(57)【要約】  本発明は、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ、ＧＣＰ−２、および／またはＥＮＡ−７８が関連する疾患を治療する抗体に関する。本発明は、特に、潰瘍性大腸炎、クローン病、ＣＯＰＤ、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺障害、急性肺疾患、敗血症、ＡＲＤＳ、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザ、ベーチェット病、ブドウ膜炎、歯周病（特に、歯肉炎）、喘息およびＣＯＰＤの増悪、嚢胞性線維症、座瘡、閉塞性細気管支炎症候群、びまん性汎細気管支炎、深静脈血栓症、子癇前症、血管炎、家族性地中海熱、再潅流障害、疼痛および／または子宮内膜症を、少ない炎症性副作用を伴って治療するための改良された抗体またはそれに対する修飾に関する。
2015517468.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４および配列番号２のポリペプチドをそれぞれ含んでなる重鎖および軽鎖を含んでなる、単離された抗体。
【請求項２】
配列番号５および配列番号２のポリペプチドをそれぞれ含んでなる重鎖および軽鎖を含んでなる、単離された抗体。
【請求項３】
ヒトにおいて潰瘍性大腸炎、クローン病、ＣＯＰＤ、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺障害、急性肺疾患、敗血症、ＡＲＤＳ、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザ、ベーチェット病、ブドウ膜炎、歯周病（特に、歯肉炎）、喘息およびＣＯＰＤの増悪、嚢胞性線維症、座瘡、閉塞性細気管支炎症候群、びまん性汎細気管支炎、深静脈血栓症、子癇前症、血管炎、家族性地中海熱、再潅流障害、疼痛および／または子宮内膜症を予防、治療または改善する方法であって、配列番号４および配列番号２のポリペプチドをそれぞれ含んでなる重鎖および軽鎖を含んでなる単離された抗体、または配列番号５および配列番号２のポリペプチドをそれぞれ含んでなる重鎖および軽鎖を含んでなる単離された抗体の有効量を投与することを含んでなる、方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の抗体を１種類以上の薬学上許容される担体と組み合わせて含んでなる、医薬組成物。
【請求項５】
配列番号４および配列番号２のポリペプチドをそれぞれ含んでなる重鎖および軽鎖を含んでなる単離された抗体、または配列番号５および配列番号２のポリペプチドをそれぞれ含んでなる重鎖および軽鎖を含んでなる単離された抗体を生産する、組換え宿主細胞。
【請求項６】
単一の宿主細胞において抗体を生産するための方法であって、
（ｉ）前記単一宿主細胞を、配列番号４または５のポリペプチドを含んでなる重鎖をコードする第１のＤＮＡ配列、および配列番号２のポリペプチドを含んでなる軽鎖をコードする第２のＤＮＡ配列で形質転換する工程；および
（ｉｉ）前記の形質転換された単一宿主細胞内で、前記第１のＤＮＡ配列および前記第２のＤＮＡ配列を発現させて前記抗体重鎖および軽鎖を生産する工程
を含んでなる、方法。
【請求項７】
前記第１および第２のＤＮＡ配列が異なるベクターに存在するか、あるいは前記第１および第２のＤＮＡ配列が単一のベクターに存在する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
配列番号４もしくは配列番号５のポリペプチドを含んでなる重鎖、または配列番号２のポリペプチドを含んでなる軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多重特異性を有する抗体に関する。特に、本発明の抗体は、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ、ＧＣＰ−２、およびＥＮＡ−７８と結合（交差反応）する。本発明はまた、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ、ＥＮＡ−７８およびＧＣＰ−２のうち１以上のレベルの上昇または不均衡を特徴とする疾患または障害、特に、潰瘍性大腸炎、クローン病、ＣＯＰＤ、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺障害、急性肺疾患、敗血症、ＡＲＤＳ、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザ、ベーチェット病、ブドウ膜炎、歯周病（特に、歯肉炎）、喘息およびＣＯＰＤの増悪、嚢胞性線維症、座瘡、閉塞性細気管支炎症候群、びまん性汎細気管支炎、深静脈血栓症、子癇前症、血管炎、家族性地中海熱、再潅流障害、疼痛および／または子宮内膜症を前記抗体で治療する方法に関する。
【発明の概要】
【０００２】
本発明は、特に、潰瘍性大腸炎、クローン病、ＣＯＰＤ、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺障害、急性肺疾患、敗血症、ＡＲＤＳ、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザ、ベーチェット病、ブドウ膜炎、歯周病（特に、歯肉炎）、喘息およびＣＯＰＤの増悪、嚢胞性線維症、座瘡、閉塞性細気管支炎症候群、びまん性汎細気管支炎、深静脈血栓症、子癇前症、血管炎、家族性地中海熱、再潅流障害、疼痛および／または子宮内膜症を、少ない炎症性副作用で治療するための改良された抗体またはそれに対する修飾に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１】図１ＡおよびＢ：刺激されたヒト全血における好中球ＣＤ１１ｂ発現の測定。ＰａｎＥＬＲ抗体とともに８０分間インキュベートした後（示されている場合、最後の６０分間に２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−８を含む）、健常ボランティアからのヘパリン処理全血を固定／溶解溶液（赤血球を溶解し、白血球を固定するため）とともにインキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。次に、白血球ペレットをＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ１６およびＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ１１ｂで染色し、２色フローサイトメトリーにより分析した。白血球を前方および側方散乱プロファイルにより識別し（図１Ａ）、出力をＣＤ１６（高）白血球のＰＥ−Ｃｙ７  ＭＦＩとした（図１Ｂ）。グラフ表示のため、これを非刺激血液におけるレベルに対して正規化した。
【図２】ＰａｎＥＬＲ［ＰａｎＥＬＲ  ＷＴとも呼称］抗体およびＰａｎＥＬＲ  Ｆｃ無効化抗体による全血における好中球ＣＤ１１ｂ調節
【図３】ＰａｎＥＬＲ（ＩｇＧ１）、ＰａｎＥＬＲ  ＩｇＧ４（ＰＥ）［ＩｇＧ４  ＰＥとも呼称］およびＰａｎＥＬＲ  ＩｇＧ４（ＰＥ）Ｎ２９７Ａ［ＩｇＧ４  ＰＥ  ＮＡとも呼称］による好中球ＣＤ１１ｂ調節
【０００４】
発明の背景
公開されているデータおよび報告書は、ＣＸＣＬケモカインのＥＬＲＣＸＣサブファミリーのメンバーがいくつかの疾患で上昇していることを示している。全部で１６のＣＸＣＬファミリーメンバーが存在する。ケモカインは、ＣＯＰＤを含むいくつかの炎症性疾患においてアップレギュレートされることが報告されており、ＣＸＣＬ１〜３、５および８は、それぞれＧｒｏ−α、−β、−γ(Haskill, S., et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 1990: 87, 7732-7736)、ＥＮＡ−７８(Wang, D. and Richmond, A., Cytokine Reference. Oppenheim, J.J. and Feldman, M. ed., Academic Press, London, 1023-1027, Power, C.A. et al. Gene, 1994: 151, 333-334)、およびＩＬ−８(Lizasa, H. and Matsushima , K., Cytokine Reference. Oppenheim, J.J. and Feldman,M. ed., Academic Press, London, 1061-1067, Matsushima, K. et al., J. Exp. Med. 1988: 167, 1883-1893)としても知られる(Am. J. Respir. Crit. Care Med., 163: 349-355, 2001, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 168: 968-975, 2003, Thorax, 57: 590-595, 2002)。これらのケモカインの発現の延長および上昇は、特に、潰瘍性大腸炎、クローン病、ＣＯＰＤ、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺障害、急性肺疾患、敗血症、ＡＲＤＳ、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザ、ベーチェット病、ブドウ膜炎、歯周病（特に、歯肉炎）、喘息およびＣＯＰＤの増悪、嚢胞性線維症、座瘡、閉塞性細気管支炎症候群、びまん性汎細気管支炎、深静脈血栓症、子癇前症、血管炎、家族性地中海熱、再潅流障害、疼痛および／または子宮内膜症などの疾患の発症に関与し得ると仮定されている。これらのＣＸＣケモカインは、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２受容体の結合および活性化により好中球の走化性を刺激することが知られる。よって、これらのケモカインの阻害は、炎症性細胞が肺組織に浸潤するのを防ぎ、従って、組織の損傷を防ぐことができる。本発明は、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ、ＧＣＰ−２、およびＥＮＡ−７８と結合する能力を有する抗体を使用することにより、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２受容体の活性化を阻害することに向けられる。
【発明の具体的内容】
【０００５】
本発明者らの公開特許出願ＷＯ２００８／１３０９６９号は、重鎖および軽鎖（それぞれ配列番号１および２、ＰａｎＥＬＲと呼称）を有する抗体が、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ、ｇｃｐ−２およびＥＮＡ−７８を中和することによるＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２受容体活性化の阻害を介して好中球走化性を低下させることを教示している。
【０００６】
ＰａｎＥＬＲは、ケモカインのＣＸＣ−ＥＬＲファミリー（ＩＬ−８、ｇｒｏ−α、ｇｒｏ−β、ｇｒｏ−γ、ＥＮＡ−７８、およびＧＣＰ−２）に対して強力な中和活性を有する、ヒト化されたＩｇＧ１野生型抗体である。ＰａｎＥＬＲは、ＬＰＳ吸入肺炎症モデルおよびカンタリジン皮膚水疱モデルを含むいくつかの動物モデルで、好中球の浸潤を特異的に抑制し、例えば、１０ｍｇ／Ｋｇ  ｉ．ｖ．で、９０％を超える好中球浸潤を抑制するが、単球浸潤は抑制せず、このケモカイン経路の特異性を示す。
【０００７】
３、３０、１００および３００ｍｇ／Ｋｇの用量の毎週１回の投与で行った２つのＧＬＰ毒性試験では、高用量群（１００〜３００ｍｇ／Ｋｇ）の大多数の動物、および低（治療）用量群（３〜１０ｍｇ／Ｋｇ）の少数の動物が１匹当たり１〜２箇所の皮膚病変を発症した。これらの病変は単球または好酸球浸潤を特徴とした。野生型ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域が炎症性応答に役割を果たしていたかどうかを理解するために、ＩｇＧ１  ＦｃＲｎおよび補体無効化抗体（ＰａｎＥＬＲ  Ｆｃ無効化、Ｌ２４８Ａ／Ｈ２５０Ａ、軽鎖および重鎖としてそれぞれ配列番号２および配列番号３）を作製し、週１回、３００ｍｇ／Ｋｇの単一濃度で投与した。これらの動物はまた、ＩｇＧ１野生型抗体を投与した動物とほぼ同じ罹患率で皮膚病変を発症し、ＩｇＧ１  ｗｔ抗体のＦｃ無効化が完全でない可能性があることを示唆する。別の観察では、高用量ＩｇＧ１ｗｔ群の動物は、無刺激条件下で好中球に高いＣＤ１１ｂ発現を持っていたが、これにより、ＰａｎＥＬＲが好中球を直接刺激している可能性があり、これが毒性につながる機構の一部であり得るという仮説に至った。
【０００８】
この可能性を探るため、ヒト全血を用いていくつかの実験を行った。予想されたように、ＰａｎＥＬＲ（野生型）またはＰａｎＥＬＲ  ＦｃＲｎおよび補体無効化抗体（ＰａｎＥＬＲ  Ｆｃ無効型）は、外から加えたＩＬ−８（２００μｇ／ｍｌ）によるＣＤ１１ｂのアップレギュレーションを強力に阻害した。しかしながら、より高濃度で、ＰａｎＥＬＲは、ＩＬ−８を添加してもしなくても、ＣＤ１１ｂ発現を直接高めた。興味深いことに、ＰａｎＥＬＲ  Ｆｃ無効化型もＣＤ１１ｂ発現を高めたが、１０００μｇ／ｍｌ（３００ｍｇ／Ｋｇの抗体を投与した動物においてＣｍａｘが高かった濃度）を超える濃度以外は、ｗｔ抗体ほど強力ではなかった（図２参照）。ＰａｎＥＬＲ  ｗｔ型またはＰａｎＥＬＲ  Ｆｃ無効型に由来するＦａｂフラグメントは、対照Ｆｃ−ｗｔ抗体およびＦｃ無効化抗体とともに、高濃度でＣＤ１１ｂの増加を促進することができなった。これらのデータは、ＰａｎＥＬＲのＦｃ領域とＣＤ１１ｂの増加の間には直接的な因果関係があり得、これはＩｇＧ１  Ｆｃ機能を無効化するために慣用されるＩｇＧ１の変更により回避されないということを示唆する。
【０００９】
ＰａｎＥＬＲのＦｃ部分の役割およびそのＦｃγＲとの相互作用をより詳しく理解するために、ＩｇＧ４の安定化型および２つのグリコシル化型、すなわち、ＰａｎＥＬＲ  ＩｇＧ４（ＰＥ）抗体（配列番号４配列および配列番号２配列をそれぞれ有する重鎖および軽鎖を有する）；ＰａｎＥＬＲ  ＩｇＧ４（ＰＥ）Ｎ２９７Ａ抗体（配列番号５配列および配列番号２配列をそれぞれ有する重鎖および軽鎖を有する）；およびＰａｎＥＬＲ  ＩｇＧ４（ＰＥ）Ｎ２９７Ｓ抗体（配列番号６配列および配列番号２配列をそれぞれ有する重鎖および軽鎖を有する）を作製した（この場合、ＰａｎＥＬＲ由来のＣＤＲをＩｇＧ４主鎖に転移させた。これらのＩｇＧ４変異体の特性決定により、それらがＩｇＧ１アイソタイプと同じ結合および中和特性を持つことが確認された。しかしながら、ＩｇＧ１アイソタイプとは対照的に、全血をこれらのＩｇＧ４変異体のいくつかに曝しても、最大１０００μｇ／ｍｌの濃度で、ＣＤ１１ｂの発現の上昇を示すことができなかったか、または最小の発現しか示さず（図３参照）、ＩｇＧ４変異体はＩｇＧ１またはＩｇＧ１−Ｆｃ無効型(aversions)のいずれよりもＦｃγＲとの相互作用が低い可能性があることが示唆された。
【００１０】
Ｐａｎ−ＥＬＲ  ＩｇＧ変異体と補体の相互作用を特徴付けるため、Ｃ１ｑ  ＢｉａＣｏｒｅ結合アッセイを確立し、これにより、Ｐａｎ−ＥＬＲ  ＩｇＧ４（ＰＥ）変異体のＣ１ｑへの結合に６５％より大きい低下が明らかになった。このことは、ＩｇＧ４（ＰＥ）は、ＩｇＧ１野生型またはＦｃ無効化抗体のいずれよりも、補体と結合してそれを活性化する能力が低いことを示し、抗体の炎症能を軽減する際に重要な考慮事項となる。
【００１１】
この一連の実験は予期しない発見を明らかにし、二重アラニン突然変異の導入によるＩｇＧ１抗体の無効化は、Ｆｃ−γ受容体相互作用またはＣ１ｑ結合の完全な消失(emimination)をもたらさないことを初めて示し、加えて、ＦｃγＲおよび補体の相互作用が炎症役割を果たしている可能性のあるＩｇＧ１  Ｆｃ無効化抗体よりも優れたＩｇＧ４抗体の利点を実証する。
【００１２】
よって、一実施形態において、本発明は、配列番号４および配列番号２のポリペプチドをそれぞれ含んでなる重鎖および軽鎖を含んでなる単離された抗体、または配列番号５および配列番号２のポリペプチドをそれぞれ含んでなる重鎖および軽鎖を含んでなる単離された抗体に関する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、ヒトにおいて、特に、潰瘍性大腸炎、クローン病、ＣＯＰＤ、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺障害、急性肺疾患、敗血症、ＡＲＤＳ、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザ、ベーチェット病、ブドウ膜炎、歯周病（特に、歯肉炎）、喘息およびＣＯＰＤの増悪、嚢胞性線維症、座瘡、閉塞性細気管支炎症候群、びまん性汎細気管支炎、深静脈血栓症、子癇前症、血管炎、家族性地中海熱、再潅流障害、疼痛および／または子宮内膜症を予防、治療または改善する方法であって、配列番号４および配列番号２のポリペプチドをそれぞれ含んでなる重鎖および軽鎖を含んでなる単離された抗体、または配列番号５および配列番号２のポリペプチドをそれぞれ含んでなる重鎖および軽鎖を含んでなる単離された抗体の有効量を投与することを含んでなる方法に関する。
【００１４】
一実施形態において、本発明は、配列番号４および配列番号２のポリペプチドをそれぞれ含んでなる重鎖および軽鎖を含んでなる単離された抗体、または配列番号５および配列番号２のポリペプチドをそれぞれ含んでなる重鎖および軽鎖を含んでなる単離された抗体を生産する組換え宿主細胞に関する。
【００１５】
本明細書で使用する場合、「抗体」は、種々の修飾型を含む。修飾型としては、抗体のグリコシル化変異体を含む。抗体の、定常領域における保存された位置でのグリコシル化は、抗体機能、特に、上記のものなどのエフェクター機能に顕著な効果を持つことが知られている。例えば、Boyd et al. (1996) Mol. Immunol. 32: 1311-1318参照。１以上の糖鎖部分が付加、置換、欠失または修飾された、抗体またはその抗体フラグメントのグリコシル化変異体が企図される。アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−トレオニンモチーフの導入が、糖鎖部分の酵素的結合のための潜在部位を作り出し、従って、抗体のグリコシル化を操作するために使用することができる。Raju et al. (2001) Biochemistry 40: 8868-8876では、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／またはα、２，３シアリルトランスフェラーゼを用いた再ガラクトシル化および／または再シアル化のプロセスを介して、ＴＮＦＲ−ＩｇＧイムノアドヘシンの末端シアル化が増大した。末端シアリル化は、免疫グロブリンの半減期を延長すると考えられている。抗体は、ほとんどの糖タンパク質と同様に、一般に、糖型の混合物として生産される。この混合物は、抗体が真核細胞、特に、哺乳類細胞で生産される場合に特に明白である。定義された糖型を作製するために様々な方法が開発されている、Zhang et al. (2004) Science 303: 371: Sears et al. (2001) Science 291: 2344; Wacker et al. (2002) Science 298: 1790; Davis et al. (2002) Chem. Rev. 102: 579; Hang et al. (2001) Acc. Chem. Res 34: 727参照。本明細書に記載の抗体（例えば、ＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１）は、定義された数（例えば、７以下、例えば、５以下、例えば、２つまたは１つ）の糖型を含み得る。
【００１６】
本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンなどの非タンパク質性ポリマーと連結させてもよい。タンパク質とＰＥＧのコンジュゲーションは、タンパク質の半減期の延長、ならびにタンパク質の抗原性および免疫原性の軽減のために確立された技術である。様々な分子量およびスタイル（直鎖または分岐）でのペグ化の使用が、完全抗体ならびにＦａｂフラグメントとともに検討されている、Koumenis et al. (2000) Int. J. Pharmaceut. 198: 83-95参照。
【００１７】
生産方法
本発明の抗体は、ヤギ（Pollock et al. (1999) J. Immunol. Methods 231: 147-157参照）、ニワトリ（Morrow (2000) Genet. Eng. News 20: 1-55参照）、マウス（Pollock et al.参照）または植物（Doran (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11: 199-204; Ma (1998) Nat. Med. 4: 601-606; Baez et al. (2000) BioPharm 13: 50-54; Stoger et al. (2000) Plant Mol. Biol. 42: 583-590参照）などのトランスジェニック生物で生産され得る。
【００１８】
本発明の抗体はまた、化学合成によっても生産され得る。しかしながら、本発明の抗体は一般に、当業者に周知の組換え細胞培養技術を用いて生産される。本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、さらなるクローニング（増幅）または発現のために、プラスミドなどの複製可能なベクターに挿入する。特に宿主細胞がＣＨＯまたはＮＳ０である場合、１つの発現系はグルタミン酸シンセターゼ系（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓにより販売されているものなど）である。抗体をコードするポリヌクレオチドは、従来の手法（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）を用いて容易に単離され、配列決定される。使用可能なベクターとしては、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、そのプラスミドが一般に用いられるミニ染色体が含まれる。一般にこのようなベクターは、シグナル配列、複製起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列（場合により、発現を助けるために抗体ポリヌクレオチドと連結してもよい）をさらに含む。軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドは、別個のベクターに挿入してもよいし、同じ宿主細胞に同時にまたは順次、導入してもよく（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたは形質導入による）、あるいは所望により、重鎖と軽鎖の両方を導入前の同じベクターに挿入することもできる。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、配列番号４または配列番号５のポリペプチドを含んでなる重鎖、または配列番号２のポリペプチドを含んでなる軽鎖、をコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターに関する。
【００２０】
コドンの最適化は、コドンが最適化された遺伝子でトランスフェクトした場合に、その配列でトランスフェクトした場合のレベルに比べて、宿主細胞により生産されるタンパク質の総レベルが高くなることを意図して使用することができる。いくつかの方法が公開されている(Nakamura et al. (1996) Nucleic Acids Research 24: 214-215; W098/34640; W097/11086)。遺伝コードの冗長性のために、本明細書に開示されているものとは別のポリヌクレオチド（特に、所与の宿主細胞における発現のためにコドンが最適化されたもの）も本明細書に記載の抗体をコードし得る。従って、本発明の抗体のコドン使用頻度を、転写産物および／または生成物収量を増大させるために宿主細胞のコドンバイアスを適応させるために改変することができる（例えば、Hoekema et al Mol Cell Biol 1987 7(8): 2914-24）。コドンの選択は、発現に使用する宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
【００２１】
よって、別の態様において、本発明は、配列番号７、８、９、または１０のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０、９５、９８、もしくは９９％または１００％同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドに関する。
【００２２】
クエリー核酸配列とサブジェクト核酸配列の間の「同一性パーセント」は、パーセンテージとして表される「一致」の値であり、ペアワイズＢＬＡＳＴＮアラインメントが実行された後、サブジェクト核酸配列がクエリー核酸配列と１００％のクエリーカバー率を有する場合に、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムにより算出される。このようなクエリー核酸配列とサブジェクト核酸配列間のペアワイズＢＬＡＳＴＮアラインメントは、National Center for Biotechnology Instituteのウェブサイトで利用可能なＢＬＡＳＴＮアルゴリズムのデフォルト設定を、低複雑性領域のフィルターをオフにして使用することにより実行する。重要なこととしては、クエリー核酸配列は、本明細書の１以上の請求項で特定される核酸配列により記載され得るということである。
【００２３】
シグナル配列
抗体は、成熟タンパク質のＮ末端に特異的切断部位を有する異種シグナル配列との融合タンパク質として生産してもよい。シグナル配列は、宿主細胞により認識され、処理されなければならない。原核生物宿主細胞の場合、シグナル配列は例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性腸毒素ＩＩリーダーであり得る。酵母分泌のためには、シグナル配列は例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーまたは酸性ホスファターゼリーダーであり得る、例えばＷＯ９０／１３６４６参照。哺乳類細胞系では、単純ヘルペスｇＤシグナルなどのウイルス分泌リーダーおよび天然免疫グロブリンシグナル配列が好適であり得る。一般に、シグナル配列は、抗体をコードするＤＮＡのリーディングフレーム内に連結する。
【００２４】
複製起点
複製起点は当技術分野で周知であり、ほとんどのグラム陰性菌に好適なｐＢＲ３２２、ほとんどの酵母に好適な２μプラスミド、およびほとんどの哺乳類細胞に好適な、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶなどの種々のウイルス起源のものがある。一般に、複製起点成分は哺乳類の発現ベクターには必要とされないが、ＳＶ４０は、初期プロモーターを含んでいるので使用可能である。
【００２５】
選択マーカー
典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質またはその他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、あるいは（ｂ）栄養要求性(auxiotrophic)欠乏を補完する、もしくは複合培地中で得られない栄養素を供給する、あるいは（ｃ）その両方の組合せを行うタンパク質をコードする。選択スキームは、宿主細胞の増殖を停止させることを含み得る。本発明の抗体をコードする遺伝子で上手く形質転換された細胞は、例えば、共送達される選択マーカーによって付与される薬剤耐性のために生残する。１つの例は、形質転換体がメトトレキサートの存在下で培養されるＤＨＦＲ選択マーカーである。細胞を漸増量のメトトレキサートの存在下で培養して、対象とする外因性遺伝子のコピー数を増幅させることができる。ＣＨＯ細胞は、ＤＨＦＲ選択に特に有用な細胞株である。さらなる例としては、グルタミン酸シンセターゼ発現系（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ）がある。酵母で使用するための選択遺伝子の一例はｔｒｐ１遺伝子である、Stinchcomb et al. (1979) Nature 282: 38参照。
【００２６】
プロモーター
本発明の抗体を発現させるために好適なプロモーターは、抗体をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドに機能的に連結される。原核生物宿主のためのプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファンおよびハイブリッドプロモーター、例えばＴａｃが含まれる。酵母細胞における発現に好適なプロモーターとしては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼおよびグルコキナーゼが含まれる。誘導酵母プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、メタロチオネインおよび窒素代謝またはマルトース／ガラクトース利用を担う酵素が含まれる。
【００２７】
哺乳類細胞系における発現のためのプロモーターとしては、ウイルスプロモーター、例えば、ポリオーマ、鶏痘およびアデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（特に、前初期遺伝子プロモーター）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターおよび初期もしくは後期シミアンウイルス４０が含まれる。当然のことながら、プロモーターの選択は、発現に使用する宿主細胞との好適な適合性に基づく。第１のプラスミドは、ＲＳＶおよび／またはＳＶ４０および／またはＣＭＶプロモーター、軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡ、ネオマイシンおよびアンピシリン耐性選択マーカーを伴うκＣ領域を含んでなってよく、第２のプラスミドは、ＲＳＶまたはＳＶ４０プロモーター、重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡ、γ１定常領域をコードするＤＮＡ、ＤＨＦＲおよびアンピシリン耐性マーカーを含んでなる。
【００２８】
エンハンサーエレメント
適当であれば、例えば、高等真核生物での発現のためには、ベクター内のプロモーターエレメントに機能的に連結されたエンハンサーエレメントが使用可能である。哺乳類エンハンサー配列としては、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテインおよびインスリン由来のエンハンサーエレメントが含まれる。あるいは、真核(eukaryotic)細胞ウイルス由来のエンハンサーエレメント、例えば、ＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０に存在）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー(polyma enhancer)、バキュロウイルスエンハンサーまたはネズミＩｇＧ２ａ遺伝子座を使用してもよい（ＷＯ０４／００９８２３参照）。エンハンサーは、ベクター上のプロモーターに対して上流の部位に位置してよい。あるいは、エンハンサーは他所、例えば、非翻訳領域内またはポリアデニル化シグナルの下流に位置してもよい。エンハンサーの選択および位置は、発現に使用する宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
【００２９】
ポリアデニル化／終結
真核生物系では、ポリアデニル化シグナルは、抗体をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドに機能的に連結される。このようなシグナルは一般に、オープンリーディングフレームの３’側に位置する。哺乳類系では、限定されない例として、成長ホルモン、伸長因子−１αおよびウイルス（例えば、ＳＶ４０）遺伝子またはレトロウイルス長末端反復配列に由来するシグナルが挙げられる。酵母系では、ポリアデニル化(polydenylation)／終結シグナルの限定されない例としては、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子およびアルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ）遺伝子に由来するものが挙げられる。原核生物系では、ポリアデニル化シグナルは一般に必要とされないが、代わりに、より短く、より良く定義されたターミネーター配列を使用するのが通例である。ポリアデニル化／終結配列の選択は、発現に使用する宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
【００３０】
収率を上げるための他の方法／エレメント
上記に加え、収率を挙げるために使用可能な他の特徴としては、クロマチン再構成エレメント、イントロンおよび宿主細胞特異的コドン改変が含まれる。
【００３１】
宿主細胞
抗体をコードするベクターをクローニングするまたは発現させるための好適な宿主細胞は、原核(prokaryotic)細胞、酵母または高等真核細胞である。好適な原核細胞としては、真正細菌、例えば、腸内細菌科、例えば、大腸菌属(Escherichia)、例えば、大腸菌(E. coli)（例えば、ＡＴＣＣ ３１，４４６；３１，５３７；２７，３２５）、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルウィニア属(Erwinia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、プロテウス属(Proteus)、サルモネラ菌属(Salmonella)（例えば、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)）、セラチア属(Serratia)（例えば、セラチア・マルセスカンス(Serratia marcescans)）および赤痢菌属(Shigella)ならびにバチルス属(Bacilli)（例えば、枯草菌(B. subtilis)およびＢ．リケニフォルミス(B. licheniformis)（ＤＤ  ２６６  ７１０参照））、シュードモナス属(Pseudomonas)（例えば、緑膿菌(P. aeruginosa)）および放線菌属(Streptomyces)が含まれる。酵母宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)（例えば、ＡＴＣＣ１６，０４５；１２，４２４；２４１７８；５６，５００）、ヤロウイア属(yarrowia)（ＥＰ４０２，２２６）、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)（ＥＰ  １８３  ０７０、Peng et al. (2004) J. Biotechnol. 108: 185-192も参照）、カンジダ属(Candida)、トリコデルマ・リーシア(Trichoderma reesia)（ＥＰ  ２４４  ２３４）、ペニシリン属(Penicillin)、トリポクラジウム属(Tolypocladium)およびアスペルギルス属(Aspergillus)宿主（例えば、Ａ．ニジュランス(A. nidulans)およびＡ．ニガー(A.niger)）も企図される。
【００３２】
高等真核生物宿主細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ヒト胎児腎臓株２９３、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ．１６３２）、ＢＨＫ５７０（ＡＴＣＣ  ＮＯ：ＣＲＬ  １０３１４）、２９３（ＡＴＣＣ  ＮＯ．ＣＲＬ  １５７３）、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣ  ＮＯ：ＣＣＬ  ６１）、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞株、例えば、ＤＧ４４（Urlaub et al. (1986) Somatic Cell Mol. Genet.12: 555-556参照）、特に、懸濁培養に適応したＣＨＯ細胞株、マウスセルトリ細胞、サル腎臓細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ＨＥＬＡ細胞、イヌ腎臓細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、ヒト肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、Ｈｅｐ  Ｇ２および骨髄腫またはリンパ腫細胞、例えば、ＮＳ０（ＵＳ  ５，８０７，７１５参照）、Ｓｐ２／０、Ｙ０が含まれる。
【００３３】
このような宿主細胞はまた、抗体の品質、機能および／または収率を変更するようにさらに操作または適合させてもよい。限定されない例として、特定の修飾（例えばグリコシル化）酵素およびタンパク質フォールディングシャペロンの発現が挙げられる。
【００３４】
細胞培養法
抗体をコードするベクターで形質転換された宿主細胞は、当業者に公知のいずれの方法によって培養してもよい。宿主細胞は、スピナーフラスコ、回転びんまたは中空繊維システムで培養可能であるが、大規模生産の場合、特に懸濁培養には撹拌タンク反応槽が使用される。撹拌タンカーは、例えばスパージャー、バッフルまたは低剪断翼を用いて曝気に適合させることができる。気泡塔およびエアリフトリアクターには、空気または酸素気泡による直接曝気が使用可能である。宿主細胞を無血清培養培地で培養する場合には、曝気プロセスの結果としての細胞損傷を避ける助けとするために、培地にプルロニックＦ−６８などの細胞保護剤を添加する。宿主細胞の特徴に応じて、足場依存性細胞株には増殖基質として微小担体を使用してもよく、または細胞を懸濁培養に適応させてもよい（これが典型的である）。宿主細胞、特に、無脊椎動物宿主細胞の培養には、流加、反復回分法(repeated batch processing)（Drapeau et al. (1994) Cytotechnology 15: 103-109参照）、拡大回分法(extended batch process)または灌流培養などの様々な操作様式を利用可能である。組換え形質転換した哺乳類宿主細胞はウシ胎児血清（ＦＣＳ）などの血清含有培地で培養できるが、このような宿主細胞は、Keen et al. (1995) Cytotechnology 17: 153-163に開示されているような合成無血清培地、または必要であれば、グルコースなどのエネルギー源および組換えインスリンなどの合成増殖因子を添加した、ＰｒｏＣＨＯ−ＣＤＭまたはＵｌｔｒａＣＨＯ（商標）（Ｃａｍｂｒｅｘ  ＮＪ、ＵＳＡ）などの市販の培地で培養してもよい。宿主細胞の無血清培養は、そのような細胞が無血清条件で増殖するように順応されていることが必要であり得る。１つの順応アプローチは、それらの宿主細胞が無血清条件で順応することを学ぶように、その宿主細胞を血清含有培地で培養し、その培養培地の８０％を無血清培地に繰り返し交換することである（例えば、Scharfenberg et al. (1995) in Animal Cell Technology: Developments towards the 21st century (Beuvery et al. eds, 619-623, Kluwer Academic publishers)参照）。
【００３５】
培地中に分泌された抗体は、意図される使用に好適な精製度を提供するために、様々な技術を用いて回収および精製することができる。例えば、ヒト患者の処置を目的とする抗体の使用には、一般に、少なくとも９５％の純度、より一般には９８％または９９％またはそれを超える純度（粗培養培地に対して）が求められる。培養培地からの細胞残渣は、一般に、遠心分離とその後の、例えば精密濾過、限外濾過および／または深層濾過を用いた上清の清澄化工程を用いて除去される。透析およびゲル電気泳動およびクロマトグラフィー技術、例えば、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、アフィニティークロマトグラフィー（場合により、ポリヒスチジンなどのアフィニティータグシステムを含む）および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、ＵＳ５，４２９，７４６参照）などの様々な他の技術が使用可能である。抗体は、種々の清澄化工程の後にプロテインＡまたはＧアフィニティークロマトグラフィーを用いて捕捉することができる。続いて、イオン交換および／またはＨＡクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーおよび硫安沈殿などのさらなるクロマトグラフィー工程を行うことができる。また、種々のウイルス除去工程も使用可能である（例えば、例えばＤＶ−２０フィルターを用いるナノフィルトレーション）。これらの種々の工程の後、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ以上、または１００ｍｇ／ｍｌ以上の抗体を含んでなる精製された（例えば、モノクローナルな）調製物が得られる。このような調製物は凝集型の抗体を実質的に含まない。
【００３６】
抗体の発現に細菌系を使用してもよい。このようなフラグメントは、細胞内、周辺質内に局在させるか、または細胞外に分泌させることができる。不溶性タンパク質は当業者に公知の方法に従い、抽出して再折りたたみを行って活性型のタンパク質を形成することができる、Sanchez et al. (1999) J. Biotechnol. 72: 13-20；およびCupit et al. (1999) Lett Appl Microbiol 29: 273-277参照。
【００３７】
当業者は、抗体の生産時に、特に、使用する細胞株および抗体の特定のアミノ酸配列に応じて、翻訳後修飾が起こり得ることを認識するであろう。例えば、これには、特定のリーダー配列の切断、様々なグリコシル化パターンでの様々な糖部分の付加、脱アミド化、酸化、ジスルフィド結合のスクランブル化、異性化、Ｃ末端リシンクリッピング、およびＮ末端グルタミン環化が含まれ得る。本発明は、１以上の翻訳後修飾を受けた、または経た抗体の使用を包含する。
【００３８】
脱アミド化は、主として、アスパラギン（Ｎ）をおよそ３：１の比でイソアスパラギン酸およびアスパラギン酸（Ｄ）に変換する酵素反応である。程度ははるかに低いが、脱アミド化は同じ様式でグルタミン残基でも起こり得る。ＣＤＲ内での脱アミド化は分子の電荷に変化をもたらすが、一般に、抗原結合に変化をもたらさないし、ＰＫ／ＰＤにも影響を及ぼさない。
【００３９】
酸化は生産および保存中に（すなわち、酸化条件の存在下で）起こり、直接的には反応性酸素種により、または間接的には酸化ストレスの二次的副産物との反応により誘導されるタンパク質の共有結合的修飾をもたらし得る。酸化は主としてメチオニン残基で起こるが、時にはトリプトファン残基および遊離システイン残基でも起こることがある。
【００４０】
ジスルフィド結合のスクランブル化は、生産中および基本保存条件で起こり得る。ある状況下では、ジスルフィド結合が切れたり不適切に形成されたりして不対合のシステイン残基（−ＳＨ）が生じ得る。これらの遊離（不対合）のスルフヒドリル（−ＳＨ）がシャッフリングを促し得る。
【００４１】
異性化は、一般に、生産、精製および保存中に（酸性ｐＨで）起こり、通常、化学的プロセスを経てアスパラギン酸がイソアスパラギン酸に変換される場合に起こる。
【００４２】
重鎖および／または軽鎖のＮ末端グルタミンは、ピログルタミン酸（ｐＧｌｕ）を形成しやすい。ほとんどのｐＧｌｕ形成は生産バイオリアクター内で起こるが、ｐＨおよび処理温度および保存条件によって非酵素的に形成される場合もある。ｐＧｌｕ形成は、組換えｍＡｂの主要な分解経路の１つと考えられる。
【００４３】
Ｃ末端リシンクリッピングは、カルボキシペプチダーゼにより触媒される酵素反応であり、組換えｍＡｂにおいて一般に見られる。このプロセスの変形として、一方または両方の重鎖からのリシンの除去が含まれる。リシンクリッピングは、生物活性に影響を及ぼさないようであり、ｍＡｂエフェクター機能に影響を持たない。
【００４４】
医薬組成物
本明細書に記載の本発明の抗体またはそれらのフラグメントの精製調製物は、本明細書に記載のヒト疾患、障害および病態の処置に使用するための医薬組成物に組み込むことができる。疾患、障害および病態という用語は、互換的に使用される。医薬製剤は、抗体を薬学上許容される担体と組み合わせて含んでなり得る。本抗体は単独で、または医薬組成物の一部として投与することができる。
【００４５】
一般に、このような組成物は、許容される製薬技術によって知られ、要求される薬学上許容される担体を含んでなる、例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 第16版 (1980) Mack Publishing Co参照。このような担体の例としては、場合により好適なバッファーで５〜８の範囲内のｐＨに緩衝された、生理食塩水、リンゲル溶液またはデキストロース溶液などの無菌担体が挙げられる。
【００４６】
医薬組成物は、注射または持続注入（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内または門脈内）によって投与することができる。このような組成物は目に見える粒状物質を含まないことが適切である。医薬組成物はまた、特にＣＰＨＰＣを含有するものは経口投与してもよい。
【００４７】
医薬組成物は、１ｍｇ〜１０ｇの間の抗体、例えば５ｍｇ〜１ｇの間の抗体を含んでなり得る。あるいは、組成物は、５ｍｇ〜５００ｍｇの間、例えば５ｍｇ〜５０ｍｇの間で含んでなり得る。
【００４８】
このような医薬組成物の調製方法は当業者に周知である。医薬組成物は、１ｍｇ〜１０ｇの間の抗体を単位投与形で、場合により使用説明書とともに含んでなり得る。医薬組成物は、周知の方法に従って、または当業者に自明の方法に従って、投与前の再構成のために凍結乾燥（フリーズドライ）されてもよい。抗体がＩｇＧ１アイソタイプを有する場合には、このアイソタイプの抗体の、銅により媒介される分解の程度を軽減するために、医薬組成物にクエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）またはＥＤＴＡまたはヒスチジンなどの銅キレーターを加えることができる、ＥＰ０６１２２５１参照。医薬組成物はまた、アルギニン塩基などの可溶化剤、ポリソルベート８０などの界面活性剤／抗凝集剤、およびバイアルのヘッドスペースの酸素と置き換えるための窒素などの不活性ガスも含んでなり得る。
【００４９】
本抗体を投与するための有効用量および処置計画は一般に経験的に決定され、患者の年齢、体重および健康状態、ならびに処置される疾患または障害などの因子に依存し得る。このような因子は担当の医師の裁量内である。適当な用量を選択する上での指針は、例えば、Smith et al (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New Yorkに見出すことができる。
【００５０】
対象に投与される抗体の容量は、一般に、１μｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇの間、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間、０．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの間、１〜２５ｍｇ／ｋｇの間または１〜１０ｍｇ／ｋｇ対象体重の間である。例えば、用量は、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、または６０ｍｇ／ｋｇであり得る。本抗体は、非経口投与、例えば、皮下、静脈内または筋肉内投与することができる。
【００５１】
所望により、治療組成物の有効一日用量は、場合により単位投与形で、１日のうちに適当な間隔で別個に投与される２、３、４、５、６またはそれを超える分割用量として投与されてもよい。
【００５２】
本抗体は、単一の大用量でまたはそれより少量の反復用量で投与してもよい。
【００５３】
用量の投与は、２〜２４時間、例えば、２〜１２時間、または２〜６時間にわたる緩慢な持続注入によってもよい。これは毒性副作用の軽減をもたらし得る。
【００５４】
用量の投与は、必要に応じて１回以上、例えば、１日３回、毎日１回、２日に１回、１週間に１回、２週間に１回、１か月に１回、３か月に１回、６か月に１回、または１２か月に１回、繰り返すことができる。本抗体は、維持療法により、例えば、１週間に１回、６か月以上の期間投与することができる。本抗体は、間欠療法により、例えば、３〜６か月間投与し、その後、３〜６か月間投与を行わず、その後、再び３〜６か月間抗体を投与するなどのサイクルで投与してもよい。
【００５５】
例えば、この用量は、１４または２８日毎に１回、各投与日に複数の分割用量の形態で、皮下投与してもよい。
【００５６】
従って、投与は、予め決定されたまたは慣例の投与スケジュールを用いてもよく、それにより、予め決定された指定の、用量投与間の期間が得られる。このスケジュールは、そのスケジュールが予め決定されている限り、同じ長さの、または異なる長さの期間を包含してよい。適当なスケジュールが特定の日に投与を含むことが前もって決定されている限り、いずれの特定の組合せもそのスケジュールに包含される。
【００５７】
医薬組成物は、他の薬剤を伴う本抗体のパーツキットを、場合により使用説明書とともに含んでなり得る。便宜のため、このキットは所定の量の試薬を使用説明書とともに含んでなり得る。
【００５８】
処置は治療的、予防的または防止的であり得る。対象はそれを必要とする者である。処置を必要とする者は、特定の医学的疾患にすでに罹患している個体ならびに将来にその疾患を発症する可能性のある個体を含み得る。
【００５９】
本明細書に記載の抗体はまた、療法の方法においても使用可能である。「療法」という用語は、疾患の少なくとも１つの側面または症状の緩和、軽減、または防止を包含する。例えば、本明細書に記載の抗体は、本明細書に記載の疾患の１以上の側面または症状を改善または軽減するために使用可能である。
【００６０】
本明細書に記載の抗体は、治療的、予防的または防止的処置に有効な量で使用される。本明細書に記載の抗体の治療上有効な量は、その疾患の１以上の側面または症状を改善または軽減するために有効な量である。本明細書に記載の抗体はまた、本明細書に記載の疾患を治療する、予防する、または治癒させるために使用され得る。
【００６１】
本明細書に記載の抗体は、完全な治癒に作用する必要はなく、または疾患の総ての症状または発現を根絶して、実行可能な治療的処置を打ち立てる必要はない。関連分野で認識されるように、治療薬として使用される薬物は、所与の病状の重篤度を軽減し得るが、有用な治療薬と見なされるために、その疾患の総ての発現を無くす必要はない。同様に、予防的に投与される処置は、実行可能な予防薬を打ち立てるために、疾患の発症の防止に完全な効果がある必要はない。単に、疾患の影響を軽減すること（例えば、その症状の数もしくは重篤度を軽減することによるか、または別の処置の有効性を高めることによるか、または別の有益な効果をもたらすことによる）、あるいは対象においてその疾患が起こる（例えば、その疾患の発症を遅延させることによる）または増悪する尤度を引き下げることで十分である。
【００６２】
使用の診断法
本明細書に記載の抗体は、１以上の抗体、検出可能な標識およびそのキットの使用説明書を含んでなる診断キットとして提供することができる。便宜のため、本キットは、所定の試薬を使用説明書とともに含んでなり得る。
【００６３】
一実施形態において、本発明は、単一の宿主細胞で抗体を生産するための方法であって、
（ｉ）前記単一宿主細胞を、配列番号４または５のポリペプチドを含んでなる重鎖をコードする第１のＤＮＡ配列、および配列番号２のポリペプチドを含んでなる軽鎖をコードする第２のＤＮＡ配列で形質転換する工程；および
（ｉｉ）前記の形質転換された単一宿主細胞内で、前記第１のＤＮＡ配列および前記第２のＤＮＡ配列を発現させて前記抗体重鎖および軽鎖を生産する工程
を含んでなる方法に関する。
【００６４】
さらに、この方法は、前記第１および第２のＤＮＡ配列が異なるベクターに存在するように、または前記第１および第２のＤＮＡ配列が単一のベクターに存在するように行うことができる。
【実施例】
【００６５】
実験詳細
実施例１（図１）
健常ヒト被験者からの血液をヘパリンナトリウム管に採取した（インフォームド・コンセントを伴う）。各データ点について、８０μｌの全血を適当な濃度（終濃度の１０倍）のＰａｎＥＬＲ抗体１０μｌを含有するポリプロピレン管にピペットで取り、十分に混合し、加湿インキュベーター内で３７℃にて２０分間インキュベートした。各管にさらに１０μｌのビヒクル（ＰＢＳ）を加え、十分に混合した後、管をインキュベーターに戻し、さらに６０分間置いた。１ｍｌの固定／溶解バッファーの添加により反応を停止させ、３７℃でさらに１０分間インキュベートした後、遠心分離（５００ｘｇ、１０分間）により白血球を回収し、２ｍｌ  ＰＢＳで洗浄し、ヒトＣＤ１６に対する抗体（ＦＩＴＣ標識）およびＣＤ１１ｂに対する抗体（ＰＥ−Ｃｙ７標識）で４５分間染色し、さらに２ｍｌのＰＢＳで洗浄し、最後に、３００μｌのＰＢＳに懸濁させた後、ＢＤ  ＦＡＣＳＣＡＮＴＯ  ＩＩフローサイトメーターにて分析を行った。各データ点について、合計２０，０００〜５０，０００イベントをキャプチャーした。好中球ＣＤ１１ｂ発現は、高レベルのＣＤ１６を発現する（ＦＩＴＣチャネルを用いたゲート設定−図１Ｂ）白血球におけるＰＥ−Ｃｙ７平均蛍光強度（前方散乱／側方散乱プロファイル上でのゲート設定−図１Ａ）として定量した。グラフ表示のために、データは総て、ベースライン（すなわち、ビヒクルのみで２０＋６０分間インキュベートした全血中の好中球ＣＤ１１ｂ  ＭＦＩ）に対する増加倍率として表した（図２および３の通り）。
【００６６】
実施例２（図２）
全血を、示された濃度の抗体で８０分間処理した。全血を固定／溶解し、白血球をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１６およびＰＥ−Ｃｙ７標識抗ＣＤ１１ｂで染色した後、好中球（高ＣＤ１６発現に関してゲート設定）において、好中球ＣＤ１１ｂをフローサイトメトリーによりベースライン（ビヒクルで８０分間処理した血液）に対するＰＥ−Ｃｙ７  ＭＦＩの変化倍率として評価した。バーは平均＋／−ＳＥＭ（ｎ＝６）；対応のあるｔ検定による確立を示す。
【００６７】
実施例３（図３）
全血を、示された濃度の抗体で８０分間処理した。全血を固定／溶解し、白血球をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１６およびＰＥ−Ｃｙ７標識抗ＣＤ１１ｂで染色した後、好中球（高ＣＤ１６発現に関してゲート設定）において、好中球ＣＤ１１ｂをフローサイトメトリーによりベースライン（ビヒクルで８０分間処理した血液）に対するＰＥ−Ｃｙ７  ＭＦＩの変化倍率として評価した。バーは平均＋／−ＳＥＭ（ｎ＝６）；対応のあるｔ検定による確立を示す。
【図１（Ａ）】
2015517468.tif 000003
【図１（Ｂ）】
2015517468.tif 000004
【図２】
2015517468.tif 000005
【図３】
2015517468.tif 000006
【配列表】
2015517468000001.app
【国際調査報告】
2015517468.tif 000007
2015517468.tif 000008