(57)【要約】  本発明は、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物の新規な治療的使用に関する。特に、本発明は、多発性硬化症の治療におけるこれらの化合物の治療的使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＳにおける障害の進行の緩徐化、休止または逆転において使用するための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物。
【請求項２】
前記化合物が、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾールもしくは４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル；またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物が、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物が、５〜５００マイクログラム／日の用量でヒトに経口投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物が、１０〜１５０マイクログラム／日の用量でヒトに経口投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
ＭＳにおける障害の進行を緩徐化、休止または逆転する方法であって、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物の治療上有効な量を患者に投与することを含んでなる、方法。
【請求項７】
前記化合物が、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾールもしくは４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル；またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、またはその薬学的に許容される塩である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物を５〜５００マイクログラム／日の用量でヒトに経口投与することを含んでなる、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物を１０〜１５０マイクログラム／日の用量でヒトに経口投与することを含んでなる、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
脱髄疾患の治療において使用するための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物。
【請求項１２】
前記化合物が、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾールもしくは４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル；またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記化合物が、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１１または１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物の治療上有効な量を患者に投与することを含んでなる、脱髄疾患を治療する方法。
【請求項１５】
前記化合物が、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾールもしくは４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル；またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物が、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
再有髄化の促進において使用するための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである、化合物。
【請求項１８】
前記化合物が、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾールもしくは４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル；またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
前記化合物が、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１７または１８に記載の化合物。
【請求項２０】
５〜５００マイクログラムの１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩と、１種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含んでなる、ＭＳの治療において使用するためにヒトに経口投与するための医薬組成物。
【請求項２１】
１０〜１５０マイクログラムの１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩を含んでなる、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾール、またはその薬学的に許容される塩である化合物。
【請求項２３】
ＭＳの治療において使用するための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物あって、前記化合物が、１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）−プロピル）ピペリジンもしくは（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オン、またはそれらの薬学的に許容される塩である、化合物。
【請求項２４】
前記化合物が、１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）−プロピル）−ピペリジンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
前記化合物が、（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物であって、前記化合物が、１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）−プロピル）ピペリジンもしくは（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オン、またはそれらの薬学的に許容される塩である、前記化合物の治療上有効な量を患者に経口投与することを含んでなる、ＭＳを治療するための方法。
【請求項２７】
前記化合物が、１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）−プロピル）−ピペリジンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物が、（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
脱髄疾患の治療において使用するための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物であって、前記化合物が、１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）−プロピル）ピペリジンもしくは（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オン、またはそれらの薬学的に許容される塩である、化合物。
【請求項３０】
前記化合物が、１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）−プロピル）−ピペリジンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３１】
前記化合物が、（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項２９に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物の新規な治療的使用に関する。特に、本発明は、多発性硬化症の治療におけるこれらの化合物の治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系を侵す慢性炎症性の脱髄疾患である。ＭＳにおける基本的傷害は、炎症により媒介されるＣＮＳの軸索の脱髄であり、これは免疫系機能の変化によって生じると考えられる。脱髄は、軸索に対する栄養補助の低下、イオンチャネルの再分布、および活動膜電位の不安定化をもたらし得る。軸索は、最初は適応するが、やがて遠位逆行性変性が起こり、その後、障害の発生をもたらし得る。
【０００３】
ＭＳの過程で脱髄イベントに対抗するために内在的ＣＮＳ修復機構が存在するという証拠が増えつつある。この再有髄化(remyelination)のプロセスは、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）と呼ばれる前駆細胞集団によって媒介される。検死データおよび実験研究は、ＭＳにおける再有髄化の不全の主因としてＯＰＣ分化の不全を指摘している。従って、ＯＰＣ分化およびオリゴデンドロサイトの保護による再有髄化の早期促進は、ＭＳにおける重要な標的である。脱髄イベントの後、脱髄領域にＯＰＣが急速に動員および増幅され、そこでそれらはミエリン形成オリゴデンドロサイトを生じる。病変部が発達すると、著しい星状細胞増殖が見られる（神経膠症）。生残しているオリゴデンドロサイトまたは前駆細胞から分化するものは、生残している裸の軸索を部分的に再有髄化して、いわゆるシャドウプラーク(shadow plaques）を生成し得る。一次性脱髄に応答した再有髄化は文献に十分示されており、一部の個体で驚くほど効果的である場合があるが、十分に理解されていない理由のためにＭＳの過程で上手くいかないことも多い。結果として、十分に再有髄化された病変部は比較的少なくなる。代わりに、多くの病変部で、再有髄化が完全にできず、病変部の端に新たに形成されたミエリン鞘の小さな縁に限定されたままとなっているのが見られる。さらに、多くの病変部で、ＯＰＣは多数存在するが、分化ができないことも示されており、ＯＰＣ分化の増強がＭＳにおける再有髄化の実行可能な標的であるという仮説を裏付ける(Kotter et al. Enhancing remyelination in disease - can we wrap it up? Brain (2011) 134: 1882-1990)。
【０００４】
ＭＳの初期段階では、急激に高まった疾病活動の短期間に炎症性発作が起こる。これらのエピソードの後に回復および寛解期がくる。この寛解期の間に、神経系病変部の局部的腫脹が消散し、免疫細胞が低活性または不活性となり、ミエリン産生細胞が軸索を再有髄化する。神経シグナル伝達は向上し、炎症によって生じた障害および脱髄は重篤性が低くなるか、または完全に消失する。この疾病期は再発寛解型ＭＳ(Relapsing-Remitting multiple sclerosis)（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。とはいっても、これらの病変部は総てが完全に治癒するわけではない。「慢性」病変としてとどまるものもあり、これらは通常、免疫細胞を欠いた脱髄コア領域を有する。時間が経つにつれ、このような病変部の中央のニューロンはほとんど死滅するが、それらの端部では炎症が続く場合が多い。脳はいくつかのニューロンの損失には十分適応することができ、永続的障害は何年も起こらない場合がある。しかしながら、５０％を超えるＭＳ患者がやがて二次進行型ＭＳ(secondary progressive multiple sclerosis)（ＳＰＭＳ）と呼ばれる進行性の悪化の段階に入る。この段階で、この疾病はもはや疾病修飾薬には十分奏功せず、患者の障害は着実に悪化する。ＭＳの自然経過の初期からのニューロンの破壊は、ＭＳの進行性障害やがては脳の補償能を圧倒するニューロン損失の蓄積の結果であり得ることを示唆する。一次進行型ＭＳは再発のないタイプの多発性硬化症であるが、何年もの間に、身体機能および認識機能の段階的損失が見られる。
【０００５】
多発性硬化症の症状および疾病経過は人によって異なり得るが、３つの形態の疾患、すなわち、再発寛解型ＭＳ、二次進行型ＭＳ、および一次進行型ＭＳが存在する。
【０００６】
現在ＭＳの治療に関して承認されている療法は総て、発作の回数を減らす働きをする。これらの療法は免疫調節剤であり、免疫調節剤は基本的にＭＳの経過を変更しない代わりに、総合障害度評価基準(The Expanded Disability Status Scale)（ＥＤＳＳ）によって評価されるような再発の低減および疾病進行の緩徐化にある程度の効果を提供する。研究によれば、現行の療法が再発をおよそ３０〜６８％減らし、持続的障害の相対的リスクを受けている再発性ＭＳ患者のパーセンテージを３０〜４２％の範囲内で低減することが示されている(Havrdova et al. (2010) Neurology 74: (suppl 3), S3-S7)。さらに、第Ｉ相臨床開発中のＢＩＩＢ０３３（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）などの抗体があり、これは主要な神経保護／神経再生有効性を提供することを目的としたものである。前臨床データは、ＢＩＩＢ０３３は軸索および／またはミエリンの損傷を修復する働きをし得ることを示唆している(Mi et al. (2007) Nature Medicine 13: 1228-1233)。
【０００７】
ヒスタミンＨ３受容体のアンタゴニストおよびインバースアゴニストは、多くの特許出願に開示されている。Ｈ３受容体は主として哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）で発現されることが確認されており、いくつかの交感神経系を除いて末梢組織での発現は最小である(Leurs et al. (1998) Trends Pharmacol. Sci. 19: 177-183)。選択的アゴニストまたはヒスタミンによるＨ３受容体の活性化は、ヒスタミン作動性およびコリン作動性ニューロンを含む、様々な異なる神経集団からの神経伝達物質の放出の阻害をもたらす(Schlicker et al. (1994) Fundam. Clin. Pharmacol. 8: 128-137）。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、Ｈ３アンタゴニストは、大脳皮質および海馬などの、認知に関連する脳領域において神経伝達物質の放出を助長することができることを示している(Onodera et al. (1998) In: The Histamine H3 receptor, ed Leurs and Timmerman, pp255-267, Elsevier Science B.V.)。さらに、文献におけるいくつかの報告が、５選択課題、物体認識、高架十字迷路、新規課題の習得および受動回避を含む、齧歯類モデルにおけるＨ３アンタゴニスト（例えば、チオペラミド、クロベンプロピット、シプロキシファンおよびＧＴ−２３３１）の認知増強特性を証明している(Giovanni et al. (1999) Behav. Brain Res. 104: 147-155)。アンタゴニストおよびパーシャルアゴニスト(partial agonisists)が神経疾患における認知障害の治療で使用するために検討されている。
【発明の概要】
【０００８】
今般、Ｈ３受容体が分化中のオリゴデンドロサイト上で発見された。さらに、Ｈ３受容体インバースアゴニストとして働く化合物がオリゴデンドロサイト前駆体の分化を促進することが示された。本発明者らはまた、Ｈ３受容体のインバースアゴニストがオリゴデンドロサイト前駆体の分化の増大によって再有髄化を増強し得ることを示した。よって、Ｈ３受容体のインバースアゴニストは、ＭＳおよびその他の脱髄疾患を治療するための新規な療法として使用可能である。
【０００９】
本発明の第１の面では、ＭＳの治療において使用するための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物が提供され、前記治療によって障害の進行は緩徐化、休止または逆転する。本発明の別の面では、ＭＳにおける障害の進行の緩徐化、休止または逆転において使用するための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物が提供される。
【００１０】
本発明の一実施態様において、前記化合物は、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩である。
【００１１】
本発明は、５〜５００マイクログラム／日の用量での経口投与による、ヒトでのＭＳの治療において使用するための、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩を提供する。一実施態様において、本発明は、ヒトでのＭＳの治療において、経口投与用として１０〜１５０マイクログラム／日の用量で使用するための、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩を提供する。別の実施態様において、本発明は、ヒトでのＭＳの治療において、経口投与用として約８０マイクログラム／日の用量で使用するための、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１２】
本発明の第２の面では、再有髄化の促進において使用するための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物が提供される。
【００１３】
本発明の一実施態様において、Ｈ３受容体インバースアゴニストは、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩である。
【００１４】
本発明の第３の面では、脱髄疾患の治療において使用するための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物が提供される。
【００１５】
本発明の一実施態様において、Ｈ３受容体インバースアゴニストは、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩である。
【００１６】
第４の面において、本発明は、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物を含んでなる、ヒトに経口投与するための医薬組成物であって、ＭＳまたは脱髄疾患の治療における使用のための医薬組成物を提供する。一実施態様において、前記医薬組成物は、１日当たり５〜５００マイクログラムの、ヒトへの経口投与において使用するための１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩を含んでなる。一実施態様において、前記医薬組成物は、１日当たり１０〜１５０マイクログラムの、ヒトへの経口投与において使用するための１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩を含んでなる。一実施態様において、前記医薬組成物は、１日当たり約８０マイクログラムの、ヒトへの経口投与において使用するための１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩を含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１ａ】ＯＰＣ分化アッセイにおけるＨ３Ｒ実施例化合物の効果を示す図である。
【図１ｂ】ＯＰＣ分化アッセイにおけるＨ３Ｒ実施例化合物の効果を示す図である。
【図１ｃ】ＯＰＣ分化アッセイにおけるＨ３Ｒ実施例化合物の効果を示す図である。
【図２】ＯＰＣ分化アッセイにおける成熟オリゴデンドロサイトマーカーの発現に対する、Ｈ３Ｒインバースアゴニストである実施例化合物２の効果を示す図である。
【図３ａ】ＯＰＣ分化アッセイにおけるＨ３Ｒインバースアゴニストである実施例化合物１の効果（ｎ＝２）を示す図である。
【図３ｂ】ＯＰＣ分化アッセイにおける実施例化合物１の効果（ｎ＝５）を示す図である。
【図４ａ】ＯＰＣ分化に対する、ｓｉＲＮＡによるＨ３Ｒノックダウンの効果を示す図である。
【図４ｂ】ＯＰＣ分化に対する、ｓｉＲＮＡによるＨ３Ｒノックダウンの効果を統計分析によって示す図である。
【図５ａ】クプリゾンモデルにおける再有髄化に対する実施例化合物１の効果（前脳、脳梁、ブラックゴールドＩＩ染色）を示す図である。
【図５ｂ】クプリゾンモデルにおける再有髄化に対する実施例化合物１の効果（後脳、脳梁、ブラックゴールドＩＩ染色）を示す図である。
【図５ｃ】クプリゾンモデルにおける再有髄化に対する実施例化合物１の効果の統計分析（脳梁、脱髄領域）を示す図である。
【図５ｄ】クプリゾンモデルにおける再有髄化に対する実施例化合物１の効果の統計分析（脳梁、平均強度）を示す図である。
【図５ｅ】クプリゾンモデルにおける再有髄化に対する実施例化合物２の効果（前脳、脳梁）を示す図である。
【図５ｆ】クプリゾンモデルにおける再有髄化に対する実施例化合物２の効果（前脳、皮質）を示す図である。
【図６ａ】一次性ＯＰＣにおけるｃＡＭＰの細胞内レベルに対する実施例化合物２の効果（ｎ＝１）を示す図である。
【図６ｂ】一次性ＯＰＣにおけるｃＡＭＰの細胞内レベルに対する実施例化合物２の効果（ｎ＝２）を示す図である。
【図７】Ｈ３Ｒへの基礎的ＧＴＰγＳ結合に対する実施例化合物１の効果を示す図である。
【発明の具体的説明】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明の第１の面では、ＭＳの治療において使用するための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物が提供され、前記治療によって障害の進行は緩徐化、休止または逆転する。本発明の別の面では、ＭＳにおける障害の進行の緩徐化、休止または逆転において使用するための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物が提供される。本発明の別の面では、ＭＳにおける障害の進行の休止または逆転において使用するための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物が提供される。本発明の別の面では、ＭＳにおける障害の進行の緩徐化において使用するための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物が提供される。
【００１９】
本発明の一実施態様において、前記化合物は、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾールもしくは４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル；またはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００２０】
本発明の一実施態様において、前記化合物は、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、またはその薬学的に許容される塩である。
【００２１】
本発明は、５〜５００マイクログラム／日の用量での経口投与による、ヒトでのＭＳの治療において使用するための１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩を提供する。一実施態様において、本発明は、ヒトでのＭＳの治療において、経口投与用として１０〜１５０マイクログラム／日の用量で使用するための、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩を提供する。別の実施態様において、本発明は、ヒトでのＭＳの治療において、経口投与用として約８０マイクログラム／日の用量で使用するための、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００２２】
また、ＭＳの治療用医薬の製造のためのＨ３受容体のインバースアゴニストである化合物の使用も提供され、前記治療によって障害の進行は緩徐化、休止または逆転する。本発明の別の面では、ＭＳにおける障害の進行の緩徐化、休止または逆転において使用するための医薬の製造のためのＨ３受容体のインバースアゴニストである化合物の使用が提供される。
【００２３】
本発明の一実施態様において、前記化合物は、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾールもしくは４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル；またはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００２４】
本発明の一実施態様において、前記化合物は、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、またはその薬学的に許容される塩である。
【００２５】
また、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物の治療上有効な量を患者に投与することを含んでなる、ヒトを含む哺乳動物におけるＭＳの治療方法も提供され、前記治療によって障害の進行は緩徐化、休止または逆転する。
【００２６】
本発明の一実施態様において、前記化合物は、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾールもしくは４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル；またはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００２７】
本発明の一実施態様において、前記化合物は、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、またはその薬学的に許容される塩である。
【００２８】
本発明は、ヒトに１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩を５〜５００マイクログラム／日の用量で経口投与することを含んでなる、ヒトにおけるＭＳの治療方法を提供し、前記治療によって障害の進行は緩徐化、休止または逆転する。一実施態様において、本発明は、ヒトに１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩を１０〜１５０マイクログラム／日の量で経口投与することを含んでなる、ヒトにおけるＭＳの治療方法を提供し、前記治療によって障害の進行は緩徐化、休止または逆転する。別の実施態様において、本発明は、ヒトに１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩を約８０マイクログラム／日の用量で経口投与することを含んでなる、ヒトにおけるＭＳの治療方法を提供し、前記治療によって障害の進行は緩徐化、休止または逆転する。
【００２９】
本発明の一実施態様において、前記治療は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の分化を促進することによって障害の進行を緩徐化、休止または逆転する。
【００３０】
本発明の第２の面では、再有髄化の促進において使用するための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物が提供される。
【００３１】
本発明の一実施態様において、前記化合物は、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾール、４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル；またはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００３２】
本発明の一実施態様において、Ｈ３受容体インバースアゴニストは、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、またはその薬学的に許容される塩である。
【００３３】
本発明の別の実施態様において、前記化合物は、１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）プロピル）−ピペリジン、（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オン、もしくは３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロピル４−クロロベンジルカルバムイミドチオエートジヒドロブロミド；またはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００３４】
また、再有髄化の促進のための医薬の製造のための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物の使用も提供される。
【００３５】
本発明の一実施態様において、前記化合物は、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾールもしくは４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル；またはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００３６】
本発明の一実施態様において、前記化合物は、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、またはその薬学的に許容される塩である。
【００３７】
本発明の別の実施態様において、前記化合物は、１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）プロピル）−ピペリジン、（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オン、もしくは３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロピル４−クロロベンジルカルバムイミドチオエートジヒドロブロミド；またはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００３８】
また、ヒトを含む哺乳動物において再有髄化を促進する方法であって、それを必要とする対象にＨ３受容体のインバースアゴニストである化合物の治療上有効な量を投与することを含んでなる方法も提供される。
【００３９】
本発明の一実施態様において、前記化合物は、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾールもしくは４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル；またはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００４０】
本発明の一実施態様において、前記化合物は、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、またはその薬学的に許容される塩である。
【００４１】
本発明の別の実施態様において、前記化合物は、１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）プロピル）−ピペリジン、（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オン、もしくは３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロピル４−クロロベンジルカルバムイミドチオエートジヒドロブロミド；またはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００４２】
本発明の第３の面では、脱髄疾患の治療において使用するための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物が提供される。
【００４３】
本発明の一実施態様において、前記化合物は、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾール、４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル；またはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００４４】
本発明の一実施態様において、前記Ｈ３受容体インバースアゴニストは、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、またはその薬学的に許容される塩である。
【００４５】
本発明の別の実施態様において、前記化合物は、１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）プロピル）−ピペリジン、（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オン、もしくは３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロピル４−クロロベンジルカルバムイミドチオエートジヒドロブロミド；またはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００４６】
また、脱髄疾患の治療のための医薬の製造のための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物の使用も提供される。
【００４７】
本発明の一実施態様において、前記化合物は、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾールもしくは４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル；またはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００４８】
本発明の一実施態様において、前記化合物は、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、またはその薬学的に許容される塩である。
【００４９】
本発明の別の実施態様において、前記化合物は、１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）プロピル）−ピペリジン、（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オン、または３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロピル４−クロロベンジルカルバムイミドチオエートジヒドロブロミド；またはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００５０】
また、ヒトを含む哺乳動物における脱髄疾患の治療方法であって、それを必要とする対象にＨ３受容体のインバースアゴニストである化合物の治療上有効な量を投与することを含んでなる方法も提供される。
【００５１】
本発明の一実施態様において、前記化合物は、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾールもしくは４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル；またはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００５２】
本発明の一実施態様において、前記化合物は、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、またはその薬学的に許容される塩である。
【００５３】
第４の面において、本発明は、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物と、１種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含んでなる、ヒトへの経口投与のための医薬組成物を提供する。一実施態様において、前記医薬組成物は、１日当たり５〜５００マイクログラムの、ヒトへの経口投与において使用するための１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩を含んでなる。一実施態様において、前記医薬組成物は、１日当たり１０〜１５０マイクログラムの、ヒトへの経口投与において使用するための１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩を含んでなる。一実施態様において、前記医薬組成物は、１日当たり約８０マイクログラムの、ヒトへの経口投与において使用するための１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩を含んでなる。
【００５４】
第５の面において、本発明は、ＭＳの治療において使用するための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物を提供する。一実施態様において、Ｈ３受容体インバースアゴニストは、１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）プロピル）−ピペリジン、またはその薬学的に許容される塩である。一実施態様において、前記Ｈ３受容体インバースアゴニストは、（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オン、またはその薬学的に許容される塩である。
【００５５】
また、ＭＳの治療用医薬の製造のための、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物の使用が提供される。一実施態様において、前記Ｈ３受容体インバースアゴニストは、１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）プロピル）−ピペリジン，またはその薬学的に許容される塩である。一実施態様において、前記Ｈ３受容体インバースアゴニストは、（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オン、またはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００５６】
また、ヒトを含む哺乳動物におけるＭＳの治療方法であって、患者にＨ３受容体のインバースアゴニストである化合物の治療上有効な量を投与することを含んでなる方法も提供される。一実施態様において、前記Ｈ３受容体インバースアゴニストは、１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）プロピル）−ピペリジン、またはその薬学的に許容される塩である。一実施態様において、前記Ｈ３受容体インバースアゴニストは、（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オン、またはその薬学的に許容される塩である。
【００５７】
本明細書で用いられるＨ３受容体のインバースアゴニストは、不活性型コンフォメーションのＨ３受容体を安定化する化合物である。この安定化は受容体のＧタンパク質への自発的結合の低下をもたらし、それにより，構成的活性を抑制する。構成的活性の不在下では、インバースアゴニストはアンタゴニストとして挙動するので、これまでの文献の多くは、化合物をＨ３アンタゴニストおよび／またはインバースアゴニストとして記載している。Ｈ３受容体のインバースアゴニスト作用(inverse agonisim)およびそのアッセイが報告されている(Constitutive Activity of Histamine H3 Receptors Stably Expressed in SK-N-MC Cells: Display of Agonism and Inverse Agonism by H3 Antagonists, Wieland et al. (2001) JPET 299:908-914)。
【００５８】
Ｈ３受容体のインバースアゴニストはまた、機能的には、Ｈ３受容体に結合し、同時にｃＡＭＰの細胞内レベルを上昇させ、かつ、ｃＡＭＰ経路を活性化する化合物と定義することもできる。
【００５９】
多発性硬化症を有する個体の神経障害の測定は、様々な機能システムを評価する基準を使用することによって達成され、最も広く使用されているのは、総合障害度評価基準（ＥＤＳＳ）または多発性硬化症機能評価(Multiple Sclerosis Functional Composite)（ＭＳＦＣ）である。ＥＤＳＳでのスコアは０（正常な神経学的判定）〜１０．０（死）の範囲である。ＭＳＦＣは、腕および手の器用さ、歩行速度および認知を測定する３つの成分からなる。これらの基準は、個々の患者の障害の進行を評価する目的と、大規模臨床研究で現在承認されている治療の影響を測定する目的の両方に使用されている。臨床試験の治療効果は、集団全体の平均変化としてまたは所与の期間にわたって持続した所与の変化を持つ対象の数として評価することができる。
【００６０】
現在承認されている治療に、ＥＤＳＳまたはＭＳＦＣにより測定される障害進行の休止または逆転も障害進行の有意な緩徐化も明らかに示されているものはない。
【００６１】
Ｈ３インバースアゴニストによる治療は、再有髄化を促進すると予測される。再有髄化によって起こり得る２つの転帰は、ａ）正常な神経インパルス伝導（跳躍伝導）の回復、それによって起こり得る障害／不全の逆転；およびｂ）急性または慢性変性機構からの軸索の保護、それによる軸索損失およびその結果として生じる障害進行の予防である。障害は、ＥＤＳＳおよびＭＳＦＣなどの機能基準を用いて測定することができる。
【００６２】
本発明の別の面では、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾール、またはその薬学的に許容される塩である化合物が提供される。
【００６３】
合成法
１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、およびその薬学的に許容される塩は、ＷＯ２００４／０５６３６９に言及されている方法によるか、またはＷＯ２００５／１２３７２３に言及されている方法によって製造することができる。
【００６４】
４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル、およびその薬学的に許容される塩は、ＷＯ２００５／０１４５７１に記載されているように製造することができる。
【００６５】
３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾールは、下記のスキーム１に従って製造することができる。
【化１】
2015503598.tif 000002
【００６６】
医薬に使用される可能性があるため、本発明の化合物の塩は薬学的に許容されることが望ましい。好適な塩に関する総説としては、Berge et al., J. Pharm. Sci., 66:1-19, (1977)を参照。一般に、薬学的に許容される塩は、必要に応じて、所望の酸または塩基を使用することによって容易に製造することができる。得られた塩は、溶液から沈殿させて濾取してもよいし、溶媒の蒸発により回収してもよい。
【００６７】
薬学的に許容される塩基付加塩は、場合により好適な溶媒中で、本発明の化合物を好適な無機または有機塩基（例えば、トリエチルアミン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、コリン、アルギニン、リシンまたはヒスチジン）と反応させて塩基付加塩を得ることによって形成させることができ、これは通常、例えば結晶化および濾過によって単離される。薬学的に許容される塩基塩としては、アンモニウム塩、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウムおよびカリウムの塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウムおよびマグネシウムの塩）ならびに有機塩基との塩（イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミンおよびＮ−メチル−Ｄ−グルカミンなどの第一級、第二級および第三級アミンの塩を含む）が挙げられる。
【００６８】
薬学的に許容される酸付加塩は、場合により、有機溶媒などの好適な溶媒中で、本発明の化合物を好適な無機または有機酸（例えば、臭化水素酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、コハク酸、マレイン酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、安息香酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸などのナフタレンスルホン酸、またはヘキサン酸）と反応させて塩を得ることによって形成させることができ、これは通常、例えば結晶化および濾過によって単離される。本発明の化合物の薬学的に許容される酸付加塩は、例えば、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩（例えば、２−ナフタレンスルホン酸塩）またはヘキサン酸塩を含んでなり得るか、またはこれらであり得る。
【００６９】
他の薬学的に許容されない塩、例えば、ギ酸塩、シュウ酸塩またはトリフルオロ酢酸塩も、例えば本発明の化合物の単離において使用可能であり、本発明の範囲に含まれる。
【００７０】
１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンの薬学的に許容される塩には、ＷＯ２００４／０５６３６９に記載されているものが含まれる。４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリルの薬学的に許容される塩には、ＷＯ２００５／０１４５７１に記載されているものが含まれる。３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾールの薬学的に許容される塩、特に上記のような酸付加塩は上記のように製造することができ、これらには特に塩酸塩が含まれる。
【００７１】
使用
Ｈ３受容体のインバースアゴニストおよびそれらの薬学的に許容される塩、特に１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンおよびその薬学的に許容される塩は、ＭＳにおける障害の進行の緩徐化、休止または逆転において使用することができる。一面において、Ｈ３受容体のインバースアゴニストおよびそれらの薬学的に許容される塩、特に１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンおよびその薬学的に許容される塩は、正常な神経インパルス伝導（跳躍伝導）の回復による再有髄化の促進、それによって起こり得る障害／不全の逆転において使用することができる。別の面において、Ｈ３受容体のインバースアゴニストおよびそれらの薬学的に許容される塩、特に１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンおよびその薬学的に許容される塩は、急性または慢性変性機構からの軸索の保護による再有髄化の促進、それによる軸索損失およびその結果として生じる障害進行の予防において使用することができる。
【００７２】
Ｈ３受容体のインバースアゴニストおよびそれらの薬学的に許容される塩、特に１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンおよびその薬学的に許容される塩は、ＲＩＳ(Radiological Isolated Syndrome)、ＣＩＳ（Clinical Isolated Syndrome）、再発寛解型多発性硬化症、二次進行型多発性硬化症、一次進行型多発性硬化症、進行性／再発性多発性硬化症、視神経脊髄炎、および急性ＭＳ（マールブルグ変異型）を含む多発性硬化症の治療において使用することができる。一面において、Ｈ３受容体のインバースアゴニストおよびそれらの薬学的に許容される塩、特に１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンおよびその薬学的に許容される塩は、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）の治療において使用することができる。別の面において、Ｈ３受容体のインバースアゴニストおよびそれらの薬学的に許容される塩、特に１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンおよびその薬学的に許容される塩は、二次進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）の治療において使用することができる。
【００７３】
Ｈ３受容体のインバースアゴニストおよびそれらの薬学的に許容される塩、特に１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンおよびその薬学的に許容される塩はまた、脱髄(demylination)を引き起こす疾患、例えば、急性散在性脳脊髄炎、視神経炎、ビタミンＢ１２欠乏症、橋中心髄鞘崩壊、脊髄ろう、横断性脊髄炎、進行性多病巣性白質脳症および白質萎縮症の治療においても使用することができる。
【００７４】
Ｈ３受容体のインバースアゴニストおよびそれらの薬学的に許容される塩、特に１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンおよびその薬学的に許容される塩はまた、血管性認知症、混合型認知症およびアルツハイマー病を含む脱髄(demylination)の側面の有する認知症性疾患の治療においても使用することができる。
【００７５】
Ｈ３受容体のインバースアゴニストおよびそれらの薬学的に許容される塩、特に１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンおよびその薬学的に許容される塩はまた、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、ギラン・バレー症候群、急性炎症性脱髄性多発神経障害、ミラー・フィッシャー症候群、急性運動性軸索型神経障害、急性運動感覚性軸索型神経障害、急性全自律神経障害、ビッカースタッフ型脳幹脳炎、抗ＭＡＧ末梢神経障害、シャルコー・マリー・トゥース病および銅欠乏症を含む末梢神経系の脱髄疾患の治療において使用の可能性を有する。
【００７６】
用量
本発明の化合物は経口投与することができる。本発明の化合物は、約１〜約１０００マイクログラム／日、または約５〜約５００マイクログラム／日、または１０〜１５０マイクログラム／日の用量でヒトに投与することができる。
【００７７】
本発明は、５〜５００マイクログラム／日の用量の１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩の経口投与によって、ヒトにおけるＭＳまたは脱髄疾患の治療において使用するための１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩を提供する。一実施態様において、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩は、ヒトでの経口投与のために１０〜１５０マイクログラム／日の用量で提供される。一実施態様において、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩は、ヒトでの経口投与のために約８０マイクログラム／日の用量で提供される。
【００７８】
医薬組成物
本発明の化合物は、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩と、１種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含有する医薬剤形として処方することができる。このような剤形および賦形剤は当技術分野において記載されている。例えば、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンは、医薬組成物中に、ＷＯ２００４／０５３６９およびＷＯ２００８／１０４５９０に記載されているような用量レベルで処方することができる。
【００７９】
本発明は、Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物と、１種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含んでなる、ヒトへの経口投与のための医薬組成物であって、ＭＳまたは脱髄疾患の治療において使用するための医薬組成物を提供する。一実施態様において、前記医薬組成物は、１日当たり５〜５００マイクログラムの、ヒトへの経口投与において使用するための本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を含んでなる。一実施態様において、前記医薬組成物は、１日当たり１０〜１５０マイクログラムの、ヒトへの経口投与において使用するための本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を含んでなる。一実施態様において、前記医薬組成物は、１日当たり約８０マイクログラムの、ヒトへの経口投与において使用するための本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を含んでなる。
【００８０】
組合せ
本発明に従って投与される化合物は、他の治療薬、例えば、多発性硬化症の治療に有用であると言われている薬剤と併用することができる。このような他の治療薬の好適な例は、酢酸グラチラマー（Ｃｏｐａｘｏｎｅ）、βインターフェロン−１ａ（ＡｖｏｎｅｘおよびＲｅｂｉｆ）、βインターフェロン−１ｂ（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）、フィンゴリモド（Ｇｉｌｅｎｙａ）、およびナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ）であり得る。他の好適な薬剤は、ＢＧ−１２、Ｐｅｇ−Ａｖｏｎｅｘ、ラキニモド、テリフルノミド、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、ＢＡＦ３１２、ＯＮＯ−４６４１、ポネシモド、Ｐｌｅｎｅｖａ、プロバマー(plovamer)、ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７、Ｔｒｉｍｅｓｔａ、Ｖ８５５４６、ＡＴＬ−１１０２、オファツムマブ、セクキヌマブ、ＬＹ−２１２７３９９、トキサビン(toxavin)、マノコート(manocort)およびＦｉｒａｔｅｇｒａｓｔであり得る。
【００８１】
本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩が他の治療薬と併用される場合、これらの化合物はいずれの慣例の経路によって順次または同時のいずれかで投与され得る。
【００８２】
よって、本発明は、さらなる面において、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノンまたはその薬学的に許容される塩と、さらなる治療薬または薬剤との組合せを提供する。
【００８３】
上記に述べた組合せは、好都合なことに、医薬製剤の形態で使用するために提供することができ、よって、上記で定義したような組合せを薬学的に許容される担体または賦形剤とともに含んでなる医薬製剤は、本発明のさらなる面を含んでなる。このような組合せの個々の成分は、別個のまたは組み合わせた医薬製剤で順次または同時のいずれかで投与され得る。
【００８４】
本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩が、同じ病態に対して活性のある第２の治療薬と併用される場合、各化合物の用量は、その化合物が単独で使用される場合とは異なる場合がある。
【実施例】
【００８５】
略語
ｂＦＧＦ              塩基性線維芽細胞増殖因子
ＢＤＭ                基本合成培地
ＢＳＡ                ウシ血清アルブミン
ＣＮＳ                中枢神経系
ＣＰＺ                クプリゾン
ＥＤＳＳ              総合障害度評価基準
ＧＰＣＲ              Ｇタンパク質共役型受容体
Ｈ３Ｒ                ヒスタミン受容体３
ＩＯＤ                積分光学密度
ＭＡＧ                ミエリン関連糖タンパク質
ＭＢＰ                ミエリン塩基性タンパク質
ＭＳ                  多発性硬化症
ＮＡｃ                Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン(N-acetyl-L-cystenine)
ＯＣＴ                最適切削温度溶液
ＯＰＣ                オリゴデンドロサイト前駆細胞
ＰＢＳ                リン酸緩衝生理食塩水
ＰＤＧＦ              血小板由来増殖因子
ＰＤＬ                ポリ−Ｄ−リシン
ＰＦＡ                パラホルムアルデヒド
ＰＯ                  ポリ−オルニチン
ＲＲＭＳ              再発寛解型ＭＳ
ＲＴ−ＰＣＲ          ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＥＭ                平均の標準誤差
ｓｉＲＮＡ            低分子干渉ＲＮＡ
ＳＰＭＳ              二次進行型ＭＳ
【００８６】
記載１：ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボニトリル
【化２】
2015503598.tif 000003
ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルバルデヒド（１６ｇ、１０７ｍｍｏｌ）、ギ酸ナトリウム（１４．５０ｇ、２１３ｍｍｏｌ）のギ酸（１５０ｍＬ）溶液に、固体の塩酸ヒドロキシルアミン（２２．２２ｇ、３２０ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を１００℃で２時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。次に、Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）を加え、この混合物をＤＣＭ（２００ｍＬ×３）で抽出し、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で蒸発させ、ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボニトリルを黄色固体として得た（１５ｇ、９１％）。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ: 7. 21 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.03 (s, 1H), 6.86 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.07 (s, 2H)。
【００８７】
記載２：（Ｚ）−Ｎ’−ヒドロキシベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキシイミドアミド
【化３】
2015503598.tif 000004
ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボニトリル（１５ｇ、１０２ｍｍｏｌ）、塩酸ヒドロキシルアミン（１４．１７ｇ、２０４ｍｍｏｌ）のエタノール（５００ｍＬ）溶液に、Ｎａ２ＣＯ３（５４．０ｇ、５１０ｍｍｏｌ）を一度に加えた。この反応混合物を８０℃で５時間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去し、残渣をＤＣＭ（１Ｌ×４）で洗浄し、濾過し、合わせた濾液を減圧下で濃縮し、（Ｚ）−Ｎ’−ヒドロキシベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキシイミドアミドを黄色固体として得た（１５ｇ、７３．５％）。MS(ES+) m/z 181.1 (MH+)。
【００８８】
記載３：２−（１−ベンジルピペリジン−４−イリデン）酢酸エチル
【化４】
2015503598.tif 000005
１−ベンジルピペリジン−４−オン（３０ｇ、１５９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（４００ｍＬ）溶液に、固体の２−（トリフェニルホスホラニリデン）酢酸エチル（１１０ｇ、３１７ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を１２０℃で２０時間撹拌した。この反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、粗生成物をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝２０：１）により精製し、２−（１−ベンジルピペリジン−４−イリデン）酢酸エチルを黄色油状物として得た（２４ｇ、５５．５％）。MS(ES+) m/z 259.9 (MH+)。
【００８９】
記載４：２−（ピペリジン−４−イル）酢酸エチル
【化５】
2015503598.tif 000006
２−（１−ベンジルピペリジン−４−イリデン）酢酸エチル（２４ｇ、９３ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（３００ｍＬ）溶液に、Ｐｄ／Ｃ（３．９４ｇ）を加えた。この混合物を、Ｈ−キューブ（設定：５５℃、５５ｐｓｉ）を用いて１６時間水素化した。この反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、２−（ピペリジン−４−イル）酢酸エチルを無色の油状物として得た（１５ｇ、９０％）。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ: 4.10 (m, 2H), 3.03 (d, J = 16.4 Hz, 2H), 2.59 (t, J = 16.4 Hz, 2H), 2.19(d, J = 9.6 Hz, 2H), 1.87 (m, 1H), 1.67 (d, J = 17.2 Hz, 2H), 1.23 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 1.10 (m, 2H)。
【００９０】
記載５：２−（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）酢酸エチル
【化６】
2015503598.tif 000007
空気中、２０℃で撹拌した、２−（ピペリジン−４−イル）酢酸エチル（１３ｇ、７６ｍｍｏｌ）、シクロブタノン（６．９２ｇ、９９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）（２００ｍＬ）溶液に、酢酸（４．３５ｍＬ、７６ｍｍｏｌ）を一度に加えた。この反応混合物を２５℃で０．５時間撹拌した。次に、上記混合物にトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２５．７ｇ、１２１ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を２５℃で３時間撹拌した。この混合物をＮａＯＨ溶液（２Ｍ、１５０ｍＬ）で洗浄し、無機層をＤＣＭ（２００ｍＬ×３）で抽出し、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で蒸発させ、２−（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）酢酸エチルを無色の油状物として得た（１５ｇ、７９％）。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ: 4.06 (m, 2H), 3.23 (d, J = 15.6 Hz, 2H), 3.01 (m, 1H), 1.96-2.28 (m, 8H), 1.70-1.81 (m, 4H), 1.48-1.65 (m, 3H), 1.19 (t, J = 9.6 Hz, 3H)。
【００９１】
記載６：２−（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）酢酸の製造
【化７】
2015503598.tif 000008
２−（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）酢酸エチル（１８ｇ、８０ｍｍｏｌ）とＨＣｌ（１２Ｍ、１５０ｍＬ）との混合物を１００℃に加熱し、この反応混合物を１００℃で５時間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去し、２−（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）酢酸を褐色固体として得た（１２ｇ、６８．５％）。
1H NMR (400MHz, DMSO) δ: 3.51 (m, 1H), 3.26 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 2.67 (m, 2H), 2.33 (m, 2H), 2.17 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 2.12 (m, 2H), 1.82 (m, 3H), 1.68 (m, 2H), 1.51 (m, 2H)。
【００９２】
記載７：（Ｚ）−Ｎ−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル（ヒドロキシイミノ）メチル）−２−（１−シクロブチル−ピペリジン−４−イル）アセトアミド：
【化８】
2015503598.tif 000009
２０℃で撹拌した、２−（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）酢酸（３ｇ、１５．２１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（８．６７ｇ、２２．８１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（７．９７ｍＬ、４５．６ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２０ｍＬ）溶液に、固体の（Ｚ）−Ｎ’−ヒドロキシベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキシイミドアミド（２．７４ｇ、１５．２１ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を２０℃で１時間撹拌した。次に、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）を加え、この混合物をＤＣＭ（３０ｍＬ×３）で抽出し、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で蒸発させ、粗生成物をそのまま次の工程に用いた（３ｇ、４９．４％）。MS(ES+) m/z 360.2 (MH+)。
【００９３】
実施例１
１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン
【化９】
2015503598.tif 000010
シクロブタノン（３．７７ｋｇ）と酢酸（１．０７４ｋｇ）との混合物を、１−［６−（２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イルオキシ）−３−ピリジニル］−２−ピロリジノン（ＷＯ２００５／１２３７２３Ａ１、記載３）（５．８ｋｇ）のジクロロメタン（５８Ｌ）溶液に加え、この混合物を２５〜３５℃で３時間撹拌した後、１０〜１５℃に冷却した。温度を１０〜１５℃に維持しながら、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（５．７２ｋｇ）を４等分して１０分間隔で加えた。得られた混合物を２５〜３５℃に加熱し、ＴＬＣによって反応の完了が確定されるまで３時間撹拌した。
【００９４】
反応混合物を５〜１０℃に冷却し、ｐＨを水酸化ナトリウム水溶液（７．４％ｗ／ｗ）でｐＨ１０〜１１に調整し、３０〜４０分間撹拌し、相に分けた。水相をジクロロメタン（３×１７．５Ｌ）で抽出した。合わせた有機相を塩化ナトリウム水溶液（１３％ｗ／ｗ）で２回洗浄し、濾過し、１４．５Ｌ未満となるまで濾液を濃縮した。メタノール（２９Ｌ）を加え、この混合物を還流下で２５〜３０分間加熱した後、温度を５０℃以下に維持しながら１４．５Ｌ未満となるまで真空濃縮した。メタノール添加、加熱および濃縮を３回繰り返し、その際、毎回、２９Ｌメタノールを用いた。
【００９５】
残渣をジクロロメタン（５８Ｌ）に溶かし、塩化ナトリウム水溶液（４．８％）で３回洗浄し、濾過し、１４．５Ｌ未満となるまで濃縮した。メタノール（２９Ｌ）を加え、この混合物を２５〜３０分間還流下で加熱した後、温度を５０℃以下に維持しながら１４．５Ｌ未満となるまで真空濃縮した。このメタノール添加、加熱および濃縮を繰り返し、８．７Ｌ未満となるまで蒸留を続けた。得られたスラリーを還流下で２−プロパノールに溶かし、温度を６０℃以下に維持しながら８．７Ｌ未満となるまで真空下で蒸留した。この操作を、２９Ｌの２−プロパノールを用いて繰り返した。残渣を２−プロパノール（２６Ｌ）中、還流下で２０分間加熱し、７０〜７５℃に冷却し、２−プロパノール（１７ｍＬ）中、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン（６ｇ）のスラリーを加えた。この混合物を５０分かけて２５〜３５℃に冷却した後、−５〜０℃に冷却し、３時間撹拌した。スラリーを濾過し、そのケークを冷２−プロパノール（６Ｌ）で洗浄し、５０〜６０℃の真空下で乾燥させ、標題生成物を得た（４．７４ｋｇ）。
【００９６】
実施例２
３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾール
【化１０】
2015503598.tif 000011
（Ｚ）−Ｎ−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル（ヒドロキシイミノ）メチル）−２−（１−シクロブチル−ピペリジン−４−イル）アセトアミド（５ｇ、１３．９１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３０ｍＬ）溶液を１２０℃に加熱し、この反応混合物を１２０℃で２４時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、粗生成物をＰｒｅ−ＨＰＬＣにより精製し、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾールを白色固体として得た（１．５ｇ、３１．６％）。
1H NMR (400MHz, MeOD) δ: 7.60 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.44 (s, 1H), 6.94 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.04 (s, 2H), 2.90 (m, 4H), 2.74 (m, 1H), 2.04 (m, 2H), 1.68-2.03 (m, 10H), 1.40 (m, 2H).
MS(ES+) m/z 342.1 (MH+)
【００９７】
実施例３
４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル塩酸塩
【化１１】
2015503598.tif 000012
４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル塩酸塩は、ＷＯ２００５０１４５７１に記載の通りに製造することができる。
【００９８】
比較例４
４−［３−（フェニルメトキシ）プロピル］−１Ｈ−イミダゾールシュウ酸塩
【化１２】
2015503598.tif 000013
４−［３−（フェニルメトキシ）プロピル］−１Ｈ−イミダゾールシュウ酸塩は、商業的供給源（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）から購入した。
【００９９】
比較例５
４−［３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロピル］ピペリジンジヒドロブロミド
【化１３】
2015503598.tif 000014
４−［３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロピル］ピペリジンジヒドロブロミドは、商業的供給源（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）から購入した。
【０１００】
実施例６
１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）プロピル）ピペリジン
【化１４】
2015503598.tif 000015
Ｈ３Ｒのインバースアゴニストである１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）プロピル）ピペリジン(Schwartz、(2011) Br. J. Pharmacol. 163:713-721)は、商業的供給源（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ、ＵＫ）から購入した。実施例６は、米国特許第７１６９９２８号に記載の通りに合成することができる。
【０１０１】
実施例７
（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オン
【化１５】
2015503598.tif 000016
Ｈ３Ｒのインバースアゴニストである（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オンは、Hudkins et al. (J. Med. Chem. (2011) 54: 4781-4792)または米国特許第８２０７１６８号に記載の通りに合成することができる。
【０１０２】
実施例８
３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロピル４−クロロベンジルカルバムイミドチオエートジヒドロブロミド
【化１６】
2015503598.tif 000017
３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロピル４−クロロベンジルカルバムイミドチオエートジヒドロブロミド（クロベンプロピットとしても知られる）はＨ３Ｒのインバースアゴニストである(Moreno-Delgado et al., Neuropharmacology (2006) 51: 517-523)。これは商業的供給源（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）から購入した。
【０１０３】
生物学的アッセイ
実施例９
オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）分化アッセイ
ヒスタミン受容体３（Ｈ３Ｒ）の小分子インバースアゴニストおよびニュートラルアンタゴニストの、ＯＰＣ分化に対する効果を、以下のアッセイを用いて調べた。
【０１０４】
細胞の単離
高濃度ＯＰＣは、２日齢の幼ラットの前脳を摘出することによって得た。これらの幼ラットを麻酔し、断頭した。次に、頭蓋を顕微解剖ハサミで切開し、皮質をＤｕｍｏｎｔ鉗子で摘出した。髄膜を鋭利な先端で剥がした。セルストレーナーで皮質の摩砕を繰り返した後、細胞を、２０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、ＣＡ）、グルタミン４ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＤＭＥＭからなる培養培地に再懸濁させ、ポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ、１００μｇ／ｍＬ、１時間、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）でコーティングされたＴ７５フラスコに播種した。得られた培養物に、週に２回新鮮な培養培地を補給した。ほとんど総てのニューロンは１週間で高濃度の血清のために死滅する。次に、混合グリア細胞に一連のシェークオフ手順を行い、２週間後に純粋なＯＰＣを得た。具体的には、混合グリア細胞をまず１００ｒｐｍで１時間振盪して小グリア細胞を除去し、２００ｒｐｍ、３７℃で２０〜２２時間振盪してＯＰＣを濃縮した。ＯＰＣを１２００ｒｐｍで５分の遠心分離により回収し、基本合成培地（ＢＤＭ）に再懸濁させた。ＢＤＭは、Ｎ２培地（１００Ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、グルタミン（４ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、ヒドロコルチゾン（２０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ）、セレン（３０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ）およびビオチン（１０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ）を添加したＤＭＥＭから構成されていた。ＯＰＣをポリオルニチン（ＰＯ、５０μｇ／ｍＬ、１時間、Ｓｉｇｍａ）でコーティングされた培養ディッシュに播種し、実験操作まで、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ロッキーヒル、ＮＪ）を添加したＢＤＭ中で維持した。Ａ２Ｂ５＋染色により判断したところ、ＯＰＣは純度９５％であった。
【０１０５】
薬物および試薬
免疫ブロットおよび免疫組織化学に用いた抗体は、ウサギ抗ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、ＭＡ）、マウス抗ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ、ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、ＭＡ）であった。
【０１０６】
ＯＰＣ分化アッセイ
ＯＰＣ分化を誘導するために、まず、ＯＰＣを０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで処理し、ＰＯでコーティングされた３８４ミニウェルプレートに２，０００〜５，０００細胞／ウェルの密度で播種した。アッセイのため、各試験化合物をＤＭＳＯに１０ｍＭの濃度で溶かした。種々の濃度（全用量曲線、０．３ｎＭ〜１０μＭ）の化合物をＯＰＣ培養物にＥｃｈｏｍａｃｈｉｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ、ウォルサム、ＭＡ）を用いて二反復で加えた。ＯＰＣを、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン(N-acetyl-L-cystenine)（３０μＭ、Ｓｉｇｍａ）を添加したＢＤＭ中で培養し、４日間、成熟オリゴデンドロサイトに分化させた。ＢＤＭは、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎ２（１００Ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−Ｇｌｕ（５０Ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ピルビン酸ナトリウム（１００Ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＢＳＡ（０．１％、Ｓｉｇｍａ）、ビオチン（１０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ）、ヒドロコルチゾン（１０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ）を含んでなる。得られた培養物を４％ポリホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で固定し、サンプルをブロッキングバッファー（ロバ血清３％、Ｓｉｇｍａ；トリトンＸ−１００  ０．０４％、Ｓｉｇｍａ）でブロッキングした。次に、固定した細胞を４℃で一晩、一次抗体（抗ミエリン塩基性タンパク質、ＭＢＰ抗体、ブロッキングバッファーで６００倍希釈）中でインキュベートし、ＰＢＳでよく洗浄した後、室温で２時間、Ａｌｅｘａ４８８標識二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにインキュベートし、その後、ＰＢＳで洗浄し、Ｄａｐｉ（１μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）で染色した。
【０１０７】
データの取得および分析
全プレート免疫組織化学染色を自動画像分析システムであるＣｅｌｌｏｍｉｃｓ（Ｔｈｅｒｍｏ）によって読み取り、各ウェルの生データを下記のようにＭＢＰ＋集団のパーセンテージとして取得した：ウェル当たり８視野の画像を取得し、定量的に分析した（このウェルデータは８視野の平均である）。サイトゾルにおける抗ＭＢＰ染色の強度を陽性対象の判定基準に用いた。陽性対象の閾値は、トリヨードチロニン（１５ｎＭ）を用いた陽性対照ウェルの平均強度に基づいて設定した。次に、このデータを分析し、ビヒクル対照ウェルの数値に対する変化倍率として表した。グラフはソフトウエア：Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＩＤＢＳ  ＸＬ  ｆｉｔ５により作成した。曲線の当てはめはソフトウエア  ＸＬ  ｆｉｔ５を用いて行い、陽性化合物のＥＣ５０を導き出した。
【０１０８】
ウエスタンブロット
処理後、ＯＰＣを氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、全細胞溶解液をＲＩＰＡ溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭ  フッ化ナトリウム、０．１％  ２−メルカプトエタノール、１％  トリトンＸ−１００およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）中に採取した。これらの溶解液を軽く超音波処理し、ウエスタン分析まで−８０℃で保存した。ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（ＰＩＥＲＣＥ、Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてタンパク質濃度を測定した。総タンパク質が１５μｇ／サンプルであるアリコートを取り、２倍ＳＤＳバッファー（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４％  ＳＤＳ、２０％  グリセロール、１００ｍＭ  ＤＴＴ）を混合した後に５分間煮沸し、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓミニゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離した。次に、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、５％ミルク／ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ中、室温で１時間ブロッキングした。次に、膜を５％ミルク／ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎで希釈した一次抗体の存在下、４℃で一晩インキュベートした。翌日、膜をＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎで５分間３回洗浄し、５％ミルク／ＴＢＳ−０．１％中、室温で１時間インキュベートした。
【０１０９】
ヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウェストグローブ、ＰＡ）を１：５０００希釈で含有するＴｗｅｅｎ。ＨＲＰコンジュゲート二次抗体の検出は、ＦＵＪＩ画像装置（ＦＵＪＩ、東京、日本）を用いて増強化学発光基質混合物（ＰＩＥＲＣＥ）により行った。
【０１１０】
統計分析
図１を除く総てのデータは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示す。図１のデータは、平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。図３ｂの統計分析は、必要に応じて、一元配置ＡＮＯＶＡまたはスチューデントのｔ検定を用いて行った。図１ｃの統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて行った。ｐ＜０．０５であれば、統計的に有意と推論した。
【０１１１】
結果
図１に示すように、多様な構造およびプロフィールを有するＨ３Ｒ標的実施例化合物を、一連の用量（０．３ｎＭ〜１０μＭ）でＯＰＣ分化アッセイにて試験した。Ｈ３Ｒインバースアゴニストである実施例化合物２による処理は、図１ａに示されるＭＢＰ＋集団の増加によって明らかなように、ＯＰＣ分化をＥＣ５０＝２５ｎＭで用量依存的に促進した。同様に、別のＨ３Ｒインバースアゴニストである実施例化合物３による処理も、３１ｎＭのＥＣ５０で同等の促進効果を示した。実施例化合物６、７および８（これらもまたＨ３Ｒインバースアゴニストであるが、構造的に異なっている）による処理は、図１ｃに示されるように、それぞれ１４ｎＭ、２５０ｎＭ、４８ｎＭのＥＣ５０でオリゴデンドロサイト分化に同等の促進効果を示した。対照的に、ニュートラルアンタゴニストである実施例化合物４および５による処理は、総ての濃度でＯＰＣ分化に何の効果も示さなかった（図１ｂ）。
【０１１２】
結論
Ｈ３Ｒのニュートラルアンタゴニストは、受容体のヒスタミン依存性活性を阻害することができるだけであり、他方、インバースアゴニストはヒスタミン依存性活性とヒスタミン非依存性構成的活性の両方を阻害することができる。インバースアゴニストだけがＯＰＣ分化アッセイで陽性効果を示し、これらの結果は、Ｈ３Ｒの構成的活性がオリゴデンドロサイト分化の調節に決定的な役割を果たすことを示す。
【０１１３】
結果
図２に示すように、実施例２の化合物をさらなるウエスタンブロット分析のために選択した。一貫して、ウエスタンブロットは、実施例化合物２による処理の後の、分化中のオリゴデンドロサイトにおける、成熟オリゴデンドロサイトの２つのマーカー、すなわち、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）およびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の発現レベルの有意な上昇を明らかにした。このことは、実施例化合物２による処理がより多くのＯＰＣを分化させることを示唆する（図２）。
【０１１４】
別のＨ３Ｒインバースアゴニストである実施例化合物１は、ＯＰＣ分化アッセイにおいて他のインバースアゴニストと同様のプロフィールを示した。実施例化合物１による処理は、より多いＭＢＰ＋細胞により示されるように、１１８±４９ｎＭのＥＣ５０でＯＰＣ分化を促進し（２回の実験からのデータ（ｎ＝２）を図３ａに示す）、成熟オリゴデンドロサイトの２つのバイオマーカーであるＭＡＧとＭＢＰの発現レベルを上昇させた。これらの実験をさらに３回行い、５回の実験からのデータ（ｎ＝５）を統計分析にかけた。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて１０用量群（ビヒクルおよび９種類の有効用量）の間の差を比較した。ＡＮＯＶＡのｐ値＜０．０００１は、統計学的に有意であることを示した。５回の実験からのデータの平均を取り、ビヒクル対照ウェルにおけるパーセンテージに対する変化倍率として表した。処理対ビヒクル、＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１。図３ｂに示されるように、実施例化合物１は、より多くのＭＢＰ陽性細胞（３μＭで対照の最大１．８±０．１倍）により示されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＯＰＣ分化をＥＣ５０値１５９±５７ｎＭで濃度依存的に促進した。
【０１１５】
結論
ウエスタンブロットの結果は、定量的免疫組織化学分析の結果と一致した。実施例化合物１および実施例化合物２は両方とも、成熟オリゴデンドロサイトマーカーの発現レベルを用量依存的に上昇させた。
【０１１６】
実施例１０
Ｈ３Ｒノックダウン実験
Ｈ３Ｒ特異的低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いて、ＯＰＣにおけるＨ３Ｒ発現をノックダウンし、得られた表現型を分化条件において検討した。
【０１１７】
細胞の単離
高濃度ＯＰＣは、２日齢の幼ラットの前脳を摘出することによって得た。これらの幼ラットを麻酔し、断頭した。次に、頭蓋を顕微解剖ハサミで切開し、皮質をＤｕｍｏｎｔ鉗子で摘出した。髄膜を鋭利な先端で剥がした。セルストレーナーで皮質の摩砕を繰り返した後、細胞を、２０％ウシ胎児血清、グルタミン４ｍＭを添加したＤＭＥＭからなる培養培地に再懸濁させ、ポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ、１００μｇ／ｍＬ、１時間）でコーティングされたＴ７５フラスコに播種した。得られた培養物に、週に２回新鮮な培養培地を補給した。ほとんど総てのニューロンは高濃度の血清のために死滅する。次に、混合グリア細胞に一連のシェークオフ手順を行い、２週間後に純粋なＯＰＣを得た。具体的には、混合グリア細胞をまず１００ｒｐｍで１時間振盪して小グリア細胞を除去し、２００ｒｐｍ、３７℃で２０〜２２時間振盪してＯＰＣを濃縮した。ＯＰＣを１２００ｒｐｍで５分の遠心分離により回収し、基本合成培地（ＢＤＭ）に再懸濁させた。ＢＤＭは、Ｎ２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、グルタミン（４ｍＭ）、ＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（２０ｎＭ）、セレン（３０ｎＭ）およびビオチン（１０ｎＭ）を添加したＤＭＥＭからなっていた。ＯＰＣをポリオルニチン（ＰＯ、５０μｇ／ｍＬ、１時間、Ｓｉｇｍａ）でコーティングされた培養ディッシュに播種し、実験操作まで、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加したＢＤＭ中で維持した。Ａ２Ｂ５＋染色により判断したところ、ＯＰＣは純度９５％であった。
【０１１８】
ＯＰＣのトランスフェクション
ＯＰＣを以下のプロトコールを用いてｓｉＲＮＡでトランスフェクトした：ＯＰＣを０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡで消化し、１００ｇの相対遠心力で１５分間ペレット化した。ＯＰＣをＤＭＥＭに再懸濁させ、総てのトリプシンをすすぎ落とすために再びペレット化した。合計２〜３×１０６アリコートのＯＰＣを、１００ｐｍｏｌのＳＭＡＲＴｐｏｏｌラットＨｒｈ３（Ｌ−０９３９０４−０１、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）または１００ｐｍｏｌのｓｉ対照非標的化低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）プール（Ｄ−００１８１０−１０、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を含有する１００μＬのＡｍａｘａ  ＯＰＣヌクレオフェクチン試薬（ＶＰＧ−１００９；Ａｍａｘａ、Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁させた後、Ａｍａｘａヌクレオフェクチン装置でＯ−１７プログラムを用いてエレクトロポレーションを行った。トランスフェクトされたＯＰＣをＰＯコーティング６ウェルプレートに播種し、トリヨードチロニン（３０ｎＭ）およびＮ−アセチル−Ｌ−システイン(N-acetyl-L-cystenine)（３０μＭ）を添加したＢＤＭ中で４日間培養した。これらの細胞を回収し、タンパク質サンプルをウエスタンブロットで分析した。
【０１１９】
試薬
免疫ブロット実験に使用した抗体は、ウサギ抗ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ、ａｂｃａｍ）およびウサギ抗Ｈ３Ｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であった。ｓｉＲＮＡ  ｓｍａｒｔｐｏｏｌは総てＤｈａｒｍａｃｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏから購入する。
【０１２０】
ウエスタンブロット
処理後、ＯＰＣを氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、全細胞溶解液をＲＩＰＡ溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭ  フッ化ナトリウム、０．１％  ２−メルカプトエタノール、１％  トリトンＸ−１００およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）中に採取した。これらの溶解液を軽く超音波処理し、ウエスタン分析まで−８０℃で保存した。ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（ＰＩＥＲＣＥ、Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてタンパク質濃度を測定した。総タンパク質が１５μｇ／サンプルであるアリコートを取り、２倍ＳＤＳバッファー（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４％  ＳＤＳ、２０％  グリセロール、１００ｍＭ  ＤＴＴ）を混合した後に５分間煮沸し、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓミニゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離した。次に、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、５％ミルク／ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ中、室温で１時間ブロッキングした。次に、膜を５％ミルク／ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎで希釈した一次抗体の存在下、４℃で一晩インキュベートした。翌日、膜をＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎで５分間３回洗浄し、５％ミルク／ＴＢＳ−０．１％中、室温で１時間インキュベートした。
【０１２１】
ヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウェストグローブ、ＰＡ）を１：５０００希釈で含有するＴｗｅｅｎ。ＨＲＰコンジュゲート二次抗体の検出は、ＦＵＪＩ画像装置（ＦＵＪＩ、東京、日本）を用いて増強化学発光基質混合物（ＰＩＥＲＣＥ）により行った。
【０１２２】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを単離し、製造者の説明に従ってＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ｍＲＮＡの発現は、標準的なサーモサイクラー条件下でＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたリアルタイムＰＣＲにより測定した。データを採取し、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００シーケンスデテクションシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて定量分析を行った。ＰＣＲプライマー対の配列は、β−アクチン（内部対照）：フォワード5’-GCGTCCACCCGCGAGTACAAC-3’、リバース5’-CGACGACGAGCGCAGCGATA-3’；Ｈｒｈ３：フォワード5'-TACTGTGTGCCTCCTCGGTCTT-3'およびリバース5'-AGCTCGAGTGACTGACAGGAATC-3'であった。
【０１２３】
統計分析
データは総て平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示す。図４ｂの統計分析は、日宇用に応じて、一元配置ＡＮＯＶＡまたはスチューデントのｔ検定を用いて行った。ｐ＜０．０５であれば、統計的に有意と推論した。
【０１２４】
結果
オリゴデンドロサイト分化におけるＨ３Ｒの関与を確認するために、特異的ｓｉＲＮＡを用いてＨ３Ｒ発現をノックダウンした。図４ａに示されるように、Ｈ３Ｒのノックダウン（正常時の約４０％までダウン、ＲＴ−ＰＣＲ）は、成熟オリゴデンドロサイトのバイオマーカーであるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）の発現レベルの上昇をもたらした。統計分析を行ったところ、図４ｂに示されるように、ｓｉＲＮＡによるＨ３Ｒのノックダウンは、内因性のＨ３Ｒの発現を有意に低下させ、２つの成熟オリゴデンドロサイトバイオマーカーの発現に統計学的に有意な上昇をもたらした：ミエリン塩基性タンパク質ＭＢＰ（１８ｋＤａバンド）、ｓｉ対照の１．７±０．１倍、ｐ＜０．０１。１８ｋＤａバンドとともに測定した場合にｓｉ対照に対して１．９±０．１の変化倍率を示した（ｐ＜０．０１）ＭＢＰのさらなるバンド（２１、１７および１４ｋＤａ）；およびミエリン関連糖タンパク質ＭＡＧ、ｓｉ対照の１．８±０．２倍、ｎ＝５、＊＊、ｐ＜０．０１（ｓｉＨｒｈ３対ｓｉ対照）。
【０１２５】
これらの所見は、構成的活性を有する数少ないＧＰＣＲの１つであるＨ３Ｒがオリゴデンドロサイト分化を負に調節することを示唆し、これは図１〜３で示す結果と一致する。
【０１２６】
結論
ＭＢＰおよびＭＡＧの発現の上昇により明らかなように、ｓｉＲＮＡによるＨ３Ｒ発現レベルの低下はＯＰＣ分化を促進した。この結果は、オリゴデンドロサイト分化におけるＨ３Ｒの構成的活性の負の役割を示す。
【０１２７】
前臨床試験
総てのｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、ＧＳＫ  Ｒ＆Ｄ  Ｃｈｉｎａの所内動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee of GSK R&D China)によって承認されたプロトコールに従い、取得したプロジェクトライセンスに応じて、また、実験動物の管理と使用に関するＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社の指針および関連の実施要領に従って行った。
【０１２８】
実施例１１
実施例１の化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ再有髄化増強能を、マウスクプリゾン誘導脱髄モデルで決定した。
【０１２９】
クプリゾン処置
クプリゾンモデルは、下記のプロトコールを用いて行った：８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、０．２％クプリゾン（ｗ／ｗ）を新たに混合した粉末マウス食餌を５週間与えて脱髄を誘導した後、動物を回復させ（食餌からクプリゾンを除去）、実施例化合物１をさらに９日間、１日２回（ｂ．ｉ．ｄ．）、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ体重で経口投与し、その後、犠牲にした。有随化の評価のために脳サンプルを採取した。実施例１の化合物を、ビヒクルとして１％水性メチルセルロースを用いた懸濁液として処方した。
【０１３０】
ミエリンの染色および定量
マウスを深麻酔し、すぐに左心室から０．９％生理食塩水を潅流させ、血液を排出した。全脳を摘出し、後固定のために４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）の入った１５ｍＬ試験管に一晩入れた後、３０％スクロース中に２４〜４８時間浸漬して脱水した。凍結包理のため、脳をすぐに、ドライアイスを混合したイソペンタン中で急速冷凍し、その後、最適切削温度溶液（ＯＣＴ）に包埋した。全脳を、クリオスタット（ＭＩＣＲＯＭ  ＨＭ５２５）を用い、Paxinos and Franklinによるマウス解剖図(The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates_3rd Edition)に従って、冠状位のブレグマ−２．４６ｍｍ〜１．１８ｍｍまで、３０μｍの厚さの切片にした。総ての切片を、不凍溶液［５００ｍＬの０．１Ｍ  ＰＢ溶液（１１．５０５ｇのＮａ２ＨＰＯ４と２．２７５ｇのＮａＨ２ＰＯ４を合わせ、蒸留水で１Ｌに希釈し、ｐＨを７．４に調整）に３００ｍＬのエチレングリコールを加えたものに、３００ｇスクロースを溶かし、蒸留水で１Ｌに希釈］を満たした９６ウェルプレートに入れた。ブラックゴールドＩＩ染色のため、Paxinos and Franklinによるマウス解剖図に従い、各マウスのそれぞれブレグマ０．８６ｍｍ前後の前脳からの２切片とブレグマ−１．５８ｍｍ前後の後脳からの２切片を選択した。有随化の検出のためのブラックゴールドＩＩ染色は、製造者（ＡＧ１０５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が適合させたプロトコールに従って行った。簡単に述べると、前脳からの２つの浮遊切片と後脳からの２切片を、各２分間、ＭｉｌｌｉＱ水中で２回再水和物させた後、２４ウェルプレート中、６０℃で２０分間、０．３％ブラックゴールドＩＩ溶液で染色した。これらの切片をモニタリングして染色の程度を決定した。最も微細な有髄化線維が暗赤色〜黒色に染まったところで、染色工程を止めた。次に、これらの切片を各２分間、ＭｉｌｌｉＱ水中で２回すすいだ。その後、切片を６０℃で６分間、チオ硫酸ナトリウム溶液（１％）で処理した。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．０５％トリトンＸ１００）中ですすいだ後、切片をスライドグラス（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｌｕｓ  Ｓｌｉｄｅｓ）にマウントし、さらに３７℃の加熱プラットフォーム上で２〜４時間風乾した。これらの脱水スライドグラスに自動カバースリッパー（ＣＶ５０３０、Ｌｅｉｃａ）でカバーグラスをかけた。染色済みのスライドグラスをＳｃａｎｓｃｏｐｅ（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）によってスキャンした。脳梁中央部または帯状束近傍の皮質のデジタル画像を、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて倍率２０倍で取り込んだ。
【０１３１】
Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  ６．３ソフトウエア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８１４  ＵＳＡ）をその後の定量的評価に用いた。ゲートをかけた各脳梁でブラックゴールドＩＩ染色に閾値を設定し、処理したスライドグラス上で同じ対物レンズおよび光強度で得られた画像に関して一定に保持した。ここでは面積およびＩＯＤ（積分光学密度）の２つのパラメーターを用いた。脱髄面積の測定に関しては、グレースケール値を８に変換した後に、総てのデジタル画像を同じ色彩範囲下で設定した。ブラックゴールド染色の空所（void）により示される２０倍での脳梁中央部の脱髄面積および総面積を各画像で別に測定した。平均脱髄面積は、（脳梁中央部の脱髄面積／総面積）×１００として計算した。平均密度の測定に関しては、総てのデジタル画像を同じ色彩範囲下に設定した後に脳梁中央部または皮質において面積およびＩＯＤを計算した。平均密度は、脳梁中央部またはゲートをかけた皮質のＩＯＤ／総面積として計算した。結果はナイーブ対照の平均密度のパーセンテージとして表した。それぞれ各動物の前脳からの２切片、後脳からの２切片、および前脳と後脳の両方からの４切片から得られたデータの平均を取り、分析した。群のデータは平均±ＳＥＭとして表した。グラフはＧｒａｐｈＰａｄ５  ＰＲＩＳＭソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃｏ、サンディエゴ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）により作成した。
【０１３２】
統計分析
グラフはＧｒａｐｈＰａｄ５  ＰＲＩＳＭソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃｏ、サンディエゴ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）により作成した。群間差の分析にはＲソフトウエアによるｔ検定を用いた。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意と見なした。有意性は、これらの表にアスタリスク＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１で示す。
【０１３３】
結果
クプリゾンモデルにおける再有髄化に対する実施例化合物１の効果
５週間のクプリゾン食とその後の９日間の正常食による処置は、ナイーブ群と比較した場合にビヒクル対照群でのブラックゴールドＩＩ染色の低下によって可視化されたように、脳梁に重度の脱髄をもたらした（図５ａおよび５ｂ）。
【０１３４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ再有髄化は、２つの異なる定量的パラメーター、すなわち、ブラックゴールドＩＩ染色により示される脱髄面積と平均染色強度とによって決定した。図５ａ〜５ｄに示されるように、実施例化合物１（１０ｍｇ／ｋｇ、９日間）による処置は、前脳および後脳の両方でビヒクル対照群に比べて、病変部のミエリン特異的ブラックゴールドＩＩ染色の強度を有意に高め、脳梁の脱髄面積を低減した。この実施例化合物１の効果は、用量が増加するとともに高くなった（３ｍｇ／ｋｇを除く）。
【０１３５】
実施例１２
実施例化合物２のｉｎ  ｖｉｖｏ再有髄化増強能を、マウスクプリゾン／ラパマイシン誘導脱髄モデルで決定した。
【０１３６】
クプリゾンおよびラパマイシン処置
クプリゾンおよびラパマイシンモデルは下記のプロトコールで行った：ラパマイシンを１００％エタノールに溶かし、使用するまで−２０℃で保存した。注射直前に、ラパマイシンをビヒクル溶液で、終濃度が５％ＰＥＧ−４００、５％Ｔｗｅｅｎ  ８０、および４％エタノールとなるように希釈した。８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、０．２％クプリゾン（ｗ／ｗ）を新しく混合した粉末マウス食餌を与え、５週間、毎日、ラパマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射を施して脱髄を誘導し、その後、動物を回復させ（食餌のクプリゾンおよびラパマイシン注射の除去）、実施例化合物２をさらに９日間、１日２回（ｂ．ｉ．ｄ．）、３０ｍｇ／ｋｇ体重で経口投与し、その後、犠牲にした。病理分析のために脳サンプルを採取した。実施例化合物２は、ビヒクルとして１％水性メチルセルロースを用いた懸濁液として処方した。
【０１３７】
ミエリンの染色および定量
マウスを深麻酔し、すぐに左心室から０．９％生理食塩水を潅流させ、血液を排出した。全脳を摘出し、後固定のために４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）の入った１５ｍＬ試験管に一晩入れた後、３０％スクロース中に２４〜４８時間浸漬して脱水した。凍結包理のため、脳をすぐに、ドライアイスを混合したイソペンタン中で急速冷凍し、その後、最適切削温度溶液（ＯＣＴ）に包埋した。全脳を、クリオスタット（ＭＩＣＲＯＭ  ＨＭ５２５）を用い、Paxinos and Franklinによるマウス解剖図(The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates_3rd Edition)に従って、冠状位のブレグマ−２．４６ｍｍ〜１．１８ｍｍまで、３０μｍの厚さの切片にした。総ての切片を、不凍溶液［５００ｍＬの０．１Ｍ  ＰＢ溶液（１１．５０５ｇのＮａ２ＨＰＯ４と２．２７５ｇのＮａＨ２ＰＯ４を合わせ、蒸留水で１Ｌに希釈し、ｐＨを７．４に調整）に３００ｍＬのエチレングリコールを加えたものに、３００ｇスクロースを溶かし、蒸留水で１Ｌに希釈］を満たした９６ウェルプレートに入れた。ブラックゴールドＩＩ染色のため、Paxinos and Franklinによるマウス解剖図に従い、各マウスのそれぞれブレグマ０．８６ｍｍ前後の前脳からの４切片（脳梁から２切片、皮質から２切片）を選択した。有随化の検出のためのブラックゴールドＩＩ染色は、製造者（ＡＧ１０５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が適合させたプロトコールに従って行った。簡単に述べると、前脳からの４つの浮遊切片（脳梁から２切片、皮質から２切片）を、各２分間、ＭｉｌｌｉＱ水中で２回再水和物させた後、２４ウェルプレート中、６０℃で２０分間、０．３％ブラックゴールドＩＩ溶液で染色した。これらの切片をモニタリングして染色の程度を決定した。最も微細な有髄化線維が暗赤色〜黒色に染まったところで、染色工程を止めた。次に、これらの切片を各２分間、ＭｉｌｌｉＱ水中で２回すすいだ。その後、切片を６０℃で６分間、チオ硫酸ナトリウム溶液（１％）で処理した。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．０５％トリトンＸ１００）中ですすいだ後、切片をスライドグラス（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｌｕｓ  Ｓｌｉｄｅｓ）にマウントし、さらに３７℃の加熱プラットフォーム上で２〜４時間風乾した。これらの脱水スライドグラスに自動カバースリッパー（ＣＶ５０３０、Ｌｅｉｃａ）でカバーグラスをかけた。染色済みのスライドグラスをＳｃａｎｓｃｏｐｅ（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）によってスキャンした。脳梁中央部または帯状束近傍の皮質のデジタル画像を、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて倍率２０倍で取り込んだ。
【０１３８】
Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  ６．３ソフトウエア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、ＵＳＡ）をその後の定量的評価に用いた。ゲートをかけた各脳梁でブラックゴールドＩＩ染色に閾値を設定し、処理したスライドグラス上で同じ対物レンズおよび光強度で得られた画像に関して一定に保持した。ここでは面積およびＩＯＤ（積分光学密度）の２つのパラメーターを用いた。総てのデジタル画像を同じ色彩範囲下に設定した後に、脳梁中央部または皮質における平均密度、面積およびＩＯＤを計算した。平均密度は、脳梁中央部またはゲートをかけた皮質のＩＯＤ／総面積として計算した。結果はナイーブ対照の平均密度のパーセンテージとして表した。それぞれ各動物の前脳脳梁からの２切片、前脳皮質からの２切片から得られたデータの平均を取り、分析した。群のデータは平均±ＳＥＭとして表した。グラフはＧｒａｐｈＰａｄ５  ＰＲＩＳＭソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃｏ、ＵＳＡ）により作成した。
【０１３９】
統計分析
グラフはＧｒａｐｈＰａｄ５  ＰＲＩＳＭソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、ＳＡ）により作成した。群間差の分析にはＧｒａｇｈＰａｄによる対応のないｔ検定を用いた。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意と見なした。有意性は、これらの表にアスタリスク＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１で示す。
【０１４０】
クプリゾンおよびラパマイシンモデルにおける再有髄化に及ぼす実施例化合物２の効果
クプリゾン(cuprzione)およびラパマイシンモデルの別のバッチにおいて、マウスをクプリゾン食とラパマイシンの腹腔内注射との組合せで５週間処置した後、９日間、化合物投与を行った。クプリゾン食とラパマイシンの腹腔内注射は、脳梁および皮質の両方で重度の脱髄を誘導し、実施例化合物２（３０ｍｇ／ｋｇ、９日間）による処置は、ビヒクル対照群に比べて、前脳の脳梁および皮質の病変部においてミエリン特異的ブラックゴールドＩＩ染色の濃度を有意に高めた（図５ｅおよび５ｆ）。
【０１４１】
結果（図５）
図５ａの代表的画像は、実施例化合物１による処置が、クプリゾンモデル（５週間のクプリゾン食＋９日間の化合物処置）において前脳の脳梁の脱髄面積を低減し、ブラックゴールドＩＩ染色の平均強度を増強したことを示す。
【０１４２】
図５ｂの代表的画像は、実施例化合物１による処置が、クプリゾンモデル（５週間のクプリゾン食＋９日間の化合物処置）において後脳の脳梁の脱髄面積を低減し、ブラックゴールドＩＩ染色の平均強度を増強したことを示す。
【０１４３】
図５ｃは、脱髄面積の低減によって証明される、再有髄化に対する実施例化合物１の治療効果の統計分析を示す。各動物について前脳および後脳の両方からの４切片を分析した。各群のデータは平均±ＳＥＭとして表した。ビヒクル対照群に対して＊＊Ｐ＜０．０１。
【０１４４】
図５ｄは、脳梁におけるブラックゴールドＩＩ染色の平均濃度の増強によって示される、再有髄化に対する実施例化合物１の治療効果の統計分析を示す。各動物について前脳および後脳の両方からの４切片を分析した。各群のデータは平均±ＳＥＭとして表した。ビヒクル対照群に対して＊＊Ｐ＜０．０５。
【０１４５】
図５ｅは、実施例化合物２による処置が、クプリゾンおよびラパマイシンモデル（５週間のクプリゾン食とラパマイシン注射＋９日間の化合物処置）において前脳の脳梁の再有髄化を促進したことを示す。代表的画像（上のパネル）および定量分析（下のパネル）は、回復期における９日間の実施例化合物２処置が、ビヒクル対照群に比べて、前脳の脳梁のブラックゴールドＩＩ染色の平均濃度を有意に増強したことを示した。各動物について前脳の脳梁からの２切片の平均を取り、分析した。各群のデータは平均±ＳＥＭとして表した。ビヒクル対照群に対して＊＊Ｐ＜０．０５。
【０１４６】
図５ｆは、実施例化合物２による処置が、クプリゾンおよびラパマイシンモデル（５週間のクプリゾン食とラパマイシン注射＋９日間の化合物処置）において前脳皮質の再有髄化を促進したことを示す。代表的画像（上のパネル）および定量分析（下のパネル）は、回復期における９日間の実施例化合物２処置が、ビヒクル対照群に比べて、前脳皮質のブラックゴールドＩＩ染色の平均濃度を有意に増強したことを示した。各動物について前脳皮質からの２切片の平均を取り、分析した。各群のデータは平均±ＳＥＭとして表した。ビヒクル対照群に対して＊＊Ｐ＜０．０５。
【０１４７】
図５ａに示されるように、クプリゾンモデル（５週間のクプリゾン食＋９日間の化合物処置）における前脳の脳梁において、実施例化合物１による処置は、ビヒクル対照群に比べて、脱髄面積（ブラックゴールドＩＩ染色の空所）を低減し、ブラックゴールドＩＩ染色の平均強度を増強した（ＡおよびＣの代表的画像により示される）。ＢおよびＤは、分析をどのように行ったかを示すための例である。Ｂは、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  ６．３ソフトウエア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、ＵＳＡ）により変換したＡ由来の画像であり、Ｂの赤い部分の面積を脱髄面積として測定した。Ｄは、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏにより変換したＡ由来の画像であり、Ｄの赤色強度をミエリン強度として測定した。
【０１４８】
図５ｂに示されるように、クプリゾンモデル（５週間のクプリゾン食＋９日間の化合物処置）における後脳の脳梁において、実施例化合物１による処置は、ビヒクル対照に比べて、脱髄面積（ブラックゴールドＩＩ染色の空所）を低減し、ブラックゴールドＩＩ染色の平均強度を増強した（ＡおよびＣの代表的画像により示される）。ＢおよびＤは、分析をどのように行ったかを示すための例である。Ｂは、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  ６．３ソフトウエアにより変換したＡ由来の画像であり、Ｂの赤い部分の面積を脱髄面積として測定した。Ｄは、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏにより変換したＡ由来の画像であり、Ｄの赤色強度をミエリン強度として測定した。
【０１４９】
図５ｃに示されるように、定量分析は、１０ｍｇ／ｋｇでの実施例化合物１による処置が脱髄面積を有意に低減したことを示した（ビヒクル群：５４．８１％±７．２７％；０．３ｍｇ／ｋｇ群：４６．８２％±３．５４％；１ｍｇ／ｋｇ群：３８．４５％±７．５５％；３ｍｇ／ｋｇ群：４１．２２％±１１．１４％；１０ｍｇ／ｋｇ群：２７．６２％±５．２０％；動物当たり４切片からのデータを分析した；２つの前脳切片、２つの後脳切片）。
【０１５０】
図５ｄに示されるように、定量分析は、１０ｍｇ／ｋｇでの実施例化合物１による処置が前脳および後脳の両方の脳梁のミエリン染色強度を増強したことを示した（ビヒクル群：１５．７５％±２．０８％；０．３ｍｇ／ｋｇ群：１８．６１％±１．０１％；１ｍｇ／ｋｇ群：２２．００％±３．４１％；３ｍｇ／ｋｇ群：２８．３２％±７．７６％；１０ｍｇ／ｋｇ群：２６．３６％±３．１０％；動物当たり４切片からのデータを分析した；２つの前脳切片、２つの後脳切片）。
【０１５１】
図５ｅに示されるように、３０ｍｇ／ｋｇでの実施例化合物２による処置は、クプリゾンおよびラパマイシンモデル（５週間のクプリゾン食とラパマイシン注射＋９日間の化合物処置）において前脳の脳梁の再有髄化を促進した。代表的画像（上のパネル）および定量分析（下のパネル）は、回復期における９日間の実施例化合物２処置が、ビヒクル対照群に比べて、前脳の脳梁におけるブラックゴールドＩＩ染色の平均濃度を有意に増強したことを示した（平均強度：ビヒクル：１４．６５±１．９６％；ｃｐｄ：２７．６８±５．４４％。ビヒクル、ｎ＝９、実施例化合物２、ｎ＝７、動物当たり２切片からのデータを分析）。
【０１５２】
図５ｆに示されるように、３０ｍｇ／ｋｇでの実施例化合物２による処置は、クプリゾンおよびラパマイシンモデル（５週間のクプリゾン食とラパマイシン注射＋９日間の化合物処置）において前脳皮質の再有髄化を促進した。代表的画像（上のパネル）および定量分析（下のパネル）は、回復期における９日間の実施例化合物２処置が、ビヒクル対照群に比べて、前脳皮質におけるブラックゴールドＩＩ染色の平均濃度を有意に増強したことを示した（平均強度：ビヒクル：４０．７９±３．６０％；ｃｐｄ：６０．０５±６．２８％。ビヒクル、ｎ＝９、実施例化合物２、ｎ＝７、動物当たり２切片からのデータを分析）。
【０１５３】
結論
これらの結果は、本発明の化合物である実施例化合物１および実施例化合物２の処置が内因性の再有髄化を増進できることを示し、これはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの知見とよく一致した。よって、本明細書に示されたｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏデータは、ＯＰＣ分化の増強を介してＣＮＳミエリン修復を促進することによる多発性硬化症の新規な療法としてのＨ３Ｒのインバースアゴニストを強く支持する。
【０１５４】
実施例１３
ＯＰＣを用いたヒスタミンＨ３Ｒ機能的インバースアゴニストアッセイ（ｃＡＭＰアッセイ）
細胞表面で発現されるヒスタミン受容体３（Ｈ３Ｒ）は、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の形成を促進するアデニリルシクラーゼへの結合が陰性である。。ヒスタミンの不在下では、構成的に活性なＨ３Ｒは、ｃＡＭＰの細胞内レベルを阻害すると思われる。従って、Ｈ３Ｒの構成的活性を遮断するＨ３Ｒのインバースアゴニストは、ｃＡＭＰレベルを上昇させるであろう。実施例化合物２の、Ｈ３Ｒの構成的活性を阻害する能力を、細胞ｃＡＭＰアッセイで決定した。
【０１５５】
アッセイする各化合物について、ＯＰＣをＰＯコーティング９６ウェルプレートに２００００細胞／ウェルの密度で播種し、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ  Ｐｅｔｒｏｔｅｃｈ）およびＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ  Ｐｅｔｒｏｔｅｃｈ）を含むＢＤＭ中で２４時間培養した。これらの細胞をまず種々の濃度の実施例化合物（３０ｎＭ〜３Ｍ）で３０分間処理した。次に、それらの細胞を実施例化合物の存在下で１５分間、フォルスコリン（３Ｍ、Ｓｉｇｍａ）で刺激した。ｃＡＭＰ濃度をｃＡＭＰ化学発光イムノアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ１０５５７）により測定した。細胞を溶解バッファー（６０μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｋｉｔ  ｒｅａｇｅｎｔ）で３７℃にて３０分間溶解させた。溶解液をプレコーティングマイクロプレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｋｉｔ  ｒｅａｇｅｎｔ）に移し、ｃＡＭＰ−ＡＰ（３０μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｋｉｔ  ｒｅａｇｅｎｔ）およびｃＡＭＰ抗体（６０μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｋｉｔ  ｒｅａｇｅｎｔ）と混合した。１時間のインキュベーション後、これらのウェルを洗浄バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｋｉｔ  ｒｅａｇｅｎｔ）で５回洗浄した。ＣＳＰＤ（商標）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ／Ｓａｐｐｈｉｒｅ−ＩＩTMエンハンサー溶液（１００μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｋｉｔ  ｒｅａｇｅｎｔ）を各ウェルに加え、３０分間インキュベートした。化学発光シグナルを各ウェル１秒間、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。
【０１５６】
結果
図６ａおよび６ｂに示されるように、実施例化合物２は、一次性オリゴデンドロサイト前駆細胞において、フォルスコリンにより刺激されたｃＡＭＰレベルを用量依存的に上昇させた。
【０１５７】
結論
実施例化合物２は、オリゴデンドロサイト前駆細胞における細胞内フォルスコリンにより刺激されたｃＡＭＰレベルを（Ｈ３Ｒアゴニストの不在下で）用量依存的に上昇させた。この結果は、実施例化合物２がＨ３Ｒのインバースアゴニストであることを示唆する。
【０１５８】
実施例１４
Ｈ３Ｒ受容体への基礎的ＧＴＰγＳ結合に対する実施例化合物１の効果をＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて決定した。
【０１５９】
細胞の維持およびＢａｃｍａｍウイルスの感染
Ｇタンパク質ＧαＯを安定発現するヒト胚性腎臓２９３細胞（ＨＥＫ−２９３−ＧＯ）を、Ｅａｒｌｅの塩、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、４００ｍｇ／ｍＬジェネティシンおよび１０％ウシ胎仔血清を添加した最小必須培地（ＭＥＭ）にて、３７〜８℃、５％ＣＯ２、加湿環境で維持した。対数増殖期の細胞にヒト組換えＨ３受容体をコードするＢａｃＭａｍウイルス（Ｂｉｏｃａｔ：ウイルス９６８０１）を以下のように感染させた。細胞をＰＢＳでフラスコから剥離し、２００Ｘｇにて室温で５分間の遠心分離により回収した。その後、これらの細胞を多重感染度（ｍ．ｏ．ｉ．）１００でウイルスを含有する増殖培地に再懸濁させ、再び播種した後、通常の増殖条件下で２４時間インキュベートした。
【０１６０】
ＧＴＰγＳ結合アッセイ
ＧＴＰγＳ結合アッセイは、上記のように、ヒトＨ３ＲをコードするＢａｃＭａｍウイルスで形質導入したＨＥＫ−２９３−ＧαＯ細胞を用いて行った。一晩のインキュベーションの後、細胞を１０ｍＬのＰＢＳ中に回収し、２００Ｘｇで５分間遠心した。上清を除去した後、ペレットを、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中に再懸濁させ、ホモジナイズし、５０，０００Ｘｇで２０分間遠心分離した後、再びホモジナイズと遠心分離を行った。次に、この膜ペレットを再懸濁させ、タンパク質濃度に関するアッセイを行った。
【０１６１】
細胞膜をアッセイバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）で約１ｍｇ／ｍＬとなるように希釈し、小麦胚芽凝集素シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに４５分間インキュベートし、その後、ＧＤＰ（４０ｍＭ）を加えた。種々の濃度の実施例化合物１（半対数刻みで１００ｎＭ〜０．００１ｎＭ）を９６ウェルプレートに、１０ｍＬのアッセイバッファーとともに加えた。非特異的結合は、０．６ｍＭ  ＧＴＰγＳを含めることによって測定した。次に、６０マイクロリットル（約５５ｍｇタンパク質／ウェル）の膜／ＳＰＡビーズ／ＧＤＰ混合物を各ウェルに加え、プレートをオービタルシェーカー上、室温で３０分間インキュベートした。その後、［３５Ｓ］−ＧＴＰγＳ（０．３ｎＭ）を各ウェルに加え、プレートをシェーカー上でさらに３０分間インキュベートし、インキュベーションは、真空下、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｂフィルターで急速濾過することによって停止させた。フィルターを４ｍＬの氷冷水で２回洗浄し、フィルター上に結合した［３５Ｓ］−ＧＴＰγＳを、Ｗａｌｌａｃ  １４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｔｒｉｌｕｘカウンターでのシンチレーション計数により測定した。
【０１６２】
データの取得および分析
データを分析し、ビヒクル対照ウェル（ＤＭＳＯ）の数値に対する変化倍率として表した。グラフはソフトウエア：Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５．０により作成した。曲線の当てはめはソフトウエアＧｒａｐｈＰａｄを用いて行い、実施例化合物１のｐＥＣ５０値を導き出した。曲線の当てはめは、このソフトウエアに組み込まれているロジスティックモデルによって行った（Ｓ字用量応答：Ｙ＝底部＋（上部−底部）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ））））。
【０１６３】
統計分析
データは総て平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で示す。統計分析は、必要に応じて、一元配置ＡＮＯＶＡまたはスチューデントのｔ検定を用いて行った。ｐ＜０．０５であれば、統計的に有意と推論した。
【０１６４】
結果
実施例化合物１は、ＨＥＫ−２９３−ＧＯ細胞で発現されたヒトＨ３Ｒにインバースアゴニスト特性を示した。基礎的ＧＴＰγＳ結合（Ｈ３Ｒアゴニストの不在下）は、実施例化合物１（１００ｎＭ〜０．００１ｎＭ）によって用量依存的に阻害され、３回の独立した実験からｐＥＣ５０＝９．９５±０．０７であった（図７）。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、１１の用量群（ビヒクルおよび１０種類の有効用量）間での違いを比較した。ＡＮＯＶＡのｐ値９．７３５ｅ−１０＜０．０００１であることは、統計学的に有意な差を示した。アッセイを検証するための対照としてＨ３Ｒアゴニストであるα−メチルヒスタミンを用いた。ＧＴＰγＳアッセイの３つの独立したバッチからのデータの平均を取り、ビヒクル対照ウェルにおけるパーセンテージに対する変化倍率として表した。実施例１対ビヒクル、＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１。α−メチルヒスタミン対ビヒクル，＃、ｐ＜０．０５。
【０１６５】
結論
実施例化合物１は、ＨＥＫ２９３細胞の膜上で発現されたＨ３Ｒに対する基礎的ＧＴＰγＳ結合を（Ｈ３Ｒアゴニストの不在下で）用量依存的に阻害した。この結果は、実施例化合物１がＨ３Ｒのインバースアゴニストであることを示した。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年10月9日(2014.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物を含んでなる、多発性硬化症における障害の進行の緩徐化、休止または逆転において使用するための医薬組成物であって、前記化合物が、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾールもしくは４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル；またはそれらの薬学的に許容される塩である、医薬組成物。
【請求項２】
前記化合物が、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記化合物が、５〜５００マイクログラム／日の用量でヒトに経口投与される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記化合物が、１０〜１５０マイクログラム／日の用量でヒトに経口投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物を含んでなる、脱髄疾患の治療のための医薬組成物であって、前記化合物が、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾールもしくは４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル；またはそれらの薬学的に許容される塩である、医薬組成物。
【請求項６】
前記化合物が、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、またはその薬学的に許容される塩である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物を含んでなる、再有髄化の促進において使用するための医薬組成物であって、前記化合物が、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾールもしくは４−（４−（（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）ベンゾニトリル；またはそれらの薬学的に許容される塩である、医薬組成物。
【請求項８】
前記化合物が、１−｛６−［（３−シクロブチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−イル）オキシ］−３−ピリジニル｝−２−ピロリジノン、またはその薬学的に許容される塩である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（（１−シクロブチルピペリジン−４−イル）メチル）−１，２，４−オキサジアゾール、またはその薬学的に許容される塩である化合物。
【請求項１０】
Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物を含んでなる、多発性硬化症の治療のための医薬組成物であって、前記化合物が、１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）−プロピル）ピペリジンもしくは（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オン、またはそれらの薬学的に許容される塩である、医薬組成物。
【請求項１１】
前記化合物が、１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）−プロピル）−ピペリジンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記化合物が、（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
Ｈ３受容体のインバースアゴニストである化合物を含んでなる、脱髄疾患の治療のための医薬組成物であって、前記化合物が、１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）−プロピル）ピペリジンもしくは（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オン、またはそれらの薬学的に許容される塩である、医薬組成物。
【請求項１４】
前記化合物が、１−（３−（３−（４−クロロフェニル）プロポキシ）−プロピル）−ピペリジンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記化合物が、（Ｒ）−６−（４−（３−（２−メチルピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル）ピリダジン−３（２Ｈ）−オンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
多発性硬化症の治療のための医薬を製造するための、請求項９に記載の化合物の使用。
【国際調査報告】
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