(57)【要約】  本発明の技術は、炎症障害に関連する症状の予防、治療、および／または緩和に有用な薬剤をスクリーニングするため、悪化した炎症応答を発達させやすい個体を特定するため、ならびに治療レジメンが個体における炎症障害に関連する症状を予防、治療、または緩和することが可能であるかを判断するための炎症を可能にするポリペプチド（またはそれらのコード配列）の使用に関する。本発明の技術は、炎症を可能にする標的の発現または活性の阻害に基づく炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するための方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するための薬剤の能力を評価するための方法であって、
（ａ）  前記薬剤を試薬と混合して、少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性に関連するパラメータを得ることと、
（ｂ）  ステップ（ａ）の前記パラメータを測定して、試験レベルを得ることと、
（ｃ）  前記試験レベルを対照レベルと比較することであって、前記対照レベルが、前記炎症状態の前記発症または維持中に観察された前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの前記少なくとも１つの生物学的活性に関連する、比較することと、
（ｄ）  前記薬剤を、（ｉ）前記試験レベルに関連する前記少なくとも１つの生物学的活性が前記対照レベルに関連する前記生物学的活性よりも低い場合、前記炎症状態に関連する前記症状の予防、治療、および／または緩和に有用であるか、または（ｉｉ）前記試験レベルに関連する前記少なくとも１つの生物学的活性が前記対照レベルに関連する前記生物学的活性以上である場合、前記炎症状態に関連する前記症状の予防、治療、および／または緩和に対する有用性に欠けると特徴付けることと、を含む、方法。
【請求項２】
前記炎症を可能にするポリペプチドが、ＣＣＤＣ８８Ｂ、ＵＳＰ１５、ＩＲＦ８、ＩＲＦ１、ＩＲＧＭ１、ＴＨＥＭＩＳ、およびＦＯＸＮ１のうちの少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試薬が、核酸分子である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸分子が、前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーターを含み、前記パラメータが、前記プロモーターによって駆動される発現の尺度である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸分子が、前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドをコードする転写物であり、前記パラメータが、前記転写物の量の尺度である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸分子が、発現が前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドによって修飾され得る少なくとも１つの遺伝子の転写物であり、前記パラメータが、前記転写物の量である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記炎症を可能にするポリペプチドが、ＩＲＦ８であり、発現が前記炎症関連ポリペプチドによって修飾され得る前記少なくとも１つの遺伝子が、表１〜３のうちのいずれか１つに提示される遺伝子からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試薬が、ポリペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記パラメータが、前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの量である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記パラメータが、前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＣＣＤＣ８８Ｂであり、前記少なくとも１つの生物学的活性が、タンパク質の折り畳み活性である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＵＳＰ１５であり、前記少なくとも１つの生物学的活性が、脱ユビキチン化活性である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＦＯＸＮ１、ＩＲＦ８、およびＩＲＦ１からなる群から選択され、前記少なくとも１つの生物学的活性が、転写因子活性である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＴＨＥＭＩＳであり、前記少なくとも１つの生物学的活性が、タンパク質シグナル伝達活性である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＩＲＧＭ１であり、前記少なくとも１つの生物学的活性が、ＧＴＰａｓｅ活性である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの結合パートナーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＵＳＰ１５であり、前記結合パートナーが、ＵＳＰ１５によって脱ユビキチン化され得るポリペプチドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｉ）が、インビトロで行われる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｉ）が、インビボで行われる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｉ）が、非ヒト動物で行われる、ステップ２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記非ヒト動物が、非機能性の炎症を可能にするポリペプチドの少なくとも１つの遺伝子コピーを有する、ステップ２１に記載の方法。
【請求項２３】
個体における炎症状態に関連する症状を治療および／または緩和するための薬剤の有用性を評価するための方法であって、
（ａ）  少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドをコードする遺伝子に対して異型接合性である動物において炎症応答を誘導するための誘発物を投与することと、
（ｂ）  前記炎症応答を有する前記動物に前記薬剤を投与することと、
（ｃ）  ステップ（ｂ）の前記動物の前記炎症応答のパラメータを測定して、試験レベルを提供することと、
（ｄ）  前記試験レベルを対照レベルと比較することであって、前記対照レベルが、前記炎症応答の発症または維持に関連する、比較することと、
（ｅ）  前記薬剤を、（ｉ）前記試験レベルに関連する前記炎症応答が前記対照レベルに関連する前記炎症応答よりも低い場合、前記炎症状態に関連する前記症状の治療および／または緩和に有用であるか、または（ｉｉ）前記試験レベルに関連する前記炎症応答が前記対照レベルに関連する前記炎症応答以上である場合、前記炎症状態に対する前記症状の治療および／または緩和に関する有用性に欠けると特徴付けることと、を含む、方法。
【請求項２４】
個体における炎症状態を予防するための薬剤の能力を評価するための方法であって、
（ａ）  炎症を可能にするポリペプチドをコードする遺伝子に対して異型接合性である動物に薬剤を投与することと、
（ｂ）  ステップ（ａ）の前記動物に、前記薬剤の不在で炎症応答を誘導することができる誘発物を投与することと、
（ｃ）  ステップ（ｂ）の前記動物における前記炎症応答のパラメータを測定して、試験レベルを提供することと、
（ｄ）  前記試験レベルを対照レベルと比較することであって、前記対照レベルが、前記炎症応答の発症または維持に関連する、比較することと、
（ｅ）  前記薬剤を、（ｉ）前記試験レベルに関連する前記炎症応答が前記対照レベルに関連する前記炎症応答よりも低い場合、前記炎症状態の予防に有用であるか、または（ｉｉ）前記試験レベルに関連する前記炎症応答が前記対照レベルに関連する前記炎症応答以上である場合、前記炎症状態の予防に対する有用性に欠けると特徴付けることと、を含む、方法。
【請求項２５】
前記炎症を可能にするポリペプチドが、ＦＯＸＮ１、ＣＣＤＣ８８Ｂ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ８、ＴＨＥＭＩＳ、ＩＲＧＭ１、およびＵＳＰ１５のうちの少なくとも１つである、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記誘発物が、感染病原体である、請求項２３または２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記パラメータが、生存率である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記パラメータが、次の神経症状：発熱、振戦、嗜眠、後肢麻痺、および昏睡のうちの少なくとも１つである。請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記パラメータが、免疫細胞の数、免疫細胞の種類、サイトカインプロファイル、ケモカインプロファイル、免疫グロブリンプロファイル、浮腫、および血液脳関門の透過性からなる群から選択される炎症関連パラメータである、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
治療剤が個体における炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するのに有用であるかを判断するための方法であって、
（ａ）  前記治療剤の少なくとも単回量を受けた前記個体の生物学的試料を得ることと、
（ｂ）  少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性に関連する試薬のパラメータを測定して、試験レベルを提供することと、
（ｃ）  前記試験レベルを対照レベルと比較することであって、前記対照レベルが前記炎症状態の発症または維持中に観察された前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの前記少なくとも１つの生物学的活性に関連する、比較することと、
（ｄ）  前記治療剤を、（ｉ）前記試験レベルに関連する前記少なくとも１つの生物学的活性が前記対照レベルに関連する前記生物学的活性よりも低い場合、前記個体における前記炎症状態に関連する前記症状の予防、治療、および／または緩和に有用であるか、または（ｉｉ）前記試験レベルに関連する前記少なくとも１つの生物学的活性が前記対照レベルに関連する前記生物学的活性以上である場合、前記個体における前記炎症状態に関連する前記症状の予防、治療、および／または緩和に対する有用性に欠けると特徴付けることと、を含む、方法。
【請求項３１】
前記炎症を可能にするポリペプチドが、ＣＣＤＣ８８Ｂ、ＵＳＰ１５、ＩＲＦ８、ＩＲＦ１、ＩＲＧＭ１、ＴＨＥＭＩＳ、およびＦＯＸＮ１のうちの少なくとも１つである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記試薬が、核酸分子である、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記核酸分子が、前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーターを含み、前記パラメータが、前記プロモーターによって駆動される前記発現の尺度である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸分子が、前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドをコードする転写物であり、前記パラメータが、前記転写物の量の尺度である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸分子が、発現が前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドによって修飾され得る少なくとも１つの遺伝子の転写物であり、前記パラメータが、前記転写物の量である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記炎症を可能にするポリペプチドが、ＩＲＦ８であり、発現が前記炎症を可能にするポリペプチドによる修飾であり得る前記少なくとも１つの遺伝子が、表１〜３のうちのいずれか１つに列挙される遺伝子からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記試薬が、ポリペプチドである、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが、前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記パラメータが、前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの量である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記パラメータが、前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＣＣＤＣ８８Ｂであり、前記少なくとも１つの生物学的活性が、タンパク質の折り畳み活性である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＵＳＰ１５であり、前記少なくとも１つの生物学的活性が、脱ユビキチン化活性である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＦＯＸＮ１、ＩＲＦ１、またはＩＲＦ８であり、前記少なくとも１つの生物学的活性が、転写因子活性である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＴＨＥＭＩＳであり、前記少なくとも１つの生物学的活性が、タンパク質シグナル伝達活性である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＩＲＧＭ１であり、前記少なくとも１つの生物学的活性が、ＧＴＰａｓｅ活性である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが、前記少なくとも１つの炎症を可能にするの結合パートナーである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＵＳＰ１５であり、前記結合パートナーが、ＵＳＰ１５によって脱ユビキチン化され得るポリペプチドである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ポリペプチドが、前記炎症を可能にするポリペプチドの前記シグナル伝達経路に関連する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４９】
前記特徴付けが、前記個体の少なくとも２つの異なる生物学的試料において実施される、請求項３０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
個体における炎症状態に対する素因またはその存在を判断するための方法であって、
（ａ）  前記個体から生物学的試料を提供することと、
（ｂ）  少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性に関連する試薬のパラメータを測定して、試験レベルを提供することと、
（ｃ）  前記試験レベルを対照レベルと比較することであって、前記対照レベルが、前記炎症状態の不在中に観察された前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの前記生物学的活性に関連する、比較することと、
（ｄ）  前記個体を、（ｉ）前記試験レベルに関連する前記少なくとも１つの生物学的活性が前記対照レベルに関連する前記生物学的活性以上である場合、前記炎症状態に感染しやすいか、または（ｉｉ）前記試験レベルに関連する前記少なくとも１つの生物学的活性が、前記対照レベルに関連する前記生物学的活性よりも低い場合、前記炎症状態の素因に欠けると特徴付けることと、を含む、方法。
【請求項５１】
前記炎症を可能にするポリペプチドが、ＣＣＤＣ８８Ｂ、ＵＳＰ１５、ＩＲＦ８、ＩＲＦ１、ＩＲＧＭ１、ＴＨＥＭＩＳ、およびＦＯＸＮ１のうちの少なくとも１つである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記試薬が、核酸分子である、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記核酸分子が、前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーターを含み、前記パラメータが、前記プロモーターによって駆動される前記発現の尺度である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記核酸分子が、前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドをコードする転写物であり、前記パラメータが、前記転写物の量の尺度である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記核酸分子が、発現が前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドによって修飾され得る少なくとも１つの遺伝子の転写物であり、前記パラメータが、前記転写物の量である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記炎症を可能にするポリペプチドが、ＩＲＦ８であり、発現が前記炎症を可能にするポリペプチドによって修飾され得る前記少なくとも１つの遺伝子が、表１〜３のうちのいずれか１つに列挙される遺伝子からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記試薬が、ポリペプチドである、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポリペプチドが、前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記パラメータが、前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの量である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記パラメータが、前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＣＣＤＣ８８Ｂであり、前記少なくとも１つの生物学的活性が、タンパク質の折り畳み活性である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＵＳＰ１５であり、前記少なくとも１つの生物学的活性が、脱ユビキチン化活性である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＦＯＸＮ１、ＩＲＦ１、またはＩＲＦ８であり、前記少なくとも１つの生物学的活性が、転写因子活性である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＴＨＥＭＩＳであり、前記少なくとも１つの生物学的活性が、タンパク質シグナル伝達活性である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＩＲＧＭ１であり、前記少なくとも１つの生物学的活性が、ＧＴＰａｓｅ活性である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記ポリペプチドが、前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの結合パートナーである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６７】
前記少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＵＳＰ１５であり、前記結合パートナーが、ＵＳＰ１５によって脱ユビキチン化され得るポリペプチドである、請求項６６に記載の方法。．
【請求項６８】
前記ポリペプチドが、前記炎症を可能にするポリペプチドの前記シグナル伝達経路に関連する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６９】
前記特徴付けが、前記個体の少なくとも２つの生物学的試料において実施される、請求項５０〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
予防、治療、および／または緩和を必要とする個体における炎症状態に関連する前記症状を予防、治療、および／または緩和するための方法であって、前記個体における前記炎症状態に関連する前記症状を防止、治療、および／または緩和するように、炎症を可能にするポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を阻害することができる薬剤を投与することを含む、方法。
【請求項７１】
前記薬剤が、前記炎症を可能にするポリペプチドの前記発現を制限することができる核酸分子である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記薬剤が、前記炎症を可能にするポリペプチドの前記生物学的活性を制限することができる抗体である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記炎症状態が、神経炎症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、１型糖尿病、およびセリアック病からなる群から選択される、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
炎症を可能にするポリペプチド（ＩＥＰ）の突然変異体であり、対象において発現される場合、前記対象の炎症状態の発症および／または維持を予防する能力を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項７５】
前記ＩＥＰが、ＣＣＤＣ８８ＢまたはＵＳＰ１５である、請求項７４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７６】
配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項７５に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７７】
請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドをコードする核酸ベクター。
【請求項７８】
炎症を可能にするポリペプチド（ＩＥＰ）をコードする遺伝子が異型接合性である細胞であって、前記細胞が、ＩＥＰをコードする第１の遺伝子コピーと、前記ＩＥＰの突然変異体をコードする第２の遺伝子コピーと、を有し、前記ＩＥＰの前記突然変異体が、対象において発現される場合、前記対象の前記炎症状態の発症および／または維持を防止する能力を有する、細胞。
【請求項７９】
炎症を可能にするポリペプチド（ＩＥＰ）の突然変異体をコードする遺伝子に対して同型接合性であって、前記ＩＥＰの前記突然変異体が、対象において発現される場合、前記対象の前記炎症状態の発症および／または維持を防止する能力を有する、細胞。
【請求項８０】
請求項７４〜７６のいずれか一項の単離されたポリペプチドを発現する、請求項７８または７９に記載の細胞。
【請求項８１】
遺伝子導入細胞である、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８２】
請求項７７に記載の核酸ベクターを有する、請求項８１に記載の細胞。
【請求項８３】
炎症を可能にするポリペプチド（ＩＥＰ）をコードする遺伝子に対して異型接合性であって、動物が、ＩＥＰをコードする第１の遺伝子コピーと、前記ＩＥＰの突然変異体をコードする第２の遺伝子コピーと、を有し、前記ＩＥＰの前記突然変異体が、動物において発現される場合、前記動物の前記炎症状態の発症および／または維持を防止する能力を有する、動物。
【請求項８４】
炎症を可能にするポリペプチド（ＩＥＰ）の突然変異体をコードする遺伝子に対して同型接合性であって、前記ＩＥＰの前記突然変異体が、動物において発現される場合、前記動物の前記炎症状態の発症および／または維持を防止する能力を有する、動物。
【請求項８５】
請求項７４〜７６のいずれか一項の単離されたポリペプチドを発現する、請求項８３または８４に記載の動物。
【請求項８６】
遺伝子導入動物である、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の動物。
【請求項８７】
請求項７７に記載の核酸ベクターを有する、請求項８６に記載の動物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１２年５月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／６５２，２７１号の優先権を主張し、その全体が本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、炎症障害に関連する症状の予防、治療、および／または緩和に有用な薬剤をスクリーニングするため、悪化した炎症応答を発達させやすい個体を特定するため、ならびに治療レジメンが個体における炎症障害に関連する症状を予防、治療、または緩和することが可能であるかを判断するためのポリペプチド（またはそれらのコード配列）の使用に関する。本発明は、炎症を可能にする標的の発現または活性の阻害に基づく、炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するための方法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
炎症は、感染、火傷、外傷、および他の侵襲によってもたらされる組織損傷に対する正常な生理学的応答である。この応答の厳しい規定は、関連する危険シグナルの初期認識、原因病変の排除、および恒常性の回復に重要である。この過程は、先天性および適応性免疫系の細胞を有する線維芽細胞、内皮細胞、および上皮細胞の間のクロストークを含む、造血細胞と間質細胞との間の複雑な相互作用を伴う。炎症誘発性可溶性媒介物質および再構築酵素の早期産生、ならびにその過程を弱め、終結させる抗炎症分子の適時合成は、そのような制御された炎症応答の独特な特徴である。しかしながら、この過程の調節不全は、急性または慢性の炎症状態を引き起こす。抗炎症薬物の多くのクラスおよび種類が存在するが、それらの有効性は、限られており、一時的な場合が多く、それらの長期使用は、著しく有害な副作用をもたらす。よって、炎症疾患は、大きな市場における未対処の薬理学的必要性を表している。
【０００４】
炎症応答は、上皮、内皮、および組織常在性免疫細胞における危険シグナルによるパターン認識受容体（ＰＲＲ）およびインフラマソームの初期活性化を含む事象の複雑なカスケードを伴う。これは、遠隔部位から損傷部位への、好中球、好塩基球、単球、マクロファージ、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋Ｔリンパ球などの免疫細胞の動員が迅速に続く。これらの浸潤物は、いくつかの可溶性媒介物質（ヒスタミン、ロイコトリエン、一酸化窒素）、サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１）、ケモカイン（ＩＬ−８、ＭＣＰ１、ＫＣ）、および酵素（リソソームプロテアーゼ）を放出し、これは、ある特定の血漿タンパク質（補体、ブラジキニン、＋ミン）と共に、炎症応答を確立し、増幅する。抗炎症分子（ＰＧＥ２、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ＩＬ−１Ｒａ）の適時産生は、この応答を弱め、最終的には終結させる。持続する組織損傷または特殊な感染／環境侵襲の存在、炎症誘発性媒介物質の過剰発現、または抗炎症シグナルの不十分な産生は、急性または慢性の衰弱状態を引き起こす。敗血症および脳炎を含む急性炎症状態は、臨床的に管理することが難しく、死亡率が高い。慢性炎症疾患は、北米において高罹患率を示し、関節リウマチ（ＲＡ、罹患率７５〜１０００／１０５）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ、約０．５〜２５／１０５）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ、４０〜２００／１０５）、乾癬（ＰＡ、２／１００）、多発性硬化症（ＭＳ、１８〜３５０／１０５）、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ、８〜１７／１０５）、およびセリアック病（ＣｅＤ、１／１００）を含む。慢性閉塞性肺疾患、冠動脈硬化症、糖尿病、癌、および神経変性疾患は、原因となる炎症成分を有する場合があるとも提案されている。これらの世界的な「炎症」疾患は、人の健康に大きな負担であり、抗炎症薬物に関する大きな薬学的市場を表している。ステロイド（コルチゾン）、非ステロイド系抗炎症薬物（ＣＯＸ２阻害剤（セレコキシブ（ｃｏｌｅｃｏｘｉｂ））を含む）、ならびにプロプリオン酸（ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（イブプロフェン）、酢酸（インドメタシン）、エノール酸、およびフェナム酸の誘導体を含むそのような薬物のいくつかのクラスが開発されてきた。しかしながら、これらの薬物の有益性は限られており、それらは有効性において個体によって著しい可変性を示し、それらの長期使用は重度の副作用を有し、特定の標的療法の必要性を高める。近年、ＴＮＦ（インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ）、ＩＬ−１２ｐ４０（モノクローナル抗体）、およびＩＬ−１（アナキンラ）経路、ならびにＢ細胞（リツキシマブ）およびＴ細胞（アバタセプト）を標的とする生物学的製剤が、炎症状態において臨床的有効性を示し、新規抗炎症標的を特定するための我々の宿主に基づくアプローチの関連性を支持する。
【０００５】
慢性の炎症状態は、先天性および後天性免疫系の持続的な活性化を含む、いくつかの臨床特徴を共有する。正常な上皮関門の破損、組織損傷、または持続的な感染は、不活性環境または宿主由来産生物（食物、尿酸ナトリウム結晶、アスベスト、シリカなど）、微生物産生物（共生細菌、ウイルス、寄生虫、および真菌を含む）への慢性的な曝露、および／または魅力的な自己抗原（核酸、損傷したタンパク質）への曝露をもたらす場合がある。これらは、先天性免疫系の細胞内もしくは細胞表面センサにより、または後天性免疫系の受容体により認識される。これらの受容体の会合および骨髄系細胞における関連するシグナル伝達経路の活性化は、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔリンパ球（Ｔｈ１、Ｔｈ２、およびＴｈ１７細胞）の会合を含む、炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−１８、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３）および媒介物質（ロイコトリエン）の産生、ならびに全身部位からの他の骨髄およびリンパ系細胞を動員し、活性化することにより局所炎症環境を悪化させる原位置での毒性種（反応性酸素ラジカル）およびプロテアーゼ（リソソーム酵素）の放出をもたらす。これらの細胞（Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７）における炎症誘発性Ｔヘルパープログラムの持続性および／または抑制性Ｔ制御（Ｔｒｅｇ）応答の欠損は、弱まることのない組織損傷をもたらし、これらの炎症疾患の主な共通の特徴である。
【０００６】
家族性集合および双生児研究は、慢性炎症状態が強い遺伝成分を有することを長年にわたって確立してきた。全ゲノム関連研究（ＧＷＡＳ）は、これらの疾患の遺伝成分が、検出された＞２５０遺伝子座との複合体であり、特に、これらの危険遺伝子座のいくつかは、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬（ＰＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、セリアック病（ＣｅＤ）、および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）において共有され、小さな相加的遺伝作用が組み合わされて、閾値機構により疾患をもたらすことを示した。これらの状態に共通の遺伝的危険性は、ａ）先天性免疫系（ＮＬＲ、ＴＬＲ）および関連するシグナル伝達カスケードのパターン認識受容体（インフラマソーム）、ｂ）抗原プロセシングおよび提示、細胞破壊種の産生（ＲＯＳ、ｉＮＯＳ）および骨髄系細胞（ＩＬ−１８、ＩＬ−１２）による炎症誘発性媒介物質の分泌、ｃ）自己反応性ＴおよびＢ細胞の制御を含む、ＴおよびＢリンパ球成熟（例えばＩＬ−２）、ｄ）クラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣに関連して、認識のためのＴおよびＢ細胞の抗原受容体（ＨＬＡ）、ｅ）炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３）の産生、および免疫応答のＴｈ１、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇ極性化の関連する調節、ｆ）自食作用、ＥＲストレス、およびその他などの遍在的な細胞応答の活性化を含む、免疫経路に見出される。これらの共通の遺伝的変異体によって定義されるタンパク質および経路は、薬物開発および治療介入の優れた候補標的であり得る。しかしながら、遺伝的制御の複雑さは、これらの経路における主要な非重複標的の特定および優先化を困難にする。
【０００７】
炎症応答の開始および／または持続性を可能にするさらなるポリペプチド標的が提供されることが非常に望ましいであろう。これらの標的は、好ましくは、疾患の原因に関わらず、炎症に関与する宿主タンパク質であるべきである。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の目的の１つは、炎症疾患の原因に無関係である、病理学的炎症応答の開始および維持に関与する宿主由来炎症を可能にするポリペプチドを提供するためである。
【０００９】
本発明によると、個体における炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するための薬剤の能力を評価するための方法が提供される。概して、本方法は、（ａ）少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチド（ＩＥＰ）の生物学的活性に関連するパラメータを得るために、薬剤を試薬と混合すること、（ｂ）ステップ（ａ）の試薬のパラメータを測定して、試験レベルを得ること、（ｃ）試験レベルを対照レベルと比較することであって、対照レベルが炎症状態の発症または維持中に観察された少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの生物学的活性に関連する、比較すること、および（ｄ）比較に基づき薬剤を特徴付けることを含む。生物学的活性ＩＥＰは炎症の発症または維持中に増加するため、薬剤は、ＩＥＰの生物学的活性を低減することができる場合、炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するのに有用であると考えられる。代替えとして、薬剤は、ＩＥＰの生物学的活性を低減できない場合（例えば薬剤の存在下で生物学的活性が対照生物学的活性以上である場合）、炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するのに有用ではない（例えば有用性を欠く）と考えられる。ある実施形態では、炎症を可能にするポリペプチドは、ＣＣＤＣ８８Ｂ、ＵＳＰ１５、ＩＲＦ８、ＩＲＦ１、ＩＲＧＭ１、ＴＨＥＭＩＳ、および／またはＦＯＸＮ１のうちの少なくとも１つである。ある実施形態では、試薬は、核酸分子である。別の実施形態では、核酸分子は、少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーターを含み、パラメータは、プロモーターによって駆動される発現の尺度である。代替えとして、核酸分子は、少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドをコードする転写物であってよく、パラメータは、転写物の量の尺度であってよい。他の実施形態では、核酸分子は、発現が炎症を可能にするポリペプチドによって修飾され得る少なくとも１つの遺伝子の転写物であり、パラメータは、転写物の量である。例えば、炎症を可能にするポリペプチドは、ＩＲＦ８であり、発現が炎症関連ポリペプチドによって修飾され得る少なくとも１つの遺伝子は、表１、２、および３に提示される前記遺伝子からなる群から選択され得る。さらに別の実施形態では、試薬は、ポリペプチドであってよい。またさらなる実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドである。そのような実施形態では、パラメータは、少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの量である。代替えとして、パラメータは、少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性である。例えば、少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＦＯＸＮ１、ＩＲＦ８、およびＩＲＦ１からなる群から選択される場合、少なくとも１つの生物学的活性は、転写因子活性であってよい。別の例として、少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＣＣＤＣ８８Ｂである場合、少なくとも１つの生物学的活性は、タンパク質の折り畳みである。さらに別の例では、少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＵＳＰ１５である場合、少なくとも１つの生物学的活性は、脱ユビキチン化活性であってよい。また別の例では、少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＴＨＥＭＩＳである場合、少なくとも１つの生物学的活性は、タンパク質シグナル伝達活性であってよい。別の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの結合パートナーである。例えば、少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドが、ＵＳＰ１５である場合、結合パートナーは、ＵＳＰ１５によって脱ユビキチン化され得るポリペプチドであってよい。別の実施形態では、ポリペプチドは、炎症を可能にするポリペプチドのシグナル伝達経路に関連する。ある実施形態では、ステップ（ｉ）は、インビトロまたはインビボで行われる。また別の実施形態では、ステップ（ｉ）は、例えば、非機能性の炎症を可能にするポリペプチドの少なくとも１つの遺伝子コピーを有する動物などの、非ヒト動物において行われる。また別の実施形態では、ステップ（ｉ）は、ヒトにおいて行われる。
【００１０】
本発明によると、治療および緩和を必要とする個体における炎症状態に関連する症状を治療および／または緩和するための薬剤の能力を評価するための方法が提供される。概して、本方法は、（ａ）炎症を可能にするポリペプチドをコードする遺伝子に対して異型接合性である動物において炎症応答を誘導するための誘発物を投与すること、（ｂ）炎症応答を経験している９例えば炎症状態にある）動物に薬剤を投与すること、（ｃ）動物における炎症応答のパラメータを測定して、試験レベルを提供すること、（ｄ）試験レベルを対照レベルと比較することであって、対照レベルが炎症状態の発症または維持中に観察された炎症を可能にするポリペプチドの生物学的活性に関連する、比較すること、および（ｅ）比較に基づき薬剤を特徴付けることを含む。生物学的活性ＩＥＰは炎症の発症または維持中に増加するため、薬剤は、処置された動物においてＩＥＰの生物学的活性を低減することが示される場合、炎症状態に関連する症状を治療および／または緩和するのに有用であると考えられる。代替えとして、薬剤は、ＩＥＰの生物学的活性が薬剤の存在下で処置された動物の対照レベル以上である場合、炎症状態に関連する症状を治療および／または緩和するのに有用性を欠くと考えられる。ある実施形態では、炎症を可能にするポリペプチドは、ＦＯＸＮ１、ＣＣＤＣ８８Ｂ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ８、ＴＨＥＭＩＳ、ＩＲＧＭ１、またはＵＳＰ１５のうちの少なくとも１つである。また別の実施形態では、誘発物は、感染病原体である。さらに別の実施形態では、パラメータは、生存率である。さらに別の実施形態では、パラメータは、発熱、振戦、嗜眠、後肢麻痺、および昏睡からなる群から選択される神経症状である。またさらに別の実施形態では、パラメータは、免疫細胞数、免疫細胞の種類、サイトカインプロファイル、ケモカインプロファイル、免疫グロブリンプロファイル、浮腫、および血液脳関門の透過性からなる群から選択される炎症関連パラメータである。
【００１１】
本発明によると、個体における炎症状態を予防するための薬剤の能力を評価するための方法が提供される。概して、本方法は、（ａ）炎症を可能にするポリペプチドをコードする遺伝子に対して異型接合性である動物に薬剤を投与すること、続いて（ｂ）薬剤の不在下で動物において炎症応答を誘導することができる誘発物を投与すること、（ｃ）動物における炎症応答のパラメータを測定して、試験レベルを提供すること、（ｄ）試験レベルを対照レベルと比較することであって、対照レベルが炎症状態の発症または維持中に観察された少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの生物学的活性に関連する、比較すること、および（ｅ）比較に基づき個体における薬剤の有用性を特徴付けることを含む。生物学的活性ＩＥＰは炎症の発症または維持中に増加するため、薬剤は、処置された動物においてＩＥＰの生物学的活性を低減することが示される場合、炎症状態を予防するのに有用であると考えられる。代替えとして、薬剤は、ＩＥＰの生物学的活性が薬剤の存在下で処置された動物の対照レベル以上である場合、個体における炎症状態を予防するのに有用性を欠くと考えられる。本明細書に記載される炎症を可能にするポリペプチド、誘発物、またはパラメータに関して本明細書に記載される実施形態は、この方法において使用することもできる。
【００１２】
本発明によると、治療剤が個体における炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するのに有用であるかを判断するための方法が提供される。概して、本方法は、（ａ）治療剤の少なくとも単回量を受けた個体の生物学的試料を提供すること、（ｂ）少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドに関連する試薬のパラメータを測定して、試験レベルを提供すること、（ｃ）試験レベルを対照レベルと比較することであって、対照レベルが炎症状態の発症または維持中に観察された少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの生物学的活性に関連する、比較すること、および（ｄ）比較に基づき治療剤の有用性を特徴付けることを含む。生物学的活性ＩＥＰは炎症の発症または維持中に増加するため、薬剤は、ＩＥＰの生物学的活性を低減することが示される場合、個体における炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するのに有用であると考えられる。代替えとして、薬剤は、ＩＥＰの生物学的活性が薬剤の存在下で対照レベル以上である場合、個体における炎症状態に関連する症状を予防、治療および／または緩和するのに有用性を欠くと考えられる。試薬、パラメータ、生物学的活性、炎症を可能にするポリペプチド、ポリペプチドに関して本明細書に記載される実施形態は、この方法において使用することもできる。さらにさらなる実施形態では、特徴付けは、少なくとも２つの生物学的試料（およびいくつかの実施形態では、それ以上であってよい）、好ましくは２つの異なる時間期間で、時間の機能として、個体における治療剤の有用性を評価するために実施される。
【００１３】
本発明によると、個体における炎症状態の素因またはその存在を判断するための方法が提供される。概して、本方法は、（ａ）個体からの生物学的試料を提供すること、（ｂ）少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドに関連する試薬のパラメータを測定して、試験レベルを提供すること、（ｃ）試験レベルを対照レベルと比較することであって、対照レベルが炎症状態の不在中に観察された少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの生物学的活性に関連する、比較すること、および（ｄ）比較に基づき個体を特徴付けることを含む。試薬、パラメータ、生物学的活性、炎症を可能にするポリペプチド、ポリペプチドに関して本明細書に記載される実施形態は、この方法において使用することもできる。
【００１４】
本発明によると、予防、治療および／または緩和を必要とする個体における炎症状態に関連する症状を予防、治療および／または緩和するための方法が提供される。概して、本方法は、個体における炎症状態に関連する前記症状を防止、治療、および／または緩和するように、炎症を可能にするポリペプチドの少なくとも１つのパラメータを阻害することができる薬剤を投与することを含む。個体における炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するために炎症を可能にするポリペプチドの少なくとも１つのパラメータを阻害することができる薬剤の使用、個体における炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するための製剤を製造するために炎症を可能にするポリペプチドの少なくとも１つのパラメータを阻害することができる薬剤の使用、ならびに個体における炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するために炎症を可能にするポリペプチドの少なくとも１つのパラメータを阻害することができる薬剤も、本明細書において提供される。ある実施形態では、薬剤は、炎症を可能にするポリペプチドの発現を制限することができる核酸分子である。記載される炎症を可能にするポリペプチドに関する実施形態は、これらの治療上の使用に適用される。別の実施形態では、薬剤は、炎症を可能にするポリペプチドの生物学的活性を制限することができる抗体である。また別の実施形態では、炎症状態は、神経炎症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、１型糖尿病、およびセリアック病からなる群から選択される。
【００１５】
本発明によると、炎症を可能にするポリペプチドに関連する様々なツールが提供される。ある実施形態では、単離されたポリペプチドが提供される。単離されたポリペプチドは、炎症を可能にするポリペプチド（ＩＥＰ）の突然変異体である。突然変異体ＩＥＰは、対象において発現される場合、対象の炎症状態の発症および／または維持を予防する能力を有する。上述の異なる種類のＩＥＰに関連する実施形態が、本明細書において適用され得る。ある実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を有する。さらに別の実施形態では、核酸ベクターが提供され、核酸ベクターは突然変異体ＩＥＰをコードする。また別の実施形態では、細胞（または細胞系）が提供される。細胞は、炎症を可能にするポリペプチド（ＩＥＰ）をコードする遺伝子に対して異型接合性であってよい。そのような実施形態では、異型接合性細胞は、ＩＥＰをコードする第１の遺伝子コピーと、ＩＥＰの突然変異体をコードする第２の遺伝子コピーとを有する。代替えとして、細胞は、炎症を可能にするポリペプチド（ＩＥＰ）の突然変異体をコードする遺伝子に対して同型接合性であってよい。細胞は、ある実施形態では、遺伝子導入細胞であってよく、例えば本明細書に記載される核酸ベクターを有し得る。さらに別の実施形態では、動物が提供される。動物は、炎症を可能にするポリペプチド（ＩＥＰ）をコードする遺伝子に対して異型接合性であってよい。そのような実施形態では、異型接合性動物は、ＩＥＰをコードする第１の遺伝子コピーと、ＩＥＰの突然変異体をコードする第２の遺伝子コピーとを有する。別の実施形態では、動物は、炎症を可能にするポリペプチド（ＩＥＰ）の突然変異体をコードする遺伝子に対して同型接合性であってよい。いくつかの実施形態では、動物は、遺伝子導入動物、例えば本明細書に記載される核酸ベクターを有するように操作されたものであってよい。
【００１６】
本明細書を通して、当該技術分野のそれらの明白な定義に従い、様々な用語が使用される。しかしながら、明確性を目的として、いくつかの特定の用語が以下に定義される。
【００１７】
生物学的試料。生物学的試料は、個体の体液、細胞、または組織の試料である。本発明では、生物学的試料は、個体の血液に由来し得る。生物学的試料は、本明細書に記載される様々な方法において前修飾されることなく使用することができる。任意に、生物学的試料は、本明細書に記載されるアッセイ前に処理（機械的、酵素的など）され得る。
【００１８】
異型接合体。接合状態は、個々の生物における遺伝的形質に関する対立遺伝子の類似性を指す。両方の対立遺伝子が同一である場合、個体（同型接合体）は、形質に対して同型接合性であると考えられる。両方の対立遺伝子が異なる場合、個体（異型接合体）は、その形質に対して異型接合性である。１つの対立遺伝子が欠損している場合、個体（半接合体）は、半接合性であると考えられ、両方の対立遺伝子が欠損している場合、個体（無接合体（ｎｕｌｌｉｚｙｇｏｔｅ））は、完全欠損性（ｎｕｌｌｉｚｙｇｏｕｓ）であると考えられる。炎症を可能にするポリペプチドの異型接合体は、機能性炎症を可能にするポリペプチドをコードする第１の対立遺伝子と、非機能性の炎症を可能にするポリペプチドをコードする第２の対立遺伝子とを有する。
【００１９】
炎症および炎症応答。炎症は、有害刺激に対する身体の応答であり、血液から損傷した組織内への血漿および白血球（特に顆粒球）の移動の増加によって達成される。生化学事象のカスケードは、損傷した組織内の局所脈管系、免疫系、および様々な細胞を伴う、炎症応答を伝播し、成熟させる。本明細書で使用される、用語「炎症」および「炎症応答」は、この応答の非病理学的態様を指し、それを経験する個体に有益であるとさえ考えられる場合がある。
【００２０】
炎症状態、炎症疾患、または炎症障害。本明細書で使用される、これらの用語は、集合的に、患っている個体の組織の病理学的細胞破壊をもたらす炎症応答の調節不全を指す。炎症は、急性または慢性のいずれかであってよい。急性炎症状態は、敗血症および脳炎を含むが、これらに限定されない。慢性の炎症状態は、先天性および後天性免疫系の持続的な活性化を含む、いくつかの臨床特徴を共有する。慢性炎症状態は、炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−１８、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３）および媒介物質（ロイコトリエン）の産生、毒性種（反応性酸素ラジカル）およびプロテアーゼ（リソソーム酵素）の放出を含み得る。いくつかの実施形態では、慢性炎症状態は、例えば、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔリンパ球（Ｔｈ１、Ｔｈ２、およびＴｈ１７細胞）など、全身部位から他の骨髄およびリンパ系細胞を動員し、活性化することも含む。これらの細胞（Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７）における炎症誘発性Ｔヘルパープログラムの持続性および／または抑制性Ｔ制御（Ｔｒｅｇ）応答の欠損は、弱まることのない組織損傷をもたらす場合がある。慢性炎症状態は、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬（ＰＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、およびセリアック病（ＣｅＤ）を含むが、これらに限定されない。慢性炎症に関連する他の状態は、慢性閉塞性肺疾患、冠動脈硬化症、糖尿病、代謝Ｘ症候群、癌、および神経変性疾患を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
炎症を可能にするポリペプチド（ＩＥＰ）。本明細書で使用される、この用語は、それらの発現および／またはが限られるか、または阻害されるとき、炎症状態（急性または慢性のいずれか）の発症および／または維持を予防するポリペプチドを指す。これらのポリペプチドは、以下およびＢｏｎｇｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｏｆ  ＥＮＵ−ｍｕｔａｔｅｄ  ａｎｉｍａｌｓ）に記載される遺伝的スクリーニングにより優先的に特定される。これらのポリペプチドは、ＩＲＦ８、ＩＲＦ１、ＩＲＧＭ１、ＣＣＤＣ８８Ｂ、ＴＨＥＭＩＳ、ＦＯＸＮ１、およびＵＳＰ１５からなる群から、より好ましくはＩＲＦ８、ＣＣＤＣ８８Ｂ、ＦＯＸＮ１、およびＵＳＰ１５からなる群から、さらにより好ましくはＣＣＤＣ８８Ｂ、ＦＯＸＮ１、およびＵＳＰ１５からなる群から、最も好ましい実施形態では、ＣＣＤＣ８８ＢおよびＵＳＰ１５からなる群から優先的に選択される。ある実施形態では、ＩＥＰは、ＪＡＫ−３を含まない。以下に示されるように、これらの炎症を可能にするポリペプチドに異型接合性動物を提供することが必要であり得る。そのような異型接合性動物は、機能性ＩＥＰをコードする第１の機能性遺伝子コピーと、非機能性ＩＥＰをコードする第２の遺伝子コピーとを有する。「機能性」ＩＥＰ（野生型ＩＥＰとも称される）は、炎症応答を開始および／または維持するために発現され、その生物学的活性を提供することができるポリペプチドを指す。対照的に、「非機能性」ＩＥＰ（突然変異体ＩＥＰとも称される）は、その対応する遺伝子コピーから発現されない、低レベルで発現される（機能性ＩＥＰと比較したとき）、および／または最終的にはＩＥＰの炎症に関連する生物学的活性の減少（さらには不在）をもたらすそのコード配列に突然変異を有するポリペプチドを指す。
【００２２】
薬学的有効量または治療有効量。これらの発現は、患者に治療利益（例えば炎症状態の症状の予防、治療、および／または緩和）を媒介するのに有効な量（用量）を指す。「薬学的有効量」は、本明細書において、単回量もしくは任意の投薬量のいずれかまたは経路で摂取される、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて摂取される、所望の治療作用を得る量として解釈され得ることも理解する。
【００２３】
薬学的に許容される塩。この表現は、本明細書に記載される治療剤の生物学的効果および性質を維持する従来の酸添加塩または塩基添加塩を指す。それらは、好適な非毒性の有機酸もしくは無機酸、または有機塩基もしくは無機塩基から形成される。見本の酸添加塩は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、および硝酸などの無機酸に由来するもの、ならびにｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸などの有機酸に由来するものを含む。見本の塩基添加塩は、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、および例えば水酸化テトラメチルアンモニウムなどの四級水酸化アンモニウムに由来するものを含む。薬剤の塩への化学修飾は、物理的または化学的安定性、例えば化合物の吸収性、流動性、または可溶性を伴う性質を改善する試みにおいて使用される周知の技術である。
【００２４】
症状の予防、治療、および／または緩和。これらの表現は、炎症状態の発達、進行、および／または総体症状を制限するための方法または薬剤の能力を指す。本表現は、炎症状態に関連する少なくとも１つの症状の予防、治療、および／または緩和を含む。
【００２５】
急性炎症は、脳マラリアおよび／または脳炎において認められ得る。急性炎症は、通常、次の症状を特徴とする：有痛性（痛み）、熱量（熱）、発赤（赤み）、腫瘍（肥大）、および／または無機能（機能の損失）。赤みおよび熱は、炎症部位への中核体温での血流の増加によると考えられ、肥大は、流体の貯留によりもたらされると考えられ、痛みは、神経終末を刺激をする化学物質の放出によると考えられる。慢性炎症は、次の症状を特徴とする：血管拡張；臓器機能不全；発熱をもたらす場合がある急性期タンパク質（例えばＣ反応性タンパク質、血清アミロイドＡ、および血清アミロイドＰ）の存在の増加、血圧の増加、発汗の減少、倦怠感、食欲不振、および／または傾眠；白血球数の調節（例えば  好中球増加、好酸球増加、白血球減少など）；インターロイキン、サイトカイン、ホルモン、または成長因子濃度（例えばＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、ＣＲＰ、インスリン、レプチン）の調節；高血糖；および／または熱。
【００２６】
肉芽種性炎症は、結核、ハンセン病、サルコイドーシス、および梅毒に認められる場合が多い肉芽種の形成を特徴とする。フィブリン性炎症は、血管透過性の大幅な増加をもたらし、フィブリンが血管を通過するのを可能にする。適切な凝固促進性刺激が存在する場合（例えば癌細胞）、フィブリン性浸出物が堆積される。これは、一般的に、フィブリン性浸出物の瘢痕への変換が漿膜間で生じ、その機能を制限することができる漿膜腔に見られる。化膿性炎症は、大量の膿汁（例えば好中球、死細胞、および流体）をもたらす。漿液性炎症は、一般的に漿膜の中皮細胞により産生されるが、血漿に由来し得る非粘稠性漿液の大量の浸出液を特徴とする。潰瘍性炎症は、上皮付近で生じ、下層を露出させる表面からの組織の壊死損失をもたらす場合がある。
【００２７】
誘発物。本明細書で使用される、用語「誘発物」（炎症応答誘発物とも称される）は、個体における炎症応答を誘導および／または維持することができる薬剤を指す。いくつかの実施形態では、「誘発物」は、個体における炎症状態の発症さえもたらすことができる。誘発物は、細菌感染、細菌由来成分（細菌またはそれに由来する成分など）、ウイルス感染、ウイルス由来成分、外来性抗原、および自己抗原を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、誘発物は、Ｐ．ベルゲイである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
よって、本発明の性質を概して説明してきたが、ここで、添付の図面が参照され、図示の目的でその好ましい実施形態を示す。
【図１】Ｐ．ベルゲイで抗原投与したときの様々なマウスの生存率パーセントを図示する。Ｊａｋ３＋／−マウスは、Ｊａｋ３遺伝子の正常なコピー１つと、内部欠失を保有する遺伝子の非機能性コピー１つの異型接合体である。Ｊａｋ３Ｗ８１Ｒ／＋マウスは、Ｊａｋ３遺伝子の正常なコピー１つと、Ｗ８１Ｒ変異体を有するタンパク質をコードする遺伝子の非機能性コピー１つの異型接合体である。Ｂ６マウスは、Ｊａｋ３遺伝子の同型接合体であり、２つの遺伝子の機能性コピーを有する。Ｊａｋ−／−マウスは、内部欠失を保有する遺伝子の非機能性コピーの同型接合体である。ＪａｋＷ８１Ｒマウスは、Ｊａｋ３遺伝子の同型接合体であり、両方の遺伝子コピーは、非機能性突然変異を有する。「処置された」は、Ｊａｋ３キナーゼ阻害剤（タソシチニブ）を受けた動物を指す。「未処置」は、Ｊａｋ３キナーゼ阻害剤を受けなかった動物を指す。
【図２−１】ＣＣＤＣ８８Ｂの発現を図示する。（Ａ）ｑＰＣＲは、成体マウスのマウス臓器のパネルにわたってＣｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡ発現を調査するために実施された。結果は、臓器の機能における相対発現として示される（ハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔに対する比率として）。（Ｂ）ｑＰＣＲは、成体マウスのマウス細胞のパネルにわたってＣｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡ発現を調査するために実施された。結果は、細胞型の機能における相対発現発現として示される（ハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔに対する比率として）。（Ｃ）野生型動物（灰色の棒）および半接合体動物（Ｃｃｄｃ８８ｂ＋／−、白色の棒）の脾臓細胞の免疫表現型。結果は、細胞型当たりの脾臓細胞（×１０６）の数として示される。（Ｄ）ｑＰＣＲは、ヒト星状細胞、小膠細胞、または血液脳関門内皮細胞におけるＣｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡ発現を調査するために実施された。星状細胞に関しては、刺激されないままか、またはＩＦＮγおよびＴＮＦα（Ｄ１）もしくはＩＦＮγおよびＩＬ１ｂ（Ｄ２）で刺激されるかのいずれか、小膠細胞に関しては、刺激されないままか、またはＩＦＮγおよびＬＰＳ（Ｄ３）で刺激されるかのいずれか、ＢＢＢ内皮細胞に関しては、刺激されないままか、またはＩＦＮγ、ＴＮＦα、もしくはＩＦＮγおよびＴＮＦα（Ｄ４）で刺激されるかのいずれかの相対的Ｃｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡ発現レベルが提供される。
【図２−２】ＣＣＤＣ８８Ｂの発現を図示する。（Ａ）ｑＰＣＲは、成体マウスのマウス臓器のパネルにわたってＣｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡ発現を調査するために実施された。結果は、臓器の機能における相対発現として示される（ハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔに対する比率として）。（Ｂ）ｑＰＣＲは、成体マウスのマウス細胞のパネルにわたってＣｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡ発現を調査するために実施された。結果は、細胞型の機能における相対発現発現として示される（ハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔに対する比率として）。（Ｃ）野生型動物（灰色の棒）および半接合体動物（Ｃｃｄｃ８８ｂ＋／−、白色の棒）の脾臓細胞の免疫表現型。結果は、細胞型当たりの脾臓細胞（×１０６）の数として示される。（Ｄ）ｑＰＣＲは、ヒト星状細胞、小膠細胞、または血液脳関門内皮細胞におけるＣｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡ発現を調査するために実施された。星状細胞に関しては、刺激されないままか、またはＩＦＮγおよびＴＮＦα（Ｄ１）もしくはＩＦＮγおよびＩＬ１ｂ（Ｄ２）で刺激されるかのいずれか、小膠細胞に関しては、刺激されないままか、またはＩＦＮγおよびＬＰＳ（Ｄ３）で刺激されるかのいずれか、ＢＢＢ内皮細胞に関しては、刺激されないままか、またはＩＦＮγ、ＴＮＦα、もしくはＩＦＮγおよびＴＮＦα（Ｄ４）で刺激されるかのいずれかの相対的Ｃｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡ発現レベルが提供される。
【図３】ＢＸＨ２マウスは、Ｐ．ベルゲイ感染後、脳マラリアに耐性であることを図示する。（Ａ）ＢＸＨ２マウス、異型接合性（ＢＸＨ２×Ｂ６）Ｆ１の子孫、ならびに感受性Ｂ６およびＣ３Ｈ親対照の生存曲線。全ての曲線は、統計的に相互に異なる。（Ｂ）非感染および感染Ｂ６（白色の棒）およびＢＸＨ２（灰色の棒）マウスからの灌流脳におけるエバンズブルー色素蓄積の定量化。データは、状態当たり３匹のマウスから平均化された。（Ｃ）異なる時間点（感染７日後もしくはｄ７、感染１６日後もしくはｄ１６のいずれか）での非感染および感染のＢ６およびＢＸＨ２マウスからの代表的なエバンズブルー染色された脳の質的比較。これは、感染Ｂ６（ｄ７  ＰｂＡ）マウスにおいて血液脳関門の破壊を明確に示すが、ＢＸＨ２（ｄ７  ＰｂＡまたはｄ１６  ＰｂＡ）マウスでは示されない。（Ｄ）感受性Ｂ６およびＣ３Ｈ親対照、ＢＸＨ２マウス、ならびに異型接合性（ＢＸＨ２×Ｂ６）Ｆ１子孫のＰ．ベルゲイによる感染後の血液寄生虫血レベル（寄生虫血のパーセンテージ）。
【図４】ＣＭ感受性親対照と比較して、ＢＸＨ２マウスが弱まった血清サイトカインおよびケモカイン応答を有することを図示する。Ｐ．ベルゲイ感染マウスからの血清は、多重ＥＬＩＳＡ（ｎ＝５マウス／株）を介して評価され、平均サイトカインレベルが決定された。（Ａ）ＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍＬ；＊＝ｐ＝０．０７）（Ｂ）ＩＬ−１０（ｐｇ／ｍＬ）、（Ｃ）ＭＩＰ−１β（ｐｇ／ｍＬ）、（Ｄ）ＣＣＬ２（ｐｇ／ｍＬ）、（Ｅ）ＴＮＦ−α（ｐｇ／ｍＬ；＊＝ｐ＜０．００１）、および（Ｆ）ＲＡＮＴＥＳ（ｐｇ／ｍＬ）のレベルは、マウスの種類（感受性Ｂ６およびＣ３Ｈ親対照ならびにＢＸＨ２マウス）の機能において提供される。
【図５】Ｂ６およびＢＸＨ２の脳の転写プロファイリングが遺伝子発現において株および感染特異的差異を見せることを示す。（Ａ）株および感染による非監視主成分分析クラスター試料。Ｂ６マウス（ｄ０＝○；ｄ７＝●）およびＢＸＨ２マウス（ｄ０＝Δ；ｄ７＝▲）の成分１（３９．４％）の機能における成分２（２４．２％）に関して結果が示される。（Ｂ）感染と非感染のＢ６およびＢＸＨ２転写プロファイルとの間のペアワイズ比較によって生成された遺伝子リストの交差。（Ｃ）各株（ｄ７／ｄ０）における感染誘導された倍率変化として図示される株および感染両方の特異的様式（２因子ＡＮＯＶＡ、ｐａｄｊ−相互作用＜０．０５）で制御される転写物のユークリッドクラスターヒートマップ。各列は、独特の遺伝子を表し、遺伝子の２つ以上の転写プローブが有意である場合、平均倍率変化が使用される。差次的発現パターンは、３つの群に分けられ、群１の遺伝子は両方の株において感染により上方制御され、群２の遺伝子はＢ６マウスにおいて感染により、およびＢＸＨ２において非応答により上方制御され、群３の遺伝子は、典型的にはＢＸＨ２よりＢ６において、感染により下方制御された。詳細は表１を参照。影付きのヒートマップは、遺伝子転写発症部位の２０ｋｂ以内に１つ以上の直接ＩＲＦ８結合部位の存在を示す。（Ｄ）Ｂ６マウスにおいてＣＭ病態中に感染により差次的に制御された転写物の遺伝子オントロジー。上方制御された遺伝子は、主として先天性および適応性免疫過程に関与する一方、下方制御遺伝子は、明確なメッセージを形成しないが、様々な恒常性の生物学的および代謝的過程を含む。
【図６−１】Ｂ６マウスにおいて、ＣＭ病態中に上方制御された遺伝子がクロマチン免疫沈降およびＤＮＡ配列決定（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ）によって画定されるＩＲＦ８結合部位に関して大幅に富化されることを図示する。（Ａ）ＩＲＦ８（例えばＴｌｒ４、Ｈ２−Ｑ４、Ｔｌｒ９、Ｃｄ７４、およびＳｏｃｓ１）の既知の結合標的は、定量的なＲＴ−ＰＣＲによるＣｈＩＰの正常終了を確認するために使用された。これらの標的は、対照のＩｇＧ調製物と比較したとき、ＩＲＦ８免疫沈降したＤＮＡにおいて高度に富化された。ｎ＝５の実験に関する代表的なデータが示される。（Ｂ）ＣｈＩＰ−Ｓｅｑピークは、マウス参照ゲノムに沿って整列された。水色（上）線は、非特異的（ＩｇＧ）結合部位を示し、暗青色（下）線は、直接ＩＲＦ８結合部位を表す。遺伝子は、ピークが転写開始部位の２０ｋｂ以内に見られる場合、ＩＲＦ８結合部位を有すると考えられた。（Ｃ）Ｂ６マウス（ｄ７／ｄ０ペアワイズ）において感染により制御された遺伝子のリストは、転写開始部位の２０ｋｂ以内のＩＲＦ８結合部位に関して問い合わせられた。感染に応答して上方制御された転写物は、ＩＲＦ８結合部位に関して大幅に富化された一方、下方制御された転写物は、富化を示さなかった。
【図６−２】Ｂ６マウスにおいて、ＣＭ病態中に上方制御された遺伝子がクロマチン免疫沈降およびＤＮＡ配列決定（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ）によって画定されるＩＲＦ８結合部位に関して大幅に富化されることを図示する。（Ａ）ＩＲＦ８（例えばＴｌｒ４、Ｈ２−Ｑ４、Ｔｌｒ９、Ｃｄ７４、およびＳｏｃｓ１）の既知の結合標的は、定量的なＲＴ−ＰＣＲによるＣｈＩＰの正常終了を確認するために使用された。これらの標的は、対照のＩｇＧ調製物と比較したとき、ＩＲＦ８免疫沈降したＤＮＡにおいて高度に富化された。ｎ＝５の実験に関する代表的なデータが示される。（Ｂ）ＣｈＩＰ−Ｓｅｑピークは、マウス参照ゲノムに沿って整列された。水色（上）線は、非特異的（ＩｇＧ）結合部位を示し、暗青色（下）線は、直接ＩＲＦ８結合部位を表す。遺伝子は、ピークが転写開始部位の２０ｋｂ以内に見られる場合、ＩＲＦ８結合部位を有すると考えられた。（Ｃ）Ｂ６マウス（ｄ７／ｄ０ペアワイズ）において感染により制御された遺伝子のリストは、転写開始部位の２０ｋｂ以内のＩＲＦ８結合部位に関して問い合わせられた。感染に応答して上方制御された転写物は、ＩＲＦ８結合部位に関して大幅に富化された一方、下方制御された転写物は、富化を示さなかった。
【図７】１０６  Ｐ．ベルゲイ寄生虫で感染させた標的遺伝子ノックアウトマウスの生存曲線を図示する。ｉ．ｐ．脳マラリア感受性マウスは、感染後ｄ５〜ｄ１０の間に神経症状で死亡した一方、１３日より長く生存したマウスは、ＣＭ症状を全く発達せず、耐性と分類された。感染特異的Ｂ６およびＢＸＨ２対照は、各ノックアウト株と一緒にプロットされる。結果は、（Ａ）ＩＦＮ−γ、（Ｂ）ＳＴＡＴ１、（Ｃ）ＪＡＫ３、（Ｄ）ＩＲＦ１、（Ｅ）ＩＲＧＭ１、（Ｆ）ＩＬ１２ｐ４０、（Ｇ）ＩＦＩＴ１、（Ｈ）ＩＳＧ１５、および（Ｉ）ＮＬＲＣ４のノックアウトに関する感染後日数の機能における生存のパーセンテージとして示される。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明によると、本明細書において、病理学的炎症応答の誘導および／または持続を可能にすることが示される宿主ポリペプチド（標的とも称される）が提供される。これらのポリペプチドは、疾患の原因に関わらず、任意の病理学的炎症応答に関与すると考えられる。本明細書にも示されるように、これらのポリペプチドの生物学的活性の減少は、炎症状態に関連する症状の治療、予防、および／または緩和に有用であることが示される。
【００３０】
乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、狼瘡、セリアック病、およびＩＢＤなどの一般的な炎症疾患は、共通経路および関連するシグナル伝達ネットワークの脱制御を示す。したがって、病原に関連するそのような共有された経路と干渉する薬理学的調節剤は、いくつかの炎症疾患に関して臨床的に有益なものであり得る。大規模な遺伝的研究は、これらの疾患の遺伝的成分が多種多様であり、高度に複雑であり、重要なことに、それらは同じ遺伝的に危険な対立遺伝子のいくつかを共有することを示す。これは、１つの炎症状態に役割を果たすと見出された遺伝子が、関連する炎症状態の病態生理をより良く理解するために有益であることを示す場合があり、これらの障害における薬物の発見に関して有益な標的を表す可能性があることを示唆する。実験モデルにおける研究は、正常および異常な炎症応答の根底にある主な細胞型、生理学的応答、および関連する経路、ならびに可溶性媒介物質がマウスにおいて保存されることを確立した。加えて、マウスにおける生殖系列修飾は、引き起こした環境刺激を注意深く制御しながら、個々の遺伝子およびタンパク質の病理学的炎症への寄与を独立して研究するための理想的なモデルを提供する。
【００３１】
これらの研究結果を基にマウスにおけるランダム突然変異が提案され、続いて、急性神経炎症に対する耐性についての得られた突然変異体のスクリーニングは、ａ）炎症疾患のスペクトルにおいて重大な役割を果たす、およびｂ）薬物の発見および炎症状態における薬理学的介入の新規標的を構成する機能的に確認された因子を特定するための系統的なアプローチを提供する。以下に提供されるように、そのような戦略は、Ｊａｋ３（ＲＡにおいて既知の薬理学的標的）およびＴｈｅｍｉｓ（ＳＬＥおよびセリアック病において既知の遺伝的危険因子）の特定をもたらし、この遺伝的アプローチの頑強性および能力の確証的な原理証明を提供する。よって、このアプローチは、ＧＷＡＳ由来の情報に不在の消失した機能性リンク、ならびに病理学的阻害が臨床的価値があるように炎症応答を十分に鈍らせるインビボ確認された前臨床系を提供する。
【００３２】
ＩＢＤは、北米において約１４０万人、欧州において２２０万人の個体に影響を及ぼす。１９４０年代以来、ＩＢＤの発生率は、より欧米化した生活様式の国において劇的に増加し、生活様式、衛生、食事および構成物質の使用を含む環境因子の影響を示唆し、それらの全ては、疾患の発症および／または進行に有利である微生物叢を変更する可能性がある。根拠の大半も、ＩＢＤの原因において遺伝的因子を指摘し、１００を超える遺伝子座がＧＷＡＳにおいて特定されている。しかしながら、これらの遺伝子座は、推定されるＩＢＤの遺伝的危険性の２０％しか占めない。さらに、ＧＷＡＳによって特定された遺伝子座は、炎症、上皮性関門機能、先天性および適応性免疫、自食作用、ＥＲストレス、およびその他に関係がある特定の経路を指摘するが、現在、疾患に対するこれらの遺伝子座のそれぞれの非重複インビボ寄与を評価する機能的研究に欠けるため、これらの研究から新薬の開発につながるような分子／経路の候補を合理的に選択することが不可能である。プラスモディウム・ベルゲイ感染により誘導された神経炎症モデルは、炎症性骨髄およびリンパ系細胞の感染部位への動員、ＩＬ１２、ＴＮＦα、ＩＦＮγの分泌、および急速かつ致死性の脳炎をもたらす後続の内皮細胞の完全性の破壊を含む、炎症状態に共通するいくつかの特徴を持つため、選択された。さらに、以下に示されるように、炎症におけるその役割が前に疑われていなかったいくつかの遺伝子は、新しい新薬の開発につながるような標的の発見の立証された可能性を確立した。
【００３３】
遺伝的スクリーニングおよび推定炎症を可能にする標的の特徴付け
【００３４】
アルキル化剤Ｎ−エチルＮ−ニトロソ尿素による突然変異は、マウスゲノムにおいて、ランダムな単一点突然変異を作製するのに効率的な方法である。一連の確認された状態は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウス株をうまく突然変異させるために開発された（Ｂｏｎｇｆｅｎら）。簡潔に、創始Ｂ６雄マウス（Ｇ０と特定される）は、３週間の間、９０ｍｇ／ＫｇのＥＮＵの腹腔内注射を毎週１回受ける。効率的に突然変異された雄（Ｇ０）は、一過性に繁殖性を失い、これは１１週後に回復する。次に、突然変異されたＧ０雄は、野生型のＢ６雌マウスと交配され、世代１（Ｇ１）子孫を産生する。これらのＦ１ハイブリッドは、突然変異した完全な染色体一式と完全な野生型Ｂ６染色体一式とを保有する。１Ｍｂ当たり１ヌクレオチドの平均置換率に基づき、各Ｇ１は、異型接合性状態において、約３０００のヌクレオチド変異体を保有すると予想される。７００匹のＧ１マウスの１遺伝子座当たりの機能減少突然変異の平均頻度を用いて可視遺伝子座について決定し、各Ｇ１マウスは、約４０〜５０の機能性変異体に対して異型接合性キャリアである可能性がある。個々のＧ１雄は、最初にＧ１雄を野生型Ｂ６雌と交配し（Ｇ２子孫を産生するため）、次いで、次のＧ２娘のうちの２匹をそれらのＧ１父に戻し交配することによって、ＥＮＵ配列変異体を（Ｇ０雄から）同型接合性にすることを目的とする別個のＢ６系統の創始として繁殖させる。Ｇ１に存在する配列変異体の５０％は、各Ｇ２娘に受け継がれ、それらのうちの２５％パーセント（合計の１２．５％）は、任意の１匹のＮ３子孫において同型接合性になると予想される。全体的に、各Ｇ３子孫は、よって、推定される３７５の配列変異体および４つの機能性変異体に対して同型接合性であると予想される。これらのＮ３系統の系統的な表現型キャンペーン中、同じＧ１祖父から連続したＧ３系統で不調和もしくは「表現型異常」形質（例えば致死性神経炎症耐性）を保有する個体の一貫した出現（約２５％の頻度で）は、刺激に対する応答を修飾する完全浸透性劣性突然変異の分離を示す。よって、系列当たり最低２４〜３２匹のＮ３子孫（６同腹仔）をスクリーニングすることにより、同じ表現型異常の形質を有する６〜８匹の個体のクラスターを特定することが予想できる。
【００３５】
プラスモディウム・ベルゲイＡＮＫＡ（ＰｂＡ）は、急性神経炎症および急速に致命的となる脳炎を特徴とする状態である脳マラリアを誘導する。それは、血液脳関門（ＢＢＢ）でのＰｂＡ−寄生赤血球の捕捉、炎症細胞の浸潤およびＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ１０、ＭＣＰ−１の産生、ＢＢＢでの内皮完全性の損失、ならびに感染後５日までに現れ、９〜１１日までに最終的には致命的である不可逆性神経症状の正確な発症によりもたらされる。感染性Ｐ．ベルゲイＡＮＫＡ（ＰｂＡ）分離株を、Ｍａｌａｒｉａ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＭＲ４）から入手し、寄生赤血球（ｐＲＢＣｓ）の貯蔵物を調製し、−８０℃で凍結保存した。感染前、寄生虫を静脈内的に継代し、血液を希釈して、大量の接種材料を調製し（１０７ｐＲＢＣ／ｍＬで滴定）、１００〜１５０匹のＧ３マウス群を感染させた（１０６ｐＲＢＣ、ｉ．ｖ）。感染ｄ３後に開始して、振え、振戦、ねこ背、触覚に対する応答の欠如に及ぶ可能性があり、麻痺および昏睡に進行する可能性がある神経症状の現れに関して、動物を数回監視した。そのような症状を見たら直ちに（通常５〜７日目までに）マウスを安楽死させ、ゲノムＤＮＡを単離することにより、組織試料を採取した。感染ｄ１２後に生存しているマウスは神経炎症に耐性であると印され、対応するＧ３系統は表現型異常と印される。同じＧ１創始からのさらなるＧ３系統は、次いで、保護的形質の安定した分離を確認し、最低２４〜３２匹のＧ３子孫（同じＧ２雌からの６同腹仔）の間でその伝播頻度（陽性系統において約２５％のＧ３個体と予想される）を確立するために表現型化される。脳期を生存する耐性動物は、血液寄生虫血について試験され（増殖性感染を確認するため）、次いで、突然変異体系のさらなる伝播のために生存動物において保護的突然変異を保存するために、薬物治癒される（アルテミシン、ｓ．ｃ．、１５０ｍｇ／ｋｇ、１週間に３回、３週間）。
【００３６】
同じ表現型異常系列からの３匹のＧ３マウスの全てのエクソンおよびエクソン−イントロン境界の配列（エクソーム配列決定）は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｌｌ  Ｅｘｏｎ（商標）システムを用いて決定される。このシステムは、合計４９．６Ｍｂの捕捉したゲノムＤＮＡに関して２４，３０６の注釈が付けられたマウス遺伝子（参照Ｃ５７ＢＬ／６ＪゲノムからのＵＣＳＣ  ｍｍ９／ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  ３７を用いて注釈が付けられた）内の＞２２１，７８４のエクソンを捕捉するライブラリを効率的に構築するために入れ子オリゴヌクレオチドプライマーを使用する。次いで、捕捉したエクソンは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（商標）配列決定プラットホームを用いた大規模配列決定（ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を受けた。これらの２つの成分は、効率的かつ信頼のある全ゲノム包括度（ｃｏｖｅｒａｇｅ）、およびＥＮＵ突然変異の検出用に最適化された：１８０〜２００ヌクレオチドの平均リード長の２００〜３００×１０６配列リードは、ゲノムの＞９０％について２０Ｘ包括度、そして＞９５％について１０Ｘ包括度を提供するのに十分である。自由に利用可能なツールである、ＢＷＡ、ＳＡＭツール、Ｐｉｃａｒｄ、およびＧＡＴＫに基づくリードアライメントおよび変異体呼び出しパイプライン（ｖａｒｉａｎｔ−ｃａｌｌｉｎｇ  ｐｉｐｅｌｉｎｅ）が実装された。このリストは、ＩＧＶ  ｖｉｅｗｅｒ（商標）ソフトウェアパッケージ（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＭＩＴ）を用いて重複するリードを排除し、配列決定エラー（ＳＮＰに対する参照対立遺伝子の比率＜５０％、複数の対立遺伝子系、エンド配列）を印し、他の非ＥＮＵの無関係な変異体（他のエクソームファイルにおいて以前見られた）またはアミノ酸配列に影響を及ぼさないサイレント変異体を特定するために精選される。３匹のＧ３マウスからのＳＮＰリストは、３匹のマウス（同型接合体または異型接合体）の状態に共通する変異体を特定するために比較される。
【００３７】
ＥＮＵ変異体（複数可）の原因性質は、同じＧ１祖父から２０匹のさらなるＧ３マウスの遺伝子型を特定し、ＥＮＵ特異的変異体（複数可）に対して同型接合性の同時分離を探すことにより確認され、「感受性」マウスにおいて逆の状態を確認する一方で、「耐性」マウスにおける野生型対立遺伝子に対する同型接合性を除外する。次いで、保護的変異体における機能の損失の原因が検査される。ＲＮＡプロセシング／スプライシングに影響を及ぼす可能性がある主要ドナーまたはアクセプタースプライス部位におけるポリペプチドの早期終結またはイントロン突然変異のいずれかをもたらすミスセンス変異体は、明らかな機能の損失を容易に特定するが、非同義変異体は、置換（非保存的＞保存的）の種類および種間の保存を示す残基（ＢＬＡＳＴまたはＢＬＯＳＳＯＭ検索）に関して優先され得る。同じ遺伝子のＥＮＵ変異体およびヌル対立遺伝子のＦ１マウス２重異型接合体における遺伝的相補性（Ｐ．ベルゲイに対する保護の反復発生を探す）は、最終的な妥当性確認試験として使用することができる。そのようなヌル突然変異体は、独立研究機関または公共の供給元（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から生存動物として入手することができるか、または国際遺伝子トラップ  コンソーシアム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｐ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）（ｗｗｗ．ｉｇｔｃ．ｏｒｇ．ｕｋ）から遺伝子トラップとして入手することができる。十分に注釈が付けられなかったタンパク質の機能的役割へのさらなる見解を得るために、インビボ炎症応答に関連する臓器（胸腺、脾臓、骨髄、血中白血球）および細胞（骨髄、リンパ系、上皮）における半定量的逆転写酵素結合増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）により、それらのＲＮＡの発現を実施することができる。これらの遺伝子のプロモーター領域は、「炎症誘発性」経路を制御することが知られている転写因子（ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＩＲＦ１、およびＩＲＦ８など）による制御に関連する配列要素の存在に関して研究され得る。最後に、優先順位を付けたＥＮＵ変異体に対して同型接合体の突然変異体マウス系は、下流の特徴付けのために十分な数のマウスを生成するために伸長される。
【００３８】
突然変異体の表現型異常系統は、それらの中枢および末梢免疫系の完全性、組成、および活性化状態を決定するために、合理化および層別化免疫表現型分析を受ける。具体的には、高処理多変量フローサイトメトリー分析において、集団特異的細胞表面マーカーおよび細胞内サイトカイン染色を用いて、中枢および末梢免疫臓器（骨髄、胸腺、脾臓、リンパ節、および末梢血）ならびに腸における、異なる免疫細胞集団を列挙した（造血性（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｉｔｉｃ）幹細胞［ＨＳＣ］、顆粒球、骨髄系細胞、ＮＫ細胞、ＴおよびＢリンパ球）。次の抗体カクテルを使用することができる：Ｔ細胞（抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、ＴＣＲＶβ、γδＴＣＲ）、Ｂ細胞（抗Ｂ２２０、ＣＤ２２、ＣＤ１３８、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＣＤ２４）、ＨＳＣ（抗ＣＤ１１７、Ｓｃａ−１）、赤血球細胞（抗Ｔｅｒ１１９）、顆粒球（抗Ｇｒ−１）、ＮＫ細胞（抗ＮＫ１．１）、マクロファージ、ＤＣ、炎症性単球（抗ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０）、および好酸球、マスト細胞、好塩基球（抗ＳｉｇｌｅｃＦ、ＣＤ１１７、ＦｃＥＲＩ）。免疫細胞機能は、エクスビボおよびインビボの両方で異なる免疫応答を分析することにより調べられる。
【００３９】
遺伝子スクリーニングは、決定的な原理証明を提供し、これらの結論を支持する：ａ）ＥＮＵスクリーニングは、急性神経炎症を鈍らせる突然変異（および最終的に遺伝子）を特定するための頑強かつ効果的なプラットホームである、ｂ）今までに検出された突然変異のいくつかは、炎症応答に重要であることが既に知られている遺伝子にある（例えばＪＡＫ３）、および／またはｃ）今までに検出された他の突然変異は、マウスの急性炎症スクリーンニングにおいて発見された遺伝子がヒト炎症状態の他の種類に関することを示すヒト慢性炎症疾患の遺伝的原因に重要であることが既に知られている遺伝子（例えばＴＨＥＭＩＳ、ＩＲＦ８）にある、ｄ）同様に、スクリーニングにおける遺伝的突然変異の神経炎症保護作用（例えばＪＡＫ３）は、慢性ヒト炎症疾患の臨床使用の化合物による対応する標的の薬理学的阻害により摸倣され得る（実施例Ｉを参照）、ｅ）急性神経炎症モデルは、新規抗炎症薬物候補の迅速かつ効果的な前臨床評価のためのインビボでの一次スクリーニングとして使用され得る、ｆ）未知の機能を有する新規遺伝子／タンパク質も特定され、抗炎症薬物を発見する新しい機会を表す、ｇ）スクリーニングは、非常に敏感であり、突然変異が神経炎症に部分的に耐性を示すため、遺伝子−投薬量依存経路を検出することができ、スクリーニングがインビボでの部分的阻害が臨床的価値のものであり得る標的を検出できることを示唆する。本明細書に提示される遺伝子スクリーニングは、宿主に由来する炎症を可能にするポリペプチドを提供するため、有利でもある。
【００４０】
炎症における未知の遺伝子／タンパク質、または未知の機能を有するタンパク質の遺伝子スクリーニングの標的をさらに特徴付けするために、異なる細胞集団は、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）システム、または必要であれば、より正確な細胞選別戦略（例えばＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標））を使用して選別することができ、ＰＲＲ作動薬（ＬＰＳ、ＰＧＮ、ＣｐＧ、ポリＩ：Ｃ、ＭＤＰ、ＤＡＰ、Ｂ−ＤＮＡ）、組換えサイトカイン、またはマイトジェン（ＩＬ−２、ＩＬ−７、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、ＰＭＡ＋イオノマイシン）を含む適切な誘発物を用いて、インビトロで抗原投与することができる。細胞に基づくアッセイは、細胞生存（アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム染色により、およびＦＡＣＳによる列挙）、増殖（ＦＡＣＳによるＣＦＳＥ染色の希釈に従うことにより）、および活性化（ＩＦＮγ［Ｔｈ１］、ＩＬ−１７［Ｔｈ１７］、ＩＬ−４［Ｔｈ２］、ＦｏｘＰ３［Ｔｒｅｇ］の細胞内染色、およびＭＨＣクラスＩＩおよび共刺激分子ＣＤ８０／ＣＤ８６［ＤＣ］の細胞表面染色）を監視するために行うことができる。これらのアッセイは、調査中の顆粒球、骨髄、およびリンパ系細胞の活性化、生存、および遊走能を決定するために、インビボ抗原投与および免疫化実験することで補完することができる。異なる血清サイトカイン、ケモカイン、および免疫グロブリンのための免疫組織化学、ビーズに基づくイムノアッセイ（ＢｉｏＰｌｅｘ）、およびＥＬＩＳＡアッセイは、インビボ先天性および適応性（細胞および体液）免疫応答を評価するために使用され得る。マウスは、腹腔内的（ＩＰ）にＰＡＭＰ／ＤＡＭＰ（例えばＬＰＳ、ＰＧＮ、ＭＳＵ、Ａｌｕｍ）を注射することができ、フローサイトメトリーは、顆粒球および骨髄系細胞を腹膜腔内に浸潤する頻度および数を定量化するために使用される（Ｇｒ−１＋、ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋、ＳｉｇｌｅｃＦ＋、ＦｃＥＲＩ＋）。腹膜灌流および血清中のサイトカインおよびケモカインは、ＢｉｏＰｌｅｘおよびＥＬＩＳＡアッセイにより定量化され得る。古典的な免疫化実験は、完全または不完全フロイントアジュバントにおけるＤＮＰ−ＦｉｃｏｌｌまたはＤＮＰ−ＫＬＨのＩＰ注射による動物の免疫化、続いて２８日目に抗原性再免疫試験／追加免疫を伴うことができる。異なる免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ／２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ）およびサイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７）の産生は、ＢｉｏＰｌｅｘおよびＥＬＩＳＡにより定量化され得る。後天性細胞免疫応答は、遅延型過敏アッセイ（ＴＮＢＳによる腹腔内免疫化および足蹠における再免疫試験ならびに読取として足蹠肥大の測定）において調べることができる。
【００４１】
炎症応答に対する突然変異の影響のより詳細な分析は、炎症耐性と炎症感受性マウスを区別する関連のある免疫細胞型において、転写シグネチャー（ＲＮＡｓｅｑ（商標）を使用）を特定することにより行うことができる。この総合的分析は、特定された標的が炎症応答に影響を及ぼす免疫機構（複数可）を定義するだけでなく、病理学的炎症に関与する細胞型および経路の総合的な見解も提供し、免疫細胞機能および炎症疾患の生理病理学に対して同等の結果を有する特定された遺伝子／タンパク質の上流または下流のいずれかで機能するさらなる薬物標的を提供する場合がある。
【００４２】
前に特定された神経炎症保護突然変異の妥当性は、ＩＢＤの動物モデルなどの他の炎症状態において評価することができる。ＩＢＤの実験動物モデルは、この問題の態様を個々に繰り返し、腸恒常性に必要とされる経路、細胞、および分子の役割に関する重要な見解を提供した。これは、ＩＢＤにおけるＩＬ−２３−Ｔｈ１７細胞経路の役割に関する際立って収斂したマウスおよびヒト研究により最適に図示される。ＩＬ−２３ｐ１９は、マウスにおいて最初にクローン化され、複数のモデルにおいて大腸炎が発症するのに必要とされることが示された。ＩＬ−２３の中和は、１つのモデルにおいて活性大腸炎を完全に反転させ、これは、ＩＢＤにおいて保護的である優性ＩＬ２３Ｒ  ＳＮＰがＩＬ−２３の可溶性受容体拮抗物質をもたらす遺伝子の別のスプライシングをコードすることを示すデータと一致する。同様に、Ｎｌｒｐ３インフラマソーム−ＩＬ−１８系は、大腸炎からの保護と関連し、これは、ＩＢＤの危険対立遺伝子としてのＮＬＲＰ３およびＩＬ−１８受容体補助タンパク質（ＩＬ１８ＲＡＰ）におけるＳＮＰを特定するヒト遺伝子研究と一致する。一次スクリーニングにおいて特定された突然変異体マウスの応答は、それぞれが免疫応答の特定の態様を調べる腸の急性および慢性炎症のいくつかの補助モデルにおいて検査することができる。そのようなモデルは、先天性免疫機構を探索するための急性および慢性デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導損傷／大腸炎モデル、Ｔｈ１／Ｔｈ１７機構ならびに調節解除Ｔｒｅｇ機能を探索するためのＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢＨｉＴ細胞転移大腸炎モデル、上皮および先天性免疫抗菌防御機構を探索するためにＴｈ２機構およびＣ・ローデンチウムによる感染を検査するためのオキサゾロン大腸炎モデルを含むが、これらに限定されない。体重減少、陰窩構築を評価するための結腸組織診断、杯細胞の損失、表面上皮のびらん、炎症細胞および浮腫の浸潤、結腸組織および血清中の様々な抗菌ペプチド（デフェンシンを含む）、ケモカイン、およびサイトカインの発現を測定するための定量的リアルタイムＰＣＲおよびＢｉｏＰｌｅｘ／ＥＬＩＳＡアッセイ、結腸および全身部位（腸間膜リンパ節および脾臓）への細菌侵入の程度を決定するための１６Ｓ  ｒＲＮＡのｑＰＣＲ、ならびに大腸炎性腸における免疫細胞の異なる集団（好中球、マクロファージ、ＴおよびＢ細胞）の頻度および絶対数を列挙するためのフローサイトメトリー分析を含む、大腸炎の重篤度を決定するために様々なパラメータが全身的に測定され得る。
【００４３】
標的のヒト対応物内またはその付近の共通の多形変異体（ＳＮＰ）が、全ゲノム関連研究（ＧＷＡＳ）において共通の炎症疾患の遺伝的危険として関連してきたか否かを調査することもできる。公開されたＧＷＡＳ研究は、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬（ＰＡ）、セリアック病（ＣｅＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、狼瘡（ＳＬＥ）、および  炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む共通の炎症状態に対する非常に複雑な遺伝成分を特定した。これらのＧＷＡＳ研究は、共通して共有されるか、または１つの疾患に特異的である遺伝子シグネチャー、および関連する免疫／生化学経路を定義したが、薬物発見および治療介入のための、ＧＷＡＳヒット（複数可）の潜在的な新規標的（複数可）への翻訳は、多くの因子によって複雑化され、最も重要なことは、疾患の発症／進行における個々の遺伝子の生物学的役割の直接的な実験確認に欠けることである。マウスにおいて阻害が急性炎症に対する保護である遺伝子と、公開されたＧＷＡＳ研究におけるＲＡ、ＰＡ、ＣｅＤ、ＭＳ、Ｔ１Ｄ、ＳＬＥ、またはＩＢＤのいずれかに関する遺伝的危険性との間の正相関は、我々の発見パイプラインにおいてこの遺伝子およびタンパク質の優先化に主要な基準である、ヒト炎症疾患におけるこの遺伝子の役割に対して生物学的確認を提示することができる。
【００４４】
炎症を可能にする標的の発現が慢性炎症疾患を患う患者からの組織試料において調節されるかを決定することもできる。アプローチの１つは、疾患と関連する対立遺伝子変異体（関連ＳＮＰ）の重要な比率（最大３０％）が、関連する遺伝子（シス作動性ｅＳＮＰ、ｅＱＴＬ）の対立遺伝子特異的差次的発現にも関連することを示す報告に基づく。これらの公開されたデータセットは、炎症を可能にするマウス標的のヒト対応物におけるｅＳＮＰの存在について探すことができ、この差次的発現は、疾患に関連し得る。別のアプローチでは、正常な腸管粘膜における炎症を可能にする標的の発現を、ＩＢＤ患者からの炎症性粘膜における炎症を可能にする標的の発現（例えば、全組織ＲＮＡにおいて捕捉するためにＲＮＡ配列決定技術を介して、または顕微解剖後）正常および炎症性組織およびＰＢＬにおいて発現した全トランスクリプトームと比較することができる。最後に、マウス標的のヒト近縁種における稀な配列変異体が、ＩＢＤの特定の臨床特徴、または家族性の症例、非常に早発性の小児症例、および遺伝的に同種の隔離集団からの孤発症例などの、ある特定の遺伝的に独特な患者群におけるＩＢＤの発症および進行に関連しているか否かを試験することができる。ある実施形態では、各遺伝子の個々のエクソンおよびエクソン−イントロン結合は、ＰＣＲ増幅することができ、ＤＮＡ配列決定を受け、標準的な方法を用いて機能対立遺伝子の明らかな欠失または非保存、および場合によって病理学的ミスセンス突然変異を探すことができる。補足的または代替えの実施形態では、イントロン配列は、標準的な方法を用いて決定することもできる。
【００４５】
炎症を可能にするタンパク質標的が、既知の生化学機能またはリガンド結合を有するタンパク質のさらなる程度の実験による特徴付けを必要とする場合、扱いやすい基質の修飾を行うことができる。バイオインフォマティクスツールは、ａ）機能が既知である他のタンパク質に対する関連性により生化学機能を推定するための予測されたアミノ酸配列、およびｂ）配列モチーフおよびシグネチャー、ならびに特定の生化学活性（ヌクレオチド結合、プロテアーゼ部位、ＤＮＡ結合、キナーゼ、ホスファターゼなど）に関連する関連する構造折り畳み、ならびにｃ）薬理学的アクセスを優先化するタンパク質の局在化（疎水性膜貫通ドメイン、シグナル配列、核局在化配列）を示す二次構造モチーフの存在を精査するためにも使用することができる。そのようなタンパク質の生化学活性の候補は、培養細胞における遺伝子導入および発現後、ならびに候補活性の出現および／もしくは炎症の機能マーカーに関する細胞成分における変化を探す、または逆に、ＲＮＡｉもしくはＳｈＲＮＡ分子による発現停止後のそれらの消失を探すことにより確認することができる。
【００４６】
炎症を可能にするタンパク質が魅力的な薬理学的標的ではないが、他の「新しい新薬の開発につながるような」部位を保有する経路に属し得る場合、炎症を可能にするタンパク質の経路を特定することができる（例えばバイオインフォマティクスツールまたは大規模なトランスクリプトームもしくはプロテオミクス分析の公開された結果を用いて）。加えて、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質の標的を特定するためのクロマチン免疫沈降／配列決定、および修飾酵素（プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ユビキチンリガーゼ）の基質を特定するためのプロテオミクス分析などの遺伝子導入細胞における直接実験も行うことができる。そのような経路は、小分子調節剤が既に入手可能であるタンパク質も保有し得る。
【００４７】
治療剤のスクリーニング方法
【００４８】
本明細書に記載されるスクリーニング方法は、炎症を可能にするポリペプチドの発現および／または活性（集合的にＩＥＰの生物学的活性と称される）とスクリーニングされる薬剤についての有用な情報を生成するための炎症との間の関係を捕捉するように設計される。
【００４９】
炎症を可能にするポリペプチドの発現／活性は炎症中に上方制御されることが示されているため、本明細書に提供されるスクリーニング方法により特定された薬剤は、それらがＩＥＰの生物学的活性を低減することが示される場合、炎症を制限し、悪化した炎症に関連する状態において治療利益を提供する利点を有する可能性もある。
【００５０】
スクリーニングの用途において、スクリーニングされる薬剤は、試薬と接触して設置される。この種類の用途に好適な試薬は、炎症を可能にするポリペプチドの生物学的活性に関連する（直接または間接的）パラメータを有する。炎症を可能にするポリペプチドの生物学的活性がスクリーニングされた薬剤と接触することによって制限される、妨害される、またはさらには阻害される場合、そのような制限、妨害、または阻害は、試薬のパラメータにも反映されると予想される。一実施形態では、パラメータのレベルまたは尺度は、炎症を可能にするポリペプチド生物学的活性がスクリーニングされた薬剤の存在および／またはそれとの接触により低下するとき、低下する（対照レベルに対して）。
【００５１】
第１の実施形態では、試薬は、核酸分子である。核酸分子は、炎症を可能にするポリペプチドのうちの１つに由来するプロモーターまたはその断片であってよく、その下流の作動可能に連結されたオープンリーディングフレームの発現を調節することができる（例えば、炎症を可能にするポリペプチドをコードする遺伝子または別の好適なレポーター遺伝子など）。核酸分子  がプロモーター（またはそれに関連する機能断片）である場合、測定されるパラメータは、下流の作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現レベルであり、これは、プロモーター（または機能断片）に由来する遺伝的発現を制限、妨害、または阻害するためのスクリーニングされた薬剤の能力（またはその欠如）に関連する。薬剤がレポーター遺伝子の発現を制限、妨害、または阻害することが可能である場合、プロモーターからの発現も、薬剤によって制限、妨害、または阻害されると想定される。代替えとして、薬剤がプロモーターからのレポーター遺伝子の遺伝的発現を制限、妨害、または阻害することが不可能である場合、プロモーターからの発現は、薬剤によって制限、妨害、または阻害されない（したがって、薬剤は治療有用性に欠ける可能性がある）と想定される。
【００５２】
別の実施形態では、核酸分子は、例えばｍＲＮＡまたはその対応するｃＤＮＡなどの転写物である。本明細書で使用されるように、転写物は、遺伝子のコード領域の少なくとも１切片の核酸分子コピーである。転写物は、例えば炎症を可能にするポリペプチドをコードするものであってよい。この特定の実施形態では、パラメータは、転写物の安定性および／または量である。薬剤が炎症関連ポリペプチドをコードする転写物の安定性および／または量を制限、妨害、または阻害することが可能である場合、転写物のレベルは、薬剤によって制限、妨害、または阻害されると想定される。代替えとして、薬剤が転写物の安定性および／または量を制限、妨害、または阻害することが不可能である場合、転写物のレベルは、薬剤によって制限、妨害、または阻害されないと想定される。
【００５３】
また別の実施形態では、核酸分子は、発現が炎症を可能にするポリペプチドによって調節される遺伝子から発現した転写物である。この実施形態は、炎症を可能にするポリペプチドが他の遺伝子の発現を調節する転写因子である場合（下流遺伝子とも称される）、特に有利である。この特定の実施形態では、パラメータは、転写物の安定性および／または量である。発現が炎症関連ポリペプチドによって調節される単一遺伝子の転写物はこの方法において使用することができるが、発現が炎症を可能にするポリペプチドによって調節される少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、または少なくとも２５０の遺伝子に関連する転写物のレベルが、本方法を実施するために使用されることも想定される。薬剤が、発現が炎症関連ポリペプチドによって調節される遺伝子の少なくとも１つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、または少なくとも２５０の転写物（複数可）の安定性および／または量を調節することが可能である場合、転写物（複数可）のレベルは、薬剤によって調節されると想定される。代替えとして、薬剤が、発現が炎症関連ポリペプチドによって調節される遺伝子の少なくとも１つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、または少なくとも２５０の転写物（複数可）の安定性および／または量を調節することが不可能である場合、転写物のレベルは、薬剤によって調節されないと想定される。
【００５４】
さらなる実施形態では、試薬は、ポリペプチドである。ポリペプチドは、例えば、炎症を可能にするポリペプチドまたはその機能断片であり得る。この特定の実施形態では、パラメータは、ポリペプチドの安定性、量、および／または生物学的活性であり得る。薬剤が、炎症関連ポリペプチドの安定性、量、および／または生物学的活性を制限、妨害、または阻害することが可能である場合、ポリペプチドは、薬剤によって制限、妨害、または阻害されると想定される。代替えとして、薬剤が、ポリペプチドの安定性、量、および／または生物学的活性を制限、妨害、または阻害することが不可能である場合、ポリペプチドは、薬剤によって制限、妨害、または阻害されないと想定される。
【００５５】
またさらなる実施形態では、試薬は、炎症を可能にするポリペプチドと同じシグナル伝達経路において、ポリペプチド（またはその機能断片）である。この特定の実施形態では、パラメータは、ポリペプチドの安定性、量、化学構造／修飾（例えばリン酸化（ｐｈｏｒｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）状態）および／または生物学的活性であり得る。薬剤が、炎症関連ポリペプチドの安定性、量、および／または生物学的活性を制限、妨害、または阻害することが可能である場合、ポリペプチドは、薬剤によって制限、妨害、または阻害されると想定される。代替えとして、薬剤が、ポリペプチドの安定性、量、および／または生物学的活性を制限、妨害、または阻害することが不可能である場合、ポリペプチドは、薬剤によって制限、妨害、または阻害されないと想定される。
【００５６】
またさらなる実施形態では、試薬は、炎症を可能にするポリペプチドと物理的に相互作用することが可能である（直接または間接的のいずれか）ポリペプチド（またはその機能断片）である。この特定の実施形態では、パラメータは、炎症を可能にするポリペプチドとその結合パートナーとの間の会合の尺度であり得る。ＩＥＰのそのパートナーとの結合がパートナーの化学構造の修飾（リン酸化状態またはユビキチン化状態）をもたらすことができる場合、パラメータは、パートナーの安定性、量、化学構造（例えばリン酸化（ｐｈｏｒｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）状態）および／または生物学的活性であり得る。薬剤が、２つのポリペプチドまたはパートナーの化学修飾の会合を制限、妨害、または阻害することが可能である場合、炎症を可能にするポリペプチドの生物学的活性が、薬剤によって制限、妨害、または阻害されると想定される。代替えとして、薬剤が、２つのポリペプチドの会合を制限、妨害、または阻害することが不可能である場合、炎症を可能にするポリペプチドは、薬剤によって制限、妨害、または阻害されないと想定される。
【００５７】
薬剤の特徴付けを可能にするために単一のパラメータが必要とされるが、試薬の２つ以上のパラメータが測定され得、さらに２つ以上の試薬が本明細書に提供されるスクリーニング用途に使用され得ることも提供される。
【００５８】
以下にさらに論じられるように、薬剤と試薬との間の接触は、インビトロ（例えば試薬のパラメータの測定に対応できる反応槽中）またはインビボで（例えば動物において）行うことができる。スクリーニング用途に関して、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイに好適なインビトロ環境は、必要な他の試薬を伴う適切な緩衝液中の単離された試薬（単離された核酸分子またはポリペプチドなど）であり得る。別の好適なインビトロ環境は、細胞（培養細胞など）または細胞抽出物であり得る。培養細胞が使用される場合、いくつかの実施形態では、培養中で生存率その生存率を維持することが得策である。培養細胞（複数可）は、試薬を提供することが可能であるべきである。細胞は、好ましくは、骨髄またはリンパ系組織（一次細胞培養物または細胞系）に由来する。一次細胞培養物が使用される場合、細胞は、単離されるか、または組織様構造であり得る。
【００５９】
インビボスクリーニング用途に関して、さらに好適な環境は、動物モデルなどの非ヒトモデルである。薬剤の特徴付けが非ヒトモデルで生じる場合、モデル（ゲッ齒類など）は薬剤が投与される。炎症状態の症状を予防、治療、および／または緩和する薬剤の能力を完全に特徴付けするために、様々な投薬量および投与モードを使用することができる。
【００６０】
薬剤を試薬と接触させたら、試薬のパラメータの測定または査定（ｖａｌｕｅ）が行われる。この評価は、接触が実行された（例えばプローブを用いて）反応槽で、またはそのような反応槽の試料上で直接行うことができる。試薬のパラメータの測定は、ＤＮＡレベル、ＲＡＮレベル、および／またはポリペプチドレベルのいずれかで行うことができる。
【００６１】
測定ステップは、評価されるパラメータに特異的な限定子の反応槽もしくはその試料への添加に依存し得る。限定子は、評価される試薬のパラメータに特異的に結合することができる。これらの場合では、試薬に特異的に結合する（または結合しない）限定子の量は、試薬のパラメータの測定をもたらすように決定され得る。別の実施形態では、限定子は、試薬のパラメータによって修飾され得る。この特定の場合では、修飾される（または修飾されない）限定子の量は、試薬のパラメータの測定をもたらすように使用される。ある実施形態では、限定子のシグナルは、限定子に直接または間接的のいずれかで結合される標識によって提供され得る。
【００６２】
関心の遺伝子のプロモーターからの転写活性（炎症を可能にするポリペプチドをコードする遺伝子に関連する、または発現が炎症を可能にするポリペプチドによって調節される標的遺伝子に関連するかのいずれか）を評価するために、レポーターアッセイが使用され得る。レポーターアッセイでは、レポーターベクターが薬剤と接触して設置され、レポーター遺伝子の発現レベル（転写物の量を介して）は、プロモーターからの転写活性を得るために測定される。レポーターベクターは、レポーターポリペプチド（例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチドに作動可能に連結される関心の遺伝子のプロモーター領域（またはその機能断片）を含み得るが、これに限定されない。薬剤を試薬と接触させることにより、プロモーターからの転写の促進が、レポーターポリペプチドの転写を測定することにより間接的に測定される。この特定の実施形態では、限定子は、レポーターポリペプチドであり、測定されるこの限定子に会合されるシグナルは、使用されるレポーターポリペプチドにより変動する。
【００６３】
代替えとして、または相補的に、核酸分子の安定性および／または発現レベルは、核酸分子の量（例えば、ｑＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲを用いて）またはそのような分子の安定性（例えば、時間の機能において、少なくとも２つの測定値を得ることにより）を定量化することにより評価することができる。アッセイ形式の１つでは、細胞または組織試料における核酸分子の発現は、核酸ハイブリダイゼーション技法（例えば、原位置ハイブリダイゼーション）を介して監視される。別のアッセイ形式では、細胞系または組織が、適切な条件下および時間で、試験される薬剤に曝露され、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡが単離され、任意に増幅され、定量化され得る。
【００６４】
いくつかの実施形態では、核酸分子または転写物の核酸同一性が実施され得る。核酸分子の核酸配列を決定する様々な方法が当業者に知られており、化学配列決定（例えば、マクサム・ギルバート配列決定）、鎖終結法（例えば、サンガー配列決定、およびダイターミネーター配列決定）、制限消化に基づく配列決定（例えばＲＦＬＰ）、ハイブリダイゼーションに基づく配列決定（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮＡマイクロアレイ、分子標識プローブ、ＴａｑＭａｎプローブ）、質量分析に基づく配列決定、次世代配列決定（例えば、全エクソーム配列決定、超並列シグネチャー配列決定もしくはＭＰＳＳ、ポロニー  配列決定、パイロ配列決定、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定、ＳＯＬｉＤ（商標）配列決定、イオン半導体配列決定、ＤＮＡナノボール配列決定、Ｈｅｌｉｏｓｃｏｐｅ（商標）単一分子配列決定、単一分子ＳＭＲＴＴＭ配列決定、単一分子リアルタイム（ＲＮＡＰ）配列決定、およびナノポアＤＮＡ配列決定）を含むが、これらに限定されない。
【００６５】
パラメータの測定がポリペプチドレベルで実施される場合、発現のポリペプチドレベルの評価が実施され得る。ある実施形態では、具体的には、ポリペプチドの発現レベルは、例えば、抗体に基づく技術（免疫組織化学、ＢｉｏＰｌｅｘ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、タンパク質マイクロアレイ、免疫検出など）、分光法などにより測定される。一実施形態では、このアッセイは、標的ポリペプチドに特異的な抗体（またはそれからの誘導体）を利用して実施される。
【００６６】
以下に示されるように、炎症を可能にするポリペプチド（ＦＯＸＮ１など）のいくつかは、炎症過程に関与する下流標的遺伝子の発現を調節する転写因子である。そのようなものとして、これらの炎症を可能にするポリペプチドの生物学的活性のうちの１つは、他の転写調節因子に結合すること（結合パートナーとも称される）、ならびに遺伝子発現を調節し、最終的には炎症応答を促進するために、その標的ヌクレオチド配列に結合することである。ＩＥＰがその結合パートナーおよび／またはその標的核酸配列のいずれかに結合するのを制限することによる炎症を可能にするポリペプチドの転写因子活性の減少は、炎症障害に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するのに有用であると考えられる。
【００６７】
転写因子活性の評価は、炎症を可能にする物がその結合パートナーの少なくとも１つと多量体複合体を形成する能力を決定することにより行うことができる。インビトロで、反応混合物は、例えば、補助因子、基質、もしくは他の結合パートナー、またはその潜在的に相互作用する断片を含み得る。ＩＲＦ８の例示的な結合パートナーは、ＩＲＦ（ＩＲＦ１、ＩＲＦ４）またはＥＴＳ（ＰＵ．１）のメンバーを含むが、これらに限定されない。ＵＳＰ１５の例示的な結合パートナーは、ＣＯＰ９シグナロソームおよび受容体活性化ＳＭＡＤ転写因子を含むが、これらに限定されない。好ましくは、結合パートナーは、直接結合パートナーである。この種類のアッセイは、標識成分の他への結合が複合体中の標識化合物を検出することにより決定され得るように、例えば、成分のうちの１つ（炎症を可能にするポリペプチドまたはその結合パートナーのいずれか）を標識と結合することにより達成され得る。成分は、直接または間接的のいずれかで、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで標識することができ、放射性同位体は、放射線放射を直接数えることにより、またはシンチレーション測定により検出され得る。代替えとして、成分は、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識することができ、酵素標識は、適切な基質の産物への変換を決定することにより検出される。競合アッセイも、試験化合物と標的との間の物理的相互作用を評価するために使用することができる。
【００６８】
別のアッセイ形式では、炎症を可能にするポリペプチドが転写因子である場合、その活性は、発現が炎症を可能にするポリペプチドの存在および活性によって調節されるその標的遺伝子の発現レベルを定量化（または半定量化）することにより測定することができる。そのような手段は、例えばＰＣＲ（ｑＰＣＲなど）によって行うことができる。例えば、ＩＲＦ８の標的遺伝子は、表１、２、および／または３に列挙される遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【００６９】
さらに別のアッセイ形式では、炎症を可能にするポリペプチドが転写因子である場合、その活性は、その核酸認識モチーフのうちの少なくとも１つに対する転写の親和性を決定することにより測定することができる。そのような手段は、例えばゲル遅延シフトアッセイにより行うことができる。例えば、核酸モチーフ認識ＩＲＦ８は、ＧＡＡＡｎｎＧＡＡＡ（配列番号１）およびＧＧＡＡＡｎｎＧＡＡＡ（配列番号２）を含むが、これらに限定されない。
【００７０】
本明細書に示されるように、いくつかの炎症を可能にするポリペプチドは、様々なシグナル伝達経路に関与し、他のポリペプチド（例えばＣＣＤＣ８８Ｂ）と相互作用する。炎症を可能にするポリペプチド（ＣＣＤＣ８８Ｂなど）を制限することが可能な薬剤がシグナル伝達カスケードに関与することは、炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するのに有用であると考えられる。炎症を可能にするポリペプチドとその結合パートナー（複数可）との間の相互作用を調節する薬剤を特定するために、例えば試薬（例えば炎症を可能にするポリペプチド）および結合パートナーを含有する反応混合物が、２つのポリペプチドに複合体を形成させるのに十分な条件下、および時間で調製される。薬剤が炎症を可能にするポリペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を調節するかを試験するために、試験薬剤の存在下または不在下で、反応混合物が提供され得る。試験薬剤は、最初に反応混合物中に含まれるか、または標的およびその細胞もしくは細胞外結合パートナーの添加後の時に添加され得る。対照反応混合物は、試験薬剤なしで、またはビヒクルと共にインキュベートされる。次いで、標的産物と細胞もしくは細胞外結合パートナーとの間の任意の複合体の形成が検出される。対照反応物では形成されないが、試験化合物を含有する反応混合物における複合体の形成は、試験薬剤が炎症を可能にするポリペプチドと相互作用的結合パートナーの相互作用を容易にすることを示す。
【００７１】
ある実施形態では、発現が複合体の存在（または不在）により調節されるレポーター遺伝子の発現レベルを間接的に測定することにより、炎症を可能にするポリペプチド複合体の形成を検出することが可能である。
【００７２】
また別のアッセイ形式では、２つの分子間（特に２つのポリペプチド）の直接相互作用も検出され得る。本方法において使用され得るシグナル生成または検出システムは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）などの蛍光法、タンパク質間相互作用検出法（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（ＰＣＡ）、生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）、蛍光消光法、蛍光偏光法、ならびに他の化学発光、電気化学発光  、ラマン、放射能、カラメトリー法（ｃｏｌｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）、ハイブリダイゼーション保護アッセイ、および質量分析法を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
炎症を可能にするポリペプチドの生物学的活性を決定するためのさらなる例は、炎症を可能にするポリペプチドがユビキチン部分をタンパク質に付加および／または除去する能力を決定することである。本明細書に示されるように、ＵＳＰ１５（炎症を可能にするポリペプチド）は、ユビキチン（Ｕｂ）単位間のイソペプチド結合、ならびにＵｂ（Ｃ終端グリシン）と結合タンパク質との間のペプチド結合の両方を切断するシステインヒドロラーゼである。ＵＳＰ１５が炎症を可能にするポリペプチドである場合、そのデユビキチナーゼ活性を制限する（さらには阻害する）ことができる薬剤は、炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するのに有用であると考えられる。例えば、無細胞アッセイが使用され得る。このアッセイは、反応における遊離Ｕｂの出現のＥＬＩＳＡに基づく免疫学的検出に結合される、ユビキチン化された不動標的（例えばユビキチン化ＳＭＡＤ３）からのＵｂ部分のポリペプチド依存除去に基づき得る。代替えとして、炎症を可能にするポリペプチドがエステル、チオエステル、ならびにアミドおよびイソペプチド結合のチオール依存加水分解を示す場合、一次アッセイとして蛍光発生ペプチドを用いたスクリーニングを使用することもできる。間接的に、炎症を可能にするポリペプチド依存標的（例えば、ＵＳＰ１５、ＴＧＦβ、もしくはＢＭＰ、またはレポーター遺伝子（ｐＣＡＧＡ１２−ｌｕｘ；ＩＤ１−ＢＲＥ−ｌｕｘ）など）の発現の調節を検出することができる。
【００７４】
無細胞スクリーニングアッセイは、通常、２つの成分を相互作用させて、結合させるのに十分な条件下および時間で、試薬および試験化合物の反応混合物を調製し、よって、除去される、および／または検出され得る複合体を形成することを伴う。一実施形態では、試薬は、固相に固定される。固相に固定された試薬関連複合体は、反応、例えば結合反応の終わりに検出され得る。例えば、試薬は、固体表面上に固定され得、試験化合物（固定されない）は、本明細書で論じられる検出可能な標識で、直接または間接的のいずれかで標識され得る。そのような固相の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、アレイスライド、ビーズ、および微量遠心管が挙げられる。一実施形態では、タンパク質のうちの１つまたはそれらの両方がマトリックスに結合されるドメインを付加する炎症を可能にするタンパク質が提供され得る。インキュベーション後、任意の未結合の成分を除去するために、槽を洗浄し、ビーズの場合、マトリックスを不動化し、例えば上述のように、直接または間接的に複合体を決定した。代替えとして、複合体は、マトリックスから解離することができ、タンパク質の結合または活性のレベルが標準的な技法を用いて決定された。
【００７５】
そのようなアッセイを行うために、固定成分を含有するコーティングされた表面に非不動成分（薬剤）を添加した。反応が完了した後、形成された任意の複合体が固体表面上に不動化されたままであるような条件下で、未反応成分を除去した（例えば洗浄により）。固体表面上に固定された複合体の検出は、いくつかの方法で達成することができる。前に非不動化した成分を予め標識する場合、表面に不動化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。前に非不動化された成分が予め標識されない場合、例えば不動化された成分に特異的な標識された抗体を用いて（抗体は、同時に、例えば標識された抗Ｉｇ抗体で直接標識されるか、または間接的に標識され得る）、表面上に固定された複合体を検出するために、間接的標識を使用することができる。
【００７６】
代替えとして、液相中で無細胞アッセイを行うことができる。そのようなアッセイでは、反応産物は、分画遠心法、クロマトグラフィー（ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー）および／または電気泳動を含むがこれらに限定されないいくつかの標準的な技法のいずれかにより、未反応成分から分離される。そのような樹脂およびクロマトグラフィーは、当業者に既知である。さらに、蛍光エネルギー転移は、本明細書に記載されるように、溶液から複合体をさらに精製することなく結合を検出するように便宜的に利用することもできる。
【００７７】
本明細書に記載されるアッセイは、不均一または均一形式で行うことができる。不均一アッセイは、試薬または結合パートナーのいずれかを固相に固定し、反応の終わりに固相に固定した複合体を検出することを伴う。均一アッセイでは、全反応が液相で実行される。いずれのアプローチにおいて、反応物の添加の順序は、試験される薬剤について異なる情報を得るために変動し得る。例えば、試薬と結合パートナーとの間の相互作用と、例えば競合により干渉する試験薬剤は、試験物質の存在下で反応を行うことにより特定することができる。代替えとして、予め形成された複合体を促進する試験薬剤は、複合体が形成される前に、試験化合物を反応混合物に添加することにより試験することができる。様々な形式を以下に簡潔に記載する。
【００７８】
不均一アッセイ系では、試薬または結合パートナーのいずれかが固相（例えばマイクロタイタープレート）に固定される一方、非固定種は直接または間接的のいずれかで標識される。固定された種は、非共有結合または共有結合により不動化され得る。代替えとして、固定される種に特異的な不動化された抗体は、その種を固体表面に固定するために使用され得る。
【００７９】
そのようなアッセイを行うために、不動化された種のパートナーは、薬剤でコーティングされた、またはコーティングされない表面に曝露される。反応が完了した後、未反応成分を除去し（例えば洗浄により）、形成された任意の複合体は、固体表面に不動化されたままである。非不動化した種を予め標識する場合、表面に不動化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。不動化された種が予め標識されない場合、例えば最初に非不動化された種に特異的な標識された抗体を用いて（抗体は、同時に、直接標識されるか、または例えば標識された抗Ｉｇ抗体で間接的に標識され得る）、表面に固定された複合体を検出するために、間接的標識を使用することができる。反応成分の添加の順序により、複合体形成を可能にする、または予め形成された複合体の安定性を促進する薬剤を検出することができる。
【００８０】
代替えとして、反応は、薬剤の存在下または不在下の液相中で行われ、反応産物が未反応成分から分離され、複合体は、例えば、溶液中に形成された任意の複合体を固定するために結合成分のうちの１つに特異的な不動化された抗体、および固定された複合体を検出するためにもう一方のパートナーに特異的な標識された抗体を用いて検出され得る。先と同様に、反応物を液相に添加する順序により、複合体を可能にする、または予め形成された複合体の安定性を促進する薬剤を特定することができる。
【００８１】
代替えの実施形態では、均一なアッセイが使用され得る。例えば、標的産物またはそれらの結合パートナーのいずれかが標識されるが、標識によって生成されたシグナルが複合体形成によりクエンチされる、試薬の予め形成された複合体および相互作用性細胞または細胞外結合パートナー産物が調製される。複合体の形成を好む薬剤の添加は、対照値を下回るシグナルの生成をもたらす。この方法により、結合パートナーの相互作用を促進する薬剤を特定することができる。
【００８２】
さらに別の態様では、試薬は、結合パートナーに結合するか、それと相互作用し、炎症を可能にするポリペプチド活性に関与する他のタンパク質を特定するために、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「ベイトタンパク質」として使用することができる。そのような結合パートナーは、シグナルまたは転写制御の活性化剤または阻害剤であってよい。
【００８３】
別の実施形態では、炎症を可能にするポリペプチドと相互作用する化合物を選択するためのアッセイは、細胞に基づくアッセイであってよい。有用なアッセイは、炎症のマーカーが測定されるアッセイを含む。細胞に基づくアッセイは、炎症を可能にするポリペプチドを発現する細胞を薬剤と接触させ、試験化合物が炎症を可能にするポリペプチドの活性を調節する（例えば、刺激または阻害する）能力を決定し、かつ／または薬剤が細胞における炎症を可能にするポリペプチドまたは関連するタンパク質の発現を調節する能力を決定することを含み得る。細胞に基づく系は、炎症を可能にするポリペプチドの発現および／または活性および／または作用を減少する化合物を特定するために使用され得る。そのような細胞は、炎症を可能にする遺伝子を発現する細胞系など、組換えまたは非組換えであってよい。いくつかの実施形態では、細胞は、炎症を可能にするポリペプチドの結合パートナーを発現する組換えまたは非組換え細胞であってよい。例示的な系は、炎症を可能にするポリペプチド（例えば組換え核酸から）を発現する哺乳類または酵母の細胞を含む。そのような系の利用において、細胞は、炎症を可能にするポリペプチドの発現および／または活性を減少すると思われる薬剤に曝露される。曝露後、細胞は、例えば、炎症を可能にするポリペプチドの発現または活性についてアッセイされる。細胞は、生物（例えば薬剤で処理された生物）から得た安定した細胞系または一次培養物からであってよい。
【００８４】
細胞に基づくおよびインビトロアッセイ系に加えて、非ヒト生物、例えば非ヒト遺伝子導入生物またはモデル生物も使用することができる。遺伝子導入生物は、異種ＤＮＡ配列が染色体に関して動物の生殖細胞に組み込まれるものである。遺伝子導入生物は、その体細胞の染色体に組み込まれた導入遺伝子も有する。酵母、虫、ハエ、魚、爬虫類、鳥、哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロブタ、およびヤギ）、および非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、サル、チンパンジー）を含むがこれらに限定されない任意の種の生物が、本明細書に記載される方法において使用され得る
【００８５】
本明細書に記載される方法において使用される遺伝子導入細胞または動物は、炎症を可能にするポリペプチド、断片、または変異体をコードする導入遺伝子を含み得る。導入遺伝子は、ヒトタンパク質、例えば、ヒト炎症を可能にするポリペプチドまたはその結合パートナーのうちの１つを含む、通常遺伝子導入細胞または動物に外因性であるタンパク質をコードすることができる。導入遺伝子は、異種または未変性プロモーターに連結され得る。遺伝子導入細胞および動物を生成する方法は、当該技術分野において既知である。
【００８６】
別のアッセイ形式では、標準単位に正規化された炎症を可能にするポリペプチドの特定の活性は、試験され、曝露されていない対照の無細胞系、細胞系、細胞集団、または動物モデルと比較された薬剤に曝露された無細胞系、細胞系、細胞集団、または動物モデルにおいてアッセイすることができる。スクリーニングされた化合物の特定の活性は、炎症を可能にするポリペプチド欠乏系（例えば、遺伝子の少なくとも１つのコピーが非機能性の炎症を可能にするポリペプチドをコードする場合）を用いて評価することもできる。
【００８７】
一実施形態では、測定ステップは、対照レベルを下回るパラメータの試験レベル（通常、炎症状態に関連する症状の予防、治療、および／または緩和の欠如に関連する）を測定することを含む（または測定することである）。この実施形態では、測定の存在は、スクリーニングされた薬剤が炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和する能力を示す。一方で、測定の不在は、スクリーニングされた薬剤が炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和する能力に欠くことを示す。
【００８８】
他の実施形態では、測定が行われると、それに関連する値が抽出され、対照値と比較され得る。スクリーニング用途では、炎症を可能にするポリペプチドの発現および／または活性に対する薬剤の作用は、対照値と比較される。ある実施形態では、対照値は、炎症状態の症状の予防、治療、および／または緩和の欠如に関連し、したがって、炎症状態の症状の予防、治療、および／または緩和に有用な薬剤は、測定されたパラメータを対照値を下回って減少させることが可能である。この実施形態では、炎症状態の症状の予防、治療、および／または緩和に有用であると考えられない薬剤は、対照値と等しいか、またはそれより高いいずれかのパラメータを提示する。
【００８９】
別の実施形態では、対照値は、炎症状態の症状の予防、治療、および／または緩和に関連し、そのようなものとして、炎症状態の症状の予防、治療、および／または緩和に有用な薬剤に関連する測定されたパラメータは、対照値以下である。そのような実施形態では、炎症状態の症状の予防、治療、および／または緩和に有用ではない薬剤は、対照値より高い試験値を示す。
【００９０】
ある実施形態では、比較は、個体ごとに行われ得る。別の実施形態では、比較は比較モジュールにおいて行うことができる。そのような比較モジュールは、アプリケーションを実施するためのプロセッサおよびメモリカードを含み得る。プロセッサは、データを取り出すためにメモリにアクセスすることができる。プロセッサは、データに対して操作を実行することができる任意のデバイスであってよい。例としては、中央処理装置（ＣＰＵ）、フロントエンドプロセッサ、マイクロプロセッサ、グラフィックスプロセッシングユニット（ＰＰＵ／ＶＰＵ）、フィジックスプロセッシングユニット（ＰＰＵ）、デジタルシグナルプロセッサ、およびネットワークプロセッサである。アプリケーションはプロセッサに結合され、対照値に対して基になる試薬のパラメータに対する薬剤の作用を決定するように構成される。この比較の出力は表示デバイスに伝送され得る。プロセッサによりアクセス可能なメモリは、測定された試薬のパラメータ、または生成もしくは使用された任意の他の情報などのデータを受信して、記憶する。メモリは、メインメモリ（高速ランダムアクセスメモリもしくはＲＡＭなど）または補助記憶装置（ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、または磁気テープドライブなど）であってよい。メモリは、任意の他の種類のメモリ（読取専用メモリもしくはＲＯＭなど）または光学記憶媒体（ビデオディスクまたはコンパクトディスクなど）であってよい。
【００９１】
試薬のパラメータと対照値との間の比較が行われると、薬剤を特徴付けることが可能である。この特徴付けは、本明細書に示されるように、炎症を可能にするポリペプチドの発現および／または活性が炎症障害に関連する症状を治療、予防、および／または緩和することが可能な薬剤に関して下方制御されるため可能である。
【００９２】
ある実施形態では、特徴付けは、個体ごとに行われ得る。別の実施形態では、特徴付けは、アプリケーションを実施するためのプロセッサおよびメモリカードを用いて行うことができる。プロセッサは、データを取り出すためにメモリにアクセスすることができる。プロセッサは、データに対して操作を実行することができる任意のデバイスであってよい。例としては、中央処理装置（ＣＰＵ）、フロントエンドプロセッサ、マイクロプロセッサ、グラフィックスプロセッシングユニット（ＰＰＵ／ＶＰＵ）、フィジックスプロセッシングユニット（ＰＰＵ）、デジタルシグナルプロセッサ、およびネットワークプロセッサである。アプリケーションはプロセッサに結合され、スクリーニングされる個体または試薬を特徴付けするように構成される。この特徴付けの出力は表示デバイスに伝送され得る。プロセッサによりアクセス可能なメモリは、測定された試薬のパラメータ、または生成もしくは使用された任意の他の情報などのデータを受信して、記憶する。メモリは、メインメモリ（高速ランダムアクセスメモリもしくはＲＡＭなど）または補助記憶装置（ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、または磁気テープドライブなど）であってよい。メモリは、任意の他の種類のメモリ（読取専用メモリもしくはＲＯＭなど）または光学記憶媒体（ビデオディスクまたはコンパクトディスクなど）であってよい。
【００９３】
本明細書に記載されるスクリーニング方法は、炎症状態の症状を予防、治療、または緩和する薬剤の能力を決定するために使用することができる。このスクリーニング方法の背景にある前提は、炎症を可能にするポリペプチドの活性または発現が炎症中に上方制御されることである。そのようなものとして、炎症を可能にするポリペプチドの活性または発現の下方制御が薬剤によって行われるかを評価することにより、炎症障害の症状を予防、治療、または緩和するその能力に関連させることができる。これらの方法において、対照値は、薬剤の不在下の試薬のパラメータであってよい。この特定の実施形態では、試薬のパラメータは、薬剤と試薬を混合する前に、またはスクリーニング系のうちの１つが薬剤を含まない同じ反応槽の少なくとも２つの複写物において測定することができる。対照値は、炎症を制限しない、または炎症障害の症状を予防／治療／緩和しないことが知られている対照薬剤の存在下における試薬のパラメータであってもよい。そのような対照薬剤は、例えば薬学的に不活性な賦形剤であってよい。対照値は、炎症を患っていない健康な対象からの細胞または組織を含む反応槽から得た試薬のパラメータであってもよい。対照値は、炎症（または炎症障害）の欠如に関連する既定値であってもよい。薬剤の能力は、対照値に対する試薬のパラメータの値の比較に基づき決定される。
【００９４】
薬剤は、試薬のパラメータの値が対照値よりも低い場合、炎症障害の症状を予防、治療、または緩和することができると特徴付けされる。一方、薬剤は、試薬のパラメータの測定値が対照値以下の場合、炎症障害の症状を予防、治療、または緩和する能力に欠くと特徴付けされる。
【００９５】
本発明は、本明細書に記載される特徴付けおよび方法を実施するためのスクリーニングシステムも提供する。これらのシステムは、薬剤および試薬を設置するための反応槽と、コンピュータシステム中のプロセッサと、プロセッサによりアクセス可能なメモリと、プロセッサに結合されたアプリケーションとを備える。アプリケーションまたはアプリケーションの一群は、薬剤の存在下における試薬のパラメータの試験値を受信する、試験値を対照値と比較する、および／またはこの比較の機能において薬剤を特徴付けするために構成される。
【００９６】
本発明は、コンピュータ読取可能媒体に統合されたソフトウェア製品も提供する。このソフトウェア製品は、本明細書に記載される方法に従い、個体または薬剤を特徴付けるための説明書を含む。ソフトウェア製品は、薬剤の存在下における試薬のパラメータの試験値を受信するための受信モジュールと、試験値が対照値より低い、等しい、またはそれより高いかを決定するための測定モジュールから入力を受信する比較モジュールと、比較に基づき特徴付けを実施するために比較モジュールから入力を受信する特徴付けモジュールとを含む。
【００９７】
ある実施形態では、このシステムのコンピュータシステムに見られるアプリケーションは、比較モジュールにおいて使用される。測定モジュールは、試薬のパラメータに関して反応槽から情報を抽出／受信する。受信モジュールは、試薬のパラメータの値（複数可）を受信し、この値が対照値より低い、等しい、またはそれより高いかを決定する比較モジュールに結合される。比較モジュールは、特徴付けモジュールに結合され得る。別の実施形態では、このシステムのコンピュータシステムに見られるアプリケーションは、特徴付けモジュールにおいて使用される。比較モジュールは、比較を受信し、この比較に基づき特徴付けを実施する特徴付けモジュールに結合される。さらなる実施形態では、受信モジュール、比較モジュール、および特徴付けモジュールは、単一の離散システムに編成される。別の実施形態では、各モジュールは、異なる離散システムに編成される。またさらなる実施形態では、少なくとも２つのモジュールは、単一の離散システムに編成される。
【００９８】
治療化合物を確認するための炎症を可能にするポリペプチド用の異型接合体動物
【００９９】
場合によって、動物モデルにおいてインビトロスクリーニング（無細胞または細胞のいずれかに基づくアッセイ）の結果を確認することが必要であり得る。他の例では、動物において直接初期スクリーニングを実施することも必要であり得る。これらの状況に関して、異型接合体動物は、本明細書において、特定の薬剤が炎症状態に関連する症状の予防、治療、または緩和に有用であるかを決定するための炎症の動物モデルを提供するように提供される。
【０１００】
本明細書に論じられるように、非機能性の炎症を可能にするポリペプチドをコードする遺伝子の２つのコピーを有するマウスは、Ｐ．ベルゲイで抗原投与される場合、完全な炎症応答を誘導、開始することができない。炎症を可能にするポリペプチドをコードする遺伝子を包含する遺伝子座で同型接合体である動物は、それらが炎症応答を誘導できないため、潜在的な抗炎症剤に差次的応答を示さないと予想される。
【０１０１】
一方、機能性炎症を可能にするポリペプチドをコードする遺伝子の２つのコピーを有するマウスは、Ｐ．ベルゲイで抗原投与される場合、完全かつ十分に炎症応答を誘導、開始、および維持することができる。炎症を可能にするポリペプチドをコードする遺伝子を包含する遺伝子座で同型接合体である動物は、それらが頑強な炎症応答を開始し、非常に迅速に死亡したため、潜在的な抗炎症剤に非常に少ししか差次的応答を示さないと予想される。
【０１０２】
よって、本発明は、炎症を可能にするポリペプチドをコードする遺伝子を包含する遺伝子座で異型接合体である動物を提供する。最初の遺伝子コピーとして、機能性炎症を可能にするポリペプチドを提供し、動物に炎症応答を開始させる。第２の遺伝子コピーとして、非機能性の炎症を可能にするポリペプチドを提供し、頑強な炎症応答の開始において動物を制限する。非機能性コピーは、例えば、その生物学的活性を失った突然変異したタンパク質、ノックアウト遺伝子、またはノックイン遺伝子をコードし得る。よって、本明細書に提供される動物は、炎症応答を開始することができるが、頑強なものではなく、潜在的な抗炎症剤に差次的応答を示すことができる。本発明は、炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するためのスクリーニングされた薬剤の有用性を評価するための異型接合性動物の使用も提供する。これは、本発明に記載される方法によって特定された所与の標的に対する阻害剤の感作されたスクリーニングとして定義される。
【０１０３】
薬剤が炎症状態に関連する症状を治療または緩和することができるかを決定するために、炎症応答は、最初に動物において誘導され（誘発物を投与することにより）、次いで、スクリーニングされた薬剤が投与される。一方、薬剤が炎症状態の発症を予防することができるかを決定するために、スクリーンニングされた薬剤が最初に投与され、次いで、誘発物が動物に提供される。誘発物（例えば、Ｐ．ベルゲイなどの例えば感染病原体）は、薬剤の不在下で、動物において炎症応答を誘導することができる。
【０１０４】
薬剤および炎症誘発物が投与されたら、炎症応答のパラメータが測定される。感染病原体が炎症誘発物として投与され、そのような誘発物が最終的には感染した動物に死をもたらすことが知られている実施形態では、パラメータは、生存率または死亡率であり得る。死は、Ｐ．ベルゲイ感染モデルにおいて急性炎症のエンドポイントであるが、他の中間表現型は死の前触れであり、致死の予測因子である。これらは、発熱、振戦、嗜眠、後肢麻痺、および昏睡などの神経症状の現れを含む。免疫細胞数および細胞型、サイトカインプロファイル、ケモカインプロファイル、免疫グロブリンプロファイル、浮腫、血液脳関門の透過性などの他の炎症関連パラメータ（代理マーカー）も、測定され得る。
【０１０５】
ある実施形態では、尺度は、対照値の機能においてパラメータを測定することも含み得る。例えば、血液脳関門の透過性が測定されるパラメータである場合、測定ステップは、非炎症状態に関連する対照値を上回る血液脳関門の透過性を測定することを含み得る。尺度の存在（例えば、尺度は対照値より高いため）は、薬剤が有用であることを示す。一方、尺度の不在（例えば、尺度は対照値より低いため）は、薬剤が有用性に欠けることを示す。
【０１０６】
測定されたら、試験パラメータ（試験レベルとも称される）は対照と比較され、薬剤はこの比較に基づき特徴付けすることができる。そのような対照は、炎症状態に関連する症状の予防、治療、および／もしくは緩和、または炎症状態に関連する症状の予防、治療、および／もしくは緩和の欠如に関連し得る。対照は、例えば、薬剤で処置されなかった、または炎症状態に関連する症状を予防、治療、もしくは緩和しないことが示された偽薬剤（例えば、薬学的に許される賦形剤）で処置された動物から得ることができる。
【０１０７】
例えば、評価されるパラメータが生存率であり、使用される対照が炎症状態に関連する症状の予防、治療、および／もしくは緩和の欠如に関連する場合、薬剤は、処置された動物の生存率が非処置／偽処置動物（例えば、炎症状態に関連する症状の予防、治療、および／または緩和の欠如に関連する対照）の生存率より高い場合、有用であると考えられる。一方、薬剤は、処置された動物の生存率が未処置／偽処置動物（例えば、炎症状態に関連する症状の予防、治療、および／または緩和の欠如に関連する）の生存率と等しいか、またはそれより高い場合、有用ではないと考えられる（または有用性に欠けると考えられる）。
【０１０８】
これらの動物モデルを使用して行うために、炎症を可能にするポリペプチドの単一遺伝子のコピー（例えば、ＣＣＤＣ８８Ｂ、ＦＯＸＮ１、またはＵＳＰ１５など）が非機能性ポリペプチドをコードするように修飾されることが予想される。しかしながら、それぞれ異なる炎症を可能にするポリペプチドをコードする少なくとも２つの異なる遺伝子のコピーが動物において修飾される（例えばＣＣＤＣ８８ＢとＦＯＸＮ１の組み合わせ、ＣＣＤＣ８８ＢとＵＳＰ１５の組み合わせ、またはＦＯＸＮ１とＵＳＰ１５の組み合わせなど）ことも想定される。それぞれ異なる炎症を可能にするポリペプチドをコードする少なくとも３つの異なる遺伝子のコピーが動物において修飾される（例えば、ＣＣＤＣ８８Ｂ、ＦＯＸＮ１、およびＵＳＰ１５の組み合わせなど）ことも想定される。場合によって、動物における炎症に関係がある他の遺伝子座に関連する遺伝的突然変異をさらに提供することが得策であり得る。例えば、ＪＡＫ３、ＴＨＥＭＩＳ、ＩＲＧＭ１、ＩＲＦ１、およびＩＲＦ８のうちの少なくとも１つ、ＪＡＫ３、ＴＨＥＭＩＳ、ＩＲＧＭ１、ＩＲＦ１、およびＩＲＦ８のうちの少なくとも２つ、ＪＡＫ３、ＴＨＥＭＩＳ、ＩＲＧＭ１、ＩＲＦ１、およびＩＲＦ８のうちの少なくとも３つ、ＪＡＫ３、ＴＨＥＭＩＳ、ＩＲＧＭ１、ＩＲＦ１、およびＩＲＦ８のうちの少なくとも４つ、またはＪＡＫ３、ＴＨＥＭＩＳ、ＩＲＧＭ１、ＩＲＦ１、およびＩＲＦ８の５つ全てをコードする非機能性遺伝子のコピーをさらに有する動物を得ることが可能である。
【０１０９】
非機能性遺伝子コピーを得るための方法は、化学突然変異誘発（例えば、ＥＮＵ指向突然変異誘発）および遺伝子組換えを含むが、これらに限定されない。異型接合体動物は、非機能性の炎症を可能にするポリペプチドをコードする遺伝子を包含する遺伝子座で同型接合体である動物を、機能性炎症を可能にするポリペプチドをコードする遺伝子を包含する遺伝子座で同型接合体である動物と繁殖させることにより得ることもできる。
【０１１０】
様々な動物を得ることができ、本方法において使用することができる。ある実施形態では、動物は、哺乳類などの非ヒト動物である。いくつかの実施形態では、動物は、ゲッ齒類（例えばマウス）である。
【０１１１】
炎症を可能にするポリペプチド標的を使用する予測方法
【０１１２】
本明細書に記載される予測方法は、個体または特徴付けされる個体に投与される治療剤について貴重な情報を生成するために、炎症を可能にするポリペプチドの生物学的活性と炎症状態との間の関係を捕捉するように設計される。本明細書に示されるように、炎症を可能にするポリペプチドの生物学的活性は、個体が炎症応答を誘導、開始、および／または持続する能力と正相関する。個体において炎症を可能にするポリペプチド（複数可）が発現され、機能性である場合（例えば、炎症を可能にするポリペプチドが生物学的活性を示す）、そのような個体は炎症応答を発症または維持することができることを示す。代替えとして、個体において炎症を可能にするポリペプチド（複数可）が低レベルで発現される、発現されない、または機能性ではない場合（例えば、炎症を可能にするポリペプチドが低下したまたは存在しない生物学的活性を示す場合）、そのような個体は、十分かつ完全な炎症応答を発達または維持することができないことを示す。
【０１１３】
炎症を可能にするポリペプチドの生物学的活性と炎症との間のこの相関は、治療レジメンが炎症応答に関する症状の予防、治療、および／または緩和のいずれかに関して、個体において良好であるかを決定するための基準も提供する。炎症を可能にするポリペプチド（複数可）の生物学的活性が治療レジメンにより低下する場合、レジメンが、個体における炎症応答に関連する症状の予防、治療、および／または緩和において良好であると想定される。代替えとして、炎症を可能にするポリペプチド（複数可）の生物学的活性が治療レジメンの投与により低下しない（例えば、同じままか、増加する）場合、レジメンが、個体における炎症状態の予防、治療、および／または緩和において良好ではないと想定される。
【０１１４】
炎症を可能にするポリペプチドの生物学的活性と炎症との間のこの相関は、炎症状態を発達させる、またはそれを患う個体の危険度を評価するための基準をさらに提供する。炎症を可能にするポリペプチド（複数可）の生物学的活性が、対照個体（例えば、炎症状態を発達させる、またはそれを患う危険にないことが知られている健康な個体）に対して、スクリーニングされた個体において高い場合、スクリーニング個体は、炎症状態を発達させる（感染しやすい）、またはそれを患う危険にあると想定される。代替えとして、スクリーニングされた個体における炎症を可能にするポリペプチド（複数可）の生物学的活性が、対照個体（例えば、炎症状態を発達させる、またはそれを患う危険にないことが知られている健康な個体）において観察される生物学的活性に類似するか、またはそれより低い場合、スクリーニングされた個体は、炎症状態を発達させる、またはそれを患う危険にない（感染しない）と想定される。
【０１１５】
これらの予測用途では、個体の生物学的試料を得、反応槽に設置することができる。生物学的試料は、炎症を可能にするポリペプチドに関連する分析物（試薬とも称される）を含む。このアッセイでは、反応槽は、分析物／試薬のパラメータの決定を収容できる任意の種類の容器であってよい。
【０１１６】
生物学的試料が提供されたら、分析物／試薬のパラメータのうちの１つを測定することができる。この測定は、反応槽で（プローブを用いて）、またはそのような反応槽の試料上で直接行うことができる。上述のように、スクリーニングのセクションにおいて、測定は、ＤＮＡレベル、ＲＡＮレベル、および／またはポリペプチドレベルのいずれかで行うことができる。同様にスクリーニングのセクションにおいて上述されるように、分析物／試薬は、炎症を可能にするポリペプチド自体（対応する転写物および／または遺伝子）、および／または生物学的活性の炎症を可能にするポリペプチド（対応する転写物および／または遺伝子）に関連するポリペプチドのいずれかであってよい。測定は、単一の炎症を可能にするポリペプチドまたは炎症を可能にするポリペプチド（例えば２つまたは３つの炎症を可能にするポリペプチド）の組み合わせに関連し得る。
【０１１７】
ある実施形態では、測定ステップは、対照値の機能においてパラメータを測定することも含み得る。例えば、ＩＥＰの量が測定されるパラメータである場合、測定ステップは、非炎症状態に関連する対照値を下回るＩＥＰの量を測定することを含み得る。尺度の存在（例えば、尺度は対照値より低いため）は、薬剤が処置された個体において有用であることを示す。一方、尺度の不在（例えば、尺度は対照値より高いため）は、薬剤が処置された個体において有用性に欠けることを示す。
【０１１８】
試薬を測定し、ＩＥＰの生物学的活性のパラメータの試験レベルを得るための上記の「治療剤のスクリーニング方法」のセクションに記載される方法は、本明細書に記載される予測方法において使用することができる。
【０１１９】
パラメータの測定が行われたら、対照レベルとの比較が行われる。例えば、方法が、個体における治療剤の有用性を決定するためであり、測定される分析物／試薬がｍＲＮＡ発現プロファイル（発現が炎症を可能にするポリペプチド、例えばＩＲＦ８により調節される複数の遺伝子の転写物の同一性および／または量）である場合、比較ステップは、発現が炎症を可能にするポリペプチドにより調節される複数の遺伝子に関連するｍＲＮＡ転写物の同一性および／または各ｍＲＮＡ転写物の量を決定することを含み得る。得られたｍＲＮＡプロファイル（転写物の遺伝的同一性および／または転写物の量のいずれか）は、得られたｍＲＮＡプロファイルがどのｍＲＮＡプロファイルにより類似するかを決定するために、健康な個体（炎症状態の欠如に関連する対照）に由来する健康なｍＲＮＡプロファイル、および／または患っている未処置の個体（炎症状態の存在、よって症状の予防、治療、および／または緩和の欠如に関連する対照）に由来する疾患ｍＲＮＡプロファイルのいずれかと比較される。得られたｍＲＮＡプロファイルが疾患ｍＲＮＡプロファイルより健康なｍＲＮＡプロファイルに類似する場合、治療剤は、炎症状態に関連する症状の予防、治療、および／または緩和に有用であると想定され得る。代替えとして、得られたｍＲＮＡプロファイルが健康なｍＲＮＡプロファイルより疾患ｍＲＮＡプロファイルに類似する場合、治療剤は、炎症状態に関連する症状の予防、治療、および／または緩和に有用ではないと想定され得る。
【０１２０】
別の例では、方法は、個体の炎症状態への素因または罹患を決定するためであり、測定される分析物／試薬が炎症を可能にするポリペプチド（例えばＵＳＰ１５）の生物学的活性である場合、比較ステップは、スクリーニングされた個体の同一性における生物学的活性の試験レベルを炎症を可能にするポリペプチドの対照レベルと比較することを含み得る。測定された生物学的活性は、測定された生物学的活性がどの対照レベルにより類似するかを決定するために、健康な個体（炎症状態の欠如に関連する対照）に由来する健康な対照レベル、および／または患っている、および未処置の個体（炎症状態の存在、よって症状の予防、治療、および／または緩和の欠如に関連する対照）に由来する疾患対照レベルのいずれかと比較され得る。測定された試験レベルが疾患レベルより健康なレベルに類似する（例えば近い）場合、個体は、炎症を可能にするポリペプチドに感染しにくい（または少なくとも健康な個体と同じくらい感染しにくい）か、またはそれに罹患しないかのいずれかであると想定され得る。代替えとして、測定されたものが健康な対照レベルより疾患対照レベルに類似する（例えば近い）場合、個体は、炎症状態に感染しやすいか、またはそれに罹患するかのいずれかであると想定され得る。
【０１２１】
ある実施形態では、比較は、個体ごとに行われ得る。別の実施形態では、比較は比較モジュールにおいて行うことができる。そのような比較モジュールは、アプリケーションを実施するためのプロセッサおよびメモリカードを含み得る。プロセッサは、データを取り出すためにメモリにアクセスすることができる。プロセッサは、データに対して操作を実行することができる任意のデバイスであってよい。例としては、中央処理装置（ＣＰＵ）、フロントエンドプロセッサ、マイクロプロセッサ、グラフィックスプロセッシングユニット（ＰＰＵ／ＶＰＵ）、フィジックスプロセッシングユニット（ＰＰＵ）、デジタルシグナルプロセッサ、およびネットワークプロセッサである。アプリケーションはプロセッサに結合され、試験レベルを対照レベルと比較するように構成される。この比較の出力は表示デバイスに伝送され得る。プロセッサによりアクセス可能なメモリは、生成もしくは使用されたデータまたは任意の他の情報を受信して、記憶する。メモリは、メインメモリ（高速ランダムアクセスメモリもしくはＲＡＭなど）または補助記憶装置（ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、または磁気テープドライブなど）であってよい。メモリは、任意の他の種類のメモリ（読取専用メモリもしくはＲＯＭなど）または光学記憶媒体（ビデオディスクまたはコンパクトディスクなど）であってよい。
【０１２２】
比較が行われたら、治療剤の有用性または個体の素因を特徴付けることが可能である。この特徴付けは、本明細書に示されるように、少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの生物学的活性が炎症の発症および維持に関連するため可能である。
【０１２３】
ある実施形態では、特徴付けは、個体ごとに行われ得る。別の実施形態では、特徴付けは、アプリケーションを実施するためのプロセッサおよびメモリカードを用いて行うことができる。プロセッサは、データを取り出すためにメモリにアクセスすることができる。プロセッサは、データに対して操作を実行することができる任意のデバイスであってよい。例としては、中央処理装置（ＣＰＵ）、フロントエンドプロセッサ、マイクロプロセッサ、グラフィックスプロセッシングユニット（ＰＰＵ／ＶＰＵ）、フィジックスプロセッシングユニット（ＰＰＵ）、デジタルシグナルプロセッサ、およびネットワークプロセッサである。アプリケーションはプロセッサに結合され、試験される個体を特徴付けするように構成される。この特徴付けの出力は表示デバイスに伝送され得る。プロセッサによりアクセス可能なメモリは、生成もしくは使用されたデータまたは任意の他の情報を受信して、記憶する。メモリは、メインメモリ（高速ランダムアクセスメモリもしくはＲＡＭなど）または補助記憶装置（ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、または磁気テープドライブなど）であってよい。メモリは、任意の他の種類のメモリ（読取専用メモリもしくはＲＯＭなど）または光学記憶媒体（ビデオディスクまたはコンパクトディスクなど）であってよい。
【０１２４】
本明細書に記載される予測方法は、投与される治療レジメンが炎症状態に関連する症状の予防、治療、および／または緩和において有用であるかを決定するのに有用である。治療レジメンが有用である場合、少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの生物学的活性が、治療剤の少なくとも単回量の投与により、個体において減少されると想定される。場合によって、ある程度の治療利益（複数可）を観察するために、治療剤を２回以上投与することが必要な場合がある。そのようなものとして、治療剤が、（ｉ）治療利益を提供し続ける、または（ｉｉ）２回以上投与される場合、治療利益を提供することができるかを決定するために、時間内に本方法を繰り返すことが可能である。許可される場合、治療剤の摂取前および摂取後にこの方法を実施することも可能である。
【０１２５】
本明細書に記載される予測方法は、個体が炎症状態に感染しやすい／罹患するかを決定するのに有用である。そのような方法は、個体における炎症状態の診断を提供するために、他の方法と併用して使用することができる。個体が感染しやすい／罹患している場合、少なくとも１つの炎症を可能にするポリペプチドの生物学的活性は、対照の健康な個体より高いと想定される。場合によって、素因がさらに増加する、または炎症状態が悪化し続けるかを決定するために、本方法を２回以上実施することが必要な場合がある。
【０１２６】
本明細書に提示される予測方法は、炎症を可能にするポリペプチドの活性レベルに基づき炎症状態と既に診断された個体を分類するのにも有用であり得る。本明細書に提示される予測方法は、その状態と以前に診断された（任意に処置された）個体における炎症状態の再発を判断するのにも有用である。
【０１２７】
本発明は、本明細書に記載される特徴付けおよび方法を実施するための予測システムも提供する。これらのシステムは、生物学的試料を設置するための反応槽と、コンピュータシステム中のプロセッサと、プロセッサによりアクセス可能なメモリと、プロセッサに結合されたアプリケーションとを備える。アプリケーションまたはアプリケーションの一群は、試薬のパラメータの試験レベルを受信する、試験レベルを対照レベルと比較する、および／またはこの比較の機能において治療剤／個体を特徴付けするために構成される。
【０１２８】
本発明は、コンピュータ読取可能媒体に統合されたソフトウェア製品も提供する。このソフトウェア製品は、本明細書に記載される方法に従い、個体を特徴付けるための説明書を含む。ソフトウェア製品は、生物学的試料における試薬のパラメータから試験レベルを受信するための受信モジュールと、試験レベルを対照レベルと比較するために測定モジュールから入力を受信する比較モジュールと、比較に基づき特徴付けを実施するための比較モジュールから入力を受信する特徴付けモジュールとを含む。
【０１２９】
ある実施形態では、このシステムのコンピュータシステムに見られるアプリケーションは、比較モジュールにおいて使用される。測定モジュールは、試験レベルに関して反応槽から情報を抽出／受信する。受信モジュールは、試験レベルの値（複数可）を受信し、この値が対照レベルと同一か、または異なるかを決定する比較モジュールに結合される。比較モジュールは、特徴付けモジュールに結合され得る。
【０１３０】
別の実施形態では、このシステムのコンピュータシステムに見られるアプリケーションは、特徴付けモジュールにおいて使用される。比較モジュールは、比較を受信し、この比較に基づき特徴付けを実施する特徴付けモジュールに結合される。
【０１３１】
さらなる実施形態では、受信モジュール、比較モジュール、および特徴付けモジュールは、単一の離散システムに編成される。別の実施形態では、各モジュールは、異なる離散システムに編成される。またさらなる実施形態では、少なくとも２つのモジュールは、単一の離散システムに編成される。
【０１３２】
研究ツール
【０１３３】
本発明は、変更された（例えば減少した）炎症を可能にするポリペプチド（ＩＥＰ）の発現、または突然変異体ＩＥＰの発現のいずれかに基づく研究ツールも提供する。
【０１３４】
炎症状態の特徴付けに有用であり得る研究ツールのうちの１つは、ＩＥＰの突然変異体ポリペプチドである。突然変異体ＩＥＰは、対象において発現される場合、対象における炎症状態の発症および／または維持を予防する能力を有する。突然変異体ＩＥＰは、対象における炎症状態の発症および／または維持を予防する能力を有する切詰型のＩＥＰ、同様に突然変異型のＩＥＰを含む。切詰型のＩＥＰは、野生型ＩＥＰよりアミノ酸が少なくとも１個分短いポリペプチドである。ＩＥＰの突然変異型は、野生型ＩＥＰと比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換、または付加を有するポリペプチドである。ポリペプチドまたはその断片は、他のポリペプチドと（適切な挿入および／または欠失により）最適に整列されるときに、ヌクレオチド塩基の少なくとも６０％、一般的には少なくとも７０％、より一般的には少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくはアミノ酸残基の少なくとも９５〜９８％においてヌクレオチド配列同一性が存在する場合、もう一方に「実質的に相同」または「実質的に同一」である。記載されるように、相同性または同一性比較の長さは、より長い伸長にわたってよく、ある特定の実施形態において、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１４個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、より一般的には少なくとも２４個のアミノ酸、典型的には少なくとも２８個のアミノ酸、より典型的には少なくとも３２個のアミノ酸、好ましくは少なくとも３６個以上のアミノ酸の伸長にわたる場合が多い。ある実施形態では、突然変異体ＩＥＰは、切詰型または突然変異型のＣＣＤＣ８８ＢまたはＵＳＰ１５である。例示的な突然変異体ＩＥＰの１つは、配列番号４に見られるアミノ酸配列である。
【０１３５】
使用することができる別の研究ツールは、本明細書に記載される単離されたＩＥＰまたは突然変異体ＩＥＰをコードする核酸ベクターである。本名明細書に使用される、用語「ベクター」は、発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス、またはワクシニアウイルス、細菌もしくは真菌プラスミド由来）ならびに組込みベクター（例えば、ＩＥＰの適切な発現を特異的に破壊するように設計される）。
【０１３６】
細胞（いくつかの実施形態では、単離された細胞）は、本明細書に記載される方法においても使用され得る。一部の細胞は、炎症を可能にするポリペプチド（ＩＥＰ）をコードする遺伝子に対して異型接合性であるように設計され得る。そのような細胞において、同じ遺伝子座で、２つの異なる遺伝子コピーが見出される。例えば、細胞は、ＩＥＰをコードする第１の遺伝子コピーと、ＩＥＰの突然変異体をコードする第２の遺伝子コピーとを有することができる。他の細胞は、突然変異の炎症を可能にするポリペプチド（ＩＥＰ）をコードする遺伝子に対して同型接合性であるように設計され得る。異型接合性と同型接合性の細胞の組み合わせも想定される。いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子導入細胞となり、本明細書に記載されるベクターさえも有することができる。
【０１３７】
動物（いくつかの実施形態では、それから単離された細胞および組織）は、本明細書に記載される方法においても使用され得る。一部の動物は、炎症を可能にするポリペプチド（ＩＥＰ）をコードする遺伝子に対して異型接合性であるように設計され得る。そのような細胞において、同じ遺伝子座で、２つの異なる遺伝子コピーが見出される。例えば、動物は、ＩＥＰをコードする第１の遺伝子コピーと、ＩＥＰの突然変異体をコードする第２の遺伝子コピーとを有することができる。他の動物は、突然変異の炎症を可能にするポリペプチド（ＩＥＰ）をコードする遺伝子に対して同型接合性であるように設計され得る。異型接合性と同型接合性の動物の組み合わせも想定される。いくつかの実施形態では、動物は、遺伝子導入のものとなり、本明細書に記載されるベクターさえも有することができる。
【０１３８】
治療方法
【０１３９】
本発明は、本明細書において、炎症を可能にするポリペプチド（複数可）の生物学的活性が炎症により増加され、逆に、炎症を可能にするポリペプチド（複数可）の生物学的活性の減少が炎症障害に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するのに有益であろうことを提供する。よって、少なくとも１つ（または２つまたは３つ）の炎症を可能にするポリペプチドの発現における減少が病理学的炎症応答のレベルまたは長さの低下に有益であろうと予想される。本出願は、よって、少なくとも１つのＩＥＰの生物学的活性の阻害に基づく炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するための方法、ならびに炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するためのＩＥＰの阻害剤の使用を提供する。
【０１４０】
この目的のために投与され得る薬剤は、小分子、ペプチド、抗体、核酸、それらの類似体、それらの多量体、それらの断片、それらの誘導体、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０１４１】
炎症を可能にするポリペプチドの発現を制限し、さらには停止するために、炎症を可能にするポリペプチドをコードする標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）に完全にまたは部分的に相補的であり、それとハイブリッド形成することができるアンチセンス核酸またはオリゴヌクレオチドなど、ヌクレオチドに基づく薬剤を使用することが可能である。例えば、アンチセンス核酸またはオリゴヌクレオチドは、５’または３’非翻訳領域に相補的であるか、または炎症を可能にするポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子の翻訳開始コドン（５’非翻訳および翻訳領域）と重複することができる。非限定的な例として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、次の領域とハイブリッド形成することを標的とし得る：ｍＲＮＡキャップ領域、翻訳開始部位、翻訳停止部位、転写開始部位、転写停止部位、ポリアデニル化シグナル、３’非翻訳領域、５’非翻訳領域、５’コード領域、ｍｉｄコード領域、３’コード領域、ＤＮＡ複製開始部位および伸長部位。好ましくは、相補オリゴヌクレオチドは、５’コード配列に及ぶ約１５〜３５ヌクレオチドのいずれかを含む、炎症を可能にするポリペプチドをコードする核酸分子の最も独特な５’配列とハイブリッド形成するように設計される。
【０１４２】
別の実施形態では、３本鎖核酸を含有する安定した３重らせんまたは３本鎖核酸を形成するために、２本鎖核酸（即ち、ＤＮＡ：ＤＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡ）に結合するオリゴヌクレオチドを構築することができる。そのような３本鎖オリゴヌクレオチドは、炎症を可能にするポリペプチドをコードする核酸の転写および／または発現を阻害することができる。３本鎖オリゴヌクレオチドは、３重らせん形成の塩基対合規則を用いて構築される。
【０１４３】
またさらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本方法において使用することができる。本出願の文脈において、「オリゴヌクレオチド」は、天然に生じる種、または天然に生じるサブユニットもしくはそれらの近接する相同体から形成された合成種を指す。本用語は、オリゴヌクレオチドに類似して機能するが、天然に生じない一部を有する部分も指す。よって、オリゴヌクレオチドは、改変糖部分または糖間連結を有し得る。これらの中の例としては、ホスホロチオエート、および当該技術分野において既知である種を含有する他の硫黄である。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合のうちの少なくとも１つは、活性が調節されるＲＮＡが位置する細胞の領域内に、組成物が浸透する能力を強化するように機能する構造で置換されている。そのような置換は、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、または短鎖アルキルもしくはシクロアルキル構造を含むことが好ましい。他の好ましい実施形態によると、ホスホジエステル結合は、すぐに、実質的に非イオンおよび非キラルである構造か、またはキラルおよびエナンチオマー特異的である構造で置換される。当業者は、本発明の実践において使用するための他の連結を選択することができる。オリゴヌクレオチドは、少なくともいくつかの修飾された塩基形態を含む種も含み得る。よって、通常の自然界において見られるもの以外のプリンおよびピリミジンがそのように採用され得る。同様に、ヌクレオチドサブユニットのフラノシル部分の修飾は、本発明の基本原則が守られる限り、影響を受けることができる。そのような修飾の例は、２’−Ｏ−アルキル−および２’−ハロゲン置換されたヌクレオチドである。本発明に有用である糖部分の２’位の修飾のいくつかの非限定的な例としては、ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、Ｏ（ＣＨ２）、ＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（式中、ｎは１〜約１０である）が挙げられる。そのようなオリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレオチドと機能的に交換可能であり、これは天然の構造とは１つ以上の相違を有する。全てのそのような類似体は、それらが炎症を可能にするポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子と効率的にハイブリッド形成し、その機能を阻害するように機能する限り、本明細書において想定される。
【０１４４】
代替えとして、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス、もしくはワクシニアウイルス、または様々な細菌プラスミドに由来する発現ベクターは、ヌクレオチド配列を標的臓器、組織、または細胞集団に送達するために使用され得る。当業者に既知である方法は、炎症を可能にするポリペプチドをコードする核酸配列に相補的である核酸配列を発現する組換えベクターを構築するために使用され得る。
【０１４５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ｍｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）により誘導される転写後遺伝子発現停止過程であり、遺伝子発現を調節するために使用されてきた。ＲＮＡｉは、本明細書に記載される治療方法において使用することができる。一般に、ＲＮＡｉは、細胞を２本鎖ｓｉＲＮＡまたは（ｏｕ）低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と接触させることによって実施される。しかしながら、細胞の外側のＲＮＡの操作は、ＲＮＡの感受性により、分解が面倒である。よって、ｓｉＲＮＡの１本鎖が使用されることを含む、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）組成物、または中間体ｓｉＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）も本明細書において包含される。したがって本出願は、単離されたＤＮＡ分子を提供し、これは、ｓｉＲＮＡの成分である場合、標的ＲＮＡのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する、中間体ｓｉＲＮＡをコードする少なくとも約１６ヌクレオチドの発現可能なテンプレートヌクレオチド配列を含む。本出願は、さらに、標的細胞において、炎症を可能にするポリペプチドをコードする核酸分子の発現を調節するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用に関係する。治療用途は、特定の作用様式に限定されないが、ＲＮＡｉは、転写された標的ｍＲＮＡの翻訳を防止するＲＮＡ誘導性発現停止複合体（ＲＩＳＣ）によるメッセンジャーＲＮＡ（例えば、炎症を可能にするポリペプチドの遺伝子のｍＲＮＡ）の分解を伴う場合がある。代替えとして、標的遺伝子の転写を停止するゲノムＤＮＡのメチル化を伴う場合もある。ＲＮＡｉによってもたらされる遺伝子発現の抑制は、一過性であるか、またはより安定しており、さらには永久であり得る。
【０１４６】
「低分子干渉ＲＮＡ」またはｓｉＲＮＡも、本方法において使用することができる。それは、ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」または遺伝子発現停止を媒介することができる任意の核酸分子を指す。例えば、ｓｉＲＮＡは、タンパク質発現（例えば  炎症を可能にするポリペプチド発現）と特異的に干渉するそれらの能力に関して名付けられる約１０〜３０ヌクレオチドの長さの２本鎖ＲＮＡ分子であってよい。一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡは、１２〜２８ヌクレオチドの長さ、より好ましくは１５〜２５ヌクレオチドの長さ、さらにより好ましくは１９〜２３ヌクレオチドの長さ、最も好ましくは２１〜２３ヌクレオチドの長さである。よって、好ましいｓｉＲＮＡは、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８ヌクレオチドである。本明細書で使用される、ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含有するそれらの分子に限定される必要はなく、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉により、標的細胞における炎症を可能にするポリペプチドの発現を減少するように設計され得る。ｓｉＲＮＡは、センス領域とアンチセンス領域とを含み得、アンチセンス領域は、炎症を可能にするポリペプチドをコードする核酸分子のｍＲＮＡ配列に相補的な配列を含み、センス領域は、遺伝子のｍＲＮＡのアンチセンス配列に相補的な配列を含む。ｓｉＲＮＡ分子は、２つの核酸断片から組み立てることができ、この場合、１つの断片がセンス領域を含み、第２の断片がｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。センス領域およびアンチセンス領域は、リンカー分子を介して共有結合的にも接合され得る。リンカー分子は、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ポリヌクレオチドリンカーであり得る。
【０１４７】
リボザイム（リボ核酸酵素から、ＲＮＡ酵素または触媒ＲＮＡとも呼ばれる）は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。一部のリボザイムは、治療剤として、定義されたＲＮＡ配列を標的とする酵素として、バイオセンサーとして、ならびにゲノム機能解析および遺伝子発見における用途に関して重要な役割を果たす場合がある。リボザイムは、発現が疾患により上方制御される炎症を可能にするポリペプチドをコードする核酸分子から遺伝子の転写物を特異的に切断するように遺伝的に操作され得る。
【０１４８】
遺伝子または遺伝材料の細胞への送達は、任意の障害の遺伝子療法の治療における第１のステップである。多くの送達方法が当業者に周知である。好ましくは、核酸は、インビボまたはエクスビボ遺伝子療法の使用に関して投与される。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソーム等の送達ビヒクルと錯体形成された核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。
【０１４９】
核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡに基づくウイルス系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルス負荷量を核に輸送するための高度に進化した過程を利用する。ウイルスベクターは、患者（インビボ）に直接投与されるか、またはそれらは、インビトロで細胞を処置し、その後、修飾された細胞を患者（エクスビボ）に投与するように使用され得る。核酸を送達するための従来のウイルスに基づく系は、遺伝子導入のために、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルスベクターを含み得る。ウイルスベクターは、現在、標的細胞および組織における遺伝子導入の最も効率的かつ汎用的な方法である。宿主ゲノムにおける組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ関連ウイルス遺伝子導入方法を用いて可能となり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、高い導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織において観察されている。
【０１５０】
核酸の一過性発現が好ましい用途では、アデノウイルスに基づく系が典型的に使用される。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率の能力があり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターにより、高力価およびレベルの発現を得てきた。このベクターは、比較的に単純な系において大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、ならびにインビボおよびエクスビボ遺伝子療法手順のために、細胞に標的核酸を形質導入するためにも使用される。
【０１５１】
組換えアデノ関連ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損性および非病原性パルボウイルスアデノ関連２型ウイルスに基づく有望な代替の遺伝子送達系である。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムへの組み込みによる効率的な遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特性である。
【０１５２】
複製欠乏性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生され、かついくつかの異なる細胞型を容易に感染させることができるため、一過性の発現遺伝子療法に主に使用される。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、およびＥ３遺伝子を置換し、その後、複製欠損ベクターが、トランスで欠失した遺伝子機能を提供するヒト２９３細胞において伝播するように操作される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋組織において見られるものなどの非分裂分化細胞を含む、インビボでの複数の型の組織を形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、高い運搬能力を有する。
【０１５３】
多くの遺伝子療法用途において、例えば骨髄またはリンパ球細胞などの特定の組織型に対して高度の特異性を有する遺伝子療法ベクターが送達されることが望ましい。ウイルスベクターは、典型的には、ウイルスの外面にウイルス被覆タンパク質を有する融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、所定の細胞型に対して特異性を有するように修飾される。リガンドは、目的とする細胞型に存在することで知られている受容体に対して親和性を有するように選択される。
【０１５４】
遺伝子療法ベクターは、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腫瘍内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所適用による個々の対象への投与によってインビボで送達することができる。代替えとして、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検）または普遍的なドナーの造血幹細胞などの細胞にエクスビボで送達することもでき、その後、通常はベクターを組み込んだ細胞の選択後に、細胞が対象に再移植される。
【０１５５】
一実施形態において、幹細胞は、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のために、エクスビボ手順で使用される。幹細胞を使用する利点は、それらをインビトロで他の細胞型に分化することができるか、またはそれらが適切な位置（骨髄など）に移植する哺乳類（細胞のドナーなど）に導入することができることである。例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αなどのサイトカインを使用して、インビトロでＣＤ３４＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞型に分化する方法は既知である。
【０１５６】
幹細胞は、既知の方法を用いて、形質導入および分化のために単離することができる。例えば、幹細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、ならびにｌａｄ（分化抗原提示細胞）などの望ましくない細胞に結合する抗体で骨髄細胞をパニングすることによって骨髄細胞から単離され得る。
【０１５７】
別の実施形態では、治療剤は、炎症を可能にするタンパク質の生物学的活性を制限する、またはさらには阻害することができる抗体（またはその変異体）であってよい。そのような抗体はまた、中和抗体として当該技術分野において既知である。
【０１５８】
天然に生じる免疫グロブリンは、２つの同一の軽鎖（約２４ｋＤ）と２つの同一の重鎖（約５５または７０ｋＤ）が４量体を形成する共通の核構造を有する。各鎖のアミノ末端部分は、可変（Ｖ）領域として知られ、各鎖の残部のより保存された定常（Ｃ）領域と区別することができる。軽鎖の可変領域内は、Ｊ領域として知られるＣ末端部分である。重鎖の可変領域内には、Ｊ領域に加えてＤ領域が存在する。免疫グロブリンにおけるアミノ酸配列差異の大半は、抗原結合に直接関与する超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られるＶ領域の３つの別個の位置に限局される。アミノ末端から開始して、これらの領域は、それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と指定される。ＣＤＲは、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）によって適所に保たれる。アミノ末端から開始して、これらの領域は、それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と指定される。
【０１５９】
抗体誘導体は、キメラ抗体およびヒト化抗体を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される、用語「キメラ」抗体は、２つの異なる種からの抗体に由来する抗体分子を指す。ヒト化抗体はキメラ抗体の一種である。本明細書で使用される、用語「ヒト化抗体」は、ヒトの抗体または免疫グロブリンに由来する領域と、非ヒト抗体または免疫グロブリンに由来する領域の両方を含む免疫グロブリンを指す。抗体をヒト化する作用は、非ヒト抗体の一部分をヒト抗体の対応する部分で置換することからなる。例えば、本明細書で使用されるヒト化抗体は、炎症を可能にするポリペプチドを特異的に認識することができる非ヒト領域可変領域（マウス抗体に由来する領域など）およびヒト抗体に由来するヒト定常領域を含み得る。別の例では、ヒト化免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖を含み得、軽鎖は、炎症を可能にするポリペプチドに結合する（特異的に）非ヒト起源の抗体に由来する相補性決定領域と、ヒト起源の軽鎖に由来するフレームワーク領域とを含み、重鎖は、炎症を可能にするポリペプチドに結合する（特異的に）非ヒト起源の抗体に由来する相補性決定領域と、ヒト起源の重鎖に由来するフレームワーク領域とを含む。
【０１６０】
ある実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体（例えば、単一の抗体産生クローンに由来する）であり得る。いくつかの実施形態では、本出願は、モノクローナル抗体の断片も提供する。本明細書で使用される、抗体（例えば、モノクローナル抗体）の「断片」は、抗体の完全型と同じエピトープを特異的に認識することができる抗体の一部分である。本特許出願において、抗体断片は、炎症を可能にするポリペプチドを特異的に認識することができる。抗体断片は、抗体軽鎖、単一鎖抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片を含むが、これらに限定されない。そのような断片は、酵素切断により、または組換え技法により産生することができる。例えば、パパインまたはペプシン切断は、それぞれ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を生成するために使用され得る。抗体は、１つ以上の終止コドンが天然の終止部位の上流に導入された抗体遺伝子を使用して、様々な切詰形態で産生することもできる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片の重鎖をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計され得る。抗体断片もヒト化され得る。例えば、ヒト化軽鎖は、非ヒト起源の軽鎖ＣＤＲ（即ち、１つ以上のＣＤＲ）およびヒト軽鎖フレームワーク領域を含む。別の例では、ヒト化免疫グロブリン重鎖は、非ヒト起源の重鎖ＣＤＲ（即ち、１つ以上のＣＤＲ）およびヒト重鎖フレームワーク領域を含み得る。ＣＤＲは、非ヒト免疫グロブリンに由来し得る。
【０１６１】
他の実施形態では、ポリクローナル抗体組成物が使用され得る。ポリクローナル抗体組成物は、本方法により生成されるとき、直接使用されるか、またはその使用前にさらに処理され得る。例えば、ポリクローナル抗体組成物は、さらに断片化、ヒト化、別の薬剤などに連結され得る。
【０１６２】
投与は、最終的に血液または組織細胞と接触する治療剤を導入するために通常使用される経路のいずれかによる。本明細書に記載される核酸分子は、任意の好適な様式で、好ましくは薬学的に許容される担体または賦形剤と共に投与され得る。用語「薬学的に許容される担体」、「賦形剤」、および「アジュバント」、ならびに「生理学的に許容されるビヒクル」などは、本発明の化合物と共に患者に投与することができ、その薬理学的活性を破壊しない許容される担体またはアジュバントを指すように理解される。さらに、本明細書で使用される、「薬学的に許容される担体」または「薬学的担体」は、当該技術分野において既知であり、０．０１〜０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液または０．８％の生理食塩水を含むが、これらに限定されない。加えて、そのような薬学的に許容される担体は、水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンであり得る。非水性溶液の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注入可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられ、生理食塩水および緩衝媒体を含む。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル液または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養補充薬、電解質補充薬（例えば、リンガゲルデキストロースに基づくもの）なとが挙げられる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、照合剤（ｃｏｌｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、不活性ガスなどの防腐剤および他の添加剤も存在し得る。
【０１６３】
本明細書で使用される、「薬学的組成物」は、薬学的に許容される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／または担体を伴う治療有効量（用量）の薬剤を意味する。本明細書で使用される、「治療有効量」は、所与の状態および投与レジメンに治療効果を提供するその量を指す。そのような組成物は、液体、または凍結乾燥もしくはさもなければ乾燥製剤であり、様々な緩衝内容物（例えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度、添加剤（表面の吸収を防止するためのアルブミンまたはゼラチンなど）、ならびに洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０（商標）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（商標）、胆汁酸塩）の希釈剤を含む。薬学的組成物は、薬学的に許容される可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、抗酸化剤、（例えばアスコルビン酸、二亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、充填物質もしくは浸透圧修飾剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、ポリエチレングリコールなどのポリマーのタンパク質への共有結合、金属イオンとの錯化、またはポリ酪酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのポリマー化合物の顆粒調製物中もしくはその上、あるいはリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多層小胞、赤血球ゴースト、またはスフェロプラスト上への物質の組み込みを含み得る。そのような組成物は、物理的状態、溶解性、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を与える。制御または徐放性組成物は、親油性デポー（例えば、脂肪酸、ワックス、油）の製剤を含む。ポリマー（例えば、ポロクサマーまたはポロキサミン）でコーティングされた顆粒組成物も本発明によって想定される。
【０１６４】
治療剤を投与する好適な方法が利用可能であり、当業者に周知であり、２つ以上の経路が特定の組成物を投与するために使用され得るが、特定の経路は、別の経路より即時かつ効果的な反応を提供する場合が多い。本発明の予防剤または治療剤は、経口または非経口、全身または局所のいずれかで投与され得る。例えば、点滴注入、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などの静脈内注射、坐剤、腸洗浄、経口腸溶コーティングされた錠剤等が選択され、投与方法は、患者の年齢および状態に応じて、適切に選択され得る。有効投薬量は、投与につき体重の１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲で選択される。代替えとして、患者当たり１〜１０００ｍｇ、好ましくは５〜５０ｍｇの範囲の投薬量が選択され得る。
【０１６５】
炎症を可能にするポリペプチド
【０１６６】
炎症を可能にするポリペプチド配列（およびそれに関連する核酸）は、本明細書において病理学的炎症応答の誘導および／または持続を可能にすることが示される宿主ポリペプチド（標的とも称される）を包含する。これらのポリペプチドは、疾患の原因に関わらず、任意の病理学的炎症応答に関与すると考えられる。ある実施形態では、ＩＥＰは、ＣＣＤＣ８８Ｂ、ＦＯＸＮ１、およびＵＳＰ１５を含む。さらに別の実施形態では、ＩＥＰは、ＣＣＤＣ８８、ＦＯＸＮ１、ＵＳＰ１５、ＴＨＥＭＩＳ、およびＩＲＦ８を含む。別の実施形態では、ＩＥＰは、ＣＣＤＣ８８Ｂ、ＦＯＸＮ１、ＵＳＰ１５、ＴＨＥＭＩＳ、ＩＲＦ１、ＩＲＧＭ１、およびＩＲＦ８を含む。また別の実施形態では、ＪＡＫ３は、ＩＥＰであると見なされない。核酸分子に関して、これは、ＩＥＰのコード配列と同一またはそれに相補的である配列、ならびにその配列保存および機能保存変異体を包含する。ＩＥＰに関して、これは、ポリペプチドに同一である配列ならびにその機能保存変異体を包含する。それらのそれぞれの遺伝子の変更された発現を生じないＩＥＰコード遺伝子の天然に生じる多型の対立遺伝子、および変更されたタンパク質レベル、活性、または安定性をもたらさない対立遺伝子が含まれる。
【０１６７】
機能保存変異体は、所与のコドン位置における１つ以上のヌクレオチドの変化が、ポリペプチドにおける所与のアミノ酸残基が保存アミノ酸置換に置き換えられたポリペプチド配列をもたらすものである。機能保存変異体は、所与のポリペプチド、および指定されたポリペプチドに特異的な抗体を誘発する能力を有する任意のポリペプチドの類似体も含む。
【０１６８】
配列保存変異体は、所与のコドン位置における１つ以上のヌクレオチドの変化がその位置でコードされるアミノ酸において変更をもたらさない（例えばサイレント突然変異）変異体からなる。
【０１６９】
核酸またはその断片は、他の核酸（またはその相補鎖）と（適切なヌクレオチド挿入および／または欠失により）最適に整列されるときに、ヌクレオチド塩基の少なくとも６０％、一般的には少なくとも７０％、より一般的には少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくはヌクレオチド塩基の少なくとも９５〜９８％においてヌクレオチド配列同一性が存在する場合、もう一方に「実質的に相同」または「実質的に同一」である。代替えとして、核酸またはその断片が、選択的なハイブリダイゼーション条件下で別の核酸（またはその相補鎖）とハイブリッド形成する場合、実質的な相同性または実質的な同一性が存在する。ハイブリダイゼーションの選択性は、特異性の完全欠如より実質的により選択性であるハイブリダイゼーションが起こるときに存在する。典型的に、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約９以上のヌクレオチオの伸長に対して少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性が存在する場合に生じる。記載されるように、相同性または同一性比較の長さは、より長い伸長にわたってよく、ある特定の実施形態において、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１４ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、より一般的には少なくとも２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも２８ヌクレオチド、より典型的には少なくと３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３６以上のヌクレオチドの伸長にわたる場合が多い。
【０１７０】
ポリペプチドまたはその断片は、他のポリペプチドと（適切な挿入および／または欠失により）最適に整列されるときに、ヌクレオチド塩基の少なくとも６０％、一般的には少なくとも７０％、より一般的には少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくはアミノ酸残基の少なくとも９５〜９８％においてヌクレオチド配列同一性が存在する場合、もう一方に「実質的に相同」または「実質的に同一」である。記載されるように、相同性または同一性比較の長さは、より長い伸長にわたってよく、ある特定の実施形態において、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１４個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、より一般的には少なくとも２４個のアミノ酸、典型的には少なくとも２８個のアミノ酸、より典型的には少なくとも３２個のアミノ酸、好ましくは少なくとも３６個以上のアミノ酸の伸長にわたる場合が多い。
【０１７１】
ＣＣＤＣ８８Ｂ．このＩＥＰは、８８Ｂ（ヒト遺伝子ＩＤ２８３２３４）を含有するコイルドコイルドメインとも称される。その機能は、まだ確立されていないが、フック関連タンパク質ファミリーのメンバーである。このファミリーのメンバーは、Ｎ末端潜在的微小管結合ドメイン、中央コイルドコイルド（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｅｄ）、およびＣ末端フック関連ドメインを特徴とする。コードされたタンパク質は、小器官の微小管への連結に関与し得る。アミノ酸突然変異体のこのタンパク質は、配列番号４（マウス型）として提供される。
【０１７２】
ＦＯＸＮ１．このＩＥＰは、フォークヘッドボックスＮ１、ＷＨＮ、ＲＯＮＵ、ならびにＦＫＨＬ２０とも称される。ＦＯＸＮ１は、ウィングドヘリックス転写調節因子（ヒト遺伝子ＩＤ８４５６）である。ＦＯＸＮ１マウス変異体は、胸腺の不在を示し、重度の免疫易感染性である。既知のヒトＦＯＸＮ１突然変異は、Ｔ細胞免疫不全、先天性脱毛症、および爪ジストロフィーを引き起こす。
【０１７３】
ＵＳＰ１５．このＩＥＰは、ユビキチン特異的ペプチダーゼ１５（ヒト遺伝子ＩＤ９９５８）とも称される。ＩＥＰは、脱ユビキチン化酵素のユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ）ファミリーのメンバーである。ＵＳＰ酵素は、ポリユビキチン鎖解体およびユビキチン−基質結合の加水分解によるユビキチン依存過程に重要な役割を果たす。コードされたタンパク質は、ＣＯＰ９シグナロソームと会合し、受容体活性化ＳＭＡＤ転写因子の脱ユビキチン化による成長因子βシグナル伝達の形質転換にも役割を果たす。代替えとして、複数のイソ型をコードするスプライシング転写変異体がこのＩＥＰをコードする遺伝子に関して確認された。
【０１７４】
ＴＨＥＭＩＳ．このＩＥＰは、胸腺細胞選択関連（ヒト遺伝子ＩＤ３８７３５７）としても知られる。このタンパク質は、後期胸腺細胞発達中の正および負の両方のＴ細胞選択において制御的な役割を果たすことが知られている。タンパク質は、Ｔ細胞抗原受容体シグナル伝達を通して機能し、適切な系列委託およびＴ細胞の成熟が必要であるように思われる。代替えのスプライシングは、複数の転写変異体においてその対応する遺伝子のものをもたらす。
【０１７５】
ＩＲＦ８．このＩＥＰは、インターフェロン制御因子８（ヒト遺伝子ＩＤ３３９４）としても知られる。このインターフェロンコンセンサス配列結合タンパク質（ＩＣＳＢＰ）は、インターフェロン（ＩＦＮ）制御因子（ＩＲＦ）ファミリーの転写因子である。このファミリーのタンパク質は、Ｎ末端領域の保存ＤＮＡ結合ドメイン、および制御ドメインとして機能する多様なＣ末端領域から構成される。ＩＲＦファミリータンパク質は、ＩＦＮ刺激された応答要素（ＩＳＲＥ）に結合し、Ｉ型ＩＦＮ、即ちＩＦＮαおよびＩＦＮβによって刺激される遺伝子の発現を制御する。ＩＲＦファミリータンパク質は、ウイルス感染により誘導されるＩＦＮαおよびＩＦＮβ制御された遺伝子の発現も制御する。
【０１７６】
ＩＲＦ１．このＩＥＰは、インターフェロン制御因子１（ヒト遺伝子ＩＤ３６５９）としても知られる。ＩＲＦ１は、インターフェロン制御転写因子（ＩＲＦ）ファミリーのメンバーである。ＩＲＦ１は、インターフェロンαおよびβ転写の活性化剤として機能し、マウスにおいて、これらの遺伝子の２重鎖ＲＮＡ誘導に必要とされることが示された。ＩＲＦ１は、インターフェロンα、β、およびγにより誘導された遺伝子の転写活性化剤としても機能する。さらに、ＩＲＦ１は、アポトーシスおよび腫瘍抑制の調節に役割を果たすことが示された。最後に、ＩＲＦ１は、感染および炎症の応答に関わる多くの遺伝子の転写活性化において、ＩＲＦ８と物理的に相互作用し、それとヘテロ２量体化する。
【０１７７】
ＩＲＧＭ１．このＩＥＰは、免疫関連ＧＴＰａｓｅファミリーＭ（ヒト遺伝子ＩＤ  ３４５６１１）としても知られる。これは、ｐ４７免疫関連ＧＴＰａｓｅファミリーのメンバーである。細胞内病原体に応答して自食作用形成を制御することにより、先天性の免疫応答に役割を果たすことが示唆される。この遺伝子の正常な発現に影響を及ぼす多型は、クローン病および結核に対する感受性に関連する。
【０１７８】
本発明は、その範囲を制限するのではなく、本発明を図示するために示される以下の実施例を参照することにより容易に理解されるだろう。
【０１７９】
実施例Ｉ−ＥＮＵ誘導された優性阻害突然変異における遺伝的スクリーニング
【０１８０】
Ｂｏｎｇｆｅｎらに示されるように、遺伝的スクリーニングが実施された。簡潔に、雄のＧ０のＥＮＵ変異型マウスの集団が最初に生成された。突然変異の雄を２世代に戻し交配し（Ｇ１およびＧ２）、その後、複数のＧ３系統において同型接合性を繁殖させた。次いで、脳マラリアを誘発するために、これらのマウスをプラスモディウム・ベルゲイに感染させた。完全な神経炎症応答を発達させ、神経炎症に特殊な耐性を示す（最終的にＰ．ベルゲイ抗原投与を生存した）のを防止した突然変異を有するマウスを選択し、Ｐ．ベルゲイ＜抗原投与により死亡することからマウスを保護することに関与する遺伝的形質を特定するために、それらのゲノムを配列決定した。
【０１８１】
Ｂｏｎｇｆｅｎらに示されるように、特徴付けされた最初の表現型異常系統は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１を含むサイトカイン受容体の共通γｃ鎖と相互作用する細胞質チロシンキナーゼであるＪａｋ３（Ｊａｋ３Ｗ８１Ｒ）に突然変異を保有する。この動員は、ＳＴＡＴファミリーメンバーの会合、ならびにＮＫ、ＴおよびＢ細胞における炎症経路の転写活性化に必要である。Ｊａｋ３Ｗ８１Ｒ突然変異体は、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＢ細胞数の減少、およびＣＤ４＋Ｔ細胞による炎症誘発性サイトカインＩＦＮγの産生の大幅な減少を示す。興味深いことに、ＪＡＫおよびＳＴＡＴファミリーメンバーにおける遺伝的変異体は、炎症疾患（ＩＢＤ、ＭＳ、ＲＡ、ＳＬＥ）と関連していた。加えて、Ｊａｋ３は、抗炎症薬物の既知標的であり、現在、関節リウマチ（ＲＡ）およびクローン病（ＣＤ）の臨床使用中であるＪａｋ３阻害剤（例えば、タソシチニブ、Ｐｆｉｚｅｒ）は、神経炎症を鈍らせ、Ｐ．ベルゲイに感染したＪａｋ３−／＋異型接合体の生存率を増加させることができる。したがって、ＪＡＫ３阻害剤は、Ｂｏｎｇｆｅｎらにおいて得られ、特徴付けされた遺伝的突然変異の作用を薬理学的に摸倣する。
【０１８２】
この最初の表現型異常系統は（４８番）は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１を含むリンパ球に発現された１型および２型のサイトカイン受容体の共通γｃ鎖と相互作用する細胞質チロシンキナーゼであるＪａｋ３（Ｊａｋ３Ｗ８１Ｒ）に突然変異を保有することが分かった。Ｊａｋ３のリン酸化は、Ｔリンパ球における炎症経路の転写活性化のためにＳＴＡＴファミリーメンバーの動員およびリン酸化を引き起こす。Ｊａｋ３Ｗ８１Ｒ突然変異体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＢ細胞数の減少、およびＣＤ４＋Ｔ細胞による炎症誘発性サイトカイン（ＩＦＮγ）の産生の大幅な減少を示す。興味深いことに、ＪＡＫ（炎症性腸疾患におけるＪＡＫ２）およびＳＴＡＴファミリーメンバー（ＩＢＤおよび多発性硬化症のＳＴＡＴ３、関節リウマチおよびエリテマトーデスのＳＴＡＴ４）の遺伝的変異体は、ヒトにおけるある特定の慢性炎症疾患において遺伝的危険があることが分かった。これらの結果は、Ｐ．ベルゲイ感染に関連する神経炎症から保護する突然変異のスクリーニングが抗炎症薬物発見の新規標的を特定することができることを確認した。
【０１８３】
マウスを、１５ｍｇ／ｋｇ／日のタソシチニブ（既知のＪａｋ３阻害剤）で、４日間、ｓ．ｃ．処置した。マウスは、１０６ＰｂＡ−ｐＲＢＣでの治療の５日目に感染し、治療はさらに４日間続いた（合計９日間の治療）。図１に示されるように、Ｊａｋ３＋／−異型接合体マウスの治療（感染の３日前に開始し、Ｐ．ベルゲイによる感染中７日間続いた）は、神経炎症を鈍らせることができ、Ｐ．ベルゲイ感染Ｊａｋ３＋／−異型接合体の生存を大幅に（未処置動物の０％から処置された動物の４５％に）増加することができる。これらの結果は、遺伝的スクリーニングにおいて発見された標的の薬理学的調節が同じ遺伝子における遺伝的病変の保護作用を模倣することができることを示す。これらの結果は、Ｐ．ベルゲイ感染モデルが抗炎症活性の薬物候補をスクリーニングするために使用され得ることも示す。
【０１８４】
実施例ＩＩ−ＴＨＥＭＩＳ
【０１８５】
遺伝的スクリーニングは、実施例Ｉに記載されるように実施され、さらなる保護突然変異は、ＥＲＫ１／ＥＲＫ２経路を刺激するためにリン酸化がＬｃｋおよびＧｒｂ２への結合を誘導する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に関連するタンパク質であるＴｈｅｍｉｓ（Ｉ２３Ｎ）において特定された。Ｔｈｅｍｉｓは、クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ依存抗原提示に応答するＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球によるＴＣＲ活性化、ならびにサイトカイン産生に必要である。加えて、ＥＲＫ経路（ＰＤ１８４３５２、Ｕ０１２６）の阻害剤が説明され、インビボでの試験に利用可能であり、インビボで炎症応答を調節するために使用することができる。
【０１８６】
異型接合体マウス株が産生された。
【０１８７】
実施例ＩＩＩ−ＦＯＸＮ１
【０１８８】
遺伝的スクリーニングは、実施例Ｉに記載されるように実施され、さらなる保護突然変異は、ウィングドヘリックス転写調節因子ＦＯＸＮ１において特定された。２匹のヌード耐性マウスは、エクソン６ドナー部位でスプライス部位突然変異（Ａ−ｔｏ−Ｃ）を示す。ＦＯＸＮ１マウス突然変異体は、胸腺の不在を示し、重度の免疫易感染性である一方、ヒトＦＯＸＮ１突然変異は、Ｔ細胞免疫不全、先天性脱毛症、および爪ジストロフィーを引き起こす。
【０１８９】
異型接合体マウス株が産生された。
【０１９０】
実施例ＩＶ−ＣＣＤＣ８８Ｂ
【０１９１】
遺伝的スクリーニングは、実施例Ｉに記載されるように実施され、さらなる保護突然変異は、胸腺、リンパ節、および骨髄において発現される遺伝子であるＣｃｄｃ８８ｂにおいて特定された。マクロファージにおけるＣｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡ発現は、先天性免疫受容体ＴＬＲ４（リポ多糖）およびＴＬＲ９（ＣｐＧオリゴヌクレオチド）の会合時に増加する。加えて、ＣＣＤＣ８８Ｂの発現も、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（肺）、プラスモディウム・ベルゲイ（血液、肝細胞）、およびリーシュマニア（Ｌｅｓｉｈｍａｎｉａ）（マクロファージ）による感染に応答して増加される。リンパ球細胞および骨髄系細胞におけるＣＣＤＣ８８Ｂタンパク質の機能、生化学活性、および作用機構は、未知のままである。構造的に、ＣＣＤＣ８８Ｂは、Ｎ末端潜在的微小管結合ドメイン、中央コイルドコイルド（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｅｄ）、およびＣ末端フック関連ドメインを特徴とする。これらの特徴に加えて、さらなる観察は、ＣＣＤＣ８８ＢがＴリンパ球において足場、場合によりＴ細胞受容体シグナル伝達複合体を組み立てるために必要とされるものを形成できることを示唆する。
【０１９２】
ＣＣＤＣ８８Ｂに同型接合体突然変異（エクソン２２／２３のスプライシングを抑制し、フレーム外転写物をもたらすイントロン２２のスプライス部位における突然変異）を有するマウスは、脾臓における顆粒球の数の強い減少（好中球減少）を示すことが留意された。より具体的には、同型接合性突然変異体において、ＣＣＤＣ８８Ｂのエクソン２２とエクソン２３との間のドナースプライス部位におけるＴからＣへの突然変異は、エクソン２２における突然変異の代替えのドナースプライス部位上流の活性化をもたらす。結果として、エクソン２２において５ヌクレオチドの欠失が存在し、突然変異体ポリペプチド配列においてフレームシフトを引き起こす。ＥＢＩによるオンラインのＴｒａｎｓｅｑ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎツールを用いて、フレームシフトが早期終止コドン、それによって非機能性に関連するタンパク質をもたらすことが予測される。突然変異体ＣＣＤＣ８８Ｂタンパク質の予想されたアミノ酸配列は、配列番号４として列挙される配列において提供される。
【０１９３】
ＣＣＤＣ８８Ｂまたはその突然変異体型のいずれかを発現する安定した細胞系が発達した（例えばＨＥＫ２９３ＥＶ細胞において）。異型接合体マウス株が産生された。加えて、野生型ポリペプチドまたは突然変異体ポリペプチドのいずれかに特異的なウサギポリクローナル血清が調製された。
【０１９４】
ＣＣＤＣ８８Ｂの発現は、原位置ハイブリダイゼーションによりさらに特徴付けされた。組織を４％のホルムアルデヒドに固定し、５０％脱イオンホルムアミド、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｎＭのＮａＰＯ４、１０％デキストラン硫酸、１×デンハート、合計５０μｇ／ｍｌの酵母ＲＮＡ、および５０〜８００００ｃｐｍ／μｌ３５Ｓ標識されたｃＲＮＡプローブ中で、５５℃で一晩、３５Ｓ標識されたｃＲＮＡアンチセンスおよびセンスプローブとハイブリッド形成した。組織は、５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、および１０ｍＭ  ＤＴＴ中で、６５℃で厳密な洗浄を受け、その後、３７℃で３０分間、２０μｇ／ｍｌ  ＲＮＡｓｅ  Ａで処理される前に、ＰＢＳ中で洗浄された。３７℃で１０分間、２×ＳＳＣおよび０．１×ＳＳＣ中で洗浄した後、スライドを脱水し、３日および６日間、ｘ線フィルムに並置し、その後、Ｋｏｄａｋ  ＮＴＢ核飛跡エマルジョンに浸漬し、４℃で乾燥させながら、光遮蔽箱中で１８日間露出させた。写真現像は、Ｋｏｄａｋ  Ｄ−１９で行われた。スライドは、クレシルバイオレットで軽く対染色され、明視野および暗視野光学の両方で分析される。原位置ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、以下のプローブを用いて、１０日齢のマウス（ｐ１０）で実施された。
【０１９５】
センスプローブ（配列番号５）−イタリック体はＴ７プロモーターに特異的なセクションを示す：
ＧＣＧＣＴＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＣＣＧＡＡＴＣＴＴＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣＴＴＣＴ
【０１９６】
アンチセンスプローブ（配列番号６）−イタリック体はＳＰ６プロモーターに特異的なセクションを示す： 
ＧＣＡＴＴＡＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＣＧＡＡＧＣＴＡＧＣＣＧＴＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＴＣＡ
【０１９７】
これらのマウスにおいて、Ｃｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡ発現は、胸腺（高レベルで）、脾臓および骨髄（低レベルで）、ならびに肋骨および寛骨（データ示さず）において検出された。
【０１９８】
ＩＳＨが同じアプローチで成体マウスで実施されたとき、Ｃｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡ発現の増加は、脾臓、および骨髄、ならびにリンパ節（データ図示せず）に見られた。胸腺において、Ｃｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡは、皮質（高い細胞密度で）および髄質（データ示さず）の両方で認められた。脾臓では、Ｃｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡ発現は、中心動脈の周囲のリンパ小節に近い胚中心において増加した（データ示さず）。リンパ節ではＣｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡ発現は、髄質において認められたが、リンパ濾胞においては認められなかった（データ示さず）。生成されたウサギポリクローナル血清を用いた共焦点顕微鏡により同様の結果が得られた（データ示さず）。
【０１９９】
ＩＳＨの結果を確認するために、ｑＰＣＲを実施し、Ｃｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡレベルの発現を評価した。リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）増幅は、５μＬ  ｃＤＮＡ試料、５ｕＬ  ＰｅｒｆｅＣＴａ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｑｕａｎｔａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、および順方向および逆方向プライマー各１５０ｎＭを含有する総容積１０μＬで、９６マイクロウェルプレートを用いて、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０システムで実施された。ＰＣＲ増幅は、温度サイクル：９４℃で１０分、その後、（９４℃で１５秒、および６０℃で１分）の４５サイクルを用いて、各試料に関して１つがＲＴ対照の３つ組で行われた。長さ１５０ｂｐのＣｃｄｃ８８ｂ  ｃＤＮＡは、それぞれ、５’−ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＣＧＧ  ＴＴＧ  （配列番号７）および５’−ＧＣＧ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  （配列番号８）を用いて増幅された。遺伝子発現は、５’−ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  （配列番号９）および５’−ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＡＣＴ  Ｇ  （配列番号１０）プライマーを用いて、１２２ｂｐ産物として増幅された参照遺伝子ＨＰＲＴに対して正規化された。ＨｐｒｔおよびＣｃｄｃ８８ｂの増幅効率を決定するために、１０Ｘ希釈の試料を５つ作製した。相対的な遺伝子発現は、製造者のプロトコルの通りにＰｆａｆｆｌ方法を用いて定量化され、未感染のＣ５７ＢＬ／１０脳試料に対して正規化された。
【０２００】
図２Ａに示されるように、高いＣｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡ発現は、脾臓、胸腺、骨髄、および肺に見られた。炎症に関与する臓器におけるＣｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡの発現の増加が存在するため、様々な炎症細胞型におけるＣｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡの発現が決定された。図２Ｂに示されるように、上昇したＣｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡの発現が、ＧＲ１＋  顆粒球、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋Ｔ細胞に見られた。
【０２０１】
免疫表現型は、半接合体突然変異体動物（ＣＣＤＣ８８Ｂ＋／−）に対して実施された。図２Ｃに示されるように、脾臓において、未感染の半接合体マウスにおいてＧｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋好中球の著しい減少があった。よって、ＣＣＤＣ８＊Ｂ＋／−動物は、重度の好中球減少表現型を有した。炎症負荷時、炎症細胞は脳に動員されなかったことも決定された（データ示さず）。
【０２０２】
ヒトグリア細胞および血液脳関門内皮細胞におけるＣｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡの発現が特徴付けされた。全ての組織試料はヒト癲癇患者から採取された。組織は非炎症性であった。細胞型当たり異なる個体３体が試験された。図２Ｄに示されるように、Ｃｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡの発現レベルは、サイトカイン、任意にＬＰＳとの組合せによる４８時間の刺激後に、ヒト星状細胞、小膠細胞、または血液脳関門内皮細胞において決定された。Ｃｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡの発現は、ＩＦＮγおよびＬＰＳによる刺激後、小膠細胞において増加した。Ｃｃｄｃ８８ｂのｍＲＮＡの発現は、星状細胞または内皮細胞において検出されなかった。
【０２０３】
実施例Ｖ−ＵＳＰ１５
【０２０４】
遺伝的スクリーニングは、実施例Ｉに記載されるように実施され、さらなる保護突然変異は、Ｕｓｐ１５（ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼ１５）、脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）において特定された。突然変異（Ｕｓｐ１５Ｌ７４９Ｒ）は、ＤＵＢに共通の触媒ドメインにおける高度に保存された残基での非保存的変化である。ＵＳＰ１５は、下流ＴＧＦβシグナル伝達を制御するための受容体関連細胞質ＳＭＡＤを脱ユビキチンすることが示された。炎症細胞におけるＵＳＰ１５の機能は未知であるが、タンパク質へのユビキチンの付加／タンパク質からのユビキチンの除去は、免疫シグナル伝達を制御する一般的な手段であり、ヒトの炎症疾患に関連するいくつかの遺伝子は、ユビキチン化（ＴＮＦＡＩＰ３）を制御するか、ユビキチン化タンパク質（ＴＮＩＰ１、ＵＢＡＳＨ３Ａ）に結合するか、またはユビキチン化（ＵＢＥ２Ｌ３）における酵素事象を制御するかのいずれかである。ＵＳＰ１５タンパク質は、少なくとも脳において発現されるようである。
【０２０５】
異型接合体マウス株が産生された。
【０２０６】
実施例ＶＩ−ＩＲＦ８
【０２０７】
ＩＲＦ８は、インターフェロンシグナル伝達、感染に対する応答、および樹状細胞（ＤＣ）を含む骨髄系列の成熟に中心的な役割を果たす転写調節因子のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）ファミリーのメンバーである。これは、ヘリックス・ターン・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、およびＩＲＦ会合ドメインとしても知られるトランス活性化ドメインから構成される。骨髄およびリンパ球細胞において、ＩＲＦ８は、構成的遺伝子発現を制御し、これらの細胞がＩ型またはＩＩ型インターフェロン、リポ多糖、および様々な微生物産物に曝露された後、病原体応答性転写プログラムを活性化または抑制もする。ＩＲＦ（ＩＲＦ１、ＩＲＦ４）またはＥＴＳ（ＰＵ．１）ファミリーのメンバーによるＩＲＦ８のヘテロ２量体は、それらのプロモーターにおいて、それぞれ、ＩＳＲＥ（ＧＡＡＡｎｎＧＡＡＡ）（配列番号１）およびＥＩＣＥ型の標準的なモチーフ（ＧＧＡＡｎｎＧＡＡＡ）（配列番号２）を含有する標的遺伝子のＤＮＡ結合および転写制御をもたらす。
【０２０８】
血球新生中、ＩＲＦ８は、多形核顆粒球経路の拮抗薬として機能することにより、単核貪食細胞系列（単球、マクロファージ、ＤＣ）に向かって骨髄前駆体の分化を促進する。これは、ＣＤ１１ｂ＋骨髄前駆体において、アポトーシス促進性シグナル（Ｃｄｋｎ２ｂ、Ｎｆ１、Ｂａｘ）の正の制御、および生存促進性（Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ−ＸＬ）の負の制御を通して達成される。完全（ヌル７）または重度（ＢＸＨ２マウスからのＩｒｆ８Ｒ２９４Ｃ）のいずれかのＩｒｆ８の機能突然変異の損失を有するマウスは、全クラスのＤＣであるＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α＋ＤＣおよび形質細胞様ＤＣの両方の完全なまたは部分的な不在を示し、Ｇｒ１＋／ＣＤ１１ｂ＋顆粒球前駆体の拡大によって支配される慢性骨髄白血病様表現型を呈する。加えて、ＩＲＦ８は、これらの抗原提示細胞の特定の機能に主要な役割を果たす生化学経路を含む、Ｂリンパ球系列の特定、傾倒、および分化に必要であることが示された。
【０２０９】
感染に関連して、ＩＲＦ８は、常在骨髄系細胞の抗菌防衛の活性、炎症誘発性シグナルの伝播、およびこれらの細胞による初期免疫応答の増幅に必要である。ＩＲＦ８は、ＩＦＮγに応答してＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ１２ｐ３５、およびＩＬ−１８遺伝子の発現に必要であるため、早期免疫応答の抗原提示細胞媒介Ｔｈ１極性化に必須である。よって、Ｉｒｆ８欠乏マウスは、、欠損Ｔｈ１応答（抗原特異的ＣＤ４＋の不在、Ｔ細胞を産生するＩＦＮγ）を呈し、Ｔｈ１７応答の強化を示し、結核および血液期マラリアを含む多くの細胞内病原体によるインビボ感染に感受性である。さらに、全ゲノム転写プロファイリング、クロマチン免疫沈降実験、および個々の遺伝子研究は、ＩＲＦ８が、抗原認識および処理を含む単核貪食細胞における抗菌防御、食胞成熟、リソソーム酵素の産生、および他の細胞質殺菌経路のいくつかの態様を制御することを示す。結果として、Ｉｒｆ８欠乏マクロファージは、様々な細胞内病原体によるエクスビボ感染に非常に感受性である。
【０２１０】
ヒトにおけるＩＲＦ８突然変異は、Ｉｒｆ８突然変異体マウスにおいて認められるものに非常に類似する病態を引き起こし、概して骨髄系細胞、特にＤＣに影響を及ぼす。１人の患者において、転写的に不活性であり、ＤＮＡ結合不全ＩＲＦ８突然変異体（ＩＲＦ８Ｋ１０８Ｅ）の同型接合性は、重度および再発性の周産期の細菌および真菌感染、リンパ節および骨髄における血中単球およびＤＣの不在、ならびにインビトロでの血液細胞の刺激後のＩＬ−１２およびＩＦＮγ産生の欠如に関連した。ＩＲＦ８欠乏（ＩＲＦ８Ｔ８０Ａ）の軽度の常染色体優性形態も、近年、Ｍ．ボビスＢＣＧの周産期ワクチン接種後、マイコバクテリア感染の再発エピソードを患うＭＳＭＤ患者２人（抗酸菌易感染性を示すメンデル型遺伝性疾患）において発見された。これらの患者は、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１ｃ＋ＤＣサブセットの選択的枯渇、および循環末梢血細胞によるＩＬ−１２の障害性産生を有する。ＩＲＦ８Ｔ８０Ａ変異体は、負の優性を呈し、ＮＯＳ２およびＩＬ−１２などの既知の転写標的の野生型ＩＲＦ８のトランス活性化の可能性を抑制することができる。最後に、最近の全ゲノム関連研究（ＧＷＡＳ）による結果は、重要な炎症成分を伴う多くのヒト疾患の複雑な遺伝的原因におけるＩＲＦ８の役割を指摘した。強い、独立して複製された会合が、全身性エリテマトーデス、クローン病（ＣＤ）、および多発性硬化症（ＭＳ）の患者のＩＲＦ８内またはその付近の多形変異体間で検出された。ＭＳ患者の一研究において、ＩＲＦ８の感受性対立遺伝子は、高いＩＲＦ８ｍＲＮＡ発現に関連する。
【０２１１】
プラスモディウム・ベルゲイＡＮＫＡ（ＰｂＡ）による感染によって誘導された脳マラリア（ＣＭ）の実験モデルは、病理学的炎症におけるＩＲＦ８の役割を調査するために使用された。このモデルにおいて、ＰｂＡ感染された赤血球の脳の微小血管系への付着は、急性および急速に致命的な神経炎症をもたらし、その症状は、感染後ｄ５〜ｄ８の間に現れ始める振戦、運動失調、および痙攣を含む。ＩＲＦ８欠乏ＢＸＨ２マウス（Ｉｒｆ８Ｒ２９４Ｃ）は、いずれの神経症状も発達させず、ＰｂＡ誘導されたＣＭに完全に耐性である。高処理ＤＮＡ配列決定に結合されたＩＲＦ８クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）と共に、野生型Ｃ５７ＢＬ／６およびＩｒｆ８欠乏ＢＸＨ２マウスのＰｂＡ感染された脳における比較転写プロファイリング研究は、発現が急性ＣＭ関連神経炎症に関連するが、Ｍ．ツベルクローシスに感染した肺において活性化されたことも分かった主要なＩＲＦ８標的のリストを特定した。ＣＭ病態におけるこれらの遺伝子のうちのいくつかの役割は、Ｐ．ベルゲイに感染した対応するマウス突然変異体において、インビボで確認された。これらの研究は、ＣＭ中の急性神経炎症の主要な調節因子としてＩＲＦ８を特定した。
【０２１２】
マウス。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）、ＢＸＨ２、ＩＩ１２ｐ４０−／−、Ｉｒｆ１−／−、およびＩｓｇ１５−／−突然変異体マウスは、最初に、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。Ｓｔａｔ１−／−突然変異体マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から購入した。Ｉｆｎｇ−／−欠乏マウスは、Ｄｒ．Ｍ．Ｍ．Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手し、Ｉｆｉｔ１−／−突然変異体マウスは、Ｄｒ．Ｍ．Ｄｉａｍｏｎｄ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ）から入手し、Ｉｒｇｍ１−／−は、Ｄｒ．Ｊ．Ｄ．ＭａｃＭｉｃｋｉｎｇ（Ｙａｌｅ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）から入手し、Ｎｌｒｃ４−／−は、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｄｒ．Ｒ．Ａ．Ｆｌａｖｅｌｌ（Ｙａｌｅ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）から入手した。全てのマウスは、無菌状態下に保たれ、カナダ動物管理協会（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）の指針および規則に従い取り扱われた。
【０２１３】
寄生虫および感染Ｐ．ベルゲイＡＮＫＡは、Ｍａｌａｒｉａ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＭＲ４）から入手し、−８０℃で保管された。実験的感染前に、Ｐ．ベルゲイＡＮＫＡは、末梢血寄生虫血レベルが３〜５％に達するまでＢ６マウスにおいて継代され、その時点で動物をＣＯ２吸引により安楽死させ、失血させ、感染性ストックを調製した。全ての実験的感染は、１０６寄生虫感染赤血球（ｐＲＢＣ）を用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を介して行われた。血中寄生虫血は、感染中、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（商標）（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ，ＵＳＡ）で染色した薄層血液塗抹の顕微鏡検査により監視された。脳マラリア（ＣＭ）に関連する神経症状（振え、振戦、被毛の乱れ、痙攣）の現れは、慎重に監視され、罹患動物は直ぐに屠殺された。生存曲線は、カプラン・マイヤー統計を用いて比較された。
【０２１４】
エバンズブルー色素溢出アッセイ。実験的ＣＭ中の血液脳関門の完全性を監視するために、対照ならびにＰｂＡ感染Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＸＨ２マウスの群は、感染後ｄ７およびｄ１６に（ＢＸＨ２のみ）減菌リン酸緩衝生理食塩（ＰＢＳ）中０．２ｍｌの１％エバンズブルー色素（Ｅ２１２９；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）をｉ．ｐ．注射された（ｎ＝３マウス／状態）。色素を１時間循環させ、次いで、マウスをＣＯ２吸引により屠殺し、ＰＢＳで灌流し、脳を切断し、撮影した。脳における色素の蓄積を定量化するために、組織を量り、色素を１ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で４８時間抽出し、その後、ＯＤ６２０で光学密度を測定した。同時に標準曲線を作成し、各抽出した試料溶液中の色素の濃度を計算するために、線形回帰を使用した。未感染マウスも色素を注射され、灌流し、対照として切断した。
【０２１５】
血清サイトカイン。それぞれ野生型Ｂ６、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、および突然変異体ＢＸＨ２の５匹の雄のマウスを、１０６  Ｐ．ベルゲイ  ＡＮＫＡ  ｐＲＢＣでｉ．ｐ．感染し、感染６日後、マウスを屠殺し、血清を収集した。ＥＬＩＳＡ系の市販（Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ａｓｓａｙ（商標）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の試薬を用いて、循環サイトカインＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ１２ｐ７０、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）、ＭＩＰ−１β（ＣＣＬ４）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＴＮＦ−α、およびＶＥＧＦのレベルを測定した。
【０２１６】
転写プロファイリング。感染前（ｄ０）または感染後７日（ｄ７）のいずれかにＢ６およびＢＸＨ２マウスから全脳を切断した（ｎ＝３／状態）。製造者の指示に従い、ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）を用いて全脳ＲＮＡを単離し、その後、ＲＮｅａｓｙ（商標）カラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）でさらに精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｏｕｓｅＷＧ−６  ｖ２．０マイクロアレイ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｑｕｅｂｅｃ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）とハイブリッド形成した。教師なし主成分分析は、ｖｓｔ（分散安定化変換）で変換し、四分位正規化を行うためにｌｕｍｉパッケージを用いて、Ｒで行われた。他の分析に関して、マイクロアレイ発現データは、ＧｅｎｅＳｉｆｔｅｒ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ）ソフトウェアを用いてｌｏｇ２変換され、中央値正規化され、分析された。発現が株依存、感染依存、および／または相互作用様式で調節される遺伝子を特定するために、ペアワイズ（ｔ検定、≧２倍カットオフ、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正されたｐａｄｊ値＜０．０５）または２因子ＡＮＯＶＡ（≧２倍カットオフ、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正されたｐａｄｊ値＜０．０５）のいずれかを用いて、群を比較した。差次的に発現された遺伝子のリストは、Ｍｕｌｔｉ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｖｉｅｗｅｒを用いて、倍率変化によりクラスター化された。
【０２１７】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）。Ｊ７７４マウスマクロファージ細胞系を、完全ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で８０％のコンフルエンスに成長させた。１５０ｍｍ組織培養グレードのペトリ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）で平板培養した細胞を、４００Ｕ／ｍｌのＩＦＮγ（Ｃｅｌｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）およびＣｐＧ  ＤＮＡオリゴヌクレオチド（５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’）（配列番号３）で３時間処理した。変更をいくつか加えて、前述のようにクロマチン免疫沈降を実施した。簡潔に、処理された細胞を、培養培地中で１％のホルムアミドで１０分間、２０ｏＣで架橋した。架橋は、０．１２５Ｍのグリシンを含有する氷冷ＰＢＳで５分間停止された。核を調製し、クロマチンをＢｒａｎｓｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）で２５０ｂｐの平均サイズに音波処理した。音波処理されたクロマチンを、２０μｌのプロテインＡと、６μｇの正常なヤギＩｇＧ（ｓｃ−２０２８）またはＩＲＦ８（ｓｃ−６０５８ｘ）抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）と予め結合された２０μｌのプロテインＧ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の混合物と共に、回転台上で一晩、４℃でインキュベートした。免疫複合体を、１ｍｌの次の緩衝液で、室温で２分間、順次洗浄した：洗浄Ｂ（１％トリトンＸ−１００、  ０．１％  ＳＤＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８）、洗浄Ｃ（１％トリトンＸ−１００、０．１％  ＳＤＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８）、洗浄Ｄ（１％  ＮＰ−４０、２５０ｍＭ  ＬｉＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、およびＴＥＮ緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）。架橋後、製造者の手順に従い（Ｑｉａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｃａ）、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ精製カラムで精製した。既知のＩＲＦ８結合部位に関して、ＩｇＧ対照に対するＩＲＦ８  ＣｈＩＰ効率を、Ｐｅｒｆｅｃｔａ  ＳＹＢＲ（商標）緑色ＰＣＲキットＱｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、ｑＰＣＲにより評価した。
【０２１８】
ＣｈＩＰ−ｓｅｑ調製および分析。各状態の合計８つの独立したＣｈＩＰをプールした（ＩＲＦ８およびＩｇＧ）。Ｉｌｌｕｍｉｎａの推奨に従い（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＩＲＣＭ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙによりライブラリおよびフローセルを調製し、サイズ選択ステップは、２５０〜５００ｂｐの間の断片を標的とした。ＣｈＩＰライブラリは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００配列決定装置により配列決定された。ＩｇＧ対照およびＩＲＦ８試料について、それぞれ、８６００万および７９００万の５０ｂｐ配列リードの配列決定を得た。リードは、次の：−ｔ  −−ｓｏｌｅｘａ１．３−ｑｕａｌ  −−ｓａｍ  −−ｂｅｓｔ  ｍｍ９のパラメータを用いて、Ｂｏｗｔｉｅを使用して、マウスｍｍ９ゲノムアセンブリにマッピングされた。マッピングの効率は、ＩｇＧについては９１．７％、そしてＩＲＦ８試料については９１．９％であった。ＩＲＦ８の結合ピークを特定するために、我々は、次の：−−ｂｗ  ２５０  −−ｍｆｏｌｄ  ７，３０  −−ｐｖａｌｕｅ  １ｅ−５  −ｇ  ｍｍに従い、ＭＡＣＳ１．４．１ピークファインダーを使用した。この分析により、ＩＲＦ８によって結合された１１２１６ゲノム領域を得、ｐ値は、１０−５の閾値を下回った。発現プロファイリング実験のＰｂＡ感染においてより影響を受けたと特定された遺伝子は、遺伝子転写開始部位（ＴＳＳ）周囲に２０ｋｂ間隔でＩＲＦ８結合ピークの存在を必要とした。この分析は、ＩＲＦ８ピークの周囲遺伝子との背景関連を評価するために、マイクロアレイ実験に使用されたＩｌｌｕｍｉｎａマウスＷＧ−６  ｖ２．０アレイに表される遺伝子全てに対しても実施された（図６）。
【０２１９】
ＢＸＨ２は、Ｉｒｆ８（Ｉｒｆ８Ｒ２９４Ｃ）に重度に低形質の対立遺伝子を保有し、顆粒球過形成、単核貪食細胞の欠失、および感染に対する感受性として発現される骨髄欠損をもたらすＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）およびＣ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｃ３Ｈ）親に由来する組換え近交系マウス株である。Ｉｒｆ８の病理学的炎症に対する寄与を評価するために、ＢＸＨ２（ｎ＝１８）ならびに親対照マウスＢ６（ｎ＝１９）およびＣ３Ｈマウス（ｎ＝１０）を、脳マラリア（ＣＭ）のマウス作用物質であるＰ．ベルゲイＡＮＫＡに感染させた。血中における寄生虫複製、ＣＭの神経症状の現れ、および全体的な生存率を、１８日にわたって感染したマウスにおいて記録した（図３）。全てのＢ６およびＣ３Ｈマウスの８０％がＣＭを発達させ、９日目までに死亡したが、ＢＸＨ２マウスは、寄生虫の未制御の血液期複製によって生じる高度貧血（ｈｙｐｅｒａｎｅｍｉａ）で後に死亡するＣＭ期に完全に耐性であった（図３ＡおよびＤ）。［ＢＸＨ２×Ｂ６］Ｆ１マウス（ｎ＝１５）は、感受性Ｂ６およびＣ３Ｈ親対照と比較した場合とき、ＰｂＡ誘導されたＣＭに顕著な耐性を示し、約５０％の動物が９日目を超えて生存し（ｐ＝０．０３対Ｃ３Ｈ、ｐ＜０．０００１対Ｂ６）、ＢＸＨ２のＣＭ耐性形質が共優性様式で遺伝することを示唆する。［ＢＸＨ２×Ｂ６］Ｆ２マウス（ｎ＝１７）の少数群の追加の表現型は、Ｉｒｆ８Ｒ２９４Ｃ対立遺伝子に対して同型接合体または異型接合体のいずれかのマウスにおいてのみＣＭ耐性を確認し、保護作用が、ＢＸＨ２の混合Ｂ６／Ｃ３Ｈ遺伝的背景の寄与が最小である、または寄与がないＩｒｆ８Ｒ２９４Ｃ突然変異によることを確認した。これらのデータは、ＩＲＦ８機能の部分的または完全な損失がこのＣＭ関連神経炎症モデルの致死からマウスを保護することを示す。それらは、Ｉｒｆ８Ｒ２９４Ｃ突然変異のＣＭ保護作用が共優性様式で遺伝することも確認する。
【０２２０】
以前の報告は、ＰｂＡ感染マウスにおける致死性ＣＭが、血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性の損失を含む内皮機能不全に関連することを示した。エバンズブルー色素溢出試験を使用して（図３ＢおよびＣ）、ＰｂＡ感染Ｂ６マウスが、ｄ７までに明らかなＢＢＢ透過性を示し、感染ＢＸＨ２マウスがＢＢＢの完全性を保持し、未感染マウスと比較可能なレベルの感染中の初期（７日目）および後期（１６日目）の両方において、エバンズブルー色素を遮断したことが留意された（図３ＢおよびＣ）。ＢＸＨ２マウスにおけるＣＭの耐性は、生存Ｂ６およびＣ３Ｈのように寄生虫負荷の減少に関連せず（図３Ｄ）、同様に、ＢＸＨ２および［ＢＸＨ２×Ｂ６］Ｆ１は、感染後５、７、および９日目に類似する循環血液寄生虫血を示した（ｐ＞０．１）。しかしながら、感染が進行するにつれて、ＢＸＨ２マウスの一部は、生存対照および［ＢＸＨ２×Ｂ６］Ｆ１とは対照的に、非常に高いレベルの血液寄生虫血（ｄ１２〜２１の間）を発達させた。脳炎症ではなく、この高い寄生虫血は、観察された死亡率に関与した。これらの結果は、ＩＲＦ８活性の損失は脳マラリアを防いだが、感染後期のＰｂＡの血液期複製を制御するために必要であり、［ＢＸＨ２×Ｂ６］Ｆ１における部分的ＩＲＦ８機能が高血液期複製を防ぐのに十分であることを示す。
【０２２１】
同じ群の個々のマウス間で実質的な差異が存在するが、血清サイトカイン分析は、感染６日後、ＢＸＨ２マウスにおけるＰｂＡへの耐性がＴＮＦ−α（Ｃ３Ｈ対照と比較して、ｐ＜０．００１）およびＩＦＮγ（Ｂ６対照と比較して、ｐ＝０．０７）のレベルの減少に関連することを示すが、これらの相違は他の親対照に関して統計的な有意性に達しなかった。ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｐ７０、およびＶＥＧＦの平均レベルは、検出のアッセイ限界を下回り、血清レベルにおける差は、他の試験されたサイトカイン（ＩＬ−１０、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β）およびＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ））の間で検出されなかった（図４）。
【０２２２】
神経炎症中に主要な病理学的役割を果たし、発現がＩＲＦ８によって制御される遺伝子、タンパク質、および経路へのさらなる見解を得るために、いくつかの実験が行われた。最初に、ＰｂＡ感染前、または感染中のいずれかで、ＢＸＨ２およびＢ６マウスの脳において差次的に制御される遺伝子を特定するために、転写プロファイリングが使用された。主要成分分析（ＰＣＡ）は２軸に沿って試料をクラスター化した：分散の３９．４％を説明し、感染状態（感染成分）に関連する成分１、および分散の２４．４％を説明する株（遺伝子成分）と類似する成分２（図５Ａ）。ＰＣＡは、ＰｂＡ感染がＢＸＨ２よりＢ６マウスにおいて転写プロファイルに非常に強い影響を有することも示し、Ｂ６のｄ７感染試料は、遠く離れたアウトグループを形成した。逆に、ＢＸＨ２のｄ７クラスターは、感染により適度に移動しただけであり、ＢＸＨ２によるはるかに適度な応答を示す、ＢＸＨ２のｄ０群の非常に近くに留まった（Ｂ６のｄ０対Ｂ６のｄ７と比較して）。病理学的神経炎症に関する強い変更を含む遺伝子リストを抽出するために、ペアｔ検定は、Ｂ６およびＢＸＨ２マウスの両方における感染による転写応答変化を評価するために使用された。ＰＣＡによって示唆されるように、感染に対するＢ６の応答は頑強であり、２９６の独特の遺伝子が発現において統計的に有意な相違を示す（ｄ０対ｄ７；倍率変化≧２、ｐａｄｊ＜０．０５）。一方、ＢＸＨ２における感染に対する応答は適度であり、８１の遺伝子が統計的な有意性に達した。ＢＸＨ２において感染により制御された遺伝子の半分以上（ｎ＝４８）は、Ｂ６セットに共通し、ＩＲＦ８独立制御機構に対応し得る。この分析は、感染前のＢ６対ＢＸＨ２マウスの発現において有意な相違を示す１１７の遺伝子のサブセットも特定した。これらの「遺伝的に制御された」遺伝子の約１０％のみ（ｎ＝１６）が、Ｐ．ベルゲイ感染によってさらに有意に調節された（図４Ｂ）。重要なことは、この分析は、感染によりＢ６マウスにおいて独特に制御された２３１の遺伝子のサブセットも特定した。
【０２２３】
ＣＭ関連神経炎症表現型におけるＩｒｆ８の役割を調査するために、脳における遺伝子発現の基礎レベル（０日目のＢ６対ＢＸＨ２）およびＰｂＡに対する関連誘導転写応答の両方の相違を構成する、２因子ＡＮＯＶＡを実施した（図５Ｃ）。この分析は、Ｉｒｆ８依存様式の感染により強く制御された（ｐａｄｊ−相互作用＜０．０５）合計１０７の遺伝子（１２３のプローブ；倍率変化≧２、ｐａｄｊ＜０．０５）を特定した（図５Ｃ、表１）。この遺伝子リストのユークリッド階層型クラスタリングは、主な３つの転写物のカテゴリーを特定した。群１の遺伝子（ｎ＝１５）は、両方の株において感染により上方制御され（ＢＸＨ２よりＢ６においてより明白な上方制御）、群２の遺伝子は、Ｂ６マウスにおいて感染により上方制御されたが、ＢＸＨ２（ｎ＝６２）において顕著に誘導されず、群３の遺伝子（ｎ＝３０）は、感染により下方制御された（ＢＸＨ２と比較して、Ｂ６において強く抑制された）。株および感染により制御された遺伝子の完全なリストを検査するために、オンラインのＤａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＤＡＶＩＤ）ツールを使用して、免疫応答の実質的な富化（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＷＧ−６  ｖ２．０チップ背景よりも４．４倍富化、ｐａｄｊ＝３．３ｘ１０−１２）、抗原処理および提示（１１．０倍富化、ｐａｄｊ１．４ｘ１０−９）、防御応答（３．８倍富化、ｐａｄｊ＝１．７ｘ１０−８）、走化性（５．２倍富化、ｐａｄｊ＝３．４ｘ１０−３）、および炎症応答（３．６倍富化、ｐａｄｊ＝３．７ｘ１０−３）を示した。これらのリストの上方制御遺伝子は、Ｃｘｃｌ９、Ｃｘｃｌ１０、Ｃｃｌ４、およびＣｃｌ１２などの、骨髄およびリンパ球細胞を感染部位および／または組織損傷部位に動員する強力な炎症誘発性化学誘引物質ケモカイン、微生物の食作用（Ｆｃｇｒ４、低親和性ＩｇＧ受容体）および食胞の成熟（低分子ＧＴＰａｓｅｓ  Ｉｇｔｐ、Ｉｒｇｍ１、Ｇｂｐ２、Ｇｂｐ３）に関連する骨髄系細胞におけるタンパク質、ＩＲＦ８のヘテロ２量体化パートナー（Ｉｒｆ１）、ならびに早期Ｉ型インターフェロン応答（Ｏａｓｌ２、Ｉｆｉｔ３）を含む。これらの免疫および炎症応答の分類に含まれる遺伝子は、ＢＸＨ２マウスよりＢ６マウスにおいて高レベルで発現されることが分かり、ＢＸＨ２におけるＣＭ関連神経炎症に対する耐性がＩＲＦ８依存炎症および先天性免疫応答の減少に関連し、骨髄コンパートメントが強く関与するという意見と一致する。
【０２２４】
【表１−１】
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【表１−２】
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【０２２５】
全脳ＲＮＡが使用されたため、Ｉｒｆ８依存様式で感染に応答して差次的に制御される遺伝子は、ＩＲＦ８の直接転写標的を表すか、またはＢ６およびＢＸＨ２マウスにおける感染の部位に差次的に動員される細胞集団のマーカーに対応する二次標的であり得る。感染に応答して、Ｉｒｆ８によって直接または間接的に制御される遺伝子と遺伝子を区別するために、我々は、全ゲノムＩＲＦ８結合部位をマッピングした。このために、クロマチン免疫沈降を実施し、その後、ＣｐＧおよびＩＦＮγで処理した培養マクロファージで高処理配列決定（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）を行った。得られた配列リードをｍｍマウス参照ゲノムにマッピングし、ＭＡＣＳピーク検索アルゴリズムを使用して、ＩＲＦ８結合ピークを特定した。ＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果を調査するために、ＩＲＦ８の動員が、独立したＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ実験によりいくつかの既知の標的部位で確認された（図６Ａ）。ＩＲＦ８結合遺伝子のリスト（転写開始部位から２０ｋｂウィンドウ内のＩＲＦ８結合部位を含有するように特定される）は、株、感染、および推定的にＩｒｆ８依存様式で、ＰｂＡにより差次的に制御された遺伝子のリストと交差された（図５Ｃ）。この交差は、感染中に上方制御された遺伝子のＩＲＦ８結合部位の強い富化を明らかにし、ＩＲＦ８結合部位は、群１の遺伝子の８５％（１３／１５）、および群２の遺伝子の５０％（３１／６２）において検出された（表１）。逆に、差次的に下方制御された遺伝子は、いかなる富化も示さず、群３の遺伝子の１３％（４／３０）のみがＩＲＦ８ピークに関連し、背景ピーク関連より低かった（Ｉｌｌｕｍｉｎａアレイに表された全ての遺伝子の２１％、図６Ｂ）。これらの結果は、神経炎症中、ＰｂＡ感染に対するこの病理学的応答に主要な役割を果たす遺伝子の発現を上方制御するために、ＩＲＦ８が直接転写活性化剤として機能することを強く示唆する。
【０２２６】
発現がＩｒｆ８コンピテントＢ６マウスにおいて制御される全ての遺伝子リストは、ＩＲＦ８結合部位の存在について、およびＣＭ易罹患性および神経病理に関連するＩＲＦ８結合遺伝子を特定するために、ＰｂＡに応答して（感染制御遺伝子、Ｂ６ｄ７／ｄ０のペアワイズ比較）追加で質問された。図６Ｂに示されるように、この分析は、感染によって上方制御された遺伝子の近くでＩＲＦ８結合部位に関して非常に強い富化を示し（ｐ＜０．０００１、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定）、上方制御された遺伝子の７４％（９２／１２５）はＴＳＳの２０ｋｂ以内に１つ以上のＩＲＦ８結合部位を有する（図６Ｃに提供されるＩＲＦ８結合プロファイル例と共に図６Ｂ）。感染に応答して下方制御を示す遺伝子は、背景を上回るそのような任意の富化を示さなかった（図６Ｂ）。Ｂ６マウスにおいて神経炎症中に感染によって制御された遺伝子のリストを機能的に検査するために、ＡＭＩＧＯ遺伝子オントロジーアノテーションツールを使用した（図５Ｄおよび表２）。このリストは、炎症および先天性免疫応答に関与する遺伝子に偏っており、これは、感染部位に対する骨髄およびリンパ系細胞型の走化性（Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ５、Ｃｃｌ７、Ｃｃｌ１２、Ｃｘｃｌ９、Ｃｘｃｌ１０）、初期先天性免疫認識および応答（Ｎｌｒｃ５、Ｉｆｉ２０５）、ウイルス感染に対する応答（Ｏａｓｌ２、Ｍｘ２、Ｏａｓ１ｇ）Ｉ型インターフェロン応答性遺伝子および経路（Ｉｆｉｔ２、Ｉｆｉｔ３、Ｉｓｇ１５、Ｒｓａｄ２）、ならびに抗原捕捉（Ｃ１ｑ、Ｃ４ｂ、Ｆｃｅｒｇ１）、食胞成熟（Ｉｒｇｍ１、Ｉｒｇｍ２、Ｉｇｔｐ、Ｇｂｐ２、Ｇｂｐ３）、抗原処理（Ｔａｐ１、Ｔａｐ２）、および骨髄系細胞におけるクラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ依存抗原提示（Ｂ２ｍ、Ｈ２−Ａｂ１、Ｈ２−Ｄ、Ｈ２−Ｋ、Ｈ２−Ｌ、Ｈ２−Ｑ、Ｈ２−Ｔ２２）に関与する炎症サイトカインおよびケモカインを含むＩＲＦ８結合遺伝子のサブセット（７４％）においてさらにより明白である。さらに、抗原刺激または危険シグナル（Ｉｒｆ１、Ｉｒｆ７、Ｉｒｆ９）に対する初期応答に関与する他のＩＲＦファミリーメンバーも誘導された（表２）。これらの結果は、ＰｂＡ感染に見られる宿主駆動病理学的神経炎症の根底にある炎症誘発性遺伝子および関連する経路の転写活性化剤としてのＩＲＦ８の主要な役割を支持する。これらのＩＲＦ８制御された炎症誘発性経路は、主に骨髄系細胞コンパートメントに関係すると思われる。
【０２２７】
【表２−１】
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【表２−２】
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【０２２８】
表２において特定された宿主応答経路の関与は、脳マラリアに独特ではないため、病理学的神経炎症中（ｄ７／ｄ０）のＢ６の脳における感染によって制御された遺伝子のリストは、マイコバクテリウム・ツベルクローシス感染Ｂ６マウス（ｄ３０／ｄ０）の肺における保護的応答に寄与する遺伝子のリストと比較された（表３）。Ｂ６およびＢＸＨ２マウスは、Ｂ６がＣＭに感受性であるが、Ｍ．ツベルクローシスに耐性である一方、ＢＸＨ２がＣＭに耐性であるが、Ｍ．ツベルクローシスに感染したときに播種されたマイコバクテリ疾患で非常に迅速に死亡する２つの疾患モデルにおいて反対の表現型を有する。際立って、ＣＭ中２倍を超えて上方制御された１２３の遺伝子のうち、６６もＭ．ツベルクローシス感染中≧２倍上方制御された（ｐ＜０．０００１，Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定）。下方制御遺伝子において最低限の重複があった（２１のＭ．ツベルクローシス制御された遺伝子が１７０のＰｂＡ制御された遺伝子と重複した）。両方の感染により上方制御された遺伝子を見ると、圧倒的多数（８０％）が少なくとも１つのＩＲＦ８結合部位を含有し、再度、炎症中および感染に対する宿主応答のＩＲＦ８の中心的役割を強調した（表３）。
【０２２９】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表３−１２】
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【表３−１３】
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【表３−１４】
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【表３−１５】
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【０２３０】
最後に、先天性免疫および病理学的神経炎症における特定されたＩＲＦ８標的および関連経路の役割を確認するために、ＰｂＡ感染に対する感受性は、これらの遺伝子座に無発現変異を有するマウス株において表現型化された。これらは、ＩＲＦ８結合部位を有する感染制御された遺伝子（Ｉｒｆ１、Ｉｆｉｔ１、Ｉｓｇ１５、Ｉｒｇｍ１、およびＮｌｒｃ４）、および初期先天性免疫応答において主要な役割を果たすことが知られる他の遺伝子（Ｉｆｎｇ、Ｊａｋ３、Ｓｔａｔ１、ＩＩ１２ｐ４０）を含んだ。これらの実験からの結果（図７）は、ＩＦＮγ−／−、ＪＡＫ３−／−、およびＳＴＡＴ１−／−  突然変異体マウスがＰ．ベルゲイ感染に完全に耐性であり、ＣＭを発達させないことを示し、病理学的炎症応答の進行または増幅においてこれらの分子の主要な役割を強調する。Ｉｒｆ１およびＩｒｇｍ１の損失は、神経症状の現れを遅らせ、ＰｂＡ感染マウスの生存を延長させた。これらの結果は、リンパ系および骨髄系細胞におけるＰｂＡ感染中に活性化されたＩＲＦ８の転写標的のいくつかが神経炎症に重要な役割を果たすことを示す。一方、ＩＬ１２ｐ４０−／−、ＩＦＩＴ１−／−、ＩＳＧ１５−／−、およびＮＬＲＣ４−／−突然変異体マウスは、ＰｂＡ誘導されたＣＭに対して感受性を維持し、これらのタンパク質が神経炎症において重要な役割を果たす可能性があるが、それらの欠失がタンパク質を誘導するのに十分ではないことを示唆する。
【０２３１】
骨髄系細胞の個体発生における示されたＩＲＦ８の役割、感染性病原体に対する防御におけるその既知の役割、および多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｍａｔｏｕｓ）およびクローン病などの慢性自己免疫炎症状態にＩＲＦ８変異体を関連付けるヒトにおけるＧＷＡＳ研究からの証拠は、急性病理学的炎症反応におけるＩＲＦ８の役割の可能性の確認を促した。このため、Ｐ．ベルゲイ（脳マラリア）の感染によって生じた急性脳炎のマウスモデルが使用され、これは、炎症単核および多核白血球の動員、およびその後の血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性の損失によって生じる致死性の神経炎症を伴う。ＢＸＨ２マウスにおけるＩｒｆ８の損失は、この病理を完全に保護し、神経症状の発達を防止し、感染後の生存を延長することが分かった。興味深いことに、保護作用は、ＰｂＡに感染した場合にＩｒｆ８Ｒ２９４Ｃ／＋Ｆ１異型接合体の５０％が脳期まで生存したとき、共優性様式で遺伝した（図３Ａ）。これらの研究結果は、ＩＲＦ８が実験による脳マラリアに関連する急性の致死性神経炎症の発達に重要であることを確立し、Ｉｒｆ８をこの病理学的応答の主な調節因子としてさらに関係づける。さらに、Ｉｒｆ８Ｒ２９４Ｃ／＋Ｆ１異型接合体からの結果は、Ｉｒｆ８が遺伝子投薬量依存様式で主な炎症誘発性細胞および経路を制御することを示す。
【０２３２】
骨髄系細胞の個体発生および機能におけるその確立された役割に加えて、Ｉｒｆ８は、Ｂリンパ球の発達およびＴリンパ球機能（Ｔｈ１、Ｔｈ１７応答）のある特定の態様にも必要である。神経炎症中にＩＲＦ８によって活性化される細胞型および遺伝子−投薬量依存経路を特定するために、ＰｂＡ感染Ｂ６およびＢＸＨ２マウスからの脳転写プロファイルは、Ｉｒｆ８依存および非依存様式で（２×２ＡＮＯＶＡおよびペアワイズ分析）感染によて誘導される遺伝子のリストと比較され、それを抽出した（図５、表１）。平行して、全ゲノムＩＲＦ８結合部位をマッピングするために、ＣｈＩＰ−ｓｅｑ実験を行った。我々は、これらの位置を転写プロファイリングにより精製された遺伝子リストと比較し、ＩＲＦ８結合遺伝子（表２）およびＩｒｆ８対立遺伝子特異的様式で制御されたＩＲＦ８結合遺伝子（表１）の両方を特定した。これらの遺伝子セットの間には実質的な重複が存在し、これは、抗原処理および提示、Ｉ型インターフェロンの産生、炎症誘発性サイトカイン／ケモカインの産生、およびその他を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）のマーカーおよび経路特性によって同様に支配された。これらの複合分析は、ＩＲＦ８が抗原捕捉および微生物の食作用（Ｃ１ｑ、Ｃ４ｂ、Ｆｃｇｒ４、Ｆｃｇｒ１）、Ｎｌｒｃ５およびＩｆｉ２０５などの細胞質インフラマソームプラットホーム、主な低分子ＧＴＰａｓｅｓ（Ｉｒｇｍ１、Ｉｒｇｍ２、Ｉｇｔｐ、Ｇｂｐ２、Ｇｂｐ３）の動員を含む食胞成熟、内質細網膜関連抗原輸送（Ｔａｐ１、Ｔａｐ２）、ＡＰＣ（Ｂ２ｍ、Ｈ２−Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｔ分子）におけるクラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ依存抗原提示を含むＡＰＣの独特な機能に顕著な役割を果たすことを確認する。これらの遺伝子リストは、骨髄およびリンパ系細胞型の感染部位に対する走化性に関与するいくつかの炎症サイトカインおよびケモカイン（Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ５、Ｃｃｌ７、Ｃｃｌ１２、Ｃｘｃｌ９、Ｃｘｃｌ１０）も考慮する。これらの研究結果は、骨髄系細胞（ＡＰＣを含む）が急速にＰ．ベルゲイ感染および関連組織損傷の部位、つまり血液脳関門の毛細管に大量に動員される単純な機能モデルと互換性がある。これは、頑強なＩＲＦ８依存炎症誘発性カスケードを開始する。動員された細胞によるこの応答の局所増幅は、Ｔリンパ球によるＩＦＮγおよびＴＮＦαなどの免疫病理学的可容性媒介物質の過剰な産生をもたらし、Ｓｔａｔ１および他のＩＲＦファミリーメンバー（Ｉｒｆ１、Ｉｒｆ７、Ｉｒｆ９）を含む他の転写因子を誘導する。ＩＲＦ８の不在は、この病理学的応答を鈍らせ、突然変異体ＢＸＨ２マウスがＣＭ中に神経炎症を発達するのを回避し、よって、危機的な急性期を乗り切る。
【０２３３】
樹状細胞およびマクロファージの重度の枯渇は、ＢＸＨ２における随伴するＩＬ１２産生の減少および抗原特異的Ｔ細胞プライミングと共に、ＣＭ耐性の重要な成分を占める可能性があるが、正常な骨髄系細胞数の状況においてさえ、ＡＰＣ特異的経路のＩＲＦ８依存転写活性の減少は、炎症応答を大幅に鈍らせ、急性病理学的炎症から保護するのに十分であることが提案される。これは、主に３つの観察に基づく。第１に、ＩＲＦ８は、上方制御された遺伝子のみのＩＲＦ８結合部位富化に見られるように、骨髄系細胞において、抑制因子としてではなく、主に転写活性化剤として挙動する（図６Ｂ）。表１は、株および感染特異的方式で制御される各遺伝子に関して、ＩＲＦ８コンピテントマウスが常にＢＸＨ２より高い規模の倍率変化を示し、これらの遺伝子の大半が、下方制御されるのではなく（群３）、上方制御される（群１＆２）ことも強調する。第２に、Ｉｒｆ８Ｒ２９４Ｃ／＋Ｆ１異型接合体は、正常な数の骨髄系細胞（ＤＣマクロファージ）およびリンパ球細胞を示すが（データ示さず）、なおＰ．ベルゲイ誘導ＣＭに顕著な耐性を示す（図３Ａ）。第３に、食胞関連低分子ＧＴＰａｓｅ  Ｉｒｇｍ１、炎症誘発性サイトカインＣｘｃｌ９およびＣｘｃｌ１０、Ｃｄ１１ｂ受容体Ｉｃａｍ１および転写活性化剤、ならびＩＲＦ８量体化パートナーＩｒｆ１を含む、ＩＲＦ８のいくつかの直接転写標的の不活性化（ＰｂＡ感染中にＩＲＦ８によって結合され、制御されると特定された）は、対応する欠失マウス突然変異体において、ＣＭに耐性をもたらすことが示された（図７）。最後に、本明細書においてＣｈＩＰ−Ｓｅｑによって検出されたさらなるＩＲＦ８標的の不活性化は、Ｊａｋ３、Ｃｄ８、Ｃｄ１４、Ｃｄ４０、Ｈｃ、Ｆｃｇｒ２、Ｌｔａ、およびＬｔｂｒ８を含む、Ｐ．ベルゲイ誘導ＣＭから保護することを示した。まとめると、これらの結果は、ＣＭ関連神経炎症中の骨髄系細胞における炎症誘発性経路の制御においてＩＲＦ８の役割を強調する。
【０２３４】
骨髄系細胞における炎症誘発性経路のＩＲＦ８依存活性化は、ＰｂＡ感染において有害な病理学的結果を有するが、肺結核を含む他の種類の感染に明らかに保護的役割を果たす。実際、同じ分析および非常に厳密な統計パラメータを用いて、マイコバクテリウム・ツベルクローシスにエアロゾル感染した３０日後、ＰｂＡ感染に応答してＢ６マウスの脳において上方制御された遺伝子のリストと、肺において上方制御された遺伝子のリストとの間に強い重複が指摘された（表３）。Ｐ．ベルゲイ感染脳において上方制御された１２３の遺伝子のうち、半分以上（ｎ＝６６）がＭ．ツベルクローシス感染肺においても上方制御され、Ｐ．ベルゲイ制御遺伝子の３／４（９０／１２３）近くがＩＲＦ８結合部位を保有した。Ｍ．ツベルクローシス感染およびＣＭの両方中に上方制御された６６の遺伝子のうち、顕著な８０％（ｎ＝５３）が１つ以上のＩＲＦ８結合部位を示す。さらに、Ｉｒｆ８、Ｉｒｆ１、およびＩｒｇｍ１を含むこれらの遺伝子のうちのいくつかにおける突然変異の不活性化は、肺性ＴＢに対する感受性を引き起こす一方、ＣＭに対するある程度の保護を伝達する。Ｔａｐ１およびＢ２ｍにおける突然変異は、ＴＢに対する感受性も引き起こす一方、ＣＭ感受性に対するそれらの作用はまだ試験されていない。この５３の遺伝子のセットは、ＴＢおよびＣＭに関連する病理学的炎症からの保護に主要な役割を果たす中心的なＩｒｆ８依存炎症誘発性応答経路を表すことが提案される。
【０２３５】
全体として、Ｐ．ベルゲイ感染モデルは、Ｉｒｆ８およびＩＲＦ８制御された標的が病理学的炎症において主要な役割を果たすことを示す。突然変異の不活性化およびＩｒｆ８（またはある特定の転写標的）の不在は、ＣＭに対する完全な保護をもたらし、Ｉｒｆ８発現の減少は、部分的な保護を引き起こす（Ｉｒｆ８Ｒ２９４Ｃ／＋Ｆ１異型接合体において）。そのような遺伝子−投薬量依存作用は、発現またはＩＲＦ８の活性における小さい変化でさえ、表現型結果を有し得る可能性も高め、Ｉｒｆ８発現の増加は、場合により増強したおよび／または慢性炎症に関連する。
【０２３６】
この仮説と一致して、最近の全ゲノム関連研究（ＧＷＡＳ）による結果は、いくつかの自己免疫および慢性炎症状態の複雑な遺伝的原因に関わる遺伝因子の１つとしてＩＲＦ８を指摘した。例えば、ＩＲＦ８付近のＳＮＰは、Ｉ型インターフェロンの産生が病原の中心となる疾患である全身性エリテマトーデスに関連することが分かった。加えて、ＩＲＦ８におけるＳＮＰは、ＧＷＡ研究および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者６３人のメタ分析を使用して、およびクローン病患者（ｒｓ１６９４０２０２）のある特定の群における連鎖不平衡において検出された危険なハプロタイプ内で見られた。最後に、ＩＲＦ８は、多発性硬化症（ＭＳ）において主要な危険因子であり、この疾患とのその関連は、複数のＧＷＡ研究およびメタ分析において確認された。ＭＳにおいて、疾患の危険は、６１ｋｂ下流ＩＲＦ８に位置し、疾患に関連する高いＩＲＦ８  ｍＲＮＡレベルで遺伝子発現を制御する発現ＳＮＰ（ｒｓ１７４４５８３６）に関連する。これらの結果は、ヒトの慢性炎症状態におけるＩＲＦ８の役割を支持するだけでなく、マウスにおける我々の結果と一致して、持続的な微生物または自己免疫刺激という状況において、Ｉｒｆ８の発現または活性の小さな変化でさえ慢性または病理学的炎症をもたらす場合があることもさらに示唆する。この提案と一致して、ＰｂＡ感染マウスにおける神経炎症中に制御されたいくつかのＩＲＦ８標的も、ＭＨＣ（１型糖尿病、関節リウマチ、狼瘡、ＭＳ、乾癬）、ＣＣＬ７（ＩＢＤ）、ＩＲＦ１（ＩＢＤ）、ＩＲＦ７（狼瘡）、およびＩＣＡＭ１（ＩＢＤ）を含むヒトの慢性炎症状態のＧＷＡ研究において遺伝的危険因子として認められたことに留意する（表２）。これは、ヒトの病理学的炎症におけるＩＲＦ８制御された経路の役割を強調する。
【０２３７】
Ｐ．ベルゲイ感染によって誘導された急性神経炎症のマウスモデルは、病理学的炎症状態に関与する新規遺伝子、タンパク質、および経路を特定するのに役立つことを証明した。このモデルは、共通のヒト炎症状態において使用するための新規抗炎症薬物候補の活性の評価を含む治療開発のヒトＧＷＡ研究において特定された遺伝子を優先するのに役立ち得る。
【０２３８】
参考文献
Ｂｏｎｇｆｅｎ  ＳＥ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅ−Ｇｅｒｖａｉｓ  ＩＧ，Ｂｅｒｇｈｏｕｔ  Ｊ，Ｔｏｒｒｅ  Ｓ，Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ  Ｐ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＡ，Ｌｅｉｖａ−Ｔｏｒｒｅｓ  ＧＡ，Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ  Ｌ，Ｓｌａｄｅｋ  Ｒ，Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ  Ｍ，Ｌａｔｈｒｏｐ  Ｍ，Ｂｅｈｒ  ＭＡ，Ｇｒｕｅｎｈｅｉｄ  Ｓ，Ｖｉｄａｌ  ＳＭ，Ｓａｌｅｈ  Ｍ，Ｇｒｏｓ  Ｐ．Ａｎ  Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ（ＥＮＵ）−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＪＡＫ３  ｋｉｎａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｍａｌａｒｉａ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２；７（２）：ｅ３１０１２．Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｆｅｂ  ２１．
本発明は、その特定の実施形態に関連して説明したが、さらなる修正が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従って、本発明の任意の変形例、使用、または適応を網羅するものであり、本発明が属する技術分野において知られているか、または慣行に含まれるような、および前述される本質的な特徴に適用され得るもの、ならびに添付の請求項の範囲に含まれるような本開示からの逸脱を含むことを理解されたい。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図４】
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【図６−１】
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【図７】
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【図３】
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【図５】
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【図６−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年1月29日(2015.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における炎症状態に関連する症状を予防、治療、および／または緩和するための薬剤の能力を評価するための方法であって、
（ａ）  前記薬剤を試薬と混合して、ＵＳＰ１５の少なくとも１つの生物学的活性に関連するパラメータを得ること、
（ｂ）  ステップ（ａ）の前記パラメータを測定して、試験レベルを得ること、
（ｃ）  前記試験レベルを対照レベルと比較すること、ここで前記対照レベルは、前記炎症状態の前記発症または維持中に観察されたＵＳＰ１５の前記少なくとも１つの生物学的活性に関連する、
（ｄ）  前記薬剤を、（ｉ）前記試験レベルに関連する前記少なくとも１つの生物学的活性が前記対照レベルに関連する前記生物学的活性よりも低い場合、前記炎症状態に関連する前記症状の予防、治療、および／または緩和に有用であるか、または（ｉｉ）前記試験レベルに関連する前記少なくとも１つの生物学的活性が前記対照レベルに関連する前記生物学的活性と同じまたはそれ以上である場合、前記炎症状態に関連する前記症状の予防、治療、および／または緩和に対する有用性に欠けると特徴付けること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記試薬が、核酸分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸分子が、（ｉ）ＵＳＰ１５をコードする遺伝子のプロモーターを含み、前記パラメータが、前記プロモーターによって駆動される発現の尺度である、（ｉｉ）ＵＳＰ１５をコードする転写物であり、前記パラメータが、前記転写物の量の尺度である、または（ｉｉｉ）発現がＵＳＰ１５によって修飾され得る少なくとも１つの遺伝子の転写物であり、前記パラメータが、前記転写物の量である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試薬が、ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記パラメータが、ＵＳＰ１５の量またはＵＳＰ１５の少なくとも１つの生物学的活性である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの生物学的活性が、脱ユビキチン化活性である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、ＵＳＰ１５の結合パートナーである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記結合パートナーが、ＵＳＰ１５によって脱ユビキチン化され得るポリペプチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｉ）が、インビトロまたはインビボで行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｉ）が、非機能性のＵＳＰ１５の少なくとも１つの遺伝子コピーを有する非ヒト動物で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
個体における炎症状態に対する素因またはその存在を判断するための方法であって、
（ａ）  前記個体から生物学的試料を提供すること、
（ｂ）  ＵＳＰ１５の少なくとも１つの生物学的活性に関連する試薬のパラメータを測定して、試験レベルを提供することと、
（ｃ）  前記試験レベルを対照レベルと比較すること、ここで前記対照レベルは、前記炎症状態の不在中に観察されたＵＳＰ１５の前記生物学的活性に関連する、
（ｄ）  前記個体を、（ｉ）前記試験レベルに関連する前記少なくとも１つの生物学的活性が前記対照レベルに関連する前記生物学的活性と同じまたはそれ以上である場合、前記炎症状態に感染しやすいか、または（ｉｉ）前記試験レベルに関連する前記少なくとも１つの生物学的活性が、前記対照レベルに関連する前記生物学的活性よりも低い場合、前記炎症状態の素因に欠けると特徴付けること、
を含む、前記方法。
【請求項１２】
前記試薬が、核酸分子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子が、（ｉ）ＵＳＰ１５をコードする遺伝子のプロモーターを含み、前記パラメータが、前記プロモーターによって駆動される前記発現の尺度である、（ｉｉ）ＵＳＰ１５をコードする転写物であり、前記パラメータが、前記転写物の量の尺度である、または（ｉｉｉ）発現がＵＳＰ１５によって修飾され得る少なくとも１つの遺伝子の転写物であり、前記パラメータが、前記転写物の量である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記試薬が、ポリペプチドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドがＵＳＰ１５である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記パラメータが、ＵＳＰ１５の量またはＵＳＰ１５の生物学的活性である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの生物学的活性が、脱ユビキチン化活性である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、ＵＳＰ１５の結合パートナーである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合パートナーが、ＵＳＰ１５によって脱ユビキチン化され得るポリペプチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＵＳＰ１５をコードする遺伝子が異型接合性または同型接合性である細胞であって、前記細胞が、ＵＳＰ１５の突然変異体をコードする遺伝子コピーの少なくとも一つを有し、前記ＵＳＰ１５の突然変異体が、対象において発現される場合、前記対象の前記炎症状態の発症および／または維持を防止する能力を有する、前記細胞。
【請求項２１】
ＵＳＰ１５をコードする遺伝子が異型接合性または同型接合性である動物であって、前記動物が、ＵＳＰ１５の突然変異体をコードする遺伝子コピーの少なくとも一つを有し、前記ＵＳＰ１５の突然変異体が、動物において発現される場合、前記動物の前記炎症状態の発症および／または維持を防止する能力を有する、前記動物。
【国際調査報告】
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