(57)【要約】  本発明は、成長因子、サイトカイン、抗菌／抗ウイルス因子、幹細胞刺激因子、補体タンパク質Ｃ３ａ／Ｃ４ａ、および走化性因子の組合せに関する。本発明はまた、血清、胎盤または初乳からこの組合せを調製するためのプロセスならびに組織修復および再生を必要とする状態の処置に使用するためおよび幹細胞治療の代替のためのこの組合せを含有する組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカイン：約５０から約５００ｐｇ／ｍｇ、好ましくは７１．４６から３４０．７６ｐｇ／ｍｇ、
成長因子：約１０００から約７０００ｐｇ／ｍｇ、好ましくは１３２１．８０から６４９４．４０ｐｇ／ｍｇ、
走化性因子：約５から５０ｐｇ／ｍｇ、好ましくは６から２４ｐｇ／ｍｇ、
幹細胞刺激因子：約１００から１５００ｐｇ／ｍｇ、好ましくは１９１から１１０５ｐｇ／ｍｇ、
抗菌／抗ウイルス因子：約１５から８０μｇ／ｍｇ、好ましくは１８から７５μｇ／ｍｇ、
補体Ｃ３ａ／Ｃ４ａタンパク質：約１から５ｐｇ／ｍｇ、好ましくは１．１０から２．７０ｐｇ／ｍｇ、
の組合せ。
【請求項２】
初乳の抽出により得られることを特徴とする請求項１に記載の組合せ。
【請求項３】
胎盤の抽出により得られることを特徴とする請求項１に記載の組合せ。
【請求項４】
分娩前血清から血清の抽出により得られることを特徴とする請求項１に記載の組合せ。
【請求項５】
組織修復および再生を必要とする状態の処置に使用するためおよび幹細胞治療の代替のための請求項１〜４のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項６】
前記状態は、骨外傷および変性病状、転移性骨病変、下顎または上顎歯槽突起の萎縮、骨折、小窩齲食および髄質炎症から選択されることを特徴とする請求項５に記載の組合せ。
【請求項７】
場合により生体材料と組合せて、皮膚科および形成外科ならびに美容外科において充填剤として使用するための請求項１〜４のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項８】
前記生体材料は、コラーゲン、ヒアルロン酸、マトリゲル、親水コロイド、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトンなどから選択されることを特徴とする、請求項７に記載の組合せ。
【請求項９】
好適な担体および／または添加剤と混合して、活性成分として請求項１〜４のいずれか一項に記載の組合せを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
非経口投与のための請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
局所投与のための請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
骨格、セメント、支持体、再吸収可能または再吸収不可能なインプラントの形態で請求項１に記載の組合せを含むことを特徴とする埋め込み可能な材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成長因子、サイトカイン、抗菌／抗ウイルス因子、幹細胞刺激因子、補体タンパク質Ｃ３ａ／Ｃ４ａ、および走化性因子の組合せに言及する。本発明はまた、血清、胎盤または初乳からこの組合せを調製するためのプロセスならびに組織修復および再生を必要とする状態の処置に使用するため、および幹細胞治療の代替のためのこの組合せを含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の科学文献によれば、幹細胞の治療効果は、２つの機構：幹細胞の常在細胞への分化および幹細胞による再生栄養素の放出に起因し得る。これら２つの機構それぞれの役割はまだ解明されていないが、幹細胞は損傷組織の成熟細胞に発達するのではなく、むしろそれらは不可欠な因子をこの組織に運搬し、この組織は次いで増殖および分化するように逆戻りすることができ、それ自体を再生することが示唆されている（非特許文献１参照）。
【０００３】
幹細胞治療は、費用ならびに技術的および実務的な複雑さだけでなく、倫理的および宗教的な良心の呵責にも関連する多くの問題を有する。
【０００４】
幹細胞治療は、注射のみにより、または一部の場合、局所的に実施可能であり、経口的には実施不可能である。培養した幹細胞の上清は、組織成長および／または修復に対する幹細胞治療の有益な効果に関与すると考えられている、成長因子、サイトカイン、走化性因子などを含有する。
【０００５】
しかしながら、幹細胞の上清から単離できる不可欠な因子の使用は、幹細胞自体を使用する同じ倫理的問題を有するだけでなく、非常に高価な費用もかかる。
【０００６】
一部の哺乳動物組織および生体液、すなわち血清、胎盤および初乳は、サイトカイン、成長因子、走化性因子、および通常、幹細胞培養物の上清にも見出される他の成分を含有していることが知られている。
【０００７】
純粋な初乳についての、またはその抽出物もしくは画分の、ならびに胎盤抽出物についてのいくつかの治療適用が過去に開示されている。例えば、初乳の臨床用途の概説は、非特許文献２、非特許文献３および非特許文献４に報告されている。
【０００８】
初乳またはその画分の治療的使用はまた、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０および特許文献１１に報告されている。後者は、初乳からの成長および分化因子の抽出を開示しているが、開示されているプロセスは、純粋な初乳の重要な成分の損失を必ず含んでいる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許第７４３０６０号明細書
【特許文献２】国際公開第９８／５１３１６号
【特許文献３】国際公開第９４／１６６７５号
【特許文献４】国際公開第９８／３６７５９号
【特許文献５】国際公開第９５／００１５５号
【特許文献６】国際公開第２００７／０００６４８号
【特許文献７】仏国特許発明第２４８７６７６号明細書
【特許文献８】国際公開第９８／１４４７３号
【特許文献９】国際公開第９９／６４０２２号
【特許文献１０】国際公開第２００８／１０３０２３号
【特許文献１１】国際公開第２００６／０２９４９４号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ＡＩ  Ｃａｐｌａｎ  ａｎｄ  ＪＥ  Ｄｅｎｎｉ，  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｓ  Ｔｒｏｐｈｉｃ  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ．  Ｂｉｏｃｈ  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  ９８：  １０７６−１０８４，  ２００６
【非特許文献２】Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  ８（４），  ２００３，  ３７８ページ
【非特許文献３】Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐ．，  ４６（５），  ２００８，  ２１１−２２５
【非特許文献４】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄａｉｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  １６，  ２００６，  １４１５−１４２０
【非特許文献５】Ｚｕｋ  ＰＡら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ，  ２００１，  ７：．２１１−２８
【非特許文献６】Ｇａｒｂｅｒ  ＳＥら、（Ｊ．Ｅｎｄｏｄ．３５（２００９）、６０−６４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来技術の文献のいずれも、幹細胞治療の代替として、全部ではないが、幹細胞培養上清の成分のほとんどを含有する、容易に利用可能な哺乳動物源に由来する組成物を開示していない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
成長因子、サイトカイン、抗菌／抗ウイルス因子、幹細胞刺激因子、補体タンパク質Ｃ３ａ／Ｃ４ａ、および走化性因子の組合せが、異なる生物学的標的におけるそれらの多機能活性に起因して多くの病状の処置に特に効果的であることが発見された。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】陽性対照は顕著な炎症性浸潤を示した。
【図１Ｂ】水酸化カルシウムで処理した歯は充血および浮腫を有する歯髄炎を示した。
【図１Ｃ】ＰＭＦを含有する充填は正常な歯髄の特徴を維持した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の組合せは以下の含有量により特徴付けられる：
サイトカイン：約５０から約５００ｐｇ／ｍｇ、好ましくは７１．４６から３４０．７６、
成長因子：約１０００から約７０００ｐｇ／ｍｇ、好ましくは１３２１．８０から６４９４．４０、
走化性因子：約５から５０ｐｇ／ｍｇ、好ましくは６から２４、
幹細胞刺激因子：約１００から１５００ｐｇ／ｍｇ、好ましくは１９１から１１０５、
抗菌／抗ウイルス因子：約１５から８０μｇ／ｍｇ、好ましくは１８から７５、
補体Ｃ３ａ／Ｃ４ａタンパク質：約１から５ｐｇ／ｍｇ、好ましくは１．１０から２．７０。
【００１５】
本明細書以下でＰＭＦと称される、本発明の組合せに存在するサイトカインは、表１に報告されている：
【００１６】
【表１】
2015506931.tif 000002
【００１７】
本発明の組合せに存在する成長因子は表２に報告されている：
【００１８】
【表２】
2015506931.tif 000003
【００１９】
本発明の組合せに存在する幹細胞刺激因子は表３に報告されている：
【００２０】
【表３】
2015506931.tif 000004
【００２１】
本発明の組合せに存在する走化性因子は表４に報告されている：
【００２２】
【表４】
2015506931.tif 000005
【００２３】
本発明の組合せに存在する抗菌／抗ウイルス因子は表５に報告されている。
【００２４】
【表５】
2015506931.tif 000006
【００２５】
本発明の組合せに存在する補体Ｃ３ａ  Ｃ４ａタンパク質は表６に報告されている。
【００２６】
【表６】
2015506931.tif 000007
【００２７】
表１〜６に報告されたデータは、ウシ分子に特異的な商業的に利用可能なサンドイッチＥＬＩＳＡ法およびフレキシブルＢｉｏ−Ｐｌｅｘ（登録商標）システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）により得られた。「約」という用語は、所与の値の±１０％、好ましくは±５％の変動を意味する。
【００２８】
組合せの成分の主な生理学的役割は以下に報告されている。
【００２９】
補体タンパク質Ｃ３／Ｃ４：補体は、感染に対抗するのに役立つ炎症反応を誘導する、種々の細胞型の表面上に位置している生体膜および特異的受容体と相互作用できる循環タンパク質からなる。
【００３０】
成長因子
ＴＧＦ−β１−形質転換成長因子：粘膜における免疫防御に関与している、クラスＡ免疫グロブリンの産生を刺激する。細胞増殖を調節し、細胞外基質の沈着を刺激する。
ＥＧＦ−上皮細胞成長因子：粘膜の発達を制御する。上皮細胞の形成を促進する。
ＩＧＦ１−インスリン様成長因子：細胞増殖、付着および遊走を調節し、粘膜の成熟を誘導する。
ＶＥＧＦ−血管内皮細胞成長因子：血管産生を刺激する。細胞分裂活性および血管透過性の活性化を提示する。
ＦＧＦ−ｂ−線維芽細胞成長因子基礎：線維芽細胞、内皮細胞、星状膠細胞およびケラチノサイトなどの、間葉細胞起源の細胞の増殖を刺激する。それはまた、走化性因子としても作用する。
ＧＨ−成長ホルモン：全ての組織の全体的な成長因子。
ＧＨＲＦ−成長ホルモン放出因子：正常な生後の成長、骨成長、タンパク質、炭水化物および脂質代謝に対する調節作用に必要とされるＧＨの放出を刺激する。
ＮＧＦ−神経成長因子：活性を刺激し、交換神経系の成長および分化を制御する。
ＰＤＧＦ−血小板由来成長因子：中胚葉起源の細胞の分化の成長。
ＢＭＰ−２−骨形成タンパク質２：骨および軟骨の発達、心臓細胞分化。
【００３１】
走化性因子
エオタキシン：炎症組織に対して好酸球を動員するためにケモカイン受容体に結合する。
ＭＣＰ−１  単球走化性因子−１：炎症組織に対して単球の凝集を促進する。
【００３２】
サイトカイン
ＩＬ−１Ｒａは、インターロイキン１アルファおよびインターロイキン１−ベータの活性を阻害し、種々のＩＬ１関連免疫および炎症反応を調節する。
ＩＬ−２はＴリンパ球の増殖を誘導する。
ＩＬ−４は抗炎症活性を保有する。
ＩＬ−６は先天性および適応免疫を刺激する。
ＩＬ−９は造血細胞の調節因子であり、細胞増殖を刺激し、アポトーシスを防ぐ。
ＩＬ−１７はＮＦ−ＫＢの活性を制御し、一酸化窒素（ＮＯ）産生を増加させる。
ＩＬ−１０は免疫制御および炎症において多面発現効果を有する。Ｂ細胞生存、およびそれによる抗体産生を改善する。ノックアウトマウスで行われた研究により、このタンパク質は粘膜の免疫制御において必須であることが実証されている。ＩＬ−１２はＴおよびナチュラルキラー細胞を刺激する。
ＩＬ−１５はＴおよびナチュラルキラー細胞活性化および増殖を制御する。
インターフェロン−ガンマは、既知の抗ウイルス、抗腫瘍および免疫調節性活性を有する。それは強力なマクロファージ活性化因子であり、細菌およびウイルスに対して細胞媒介性活性を活性化する。
ＴＮＦ−α−腫瘍壊死因子は感染部位への好中球および単球の遊走を刺激する。
【００３３】
幹細胞刺激因子
ＧＭ−ＣＳＦ−顆粒球コロニー刺激因子：骨髄由来の免疫前駆体の刺激および末梢部のディスミッション（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｄｉｓｍｉｓｓｉｏｎ）に関与する。
ＬＩＦ−白血病抑制因子：例えば、正常および骨髄性白血病細胞における造血分化の誘導、神経細胞分化の誘導、腎臓発達の間の上皮変換に対する間葉細胞の調節因子に関与するいくつかの異なる系において役割を有する多面的サイトカイン。
ＳＣＦ−幹細胞因子：胚細胞および神経系細胞発達および造血において子宮内で作用する。
ＳＤＦ−１−ストロマ細胞由来因子−１：ＣＸＣＲ４リガンドを発現する幹前駆体細胞の走化性因子として作用する。
【００３４】
抗菌
トランスフェリン：鉄を赤血球に送達し、細菌およびウイルスが鉄に結合することを防ぐ。
ラクトフェリン：細菌およびウイルスの成長に必要とされる鉄をそれらから奪う。
リゾチーム：その酵素活性を考慮して、ならびにそのカチオン性および疎水性特性の結果として抗菌作用を有する。
ラクトペルオキシダーゼ：必須タンパク質ＳＨ基の酸化により細菌代謝を阻害する。
【００３５】
本発明の組合せは、以下に詳述した方法に従って、分娩後の哺乳動物からの初乳、血清または胎盤の抽出により調製され得る。
【００３６】
血清は出生前の最後の日に因子の最も高いピークを有し、初乳は出生後の最初の数時間で、かつ６時間以内である。
【００３７】
分娩の１２時間後、初乳における因子は著しく減少し、２４時間でそれらの多くはもはや検出されない。
【００３８】
これらの因子は異なる種において遺伝学的に高度に保存されるので、例えば、ウシ、ウマ、ラクダ、海洋哺乳動物などの他の哺乳動物種から単離された因子を使用することができる。
【００３９】
因子は、種間交差反応が非常に高い場合でさえも、種に特異的であるＥＬＩＳＡアッセイを用いてコントロールされる。なぜなら、因子は系統発生的に非常に保存されるので、異なる種（例えば、ヒト−ウシおよびその逆）のために使用されるＥＬＩＳＡを用いても定性的に測定できるからである。
【００４０】
哺乳動物血清からの抽出
妊娠したメスの哺乳動物の血清は、分娩または出産前の最後の数日、通常、最後の５〜１５日において、本発明の組合せについて成分の最も高いピークを有する。
【００４１】
本発明の組合せを調製するための典型的な手順は記載されている。
【００４２】
動物、好ましくはウシまたはウマに対する損傷を防ぐように全部で４つの試料について１リットルの血液を４日目に採取する。
【００４３】
血清を室温にて２４時間、血液から分離し、次いで血餅を搾るために遠心分離する。
【００４４】
血清を回収し（全体積の約３０／４０％）、フェノキシエタノール２．５％およびジアゾリジニル−尿素１％を消毒剤としてそれらに加える。このように処理した血清を次いで以下の工程に供する。
【００４５】
限外濾過３００，０００Ｄａ：
哺乳動物血液から凝固および遠心分離により得た血清試料（−２０℃で凍結した）を室温にて解凍し、２体積の脱塩水で希釈した。得られた溶液を、４℃にて冷却した部屋において０．５から１バールのＰｉにてポリエーテルスルホン中でＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｏｍａｘ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ３００，０００Ｄａ平面接線フロー膜を通して限外濾過する。
【００４６】
透過物の約１：１０に対応する残余分および画分を、再生セルロース中でＳｐｅｃｔｒｕｍ  ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ製の１０００Ｄａ透析管に移し、脱塩水に対して透析する。
【００４７】
限外濾過５，０００Ｄａ：
残存している透過物を、５０００Ｄａ膜を通して限外濾過する。３００，０００Ｄａ限外濾過からの透過物を、４℃にて冷却した部屋において０．５から１バールのＰｉにてポリエーテルスルホン中で５０００Ｄａ平面接線フロー膜Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｏｍａｘ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ上で濃縮する。
【００４８】
残余分をＳｐｅｃｔｒｕｍ  ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ製の再生セルロース中で１，０００Ｄａ透析管に移し、脱塩水に対して透析する（この透析はまた、防腐剤を除去する）。次いで産物をすぐに凍結乾燥する。
【００４９】
胎盤からの抽出
ウシ、ウマまたはブタの胎盤が好ましくは使用される。
【００５０】
均質化
胎盤（−２０℃で凍結した）を室温にて解凍し、小切片に切断し、多量の冷却した（４℃）生理食塩水（ＮａＣｌ０．９％）で洗浄し、ｐＨ７．４にて以下の成分：Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２５ｍＭ、トリトンＸ−１００  ０．００１％を有する溶解緩衝液中でＳｉｒａｍｍカッターを使用して均質化する。０．９％の濃度でＮａＣｌを得られた懸濁液に加える。上清を２時間、（マグネチックスターラーで）撹拌し、４℃にて冷却した部屋で終夜静置した。
【００５１】
遠心分離
４５分間４℃にて、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ６およびローターＳＬＡ１５０００を用いて上清を１３，０００ｒｐｍにて遠心分離した。遠心分離からの上清を回収し、０．４５μｍから０．２２μｍのＤｉｃａｌｉｔｅおよび再生セルロールフィルター上で、真空前濾過する。
【００５２】
限外濾過３００，０００Ｄａ
産物を、４℃にて冷却した部屋において、０．５から１バールのＰｉにて３００．０００Ｄａ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｏｍａｘ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ平面接線フロー膜を通して濾過および限外濾過する。
【００５３】
限外濾過５，０００Ｄａ
３００，０００Ｄａ限外濾過からの透過物を、４℃にて冷却した部屋において、０．５から１バールのＰｉにてポリエーテルスルホン中の５０００Ｄａ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｏｍａｘ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ平面接線フロー膜上で濃縮する。残余分を再生セルロース中でＳｐｅｃｔｒｕｍ  ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ製の１，０００Ｄａ析管に移し、脱塩水に対して透析し、次いですぐに凍結乾燥する。
【００５４】
初乳からの抽出
特にホルスタイン（フリージアン）およびガーンジーウシからのウシ初乳が好ましい。これらのウシは、最も高い濃度の成長因子、免疫調節因子、走化性因子および抗菌／抗ウイルス因子を有する初乳を産生することが実証されている。ウシは好ましくは２回または３回分娩している。初乳は好ましくは分娩後５〜６時間以内に採取され、好ましくは初乳は分娩後１時間で採取される。なぜなら、最も高い濃度の活性物質がこの時間の間に見られるのに対して、６時間から先へ進むと、活性因子は急速に減少するからである（２０％のみが分娩後２４時間で存在する）。
【００５５】
採取した初乳を、結核、細胞培養物における細胞毒性、マイコプラズマ、プリオンならびにヒトおよびウシウイルスについて試験する。
【００５６】
乳房槽内の初乳は実質的に無菌であるが、一旦搾られると、高濃度の成長因子に起因して、あらゆる予防措置にも関わらず、凍結および解凍の間にその細菌数は非常に急速に上昇し、これは、最初の数時間における初乳の密度の高さを考慮するとかなり遅いプロセスである。
【００５７】
食事使用に許容される防腐剤の濃度ならびに非経口および／または静脈内使用に許容される防腐剤の濃度は、細菌数を押しとどめるのに十分ではない。γ線のみの使用は、１０Ｋｇｙを超える放射線が使用される場合、無菌初乳を生じるが、これは大部分の活性因子を破壊し、いずれにしてもこの方法は発熱物質の形成を防がず、その静脈内および／または局所使用は血液およびリンパ節と接触する領域において禁止されている。したがって、革新的な回収システムが、防腐剤または発熱物質を用いずに、無菌のアレルゲンを含まない化合物を得るために考案されている。
【００５８】
無菌で発熱物質を含まないことを保証するのに十分な量の消毒剤が、無菌タンク（これは２５Ｋｇｙにて空の状態で滅菌されている）に回収された初乳に加えられる。各々、１２．５％の濃度（通常使用される濃度、すなわち０．２％より非常に高い濃度）にてソルビン酸カリウムおよび安息香酸ナトリウム、または代替として、２．５％の濃度にてフェノキシエタノールもしくは１％の濃度にてジアゾリジニル尿素が好ましくは使用される。
【００５９】
このように処理された初乳は活性因子抽出プロセスの前に凍結保存されることを必要とせず、これにより費用の明らかな節約となる。
【００６０】
次いで初乳を食塩水で希釈する：この希釈は、濾過孔を詰まらせずに良好な濾過を与えるだけでなく、上記の全てが脂肪およびカゼインに結合した活性因子の放出を可能にする。したがって、希釈した初乳は接線精密濾過（２から６μｍの間のカットオフを有するセラミック膜、温度５／２０℃、０．２から２バールの間の膜貫通圧力）に供され、カゼイン、脂肪基質および乳タンパク質を含まない乳白色溶液を得るために、これは繰り返されてもよい。全てのこれらの物質は初乳および牛乳のアレルギー性含有物の９０％以上を構成する。次いで溶液を、全て２００，０００ダルトン未満の重量である、活性因子をさらに精製するために３００，０００ダルトン（Ｄａ）にてカットオフを有する膜に通すか、または代替として分子篩に通す。
【００６１】
次いで溶液を、高圧にて限外濾過（カットオフ１０００／２０００ダルトン）により透析し、次いですぐに凍結乾燥する。この結果は、可能な最大濃度の活性因子を有する、無菌で、防腐剤を含まない、非常に高い溶解度の非アレルギー性粉末（カゼインおよびラクトアルブミンは牛乳に対するアレルギーの９５％以上を占める）である。
【００６２】
免疫グロブリンの喪失
免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭは、以下の工程からなる方法によって、以前に開示された抽出物により得られた画分から定量的に喪失させる：１）アフィニティクロマトグラフィーによるＩｇＧ枯渇、２）接線フロー濾過による、および１００ｋＤａのカットオフを有する膜を使用するＩｇＡおよびＩｇＭ枯渇、３）３ｋＤａのカットオフを有する膜を使用する透析濾過による脱塩および濃縮、４）凍結乾燥。
【００６３】
アフィニティクロマトグラフィーによるＩｇＧ喪失
今までのところ、抗体精製に採用されている最も一般的な技術は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡおよび連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）由来のプロテインＧなどの細菌表面から単離された非常に特異的な免疫グロブリン結合タンパク質（ＩＢＰ）を使用するアフィニティクロマトグラフィーに基づく。このようなタンパク質は、通常、分取クロマトグラフィーカラムにおいて固定され、高い程度の純度で免疫グロブリンを捕捉し、１工程のみで回収する。ＩｇＧに対する最も高い親和性により特徴付けられる、最も好適なウシＩＢＰが選択され、セファロース上で固定された５ｍｌのプロテインＡまたはＧを含有するＨｉＴｒａｐカラムを試験した。電気泳動およびＥＬＩＳＡの両方によりＩｇＧ喪失を測定することによって、本発明者らは、プロテインＧが、ウシＩｇＧについての最も好適なＩＢＰであり、９５％より高い喪失に至ることを発見した。ほぼ１ｇの全量に対して２３ｍｇのＩｇＧ／ｍｌを結合できる臭化シアン（ＣＮＢｒ）によりセファロース上で固定された組換えプロテインＧからなる４００ｍｌのプロテインＧセファロース４高速流（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有する、ＨｉＳｃａｌｅ（商標）５０カラムＩの使用が好ましい。移動相はＦＰＬＣシステム（ＡＫＴ  Ａｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ）により溶出され、２８０ｎｍにてＵＶ検出器、導電率計（０．００１〜９９９．９ｍＳ／ｃｍ）およびｐＨメータによりモニターされる。アフィニティクロマトグラフィー法は以下の工程からなる：１）結合、２）溶出、３）カラム再生。結合工程は、２０ｍｌ／分の流速にて、０．１ＭＰａの背圧を超えずに、５体積の結合緩衝液（リン酸緩衝液、２０ｍＭ  ｐＨ７）でカラムを平衡化することからなる。次いで抽出物の試料をカラム上に負荷し、次いで結合緩衝液で溶出する。この段階の間、免疫グロブリンは固定相に結合するのに対して、他のタンパク質はカラムから溶出される。ＩｇＧから喪失させた溶出タンパク質の回収は溶出液のＵＶをモニターすることにより自動的に誘導される。次の工程は、２０ｍｌ／分の流速に設定したｐＨ２．５にて酸性移動相（グリシン−ＨＣｌ）を使用することにより免疫グロブリンを溶出することからなる。溶出工程の後、その正確な再生および保存のためにエタノール（２０％）をカラム内にフラッシュすることが必要である。
【００６４】
接線フロー濾過によるＩｇＡおよびＩｇＭ喪失。ＩｇＭおよびＩｇＡサブクラスの分離は、得られた画分のプロテオームに対するそれらの高分子量に基づく。特に、ウシ初乳由来のウシ分泌ＩｇＡ（ＳＩｇＡ）（分子量約４１０，０００）は、４つのアルファ鎖（分子量６１，０００）、４つの軽鎖（分子量約２３，０００）および１つの糖タンパク質−ａの分子（分子量７０，０００〜８６，０００）からなる。複数の免疫グロブリンが、大部分は五量体としてであるが、六量体としてもジスルフィド結合と一緒に共有結合される場合、ＩｇＭはポリマーを形成するので、ＩｇＭは、（その五量体形態において）少なくとも９７０ｋＤａの分子量により特徴付けられる。Ｉｇのこれら２つのクラスの喪失は、１００ＫＤａのカットオフを有する多孔質膜の使用に基づいた接線濾過システムにより実施される。特に、このシステムは、供給口、残余分口、および２つの透過口ならびに生体液の穏やかな再循環のための蠕動ポンプを備える中空繊維クロスフロー濾過カートリッジに基づく。
【００６５】
透析濾過による脱塩および濃縮ならびに４）凍結乾燥。免疫グロブリンから喪失させたプロテオームを次いで、脱塩および濃縮するための３〜５ｋＤａのカットオフを有する膜を通して透析濾過する。得られた溶液を次いで、無菌状態において０．２ミクロンの膜を通して濾過し、最後に凍結乾燥する。
【００６６】
凍結乾燥：
５０００Ｄａからの限外濾過残余分を、０．２μｍから再生されたセルロースから作製されたＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタ上で、真空下で濾過し、−２０℃にて凍結し、凍結乾燥する。
【００６７】
血清、胎盤または初乳から得られる産物は別々に使用されてもよく、またはそれらは一
緒にプールされてもよい。産物はいかなる場合も表１〜６に指定した定量的範囲を満たす。
【００６８】
本発明の組合せは、幹細胞治療の代替のための組織修復および再生を必要とする状態の処置において、非経口または局所的のいずれかで有益に使用される。特に、場合により、例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸、マトリゲル、親水コロイド、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトンなどの生体材料と組合せて、皮膚科および形成外科ならびに美容外科に使用するための充填剤として、幹細胞培養物の上清の同じ成分を含有する、本発明の組合せが、骨外傷および変性病状の処置に有用である。投与される本発明の組合せの量は０．１から１０ｇで変化してもよい。本発明の組合せはまた、転移性骨病変、下顎または上顎歯槽突起萎縮の処置のため、および骨折の硬化のために有用である、１から１０％の範囲の濃度において本発明の組合せを含有する材料を与えるために、骨格、ブラケット、インプラントまたはプロテーゼを含浸するために使用されてもよい。濃度はＰＭＦ含有材料により処置される病変の期間および種類に明らかに依存する。
【００６９】
非経口処置に関して、本発明の組合せは、無菌溶液などの好適な投与量で好適な担体および添加剤と共に製剤化される。
【００７０】
組合せはまた、小窩齲食および髄質炎症の治療のための空洞のための回復材料として使用されてもよい。この目的のために、組合せは、骨格、セメント、支持体、再吸収可能または再吸収不可能なインプラントの形態で製剤化される。
【００７１】
組合せの１日投与量は、処置される状態の種類および重症度ならびに患者の状態、年齢および性別に依存する。それは一般に、１または複数回の投与、典型的に２から３回の投与において１日に１から１０ｇの範囲である。
【００７２】
局所処置に関して、適切な投与形態としては、典型的に１０から２０重量％の本発明の組合せを含む、クリーム、軟膏、ゲル、粉剤、ローション、口内洗浄液、パッチが挙げられる。所望の場合、初乳、血清または胎盤から得た本発明の組合せは、例えば制御放出形態において、好ましくはミクロスフェア内で、特定の用途のために被覆されてもよい。
【００７３】
製剤は特定の使用に有用である他の成分を含有してもよい。
【００７４】
本発明は、実施例により与えられる、以下の実験部分により詳細に記載されている。
【実施例１】
【００７５】
骨疾患の処置
インビトロ試験
最初の（Ｅｘ  ｎｏｖｏ）骨形成
骨形成に対するＰ．Ｍ．Ｆ．の効果を、ヒトおよびマウスの骨形成間葉系幹細胞、および骨の前駆体の増殖および分化アッセイによりインビトロにおいて評価した。インビボで、ＰＭＦの骨形成活性を、ＰＭＦおよびヒドロキシアパタイトを含有するマトリゲル、無定形基質の皮下注射のモデルにおいて評価した。
【００７６】
増殖
骨芽前駆体（ヒト脂肪組織由来の幹細胞、ｈＡＳＣ）のモデルとして、ヒト骨芽（Ｓａｏｓ−２およびＭＧ−６３）細胞およびヒト間葉系幹細胞を使用して、細胞増殖に対するＰ．Ｍ．Ｆ．の効果を評価した。
【００７７】
６人のボランティアドナーからＡＳＣを単離し（非特許文献５参照）、対照培地（ピルビン酸ナトリウム、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２５０ｎｇ／ｍｌアンホテリシンＢを補足したＤＭＥＭ）中に維持した。骨芽細胞Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−８５）およびＭＧ−６３（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１４２７）はＡＴＣＣから購入した。Ｓａｏｓ−２およびＭＧ−６３をそれぞれ、１５％ＦＢＳを有するＭｃＣｏｙ’５Ａ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、および１０％ＦＣＳを有するＤＭＥＭ中に維持した。
【００７８】
細胞を９６ウェルプレート中に播種し、１、３、５および７日目にＭＴＴ試験に供し、３７℃にて５％ＣＯ２の湿気にある環境中に維持した。ＰＭＦは、研究した株の全てに対して有効な用量依存的増殖効果を示し、５ｍｇ／ｍｌの濃度で最大に達した。
【００７９】
遊走
間葉前駆体（ＡＳＣ）およびヒト骨芽細胞（ＭＧ−６３およびＳＡＯＳ）を動員するＰＭＦの能力を、細胞運動性を誘導する能力を研究するための重要な試験として認識されている、創傷治癒アッセイにより評価した。示した濃度（５ｍｇ／ｍｌ）におけるＰＭＦは、ＡＳＣおよびＭＧ−６３について陽性対照（１０％ＦＢＳ）の条件と匹敵するように、ならびにＳａｏｓについて常に統計的に有意であるが、より少ない程度で細胞運動性を促進する。
【００８０】
ＰＭＦによるチタン表面の機能化
歯科インプラントの表面をインビトロで試験するために一般に使用されている、平滑なチタンのシリンダを、ＰＭＦの機能化を可能にするためにポリアクリレート薄膜で被覆した。表面上のカルボキシル基の導入により、実際に、ＰＭＦに含まれる成長因子のアミノ酸残基に存在するアミノ基との共有結合の形成が可能となる。Ｓａｏｓ−２ヒト骨芽細胞を試料上に播種し、３および６時間後に固定し、免疫細胞化学的分析のために調製した。ちょうど３時間後、処理していない表面と比べて、処理した表面上の細胞のより広い拡散に気づくことができ、一方、播種の６時間後において、拡散は２つの条件において同様であるが、細胞の数は機能化した表面について著しく多い。
【００８１】
インビボ試験
マトリゲルにおける骨形成のインビボモデル
ＰＭＦの骨形成活性を、１００マイクログラム／ｍｌのＰＭＦの存在または非存在下でＢａｌｂ−Ｃ内にマトリゲルを皮下に接種することによって評価した。ＰＭＦを含有する基質の検査は、接種の１０〜１５日後、炎症細胞の動員を示した。
【００８２】
その後の研究は、ＰＭＦを含有しているまたは含有していないマトリゲルに加えられる、ヒドロキシアパタイトの存在下で行った。接種の１０日後、マクロファージおよび反応性巨細胞がヒドロキシアパタイト結晶周囲にＰＭＦの存在下で動員した。免疫組織化学的分析もまた、オステオカルシンの沈着を示した。６０日目に、Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色にてカルシウム沈着について陽性である、反応性ストロマに囲まれた石灰化領域が明らかになった。
【００８３】
上記の結果から、その可溶性骨誘導因子が培養培地またはインビボでヒドロキシアパタイト骨格に供給される場合、ＰＭＦが骨形成を増強するのにどのように役割を果たしているのかが明らかになる。したがって、ＰＭＦは、整形外科および歯科に使用される代用骨材料に都合良く利用され得る。さらに、ＰＭＦは試験細胞上で正の走化性の能力を有し、インプラント表面の機能化のために使用され得る。骨および骨芽細胞の前駆体増殖および遊走に対する効果は、種々のケモカインおよび成長因子がＰＭＦに存在することに起因する。
【００８４】
イヌにおける骨折
癒着不能または遷延治癒の高いリスクがある長い骨を骨折している５匹のイヌにおいて、３から１５ｇのＰＭＦを含有する骨格を骨折とプラークとの間に置いた。
【００８５】
未処置の対照イヌと比べて骨量の増加が観察された。特に、ＰＭＦに含有される特異的成長因子により刺激される生理学的骨芽細胞の作用に起因する新たな骨梁の形成が観察された。骨折のより迅速な硬化および仮骨のミネラル化が、考慮される骨折の種類に通常必要とされる期間の半分で観察された。骨折硬化の平均期間は、未処置の動物について３０週からＰＭＦ処置した動物について１６週まで減少した。
【００８６】
得られた結果は、ＰＭＦが骨再生を活性化できることを示す。この結果は、硬化の高いリスクがある骨折の存在下で使用するために臨床的および生理学的観点から非常に有望である。
【実施例２】
【００８７】
歯における穿通性齲蝕および髄質炎症の治療
インビボでの歯髄損傷
１０匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、３ヶ月齢を、歯冠に対する傷害のモデルのために使用し、続いて、非特許文献６のプロトコルに従って充填した。ゼロ日目に、穴を臼歯の右近心面上に開け、水酸化カルシウムまたは２００マイクログラムのＰＭＦによる充填を空洞内に適用した。２つの歯は髄質炎症の陽性対照として開けたままにした。
【００８８】
結果
陽性対照は顕著な炎症性浸潤を示した（図１Ａ）のに対して、水酸化カルシウムで処理した歯は充血および浮腫を有する歯髄炎を示した（図１Ｂ）。ＰＭＦを含有する充填は正常な歯髄の特徴を維持した（図１Ｃ）。
【実施例３】
【００８９】
皮膚再生
インビトロ試験
ＰＭＦは、対照（１０％ＦＢＳ）と比較してヒト脂肪組織（ｈＡＳＣ）に由来する間葉系幹細胞の増殖能力をかなり増加させた（＞１００％）。培養培地中で、２つの異なる濃度（５ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌ）で使用したＰＭＦは、用量およびインキュベーション時間に依存した効果を有した。
【００９０】
インビボ試験
ＰＭＦ（１００γ）を、１ｍｌの架橋していないヒアルロン酸と混合した。ヒアルロン酸またはマトリゲルなどの他の媒体は、長期の真皮およびコラーゲンの再生を可能にするように１５〜２０日の期間でＰＭＦを放出するように設計する。
【００９１】
インビボでの細胞増殖
ＰＭＦ、マトリゲルまたはヒアルロン酸の混合物をマウスに皮下に注射する。７日後、支持体非晶質の周囲において血管細胞増殖が観察される。２０日後、非晶質支持体には、細胞が完全にコロニー形成している。さらに３０日後、コラーゲンの著しい形成が観察される。
【００９２】
ブタの尾に対する機械的損傷：皮内治療
ブタの尾の結紮は尾の下流の壊死を生じる。実験モデルは、１）生理的、２）生理食塩水＋ＰＭＦ、３）ヒアルロン酸＋ＰＭＦの上流の注射を含む。
【００９３】
生理食塩水の注射後、病変の上流で、尾は２４時間で落ちる。注射から１５日後、生理的＋ＰＭＦの病変の上流で、尾は落ちないが、最適条件未満の下で成長し始め、特に病変に対する末梢部において、壊死病変を見ることができ、毛の成長は起こらない。ヒアルロン酸＋ＰＭＦの注射から１５日後、病変の上流で、尾は完全に正常である。
【００９４】
組織学的検査は、神経および筋肉の変化が処置した動物において観察されず、その皮膚および血管系は生理学的状態に戻ることを示す。未処置の動物の尾部分は、処置した動物のもののおおよそ半分の直径を有すること以外に、神経−筋肉、血管および皮膚成分の全ての萎縮を有する、広範な硬化を示す。動脈は内膜プラークにより完全に遮断される。
【実施例４】
【００９５】
心筋の修復
注射針による心筋の障害は、針自体からマトリゲル＋１００マイクログラムのＰＭＦを放出することにより防がれた。筋細胞による病変のコロニー形成が最初に起こり、続いて完全な修復が起こる。
【図１Ａ】
2015506931.tif 000008
【図１Ｂ】
2015506931.tif 000009
【図１Ｃ】
2015506931.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成26年3月7日(2014.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカイン、成長因子、走化性因子、幹細胞刺激因子、抗菌／抗ウイルス因子の組合せ。
【表１】
2015506931.tif 000011
【表２】
2015506931.tif 000012
【表３】
2015506931.tif 000013
【表４】
2015506931.tif 000014
【表５】
2015506931.tif 000015
【表６】
2015506931.tif 000016
【請求項２】
初乳の抽出により得られることを特徴とする請求項１に記載の組合せ。
【請求項３】
胎盤の抽出により得られることを特徴とする請求項１に記載の組合せ。
【請求項４】
分娩前５−１５日前に採取した血清から血清の抽出により得られることを特徴とする請求項１に記載の組合せ。
【請求項５】
組織修復および再生を必要とする状態の処置に使用するためおよび幹細胞治療の代替のための請求項１〜４のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項６】
前記状態は、骨外傷および変性病状、転移性骨病変、下顎または上顎歯槽突起の萎縮、骨折、小窩齲食および髄質炎症から選択されることを特徴とする請求項５に記載の組合せ。
【請求項７】
場合により生体材料と組合せて、皮膚科および形成外科ならびに美容外科において充填剤として使用するための請求項１〜４のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項８】
前記生体材料は、コラーゲン、ヒアルロン酸、マトリゲル、親水コロイド、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトンなどから選択されることを特徴とする、請求項７に記載の組合せ。
【請求項９】
好適な担体および／または添加剤と混合して、活性成分として請求項１〜４のいずれか一項に記載の組合せを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
非経口投与のための請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
局所投与のための請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
骨格、セメント、支持体、再吸収可能または再吸収不可能なインプラントの形態で請求項１に記載の組合せを含むことを特徴とする埋め込み可能な材料。
【国際調査報告】
2015506931.tif 000017
2015506931.tif 000018
2015506931.tif 000019
2015506931.tif 000020
2015506931.tif 000021