(57)【要約】  本発明は、プトレシンを生産するように変異させたコリネバクテリウム属微生物において、ＮＣｇｌ０１０１活性が低下して高収率でプトレシンを生産することのできる組換え微生物及び前記微生物を用いてプトレシンを生産する方法に関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プトレシンを生産するように変異させたコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物において、配列番号１７又は１９で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が内在的活性より低下又は欠失した、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物。
【請求項２】
オルニチンデカルボキシラーゼ（ｓｐｅＣ）の活性がさらに導入された、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記オルニチンデカルボキシラーゼが配列番号２２のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）及びグルタミン酸エクスポーター（ＮＣｇｌ１２２１）からなる群から選択される少なくとも１種の活性が内在的活性よりさらに低下した、請求項１に記載の微生物。
【請求項５】
ＡｒｇＦが配列番号２０のアミノ酸配列を有し、ＮＣｇｌ１２２１が配列番号２１のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタミン酸シンターゼ又はオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタミン酸キナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）からなる群から選択される少なくとも１種の活性がさらに向上した、請求項１に記載の微生物。
【請求項７】
前記ＡｒｇＣ、ＡｒｇＪ、ＡｒｇＢ及びＡｒｇＤが、それぞれ配列番号２３、２４、２５及び２６のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
活性低下が、１）前記タンパク質をコードする遺伝子の一部又は全部の欠失、２）前記遺伝子発現の減少、３）前記タンパク質の活性が低下するように染色体上の前記遺伝子配列の変異、又は４）それらの組み合わせにより行われる、請求項１に記載の微生物。
【請求項９】
コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項１に記載の微生物。
【請求項１０】
配列番号１７又は１９で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が内在的活性より低下又は欠失した、向上したプトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培養する工程と、
前記工程で得られた培養物からプトレシンを分離する工程とを含むプトレシンの生産方法。
【請求項１１】
コリネバクテリウム属微生物がコリネバクテリウムグルタミカムである、請求項１０に記載のプトレシンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プトレシン生産能が向上した組換え微生物及びそれを用いてプトレシンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ又は１，４−ブタンジアミン）は、スペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、スペルミン（ｓｐｅｒｍｉｎｅ）などのポリアミンの一種であり、グラム陰性バクテリアやカビから発見され、様々な種に高濃度で存在するので、微生物の代謝に重要な役割を果たことが予測されている。プトレシンは、主にプロピレンからアクリロニトリル（ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）及びスクシノニトリル（ｓｕｃｃｉｎｏｎｉｔｒｉｌｅ）を経由する化学合成法で生産される。この化学合成法は、石油化学物質を出発物質とし、有毒性物質などを用いるので、環境にやさしいものではなく、石油資源の枯渇問題を抱えている。
【０００３】
前記問題を解決するために、より環境にやさしく、エネルギー消費を削減できるように、微生物を用いてプトレシンを生合成する方法を開発する研究が盛んに行われている。従来技術によれば、プトレシンは微生物から２つの経路を経て生合成することができる。一方はグルタメートからオルニチンを生成し、前記オルニチンを脱カルボキシル化してプトレシンを合成する経路であり、他方は前記合成されたオルニチンから合成されたアルギニンを用いてアグマチン（ａｇｍａｔｉｎｅ）を生成し、前記アグマチンからプトレシンを合成する経路である。また、このように公知のプトレシン合成経路に関与する酵素を用いて標的微生物を形質転換することによりプトレシンを合成する方法も研究されている。例えば、特許文献１には、大腸菌に存在するプトレシンの分解及び利用に関与する経路を不活性化し、プトレシンの前駆体であるオルニチンがアルギニンに変換される経路を不活性化し、オルニチン生合成経路を強化することにより、プトレシンを高収率で生産する方法が開示されている。２０１０年に発表された論文においては、プトレシン生産能のないコリネバクテリウム属菌株に、オルニチンをプトレシンに変換するタンパク質を導入し、活性を向上させることにより、プトレシンを高濃度で生産する方法が開示されており、大腸菌由来のアルギニンデカルボキシラーゼとアグマチナーゼ（Ａｇｍａｔｉｎａｓｅ）を導入してアルギニンからプトレシンを生産する方法が開示されている。ここで、アルギニン経路よりオルニチン経路によるプトレシン生産のほうが約５０倍高かった（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第０９／１２５９２４号
【特許文献２】韓国公開特許第１９９２−００００９３３号公報
【特許文献３】国際公開第２００９／０９６６８９号
【特許文献４】韓国登録特許第０６２００９２号公報
【特許文献５】韓国公開特許第２０１２−００６４０４６号公報
【特許文献６】韓国登録特許第１０−０８６０９３２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８８：  ４，８５９−８６８，  ２０１０
【非特許文献２】Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｉｔｏｒｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９
【非特許文献３】Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｉｔｏｒｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献４】Ｓａｋａｎｙａｎ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  １４２：１，  ９９−１０８，  １９９６
【非特許文献５】”Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”  ｆｒｏｍ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，  ＵＳＡ，  １９８１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
こうした背景の下、本発明者らは、ＮＣｇｌ０１０１タンパク質の活性を低下又は欠失させると、コリネバクテリウム属微生物においてプトレシンの生産量が増加することを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＮＣｇｌ０１０１の活性が内在的活性より低下するように変異し、プトレシンを高収率で生産することのできる組換えコリネバクテリウム属微生物を提供することを目的とする。
【０００８】
また、本発明は、前記微生物を用いてプトレシンを生産する方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を用いると、ＮＣｇｌ０１０１の活性が内在的活性より低下するように変異し、プトレシンを高収率で生産することができるので、より効果的なプトレシンの生産に広く活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】野生型コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体に存在するＮＣｇｌ０１００、ＮＣｇｌ０１０１、ＮＣｇｌ０１０２、ＮＣｇｌ０１０３及びＮＣｇｌ０１０４をコードする遺伝子の相対的な位置を示す概略図である。
【図２】本発明で作製した各変異菌株の成長比較試験の結果を示す図である。１、２、３、４、５、６は、ＫＣＣＭ１１１３８ＰにｐＨＣ１３９Ｔ、ｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ０１００、ｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ｔＮＣｇｌ０１００、ｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ０１０１、ｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ０１０２−ＮＣｇｌ０１０３、ｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ０１０４が導入された菌株である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
前記本発明の目的を達成するための一実施態様として、本発明はプトレシンを生産するように変異させたコリネバクテリウム属微生物において、配列番号１７又は１９で表されるアミノ酸配列を有するＮＣｇｌ０１０１タンパク質の活性が内在的活性より低下又は欠失した、プトレシン生産能が向上した組換えコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【００１２】
本発明における用語「ＮＣｇｌ０１０１」とは、コリネバクテリウムグルタミカムにおいて発現し、いまだ機能が明らかにされていない金属依存性酵素活性を示すタンパク質を意味するが、ペプチダーゼＭ２０ファミリー又はアミノベンゾイルグルタメート分解タンパク質（ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｙｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ａｂｇＢ）が有する金属結合ドメインを含むものである。大腸菌に存在するａｂｇＢは、ａｂｇＡと共にアミノベンゾイルグルタメートヒドロラーゼを構成し、アミノベンゾイルグルタメートをアミノベンゾエートとグルタメートに分解することができる。前記アミノベンゾエートは葉酸（ｆｏｌａｔｅ）を合成する前駆体として用いられることが知られているが、プトレシン生産能との関連は明らかにされていない。
【００１３】
本発明のＮＣｇｌ０１０１タンパク質は、配列番号１７又は１９で表されるアミノ酸配列を含むことができる。しかし、微生物の種又は菌株によって前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列が異なることがあるので、これらに限定されるものではない。すなわち、活性を低下させることにより、プトレシン生産性の向上を助けるタンパク質であれば、配列番号１７又は１９のアミノ酸配列の少なくとも１つの位置における１個又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は添加などを含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする突然変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「複数」とは、タンパク質のアミノ酸残基の立体構造における位置や種類によって異なるが、具体的には２個〜２０個、好ましくは２個〜１０個、より好ましくは２個〜５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、添加、又は逆位などには、前記ポリペプチドの活性を有する微生物の個体又は種の違いに基づく場合など、天然に生じる突然変異又は人為的な変異（ｖａｒｉａｎｔ）により発生するものも含まれる。
【００１４】
本発明の前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、本発明のＮＣｇｌ０１０１タンパク質に類似した活性を有するものであれば、配列番号１７又は１９のアミノ酸配列又はこれと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよく、最も好ましくは配列番号１６又は１８で表されるポリヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００１５】
前記用語「相同性」とは、２つのアミノ酸配列間の同一性を示すものであり、スコア（ｓｃｏｒｅ）、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）などのパラメーター（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を計算するＢＬＡＳＴ２．０を用いる、当業者に周知の方法で決定されうる。
【００１６】
また、本発明のＮＣｇｌ０１０１をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１６のポリヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列から製造されたプローブと「ストリンジェントな条件」でハイブリダイズすることができ、正常に機能するＮＣｇｌ０１０１タンパク質をコードする変異型であってもよい。本発明における用語「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイズを可能にする条件を意味する。例えば、分子クローニング（非特許文献２）又は分子生物学カレント・プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（非特許文献３）に具体的に記載されており、例えば６５℃のハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ，０．０２％フィコール，０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％牛血清アルブミン，２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７），０．５％ＳＤＳ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ）におけるハイブリダイゼーションが記載されている。ＳＳＣは、ｐＨ７の０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウムである。ハイブリダイゼーション後に、ＤＮＡが転写されているメンブランを室温にて２×ＳＳＣで洗浄し、その後６８℃の温度にて０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳで洗浄する。
【００１７】
本発明のＮＣｇｌ０１０１タンパク質の活性低下は、１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部又は全部の欠失、２）前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列の改変、３）前記ＮＣｇｌ０１０１タンパク質の活性が低下するように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の改変、又は４）それらの組み合わせにより行うことができる。
【００１８】
前記方法のうち、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部又は全部を欠失させる方法は、細菌内染色体挿入ベクターにより染色体内の内在的な標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを一部の核酸配列が欠失したポリヌクレオチド又はマーカー遺伝子に置換することにより行うことができる。前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって異なるが、具体的には２個〜３００個、好ましくは２個〜１００個、より好ましくは１個〜５個である。
【００１９】
また、前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列を改変する方法は、前記発現調節配列の活性がより低下するように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレータ配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と翻訳の終結を調節する配列が含まれる。
【００２０】
また、本発明のタンパク質をコードする、染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法は、前記配列の活性がより低下するように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有するように改良された核酸配列に置換することにより行うこともできる。
【００２１】
一方、本発明のプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物は、オルニチンにおいて、アルギニン合成に関与するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｃａｒｂａｍｏｙｌｔｒａｎｓｆｒａｓｅ，  ＡｒｇＦ）、及びグルタメートの排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）の活性を内在的活性より低下するようにさらに変異させてもよい。それだけでなく、オルニチンデカルボキシラーゼ（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，  ＯＤＣ）の活性を導入するように変異させてもよく、プトレシン前駆体であるオルニチン生合成経路の強化のために、グルタメートをアセチルグルタメートに変換させるアセチルグルタミン酸シンターゼ、又はアセチルオルニチンをオルニチンに変換させるオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタミン酸をアセチルグルタミルホスフェートに変換させるアセチルグルタミン酸キナーゼ（ＡｒｇＢ）、アセチルグルタミルホスフェートをアセチルグルタミン酸セミアルデヒドに変換させるアセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、及びアセチルグルタミン酸セミアルデヒドをアセチルオルニチンに変換させるアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）の活性を内在的活性より向上するようにさらに変異させてもよい（非特許文献４）。
【００２２】
ここで、前記記載のＡｒｇＦ、ＮＣｇｌ１２２１、ＯＤＣ、ＡｒｇＣ、ＡｒｇＪ、ＡｒｇＢ及びＡｒｇＤは、特にこれらに限定されるものではないが、好ましくは、それぞれ配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６のアミノ酸配列、又はそれらと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００２３】
本発明における用語「オルニチンデカルボキシラーゼ（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，  ＯＤＣ）」とは、オルニチンを用いてプトレシンを生成する酵素を意味するが、前記ＯＤＣは補酵素としてピリドキサールホスフェート（Ｐｙｒｉｄｏｘａｌ  ５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ＰＬＰ）を必要とし、ほとんどのグラム陰性菌に存在し、グラム陽性菌のうちラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）などの腸内細菌の一部に存在する。大腸菌の場合、ＯＤＣをコードする遺伝子は２つあるが、一方のｓｐｅＣは持続的に一定濃度で発現し、他方のｓｐｅＦは特定条件（一定濃度以上のオルニチンの存在及び低いｐＨ条件）下で発現が誘導される遺伝子である。種によって、大腸菌のように２種類のＯＤＣを有する種もあり、１種類しかない種もある。エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）などの種は２種類のＯＤＣ（ｓｐｅＣ，ｓｐｅＦ）を有し、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐ．）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．）などの菌株は１種類のＯＤＣ（ｓｐｅＣ）を有する。乳酸菌の場合、ＯＤＣが１種類の遺伝子（ｓｐｅＦ）から発現し、低いｐＨやオルニチンとヒスチジンが豊富な条件で発現が誘導されることが知られている。
【００２４】
本発明の組換えコリネバクテリウム属微生物は、前述した様々な種由来のＯＤＣコード遺伝子を用いてＯＤＣ活性を導入することができる。前記ＯＤＣをコードするポリヌクレオチドは、特にこれらに限定されるものではないが、配列番号２２のアミノ酸配列、又はそれと７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００２５】
また、微生物にオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）の活性を導入することは当該分野で周知の様々な方法で行うことができ、例えばＯＤＣをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを染色体に挿入する方法、前記ポリヌクレオチドをベクターシステムに導入して微生物に導入する方法、ＯＤＣをコードする塩基配列の上流に改良された活性を示すプロモーターを導入するか、プロモーターに変異を入れたＯＤＣを導入する方法、ＯＤＣをコードする塩基配列の変異体を導入する方法などを用いることができ、より好ましくは、前記ＯＤＣをコードする塩基配列を導入する場合は、この発現を調節するためのプロモーターとして公知のＣＪ７プロモーターを用いることができる。
【００２６】
また、前記ＡｒｇＣ、ＡｒｇＪ、ＡｒｇＢ及びＡｒｇＤの活性向上は、１）前記酵素をコードするポリヌクレオチドのコピー数増加、２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の改変、３）前記酵素の活性が向上するように染色体上の前記酵素をコードするポリヌクレオチド配列の改変、４）それらの組み合わせにより向上するように改変する方法などにより行うことができる。
【００２７】
具体的には、前記１）ポリヌクレオチドのコピー数増加は、ベクターに作動可能に連結した形態で行うか、宿主細胞内の染色体内に挿入することにより行うことができる。より具体的には、本発明の酵素をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結した、宿主に関係なく複製されて機能するベクターを宿主細胞に導入することにより行うことができ、前記ポリヌクレオチドを作動可能に連結した、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターを宿主細胞に導入することにより前記宿主細胞の染色体内の前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加する方法で行うことができる。
【００２８】
本発明における用語「ベクター」とは、好適な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列は、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレータ配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列を含む。ベクターは、好適な宿主内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
【００２９】
本発明において用いられるベクターは、宿主内で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当業界で公知の任意のベクターを用いることができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いることができる。本発明において使用可能なベクターは、特に限定されるわけではなく、公知の発現ベクターを用いることができる。好ましくは、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。最も好ましくは、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＣＬ、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターを用いることができる。
【００３０】
また、宿主細胞を形質転換し、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞内の染色体内に挿入することのできるベクターの好ましい例としては、大腸菌とコリネフォルム細菌の両方で自己複製可能なシャトルベクターｐＥＣＣＧ１１２ベクター（特許文献２）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００３１】
また、細菌内染色体挿入ベクターにより染色体内の内在的な標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを新規ポリヌクレオチドに置換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができる。本発明のベクターは、相同組換えを起こして染色体内に挿入されるので、前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカーをさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的ポリヌクレオチドが挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬剤耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、又は表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与するマーカーを用いてもよい。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）で処理された環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
【００３２】
本発明における用語「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内に発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体以外に位置するかに関係なく、それらを全て含むものである。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセットの形態で宿主細胞に導入される。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよい。
【００３３】
また、前記用語「作動可能に連結」とは、本発明の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結していることを意味する。
【００３４】
また、本発明の２）ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を改変する方法は、前記発現調節配列の活性がさらに向上するように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より高い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレータ配列、リボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。
【００３５】
前記ポリヌクレオチド発現単位の上流には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されてもよく、前記強力なプロモーターの例としては、ｐｃｊ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ−Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡ又はａｃｅＢプロモーターなどが挙げられ、より好ましくは、コリネバクテリウム由来のプロモーターであるｌｙｓＣＰ１プロモーター又はｐｃｊ７プロモーターが作動可能に連結されて前記酵素をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させることができる。ここで、ｌｙｓＣＰ１プロモーターは、アスパラギン酸キナーゼ及びアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドのプロモーター部位の塩基配列の置換により改良されたプロモーターであり、アスパラギン酸キナーゼ遺伝子の発現量増大により糖酵素の活性を野生型に比べて約５倍向上させることのできる強力なプロモーターである（特許文献３）。また、ｐｃｊ７プロモーターは、コリネバクテリウムアンモニアゲネスから強力なプロモーター配列を有する領域を探索中にコリネバクテリウムアンモニアゲネス及びエシェリキアから発現可能で、かつ強力なプロモーター活性を有することが確認されたプロモーターであり、コリネバクテリウムグルタミカムにおいても高い発現強度が可能なプロモーターである（特許文献４）。
【００３６】
また、３）染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、前記配列の活性がより向上するように、核酸配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より高い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。
【００３７】
本発明の微生物は、プトレシンの生産が可能な微生物であり、配列番号１７又は１９で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質が発現する原核微生物を含み、その例としては、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐ．）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、セレノモナス属（Ｓｅｌｅｎｏｍａｎａｓ  ｓｐ．）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．）に属する微生物が挙げられる。
【００３８】
好ましくは、本発明の微生物は、コリネバクテリウム属に属する微生物であり、より好ましくは、コリネバクテリウムグルタミカムであってもよい。
【００３９】
本発明の一実施態様においては、グルタミン酸からのプトレシン生成経路が強化されて高濃度プトレシン生産能を有する、寄託番号ＫＣＣＭ１１１３８Ｐのコリネバクテリウム属微生物（特許文献５）を変異させた。具体的には、プトレシン生産菌株ＫＣＣＭ１１１３８Ｐは、ＡＴＣＣ１３０３２菌株において、オルニチン蓄積のためのオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）をコードする遺伝子、及び細胞内のグルタミン酸を増加させるためのグルタミン酸エクスポーター（ＮＣｇｌ１２２１）をコードする遺伝子が欠損し、オルニチンデカルボキシラーゼ（ｓｐｅＣ）をコードする遺伝子が導入され、オルニチン生合成遺伝子（ＡｒｇＣＪＢＤ）の発現量が増加したプトレシン過剰生産菌株である。
【００４０】
本発明の他の実施態様においては、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ベースのプトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１１３８Ｐと同じ遺伝子型を有するコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９ベースのプトレシン生産菌株ＤＡＢ１２−ａを変異させた。具体的には、プトレシン生産菌株ＤＡＢ１２−ａは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；  ＡＴＣＣ）から入手したＡＴＣＣ１３８６９菌株において、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）をコードする遺伝子及びグルタミン酸排出タンパク質ＮＣｇｌ１２２１をコードする遺伝子が欠損し、大腸菌由来のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＣＤ）をコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）が導入され、オルニチン生合成遺伝子オペロン（ＡｒｇＣＪＢＤ）のプロモーターが改良されたプロモーターに置換されたことを特徴とする。
【００４１】
本発明の一実施例においては、野生型コリネバクテリウムグルタミカム菌株ＡＴＣＣ１３０３２において、染色体内のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）をコードする遺伝子及びグルタミン酸排出に関与するグルタミン酸エクスポーターＮＣｇｌ１２２１をコードする遺伝子が欠損し、グルタミン酸においてオルニチン合成に関与する酵素をコードするＡｒｇＣＪＢＤ遺伝子群のプロモーターが置換され、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）をコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）が染色体内に導入されることにより作製された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物ＫＣＣＭ１１１３８Ｐに基づいて、高濃度プトレシン培地で成長性のよいクローンＡ１５を選択し、選択したＡ１５にＮＣｇｌ０１００、ＮＣｇｌ０１０１、ＮＣｇｌ０１０２、ＮＣｇｌ０１０３及びＮＣｇｌ０１０４をコードする遺伝子が含まれることが確認され（実施例１）、前記５種の遺伝子のうちＮＣｇｌ０１０１をコードする遺伝子により高濃度プトレシン培地でも前記微生物が成長することが確認された（実施例２）。ＮＣｇｌ０１０１をコードする遺伝子の特性を研究した結果、ＮＣｇｌ０１０１をコードする遺伝子が過剰発現した菌株においてはプトレシンの生産量が減少し（実施例３）、前記ＮＣｇｌ０１０１をコードする遺伝子が欠失した菌株においてはプトレシンの生産量が増加する（実施例４）ことが確認された。
【００４２】
よって、本発明者らは、プトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１１３８Ｐにおいて、ＮＣｇｌ０１０１遺伝子を欠失することによりプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミカム菌株をＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＣＣ０１−０２４４と命名し、２０１１年１２月２６日付けで韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，  以下「ＫＣＣＭ」という）に受託番号ＫＣＣＭ１１２４１Ｐとして寄託した。
【００４３】
前記目的を達成するための本発明の他の態様によれば、配列番号１７又は１９で表されるアミノ酸配列を含むＮＣｇｌ０１０１タンパク質の活性が低下するように変異し、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を培養する工程と、前記工程で得られた培養物からプトレシンを分離する工程とを含むプトレシン生産方法に関する。
【００４４】
本発明の前記培養過程は、当業界で公知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。前記培養方法の例としては、回分培養、連続培養及び流加培養が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
用いられる培養培地は特定の菌株の要件を満たさなければならない。各微生物の培養培地は公知である（例えば、非特許文献５）。培地内の炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン及びセルロース）、油脂（例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセリン及びエタノール）、並びに有機酸（例えば、酢酸）などを用いることができる。これらの物質は、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及びウレア）、又は無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）を用いることができる。これらの物質も、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、又はそれらに相当するナトリウム含有塩を用いることができる。また、培養培地は、成長に必要な金属塩（例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）を含有してもよい。最後に、前述した物質以外にも、アミノ酸やビタミンなどの成長に必要な促進物質をさらに用いてもよい。好適な前駆体を前記培養培地にさらに加えてもよい。前記供給物質は、培養物に一度に全て加えてもよく、培養中に適宜供給してもよい。
【００４６】
培養物のｐＨは、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア）又は酸性化合物（例えば、リン酸又は硫酸）を適宜用いることにより調節することができる。発泡は、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いることにより調節することができる。酸素又は酸素を含むガス混合物、例えば空気を培養物中に導入することにより、好気性条件を維持することができる。培養温度は、通常２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃である。培養は、プトレシンの所望の生成量が最大限に得られるまで続ける。これらの目的は、通常１０〜１６０時間で達成される。プトレシンは、培養培地中に排出されるか、細胞中に含まれている場合もある。
【００４７】
本発明の前記培養工程で生産されたプトレシンを収集及び回収する方法は、培養方法、例えば回分培養、連続培養、流加培養方法などにより、当該分野で公知の好適な方法を用いて培養液から標的アミノ酸を収集することができる。
【００４８】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
実施例１：プトレシンに対する有効遺伝子選択用ライブラリーの作製及びクローンの選択
野生型コリネバクテリウム菌株の染色体からプトレシン生合成に有効な遺伝子をスクリーニングするために、野生型コリネバクテリウム菌株の染色体ライブラリーを作製した。具体的には、野生型コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株から抽出された染色体を制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで処理してランダムに切断し、そこから５〜８ｋｂの断片を選択し、大腸菌とコリネバクテリウムのシャトルベクターであるｐＥＣＣＧ１２２（特許文献２）にクローニングすることにより染色体ライブラリーを作製した。
【００５０】
作製したコリネバクテリウム染色体ライブラリーからプトレシン生合成に有効な遺伝子を選択するために、プトレシンを高濃度で含む培地で成長可能なコロニーを確保した。
【００５１】
一方、本発明者らによる特許文献５に開示されている、野生型コリネバクテリウムグルタミカム菌株ＡＴＣＣ１３０３２において、染色体内のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）をコードする遺伝子、及びグルタミン酸の排出に関与するグルタミン酸エクスポーター（ＮＣｇｌ１２２１）をコードする遺伝子が欠損し、野生型大腸菌Ｗ３１１０菌株由来のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）をコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）が染色体内に導入され、グルタミン酸においてオルニチン合成に関与する酵素をコードするＡｒｇＣＪＢＤ遺伝子群のプロモーターが置換されることにより作製された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物（ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ）に、前記ライブラリーを導入することによりそれぞれの形質転換体を作製し、０．３５Ｍのプトレシンを含む最小培地（ブドウ糖１０ｇ／リットル，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．４ｇ／リットル，ＮＨ４Ｃｌ  ４ｇ／リットル，ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ／リットル，Ｋ２ＨＰＯ４  １ｇ／リットル，尿素２ｇ／リットル，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／リットル，ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／リットル，ニコチンアミド５ｍｇ／リットル，チアミン塩酸塩５ｍｇ／リットル，ビオチン０．１ｍｇ／リットル，１ｍＭアルギニン，カナマイシン２５ｍｇ／リットル，０．３５Ｍプトレシン，ｐＨ７．０）で成長する形質転換体を選択した。その結果、２７５個のコロニーが選択され、高濃度プトレシンを含む培地で成長のよかったコロニーを２次確認し、各ライブラリークローンを得てプトレシン菌株に再導入し、その後高濃度プトレシンを含む培地で成長のよかったコロニーを３次確認することにより最終的に１つのクローン（Ａ１５）を選択した。選択した前記クローンをシークエンシングで確認した結果、Ｎ末端の４３６個のアミノ酸が除去されたＮＣｇｌ０１００、ＮＣｇｌ０１０１、ＮＣｇｌ０１０２、ＮＣｇｌ０１０３及びＮＣｇｌ０１０４の計５つのＯＲＦが含まれることが確認された（図１）。図１は野生型コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体に存在するＮＣｇｌ０１００、ＮＣｇｌ０１０１、ＮＣｇｌ０１０２、ＮＣｇｌ０１０３及びＮＣｇｌ０１０４をコードする遺伝子の相対的な位置を示す概略図である。
【００５２】
実施例２：Ａ１５クローンに含まれるプトレシンに対する有効遺伝子の確認
実施例２−１．Ａ１５クローンに含まれる５つの遺伝子のクローニング及び形質転換体の作製
実施例１で得たＡ１５クローンの塩基配列は既に公開されている。ＡＴＣＣ１３０３２菌株の公知の塩基配列に基づいて、ＮＣｇｌ０１００遺伝子を増幅するためのプライマーとして配列番号１及び２のＮＣｇｌ０１００−Ｆ、ＮＣｇｌ０１００−Ｒを作製し、Ｎ末端の４３６個のアミノ酸が除去された形態のｔＮＣｇｌ０１００遺伝子を増幅するためのプライマーとして配列番号２及び３のＮＣｇｌ０１００−Ｒ、ｔＮＣｇｌ０１００−Ｆを作製し、ＮＣｇｌ０１０１遺伝子を増幅するためのプライマーとして配列番号４及び５のＮＣｇｌ０１０１−Ｆ、ＮＣｇｌ０１０１−Ｒを作製し、ＮＣｇｌ０１０２とＮＣｇｌ０１０３遺伝子を同時に増幅するためのプライマーとして配列番号６及び７のＮＣｇｌ０１０２−Ｆ、ＮＣｇｌ０１０３−Ｒを作製し、ＮＣｇｌ０１０４遺伝子を増幅するためのプライマーとして配列番号８及び９のＮＣｇｌ０１０４−Ｆ、ＮＣｇｌ０１０４−Ｒを作製した。また、発現プロモーターであるＰ（ＣＪ７）（又はｐｃｊ７）（特許文献４参照）を増幅するためのプライマーとして配列番号１０及び１１のＰ（ＣＪ７）−Ｆ、Ｐ（ＣＪ７）−Ｒを作製した（表１）。
【００５３】
次に、ＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体を鋳型とし、前記配列番号１〜９の各プライマーを用いたＰＣＲ（９５℃、３０秒間の変性、５０℃、３０秒間のアニーリング、７２℃、１分〜１分３０秒間の伸長を２５サイクル）を行うことにより、５種類の遺伝子断片を増幅した。また、コリネバクテリウムアンモニアゲネスの染色体を鋳型とし、前記配列番号１０及び１１のプライマーを用いたＰＣＲを行うことにより、プロモーター断片を増幅した。
【００５４】
ＫｐｎＩとＸｂａＩにより切断された５つの遺伝子とＥｃｏＲＶとＫｐｎＩにより切断されたＣＪ７プロモーターをＥｃｏＲＶとＸｂａＩにより切断された発現ベクターであるｐＨＣ１３９Ｔ（特許文献６）に結合することにより、計５つの発現ベクターｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ０１００、ｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ｔＮＣｇｌ０１００、ｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ０１０１、ｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ０１０２−ＮＣｇｌ０１０３、及びｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ０１０４を作製した。
【００５５】
【表１】
2015506686.tif 000003
【００５６】
作製された前記５つの発現ベクターと対照群であるｐＨＣ１３９Ｔを実施例１で用いられたＫＣＣＭ１１１３８Ｐ菌株に電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で導入し、その後２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＢＨＩＳ平板培地に塗抹して形質転換体を選択した。
【００５７】
実施例２−２．プトレシンに対する有効遺伝子の探索
実施例２−１で得た全６種の形質転換体を対象に、実施例１と同様の方法で高濃度プトレシンを含む培地で成長のよかった形質転換体を選択した（図２）。図２は本発明で作製した各形質転換菌株の成長の程度を比較した結果を示す写真であり、１、２、３、４、５及び６は、それぞれ前記６種の発現ベクターであるｐＨＣ１３９Ｔ、ｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ０１００、ｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ｔＮＣｇｌ０１００、ｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ０１０１、ｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ０１０２−ＮＣｇｌ０１０３、及びｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ０１０４が導入された菌株を示す。図２に示すように、ｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ０１０１が導入された形質転換体（４番）のみ高濃度プトレシンを含む培地で成長がよかったことが確認されたので、前記ＮＣｇｌ０１０１をプトレシン有効遺伝子として選択した。
【００５８】
実施例３：ＮＣｇｌ０１０１過剰発現菌株におけるプトレシン生産能の評価
実施例２で有効遺伝子として確認されたＮＣｇｌ０１０１遺伝子を過剰発現する菌株のプトレシン生産能を評価した。プトレシン生産菌株ＫＣＣＭ１１１３８ＰにｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ０１０１が導入された菌株を用いた。
【００５９】
実施例２−１で作製したｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ０１０１と対照群として用いるｐＨＣ１３９ＴベクターをＫＣＣＭ１１１３８Ｐプトレシン生産菌株に電気穿孔法で導入し、その後２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＢＨＩＳ平板培地に塗抹して形質転換体を選択し、ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ／ｐＨＣ１３９Ｔ、ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ／ｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ０１０１と命名した。選択した２つの形質転換体を対象に、１ｍＭアルギニンを含むＣＭ平板培地（ブドウ糖１％，ポリペプトン  １％，酵母抽出物０．５％，牛肉エキス０．５％，ＮａＣｌ  ０．２５％，尿素  ０．２％，５０％ＮａＯＨ  １００μｌ，寒天  ２％，ｐＨ６．８，１Ｌ中）で３０℃にて２４時間培養し、その後２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む表２の力価培地２５ｍｌに１白金耳ほど接種し、次いでそれを３０℃にて２００ｒｐｍで９６時間振盪培養した。作製された全ての菌株において、発酵の際に培地にアルギニン１ｍＭを添加して培養した。
【００６０】
【表２】
2015506686.tif 000004
【００６１】
その結果、表３に示すように、ＮＣｇｌ０１０１を過剰発現する場合はプトレシン生産量が減少することが確認された。
【００６２】
【表３】
2015506686.tif 000005
【００６３】
実施例４：ＮＣｇｌ０１０１が欠失した菌株におけるプトレシン生産能の評価
実施例４−１．ＡＴＣＣ１３０３２ベースのプトレシン生産菌株におけるＮＣｇｌ０１０１欠損菌株の作製
ＮＣｇｌ０１０１を過剰発現する場合は高濃度プトレシン培地で細胞成長性が増加するが、実施例３によれば、ＮＣｇｌ０１０１を過剰発現する場合にプトレシン生産量が減少することが確認された。このような結果に基づいて、ＮＣｇｌ０１０１欠損時にプトレシン生産性に及ぼす影響を確認した。
【００６４】
具体的には、ＡＴＣＣ１３０３２菌株のＮＣｇｌ０１０１塩基配列に基づいて、ＮＣｇｌ０１０１のＮ末端外部の相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）断片を得るためのプライマーとして配列番号１２及び１３のＮＣｇｌ０１０１−ｄｅｌ−Ｆ１＿ＢａｍＨＩ、ＮＣｇｌ０１０１−ｄｅｌ−Ｒ１＿ＳａｌＩを作製し、ＮＣｇｌ０１０１のＣ末端外部の相同組換え断片を得るためのプライマーとして配列番号１４及び１５のＮＣｇｌ０１０１−ｄｅｌ−Ｆ２＿ＳａｌＩ、ＮＣｇｌ０１０１−ｄｅｌ−Ｒ２＿ＸｂａＩを作製した（表４）。２組のプライマーを用いてＮＣｇｌ０１０１遺伝子のＮ末端部分の断片とＣ末端部分の断片をＰＣＲで作製し、ＰＣＲ産物をそれぞれＢａｍＨＩ＆ＳａｌＩとＳａｌＩ＆ＸｂａＩで処理し、ＢａｍＨＩ＆ＸｂａＩで処理したｐＤＺベクターにクローニングした。結果として得られたプラスミドをｐＤＺ−ＮＣｇｌ０１０１（Ｋ／Ｏ）と命名した。
【００６５】
【表４】
2015506686.tif 000006
【００６６】
ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ△ＮＣｇｌ０１０１菌株を得るために作製したｐＤＺ−ＮＣｇｌ０１０１（Ｋ／Ｏ）ベクターをＫＣＣＭ１１１３８Ｐ菌株に電気穿孔法で導入し、その後２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＢＨＩＳ平板培地に塗抹した。ベクターの染色体挿入が成功したか否かは、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含む固体培地で青色を示すか否かにより判別した。染色体に１次挿入された菌株を栄養培地で振盪培養（３０℃，８時間）し、その後それぞれ１０−４から１０−１０に希釈し、Ｘ−ｇａｌを含む固体培地に塗抹した。ほとんどのコロニーが青色を示すのに対して、低い割合で出現する白色のコロニーを選択することにより、２次交差による最終のＮＣｇｌ０１０１欠失菌株を選択し、配列番号１２及び１５のプライマーを用いてＰＣＲで確認した。確認した菌株をＫＣＣＭ１１１３８Ｐ△ＮＣｇｌ０１０１と命名した。
【００６７】
実施例４−２．ＡＴＣＣ１３８６９ベースのプトレシン生産菌株におけるＮＣｇｌ０１０１欠損菌株の作製
コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ベースのプトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１１３８Ｐと同じ遺伝型を有するコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９ベースのプトレシン生産菌株ＤＡＢ１２−ａ（ＡｒｇＦ欠損、ＮＣｇｌ１２２１欠損、大腸菌ｓｐｅＣ導入、Ａｒｇオペロン−ＡｒｇＣＪＢＤプロモーター置換により強化）を対象に、ＮＣｇｌ０１０１欠損菌株を作製した。
【００６８】
具体的には、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ０１０１をコードする遺伝子及びそこから発現するタンパク質配列を確認するために、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２及び１５（ＮＣｇｌ０１０１−ｄｅｌ−Ｆ１＿ＢａｍＨＩ，ＮＣｇｌ０１０１−ｄｅｌ−Ｒ２＿ＸｂａＩ）のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。ここで、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分３０秒間の伸長を３０サイクル行った。こうして得られたＰＣＲ産物を電気泳動で分離し、その後配列分析を行った結果、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ０１０１をコードする遺伝子は配列番号１８で表される塩基配列を含み、それによりコードされるタンパク質は配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むことが確認された。コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のＮＣｇｌ０１０１とコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ０１０１のアミノ酸配列を比較した結果、これらは９８％の配列相同性を有することが確認された。
【００６９】
コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ０１０１をコードする遺伝子を欠損させるために、前記実施例４−１と同様に、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表４に示す２組のプライマーを用いてＮＣｇｌ０１０１遺伝子のＮ末端部分の断片とＣ末端部分の断片をＰＣＲで作製し、ＰＣＲ産物をそれぞれＢａｍＨＩ＆ＳａｌＩとＳａｌＩ＆ＸｂａＩで処理し、ｐＤＺベクターはＢａｍＨＩ＆ＸｂａＩで処理してクローニングすることにより、プラスミドｐＤＺ−２’ＮＣｇｌ０１０１（Ｋ／Ｏ）を作製した。
【００７０】
前記プラスミドｐＤＺ−２’ＮＣｇｌ０１０１（Ｋ／Ｏ）を実施例４−１と同様の方法でコリネバクテリウムグルタミカムＤＡＢ１２−ａに形質転換することにより、ＮＣｇｌ０１０１をコードする遺伝子が欠失した菌株を選択した。こうして選択されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株をＤＡＢ１２−ａ△ＮＣｇｌ０１０１と命名した。
【００７１】
実施例４−３．ＮＣｇｌ０１０１欠損菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株においてＮＣｇｌ０１０１欠損がプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例４−１及び４−２で作製されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株を対象に、プトレシン生産能を比較した。
【００７２】
具体的には、２種のコリネバクテリウムグルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ△ＮＣｇｌ０１０１，ＤＡＢ１２−ａ△ＮＣｇｌ０１０１）を対象に、実施例３と同じ評価方法でプトレシン生産性を測定した。その結果、下記表５に示すように、ＮＣｇｌ０１０１欠失によりプトレシン生産量が増加することが確認された。
【００７３】
【表５】
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【００７４】
実施例３及び４の内容をまとめると、野生型コリネバクテリウムグルタミカム菌株においてＮＣｇｌ０１０１をコードする遺伝子が過剰発現するとプトレシンの生産量が減少し、欠失するとプトレシンの生産量が増加したので、前記ＮＣｇｌ０１０１はプトレシンの生合成に直接影響を及ぼすことが分かった。
【００７５】
よって、本発明者らは、前記実施例で作製された、プトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１１３８ＰにおいてＮＣｇｌ０１０１遺伝子を欠失させてプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミカム菌株をＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＣＣ０１−０２４４と命名し、２０１１年１２月２６日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ１１２４１Ｐとして寄託した。
【００７６】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例は全ての面において例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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