(57)【要約】  金属アフィニティー官能基としてはたらく第１の表面結合リガンドを有する第１の基質と、第２の基質上に任意に設けられ、前記第１の基質の前記金属アフィニティー官能基のそれとは逆の電荷をもつ凝集物をもつ第２の表面結合リガンドを有する第２の基質と、を含み、前記第１の表面結合リガンドと前記第２の表面結合リガンドは、前記タンパク質製剤が前記第１及び第２の表面結合リガンドの両方に同時に接触するように配置される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属アフィニティー官能基としてはたらく第１の表面結合リガンドを有する第１の基質と、第２の基質上に任意に設けられ、前記第１の基質の前記金属アフィニティー官能基のそれとは逆の電荷をもつ凝集物をもつ第２の表面結合リガンドを有する第２の基質と、を有し、
前記第１の表面結合リガンドと前記第２の表面結合リガンドは、前記タンパク質製剤が前記第１及び第２の表面結合リガンドの両方に同時に接触するように配置される、ことを特徴とするタンパク質製剤の凝集物含量を低減する組成物。
【請求項２】
前記第１の表面結合リガンドまたは前記第２の表面結合リガンド、またはこれらの両方は、多座配位の金属キレート部分を有することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記第２の表面結合リガンドは、前記金属アフィニティー官能基として機能することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記第１の表面結合リガンドは、負の電荷をもつ凝集物を有することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記第１の基質はそれに結合した付加的なケミカル部分を有し、前記第１の基質の凝集チャージに負の電荷の残留が提供されることを特徴とする請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記第１の表面結合リガンドは、負の電荷を帯びたものであり、イミノ二酢酸（ 2-(カルホ゛キシメチルアミト゛)酢酸）、エチレングリコール（アミノエチルエーテル）二酢酸、ニトリロ酢酸（ 2,2’,2”-ニトリロ三酢酸）、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択されたものであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記第２の表面結合リガンドは、トリ（ 2-アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレニミン・テトラアミン、またはデスフェロキサミンのいずれかであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記第１の表面結合リガンドは、イミノ二酢酸（ 2-(カルホ゛キシメチルアミト゛)酢酸）であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記第１の表面結合リガンドは、正の電荷を帯びた凝集帯電を有することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記第１の基質はそれに結合した付加的なケミカル部分を有し、前記第１の基質の凝集チャージに負の電荷の残留が提供されることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
前記第１の表面結合リガンドは、トリ（ 2-アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレニミン・テトラアミン、またはデスフェリオキサミンのいずれかであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１の基質または前記任意の第２の基質のうちの少なくとも一方には、１つ又はそれ以上の更なる表面結合リガンドが前記第１の表面結合リガンドおよび前記第２の表面結合リガンドにさらに付加されることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
前記第１の基質、または前記第２の基質、または前記第１及び第２の基質の両方は、１つ又はそれ以上の逆の電荷に帯電する群と結合して負の電荷に帯電した１つ以上の金属キレート群を有することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
前記第１の基質、または前記第２の基質、または前記第１及び第２の基質の両方は、逆の電荷に帯電する群と結合して正の電荷に帯電した１つ以上の金属キレート群を有することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
前記第１の表面結合リガンドおよび前記第２の表面結合リガンドは、前記第１の基質に供給結合していることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１６】
前記第１の表面結合リガンドは前記第１の基質に共有結合し、前記第２の表面結合リガンドは前記第１の基質とは異なる前記第２の基質に共有結合していることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１７】
前記第１の基質、または前記第２の基質、または前記第１及び第２の基質の両方は、粒子を有することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１８】
前記粒子は非多孔質であることを特徴とする請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
前記粒子は多孔質であることを特徴とする請求項１７記載の組成物。
【請求項２０】
前記粒子は、タンパク質製剤中にタンパク質の進入を許容するのに十分に大きいサイズの孔を有することを特徴とする請求項１７記載の組成物。
【請求項２１】
前記粒子は、タンパク質製剤中にタンパク質の進入を許容するのに十分に小さいサイズの孔も有することを特徴とする請求項１７記載の組成物。
【請求項２２】
前記粒子は、約１０ｎｍから約１００ｎｍまでの間の平均孔サイズを有することを特徴とする請求項１９記載の組成物。
【請求項２３】
前記粒子は、約１０ｎｍ未満の平均孔サイズを有することを特徴とする請求項１９記載の組成物。
【請求項２４】
前記粒子は、約１００ｎｍを超える平均孔サイズを有することを特徴とする請求項１９記載の組成物。
【請求項２５】
前記第１の基質、または前記第２の基質、または前記第１及び第２の基質の両方は、メンブレンまたはモノリスを有することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項２６】
前記第１の基質、または前記第２の基質、または前記第１及び第２の基質の両方は、固体または多孔質壁の中空ファイバを有することを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１乃至２６のいずれか１項記載の組成物を有する装置であって、クロマトグラフィーに任意に用いられることを特徴とする装置。
【請求項２８】
請求項１乃至２６のいずれか１項記載の前記組成物と前記１つ又はそれ以上の更なる基質とが前記タンパク質製剤に対して任意の順序で連続的に接触させることが可能であり、前記１つ又はそれ以上の更なる基質は、負の電荷、正の電荷、中性の電荷、およびこれらの組み合わせのなかから選択されるチャージを有する１つ又はそれ以上の更なる表面結合リガンドを有するものであることを特徴とする請求項２７記載の装置。
【請求項２９】
前記第１の基質、前記任意の第２の基質、前記１つ又はそれ以上の更なる基質、およびそれらの組み合わせがパックされたクロマトグラフィー装置であることを特徴とする請求項２７または２８のいずれか１項記載の装置。
【請求項３０】
装置入口の組成物が装置出口の組成物とは異なることを特徴とする請求項２７乃至２９のいずれか１項記載の装置。
【請求項３１】
１つ又はそれ以上の装置構成部品のケミカル表面が、実質的に不活性であるか、または、装置の化学官能性に対して重大な貢献をしない程度に十分に低面積であることを特徴とする請求項２７乃至３０のいずれか１項記載の装置。
【請求項３２】
前記１つ又はそれ以上の装置構成部品のケミカル表面は、(1)構造的完全性をつくり出す、(2)それを通して液の流れを向かせる、(3)装置の効果的な使用を阻害するそれらを防ぐためにタンパク質製剤中の不溶性材料を物理的にブロックするか、またはトラップするか、または随伴するか、のうちの１つ又はそれ以上を可能にすることを特徴とする請求項２７乃至３１のいずれか１項記載の装置。
【請求項３３】
１つ又はそれ以上の多孔質メンブレンを有し、前記１つ又はそれ以上の多孔質メンブレンのうちの少なくとも１つは前記第１の表面結合リガンドまたは前記第２の表面結合リガンドのいずれかに結合されている前記第１の基質であることを特徴とする請求項２７乃至３２のいずれか１項記載の装置。
【請求項３４】
前記第１の基質、または前記任意の第２の基質、または前記第１及び第２の基質の両方は、パーマネント短繊維マットを有することを特徴とする請求項２７乃至３２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３５】
前記第１の基質、または前記任意の第２の基質、または前記第１及び第２の基質の両方は、規則巻き糸（オーダード・ワウンド）、織物、または不織布繊維構造を有することを特徴とする請求項２７乃至３２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３６】
前記第１の基質、または前記任意の第２の基質、または前記第１及び第２の基質の両方は、パーマネント短繊維マットおよび規則巻き糸（オーダード・ワウンド）、織物、または不織布繊維構造の組み合わせを有することを特徴とする請求項２７乃至３２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３７】
中空の多孔質壁繊維または非多孔質繊維からなり、かつ、前記第１の表面結合リガンド及び前記第２の表面結合リガンドに結合される前記第１の基質である多孔質細網繊維を有することを特徴とする請求項２７乃至３２のいずれか１項記載の装置。
【請求項３８】
多孔質メンブレンまたはモノリスの間に挟まれた多孔質または非多孔質の粒子を有することを特徴とする請求項２７乃至３２のいずれか１項記載の装置。
【請求項３９】
多孔質または非多孔質の粒子は前記第１の表面結合リガンドまたは前記第２の表面結合リガンドのいずれかに結合された前記第１の基質であり、メンブレンまたはモノリスは前記第１の表面結合リガンドおよび前記第２の表面結合リガンド以外の他の第２の基質であることを特徴とする請求項２７乃至３２のいずれか１項記載の装置。
【請求項４０】
多孔質または非多孔質の粒子は、織物またはアモルファス繊維フィルタの間に挟まれているか、または繊維基質のなかに埋め込まれていることを特徴とする請求項２７乃至３２のいずれか１項記載の装置。
【請求項４１】
粒子は前記第１の表面結合リガンドまたは前記第２の表面結合リガンドのいずれかに結合される前記第１の基質または前記第２の基質を有し、繊維フィルタは前記第１及び第２の表面結合リガンド以外の他の表面結合リガンドに結合される前記第２の基質を有することを特徴とする請求項２７乃至３２のいずれか１項記載の装置。
【請求項４２】
織物または結晶性フリットの間に挟まれた多孔質または非多孔質の粒子を有することを特徴とする請求項２７乃至３２のいずれか１項記載の装置。
【請求項４３】
前記多孔質または非多孔質の粒子は前記第１の表面結合リガンドまたは前記第２の表面結合リガンドのいずれかに結合される前記第１の基質であり、前記織物または結晶性フリットは前記第１及び第２の表面結合リガンド以外の他の表面結合リガンドに結合される前記第２の基質であることを特徴とする請求項２７乃至３２のいずれか１項記載の装置。
【請求項４４】
網状ポリマー組織のなかに埋め込まれた多孔質または非多孔質の粒子を有することを特徴とする請求項２７乃至３２のいずれか１項記載の装置。
【請求項４５】
前記第１の基質および前記第２の基質は、請求項２７〜４４に挙げられた形態のいずれかの組み合わせを有することを特徴とする請求項２７乃至４４のいずれか１項記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の精製、とくに抗体精製用の材料に関する。中でもとくに、凝集物の含量を低減するための材料に係り、とくにヌクレオソーム、ヒストンおよびDNAなどのような宿主細胞クロマチン残留物を含む凝集物を低減する材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
宿主細胞に由来する汚染物質と試験管内細胞培養法により生成された遺伝子組み換えタンパク質との間に非天然のヘテロ凝集物が自然発生的に形成されることが示されている（シュクラ他,バイオテクノロジー・プログラム(2008)24:1115-1121;ルアース他,J.クロマトグラフィー.B(2009)877:1543-1552;メチェットナー他,J.クロマトグラフィ.B(2011)879:2583-2594; ガグノン,バイオプロセッシングJ.(2010)9(4):14-24）。これらのヘテロ凝集物は、次の２つの点で自然界に存在しない非天然物であると考えられる。その２点とは、1)人以外の宿主細胞が死んで溶解した場合に、培養基内において生き延びた人以外の宿主細胞が隠れているか又は培養基内に人以外の宿主細胞が放出されることにより、構成汚染物質がしばしば人間以外を起源としていること。生きている人体内には人間以外の構成汚染物質は存在しない。2) 死んだ細胞が迅速に取り除かれる人の生体内システムに比べて構成汚染物質が高濃度に蓄積されること、である。このため、遺伝子組み換え物では、通常は生体システム内では起こり得ない濃度で強い相互作用的な高レベルの汚染が現われる。その一方で、同時に、遺伝子組み換えタンパク質の汚染の高発現レベルは、これら人以外の非人間の汚染に関連する非特異性に基質を適合できるようにする。
【０００３】
ヘテロ凝集物の夾雑タンパク質の含量は、夾雑タンパク質を直接ターゲットとすることによりある程度の範囲にされるばかりでなく（シュクラ他とガグノン他を参照）、夾雑タンパク質について責任ある対応DNA成分をターゲットとすることにより間接的にある程度の範囲にされている（ルアース他とガグノンを参照）。ある錯体を解離したときに、抗体凝集レベルの減少が示されている（シュクラ他、メチェットナー他、およびガグノンを参照）。抗体汚染錯体のレベルを低減する陰イオン交換能力は開示されているが（ルアース他とガグノン他を参照）、ヘテロ凝集物を完全に取り除くことができる陰イオン交換処理は未だ示されていない。
【０００４】
サイズ排除クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーは、ヘテロ凝集物を低減しようとするのに試しに用いてみたが、これらのクロマトグラフィー法は一般的に陰イオン交換よりも優れていた（ガグノン他を参照）。
【０００５】
抗体と関連して安定的に形成する汚染物質の特定の発生源はこれまでにまったく知られていない（例えばシュクラ他を参照）。他の可能性のある汚染物質の特定の発生源にはほとんど注意を払わないでDNA汚染物質に着目したいくつかの取り組みがなされている（ガグノン他およびガグノンを参照）。クロマチン異化生成物を有する汚染物質にとくに注目した抗体製剤中の凝集物に随伴される宿主汚染要因物(host contaminants)に関連することを示すことのいくつかの努力がなされている（ルアース他とメチェットナー他を参照）。これらの例において、凝集物は、ヒストンおよびDNAのようなクロマチン異化生成物のための抗体の免疫特異性を直接通して仲介されてもよい。クロマチン異化生成物は、非特異的相互作用を介して抗体に安定な錯体を形成する能力もある。このように、クロマチン異化生成物を含まない抗体のための周知の免疫特異性をもつモノクローナル抗体は、死んだ宿主細胞の核に由来するヌクレオソーム、ヒストン、およびDNAに伴う多様な記述の凝集物を高安定性に形成することができる。クロマチン異化生成物が高分子(HMW)凝集物のなかに高率で表われることがとくに示されてきた。HMW凝集物は、セラピー中和抗体の形成促進の関与の疑いがあるために特に関心事となっている。HMW凝集物は、関心の対象となっている抗体の小さな倍数より大きいサイズの凝集物として一般に定義されている。例えば、2-抗体アソシエーションはHMW凝集物を考えられないし、ほとんどの4-抗体凝集物でもHMW凝集物を考えられない。しかし、約8か約10に相当するもっと大きいサイズの凝集物は、HMW凝集物として一般に分類され得る。
【０００６】
ヘテロ凝集物を分離することが期待されるエージェントで抗体製剤を処理することは、一般的に効果がないことが証明されている。例えば、尿素、塩、または尿素と塩の２つの組合せを高濃度で用いたとしても、免疫グロブリンＭ−汚染へテロ凝集物を実質的に分離できない（ガグノン他を参照）。尿素、アルコール、および界面活性剤の溶出前ウォッシュを行うタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーでは、タンパク質Ｇアフィニティークロマトグラフィーを尿素、塩、およびＥＤＴＡと組合せる溶出前ウォッシュで行われるように（メチェットナー他を参照）、ウォッシュ無しの場合よりもさらに効果的にヘテロ凝集物レベルを低減することが示されている（シュクラ他を参照）。尿素を溶出前ウォッシュするアニオン交換クロマトグラフィーでは、尿素をウォッシュしない場合よりもさらに効果的にヘテロ凝集物を低減することが示されている（ガグノン他を参照）。カチオン交換クロマトグラフィーでは、ウォッシュ無しの場合よりも溶出前ＥＤＴＡを行うほうがさらに効果的にヘテロ凝集物を低減することが示されている（ガグノン他を参照）。最後に、尿素及び／又は塩の溶出前ウォッシュを行うヒドロキシアパタイトでも、ウォッシュを行わない場合よりもさらに効果的にヘテロ凝集物を低減される（ガグノンを参照）。これらの知見があるにもかかわらず、一般に、クロマトグラフィーカラムに結合された抗体の溶出前ウォッシュにおいてエージェントの分離への使用が適度に成功している。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、抗体製剤中の凝集物濃度の低減を含み、タンパク質の精製のための組成物及び装置に係る実施の形態を提供する。ある実施の形態では、本発明の組成物はヌクレオソーム及び／又はヒストン及び／又はDNAのようなクロマチン残留物を含む凝集物の含量を特に低減する。また、ある実施の形態では、タンパク質製剤の凝集物含量を低減する組成物は、金属アフィニティー官能基としてはたらく第１の表面結合リガンドを有する第１の基質と、第２の基質上に任意に設けられ、前記第１の基質の前記金属アフィニティー官能基のそれとは逆の電荷をもつ凝集物をもつ第２の表面結合リガンドを有する第２の基質と、を含み、前記第１の表面結合リガンドと前記第２の表面結合リガンドは、前記タンパク質製剤が前記第１及び第２の表面結合リガンドの両方に同時に接触するように配置される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、アラントイン-エタクリジン・バッチ粒子処理を対象とした免疫グロブリンＭ-529の精製において、示した時間間隔でサンプリングしたサイズ交換クロマトグラフィー（SEC）プロファイルの経時変化プロットを示す図である。但し、Aggrは凝集物、HCPは宿主細胞タンパク質、実線は280 nm、破線は254 nm、倍率はすべてセンターパネルと同じである。
【図２Ａ】図２Ａは、細胞培養上澄み液（CCS）をろ過した免疫グロブリンＭ-84のSECプロファイルを示す図である。但し、Aggrは凝集物、HMWは高分子重量凝集物、HCPは宿主細胞タンパク質、LMWは低分子重量細胞培地成分、実線は280 nm、破線は254 nmである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、アラントイン-エタクリジン及びカラムに処理液を通流させた後の図２ＡのCCSをろ過した免疫グロブリンＭ-84のSECプロファイルを示す図である。但し、Aggrは凝集物、HCPは宿主細胞タンパク質、実線は280 nm、破線は254 nmである。
【図３】図３は、アラントイン-エタクリジン及びカラムに処理液を通流させる前（左図）と後（右図）との単クローン抗体IgG HER2 CCSのSECプロファイルを示す図である。但し、Aggrは凝集物、HCPは宿主細胞タンパク質、LMWは低分子重量細胞培地成分、LCはＬ鎖、実線は280 nm、破線は254 nmである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の実施の形態に係る組成物は、負の電荷の表面結合金属アフィニティーリガンド（第１の表面結合リガンド）に正の電荷の表面結合金属アフィニティーリガンド（第２の表面結合リガンド）を組合せたものとするか、または正の電荷の表面結合金属アフィニティーリガンド（第１の表面結合リガンド）に負の電荷の表面結合金属アフィニティーリガンド（第２の表面結合リガンド）を組合せたものとし、高分子重量成分（HMW）を実質的に低減する機能を有し、タンパク質製剤中の凝集物をより小さいサイズにする。ある実施の形態では、第１及び第２の表面結合リガンドは同一面上にある。また、ある実施の形態では、第１及び第２の表面結合リガンドは別々の離れた面上にあるものとしてもよい。また、ある実施の形態では、第１及び第２の表面結合リガンドを同一面上にするか及び／又は別々の離れた面上にするかのいずれにしてもよい。また、本発明のある実施の形態では、タンパク質製剤に加えることができる多価イオンおよび抗ウィルス化合物のような薬剤を取り除く追加能力を有していてもよい。
【００１０】
本発明の実施の形態は、タンパク質製剤中の凝集物レベルを低減するために２つ又はそれ以上の表面官能基の混合物を有する装置を提供し、少なくとも１つの表面が金属イオンと安定に配位結合を形成する能力をもつ金属アフィニティー官能基を有し、他の表面は金属アフィニティー官能基とは逆の正味荷電（net charge opposite）を有している。本発明の好ましい実施の形態では、負の電荷の金属アフィニティー官能基をもつ１つの表面を有する一方で、正の電荷の金属アフィニティー官能基をもつ他の表面を具象化する化合物を設けている。どちらの表面も、付加的な化学官能基を具象化するか又は付加的な化学官能基と組み合わせてもよいが、疎水性、Π-Π結合、水素結合、および金属アフィニティーに限定されるものではない。固体表面は、微粒子状、繊維状、多孔質膜状、またはモノリシック状のいずれの構造であってもよく、多様なマルチ構造タイプの組み合わせをも含むものである。装置は、負の電荷の表面と正の電荷の表面をもつ適用サンプルへの接触を同時に行う手段を有することができる。
【００１１】
本発明は、タンパク質精製のための組成物および装置が抗体製剤中の凝集物濃度の低減を含む実施の形態を提供する。ある実施の形態では、タンパク質製剤の凝集物成分を低減する組成物として、該組成物が金属アフィニティー官能基を保有する第１の表面結合リガンドと第１表面の金属アフィニティー官能基の電荷とは逆の凝集物電荷をもつ第２の表面結合リガンドとを含むものであり、前記第１及び第２の表面結合リガンドは、タンパク質製剤中のタンパク質が第１及び第２の表面結合リガンドの両方に同時に接触できるように位置決めされている実施の形態を提供する。
【００１２】
ある実施の形態では、第１の表面結合リガンドと第２の表面結合リガンドとは基質に対して相互に共有結合的に結合されている。第１及び第２の表面結合リガンドは、同一の基質に対して相互に共有結合的に結合されていてもよい。他の実施の形態では、第１の表面結合リガンドと第２の表面結合リガンドとは異なる基質に対して相互に共有結合的に結合されている。基質は粒子であってもよく、ある実施の形態では粒子は多孔質または非多孔質のいずれであってもよい。ある実施の形態では、基質はタンパク質製剤中のタンパク質が入り込むのに十分な大きさの孔を有する多孔質粒子である。他の実施の形態では、タンパク質製剤中のタンパク質の入り込みを許容することができないほど孔は小さくない。ある実施の形態では、基質は、約１０ｎｍおよび約１００ｎｍの間の、または約１０ｎｍ未満の、または約１００ｎｍ以上のいずれかの平均サイズの孔を有する多孔質粒子である。ある実施の形態では、基質は、メンブレン、モノリス、あるいは固体又は多孔質壁の繊維のいずれかである。ある実施の形態では、第１のケミカル部分が結合される基質は第２のケミカル部分が結合される基質と異なる種類である。例えば、一方の基質が粒子であり、他方の基質がモノリス、メンブレン、または繊維のいずれかであってもよい。
【００１３】
ある実施の形態では、第１の表面結合リガンドと第２の表面結合リガンドとが異なる。ある実施の形態では、第１の表面結合リガンドが多歯状の金属キレート部分である。ある実施の形態では、第１の表面結合リガンドが負の電荷の凝集物電荷を有する。ある実施の形態では、第２の表面結合リガンドが金属アフィニティー官能基を保有する。ある実施の形態では、第２の表面結合リガンドが多歯状の金属キレート部分である。
【００１４】
ある実施の形態では、第１の表面結合リガンドが正の電荷であり、その表面がそれに結合した付加的なケミカル部分を有し、その表面の凝集物チャージが正の電荷である。他の実施の形態では、第１の表面結合リガンドが負の電荷であり、その表面がそれに結合した付加的なケミカル部分を有し、その表面の凝集物チャージが負の電荷である。また、ある実施の形態では、基質の少なくとも１つが第１の表面結合リガンドまたは第２の表面結合リガンドのいずれかに付加される１つ又はそれ以上のケミカル部分を有する。そのような付加的なケミカル部分は、タンパク質製剤のタンパク質がもつ水素結合、疎水性相互作用、またはΠ-Π結合において共有する組成物の能力を高めるはたらきがある。
【００１５】
ある実施の形態では、第１の表面結合リガンドは、負の電荷であり、イミノ二酢酸（2-(カルボキシメチルアミノ)酢酸）、エチレングリコール（アミノエチルエーテル）二酢酸、ニトリロ三酢酸（2,2',2"-ニトリロ三酢酸）、アスパラギン酸、またはグルタミン酸のいずれかである。ある実施の形態では、第２の表面結合リガンドはトリス（2-アミノエチル）アミンである。また、ある実施の形態では、第１の表面結合リガンドがイミノ二酢酸（2-(カルボキシメチルアミノ)酢酸）であり、第２の表面結合リガンドがトリス（2-アミノエチル）アミンである。
【００１６】
ある実施の形態では、前述の実施の形態に記載した表面結合ケミカル部分は、物理的表面の統合の間においてポリマー構造のなかに直接含ませるようにしてもよいし、あるいはポリマーに直接含ませるようにしてもよい。
【００１７】
ある実施の形態では、本発明は、本発明の組成物を含むクロマトグラフィーを行う装置を提供する。ある実施の形態では、装置は、基質が充填されたクロマトグラフィーカラムであるか、または第１の表面結合リガンドおよび第２の表面結合リガンドに結合された基質が充填されたクロマトグラフィーカラムである。ある実施の形態では、装置は１つ又はそれ以上の多孔質メンブレンを収容しており、そのメンブレンの少なくとも１つは第１の表面結合リガンドおよび第２の表面結合リガンドに結合された基質である。ある実施の形態では、装置は繊維の網様体を収容しており、その繊維は、中空多孔質壁繊維または非多孔質繊維であり、かつ第１の表面結合リガンドおよび第２の表面結合リガンドに結合された基質である。
【００１８】
ある実施の形態では、装置は、多孔質メンブレンまたはモノリスの間に挟みこまれた多孔質または非多孔質の粒子を収容している。そのような実施の形態では、粒子は、第１の表面結合リガンドまたは第２の表面結合リガンドのいずれかに結合された基質である。また、メンブレンまたはモノリスは、第１の表面結合リガンドおよび第２の表面結合リガンド以外の他のものに結合された表面である。ある実施の形態では、装置は、織物またはアモルファス繊維フィルタの間に挟まれた多孔質または非多孔質の粒子を収容している。そのような実施の形態では、粒子は、第１の表面結合リガンドまたは第２の表面結合リガンドのいずれかに結合された基質である。また、繊維フィルタは、第１の表面結合リガンドおよび第２の表面結合リガンド以外の他のものに結合された表面である。ある実施の形態では、装置は結晶質フリットの間に挟まれた多孔質または非多孔質の粒子を収容している。そのような実施の形態では、粒子は、第１の表面結合リガンドまたは第２の表面結合リガンドのいずれかに結合された基質である。また、結晶質フリットは、第１の表面結合リガンドおよび第２の表面結合リガンド以外の他のものに結合された表面である。ある実施の形態では、装置は網状ポリマーネットワークのなかに埋設された多孔質または非多孔質の粒子を収容している。そのような実施の形態では、粒子は、第１の表面結合リガンドまたは第２の表面結合リガンドのいずれかに結合された基質である。また、網状ポリマーネットワークは、第１の表面結合リガンドおよび第２の表面結合リガンド以外の他のものに結合された表面である。ある実施の形態では、装置は第１の表面結合リガンドに結合された基質および第２の表面結合リガンドに結合された基質の両方を備えており、粒子はメンブレン、モノリス、網状ポリマーネットワーク、織物またはアモルファス繊維フィルタ、結晶質フリット、またはこれらを組合せたものの間に閉じ込められる。
【００１９】
ある実施の形態では、装置の１つまたはそれ以上の成分のケミカル表面は、装置の化学官能性に大きく寄与しないように比較的不活性にするか又は比較的低い面積にすることができる。そのような実施の形態では、比較的不活性であるかまたは比較的低面積であるケミカル表面は、装置の効果的な使用が阻害されるのを防ぐためにタンパク質製剤のなかにおいて不溶性材料を、一体構造とするか、通り抜ける液体を直接流れるようにするか、物理的にブロックするか、エントラップするか、またはエントレインするか、のいずれかのように構成されている。
【００２０】
いくつかの実施の形態では、第１の表面と第２の表面の比を約1:99から約99:1までの範囲にすることができる。ほとんどどのような比であっても特定の用途に適合させ得るということが熟練技術者間に認識されている。便宜上、いくつかの実施の形態では、第１の表面と第２の表面の比の最適化は、第１及び第２の成分に衡平な1:1の比を用いることから始め、この開始点から比を変えることにより系統的に最適化することができる。
【００２１】
用語は本発明が容易に理解され得るように定義される。追加の定義は明細書の詳細な説明を通して説明される。
【００２２】
「凝集物」は、生理学的条件で安定し、かつpHおよび伝導度の条件が広範囲にわたり安定性が保たれる２つ又はそれ以上の会合（アソシエーション）を指す。凝集物は、タンパク質、核酸、または脂質およびその他の分子や金属イオンのような少なくとも１つのバイオ分子をしばしば有する。会合（アソシエーション）は、化学相互作用のどのようなタイプまたは組み合わせであっても発生し得る。抗体の凝集物はホモ凝集物とヘテロ凝集物の２つのカテゴリーに分類することができ、「ホモ凝集物」は２つ又はそれ以上の抗体分子の安定な会合を指し、「ヘテロ凝集物」は１つ又はそれ以上の非抗体分子を有する１つ又はそれ以上の抗体分子の安定な会合を指す。非抗体成分は、ヌクレオチド、エンドトキシン、金属イオン、タンパク質、脂質、または細胞培養液成分からなる群からの１つ以上の構成要素からなる。
【００２３】
「抗体」は、免疫グロブリン、コンポジット、またはそれらのフラグメンタリー・フォームを指す。用語は、これらに限定されるものではないが、ヒトまたは他の哺乳類の細胞株に由来するクラスIgA, IgD, IgE, IgGおよびIgMのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、あるいはヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、遺伝子組み換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、移植抗体、および試験管内で作製した抗体などのような天然または一般的な変形フォームを含む。「抗体」は、免疫グロブリン部分を有する融合タンパク質に限定されるものではないが、これを含むコンポジットフォームも含むことができる。また、「抗体」は、抗原結合作用をもっているか否かにかかわらず、Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, Fcおよびその他の成分のような抗体フラグメントも含むことができる。
【００２４】
「エンドトキシン」は、溶菌上の細胞から出てくるグラム陰性菌の外膜に存在する毒性の熱安定性リポ多糖類薬物を指す。エンドトキシンは、高含量のリン酸塩およびカルボキシル残基のために一般的に酸性にでき、脂質-Ａ領域の脂肪酸成分のために高疎水性にできる。エンドトキシンは、水素結合のために広範囲の機会を提供することができる。
【００２５】
「基質」または「固体材料」は、粒子状の、結晶質の、重合体の、繊維質の、多孔質中空繊維質の、モノリシックの、または膜質のものからなる、天然の不溶性の有機物または無機物を指す。それは非多孔質または多孔質の粒子、多孔質メンブレン、多孔質フィルタ、または多孔質モノリスからなり得る。もしそれが粒子状物質ならば、その粒子はほぼ球形であるか又はそうではなく、100ナノメータ未満から100ミクロン超えまでの範囲のサイズにできる。多孔質粒子の平均孔サイズは10ナノメータ未満（ミクロ多孔質）から100ナノメータ超え（マクロ多孔質）までの範囲にできる。メンブレンの平均孔サイズは、100ナノメータ未満から1ミクロン超えまでの範囲にできる。メンブレンまたはモノリスの平均チャネルサイズは、1ミクロン未満から10ミクロン超えまでの範囲にできる。固体材料は、さらに化合物構造からなる構造とすること、例えば粒子を網状マトリックスのなかに埋設すること、粒子をメンブレンの間に挟みこむこと、またはその両方を組合せた構造としてもよい。
【００２６】
「金属アフィニティー官能基」とは、好ましくは1:1のつくり方で金属イオンに結合するように、表面に固定することができる、ケミカル部分の性能をいう。そのようなケミカル部分は、金属イオンに等位接続を形成する性能をもつことができ、二座または多座の配位性状であり得る。これらに限定されるものではないが、この性能をもつ負の電荷の部分の例は、イミノ二酢酸（2-(カルボキシメチルアミノ)酢酸）、ジエチルアミン・トリアミン・ペンタ酢酸、およびニトリロ三酢酸（2,2',2"-ニトリロ三酢酸）を含む。
【００２７】
この性能をもつ正の電荷の化合物の例は、これらに限定されるものではないが、トリ(2-アミノエチル)アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレニミン・テトラアミン、およびデスフェリオキサミンを含む。
【００２８】
「正の電荷の表面」とは、正の電荷によって支配される基質または固体材料の表面を指す。表面の正の電荷は、これらに限定されるものではないが、弱アニオン交換基、アミノ類、エチレンジアミノ、ジエチルアミノエチル、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、強アニオン交換基、４級アミノ基のようなもの(such as quaternary amino groups)、強弱交換基を組合せたもの、ポリリシンのようなもの(such as polylysine)、ポリアルギニン、またはトリ(2-アミノエチル)アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレニミン・テトラアミン、PAMAMデンドリマー(エチレンジアミノ・コア)、またはこれら前述したものの組み合わせを含む化学基により与えられ得るものである。正の電荷に帯電した表面上に混合化学的特性をつくりだす第２の官能基は、正または負の電荷に帯電した基、疎水基、Π-Π結合基、水素結合基、または金属キレート基とすることができる。第２の官能基は、製造される材料の偶然の副産物としてか、または粒子を合成するプロセスにおいて正の電荷の表面上に存在していてもよく、あるいはそれらはよく考えられたデザインにより存在するものであってもよい。第２の官能基の濃度は、粒子のミリリットル当たり１ミリグラム当量(1mg/mL)未満から100mg/mL超えまでの範囲とすることができる。
【００２９】
「負の電荷の表面」とは、負の電荷によって支配される基質または固体材料の表面を指す。表面の負の電荷は、これらに限定されるものではないが、いわゆる弱カチオン交換基、カルボキシルのようなもの、アミノカルボキシル（イミノ二酢酸またはニトリロ三酢酸）、またはホスホリル、またはスルホン基のような強交換基（例えばスルホ、スルホメチル、スルホエチル、スルホプロピル）を含む化学基により与えられ得るものである。負の電荷に帯電した表面上に混合化学的特性をつくりだす第２の官能基は、正または負の電荷に帯電した基、疎水基、Π-Π結合基、水素結合基、または金属キレート基とすることができる。第２の官能基は、製造される材料の偶然の副産物としてか、または粒子を合成するプロセスにおいて負の電荷の表面上に存在していてもよく、あるいはそれらはよく考えられたデザインにより存在するものであってもよい。第２の官能基の濃度は、粒子のミリリットル当たり１ミリグラム当量(1mg/mL)未満から100mg/mL超えまでの範囲とすることができる。
【００３０】
「ポリヌクレオチド」とは、鎖内で共有結合されたマルチプル・ヌクレオチドモノマーからなるバイオポリマーを指す。DNA（デオキシリボ核酸）とRNA（リボ核酸）はポリヌクレオチドの一例である。ポリヌクレオチドは水素結合の形成に高い傾向をもつことができる。
【００３１】
「タンパク質」とは、炭素、水素、酸素、窒素、および通常は硫黄を含む複合有機高分子グループのことをいい、ペプチド結合によりリンクしたアミノ酸の１つまたはそれ以上の鎖が主に構成されたものをいう。タンパク質は、天然のもの又はオリジナルを組み換えたものであってもよい。タンパク質は、グリコシル化されるか、ペグ化されるか、あるいは接合されることを介して非アミノ酸部分を変えたものであってもよい。タンパク質の例は、これらに限定されるものではないが、抗体、凝固因子、酵素、およびペプチドホルモンを含む。
【００３２】
「タンパク質製剤」とは、細胞を含む細胞培養採取物、（実質的に）無細胞の細胞培養上澄み液、または精製のステージから関与のタンパク質を含む溶液のような関与のタンパク質を含む水性のまたはほとんど水性の溶液をいう。
【００３３】
「ウィルス」または「ビリオン」とは、超顕微鏡（概略20〜300nm径）の大きさで、代謝不活性であり、主にバクテリア、植物、および動物の生きた宿主細胞内でのみ複製され、RNAまたはDNAコア、タンパク質被覆、および複合型の周囲膜で構成される感染体をいう。
【００３４】
ある実施の形態では、本発明に実際に使用される固体材料は、クロマトグラフィーの実用に供される通常の多孔質ミクロ粒子に限定されるものではないが、天然の不溶性粒子または合成起源を含む。そのような粒子は、抗体に限定されるものではないが、タンパク質を拡散流入(diffusive entry)させうる大きいサイズの孔を用いることができるか、あるいは、それらの粒子は、抗体のようなタンパク質を拡散流入させうるほどに小さくはないが、塩、砂糖、およびヘテロ凝集-解離剤のような小さい化学種を拡散流入させうる小さいサイズの孔を具現化しうるものである。固体材料は、非多孔質粒子、メンブレンまたはモノリス、多孔質壁を含む中空繊維、多孔質メンブレン、及び／又は上述した要素を組み合わせたものを用いた複合構造物を含むことができる。
【００３５】
正の電荷の基は、いわゆる強アニオン交換基、及び／又はいわゆる弱アニオン交換基を含むことができる。強アニオン交換基の用語は、pH12を超えるpKasを具現化する４級アミンのような官能基を含む。弱アニオン交換基の用語は、pH12以下のpKasを具現化するジエチルアミノエチルおよびエチレンジアミンのような官能基をいうものと理解される。弱い正の電荷の基または強弱混合アニオン交換基は、溶解金属イオンを有する配位相互作用 (coordination interactions)に加わる能力があるという点で望ましく、適用したバイオロジカルサンプルから金属イオン汚染を取り除くという所望の結果を生じる。金属配位能力をもつ強弱混合アニオン交換基の非限定実施例は、トリス(2-アミノエチル)アミン（TREN）である。
【００３６】
負の電荷の基は、いわゆる強カチオン交換基、及び／又はいわゆる弱カチオン交換基を含むことができる。強カチオン交換の用語は、３以下のpKasをもつ部分を有する硫酸塩またはスルホを含むものと理解される。弱カチオン交換の用語は、３を超えるpKasをもつカルボキシ基及び／又はホスホ基を有する部分を含むものと理解される。アミノ基をもつ２つのカルボキシ基の組み合わせのように（中性pHで）双極特性の支配的な負の電荷の基は、溶解金属イオンをもつ配位相互作用に関与する強い能力がある点で望ましく、適用したバイオロジカルサンプルから金属イオン汚染を取り除くという所望の結果を生じる。本発明はイミノ二酢酸（IDA）基およびニトリロ三酢酸（NTA）基を含むそのような基の例に限定されるものではない。
【００３７】
正の電荷または負の電荷の材料の表面は、脂肪族キャラクター及び／又は芳香族キャラクターの疎水基も含むことができるが、いわゆるΠ-Π結合に加わる能力の理由で後者のほうが望ましい。混合化学キャラクターは、単一の複合化学基(single complex chemical group)の中にあるか、または単一型の表面上における別の異なるキャラクターの分離化学基(separate chemical groups)の中にあるか、または別の異なる表面上にあるか、またはこれらのあらゆる組み合わせに存在することができる。１つ又はそれ以上の負の電荷の金属アフィニティー基及び／又は１つ又はそれ以上の正の電荷の金属アフィニティー基は、同時に用いられてもよいし、それらが用いられる形態に応じて別々に用いられてもよい。個別のキャラクターの化学官能基は、特定のサンプル成分の必要性に応じて種々の比率にカスタマイズされて用いることができる。例えば、澄ませた細胞培養上澄み液(clarified cell culture supernatant)の処理を意図した組み合わせでは正の電荷の表面のほうが過剰に含まれる。一方、エタクリジンまたはポリエチレンイミンのような正の電荷のヘテロ凝集物解離剤ですでに処理済みの上澄み液の処理を意図した組み合わせでは負の電荷の表面のほうが過剰に含まれる。
【００３８】
ある実施の形態では、本発明は、負の電荷の金属アフィニティー官能基をもつ粒子、これと一緒に混合される正の電荷の粒子との組合せ、および電気的な中性材料とともに更に混合されるか及び／又は中性材料により取り囲まれるかする粒子、中性材料のなかに埋設される粒子、またはそれら自体が負の電荷及び／又は正の電荷である材料によって取り囲まれるか又はその材料のなかに埋設された粒子、をそれぞれ提供することができる。
【００３９】
ある実施の形態では、本発明は、正の電荷の金属アフィニティー官能基をもつ粒子、これと一緒に混合される負の電荷の粒子との組合せ、および電気的な中性材料とともに更に混合されるか及び／又は中性材料により取り囲まれるかする粒子、中性材料のなかに埋設される粒子、またはそれら自体が負の電荷及び／又は正の電荷である材料によって取り囲まれるか又はその材料のなかに埋設された粒子、をそれぞれ提供することができる。
【００４０】
ある実施の形態では、本発明は、負の電荷の金属アフィニティー官能基をもつ粒子、これと一緒に混合される正の電荷の金属アフィニティー官能基をもつ粒子との組み合わせ、および電気的な中性材料とともに更に混合されるか及び／又は中性材料により取り囲まれるかする粒子、中性材料のなかに埋設される粒子、またはそれら自体が負の電荷及び／又は正の電荷である材料によって取り囲まれるか又はその材料のなかに埋設された粒子、をそれぞれ提供することができる。
【００４１】
ある実施の形態では、本発明は、これらに限定されるものではないが疎水相互作用、Π-Π結合、水素結合、および金属アフィニティーに関与する能力を含む、追加の化学官能基を具現化する負の電荷及び／又は正の電荷の表面を提供することができる。ある実施の形態では、本発明は、中性材料とともに混合されるか又は中性材料により周囲を取り囲まれる１つ又はそれ以上の負の電荷タイプの粒子および１つ又はそれ以上の正の電荷タイプの粒子を提供することができる。
【００４２】
ある実施の形態では、これらの粒子はサイズを異ならせてもよいし、及び／又は気孔率を異ならせてもよい。ある実施の形態では、本発明は、これらに限定されるものではないが、メンブレン、繊維、およびモノリスを含む、他の物理的形状の負の電荷及び／又は正の電荷の材料とともに混合されるか、または該材料の間に取り囲まれる粒子を、提供することができる。
【００４３】
ある実施の形態では、１つ又はそれ以上の基質上に負の電荷の官能基と正の電荷の官能基との比率を異ならせたものは、成分を異ならせたタンパク質製剤の必要性に適合する比率で選択されてもよい。
【００４４】
タンパク質製剤中のホモ凝集物およびヘテロ凝集物の含量を低減するために有用であるものの追加は当業者において明らかにされるはずである。ある実施の形態では、本発明は、タンパク質製剤から宿主細胞タンパク質、ポリヌクレオチド、エンドトキシン、およびウィルスの含量を実質的に低減するために役立つものである。主要な官能基が例えば疎水基および水素結合のような追加の官能基を随伴するケースにおいて、本発明は、最終地点に到達する再生可能なダウンストリーム浄化方法の能力を制限する細胞培養媒体の成分および添加物の含量を低減することができる。本発明の実施の形態は、加工されていない生のフィードストリームに関連して用いられるときの実質の値を有するものであり、当業者において明らかにされるはずであるが、それにもかかわらず実質的に浄化される適用サンプルに対するときに重要な値を提供するものである。
【００４５】
ある実施の形態では、本発明は、固体材料を使用後にクリーニング清浄して再利用できるような構成部材または装置を提供するものである。他の実施の形態では、それらを１回の使用に供するものである。
【００４６】
本発明のさらなる追加の目的および利点は、以下の記載において一部を述べ、また一部は記載から自明であり、あるいは本発明の実践により教示され得る。本発明の目的および利点は、請求項に特定した要素および組合せの手段により実現され達成される。
【００４７】
前述の一般的記述説明および以下の詳細な説明の両方ともに模範的かつ説明的なもののみであり、請求したように本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４８】
実施例１：
負に帯電した0.5mLのキレート多孔質粒子（キレックス100；登録商標）と正に帯電した0.5mLの多孔質粒子（マクロ・プレップ・ハイQ；登録商標）とを混合してプロトタイプ粒子混合物を準備し、これをガラスアッセンブリ内のセルロースフィルタの間に挟み込んだ。IgGモノクローナル抗体（Her2）の精製試料をpH7.0, 10mS/cmの近生理学的条件で損失することなく粒子に通過させた。非精製抗体の実験を25mS/cm, 20mS/cm, 30mS/cmの条件で行った。全ケースにおいてヘテロ凝集物およびHMW凝集物を取り除いた。0.02%エタクリジンを含む非精製抗体の実験を同一の伝導度で行った。全ケースでヘテロ凝集物とHMW凝集物を取り除き、365nmの紫外線吸収がなかったことにより通過液中にエタクリジンが無いということが立証された。
【００４９】
実施例２：
実施例１に沿う実験の一式において、IgMモノクローナル抗体（クローン529）の精製試料をpH7.0, 20mS/cmの（塩濃度を上昇させた）上昇塩条件で粒子に通過させた。非精製抗体および0.02%エタクリジンを含む非精製抗体の実験を20mS/cm, 30mS/cm, 40mS/cmの条件で行った。全ケースにおいてヘテロ凝集物とHMW凝集物を取り除き、365nmの紫外線吸収がなかったことにより通過液中にエタクリジンが無いということが立証された。0.2%エタクリジンを添加した試料についてこれらの実験を繰り返し行った。全ケースでヘテロ凝集物とHMW凝集物を除去し、通過液中からエタクリジンが無くなった。
【００５０】
実施例３：
キレックス100とマクロ・プレップ・ハイQとの等量の混合物からなる充填床に通過させた際の、モノクローナルIgM培養上澄み液からDNAと凝集物とを除去する能力試験。それぞれ0.5mLのキレックス100およびマクロ・プレップ・ハイQをＰＶＤＦメンブレンの間に挟み込んだ。IgM-529細胞培養上澄み液を毎分１ミリリットルで負荷し、25mL,50mL,100mLの通過液サンプルをそれぞれ得た。これらのサンプルを分析的なＳＥＣにより分析した。最大限の負荷では実に、通過液からかなりの254-主要ヘテロ凝集物を除去した。（低いものから高いものまで）種々の負荷でそれぞれ58%,73%,85%のIgM回収を行った。25mS/cmの伝導度を生じさせるＮａＣｌを添加した条件で、この実験を繰り返した。ヘテロ凝集物の低減は影響を受けなかったが、IgM回収のほうはそれぞれ約85%,90%,95%増加した。
【００５１】
実施例４：
QAEセファデックスA-25（登録商標）、SPセファデックスC-25（登録商標）、ヌビアQ（登録商標）、ヌビアS（登録商標）、およびセファデックスLH-20（登録商標）を等量でミクロ多孔質脂溶性粒子に加え、ミクロ多孔質とマクロ多孔質および正の電荷と負の電荷の媒体の組合せで20mS/cmの伝導度として実施例３の実験を繰り返した。アラントイン及びエタクリジンを5%血清補充したモノクローナルIgM上澄み液に添加し、最終的に1%濃度（過飽和）と0.02%濃度とした。遠心分離により上澄み液を浄化し、浄化した上澄み液（充填床単位ミリリットル当たり20ミリリットルの上澄み液）を充填床に通過させた。カチオン交換クロマトグラフィーによりIgMを捕捉するとともに分画した。２段プロセスでIgM 回収が80%を超えた。外見上はっきりした凝集物がなく、分析的ＳＥＣにより純度が90%以上になった。
【００５２】
実施例５：
負に帯電した金属キレート・イミノ二酢酸基をもつミクロ多孔質スチレンジビニルベンゼン粒子と正に帯電したキレート・リガンド・トリス（2-アミノエチル）アミンをもつマクロ多孔質アガロース粒子との等量混合物をポリエチレンフリットの間に挟み込み、50mMヘペス、100mM NaCl、pH 7.0に平衡保持した。IgG（クローンHER2）を含むろ過した哺乳類細胞培養上澄み液をアセンブリーに通り抜けさせて、サイズ交換クロマトグラフィーで分析した。非処理サンプルは約10%の凝集物を含んでいた。これに対して処理サンプルは0.2%未満の凝集物を含んでいた。アキュブルー（登録商標）試験では処理サンプルはDNAの98%が除去された。抗体回収率は99%であった。
【００５３】
実施例６：
実施例５の粒子混合物を50mMヘペス、100mM NaCl、pH 7.0に平衡を保ち、IgG（クローンHER2）を含むろ過した哺乳類の細胞培養上澄み液を加えて、１時間の培養撹拌を行い、膜ろ過により取り除いた。実施例５の凝集物の低減とDNA除去がそれぞれ概略半分になることが分析で明らかになった。４で１６時間の培養撹拌を行うと実施例５の約８０％の効果を示した。
【００５４】
実施例７：
負に帯電した金属キレート・スチレンジビニルベンゼン粒子と正に帯電したポリメタクリレート多孔質粒子と負に帯電したポリメタクリレート粒子との等量混合物を、20 mS/cmの最終伝導度のNaCl、1%アラントインおよび0.025%エタクリジンで予め処理されたIgM-529サンプルと混合した。サンプルにおける粒子の体積比を１：２０とした。１０分、２０分、４０分、６０分の時間でサンプルを採取し、それぞれミクロろ過によって粒子を取り除いた。図１に示すように全時点で高分子凝集物の著しい低減が見られるが、宿主細胞タンパク質汚染の実質的に目に見える低減により付随して、時間を掛ければ全凝集物のより大きな低減が見られる。続いて分析により、サンプルからクロマチン残留物の併合低減を反映した凝集物と宿主タンパク質の両方の低減が明らかになった。また、全時点でサンプルからエタクリジンを取り除いた。
【００５５】
実施例８：
図２Ａおよび図２Ｂには、実施例７と同様にNaCl、アラントイン、およびエタクリジンで処理され、次いで実施例７と同じ媒体混合物で処理されるが、粒子を十分に収容する狭いメッシュの織物ポリマーリテーナーの間に混合媒体を挟み込んだ装置にサンプルを通過させることにより処理されるIgM-84の処理前と処理後のサイズ排除クロマトグラフィー・プロファイルをそれぞれ示す。HMW凝集物は、より小さな凝集物の大部分とともに完全に除去された。以下の表１に、DNA及びヒストンがIgGフラクションを伴う全凝集物フラクションにわたり、また全タンパク質含有フラクションにわたり当初から分散していることを示す。
【表１】
2015518043.tif 000002
【００５６】
表１に、DNAとヒストンに加えて更に多数のヌクレオソームを含むヌクレオソーム配列が含まれた凝集物群を予期せぬ発見物としてもたらされるDNAのサイズのばらつきを示す。この処理からのIgM回収率は98%であった。
【００５７】
実施例９：
図３に、抗HER2モノクローナルIgG抗体の実施例１６と同じ手順を施す前と後のサイズ排除クロマトグラフィー・プロファイルをそれぞれ示す。それらの結果は、本質的には同じであるが、おおよそ、少なくとも一部では、抗体の濃度が約１０倍以上となることから、実施例８を超える程度には改善されている。
【００５８】
実施例１０：
20 mS/cmの伝導度になるまで加えたNaClを伴うIgM-84細胞培養上澄み液を、負に帯電した表面結合キレート剤イミノ二酢酸をもつ多孔質モノリシック・ポリメタクリレート・ディスク（CIM IDA, BIA分離）に通過させ、次いで正に帯電したジエチルアミノエチル基（CIM DEAE, BIA）に直ちに通過させ、これにより上澄み液とモノリスを５０：１の体積比とした。実施例７と同様に効果的に凝集物とDNAが取り除かれた。IgM回収率は98%であった。ヒストンおよび一般的な宿主タンパク質の除去は、両方とも実施例７からの凡そ70%に対して約35%であり、実施例７の到達レベルの約半分であった。両化学基を単体モノリスの表面上に種々変えて混在させることができることは当業者において明らかである。
【００５９】
実施例１１：
正に帯電したモノリスを、正に帯電した４級アミノ基（登録商標「ザルトバインドＱナノ」）をもつミクロろ過膜に置き換えたことを除いて、実施例１０の手順を繰り返した。DNAと凝集物の除去およびIgM回収は変わらなかった。両化学基を単体モノリスの表面上に存在させることができることは当業者において明らかである。
【００６０】
実施例１２：
正に帯電した膜を、拡張形態内に誘導体化されたアミノリガンドをもつグラフトしたリガンドを有する正に帯電したミクロ多孔質中空繊維（ Qyu-speed D；旭化成メディカルカンパニー社）に置き換えたことを除いて、実施例１１の手順を繰り返した。
【００６１】
実施例１３：
正に帯電したミクロろ過膜の代わりに、織物ポリマーリテーナーの間に挟み込まれた正に帯電したキレート剤トリス（2-アミノエチル）アミン（バイオワークスTRENハイ-サブ）をもつ多孔質アガロース粒子を用いたことと、余分な塩が無添加のIgG含有細胞培養上澄み液を通液することとを除いて、実施例１２の手順を繰り返した。
【００６２】
実施例１４：
イミノ二酢酸モノリスのために負に帯電した膜（登録商標「ザルトバインドＳナノ」）を代用したことを除いて、実施例１３の手順を繰り返した。本実施例の結果は実施例１２と同じであった。
【００６３】
実施例１５：
負に帯電したキレート・リガンド・イミノ二酢酸（登録商標；キレックス100）をもつ多孔質スチレン・ジビニルベンゼン粒子を正に帯電したトリス（2-アミノエチル）アミン・キレート・リガンド・アガロース粒子と混合したことを除いて、実施例１４の手順を繰り返した。混合した粒子を多孔質ポリエチレンリテーナーの間に挟み込んだ。そして、1%アラントインと0.025%エタクリジンで処理したIgG含有細胞培養上澄み液を混合粒子の多孔質ポリエチレンリテーナーに通液した。凝集物は除去された。IgG回収率は99%であった。両化学基を単体粒子タイプの表面上で混合できることは当業者において明らかである。
【００６４】
実施例１６：
正に帯電した粒子を２部、負の電荷の疎水性粒子を１部、負に帯電したキレート粒子を１部の割合でこれらを混合した混合物に対して負に帯電した多孔質ポリメタクリレート粒子（マクロプレップT-ブチル；バイオラッド社の登録商標）上にブチル疎水性リガンドを添加することを除いて、実施例１５の手順を繰り返した。抗体回収率は99%であった。凝集物は約7%から2%未満まで低減された。エタクリジンは取り除かれた。
【００６５】
実施例１７：
モノクローナルIgGを含有する哺乳類細胞培養上澄み液を実施例１５に記載したように処理した。凝集物は2.7%以上から0.31%まで低減した。IgG回収率は99%であった。立体排除クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、およびアニオン交換クロマトグラフィーからなる３段プロセスにより抗体を順次浄化した。最終精製IgGのなかにDNAを検出できなくなる検出限界まで低減した。原則としてサイズ排除クロマトグラフィーの検出限界である0.05%未満に凝集物を低減した。最終の抗体純度は99.999%以上と算出された。最終の抗体回収率は81%であった。
【００６６】
実施例１８：
ネズミ白血病ウィルスに感染した哺乳類細胞の検査液からのろ過上澄み液を1%アラントイン及び0.025%エタクリジンで処理し、次いで処理液を実施例１０に記載したモノリスに通過させた。ウィルスレベルは3.06 logsに減少した。DNAは3.5 logsに減少した。エタクリジンは処理サンプルから除去された。
【００６７】
実施例１９：
ネズミの微小ウィルスに感染した哺乳類細胞の検査液から上澄みをろ過したことを除いて、実施例１７の手順を繰り返した。ウィルスレベルは5.06 logsに減少した。DNAは3.5 logsに減少した。エタクリジンは処理サンプルから除去された。これら最後の２つの実施例は、本発明がウィルス汚染を低減するために価値ある実用的なものであることを示すばかりでなく、凝集物および宿主由来汚染を除去するためにも有用であることを示している。エンドトキシンをも除去できることは当業者において明らかである。
【００６８】
上記実施例では、粒子、モノリス、メンブレン、および繊維の上に化学基を用いること、および、負に帯電した基を正に帯電したキレート剤と、正に帯電したキレート剤を負に帯電したキレート剤と、正に帯電した基を負に帯電したキレート剤と、それぞれ組み合わせること、および、両方を疎水性相互作用リガンドのような他の化学反応性と組み合わせることができることは、それぞれ当業者において明らかである。IgG抗体およびIgM抗体を有するこれらの実施例の多様性にもかかわらず、本発明の本質的な特徴が表れる相違を通して多くの組合せを思い付くことができることはさらに明らかであり、これら示した上述に類似する利益を生じることを期待することができる抗体以外の多くの型のタンパク質にも適用することができる。
【００６９】
本発明では望ましい浄化のレベルに到達するための種々様々な浄化方法を組み合わせることができる。実施例は、これらに限定されるものではないが、抗体の浄化に通常用いられる他の方法、すなわちタンパク質Ａおよびアフィニティークロマトグラフィーの他の形態、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、および追加混合モード・クロマトグラフィー方法のような他の方法を含む。種々の方法に適合する条件を開発すること、および特定抗体の浄化の要求に到達するために本発明と一体とされることは当業者の範囲内である。
【００７０】
ここに記載された全てのリファレンスは、個々の公開公報または特許公報または特許出願の各々が全ての目的のためにその全体においてリファレンスにより包含されるべき明確かつ個別に示されたものであるかのように、それらの全体と同程度に全ての目的のためにリファレンスにより包含されるものである。リファレンスにより包含される程度の公開公報および特許公報または特許出願が本願明細書に含まれる開示と矛盾する場合は、本願明細書のほうが優先されるものであり、及び／又はその矛盾材料を超えて明細書のほうが優位にとらえられるものである、ということを意図している。
【００７１】
構成要素の量、クルマトグラフィー条件、および本願明細書及び特許請求の範囲に記載されているものを表す全ての数値は、「約」という用語により全ての例においてモディファイされるということが理解されるべきである。このため、逆のことを示される場合を除いて、明細書及び特許請求の範囲に記載した数値パラメータは本発明により得られるべき望ましいパーフォーマンスソートに種々依存していることに近似するものである。
【００７２】
本発明の多くの変更と変形は、当業者において明らかである趣旨および範囲から逸脱することなくできる。ここに記載された特有の実施の形態は、実施例のみの手段方法により示され、いかなる手段方法にも限定されるものではない。以下の請求項により示される本発明の範囲と趣旨とともに明細書および実施例は、模範となるべきものとしてのみ考慮されるということが意図されている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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