(57)【要約】  本発明は、医学および生物学に関し、特に血液およびその成分の凝固特性を決定するための診断および研究の目的に、そしてバイオテクノロジーおよび基礎生物学的研究において、使用可能である。  本発明の課題は、試験サンプル中およびサーモスタットで制御された流体中の気泡が試験プロセス自体（たとえば、血液の凝固）や記録されたデータの処理に影響しないようにすることであり、このことは、得られる結果の精度や試験の完全性に、そして凝固プロセスおよびその特定のパラメーターに関する新たな情報の取得に影響を及ぼす。  この課題は、流体が充填されたサーモスタット制御式チャンバーと、少なくとも１つの照明手段と、記録手段と、圧力調節手段と、を含む、血液およびその成分の空間的な凝固をモニタリングするための装置であって、サーモスタット制御式チャンバーの内部には、試験液のサンプルを入れるためのキュベットが設けられ、記録手段は、サーモスタット制御式チャンバーの内面の幾何学形状によって形成されたライトトラップを備え、圧力調節手段は、サーモスタット制御式チャンバーまたはキュベットに接続されている装置を作製することによって、解決される。
2015529323.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体が充填されたサーモスタット制御式チャンバーと、少なくとも１つの照明手段と、記録手段と、圧力調節手段と、を含む、血液およびその成分の空間的な凝固をモニタリングするための装置であって、前記サーモスタット制御式チャンバーの内部には、試験液のサンプルを入れるためのキュベットが設けられ、前記記録手段は、前記サーモスタット制御式チャンバーの内面の幾何学形状によって形成されたライトトラップを備え、前記圧力調節手段は、前記サーモスタット制御式チャンバーまたは前記キュベットに接続されている、装置。
【請求項２】
少なくとも１つの別の照明手段を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記照明を指向させ、その焦点を絞り、スペクトル補正をする光学素子を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記照明手段、前記記録手段、および前記圧力調節手段の作業を同期可能となるよう製造された、前記照明手段、前記記録手段、および前記圧力調節手段の制御ユニットを更に含む、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
試験の結果を処理する手段との接続を更に含む、請求項１に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術判定は、医学および生物学に関し、特に血液およびその成分の凝固特性を決定するための診断および研究の目的に、そしてバイオテクノロジーおよび基礎生物学的研究において、使用可能である。
【背景技術】
【０００２】
血液およびその成分の凝固についての研究は、特定の疾患の診断を可能にするだけでなく、血液凝固パラメーターに影響する調製物の活性評価もできるようにするため、実用上、重要である。全血および血漿における凝固速度を決定するためのさまざまな装置が、背景技術から知られている。しかしながら、現在まで、これらの研究は恒久的に混合されている均一系において設計されてきた。試験の最初から終わりまで血漿全体が恒久的に混合されるため、凝固血漿形成過程の間に形成されるすべての凝固因子が試験液中で均一に分散され、同時に試験サンプル全体で凝塊の形成が進行している。生理学的観点から、この過程はｉｎ  ｖｉｖｏでの凝塊形成条件とは基本的に異なる。
【０００３】
背景技術から、本発明者らは、国際出願第ＰＣＴ／ＣＨ２００７／０００５４３号（国際公開ＷＯ２００９／０５５９４０号、分類Ｇ０１Ｎ  ３３／４９、２００９年５月７日公開）に開示された、フィブリン凝塊の空間的な形成をモニタリングするための装置を知っている。この装置は、凝固活性化因子が底端に固定化されたインサートと、キュベットと、からなるキュベットアセンブリーを含む。キュベットアセンブリーは、キュベットを熱的に安定させるためのサーモスタットとキュベットをサーモスタットの内部に固定するための装置とを含むホルダー内に配置される。サーモスタットには、少なくとも部分的に透明な流体が充填されている。前記装置は、フィブリン凝塊の空間的な成長の過程を調節する他の凝固因子の形成過程と空間的な分布を登録する可能性を与えることなく、フィブリン凝塊の形成過程の登録を凝固系の作用の最終生成物とすることを可能にする。このように開示された解決手段に対する最も近い類似物としては、血液およびその成分の凝固特性を調査するための装置（特許ＲＵ  ２３９５８１２、分類Ｇ０１Ｎ３３／４９、２０１０年７月２７日公開）があり、この装置は、流体が充填され、かつ、試験サンプルを有するキュベットと凝固活性化因子が固定化されたインサートとを収容しているサーモスタット制御式チャンバーと、キュベットの内容物およびインサートの下端付近で形成される凝塊に光を照射するための照明手段と、デジタルカメラと、を含み、得られたデータを処理するようコンピューターに接続される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前記装置の欠点の一つは、サーモスタット制御式チャンバーでの試験サンプルの加熱時における登録領域内での試験サンプルおよび流体中の気泡の形成である。これらの気泡は、フィブリン凝塊からの光散乱信号を歪めてしまう。さらに、この装置は、たとえば赤色光など一波長のみの照明手段しか有しておらず、このことが、たとえば蛍光的な方法でのタンパク質分解酵素の時空間分布の研究をフィブリン凝塊形成についての研究と同時に行うことを妨げている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
特許請求の範囲に記載の解決手段を実現することで得られる技術的な結果は、多数の血液疾患を診断するのに必要な、血液およびその成分の空間的な凝固のパラメーターの定義に関して、方法の精度と信頼性が改善されるのみならず、過去には研究されていなかった多数の別のパラメーターを決定できるようになることである。
【０００６】
開示された解決手段によって解決される課題は、試験サンプル中やサーモスタットで制御された流体中の気泡が試験プロセス自体（たとえば、血液の凝固）や記録されたデータの処理に影響しないようにすることであり、このことは、得られる結果の精度や試験の完全性に、そして凝固プロセスおよびその特定のパラメーターに関する新たな情報の取得に影響を及ぼす。
【０００７】
この課題は、流体が充填されたサーモスタット制御式チャンバーと、少なくとも１つの照明手段と、記録手段と、圧力調節手段と、を含む、血液およびその成分の空間的な凝固をモニタリングするための装置であって、サーモスタット制御式チャンバーの内部には、試験液のサンプルを入れるためのキュベットが設けられ、記録手段は、サーモスタット制御式チャンバーの内面の幾何学形状によって形成されたライトトラップを備え、圧力調節手段は、サーモスタット制御式チャンバーまたはキュベットに接続されている装置を作製することによって、解決される。
【０００８】
さらに、事実によれば、装置は、少なくとも１つの別の照明手段を含む。
【０００９】
さらに、事実によれば、装置は、照明を指向させ、その焦点を絞り、スペクトル補正をする光学素子を含む。
【００１０】
さらに、事実によれば、装置は、前記照明手段、記録手段、および圧力調節手段の作業を同期可能とするよう製造された、照明手段、記録手段、および圧力調節手段の制御ユニットを更に含む。
【００１１】
さらに、事実によれば、装置は、試験の結果を処理する手段との接続を更に含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】特許請求の範囲に記載の装置の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
特許請求の範囲に記載の装置は、温度調節可能に製造され、流体が充填されたサーモスタット制御式チャンバー１を含む。水および空気のサーモスタット制御や、ゲルの使用を伴うサーモスタット制御を含む、異なるタイプのサーモスタット制御を提供する可能性がある。ところで、試験液は放射線用に透明に維持されなければならないことが考慮されてきた。水のサーモスタット制御が好ましい。サーモスタット制御時、恒久的な温度が維持される。キュベット２は、前記チャンバー１の内部に配置される。キュベット２は、少なくとも１本のチャネル３を設けて製造可能である。試験液サンプルは、チャネル３内に入れられる。試験液サンプルの代表例は、血液、血漿、全血、乏血小板血漿、または多血小板血漿などの哺乳動物（ヒトまたは動物）の体液であってもよい。さらに、サンプルは、止血活性を有する、精製された天然、合成、または組換えタンパク質、および／または他の調製物／試薬の混合物を含んでもよい。たとえば凝固の研究対象プロセスの開始を容易にする作用剤が底端に適用されたインサート４を、前記キュベット２の中に入れることができる。以下の作用剤を使用して、凝固プロセスの開始を容易にすることが可能である：タンパク質、異なる手段によってインサート４の前面に、あるいは、あらかじめ定められた位置でキュベット２の内面に直接、固定化されたいわゆる組織因子（トロンボプラスチン）、そして、細胞および組織の調製物などの他の有機体剤。ガラス、カオリンなどの他の血栓形成剤を活性化因子として使用してもよい。
【００１４】
背景技術から知られている装置の主な欠点のひとつは、加熱時に、サンプル中の気泡のみならず、サーモスタット制御式チャンバー１内の流体中の気泡の形成によって生じるモニタリングパラメーターのゆがみである。この欠点を排除するために、著者らは、試験時に安定した圧力を調節および維持する手段５を有する、特許請求の範囲に記載の装置を提供することを提案した。この目的のために、圧力調節手段５が、サーモスタット制御式チャンバー１に接続される。圧力調節手段５は、特定の製造例において、戻し弁を介してサーモスタット制御式チャンバー１の内側の（圧力がシールされた）部分と上述したチャンバー１の圧力を測定する圧力センサーとに接続された空気ポンプで代表されるものであってもよい。圧力センサーの値に基づいて、制御ユニット（図１には図示せず）は、空気ポンプを制御する（これのオン／オフを切り替える）。ポンプは、たとえば、当該空気ポンプを介したサーモスタット制御式チャンバー１からの偶発的な圧力開放を防止する戻し弁が組み込まれるパイプによって形成された圧力ラインを介して、サーモスタット制御式チャンバー１に接続される。弁は、受動的かつ機械的であってもよいし、制御ユニットによって電機機械的に調整されてもよい。制御ユニットの命令下、サーモスタット制御式チャンバー１の圧力シール時に、ポンプはオンに切り替わり、チャンバー１内での加圧を開始する。圧力センサーによって測定される標的圧力に達した後、ポンプは、オフに切り替わる。試験時、圧力が標的レベル未満まで降下したらポンプのオン／オフを切り替えることによって、標的圧力が維持される。
【００１５】
標的圧力を維持しつつ、サーモスタット制御式チャンバー１の圧力シールが与えられる。圧力シールは、たとえば、サーモスタット制御式チャンバー１の内側部分の加圧手段６を用いて与えることができる。加圧手段は、カバー、カップ、シャッター、または他の任意の一般的な手段に代表されるものであってもよい。同時に、加圧手段６は、オペレーターによって閉じられる機械的なものであってもよいし、制御ユニットによって指令される電気機械的なものであってもよい。
【００１６】
さらに、キュベット２内で圧力を直接発生させてもよい。その後、圧力調節手段５がキュベット２内に圧力を加え、圧力ライン（パイプ）が前記キュベットと接続される。
【００１７】
試験全体を通して大気圧に対して過剰な圧力、好ましくは０．２から０．５ａｔｍを維持すると、気泡の排除が可能であるということが立証された。
【００１８】
サーモスタット制御式チャンバー１には、透明なウィンドウ７が設けられ、このウィンドウを介して少なくとも１つの照明手段８が試験サンプルとその中に形成された凝塊に光を照射する。所望のスペクトル範囲のＬＥＤまたは他の任意の放射線源（たとえば、光学フィルター付き電球）を照明手段として用いることができる。大きくなっていく凝塊の画像（凝塊からの光散乱）を、たとえばレンズ１０を備えるデジタルカメラなどの登録手段９によって固定する。登録された画像の品質（信号／バックグラウンドの相関）を改善するため、ならびにサーモスタット制御式チャンバー１における凝固の追加のパラメーターをモニタするために、ライトトラップ１１が提供される。前記ライトトラップ１１は、バックグラウンドの放射線を低減するのに用いられる。バックグラウンドの放射線は、光を散乱できる凝塊などの研究対象の構造体によって登録手段の方向に散乱する以外のすべての放射線である。ライトトラップ１１は、異なる方法で製造可能であり、とりわけサーモスタット制御式チャンバーの内面の特定の幾何学形状によって形成され、特に、扁平な錐形によって表される。また、これは、たとえばチャンバーの内面を暗色にしていくぶん粗くするなど、その内面に吸光特性を与えることによっても形成可能である。ライトトラップ１１の幾何学形状および光学特性は、バックグラウンドの放射線を繰り返し再反射および吸収するように考え出された。
【００１９】
そして、登録手段９は、試験結果を処理する手段１３、たとえばコンピューターと電気的および情報的に接続されている。照明手段および登録手段は、制御ユニット（図１に図示せず）によって調節できるよう製造される。
【００２０】
発色基質、続いて蛍光基質の登場によって、凝固系の機能原理についての新たな情報を取得することが可能になった。前記基質を、タンパク質分解酵素を含む試験サンプルに加えると、後者が基質から信号プローブを切断する。このプローブは、試験サンプルの光学密度を変更する（発色基質）か、あるいは照射されると蛍光を発する（蛍光基質）ことができる。反応−拡散−対流タイプの式を使用し、信号プローブの空間分布に基づいて、対応するタンパク質分解酵素の空間分布を把握可能である。
【００２１】
蛍光基質を用いる場合、プローブの蛍光を励起するために、特許請求の範囲に記載の装置には、定められた時点で試験液のサンプルに励起放射線を照射する少なくとも１つの照明手段１２が更に設けられる。照明手段１２は、好ましくはキュベット壁２に直交する方向で、光学素子を介して放射線を供給する。この光学素子は、たとえば、鏡１４と共に放射フィルター１５および励起フィルター１６を用いて、サーモスタット制御式チャンバー１に形成されたウィンドウ７を介して、照明を指向させ、その焦点を絞り、スペクトル補正をする。ＵＶ−スペクトルＬＥＤのようなＵＶ放射線源を、照明手段１２として使用する。励起フィルターは、照明手段１２のスペクトルからプローブの蛍光スペクトルを分離する。
【００２２】
この装置は、以下のように動作する。サーモスタット制御式チャンバー１の温度が固定されたレベルに設定され、維持されて、その内部に配置されたキュベット２が均一に加温される。試験の前に、たとえば血漿などのサンプルがキュベット２内に入れられる。サンプルの体積全体が同じ温度になり、その中の対流が停止したら、インサート４がキュベット内に入れることによって、前記インサート４の端に塗布した血栓形成剤をサンプルと接触させて、研究対象の凝固プロセスが開始されるようにする。サーモスタット制御式チャンバー１は、加圧手段６によって閉じられ、圧力調節手段５によってチャンバー内の過剰な圧力が生み出される。研究時、ライトトラップ１１は、その幾何学形状および表面挙動がゆえに、キュベット２の面の後ろを通過する放射線を効率的に吸収し、バックグラウンドの放射線を繰り返し再反射および吸収して、反射された放射線がキュベット２の登録領域に戻ってレンズ１０の入射開口に入射することがないようにする。キュベット２の内部で大きくなっている凝塊の画像は、透明なウィンドウ７およびレンズ１０を介して、登録手段９に送られる。その後、結果をさらにデジタル処理するために、記憶手段１３にデジタル画像が送られる。
【００２３】
もし、たとえば蛍光基質が試験サンプルに添加されると、定められた時点で、照明手段１２によって蛍光基質が照明されてプローブの蛍光を励起し、サンプル中のプローブの蛍光の空間分布が登録手段９によって登録される。特別に開発されたソフトウェアによって、照明手段および登録手段の制御ユニットは、記録が行われている短い時間のみ照明手段８および／または１２をオンにすることができる。照明手段のこのような動作方式は、基質プローブの光退色の作用を低減する。基質プローブの照明と同時に、照明手段８によって試験液サンプルが照明され、光散乱の空間分布、サンプル内での光透過の空間分布、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される試験サンプルの光学パラメーターが登録される。それによって、血液凝固パラメーターの空間分布、特に、フィブリンの空間分布が登録される。照明波長は、蛍光が研究される場合であれば、プローブの励起スペクトルに従って選択され、あるいは、光散乱が登録される場合であれば、光散乱のスペクトルおよび登録手段の感度に従って選択される点に注意されたい。
【００２４】
このように、特許請求の範囲に記載の装置は、時間および空間における凝固プロセスの全段階のより正確で詳細な研究を可能にし、正常な病理学的条件および様々な病理学的条件下における試験サンプルの臨床評価の精度と信頼性を高めるものである。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年4月14日(2015.4.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体が充填されたサーモスタット制御式チャンバーと、少なくとも１つの照明手段と、記録手段と、圧力調節手段と、を含む、血液およびその成分の空間的な凝固をモニタリングするための装置であって、
前記サーモスタット制御式チャンバーの内部には、試験液のサンプルを入れるためのキュベットが設けられ、
前期記録手段は、前期少なくとも１つの照明手段と共に、前期キュベットの第一の側面に配置され、
前記記録手段は、前記サーモスタット制御式チャンバーの内面の幾何学形状によって形成されたライトトラップを備え、
前期ライトラップは、前期キュベットの前期第一の側面とは反対の側面に配置され、
前期圧力調節手段は、過剰な圧力（好ましくは０．２から０．５ａｔｍ）を維持可能なように製造されており、
前記圧力調節手段は、前記サーモスタット制御式チャンバーおよび前記キュベットに接続されている、装置。
【請求項２】
異なる照明波長を有する２つ以上の照明手段を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記照明を指向させ、その焦点を絞り、スペクトル補正をする光学素子を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記照明手段、前記記録手段、および前記圧力調節手段の作業を同期可能となるよう製造された、前記照明手段、前記記録手段、および前記圧力調節手段の制御ユニットを更に含む、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
更に、試験の結果を処理する手段と接続されている、請求項１に記載の装置。
【国際調査報告】
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