を捕捉する方法。
【００５０】
（１６）捕捉すべき対象が生物学的物質または非生物学的物質である、上記の（９）〜（１５）のいずれかに従う物質を捕捉する方法。
【００５１】
（１７）その生物学的物質がバイオマーカー、バイオマーカー候補分子、およびバイオマーカーまたはバイオマーカー候補分子からスプライシングにより生成した断片からなる群から選択される、上記の（１６）に記載の物質を捕捉する方法。
【００５２】
（１８）そのバイオマーカーが癌、脳疾患、心疾患、免疫疾患、肝疾患、腎疾患、および眼疾患からなる群から選択される疾患に関連する、上記の（１７）に記載の物質を捕捉する方法。
【００５３】
（１９）その生物学的物質がウイルスまたは細菌である、上記の（１６）に記載の物質を捕捉する方法。
【００５４】
（２０）その非生物学的物質が環境的に危険な物質である、上記の（１６）に記載の物質を捕捉する方法。
【００５５】
以下の工程を含む、マイクロ質量分析（ｍｉｃｒｏ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）の方法：
上記の物質を捕捉するための方法により、捕捉すべき対象を親和性支持体に結合させ；
その親和性支持体に結合した対象をその親和性支持体から溶離し；そして
その溶離された対象に対して質量分析を行う。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本発明は、支持体、その支持体に結合したスペーサーおよびそのスペーサーに結合した親和性物質を含む親和性支持体を提供し、ここでそのスペーサーに結合した２〜５種類の親和性物質は混合状態で存在する。
【００５７】
一部の態様において、そのスペーサーの長さは１〜１００ｎｍである。
【００５８】
一部の態様において、そのスペーサーはオキシアルキレン基を含む。
【００５９】
一部の態様において、そのスペーサーはポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、多糖類、生分解性ポリマー、およびリポポリマーからなる群から選択される。
【００６０】
一部の態様において、そのスペーサーは分枝状であり、その支持体はそのスペーサーの主鎖に結合しており、そしてその親和性物質はそのスペーサーの分枝鎖に結合している。
【００６１】
一部の態様において、その親和性物質に結合したスペーサーの支持体上の結合位置の間の間隔は１〜５０オングストローム（Å）である。
【００６２】
一部の態様において、その支持体はアガロース、セファロース、デキストラン、シリカゲル、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、（メタ）アクリル酸ポリマー、フッ化炭素樹脂、金属錯体樹脂、ガラス、金属、および磁性体からなる群から選択される材料で作製されている。
【００６３】
一部の態様において、その親和性物質は免疫グロブリン、免疫グロブリンＦ（ａｂ’）断片、免疫グロブリンＦ（ａｂ）断片、免疫グロブリンＦｖ断片、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー、受容体タンパク質、および生理活性物質からなる群から選択される。
【００６４】
本発明は、捕捉すべき対象を親和性物質に結合させるために、捕捉すべき対象を支持体、その支持体に結合したスペーサーおよびそのスペーサーに結合した親和性物質を含む親和性支持体と接触させる工程を含む、物質を捕捉する方法を提供し、ここでその捕捉すべき対象のそれぞれの１つが複数の親和性部位を有し、その親和性物質はその親和性部位の少なくとも２つに同時に結合する。
【００６５】
一部の態様において、そのスペーサーに結合した１種類の親和性物質がその親和性支持体上に存在する。
【００６６】
一部の態様において、そのスペーサーに結合した２〜５種類の親和性物質がその親和性支持体上に混合状態で存在する。
【００６７】
一部の態様において、そのスペーサーはオキシアルキレン基を含む。
【００６８】
一部の態様において、そのスペーサーはポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、多糖類、生分解性ポリマー、およびリポポリマーからなる群から選択される。
【００６９】
一部の態様において、捕捉すべき対象のそれぞれの１つは複数の分子を含む１つの多量体または１つの凝集体であり、その複数の親和性部位のそれぞれがその複数の分子のそれぞれの上に存在する。
【００７０】
一部の態様において、捕捉すべき対象のそれぞれの１つは１個の分子である。
【００７１】
一部の態様において、捕捉すべき対象は生物学的物質または非生物学的物質である。
【００７２】
一部の態様において、その生物学的物質はバイオマーカー、バイオマーカー候補分子、およびバイオマーカーまたはバイオマーカー候補分子からスプライシングにより生成した断片からなる群から選択される。
【００７３】
一部の態様において、そのバイオマーカーは癌、脳疾患、心疾患、免疫疾患、肝疾患、腎疾患、および眼疾患からなる群から選択される疾患に関連する。
【００７４】
一部の態様において、その生物学的物質はウイルスまたは細菌である。
【００７５】
一部の態様において、その非生物学的物質は環境的に危険な物質である。
【００７６】
発明の効果
本発明に従って、物質が抗体以外の分子である場合でさえも解離を引き起こす可能性がより低い協同的結合により物質を捕捉することができる親和性支持体およびその同じものを用いる捕捉法を提供することが可能である。
【００７７】
本発明に従う親和性支持体は、従来の親和性支持体よりも１００〜１００，０００倍低い解離定数ＫＤを達成する。従って、本発明に従う親和性支持体の使用は、従来の親和性支持体の使用と比較して、試料中の標的分子をより効率的に単離および濃縮する（すなわち、標的分子を親和性支持体に結合させてそれらを試料から濃縮状態で単離する）ことを可能にする。例えば、従来の免疫沈降法の捕捉率よりも（モル基準で）約５．６〜８．５倍高い捕捉率が達成され、質量分析計による捕捉された物質の分析の感度が１０倍向上する。さらに、低い解離定数ＫＤは、洗浄条件を拡張する、および／または非特異的吸着を低減することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、本発明に従う親和性支持体の１態様であるＦ（ａｂ’）−ＰＥＧビーズを製造するための方法を示す模式図である。
【図２】図２は、６Ｅ１０のフィシン消化物のサイズ排除クロマトグラムである。
【図３】図３Ａは、６Ｅ１０消化物の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィーにより得られたゲルの画像を示し；図３Ｂは６Ｅ１０消化物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィーにより得られたゲルの画像を示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、還元処理による６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）断片の生成を決定するための、還元処理の前（図４Ａ）および後（図４Ｂ）の６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）２画分のサイズ排除クロマトグラムである。
【図５】図５は、アミロイドβ（１−４２）の凝集体の存在を決定するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィーにより得られたゲルの画像を示す。
【図６】図６は、一定量（１００ｎｇ）のアミロイドβ（１−４２）を含有し、異なる脂質量（１０、１００、および１，０００μＬ）を有する反応溶液を様々な親和性支持体（６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズ、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２ビーズ、および６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズ）にそれぞれ晒した際に捕捉されたアミロイドβ（１−４２）の量を示すグラフである。
【図７】図７は、異なる量のアミロイドβ（１−４２）を様々な親和性支持体（６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズ（図７Ａ）、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２ビーズ（図７Ｂ）、および６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズ（図７Ｃ））を用いて捕捉した場合に得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルおよび純粋なアミロイドβ（１−４２）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図７Ｄ）の比較を示す。
【図８】図８は、４Ｇ８のＬｙｓＣ消化物のサイズ排除クロマトグラムである。
【図９】図９Ａは、４Ｇ８消化物の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィーにより得られたゲルの画像を示し；図９Ｂは４Ｇ８消化物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィーにより得られたゲルの画像を示す。
【図１０】図１０は、異なる量のアミロイドβ（１−２８）を様々な親和性支持体（６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズ（図１０Ａ）、４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズ（図１０Ｂ）、６Ｅ１０／４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズ（図１０Ｃ）、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズ（図１０Ｄ）、４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズ（図１０Ｅ）、および６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズ（図１０Ｆ））を用いて捕捉した場合に得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルならびに純粋なアミロイドβ（１−２８）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図１０Ｇ）の比較を示す。
【図１１】図１１は、アミロイドβ（１−２８）をスパイクした（ｓｐｉｋｅｄ）ヒト血漿を親和性支持体（６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズ）に晒した際に得られた質量スペクトルを示す。
【図１２】図１２は、ヒト血漿中にスパイクした異なる量のアミロイドβ（１−２８）を様々な親和性支持体（６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズ（図１２Ａ）、４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズ（図１２Ｂ）、６Ｅ１０／４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズ（図１２Ｃ）、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズ（図１２Ｄ）、４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズ（図１２Ｅ）、および６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズ（図１２Ｆ））を用いて捕捉した場合に得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルおよび純粋なアミロイドβ（１−２８）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図１２Ｇ）の比較を示す。
【図１３】図１３は、ヒト血漿中にスパイクした１ｐｇ（３０７ａｍｏｌ）のアミロイドβ（１−２８）を親和性支持体（６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズ）を用いて捕捉した場合に得られた質量スペクトルを示している。
【００７９】
本発明を実施するための方式
１．親和性支持体
本発明に従う親和性支持体は、支持体、その支持体に結合したスペーサー、およびそのスペーサーに結合した親和性物質を含む。用語“結合した”には、直接的な結合および間接的な結合が含まれる。
【００８０】
１−１．支持体
その支持体の材料は、アガロース、セファロース、デキストラン、シリカゲル、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、（メタ）アクリル酸ポリマー、フッ化炭素樹脂、金属錯体樹脂、ガラス、金属、および磁性体からなる群から選択することができる。
【００８１】
その支持体は、平面の形状、球形の形状等のようなあらゆる形状を有していてよい。例えば、その支持体は標的物質の分離および／または濃縮における使用のためのチップ、ビーズ、またはマイクロデバイス中の流路壁を構成していてよい。
【００８２】
１−２  スペーサー
そのスペーサーの末端の一方はその支持体に結合しており、他方の末端はその親和性物質に結合していることが好ましい。そのスペーサーは、協同的結合を達成するためのその支持体および親和性物質の間の適切な間隔の保持において、ならびに前記のスペーサー自体への柔軟性、または柔軟性および伸長性の両方の付与において役割を果たすことができる。そのスペーサーは好ましくは鎖様（スペーサー鎖）構造を有する。その鎖様スペーサーの存在は、捕捉すべき対象がその親和性物質に結合した際に、その鎖様スペーサーが存在しない場合と比較してその支持体において立体障害を低減する。結果として、その親和性物質および捕捉すべき対象の間の結合強度を高めることが可能である。
【００８３】
そのスペーサーの長さは、例えば１〜１００ｎｍ、好ましくは１〜２０ｎｍ、より好ましくは５〜１０ｎｍである。そのスペーサーの長さが上記の下限未満である場合、そのスペーサーは短すぎ、従って前記のスペーサーの届く範囲（ｒｅａｃｈ）は２個以上の親和性物質を捕捉すべき対象の２個以上の親和性部位に同時に結合させるために十分ではなく、従って協同的結合が起こる可能性はより低い。そのスペーサーの長さが上記の上限を超えている場合、そのスペーサーは長すぎ、従ってその親和性物質の可動範囲の自由度は逆に限られ、従って協同的結合が起こる可能性はより低い。
【００８４】
そのスペーサーは、例えば高分子量ポリマーであることができる。本発明におけるスペーサーとして用いられる高分子量ポリマーは通常は鎖様構造を有する。
【００８５】
そのスペーサーは、好ましくは非ペプチド性である。用語“非ペプチド性”は、ペプチド結合を有しないことを意味する。
【００８６】
例えば、その非ペプチド性スペーサーはオキシアルキレン基を含有することができる。オキシアルキレン基を含有する基は二価の基であり、例えば２〜６個の炭素原子を有する基であることができる。より具体的には、オキシアルキレン基を含有する基中のオキシアルキレンはエチレンオキシドまたはプロピレンオキシドである。そのオキシアルキレン基を含有する基は好ましくは有機性高分子量ポリマー、すなわちポリオキシアルキレン基を含有する基である。そのポリオキシアルキレン基を含有する基は好ましくは２〜６個の炭素原子を有するアルキレングリコールの重合により得られるポリアルキレングリコール基である（例えば重合度：２〜４０）。例えば、そのポリアルキレングリコール基はポリエチレングリコール基（エチレングリコールの重合により得られる）、およびポリプロピレングリコール基（１，２−プロパンジオールまたは１，３−プロパンジオールの重合により得られる）からなる群から選択することができる。
【００８７】
本発明において、特に、２〜４０、好ましくは１２〜３６の重合度を有するエチレングリコール基またはポリエチレングリコール基をそのオキシアルキレン基を含有する基として選択することができる。
【００８８】
あるいは、その非ペプチド性スペーサーは、例えばポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、多糖類、生分解性ポリマー、およびリポポリマーからなる群から選択される有機性高分子量ポリマーであることができる。ポリオキシアルキル化ポリオールまたはポリビニルアルキルエーテル中のアルキル基は、例えば１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜３個の炭素原子を有していてよい。多糖類の例には、デキストラン、ムコ多糖類、およびキチンが含まれる。ムコ多糖類の例にはヒアルロン酸が含まれる。生分解性ポリマーの例にはＰＬＡ（ポリ（乳酸））およびＰＬＧＡ（ポリ（乳酸−グリコール酸））が含まれる。
【００８９】
これらの有機性高分子量ポリマーは、例えば２〜４０、好ましくは１２〜３６の重合度を有していてよい。
【００９０】
本発明の１態様（より具体的には、２種類以上の親和性物質がその支持体に混合状態で結合している態様）によれば、そのスペーサーはポリペプチドであることができる。本明細書において、用語“ポリペプチド”はペプチド（例えば２以上かつ１００以下のアミノ酸残基を有する）およびタンパク質（例えば１００より多くのアミノ酸残基を有する）に関する一般名として用いられている。スペーサーとしてのポリペプチドは、定常領域に関する親和性を有する結合基であることができる。そのような結合基の例には、プロテインＡおよびプロテインＧが含まれる。
【００９１】
本発明において用いられるスペーサーは、上記の例の１種類を含有するスペーサーまたは上記の例から選択されるいずれか２種類以上を含有するスペーサーであることができる。
【００９２】
そのスペーサーは直鎖または分枝鎖であることができる。そのスペーサーが分枝状である場合、その支持体は鎖の一方、すなわち主鎖の末端に結合しており、その親和性物質は他方の鎖、すなわち分枝鎖の末端に結合している。分枝鎖の数は特に限定されておらず、例えば２〜１０であることができる。そのスペーサーが分枝状である場合、その親和性支持体上の親和性物質の密度はそのスペーサーが直鎖である場合と比較して増大し得る。
【００９３】
１−３．親和性物質
その親和性物質は、一般に分子認識系を構築することができるゲスト物質またはホスト物質のどちらであることもでき、非共有結合により相互作用することができる。その親和性物質は好ましくはホスト物質である。
【００９４】
本発明において、分子認識における相互作用は、その親和性物質が捕捉すべき対象の親和性部位を認識して非共有結合的に相互作用することを意味し、例えば少なくとも１０３または１０４、例えば１０３〜１０５または１０４〜１０５の会合速度定数ｋａ（単位：１／Ｍｓ）が達成されるような親和性での特異的な結合であることができる。１個の親和性物質あたりの特異的な結合部位の数は、１または２以上（例えば５以下）であることができる。
【００９５】
その親和性物質は天然由来の構造を有していても有していなくてもよい。
【００９６】
その親和性物質の例には、アミノ酸およびポリペプチドが含まれる。より具体的には、その親和性物質はアミノ酸または２〜５０アミノ酸残基を有するポリペプチドであることができる。
【００９７】
その親和性物質の別の例は、免疫グロブリンおよび免疫グロブリン断片からなる群から選択される親和性物質である。その免疫グロブリン断片は、それが抗原に結合する能力を有する限り特に限定されず、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｌ鎖、およびＨ鎖からなる群から選択することができる。それらの中で、非特異的吸着を低減する観点から、その免疫グロブリン断片は好ましくは免疫グロブリンＦ（ａｂ’）断片、免疫グロブリンＦ（ａｂ）断片、およびＦｃ領域を有しないＦｖ断片からなる群から選択される。免疫グロブリンの例には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等が含まれる。その免疫グロブリンはあらゆる動物に由来することができるが、特にヒトに由来する。
【００９８】
その親和性物質の別の例は、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー、受容体タンパク質、および生理活性物質からなる群から選択される親和性物質である。その生理活性物質の例には、サイトカイン、ホルモン類、および神経伝達物質が含まれる。
【００９９】
その親和性物質に結合したスペーサーの支持体上の結合位置の間の間隔は特に限定されず、当業者はそれをその親和性物質が好ましくは可能な限り密に存在するように適切に決定することができる。より具体的には、その親和性物質の結合位置の間の間隔は、例えばその親和性物質の大きさに依存して異なり得るが、例えば１〜１，０００オングストローム（Å）、好ましくは１〜１００オングストローム、より好ましくは１〜５０オングストローム、さらにもっと好ましくは１．５〜３０オングストロームである。上記の下限は、実質的には隣接する親和性物質間の間隔の物理限界に相当する。一方で、その親和性物質結合位置の間の間隔が上記の上限を超える場合、その親和性物質は低密度であり、従って協同的結合が起こる可能性がより低い。
【０１００】
本発明の１態様によれば、その支持体にスペーサーを介して結合している１種類の親和性物質がその支持体上に（より具体的には、その支持体上の特定の領域に）存在する。
【０１０１】
本発明の別の態様によれば、その支持体にスペーサーを介して結合している２種類以上の親和性物質がその支持体上に（より具体的には、その支持体上の特定の領域に）存在する。この態様において用いられる親和性物質の種類の数は２以上であるが、例えば一般的なポリクローナル抗体を構成する抗体の種類の数よりも小さい。２〜５種類の親和性物質の量は、好ましくは互いと同じまたは互いに近い。より具体的には、２〜５種類の親和性物質を、２〜５種類の親和性物質から選択される任意の２種類の親和性物質の間の量における差が２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内（モル基準）であるような様式で用いることができる。さらに、この態様において、異なる種類の親和性物質が同じ支持体上に混合状態で存在する。異なる種類の親和性物質が同じ支持体上に混合状態で存在する態様は、異なる種類の親和性物質がそれらが互いと識別され得る状態で結合している態様（例えばマイクロアレイ）とは明確に区別される。
【０１０２】
処理はそれに結合した親和性物質の種類またはそれに結合した異なる種類の親和性物質の組み合わせに依存してその支持体上の特定の領域上で実施することができる。２以上の領域を同じ支持体上で、それに結合した親和性物質の種類またはそれに結合した異なる種類の親和性物質の組み合わせが領域ごとに異なるような様式で提供することができる。この場合、異なる処理を同じ支持体上の異なる領域上で実施することができる。
【０１０３】
２．親和性支持体の調製
本発明に従う親和性支持体は、前記の支持体の表面上に結合性官能基を有する支持体を、結合性官能基を有する親和性物質に、その支持体の結合性官能基に対応する結合性官能基およびその親和性物質の結合性官能基に対応する結合性官能基の両方を有するスペーサー物質を介して同時に（すなわち二官能性スペーサー物質）または連続的に（すなわち単官能性スペーサー物質）結合させることにより調製することができる。
【０１０４】
その構成要素、すなわちその支持体、そのスペーサー物質、およびその親和性物質のそれぞれの結合性官能基は、共有結合性官能基、イオン結合性官能基、および水素結合性官能基からなる群から選択することができる。特に、共有結合性官能基が好ましい。
【０１０５】
当業者は、互いに対応する構成要素の結合性官能基の組み合わせを、共有結合、イオン結合、および水素結合からなる群から選択される結合、好ましくは共有結合を達成することができるように容易に決定することができる。
【０１０６】
例えば、その構成要素の１種類の結合性官能基がアミノ基である場合、対応する他の構成要素の結合性官能基の例には、カルボキシル基、活性エステル基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）エステル基）、エポキシ基、アルデヒド基、イソシアナト基、イソチオシアナト基等が含まれる。その構成要素の１つの結合性官能基がチオール基である場合、その対応する他の構成要素の結合性官能基の例には、マレイミド基、ピリジルジスルフィド基、ビニルスルホン基、ブロモアセチル基等が含まれる。その構成要素の１つの結合性官能基がヒドロキシル基である場合、その対応する他の構成要素の結合性官能基の例には、エポキシ基、シリルクロリド基等が含まれる。
【０１０７】
前記の支持体の表面上に結合性官能基を有する支持体は、結合性官能基を有する分子が支持体の表面上に配置される自己組織化表面法；支持体の表面が結合性官能基を有する物質でコートされる方法；結合性官能基および支持体に共有結合することができる官能基を有する物質がその支持体の表面に共有結合している方法；等により調製することができる。これらの方法の中で、前記の支持体の表面上に結合性官能基を有する支持体は、好ましくは共有結合に基づく方法により調製される。上記の結合性官能基の例の中で、アミノ基はその支持体の結合性官能基として特に好ましい。
【０１０８】
その支持体上の結合性官能基の密度は、例えば０．００１〜０．５ｍｍｏｌ／ｍ２、好ましくは０．０１〜０．１ｍｍｏｌ／ｍ２である。
【０１０９】
そのスペーサー物質の結合性官能基のそれぞれは、生体分子中に天然に存在する結合性官能基、有機性高分子量ポリマーが既に有している結合性官能基、または分解、合成、もしくは修飾により人工的に製造される結合性官能基であることができる。当業者は、その結合性官能基を製造するための方法を容易に選択することができる。その支持体の結合性官能基に対応するスペーサー物質の結合性官能基およびその親和性物質の結合性官能基に対応するスペーサー物質の結合性官能基は、互いと同じまたは異なっていてよい。上記の結合性官能基の例の中で、スペーサー物質の結合性官能基の組み合わせの特に好ましい例は、活性エステル基およびマレイミド基の組み合わせである。
【０１１０】
その親和性物質の結合性官能基は、天然由来の構造中に天然に存在している結合性官能基または分解、合成、もしくは修飾により人工的に生成された結合性官能基であってよい。すなわち、結合性官能基を有する親和性物質は、例えば生物の生体からの単離、生体からの単離物の分解、遺伝子工学による合成、生化学合成および修飾、ならびに有機化学合成および修飾から当業者により適切に選択される方法により調製される。上記で言及した結合性官能基の例の中で、チオール基はその親和性物質の結合性官能基として特に好ましい。例えば、その親和性物質が免疫グロブリン断片である場合、その免疫グロブリン断片は酵素（例えばパパイン、ペプシン、フィシン等）を用いる消化により、および／または還元剤を用いたジスルフィド結合の切断により調製することができる。
【０１１１】
それぞれの構成要素が互いに結合する順序は特に限定されない。従って、スペーサー物質および親和性物質の間の結合は、支持体およびスペーサー物質を互いに結合させた後に達成されてよく、またはスペーサー物質および支持体の間の結合は親和性物質およびスペーサー物質を互いに結合させた後に達成されてよい。それぞれの構成要素をこの方法で互いに連続的に結合させる際、そのスペーサー物質は単官能性または二官能性のどちらであってもよい。単官能性スペーサー物質がそのスペーサー物質として用いられる場合、それぞれの構成要素を、例えば結合性官能基を有する支持体をその支持体の結合性官能基に対応する結合性官能基を有する単官能性スペーサー物質に結合させ、次いでその親和性物質の結合性官能基に対応するスペーサー物質の結合性官能基を生成し、次いでそのスペーサー物質をその親和性物質にその生成した結合性官能基により結合させることにより、互いに結合させることができる。
【０１１２】
一方で、二官能性スペーサー物質をスペーサー物質として用いてその支持体、その二官能性スペーサー物質、およびその親和性物質を同じ反応系に晒すことにより、それぞれの構成要素を互いに同時に結合させることができる。
【０１１３】
さらに、それぞれの構成要素は、その親和性物質が可能な限り密に結合するような量で用いられる。より具体的には、そのスペーサー物質はその親和性物質が結合している支持体上の領域中に存在する結合性官能基の量の１０〜５，０００倍（モル基準）の量で用いることができ、その親和性物質はその親和性物質を結合させる予定の支持体上の領域中に存在する結合性官能基の量の０．１〜１０倍（モル基準）の量で用いることができる。
【０１１４】
３．親和性支持体の使用
本発明に従う親和性支持体は、前記の親和性支持体をそれに結合した親和性物質に応じて当業者により選択された分子認識系に晒すことにより用いることができる。より具体的には、捕捉すべき物質を含有する試料をその親和性支持体と接触させてその試料中に含有される捕捉すべき物質をその親和性支持体上の親和性物質に結合させる。
【０１１５】
３−１．捕捉すべき対象および協同的結合
本発明の１態様によれば、ある捕捉すべき対象は単一分子である。本発明の別の態様によれば、ある捕捉すべき対象は２個以上の分子で構成される１個の２量体もしくはより高次の多量体または１個の凝集体である。
【０１１６】
捕捉すべき１個の対象において、２つ以上の親和性部位、すなわちその親和性物質（単数または複数）に特異的に結合する部位が存在する。本発明に従う親和性支持体の使用は、少なくとも２個の親和性物質を、１個の捕捉すべき対象中に存在する２つ以上の親和性部位の少なくとも２つに同時に結合させる（協同的結合を達成する）ことを可能にする。協同的結合の間、その少なくとも２個の親和性部位への同時結合が常に達成されるべきであることは必要とされない。例えば、その少なくとも２つの親和性部位の１つのみがその親和性物質に結合している瞬間があってよい。すなわち、協同的結合は捕捉すべき物質の２つ以上の親和性部位のいずれか１つが常に親和性物質に結合していることを可能にし、それは捕捉すべき物質がその親和性物質により捕捉されている状態を維持することを容易にする。換言すれば、その捕捉すべき物質およびその親和性物質の間の完全な乖離が起こる可能性がより低い。
【０１１７】
本発明によれば、上記の１〜３において記載されているように、その親和性物質の結合に関する会合速度定数ｋａ（単位：１／Ｍｓ）は、従来の一般的な分子認識系の会合速度定数ｋａに匹敵する。一方で、その親和性物質の結合に関する解離速度定数ｋｄ（単位：１／ｓ）は、従来の一般的な分子認識系に関する解離速度定数ｋｄより低い。従って、本発明によれば、その親和性物質の結合に関する解離定数ＫＤ（単位：Ｍ）は従来の一般的な分子認識系に関する解離定数ＫＤよりも小さく、例えば最大で１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、または１０−１２であり、例えば１０−１３〜１０−７であってよい。
【０１１８】
例えば、捕捉すべき１つの対象が単一の分子である場合、２つ以上の親和性部位がその単一の分子中に存在する。この場合、その単一の分子中に存在する２つ以上の親和性部位は一般に互いに異なる。従って、２以上の異なる種類の親和性物質は、その親和性物質が少なくとも２つの親和性部位に同時に結合することができるようにその親和性支持体に結合している必要がある。
【０１１９】
捕捉すべき１個の対象が２個以上の分子からなる場合、少なくとも１つの親和性部位がその分子のそれぞれにおいて存在する必要がある。この場合、捕捉すべき１個の対象を構成する２個以上の分子は一般に同じであり、従って同じ少なくとも１個の親和性部位を有する。従って、１種類の親和性物質がその親和性支持体に結合している。しかし、この場合、２種類以上の親和性物質がその親和性支持体に結合している可能性は特に排除されない。
【０１２０】
３−２．捕捉すべき対象を含有する試料
当業者は、本発明に従う親和性支持体により捕捉されるべき対象を、それに結合する親和性物質の種類またはそれに結合する親和性物質の異なる種類の組み合わせに応じて容易に決定することができる。
【０１２１】
その捕捉すべき対象は、天然由来の構造を有していてもいなくてもよい。
【０１２２】
その捕捉すべき対象の具体的な例には、生物学的物質、特にポリペプチド、糖鎖、核酸、およびそれらの２種類以上のコンジュゲート（例えば、それらの２種類以上を任意に組み合わせることにより得られるコンジュゲート、例えば糖ペプチドおよびペプチド核酸）が含まれる。これらの生物学的物質は、例えば２００〜１，０００，０００、好ましくは１，０００〜２００，０００の分子量を有していてよい。
【０１２３】
その捕捉すべき対象のより具体的な例は、バイオマーカー、バイオマーカー候補分子、およびバイオマーカーまたはバイオマーカー候補分子からスプライシングにより生成された断片からなる群から選択される生物学的物質である。さらに、そのバイオマーカーは癌、脳疾患（例えばアルツハイマー病）、心疾患、免疫疾患、肝疾患、腎疾患、および眼疾患からなる群から選択される疾患に関連するバイオマーカーであることができる。その捕捉すべき対象がそのような生物学的物質である場合、疾患の初期診断、疾患の追跡調査、および／または疾患に関する化学療法の感受性の評価を本発明により実施することができる。
【０１２４】
その捕捉すべき対象の別のより具体的な例はウイルスである。この場合、その親和性支持体はウイルスの表面抗原を捕捉することができる。それに結合した２〜５種類の親和性物質を有する本発明の１態様に従う親和性支持体は、その表面抗原を変えることにより作り出され得るウイルスのバリエーションに容易に応じることができる。
【０１２５】
その捕捉すべき対象の別のより具体的な例は、細菌細胞、動物細胞、および植物細胞からなる群から選択される細胞である。この場合、その親和性支持体は、例えば２量体またはより高次の多量体を構成する受容体、例えば血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦＲ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）を捕捉することができる。
【０１２６】
その捕捉すべき対象の別の具体的な例は、非生物学的物質、特に環境的に危険な物質である。その環境的に危険な物質の例には、ダイオキシン、エストロゲン、ポリ塩化ビフェニル等のような化合物が含まれる。これらの化合物以外では、その非生物学的物質は１００〜１，０００、好ましくは２００〜７００の分子量を有する低分子量化合物であることができる。
【０１２７】
捕捉すべき対象の別の具体的な例は、薬物分子の多量体または凝集体である。本発明は、薬物分子の会合または凝集が薬物の調製の間に問題になる場合にも有用である。ほとんどの場合において、そのような問題を引き起こす危険性を有する薬物分子はポリペプチド性薬物分子である。従って、そのような薬物分子の例にはポリペプチド性薬物分子が含まれ、そのポリペプチド性薬物分子の具体的な例にはインスリン、副甲状腺ホルモン等が含まれる。
【０１２８】
親和性支持体に晒すべき試料は、それが上記で記載した捕捉すべき対象を含有する限り、特に限定されない。その試料は通常は液体状態で調製される。その試料中に含有される捕捉すべき対象は、常に精製する必要があるわけではない。その捕捉すべき対象を精製する場合、その精製の程度は問題ではない。本発明によれば、その捕捉すべき対象の微量分析の観点から、その試料中に含有される捕捉すべき対象に対して実施される精製のような処理の程度が好ましくは低い場合が存在する。
【０１２９】
親和性支持体に晒すべき試料の例には、生物の細胞、組織、体液、分泌物、および排泄物から調製される生物学的試料が含まれる。体液から調製される典型的な生物学的試料は、血液由来の試料である。血液由来の試料の例には、全血、血漿、および血清が含まれる。血液由来の試料を体液から調製する際に実施することができる操作の例は、血液への抗凝固剤（例えばエチレンジアミン四酢酸、クエン酸、またはヘパリン）の添加後の遠心分離による血球（より具体的には赤血球、白血球、および／または血小板）の除去である。血液由来の試料の調製の間に実施することができる操作の別の例は、血液凝固および遠心分離後の血液凝固因子および血球の除去である。血液は疾患の発生のためにその構成要素において動的変化を経ることは周知である。従って、その血液由来の試料は、その血中レベルが変動する分子をバイオマーカーとして用いることにより様々な疾患の早期診断、追跡調査、および／または処置後の追跡調査のために用いることができる。さらに、血中の新規のマーカー分子は将来において早期診断および高精度診断を達成するための可能性を有する。従って、その血液由来の試料は新規の診断法を開発する目的で血中の新規のマーカー分子を探すために用いることもできる。
【０１３０】
そのような生物学的試料を親和性支持体に晒すことにより、その試料中に含有される標的物質を捕捉し、その捕捉された標的物質を調べることが可能である。
【０１３１】
親和性支持体に晒すべき試料の別の例は、環境物質から調製された環境試料である。環境物質の例には、土、地層、水、空気等が含まれる。環境試料を環境物質から調製した際に実施することができる操作の例は、有機溶媒（例えばアセトンまたはトルエン）を用いた抽出である。
【０１３２】
そのような環境試料を親和性支持体に晒すことにより、その試料中に含有される標的物質を捕捉し、その捕捉された標的物質を調べることが可能である。
【０１３３】
親和性支持体に晒すべき試料の別の例は、未精製の薬物試料である。そのような薬物試料をその親和性支持体に晒すことにより、その試料中に含有される不要な物質（薬物分子の多量体および凝集体）を除去して精製された薬物を得ることが可能である。
【０１３４】
その試料中に含有される捕捉すべき対象の濃度は、例えば１〜１０１２ａｍｏｌ／ｍＬ、好ましくは１００〜１０９ａｍｏｌ／ｍＬであることができる。その試料は、捕捉すべき対象の量がその支持体の表面の１ｃｍ２あたり０．１〜５００ｐｍｏｌ、好ましくは１〜１００ｐｍｏｌであるような様式で親和性支持体に晒すことができる。
【０１３５】
３−３．洗浄
その支持体に結合した親和性物質および捕捉すべき対象が互いに結合した後、その支持体の表面に対して洗浄プロセスを行うことができる。その洗浄プロセスは、不要な構成要素を除去するためにその支持体の表面を０．０１〜５００ＭＰａ、好ましくは０．０５〜３００ＭＰａ、より好ましくは０．１〜２００ＭＰａの流圧に晒すことにより実施することができる。その流圧が上記の下限未満である場合、所望の洗浄効果が得られる可能性がより低い。その流圧が上記の上限を超える場合、その親和性物質および捕捉された対象の間の結合が切断される恐れがある。本発明に従う親和性支持体は捕捉すべき対象を協同的結合により保持することができ、従って従来の親和性支持体が用いられる場合と比較してより高い圧力条件下で洗浄することができる。そのような洗浄条件の拡張は、その親和性支持体に非特異的に吸着した物質の除去効率を向上させ、それは結果としてその捕捉された対象の分析の感度における向上に寄与する。
【０１３６】
具体的な洗浄法は特に限定されないことは特筆すべきである。例えば、球形の形状を有する場合、その親和性支持体を、前記の親和性支持体を洗浄液中で強く攪拌することにより洗浄することができる。平面の形状を有する場合、その親和性支持体を、前記の親和性支持体にスプレーノズルから放出された高圧洗浄液を噴霧することにより洗浄することができる。より具体的には、その平面の形状の支持体上の特定の領域に対して高圧洗浄を行うために、その特定の領域の面積に対応する内径を有するスプレーノズルを用いることができる。このノズルは、例えば二重管から構成されており、内管はその支持体の表面に洗浄液を噴霧するための噴射管としてのみ機能することができ、外管はその支持体の表面上に噴霧された洗浄液を吸い込むためのドレン管としてのみ機能することができる。
【０１３７】
３−４．捕捉された対象の分析
その捕捉された対象を、適切な検出系により、前記の捕捉された対象がその親和性支持体に結合したままである、または前記の捕捉された対象をその親和性支持体からの溶離により（すなわち、その捕捉された対象をその捕捉された対象および親和性物質の間の結合を切断することにより遊離させることにより）収集した状態で分析することができる。その捕捉された対象の親和性支持体からの溶離は、その捕捉された対象に結合した親和性支持体を溶離液に晒すことにより実施することができ、当業者はそれをその捕捉された対象およびその親和性物質の組み合わせに応じて容易に選択することができる。
【０１３８】
本発明において、検出系の例として、放射性アッセイ、酵素活性アッセイ、蛍光強度アッセイ、または発光強度アッセイに基づく検出系を用いることができる。
【０１３９】
例えば、その親和性支持体を晒す分子認識系が免疫系である場合、あらゆる固相免疫アッセイに基づく検出系を選択することができる。例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、化学発光免疫アッセイ（ＣＬＩＡ）等に基づく検出系が選択される。当業者は、用いる検出系の種類に応じて、（放射性同位体、酵素、蛍光物質、および化学発光物質からなる群から選択される）標識をその親和性物質および／または捕捉すべき対象に適切に、そして予め結合させることができる。
【０１４０】
その親和性支持体を晒す分子認識系がアプタマー−受容体タンパク質系である場合、用いられる検出系は上記で記載した免疫系において用いられる検出法に基づくことができる。アプタマー−受容体タンパク質系の使用は、そのアプタマー−受容体タンパク質系は上記で記載した免疫系よりも特異的結合能力およびアプタマーの調製の容易さにおいて優れているため、好ましい。
【０１４１】
本発明において、上記で記載した検出系以外の検出系の好ましい例として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、和周波発生（ＳＦＧ）、局在プラズモン共鳴（ＬＰＲ）、偏光解析法等に基づく光学検出系が用いられる。上記で記載した検出系とは異なり、そのような光学検出系は標識を必要としない。
【０１４２】
本発明において、上記で記載した検出系以外の検出系の別の好ましい例として、質量分析に基づく検出系が用いられる。この場合、好ましくはマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析が質量分析の方法として用いられる。例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間）質量分析計、ＭＡＬＤＩ−ＩＴ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−イオントラップ）質量分析計、ＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−イオントラップ−飛行時間）質量分析計、ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）質量分析計等を用いることができる。
【０１４３】
当業者は、マトリックスおよびマトリックス溶媒を分析すべき対象の種類に応じて（すなわち、その親和性支持体により捕捉された対象の種類に依存して）容易に決定することができる。
【０１４４】
マトリックスとして、例えばα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸、３−アミノキノリン等を用いることができる。
【０１４５】
用いるべきマトリックス溶媒は、例えばアセトニトリル（ＡＣＮ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、メタノール、エタノール、および水からなる群から選択することができる。より具体的には、水性ＡＣＮ−ＴＦＡ溶液、水性ＡＣＮ溶液、水性メタノール−ＴＦＡ溶液、水性メタノール溶液、水性エタノール−ＴＦＡ溶液、エタノール溶液等を用いることができる。水性ＡＣＮ−ＴＦＡ溶液中のＡＣＮの濃度は例えば１０〜９０体積％であることができ、ＴＦＡの濃度は例えば０．０５〜１体積％、好ましくは０．０５〜０．１体積％であることができる。
【０１４６】
そのマトリックスの濃度は、例えば０．１〜５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．３〜２０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｍＬであることができる。
【０１４７】
ＭＡＬＤＩ質量分析に基づく検出系を用いる場合、好ましくはマトリックス添加剤（コ−マトリックス（ｃｏ−ｍａｔｒｉｘ））がマトリックスとの組み合わせで用いられる。当業者はそのマトリックス添加剤を分析すべき対象および／または用いる予定のマトリックスの種類に応じて適切に選択することができる。例えば、マトリックス添加剤として、ホスホン酸基を含有する化合物を用いることができる。１個のホスホン酸基を含有する化合物の具体的な例には、ホスホン酸、メチルホスホン酸、フェニルホスホン酸、１−ナフチルホスホン酸等が含まれる。２個以上のホスホン酸基を含有する化合物の具体的な例には、メチレンジホスホン酸、エチレンジホスホン酸、エタン−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸、ニトリロトリホスホン酸、エチレンジアミンテトラホスホン酸等が含まれる。上記で言及したホスホン酸基を含有する化合物の中で、１個の分子中に２個以上のホスホン酸基、好ましくは２〜４個のホスホン酸基を含有する化合物が好ましい。
【０１４８】
ホスホン酸基を含有する化合物の使用は、例えばオキシアルキレン基を含有する基がスペーサーとして用いられる場合に有用である。そのオキシアルキレン基を含有する基はその酸素原子の周囲に正に荷電した金属イオンを組み込む特性を有するが、その金属イオンは質量分析においてバックグラウンドに悪影響を及ぼす。ホスホン酸基を含有する化合物の使用は、そのような悪影響を低減する作用を有する。
【０１４９】
上記で言及したマトリックス添加剤以外に、例えばアンモニウム塩および有機塩基からなる基から選択されるより一般的な添加剤を用いることができる。
【０１５０】
そのマトリックス添加剤は、０．１〜１０ｗ／ｖ％、好ましくは０．２〜４ｗ／ｖ％水溶液またはマトリックス溶媒溶液として調製することができる。マトリックス添加剤溶液およびマトリックス溶液は、例えば１：１００〜１００：１、好ましくは１：１０〜１０：１の体積比で混合することができる。
【実施例】
【０１５１】
以下で本発明は実施例に関連してより具体的に記載されるであろうが、以下の実施例に限定されない。以下の記載において、“％”として表される物質の量は、別途明記しない限り、その物質が固体である場合は重量に、その物質が液体である場合は体積に基づいている。
【０１５２】
実施例１：１種類の抗体断片を用いるＦ（ａｂ’）−ＰＥＧｎビーズによるアミロイドβ（１−４２）の捕捉
（１）６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧｎビーズの調製
６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧｎビーズを調製するための手順を図１において模式的に示す。
【０１５３】
最初に、抗体Ｆ（ａｂ’）断片を調製した。より具体的には、そのエピトープにアミロイドβの残基３〜８が含まれる２５０μｇの抗アミロイドβ抗体（６Ｅ１０）を１，２５０μＬのフィシンアガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ）（３３％スラリー）で消化し、フィシン消化物をサイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。図２は、６Ｅ１０のフィシン消化物のサイズ排除クロマトグラフィーによる分離の結果を示す。図３Ａは分画された６Ｅ１０の消化物の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィーにより得られたゲルの画像を示し、図３Ｂは分画された６Ｅ１０の消化物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィーにより得られたゲルの画像を示す。Ｆ（ａｂ’）２の性質において、バンドは非還元条件下で約１００ｋＤａにおいて見られ、還元条件下ではＨおよびＬ鎖の間のジスルフィド結合の切断のため２５ｋＤａにおいて見られる。６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）２の精製の成功は、画分２４〜２９が還元条件下で２５ｋＤａにおいて（図３Ａ）、非還元条件下で約１００ｋＤａにおいて（図３Ｂ）バンドを示すことが認められることにより確証された。これらの画分２４〜２９をＦ（ａｂ’）２画分として集めた。この６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）２画分を３０ｍＭ水性２−メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）溶液を用いて還元した。図４は、還元処理前（図４Ａ）および還元処理後（図４Ｂ）のＦ（ａｂ’）２画分のサイズ排除クロマトグラムを示す。図４から、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）２画分の還元により６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）が生成されることが確証された。
【０１５４】
次いで、５μＬのアミノ磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ａｍｉｎｅ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（３３％スラリー）を調製し、そのビーズの表面上のアミノ基をＳＭ（ＰＥＧ）ｎ（ｎ＝２、２４）のＮＨＳ基と室温で３０分間反応させて、ＰＥＧをそのビーズに共有結合させた（図１はｎ＝２４の場合を示す）。次いで、Ｆ（ａｂ’）をその磁性ビーズに結合したＳＭ（ＰＥＧ）ｎのマレイミド基と室温で３０分間反応させてＦ（ａｂ’）をＳＭ（ＰＥＧ）ｎに共有結合させた。
【０１５５】
（２）６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズの調製
対照実験に関して、ＩｇＧ−プロテインＧビーズを０．７５μｇの６Ｅ１０  ＩｇＧの５μＬのプロテインＧ磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（３３％スラリー）への親和性結合により調製した。
【０１５６】
（３）抗原としてのアミロイドβ（１−４２）
抗原として、アミロイドβ（１−４２）を用いた。アミロイドβ（１−４２）のＣ末端は凝集して多量体を形成することが知られている。従って、１個のアミロイドβ（１−４２）凝集体は２個以上の６Ｅ１０に関するエピトープを有し、従って協同的結合の結合強度の評価に適した物質として用いることができる。この実施例において用いられるアミロイドβ（１−４２）の凝集はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確証されたことは特筆すべきである。その濃度が３〜１００μｇ／ｍＬであるアミロイドβ（１−４２）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そのゲルを銀を用いて染色した。そのゲルの画像を図５において示す。図５において示されるように、アミロイドβ（１−４２）の単量体、３量体、および４量体が検出された。
【０１５７】
（４）ビーズを用いてアミロイドβ（１−４２）を捕捉するための方法
３種類のビーズ：６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧｎビーズ（ｎ＝２、２４）および６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズをそれぞれＴＢＳ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）−１％  ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグリコシド（ＯＴＧ）で３回洗浄し、次いでそれぞれの種類のビーズをアミロイドβ（１−４２）と、それらを反転により混合しながら室温で１時間反応させた。次いで、得られたビーズをＴＢＳ−１％  ＯＴＧで３回およびＨ２Ｏで１回洗浄した。次いで、そのビーズに対して５μＬの３ｍＭ  ＨＣｌを用いた溶離を２回行ってそれぞれの溶離物を得た。この方法で、捕捉すべき対象の単離および濃縮を実施した。その溶離物を、以下の様式でサンドイッチＥＬＩＳＡおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析した。
【０１５８】
（５）サンドイッチＥＬＩＳＡによるアミロイドβ（１−４２）の定量的決定
抗アミロイドβ抗体（４Ｇ８）を炭酸緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中で０．５μｇ／ｍＬで溶解させた溶液を、９６ウェルプレートのウェル中に１００μＬ／ウェルの量で入れ、４℃で一夜静置した。次いで、そのウェル中に入れた抗体溶液を除去し、２０％ブロッキング緩衝液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｇｕｅ）をそのウェル中に２００μＬ／ウェルの量で入れ、室温で２時間静置した。そのウェルを３００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣ１、０．１％  Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した。
【０１５９】
アミロイドβ（１−４２）を反応緩衝液（１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣ１、０．１％  Ｔｗｅｅｎ、５％ブロッキング緩衝液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｇｕｅ））中で既知の濃度で溶解させ、上記の（４）で得られた溶離液を上記で記載した反応緩衝液により１００倍希釈することにより得られた試料をウェル中に別々に１００μＬ／ウェルの量で入れ、室温で１時間振盪した。そのウェルを３００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で５回洗浄し、次いで０．１μｇ／ｍＬのＨＰＲ標識した抗アミロイドβ抗体（６Ｅ１０−ＨＰＲ）をそのウェルの中に１００μＬ／ウェルの量で入れ、室温で１時間振盪した。そのウェルを３００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（ＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ）で５回洗浄し、次いでＴＭＢをそのウェルの中に１００μＬ／ウェルの量で入れ、室温で１５分間振盪した。１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４をそのウェルに１００μＬ／ウェルの量で入れ、そのウェルの吸光度（４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）をプレートリーダーを用いて測定した。
【０１６０】
（６）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ＭＡＬＤＩプレート上で、１μＬの上記の（４）で得られた溶離液および１μＬのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）の溶液（ＣＨＣＡを０．１％トリフルオロ酢酸を含有する５０％アセトニトリル水溶液中で０．５ｍｇ／ｍＬで溶解させたもの）を滴下し、混合して試料を得た。その試料を、ＡＸＩＭＡ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（島津製作所）を線形モードで用いて分析した。試料間で比較することを可能にするため、全ての試料をラスターモードで、プロフィールの数が５００であり、プロフィールあたりのショットの数が５であり、そしてレーザーショットの数が１００ポイントである一定条件下で分析した。ピーク検出に関する基準はＳ／Ｎ≧３であった。
【０１６１】
（７）６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧｎビーズにより捕捉されたアミロイドβ（１−４２）の量の評価
アミロイドβ（１−４２）の単離および濃縮を、異なる種類のビーズ（すなわち、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズ、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２ビーズ、および６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズ）を用いて、抗原としてのアミロイドβ（１−４２）の量が１００ｎｇの固定値に設定され、それぞれの種類のビーズの数が１０７の固定値に設定され、反応溶液の液量が１０、１００、および１，０００μＬに設定された（すなわち、抗体および抗原の濃度レベルのバリエーションが１倍、１０倍、および１００倍であった）条件下で実施した。単離および濃縮に関する捕捉された抗原の量はＥＬＩＳＡにより測定された。捕捉されたアミロイドβ（１−４２）の量を表すグラフを図６において示す。６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズにより捕捉された抗原の量は６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズにより捕捉された抗原の量よりも５．９〜８．５倍多く、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２ビーズにより捕捉された抗原の量は６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズにより捕捉された抗原の量よりも５．６〜６．９倍多かった。
【０１６２】
その３種類のビーズ全てが、捕捉された抗原の量がその反応溶液の量が増大するにつれて低減する傾向を示した。しかし、その低減の比率は、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２ビーズを用いた場合よりも低かった。その反応溶液の量が１，０００μＬである場合、その捕捉された抗原の量は、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合に最大であった。ここで、その抗原のその抗体に対する結合の比率は、その抗体およびその抗原のそれぞれのモル濃度ならびにその抗体の会合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）に依存して異なる。非特許文献２(Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, Physical and Biological Sciences 2011; 87(9): 603-16)において記載されているＳＰＲの結果によれば、協同的結合が起こる場合および協同的結合が起こらない場合の間で抗原−抗体反応の会合速度定数（ｋａ）において差はないが、抗原−抗体反応の解離速度定数（ｋｄ）は協同的結合が起こる場合に協同的結合が起こらない場合よりも低い。
【０１６３】
捕捉された抗原の量はＦ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合にＦ（ａｂ’）−ＰＥＧ２ビーズを用いた場合よりも多いという結果から、好ましい協同的結合（すなわちより低いｋｄでの結合）はＦ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズがその抗原に結合する際に起こったと考えられる。これは、そのＦ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズは生物学的試料中のその濃度がより低い分子を捕捉するためのより有効な道具として用いることができることを示している。
【０１６４】
（８）質量分析計による検出限界の評価
質量分析計による検出のために必要とされる抗原の量が、本発明に従う方法を用いた場合に従来の免疫沈降法を用いた場合よりも（すなわち、６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズを用いた場合よりも）少ないことを検証するための実験を実施した。図７は、６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズを用いた場合に得られたアミロイドβ（１−４２）の溶離物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図７Ａ）、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２ビーズを用いた場合に得られたアミロイドβ（１−４２）の溶離物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図７Ｂ）、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合に得られたアミロイドβ（１−４２）の溶離物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図７Ｃ）、およびビーズによる捕捉なしでＭＡＬＤＩプレート上に（直接）スポットした純粋なアミロイドβ（１−４２）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図７Ｄ）を示す。全ての場合におけるアミロイドβ（１−４２）の検出限界を表１において示す。
【０１６５】
【表１】
2015529322.tif 000003
【０１６６】
従来の免疫沈降法を用いた場合、すなわち６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズを用いた場合、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる検出に必要なアミロイドβ（１−４２）の量は１００ｐｇであった。一方で、本発明に従う方法を用いた場合、すなわち６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズまたは６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２ビーズを用いた場合、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる検出に必要なアミロイドβ（１−４２）の量はわずか２５ｐｇであった。これは、質量分析計による検出に必要な抗原の量が、本発明に従う方法を用いた場合に従来の免疫沈降法を用いた場合よりも少ないことを示している。加えて、本発明に従う方法により達成される検出レベルは、アミロイドβ（１−４２）をＭＡＬＤＩプレート上に直接スポットすることにより達成される検出限界と同等であった。すなわち、本発明に従う方法はアミロイドβ（１−４２）を試料からほぼ１００％の割合で収集することを可能にする。
【０１６７】
実施例２：２種類の抗体断片を用いた６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧｎビーズによるアミロイドβ（１−４２）の捕捉
ホモ多量体を形成する分子、例えばアミロイドβ（１−４２）が捕捉すべき対象である場合、その捕捉すべき対象の量を、１種類の抗体に由来する実施例１の６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧｎビーズを用いた場合に、６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズを用いた場合と比較して増大させることができる。
【０１６８】
一方で、この実施例において、２種類のＦ（ａｂ’）断片を有するビーズを、抗原の単一の分子が捕捉すべき対象である場合、その抗原の単一の分子中の２つ以上の部位を認識する少なくとも２種類の抗体由来のＦ（ａｂ’）断片が捕捉される抗原の量を増大させるために必要であるという見込みに基づいて調製した。
【０１６９】
（１）様々なＦ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズの調製
（１−１）６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズの調製
２種類のＦ（ａｂ’）断片の一方を実施例１における方法と同じ方法でそのエピトープにアミロイドβの３〜８番目の残基が含まれる抗アミロイドβ抗体６Ｅ１０から調製し、他方をそのエピトープにアミロイドβの１８〜２２番目の残基が含まれる抗アミロイドβ抗体４Ｇ８から調製した。その４Ｇ８抗体はＩｇＧ２ｂであり、従ってＦ（ａｂ’）２をフィシンまたはペプシンにより得ることはできない。この理由のため、Ｆ（ａｂ’）２をリシルエンドペプチダーゼ（ＬｙｓＣ）により得た。より具体的には、１００μｇの４Ｇ８を５００ｎｇのＬｙｓＣを用いて２．５時間消化し、次いでＬｙｓＣ消化物をサイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。
【０１７０】
図８は、４Ｇ８のＬｙｓＣ消化物のサイズ排除クロマトグラフィーによる分離の結果を示す。さらに、図９は、分画された４Ｇ８の消化物の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィーにより得られたゲルの画像（図９Ａ）および分画された４Ｇ８の消化物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィーにより得られたゲルの画像（図９Ｂ）を示す。非還元条件下で約１５０ｋＤａのバンドおよび還元条件下で２５ｋＤａのバンドを示す画分１６〜２９を４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）２画分として集めた。その４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）２画分を還元すると４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）が得られた。
【０１７１】
そのそれぞれに２種類のＦ（ａｂ’）断片がＰＥＧにより結合しているビーズ、すなわち６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを、４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）画分および実施例１中の（１）において得られた６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）画分を１：１（モル比）でＦ（ａｂ’）画分として用いたことを除いて実施例１中の（１）と同じ方法で調製した。
【０１７２】
（１−２）６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズおよび４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズの調製
参照実験のため、実施例１において用いられたものと同じ６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを調製し、４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを、４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）画分をＦ（ａｂ’）画分として用いたことを除いて実施例１中の（１）と同じ方法で調製した。
【０１７３】
（２）様々なＩｇＧ−プロテインＧビーズの調製
（２−１）６Ｅ１０／４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズの調製
そのそれぞれに２種類の抗体が結合しているプロテインＧビーズ、すなわち６Ｅ１０／４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズを、４Ｇ８  ＩｇＧおよび６Ｅ１０  ＩｇＧを１：１（モル比）で用いたことを除いて実施例１中の（２）と同じ方法で調製した。
【０１７４】
（２−２）６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズおよび４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズの調製
対照実験に関して、実施例１において用いたものと同じ６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズを調製し、４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズを、４Ｇ８  ＩｇＧを抗体として用いたことを除いて実施例１中の（２）と同じ方法で調製した。
【０１７５】
（３）抗原としてのアミロイドβ（１−２８）
抗原として、アミロイドβ（１−２８）を用いた。アミロイドβ（１−２８）は溶液中で単一の分子および凝集体として存在する。
【０１７６】
（４）６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズにより捕捉されたアミロイドβ（１−２８）の量の評価
アミロイドβ（１−２８）を、実施例１中の（４）における方法と同じ方法で、上記で記載した親和性ビーズ（６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズ、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズ、４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズ、６Ｅ１０／４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズ、６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズ、および４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズ）を用いて捕捉した。さらに、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを実施例１中の（６）における方法と同じ方法で質量分析計を用いて実施し、検出限界を決定した。図１０は、６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズを用いた場合に得られたアミロイドβ（１−２８）溶離物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図１０Ａ）、４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズを用いた場合に得られたアミロイドβ（１−２８）溶離物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図１０Ｂ）、６Ｅ１０／４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズを用いた場合に得られたアミロイドβ（１−２８）溶離物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図１０Ｃ）、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合に得られたアミロイドβ（１−２８）溶離物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図１０Ｄ）、４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合に得られたアミロイドβ（１−２８）溶離物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図１０Ｅ）、６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合に得られたアミロイドβ（１−２８）溶離物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  １０スペクトル（図１０Ｆ）、およびビーズによる捕捉なしでＭＡＬＤＩプレート上に（直接）スポットした純粋なアミロイドβ（１−２８）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図１０Ｇ）を示す。全ての場合におけるアミロイドβ（１−２８）の検出限界（Ｓ／Ｎ≧３）を表２において示す。
【０１７７】
【表２】
2015529322.tif 000004
【０１７８】
その３種類のＩｇＧ−プロテインＧビーズ（６Ｅ１０／４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインビーズ、６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズ、および４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズ）を用いた際、その検出限界は全ての場合において２５ｐｇであった。一方で、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合、その検出限界は５ｐｇであった。すなわち、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合の感度はそれぞれの種類のＩｇＧ−プロテインＧビーズを用いた場合の感度よりも５倍高い。これは、ＰＥＧの挿入によりそのビーズおよび−Ｆ（ａｂ’）のそれぞれの間に空間が作り出され、従って立体障害が起こる可能性がより低くなり、かつ抗原−抗体反応の結合強度が高められるためであると考えられる。
【０１７９】
一方で、４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合の検出限界は２５ｐｇであり、それは４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズを用いた場合の検出限界と同じであった。ＩｇＧのＦ（ａｂ’）断片化が抗原および抗体の間の結合強度を低減する場合があるが、抗原および抗体の間の結合強度を高めるＰＥＧ挿入の作用はＩｇＧの断片化による抗原および抗体の間の結合強度の低減を埋め合わせ得ることが分かっている。
【０１８０】
６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合、検出限界は２．５ｐｇであり、それはアミロイドβ（１−２８）をＭＡＬＤＩプレート上に直接スポットすることにより達成された検出限界と同等のレベルであった。
【０１８１】
ここで、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）および４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）の結合強度の単純な計算から、６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合の検出限界は約１５ｐｇであると推定され、それは６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合の検出限界（５ｐｇ）および４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合の検出限界（２５ｐｇ）の平均である。しかし、６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合の検出限界は２．５ｐｇであり、それは推定された検出限界の１／６であった。これは、その結合強度がそのビーズのそれぞれの上で互いに異なるエピトープを認識する２種類の抗体断片（６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）および４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’））により達成される協同的結合により高められるためであると考えられる。一方で、６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合のＳ／Ｎ比は純粋なアミロイドβ（１−２８）を分析した場合よりも低く、それからその溶離物は微量の不純物（低分子量化合物、金属イオン等）を含有していたと考えられる。
【０１８２】
実施例３：ヒト血漿中にスパイクしたアミロイドβ（１−２８）の捕捉
質量分析計により生物学的試料中の標的生体分子を測定するために、その標的分子を単離および濃縮することにより不純物を排除することが重要である。この実施例において、捕捉すべき対象を単離および濃縮することにより不純物を排除するＦ（ａｂ’）−ＰＥＧｎビーズの能力を調べるための実験を実施した。生物学的試料として、ヒト血漿を用いた。
【０１８３】
１ｎｇ（３０７ｆｍｏｌ）のアミロイドβ（１−２８）を５０μＬのヒト血漿をＴＢＳ−１％ＯＴＧで２０倍希釈することにより得られた血漿中にスパイクすることにより、１ミリリットルの試料を調製した。試料中のアミロイドβ（１−４２）を実施例１中の（４）における方法と同じ方法で単離および濃縮した。しかし、この実施例では、実施例１で実施されたＴＢＳ−１％ＯＴＧでの洗浄（ビーズおよび試料の間の反応後に３回）を５回実施して、そのビーズに非特異的に吸着された不純物を除去した。
【０１８４】
参照実験のため、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いてアミロイドβ（１−２８）を単離および濃縮し、次いで実施例１中の（６）における方法と同じ方法で質量分析計により分析した。そうして得られた質量スペクトルを図１１（Ａ）において示す。図１１（Ａ）において示されるように、アミロイドβ（１−２８）のピーク以外の多くのピークが検出された。
【０１８５】
ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）はヒト血液中に存在することが知られている。６Ｅ１０および４Ｇ８はマウス由来のＩｇＧであるため、そのような抗体の分子はそれに結合する。そのような結合を防ぐため、血漿試料にアミロイドβ（１−２８）をスパイクしてビーズを混合する前に、その血漿中に含有されるヒト抗マウス抗体を、その血漿試料および５０μＬのプロテインＧアガロースを混合してその混合物を４℃で３０分間保温することにより除去した。次いで、質量分析を同じ方法で実施した。そうして得られた質量スペクトルを図１１（Ｂ）において示す。図１１（Ｂ）において示されるように、アミロイドβ（１−２８）のピーク以外の多くのピークがヒト抗マウス抗体を除去することにより除去された。一方で、高いバックグラウンドスペクトルが観察された。
【０１８６】
ＰＥＧは正に荷電した金属イオンをその負に荷電した酸素原子の周りに組み込む特性を有する。ＰＥＧ中に組み込まれ、次いでＨＣｌを用いた溶離によりＰＥＧから遊離する際、その反応緩衝液および血漿中に含有される金属イオンは質量分析計により実施される分析への影響を有する。この影響はその質量スペクトルにおいて高いバックグラウンドを引き起こすと考えられる。この理由のため、金属イオンによるバックグラウンドを低減する作用を有する１μＬの２％水性メタンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）溶液をＭＡＬＤＩプレート上でコマトリックスとして混合し、次いで質量分析を実施した。そうして得られた質量スペクトルを図１１（Ｃ）において示す。図１１（Ｃ）において示されるように、高いＳ／Ｎ比を有するスペクトルが得られた。２％ＭＤＰＮＡをそれとの組み合わせで用いた際に最高のシグナルが得られたＣＨＣＡの濃度は５ｍｇ／ｍＬであったことを特筆すべきである。
【０１８７】
上記の条件下で、血漿中にスパイクしたアミロイドβ（１−２８）をＦ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いて単離および濃縮し、質量分析計により分析してアミロイドβ（１−２８）の検出限界を決定した。図１２は、６Ｅ１０  ＩｇＧ−プロテインＧビーズを用いた場合に得られたアミロイドβ（１−２８）溶離物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図１２Ａ）、４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズを用いた場合に得られたアミロイドβ（１−２８）溶離物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図１２Ｂ）、６Ｅ１０／４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズを用いた場合に得られたアミロイドβ（１−２８）溶離物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図１２Ｃ）、６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合に得られたアミロイドβ（１−２８）溶離物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図１２Ｄ）、４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合に得られたアミロイドβ（１−２８）溶離物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図１２Ｅ）、６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合に得られたアミロイドβ（１−２８）溶離物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図１２Ｆ）、およびビーズによる捕捉なしでＭＡＬＤＩプレート上に（直接）スポットした純粋なアミロイドβ（１−２８）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（図１２Ｇ）を示す。全ての場合におけるアミロイドβ（１−２８）の検出限界（Ｓ／Ｎ≧３）を表３において示す。
【０１８８】
【表３】
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【０１８９】
純粋なアミロイドβ（１−２８）をビーズにより捕捉することなく質量分析計により検出した場合の検出限界は１ｐｇ（３０７ａｍｏｌ）であった（図１２Ｇ）。この実施例の評価点は、Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いて血漿中のアミロイドβ（１−２８）を単離および濃縮することにより１ｐｇ（３０７ａｍｏｌ）に近い質量分析での検出レベルを達成することである。この実施例において達成された１ｐｇ（３０７ａｍｏｌ）の検出限界は、実施例２でマトリックスＣＨＣＡのみを用いて達成された検出限界よりも低かった。これは、マトリックスおよびコマトリックスＭＤＰＮＡの併用がバックグラウンドを低減し、それがＳ／Ｎ比を増大させるためである。
【０１９０】
血漿中にスパイクされたアミロイドβ（１−２８）を、３種類のＦ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズ（６Ｅ１０  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズ、４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズ、および６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズ）ならびに３種類のＩｇＧ−プロテインＧビーズ（６Ｅ１０−プロテインＧビーズ、４Ｇ８−プロテインＧビーズ、および６Ｅ１０／４Ｇ８−プロテインＧビーズ）を用いて単離および濃縮した。結果として、６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合に最も低いレベルのアミロイドβ（１−２８）（１ｐｇ）を検出することができた。この場合において達成された検出レベルは、純粋なアミロイドβ（１−２８）を質量分析計により分析した場合に達成された検出レベルと同等であった。しかし、この実施例においても、６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合のＳ／Ｎ比は純粋なアミロイドβ（１−２８）を分析した場合のＳ／Ｎ比よりも低く、それからその溶離物は微量の不純物を含有していたと考えられる。
【０１９１】
その３種類のＩｇＧ−プロテインＧビーズの中で、検出限界において差があった。それらの中で、６Ｅ１０／４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズを用いた際に最も低いレベルのアミロイドβ（１−２８）（５ｐｇ）を検出することができた。一方で、実施例２において、その３種類のＩｇＧ−プロテインＧビーズの中で検出限界において差はなかったが、Ｓ／Ｎ比は６Ｅ１０／４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズを用いた場合に最も高いことが確証された。実施例３において、なぜ６Ｅ１０／４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズを用いた場合に低いレベルのアミロイドβ（１−２８）を検出することができたのかの確からしい理由は、２種類の抗体が結合したプロテインＧビーズを用いた場合も協同的結合がその異なる抗体のＦ（ａｂ’）断片により達成されたことである。
【０１９２】
実際、非特許文献２（Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, Physical and Biological Sciences 2011; 87(9): 603-16）は、ＰＥＧがヒンジ領域中に挿入されていないアミロイドβ（１−１５）−Ｆｃ６抗体様分子のＫＤ値はアミロイドβ（１−１５）ペプチドのＫＤ値よりも低く、すなわちＰＥＧがヒンジ領域中に挿入されていないアミロイドβ（１−１５）−Ｆｃ６抗体様分子はアミロイドβ（１−１５）ペプチドよりも抗アミロイドβ抗体の解離を引き起こす可能性がより低いことを記載している。その非特許文献２は、協同的結合はその抗体様分子のヒンジ領域がＩｇＧの本来の（ＰＥＧが挿入されていない）ヒンジ領域である場合にも達成され得ることを示唆している。これは、ＳＰＲ分析の結果によっても示唆されている。
【０１９３】
加えて、非特許文献２は、その中にＰＥＧが挿入されているヒンジ領域を有する抗体様分子のＫＤ値はその中にＰＥＧが挿入されていないヒンジ領域を有する抗体様分子のＫＤ値よりも低いことも記載している。ＫＤ値がＰＥＧの挿入により低下する傾向は、捕捉された抗原の量が６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合に６Ｅ１０／４Ｇ８  ＩｇＧ−プロテインＧビーズを用いた場合よりも大きいというこの実施例の結果においても見られる。
【０１９４】
さらに、非特許文献２におけるＳＰＲ分析の結果によれば、アミロイドβ（１−１５）−ＰＥＧ２４−Ｆｃ６抗体様分子の最大結合量（Ｒｍａｘ）は、アミロイドβ（１−１５）−Ｆｃ６抗体様分子のＲｍａｘが３４．９である場合に４０である。ＰＥＧの挿入により結合量が増大する傾向は、この実施例の結果とも一致している。
【０１９５】
標的アミロイドβ（１−２８）以外の物質がそのビーズに吸着されるか否かを決定するための実験を実施した。図１３は、血漿中にスパイクした１ｐｇ（３０７ａｍｏｌ）のアミロイドβ（１−２８）を６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いて単離および濃縮することにより得られた溶離物を質量分析計を用いて分析することにより得られた質量スペクトルを示す。図１３において示されるように、６Ｅ１０／４Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズを用いた場合、ｍ／ｚ  １，５００〜５，０００の範囲においてアミロイドβ（１−２８）のピーク以外のピーク（Ｓ／Ｎ≧３）は検出されなかった。その結果から、不純物の非特異的吸着が高親水性ＰＥＧのそのビーズへの結合およびその抗体のＦｃ領域の非存在により低減したと考えられる。従って、Ｆ（ａｂ’）−ＰＥＧ２４ビーズは特異性においても優秀であると言うことができる。
【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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