(57)【要約】  本発明は、一態様において、全体としてin vivoでの、抗体可変ドメインの誘導選択、組合せおよび発現の新規概念に一般的に関する。ある適用は、多価ポリペプチドを生成することである。本発明は、多価(例えば、多特異的)抗体、抗体鎖およびポリペプチド、ならびに軽鎖を含まない重鎖のみの抗体(H2抗体)に関する。本発明はさらに、非ヒト脊椎動物および非ヒト脊椎動物細胞におけるin vivoでのこれらのものの選択、成熟および生成に関する。この目的のために、本発明はまた、そのような非ヒト脊椎動物および細胞にも関する。本発明はまた、重鎖のみの抗体および親和性成熟を受けた可変ドメインを含む重鎖を生成および選択するための手段の提供にも関する。
2015519055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト脊椎動物(例えば、マウスもしくはラット)または細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)であって、そのゲノムのIg重鎖または軽鎖遺伝子座が(5'から3'の向きに)(i)第1の可変ドメインをコードするための再構成されていないヒト可変領域、(ii)任意選択のリンカーをコードする配列および(iii)エピトープ結合部分をコードする配列を含む、非ヒト脊椎動物または細胞。
【請求項２】
(i)の可変領域が再構成を受けることができ、再構成を受けることによって脊椎動物が標的エピトープに特異的な結合部位を含むポリペプチドを発現することができ、結合部位が構造V1-L-E(式中、V1は抗体可変ドメインであり、Eはエピトープ結合部分であり、Lは任意選択のペプチドリンカーである)を有する、請求項1に記載の脊椎動物。
【請求項３】
配列(i)が再構成を受けて、細胞が配列(i)および(iii)から誘導される第1および第2の可変ドメインを含むエピトープ結合部位をそれぞれ有する抗体鎖を生成することができ、第1および第2の可変ドメインの間にさらなる抗体ドメインが存在しない、請求項1または2に記載の脊椎動物。
【請求項４】
標的エピトープに特異的な結合部位を含むポリペプチドであって、結合部位が構造V1-L-E(式中、V1は抗体可変ドメインであり、Eはエピトープ結合部分であり、Lは任意選択のペプチドリンカーである)を有し、V1は、Eをもコードするヌクレオチド配列における、得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異と共に、非ヒト脊椎動物中中でのin vivoでのヒト可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導され、V1は、内因性AIDパターンの体細胞超変異を含みかつ標的エピトープに特異的に結合する、ポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドが構造V1-L-E-X(式中、Xは定常領域(任意選択で、ガンマ定常領域)である)を有する、請求項2もしくは3に記載の脊椎動物、または請求項4に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項1、2または3に記載の非ヒト脊椎動物を、前記標的エピトープで免疫する工程、Ig遺伝子座の内因性AIDによる体細胞超変異を得て、V1-L-Eをコードする変異したIg遺伝子座を生成する工程、ならびにポリペプチド、および/またはポリペプチドをコードする核酸を単離する工程を含む、請求項4または5に記載のポリペプチドを生成する方法。
【請求項７】
ゲノムが(5'から3'の方向に)再構成された可変領域および非ミュー定常領域を含む抗体重鎖または軽鎖遺伝子座を含むリンパ球細胞を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)であって、
非ミュー定常領域が、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび第1の可変ドメインをコードする再構成された可変領域をコードするヌクレオチド配列を含み、アイソタイプスイッチング後に、脊椎動物が、(N末端からC末端の方向に)再構成された第2の可変ドメインヌクレオチド配列および第1の可変ドメインヌクレオチド配列からそれぞれ誘導される第2および第1の抗体可変ドメインを含むエピトープ結合部位を含む、ポリペプチド鎖を発現し、第2のヌクレオチド配列が脊椎動物中で再構成された、脊椎動物。
【請求項８】
細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成された可変領域および非ミュー定常領域を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)またはハイブリドーマであって、
非ミュー定常領域が、(N末端からC末端の方向に)再構成された第2の可変ドメインヌクレオチド配列および第1の可変ドメインヌクレオチド配列からそれぞれ誘導される第2および第1の抗体可変ドメインを含むエピトープ結合部位を含むポリペプチド鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーと第1の可変ドメインをコードする再構成された可変領域とをコードするヌクレオチド配列を含み、第2のヌクレオチド配列が細胞中で再構成された、脊椎動物細胞またはハイブリドーマ。
【請求項９】
リンパ球細胞を含む非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)であって、それぞれの細胞ゲノムが、
(i)(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ、ミュー定常領域、第2のスイッチおよび非ミュー定常領域を含み、それぞれの細胞の重鎖遺伝子座がIgMから非ミューへのアイソタイプスイッチングを受けることができる、抗体重鎖遺伝子座
を含み、
(ii)非ミュー定常領域が、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、アイソタイプスイッチング後に、脊椎動物が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、
脊椎動物。
【請求項１０】
細胞ゲノムが、
(i)(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ、ミュー定常領域、第2のスイッチおよび非ミュー定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座であり、それぞれの細胞の重鎖遺伝子座がIgMから非ミューへのアイソタイプスイッチングを受けることができる抗体重鎖遺伝子座
を含み、
(ii)非ミュー定常領域が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、
非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)。
【請求項１１】
非ミュー定常領域がガンマ定常領域であり、重鎖遺伝子座が、アイソタイプスイッチングを受けて、軽鎖の非存在下で1つまたは複数のIgG重鎖を含みかつそれぞれの重鎖がCH1ドメインを欠く、IgG抗体を生成することができる、請求項9または10に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項１２】
ゲノムが(5'から3'の方向に)再構成された可変領域および非ミュー定常領域を含む抗体重鎖または軽鎖遺伝子座を含むリンパ球細胞を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)であって、
非ミュー定常領域が(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、脊椎動物が(N末端からC末端の方向に)鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、脊椎動物。
【請求項１３】
細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成された可変領域および非ミュー定常領域を含む抗体重鎖または軽鎖遺伝子座を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)またはハイブリドーマであって、
非ミュー定常領域が(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、細胞が(N末端からC末端の方向に)遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、脊椎動物細胞またはハイブリドーマ。
【請求項１４】
(N末端からC末端の方向に)抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含み、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する多価ポリペプチド鎖を、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)中で生成する方法であって、
(a)脊椎動物を、第1のエピトープを担持する第1の所定の抗原で免疫し、脊椎動物の少なくともいくつかの重鎖遺伝子座中での非ミュー定常領域からの発現および体細胞超変異を受けた可変領域の発現へのアイソタイプスイッチングを得る工程;ならびに
(b)前記第1のエピトープに結合する可変領域の選択により前記免疫した脊椎動物から1つまたは複数のポリペプチド鎖を選択し、それぞれの選択された鎖がエピトープに特異的に結合する体細胞超変異した可変領域を含む工程;ならびに
(d)脊椎動物のゲノム中の重鎖遺伝子座の非ミュー定常領域中にエピトープ結合部分のヌクレオチド配列を提供し、工程(b)で選択されたポリペプチド鎖が第1および第2のエピトープに結合する工程
を含む方法。
【請求項１５】
工程(a)におけるそれぞれの体細胞変異した可変領域が、CH1ドメインを欠く非ミュー型重鎖により提供される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
選択されたポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を単離または合成する工程;および任意選択で、その配列をヒト化する工程をさらに含む、請求項14または15に記載の方法。
【請求項１７】
請求項14から16のいずれか一項に記載の方法により得られる多特異的ポリペプチド鎖、または第1および第2のエピトープに特異的に結合するその誘導体。
【請求項１８】
(N末端からC末端の方向に)構造V-X-L-E-L-C
(式中、
(i)Vは第1のエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメインであり、
(ii)Xは、存在しない、抗体ヒンジ領域、または定常ドメインを含む抗体定常領域であり、
(iii)Lはそれぞれ、任意選択のリンカーであり、
(iv)Eは第2のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合部分であり、
(v)Cは存在しないか、または定常ドメインを含む抗体定常領域であり(例えば、CはヒトガンマFcである))
を有する多価ポリペプチド鎖であって、
Vは、エピトープ結合部分をもコードするヌクレオチド配列における、得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異と共に、非ヒト脊椎動物中(例えば、マウスまたはラット)中でのin vivoでの可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導される再構成された抗体可変ドメインであり、
再構成された抗体可変ドメインは、内因性(例えば、マウスまたはラット)AIDパターンの体細胞超変異を含む、ポリペプチド。
【請求項１９】
エピトープ結合部分が、内因性AIDパターンの体細胞超変異を欠く、請求項18に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
それぞれの重鎖が、請求項18または19に記載のポリペプチドであり、(N末端からC末端の方向に)構造
V-CH1-M-CH2-CH3-L-E、
V-M-CH2-CH3-L-E、
V- L-E-L-CH1-M-CH2-CH3、
V- L-E-L-M-CH2-CH3、
V-CH1-N-E、
V- L-E-N-CH1、または
V- N-E-L-CH1
(式中、Nは任意選択の抗体ヒンジ領域を有するLであり;Mは任意選択の抗体ヒンジ領域である)
を有し、
任意選択で、定常ドメインはヒト定常ドメインである、重鎖の二量体を含む二価抗体。
【請求項２１】
1つまたは複数のエピトープ結合部分に連結されたタンパク質スキャホールドを含む抗原結合ポリペプチドであって、少なくとも2つのエピトープ結合部位を含み、そのうちの少なくとも一方がエピトープ結合部分により提供され、少なくとも一方が第2の抗体可変ドメインと対形成した第1の抗体可変ドメインにより提供され、
第1の可変ドメインが、第2の可変ドメインおよび1つまたは複数のエピトープ結合部分をもコードするヌクレオチド配列における、得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異と共に、非ヒト脊椎動物中でのin vivoでの可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導される再構成された抗体可変ドメインであり;
再構成された第1の抗体可変ドメインが、内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む、抗原結合ポリペプチド。
【請求項２２】
1つまたは複数のエピトープ結合部分に連結されたタンパク質スキャホールドを含む抗原結合ポリペプチドの製造における第1および第2の再構成された抗体可変ドメインの使用であって、抗原結合ポリペプチドが少なくとも2つのエピトープ結合部位を含み、そのうちの少なくとも一方がエピトープ結合部分により提供され、少なくとも一方が第2の抗体可変ドメインと対形成した第1の抗体可変ドメインにより提供され、
(i)第2の可変ドメインおよび1つまたは複数のエピトープ結合部分をもコードするヌクレオチド配列における、得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異と共に、非ヒト脊椎動物中でのin vivoでの可変領域遺伝子セグメントの再構成によって第1の可変ドメインの配列を取得し;再構成された第1の抗体可変ドメイン配列が内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む可変ドメイン配列を、単離する工程;(ii)可変ドメインと、タンパク質スキャホールドおよび1つまたは複数のエピトープ結合部分とを発現させ組み合わせて、前記抗原結合ポリペプチドを生成する工程;ならびに(iii)前記ポリペプチドを単離する工程を含む、使用。
【請求項２３】
リンパ球細胞を含み、それぞれの細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域および任意選択のリンカーと所定のエピトープ結合部分とをコードするヌクレオチド配列を含むミュー定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)であって、脊椎動物が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、脊椎動物。
【請求項２４】
細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域および任意選択のリンカーと所定のエピトープ結合部分とをコードするヌクレオチド配列を含むミュー定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)であって、細胞が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、細胞。
【請求項２５】
N末端可変ドメインもしくは5'末端可変領域またはそれぞれのN末端可変ドメインもしくは5'末端可変領域が、ヒト可変ドメインまたは領域である、請求項9から24のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞、ポリペプチド、方法または使用。
【請求項２６】
ゲノムが、抗体重鎖遺伝子座および抗体軽鎖遺伝子座を含み、軽鎖遺伝子座が、
(a)IgM抗体を発現するリンパ球細胞中で軽鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)可変領域および定常領域;ならびに
(b)非ミュー抗体を発現するリンパ球細胞中での軽鎖発現を停止させるための手段
を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)。
【請求項２７】
ゲノムが抗体重鎖遺伝子座および抗体軽鎖遺伝子座を含み、軽鎖遺伝子座が、
(a)IgM抗体を発現するリンパ球細胞中で軽鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)可変領域および定常領域;ならびに
(b)非ミュー抗体を発現するリンパ球細胞中での軽鎖発現を停止させるための手段
を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)またはハイブリドーマ。
【請求項２８】
(a)脊椎動物が、それぞれ抗体重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座によりコードされる重鎖および軽鎖を含むIgM抗体を発現し;
(b)脊椎動物が、非ミュー抗体を発現することができ、それぞれの非ミュー抗体重鎖が機能的CH1ドメインを欠き;
(c)IgM抗体がリンパ球細胞により発現され、それぞれの細胞が、該細胞により発現されるIgM抗体の軽鎖を発現させるための機能的軽鎖遺伝子座を含み;
(d)非ミュー抗体がリンパ球細胞により発現され、それぞれの細胞が、機能的軽鎖遺伝子座を欠き、非ミュー抗体が軽鎖発現の非存在下で該細胞により発現される、
非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)。
【請求項２９】
ゲノムが
(i)(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ、ミュー定常領域、第2のスイッチ、およびCH1遺伝子セグメントを欠く非ミュー定常領域を含む、抗体重鎖遺伝子座;
(ii)軽鎖を発現させるための機能的抗体軽鎖遺伝子座であり、
該細胞が、IgM型重鎖および軽鎖を含むIgM抗体を発現することができ;
それぞれの細胞の重鎖遺伝子座が、アイソタイプスイッチングを受けて、軽鎖の非存在下で1つまたは複数の非ミュー型重鎖を含みかつそれぞれの重鎖がCH1ドメインを欠く、非ミュー抗体を生成することができる、機能的抗体軽鎖遺伝子座;ならびに
(iii)機能的軽鎖が前記非ミュー型抗体へのアイソタイプスイッチングの後に発現されない、軽鎖発現を停止させるための手段
を含むリンパ球細胞を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)。
【請求項３０】
細胞ゲノムが、
(i)軽鎖を発現させるための機能的抗体軽鎖遺伝子座;
(ii)IgM型重鎖および軽鎖を含むIgM抗体を発現させるための;ならびに軽鎖の非存在下で1つまたは複数の非ミュー型重鎖を含みかつそれぞれの重鎖がCH1ドメインを欠く非ミュー抗体を生成する、IgMから非ミューへのアイソタイプスイッチングのための、(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ、ミュー定常領域、第2のスイッチ、およびCH1遺伝子セグメントを欠く非ミュー定常領域を含む、抗体重鎖遺伝子座;ならびに
(iii)機能的軽鎖が前記非ミュー型抗体へのアイソタイプスイッチング後に発現されない、軽鎖発現を停止させるための手段
を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)。
【請求項３１】
軽鎖発現を停止させるための手段が、前記軽鎖遺伝子座からの機能的軽鎖発現にとって必須であるヌクレオチド配列(例えば、軽鎖可変領域または軽鎖遺伝子座のCL領域)を含み、ヌクレオチド配列がIgMを発現する未熟B細胞中では機能的であるが、ヌクレオチド配列が、前記非ミュー型抗体を発現する成熟B細胞中には存在しないか、または実質的に非機能的である、請求項29または30に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項３２】
B細胞が、請求項29から31のいずれか一項に記載の脊椎動物から単離されたリンパ球細胞であり、B細胞が前記非ミュー抗体を発現し、抗体が抗原にとって特異的である、B細胞から生成された不死化B細胞またはハイブリドーマ。
【請求項３３】
非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)において体細胞超変異した可変領域を含むポリペプチド鎖を生成する方法であって、
(a)脊椎動物中で、抗体がそれぞれ重鎖および軽鎖遺伝子座から発現される重鎖および軽鎖を含む、未熟B細胞においてIgM抗体を発現させる工程;
(b)脊椎動物を所定のエピトープで免疫し、少なくともいくつかの重鎖遺伝子座におけるアイソタイプスイッチングおよび体細胞超変異を受けた非ミュー(例えば、IgG)抗体の発現を得る工程であり、抗体が、CH1ドメインを欠く重鎖を含みかつ抗原に特異的に結合する可変領域を含む、工程;ならびに
(c)前記エピトープに結合する可変領域の選択により前記免疫された脊椎動物から1つまたは複数のポリペプチド鎖を選択し、それぞれの選択された鎖がエピトープに特異的に結合する体細胞超変異した可変領域を含む、工程
を含み、軽鎖発現の非存在下で、工程(b)の非ミュー抗体を発現させる工程をさらに含む方法。
【請求項３４】
免疫された脊椎動物から、エピトープに結合する体細胞超変異した可変領域を含むポリペプチド鎖を発現するB細胞を単離する工程;および任意選択で、該細胞を不死化する工程、またはそれからハイブリドーマを生成する工程を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
非ヒト種の脊椎動物を生成する方法であって、前記種の2つの脊椎動物を一緒に育種する工程を含み、脊椎動物が両方とも請求項1から3、5、7、9、12、23、25、26、28、29および31のいずれか一項に規定の通りである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一態様において、全体として完全にin vivoでの、抗体可変ドメインの誘導選択(guided selection)、組合せおよび発現の新規概念に一般的に関する。ある適用は、多価ポリペプチドを生成することである。
【０００２】
本発明はまた、多価(例えば、多特異的)抗体、抗体鎖およびポリペプチド、ならびに軽鎖を含まない重鎖のみの抗体(H2抗体)にも関する。本発明はさらに、非ヒト脊椎動物中および非ヒト脊椎動物細胞中におけるin vivoでのこれらのものの選択、成熟および生成に関する。この目的のために、本発明はまた、そのような非ヒト脊椎動物および細胞にも関する。本発明はまた、重鎖のみの抗体および親和性成熟を受けた可変ドメインを含む重鎖を生成および選択するための手段の提供にも関する。
【背景技術】
【０００３】
技術水準は、in vitro(例えば、ファージ、リボソームもしくは酵母ディスプレイを用いる)またはin vivo(例えば、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスおよびラット)およびトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を含む細胞を用いる)で抗体を生成するための方法を提供する。そのようなin vivo系(例えば、Xenomouse(商標))は、ヒト定常領域の上流のヒト可変領域(ヒトVH、DおよびJH遺伝子セグメント)(例えば、ヒトガンマ定常遺伝子セグメントの上流のヒトミュー)を含む完全ヒトトランスジェニック重鎖遺伝子座を用いてきた。その後、そのようなin vivo系における全ヒトトランスジェニック遺伝子座の使用が有害であり、B細胞発生が阻害され、相対的に小さいB細胞コンパートメントおよび抗体を作成するための限られた利用性をもたらすことが発見された。ヒト可変領域が内因性(例えば、マウスまたはラット)定常領域(すなわち、生殖細胞系列構成における、ガンマ定常領域の上流のマウスミュー定常領域)の上流にあるキメラ重鎖遺伝子座を有する後の世代のトランスジェニック動物(例えば、Velocimouse(商標))が作出された。これにより、B細胞および抗体発生のための内因性制御機構の利用が可能になり、そのようなものとして、全ヒトトランスジェニック遺伝子座の問題の程度は見られない。トランスジェニック脊椎動物を構築するための方法および抗原免疫化後に抗体およびその核酸を作成するためのこれらの使用は当業界で公知であり、例えば、US7501552 (Medarex); US5939598 & US6130364 (Abgenix); WO02066630、WO2011163311 & WO2011163314 (Regeneron); WO2011004192 & WO2011158009 (Kymab Limited); WO2009076464、WO2009143472、EP1414858、WO2009013620A2、WO2010070263A1 & WO2010109165A2 (Harbour Antibodies); EP1399559 (Crescendo Biologics)およびWO2010039900 (Ablexis)(これらの開示は、限定されるものではないが、トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を担持する非ヒト動物を作製する方法および内因性遺伝子座発現を不活化する方法の指針を当業者に提供する目的などのために、本明細書に明示的に組込まれる)を参照されたい。
【０００４】
当業界は、エピトープまたは抗原結合部位と、特異性との人工的な組合せを生成する望ましさを認識している。従って、当業界は、複数の結合部位を合成的に組み合わせて、同じか、または異なる標的上の複数のエピトープへの結合を提供する多価抗原結合抗体およびポリペプチドを提唱してきた。標的が異なる場合、エピトープを提供する複数の異なる抗原を標的とし、これに結合する(例えば、抗原を中和する)ことができる多特異的構築物が可能である。1つの技術は、異なる抗体に由来する重鎖と軽鎖との対形成が得られるクアドローマを生成するための異なるハイブリドーマのin vitroでの組合せ(融合)を含む(Milstein & Cuello, Nature, 1983, 305(5934): 537〜40頁)。この技術は、不利なことに、ミスマッチ対形成および抗体鎖の複数の異なる組合せをもたらし、所望の組合せの特異性の収率は相対的に低い。それに続く技術は、エピトープ結合部分(例えば、抗体可変ドメイン、dAbまたはscFv)を合成的に組み合わせて、多価、多特異的構築物を生成するためにin vitro抗体工学を用いてきた。エピトープ結合部分は、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイおよび酵母ディスプレイなどのin vitro技術において個別に選択される(通常、エピトープ結合親和性に基づく)。一度、望ましい部分が同定されたら、その後、これらのものを操作によりin vitroで組合せて、得られる多価構築物の性能および特徴を評価する。多価性および多特異性を提供するが、in vitroでのそのような操作は得られる抗体の望ましい特徴をダウングレードし得るため、これらの技術は阻害される。例えば、抗原結合親和性、抗原特異性、発現性(例えば、CHOもしくはHEK293細胞などの細胞系中での)、半減期および/または生物物理学的特徴(例えば、融点、溶液状態、凝集に対する耐性など)はダウングレードされることがあり、それによって、ヒトの治療的または予防的使用のための薬物としての抗体の開発を阻害する。当業界におけるこれらの欠点に対処する多価および多特異的抗体を生成し、成熟させ、選択するための手段を有することが望ましい。多価および多特異的形式は、例えば、Trends Biotechnol. 2010年7月;28(7):355〜62頁、2010年5月4日(電子版);「Multivalent antibodies: when design surpasses evolution」; Cuesta AMらに開示されている。
【０００５】
Harbour Antibodies and Crescendo Biologicsから上記に引用された特許出願を参照する;これらのものは、CH1を欠き、軽鎖を含まない重鎖のみの抗体(H2抗体)の生成に関する。Proc Natl Acad Sci U S A. 2006年10月10日;103(41):15130〜5頁、2006年10月2日(電子版);「Generation of heavy-chain-only antibodies in mice」; Janssensらに、CH1が欠失したCγ2およびCγ3領域の上流にラマVHHエクソンおよびCμ領域を含む抗体重鎖遺伝子座を含むトランスジェニックマウス(MGΔマウス)が開示されている。マウスは、μMTバックグラウンドを有し、軽鎖を発現する。重鎖MGΔ遺伝子座は、マウス受精卵へのDNAの注入、次いで、1〜5コピーの遺伝子座のマウスゲノム中への無作為な組込みにより導入される。MGΔ遺伝子座は、B細胞発生をレスキューしなかった。MGΔマウスは、細胞表面キメラIgを発現する非常に少数のB細胞を含んでいた; 30%の骨髄B220+細胞が、IgGではなく、細胞内IgMを発現した。かくして、改良されたトランスジェニック重鎖遺伝子座ならびにH2抗体(例えば、ガンマ型H2抗体などのクラススイッチしたH2抗体)を作成するためのこれらのものを含む脊椎動物および細胞の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】US7501552
【特許文献２】US5939598
【特許文献３】US6130364
【特許文献４】WO02066630
【特許文献５】WO2011163311
【特許文献６】WO2011163314
【特許文献７】WO2011004192
【特許文献８】WO2011158009
【特許文献９】WO2009076464
【特許文献１０】WO2009143472
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【特許文献１２】WO2009013620A2
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【特許文献１４】WO2010109165A2
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【特許文献１６】WO2010039900
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【特許文献１８】WO2002/002773
【特許文献１９】EP1523496
【特許文献２０】WO2004061104
【特許文献２１】WO2008145133
【特許文献２２】WO2011097603
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【特許文献２４】US6673986
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【特許文献４３】WO2010132872
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【特許文献４５】EP1314741
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、改良された多価および多特異的抗体、鎖およびポリペプチド、ならびにこれらのものを生成し、選択するための手段の必要性に取り組むものである。これに関して、本発明は、完全にin vivoでエピトープ結合特異性の組合せの生成、成熟および選択を提供することによる解決を提供する。このように、当業者であれば、本発明により、1つまたは複数の所定の他の結合部位または特異性との関連において、in vivo系により生成、成熟および発現された抗体可変ドメインを選択することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かくして、本発明を用いて、1つまたは複数の所定の他の結合部分との関連において、in vivoでjunctional mutationおよび親和性成熟を受けた抗原特異的可変ドメインを含む多抗原特異的抗体、鎖およびポリペプチドを直接的かつ迅速に取得することができる。そのような抗体、鎖およびポリペプチドは、最終生成物として用いられる組合せにおいて、全体としてin vivoで生成および選択され、そのようなものとして、本発明は、所望の可変ドメインおよび所定のエピトープ結合部分対形成についての発現性に関してin vivoフィルタリングを利用する(かつ、in vivo選択において考慮に入れられる親和性および生物物理学的特徴の態様をおそらく提供する)。これは、エピトープ結合部分をin vitroで別々に選択した後、組み合わせる場合の先行技術において見られる生物物理学的および親和性特徴をダウングレードする問題を回避する。かくして、当業者であれば、本発明により、その後のヒト治療的および予防的使用のために用いられる形式において直接的に多価および多特異的抗体、鎖およびポリペプチドを選択することができる。
【００１０】
本発明はまた、重鎖のみの抗体の改良されたin vivoでの生成の必要性にも取り組むものである。本発明を用いて、親和性成熟を受けた重鎖のみの抗体および可変ドメインを含む重鎖を生成および選択することができる。本発明により、抗体およびB細胞コンパートメント発生は、より初期の4鎖IgM段階により提供される重鎖VDJ組換えの良好なプールから重鎖のみ(H2)抗体を専ら選択するその後の(例えば、ガンマ)段階（当該段階は4鎖抗体の可能性を本質的に排除する）に進行する前に、好ましい4鎖内因性IgM段階を通過することができる。このその後の段階は、さらなるエピトープ特異性を所定の方法で組込むことができ、従って、重鎖のみの抗体および鎖は任意選択で多特異的であってもよい。本発明は、1つまたは複数の以下の利点を提供することが期待される:良好なB細胞コンパートメント発生(例えば、正常な骨髄および/もしくは脾臓または野生型もしくはほぼ野生型の二次リンパコンパートメント);骨髄および/または脾臓コンパートメントにおける正常なB細胞比;正常な血清抗体レベル;正常な血清ガンマH2抗体レベル;H2抗体に対する良好な抗原結合親和性;アイソタイプスイッチングしたH2抗体を含まない生成;ならびに可変ドメインが抗体単一可変ドメイン(すなわち、dAb)であるアイソタイプスイッチングした抗体を含まない生成。
【００１１】
かくして、第1の構成において、本発明は、以下を提供する。
【００１２】
第1の態様において、
リンパ球細胞を含む非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)であって、それぞれの細胞ゲノムが、
(i)(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ、ミュー定常領域(例えば、CH1遺伝子セグメントを含む)、第2のスイッチおよび非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域を含み、それぞれの細胞の重鎖遺伝子座がIgMから非ミュー(例えば、IgG)へのアイソタイプスイッチングを受けることができる、抗体重鎖遺伝子座
を含み、
(ii)非ミュー定常領域が、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、アイソタイプスイッチング後に、脊椎動物が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、
脊椎動物。
【００１３】
第2の態様において、
細胞ゲノムが、
(i)(5'から3'の方向に)再構成された、もしくは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ、ミュー定常領域(例えば、CH1遺伝子セグメントを含む)、第2のスイッチおよび非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座であって、それぞれの細胞の重鎖遺伝子座がIgMから非ミュー(例えば、IgG)へのアイソタイプスイッチングを受けることができる抗体重鎖遺伝子座
を含み、
(ii)非ミュー定常領域が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、
非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞、例えば、ES細胞またはB細胞)。
【００１４】
第2の構成において、本発明は、以下を提供する。
【００１５】
第1の態様において、
ゲノムが(5'から3'の方向に)再構成された可変領域および非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座を含むリンパ球細胞を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)であって、
非ミュー定常領域が(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、脊椎動物が(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)。
【００１６】
第2の態様において、
細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成された可変領域および非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)またはハイブリドーマであって、
非ミュー定常領域が(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、細胞が(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、脊椎動物細胞またはハイブリドーマ。
【００１７】
第3の構成において、本発明は以下を提供する。
【００１８】
第1の態様において、
脊椎動物がリンパ球細胞を含み、各細胞のゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域および第2の領域を含む抗体軽鎖遺伝子座を含み;
第2の領域が(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、脊椎動物が(N末端からC末端の方向に)軽鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含むポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)。
【００１９】
第2の態様において、
細胞ゲノムが(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域および第2の領域を含む抗体軽鎖遺伝子座を含み;
第2の領域が(N末端からC末端の方向に)軽鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含むポリペプチド鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)またはハイブリドーマ。
【００２０】
第4の構成において、本発明は以下を提供する。
【００２１】
第1の態様において、
(N末端からC末端の方向に)抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含み、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する多価ポリペプチド鎖を生成する方法であって、
(a)非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)において、未熟B細胞中でIgM抗体を発現させ、抗体が、それぞれ重鎖および軽鎖遺伝子座から発現された重鎖および軽鎖を含み、任意選択で、重鎖がCH1ドメインを含む工程;
(b)脊椎動物を、第1のエピトープを担持する第1の所定の抗原で免疫し、少なくともいくつかの重鎖遺伝子座中の非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域からの発現および体細胞超変異を受けた可変領域の発現へのアイソタイプスイッチングを得る工程;ならびに
(c)前記第1のエピトープに結合する可変領域の選択により前記免疫された脊椎動物から1つまたは複数のポリペプチド鎖を選択し、それぞれの選択された鎖がエピトープに特異的に結合する体細胞超変異した可変領域を含む工程
を含み、
(d)脊椎動物のゲノム中の重鎖遺伝子座の非ミュー定常領域中にエピトープ結合部分のヌクレオチド配列を提供し、工程(c)で選択されたポリペプチド鎖が第1および第2のエピトープに結合する工程
をさらに含む、方法。
【００２２】
第2の態様において、
非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)において、(N末端からC末端の方向に)抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含み、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する多価ポリペプチド鎖を生成する方法であって、
(a)脊椎動物を、第1のエピトープを担持する第1の所定の抗原で免疫し、脊椎動物の少なくともいくつかの重鎖遺伝子座中の非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域からの発現および体細胞超変異を受けた可変領域の発現へのアイソタイプスイッチングを得る工程;ならびに
(b)前記第1のエピトープに結合する可変領域の選択により前記免疫された脊椎動物から1つまたは複数のポリペプチド鎖を選択し、それぞれの選択された鎖がエピトープに特異的に結合する体細胞超変異した可変領域を含む工程
を含み、
(d)脊椎動物のゲノム中の重鎖遺伝子座の非ミュー定常領域中にエピトープ結合部分のヌクレオチド配列を提供し、工程(b)で選択されたポリペプチド鎖が第1および第2のエピトープに結合する工程
をさらに含む、方法。
【００２３】
第5の構成において、本発明は、以下を提供する。
【００２４】
第1の態様において、
(N末端からC末端の方向に)構造V-X-L-E-L-C
(式中、
(i)Vは第1のエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメインであり、
(ii)Xは、存在しない、抗体ヒンジ領域、または定常ドメインを含む抗体定常領域であり、
(iii)Lはそれぞれ、任意選択のリンカーであり、
(iv)Eは第2のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合部分であり、
(v)Cは存在しないか、または定常ドメインを含む抗体定常領域であり(例えば、CはヒトガンマFcである))
を有する多価(例えば、多特異的または二特異的)ポリペプチド鎖であって、
Vは、エピトープ結合部分をもコードするヌクレオチド配列中に得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異を有する非ヒト脊椎動物中においてin vivoで可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導される再構成された抗体可変ドメインであり、
再構成された抗体可変ドメインは、内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む、ポリペプチド。
【００２５】
第2の態様において、
それぞれの重鎖が第5の構成の第1の態様に記載されたポリペプチド鎖であり、Eが抗体可変ドメインであり;
それぞれの軽鎖が(N末端からC末端の方向に)構造V'-L'-E'-L'-C'を有するポリペプチドであり、ここで、
(i)V'は抗体可変ドメインであり、
(ii)それぞれのL'は任意選択のリンカーであり、
(iv)E'はエピトープ結合部分であり、および
(v)C'は存在しないか、または定常ドメインを含む抗体定常領域であり(例えば、C'はヒトCLである);
V'が、E'をもコードするヌクレオチド配列中に得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異を有する非ヒト脊椎動物中におけるin vivoで可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導される再構成された抗体可変ドメインであり;ならびに
V'が内因性AIDパターンの体細胞超変異を含み;
VおよびV'が第1のエピトープに特異的に結合する第1の結合部位を形成し;ならびに
任意選択で、E'が抗体可変ドメインである場合(例えば、EがVHであり、E'がVLである;またはEがVLであり、E'がVHである)、EおよびE'が第2のエピトープに特異的に結合する第2の結合部位を形成する、
軽鎖と会合した重鎖を含む多価(例えば、多特異的または二特異的)抗体。
【００２６】
第3の態様において、
1つまたは複数のエピトープ結合部分に連結されたタンパク質スキャホールド(protein scaffold)を含む抗原結合ポリペプチドであって、少なくとも2つのエピトープ結合部位を含み、そのうちの少なくとも一方がエピトープ結合部分により提供され、少なくとも一方が第2の抗体可変ドメインと対形成した第1の抗体可変ドメインにより提供され、それぞれの可変ドメインが、1つまたは複数のエピトープ結合部分をもコードするヌクレオチド配列中に得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異を有する非ヒト脊椎動物中におけるin vivoでの可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導される再構成された抗体可変ドメインであり、再構成された抗体可変ドメインが内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む、抗原結合ポリペプチド。
【００２７】
第4の態様において、
ヒト免疫エフェクター細胞上に位置するエフェクター抗原(例えば、ヒトCD3)に特異的に結合することによりヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員することができる、第1、第2または第3の態様に記載の多特異的抗原結合ポリペプチド、二量体または抗体であって、ポリペプチド、二量体または抗体の第1のエピトープ結合部位が前記エフェクター抗原に特異的に結合することができ、ポリペプチド、二量体または抗体の第2のエピトープ結合部位がエフェクター抗原以外の標的抗原(例えば、ヒトEpCAMまたはヒトCD19)に特異的に結合することができ、任意選択で、前記標的抗原が前記ヒト免疫エフェクター細胞以外の標的細胞上に位置する、多特異的抗原結合ポリペプチド、二量体または抗体。
【００２８】
第6の構成において、本発明は以下を提供する。
【００２９】
第1の態様において、
(a)脊椎動物が、それぞれ抗体重鎖および軽鎖遺伝子座によりコードされる重鎖および軽鎖を含むIgM抗体を発現し、任意選択で、それぞれの重鎖がCH1ドメインを含む;
(b)脊椎動物が、それぞれの非ミュー抗体重鎖が機能的CH1ドメインを欠く、非ミュー(例えば、IgG)抗体を発現することができる;ならびに
(c)IgM抗体が、リンパ球細胞により発現され、それぞれの細胞が該細胞により発現されるIgM抗体の軽鎖を発現させるための機能的軽鎖遺伝子座を含む、ならびに
(d)非ミュー抗体が、リンパ球細胞により発現され、それぞれの細胞が機能的軽鎖遺伝子座を欠き、非ミュー抗体が軽鎖発現の非存在下で該細胞により発現される、
非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)。
【００３０】
第2の態様において、
ゲノムが
(i)(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ、ミュー定常領域(例えば、CH1遺伝子セグメントを含む)、第2のスイッチ、およびCH1遺伝子セグメントを欠く非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域を含む、抗体重鎖遺伝子座;
(ii)軽鎖を発現させるための機能的抗体軽鎖遺伝子座であり、
該細胞が、IgM型重鎖および軽鎖を含むIgM抗体を発現することができ;
それぞれの細胞の重鎖遺伝子座が、アイソタイプスイッチングを受けて、軽鎖の非存在下で1つまたは複数の非ミュー型(例えば、IgG型)重鎖を含みかつそれぞれの重鎖がCH1ドメインを欠く、非ミュー(例えば、IgG)抗体を生成することができる、機能的抗体軽鎖遺伝子座;ならびに
(iii)機能的軽鎖が前記非ミュー型抗体へのアイソタイプスイッチングの後に発現されない、軽鎖発現を停止させるための手段
を含むリンパ球細胞を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)。
【００３１】
第3の態様において、
細胞ゲノムが、
(i)軽鎖を発現させるための機能的抗体軽鎖遺伝子座;
(ii)IgM型重鎖および軽鎖を含むIgM抗体を発現させるための;ならびに軽鎖の非存在下で1つまたは複数の非ミュー型重鎖を含みかつそれぞれの重鎖がCH1ドメインを欠く非ミュー(例えば、IgG)抗体を生成する、IgMから非ミュー(例えば、IgG)へのアイソタイプスイッチングのための、(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ、ミュー定常領域(例えば、CH1遺伝子セグメントを含む)、第2のスイッチ、およびCH1遺伝子セグメントを欠く非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域を含む、抗体重鎖遺伝子座;ならびに
(iii)機能的軽鎖が前記非ミュー型抗体へのアイソタイプスイッチング後に発現されない、軽鎖発現を停止させるための手段
を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)。
【００３２】
第7の構成において、本発明は、以下を提供する。
【００３３】
非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)中に体細胞超変異した可変領域を含むポリペプチド鎖を生成する方法であって、
(a)脊椎動物中で、抗体がそれぞれ重鎖および軽鎖遺伝子座から発現される重鎖および軽鎖を含む、未熟B細胞中のIgM抗体を発現させる工程;
(b)脊椎動物を所定のエピトープで免疫し、少なくともいくつかの重鎖遺伝子座におけるアイソタイプスイッチングおよび体細胞超変異を受けた非ミュー(例えば、IgG)抗体の発現を得る工程であり、抗体が、CH1ドメインを欠く重鎖を含みかつ抗原に特異的に結合する可変領域を含む、工程;ならびに
(c)前記エピトープに結合する可変領域の選択により前記免疫された脊椎動物から1つまたは複数のポリペプチド鎖を選択し、それぞれの選択された鎖がエピトープに特異的に結合する体細胞超変異した可変領域を含む、工程
を含み、軽鎖発現の非存在下で、工程(b)の非ミュー抗体を発現させる工程をさらに含む方法。
【００３４】
第8の構成において、本発明は、以下を提供する。
【００３５】
ゲノムが、抗体重鎖遺伝子座および抗体軽鎖遺伝子座、
(a)IgM抗体を発現するリンパ球細胞中で軽鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)軽鎖可変領域および定常領域を含む軽鎖遺伝子座;ならびに
(b)非ミュー(例えば、IgG)抗体を発現するリンパ球細胞中での軽鎖発現を停止させるための手段
を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)。
【００３６】
ゲノムが抗体重鎖遺伝子座および抗体軽鎖遺伝子座を含み、軽鎖遺伝子座が、
(a)IgM抗体を発現するリンパ球細胞中で軽鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)軽鎖可変領域および定常領域;ならびに
(b)非ミュー(例えば、IgG)抗体を発現するリンパ球細胞中での軽鎖発現を停止させるための手段
を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)またはハイブリドーマ。
【００３７】
本発明はまた、以下を提供する。
【００３８】
脊椎動物または細胞のゲノムのIg重鎖または軽鎖遺伝子座が(5'から3'の向きに)(i)第1の可変ドメインをコードするための再構成されていないヒト可変領域、(ii)任意選択のリンカーをコードする配列および(iii)エピトープ結合部分をコードする配列を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスもしくはラット)または細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)。
【００３９】
標的エピトープに特異的な結合部位を含むポリペプチドであって、結合部位が構造V1-L-E(式中、V1は抗体可変ドメインであり、Eはエピトープ結合部分であり、Lは任意選択のペプチドリンカーである)を有し、V1は、Eをもコードするヌクレオチド配列中に得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異を有する非ヒト脊椎動物中においてin vivoでヒト可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導され、V1は、内因性AIDパターンの体細胞超変異を含み、標的エピトープに特異的に結合する、ポリペプチド。
【００４０】
ゲノムが(5'から3'の方向に)再構成された可変領域および非ミュー定常領域を含む抗体重鎖または軽鎖遺伝子座を含むリンパ球細胞を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)であって、
非ミュー定常領域が、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび第1の可変ドメインをコードする再構成された可変領域をコードするヌクレオチドを含み、アイソタイプスイッチング後に、脊椎動物が、(N末端からC末端の方向に)再構成された第2の可変ドメインヌクレオチド配列および第1の可変ドメインヌクレオチド配列からそれぞれ誘導される第2および第1の抗体可変ドメインを含むエピトープ結合部位を含む、ポリペプチド鎖を発現し、第2のヌクレオチド配列が脊椎動物中で再構成された、脊椎動物。
【００４１】
細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成された可変領域および非ミュー定常領域を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)またはハイブリドーマであって、
非ミュー定常領域が、(N末端からC末端の方向に)再構成された第2の可変ドメインヌクレオチド配列および第1の可変ドメインヌクレオチド配列からそれぞれ誘導される第2および第1の抗体可変ドメインを含むエピトープ結合部位を含むポリペプチド鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーと第1の可変ドメインをコードする再構成された可変領域とをコードするヌクレオチド配列を含み、第2のヌクレオチド配列が細胞中で再構成された、脊椎動物細胞またはハイブリドーマ。
【００４２】
非ヒト種の脊椎動物を作製する方法であって、前記種の2つの脊椎動物を一緒に育種することを含み、両方の脊椎動物が本発明の任意の態様に記載の通りである、方法。
【００４３】
軽鎖発現を停止させることにより、アイソタイプスイッチングされた重鎖は軽鎖発現の非存在下で発現され、かくして、B細胞増殖中および体細胞変異および抗原またはエピトープ免疫化の後の重鎖の選択中に新しく発現された軽鎖が重鎖と会合する可能性はない。かくして、重鎖生成は、本質的には専ら、H2抗体型重鎖の生成であり、可変領域は軽鎖可変領域パートナーの非存在下で抗原に結合する。そのようなH2抗体は、抗体単一可変ドメイン配列(例えば、重鎖遺伝子座がヒト可変領域を含む場合のヒトVH単一可変ドメイン)のための良好な供給源であってよい。かくして、本発明の非ヒト脊椎動物または細胞のin vivoでの抗体生成機構を、免疫化後にH2抗体応答の程度を阻害する任意の有意な4鎖抗体(H2L2)生成なしにH2抗体生成に専心させることができ、最終的には、望ましいレベルのH2が得られる。この利点により、望ましい組換えVDJレパートリーおよび以下にさらに考察される内因性IgM段階の保持から生じるB細胞コンパートメントから、このアイソタイプスイッチングした、抗原/エピトープ特異的なin vivo応答を生じさせることができる。
【００４４】
内因性IgM段階を保持することにより、本発明の構成および態様は、非ヒト脊椎動物または細胞の内因性抗体およびB細胞発生制御機構を利用する能力を保持する。これは、良好なサイズのB細胞コンパートメントおよび本発明の抗体重鎖または軽鎖遺伝子座から生成されるアイソタイプスイッチングされた重鎖を後に選択し、成熟させる組換えVDJ多様性の良好なサイズおよび品質のレパートリーを生じる内因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)活性およびjunctional mutationならびに適切なB細胞発生(IgMが発現される場合、発生の初期段階を含む)を利用する能力を含む。かくして、例えば、本発明の脊椎動物を、所定の治療標的抗原(例えば、ヒト、ウイルスもしくは細菌抗原)で免疫し、(i)junctional mutationおよび体細胞変異、かくして、抗原チャレンジに応答してin vivoで親和性成熟を受けた、(ii)ヒト可変ドメインを有する、および(iii)発現のために全体としてin vivo系により選択され、抗原またはエピトープに結合する能力を有する抗体(例えば、ガンマ型)または重鎖(例えば、ガンマ型重鎖)を単離することができる。かくして、本発明は、当業者に、in vivoで良好に発現させることができ、所定の抗原に対して特異的である生きたヒト抗体(例えば、H2または4鎖二特異的抗体)および重鎖に向かわせるためにin vivo系を用いる。
【００４５】
本発明の多価構成は、in vivoとin vitroでの生成の複数工程の組合せを回避し、先行技術の方法のような多価形式を生成するために操作することにより簡便に生成される。
【００４６】
さらに、脊椎動物または細胞中で親和性成熟を受けると、選択された抗体は、人間によるよりもむしろ、自然によって調整されたその抗原結合親和性を有している。かくして、本発明の脊椎動物および細胞は、骨の折れるin vitroでの親和性成熟を実施する必要(またはin vitroでの操作に起因して望ましい特徴をダウングレードする危険性)なく、治療の影響を受けやすい親和性を有する完全ヒト抗原特異的抗体および重鎖のための良好な供給源を提供する。
【００４７】
さらに、当業者であれば、本発明により、予測可能な方法で特異的な望ましいアイソタイプの多価抗体、鎖およびポリペプチドを生成する脊椎動物および細胞を設計することができる。例えば、当業者は、全てのガンマ定常領域遺伝子セグメントが上記の多価設計を含むように、本発明の脊椎動物中の重鎖遺伝子座を設計することができる。このように、当業者は、脊椎動物から選択された全てのIgG型抗体または重鎖がそのH鎖において多価であり、そして、内因性抗体発生(例えば、親和性成熟)に供し、結合部位の組合せに照らしてin vivoでの発現および選択にかけることができることを知っている。工程をさらに進めると、当業者であれば、IgG1アイソタイプ遺伝子セグメントだけが多価設計を有する脊椎動物を設計することができる。かくして、当業者であれば、全てのIgG1アイソタイプ抗体が多価(例えば、二特異的)であり、in vivoで成熟させ、発現させ、選択することができることを発端から知ることができる。これは、予測可能な様式で特定の標的エピトープまたは抗原組合せに対して、IgG1またはIgG4などの抗体サブタイプをin vivoで調整するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】マウス重鎖遺伝子座におけるAIDの体細胞超変異パターンを示す図である。
【図２】B細胞発生ならびに骨髄および脾臓コンパートメント中のマーカーを示す図である。
【図３】本発明による非ヒト脊椎動物における重鎖のみの抗体のin vivo生成に対する改良された経路を示す図である。
【図４】条件的軽鎖発現を提供するための非ヒト脊椎動物のゲノムを操作する方法の例を示す図である。
【図５】条件的軽鎖発現を提供するための非ヒト脊椎動物のゲノムを操作する方法の例を示す図である。
【図６】二特異的重鎖および抗体を生成するための方法を示す図である。
【図７】野生型脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)における膜結合型または分泌型抗体に関するスプライシングとポリアデニル化との競合を示す図である。
【図８】発明の多価生成物を生成するための選択的スプライシングを示す図である。
【図９】発明の多価生成物を生成するための選択的スプライシングを示す図である。
【図１０Ａ】本発明の関連する二価重鎖遺伝子座を構築するための方法の詳細な図である。
【図１０Ｂ】本発明の関連する二価重鎖遺伝子座を構築するための方法の詳細な図である。
【図１１Ａ】共通の軽鎖を発現する遺伝子座を構築するための方法の詳細な図である。
【図１１Ｂ】共通の軽鎖を発現する遺伝子座を構築するための方法の詳細な図である。
【図１２Ａ】in vivoで多価ポリペプチドを発現させるための遺伝子座を構築するための方法、ならびに例示的生成物の詳細な図である。
【図１２Ｂ】in vivoで多価ポリペプチドを発現させるための遺伝子座を構築するための方法、ならびに例示的生成物の詳細な図である。
【図１３Ａ】in vivoで多価ポリペプチドを発現させるための遺伝子座を構築するための方法、ならびに例示的生成物の詳細な図である。
【図１３Ｂ】in vivoで多価ポリペプチドを発現させるための遺伝子座を構築するための方法、ならびに例示的生成物の詳細な図である。
【図１３Ｃ】in vivoで多価ポリペプチドを発現させるための遺伝子座を構築するための方法、ならびに例示的生成物の詳細な図である。
【図１３Ｄ】in vivoで多価ポリペプチドを発現させるための遺伝子座を構築するための方法、ならびに例示的生成物の詳細な図である。
【図１３Ｅ】in vivoで多価ポリペプチドを発現させるための遺伝子座を構築するための方法、ならびに例示的生成物の詳細な図である。
【図１４Ａ】多価ポリペプチドを発現させるためのトランスジェニック遺伝子座を含む非ヒト脊椎動物を構築するのに用いられる詳細な方法を示す図である。
【図１４Ｂ】多価ポリペプチドを発現させるためのトランスジェニック遺伝子座を含む非ヒト脊椎動物を構築するのに用いられる詳細な方法を示す図である。
【図１５】本発明のトランスジェニック脊椎動物から得られた脾臓およびリンパ節の例と共に、そのような脊椎動物から抽出されたmRNAのPCR分析の結果を示す図である。(A)1%TAEアガロースゲル上で分離されたトランスジェニックマウスKMBS2.1dおよびKMBS3.1aの脾臓およびリンパ節から抽出された全RNA。(B)内部セミネステッド(semi-nested)プライマー1を用いて脾臓およびリンパ節から抽出されたRNAから合成されたcDNA上で実行された第1ラウンドのPCR。二特異的転写物に対応する予想されたDNA断片は約1.7kbであり、白色のボックスにより強調される。予想される転写物サイズ周辺のアガロースゲルを切出し、ゲル抽出し、同じセミネステッドリバースプライマー1または内部セミネステッドリバースプライマー2のいずれかを用いる第2ラウンドのPCR(C)において用いた。予想される二特異的抗体サイズに対応する転写物が、マウスKMBS2のリンパ節から抽出されたRNA試料中で検出された。約1.7kbのDNA断片をアガロースゲルから切出し、ゲル抽出し、小部分を、さらなる内部リバースプライマー3を用いる第3ラウンドのPCR(D)のために用いた。第3ラウンドのPCRにより、新規二特異的転写物について予想されるサイズに対応する有意な量の生成物が得られた。省略形:S、脾臓;L、リンパ節。
【図１６】PCRゲル:SalI制限消化による第3ラウンドのPCR生成物AおよびBの分析を示す図である。二特異的抗体に対応する転写物のSalI消化から予想されるDNA断片サイズは約400bpおよび1300bpである。予想される二特異的抗体転写物に対応するバンドは、SalI消化後に見ることができる。SalI消化されたDNA(D)を、未消化(U)のPCR生成物と共に泳動した。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
以下の定義は、本発明の任意の構成、態様、条項、節、特性、例または実施形態に適用される。
【００５０】
「から誘導される」は、その用語の通常の意味で用いられる。類義語の例としては、「として生成される」、「から得られる」、「から受容される」、「から取得される」、「の生成物」、「の結果」、および「から改変される」が挙げられる。例えば、重鎖のヒト可変領域を、ヒトVH、DおよびJH遺伝子セグメントの組換えから誘導することができ、これは、例えば、任意の付随する変異(例えば、接合変異)を有する本発明による重鎖遺伝子座中でのこれらの遺伝子セグメントのin vivoでの組換えを反映する。
【００５１】
B細胞を取得することができる試料としては、限定されるものではないが、血液、血清、脾臓、脾臓組織、骨髄、リンパ、リンパ節、胸腺、および虫垂が挙げられる。抗体および免疫グロブリン鎖を、以前に記載の試料のそれぞれから、ならびにまた、以下の非限定的一覧:B細胞、腹水、ハイブリドーマ、および細胞培養物から取得することができる。
【００５２】
「複数」は、この用語の通常の意味で用いられ、「少なくとも1つ」または「1つより多い」を意味する。
【００５３】
用語「生殖系列構成」とは、生殖系列ゲノム構成を指す。例えば、トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、遺伝子セグメントの相対的順序がヒト生殖系列ゲノム中の対応する遺伝子セグメントの順序と同じである場合、生殖系列構成にある。例えば、トランスジェニック遺伝子座が、仮定的ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントA、BおよびCを含む本発明の重鎖遺伝子座である場合、これらのものは、ヒト生殖系列ゲノムの対応する遺伝子セグメントが配列5'-A-B-C-3'を含む場合、この順序(遺伝子座中で5'から3'に向かって)で提供される。一例において、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のエレメント(例えば、遺伝子セグメント、エンハンサーまたは他の調節エレメント)が本発明によるトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座中で提供される場合、ヒトIg遺伝子座エレメントは、遺伝子セグメントの相対的順序がヒト生殖系列ゲノム中の対応する遺伝子セグメントの順序と同じであり、そのエレメント間にヒト配列が含まれ、これらのものがヒト生殖系列ゲノム中で対応するエレメント間のそのような配列に対応する場合、生殖系列構成にある。かくして、仮定的な例において、トランスジェニック遺伝子座は、配列5'-A-S1-B-S2-C-S3-3'(ここで、A、BおよびCは、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントであり、S1〜S3は、ヒト遺伝子間セグメント配列であり、対応する配列5'-A-S1-B-S2-C-S3-3'はヒト生殖系列ゲノム中に存在する)中にヒトエレメントを含む。例えば、本発明のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座中に、ヒト生殖系列ゲノム中のAからCまでのDNA配列に対応するDNA挿入物(またはAからCまでのDNA配列を含む挿入物)を提供することにより、これを達成することができる。ヒト生殖系列ゲノムおよび免疫グロブリン遺伝子座中の配列は、当業界で公知である(例えば、World Wide Web上のIMGT(上記を参照されたい)、Kabatおよび本明細書で引用される他の抗体資源を参照されたい)。
【００５４】
用語「抗体」は、モノクローナル抗体(免疫グロブリンFc領域を有する完全長抗体を含む)、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多特異的抗体(例えば、二特異的抗体、ダイアボディ、および一本鎖分子)ならびに抗体断片(例えば、dAb、Fab、F(ab')2およびFv)を含む。用語「抗体」はまた、重鎖の二量体(5'-VH-(任意選択のヒンジ)-CH2-CH3-3')を含み、軽鎖を含まないH2抗体も含む(天然のH2抗体と同種;例えば、Nature. 1993年6月3日;363(6428):446〜8頁; Naturally occurring antibodies devoid of light chains; Hamers-Casterman C、Atarhouch T、Muyldermans S、Robinson G、Hamers C、Songa EB、Bendahman N、Hamers Rを参照されたい)。かくして、本発明の実施形態においては、トランスジェニック重鎖遺伝子座から生成されるRNAは、CH1遺伝子セグメントを再び含まない重鎖をコードし、機能的抗体軽鎖を含まない。一例においては、トランスジェニック重鎖遺伝子座から生成されたRNAは、VH単一可変ドメイン(dAb;ドメイン抗体)をコードする。これらのものは、任意選択で定常領域を含んでもよい。
【００５５】
用語「免疫グロブリン」(Ig)は、本明細書では「抗体」と互換的に用いられる。
【００５６】
抗体の例は、2つの軽鎖と対形成した2つの重鎖を含む古典的な4鎖抗体(例えば、5'-VL-CL-3'と対形成した5'-VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3-3'の二量体)または重鎖の二量体(5'-VH-(任意選択のヒンジ)-CH2-CH3-3')を含み、軽鎖を含まないH2抗体である。かくして、本発明の実施形態においては、重鎖配列レパートリーは、CH1遺伝子セグメントを再び含まない重鎖をコードし、機能的抗体軽鎖を含まない。一例においては、脊椎動物により生成される重鎖配列レパートリーは、1つまたは複数のヒト定常ドメインと共に、VH単一可変ドメイン(dAb;ドメイン抗体)のレパートリーをコードする。
【００５７】
本発明の任意の構成の一例において、レパートリーは、複数の異なるメンバーを含む(かくして、例えば、重鎖レパートリーは複数の異なる重鎖配列、例えば、その可変領域および/またはヒト非ミュー定常領域において異なる配列を含む)。本発明の任意の構成の一例において、レパートリーは、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、少なくとも100個、少なくとも103個、少なくとも104個、少なくとも105個、少なくとも106個、少なくとも107個、少なくとも108個、少なくとも109個、少なくとも1010個、少なくとも1011個、少なくとも1012個、少なくとも1013個、もしくは少なくとも1014個のメンバーを含むか、またはそれからなる。例えば、抗体重鎖または抗体のレパートリーは、それぞれ、少なくとも100個、少なくとも103個、少なくとも104個、少なくとも105個、少なくとも106個、少なくとも107個、少なくとも108個、少なくとも109個、少なくとも1010個、少なくとも1011個、少なくとも1012個、少なくとも1013個、もしくは少なくとも1014個の抗体鎖配列または抗体を含むか、またはそれからなる。例えば、レパートリーは、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、少なくとも100個、少なくとも103個、少なくとも104個、少なくとも105個、少なくとも106個、少なくとも107個、少なくとも108個、少なくとも109個、少なくとも1010個、少なくとも1011個、少なくとも1012個、少なくとも1013個、もしくは少なくとも1014個の異なるメンバーを含むか、またはそれからなる。例えば、遺伝子セグメントのレパートリーは、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個の遺伝子セグメントを含むか、またはそれからなる。
【００５８】
「単離された」抗体は、その生成環境(例えば、天然または組換え)の構成成分から同定、分離および/または回収されたものである。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その生成環境に由来するあらゆる他の構成成分との会合を含まず、例えば、抗体はFDAにより認可され得るか、または認可された標準に対して単離されている。組換えトランスフェクト細胞から生じるものなどの、その生成環境の汚染構成成分は、抗体に関する研究、診断的または治療的使用を典型的に妨げる材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が挙げられる。好ましい実施形態においては、ポリペプチドは、(1)例えば、Lowry法により決定された場合に抗体が95質量%を超えるまで、いくつかの実施形態においては、99%を超えるまで;(2)スピニングカップシークエネーターの使用によってN末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで;または(3)クマシーブルー、もしくは、好ましくは、銀染色を用いる非還元もしくは還元条件下でのSDS-PAGEで均一になるまで精製される。抗体の天然環境の少なくとも1つの構成成分が存在しないため、単離された抗体は組換え細胞内のin situの抗体を含む。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドまたは抗体は少なくとも1つの精製工程によって調製されるであろう。
【００５９】
「抗体断片」は、無傷抗体の一部、好ましくは、無傷抗体の抗原結合領域および/または可変領域を含む。抗体断片の例としては、dAb、Fab、Fab'、F(ab')2およびFv断片;ダイアボディ;直鎖状抗体;一本鎖抗体分子ならびに抗体断片から形成された多特異的抗体が挙げられる。
【００６０】
特定のポリペプチド、抗原、またはエピトープに「特異的に結合する」または「特異的な」抗体は、他のポリペプチド、抗原またはエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチド、抗原、またはエピトープに結合するものである。例えば、抗原またはエピトープへの結合は、抗体が100μM以下、10μM以下、1μM以下、100nM以下、例えば、10nM以下、1nM以下、500pM以下、100pM以下、または10pM以下のKDで結合する場合に特異的である。当業者によって公知である標準的な手順、例えば、ELISAにおける結合および/または表面プラズモン共鳴を用いる親和性決定(例えば、Biacore(商標)、Proteon(商標)もしくはfMまでの親和性を検出することができるKinExA(商標)液相親和性測定(Sapidyne Instruments、Idaho))を用いて、結合親和性(KD)を決定することができる。
【００６１】
一実施形態においては、表面プラズモン共鳴(SPR)は、25℃で実行される。別の実施形態においては、SPRは37℃で実行される。
【００６２】
一実施形態においては、SPRは、生理的pH、例えば、pH約7またはpH7.6で実行される(例えば、pH7.6のHepes緩衝生理食塩水(HBS-EPとも呼ばれる)を用いる)。
【００６３】
一実施形態においては、SPRは、生理的塩レベル、例えば、150mM NaClで実行される。
【００６４】
一実施形態においては、SPRは、0.05体積%以下の界面活性剤レベルで、例えば、0.05%のP20(ポリソルベート20;例えば、Tween-20TM)および3mMのEDTAの存在下で実行される。
【００６５】
一例においては、SPRは、pH7.6のバッファー、150mM NaCl、0.05%界面活性剤(例えば、P20)および3mM EDTA中、25℃または37℃で実行される。バッファーは10mMのHepesを含有することができる。一例においては、SPRは、HBS-EP中、25ocまたは37ocで実行される。HBS-EPはTeknova Incから入手できる。(California;カタログ番号  H8022)
【００６６】
一例においては、親和性は、
1. 抗マウス(または他の関連する非ヒト脊椎動物)IgG(例えば、Biacore BR-1008-38)を、一次アミンカップリングなどによりバイオセンサチップ(例えば、GLMチップ)にカップリングさせる工程;
2. 抗マウスIgG(非ヒト脊椎動物抗体)を、試験IgG抗体または重鎖に曝露して、チップ上に試験抗体を捕捉する工程;
3. 1024nM、256nM、64nM、16nM、4nMおよび0nM(すなわち、バッファーのみ)でチップの捕捉表面上に試験抗原を通過させる工程;ならびに
4. そして、例えば、上記で考察されたSPR条件下で(例えば、生理的バッファー中、25℃で)、表面プラズモン共鳴を用いて試験抗原に対する試験抗体/鎖の結合の親和性を決定する工程
によりSPRを用いて決定される。SPRは、BiacoreTMなどの任意の標準的なSPR装置を用いるか、またはProteOn XPR36TM(Bio-Rad(登録商標))を用いて実行することができる。
【００６７】
捕捉表面の再生を、pH1.7の10mMグリシンを用いて実行することができる。これは捕捉された抗体を除去し、表面を別の相互作用のために用いることができる。結合データを、標準的な技術を用いる固有のモデル、例えば、ProteOn XPR36TM分析ソフトウェアに固有のモデルを用いて1:1に適合することができる。
【００６８】
「薬学的に許容される」とは、米国連邦もしくは州政府の規制当局により認可されたか、もしくは認可され得るか、または米国薬局方もしくはヒトを含む動物における使用のための他の一般的に認識される薬局方に列挙されていることを指す。「薬学的に許容される担体、賦形剤、またはアジュバント」とは、薬剤、例えば、本明細書に記載の任意の抗体または抗体鎖と一緒に、対象に投与することができ、治療量の薬剤を送達するのに十分な用量で投与した場合にその薬理活性を破壊せず、非毒性的である担体、賦形剤、またはアジュバントを指す。
【００６９】
本明細書で用いられる用語「Fc」とは、(N末端からC末端の方向に)免疫グロブリンCH2およびCH3ドメインを含むタンパク質を指す。CH2およびCH3ドメインは、抗体または重鎖の定常領域の少なくとも一部を形成することができる。
【００７０】
本発明の抗体遺伝子座(例えば、ゲノムの重鎖遺伝子座)に言及する場合、本明細書で用いられる「定常領域」は、遺伝子座中の組換えVDJ配列とin vivoで組み合わせる遺伝子セグメント(定常領域遺伝子セグメント)を含むDNA配列のストレッチに対する参照である。VDJは、(任意選択で超変異後に)定常領域遺伝子セグメントと一緒に、それぞれの鎖が可変ドメインおよび1つまたは複数の定常ドメインを含む抗体鎖を生成することができる(例えば、RNAのスプライシングの後に)脊椎動物または細胞中でRNA転写物をもたらす。「定常領域」が抗体または抗体重鎖を参照して用いられる場合、これは可変ドメインに対してC末端であり、1つまたは複数の定常ドメインを含む領域を指す。
【００７１】
本明細書で用いられる「内因性」は、定常領域などが、脊椎動物または細胞中に通常見出される型の定常領域などである(配列がそのような脊椎動物または細胞中には通常見出されない外因性定常領域、例えば、ヒト配列とは対照的である)ことを示す。例えば、内因性定常領域は、非ヒト脊椎動物または細胞の野生型ゲノムによりコードされるものであってよい。従って、脊椎動物がマウスである例においては、内因性定常領域はマウス定常領域である。さらに行くと、内因性領域は、一例においては、脊椎動物または細胞に対して株一致される。従って、一実施形態においては、脊椎動物または細胞はマウス129ES細胞であり、内因性定常領域はマウス129定常領域である。別の実施形態においては、脊椎動物または細胞はJM8株のマウスまたはマウス細胞であり、内因性定常領域はマウスJM8定常領域である。別の実施形態においては、脊椎動物または細胞はBlack6マウスまたはマウス細胞であり、内因性定常領域はマウスBlack6定常領域である。
【００７２】
in vivoでの誘導選択
Biotechnology、1994年9月;12(9):899〜903頁、「Guiding the selection of human antibodies from phage display repertoires to a single epitope of an antigen」; Jespers LSらを参照する。これは、マウス抗体結合部位(VH/VL対)を、抗原特異性を保持するヒトVH/VL対に変換することができる、in vitroでの可変ドメイン対の誘導選択への経路を開示するものである。この技術は、得られる生成物の可変ドメイン対がin vivo系および発現にとって良好に適合するかどうかを評価するものではない。本発明の以下の態様は、別の可変ドメイン(または他のエピトープ結合部分)との可変ドメインの組合せ、成熟および発現を行うin vivoでの誘導選択を提供することによってその問題に取り組むものである。
【００７３】
本発明の態様において、脊椎動物または細胞のゲノムのIg重鎖または軽鎖遺伝子座が(5'から3'の向きに)(i)第1の可変ドメインをコードする再構成されたヒト可変領域、(ii)任意選択のリンカーをコードする配列および(iii)エピトープ結合部分(任意選択で、第2の可変ドメインの再構成された配列)を含む非ヒト脊椎動物または細胞が提供される。エピトープ結合部分または第2の可変ドメインヌクレオチド配列は、所定の配列、例えば、既知の抗体の結合部位のVHもしくはVLドメインをコードする配列、またはダミー(生殖系列)VHもしくはVL配列である。配列(i)および(iii)は、Ig遺伝子座中で一緒に近接し(例えば、直接隣接するか、またはペプチドリンカーをコードする配列、例えば、タンパク質生成物中の20、15、10もしくは5アミノ酸以下のリンカーによってのみ分離される)、それによって、組合せのための対形成およびin vivoでの選択を可能にする。かくして、例えば、タンパク質生成物中に、(i)および(iii)から誘導される生成物の間にタンパク質ドメインは存在しない。同様に、Ig遺伝子座に、例えば、そのようなタンパク質ドメインをコードする配列は存在しない。
【００７４】
ある実施形態において、(iii)に関して、VH/VL対形成におけるVHによる結合の寄与が一般に最も強いため、既知の抗体の結合部位のVHドメイン配列を用いることが望ましく、それによって、(i)以下のin vivoでの再構成によりコードされるパートナー可変ドメインの選択を誘導するのに有用である。この実施形態のある例においては、(i)は、(iii)から誘導されるVHドメインと対形成させるための再構成されていないヒト軽鎖可変領域(カッパまたはラムダヒト可変領域)である。別の例においては、(i)は、再構成されていないヒト重鎖可変領域または重鎖および軽鎖可変領域遺伝子セグメント(例えば、WO2012018764に開示されたもの)を含む可変領域である。
【００７５】
(i)のヒト可変領域は、in vivoで再構成し、標的抗原エピトープによる脊椎動物の免疫化後、親和性成熟および選択を行うことができる。上手く再構成し、成熟し、配列(iii)によりコードされる生成物と組み合わせることができる可変ドメインを発現する可変領域は、V-任意選択のリンカー-Eの組合せ(例えば、V-任意選択のリンカー-V)を提供する。当業者であれば、所望の抗原(例えば、標的抗原または関連抗原)に特異的に結合することができるそのような組合せにより提供される抗原結合部位を見出すことができる。本発明のこの態様により、(iii)の既知の配列およびその生成物は、(i)の再構成され、成熟した配列によりコードされる好適なパートナーVドメインの選択を誘導することができるため、これは有用である。従って、in vivoでの選択が配列(iii)から誘導される隣接するエピトープ結合部分(例えば、Vドメイン)により誘導された、潜在的な成熟し、再構成された配列のレパートリーを提供するために、脊椎動物が用いられる。組合せの成功裏の発現は、発現されたVおよびEの対形成に基づく、潜在的に有用な薬物および薬物候補のためのさらなる選択基準を提供する。
【００７６】
(iii)のための既知の抗体に由来するVドメイン配列の使用は、既知の抗体と同じ標的に結合するが、出発点として既知のVドメインを用いる誘導選択に基づいて改変された抗原結合部位を有するバイオベター薬物を生成するのに望ましい。生成物結合部位は、既知の元の抗体の結合部位により示されるものよりも良好である1つまたは複数の特徴を有してもよい。例えば、誘導選択法を用いて、標的抗原に対するより高い親和性結合(例えば、表面プラズモン共鳴、例えば、Biocore(商標)により決定されるような、より良好な結合率、解離率および/またはKD)、新しい標的特異性(例えば、さらなる特異性、それにより、二特異的結合部位を提供する)、より良好な薬物動態、より良好な薬力学、標的抗原上の新規エピトープ(すなわち、元の結合部位によっては特異的に結合されないエピトープ)に特異的に結合する能力、より良好なin vivoでの抗体クリアランス、より良好なin vivoでの抗体分布および生物(例えば、ヒト患者またはマウス)に対するより低い毒性のうちの1つまたは複数を有するV対を見出すことができる。より高い親和性結合部位を見出すことにより、誘導選択法により選択された対のVドメインをクローニングし、Vドメイン配列を、結合部位を形成するために会合する抗体重鎖および軽鎖の発現のために標準的な重鎖および軽鎖ベクター中に挿入することができる。このように、標的抗原に特異的に結合するバイオベター抗体を再構成させることができる。
【００７７】
一実施形態においては、免疫化に用いられる標的抗原は、既知の抗体結合部位が結合する抗原と異なる。これは、対が標的抗原および他の抗原に特異的に結合することができる本発明を用いる二特異的V-任意選択のリンカー-V対を作成する可能性を提供する。ある実施形態においては、2つの抗原は構造的に関連する抗原である(例えば、WO2002/002773を参照されたい)。
【００７８】
別の実施形態においては、(iii)の配列は、ダミーVドメインをコードする生殖系列ヒト可変ドメイン配列である。この場合、免疫化後に再構成された配列(i)によりコードされる可変ドメインが抗体単一可変ドメイン(dAb)である、すなわち、それが別の可変ドメインの非存在下で標的抗原に特異的に結合することができるように、ダミーはスキャホールド機能を満たしてもよい。次いで、これはヒト抗体単一可変ドメインの有用な供給源を提供する(任意選択で、配列(iii)の3'側のIg遺伝子座によりコードされるFcまたは他の定常領域に連結され、それとの関連において選択される)。
【００７９】
上記の例においては、本発明のこの態様は、さらなるエピトープ結合部分(aka、結合モジュール、例えば、CH1と置きかわる公知のscFv)に基づいて多特異的生成物を生成するためのIg遺伝子座との関連で提供される。このように、本発明は、N-末端V-任意選択のリンカー-E(例えば、V-任意選択のリンカー-V)と、scFvまたは他の結合モジュールとの組合せを提供する。
【００８０】
本発明のこの態様の他の例においては、Ig遺伝子座中にそのようなさらなるエピトープ結合部分配列は提供されず、遺伝子座の生成物は、定常領域(例えば、Fc)に連結された、または定常領域を含まない(例えば、IgM段階後の切断が本明細書の他の場所に記載される遺伝子座構築を用いて行われる場合)N-末端V-任意選択のリンカー-E(例えば、V-任意選択のリンカー-V)である。
【００８１】
実施形態において、非ヒト脊椎動物または細胞ゲノムは、Ig重鎖定常領域、例えば、マウスまたはヒト定常領域、例えば、脊椎動物または細胞にとって内因性である重鎖定常領域の5'側に配列(ii)および(iii)を含む。ある例において、定常領域はガンマ(例えば、ガンマ-1)定常領域である。
【００８２】
ある例において、ゲノムは、S-ミューの下流(3'側)、例えば、ミュー定常領域の下流に配列(ii)および(iii)を含む。配列(iii)は、上記のようにAIDの作用から保護される。かくして、これは、公知の配列(iii)生成物に基づく誘導選択を提供するのに有用である。ある例において、ゲノムは、ガンマCH1遺伝子(例えば、ガンマ-1 CH1)の代わりに配列(iii)を含む。このように、定常領域は、CH1を含まず、重鎖のみの生成物を生成することができる。別の実施形態においては、配列(i)-(ii)-(iii)は、S-ミューの上流(5'側)に提供され、V-任意選択のリンカー-E対はIgM段階で生成され、次いで、ガンマ(または他の非ミュー)アイソタイプへのクラススイッチングが免疫化後に得られる。これにより、AIDによるV/E対の成熟が可能になり、それによって、入力配列(iii)と一部関連する成熟した結合部位の有用なレパートリーを提供することができる。
【００８３】
本発明の任意の誘導選択の例において、第2の可変ドメインは、Vκ1-39/JκまたはVκ3-20/JκVLドメインである。これらのものはVHドメインと自由に対形成し、かくして、所望の抗原結合鎖を選択するためのものからV-V対のレパートリーを生成するための誘導選択法における有用な対形成パートナーである。これらの1つなどの共通のVLと個別に対形成する2つ以上のVHドメインを選択することにより、単一のVLを含む異なるVHを発現させることによってVH/VL結合部位の混合物をより簡単に生成することができる。例えば、一度、好適なVHドメインが共通のVLとの対形成のために選択されたら、異なるVHドメインを発現する2つ以上の重鎖の生成のため、およびVLドメインを含有する単一の軽鎖の生成のために、VHおよびVLドメインを、それぞれ重鎖および軽鎖定常領域(例えば、それぞれ、重鎖CH1〜CH3;またはCκもしくはCλ)を含有する標準的な重鎖および軽鎖ベクター中にクローニングすることができる。そのような鎖を一緒に混合するか、または同時発現させることにより、全て共通の軽鎖に基づく抗体の混合物を生成することができる。かくして、一実施形態においては、本発明は、複数の異なる抗体を含む抗体組成物であって、抗体が重鎖および軽鎖を含み、重鎖がそれぞれ本発明の任意の誘導選択法において選択されたVH-VL対によりコードされるVHを含み、任意選択で、その方法において、第2の可変ドメインがVκ1-39/JκまたはVκ3-20/JκVLドメインである、抗体組成物を提供する。ある例において、組成物のそれぞれの抗体は、単一の型のVH/VL対を含む。これは、所望の混合物を溶解するための従来の精製技術により取得することができる。例えば、EP1523496、WO2004061104、WO2008145133、WO2011097603およびWO2010151792を参照されたい。
【００８４】
ある実施形態において、本発明の誘導選択の生成物、脊椎動物、細胞または方法の態様は、V-任意選択のリンカー-E(例えば、V-任意選択のリンカー-V)結合部位を含む発現された重鎖および(その3'側の)CH1ドメインを含まない重鎖定常領域(例えば、Fc、例えば、CH2-CH3)である。この実施形態においては、重鎖は、二量体化して、そのN末端に対形成したV-任意選択のリンカー-V結合部位を担持するH2抗体(軽鎖を含まない重鎖のみの抗体)を生成することができる。かくして、ある実施形態において、本発明は、標的抗原に特異的に結合するV-任意選択のリンカー-V結合部位を含むそのような重鎖およびそのようなH2抗体を提供する。本発明のさらなる実施形態によれば、この態様は、本明細書にさらに記載される、非ミューアイソタイプへのアイソタイプスイッチング後に軽鎖発現の停止と組み合わせることができる。
【００８５】
誘導選択の態様の適用は、多価生成物の生成における使用のために以下でさらに説明される。
【００８６】
多価生成物
本発明は、多価(例えば、多特異的)抗体、抗体鎖およびポリペプチド、ならびに軽鎖を再度含まない重鎖のみの抗体(H2抗体)に関する。本発明はさらに、非ヒト脊椎動物および非ヒト脊椎動物細胞中、in vivoでのこれらのものの選択、成熟および生成に関する。この目的のために、本発明はまた、そのような非ヒト脊椎動物および細胞にも関する。
【００８７】
かくして、本発明は、
脊椎動物がリンパ球細胞を含み、それぞれの細胞ゲノムが、
(i)(5'から3'の方向に)再構成された、もしくは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ(例えば、S-ミュー、例えば、ヒトもしくは内因性S-ミュー)、ミュー定常領域(例えば、CH1遺伝子セグメントを含む)、第2のスイッチ(例えば、S-ガンマ、例えば、ヒトもしくは内因性S-ガンマ)、および非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座であって、各細胞の重鎖遺伝子座がIgMから非ミュー(例えば、IgG)へのアイソタイプスイッチングを受けることができ、任意選択で、非ミュー定常領域がCH1遺伝子セグメントおよび/またはヒンジヌクレオチド配列を欠く、抗体重鎖遺伝子座;ならびに
(ii)(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む非ミュー定常領域であって、アイソタイプスイッチング後に、脊椎動物が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する非ミュー定常領域
を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)
を提供する。
【００８８】
可変ドメインは、重鎖遺伝子座の可変領域から誘導される。かくして、遺伝子座の可変領域が再構成された可変領域である場合、可変ドメインは、任意選択で体細胞超変異を含む可変領域(例えば、VHDJHまたはVLJL領域)の配列によりコードされる。可変領域が再構成されていない可変領域である場合、この領域は1つまたは複数のV遺伝子セグメント、1つまたは複数のJ遺伝子セグメントおよび任意選択で、1つまたは複数のD遺伝子セグメント(例えば、これらのセグメントの全部がヒトである場合)を含む。重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントの再構成後、再構成されたVDJまたはVJが形成され、これは、任意選択で、体細胞超変異後に、可変ドメインをコードする。
【００８９】
任意選択で、非ミュー定常領域は、複数のエピトープ結合部分、例えば、任意選択のリンカーにより連結された2つまたは3つのエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００９０】
任意選択で、非ミュー定常領域は、CH1遺伝子セグメントの代わりに1つまたは複数のエピトープ結合部分(任意選択で、リンカーにより連結される)をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００９１】
有利には、当業者であれば、本発明を考慮して、望ましい、所定の、エピトープ結合部分を選択し、脊椎動物により生成された可変ドメインのレパートリーとのその後のin vivoでの混合およびマッチングのために対応するヌクレオチド配列を遺伝子座中に意図的に含有させることができる。成功裏の対形成は、例えば、標的抗原またはエピトープを用いる免疫化後に、発現および選択することができるものである。この意味において、アイソタイプスイッチングされた重鎖(例えば、非ミュー抗体の一部として)を発現し、鎖(または抗体)が標的を特異的に認識し、これに結合することができるB細胞が、古典的免疫応答のように脊椎動物の免疫系によって増殖およびB細胞拡張のために選択されるため、選択は脊椎動物のin vivo系によって最初に行われる。かくして、抗原特異的であり、多価形式で発現され得るこれらの生成物は、自然に選択される。さらに、1つまたは複数の特異性および価数が所定のエピトープ結合部分によって提供され、1つまたは複数の他の特異性または価数が、エピトープ結合部分についてin vivoで選択および成熟された可変ドメインによって提供される、対形成した結合特異性および価数のレパートリーが提供される。このように、良好に動作する(例えば、検出可能なレベルで発現可能であり、薬物開発におけるその後の使用にとって有用である、in vivoで適合する生物物理学的特徴を有する)組合せのための自然の選択が存在する。当業者であれば、標的結合に対する親和性(例えば、周知である表面プラズモン共鳴を用いる)などの、望ましい抗体特性に従ってレパートリーから(例えば、血清または脾臓細胞から)1つまたは複数の多価重鎖(または抗体)の選択を実施することができる。かくして、本発明は、所定のさらなる価数および特異性に関連して、ならびにかくして、ヒトまたは動物の治療または予防におけるその後の使用のための最終薬物形式に関連して、可変ドメインの選択および成熟のための全体としてin vivoでの組合せ方法を使用する。これは、in vitroでの操作、選択および次いで、さらなるin vitroでの親和性成熟の必要性に依拠する多価生成物を生成するための先行技術と比較して有意な進歩である。
【００９２】
さらに、本発明者らは、S-ミューまたはミュー定常領域の下流に既知のエピトープ結合部分ヌクレオチド配列を提供することが有利であることに気付いた。本発明者らは、標的抗原またはエピトープ曝露後の親和性成熟プロセス中にエピトープ結合部分配列の変異を最小化する望ましさを考慮した。これは、所望のエピトープ結合特性(例えば、親和性)およびおそらくまた、部分の望ましい生物物理学的特性を保持するのに有用である。本発明者らは、体細胞超変異中に配列変異を導入するのを担う酵素である、活性化誘導シチジンデアミナーゼ(AID)の活性の典型的パターンを考慮した。参照により本明細書に組込まれる、Mauel, R.W. & Gearhart, P.J.;「AID and somatic hypermutation」、Advances in Immunology 2010. 105: 159〜191頁から適合させた、図1を参照されたい。本発明者らは、AIDが、S-ミュースイッチおよび重鎖遺伝子座中のこの上流(5'側)において体細胞超変異を誘導することに気付いた。かくして、本発明者らは、S-ミューの下流(3'側)、例えば、ミュー定常領域の下流のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を引用することを決定した。本発明者らは、これが、エピトープ結合部分の配列を無傷のままに保持する機会を最大化し、かくして、最終生成物におけるこれらのエレメントの結合特異性および性能のより良好な予測性を提供するのに有用であることに気付いた。かくして、当業者であれば、以前のin vivoまたはin vitroでの生成および選択プロセスにおいて別々に作成された任意のエピトープ結合部分(アミノ酸配列を含む)を相対的に予測的に使用し、この部分(エピトープ結合特異性および/または親和性などの特徴が既に公知である)を、本発明に従ってin vivoで生成された最終多価生成物中に組込むことができる。かくして、本発明は、多価および多特異的生成物(抗体、鎖およびポリペプチド)の生成のために既知の、望ましいエピトープ結合部分の利用性を拡張する。
【００９３】
さらに、有利には、本発明者らは、初期のB細胞コンパートメントおよび一次可変領域レパートリーの発生中に重要であるIgM段階の適切な機能を損なうことなく、アイソタイプ(クラス)スイッチングされた生成物(例えば、ガンマ型抗体または重鎖)の生成、成熟および選択を可能にする方法で、所定のエピトープ結合部分のためのコード配列を選択的に位置決めすることができることに気付いた。この目的のために、本発明者らは、ある特定の構成において、ミュー定常領域の下流(3'側)にエピトープ結合部分をコードする配列を提供することを決定した。かくして、ある実施形態によれば、本発明者らは、ミュー定常領域の3'側の1つまたは複数の非ミュー定常領域中にこれらのコード配列を提供した。例えば、1つ(例えば、ガンマ-1)または全てのガンマ定常領域は、1つまたは複数のエピトープ結合部分ヌクレオチド配列を含んでもよい。このように、全てのガンマ重鎖(およびこれらを提供する抗体)は、可変ドメインおよび1つまたは複数のエピトープ結合部分を担持する。部分のためのコード配列がこの位置にあるため、得られる部分のタンパク質配列は未変異(または実質的に未変異)であり、上流の可変ドメインと一緒に組合せおよび発現のために選択される。
【００９４】
代替的な実施形態においては、1つまたは複数のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列は、ミュー定常領域中に提供される。かくして、これらの配列は、S-ミューの下流にあり、AID活性の程度である。この実施形態においては、脊椎動物は、N末端抗体可変ドメインの下流に1つまたは複数のエピトープ結合部分を含むミューアイソタイプの多価(例えば、多特異的)重鎖(例えば、抗体、例えば、H2抗体により提供される)を生成する。免疫化後、例えば、可変ドメインは、エピトープ結合部分について成熟される。かくして、本発明は、以下を提供する。
【００９５】
リンパ球細胞を含み、それぞれの細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域および任意選択のリンカーと所定のエピトープ結合部分とをコードするヌクレオチド配列を含むミュー定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)であって、脊椎動物が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、脊椎動物。任意選択で、ミュー定常領域は、CH1遺伝子セグメントを欠く;この例は、第1および第2のエピトープに結合する多価H2抗体を生成するのに有用である。別の例においては、ミュー定常領域はCH1を含む;これは、第1および第2のエピトープに結合する4鎖(H2L2)多価抗体を生成するのに有用である。任意選択で、ミュー定常領域は、ヒンジヌクレオチド配列を欠く。
【００９６】
B細胞は、リンパ球細胞の一例である。B細胞を取得することができる試料としては、限定されるものではないが、血液、血清、脾臓、脾臓組織、骨髄、リンパ、リンパ節、胸腺、および虫垂が挙げられる。例えば、B細胞は、未熟B細胞および/または成熟B細胞である。
【００９７】
非ミュー定常領域は、一実施形態においては、ガンマ定常領域(例えば、ガンマ-1)である。あるいは、非ミュー定常領域は、デルタ、アルファまたはエプシロン定常領域である。ある実施形態においては、ゲノムの重鎖遺伝子座(または全ての重鎖遺伝子座)のそれぞれの非ミュー定常領域は、上記の(ii)に記載の通りである。ある実施形態においては、ゲノムの重鎖遺伝子座(または全ての重鎖遺伝子座)のそれぞれのガンマ定常領域は、上記の(ii)に記載の通りである。例えば、ゲノムの重鎖遺伝子座(または複数の遺伝子座)は、ガンマ-1、ガンマ-2a、ガンマ-2bおよび任意選択で、ガンマ-4定常領域を含み、これらの定常領域のそれぞれは上記の(ii)に記載の通りである。
【００９８】
ある実施形態においては、ゲノムは前記重鎖遺伝子座について同型である。
【００９９】
任意選択で、代替において、ミュー定常領域はCH1遺伝子セグメントを含まない。しかしながら、ミュー定常領域中にCH1遺伝子セグメントを含有させることにより、4-鎖(H2L2)IgM抗体である抗体レパートリーおよびB細胞コンパートメント発生の間に重鎖を発現させることができる。そのような構築物の表面発現は、良好な脾臓および骨髄B細胞コンパートメントを提供する初期B細胞発生の間に有利であり得る。かくして、抗原に応答してアイソタイプスイッチングされた鎖(CH1を含むか、または含まない)をその後選択するための有用な一次抗体レパートリーを提供することができる。
【０１００】
非ミュー定常領域中のCH1遺伝子セグメントの削除は、例えば、H2抗体が生成される場合に見られるように、軽鎖対を含まない重鎖を生成および選択するのに有用である。軽鎖対の非存在下では、上記の遺伝子座により発現される非ミュー型重鎖の可変ドメインは、可変ドメインパートナー(例えば、重鎖の可変ドメインがVHである場合、これらのものはVH/VL対の非存在下で生成、親和性成熟および選択され、かくして、VHは抗体単一可変ドメイン(aka dAbまたはドメイン抗体)である)なしに選択および成熟される。H2抗体およびdAbの利用性および利点は、例えば、本明細書に記載のHarbour Antibodies and Crescendo Biologicsの特許出願に記載され、Domantis LimitedおよびAblynxの名称で出願された特許出願に記載されるように、当業界で周知である。任意選択で、非ミュー型鎖が発現される場合、軽鎖発現は起こらない。これは、H2抗体および重鎖の生成のための上記の利点を提供する。
【０１０１】
可変領域は再構成されていなくてもよい、すなわち、重鎖遺伝子座の可変領域は、1つまたは複数のVH遺伝子セグメント、1つまたは複数のD遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のJH遺伝子セグメント(例えば、複数のヒトVH遺伝子セグメント、1つまたは複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJH遺伝子セグメント)を含む。遺伝子セグメントは、再構成して、定常領域配列と組み合わせることができる再構成された可変領域(VDJ、例えば、ヒトVDJ)を形成することができる。かくして、可変領域の再構成後、重鎖は、抗体重鎖可変ドメインおよび定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むRNAをコードすることができる。
【０１０２】
あるいは、重鎖遺伝子座の可変領域は、再構成される(すなわち、VDJヌクレオチド配列)。
【０１０３】
ミューから非ミューアイソタイプへのスイッチングを得るために、遺伝子座は、ミュー定常領域の5'側のスイッチ(例えば、内因性S-ミューが保持される)および非ミュー定常領域の5'側(またはそれぞれ)の第2のスイッチを含む。第2のスイッチは、通常は定常領域と共に存在するスイッチであってもよい(例えば、定常領域がガンマ-1定常領域である場合、ガンマ-1スイッチが保持される)。スイッチ配列は、当業界で公知であり、例えば、Nikaidoら、Nature 292: 845〜848頁(1981)ならびにまた、WO2011004192、US7501552、US6673986、US6130364、WO2009/076464、およびUS6586251、例えば、US7501552に開示された配列番号9〜24を参照されたい。市販のヒトおよびマウスBACライブラリー(例えば、RPC-11ならびにCaltech A、B、CおよびDライブラリー)は、好適な免疫グロブリン遺伝子座配列、例えば、スイッチまたは定常領域の配列の供給源である。あるいは、ヒトDNA試料を、同意のあるドナーからde novoで(例えば、口腔粘膜検体採取を用いる)取得し、DNA配列をその試料から取得することができる。
【０１０４】
本発明の任意の構成において、多価抗体、抗体鎖またはポリペプチドが提供される。抗体鎖の文脈における「多価」とは、鎖が2以上の価数(すなわち、エピトープまたは抗原結合部位)を含むことを意味する。例えば、本発明による重鎖は、第1および第2のエピトープ結合部位を含んでもよく(他のエピトープ結合部位は含まない)、そのようなものとして、鎖は二価である。これは、N末端可変ドメインのため一価である(例えば、パートナー軽鎖上のVドメインと対形成して、VH/VLエピトープ結合部位を形成する)、技術水準においてin vivoで生成される抗体鎖とは対照的である。抗体の文脈における「多価」とは、抗体がH2抗体である場合、抗体が2以上の価数(すなわち、エピトープまたは抗原結合部位)を含む、または抗体が4鎖(H2L2)抗体である場合、3以上の価数を含むことを意味する。そのような抗体の対応するエピトープ結合断片(例えば、Fab)は、当業界で等価な抗体断片よりも多くのエピトープ結合部位を含む。例えば、本発明によるFab様構造は2つのエピトープ結合部位を有してもよいが、従来のFabは1つの結合部位(VH/VL対により提供される)を有する。本発明によるポリペプチドは、それが2つ以上のエピトープまたは抗原結合部位を含む場合、多価である。
【０１０５】
多価であることに加えて、本発明の抗体、鎖またはポリペプチドは、場合によっては多特異的(例えば、二特異的)である。これは、抗体、鎖またはポリペプチドが2つ以上の異なるエピトープまたは抗原に(同時的に、または非同時的に)特異的に結合することを意味する。エピトープは、例えば、異なる抗原または同じ抗原種により提供することができる(標的抗原への結合のアビディティを提供するのに有利である)。結合を、標準的なin vivo技術、例えば、競合表面プラズモン共鳴(例えば、Biacore(商標)もしくはProteon)または競合ELISAを用いて評価することができる。薬物(例えば、本発明の抗体、鎖もしくはポリペプチドまたはその誘導体)を投与された患者における異なるエピトープへの結合は、ヒトまたは動物における多くの疾患または状態に取り組むのに有用である。
【０１０６】
あるいは、抗体、鎖またはポリペプチドは、多価であり、一特異的である、すなわち、同じエピトープ種に特異的に結合する複数のエピトープ結合部位を含む(例えば、結合のアビディティを提供するのに有用であってよい、単一の抗原上の、同じエピトープのコピーに同時的に結合する)。
【０１０７】
抗原は、例えば、EP1697421 (Micromet AG)、WO2007024715 (Abbott Laboratories)またはWO2010136485 (Glaxo Group Limited)(これらの開示は参照により本明細書に組込まれる)に開示された抗原のいずれかである。例えば、本発明は、引用された1つまたは複数の医学的適応における使用を含む、または含まない、WO2007024715、6頁、14行〜8頁、23行;16頁、15行〜18頁、26行;24頁、9〜26行;52頁、5〜22行;および55頁、10行〜66頁、23行で具体的に考察された1つまたは複数の抗原および抗原クラスに関するものであってもよい。抗原のこれらの例は、本発明に関する可能な抗原として、および1つまたは複数の請求項への可能な含有のために、あたかも本明細書に具体的かつ明示的に開示されたかのように、具体的に本明細書に組込まれる。例えば、本発明は、引用された1つまたは複数の医学的適応における使用を含む、または含まない、限定されるものではないが、VEGF、TNF-α、EGFR、VEGFR2、IL-13およびHER2などの、WO2010136485に具体的に開示された1つまたは複数の抗原および抗原クラスに関するものであってもよい。抗原のこれらの例は、本発明に関する可能な抗原として、および1つまたは複数の請求項への可能な含有のために、あたかも本明細書に具体的かつ明示的に開示されたかのように、具体的に本明細書に組込まれる。本発明における使用のための好適なエピトープの例は、これらの抗原の1つまたは複数によって提供されるエピトープである。
【０１０８】
例えば、本発明の任意の構成において、抗原またはそれぞれの抗原は、ABCF1; ACVR1; ACVR1B; ACVR2; ACVR2B; ACVRL1; ADORA2A;アグレカン; AGR2; AICDA; AWl; AIG1; AKAP1; AKAP2; AIYIH; AMHR2; ANGPT1; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOC1; AR; AZGP1 (亜鉛-a-糖タンパク質); B7.1; B7.2; BAD; BAFF; BAG1; BAI1; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLR1 (MDR15); B1yS; BMP1; BMP2; BMP3B (GDF1O); BMP4; BMP6; BMP8; BMPR1A; BMPR1B; BMPR2; BPAG1 (プレクチン); BRCA1; Cl9orflO (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANT1; CASP1; CASP4; CAV1; CCBP2 (D6 / JAB61); CCL1 (I-309); CCL11 (エオタキシン); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP-id); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3b); CCL2 (MCP-1); MCAF; CCL2O (MIP-3a); CCL21 (MIP-2); SLC;エクソダス-2; CCL22 (MDC / STC-1); CCL23 (MPIF-1); CCL24 (MPIF-2 Iエオタキシン-2); CCL25 (TECK); CCL26 (エオタキシン-3); CCL27 (CTACK /ILC) ; CCL28; CCL3 (MIP-1a); CCL4 (MIP-1b); CCL5 (RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNA1; CCNA2; CCND1; CCNE1; CCNE2; CCR1 (CKR1 / HM145); CCR2 (mcp-1RB / RA);CCR3 (CKR3 / CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5 / ChemR13); CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6); CCR7 (CKR7 / EBI1); CCR8 (CMKBR8 / TER1 / CKR-L1); CCR9 (GPR-9-6); CCRL1 (VSHK1); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CD1C; CD2O; CD200; CD-22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD4O; CD4OL; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD8O; CD81; CD83; CD86; CDH1 (E-カドヘリン); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKN1A (p2lWap1/Cip1); CDKN1B (p27Kip1); CDKNIC; CDKN2A (p16lNK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CER1; CHGA; CHGB;チキナーゼ; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3; CLDN7 (クラウジン-7); CLN3; CLU (クラステリン); CMKLR1; CMKOR1 (RDC1); CNR1; COL18A1; COL1A1; COL4A3; COL6A1; CR2; CRP; CSF1 (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF); CTLA4; CTNNB1 (b-カテニン); CTSB (カテプシンB); CX3CL1 (SCYDi) ; CX3CR1 (V28); CXCL1 (GRO1); CXCL1O (IP-10); CXCL11 (I-TAC / IP-9); CXCL12 (SDF1); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-78 I LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6 (TYMSTR ISTRL33 I Bonzo); CYB5; CYC1; CYSLTR1; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DNCL1; DPP4; E2F1; ECGF1; EDG1; EFNAI; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3; EPHB4; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESR1; ESR2; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCER1A; FCER2; FCGR3A; FGF; FGF1 (aFGF); FGF1O; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF2O; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF (VEGFD); FIL1 (EPSILON); FIL1 (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRT1 (フィブロネクチン); FLT1; FOS; FOSL1 (FRA-l); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEB1; GAGEC1; GALNAC4S-65T; GATA3; GDF5; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNAS1; GNRH1; GPR2 (CCR1O); GPR31; GPR44; GPR81 (FKSG8O); GRCC10 (C10); GRP; GSN (Gelsolin); GSTP1; HAVCR2; HDAC4; EDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIF1A; HIP1;ヒスタミンおよびヒスタミン受容体; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOX1; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; 1D2; IFN-a; IFNA1; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFNガンマ; TFNW1; IGBP1; IGF1; IGF1R; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-1; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; 1L13; IL13RA1; IL13RA2; 1L14; 1L15; IL15RA; IL16; 1L17; IL17B; IL17C; IL17R; 1L18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; 1L19; IL1A; IL1B; IL1F1O; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HY1; IL1R1; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2; IL1RL1;IL1RL2 IL1RN; 1L2; 1L20; IL2ORA; IL21R; 1L22; 1L22R; 1L22RA2; 1L23; 1L24; 1L25; 1L26; 1L27; 1L28A; 1L28B; 1L29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; 1L3; 1L30; IL3RA; 1L4; IL4R; 1L5; IL5RA; 1L6; IL6R; IL6ST (糖タンパク質130); 1L7; TL7R; 1L8; IL8RA; IL8RB; IL8RB; 1L9; IL9R; ILK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAK1; IRAK2; ITGA1; ITGA2; 1TGA3; ITGA6 (a6インテグリン); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b 4インテグリン); JAG1; JAK1; JAK3; JUN; K6HF; KAI1; KDR; MTLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLK10; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (ケラチン19); KRT2A; KRTHB6 (毛髪特異的II型ケラチン); LAMA5; LEP (レプチン); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-b); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAGまたはOmgp; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MIB1; midkine; MIF; MIP-2; MK167 (Ki-67); MMP2; MMP9; MS4A1; MSMB; MT3 (メタロチオネクチン-ifi); MTSS 1; MUC 1 (ムチン); MYC; MYD88; NCK2;ニューロカン; NFKB 1; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR-Nogo66 (Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NME1 (NM23A); NOX5; NPPB; NROB1; NROB2; NR1D1; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR1I2; NR1I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRP1; NRP2; NT5E; NTN4; ODZ1; OPRD1; P2RX7; PAP; PART1; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAM1; PF4 (CXCL4); PGF; PGR;ホスファカン; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDC1; PPBP (CXCL7); PPID; PR1; PRKCQ; PRKD1; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p2lRac2); RARB; RGS1; RGS13; RGS3; RNF11O (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1D2 (リポフィリンB); SCGB2A1 (マンマグロビン2); SCGB2A2 (マンマグロビン1); SCYE1 (内皮単球活性化サイトカイン); SDF2; SERPINA1; SERPINIA3; SERPINB5 (マスピン); SERPINE1 (PAT-i); SERPINF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPP1; SPRR1B (Spri); ST6GAL1; STAB1; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21; TCP1O; TDGF1; TEK; TGFA; TGFB1; TGFB1I1; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBR1; TGFBR2; TGFBR3; TH1L; THBS1 (トロンボスポンジン-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-i); T]MP3;組織因子; TLR1O; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-a; TNFAIP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSF1 1A; TNFRSF1A; TNFRSF1B; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSF1O (TRAIL); TNFSF1 1 (TRANCE); TNFSF12 (APO3L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF1 5 (VEGI); TNFSF1 8; TNFSF4 (0X40リガンド); TNFSF5 (CD4Oリガンド); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (CD27リガンド); TNFSF8 (CD3Oリガンド); TNFSF9 (4-1BBリガンド); TOLLIP; Toll様受容体; TOP2A (トポイソメラーゼlia); TP53; TPM1; TPM2; TRADD; TRAF1; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREM1; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC;バーシカン; VHL C5; VLA-4; XCL1 (リンホタクチン); XCL2 (SCM-lb); XCR1 (GPR5 / CCXCR1); YY1;およびZFPM2からなる群から選択される。本発明における使用のための好適なエピトープの例は、これらの抗原の1つまたは複数によって提供されるエピトープである。
【０１０９】
例えば、本発明の任意の構成において、第1および第2のエピトープまたは抗原は、EpCAMおよびCD3; CD19およびCD3; VEGFおよびVEGFR2; VEGFおよびEGFR; CD138およびCD2O; CD138およびCD4O; CD2OおよびCD3; CD38およびCD138; CD38およびCD2O; CD38およびCD4O; CD4OおよびCD2O; CD19およびCD2O; CD-8およびIL-6; PDL-1およびCTLA-4; CTLA-4およびBTNO2; CSPGおよびRGM A; IGF1およびIGF2; IGF1および/または2ならびにErb2B; IL-12およびIL-18; IL-12およびTWEAK; IL-13およびADAM8; IL-13およびCL25; IL-13およびIL-1ベータ; IL-13およびIL-25; IL-13およびIL-4; IL-13およびIL-5; IL-13およびIL-9; IL-13およびLHRアゴニスト; IL-13およびMDC; IL-13およびMIF; IL-13およびPED2; IL-13およびSPRR2a; IL-13およびSPRR2b; IL-13およびTARC; IL-13およびTGF-ベータ; IL-1アルファおよびIL-1ベータ; MAGおよびRGM A; NgRおよびRGM A; NogoAおよびRGM A; OMGpおよびRGM A; RGM AおよびRGM B; Te38およびTNFアルファ; TNFアルファおよびIL-12; TNFアルファおよびIL-12p40; TNFアルファおよびIL-13; TNFアルファおよびIL-15; TNFアルファおよびIL-17; TNFアルファおよびIL-18; TNFアルファおよびIL-1ベータ; TNFアルファおよびIL-23; TNFアルファおよびMIF; TNFアルファおよびPEG2; TNFアルファおよびPGE4; TNアルファおよびVEGF;およびVEGFRおよびEGFR; TNFアルファおよびRANKリガンド; TNFアルファおよびBlys; TNFアルファおよびGP130; TNFアルファおよびCD-22;ならびにTNFアルファおよびCTLA-4からなる群から選択される。
【０１１０】
例えば、本発明の任意の構成において、第1のエピトープまたは抗原は、CD3; CD16; CD32; CD64;およびCD89からなる群から選択され;第2のエピトープまたは抗原は、EGFR; VEGF; IGF-1R; Her2; c-Met (aka HGF); HER3; CEA; CD33; CD79a; CD19; PSA; EpCAM; CD66; CD30; HAS; PSMA; GD2; ANG2; IL-4; IL-13; VEGFR2;およびVEGFR3からなる群から選択される。
【０１１１】
本発明の抗体、鎖またはポリペプチドの使用は、EP1697421 (Micromet AG)、WO2007024715 (Abbott Laboratories)またはWO2010136485 (Glaxo Group Limited)(これらの開示は参照により本明細書に組込まれる)に開示された任意の使用であることが企図される。例えば、本発明は、WO2007024715の11頁、24行〜15頁、14行;51頁、6行〜66頁、23行;76頁、1行〜79頁、29行;および84頁、1行〜90頁、2行で考察された1つまたは複数の使用に関するものであってもよい。これらの使用例は、本発明に関する可能な使用として、および1つまたは複数の請求項における可能な含有のために、あたかも本明細書に具体的かつ明示的に開示されたかのように、具体的に本明細書に組込まれる。例えば、本発明は、限定されるものではないが、12頁、33行〜13頁、7行;および15頁、16〜32行に開示された使用などの、WO2010136485で具体的に考察された1つまたは複数の使用に関するものであってもよい。これらの使用例は、本発明に関する可能な抗原として、および1つまたは複数の請求項における可能な含有のために、あたかも本明細書に具体的かつ明示的に開示されたかのように、具体的に本明細書に組込まれる。例えば、本発明は、限定されるものではないが、6頁、31〜33行に開示された使用などの、EP1697421で具体的に考察された1つまたは複数の使用に関するものであってもよい。これらの使用例は、本発明に関する可能な抗原として、および1つまたは複数の請求項における可能な含有のために、あたかも本明細書に具体的かつ明示的に開示されたかのように、具体的に本明細書に組込まれる。
【０１１２】
本発明の抗体、鎖、またはポリペプチドの使用、またはそれを含む組成物は、EP1697421 (Micromet AG)、WO2007024715 (Abbott Laboratories)またはWO2010136485 (Glaxo Group Limited)(これらの開示は参照により本明細書に組込まれる)に開示された第2の薬剤と組み合わせた任意の使用または組成物であることが企図される。例えば、本発明は、WO2007024715の11頁、7〜23行;15頁、15〜32行;および79頁、30行〜90頁、2行で具体的に考察された1つまたは複数のさらなる薬学的に許容される薬剤を含む、本発明の抗体、鎖またはポリペプチドに関するものであってもよい。これらの使用、組合せおよび組成物の例は、本発明の抗体、鎖またはポリペプチドがこれらの先行技術の開示に開示された抗体、鎖またはポリペプチドの代わりに用いられることを除いて、本発明に関する可能な使用、組合せおよび組成物として、および1つまたは複数の請求項における可能な含有のために、あたかも具体的かつ明示的に開示されたかのように、具体的に本明細書に組込まれる。
【０１１３】
本発明の抗体、鎖またはポリペプチドを含む組成物は、本発明の抗体、鎖またはポリペプチドがこれらの先行技術の文献に開示された抗体、鎖またはポリペプチドの代わりに用いられることを除いて、EP1697421 (Micromet AG)、WO2007024715 (Abbott Laboratories)またはWO2010136485 (Glaxo Group Limited)(これらの開示は参照により本明細書に組込まれる)に開示された任意の組成物の成分の一般的な混合物を有することが企図される。例えば、本発明は、WO2007024715の66頁、25行〜75頁、23行;および90頁、2〜26行で具体的に考察された医薬組成物中の本発明の抗体、鎖またはポリペプチドに関するものであってもよい。これらの組成物の例は、本発明の抗体、鎖またはポリペプチドがこれらの先行技術の開示に開示された抗体、鎖またはポリペプチドの代わりに用いられることを除いて、本発明に関する可能な組成物として、および1つまたは複数の請求項における可能な含有のために、あたかも具体的かつ明示的に開示されたかのように、具体的に本明細書に組込まれる。
【０１１４】
本発明の組成物、抗体、鎖またはポリペプチドは、本発明の組成物、抗体、鎖またはポリペプチドがこれらの先行技術の文献に開示された抗体、鎖またはポリペプチドの代わりに用いられることを除いて、EP1697421 (Micromet AG)、WO2007024715 (Abbott Laboratories)またはWO2010136485 (Glaxo Group Limited)(これらの開示は参照により本明細書に組込まれる)に開示されたように投与されるか、または投与可能であることが企図される。例えば、本発明は、WO2007024715の69頁、29行〜75頁、23行;および90頁、3〜33行で具体的に考察された投与のような、本発明の抗体、鎖またはポリペプチド(またはこの目的のための医薬組成物)の投与に関するものであってもよい。これらの組成物の例は、本発明の組成物、抗体、鎖またはポリペプチドがこれらの先行技術の開示に開示された抗体、鎖またはポリペプチドの代わりに用いられることを除いて、本発明に関する可能な組成物、ならびに投与経路およびレジメンとして、ならびに1つまたは複数の請求項における可能な含有のために、あたかも具体的かつ明示的に開示されたかのように、具体的に本明細書に組込まれる。
【０１１５】
それぞれのリンカー(存在する場合)は、本発明の抗体、鎖またはポリペプチド中のアミノ酸配列である。ゲノムの遺伝子座において、遺伝子座は、それぞれのリンカーをコードする対応するヌクレオチド配列を含む。
【０１１６】
本発明における使用のために、1つ、より多く、またはそれぞれのリンカーは、EP1697421 (Micromet AG)、WO2007024715 (Abbott Laboratories)またはWO2010136485 (Glaxo Group Limited)(これらの開示は参照により本明細書に組込まれる)に開示されたものであることが企図される。例えば、本発明は、WO2007024715の4頁、25行〜6頁、13行;24頁、27行〜25頁、2行;44頁、11行〜45頁、3行で具体的に考察されたリンカーを用いることができる。これらのリンカーの例は、本発明に関する使用のための可能なリンカーとして、および1つまたは複数の請求項における可能な含有のために、あたかも具体的かつ明示的に開示されたかのように、具体的に本明細書に組込まれる。例えば、本発明は、WO2010136485の10頁、27行〜12頁、28行;および14頁、6〜14行で具体的に考察されたリンカー;またはWO2010136485の配列番号10〜38に記載のリンカーを用いることができる。これらのリンカーの例は、本発明に関する使用のための可能なリンカーとして、および1つまたは複数の請求項における可能な含有のために、あたかも具体的かつ明示的に開示されたかのように、具体的に本明細書に組込まれる。
【０１１７】
例えば、本発明の任意の構成において、1つ、より多くまたはそれぞれのリンカーは、(GGGGS)nリンカー(ここで、n=1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である)である。
【０１１８】
例えば、本発明の任意の構成において、1つ、より多くまたはそれぞれのリンカーは、AKTTPKLEEGEFSEAR; AKTTPKLBEGEFSEARV; AKTTPKLGG; SAKTTPKLGG; AKTTPKLEEGEFSEARV; SAKTTP; SAKTTPKLGG; RADAAP; RADAAPTVS; RADAAAAGGPGS; RADAAAA(G4S)4; SAKTTP; SAKTTPKLGG; SAKTTPKLEBGEFSEARV; ADAAP; ADAAPTVSIFPP; TVAAP; TVAAPSVFIFPP; QPKAAP; QPKAAPSVTLFPP; AKTTPP; AKTTPPSVTPLAP; AKTTAP; AKTTAPSVYPLAP; ASTKGP; ASTKGPSVFPLAP; GGGGSGGGGSGGGGS; GBNKVEYAPALMALS; GPAKELTPLKEAKVS;およびGHEAAAVMQVQYPASからなる群から選択されるリンカーである。
【０１１９】
例えば、本発明の任意の構成において、1つ、より多くまたはそれぞれのリンカーは、長さ1アミノ酸から150アミノ酸、または1アミノ酸から140アミノ酸、例えば、1アミノ酸から130アミノ酸、または1から120アミノ酸、または1から80アミノ酸、または1から50アミノ酸、または1から20アミノ酸、または1から10アミノ酸、または5から18アミノ酸のアミノ酸配列である。そのような配列は、それら自身の三次構造を有してもよく、例えば、本発明のリンカーは、ドメイン、例えば、抗体単一可変ドメインであってもよいか、またはそれを含んでもよい。リンカーのサイズは、一実施形態においては、単一可変ドメインと等しい。好適なリンカーは、1から20オングストローム、例えば、15オングストローム未満、または10オングストローム未満、または5オングストローム未満のサイズであってもよい。
【０１２０】
本発明の一実施形態においては、リンカーは、1から150アミノ酸、例えば、1から50アミノ酸、例えば、1から20アミノ酸、例えば、1から10アミノ酸を含む。そのようなリンカーは、WO2010136485 (この開示は、本発明に関する使用のための可能なリンカーとして、および1つまたは複数の請求項における可能な含有のために、あたかも具体的かつ明示的に開示されたかのように、参照により本明細書に明示的に組込まれる)に開示された配列番号10〜38もしくは配列番号42〜44に記載されたもののいずれか1つ、または複数のそのようなリンカーから選択することができる。
【０１２１】
リンカーは、単独で、または他のリンカーに加えて、1つまたは複数のセットのGS残基、例えば、GSTVAAPSまたはTVAAPSGSまたはGSTVAAPSGSを含んでもよい。
【０１２２】
リンカーの例は、(PAS)n(GS)mである。別の実施形態においては、リンカーは、(GGGGS)n(GS)mである。別の実施形態においては、リンカーは、(TVAAPS)n(GS)mである。別の実施形態においては、リンカーは、(GS)m(TVAAPSGS)nである。別の実施形態においては、リンカーは、(PAVPPP)n(GS)mである。別の実施形態においては、リンカーは、(TVSDVP)n(GS)mである。別の実施形態においては、リンカーは、(TGLDSP)n(GS)mである。全てのそのような実施形態において、n=1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり、m=0、1、2、3または4である。
【０１２３】
そのようなリンカーの例としては、(PAS)n(GS)m(式中、n=1およびm=1である)、(PAS)n(GS)m(式中、n=2およびm=1である)、(PAS)n(GS)m(式中、n=3およびm=1である)、(PAS)n(GS)m(式中、n=4およびm=1である)、(PAS)n(GS)m(式中、n=2およびm=0である)、(PAS)n(GS)m(式中、n=3およびm=0である)、(PAS)n(GS)m(式中、n=4およびm=0である)が挙げられる。
【０１２４】
そのようなリンカーの例としては、(GGGGS)n(GS)m(式中、n=1およびm=1である)、(GGGGS)n(GS)m(式中、n=2およびm=1である)、(GGGGS)n(GS)m(式中、n=3およびm=1である)、(GGGGS)n(GS)m(式中、n=4およびm=1である)、(GGGGS)n(GS)m(式中、n=2およびm=0である)、(GGGGS)n(GS)m(式中、n=3およびm=0である)、(GGGGS)n(GS)m(式中、n=4およびm=0である)が挙げられる。
【０１２５】
そのようなリンカーの例としては、(TVAAPS)n(GS)m(式中、n=1およびm=1である)、(TVAAPS)n(GS)m(式中、n=2およびm=1である)、(TVAAPS)n(GS)m(式中、n=3およびm=1である)、(TVAAPS)n(GS)m(式中、n=4およびm=1である)、(TVAAPS)n(GS)m(式中、n=2およびm=0である)、(TVAAPS)n(GS)m(式中、n=3およびm=0である)、(TVAAPS)n(GS)m(式中、n=4およびm=0である)が挙げられる。
【０１２６】
そのようなリンカーの例としては、(GS)m(TVAAPSGS)n(式中、n=1およびm=1である)、(GS)m(TVAAPSGS)n(式中、n=2およびm=1である)、(GS)m(TVAAPSGS)n(式中、n=3およびm=1である)、(GS)m(TVAAPSGS)n(式中、n=4およびm=1である)、(GS)m(TVAAPSGS)n(式中、n=5およびm=1である)、(GS)m(TVAAPSGS)n(式中、n=6およびm=1である)、(GS)m(TVAAPSGS)n(式中、n=1およびm=0である)、(GS)m(TVAAPSGS)n(式中、n=2およびm=10である)、(GS)m(TVAAPSGS)n(式中、n=3およびm=0である)、または(GS)m(式中、m = 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10である)が挙げられる。
【０１２７】
そのようなリンカーの例としては、(PAVPPP)n(GS)m(式中、n=1およびm=1である)、(PAVPPP)n(GS)m(式中、n=2およびm=1である)、(PAVPPP)n(GS)m(式中、n=3およびm=1である)、(PAVPPP)n(GS)m(式中、n=4およびm=1である)、(PAVPPP)n(GS)m(式中、n=2およびm=0である)、(PAVPPP)n(GS)m(式中、n=3およびm=0である)、または(PAVPPP)n(GS)m(式中、n=4およびm=0である)が挙げられる。
【０１２８】
そのようなリンカーの例としては、(TVSDVP)n(GS)m(式中、n=1およびm=1である)、(TVSDVP)n(GS)m(式中、n=2およびm=1である)、(TVSDVP)n(GS)m(式中、n=3およびm=1である)、(TVSDVP)n(GS)m(式中、n=4およびm=1である)、(TVSDVP)n(GS)m(式中、n=2およびm=0である)、(TVSDVP)n(GS)m(式中、n=3およびm=0である)、(TVSDVP)n(GS)m(式中、n=4およびm=0である)が挙げられる。
【０１２９】
そのようなリンカーの例としては、(TGLDSP)n(GS)m(式中、n=1およびm=1である)、(TGLDSP)n(GS)m(式中、n=2およびm=1である)、(TGLDSP)n(GS)m(式中、n=3およびm=1である)、(TGLDSP)n(GS)m(式中、n=4およびm=1である)、(TGLDSP)n(GS)m(式中、n=2およびm=0である)、(TGLDSP)n(GS)m(式中、n=3およびm=0である)、(TGLDSP)n(GS)m(式中、n=4およびm=0である)が挙げられる。
【０１３０】
別の実施形態においては、エピトープ結合部分と可変ドメインとの間にはリンカーは存在しない(およびかくして、遺伝子座は対応するリンカーをコードするヌクレオチド配列を含まない)。別の実施形態においては、エピトープ結合部分は、リンカーTVAAPSにより可変ドメインに連結される。別の実施形態においては、エピトープ結合部分は、リンカーTVAAPSGSにより可変ドメインに連結される。別の実施形態においては、エピトープ結合部分は、リンカーGSにより可変ドメインに連結される。別の実施形態においては、エピトープ結合部分は、リンカーASTKGPTにより可変ドメインに連結される。
【０１３１】
ある実施形態においては、本発明の脊椎動物または細胞は、(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ(例えば、S-ミュースイッチ、例えば、内因性S-ミュー)、内因性ミュー定常領域、第2のスイッチ(S-ガンマスイッチ、例えば、内因性S-ガンマ)および前記非ミューアイソタイプのヒト定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座であって、IgMから非ミューアイソタイプへのスイッチングを受けることができる重鎖遺伝子座を含む。かくして、例えば、1つまたは複数の非ミュー定常領域配列を、非ヒト脊椎動物または細胞(例えば、ES細胞)のゲノム中の内因性ミュー領域の下流(3')に挿入することにより、これを提供することができる。このように、ヒト配列は、内因性重鎖遺伝子座の位置内に提供され、ヒト配列からの発現を、内因性抗体およびB細胞機構を用いて効率的に制御することができる。
【０１３２】
本発明において、遺伝子座またはそれぞれの遺伝子座の可変領域は、任意選択で、ヒト可変領域である。例えば、可変領域は、ヒト再構成VDJまたはVJである。例えば、可変領域は再構成されておらず、複数のヒトV遺伝子セグメント、1つまたは複数のヒトJ遺伝子セグメントおよび任意選択で1つまたは複数のヒトD遺伝子セグメント(例えば、複数のヒトVHセグメント、1つまたは複数のヒトJH遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトD遺伝子セグメント)を含む。可変領域は重鎖または軽鎖可変ドメイン(VH、VHHまたはVL)をコードしてもよいことが企図される。可変領域は、本明細書で引用されるKymab Limited、Regeneron、Harbour Antibodies、Crescendo BiologicsまたはAblexixの特許出願のいずれかに開示された任意の可変領域であってもよく、これらの可変領域の組成物(そこに含まれた遺伝子セグメントのレパートリーなど)の開示は、あたかも本明細書に明示的に書かれたかのように、および1つまたは複数の請求項への可能な含有のために、参照により本明細書に組込まれる。
【０１３３】
本発明において、遺伝子座またはそれぞれの遺伝子座のミュー定常領域は、任意選択で、例えば、脊椎動物自体と同じ種または株の、非ヒト脊椎動物のミュー定常領域である。例えば、ミュー定常領域は、マウス定常領域である。
【０１３４】
本発明において、遺伝子座またはそれぞれの遺伝子座のミュー定常領域は、任意選択で、内因性宿主のミュー定常領域である。このように、定常領域(およびIgM段階)は、良好なB細胞コンパートメントおよび一次レパートリー発生のために宿主適合される。
【０１３５】
本発明において、遺伝子座またはそれぞれの遺伝子座の非ミュー定常領域またはそれぞれの非ミュー定常領域は、任意選択で、例えば、脊椎動物自体と同じ種または株の非ヒト脊椎動物定常領域である。例えば、非ミュー定常領域またはそれぞれの非ミュー定常領域は、マウス定常領域である。
【０１３６】
本発明において、遺伝子座またはそれぞれの遺伝子座の非ミュー定常領域またはそれぞれの非ミュー定常領域は、任意選択で、内因性宿主定常領域である。このように、定常領域は、良好なB細胞コンパートメントおよび抗体/鎖発生のために宿主適合される。
【０１３７】
ある実施形態において、脊椎動物種は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ニワトリ、魚類、鳥類、爬虫類、ラクダ科、ウシ、チンパンジー、非ヒト霊長類および霊長類から選択される。
【０１３８】
ある実施形態において、脊椎動物は、マウスである。ある実施形態において、脊椎動物は、ラットである。
【０１３９】
本発明はまた、細胞ゲノムが、
(i)(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ(例えば、S-ミュースイッチ、例えば、内因性S-ミュー)、ミュー定常領域(例えば、CH1遺伝子セグメントを含む)、第2のスイッチ(例えば、S-ガンマスイッチ、例えば、内因性S-ガンマ)および非ヒト(例えば、ガンマ)定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座であって、各細胞の重鎖遺伝子座がIgMから非ミュー(例えば、IgG)へのアイソタイプスイッチングを受けることができる抗体重鎖遺伝子座;ならびに
(ii)(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価(例えば、多特異的、例えば、二特異的)ポリペプチド鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む非ミュー定常領域であって、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープ(例えば、エピトープが異なる場合)に特異的に結合する、非ミュー定常領域
を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)も提供する。
【０１４０】
任意選択で、ガンマ定常領域は、上記のCH1遺伝子セグメントを欠く。
【０１４１】
脊椎動物を参照する本明細書に記載の任意選択の特徴は、本発明の細胞にも適用可能である。
【０１４２】
一例において、細胞は、B細部、ハイブリドーマ、ES細胞またはiPS細胞である。ES細胞およびiPS細胞(誘導多能性幹細胞)を用いて、対応する非ヒト脊椎動物(本発明の脊椎動物)を開発することができる。
【０１４３】
本発明の脊椎動物または細胞のある実施形態において、ゲノムは軽鎖を発現させるための機能的抗体軽鎖遺伝子座を含み、細胞はIgM型重鎖および軽鎖を含むIgM抗体を発現することができ、それぞれの重鎖はCH1ドメインを含む。任意選択で、軽鎖遺伝子座は、ヒトの再構成されたまたは再構成されていない可変領域を含む。
【０１４４】
任意選択で、軽鎖遺伝子座は、機能的軽鎖がIgMから非ミューへのアイソタイプスイッチング後に発現されない、軽鎖発現を停止させるための手段を含む。好適な手段の例は、以下に記載される。任意選択で、非ミューガンマ定常領域も、CH1遺伝子セグメントを含まない。かくして、CH1ドメインを欠く非ミュー重鎖は、軽鎖の非存在下で脊椎動物または細胞により発現可能である;これは、H2多価抗体を生成するのに有用である。
【０１４５】
ある実施形態において、脊椎動物は、(N末端からC末端の方向に)(a)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン(任意選択で、体細胞超変異の後)、任意選択のリンカー、エピトープ結合部分および非ミュー(例えば、ガンマ)定常ドメイン(例えば、ガンマFc)または(b)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン(任意選択で、体細胞超変異の後)、非ミュー(例えば、ガンマ)定常ドメイン(例えば、ガンマFc)、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含むポリペプチドであって、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、ポリペプチド鎖を発現する。ある例において、ポリペプチドは、構造V-L-EまたはV-L-E-L(式中、Vは重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン(VH、VHHまたはVL)であり、Lは任意選択のリンカーであり、Eはエピトープ結合ドメインである)を有する。可能な構造は、V-L-E-FcまたはV-L-E-L-Fc(式中、Fcは抗体Fc領域(例えば、ガンマFc)である)である。
【０１４６】
ある実施形態において、エピトープ結合部分またはそれぞれのエピトープ結合部分は、エピトープ結合ドメインである。
【０１４７】
本発明の脊椎動物または細胞のある実施形態においては、非ミュー定常領域はガンマ定常領域であり、重鎖遺伝子座はアイソタイプスイッチングを受けて、軽鎖の非存在下で1つまたは複数のIgG重鎖を含み、それぞれの重鎖がCH1ドメインを欠くIgG抗体を生成することができる。
【０１４８】
本発明の脊椎動物または細胞のある実施形態においては、構造V-L-EまたはV-L-E-L(例えば、V-L-E-FcまたはV-L-E-L-Fc)(式中、Vは抗体可変ドメイン(VH、VHHまたはVL)であり、Lは任意選択のリンカーであり、Eはエピトープ結合部分であり、VおよびEはそれぞれ第1および第2の抗原に特異的に結合し、抗原は異なる)を含む多価重鎖(またはその二量体)を発現する非ヒト(例えば、ラットまたはマウス)脊椎動物または細胞が提供される。
【０１４９】
再構成された非ミュー(例えば、ガンマ)遺伝子座
本発明はまた、非ミュー重鎖(任意選択で、非ミュー抗体により提供される)の生成のための、ミュー定常領域を含まないガンマアイソタイプ定常領域などの、非ミューアイソタイプを有する非ヒト脊椎動物および細胞にも関する。本発明はまた、非ミュー重鎖(任意選択で、非ミュー抗体により提供される)の生成のためのガンマアイソタイプなどの、非ミューアイソタイプへのアイソタイプスイッチングを受けた非ヒト脊椎動物および細胞にも関する。この目的のために、本発明は、以下を提供する。
【０１５０】
脊椎動物が、ゲノムが(5'から3'の方向に)再構成された可変領域および非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座を含むリンパ球細胞を含み、
ここで、
非ミュー定常領域が、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、脊椎動物が(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価(例えば、二価、例えば、二特異的)ポリペプチドであって、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープ(例えば、エピトープが異なる場合)に特異的に結合する、ポリペプチド鎖を発現する、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)。
【０１５１】
また、本発明は、細胞ゲノムが(5'から3'の方向に)再構成された可変領域および非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座を含み、
ここで、
非ミュー定常領域が(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、細胞が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチドであって、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、ポリペプチド鎖を発現する、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)またはハイブリドーマを提供する。
【０１５２】
ミュー定常領域を含む脊椎動物および細胞の文脈における上記の任意選択の特徴は、脊椎動物および細胞のこれらのアイソタイプスイッチングされた実施形態にも適用可能である。
【０１５３】
脊椎動物または細胞のある実施形態において、重鎖遺伝子座は、IgMから非ミュー(例えば、IgG)へのアイソタイプスイッチングを受けている。
【０１５４】
脊椎動物または細胞のある実施形態において、リンカーおよび/またはエピトープ結合部分のヌクレオチド配列は、非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域中でCH1ドメイン遺伝子セグメントの代わりに提供される。かくして、生成物は、構造V-L-E(例えば、V-L-E-CH2-CH3(式中、定常ドメインはガンマ型定常ドメインである))を含むか、またはそれからなる。
【０１５５】
多価生成物のためのL鎖遺伝子座
本発明は、多価(例えば、多特異的、例えば、二特異的)軽鎖の発現のための軽鎖遺伝子座を同様に提供する。この目的のために、本発明は、以下を提供する。
【０１５６】
脊椎動物がリンパ球細胞を含みそれぞれの細胞のゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域および第2の領域を含む抗体軽鎖遺伝子座(例えば、カッパまたはラムダ遺伝子座)を含み、
ここで、
第2の領域が(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、脊椎動物が(N末端からC末端の方向に)軽鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン(任意選択で、変異、例えば、体細胞超変異の後)、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含むポリペプチド鎖であって、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープ(例えば、エピトープが異なる場合)に特異的に結合する、ポリペプチド鎖を発現する、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)。
【０１５７】
可変ドメインは、軽鎖遺伝子座の可変領域から誘導される。かくして、遺伝子座の可変領域が再構成された可変領域である場合、可変ドメインは、任意選択で体細胞超変異を含む可変領域(例えば、VHDJHまたはVLJL領域)の配列によりコードされる。可変領域が再構成されていない可変領域である場合、この領域は、1つまたは複数のV遺伝子セグメント、1つまたは複数のJ遺伝子セグメントおよび任意選択で、1つまたは複数のD遺伝子セグメント(例えば、これらのセグメントの全てがヒトである場合)を含む。軽鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントの再構成後、再構成されたVDJまたはVJが形成され、これは、任意選択で体細胞超変異後に可変ドメインをコードする。
【０１５８】
任意選択で、第2の領域は、複数のエピトープ結合部分、例えば、任意選択のリンカーにより連結された2つまたは3つのエピトープ結合部分をコードするヌクレオチドを含む。
【０１５９】
任意選択で、第2の領域は、CL遺伝子セグメントの代わりに、またはそれに加えて、1つまたは複数のエピトープ結合部分(任意選択で、リンカーにより連結される)をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、第2の領域は、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカー、所定のエピトープ結合部分およびCL;またはCL、任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分;または任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分(CLの非存在下で)をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１６０】
例えば、ポリペプチド鎖はそれぞれ、軽鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカー、エピトープ結合部分およびCLドメイン;または軽鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、CLドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分;または軽鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む。
【０１６１】
本発明の軽鎖遺伝子座を含む非ヒト脊椎動物に関する本明細書に記載の特徴は、本発明の軽鎖遺伝子座を含む細胞にも適用される。本発明は、かくして、以下も提供する。
【０１６２】
細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域および第2の領域を含む抗体軽鎖遺伝子座を含み、
ここで、
第2の領域が、(N末端からC末端の方向に)軽鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含むポリペプチド鎖であって、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、ポリペプチド鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)またはハイブリドーマ。
【０１６３】
ある例において、本明細書に記載のような本発明の重鎖および軽鎖を含む非ヒト脊椎動物または細胞が提供される。かくして、脊椎動物は、例えば、多価抗体により提供されるように、多価重鎖および多価軽鎖を発現することができる。例えば、抗体は、二特異的、三特異的、四特異的、五特異的、六特異的もしくは七特異的であってよく、または7より多い特異性を有してもよい。例えば、抗体は、3、4、5、6、7、8以上の価数を有してもよい。価数および特異性は、特異的エピトープまたは抗原結合を指す。
【０１６４】
ある例において、記載のような本発明の重鎖および軽鎖を含む非ヒト脊椎動物または細胞が提供される。任意選択で、脊椎動物または細胞ゲノムは、前記重鎖および軽鎖遺伝子座を含み、重鎖遺伝子座から誘導される前記ポリペプチド鎖可変ドメインは、軽鎖遺伝子座から誘導されるポリペプチド鎖可変ドメインとの結合部位を形成し、結合部位は第1のエピトープに特異的に結合する。例えば、重鎖および軽鎖遺伝子座から誘導されるポリペプチド鎖のエピトープ結合部分は抗体可変ドメインであり、重鎖遺伝子座から誘導される鎖のエピトープ結合ドメインは、第2のエピトープに特異的に結合する結合部位を形成する軽鎖遺伝子座から誘導される鎖のエピトープ結合ドメインと会合する。一実施形態においては、重鎖遺伝子座から誘導される鎖中のエピトープ結合部分はVHドメインである;および軽鎖遺伝子座から誘導される鎖中のエピトープ結合部分はVLドメインである。別の実施形態においては、重鎖遺伝子座から誘導される鎖中のエピトープ結合部分はVLドメインである;および軽鎖遺伝子座から誘導される鎖中のエピトープ結合部分はVHドメインである。重鎖と軽鎖との間のVHおよびVLドメインは、任意選択で、VH/VL対を形成し、それぞれのVH/VLはエピトープ結合部位を提供する。鎖は、例えば、再構成および体細胞超変異の後に、遺伝子座がRNAをコードし、RNAが次いで鎖をコードする場合、遺伝子座から誘導される。これは、例えば、第1のエピトープ(生成物鎖中のN末端可変ドメインにより特異的に結合されるエピトープ)に対する脊椎動物の免疫化後に起こってもよい。
【０１６５】
ある例において、本発明の脊椎動物または細胞は、本明細書に記載の重鎖および/または本明細書に記載の軽鎖に関して同型である。
【０１６６】
方法
本発明はまた、第1および第2のエピトープに特異的に結合する多価抗体、抗体鎖およびポリペプチドのin vivoでの生成、成熟および選択のための方法も提供する。この目的のために、本発明は、
(N末端からC末端の方向に)抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価(例えば、二価、例えば、二特異的)ポリペプチド鎖であり、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープ(例えば、エピトープが異なるか、または同じである場合)に特異的に結合する多価ポリペプチド鎖を生成する方法であって、
(a)非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)において、IgM抗体を未熟B細胞(例えば、T1およびT2 B細胞、例えば、脾臓B細胞)中で発現させ、抗体がそれぞれ重鎖および軽鎖遺伝子座から発現される重鎖および軽鎖を含む工程;
(b)脊椎動物を、第1のエピトープを担持する第1の所定の抗原で免疫し、少なくともいくつかの重鎖遺伝子座中の非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域からの発現および体細胞超変異を受けた可変領域(例えば、IgG抗体重鎖により提供される可変領域)の発現へのアイソタイプスイッチングを取得する工程;ならびに
(c)前記第1のエピトープに結合する可変領域の選択(例えば、前記非ミューアイソタイプの重鎖の選択による)により、前記免疫した脊椎動物から1つまたは複数のポリペプチド鎖を選択し、それぞれの選択された鎖が、エピトープに特異的に結合する体細胞超変異した可変領域を含む工程;
を含み、
(d)脊椎動物のゲノム中の重鎖遺伝子座の非ミュー定常領域中にエピトープ結合部分(または第2のエピトープに特異的に結合するその所定の親)のヌクレオチド配列を提供し、工程(c)で選択されたポリペプチド鎖が第1および第2のエピトープに結合する工程
を含む、方法を提供する。
【０１６７】
任意選択で、(a)において、重鎖はCH1ドメインを含む。
【０１６８】
脊椎動物および細胞を参照する本明細書に記載の任意選択の特徴は、必要な変更を加えて、本発明の方法にも適用される。
【０１６９】
例えば、本発明の任意の方法において、エピトープは、異なる第1および第2の抗原により提供され、従って、生成物は多特異的(例えば、生成物が二価である場合、二特異的)である。
【０１７０】
脾臓において、B細胞は、細胞表面マーカー、IgMおよびIgDのレベルに基づいて、未熟(T1およびT2)ならびに成熟(M)として特徴付けられる。T1細胞は高いIgMおよび低いIgDを有する。T2細胞は中レベルのそれら両方を有する。M細胞は低いIgMを有するが、高いIgDを有する(図2)。J Exp Med. 1991年5月1日;173(5):1213〜25頁;「Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow」; Hardy RRらおよびJ Exp Med. 1999年7月5日;190(1):75〜89頁;「B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals」; Loder Fらも参照されたい。
【０１７１】
例えば、工程(c)において、鎖の選択は、血清、血液、脾臓組織、リンパ節組織、または二次リンパ器官組織に由来する。例えば、鎖は、B細胞により分泌された鎖である。
【０１７２】
任意選択で、本発明の任意の方法において、ポリペプチド鎖は、1つまたは複数の重鎖定常ドメインを含み、この意味において、鎖は重鎖と見なすことができる。別の実施形態においては、鎖は、例えば、鎖が本明細書に記載のV-L-Eポリペプチドからなる場合、定常ドメインを含まない鎖である。
【０１７３】
工程(d)は、当業者には容易に明らかとなるように、任意の標準的なゲノム操作技術により実施することができる。例えば、その後の世代の子孫生物に関して、ES細胞技術を用いる。
【０１７４】
ある例において、工程(b)におけるそれぞれの体細胞変異した可変領域は、CH1ドメインを欠く非ミュー型(例えば、IgG型)重鎖により提供される。これは、特に、軽鎖発現が不活性である場合、重鎖のみ(H2)の抗体を生成するのに有用である。かくして、例えば、工程(b)は、軽鎖発現の非存在下で体細胞変異した可変領域を発現させることを含む。
【０１７５】
本発明はさらに、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)において、(N末端からC末端の方向に)抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価(例えば、二価、例えば、二特異的)ポリペプチド鎖であり、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープ(例えば、エピトープが異なるか、または同じである場合)に特異的に結合する多価ポリペプチド鎖を生成する方法であって、
(a)脊椎動物を、第1のエピトープを担持する第1の所定の抗原で免疫し、脊椎動物の少なくともいくつかの重鎖遺伝子座中の非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域からの発現および体細胞超変異を受けた可変領域(例えば、IgG抗体重鎖により提供される)の発現へのアイソタイプスイッチングを取得する工程;ならびに
(b)前記第1のエピトープに結合する可変領域の選択により前記免疫された脊椎動物から1つまたは複数のポリペプチド鎖を選択し、それぞれの選択された鎖がエピトープに特異的に結合する体細胞超変異した可変領域を含む工程;ならびに
ここで、
(d)脊椎動物のゲノム中の重鎖遺伝子座の非ミュー定常領域中にエピトープ結合部分(または第2のエピトープに特異的に結合するその所定の親)のヌクレオチド配列を提供し(例えば、ES細胞技術を用いて行う)、工程(b)で選択されたポリペプチド鎖が第1および第2のエピトープに結合する工程
を含む方法を提供する。
【０１７６】
ある例において、工程(a)におけるそれぞれの体細胞変異した可変領域は、CH1ドメインを欠く非ミュー型(例えば、IgG型)重鎖により提供される。任意選択で、工程(a)は、軽鎖発現の非存在下で体細胞変異した可変領域を発現させることを含む。
【０１７７】
任意選択で、本発明の任意の方法において、脊椎動物は、本明細書に記載の本発明の任意の構成、態様、実施形態または例に記載の通りである。
【０１７８】
任意選択で、本発明の方法は、前記方法において選択されたポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を単離または合成すること;および任意選択で、その配列をヒト化すること(例えば、非ヒト抗体定常ドメインを1つまたは複数の(または対応する)ヒト抗体定常ドメインで置き換えること)をさらに含む。
【０１７９】
本発明はまた、本発明の方法により得られる多価(例えば、多特異的、例えば、二特異的)ポリペプチド鎖または第1および第2のエピトープに特異的に結合するその誘導体も提供する。誘導体(例えば、コンジュゲートまたは結晶またはグリコシル化形態)の例は、WO2007024715の9頁、22行〜10頁、4行;10頁、25行〜11頁、6行;および47頁、26行〜50頁、23行に開示されている。これらの例は、本発明の抗体、鎖またはポリペプチドがこれらの先行技術の開示に開示された抗体、鎖またはポリペプチドの代わりに用いられることを除いて、本発明に関する可能な誘導体として、および1つまたは複数の請求項への可能な含有のために、あたかも本明細書に具体的かつ明示的に開示されたかのように本明細書に具体的に組込まれる。
【０１８０】
生成物
本発明は、以下のような多価生成物を提供する:
(N末端からC末端の方向に)構造V-X-L-E-L-C(式中、
(i)Vは第1のエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメインであり、
(ii)Xは存在しない、抗体ヒンジ領域または定常ドメイン(例えば、ガンマ型CH1、ヒトガンマ定常ドメイン、抗体ヒンジ領域-CHドメイン;またはCHドメイン-抗体ヒンジ領域)を含む抗体定常領域であり、
(iii)Lはそれぞれ、任意選択のリンカーであり、
(iv)Eは第2のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合部分であり、および
(v)Cは存在しないか、または1つもしくは複数の(例えば、1、2、3もしくは4つ)定常ドメインを含む抗体定常領域であり(例えば、CはヒトガンマFcまたはガンマCH1-ヒンジ-CH2-CH3である)、
Vは、エピトープ結合部分(または同じエピトープ結合特異性を共有するその親)もコードするヌクレオチド配列中に得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異を有する非ヒト脊椎動物中、in vivoで可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導される再構成された抗体可変ドメインであり、再構成された抗体可変ドメインは内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む)
を有するか、またはそれからなる多価(例えば、多特異的、例えば、二特異的)ポリペプチド鎖。
【０１８１】
これは、B細胞が所定のエピトープ結合ドメインについて体細胞超変異および再構成された可変ドメインの選択を実行したことを意味する。これは、結合部分が別々に選択され(例えば、in vitroでの別々のファージディスプレイ実験において)、次いで、組み合わされて二特異的ポリペプチドを形成させる現在の方法よりも優れている。この先行技術の場合、二特異性に関しては考慮されるが、in vivo動物系と適合する良好な生物物理的特徴および発現を有する良好な挙動のポリペプチドに関する構築は考慮されない。
【０１８２】
かくして、可変ドメインがマウスにおいて生成された場合、それぞれの再構成された可変ドメインは、マウスAIDにより引き起こされる体細胞超変異を含む。AIDのための変異ホットスポットが公知であり(Mauel, R.W. & Gearhart, P.J.;「AID and somatic hypermutation」Advances in Immunology 2010. 105: 159〜191頁を参照されたい)、かくして、当業者であれば、内因性AIDのためのそのようなホットスポットにある1つまたは複数の変異を容易に同定することができる(例えば、任意の変異の非存在下で生成される予測されたアミノ酸配列に対して比較することにより)。
【０１８３】
ある例において、VはヒトVHのDHおよびJHとの再構成から誘導された再構成された抗体可変ドメインである。別の例においては、VはヒトVLおよびJL(例えば、VκおよびJκまたはVλおよびJλ)の再構成から誘導されたVLドメインである。
【０１８４】
一実施形態においては、Eに加えて、それぞれさらなる部分が対応するエピトープに対する結合特異性を有する、VとCの間の複数(例えば、1、2または3)のさらなるエピトープ結合部分が提供される。ある例において、エピトープ結合部分は、異なるエピトープ特異性を有する。別の例においては、それらは第2のエピトープに対する特異性を共有する。例えば、鎖は、(N末端からC末端の方向に)構造V-X-L-E-L-E''L-C(式中、E''は、例えば、第1および第2のエピトープと異なる第3のエピトープに対する結合特異性を有する、さらなるエピトープ結合ドメインである)を有するか、またはそれからなる。
【０１８５】
抗体ヒンジは、任意の種、例えば、マウスヒンジ、ラットヒンジ、ヒトヒンジまたはラクダ科ヒンジに由来するものであってもよい。
【０１８６】
本発明によるポリペプチドの例は、N末端からC末端に向かって、以下のもの:
(i)V-dAb-ヒトFc(任意選択で、二量体として)(式中、VはVH、VHHまたはVLであり、dAbはVH、VHHまたはVLである);
(ii)V-dAb(任意選択で、二量体として)(式中、VはVH、VHHまたはVLであり、dAbはVH、VHHまたはVLである);
(iii)V-scFv-ヒトFc(任意選択で、二量体として)(式中、VはVH、VHHまたはVLである);
(iv)V-scFv(任意選択で、二量体として)(式中、VはVH、VHHまたはVLであり、dAbはVH、VHHまたはVLである);
(v)mAb-dAb(すなわち、例えば、mAbの重鎖中の、1つもしくは複数のdAbに共有結合されたか、またはそれを含むmAb)(式中、mAbの重鎖可変ドメインは記載されたVドメインであり、VはVH、VHHまたはVLを表す);
(vi)Fab-dAb(すなわち、例えば、Fabの重鎖中の、1つもしくは複数のdAbに共有結合されたか、またはそれを含むmAb)(式中、Fabの重鎖可変ドメインは記載されたVであり、VはVH、VHHまたはVLを表す);
(vii)Fab2-dAb(すなわち、例えば、Fab2の重鎖中の、1つもしくは複数のdAbに共有結合されたか、またはそれを含むFab2)(式中、Fabの重鎖可変ドメインは記載されたVドメインであり、VはVH、VHHまたはVLを表す)
である。
【０１８７】
VHHは、当業界で公知のような、ラクダ科重鎖単一可変ドメインまたはラクダ化ヒトVH単一可変ドメインを示す。
【０１８８】
本発明のポリペプチド鎖を生成する方法であって、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)を、第1のエピトープで免疫し、エピトープ結合部分(E)、Vをコードする可変領域遺伝子もコードするヌクレオチド配列中の可変領域遺伝子の体細胞超変異を引き起こし、VおよびEを含む前記ポリペプチド鎖を単離することを含む方法が提供される。この方法は任意選択で、第1および第2のエピトープに対する特異性を保持する誘導体ポリペプチド鎖(例えば、そのヒト化バージョン)を生成することをさらに含む。
【０１８９】
ポリペプチド鎖の方法の実施形態によれば、エピトープ結合部分は、内因性AIDパターンの体細胞超変異を欠く。かくして、本発明によるマウスを用いて鎖を作成する場合、鎖のエピトープ結合部分は、内因性(マウス)AID変異を含まず、そのヌクレオチド配列も含まない。有利には、これは、本発明の重鎖遺伝子座中のS-ミューまたはミュー定常領域の下流への部分ヌクレオチド配列の構成の結果生じ得る。かくして、エピトープ結合部分の望ましい特徴(例えば、結合特性)は、AID変異によりダウングレードされない。
【０１９０】
代替において、エピトープ結合部分は、内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む。これは、バリアントをN末端可変ドメインのレパートリーと組み合わせることができ、この形式でin vivo系により発現させることができる、所定のエピトープ結合ドメインのin vivoで選択されたバリアントを提供するのに有用であってよい。バリアントを、親エピトープ結合部分に対するエピトープ結合親和性の改善などの、1つまたは複数の望ましい特徴について選択することができる(この多価生成物形式で)。
【０１９１】
抗体軽鎖を欠く、本発明によるポリペプチドの二量体がさらに提供される。かくして、例えば、ポリペプチドがCH1ドメインを欠く重鎖である場合、二量体は、この形式でin vivoで生成、変異および選択される多価(例えば、多特異的)重鎖のみ(H2)の抗体を提供することができる。
【０１９２】
ポリペプチドが(N末端からC末端の方向に)構造V-N-E;V-CH1-M-CH2-CH3-L-E;またはV-M-CH2-CH3-L-E(式中、Nは任意選択の抗体ヒンジ領域と一緒にLであり;Mは任意選択の抗体ヒンジ領域である)を有する、本発明によるポリペプチド、二量体または方法がさらに提供される。任意選択で、定常ドメインは、ヒトガンマ定常ドメインである。かくして、Mは、Lのみ;ヒンジ-L;L-ヒンジ;またはヒンジであってもよい。
【０１９３】
Vが第2の抗体可変ドメイン(V2)にペプチド結合して、第1のエピトープに特異的に結合する第1および第2の可変ドメインを含む結合部位を形成し;任意選択で、VおよびV2がscFvとして提供される、本発明によるポリペプチド、二量体または方法がさらに提供される。例えば、Vは、本発明の重鎖遺伝子座から多価ポリペプチド鎖として選択されたVH(例えば、ヒトVH)であり、ここでVHはVLと対形成して、第1のエピトープのための結合部位を形成する(例えば、VLが脊椎動物または細胞の軽鎖遺伝子座によりコードされるヒトVLである場合)。重鎖またはこれをコードするヌクレオチドの選択後、組換えDNA技術またはタンパク質工学を用いて、VLまたはこれをコードするヌクレオチド配列をVL(またはVLヌクレオチド配列)と組み合わせて、N末端scFvおよびまたエピトープ結合部分を含む重鎖を生成することができる。scFvは第1のエピトープのための結合部位を提供し、エピトープ結合部分は第2のエピトープのための結合部位を提供する。
【０１９４】
本発明のポリペプチド、二量体または方法の一実施形態においては、ポリペプチドはCH1ドメインを欠く。
【０１９５】
本発明のポリペプチド、二量体または方法の一実施形態においては、ポリペプチドはCH1ドメインを含み、ポリペプチドは抗体中の第1および第2のコピー中に存在し、第1のポリペプチドは第1の抗体軽鎖と会合し、第2のコピーは第2の抗体軽鎖と会合する。任意選択で、軽鎖は同一である。かくして、生成物は、4鎖mAb様構造を有し得る。
【０１９６】
本発明は、本明細書に記載の通りの二量体、ポリペプチド鎖またはそのヒト化バージョンを含む抗体を提供する。
【０１９７】
本発明は、それぞれの重鎖が本明細書に記載のポリペプチドであり、(N末端からC末端の方向に)構造
V-CH1-M-CH2-CH3-L-E、
V-M-CH2-CH3-L-E、
V- L-E-L-CH1-M-CH2-CH3、
V- L-E-L-M-CH2-CH3、
V-CH1-N-E、
V- L-E-N-CH1、または
V- N-E-L-CH1
(式中、Nは任意選択の抗体ヒンジ領域と一緒にLであり;Mは任意選択の抗体ヒンジ領域であり(かくして、MはLのみ;ヒンジ-L;L-ヒンジ;またはヒンジであってよい);
任意選択で、定常ドメインはヒト定常ドメイン(例えば、ヒトガンマ定常ドメイン)である)
を有する、重鎖の二量体を含むか、またはそれからなる二価(例えば、二特異的)抗体を提供する。
【０１９８】
任意選択で、本発明の抗体またはポリペプチドのヒトおよび定常領域は、ヒトである。
【０１９９】
体細胞超変異したVH/VLは固定されたエピトープ結合ドメインと対形成する
任意選択で、抗体は、それぞれの重鎖が対応する軽鎖と会合し、それぞれの重鎖中のVがその対応する軽鎖の可変ドメインとの抗原結合部位を形成し、それぞれの軽鎖の可変ドメインが内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む、2コピーの軽鎖を含む。かくして、それぞれの重鎖の可変ドメインを、V対が標的抗原を用いる免疫化後にin vivoで親和性成熟および選択される、軽鎖パートナーに由来するVとのV対(例えば、VH/VL)として選択することができる。例えば、抗体は、mAb-dAb(すなわち、重鎖上、例えば、そのC末端に1つまたは複数のdAbを含むmAb構造)である。
【０２００】
任意選択で、本発明の抗体のヒトおよび定常領域は、ヒトである。
【０２０１】
本発明は、軽鎖と会合した重鎖を含む多価(例えば、多特異的、例えば、二特異的)抗体であって、
それぞれの重鎖が、構造V-X-L-E-L-C(式中、Eは抗体可変ドメインである)を有するか、またはそれからなる上記のポリペプチド鎖であり;
それぞれの軽鎖が、(N末端からC末端の方向に)構造V'-L'-E'-L'-C'(式中、
(i)V'は抗体可変ドメインであり、
(ii)L'はそれぞれ任意選択のリンカーであり、
(iv)E'はエピトープ結合部分であり、および
(v)C'は存在しないか、または定常ドメイン(例えば、1、2、3または4つの定常ドメイン、例えば、C'はヒトCLである)を含む抗体定常領域であり;
V'は、E'もコードするヌクレオチド配列(またはE'により特異的に結合されるエピトープに特異的に結合するその親)中に得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異を含む非ヒト脊椎動物におけるin vivoでの可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導される再構成された抗体可変ドメインであり;
V'は、内因性AIDパターンの体細胞超変異を含み;
VおよびV'は、第1のエピトープに特異的に結合する第1の結合部位を形成し;
任意選択で、EおよびE'は、E'が抗体可変ドメインである(例えば、EはVHであり、E'はVLである)場合、第2のエピトープに特異的に結合する第2の結合部位を形成する)
を有するか、またはそれからなるポリペプチド鎖である、多価抗体を提供する。
【０２０２】
ある例において、V'は、ヒトVHのDHおよびJHとの再構成から誘導される。別の例においては、V'は、ヒトVLおよびJLの再構成(例えば、VκおよびJκまたはVλおよびJλ)から誘導されるVLドメインである。
【０２０３】
本発明はまた、抗原結合ポリペプチドが、少なくとも2つのエピトープ結合部位を含み、そのうちの少なくとも一方がエピトープ結合部分により提供され、少なくとも一方が第2の抗体可変ドメインと対形成した第1の抗体可変ドメインにより提供され、それぞれの可変ドメインが、1つまたは複数のエピトープ結合部分(または同じエピトープ結合特異性を有するその対応する親)もコードするヌクレオチド配列中に得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異を有する非ヒト脊椎動物中におけるin vivoでの可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導される再構成された抗体可変ドメインであり;ならびに再構成された抗体可変ドメインが内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む、1つまたは複数のエピトープ結合部分に連結されたタンパク質スキャホールドを含む抗原結合ポリペプチドも提供する。
【０２０４】
かくして、可変ドメインがマウス中で生成された場合、それぞれの再構成された可変ドメインは、マウスAIDにより引き起こされる体細胞超変異を含む。AIDのための変異ホットスポットは公知であり(Mauel, R.W. & Gearhart, P.J.;「AID and somatic hypermutation」Advances in Immunology 2010. 105: 159〜191頁を参照されたい)、かくして、当業者であれば、内因性AIDのためのそのようなホットスポットにある1つまたは複数の変異を容易に同定することができる(例えば、任意の変異の非存在下で生成される予測されたアミノ酸配列に対して比較することにより)。
【０２０５】
本発明はまた、タンパク質スキャホールドを含む抗原結合ポリペプチドのコピーである抗原結合ポリペプチドも提供する。かくして、そのコピーの可変ドメインはそれ自身、脊椎動物において生成されている必要はないが、例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターからin vitroで発現させることができる。
【０２０６】
ある例において、それぞれの可変ドメインは、ヒトVHのDHおよびJHとの再構成から誘導される再構成された抗体可変ドメインである。別の例においては、それぞれの可変ドメインは、ヒトVLおよびJL(例えば、VκおよびJκまたはVλおよびJλ)の再構成から誘導されるVLドメインである。
【０２０７】
ある例において、タンパク質スキャホールドは、抗体スキャホールド、すなわち、重鎖(またはその二量体、例えば、H2抗体);重鎖および対形成した軽鎖(またはその二量体、例えば、H2L2抗体)を含むスキャホールドである。
【０２０８】
ある例において、タンパク質スキャホールドは、Igスキャホールド、例えば、IgGスキャホールドである。例えば、IgGスキャホールドは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4から選択される。例えば、エピトープ結合ドメインは、その軽鎖のN末端でIgスキャホールドに結合される。例えば、エピトープ結合ドメインは、重鎖のN末端でIgスキャホールドに結合される。例えば、エピトープ結合ドメインは、軽鎖のC末端でIgスキャホールドに結合される。例えば、エピトープ結合ドメインは、重鎖のC末端でIgスキャホールドに結合される。
【０２０９】
ある例において、タンパク質スキャホールドは、一価または二価抗体(例えば、二価一特異的抗体)を含むか、またはそれからなる。
【０２１０】
ある例において、少なくとも1つの前記エピトープ結合部分は、少なくとも10アミノ酸(例えば、10〜50アミノ酸)を含むペプチドリンカーによってタンパク質スキャホールドに連結される。一例において、ある(またはそれぞれの)エピトープ結合部分(例えば、ドメイン)は、配列番号53〜60、配列番号62〜72、配列番号74、配列番号76〜78および配列番号112〜114に記載のものから選択されるリンカーおよびそのようなリンカーの組合せまたは複数のそのようなリンカーによってタンパク質スキャホールドに連結される(これらの配列は、開示が本発明との使用のため、および請求項への可能な含有のために参照により本明細書に組込まれるWO2010136483に開示されたものである)。ある例において、リンカーは、(PAS)n(GS)m、(GGGGS)p(GS)m、(TVAAPS)p(GS)m、(GS)m(TVAAPSGS)p、(PAVPPP)n(GS)m、(TVSDVP)n(GS)m、および(TGLDSP)n(GS)m (式中、n = 1〜10の整数であり、m = 0または1〜4の整数であり、p = 2〜10の整数である)から選択される。
【０２１１】
ある例において、リンカーは、(PAS)n(GS)m(式中、n = 1〜10の整数であり、m = 0または1〜4の整数である)から選択される。
【０２１２】
ある例において、リンカーは、(TVAAPS)p(GS)mおよび(GS)m(式中、m = 0または1〜10の整数であり、p =または2〜10の整数である)から選択される。
【０２１３】
本発明は、上記の抗原結合ポリペプチドの重鎖をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。本発明は、上記の抗原結合ポリペプチドの軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【０２１４】
本発明はまた、患者において免疫エフェクター細胞を動員するのに有用である多特異的ポリペプチドに関する。かくして、本発明は、ヒト免疫エフェクター細胞上に位置するエフェクター抗原(例えば、ヒトCD3)に特異的に結合することによりヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員することができる、上記の説明による多特異的抗原結合ポリペプチド、二量体または抗体であって、ポリペプチド、二量体または抗体の第1のエピトープ結合部位は前記エフェクター抗原に特異的に結合することができ、ポリペプチド、二量体または抗原の第2のエピトープ結合部位はエフェクター抗原以外の標的抗原(例えば、ヒトEpCAMまたはヒトCD19)に特異的に結合することができ、任意選択で、前記標的抗原は前記ヒト免疫エフェクター細胞以外の標的細胞上に位置する、多特異的抗原結合ポリペプチド、二量体または抗体を提供する。
【０２１５】
例えば、エフェクター抗原は、CD3、CD16、CD32、CD64およびCD89からなる群から選択される。
【０２１６】
例えば、標的抗原は、EGFR; VEGF; IGF-1R; Her2; c-Met (aka HGF); HER3; CEA; CD33; CD79a; CD19; PSA; EpCAM; CD66; CD30; HAS; PSMA; GD2; ANG2; IL-4; IL-13; VEGFR2;およびVEGFR3からなる群から選択される。
【０２１７】
ある実施形態において、第2のエピトープがヒト免疫エフェクター細胞抗原(例えば、ヒトCD3)により提供される、本発明の脊椎動物、細胞ポリペプチド、二量体または抗体が提供される。
【０２１８】
ある実施形態において、第1のエピトープがエフェクター抗原以外の標的抗原(例えば、ヒトEpCAMまたはヒトCD19)により提供され、任意選択で、前記標的抗原が前記ヒト免疫エフェクター細胞以外の標的細胞の抗原である、本発明の脊椎動物、細胞ポリペプチド、二量体または抗体が提供される。
【０２１９】
本発明はまた、軽鎖および軽鎖二量体も提供する。この目的のために、本発明は、
(N末端からC末端の方向に)構造V-X-L-E-L-C
(式中、
(i)Vは第1のエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン(例えば、VL)であり、
(ii)Xは、存在しない、または定常ドメインを含む抗体定常領域(例えば、CL)であり、
(iii)Lはそれぞれ、任意選択のリンカーであり、
(iv)Eは第2のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合部分であり、
(v)Cは存在しないか、または定常ドメインを含む抗体定常領域であり(例えば、CはCLである))
を有する多価(例えば、多特異的)軽鎖であって、
Vは、エピトープ結合部分をもコードするヌクレオチド配列中に得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異を有する非ヒト脊椎動物中においてin vivoで可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導される再構成された抗体可変ドメインであり、
再構成された抗体可変ドメインは、内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む、軽鎖
を提供する。
【０２２０】
本発明はまた、そのような軽鎖の二量体も提供する。
【０２２１】
そのような構築物を生成するための軽鎖遺伝子座を含む対応する脊椎動物が提供される。この目的のために、本発明は、以下を提供する。
脊椎動物がリンパ球細胞を含み、それぞれの細胞ゲノムが、
(i)(5'から3'の方向に)再構成された、もしくは再構成されていない可変領域、任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列、ならびにCL遺伝子セグメントを含む抗体軽鎖遺伝子座であって、脊椎動物が(N末端からC末端の方向に)軽鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカー、エピトープ結合部分およびCLドメインを含む多価軽鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープ(本明細書に定義される任意のエピトープであってもよい)に特異的に結合する、抗体軽鎖遺伝子座;または
(ii)(5'から3'の方向に)再構成された、もしくは再構成されていない可変領域、CL遺伝子セグメント、任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む抗体軽鎖遺伝子座であって、脊椎動物が(N末端からC末端の方向に)軽鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、CLドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価軽鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープ(本明細書に定義される任意のエピトープであってもよい)に特異的に結合する、抗体軽鎖遺伝子座
を含む非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)。
【０２２２】
細胞ゲノムが、
(i)(5'から3'の方向に)再構成された、もしくは再構成されていない可変領域、任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列、ならびにCL遺伝子セグメントを含む抗体軽鎖遺伝子座であって、細胞が(N末端からC末端の方向に)軽鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカー、エピトープ結合部分およびCLドメインを含む多価軽鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープ(本明細書に定義される任意のエピトープであってもよい)に特異的に結合する、抗体軽鎖遺伝子座;または
(ii)(5'から3'の方向に)再構成された、もしくは再構成されていない可変領域、CL遺伝子セグメント、任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む抗体軽鎖遺伝子座であって、細胞が(N末端からC末端の方向に)軽鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、CLドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価軽鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープ(本明細書に定義される任意のエピトープであってもよい)に特異的に結合する、抗体軽鎖遺伝子座
を含む非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)。
【０２２３】
エピトープ結合ドメインの例
ある例において、エピトープ結合部分もしくはドメインまたはそれぞれのエピトープ結合部分もしくはドメインは、抗体可変ドメイン(例えば、VLもしくはVH、抗体単一可変ドメイン(ドメイン抗体もしくはdAb)、ラクダ科VHH抗体単一可変ドメイン、サメ免疫グロブリン単一可変ドメイン(NARV)、Nanobody(商標)またはラクダ化VH単一可変ドメイン);T細胞受容体結合ドメイン;免疫グロブリンスーパーファミリードメイン;無顎類可変リンパ球受容体(J Immunol; 2010年8月1日;185(3):1367〜74頁;「Alternative adaptive immunity in jawless vertebrates」; Herrin BR & Cooper MD.);フィブロネクチンドメイン(例えば、Adnectin(商標));定常ドメインが機能的CH1ドメイン(軽鎖と会合することができるCH1ドメインと定義される)ではない抗体定常ドメイン(例えば、CH3ドメイン、例えば、Fcab(商標)のCH2および/またはCH3);scFv;(scFv)2;sc-ダイアボディ;scFab;センチリン(centyrin)およびCTLA-4(Evibody(商標))から選択されるスキャホールドから誘導されるエピトープ結合ドメイン;リポカリンドメイン;プロテインAのZドメインなどのプロテインA(例えば、Affibody(商標)またはSpA);A-ドメイン(例えば、Avimer(商標)またはMaxibody(商標));熱ショックタンパク質(例えば、GroEIおよびGroESから誘導されるエピトープ結合ドメイン);トランスフェリンドメイン(例えば、trans-body);アンキリンリピートタンパク質(例えば、DARPin(商標));ペプチドアプタマー;C型レクチンドメイン(例えば、Tetranectin(商標));ヒトγ-クリスタリンまたはヒトユビキチン(アフィリン);PDZドメイン;サソリ毒;ならびにヒトプロテアーゼ阻害剤のkunitz型ドメインからなる群から選択される。
【０２２４】
エピトープ結合部分のさらなる供給源は、WO2007024715の40頁、23行〜43頁、23行に開示された抗体の可変ドメインおよびVH/VL対である。この特定の開示は、本発明における使用のため、および請求項への可能な含有のために、エピトープ結合部分のための基礎を提供するためにあたかも本明細書に明示的に書かれたかのように参照により本明細書に組込まれる。
【０２２５】
「ドメイン」は、タンパク質の残りの部分から独立した三次構造を有する折畳まれたタンパク質構造である。一般に、ドメインは、タンパク質の個別の機能的特性の原因となり、多くの場合、タンパク質および/またはドメインの残りの部分の機能を喪失することなく他のタンパク質に付加する、除去するまたは移動させることができる。「単一可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折畳まれたポリペプチドドメインである。従って、単一可変ドメインは、完全な抗体可変ドメインおよび例えば、1つまたは複数のループが、抗体可変ドメインに特徴的ではない配列によって置き換えられた改変された可変ドメイン、またはトランケートされた、もしくはN-もしくはC-末端伸長を含む抗体可変ドメイン、ならびに完全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折畳まれた断片を含む。
【０２２６】
語句「免疫グロブリン単一可変ドメイン」とは、異なるV領域またはドメインとは無関係に抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン(VH、VHH、VL)を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の領域またはドメインが単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合にとって必要ではない(すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインがさらなる可変ドメインとは無関係に抗原に結合する)他の異なる可変領域または可変ドメインと共にある形式(例えば、ホモ-またはヘテロ-多量体)で存在してもよい。「ドメイン抗体」または「dAb」は、この用語が本明細書で用いられるように抗原に結合することができる「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであってもよいが、げっ歯類(例えば、WO00/29004に開示された)、テンジクザメおよびラクダ科VHH免疫グロブリン単一可変ドメインなどの他の種に由来する単一抗体可変ドメインも含む。ラクダ科VHHは、軽鎖を自然に含まない重鎖抗体を生成する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種から誘導される免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。そのようなVHHドメインは、当業界で利用可能な標準的な技術に従ってヒト化することができ、そのようなドメインは依然として本発明による「ドメイン抗体」であると考えられる。本明細書で用いられる「VH」はラクダ科VHHドメインを含む。NARVは、テンジクザメを含む軟骨魚類において同定された別の型の免疫グロブリン単一可変ドメインである。これらのドメインは、新規抗原受容体(Novel Antigen Receptor)可変領域(V(NAR)またはNARVと一般に省略される)としても知られる。さらなる詳細については、MoI. Immunol. 44, 656〜665頁(2006)およびUS20050043519Aを参照されたい。
【０２２７】
CTLA-4(細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4)は、主にCD4+ T細胞上に発現されるCD28ファミリーの受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様Ig折畳みを有する。抗体のCDRに対応するループは、異種配列と置換して、異なる結合特性を付与することができる。異なる結合特異性を有するように操作されたCTLA-4分子は、Evibodyとしても知られる。さらなる詳細については、Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31〜45頁(2001)を参照されたい。
【０２２８】
リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイドおよび脂質などの小さい疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。それらは異なる標的抗原に結合するように操作することができる円錐構造の開いた端部にいくつかのループを有する固いβシート二次構造を有する。アンチカリンは、160〜180アミノ酸のサイズであり、リポカリンから誘導される。さらなる詳細については、Biochim Biophys Acta 1482: 337〜350頁(2000)、US7250297B1およびUS20070224633を参照されたい。affibodyは、抗原に結合するように操作することができるスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)のプロテインAから誘導されるスキャホールドである。そのドメインは、約58アミノ酸の3ヘリックス束からなる。ライブラリーが、表面残基の無作為化によって作成されている。さらなる詳細については、Protein Eng. Des. SeI. 17, 455〜462頁(2004)およびEP1641818A1を参照されたい。
【０２２９】
Avimer(商標)は、A-ドメインスキャホールドファミリーから誘導される多ドメインタンパク質である。約35アミノ酸の天然ドメインは、規定のジスルフィド結合した構造を採用する。多様性は、A-ドメインのファミリーにより示される天然の変化のシャッフリングにより作成される。さらなる詳細については、Nature Biotechnology 23(12), 1556〜1561頁(2005)およびExpert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909〜917頁(June 2007)を参照されたい。
【０２３０】
トランスフェリンは、単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンを、許容状態の表面ループ中へのペプチド配列の挿入により異なる標的抗原に結合するように操作することができる。操作されたトランスフェリンスキャホールドの例としては、Trans-bodyが挙げられる。さらなる詳細については、J. Biol. Chem 274, 24066〜24073頁(1999)を参照されたい。
【０２３１】
設計されたアンキリンリピートタンパク質(Designed Ankyrin Repeat Proteins) (DARPins(商標))は、内在性膜タンパク質の細胞骨格への結合を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンから誘導される。単一のアンキリンリピートは、2つのα-ヘリックスとβ-ターンとからなる33残基のモチーフである。それらは、それぞれのリピートの第1のα-ヘリックスおよびβ-ターン中の残基を無作為化することにより異なる標的抗原に結合するように操作することができる。それらの結合境界面を、モジュールの数を増加させることによって増加させることができる(親和性成熟の方法)。さらなる詳細については、J. Mol. Biol. 332, 489〜503頁(2003)、PNAS 100(4), 1700〜1705頁(2003)およびJ. Mol. Biol. 369, 1015〜1028頁(2007)ならびにUS20040132028A1を参照されたい。
【０２３２】
フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作することができるスキャホールドである。Adnectin(商標)は、ヒトIII型フィブロネクチン(FN3)の15の反復単位の10番目のドメインの天然アミノ酸配列の骨格からなる。β-サンドイッチの一方の端部にある3つのループを、Adnectinに対象の治療標的を特異的に認識させるように操作することができる。さらなる詳細については、Protein Eng. Des. SeI. 18, 435〜444頁(2005)、US20080139791、WO2005056764およびUS6818418B1を参照されたい。
【０２３３】
ペプチドアプタマーは、定常的スキャホールドタンパク質、典型的には、活性部位に挿入された拘束された可変ペプチドループを含有するチオレドキシン(TrxA)からなるコンビナトリアル認識分子である。さらなる詳細については、Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783〜797頁(2005)を参照されたい。
【０２３４】
ミクロボディは、3〜4個のシステイン架橋を含有する長さ25〜50アミノ酸の天然に存在する微小タンパク質から誘導される。微小タンパク質の例としては、KalataBIおよびコノトキシンおよびノッチンが挙げられる。微小タンパク質は、微小タンパク質の全体の折畳みに影響することなく最大25アミノ酸を含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインのさらなる詳細については、WO2008098796を参照されたい。
【０２３５】
他のエピトープ結合部分およびドメインは、異なる標的抗原結合特性を操作するためのスキャホールドとして用いられたタンパク質を含み、ヒトγ-クリスタリンおよびヒトユビキチン(アフィリン)、ヒトプロテアーゼ阻害剤のkunitz型ドメイン、Ras-結合タンパク質AF-6のPDZ-ドメイン、サソリ毒(カリブドトキシン)、C型レクチンドメイン(テトラネクチン)がChapter 7 - Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007、Stefan Dubel(編))およびProtein Science 15:14〜27頁(2006)に概説されている。本発明のエピトープ結合部分およびドメインを、これらの代替的なタンパク質ドメインのいずれかから誘導することができる。
【０２３６】
本発明の一実施形態においては、エピトープ結合部分、ドメインもしくは抗原結合部位またはそれぞれのエピトープ結合部分、ドメインもしくは抗原結合部位は、WO2010136485の方法4もしくは方法5に記載された、または本明細書の他の場所に記載されたBiacore(商標)方法などの、Biacore(商標)またはProteon(商標)により測定された場合、それぞれの抗原に1mMのKD、例えば、10nM、1nM、500pM、200pM、100pMまたは10pM以下のKD(すなわち、より良好な親和性)で抗原または第2のエピトープに結合する。
【０２３７】
本発明の一実施形態においては、本発明のポリペプチド、鎖もしくは抗体のN末端にある、本発明の可変ドメイン、可変ドメイン対もしくは抗原結合部位またはそれぞれの可変ドメイン、可変ドメイン対もしくは抗原結合部位は、WO2010136485の方法4もしくは方法5に記載された、または本明細書の他の場所に記載されたBiacore(商標)方法などの、Biacore(商標)またはProteon(商標)により測定された場合、それぞれの抗原に1mMのKD、例えば、10nM、1nM、500pM、200pM、100pMまたは10pM以下のKD(すなわち、より良好な親和性)で抗原または第1のエピトープに結合する。
【０２３８】
本発明の脊椎動物、細胞ポリペプチド、二量体または抗体のある例においては、N末端可変ドメインもしくは5'-末端可変領域またはそれぞれのN末端可変ドメインもしくは5'-末端可変領域は、ヒト可変ドメインまたは領域である。
【０２３９】
本発明の脊椎動物、細胞ポリペプチド、二量体または抗体のある例においては、それぞれの定常領域またはドメインは、内因性非ヒト脊椎動物定常領域またはドメインである。
【０２４０】
本発明は、リンパ球細胞を含み、それぞれの細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域および任意選択のリンカーと所定のエピトープ結合部分とをコードするヌクレオチド配列を含むミュー定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)であって、脊椎動物が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、脊椎動物を提供する。これは、ミュー型多価(例えば、多特異的、例えば、二特異的)重鎖および抗体を生成するのに有用である。
【０２４１】
本発明は、細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域および任意選択のリンカーと所定のエピトープ結合部分とをコードするヌクレオチド配列を含むミュー定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)であって、細胞が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、細胞を提供する。これは、ミュー型多価(例えば、多特異的、例えば、二特異的)重鎖および抗体を生成するのに有用である。
【０２４２】
本発明は、構造V-L-EまたはV-L-E-L(例えば、V-L-E-FcまたはV-L-E-L-Fc)(式中、VはN末端抗体可変ドメインであり、Lは任意選択のリンカーであり、Eはエピトープ結合部分であり、VおよびEはそれぞれ第1および第2の抗原に特異的に結合し、抗原は異なる)を含む多価、多特異的重鎖(またはその二量体)を発現する非ヒト(例えば、ラットもしくはマウス)脊椎動物または細胞を提供する。任意選択で、Vはヒト可変ドメインである。
【０２４３】
重鎖のみの抗体および遺伝子座
上記で説明されたように、および以下に例示されるように、本発明は、in vivoでの重鎖抗体(H2抗体)の改善された生成にも関する。
【０２４４】
かくして、本発明は、
(a)脊椎動物が、それぞれ抗体重鎖および軽鎖遺伝子座によりコードされる重鎖および軽鎖を含むIgM抗体を発現し;
(b)脊椎動物が、非ミュー(例えば、IgG)抗体を発現することができ、それぞれの非ミュー抗体重鎖が機能的CH1ドメインを欠き;
(c)IgM抗体が、リンパ球細胞(例えば、未熟B細胞)により発現され、それぞれの細胞が該細胞により発現されるIgM抗体の軽鎖を発現させるための機能的軽鎖遺伝子座を含み;
(d)非ミュー抗体が、リンパ球細胞(例えば、成熟B細胞、形質芽細胞または形質細胞)により発現され、それぞれの細胞が、非ミュー抗体が軽鎖発現の実質的に非存在下で該細胞により発現される機能的軽鎖遺伝子座を欠く
非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)を提供する。
【０２４５】
任意選択で、(a)において、それぞれの重鎖はCH1ドメインを含む。
【０２４６】
ある例において、(b)において、非ミュー抗体の発現は、所定の抗原を用いる免疫化およびアイソタイプスイッチングの後である。
【０２４７】
本発明はまた、そのゲノムが
(i)(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ(例えば、S-ミュー、例えば、内因性S-ミュー)、ミュー定常領域(例えば、CH1遺伝子セグメントを含む)、第2のスイッチ(例えば、S-ガンマ、例えば、内因性S-ガンマ)およびCH1遺伝子セグメントを欠く非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座;
(ii)軽鎖を発現させるため(VJ再構成後に)の機能的抗体軽鎖遺伝子座であり、
該細胞がIgM型重鎖および軽鎖を含むIgM抗体を発現することができ(任意選択で、それぞれの重鎖はCH1ドメインを含む);
それぞれの細胞の重鎖遺伝子座が、軽鎖の非存在下で1つまたは複数の非ミュー型(例えば、IgG型)重鎖を含む非ミュー(例えば、IgG)抗体を生成するためのアイソタイプスイッチングを受けることができ、それぞれの重鎖がCH1ドメインを欠く、機能的抗体軽鎖遺伝子座;ならびに
(iii)機能的軽鎖が前記非ミュー型抗体へのアイソタイプスイッチング後に発現されない、軽鎖発現を停止させるための手段
を含むリンパ球細胞を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)、例えば、直前の実施形態に記載の脊椎動物も提供する。
【０２４８】
同様に、本発明は、細胞に関する。かくして、細胞ゲノムが、
(i)軽鎖を発現させるための機能的抗体軽鎖遺伝子座;
(ii)IgM型重鎖および軽鎖を含む(任意選択で、それぞれの重鎖はCH1ドメインを含む)IgM抗体を発現させるため;ならびに軽鎖の非存在下に1つまたは複数の非ミュー型重鎖を含み、それぞれの重鎖がCH1ドメインを欠く非ミュー(例えば、IgG)抗体を生成するためのIgMから非ミュー(例えば、IgG)へのアイソタイプスイッチングのための、(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ(例えば、S-ミュー、例えば、内因性S-ミュー)、ミュー定常領域(例えば、CH1遺伝子セグメントを含む)、第2のスイッチ(例えば、S-ガンマ、例えば、内因性S-ガンマ)およびCH1遺伝子セグメントを欠く非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座;ならびに
(iii)機能的軽鎖が前記非ミュー型抗体へのアイソタイプスイッチング後に発現されない、軽鎖発現を停止させるための手段
を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞、例えば、リンパ球細胞または本明細書で定義される他の細胞)が提供される。
【０２４９】
脊椎動物または細胞のある例において、軽鎖発現を停止させるための手段は、前記軽鎖遺伝子座からの機能的軽鎖発現にとって必須であるヌクレオチド配列(例えば、軽鎖遺伝子座の軽鎖可変領域、J領域および/またはCL領域)を含み、そのヌクレオチド配列はIgMを発現する未熟B細胞において機能的であるが、そのヌクレオチド配列は前記非ミュー型抗体を発現する成熟B細胞においては存在しないか、または実質的に非機能的である。
【０２５０】
例えば、それぞれの軽鎖遺伝子座の全部または実質的に全部が、前記脊椎動物において欠失している。例えば、カッパ(またはカッパおよびラムダ)軽鎖遺伝子座は、それぞれの遺伝子座の軽鎖定常遺伝子セグメントおよび/またはJ領域を欠失させることによって非機能的にされる。欠失は、例えば、以下の実施例に記載のような、段階特異的リコンビナーゼを用いて実施することができる。例えば、カッパ(またはカッパおよびラムダ)軽鎖遺伝子座は、軽鎖可変領域(再構成されたまたは再構成されていないV-J)遺伝子セグメントの欠失によって非機能的にされる。別の例においては、カッパ(またはカッパおよびラムダ)軽鎖遺伝子座は、ネオマイシン耐性ヌクレオチド配列などの干渉配列の前記軽鎖遺伝子座もしくはそれぞれの前記軽鎖遺伝子座への挿入によって、または軽鎖遺伝子座遺伝子セグメント(例えば、定常領域および/またはJ領域セグメント)のリコンビナーゼもしくはトランスポザーゼ媒介性逆転によって非機能的にされる。逆転は、本明細書に記載のKymab LimitedのPCT出願でさらに考察されたように、遺伝子座を不活化することができる。
【０２５１】
一例において、ヌクレオチド配列は、軽鎖遺伝子座またはその一部であり、その配列は第1および第2の部位特異的組換えエレメント(SSRE)によりフランキングし、そのゲノムは対応する部位特異的リコンビナーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子を含み、その遺伝子はIgMを発現する未熟B細胞においては不活性であるが、前記IgG型抗体を発現する成熟B細胞においては第1および第2のSSREで切断し、ゲノムから軽鎖遺伝子座もしくはその一部を欠失させるように活性であるか、または遺伝子座を不活化する。
【０２５２】
必要な遺伝子操作をES細胞において行うことができ、従って、以下に例示されるように、子孫B細胞および対応する脊椎動物のその後の分化段階において条件的軽鎖不活化を行うことができる。
【０２５３】
ある実施形態において、カッパ鎖発現は、この手段を用いて停止される。ある実施形態において、ラムダ鎖発現は、この手段を用いて停止される。ある実施形態において、カッパおよびラムダ鎖発現は、この手段を用いて停止される。マウス系を用いる場合、ラムダ鎖発現は通常低く(約5%)、従って、アイソタイプスイッチングされた鎖が発現される場合にカッパ鎖発現が停止される限り、ラムダ鎖発現を停止させる必要はない。
【０２５４】
脊椎動物または細胞のある実施形態において、軽鎖発現を停止させるための手段は、IgMを発現する未熟B細胞における前記軽鎖遺伝子座からの軽鎖発現を駆動するための調節エレメント(例えば、プロモーター)を含むヌクレオチド配列を含み、その調節エレメントは、前記非ミュー型抗体を発現する成熟B細胞においては実質的に不活性であるか、または存在しない。
【０２５５】
脊椎動物または細胞のある実施形態において、ヌクレオチド配列または調節エレメントは、(例えば、すぐ上流および下流の5'および3'側の)第1および第2の組合せエレメント(例えば、部位特異的組換えエレメントまたはトランスポザーゼエレメント、例えば、piggyBac LTR)によりフランキングし、そのゲノムは対応するリコンビナーゼまたはトランスポザーゼをコードする遺伝子を含み、遺伝子はIgMを発現する未熟B細胞においては不活性であるが、前記非ミュー型抗体を発現する成熟B細胞においては第1および第2の組換えエレメントを切断し、ヌクレオチド配列または調節エレメントを不活化するように活性である。切断は、ヌクレオチド配列または調節エレメントの欠失、転位および/または逆転を誘導し、それを不活化することができる。
【０２５６】
部位特異的組換えエレメントおよびリコンビナーゼの例は、frt/flp、dre/roxおよびcre/loxまたはこれらの組合せである。第1および第2の組換えエレメントは異なっていてもよい。
【０２５７】
脊椎動物または細胞のある実施形態においては、調節エレメントはIgMを発現する未熟B細胞において誘導され、および/または前記非ミュー型抗体を発現する成熟B細胞においては抑制される。
【０２５８】
脊椎動物または細胞のある実施形態において、軽鎖発現を停止させるための手段は、再構成された軽鎖可変ドメイン、例えば、公知のエピトープ結合特異性の所定のVLを含むポリペプチド鎖を発現させるためのゲノム中の別の遺伝子座である。これは、軽鎖発現のスイッチを切るために軽鎖対立遺伝子排除を用いる。同様に、代替的な例において、前記別の遺伝子座は、上記で定義された重鎖遺伝子座であり、前記アイソタイプスイッチング後に、重鎖遺伝子座は前記再構成された軽鎖可変ドメインを含む抗体鎖をコードする。任意選択で、抗体鎖は第2の抗体可変ドメインをさらに含む;任意選択で、軽鎖可変ドメインおよび前記第2の抗体可変ドメインはそれぞれ、異なる第1および第2のエピトープに特異的に結合する。
【０２５９】
脊椎動物または細胞のある実施形態において、再構成された軽鎖可変ドメインは上記で定義された重鎖遺伝子座の前記再構成されていない可変領域から誘導され(例えば、VL-Fcが生成される)、重鎖遺伝子座の再構成されていない可変領域は1つまたは複数の軽鎖J遺伝子セグメントの5'側に1つまたは複数の軽鎖V遺伝子セグメントを含む。
【０２６０】
脊椎動物または細胞のある実施形態において、抗体鎖は、(5'から3'の方向に)上記で定義された重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される可変ドメイン(例えば、VL-Fcが生成される)、任意選択のリンカー(例えば、本明細書で定義される任意のリンカー)および前記再構成された軽鎖可変ドメインを含む。
【０２６１】
脊椎動物または細胞のある実施形態において、非ミュー定常領域は、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分(または任意選択のリンカーと共に複数、例えば、2つまたは3つのエピトープ結合ドメイン;例えば、CH1ドメインの代わりに)をコードするヌクレオチド配列を含み、アイソタイプスイッチング後に、脊椎動物は、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価(例えば、二価、例えば、二特異的)ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分はそれぞれ第1および第2のエピトープ(例えば、エピトープは異なる、または同じである)に特異的に結合する。
【０２６２】
例えば、ポリペプチド鎖は、上記で定義されたように、構造V-L-E(式中、Vは重鎖遺伝子座の前記再構成された可変領域から誘導される抗体可変ドメインであり、Lは任意選択のリンカーであり、Eはエピトープ結合ドメインである)を有する。
【０２６３】
脊椎動物のある実施形態において、非ミュー定常領域は、前記エピトープ結合部分の3'側に1つまたは複数の非ミュー定常領域遺伝子セグメント(例えば、CH2およびCH3遺伝子セグメント)を含み、アイソタイプスイッチング後に、脊椎動物は(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカー、エピトープ結合部分および前記1つまたは複数の非ミュー定常領域遺伝子セグメントをそれぞれ含む多価ポリペプチド鎖を発現する。
【０２６４】
脊椎動物または細胞のある実施形態において、ポリ(A)部位はエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列の3'側(例えば、3'側すぐ)にあり、アイソタイプスイッチング後に、脊椎動物は(N末端からC末端の方向に)構造V-X-L-E(式中、Vは重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメインであり、Xはガンマ定常領域によりコードされる抗体ヒンジ領域またはポリペプチドに存在せず、Lは任意選択のリンカーであり、Eはエピトープ結合部分である)を有するか、またはそれからなる多価ポリペプチド鎖を発現する;任意選択で、脊椎動物は、V-X-L-EまたはV-L-E二量体を発現する。
【０２６５】
例えば、ポリ(A)部位は、転写を終結させるための停止コドンと一緒に提供される。
【０２６６】
例えば、非ミュー定常領域は、ガンマ型CH2-CH3である。かくして、一例においては、構造V-CH2-CH3-L-Eを有する二特異的鎖が発現され、これは例えば、二量体として生成され得る(この場合、鎖のCH2-CH3の相互の親和性は二量体化を補助し得る)。二量体は、結合のアビディティを提供するのに有用であるそれぞれのエピトープ特異性のための複数の結合部位を提供する。本発明の実施形態におけるガンマCH2およびCH3の提供はまた、in vivoでの半減期の延長、再循環、ADCCまたは細胞殺傷活性などのFc活性を提供するのに有用である。ADCCおよび細胞殺傷は、がん、炎症疾患、自己免疫疾患および感染症の分野における適応症を処置するのに有用であり得る。
【０２６７】
「抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性」または「ADCC」とは、特定の細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ)上に存在するFc受容体(FcR)上に結合した分泌型Igが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を抗原担持標的細胞に特異的に結合させ、続いて標的細胞を細胞毒素で殺傷させる細胞傷害性の形態を指す。標的細胞の表面を指向するリガンド特異的高親和性IgG抗体は、細胞傷害性細胞を刺激し、そのような殺傷にとって必要である。標的細胞の溶解は細胞外のものであり、直接的な細胞間接触を必要とし、補体を含まない。
【０２６８】
ADCCによる標的細胞の溶解を媒介する任意の特定の抗体の能力をアッセイすることができる。ADCC活性を評価するために、対象の抗体を、標的細胞の細胞溶解をもたらす抗原抗体複合体により活性化され得る免疫エフェクター細胞と共に標的リガンドを展示する標的細胞に添加する。細胞溶解は一般に、溶解した細胞からの標識(例えば、放射性物質、蛍光染料または天然の細胞内タンパク質)の放出により検出される。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が挙げられる。in vitro ADCCアッセイの特定例は、Wisecarverら、1985, 19:21 1頁; Bruggemannら、1987, J Exp Med 166: 1351頁; Wilkinsonら、2001, J Immunol Methods 258: 183頁; Patelら、1995 J Immunol Methods 184:29頁(それぞれ参照により本明細書に組込まれる)に記載されている。あるいは、またはさらに、対象の抗体のADCC活性を、in vivoで、例えば、Clynesら、1998, PNAS USA 95:652頁(この内容はその全体が参照により本明細書に組込まれる)に開示されたものなどの、動物モデルにおいて評価することができる。
【０２６９】
「補体指向性細胞傷害性」またはCDCとは、補体カスケードが抗体Fcに結合する補体構成成分C1qにより活性化される細胞傷害性の形態を指す。
【０２７０】
本明細書で用いられる用語「Fc」とは、(N末端からC末端の方向に)免疫グロブリンCH2およびCH3ドメインを含むタンパク質を指す。CH2およびCH3ドメインは、抗体または重鎖の定常領域の少なくとも一部を形成することができる。
【０２７１】
ある例において、ポリ(A)部位は、1つまたは複数の非ミュー定常領域遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列の3'側にあり、アイソタイプスイッチング後に、脊椎動物は(N末端からC末端の方向に)構造V-X-L-E-L-C(式中、Vは重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメインであり、Xは非ミュー定常領域によりコードされる抗体ヒンジ領域またはポリペプチドに存在せず、Lは任意選択のリンカーであり、Eはエピトープ結合部分であり、Cnは1つまたは複数の非ミュー定常領域遺伝子セグメント(例えば、ガンマFc)である)を有するか、またはそれからなる多価ポリペプチド鎖を発現する;任意選択で、脊椎動物は、V-X-L-E-L-CまたはV-L-E-L-C二量体を発現する。
【０２７２】
ある例において、非ミュー定常領域は、ガンマ型CH2、CH3またはCH2-CH3である。かくして、一例においては、構造V-CH2-L-E-CH3を有する二特異的鎖が発現され、これは例えば、二量体として生成され得る(この場合、鎖間のCH2とCH3の相互の親和性は二量体化を補助し得る)。二量体は、結合のアビディティを提供するのに有用である、それぞれの抗原特異性のための複数の結合部位を提供する。
【０２７３】
脊椎動物または細胞のある例において、エピトープ結合部分またはそれぞれのエピトープ結合部分は、本明細書に開示される任意のそのような部分であり、例えば、それは、抗体可変ドメイン(例えば、VLもしくはVH、抗体単一可変ドメイン(ドメイン抗体もしくはdAb)、ラクダ科VHH抗体単一可変ドメイン、サメ免疫グロブリン単一可変ドメイン(NARV)、Nanobody(商標)またはラクダ化VH単一可変ドメイン);T細胞受容体結合ドメイン;免疫グロブリンスーパーファミリードメイン;無顎類可変リンパ球受容体;フィブロネクチンドメイン(例えば、Adnectin(商標));定常ドメインが機能的CH1ドメインではない抗体定常ドメイン(例えば、CH3ドメイン、例えば、Fcab(商標)のCH2および/またはCH3);scFv;(scFv)2;sc-ダイアボディ;scFab;センチリンおよびCTLA-4(Evibody(商標))から選択されるスキャホールドから誘導されるエピトープ結合ドメイン;リポカリンドメイン;プロテインAのZドメインなどのプロテインA(例えば、Affibody(商標)またはSpA);A-ドメイン(例えば、Avimer(商標)またはMaxibody(商標));熱ショックタンパク質(例えば、GroEIおよびGroESから誘導されるエピトープ結合ドメイン);トランスフェリンドメイン(例えば、trans-body);アンキリンリピートタンパク質(例えば、DARPin(商標));ペプチドアプタマー;C型レクチンドメイン(例えば、Tetranectin(商標));ヒトγ-クリスタリンまたはヒトユビキチン(アフィリン);PDZドメイン;サソリ毒;ならびにヒトプロテアーゼ阻害剤のkunitz型ドメインからなる群から選択される。
【０２７４】
脊椎動物または細胞のある例において、脊椎動物は、前記非ミュー型(例えば、IgG型)抗体を生成するようにアイソタイプスイッチングを受けたリンパ球細胞を含む;または細胞は、前記非ミュー型(例えば、IgG型)抗体を生成するようにアイソタイプスイッチングを受けている。
【０２７５】
脊椎動物または細胞のある例において、脊椎動物は、所定の抗原で免疫されており、脊椎動物はCH1ドメインを欠き、所定の抗原に特異的に結合する可変ドメインを含む非ミュー型(例えば、IgG型)抗体を発現する;または細胞は、そのような脊椎動物から単離される。
【０２７６】
脊椎動物または細胞のある例において、N末端可変ドメインもしくは5'末端可変領域またはそれぞれのN末端可変ドメインもしくは5'末端可変領域は、ヒト可変ドメインまたは領域である。ヒト可変ドメインは、再構成された可変領域DNA配列から誘導されるRNAによりコードされる可変ドメインであり、再構成は、ヒトV遺伝子セグメントの、ヒトJ遺伝子セグメント(およびまた、任意選択で、再構成された可変領域がVH領域である場合、ヒトD遺伝子セグメント)との再構成である。かくして、例えば、RNAは、任意選択で、抗体生成の間にin vivoで天然に見られる変異と共に、それが再構成された可変領域DNA配列によりコードされる場合、そのようなDNA配列から誘導される。
【０２７７】
脊椎動物または細胞のある例において、N末端可変ドメインもしくは5'末端可変領域またはそれぞれのN末端可変ドメインもしくは5'末端可変領域は、ラクダ科、ラクダ化されたヒト;マウス;ラット;げっ歯類;ウサギ;ニワトリ;またはウシ可変ドメインまたは領域である。
【０２７８】
ポリペプチド、鎖、抗体、脊椎動物または細胞のある例において、それぞれの定常領域またはドメインは、内因性非ヒト脊椎動物定常領域またはドメインである。ポリペプチド、鎖、抗体、脊椎動物または細胞のある例において、それぞれの非ミュー定常領域またはドメインは、ヒト非ヒト脊椎動物定常領域またはドメインである。
【０２７９】
脊椎動物または細胞のある例において、リンパ球細胞は、前記非ミュー抗体または二価ポリペプチド鎖を発現するB細胞を含み、非ミュー抗体または多価鎖は前記非ヒト脊椎動物に対して外来である抗原(例えば、ヒト抗原または感染症病原体の抗原)に特異的である;または前記非ヒト脊椎動物細胞は、そのようなB細胞である。
【０２８０】
本発明はまた、以下のようなB細胞、ハイブリドーマおよび生成物も提供する:
上記のB細胞から生成される不死化B細胞またはハイブリドーマ。
【０２８１】
上記のB細胞もしくはハイブリドーマから単離された非ミュー型(例えば、IgG型)抗体または多価鎖;または非ヒト定常ドメインがヒト定常ドメインで置き換えられたそのヒト化バージョン。例えば、非ヒト定常ドメインの全部が欠失され、任意選択で、1つまたは複数のヒト定常ドメイン(例えば、欠失した非ヒトドメインに対応する)で置き換えられている。かくして、一実施形態においては、非ヒト(例えば、マウス)Fcは、ヒトFcで置き換えられる。
【０２８２】
方法
本発明は、以下のようなアイソタイプスイッチングされた非ミューH2抗体および重鎖のin vivoでの生成のための改良された方法を提供する。
【０２８３】
かくして、本発明は、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)中に体細胞超変異した可変領域を含むポリペプチド鎖を生成する方法であって、
(a)抗体がそれぞれ重鎖および軽鎖遺伝子座から発現される重鎖および軽鎖(任意選択で、CH1ドメインを含む重鎖)を含む、未熟B細胞中で脊椎動物IgM抗体を発現させる工程;
(b)脊椎動物を所定のエピトープで免疫し、少なくともいくつかの重鎖遺伝子座におけるアイソタイプスイッチングおよび抗体がCH1ドメインを欠く重鎖を含み、抗原に特異的に結合する可変領域を含む、体細胞超変異を受けた非ミュー(例えば、IgG)抗体の発現を得る工程;ならびに
(c)それぞれの選択された鎖が、エピトープに特異的に結合する体細胞超変異した可変領域を含む、前記エピトープに結合する可変領域の選択により前記免疫した脊椎動物から1つまたは複数のポリペプチド鎖を選択する工程
を含み、工程(b)において軽鎖発現の非存在下で非ミュー抗体を発現させる工程をさらに含む、方法を提供する。
【０２８４】
例えば、工程(c)において、鎖は、血清、血液、脾臓細胞もしくは組織、リンパ節細胞もしくは組織または二次リンパ器官細胞もしくは組織から選択される。
【０２８５】
任意選択で、ポリペプチド鎖は、1つまたは複数の重鎖定常ドメインを含み、この意味において、鎖は重鎖と見なすことができる。別の実施形態においては、鎖は定常ドメインを含まない鎖であり、例えば、鎖は本明細書に記載のようなV-L-Eポリペプチドである。
【０２８６】
前記方法は、任意選択で、免疫した脊椎動物から、エピトープに結合する体細胞超変異した可変領域を含むポリペプチド鎖を発現するB細胞を単離する工程;および任意選択で、該細胞を不死化するか、またはそれからハイブリドーマを生成する工程を含む。
【０２８７】
前記方法は、任意選択で、エピトープに結合する体細胞超変異した可変領域を含む選択されたポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を取得し、該ヌクレオチド配列を、ポリペプチド鎖またはそのヒト化バージョンの発現のための発現ベクターに導入する工程を含む;任意選択で、ベクターは宿主細胞(例えば、大腸菌(E.coli)、酵母、ピチア(Picchia)、サッカロミセス(Saccharomyces)、CHOまたはHEK293細胞)中にある。
【０２８８】
前記方法のある実施形態において、脊椎動物は、本明細書の本発明の任意の態様によるものである。
【０２８９】
本発明は、前記方法により得られた多特異的ポリペプチド鎖またはエピトープに特異的に結合するその誘導体を提供する。
【０２９０】
段階スイッチ可能軽鎖遺伝子座
本明細書および以下の実施例で説明されるように、本発明の脊椎動物および細胞における条件的、または段階特異的な軽鎖発現を提供することが望ましい。これは、例えば、所定のエピトープまたは抗原に特異的に結合する非ミュー重鎖または抗体を発現させる場合に有用である。
【０２９１】
かくして、本発明は、ゲノムが、抗体重鎖遺伝子座および抗体軽鎖遺伝子座、
(a)IgM抗体を発現するリンパ球細胞(例えば、未熟B細胞)中で軽鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)軽鎖可変領域および定常領域(例えば、CκまたはCλ)を含む軽鎖遺伝子座;ならびに
(b)非ミュー(例えば、IgG)抗体を発現するリンパ球細胞における軽鎖発現を停止させるための手段
を含む、任意選択で本発明の任意の他の態様に記載の非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)を提供する。
【０２９２】
例えば、軽鎖可変領域は、1つもしくは複数のヒトVκ遺伝子セグメントおよび1つもしくは複数のヒトJκ遺伝子セグメント;または1つもしくは複数のヒトVλ遺伝子セグメントおよび1つもしくは複数のヒトJλ遺伝子セグメントを含む。
【０２９３】
ゲノムが、抗体重鎖遺伝子座および抗体軽鎖遺伝子座を含み、軽鎖遺伝子座が、
(a)IgM抗体を発現するリンパ球細胞(例えば、未熟B細胞)中で軽鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)軽鎖可変領域および定常領域(例えば、CκまたはCλ);ならびに
(b)非ミュー(例えば、IgG)抗体を発現するリンパ球細胞における軽鎖発現を停止させるための手段
を含む、任意選択で本発明の任意の他の態様に記載の非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)またはハイブリドーマ。
【０２９４】
例えば、軽鎖可変領域は、1つもしくは複数のヒトVκ遺伝子セグメントおよび1つもしくは複数のヒトJκ遺伝子セグメント;または1つもしくは複数のヒトVλ遺伝子セグメントおよび1つもしくは複数のヒトJλ遺伝子セグメントを含む。
【０２９５】
軽鎖発現を停止させるための手段の例は、上記および実施例に提供される。
【０２９６】
それぞれの重鎖および軽鎖遺伝子座は、好ましい実施形態においては、内因性非ヒト脊椎動物ゲノムの重鎖または軽鎖遺伝子座である、すなわち、それは前記型の脊椎動物または細胞の重鎖または軽鎖遺伝子座の生殖系列位置にある。この例においては、従って、本発明の遺伝子座を、外因性DNAを内因性(すなわち、非ヒト脊椎動物)重鎖または軽鎖遺伝子座に挿入することにより構築することができる。別の実施形態においては、本発明の遺伝子座は、ゲノム中の他の場所で(すなわち、内因性重鎖遺伝子座位置ではない)合成的に構築され、野生型脊椎動物または細胞中の重鎖遺伝子座を担持する染色体とは異なる染色体上にあってもよい。例えば、本発明の遺伝子座は、Rosa26遺伝子座で構築される。
【０２９７】
ヒトDNAのストレッチを、1つのピースで、または連続挿入物で、非ヒト脊椎動物のゲノムまたは細胞(例えば、ES細胞)ゲノム中に挿入することができる。例えば、複数の細菌人工染色体(BAC)を、それらの間に、挿入されるヒト定常領域DNAの全配列を含み、それぞれのBACがそのDNAのストレッチの一部を含有する、標準的な組換え工学技術を用いて構築することができる。連続BACからの連続挿入物(例えば、標準的な相同組換え(例えば、本明細書に開示されるRegeneronおよびAblexisのPCTを参照されたい)を用いる)または連続リコンビナーゼ媒介性カセット交換-sRMCE(例えば、本明細書に開示されるKymab LimitedのPCTを参照されたい)を用いることにより、当業者であれば、ゲノム中にトランスジェニック遺伝子座を築き上げることができる。ES細胞をこのように操作する場合、ES細胞を標準的であるように用いて、ドナー胚盤胞に移植した後、養母に移植することができる。生殖系列の伝達および任意の必要なその後の育種および交配(再度、従来的である)に関して、当業者であれば、本発明の遺伝子座を担持する子孫脊椎動物および細胞に到達することができる。この遺伝子座は、同型状態(例えば、それぞれの重鎖対立遺伝子での本発明の遺伝子座)または異型状態(例えば、第2の対立遺伝子が不活化された内因性重鎖であり、従って、本発明の遺伝子座を担持する、第1の対立遺伝子からの重鎖のみの発現が重鎖の発現を提供する)で存在してもよい。代替において、本発明の異なる遺伝子座は、ゲノム中の重鎖遺伝子座の第1および第2の対立遺伝子に提供され、従って、異なる組合せのヒトアイソタイプスイッチングされた重鎖を遺伝子座の組合せによって発現させることができる。
【０２９８】
ある実施形態において、ゲノムはまた、ヒト軽鎖可変領域を発現するトランスジェニック軽鎖遺伝子座を含み、内因性軽鎖発現は実質的に不活性である;また、内因性重鎖発現は実質的に不活性である。この実施形態は、有利には、完全ヒト重鎖および軽鎖N末端可変領域のみの予測可能な発現のためのゲノムを提供し、当業者であれば、抗体のプールから、(例えば、標的抗原を用いる免疫化の後に)脊椎動物または細胞のin vivo機構によって変異および成熟および選択を受けた非ミュー型抗体(例えば、ガンマ型)を選択することができる。
【０２９９】
内因性IgMについてVH、DおよびJH組換えならびに初期発現を適合することにより、これは有利には、内因性RAG-1およびRAG-2を効率的に用いることを可能にし、ならびに、抗体およびB細胞発生に関与する内因性制御、変異およびシグナリングを利用することを可能にする。次いで、本発明は、ヒト非ミューC領域へのスイッチングを可能にし、内因性活性化誘導シチジンデアミナーゼ(AID)により行われる体細胞超変異により親和性成熟した生成物重鎖を生成することができる。依然として良好に動作する(例えば、良好な発現、親和性、生物物理学的特徴)(例えば、エピトープ結合部分について)これらの再構成された可変領域は、マウスによってin vivoで選択され、所定の抗原を用いる免疫化後に増幅される。これは、良好な、完全ヒト抗体および重鎖を選択するためにマウス(または他の非脊椎動物)系を利用する方法で所望の抗体/重鎖を発現する選択されたB細胞の親和性成熟およびin vivoでの増幅と一緒に、内因性抗体およびB細胞の生成および制御を利用する利点を保持する。これは、良好な生物物理学的特徴、発現、親和性などの選択が考慮されず(かくして、先行技術においてはこれらのダウングレードをもたらすことが多い)、in vivoでの初期生成後に多段階の手順を追加する、in vitroでの先行技術の操作方法より優れている。
【０３００】
一実施形態においては、本発明の脊椎動物または細胞は、前記非ミューアイソタイプの内因性抗体重鎖を発現しない。例えば、これは、内因性重鎖可変領域を欠失させるか、または不活化するための標準的な方法を用いて行われる。かくして、当業者であれば、脊椎動物または細胞により生成される所定のヒト非ミューアイソタイプ(例えば、IgG抗体)の重鎖(およびこれらを含む抗体)が、ヒトV、DおよびJ遺伝子セグメント(またはヒト再構成VDJ)が重鎖遺伝子座に含まれる場合、ヒト可変領域を常に含むことを知っている。
【０３０１】
一実施形態においては、本発明の脊椎動物または細胞において、ヒト非ミュー定常領域は、ガンマ定常領域(例えば、ガンマ-1、-2、3または-4)である。ガンマ定常領域の代わりに、定常領域はデルタ、アルファ(例えば、アルファ-1もしくは-2)またはエプシロン定常領域であってもよい。かくして、本発明により、当業者は得られる抗体および重鎖の所望の定常領域機能に従って脊椎動物または細胞のゲノムを調整することができる。
【０３０２】
一実施形態においては、本発明の脊椎動物または細胞において、ガンマ定常領域は、抗体Fc領域をコードするCH2およびCH3遺伝子セグメントを含む。ある例において、定常領域は、CH1遺伝子セグメントも含む。これは、4鎖抗体(古典的なH2L2抗体)の一部を形成するためのものである重鎖を生成するのに有用である。別の例においては、定常領域はCH1遺伝子セグメントを欠く。これは、軽鎖を含まない重鎖のみの抗体(H2抗体)の一部を形成するためのものである重鎖を生成するのに有用である。
【０３０３】
一実施形態においては、本発明の脊椎動物または細胞において、ゲノムは、ヒト可変領域を含む軽鎖の発現のための定常領域の上流にヒトVLおよびJL遺伝子セグメントを含む軽鎖遺伝子座を含む;任意選択で、定常領域は、ヒト軽鎖定常領域である。例えば、ゲノムは、ヒト可変領域を含むカッパ軽鎖の発現のための内因性カッパ遺伝子座中の内因性またはヒトカッパ定常領域の上流にヒトVκおよびJκ遺伝子セグメントを含む軽鎖遺伝子座を含む。この例において、脊椎動物がマウスである場合、マウスにおけるラムダ鎖発現は相対的に低いため、ラムダ遺伝子座をヒト化する必要はなくてもよい。任意選択で、ラムダ遺伝子座は不活性である、および/または内因性もしくはヒトラムダ定常領域の上流にヒトVλおよびJλを含む。任意選択で、内因性カッパ鎖発現は不活性である。
【０３０４】
例えば、脊椎動物または細胞は、アイソタイプスイッチング後に内因性軽鎖を実質的に発現しない。
【０３０５】
内因性抗体、抗体鎖または遺伝子セグメント使用の不活化は、例えば、実質的に完全な不活化または防止である(内因性抗体鎖など(例えば、内因性重鎖など)が実質的に100%、すなわち、本質的に(例えば、10、5、4、3、2、1または0.5%未満)発現されない)。これは、例えば、非ヒト脊椎動物もしくは細胞により生成される抗体レパートリーを評価することにより抗体鎖(タンパク質)レベルで、または例えば、RACEを用いて抗体遺伝子座のmRNA転写物を評価することによりヌクレオチドレベルで決定することができる。ある実施形態において、不活化は、50%より高い(すなわち、抗体もしくは転写物の50%以下が内因性抗体鎖のものである)、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%より高い。例えば、ある実施形態においては、内因性重鎖発現は、脊椎動物の重鎖レパートリーの85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%以下が内因性重鎖により提供されるように実質的に不活化される。例えば、内因性重鎖発現は、脊椎動物の重鎖レパートリーの実質的にいずれも内因性重鎖によって提供されないように実質的に不活化される。例えば、ある実施形態においては、内因性カッパ鎖発現は、脊椎動物のカッパ鎖レパートリーの85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%以下が内因性カッパ鎖により提供されるように実質的に不活化される。例えば、内因性カッパ鎖発現は、脊椎動物のカッパ鎖レパートリーの実質的にいずれも内因性カッパ鎖によって提供されないように実質的に不活化される。例えば、ある実施形態においては、内因性ラムダ鎖発現は、脊椎動物のラムダ鎖レパートリーの85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%以下が内因性ラムダ鎖により提供されるように実質的に不活化される。例えば、内因性ラムダ鎖発現は、脊椎動物のラムダ鎖レパートリーの実質的にいずれも内因性ラムダ鎖によって提供されないように実質的に不活化される。
【０３０６】
一実施形態においては、本発明の脊椎動物または細胞において、ガンマ定常領域は、CH1遺伝子セグメントを含まない。この実施形態においては、ある例において、軽鎖発現は、非ミュー重鎖が発現される場合、不活性である。これは、非ミューアイソタイプの重鎖のみの抗体を生成するのに有用である。
【０３０７】
ある例において、可変領域および/またはミュー定常領域は、それぞれ、ヒトおよび内因性生殖系列構成にある。用語「生殖系列構成」とは、生殖系列ゲノム構成を指す。例えば、本発明の遺伝子座中に存在するヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントの相対的順序がヒト生殖系列ゲノム中の対応する遺伝子セグメントの順序と同じである場合、生殖系列構成にある。例えば、本発明の遺伝子座が仮定のヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子セグメントA、BおよびCを含む場合、これらのものは、ヒト生殖系列ゲノムの対応する遺伝子セグメントが配列5'-A-B-C-3'を含む場合、(遺伝子座中で5'から3'に)この順序で提供される;任意選択で、遺伝子間セグメントも生殖系列構成にある(すなわち、AからCのヌクレオチド配列はヒト生殖系列ゲノムにおいてAからCの連続したヌクレオチド配列のストレッチに対応する)。ヒト生殖系列配列の利用可能なデータベースおよび供給源は、以下に考察される。かくして、ある例において、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のエレメント(例えば、遺伝子セグメント、エンハンサーまたは他の調節エレメント)が本発明による遺伝子座中に提供される場合、ヒトIg遺伝子座エレメントは、そのエレメントの相対的順序がヒト生殖系列ゲノム中の対応するエレメントの順序と同じであり、エレメント間のヒト配列が含まれる場合、生殖系列構成にあり、これらのものは、ヒト生殖系列ゲノム中の対応するエレメント間のそのような配列に対応する。かくして、仮定的な例において、トランスジェニック遺伝子座は、配列5'-A-S1-B-S2-C-S3-3'(ここで、A、BおよびCはヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントであり、S1〜S3はヒト遺伝子間セグメント配列であり、対応する配列5'-A-S1-B-S2-C-S3-3'はヒト生殖系列ゲノム中に存在する)中にヒトエレメントを含む。例えば、これは、本発明のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座中に、ヒト生殖系列ゲノム中のAからCのDNA配列に対応するDNA挿入物(またはAからCのDNA配列を含む挿入物)を提供することにより達成することができる。ヒト生殖系列ゲノムおよび免疫グロブリン遺伝子座中の配列は当業界で公知である(例えば、IMGT、Kabatおよび他の抗体資源を参照されたい)。
【０３０８】
ある実施形態において、重鎖遺伝子座(またはそれぞれの重鎖遺伝子座)のVH遺伝子セグメントレパートリーは、機能的ヒトVH遺伝子セグメントの実質的に完全なレパートリーである;任意選択で、少なくとも6の異なるヒトJH遺伝子セグメント、27の異なるヒトDセグメントおよび少なくとも40の異なるヒトVH遺伝子セグメントを提供する。
【０３０９】
ある実施形態において、重鎖遺伝子座(またはそれぞれの重鎖遺伝子座)のVH遺伝子セグメントレパートリーは、少なくとも20、25、30、35または40の異なるヒトVH遺伝子セグメントである。
【０３１０】
ある実施形態において、本発明の方法は、所望の抗体または重鎖特性(例えば、標的抗原に対する結合親和性)に基づいて1つまたは複数の重鎖または抗体を選択する工程を含み、選択された抗体は非ミュー重鎖を含むか、または選択された重鎖は非ミュー鎖である。
【０３１１】
抗体/鎖選択の方法
ある態様は、抗体、重鎖、または前記抗体をコードするヌクレオチド配列を単離する方法であって、
(a)本発明による脊椎動物を、脊椎動物が抗体を生成するように抗原で免疫する工程(例えば、Harlow, E. & Lane, D. 1998、第5版、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY;ならびにPasqualiniおよびArap, Proceedings of the National Academy of Sciences (2004) 101:257〜259頁を参照されたい);ならびに
(b)免疫した脊椎動物から、前記抗原に特異的に結合する抗体もしくは重鎖および/または前記抗体の少なくとも重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を単離する工程
を含む方法を提供する。
【０３１２】
好適には、免疫原性量の抗原が、本発明の方法において送達される。本発明はまた、上記のように生成された抗体もしくは重鎖またはその誘導体を、その抗体/鎖の一部を認識する第2の検出剤で検出することを含む、標的抗原を検出するための方法にも関する。
【０３１３】
工程(b)における抗体の単離を、従来の抗体選択技術、例えば、任意選択で、当業者には容易に明らかであるように、増大するストリンジェンシーでの反復ラウンドと共に、固相支持体上に固定された抗原に対する抗体のパンニングを用いて実行することができる。
【０３１４】
さらなる任意選択の工程として、工程(b)の後に、重鎖可変領域のアミノ酸配列を変異させて、前記抗原への結合に関する親和性を改善する。変異は、当業者には容易に明らかであるような従来の技術により、例えば、変異性PCRにより生じさせることができる。親和性は、当業者には容易に明らかであるような従来の技術により、例えば、Biacore(商標)またはProteon(商標)を用いる、例えば、表面プラズモン共鳴により決定することができる。
【０３１５】
さらに、またはあるいは、さらなる任意選択の工程として、工程(b)の後に、重鎖可変領域のアミノ酸配列を変異させて、抗体の1つまたは複数の生物物理学的特徴、例えば、融点、溶液状態(単量体もしくは二量体)、安定性および発現(例えば、CHOもしくは大腸菌における)のうちの1つまたは複数をさらに改善する。
【０３１６】
ある態様は、任意選択で、ヒト医療における使用のため、例えば、ヒト患者における医学的状態または疾患を処置および/または防止するための、本発明の抗体、鎖またはポリペプチドを提供する。
【０３１７】
本発明は、本発明の抗体、鎖もしくはポリペプチドまたはそのコピーもしくは誘導体を含む医薬組成物を提供する。
【０３１８】
任意選択で、前記方法は、前記免疫した脊椎動物から、前記単離された抗体または重鎖を発現するB細胞を単離する工程;および任意選択で、B細胞を不死化する工程を含む。
【０３１９】
任意選択で、前記方法は、前記免疫した脊椎動物またはB細胞から、前記単離された抗体またはその重鎖をコードするヌクレオチド配列を単離する工程を含む。
【０３２０】
前記方法は、本発明のヌクレオチド配列もしくはそのコピー、またはその誘導体を含み、任意選択で、最大で15、10、9、8、7、6、5、4、3、または1個の変異を含むベクター(任意選択で、宿主細胞中の)を提供する。誘導体は、標的抗原に特異的に結合する。
【０３２１】
前記方法は、1つまたは複数の前記抗原エピトープと関連するか、またはそれにより引き起こされるヒトにおける医学的状態または疾患を処置または防止する方法であって、ヒトに、本発明の方法において得られたか、または本発明の脊椎動物もしくは細胞から単離された抗原特異的抗体または重鎖を投与する工程を含む方法を提供する。
【０３２２】
前記方法は、前記抗原と関連するか、またはそれにより引き起こされるヒトにおける医学的状態または疾患の処置または予防における使用のための、本発明の方法において得られたか、または本発明の脊椎動物もしくは細胞から単離された抗原特異的抗体または重鎖を提供する。
【０３２３】
前記方法は、前記抗原と関連するか、またはそれにより引き起こされるヒトにおける医学的状態または疾患の処置または予防における使用のための医薬品の製造における、本発明の方法において得られたか、または本発明の脊椎動物もしくは細胞から単離された抗原特異的抗体または重鎖の使用を提供する。
【０３２４】
当業者には容易に明らかであるように、本発明の任意の構成におけるIg遺伝子座中の定常領域の上流でのヒト遺伝子セグメント(例えば、VまたはJ遺伝子セグメント)の作動可能な接続により、遺伝子セグメントを、遺伝子座の定常領域によりコードされる配列を含む免疫グロブリン鎖中で組換え、発現させることができる。
【０３２５】
本発明の任意の構成における一実施形態においては、それぞれの脊椎動物は、非ヒト哺乳動物である。本発明の任意の構成における一実施形態においては、脊椎動物は、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ科(例えば、ラマ、アルパカもしくはラクダ)、ニワトリ、ヤツメウナギまたはサメである。例えば、全ての脊椎動物は、同じ脊椎動物種のものであり、例えば、全てマウスまたは全てラットである。
【０３２６】
本発明の任意の構成において、ヒト遺伝子領域またはセグメントは、同じ個体もしくは異なる個体から誘導されるか、または合成(合成的に変異されたヒト遺伝子セグメント)であってよく、もしくはヒトコンセンサス配列であってもよい。
【０３２７】
ゲノムがヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む非ヒト脊椎動物および脊椎動物細胞を構築するための技術は、当業界で周知である。例えば、WO2011004192、US7501552、US6673986、US6130364、WO2009076464およびUS6586251(これらの開示はその全体が参照により本明細書に組込まれる)を参照されたい。
【０３２８】
一例において、本発明の任意の構成の非ヒト脊椎動物は、少なくとも1x106の多様性の異なる機能的非ミュー免疫グロブリン配列組合せを生じさせることができる。
【０３２９】
ヒト可変領域は、非ヒト脊椎動物ミュー定常領域の上流に、後者は同時に、完全な定常領域または標的抗原を特異的に認識することができる有効な非ミュー抗体/重鎖の形成を可能にするのに十分な部分の定常領域をコードするのに必要とされる全てのDNAを含むヒト定常領域の下流に好適に挿入される。
【０３３０】
本明細書の内因性ミュー非ヒト脊椎動物定常領域は、任意選択で、重鎖にとって適切であるように、野生型遺伝子座に位置する内因性宿主野生型定常領域である。
【０３３１】
脊椎動物がマウスである1つの任意選択の態様においては、ヒト可変領域DNA(V、DおよびJ遺伝子セグメント)の挿入は、マウスゲノムIgH遺伝子座中のJ4エクソンと内因性Sミュー遺伝子座との間の領域を標的とし、一態様においては、座標114,667,090と114,665,190との間、好適には、114,667,090の後の座標114,667,091に挿入される。
【０３３２】
マウスに関する全てのヌクレオチド座標は、別途特定しない限り、マウスC57BL/6J株に関するNCBI m37、例えば、2007年4月のENSEMBL Release 55.37h、例えば、2007年7月のNCBI37(NCBI build 37)(例えば、UCSCバージョンmm9、www.genome.ucsc.eduおよびhttp://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.htmlを参照されたい)に対応するものである。ヒトヌクレオチド座標は、別途特定しない限り、GRCh37(例えば、UCSCバージョンhg19、http://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html)、2009年2月のENSEMBL Release 55に対応するもの、またはNCBI36、Ensemble release 54に対応するものである。ラットヌクレオチドは、別途特定しない限り、RGSC 3.4、2004年12月のENSEMBL release 55.34w、またはBaylor College of Medicine HGSC v3.4、2004年11月(例えば、UCSC rn4、www.genome.ucsc.eduおよびhttp://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.htmlを参照されたい)に対応するものである。
【０３３３】
ヒト可変領域、定常領域または内因性ミュー定常領域の上流もしくは下流の遺伝子セグメントの位置に対する参照は、脊椎動物においてin vivoでミューおよび次いで非ミュー重鎖の形成を可能にする抗体ヌクレオチドエレメントの好適な相対的位置が存在することを意味する。かくして、挿入されたヒトDNAおよび内因性定常領域および任意の他の内因性配列は、抗体または抗体鎖生成のために互いに作動可能な接続にある。
【０３３４】
ヒトおよび非ヒト抗体遺伝子セグメント配列の供給源として、当業者であれば、以下の利用可能なデータベースおよび資源(そのアップデート版を含む)も知っており、これらの内容は参照により本明細書に組込まれる。
【０３３５】
Kabatデータベース(G. JohnsonおよびT. T.Wu, 2002; World Wide Web (www) kabatdatabase.com)。1966年にE.A.KabatおよびT.T.Wuによって作出されたKabatデータベースは、抗体、T細胞受容体、主要組織適合複合体(MHC)クラスIおよびII分子、ならびに免疫学的対象の他のタンパク質の整列された配列を公開する。検索可能なインタフェースは、SeqhuntIIツールにより提供され、配列アラインメント、配列亜群分類、および変動性プロットを作るための幅広いユーティリティが利用可能である。また、特に、本発明における使用のためのヒト遺伝子セグメントを参照して、参照により本明細書に組込まれる、Kabat, E. A.、Wu, T. T.、Perry, H.、Gottesman, K.、およびFoeller, C. (1991)  「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、第5版、NIH Publication No. 91-3242、Bethesda、MDも参照されたい。
【０３３６】
KabatMan(A. C. R. Martin、2002; World Wide Web (www) bioinf.org.uk/abs/simkab.html)。これは、Kabat配列データベースへのクエリーを簡単にするウェブインタフェースである。
【０３３７】
IMGT(International ImMunoGeneTics Information System(登録商標); M.-P. Lefranc、2002; World Wide Web (www) imgt.cines.fr)。IMGTは、あらゆる脊椎動物種の抗体、T細胞受容体、およびMHC分子を専門とする統合情報システムである。それは、ヌクレオチドおよびタンパク質配列、オリゴヌクレオチドプライマー、遺伝子マップ、遺伝子多型、特異性、および二次元(2D)および三次元(3D)構造を含む標準化されたデータへの共通のポータルを提供する。IMGTは、3つの配列データベース(IMGT/LIGM-DB、IMGT/MHC-DB、IMGT/PRIMERDB)、1つのゲノムデータベース(IMGT/GENE-DB)、1つの3D構造データベース(IMGT/3D構造-DB)、および幅広いウェブ資源(「IMGT Marie-Pauleのページ」)ならびに相互作用ツールを含む。
【０３３８】
V-BASE(I. M. Tomlinson、2002; World Wide Web (www) mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)。V-BASEは、1000を超える公開された配列から蓄積された全てのヒト抗体生殖系列可変領域配列の包括的辞書である。それは、再構成された抗体V遺伝子の、その最も近い生殖系列遺伝子セグメントへの割り当てを可能にするアラインメントソフトウェアDNAPLOTのバージョン(Hans-Helmar AlthausおよびWerner Mullerにより開発された)を含む。
【０３３９】
抗体-構造および配列(A. C. R. Martin、2002; World Wide Web (www) bioinf.org.uk/abs)。このページは、抗体の構造および配列に関する有用な情報をまとめたものである。それは、Kabat抗体配列データへの問い合わせインタフェース、抗体、結晶構造に関する一般情報、および他の抗体関連情報へのリンクを提供する。それはまた、Protein Databank(PDB)に寄託されたあらゆる抗体構造の自動化された概要を配布している。特に興味深いのは、抗体可変領域の様々な番号付けスキームの徹底的な記載および比較である。
【０３４０】
AAAAA(A Ho's Amazing Atlas of Antibody Anatomy; A. Honegger, 2001; World Wide Web (www) unizh.ch/〜antibody)。この資源は、構造分析、モデリング、および遺伝子操作のためのツールを含む。それは、抗体およびT細胞受容体配列の包括的構造アラインメントのための統一的スキームを採用しており、抗体分析および図示のためのExcelマクロを含む。
【０３４１】
WAM(Web Antibody Modeling; N. WhiteleggおよびA. R. Rees, 2001; World Wide Web (www) antibody.bath.ac.uk)。University of Bath、United KingdomのCentre for Protein Analysis and Designにより主催されている。確立された理論的方法の組合せを用いて抗体Fv配列の3Dモデルを構築するためのAbMパッケージ(以前はOxford Molecularにより市販されていた)に基づけば、このサイトは最新の抗体構造情報も含む。
【０３４２】
Mike's Immunoglobulin Structure/Function Page (M. R. Clark、2001; World Wide Web (www) path.cam.ac.uk/〜mrc7/mikeimages.html)。これらのページは、免疫グロブリンの構造および機能に関する教育材料を提供し、多くのカラー画像、モデル、およびアニメーションにより例示されている。抗体ヒト化およびMike Clark's Therapeutic Antibody Human Homology Projectに関するさらなる情報が利用可能であり、これは臨床効果および抗免疫グロブリン応答と、治療抗体の可変領域配列とを相関させることを目的とする。
【０３４３】
The Antibody Resource Page (The Antibody Resource Page、2000; World Wide Web (www) antibodyresource.com)。このサイトは自身で、「抗体研究および供給業者に対する完全な指針」と記載している。アミノ酸配列決定ツール、ヌクレオチド抗体配列決定ツール、およびハイブリドーマ/細胞培養データベースへのリンクが提供される。
【０３４４】
Humanization bY Design (J. Saldanha、2000; World Wide Web (www) people.cryst.bbk.ac.uk/〜ubcg07s)。この資源は、抗体ヒト化技術に関する概説を提供する。最も有用な特徴は、設計問題、フレームワーク選択、フレームワーク復帰変異、およびヒト化構築物の結合親和性に関する情報を含む40を超える公開されたヒト化抗体の検索可能なデータベース(配列およびテキストによる)である。
【０３４５】
また、「Antibody Engineering Methods and Protocols」、Benny K C Lo(編)、Methods in Molecular Biology(商標)、Human Pressも参照されたい。また、World Wide Web (www) blogsua.com/pdf/antibody-engineering-methods-and-protocolsantibody-engineering-methods-and-protocols.pdfも参照されたい。
【０３４６】
B細胞を取得することができる試料としては、限定されるものではないが、血液、血清、脾臓、脾臓組織、骨髄、リンパ、リンパ節、胸腺、および虫垂が挙げられる。抗体および免疫グロブリン鎖を、以前に記載の試料のそれぞれから、ならびにまた、以下の非限定的一覧:B細胞、腹水、ハイブリドーマ、および細胞培養物から取得することができる。
【０３４７】
本発明の任意の構成における一実施形態においては、脊椎動物または細胞のゲノムは、完全に内因性の抗体または重鎖の発現を防止するか、または低下させるように改変されている。これを行うための好適な技術の例は、WO2011004192、US7501552、US6673986、US6130364、WO2009/076464、EP1399559、およびUS6586251に見出すことができ、その開示は参照により本明細書に組込まれる。一実施形態においては、内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座の非ヒト脊椎動物VDJ領域、および任意選択で、内因性軽鎖免疫グロブリン遺伝子座(ラムダおよび/またはカッパ遺伝子座)のVJ領域は、不活化されている。例えば、非ヒト脊椎動物VDJ領域の全部または一部は、哺乳動物の内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座における逆転により不活化され、任意選択で、逆転した領域は内因性Ig遺伝子座の上流または下流に動く。例えば、非ヒト脊椎動物VJ領域の全部または一部は、哺乳動物の内因性カッパ鎖免疫グロブリン遺伝子座における逆転により不活化され、任意選択で、逆転した領域は内因性Ig遺伝子座の上流または下流に動く。例えば、非ヒト脊椎動物VJ領域の全部または一部は、哺乳動物の内因性ラムダ鎖免疫グロブリン遺伝子座における逆転により不活化され、任意選択で、逆転した領域は内因性Ig遺伝子座の上流または下流に動く。一実施形態においては、内因性重鎖遺伝子座は、内因性カッパおよびラムダ遺伝子座の一方または両方と同様、この方法で不活化される。
【０３４８】
さらに、またはあるいは、脊椎動物は、成熟宿主BおよびTリンパ球が生じることを防止する遺伝的背景、任意選択で、RAG-1欠損および/またはRAG-2欠損背景で生じたものである。RAG-1欠損動物を作するための技術については、US5859301を参照されたい。
【０３４９】
本発明の脊椎動物または細胞の任意の構成の一実施形態においては、ゲノムは、少なくとも1つのヒトJλ領域および少なくとも1つのヒトCλ領域、任意選択で、Cλ6および/またはCλ7を含むヒトIgλ遺伝子座の全部または一部を含む抗体軽鎖遺伝子座を含む。任意選択で、軽鎖遺伝子座は、複数のヒトJλ領域、任意選択で、Jλ1、Jλ2、Jλ6およびJλ7のうちの2つ以上、任意選択で、Jλ1、Jλ2、Jλ6およびJλ7の全部を含む。ヒトラムダ免疫グロブリン遺伝子座は、連続するJ-Cクラスターから構成されるユニークな遺伝子構造を含む。この特徴を利用するために、本発明は、任意選択の態様において、1つまたは複数のそのようなヒトJ-Cクラスターを用いる。かくして、任意選択で、軽鎖遺伝子座は、少なくとも1つのヒトJλ-Cλクラスター、場合によっては少なくともJλ7-Cλ7を含む。トランスジーンが生殖系列構成中に1つまたは複数のJ-Cクラスターを含み、有利には、ヒト遺伝子座中のクラスター間および/または隣接するJ領域とC領域の間に介在配列をも含むように、ヒトラムダ遺伝子座の全部または一部を用いることができることにより、そのようなトランスジーンの構築は容易になる。これは、VJおよび/またはJC組換えに関与し得る、ならびに内因性AID(活性化誘導デアミナーゼ)により認識され得る介在配列内に任意の調節エレメントを保存する。
【０３５０】
ある態様は、任意選択で、ヌクレオチド配列がベクターの一部である、本発明のポリペプチド、抗体、鎖または誘導体をコードするヌクレオチド配列を提供する。好適なベクターは、当業者には容易に明らかであり、例えば、1つまたは複数の発現制御エレメントと共に作動可能な連結にあるヌクレオチド配列を含む従来の抗体発現ベクターである。
【０３５１】
ある態様は、本発明のポリペプチド、抗体、鎖または誘導体と、希釈剤、賦形剤または担体とを含む医薬組成物を提供し、任意選択で、該組成物はIV容器(例えば、IVバッグ)またはIVシリンジに接続された容器中に含有される。
【０３５２】
ある態様は、ヒト患者における疾患または状態の処置および/または予防のための医薬品の製造における本発明のポリペプチド、抗体、鎖または誘導体の使用を提供する。
【０３５３】
当業者であれば、一般に、標準的なクローニング技術および組換えDNA技術に精通している。例えば、Sambrook, JおよびRussell, D. (2001、第3版) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)を参照されたい。
【０３５４】
さらなる態様において、本発明は、本発明に従って生成されたヒト化抗体および抗体重鎖、ならびにヒト医学における前記抗体の使用に関する。本発明はまた、そのような抗体または重鎖と、薬学的に許容される担体または他の賦形剤とを含む医薬組成物にも関する。
【０３５５】
モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方の作成のための方法が当業界で周知であり、本発明は、本発明による脊椎動物または細胞中での抗原チャレンジに応答して生成される完全ヒト化抗体および重鎖のポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方に関する。
【０３５６】
さらなる態様において、本発明は、抗体鎖レパートリーに関する薬物およびワクチンの相応しい効果の分析における本発明の非ヒト脊椎動物の使用に関する。
【０３５７】
本発明はまた、薬物またはワクチンの同定または検証のための方法であって、ワクチンまたは薬物を、本発明の脊椎動物に送達する工程および免疫応答、安全性プロフィール、疾患に対する効果のうちの1つまたは複数をモニタリングする工程を含む方法にも関する。
【０３５８】
本発明はまた、本明細書に開示される抗体、ポリペプチド、鎖または誘導体と、そのようなものを、任意選択で好適な実験試薬、例えば、バッファー、抗体検出試薬と共に使用するためのいずれかの説明書とを含むキットにも関する。
【０３５９】
本発明はまた、抗体、またはその一部を作製するための方法であって、
(i)本発明の脊椎動物もしくは細胞を用いて得られた、ポリペプチド、抗体もしくは鎖をコードする核酸;または
(ii)本発明の脊椎動物もしくは細胞を用いて得られた抗体、ポリペプチドもしくは鎖をコードする核酸を発現させて、抗体、鎖もしくはポリペプチドを生成させることができる配列情報
を提供する工程を含む方法にも関する。
【０３６０】
ある実施形態において、それぞれの脊椎動物は、非ヒト脊椎動物、マウスまたはラットであり、そのゲノムは、
(a)上記で定義された重鎖遺伝子座;ならびに
(b)抗体カッパ軽鎖遺伝子座および/または抗体ラムダ鎖遺伝子座
を含み、前記遺伝子座中のV、DおよびJの全てはヒトV、DおよびJであり;内因性抗体重鎖および軽鎖発現は不活化されており;任意選択で、前記ゲノムは前記重鎖および軽鎖遺伝子座にとって同型である。これは、予想通り、脊椎動物において抗体および鎖中のヒトN末端可変ドメインだけを作成するのに有用である。
【０３６１】
ある実施形態においては、それぞれのカッパ鎖遺伝子座は、実質的に完全なヒト機能的VκおよびJκレパートリーを含み、それぞれのラムダ鎖遺伝子座は、実質的に完全なヒト機能的VλおよびJλレパートリーを含む。本明細書における「機能的」は、Ig遺伝子セグメント偽遺伝子および非機能的ヒトIg遺伝子セグメントを排除することができることを認識するものである。
【０３６２】
一例においては、本発明の遺伝子座は、前記第1のスイッチとしてのS-ミュースイッチ(例えば、内因性S-ミュー)および前記第2のスイッチとしてのS-ガンマスイッチ(例えば、内因性S-ガンマ)を含む重鎖遺伝子座である。例えば、C-ミュー領域およびスイッチは、マウス129C-ミュー領域およびスイッチである;またはC-ミュー領域およびスイッチは、マウスBlack6 C-ミュー領域およびスイッチである。別の実施形態においては(非ヒト脊椎動物種がマウスまたはラットである場合)、SミューはラットSミューであり、C-ミュー領域はマウスであり、任意選択で、非ミューC領域の3'側にマウスS-ガンマが存在する。
【０３６３】
一態様において、それぞれの脊椎動物は、遺伝的背景がマウス株C57BL/6、M129、例えば、129/SV、BALB/c、およびC57BL/6、M129、例えば、129/SV、またはBALB/cの任意のハイブリッドから選択されるマウスである。
【０３６４】
ある実施形態において、本発明のそれぞれの遺伝子座のJセグメントは、ヒトJH遺伝子セグメントであり;任意選択で、それぞれの重鎖遺伝子座は、ヒトJH遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む。
【０３６５】
ある実施形態において、本発明のそれぞれの遺伝子座は、少なくとも2、3、4、5または6の異なるヒトJH遺伝子セグメントを含む。
【０３６６】
ある実施形態において、本発明のそれぞれの遺伝子座のDセグメントは、ヒトD遺伝子セグメントである;任意選択で、それぞれの重鎖遺伝子座は、ヒトD遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む。
【０３６７】
ある実施形態において、本発明のそれぞれの遺伝子座は、少なくとも5、10、15、20、25、26または27の異なるヒトD遺伝子セグメントを含む。
【０３６８】
ある実施形態において、それぞれの重鎖遺伝子座は、J1、J2、J3、J4、J5およびJ6からなる群から選択される少なくとも2つのヒトJH遺伝子セグメント;任意選択で、前記群の遺伝子セグメントの全部を含む。
【０３６９】
ある実施形態において、それぞれの重鎖遺伝子座は、V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41、V2-5、V3-7、V1-8、V3-9、V3-11、V3-15、V1-18、V3-20、V3-21、V3-23、V1-24、V2-26、V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46、V3-48、V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73およびV3-74からなる群から選択されるヒトVH遺伝子セグメントを含み、VH遺伝子レパートリーは、実質的に完全なヒト機能的VH遺伝子レパートリーを含む。
【０３７０】
ある実施形態において、内因性抗体重鎖発現は、本発明の脊椎動物または細胞中で不活化されている。例えば、10、5、4、3、2、1もしくは0.5%(または0)の重鎖は、内因性重鎖(すなわち、可変領域が非ヒト脊椎動物のV、DおよびJ遺伝子セグメントの組換えから誘導された重鎖)により提供される。
【０３７１】
レパートリーのVL遺伝子セグメントは、一実施形態においては、組換えVLであってよい、すなわち、ヒトVLとJLとの組換え(例えば、VLおよびJLがヒトである場合)から誘導される可変領域の一部として提供することができる。
【０３７２】
ある実施形態において、それぞれの軽鎖遺伝子座のJセグメントは、ヒトJL遺伝子セグメントである;任意選択で、それぞれの軽鎖遺伝子座は、ヒトJκまたはJλ遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む(例えば、それぞれの遺伝子座は、ヒトVλ遺伝子セグメントおよびJλ遺伝子セグメント、任意選択で、ヒトJλ遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む;またはそれぞれの遺伝子座は、ヒトVκ遺伝子セグメントおよびJκ遺伝子セグメント、任意選択で、ヒトJκ遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む)。
【０３７３】
ある実施形態において、脊椎動物または細胞ゲノムのカッパ鎖レパートリーは、機能的ヒトVκ遺伝子セグメントの実質的に完全なレパートリーを含む;任意選択で、少なくとも5の異なるヒトJκ遺伝子セグメントおよび少なくとも40の異なるヒトVκ遺伝子セグメントを提供する。
【０３７４】
ある実施形態において、カッパ鎖レパートリーは、少なくとも20、25、30、35または40の異なるヒトVκ遺伝子セグメントを含む。
【０３７５】
ある実施形態において、脊椎動物または細胞ゲノムのラムダ鎖レパートリーは、機能的ヒトVλ遺伝子セグメントの実質的に完全なレパートリーを含む;任意選択で、少なくとも5の異なるヒトJλ遺伝子セグメントおよび少なくとも40の異なるヒトVλ遺伝子セグメントを提供する。
【０３７６】
ある実施形態において、ラムダ鎖レパートリーは、少なくとも20、25、30、35または40の異なるヒトVλ遺伝子セグメントを含む。
【０３７７】
ある実施形態において、脊椎動物または細胞のそれぞれの軽鎖遺伝子座は、少なくとも2、3、4、5または6の異なるヒトJκまたはJλ遺伝子セグメントを含む。
【０３７８】
ある実施形態において、内因性抗体カッパおよび/またはラムダ軽鎖発現は、脊椎動物または細胞中で不活化されている。
【０３７９】
本発明の方法における抗体、鎖またはポリペプチドの選択のために、望ましい抗体/鎖/ポリペプチド特性の例は、所定の抗原またはエピトープへの結合の親和性(例えば、表面プラズモン共鳴により決定される)、所定の抗原またはエピトープへの結合に関する既知の抗体との完了、エピトープ特異性(例えば、X線結晶学により決定される)、既知の抗体が抗原に特異的に結合する場合の抗原結合に関する既知の抗体との競合(例えば、表面プラズモン共鳴、例えば、Biacore(商標)またはProteon(商標)により決定される)、ELISAまたは別の免疫アッセイにおける性能、望ましい生物物理学的特性(例えば、融点、pI、溶液状態、凝集度、貯蔵プロフィールなど)である。ある実施形態において、親和性は、表面プラズモン共鳴により決定される。
【０３８０】
本発明における使用のための免疫化の方法は、当業者には周知であり、古典的な初回-追加レジメ、RIMMSまたは任意の他のプロトコールを含んでもよい。当業界で公知のように、アジュバントを抗原と共に投与してもよい。
【０３８１】
誘導体抗体/鎖/ポリペプチド(本明細書の任意の態様による)の例は、単離された抗体または鎖またはポリペプチドと比較して1つまたは複数の変異(例えば、抗原結合親和性を改善する、および/またはFc機能を増強もしくは不活化するための)を有する抗体/鎖/ポリペプチドである。そのような変異体は、抗原に特異的に結合する。誘導体を生成するための変異または適合は、例えば、Fc増強または不活化をもたらすための変異を含む。誘導体は、毒性ペイロードまたはリポーターまたは標識または他の活性部分へのコンジュゲーション後の抗体または鎖またはポリペプチドであってもよい。
【０３８２】
ある実施形態において、脊椎動物は、ナイーブである(すなわち、この用語が当業界で理解されている通り、所定の抗原で免疫されていない;例えば、そのような脊椎動物は、R&Dのために用いられる動物舎により提供されるように比較的無菌環境中で保持されている)。別の例においては、脊椎動物は、所定の抗原、例えば、ヒトエピトープを担持する抗原で免疫されている。
【０３８３】
ある実施形態において、前記方法は、所望の特徴(例えば、抗原への結合の親和性)による前記集団またはレパートリーから1つまたは複数の抗体重鎖(例えば、抗体の一部として)を選択する工程を含む。
【０３８４】
例えば、本発明を用いることにより、これは脾臓コンパートメントおよび/または骨髄B前駆細胞コンパートメントにおけるB細胞の比率を実質的に変化させず、血清中の免疫グロブリンレベルが正常であり、正確なIgサブタイプが発現されることが期待される。これは、本発明による遺伝子座(例えば、少なくともヒトVH遺伝子セグメントVH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1、ならびに全てのヒトDおよびJH遺伝子セグメントD1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26および7-27;ならびにJ1、J2、J3、J4、J5およびJ6の挿入を含む重鎖遺伝子座)が、トランスジェニック重鎖遺伝子座、B細胞受容体(BCR)シグナリングおよび適切なB細胞成熟に由来するVDJ遺伝子セグメント再構成にとって完全に機能的であることを示す。
【０３８５】
かくして、一態様において、本発明によるマウスは、例えば、正常な相対的割合の血清IgG1、IgG2a、IgG2bおよびIgM抗体を発現することができると期待される。
【０３８６】
「正常」とは、マウス抗体鎖のみを発現するマウス(例えば、ナイーブなマウス)、例えば、ゲノムが野生型機能的Ig重鎖および軽鎖遺伝子座のみを含むマウス、例えば、野生型マウスにおける発現と同等であることを意味する。
【０３８７】
かくして、一態様において、本発明によるマウスは、例えば、プレート上でのIg捕捉、次いで、抗マウスアイソタイプ特異的標識抗体とのインキュベーション(例えば、RTで1時間、例えば、20℃で1時間)および標識を用いるIgの定量(例えば、0.1%Tween(商標)を含むPBS中、1/10000の比でコンジュゲートした西洋ワサビペルオキシダーゼにそれぞれコンジュゲートした抗マウスIgアイソタイプ特異的抗体を用いた後、室温(例えば、20℃)で暗室中4〜5分間、テトラメチルベンジジン基質(TMB)を用いて標識を展開し、標識の展開を停止させるために硫酸を添加し、450nmで標識を読み取る)により決定された場合、
(i)約25〜350μg/mlの濃度の血清IgG1;
(ii)約0〜200μg/mlの濃度の血清IgG2a;
(iii)約30〜800μg/mlの濃度の血清IgG2b;および
(iv)約50〜300μg/mlの濃度の血清IgM
または
(i)約10〜600μg/mlの濃度の血清IgG1;
(ii)約0〜500μg/mlの濃度の血清IgG2a;
(iii)約20〜700μg/mlの濃度の血清IgG2b;および
(iv)約50〜700μg/mlの濃度の血清IgM
を発現することができると期待される。
【０３８８】
かくして、一態様において、本発明によるマウスは、例えば、
プレート上でのIg捕捉、次いで、抗マウスアイソタイプ特異的標識抗体とのインキュベーション(例えば、RTで1時間、例えば、20℃で1時間)および標識を用いるIgの定量(例えば、0.1%Tween(商標)を含むPBS中、1/10000の比でコンジュゲートした西洋ワサビペルオキシダーゼにそれぞれコンジュゲートした抗マウスIgアイソタイプ特異的抗体を用いた後、室温(例えば、20℃)で暗室中4〜5分間、テトラメチルベンジジン基質(TMB)を用いて標識を展開し、標識の展開を停止させるために硫酸を添加し、450nmで標識を読み取る)により決定された場合、
(i)約25〜150μg/mlの濃度の血清IgG1;
(ii)約0〜200μg/mlの濃度の血清IgG2a;
(iii)約30〜300μg/mlの濃度の血清IgG2b;および
(iv)約50〜200μg/mlの濃度の血清IgM
または
(i)約10〜200μg/mlの濃度の血清IgG1;
(ii)約0〜500μg/mlの濃度の血清IgG2a;
(iii)約20〜400μg/mlの濃度の血清IgG2b;および
(iv)約50〜700μg/mlの濃度の血清IgM
を発現することができると期待される。
【０３８９】
かくして、一態様において、本発明によるマウスは、例えば、プレート上でのIg捕捉、次いで、抗マウスアイソタイプ特異的標識抗体とのインキュベーション(例えば、RTで1時間、例えば、20℃で1時間)および標識を用いるIgの定量(例えば、0.1%Tween(商標)を含むPBS中、1/10000の比でコンジュゲートした西洋ワサビペルオキシダーゼにそれぞれコンジュゲートした抗マウスIgアイソタイプ特異的抗体を用いた後、室温(例えば、20℃)で暗室中4〜5分間、テトラメチルベンジジン基質(TMB)を用いて標識を展開し、標識の展開を停止させるために硫酸を添加し、450nmで標識を読み取る)により決定された場合、
(i)約25〜150μg/mlの濃度の血清IgG1;
(ii)約0〜200μg/mlの濃度の血清IgG2a;
(iii)約30〜300μg/mlの濃度の血清IgG2b;および
(iv)約50〜200μg/mlの濃度の血清IgM
または
(i)約10〜200μg/mlの濃度の血清IgG1;
(ii)約0〜500μg/mlの濃度の血清IgG2a;
(iii)約20〜400μg/mlの濃度の血清IgG2b;および
(iv)約50〜700μg/mlの濃度の血清IgM
の相対割合でIgを発現することができると期待される。
【０３９０】
かくして、一態様において、本発明によるマウスは、例えば、FACSにより決定された場合、例えば、正常な割合またはパーセンテージの成熟脾臓B細胞を生成するマウスにおいて脾臓B細胞から重鎖を発現することができると期待される。
【０３９１】
「正常」とは、マウス抗体鎖のみを発現するマウス(例えば、ナイーブなマウス)、例えば、ゲノムが野生型機能的Ig重鎖および軽鎖遺伝子座のみを含むマウス、例えば、野生型マウスにおける成熟脾臓B細胞生成と同等であることを意味する。
【０３９２】
例えば、本発明のマウスにより生成される全脾臓B細胞の少なくとも40、50、60または70%が、成熟B細胞である。脾臓B細胞は、B220+であり、当業者ならば知っているように、比較的高レベルでB220を発現する。成熟脾臓B細胞は、当業者であれば知っているように、両方とも比較的高レベルで、B220とIgDとを発現する。IgM発現は、これも当業界で公知のように、成熟脾臓B細胞中では比較的低い。例えば、J Exp Med. 1999年7月5日;190(1):75〜89頁;「B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals」; Loder Fらを参照されたい。
【０３９３】
任意選択で、マウスは、例えば、FACSにより決定された場合、正常な比率のT1、T2および成熟脾臓B細胞を生成する。例えば、本発明のマウスは、約40〜70%の成熟脾臓B細胞、15〜35%の脾臓T1細胞、および5〜10%の脾臓T2細胞(全脾臓B220陽性(高)集団を参照したパーセンテージ)を生成する。例えば、約40〜60%の成熟脾臓B細胞、15〜30%の脾臓T1細胞、および5〜10%の脾臓T2細胞である。「正常」とは、マウス抗体鎖のみを発現するマウス(例えば、ナイーブなマウス)、例えば、ゲノムが野生型機能的Ig重鎖および軽鎖遺伝子座のみを含むマウス、例えば、野生型マウスにおけるT1/T2/成熟脾臓B細胞集団と同等であることを意味する。
【０３９４】
かくして、一態様において、本発明によるマウスは、例えば、正常な割合またはパーセンテージの骨髄B細胞前駆細胞を生成する(例えば、FACSにより決定された場合)マウスにおいて重鎖を発現することができると期待される。
【０３９５】
一実施形態においては、マウスは、正常な割合またはパーセンテージの骨髄プレ、プロおよびプレプロB細胞を生成する(例えば、FACSにより決定された場合)マウスにおいて前記重鎖を発現させるためのものである。前駆細胞に関するさらなる考察については、J Exp Med. 1991年5月1日;173(5):1213〜25頁;「Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow」; Hardy RRらを参照されたい。
【０３９６】
「正常」とは、マウス抗体鎖のみを発現するマウス(例えば、ナイーブなマウス)、例えば、ゲノムが野生型機能的Ig重鎖および軽鎖遺伝子座のみを含むマウス、例えば、野生型マウスにおける骨髄B細胞生成と同等であることを意味する。
【０３９７】
そのようなマウスの一例においては、重鎖の少なくとも90%が、ヒト可変領域を含む重鎖である。例えば、重鎖の少なくとも90、95、96、97、98、99もしくは99.5%または100%が、ヒト可変領域、すなわち、ヒトVHと、ヒトDおよびJH遺伝子セグメントとの組換えから誘導された可変領域を含む。
【０３９８】
一実施形態においては、脊椎動物、マウスまたは細胞のゲノムは、ヒトカッパ遺伝子セグメント
(i)Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8およびVκ1-9(ならびに任意選択で、Vκ5-2およびVκ4-1);または
(ii)Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ3-20(ならびに任意選択で、Vκ2-24および/もしくはVκ1-13);または
(iii)Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ3-20、Vκ2-24、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-30およびVκ1-33(ならびに任意選択で、Vκ2-29および/もしくはVκ2-40および/もしくはVκ1-39);
ならびに任意選択で、
(iv)Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4およびJκ5
を含む。
【０３９９】
一実施形態においては、ゲノムはまた、(i)少なくともヒトVH遺伝子セグメントVH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1、ならびに全てのヒトDおよびJH遺伝子セグメントD1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26および7-27;ならびにJ1、J2、J3、J4、J5およびJ6と、(ii)少なくともヒト遺伝子セグメントVκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2、Vκ4-1、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4およびJκ5とを含む。
【０４００】
LOX部位
新規Loxバリアントが以下の実施例に記載される(lox2272/66およびlox2272/71)。これらのものは、部位特異的組換え(例えば、ES細胞または他の核酸源における)にとって有用である。さらに、これらの部位は適合性ではないため、それらをRMCE(リコンビナーゼ媒介性カセット交換)に用いることができる。かくして、本発明は、以下を含む。
【０４０１】
lox2272/66である部位特異的組換え部位。配列を、以下に与える。
【０４０２】
lox2272/71である部位特異的組換え部位。配列を、以下に与える。
【０４０３】
lox2272/66:  5'-ATAACTTCGTATA-AaGTATcC-TATACGAAcggta-3'
lox2272/71: 5'-taccgTTCGTATA-AaGTATcC-TATACGAAGTTAT-3'。
【０４０４】
lox2272/66および/またはlox2272/71を含むDNAベクターまたはDNA配列。例えば、ベクターまたは配列は、lox2272/66およびlox2272/71によりフランキングしたヌクレオチド配列(例えば、遺伝子または遺伝子セグメント配列)を含む;任意選択で、lox部位は互いに逆向きである(これは、実施例で説明されるように、ゲノム中に挿入された配列をロックするのに有用である)。この意味において、lox2272/66はヌクレオチド配列の5'側(例えば、5'側すぐ)にあり、lox2272/71は配列の3'側(例えば、3'側すぐ)にある。別の例においては、lox2272/71はヌクレオチド配列の5'側(例えば、5'側すぐ)にあり、lox2272/66は配列の3'側(例えば、3'側すぐ)にある。ある例においては、DNA配列は、細胞ゲノム、例えば、ES細胞ゲノムまたはB細胞ゲノムまたはハイブリドーマゲノムまたはiPS細胞ゲノムの一部である。
【０４０５】
発明の記述:
本発明の態様は以下の条項に記載される。
1.
多価
リンパ球細胞を含む非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)であって、それぞれの細胞ゲノムが、
(i)(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ、ミュー定常領域、第2のスイッチおよび非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域を含み、それぞれの細胞の重鎖遺伝子座がIgMから非ミュー(例えば、IgG)へのアイソタイプスイッチングを受けることができる、抗体重鎖遺伝子座
を含み、
(ii)非ミュー定常領域が、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、アイソタイプスイッチング後に、脊椎動物が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、
脊椎動物。
または
in vivoでの誘導選択
ゲノムが、(5'から3'の向きに)(i)第1の改変ドメインをコードする再構成されていないヒト可変領域(例えば、重鎖可変領域)、(ii)任意選択のリンカーをコードする配列および(iii)第2の可変ドメイン(例えば、VLドメイン)の再構成された配列を含むIg遺伝子座を含み、配列(i)が、脊椎動物が配列(i)および(iii)から誘導される第1および第2の可変ドメインを含むエピトープ結合部位をそれぞれ有する抗体鎖を生成するように再構成を受けることができ、第1および第2の可変ドメインの間にさらなる抗体ドメインが存在しない、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)。
任意選択で、(i)、(ii)および(iii)は、遺伝子座が重鎖遺伝子座である場合、S-ミューの5'側にある。任意選択で、(i)は、遺伝子座が重鎖遺伝子座である場合、S-ミューの5'側にあり、(ii)および(iii)はS-ミューの下流にある。
または
脊椎動物がリンパ球細胞を含み、それぞれの細胞ゲノムが、
(i)(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域(例えば、重鎖可変領域)、第1のスイッチ、ミュー定常領域、第2のスイッチおよび非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域を含み、それぞれの細胞の重鎖遺伝子座がIgMから非ミュー(例えば、IgG)へのアイソタイプスイッチングを受けることができる、抗体重鎖遺伝子座
を含み、
(ii)非ミュー定常領域が、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび第1の可変ドメイン(例えば、VLドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含み、アイソタイプスイッチングの後、脊椎動物が(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域に由来する第1の可変ドメインヌクレオチド配列からそれぞれ誘導される第1および第2の抗体可変ドメインを含むエピトープ結合部位を含むポリペプチド鎖を発現する、
非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)。
【０４０６】
2.
多価
細胞ゲノムが、
(i)(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ、ミュー定常領域、第2のスイッチおよび非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座であり、それぞれの細胞の重鎖遺伝子座がIgMから非ミュー(例えば、IgG)へのアイソタイプスイッチングを受けることができる抗体重鎖遺伝子座;
を含み、
(ii)非ミュー定常領域が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、
非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)。
または
in vivoでの誘導選択
ゲノムが、(5'から3'の向きに)(i)第1の改変ドメインをコードする再構成されていないヒト可変領域(例えば、重鎖可変領域)、(ii)任意選択のリンカーをコードする配列および(iii)第2の可変ドメイン(例えば、VLドメイン)の再構成された配列を含むIg遺伝子座を含み、配列(i)が、細胞が配列(i)および(iii)から誘導される第1および第2の可変ドメインを含むエピトープ結合部位をそれぞれ有する抗体鎖を生成するように再構成を受けることができ、第1および第2の可変ドメインの間にさらなる抗体ドメインが存在しない、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)。
または
細胞ゲノムが、
(i)(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域(例えば、重鎖可変領域)、第1のスイッチ、ミュー定常領域、第2のスイッチおよび非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域を含み、それぞれの細胞の重鎖遺伝子座がIgMから非ミュー(例えば、IgG)へのアイソタイプスイッチングを受けることができる抗体重鎖遺伝子座;
を含み、
(ii)非ミュー定常領域が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域に由来する第1の可変ドメインヌクレオチド配列からそれぞれ誘導される第1および第2の抗体可変ドメインを含むエピトープ結合部位を含むポリペプチド鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび第1の可変ドメイン(例えば、VLドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む、
非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)。
【０４０７】
3.ゲノムが軽鎖を発現させるための機能的抗体軽鎖遺伝子座を含み、細胞がIgM型重鎖および軽鎖を含むIgM抗体を発現することができる、項1に記載の脊椎動物または項2に記載の細胞。
【０４０８】
4.軽鎖遺伝子座が軽鎖発現を停止させるための手段を含み、機能的軽鎖がIgMから非ミューへのアイソタイプスイッチング後に発現されない、項3に記載の脊椎動物または細胞。
【０４０９】
5.脊椎動物が(N末端からC末端の方向に)(a)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカー、エピトープ結合部分および非ミュー(例えば、ガンマ)定常ドメイン(例えば、ガンマFc)または(b)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、非ミュー(例えば、ガンマ)定常ドメイン(例えば、ガンマFc)、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含むポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、項1から項4のいずれ一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０４１０】
6.非ミュー定常領域がガンマ定常領域であり、重鎖遺伝子座がアイソタイプスイッチングを受けて、軽鎖の非存在下で1つまたは複数のIgG重鎖を含み、それぞれの重鎖がCH1ドメインを欠く、IgG抗体を生成することができる、項1から5のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０４１１】
7.
多価
ゲノムが(5'から3'の方向に)再構成された可変領域および非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座を含むリンパ球細胞を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)であって、
非ミュー定常領域が(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、脊椎動物が(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、脊椎動物。
ある実施形態において、再構成された可変領域と非ミュー定常領域との間にミュー定常領域は存在しない。
または
in vivoでの誘導選択
ゲノムが(5'から3'の方向に)再構成された可変領域および非ミュー定常領域を含む抗体重鎖または軽鎖遺伝子座を含むリンパ球細胞を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)であって、
非ミュー定常領域が、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび第1の可変ドメインをコードする再構成された可変領域をコードするヌクレオチドを含み、アイソタイプスイッチング後に、脊椎動物が、(N末端からC末端の方向に)再構成された第2の可変ドメインヌクレオチド配列および第1の可変ドメインヌクレオチド配列からそれぞれ誘導される第2および第1の抗体可変ドメインを含むエピトープ結合部位を含む、ポリペプチド鎖を発現し、第2のヌクレオチド配列が脊椎動物中で再構成された、脊椎動物。
【０４１２】
8.細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成された可変領域および非ミュー定常領域を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)またはハイブリドーマであって、
非ミュー定常領域が、(N末端からC末端の方向に)再構成された第2の可変ドメインヌクレオチド配列および第1の可変ドメインヌクレオチド配列からそれぞれ誘導される第2および第1の抗体可変ドメインを含むエピトープ結合部位を含むポリペプチド鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーと第1の可変ドメインをコードする再構成された可変領域とをコードするヌクレオチド配列を含み、第2のヌクレオチド配列が細胞中で再構成された、椎動物細胞またはハイブリドーマ。
脊椎動物または細胞のある実施形態において、第1の可変ドメインをコードする再構成された可変領域と、非ミュー定常領域との間にミュー定常領域は存在しない。
【０４１３】
9.重鎖遺伝子座がIgMから非ミュー(例えば、IgG)へのアイソタイプスイッチングを受けている、項7に記載の脊椎動物または項8に記載の細胞。
【０４１４】
10.リンカーおよび/またはエピトープ結合部分のヌクレオチド配列が、非ミュー定常領域中でCH1ドメイン遺伝子セグメントの代わりに提供される、項1から9のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
または
前記リンカーまたは第1の可変ドメインヌクレオチド配列が、非ミュー定常領域中でCH1ドメイン遺伝子セグメントの代わりに提供される、項1から9のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０４１５】
11.
多価
脊椎動物がリンパ球細胞を含み、それぞれの細胞のゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域および第2の領域を含む抗体軽鎖遺伝子座を含み、
第2の領域が(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、免疫化後に、脊椎動物が(N末端からC末端の方向に)軽鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含むポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)。
または
in vivoでの誘導選択
脊椎動物がリンパ球細胞を含み、それぞれの細胞のゲノムが(5'から3'の方向に)再構成されていない可変領域(例えば、重鎖可変領域)および第2の領域(非ミュー定常領域である)を含む抗体軽鎖遺伝子座を含み、
第2の領域が(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび第1の可変ドメイン(例えば、VLドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含み、免疫化後に、脊椎動物が(N末端からC末端の方向に)軽鎖遺伝子座の前記可変領域に由来する第1の可変ドメインヌクレオチド配列からそれぞれ誘導される第1および第2の抗体可変ドメインを含むエピトープ結合部位を含むポリペプチド鎖を発現する、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)。
【０４１６】
12.
多価
細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域および第2の領域を含む抗体軽鎖遺伝子座を含み、
第2の領域が、(N末端からC末端の方向に)軽鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含むポリペプチド鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)またはハイブリドーマ。
または
in vivoでの誘導選択
細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成されていない、または再構成された可変領域(例えば、重鎖可変領域)および第2の領域を含む抗体軽鎖遺伝子座を含み、
第2の領域が、(N末端からC末端の方向に)軽鎖遺伝子座の前記可変領域に由来する第1の可変ドメインヌクレオチド配列からそれぞれ誘導される第1および第2の抗体可変ドメインを含むエピトープ結合部位を含むポリペプチド鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび第1の可変ドメイン(例えば、VLドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)またはハイブリドーマ。
【０４１７】
13.項1から10のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞による、項11に記載の脊椎動物または項12に記載の細胞。
【０４１８】
14.ゲノムが前記重鎖および軽鎖遺伝子座を含み、重鎖遺伝子座から誘導される前記ポリペプチド鎖可変ドメインが軽鎖遺伝子座から誘導されるポリペプチド鎖可変ドメインと結合部位を形成し、結合部位が第1のエピトープに特異的に結合する、項13に記載の非ヒト脊椎動物または細胞。
【０４１９】
15.重鎖および軽鎖遺伝子座から誘導されるポリペプチド鎖のエピトープ結合部分が抗体可変ドメインであり、重鎖遺伝子座から誘導される鎖のエピトープ結合ドメインが軽鎖遺伝子座から誘導される鎖のエピトープ結合ドメインと会合して、第2のエピトープに特異的に結合する結合部位を形成する、項14に記載の脊椎動物または細胞。
【０４２０】
16.(N末端からC末端の方向に)抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含み、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する多価ポリペプチド鎖を生成する方法であって、
(a)非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)において、未熟B細胞中でIgM抗体を発現させ、抗体が、それぞれ重鎖および軽鎖遺伝子座から発現された重鎖および軽鎖を含む工程;
(b)脊椎動物を、第1のエピトープを担持する第1の所定の抗原で免疫し、少なくともいくつかの重鎖遺伝子座中の非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域からの発現および体細胞超変異を受けた可変領域の発現へのアイソタイプスイッチングを得る工程;ならびに
(c)前記第1のエピトープに結合する可変領域の選択により前記免疫された脊椎動物から1つまたは複数のポリペプチド鎖を選択し、それぞれの選択された鎖がエピトープに特異的に結合する体細胞超変異した可変領域を含む工程
を含み、
(d)脊椎動物のゲノム中の重鎖遺伝子座の非ミュー定常領域中にエピトープ結合部分のヌクレオチド配列を提供し、工程(c)で選択されたポリペプチド鎖が第1および第2のエピトープに結合する工程
を含む、方法。
【０４２１】
17.工程(b)におけるそれぞれの体細胞変異した可変領域が、CH1ドメインを欠く非ミュー型(例えば、IgG型)重鎖により提供される、項16に記載の方法。
【０４２２】
18.工程(b)が軽鎖発現の非存在下で体細胞変異した可変領域を発現させることを含む、項16または17に記載の方法。
【０４２３】
19.非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)において、(N末端からC末端の方向に)抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含み、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する多価ポリペプチド鎖を生成する方法であって、
(a)脊椎動物を、第1のエピトープを担持する第1の所定の抗原で免疫し、脊椎動物の少なくともいくつかの重鎖遺伝子座中での非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域からの発現および体細胞超変異を受けた可変領域の発現へのアイソタイプスイッチングを得る工程;ならびに
(b)前記第1のエピトープに結合する可変領域の選択により前記免疫した脊椎動物から1つまたは複数のポリペプチド鎖を選択し、それぞれの選択された鎖がエピトープに特異的に結合する体細胞超変異した可変領域を含む工程;ならびに
(d)脊椎動物のゲノム中の重鎖遺伝子座の非ミュー定常領域中にエピトープ結合部分のヌクレオチド配列を提供し、工程(b)で選択されたポリペプチド鎖が第1および第2のエピトープに結合する工程
を含む方法。
【０４２４】
20.工程(a)におけるそれぞれの体細胞変異した可変領域が、CH1ドメインを欠く非ミュー型(例えば、IgG型)重鎖により提供される、項19に記載の方法。
【０４２５】
21.工程(a)が軽鎖発現の非存在下で体細胞変異した可変領域を発現させることを含む、項19または20に記載の方法。
【０４２６】
22.脊椎動物が項1から15のいずれか一項に記載のものである、項19から21のいずれか一項に記載の方法。
【０４２７】
23.選択されたポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を単離または合成する工程;および任意選択で、その配列をヒト化する工程をさらに含む、項19から22のいずれか一項に記載の方法。
【０４２８】
24.項19から23のいずれか一項に記載の方法により得られる多特異的ポリペプチド鎖、または第1および第2のエピトープに特異的に結合するその誘導体。
【０４２９】
25.(N末端からC末端の方向に)構造V-X-L-E-L-C
(式中、
(i)Vは第1のエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメインであり、
(ii)Xは、存在しない、抗体ヒンジ領域、または定常ドメインを含む抗体定常領域であり、
(iii)Lはそれぞれ、任意選択のリンカーであり、
(iv)Eは第2のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合部分であり、および
(v)Cは存在しないか、または定常ドメインを含む抗体定常領域であり(例えば、CはヒトガンマFcである))
を有する多価(例えば、多特異的)ポリペプチド鎖であって、
Vは、エピトープ結合部分をもコードするヌクレオチド配列中に得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異を有する非ヒト脊椎動物中においてin vivoで可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導される再構成された抗体可変ドメインであり、
再構成された抗体可変ドメインは、内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む、ポリペプチド。
【０４３０】
26.非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)を、第1のエピトープで免疫し、エピトープ結合部分(E)、Vをコードする可変領域遺伝子もコードするヌクレオチド配列中で可変領域遺伝子の体細胞超変異を引き起こし、ならびにVおよびEを含む前記ポリペプチド鎖を単離する工程を含む、項25に記載のポリペプチド鎖を生成する方法。
【０４３１】
27.エピトープ結合部分が内因性AIDパターンの体細胞超変異を欠く、項25に記載のポリペプチドまたは項26に記載の方法。
【０４３２】
28.エピトープ結合部分が内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む、項25に記載のポリペプチドまたは項26に記載の方法。
【０４３３】
29.抗体軽鎖を欠く、項25から28のいずれか一項に記載のポリペプチドの二量体。
【０４３４】
30.ポリペプチドが(N末端からC末端の方向に)構造V-N-E;V-CH1-M-CH2-CH3-L-E;またはV-M-CH2-CH3-L-E(式中、Nは任意選択の抗体ヒンジ領域と一緒になってLであり;Mは任意選択の抗体ヒンジ領域である)を有する、項25から29のいずれか一項に記載のポリペプチド、二量体または方法。
【０４３５】
31.Vが第2の抗体可変ドメイン(V2)にペプチド結合して、第1のエピトープに特異的に結合する第1および第2の可変ドメインを含む結合部位を形成し、任意選択で、VおよびV2がscFvとして提供される、項25から30のいずれか一項に記載のポリペプチド、二量体または方法。
【０４３６】
32.ポリペプチドがCH1ドメインを欠く、項25から31のいずれか一項に記載のポリペプチド、二量体または方法。
【０４３７】
33.ポリペプチドがCH1ドメインを含み、ポリペプチドが抗体中の第1および第2のコピー中に存在し、第1のポリペプチドが第1の抗体軽鎖と会合し、第2のコピーが第2の抗体軽鎖と会合する、項25から31のいずれか一項に記載のポリペプチド、二量体または方法。
【０４３８】
34.項25から33のいずれか一項に記載の二量体、ポリペプチド鎖またはそのヒト化バージョンを含む抗体。
【０４３９】
35.それぞれの重鎖が項25、27、28および30から33のいずれか一項に記載のポリペプチドであり、N末端からC末端の方向に、構造
V-CH1-M-CH2-CH3-L-E、
V-M-CH2-CH3-L-E、
V- L-E-L-CH1-M-CH2-CH3、
V- L-E-L-M-CH2-CH3、
V-CH1-N-E、
V- L-E-N-CH1、または
V- N-E-L-CH1
(式中、Nは任意選択の抗体ヒンジ領域を有するLであり;Mは任意選択の抗体ヒンジ領域であり)
を有し;
任意選択で、定常ドメインはヒト定常ドメインである、重鎖の二量体を含む二価(例えば、二特異的)抗体。
【０４４０】
36.抗体が2コピーの軽鎖を含み、それぞれの重鎖が対応する軽鎖と会合し、それぞれの重鎖中のVがその対応する軽鎖の可変ドメインとの抗原結合部位を形成し、それぞれの軽鎖の可変ドメインが内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む、項35に記載の抗体。
【０４４１】
37.軽鎖と会合した重鎖を含む多価(例えば、多特異的)抗体であって、
それぞれの重鎖が、項25および項27から35のいずれか一項に記載のポリペプチド鎖であり、Eが抗体可変ドメインであり;
それぞれの軽鎖が、(N末端からC末端の方向に)構造V'-L'-E'-L'-C'
(式中、
(i)V'は抗体可変ドメインであり、
(ii)それぞれのL'は任意選択のリンカーであり、
(iv)E'はエピトープ結合部分であり、および
(v)C'は存在しないか、または定常ドメインを含む抗体定常領域であり(例えば、C'はヒトCLである))
を有するポリペプチド鎖であり;
V'は、非ヒト脊椎動物中におけるin vivoでの可変領域遺伝子セグメントの、E'をもコードするヌクレオチド配列中の得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異との再構成から誘導される再構成された抗体可変ドメインであり;
V'は、内因性AIDパターンの体細胞超変異を含み;
VおよびV'は、第1のエピトープに特異的に結合する第1の結合部位を形成し;
任意選択で、EおよびE'は、E'が抗体可変ドメインである第2のエピトープに特異的に結合する第2の結合部位を形成する、多価抗体。
【０４４２】
38.1つまたは複数のエピトープ結合部分に連結されたタンパク質スキャホールドを含む抗原結合ポリペプチドであって、少なくとも2つのエピトープ結合部位を含み、そのうちの少なくとも一方がエピトープ結合部分により提供され、少なくとも一方が第2の抗体可変ドメインと対形成した第1の抗体可変ドメインにより提供され、
それぞれの可変ドメインが、1つまたは複数のエピトープ結合部分をもコードするヌクレオチド配列中に得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異を有する非ヒト脊椎動物中においてin vivoでの可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導される再構成された抗体可変ドメインであり;
再構成された抗体可変ドメインが、内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む、抗原結合ポリペプチド。
または
1つまたは複数のエピトープ結合部分に連結されたタンパク質スキャホールドを含む抗原結合ポリペプチドであって、少なくとも2つのエピトープ結合部位を含み、そのうちの少なくとも一方がエピトープ結合部分により提供され、少なくとも一方が第2の抗体可変ドメインと対形成した第1の抗体可変ドメインにより提供され、
第1の可変ドメインが、第2の可変ドメインおよび1つまたは複数のエピトープ結合部分をもコードするヌクレオチド配列中に得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異を有する非ヒト脊椎動物中におけるin vivoでの可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導される再構成された抗体可変ドメインであり;
再構成された第1の抗体可変ドメインが、内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む、抗原結合ポリペプチド。
【０４４３】
39.少なくとも10アミノ酸(例えば、10〜50アミノ酸)を含むペプチドリンカーによりタンパク質スキャホールドに連結された少なくとも1つの前記エピトープ結合部分を含む、項38に記載のポリペプチド。
【０４４４】
40.ヒト免疫エフェクター細胞上に位置するエフェクター抗原(例えば、ヒトCD3)に特異的に結合することによりヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員することができ、ポリペプチド、二量体または抗体の第1のエピトープ結合部位が前記エフェクター抗原に特異的に結合することができ、ポリペプチド、二量体または抗体の第2のエピトープ結合部位がエフェクター抗原以外の標的抗原(例えば、ヒトEpCAMまたはヒトCD19)に特異的に結合することができ、任意選択で、前記標的抗原が前記ヒト免疫エフェクター細胞以外の標的細胞上に位置する、項25および項27から39のいずれか一項に記載の多特異的抗原結合ポリペプチド、二量体または抗体。
【０４４５】
41.第2のエピトープがヒト免疫エフェクター細胞抗原(例えば、ヒトCD3)により提供される、項1から40のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞ポリペプチド、二量体または抗体。
【０４４６】
42.第1のエピトープがエフェクター抗原以外の標的抗原(例えば、ヒトEpCAMまたはヒトCD19)により提供され、任意選択で、前記標的抗原が前記ヒト免疫エフェクター細胞以外の標的細胞の抗原である、項1から41のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞ポリペプチド、二量体または抗体。
【０４４７】
43.エピトープ結合部分が、抗体可変ドメイン(例えば、VLもしくはVH、抗体単一可変ドメイン(ドメイン抗体もしくはdAb)、ラクダ科VHH抗体単一可変ドメイン、サメ免疫グロブリン単一可変ドメイン(NARV)、Nanobody(商標)またはラクダ化VH単一可変ドメイン);T細胞受容体結合ドメイン;免疫グロブリンスーパーファミリードメイン;無顎類可変リンパ球受容体;フィブロネクチンドメイン(例えば、Adnectin(商標));定常ドメインが機能的CH1ドメインではない抗体定常ドメイン(例えば、CH3ドメイン、例えば、Fcab(商標)のCH2および/またはCH3);scFv;(scFv)2;sc-ダイアボディ;scFab;センチリン(centyrin)およびCTLA-4(Evibody(商標))から選択されるスキャホールドから誘導されるエピトープ結合ドメイン;リポカリンドメイン;プロテインAのZドメインなどのプロテインA(例えば、Affibody(商標)またはSpA);A-ドメイン(例えば、Avimer(商標)またはMaxibody(商標));熱ショックタンパク質(例えば、GroEIおよびGroESから誘導されるエピトープ結合ドメイン);トランスフェリンドメイン(例えば、trans-body);アンキリンリピートタンパク質(例えば、DARPin(商標));ペプチドアプタマー;C型レクチンドメイン(例えば、Tetranectin(商標));ヒトγ-クリスタリンまたはヒトユビキチン(アフィリン);PDZドメイン;サソリ毒;ならびにヒトプロテアーゼ阻害剤のkunitz型ドメインからなる群から選択される、項1から42のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞ポリペプチド、二量体または抗体。
【０４４８】
44.N末端可変ドメインもしくは5'末端可変領域またはそれぞれのN末端可変ドメインもしくは5'末端可変領域がヒト可変ドメインまたは領域である、項1から43のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞ポリペプチド、二量体または抗体。
【０４４９】
45.それぞれの定常領域またはドメインが内因性非ヒト脊椎動物定常領域またはドメインである、項1から44のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞ポリペプチド、二量体または抗体。
【０４５０】
46.(a)脊椎動物が、それぞれ抗体重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座によりコードされる重鎖および軽鎖を含むIgM抗体を発現し;
(b)脊椎動物が、非ミュー(例えば、IgG)抗体を発現することができ、それぞれの非ミュー抗体重鎖が機能的CH1ドメインを欠き;
(c)IgM抗体がリンパ球細胞により発現され、それぞれの細胞が、該細胞により発現されるIgM抗体の軽鎖を発現させるための機能的軽鎖遺伝子座を含み;
(d)非ミュー抗体がリンパ球細胞により発現され、それぞれの細胞が、機能的軽鎖遺伝子座を欠き、非ミュー抗体が軽鎖発現の非存在下で該細胞により発現される、
非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)。
【０４５１】
47.ゲノムが
(i)(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ、ミュー定常領域、第2のスイッチ、およびCH1遺伝子セグメントを欠く非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域を含む、抗体重鎖遺伝子座;
(ii)軽鎖を発現させるための機能的抗体軽鎖遺伝子座であり、
該細胞が、IgM型重鎖および軽鎖を含むIgM抗体を発現することができ;
それぞれの細胞の重鎖遺伝子座が、アイソタイプスイッチングを受けて、軽鎖の非存在下で1つまたは複数の非ミュー型(例えば、IgG型)重鎖を含みかつそれぞれの重鎖がCH1ドメインを欠く、非ミュー(例えば、IgG)抗体を生成することができる、機能的抗体軽鎖遺伝子座;ならびに
(iii)機能的軽鎖が前記非ミュー型抗体へのアイソタイプスイッチングの後に発現されない、軽鎖発現を停止させるための手段
を含むリンパ球細胞を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)。
【０４５２】
48.細胞ゲノムが、
(i)軽鎖を発現させるための機能的抗体軽鎖遺伝子座;
(ii)IgM型重鎖および軽鎖を含むIgM抗体を発現させるための;ならびに軽鎖の非存在下で1つまたは複数の非ミュー型重鎖を含みかつそれぞれの重鎖がCH1ドメインを欠く非ミュー(例えば、IgG)抗体を生成する、IgMから非ミュー(例えば、IgG)へのアイソタイプスイッチングのための、(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ、ミュー定常領域、第2のスイッチ、およびCH1遺伝子セグメントを欠く非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域を含む、抗体重鎖遺伝子座;ならびに
(iii)機能的軽鎖が前記非ミュー型抗体へのアイソタイプスイッチング後に発現されない、軽鎖発現を停止させるための手段
を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)。
【０４５３】
49.軽鎖発現を停止させるための手段が、前記軽鎖遺伝子座からの機能的軽鎖発現にとって必須であるヌクレオチド配列(例えば、軽鎖可変領域または軽鎖遺伝子座のCL領域)を含み、ヌクレオチド配列がIgMを発現する未熟B細胞中では機能的であるが、ヌクレオチド配列が前記非ミュー型抗体を発現する成熟B細胞中には存在しないか、または実質的に非機能的である、項46から48のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０４５４】
50.軽鎖発現を停止させるための手段が、IgMを発現する未熟B細胞中の前記軽鎖遺伝子座からの軽鎖発現を駆動するための調節エレメント(例えば、プロモーター)を含むヌクレオチド配列を含み、調節エレメントが前記非ミュー型抗体を発現する成熟B細胞中で実質的に不活性であるか、または存在しない、項46から49のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０４５５】
51.ヌクレオチド配列または調節エレメントが第1および第2の組合せエレメント(例えば、部位特異的組換えエレメント)によりフランキングし、ゲノムが対応するリコンビナーゼまたはトランスポザーゼをコードする遺伝子を含み、遺伝子がIgMを発現する未熟B細胞中では不活性であるが、前記非ミュー型抗体を発現する成熟B細胞中では第1および第2の組換えエレメントで切断するように活性であり、ヌクレオチド配列または調節エレメントを不活化する、項49または50に記載の脊椎動物または細胞。
【０４５６】
52.調節エレメントがIgMを発現する未熟B細胞中では誘導され、および/または前記非ミュー型抗体を発現する成熟B細胞中では抑制される、項50に記載の脊椎動物または細胞。
【０４５７】
53.軽鎖発現を停止させるための手段が、再構成された軽鎖可変ドメインを含むポリペプチド鎖を発現させるためのゲノム中の別の遺伝子座である、項46から48のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０４５８】
54.前記別の遺伝子座が、項47または48に規定の重鎖遺伝子座であり、前記アイソタイプスイッチング後に、重鎖遺伝子座が前記再構成された軽鎖可変ドメインを含む抗体をコードする、項53に記載の脊椎動物または細胞。
【０４５９】
55.抗体鎖が、第2の抗体可変ドメインをさらに含み、任意選択で、軽鎖可変ドメインおよび前記第2の抗体可変ドメインが、異なるものであるそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、項54に記載の脊椎動物または細胞。
【０４６０】
56.再構成された軽鎖可変ドメインが、項47または48に規定の重鎖遺伝子座の前記再構成されていない可変領域から誘導され、重鎖遺伝子座の再構成されていない可変領域が1つまたは複数の軽鎖J遺伝子セグメントの5'側に1つまたは複数の軽鎖V遺伝子セグメントを含む、項53から55のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０４６１】
57.抗体鎖が(5'から3'の方向に)項47または48に規定の重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される可変ドメイン、任意選択のリンカーおよび前記再構成された軽鎖可変ドメインを含む、項54または55に記載の脊椎動物または細胞。
【０４６２】
58.非ミュー定常領域が(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、アイソタイプスイッチング後に、脊椎動物が(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、項47、48および項47または48に従属する項49から57のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０４６３】
59.非ミュー定常領域が前記エピトープ結合部分の3'側に1つまたは複数の非ミュー定常領域遺伝子セグメント(例えば、CH2およびCH3遺伝子セグメント)を含み、アイソタイプスイッチング後に、脊椎動物が(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカー、エピトープ結合部分および前記1つまたは複数の非ミュー定常領域遺伝子セグメントをそれぞれ含む多価ポリペプチド鎖を発現する、項58に記載の脊椎動物。
【０４６４】
60.ポリ(A)部位がエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列の3'側にあり、アイソタイプスイッチング後に、脊椎動物が(N末端からC末端の方向に)構造V-X-L-E(式中、Vは重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメインであり、Xは存在しないか、抗体ヒンジ領域またはガンマ定常領域によりコードされるポリペプチドであり、Lは任意選択のリンカーであり、Eはエピトープ結合部分である)を有するか、またはそれからなる多価ポリペプチド鎖を発現し、任意選択で、脊椎動物がV-X-L-EまたはV-L-E二量体を発現する、項58または59に記載の脊椎動物または細胞。
【０４６５】
61.ポリ(A)部位が1つまたは複数の非ミュー定常領域遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列の3'側にあり、アイソタイプスイッチング後に、脊椎動物が(N末端からC末端の方向に)構造V-X-L-E-L-C(式中、Vは重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメインであり、Xは存在しないか、抗体ヒンジ領域または非ミュー定常領域によりコードされるポリペプチドであり、Lは任意選択のリンカーであり、Eはエピトープ結合部分であり、Cnは1つまたは複数の非ミュー定常領域遺伝子セグメント(例えば、ガンマFc)である)を有するか、またはそれからなる多価ポリペプチド鎖を発現し、任意選択で、脊椎動物がV-X-L-E-L-CまたはV-L-E-L-C二量体を発現する、項58または59に記載の脊椎動物または細胞。
【０４６６】
62.エピトープ結合部分が、抗体可変ドメイン(例えば、VLもしくはVH、抗体単一可変ドメイン(ドメイン抗体もしくはdAb)、ラクダ科VHH抗体単一可変ドメイン、サメ免疫グロブリン単一可変ドメイン(NARV)、Nanobody(商標)またはラクダ化VH単一可変ドメイン);T細胞受容体結合ドメイン;免疫グロブリンスーパーファミリードメイン;無顎類可変リンパ球受容体;フィブロネクチンドメイン(例えば、Adnectin(商標));定常ドメインが機能的CH1ドメインではない抗体定常ドメイン(例えば、CH3ドメイン、例えば、Fcab(商標)のCH2および/またはCH3);scFv;(scFv)2;sc-ダイアボディ;scFab;センチリン(centyrin)およびCTLA-4(Evibody(商標))から選択されるスキャホールドから誘導されるエピトープ結合ドメイン;リポカリンドメイン;プロテインAのZドメインなどのプロテインA(例えば、Affibody(商標)またはSpA);A-ドメイン(例えば、Avimer(商標)またはMaxibody(商標));熱ショックタンパク質(例えば、GroEIおよびGroESから誘導されるエピトープ結合ドメイン);トランスフェリンドメイン(例えば、trans-body);アンキリンリピートタンパク質(例えば、DARPin(商標));ペプチドアプタマー;C型レクチンドメイン(例えば、Tetranectin(商標));ヒトγ-クリスタリンまたはヒトユビキチン(アフィリン);PDZドメイン;サソリ毒;ならびにヒトプロテアーゼ阻害剤のkunitz型ドメインからなる群から選択される、項46から61のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０４６７】
63.脊椎動物が、前記非ミュー型(例えば、IgG型)抗体を生成するようにアイソタイプスイッチングを受けたリンパ球細胞を含む;または細胞が前記非ミュー型(例えば、IgG型)抗体を生成するようにアイソタイプスイッチングを受けた、項46から62のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０４６８】
64.脊椎動物が所定の抗原で免疫されており、脊椎動物がCH1ドメインを欠き、所定の抗原に特異的に結合する可変ドメインを含む非ミュー型(例えば、IgG型)抗体を発現する;または細胞がそのような脊椎動物から単離される、項46から63のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０４６９】
65.N末端可変ドメインもしくは5'末端可変領域またはそれぞれのN末端可変ドメインもしくは5'末端可変領域がヒト可変ドメインまたは領域である、項46から64のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０４７０】
66.それぞれの定常領域またはドメインが内因性非ヒト脊椎動物定常領域またはドメインである、項46から65のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０４７１】
67.リンパ球細胞が前記非ミュー抗体または二価ポリペプチド鎖を発現するB細胞を含み、非ミュー抗体または多価鎖が前記非ヒト脊椎動物にとって外来である抗原に特異的である;または前記非ヒト脊椎動物細胞がそのようなB細胞である、項46から66のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０４７２】
68.項67に記載のB細胞から生成される不死化B細胞またはハイブリドーマ。
【０４７３】
69.項67もしくは68に記載のB細胞もしくはハイブリドーマから単離された非ミュー型(例えば、IgG型)抗体もしくは多価鎖;または非ヒト定常ドメインがヒト定常ドメインと置き換えられたそのヒト化バージョン。
【０４７４】
70.非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)中に体細胞超変異した可変領域を含むポリペプチド鎖を生成する方法であって、
(a)脊椎動物中で、抗体がそれぞれ重鎖および軽鎖遺伝子座から発現される重鎖および軽鎖を含む、未熟B細胞中のIgM抗体を発現させる工程;
(b)脊椎動物を所定のエピトープで免疫し、少なくともいくつかの重鎖遺伝子座におけるアイソタイプスイッチングおよび体細胞超変異を受けた非ミュー(例えば、IgG)抗体の発現を得る工程であり、抗体が、CH1ドメインを欠く重鎖を含みかつ抗原に特異的に結合する可変領域を含む、工程;ならびに
(c)前記エピトープに結合する可変領域の選択により前記免疫された脊椎動物から1つまたは複数のポリペプチド鎖を選択し、それぞれの選択された鎖がエピトープに特異的に結合する体細胞超変異した可変領域を含む、工程
を含み、軽鎖発現の非存在下で、工程(b)の非ミュー抗体を発現させる工程をさらに含む方法。
【０４７５】
71.エピトープに結合する体細胞超変異した可変領域を含むポリペプチド鎖を発現するB細胞を、免疫した脊椎動物から単離する工程;および任意選択で、細胞を不死化するか、またはそれに由来するハイブリドーマを生成する工程を含む、項70に記載の方法。
【０４７６】
72.エピトープに結合する体細胞超変異した可変領域を含む選択されたポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を取得する工程、およびそのヌクレオチド配列を、ポリペプチド鎖またはそのヒト化バージョンの発現のための発現ベクター中に導入する工程を含み、任意選択で、ベクターが宿主細胞中にある、項70または71に記載の方法。
【０４７７】
73.脊椎動物が項46から69のいずれか一項に記載のものである、項70から72のいずれか一項に記載の方法。
【０４７８】
74.項70から73のいずれか一項に記載の方法により得られた多特異的ポリペプチド鎖またはエピトープに特異的に結合するその誘導体。
【０４７９】
75.ゲノムが、抗体重鎖遺伝子座および抗体軽鎖遺伝子座、
(a)IgM抗体を発現するリンパ球細胞中で軽鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)軽鎖可変領域および定常領域を含む軽鎖遺伝子座;ならびに
(b)非ミュー(例えば、IgG)抗体を発現するリンパ球細胞中での軽鎖発現を停止させるための手段
を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)。
【０４８０】
76.ゲノムが抗体重鎖遺伝子座および抗体軽鎖遺伝子座を含み、軽鎖遺伝子座が、
(a)IgM抗体を発現するリンパ球細胞中で軽鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)軽鎖可変領域および定常領域;ならびに
(b)非ミュー(例えば、IgG)抗体を発現するリンパ球細胞中での軽鎖発現を停止させるための手段
を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)またはハイブリドーマ。
【０４８１】
77.軽鎖発現を停止させるための手段が項49から56のいずれか一項に記載の通りである、項73に記載の脊椎動物または項74に記載の細胞。
【０４８２】
78.リンパ球細胞を含み、それぞれの細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域および任意選択のリンカーと所定のエピトープ結合部分とコードするヌクレオチド配列を含むミュー定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)であって、脊椎動物が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、脊椎動物。
【０４８３】
79.細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域および任意選択のリンカーと所定のエピトープ結合部分とをコードするヌクレオチド配列を含むミュー定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)であって、細胞が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、細胞。
【０４８４】
80.構造V-L-EまたはV-L-E-L(例えば、V-L-E-FcまたはV-L-E-L-Fc)(式中、VはN末端抗体可変ドメインであり、Lは任意選択のリンカーであり、Eはエピトープ結合部分であり、VおよびEはそれぞれ第1および第2の抗原に特異的に結合し、抗原は異なる)を含む多価、多特異的重鎖(またはその二量体)を発現する非ヒト(例えば、ラットまたはマウス)脊椎動物または細胞。
【０４８５】
81.Vがヒト可変ドメインである、項80に記載の脊椎動物または細胞。
【０４８６】
82.(N末端からC末端の方向に)構造V-X-L-E-L-C
(式中、
(i)Vは第1のエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン(例えば、VL)であり、
(ii)Xは、存在しない、または定常ドメインを含む抗体定常領域(例えば、CL)であり、
(iii)Lはそれぞれ、任意選択のリンカーであり、
(iv)Eは第2のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合部分であり、
(v)Cは存在しないか、または定常ドメインを含む抗体定常領域であり(例えば、CはCLである))
を有する多価(例えば、多特異的)軽鎖であって、
Vは、エピトープ結合部分をもコードするヌクレオチド配列中に得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異を有する非ヒト脊椎動物中においてin vivoで可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導される再構成された抗体可変ドメインであり、
再構成された抗体可変ドメインは内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む、軽鎖。
【０４８７】
83.項82に記載の軽鎖の二量体。
【０４８８】
84.リンパ球細胞を含む非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)であって、それぞれの細胞ゲノムが、
(i)(5'から3'の方向に)再構成されたもしくは再構成されていない可変領域、任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列、ならびにCL遺伝子セグメントを含む抗体軽鎖遺伝子座であり、脊椎動物が、(N末端からC末端の方向に)軽鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカー、エピトープ結合部分およびCLドメインを含む多価軽鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープ(本明細書に定義される任意のエピトープであってもよい)に特異的に結合する、抗体軽鎖遺伝子座;または
(ii)(5'から3'の方向に)再構成されたもしくは再構成されていない可変領域、CL遺伝子セグメント、任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む抗体軽鎖遺伝子座であって、脊椎動物が、(N末端からC末端の方向に)軽鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、CLドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価軽鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープ(本明細書に定義される任意のエピトープであってもよい)に特異的に結合する、抗体軽鎖遺伝子座
を含む、脊椎動物。
【０４８９】
85.細胞ゲノムが、
(i)(5'から3'の方向に)再構成されたもしくは再構成されていない可変領域、任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列、ならびにCL遺伝子セグメントを含む抗体軽鎖遺伝子座であり、細胞が、(N末端からC末端の方向に)軽鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカー、エピトープ結合部分およびCLドメインを含む多価軽鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープ(本明細書に定義される任意のエピトープであってもよい)に特異的に結合する、抗体軽鎖遺伝子座;または
(ii)(5'から3'の方向に)再構成されたもしくは再構成されていない可変領域、CL遺伝子セグメント、任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む抗体軽鎖遺伝子座であり、細胞が、(N末端からC末端の方向に)軽鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、CLドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価軽鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープ(本明細書に定義される任意のエピトープであってもよい)に特異的に結合する、抗体軽鎖遺伝子座
を含む非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)。
【０４９０】
86.エピトープに特異的な結合部位を含むポリペプチドであって、結合部位が構造V1-L-E(任意選択で、V1-L-V2)(式中、V1およびV2は抗体可変ドメイン(例えば、それぞれVHおよびVLまたはそれぞれVH)であり、Eはエピトープ結合部分であり、Lは任意選択のペプチドリンカー(例えば、20、15または10個以下のアミノ酸の)であり;V1は、Eをもコードするヌクレオチド配列における、得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異と共に、非ヒト脊椎動物中でのin vivoでのヒト可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導され、V1は内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む)を有する結合部位を含むポリペプチド。ここで、「内因性」とは、脊椎動物に対して内因性であるAIDにより引き起こされる(例えば、脊椎動物がマウスである場合、マウスAIDにより引き起こされる)パターンを指す。
【０４９１】
87.非ヒト脊椎動物を前記エピトープで免疫し、Ig遺伝子座の内因性AIDにより体細胞超変異を得て、V1およびEをコードする変異したIg遺伝子座を生成し、ならびにポリペプチドおよび/またはポリペプチドをコードする核酸を単離する工程を含む、項86に記載のポリペプチドを生成する方法。
【０４９２】
88.脊椎動物または細胞のゲノムのIg重鎖または軽鎖遺伝子座が(5'から3'の向きに)(i)第1の可変ドメインをコードするための再構成されていないヒト可変領域、(ii)任意選択のリンカーをコードする配列および(iii)エピトープ結合部分をコードする配列(任意選択で、第2の可変ドメインの再構成された配列)を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスもしくはラット)または細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)。
一例において、脊椎動物は、項1、7または11に記載のものである。ある実施形態において、ポリペプチドまたは核酸は、エピトープに特異的に結合するポリペプチド誘導体を生成する(またはコードする)ように単離後に改変または変異される。
【０４９３】
89.1つまたは複数のエピトープ結合部分に連結されたタンパク質スキャホールドを含む抗原結合ポリペプチドの製造における第1および第2の再構成された抗体可変ドメインの使用であって、抗原結合ポリペプチドが少なくとも2つのエピトープ結合部位を含み、そのうちの少なくとも一方がエピトープ結合部分により提供され、少なくとも一方が第2の抗体可変ドメインと対形成した第1の抗体可変ドメインにより提供され、
(i)第2の可変ドメインおよび1つまたは複数のエピトープ結合部分をもコードするヌクレオチド配列中に得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異を有する非ヒト脊椎動物中、in vivoでの可変領域遺伝子セグメントの再構成によって第1の可変ドメインの配列を取得し;再構成された第1の抗体可変ドメイン配列が内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む可変ドメイン配列を、単離する工程;(ii)可変ドメインと、タンパク質スキャホールドおよび1つまたは複数のエピトープ結合部分とを発現させ組み合わせて、前記抗原結合ポリペプチドを生成する工程;ならびに(iii)前記ポリペプチドを単離する工程を含む、使用。
任意選択で、工程(ii)で用いられる第2の可変ドメインは、内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む。
【０４９４】
90.非ヒト種の2つの脊椎動物を一緒に育種する工程を含み、両方の脊椎動物が上記の項のいずれか一項に記載のものである、前記種の脊椎動物を生成する方法。
【０４９５】
91.共通の軽鎖がIgM段階で発現される、項1から90のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【０４９６】
92.ゲノムがIgM段階で共通の軽鎖を発現させるための手段を含む、項1から90のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
共通の軽鎖は、例えば、ヒトVκ1-39JκもしくはVκ3-20Jκ(例えば、Vκ1-39Jκ5もしくはVκ3-20Jκ1)またはVpreB(ヒトVpreBなど)を含む。これらの可変ドメインは、VHと自由に対形成し、従って、脊椎動物または細胞中での抗体発生中に結合部位のレパートリーを生成するのに有用である。
【０４９７】
本発明の多価態様のいずれかのある実施形態において、第1のエピトープは、ヒトCD19エピトープであり、第2のエピトープはヒトCD3またはCD16エピトープである。
【０４９８】
本明細書に記載の特定の実施形態は例示によって示され、本発明の限定として示されるものではなく、(文脈が別途記述しない限り)実施形態は本明細書に記載の本発明の任意の構成に適用することができることが理解される。本発明の主な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態において用いることができる。当業者であれば、単なる日常的な試験を用いて、本明細書に記載の特定の手順に対するいくつかの等価物を認識するか、または確認することができる。そのような等価物は、本発明の範囲内にあると考えられ、特許請求の範囲によって包含される。本明細書に記載の全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する当業界における当業者の技術のレベルを示す。全ての刊行物および特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組込まれると示すのと同程度まで参照により本明細書に組込まれる。単語「a」または「an」の使用は、特許請求の範囲および/または明細書における用語「含む(comprising)」と共に用いられる場合、「1(one)」を意味してもよいが、「1または複数」、「少なくとも1」および「1または1より多い」の意味とも一致する。特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すと明示的に示されないか、または選択肢が相互に排他的でない限り、「および/または」を意味するように用いられるが、本開示は選択肢のみならびに「および/または」を指す定義を支持する。本出願を通じて、用語「約」は、ある値がデバイスに関する誤差の固有の変動、方法がその値を決定するために用いられる方法、または試験対象間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。
【０４９９】
本明細書および特許請求の範囲において用いられる場合、単語「含む(comprising)」(ならびに「含む(comprise)」および「含む(comprises)」などのcomprisingの任意の形態)、「有する(having)」(ならびに「有する(have)」および「有する(has)」などのhavingの任意の形態)、「含む(including)」(ならびに「含む(includes)」および「含む(include)」などのincludingの任意の形態)または「含有する(containing)」(ならびに「含有する(contains)」および「含有する(contain)」などのcontainingの任意の形態)は、包括的であるか、または制約がなく、さらなる、記載されていない要素または方法工程を排除しない。
【０５００】
本明細書で用いられる用語「またはその組合せ」とは、この用語に先行する列挙された項目の全ての順列および組合せを指す。例えば、「A、B、Cまたはその組合せ」は、A、B、C、AB、AC、BC、またはABCのうちの少なくとも1つを含むことが意図され、特定の文脈において順序が重要である場合、BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、またはCABも含むことが意図される。この例を続ければ、明示的に含まれるのは、BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABBなどの、1つもしくは複数の項目または用語の反復を含有する組合せである。当業者であれば、典型的には、別途文脈から明らかでない限り、任意の組合せにおける項目または用語の数に制限はないことを理解できる。
【０５０１】
本開示の任意の部分は、別途文脈から明らかでない限り、本開示の任意の他の部分と組み合わせて読むことができる。
【０５０２】
本明細書に開示され、特許請求される全ての組成物、集団、脊椎動物、抗体、レパートリーおよび/または方法を、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作製および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および/または方法ならびに方法の工程もしくは方法の一連の工程に変更を加えてもよいことが当業者には明らかであろう。当業者にとって明らかな全てのそのような類似する置換および改変は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内にあると見なされる。
【０５０３】
本発明を、以下の非限定的で先見的な実施例においてより詳細に説明する。
【実施例】
【０５０４】
(実施例1:重鎖のみの抗体の改善された生成)
図3は、本発明による非ヒト脊椎動物中での重鎖のみの抗体のin vivoでの生成に対する改善された経路の略図である。この図面は、トランスジェニック脊椎動物中の重鎖遺伝子座の構造を示す。それぞれの重鎖遺伝子座は、内因性(例えば、マウスまたはラット)S-ミュースイッチの上流にヒトVH、DおよびJH遺伝子セグメントを含む可変領域および定常領域遺伝子セグメント(CH1、CH2、CH3、H(ヒンジ)およびM(膜領域))を含む内因性C-ミュー領域を含む。この下流は、S-ガンマスイッチ(例えば、内因性スイッチ)およびガンマ-1定常領域(例えば、内因性ガンマ-1定常領域)である。ガンマ定常領域は、CH1遺伝子セグメントを含まない。遺伝子セグメントを欠失させる、特に、CH1を欠失させるための方法は、当業界で公知である(例えば、上記のJanssens 2006を参照されたい)。例えば、相同組換えまたはRMCEによる欠失を、非ヒト脊椎動物のES細胞祖先中で行うことができる。さらなる例示は、結合モジュールを用いて重鎖遺伝子座中のガンマCH1を置き換える実施形態において以下に提供される。
【０５０５】
4鎖IgM抗体(H2L2)を、B細胞発生中などに、脊椎動物中の重鎖遺伝子座に由来する重鎖と、軽鎖遺伝子座から発現される軽鎖との組合せにより生成させることができる(例えば、未熟脾臓B細胞上での表面発現のために)。正常なIgM段階を可能にすることにより、本発明は、正常なB細胞コンパートメントおよび一次可変領域レパートリーの発生を提供する。
【０５０６】
本発明によれば、標的抗原を用いる免疫化後などの、その後のアイソタイプ(クラス)スイッチング段階の間に、軽鎖発現は条件的軽鎖ノックアウト(以下でさらに説明される)によりスイッチを切られる。かくして、アイソタイプスイッチングされた重鎖遺伝子座から発現される重鎖は、CH1および軽鎖を欠く重鎖二量体(すなわち、H2抗体)を形成することができる。かくして、これらの後の段階中での重鎖のみの発現および成熟は、軽鎖発現に妨害されることなくin vivoで脊椎動物によって行われる(および重鎖の使用が望ましくない4鎖H2L2抗体生成、かくして、有用なH2収率およびレパートリーの減少を指向する危険性を回避する)。これは、従って、脊椎動物の免疫化後に生成されるアイソタイプスイッチングされ、成熟した重鎖のみの抗体の生成およびレパートリーを最大化するのに有利である。このように、H2抗体の可変ドメインは、任意の軽鎖可変ドメイン対形成の影響なしに成熟および選択され、かくして、H2可変ドメインはH2形式での性能について選択される。これは、望ましい抗原結合親和性ならびにまた、in vivoでのH2可溶性および発現のためのH2抗体の選択にとって有用である。かくして、これらのH2抗体は、抗体単一可変ドメイン(dAb)の良好な供給源を提供することができる。
【０５０７】
さらに、正常なIgM初期段階を適合させることにより、重鎖可変領域レパートリー(一次レパートリー)を最大化する機会が保持され、これは、続いてH2抗体Vドメインを選択することができる良好なレパートリーを提供する。
【０５０８】
(実施例2:条件的軽鎖発現)
条件的、または段階特異的発現を、B細胞コンパートメントおよびVレパートリー発生の初期段階の間に本発明に従って実施することができる。実施例1で説明されたように、本発明は、アイソタイプスイッチングされた(非ミュー)重鎖が発現される場合に、軽鎖発現のスイッチオフを提供する。
【０５０９】
図4および図5は、そのような条件的軽鎖発現を提供するための非ヒト脊椎動物(本実施例においてはマウス)のゲノムを操作する方法の例を示す。マウス第6染色体は、活性化誘導性シチジンデアミナーゼ(AICDAまたはAID)遺伝子を含有する。これは、図4の上部に示される遺伝子座中で黒箱により示される5つのエクソンを含む。UTRは5'および3'末端で白箱で示される。AIDはB細胞中で段階特異的に発現され、実際、アイソタイプスイッチングされた非ミュー(例えば、ガンマ)重鎖が発現される場合、活性である。本発明者らは、この発現プロファイルを有利に利用して、この段階特異的様式でリコンビナーゼ(この場合、creリコンビナーゼ)を発現させることができることに気付いた。当業者には公知のように、ES細胞技術を用いてゲノム操作を行う(例えば、WO2011004192(この開示は参照により本明細書に組込まれる)に記載のRMCE、ランディングパッド、マーカーおよびトランスポザーゼ活性を用いる)。好適なES細胞も当業者には公知であり、例えば、マウスAB2.1細胞(Baylor College of Medicine、Texas、USAから取得可能である)である。
【０５１０】
(a)AID調節エレメントによるcre発現の作成
IGγ1遺伝子座(以下を参照)を操作するために用いられるものと同一のランディングパッドをAID遺伝子座に標的化して、AID遺伝子の5番目のエクソン、停止コドンおよび3'UTRを含む配列(マウス第6染色体:座標12256576〜122564230)を置き換える(図4)。正確に標的化されたクローンを、HATにより選択し、遺伝子型決定により確認する。図4に示されるように、「loxP-PB3'LTR-AIDの5番目のエクソンおよび停止コドンに対応する配列-次いで、T2Aコード配列(5'-GGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCT-3')およびcre遺伝子-3'UTR -PB3'LTR- PuroΔTK-lox5171」の構造を有する挿入ベクターを挿入して、HPRT遺伝子を不活化し、PGKプロモーターの次にPuroΔTKを置く。正確に標的化されたクローンを、ピューロマイシンにより選択し、ジャンクションPCR(junction PCR)により確認する。挿入は、遺伝子座中での2つの逆転したトランスポゾン構造(図4)をもたらす。それらを欠失させるために、当業界で公知のように、PiggyBacトランスポザーゼをこれらのクローン中で一過的に発現させる。正確な欠失を有するクローンを、FIAUにより選択し、ジャンクションPCRにより確認する。
【０５１１】
T2Aは、トセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルスから同定された自己切断性ペプチドである。T2A媒介性切断は、真核細胞における普遍的現象である。タンパク質間へのT2A配列の挿入により、複数のタンパク質の化学量論的発現が可能になる(Szymczakら、「Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors」; Expert Opin Biol Ther. 5: 627〜638頁)。
【０５１２】
得られるゲノム構造は図4の下部に示され、ゲノム中のAID調節エレメントにより調節されるように、段階特異的様式でAIDとcre活性との両方の同時発現を提供する。
【０５１３】
(b)条件的IGκ対立遺伝子の作成
ランディングパッドをイントロンIGκエンハンサー(iEκ)の下流のIGκ遺伝子座に標的化し、マウスES細胞中のCκ領域をコードするエクソン(マウス第6染色体:座標70724743〜70727043)を置き換える。(図5)正確に標的化されたクローンをHATにより選択し、遺伝子型決定により確認する。「loxP-PB3'LTR-lox2272/66-Cκエクソン-lox2272/71- PB3'LTR-PuroΔTK-lox5171」(図5)の構造を有する標的化ベクターを用いて、ランディングパッド中のloxPとlox5171との間の配列を置き換える。挿入は、遺伝子座中の2つの逆転したトランスポゾン構造(図5)をもたらす。それらを欠失させるために、PiggyBacハイパートランスポザーゼをこれらのクローン中で一過的に発現させる。正確な欠失を有するクローンをFIAUにより選択し、ジャンクションPCRにより確認する。lox2272/66 (5'-ATAACTTCGTATA-AaGTATcC-TATACGAAcggta-3')およびlox2272/71 (5'-taccgTTCGTATA-AaGTATcC-TATACGAAGTTAT-3')はCκエクソンにフランキングし、互いに逆向きである。そのようなゲノム操作されたES細胞から、実施例2(a)に記載のようにcreの段階特異的発現のためのAID-cre遺伝子も担持する子孫マウスを作成する。マウスにおいては、AID-cre遺伝子からのcre発現に関して、Cκエクソンは欠失しており、それによって、アイソタイプスイッチングされた重鎖が発現される場合に軽鎖発現を不活化する。
【０５１４】
代替的な設計において、カッパ遺伝子座の他の部分またはさらなる部分はlox部位にフランキングし、従ってそれらはcreの発現時に欠失される。例えば、図5におけるスキームは、lox2272/66が最初のJκ遺伝子セグメントのすぐ5'側にあり、最初のJκからCκへのストレッチがcre発現時に欠失されるように変化させることができる。あるいは、lox2272/66およびlox2272/71はそれぞれ最初および最後のJκ遺伝子セグメントの5'および3'側すぐにフランキングしてもよく、J領域全体がcre発現時に欠失される。
【０５１５】
一実施形態においては、カッパ鎖発現のみが、アイソタイプスイッチングされた段階の間に不活化される。マウスにおいては、ラムダ鎖発現は相対的に低い(通常、軽鎖のわずか5%の規模である)ため、条件的カッパ鎖発現のみを提供することが許容され得る。別の実施形態においては、カッパ鎖およびラムダ鎖発現の両方が条件的であり(例えば、ゲノムはlox部位にフランキングしたCλも含む)、それらは初期IgM段階の間には段階特異的様式で起こるが、アイソタイプスイッチングされた非ミュー重鎖の発現の間には起こらない。
【０５１６】
(実施例3:IGγ1遺伝子座ならびに多価重鎖および抗体の遺伝子操作)
二特異的重鎖および抗体を生成するための方法の図ならびにこれらをin vivoで生成するための非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)ゲノム中の重鎖遺伝子座を示す図6を参照する。
【０５１７】
図6の上部には、(5'から3'の方向に)再構成されていない可変領域(ヒトVH、DおよびJH遺伝子セグメントを含む)、内因性S-ミュー、ミュー定常領域(CH1、H、CH2、CH3およびM遺伝子セグメントを含む)、内因性S-ガンマ-1およびガンマ-1定常領域を含む本発明の重鎖遺伝子座が示される。後者は、リンカーおよび可変領域結合ドメインヌクレオチド配列、ならびにガンマ-1H、CH2、CH3およびM遺伝子セグメントを含むヌクレオチド配列(結合モジュール、またはBMと呼ばれる)を含む。この例において、BMは、
・リンカー(例えば、(GGGGG)3)-VH(式中、VHは既知の抗原結合特異性の抗体単一可変ドメイン(dAb)である;または
既知の抗原特異性のscFv(VH-リンカー-VLもしくはVL-リンカー-VH)である);または
・dAb-リンカー-scFv
をコードする。かくして、BMの結合部分は、軽鎖対形成を必要とすることなく機能的である。
【０５１８】
VDJ再構成後、IgMは4鎖(H2L2)抗体として発現される。続いて、段階特異的軽鎖ノックアウトバックグラウンドにおけるアイソタイプ(クラス)スイッチング後(例えば、標的抗原を用いる免疫化後)(実施例2を参照されたい)、ガンマ-1型のH2抗体が多特異的重鎖の二量体として生成される。それぞれの重鎖は、標的抗原に特異的に結合する親和性成熟したN-末端VHドメインを担持する。さらに、それぞれの重鎖は、BMのために選択された所定の特異性を有する1つまたはその他の抗原結合部位を含む。この例においては、それぞれのBMはヒンジ-ガンマ1FcのN末端側すぐにある。かくして、多特異的抗体はFc機能(FcRn結合およびリサイクリングならびにADCCおよび/またはCDC機能)を有用に保持する。
【０５１９】
代替的な実施形態において(段階特異的軽鎖ノックアウトが存在しない場合)、アイソタイプスイッチングされた重鎖は、4鎖(H2L2)抗体の一部として軽鎖と一緒に発現される。CH1は重鎖遺伝子座の非ミュー(例えば、ガンマ)定常領域中に存在する。これらの抗体において、N末端VH/VL対は成熟し、免疫化のために用いられた標的抗原に対して選択される。実施形態において、CH1が軽鎖中でCLと自由に対形成し、BMが軽鎖ドメインとの対形成を必要としない定常領域の一部上に存在するように、BMを、非ミューCH1遺伝子セグメントまたはヒンジの下流に構成することが望ましい。例えば、BMヌクレオチド配列を、非ミュー定常領域中のCH2遺伝子セグメントの5'側すぐに(およびかくして、生成物である重鎖および抗体中のCH2もしくはFcのN末端側すぐ)に構成するか、またはそれはCH2もしくはCH3を置き換えるか、またはそれはCH3の3'側(すなわち、得られる生成物中のFcのC末端)にあってもよい。後者については、例えば、BMは任意選択のリンカー-dAb(dAbは既知の抗原結合特異性のものである)をコードしてもよい;得られる4鎖生成物は、それぞれの重鎖のC末端にdAbを有するmAbである。
【０５２０】
多価(例えば、二特異的)軽鎖を本発明に従って生成することができるように、同様の構成を軽鎖遺伝子座について行うことができる。
【０５２１】
(実施例4:分泌型アイソタイプスイッチングされ、成熟した多価、多特異的抗体および鎖の生成)
本発明者らは、B細胞コンパートメントおよびVレパートリー発生の初期段階の間の膜結合型4鎖IgMの正常な細胞表面発現、次いで、クラススイッチングされ、成熟した(例えば、免疫化後に)本発明の特異的に設計された多価重鎖および抗体の分泌を可能にする方法を考案した。
【０５２２】
野生型脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)における膜結合型または分泌型抗体に関するスプライシングとポリアデニル化との競合を例示する図7を参照する。
【０５２３】
B細胞発生の初期に、IgMは膜固定ドメイン(重鎖遺伝子座中でMによりコードされる)を含む重鎖のおかげで表面発現される。
【０５２４】
後に、形質芽細胞および形質細胞段階の間に、抗体は代わりに分泌される。これは、Mが足りない転写の停止およびCH3とMとの間のポリAシグナルの活性のため生じる(図7に示されるように、Mの3'側のポリAと異なる)。
【０５２５】
本発明の本実施例によれば、停止コドン(転写終結部位)およびポリAを、エピトープ結合部分をコードする配列の3'側すぐに(または最も3'側の部分)に挿入することができる。図8において、これはBMとHとの間に示される。例えば、脊椎動物ゲノム(例えば、ヒトゲノム、マウスゲノム、ラットゲノムまたは非ヒトゲノム)中のCH3とMとの間に、ポリAを含有させ、DNAのストレッチに対応するイントロン配列(停止コドンを含む)にフランキングさせることにより、これを実施することができる。好適なDNA配列は、マウス第12染色体:座標113324868〜113328978;およびヒト第14染色体:座標106206531〜106207817に対応する配列である。図8および図9に示されるように(任意選択で、条件的カッパ軽鎖ノックアウト中)、得られる脊椎動物または細胞の細胞における選択的スプライシングは、以下の分泌生成物(i)V-BM-H-ガンマ1Fc(例えば、Fcを含む二特異的H2抗体を生成するために二量体化することができる);または(ii)V-BM(単量体もしくは二量体として)を生成することができる。例えば、CH3とMとの間のポリAよりも強力なBMとHとの間のポリAシグナル中に操作することにより、後者の生成物を選択することができる。CH3とMとの間のより強力なポリAシグナルの使用は、生成物(i)を選択する。あるいは、分泌型V-BM(単量体または二量体として)のみが生成されるように、CH3とMとの間のポリAを省略することができる。
【０５２６】
図10Aおよび図10Bは、関連する本発明の重鎖遺伝子座を構築するための方法の詳細な略図を示す。「PiggyBac(PB)5'LTR-HPRT3'部分-loxP-HPRT5'部分-lox5171-PGKプロモーター-PB5'LTR」(図10A)の構造を有するランディングパッドを、ES細胞のマウスCγ1遺伝子座に標的化して、CH1およびヒンジならびにそれらの間のイントロンをコードするエクソン(マウス第12染色体:座標113329794〜113330598)を置き換える。正確に標的化されたクローンをHATにより選択し、遺伝子型決定により確認する。ランディングパッド標的化の後、「loxP-PB3'LTR-BMをコードする配列-CH3とM1エクソンとの間のイントロンに類似する配列を有するイントロン-ヒンジ領域をコードするエクソン-PB3'LTR-ピューロマイシン-デルタ-チミジンキナーゼをコードする遺伝子(PuroΔTK)-lox5171」(図10B)の構造を含有する挿入ベクターを挿入して、creリコンビナーゼ媒介性カセット交換(RMCE)を通じてランディングパッド中のloxPとlox5171との間の配列を置き換える。この例においては、挿入ベクター中のヒンジ配列は、第1の工程で欠失したヒンジ配列と同一であるが、ヒンジを含まない、または異なるヒンジ、例えば、ヒトもしくはラクダ科またはES細胞がマウスもしくはラットES細胞である場合、異なるマウスもしくはラット株に由来するヒンジを含む挿入ベクターを構築することができる。正確に挿入されたクローンをピューロマイシンにより選択し、ジャンクションPCRにより確認する。挿入は、遺伝子座中の2つの逆転したトランスポゾン構造(図10B)をもたらす。これらの2つのトランスポゾンを切り出すために、PiggyBacハイパートランスポザーゼ(Yusa,Kら、PNAS.2010.108:1531〜1536頁)を、これらのクローン中で一過的に発現させる。正確な欠失を含むクローンをチミジン類似体5-ヨード-2'-フルオロ-2'-デオキシ-1-β-D-アラビノ-フロノシルウラシル(FIAU)により選択し、ジャンクションPCRにより確認する。
【０５２７】
図10Bに示されるように、上記の生成物(i)および(ii)が可能である。
【０５２８】
(実施例5:条件的共通軽鎖対立遺伝子の作成)
図11Aおよび図11Bを参照する。任意の非ヒト脊椎動物ゲノムを操作するのに有用であるが、本実施例は、マウスゲノムの操作に適用される。
【０５２９】
内因性可変領域の不活化
内因性マウスVκ-Jκ遺伝子セグメントの逆転は、内因性カッパ可変領域発現を不活化する。図11Aは、リコンビナーゼ媒介性カセット交換を用いてこれを行うための方法を示す。Creリコンビナーゼの存在下では、挿入されたloxP部位での組換えは、内因性マウスカッパ可変領域DNAの逆転をもたらし、内因性Vκの発現を不活化する。最終工程は、図11Bに示される方法における使用のために5'カセットを除去し、カッパ遺伝子座の代わりに3'カセットのみを脱離させるためにpiggyBacトランスポザーゼを使用する。
【０５３０】
条件的Vκの挿入
図11Bを参照する。合成共通軽鎖ゲノム配列(プロモーター、リーダーエクソン、イントロンおよび共通軽鎖をコードするエクソン)、マウスゲノムイントロンEκ領域、ならびにlox2272/66およびlox2272/71-floxedマウスCκ領域を含むDNA断片を、一緒にライゲーションして、挿入配列を作成する(以下の配列を参照されたい)。挿入配列を、loxP-PB3'LTRおよびPB3'LTR-無プロモーターPuroΔTK遺伝子-lox5171を含むベクターpBR322中にさらにサブクローニングして、挿入ベクターを形成させる。内因性マウスVκ-Jκ遺伝子セグメントの逆転後、挿入ベクターを、Creの一過的発現を用いるRMCEを用いて、逆転した内因性IGκ遺伝子座に挿入する。挿入後、トランスポゾン構造を有する5'および3'末端中の改変カセットを、piggyBacトランスポザーゼの一過的発現により切り出す。得られるloxにフランキングするCκ配列を、Cre発現を駆動するAID調節エレメントを用いることにより、クラススイッチ段階などで上記の段階特異的cre発現の際に欠失させることができる。
【０５３１】
共通軽鎖可変領域ヒトVκ1-39JκもしくはVκ3-20Jκ(例えば、Vκ1-39JκもしくはVκ3-20Jκ1)またはVpreB(ヒトVpreBなど)の使用は、そのような可変領域はヒトVH領域と自由に対形成するため有用であり、かくして、クラススイッチング後にVHドメインがVLドメインと対形成しないH2抗体中で機能するVHドメインのその後の選択のための有用な一次レパートリーを提供することができるヒトVHドメイン配列の選択(4鎖IgM段階における)にとって有利であるスキャホールド能力を有し得ると本発明者らは考えている。
【０５３２】
共通の軽鎖挿入配列(5'から3'に):
atctttcagggacaatgatgcccatgcaggcagcatatttataatgcacagtaaacactaggaggaaacaaggcagtgagagaggaaagagagcagcgataccgaaaatgtcctcagcgagaagctaccacagaggatgaatggagatcaagcccacgtggaaacatgggaaaatgtctcagtatttttccacctaagaagggagggagatggggtatgtatacacctccctgtcctcactgattgagggctttccgagaggatgctcattccaggtgctgtgataggccatgtgtacaggcagggctgccttctccagcttcagatagagcagtgaggaaaagatatggccatggggggtcagcagaagtacagcaaagggaaaagggaaagggtagcaagagtgacaactatattcaccccccccacacacacacacacacacacgaaattgtgtattgcaatccagaactgcttctctctgaacctaaatcttagcaagcagtttaccagtaactgcccttgaaattcaggcccctggaaaggagcagggggttgtgtacaggctataccacagcagtctgcccacccttagtgatgcatgagtaatgctccctggactccccaggttctagtcttctcatgtcgatgtagttgattccacttcccttgctgcacaaccaggctgggatgcctgggcagaggcagacatgtgaggtataggggttcaaatctgtttccaagttttatccagcttcaaagcatttctccgtgtacatgagcggtggcttgacaggagatggagactctctttcctggatgtgaggcaaggaggcaggcgtctgagtcaggatgatgtccctactcactgctaaagagaaaagtggctttgatggtgcagggcagggaaatgcactgagtggtcgccaccctcacagaagagaaagtgttcactgacctggcctttccccagggcctctccctcccattgctttccagaaagccatgatttttgagagccacacctgaacactcacaaacattatggtgggaaaagcagatcagagcattaggcaagttgcattaccttggccttcttcctttggagacaattgatgtggggttctagattgacccagagtttcaagtttatcctgattcaggcttcaacagctggaggaagaaacagagatgttttttgaagtaaacagatctagcattactaatcaacccttcatactgatgacctatgggaaataatacccaagggcagaaaaatgggcagaataaggggagccccaaaccaagacgaagctgctgcccattgagaccctgggtattacagagacctatagctctggataatggaagatctatgagtggcacaggcgctgaggaatcacagcatcattatcgtgcatctgcagggaattgcttgtaaatatactggtaattacaaatgtttaaggtcactacaaatactttggagtgtattaaatatgcttctgataaagactgtttttctcacatgaaacaatgggaaccatgtgacaatcacagaggtgttgttactatagcaaaagggattgttactctccacatccctttaagtaacttgaaggcctgatagacccaccctctaagacttcattagacattccctacgaatggttatactctcctgtatactcccaatacaactctaaaatatattattccatatagtccttaggtttgtattaaagtttgacttttttccttcaaaatatctcttgtcacaacagcggctctagagagaaatacattccctccaggcaaatctatgctgcgctggtctgacctgggaccctggggacattgcccctgtgctgagttactaagatgagccagccctgcagctgtgctcagcctgccccatgccctgctgattgatttgcatgttccagagcacagccccctgccctgaagacttttttatgggctggtcgcaccctgtgcaggagtcagtctcagtcaggacacagcATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGgtaaggatggagaacactaggaatttactcagccagtgtgctcagtactgactggaacttcagggaagttctctgataacatgattaatagtaagaatatttgtttttatgtttccaatctcagGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACgtaagtacacttttctcatctttttttatgtgtaagacacaggttttcatgttaggagttaaagtcagttcagaaaatcttgagaaaatggagagggctcattatcagttgacgtggcatacagtgtcagattttctgtttatcaagctagtgagattaggggcaaaaagaggctttagttgagaggaaagtaattaatactatggtcaccatccaagagattggatcggagaataagcatgagtagttattgagatctgggtctgactgcaggtagcgtggtcttctagacgtttaagtgggagatttggaggggatgaggaatgaaggaacttcaggatagaaaagggctgaagtcaagttcagctcctaaaatggatgtgggagcaaactttgaagataaactgaatgacccagaggatgaaacagcgcagatcaaagaggggcctggagctctgagaagagaaggagactcatccgtgttgagtttccacaagtactgtcttgagttttgcaataaaagtgggatagcagagttgagtgagccgtaggctgagttctctcttttgtctcctaagtttttatgactacaaaaatcagtagtatgtcctgaaataatcattaagctgtttgaaagtatgactgcttgccatgtagataccatggcttgctgaataatcagaagaggtgtgactcttattctaaaatttgtcacaaaatgtcaaaatgagagactctgtaggaacgagtccttgacagacagctcaaggggtttttttcctttgtctcatttctacatgaaagtaaatttgaaatgatcttttttattataagagtagaaatacagttgggtttgaactatatgttttaatggccacggttttgtaagacatttggtcctttgttttcccagttattactcgattgtaattttatatcgccagcaatggactgaaacggtccgcaacctcttctttacaactgggtgacctcgcggctgtgccagccatttggcgttcaccctgccgctaagggccatgtgaacccccgcggtagcatcccttgctccgcgtggaccactttcctgaggcacagtgataggaacagagccactaatctgaagagaacagagatgtgacagactacactaatgtgagaaaaacaaggaaagggtgacttattggagatttcagaaataaaatgcatttattattatattcccttattttaattttctattagggaattagaaagggcataaactgctttatccagtgttatattaaaagcttaatgtatataatcttttagaggtaaaatctacagccagcaaaagtcatggtaaatattctttgactgaactctcactaaactcctctaaattatatgtcatattaactggttaaattaatataaatttgtgacatgaccttaactggttaggtaggatatttttcttcatgcaaaaatatgactaataataatttagcacaaaaatatttcccaatactttaattctgtgatagaaaaatgtttaactcagctactataatcccataattttgaaaactatttattagcttttgtgtttgacccttccctagccaaaggcaactatttaaggaccctttaaaactcttgaaactactttagagtcattaagttatttaaccacttttaattactttaaaatgatgtcaattcccttttaactattaatttattttaaggggggaaaggctgctcataattctattgtttttcttggtaaagaactctcagttttcgtttttactacctctgtcacccaagagttggcatctcaacagaggggactttccgagaggccatctggcagttgcttaagatcagaagtgaagtctgccagttcctcccaggcaggtggcccagattacagttgacctgttctggtgtggctaaaaattgtcccatgtggttacaaaccattagaccagggtctgatgaattgctcagaatatttctggacacccaaatacagaccctggcttaaggccctgtccatacagtaggtttagcttggctacaccaaaggaagccatacagaggctaatatcagagtattcttggaagagacaggagaaaatgaaagccagtttctgctcttaccttatgtgcttgtgttcagactcccaaacatcaggagtgtcagataaactggtctgaatctctgtctgaagcatggaactgaaaagaatgtagtttcagggaagaaaggcaatagaaggaagcctgagaatatcttcaaagggtcagactcaatttactttctaaagaagtagctaggaactagggaataacttagaaacaacaagATAACTTCGTATAAAGTATCCTATACGAACGGTAattgtatatatgtgcatcctggccccattgttccttatctgtagggataagcgtgcttttttgtgtgtctgtatataacataactgtttacacataatacactgaaatggagcccttccttgttacttcataccatcctctgtgcttccttcctcagGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTtagagacaaaggtcctgagacgATAACTTCGTATAGGATACTTTATACGAACGGTA
【０５３３】
この配列は、以下の構成成分(数字は配列中の位置に関するものである)を含む:
1.ヒトVκ1-39プロモーター:1894〜2000
2.再構成されたヒトVκ1-39/Jκ5:2026〜2537
a.リーダーエクソン:2026〜2080
b.Vκ1-39/Jκ5エクソン:2205〜2537
3.マウスイントロン配列:2538〜4891
4.Lox2272/66: 4892〜4925
5.マウスCκエクソン:5083〜5402
6.Lox2272/71:5425〜5458。
【０５３４】
別の実施形態においては、マウス可変領域DNAを逆転させる初期工程を実行しないが、その代わりに、上記の共通Vκの挿入により、マウスVκ発現を実質的に不活化する。
【０５３５】
(実施例6:共通VLドメイン多特異性:Cγ1遺伝子座内の並列scFv対立遺伝子の作成)
図12Aおよび図12Bを参照する。任意の非ヒト脊椎動物ゲノムを操作するのに有用であるが、本実施例はマウスゲノムの操作に適用される。この方法は、内因性ガンマ定常領域の内因性CH1を共通Vκと置き換えるものである。また、この方法を用いて、共通Vκの3'側に結合モジュールを挿入することもできる。
【０５３６】
構造「リンカー(L1)-共通ヒト軽鎖VκJκ-リンカー(L2)-結合モジュール」をコードするエクソンと、「選択的スプライシング部位-ポリアデニル化部位」を含有するイントロンとを含むDNA断片を合成し、loxP-PB3'LTRとPB3'LTR-無プロモーターPuroΔTK遺伝子-lox5171カセットとの間に挿入して、挿入ベクターを作成する(図12B;選択的スプライシング部位-ポリアデニル化部位は、縦の網掛け付きの小さい箱で示され、結合モジュールとヒンジとの間に示される)。リンカーは、1から4個の「Gly-Gly-Gly-Gly-Ser」をコードする配列であってもよい。共通軽鎖領域は、ヒト配列、例えば、ヒトVκ1-39Jκ5もしくはVκ3-20Jκ1またはヒトVpreB(以下の配列を参照されたい)または再構成された、もしくは生殖系列のVλJλをコードする配列であってもよい。結合モジュールは、一本鎖Fv(ScFv)または再構成されたVHDJHまたは第1のヒト標的抗原(例えば、抗原はヒトCD3もしくはヒトCD16または標的化細胞のエフェクター細胞殺傷を約束する別の細胞表面抗原である)に結合する任意の他の形態のエピトープ結合部分もしくはドメインをコードする配列であってもよい。選択的スプライシング部位-ポリアデニル化部位は、(例えば、マウスゲノムの)Cγ1H3とM1エクソンとの間のイントロン配列と類似するか、または同一である配列により提供することができ、「選択的スプライシング部位-分泌形態のIgG1-停止コドン-ポリアデニル化部位のカルボキシル末端をコードする配列」の構造を含む。挿入ベクターは、マウスES細胞中のCγ1H1中に標的化され、図12Aに示されるように、RMCEにより予め挿入されたランディングパッドを、Creの一過的発現と置き換える。
【０５３７】
挿入後、トランスポゾン構造を有する5'および3'末端中の改変カセットを、piggyBacトランスポザーゼの一過的発現により切り出す。ES細胞から標準的な手順を用いて子孫マウスを作成する。
【０５３８】
エピトープ結合部分配列(結合モジュール)をミュースイッチおよびミュー定常領域(この場合、ガンマ-1領域中)の下流に置くことにより、この配列は遺伝子座におけるAID変異ホットスポットから防護される。
【０５３９】
ナイーブなB細胞段階の間に、得られる遺伝子座は、N末端からC末端の方向に以下の構造からなる膜結合型重鎖(例えば、H2抗体の一部として)を生成することができる:
VH-L1-共通VL-L2-結合モジュール-ヒンジ-Fc-膜固定領域。
【０５４０】
本実施例において、結合モジュールは、ヒトCD3またはヒトCD16Aに特異的に結合するscFvである(例えば、以下にさらに記載される)。
【０５４１】
マウスを標的抗原(例えば、ヒトCD19またはヒトEpCAM)で免疫した後、形質芽細胞および血漿B細胞は、N末端からC末端の方向に、図12Bの下部に最後から2番目の線により示される構造の分泌型重鎖(例えば、分泌型H2抗体の一部として)を発現する:
scFv1-L2-結合モジュール。
【０５４２】
ここで、scFv1は、「VH-L1-VL」(式中、VLは共通VLに基づくものである)により提供され、scFv1は免疫化に用いられる標的抗原(例えば、CD19またはEpCAM)に特異的に結合する。本実施例においては、第2のscFv(結合モジュール)は、CD3またはCD16Aに特異的に結合する。
【０５４３】
あるいは、N末端からC末端の方向に、分泌型が存在する(図12Bの下部の線を参照されたい):
scFv1-L2-結合モジュール-ヒンジ-Fc。
【０５４４】
この生成物の生成を排除するために、CH3とM1との間のポリA部位を欠失させることができ、かくして、分泌型scFv1-L2-結合モジュールの生成を選択する。
【０５４５】
有利には、結合ドメインは完全にin vivoで組合せ、選択されたものであり、そのような組合せおよび選択に関する1つまたは複数のin vitro工程に依拠する当業界における問題を回避する。
【０５４６】
バイオベター
ある例において、抗体が抗原に特異的である、存在する抗体のバイオベターバージョンが生成される。この実施形態においては、結合モジュールは、抗原に特異的に結合するscFv(または他の結合形式)を含み、抗体の結合部位に見出されるVHとVLとの対を含む。共通VLは、その対に見出されるVLである。遺伝子座は、共通VL配列の5'側のヒトV、DおよびJ遺伝子セグメントを含む。得られるES細胞からの非ヒト脊椎動物の生成の後、脊椎動物を抗原で免疫し、VDJ組換えおよび成熟をin vivoで行う。かくして、成熟したVHを共通VLおよび結合モジュールscFvと組み合わせて、生成物であるscFv-リンカー-scFv(ここで、それぞれのscFvは抗原にとって特異的である)を生成する。この方法を用いて、抗原に結合する生成物を取得し、標的に対するより高い結合親和性を有する、および/もしくは元の出発抗体とは異なるエピトープに結合するか、またはより望ましい治療効力、発現もしくは生物物理学的特徴を有する生成物を選択することができる。
【０５４７】
かくして、本発明のある態様において、本発明の生成物により結合されるエピトープは、同じ抗原種に見出されるエピトープである。
【０５４８】
別の例においては、N末端に単一のscFv結合部位が生成されるように3'scFv結合モジュールを省略し、これは予め存在する(元の)抗体に由来するVLの存在下での誘導選択を受けた結合部位である。上記で考察されたように、選択されたVH/VL対を、元の抗体のバイオベターバージョンである抗体を生成するための重鎖および軽鎖発現ベクター中へのクローニングのために用いることができる。
【０５４９】
(実施例7:共通VLドメイン多特異性:抗CD19/抗CD3/抗CD16二特異的構築物)
本発明は、患者において免疫エフェクター細胞を動員するのに有用である多特異的ポリペプチドに関する。かくして、本発明は、(i)ヒト免疫エフェクター細胞上に位置するエフェクター抗原(例えば、ヒトCD3)および(ii)エフェクター抗原以外の標的抗原(例えば、ヒトEpCAMまたはヒトCD19)に特異的に結合することにより、ヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員することができる多特異的抗原結合ポリペプチド、二量体または抗体を提供し、任意選択で、前記標的抗原は前記ヒト免疫エフェクター細胞以外の標的細胞上に位置する。抗CD19/抗CD3生成物は、例えば、白血病または非ホジキンリンパ腫などの、患者におけるがんを処置するのに有用である。この目的のために、本実施例は、そのような生成物を提供する。例をTable 1(表1)に示す。
【０５５０】
【表１】
2015519055.tif 000003
【０５５１】
代替的な実施形態においては、L2およびL3はそれぞれ、
VEGGSGGSGGSGGSGGVD;または
(GGGGS); または
(GGGGS)2; または
(GGGGS)3; または
(GGS)3; または
AKTTP; または
AKTTPRLGG; または
EEGEFSEA
から別々に選択される。
【０５５２】
他の代替物は以下に提供される。
【０５５３】
遺伝子座構築の方法およびいくつかの例示的生成物を示す図については図13を参照されたい。図13Dおよび図13Eにおいて、BM1は遺伝子座の5'部分に可変領域の再構成から生じる配列を含む;BM2は挿入された既知の結合モジュールの配列から誘導される。
【０５５４】
代替的な実施形態においては、最終生成物がN末端dAb(免疫化のために用いられる抗原、例えば、CD19に特異的に結合する単一可変ドメイン)を含有するように、共通VLおよびL1(図12Bに示される共通VLの5'側であるリンカー)を省略することができる。任意選択で、scFvを用いる代わりに、結合モジュールは第2の抗原(例えば、CD3またはCD16)に特異的に結合するdAbであってもよい。かくして、生成物は、(N末端からC末端に向かって)dAb1-リンカー-dAb2(式中、dAbは異なる抗原(または例えば、改良されたバイオベター生成物を生成するための、同じ抗原種上の異なるエピトープ)に結合する)を含む。
【０５５５】
別の例においては、結合モジュール配列は、CH3の3'側に挿入される(図13C)。
【０５５６】
ある例においては、全ての結合モジュール可変領域がヒトである。さらに、またはあるいは、共通VLはヒトである。かくして、ヒトV、DおよびJ遺伝子セグメントが共通VL配列の5'側のIgH遺伝子座中に存在する場合、抗原を用いる免疫化後に、結合ドメインが全てヒトである二特異的生成物が生成される(生成物は免疫化に用いられる抗原に対して特異的な5'scFvおよび他の抗原に対して特異的な3'scFvを有する)。5'結合ドメインは、免疫化に応答してin vivoで選択および成熟される。3'結合ドメインは、それらが元々結合した抗原(例えば、CD3またはCD16)に対する特異性を保持する。
【０５５７】
V領域を好適なリンカーと連結し、そのような作出されたscFvまたは結合単位を他の結合モジュールと接続して一特異的または二特異的実体を作成する一般的概念およびそのようなリンカーの最適化は、文献に広く記載されている(例えば、Neri D, Momo M, Prospero T, Winter G. J Mol Biol. 1995年2月24日;246(3):367〜73頁; Wright MJ, Deonarain MP. Mol Immunol. 2007年4月;44(11):2860〜9頁を参照されたい)。リンカーの長さは、優先的に生成される分子形式に影響し得る。例えば、単量体二特異的並列scFvまたはV領域がVH-VL結合モジュールを形成するいわゆるダイアボディ形式は、2つの独立したポリペプチド鎖により提供される。
【０５５８】
L3配列の例は、
GTCGAAGGTGGAAGTGGAGGTTCTGGTGGAAGTGGAGGTTCAGGTGGAGTCGACによりコードされるVEGGSGGSGGSGGSGGVD
GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTによりコードされるGGGGSGGGGSGGGGS (aka (G4S)3)
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTによりコードされるGGGGSGGGGSGGGGS (aka (G4S)2)
GGAGGTGGTGGATCCによりコードされるGGGGS
gccaaaacaacacccによりコードされるAKTTP (WO2004024771を参照されたい)
AKTTPRLGG (WO2004024771を参照されたい)
gaagaaggtgaattttcagaagcaによりコードされるEEGEFSEA (US20090214574を参照されたい)
である。
【０５５９】
L2配列の例は、
GGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTによりコードされるGGSGGSGGS (aka (G2S)3)
GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTによりコードされるGGGGSGGGGSGGGGS (aka (G4S)3)
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTによりコードされるGGGGSGGGGSGGGGS (aka (G4S)2)
GGAGGTGGTGGATCCによりコードされるGGGGS
GTCGAAGGTGGAAGTGGAGGTTCTGGTGGAAGTGGAGGTTCAGGTGGAGTCGACによりコードされるVEGGSGGSGGSGGSGGVD
である。
【０５６０】
そのような二特異的治療剤において用いることができるヒト抗CD3可変領域の例は(WO2010132872を参照されたい、これらの配列は本発明における使用のために参照により本明細書に組込まれる)、以下の通りである。
【０５６１】
VH(WO2010132872における配列番号2である)
caggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc
tcctgtgcag cgtctggatt caagttcagt ggctatggca tgcactgggt ccgccaggct
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa gaaatactat
gtagactccg tgaagggccg cttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagacaaatg
ggctactggc acttcgatct ctggggccgt ggcaccctgg tcactgtctc ctca
によりコードされる
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFKFSGYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQMGYWHFDLWGRGTLVTVSS
【０５６２】
VL(WO2010132872における配列番号4である)
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgct cactttcggc
ggagggacca aggtggagat caaa
によりコードされる
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPLTFGGGTKVEIK
【０５６３】
ヒト抗CD3VH
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCCGCTCACTTTCGGCGGAGG GACCAAGGTGGAGATCAAA
によりコードされる
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFKFSpYGMHlWVRQAPGKGLEWVAlVIWYDGSKKYYVDSVKGIRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR^GYWHFDLIWGRGTLVTVSS
【０５６４】
ヒト抗CD3 VL
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
によりコードされる
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCIRASQSVSSYLAJWYQQKPGQAPRLLIYIDASNRATIGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPLTFGGGTKVEIK
【０５６５】
CD3に結合するVHおよびVLのさらなる例は、以下に示される。
【０５６６】
抗CD3 VH
GATATCAAACTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
によりコードされる
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS
【０５６７】
抗CD3 VH
caggtgcagctgcagcagtctggggctgaactggcaagacctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttactaggtacacgatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatcctagccgtggttatactaattacaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactacagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatattatgatgatcattacagccttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca
によりコードされる
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSS
【０５６８】
抗CD3 VL
GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAA
によりコードされる
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK
【０５６９】
抗CD3 VL
gatatcgtgctcactcagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgaactggtaccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtccctgctcacttcaggggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcggcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtaacccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaac
によりコードされる
DIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN
【０５７０】
従って、CD3にとって好適なscFv結合モジュールは、
GATATCAAACTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGTCGAAGGTGGAAGTGGAGGTTCTGGTGGAAGTGGAGGTTCAGGTGGAGTCGACGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAA
によりコードさせることができる。
【０５７１】
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLEL
のポリペプチド配列に翻訳される。
【０５７２】
あるいは、T細胞よりもむしろNK細胞の動員を好む、CD16エフェクター細胞動員のための結合部分を構成するVHおよびVL配列を用いることができる。ヒト抗CD16可変領域の例は、US2009021474に記載されている。
【０５７３】
ヒト抗CD16A VH
GAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAATAATCAACCCTAGTGGTGGTAGCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCCGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTTAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCTAGAGGTAGTGCTTATTACTACGATTTTGCTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
によりコードされる
EVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS
【０５７４】
ヒト抗CD16A VL
CAGCCTGTGCTGACTCAGCCATCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCACGATCTCCTGTGGGGGACACAACATTGGGAGTAAAAATGTGCACTGGTACCAGCAGAGGCCAGGCCAGTCCCCTGTGTTGGTCATTTATCAGGATAATAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCGATGGATGAGGCTGACTACTATTGTCAGGTGTGGGACAATTACAGTGTGCTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
によりコードされる
QPVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL
【０５７５】
CD16に結合するV領域のさらなる例は、EP1314741に記載されており、それらの配列は本発明における使用のために参照により本明細書に組込まれる。
【０５７６】
抗CD16結合VL
GATATCCAGCTGACCCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATTTGAACTGGTACCAACAGATTCCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGATGCATCCAATCTAGTTTCTGGGATCCCACCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGAAGGTGGATGCTGCAACCTATCACTGTCAGCAAAGTACTGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTCGAGATCAAA
によりコードされる
DIQAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSNTGTVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGHTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYNNHWVFGGGTKLTVL
【０５７７】
抗CD16結合VH
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTGGCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACTCTGACTGCAGACGAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTAGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGACGGGAGACTACGACGGTAGGCCGTTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCCG
によりコードされる
QVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYTFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGGGYTNYNEKFKGKATVTADTSSRTAYVQVRSLTSEDSAVYFCARSASWYFDVWGARTTVTVSS
【０５７８】
GGGGSGGGGSGGGGS (G4S)3(太字で強調される)をコードするリンカーを含む、CD19に結合するscFv VL-VHの例
GATATCCAGCTGACCCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATTTGAACTGGTACCAACAGATTCCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGATGCATCCAATCTAGTTTCTGGGATCCCACCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGAAGGTGGATGCTGCAACCTATCACTGTCAGCAAAGTACTGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTCGAGATCAAAGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTGGCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACTCTGACTGCAGACGAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTAGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGACGGGAGACTACGACGGTAGGCCGTTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCC
によりコードされる
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSS
【０５７９】
GGGGSGGGGSGGGGS (G4S)3(太字で強調される)をコードするリンカーを含む、CD19に結合するscFv VH-VLの例
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTGGCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACTCTGACTGCAGACGAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTAGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGACGGGAGACTACGACGGTAGGCCGTTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGATATCCAGCTGACCCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATTTGAACTGGTACCAACAGATTCCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGATGCATCCAATCTAGTTTCTGGGATCCCACCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGAAGGTGGATGCTGCAACCTATCACTGTCAGCAAAGTACTGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTCGAGATCAAA
によりコードされる
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIK
【０５８０】
CD19結合抗体に由来する固定されたVLおよびヒトCD3に特異的なscFvを含むTable x(表x)に記載のモジュールの例は、
GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGATATCCAGCTGACCCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATTTGAACTGGTACCAACAGATTCCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGATGCATCCAATCTAGTTTCTGGGATCCCACCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGAAGGTGGATGCTGCAACCTATCACTGTCAGCAAAGTACTGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTCGAGATCAAAGGAGGTGGTGGATCCGATATCAAACTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGTCGAAGGTGGAAGTGGAGGTTCTGGTGGAAGTGGAGGTTCAGGTGGAGTCGACGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAA
としてコードされる。
【０５８１】
本発明の脊椎動物または細胞中、in vivoで作成されるN末端ヒトVHドメインを上記のようにin vivoで融合することができる、
GGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLEL
のアミノ酸配列が得られる。CD19に特異的なコードされたVLと対形成するためのVHドメインを、例えば、本発明のトランスジェニック脊椎動物をヒトCD19で免疫することにより作成することができる。次いで、脊椎動物(例えば、マウス)ゲノム中の重鎖遺伝子座のVDJ遺伝子セグメントのin vivoでの組換えは、動物中でin vivoで選択されたVHおよび脊椎動物のゲノム中でコードされるVLからなるscFvモジュールを作成し、これは上記で概略されたようにヒトCD3に特異的な結合モジュールにリンカーを介して接続されたヒトCD19に特異的である。
【０５８２】
免疫化手順
CD19細胞表面抗原のための免疫化手順は、モノクローナル抗体の作成のために記載されている(PEZZUTTO, A., DORKEN, B., RABINOVITCH, P.S., LEDBETTER, J.A., MOLDENHAUER, G.およびCLARK, E.A., CD19 monoclonal antibody HD37 inhibits anti-immunoglobulin-induced B cell activation and proliferation. J. Immunol.; Pezzutto A, Dorken B, Feller A, Moldenhauer G, Schwartz R, Wernet Pら、HD37 monoclonal antibody: a useful reagent for further characterization of "non-T, non-B" lymphoid malignancies. In: Reinherz EL,Haynes BF, Nadler LM, Bernstein ID, editors. Leukocyte typing II. Proceedings of the 2nd International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens; 1984年9月17日〜20日; Boston, USA. New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo: Springer-Verlag; 1986. Volume 2、391〜402頁、138、2793〜2799頁(1987))。
【０５８３】
CD19特異的scFvのスクリーニング
ヒトCD19に特異的である本発明の分子のスクリーニングを、KohlerおよびMilsteinにより記載されたようにマウス(または他の脊椎動物)脾臓細胞とミエローマ系との融合により作成されたハイブリドーマ細胞の培養上清からスクリーニングすることができる。これを、例えば、フローサイトメトリーまたは細胞に基づくELISAなどの免疫アッセイ技術またはLi-Cor Odysee(商標)などの画像化技術を用いて、細胞表面上にヒトCD19を発現する一次細胞または不死化細胞系への結合についてスクリーニングすることにより達成することができる。同様に、二特異的ELISAおよびSPRスクリーンを、例えば、Mooreら、2011(Moore PA, Zhang W, Rainey GJら、Application of dual-affinity re-targeting molecules to achieve optimal redirected T-cell killing of B-cell lymphoma. Blood. 2011; 117(17):4542〜4551頁)に記載のように組換えタンパク質を用いて実行することができる。ヒトCD19への結合について陽性のハイブリドーマクローンを選択し、同じ技術を用いて別々にヒトCD19およびヒトCD3への結合について二次スクリーニングにかける。これらの選択されたクローンの機能的分析は、B細胞リンパ腫系のCD19媒介性殺傷またはヒトPBMC調製物からのB細胞の枯渇を含み、両方とも例えば、Mooreら、2011に記載されている。
【０５８４】
(実施例8:トランスジェニック非ヒト脊椎動物)
マウスIgG1定常領域の操作(ランディングパッド挿入)
例として構造VH1-L1-VL1-L2-VH2-L3-VL2-ヒンジ-CH2-CH3を有する多価(例えば、多特異的または二特異的)ポリペプチド鎖のin vivoでの選択を可能にするために、マウスIgG1定常領域を以下に詳述するように操作した。
【０５８５】
R232と呼ばれる進入ベクターを、別途記述しない限り標準的な分子生物学技術を用いて図14Aに詳述される特徴を含有するマウスIgG1定常領域中に標的化するために構築した。一度、標的化ベクターがIgG1定常領域中に挿入されたら、それはRMCEにより任意のDNA断片を挿入するためのランディングパッドとして作用し、これは、例えば、遺伝子または複数の遺伝子、抗体単一可変ドメイン(dAb)、scFv、ペプチドなどの結合モジュールであってもよい。
【０５８６】
IgG1定常領域を含有するSource BioScience LifeSciencesから購入したマウス129BAC bMQ263j18を用いて、5'および3'相同性アーム(HA)の組換え工学により回収した。5'-HAは2707bpであり、3'-HAは3001bpであり、回収はプラスミドpBR322中で行われた。回収に用いられたオリゴは、下流のクローニングを容易にする組込まれた制限部位を含有していた。5'-HAは制限部位NotIおよびMluIを含有していたが、3'-HAは制限部位EcoRIおよびKpnIを含有していた。それぞれの相同性アームを、2つのPB5'LTRを有する不活性piggyBACトランスポゾンエレメントを含有し、その中に2つの部分に分割されたPGKプロモーターおよびHPRT遺伝子を含むベクターR3中に連続的にクローニングした(5'HPRTおよび3'HPRT)。3'-HPRT部分はloxPおよびlox5171部位変異体にフランキングしていた。R3中への5'および3'-HAのクローニングにより、進入ベクターR232が得られた。
【０５８７】
NotI制限酵素を用いて線状化することにより、ES細胞中に標的化するために進入ベクターを調製した。約10μgの線状化R232プラスミドDNAを、IgH遺伝子座にヒトVDJ遺伝子セグメントを含有するES細胞中に標的化するために用いた。標的化されたESクローンを、ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン(HAT)を含有する培地上で選択し、正確に標的化されたクローンをPCRにより遺伝子型決定した。
【０５８８】
結合モジュールベクターの構築
別途記述しない限り標準的な分子クローニング技術を用いて、結合モジュールベクターを構築した。ヒンジ、CH2、CH3、M1およびM2ドメインを含有するIgG1定常領域を、組換え工学によりBAC bMQ263j18から回収した。WO2004/106381に文書化されたようなヒトCD3およびヒトCD19に特異的な結合ドメインを含む二特異的一本鎖抗体構築物に由来するscFvを、CD3に対する固定結合モジュールとして用いた。全体の結合モジュール構造は、CD19の可変重鎖が含まれず、CD19の可変軽鎖が単一の再構成された共通軽鎖と置き換えられた以外はWO2004/106381に文書化された構築物2(配列番号1;タンパク質番号2)のものと類似していた。対象の抗原で免疫した場合、単一の再構成された軽鎖と会合した逆キメラ免疫グロブリン重鎖(例えば、Vκ1-39/JまたはVκ3-20/J)を発現するように遺伝子操作されたマウスが、多様なヒトVセグメント再構成を含み、多様な高親和性抗原特異的抗体を発現するB細胞を作成することがEP2505654に文書化された。この目的のために、本発明者らは、VHの非存在下で再構成されたVκ1-39Jκ5を用いて、第2の抗原のための結合モジュールの一部を形成させた(これは遺伝子座の5'でのヒト可変領域遺伝子セグメントの再構成により生成されたVHと組み合わさる)。固定されたCD3結合ドメインの下流に、マウスIgG1 CH1とヒンジドメインとの間に位置するイントロン配列を含有させて、CD3結合ドメインのヒンジドメインおよびかくして、残りのIgG1定常領域へのスプライシングを可能にした。結合モジュールドメインおよびイントロンDNAを、GeneArt(Invitrogen)により合成的に構築し、これは以下の構造を有していた:
L1-VL(Vk1-39Jk5)-L2-VH(CD3)-L3-VL(CD3)-イントロン配列
L1は、リンカー1:
GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTによりコードされるGGGGSGGGGSGGGGS
L2は、リンカー2:
TCCGGAGGTGGTGGATCCによりコードされるSGGGGS
L3は、リンカー3:
GTCGAAGGTGGAAGTGGAGGTTCTGGTGGAAGTGGAGGTTCAGGTGGAGTCGACによりコードされるVEGGSGGSGGSGGSGGVD
VL(Vk1-39Jk5):
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagtacccctccgatcaccttcggccaagggacacgactggagattaaacgtaag
によりコードされる
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIKRK
VH(CD3):
GATATCAAACTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
によりコードされる
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS
VL(CD3):
GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
によりコードされる
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK
【０５８９】
ヒンジ、CH2、CH3、M1およびM2を含有する回収されたマウスIgG1定常領域を、NdeIおよびMluI制限部位により、合成的に構築された結合モジュールドメインの下流にクローニングした。得られる結合モジュールおよびIgG1定常領域を、HindIIIおよびMluIによりベクターR217中に単一の断片として、puro-デルタ-TK選択カセットおよびRMCEを可能にするための進入ベクターと適合するlox部位も含有する2つのPB3'LTRの間にクローニングした。結合モジュールの最終的な構造を、図14Bに示し、R246と呼ぶ。
【０５９０】
ランディングパッドを含有するES細胞中への結合モジュールベクターR246の標的化を、Creリコンビナーゼの一過的発現およびピューロマイシンを含有する培地中でのクローンの選択と共にRMCEにより達成した。ES細胞中の正確に標的化された結合モジュールベクターはランディングパッドを置き換え、挿入された結合モジュールの5'および3'末端で2つの機能的なpiggyBACトランスポゾンを再構成する。2つの機能的トランスポゾンは改変エレメントおよび選択カセットにフランキングし、かくして、これらのものはハイパー-piggyBacトランスポザーゼの一過的発現により同時に都合良く切り出された。結合モジュールベクターの標的化およびその後の二重切出しをPCRにより連続的に分析した。
【０５９１】
ES細胞から標準的な手順を用いて子孫マウスを作成した。
【０５９２】
キメラマウスからの二特異的転写物の増幅
2つのキメラマウス(Table 2(表2))を、誕生の25日後に犠牲にし、その脾臓およびリンパ節を採取し、全RNAを製造業者のプロトコールに従ってTrizol試薬(Life Technologies)を用いて抽出した(図15a)。
【０５９３】
【表２】
2015519055.tif 000004
【０５９４】
脾臓を3等分に切片化し、それから全RNAを抽出した。マウスIgG1 CH2ドメインに特異的なリバースプライマーを、5'-RACE second generation kit(Roche)を用いて約5μgの全RNAからの第1鎖cDNA合成のために用いた。cDNAを、High Pure PCR Purification Kit(Roche)を用いて精製した。ポリ(A)尾部を、製造業者のプロトコールに従って、組換え末端トランスフェラーゼおよびdATPを用いて第1鎖cDNAに付加した。dA尾部付きcDNAを、オリゴdT固定プライマーおよびマウスIgG1 CH2ドメインに特異的な内部リバースプライマー1を用いるPCR増幅のために直接用いた(第1ラウンドの単一セミネステッドPCR)(図15B)。第2ラウンドのPCRを、第1ラウンドのPCRと同じネステッドオリゴ(第2ラウンドの単一セミネステッドPCR)を用いるか、またはマウスCH2ドメインに特異的なさらなる内部リバースプライマー2(第2ラウンドの二重セミネステッドPCR)およびPCRアンカープライマーを用いて、鋳型としての1μlのゲル抽出した第1ラウンドのPCR生成物を用いて実行した(図15C)。予想されるサイズの二特異的転写物(約1.7kb)に対応するPCR生成物をゲル抽出し、Qiagenゲル抽出キットを用いてDNAを精製した。第3ラウンドのPCRを、CH2ドメインに特異的なさらなる内部リバースプライマー3(第3ラウンドの三重セミネステッドPCR)を用いて実行して、任意の非特異的DNA断片を増幅する可能性を低下させた。(図15D)
【０５９５】
結果
二特異的抗体トランスジェニックマウス作成
挿入されたヒトVDJ遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを、さらに操作した。IgG1定常領域を、ランディングパッド中で標的化することにより最初に置き換えた。ランディングパッドは、CH1ドメインを欠く、以下の構造L1-VL1-L2-VH2-L3-VL2-ヒンジ-CH2-CH3-イントロン配列-M1-M2を含有するRMCEによる結合モジュールの挿入を容易にした。in vivoで選択されたV遺伝子のリンカー1(L1)へのRNAスプライシングを可能にするために、スプライスアクセプターを、L1の5'末端側に置いた。さらに、内因性マウスIgG1 CH1とヒンジとの間に位置する遺伝子内領域を、結合モジュール内のVL2とヒンジ領域との間に操作して、2つのドメインの正確なスプライシングを可能にした。さらに、普遍的選択およびVH遺伝子のL1への再構成およびかくして、重鎖と軽鎖との対形成を可能にするために、共通の軽鎖をVL1として用いた(Vκ1-39/Jκ5)。
【０５９６】
若いナイーブなキメラマウス(25日齢)を、5'-RACEを用いて予想されるサイズの新規二特異的抗体に対応するmRNA転写物について分析した。IgG1 CH2ドメインに特異的なプライマーを用いて脾臓および骨髄から収穫された全RNAから合成されたcDNAに対する3ラウンドの連続的セミネステッドPCRを用いて、予想されるサイズの新規二特異的抗体(約1.7kb)に対応するサイズを有する転写物を、マウスKMBS2.1dのリンパ節から抽出されたRNA中で検出することができた。これらの転写物は、生殖系列対立遺伝子から増幅されたもの(約850bp)とはサイズが異なっていた(図15)。
【０５９７】
図16は、SalIで消化されたPCR生成物のゲルを示す。予想されるサイズの二特異的抗体転写物に対応するバンドを見ることができた。配列決定を行って、結果をさらに確認することができる。
【０５９８】
本発明者らは、安定であり、天然の選択、VDJ再構成およびクラススイッチ組換えによりin vivoで作成することができる誘導選択の生成物を作成する方法であって、さらに、CH1ドメインの非存在下でVDJ再構成およびクラススイッチ組換えに有害に影響することなく定常領域を変化させることができる方法を提供したと考えている。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１６】
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【図１】
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【図２】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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