(57)【要約】本発明は、生物学的に活性な分子を送達させることができる低温保存された被包細胞治療デバイスおよびこれらのデバイスの使用方法を提供する。本発明は、ＥＣＴデバイスのための低温保存プロセスを記載する。低温保存プロセスにより、低温保存されたＥＣＴデバイスが無期限に保存され、それにより、貯蔵期間が数週間／数ヶ月から潜在的には無限に延長される。本発明は、細胞培養デバイスの製造、貯蔵、流通、および商品原価で大きな利点がもたらされる。
2015519370.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植込み型細胞培養デバイスであって、前記デバイスは、
ａ）コアであって、
（ｉ）ＡＲＰＥ−１９細胞を含む細胞株であって、前記ＡＲＰＥ−１９細胞は、反復トランスフェクションプロセスによって前記ＡＲＰＥ−１９細胞に導入された治療有効量の１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、または生物学的に活性な分子を産生するように遺伝子操作され、前記反復トランスフェクションが１回のトランスフェクション、２回のトランスフェクション、または３回のトランスフェクションを含む、細胞株；
（ｉｉ）少なくとも１０，０００ｎｇ／日／１０６細胞である治療有効量の１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、または生物学的に活性な分子を産生するように遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞を含む細胞株；あるいは
（ｉｉｉ）治療有効量の１つ以上の生物学的に活性な分子を分泌するように遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞、
を含むコア、および
ｂ）（ｉ）の細胞株、（ｉｉ）の細胞株、または（ｉｉｉ）のＡＲＰＥ−１９細胞を取り囲む半透性膜であって、前記膜が、前記膜を通して前記サイトカイン、前記神経栄養因子、前記可溶性受容体、前記抗血管新生抗体および前記抗血管新生分子、または前記生物学的に活性な分子の拡散を可能にする、半透性膜
を含み、前記デバイスが低温保存される、植込み型細胞培養デバイス。
【請求項２】
前記コアが抗凍結剤を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記デバイスを低温貯蔵バイアルに入れ、レート制御凍結下で凍結し、最後に気相式液体窒素（−１９０℃）条件下で貯蔵する、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記デバイスを、気相式液体窒素（−１９０℃）条件下、ドライアイス（−７０℃）条件下、またはその組み合わせで輸送する、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記反復トランスフェクションが１回のトランスフェクションである場合、（ｉ）の細胞株が、１０，０００ｎｇ／日／１０６細胞と３０，０００ｎｇ／日／１０６細胞との間の１つ以上の前記サイトカイン、前記神経栄養因子、前記可溶性受容体、前記抗血管新生抗体および前記抗血管新生分子、または前記生物学的に活性な分子を産生する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
（ｉ）の細胞株が、約１５，０００ｎｇ／日／１０６細胞の１つ以上の前記サイトカイン、前記神経栄養因子、前記可溶性受容体、前記抗血管新生抗体および前記抗血管新生分子、または前記生物学的に活性な分子を産生する、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
前記反復トランスフェクションが２回のトランスフェクションである場合、（ｉ）の細胞株が、３０，０００ｎｇ／日／１０６細胞と５０，０００ｎｇ／日／１０６細胞との間の１つ以上の前記サイトカイン、前記神経栄養因子、前記可溶性受容体、前記抗血管新生抗体および前記抗血管新生分子、または前記生物学的に活性な分子を産生する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
（ｉ）の細胞株が、約３５，０００ｎｇ／日／１０６細胞の１つ以上の前記サイトカイン、前記神経栄養因子、前記可溶性受容体、前記抗血管新生抗体および前記抗血管新生分子、または前記生物学的に活性な分子を産生する、請求項７に記載のデバイス。
【請求項９】
前記反復トランスフェクションが３回のトランスフェクションである場合、（ｉ）の細胞株が、５０，０００ｎｇ／日／１０６細胞と７５，０００ｎｇ／日／１０６細胞との間の１つ以上の前記サイトカイン、前記神経栄養因子、前記可溶性受容体、前記抗血管新生抗体および前記抗血管新生分子、または前記生物学的に活性な分子を産生する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
（ｉ）の細胞株が、約７０，０００ｎｇ／日／１０６細胞の１つ以上の前記サイトカイン、前記神経栄養因子、前記可溶性受容体、前記抗血管新生抗体および前記抗血管新生分子、または前記生物学的に活性な分子を産生する、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１１】
１つ以上の前記生物学的に活性な分子が、ニューロトロフィン、インターロイキン、サイトカイン、成長因子、抗アポトーシス因子、血管新生因子、抗血管新生因子、抗体および抗体フラグメント、抗原、神経伝達物質、ホルモン、酵素、リンホカイン、抗炎症因子、治療タンパク質、遺伝子移入ベクター、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１２】
１つ以上の前記生物学的に活性な分子が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＮＴ−４、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、アクソカイン、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦＩ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ミッドカイン、ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート、トリオフォチン、アクチビン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、インターロイキン、骨形態形成タンパク質、マクロファージ炎症タンパク質、ヘパリン硫酸、アンフィレグリン、レチノイン酸、腫瘍壊死因子α、線維芽細胞成長因子受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＰＥＤＦ、ＬＥＤＧＦ、ＮＴＮ、ノイブラスチン、ＶＥＧＦインヒビター、および潜在的な標的組織に治療的に有用な影響を及ぼすと予想される他の薬剤からなる群より選択される、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記コアが、０．５〜１．０×１０６個のＡＲＰＥ−１９細胞を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記コアが、前記半透性膜内に配置されたマトリックスをさらに含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記マトリックスが複数のモノフィラメントを含み、前記モノフィラメントは、
ａ．ヤーンに撚られるか、もしくはメッシュに織られ、または
ｂ．不織ストランドの状態のヤーンに撚られ、そして
前記細胞が、その上に分布している、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記モノフィラメントが、アクリル、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアセトニトリル、ポリエチレンテレフタラート、ナイロン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリブトエステル、絹、綿、キチン、カーボン、および生体適合性金属からなる群より選択される生体適合性材料を含む、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記モノフィラメントが、前記デバイスの内部体積の４０％〜８５％を構成するポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）繊維を含む、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記デバイスがテザーアンカーをさらに含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記テザーアンカーがアンカーループを含む、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記アンカーループが前記デバイスの眼構造への係留に適合されている、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記デバイスを、眼または脾臓、耳、心臓、結腸、肝臓、腎臓、乳房、関節、骨髄、皮下、および腹膜腔からなる群より選択される別の標的領域に植込む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記デバイスを、前記眼の硝子体、眼房水、テノン嚢下腔、眼周囲間隙、後眼房、または前眼房内に植込む、請求項２１に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記半透性膜が選択的透過性の免疫防御性膜を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記半透性膜が限外濾過膜または微細濾過膜を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記半透性膜の孔径の中央値が１００ｎｍである、請求項２３または２４に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記半透性膜が非多孔質膜材料を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２７】
前記非多孔質膜材料がヒドロゲルまたはポリウレタンである、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記半透性膜の名目分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）が５０ｋＤと５００ｋＤとの間である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２９】
前記半透性膜の厚さが９０〜１２０μｍである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３０】
前記デバイスが中空繊維または平坦なシートとして構成される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３１】
前記デバイスの長さが１ｍｍ〜２０ｍｍである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３２】
前記デバイスの内径が０．１ｍｍ〜２．０ｍｍである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３３】
前記デバイスの端部をメチルメタクリラートを使用して密封する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３４】
少なくとも１つのさらなる生物学的に活性な分子が前記デバイスから同時送達される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３５】
前記少なくとも１つのさらなる生物学的に活性な分子が非細胞供給源に由来する、請求項３４に記載のデバイス。
【請求項３６】
前記少なくとも１つのさらなる生物学的に活性な分子が細胞供給源に由来する、請求項３４に記載のデバイス。
【請求項３７】
前記少なくとも１つのさらなる生物学的に活性な分子が、前記コア内の１つ以上の遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞によって産生される、請求項３６に記載のデバイス。
【請求項３８】
ａ．前記コアが０．５〜１．０×１０６個のＡＲＰＥ−１９細胞を含むこと；
ｂ．前記デバイスの長さが１ｍｍ〜２０ｍｍであること；
ｃ．前記デバイスの内径が０．１ｍｍ〜２．０ｍｍであること；
ｄ．前記デバイスの端部をメチルメタクリラートを使用して密封すること；
ｅ．前記半透性膜の孔径の中央値が約１００ｎｍであること；
ｆ．前記半透性膜の名目分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）が５０ＫＤと５００ＫＤとの間であること；
ｇ．前記半透性膜の厚さが９０〜１２０μｍであること；
ｈ．前記コアが内部足場を含み、ここで、前記足場が前記デバイスの内部体積の４０％〜８５％を構成するポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）繊維を含むこと；および
ｉ．それらの組み合わせ
からなる群より選択される１つ以上のさらなる特徴をさらに含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３９】
前記デバイスが、前記さらなる特徴のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または全てを含む、請求項３８に記載のデバイス。
【請求項４０】
解凍後に適切な治療用量の１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、または生物学的に活性な分子を被験体の眼に送達するための、請求項１に記載のデバイスの使用であって、前記治療用量が少なくとも１００ｎｇ／日／眼である、使用。
【請求項４１】
眼科障害を処置するための方法であって、ａ）請求項１に記載の植込み型細胞培養デバイスを解凍する工程、ｂ）前記デバイスを患者の眼に植込む工程、およびｃ）１つ以上の可溶性受容体または抗血管新生抗体および抗血管新生分子を前記デバイスから拡散させて前記眼におけるＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、またはＶＥＧＦおよびＰＤＧＦの両方に結合させ、それによって前記眼科障害を処置する工程を含む、方法。
【請求項４２】
眼科障害を処置するための方法であって、ａ）請求項１に記載の植込み型細胞培養デバイスを解凍する工程、ｂ）前記デバイスを患者の眼に植込む工程、およびｃ）１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、または生物学的に活性な分子を前記デバイスから拡散させ、それによって前記眼科障害を処置する工程を含む、方法。
【請求項４３】
前記眼科障害が、未熟児網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、緑内障、網膜色素変性、白内障形成、網膜芽細胞腫、および網膜虚血からなる群より選択される、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
加齢性黄斑変性が湿潤型加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）または萎縮性ＡＭＤである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記眼科障害が糖尿病性網膜症である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
０．１ｐｇ／眼／患者／日と１００００μｇ／眼／患者／日との間の前記可溶性受容体または前記抗血管新生抗体および前記抗血管新生分子が前記眼に拡散し、前記可溶性受容体が可溶性ＶＥＧＦ受容体または可溶性ＰＤＧＦ受容体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
０．１ｐｇ／眼／患者／日と１００００μｇ／眼／患者／日との間の前記サイトカイン、前記神経栄養因子、前記可溶性受容体、ならびに前記抗血管新生抗体および前記抗血管新生分子、または前記生物学的に活性な分子が前記眼に拡散する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
内皮細胞増殖または脈管形成を阻害するための方法であって、ａ）請求項１に記載の植込み型細胞培養デバイスを解凍する工程、ｂ）前記デバイスを細胞増殖障害を罹患した患者に植込む工程、およびｃ）可溶性受容体または抗血管新生抗体および抗血管新生分子を前記デバイスから拡散させてＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、またはＶＥＧＦおよびＰＤＧＦの両方に結合させる工程を含み、前記結合が前記患者における内皮細胞増殖または脈管形成を阻害する、方法。
【請求項４９】
内皮細胞増殖または脈管形成を阻害するための方法であって、ａ）請求項１に記載の植込み型細胞培養デバイスを解凍する工程、ｂ）前記デバイスを細胞増殖障害を罹患した患者に植込む工程、およびｃ）１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、または生物学的に活性な分子を前記デバイスから拡散させて前記患者における内皮細胞増殖または脈管形成を阻害する工程を含む、方法。
【請求項５０】
前記障害が、血液学的障害、アテローム性動脈硬化症、炎症、血管透過性の増大、および悪性疾患からなる群より選択される、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
治療有効量／患者／日の前記可溶性受容体または前記抗血管新生抗体および前記抗血管新生分子が前記デバイスから拡散する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
治療有効量／患者／日の１つ以上の前記サイトカイン、前記神経栄養因子、前記可溶性受容体、前記抗血管新生抗体および前記抗血管新生分子、または前記生物学的に活性な分子がデバイスから拡散する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
サイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、または生物学的に活性な分子をレシピエント宿主に送達する方法であって、ａ）請求項１に記載の植込み型細胞培養デバイスを解凍する工程、およびｂ）前記デバイスを前記レシピエント宿主の標的領域に植込む工程を含み、ここで１つ以上の被包されたＡＲＰＥ−１９細胞が前記サイトカイン、前記神経栄養因子、前記可溶性受容体、前記抗血管新生抗体および前記抗血管新生分子、または前記生物学的に活性な分子を前記標的領域に分泌する、方法。
【請求項５４】
１つ以上の生物学的に活性な分子をレシピエント宿主に送達する方法であって、ａ）請求項１に記載の植込み型細胞培養デバイスを解凍する工程、およびｂ）前記デバイスを前記レシピエント宿主の標的領域に植込む工程を含み、ここで１つ以上の被包されたＡＲＰＥ−１９細胞が１つ以上の前記生物学的に活性な分子を前記標的領域に分泌する、方法。
【請求項５５】
前記標的領域が、中枢神経系（脳、脳室、脊髄が含まれる）、眼房水および硝子体液、脾臓、耳、心臓、結腸、肝臓、腎臓、乳房、関節、骨髄、皮下、および腹膜腔からなる群より選択される、請求項５３または５４に記載の方法。
【請求項５６】
治療有効量／患者／日の前記サイトカイン、前記神経栄養因子、前記可溶性受容体、前記抗血管新生抗体および前記抗血管新生分子、または前記生物学的に活性な分子が前記標的領域に拡散する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
治療有効量／患者／日の１つ以上の前記生物学的に活性な分子が前記標的領域に拡散する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
請求項１に記載の植込み型細胞培養デバイスを作製するための方法であって、前記方法は：
ａ．１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、または生物学的に活性な分子を分泌するように少なくとも１つのＡＲＰＥ−１９細胞を遺伝子操作する工程；
ｂ．遺伝子改変した前記ＡＲＰＥ−１９細胞を半透性膜内に被包する工程であって、前記膜が前記膜を通して１つ以上の前記サイトカイン、前記神経栄養因子、前記可溶性受容体、前記抗血管新生抗体および前記抗血管新生分子、または前記生物学的に活性な分子の拡散を可能にする、工程；ならびに
ｃ．前記デバイスを低温保存する工程
を含む、方法。
【請求項５９】
１つ以上の前記生物学的に活性な分子が、ニューロトロフィン、インターロイキン、成長因子、抗アポトーシス因子、血管新生因子、抗血管新生因子、抗体および抗体フラグメント、抗原、神経伝達物質、ホルモン、酵素、リンホカイン、抗炎症因子、治療タンパク質、遺伝子移入ベクター、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
１つ以上の前記生物学的に活性な分子が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＮＴ−４、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、アクソカイン、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦＩ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ミッドカイン、ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート、トリオフォチン、アクチビン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、インターロイキン、骨形態形成タンパク質、マクロファージ炎症タンパク質、ヘパリン硫酸、アンフィレグリン、レチノイン酸、腫瘍壊死因子α、線維芽細胞成長因子受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＰＥＤＦ、ＬＥＤＧＦ、ＮＴＮ、ノイブラスチン、ＶＥＧＦインヒビター、および潜在的な標的組織に治療的に有用な影響を及ぼすと予想される他の薬剤からなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１２年５月３０日に出願された米国仮出願第６１／６５３，１９１号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、被包細胞治療分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
この２０年間にわたる分子生物学の進歩により、有望な治療可能性を有する多数のタンパク質分子（サイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、ならびに抗血管新生抗体および抗血管新生分子が含まれる）が発見されている。しかし、これらの新規の分子の臨床用途における価値は十分に理解されておらず、これは主に有効な送達系を欠くことに起因する。血液網膜関門（ＢＲＢ）は、血流中の大分子の網膜への侵入を防止する。この関門の包囲は、網膜へのタンパク質の長期持続送達における大きな困難の１つである。
【０００４】
網膜へのタンパク質送達のための伝統的アプローチは非常に限定されている。網膜へのタンパク質送達の選択肢としては、精製組換えタンパク質のボーラス注射および遺伝子療法の２つが存在する。湿潤型の加齢性黄斑変性の処置のためのマクゲン、ルセンチス、またはアイリーアのボーラス注射が承認されている。しかし、これらの薬剤は半減期が短く、反復長期投与が必要である。他方では、遺伝子療法は、所与のタンパク質を持続的に発現することができる。しかし、治療タンパク質の用量は、導入遺伝子の発現レベルを制御するための信頼できる手段が利用できないので、その制御が困難である。さらに、一旦遺伝子が送達されると、処置を逆行させることは不可能である。
【０００５】
被包化細胞技術、すなわちＥＣＴは、治療薬を分泌させるために生細胞を使用する送達系である。これを、通常、特定の薬剤を過剰発現するように特定の細胞型を遺伝子操作することによって行う。次いで、操作した細胞を、半透性ポリマーカプセルに被包する。次いで、カプセルを標的手術部位に植込む。半透性膜は、栄養素を自由拡散させるが、治療分子が宿主免疫系細胞のデバイス内の細胞との直接的接触を防止する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明は、ＥＣＴデバイスのための低温保存プロセスを記載する。低温保存プロセスにより、低温保存されたＥＣＴデバイスが無期限に保存され、それにより、貯蔵期間が数週間／数ヶ月から潜在的には無限に延長される。本発明は、細胞培養デバイスの製造、貯蔵、流通、および商品原価で大きな利点がもたらされる。
【０００７】
細胞株（ＡＲＰＥ−１９細胞など）を遺伝子操作して、治療量の１つ以上の生物学的に活性な分子を産生することができる。例えば、１つ以上の生物学的に活性な分子は、ＷＯ２０１２／０７５１８４号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載の抗血管新生抗体および抗血管新生分子、抗血管新生抗体足場、または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体であり得る。他の生物学的に活性な分子には、ニューロトロフィン、インターロイキン、サイトカイン、成長因子、抗アポトーシス因子、血管新生因子、抗血管新生因子、抗体および抗体フラグメント、抗原、神経伝達物質、ホルモン、酵素、リンホカイン、抗炎症因子、治療タンパク質、遺伝子移入ベクター、および／またはその任意の組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。種々の実施形態では、かかる分子には、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＮＴ−４、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、アクソカイン、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦＩ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ミッドカイン、ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート、トリオフォチン（ｔｒｙｏｐｈｏｔｉｎ）、アクチビン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、インターロイキン、骨形態形成タンパク質、マクロファージ炎症タンパク質、ヘパリン硫酸、アンフィレグリン、レチノイン酸、腫瘍壊死因子α、線維芽細胞成長因子受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＰＥＤＦ、ＬＥＤＧＦ、ＮＴＮ、ノイブラスチン、ＶＥＧＦインヒビター、および／または潜在的な標的組織に治療的に有用な影響を及ぼすと予想される他の薬剤が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０００８】
かかる細胞株を、当該分野で公知の任意の方法を使用して被包細胞治療（ＥＣＴ）デバイス中に被包することができる。
【０００９】
コアを含み、１つ以上の細胞および／または細胞株ならびにコアを取り囲む半透性膜を含む植込み型細胞培養デバイスであって、この膜が膜を通して分子を分散させ、かかるデバイスが、低温保存されている（すなわち、デバイス製造後且つ植込み前に）植込み型細胞培養デバイスを本明細書中に記載する。例えば、コア中の細胞株は、反復トランスフェクションプロセスによってＡＲＰＥ−１９細胞に導入された治療有効量のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を産生するように遺伝子操作され、反復トランスフェクションプロセスが１回、２回、または３回のトランスフェクションを含む１つ以上のＡＲＰＥ−１９細胞株を含むことができるか、コア中の細胞株は、治療有効量の１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を分泌するように遺伝子操作された少なくとも１０，０００ｎｇ／日／１０６細胞である１つ以上のＡＲＰＥ−１９細胞を含むことができる。本明細書中に記載の任意の低温保存されたデバイスはまた、治療有効量の１つ以上の生物学的に活性な分子を分泌するように遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞を含むことができる。
【００１０】
用語「カプセル」、「デバイス」、および「インプラント」を、本明細書中で、遺伝子操作された細胞および細胞株（例えば、ＡＲＰＥ−１９細胞または細胞株）を含む任意のバイオ人工臓器または被包化細胞治療デバイスをいうために交換可能に使用する。かかる低温保存デバイスのコアはまた、コア内に含まれる細胞培養培地に添加することができる抗凍結剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ  ａｇｅｎｔ）を含むことができる。
【００１１】
当該分野で公知の任意の低温保存方法を使用することができる。非限定的な例として、被包化細胞治療デバイスを、低温貯蔵バイアルに入れ、レート制御凍結（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒａｔｅ  ｆｒｅｅｚｉｎｇ）下で凍結し（例えば、−８０℃に）、最後に気相式液体窒素（例えば、−１９０℃）条件下で貯蔵することができる。
【００１２】
低温保存デバイスを、気相式液体窒素（例えば、−１９０℃）条件下および／またはドライアイス（例えば、−７０℃）条件下で輸送することができる。
【００１３】
任意の適切な低温保存技術を使用することができる。非限定的な例として、本発明のＥＣＴデバイスを、ドライアイス中（例えば、−７０℃）、フリーザー中（例えば、−８０℃）、および／または気相式液体窒素中（例えば、−１９０℃）で貯蔵することができる。例えば、本発明の低温保存ＥＣＴデバイスを、約−７０℃、約−７１℃、約−７２℃、約−７３℃、約−７４℃、約−７５℃、約−７６℃、約−７７℃、約−７８℃、約−７９℃、約−８０℃、約−８１℃、約−８２℃、約−８３℃、約−８４℃、約−８５℃、約−８６℃、約−８７℃、約−８８℃、約−８９℃、約−９０℃、約−９１℃、約−９２℃、約−９３℃、約−９４℃、約−９５℃、約−９６℃、約−９７℃、約−９８℃、約−９９℃、約−１００℃、約−１０１℃、約−１０２℃、約−１０３℃、約−１０４℃、約−１０５℃、約−１０６℃、約−１０７℃、約−１０８℃、約−１０９℃、約−１１０℃、約−１１１℃、約−１１２℃、約−１１３℃、約−１１４℃、約−１１５℃、約−１１６℃、約−１１７℃、約−１１８℃、約−１１９℃、約−１２０℃、約−１２１℃、約−１２２℃、約−１２３℃、約−１２４℃、約−１２５℃、約−１２６℃、約−１２７℃、約−１２８℃、約−１２９℃、約−１３０℃、約−１３１℃、約−１３２℃、約−１３３℃、約−１３４℃、約−１３５℃、約−１３６℃、約−１３７℃、約−１３８℃、約−１３９℃、約−１４０℃、約−１４１℃、約−１４２℃、約−１４３℃、約−１４４℃、約−１４５℃、約−１４６℃、約−１４７℃、約−１４８℃、約−１４９℃、約−１５０℃、約−１５１℃、約−１５２℃、約−１５３℃、約−１５４℃、約−１５５℃、約−１５６℃、約−１５７℃、約−１５８℃、約−１５９℃、約−１６０℃、約−１６１℃、約−１６２℃、約−１６３℃、約−１６４℃、約−１６５℃、約−１６６℃、約−１６７℃、約−１６８℃、約−１６９℃、約−１７０℃、約−１７１℃、約−１７２℃、約−１７３℃、約−１７４℃、約−１７５℃、約−１７６℃、約−１７７℃、約−１７８℃、約−１７９℃、約−１８０℃、約−１８１℃、約−１８２℃、約−１８３℃、約−１８４℃、約−１８５℃、約−１８６℃、約−１８７℃、約−１８８℃、約−１８９℃、および／または約−１９０℃またはより低温（またはこれらの任意の組み合わせ）で貯蔵することができる。
【００１４】
低温保存デバイスを、使用前に当該分野で公知の任意の方法を使用して解凍することができる。
【００１５】
いくつかの非限定的な実施形態では、１つ以上の生物学的に活性な分子（例えば、サイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、および／または他の生物学的に活性な分子）を、ＷＯ２０１２／０７５１８４号に記載のように反復トランスフェクションプロセスを使用してＡＲＰＥ−１９細胞に導入することができる。具体的には、反復トランスフェクションは、１回のトランスフェクション、２回のトランスフェクション、３回のトランスフェクション、またはそれを超えるトランスフェクション（例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれを超えるトランスフェクション）であり得る。反復トランスフェクションプロセスが１回のトランスフェクションである場合、細胞株は１つの生物学的に活性な分子を含むであろう。反復トランスフェクションプロセスが２回のトランスフェクションである場合、細胞株は２つの生物学的に活性な分子を含むであろう。当業者は、これらが同一または異なる生物学的に活性な分子であり得ることを認識するであろう。反復トランスフェクションプロセスが３回のトランスフェクションである場合、細胞株は３つの生物学的に活性な分子を含むであろう。また、これらは同一または異なる生物学的に活性な分子であり得る。当業者は、反復トランスフェクションプロセス中のトランスフェクション数が得られた細胞株中の生物学的に活性な分子数（同一または異なる）を決定づけると認識するであろう。
【００１６】
反復トランスフェクションプロセスを使用して、同一または異なる生物学的に活性な分子の複数のコピーをＡＲＰＥ−１９細胞に導入することができる。
【００１７】
ＡＲＰＥ−１９細胞を、治療有効量の１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を産生するように遺伝子操作することができ、治療有効量は、少なくとも１０，０００ｎｇ／日／１０６細胞（例えば、少なくとも１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００ｎｇ／日／１０６細胞またはそれを超える）である。かかる細胞株は、この治療有効量を少なくとも３ヶ月間（例えば、少なくとも６、９、１２、１５、１８、２１、または２４ヶ月間）またはそれを超えて産生することができる。当業者は、反復トランスフェクションプロセスを使用してかかる細胞株を産生することができると認識するであろう。しかし、当該分野で公知の他の方法を使用して、この治療有効量の１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を産生することもできる。
【００１８】
反復トランスフェクションプロセスが１回のトランスフェクションである場合、デバイス中に含まれる細胞株は、１０，０００ｎｇ／日／１０６細胞と３０，０００ｎｇ／日／１０６細胞との間の１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を産生する。例えば、細胞株は、約１５，０００ｎｇ／日／１０６細胞を産生することができる。反復トランスフェクションプロセスが２回のトランスフェクションである場合、デバイス中に含まれる細胞株は、３０，０００ｎｇ／日／１０６細胞と５０，０００ｎｇ／日／１０６細胞との間の１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を産生する。例えば、細胞株は約３５，０００ｎｇ／日／１０６細胞を産生することができる。反復トランスフェクションプロセスが３回のトランスフェクションである場合、デバイス中に含まれる細胞株は、５０，０００ｎｇ／日／１０６細胞と７５，０００ｎｇ／日／１０６細胞との間の１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を産生する。例えば、細胞株は約７０，０００ｎｇ／日／１０６細胞を産生することができる。
【００１９】
当業者は、当該分野で公知の任意の適切なデバイスの構造形を、本明細書中に記載の方法およびデバイスにしたがって低温保存することができると認識するであろう。特定のデバイスのデザインまたは構造形の選択は、デバイスの低温保存に関連する利点に影響を及ぼさない。
【００２０】
デバイスの低温保存（すなわち、製造後且つ使用前）によって被包化細胞治療デバイスの貯蔵期間を増大させる方法も提供する。当業者は、デバイスのコアへの１つ以上の低温保存剤の組み込みによってこれを行うことができると認識するであろう。非限定的な例として、コアは低温保存剤として１０％グリセロールを含むことができる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、コアは、０．２５〜１．０×１０６個の細胞を含む。
【００２２】
コアは、半透性膜内に配置されたマトリックスをさらに含むことができる。他の実施形態では、マトリックスは複数のモノフィラメントを含み、モノフィラメントは、ヤーンに撚られるか、もしくはメッシュに織られ、または不織ストランドの状態のヤーンに撚られ、細胞または組織がその上に分布している。当業者は、モノフィラメントを、アクリル、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアセトニトリル、ポリエチレンテレフタラート、ナイロン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリブトエステル、絹、綿、キチン、カーボン、および／または生体適合性金属から選択される生体適合性材料から作製することができると認識するであろう。例えば、モノフィラメントは、デバイスの内部体積の４０〜８５％を構成するポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）繊維である。
【００２３】
本明細書中に記載の細胞被包デバイスはまた、テザーアンカーを有することもできる。例えば、テザーアンカーは、眼構造へのデバイスの繋留に適合したアンカーループであり得る。
【００２４】
一旦解凍されると、本明細書中に記載の任意のデバイスを、眼または身体の別の標的領域（例えば、脾臓、耳、心臓、結腸、肝臓、腎臓、乳房、関節、骨髄、皮下、および／または腹膜腔など）に植込むことができる（または植込み用である）。非限定的な例として、デバイスを、硝子体、眼房水、テノン嚢下腔（Ｓｕｂｔｅｎｏｎ’ｓ  ｓｐａｃｅ）、眼周囲間隙、後眼房、および／または前眼房に植込むことができる（または植込み用である）。
【００２５】
いくつかの例示的な実施形態では、本明細書中に記載のデバイスのジャケットは、選択的透過性の免疫防御性膜から作製される。例えば、ジャケットは、限外濾過膜または微細濾過膜から作製される。当業者は、限外濾過膜の孔径が典型的には１〜１００ｎｍであるのに対して、微細濾過膜の孔径が典型的には０．１〜１０μｍであると認識するであろう。他の実施形態では、ジャケットを、非多孔質膜材料（例えば、ヒドロゲルまたはポリウレタン）から作製することができる。用語「ジャケット」および「半透性膜」を、本明細書中で交換可能に使用する。
【００２６】
いくつかの例示的な実施形態では、本明細書中に記載のデバイスの半透性膜は、選択的透過性の免疫防御性膜から作製される。他の実施形態では、半透性膜は、限外濾過膜または微細濾過膜から作製される。当業者は、半透性膜の孔径の中央値が典型的には約１００ｎｍであると認識するであろう。
【００２７】
さらなる他の実施形態では、半透性膜を、非多孔質膜材料（例えば、ヒドロゲルまたはポリウレタン）から作製することができる。本明細書中に記載の任意のデバイスでは、半透性膜の名目分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）は、５０ｋＤと５００ｋＤとの間（例えば、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００ｋＤ）である。半透性膜の厚さは、約９０〜１２０μｍ（例えば、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０μｍ）であり得る。デバイスの長さは、約１ｍｍ〜２０ｍｍ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｍｍ）であり得る。いくつかの実施形態では、デバイスの内径は、約０．１ｍｍ〜２．０ｍｍ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２．０）である。
【００２８】
１つの実施形態では、メチルメタクリラートを使用してデバイスの端部を密封する。
【００２９】
本明細書中に記載の任意のデバイスでは、カプセルは、中空繊維または平坦なシートとして構成することができる。しかし、当業者は、生物学的に活性な分子の生物学的活性の維持および送達のためのアクセスに適切な任意の他のデバイスの構造形も使用することができると認識するであろう。
【００３０】
さらに、種々の実施形態では、少なくとも１つのさらなる生物学的に活性な分子を、これらのデバイスから同時送達させることができる。例えば、少なくとも１つのさらなる生物学的に活性な分子を、非細胞供給源または細胞供給源から産生または放出することができる（すなわち、少なくとも１つのさらなる生物学的に活性な分子は、コア内の１つ以上の遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞または細胞株によって産生される）。
【００３１】
非限定的な例として、本発明で用いるデバイスは、以下のさらなる特徴のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または全てを含むことができる：
ａ．コアが０．５〜１．０×１０６個のＡＲＰＥ−１９細胞を含むこと；
ｂ．デバイスの長さが１ｍｍ〜２０ｍｍであること；
ｃ．デバイスの内径が０．１〜２．０ｍｍであること；
ｄ．デバイスの端部をメチルメタクリラートを使用して密封すること；
ｅ．半透性膜の孔径の中央値が約１００ｎｍであること；
ｆ．半透性膜の名目ＭＷＣＯが５０〜５００ｋＤであること；
ｇ．半透性膜の厚さが９０〜１２０μｍであること；
ｈ．コアが内部足場を含み、ここで、足場がデバイスの内部体積の４０〜８５％を構成するポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）繊維を含むこと；および
ｉ．その任意の組み合わせ。
【００３２】
当業者は、本明細書中に記載の任意の方法および使用では、本発明の低温保存デバイスを使用前に解凍することが好ましいと認識するであろう。当該分野で公知のかかるデバイスの任意の適切な解凍方法を使用することができる。
【００３３】
本発明は、適切な治療用量の任意の生物学的に活性な分子（例えば、サイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、および／または他の生物学的に活性な分子）を被験体の眼に送達させるための本発明の任意の植込み型細胞培養デバイスの解凍後の使用をさらに提供する。例えば、治療用量は、少なくとも１００ｎｇ／日／眼（例えば、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００ｎｇ／日／眼、またはそれを超える）である。
【００３４】
低温保存デバイスを解凍し、本発明の任意の植込み型細胞培養デバイスを患者の眼に植込み、可溶性受容体または抗血管新生抗体および抗血管新生分子をデバイスから拡散させて眼内のＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦに結合させ、それによって眼科障害を処置することによる、眼科障害を処置するための方法も本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、眼科障害の処置で用いる細胞株（すなわち、本明細書中に記載の任意の細胞株）であって、細胞株が植込み型細胞培養デバイスに組み込まれ、低温保存デバイスの解凍後、デバイスを患者の眼に植込み、可溶性受容体または抗血管新生抗体および抗血管新生分子がデバイスから拡散されて眼内のＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦに結合し、それによって眼科障害が処置される、細胞株を提供する。
【００３５】
低温保存デバイスを解凍し、本発明の任意の植込み型細胞培養デバイスを患者の眼に植込み、１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を眼内のデバイスから拡散させ、それによって眼科障害を処置することによる、眼科障害を処置するための方法も提供する。例えば、本発明は、眼科障害の処置で用いる細胞株（すなわち、本明細書中に記載の任意の細胞株）であって、細胞株が植込み型細胞培養デバイスに組み込まれ、デバイスを患者の眼に植込み、低温保存デバイスの解凍後、１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子が眼内のデバイスから拡散され、それによって眼科障害を処置することによる、細胞株を提供する。
【００３６】
例えば、処置すべき眼科障害を、未熟児網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性（例えば、湿潤型加齢性黄斑変性または萎縮性ＡＭＤ（ドライ型のＡＭＤとも呼ばれる））、緑内障、網膜色素変性、白内障形成、網膜芽細胞腫、および網膜虚血から選択することができる。１つの実施形態では、加齢性黄斑変性は湿潤型加齢性黄斑変性である。別の実施形態では、眼科障害は糖尿病性網膜症である。
【００３７】
驚いたことに、本明細書中に記載の任意の方法および使用では、低温保存は、デバイスからの排出量に悪影響を及ぼさない。実際、低温保存は、デバイスからの排出量を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、またはそれを超えて増強することができる。
【００３８】
当業者は、本明細書中に記載の任意のデバイスを使用して、種々の非眼障害を処置することもできると認識するであろう。非眼障害のために、デバイスのデザインを改変しなければならないであろう。デバイスデザインの改変は、当該分野の通常の技術レベルの範囲内である。
【００３９】
本発明は、低温保存デバイスを解凍し、本発明の植込み型細胞培養デバイスを細胞増殖障害を罹患した患者に植込み、可溶性受容体または抗血管新生抗体および抗血管新生分子をデバイスから拡散させてＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦに結合させ、結合が患者における内皮細胞増殖または脈管形成（ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を阻害することによる、内皮細胞増殖または脈管形成を阻害するための方法をさらに提供する。同様に、低温保存デバイスを解凍して本発明の植込み型細胞培養デバイスを細胞増殖障害を罹患した患者に植込み、１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子をデバイスから拡散させて患者における内皮細胞増殖または脈管形成を阻害することなる、内皮細胞増殖または脈管形成を阻害するための方法も提供する。
【００４０】
例えば、細胞増殖障害を、血液学的障害、アテローム性動脈硬化症、炎症、血管透過性の増大、および／または悪性疾患から選択することができる。かかる方法では、治療有効量／患者／日のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、ならびに抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子がデバイスから拡散する。
【００４１】
低温保存デバイスを解凍して本明細書中に記載の任意の植込み型細胞培養デバイスをレシピエント宿主の標的領域に植込むことによるレシピエント宿主にサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を送達させる方法であって、１つ以上の被包されたＡＲＰＥ−１９細胞または細胞株がサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を標的領域に分泌する、方法も提供する。他の実施形態では、本発明は、低温保存デバイスを解凍して本明細書中に記載の任意の植込み型細胞培養デバイスをレシピエント宿主の標的領域に植込むことによるレシピエント宿主に１つ以上の生物学的に活性な分子を送達させる方法であって、１つ以上の被包されたＡＲＰＥ−１９細胞または細胞株が１つ以上の生物学的に活性な分子を標的領域に分泌する、方法を提供する。
【００４２】
好ましい標的領域には、中枢神経系（脳、脳室、脊髄が含まれる）、眼房水および硝子体液、脾臓、耳、心臓、結腸、肝臓、腎臓、乳房、関節、骨髄、皮下、および／または腹膜腔が含まれ得るが、これらに限定されない。他の標的領域には、全身送達のための全身および／または身体の器官内もしくは器官付近の局所標的部位（乳房、結腸、脾臓、卵巣、精巣、および／または骨髄など）が含まれ得るが、これらに限定されない。かかる方法では、治療有効量／患者／日のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体ならびに抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子が標的領域に拡散する。
【００４３】
当業者は、眼の植込みおよび／または障害に関する本明細書中に記載の任意の方法および使用では、０．１ｐｇ／患者／日と１０，０００μｇ／患者／日との間の生物学的に活性な分子（例えば、サイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または他の生物学的に活性な分子）を植込み型細胞培養デバイスから分散することができると認識するであろう。しかし、身体の他の標的領域への全身植込みのために、治療有効量は、１０００ｍｇ／患者／日以上であり得る。かかる全身適応症のために、当業者は、はるかに大きなＥＣＴデバイスを使用しなければならないと認識するであろう。
【００４４】
眼への植込みのために、治療量は、１ｐｇ〜１０，０００μｇ／日／６ｍｍ〜８．５ｍｍデバイス（両端含む）の任意の量である。いくつかの実施形態では、治療量は少なくとも１０００ｎｇ／日（１．０ｐｃｄ）である。さらに、本発明の細胞株およびデバイスは、この治療量を少なくとも３週間発現することができる。他の実施形態では、治療量は少なくとも１００〜１０，０００ｎｇ／日である。１つの非限定的な実施形態では、量は少なくとも４μｇ／日である。可溶性受容体ならびに抗血管新生抗体および抗血管新生分子を送達させる場合、５〜１０μｇ／日の送達が最適である。この投薬量の達成には、眼あたり１つを超えるデバイスの植込みが必要であり得る。他の生物学的に活性な分子を送達させる場合、より少ない用量の生物学的に活性な分子を送達させるより短いデバイスを利用することが可能かもしれない。
【００４５】
本発明はまた、例えば、１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を分泌するように少なくとも１つのＡＲＰＥ−１９細胞を遺伝子操作することによる本発明の植込み型細胞培養デバイスを作製するための方法を提供する。
【００４６】
本発明はまた、例えば、局在化送達ならびにサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子の分子送達のための患者の眼または他の罹患部位へのデバイスの植込み（低温保存デバイスの解凍後）による障害（眼内の障害が含まれる）の処置のための本発明の任意の植込み型細胞培養デバイスの製造における１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を産生するように遺伝子操作された１つ以上のＡＲＰＥ−１９細胞株の使用も記載する。
【００４７】
さらに、本明細書中に記載の任意の植込み型細胞培養デバイスを、患者の眼へのデバイスの植込み（低温保存デバイスの解凍後）および可溶性受容体または抗血管新生抗体および抗血管新生分子をデバイスから拡散させて眼内のＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦに結合させることによって眼科障害の処置のために使用することができる。同様に、本明細書中に記載の任意の植込み型細胞培養デバイスを、患者の眼へのデバイスの植込み（低温保存デバイスの解凍後）ならびに１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を眼内のデバイスから拡散させることによって眼科障害の処置のために使用することができる。
【００４８】
患者の眼への本発明の任意の植込み型細胞培養デバイスの植込み（低温保存デバイスの解凍後）および１つ以上の可溶性受容体または抗血管新生抗体および抗血管新生分子をデバイスから拡散させて眼内のＶＥＧＦまたはＰＤＧＦに結合させることによる眼科障害の処置のために１つ以上の可溶性受容体または抗血管新生抗体および抗血管新生分子を産生するように遺伝子操作した１つ以上のＡＲＰＥ−１９細胞も提供する。さらに、本発明はまた、患者の眼への本発明の任意の植込み型細胞培養デバイスの植込み（低温保存デバイスの解凍後）およびサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を眼内のデバイスから拡散させることによる眼科障害の処置のために１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を産生するように遺伝子操作した１つ以上のＡＲＰＥ−１９細胞を提供する。
【００４９】
本発明はまた、細胞増殖障害を罹患した患者の眼へのデバイスの植込み（低温保存デバイスの解凍後）ならびに可溶性受容体または抗血管新生抗体および抗血管新生分子をデバイスから拡散させて眼内のＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦに結合させ、それによって前記患者における内皮細胞増殖を阻害することによる内皮細胞増殖の阻害のための本発明の植込み型細胞培養デバイスの製造においてポリペプチド（例えば、可溶性受容体または抗血管新生抗体および抗血管新生分子）を産生するように遺伝子操作した１つ以上のＡＲＰＥ−１９細胞の使用を提供する。いくつかの実施形態では、本発明はまた、細胞増殖障害を罹患した患者の眼へのデバイスの植込み（低温保存デバイスの解凍後）ならびにサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を眼内のデバイスから拡散させて前記患者における内皮細胞増殖を阻害することによる内皮細胞増殖の阻害のための本発明の植込み型細胞培養デバイスの製造において１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を産生するように遺伝子操作した１つ以上のＡＲＰＥ−１９細胞株の使用を提供する。
【００５０】
同様に、本発明はまた、細胞増殖障害を罹患した患者の眼へのデバイスの植込み（低温保存デバイスの解凍後）ならびに可溶性受容体または抗血管新生抗体および抗血管新生分子をデバイスから拡散させて眼内のＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦに結合させ、それによって前記患者における内皮細胞増殖を阻害することによる内皮細胞増殖を阻害するための本発明の植込み型細胞培養デバイスを提供する。他の実施形態では、本発明はまた、細胞増殖障害を罹患した患者の眼へのデバイスの植込み（低温保存デバイスの解凍後）ならびに１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を眼内のデバイスから拡散させて前記患者における内皮細胞増殖を阻害することによる内皮細胞増殖を阻害するための本発明の植込み型細胞培養デバイスを提供する。
【００５１】
レシピエント宿主の標的領域へのデバイスの植込み（低温保存デバイスの解凍後）によるサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子のレシピエント宿主への送達のための本発明の植込み型細胞培養デバイスの製造においてポリペプチドを産生するように遺伝子操作した１つ以上のＡＲＰＥ−１９細胞株の使用であって、ここで、１つ以上の被包されたＡＲＰＥ−１９細胞がサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を標的領域に分泌する、使用も本明細書中に提供する。同様に、本発明の任意の植込み型細胞培養デバイスを、レシピエント宿主の標的領域へのデバイスの植込み（低温保存デバイスの解凍後）によってサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子をレシピエント宿主に送達するために使用することができ、ここで、１つ以上の被包されたＡＲＰＥ−１９細胞がサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を標的領域に分泌する。
【００５２】
さらに、任意のポリペプチドを産生するように遺伝子操作した１つ以上のＡＲＰＥ−１９細胞を、レシピエント宿主の標的領域への本発明の任意の植込み型細胞培養デバイスの植込み（低温保存デバイスの解凍後）によるサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子のレシピエント宿主への送達のために使用することができ、ここで、１つ以上の被包されたＡＲＰＥ−１９細胞がサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子を標的領域に分泌する。
【００５３】
デバイスを解凍する工程を含む１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子の被験体の眼への送達方法で用いる本明細書中に記載の任意の植込み型細胞培養デバイスも提供し、ここで、解凍されたデバイスが１つ以上の可溶性受容体または抗血管新生抗体および抗血管新生分子をデバイスから拡散させて眼内のＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、またはＶＥＧＦおよびＰＤＧＦの両方に結合させるための眼への植込み用であり、ここで、１つ以上のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子が内皮細胞増殖または脈管形成を阻害するための方法で眼科障害を処置する方法で用いるためのものである。
【００５４】
当業者は、標的領域が中枢神経系（脳、脳室、脊髄が含まれる）および眼房水および硝子体液から選択されると認識するであろう。他の標的領域は体内の他の部分に存在することができ、ＥＣＴデバイスをこれらの領域の近傍に配置することができる。領域には、脾臓、耳、心臓、結腸、肝臓、腎臓、乳房、関節、骨髄、皮下、および腹膜腔が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００５５】
他で定義しない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、本発明に属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書中に記載のものと類似するか等価な方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができるにもかかわらず、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書中で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書を優先するであろう。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみを目的とし、本発明を制限することを意図しない。
【００５６】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、ｐＣｐＧフリービトロ発現ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）マップを示す略図である。
【図２】図２は、ｐ８３４を発現する細胞株の安定性を示す。
【図３】図３は、容器中で４週間保持後のｐ８３４  ＥＣＴデバイスの組織切片を示す。
【図４】図４は、ニュージーランドホワイトウサギの眼への３ヶ月の植込み後の外植したｐ８３４  ＥＣＴデバイスの組織学的性質を示す。
【図５】図５は、質量  対  効力プロット上の８３４タンパク質を産生する細胞株のＰＣＤを示す。第１、第２、および第３のトランスフェクション／反復細胞株をプロットする。
【図６】図６は、ｐ８３４およびアフリベルセプトの配列アラインメントである。
【図７−１】図７Ａは、低温保存をしない被包の１週間後の通常の条件下でのコントロール細胞の組織学的性質を示す写真である。図７Ｂは、気相式ＬＮ２内で凍結したがデバイス内で細胞懸濁液を使用して処方した凍結保護剤を使用しなかった被包後１週間の細胞の組織学的性質を示す写真である。図７Ｃは、凍結保護剤をデバイス内で細胞懸濁液を使用して処方した１週間の被包および低温保存後の細胞の組織学的性質を示す写真である。図７Ｄは、凍結保護剤をデバイス内で細胞懸濁液を使用して処方した１ヶ月の被包および低温保存後の細胞の組織学的性質を示す写真である。
【図７−２】図７Ｅは、凍結保護剤をデバイス内で細胞懸濁液を使用して処方した１年間の被包および低温保存後の細胞の組織学的性質を示す写真である。
【図８−１】図８Ａは、１週間低温保存したデバイスおよびコントロールデバイスからのＶＥＧＦＲ産生を示すグラフである。
【図８−２】図８Ｂは、１ヶ月間低温保存したデバイスからのＶＥＧＦＲ産生を示すグラフである。図８Ｃは、１年間低温保存したデバイスからのＶＥＧＦＲ産生を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
発明の詳細な説明
ＥＣＴの利点はいくつかある。第１に、ＥＣＴは潜在的に任意の治療タンパク質をコードする遺伝子を細胞内へと操作することができ、したがって、広範に適用される。持続性の排出により、確実に標的部位でタンパク質を継続的だけでなく長期間利用可能である。さらに、ＥＣＴインプラントからの排出を、最適な処置用量が得られるように制御することができる。最後に、インプラントの簡単な回収により、ＥＣＴによる処置を必要に応じて終了させることができる。したがって、ＥＣＴは、生物学的に活性なタンパク質およびポリペプチドの網膜への非常に有効な長期送達手段である。実際、特に、必要な治療分布体積が制限されること、眼への容易なアクセス、および慢性疾患を考慮すると、ＥＣＴ自体が網膜疾患のために優れた選択肢であることを示している。
【００５９】
しかし、ほとんどの細胞ベースの治療製品と同様に、ＥＣＴデバイスは貯蔵期間が比較的短く、数週間から数ヶ月の範囲である。結果として、大量の未使用製品を破棄しなければならないであろう。典型的には、組換えタンパク質の貯蔵期間は、最良のシナリオにおいて１２〜２４ヶ月間の範囲である。
【００６０】
当業者は、本発明によれば、任意の被包化細胞治療（ＥＣＴ）デバイスを、製造後且つ投与および／または実施前に低温保存することができると認識するであろう。低温保存は、成功すれば、ＥＣＴデバイスの貯蔵期間の改善に役立ち、それにより、デバイスの貯蔵が改善され、そして／またはデバイス製造が簡略化されるであろう。
【００６１】
医学療法の価値連鎖の主な要素は、製品製造の容易さ、長期間の製品の使用期限、流通時の製品の安定性である。細胞ベース治療の現在の方法論は、最適な成長条件を模倣した条件下での生細胞の輸送を軸としている。これらの条件は、例えば、湿度、ＣＯ２、および温度の制御を含み得、細胞の拡大、貯蔵、および流通中に実施されなければならない。これらの環境パラメータには、精緻なパッケージングを必要とし、製造後に各プロセス段階で継続的に環境モニタリングを行う。以下に示すように、細胞治療製品の貯蔵期間は、典型的には、数日から数週間である。したがって、複雑なパッケージングが必要であることおよび貯蔵期間の短さが、細胞ベースの製品の製造、貯蔵、および流通に関連する主な課題である。
【００６２】
【化１】
2015519370.tif 000003
これらの現在の細胞ベースの製品の貯蔵期間の制限は、製品の流通および運搬に影響を及ぼしている。したがって、製造ロジスティックスを簡潔にする貯蔵期間が延長された細胞ベースの製品が必要である。
【００６３】
低温保存は、かかる制限を緩和するであろう。この文脈では、低温保存は、製品の貯蔵期間を有意に延長させ、製品の流通を簡潔にして最終使用者に製品を供給するであろう。それにより、ＥＣＴデバイスの製造および流通に関連する費用が軽減されるであろう。驚いたことに、以下の実施例５に記載のように、デバイスの低温保存は、デバイスからの排出にいかなる負の効果や有害作用も及ぼさない。
【００６４】
当該分野で公知の任意の適切な低温保存を使用して、本明細書中に記載の任意のＥＣＴデバイスを低温保存することができる。
【００６５】
例えば、気相式液体窒素中での低温保存は、確立された生細胞の長期貯蔵法であり、適切な抗凍結剤および細胞の超低温条件での生存能力に依存する。一旦低温保存に適切な条件が満たされると、細胞を気相式液体窒素内にほぼ無期限に貯蔵することができる。
【００６６】
ＥＣＴの１つの利点は、細胞インプラントがデバイスカプセル内に自己含有されており、ＥＣＴデバイスに細胞を充填した後に細胞を外部で培養する必要がないことである。したがって、細胞を含むＥＣＴデバイス全体を低温保存して貯蔵することができることは、環境制御条件下での貯蔵の魅力的な代替法である。
【００６７】
当該分野で公知の任意の適切な低温保存方法をＥＣＴ製品に適合することができ、それにより、ＥＣＴデバイスの製造、貯蔵、および流通のプロセスが簡略化されるであろう。非限定的な例として、低温保存システムを使用して、本発明の任意のＥＣＴデバイスに抗凍結剤（例えば、１０％グリセロール）を使用して処方した細胞を充填し、低温貯蔵バイアルに入れ、レート制御凍結下で凍結し（例えば、−８０℃）、最後に気相式液体窒素（−１９０℃）条件下で貯蔵することができる。しかし、当該分野で公知の任意の他の低温保存方法を、本発明にしたがって使用することもできる。適切な低温保存方法の決定は、当業者の通常レベルの範囲内である。
【００６８】
さらに、価値連鎖全体が簡略化されるので、本発明の任意のＥＣＴデバイスを、気相式液体窒素（−１９０℃）条件下および／またはドライアイス（−７０℃）条件下（またはその任意の組み合わせ）で輸送することができる。
【００６９】
低温保存デバイスを、使用前に当該分野で公知の任意の適切な方法またはプロトコールを使用して解凍することができる。驚いたことに、解凍したＥＣＴデバイスは、低温保存条件下で１週間後、１ヶ月後、および１年後に、頑健な成長および組換えタンパク質の排出を示す細胞を含む。実際、いくつかの例では、低温保存デバイスのデバイス排出は、同一時点で非低温保存デバイスと比較して改善された（すなわち、より良いか高められた）。カプセル構築のために使用した材料および細胞内容物を含むＥＣＴデバイスは、気相式液体窒素の超低温条件に耐えることができることは予想していなかった。しかし、ＥＣＴデバイスのインタクトな成分、低温保存後のＥＣＴデバイス内の健康な細胞増殖、およびＥＣＴデバイスからの頑健な組換えタンパク質分泌は、本研究内で使用したＥＣＴデザインの耐久性を証明している（以下の実施例５を参照のこと）。
【００７０】
したがって、ＥＣＴ低温保存（当該分野で公知の任意の手段による）は、ＥＣＴ製品の大規模製造を可能にする一方で、商業的に実行可能な最終製品の貯蔵および流通を有意に簡略化するであろう。
【００７１】
タンパク質は、眼疾患処置で使用される主要な治療薬クラスである。しかし、巨大な抗体ベースのタンパク質薬は血液網膜関門を迂回することができず、したがって、処置のために反復眼内投与が必要である。被包化細胞技術（ＥＣＴ）眼内デバイスが生物治療薬（例えば、生物学的に活性な分子）をヒト臨床試験において２年間にわたって一貫して眼に直接送達させることができることが以前に証明されており、それにより、このテクノロジーを他の眼科生物製剤（例えば、湿性ＡＭＤに関連するもの）にも拡大することができることが示唆される。
【００７２】
特許請求の範囲に記載の発明で使用することができる抗血管新生抗体足場および抗血管新生分子は、ＷＯ２０１２／０７５１８４号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。本発明と併せて使用することができる他の生物学的に活性な薬剤には、ニューロトロフィン、インターロイキン、サイトカイン、成長因子、抗アポトーシス因子、血管新生因子、抗血管新生因子、抗体および抗体フラグメント、抗原、神経伝達物質、ホルモン、酵素、リンホカイン、抗炎症因子、治療タンパク質、遺伝子移入ベクター、および／またはその任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。かかる分子の非限定的な例には、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＮＴ−４、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、アクソカイン、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦＩ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ミッドカイン、ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート、トリオフォチン、アクチビン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、インターロイキン、骨形態形成タンパク質、マクロファージ炎症タンパク質、ヘパリン硫酸、アンフィレグリン、レチノイン酸、腫瘍壊死因子α、線維芽細胞成長因子受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＰＥＤＦ、ＬＥＤＧＦ、ＮＴＮ、ノイブラスチン、ＶＥＧＦインヒビターおよび／または潜在的な標的組織に治療的に有用な影響を及ぼすと予想される他の薬剤が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００７３】
１回、２回、３回、またはそれを超えるトランスフェクション（例えば、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれを超える）の反復トランスフェクションプロセスを使用して、細胞を遺伝子操作することができる。驚いたことに、反復ＤＮＡトランスフェクションおよび選択により、細胞株の組換えタンパク質の分泌能力が５０，０００から７０，０００ｎｇ／１００万細胞／日（７０ｐｃｄ）を超えるまでに有意に増大する。反復トランスフェクションプロセスを使用して、同一または異なる生物学的に活性な分子の複数のコピーを細胞（例えば、ＡＲＰＥ−１９細胞）に導入することができる。１回のトランスフェクションを含む反復トランスフェクションプロセスを使用して産生された分子を、「第１世代」分子ということができる。２回のトランスフェクションを含む反復トランスフェクションプロセスを使用して産生された分子を、「第２世代」分子ということができる。３回のトランスフェクションを含む反復トランスフェクションプロセスを使用して産生された分子を、「第３世代」分子ということができる。
【００７４】
当業者は、この反復トランスフェクションプロセスを、任意のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、抗血管新生抗体足場、抗血管新生分子、ならびに／または他の生物学的に活性な分子と共に使用することができると認識するであろう。
【００７５】
ＥＣＴデバイスは、眼科適応症、ならびに局所適応症および／または全身適応症のための巨大生物学的分子（抗体、抗体足場、他の生物学的に活性な分子、および／または受容体融合タンパク質が含まれる）に有効な薬物送達プラットフォームであり得る。
【００７６】
目的の遺伝子（すなわち、所与のサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子をコードする遺伝子）を、当該分野で公知の標準的技術を使用して適切な発現ベクターのクローニング部位に挿入することができる。
【００７７】
公知の抗ＶＥＧＦ化合物に由来する（および／または生物的に類似する）血管新生抗体足場および受容体融合タンパク質ならびにその生物活性フラグメントは以前に記載されている（例えば、ＷＯ２０１２／０７５１８４号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。例えば、公知の抗ＶＥＧＦ化合物には、抗ＶＥＧＦ受容体フラグメント（すなわち、アフリベルセプト）および／または抗ＶＥＧＦ抗体（またはその抗原結合フラグメント）（すなわち、ベバシズマブ、ＤｒｕｇＢａｎｋ  ＤＢ００１１２；またはラニビズマブ  ＤｒｕｇＢａｎｋ  ＤＢ０１２７０））が含まれるが、これらに限定されない。これらの公知の抗ＶＥＧＦ化合物の配列は、当該分野で公知である。
【００７８】
本明細書中に開示のデバイスおよび方法で使用することができる特異的ＶＥＧＦ受容体構築物の１つの非限定的な例は、ｐ８３４（ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ＃１、［ＲＳ−ＶＥＧＦ受容体１、ドメイン２およびＶＥＧＦ受容体２、ドメイン３（Ｒ１Ｄ２−Ｒ２Ｄ３）］−ＥＦＥＰＫＳＣ−ｈＩｇＧ１  Ｆｃ）である。しかし、任意の他の適切なサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、ならびに／または生物学的に活性な分子も使用することができる。
【００７９】
８３４にもとづいて生成された細胞株の排出を、以下にまとめる。
【００８０】
【化２】
2015519370.tif 000004
ｐ８３４（ｐ９１０、ｐ９６９も）のトランスフェクションにより、毎回高発現クローンが生成される。
【００８１】
ｐ８３４構築物の特異的なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を以下に示す。
【００８２】
明確にするために、本発明の構築物、細胞株および抗血管新生抗体足場、および／または抗血管新生分子ならびに／または任意の他の生物学的に活性な分子を、以下の例示的適用のように同定する：「ｐＸＸＸ」はプラスミド（例えば、プラスミドｐ８３４）をいい、「ＸＸＸ−Ｘ−ＸＸ」は細胞株（例えば、細胞株８３４−１０−５）をいい、「ＸＸＸ」は分子（例えば、分子８３４）をいう。しかし、当業者は、本発明に基づく任意の足場および／または構築物および／または分子および／または細胞株を、本明細書中で交換可能に言及し、同定し、そして／または区別することができると認識するであろう。
【００８３】
同一分子を、異なる発現ベクターに導入し、それにより、異なるプラスミドを作製することができる。例えば、分子８３４のｃＤＮＡを、ｐＣｐＧビトロフリーブラストサイジン耐性ベクター（図１を参照のこと）に導入してプラスミドｐ８３４ｃＤＮＡを作製することができる。あるいは、分子８３４を、ｐＣｐＧビトロフリーネオマイシン耐性ベクターに導入してプラスミドｐ９１０を作製するか、ｐＣｐＧハイグロマイシン耐性ベクターに導入してプラスミドｐ９６９を作製することもできる（ＷＯ２０１２／０７５１８４号を参照のこと）。
【００８４】
本明細書中に記載の反復トランスフェクションプロセスを使用して、同一（または異なる）抗血管新生抗体足場および／または抗血管新生分子および／または他の生物学的に活性な分子の複数のコピーを、細胞（例えば、ＡＲＰＥ−１９細胞）に組み込むことができる。例えば、反復トランスフェクションプロセスが２回のトランスフェクションを導入する場合、２コピーの８３４ｃＤＮＡを含む第２世代の構築物（９１０）が生成される。同様に、反復トランスフェクションプロセスが３回のトランスフェクションを導入する場合、３コピーの８３４ｃＤＮＡを含む第３世代の構築物（９６９）が生成される。
【００８５】
【化３】
2015519370.tif 000005
広範な種々の宿主／発現ベクター組み合わせを使用して、目的の生物学的に活性な分子をコードする遺伝子を発現することができる。哺乳動物宿主中へのｉｎ  ｖｉｖｏ植込みの際に下方制御されないプロモーターに目的の遺伝子が作動可能に連結された発現ベクター（すなわち、組換えＤＮＡ分子）を使用して、長期の安定なｉｎ  ｖｉｖｏ発現が達成される。適切なプロモーターには、例えば、強力構成性哺乳動物プロモーター（β−アクチン、ｅＩＦ４Ａ１、ＧＡＰＤＨなど）が含まれる。ストレス誘導性プロモーター（メタロチオネイン１（ＭＴ−１）またはＶＥＧＦプロモーターなど）も適切であり得る。さらに、コアプロモーターおよびカスタム５’ＵＴＲまたはエンハンサーエレメントを含むハイブリッドプロモーターを使用することができる。遺伝子発現を調節することができる他の公知の非レトロウイルスプロモーター（ＳＶ４０またはアデノウイルスのＣＭＶまたは初期および後期プロモーターなど）が適切である。エンハンサーエレメントを、ストレス環境下（低Ｏ２など）でさらに遺伝子発現させるように配置することもできる。一例は、低酸素誘導の際に関連遺伝子エレメントを上方制御させるエリスロポエチンエンハンサーである。
【００８６】
次いで、目的の遺伝子を含む発現ベクターを使用して、所望の細胞株をトランスフェクションすることができる。標準的なトランスフェクション技術（リポソーム、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、またはエレクトロポレーションなど）を利用することができる。市販の哺乳動物トランスフェクションキット（Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）など）を購入することができる。さらに、ウイルスベクターを使用して、所望の細胞株を形質導入することができる。適切なウイルスベクターの例は、市販のウイルスベクターのｐＬｅｎｔｉファミリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。ヒト哺乳動物細胞を使用することができる。全ての場合、デバイス中に含まれる細胞または組織は汚染でも不良品でもないことが重要である。重鎖成分および軽鎖成分を必要とする抗体足場タンパク質（関連する抗体重鎖または軽鎖をそれぞれコードする二重構築物）を、同時トランスフェクションし、それにより、機能的な２価のＦａｂおよび４価の完全抗体分子を発現する細胞株を得ることができる。
【００８７】
例示的なプロモーターには、図１に示すようなＳＶ４０プロモーターおよびＣＭＶ／ＥＦ１αプロモーターが含まれる。
【００８８】
他の有用な発現ベクターは、例えば、染色体配列、非染色体配列、および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなり得る（ＳＶ４０および公知の細菌プラスミド（例えば、大腸菌由来のｐＵＣ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（商標）プラスミド）の種々の公知の誘導体（ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ１、ｐＭＢ９、およびこれらの誘導体が含まれる）など）。ジェネテシン（Ｇ４１８）、ハイグロマイシン、またはブラストサイジンの薬物選択遺伝子を含む発現ベクター（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，１８，ｐ．３１５（１９８１），Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，ｐ．３２７（１９８２））も有用である。これらのベクターは、目的の生物学的遺伝子および／またはＧ４１８、ハイグロマイシンＢ、またはブラストサイジンなどの毒素を使用した選択に耐性を付与する遺伝子の両方の発現を駆動するための種々の異なるエンハンサー／プロモーター領域を使用することができる。種々の異なる哺乳動物プロモーターを使用して、Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢの遺伝子および／または目的の生物学的遺伝子の発現を指示することができる。Ｇ４１８耐性遺伝子は、培養培地に添加したＧ４１８（１００〜１０００μｇ／μｌ）を酵素的に不活化するアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードする。ＡＰＨ遺伝子を発現する細胞のみが薬物選択を生き抜き、通常、第２の生物学的遺伝子も発現するであろう。ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）遺伝子は、ハイグロマイシン毒素を特異的に改変して不活化させる酵素をコードする。ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子と同一のプラスミドで同時トランスフェクションされたかこのプラスミド上に含まれる遺伝子は、５０〜２００μｇ／ｍｌ濃度のハイグロマイシンＢの存在下で優先的に発現されるであろう。
【００８９】
使用することができる発現ベクターの例には、市販のｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＣ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＤＮＡ１ＮＥＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ−Ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐｃＤＮＡ３．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＧＳベクター系（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が含まれるが、これらに限定されない。他の適切な市販のベクターには、ｐＢｌａｓｔ、ｐＭｏｎｏ、またはｐＶｉｔｒｏが含まれる。１つの実施形態では、発現ベクター系は、ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、およびブラストサイジン耐性遺伝子と共に利用可能なｐＣｐＧフリービトロ発現ベクターである（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））（図１を参照のこと）。
【００９０】
１つの実施形態では、変異ＤＨＦＲのｃＤＮＡおよびポリリンカーを含む全ｐＵＣ１８配列を含むｐＮＵＴ発現ベクターを使用することができる。例えば、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．ら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，５８，ｐｐ．１２７５−１２７７（１９９４）；Ｂａｅｔｇｅら，ＰＮＡＳ，８３，ｐｐ．５４５４−５８（１９８６）を参照のこと。ｐＮＵＴ発現ベクターを、ＤＨＦＲコード配列がＧ４１８またはハイグロマイシン薬物耐性のコード配列に置換されるように改変することができる。ｐＮＵＴ発現ベクター内のＳＶ４０プロモーターを、任意の適切な構成性に発現される哺乳動物プロモーター（上記考察のものなど）に置換することもできる。
【００９１】
当業者は、任意の他の適切な市販の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡファミリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＢｌａｓｔ、ｐＭｏｎｏ、ｐＶｉｔｒｏ、またはｐＣｐＧ−ｖｉｔｒｏ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ））も使用することができると認識するであろう。主な発現調節エレメントは、典型的には、発現カセット中に見いだされる。これらのエレメントには、プロモーター、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）が含まれる。適切な発現ベクターの他のエレメントはプラスミドの組み込みまたは発現に重要であり得るが、直ちに明らかでなくても良い。当業者は、特許請求の範囲に記載の発明で用いる適切な発現ベクターをデザインおよび構築することができるであろう。適切なベクターの選択、デザイン、および／または構築は、十分に当該分野の通常の技術レベルの範囲内である。
【００９２】
本発明にしたがって使用することができる適切な生物学的に活性な分子の配列も公開されており、そして／または当該分野で公知である。公的に利用可能でない本発明で有用な生物学的に活性な分子をコードする他の遺伝子を、標準的な組換えＤＮＡ法（オリゴヌクレオチドプローブを使用したＰＣＲ増幅、ゲノムライブラリースクリーニングおよびｃＤＮＡライブラリースクリーニングなど）を使用して得ることができる。
【００９３】
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術によって原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書中で使用する場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、種々の当該分野で認識された外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入する技術（リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる）をいうことを意図する。適切な宿主細胞の形質転換法またはトランスフェクション法を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ，ＮＹ  １９８９）および他の実験マニュアルに見出すことができる。
【００９４】
最適な細胞は、ＡＲＰＥ−１９細胞株（自然発生的な連続継代ヒト網膜色素上皮細胞株）である。しかし、当業者は、他の適切な細胞（ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＲＰＥ（初代細胞または不死化細胞）が含まれるが、これらに限定されない）も使用することができると認識するであろう。細胞の選択は、意図する適用に依存する。被包された細胞を、生物学的に活性な分子の選択のために選ぶことができる。活性である構築物のアゴニスト、アナログ、誘導体、またはフラグメントを合成および分泌する細胞を使用することもできる。当業者は、他の適切な細胞型を生物学的に活性な分子を分泌するように遺伝子操作することもできると認識するであろう。
【００９５】
被包された細胞ベースの送達系のためのプラットフォーム細胞株であるために、細胞株は、可能な限り多くの以下の特徴を有するべきである：（１）細胞がストリンジェントな条件下で頑健であるべきであること（被包された細胞が、無血管組織腔（中枢神経系内または眼内、特に眼内環境下など）で機能すべきであること）；（２）細胞を遺伝子改変することができなければならないこと（所望の治療因子が細胞内へと操作される必要があること）；（３）細胞の寿命が比較的長くなければならないこと（細胞が寄託、特徴付け、操作、安全性試験、および臨床ロットでの製造に十分な子孫を産生しなければならないこと）；（４）細胞がヒト起源でなければならないこと（被包された細胞と宿主との間の適合性が増大する）；（５）デバイス内のｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の生存率が１ヶ月超の期間８０％超を示さなければならないこと（長期送達を確実にする）；（６）被包された細胞が有効量の有用な生物学的産物を送達しなければならないこと（有効な処置が確実になる）；（７）細胞の宿主免疫反応レベルが低くなければならないこと（移植片の寿命延長が確実になる）；および（８）細胞が非腫瘍形成性でなければならないこと（デバイス漏洩の場合に宿主に安全性を付与するため）。
【００９６】
ＡＲＰＥ−１９細胞株（Ｄｕｎｎら，６２  Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１５５−６９（１９９６），Ｄｕｎｎら，３９  Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．２７４４−９（１９９８），Ｆｉｎｎｅｍａｎｎら，９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １２９３２−７（１９９７），Ｈａｎｄａら，６６  Ｅｘｐ．Ｅｙｅ．４１１−９（１９９８），Ｈｏｌｔｋａｍｐら，１１２  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４−４３（１９９８），Ｍａｉｄｊｉら，７０  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４０２−１０（１９９６）；米国特許第６，３６１，７７１号を参照のこと）は、被包された細胞ベースの送達系のための首尾の良いプラットフォーム細胞の全ての特徴を示している。ＡＲＰＥ−１９細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２３０２）から利用可能である。ＡＲＰＥ−１９細胞は、正常な網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞であり、網膜色素上皮細胞特異的マーカーＣＲＡＬＢＰおよびＲＰＥ−６５を発現する。ＡＲＰＥ−１９細胞は、形態的および機能的な極性を示す安定な単層を形成する。
【００９７】
遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞は、治療量の生物学的に活性な分子を産生するための１つ以上の生物学的に活性な分子を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞は、少なくとも１０，０００ｎｇ／日／１０６細胞を産生することができる。これらの細胞は、少なくとも３ヶ月間この量を産生することができる。
【００９８】
これらの分子を、反復トランスフェクションプロセスを使用してＡＲＰＥ−１９細胞に導入することができる。反復トランスフェクションは、少なくとも１回のトランスフェクション、２回のトランスフェクション、３回のトランスフェクション、またはそれを超えるトランスフェクション（例えば、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれを超える）トランスフェクションを含む。本発明の細胞株は、反復トランスフェクションが１回のトランスフェクションである場合、１０，０００ｎｇ／日／１０６細胞と３０，０００ｎｇ／日／１０６細胞との間（例えば、約または少なくとも１５，０００ｎｇ／日／１０６細胞）の１つ以上の生物学的に活性な分子を産生することができる。あるいは、細胞株は、反復トランスフェクションが２回のトランスフェクションである場合、３０，０００ｎｇ／日／１０６細胞と５０，０００ｎｇ／日／１０６細胞との間（例えば、約または少なくとも３５，０００ｎｇ／日／１０６細胞）の１つ以上の生物学的に活性な分子を産生することができる。他の実施形態では、細胞株は、反復トランスフェクションが３回のトランスフェクションである場合、５０，０００ｎｇ／日／１０６細胞と７５，０００ｎｇ／日／１０６細胞との間（例えば、約または少なくとも７０，０００ｎｇ／日／１０６細胞）の１つ以上の生物学的に活性な分子を産生する。いくつかの実施形態では、同一の生物学的に活性な分子を、かかる反復トランスフェクションを使用して細胞に導入することができる。あるいは、異なる生物学的に活性な分子を、反復トランスフェクションの各トランスフェクションにおいて細胞に導入する。
【００９９】
本発明のデバイスを使用する場合、１０２個と１０８個との間の遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞（例えば、０．５〜１．０×１０６または５×１０２〜６×１０５個の遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞）を各デバイス内に被包する。投薬量を、より少数または多数のカプセル（例えば、１カプセル／患者と５０カプセル／患者との間）の植込みによって調節することができる。本明細書中に記載の眼科デバイスは、約０．１ｐｇ／眼／患者／日と１００００μｇ／眼／患者／日との間で送達することができる。１つの非限定的な例では、治療量は５００〜５０，０００ｎｇ定常状態／眼である。別の例では、治療量は少なくとも１０μｇ／ｍｌ定常状態／眼である。さらに、一旦解凍されると、本発明の低温保存デバイスは、少なくとも３ヶ月間この治療量を発現することができる。
【０１００】
選択された産物を産生する細胞または組織を単離する技術および手順は当業者に公知であるか、日常的実験のみを使用して公知の手順から適応させることができる。
【０１０１】
単離すべき細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成長に適応した細胞または細胞株を複製する場合、これらの細胞のセルバンクを生成することが特に有利である。セルバンクの特定の利点は、セルバンクが細胞の同一の培養物またはバッチから調製される細胞供給源であることである。すなわち、全ての細胞が同一の細胞供給源に由来し、同一の条件およびストレスに曝されている。したがって、バイアルを同種の培養物として処置することができる。移植の文脈では、これにより、同一デバイスまたは置換デバイスの産生が非常に容易になる。これにより、植込んだ細胞が確実にレトロウイルスなどを含まない単純化した試験プロトコールも可能である。これにより、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのビヒクルの並行モニタリングも可能であり、したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの所在に固有の効果または因子の調査が可能である。
【０１０２】
本明細書中で使用する場合、用語「個体」または「レシピエント」または「宿主」を、ヒトまたは動物の被験体をいうために交換可能に使用する。
【０１０３】
本明細書中で使用する場合、「生物学的に活性な分子」（「ＢＡＭ」）は、本発明のデバイスを植込んだ個体の身体に生物学的に有用な効果を発揮することができる任意の物質である。抗血管新生抗体足場ならびに抗血管新生抗体および抗血管新生分子は、ＢＡＭの例である。ＢＡＭには、サイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、ならびに／または抗血管新生抗体および抗血管新生分子が含まれ得る。ＢＡＭの他の適切な例には、例えば、ニューロトロフィン、インターロイキン、サイトカイン、成長因子、抗アポトーシス因子、血管新生因子、抗血管新生因子、抗体および抗体フラグメント、抗原、神経伝達物質、ホルモン、酵素、リンホカイン、抗炎症因子、治療タンパク質、遺伝子移入ベクター、および／またはその任意の組み合わせが含まれ得る。種々の実施形態では、かかる分子には、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＮＴ−４、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、アクソカイン（Ａｘｏｋｉｎｅ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦＩ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ミッドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）、ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート、トリオフォチン、アクチビン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、インターロイキン、骨形態形成タンパク質、マクロファージ炎症タンパク質、ヘパリン硫酸、アンフィレグリン、レチノイン酸、腫瘍壊死因子α、線維芽細胞成長因子受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＰＥＤＦ、ＬＥＤＧＦ、ＮＴＮ、ノイブラスチン、ＶＥＧＦインヒビターおよび／または潜在的な標的組織に治療的に有用な影響を及ぼすと予想される他の薬剤が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１０４】
用語「カプセル」および「デバイス」および「ビヒクル」を、本発明のＥＣＴデバイスをいうために本明細書中で交換可能に使用する。
【０１０５】
別段の定めがない限り、用語「細胞」は、任意の形態の細胞（組織中に保持された細胞、細胞クラスター、および個別に単離された細胞が含まれるが、これらに限定されない）を意味する。
【０１０６】
本明細書中で使用する場合、「生体適合性カプセル」または「生体適合性デバイス」または「生体適合性ビヒクル」は、カプセルまたはデバイスまたはビヒクルが、個体への植込みの際、カプセルを拒絶するか例えば分解によって操作不可能にするのに十分な有害な宿主応答を誘発しないことを意味する。
【０１０７】
本明細書中で使用する場合、「免疫隔離カプセル」または「免疫防御カプセル」または「免疫隔離デバイス」または「免疫防御デバイス」または「免疫隔離ビヒクル」または「免疫防御ビヒクル」は、個体への植込みの際にカプセルがデバイスの細胞内容物を都合よく仕切り、デバイスコア内の細胞に及ぼす宿主の免疫系の悪影響を最小にすることを意味する。
【０１０８】
本明細書中で使用する場合、「生物学的に活性な分子の長期安定発現」は、１ヶ月超（例えば、３ヶ月超または６ヶ月超）にわたってその有用な生物学的活性を維持するのに十分なレベルでの生物学的に活性な分子の継続的産生を意味する。デバイスおよびその内容物の植込みは、ｉｎ  ｖｉｖｏで３ヶ月超、多くの場合に１年超、いくつかの場合に２年以上機能を保持することができる。
【０１０９】
用語「ジャケット」および「半透性膜」を、本明細書中で交換可能に使用する。
【０１１０】
用語「内部足場」は、本明細書中に記載のデバイス中で使用することができる「マトリックス」の一例である。
【０１１１】
コアを取り囲むジャケット膜の「半透」性は、細胞によって産生された分子（例えば、代謝産物、栄養素、および／または治療物質）をデバイスから周辺の宿主眼組織内に拡散させるが、コア内の細胞を宿主による有害な免疫学的攻撃から防御するのに十分な不透過性を示す。
【０１１２】
用語「被包化細胞治療」または「ＥＣＴ」を、宿主内への植込み前に細胞を半透性生体適合性材料で取り囲むことによって細胞をレシピエント宿主の免疫系から隔離することができる任意のデバイスをいうために本明細書中で交換可能に使用する。当業者は、本発明の任意のデバイス、方法、および／または使用において当該分野で公知の任意のＥＣＴデバイスを使用することができると認識するであろう。
【０１１３】
ビヒクルのコアからのＩｇＧの排除は免疫隔離の試金石ではなく、何故なら、多くの場合、ＩｇＧのみでは標的細胞または組織の細胞溶解に不十分であるからである。したがって、免疫隔離カプセルのために、１０００ｋＤまでのジャケットの名目上のＭＷＣＯ値を意図する。例えば、ＭＷＣＯは、５０〜７００ｋＤまたは５０〜５００ｋＤまたは７０〜３００ｋＤである。例えば、ＷＯ９２／１９１９５号を参照のこと。１つの実施形態では、ＭＷＣＯは５００ｋＤである。
【０１１４】
本発明はまた、生物学的に活性な分子の眼への送達のための生体適合性を示し、任意選択的に免疫隔離性および／または免疫防御性を示す低温保存デバイスに関する。かかるデバイスは、抗凍結剤および生物学的に活性な分子を産生または分泌する生細胞を含むコアならびにコアを取り囲む生体適合性ジャケットを含み、ここで、ジャケットは、生物学的に活性な分子を眼内または中枢神経系（脳、脳室、脊髄が含まれる）に拡散させるＭＷＣＯを有する。
【０１１５】
本発明はまた、抗凍結剤および１つ以上の生物学的に活性な分子を産生または分泌する細胞を有するコアならびに細胞を取り囲む半透性膜を含む生体適合性および植込み型であり、任意選択的に免疫隔離性および／または免疫防御性を示す低温保存デバイスであって、デバイスを介して１つ以上の生物学的に活性な分子の拡散を可能にする、デバイスを提供する。
【０１１６】
当業者は、任意のデバイスの構造形を本発明に従って低温保存することができると認識するであろう。デバイスは、生物学的に活性な分子の生物学的活性の維持および送達のためのアクセスに適切な任意の構造形であり得る。使用される特定のデバイス構造形は、低温保存に関連する有利な効果に影響を及ぼさないであろう。
【０１１７】
非限定的な例として、適切なデバイスは、以下のさらなる特徴のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または全てを含むことができる：
ａ．コアが約０．５〜１．０×１０６個のＡＲＰＥ−１９細胞を含むこと；
ｂ．デバイスの長さが約１ｍｍ〜２０ｍｍであること；
ｃ．デバイスの内径が０．１〜２．０ｍｍであること；
ｄ．デバイスの端部をメチルメタクリラートを使用して密封すること；
ｅ．半透性膜の孔径の中央値が約１００ｎｍであること；
ｆ．半透性膜の名目ＭＷＣＯが５０ｋＤと５００ｋＤとの間であること；
ｇ．半透性膜の厚さが９０〜１２０ｕｍであること；
ｈ．コアが内部足場を含み、ここで、足場がデバイスの内部体積の４０〜８５％を構成するポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）繊維を含むこと；
ｉ．その任意の組み合わせ。
【０１１８】
種々の生体適合性カプセルは、本発明の分子の送達に適切である。有用な生体適合性カプセルは、（ａ）液体培地に懸濁されているか生体適合性マトリックス内に固定化された細胞を含むコア、および（ｂ）生体適合性を示し、且つ細胞が産生した生物学的に活性な分子を眼に拡散させる隔離細胞を含まない膜を含む包囲ジャケットを含む。関連する当業者は、過度の実験を用いずに所与の適応症または使用に適切なデバイスの構造形を選択しようとするであろう。
【０１１９】
多数の形質転換された細胞または細胞株を、例えば、栄養培地を含み、任意選択的に細胞の生存度および機能を維持するためのさらなる因子の供給源を含む液体コアを有するカプセル内に隔離することが有利である。本発明のデバイスのコアは、成長因子（例えば、プロラクチンまたはインスリン様成長因子２）、成長調節物質（トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）など）、網膜芽細胞腫遺伝子タンパク質、または栄養素輸送増強剤（例えば、コア内の溶存酸素濃度を増強することができるペルフルオロカーボン）のためのリザーバとして機能することができる。これらの物質のうちのいくつかも、液体培地中に含めるのに適切である。
【０１２０】
あるいは、コアは、細胞の位置を安定化するヒドロゲルまたは他の生体適合性材料（例えば、細胞外基質成分）の生体適合性マトリックスを含むことができる。被包すべき細胞の成長特性に応じて、任意の適切なマトリックスまたはスペーサー（沈殿キトサン、合成ポリマーおよびポリマーブレンド、およびマイクロキャリアなどが含まれる）を、コア内で使用することができる。
【０１２１】
あるいは、デバイスは、内部足場を有することができる。足場は、細胞が凝集するのを防止し、デバイス内での細胞分布を改善することができる（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／０２６４６号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。足場は、被包された細胞の微小環境を定義し、コア内での細胞の十分な分布を維持する。特定のデバイスに最適な内部足場は、使用すべき細胞型に高度に依存する。かかる足場の非存在下で、接着細胞が凝集してクラスターを形成する。
【０１２２】
例えば、内部足場は糸または網目であり得る。糸または網目状の内部足場を形成するために使用されるフィラメントを、任意の適切な生体適合性の実質的に非分解性の材料から形成する（米国特許第６，３０３，１３６号および同第６，６２７，４２２号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。糸または織物の網目の形成に有用な材料には、繊維を形成することができる任意の生体適合性ポリマー（例えば、アクリル、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンテレフタラート、ナイロン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリブトエステルなど）、または天然繊維（綿、絹、キチン、またはカーボンなど）が含まれる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、非ランダムな一方向で組織化することができるフィラメントを束状構造に撚りをかけて種々の厚さおよび空隙容量の糸を形成する。空隙容量を、フィラメント間に存在する空間と定義する。糸内の空隙容量は、２０〜９５％、例えば、５０〜９５％で変化する。１つの実施形態では、内部足場は、デバイスの内部体積の４０〜８５％を占めるＰＥＴ繊維から作製される。あるいは、フィラメントまたは糸を、網目に織ることができる。他の実施形態では、管状ブレイドを構築する。
【０１２４】
免疫学的特権部位でないインプラント部位（眼周囲部位など）、ならびに前眼房（眼房水）および後眼房（硝子体）の外側の他の領域のために、カプセルは免疫隔離性を示し得る。生体適合性材料の成分は、包囲する半透性膜および内部の細胞を支持する足場を含むことができる。形質転換された細胞を足場上に播種することができ、これを上記の選択透過性膜によって被包する。また、細胞植込みのために不織布構造を使用することができる（米国特許第５，５１２，６００号（参考として援用される）を参照のこと）。生分解性ポリマーには、例えば、ポリ（乳酸）ＰＬＡ、ポリ（乳酸−コグリコール酸）ＰＬＧＡ、およびポリ（グリコール酸）ＰＧＡ、ならびにその等価物から構成されるものが含まれる。移植細胞を接着することができる表面を得るために泡状足場が使用されている（ＰＣＴ国際特許出願番号９８／０５３０４号（参考として援用される））。血管移植片として網目状管織物が使用されている（ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ９９／５２５７３号（参考として援用される））。さらに、コアは、細胞の位置を安定化するヒドロゲルから形成された固定マトリックスから構成することができる。ヒドロゲルは、実質的に水から構成されるゲルの形態の架橋親水性ポリマーの三次元網目構造である。
【０１２５】
種々のポリマーおよびポリマーブレンド（ポリアクリラート（アクリルコポリマーが含まれる）、ポリビニリデン、ポリ塩化ビニルコポリマー、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリアミド、酢酸セルロース、セルロースニトラート、ポリスルホン（ポリエーテルスルホンが含まれる）、ポリホスファゼン、ポリアクリロニトリル、ポリ（アクリロニトリル／コ塩化ビニル）、ならびにその誘導体、コポリマー、および混合物が含まれる）を使用して、包囲半透性膜を製造することができる。いくつかの例示的な実施形態では、包囲半透性膜は、生体適合性の半透性中空繊維膜である。かかる膜およびその作製方法は、米国特許第５，２８４，７６１号および同第５，１５８，８８１号（参考として援用される）に開示されている。包囲半透性膜は、ポリエーテルスルホン中空繊維（米国特許第４，９７６，８５９号または米国特許第４，９６８，７３３号（参考として援用される）によって記載のものなど）から形成される。代替の包囲半透性膜材料はポリスルホンである。
【０１２６】
カプセルは、生物学的活性を維持し、産物または機能の送達のためにアクセスするのに適切な任意の構造形であり得、そして／またはこの構造形には、例えば、円柱状、矩形、円盤状、パッチ状、卵形、星状、または球形が含まれる。さらに、カプセルを、網目様構造または入れ子状態の構造にらせん状に巻き入れるか、包み込むことができる。カプセルを植込み後に回収しなければならない場合、カプセルが植込み部位から移動する傾向がある構造形（レシピエント宿主の血管内を移動するのに十分に小型の球形カプセルなど）は好ましくない。一定の形状（矩形、パッチ、円盤、円柱、および平坦なシートなど）は構造的完全性がより高く、所望の回収場所で使用することができる。
【０１２７】
デバイスは、植込み中のデバイスの配置の維持を補助し、回収を補助するテザーを有することができる。かかるテザーは、適所にカプセルを固定するのに適応した任意の適切な形状を有することができる。例えば、テザーは、ループ、円盤、または縫合糸であり得る。いくつかの実施形態では、テザーは、テザー（したがって、デバイス）を強膜または他の適切な眼構造に固定するために縫合糸を使用することができるようなアイレット様の形状である。別の実施形態では、テザーは、一方の端部でカプセルと接続され、他方の端部に予めテザーを通した縫合針を形成している。１つの実施形態では、テザーは、カプセルの眼構造への係留に適合したアンカーループである。テザーは、形状記憶金属および／または当該分野で公知の任意の他の適切な医薬グレードの材料から構成され得る。
【０１２８】
中空繊維構造形では、繊維の内径は、２０００ミクロン未満（例えば、１２００ミクロン未満）であろう。外径が３００〜６００ミクロン未満のデバイスも意図する。１つの実施形態では、内径は０．１ｍｍと２．０ｍｍとの間である。眼内への植込みのために、中空繊維構造形では、カプセルは、長さ０．４ｃｍ〜１．５ｃｍまたは長さ０．４〜１．０ｃｍであり得る。１つの実施形態では、デバイスの長さは、１ｍｍと２０ｍｍとの間である。より長いデバイスを眼内に収容することができるが、確実且つ適切な配置には湾曲または弓状の形状を必要とし得る。中空繊維構造形を、眼内配置のために使用することができる。
【０１２９】
眼周囲配置のために、中空繊維構造形（実質的に上記の直径）または平坦なシート構造形のいずれかを意図する。平坦なシートで意図される上限は、方形と仮定するとおよそ５ｍｍ×５ｍｍである。およそ同一の表面積を有する他の形状も意図する。
【０１３０】
抗血管新生抗体足場、可溶性ＶＥＧＦＲもしくは可溶性ＰＤＧＦＲ、または１つ以上の生物学的に活性な分子の送達のために製造したマイクロデバイスは、１ミリメートルと２．５ミリメートルとの間の長さ、３００ミクロンと５００ミクロンとの間の内径、および４５０ミクロンと７００ミクロンとの間の外径であり得る。微小化デバイスの内部体積は、０．５μｌ未満（すなわち、０．５μｌ）であろう。微小化デバイスについての徹底的な考察については、ＷＯ２００７／０７８９２２号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１３１】
使用が意図される多孔膜の名目分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）値は１０００ｋＤまでであろう。例えば、ＭＷＣＯは、５０〜７００ｋＤまたは５０〜５００ｋＤ、理想的にはおよそ３００ｋＤである。１つの実施形態では、ＭＷＣＯは５００ｋＤである。意図する膜の名目孔径はおよそ１００ｎｍであり、孔のガウス分布に基づいて、最大絶対孔は１５０ｎｍ未満であろう。あるいは、非常に多孔の膜が利用されない場合、「免疫隔離性」および／または「免疫防御性」のより高い膜を使用するであろう。
【０１３２】
１つの実施形態では、孔径の中央値は約１００ｎｍである。本発明のデバイスのコアを取り囲む包囲領域または周辺領域（ジャケット）は、選択透過性、生体適合性、および／または免疫隔離性を示し得る。これを、隔離細胞を含まず、コアを完全に取り囲み（すなわち、隔離し）、それにより、コア内の任意の細胞とレシピエントの身体との間の接触が防止されるような様式で生成する。生体適合性半透性中空繊維膜およびその作製方法は、米国特許第５，２８４，７６１号および同第５，１５８，８８１号（ＷＯ９５／０５４５２号も参照のこと）（それぞれ、その全体が本明細書中で参考として援用される）に開示されている。例えば、カプセルジャケットを、ポリエーテルスルホン中空繊維（米国特許第４，９７６，８５９号、同第４，９６８，７３３号、および同第５，７６２，７９８号（それぞれ本明細書中で参考として援用される）に記載のものなど）から形成することができる。
【０１３３】
選択透過性を示すために、ジャケットを、デバイスの植込み後に遭遇すると予想される免疫学的反応の型および範囲ならびに眼内のデバイスの内外の通過が望まれる最大の物質の分子サイズの両方に適切なＭＷＣＯ範囲を有するような様式で形成する。デバイスの植込み後にレシピエントによって開始することができる免疫学的攻撃の型および範囲は、デバイス内に隔離された部分の型に一部依存し、レシピエントの同一性（すなわち、レシピエントのＢＡＭの供給源との遺伝的関連の程度）に一部依存する。植込んだ組織または細胞がレシピエントと同種の場合、免疫学的拒絶は、レシピエントの免疫細胞による植込んだ細胞に対する細胞媒介性の攻撃によって非常に進行し得る。組織または細胞が患者と異種である場合、補体との抗体相互作用と同様にレシピエントの細胞溶解性補体攻撃複合体のアセンブリによる分子攻撃が優位を占め得る。
【０１３４】
ジャケットは、所定のサイズまでの物質の通過が可能であるが、より大きな物質の通過を防止する。より具体的には、包囲領域または周辺領域を、所定のサイズ範囲の孔または間隙を有し、結果としてデバイスが選択透過性を示す様式で生成する。包囲ジャケットのＭＷＣＯは、コアへの免疫学的攻撃の実施に必要な物質のアクセスを防止するのに十分に低いが、生物学的に活性な分子をレシピエントに送達させるのに十分に高くなければならない。短縮された生物学的に活性な分子を使用する場合、本発明のデバイスの生体適合性ジャケットのＭＷＣＯは、約１ｋＤ〜約１５０ｋＤである。しかし、非短縮の生物学的に活性な分子の送達が望ましい場合、ＭＷＣＯが２００ｋＤ超の多孔膜を使用すべきである。
【０１３５】
デバイスのジャケットに関して本明細書中で使用する場合、用語「生体適合性」は、集合的にデバイスおよびその内容物の両方をいう。具体的には、植込んだインタクトなデバイスおよびその内容物が身体の種々の防御システムの有害作用を回避し、有意な期間機能を保持する能力をいう。本明細書中で使用する場合、用語「防御システム」は、本発明のビヒクルが植込まれた個体の免疫系によって開始することができる免疫学的攻撃の型および他の拒絶機構（線維化応答、異物応答、および個体の体内の外来物の存在によって誘導され得る他の炎症反応型など）をいう。免疫系由来の防御応答または異物線維化応答の回避に加えて、用語「生体適合性」は、本明細書中で使用する場合、特異的な望ましくない細胞傷害性または全身性の影響がビヒクルまたはその内容物が原因ではない（ビヒクルまたはその内容物の所望の機能を妨害すると考えられる影響などがない）ことも意味する。
【０１３６】
デバイスの外面を、選択された部位での植込みに特に適切な様式で選択またはデザインすることができる。例えば、細胞による周囲組織の結合が望ましいかどうかに応じて、外面は、滑らかであるか、斑点で覆われているか、粗面であり得る。形状または構造形を、選択した植込み部位に特に適切なように選択またはデザインすることもできる。
【０１３７】
デバイスの構築のために使用される材料の選択は、ＤｉｏｎｎｅのＷＯ９２／１９１９５号（本明細書中で参考として援用される）に詳述の多数の要因によって決定される。簡潔に述べれば、種々のポリマーおよびポリマーブレンドを使用して、カプセルジャケットを製造することができる。デバイスおよびデバイス中の成長表面を形成する高分子膜には、ポリアクリラート（アクリルコポリマーが含まれる）、ポリビニリデン、ポリ塩化ビニルコポリマー、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリアミド、ポリメチルメタクリラート、ポリビニルジフルオリド、ポリオレフィン、酢酸セルロース、セルロースニトラート、ポリスルホン、ポリホスファゼン、ポリアクリロニトリル、ポリ（アクリロニトリル／コ塩化ビニル）、ならびにその誘導体、コポリマー、および混合物が含まれ得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本発明のデバイスのジャケットは、免疫隔離性および／または免疫防御性を示す。すなわち、ジャケットは、デバイスのコア内の細胞をデバイスが植込まれた個体の免疫系から防御する。ジャケットは、（１）個体の身体の有害物質がコアに進入するのを防止すること、（２）個体とコア内に存在し得る炎症性、抗原性、または有害な材料との間の接触を最小にすること、および（３）隔離部分と個体の免疫系の有害部分との間の免疫学的接触を防止するのに十分な空間的および物理的なバリアを提供することによって防御する。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、外部ジャケットは、限外濾過膜または微孔性膜のいずれかであり得る。当業者は、限外濾過膜が、約１〜約１００ナノメートルの孔径範囲を有するものである一方で、微孔性膜の孔径範囲が約１〜約１０ミクロンであると認識するであろう。
【０１４０】
この物理的バリアの厚さは変動し得るが、いずれかのバリア側面での細胞および／または物質の直接的接触を防止するのに常に十分な厚さであろう。この領域の厚さは、一般に、５ミクロンと２００ミクロンとの間の範囲である。例えば、１０〜１００ミクロンまたは２０〜５０または２０〜７５ミクロンの厚さを使用することができる。１つの実施形態では、半透性膜の厚さは、９０μｍと１２０μｍとの間である。本発明のデバイスの使用によって防止または最小化することができる免疫学的攻撃の型には、マクロファージ、好中球、細胞性免疫応答（例えば、ナチュラルキラー細胞および抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞溶解（ＡＤＣＣ））、および体液性応答（例えば、抗体依存性補体媒介性細胞溶解）による攻撃が含まれる。
【０１４１】
カプセルジャケットを、種々のポリマーおよびポリマーブレンド（ポリアクリラート（アクリルコポリマーが含まれる）、ポリビニリデン、ポリ塩化ビニルコポリマー、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリアミド、酢酸セルロース、セルロースニトラート、ポリスルホン（ポリエーテルスルホンが含まれる）、ポリホスファゼン、ポリアクリロニトリル、ポリ（アクリロニトリル／コ塩化ビニル）、ならびにその誘導体、コポリマー、および混合物が含まれる）から製造することができる。かかる材料から製造されたカプセルは、例えば、米国特許第５，２８４，７６１号および同第５，１５８，８８１号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）繊維（米国特許第４，９７６，８５９号および同第４，９６８，７３３号（本明細書中で参考として援用される）に記載のものなど）から形成したカプセルも使用することができる。
【０１４２】
当業者は、選択透過性の免疫隔離性膜を有するカプセルジャケットが、免疫学的特権が与えられていない部位に好ましいと認識するであろう。対照的に、微孔性膜または選択透過性膜は、免疫学的特権部位に適切であり得る。免疫学的特権部位への植込みのために、ＰＥＳ膜またはＰＳ膜から作製されたカプセルを使用することができる。
【０１４３】
本発明の方法およびデバイスは、霊長類（例えば、ヒトの宿主、レシピエント、患者、被験体、または個体）での使用を意図する。多数の異なる眼球植込み部位が本発明のデバイスおよび方法のために意図される。適切な植込み部位には、眼房水および硝子体液、眼周囲間隙、前眼房、および／またはテノン嚢下が含まれるが、これらに限定されない。体内の植込み部位には、皮下、腹腔内、またはＣＮＳ内が含まれ得る。さらに、植込みを、所望の生物学的治療を必要とする病変または病変付近に送達を方向付けるか局在させることができる。かかる疾患部位の例は、炎症関節、脳、およびＣＮＳ病変、良性腫瘍または悪性腫瘍部位であり得る。デバイスによる循環系へのアクセスにより、体内の潜在的罹患部位の範囲を遠位で罹患した器官および組織にさらに拡大することができる。
【０１４４】
植込んだデバイスに対するレシピエントによる免疫学的応答の型および範囲は、レシピエントのコア内の隔離細胞との関係に影響を受けるであろう。例えば、コアが同系細胞を含む場合、レシピエントがデバイス内の特定の細胞型または組織型に関する自己免疫を罹患しない限り、これらの細胞は強い免疫学的反応を生じないであろう。同系の細胞または組織が利用可能であることは稀である。多くの場合、同種または異種の細胞または組織（すなわち、予想されるレシピエントと同種または異なる種のドナー由来）を利用可能かもしれない。免疫隔離デバイスの使用により、レシピエントを免疫抑制する必要性を伴わずに同種または異種の細胞または組織に植込むことが可能である。免疫隔離カプセルの使用により、非適合細胞（同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｐｈ））を使用することも可能である。したがって、本発明のデバイスは、従来の移植技術によって処置することができる個体よりも多くの個体を処置することを可能にする。
【０１４５】
より低いＭＷＣＯのカプセルを使用して、患者の免疫系の分子の被包された細胞との相互作用をさらに防止することができる。
【０１４６】
本明細書中に記載の方法で使用される任意のデバイスは、隔離細胞の生存度および機能を維持するために、少なくとも１つの寸法で、コア中の任意の隔離細胞がレシピエントの包囲組織（すなわち、眼組織）に十分に近くなければならない。
【０１４７】
本発明のデバイスは、植込み後の完全な回収に十分なサイズおよび耐久性を示すデバイスである。１つの例では、デバイスは、およそ２〜２０μＬ（例えば、１〜３μＬ）の体積のコアを有する。微小化デバイスの内部形態の体積は、およそ０．０５〜０．１γＬである。他のデバイスの構造形および／または幾何学的形状も使用することができる。
【０１４８】
本発明の方法にしたがって、他の分子（例えば、さらなる生物学的に活性な分子（「ＢＡＭ」））を同時送達させることができる。例えば、栄養因子を、抗血管新生因子と共に送達させることができる。
【０１４９】
多数の方法で同時送達させることができる。第１に、細胞を、記載の分子をコードする遺伝子を含む個別の構築物でトランスフェクションすることができる。第２に、細胞を、２つ以上の遺伝子および必要な調節エレメントを含む単一の構築物でトランスフェクションすることができる。第３に、２つ以上の個別に操作した細胞株を同時に被包することができるか、１つを超えるデバイスを目的の部位に植込むことができる。
【０１５０】
いくつかの適応症のために、ＢＡＭを、２つの異なる部位（例えば、眼内）に同時に送達させることができる。例えば、神経網膜に供給するために神経栄養因子を硝子体に送達させ（神経節細胞に供給するためのＲＰＥへの送達）、脈絡膜脈管構造に供給するためにテノン嚢下腔を介して抗血管新生因子（１つ以上の可溶性受容体または抗血管新生抗体および抗血管新生分子など）を送達させることが望ましいかもしれない。
【０１５１】
本発明はまた、一連の処置レジメンの間の異なる細胞型の使用を意図する。例えば、患者に、第１の細胞型（例えば、ＢＨＫ細胞）を含むカプセルデバイスを植込むことができる。その後に患者がこの細胞型に対して免疫応答を発生する場合、カプセルを回収するか外植することができ、第２の細胞型（例えば、ＣＨＯ細胞）を含む第２のカプセルを植込むことができる。この様式では、患者が被包された細胞型のうちの１つに対して免疫応答を発生した場合でさえも、継続的に治療分子を提供することが可能である。
【０１５２】
本明細書中に記載の生物学的に活性な分子と共に、少なくとも１つのさらなるＢＡＭをデバイスから眼に送達させることもできる。例えば、少なくとも１つのさらなるＢＡＭを、細胞供給源または非細胞供給源から提供することができる。少なくとも１つのさらなるＢＡＭが非細胞供給源から提供される場合、さらなるＢＡＭを、細胞系の１つ以上の成分（（ａ）シーラント；（ｂ）足場；（ｃ）ジャケット膜；（ｄ）テザーアンカー；および／または（ｅ）コア培地が含まれるが、これらに限定されない）中に被包するか、成分内に分散させるか、成分に結合させることができる。かかる実施形態では、非細胞供給源由来のさらなるＢＡＭを、細胞供給源由来のＢＡＭと同一のデバイスから同時送達させることができる。
【０１５３】
あるいは、２つ以上の被包された細胞系を使用することができる。例えば、少なくとも１つのさらなる生物学的に活性な分子は、核酸、核酸フラグメント、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質、有機分子、無機分子、治療薬、またはその任意の組み合わせであり得る。具体的には、治療薬は、抗血管新生薬、ステロイド性および非ステロイド性抗炎症薬、抗有糸分裂薬、抗腫瘍薬、抗寄生虫薬、ＩＯＰ低下薬、ペプチド薬、および／または商業的使用が認可された任意の他の生物学的に活性な分子薬であり得る。
【０１５４】
適切な賦形剤には、任意の非分解性または生分解性のポリマー、ヒドロゲル、溶解促進剤、疎水性分子、タンパク質、塩、または処方が認可された他の錯化剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５５】
非細胞投薬量を、当該分野で公知の任意の適切な方法（治療薬濃度の変化、および／または眼あたりのデバイス数、および／または被包賦形剤の組成の改変など）によって変化させることができる。細胞投薬量を、（１）デバイスあたりの細胞数、（２）眼あたりのデバイス数、および／または（３）細胞あたりのＢＡＭ産生レベル（例えば、反復トランスフェクションによる）の変更によって変化させることができる。細胞産生を、例えば、形質導入細胞中のさらなるＢＡＭ遺伝子のコピー数、またはさらなるＢＡＭの発現を駆動するプロモーターの効率の変更によって変化させることができる。細胞供給源由来の適切な投薬量は、約１ｐｇ〜約１００００ｍｇ／日の範囲であり得る。
【０１５６】
デバイスを、当該分野で公知の任意の適切な方法によって形成することができる（例えば、米国特許第６，３６１，７７１号；同第５，６３９，２７５号；同第５，６５３，９７５号；同第４，８９２，５３８号；同第５，１５６，８４４号；同第５，２８３，１３８号；および同第５，５５０，０５０号（それぞれ本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０１５７】
当該分野で公知の任意の適切なカプセルのシーリング方法（ポリマー接着剤および／またはクリンピング、ノッティング、ならびにヒートシーリングの使用が含まれる）を使用することができる。さらに、任意の適切な「ドライ」シーリング法も使用することができる。かかる方法では、細胞含有溶液を導入した実質的に非多孔質のフィッティングを提供する。充填後、カプセルを密封する。かかる方法は、例えば、米国特許第５，６５３，６８８号；同第５，７１３，８８７号；同第５，７３８，６７３号；同第６，６５３，６８７号；同第５，９３２，４６０号；および同第６，１２３，７００号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。１つの方法では、デバイスの端部をメチルメタクリラートを使用して密封する。
【０１５８】
使用される膜を、その分子量に基づいて、生物学的に活性な分子の拡散が調節されるように操作することもできる（Ｌｙｓａｇｈｔら，５６  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６（１９９６），Ｃｏｌｔｏｎ，１４  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５８（１９９６）を参照のこと）。被包技術を使用して、細胞を、免疫抑制薬を使用するか使用しないで免疫拒絶を起こすことなく宿主に移植することができる。カプセルを、宿主への植込み後、カプセルが拒絶されるか、例えば分解によってカプセルが操作不可能にされるのに十分な有害な宿主応答を誘発しない生体適合性材料から作製することができる。
【０１５９】
デバイス数およびデバイスサイズは、植込みの際に治療効果を得るのに十分であるべきであり、特定の適用に必要な生物学的活性量によって決定される。治療物質を放出する分泌細胞の場合、当該分野で公知の標準的な投薬量の考察および基準を使用して、必要な分泌物質の量を決定するであろう。考慮すべき要因には、レシピエントのサイズおよび体重；細胞の産生性または機能レベル；および、適切な場合には、その機能が置換または増大される器官または組織の通常の産生性または代謝活性が含まれる。細胞画分は免疫隔離および組み込み手順を生存することができないことを考慮することも重要である。さらに、レシピエントがインプラントの有効性を妨害し得る既存の容態を有するかどうかも考慮すべきである。何千もの細胞を含む本発明のデバイスを、容易に製造することができる。例えば、本発明の眼科臨床デバイスが２００，０００細胞と７５０，０００細胞との間を含むのに対して、微小化デバイスは１０，０００細胞と１００，０００細胞との間を含むであろう。他の大規模デバイスは、１，０００，０００〜１００，０００，０００細胞を含むことができる。
【０１６０】
被包化細胞治療は、宿主内の植込み前に細胞を半透性生体適合性材料で取り囲むことによって細胞をレシピエント宿主の免疫系から隔離するという概念に基づく。例えば、本発明は、遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞が免疫隔離カプセル中に被包され、レシピエント宿主内への植込みの際に、デバイスのコア内のＡＲＰＥ−１９細胞に及ぼす宿主の免疫系の悪影響を最小にするデバイス（例えば、低温保存デバイス）を含む。ＡＲＰＥ−１９細胞を、微孔性膜によって形成された植込み型ポリマーカプセル内にＡＲＰＥ−１９細胞を封入することによって宿主から免疫隔離する。このアプローチは、宿主と植込んだ組織との間の細胞間接触を防止し、それにより、直接提示による抗原認識を排除する。
【０１６１】
本明細書中に記載のデバイスによって分泌された任意の生物学的に活性な分子（単独または任意の組み合わせ）を、眼内（例えば、前眼房および硝子体腔内）、眼周囲（例えば、テノン嚢の内部または下位）、またはその両方に送達させることができる。本発明のデバイスを使用して、種々の眼科障害、眼疾患、および／または眼に影響を及ぼす他の疾患を処置するために生物学的に活性な分子を制御放出および徐放することもできる。
【０１６２】
本明細書中に記載の方法および使用にしたがった多数の容態の処置には、適切な治療投薬量を供給するために眼あたりたった１個または最大で５０個の植込みデバイスが必要であろう。
【０１６３】
眼内（例えば、硝子体内）または眼球全体（例えば、テノン嚢下腔または領域下）に生物学的に活性な分子を送達可能である。治療投薬量は、０．１ｐｇ／眼／患者／日と１００００μｇ／眼／患者／日との間（例えば、０．１ｐｇと５０００μｇとの間；０．１ｐｇと２５００μｇとの間；０．１ｐｇと１０００μｇとの間；０．１ｐｇと５００μｇとの間；０．１ｐｇと２５０μｇとの間；０．１ｐｇと１００μｇとの間；０．１ｐｇと５０μｇとの間；０．１ｐｇと２５μｇとの間；０．１ｐｇと１０μｇとの間；０．１ｐｇと５μｇとの間；０．１ｐｇと１００ｎｇとの間；０．１ｐｇと５０ｎｇとの間；０．１ｐｇと２５ｎｇとの間；０．１ｐｇと１０ｎｇとの間；または０．１ｐｇと５ｎｇとの間）であり得ることが意図される。１つの非限定的な例では、治療量は、少なくとも眼内で０．５〜５０μｇ／ｍｌ定常状態である。適切な治療量には、例えば、０．５μｇ、０．６μｇ、０．７ｕｇ、０．８μｇ、０．９μｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１１μｇ、１２μｇ、１３μｇ、１４μｇ、１５μｇ、１６μｇ、１７μｇ、１８μｇ、１９μｇ、２０μｇ、２１μｇ、２２μｇ、２３μｇ、２４μｇ、２５μｇ、２６μｇ、２７μｇ、２８μｇ、２９μｇ、３０μｇ、３１μｇ、３２μｇ、３３μｇ、３４μｇ、３５μｇ、３６μｇ、３７μｇ、３８μｇ、３９μｇ、４０μｇ、４１μｇ、４２μｇ、４３μｇ、４４μｇ、４５μｇ、４６μｇ、４７μｇ、４８μｇ、４９μｇ、５０μｇ、５１μｇ、５２μｇ、５３μｇ、５４μｇ、５５μｇ、５６μｇ、５７μｇ、５８μｇ、５９μｇ、６０μｇ、６１μｇ、６２μｇ、６３μｇ、６４μｇ、６５μｇ、６６μｇ、６７μｇ、６８μｇ、６９μｇ、７０μｇ、７１μｇ、７２μｇ、７３μｇ、７４μｇ、７５μｇ、７６μｇ、７７μｇ、７８μｇ、７９μｇ、８０μｇ、８１μｇ、８２μｇ、８３μｇ、８４μｇ、８５μｇ、８６μｇ、８７μｇ、８８μｇ、８９μｇ、９０μｇ、９１μｇ、９２μｇ、９３μｇ、９４μｇ、９５μｇ、９６μｇ、９７μｇ、９８μｇ、９９μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、３５０μｇ、４００μｇ、４５０μｇ、５００μｇ、５５０μｇ、６００μｇ、６５０μｇ、７００μｇ、７５０μｇ、８００μｇ、８５０μｇ、９００μｇ、９５０μｇ、１０００μｇ、１５００μｇ、２０００μｇ、２５００μｇ、３０００μｇ、３５００μｇ、４０００μｇ、４５００μｇ、５０００μｇ、５５００μｇ、６０００μｇ、６５００μｇ、７０００μｇ、７５００μｇ、８０００μｇ、８５００μｇ、９０００μｇ、９５００μｇ、１００００μｇが含まれ得る。さらに、本発明の細胞株およびデバイスは、この治療量を少なくとも３ヶ月間発現することができる。
【０１６４】
本発明の種々の実施形態によって処置することができる眼科障害には、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性網膜症、網膜血管疾患、血管形成異常、加齢性黄斑変性および他の後天性障害、眼内炎、感染症、炎症性であるが非感染性の疾患、ＡＩＤＳ関連障害、眼虚血症候群、妊娠関連障害、周辺部網膜変性、網膜変性、毒素性網膜症、網膜腫瘍、脈絡膜腫瘍、脈絡膜障害、硝子体障害、網膜剥離および増殖性硝子体網膜症、非穿通性外傷、穿通性外傷、白内障後合併症、および炎症性視神経症が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６５】
当業者は、加齢性黄斑変性には、湿性および乾性加齢性黄斑変性、滲出性加齢性黄斑変性、および近視性変性が含まれるが、これらに限定されないと認識するであろう。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、処置すべき障害は、湿潤型の加齢性黄斑変性または糖尿病性網膜症である。本発明はまた、眼血管新生（多数の眼の疾患および障害に関連する容態）の処置に有用であり得る。例えば、網膜虚血関連眼血管新生は、糖尿病および多数の他の疾患における失明の主な原因である。
【０１６７】
本発明の細胞株および低温保存デバイスを使用して、眼症候群および非癌症候群の両方を有する疾患または容態に起因する眼の症状を処置することもできる。いくつかの例には、ＡＩＤＳにおけるサイトメガロウイルス網膜炎ならびに他の容態および硝子体障害；妊娠の結果としての網膜の高血圧性変化；種々の感染症（結核、梅毒、ライム病、寄生虫病、イヌ回虫、眼モリニア症、嚢虫症、および真菌感染など）の眼への影響が含まれる。
【０１６８】
デバイスおよび細胞株を使用して、他の眼内血管新生ベースの疾患に関する容態を処置することもできる。例えば、かかる血管新生は、糖尿病性網膜症、網膜中心静脈閉塞、および、おそらく、加齢性黄斑変性などの疾患で生じ得る。角膜血管新生は、視力を妨害し、患者に角膜生着不全を起こし易くするので、主要な問題である。重篤な失明の大部分は、眼球の血管新生に至る障害に関連する。
【０１６９】
本発明はまた、眼球環境内または体内の所望の標的部位の外側における細胞増殖性障害（例えば、血液学的障害、アテローム性動脈硬化症、炎症、血管透過性の増大、および悪性疾患など）を処置するためのサイトカイン、神経栄養因子、可溶性受容体、抗血管新生抗体および抗血管新生分子、または生物学的に活性な分子の送達方法に関する。
【０１７０】
本明細書中に記載のデバイスおよび技術の使用により、他の送達経路を超えるいくつかの利点が得られる。生物学的に活性な分子を眼に直接送達させることができ、これにより、望ましくない周囲の副作用が軽減されるか最小になり、局所適用と比較して非常に少用量の生物学的に活性な分子（すなわち、ミリグラムよりもむしろナノグラムまたは低マイクログラムの量）を送達させることができる、それにより、副作用を潜在的に軽減することもできる。さらに、生存細胞が新規に合成された生物学的に活性な分子を持続的に産生するので、これらの技術は、注射間で用量が非常に変動し、生物学的に活性な分子が持続的に分解されるが持続的に補充されない生物学的に活性な分子の注射送達より優れているはずである。
【０１７１】
生物学的に活性な分子を分泌するように遺伝子操作された生細胞および細胞株を、本発明のデバイスに被包し、（球後麻酔下で）眼の任意の適切な解剖学的構造に外科的に挿入することができる。例えば、デバイスを眼の硝子体に外科的に挿入することができ、ここで、除去を助けるためにデバイスを強膜に係留することができる。所望の予防または治療を得るために必要である限り、デバイスを硝子体内に留まらせることができる。例えば、所望の治療には、ニューロンまたは光受容体の生存または修復の促進、または網膜もしくは脈絡膜の血管新生の阻害および／もしくは逆転、ならびにブドウ膜、網膜、および視神経の炎症の阻害が含まれ得る。硝子体置換を使用して、生物学的に活性な分子を、網膜または網膜色素上皮（ＲＰＥ）に送達させることができる。
【０１７２】
他の実施形態では、細胞負荷デバイスを、硝子体内への植込みよりも侵襲性が低い眼周囲（テノン嚢として公知の空間内または空間下）に植込む。したがって、硝子体出血および／または網膜剥離などの合併症が潜在的に排除される。この投与経路により、本明細書中に記載の生物学的に活性な分子をＲＰＥまたは網膜に送達させることも可能である。眼周囲植込みを、脈絡膜血管新生ならびに視神経およびブドウ膜路の炎症の処置のために使用することができる。一般に、眼球周囲植込み部位からの送達により、脈絡膜脈管構造、網膜脈管構造、および視神経への生物学的に活性な分子の循環が可能であろう。
【０１７３】
本明細書中に記載のデバイスおよび方法を使用した生物学的に活性な分子（抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体など）の脈絡膜脈管構造（眼周囲）または硝子体（眼内）への直接送達により、先行技術の処置方法およびデバイスに関連する問題を軽減または緩和することができ、定義が不十分であるか潜在性の脈絡膜血管新生を処置し、付加療法または維持療法によって再発性脈絡膜血管新生を軽減または防止する方法を提供することができる。
【０１７４】
解凍後、本発明の低温保存生体適合性デバイスの植込みを、滅菌条件下で行う。デバイスを、シリンジまたは当業者に公知の任意の他の方法を使用して植込むことができる。一般に、デバイスを、レシピエントへの分泌された産物または機能の適切な送達および組み込んだ細胞または組織への栄養素の適切な送達を可能にし、回収および／または置換のためにデバイスにアクセスすることも可能なレシピエントの体内の部位に植込む。多数の異なる植込み部位が意図される。これらには、例えば、眼房水、硝子体液、テノン嚢下、眼周囲間隙、および前眼房が含まれる。免疫学的特権が与えられていない植込み部位（眼周囲部位ならびに前眼房（眼房水）および後眼房（硝子体）の外側の他の領域など）のためにカプセルは免疫隔離性を示す。
【０１７５】
デバイス内に固定された細胞が植込み前後の両方で適切に機能することを検証することが好ましい。当該分野で周知の任意のアッセイまたは診断試験を、これらの目的のために使用することができる。例えば、分泌された生物学的に活性な分子に特異的なＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、クロマトグラフアッセイまたは酵素アッセイ、またはバイオアッセイを使用することができる。必要に応じて、インプラントの分泌機能を、レシピエントからの適切なサンプル（例えば、血清）の回収およびサンプルのアッセイによって経時的にモニタリングすることができる。
【０１７６】
本発明は、以下の実施例でさらに説明されるであろう。これらの実施例は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を制限しない。
【実施例】
【０１７７】
実施例１：デバイスの特徴付けおよび植込みの結果
細胞株の安定性研究
組換え細胞株の製造可能性の１つの基準は、クローン拡大による産生限度である。４０世代のクローン細胞の成長および産生性の分析によって排出安定性が確認され、マスターセルバンク（約１７継代まで）およびワーキングセルバンク（約２３継代まで）の作製のための十分な情報が提供されると算定された。１つのワーキングセルバンクは、少なくとも１００，０００，０００デバイスの製造に十分であると算定される。ｐ８３４−１０−５細胞株の連続継代により、アッセイした一連の時点で平均排出１０．４ｐｃｄ（ピコグラム／細胞／日）にて組織培養において４０世代までの安定性が明らかとなった（図２を参照のこと）。
【０１７８】
デバイス排出のタイムコース研究
ｐ８３４−１０−５細胞株を、研究用セルバンクのアリコートから拡大させ、デバイス充填前に拡大させた。細胞を、ポリスルホン半透性膜を使用して構築した壁を有し、細胞付着のためのポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）糸を充填した６ｍｍのＥＣＴデバイスへの注射によって被包した。デバイスを、栄養培地を有する密封容器の一次パッケージングに個別に入れ、３７℃で１０週間インキュベーションした。インキュベーション保持のタイムコース中、組換えタンパク質の排出を、パッケージングからの取り出しおよびＥＬＩＳＡによるｐ８３４−１０−５タンパク質分泌のアッセイによってＥＣＴデバイスから定期的に調査した。結果は、４８０ｎｇ／デバイス／日のｐ８３４−１０−５タンパク質の最初のデバイス排出、６週間後の約６０ｎｇ／デバイス／日のベースライン排出までの段階的減少を示す。図３では、２つのデバイスの組織学的切片によって８３４−１０−５細胞成長の内部的頑健性が明らかとなり、これは１ヶ月間のデバイス培養を通した高い生存性を証明している。
【０１７９】
ｐ８３４ＶＥＧＦＲ構築物を分泌するように遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞を含むデバイスは、植込みの１ヶ月後および３ヶ月後に優れた安全性プロフィールを示した。さらに、これらのデバイス（「ＮＴ−５０３デバイス」）は、植込みの１ヶ月後および３ヶ月後にｉｎ  ｖｉｖｏで安定である。
【０１８０】
表１は、これらのＮＴ−５０３デバイスについてのＰＫデータを示す。
【０１８１】
【表１】
2015519370.tif 000006
表２は、ＮＴ−５０３デバイスの貯蔵安定性の結果を示す。
【０１８２】
【表２】
2015519370.tif 000007
ｉｎ  ｖｉｔｒｏデバイスの排出およびｉｎ  ｖｉｖｏ性能（硝子体内レベルについて測定）の両方は、ＮＴ−５０３デバイスについて安定性が維持されていた。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ保持期間および対応する植込んだＮＴ−５０３デバイスのｉｎ  ｖｉｖｏ性能の評価により、４週間までの貯蔵期間安定性が証明される。
【０１８３】
最後に、可能なら、４週間を超えるＮＴ−５０３デバイスの貯蔵期間の延長（すなわち、本発明にしたがったデバイスの低温保存による）を試み続ける。
【０１８４】
実施例２：動物研究
パッケージングの４週間後、デバイスを、非免疫抑制ニュージーランドホワイトウサギの眼に植込んだ。植込みから１ヶ月後および３ヶ月後のｐ８３４−１０−５排出を決定するために、動物を眼球摘出し、ｐ８３４−１０−５濃度を抽出した硝子体から定量し、拡大デバイスの産生性と比較した。植込み１ヶ月後、拡大デバイスは１００ｎｇ／ｍｌ／日を超えるｐ８３４−１０−５タンパク質を産生し、定常状態の硝子体内濃度は２５０ｎｇ／ｍｌ超であった。植込み３ヶ月後、拡大デバイスは、２００ｎｇ／ｍｌ超を産生し続けた一方で、硝子体内濃度は７００ｎｇ／ｍｌ超で検出された（表３を参照のこと）。１年後、ウサギの硝子体サンプルは、３５０ｎｇ／ｍｌのｐ８３４−１０−５タンパク質を含んでおり、１２ヶ月にわたる組換え受容体の継続産生が証明された。
【０１８５】
図４に示すように、植込み３ヶ月後の拡大デバイスの組織学的検査により、図３に示す容器保持デバイス由来のサンプルで認められる細胞形態に類似する頑健な細胞成長が明らかとなった。動物眼科医が定期的に試験したところ、研究中の処置ウサギの眼内に臨床的に有意な有害事象は認められなかった。
【０１８６】
【表３】
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実施例３：反復遺伝子投与により組換えタンパク質産生が増加する
反復トランスフェクションを使用して、特にｐ８３４ｃＤＮＡの遺伝子投薬量を増加させた。同一の８３４ｃＤＮＡを有する以下の３つの発現プラスミドを産生した：ｐ８３４ｐＣｐＧビトロフリー（ブラストサイジン耐性）、ｐ９１０ｐＣｐＧビトロフリー（ネオマイシン耐性）、およびｐ９６９ｐＣｐＧビトロフリー（ハイグロマイシン耐性）。ｐ９１０をブラストサイジン耐性ｐ８３４−１０−５細胞株にトランスフェクションし、得られた二重インテグラントクローンを、ネオマイシン選択の適用によって回収した。ｐ８３４−１０−５のＰＣＤ排出レベルが超過したサブクローンを単離した。図５に示すように、最初の１倍（「１×」）トランスフェクションにより、裸細胞排出レベル（ＦｃＥＬＩＳＡ）が１５〜２０ＰＣＤの上記ｐ８３４−１０−５細胞株が得られた。トランスフェクションおよび親８３４−１０−５クローンからのｐ９１０の選択により、排出レベルが３５〜４０ＰＣＤの９１０（８３４−１０−５）−４−４７クローンを得た。ｐ９６９の９１０（８３４−１０−５）−４−４７サブクローンへの反復トランスフェクションおよび選択によって多数のハイグロマイシン耐性ｐ９６９由来クローンが得られ、最初の分離株の組換えタンパク質の分泌レベルは５０ＰＣＤから１００ＰＣＤ超までの範囲であった。３つ全ての遺伝子組込み事象由来の発現の維持を、各ブラストサイジン、ハイグロマイシン、およびネオマイシン培養培地中での９６９クローン株の培養によって確認した。組換えタンパク質のプレート結合ＶＥＧＦへの直接結合およびその後の抗ヒトＦｃを使用した検出に基づいたＥＬＩＳＡアッセイによって決定したところ、力価喪失が最小であることが証明された三重トランスフェクションクローンが存在していた。驚いたことに、３×トランスフェクションに基づいた遺伝子投薬量の単純な算術加算の８倍までの値の組換えタンパク質が検出された。これは、予想外の相乗的生物学的選択が連続トランスフェクション（例えば、反復トランスフェクションプロセスの使用）による遺伝子投薬量の増加に関与することが示唆される。
【０１８７】
実施例４：反復トランスフェクションした細胞株による用量漸増の前臨床研究
実施例２中の方法後、二重トランスフェクタント細胞株９１０（８３４−１０−５）−４−４７および三重トランスフェクタント細胞株９６９（９１０（８３４−１０−５）−４−４７）−３３を使用してＥＣＴデバイスを生成し、その後にウサギに植込んだ。植込みの１ヶ月後、ウサギを眼球摘出し、硝子体を抽出して８３４タンパク質レベルを定量した。同時に、デバイスを外科的に取り出し、拡大デバイスを細胞成長培地中でさらに培養して、組換えタンパク質のデバイス産生性を確認した。表４に示すように、９１０および９６９デバイスからの排出により、８３４を１回トランスフェクションしたタンパク質を用いて観察されたレベルよりもそれぞれほぼ５倍および１０倍の８３４タンパク質の定常状態硝子体内レベルが得られた（表４）。細胞株ＰＣＤ排出データと一致して、再度連続トランスフェクションした遺伝子用量の単純な相加作用によって予想されるよりも高い定常状態濃度の８３４タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで認められた（表５対表３）。これは、反復トランスフェクション法に起因する相乗的分泌増強の予想外の相乗的生物学的選択が示唆された。
【０１８８】
【表４】
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【０１８９】
【表５】
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実施例５  被包された細胞の低温保存
９１０（８３４−１０−５）−４−４７細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で３×１０６細胞／Ｔ−１７５フラスコを播種して増殖させた。５％ＣＯ２および３７℃の湿度制御インキュベーター内で３日間の成長後、細胞をトリプシン処理し、１０ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘおよび抗凍結剤としての１０％グリセロールを補足したＨｙｃｌｏｎｅ  ＳＦＭ４  ＭｅｇａＶｉｒ培地中で１００，０００細胞／μｌに再懸濁した。
【０１９０】
８ｍｍ  ＥＣＴデバイスに１×１０６細胞を負荷し、その後にカプセルを完全に閉じることによって細胞を被包した。全部で１８のＥＣＴデバイスを生成した。次いで、ＥＣＴデバイスを、抗凍結剤も含む１ｍｌ凍結保存培地を含む２ｍｌの低温貯蔵用バイアルに入れた。次いで、ＥＣＴデバイスを含む低温貯蔵バイアルを、１℃／分刻みのレート制御凍結容器（Ｍｒ．ＦｒｏｓｔｙまたはＣｏｏｌ  Ｃｅｌｌ）を使用して−８０℃まで凍結した。２日後、低温貯蔵用バイアルを−８０℃から取り出し、直ちに気相式液体窒素貯蔵器に入れた。
【０１９１】
低温貯蔵インプラントを低温保存１週間後および１ヶ月後ならびに１年後に評価した。各時点で、低温貯蔵用バイアルを気相式液体窒素貯蔵から取り出し、ＥＣＴデバイスを３７ｍｌのＨｙｃｌｏｎｅ  ＳＦＭ４  ＭｅｇａＶｉｒ培地に入れ、標準的な組織培養条件下に保持した。６日後、ＥＣＴデバイスを、ＣＣＫ−８比色アッセイを使用して細胞コンフルエンスについてアッセイし、ＶＥＧＦＲ排出をＦｃＥＬＩＳＡによって測定した。その後にＥＣＴデバイスを固定し、細胞成長特性の調査のために組織学的切片を染色した。抗凍結剤の非存在下での細胞の凍結によって細胞が死滅し（図７Ｂ）、デバイスからＶＥＧＦＲは分泌されなかった（図８Ａ）。低温保存した細胞は、正常な培養ＥＣＴデバイス（図７Ａ）と同一の頑健な成長を示し（図７Ｃ、７Ｄ、７Ｅ）、１週間、１ヶ月間、および１年間保存後の各時点で、高いＶＥＧＦＲ発現を示す（図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ）。低温保存したインプラントの細胞の生存度、分布、およびＶＥＧＦＲ分泌は、従来の環境制御条件下で保存したインプラントと比較して予想されるレベルである。
【０１９２】
均等物
１つ以上の本発明の実施形態の詳細を、上記の添付の説明に記載している。本明細書中に記載のものと類似するか均等である任意の方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができるにもかかわらず、好ましい方法および材料をここに記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明または特許請求の範囲から自明であろう。文脈上そうでないと明確に示されない限り、明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形には複数形が含まれる。他で定義されていない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。本明細書中に引用した全ての特許および刊行物は、参考として援用される。
【０１９３】
前述の説明は、本発明の例示のみを目的として記載されており、開示の厳密な形態に本発明を制限することを意図しておらず、本発明は添付の特許請求の範囲によって制限される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【国際調査報告】
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