(57)【要約】  本発明は、ミゾコウジュ（Salvia plebeia R. Br.）の抽出物またはその分画物を有効成分として含むSTAT3媒介性疾患の予防または治療用医薬組成物および前記組成物をSTAT3媒介性疾患の疑いのある個体に投与する段階を含む、STAT3媒介性疾患の治療方法に関する。また、本発明は、前記抽出物またはその分画物を有効成分として含むSTAT3媒介性疾患の予防または改善用の食品組成物および医薬部外品組成物に関する。【選択図】  図１
2015518861.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミゾコウジュ（Salvia plebeia R. Br.）の抽出物またはその分画物を有効成分として含む、STAT3媒介性疾患の予防または治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記抽出物が、水、炭素数１〜６のアルコールおよびこれらの混合溶媒からなる群から選択される溶媒で抽出したものである、請求項１に記載の医薬組成物。 
【請求項３】
前記アルコール溶媒がエタノールである、請求項２に記載の医薬組成物。 
【請求項４】
前記分画物が酢酸エチル分画物である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記STAT3媒介性疾患が、炎症性疾患、自己免疫疾患および代謝性疾患からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。 
【請求項６】
前記炎症性疾患が、形質細胞増加症、超免疫グロブリン血症、貧血、腎炎、悪液質、牧畜業者の疾病、血管増殖性腎炎、ブドウ膜炎、慢性甲状腺炎、遅延型過敏症、クローン病、膵臓炎、若年性特発性萎縮症、糖尿病およびアルツハイマー病からなる群から選択される、請求項５に記載の医薬組成物。 
【請求項７】
前記自己免疫疾患が、アトピー性皮膚炎、リウマチ性関節炎、骨関節炎、乾癬、喘息、移植片対宿主疾患、免疫不全、全身性エリテマトーデスおよび多発性硬化症からなる群から選択される、請求項５に記載の医薬組成物。 
【請求項８】
前記代謝性疾患が、骨粗しょう症、動脈硬化症および心筋梗塞からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。 
【請求項９】
前記STAT3媒介性疾患が、自己免疫疾患に属するリウマチ性関節炎である、請求項１に記載の医薬組成物。 
【請求項１０】
前記STAT3媒介性疾患が、自己免疫疾患に属するアトピー性皮膚炎である、請求項１に記載の医薬組成物。 
【請求項１１】
前記組成物が、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、無菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤および坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形で製造されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物 
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物をSTAT3媒介性疾患の疑いのある個体に投与する段階を含む、STAT3媒介性疾患の治療方法。 
【請求項１３】
ミゾコウジュの抽出物またはその分画物を有効成分として含む、STAT3媒介性疾患の予防または改善用の食品組成物。 
【請求項１４】
ミゾコウジュの抽出物またはその分画物を有効成分として含む、STAT3媒介性疾患の予防または改善用の医薬部外品組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミゾコウジュ（Salvia plebeia R. Br.）の抽出物またはその分画物を有効成分として含む、STAT3媒介性疾患の予防または治療用医薬組成物および前記組成物をSTAT3媒介性疾患の疑いのある個体に投与する段階を含む、STAT3媒介性疾患の治療方法に関する。また、本発明は、前記抽出物またはその分画物を有効成分として含むSTAT3媒介性疾患の予防または改善用の食品組成物および医薬部外品組成物に関する。 
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン-6（IL-6）は、B細胞刺激因子2（BSF2）またはインターフェロン-2（INF-2）とも呼ばれるサイトカインであり、Bリンパ球の活性化に関与する分化因子として発見された。その後、様々な細胞の機能に影響を与える多機能サイトカインであることが明らかになった。IL-6は、細胞膜上に二種類のタンパク質を介してその生物学的活性を伝達する。一つは、IL-6が結合するタンパク質であるIL-6受容体に、IL-6受容体は、細胞膜を貫通して発現されており、約８０ｋＤａの分子量を有する膜結合型タンパク質である。他の一つは、リガンド非結合性のシグナル伝達に属する約130kDaの分子量を有する膜タンパク質gp130である。IL-6とIL-6受容体は、IL-6/IL-6受容体複合体を形成し、次いでgp130と結合する。このようなリガンドと受容体の結合後、細胞内ではヤヌスキナーゼ2 (Janus Kinase 2、JAK2）がリン酸転移反応によって活性化される。活性化されたJAK2によって受容体の細胞質ドメインの複数のチロシン残基がリン酸化され、これはSH2や他のホスホチロシン結合モチーフを有するシグナル伝達性転写因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）のような細胞内タンパク質のドッキング部位の役割を果たすようになる。受容体の細胞質ドメインに結合したSTAT3は、JAK2によってリン酸化がなされた後、受容体から離れ、このような活性化されたSTAT3は、細胞質内に互いに結合してホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成した後、核内入って標的遺伝子の認識配列に結合し、転写を増加させる。
【０００３】
このようなIL-6によって誘導されるシグナル伝達系と炎症性疾患、自己免疫疾患および代謝性疾患に対する関連性は既に知られている。炎症性疾患、自己免疫疾患などの治療のため、IL-6によって誘導されるシグナル伝達系の抑制に関する研究が盛んに進められており、現在IL-6のシグナル伝達系の抑制に対しては抗IL-6 R抗体（anti-IL-6 receptor antibody）を用いたものが最も多く知られている。前記抗IL-6 R抗体を用いたリウマチ性関節炎に対する滑液細胞増殖抑制剤（特許文献１)、抗IL-6 R抗体を用いた形質細胞増加症、超免疫グロブリン血症、貧血、腎炎、悪液質、リウマチ性関節炎、牧畜業者の疾病および血管増殖性腎炎のようなIL-6生成物に起因する疾患の治療などが既に知られている（特許文献２)。また、抗IL-6 R抗体は、多発性硬化症、ブドウ膜炎、慢性甲状腺炎、遅延型過敏症およびアトピー性皮膚炎などの過敏性T細胞に関連する疾患（特許文献３)、全身性エリテーマトスの治療、クローン病の治療（特許文献４)、膵臓炎の治療（特許文献５)、乾癬の治療（特許文献６）および若年性慢性関節炎の治療（特許文献７）に適用され得ることが報告されている。しかし、前記抗IL-6 R抗体の場合、個体内に導入されると、外来タンパク質として認知される部分であるエピトープを有することがあるため、治療剤として使用する際、依然として免疫原性を有することがある。前記のような問題点を解決するために、免疫システムに認識されないタンパク質ではない、小さな分子化合物を利用して、IL-6およびSTAT3によって媒介される疾病の治療薬を開発するために多くの研究がなされている。 
【０００４】
一方、インターロイキン-11（IL-11）は、IL-6ファミリーに属している炎症性サイトカインであり、IL-6とほぼ同じシグナル伝達系を持つことが知られており、造血、免疫反応、炎症および各種癌細胞でその発現が増加されたことが知られている。最近では、IL-11が、その受容体であるIL-11Ｒとgp130に結合して、胃がん、大腸がん細胞の増殖および癌の浸潤を促進することが報告されており（非特許文献１、非特許文献２)、IL-11/STAT3シグナルによってsmad7が活性化され、同時にTGFシグナルを誘導するsmad活性因子が遮断されることにより、抗アポトーシス遺伝子、プロ血管形成遺伝子または増殖遺伝子が関与する発癌性プログラム（oncogenic program）が活性化され、炎症関連の胃腫瘍が誘導される場合がある（非特許文献３)。また、IL-11は、骨細胞の増殖および分化の調節に関与しており、骨粗しょう症において治療標的となり得ることがことが知られている（非特許文献４)。これらの事実が明らかになると共に、IL-11によるgp130/JAK/STAT3経路が骨粗しょう症などの様々な病気の治療における新たなターゲットとして浮上している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際特許公開  第96/011020号  公報
【特許文献２】国際特許  第96/012503号  公報
【特許文献３】国際特許公開  第98/042377号  公報
【特許文献４】国際特許公開  第99/047170号  公報
【特許文献５】国際特許公開  第00/010607号  公報
【特許文献６】国際特許公開  第02/034292号  公報
【特許文献７】国際特許公開  第02/080969号  公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nakayama Tなど Int J Oncol, 2007, 30, 825 -833
【非特許文献２】Yoshizaki Aなど Int J Oncol, 2006, 29、869-876
【非特許文献３】Ernstなど J. Clin．Invest2008、118(5), 1728-1738
【非特許文献４】Sims NA el al., J Bone Miner Res.,2005 Jul;20(7):1093-102
【非特許文献５】Harborne J.B. Phytochemical methods：A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed. p6-7, 1998
【非特許文献６】Wrighting DM et al, Blood 2006 Nov1;108(9)：3204-9
【非特許文献７】Arakawa T et al,  Nephrol Dial Transplant  2008 Nov;23(11):3418-26
【非特許文献８】Lovato P et al., J Biol Chem, 2003 May 9; 278(19)：16777-81
【非特許文献９】Fukuda A et al, Cancer Cell、2011 Apr12;19(4)：441-55
【非特許文献１０】Simeone-Penney MC et al., J Immunol. 2007 May15;178(10):6191-9
【非特許文献１１】Ma HH et al., Cell Immunol. 2011;268(1):37-46
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明者らは、前記IL-6またはIL-11によって活性化されたSTAT3経路を標的とする天然物を見出すため鋭意努力した結果、ミゾコウジュの抽出物および分画物がIL-6によって活性化される炎症、自己免疫疾患など関連する転写因子であるSTAT3の転写活性およびリン酸化を阻害し、IL-6により誘導されるシグナル伝達系を効果的に阻害することを確認することにより、前記抽出物またはその分画物を有効成分として含むSTAT3媒介性疾患の予防または治療用医薬組成物の発明を完成した。
【発明を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一つの目的は、ミゾコウジュの抽出物またはその分画物を有効成分として含む、STAT3媒介性疾患の予防または治療用医薬組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記組成物をSTAT3媒介性疾患の疑いのある個体に投与する段階を含む、STAT3媒介性疾患の治療方法を提供することにある。 
【００１０】
また、本発明の他の目的は、ミゾコウジュの抽出物またはその分画物を有効成分として含む、STAT3媒介性疾患の予防または改善用の食品組成物を提供することにある。  さらに、本発明の他の目的は、ミゾコウジュの抽出物またはその分画物を有効成分として含む、STAT3媒介性疾患の予防または改善用の医薬部外品組成物を提供することにある。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のミゾコウジュ抽出物またはその分画物は、長年、天然薬剤として使用されてきた天然物に由来しており、副作用がなく、且つIL-6に誘導されるSTAT3シグナル伝達系を効率的に阻害するので、STAT3媒介性疾患、例えば炎症性疾患、自己免疫疾患または代謝性疾患の予防または治療において有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ミゾコウジュエタノール抽出物および酢酸エチル分画物の、IL-6によって誘導されるルシフェラーゼの発現阻害活性を示した図である。
【図２】ミゾコウジュエタノール抽出物の、IL-6によって誘導されるSTAT3リン酸化を阻害する活性を示した図である。
【図３】ミゾコウジュ酢酸エチル分画物の、IL-6によって誘導されるSTAT3リン酸化を阻害する活性を示した図である。
【図４】ミゾコウジュエタノール抽出物および酢酸エチル分画物の、IL-6によって誘導されるJAK2およびERKリン酸化を阻害する活性を示した図である。
【図５】ミゾコウジュエタノール抽出物の、STAT3によって誘導されたSCOS-3 mRNAの発現阻害活性を示した図である。
【図６】ミゾコウジュエタノール抽出物の、STAT3によって誘導されたMCP-1 mRNAの発現阻害活性を示した図である。
【図７】ミゾコウジュエタノール抽出物の、STAT3によって誘導されたICAM-1 mRNAの発現阻害活性を示した図である。
【図８】ミゾコウジュエタノール抽出物の効能を確認するための、リウマチ性関節炎マウスモデルの製作スケジュールを示した図である。
【図９】ミゾコウジュエタノール抽出物の投与によって、リウマチ性関節炎誘導マウスの足裏の厚さが減少する効果を示した図である。
【図１０】ミゾコウジュエタノール抽出物の投与によって、リウマチ性関節炎誘導マウスの関節炎の重症度を低下させる効果があることを示す図である。
【図１１】ミゾコウジュエタノール抽出物の投与によって、リウマチ性関節炎誘導マウスの関節炎発病率が減少していることを示した図である。
【図１２】ミゾコウジュエタノール抽出物の投与によって、リウマチ性関節炎誘導マウスの血中免疫グロブリンG1が減少していることを示した図である。
【図１３】ミゾコウジュエタノール抽出物の投与によって、リウマチ性関節炎誘導マウスの血中免疫グロブリンG2aが減少していることを示した図である。
【図１４】アトピー性皮膚炎マウスモデルの製作スケジュールを示した図である。
【図１５】ミゾコウジュエタノール抽出物が、アトピー性皮膚炎誘導マウスの耳の厚さを減少させる効果があることを確認した図である。ここで、ADはアトピー性皮膚炎を、MEBCはミゾコウジュ抽出物を示す。
【図１６】ミゾコウジュエタノール抽出物の、アトピー性皮膚炎誘導マウスの血中免疫グロブリンEに対する抑制効果を確認した図である。
【図１７】ミゾコウジュエタノール抽出物の、アトピー性皮膚炎誘導マウスの血中免疫グロブリンG2aに対する抑制効果を確認した図である。
【図１８】ミゾコウジュエタノール抽出物の、アトピー性皮膚炎誘導マウスの血中ヒスタミンの抑制効果を示した図である。
【図１９】ミゾコウジュエタノール抽出物の、アトピー性皮膚炎誘導マウスの炎症誘発性サイトカインの分泌抑制効果を示した図である。ここで、ADはアトピー性皮膚炎、MEBCはミゾコウジュ抽出物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
一つの実施態様として、本発明は、ミゾコウジュの抽出物またはその分画物を有効成分として含む、STAT3媒介性疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。 
【００１４】
本発明における用語「ミゾコウジュ（Salvia plebeia R. Br.）」とは、双子葉植物アキギリ属にするシソ科の２年草で、ユキミソウまたは過冬青などとも呼ばれる植物を意味する。形態的には、茎は四角柱状で短く柔らかい毛で覆われており、葉は楕円形か披針形で、縁は鈍い鋸歯や鋭い鋸歯の形を有し、基部は円形またはくさび形をしている。薬理活性の面においては、咳血、吐血、血尿、腹水、白濁尿などに効能があることで知られているが、ミゾコウジュのSTAT3媒介性疾患の治療用途については、まだ知られていない。また、本発明において、ミゾコウジュは商業的に市販されているものを購入したり、自然から採取したり、または栽培したものを使用することができる。 
【００１５】
本発明における用語「ミゾコウジュ抽出物」とは、ミゾコウジュを抽出することによって得られた抽出物を意味する。前記ミゾコウジュ抽出物は、ミゾコウジュ粉砕物を乾燥重量の約2〜20倍、好ましくは約3〜5倍の容量の水、メタノール、エタノールおよびブタノールなどの炭素数1（C1）〜6（C6）のアルコールなどの極性溶媒またはこれらの約1：0.1 〜1：10の混合比を有する混合溶媒を溶出することができ、抽出温度は20℃〜100℃、好ましくは室温で、抽出期間は約12時間〜4日間、好ましくは3日間、熱水抽出、冷浸抽出、還流冷却抽出または超音波抽出などの抽出方法を用いて抽出した抽出物であってもよい。好ましくは冷浸抽出で1回〜5回連続抽出して減圧濾過し、そのろ過抽出物を真空回転濃縮機で20℃〜100℃、好ましくは室温で減圧濃縮して、水、アルコール、またはこれらの混合溶媒に可溶したミゾコウジュ粗抽出物を得た結果物であってもよいが、本発明のSTAT3媒介性疾患の治療効果を示し得る抽出物であれば、これに限定されず、抽出液、抽出液の希釈液または濃縮液、抽出液を乾燥することによって得られる乾燥物、またはこれらの粗精製物もしくは精製物をすべて含む。前記ミゾコウジュ抽出物は、天然、雑種、変種植物の様々な器官から抽出することができ、例えば、根、地上部、茎、葉、花、実の胴体、実の皮だけでなく、植物組織の培養物からも抽出可能である。
【００１６】
本発明の一実施例では、ミゾコウジュ粉砕物の抽出を、エタノールを溶出溶媒として用い、室温で7日間冷浸抽出した後減圧濾過し、真空回転濃縮機で室温にてエタノール溶媒を除去することによって行った（実施例1)。 
【００１７】
本発明における用語「分画物」とは、様々なな構成成分を含む混合物から特定の成分または特定のグループを分離する分画方法によって得られた結果物を意味する。前記分画物は、好ましくはミゾコウジュ抽出物をn-ヘキサン、酢酸エチル等の溶媒を用いた溶媒分画方法で分画された結果物であってもよく、極性溶媒分画物と非極性溶媒分画物をすべて含み、具体的にはヘキサン分画物または酢酸エチル分画物などがすべて使用できる。より好ましくは、酢酸エチル分画物であってもよく、本発明のSTAT3媒介性疾患の治療効果を奏し得る分画物はすべて含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、水分画物の場合、STAT3ルシフェラーゼ活性を阻害しないので、本発明の分画物に含まれないこともある 。 
【００１８】
前記で得られたミゾコウジュ粗抽出物を蒸留水に懸濁した後、懸濁液の約1〜100倍、好ましくは約1〜5倍の容量の酢酸エチルなどの非極性溶媒を加えて1回〜10回、好ましくは2回〜5回にわたり非極性溶媒の可溶層を抽出、分離することによって得ることができる。また、さらに通常の分画工程を行うこともできる（非特許文献５)。具体的には、前記ミゾコウジュ粗抽出物を水に懸濁した後、同量の酢酸エチル溶媒を用いて連続抽出によってミゾコウジュの各溶媒可溶抽出物を得ることができ、より具体的には、ミゾコウジュ粗抽出物を水に懸濁した後、同量の酢酸エチルを加え、酢酸エチル可溶性分画物および水可溶性分画物を得ることができる。 
【００１９】
本発明の一実態様では、ミゾコウジュ粗抽出物を水に懸濁した後、同量の酢酸エチルを加えて混合して分画し、このプロセスを3回繰り返して得られた酢酸エチル可溶性分画物を減圧濃縮することによって、酢酸エチル可溶抽出物を得た（実施例1)。 
【００２０】
本発明における用語「STAT3媒介性疾患」とは、IL-6またはIL-11がその受容体に結合してSTAT3のリン酸化、すなわちSTAT3の活性化を誘導し、リン酸化したSTAT3が核内に移動して、自己免疫疾患、炎症性疾患または代謝性疾患の発病または進行に関与するその標的遺伝子を発現させることよって発病する疾患の総称を意味する。前記STAT3媒介性疾患は、特にこれに限定されないが、自己免疫疾患、炎症性疾患または代謝性疾患である。
【００２１】
本発明における用語「自己免疫疾患」とは、病的個体の自己抗原に対する免疫反応が、直接的または間接的な原因によって現れる疾患の総称を意味し、本発明の目的上、前記IL-6またはIL-11によって活性化されたSTAT3により媒介される自己免疫疾患である。前記自己免疫疾患は、これらに限定されないが、好ましくは、アトピー性皮膚炎、リウマチ性関節炎、骨関節炎、乾癬、喘息、移植片対宿主病、免疫不全症、全身性エリテマトーデスまたは多発性硬化症である。自己免疫疾患において活性化されたSTAT3は主要転写因子として作用するので、IL-6によって媒介されるSTAT3の活性化を抑制する本発明の組成物は、自己免疫疾患の治療に有効に利用できる。 
【００２２】
本発明における用語「炎症性疾患」とは、炎症を主病変とする疾患の総称を意味し、本発明の目的上、前記IL-6またはIL-11により活性化されたSTAT3によって媒介される炎症性疾患を意味する。前記炎症性疾患は、形質細胞増加症、超免疫グロブリン血症、貧血、腎炎、悪液質、牧畜業者の疾病、血管増殖性腎炎、ブドウ膜炎、慢性甲状腺炎、遅延型過敏症、クローン病、膵臓炎、若年性特発性萎縮症、糖尿病およびアルツハイマー病を含む。本発明のミゾコウジュ抽出物またはその分画物を有効成分として含む医薬組成物は、STAT3によって媒介された炎症が誘発された疾患に有効に利用できるが、STAT3によって媒介された炎症が誘発された皮膚以外の身体部位の治療により有用である。IL-6は、様々な免疫反応に関与しているサイトカインとして知られているが、皮膚におけるIL-6の役割には違いがあることが知られている。具体的には、皮膚におけるIL-6は、宿主防御の際に、角質層の強化に関与し、刺激または感染からの保護に関与しており、そのほかの役割においては、インターフェロンガンマなどの他の因子が必要となり、内臓器官などの他の部位での免疫反応に関与するものとは異なるので、本発明のIL-6が関与する炎症性疾患の場合には、皮膚の炎症というよりは他の身体部位の炎症の治療に有用である。 
【００２３】
本発明における用語「代謝性疾患」とは、生体内の物質代謝障害によって発生する疾患の総称を意味し、本発明の目的上、IL-6またはIL-11により活性化されたSTAT3によって媒介された代謝性疾患である。前記代謝性疾患は、これらに限定されないが、骨粗しょう症、動脈硬化症または心筋梗塞である。前記骨粗しょう症の原因の一つとして、骨吸収を促進するIL-6の過剰生産を挙げることができるが、これにより、IL-6によって媒介されるSTAT3の活性を抑制する本発明の組成物は、骨粗しょう症の治療に効果的である。
【００２４】
本発明の一実態様によれば、本発明者らは、IL-6によって誘導されるSTAT3ルシフェラーゼ活性をミゾコウジュエタノール抽出物およびその酢酸エチル分画物が濃度依存的に阻害することを確認し（図1)、また、IL-6によって誘導されるSTAT3のチロシン705位残基（Try705）のリン酸化をエタノール抽出物および酢酸エチル分画物が濃度依存的に効果的に阻害し（図2および3)、STAT3のリン酸化を媒介するJAK2のリン酸化もまた、エタノール抽出物および酢酸エチル分画物が効果的に阻害し、STAT3の標的遺伝子であるS0CS-3、MCP-1およびICAM-1のmRNA発現をミゾコウジュエタノール抽出物が低減させることを確認した（図7)。また、本発明では、ミゾコウジュエタノール抽出物が、2型コラーゲンによって誘導されたリウマチ性関節炎マウスの足の浮腫、関節炎の発病などを効果的に治療することを確認し、また、ミゾコウジュエタノール抽出物の効能が商用化されている関節炎治療剤のケトプロフェンと比較した場合においても、ケトプロフェンと類似した治療効果を示すことを確認した（図9、10および11)。さらに、ミゾコウジュエタノール抽出物は、コラーゲンに対する免疫グロブリンG1およびG2aの生成も効果的に抑制するという結果を示した（図12および13)。このような結果から、本発明のミゾコウジュ抽出物が代表的な自己免疫疾患の一種であるリウマチ性関節炎を効果的に予防または治療することができることを確認し、それを自己免疫疾患などのSTAT3媒介疾患の治療に有効に利用できることを確認した。 
【００２５】
また、本発明では、ミゾコウジュ抽出物がチリダニ抽出物とDNCBによって誘導したアトピー性皮膚炎マウスモデルにおいて治療効果があることを立証した。具体的には、ミゾコウジュエタノール抽出物は、アトピー性皮膚炎誘導マウスの耳の浮腫を効果的に減少させ（図15)、アトピー性皮膚炎による血中免疫グロブリンEとグロブリンG2aの生成を抑制させる結果を示した（図16および17)。また、ミゾコウジュエタノール抽出物は、アトピー性皮膚炎によるヒスタミン遊離を抑制させる結果を示し（図18)、炎症性サイトカインの生成および分泌を抑制させる結果を示した（図19)。このような結果から、本発明のミゾコウジュ抽出物が代表的な自己免疫疾患の一種であるアトピー性皮膚炎を効果的に予防または治療可能であることを示し、これを自己免疫疾患などのSTAT3媒介疾患の治療に有効に利用できることを確認した。総合すると、本発明のIL-6によって誘導されたSTAT3活性を阻害したミゾコウジュの抽出物及びその分画物は、STAT3媒介性疾患の予防または治療において効果的に利用できることを示した。 
【００２６】
本発明における用語「予防」とは、前記組成物の投与によってSTAT3媒介性疾患を抑制したり、発病を遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、前記組成物の投与によってSTAT3媒介性疾患による症状が好転したり、有利に変更するすべての行為を意味する。
【００２７】
本発明のミゾコウジュ排出抽出物またはその分画物を含む医薬組成物は、医薬組成物の製造に通常用いられる適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。この時、前記組成物に含まれるミゾコウジュ抽出物及びその分画物の含有量は、特に限定されないが、組成物の総重量に対して0.0001〜10重量％で、好ましくは0.001〜1重量％を含むように製造することが好ましい。 
【００２８】
前記医薬組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、無菌水溶液、非水性溶剤、凍結乾燥製剤および坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有することができ、経口または非経口の様々なな剤形であってもよい。製剤化する場合には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して製造される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて製造される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、一般的に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々なな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与用の製剤には、無菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが使用されてもよい。坐剤の基剤としては、ウィテプソル（witepsol)、マクロゴール（macrogol)、トウイーン（tween)６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用してもよい。 
【００２９】
前記本発明の組成物は、薬剤学的に有効な量で投与することができる。 
【００３０】
本発明における用語「薬剤学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な利益/リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは個体の種類および重症度、年齢、性別、疾患の種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素ならびにその他医学分野に周知の要素によって決定されてもよい。本発明の組成物は、治療剤として個別に投与するか、または他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは、順次または同時に投与してもよい。また、単一または多重投与してもよい。前記要素をすべて考慮し、副作用のない最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定され得る。本発明の組成物の好ましい投与量は、患者の状態および体重、病気の程度、薬物の形態、投与経路および期間によって異なるが、好ましい効果を得るために、本発明のミゾコウジュ抽出物またはその分画物は、１日に0.0001〜100mg/kgであり、好ましくは0.001〜100mg/kgで投与するのがよい。投与は、1日1回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。 
【００３１】
前記組成物は、ラット、家畜、ヒトなどの様々な哺乳動物に様々な経路により投与してもよい。あらゆる投与方式が予想され得るが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳室内注射などの多様な方法が考えられる。 
【００３２】
また、別の実施態様として、本発明は、前記組成物をSTAT3媒介性疾患の疑いのある個体に投与する段階を含む、STAT3媒介性疾患の治療方法を提供する。 
【００３３】
具体的には、本発明の治療方法は、前記医薬組成物を薬学的有効量でSTAT3媒介性疾患の疑いのある個体内に投与することを含む。前記の個体は、犬、牛、馬、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリまたはヒトを含む哺乳類全体を意味するが、前記例により本発明の哺乳類が限定されるものではない。前記医薬組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内に投与することができ、局部的免疫抑制治療のために、必要に応じて病変内投与を含む適切な方法によって投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。好ましい投与方法は、静脈注射、皮下注射、皮内注射剤、筋肉注射および点滴注射である。本発明の前記医薬組成物の好ましい投与量は、個体の状態および体重、疾患の程度、薬物の形態、投与経路および期間により異なるが、当業者によって適宜選択され得る。本発明のミゾコウジュ抽出物またはその分画物を有効成分として含む医薬組成物をSTAT3媒介性疾患の疑いのある個体に投与して、STAT3媒介性疾患の発生または進行を防ぐことによってSTAT3媒介性疾患を治療することができる。前記STAT3媒介性疾患については、前述の通りである。 
【００３４】
さらに、別の実施態様として、本発明はミゾコウジュ抽出物またはその分画物を有効成分として含む、STAT3媒介性疾患の予防または改善用の食品組成物を提供する 
前記ミゾコウジュ抽出物またはその分画物については前述した通りである。より具体的には、本発明の抽出物または分画物は、STAT3媒介性疾患の予防または改善を目的として、好ましくは、自己免疫疾患、炎症性疾患または代謝性疾患の予防または改善を目的として食品組成物に添加することができる。 
【００３５】
本発明のミゾコウジュ抽出物またはその分画物を食品添加物として使用する場合、前記抽出物またはその分画物をそのまま添加したり、他の食品または成分と共に使用することができ、通常の方法により適宜使用することができる。有効成分の混合量は、使用目的に応じて適宜決定することができる。 
【００３６】
本発明の食品の種類は特に限定されない。 前記ミゾコウジュ抽出物またはその分画物を添加することのできる食品の例としは、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、通常の意味における食品のすべてが含まれ、動物のための飼料として利用される食品を含む。 
【００３７】
前記以外に、本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクト酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。その他には、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料および野菜飲料製造のための果肉を含有することができる。また、前記食品は、公知の製造方法によって、錠剤、顆粒、粉末、カプセル、液状の溶液および丸剤などの剤型でも製造することができる。本発明によるミゾコウジュ抽出物またはその分画物を有効成分として含むこと以外には、他の成分には、特に限定はなく、通常の様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。
【００３８】
前記に加えて、本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクト酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。その他、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。これらの成分は、単独または組み合わせて使用することができる。 
【００３９】
また、他の実施態様として、本発明はミゾコウジュの抽出物またはその分画物を有効成分として含む、STAT3媒介性疾患の予防または改善用の医薬部外品組成物を提供する 
前記ミゾコウジュ抽出物またはその分画物については、前述した通りである。より具体的には、本発明の組成物は、STAT3媒介性疾患の予防または改善を目的として、好ましくは、自己免疫疾患、炎症性疾患または代謝性疾患の予防または改善を目的として、医薬部外品組成物に添加することができる。 
【００４０】
本発明における用語「医薬部外品」とは、人や動物の病気を治療、軽減、処置または予防する目的で使用される繊維、ゴム製品またはそれと類似するもの；人体に対する作用が弱いものや人体に直接作用せず、器具または機械ではないもの、およびこれに類似するもの；感染型の予防のため殺菌、殺虫およびこれらに類似する用途で使用される製剤；のいずれかに該当する物であり、人や動物の病気を診断、治療、軽減、処置または予防を目的とし使用する物のうち、器具、機械または装置ではないもの、および人や動物の構造と機能に薬理学的影響を与える目的で使用する物のうち、器具、機械や装置ではないものを除いた商品を意味する。また、前記医薬部外品は、皮膚外用剤および個人衛生用品を含む。
【００４１】
本発明のミゾコウジュ抽出物またはその分画物を医薬部外品の添加物として使用する場合、前記抽出物またはその分画物をそのまま添加したり、他の医薬部外品または医薬部外品の成分と共に使用することができ 、通常の方法によって適宜使用できる。有効成分の混合量は、使用目的に応じて適宜決定することができる。 
【００４２】
前記皮膚外用剤は、特にこれに限定されないが、好ましくは、軟膏剤、ローション剤、スプレー剤、貼付剤、クリーム剤、散剤、懸濁剤、ゲル剤またはゲル形態に製造されて使用してもよい。前記個人衛生用品は、特にこれに限定されないが、好ましくは、石鹸、化粧品、ウェットティッシュ、ティッシュペーパー、シャンプー、スキンクリーム、顔用クリーム、歯磨き粉、口紅、香水、メイクアップ、ファンデーション、チーク、マスカラ、アイシャドウ、日焼け止めローション、ヘアケア製品、エアフレッシュナーゲルまたは洗浄用ゲルであってもよい。また、本発明の医薬部外品組成物の他の例としては、消毒清潔剤、シャワーフォーム、洗剤、石鹸、ハンドソープ、加湿器充填剤、マスク、軟膏剤またはフィルター充填剤が挙げられる。
【００４３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
実施例１：ミゾコウジュ抽出物及び分画物の製造
実施例１−１：ミゾコウジュ抽出物の製造
ミゾコウジュは水できれいに洗浄して、日陰で乾燥した後、ワーリングブレンダーで粉末化した。粉末化されたミゾコウジュ8kgをエタノール50Lに入れ、室温で7日間冷浸抽出した後、ろ紙（Whatman社、USA）で減圧濾過した後、ろ過抽出物は真空回転濃縮機を用いて室温でエタノール溶媒を除去し、その後抽出残渣としてミゾコウジュ粗抽出物1.1kgを得た。 
【００４５】
実施例1-2：分画物の製造
前記粗抽出物から活性分画物を分離するために、ミゾコウジュ粗抽出物を水1Lに懸濁した後、同量の酢酸エチルを加え、混合して分画した。前記プロセスを３回繰り返して水可溶性分画物1Lおよび酢酸エチルの可溶性分画物3Lを得た後、前記酢酸エチル可溶性分画物を減圧濃縮して、酢酸エチル可溶抽出物145gを得た。残りの水可溶性分画物を減圧濃縮して35gを得て、これを水分画物として使用した。
【００４６】
実施例２：ミゾコウジュ抽出物および分画物の、IL-6によって誘導されるSTAT3の転写活性抑制効果の分析
ミゾコウジュ抽出物および分画物の、IL-6によって誘導されるSTAT3の転写活性抑制効果を測定するために、下記のような実験を行った。
【００４７】
実施例2-1：ルシフェラーゼが導入された形質転換体の製造
Hep3B細胞（ATCC HB-8064）にSTAT3レポーター遺伝子を含むｐSTAT3-LucとpcDNA3.1（+）(Clontech laboratories社、Palo Alto、CA）をリポフェクタミンプラス（lipofectamine plus、Invitrogen社、Carlsbad、CA、USA）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションした後、さらに2日後、ハイグロマイシンを前記トランスフェクションした細胞に100μg/mLの濃度で処理してルシフェラーゼを安定して発現するクローンを得た。このクローンからルシフェラーゼが安定して発現されるか否かについては、ルシフェラーゼアッセイによって確認した。 
【００４８】
実施例２−２：IL-6反応性STAT3ルシフェラーゼの検査
前記トランスフェクションした細胞をDMEM（GIBCO 119950965）培地で無血清培養（serum starvation）して試料を下記のように1時間処理した後、10ng/mL IL-6（R＆D system社、USA）を添加して12時間培養した。
１：陰性対照群（非処理群)、
２：陽性対照群（IL-6 10ng/mL)、
３：抽出物および分画物（1、3、6、10μg/mL）および
４：ゲニステイン処理群（100μM） 
前記反応した細胞をＰＢＳで洗浄した後、50μLの溶解緩衝液（luciferase assay system、promega社、USA）を入れ、20分間攪拌した後、30〜100μLのルシフェラーゼ基質（luciferase assay system、promega社、USA）を入れて発色の程度をルミノメーター（EG＆G BERTHOLD、USA）を用いて５分以内で測定した。実験の結果、ミゾコウジュエタノール抽出物および酢酸エチル分画物は、濃度依存的にSTAT3ルシフェラーゼ活性を阻害した。具体的には、ミゾコウジュエタノール抽出物はIL-6によって誘導されるSTAT3ルシフェラーゼ活性を10、6、3、1μg/mLでそれぞれ88％、73％、48％、23％阻害し、酢酸エチル分画物は、6、3、1μg/mLでそれぞれ100％、98％、72％阻害した（図１)。
【００４９】
これらの結果は、IL-6によって誘導されるSTAT3活性化をミゾコウジュ抽出物またはその分画物が効果的に抑制することができることを示すものである。 
【００５０】
STAT3は、炎症性貧血において活性化し、マクロファージの鉄の分泌を防ぐヘプシジン（Hepcidin）の発現を増加させることが知られており（非特許文献６)、ヒトの糸球体腎炎（非特許文献７)、悪液質患者の骨格筋、クローン病患者（非特許文献８)、慢性膵臓炎（非特許文献９）などの炎症性疾患において活性化しているので、前記ミゾコウジュ抽出物またはその分画物を含む本発明の組成物は、前記炎症性疾患の予防または治療に有効に用いることができる。 
【００５１】
また、STAT3はリウマチ性関節炎における骨吸収の治療に新しいターゲットとして見なされており、気道の上皮に存在するSTAT3は、喘息などにおいてアレルギー性炎症反応を誘導することが報告され（非特許文献１０)、移植片対宿主病の発生（非特許文献１１)、多発性硬化症患者および動脈硬化が発生したApoE-/-マウスではSTAT3がリン酸化されて活性化していることが知られている。 
【００５２】
したがって、前記のような結果は、本発明のミゾコウジュ抽出物を含む組成物が、前記のような自己免疫疾患および代謝性疾患の予防または治療において有効に使用できることを示すものである。 
【００５３】
実施例2−3：ミゾコウジュ抽出物またはその分画物の、IL-6誘導STAT3、JAK2およびＥＲＫリン酸化に対する阻害活性の検定
6ウェルプレートに5X105細胞/ウェルでHep3B、U266細胞を分注し、80％の密度で培養皿いっぱいに培養した後、無血清培地に交換してさらに12時間培養し、下記のように試料を60分間処理した。
１：陰性対照群（非処理群)、
２：陽性対照群（IL-16 10ng/mL)、 
３：抽出物および分画物（10、30、60μg/mL)、および
４：ゲニステイン処理群（100μM） 
その後、20ng/mLの濃度のIL-6を処理して２０分間反応させた後、４０μLの溶解緩衝溶液（[pH8、20mM Tris-HCl、137mM NaCl、10％グリセロール、1％ Triton X-100、1mM Na3VO4、2mM EDTA、1mM PMSF、20mM ロイペプチン、20m/mL アプロチニン（Sigma社、USA）を用いて細胞を溶解させた後、遠心分離（13000g、15分）してタンパク質が溶解している上澄み液を得た。タンパク質の濃度はDCタンパク質検査キット（Bio-Rad社、USA）を用いて定量し、4〜12％のSDS-ポリアクリルアミドゲル（SDS−PAGE）にタンパク質をロードして175mAで2時間電気泳動した。電気泳動終了後、ゲルのタンパク質をPVDFメンブレン（Westran S、孔径0.2、Whatman社、USA）を用いて35Vで90分間転写した。転写したメンブレンをTris-緩衝溶液（T-TBS;50mM Tri-HCl、pH7.6、150mM NaCl、0.2％トウイーン-20、5％スキムミルク；Sigma社、USA）を用いて室温で1時間ブロッキングし、T-TBSで5回洗浄した。前記メンブレンに一次抗体としてphospho-STAT3、phospho-JAK2およびphospho-ERK（1：1000希釈）のポリクロナール抗体を4〜12時間処理した。 T-TBSで5回洗浄した後、二次抗体としてHRP結合抗マウス抗体（1：5000希釈）および抗ウサギ抗体（1：1000希釈）を1時間反応させた。T-TBSで洗浄した後、暗室でECLキット（Amersham社、USA）を用いてフィルムを現像した。その結果、ミゾコウジュエタノール抽出物および酢酸エチル分画物がIL-6によって誘導されたSTAT3、JAK2およびERKのリン酸化を阻害したことが確認された（図2〜4)。
【００５４】
このような結果は、ミゾコウジュ抽出物またはその分画物がIL-6下位に位置するJAK2のリン酸化を阻害して不活性化させ、JAK2によってリン酸化されて活性化されるSTAT3のリン酸化を減少させることを示すものであり、ミゾコウジュ抽出物またはその分画物がIL-6によって媒介されるシグナル伝達系を抑制させることを示すものである。さらに、このような結果は、ミゾコウジュ抽出物またはその分画物を含む本発明の組成物が、IL-6によって活性化されるSTAT3媒介性疾患の予防または治療に使用できることを裏付けるものである。
【００５５】
実施例2-4：ミゾコウジュ抽出物またはその分画物の、STAT3によって誘導されたS0CS-3、MCP-1およびICAM-1 mRNA発現に対する阻害活性の検定 
6ウェルプレートに5 X104細胞/ウェルの濃度でHep3B細胞を分注し、80％の密度で培養皿いっぱいに培養した後、無血清培地に交換してさらに12時間培養して、下記の通り試料を60分間処理した。 
１：陰性対照群（非処理群)、
２：陽性対照群（IL-16 10ng/ mL)、および 
３：抽出物および分画物（10、30、60μg/ mL）
その後、20ng/mLの濃度のIL-6を処理して6時間反応させた後、細胞をチューブに集め、遠心分離して培地を除去し、PBSで1回洗浄した後、RNeasy Mini 溶出クリーンアップキット（RNeasy Mini Elute Cleanup kit）を用いてRNAを抽出した。 RNAの濃度と純度は、2100バイオアナライザーシステム（Agilent Technologies社）で測定し、Maxime RT PreMix（ランダムプライマー、iNtRON Biotechnology社）を使用してcDNAを合成した。
【００５６】
S0CS-3 mRNAの発現程度は、Taqman PCR master mix kit（Applied Biosystems社）を用いてリアルタイムPCRによって測定した。MCP-1、ICAM-1 mRNAの発現程度は、SYBR Green master mix kit（Applied Biosystems社）を用いてリアルタイムPCRによて測定した。
【００５７】
その結果、ミゾコウジュエタノール抽出物は、濃度依存的にIL-6誘導によって増加したサイトカインの抑制因子であるS0CS-3、サイトカインであるMCP-1および細胞接着因子であるICAM-1のmRNA発現を阻害した（図5〜7)。このような結果は、ミゾコウジュ抽出物またはその分画物がIL-6によって活性化されるSTAT3シグナル伝達経路を阻害することを、STAT3の標的遺伝子の発現が減少することによって裏付けられるものである。 
【００５８】
実施例3：ミゾコウジュ抽出物のコラーゲン誘導リウマチ性関節炎の治療効果
ミゾコウジュ抽出物が、2型コラーゲン（bovine typeIIcollagen）によって誘導されるリウマチ性関節炎を抑制し、リウマチ性関節炎の治療効果を有するか否かを測定するために、次のような実験を行った。 
【００５９】
実施例3-1：コラーゲン誘導リウマチ性関節炎マウスモデルの製作および関節炎抑制効果の検定
リウマチ性関節炎は、自己免疫疾患の一種で、関節の滑液膜に慢性的に肥大および炎症反応が起こることによって、軟骨と骨の破壊による関節の破壊と変形を特徴とする慢性炎症性疾患である。本発明では、このようなリウマチ性関節炎の代表的な動物モデルとして、コラーゲン誘導関節炎（collagen-induced arthritis; CIA）モデルを用いて、本発明のミゾコウジュ抽出物のコラーゲン誘導関節炎に対する治療効果を確認した。 
【００６０】
具体的に、本発明では、コラーゲン誘導関節炎のマウスを作製するために、6〜8週齢のBALB/cマウスを用いた。2型コラーゲン（bovine CII、Chondrex社）を完全フロイントアジュバント（Chondrex社）と混合して、マウスの尾にCII 100μgを皮内注射し、免疫化してから21日後に、CIIと不完全フロイントアジュバンド（incomplete Freund ADjuvant）を混合し、その後2次免疫化させた。 
【００６１】
次に、ミゾコウジュ抽出物が関節炎が誘導された前記マウスに治療効果を示し得るか否かを確認するために、ミゾコウジュエタノール抽出物を2mg/kg、10mg/kgまたは50mg/kgの濃度で3次蒸留水に溶かした後、1次免疫化後28日目から毎日経口投与し、比較群としては、現在市販されている関節炎治療剤ケトトップの主成分であるケトプロフェン（Ketoprofen、Sigma社）を3次蒸留水に溶かした後、5mg/kgを経口投与して関節炎の治療効果を確認した。このような投与のプロセスを図8に示し、図8におけるWは週（week）を示す。関節炎の重症度（clinical arthritis index）は、足の浮腫と発赤を評価しており、0〜4点（0：浮腫なし、1：1つの関節における軽い浮腫、2：2つ以上の関節における中等度の浮腫、3：大部分の関節における重度の浮腫、4：全体的な重度の浮腫）に分類した。前記のような実験の結果を図9〜11に示した。 
【００６２】
その結果、図9〜11に示すように、ミゾコウジュエタノール抽出物を経口投与した場合、2型コラーゲン誘導リウマチ性関節炎誘導マウスの足の厚さ、関節炎の重症度、発病率をいずれも効果的に抑制する結果を示し、このような効果は関節炎治療剤であるケトプロフェンと類似していることが分かる （図9、10および11)。
【００６３】
実施例3-2：血中免疫グロブリンG1およびG2aの検査
実験終了後、マウスを犠牲死させた後、開腹して腹腔内から採血し、その後これを3,000rpmで15分間遠心分離して血清を分離した。免疫グロブリンG1とG2a測定は、BD Biosciences社のELISAキットを使用して、次のように測定した。 
【００６４】
具体的には、コーティング緩衝液（1Lの蒸留水中に8.40gのNaHCO3、3.56gのNa2CO3を溶解、pH9.5）に捕獲抗体（精製ラット抗マウスIgG1、抗マウスIgG2a）を、それぞれ1：250の割合でコーティング緩衝液で希釈させた後、各ウェルに100μLずつ分注して37℃で3時間反応させた後、洗浄緩衝液（0.05％トウイーン-20 PBS）で3回洗浄した。次に、Assay Diluent（10％FBS PBS）を各ウェル当り200μLずつ分注した後、37℃で1時間反応させ、これを再び洗浄緩衝液で3回洗浄した。次いで、マウス血清をAssay Diluentに1：300で希釈して、各ウェル当り100μLずつ分注した後、37℃で2時間反応させ、5回洗浄後に検出抗体（ビオチンラット-抗マウスIgG1、ビオチン標識抗マウスIgG2a）と酵素反応液（SAv-HRP）をそれぞれ1：250でAssay Diluentに希釈して、各ウェル当り100μLずつ希釈標準溶液（working solution）を加えて1時間室温で反応させた後、それぞれ1分間の洗浄を7回行った。最後に、基質溶液（Substrate Solution）を100μLずつ分注して光を遮断した後30分放置し、その後50μLの停止液（Stop Solution）を処理し、ELISA reader 450nmで吸光度を測定してその結果を図12および13に示した。 
【００６５】
その結果、図12および13に示すように、本発明のミゾコウジュ抽出物は血清IgG1およびIgG2aの濃度を効果的に減少させる結果を示した（図12、13)。 
【００６６】
実施例4：ミゾコウジュ抽出物のアトピー性皮膚炎（atopic dermatitis）抑制効果
ミゾコウジュ抽出物のアトピー性皮膚炎抑制効果を測定するために、次のような実験を行った。 
【００６７】
実施例4-1：アトピー性皮膚炎モデルマウスの確立及びミゾコウジュ抽出物による耳の厚さの減少効果の検定
アトピー性皮膚炎を誘導するために、チリダニ抽出物（チリダニ抽出物、コナヒョウダニ抽出物、DFE）とDNCB（2,4-ジニトロクロロベンゼン）をマウスに使用し、アトピー性皮膚炎誘導過程は、図14に示した。
【００６８】
前記のようなアトピー性皮膚炎モデルマウスを用いて、本発明のミゾコウジュ抽出物が代表的な自己免疫疾患であるアトピー性皮膚炎を治療できるか否かを確認するために、下記のような実験を行った。 
【００６９】
具体的には、ミゾコウジュ抽出物を経口投与した後、アトピー性皮膚炎誘導マウスの耳の厚さの減少効果を実験した。
１：陰性対照群（非処理群)、
２：陽性対照群（DFE/ DNCB20μg/mL)および
３：抽出物（20、100mg/kg）
溶液を塗る前のマウスの耳に絆創膏を使用して、同じ力と回数でストリッピング（striping）を3、4回繰り返した後、DFEを10mg/mLで溶かした溶液を、毎週木曜日にマウスの耳の前/後面に20μgずつ塗布した。また、AOO（アセトン/ オリーブオイル、1：3）に溶かしたDNCB（1％）は、毎週月曜日にマウスの耳の前/後面に20μgずつ塗布し、火曜日と金曜日毎に耳の厚さを測定した。このように、DFEとDNCBをマウスの皮膚に塗布すると、耳の厚さが増加するようになるが、このような耳の厚さの増加をミゾコウジュ抽出物が抑制できるか否かを確認した。
【００７０】
その結果、図15に示すように、ミゾコウジュエタノール抽出物を経口投与したところ、濃度依存的にアトピー性皮膚炎による耳の厚さを減少させる結果を示した（図15)。
【００７１】
実施例4-2：ミゾコウジュ抽出物の、アトピー性皮膚炎による血中免疫グロブリンEと免疫グロブリンG2aに対する抑制効果の検定
4週間の実験終了後、マウスを犠牲死させてから採血し、これを3,000rpmで15分間遠心分離して血清を分離した。免疫グロブリンEと免疫グロブリンG2aの測定は、BD Biosciences社のELISAキットを用いて、次のように測定した。
【００７２】
コーティング緩衝液（1Lの蒸留水中に8.40gのNaHCO3、3.56gのNa2CO3、pH9.5）に捕獲抗体（精製ラット抗マウスIgG1、抗マウスIgG2a）を、それぞれ1：250の割合でコーティング緩衝液に希釈させた後、各ウェルに100μLずつ分注し、37℃で3時間反応させ、その後洗浄緩衝液（0.05％トウイーン-20 PBS）で3回洗浄した。次いで、Assay Diluent（10％FBS PBS）を各ウェル当り200μLずつ分注した後、37℃で1時間反応させ、これを再び洗浄緩衝液で3回洗浄した。次に、マウス血清をAssay Diluentに1：300で希釈して、100μLずつ各ウェル当たり分注した後、37℃で2時間反応させ、5回洗浄した後、検出抗体（ビオチンラット-抗マウスIgG1、ビオチン標識抗マウスIgG2a）と酵素試薬（SAv-HRP）をそれぞれ1：250でAssay Diluentに希釈して、各ウェル当り100μLずつ希釈標準溶液を加えて1時間室温で反応させた後、それぞれ1分間の洗浄を7回行った。最後に、基質溶液を100μLずつ分注し、光を遮断した後30分放置し、その後50μLの停止液を処理し、ELISA reADer 450nmで吸光度を測定してその結果を図16および17に示した。 
【００７３】
その結果、図16、17に示すように、ミゾコウジュエタノール抽出物は、濃度依存的に血清中の免疫グロブリンEと免疫グロブリンG2aの量を抑制する結果を示した。 
【００７４】
実施例4-3：アトピー性皮膚炎によるヒスタミンの遊離抑制の測定
エッフェンドルフチューブに血清を取り、PBSで100分の1に希釈した後、0.1M HCl 450μLと60％過塩素酸溶液50μLを混合した後、遠心分離（400g、20分）した。次いで、上澄み液800μLを取り、5M NaOH溶液500μL、蒸留水3mL、n-ブタノール10mL、NaCl 1.2gを混合した試験管に入れ、これを振とうした後、遠心分離（500g、10分）を行った。前記試験管でブタノール層8 mLを取り、0.1M HClを3mL、n-ヘプタン10mLを加えて振とうして再び遠心分離（500g、10分）を行って得られた水層2mLに1M NaOH400μL、1％の o-フタルアルデヒド溶液（Sigma社）100μLを加えて混合し、2分間放置した後、発光波長（emission）438nm、励起波長（excitation）353 nmにおいて、蛍光強度を蛍光分析装置（RF-5301 PC、Shimadzu社）を用いて測定した。 
【００７５】
その結果、図18に示すように、ミゾコウジュエタノール抽出物は、濃度依存的に血清中のヒスタミンの遊離を抑制する結果を示し、前記ミゾコウジュエタノール抽出物が代表的な自己免疫疾患であるアトピー性皮膚炎の治療効果を奏し得ることを示唆した。
【００７６】
実施例4-4：アトピー性皮膚炎による炎症誘発性サイトカインの分泌阻害活性の検定
実験終了後、マウスを犠牲死させた後、耳の組織を切り取り、耳組織内の炎症誘発性サイトカインの発現を測定するために、Maxime RT PreMix（ランダムプライマー、iNtRON Biotechnology社）を用いてcDNAを合成した。各チューブ当り2μLのcDNA、1μLのセンスおよびアンチセンスプライマー溶液（0.4μM)、12.5μLのSYBR Premix Ex Taq（Takarabio社)、および9.5μLのdH2Oを共に混合して、全25μLになるようにした。 TNF-α、IFN-γ、ＩＬ-4、ＩＬ-13、ＩＬ-31、ＩＬ-17 mRNAの発現の程度は、TP850ソフトウェアを使用してリアルタイムPCRにより測定した。
【００７７】
その結果、図19に示すように、ミゾコウジュエタノール抽出物は、濃度依存的に炎症誘発性サイトカインであるTNF-α、IFN-γ、ＩＬ-4、ＩＬ-13、ＩＬ-31およびＩＬ-17のいずれの発現も抑制し、分泌抑制効果を奏し得ることを示唆した。
【００７８】
前記のような結果を総合すると、本発明のミゾコウジュ抽出物は、STAT3媒介性疾患の代表的な例として挙げられるリウマチ性関節炎およびアトピー性皮膚炎のいずれに対しても優れた予防または治療効果を奏することが示されるので、このような結果は、ミゾコウジュ抽出物を炎症性疾患、自己免疫疾患および代謝性疾患などの様々なSTAT3媒介性疾患の治療に利用できることを示唆するものである。
【００７９】
以上の説明から、本発明の属する技術分野における当業者は、本発明がその技術的思想や必須的特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施可能であることを理解し得るであろう。これに関連し、上述した実施例はすべての面において例示的なものであり、限定的なものではないことを理解するべきである。本発明の範囲は、前記発明の詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味および範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年12月2日(2014.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミゾコウジュ（Salvia plebeia R. Br.）の抽出物またはその分画物を有効成分として含む、STAT3媒介性疾患の予防または治療用医薬組成物。 
【請求項２】
前記抽出物が、水、炭素数１〜６のアルコールおよびこれらの混合溶媒からなる群から選択される溶媒で抽出したものである、請求項１に記載の医薬組成物。 
【請求項３】
前記アルコール溶媒がエタノールである、請求項２に記載の医薬組成物。 
【請求項４】
前記分画物が酢酸エチル分画物である、請求項１に記載の医薬組成物 
【請求項５】
前記STAT3媒介性疾患が、代謝性疾患、炎症性疾患および自己免疫疾患からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。 
【請求項６】
前記代謝性疾患が、骨粗しょう症、動脈硬化症および心筋梗塞からなる群れから選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記自己免疫疾患が、アトピー性皮膚炎、リウマチ性関節炎、骨関節炎、乾癬、喘息、移植片対宿主疾患、免疫不全、全身性エリテマトーデスおよび多発性硬化症からなる群から選択される、請求項５に記載の医薬組成物。 
【請求項８】
前記炎症性疾患が、クローン病、形質細胞増加症、超免疫グロブリン血症、貧血、腎炎、悪液質、血管増殖性腎炎、ブドウ膜炎、慢性甲状腺炎、遅延型過敏症、膵臓炎、若年性特発性萎縮症、糖尿病およびアルツハイマー病からなる群から選択される、請求項５に記載の医薬組成物。 
【請求項９】
前記STAT3媒介性疾患が、骨粗しょう症、リウマチ性関節炎、アトピー性皮膚炎またはクローン病である、請求項１に記載の医薬組成物。 
【請求項１０】
前記組成物が、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、無菌水溶液、非水性溶剤、凍結乾燥製剤および坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形で製造されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物を、ヒト以外のSTAT3媒介性疾患の疑いのある個体に投与する段階を含む、STAT3媒介性疾患の治療方法。 
【請求項１２】
ミゾコウジュの抽出物またはその分画物を有効成分として含む、STAT3媒介性疾患の予防または改善用の食品医薬組成物。 
【請求項１３】
ミゾコウジュの抽出物またはその分画物を有効成分として含む、STAT3媒介性疾患の予防または改善用の医薬部外品医薬組成物。
【国際調査報告】
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