(57)【要約】  本発明は、アクリジンおよびアクリジニウム誘導体ベースの蛍光色素、およびこのような色素の、例えば、生化学的アッセイおよび／または細胞ベースのアッセイでの使用に関する。
2015506462.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光寿命の測定を含む、ターゲット分子を検出するための方法における試薬としての、式（Ｉ）の蛍光色素の使用。
【化１】
2015506462.tif 000044
（式中：
Ｒ1は水素またはＪ−Ｌであり、
Ｒ2は不在、水素またはＪ−Ｌであり、
Ｒ3およびＲ4は、独立して、各々、水素、ハロ、アミド、ヒドロキシル、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアリール、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1−Ｃ4アルキル−置換アミノ、スルフヒドリル、カルボキシ、アシル、ホルミル、スルホネート、第四級アンモニウム、Ｊ−Ｌ、または−Ｋから選択され、
Ｒ2が不在である場合、Ｘは不在であり、Ｒ2が存在する場合、Ｒ2に結合している窒素原子は正に帯電しており、Ｘは対イオンであり、
各Ｊは、独立して、リンカー基であり、
各Ｌは、独立して、水素またはＫであり、
各Ｋは、独立して、ターゲット結合基であるが、
ただし、少なくとも１つの基Ｋが存在するものとする）
【請求項２】
各Ｊが、独立して、炭素を含み、ならびに窒素、酸素、硫黄および／またはリンを含んでもよい１〜４０個の鎖原子を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
各Ｊが、独立して、置換もしくは非置換のアルキレン、アルケニレン、アルキレンオキシ鎖またはアルキレンアンカルボキサミド（ａｌｋｙｌｅｎｅａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）鎖である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
各Ｊが、独立して、２〜６個の炭素原子を含む非置換のアルキレン鎖である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
各Ｋが、独立して、スクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハロゲン化物、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン、カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｍｉｄｅ）、ヒドラジド、ホスホラミダイトペンタフルオロフェニルエステル、およびハロゲン化アルキル、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、カルボキシル、カルボニル、ホスフェート、チオホスフェートならびにアミノオキシからなる群から選択される、請求項１から４までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
１つの基Ｋが存在する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
基Ｋがカルボキシルである、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
（ｉ）基Ｒ2が存在し、式−Ｊ−Ｌのものであり、および／または
（ｉｉ）基Ｒ1が水素であるか、または式−Ｊ−Ｌのものである、請求項１から７までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
（ｉ）基Ｒ2が非置換のアルキル基または式−Ｊ−Ｋのもののいずれかであり、および／あるいは
（ｉｉ）基Ｒ1が式−Ｊ−Ｋのものである、請求項８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
Ｒ1が水素またはＪ−Ｈであり、Ｒ2がＪ−Ｌであり、Ｒ3が水素またはＪ−Ｋである、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
Ｒ2および対イオンＸが存在する、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
化合物が、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）のうちの１つを有する、請求項１に記載の使用。
【化２】
2015506462.tif 000045
【請求項１３】
ターゲット分子が生体分子である、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
生体分子が、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ヌクレオチドおよびオキシまたはデオキシポリ核酸からなる群から選択され、これらが、１個または複数のアミノ、スルフィドリル、カルボニル、ヒドロキシルおよびカルボキシル、ホスフェート、チオホスフェートアミノオキシおよびヒドラジド基を含有するか、または誘導体化されて含有する、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
試料中の分析物の存在を判定するための方法であって、
（ｉ）試料を、分析物の公知の結合パートナーと式（Ｉ）の蛍光色素：
【化３】
2015506462.tif 000046
（式中：
Ｒ1は水素またはＪ−Ｌであり、
Ｒ2は不在、水素またはＪ−Ｌであり、
Ｒ3およびＲ4は、独立して、出現ごとに、水素、ハロ、アミド、ヒドロキシル、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアリール、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1−Ｃ4アルキル−置換アミノ、スルフヒドリル、カルボキシ、アシル、ホルミル、スルホネート、第四級アンモニウム、Ｊ−Ｌ、または−Ｋから選択され、
Ｘは対イオン（Ｒ2が不在である場合不在である）であり
各Ｊは、独立して、リンカー基であり、
各Ｌは、独立して、水素またはＫであり、
各Ｋは、独立して、ターゲット結合基であるが、
ただし、少なくとも１つの基Ｋが存在するものとする）のコンジュゲートと、分析物の少なくとも一部分をコンジュゲート内の公知の結合パートナーと結合させて分析物とコンジュゲートの複合体を形成するのに有効な条件下で、接触させるステップと、
（ｉｉ）分析物との接触前に、コンジュゲートの蛍光寿命または蛍光強度を測定するステップと、
（ｉｖ）接触により生成した混合物の蛍光性寿命または蛍光強度を測定するステップと
を含む方法。
【請求項１６】
分析物および公知の結合パートナーが、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質または共同因子、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／結合タンパク質からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
分析物が酵素であり、公知の結合パートナーがこれに対する基質もしくは共同因子であるか、または分析物が酵素に対する基質もしくは共同因子であり、この酵素が公知の結合パートナーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
コンジュゲートの存在下で酵素の活性を測定する方法であって、このコンジュゲートが化合物と式（Ｉ）の蛍光色素：
【化４】
2015506462.tif 000047
（式中、
Ｒ1は水素またはＪ−Ｌであり、
Ｒ2は不在、水素またはＪ−Ｌであり、
Ｒ3およびＲ4は、独立して、出現ごとに、水素、ハロ、アミド、ヒドロキシル、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアリール、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1−Ｃ4アルキル−置換アミノ、スルフヒドリル、アシル、ホルミル、カルボキシ、スルホネート、第四級アンモニウム、Ｊ−Ｌ、または−Ｋから選択され、
Ｘは対イオン（Ｒ2が不在である場合、不在である）であり、
各Ｊは、独立して、リンカー基であり、
各Ｌは、独立して、水素またはＫであり、
各Ｋは、独立して、ターゲット結合基であり、
ただし、少なくとも１つの基Ｋが存在するものとする）の間のコンジュゲーションから生成したコンジュゲートであり、
（ｉ）酵素との接触前に、コンジュゲートの蛍光寿命または蛍光強度を測定するステップと、
（ｉｉ）酵素をコンジュゲートと接触させるステップと、
（ｉｉｉ）接触により生成した混合物の蛍光性寿命または蛍光強度を測定するステップと
を含む方法。
【請求項１９】
コンジュゲートの化合物が生体分子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
酵素が、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、ペプチダーゼ、アミダーゼ、ヌクレアーゼおよびグリコシダーゼからなる群から選択される、請求項１７から１９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
生体分子が、酵素に対する基質であり、酵素により切断が可能である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
基質が、酵素による基質の切断により式（Ｉ）の蛍光色素から分離する部分である蛍光モジュレート部分を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
蛍光モジュレート部分が、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、ナフチルアラニンまたはフェニルアラニン残基またはナフチル、インドリルまたはフェノキシ基である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
酵素がキナーゼであり、生体分子がキナーゼに対する基質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
基質が、キナーゼによる基質のリン酸化により変化する蛍光モジュレート部分を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
鉄（ＩＩＩ）イオンに配位した多座の配位子で構成される蛍光モジュレート部分の存在下で行われ、キナーゼによる基質のリン酸化により、鉄（ＩＩＩ）イオンが配位するホスフェート基が得られる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
試験化合物の存在下と不在下との両方で行われる、請求項１８から２６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
各測定が、蛍光寿命の測定である、請求項１５から２７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１５から２８までのいずれか１項に記載の方法を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３０】
請求項１０に記載の式（Ｉ）の蛍光色素。
【請求項３１】
請求項１０に記載の式（Ｉ）の蛍光色素と生体分子のコンジュゲート。
【請求項３２】
（ｉ）請求項１０に記載の式（Ｉ）の蛍光色素と生体分子のコンジュゲートと、
（ｉｉ）生体分子の公知の結合パートナーと
を含むキット。
【請求項３３】
公知の結合パートナーが酵素であり、生体分子が酵素に対する基質または共同因子である、請求項３２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクリジンおよびアクリジニウム誘導体ベースの蛍光色素、ならびにこのような色素の、例えば、生化学的アッセイおよび／または細胞ベースのアッセイにおける使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
色素を含む蛍光性分子は、長い間、無細胞生化学的アッセイならびに細胞ベースのアッセイにおいて生体分子を標識および検出するための薬剤として使用されてきた。しかし、多くの系において、背景蛍光が存在し、関連する蛍光シグナルをうまく検出するためには、良好なシグナル／ノイズ比を有することが必要である。
多くの高度な蛍光色素が公知であり、シグナル／ノイズ比を改善するために使用されている。背景蛍光の問題に取り組む変質性方式は、試験対象の系と異なる蛍光寿命を示す蛍光性分子を使用することである。こうすることによって、蛍光性分子の検出を背景と見分けることができる。
以前に、発明者らは、バイオアッセイにおける長い寿命の蛍光レポーターとして９−アミノアクリジン誘導体の使用について記載した（国際公開第２００７／０４９０５７号；G. Cotton et al., Chem. Commun., 2010, 46, 6929；およびA. Gray et al., Anal. Biochem., 2010, 402, 54を参照されたい）。しかし、生化学的アッセイおよび細胞ベースのアッセイにおいて使用するのに有用な蛍光特性、例えば蛍光寿命を有する、新規な蛍光性分子および／または公知の分子の同定に対する必要性が絶えず存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明者らは驚くことに、９位にアミノ基が結合しておらず、むしろ主にヒドロカルビル性の特徴を有する基が存在するアクリジンおよびアクリジニウム誘導体ベースの一連の蛍光体が、生化学的アッセイおよび細胞ベースのアッセイにおける使用に対して適切であることを見出した。この発見は、９−アミノアクリジンおよびその誘導体は蛍光性が強いという当技術分野での知識を考えると特に驚くべきものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
したがって、第１の態様から見た場合、本発明は、ターゲット分子を検出するための方法における試薬としての、式（Ｉ）：
【化１】
2015506462.tif 000003
（式中、
Ｒ1は水素またはＪ−Ｌであり、
Ｒ2は不在、水素またはＪ−Ｌであり、
Ｒ3およびＲ4は、独立して、出現ごとに、水素、ハロ、アミド、ヒドロキシル、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアリール、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1−Ｃ4アルキル−置換アミノ、スルフヒドリル、カルボキシ、アシル、ホルミル、スルホネート、第四級アンモニウム、Ｊ−Ｌ、または−Ｋから選択され、
Ｒ2が不在である場合、Ｘは不在であり、Ｒ2が存在する場合、Ｒ2に結合している窒素原子は正に帯電しており、Ｘは対イオンであり、
各Ｊは、独立して、リンカー基であり、
各Ｌは、独立して、水素またはＫであり、
各Ｋは、独立して、ターゲット結合基であるが、
ただし、少なくとも１つの基Ｋが存在するものとする）の蛍光色素の使用を提供し、この方法は、寿命蛍光の測定を含む。
【０００５】
第２の態様から見た場合、本発明は、試料中の分析物の存在を判定するための方法であって、
（ｉ）試料を、分析物の公知の結合パートナーと式（Ｉ）の蛍光色素：
【０００６】
【化２】
2015506462.tif 000004
（式中、
Ｒ1は水素またはＪ−Ｌであり、
Ｒ2は不在、水素またはＪ−Ｌであり、
Ｒ3およびＲ4は、独立して、出現ごとに、水素、ハロ、アミド、ヒドロキシル、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアリール、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1−Ｃ4アルキル−置換アミノ、スルフヒドリル、カルボキシ、アシル、ホルミル、スルホネート、第四級アンモニウム、Ｊ−Ｌ、または−Ｋから選択され、
Ｘは対イオン（Ｒ2が不在である場合不在である）であり、
各Ｊは、独立して、リンカー基であり、
各Ｌは、独立して、水素またはＫであり、
各Ｋは、独立して、ターゲット結合基であるが、
ただし、少なくとも１つの基Ｋが存在するものとする）のコンジュゲートと、分析物の少なくとも一部分をコンジュゲート内の公知の結合パートナーと結合させて分析物とコンジュゲートの複合体を形成するのに有効な条件下で、接触させるステップと、
（ｉｉ）分析物との接触前に、コンジュゲートの蛍光寿命または蛍光強度を測定するステップと、
（ｉｖ）接触により生成した混合物の蛍光性寿命または蛍光強度を測定するステップと
を含む方法を提供する。
【０００７】
第３の態様から見た場合、本発明は、コンジュゲートの存在下で、酵素の活性を測定する方法であって、このコンジュゲートが、化合物と式（Ｉ）の蛍光色素：
【化３】
2015506462.tif 000005
（式中、
Ｒ1は水素またはＪ−Ｌであり、
Ｒ2は、不在、水素またはＪ−Ｌであり、
Ｒ3およびＲ4は、独立して、出現ごとに、水素、ハロ、アミド、ヒドロキシル、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアリール、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1−Ｃ4アルキル−置換アミノ、スルフヒドリル、アシル、ホルミル、カルボキシ、スルホネート、第四級アンモニウム、Ｊ−Ｌ、または−Ｋから選択され、
Ｘは対イオン（Ｒ2が不在である場合不在である）であり、
各Ｊは、独立して、リンカー基であり、
各Ｌは、独立して、水素またはＫであり、
各Ｋは、独立して、ターゲット結合基であるが、
ただし、少なくとも１つの基Ｋが存在するものとする）の間のコンジュゲーションから生成したコンジュゲートであり、
（ｉ）酵素との接触前に、コンジュゲートの蛍光寿命または蛍光強度を測定するステップと、
（ｉｉ）酵素をコンジュゲートと接触させるステップと、
（ｉｉｉ）接触により生成した混合物の蛍光性寿命または蛍光強度を測定するステップと
を含む方法を提供する。
【０００８】
第４の態様から見た場合、本発明は、本明細書中で以前に定義された通りの式（Ｉ）の蛍光色素（式中、
Ｒ1は水素またはＪ−Ｈであり、
Ｒ2はＪ−Ｌであり、
Ｒ3は水素またはＪ−Ｋである）を提供する。
第５の態様から見た場合、本発明は、本発明の第４の態様による蛍光色素と生体分子のコンジュゲートを提供する。
【０００９】
第６の態様から見た場合、本発明は、
（ｉ）本発明の第５の態様によるコンジュゲートと、
（ｉｉ）生体分子の公知の結合パートナー、例えば酵素と
を含むキットを提供する。
【００１０】
本発明のさらなる態様および実施形態は、以下に続く考察から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムメチルスルフェートの蛍光特性（ａ）蛍光励起および蛍光発光スペクトル、（ｂ）蛍光寿命減衰曲線（２６．２ｎｓ）を示している。測定は、１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４中、定常状態に対して、励起波長３５０ｎｍおよび発光波長４９０ｎｍで、ならびに蛍光寿命に対して、励起波長４０５ｎｍおよび発光波長４７３ｎｍロングパスフィルターで実施した；
【図２】ｐＨの関数として測定したリン酸塩緩衝液中の９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムメチルスルフェートの蛍光寿命を示している。０．２Ｍリン酸一ナトリウムおよび０．２Ｍ二塩基性リン酸ナトリウム緩衝液混合物を使用して、９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムメチルスルフェートの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中１μΜ溶液を調製し、０．１Ｍ  ＨＣＩ溶液を使用して、ｐＨを＜６に調整し、０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液を使用して、ｐＨを＞８に調整した；
【図３】４０５ｎｍでの励起による、ｐＨの関数として測定された９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムメチルスルフェートに対する蛍光発光スペクトルを示している；
【図４】ＬＬＤ−ＤＥＶＤＳＫおよびＬＬＤ−ＤＥＶＤＳＷ（ＬＬＤ＝２−（２−カルボキシエチル）−９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムを有する）に対する蛍光発光スペクトルを示している。測定は、１０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４中５００ｎＭの濃度、励起波長４０５ｎｍで実施した。実線はＬＬＤ−ＤＥＶＤＳＫであり、破線はＬＬＤ−ＤＥＶＤＳＷである；
【図５】ＬＬＤ−ＤＥＶＤＳＷを基質として、および組換え型カスパーゼ３を酵素として（ウェル１つ当たり１．２５および２．５Ｕ）を使用するカスパーゼ３アッセイについての、時間に対する平均寿命のプロットを示している。
【図６】ＡｃＤＥＶＤ−ＣＨＯによるカスパーゼ３の阻害、すなわちＬＬＤ−ＤＥＶＤＳＷを基質として使用した、組換え型カスパーゼ３に対するＡｃＤＥＶＤ−ＣＨＯの阻害剤滴定を示している。
【図７】ＬＬＤ−ＰＬＧＬＮａｌＡＲを基質として、および組換え型ＭＭＰ２を酵素として使用し、異なる濃度の酵素でのＭＭＰ２プロテアーゼアッセイについての、時間に対する平均寿命のプロットを示している。
【図８】ＬＬＤ−ＥＰＥＧＩＹＧＶＬＦを基質として、および組換え型Ｌｃｋを酵素として使用し、異なる濃度の酵素でのＬｃｋキナーゼアッセイについての、時間に対する平均寿命のプロットを示している。
【図９】ＬＬＤ−ＥＰＥＧＩＹＧＶＬＦを基質として使用する組換え型Ｌｃｋキナーゼに対するスタウロスポリンの阻害剤滴定を示している。
【図１０】アッセイした系に対するＡＴＰ  Ｋmを求めるために、ＬＬＤ−ＥＰＥＧＩＹＧＶＬＦを基質として使用する組換え型Ｌｃｋキナーゼに対する様々な濃度のＡＴＰの滴定を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、９位にアミノ基が結合しておらず、むしろ主にヒドロカルビル性の特徴を有する基がこの位置に存在する、アクリジンおよびアクリジニウム誘導体ベースの蛍光体が、生化学的アッセイおよび細胞ベースのアッセイに使用するのに適切であるという発見から生じている。特に、本発明の様々な態様による蛍光体および／または使用のいくつかは、有利なことに長い蛍光寿命を有する（例えば２５〜３０ｎｓ）。これらは、およそ１５〜１７ｎｓの蛍光寿命を一般的に有する９−アミノアクリジンと有利に対比することができる。
【００１３】
当技術分野で知られているように、より長い蛍光寿命を使用することによって、シグナル／ノイズ比を改善することができ、これによって、アッセイにおいてさらに感受性の高い応答能力が可能となる。蛍光強度とは異なり、蛍光寿命は一般にプローブ濃度および量とは無関係で、自家蛍光、光散乱および内部フィルター作用により影響を受けない。追加的に、蛍光寿命の測定は、蛍光化合物ライブラリーおよび細胞の構成成分からの背景干渉を最小限に抑えることを可能にし、薬物スクリーニング用途における偽陽性が少なくなる。したがって、本発明の第２および第３の態様に従い蛍光寿命（蛍光強度とは対照的に）を測定することは、必ずではないが、一般的である。
第１に、文脈により反対であると決定されない限り、以下の定義を適用させて、式（Ｉ）化合物が記載されている。
アルキルとは、本明細書中で飽和したヒドロカルビル基を意味し、このヒドロカルビル基は、直鎖、環式または分枝であってよい（文脈により反対であると決定されない限り、一般的には直鎖である）。アルキレン基は、正式には、アルキル基からの水素原子の抽出により形成されるジラジカルである。一般的にアルキルおよびアルキレン基は、１〜２５個の炭素原子、さらに普通は１〜１０個の炭素原子、よりさらに普通は１〜６個の炭素原子を含み、当然のことながら、シクロアルキルおよびシクロアルキレン基内の炭素原子の数の下限が３であることは理解されている。
【００１４】
アルケニルおよびアルキニル基は、炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合で構成される、１つまたは複数の不飽和の部位を有することでアルキル基と異なる。炭素−炭素二重結合の存在がアルケニル基を提供し、炭素−炭素三重結合の存在がアルキニル基を提供する。アルケニレンおよびアルキニレン基は、正式には、それぞれアルケニルおよびアルキニル基からの水素原子の抽出により形成されるジラジカルである。一般的に、アルケニル、アルケニレン、アルキニルおよびアルキニレン基は、２〜２５個の炭素原子、さらに普通は２〜１０個の炭素原子、よりさらに普通は２〜６個の炭素原子を含む。アルケニル基の例として、ビニル、スチリルおよびアクリレートが挙げられる；アルキニル基の例はプロパルギルである。いかなる疑いもないように、炭素−炭素二重結合と炭素−炭素三重結合の両方を含むヒドロカルビル基は、アルケニルとアルキニル基の両方であるとみなすことができる。
【００１５】
アルキル、アルケニルまたはアルキニル（およびアルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン）基は、例えば１回、２回、または３回、例えば１回置換されていてもよく、すなわち正式には基の１個または複数の水素原子を置き換えている。このような置換基の例は、ヒドロキシ、アミノ、ハロ、アリール、（ヘテロアリールを含む）、ニトロ、アルコキシ、アルキルチオ、シアノ、スルフヒドリル、アシルおよびホルミルである。アルキル基がアリール基で置換されている場合、これは、時にはアラルキル基と呼ばれる。一般的に、アラルキル基は、置換されていてもよいアリール基で置換されているＣ1-6アルキル基を含む。
【００１６】
直前に言及された置換基の代わりにまたはこれに加えて、アルキル、アルケニルまたはアルキニル（ならびにアルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン）基の置換基が、一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物に注目すべき有利な水溶化特性を付与し得る。適当な可溶化置換基（これらのうちのもう１つ、一般的にはこれらのうちの１つは、置換されている基のみで存在し得る）は、例えば、スルホネート、第四級アンモニウム、スルフェート、ホスホネート、ホスフェートおよびカルボキシルを含む群から選択することができる。代わりに、可溶化基は、炭水化物の残基、例えば、単糖であってもよい。水溶化置換基が存在する場合、これは、アルキル基の置換基、一般的には、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3またはＲ4を構成するＣ1-6アルキル基として存在することができる。したがって、水溶化置換されているアルキル基の例として、Ｃ1-6アルキルカルボキシレートおよびスルホネート、例えば、−（ＣＨ2）2-4−ＳＯ3-および−（ＣＨ2）2-4−ＣＯ2-、例えば−（ＣＨ2）2−ＣＯ2-などが挙げられるが、ただし、このような可溶化置換基は、式（Ｉ）の化合物の三環式コアに直接結合することができるものとする（置換基Ｒ3およびＲ4への可能性として）ことに注目されたい。水溶性は、式（Ｉ）の化合物がタンパク質またはペプチドとコンジュゲートする、すなわちこれらを標識するために使用される場合特に有利となり得る。
【００１７】
アリールとは、本明細書中で、正式には、芳香族化合物からの水素原子の抽出により形成される基を意味する。アリール基は、一般的に、文脈により反対であると具体的に決定されない限り、単環式基、例えばフェニルであるが、ただし、二環式アリール基、例えばナフチルなど、および三環式アリール基、例えばフェナントレンおよびアントラセンなどもまた、アリールという用語に包含される。当業者には公知のように、ヘテロ芳香族部分は、１個または複数の炭素原子およびこれに結合していてもよい任意の水素原子の代わりに、１個または複数のヘテロ原子、一般的にはＯ、ＮまたはＳを含む芳香族部分のサブセットである。その結果、ヘテロアリール基はアリール基のサブセットであることを理解されたい。例示的ヘテロ芳香族部分として、ピリジン、フラン、ピロールおよびピリミジンが挙げられる。ヘテロ芳香族環のさらなる例として、ピリダジン（２個の窒素原子が芳香族６員環内で隣接している）；ピラジン（２個の窒素が６員の芳香族環内で１，４−配置されている）；ピリミジン（２個の窒素原子が６員の芳香族環内で１，３−配置されている）；または１，３，５−トリアジン（３個の窒素原子が６員の芳香族環内で１，３，５−配置されている）が挙げられる。
【００１８】
アリール基は、例えば、ヒドロキシ、アミノ、ハロ、アルキル、アリール、（ヘテロアリールを含む）、ニトロ、アルコキシ、アルキルチオ、シアノ、スルフヒドリル、アシルおよびホルミルからなる群から選択される置換基で１回または複数回置換されていてもよい。
アミドとは、本明細書中で、官能基−ＮＨＣＯＲ、または−ＣＯＮＨＲ（式中、Ｒは水素または置換されていてもよいアルキル基である）のいずれかを意味する。
アシルとは、式−Ｃ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは置換されていてもよいアルキル基である）の官能基を意味する。
エステルとは、部分−ＯＣ（＝Ｏ）−を含む官能基を意味する。
アルコキシ（アルキルオキシと同じ意味）およびアルキルチオ部分は、それぞれ式−ＯＲおよび−ＳＲ（式中、Ｒは置換されていてもよいアルキル基である）のものである。
カルボキシとは、本明細書中で、官能基−ＣＯ2Ｈを意味し、これは、脱プロトン化した形態（ＣＯ2）であってもよい。
スルホネートとは、本明細書中で、官能基−ＳＯ3-（スルホン酸（−ＳＯ3Ｈ）の脱プロトン化した形態）を意味し、これは、プロトン化した形態であってもよい。
ホルミルとは、式−ＣＨＯの基を意味する。
ハロは、フルオロ、ブロモ、クロロまたはヨードである。
【００１９】
アミノ基とは、本明細書中で、式−ＮＨ2の基を意味する。アミノ基の水素原子のうちの１つまたは両方がアルキル基で置換されている場合、これは、モノアルキル置換アミノ基またはジアルキル置換アミノ基を提供する。ジアルキル置換アミノ基の一例は、２つのアルキル基が結合することによって、アルキレンジラジカルを形成する場合であり、このアルキレンジラジカルは、正式には２個の水素原子が、一般的には末端炭素原子から抽出されているアルカンから誘導され、これによって、アミンの窒素原子と一緒に環を形成する。知られているように、環式アミンのジラジカルは必ずしもアルキレンである必要はない：モルホリン（この中でアルキレンは−（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2−である）は、このような一例であり、これから環式アミノ置換基を調製することができる。
アミノおよびモノ置換アミノ基またはジアルキル置換アミノ基についての本明細書中での言及はまた、これらの範囲内に、このようなアミノ基を含む化合物から生成したアミンのプロトン化誘導体を包含すると理解されたい。後者の例は、塩、例えば塩酸塩などであると理解してもよい。
第四級アンモニウム基は、窒素原子および３つの置換されていてもよいアルキル基を含む置換基であり、生成した窒素原子への４つの結合が永久的正電荷を付与している。
【００２０】
１個または複数のリンカー基が、式（Ｉ）の化合物の三環式コアに結合していてもよい。これらは、非置換（Ｌが水素の場合）であっても、またはターゲット結合基Ｋで置換されていてもよい。一般的には、連結基Ｊは、基Ｌを式（Ｉ）の化合物の三環式コアに接続している原子の非分枝の鎖を含む。各連結基Ｊは、一般的に炭素を含み、ならびに窒素、酸素、硫黄および／またはリンを含んでもよい、１〜４０個（例えば１〜１０個の）鎖原子を含む。例えば、鎖は、置換もしくは非置換の（一般的に非置換の）アルキレン（例えばメチレン、エチレンまたはプロピレン）、アルケニレン（例えばエテニレンまたはプロペニレン）、アルキレンオキシ鎖（例えば−Ｏ（ＣＨ2）4−）、またはアルキレンアンカルボキサミド（ａｌｋｙｌｅｎｅａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）鎖、例えばアセトアミドなどであってよい。基Ｒ1がリンカー基Ｊを含む場合、式（Ｉ）の化合物の三環式コアに結合するリンカー基Ｊの原子は一般に炭素原子である。
【００２１】
ターゲット結合基Ｋは、反応性基または官能基であり、これによって、式（Ｉ）の化合物が、適切な条件下で、ターゲット分子、例えば生体分子と反応することを可能となる。式（Ｉ）による化合物の反応性基は、適切な条件下で、例えば、生体分子の官能基と反応させることができ；式（Ｉ）による化合物の官能基は適切な条件下で、例えば、生体分子の反応性基と反応させることができる。これらのコンジュゲーション戦略のいずれかに従い、式（Ｉ）の化合物を用いて、ターゲット化合物、例えば所望の生体分子を標識することが可能である。
【００２２】
Ｋが反応性基である場合、Ｋは、スクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハロゲン化物、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン、カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｍｉｄｅ）、ヒドラジド、ホスホラミダイトペンタフルオロフェニルエステルおよびハロゲン化アルキルから選択することができる。Ｋが官能基である場合、Ｋは、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、カルボキシル、カルボニル（アルデヒド、ケトンおよびチオエステルを含む）、ホスフェート、チオホスフェートおよびアミノオキシから選択することができる。生体分子とコンジュゲートした場合、Ｋは修飾され得る、例えば、アミノ基は、アミド基の一部となることができ、またはカルボキシルは、エステル基の一部となることができることを理解されたい。これらの反応性基および官能基により式（Ｉ）の化合物は、生体分子と反応し、生体分子と共有結合することができる。当業者であれば、官能基／反応性基が、式（Ｉ）の化合物のカップリング／コンジュゲート対象である生体分子の対応する反応性基／官能基と反応することが可能であることを容易に承知している。
基Ｒ2が存在する場合、対イオンＸもまた存在することになる。対イオンＸの性質に関して特定の制限はなく、これらは、任意の便利な対イオンであってよい。例えば、Ｘは、ハロゲン化物イオン、特に、塩化物イオン、臭化物イオンまたはヨウ化物イオン、トシル酸イオン、スルホン酸メチルイオンまたはアルキルカルボン酸イオン、例えば酢酸イオンまたはトリフルオロ酢酸イオンなどであってよい。他の例は、当業者には明らかである。本発明の特定の実施形態によると、Ｒ2および対イオンＸは存在する。
【００２３】
本発明のすべて態様の実施形態による式（Ｉ）の特定の化合物は、本発明の第４の態様として上記に定義された通りであり、これによると、式（Ｉ）の化合物は、Ｒ1＝水素またはＪ−Ｈ；Ｒ2＝Ｊ−Ｌ；およびＲ3＝水素またはＪ−Ｋを含む。他の実施形態によると、化合物は、以下を含む：
（ｉ）基Ｒ2、これは、アルキル基、例えばＣ1-6アルキル基、例えばメチル、エチルもしくはプロピルなど、例えばメチルであるか、または式−Ｊ−Ｋのもの、例えば、Ｊが１〜６個の炭素原子を含むアルキレンリンカー基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンまたはブチレンであり、特定の実施形態によるとエチレンであり、および／または、ターゲット結合基がカルボキシルであるもの；ならびに／あるいは
（ｉｉ）基Ｒ1、これは式−Ｊ−Ｋのものであり、例えば、Ｊが１〜６個の炭素原子を含むアルキレンリンカー基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンまたはブチレンであり、特定の実施形態によると、エチレンであり；および／または、ターゲット結合基がカルボキシルであるもの。
【００２４】
本発明の第４の態様の化合物の前述の実施形態のさらに特定の実施形態は、基Ｒ2を含み、この基Ｒ2は、アルキル基、例えばＣ1-6アルキル基、例えばメチル、エチルまたはプロピル、例えばメチルなどであるか、または式−Ｊ−Ｋのもの、例えばＪが１〜６個の炭素原子を含むアルキレンリンカー基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンまたはブチレンであり、特定の実施形態によるとエチレンであり；ターゲット結合基がカルボキシルであってもよいものである。
【００２５】
（ｉ）および（ｉｉ）により本明細書中で直前に定義された化合物の特定およびさらに特定の実施形態は、（ｉｉｉ）１つのＲ3もしくはＲ4は、式−Ｊ−Ｋの基、例えばＪが、１〜６個の炭素原子を含むアルキレンリンカー基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンもしくはブチレンであり、特定の実施形態によるとエチレンであり、および／またはターゲット結合基がカルボキシルであるものをさらに含み得る。
【００２６】
本明細書中で直前に記載されている（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特定の実施形態によると，１つのターゲット結合基、例えばカルボキシルしか存在しない。一般的に、本発明のこれらおよび他の実施形態におけるターゲット結合基は、基Ｊを介して化合物の残りに接続している。
【００２７】
本発明のすべて態様の特定の実施形態によると、式（Ｉ）の化合物は、以下に示す式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）（式中、Ｘ-は本明細書中に以前に記載されている通りである）のうちの１つを有する色素である。
【化４】
2015506462.tif 000006
【００２８】
本明細書中に記載されている蛍光色素の一部は、例えば第四級のアミノ基において電荷を含有することができ、これを使用することによって、塩を形成するか、または負に帯電した分子、例えば、ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡに結合することができることを理解されたい。
【００２９】
本明細書中に記載されている式（Ｉ）の化合物は、当業者により容易に合成することができる。ターゲット結合基は、化合物の合成開始時点で式（Ｉ）の化合物に導入してもよいし（例えば、三環式コアの構築以前）、または三環式に導入してもよいし、またはその構築後に導入してもよい。例えば、置換基Ｒ2がターゲット結合基を含む場合、これは、Ｒ2基の不在下で、Ｒ2（およびＸ-）への適当な前駆体を有する三輪系の中心窒素の四級化により、前駆体を式（Ｉ）の化合物と反応させることによって導入してもよい。代表的な合成は、当業者であれば、これらを容易に適合させることによって、必要に応じて式（Ｉ）の他の化合物を作製することができ、これらを以下に記載する。
式（Ｉ）の化合物とコンジュゲートすることによって、例えば、本発明の第１、第２、第３および第６の態様、ならびに第５の態様に従い有用なコンジュゲートを提供することができる適切な生体分子として、これらに限定されないが、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ヌクレオチドおよびオキシまたはデオキシポリ核酸からなる群が挙げられ、これらは、１つまたは複数のアミノ、スルフィドリル、カルボニル（アルデヒドおよびケトンを含む）、ヒドロキシル、カルボキシル、ホスフェート、チオホスフェート、アミノキシおよびヒドラジド基、微生物の物質、薬物、ホルモン、細胞、細胞膜および毒素を含有または誘導体化して含有する。
【００３０】
本明細書中に記載されている式（Ｉ）の蛍光色素を用いて標識するために特に好ましい生体分子はペプチドまたはタンパク質である。当業者であれば、合成されたペプチドの特異的な部位における標識を可能にする方法を認識している（例えば、Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, Academic Press (1996)を参照されたい）。本明細書中に記載されているコンジュゲートは、細胞移入ペプチドを含み得る。細胞移入ペプチドは、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ（Ｃｙｃｌａｃｅｌ、ＵＫ）、例えばＴＡＴまたはＣｈａｒｉｏｔであってよい。
式（Ｉ）の色素は、蛍光寿命色素として使用するのが特に適切である。本発明によると、寿命色素という用語は、励起に続いて、色素がその励起状態のままである平均時間として定義される、測定可能な蛍光寿命を色素が有することを意味することを意図する（Lackowicz, J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, (1999)）。
【００３１】
本発明の第１の態様に関して、本明細書中に記載されている式（Ｉ）の色素は、蛍光寿命を測定することができ、これによって、ターゲット物質、例えば、式（Ｉ）の色素がコンジュゲートすることができる生体分子の検出を可能にする多くの生化学的アッセイおよび／または細胞ベースのアッセイにおいて特に使用される。その結果として、本発明の第１の態様の代替の記載は、式（Ｉ）の化合物とターゲット分子（このターゲット分子は本明細書中に記載されているような生体分子であってよい）のコンジュゲートの蛍光寿命を測定することを含む方法とみなすことができる。例えば、本発明の第１の態様による使用および方法はアッセイ、例えば、国際公開第０２／０９９４２４号および国際公開第０３／０８９６６５号に記載されているものなど、または以下に記載されている実施形態を含めて、本発明の第２または第３の態様の方法などを含んでもよい。
【００３２】
本発明の第２の態様によるアッセイにおいて、例えば、式（Ｉ）の蛍光色素を使用することによって、試料中に分析物が存在するかどうかを検出することができる。これは、（ｉ）分析物の公知の結合パートナーと、（ｉｉ）本明細書中で定義された通りの式（Ｉ）の化合物（例えば、必ずしも本発明の第４の態様によるものではない）のコンジュゲートを、分析物を含んでも、含まなくてもよい試料と接触させることによって達成する。コンジュゲート内の式（Ｉ）の蛍光色素の存在に起因する蛍光強度／蛍光寿命を、試料との接触の前後に測定する。測定した蛍光強度または蛍光寿命の任意のモジュレーションは、分析物の存在と相関させることができ、したがってこれをアッセイするために使用することができる。
【００３３】
一部の実施形態によると、本発明の第２の態様に従い使用されるコンジュゲートは、その存在を検出できることが望まれている分析物の特異結合パートナーを含むことができる。分析物と特異結合パートナーの例示的ペアとして、タンパク質／タンパク質、タンパク質／核酸、核酸／核酸、タンパク質／小分子および核酸／小分子のパートナー；または抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質または共同因子、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／結合タンパク質が挙げられる。このリストは完全ではなく、他の組合せは当業者には明らかである。各組合せに対して、組合せのメンバーが分析物または分析物の公知の結合パートナーのいずれであってもよいことを理解されたい。したがって、例えば、本発明の第２の態様の実施形態によると、分析物は酵素であってよく、公知の結合パートナーは、これに対する基質もしくは共同因子であってよい、または分析物が、酵素に対する基質もしくは共同因子であってよく、この酵素が公知の結合パートナーである。
【００３４】
本発明の第３の態様によるアッセイにおいて、例えば、式（Ｉ）の蛍光色素を使用することによって、対象となる化合物と式（Ｉ）の色素とを含むコンジュゲートの存在下、酵素の活性を測定することができる。これは、このようなコンジュゲートを酵素に接触させることによって達成される。コンジュゲート内の式（Ｉ）の蛍光色素の存在に起因する蛍光強度／蛍光寿命を酵素との接触の前後に測定する。測定した蛍光強度または蛍光寿命の任意のモジュレーションは、酵素の活性と相関し得る。
【００３５】
一部の実施形態に従い、本発明の第３の態様により使用されるコンジュゲートの化合物は、生体分子、例えば、酵素に対する基質または共同因子、例えば酵素に対する基質であってよい。例えば、生体分子は、リン酸化および酵素キナーゼの影響を受けやすい。基質は、ペプチド基質、例えば４〜２０の間のアミノ酸残基を含むものであってよい。このようなペプチド基質はまた、本発明の第２の態様に従い分析物または公知の結合パートナーを構成してもよい。
このような基質または共同因子は、式（Ｉ）の化合物の蛍光および／または蛍光寿命をモジュレート（一般的に、必ずではないが、減少させる）する部分を含み得るが、その一方でコンジュゲートはインタクトなままである。式（Ｉ）の化合物からの蛍光（寿命）をモジュレートする部分の分離により、例えば、酵素によるコンジュゲートの切断により、蛍光強度および／または蛍光寿命は次いで一般的に増加する可能性があり、このような増加を使用して酵素の活性を測定する。
【００３６】
例えば、芳香族アミノ酸、例えば、トリプトファンなどを使用することによって、式（Ｉ）の色素の蛍光強度および／または蛍光寿命をモジュレートすることができる。式（Ｉ）の色素、およびトリプトファン残基（この残基は、ペプチダーゼ酵素の作用でペプチド基質から切断される）を含むペプチダーゼ酵素に対するペプチド基質のコンジュゲートを使用することによって、酵素の活性を測定することができる。蛍光標識したペプチドの蛍光をクエンチするための追加の方法が開示されている。したがって国際公開第０２／０８１５０９号は、例えば、蛍光標識したペプチド内の蛍光強度を内部でクエンチするためのトリプトファン、チロシンまたはヒスチジン残基の使用について記載している。フェニルアラニンもまた、この目的のために使用することができ、ナフチルアラニン、その非天然アミノ酸変異体、またはむしろ非天然の芳香族アミノ酸であってよい。ペプチドを使用することによって、エンド−およびエキソ−ペプチダーゼ活性を検出することができる。蛍光性寿命測定に関する追加の方法は、当業者らが対象とする国際公開第０３／０８９６６３号に記載されている。この中に記載されている技法は、本明細書中に開示されている方法に適用することができる。
代わりに、コンジュゲートが、キナーゼに対する基質と式（Ｉ）の蛍光色素のものであってもよく、すなわちコンジュゲートがキナーゼでリン酸化されてもよい。このようなコンジュゲートは、本明細書中に記載されている、例えば芳香族アミノ酸（直前に記載されている）などのような蛍光−モジュレートした部分を含み得る。蛍光モジュレートする部分がチロシンである場合、例えば、そのフェノールのヒドロキシル基のリン酸化は、これをホスフェート部分に変換する働きをし、これによって、チロシンの芳香族環の蛍光−モジュレート作用がモジュレートされて、基質の蛍光の増加が生じる。
【００３７】
直前に記載されている本発明の実施形態の変異形として、コンジュゲートは、キナーゼによるリン酸化に影響を受けやすい基質を含んでもよく、このリン酸化が蛍光モジュレートする部分の導入を許す働きをする。例えば、蛍光モジュレートする必要のないアミノ酸残基の側鎖のリン酸化（例えばセリンまたはトレオニン）は、国際公開第２００９／００１０５１号に記載されているように、鉄（ＩＩＩ）イオンに配位した多座の配位子で構成される蛍光モジュレート部分へ曝露させて、タンデムで使用することができる。例えば、多座の配位子は、芳香族またはヘテロ芳香族を含有し、および／または二座配位もしくは三座配位であってよい。こうして、本発明の第３の態様による接触は、鉄（ＩＩＩ）イオンとこのような配位子の間に形成されるキレートの存在下で（コンジュゲートに加えて）行うことができる。特定の実施形態によると、キレートは、フェニルマロン酸または２−ヒドロキシアセトフェノンのものであってよい。理論に制約されることを望むことなく、鉄（ＩＩＩ）イオンは、本発明のこれらの実施形態に従い、静電相互作用を介してホスフェート部分に結合し、芳香族配位子を蛍光体と近接させ、これによって、蛍光モジュレーションが生じ、したがって基質の蛍光を低減させることを理解されたい。
【００３８】
本発明の第３の態様の代替の実施形態に従い、酵素を使用することによって、化合物とコンジュゲートの間のライゲーションを生じることができ、このライゲーションが、ライゲーションの際に式（Ｉ）の化合物の蛍光および／または蛍光寿命をモジュレートする（一般的に、必ずではないが、減少させる）。したがって、酵素の反応により、蛍光強度および／または蛍光寿命は、次いで一般的に低減する可能性があり、このような低減を使用して、酵素の活性を測定する。例えば，モジュレートする化合物は、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、ナフチルアラニンまたはフェニルアラニン残基を含むペプチドであってよく、ライゲーションが、残基を式（Ｉ）の色素に近接させる働きをすることによって、生成したライゲーション生成物の蛍光強度および／または蛍光寿命が生じるようになる。他の蛍光モジュレートする部分として、例えば、ナフチル、インドリルおよびフェノキシ基が挙げられる。
【００３９】
本発明の第２の態様（分析物または公知の結合パートナーのいずれかが酵素である場合）および本発明の第３の態様の実施形態に従い、酵素は、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、ペプチダーゼ、アミダーゼ、ヌクレアーゼおよびグリコシダーゼ、例えばキナーゼおよびホスファターゼからなる群から選択することができる。例えば、酵素は、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、カスパーゼ、カテプシンＤ、キモトリプシン、ペプシン、スブチリシン、プロテアーゼＫ、エラスターゼ、ネプリライシン、サーモリシン、ａｓｐ−ｎ、マトリクスメタロタンパク質１〜２０、パパイン、プラスミン、トリプシン、エンテロキナーゼおよびウロキナーゼからなる群から選択される。
【００４０】
本発明の第３の態様の特定の実施形態に従い、本方法を使用することによって、もしある場合には、酵素の活性の際に試験化合物が有する作用を求めることができる。これらの実施形態に従い、本発明の第３の態様の方法を試験化合物の存在下および不在下の両方で行う。見出された酵素の活性の何らかの相違点は、化合物により示される酵素の活性の際の作用を示している。例えば、化合物は、酵素の阻害剤または助触媒として作用し得る。特定の実施形態に従い、本発明の第３の態様よる複数の方法を試験化合物の異なる量または濃度で行うことができる。こうして、例えば、ＩＣ50値を求めることができ、この場合、試験化合物は酵素の阻害剤である。
【００４１】
細胞ベースのアッセイに関して、アッセイは、生細胞上でまたは細胞構成成分、例えば、細胞壁フラグメントなどを使用して行うことができる。原核のおよび真核細胞を含めた任意の細胞、特に哺乳動物のおよびヒト細胞を採用することができる。
本発明の方法および使用は、液体培地、一般には溶液中で、任意の便利なｐＨで（一般的にはおよそ５〜９の範囲）行うことができる。液体培地は、一般的に水性である。例えば、水または適当な酸性またはアルカリ性溶液、例えば緩衝溶液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液などを使用することができる。
本発明の特定の実施形態によると、式（Ｉ）の異なる色素、例えば異なる化合物へのコンジュゲートを、本発明の様々な態様に従い同時に使用することができる。色素の蛍光強度および／または蛍光寿命により互いに区別することが可能である場合、これによって多重化が可能となる。さらなる詳細は、国際公開第０３／０８９６６３号において見出すことができる（以下）。
【００４２】
本発明の方法は、マルチウェルプレートのウェル、例えば、２４、９６、３８４またはより高い密度のウェル、例えば８６４または１５３６ウェルを有するマイクロタイタープレートの中で一般的に実施することができる。適切な装置は、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｎａｎｏｔａｕｒｕｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌｉｆｅｔｉｍｅ  Ｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒである。代わりに、本方法は、アッセイ管内または多流体デバイスのマイクロチャネル内で行うこともできる。
【００４３】
従来の検出方法を採用して、標識の蛍光強度および／または寿命を測定することができる。これらの方法は、検出デバイスとして光電子増倍管を使用する装置を含む。これらの方法、例えば：
ｉ）時間相関単一光子計数に基づく方法（Principles of Fluorescence Spectroscopy, (Chapter 4) ed. J R Lakowicz, Second Edition, 1999, Kluwer/Academic Pressを参照）；
ｉｉ）周波数領域／位相変調に基づく方法（Principles of Fluorescence Spectroscopy, (Chapter 5) ed. J R Lakowicz, Second Edition, 1999, Kluwer/Academic Pressを参照）；および
ｉｉｉ）時間ゲーティングに基づく方法（Sanders et al., (1995) Analytical Biochemistry, 227 (2), 302-308を参照）
を使用するいくつかの手法が可能である。
適切なデバイスは、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＦＬＳ９２０  蛍光光度計、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫである。
【００４４】
蛍光性強度の測定を電荷結合素子（ＣＣＤ）撮像装置、例えば、走査型撮像装置またはエリアイメージャーなどを用いて実施することによって、マルチウェルプレートのすべてのウェルを撮像することができる。ＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ（商標）システムは、単一パスでの高密度マイクロタイタープレートの画像化を可能にするＣＣＤカメラを特徴として備えている。画像化は、定量的で、急速であり、画像化用途に対して適切な装置類は、現在ではマルチウェルプレート全体を同時に撮像することができる。
本明細書中で言及されたすべての刊行物（特許および非特許）は、これらの全体が、各言及の全体の内容が、本明細書中に全体として記載されているかのように、参照により組み込まれている。
本発明はここで以下の非限定的例により例示される。
【実施例】
【００４５】
（例１）
試験した様々なアクリジン誘導体に対する蛍光寿命が表１に報告されている。蛍光寿命は、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｎａｎｏｔａｕｒｕｓ蛍光寿命プレートリーダーを使用して、検出用の励起レーザー４０５ｎｍおよび４３８ｎｍバンドパス、４５０ｎｍバンドパスまたは４７３ｎｍロングパス発光フィルターのいずれかを使用して、時間相関単一光子計数（ＴＣＳＰＣ）の取得により求めた。
【００４６】
【表１】
2015506462.tif 000007
【００４７】
（例２）
９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムメチルスルフェートの合成
【化５】
2015506462.tif 000008
９−メチルアクリジン（４４０ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）をトルエン（１０ｍｌ）中に溶解し、次いでジメチルスルフェート（６５２μｌ、６．９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を２時間加熱還流し、次いで室温まで冷却させておいた。黄色の沈殿物を濾過で単離し、ジエチルエーテル、続いてジエチルエーテル／ジクロロメタンで洗浄することによって、黄緑色の粉末として、生成物を得た（７２０ｍｇ、定量的収量）。1Ｈ  ＮＭＲおよびＭＳによる分析は構造に一致した。
【００４８】
（例３）
９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムメチルスルフェートの蛍光分析
励起波長３５０ｎｍおよび発光波長４９０ｎｍを用いて、定常状態測定をＥｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＦＬＳ９２０定常状態蛍光光度計で実施した。Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｎａｎｏｔａｕｒｕｓ蛍光寿命プレートリーダーを使用して、検出用の励起レーザー４０５ｎｍおよび４７３ｎｍロングパス発光フィルターを使用して、時間相関単一光子計数（ＴＣＳＰＣ）の取得により蛍光寿命を求めた。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、ｐＨ７．４中、１μΜの９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムメチルスルフェートの濃度で蛍光励起および発光スペクトルを測定した。蛍光励起および発光スペクトル、ならびに蛍光寿命減衰曲線がそれぞれ図１（ａ）および図１（ｂ）に示されている。
９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムメチルスルフェートは、有利なことに、およそ２５〜３０ｎｓという長い蛍光寿命を有する。加えて、蛍光寿命の規模は、試験した３つの緩衝系にわたり維持された（表１、エントリー６を参照されたい）。
【００４９】
（例４）
ｐＨ安定性の実験
生化学的アッセイおよび細胞ベースのアッセイにおける使用に対して適切な蛍光色素の重要な基準は、蛍光寿命が、ｐＨに関係なく、生理学的範囲の５〜９内にあるという利点である。９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムメチルスルフェートの蛍光寿命は、ｐＨ範囲３〜１０にわたり安定している（図２を参照されたい）。
４０５ｎｍでの励起において、ｐＨの関数として蛍光発光プロファイルを測定した（図３）。最大発光である４６０ｎｍおよび４９０ｎｍをｐＨ３〜１０のすべての溶液に対して観察したが、ｐＨ＞１０の溶液に対して、最大発光が４２５および４５０ｎｍにシフトした。ｐＨ＞１０に対する蛍光発光プロファイルおよび蛍光寿命のこの変化は、塩基性条件下での、９位での酸性メチルプロトンの脱プロトン化を表している可能性があり、以下のスキーム１で示されているように９−メチレンアクリジンが供給される。：これらのメチルプロトンは、普通と違い酸性であり、酢酸と同種のｐＫａを有することがことを報告されている（Tanaka, Y. et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 2227）。
【００５０】
【化６】
2015506462.tif 000009
スキーム1
【００５１】
（例５）
カルボン酸部分を用いた、９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムメチルスルフェートの誘導化
蛍光体の生体分子、例えば、ペプチドおよびタンパク質などへの付着を促進するためには、多くの場合、蛍光体のカルボン酸誘導体が望ましい。このような化合物は、ペプチドおよびタンパク質上のアミノ官能基と反応することによって、アミド結合形成を介したコンジュゲーションを可能にする。一連のアクリジンおよびアクリジニウム化合物が設計され、これらすべては、カルボン酸部分を取り込むことによって、アミド結合連結を介したペプチドへの付着を可能にしている（表２を参照されたい）。
【００５２】
【表２】
2015506462.tif 000010
【００５３】
カルボン酸を用いた、９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムメチルスルフェートの２位での誘導化
【００５４】
ターゲット１：２−（２−カルボキシエチル）−９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムクロリド
【化７】
2015506462.tif 000011
ターゲット１を６ステップで合成することによって、塩化物塩として、２−（２−カルボキシエチル）−９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムを得た（スキーム２）。最初の３ステップはうまく進行して、所望のプロピオン酸リンカーが結合しているアクリジン環骨格が得られた。しかし残念なことに、メチルエステル基は最後の環化ステップ（ステップ３）で加水分解され、取扱いを簡単にするために酸をエステルに変換し戻し、それに続くステップのために溶解度を補強することを決定した。封管内でヨウ化メチルを使用してＮ−メチル化を行い、最後にエステルの加水分解により、所望のターゲットを得た。
【００５５】
【化８】
2015506462.tif 000012
スキーム2
【００５６】
ステップ１
【化９】
2015506462.tif 000013
３−（４−アミノ−フェニル）−プロピオン酸１（５ｇ、３０．３ｍｍｏｌ）をＳＯＣｌ2（２０ｍＬ）中、室温で３時間撹拌した。ＳＯＣｌ2を真空中で除去し、残渣をＭｅＯＨ中で慎重に再溶解し、５分間撹拌した。ＭｅＯＨを真空中で除去し、残渣をＤＣＭ中に溶解し、１０％Ｋ2Ｃ０3溶液中で洗浄し、ＭｇＳ０4上で乾燥させ、真空中で濃縮した。カラムクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ、７０：３０）での精製により、無色の固体として、３−（４−アミノ−フェニル）−プロピオン酸メチルエステル２を得た（５．３７ｇ、２９．９ｍｍｏｌ、９８％）。1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 6.98(d, J=8.4Hz, 2H, ar), 6.62(d, J=8.4Hz, 2H, ar), 3.66(s, 3H, OCH3), 2.83(t, J=7.8Hz, 2H, CH2), 2.57(t, J=7.8Hz, 2H, CH2); 13C NMR(125MHz, CDCl3) δ 173.56(C=O), 144.64(C), 130.54(C), 129.10(CH x 2), 115.30(CH x 2), 51.54(OCH3), 36.15(CH2), 30.18(CH2); ESI m/z=180.17(M+H)+, 計算値C10H13NO2=179.09
【００５７】
ステップ２
【化１０】
2015506462.tif 000014
【００５８】
３−（４−アミノ−フェニル）−プロピオン酸メチルエステル２（５．３７ｇ、２９．９ｍｍｏｌ）、２−クロロアセトフェノン（４．０９ｍＬ、３１．５ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）2（３３８ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ、５モル％）、キサントホス（８６４ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ、５モル％）およびＣｓ2ＣＯ3（１４．６ｇ、４４．８ｍｍｏｌ）をジオキサン（６０ｍＬ）中に溶解した。混合物を１１０℃で２０時間撹拌した。冷却後、セライトを介して混合物を濾過し、ＤＣＭで洗浄し、溶媒を真空中で除去した。カラムクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ、８０：２０）での精製により、黄色の油として、３−［４−（２−アセチル−フェニルアミノ）−フェニル］−プロピオン酸メチルエステル３を得た（６．２６ｇ、２１．１ｍｍｏｌ、７１％）。1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 10.41(br, NH), 7.73(dd, J=8.1, 1.4Hz, 1H, ar), 7.22(dt, J=8.5, 1.4Hz, 1H, ar), 7.11(m, 5H, ar), 6.63(dt, J=7.5, 1.1Hz, 1H, ar), 3.61(s, 3H, OCH3), 2.87(t, J=7.8Hz, 2H, CH2), 2.57(t, J=7.8Hz, 2H, CH2), 2.55(s, 3H, COCH3); 13C NMR(125MHz, CDCl3) δ 201.16(C), 173.34(C), 148.24(C), 138.49(C), 136.31(C), 134.55(CH), 132.53(CH), 129.21(CH x 2), 123.56(CH x 2), 118.83(C), 116.29(CH), 114.08(CH), 51.64(OCH3), 35.75(CH2), 30.42(CH2), 28.11(COCH3); ESI m/z=280.25(M+H)+, 計算値C18H19NO3=279.35
【００５９】
ステップ３：
【化１１】
2015506462.tif 000015
３−［４−（２−アセチル−フェニルアミノ）−フェニル］−プロピオン酸メチルエステル３（２．２０ｇ、７．４０ｍｍｏｌ）を酢酸（３０ｍＬ）中に溶解した。Ｈ2ＳＯ4（２ｍＬ）を加え、混合物を撹拌しながら３時間還流させた。室温まで冷却後、ｐＨ６が得られるまで固体Ｋ2ＣＯ3を加えた。固体を濾過で単離し、真空下で乾燥させることによって、淡黄色の固体として、３−（９−メチル−アクリジン−２−イル）プロピオン酸４を得た（１．７１ｇ、６．４５ｍｍｏｌ、８７％）。この物質をさらなる精製なしで使用した。
【００６０】
ステップ４：
【化１２】
2015506462.tif 000016
３−（９−メチル−アクリジン−２−イル）プロピオン酸４（１．３５ｇ、５．０９ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中に溶解し、Ｈ2ＳＯ4（２ｍＬ）を加えた。混合物を４時間還流で撹拌し、次いで水の中に注ぎ入れた。生成物をＤＣＭで抽出し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、真空中で濃縮することによって、淡褐色の固体として、３−（９−メチル−アクリジン−２−イル）−プロピオン酸メチルエステル５を得た（１．１６ｇ、４．１５ｍｍｏｌ、８２％）。1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 8.14(m, 3H, ar), 7.96(s, 1H, ar), 7.68(m, 1H, ar), 7.57(m, 1H, ar), 7.47(m, 1H, ar), 3.62(s, 3H, OCH3), 3.14(t, J=7.8Hz, 2H, CH2), 3.04(s, 1H, CH3), 2.72(t, J=7.8Hz, 2H, CH2); 13C NMR(125MHz, CDCl3) δ 173.18(C), 184.21(C), 147.61(C), 141.43(C), 137.53(C), 131.19(CH), 130.50(CH), 130.26(CH), 129.48(CH), 125.70(C), 125.47(CH), 124.48(CH), 122.65(CH), 51.73(OCH3), 35.39(CH2), 31.47(CH2), 13.60(CH3); ESI m/z=280.25(M+H)+, 計算値C18H17NO2=279.33
【００６１】
ステップ５：
【化１３】
2015506462.tif 000017
【００６２】
３−（９−メチル−アクリジン−２−イル）プロピオン酸メチルエステル５（１２０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）をＭｅｌ（３ｍＬ）中に溶解した。混合物を封管内、９０℃で２０時間撹拌した。沈殿物を濾過で収集し、真空下で乾燥させることによって、未反応の５および２−（２−メトキシカルボニル−エチル）−９，１０−ジメチル−アクリジニウムヨウ化物６の混合物を得た（１５／８５）。この混合物をカラムクロマトグラフィーで精製した（ＤＣＭ／ＥｔＯＨ、９０：１０）。1H NMR(500MHz,(CD3)2SO2) δ 8.88(d, J=8.6Hz, 1H, ar), 8.72(m, 3H, ar), 8.40(dt, J=9.9, 7.5Hz, 2H, ar), 8.01(t, J=7.6Hz, 1H, ar), 4.80(s, 3H, NCH3), 3.62(s, 3H, OCH3), 3.50(s, 3H, CH3), 3.25(t, J=7.5Hz, 2H, CH2), 2.91(t, J=7.5Hz, 2H, CH2); 13C NMR(125MHz,(CD3)2SO2) δ 172.46(C), 159.65(C), 140.24(C), 139.93(C), 139.65(CH), 139.32(C), 137.79(CH), 128.05(CH), 127.28(CH), 126.07(CH), 125.60(C x 2), 119.29(CH), 119.20(CH), 51.43(OCH3), 38.67(CH3), 34.13(CH2), 29.78(CH2), 16.40(CH3); ESI m/z=294.25(M)+, 計算値C19H20NO2=294.37
【００６３】
ステップ６：
【化１４】
2015506462.tif 000018
２−（２−メトキシカルボニル−エチル）−９，１０−ジメチル−アクリジニウムヨージド６（２５０ｍｇ、０．５９４ｍｍｏｌ）を６Ｍ  ＨＣＩ（１０ｍＬ）中に溶解し、混合物を撹拌しながら３．５時間還流させた。真空中での濃縮により、淡褐色の固体として、２−（２−カルボキシ−エチル）−９，１０−ジメチル−アクリジニウムクロリド７を得た（１８０ｍｇ、０．５７０ｍｍｏｌ、９６％）。1H NMR(500MHz,(CD3)2SO2) δ 8.88(d, J=8.7Hz, 1H, ar), 8.72(m, 3H, ar), 8.40(m, 2H, ar), 8.01(t, J=7.6Hz, 1H, ar), 4.80(s, 3H, NCH3), 3.50(s, 3H, CH3), 3.22(t, J=7.5Hz, 2H, CH2), 2.31(t, J=7.5Hz, 2H, CH2); 13C NMR(125MHz,(CD3)2SO2) δ 173.52(C), 159.56(C), 140.63(C), 139.88(C), 139.74(CH), 139.29(C), 137.45(CH), 128.04(CH), 127.26(CH), 125.97(CH), 125.60(C), 125.55(C), 119.24(CH), 119.19(CH), 38.68(CH3), 34.53(CH2), 29.91(CH2), 16.40(CH3); ESI m/z=280.26(M)+, 計算値C18H18NO2+=280.34
【００６４】
１０位での誘導化
ターゲット２：１０−（２−カルボキシエチル）アクリジン−１０−イウムブロミド
【化１５】
2015506462.tif 000019
ターゲット２を４ステップで合成することによって、１０−（２−カルボキシエチル）アクリジン−１０−イウムブロミドを得た（スキーム３）。Omura, S. et al., J. Antibiotics, 1992, 45, 1139に記載されているように、プロピオラクトン８を３−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−プロピオン酸ベンジルエステル１０に変換した。それに続いて、アクリジンとの反応を、Fukuzumi, S. et al., J. Mater. Chem., 2005, 15, 372に記載のプロトコルに従い実施した。
【００６５】
【化１６】
2015506462.tif 000020
スキーム3
【００６６】
ステップ１
【化１７】
2015506462.tif 000021
ベンジルアルコール（５ｍＬ、４８．３ｍｍｏｌ）を、氷浴内で冷却し、６０％ＮａＨ（５０ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を少しずつ加え、混合物を０℃で３０分間撹拌した。次いで、プロピオラクトン８（０．５ｍＬ、７．９７ｍｍｏｌ）を滴加し、混合物を０℃でさらに３０分間撹拌した。２Ｍ  ＨＣＩ（２ｍＬ）の添加により反応をクエンチした。混合物をＤＣＭで抽出し、水で洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製することによって（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ、８０：２０）、無色の油として、３−ヒドロキシ−プロピオン酸ベンジルエステル９を得た（１．０２ｇ、５．６６ｍｍｏｌ、７１％）。1Ｈ  ＮＭＲ、13Ｃ  ＮＭＲおよびＭＳによる分析は構造と一致した。
【００６７】
ステップ２
【化１８】
2015506462.tif 000022
３−ヒドロキシ−プロピオン酸ベンジルエステル９（３６０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）およびピリジン（１７８μＬ、２．２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（８ｍＬ）中に溶解した。溶液を−２０℃に冷却し、トリフル無水物（３６８μＬ、２．２ｍｍｏｌ）を滴加した。混合物を−２０℃で３０分間撹拌し、次いで室温で１時間撹拌した。真空中での濃縮および急速なカラムクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ、８０：２０）での精製により、３−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−プロピオン酸ベンジルエステル１０を得た。これを次のステップでそのまま使用した（２ｍｍｏｌと推測）。
【００６８】
ステップ３
【化１９】
2015506462.tif 000023
３−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−プロピオン酸ベンジルエステル１０（２ｍｍｏｌと推測）およびアクリジン（３６０ｍｇ、２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解し、混合物を室温で２４時間撹拌した。真空中での濃縮により、黒色油を得た。これを、ヘプタン中に沈殿させ、濾過で単離した。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＥｔＯＨ、９５：５）での精製により、黄色の固体として、１０−（３−（ベンジルオキシ）−３−オキソプロピル）アクリジン−１０−イウムトリフルオロメタンスルホネート１１を得た（２６０ｍｇ、０．５２９ｍｍｏｌ、２６％）。1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 9.99(s, 1H, ar), 8.54(dd, 4H, ar), 8.29(t, 2H, ar), 7.83(t, 2H, ar), 7.23(m, 5H, ar), 5.70(t, 2H, CH2), 5.05(s, 2H, CH2), 3.25(t, 3H, CH2).
【００６９】
ステップ４
【化２０】
2015506462.tif 000024
１０−（３−（ベンジルオキシ）−３−オキソプロピル）アクリジン−１０−イウムトリフルオロメタンスルホネート１１（２５０ｍｇ、０．５０８ｍｍｏｌ）を、酢酸中３０％ＨＢｒの中に溶解し、混合物を５０℃で２時間撹拌した。真空中での濃縮により、淡褐色固体として、１０−（２−カルボキシエチル）アクリジン−１０−イウムブロミド１３を得た（１６０ｍｇ、０．４８２ｍｍｏｌ、９５％）。1H NMR(500MHz,(CD3)2SO2) δ 10.25(s, 1H, ar), 8.76(d, 2H, ar), 8.67(d, 2H, ar), 8.49(t, 2H, ar), 8.06(t, 2H, ar), 5.60(t, 2H, CH2), 3.13(t, 3H, CH2); 13C NMR(125MHz,(CD3)2SO2) δ 171.40(C), 151.49(CH), 140.30(C), 139.53(CH), 130.00(CH), 127.76(CH), 126.43(C), 118.42(CH), 46.16(CH2), 32.52(CH2); ESI m/z=252.24(M)+, 計算値C16H14NO2=252.29
【００７０】
ターゲット３：１０−（２−カルボキシエチル）−９−メチルアクリジン−１０−イウムブロミド
【化２１】
2015506462.tif 000025
【００７１】
ターゲット２と同様の方式でターゲット３を得たが、９−メチルアクリジンをアクリジンの代わりに使用した（スキーム４）。
【化２２】
2015506462.tif 000026
スキーム4
【００７２】
ステップ３
【化２３】
2015506462.tif 000027
３−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−プロピオン酸ベンジルエステル１０（３．５ｍｍｏｌと推測）および９−メチルアクリジン（３８６ｍｇ、２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解し、混合物を室温で２４時間撹拌した。真空中での濃縮により、黒色油を得て、カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＥｔＯＨ、１００〜９５：０〜５）での精製により、黄色の固体として、所望の１０−（３−（ベンジルオキシ）−３−オキソプロピル）−９−メチルアクリジン−１０−イウムトリフルオロメタンスルホネート１３を得た（１２０ｍｇ、０．２３２ｍｍｏｌ、１２％）。1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 8.69(d, 2H, ar), 8.60(d, 2H, ar), 8.32(t, 2H, ar), 7.92(t, 2H, ar), 7.27(m, 5H, ar), 5.69(t, 2H, CH2), 5.06(s, 2H, CH2), 3.46(s, 3H, CH3), 3.27(t, 3H, CH2); 13C NMR(125MHz, CDCl3) δ 169.79(C), 161.32(C), 139.93(CH), 138.51(C), 135.02(C), 128.57(CH), 128.44(CH), 128.42(CH), 128.21(CH), 128.03(CH), 126.10(C), 118.52(CH), 67.53(CH2), 46.08(CH2), 33.28(CH2), 16.25(CH3); ESI m/z=356.20 計算値C24H22NO2=356.44.
【００７３】
ステップ４
【化２４】
2015506462.tif 000028
１０−（３−（ベンジルオキシ）−３−オキソプロピル）−９−メチルアクリジン−１０−イウムトリフルオロメタンスルホネート１３（１００ｍｇ、０．１９３ｍｍｏｌ）を酢酸中３０％ＨＢｒの中に溶解し、混合物を５０℃で２時間撹拌した。真空中での濃縮により、淡褐色の固体として、１０−（２−カルボキシエチル）−９−メチルアクリジン−１０−イウムブロミド１４を得た（６５ｍｇ、０．１８７ｍｍｏｌ、９９％）。1H NMR(500MHz,(CD3)2SO2) δ 8.93(d, 2H, ar), 8.72(d, 2H, ar), 8.44(t, 2H, ar), 8.03(t, 2H, ar), 5.54(t, 2H, CH2), 3.49(s, 3H, CH3), 3.13(t, 3H, CH2); 13C NMR(125MHz,(CD3)2SO2) δ 171.41(C), 161.71(C), 139.72(CH), 138.76(C), 128.32(CH), 127.40(CH), 125.67(C), 118.70(CH), 46.08(CH2), 32.48(CH2), 16.59(CH3); ESI m/z=266.26 計算値C17H16NO2=266.32.
【００７４】
９位での誘導化
ターゲット４：３−（アクリジン−９−イル）プロピオン酸
【化２５】
2015506462.tif 000029
【００７５】
提案された合成経路−Jensen, H., J. Am. Chem. Soc, 1926, 48, 1988に記載されている通り。
【化２６】
2015506462.tif 000030
Toma, S. et al., Syn. Commun, 2002, 32, 729
【００７６】
ターゲット５：９−（２−カルボキシエチル）−１０−メチルアクリジン−１０−イウムクロリド
【化２７】
2015506462.tif 000031
ターゲット５は、蛍光強度技法を使用して、水性緩衝液中のアニオンを判定するために以前に使用された（Geddes, C. D., Meas. Sci. Techno/., 2001, 12, R53；Wolfbeis, O. S., et al., Anal. Chem., 1984, 56, 427；Chen, C.-T. et al., Org. Letters 2009, 11, 4858）。しかし、ターゲット５が蛍光寿命リポーターとして使用されたという報告は知られていない。
【００７７】
ターゲット５の合成は以前に記述されているが（Wolfbeis, O. S., et al., Anal. Chem., 1984, 56, 427）、合成経路は以前のターゲットに対する発明者らの合成戦略に基づいて提案された（スキーム５）。
【化２８】
2015506462.tif 000032
スキーム5
【００７８】
ステップ１
【化２９】
2015506462.tif 000033
３−（アクリジン−９−イル）プロピオン酸１４（２００ｍｇ、０．７９６ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（３ｍＬ）中に溶解し、Ｈ2Ｓ０4（０．５ｍＬ）を加えた。混合物を４時間還流で撹拌し、次いで水の中に注ぎ入れた。生成物をＤＣＭで抽出し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、真空中で濃縮することによって、メチル３−（アクリジン−９−イル）プロパノエート１５（１７０ｍｇ、０．６４１ｍｍｏｌ、８１％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ、13Ｃ  ＮＭＲおよびＭＳによる分析は構造と一致した。
【００７９】
ステップ２
【化３０】
2015506462.tif 000034
メチル３−（アクリジン−９−イル）プロパノエート１５（１５０ｍｇ、０．５６５ｍｍｏｌ）をＭｅｌ（３ｍｌ）中に溶解した。混合物を封管内で、９０℃で２０時間撹拌した。沈殿物を濾過で収集し、真空下で乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＥｔＯＨ、９０：１０）での精製により、９−（３−メトキシ−３オキソプロピル）−１０−メチルアクリジン−１０−イウムヨージド１６を得た（１２０ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ、５２％）。1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 8.89(d, 2H, ar), 8.71(d, 2H, ar), 8.43(t, 2H, ar), 8.00(t, 2H, ar), 5.15(s, 3H, NCH3), 4.27(t, 2H, CH2), 3.70(s, 3H, CH3), 2.95(t, 2H, CH2); 13C NMR(125MHz,(CDCl3) δ 171.46(C), 160.91(C), 141.10(C), 139.22(CH), 128.55(CH), 127.0(CH), 125.34(C), 120.25(CH), 52.45(CH3), 41.47(CH3), 35.15(CH2), 24.91; ESI m/z=280.19(M)+, 計算値C18H18NO2=280.28.
【００８０】
ステップ３：
【化３１】
2015506462.tif 000035
所望の酸へのエステルのけん化は、ターゲット１の合成に対して以前に記述されたプロトコルを使用して行うことができることが予測された（ステップ６）。
【００８１】
（例６）
２−［２−（カルバモイルメチル−カルバモイル）−エチル］−９、１０−ジメチル−アクリジニウムトリフルオロ酢酸塩の合成および蛍光特性
【化３２】
2015506462.tif 000036
【００８２】
生体分子、例えばペプチドなどとのコンジュゲーションを可能にするために基を用いて官能化した色素の重要な特徴とは、コンジュゲーション反応中に使用される条件に対してできる限り安定していることである。この場合、９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムメチルアクリジウム（ａｃｒｉｄｉｕｍ）コアは、アミノ基とのアミド結合形成を可能にするためのカルボン酸部分の活性化に必要とされる条件に対して安定していなければならない。結果的に、グリシンは、ＰｙＢＯＰカップリング条件を使用して、固形支持体上の２−（２−カルボキシエチル）−９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウム色素で標識することによって、ターゲット、ＬＬＤ−Ｇｌｙ−ＣＯＮＨ2を得た（スキーム６）。色素の安定性を確認するための1Ｈ／13Ｃ  ＮＭＲおよびＭＳにより容易に特徴づけることができるため、このターゲットが選択された。実際に、1Ｈ／13Ｃ  ＮＭＲおよびＭＳによる特徴付けにより、所望のターゲット、ＬＬＤ−Ｇｌｙ−ＣＯＮＨ2が逆相ＨＰＬＣ精製後に得られたことが確認された。
【００８３】
【化３３】
2015506462.tif 000037
スキーム6
【００８４】
２−（２−カルボキシエチル）−９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムクロリド（４０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５００μｌ）およびＰｙＢＯＰ（６６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）中に溶解し、次いでＨＯＢｔ（９１７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（８８．９μｌ、０．５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１０分間超音波処理した。Ｒｉｎｋアミド結合したグリシン（２００ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍｌ）中で膨張させ、次いで予備活性化した色素溶液を樹脂に加え、混合物を４．５時間超音波処理した。樹脂を濾過し、ＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄し、次いで真空中で乾燥させた。水（２５０μｌ）、ＴＩＳ（１２５μｌ）およびＴＦＡ（５ｍｌ）を乾燥樹脂に加え、混合物を室温で４時間撹拌した。溶液を冷たいジエチルエーテル（３０ｍｌ）へと濾過したが、沈殿は生じなかった。色素標識した生成物を水（２×３０ｍｌ）に抽出し、次いで凍結乾燥した。ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｌｕｎａ  Ｃ１８、２５０×４．６ｍｍカラム、４０分間にわたり１０〜５０％）での精製によって、濃緑色の飛散性固体を得た（９．７５ｍｇ、２３％）。1H NMR(300MHz,(CD3)CN) δ 8.77(d, J=8.4Hz, 1H, ar), 8.59(s, 1H, ar), 8.50(m, 2H, ar), 8.32(m, 2H, ar), 7.96(m, 1H, ar), 4.72(s, 3H, NCH3), 3.76(s, 2H, CH2), 3.45(s, 3H, CH3), 3.28(t, J=7.5Hz, 2H, CH2), 2.77(t, J=7.5Hz, 2H, CH2); 13C NMR(100MHz, CD3CN) δ 174.04(C), 173.43(C), 161.14(C), 142.11(C), 141.37(C), 141.12(CH), 140.74(C), 139.02(CH), 128.97(CH), 128.37(CH), 127.20(CH), 127.15(C), 127.10(C), 119.70(CH), 119.63(CH), 42.90,(CH2), 39.39(CH3), 37.04(CH2), 31.60(CH2), 16.36(CH3); ESI m/z=336.25(M)+, 計算値C20H22N3O2=336.41; HRMS 336.17060(M)+, 計算値C20H22N3O2=336.17065
【００８５】
（例７）
２−（２−カルボキシエチル）−９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムクロリドを使用して色素標識したペプチドの合成−一般のプロトコル
ステップ１：２−（２−カルボキシエチル）−９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムクロリドのペプチドへの付着
２−（２−カルボキシエチル）−９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムクロリド（２２ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２００μｌ）およびＰｙＢＯＰ（３６．４ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）中に溶解し、次いでＨＯＢｔ（９．５ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２３μｌ、０．１７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１０分間超音波処理した。樹脂結合したペプチド（１００ｍｇ）をＤＭＦ（５００μｌ）中で膨張させ、次いで予備活性化した色素溶液を樹脂に加え、混合物を４．５時間超音波処理した。樹脂を濾過し、ＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄し、次いで真空中で乾燥させた。
【００８６】
ステップ２：色素標識したペプチドの樹脂からの切断
水（１２５μ）、ＴＩＳ（６２．５μｌ）およびＴＦＡ（２．５ｍｌ）を乾燥樹脂（約１００ｍｇ）に加え、混合物を室温で３時間撹拌した。溶液を冷たいジエチルエーテル（３０ｍｌ）へと濾過し、沈殿したペプチドを遠心分離し、ジエチルエーテル（３０ｍｌ）で洗浄し、凍結乾燥させることによって、固体を得た。分取ＨＰＬＣでの精製により所望の生成物を得た。
【００８７】
（例８）
カスパーゼ３アッセイに対する２−（２−カルボキシエチル）−９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウム標識したペプチド基質の設計
２つの色素標識したペプチド、２−（２−カルボキシエチル）−９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウム−ＤＥＶＤＳＫ（ＬＬＤ−ＤＥＶＤＳＫ）および２−（２−カルボキシエチル）−９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウム−ＤＥＶＤＳＷ（ＬＬＤ−ＤＥＶＤＳＷ）を、例７に記載の一般のプロトコルを使用して合成した。これらのペプチド基質は、２つの理由から選択された；（１）２−（２−カルボキシエチル）−９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウム蛍光のモジュレーターとしてのトリプトファン（Ｗ）の作用を実験するため、および（２）プロテアーゼカスパーゼ３に対してＤＥＶＤＳＸが優れた基質であること。
【００８８】
色素標識したペプチドの蛍光寿命を、水および５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．５中、１μΜのペプチド濃度で測定した（表３）。５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．４において、ＬＬＤ−ＤＥＶＤＳＫの蛍光寿命は２９．３ｎｓであった。リシン残基をトリプトファンで置き換えると、蛍光寿命の２１．５ｎｓから７．８ｎｓの有意な減少がもたらされ、これは、トリプトファンが９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムの蛍光寿命の優れたモジュレーターであることを示唆している。
【００８９】
【表３】
2015506462.tif 000038
【００９０】
トリプトファンはまた、９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムの蛍光強度をモジュレートすることが示されている。ＬＬＤ−ＤＥＶＤＳＫと比較して、ＬＬＤ−ＤＥＶＤＳＷでは、４０５ｎｍでの励起により、蛍光発光が９０％（５００ｎｍ）低減することが観察された（図４）。１０ｍＭ  ＰＢＳ中、５００ｎＭのペプチド濃度で測定を実施した。
【００９１】
（例９）
カスパーゼ３アッセイ−ＬＬＤ−ＤＥＶＤＳＷを基質として使用
【化３４】
2015506462.tif 000039
スキーム7
【００９２】
トリプトファンでクエンチした基質、ＬＬＤ−ＤＥＶＤＳＷの酵素媒介された切断により、蛍光強度（増加）および蛍光寿命の変化（増加）が生じ（スキーム７）、したがってこれによって、生化学的アッセイおよび細胞ベースのアッセイにおいて色素を蛍光性リポーターとして採用することができることが予測された。したがって、部分的にクエンチした２−（２−カルボキシエチル）−９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウム−標識したペプチド基質、ＬＬＤ−ＤＥＶＤＳＷを、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した組換え型カスパーゼ−３酵素を使用した生化学的酵素の切断アッセイに採用した。２．５または１．２５単位の酵素の存在下、１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．１％ＣＨＡＰＳを含有する５０ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ７．２中、５００ｎＭの基質濃度を使用してアッセイを行った（３８４ウェルプレート中最終容量３０μｌ、３回重複）。Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｎａｎｏｔａｕｒｕｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌｉｆｅｔｉｍｅ  ＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒ（Ｅｘ４０５ｎｍおよび４７３ｎｍロングパス発光フィルター）を使用して、時間間隔をおいて、リアルタイムでアッセイ混合物を分析した。反応の進行中に、反応混合物の蛍光寿命における大規模な変化が観察され（７．３ｎｓから２３．４ｎｓ）、これは基質が生成物に変換したことを示している（図５）。上記に述べられているものからの蛍光寿命の偏差は、緩衝液および酵素混合物によるものである。
【００９３】
（例１０）
カスパーゼ３アッセイ−ＡｃＤＥＶＤ−ＣＨＯによるカスパーゼ３の阻害
緩衝液：１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．１％ＣＨＡＰＳを含有する５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．２
阻害剤：ＡｃＤＥＶＤ−ＣＨＯ（１０００ｎＭ〜０．１２ｎＭ、１４段階希釈）
基質：ＬＬＤ−ＤＥＶＤＳＷ（５００ｎＭ）
酵素：カスパーゼ３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２５２Ｕ／ｍｌ）、２Ｕ／ウェル
ＡｃＤＥＶＤ−ＣＨＯ溶液（緩衝液中３０００ｎＭ、３×濃縮）を、２倍に段階希釈することによって、１４の連続した阻害剤濃度範囲を作った。各溶液１０μｌを３８４ウェルプレートに３回重複して加えた。次いで、酵素（１０μＬ緩衝液中２Ｕ）を各ウェルに加え、６０分間静置させた。ＬＬＤ−ＤＥＶＤＳＷ（１０μＬ、緩衝液中１．５μΜ、３×濃度）を各ウェルに加えることによって、アッセイを開始した。２０分後、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｎａｎｏｔａｕｒｕｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌｉｆｅｔｉｍｅ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｅｘ４０５ｎｍおよび４７３ｎｍ切断発光フィルター）を使用してプレートを分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して、ログ阻害剤濃度に対する平均寿命のプロットを、可変の勾配非直線回帰モデルにフィットさせることによって、ＡｃＤＥＶＤ−ＣＨＯに対する３．３ｎＭのＩＣ50値を得た（図６を参照されたい）。
【００９４】
（例１１）
ＭＭＰ２プロテアーゼアッセイに対する基質の設計
カスパーゼ−３アッセイにおける、２−（２−カルボキシエチル）−９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウム−標識したペプチド基質の使用の成功に続いて、蛍光寿命ＭＭＰ２プロテアーゼアッセイに使用するためのＬＬＤ−標識したペプチド基質の設計に同じ原理を適用した。この場合、２−（２−カルボキシエチル）−９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウム−標識したペプチド基質、ＬＬＤ−ＰＬＧＬＮａｌＡＲは、ナフチルアラニン（Ｎａｌ）残基を、蛍光モジュレーター（この切断が、蛍光強度および蛍光寿命の増加を結果として生じることになる）として含有した。（スキーム８）。
【００９５】
【化３５】
2015506462.tif 000040
スキーム8
【００９６】
例７に記載の一般のプロトコルに従いＬＬＤ−ＰＬＧＬＮａｌＡＲを合成し、ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓから購入した組換え型ＭＭＰ２酵素を使用する、生化学的酵素の切断アッセイに採用した。異なる酵素濃度の存在下、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＺｎＣｌ2および０．１％ＣＨＡＰＳを含有する５０ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ７．５中、１μΜの基質濃度を使用してこのアッセイを行った（３８４ウェルプレート中最終容量３０μｌ、３回重複）。Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｎａｎｏｔａｕｒｕｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｌｉｆｅｔｉｍｅ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｅｘ４０５ｎｍおよび４７３ｎｍロングパス発光フィルター）を使用して、時間間隔をおいて、リアルタイムで、アッセイ混合物を分析した。反応の進行中に、反応混合物の蛍光寿命における大規模な変化が観察され（９．７ｎｓから２０．８ｎｓ）、基質が生成物に変換したことを示した（図７）。
【００９７】
（例１２）
チロシンキナーゼアッセイのための基質の設計
例７に記載のプロトコルを使用して、以下の色素標識したペプチドを合成した；ＬＬＤ−ＥＰＥＧＩＹＧＶＬＦ（Ｌｃｋ基質）、ＬＬＤ−ＥＰＥＧＩｐＹＧＶＬＦ（Ｌｃｋ生成物）、ＬＬＤ−ＧＧＥＥＥＥＹＦＥＬＶＫＫ（Ｊａｋ２／３基質）およびＬＬＤ−ＧＧＥＥＥＥｐＹＦＥＬＶＫＫ（Ｊａｋ２／３生成物）。これらのペプチドを２つの理由で選択した；（１）２−（２−カルボキシエチル）−９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウム蛍光のモジュレーターとしてのチロシン（Ｙ）の作用を実験するため、および（２）ＥＰＥＧＩＹＧＶＬＦは、Ｌｃｋキナーゼに対する基質であり、ＧＧＥＥＥＥＹＦＥＬＶＫＫは、Ｊａｋ２およびＪａｋ３キナーゼに対する基質である。
【００９８】
４０μΜ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2および１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有する５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．４中、１μΜのペプチド濃度で、色素標識したペプチドの蛍光寿命を測定した（表４）。非リン酸化とリン酸化したＬｃｋペプチドの間で５．２ｎｓ（１３．０ｎｓから１８．２ｎｓ）の増加、および非リン酸化とリン酸化したＪａｋ２／３ペプチドの間で４．８ｎｓ（１１．３ｎｓから１６．１ｎｓ）の増加を観察し、これは、チロシンもまた９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウムの蛍光寿命の良好なモジュレーターであることを示唆している。リン酸化により、中性のフェノール部分が負に帯電した種に変換され、これによって、チロシンのモジュレート作用のいくらかが軽減し、結果的に蛍光の増加が観察されている。チロシンにより引き起こされるモジュレート作用は、リン酸化により部分的にしか軽減せず、したがってリン酸化したペプチドの蛍光寿命は、遊離の色素に対する蛍光寿命ほど長くはならない。
【００９９】
【表４】
2015506462.tif 000041
【０１００】
（例１３）
Ｌｃｋチロシンキナーゼアッセイ−ＬＬＤ−ＥＰＥＧＩＹＧＶＬＦ基質を使用
【化３６】
2015506462.tif 000042
スキーム9
【０１０１】
ＡＴＰの存在下、ＬＬＤ−標識した基質のキナーゼ媒介されたリン酸化が、リアルタイムでモニターすることができる蛍光寿命および蛍光強度の増加を生じることが提案された。したがって、部分的にクエンチした２−（２−カルボキシエチル）−９，１０−ジメチルアクリジン−１０−イウム−標識したペプチド基質、ＬＬＤ−ＥＰＥＧＩＹＧＶＬＦを、ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓから購入した組換え型Ｌｃｋ（ｐ５６ｌｃｋ）酵素を使用する生化学的酵素のリン酸化アッセイに採用した。異なる酵素濃度の存在下、４０μΜ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2および１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有する５０ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ７．２中、１μΜの基質濃度を使用してアッセイを行った（３８４ウェルプレート中最終容量３０μｌ、３回重複）。Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｎａｎｏｔａｕｒｕｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌｉｆｅｔｉｍｅ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｅｘ４０５ｎｍおよび４７３ｎｍロングパス発光フィルター）を使用して、時間間隔をおいて、リアルタイムでアッセイ混合物を分析した。反応の進行中に、反応混合物の蛍光寿命における変化が観察され（１３．２ｎｓから１７．１ｎｓ）、基質が生成物に変換したことを示した（図８）。
【０１０２】
（例１４）
Ｌｃｋチロシンキナーゼアッセイ−スタウロスポリンによるＬｃｋ阻害
緩衝液Ａ：１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含有する５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．２
緩衝液Ｂ：８０μΜ  ＡＴＰ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2および１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有する５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．２
阻害剤：スタウロスポリン（１０００ｎＭ〜０．１２ｎＭ、１４段階希釈）
基質：ＬＬＤ−ＥＰＥＧＩＹＧＶＬＦ（１μΜ）
酵素：Ｌｃｋ（ｐ５６ｌｃｋ）（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、１８Ｕ／ｍｌ）、４．５ｍＵ／ウェル
【０１０３】
スタウロスポリン溶液（緩衝液Ａ中６０００ｎＭ、６×濃縮）を２倍に段階希釈することによって、１４の連続した阻害剤濃度範囲を作った。各溶液５μｌを３８４ウェルプレートに３回重複して加えた。次いで、酵素（１０μｌ緩衝液Ａ中４．５ｍＵ）を各ウェルに加え、１５分間静置させた。ＬＬＤ−ＥＰＥＧＩＹＧＶＬＦ（１５μｌ、緩衝液Ｂ中２μΜ、２×濃縮）を各ウェルに加えることによって、アッセイを開始した。３０分後、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｎａｎｏｔａｕｒｕｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌｉｆｅｔｉｍｅ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｅｘ４０５ｎｍおよび４７３ｎｍ切断発光フィルター）を使用してプレートを分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して、ログ阻害剤濃度に対するパーセンテージ阻害のプロットを可変の勾配非直線回帰モデルにフィットさせることによって、スタウロスポリンに対する２５．９ｎＭのＩＣ50値を得た（図９を参照されたい）。
【０１０４】
（例１５）
Ｌｃｋチロシンキナーゼアッセイ−ＡＴＰ  Ｋｍの判定
緩衝液Ａ：１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有する５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．２
緩衝液Ｂ：８０μΜ  ＡＴＰ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2および１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ  ＡＴＰ：２００μΜ〜９８ｎＭ、１２段階希釈を含有する、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．２
基質：ＬＬＤ−ＥＰＥＧＩＹＧＶＬＦ（１μΜ）
酵素：Ｌｃｋ（ｐ５６ｌｃｋ）（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、１８Ｕ／ｍｌ）、３．６ｍＵ／ウェル
ＡＴＰ溶液（緩衝液Ａ中６００μΜ、３×濃縮）を、２倍に段階希釈することによって、１４の連続する濃度範囲を作った。各溶液１０μｌを、３８４ウェルプレートに３回重複して加えた。次いで、酵素（５μｌ緩衝液Ａ中３．６ｍＵ）を各ウェルに加えた。ＬＬＤ−ＥＰＥＧＩＹＧＶＬＦ（１５μｌ、緩衝液Ｂ中２μΜ、２×濃縮）を各ウェルに加えることによってアッセイを開始した。Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｎａｎｏｔａｕｒｕｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌｉｆｅｔｉｍｅ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｅｘ４０５ｎｍおよび４７３ｎｍ切断発光フィルター）を使用して、時間間隔をおいて、リアルタイムでプレートを分析した。検量線から平均寿命値をｐｍｏｌのホスホペプチドに変換し、ＡＴＰ濃度に依存する反応の最初の速度のプロットを使用することによって、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して非直線回帰フィッティングによりＡＴＰ  Ｋｍ値を求めた（図１０を参照されたい）。ＬＬＤ−ＥＰＥＧＩＹＧＶＬＦを使用して、Ｌｃｋキナーゼに対して求めたＡＴＰ  Ｋｍは３６．４１μΜであった。
【０１０５】
（例１６）
蛍光寿命分析のための、色素誘導体ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩのペプチドへの付着
例７に記載の一般のプロトコルを使用し、各誘導体の蛍光寿命値の測定および比較を可能にするための色素誘導体のそれぞれ（ＩＩＩ〜ＶＩＩ）を用いて、ペプチド基質、ＤＥＶＤＳＫをＮ−末端を介して標識した。色素標識したペプチドの蛍光寿命を、水および５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．４中、１μΜの濃度で測定した（表５）。
【０１０６】
【表５】
2015506462.tif 000043
【図１】
2015506462.tif 000048
【図２】
2015506462.tif 000049
【図３】
2015506462.tif 000050
【図４】
2015506462.tif 000051
【図５】
2015506462.tif 000052
【図６】
2015506462.tif 000053
【図７】
2015506462.tif 000054
【図８】
2015506462.tif 000055
【図９】
2015506462.tif 000056
【図１０】
2015506462.tif 000057
【国際調査報告】
2015506462.tif 000058
2015506462.tif 000059
2015506462.tif 000060