(57)【要約】  【解決手段】  Ｂ細胞腫瘍を抑制、治療、および／または予防する組成物および方法が提供される。本発明に沿って、被験者において癌を抑制、治療、および／または予防する方法が提供される。特定の実施形態では、前記方法が前記被験者に治療有効量の少なくとも１つのＣＤ１９−ＰＩ３Ｋ相互作用阻害剤を投与する工程を有する。特定の実施形態では、前記方法がさらに、少なくとも１つの他の化学療法剤の投与および／または放射線療法の実施など、少なくとも１つの他の抗癌治療を行う工程を有する。  【選択図】      図１
2015517655.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学療法剤を同定する方法であって、少なくとも１つの被験化合物の存在下で、ＣＤ１９とホスファチジルイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）との結合アッセイを行う工程を有し、前記被験化合物が存在しない場合の結合と比較した、前記被験化合物の存在下でのＣＤ１９−ＰＩ３Ｋ結合量の減少が、前記化合物が化学療法剤であることを示すものである方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記結合アッセイは細胞によるスクリーニングアッセイである方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記ＣＤ１９はＣＤ１９の細胞質尾部である方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記被験化合物は小分子、ペプチド、または抗体である方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、前記化合物はＢ細胞腫瘍を治療する化学療法剤である方法。
【請求項６】
それを必要とする被験者におけるＢ細胞腫瘍を阻害する方法であって、治療有効量の少なくとも１つのＣＤ１９−ＰＩ３Ｋ相互作用阻害剤を前記被験者に投与する工程を有する方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、前記Ｂ細胞腫瘍はリンパ腫またはＢ細胞急性リンパ芽球性白血病である方法。
【請求項８】
請求項６記載の方法であって、さらに、前記被験者に少なくとも１つの他の化学療法剤を投与し、または放射線療法を行う工程を有する方法。
【請求項９】
請求項６記載の方法において、前記阻害剤はＣＤ１９細胞質尾部のペプチド模倣体またはＣＤ１９細胞質尾部に免疫学的に特異的な抗体である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願書類は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２０１２年５月１日に提出された米国仮特許出願第６１／６４０，９８７号の優先権を請求するものである。前述の出願書類は、この参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所が与える助成金番号Ｒ０１  ＣＡ１０２７０９、Ｔ３２  ＨＬ００７４３９、Ｔ３２  ＣＡ１１５２９９による政府支援を受けた。政府は本発明に対して特定の権利を持つ。
【０００３】
本発明は、癌治療の分野に関する。具体的には、癌を抑制、治療、および／または予防する組成物および方法が開示される。
【背景技術】
【０００４】
本発明が関与する技術の状況を説明するため、いくつかの文献および特許文書が本明細書の中で引用されている。これらの引用それぞれは、全文を説明するものとして、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００５】
癌遺伝子依存（ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）の概念は、特に血液悪性腫瘍で十分有効である（Ｆｅｌｓｈｅｒ，  Ｄ．Ｗ．  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ３：３７５−３８０）。「液性」腫瘍は遺伝子変化への依存が少ないため、異常発現した腫瘍性タンパク質を標的とする薬物に対して感受性が高いと考えられ、ＧｌｅｅｖｅｃとＢｃｒ−Ａｂｌが主な例である（Ｒｏｗｌｅｙ，  Ｊ．Ｄ．  （２００１）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  １：２４５−２５０；  Ｄｒｕｋｅｒ，  Ｂ．Ｊ．  （２００２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １：３１−３６）。さらに、多くのリンパ腫および白血病の癌遺伝子のイニシエーションは、反復性染色体転座の生成物として容易に同定される。例えば、ヒトバーキット（ＢＬ）リンパ腫および一部のびまん性大細胞型Ｂ細胞性（ＤＬＢＬＣ）リンパ腫では、ｔ（８；１４）転座により、ｃ−Ｍｙｃが免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子エンハンサーの制御下に入る（Ｔａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ７９：７８３７−７８４１；  Ｄａｌｌａ−Ｆａｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ７９：７８２４−７８２７）。マウス形質細胞腫でも同様の転座が同定された（Ｓｈｅｎ−Ｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）  Ｃｅｌｌ  ３１：４４３−４５２）。
【０００６】
Ｂ細胞腫瘍と関連した別のタンパク質はペアードボックス転写因子５、つまりＰａｘ５である。Ｐａｘ５はプロＢ細胞から成熟Ｂ細胞の段階へのＢ細胞の分化を制御し、主にＢ細胞受容体（ＢＣＲ）複合体の発現に関与している（Ｂｕｓｓｌｉｎｇｅｒ，  Ｍ．  （２００４）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２２：５５−７９；  Ｍｏｎｒｏｅ，  Ｊ．Ｇ．  （２００６）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ６：２８３−２９４）。これは、細胞表面でＩｇ−βをヘテロ二量体化する（Ｓｃｈａｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：５−１４）ＣＤ７９ａ（ａ．ｋ．ａ．  Ｉｇ−α；  Ｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３１：５４８３−５４８９）、およびＣＤ１９補助受容体（Ｎｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １７：２３１９−２３３３；  Ｋｏｚｍｉｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １２：２６６２−２６７２）をコードする遺伝子の直接的な転写活性化により達成される。ＰＡＸ５も、Ｂ細胞リンパ腫のサブセットで染色体転座により過剰発現されている。前記Ｐａｘ５遺伝子は、進行性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）と関連がある、比較的まれであるが、持続性のｔ（９；  １４）（ｐ１３；  ｑ３２）転座の影響を受ける。（Ｏｆｆｉｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｂｌｏｏｄ  ８０：２５９４−２５９９；  Ｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｈｕｍ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  ３５：４４７−４５４；  Ｂｕｓｓｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９３：６１２９−６１３４；  Ｉｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｂｌｏｏｄ  ８８：４１１０−４１１７；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｂｌｏｏｄ  ９２：３８６５−３８７８；  Ｐｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ４４：２１８−２２３）。ゲノム再編成に加え、特にびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）患者のＰａｘ５遺伝子は体細胞超変異の影響も受ける（Ｐａｓｑｕａｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１２：３４１−３４６）。他にもいくつかＰａｘ５が関与した反復性転座があり［例えば、ｔ（７；９）（ｑ１１；ｐ１３）およびｔ（９；１２）（ｑ１１；ｐ１３）］、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）にみられた。これらの転座によりＰａｘ５およびＥＬＮおよびＥＴＶ６／ＴＥＬ遺伝子が融合し、これらの転座はＰａｘ５転写活性の優性ネガティブ阻害因子とみなされる（Ｂｏｕｓｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｂｌｏｏｄ  １０９：３４１７−３４２３；  Ｃａｚｚａｎｉｇａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６１：４６６６−４６７０）。さらに、高解像度ＳＮＰアレイおよび直接ゲノム解読を利用したＢ−ＡＬＬのゲノムレベル解析では、いくつかのＰａｘ５の機能欠失型変異が得られた（Ｍｕｌｌｉｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  ４４６：７５８−７６４）。しかし、他の癌遺伝子転写因子で制御される経路におけるＰＡＸ５の影響についてはわかっていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に沿って、被験者の癌を抑制、治療、および／または予防する方法が提供される。特定の実施形態では、前記方法が前記被験者に治療有効量の少なくとも１つのＣＤ１９−ＰＩ３Ｋ相互作用阻害剤を投与する工程を有する。特定の実施形態では、前記方法がさらに、少なくとも１つの他の化学療法剤の投与および／または放射線療法の実施など、少なくとも１つの他の抗癌治療を行う工程を有する。
【０００８】
本発明の別の態様に従い、化学療法剤（例えば、ＣＤ１９−ＰＩ３Ｋ相互作用阻害剤）をスクリーニングする方法も提供される。特定の実施形態では、前記方法が少なくとも１つの被験化合物存在下、結合アッセイを行う工程と、ＣＤ１９−ＰＩ３Ｋの結合量と前記被験化合物非存在下での結合量を比較する工程とを有し、前記結合の減少は前記被験化合物が阻害剤であることを示す。
【０００９】
本発明に従い、癌がＣＤ１９−ＰＩ３Ｋ相互作用阻害剤に感受性であるか抵抗性であるかを判断する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、Ｐａｘ５がｃ−Ｍｙｃタンパク質レベルを制御することを示す。すべての図が、左に示したタンパク質の免疫ブロット解析を示す。アクチンはローディング・コントロールとして用いた。図１Ａは、表示された収集前間隔について、Ｄｏｘ処理前（０時間）または処理後のＰ４９３−６細胞を示す。図１Ｂは、空のＭＩＧＲ１ベクター（「ＧＦＰ」）またはＰａｘ５−ＭＩＧＲ１（「Ｐａｘ５」）を感染させたＭｙｃ５細胞を示す。感染後２４時間および４８時間でタンパク質溶解液を調製した。図１Ｃは、Ｍｙｃ腫瘍サンプルから得られたタンパク質溶解液を示す。移植前にＭｙｃ５細胞を空のＭＩＧＲ１ベクター（「ＧＦＰ」）またはＰａｘ５ＥＲＭＩＧＲ１（「Ｐａｘ５ＥＲ」）に感染させた。図１Ｄは、様々な抗Ｐａｘ５（「Ｐａｘ５」）または対照（「Ｃｔｒｌ」）ｓｉＲＮＡを用いて電気穿孔したＰ４９３−６細胞を示す。図１Ｅは、1μＭの対照または抗Ｐａｘ５  ｓｉＲＮＡを用いて電気穿孔したＰ４９３−６細胞を示す。溶解液は電気穿孔後２４時間および４８時間で収集した。
【図２】図２は、Ｐ４９３−６細胞へのＲＮＡの電気穿孔効率を示す。Ｐ４９３−６細胞は、Ａｍａｘａ（登録商標）により、ＢＬＯＣＫ−ＩＴ（登録商標）ＦＩＴＣ標識二本鎖ＲＮＡオリゴ１０ｎＭ、０．１μＭ、または１μＭを用いて電気穿孔した。電気穿孔後２４時間でフローサイトメトリーを行い、ＦＩＴＣ陽性細胞の割合を決定した。
【図３】図３は、Ｐａｘ５がＣＤ１９によりｃ−Ｍｙｃタンパク質レベルを制御することを示す。図３Ｅおよ３Ｈを除くすべての図が、左に示したタンパク質の免疫ブロット解析を示す。アクチンはローディング・コントロールとして用いた。図３Ａの括弧を付けた部分は、ＨＡ標識野生型または変異型（「ｍｕｔ」）ＩＴＡＭを発現したＭｙｃ５細胞の全細胞溶解物をα−ＨＡ抗体で免疫沈降した後、抗ｔｏｔａｌ  Ｌｙｎ抗体、Ｔｙｒ３９６−ホスホ−Ｌｙｎ、または別のα−ＨＡによる免疫ブロットを行った。下の図では、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体およびβ−アクチンで同じ細胞の溶解液の免疫ブロットを行った。図３Ｂは、空（「ＧＦＰ」）またはＣＤ１９をコードしたレトロウイルス（「ＣＤ１９」）を形質導入したＭｙｃ５細胞のＣＤ１９およびＭｙｃレベルを示す。図３Ｃは、対照またはα−ＣＤ１９  ｓｉＲＮＡいずれかの濃度を上昇させて電気穿孔したＰ４９３−６細胞のＰａｘ５、ＣＤ１９、およびＭｙｃレベルを示す。図３Ｄは、野生型（「ＷＴ」）およびＣＤ１９ヌル（「ＫＯ」）マウスの骨髄由来Ｂ細胞のＣＤ１９およびＭｙｃレベルを示す。図３Ｅは、Ｐａｘ５または低／高レベルのＣＤ１９を発現したＭｙｃ５細胞表面のＣＤ１９発現をフローサイトメトリーで検出したものを示す。各プロットに平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。図３Ｆは、同じ培養中のＣＤ１９およびＭｙｃタンパク質発現を示す。図３Ｇは、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）処理後のＰａｘ５およびＣＤ１９再構成細胞株中のＭｙｃレベルを示す。ＣＨＸは１μｇ／ｍｌの濃度で７．５〜３０分間追加した。下の図では、Ｍｙｃ特異的バンドをデンシトメトリーにより定量化し、アクチンに対して正規化し、処理後経過時間に対してプロットした。正確にバンドを定量できるようにするため、親細胞とＰａｘ５／ＣＤ１９形質導入細胞で異なる曝露量芽示されていることに注意する。図３Ｈは、放射性免疫沈降法により検出した同じ培養中で定常状態のＭｙｃレベルを示す。細胞は３５Ｓメチオニンで３０分間パルスラベルした後、「冷（ｃｏｌｄ）」アミノ酸で０〜３０分間追跡した。
【図４】図４は、野生型およびＣＤ１９ヌルマウスの一次Ｂ細胞の短時間培養を解析したものを示す。図４Ａは、９日間培養した骨髄細胞のフローサイトメトリーと、Ｂ２２０およびＣＤ１９陽性細胞の割合を示す。数字は、主要細胞分画の相対存在量を指す。図４Ｂは、３日間培養した野生型マウス脾細胞のフローサイトメトリーを示す。
【図５】図５は、ＣＤ１９がＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路によりＭｙｃタンパク質の発現を制御することを示す。すべての図が、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路に属するタンパク質の免疫ブロット分析を示す。アクチンはローディング・コントロールとして用いた。図５Ａは、１μＭの対照または抗ＣＤ１９  ｓｉＲＮＡにより収集する前２４時間で電気穿孔したＰ４９３−６細胞を示す。図５Ｂは、１０μＭのＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９００４または溶媒のみ（エタノール）を１時間処理した同じ細胞を示す。図５Ｃは、同じ試薬で０．５時間前処理した脾臓Ｂ細胞を示す。図５Ｄは、空のレトロウイルスベクター（ｎｅｏ）または構成的活性化Ａｋｔ１／２（ＡＫＴｍｙｒ）を発現したレトロウイルスを形質導入したＭｙｃ５細胞を示す。タンパク質溶解液は、さらに抗Ｍｙｃ残基Ｔｈｒ−５８およびＳｅｒ−６２抗体でプローブした。図５Ｅは、対照または抗ＧＳＫβ  ｓｉＲＮＡの濃度を上昇させて収集する前４８時間で電気穿孔したＰ４９３−６細胞を示す。図５Ｆは、空のベクター、ＷＴ  Ｍｙｃ、またはＴ５８Ａ変異体によりさらに形質導入し、ＧＦＰまたはＰａｘ５を発現したＭｙｃ５細胞を示す。形質導入細胞のＭｙｃ（上）を免疫ブロットし、Ｐａｘ５形質導入細胞のＭｙｃタンパク質レベルをＧＦＰ形質導入細胞と比較した。Ｔ５８Ａ変異体にはＰｙｏ標識があるため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでは移動速度が遅いことに注意する。図５Ｇは、空のベクターまたはＰＴＥＮをコードしたレトロウイルス（「ＰＴＥＮ」）でさらに形質導入し、図３ＢでＧＦＰまたはＣＤ１９を発現したＭｙｃ５細胞を示す。
【図６】図６は、ＣＤ１９がｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞発現、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖を促すことを示す。これらの実験で使用した細胞株は、ＭＹＣ５（図６Ａ〜６Ｃ）または単細胞サブクローンのＭｙｃ５−Ｍ５（図６Ｄ〜６Ｇ）であった。図６Ａは、対照および抗Ｍｙｃ  ｓｉＲＮＡを処理したＧＦＰおよびＣＤ１９再構成ＭＹＣ５培養の増殖速度を比較分析したものを示す。図６Ｂは、同じ培養のＭｙｃタンパク質レベルを示す。図６Ｃは、Ｐａｘ５、ＣＤ１９、およびＭｙｃ再構成ＭＹＣ５培養の増殖速度を比較分析したものを示す。図６Ｄは、ＣＤ１９再構成ＭＹＣ５−Ｍ５細胞のＣＤ１９−Ｍｙｃ軸成分の発現レベルを示す。図６Ｅは、図６Ｄの培養で既知のＭｙｃ標的遺伝子のレベルを示す。図６Ｆは、ＳＣＩＤマウスに皮下移植後のＣＤ１９再構成ＭＹＣ５−Ｍ５腫瘍のＣＤ１９−Ｍｙｃ軸成分の発現レベルを示す。この分析では、各コホートから３つずつ腫瘍を無作為に選択した。図６Ｇは、図６Ｆの腫瘍異種移植片の増殖速度を示す。各群５匹以上のマウスを分析した。エラーバーは標準偏差を示す。
【図７】図７は、ＣＤ１９発現Ｍｙｃ５−Ｍ５細胞の生成および分析を示す。Ｍｙｃ５−Ｍ５細胞には、空のベクター（ＧＦＰ）またはＣＤ１９レトロウイルスを形質導入した。感染後２４時間でフローサイトメトリーを行い、ＧＦＰ陽性細胞の割合を決定した（図７Ａ）。この後、これらの細胞を分類し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させ、図６に示した実験に使用した。対照（ＧＦＰ）およびＣＤ１９再構成Ｍｙｃ５−Ｍ５細胞における重要なＭｙｃ抑制ミクロＲＮＡ細胞の相対レベルを図７Ｂに示す。
【図８】図８は、ＣＤ１９がヒトＢリンパ腫のＭｙｃ機能に関与していることを示す。図８Ａはモデル全体を提示し、ＣＤ１９はＢＣＲ依存的にＭｙｃの安定化を促す。図８ＢはＤＡＮＧ＿ＭＹＣ＿ＴＡＲＧＥＴＳ＿ＵＰセットのＧＳＥＡエンリッチメントプロットを示し、ＣＤ１９ＨＩＧＨ腫瘍とＣＤ１９ＬＯＷ腫瘍を比較している。正規化したエンリッチメントスコア、ｐ値、およびＦＤＲ  ｑ値をプロットの下に示す。図８ＣはＧＳＥＡ時に作成されたヒートマップを提示し、Ｍｙｃ標的遺伝子を示し、ＣＤ１９ＨＩＧＨ腫瘍とＣＤ１９ＬＯＷ腫瘍を比較している。図８Ｄは、Ｈｕｍｍｅｌ（左図）およびＬｅｎｚ（右図）の研究でＭＹＣＨＩＧＨ患者とＭＹＣＬＯＷ患者の生存を比較したカプラン・マイヤー曲線を示す。図８Ｅは、Ｈｕｍｍｅｌ（左図）およびＬｅｎｚ（右図）の研究でＣＤ１９ＨＩＧＨ患者とＣＤ１９ＬＯＷ患者の生存を比較したカプラン・マイヤー曲線を提示する。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、表示された患者の経時的生存率を示す。図９Ｃは、ｍｉＲ−１７〜９２存在量とｍｉｒ１７ｈｇシグナルとの関連を示したグラフを提示する。図９ＤはＢＣＲシグニチャーとｍｉｒ１７ｈｇ発現との関連を示す。図９Ｅ、９Ｆ、および９Ｇは、表示された被験者の経時的生存率を示したグラフを提示する。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、ｍｉＲ−１７〜９２阻害剤存在下または非存在下で様々な細胞タイプのＢＬＮＫのリン酸化反応を示す。図１０Ｃは、様々な細胞のＣＤ２２発現を示す。図１０Ｄおよび１０Ｅは、表示されたｍｉＲＮＡ存在下または非存在下でルシフェラーゼの発現を示したグラフを提示する。図１０Ｆは、ｍｉＲ１７−９２模倣体存在下または非存在下でＡｋｔおよびＧＳＫ３βのリン酸化反応を示す。図１０Ｇは、ＢＣＲ反応の図を提示する。
【図１１】図１１は、ＰＩ３Ｋが機能しないＣＤ１９はＪＮＫを活性化し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖を促すことを示す。図１１Ａは、野生型または変異型ＣＤ１９のいずれかを発現したＭＹＣ５腫瘍の増殖速度を提示する。図１１Ｂは、２３日目で図１１Ａの個々の腫瘍から得られたタンパク質溶解液の免疫ブロットを提示する。図１１Ｃは、ＭＹＣ５−Ｍ５細胞におけるｗｔまたは変異型ＣＤ１９の再発現に反応したＭＡＰＫシグナル伝達分子およびその標的のリン酸化反応を示す。図１１Ｄは、ＰＩ３Ｋ阻害剤のＬＹ２９４００２または溶媒（エタノール）を処理した一次マウスＢ細胞を示す。図１１Ｅは、表示された時間、ＳＵ６６５６または溶媒のみ（ＤＭＳＯ）を処理し、ＷＴまたはＭＵＴＣＤ１９を発現したＭＹＣ５細胞を示す。リン酸化反応は、リン酸特異的抗体を使用したウエスタンブロット法により評価した。図１１Ｆは、ＳＵ６６５６によるＭＹＣ５／ＣＤ１９細胞増殖の抑制を示す。ＧＦＰのみを発現したＭＹＣ５細胞を対照として使用した。細胞増殖は、表示された時間、ＷＳＴアッセイにより測定した。図１１Ｇは、一覧にした抗体で免疫ブロットしたＷＴまたはＭｕｔＣＤ１９で回復させたＭｙｃ＿Ｍ５（ＣＤ１９−／ＢＣＲ−）細胞のタンパク質溶解液を示す。
【図１２】図１２は、Ｂ−ＡＬＬ細胞（ＢＣＲ−ＣＤ１９＋）がＳｒｃファミリーチロシン（ＳＦＴＫ）キナーゼのＬｙｎを動員し、ＬＹＮ抑制に対して感受性があることを示す。Ｂ−ＡＬＬ細胞６９７およびバーキットリンパ腫細胞Ｐ−４９３６の溶解液は、抗ＣＤ１９抗体またはウサギＩｇＧ（ネガティブコントロール）による免疫沈降を受ける。免疫沈降したタンパク質を次にＰＩ３ＫまたはＬｙｎで免疫ブロットした（図１２Ａ、上）。Ｂ−ＡＬＬ細胞６９７の溶解液を抗ＣＤ１９またはＬｙｎ抗体で免疫沈降させた後、ＣＤ１９の免疫ブロットを行った（図１２Ａ、下）。ＣＤ１９  ｓｈＲＮＡ処理はＬｙｎのリン酸化とＭｙｃの発現を抑制し、Ｌｙｎ  ｓｈＲＮＡ処理は全Ｌｙｎおよびｐ−Ｌｙｎレベルを低下させる。Ｍｙｃの抑制も観察される（図１２Ｂ、上）。図１２Ｂの下図は、ＣＤ１９（左）またはＬｙｎ（右）ｓｈＲＮＡ処理細胞の増殖をモニターしたＷＳＴアッセイのグラフを提示する。図１２Ｃは、ＣＤ１９またはＬｙｎ  ｓｈＲＮＡと、ダサチニブ（濃度１００ｎＭ）または溶媒（ＤＭＳＯ）で処理した細胞のアネキシンＶ／ヨウ化プロピジウ（ＰＩ）染色を示す。図１２Ｄは、Ｌｙｎに対するダサチニブの有効性を示す。ウエスタンブロット解析を行うため、処理後０．５、１．０、２．０、および４．０時間でタンパク質溶解液を収集した（図１２Ｄ、上）。図１２Ｄは、前記薬物で処理後の細胞増殖をモニターしたＷＳＴアッセイのグラフも提示する。細胞周期を分析するため、処理後４８時間で細胞を収集した。ダサチニブはＧ１期で細胞周期を停止し、ＳおよびＧ２／Ｍ期を同程度抑制した（図１２Ｄ）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
Ｐａｘ５の発癌活性および癌抑制活性を調製する１つの考えられる経路は、Ｐａｘ５が、ステージ分化、特にＢＣＲの発現に依存した方法で腫瘍性成長に影響するというものである。ほとんどのＮＨＬが成熟および胚中心前後のＢ細胞に由来するため、この成長促進複合体を発現している（Ｓｈａｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２：９２０−９３２；  Ｇｕｒｕｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７６：５７１５−５７１９）。対照的に、大部分のＢ−ＡＬＬ（Ａ１およびＡ２タイプ）がＢＣＲがない未成熟のプロまたはプレＢ細胞に由来する（Ｓｔａｕｄｔ，  Ｌ．Ｍ．  （２００２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １：１０９−１１０）。Ｐａｘ５の形質転換活性がＢＣＲシグナル伝達に依存していた場合、それ自体はＮＨＬで発現するだけであるがＢ−ＡＬＬでは発現せず、Ｐａｘ５本来の増殖抑制効果はアンマスキングされているかもしれない（Ｔｈｏｍａｓ−Ｔｉｋｈｏｎｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ  ４：５−９）。
【００１２】
実際、ＢＣＲシグナル伝達の誘導はＭｙｃで誘発されるＰａｘ５介在性のリンパ腫形成に重要である（Ｃｏｚｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖ．，  １１７：２６０２−２６１０）。具体的には、Ｐａｘ５依存性の腫瘍性成長は、ＩＴＡＭ特異的ＣＤ２２ホスファターゼの過剰発現またはＳｙｋ阻害剤の処理により抑制されるか、または構成的活性化ＩＴＡＭコンストラクトの強制発現により再現される可能性がある（Ｇｒａｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５：２７４８−２７５７）。トランスジェニックマウスモデルを使用したその後のデータでは、ＭｙｃおよびＢＣＲシグナル伝達経路がＢリンパ腫形成時に連携し合っているという考えの妥当性が確認された（Ｒｅｆａｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ６：ｅ１５２）。けれども、Ｍｙｃ自体とＰａｘ５という２つの重要な転写因子の間に直接的な機能的相互作用があるのか否かはまだわかっていない。この問題には、２つの細胞モデルを利用して取り組んだ。１つはｐ５３ヌル／Ｍｙｃ誘導性マウスリンパ腫細胞由来のＭｙｃ５細胞株であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養するとＰａｘ５の自発的サイレンシングを受ける（Ｃｏｚｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖ．，  １１７：２６０２−２６１０；  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｂｌｏｏｄ  １０１：１９５０−１９５５；  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ５：８５３−８６１；  Ｈｏｄａｗａｄｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７７：６１６５−６１７１；  Ｈｏｄａｗａｄｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，  ３１３：３３１−３４０）。もう１つは、エプスタイン・バー・ウイルスにより不死化し、ｔｅｔ調節プロモーターからＭｙｃ導入遺伝子を発現したＰ４９３−６ヒトＢリンパ芽球様細胞である（Ｐａｊｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８７：７８７−７９３；  Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１２３−１２６）。これらの細胞株および一次マウスＢ細胞とヒト非ホジキンリンパ腫を用いて得られたｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏデータでは、Ｂ細胞では、Ｐａｘ５およびその下流エフェクターのＣＤ１９がＭｙｃタンパク質レベルの重要な翻訳後転写制御因子である、という驚くべき結論が得られた。この所見は、Ｂリンパ腫形成に重要な意味を持つ。 
より具体的には、ＭＹＣ誘導性マウスリンパ腫モデルおよびＭＹＣ形質転換ヒトＢ細胞株を用い、本明細書では、ＰＡＸ５がｃ−ＭＹＣタンパク質の安定性と定常状態レベルを制御することが示されている。このプロモーター依存性翻訳後のｃ−ＭＹＣ制御機構はＩＴＡＭ／ＢＣＲ活性に依存した。代わりに、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ＧＳＫ３β軸では、ｃ−ＭＹＣは別のＰＡＸ５の標的であるＣＤ１９の制御を受けた。その結果、ＣＤ１９欠乏マウスのＢ細胞のＭＹＣレベルは急激に低下した。逆に、ＰＡＸ５の自発的サイレンシングによりマウスリンパ腫のＣＤ１９が再発現するとＭＹＣレベルが上昇し、その重要な標的遺伝子の発現、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖、およびｉｎ  ｖｉｖｏでの全体的な腫瘍成長が亢進した。ヒトＢリンパ腫では、ＣＤ１９  ｍＲＮＡレベルがＭＹＣ活性化遺伝子レベルと相関することがわかった。この値は、ＭＹＣレベル同様、リンパ腫患者の全生存率とも負の相関関係があった。したがって、ＣＤ１９はＢ細胞腫瘍におけるＭＹＣ由来腫瘍性成長の主なＢＣＲ依存性制御因子である。
【００１３】
Ｐａｘ５はＢリンパ腫形成を促す（Ｔｈｏｍａｓ−Ｔｉｋｈｏｎｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ．，  ４：５−９）。実際、その根拠としては、ＰＡＸ５とＩｇＨ遺伝子座を並べて置く、比較的まれであるが持続的なｔ（９；１４）（ｐ１３；ｑ３２）転座、Ｐａｘ５発現を亢進すると推定されるＤＬＢＣＬのＰＡＸ５体細胞超変異、および遺伝子ノックダウン／過剰発現研究などがある（Ｃｏｚｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖ．，  １１７：２６０２−２６１０；  Ｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｈｕｍ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  ３５：４４７−４５４；  Ｂｕｓｓｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９３：６１２９−６１３４；  Ｉｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｂｌｏｏｄ  ８８：４１１０−４１１７；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｂｌｏｏｄ  ９２：３８６５−３８７８；  Ｐｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ４４：２１８−２２３；  Ｐａｓｑｕａｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１２：３４１−３４６）。Ｂ細胞発現の負の影響は、ＤＬＢＣＬ細胞株において、Ｐａｘ５エフェクターＣＤ７９ａ（Ｉｇ−α）のノックダウン後にも観察された（Ｇｕｒｕｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７６：５７１５−５７１９）。ＣＤ７９ａはＢ細胞受容体の中心的構造要素であるため（Ｍｏｎｒｏｅ，  Ｊ．Ｇ．  （２００６）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ６：２８３−２９４）、これらの結果は、Ｉｇ−α／ＢＣＲシグナル伝達経路のＰａｘ５による刺激がその形質転換活性の根底にあることを示唆していた。実際、構成的活性化ＣＤ７９ａ／ｂヘテロダイマー（ＩＴＡＭ）もＢリンパ腫形成を促す（Ｃｏｚｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖ．，  １１７：２６０２−２６１０；  Ｒｅｆａｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ６：ｅ１５２）。ＢＣＲとＭｙｃの連携も観察され、これらは共線的経路ではなく、並列的に作用しているかもしれないことが示唆された。本明細書では、Ｐａｘ５発現の回復はＭｙｃレベルを強く上昇させるが、ＩＴＡＭはＭｙｃレベルにあまり影響しないことが示された。実際、その役割はＣＤ１９介在性シグナル伝達経路に基づく可能性がある。
【００１４】
ＣＤ１９は既知のＢ細胞表面分子であり、ＢＣＲの活性化は、Ｂ細胞集団の発現に極め重要な、Ｂ細胞抗原受容体誘導性のシグナル伝達経路を亢進する（Ｔｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．  （２００９）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，  ５：５７２−５７７）。１つの既知の作用機序は、ＰＩ３およびその後のＡｋｔキナーゼの動員と活性化である（Ｔｕｖｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９８６−９８９；  Ｂｕｈｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６２：４４３８−４４４６；  Ｏｔｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７６：１４７４−１４７８；  Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６８：５４６５−５４７６；    Ａｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｂｌｏｏｄ  １１１：１４９７−１５０３）。これは、ＣＤ１９の細胞質領域にある２つのチロシン残基Ｙ４８２とＹ５１３のドッキング機能により達成される（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １７：５０１−５１４）。さらに、Ｓｅｒ−９上のＧＳＫ３βのＡｋｔによる抑制的リン酸化は、この経路の重要な機能の１つである（Ｃｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：７８５−７８９）。同様に、ＧＳＫ３βによりＴｈｒ−５８上のＭｙｃがリン酸化されることでＦｂｗ７  Ｅ３ユビキチンリガーゼによる認識が亢進し、タンパク質分解が加速した（Ｈａｎｎ，  Ｓ．Ｒ．  （２００６）  Ｓｅｍｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．，  １６：２８８−３０２；  Ｗｅｌｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １０１：９０８５−９０９０；  Ｐｕｌｖｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：５９−７０）。しかし、Ｍｙｃタンパク質の安定性は、他のリン酸化部位および他のユビキチンリガーゼにより広く制御される（Ｈａｎｎ，  Ｓ．Ｒ．  （２００６）  Ｓｅｍｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．，  １６：２８８−３０２；  Ｓｅａｒｓ，  Ｒ．Ｃ．  （２００４）  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ３：１１３３−１１３７）。したがって、本明細書において、ＧＳＫ３βのＢ細胞不活化がこのようにＭｙｃタンパク質レベルに計り知れない影響を持つことが判明したことは、驚くべきことであった（図５Ｅ参照）。他の驚くべき結果は、中心のＢＣＲ要素ＣＤ７９ａ（Ｉｇ−α）がない細胞ではＣＤ１９によるＡｋｔシグナル伝達の刺激（図５Ｇ参照）が観察されたため、これは、成熟Ｂリンパ球の生存を制御することが知られているＢ細胞受容体のシグナル伝達と完全に独立していたことであった（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｃｅｌｌ  １３９：５７３−５８６；  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５：５５−６５；  Ｋｒａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｃｅｌｌ  １１７：７８７−８００）。 
ＣＤ１９はＭｙｃレベルを上昇させるだけでなく、明らかにＭｙｃの機能にプラスの効果を持つ。例えば、ＣＤ１９で再構成されたＭｙｃ５−Ｍ５細胞は、Ｍｙｃの標的であるＯＤＣ１、ＣＤＫ４、およびＬＤＨＡ値の上昇を示す（図６Ｅ参照）。さらに、ヒトＤＬＢＣＬでは、ＣＤ１９  ｍＲＮＡレベルとＯＤＣ１、ＣＤＫ４、およびＬＤＨＡを含むＭｙｃ活性化遺伝子レベル（図８Ｂ、８Ｃ参照）との間に、非常に統計的に有意な相関関係がある。したがって、ＭＹＣレベル同様、ＤＬＢＣＬのＣＤ１９レベルは患者の生存と負の相関関係がある（図８Ｄ、８Ｅ）。
【００１５】
ＣＤ１９（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １９、遺伝子ＩＤ番号：９３０、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１５３９１．６、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ１５３９１）は、正常および腫瘍性Ｂ細胞のいずれにおいても広く発現される。Ｂ細胞腫瘍はＰａｘ５およびＣＤ１９の発現を維持することが多いため、（ＣＤ２０とともに）免疫毒素を含む様々な免疫療法薬で選択される標的とみなされる（Ｓｃｈｅｕｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｌｅｕｋ．  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  １８：３８５−３９７；  Ｔｅｄｄｅｒ，  Ｔ．Ｆ．  （２００９）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，  ５：５７２−５７７）。特に、ヒト化抗ＣＤ１９  ｍＡｂおよびＣＤ１９のキメラ抗体受容体を発現した同種異系Ｔ細胞が臨床試験に入っている。これらはＣＤ１９発現腫瘍性Ｂ細胞を認識し、減少させることで作用すると推定される（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ７０：３９１５−３９２４；  Ａｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｂｌｏｏｄ  １１５：１２０４−１２１３）。特に、抗ＣＤ１９抗体で処理すると通常はＣＤ１９が内部移行し、推測ではその機能が消失する（Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  １０：２５３０−２５３７）。したがって、抗癌剤またはＴ細胞の送達に加え、共役抗ＣＤ１９抗体はＰＩ３Ｋシグナル伝達を抑制し、結果としてＭｙｃ発現を阻害する可能性がある。
【００１６】
特に、形質細胞に由来する、多発性骨髄腫症（ＭＭ）などのＣＤ１９陰性Ｂ細胞腫瘍の細胞増殖を促進しているのは何かは不明である。興味深いことに、この疾患ではＭｙｃの転位が非常に多く、最近報告されたＭｙｃ遺伝子転写阻害剤（ＪＱ１）は、ＭＭの発症機序におけるＭｙｃの重要な役割を証明するために使用された（Ｃｈｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２５：１０２６−１０３５；  Ｓｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９７：２２８−２３３；  Ｄｅｌｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｃｅｌｌ  １４６：９０４−９１７）。ＭＭのＭｙｃレベルはＣＤ１９〜１存在下では維持されるが、これは１）再配列された対立遺伝子がそのような確実な転写を促し、これによってＰＩ３Ｋシグナル伝達が行われなくても、Ｍｙｃタンパク質が十分なレベルまで蓄積することができることによるもの、または２）ＣＤ１９以外の表面受容体がＭＭ（およびホジキンリンパ腫など、他のＣＤ１９陰性腫瘍）のＰＩ３Ｋ活性化に関与していることによるものである。第２の選択肢は、少なくともｉｎ  ｖｉｔｒｏのＭＭ細胞はＰＩ３Ｋ阻害剤に対する感受性が高いという所見により裏付けられ（Ｋｈｗａｊａ，  Ａ．  （２０１０）  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ３４７：１６９−１８８）、これはＢ細胞由来腫瘍の重要な腫瘍性タンパク質であるＭｙｃの不安定化を介している可能性がある。
【００１７】
本発明に従い、化学療法剤（例えば、ＣＤ１９−ＰＩ３Ｋ相互作用阻害剤）を同定する方法も提供される。ＣＤ１９細胞質尾部はリン酸化に利用できる複数のチロシン残基を有する（例えば、Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６４：３１２３−３１３１）。ＰＩ３Ｋのｐ８５サブユニットはＣＤ１９細胞質尾部のチロシン４８２および５１３と相互作用することが示された（Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７２：７５５６−７５６４；  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ２７：３１０９−３１２２；  Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：４７−５７；  Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：６３５−６４５；  Ｔｕｖｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９８６−９８９）。特定の実施形態では、本発明のスクリーニング方法が少なくとも１つの被験化合物存在下で結合アッセイを行い、ＣＤ１９、特に細胞質尾部とＰＩ３Ｋとの相互作用を崩壊させる、および／または阻害する阻害剤を特定する工程を有する。前記結合アッセイは細胞で行うことができる（例えば、酵母ツーハイブリッド法）。前記結合アッセイは、被験化合物非存在下および／または既知の阻害剤存在下で前記アッセイを行うなど、適切な管理工程も有する。結合アッセイには、これに限定されるものではないが、細胞表面受容体結合アッセイ、蛍光エネルギー移動測定、液体クロマトグラフィー、膜ろ過アッセイ、リガンド結合アッセイ、放射性結合アッセイ、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学的分析、ウエスタンブロット、および表面プラズモン共鳴を含む。特定の実施形態では、前記結合アッセイにおいてＣＤ１９またはＰＩ３Ｋが（例えば固体支持材などに）固定され、前記被験化合物存在下、特に結合していないタンパク質を洗い流した後、前記固定されたタンパク質に結合した他のタンパク質量を測定する。特定の実施形態では、前記アッセイが細胞によるスクリーニングアッセイである。例えば、Ｂ細胞上の化合物はＣＤ１９のリガンド存在下でスクリーニングすることができる（例えば、ＢＣＲを有する抗ＩｇＭ抗体のＣＤ１９−Ｌ（Ｕｃｋｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．，  １５３：１５−２３））。前記化合物のＣＤ１９によるＰＩ３Ｋまたは下流タンパク質との相互作用／活性化阻害力はスクリーニングすることができる（例えば、図８Ａを参照。例えば、Ｍｙｃタンパク質レベルの低下、Ａｋｔリン酸化の減少、ＧＳＫ３βリン酸化の低下など）。    
特定の実施形態では、前記被験化合物が抗体、小分子、またはペプチド、特にＣＤ１９またはＰＩ３Ｋの結合ドメインを模倣したペプチドである。このペプチドは約５〜約５０アミノ酸長、特に約５〜約１０、１５、または２０アミノ酸長であり、前記タンパク質の１つと配列同一性を有する（例えば、少なくとも９０％、９５％、または１００％同一）。例えば、前記ペプチドは、前記ＣＤ１９細胞質尾部のチロシン４８２および／または５１３を含む配列を有する（例えば、前記チロシン残基は前記ペプチドを１／３に分けたほぼ中央部に位置する）。
【００１８】
本発明に従い、癌を抑制（例えば、軽減）、予防、および／または治療する方法が提供される。特定の実施形態では、前記癌がＣＤ１９陽性である。特定の実施形態では、前記癌がＣＤ−１９陽性多発性骨髄腫である。特定の実施形態では、前記癌がＢ細胞腫瘍である。Ｂ細胞腫瘍には、これに限定されるものではないが、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、および慢性リンパ性白血病を含む。特定の実施形態では、前記方法が、少なくとも１つのＣＤ１９−ＰＩ３Ｋ相互作用阻害剤を、それを必要とする被験者に投与する工程を有する。特定の実施形態では、前記方法が、少なくとも１つのＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤、特にＬｙｎ阻害剤（例えば、ダサニチブ、ＰＰ２）をそれを必要とする被験者に投与する工程を有する。前記ＣＤ１９−ＰＩ３Ｋ阻害剤は、以上に説明した方法により同定することができる。特定の実施形態では、前記ＣＤ１９−ＰＩ３Ｋ相互作用阻害剤が小分子、ペプチド、または抗体である。特定の実施形態では、特にＣＤ１９陽性細胞を排除せずに、前記抗体がＣＤ１９を内部移行させる。特定の実施形態では、前記抗体が細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ、Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｈａｎｄｂ．  Ｅｘｐ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  １８１：３４３−７３）、特に、ＰＩ３ＫまたはＣＤ１９の結合ドメイン（例えば、細胞質ドメイン、例えば、チロシン４８２および／または５１３を含むエピトープ）に免疫学的に特異的な抗体（例えば、ｓｃＦｖ）である。
【００１９】
前記方法はさらに、放射線療法および／または１若しくはそれ以上の他の化学療法剤の投与など、（同時および／または連続的に（前および／または後））少なくとも１つの他の抗癌療法を実施する工程を有する。特定の実施形態では、前記方法がさらに、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）のさらなる投与を有する。特定の実施形態では、前記方法がさらに、少なくとも１つのＰＩ３Ｋ阻害剤（例えば、ワートマニン、ＰＸ−８６６、ＬＹ２９４００２）をさらに投与する工程を有する。特定の実施形態では、前記方法が、抗ＣＤ１９抗体（例えば、ＭＥＤＩ−５５１（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）またはＸｍＡｂ５５７４（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ））またはキメラ抗原受容体および／またはＣＤ１９を標的とした細胞をさらに投与する工程を有する。キメラ抗原受容体は、典型的には抗体および細胞内ドメイン（例えば、Ｔ細胞活性化ドメイン）に少なくとも１つの抗原認識ドメインを有する。特定の実施形態では、前記方法がさらに、少なくとも１つの免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）タンパク質（例えば、ＣＤ２２またはＦＣＧＲ２Ｂ）の発現および／または機能を亢進させる工程を有する（例えば、前記ＩＴＩＭタンパク質をコードする核酸分子を送達することによる（例えば、ベクター、特にウイルスベクターとして（例えば、遺伝子療法））。特定の実施形態では、前記方法がさらに、（例えば、抑制性核酸分子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）を介して）ｍｉＲ−１７〜９２、および／またはＢＬＮＫおよびＳＹＫなど、その下流エフェクターを標的とする、または阻害する工程を有する。特定の実施形態では、前記方法が、特にＰＩ３Ｋ阻害剤と同時に投与し、少なくとも１つのＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤、特にＬｙｎ阻害剤（例えば、ダサニチブ、ＰＰ２）を投与する工程を有する。特定の実施形態では、前記方法がさらに、特にＬｙｎ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤と同時投与し、少なくとも１つのＭｙｃ阻害剤（例えば、ブロモドメイン阻害剤（例えば、ＪＱ１）、１００５８−Ｆ４）を投与する工程を有する。
【００２０】
本発明は、１）少なくとも１つのＣＤ１９−ＰＩ３Ｋ阻害薬、および２）少なくとも１つの薬学的に許容される担体を有する組成物を含む。そのような組成物は、癌の治療のため、それを必要とする患者に、治療有効量で投与される。前記組成物はさらに、１つの他の化学療法剤を有してもよい。代わりに、前記他の化学療法剤は、連続的および／または同時に投与する少なくとも１つの薬学的に許容される担体とともに、別の組成物に含まれてもよい。本発明の組成物はキット内に含まれてもよい。
【００２１】
化学療法剤は、抗癌活性を示す、および／または細胞に有害な化合物（例えば、毒素）である。これに限定されるものではないが、適した化学療法剤には、毒素（例えば、サポリン、リシン、アブリン、エチジウムブロマイド、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、および上記以外の毒素、それによって抗体と結合または融合した場合に免疫毒素を生成する）；モノクローナル抗体の薬物（例えば、リツキシマブ、セツキシマブ）；アルキル化剤（例えば、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、およびウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；チオテパなどのアジリジン；ブスルファンなどのメタンスルホン酸エステル；カルマスティン、ロムスチン、およびストレプトゾシンなどのニトロソウレア；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金錯体；マイトマイシン、プロカルバジン、ダカルバジン、およびアルトレタミンなどの生体内還元アルキル化剤）；ＤＮＡ鎖切断剤（例えば、プレオマイシン）；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、アムサクリン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ドキソルビシン、エトポシド、およびテニポシド）；ＤＮＡ副溝結合剤（例えば、プリカミジン（ｐｌｉｃａｍｙｄｉｎ））；代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセートおよびトリメトレキサートなどの葉酸拮抗薬；フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ＣＢ３７１７、アザシチジン、シタラビン、およびフロクスウリジンなどのピリミジン拮抗薬；メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチンなどのプリン拮抗薬；アスパラギナーゼ；およびヒドロキシウレアなどのリボヌクレオチド還元酵素阻害剤）；チューブリン相互作用剤（ｔｕｂｕｌｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびパクリタキセル（タキソール））；ホルモン剤（例えば、エストロゲン；抱合型エストロゲン；エチニルエストラジオール；ジエチルスチルベストロール；クロルトリアニセン；イデネストロール；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、およびメゲストロールなどのプロゲスチン；およびテストステロン、プロピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン、およびメチルテストステロンなどのアンドロゲン）；副腎皮質ホルモン剤（例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、およびプレドニゾロン）；黄体形成ホルモン放出剤またはゴナドトロピン放出ホルモン拮抗薬（例えば、酢酸ロイプロリドおよび酢酸ゴセレリン）；および抗ホルモン抗原（例えば、タモキシフェン、フルタミドなどの抗アンドロゲン薬；およびミトタンおよびアミノグルテチミドなどの抗副腎薬（ａｎｔｉａｄｒｅｎａｌ  ａｇｅｎｔ））が含まれる。
【００２２】
本発明の組成物は、適切な経路、例えば注射（例えば、局所（腫瘍へまたは腫瘍内などに直接）または全身投与）、経口、経肺、局所、経鼻、または他の投与方法により投与することができる。前記組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、局所、吸入、経皮、肺内、動脈内、直腸内、筋肉内、および鼻内投与を含む適切な方法により投与することができる。特定の実施形態では、前記組成物が静脈内投与される。一般に、前記組成物の薬学的に許容される担体は、希釈剤、保存料、安定化剤、乳化剤、補助剤、および／または担体から成る群から選択される。前記組成物には、様々な緩衝剤含有量（例えば、塩酸、酢酸、リン酸トリス）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；および洗剤および安定化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存料（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）および充填剤（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加物を含むことができる。また前記組成物は、ポリエステルなどのポリマー化合物、ポリアミノ酸、ハイドロゲル、ポリラクチド／グリコシドコポリマー、エチレンビニルアセテートコポリマー、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの微粒子製剤、またはリポソームに組み込むことができる、そのような組成物は、本発明の医薬組成物成分の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出率、およびｉｎ  ｖｉｖｏ除去率に影響する可能性がある。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  &  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ２００５を参照。本発明の医薬組成物は、例えば液体として調製することができ、または乾燥粉末の形態（例えば、後で再溶解するための凍結乾燥形態）とすることもできる。
【００２３】
本明細書で用いるとおり、「薬学的に許容される担体」は、すべての溶媒、分散媒などを含み、これは前段落で例示したとおり、医薬製剤の望みの投与形態に適していてもよい。薬学的に活性な物質におけるそのような媒体の使用は当該分野で既知である。従来の媒体または薬物がすべて、投与する分子と適合しない場合を除き、前記医薬製剤のでの使用が検討される。
【００２４】
特定の患者への投与に適した本発明の分子の投与量および投与方法は、患者の年齢、性別、体重、全身病状、および前記阻害剤が投与される特定の病状およびその重症度を考慮し、医師が決定することができる。前記医師は、投与経路、薬学的担体、および分子の生物学的活性を考慮することもできる。
【００２５】
適切な医薬製剤の選択は、選択した投与方法によって決まる。例えば、本発明の分子は、すべての癌組織または前記癌を囲む領域に直接注射することで投与されてもよい。この場合、医薬製剤は、前記癌組織と適合した媒体に分散する分子を有する。
【００２６】
本発明の分子は、血流中への静脈内注射、または皮下、筋肉内、くも膜下、または腹腔内注射により非経口投与することもできる。非経口注射用の医薬製剤は、当該分野で既知である。非経口注射が前記分子の投与方法として選択される場合、十分な量の前記薬物が標的細胞に到達し、生物学的効果を発揮するように段階を踏む必要がある。前記分子、または送達される医薬製剤の親油性は、前記分子が標的部位に達することができるように、上昇しなければならない場合もある。分子の親油性を上昇させる方法は当該分野で既知である。
【００２７】
薬学的担体との密接な混合物中の活性成分として、本発明の化合物を含む医薬組成物は、従来の薬学的配合技術に従って調製することができる。前記担体は、投与、例えば、静脈内、経口、局所、または非経口的投与に望ましい製剤形態によって、広範な形態をとることができる。経口投与形態の分子の調製では、通常の医薬媒体は、（例えば、懸濁液、エリキシル剤、および溶液などの）経口液体製剤の場合は、例えば、水、グリコール、オイル、アルコール、香料添加剤、保存料、着色料など、または（例えば、粉末、カプセル、および錠剤などの）経口固体製剤の場合は、でんぷん、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などの担体を利用することができる。投与しやすいため、錠剤およびカプセルが最も有利な経口投与単位形態であり、この場合は明らかに、固体薬学的担体が利用される。望ましい場合、錠剤は標準的な技法により糖衣錠または腸溶錠とすることができる。非経口では、前記担体が通常、滅菌水を有するが、例えば溶解を助けるため、または保存の目的で他の成分を含めてもよい。注射用懸濁液も調製することができ、この場合は適切な液体担体、懸濁剤などを使用することができる。
【００２８】
医薬製剤は、投与しやすく、投与量を均一にするため、投与単位に製剤化してもよい。投与単位形態は、本明細書で使用するとおり、治療を受ける患者に適した医薬製剤の物理的に個別の単位を指す。各投与単位には、選択された薬学的担体と関連して望みの作用を生じるように計算された一定量の活性成分を含む必要がある。前記適切な投与単位を決定する方法は、当業者に周知である。投与単位は前記患者の体重を基に、比例して増減させることができる。特定の病的状態を軽減するための適切な濃度は、当該分野で既知のとおり、投与濃度の曲線計算により決定することができる。本発明の分子を投与するための適切な投与単位は、動物モデルにおいて前記分子の毒性を評価することで決定することができる。様々な濃度の医薬製剤をヒト腫瘍を移植したマウスに投与することができ、最小および最大投与量は、腫瘍サイズが大きく減少したという結果、および投与による副作用に基づき決定することができる。適切な投与単位は、他の標準的な化学療法と併用した場合の投与の有効性を評価することで決定することができる。前記分子の投与単位は、腫瘍縮小の程度および／または腫瘍増殖速度の低下により、個別に、または各化学療法との併用で決定することができる。
【００２９】
本発明の分子を有する医薬製剤は、適切な間隔、例えば、少なくとも１日２回またはそれ以上で、病的症状が軽減または消退するまで投与することができ、その後、投与量を維持用量まで減量してもよい。特定の場合に適切な間隔は、通常、患者の状態によって決まる。
【００３０】
本発明の別の観点に従い、ある癌が本発明のＣＤ１９−ＰＩ３Ｋ阻害剤に反応しやすいか否かを決定する方法が提供される。特定の実施形態では、前記方法が細胞（例えば、被験者から得られた癌細胞またはＢ細胞（例えば、前記被験者から得られた生体サンプルの一部））内のＭｙｃ（例えば、アミノ酸のトレオニン５８）に機能獲得型変異があるかを決定する工程を有し、Ｍｙｃに機能獲得型変異がある場合は、前記細胞がＰＩ３Ｋ阻害剤およびＣＤ１９−ＰＩ３Ｋ阻害剤に抵抗性を持つことを示している。別の実施形態では、前記方法が細胞内のＰａｘ５に機能欠失型変異があるかを決定する工程を有し（例えば、Ｍｕｌｌｉｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  ４４６：７５８−７６１）、Ｐａｘ５に機能欠失型変異がある場合は、前記細胞がＰＩ３Ｋ阻害剤およびＣＤ１９−ＰＩ３Ｋ阻害剤に抵抗性を持つことを示している。さらに別の実施形態では、前記方法が細胞内のＣＤ１９レベルを決定する工程を有し、野生型または正常Ｂ細胞と比較してＣＤ１９レベルが上昇している場合は、前記細胞がＣＤ１９−ＰＩ３Ｋ阻害剤に抵抗性を持つことを示している。
【００３１】
定義
以下の定義は、本発明の理解を促すために提供される。
【００３２】
単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容で明確にそうでないことを示していない限り、複数の言及も含む。
【００３３】
「薬学的に許容される」は、動物、より具体的にはヒトに使用するため、連邦または州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方または他の一般的に認識されている薬局方に記載されていることを示す。
【００３４】
「担体」は、例えば、本発明の活性成分と一緒に投与される、希釈剤、補助剤、保存料（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ポリソルベート８０）、乳化剤、緩衝剤（例えば、トリス塩酸、酢酸塩、リン酸塩）、抗菌剤、充填剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、賦形剤、助剤、または溶媒を指す。薬学的に許容される担体は、石油、動物、植物、または合成由来のものを含む、水および油などの滅菌液とすることができる。水または食塩水溶液および含水デキストロースおよびグリセロール溶液が担体、特に注射剤として利用するのに好ましい。適切な薬学的担体については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ；  ２００５）；  Ｌｉｂｅｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８０；およびＲｏｗｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  （６ｔｈ  Ｅｄ．），  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒ，  ２００９に説明されている。
【００３５】
本明細書で使用する「治療する」という用語は、疾患に罹患している患者に利益をもたらすすべての治療タイプを指し、前記患者の状態（例えば、１若しくはそれ以上の症状）の改善、前記状態の進行遅延を含む。
【００３６】
本明細書で使用するとおり、「予防する」という用語は、ある状態（例えば、癌）を発症するリスクがある被験者の予防的治療を指し、これにより前記被験者が前記病状を発症する可能性が低下する。
【００３７】
化合物または医薬組成物の「治療有効量」は、特定の疾患または疾病および／またはその症状を予防、抑制、または治療するために有効な量を指す。  
本明細書で使用するとおり、「被験者」という用語は、動物、特に哺乳類、特にヒトを指す。
【００３８】
本明細書で使用するとおり、「小分子」という用語は、比較的小さな分子量（例えば、４，０００未満、特に２，０００未満）を有する物質または化合物を指す。典型的には、小分子は有機化合物であるが、タンパク質、ポリペプチド、または核酸ではなく、ただし、アミノ酸またはジペプチドであってもよい。
【００３９】
「抗体」または「抗体分子」は、抗体およびそのフラグメントなど、特定の抗原に結合する任意の免疫グロブリンである。本明細書で使用するとおり、抗体または抗体分子は完全な免疫グロブリン分子、免疫学的に活性な免疫グロブリン分子の一部、および免疫学的に活性な免疫グロブリン分子の一部を融合したものを意図する。この用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単一ドメイン抗体（Ｄａｂ）、および二重特異性抗体を含む。本明細書で使用するとおり、抗体または抗体分子は組み換え技術によって作られた完全な免疫グロブリン分子、免疫学的に活性な免疫グロブリン分子の一部を有する分子を意図し、これに限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ｖ）、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニ抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、および単一の可変ドメイン（例えば、重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン）などである。
【００４０】
本明細書で使用するとおり、「免疫学的に特異的」であるという用語は、１つ以上のタンパク質エピトープまたは対象化合物に結合するタンパク質／ポリペプチド、特に抗体を指すが、これは抗原性のある生物分子が混合したサンプル中では、実質的に他の分子を認識、結合することはない。
【００４１】
「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」という表現は、低分子（典型的には３０ヌクレオチド長未満、特に１２〜３０または２０〜２５ヌクレオチド長）二本鎖ＲＮＡ分子を指す。典型的には、前記ｓｉＲＮＡは前記ｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の発現を調節する。ｓｉＲＮＡ分子を同定および合成する方法は、当該分野で既知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃを参照）。本明細書で使用するとおり、前記ｓｉＲＮＡの用語は、低分子ヘアピン型ＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）を含む。典型的には、ｓｈＲＮＡ分子は低分子のループ配列で分かれた低分子相補配列から成り、前記配列の１つが前記遺伝子標的に相補的である。ｓｈＲＮＡ分子は、典型的には細胞内でエンドヌクレアーゼによりｓｉＲＮＡにプロセシングされる。典型的なｓｉＲＮＡ分子への変化については、米国出願公開第２００５００３２７３３号で提供されている。ｓｉＲＮＡ分子を発現する発現ベクターでは、好ましくは、構成的または調節性の、強いプロモーターを利用する。そのようなプロモーターは当該分野で周知であり、これに限定されるものではないが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターＵ６およびＨ１を含む（例えば、Ｍｙｓｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２９：２５０２  ０９を参照）。
【００４２】
「アンチセンス核酸分子」または「アンチセンスヌクレオチド」は、選択された配列（例えば、翻訳開始点および／またはスプライス部位）を標的とし（相補的であり）、対象タンパク質の発現を抑制する核酸分子（例えば、単鎖分子）を含む。そのようなアンチセンス分子は典型的には約１５〜約５０ヌクレオチド長、より詳しくは約１５〜約３０ヌクレオチドであり、ｍＲＮＡ分子の翻訳開始部位に広がることが多い。標的核酸分子の全配列を逆方向で含むアンチセンスコンストラクトも作成することができる。既知のヌクレオチド配列を標的としたアンチセンスヌクレオチドは、標準的な方法に従い、ヌクレオチド合成により調製することができる。
【００４３】
「固体支持材」という表現は、これに限定されるものではないが、チップ（例えば、シリカベース、ガラス、またはゴールドチップ）、ガラススライド、膜、プレート、ビーズ、固体粒子（例えば、アガロース、セファロース、ポリスチレン、または電磁ビーズ）、カラム（またはカラム材料）、試験管、またはマイクロタイター皿を含む固体表面を指す。
【００４４】
以下の例は、本発明を実行する方法を説明しており、いかなる方法でも、本発明の範囲を制限する意図はない。
【実施例１】
【００４５】
材料および方法
細胞培養とＰ１３Ｋ阻害剤による処理
Ｍｙｃ５およびＭｙｃ５−Ｍ５マウスＢリンパ腫細胞は、報告されているとおり培養した（Ｃｏｚｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖ．，  １１７：２６０２−２６１０；  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｂｌｏｏｄ  １０１：１９５０−１９５５；  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ５：８５３−８６１；  Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  ７：１７５８−１７６４）。ヒトＢ−リンパ芽球細胞株のＰ４９３−６には誘導型ｃ−Ｍｙｃ抑制系があり、ｃ−Ｍｙｃ転写は合成ｔｅｔＯ７−ＴＰプロモーターによって行われる（Ｐａｊｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８７：７８７−７９３）。この細胞株は、１０％の加熱不活性化した無ｔｅｔ  ＦＢＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を加えたＲＰＭＩ−１６４０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）で培養した。Ｐ４９３−６におけるｃ−Ｍｙｃの発現は、ドキシサイクリンを加えることで抑制した。一部の実験では、Ｐ４９３−６を１０μＭの濃度でＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２（＃９９０１；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）により処理した。
【００４６】
一次Ｂ細胞培養
脾臓全体は８〜１２週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスから採取し、１ｍｌシリンジの先の丸い吸引具で優しくすりつぶした後、７０ミクロンの細胞ろ過器に細胞を通過させた。脾細胞の赤血球は、赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ）を用い、２分間室温で溶解させた。次に細胞を計数し、５０μＭのβ−ＭＥを加えた完全ＲＰＭＩ培地に１ｘ１０６／ｍｌで播種した。５％  ＣＯ２を使用し、３７℃のインキュベーターで２時間培養した後、浮遊細胞を採取した。これを、ＬＰＳ（原液濃度１０μｇ／ｍｌ）を１：１０００で希釈したものを加えた前述の培地を用い、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで播種した。脾細胞は３日間ＬＰＳで培養した。培地およびＬＰＳは毎日補充し、細胞も毎日計数して増殖を確認した。３日目までに、フローサイトメトリーにより評価すると細胞のＣＤ１９＋Ｂ２２０＋は９０％を超えた。８〜１２週齢の雌ＷＴまたはＣＤ１９ノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６系バックグラウンド、Ｒｉｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：３５２−３５５）の骨髄は、大腿骨および脛骨から完全ＤＭＥＭで洗い流して採取した。前記骨髄の赤血球は、赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ）を用い、２分間室温で溶解させた。次に細胞を計数し、ＩＬ−７を含むＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）培地において、０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／３５ｍｍ皿で播種した。９日目、フローサイトメトリーにより評価すると細胞のＣＤ１９＋Ｂ２２０＋は９０％を超えた。フローサイトメトリーに使用したＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ抗体はＰＥラット抗マウスＣＤ１９（ｃａｔ番号５５７３９９）、ＦＩＴＣラット抗マウスＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ｃａｔ番号５５３０８８）であった。対照抗体は、ＦＩＴＣラットＩｇＧａ（ｃａｔ番号５５３９２９）およびＰＥラットＩｇＧａ（ｃａｔ番号５５３９３０）を含む。
【００４７】
レトロウイルスの産生と形質導入
Ｍｙｃ５細胞でＰａｘ５またはＣＤ１９を過剰発現させるため、細胞をレトロウイルスコンストラクトのＰａｘ５−ＭＩＧＲ１（Ｃｏｚｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖ．，  １１７：２６０２−２６１０；  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｂｌｏｏｄ  １０１：１９５０−１９５５）またはＣＤ１９−ｐＭｘ−ｉｒｅｓ−ＧＦＰ（日本、横浜の理化学研究所Ｔｏｍｏｈｉｒｏ  Ｋｕｒｏｓａｋｉ博士）により形質導入した。空のベクターによる形質導入を対照とした。Ｍｙｃ５細胞のＩＴＡＭが介在したシグナル伝達の影響を解明するため、細胞はＷＴまたは変異型ＩＴＡＭをコードするレトロウイルスＭＩＧＲ１により形質導入し、いずれのチロシンＹｘｘ（Ｌ／Ｉ）ｘ６−８Ｙｘｘ（Ｌ／Ｉ）もアラニンで置換した。ＩＴＡＭコンストラクトはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ（米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）のものとした。形質導入後２４時間で形質導入細胞のＧＦＰ発現を分析し、形質移入効率を決定した。また、形質導入細胞のＧＦＰ発現は、ＧＦＰ発現ごとに同一のゲートを用いて分類、回収し、タンパク質解析を行った。構成的に活性な形態のＡＫＴを過剰発現させるため、ＨＡ標識ミリストイル化ＡＫＴ１またはＡＫＴ２をコードするレトロウイルスコンストラクトのｐＬＮＣＸ１をＭｙｃ５細胞に形質導入した（米国ペンシルバニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａのペンシルバニア大学Ｍｏｒｒｉｓ  Ｂｉｍｂａｕｍ博士）。形質導入細胞はＧ４１８（Ｓｉｇｍａ）により２週間選択し、レトロウイルスコンストラクトの過剰発現をウエスタンブロットによるＨＡ発現を通してアッセイした。マウスＰＴＥＮ、ＷＴヒトＭｙｃおよび前記Ｔ５８Ａ  Ｍｙｃ変異体（米国ニューハンプシャー州ＨａｎｏｖｅｒのＤａｒｔｍｏｕｔｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃｏｌｅ博士）のｃＤＮＡをレトロウイルスベクターＭＳＣＶ−ｉｒｅｓ−ＮＧＦＲにクローン化した。形質移入効率は、アイソタイプの対照抗体であるＰＥマウスＩｇＧ１（５５５７４９、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））またはＰＥマウス抗ヒトＣＤ２７１／ＮＧＦＲ（５６０９２７、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））を用いてフローサイトメトリーにより決定し、細胞表面のＮＧＦＲ発現を検出した。すべてのレトロウイルスをＧＰ２９３細胞へのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた形質移入により作成した。感染はポリブレン（４μｇ／ｍｌ）存在下、３０時間かけて行った。
【００４８】
ウエスタンブロットおよび免疫沈降
報告されているとおりに全細胞溶解物を調製し、ウエスタンブロットを行った（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  ７：１７５８−１７６４）。抗Ｐａｘ５抗体は米国ペンシルバニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ペンシルバニア大学のＭｉｃｈａｅｌ  Ｌ．  Ａｔｃｈｉｓｏｎ博士から入手した。この研究で使用された他の一次抗体は、抗ＣＤ１９抗体（＃３５７４、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＰＡＮ  ＡＫＴ抗体（＃４６９１、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ホスホＡＫＴ抗体（ｓｅｒ４７３、＃４０６０、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗Ｔｏｔａｌ  ＧＳＫ３β抗体（＃９３１５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ホスホＧＳＫ３β（ｓｅｒ９、＃９３３６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｐ４９３およびＭｙｃ５細胞のレトロウイルスｃ−Ｍｙｃを検出する抗Ｔｏｔａｌ  ｃ−Ｍｙｃ抗体（ＯＰ−１０、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、脾臓Ｂ細胞および骨髄由来Ｂ細胞のｃ−Ｍｙｃを検出する抗Ｔｏｔａｌ  ｃ−Ｍｙｃ抗体（＃５６０５、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ｐ−ｃ−Ｍｙｃ  Ｔｈｒ５８抗体（Ａ００２４２、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、抗ｐ−ｃ−Ｍｙｃ  Ｓｅｒ６２抗体（ａｂ７８３１８、ａｂｃａｍ）、抗Ｔｏｔａｌ  Ｌｙｎ抗体（＃２７３２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ホスホＬｙｎ抗体（ｔｙｒ３９６、ａｂ４０６６０、Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗ＨＡクローン（Ｃａｔ＃Ｈ６９０８、Ｓｉｇｍａ）、抗ＣＤ２２抗体（ｓｃ−７９３２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、および抗β−アクチン抗体（Ａ３８５３、Ｓｉｇｍａ）を含む。免疫沈降については、ＨＡ標識ＷＴまたは変異型ＩＴＡＭ形質導入Ｍｙｃ５細胞を冷ＰＢＳで一度洗って採取した後、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む冷却した溶解用試薬（Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）で溶解した。マウスモノクローナル抗ＨＡクローン１２ＣＡ５（Ｃａｔ番号１１５８３  ８１６  ００１、Ｒｏｃｈｅ）の１：１０００希釈液を用い、細胞対容積比１×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌで溶解用試薬を用い、各サンプル同数の細胞からＨＡ標識ＩＴＡＭを免疫沈降させた。抗体のインキュベーションは４℃で１４〜１８時間行った後、プロテインＡビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により免疫沈降し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む冷却した溶解用試薬で洗った。
【００４９】
シクロヘキシミド実験
Ｐａｘ５またはＣＤ１９レトロウイルスコンストラクトで安定的に形質導入されたＭｙｃ５を、１μｇ／ｍｌでシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ）処理した５０ｍｌの円錐管に１×１０６／ｍｌで播種し、９５％エタノール（ｓｉｇｍａ）による刺激を対照とした。０、７．５、１５、および３０分間細胞を刺激し、１分間１７００ｒｐｍで回転させて採取した後、直ちにタンパク質溶解液（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ、Ｂｉｏ−ｒａｄ）で溶解した。ウエスタンブロット解析用のタンパク質サンプルは１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ｃ−Ｍｙｃタンパク質レベルはＩｍａｇｅＪ  １．４３（米国国立衛生研究所）を用いたデンシトメトリーにより定量化し、β−アクチンに対して正規化した値を定量化した。
【００５０】
パルス・チェイス実験
Ｐａｘ５またはＣＤ１９レトロウイルスコンストラクトで安定的に形質導入されたＭｙｃ５は、培地をＬ−メチオニンを含まないＲＰＭＩと１時間交換し、事前にメチオニンを除去した。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、３０分間１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度、０．２ｍＣｉ／ｍｌとし、３５Ｓ−メチオニンにより細胞を標識した。標識後、直ちに５ｍＭ  Ｌ−メチオニンを含むＲＰＭＩで一度細胞を洗い、表示された追跡時間、同じ培地でインキュベートした。細胞を採取し、ｃ−Ｍｙｃタンパク質を免疫沈降させた。標識ｃ−Ｍｙｃをオートラジオグラフィーで画像化し、ホスフォイメージャーにより定量化した。
【００５１】
腫瘍負荷試験
すべての動物実験について、ペンシルバニア小児病院の所内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ：ＩＡＣＵＣ）（プロトコール番号２００９−１２−９０２）がレビューおよび承認を行った。 
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験では、１．５×１０７個のＭｙｃ５−Ｍ５細胞に、空のレトロウイルスベクター、ｐＭｘ−ｉｒｅｓ−ＧＦＰ、またはＣＤ１９をコードするレトロウイルスベクターを安定的に形質導入させた。最高ＧＦＰ＋発現量で分類した形質導入細胞をＳＣＩＤマウス（米国国立癌研究所）に皮下注射した。腫瘍サイズはキャリパーを用いて毎日測定し、腫瘍切除を行った日に腫瘍重量を記録した。ウエスタンブロット解析用のタンパク質溶解液は、溶解緩衝液１ｍｌあたり腫瘍４０ｍｇの比で腫瘍を溶解させることで、腫瘍から採取した。Ｐａｘ５ＥＲＴＡＭをコードするレトロウイルス（＋４ＯＨＴ）またはその対照ベクター（＋４ＯＨＴ）を感染させたＭｙｃ５−Ｍ５細胞の腫瘍を入手し（Ｃｏｚｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖ．，  １１７：２６０２−２６１０）、ウエスタンブロット解析用のタンパク質溶解液を入手した。
【００５２】
増殖アッセイ
Ｍｙｃ５−Ｍ５  ＣＤ１９形質導入細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増殖は、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて決定した。細胞を１００μｌの培地に１×１０３／ウェルで播種し、合計７２時間インキュベートした。増殖の状態は、１０μｌの細胞増殖試薬ＷＳＴ−１を４時間インキュベートすることで、２４時間ごとに判定した。処理済みサンプルの吸光度は、Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）２マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い、４４０ｎＭでブランクの対照に対して３回測定した。
【００５３】
ｓｉＲＮＡノックダウン実験
Ｐ４９３−６には、ヒトＰａｘ５（Ｌ−０１２２４１−００、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ヒト総ＧＳＫ３β（Ｌ−００３０１０−００、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、またはヒトＣＤ１９（ｓｃ−２９９６８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に対して二本鎖ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ（商標）ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（登録商標）ｓｉＲＮＡを処理した。ｓｉＲＮＡ（Ｄ−００１８１０−１０）の非標的プールを、ｓｉＲＮＡ実験のネガティブコントロール（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）として用いた。ヒトＰａｘ５、ＣＤ１９、またはＧＳＫ３βに対して個々のｓｉＲＮＡ  ４種類のＯＮ−ＴＡＲＧＥＴセットを用いた。ｓｉＲＮＡは製造業者の指示に従い（Ｌｏｎｚａ  ＡＧ）、Ａｍａｘａ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ（登録商標）を用いてＰ４９３−６細胞に電気穿孔した。ｓｉＲＮＡの送達効率は、非特異的二本鎖ＢＬＯＣＫ−ｉＴＴＭ蛍光オリゴ（＃２０１３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により確認した。サイレンシングの有効性はウエスタンブロットにより確認した。１０ｎＭの対照または抗ヒトＭｙｃ  ｓｉＲＮＡ（Ｌ−００３２８２、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を用い、ＣＤ１９レトロウイルスコンストラクトまたは前記対照ベクターを安定的に形質導入したＭｙｃ５を電気穿孔した。電気穿孔後２４時間で細胞を採取し、細胞増殖を明らかにした。
【００５４】
リアルタイムｑ−ＰＣＲ
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）７５００システムを用いてリアルタイムｑ−ＰＣＲを行った。マウスＭｙｃ５＿Ｍ５由来腫瘍の増幅に使用されたプライマー配列は、ＣＤＫ４センス５’−ｃａａｔｇｔｔｇｔａｃｇｇｃｔｇａｔｇｇ−３’（配列ＩＤ番号：１）；ＣＤＫ４アンチセンス５’−ｃａｇｇｃｃｇｃｔｔａｇａａａｃｔｇａｃ−３’（配列ＩＤ番号：２）；ＯＤＣ１センス５’−ｇｔｇｇｃａａｃｔｃａｔｇａａｇｃａｇａ−３’（配列ＩＤ番号：３）；ＯＤＣ１アンチセンス５’−ｔｇｃａｇｇｃａａｇａｇｃｔａｃａａｇａ−３’（配列ＩＤ番号：４）；ＬＤＨＡセンス５’−ｔｃｃｇｔｔａｃｃｔｇａｔｇｇｇａｇａｇ−３’（配列ＩＤ番号：５）；ＬＤＨＡアンチセンス５’−ｇｔａｇｇｃａｃｔｇｔｃｃａｃｃａｃｃｔ−３’（配列ＩＤ番号：６）であった。
【００５５】
細胞および腫瘍増殖の統計解析
細胞増殖試験は３回行った。ＣＤ１９腫瘍試験は１群につき５匹のマウスで行った。統計学的有意性は、対応のない片側スチューデントのｔ検定により評価した。
【００５６】
Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓおよび生存解析 
ＨｕｍｍｅｌおよびＬｅｎｚの研究データは、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓゲートウェイ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）から、それぞれＧＥＯ受入番号ＧＳＥ４４７５およびＧＳＥ１０８４６を用いてダウンロードした。Ｈｕｍｍｅｌの研究の患者は、最初にＩｇ−ＭＹＣ転座陽性と陰性に分類した。転座陰性の腫瘍はさらにＣＤ１９高値、中間値、低値に分類した。Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓを行い、ＣＤ１９ＨＩＧＨおよびＣＤ１９ＬＯＷ腫瘍の発現データを比較した。ＬｅｎｚおよびＨｕｍｍｅｌの研究はデザインが同様であり、合わせて考えることができるため、これらのデータを用い、ＣＤ１９およびＭＹＣの発現が患者の生存に与える影響を評価した。プールしたデータを用い、正規化したＣＤ１９およびＭＹＣの値の三分位を計算し、患者をＣＤ１９（またはＭＹＣ）低値、ＣＤ１９（またはＭＹＣ）中間値、およびＣＤ１９（またはＭＹＣ）高値の３群に分類した。ＣＤ１９（またはＭＹＣ）高値群とＣＤ１９（またはＭＹＣ）低値群のカプラン・マイヤー（ＫＭ）曲線を比較した。
【００５７】
統計学的概要
生存解析については層別ログランク検定を行い、試験番号で層別化したＣＤ１９の効果を検討し（Ｋａｌｂｆｌｅｉｓｃｈ  ｅ  ｔａｌ．  （２００２）  Ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｔｉｍｅ  ｄａｔａ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、２試験で考えられる差を明らかにした。両側Ｐ値０．０５未満を統計学的に有意と考え、ＳＡＳ  ９．２を用いて解析を行った。ＧＳＥＡについては、公称Ｐ値０．０５未満、かつＦＤＲ  ｑ値０．２５未満の場合に統計学的に有意であると考えた。
【００５８】
結果
Ｐａｘ５はｃ−Ｍｙｃタンパク質レベルを維持する
まず、Ｍｙｃの発現を停止するとＰａｘ５タンパク質レベルが低下するか否かを判断した。Ｐ４９３−６細胞に２〜１２時間ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を処理した。Ｄｏｘ処理後２時間でＭｙｃタンパク質レベルが急激に低下したが、ウエスタンブロット法で判断する限り、Ｐａｘ５レベルには感知できる変化がなかった（図１Ａ、左図）。Ｄｏｘを長時間曝露した後でも（２４〜４８時間）、Ｐａｘ５の発現レベルに影響はなかった（図１Ａ、右図）。Ｐａｘ５発現量の変化がＭｙｃタンパク質レベルに影響するか否かを判断するため、Ｐａｘ５の発現をＰａｘ５をコードしたレトロウイルス（ＭＩＧＲ１）を用い、ＭＹＣ５細胞で回復させた。感染後２４時間および４８時間で細胞溶解液を採取し、ウエスタンブロット法により分析した。いずれの時点でも、Ｍｙｃレベルの明確な上昇が観察された（図１Ｂ）。ｉｎ  ｖｉｖｏでＭｙｃレベルがＰａｘ５により誘導されるか否かを判断するため、条件付きで活性なＰａｘ５エストロゲン受容体（ＥＲ）の融合により再構成されたＭｙｃ５腫瘍を分析した（Ｃｏｚｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖ．，  １１７：２６０２−２６１０）。Ｐａｘ５活性を確認するため、腫瘍を持つ全マウスにＥＲリガンドの４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）を処理した。これらの検体でも、Ｍｙｃ値とＰａｘ５ＥＲ値の間に強い正の相関関係があった（図１Ｃ）。対照的に、ＣＤ２２値はＰａｘ５によりダウンレギュレートされた。
【００５９】
機能欠失型のアプローチを用いて異なる細胞系で得られたこの結果を再現するため、Ｐ４９３−６細胞のＰａｘ５をｓｉＲＮＡによりノックダウンした。形質移入の条件を最適化するため、ＦＩＴＣ標識二本鎖ＲＮＡ  ２本を別々にＰ４９３−６細胞に電気穿孔し、フローサイトメトリーを行い、ｓｉＲＮＡ送達効率を決定した。０．１μＭおよび１μＭでは、形質移入効率が６２〜９６％の範囲であった（図２Ａ）。α−Ｐａｘ５  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（登録商標）ｓｉＲＮＡを増量して（１０ｎＭ、０．１μＭ、および１μＭ）Ｐ４９３−６細胞に導入し、ウエスタンブロット解析を行うため、電気穿孔後２４時間でタンパク質溶解液を採取した。Ｐａｘ５タンパク質レベルには配列特異的、用量依存的減少が認められ、これにより比例して直接のＰａｘ５の標的であるＣＤ１９が減少し、両タンパク質の最大抑制は１μＭで達成された（図２Ｂ）。オフターゲット効果を除外するため、ＳｍａｒｔＰｏｏｌ（登録商標）を有する個別のｓｉＲＮＡ  ４種類も分析した。予想どおり、４種類中３種類のｓｉＲＮＡがＰａｘ５の発現を抑制し、３種類すべてがＭｙｃレベルを減少させ、この作用には再現性があった（図１Ｄ）。次に、前記細胞を１μＭのα−Ｐａｘ５  ｓｉＲＮＡで処理し、電子穿孔後２４時間および４８時間でＭｙｃレベルを評価した。２４時間でＭｙｃレベルに変化は認められなかったが、４８時間後にはかなり減少した。この結果は、間接的な制御メカニズムを示しており、おそらくＰａｘ５の標的が介在している。
【００６０】
ＣＤ１９はｃ−Ｍｙｃタンパク質を安定的に増加させるが、Ｂ細胞受容体のシグナル伝達はｃ−Ｍｙｃタンパク質を増加させない
Ｐａｘ５がないため、Ｍｙｃ５細胞はＰａｘ５標的遺伝子を発現せず、ＣＤ７９ａで最も顕著である（Ｉｇ−α）。ただし、Ｍｙｃ５細胞はＰａｘ５が再発現すると確実に誘導され（Ｃｏｚｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖ．，  １１７：２６０２−２６１０）、構成的に発現したＣＤ７９ｂと複合体を形成する可能性があり（Ｉｇ−β）、その結果ＩＴＡＭモチーフがリン酸化され、ＢＣＲシグナル伝達が起こる。この一連の事象がＭｙレベルを上昇させるか否かを判断するため、Ｉｇ−α／βのＨＡ標識ＩＴＡＭをコードするＭＩＧＲ１レトロウイルスを形質導入したＭｙｃ５細胞を構成的に活性な配置または変異型配置で使用したが、ここでは、いずれのチロシンもアラニンで置換されている（Ｇｒａｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５：２７４８−２７５７）。感染効率はフローサイトメトリーにより決定し、形質導入細胞はＧＦＰ＋が９７％を超えていることが確認された。ＭＹＣ５−ＩＴＡＭｗｔおよびＭＹＣ５−ＩＴＡＭｍｕｔ細胞のタンパク質溶解物は、最初にマウス抗ＨＡ抗体で免疫沈降させた。次に、免疫沈降物のＳｒｃファミリーキナーゼＬｙｎを免疫ブロットしたが、ＬｙｎはＢ細胞Ｉｇ−αのＩＴＡＭに特異的に結合する（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１２３−１２６）。ウサギ抗ＨＡ抗体反応性ＩＴＡＭをローディング・コントロールとして用いた。予想どおり、親細胞およびＩＴＡＭｍｕｔ形質導入細胞と比較し、野生型ＩＴＡＭの過剰発現によりＬｙｎの結合は増加した（図３Ａ、上図）。さらに、Ｔｙｒ３９６のリン酸化により活性化したＩＴＡＭ結合Ｌｙｎの量も、ＩＴＡＭｗｔ細胞で増加した。注意すべき点として、ＩＴＡＭｍｕｔは一部のホスホ−Ｌｙｎを動員したが、ＩＴＡＭｗｔによるＬｙｎの動員ほど確実ではなく、ＩＴＡＭコンストラクトの機能性を証明している（図３Ａ、中央図）。それでも、Ｍｙｃタンパク質レベルに変化はなく（図３Ａ、下図）、ＢＣＲ経路の重要な要素であるＩＴＡＭの活性化は、Ｍｙｃタンパク質の発現を増加させるには不十分であることを示している。
【００６１】
別のＰａｘ５の重要な標的はＣＤ１９である（Ｎｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  ＥＭＢＯ  Ｊ  １７：２３１９−２３３３；  Ｋｏｚｍｉｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １２：２６６２−２６７２）。ＣＤ１９はＢＣＲとの関連で機能すると考えられるが、ＢＣＲ依存性の機能、例えばＭｙｃの調節機能を有すると考えられる。したがって、Ｉｇ−α陰性Ｍｙｃ５細胞にＣＤ１９レトロウイルスを形質導入し、定常状態のＭｙｃレベルを測定した。驚くべきことに、Ｍｙｃの発現は数倍増加した（図３Ｂ）。機能欠失型のアプローチを用いて異なる細胞系で得られたこの結果を再現するため、Ｐ４９３−６細胞のＣＤ１９をＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（登録商標）ｓｉＲＮＡによりノックダウンした。ＣＤ１９のノックダウンは部分的にしか行われなかったにもかかわらず、Ｍｙｃレベルは一貫してかなり減少したが、Ｐａｘ５レベルに影響はなかった（図２Ｃ）。ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（登録商標）を有する個々のｓｉＲＮＡも分析した。ＣＤ１９の最も確実なダウンレギュレーションに関与するオリゴヌクレオチドも、配列特異的、用量依存的にＭｙｃをダウンレギュレートした（図３Ｃ）。最後に、ＭｙｃレベルはＣＤ１９欠乏マウスの骨髄由来Ｂ細胞で測定した（Ｒｉｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：３５２−３５５）。そのため、一次Ｂ細胞の短期培養が確立された。これらの培養では９５％以上の細胞がＢ細胞系統であり、Ｂ２２０陽性であるかによって確認した（図４Ａ）。ここでも、ＣＤ１９欠乏Ｂ細胞に含まれるＭｙｃレベルは、ＣＤ１９充足細胞よりも少なかった（図３Ｄ）。注意すべき点として、検討した３つのモデル（ＭＹＣ５、Ｐ４９３−６、および一次マウスＢ細胞）では、Ｍｙｃの発現が３種類の制御要素によって促進された（それぞれ、レトロウイルスＬＴＲ、ＣＭＶ  ＩＥ領域、および内因性ｍｙｃ遺伝子プロモーター）。したがって、ＣＤ１９をサイレンシングした際のＭｙｃの均一なダウンレギュレーションは、プロモーター依存的、転写後の制御であることを示していた。
【００６２】
次に、Ｍｙｃタンパク質の半減期を、親細胞とＰａｘ５およびＣＤ１９形質導入Ｍｙｃ５細胞で測定した。この実験では、ＣＤ１９陽性細胞がＣＤ１９ｌｏｗおよびＣＤ１９ｈｉｇｈ亜集団にさらに分割された。これらの培養におけるＣＤ１９の過剰発現レベルは、Ｐａｘ５で誘導される発現レベルと比較し、それぞれ２．５倍および４．０倍であった（図３Ｅの平均蛍光強度を参照）。これらの計算はウエスタンブロットにより確認した。それにもかかわらず、ＭｙｃレベルはＣＤ１９ｌｏｗおよびＣＤ１９ｈｉｇｈ培養で同等であり、Ｍｙｃの活性化には４倍のＣＤ１９過剰発現は必要ないことを示している（図３Ｆ）。 
次に、Ｐａｘ５およびＣＤ１９再構成株にタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド（ＣＨＸ；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−Ｐｏｅｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ６：２０９−２１７）を処理し、定常状態のＭｙｃレベルをウエスタンブロットにより測定した。３０分にわたるＣＨＸ処理では、レトロウイルスにより形質導入されたＰａｘ５またはＣＤ１９のタンパク質発現に観察可能な影響はなかったが、Ｍｙｃレベルは明らかにダウンレギュレートされた（図３Ｇ）。しかし、ベクターを形質導入したＭｙｃ５細胞ではＭｙｃの半減期が約１７分であり、Ｐａｘ５またはＣＤ１９を形質導入した細胞ではＭｙｃの半減期が大幅に延長し、それぞれ約９０分および約４０分となった（図３Ｇ、下図）。
【００６３】
シクロヘキシミド処理は、ｍＲＮＡ安定性またはタンパク質翻訳の変化により遺伝子発現を間接的に抑制する可能性がある。したがって、Ｍｙｃの半減期もパルス標識により測定した後、追跡および放射性免疫沈降を行った。ＣＨＸ実験の結果と完全に一致し、親細胞では追跡３０分後にＭｙｃがほとんど検出されなかったが、Ｐａｘ５またはＣＤ１９存在下では強く安定化した（図３Ｈ）そのため、これら２つのタンパク質は実際、Ｍｙｃタンパク質レベルの転写後制御因子が陽性である。
【００６４】
ＢＣＲ依存性のＡＫＴ活性化はＣＤ１９によるＭｙｃの誘導に必要で、十分である
ＣＤ１９シグナル伝達の１つの既知の機能は、すべてＢＣＲシグナル伝達との関連で、ＰＩ３の動員と活性化およびＡｋｔの活性化を確実に行うことである（Ｔｕｖｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９８６−９８９；  Ｂｕｈｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６２：４４３８−４４４６；  Ｏｔｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７６：１４７４−１４７８；  Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６８：５４６５−５４７６；  Ａｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｂｌｏｏｄ  １１１：１４９７−１５０３；  Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．，  １７６：４７−６８）。Ａｋｔの活性化にＣＤ１９によるＭｙｃの安定化が伴うか否かを判断するため、Ｐ４９３−６細胞を抗ＣＤ１９  ｓｉＲＮＡを用いて電気穿孔し、Ａｋｔシグナル伝達経路の要素の発現レベルを評価した。図５Ａに示すとおり、ＣＤ１９のノックダウンにより、Ｍｙｃタンパク質レベルが低下しただけでなく、Ａｋｔのホスホセリン−４７３およびＡｋｔの標的であるＧＳＫ３βのホスホセリン−９レベルも低下した。ＡｋｔおよびＧＳＫ３β全体のレベルに変化はなかった。Ａｋｔのリン酸化がＭｙｃの安定化に必要であるか否かを判断するため、Ｐ４９３−６細胞にＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２を処理した。１時間のＬＹ２９４００２処理でｐＡｋｔおよびｐＧＳＫ３βレベルが低下し、Ｍｙｃレベルも低下した（図５Ｂ）。Ｍｙｃレベルの低下は比較的控えめであったため、この実験を脾臓Ｂ細胞で再度行い、フローサイトメトリーにより純度を分析した（図４Ｂ）。ｐＡｋｔおよびｐＧＳＫ３βレベルが非常に低く、Ｍｙｃが急激にダウンレギュレートされたことが根拠となっているとおり、これらの短期培養は非常に確実にＬＹ２９４００２に反応した（図５Ｃ）。
【００６５】
Ｍｙｃ誘導におけるＡｋｔの役割をさらに確定するため、Ｍｙｃ５細胞に構成的活性化Ａｋｔ１および２をコードしたレトロウイルスを形質導入した。いずれの場合も、特にＡｋｔ２を形質導入した細胞では、抑制的ＧＳＫ３βリン酸化および定常状態のＭｙｃレベルの比例した上昇が観察された（図５Ｄ）。Ａｋｔの標的であることに加え、Ｓｅｒ−６２がすでに別のキナーゼによるリン酸化を受けているならば、ＧＳＫ３βはＴｈｒ−５８をリン酸化することでＭｙｃレベルの負の調節を行う（Ｈａｎｎ，  Ｓ．Ｒ．  （２００６）  Ｓｅｍｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．，  １６：２８８−３０２；  Ｓｅａｒｓ，  Ｒ．Ｃ．  （２００４）  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ３：１１３３−１１３７）。これによりＦｂｗ７ユビキチンリガーゼが結合することができ、これがＭｙｃの分解に寄与する（Ｗｅｌｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １０１：９０８５−９０９０）。そのため、同じタンパク質溶解液を、抗Ｍｙｃ残基Ｔｈｒ−５８およびＳｅｒ−６２抗体でプローブした。Ｔｈｒ−５８のリン酸化はＡｋｔ発現細胞で低下したが、ＧＳＫ３βと独立したＳｅｒ−６２のリン酸化は増加した（Ｌｕｔｔｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９４）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １４：５５１０−５５２２）。
【００６６】
ＧＳＫ３βがＭｙｃタンパク質レベルを制御するのか否かを判断するため、抗ＧＳＫ３β  ｓｉＲＮＡの濃度を上昇させて（１０ｎＭ、０．１μＭ、１μＭ）、Ｐ４９３−６細胞に電気穿孔した。図５Ｅのデータで根拠が示されているとおり、ＧＳＫβのノックダウンによりＭｙｃが確実にアップレギュレートし、Ｂ細胞のＭｙｃタンパク質の産出を制御する上で、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ＧＳＫ３β経路が重要な役割を果たしていることを証明している。ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（登録商標）を有する個々のｓｉＲＮＡでも同様の効果が観察された（図２Ｄ）。この所見の妥当性をさらに確認するため、ＭｙｃのＧＳＫ３βコンセンサス部位（Ｔｈｒ５８Ａｌａ）の変異の影響を分析した。ＧＦＰおよびＰａｘ５を過剰発現したＭＹＣ５細胞に、さらに野生型またはＴ５８Ａ  Ｍｙｃコンストラクトを形質導入した。Ｐａｘ５は内因性およびレトロウイルスによってコードされた野生型Ｍｙｃの発現レベルを上昇させたが、Ｔ５８Ａ変異型の発現レベルは上昇させなかった（図５Ｆ）。 
最後に、Ａｋｔ−ＧＳＫ３β軸がＢＣＲ陰性細胞のＣＤ１９によるＭｙｃの活性化に必要か否かを判断した。対照ベクター（ＭＳＣＶ−ｉｒｅｓ−ＮＧＦＲ）およびＣＤ１９を形質導入したＭｙｃ５細胞の分析では、Ａｋｔのリン酸化およびＧＳＫ３βの抑制的リン酸化の活性化がＢＣＲ充足Ｂ細胞と同様に亢進することが明らかとなった（図５Ｇ、左２列）。次に、前記ＰＩ３Ｋ経路の重要な負の制御因子であるＰＴＥＮを過剰発現するように組み換えた細胞で、同じ実験を繰り返した。予想どおり、ＰＴＥＮは完全にＣＤ１９によるＡｋｔの活性化を消失させ、Ｍｙｃのアップレギュレーションも阻害し（図５Ｇ、右２列）、これらの２つの現象に因果関係があることが確定した。
【００６７】
ＣＤ１９−Ｍｙｃ軸はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで細胞の発現を促す
細胞分裂でＭｙｃが突出した役割を果たしていることを考え、ＣＤ１９がＭｙｃ依存的に細胞増殖を促すのか否かを判断した。そのため、親およびＣＤ１９発現ＭＹＣ５細胞に抗Ｍｙｃ  ｓｉＲＮＡを処理し、Ｍｙｃの基底レベルとＣＤ１９で誘導されたＭｙｃレベルを低下させた。α−Ｍｙｃ  ｓｉＲＮＡ存在下、ＣＤ１９が細胞増殖に与える影響は、対照ｓｉＲＮＡ存在下でみられた影響よりもはるかに小さかった（図６Ａ）。しかし、ＣＤ１９存在下では、抗Ｍｙｃ  ｓｉＲＮＡが対照細胞ほどＭｙｃレベルを低下させる効果がなく（図６Ｂ）、結果の解釈を複雑にしていた。そのため、Ｐａｘ５、ＣＤ１９、Ｍｙｃで形質導入したＭＹＣ５細胞の増殖速度も比較した（それぞれ図３Ｆ〜５Ｆ）。ＣＤ１９またはＭｙｃで形質導入された細胞と比較し、Ｐａｘ５で形質導入された細胞はかなり速く増殖したが（図６Ｃ）、これはおそらくＣＤ１９に加え、Ｐａｘ５がＩｇαおよび増殖を促すＢＣＲシグナル伝達を再活性化するためである（Ｃｏｚｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖ．，  １１７：２６０２−２６１０）。しかし、ＣＤ１９およびＭｙｃを形質導入した細胞はほぼ同じ速度で増殖し、ＣＤ１９で誘導される増殖には、重要なＭｙｃ依存性の要素はないことを示唆している（図６Ｃ）。
【００６８】
ＣＤ１９がｉｎ  ｖｉｖｏで細胞の増殖を促すか否かを判断するため、マウスに注入した場合にＰａｘ５およびＣＤ１９を再活性化しないＭＹＣ５  Ｍ５サブクローンを利用した（Ｃｏｚｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖ．，  １１７：２６０２−２６１０；  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｂｌｏｏｄ  １０１：１９５０−１９５５）。ＣＤ１９によるＭｙｃ５−Ｍ５細胞の再構成は、ＧＦＰの分類を利用し、親Ｍｙｃ５細胞で報告されているとおりに行った（図７Ａ）。ＭＹＣ５−Ｍ５／ＣＤ１９細胞はまだＭａｃ１が陽性でＢ２２０が陰性であるという点で、その準骨髄細胞系列（ｑｕａｓｉ−ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｉｎｅａｇｅ）を保持した（図７Ｂ）。また、これらの細胞はホスホ−ＡｋｔおよびＭｙｃを確実にアップレギュレートした（図６Ｄ）。細胞周期の進行に関与するＭｙｃ標的遺伝子がＣＤ１９再構成細胞でアップレギュレートされているか否かを判断するため、３つの重要なＭｙｃ活性化遺伝子ＯＤＣ１、ＬＤＨＡ、およびＣＤＫ４のｍＲＮＡレベルを測定した（Ｂｅｌｌｏ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９０：７８０４−７８０８；  Ｓｃｈｕｈｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２９：３９７−４０６；  Ｅｌｋｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３２：４９５５−４９６１；  Ｈｅｒｍｅｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９７：２２２９−２２３４）。３つすべての場合において、ＣＤ１９充足またはＣＤ１９欠乏培養でｍＲＮＡレベルの上昇が観察された（図６Ｅ）。またＭｙｃによるミクロＲＮＡの広範なダウンレギュレーションが腫瘍性成長に寄与していることが証明された（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ４０：４３−５０）。したがって、ＣＤ１９陰性および再構成Ｍｙｃ５細胞株で重要な５つのＭｙｃ抑制ミクロＲＮＡレベルを比較した。検討した５種類の増殖抑制ミクロＲＮＡすべてについて（ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５、およびｌｅｔ−７ｅ）、ＣＤ１９再構成細胞レベルの低下が観察された（図７Ｃ）。
【００６９】
対照およびＣＤ１９再構成ＭＹＣ５−Ｍ５細胞を免疫抑制状態にあるマウスに注入した。得られた腫瘍のＣＤ１９−Ｍｙｃ軸の要素を分析した。Ｍｙｃレベルの上昇にはホスホ−Ａｋｔおよびホスホ−ＧＳＫ３βレベルの上昇が伴ったが（図６Ｆ）、変異型ＣＤ１９を発現した腫瘍細胞はＡｋｔを活性化し、Ｍｙｃタンパク質の発現をアップレギュレートすることができず、Ｍｙｃ依存性腫瘍性成長におけるこの経路の重要性をさらに強調していた。注意すべき点として、ＣＤ１９再構成細胞はＧＦＰのみの対照細胞よりも増殖速度がはるかに速く、最終的にはるかに大きな腫瘍を形成した（図６Ｇ）。このため、ＣＤ１９はＰＩ３Ｋ依存的にＭｙｃレベルを制御するが、ＢＣＲは制御しないという分子モデルができる（図８Ａ）。
【００７０】
最後に、ＣＤ１９がヒトＢリンパ腫のＭｙｃ機能に関与しているか否かを判断した。ＣＤ１９の発現増加を示す腫瘍は、今度はＭｙｃの標的の発現増加も示すと仮定された。そのため、Ｈｕｍｍｅｌの研究でプロファイリングされた数千の腫瘍検体に対応し、公開されているデータセットを分析した（Ｈｕｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ３５４：２４１９−２４３０）。Ｔｈｒ−５８に変異を持つことが多いバーキットリンパ腫症例を避けるため（Ｈｏａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １５：４０３１−４０４２）、Ｉｇ−ＭＹＣ転座のないびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫１４２例に焦点を当てた。このように条件をかけた症例を用い、患者サンプルを３つの群に分類し（ＣＤ１９高値、中間、および低値）、Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ；  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １０２：１５５４５−１５５５０）を行い、ＣＤ１９ＨＩＧＨ腫瘍とＣＤ１９ＬＯＷ腫瘍を比較した。ＣＤ１９ＨＩＧＨ腫瘍はキュレートした（ｃｕｒａｔｅｄ）遺伝子セットＤＡＮＧ＿ＭＹＣ＿ＴＡＲＧＥＴＳ＿ＵＰを含む頻度が高いことが観察された（Ｚｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，  ４：Ｒ６９．１−Ｒ６９．１０）（図８Ｂ）。このエンリッチメントは非常に有意で、正規化したエンリッチメントスコアは１．５１０６７７、ｐ値<０．０２６４７６５７９、およびＦＤＲ  ｑ値<０．１７２５２２６３であった。重要なことに、頻度の高いセットには、図８Ｃのヒートマップに示されているとおり、妥当性が確認された３つのＭｙｃ標的のＯＤＣ１、ＣＤＫ４、およびＬＤＨＡが含まれた。
【００７１】
この分析はＣＤ１９発現とＭｙｃ標的の発現を強く関連付けているため、さらにＣＤ１９とＭｙｃが患者の生存に同様の効果を持つと想定された。Ｈｕｍｍｅｌの解析に加え、数千例のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）患者に関する生存データと併せてｍＲＮＡ発現をプロファイリングしたＬｅｎｚの研究が含まれた（Ｌｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ３５９：２３１３−２３２３）。両方の統計的見識を得ながら個別の研究それぞれの忠実性を維持するため、層別ログランク検定を用い、全生存率に対する遺伝子発現レベルの重要性を判断した。注意すべき点として、正規化したＭＹＣおよびＣＤ１９値の分布と２つの研究の推定ＫＭ曲線は同様であり、２つの研究を組み合わせることは適切であることが確認された。ＭＹＣレベルが患者の生存にどのように影響するかが初めて検討された。各研究において、ＭＹＣ発現値が低い患者はＭＹＣ発現値が高い患者と比較して生存が良好であった（図８Ｄ）。層別ログランク検定では、χ２値が１５．１７、ｐ値が<０．０００１であり、ＭＹＣは生存に有意に負の影響を持つことを示していた。次に、ＣＤ１９がどのように患者の生存に影響するかを調査した。前記仮説を確認し、ＣＤ１９の発現は患者の生存にＭＹＣの発現と同様の効果を示した（図８Ｄと８Ｅを比較）。この場合も、層別ログランク検定では（Ｋａｌｂｆｌｅｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｔｉｍｅ  ｄａｔａ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）χ２値が５．３９、ｐ値が０．０２０３であり、ＣＤ１９レベルが患者の生存に有意に負の影響を持つことを示していた。したがって、前記ＧＳＥＡおよび生存解析は、いずれもＣＤ１９がヒトＢリンパ腫のＭｙｃ機能を積極的に制御していることを示している。
【実施例２】
【００７２】
ほとんどのタイプのＢ細胞で、ＣＤ１９がＢ細胞受容体（ＢＣＲ）の補助受容体として機能することは周知である。ＣＤ１９およびＢＣＲが全体としてリンパ腫患者の生存にどのように影響しているかをさらに理解するため、２つの公開されているデータセットを利用した。最初の研究では、慢性的に活性化したＢＣＲシグナル伝達を示すＨＢＬ−１びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞株において、低分子ヘパリンを使用してＢＣＲの要素であるｃｄ７９ａをノックダウンした。ノックダウン中に発生したｍＲＮＡプロファイリングの変化から、「ＢＣＲシグニチャー」、つまり、発現が機能的ＢＣＲに依存する遺伝子セットを同定した。次に、ヒトＤＬＢＣＬ腫瘍４２０例をプロファイリングした第２のデータセットを利用した。ＢＣＲシグニチャー内の遺伝子の平均発現量を基に、各腫瘍にＢＣＲシグニチャースコアを割り当てた。ＤＬＢＣＬ患者の中では、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ−）サブタイプの侵襲性が高いと考えられ、患者の死亡率は胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ−）サブタイプ（およびこれよりもまれな縦隔リンパ腫）で観察される死亡率よりも有意に高い。このため、腫瘍をサブタイプの分類により２群に分けた。ＢＣＲシグニチャーが高い患者をＢＣＲシグニチャーが低い患者と比較した場合、ＢＣＲシグニチャーが高いことはＡＢＣ−の生存に負の影響を与えたが、ＧＣＢ−のＤＬＢＣＬ患者には影響がなく（図９Ａおよび９Ｂ）、ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬの発症機序がＢＣＲシグナル伝達に依存することを示していた。したがって、前記ＢＣＲを標的とすることは、治療上の利益を提供する。
【００７３】
ｍｉＲ−１７〜９２ミクロＲＮＡクラスター（Ｏｌｉｖｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｉｎｔｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ４２：１３４８−５４；  Ｉｎｏｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｂｌｏｏｄ  １１３：３９６−４０２）は、ＢＣＲの制御に関与している。次に、ｍｉＲ−１７〜９２とＢＣＲシグナル伝達との関係がヒトにおけるＢリンパ腫形成と関連しているか否かを判定した。その点では、ＢＣＲメタ遺伝子はｍｉＲ−１７〜９２の一次転写産物であるｍｉｒ１７ｈｇの発現と関連していた（図９Ｄ）。ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬでは、ＢＣＲシグネチャーとｍｉｒ１７ｈｇの発現との間に有意な相関関係があった（図９Ｄ）。次に、ｍｉｒ１７ｈｇ発現量の多い患者をｍｉｒ１７ｈｇ発現量の少ない患者と比較した（図９Ｅ）。ヒトおよびマウスでは癌遺伝子として同定されているが、ｍｉｒ１７ｈｇ発現量が多いだけでは患者の生存が有意に変化することはなかった。ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ患者の生存に対するｍｉＲ−１７〜９２とＢＣＲシグナル伝達との相互作用をさらに分析するため、前記患者を高ＢＣＲシグネチャー／高ＭＩＲ１７ＨＧ、高ＢＣＲシグネチャー／低ＭＩＲ１７ＨＧ、低ＢＣＲシグネチャー／高ＭＩＲ１７ＨＧ、および低ＢＣＲシグネチャー／低ＭＩＲ１７ＨＧの４群に分けた。ｍｉｒ１７ｈｇの発現量が少なく、ＢＣＲシグナル伝達レベルが高いことは（高ＢＣＲシグネチャー／低ＭＩＲ１７ＨＧ）、ＢＣＲシグナル伝達レベルが低い患者（低ＢＣＲシグネチャー／低ＭＩＲ１７ＨＧ）と比較し、患者の生存に影響しない（図９Ｇ）。しかし、驚くことに、高ＢＣＲシグネチャー／高ＭＩＲ１７ＨＧ患者の生存は、低ＢＣＲシグネチャー／高ＭＩＲ１７ＨＧ患者と比較し、有意に低下している（図９Ｆ）。患者の死亡率に対するＢＣＲシグナル伝達の影響は、ｍｉｒ１７ｈｇ自体は死亡率に影響しないとしても（図９Ｅ）、ｍｉｒ１７ｈｇの発現量が高いことで悪化した（図９Ｆ〜９Ｇを比較）。したがって、ｍｉＲ−１７〜９２はＢＣＲシグナル伝達と協力して、ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ患者の生存に悪影響を及ぼす。
【００７４】
ＢＣＲシグナル伝達を積極的に制御するため、ｍｉＲ−１７〜９２クラスターはＢＣＲシグナル伝達の負の制御因子を標的とすることができ、これらの標的はＢ細胞リンカータンパク質（ＢＬＮＫ）リン酸化部位の上流で機能する。ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／）において負の制御因子を検索し、３’ＵＴＲの予想されるｍｉＲ−１７〜９２結合部位およびｃｄ２２およびｆｃｇｒ２ｂを同定したが、いずれも免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）をコードしている。次に、この制御がｍｉＲ−１７〜９２クラスターを直接標的とした結果であるのか、それとも間接的な影響であるのかを決定した。（それぞれ）ｍｉＲ−１９ａおよび−１８ａのｃｄ２２およびｆｃｇｒ２ｂ  ３’ＵＴＲへの直接的結合を調査するため、二重ルシフェラーゼセンサーアッセイを利用した具体的には、各３’ＵＴＲの１００ｂｐフラグメントをウミシイルシフェラーゼ遺伝子の下流でクローニングしたが、ホタルシフェラーゼは内部標準として提供された（図１０Ｄ〜１０Ｅ）。野生型３’ＵＴＲを有するフラグメントに加え、予想されるシード配列に変異のあるコンストラクトをネガティブコントロール用にクローニングした。個々のプラスミドコンストラクトそれぞれ（空のベクター、野生型３’ＵＴＲ、および変異型３’ＵＴＲ）およびマッチしたｍｉＲＮＡ模倣体をＨＣＴ１１６  Ｄｉｃｅｒ低次形態細胞に同時形質移入し、４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１８ａによりｃｄ２２およびｆｃｇｒ２ｂ  ３’ＵＴＲを直接標的とした（図１０Ｄ〜１０Ｅ）。野生型ｃｄ２２  ３’ＵＴＲは変異型３’ＵＴＲコンストラクトと比較し、ルシフェラーゼ活性の２５％の（統計的に有意な）低下を示した（図１０Ｄ）。ｆｃｇｒ２ｂの実験では、ｍｉＲ−１８ａの形質移入によりすべてのコンストラクトでルシフェラーゼ活性が低下した（図１０Ｅ）。しかし、野生型ｆｃｇｒ２ｂ  ３’ＵＴＲは変異型３’ＵＴＲコンストラクトと比較し、さらにルシフェラーゼ活性の低下を示し、この差は有意であった（図１０Ｅ）。
【００７５】
ＢＬＮＫのリン酸化と平行した経路では、ＢＣＲ連結反応によりＡｋｔもリン酸化し、ｍｉＲ−１７〜９２はＣＤ２２およびＦＣＧＲ２Ｂを阻害することでＡｋｔのリン酸化を亢進することができるため、ＳＨＩＰの活性は低くなる。リンパ腫細胞は、可溶性抗ＩｇＭで刺激する前に対照またはｍｉＲ−１７〜９２模倣体で処理し、連結反応後３０分および９０分で細胞を採取した（図１０Ｆ）。対照およびｍｉＲ−１７〜９２模倣体処理細胞では、ＢＣＲ連結反応後にＡｋｔのリン酸化亢進が観察された（図１０Ｆ）。しかし、リン酸化の亢進はｍｉＲ−１７〜９２模倣体処理細胞の方が大きく、ｍｉＲ−１７〜９２を介したＢＣＲシグナル伝達の増幅は複数の下流シグナル伝達経路に影響する可能性があることを示唆している（図１０Ｆ）。Ａｋｔ１はリン酸化により直接グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を阻害し、さらに下流のＧＳＫ３βがＭｙｃを標的とし、分解する。そのため、Ａｋｔのリン酸化によりＧＳＫ３ｂが不活性化し、Ｂ細胞のＭｙｃレベルが上昇する。実際、ＧＳＫ３βのリン酸化亢進は内因性ｍｉＲ−１７〜９２模倣体存在下で観察された（図１０Ｆ）。ＭｙｃはｍｉＲ−１７〜９２処理細胞ではより強くアップレギュレートされることがわかった（図１０Ｆ）。これらの結果は、ＭｙｃはｍｉＲ−１７〜９２を介してＢＣＲ反応を刺激し、フィードフォワードの制御ループに関与することを証明している（例えば、図１０Ｇのモデル参照）。
【実施例３】
【００７６】
ＰＩ３Ｋシグナル伝達の抑制後に活性化される可能性がある経路を同定するため、ＭＹＣ５細胞とＰＩ３Ｋを動員することができないＣＤ１９変異株を利用した。興味深いことに、ＭＹＣ５−ＣＤ１９ｍｕｔ腫瘍はＣＤ１９ｗよりもかなり遅く増殖するが、それでもＣＤ１９陰性腫瘍よりははるかに速く増殖する（図１１Ａ、１１Ｂ）。別のどの増殖経路がＣＤ１９ｍｕｔによって活性化されるかを判断するため、報告されたＣＤ１９との関連性を考え、様々な群のＭＡＰＫシグナル伝達をプロファイリングした。予想外に、Ｅｒｋおよびｐ３８のリン酸化に大きな変化は認められなかったが、ＣＤ１９ｍｕｔ（ただし、ＣＤ１９ｗｔではない）はＪｕｎキナーゼＪＮＫのリン酸化を強く亢進した（図１１Ｃ）。ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２を処理したＣＤ１９充足Ｂ細胞でも同様の効果が認められた（図１１Ｄ）。誘発するように、ＪＮＫはＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ（ＳＦＴＫ）による活性化を受けることが知られており、ＳＦＴＫ  ＬｙｎおよびＦｙｎはＣＤ１９により細胞膜に動員されることで活性化する。この推定上の経路と一致し、Ｓｕｇｅｎの化合物ＳＵ６６５６によるＳＦＴＫの阻害でホスホ−ＪＮＫレベルが低下し、ＣＤ１９ｍｕｔ／ＰＩ３Ｋの機能を停止した細胞の増殖が選択的に抑制された（図１１Ｅ、１１Ｆ）。さらに、ＣＤ１９ｍｕｔ／ＰＩ３Ｋの機能を停止した細胞は、ＳＦＴＫ  Ｌｙｎを選択的にリン酸化する（図１１Ｇ）。
【００７７】
ＪＮＫは、ＰＩ３Ｋの動員／活性化がない状態で、ＣＤ１９／Ｌｙｎを介したシグナル伝達により活性化すると仮定された。マウスＭｙｃ５  Ｂリンパ腫系とヒトＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）細胞との間に興味深い類似点が特定された。Ｍｙｃ５細胞同様、ＣＤ１９＋  Ｂ−ＡＬＬ細胞は表面（ｓ）−ＩｇＭ（つまりＢＣＲ）を発現せず、ｓ−ＩｇＭ刺激に反応しない。さらに、抗ＣＤ１９抗体を用いたＢ−ＡＬＬ細胞の免疫沈降実験のデータは、ＣＤ１９はＬｙｎと相互作用するがＰＩ３Ｋとは相互作用せず、一方、Ｐ４９３−６リンパ腫細胞ではその両方の相互作用が発生することを証明している（図１２Ａ、上図）。Ｌｙｎを認識する抗体を使用する場合、ＣＤ１９はＢ−ＡＬＬ細胞で免疫共沈降する（図１２Ａ、下図）。
【００７８】
ｓｈＲＮＡを用いたＣＤ１９のノックダウンはＢ−ＡＬＬ細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘発したため、ＣＤ１９はＢ−ＡＬＬ細胞の増殖と生存に重要であることがわかった（図１２Ｂ、左上図と左下図）。ＣＤ１９ノックダウン後のこの増殖障害とアポトーシスは、主に、Ｌｙｎが介在したシグナル伝達が損なわれることで説明される。これは、抗Ｌｙｎヘパリン処理も細胞増殖を抑制し、アポトーシスを誘発したためである（図１２Ｂ、右上図と右下図）。ＣＤ１９またはＬｙｎヘパリン処理がＭｙｃタンパク質の発現を阻害するため、これはさらに、Ｍｙｃレベル低下に起因する可能性もある（図１２Ｂ、上図）。ＣＤ１９およびＬｙｎのノックダウンがアポトーシスに与える同様の作用が、フローサイトメトリーにより観察された（図１２Ｃ）。
【００７９】
これらの新しい所見は、ＣＤ１９−Ｌｙｎが介在したシグナル伝達はＢ−ＡＬＬ細胞の生存に重要であることを証明している。このことが重要であるのは、ＳＦＴＫ  Ｌｙｎを標的とすることが、Ｂ−ＡＬＬ処理の標的となりうるためである。例えば、本明細書では、ＳＦＴＫ阻害剤のダサニチブ（当初、再発性ＣＭＬの治療に使用）がＬｙｎのリン酸化阻害に効果的であることが示された（図１２Ｄ、上）。また、細胞周期の停止によりＢ−ＡＬＬ細胞の増殖を抑制する。（図１２Ｄ、下）。
【００８０】
本発明の好適な実施例のいくつかは上記に説明し、具体的に例示してきたが、本発明をそのような実施形態に限定する意図はない。以下の請求項に示すとおり、本発明の範囲と精神から離れずに、そこに様々な修正を加えることができる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【国際調査報告】
2015517655.tif 000031