(57)【要約】  本発明は、部位特異的変異アルギナーゼおよびその調製方法、アルギナーゼ関連疾患を治療する薬剤を調製する際に上記部位特異的変異アルギナーゼを使用する方法を提供する。本発明は、部位特異的ＰＥＧ化アルギナーゼおよびその調製方法、アルギナーゼ関連疾患を治療する薬剤を調製する際に上記ＰＥＧ化アルギナーゼを使用する方法も提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギナーゼであって、
上記アルギナーゼがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むヒトアルギナーゼＩであって、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列の位置４５、１６８および３０３のシステインのうちいずれか１つ、２つまたは全部が非極性アミノ酸に変異しているアルギナーゼ。
【請求項２】
位置４５、１６８または３０３の上記システインが、独立してアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、好ましくは上記システインがアラニンに変異している、請求項１に記載のアルギナーゼ。
【請求項３】
位置４５、１６８および３０３の上記システインのうち１つが変異し、好ましくは、位置３０３の上記システインが変異し、さらに好ましくは、位置３０３の上記システインがアラニンに変異している、請求項１または２に記載のアルギナーゼ。
【請求項４】
位置４５、１６８および３０３の上記システインのうちいずれか２つが変異し、例えば、位置４５および３０３の上記システイン、または位置１６８および３０３の上記システイン、または位置４５および１６８の上記システインが変異し、好ましくは、上記システインがアラニンに変異している、請求項１〜３のいずれかに記載のアルギナーゼ。
【請求項５】
位置４５、１６８および３０３の上記３つのシステインが変異し、好ましくは、上記システインがアラニンに変異している、請求項１〜３のいずれかに記載のアルギナーゼ。
【請求項６】
ＰＥＧ化アルギナーゼであって、
上記アルギナーゼがヒトアルギナーゼＩであり、
上記アルギナーゼのＰＥＧ化が部位特異的であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列の位置４５、１６８および３０３のシステインのうちいずれか１つまたは２つがＰＥＧ化しているＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項７】
部位特異的ＰＥＧ化が、ＰＥＧ化していない上記システイン位置のうちいずれか１つまたは２つにおいてシステインから他のアミノ酸に部位特異的変異し、その後システイン残基において変異アルギナーゼが部位特異的ＰＥＧ化することにより成し遂げられる、請求項６に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項８】
上記部位特異的変異において、上記システインは非極性アミノ酸に変異し、好ましくは、上記システインはアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、さらに好ましくは、上記システインはアラニンに変異している、請求項７に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項９】
上記ＰＥＧが、平均分子量２０Ｋ、３０Ｋまたは４０Ｋである、請求項６〜８のいずれかに記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項１０】
上記アルギナーゼが、血液または血清中で、少なくとも０．５日間の半減期を有し、好ましくは、上記アルギナーゼが少なくとも２．５日間の半減期を有し、さらに好ましくは、上記アルギナーゼが少なくとも３．５日間の半減期を有する、請求項６〜９のいずれかに記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載のアルギナーゼまたは請求項６〜１０のいずれかに記載のＰＥＧ化アルギナーゼの調製方法。
【請求項１２】
アルギナーゼ関連疾患を治療するための薬剤の調製における請求項１〜５のいずれかに記載のアルギナーゼまたは請求項６〜１０のいずれかに記載のＰＥＧ化アルギナーゼの使用方法であって、好ましくは、上記疾患が高アルギニン血症、アルギニン依存性過形成または、肝臓癌、黒色腫、乳癌、肺小細胞癌、前立腺癌、リンパ腫または白血病のような腫瘍から選択される、使用方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに記載のアルギナーゼまたは請求項６〜１０のいずれかに記載のＰＥＧ化アルギナーゼを含むアルギナーゼ関連疾患を治療するための医薬組成物であって、
上記疾患が、高アルギニン血症、アルギニン依存性過形成または、肝臓癌、黒色腫、乳癌、肺小細胞癌、前立腺癌、リンパ腫または白血病のような腫瘍から選択される、医薬組成物。
【請求項１４】
アルギニン関連疾患を治療するための方法であって、請求項１〜５のいずれかに記載のアルギナーゼまたは請求項６〜１０のいずれかに記載のＰＥＧ化アルギナーゼを投与することを含み、好ましくは、上記疾患が、高アルギニン血症、アルギニン依存性過形成または、肝臓癌、黒色腫、乳癌、肺小細胞癌、前立腺癌、リンパ腫または白血病のような腫瘍から選択される、治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願の特許請求の範囲は、中国特許出願番号２０１１１０４４５９６８．８、出願日２０１１年１２月２７日、発明の名称「ヒトアルギナーゼおよびＰＥＧ化ヒトアルギナーゼとその使用方法」、および中国特許出願番号２０１２１００６９６０５．７、出願日２０１２年３月１６日、発明の名称「ヒトアルギナーゼおよび部位特異的ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼとその使用方法」を優先権主張の基礎とし、それら全体を参照して本願に取り入れている。
【０００２】
添付した配列表のハードコピーおよび対応するコンピューターで読み取り可能形式は、それら全体を参照して双方とも本願に取り入れている。
【０００３】
本発明は、アルギナーゼ、その調製方法、およびアルギナーゼ関連疾患の治療におけるその使用方法を提供する。特に、本発明は、部位特異的変異アルギナーゼ、その調製方法、およびアルギナーゼ関連疾患の治療におけるその使用方法を提供する。本発明は、部位特異的ＰＥＧ化アルギナーゼ、その調製方法、およびその使用方法も提供する。
【背景技術】
【０００４】
アルギニンは、ヒトを含む哺乳動物において重要なアミノ酸であり、細胞の増殖や成長を含む、さまざまな生理的プロセスに関与している。例えば、アルギニンは、ポテンシャルシグナル分子である一酸化窒素（ＮＯ）の合成のための即時前駆体である。ＮＯは、神経伝達物質、機能筋弛緩薬または血管拡張薬として機能する。ＮＯの生合成は、Ｃａ＋＋を触媒とする一酸化窒素合成酵素およびＮＡＤＰＨ依存性反応を含む。アルギニンの他の機能は、ポリアミン、スペルミジンまたはスペルミンの前駆体となること、および他の生理的プロセスに関与することである。
【０００５】
研究では、アルギニンが８μＭより少ない場合、癌細胞は不可逆的な死に至る（非特許文献１）。細胞の成長における影響について研究によれば、アルギニンを除去すると、細胞周期のＧ０期にある通常の細胞は、休止期に入り、重大な損傷なしに数週間は生存し続ける。アルギニンの濃度を通常の水準まで戻すと、細胞は通常の細胞周期に戻る。ある腫瘍細胞は、細胞周期Ｇ１期のＲ点からアルギニンが欠乏するＳ期まで進行すると、すぐにアポトーシスを起こす。アルギニンが欠乏する結果としての腫瘍細胞のアポトーシスは、不可逆的である。したがって、科学者は、特に、肝臓癌や黒色腫のような栄養要求性腫瘍に関しては、体内のアルギニンの量を制御することによって癌を治療しようと考え始めている。このアプローチは、さまざまな腫瘍の抑制についての研究に使われている。
【０００６】
アルギナーゼは、Ｌ−アルギニンの加水分解を触媒してオルニチンと尿素にする酵素である。一般的に、アルギナーゼは、尿素を生産する動物（哺乳動物、軟骨魚類、両生類、カメ類）の肝臓、腎臓および精巣において、尿素周期の酵素の１つとして発現する。アルギナーゼは、哺乳動物の尿素周期の最終段階を触媒し、アルギニンをオルニチンおよび尿素に変える。多くの哺乳動物では、アルギナーゼのファミリーは、アルギナーゼＩとアルギナーゼＩＩを含む。アルギナーゼＩは主に肝臓細胞で発現し、アルギナーゼＩＩは主に腎臓および赤血球で発現する。
【０００７】
アルギナーゼを製造する方法は２つある。１つは、アルギナーゼを作り出す有機体から分離する方法であり、もう１つは、組み換え遺伝子工学技術によるものである。後者には有利な点がある。例えば、実験では、大量のアルギナーゼが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により生産できることが示された。しかしながら、組み換え遺伝子工学技術によりアルギナーゼを製造することには、酵素活性が低いまたは安定性に乏しい、および生体内での半減期が短いなどの技術的な問題があり、臨床実験への応用が制限される。
【０００８】
特許文献１では、Ｈｉｓタグを有する組み換えヒトアルギナーゼＩを用いたアルギニンの除去による、ヒト悪性腫瘍に対する医薬組成物および治療方法が開示されており、この中で、アルギナーゼの表面のＮ末端またはアミン基で、分子量５０００（ＭＷ５０００）のポリエチレングリコールと、共有結合することにより、アルギナーゼを修飾している。修飾したヒトアルギナーゼは、ヒト血清中で３日間の半減期を有しており、安定性が増加した。
【０００９】
特許文献２では、Ｈｉｓタグを有する修飾ヒトアルギナーゼが開示されており、この中で、１６８および３０３システインはセリンに置き換えられ、アルギナーゼは分子量２０ＫＤａのポリエチレングリコールでＰＥＧ化されている。特許文献１で開示された組み換えヒトアルギナーゼと同様に、付加的なペプチド断片であるＨｉｓタグには、アルギナーゼのアミノ酸配列が含まれる。多くの国々の薬剤規制機関は、これらのペプチド断片を使用することを推奨しない。例えば、中国食品薬品監督管理局は、「人への使用に関する組み換えＤＮＡ製品の品質管理の技術的ガイドライン」において、製造工程を簡便化する目的で導入されるＨｉｓタグのような付加的なペプチド断片は、最終製品から可能な限り除去すべきだと指摘している。
【００１０】
特許文献３では、部位特異的に修飾したアルギナーゼが開示されおり、このアルギナーゼにおいて、３つのシステインが保持され、別のシステイン残基はＮ末端の３番目のアミノ酸残基を置換するために導入され、分子量２０ＫＤａのメトキシポリエチレングリコールマレイミドでＰＥＧ化される。上記ヒトアルギナーゼは、元からある３つのシステイン残基を担持しているので、ＰＥＧ化生成物は不均質なる傾向があり、歩留まりが低く、さらに精製も困難である。
【００１１】
本発明の技術分野では、アルギニンに関する病気や疾患を治療するための、より良いアルギナーゼおよびその誘導体への需要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】US7951366B2
【特許文献２】US20100247508A1
【特許文献３】WO 2011/008495A2
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Srorr & Burton, 1974, The effects of arginine deficiency on lymphoma cells.Br.J.Cancer 30, 50
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明では、単離した、実質的に純粋なアルギナーゼを提供する。アルギナーゼは、哺乳動物の尿素合成における尿素再循環経路の最終段階にある酵素であり、アルギニンをオルニチンおよび尿素に変換する。多くの哺乳動物では、アルギナーゼのファミリーに、アルギナーゼＩおよびアルギナーゼＩＩを含む。さまざまな由来のアルギナーゼＩについての研究では、異なる由来のアルギナーゼＩは、多くの保存配列と活性部位を有するが、その配列は異なるだろうということが示されている。原口らの報告（1987, Proc. Natl. Acad. Sc1. 84, 412-415）のように、野生型ヒトアルギナーゼＩは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸配列を有しており、アミノ酸位置４５、１６８および３０３に３つのシステインを含む。野生型ヒトアルギナーゼＩは、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２を有する。
【００１５】
本発明において、「単離した」の語は、非天然の形態をいう。「実質的に純粋」の語は、生成物が、生成やタンパク質修飾に由来する他の成分を含むことがあるが、そのような他の成分は実質的に存在しないか存在しても非常にわずかであることを意味する。
【００１６】
本発明において、アミノ酸部位の位置についての記述は、当業者が通常使用するものである。例えば、「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．ｘの配列の位置４５」または「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．ｘの配列の位置４５のＣｙｓ（システイン）」または「Ｃｙｓ４５」は、すべて、アミノ酸配列の４５番目のアミノ酸残基または位置４５のシステインを示す。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
１つの態様において、本発明はアルギナーゼが、
（１）位置４５、１６８および３０３にあるシステインのうちの１つ、２つまたは３つが変異している、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列、または
（２）１つ以上のアミノ酸を置換、除去、挿入、付加、または転置した（１）に規定するアミノ酸配列
を含むヒトアルギナーゼＩであって、アルギナーゼ活性を有する、変異アルギナーゼを提供する。
【００１８】
１つの態様では、本発明のアルギナーゼにおけるシステインは、独立して非極性アミノ酸に変異する。その側鎖の特性により、アミノ酸は、極性または非極性のアミノ酸に区別することができる。非荷電の、またはわずかに極性化された側鎖を有するアミノ酸は、非極性アミノ酸とよばれ、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびプロリンが挙げられる。
【００１９】
１つの態様では、本発明のアルギナーゼにおけるシステインは、独立してグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異する。システインは、独立してアラニンに変異することが好ましい。本発明では、非イオン極性のアミノ酸であるシステインが非極性アミノ酸（例えばアラニン）に変異する場合に、ヒトアルギナーゼＩの酵素活性は著しく増加することを、図らずも発見した。変異アルギナーゼと基質との間の結合が強化されることが理由の１つとして考えられる。
【００２０】
１つの態様では、本発明のアルギナーゼにおける位置４５、１６８および３０３のシステインのうちの１つが、変異する。本発明ではさらに、位置３０３のシステインが変異する。好ましくは、上記システインは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、さらに好ましくは、上記システインはアラニンに変異する。
【００２１】
１つの態様では、本発明のアルギナーゼにおける位置４５、１６８および３０３のシステインのうちのいずれか２つが、変異する。さらに本発明では、位置４５および３０３のシステインが変異する。好ましくは、上記システインは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異すし、さらに好ましくは、上記システインがアラニンに変異する。１つの態様では、本発明のアルギナーゼにおけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸配列の位置１６８および３０３のシステインが、変異する。好ましくは、上記システインは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、さらに好ましくは、上記システインがアラニンに変異する。１つの態様では、本発明のアルギナーゼにおけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸配列の位置４５および３０３のシステインが、変異する。好ましくは、上記システインは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、さらに好ましくは、上記システインがアラニンに変異する。
【００２２】
１つの態様では、本発明のアルギナーゼにおけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸配列の位置４５、１６８および３０３のシステインが、変異する。好ましくは、上記システインは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、さらに好ましくは、上記システインがアラニンに変異する。
【００２３】
本発明のアルギナーゼは、野生型アルギナーゼよりも高い酵素活性を有する。本発明のアルギナーゼは、通常、少なくともおよそ５００Ｕ／ｍｇの比活性を有し、好ましくは、活性は少なくともおよそ７００Ｕ／ｍｇであり、さらに好ましくは、活性は少なくともおよそ８００Ｕ／ｍｇである。本発明のアルギナーゼは、通常、野生型アルギナーゼよりも高い酵素活性を有する。
【００２４】
本発明における１つの態様では、アルギナーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２の核酸配列を有しており、その中で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸配列における位置４５、１６８および３０３のアミノ酸残基システインに対する少なくとも１つのコドンが置換さていれる。システインに対する１つ、２つ、または３つのコドンが置換されることが好ましい。アミノ酸は、ポリヌクレオチドによってコード化される。メッセンジャーＲＮＡにおける３つのヌクレオチドコドンは、１つのアミノ酸を定義づける。本発明における１つの態様では、ヌクレオチドの置換は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンをコード化するコドンによって置換されるコドンＴＧＴである。コドンＴＧＴは、アラニンをコード化するコドンによって置換されるのが好ましい。
【００２５】
本発明における１つの態様では、アラニンをコード化する上記コドンは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧであり、好ましくはＧＣＴである。
【００２６】
１つの態様において、本発明では、タンパク質を発現できる宿主におけるアルギナーゼまたは変異アルギナーゼの遺伝子を発現することを含む、上述したアルギナーゼの調製方法を提供する。本発明のアルギナーゼの調製方法は、通常、以下の主な工程を含む。所望の遺伝子またはヌクレオチド断片は、ＰＣＲまたは合成方法により得られる。所望の遺伝子を有するＤＮＡ断片は、独立して複製でき、組み換えＤＮＡ分子を形成する選択マーカーを有する、プラスミド、ファージまたはウィルスのような、ベクターと結合している。ＤＮＡ断片のベクターとの連結は、主にホモポリマーの末端、相補末端、ブラントエンド、または人工のリンカーによってなされる。組み換えＤＮＡは、増殖して発現されるように、宿主細胞に導入されなければならない。組み換えＤＮＡ分子が宿主細胞に導入されて増殖するように、ベクターのさまざまな性質により、形質移入、形質転換、形質導入が行われる。適切な遺伝子工学的宿主は、当該分野で知られており、大腸菌、イースト菌、昆虫細胞などを含む。
【００２７】
本発明は、ＰＥＧ化が部位特異的であることを特徴とする、単離した、実質的に純粋なＰＥＧ化アルギナーゼも提供する。上記ＰＥＧ化アルギナーゼにおいて、ポリエチレングリコール分子は、アルギナーゼの特定のアミノ酸残基に共有結合して、部位特異的ＰＥＧ化を成し遂げている。本発明において、アルギナーゼは、それぞれ、少なくとも１つのポリエチレングリコール分子と結合して、ＰＥＧ化アルギナーゼを形成する。
【００２８】
本発明の１つの態様において、上記ＰＥＧ化アルギナーゼにおけるアルギナーゼは、既に定義したように変異アルギナーゼである。
【００２９】
１つの態様において、本発明は、アルギナーゼが、
（１）位置４５、１６８および３０３にあるシステインのうちのいずれか１つまたは２つが変異している、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列、または
（２）１つ以上のアミノ酸における置換、除去、挿入、付加または転置が（１）に規定するアミノ酸配列に導入されたアミノ酸配列
を含むヒトアルギナーゼＩであって、アルギナーゼ活性を有する、ＰＥＧ化アルギナーゼを提供する。
【００３０】
１つの態様において、本発明のＰＥＧ化アルギナーゼにおけるシステインは、独立して非極性アミノ酸に変異する。２０個のアミノ酸の構造は、その側鎖の相違によって異なる。非荷電またはわずかに極性化された側鎖を有するアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびプロリンのような、非極性アミノ酸に属す。
【００３１】
１つの態様において、ＰＥＧ化アルギナーゼＩは、ＣまたはＮ末端に付加されるＨｉｓタグ配列のような、精製において用いられるタグ配列を含まない。Ｈｉｓタグ融合タンパク質は、タンパク質発現のもっとも一般的な手段であり、容易に精製できる利点を有し、タンパク質の活性に重大な影響を与えない。可溶型または封入体のいずれかのタンパク質発現生成物は、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィにより精製され得る。一方、潜在的な免疫原性の特性により、中国食品薬品監督管理局は、「人への使用に関する組み換えＤＮＡ製品の品質管理の技術的ガイドライン」において、製造工程を簡便化する目的で導入されるＨｉｓタグのような付加的なペプチド断片は、最終製品から可能な限り除去されるべきだと指摘している。
【００３２】
本発明において、アルギナーゼのＰＥＧ化は、化学装飾によって行うことができ、上記化学装飾は、カップリング剤（ＰＥＧ化試薬ともいう）を有するポリエチレングリコール誘導体を用いて、ポリエチレングリコール分子をアルギナーゼにある基と共有結合することにより行うことができる。上記化学修飾は特異的であり、すなわち、ＰＥＧ分子を、所定の結合活性を有するカップリング剤を用いて、アルギナーゼ上の所定の基と結合させる。部位特異的ＰＥＧ化は、以下の原則に従う。（１）タンパク質活性部位の修飾は避けて、できる限りタンパク質活性への負の影響を防止する、および（２）全体の工程は制御可能な程度に簡素化すべきである。一般的なポリエチレングリコール分子は、それぞれの末端に水酸基を有する。メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）は、一方の末端がメトキシ基でブロックされているポリエチレングリコールである。もっとも一般的に研究されているペプチドまたはタンパク質の修飾において用いられるＰＥＧ化試薬は、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）の誘導体である。一般的なＰＥＧ化方法の１つは、ポリエチレングリコールまたはＰＥＧ化試薬を、リジン表面のε-ＮＨ２またはタンパク質のＮ末端α−ＮＨ２と共有結合することであり、例えばメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルブチラート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオナート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルスクシナート（ｍＰＥＧ−ＳＳ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルカーボナート（ｍＰＥＧ−ＳＣ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルグルタラート（ｍＰＥＧ―ＳＧ）、ｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシル−スクシンイミド（ｍＰＥＧ―ＮＨＳ）、ｍＰＥＧ―トレシラートおよびｍＰＥＧ―アルデヒドが挙げられる。他の一般的なＰＥＧ化方法は、特にタンパク質のチオール基と結合する、ポリエチレングリコールまたはＰＥＧ化試薬を選択的に使用することであり、例えばｍＰＥＧ−マレイミド、ｍＰＥＧ−オルト−ピリジル−ジスルフィド、ｍＰＥＧ−ビニルスルホンおよびｍＰＥＧ−ヨードアセトアミドを用いてペプチドまたはタンパク質のチオール基を修飾する。タンパク質またはペプチドにおけるチオール基の数は比較的少ないので、通常は簡単に均質なＰＥＧ化生成物が得られる。
【００３３】
ヒトアルギナーゼは、アミノ酸配列の位置４５、１６８または３０３に位置する３つのシステイン残基を有する。本発明の１つの態様において、上記ＰＥＧ化アルギナーゼは、上記システインの位置のうちの１つまたは２つにおいて特異的にＰＥＧ化している。
【００３４】
本発明の１つの態様において、上記部位特異的ＰＥＧ化は、アルギナーゼのシステインの部位特異的変異形成によって成し遂げられ、その後システイン残基における変異アルギナーゼの部位特異的ＰＥＧ化となる。本発明のさらなる態様では、上記システイン特異的ＰＥＧ化は、メトキシポリエチレングリコール−マレイミドにより、アルギナーゼ上のシステインのチオール基とＰＥＧを共有結合することによって成し遂げられる。
【００３５】
本発明の１つの態様では、部位特異的ＰＥＧ化は、ＰＥＧ化していない１つまたは２つのシステイン位置でシステインが他のアミノ酸、好ましくは、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリン、さらに好ましくは、上記システインがアラニンに部位特異的変異形成することにより成し遂げられる。
【００３６】
ＰＥＧの分子量の選択は、生体活性および薬物動態学的特性を総合的に勘案して行う。研究では、体内での修飾タンパク質薬剤の動作時間は、結合したＰＥＧの数と分子量と相関関係があることが示された。本発明で用いるＰＥＧは、３〜４０Ｋの範囲の分子量を有し、直線型または分岐型である。本発明で用いるＰＥＧは、当該技術分野で用いられるＰＥＧ誘導体とすることができる。本発明で用いるＰＥＧは、特定の種類に限定されない。本発明の１つの態様では、アルギナーゼと共有結合するＰＥＧ分子の平均分子量は、およそ２０Ｋ、３０Ｋまたは４０Ｋである。ＰＥＧ化タンパク質は、静脈注射により投与される。ポリエチレングリコールの平均分子量は、血清半減期に影響し得る。研究では、ＰＥＧの腎クリアランスは、その糸球体濾過率に依存することがわかった。糸球体は、分子量が７０ＫＤａよりも小さいタンパク質または分子量が３０ＫＤａよりも小さいＰＥＧを濾過する。ＰＥＧの分子量が結合タンパク質の半減期および活性に与える影響は、一般には予測不可能であるが、通常は、タンパク質の分子量、作用機構、活性部位およびタンパク質のＰＥＧ結合部位に密接に関係している。
【００３７】
本発明の１つの態様では、ＰＥＧ化アルギナーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列における位置４５および１６８で部位特異的にＰＥＧ化しており、好ましくは、上記部位特異的ＰＥＧ化は、アルギナーゼの位置３０３のシステインの変異形成によって成し遂げられ、ＰＥＧの平均分子量はおよそ２０Ｋまたは３０Ｋである。好ましくは、上記システインは、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、さらに好ましくは、上記システインはアラニンに変異する。
【００３８】
本発明の１つの態様では、ＰＥＧ化アルギナーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列における位置１６８で部位特異的にＰＥＧ化しており、好ましくは、上記部位特異的ＰＥＧ化は、アルギナーゼの位置４５および３０３のシステインの変異形成によって成し遂げられ、ＰＥＧの平均分子量はおよそ４０Ｋである。好ましくは、上記システインは、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、さらに好ましくは、上記システインはアラニンに変異する。
【００３９】
本発明の１つの態様では、ＰＥＧ化アルギナーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列における位置４５で部位特異的にＰＥＧ化しており、好ましくは、上記部位特異的ＰＥＧ化は、アルギナーゼの位置１６８および３０３のシステインの変異形成によって成し遂げられ、ＰＥＧの平均分子量はおよそ４０Ｋである。好ましくは、上記システインは、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、さらに好ましくは、上記システインはアラニンに変異する。
【発明の効果】
【００４０】
本発明では、純度が７０％を超える、好ましくは８０％を超える、さらに好ましくは、９０％を超えるＰＥＧ化アルギナーゼを提供する。本発明において、「ＰＥＧ化アルギナーゼの純度」とは、全アルギナーゼ（ＰＥＧと共有結合したアルギナーゼ、ＰＥＧと共有結合していないアルギナーゼ、および重合体のＰＥＧ化アルギナーゼ）のうち、ＰＥＧ化アルギナーゼ（すなわち、ＰＥＧと共有結合したアルギナーゼ）の百分率を意味する。一般に、生成物には、ＰＥＧと共有結合していないアルギナーゼや重合体のＰＥＧ化アルギナーゼを含むので、さらなる精製が要求される。精製技術として一般に用いられる方法は、当該技術分野で知られており、陽イオン交換クロマトグラフィを含む。
【００４１】
本発明のＰＥＧ化アルギナーゼは、血液または血清において、少なくとも０．５日の半減期を有し、好ましくは、上記アルギナーゼは少なくとも２．５日の半減期を有し、さらに好ましくは、上記アルギナーゼは少なくとも３．５日の半減期を有する。アルギナーゼの半減期は、当該分野で公知の通常用いられる方法により測定することができる。血液または血清中のアルギナーゼと使用した動物モデルでのアルギナーゼとの半減期を測定したデータには確かに関連性がある。代謝率の高い動物（たとえば、ラット）において得られた半減期のデータは、通常、代謝率の低い動物（たとえば、ヒト）よりも短い。
【００４２】
本発明は、ＰＥＧ化が部位特異的である、ＰＥＧ化アルギナーゼの調製方法を提供する。本発明のＰＥＧ化アルギナーゼにおいて、ＰＥＧ分子はアルギナーゼ上の所定の基と結合し、部位特異的ＰＥＧ化を成し遂げる。本発明のＰＥＧ化アルギナーゼにおいて、アルギナーゼ分子はそれぞれ少なくとも１つのＰＥＧ分子と結合して、ＰＥＧ化アルギナーゼを形成する。
【００４３】
本発明において、部位特異的ＰＥＧ化は化学修飾によって成し遂げられるが、上記修飾は、カップリング剤存在下でＰＥＧ分子をアルギナーゼ上の基と共有結合することにより行われる。上記化学修飾は特異的であって、つまり、つまり、ＰＥＧ分子は、特定の基と結合する試薬を用いて、アルギナーゼの特定のアミノ酸残基のみと結合する。
【００４４】
本発明は、上述したアルギナーゼまたはＰＥＧ化アルギナーゼの応用／使用方法、またはアルギナーゼに関連疾患を治療する際の、それらを含む医薬組成物も提供する。当該分野において公知である上記アルギナーゼ関連疾患には、哺乳動物の体内におけるアルギニン量に関連する体調／病気／疾患が含まれる。そのような体調／病気／疾患には、高アルギニン血症が含まれる。アルギナーゼが欠乏することにより、患者の体内のアルギニンは尿素に分解することもオルニチン代謝周期に加わることもできず、血液中のアルギニン量は、通常の血液の値よりも７〜１０倍も高くなり、脳脊髄液または尿におけるアルギニン量と同時に排泄物における尿素排泄も増加する。さらに、上記体調／病気／疾患には、アルギニン依存増殖または腫瘍が含まれる。細胞の成長における影響についての研究では、アルギニンを除去した場合に、細胞周期のＧ０期にある通常の細胞は休止期に入り、重大な損傷なしに数週間は生存し続けることがわかった。アルギニンの濃度が通常の水準まで戻ると、細胞は通常の細胞周期に戻る。増殖中の細胞や腫瘍は、しかしながら、細胞周期のＧ１期のＲ点を経て、アルギニンが欠乏するＳ期に入って、すぐにアポト―シスをおこす。アルギニンの欠乏による過形成細胞または腫瘍細胞のアポトーシスは、不可逆的である。そのため、科学者は、体内のアルギニン量を制御することによって、過形成または腫瘍を治療することを考え始めた。
【００４５】
本発明は、医薬組成物も提供し、この場合、本発明の上記医薬組成物の有効成分は、上述したアルギナーゼまたはＰＥＧ化アルギナーゼである。上記医薬組成物の剤型は、固形体、液剤、乳剤、分散剤、ミセル、リポソームの形態をとり得るが、この場合、処方には、有効成分として本発明のヒトアルギナーゼまたはＰＥＧ化アルギナーゼのうちの１つ以上含まれており、有機または無機のキャリアー、または非経口の使用法に適切な医薬品添加物と混合される。さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤、着色剤および香料を添加できる。本発明の単離した実質的に純粋なヒトアルギナーゼまたはＰＥＧ化アルギナーゼのうちの１つ以上は、有効成分として、体調や病気に対して所望の効果を奏するのに十分な量が含まれる。医薬組成物は、錠剤、丸薬、トローチ剤、水和または油性の懸濁剤、分散した粉剤または粒剤、または乳剤、硬いまたは柔らかいカプセル、またはシロップのような、経口投与に適する形態で処方される。経口投与の処方は、当該分野で公知の技術にしたがって、消化管のなかでゆっくりと分解し吸収されるようにカプセル化することで、長時間効果が持続する。処方は、無菌の注射可能な液剤また懸濁剤の形態でもよい。上記懸濁剤は、当該分野において公知の方法により、分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を用いて調製することができる。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、さらに、固形体、液剤、懸濁剤、ミセル、またはリポソームの形態で処方され得る。１つの態様では、医薬組成物は、経口投与または注射可能な形態に処方される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、野生型アルギナーゼＩのヌクレオチド配列を示す。
【図２】図２は、還元条件におけるヒトアルギナーゼＩのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
【図３】図３は、高圧液体クロマトグラフィ分析によるヒトアルギナーゼの発現を示す。
【図４】図４は、還元条件および非還元条件でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による野生型および変異アルギナーゼＩの試験結果を示す。
【図５】図５は、還元条件および非還元条件における精製した変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
【図６ａ】図６は、還元条件および非還元条件における精製した変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。図６ａは、精製した変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３）の非還元条件のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
【図６ｂ】図６ｂは、精製した変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３）の還元条件でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
【図７】図７は、ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩの非還元条件でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
この発明を、以下に述べる実施例を用いてさらに説明する。これらの実施例は本発明の好ましい実施態様を説明しており、説明する実施例に限定されない。上述の記載および実施例を参考にすれば、当業者は本発明の重要な特質を決定することができ、発明の意図および範囲を逸脱することなく、他の使用方法や条件に適用する場合にさまざまな方法で本発明を変更し修正することができる。つまり、本発明に対する前述のいかなる変更／修正によれば、ここで示しまた説明したこと以外でも、当業者には明白であり、それらの修正は、付加した請求項の範囲の一部を形成することが意図されている。
【００４９】
例１：Ｈｉｓタグを有さない組み換えヒトアルギナーゼＩプラスミドｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈアルギナーゼ−Ｖの発現および構築。
【００５０】
ヒトアルギナーゼＩ遺伝子配列は、１９８７年に公表された（Haraguchi. Y. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci, 84, 412-415）。ヒトアルギナーゼ遺伝子は、テンプレートとしてヒト肝臓５’ストレッチプラスｃＤＮＡライブラリ（クロンテック社）、および前述のアルギナーゼＩ配列により設計されたプライマーＡＲＧ−Ｖ（＋）およびＡＲＧ−Ｖ（−）を用いて、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって増大した。プライマーＡＲＧ−Ｖ（＋）は、ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、ＡＲＧ−Ｖ（−）プライマーは、ＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。分子生物学の通常の検査技法を用いれば、ヒトアルギナーゼＩのＰＣＲ生成物が得られ、アルガロースゲル電気泳動により確認された。上記増大したヒトアルギナーゼＩのＰＣＲ生成物および商業的に入手可能な発現ベクターｐＥＴ３０ａ（＋）は、制限エンドヌクレアーゼ、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ（プロメガ社）で、それぞれ３７℃１．５時間で消化された。消化された断片は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより１６℃で一晩連結され、得られた連結組み換えプラスミドは、ＤＨ５α大腸菌コンピテント細胞に形質転換した。その形質転換細胞は、ＬＢ寒天平板を含むカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）上に流し入れ培養することで選択した。正しい挿入断片を含むプラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ消化分析によって同定した。正しい組み換えヒトアルギナーゼＩ発現プラスミドは、以下ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈアルギナーゼ−Ｖとするが、正しい配列およびヒトアルギナーゼＩ遺伝子の挿入を確実にするために、順番に配列することによって分析する。挿入断片の大きさは、長さで９６９個分の塩基対である。図１に示すように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２のヌクレオチド配列を有する。
【００５１】
ARG-V(+): 
5' GGAATTCCATATGAGCGCCAAGTCCAGAACCATAG 3'
NdeI
ARG-V(-): 
5' CCGCTCGAGTTATTACTTAGGTGGGTTAAGGTAGTCAATAGG 3'
XhoI
【００５２】
例２：Ｈｉｓタグを有さない組み換えヒトアルギナーゼＩプラスミドＤＮＡｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈアルギナーゼ−Ｖの発現、および標的タンパク質の精製。
【００５３】
１００μｌのコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細胞は氷上で解凍した。１μｌのｐＥＴ３０ａ（＋）−Ｖ組み換えプラスミドは、そのコンピテント細胞に加えられ、３０分間氷上で培養した。その混合物は、４２℃の水浴中で９０秒間ヒートショック処理をし、その後氷上で２分間培養した。５００μｌのＬＢ培養液を、形質転換細胞に加え、３７℃、１５０ｒｐｍで１時間振とう培養した。培養後、２００μｌの形質転換細胞の懸濁液を、カナミシンＬＢ寒天平板上に平らに流し広げ、逆さまにして３７℃の培養器で１６時間培養した。
【００５４】
組み換えプラスミドで形質転換した１つのコロニーを選択し、２５ｍｌのＬＢ培養液に移して、光学濃度６００ｎｍ（ＯＤ６００ｎｍ）が０．６〜０．８に達するまで、３７℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。最終濃度０．２ｍＭのＩＰＴＧを、標的たんぱく質の発現を３時間で誘発するようにその培養液に加えた。選択したクローンの標的タンパク質発現は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分析した。高度にタンパク質発現するクローンは、遺伝子操作バクテリアとしてグリセロールストックに保管した。
【００５５】
遺伝子操作バクテリア細胞は、１５Ｌの発酵槽で流加培養した。ＯＤ６００ｎｍが１２〜１３に達したとき、最終濃度０．２ｍＭのＩＰＴＧを、標的タンパク質の発現を３〜４時間で誘発するために培養液に加えた。誘発したバクテリア細胞は、集められて溶解された。その後の標的タンパク質の分離および精製のため、細胞ライセートは遠心分離され、その上澄み液は集められた。
【００５６】
標的タンパク質の精製は、ＣＭ陽イオン液体クロマトグラフィを用いて行った。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、サンプルローディングの前にカラムを平衡にするために用いた。バクテリア細胞のライセート上澄み液をカラムにロードして、その後、弱く結合するまたは非特異的に結合する不純物を除去するために、カラム容量３個分の平衡バッファーで洗浄した。安定化したＵＶ２８０ｎｍを読み取るときに、標的タンパク質は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびＮａＣｌを含む溶離バッファーを用いて溶離した。カラムから溶離したタンパク質のピークは、集められて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で分析した。
【００５７】
実験結果は、図２および３に示した。
【００５８】
図２に、ヒトアルギナーゼＩ発現量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。それぞれのレーンの試料は以下のとおりである。
【００５９】
１．タンパク質分子量標準、２．バクテリアライサート上澄み液、３．精製したＨｉｓタグを有さないヒトアルギナーゼＩ、４．ＣＭ陽イオン交換カラムのフロースルー。
【００６０】
図３に、精製したヒトアルギナーゼＩのＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【００６１】
図２および３に示すように、上記のクロマトグラフィの手法により得られたアルギナーゼの純度は、９０％を超える。
【００６２】
例３：ヒトアルギナーゼＩの部位特異的変異形成（ｒｈＡｒｇＩ）。
【００６３】
部位特異的な変異は、クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）部位特異的変異形成キット（ストラタジーン社）を用いて、ヒトアルギナーゼＩのアミノ酸配列における位置４５、１６８および３０３に導入した。野生型ヒトアルギナーゼを含む組み換えプラスミドｐＥＴ３０ａ−ｒｈアルギナーゼＩ−Ｖは、テンプレートとして用いた。位置４５、１６８および３０３におけるシステインをコード化するコドン（ＴＧＴ）は、独立してアラニンをコード化するコドン（ＧＣＴ）に変異し、結果として１つ、２つまたは３つの部位が変異した変異体となった。ヒトアルギナーゼＩの部位４５、１６８および３０３における置換コドンＧＣＴの導入を目的とするプライマーを以下に示す。
【００６４】
ARG-m45(+): 
5' GAGAAACTTAAAGAACAAGAGGCTGATGTGAAGGATTATGGGG 3'
ARG-m45(-): 
5' CCCCATAATCCTTCACATCAGCCTCTTGTTCTTTAAGTTTCTC 3'
ARG-m168(+): 
5' GATTCTCCTGGGTGACTCCCGCTATATCTGCCAAGGATATTG 3'
ARG-m168(-): 
5' CAATATCCTTGGCAGATATAGCGGGAGTCACCCAGGAGAATC 3'
ARG-m303(+): 
5' GTTGCAATAACCTTGGCTGCTTTCGGACTTGCTCGGG 3'
ARG-m303(-): 
5' CCCGAGCAAGTCCGAAAGCAGCCAAGGTTATTGCAAC 3'
【００６５】
ＰＣＲは、変異形成キットで与えられる指示どおりに行った。非変異の親ＤＮＡテンプレートは、制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩで消化した。変異プラスミドは、コンピテント細胞に形質転換し、配列により確認した。システインをコード化するコドン（ＴＧＴ）からアラニンをコード化するコドン（ＧＣＴ）への変異を含む変異アルギナーゼプラスミドで形質転換したクローンを選択し、ＬＢ培養液に広げた。標的とする変異プラスミドは、ウィザードプラスミニ準備キットを用いて分離した。
【００６６】
アミノ酸位置３０３、１６８または４５でアラニン変異体となる１つのシステインを有する変異ヒトアルギナーゼＩは、それぞれｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８またはｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５と表される。アミノ酸位置１６８と３０３、アミノ酸位置４５と３０３、およびアミノ酸位置４５と１６８でアラニン変異体となる２つのシステインを有する変異ヒトアルギナーゼＩは、それぞれｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３、およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８と表される。アミノ酸位置４５、１６８および３０３でアラニン変異体となる３つのシステインを有する変異ヒトアルギナーゼＩは、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３と表される。上記アルギナーゼ変異挿入断片を含むプラスミドは、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３と表される。
【００６７】
１００μｌのコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細胞は、氷上で解凍した。１μｌの変異構成物をＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に加え、３０分間氷上で培養した。その混合物は、４２℃で９０秒間ヒートショック処理をし、その後、２分間氷上で培養した。５００μｌのＬＢ培養液を形質転換細胞に加え、３７℃、１５０ｒｐｍで１時間振とう培養した。培養後、２００μｌの形質転換細胞の懸濁液を、カナミシンＬＢ寒天平板上に平らに流し広げ、逆さまにして３７℃で１６時間培養した。
【００６８】
組み換えプラスミドで形質転換した１つのコロニーを選択し、２５ｍｌのＬＢ培養液に移して、光学濃度６００ｎｍ（ＯＤ６００ｎｍ）が０．６〜０．８に達するまで、３７℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。最終濃度０．２ｍＭのＩＰＴＧを、標的たんぱく質の発現を３時間で誘発するようにその培養液に加えた。選択したクローンの標的タンパク質発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。高度にタンパク質発現するクローンは、遺伝子操作バクテリアとしてグリセロールストックに保管した。
【００６９】
例４：部位特異的変異アルギナーゼＩの発現およびタンパク質精製
【００７０】
変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ）プラスミド（ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５/１６８またはＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３）で形質転換させた遺伝子操作大腸菌細胞は、１５Ｌの発酵槽で流加培養した。ＯＤ６００ｎｍが１２〜１３に達したとき、最終濃度０．２ｍＭのＩＰＴＧを、標的タンパク質の発現を３〜４時間で誘発するために培養液に加えた。バクテリア細胞は、集めて溶解した。その後のタンパク質の分離および精製のため、細胞ライセートは遠心分離され、その上澄み液は集められた。
【００７１】
標的タンパク質の精製は、ＣＭ陽イオン液体カラムを用いて行った。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、サンプルローディングの前にカラムを平衡にするために用いた。バクテリア細胞のライセート上澄み液をカラムにロードして、その後、弱く結合するまたは非特異的に結合する不純物を除去するために、カラム容量３個分の平衡バッファーで洗浄した。安定化したＵＶ２８０ｎｍを読み取るときに、標的タンパク質は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびＮａＣｌを含む溶離バッファーを用いて溶離した。カラムから溶離したタンパク質のピークは、変異アルギナーゼＩのｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３を得るために集められた。
【００７２】
集めたタンパク質試料の純度は、ＳＤＳ−ＡＰＧＥおよびＨＰＬＣで分析した。上記クロマトグラフィの手法を用いた場合、アルギナーゼの純度は９０％を超えると測定された。
【００７３】
例５：部位特異的変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ）の活性
【００７４】
アルギナーゼの活性は、ウレアーゼおよびグルタミン酸脱水素酵素を組み合わせた分光光度分析によって測定し、それを以下の模式図に示した。ＮＡＤＰＨは、波長３４０ｎｍに光吸収を有する。ＮＡＤＰＨが酸化してＮａＤＰ＋となると、３４０ｎｍにおける吸収は減少する。アルギナーゼの活性は、ＮＡＤＰＨ（ΔＥ３４０＝６２２０Ｍ−１ｃｍ−１）のモル吸光係数とともに、３４０ｎｍにおける吸収の減少量を監視することで、相関付けて測定できる。
【００７５】
【化１】
2015503333.tif 000003
【００７６】
アルギナーゼ活性の１単位（Ｕ）は、３０℃、ｐＨ８．３の条件で、１μｍｏｌの尿素を放出することと定義した。
【００７７】
アルギナーゼの比活性は、下記式を用いて算出した。
【００７８】
比活性 （Ｕ／ｍｇ）＝［（ΔＡ／Δｔ）×（１／ε）×１０６×（１／２）］／［Ｅ］
ΔＡ＝３４０ｎｍにおける吸光度の差
ε＝ＮＡＤＰＨミカエリスメンテン定数（Ｋｍ）（６２２０Ｍ−１ｃｍ−１）
［Ｅ］＝反応混合液における酵素濃度（ｍｇ／ｍＬ）
【００７９】
上記の分析評価を用いると、さまざま変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３）の比活性は、それぞれ、７４７±６３Ｕ／ｍｇ、８１４±９１Ｕ／ｍｇ、７８６±５８Ｕ／ｍｇ、７８２±１９Ｕ／ｍｇおよび７５９±６８ Ｕ/ｍｇと測定された。野生型ヒトアルギナーゼＩの比活性は４９１±４２Ｕ/ｍｇと測定され、位置１６８／３０３、４５／３０３、４５／１６８および４５／１６８／３０３にある非極性非イオン性アミノ酸システインが非極性アミノ酸アラニンに変異した後に、アルギナーゼの活性が著しく増加することを説明している。
【００８０】
例６：野生型および変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
【００８１】
ポリアクリルアミドゲルは、従来の方法を用いて調製した。試料は、分析の前に還元条件（つまり、ジスルフィド分子間の結合またはその分子内結合を壊すために、β−メルカプトエタノールはサンプルローディングバッファーに含有される）または非還元条件件下で処理し、１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、野生型およびさまざまな変異アルギナーゼＩの分子内ジスルフィド架橋構造を解読した（図４、５、６ａ、６ｂ）。
【００８２】
図４に、還元条件および非還元条件下で処理した後の野生型アルギナーゼＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。各レーンの試料は以下のとおりである。レーン１および３：バクテリア細胞ライセートの上澄み液、レーン２：精製したＨｉｓタグを有さないアルギナーゼ（非還元）、Ｍ：タンパク質分子量標準、レーン４：精製したＨｉｓタグを有さないヒトアルギナーゼＩ（還元）。
【００８３】
図５に、還元条件および非還元条件下での、精製した変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。各レーンの試料は以下のとおりである。レーン１：変異アルギナーゼＩ、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３（非還元）、レーン２：変異アルギナーゼＩ、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３（非還元）、レーン３：変異アルギナーゼＩ、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３（非還元）、Ｍ：タンパク質分子量標準、レーン４：変異アルギナーゼＩ、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３（還元）、レーン５：変異アルギナーゼＩ、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３（還元）、レーン６：変異アルギナーゼＩ、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３（還元）。
【００８４】
図６ａに、非還元条件下での精製した変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。各レーンの試料は以下のとおりである。Ｍ：タンパク質分子量標準、レーン１：変異アルギナーゼＩ、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３、レーン２：ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８。
【００８５】
図６ｂに、還元条件下での精製した変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。各レーンの試料は以下のとおりである。Ｍ：タンパク質分子量標準、レーン１：変異アルギナーゼＩ、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３、レーン２：ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８。
【００８６】
還元条件および非還元条件下でのアルギナーゼＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、野生型ヒトアルギナーゼＩは、本発明における所定の実験条件下では、他のコンホメーションを有すること明らかになった。そのような条件下では、位置３０３のシステインが変異してアラニンとなる場合、他のコンホメーションも存在した。しかしながら、アミノ酸の位置４５、１６８および３０３にある３つのシステイン残基のうち２つ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３またはｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８）または全部のいずれかが、アルギナーゼに変異した場合、非還元条件下では１つのコンホメーションのみが検出された（図５および図６ａ）。既知の理論に何ら制限されるものではないが、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける野生型ヒトアルギナーゼＩの多数のコンホメーションの存在は、所定条件下でのシステイン４５、１６８および３０３によりもたらされた分子内ジスルフィド結合の形成によるものだと考えられる。システイン３０３のみがアラニンに変異した場合には、未変異のシステイン４５および１６８間の分子内ジスルフィド結合の形成により、そのようなコンホメーションのアルギナーゼＩ変異も、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出されると発明者は考えている。位置４５、１６８および３０３の３つのシステイン残基のうち２つまたは全部のいずれかが変異した場合（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８またはｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３）、ジスルフィド結合の形成のすべての可能性がなくなり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では１つのコンホメーションのみが検出される。
【００８７】
例７：変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ）の部位特異的ＰＥＧ化およびＰＥＧ化タンパク質の精製
【００８８】
部位特異的変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３／１６８またはｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３）は、２０ｍＭのＰＢＳバッファー（ｐＨ７．０）中のモル比の範囲１：５〜１：１０で、メトキシポリエチレングリコールマレイミドとそれぞれ混合し、上記メトキシポリエチレングリコールマレイミドの分子量はそれぞれ２０Ｋ、３０Ｋ、４０Ｋであった。４０Ｋのメトキシポリエチレングリコールマレイミドは、２つのポリエチレングリコール鎖からなるＹ字状の枝分かれである。ＰＥＧ化反応は、室温で２〜４時間行われた。反応の最後に、最終生成物は４℃の冷蔵庫に保管された。
【００８９】
部位特異的ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩは、残存する未反応のタンパク質およびＰＥＧを除去するため、マクロ（Ｍａｃｒｏ）ＳＰマトリックス陽イオン交換カラムを用いて分離、精製した。リン酸バッファーおよびリン酸バッファーを含むＮａＣｌ（１Ｍ）は、それぞれ平衡バッファーおよび溶離バッファーとして用いた。サンプルローディングの前に、ＰＥＧ化タンパク質の試料は、試料の電気伝導度が平衡バッファーと同じになるまで蒸留水で希釈し、カラムは、カラム容量の５倍の平衡バッファーで平衡にした。サンプルローディングの後、カラムはさらにカラム容量の５倍の平衡バッファーで洗浄し、３５％溶離バッファーで溶離した。タンパク質ピークを含む溶離液は、集めてＧ２５カラムを用いて脱塩した。標的とするタンパク質は集めて、図７に示すとおりＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００９０】
Ａ３０３−Ｍ２０Ｋ（２）：部位特異的変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３）は、メトキシポリエチレングリコールマレイミド−２０ｋＤａと反応させた（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ−２０Ｋ）。部位特異的ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩは、マクロキャップ（Ｍａｃｒｏｃａｐ）ＳＰマトリックス陽イオン交換カラムで精製した。システイン４５および１６８で２つの２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＭＡＬ分子と結合したＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩ（Ａ３０３−Ｍ２０Ｋ（２）という）の百分率は、全反応生成物の７０％を超える。
【００９１】
Ａ３０３−Ｍ３０Ｋ（２）：部位特異的変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３）は、メトキシポリエチレングリコールマレイミド−３０ｋＤａと反応させた（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ−３０Ｋ）。部位特異的ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩは、マクロキャップ（Ｍａｃｒｏｃａｐ）ＳＰマトリックス陽イオン交換カラムで精製した。システイン４５および１６８で２つの３０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＭＡＬ分子と結合したＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩ（Ａ３０３−Ｍ３０Ｋ（２）という）の百分率は、全反応生成物の７０％を超える。
【００９２】
Ａ１６８／３０３−Ｙ４０Ｋ：部位特異的変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３）は、Ｙ字状に枝分かれしたポリエチレングリコールマレイミド４０Ｋ（Ｙ−ＭＡＬ−４０Ｋ）と反応させた。ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩは、マクロキャップ（Ｍａｃｒｏｃａｐ）ＳＰマトリックス陽イオン交換カラムで精製した。システイン４５における１つのＰＥＧ鎖Ｙ−ＭＡＬ−４０Ｋと結合したＰＥＧ化アルギナーゼＩタンパク質（Ａ１６８／３０３−Ｙ４０Ｋ）は、全反応生成物の８５％を超える。
【００９３】
Ａ４５／３０３−Ｙ４０Ｋ：部位特異的変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３）は、Ｙ字状に枝分かれしたポリエチレングリコールマレイミド４０Ｋ（Ｙ−ＭＡＬ−４０Ｋ）と反応させた。ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩは、マクロキャップ（Ｍａｃｒｏｃａｐ）ＳＰマトリックス陽イオン交換カラムで精製した。システイン１６８における１つのＰＥＧ鎖Ｙ−ＭＡＬ−４０Ｋと結合したＰＥＧ化アルギナーゼＩタンパク質（Ａ４５／３０３−Ｙ４０Ｋ）は、全反応生成物の８５％を超える。
【００９４】
前述した２つの分光光度分析を用いて、異なるＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩの活性を、ＮＡＤＰＨの吸収の変化により測定し決定した。試験結果は、ＰＥＧ化生成物がアルギナーゼ活性を維持することを示しており、この中で、Ａ３０３−Ｍ２０Ｋ（２）、Ａ３０３−Ｍ３０Ｋ（２）、Ａ１６８／３０３−Ｙ４０ＫおよびＡ４５／３０３−Ｙ４０Ｋの比活性は、すべて４００Ｕ／ｍｇであり、４００〜８００Ｕ／ｍｇの範囲であった。
【００９５】
例７：部位特異的ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩの生体内の薬物動態学的分析
【００９６】
異なるＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩの薬物動態学的特性は、ＳＰ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）系ラットに対する投与量３ｍｇ／ｋｇの１回の静脈内投与の後で評価する。これらの研究は、ファーマレガシーラボラトリーズ有限会社（上海）で行った。血清アルギナーゼおよびアルギニンの分析のために、血液試料は投与前、投与後２分、１時間、４時間、２４時間、７２時間、１２０時間、１６８時間および２４０時間後に採取した。およそ０．４ｍｌの血液試料は、イソフルランによる麻酔後それぞれの時点における眼窩の静脈を採取し、２ｍｌの遠心管に移した。試料は、４０００ｇ、１５分間、４℃で遠心分離するまで、室温に３０分間放置した。
【００９７】
アルギナーゼＩの血清濃度は、シャンハイエクセルバイオロジー社製の定量的サンドイッチ酵素免疫測定キッドにより測定した。抗ヒトアルギナーゼＩモノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡプレートのウェルの表面に塗布した。ヒトアルギナーゼＩの試料またはタンパク質標準は、それぞれＥＬＩＳＡプレートのウェルの中に添加し（１００μｌ／ウェル）、密封テープで覆い、３７℃で９０分間培養して、モノクローナル抗体とヒトアルギナーゼＩとの間に免疫複合体が形成されるようにした。培養後、プレートは５回洗浄し、ウェルにウサギ抗ヒトアルギナーゼＩポリクロナール抗体を添加した（１００μｌ／ウェル）。再び密封テープで覆い、さらに３７℃で６０分間培養した。２回目の培養後、再びプレートを５回洗浄し、各ウェルにＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧを添加し（１００μｌ／ウェル）、３０分間共培養した。さらに５回洗浄した後、発色基質をウェルに添加し、暗所で１０〜１５分間培養した。停止液を各ウェルに添加し、よく混合した。４５０ｎｍにおける光学濃度を、停止液を添加後１０分以内に測定した。標準曲線は、回帰方程式における二次的な適切な方法を用いて作成し、各試料のアルギナーゼＩの濃度は、測定したＯＤ値を用いて算出した。ＰＫパラメータは、ウィンノリン（ＷｉｎｎｏＬｉｎ）の無区画分析法を用いて導き出した。さまざまな構造の部位特異的ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩ、Ａ３０３−Ｍ２０Ｋ（２）、Ａ３０３−Ｍ３０Ｋ（２）、Ａ１６８／３０３−Ｙ４０ＫおよびＡ４５／３０３−Ｙ４０Ｋの半減期（Ｔ１／２）の値は、それぞれ、２８．０±４．５、２８．４±８．４、２７．２±３．８および １５．１±０．６と測定された。
【００９８】
表１：ラットにＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩを１回投与したときの薬物動態的パラメータ（平均±標準偏差、ｎ＝６）
【００９９】
【表１】
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【０１００】
本発明では、ヒトアルギナーゼＩの位置４５、１６８および３０３のシステイン残基のうちの１つ、２つまたは全部のいずれかを修飾するための部位特異的変異形成を用いており、高い比活性を有するヒトアルギナーゼを得るため、上記修飾は、システインをコード化するコドンを、他のアミノ酸、特に、アラニンに置換することによって行う。さらに、本発明では、新しい部位特異的ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼを提供し、それは潜在的な免疫原性Ｈｉｓタグタンパク質配列を含まない。上記ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼは、２０、３０または４０ｋＤａのポリエチレングリコールマレイミドを、それぞれシステイン残基４５、１６８または３０３と結合することによってＰＥＧ化された。このようにして生成したＰＥＧ化ヒトアルギナーゼは、糸球体濾過率が低い。さらに、ＰＥＧと結合したアルギナーゼのＰＥＧ化部位は明確であり、ＰＥＧ化生成物はより均質であり、容易に精製でき、大量生産における品質管理に有利である。本願発明で提供されるＰＥＧ化アルギナーゼは、哺乳動物における半減期を著しく増加させ、ラットの血清では１５〜２８時間とすることができる。
【０１０１】
特別な記載がない限り、本発明の実施には、バイオテクノロジー、有機化学または無機化学などで採用される一般的な技術の使用を含む。明らかに、上述した記載や実施例の他に、本発明を実施するのに用いることができる他の方法がある。本発明の範囲におけるいかなる改変や修正は、当業者には明らかである。本発明の教示により、多くの改変や修正は可能であり、それゆえそれらは本発明の適用範囲に区分される。本明細書で述べた特許、その出願書類および化学論文は、すべてこの明細書に組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年8月28日(2014.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＥＧ化アルギナーゼであって、
上記アルギナーゼがヒトアルギナーゼＩであり、
上記アルギナーゼのＰＥＧ化が部位特異的であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列の位置４５、１６８および３０３のシステインのうちいずれか１つまたは２つがＰＥＧ化しており、
上記部位特異的ＰＥＧ化が、ＰＥＧ化していない上記システイン位置のうちいずれか１つまたは２つにおいてシステインから他のアミノ酸に部位特異的変異し、その後システイン残基において変異アルギナーゼが部位特異的ＰＥＧ化することにより成し遂げられ、上記アルギナーゼにおいて、
（１）上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置４５、１６８および３０３のシステインのうちいずれか１つまたは２つがアラニンに変異しており、または、
（２）上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１において１つ以上のアミノ酸の置換、除去、挿入、付加または転置が導入されており、
上記アルギナーゼが活性を有するＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項２】
上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置４５、１６８および３０３の上記システインのうち１つがアラニンに変異している、請求項１に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項３】
上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置４５および３０３の上記システインがアラニンに変異している、請求項１に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項４】
上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置１６８および３０３の上記システインがアラニンに変異している、請求項１に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項５】
上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置４５および１６８の上記システインがアラニンに変異している、請求項１に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項６】
上記アルギナーゼがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合しており、
上記ＰＥＧが平均分子量２０Ｋ、３０Ｋまたは４０Ｋを有する、請求項１に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項７】
部位特異的ＰＥＧ化がＣｙｓ１６８で行われ、
上記ＰＥＧが平均分子量４０Ｋを有する、請求項３に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項８】
部位特異的ＰＥＧ化がＣｙｓ４５で行われ、
上記ＰＥＧが平均分子量４０Ｋを有する、請求項４に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項９】
上記ＰＥＧ化アルギナーゼの純度が７０％を超える、請求項１に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項１０】
上記アルギナーゼが、血液または血清中で、少なくとも０．５日間の半減期を有する、請求項１に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項１１】
請求項１に記載の上記ＰＥＧ化アルギナーゼを含むアルギナーゼ関連疾患を治療するための医薬組成物。  
【請求項１２】
上記疾患が、高アルギニン血症、アルギニン依存性過形成または腫瘍から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
アルギナーゼ関連疾患を治療するための薬剤の調製における請求項１に記載の上記ＰＥＧ化アルギナーゼの使用方法。
【請求項１４】
上記疾患が、高アルギニン血症、アルギニン依存性過形成または腫瘍から選択される、請求項１３に記載の使用方法。
【国際調査報告】
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