(57)【要約】本発明は、治療化合物の吸収、半減期、又はバイオアベイラビリティを高める担体を提供する。担体は、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）に結合する標的化基、標的化基を治療化合物に結合するための連結基、及び任意選択的にスカフォールド部分を含む。
2015518825.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）に結合する標的化基、及び
（ｂ）前記標的化基を治療化合物にコンジュゲートする結合基
を含む医薬担体であって、
前記医薬担体が、循環中の前記治療化合物の吸収、半減期、効力、又はバイオアベイラビリティを増加させる医薬担体。
【請求項２】
前記標的化基が、ビタミンＤ、ビタミンＤアナログ、ビタミンＤ関連代謝物、ビタミンＤ関連代謝物のアナログ、ペプチド、抗ＤＢＰ抗体、抗ＤＢＰ抗体誘導体、ヌクレオチドアプタマー、及びＤＢＰに結合する小型の炭素系分子からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬担体。
【請求項３】
スカフォールド部分をさらに含み、前記スカフォールド部分が、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含む修飾基、水溶性ポリマー、小型炭素鎖リンカー、及び追加の治療部分からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬担体。
【請求項４】
前記結合基が、アミン反応性基、チオール反応性基、マレイミド基、チオール基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、ハロアセチル基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、ＳＭＣＣ基、スルホＳＭＣＣ基、カルボジイミド基、二官能性架橋剤、ＮＨＳ−マレイミド、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬担体。
【請求項５】
前記スカフォールド部分が約１００Ｄａ．から２００，０００Ｄａ．である、請求項３に記載の医薬担体。
【請求項６】
前記スカフォールド部分が、約１００Ｄａ．から２０，０００Ｄａ．、２００Ｄａ．から１５，０００Ｄａ．、３００Ｄａ．から１０，０００Ｄａ．、４００Ｄａ．から９，０００Ｄａ．、５００Ｄａ．から５，０００Ｄａ．、６００Ｄａ．から２，０００Ｄａ．、１０００Ｄａ．から２００，０００Ｄａ．、５０００Ｄａ．から１００，０００Ｄａ．、１０，０００Ｄａ．から８０，０００Ｄａ．、２０，０００Ｄａ．から６０，０００Ｄａ．、又は２０，０００Ｄａ．から４０，０００Ｄａ．である、請求項５に記載の医薬担体。
【請求項７】
担体にコンジュゲートされ、又は担体と共に製剤された治療化合物を含む医薬組成物であって、前記担体が、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）に結合する標的化基を含み、前記担体が、循環中の前記治療化合物の吸収、バイオアベイラビリティ、又は半減期を増加させる医薬組成物。
【請求項８】
前記標的化基が、ビタミンＤ、ビタミンＤアナログ、ビタミンＤ関連代謝物、ビタミンＤ関連代謝物のアナログ、ペプチド、抗ＤＢＰ抗体、抗ＤＢＰ抗体誘導体、ヌクレオチドアプタマー、及びＤＢＰに結合する小型の炭素系分子からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
スカフォールド部分をさらに含み、前記スカフォールド部分が、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含む修飾基、水溶性ポリマー、小型炭素鎖リンカー、及び追加の治療化合物からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記治療化合物が、小分子、化学物質、核酸、核酸誘導体、ペプチド、ペプチド誘導体、天然のタンパク質、非天然のタンパク質、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ステープルドペプチド、モルホリノ、ホスホロジアミデートモルホリノ、アンチセンス薬、ＲＮＡ系サイレンシング薬、アプタマー、糖タンパク質、酵素、ホルモン、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、血液凝固因子、抗体、抗体断片、抗体誘導体、毒素結合抗体、代謝エフェクター、鎮痛剤、解熱剤、抗炎症剤、抗生物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、筋骨格の薬、心臓血管の薬、腎臓の薬、肺の薬、消化器疾患の薬、血液作用薬、泌尿器の薬、代謝作用薬、肝臓の薬、神経作用薬、抗糖尿病薬、抗癌剤、胃の病気を治療する薬、結腸の病気を治療する薬、皮膚病を治療する薬、及びリンパの病気を治療する薬からなる群から選択される、請求項７から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記治療化合物が、配列番号２に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＧＦ２１活性を有するタンパク質である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記標的化基がビタミンＤである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記スカフォールド部分がポリ（エチレングリコール）である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
（ａ）配列番号２に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＧＦ２１活性を有するタンパク質、
（ｂ）ポリ（エチレングリコール）であるスカフォールド部分、及び
（ｃ）ビタミンＤである標的化基
を含む医薬組成物であって、前記標的化基が、循環中の前記治療化合物の吸収、バイオアベイラビリティ、又は半減期を増加させる医薬組成物。
【請求項１５】
前記治療化合物が、配列番号５に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むグレリン活性を有するタンパク質である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記標的化基がビタミンＤである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記スカフォールド部分がポリ（エチレングリコール）である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
（ａ）配列番号５に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むグレリン活性を有するタンパク質、
（ｂ）ポリ（エチレングリコール）であるスカフォールド部分、及び
（ｃ）ビタミンＤである標的化基
を含む医薬組成物であって、前記標的化基が、循環中の前記治療化合物の吸収、バイオアベイラビリティ、又は半減期を増加させる医薬組成物。
【請求項１９】
治療化合物を必要とする患者を治療する方法であって、請求項７〜９のいずれか一項に記載の有効量の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項２０】
前記治療化合物が、小分子、化学物質、核酸、核酸誘導体、ペプチド、ペプチド誘導体、天然のタンパク質、非天然のタンパク質、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ステープルドペプチド、モルホリノ、ホスホロジアミデートモルホリノ、アンチセンス薬、ＲＮＡ系サイレンシング薬、アプタマー、糖タンパク質、酵素、ホルモン、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、血液凝固因子、抗体、抗体断片、抗体誘導体、毒素結合抗体、代謝エフェクター、鎮痛剤、解熱剤、抗炎症剤、抗生物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、筋骨格の薬、心臓血管の薬、腎臓の薬、肺の薬、消化器疾患の薬、血液作用薬、泌尿器の薬、代謝作用薬、肝臓の薬、神経作用薬、抗糖尿病薬、抗癌剤、胃の病気を治療する薬、結腸の病気を治療する薬、皮膚病を治療する薬、及びリンパの病気を治療する薬からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記治療化合物が、配列番号２に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＧＦ２１活性を有するタンパク質である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記治療化合物が、配列番号５に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むグレリン活性を有するタンパク質である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的化基がビタミンＤである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記スカフォールドがポリ（エチレングリコール）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記医薬組成物が、薬学的に許容できる製剤中にある、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記医薬組成物が、経皮、経口、非経口、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病変内、頭蓋内注射、注入、吸入、眼、局所、直腸、鼻腔内、頬側、舌下、膣内、又は埋め込みリザーバー方式により前記患者に送達される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記医薬を必要とする患者を治療するための医薬品の製造のための、請求項７から９、１４又は１８のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２８】
標的化基及び薬物をコンジュゲートして担体−薬物化合物にすることを含み、前記コンジュゲート工程が結合基を利用する、請求項７から９、１４又は１８のいずれか一項に記載の医薬組成物を製造する方法。
【請求項２９】
スカフォールド部分を前記標的化基又は前記薬物にコンジュゲートすることをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記結合基が、アミン反応性基、チオール反応性基、マレイミド基、チオール基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、ハロアセチル基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、ＳＭＣＣ基、スルホＳＭＣＣ基、カルボジイミド基、二官能性架橋剤、ＮＨＳ−マレイミド、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物が、チオール結合、アミド結合、オキシム結合、ヒドラゾン結合、及びチアゾリジノン結合からなる群から選択される結合を含む担体−薬物化合物を含む、請求項２８の方法から得られる医薬組成物。
【請求項３２】
前記コンジュゲート工程が環化付加反応により達成される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記標的化基が、ビタミンＤ、ビタミンＤアナログ、ビタミンＤ関連代謝物、ビタミンＤ関連代謝物のアナログ、ペプチド、抗ＤＢＰ抗体、抗ＤＢＰ抗体誘導体、ヌクレオチドアプタマー、及びＤＢＰに結合する小型の炭素系分子からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記スカフォールド部分が、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含む修飾基、水溶性ポリマー、小型炭素鎖リンカー、及び追加の治療部分からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記治療化合物が抗体である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記抗体が、配列番号１０に少なくとも９０％の配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗ＴＮＦα抗体である、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記抗ＴＮＦα抗体が、配列番号１０のアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記標的化基がビタミンＤであり、前記スカフォールド部分がポリ（エチレングリコール）である、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
式Ｉ：
【化１】
2015518825.tif 000048
（式中、
Ｂは、ビタミンＤ、ビタミンＤアナログ、ビタミンＤ関連代謝物、ビタミンＤ関連代謝物のアナログ、ＤＢＰに結合するペプチド、抗ＤＢＰ抗体、抗ＤＢＰ抗体誘導体、ＤＢＰに結合するヌクレオチドアプタマー、又はＤＢＰに結合する小型の炭素系分子から選択される標的化基であり；
Ｓは、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含む修飾基、ポリ乳酸、水溶性ポリマー、小型炭素鎖リンカー、又は追加の治療部分を含むスカフォールド部分であり；
Ｃは、アミン反応性基、チオール反応性基、マレイミド基、チオール基、ジスルフィド基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、４−ニトロフェニルエステル、アシルイミダゾール、ハロアセチル基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、ＳＭＣＣ基、スルホＳＭＣＣ基、カルボジイミド基、及びＮＨＳ−マレイミドなどの二官能性架橋剤、又はこれらの組み合わせであり；
Ｌ１及びＬ２は、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＨＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、及び−ＮＨ−から独立に選択されるリンカーであり；
Ｌ３は−（ＣＨ２）ｏ−であり；
ｎは、０〜３の整数であり；且つ
ｏは、０〜３の整数である）
を含む医薬担体。
【請求項４０】
式Ｖ：
【化２】
2015518825.tif 000049
を含む請求項３９に記載の医薬担体。
【請求項４１】
式ＶＩ：
【化３】
2015518825.tif 000050
を含む請求項３９に記載の医薬担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、インビボでの薬物動態的性質を向上させることにより治療化合物の効力、吸収、バイオアベイラビリティ、又は循環半減期を増加させるための化合物の担体、コンジュゲート、融合体、又は製剤の組成物及び全般的な使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、治療化合物の効力、吸収、又は薬物動態的性質を向上させることに関する。ポリ（エチレングリコール）すなわち（ＰＥＧ）の添加は、腎クリアランスの低下、凝集の低下、及び潜在的に望ましくない免疫認識の減少により、いくつかの化合物の半減期を増加させる公知の方法である（Ｊａｉｎ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．２５：４０３−４４７（２００８））。ＰＥＧは、典型的には、循環中の半減期を最大にするため、かなり大きいサイズで使用される（２０〜４０ｋＤａ）。これは、単一の大きいＰＥＧの使用でも、化合物に結合した複数のより小さなＰＥＧの使用でも達成できる（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１９６９−２１９７７（１９９６）；Ｆｉｓｈｂｕｒｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９７：４１６７−４１８３（２００８））。
【０００３】
医薬の効果が起こる前に薬物は吸収されなければならないため、吸収は、薬物の開発及び医薬の化学において主な焦点である。薬物の薬物動態プロファイルは、多くの因子に影響され得る。さらに、治療化合物の吸収性は、化合物によって著しく異なる。経口又は経皮投与後にあまり吸収されない治療化合物がいくつかある。ほとんどのペプチド系及びタンパク質系治療薬などの他の治療化合物は、経口投与できない。静脈内、皮下、又は筋肉内注射などの代替投与経路が、いくつかの化合物に日常的に利用されている。しかし、これらの経路は、遅い吸収及び分解を起こし得る酵素への治療化合物の曝露を起こすことが多く、そのため有効性を得るためにより高い投与量を必要とする。
【０００４】
いくつかのペプチドが、治療上期待が持てるものと特定されてきた。ペプチド及びタンパク質の化学的性質及び生物学的性質により、それらは、治療化合物として使用するための魅力的な候補である。ペプチド及びタンパク質は、アミノ酸でできた天然の分子であり、多くの生理学的プロセスに関与している。ペプチド及びタンパク質は、高度の選択性及び効力を示し、潜在的な有害薬物間相互作用も他の負の副作用も欠点として持たないことがある。そのため、ペプチド及びタンパク質は、多様性が高く、効き目が強く、選択性の高いクラスの低毒性の治療化合物として大いに有望なものである。しかし、ペプチド及びタンパク質は、短いインビボ半減期を有し得る。そのようなペプチドでは、これは数分になり得る。そのため、それらは、その天然の形態において治療的投与には一般的に非実用的である。さらに、ペプチドは、作用持続時間が短く、バイオアベイラビリティが低いことがある。
【０００５】
線維芽細胞増殖因子２１（配列番号２）は、血清中を循環するタンパク質である。それは、ＦＧＦ２１遺伝子によりコードされており、ＦＧＦ１９及びＦＧＦ２３を含む非定型の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のファミリーのメンバーである。それは、従来のＦＧＦヘパリン結合ドメインを欠いている。ＦＧＦファミリーメンバーは、広い細胞分裂活性及び細胞生存活性を有し、胚発生、細胞成長、形態形成、組織修復、腫瘍の増殖及び侵入を含む種々の生物学的プロセスに関与している。ＦＧＦ２１は、ＨＭＧＣＳ２活性により特異的に誘起される。ＦＧＦ２１は、脂肪細胞でのグルコース取り込みを刺激するが、他の細胞型ではそうではない。この作用は、インスリンの活性に追加的なものである。
【０００６】
インビトロ試験により、ＦＧＦ２１が、ＦＧＦＲ１ｃ／ｂ−Ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体への結合を、他のＦＧＦＲアイソタイプを含むものよりも好むことが示される（Ｋｌｉｅｗｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．９１：２５４Ｓ−２５７Ｓ（２０１０））。ＦＧＦ２１は、インビトロで脂肪細胞によるグルコース取り込みを促進する。ＦＧＦ２１を糖尿病性動物へ投与すると、循環グルコースレベルが低下する一方で、過剰なＦＧＦ２１は、過剰なインスリンの投与でみられる低血糖を引き起こさない（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ  ａｎｄ  Ｓｈａｎａｆｅｌｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  １０：３５９−３６４（２００９））。したがって、ＦＧＦ２１は、糖尿病の治療のための期待が持てる治療用タンパク質である。しかし、動物モデルにおいて治療効果を見るためにＦＧＦ２１は頻繁に投与された（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：１６２７−１６３５（２００５））。ＦＧＦ２１は、その天然の状態で、非常に短い血清中の半減期（１．１時間）を有するので、天然の状態のＦＧＦ２１を体外から加えても、治療として臨床上実際的でない（国際公開第０３／０１１２１３号パンフレット参照）。さらに、ＦＧＦ２１は、皮下注射される場合、低いバイオアベイラビリティを示す。比較薬物動態学試験において、１ｍｇ／ｋｇのＦＧＦ２１が静脈内（ＩＶ）と皮下（ＳＣ）のいずれかで注射され、ＦＧＦ２１の濃度が時間とともに分析された。その結果は、静脈内経路に比べて（Ｃｍａｘ  １８９０ｎＭ；Ｘｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２９７：Ｅ１１０５−Ｅ１１１４の表１参照）、皮下投与経路を使用する（Ｃｍａｘ  ７３ｎＭ）バイオアベイラビリティの著しい低下を示した。上記の引用文献は、引用によりその全体として本明細書に組み込まれる。
【０００７】
グレリンペプチド（配列番号５）は、哺乳動物の胃から循環に自然に分泌され、食欲及び成長ホルモンの放出を刺激する。グレリンは、細胞受容体ＧＨＳ−Ｒを介して成長ホルモン（ＧＨ）の脳下垂体からの放出を刺激し、エネルギー恒常性に重要な役割を果たす。さらに、グレリンは中枢神経系に直接作用し、交感神経の活性を低下させる。グレリン受容体（ＧＨＳ−Ｒ）は、視床下部−下垂体ユニットに集中している。ＧＨＳ−Ｒは、心臓、肺、肝臓、腎臓、すい臓、胃、小腸及び大腸、脂肪、並びに免疫細胞を含む末梢組織に分布している。
【０００８】
グレリンは、カヘキシー又は癌などの慢性病から起こる非自発的な体重減少を患っている患者の体重及び除脂肪体重を増やすために、治療的に使用されてきた（Ｈｉｕｒａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊａｎ  ２６，２０１２，ｈｔｔｐ：／／ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／１０．１００２／ｃｎｃｒ．２７４３０／ａｂｓｔｒａｃｔ）。しかし、グレリンは、ヒトの中で１１分という元々短い半減期を有し（Ａｋａｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １５０：４４７−５５（２００４））、そのため治療効果を得るには頻繁に投薬しなければならない。
【０００９】
インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、米国特許第５，９１９，４５２号明細書及び米国特許出願公開第２００２／０１４１９９６号明細書、引用によりその全体として本明細書に組み込まれる）は、自己免疫疾患の治療に使用される、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α、配列番号１０）に結合するモノクローナル抗体である。インフリキシマブは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により、乾癬、クローン病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、関節リウマチ、及び潰瘍性大腸炎の治療用に認可された。ＴＮＦ−αは、化学的メッセンジャー（サイトカイン）及び自己免疫反応の重要な部分である。インフリキシマブは、医療従事者により静脈内投与され、皮下投薬には認可されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、治療化合物の吸収、安定性、半減期、作用持続期間、効力、又はバイオアベイラビリティを増加させる担体を提供する。担体は、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）に結合する標的化基（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ）、標的化基を治療化合物に結合する連結基（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｇｒｏｕｐｓ）、及び任意選択のスカフォールド部分（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含む。
【００１１】
本発明の一実施形態において、標的化基は、ビタミンＤ、ビタミンＤアナログ、ビタミンＤ関連代謝物、及びビタミンＤ関連代謝物のアナログ、ＤＢＰに結合するペプチド、抗ＤＢＰ抗体、抗ＤＢＰ抗体誘導体、ＤＢＰに結合するヌクレオチドアプタマー、又はＤＢＰに結合する小型の炭素系分子である。
【００１２】
他の実施形態において、結合基（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）は、アミン反応性基、チオール反応性基、マレイミド基、チオール基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、４−ニトロフェニルエステル、アシルイミダゾール、ハロアセチル基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、ＳＭＣＣ基、スルホＳＭＣＣ基、カルボジイミド基、及びＮＨＳ−マレイミドなどの二官能性架橋剤、又はこれらの組み合わせである。本発明の結合基は、チオール結合、アミド結合、オキシム結合、ヒドラゾン結合、チアゾリジノン結合を促進することも、環化付加反応（例えば、クリックケミストリー）を利用して担体又は標的化基を治療化合物に結合することもできる。
【００１３】
他の実施形態において、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含む修飾基、水溶性ポリマー、小型炭素鎖リンカー、又は追加の治療部分を含む、スカフォールド部分をさらに含む医薬担体。
【００１４】
他の実施形態において、スカフォールド部分は、約１００Ｄａ．から２００，０００Ｄａ．である。好ましい実施形態において、スカフォールド部分は、約１００Ｄａ．から２０，０００Ｄａ．、２００Ｄａ．から１５，０００Ｄａ．、３００Ｄａ．から１０，０００Ｄａ．、４００Ｄａ．から９，０００Ｄａ．、５００Ｄａ．から５，０００Ｄａ．、６００Ｄａ．から２，０００Ｄａ．、１０００Ｄａ．から２００，０００Ｄａ．、５０００Ｄａ．から１００，０００Ｄａ．、１０，０００Ｄａ．から８０，０００Ｄａ．、２０，０００Ｄａ．から６０，０００Ｄａ．、又は２０，０００Ｄａ．から４０，０００Ｄａ．である。
【００１５】
本発明は、担体にコンジュゲートされた、融合された、又は共に製剤された治療化合物を含む医薬組成物を与える。担体は、ＤＢＰに結合する標的化基を含み、循環中の治療化合物の吸収、バイオアベイラビリティ、又は半減期を増加させる。本発明の医薬組成物は、単一の担体にコンジュゲートされた２つ以上の治療化合物を含み得る。本発明の医薬組成物は、治療化合物にコンジュゲートされた２つ以上の担体を含み得る。
【００１６】
一実施形態において、医薬組成物中の標的化基は、ビタミンＤ、ビタミンＤアナログ、ビタミンＤ関連代謝物、ビタミンＤ関連代謝物のアナログ、ＤＢＰに結合するペプチド、抗ＤＢＰ抗体、抗ＤＢＰ抗体誘導体、ＤＢＰに結合するヌクレオチドアプタマー、又はＤＢＰに結合する小型の炭素系分子である。
【００１７】
他の実施形態において、医薬組成物はスカフォールド部分をさらに含む。好ましい実施形態において、スカフォールド部分は、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含む修飾基、水溶性ポリマー、小型炭素鎖リンカー、又は追加の治療化合物である。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、小分子、化学物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）、核酸、核酸誘導体、ペプチド、ペプチド誘導体、天然のタンパク質、非天然のタンパク質、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ステープルドペプチド、モルホリノ、ホスホロジアミデートモルホリノ、アンチセンス薬、ＲＮＡ系サイレンシング薬、アプタマー、糖タンパク質、酵素、ホルモン、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、血液凝固因子、抗体、抗体断片、抗体誘導体、毒素結合抗体（ｔｏｘｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、代謝エフェクター、鎮痛剤、解熱剤、抗炎症剤、抗生物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、筋骨格の薬、心臓血管の薬、腎臓の薬、肺の薬、消化器疾患の薬、血液作用薬、泌尿器の薬、代謝作用薬、肝臓の薬、神経作用薬、抗糖尿病薬、抗癌剤、胃の病気を治療する薬、結腸の病気を治療する薬、皮膚病を治療する薬、又はリンパの病気を治療する薬を含み得る。
【００１９】
好ましい実施形態において、医薬組成物は、配列番号２に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＧＦ２１活性を有するタンパク質を含む。他の好ましい実施形態において、標的化基はビタミンＤである。他の好ましい実施形態において、スカフォールド部分はポリ（エチレングリコール）である。
【００２０】
最も好ましい実施形態において、本発明は、配列番号２に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＧＦ２１活性を有するタンパク質、ポリ（エチレングリコール）であるスカフォールド部分、及びビタミンＤである標的化基を含む医薬組成物を企図する。この実施形態において、標的化基は、循環中の治療化合物の吸収、バイオアベイラビリティ、又は半減期を増加させる。他の最も好ましい実施形態において、本発明は、ＦＧＦ２１活性及び配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む医薬組成物を企図する。
【００２１】
好ましい実施形態において、医薬組成物は、配列番号５に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むグレリン活性を有するタンパク質を含む。他の好ましい実施形態において、標的化基はビタミンＤである。他の好ましい実施形態において、スカフォールド部分はポリ（エチレングリコール）である。
【００２２】
最も好ましい実施形態において、本発明は、配列番号５に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むグレリン活性を有するタンパク質、ポリ（エチレングリコール）であるスカフォールド部分、及びビタミンＤである標的化基を含む医薬組成物を企図する。この実施形態において、標的化基は、循環中の治療化合物の吸収、バイオアベイラビリティ、又は半減期を増加させる。他の最も好ましい実施形態において、本発明は、グレリン活性及び配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む医薬組成物を企図する。
【００２３】
一実施形態において、医薬組成物は抗体を含む。好ましい実施形態において、抗体は、配列番号１０に対する少なくとも９０％の配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗ＴＮＦα抗体である。より好ましい実施形態において、抗ＴＮＦα抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する。他の好ましい実施形態において、標的化基はビタミンＤである。他の好ましい実施形態において、スカフォールド部分はポリ（エチレングリコール）である。
【００２４】
最も好ましい実施形態において、本発明は、配列番号１０に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗ＴＮＦα抗体、ポリ（エチレングリコール）であるスカフォールド部分、及びビタミンＤである標的化基を含む。この実施形態において、標的化基は、循環中の治療化合物の吸収、バイオアベイラビリティ、又は半減期を増加させる。
【００２５】
特定の実施形態において、本発明は、式Ｉのものを含む担体を与える：
【化１】
2015518825.tif 000003
式中、
Ｂは、ビタミンＤ、ビタミンＤアナログ、ビタミンＤ関連代謝物、ビタミンＤ関連代謝物のアナログ、ＤＢＰに結合するペプチド、抗ＤＢＰ抗体、抗ＤＢＰ抗体誘導体、ＤＢＰに結合するヌクレオチドアプタマー、又はＤＢＰに結合する小型の炭素系分子から選択される標的化基であり；
Ｓは、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含む修飾基、ポリ乳酸、水溶性ポリマー、小型炭素鎖リンカー、又は追加の治療部分を含むスカフォールド部分であり；
Ｃは、アミン反応性基、チオール反応性基、マレイミド基、チオール基、ジスルフィド基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、４−ニトロフェニルエステル、アシルイミダゾール、ハロアセチル基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、ＳＭＣＣ基、スルホＳＭＣＣ基、カルボジイミド基、及びＮＨＳ−マレイミドなどの二官能性架橋剤、又はこれらの組み合わせであり；
Ｌ１及びＬ２は、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＨＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、及び−ＮＨ−から独立に選択されるリンカーであり、
Ｌ３は、−（ＣＨ２）ｏ−であり；
ｎは、０〜３の整数であり；且つ
ｏは、０〜３の整数である。
【００２６】
特定の実施形態において、本発明は、式Ｉの担体を製造する方法であって、
【化２】
2015518825.tif 000004
式Ｉａの化合物：
【化３】
2015518825.tif 000005
を、式Ｉｂの化合物：
【化４】
2015518825.tif 000006
と、アミドカップリング剤の存在下で反応させる工程を含み、
式中、Ｂ、Ｓ、Ｃ、Ｌ２、及びＬ３が先に定義された通りであり、Ｌ１が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である方法を与える。
【００２７】
特定の他の実施形態において、本発明は、式Ｉの担体を製造する方法であって、
【化５】
2015518825.tif 000007
式Ｉａの化合物：
【化６】
2015518825.tif 000008
を、式Ｉｃの化合物：
【化７】
2015518825.tif 000009
と、アミドカップリング剤の存在下で反応させる工程、
エステルをカルボン酸に加水分解する工程、及び
カルボン酸を活性エステルに変換する工程を含み、
式中、Ｂ、Ｓ、Ｌ２、Ｌ３、並びにｎ及びｏが先に定義された通りであり、
Ｌ１が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−であり、且つ
Ｒ１がＣ１〜Ｃ６アルキルである方法を与える。
【００２８】
本発明は、有効量の本明細書に記載される１種以上の医薬組成物を投与することを含む、治療化合物を必要とする患者を治療する方法を与える。例示的な治療化合物には、小分子、化学物質、核酸、核酸誘導体、ペプチド、ペプチド誘導体、天然のタンパク質、非天然のタンパク質、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ステープルドペプチド、モルホリノ、ホスホロジアミデートモルホリノ、アンチセンス薬、ＲＮＡ系サイレンシング薬、アプタマー、糖タンパク質、酵素、ホルモン、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、血液凝固因子、抗体、抗体断片、抗体誘導体、毒素結合抗体、代謝エフェクター、鎮痛剤、解熱剤、抗炎症剤、抗生物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、筋骨格の薬、心臓血管の薬、腎臓の薬、肺の薬、消化器疾患の薬、血液作用薬、泌尿器の薬、代謝作用薬、肝臓の薬、神経作用薬、抗糖尿病薬、抗癌剤、胃の病気を治療する薬、結腸の病気を治療する薬、皮膚病を治療する薬、及びリンパの病気を治療する薬がある。
【００２９】
好ましい方法において、治療化合物は、配列番号２に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＧＦ２１活性を有するタンパク質である。他の好ましい方法において、治療化合物は、配列番号５に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むグレリン活性を有するタンパク質である。他の好ましい方法において、治療化合物は、配列番号１０に少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質に特異的に結合する抗ＴＮＦα抗体である。他の好ましい方法において、標的化基はビタミンＤであるか、又はスカフォールドはポリ（エチレングリコール）である。
【００３０】
他の実施形態及び方法において、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる製剤である。医薬組成物は、経皮、経口、非経口、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病変内、頭蓋内注射、注入、吸入、眼、局所、直腸、鼻腔内、頬側、舌下、膣内、又は埋め込みリザーバー方式により、患者に送達できる。
【００３１】
本発明は、医薬を必要とする患者の治療のための医薬の製造のための、開示された医薬組成物の使用を与える。
【００３２】
本発明は、本明細書に開示される医薬組成物を製造する方法であって、標的化基及び薬物を、結合基を利用してコンジュゲートし担体−薬物化合物にすることを含む方法を与える。結合基は、アミン反応性結合基、マレイミド結合基、システイン結合基、アルデヒド結合基、又はチオール反応性結合基でよい。マレイミドは、所望の位置で部位特異的にペプチド又はタンパク質に作り出され得る、遊離のシステイン残基上などのスルフヒドリル基に結合するのに使用される有用な結合基である。治療化合物のＮ末端に部位特異的に結合するのに使用できる、アミン基又はアルデヒドを標的とするＮＨＳなどの他の結合基は、当業者に周知である。他のさらに特殊化された結合基が企図され、当業者により替えられ得る。
【００３３】
いくつかの方法において、標的化基は、ビタミンＤ、ビタミンＤアナログ、ビタミンＤ関連代謝物、ビタミンＤ関連代謝物のアナログ、ＤＢＰに結合するペプチド、抗ＤＢＰ抗体、抗ＤＢＰ抗体誘導体、ＤＢＰに結合するヌクレオチドアプタマー、又はＤＢＰに結合する小型の炭素系分子である。
【００３４】
他の実施形態において、医薬組成物を製造する方法は、スカフォールド部分を標的化基又は薬物にコンジュゲートすることをさらに含む。スカフォールド部分は、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含む修飾基、水溶性ポリマー、小型炭素鎖リンカー、又は追加の治療化合物でよい。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、薬物に結合した担体の全般的構造を示す概略図である。担体は、標的化基、スカフォールド、及び任意選択的に結合基を含む。
【図２】図２は、担体、ビタミンＤ３−ＰＥＧ−マレイミド付加物の生成に利用された化学構造及び合成を示す反応スキームである。担体は、１）ビタミンＤアナログ（標的化基）、２）ＰＥＧスカフォールド、及び３）マレイミド結合基をコンジュゲートして生成された。
【図３】図３は、ＦＧＦ２１−担体コンジュゲートのバイオアベイラビリティ及び薬物動態である。ＦＧＦ２１のみ（配列番号３）又はビタミンＤ３−ＰＥＧ−マレイミド担体にコンジュゲートされたＦＧＦ２１を、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに０．１ｍｇ／ｋｇで皮下注射した。血漿試料を、二連でＥＬＩＳＡによりＦＧＦ２１濃度に関して分析し、１時点あたり３〜５匹の動物から得た平均を、片対数プロットグラフにプロットした。
【図４】図４は、グレリン−担体コンジュゲートの薬物動態である。グレリン（配列番号６）のみ又はビタミンＤ３−ＰＥＧ−マレイミド担体にコンジュゲートされたグレリンを、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに０．１ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。血漿試料を、二連でＥＬＩＳＡによりグレリン濃度に関して分析し、１時点あたり３〜５匹の動物から得た平均を、片対数プロットグラフにプロットした。
【図５】図５は、他の担体、ビタミンＤ３−ＰＥＧ−ＮＨＳ付加物の生成に利用された化学構造及び合成を示す反応スキームである。担体は、１）ビタミンＤアナログ（標的化基）、２）ＰＥＧスカフォールド、及び３）ＮＨＳ結合基をコンジュゲートして生成された。
【図６】図６は、インフリキシマブ−担体コンジュゲートのバイオアベイラビリティ及び薬物動態である。インフリキシマブのみ又はビタミンＤ３−ＰＥＧ−ＮＨＳ担体にコンジュゲートされたインフリキシマブを、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに１ｍｇ／ｋｇで皮下注射した。血漿試料を、インフリキシマブ特異的ＥＬＩＳＡによりインフリキシマブの濃度に関して分析し、１時点あたり３匹の動物から得た平均を線形プロットグラフにプロットした。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、治療化合物の効力、吸収、バイオアベイラビリティ、循環半減期、又は薬物動態的性質を向上させるために、治療用タンパク質、ペプチド、核酸、又は小分子に共有結合された、融合された、又は共に製剤された担体分子を与える。特定の実施形態において、担体は、標的化基、スカフォールド、及び結合基を含む。他の実施形態において、担体はスカフォールドを欠くが、それは、とりわけ、標的化基と治療化合物の間の「スペーサー」として作用する。
【００３７】
担体は、ヒト及び動物における使用に好適であるように設計される。担体は、担体に結合された、コンジュゲートされた、融合された、又は共に製剤された生物学的実体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｙ）又は化学物質の薬物動態的性質を向上させる目的を果たす。これは、標的化基とビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）との相互作用により起こり、そのため投与の部位から循環している血漿に速く効果的に分子を積極的に輸送でき、それにより分解酵素への薬物の曝露が低減する。担体は、ＤＢＰに結合することにより、薬物の循環半減期も向上させるが、それにより、腎臓の濾過を防ぐことにより薬物の効力及び治療有効性を増加させる。担体を本明細書に記載される治療化合物にコンジュゲートする方法は当技術分野に公知である。例としては、本発明の結合基を使用するコンジュゲーションは、それぞれ引用によりその全体として本明細書に組み込まれる国際公開第９３／０１２１４５号パンフレット（Ａｔａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．）及び第７，８０３，７７７号（Ｄｅｆｒｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）に記載の組成物及び方法を使用して実施できる。
【００３８】
本発明の１つ以上の実施形態を記載し特許請求するにあたり、以下の専門用語が、以下に記載の定義に従って使用されるだろう。
【００３９】
用語「吸収」は、薬物の血流への動きである。薬物は、ある投与経路により（例えば、経口、局所、若しくは経皮）、又は錠剤、カプセル剤、若しくは液剤などの特定の剤形で導入される必要がある。輸液、筋肉内注射、及び経腸栄養では、吸収に変動が少なく、バイオアベイラビリティが１００％に近いことが多い。最も速い吸収の経路は吸入である。
【００４０】
用語「拮抗剤」は、リガンドの場合１つ以上の受容体に結合し、又は受容体の場合に１つ以上のリガンドに結合することを含む、特定又は指定されたタンパク質の活性を、中和し、遮断し、阻害し、無効にし、低減し、干渉できる分子を意味する。拮抗剤には、抗体及びその抗原結合断片、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチドミメティクス、薬理的薬剤（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅｎｔｓ）及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などがある。拮抗剤には、タンパク質、ホルモン、又は他の生物活性分子の小分子阻害剤もある。拮抗剤は、融合タンパク質、受容体分子、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、又はタンパク質、ホルモン、若しくは他の生物活性分子に特異的に結合して標的へのその結合を封鎖する誘導体でもよい。
【００４１】
「抗体」（Ａｂ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、類似の構造的特徴を有する糖タンパク質を意味する。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体と、全般的に抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系により低レベルで産生され、骨髄腫により増加したレベルで産生される。
【００４２】
「アプタマー」は、特定の標的に結合するように選択された核酸系化合物である。アプタマー系治療化合物の例は、引用により本明細書にその全体として組み込まれる国際公開第０７／０３５９２２号パンフレットに見ることができる。
【００４３】
用語「バイオアベイラビリティ」は、全身循環に到達する未変化の薬物の投与された投与量の分率であり、薬物の主要な薬物動態的性質の１つである。医薬が静脈内に投与される場合、そのバイオアベイラビリティは１００％である。医薬が他の経路により（経口など）投与される場合、そのバイオアベイラビリティは一般的に低下するか（不完全な吸収及び初回通過代謝により）、又は患者により様々になり得る。バイオアベイラビリティは、非静脈内投与経路の用量を計算する場合に考慮される、薬物動態において重要なパラメーターである。
【００４４】
「担体」は、治療化合物にコンジュゲートされ、融合され、結合され、又は共に製剤されて、薬物の吸収、半減期、バイオアベイラビリティ、薬物動態的性質、又は薬力学的性質を向上させることができる化合物である。それらは、標的化基、結合基、及び任意選択的にスカフォールド部分を含む。
【００４５】
「有効量」は、必要な用量及び期間で、所望の治療的又は予防的な結果を得るのに効果的な治療化合物の量を意味する。治療化合物の「治療上有効な量」は、個人の病態、年齢、性別、及び体重、並びに抗体が個人に所望の反応を惹起する能力などの因子により変わり得る。治療上有効な量は、例えば、向上した生存率、より迅速な回復若しくは寛解、症状の改善若しくは解消、又は他の許容できるバイオマーカー若しくは代用マーカーにより測定できる。治療上有効な量は、治療化合物の有毒又は有害な作用より、治療上利益のある効果が上回るものでもある。「予防上有効な量」は、必要な用量及び期間で、所望の予防的な結果を得るのに効果的な治療化合物の量を意味する。必ずではないが典型的には、予防的な投与量は対象において疾病の前又は初期に利用されるので、予防上有効な量は治療上有効な量より少ないだろう。
【００４６】
「半減期」は、被験分子の量の半分がもはや検出されない経過時間の量を意味する、当技術分野に公知である科学用語である。インビボ半減期は、被験分子の半分が、ヒト又は動物の循環している血清又は組織にもはや検出されない経過時間を意味する。
【００４７】
「ホルモン」は、ある細胞（又は細胞の群）からシグナル伝達能力を有する他の細胞への生物学的又は化学的メッセンジャーである。本明細書に記載される通り、本発明に使用するホルモンは、ペプチド、ステロイド、フェロモン、インターロイキン、リンフォカイン、サイトカイン、又は当技術分野に公知である他のホルモンクラスのメンバーであり得る。
【００４８】
「ホモログ」は、ヌクレオチド配列レベル、ペプチド配列レベル、機能的レベル、又は構造的レベルで基準分子に類似である生物活性分子である。ホモログは、基準配列と特定のパーセントの同一性を共有する配列誘導体を含み得る。そのため、一実施形態において、ホモログ配列又は誘導配列は、少なくとも７０パーセントの配列同一性を共有する。好ましい実施形態において、ホモログ配列又は誘導配列は、少なくとも８０又は８５パーセントの配列同一性を共有する。より好ましい実施形態において、ホモログ配列又は誘導配列は、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの配列同一性を共有する。ホモログ核酸配列又は誘導核酸配列は、ハイストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で基準核酸配列に結合したままでいる能力によっても定義できる。基準分子に構造的又は機能的類似性を有するホモログは、基準分子の化学的誘導体であり得る。構造的又は機能的なホモログ並びに誘導体を検出、発生、及びスクリーニングする方法は、当技術分野に公知である。
【００４９】
「ハイブリダイゼーション」は、一般的には、相補鎖が環境中にある場合、その融解温度未満で、変性したＤＮＡがリアニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列の間の望まれる相同性の程度が高いほど、利用可能な相対温度は高くなる。結果として、より高い相対温度は反応条件をよりストリンジェントにする傾向となり、より低い温度は、ストリンジェンシーを低くする傾向になることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細及び説明には、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照されたい。
【００５０】
「個人」、「対象」、又は「患者」は、脊椎動物である。特定の実施形態において、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物には、霊長類（ヒト及びヒト以外の霊長類を含む）及びげっ歯類（例えば、マウス、ハムスター、モルモット、及びラット）があるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、哺乳動物はヒトである。「対照対象」は、個人、対象、又は患者に確認された疾病、機能不全、又は病態があると診断されていない健康な対象を意味する。対照対象には、疾病、機能不全、又は病態に関連する徴候又は症状が全くない。
【００５１】
「医薬品」は、疾病、障害、又は病態の治療のために製造された活性薬物である。
【００５２】
「モルホリノ」は、引用により本明細書にその全体として組み込まれる米国特許第８，０７６，４７６号明細書に記載されている、ホスホロジアミデート結合を利用する、天然の核酸の非天然バリアントである合成分子である。
【００５３】
「核酸」は、細胞機能を支配し得る遺伝情報を保持する高分子の群、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそのバリアントのいずれかである。核酸は、酵素様活性を持つことがあり（例えばリボザイム）、又は対象の遺伝子発現の阻害に使用されることもある（例えばＲＮＡｉ）。本明細書に記載される本発明に使用される核酸は、一本鎖でも、二本鎖でも、直鎖でも、環状でもよい。本発明は、アプタマー、ＰＮＡ、モルホリノ、又は核酸の他の非天然バリアントを含むがこれらに限定されない核酸バリアントの使用をさらに組み込む。例としては、本発明に有用な核酸は、引用によりその全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８，０７６，４７６号明細書に記載されている。
【００５４】
「患者の反応」又は「反応」は、非限定的に下記を含む、患者にとっての利益を示す任意のエンドポイントを使用して評価できる、（１）緩徐化及び完全な停止を含む、疾病の進行のある程度の阻害；（２）疾病エピソード及び／又は症状の数の低減；（３）隣接周辺臓器及び／又は組織への疾病細胞の浸潤の阻害（すなわち、低減、緩徐化、又は完全な停止）；（４）疾病の広がりの阻害（すなわち、低減、緩徐化、又は完全な停止）；（５）自己免疫状態の低下；（６）疾病に関連するバイオマーカーの発現の有利な変化；（７）疾病に関連する１つ以上の症状のある程度の緩和；（８）治療後の無病表示（ｄｉｓｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の長さの増加；又は（９）治療後のある時点での死亡率低下。
【００５５】
本明細書では、用語「ペプチド」は、２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドである。用語ペプチドは、短鎖ペプチドも（例えば、２〜１４個のアミノ酸を含むペプチド）、中鎖ペプチド（１５〜５０）も、長鎖ペプチド（例えば、タンパク質）も含む。用語ペプチド、中鎖ペプチド、及びタンパク質は本明細書では互換的に使用できる。本明細書では、用語「ペプチド」は、アミノ酸残基から構成されたポリマー、関連する天然の構造的バリアント、及びペプチド結合で結合した合成の非天然アナログ、関連する天然の構造的バリアント、及びその合成の非天然アナログを意味すると解釈される。合成ペプチドは、例えば、自動ペプチド合成機を使用して合成できる。ペプチドは、細胞、細菌、酵母、又は他の生物などの他の手段によっても合成できる。ペプチドは、遺伝子がコードした２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含むことがある。ペプチドは、プロセシング及び他の翻訳後修飾などの天然のプロセスにより修飾されたものも、化学修飾技術により修飾されたものも含む。そのような修飾は、基本的な教科書及びより詳述されたモノグラフに詳細に記載されており、当業者に周知である。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及びアミノ又はカルボキシル末端を含む、ペプチド内のどこにでも起こる。
【００５６】
本明細書では、「薬学的に許容できる担体」又は「治療上有効な担体」は、水性又は非水性（固体）、例えばアルコール性又は油性、又はこれらの混合物であり、界面活性剤、軟化薬、潤滑剤、安定剤、染料、香料、保存剤、ｐＨ調整用の酸若しくは塩基、溶媒、乳化剤、ゲル化剤、保湿剤、安定剤、湿潤剤、時間放出剤（ｔｉｍｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｇｅｎｔ）、保水剤、又は特定の形態の医薬組成物に通常含まれる他の成分を含み得る。薬学的に許容できる担体は当技術分野に周知であり、例えば、水又は生理学的に緩衝された塩水などの水溶液、又は他の溶媒若しくはビヒクル、例えばグリコール、グリセロール、及びオリーブ油又は注射用有機エステルなどの油類がある。薬学的に許容できる担体は、例えば、特定の阻害剤の吸収を安定化又は増加させるように働く生理的に許容できる化合物、例えば、グルコース、スクロース又はデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸又はグルタチオンなどの酸化防止剤、キレート剤、低分子量タンパク質、又は他の安定剤若しくは賦形剤を含み得る。
【００５７】
用語「薬物動態」は、治療化合物の吸収、分布、代謝、及び排泄の時間経過であると現在定義されている。向上した「薬物動態的性質」は、特定の治療化合物に望まれる１つ以上の薬物動態的性質を向上させることと定義される。例には、代謝又は分泌による排出を低減すること、薬物吸収を増加させること、半減期を延ばすこと、及び／又はバイオアベイラビリティを増加させることがあるが、これらに限定されない。
【００５８】
「ＰＮＡ」は、ＤＮＡ又はＲＮＡに類似の化学構造を持つペプチド核酸を意味する。ペプチド結合は、ヌクレオチド又はヌクレオシドを結合するために利用される。
【００５９】
「スカフォールド」は、他の分子が共有結合若しくは非共有結合で自身に結合するか、又は製剤される分子である。本発明のスカフォールドは、標的化基と薬物の間の「スペーサー」又は「リンカー」として作用し得る。スカフォールドは、反応性リンカーを含むこともあり、薬物に追加的に有益な治療性を有することもある。そのため、本発明のスカフォールドは、例えば、ＰＥＧ、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、反応性リンカーを含む修飾基、水溶性ポリマー、又は治療化合物のことがある。
【００６０】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者により容易に決定可能であり、プローブの長さ、洗浄温度、及び塩の濃度に依存する経験的計算である。一般に、プローブが長いほど適切なアニーリングに高温が必要であり、プローブが短いほど低温が必要である。
【００６１】
本明細書に定義される「ストリンジェントな条件」又は「ハイストリンジェンシー条件」は、以下により定義され得る：（１）洗浄に、低イオン強度及び高温を利用するもの、例えば、５０℃で０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム；（２）ハイブリダイゼーションの間に、ホルムアミドなどの変性剤を利用するもの、例えば、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ６．５）と、７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム；又は（３）４２℃での、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（５０μｌ／ｍ１）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％硫酸デキストランを利用する溶液中での一晩のハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中４２℃での１０分間の洗浄、それに続いて、５５℃のＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる１０分間のハイ−ストリンジェンシー洗浄。
【００６２】
本明細書に開示される「治療化合物」は、対象に投与されて疾病若しくは機能不全を治療するか、又は他の方法で個人の健康に影響を与える小分子、化学物質、核酸、核酸誘導体、ペプチド、ペプチド誘導体、天然のタンパク質、非天然のタンパク質、糖タンパク質、及びステロイドを意味する。治療化合物の非限定的な例には、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体又は抗体断片、抗体誘導体などのポリペプチド、代謝機能に影響する薬物、並びに、鎮痛剤、解熱剤、抗炎症剤、抗生物質、抗ウイルス化合物、抗真菌化合物、心臓血管薬、腎機能、電解質代謝に影響する薬物、中枢神経系に作用する薬物、化学療法化合物、受容体作動剤、及び受容体拮抗剤などの有機化合物がある。治療化合物には、例えば、血清アルブミン、免疫グロブリン、アポリポタンパク質、若しくはトランスフェリンなどの血漿タンパク質、又は赤血球若しくはリンパ球の表面に存在するタンパク質があるがこれらに限定されない血清因子などの細胞外分子がある。そのため、例示的な治療化合物は、小分子、化学物質、核酸、核酸誘導体、ペプチド、ペプチド誘導体、天然のタンパク質、非天然のタンパク質、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ステープルドペプチド、ホスホロジアミデートモルホリノ、アンチセンス薬、ＲＮＡ系サイレンシング薬、アプタマー、糖タンパク質、酵素、ホルモン、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、血液凝固因子、抗体、抗体断片、抗体誘導体、毒素結合抗体、代謝エフェクター、鎮痛剤、解熱剤、抗炎症剤、抗生物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、筋骨格の薬、心臓血管の薬、腎臓の薬、肺の薬、消化器疾患の薬、血液作用薬、泌尿器の薬、代謝作用薬、肝臓の薬、神経作用薬、抗糖尿病薬、抗癌剤、胃の病気を治療する薬、結腸の病気を治療する薬、皮膚病を治療する薬、及びリンパの病気を治療する薬を含む。本明細書での用語「治療化合物」は、基本的に、用語「薬物」又は「治療剤」と同じ意味を有する。
【００６３】
本明細書では、「治療」は、治療される個人又は細胞の自然の経過を変えようとする臨床介入を意味し、臨床病理の過程の前又はその間に実施できる。治療の望ましい効果には、疾病又はその状態若しくは症状の発生又は再発の予防、疾病の状態又は症状の緩和、疾病の直接又は間接の病理的な結果の減少、疾病進行の速度の低減、疾病状態の寛解又は軽減、軽快又は改善された予後の達成がある。いくつかの実施形態において、本発明の方法及び組成物は、疾病又は疾患の発生を遅延する試みに有用である。
【００６４】
「ビタミン」は、当技術分野における認識された用語であり、体の正常な成長及び活動のために微量で欠くことのできない脂溶性又は水溶性有機物質であると定義され、植物性又は動物性の食品又はサプリメントから自然に得られる。
【００６５】
「ビタミンＤ」は、一群の脂溶性セコステロイドである。いくつかの形態（ビタマー）のビタミンＤが存在する。主要な２つの形態は、ビタミンＤ２すなわちエルゴカルシフェロール及びビタミンＤ３すなわちコレカルシフェロールである。下付き文字のないビタミンＤは、Ｄ２とＤ３のいずれか又は両方を意味する。ヒトでは、ビタミンＤは、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）又はエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）として摂取される。さらに、ヒトは、日光の曝露が充分であると、コレステロールからビタミンＤを合成できる。
【００６６】
「ビタミンＤ結合タンパク質」又は「ＤＢＰ」は、いろいろな活性の中でも、ビタミンＤ及びそのアナログに結合して、ビタミンがその活性型に修飾される肝臓及び腎臓中の部位に輸送できる、全哺乳動物に見られる自然に循環している血清タンパク質であり、それは、ビタミンＤをその種々の形態で、ヒトで平均３０日間循環した状態に保つ。ＤＢＰタンパク質配列は、配列番号７に開示されており、ＤＢＰタンパク質配列をコードする例示的な核酸配列は、配列番号８に開示されている。ＤＢＰは、複数の天然のアイソフォームを有する。例示的なアイソフォームは、公共の配列データベースで利用できる（例えば、受託番号ＮＭ＿００１２０４３０６．１、ＮＭ＿００１２０４３０７．１、ＮＭ＿０００５８３．３、ＢＣ０３６００３．１、Ｍ１２６５４．１、Ｘ０３１７８．１、ＡＫ２２３４５８、Ｐ＿００１１９１２３５．１、ＮＰ＿０００５７４．２、ＡＡＡ６１７０４．１、ＡＡＤ１３８７２．１、ＮＰ＿００１１９１２３６．１、ＡＡＡ１９６６２．２、Ｉ５４２６９、Ｐ０２７７４．１、ＥＡＸ０５６４５．１、ＡＡＨ５７２２８．１、ＡＡＡ５２１７３．１、ＡＡＢ２９４２３．１、ＡＡＤ１４２４９．１、ＡＡＤ１４２５０．１、及びＢＡＤ９７１７８．１）。
【００６７】
本発明は、実質的にＤＢＰ活性を保持する保存的又は非保存的アミノ酸置換を含むＤＢＰバリアント及びホモログの使用を企図する。ＤＢＰ結合分子又は機能的ＤＢＰバリアントは、公知の技術を利用して特定でき、公知の方法を利用して特性化できる（Ｂｏｕｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．６（１０）：１０５１−７（１９９１），Ｔｅｅｇａｒｄｅｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９（２）：２９３−２９９（１９９１），ＭｃＬｅｏｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６４（２）：１２６０−７（１９８９），Ｒｅｖｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：４６９−４７４（１９８５））。上記引用文献は、引用によりその全体として本明細書に組み込まれる。
【００６８】
用語「水溶性」は、水にいくらかの検出可能な程度の溶解度を有する部分を意味する。水溶性を検出及び／又は定量化する方法は、当技術分野に周知である。例示的な水溶性ポリマーには、ペプチド、糖類、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）などがある。
【００６９】
本発明は、タンパク質、ペプチド、他の生物製剤、核酸、及び小分子薬物の投与のための効果的な経路を与える。本発明は、経皮、経口、非経口、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病変内、頭蓋内注射、注入、吸入、眼、局所、直腸、鼻腔内、頬側、舌下、膣内、又は埋め込みリザーバー方式による、薬物投与の効果的な経路をさらに与える。
【００７０】
さらに、本明細書に記載される本発明は、治療化合物に、標的結合活性、すなわち薬力学（ＰＤ）を維持する組成物及び方法を与える。それは、本明細書に記載される治療化合物の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを向上させる組成物及び方法もさらに与える。本発明は、同じ投与経路又は異なる投与経路を利用するが本明細書に記載される本発明のない薬物の薬物吸収プロファイルと比べて、向上した薬物吸収プロファイルのための組成物及び方法をさらに与える。本発明は、同じ投与経路又は異なる投与経路を利用するが本明細書に記載される本発明のない薬物の薬物バイオアベイラビリティプロファイルと比べて、向上した薬物バイオアベイラビリティプロファイルのための組成物及び方法をさらに与える。本発明は、同じ投与経路又は異なる投与経路を利用するが本明細書に記載される本発明のない薬物の薬物半減期プロファイルと比べて、向上した薬物半減期プロファイルのための組成物及び方法をさらに与える。
【００７１】
本発明は、本明細書に記載される本発明のない薬物と比べて、より経済的で患者に好都合な薬物投与の代替経路も与える。
【００７２】
本発明は、薬物の吸収、半減期、バイオアベイラビリティ、又は薬物動態的性質を向上させるために、活性な治療化合物にコンジュゲートされ、融合され、又は共に製剤され得る担体として作用する分子を使用するための組成物及び方法を提供する。担体は、体の天然のＤＢＰに結合する性質を有する。本発明の一態様は、天然のＤＢＰの使用により、担体−薬物複合体を、投与部位から循環する血清に輸送することを与える。本発明の他の態様は、天然のＤＢＰの使用により、薬物を長時間循環中に保持することである。これにより、体からのその排泄を妨げ、体内の治療化合物の曝露を増加させて、より長く続く治療効果を得ることができる。本発明の他の態様において、コンジュゲートされず、融合されず、製剤されていない薬物と比べて、担体にコンジュゲートされ、融合され、又は共に製剤されている場合、要求される薬物の投与量がより低い。本発明の他の態様は、治療化合物に結合している場合、はるかに大きいＰＥＧ化合物の機能に代わって担体を使用することである。これにより、コンジュゲートされ、融合され、又は製剤された化合物の薬物動態プロファイル及び有効性を向上させることができる。
【００７３】
本発明は、好ましくは１つ以上の部分又は構成要素から構成される担体分子を与える。一実施形態において、担体は、標的化基及び、標的化基を治療化合物に結合するための結合基を含む。他の実施形態において、担体は、標的化基及び治療化合物に結合したスカフォールド部分を含む。標的化基は、ビタミンＤ、ビタミンＤアナログ、ビタミンＤ関連代謝物、ビタミンＤ関連代謝物アナログ、又はビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）に結合でき、若しくは相互作用できる他の分子である。一実施形態において、標的化基は、抗体又は抗体誘導体、ＤＢＰ又はその断片に結合するように設計されたペプチド、ＤＢＰ又はその断片に対して選択されたファージディスプレイ又は他のペプチドライブラリーから誘導されたペプチド、ＤＢＰに結合するヌクレオチドアプタマー、ＤＢＰに結合するように設計された、又はＤＢＰ若しくはその断片に対して選択された化合物ライブラリーから誘導された小分子である。
【００７４】
本発明の治療化合物担体コンジュゲートは、典型的には、個別に治療化合物に結合している約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の標的化基を有する。一実施形態において、本発明の担体コンジュゲートは、個別に治療化合物に結合している約４個の標的化基、又は個別に治療化合物に結合している約３個の標的化基、又は個別に治療化合物に結合している約２個の標的化基、又は治療化合物に結合している約１個の標的化基を含むだろう。治療化合物に結合している標的化基のそれぞれの構造は、同じでも異なっていてもよい。好ましい実施形態において、１つ以上の標的化基は、治療用タンパク質のＮ末端で治療化合物に安定に結合している。他の好ましい実施形態において、１つ以上の標的化基は、治療用タンパク質のＣ末端で治療用タンパク質に安定に結合している。他の好ましい実施形態において、１つ以上の標的化基は、治療用タンパク質の他の部位に安定に結合していることがある。例えば、治療化合物担体コンジュゲートは、Ｎ末端に結合した標的化基及び追加的にリジン残基に結合した標的化基を含み得る。他の実施形態において、治療化合物担体コンジュゲートは、グリコシル化部位の一部としての糖残基などの修飾により、又はペプチドのアシル化部位上で治療用タンパク質に結合した標的化基、又はリン酸化部位若しくは当業者に周知の他の天然若しくは非天然の修飾に結合した標的化基を有する。上述の部位の組み合わせを利用する結合部位も企図される。本発明のある好ましい実施形態は、治療化合物のある特異的な部位で治療化合物に結合している標的化基を含む。他の好ましい実施形態において、タンパク質上の結合部位は、システインでも、リジンでも、Ｎ末端でも、Ｃ末端でもよい。
【００７５】
他の実施形態において、スカフォールドは、薬学的に許容できる担体である。好ましい実施形態において、スカフォールドは、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含む修飾基、水溶性ポリマー、小型炭素鎖リンカー、又は追加の治療部分である。
【００７６】
一実施形態において、水溶性スカフォールド部分は、水に対していくらかの検出可能な程度の溶解度を有する。水溶性を検出及び／又は定量化する方法は、当技術分野に周知である。例示的な水溶性ポリマーには、ペプチド、糖類、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）などがある。
【００７７】
ペプチドは、混合された配列を有しても、単一のアミノ酸、例えば、ポリ（リジン）で構成されていてもよい。例示的な多糖類はポリ（シアル酸）である。例示的なポリ（エーテル）はポリ（エチレングリコール）、例えば、ｍ−ＰＥＧである。ポリ（エチレンイミン）は例示的なポリアミンであり、ポリ（アクリル）酸は代表的なポリ（カルボン酸）である。水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）（すなわちＰＥＧ）でよい。しかし、他の関連ポリマーも本発明の実施での使用に好適であり、用語ＰＥＧ又はポリ（エチレングリコール）の使用がこの点で包括的であり、排他的でないものとすることを理解されたい。用語ＰＥＧは、その形態のいずれにあるポリ（エチレングリコール）も含み、アルコキシＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、分岐鎖ＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ（すなわち、１つ以上の官能基がポリマー骨格に懸垂しているＰＥＧ又は関連ポリマー）、又は中に分解性結合を有するＰＥＧを含む。ポリマー骨格は、直鎖でも分岐鎖でもよい。
【００７８】
分岐鎖ポリマー骨格は、一般的に当技術分野に公知である。典型的には、分岐鎖ポリマーは、中心の分岐コア部分及び中心分岐コアに結合した複数の直鎖ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、通常、エチレンオキシドを種々のポリオールに、例えばグリセロール、ペンタエリスリトール、及びソルビトールに付加して調製できる分岐鎖形態で使用されている。中心の分岐部分は、リジンなどのいくつかのアミノ酸からも誘導できる。分岐鎖ポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍとして一般形態で表すことができるが、Ｒはグリセロール又はペンタエリスリトールなどのコア部分を表し、ｍはアームの数を表す。引用により本明細書にその全体として組み込まれる米国特許第５，９３２，４６２号明細書に記載されるものなどのマルチアームＰＥＧ分子もポリマー骨格として使用できる。
【００７９】
多くの他のポリマーも本発明に好適である。非ペプチド性で水溶性であり、２から約３００の末端を持つポリマー骨格は、本発明に特に有用である。好適なポリマーの例には、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）などの他のポリ（アルキレングリコール）、エチレングリコールとプロピレングリコールなどのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリビニルピロリドン）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、引用により本明細書にその全体として組み込まれる米国特許第５，６２９，３８４号明細書に記載のものなどのポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、並びにこれらのコポリマー、ターポリマー、及び混合物があるが、これらに限定されない。ポリマー骨格の各鎖の分子量はさまざまになり得るが、典型的には約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの範囲である。
【００８０】
他の実施形態において、スカフォールド部分は、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含む修飾基、水溶性ポリマー、小型炭素鎖リンカー、又は追加の治療化合物でよい。一実施形態において、スカフォールド部分はヒト及び動物にとって非毒性である。他の実施形態において、スカフォールドは内在性の血清タンパク質である。他の実施形態において、スカフォールド部分は水溶性ポリマーである。他の実施形態において、スカフォールドは非天然ポリマーである。他の実施形態において、スカフォールドは、追加の部分（例えば、ＰＥＧ、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（アスパルテート）、生体分子、治療用部分、又は診断用部分）への共有結合により修飾されている天然の部分である。
【００８１】
ＰＥＧなどの親水性ポリマーのコンジュゲーションは当技術分野に公知である。その最も通常の形態では、ＰＥＧは、各末端がヒドロキシル基である直鎖ポリマーである：ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ、式中、ｎは、典型的には、約３から約４０００の範囲である。好ましい実施形態において、ＰＥＧは、基本的に単分散である分子量分布を有する。他の好ましい実施形態において、ＰＥＧは直鎖ポリマーである。他の好ましい実施形態において、ＰＥＧは分岐ポリマーである。
【００８２】
多くの末端官能化誘導体又は分岐誘導体並びに種々のサイズが当技術分野に公知であり、市販されている。例としては、ＰＥＧ又はＰＥＯのコンジュゲーションは、本明細書に記載並びにそれぞれ引用により本明細書にその全体として組み込まれる米国特許第７，８０３，７７７号明細書（Ｄｅｆｒｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）及び同第４，１７９，３３７号明細書（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）に記載の組成物及び方法を利用して実施できる。
【００８３】
いくつかの実施形態において、小さめの治療化合物は小さめのスカフォールド部分と組み合わされ、大きめの治療化合物は大きめのスカフォールド部分と組み合わされる。しかし、小さめの治療化合物を大きめのスカフォールド部分と組み合わせることができ、逆も同様であることが企図される。小さめの治療化合物は、１Ｄａから１０ｋＤａの分子量を持つものと定義される。大きめの治療化合物は、１０ｋＤａから１０００ｋＤａの分子量を持つものと定義される。
【００８４】
本発明のスカフォールドは、例えば、１００ダルトン（Ｄａ．）、５００Ｄａ．、１０００Ｄａ．、２０００Ｄａ．、５０００Ｄａ．、１０，０００Ｄａ．、１５，０００Ｄａ．、２０，０００Ｄａ．、３０，０００Ｄａ．、４０，０００Ｄａ．又は６０，０００Ｄａ．の分子量を有し得る。本発明の一実施形態において、「小さい」スカフォールド部分は、約１００Ｄａ．から２０，０００Ｄａ．であり得る。他の実施形態において、「大きい」スカフォールド部分は、約２０，０００Ｄａ．を超え約２００，０００Ｄａ．になり得る。好ましい実施形態において、スカフォールド部分は、約１００Ｄａ．から２００，０００Ｄａ．である。より好ましい実施形態において、スカフォールド部分は、約１００Ｄａ．から２０，０００Ｄａ．、２００Ｄａ．から１５，０００Ｄａ．、３００Ｄａ．から１０，０００Ｄａ．、４００Ｄａ．から９，０００Ｄａ．、５００Ｄａ．から５，０００Ｄａ．、６００Ｄａ．から２，０００Ｄａ．、１０００Ｄａ．から２００，０００Ｄａ．、２０，００Ｄａ．から２００，０００Ｄａ．、１００，０００から２００，０００Ｄａ．、５０００Ｄａ．から１００，０００Ｄａ．、１０，０００Ｄａ．から８０，０００Ｄａ．、２０，０００Ｄａ．から６０，０００Ｄａ．、又は２０，０００Ｄａ．から４０，０００Ｄａ．である。
【００８５】
担体分子の他の構成要素は、好ましくは、スカフォールド又は担体に薬物を共有結合するのに使用される結合基を含む。本発明の結合基には、アミン反応性基、チオール反応性基、マレイミド基、チオール基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、ハロアセチル基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、ＳＭＣＣ基、スルホＳＭＣＣ基、カルボジイミド基、及びＮＨＳ−マレイミドなどの二官能性架橋剤、これらの組み合わせ、又は当業者に周知である他の結合基がある。本発明の結合基は、チオール結合、アミド結合、オキシム結合、ヒドラゾン結合、チアゾリジノン結合を促進することができ、クリックケミストリーとも呼ばれる環化付加反応を利用して担体を治療化合物に結合することもできる。他の実施形態において、組成物は、好ましくは、スカフォールド分子の結合基に結合した１つ以上の治療化合物の組み合わせを含む。
【００８６】
ＮＨＳ基は、結合の部位で操作する必要なく、天然のペプチド及びタンパク質にカップリングするのに有用であると、当業者に公知である。ＮＨＳ基は、リジン残基などのアミン基を有するアミノ酸を含むほとんどのタンパク質及びペプチドへの結合を可能にする。タンパク質構造及び反応時間が、結合部位及び治療化合物にコンジュゲートされる担体分子の数に影響を与え得るので、ＮＨＳ基を利用すると担体コンジュゲーションの部位に柔軟性ができる。例としては、ＮＨＳ−担体と治療化合物のモル比を制御することにより、当業者は、治療化合物に結合する担体分子の数をいくらか制御することができ、そのため、望まれる場合、２つ以上の担体が、ある治療化合物にコンジュゲートするのが可能となる。
【００８７】
治療化合物への担体のコンジュゲーションは、分子の溶液を、特定のモル比で、適合性のある溶液、緩衝液、又は溶媒を使用して混合することにより達成される。例えば、担体と治療化合物の１：１、２：１、４：１、５：１、１０：１、２０：１、２５：１、５０：１、１００：１、１０００：１、又は１：２、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：２５、１：５０、１：１００、若しくは１：１０００のモル比を利用できる。特定の実施形態において、担体と治療化合物の１：１、２：１、４：１、５：１、１０：１、２０：１、２５：１又は１：２、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：２５、１：５０のモル比を利用できる。好ましい実施形態において、担体と治療化合物の１：１、２：１、４：１、５：１、１０：１又は１：２、１：４、１：５、１：１０のモル比を利用できる。比率を変えれば、治療化合物に結合する個別の担体の数を変えることができ、結合の特定の部位を選択するのを助けることができる。担体の結合は、ｐＨ、緩衝剤、塩、及び温度にも依存し、他のパラメーターの中でもこれらのパラメーターを変えると、結合部位、結合する担体の数、及び反応のスピードに影響を与えることができる。例えば、反応にｐＨ６以下のｐＨを選択すると、担体のアルデヒドバージョンが選択的に治療用タンパク質又はペプチドのＮ末端にコンジュゲートするのを助けることができる。
【００８８】
特定の実施形態において、本発明は、
Ｂが、ビタミンＤ、ビタミンＤアナログ、ビタミンＤ関連代謝物、ビタミンＤ関連代謝物のアナログ、ＤＢＰに結合するペプチド、抗ＤＢＰ抗体、抗ＤＢＰ抗体誘導体、ＤＢＰに結合するヌクレオチドアプタマー、又はＤＢＰに結合する小型の炭素系分子から選択される標的化基であり；
Ｓが、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含む修飾基、ポリ乳酸、水溶性ポリマー、小型炭素鎖リンカー、又は追加の治療化合物を含むスカフォールド部分であり；
Ｃが、アミン反応性基、チオール反応性基、マレイミド基、チオール基、ジスルフィド基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、４−ニトロフェニルエステル、アシルイミダゾール、ハロアセチル基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、ＳＭＣＣ基、スルホＳＭＣＣ基、カルボジイミド基、及びＮＨＳ−マレイミドなどの二官能性架橋剤、又はこれらの組み合わせであり；
Ｌ１及びＬ２が、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＨＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、及び−ＮＨ−から独立に選択されるリンカーであり；
Ｌ３が−（ＣＨ２）ｏ−であり；
ｎが０〜３の整数であり；且つ
ｏが０〜３の整数である、式Ｉのものを含む担体を与える。
【化８】
2015518825.tif 000010
【００８９】
好ましい実施形態において、本発明は、
Ｂが、ビタミンＤ、ビタミンＤアナログ、ビタミンＤ関連代謝物、ビタミンＤ関連代謝物のアナログ、又はＤＢＰに結合する小型の炭素系分子から選択される標的化基であり；
Ｓが、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、アミノ酸、核酸、グリカン、ポリ乳酸、水溶性ポリマー、又は小型炭素鎖リンカーを含むスカフォールド部分であり；
Ｃが、マレイミド基、チオール基、ジスルフィド基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、ヨードアセチル基、又はブロモアセチル基であり；
Ｌ１及びＬ２が、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＨＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、及び−ＮＨ−から独立に選択されるリンカーであり；
Ｌ３が−（ＣＨ２）ｏ−であり；
ｎが０〜３の整数であり；且つ
ｏが０〜３の整数である、式Ｉのものを含む担体を与える。
【化９】
2015518825.tif 000011
【００９０】
より好ましい実施形態において、本発明は、
Ｂが、ビタミンＤ、ビタミンＤアナログ、又はビタミンＤ関連代謝物から選択される標的化基であり；
Ｓが、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、又はポリ（プロピレングリコール）を含むスカフォールド部分であり；
Ｃが、マレイミド基、ジスルフィド基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、又はヨードアセチル基であり；
Ｌ１及びＬ２が、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＨＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、及び−ＯＣ（Ｏ）−から独立に選択されるリンカーであり；
Ｌ３が−（ＣＨ２）ｏ−であり；
ｎが０〜３の整数であり；且つ
ｏが０〜３の整数である、式Ｉのものを含む担体を与える。
【化１０】
2015518825.tif 000012
【００９１】
最も好ましい実施形態において、本発明は、
Ｂが、ビタミンＤ、ビタミンＤアナログ、又はビタミンＤ関連代謝物から選択される標的化基であり；
Ｓが、ポリ（エチレングリコール）、又はポリ（プロピレングリコール）を含むスカフォールド部分であり；且つ
Ｃが、マレイミド基、ジスルフィド基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、又はヨードアセチル基であり；
Ｌ２が−（ＣＨ２）ｎ−であり；
Ｌ３が−（ＣＨ２）ｏ−であり；
ｎが１であり；且つ
ｏが２である、式ＩＩａ及びＩＩｂのものを含む担体を与える。
【化１１】
2015518825.tif 000013
【００９２】
式ＩＩａの特定の最も好ましい実施形態において、Ｂは式ＩＩＩにより表され、Ｓはポリ（エチレングリコール）であり、Ｌ３−Ｃは式ＩＶａにより表される。
【化１２】
2015518825.tif 000014
【００９３】
式ＩＩｂの特定の最も好ましい実施形態において、Ｂは式ＩＩＩにより表され、Ｓはポリ（エチレングリコール）であり、Ｌ２−Ｃは式ＩＶｂにより表される。
【化１３】
2015518825.tif 000015
【００９４】
特定の最も好ましい実施形態において、Ｓは、約１００Ｄａ．から２００，０００Ｄａ．である。他の最も好ましい実施形態において、スカフォールド部分は、約１００Ｄａ．から２０，０００Ｄａ．、２００Ｄａ．から１５，０００Ｄａ．、３００Ｄａ．から１０，０００Ｄａ．、４００Ｄａ．から９，０００Ｄａ．、５００Ｄａ．から５，０００Ｄａ．、６００Ｄａ．から２，０００Ｄａ．、１０００Ｄａ．から２００，０００Ｄａ．、５０００Ｄａ．から１００，０００Ｄａ．、１０，０００Ｄａ．から８０，０００Ｄａ．、２０，０００Ｄａ．から６０，０００Ｄａ．、又は２０，０００Ｄａ．から４０，０００Ｄａ．である。
【００９５】
具体的な実施形態において、本発明は、式Ｖにより表される担体を与える。
【化１４】
2015518825.tif 000016
【００９６】
他の具体的な実施形態において、本発明は、式ＶＩにより表される担体を与える。
【化１５】
2015518825.tif 000017
【００９７】
特定の実施形態において、本発明は、式Ｉの担体を製造する方法であって、
【化１６】
2015518825.tif 000018
式Ｉａの化合物：
【化１７】
2015518825.tif 000019
を、式Ｉｂの化合物：
【化１８】
2015518825.tif 000020
と、アミドカップリング剤の存在下で反応させる工程を含み、
式中、Ｂ、Ｓ、Ｃ、及びＬ２が先に定義された通りであり、Ｌ１が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である方法を与える。
【００９８】
当業者は、式Ｉｂの化合物を、遊離塩基としても、好適な塩形態としても使用できることを認識するだろう。好適な塩形態には、ＴＦＡ、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＭｓＯＨ、ＴｆＯＨ、及びＡｃＯＨがあるが、これらに限定されない。
【００９９】
任意の好適なアミドカップリング剤を使用して、式Ｉの化合物を形成できる。好適なアミドカップリング剤には、２−クロロメチルピリジニウムヨージド、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＤＣＣ、ＥＤＣＩ、ＴＢＴＵ、及びＴ３Ｐがあるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は単独で使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰなどの共試薬（ｃｏ−ｒｅａｇｅｎｔ）と共に使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンなどの塩基と共に使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰなどの共試薬と、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンなどの塩基の両方と共に使用される。当業者は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰ以外の共試薬を使用できることを認識するだろう。さらに、当業者は、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミン以外の塩基を使用できることを認識するだろう。
【０１００】
特定の実施形態において、式Ｉａのカルボン酸成分は、式Ｉｄのエステルを、加水分解剤により処理して製造される：
【化１９】
2015518825.tif 000021
式中、Ｂは先に定義された通りであり、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６の分岐鎖又は非分岐鎖のアルキル基である。
【０１０１】
任意の好適な加水分解剤を使用して、式Ｉａの化合物を式Ｉｄの化合物から調製できる。
【０１０２】
他の特定の実施形態において、本発明は、式Ｉｇの担体を製造する方法であって、
【化２０】
2015518825.tif 000022
式Ｉａの化合物：
【化２１】
2015518825.tif 000023
を、式Ｉｃの化合物：
【化２２】
2015518825.tif 000024
と、アミドカップリング剤の存在下で反応させて式Ｉｅの化合物を形成する工程；
式Ｉｅのエステルを加水分解して式Ｉｆのカルボン酸にする工程；及び
【化２３】
2015518825.tif 000025
式Ｉｆのカルボン酸を式Ｉの活性なエステルに変換する工程；
【化２４】
2015518825.tif 000026
を含み、式中、Ｂ、Ｓ、Ｃ、Ｒ１、Ｌ２、Ｌ３、ｎ、及びｏが先に定義された通りであり、Ｌ１が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である方法を与える。
【０１０３】
当業者は、式Ｉｃの化合物が、遊離塩基としても、好適な塩の形態としても使用できることを認識するだろう。好適な塩の形態には、ＴＦＡ、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＭｓＯＨ、ＴｆＯＨ、及びＡｃＯＨがあるが、これらに限定されない。
【０１０４】
任意の好適なアミドカップリング剤を使用して、式Ｉｅの化合物を形成できる。好適なアミドカップリング剤には、２−クロロメチルピリジニウムヨージド、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＤＣＣ、ＥＤＣＩ、ＴＢＴＵ、及びＴ３Ｐがあるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は単独で使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰなどの共試薬と共に使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンなどの塩基と共に使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰなどの共試薬と、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンなどの塩基の両方と共に使用される。当業者は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰ以外の共試薬を使用できることを認識するだろう。さらに、当業者は、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミン以外の塩基を使用できることを認識するだろう。
【０１０５】
特定の実施形態において、式Ｉａのカルボン酸成分は、式Ｉｄのエステルを加水分解剤により処理して製造される：
【化２５】
2015518825.tif 000027
式中、Ｂは先に定義された通りであり、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６の分岐鎖又は非分岐鎖のアルキル基である。
【０１０６】
任意の好適な加水分解剤を使用して、式Ｉａの化合物を式Ｉｄの化合物から調製できる。好適な加水分解剤には、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、及び水酸化カリウムがあるが、これらに限定されない。
【０１０７】
任意の好適な加水分解剤を使用して、式Ｉｆの化合物を式Ｉｅの化合物から調製できる。好適な加水分解剤には、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、及び水酸化カリウムがあるが、これらに限定されない。
【０１０８】
任意の好適な脱離基を、好適なカップリング試薬の存在下で式Ｉｆのカルボン酸とカップリングして、式Ｉの活性エステルを形成できる。好適な脱離基には、イミダゾール、ＨＯＢＴ、ＮＨＳ、及び４−ニトロフェノールがあるが、これらに限定されない。好適なカップリング試薬には、２−クロロメチルピリジニウムヨージド、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＤＣＣ、ＥＤＣＩ、ＴＢＴＵ、及びＴ３Ｐがあるが、これらに限定されない。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、式Ｉの活性エステルは、好適な脱離基とカップリング試薬の組み合わせを使用して、式Ｉｆのカルボン酸から形成される。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、式Ｉの活性エステルは、脱離基を生成しカップリング反応も起こす単一の試薬を使用して、式Ｉｆのカルボン酸から形成される。そのような試薬には、１，１’−カルボニルジイミダゾール、炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル、トリフルオロ酢酸４−ニトロフェニル、及びＨＢＴＵがあるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、単一の試薬が単独で使用される。他の実施形態において、単一の試薬は、アシル転移触媒と共に使用される。そのようなアシル転移触媒には、ＤＭＡＰ及びピリジンがあるが、これらに限定されない。当業者は、追加のアシル転移触媒を使用してよいことを認識するだろう。
【０１１１】
具体的な実施形態において、本発明は、式Ｖにより表される担体を製造する方法であって、
【化２６】
2015518825.tif 000028
式Ｖａの化合物：
【化２７】
2015518825.tif 000029
を、式Ｖｂの化合物：
【化２８】
2015518825.tif 000030
と、アミドカップリング剤の存在下で反応させる工程を含む方法を与える。当業者は、式Ｖｂの化合物が、遊離塩基としても、好適な塩の形態としても使用できることを認識するだろう。好適な塩の形態には、ＴＦＡ、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＭｓＯＨ、ＴｆＯＨ、及びＡｃＯＨがあるが、これらに限定されない。
【０１１２】
任意の好適なアミドカップリング剤を使用して、式Ｖの化合物を形成できる。好適なアミドカップリング剤には、２−クロロメチルピリジニウムヨージド、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＤＣＣ、ＥＤＣＩ、ＴＢＴＵ、及びＴ３Ｐがあるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、単独で使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰなどの共試薬と共に使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンなどの塩基と共に使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰなどの共試薬と、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンなどの塩基の両方と共に使用される。当業者は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰ以外の共試薬を使用できることを認識するだろう。さらに、当業者は、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミン以外の塩基を使用できることを認識するだろう。
【０１１３】
具体的な実施形態において、式Ｖａのカルボン酸成分は、式Ｖｃのメチルエステルを加水分解剤により処理して製造される。
【化２９】
2015518825.tif 000031
【０１１４】
任意の好適な加水分解剤を使用して、式Ｖａの化合物を式Ｖｃの化合物から調製できる。好適な加水分解剤には、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、及び水酸化カリウムがあるが、これらに限定されない。
【０１１５】
他の具体的な実施形態において、本発明は、式ＶＩにより表される担体を製造する方法であって、
【化３０】
2015518825.tif 000032
式Ｖａの化合物：
【化３１】
2015518825.tif 000033
を、式ＶＩａの化合物：
【化３２】
2015518825.tif 000034
と、アミドカップリング剤の存在下で反応させて式ＶＩｂの化合物を形成する工程；
式ＶＩｂのエステルを加水分解して式ＶＩｃのカルボン酸にする工程；及び
【化３３】
2015518825.tif 000035
式ＶＩｃのカルボン酸を式ＶＩの活性エステルに変換する工程；
【化３４】
2015518825.tif 000036
を含む方法を与える。
【０１１６】
当業者は、式ＶＩａの化合物を、遊離塩基としても、好適な塩の形態としても使用できることを認識するだろう。好適な塩の形態には、ＴＦＡ、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＭｓＯＨ、ＴｆＯＨ、及びＡｃＯＨがあるが、これらに限定されない。
【０１１７】
任意の好適なアミドカップリング剤を使用して、式ＶＩｂの化合物を形成できる。好適なアミドカップリング剤には、２−クロロメチルピリジニウムヨージド、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＤＣＣ、ＥＤＣＩ、ＴＢＴＵ、及びＴ３Ｐがあるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、単独で使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰなどの共試薬と共に使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンなどの塩基と共に使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰなどの共試薬と、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンなどの塩基の両方と共に使用される。当業者は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰ以外の共試薬を使用できることを認識するだろう。さらに、当業者は、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミン以外の塩基を使用できることを認識するだろう。
【０１１８】
任意の好適な加水分解剤を使用して、式ＶＩｃの化合物を式ＶＩｂの化合物から調製できる。好適な加水分解剤には、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、及び水酸化カリウムがあるが、これらに限定されない。
【０１１９】
ＮＨＳは、好適なカップリング試薬の存在下で式ＶＩｃのカルボン酸とカップリングして、式ＶＩの活性エステルを形成できる。好適なカップリング試薬には、２−クロロメチルピリジニウムヨージド、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＤＣＣ、ＥＤＣＩ、ＴＢＴＵ、及びＴ３Ｐがあるが、これらに限定されない。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、式ＶＩの活性エステルは、ＮＨＳとカップリング試薬の組み合わせを使用して、式ＶＩｃのカルボン酸から形成される。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、式ＶＩの活性エステルは、脱離基を生成しカップリング反応も起こす単一の試薬を使用して、式ＶＩｃのカルボン酸から形成される。そのような試薬には、炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルがあるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、単一の試薬が単独で使用される。他の実施形態において、単一の試薬はアシル転移触媒と共に使用される。そのようなアシル転移触媒には、ＤＭＡＰ及びピリジンがあるが、これらに限定されない。当業者は、追加のアシル転移触媒を使用してよいことを認識するだろう。
【０１２２】
具体的な実施形態において、式Ｖａのカルボン酸成分は、式Ｖｃのメチルエステルを加水分解剤により処理して製造される。
【化３５】
2015518825.tif 000037
【０１２３】
任意の好適な加水分解剤を使用して、式Ｖａの化合物を式Ｖｃの化合物から調製できる。好適な加水分解剤には、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、及び水酸化カリウムがあるが、これらに限定されない。
【０１２４】
望まれる場合、異なる分子量を有する治療化合物担体コンジュゲートを、ゲル濾過クロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーを使用して単離できる。ゲル濾過クロマトグラフィーを利用して、異なる分子量に基づいて（差異は、基本的に標的化基の平均分子量に相当する）、異なる治療化合物担体コンジュゲートを分別することができる（例えば、１−マー、２−マー、３−マーなど、ここで、「１−マー」は、治療化合物あたり１つの標的化基分子を示し、「２−マー」は治療化合物に結合した２つの標的化基を示す、など）。
【０１２５】
この種の分離を実施するのに好適なゲル濾過カラムには、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）から入手できるＳｕｐｅｒｄｅｘ及びＳｅｐｈａｄｅｘカラムがある。特定のカラムの選択は、所望の分別範囲によるだろう。溶離は、一般的に、リン酸塩、酢酸塩などの好適な緩衝剤を使用して実施される。回収された分画は、いくつかの異なる方法、例えば、（ｉ）タンパク質含量に関して２８０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）、（ｉｉ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質分析、及び（ｉｉｉ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）により分析することができる。
【０１２６】
治療化合物担体コンジュゲートの分離は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）Ｃ１８カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又はＶｙｄａｃ）を利用して逆相クロマトグラフィーによっても、イオン交換カラム、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＤＥＡＥ−又はＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換カラムを利用してイオン交換クロマトグラフィーによっても実施できる。生じた精製された組成物は、好ましくは、標的化基にコンジュゲートされていない治療化合物を実質的に含まない。さらに、組成物は、好ましくは、他の非共有結合した標的化基の全てを実質的に含まない。
【０１２７】
本発明は、ビタミンＤ又は他のＤＢＰ結合分子を使用して薬物動態的性質を向上させることにより、薬物の効能を高める組成物及び方法を与える。紫外線への曝露時に皮膚でビタミンＤを形成する自然の経路はＤＢＰとの相互作用に依存しており、それによりＵＶ活性化ビタミンＤが循環にのり、細胞プロセスのために利用できる（Ｌｉｐｓ，Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．９２：４−８（２００６）；ＤｅＬｕｃａ，Ｎｕｔｒ．Ｒｅｖ．６６（ｓｕｐｐｌ．２）：Ｓ７３−Ｓ７８（２００８））。ＤＢＰは、ビタミンＤを、速く効果的に循環させる。ＤＢＰは、また、活性型ビタミンＤを平均で３０日間循環した状態に保つ（Ｃｏｏｋｅ，Ｎ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｊ．Ｇ．Ｈａｄｄａｄ．１９８９．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１０：２９４−３０７；Ｈａｄｄａｄ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２５５２−２５５５；Ｈａｄｄａｄ，Ｊ．Ｇ．１９９５．Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．５３：５７９−５８２）。本発明は、ＤＢＰを利用して治療化合物をより効果的に体に送達することを初めて与える。一実施形態において、治療化合物は、担体に共有結合しているか、又は担体に融合している。他の実施形態において、治療化合物は、担体と共に製剤されているが、共有結合していない。一実施形態において、投与の部位から薬物を体内により効果的に運ぶために、担体はＤＢＰと相互作用する。他の実施形態において、担体は、薬物を長期間循環したままに保つ。
【０１２８】
一実施形態において、担体は、標的化基及び標的化基を治療化合物に結合するための結合基を含む。他の実施形態において、担体は、標的化基及び治療化合物に結合したスカフォールド部分を含む。標的化基は、ビタミンＤ、ビタミンＤアナログ、ビタミンＤ関連代謝物、ビタミンＤ関連代謝物アナログ、又はビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）と結合若しくは相互作用できる他の分子である。一実施形態において、標的化基は、抗体若しくは抗体誘導体、ＤＢＰ若しくはその断片に結合するように設計されたペプチド、ＤＢＰ若しくはその断片に対して選択されたファージディスプレイ若しくは他のペプチドライブラリーから誘導されたペプチド、ＤＢＰに結合するヌクレオチドアプタマー、ＤＢＰに結合するように設計された、若しくはＤＢＰ若しくはその断片に対して選択された化合物ライブラリーから誘導された小分子、又は本明細書に開示されるＤＢＰに結合できる部分である。他の実施形態において、担体は、ＤＢＰ自体又はＤＢＰの誘導体を含む。
【０１２９】
ビタミンＤは一群の脂溶性セコステロイドである。いくつかの形態（ビタマー）のビタミンＤが存在する。２つの主要な形態はビタミンＤ２すなわちエルゴカルシフェロール、及びビタミンＤ３すなわちコレカルシフェロールであり、下付き文字のないビタミンＤは、Ｄ２とＤ３のいずれか又は両方を意味する。ヒトでは、ビタミンＤは、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）又はエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）として摂取され得る。さらに、ヒトは、日光の曝露が充分であると、コレステロールからビタミンＤを合成できる。
【０１３０】
ビタミンＤは、種々の臓器にある酵素によりさらに修飾されて、やはりＤＢＰに結合可能な「ビタミンＤ代謝物」のファミリーになる。例えば、ビタミンＤは、肝臓でカルシジオール（２５ＯＨヒドロキシ−ビタミンＤ）に変換される。カルシジオールの一部は、腎臓によりカルシトリオール（１，２５（ＯＨ）２ジヒドロキシ−ビタミンＤ）に変換される。カルシジオールは、他の目的で、腎臓外でもカルシトリオールに変換される。２４，２５（ＯＨ）２ジヒドロキシ−ビタミンＤも体内にみられる。そのため、一実施形態において、標的化基はビタミンＤ代謝物である。
【０１３１】
他の実施形態において、標的化基は「ビタミンＤアナログ」である。これらの化合物はビタミンＤ構造に基づき、ビタミンＤの部分的機能を保持している。それらは、ビタミンＤと同じタンパク質のいくつかと、親和性は様々であるが相互作用する（例えば、ＤＢＰとビタミンＤ受容体）。例示的なアナログには、ＯＣＴ、側鎖の２２位に酸素原子がある化学合成された１，２５（ＯＨ）２Ｄ３のアナログ（Ａｂｅ  ｅｔ．ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２６：５８−６２（１９８７））；ジェミニビタミンＤアナログ、１α，２５−ジヒドロキシ−２０Ｒ−２１（３−ヒドロキシ−３−ジュウテロメチル−４，４，４−トリジュウテロブチル）−２３−イン−２６，２７−ヘキサフルオロ−コレカルシフェロール（ＢＸＬ０１２４）（Ｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７９（３）：３６０−７（２０１１））；パリカルシトール、天然のビタミンＤ代謝物全てに見られる炭素−１９メチレン基を欠く、ビタミンＤ２誘導ステロール（Ｓｌａｔｏｐｏｌｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．２６：８５２（１９９５））；アルファカルシドール（１α−ヒドロキシビタミンＤ３）にように、肝臓でヒドロキシル化されて１α，２５（ＯＨ）２Ｄ２になるプロドラッグ、ドキセルカルシフェロール（１α−ヒドロキシビタミンＤ２）がある。アルファカルシドールとは異なり、ドキセルカルシフェロールは、２４−ヒドロキシル化されて、１α，２４（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ２も生じる（Ｋｎｕｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５３：８２９（１９９７））；ジヒドロタキステロール２（ＤＨＴ２）、インビボでヒドロキシル化されて２５（ＯＨ）ＤＨＴ２及び１，２５（ＯＨ）２ＤＨＴ２になる（ＭｃＩｎｔｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５５：５００（１９９９））。Ｅｒｂｅｎ  ａｎｄ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌ，Ｎｅｕｒｏｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２（１）：５９−６９（２００１）、及びＳｔｅｄｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１６（１０）：１９６５−１９６７（２００１）も参照されたい。上記引用文献は、引用によりその全体として組み込まれる。
【０１３２】
他の実施形態において、担体は、標的化基及び治療化合物に共有結合した薬学的に許容できるスカフォールド部分をさらに含む。本発明の担体のスカフォールド部分は、治療化合物の機能に必ずしも関与しないが、機能に貢献することがあり、治療化合物の薬物動態的性質を向上させることがある。本発明のスカフォールドは、標的化基のＤＢＰへの結合に実質的に干渉しない。同様に、本発明のスカフォールドは、治療化合物の構造又は機能に実質的に干渉しない。スカフォールド部分の長さは、標的化基及び治療化合物の性質による。当業者は、種々の結合間の公知の距離に基づいて、種々の原子の組み合わせが可変の長さの分子を与えることを認識するだろう（引用により本明細書に組み込まれるＭｏｒｒｉｓｏｎ，ａｎｄ  Ｂｏｙｄ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ  Ｅｄ，Ａｌｌｙｎ  ａｎｄ  Ｂａｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．（１９７７））。本発明により企図される他のスカフォールドには、ペプチドリンカー、ヒト血清アルブミンなどのタンパク質リンカー、抗体又はその断片、核酸リンカー、小型炭素鎖リンカー、酸素又は窒素が挿入された炭素リンカーがあり、これらの例の組み合わせも企図される。
【０１３３】
他の実施形態において、ＤＢＰに結合する標的化基としてペプチドが選択された。ペプチド又はタンパク質ライブラリーを、ＤＢＰ結合ペプチドを求めてスクリーニングする方法は当技術分野に公知である。好ましい実施形態において、ＤＢＰ結合ペプチドを特定するツーハイブリッド法が利用される。他の好ましい実施形態において、ＤＢＰ結合のインビトロスクリーンも利用される。次いで、この標的化ペプチドは、薬物と共有結合しても、薬物と共に製剤されてもよい。好ましい実施形態において、スカフォールド部分が使用される。他の実施形態において、標的化基は、ＤＢＰに結合する理由で選択されたアプタマーである。次いで、前記アプタマーは、スカフォールドにより、又は薬物に直接融合して、薬物に共有結合することも、薬物と共に製剤することもできる。
【０１３４】
一実施形態において、薬物は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、アプタマー（一本鎖又は二本鎖）、ＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチド、直鎖又は環状のより大きいＤＮＡ分子、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に使用されるオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子の置換などのＤＮＡのバリエーション、ＰＮＡ又は他の核酸誘導体分子などの合成ＤＮＡ様分子（引用により本明細書にその全体として組み込まれる国際公開第０７／０３５９２２号パンフレット参照）である。他の実施形態において、治療化合物は、ヌクレアーゼ耐性ＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドで構成されている。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼ耐性ＤＮＡオリゴヌクレオチドはモルホリノである（すなわち、配列特異的に核酸に結合する核酸のホスホロジアミデートアナログ、ＡＶＩ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）。
【０１３５】
他の実施形態において、薬物は小分子又は化学物質である。他の実施形態において、薬物は、ペプチド又はＰＮＡなどペプチドの誘導体である。他の実施形態において、薬物は、全長だろうと、断片だろうと、切断されたバージョンであろうと、ペグ化されていようと、グリコシル化されていようと、他の方法で共有結合的に若しくは非共有結合的に修飾されていようと、未修飾のままであろうと、ポリペプチドの全て又は部分から構成されたタンパク質である。
【０１３６】
治療化合物には、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸などがある。例示的なポリペプチドには、成長因子、例えば、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＦＧＦ２１を含む線維芽細胞増殖因子、血液凝固因子、成長ホルモン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）などのホルモン、サイトカイン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、酵素、骨形成タンパク質、ニューロトロフィン、及び増殖分化因子がある。本発明の組成物及び方法は、上述のタンパク質、糖タンパク質、小分子、ホルモン、成長因子、及び患者又は対象内に見られる他の分子のコンジュゲートされた作動剤、拮抗剤、又は他のエフェクターも含む。
【０１３７】
治療用ペプチドも本発明の範囲内にある。用語ペプチドは、ひとつなぎのアミノ酸を含むように意図される。本発明のペプチド中のアミノ酸は、天然でも、非天然でもよい。本発明のペプチドは、化学的に合成されても生物学的に合成されてもよく、システインリッチペプチド、環状ペプチド、ステープルドペプチド、Ｄ−又はＬ−アミノ酸及びこれらの混合物を含むペプチド、ペプチドミメティクス、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、並びにこれらの組み合わせを含んでよい。例示的な実施形態には、ＡＩＤＳワクチン、アレルギーワクチン、抗炎症ペプチド、抗インテグリンペプチド、抗ＴＣＲワクチン、抗アレルギーペプチド、抗癌ペプチド、抗真菌性ペプチド、抗菌性ペプチド、抗リウマチペプチド、抗トロンビンペプチド、抗ウイルスペプチド、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）リガンド及び関連ペプチド（例えば、セクレチンファミリー）、ＣＧＲＰアナログ、ＧＰＣＲ拮抗剤、ＣＭＶペプチド、カルパイン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、ＤＡＰ阻害剤、ディフェンシン、透析性オリゴペプチド（ｄｉａｌｙｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）、エンハンシン、エンドルフィン、エンドセリン拮抗剤、フィブロネクチン阻害剤、ガストリン拮抗剤、グレリン、グルカゴン拮抗剤、ゴナドレリンアナログ、成長因子ペプチド、視床下部ホルモン、下垂体ホルモン、腸の機能及び食欲を制御するペプチド、炎症誘発性脂肪組織産生物、幹細胞増殖を刺激するペプチド、炎症性ペプチド、天然物、単純ヘルペスワクチン、ヘパリン結合ペプチド、Ｂ型肝炎ワクチン、免疫調節性ペプチド、インフルエンザワクチン、ＬＨＲＨ拮抗剤、オピオイドペプチド誘導体、ＭＭＰ阻害剤、ＭＵＣ−１ワクチン、マラリアワクチン、メラノーマワクチン、髄膜炎ワクチン、神経ペプチド、オピオイドペプチド、骨形成ペプチド、骨粗鬆症ペプチド（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、パピローマウイルスワクチン、前立腺ガンワクチン、ＲＧＤペプチド、ＲＳＶワクチン、Ｔ細胞受容体ペプチドなどがある。本発明は、本明細書に記載される方法によるさらなる修飾により臨床製品として改良されるだろう、その合成アナログも企図する。当業者は、増加した半減期、作用持続時間、吸収、及び／又はバイオアベイラビリティを与える本明細書に記載される修飾を受ける余地がある多くの追加の商業的に重要なペプチドを認識するだろう。
【０１３８】
本明細書に記載される実施形態の範囲内にやはり企図されるのは、分岐鎖又は分岐があるか若しくは分岐がない環状のペプチドである。環状、分岐鎖、及び分岐のある環状ペプチドは、翻訳後の自然のプロセスから生じ、好適な合成法によっても作られる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される任意のペプチド生成物は、先に記載されたペプチドアナログを含み、それが次いでアルキル−グリコシド界面活性剤部分に共有結合する。
【０１３９】
本明細書に示される実施形態の範囲内にやはり企図されるのは、本明細書に特許請求されているアナログの修飾により好適な部位で置換されているペプチド鎖である。例えば、アシル化は、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸、３−フェニルプロパン酸などの脂肪酸又は飽和若しくは不飽和アルキル鎖により、例えば、リジンのε位でリンカーアミノ酸上である（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ａｎｄ  Ｂｕｌａｊ，Ｇ．（２０１２）Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １９：１６０２−１６１８、引用により本明細書に全体として組み込まれる）。
【０１４０】
本明細書に示される実施形態の範囲内にやはり企図されるのは、天然及び非天然のアミノ酸又は天然のアミノ酸のアナログで構成されたペプチド鎖である。本明細書では、ペプチド及び／又はタンパク質の「アナログ」は、チロシン上の置換基が、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、メチル基、イソプロピル基、Ｃ２〜Ｃ２０直鎖又は分岐鎖の炭化水素、飽和又は不飽和の炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ハロゲン、ニトロ基などを含むパラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンを含むチロシンアナログなど、天然のアミノ酸に基づく非天然のアミノ酸を含む。Ｔｙｒアナログの例には、２，４−ジメチル−チロシン（Ｄｍｔ）、２，４−ジエチル−チロシン、Ｏ−４−アリル−チロシン、４−プロピル−チロシン、Ｃａ−メチル−チロシンなどがある。リジンアナログの例には、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモリジン、Ｃａ−メチル−リジン（ＣＭｅＬｙｓ）などがある。フェニルアラニンアナログの例には、置換基が、メトキシ基、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、例えば、メチル基、アリル基、アセチル基などを含むメタ置換フェニルアラニンがあるが、これらに限定されない。具体例には、２，４，６−トリメチル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｔｍｐ）、Ｏ−メチル−チロシン、３−（２−ナフチル）アラニン（Ｎａｌ（２））、３−（１−ナフチル）アラニン（Ｎａｌ（１））、３−メチル−フェニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル−フェニルアラニン、ｐ−アジド−フェニルアラニン、ｐ−アシル−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−フェニルアラニン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−フェニルアラニンなどがあるが、これらに限定されない。
【０１４１】
本明細書に示される実施形態の範囲内にやはり企図されるのは、当技術分野に公知である非標準的又は非天然のアミノ酸を含むペプチド鎖であり、例えば、ＡｉｂなどのＣ−α−二置換アミノ酸、Ｃａ−ジエチルグリシン（Ｄｅｇ）、アミノシクロペンタン−１−カルボン酸（Ａｃ４ｃ）、アミノシクロペンタン−１−カルボン酸（Ａｃ５ｃ）などである。そのようなアミノ酸は、しばしばアルファヘリックス構造に偏る制限された構造になることが多い（Ｋａｕｌ，Ｒ．ａｎｄ  Ｂａｌａｒａｍ，Ｐ．（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ７：１０５−１１７、引用により本明細書にその全体として組み込まれる）。アナログ設計に有用な、そのような非天然のアミノ酸の追加例は、ホモ−アルギニン（Ｈａｒ）などである。特定の例における還元アミド結合の置換は、酵素的破壊からの保護の向上につながるか、又は受容体結合を変える。例としては、還元アミド結合を持つＴｉｃ−Ｐｈｅジペプチドユニットの残基の間への組み込みは（Ｔｉｃ−Ｆ［ＣＨ２−ＮＨ］＾−Ｐｈｅとして設計）、酵素分解を低減する。
【０１４２】
本明細書に示される実施形態の範囲内にやはり企図されるのは、アミノ末端又はカルボキシル末端での修飾が任意選択的に本ペプチド又はタンパク質に導入され得ることである（Ｎｅｓｔｏｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｊｒ．（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６：４３９９−４４１８）。例えば、本ペプチド又はタンパク質を、Ｎ末端でトランケートすることも、アシル化することもできる（Ｇｏｕｒｌｅｔ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３５４：１０５−１１１，Ｇｏｚｅｓ，Ｉ．ａｎｄ  Ｆｕｒｍａｎ，Ｓ．（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  ９：４８３−４９４）、その内容は引用により本明細書に組み込まれる）。Ｄ−ＰｈｅなどのＤ−アミノ酸の欠失又は組み込みなどの、ペプチド又はタンパク質のＮ末端への他の修飾は、長鎖アルキルグリコシドなどの本明細書に記載される修飾により置換されると、強力で長時間作用型の作動剤又は拮抗剤を与えることもできる。そのような作動剤及び拮抗剤も商業的有用性があり、本明細書に記載される企図される実施形態の範囲内にある。上記引用文献は、その全体として本明細書に組み込まれる。
【０１４３】
本明細書に記載される実施形態の範囲内にやはり企図されるのは、治療化合物アナログに共有結合され、融合され、又は共に製剤されている担体であって、天然の治療化合物が、アセチル化、アシル化、ペグ化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、システインの共有結合架橋形成の形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγカルボキシル化、ヒドロキシル化及びＡＤＰ−リボシル化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化などトランスファーＲＮＡが媒介するアミノ酸のタンパク質への付加、並びにユビキチン化により修飾されているものである。例えば、（Ｎｅｓｔｏｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｊｒ．（２００７）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＩ  ２：５７３−６０１，Ｎｅｓｔｏｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｊｒ．（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６：４３９９−４４１８，Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．（１９９３，Ｗｏｌｄ，Ｆ．（１９８３）Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １−１２，Ｓｅｉｆｔｅｒ，Ｓ．ａｎｄ  Ｅｎｇｌａｒｄ，Ｓ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６，Ｒａｔｔａｎ，Ｓ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２）を参照されたい。上記の引用文献は、引用によりその全体として組み込まれる。
【０１４４】
グリコシル化された治療用ペプチドは、従来のＦｍｏｃ化学及び例えば樹脂上の固相ペプチド合成を利用して調製できるが、その場合、所望の保護された糖アミノ酸がペプチド合成の前に調製され、次いでペプチド合成の間に所望の部位でペプチド鎖に導入される。このように、治療用ペプチドポリマーコンジュゲートはインビトロでコンジュゲートされ得る。グリコシル化は脱保護の前に起こり得る。アミノ酸グリコシドの調製は、引用により本明細書にその全体として組み込まれる米国特許第５，７６７，２５４号明細書、国際公開第２００５／０９７１５８号パンフレット、及びＤｏｏｒｅｓ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４０１−１４０３，２００６に記載されている。例えば、セリン及びスレオニン残基のアルファ及びベータ選択的グリコシル化は、ケーニッヒ−クノール反応及びシッフ塩基中間体を伴うＬｅｍｉｅｕｘのインサイチューアノマー化方法を利用して実施される。次いで、シッフ塩基グリコシドの脱保護が、弱酸性条件又は加水素分解を利用して実施される。グリコシル化された治療用ペプチドコンジュゲートを含む組成物は、成長するペプチド鎖を、保護されたアミノ酸の少なくとも１つがグリコシル化されている保護されたアミノ酸と段階的に接触させ、それに続いて、水溶性ポリマーのコンジュゲーションを含む、段階的な固相ペプチド合成により作られる。そのような組成物は、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％のグリコシル化されコンジュゲートされた治療用ペプチドの単一の種の純度を有し得る。
【０１４５】
本明細書に定義及び／又は開示される治療用ペプチドの１つ以上のアミノ酸残基の導入に使用できる単糖類には、グルコース（デキストロース）、フルクトース、ガラクトース、及びリボースがある。使用に好適な追加の単糖類には、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、エリトロース、トレオース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、キシロース、リブロース、キシルロース、アロース、アルトロース、マンノース、Ｎ−アセチルノイラミン酸、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、及びＮ−アセチルグルコサミンなどがある。本明細書に定義及び／又は開示される治療用ペプチド、治療用ペプチドの１つ以上のアミノ酸残基の修飾に使用される単糖類、二糖類、及び三糖類などのグリコシドには、とりわけ、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、メリビオース、及びセロビオースがある。三糖類には、アカルボース、ラフィノース、及びメレジトースがある。
【０１４６】
本発明のさらなる実施形態において、本明細書に定義及び／又は開示される治療化合物は、ビオチンに化学的に結合していてもよい。次いで、ビオチン／治療化合物がアビジンに結合できる。
【０１４７】
やはり本発明の範囲内にあるのは、抗体であるポリペプチドである。用語抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、毒素結合抗体、ヒト化抗体、抗体断片（例えば、Ｆｃドメイン）、Ｆａｂ断片、一本鎖抗体、二重特異性又は多重特異性抗体、ラマ抗体、ナノボディ、ダイアボディ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃなどを含むように意図される。用語の中にやはり含まれるのは、Ｉｇキメラなどの抗体融合タンパク質である。好ましい抗体には、ヒト化若しくは完全ヒトモノクローナル抗体又はその断片がある。
【０１４８】
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は最も広い意味で互換的に使用され、モノクローナル抗体（例えば、完全長又はインタクトモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を示す限り二重特異性抗体）を含み、特定の抗体断片（本明細書により詳細に記載されるとおり）も含み得る。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化、及び／又は親和性成熟であり得る。
【０１４９】
用語「完全長抗体」、「インタクト抗体」及び「ホール抗体」は本明細書において互換的に使用され、以下に定義される抗体断片ではなく、実質的に無傷な形態にある抗体を意味する。その用語は、特に、Ｆｃ領域を含む重鎖を持つ抗体を意味する。「抗体断片」は、好ましくは、抗原結合領域を含むインタクト抗体の一部を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体がある。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書では、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を意味し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量存在する可能性のある突然変異、例えば、自然発生突然変異以外は同一である。そのため、修飾語「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物でないとして、抗体の特性を示す。
【０１５０】
特定の実施形態において、そのようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含むが、その場合、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスにより得られた。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、又はリコンビナントＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからの独特のクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列が、さらに変化されて、例えば、標的への親和性が改善されたり、標的結合配列がヒト化されたり、細胞培養物中でのその産生が向上されたり、インビボでのその免疫原性が低下したり、多重特異性抗体が作り出されたりし得ることなど、及び変化された標的結合配列を含む抗体が、やはり本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には、他の免疫グロブリンにより汚染されていないという点で有利である。
【０１５１】
抗原に特異的に結合する抗体は、その抗原に高い親和性を有する。抗体親和性は解離定数（Ｋｄ）により測定できる。特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）である。
【０１５２】
一実施形態において、Ｋｄは、以下のアッセイにより記載されるとおり、対象としている抗体のＦａｂバージョン及びその抗原と共に、放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、未標識の抗原の漸増系列の存在下で、Ｆａｂを最低濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原と共に平衡化させ、次いで、結合した抗原を、抗Ｆａｂ抗体−コートプレートにより捕捉して測定される（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの抗Ｆａｂ捕捉抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）により一晩被覆され、その後ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンにより、２から５時間室温（およそ２３℃）でブロックされる。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ  ２６９６２０番）において、１００μＭ又は２６μＭ［１２５Ｉ］−抗原は、対象とするＦａｂの段階希釈物と混合される（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）中の、抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。次いで、対象とするＦａｂは一晩インキュベートされる。しかし、確実に平衡に達するように、インキュベーションをより長時間（例えば、約６５時間）続けてもよい。その後、混合物は捕捉プレートに移され、室温でインキュベートされる（例えば、１時間）。次いで、溶液は除かれ、プレートは、ＰＢＳ中０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で８回洗浄される。プレートが乾燥すると、１５０μｌ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）が加えられ、プレートはＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計測される。最大結合の２０％以下を与える各Ｆａｂの濃度が、競合結合アッセイのために選択される。
【０１５３】
他の実施形態によると、Ｋｄは、例えば、固定化された抗原ＣＭ５チップと共に、約１０の応答単位（ＲＵ）で、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を２５℃で使用して、表面プラズモン共鳴アッセイにより測定される。簡単に述べると、製造業者の説明書に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）は、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性化される。抗原は、ｐＨ４．８の１０ｍＭ酢酸ナトリウムで５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈されてから、流量５μｌ／分で注入されて、結合したタンパク質のおよそ１０応答単位（ＲＵ）を得る。抗原の注入後、１Ｍエタノールアミンが注入されて、未反応の基がブロックされる。反応速度測定のため、Ｆａｂの２倍の段階希釈物（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）が、２５℃の０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に、流量およそ２５μｌ／分で注入される。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）が簡単な１対１ラングミュアーの結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を利用して、会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィッティングすることにより計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。ｏｎ速度が上記表面プラズモン共鳴アッセイにより１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、ｏｎ速度は、ストップフローを備えた分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は８０００−シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計中で測定して増加する濃度の抗原の存在下、撹拌しているキュベットで、２５℃で、ｐＨ７．２のＰＢＳ中の２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の蛍光発光強度の増加又は減少を測定する蛍光消光技法（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）を利用して測定できる。チップ表面への標的抗原の他のカップリング化学作用（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン、疎水性相互作用、又はジスルフィド化学作用）も、当業者により理解されるとおり、上述のアミンカップリング方法（ＣＭ５チップ）の代りに容易に利用可能である。
【０１５４】
修飾語「モノクローナル」は、抗体の特性を、抗体の実質的に均質な集団から得られたものとして示し、特別な方法による抗体の製造が必要であると解釈されないものとする。例えば、本発明により使用すべきモノクローナル抗体は、種々の技法、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書参照）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）参照）、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全てを有する動物中でヒト又はヒト様抗体を製造する技術（例えば、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット；同第９６／３４０９６号パンフレット；同第９６／３３７３５号パンフレット；同第９１／１０７４１号パンフレット；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）及びＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）参照）により製造できる。上記特許、刊行物、及び引用文献は、引用によりその全体と��て組み込まれる。
【０１５５】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、ネズミ科の）抗体は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小限の配列を含むキメラ抗体である。一実施形態において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び／又は能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類などの非ヒト種の超可変領域（ドナー抗体）由来の残基により代えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により代えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含むことがある。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改良するために実施されることがある。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変領域の実質的に全てを含むだろうが、ここで、超可変ループの全て又は実質的に全ては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列に対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むだろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。以下の総説記事及びそこに引用されている引用文献も参照されたい：Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）。上記引用文献は、引用によりその全体として組み込まれる。
【０１５６】
「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含むか、且つ／又は本明細書に開示されるヒト抗体を製造する技術のいずれかを利用して作られたものである。そのような技術には、ファージディスプレイライブラリーなどのヒトから誘導されたコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）及びＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：４１３３−４１３７（１９９１）参照）；ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞系の利用（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５５−９３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７：８６（１９９１）参照）；及び内因性免疫グロブリン産生のない状態でヒト抗体の完全なレパートリーを産生できる遺伝子導入動物（例えばマウス）でのモノクローナル抗体の生成（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）参照）がある。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト動物由来の抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に排除する。
【０１５７】
公知の全種類のそのような抗体は本発明の範囲内にある。例示的な抗体には、成長因子、サイトカイン、リンフォカイン、細胞表面受容体、酵素、血管内皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子に結合するもの及びそれらのそれぞれの受容体に対する抗体がある。他の例示的な抗体には、受容体−ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質、及び糖タンパク質に対するモノクローナル抗体がある。先に列記されたポリペプチドのいずれの修飾された（例えば、突然変異した）任意のバージョンも、本発明の範囲内にある。本発明に使用すべき治療化合物は当技術分野に公知であり、例としては、引用により本明細書にその全体として組み込まれる米国特許第７，６０８，６８１号明細書に開示されている。さらに、本発明は、自己免疫疾患又は望ましくない炎症状態を起こす、対象中の天然又は非天然の抗体の阻害剤又は拮抗剤のコンジュゲートを企図する。
【０１５８】
担体のアセンブリーのいくつかの態様は、当技術分野に周知である化学的方法を利用する。例えば、ビタミンＥ−ＰＥＧはＥａｓｔｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌにより製造され、ビオチン−ＰＥＧは、Ｅｎｚｏｎ、Ｎｅｋｔａｒ、及びＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎなどの多くのＰＥＧ製造業者により製造されている。いくつかのビタミン及び他の治療化合物が連結しているＰＥＧ分子を製造する方法は、これらの方法及び当技術分野に公知である他の化学的方法に従う。例えば、５’アミン部分によりオリゴヌクレオチドに結合したＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなど、オリゴヌクレオチド又は関連する分子へのＰＥＧの結合が起こる。いくつかのカップリング法が企図され、例えば、ペプチド上のリジン残基などのアミン基へのＮＨＳカップリング、システイン残基上などのスルフヒドリル基へのマレイミドカップリング、スルフヒドリル基へのヨードアセチルカップリング、スルフヒドリル基へのピリジルジチオールカップリング、炭水化物基へカップリングするためのヒドラジド、Ｎ末端にカップリングするためのアルデヒド、又は一級若しくは二級アミンと反応することが知られているテトラフルオロフェニルエステルカップリングがある。他の可能な化学的カップリング法は当業者に知られており、代えることができる。例としては、本発明の結合基を使用するコンジュゲーションは、引用により本明細書にその全体として組み込まれる国際公開第９３／０１２１４５号パンフレット（Ａｔａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．）に記載の組成物及び方法を利用して実施できるが、第７，８０３，７７７号明細書（Ｄｅｆｒｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）も参照されたい。
【０１５９】
一実施形態において、担体化合物は、薬物に、共有結合で結合しても、非共有結合で結合してもよい。他の実施形態において、担体化合物は薬物と分離しているが、機能単位（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｕｎｉｔｓ）に製剤されるように個別の濃度で混合されている。本発明の例示的な薬物製剤には、水性液剤、有機液剤、粉末製剤、固体製剤、及び混合相製剤（ｍｉｘｅｄ  ｐｈａｓｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）がある。
【０１６０】
本発明の医薬組成物は、本発明の化合物のいずれか及びその薬学的に許容できる塩を、任意の薬学的に許容できる担体、アジュバント、又はビヒクルと共に含む。本発明の医薬組成物に使用できる薬学的に許容できる担体、アジュバント、及びビヒクルには、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩など、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリラート、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂があるが、これらに限定されない。
【０１６１】
薬学的に許容できる塩は、毒性の副作用なしに治療用組成物の望ましい生物学的活性を保持する。そのような塩の例は、（ａ）無機酸、例えば、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などにより形成される酸付加塩／及び有機酸、例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タニン酸（ｔａｎｉｃ  ａｃｉｄ）、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などにより形成される塩；（ｂ）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどの多価金属カチオンにより形成される；又はＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン又はエスレンジアミン（ｅｔｈｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）から形成された有機カチオンにより形成される塩基付加塩若しくは錯体；又は（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組み合わせ、例えば、亜鉛のタンニン酸塩などである。
【０１６２】
本発明の医薬組成物は、経皮、経口、非経口、吸入、眼、局所、直腸、鼻腔内、頬側（舌下含む）、膣内、又は埋め込み式リザーバー方式により投与できる。本発明の医薬組成物は、従来の、非毒性で薬学的に許容できる担体、アジュバント、又はビヒクルを含み得る。本明細書での用語非経口は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病変内、及び頭蓋内注射又は注入技術を含む。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、薬学的に許容できる非毒性の成分との混合物中に有効成分として本明細書に記載される治療化合物又はその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物も企図される。上述の通り、そのような組成物は、非経口投与用に、特に、液体溶液又は懸濁液の形態で；経口又は頬側投与用に、特に錠剤又はカプセルの形態で；鼻腔内投与用に、特に、散剤、点鼻剤、蒸発する溶液、又はエアロゾルの形態で；吸入用に、特に、液体溶液又は広く定義された賦形剤を含む乾燥粉末の形態で；経皮投与用に、特に皮膚パッチ又はマイクロニードルパッチの形態で；及び直腸又は膣内投与用に、特に坐剤の形態で調製することができる。
【０１６４】
組成物は、簡便には単位剤形で投与でき、例えば、引用により本明細書にその全体として組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８５）に記載の通り、医薬分野に周知である方法のいずれによっても調製できる。非経口投与用の製剤は、賦形剤として、滅菌水又はプロピレングリコールなどの含塩アルキレングリコール、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、糖類、植物由来の油、水素化ナプタレン（ｎａｐｔｈａｌｅｎｅｓ）、血清アルブミン、又は他のナノ粒子（Ａｂｒａｘａｎｅ（商標）に使用されるとおり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩＬ）などを含んでよい。経口投与には、製剤は、胆汁酸塩又はアシルカルニチンの添加により強化され得る。鼻腔内投与用の製剤は、固体でも、ハイドロフルオロカーボンなどの蒸発する溶媒中の溶液でもよく、安定化のための賦形剤、例えば、糖類、界面活性剤、サブミクロン無水アルファ−ラクトース又はデキストランを含んでよく、点鼻剤又は定量スプレーの形態で使用するための水性又は油性の溶液でもよい。頬側投与には、典型的な賦形剤には、糖類、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、アルファ化デンプンなどがある。
【０１６５】
本明細書に記載される修飾された治療化合物の、長時間にわたる、例えば１週間から１年にわたる対象への送達は、所望の放出期間のために充分な有効成分を含む制御放出系の単一投与により達成され得る。モノリシック又はリザーバータイプのマイクロカプセル、デポインプラント（ｄｅｐｏｔ  ｉｍｐｌａｎｔｓ）、ポリマー性ヒドロゲル、浸透圧ポンプ、ベシクル、ミセル、リポソーム、経皮パッチ、イオン導入装置、及び別な注射可能な剤形などの種々の制御放出系を、この目的に利用できる。有効成分の送達が望まれる部位での局在化は、いくつかの制御放出装置の追加の特徴であり、特定の疾患の治療において有益であると証明され得る。
【０１６６】
経皮投与用の特定の実施形態において、皮膚のバリアを越えた送達が、電極（例えば、イオン導入）、電気穿孔、又は短い高電圧の電気パルスの皮膚への印加、無線周波数、超音波（例えば、超音波導入）、マイクロプロジェクション（例えば、マイクロニードル）、ジェットインジェクター、熱アブレーション、磁気泳動、レーザー、速度、又はフォトメカニカル波を利用すると増強され得る。薬物は、単層薬物含有粘着剤、複層薬物含有粘着剤、リザーバー、マトリックス、又は蒸気型パッチ（ｖａｐｏｒ  ｓｔｙｌｅ  ｐａｔｃｈｅｓ）に含まれてよく、パッチレス技術（ｐａｔｃｈｌｅｓｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を利用できる。皮膚のバリアを越えた送達は、カプセル化、皮脂流動化剤（ｓｋｉｎ  ｌｉｐｉｄ  ｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）、又は中空型若しくは中実型ミクロ構造経皮システム（ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｓｙｓｔｅｍ）（ＭＴＳ、３Ｍにより製造されるものなど）、ジェットインジェクターを利用しても増強できる。治療化合物が皮膚を通るのを助けるための製剤への添加剤には、プロドラッグ、化学物質、界面活性剤、細胞透過性ペプチド、透過促進剤、カプセル化技術、酵素、酵素阻害剤、ゲル、ナノ粒子、及びペプチド又はタンパク質シャペロンがある。
【０１６７】
制御放出製剤の一形態は、引用により本明細書に組み込まれるＫｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，６７５，１８９号明細書の先駆的な研究に記載されている、コポリ（乳酸／グリコール酸）などのゆっくりと分解する非毒性で非抗原性ポリマーに分散されているか又はカプセル化されている治療化合物又はその塩を含む。化合物又はその塩は、コレステロール若しくは他の脂質マトリックスペレット、又はシラストマーマトリックスインプラント中に製剤されていてもよい。追加の徐放性デポインプラント又は注射用製剤は、当業者には明らかだろう。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＪＲ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８；及びＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ，ＲＷ  Ｂａｋｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７を参照されたい。上記は引用によりその全体として組み込まれる。
【０１６８】
追加の形態の制御放出製剤は、生体許容性（ｂｉｏａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）溶媒中のコポリ（乳酸／グリコール酸）又は乳酸とＰＥＧのブロックコポリマーなどの生分解性ポリマーの溶液を含み、それが皮下又は筋肉内に注射されて、デポ製剤が得られる。本明細書に記載される治療化合物をそのようなポリマー性製剤と混合すると、作用持続時間が非常に長い製剤を得るのに好適である。
【０１６９】
鼻腔内投与用に製剤される場合、鼻腔内粘膜を越える吸収は、例えばグリココール酸、コール酸、タウロコール酸、エトコール酸（ｅｔｈｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、デフドロコール酸（ｄｅｈｄｒｙｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、シクレデキストリン（ｃｙｃｌｅｄｅｘｔｒｉｎｓ）などの界面活性剤を、約０．１から１５重量パーセント、約０．５から４重量パーセント、又は約２重量パーセントの量で使用してさらに増強され得る。刺激が少なくより高い有効性を示すことが報告されている追加のクラスの吸収促進剤は、テトラデシルマルトシドなどのアルキルマルトシドのクラスである（全て引用により本明細書に組み込まれているＡｒｎｏｌｄ，ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９３：２２０５−１３；Ａｈｓａｎ，Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １８：１７４２０４６及びそこに引用されている引用文献）。
【０１７０】
医薬組成物は、例えば、滅菌注射用の水性又は油性懸濁剤としての滅菌注射用調合物の形態でよい。この懸濁剤は、好適な分散剤又は湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０など）及び懸濁化剤を使用して、当技術分野に公知である技術に従って製剤され得る。滅菌注射用調合物は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用液剤又は懸濁剤でもよい。利用され得る許容できるビヒクル及び溶媒の中に、マンニトール、水、リンゲル液、及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌の不揮発油は、従来、溶媒又は懸濁媒体として使用されている。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の低刺激性不揮発油も利用できる。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、特にポリオキシエチル化バージョンにおけるオリーブ油又はヒマシ油など、天然の薬学的に許容できる油であるので、注射剤の調製に有用である。これらの油液剤又は懸濁剤は、スイス薬局方又は類似のアルコールなどの長鎖アルコール希釈剤又は分散剤も含み得る。
【０１７１】
本発明の医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、並びに水性懸濁剤及び液剤を含むがこれらに限定されない経口的に許容できる任意の剤形で経口投与できる。経口使用のための錠剤の場合、通常使用される担体には、ラクトース及びコーンスターチがある。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も典型的には加えられる。カプセル形態での経口投与のためには、有用な希釈剤には、ラクトース及び乾燥コーンスターチがある。水性懸濁剤が経口投与される場合、有効成分は、乳化剤及び懸濁化剤と組み合わされる。所望の場合、特定の甘味剤及び／又は着香剤及び／又は着色剤を加えてよい。
【０１７２】
本発明の医薬組成物は、直腸投与用の坐剤の形態でも投与できる。これらの組成物は、本発明の化合物を、室温で固体であるが直腸の温度で液体であり、したがって直腸で融けて活性成分を放出する好適な非刺激性の賦形剤と混合して調製できる。そのような材料には、ココアバター、蜜蝋、及びポリエチレングリコールがあるが、これらに限定されない。
【０１７３】
本発明の医薬組成物の局所投与は、所望の治療が、局所適用により容易にアクセスできる部分又は臓器を含む場合に特に有用である。皮膚に局所的に適用するために、医薬組成物は、担体に懸濁又は溶解している活性成分を含む好適な軟膏により製剤されなくてはならない。本発明の化合物の局所投与用の担体には、鉱油、液化石油（ｌｉｑｕｉｄ  ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ）、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化蝋、及び水があるが、これらに限定されない。或いは、医薬組成物は、担体に懸濁又は溶解している活性化合物を含む好適なローション又はクリームにより製剤できる。好適な担体には、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水があるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物は、直腸坐剤製剤により、又は好適な浣腸製剤で、下部消化管に局所適用することもできる。局所経皮パッチも本発明に含まれる。
【０１７４】
本発明の医薬組成物は、鼻腔内エアゾールによっても、吸入よっても投与できる。そのような組成物は、医薬製剤の分野に周知である技法により調製され、ベンジルアルコール又は他の好適な保存剤、バイオアベイラビリティを高める吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／又は当技術分野に公知である他の可溶化剤若しくは分散剤を使用して、食塩水中の液剤として調製できる。
【０１７５】
吸入による送達用に製剤される場合、いくつかの製剤は利点を与える。ジケトピペラジン（例えば、Ｔｅｃｈｎｏｓｐｈｅｒｅ粒子［Ｐｆｕｔｚｎｅｒ，Ａ  ａｎｄ  Ｆｏｒｓｔ，Ｔ，２００５，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  ２：１０９７−１１０６］）などの容易に分散する固体又は類似の構造への治療化合物の吸着は、治療化合物の迅速な初期の取り込みをもたらす製剤を与える。治療化合物及び賦形剤を含む凍結乾燥された粉末、特にガラス質粒子は、良好なバイオアベイラビリティを持ち肺への送達に有用であり、例えば、Ｅｘｕｂｅｒａ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ及びＡｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．による吸入式インスリン）を参照されたい。
【０１７６】
一日あたり体重ｋｇあたり約０．０１から約１００ｍｇ、好ましくは一日あたり体重ｋｇあたり０．５から約５０ｍｇの有効成分化合物の用量レベルが、疾病の予防及び治療に有用である。典型的には、本発明の医薬組成物は、一日あたり約１から約５回、或いは持続注入として投与されるだろう。そのような投与は、慢性の療法としても急性の療法としても利用できる。担体材料と組み合わせて単一剤形を製造できる有効成分の量は、治療される宿主及び特定の投与様式により変わるだろう。典型的な調合物は、約５％から約９５％の活性化合物（ｗ／ｗ）を含むだろう。好ましくは、そのような調合物は、約２０％から約８０％の活性化合物を含む。
【０１７７】
患者の状態が改善されると、本発明の化合物、組成物、又は組み合わせの維持量が、必要な場合投与され得る。その後、投与の用量若しくは頻度、又はその両方を、症状に応じて、改善された状態が保持されるレベルに低減することができ、症状が望ましいレベルに緩和した時、治療をやめなければならない。しかし、患者は、疾病の症状の再発時に、長期間の間欠的な治療を必要とすることがある。
【０１７８】
当業者が認識する通り、先に列挙したものより低い投与量又は高い投与量も必要になり得る。特定の患者のための具体的な用量及び治療レジメンは、種々の因子、例えば、利用される具体的な化合物の活性、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与の時間、排泄率、薬物の組み合わせ、感染の重症度及び経過、患者の感染に対する傾向、並びに治療する医師の判断に依存するだろう。
【０１７９】
担体−薬物コンジュゲート、融合体、又は製剤は、コンジュゲートされていない、融合されていない、又は製剤されていない薬物よりも薬物製造者及び患者に利点を与える。具体的には、担体−薬物コンジュゲート又は製剤は、コンジュゲートされていない、融合されていない、又は製剤されていない薬物と比べて、投薬がより小さく頻度が少なくて済む、より強力で長期間作用する薬物だろう。これは、患者にとって、ヘルスケアコストがより低く、薬物投与スケジュールがより簡便であるということになる。担体−薬物コンジュゲート又は製剤は、通常静脈内注射により注入される薬物の注射経路を、いまや皮下注射又は経皮送達系により投与されるように、影響し得る。皮下注射又は経皮送達による投与経路は、患者が自宅で自己投与できるので最も好都合である。これは、患者の服薬遵守を向上させることができる。
【０１８０】
本発明のさらに他の態様において、ＤＢＰのレベルは、担体−薬物療法の一部として増加させることができる。エストロゲンがＤＢＰレベルを増加させ得ることが報告されている（Ｓｐｅｅｃｋａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３７１：３３）。担体−薬物コンジュゲートのより効果的な送達のためのエストロゲンの投与により、ＤＢＰのレベルが増加し得ることが、ここで企図される。
【０１８１】
本発明のさらに他の態様において、薬物を経皮送達するために担体が使用できることが企図される。ＤＢＰは、通常、皮膚の表面近くの位置でＵＶにより活性化されたビタミンＤを輸送するので、担体を持つ経皮送達系を使用することが実現可能になる。
【０１８２】
本明細書に記載される本発明がより完全に理解されるために、以下の実施例が述べられる。これらの実施例が説明目的のみのものであり、本発明をどのようにも限定すると解釈されるものでないことを理解されたい。
【実施例】
【０１８３】
実施例１：マレイミド反応性基を有するビタミンＤ３−ＰＥＧで構成された例示的なチオール反応性担体の調製
この実施例の担体上のマレイミドを使用して、実施例２及び３でタンパク質又はペプチド上の遊離のシステインにコンジュゲートした。本発明のスカフォールド中のＰＥＧのサイズが０．１ｋＤａから１００ｋＤａであることが企図される。そのため、２ｋＤａのＰＥＧを、この実施例でスカフォールドとして選択した。この実施例で使用する出発物質は、ビタミンＤアナログ（化合物１）についてはＴｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから、２ｋＤａのｍＰＥＧ−マレイミド（化合物４）についてはＣｒｅａｔｉｖｅ  Ｐｅｇｗｏｒｋｓから購入した。
【０１８４】
図２によると、（Ｒ）−メチル５−（（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ，Ｅ）−４−（（Ｚ）−２−（（Ｓ）−５−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−２−メチレンシ−クロヘキシリデン）エチリデン）−７ａ−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）ヘキサノアート（化合物１、７．５ｍｇ、０．０１４５ｍｍｏｌ、１当量、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入）を無水テトラヒドロフラン（０．４ｍＬ）に溶解させ、窒素を流した。テトラブチルアンモニウムフルオリド（２２．７ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ、６当量）を加え、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、シリカゲル、ヘキサン中３０％酢酸エチル、ＵＶ検出、リンモリブデン酸染色）によりモニタリングしながら反応物を室温で３時間撹拌した。化合物２を含む生じた混合物に、水酸化リチウム一水和物（４．２ｍｇ、０．１０１５ｍｍｏｌ、７当量）、テトラヒドロフラン（０．３ｍＬ）、及び水（０．１５ｍＬ）を加えた。反応物に窒素を流し、室温で１８時間撹拌した。ＴＬＣ及び質量分析法（ＭＳ）による評価により、期待される化合物３の存在と共に完全な反応が示された。反応混合物をエーテル（２×１５ｍＬ）で希釈し、１０％クエン酸水溶液（３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）、及びブライン（３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、温度を２０℃未満に保ちながら濃縮した。試料を窒素気流下でさらに乾燥させると、（（Ｒ）−５−（（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ，Ｅ）−４−（（Ｚ）−２−（（Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−メチレンシクロヘキシリデン）エチル−イデン）−７ａ−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）ヘキサン酸）（化合物３、５．３ｍｇ、収率９５％）を無色のゴムとして与えた。Ｒｆ０．２（シリカゲル、ヘキサン中４０％ＥｔＯＡｃ）。ＮＭＲ分析により、約１．１４％のＴＨＦ及び約０．１４％のエーテルの存在が明らかになった。
【０１８５】
化合物３（５．３ｍｇ、０．０１３７ｍｍｏｌ、１当量）、化合物４（ＭＡＬ−ＰＥＧ−アミンＴＦＡ塩、２１．９ｍｇ、０．０１０９ｍｍｏｌ、０．８当量、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｐｅｇｗｏｒｋｓから購入）、及び２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨージド（８．７ｍｇ、０．０３４２ｍｍｏｌ、２．５当量）を、無水ジクロロメタン（０．５ｍＬ）に溶解させた。トリエチルアミン（７．６μＬ、０．０５４８ｍｍｏｌ、４当量）を加え、反応混合物を、窒素下、室温で３時間撹拌した。次いで、反応物をジクロロメタン（３０ｍＬ）で希釈し、１０％クエン酸水溶液（４０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）、及びブライン（３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、温度を２０℃未満に保ちながら濃縮した。試料を、窒素気流下でさらに乾燥させると、目的化合物を茶色のゴムとして与えた。Ｒｆ０．６（シリカゲル、ジクロロメタン中２０％メタノール）。単離した生成物のＴＬＣ分析（ニンヒドリン染色）により、化合物４がないことが示された。単離された物質の１Ｈ  ＮＭＲ分析により、その正体及び純度が確認された。ＮＭＲ分析は、認識できる量の塩化メチレンも他の溶媒も示さなかった。
【０１８６】
実施例２：修飾されたＦＧＦ２１タンパク質−担体コンジュゲートの調製及び特性化：
修飾されたＦＧＦ２１を、実施例１に記載のビタミンＤ３−ＰＥＧ−マレイミド担体にコンジュゲートした。以下に示す通り、ＦＧＦ２１−担体組成物は、天然のＦＧＦ２１と比べて著しく向上した薬物動態的性質を与え、それにより、担体コンジュゲート分子は、糖尿病の治療にとって重要な治療化合物となる。
【０１８７】
ＦＧＦ２１を、以下の通り、エシェリキア・コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中に発現させ、精製し、担体にコンジュゲートした。修飾されたＦＧＦ２１を、タンパク質の担体への部位特異的カップリングを可能にするＦＧＦ２１のアミノ末端付近の遊離システイン残基及び精製を容易にするために加えたＨｉｓ６タグを組み込むように設計した。修飾されたＦＧＦ２１コード配列（配列番号４）を、エシェリキア・コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）での発現のために計算により最適化し、遺伝子をコンストラクト研究組織（ＤＮＡ２．０  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）に化学合成させ、Ｔ５プロモーター及びカナマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１中にクローニングした。プラスミドを、エシェリキア・コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）Ｏｒｉｇａｍｉ２細胞（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）中に形質転換した。Ｏｒｉｇａｍｉ株でのｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１ベクターからのＦＧＦ２１の発現は、以下の通り達成した。ルリア培地プラス１％グルコースに、１：１００の希釈で一晩培養物を接種し、ＯＤ６００が０．６である対数期まで増殖させた。次いで、培養温度を３７℃から１８℃に下げ、培養物を、０．２ｍＭのＩＰＴＧを使用して誘導し、１８０ｒｐｍで振とうしながら１８℃で一晩増殖させた。細胞を収集し、溶解させ、上清を回収した。タンパク質を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を使用して親和性精製し、イオン交換クロマトグラフィーにより仕上げた。
【０１８８】
次いで、精製したＦＧＦ２１タンパク質を、１０ｍＭのトリスｐＨ  ８．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ中で緩衝液交換した。ビタミンＤ３−ＰＥＧ−マレイミド担体分子（実施例１）へのコンジュゲーションは、ＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍＬで溶解させたチオール反応性担体を、０．５ｍｇ／ｍＬの遊離のシステインを含むＦＧＦ２１タンパク質（配列番号３）と、２：１の担体とタンパク質のモル比で混合して実施した。コンジュゲートしたタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィーにより未反応成分から分離した。コンジュゲーション及び純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。次いで、ＦＧＦ２１単体及びＦＧＦ２１−担体コンジュゲートを、ＰＢＳに緩衝液交換して、０．２２ミクロンフィルターを使って動物実験に使用するために滅菌した。
【０１８９】
ＦＧＦ２１（配列番号３）又はＦＧＦ２１−担体コンジュゲートの薬物動態は、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットで試験した。簡単に述べると、０．１ｍｇ／ｋｇの各分子を、ＳＣ注射によりラットに別々に注射した。血漿の試料を、３０分、６０分、１２０分、２４０分、３６０分、２４時間、及び４８時間で回収した。試料を、ＦＧＦ２１用に確認されている市販のＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＥＺＨＦＧＦ２１−１９Ｋ）を使用して分析した。結果は、ＦＧＦ２１とＦＧＦ２１−担体コンジュゲートの間で、以下の時点で（３０、６０、１２０、及び２４０分）、ＳＣ投与の後の吸収の著しい差を示し、その後ＦＧＦ２１レベルは低下し始めた（図３）。これらのデータは、担体のＦＧＦ２１へのコンジュゲーションが、ＳＣ注射の後のＦＧＦ２１のバイオアベイラビリティを著しく高めたことを示す（３８０倍の増加、ＦＧＦ２１の平均Ｃｍａｘ、３７６ｐｇ／ｍＬを、ＦＧＦ２１−担体コンジュゲートの平均Ｃｍａｘ、１４３５２６ｐｇ／ｍＬから分けることにより計算）。曲線下面積（ＡＵＣ）は、ＦＧＦ２１−担体コンジュゲートでは１０４７９８０ｈ＊ｐｇ／ｍＬ及びＦＧＦ２１単体では１５５１ｈ＊ｐｇ／ｍＬと計算した。したがって、ＦＧＦ２１−担体コンジュゲートの平均ＡＵＣを、ＦＧＦ２１の平均ＡＵＣから分けると、６７５倍の薬物曝露の増加があった。合わせると、データは、バイオアベイラビリティの増加における担体分子の有用性を実証し、コンジュゲートされたＦＧＦ２１が、天然のＦＧＦ２１に優って著しい薬物動態の利点を持つことを示す。
【０１９０】
実施例３：グレリンペプチド−担体コンジュゲートの調製及び特性化：
この実施例では、実施例１で生成されたビタミンＤ３−ＰＥＧ−マレイミド担体のグレリンへのコンジュゲーションが、著しく長い半減期をグレリンに与え、それにより、コンジュゲートされた分子が、カヘキシー、食欲不振、及び／又は高齢者の虚弱の治療のための潜在的に有用な治療薬となる。
【０１９１】
Ｃ末端システインが加えられた合成ラットグレリンペプチドをＩｎｎｏｖａｇｅｎ（Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ、配列番号６）から購入した。コンジュゲーションが生物活性に著しい影響を与えないように、実施例１に記載のビタミンＤ３−ＰＥＧ−マレイミド担体を、サイズで２〜３ｋＤａペプチドに比例するように選択した。担体とのコンジュゲーションは、１０ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解させたチオール反応性担体（実施例１）を、１５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ  ６．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ中で１ｍｇ／ｍＬの濃度の遊離システインを含むグレリンペプチドと、２：１の担体とペプチドのモル比で混合させて実施した。コンジュゲートしたペプチドを、イオン交換クロマトグラフィーにより未反応成分から分離した。コンジュゲーション及び純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。次いで、ラットグレリン（ｒグレリン）ペプチド及びｒグレリン−担体コンジュゲートを、ＰＢＳに緩衝液交換して、動物試験に使用するために０．２２ミクロンのフィルターを使用して濾過滅菌した。
【０１９２】
ｒグレリン（配列番号６）又はｒグレリン−担体コンジュゲートの薬物動態を、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットで試験した。簡単に述べると、０．１ｍｇ／ｋｇの各分子を静脈内（ＩＶ）注射により別々にラットに注射した。血漿の試料を、３０分、６０分、１２０分、２４０分、３６０分、２４時間、及び４８時間で回収した。試料を、ラット血漿からのｒグレリンの分析用に確認されている市販のＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＥＺＲＧＲＴ−９１Ｋ）を使用して分析した。結果は、ｒグレリンとｒグレリン−担体コンジュゲートの薬物動態プロファイルにおいて著しい差を示す（図４）。ＷｉｎＮｏｎＬｉｎを使用して半減期を計算すると、ｒグレリンで０．３７時間の半減期及びｒグレリン−担体コンジュゲートで８時間の半減期が明らかになり、計算すると２２倍の向上である。データは、半減期の増加における担体分子の有用性の第二の例を実証した。このように、コンジュゲートされた形態でのグレリンは、カヘキシー、食欲不振、及び高齢者の虚弱などのグレリン反応性の疾病の治療に有用な治療薬である。
【０１９３】
実施例４．グレリンペプチド−担体の受容体結合活性の評価
グレリンペプチドの活性は、担体にコンジュゲートされている場合、スカフォールド及び標的化基の存在により悪影響を受けなかった。これを示すために、グレリン（配列番号５）及び実施例３のビタミンＤ３−ＰＥＧ−マレイミド担体−コンジュゲートグレリンを、以下に記載する細胞ベースの受容体作動剤アッセイを利用して、受容体結合及びグレリン受容体の活性化（作動剤活性）に関して比較した。
【０１９４】
被験化合物を、ＧＨＳ−Ｒ−発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞培養物に加えた。グレリンはＧＨＳ−Ｒ受容体に結合し、それを活性化し、細胞内カルシウム応答を作動剤活性の指標として評価した。ＦＬＩＰＲ（商標）（蛍光イメージングプレートリーダー）ハイスループット細胞スクリーニング装置用のＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．により開発されたカルシウムフラックス系アッセイにより、活性を測定した。
【０１９５】
ＧＨＳ−Ｒを発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞を、最適な細胞の健康を維持するために、１０％ウシ胎児血清、５００ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を補ったＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地で培養し、継代した。アッセイ１８時間前に、３８４−ウェルブラックウォールクリアボトムプレートに、ウェルあたり２０，０００細胞の密度で、２０μＬの増殖培地に細胞を播種し、３７℃／５％ＣＯ２で保った。アッセイの最初に、２０μＬのカルシウム−４ローディングバッファーをウェルに加えた。プレートを、暗所で、３７℃で６０分間、次いで室温で１５分間インキュベートした。グレリン及びグレリン−コンジュゲート被験物は、ＤＭＳＯ中１ｍＭの初期濃度であった。被験物を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝剤を含むハンクの緩衝食塩水（ＨＢＳＳ）（ｐＨ  ７．４）に、連続的に１０倍希釈してから、試験プレートに加えた。各被験物の最終濃度は、細胞への添加前に５×濃度であった。細胞中の細胞内カルシウムレベルを、被験物の添加前にＦＬＩＰＲ（商標）装置を使用して２０秒間測定した。各希釈被験物の１０μＬをプレートに加え、最終体積を５０μＬにした。細胞内カルシウムレベルの変化を、さらに１００秒間（２１から１２０秒）測定した。
【０１９６】
２０秒の読み（１から２０秒）の平均値をベースラインの読みとして計算し、相対蛍光単位（ΔＲＦＵ）強度値を、ベースラインの読みの平均値を引いた最大蛍光単位（２１から１２０秒）により計算した。データ取得及び分析はＳｃｒｅｅｎＷｏｒｋｓ（登録商標）（バージョン３．１）を利用して実施し、Ｅｘｃｅｌにエクスポートした。
【０１９７】
化合物の活性化％は、以下の式を利用して計算した：
活性化％＝（ΔＲＦＵ化合物−ΔＲＦＵバックグラウンド）／（ΔＲＦＵ作動剤対照−ΔＲＦＵバックグラウンド）｝×１００％、次いで、活性化を、化合物の累積投与量の対数の関数としてプロットした。データは、二連の測定の平均を表す。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより書かれたデータ分析ウィザードを利用してＥＣ５０を決定した。
【０１９８】
担体のないグレリンのＥＣ５０値は８８．５ｎＭであった。比較すると、担体コンジュゲートグレリンは、ＥＣ５０値が８５ｎＭであり、対照ペプチドにほぼ等しい。このように、ペプチドの作動剤活性は、グレリンペプチドへの担体のコンジュゲーションの後に保存された。ＤＢＰを含む１０％血清の存在下でアッセイを実施したことに留意されたい。担体コンジュゲートペプチドでは、受容体結合及び活性化に干渉は全く観察されなかった。
【０１９９】
実施例５．ＮＨＳ反応性基を有するビタミンＤ３−ＰＥＧで構成された例示的なアミン反応性担体の調製
担体上のＮＨＳ反応性基を、タンパク質上のアミン基へのコンジュゲーションのために生成させた。２ｋＤａのＰＥＧを、この実施例のスカフォールドとして選択した。この実施例に使用した出発物質は、ビタミンＤアナログ（化合物１）に関してはＴｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから、２ｋＤａのｍＰＥＧ−アミノ酸（化合物５）に関してはＣｒｅａｔｉｖｅ  Ｐｅｇｗｏｒｋｓから購入した。
【０２００】
図５（工程１及び２）によると：（Ｒ）−メチル−５−（（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ，Ｅ）−４−（（Ｚ）−２−（（Ｓ）−５−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−２−メチレンシ−クロヘキシリデン）エチリデン）−７ａ−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）ヘキノアート（化合物１、８．２ｍｇ、０．０１５９ｍｍｏｌ、１当量）を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、０．４ｍＬ）に溶解させ、混合物に窒素を流した。テトラブチルアンモニウムフルオリド溶液（２５ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ、６当量）を加え、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、シリカゲル、ヘキサン中３０％酢酸エチル、ＵＶ検出、リンモリブデン酸染色）によりモニタリングしながら、反応混合物を室温で３時間撹拌した。化合物２を含む生じた混合物に、水酸化リチウム一水和物（４．６ｍｇ、０．１０９ｍｍｏｌ、７当量）、ＴＨＦ（０．３ｍＬ）、及び水（０．１６ｍＬ）を加えた。反応混合物に窒素を流し、室温で１８時間撹拌した。ＴＬＣ及び質量分析法（ＭＳ）による評価により、期待される化合物３の存在と共に完全な反応が示された。反応混合物をエーテル（１０ｍＬ）で希釈し、１０％クエン酸水溶液（１０ｍＬ）、水（１０ｍＬ）、及びブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、温度を２０℃未満に保ちながら濃縮した。窒素気流下で試料をさらに乾燥させると、（（Ｒ）−５−（（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ，Ｅ）−４−（（Ｚ）−２−（（Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−メチレンシクロヘキシリデン）エチル−インデン）−７ａ−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）ヘキサン酸（化合物３、６．１ｍｇ、収率９９％）を無色ゴムとして与えた。Ｒｆ０．２（シリカゲル、ヘキサン中４０％酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ））。核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）分析により、約７％のエーテルの存在が明らかになった。
【０２０１】
図５（工程３）によると：ＰＥＧ−アミノ酸４（１８．５ｍｇ、０．００９２ｍｍｏｌ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｐｅｇｗｏｒｋｓから購入）の無水メタノール溶液に、ジオキサン中のＨＣｌ（４Ｍ、１．５ｍＬ）を加え、反応混合物を密封した管の中で７０℃で２０時間加熱した。反応物をＴＬＣ（ニンヒドリン染色）によりモニタリングし、反応が完了すると、ロータバップで濃縮させた。残渣をジクロロメタン（３×５ｍＬ）及びエーテル（３×５ｍＬ）と同時蒸発させて薄黄色の泡とし、それをエーテル（５ｍＬ）に懸濁させた。液体をデカンテーションし、得られた固体を乾燥して、所望の生成物５（１４ｍｇ、７５％）を薄黄色の固体として単離した。Ｒｆ０．２（シリカゲル、２０％メタノール（ＭｅＯＨ）／ＤＣＭ／０．２％ＮＨ４ＯＨ）。ＮＭＲ分析により、認識できる量の塩化メチレンもエーテルも示されなかった。
【０２０２】
図５（工程４）によると：化合物３（３．４ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ、１当量）、化合物６（メチルエステルＰＥＧ−アミンＨＣｌ塩、１４ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ、０．８当量）、及び２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨージド（５．６ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ、２．５当量）を、無水ジクロロメタン（０．６ｍＬ）に溶解させた。トリエチルアミン（５μＬ、０．０３５６ｍｍｏｌ、４当量）を加え、反応混合物を窒素下で、３時間室温で撹拌した。反応はこの時点では不完全であったので、追加量の化合物３（１．７ｍｇ、０．００４５ｍｍｏｌ）を加え、反応をさらに３時間継続し、次いで、ジクロロメタン（１０ｍＬ）で希釈し、１０％クエン酸水溶液（１０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）、及びブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、温度を２０℃未満に保ちながら濃縮した。試料をシリカゲル（２ｇ）フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。カラムを、最初に酢酸エチルにより溶出して、未反応の化合物３を除き、次いで１〜１０％のＭｅＯＨ／ジクロロメタン（各２０ｍＬ）で溶出した。純粋な生成物を含む分画を合わせて、温度を２０℃未満に保ちながらロータバップで蒸発させた。窒素気流下で試料を乾燥させると、化合物７を茶色のゴムとして与えた（１０ｍｇ、６０％）。Ｒｆ０．３（シリカゲル、ジクロロメタン中５％ＭｅＯＨ）。単離した生成物のＴＬＣ分析（ニンヒドリン染色）により、化合物６がないことが示された。単離した物質の１Ｈ  ＮＭＲ分析により、その正体及び純度が確認された。ＮＭＲ分析により、１．１％の塩化メチレンの存在が明らかになった。
【０２０３】
図５（工程５）によると：化合物７（１０ｍｇ、０．００４２ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（０．２ｍＬ）と一滴のメタノールの混合物に溶解させた。この溶液に、水酸化リチウム一水和物溶液（０．９ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ、０．１ｍＬの水中５当量）を加えた。反応混合物に窒素を流し、室温で１８時間撹拌した。ＴＬＣにより評価すると、化合物８の存在と共に完全な反応が示された。反応混合物をジクロロメタン（１０ｍＬ）で希釈し、１０％クエン酸水溶液（１０ｍＬ）及びブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、温度を２０℃未満に保ちながら濃縮した。窒素気流下で、試料をさらに乾燥させると、所望のビタミン−Ｄ３−ＰＥＧ−酸（化合物８、７ｍｇ、収率７１％）を茶色のゴムとして与えた。Ｒｆ０．２（シリカゲル、１０％ＭｅＯＨ／ジクロロメタン）。ＮＭＲ分析により、約２％のジクロロメタンの存在が明らかになった。
【０２０４】
ストック溶液を調製した：１ｍＬの無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の３４ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び１ｍＬの無水ジクロロメタン中の６１ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）。
【０２０５】
図５（工程６）によると：化合物８（７ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ、１当量）のジクロロメタン（０．３ｍＬ）溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのＤＭＦ溶液（１０μＬ、０．３４ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）、それに続いてＤＣＣのジクロロメタン溶液（１０μＬ、０．６１ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物に窒素を流し、２０時間撹拌した。ＴＬＣにより示されるとおり反応がこの時点で不完全であったので、追加量のＤＭＦ中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２５μＬ、０．８５ｍｇ、０．００７５ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン中のＤＣＣ（２５μＬ、１．５３ｍｇ、０．００７５ｍｍｏｌ）を加え、反応をさらに２０時間継続した。クロロホルム（１０ｍＬ）を反応混合物に加え、水（１０ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去すると、所望の目的化合物ビタミンＤ３−ＰＥＧ−ＮＨＳ（７．０ｍｇ、粗製）を与えた。この物質の１Ｈ  ＮＭＲ及びＴＬＣ（Ｒｆ：０．３、１０％ＭｅＯＨ／クロロホルム）により所望の物質の存在が示された。次いで、ビタミンＤ３−ＰＥＧ−ＮＨＳ担体を実施例６で使用した。
【０２０６】
実施例６．抗体−担体コンジュゲートの調製及び特性化
インフリキシマブ−担体コンジュゲートは、インフリキシマブ単体と比べて、ラットで血清濃度及びバイオアベイラビリティの増加を示した。
【０２０７】
インフリキシマブは、凍結乾燥粉末として適切な塩と共に販売されており（Ｈａｎｎａｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、それを、水で１０ｍｇ／ｍＬの濃度で再懸濁させた。ビタミンＤ３−ＰＥＧ−ＮＨＳ担体を、ＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍＬの濃度で再懸濁させた。次いで、ビタミンＤ３−ＰＥＧ−ＮＨＳ担体とインフリキシマブを、担体とインフリキシマブのモル比５：１及び１０：１で混合した。本発明の治療化合物担体コンジュゲートは、典型的には、治療化合物に個々に結合した担体分子を少なくとも１個有し、１〜１０個の担体分子になり得る。担体のＮＨＳバージョンを使用することにより、２個以上の担体を治療用タンパク質に結合することができ、これは、実験的には、反応物中の担体と目的治療薬のモル比を変えることにより制御できる。この実施例において、２〜４担体の目標分布を、所望のパラメーターとして設定した。２つの異なるモル比を試験し、得られたコンジュゲートを質量分析法により調べることにより、実際の比率を決定した。
【０２０８】
インフリキシマブ及びインフリキシマブＮＨＳ−担体コンジュゲートを、コンジュゲートしていない担体から、４０ｋＤａカットオフの脱塩カラム（Ｚｅｂａ  Ｓｐｉｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分離した。質量分析法を利用して、反応物中のインフリキシマブのインタクトマスを計算した。結果により、未修飾のインフリキシマブが圧倒的に１４９ｋＤａの質量を有することが示された。担体にコンジュゲートされたインフリキシマブの質量は、抗体あたり２〜４担体で３ｋＤａ担体の平均結合と共に増加する割合の質量を有した。
【０２０９】
次いで、精製した５：１反応生成物を、皮下（ＳＣ）投与されたインフリキシマブをインフリキシマブ−担体コンジュゲートと比較するラット薬物動態試験に使用した。投与量は全試験群で１ｍｇ／ｋｇであり、一群には３匹のラットがいた。血清試料を、投薬前及び注射後５分から４８時間の種々の時間で回収した。次いで、血清中のインフリキシマブのレベル決定に特異的なＥＬＩＳＡキット（Ｐｒｏｍｏｎｉｔｏｒ（商標）、Ｐｒｏｇｅｎｉｋａ（商標））を使用して、血清試料をＥＬＩＳＡにより分析した。薬物動態パラメーターを、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎを利用して決定した。図６に示す結果は、コンジュゲートしていない抗体に比べて抗体がビタミンＤ３−ＰＥＧ−ＮＨＳ担体にコンジュゲートしている場合の、血清濃度及び曲線下面積（ＡＵＣ）の１．５倍の向上を表す。より具体的には、２４時間及び４８時間の時点で、インフリキシマブでは、２１００ｎｇ／ｍＬ及び４８００ｎｇ／ｍＬの濃度が観察される。対照的に、２４時間及び４８時間の時点で、担体にコンジュゲートされたインフリキシマブでは、３２００ｎｇ／ｍＬ及び７０００ｎｇ／ｍＬの濃度が観察される。これは、バイオアベイラビリティの５０％向上ということになる。ＡＵＣ計算により、５０％向上が示された（図６）。このように、この実施例は、コンジュゲートしていない抗体に比べて、インフリキシマブの血清濃度及びバイオアベイラビリティの向上における担体の有用性を示す。
【０２１０】
例示的な配列
【化３６】
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【化３７】
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【化３８】
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【化３９】
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【化４０】
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【化４１】
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【化４２】
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【化４３】
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【化４４】
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【化４５】
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【０２１１】
本明細書に開示され言及された全ての刊行物及び特許は、引用によりその全体として組み込まれる。上記明細書は説明及び記載の目的のみに提示された。本明細書は、本発明を、開示された厳密な形態に限定しないものとする。本発明の範囲が、本明細書に添付される特許請求の範囲により定義されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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