(57)【要約】  本発明は、連続アフィニティークロマトグラフィー法およびかかる方法において用いる装置に関する。該方法は、高い結合容量を維持しつつ、高い操作速度の使用を可能とする。
2015520667.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の１または２以上の不純物から標的分子を精製する方法であって、該方法が、以下のステップ：
ａ）同一のクロマトグラフィーマトリックスを有する少なくとも３つの分離ユニットであって、これらが、液体が少なくとも、１つの分離ユニットから後続のものへと、および最後のものから第１の分離ユニットへと流れることができるように接続された、前記分離ユニットを提供すること、
ｂ）試料を第１の分離ユニット上にフィードして、試料がこの分離ユニット上（ここで試料は、標的分子がこの分離ユニットに結合することを可能とする第１のｐＨおよび伝導率にある）にロードされている間、前記分離ユニットは、ローディング時間の少なくとも一部において次の分離ユニットと流体連通しており、これにより前記第１分離ユニットに結合していない標的分子が、次の分離ユニットに、ロードされている分離ユニットともロードされている分離ユニットと流体連通している分離ユニットとも異なる１つの分離ユニットを少なくとも洗浄、溶出、および再平衡化するのと同時に、結合することができるようにすること、
ｃ）フィードを、次の分離ユニットへと切り替えること、
ｄ）試料を次の分離ユニット上にフィードして、試料が前記次の分離ユニット上（ここで試料は、標的分子が前記次の分離ユニットに結合することを可能とする第１のｐＨおよび伝導率にある）にロードされている間、前記次の分離ユニットは、ローディング時間の少なくとも一部において、次の後の分離ユニットと流体連通しており、これにより前記次の分離ユニットに結合していない標的分子が、次の後の分離ユニットに、ロードされている分離ユニットともロードされている分離ユニットと流体連通している分離ユニットとも異なる１つの分離ユニットを少なくとも洗浄、溶出、および再平衡化するのと同時に、結合することができるようにすること、
ｅ）ステップｃ）およびｄ）を１または２回以上繰り返すこと、
を含み、
フィードは停止されず８００ｃｍ／ｈを超える速度を有すること、および分離ユニットのクロマトグラフィーマトリックスは、４０〜２００μｍの直径および５０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の細孔径を有する粒子を含むこと、を特徴とする、前記方法。
【請求項２】
フィードが、８００ｃｍ／ｈを超える速度を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
同一のクロマトグラフィーマトリックスを有する３、４または５個の分離ユニットが、ステップａ）で提供されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
分離ユニットのクロマトグラフィーマトリックスが、直径５５〜１００μｍの粒子を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
分離ユニットのクロマトグラフィーマトリックスが、６０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲の細孔径の粒子を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｂ）、ｃ）およびｄ）において、ロードされている分離ユニットが、ローディング時間の一部のみでなく、ローディング時間の全体を通して、次の分離ユニットと流体連通していることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップｂ）、ｃ）およびｄ）において、ロードされている分離ユニットと次の分離ユニットの間の流体連通が、ローディング時間の後半に開始されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ロードされた分離ユニットを洗浄する場合に、前記ロードされた分離ユニットから溶出される洗浄液体が、別の分離ユニットの入口に向けられることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
試料が清澄化された試料であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
分離ユニットから溶出される標的分子が、少なくとも１つのフロースルー精製ステップにさらに供されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
以下を含む装置：
−  同一のクロマトグラフィーマトリックスを有する少なくとも３つの分離ユニットであって、これらは接続線によって、液体が、第１の分離ユニットから後続のものへと、および最後のものから第１の分離ユニットへと流れることができるように接続されており、ここで２つの分離ユニットの間の各接続線が、少なくとも１つのオン／オフ弁を含む、前記分離ユニット、
−  分離ユニットの間の接続線における各分離ユニットの入口に近い分岐を介して、各分離ユニットの入口と流体連通している、溶媒送達システム、
−  分離ユニットの出口近くの、分離ユニットの間の各接続線から分岐する流体出口線であって、線および少なくとも２つの分岐（各分岐はオン／オフ弁を含む）を含む前記流体出口線。
【請求項１２】
本発明に記載の方法を含む、タンパク質を精製するためのプロセス。
【請求項１３】
プロセスがさらに、１または２以上の以下のステップ：
−  清澄化
−  ウイルスの不活化
−  フロースルー精製
−  滅菌濾過
を含むことを特徴とする、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
プロセスの少なくとも２つのステップが、それらの持続時間の少なくとも一部において重複していることを特徴とする、請求項１２または１３に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、連続クロマトグラフィー法および、かかる方法で用いられる装置に関する。本方法は、高い結合容量を維持しつつ高い操作速度の使用を可能とする。
【背景技術】
【０００２】
バイオ医薬品分子の精製には、広く確立された技術の一つとしてクロマトグラフィー分離法の使用が関与する。通常の用途には、標的分子のキャプチャーおよびポリッシングが伴う。多様なクロマトグラフィー法および樹脂を、これらのタスク（例えば、順相、逆相、サイズ排除、イオン交換クロマトグラフィーモード）を行うために適用することができる。特殊な分野では、アフィニティークロマトグラフィーなどのより特異的かつ効率的な分離方法が開発されている。抗体精製の最先端では、ＰｒｏｔＡ修飾されたアフィニティークロマトグラフィー支持体材料を用いて、最も豊富な不純物（宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、糖、アミノ酸、成長因子等）の大部分から、標的分子を結合して分離する。様々な特性の３０以上のクロマトグラフィー樹脂が、現在市場で利用可能であり、顧客に対してその用途に最適なものを見出す機会を提供している。これらの生成物の主な相違点は、物理的特性（支持体材料、粒子サイズ、粒子形状および細孔サイズ）および化学的特性（ＰｒｏｔＡリガンド、リガンド密度、支持マトリックス型）であり、これらは結合容量、物質移動特性、圧縮性および堅牢性に影響する。
【０００３】
結合容量は、アフィニティーリガンド、表面上でのその密度、およびそのアクセシビリティに強く依存する。修飾技術の改善により、支持マトリックスの化学からは独立して、＞３０ｇ／Ｌの高い結合容量に＞３分の滞留時間で到達することができる。
【０００４】
一方、物質移動特性は非常に変化しやすく、用途において根本的な違いを引き起こす。薄膜物質移動および細孔拡散は、吸着部位に向かう標的分子の拡散性に影響する２つの主要なパラメータである。薄膜物質移動は、主に粒子サイズおよび形状に影響される。粒子および粒子間の体積が小さいほど、物質移動および流動抵抗は大きくなる。したがって、分析規模の用途には小さな粒子サイズを用いて、高速物質移動と高効率を確保する。しかし、圧力耐性の問題のため、工業規模での操作は＜３バールの操作圧で行われる。より大きい粒子（６０μｍ〜１２０μｍ）が通常選択される。
【０００５】
上記の論点により、細孔拡散は物質移動を規定する最も影響力の強い特性の一つである。いくつかの材料は広い細孔を呈して（５０〜５００ｎｍ）、高速の物質移動を可能にすることが示された。しかしこれらの材料は、小さい表面積のために低い結合容量（〜２０ｇ／Ｌ）を示す。結合容量を高めるためにはより大きな表面積が必要であり、これは通常、小さな細孔サイズによって達成される。〜１００ｎｍの細孔サイズを示す材料は、４０ｇ／Ｌの結合容量を示し（Prosep-vA High Capacity（Millipore Bioprocessing, Consett, UK））、さらに〜７０ｎｍの細孔サイズを示す材料は、５６ｇ／Ｌの結合容量を示した（Prosep-vA Ultra（Millipore Bioprocessing, Consett, UK））。匹敵する範囲の広い細孔サイズ分布を有する支持体材料も、類似の結合容量を示した（MabSelect Sure（登録商標）（GE Healthcare, Uppsala, Sweden））。小さい細孔サイズのために、標的分子の拡散は遅く、４０ｇ／Ｌを超える結合容量を達成するためには、一定の標的分子滞留時間が必要となる。使用される滞留時間の通常の範囲は、標的分子が結合部位に向かって拡散することを保証するために３〜６分の範囲である。これは、支持体材料が標的分子を含む溶液で処理される、クロマトグラフィープロセスのローディング段階において重要である。アフィニティークロマトグラフィー法の残りの必要なステップ（例えば洗浄、溶出、ストリップ、定置洗浄、再平衡化など）をより高速で実施して、より短い処理時間を確保することができる。この場合の操作速度は、支持材料の剛性の影響を受ける。
【０００６】
しかしながら、この特異的かつ非常に選択的な方法を約２０年間適用の後に、より高い経済的効率および生産性を追求して、さらなる方法の最適化の必要性が高まっている（ｇ（標的分子）／ｍｌ（固定相）／ｈ（操作時間））。現状は、より多量の樹脂へのより高い投資によって、より高いスループットのために大きなカラムを用いることである。直径１．２ｍおよび１０〜２０ｃｍの床高さのカラムが、ｍＡｂの精製に使用されることもある。経済的な処理を可能とし得る代替的技術、すなわち連続クロマトグラフィーの存在も認識されていた。この方法の基本は、生成物の損失なしで、標準のバッチにおける６０％の代わりに８０％の樹脂結合容量にローディングするというより高い樹脂の利用と、逐次的バッチ処理を多数のカラムでの並行操作に分割することによる、より短い操作時間であり、したがってより小さいカラムの利用を可能とすることである。
【０００７】
連続クロマトグラフィーにおいては、複数の同一のカラムは、方法の要請に応じてカラムが直列および／または並列に操作されることを可能にする配置で、接続されている。したがって、すべてのカラムは原理的に同時に、しかし方法ステップにおいてわずかにシフトされて、実行することができる。手順は繰り返すことができて、各カラムはプロセス中に複数回ロードされ、溶出され、および再生される。単一のクロマトグラフィーサイクルがローディング、洗浄、溶出、および再生などの複数の連続したステップに基づく、「従来の」クロマトグラフィーと比較すると、複数の同一カラムに基づく連続クロマトグラフィーにおいては、これらの全ステップは、異なるカラムそれぞれにおいて、同時に実施される。連続クロマトグラフィー操作は、クロマトグラフィー樹脂のより良好な利用、処理時間の低減、およびバッファー要件の低減をもたらし、これらは全て、プロセスの経済性に利益となる。連続クロマトグラフィーの一例は、擬似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーである。
近年この擬似移動床（ＳＭＢ）技術は、バイオ医薬品市場、特に抗体の精製にも導入されている。以前の通常のバッチクロマトグラフィーにおいて、クロマトグラフィーカラムのローディングが標的分子のブレークスルーの特定のパーセンテージにおいて停止されていたとしても、現在のローディングは、標的分子を損失することなく、結合容量を増加させるために継続することができるが、これは、ブレークスルー画分が、最初の次のカラムにロードされるからである。
【０００８】
しかしながら、より優れた経済性のためには、処理時間は、これが生産性に直接影響を与えるので、非常に重要である。結合容量の増加は、どれだけ多くの物質を表面に結合させることができるかというレベルで、既に生産性を増加させているが（〜２０から４０％）、しかし、標的分子が修飾された表面に結合するのに必要な滞留時間の減少は、経済効率をさらに高めるであろう。おそらく、滞留時間を０．３分に減少させると、３分の滞留時間と比較して、生産性の１０倍の増加につながるであろう。残念ながら、標的分子の吸着段階の間の滞留時間を減少させることは、物質移動速度が減少するために、動的結合容量の低下につながる。その結果、カラムのローディングは典型的には、US 20090209736に開示されているように、約６００ｃｍ／ｈまで上昇した速度で実施される。しかし、E. Mahajan et el., Journal of Chromatography A, 1227 (2012) 154-162に実際に記載されているように、より高い流量においてカラムの結合容量は低減されるため、カラムのローディングに対して高い流量は実現不可能である。
驚くべきことに、我々は、適切な支持材料の物理的特性（粒子サイズ、細孔サイズ）の選択を一定の連続クロマトグラフィー法と組み合わせて、８００ｃｍ／ｈを超えるローディング速度が可能となることを見出した。
【発明の開示】
【０００９】
発明の簡単な説明
アフィニティー樹脂の６０％を超える総結合容量を、ローディング中に＜５％の低い標的分子損失有りまたは無しで、８００ｃｍ／ｈを超える、さらに１０００ｃｍ／ｈを超える速度を用いて、ロード中に浸出標的分子を、第１キャプチャーアフィニティーカラムから第２キャプチャーアフィニティーカラムへと移動することにより、実現することができる。同時に、少なくとも第３のカラムを別のクロマトグラフィープロセスステップに用いて、並行ユニット操作を実現することができる。これにより、バッチユニット操作と直接比較した場合に（同一のユニット操作条件）、＞２０％の結合容量の増加と、操作時間の＞３倍の減少がもたらされる（通常のバッチユニット操作は、３００ｃｍ／ｈで実施される）。これは、アフィニティークロマトグラフィー用途のためのみではなく、イオン交換クロマトグラフィー用途に対しても機能する。
【００１０】
本発明は、結果として、標的分子を試料中の１または２以上の不純物から精製する方法に関し、この方法は以下のステップ：
ａ）同一のクロマトグラフィーマトリックスを有する少なくとも３つの分離ユニットであって、これらが、液体が１つの分離ユニットから後続のものへと、および最後のものから第１の分離ユニットへと流れることができるように少なくとも接続されている、前記分離ユニットを提供すること、
ｂ）試料を第１の分離ユニット上にフィードして、試料がこの分離ユニット上（ここで試料は、標的分子がこの分離ユニットに結合することを可能とする第１のｐＨおよび伝導率にある）にロードされている間、前記分離ユニットは、ローディング時間の少なくとも一部において次の分離ユニットと流体連通（fluid communication）しており、これにより前記第１分離ユニットに結合していない標的分子が、次の分離ユニットに、ロードされている分離ユニットともロードされている分離ユニットと流体連通している分離ユニットとも異なる１つの分離ユニットを少なくとも洗浄、溶出、および／または再平衡化するのと同時に、結合することができるようにすること、
【００１１】
ｃ）フィードを、次の分離ユニットへと切り替えること、
ｄ）試料を次の分離ユニット上にフィードして、試料が前記次の分離ユニット（ここで試料は、標的分子が前記次の分離ユニットに結合することを可能とする第１のｐＨおよび伝導率にある）上にロードされている間、前記次の分離ユニットは、ローディング時間の少なくとも一部において、次の後の分離ユニットと流体連通しており、これにより前記次の分離ユニットに結合していない標的分子が、次の後の分離ユニットに、ロードされている分離ユニットともロードされている分離ユニットと流体連通している分離ユニットとも異なる１つの分離ユニットを少なくとも洗浄、溶出、および再平衡化するのと同時に、結合することができるようにすること、
ｅ）ステップｃ）およびｄ）を１または２回以上繰り返すこと、
を含み、
フィードフローは停止されず８００ｃｍ／ｈを超える速度を有すること、および分離ユニットのクロマトグラフィーマトリックスは、３０〜２００μｍの平均直径および４０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の平均細孔径を有する粒子を含むこと、を特徴とする。
【００１２】
好ましい態様において、フィードは、１０００ｃｍ／ｈを超える速度を有する。
好ましい態様において、同一のクロマトグラフィーマトリックスを有する３、４または５個の分離ユニットが、ステップａ）で提供される。非常に好ましい態様において、同一のクロマトグラフィーマトリックスを有する３個のみの分離ユニットが、ステップａ）で提供される。
好ましい態様において、クロマトグラフィーマトリックスは、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスである。
別の好ましい態様において、分離ユニットのクロマトグラフィーマトリックスは、平均粒子径（ｄ５０）が４０〜１２０μｍの粒子を含む。さらに好ましくは、５５〜１００μｍである。
【００１３】
別の好ましい態様において、分離ユニットのクロマトグラフィーマトリックスは、４０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の平均細孔径の粒子を含む。さらに好ましくは、分離ユニットに存在する粒子の細孔は、５０ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲の平均細孔径の細孔を有する。さらに好ましくは、粒子の細孔は、６０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲の平均細孔径を有する。
好ましい態様において、ステップｂ）、ｃ）およびｄ）において、ロードされている分離ユニットは、ローディング時間の一部のみでなく、ローディング時間の全体を通して、サークルにおける次の分離ユニットと流体連通している。
別の好ましい態様において、ステップｂ）、ｃ）およびｄ）において、ロードされている分離ユニットとサークルにおける次の分離ユニットの間の流体連通は、ローディング時間の後半に開始される。
【００１４】
別の態様において、ロードされた分離ユニットを洗浄する場合に、前記ロードされた分離ユニットから溶出される洗浄液体は、別の分離ユニットの入口に向けられる。
別の態様において、ロードされた分離ユニットを洗浄する場合に、前記ロードされた分離ユニットから溶出される洗浄液体は、フィードストック（feedstock）に向けられる。
好ましい態様において、試料は、清澄化された試料である。清澄化された試料は、前に清澄化ステップに供された試料である。
別の好ましい態様において、分離ユニットからの溶出液である精製された標的分子、したがって本発明の方法からもたらされる精製された標的分子は、少なくとも１つのフロースルー精製ステップにさらに供される。
【００１５】
本発明はさらに、以下を含む装置に向けられる：
−  同一のクロマトグラフィーマトリックスを有する少なくとも３つの分離ユニットであって、これらは接続線によって、液体が、第１の分離ユニットから後続のものへと、および最後のものから第１の分離ユニットへと流れることができるように接続されており、ここで２つの分離ユニットの間の各接続線が、少なくとも１つのオン／オフ弁を含む、前記分離ユニット、
−  分離ユニットの間の接続線における各分離ユニットの入口に近い分岐を介して、各分離ユニットの入口と流体連通している、溶媒送達システム、
−  分離ユニットの出口近くの、分離ユニットの間の各接続線から分岐する流体出口線であって、線および少なくとも２つの分岐（各分岐はオン／オフ弁を含む）を含む前記流体出口線。
【００１６】
本発明はさらに、本発明による方法を含む、標的分子を精製するためのプロセス、典型的にはバイオ医薬品生産プロセスに向けられる。バイオ医薬品生産プロセスは、生物反応器内の細胞培養物中で産生された標的分子を、製薬用途に用いることができるように精製するプロセスである。
好ましい態様において、プロセスはさらに、１または２以上の以下のステップを含む：
−  清澄化（遠心分離および／または濾過および／または沈下）
−  ウイルスの不活化
−  少なくとも１つのフロースルー精製ステップ、これはフロースルーポリッシングとも呼ばれる
−  滅菌濾過。
好ましい態様において、プロセスの少なくとも２つのステップは、それらの持続時間の少なくとも一部において重複している。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
図面
【図１】図１は、本発明による装置の好ましい態様の概略図を示す。ここには、３つのキャプチャー分離ユニット（ＰｒｏｔＡ、またはＩＥＸ）、溶媒リザーバＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆへの接続部および接続線、弁およびポンプが示されている。
【図２】図２ａ−ｅは、３つのカラムの連続プロセスの一部の概略図を示し、ここで第１および第２分離ユニットはローディング段階（フィード）の間流体連通しており、ロードされている分離ユニットおよびロードされている分離ユニットと流体連通している分離ユニットとは異なる第３の分離ユニットは、多様なプロセスサブステップ：ａ）溶液Ａによる洗浄、ｂ）溶液Ｂによる洗浄、ｃ）結合した標的分子の溶出、ｄ）定置洗浄、およびｅ）分離ユニットの再生、に供されている。
【図３】図３ａ−ｃは、３つのカラムの連続プロセスの、ローディング段階の間の流体連通について強調表示した選択された部分の概略図であり、ここでａ）ローディングの間に分離ユニット１は分離ユニット２と流体連通しており、分離ユニット３は洗浄段階にあり、ｂ）分離ユニット２は分離ユニット３と流体連通しており、分離ユニット１は洗浄段階にあり、ｃ）分離ユニット３は分離ユニット１と流体連通しており、分離ユニット２は洗浄段階にある。
【００１８】
【図４】図４は、３つの分離ユニットおよび２つの溶媒送達システムの本質的特徴に主に限定された、セットアップの図である。
【図５】図５ａ−ｄは、４つのカラムの連続プロセスの、ローディング段階の間の流体連通について強調表示した、選択された部分の概略図であり、ここでａ）ローディングの間に分離ユニット１は分離ユニット２と流体連通しており、洗浄段階に対して、分離ユニット４は分離ユニット３と流体連通しており、ｂ）分離ユニット２は分離ユニット３と流体連通しており、洗浄段階に対して、分離ユニット１は分離ユニット４と流体連通しており、ｃ）分離ユニット３は分離ユニット４と流体連通しており、洗浄段階に対して、分離ユニット２は分離ユニット１と流体連通しており、ｄ）分離ユニット４は分離ユニット１と流体連通しており、洗浄段階に対して、分離ユニット３は分離ユニット２と流体連通している。
【００１９】
【図６】図６ａ−ｅは、４つのカラムの連続プロセスの一部の概略図を示し、ここで第１および第２分離ユニットはローディング段階（フィード）の間流体連通しており、ロードされている分離ユニットおよびロードされている分離ユニットと流体連通している分離ユニットとは異なる第４の分離ユニットは、多様なプロセスサブステップ：ａ）溶液Ａによる洗浄、および前記洗浄溶液を、この分離ユニットから、洗浄されている分離ユニットと流体連通している前のものへと移動させること、ｂ）溶液Ｂによる洗浄、ｃ）結合した標的分子の溶出、ｄ）定置洗浄、およびｅ）分離ユニットの再生、に供されている。
【図７】図７ａは、弱くまたは非結合の標的分子の洗浄のための代替的流路の概略図を示し、前記分子の、別の分離ユニットへの移動を明らかにしている。一方図７ｂは、不純物の洗浄のための流路を示す。
【００２０】
【図８】図８は、標準的なバッチ法に対する連続クロマトグラフィーの魅力的な利点を示し、ProSep vA Ultra Plus樹脂について、滞留時間にわたる結合容量で表わしたものである。
【図９】図９は、ProSep vA Ultra Plusカラムを適用したｍＡｂＡ精製実験において、３分離ユニットの連続クロマトグラフィーシステム上で実施した１０３サイクルについての、ＵＶシグナルトレースのオーバーレイを示す図である。
【図１０】図１０は、ProSep vA Ultra Plusカラムを適用して３分離ユニットの連続クロマトグラフィーシステム上で実施した１０３サイクルについての、ｍＡｂＡ入力濃度およびｍＡｂ溶出濃度を示す図である。
【図１１】図１１は、ｍＡｂＡ精製について、ProSep vA Ultra Plusカラムを適用した３分離ユニットの連続クロマトグラフィーシステム上で実施した１０３サイクルについての、溶出プールでのＨＣＰ濃度を示す図である。
【図１２】図１２は、バッチおよび連続操作モードにおける、様々なＰｒｏｔＡ樹脂および様々なｍＡｂ濃度に対する動的結合容量を示す図である。材料が示されていない凡例はＰＵＰ材料を指すことに注意。すべてのカラムは０．８＊１０ｃｍの同一サイズを有していた。
【００２１】
【図１３】図１３は、標準的なバッチ法に対する連続クロマトグラフィーの魅力的な利点を示し、Eshmuno S樹脂について、滞留時間にわたる結合容量で表わしたものである。
【図１４】図１４は、Eshmuno Sカラムを適用したｍＡｂＡ精製実験において、３分離ユニットの連続クロマトグラフィーシステム上での実施についての、ＵＶシグナルトレースのオーバーレイを示す図である。
【図１５】図１５は、結合および溶出クロマトグラフィー（キャプチャー）ステップに本発明の方法を用いた、標的分子を精製するためのプロセスを示す。示された精製プロセスには細胞培養用にバイオリアクターを使用し、続いて以下のプロセスステップを用いる：清澄化；プロテインＡ結合および溶出クロマトグラフィー（キャプチャー）；ウイルス不活化；フロースルー精製；および製剤化。示されるように、各プロセスステップは、プロセスステップの意図する結果を達成するために用いる１または２以上の装置を使用する。示されるように、清澄化には沈殿およびデプス濾過を使用する；プロテインＡ結合および溶出クロマトグラフィーは、本発明のプロセスを用いて行われる；ウイルス不活化には、２つのインラインスタティックミキサーを使用する；フロースルー精製には、活性炭（ＡＣ）、次にアニオンイオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、次にインラインスタティックミキサーとサージタンクを用いるｐＨ変化、次にフロースルーカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーおよびウイルス濾過を用いる；および製剤化には、透析濾過／濃縮タンジェンシャルフロー濾過装置、次に滅菌濾過を用いる。１または２以上の滅菌フィルターも、プロセス全体を通して使用される。
【００２２】
定義
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定の組成物またはプロセスステップに限定されず、それら自体は変更されてもよいことが理解されるべきである。本明細書および添付の請求の範囲において用いられる場合、文脈が明らかに異なることを示さない限りにおいて、単数形「a」「an」および「the」は、複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「リガンド」は複数のリガンドを含み、「抗体」は複数の抗体を含み、他も同様である。
別に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は、本発明が関連する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。以下の用語を、本明細書において記載されるような本発明の目的のために定義する。
【００２３】
本明細書において用いられる場合、用語「標的分子」または「標的化合物」は、試料中の１または２以上の不純物から単離、分離または精製されるべき、任意の分子、物質もしくは化合物、またはそれらの混合物を指す。好ましい態様において、標的分子はタンパク質、または１もしくは２以上のタンパク質の混合物である。非常に好ましい態様において、標的分子は抗体である。代替的に、「標的分子」または「標的化合物」は、１または２以上の所望の化合物から除去されるべき不所望の化合物であり得る。
【００２４】
用語「抗体」は、抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質を指す。典型的には、抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる基本的な４ポリペプチド鎖構造を有しており、前記鎖は、例えば鎖間ジスルフィド結合により安定化されている。抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、単量体形態で存在しても多量体形態で存在してもよく、例えば、五量体形態で存在するＩｇＭ抗体、および／または単量体、二量体もしくは多量体形態で存在するＩｇＡ抗体であってもよい。抗体はまた、多選択性抗体（例えば二選択性抗体）、および、リガンド特異的結合ドメインを保持するかまたはそれを含むように改変される限りにおいて、抗体フラグメントを含んでもよい。用語「フラグメント」とは、インタクトもしくは完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の一部または部分を指す。フラグメントは、インタクトもしくは完全な抗体または抗体鎖の、化学的または酵素的処理を介して得ることができる。フラグメントはまた、組換え的手段により得ることができる。組換えにより生成される場合、フラグメントは、単独で、または融合タンパク質と称されるより大きなタンパク質の一部として、発現させることができる。例示的なフラグメントとして、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃおよび／またはＦｖフラグメントが挙げられる。例示的な融合タンパク質としては、Ｆｃ融合タンパク質が挙げられる。本発明により、融合タンパク質はまた、用語「抗体」により包含される。
【００２５】
上で議論されるように、一部の態様において、抗体は、Ｆｃ領域を含有するタンパク質、例えば免疫グロブリンである。一部の態様において、Ｆｃ領域を含有するタンパク質は、別のポリペプチドまたはそのフラグメントに融合した免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、組換えタンパク質である。例示的なポリペプチドとして、例えば以下が挙げられる：レニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンα鎖；インスリンβ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体ホルモン；グルカゴン；ＶＩＩＩＣ因子、ＩＸ因子、組織因子およびフォン・ウヴィルブラント因子などの凝固因子；プロテインＣなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などの、プラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血系増殖因子；腫瘍壊死因子−αおよび−β；エンケファリナーゼ；ランテス（ＲＡＮＴＥＳ：regulated on activation normally T-cell expressed and secreted）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；リラキシンα鎖；リラキシンβ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）（例えば、ＣＴＬＡ−４）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子のための受容体；プロテインＡまたはＤ；リウマトイド因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）などの神経栄養因子、またはＮＧＦ−βなどの神経増殖因子；
【００２６】
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；αＦＧＦおよびβＦＧＦなどの線維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−βｌ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（ｌ−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、およびＣＤ４０などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β、および−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジムスターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜（surface membrane）タンパク質；崩壊促進因子；例えばＡＩＤＳエンベロープの一部などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤｌ  Ｉａ、ＣＤｌ  Ｉｂ、ＣＤｌ  Ｉｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭなどのインテグリン；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体などの腫瘍関連抗原；ならびに上で列記されるポリペプチドのいずれかのフラグメントおよび／またはバリアント。さらに、本発明による抗体は、上で列記されるポリペプチドのいずれかに特異的に結合する任意のタンパク質またはポリペプチド、そのフラグメントまたはバリアントである。
【００２７】
本明細書において用いられる場合、および特に指定されない限り、用語「試料」は、標的分子を含有する任意の組成物または混合物を指す。試料は、生物学的ソースまたは他のソースから誘導することができる。生物学的ソースとして、植物および動物細胞、組織または器官などの、真核生物または原核生物のソースが挙げられる。試料はまた、標的分子と混合されて見出される希釈剤、バッファー、洗剤、および混入する種、デブリなどを含んでもよい。試料は、「部分的に精製され」ていても（すなわち、濾過ステップなどの１または２以上の精製ステップに供されていても）、または、標的分子を生成する宿主細胞または生物から直接的に得てもよい（例えば、試料は、収集された細胞培養液を含んでもよい）。
用語「不純物」または「混入物」とは、本明細書において用いられる場合、任意の外来のまたは好ましくない分子を指し、本発明のプロセスを用いて１または２以上の外来のまたは好ましくない分子から分離されている標的分子を含む試料中に存在し得る、ＤＮＡ、ＲＮＡ、１または２以上の宿主細胞タンパク質、エンドトキシン、脂質、および１または２以上の添加物などの生物学的巨大分子を含む。
【００２８】
さらに、かかる不純物は、本発明の方法に先立って行われてもよいステップにおいて用いられる、任意の試薬を含んでもよい。
用語「精製する」、「分離する」、または「単離する」は、本明細書において交換可能に用いられ、標的分子および１または２以上の不純物を含む組成物または試料からの、標的分子の純度の程度を増大させることを指す。典型的には、標的分子の純度の程度は、組成物から少なくとも１つの不純物を（完全にまたは部分的に）取り除くことにより、増大する。
用語「結合および溶出モード」および「結合および溶出プロセス」は、本明細書において交換可能に用いられ、試料中に含有される少なくとも１つの生成物（例えば、Ｆｃ領域を含有するタンパク質）をクロマトグラフィー用樹脂または媒質に結合させて、それをその後に溶出させる、生成物分離技術を指す。
【００２９】
本明細書において用いられる場合、用語「リザーバ」とは、本明細書において用いられる場合、任意の容器、タンクまたはバッグであって、本発明の方法を行う場合に用いられるべき任意のバッファー、または本発明の方法において用いられるであろう試料もしくは任意の他の液体を貯蔵するために用いることができるものを指す。さらに「リザーバ」は、任意の容器、タンクまたはバッグであって、プロセスステップのアウトプット（例えば、カラムからの溶出液）を収集するために使用されるものを指す。
用語「クロマトグラフィー」とは、混合物中に存在する他の分子から目的の分析物（例えば標的分子）を分離する任意の種類の技術を指す。通常、標的分子は、移動相の影響下において、または結合および溶出プロセスにおいて、混合物の個々の分子が固定媒体中を通って移動する速度の差異の結果として、他の分子から分離される。
【００３０】
用語「マトリックス」または「クロマトグラフィーマトリックス」は、本明細書において相互交換可能に用いられ、任意の種類の粒子状吸着剤、樹脂または固相であって、分離プロセスにおいて、混合物中に存在する他の分子から標的分子（例えば、免疫グロブリンなどのＦｃ領域を含有するタンパク質）を分離するものを指す。通常、標的分子は、移動相の影響下において、または結合および溶出プロセスにおいて、混合物の個々の分子がマトリックス中を通って移動する速度の差異の結果として、他の分子から分離される。樹脂粒子からなるマトリックスを、カラムまたはカートリッジ中に入れることができる。マトリックスを形成するための材料の例として、多糖（アガロースおよびセルロースなど）；ならびにシリカ（例えば孔制御ガラス）、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリアクリルアミド、セラミック粒子および上のいずれかの誘導体などの、他の機械的に安定なマトリックスが挙げられる。典型的には、マトリックスは１または２以上のタイプのリガンドを担持する。
【００３１】
「リガンド」とは、クロマトグラフィーマトリックスに付着して、当該マトリックスの結合特性を決定する官能基である。「リガンド」の例として、限定されないが、イオン交換基、疎水性相互作用基、親水性相互作用基、thiophilic相互作用基、金属アフィニティー基、アフィニティー基、バイオアフィニティー基、およびミックスモード基（前述のものの組み合わせ）が挙げられる。本明細書において用いることができる幾つかの好ましいリガンドとして、限定されないが、スルホプロピル、スルホン酸などの強力なカチオン交換基；トリメチル塩化アンモニウムなどの強力なアニオン交換基；カルボン酸などの弱いカチオン交換基；Ｎ５ＮジエチルアミノまたはＤＥＡＥなどの弱いアニオン交換基；フェニル、ブチル、プロピル、ヘキシルなどの疎水性相互作用基；ならびに、プロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬなどのアフィニティー基が挙げられる。
【００３２】
用語「アフィニティークロマトグラフィー」とは、標的タンパク質（例えば、目的のＦｃ領域を含有するタンパク質または抗体）が、当該標的タンパク質に対して特異的なリガンドに特異的に結合する、タンパク質分離技術を指す。かかるリガンドは、一般に、生物特異的リガンドとして言及される。一部の態様において、生物特異的リガンド（例えば、プロテインＡまたはその機能的バリアント）は、クロマトグラフィーマトリックス材料に共有結合し、溶液が当該クロマトグラフィーマトリックスに接触した際に、当該液中の標的タンパク質にアクセス可能である。標的タンパク質は、一般に、クロマトグラフィーのステップの間、生物特異的リガンドに対するその特異的結合アフィニティーを保持するが、一方、混合物中の他の溶質および／またはタンパク質は、当該リガンドに対して、感知できるほどには、または特異的には、結合しない。固定されたリガンドへの標的タンパク質の結合により、標的タンパク質を固相材料上に固定されたリガンドに特異的に結合させたままで、混入しているタンパク質またはタンパク質不純物をクロマトグラフィーマトリックスに通過させることが可能になる。特異的に結合した標的タンパク質を、次いで、活性形態において、固定されたリガンドから、好適な条件下（例えば、低ｐＨ、高ｐＨ、高塩、競合するリガンドなど）において取り除き、前にカラムを通過させられた混入タンパク質またはタンパク質不純物フリーで、溶出バッファーによりクロマトグラフィーカラムを通過させる。そのそれぞれの特異的結合タンパク質、例えば抗体を精製するために、任意の成分をリガンドとして用いてよい。しかし、本発明による多様な方法において、プロテインＡを、Ｆｃ領域を含有する標的タンパク質のためのリガンドとして用いる。生物特異的リガンド（例えばプロテインＡ）からの標的タンパク質（例えば、Ｆｃ領域を含有するタンパク質）の溶出のための条件は、当業者により、容易に決定され得る。一部の態様において、プロテインＧもしくはプロテインＬまたはそれらの機能的バリアントを、生物特異的リガンドとして用いてもよい。一部の態様において、Ｆｃ領域を含有するタンパク質への結合、生物特異的リガンド／標的タンパク質コンジュゲートの洗浄または再平衡化のために、プロテインＡなどの生物特異的リガンドを、５〜９のｐＨ範囲において用い、その後、約４またはそれより低いｐＨを有する、少なくとも１つの塩を含有するバッファーにより溶出する。
【００３３】
用語「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」とは、目的の溶質または分析物が、混合物中の溶質不純物または混入物より高くまたは低く、荷電された化合物と非特異的に相互作用するように、混合物中の目的の溶質または分析物（例えば、Ｆｃ領域を含有する標的タンパク質）が、固相イオン交換材料に結合（共有結合によるものなど）した荷電された化合物と相互作用する、クロマトグラフィーのプロセスを指す。混合物中に混入している溶質は、イオン交換材料のカラムから、目的の溶質より速くまたは遅く溶出するか、目的の溶質に相対的に樹脂に結合するかまたはこれから取り除かれる。「イオン交換クロマトグラフィー」は特に、カチオン交換、アニオン交換およびミックスモードイオン交換クロマトグラフィーを含む。例えば、カチオン交換クロマトグラフィーを、標的分子（例えば、Ｆｃ領域を含有する標的タンパク質）に結合させ、その後溶出させても（カチオン交換結合および溶出クロマトグラフィーまたは「ＣＩＥＸ」）、あるいは、標的分子がカラムを貫流する間に、不純物に優先的に結合してもよい（カチオン交換フロースルークロマトグラフィーＦＴ−ＣＩＥＸ）。アニオン交換クロマトグラフィーは、標的分子（例えば、Ｆｃ領域を含有する標的タンパク質）を結合してその後溶出することも、標的分子がカラムを貫流する間に、不純物に優先的に結合することもできる。一部の態様において、および本明細書に記載される例において示されるように、アニオン交換クロマトグラフィーステップは、フロースルーモードにおいて行われる。
【００３４】
句「イオン交換マトリックス」とは、負に荷電（すなわちカチオン交換樹脂）または正に荷電（すなわちアニオン交換樹脂）されたクロマトグラフィーマトリックスを指す。電荷は、例えば共有結合によって、１または２以上の荷電されたリガンドをマトリックスに付着させることにより、提供することができる。代替的に、またはさらに、電荷はマトリックスの固有の特性であってもよい（例えば、全体的に負の電荷を有するシリカについての場合のように）。
【００３５】
「カチオン交換マトリックス」とは、負に荷電したクロマトグラフィーマトリックスを指し、これはしたがって、固相の上または中を通過する水溶液中のカチオンとの交換のための、遊離のカチオンを有する。固相に付着してカチオン交換樹脂を形成する負に荷電されたリガンドは、例えばカルボン酸またはスルホン酸であってよい。市販のカチオン交換樹脂として、カルボキシメチルセルロース、アガロース上に固定されたスルホプロピル（ＳＰ）（例えば、SP-SEPHAROSE FAST FLOW（商標）またはSP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE（商標）、Pharmacia製）およびアガロース上に固定されたスルホニル（例えばS-SEPHAROSE FAST FLOW（商標）、Pharmacia製）が挙げられる。好ましいものは、Fractogel（登録商標）EMD SO3、Fractogel（登録商標）EMD SE Highcap、Eshmuno（登録商標）SおよびFractogel（登録商標）EMD COO（Merck）である。
【００３６】
「ミックスモードイオン交換マトリックス」とは、カチオン性および／またはアニオン性ならびに疎水性の部分で共有的に修飾されているクロマトグラフィーマトリックスを指す。市販のミックスモードイオン交換樹脂は、シリカゲル固相支持マトリックスに付着した弱いカチオン交換基、低濃度のアニオン交換基、および疎水性リガンドを含有する、BAKERBOND ABX（商標）（J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.）である。ミックスモードカチオン交換材料は、典型的には、カチオン交換基および疎水性部分を有する。好適なミックスモードカチオン交換材料は、Capto（登録商標）MMC（GE Healthcare）およびEshmuno（登録商標）HCX（Merck）である。ミックスモードアニオン交換材料は、典型的には、アニオン交換基および疎水性部分を有する。好適なミックスモードアニオン交換材料は、Capto（登録商標）Adhere（GE Healthcare）である。
【００３７】
用語「アニオン交換マトリックス」は、本明細書において、正に荷電した、例えばそれに付着した四級アミノ基などの１または２以上の正に荷電されたリガンドを有する、クロマトグラフィーマトリックスを指す。市販のアニオン交換樹脂として、DEAEセルロース、QAE SEPHADEX（商標）およびFAST Q SEPHAROSE（商標）（Pharmacia）が挙げられる。好ましい材料は、Fractogel（登録商標）EMD TMAE、Fractogel（登録商標）EMD TMAE highcap、Eshmuno（登録商標）QおよびFractogel（登録商標）EMD DEAEである。
用語「プロテインＡ」および「Ｐｒｏｔ  Ａ」は、本明細書において相互交換可能に用いられ、そのネイティブのソースから回収されたプロテインＡ、合成で（例えば、ペプチド合成により、または組換え技術により）生成されたプロテインＡ、および、Ｆｃ領域などのＣＨ２／ＣＨ３領域を有するタンパク質に結合する能力を保持するそれらのバリアントを包含する。プロテインＡは、Repligen、PharmaciaおよびFermatechから市販で購入することができる。プロテインＡは、一般に、クロマトグラフィーマトリックス上に固定される。用語「ＰｒｏＡ」はまた、プロテインＡが共有結合するクロマトグラフィー用固体支持マトリックスを含有する、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスまたはカラムを指す。
【００３８】
本発明による方法において用いられるプロテインＡの機能的誘導体、フラグメントまたはバリアントは、マウスＩｇＧ２ａまたはヒトＩｇＧｌのＦｃ領域について、少なくともＫ＝１０”８Ｍ、および好ましくはＫ＝１０”９Ｍの結合定数により特徴づけることができる。結合定数についてのかかる値を遵守する相互作用は、本文脈において「高アフィニティー結合」と称される。好ましくは、プロテインＡのかかる機能的誘導体またはバリアントは、天然のドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、またはその操作された変異体であってＩｇＧ結合機能を保持しているものから選択される、野生型プロテインＡの機能的ＩｇＧ結合ドメインの少なくとも一部を含む。
また、一点付着（single-point attachment）を可能にするように操作されたプロテインＡの誘導体またはバリアントもまた、請求される方法におけるアフィニティークロマトグラフィーステップにおいて用いることができる。
【００３９】
一点付着は、一般に、タンパク質部分が、単一の共有結合を介してプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーのクロマトグラフィー支持材料に付着することを意味する。かかる一点付着はまた、ＮまたはＣ末端の近傍、またはタンパク質折り畳みの外周のどこかにおける、暴露されたアミノ酸位置に、すなわちループにおいて位置する、好適な反応性残基の使用によっても起こる。好適な反応性基は、例えばスルフヒドリルまたはアミノ官能基である。
用語「アフィニティークロマトグラフィーマトリックス」は、本明細書において、アフィニティークロマトグラフィーに好適なリガンドを担持するクロマトグラフィーマトリックスを指すように用いられる。典型的には、リガンド（例えば、プロテインＡまたはその機能的バリアント）は、クロマトグラフィーマトリックス材料に共有結合しており、溶液がクロマトグラフィーマトリックスと接触した際に、溶液中の標的分子に対してアクセス可能である。アフィニティークロマトグラフィーマトリックスの一例は、プロテインＡマトリックスである。アフィニティークロマトグラフィーマトリックスは典型的には、抗原／抗体または酵素／受容体結合などのロック／キー機構に基づき、高い特異性で標的分子に結合する。
アフィニティーマトリックスの例は、SEPHAROSE（商標）またはPROSEP（登録商標）-Aなどの、プロテインＡリガンドを担持するマトリックスである。
【００４０】
用語「結合する」とは、本明細書において、標的分子（例えば、Ｆｃ領域を含有するタンパク質）とマトリックスに付着したリガンド（例えば、固相マトリックスまたは樹脂に結合したプロテインＡ）との間の相互作用を記載するために用いられる場合、例えば、結合部位におけるタンパク質およびリガンドの構造の空間的相補性と、結合部位における静電力、水素結合、疎水力、および／またはファンデルワールス力との組み合わせ効果を通しての、標的分子のリガンドへの一般には可逆的な結合を指す。一般に、空間的相補性が高いほど、および結合部位における他の力が強いほど、タンパク質のそのそれぞれのリガンドに対する結合特異性は高くなるであろう。特異的結合の非限定的な例として、抗体−抗原結合、酵素−基質結合、酵素−コファクター結合、金属イオンキレート、ＤＮＡ結合タンパク質−ＤＮＡ結合、調節タンパク質−タンパク質相互作用などが挙げられる。理想的には、アフィニティークロマトグラフィーにおいては、特異的結合は、遊離溶液（free solution）中で、約１０”４〜１０”８Ｍのアフィニティーにより起こる。
【００４１】
用語「洗剤」とは、ポリソルベート（例えばポリソルベート20または80）；ポリクサマー（例えばポリクサマー188)；Triton；ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）；ラウリル硫酸ナトリウム；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、またはステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、またはステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−、またはセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノールアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、またはイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えばラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、またはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；メチルココイルナトリウム−、またはメチルオレイルタウリン酸二ナトリウム；およびMONAQU AT（商標）シリーズ（Mona Industries, Inc., Paterson、N. J.）などの、イオン性および非イオン性界面活性剤を指す。有用な洗剤は、ポリソルベート20（TWEEN 20（登録商標））またはポリソルベート80（TWEEN 80（登録商標））などのポリソルベート、またはオクタン酸などの多様な酸である。
【００４２】
「バッファー」は、その酸−塩基コンジュゲート成分の作用によりｐＨの変化を耐容する溶液である。例えばバッファーの所望されるｐＨに依存して使用することができる多様なバッファーは、Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems、Gueffroy, D.編、Calbiochem Corporation（1975年）において記載される。バッファーの非限定的な例として、MES、MOPS、MOPSO、Tris、HEPES、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、およびアンモニウムバッファー、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
本発明によれば、用語「バッファー」または「溶媒」は、分離ユニットをロード、洗浄、溶出、および再平衡化するために使用される任意の液体組成物について用いられる。
【００４３】
分離カラムに「ロードする」場合、バッファーは、標的分子（例えば、Ｆｃ領域を含有する標的タンパク質）と１または２以上の不純物を含む試料または組成物を、クロマトグラフィーカラム（例えば、アフィニティーカラムまたはイオン交換カラム）上にロードするために用いられる。バッファーは、標的分子はクロマトグラフィーマトリックスに結合するが、一方、理想的には全ての不純物は当該カラムに結合せずそれを貫流するような、伝導率および／またはｐＨを有する。
標的分子を「貫流させる」ために分離カラムに「ロードする」場合、バッファーは、標的分子（例えば、Ｆｃ領域を含有する標的タンパク質）と１または２以上の不純物を含む試料または組成物を、クロマトグラフィーカラム（例えば、アフィニティーカラムまたはイオン交換カラム）上にロードするために用いられる。バッファーは、標的分子はクロマトグラフィーマトリックスに結合せずカラムを貫流するが、一方、理想的には全ての不純物は当該カラムに結合するような、伝導率および／またはｐＨを有する。
【００４４】
用語「再平衡化する」とは、標的分子をロードする前にクロマトグラフィーマトリックスを再平衡化するための、バッファーの使用を指す。典型的には、ローディングバッファーは、再平衡化のために用いられる。
クロマトグラフィーマトリックスを「洗浄」または「洗浄する」により、バッファーなどの適切な液体を、マトリックスの中または上を通過させることが意味される。典型的には、洗浄は、標的分子を溶出させる前に、マトリックスから弱く結合した混入物を取り除くため、および／または未結合もしくは弱く結合した標的分子を取り除くために、用いられる。
この場合において、典型的には、洗浄バッファーとローディングバッファーは同一である。ウイルス不活化バッファーが用いられる場合、それは、標的分子を溶出させる前に、特定の存在するウイルスを不活化するために用いられる。この場合において、典型的には、ウイルス不活化バッファーは、ローディングバッファーとは異なる。なぜならば、それは、１種または２種以上の洗剤を含有するか、または異なる特性（ｐＨ／伝導率／塩およびそれらの量）を有する場合があるからである。
【００４５】
クロマトグラフィーマトリックスから分子（例えば、目的のポリペプチドまたは不純物）を「溶出させる」とは、バッファーが目的の分子とクロマトグラフィー樹脂上のリガンド部位について競合するように、溶液の条件を変更することにより、クロマトグラフィーマトリックスから分子を取り除くことを意味する。非限定的な例は、バッファーがイオン交換材料上の荷電された部位について分子と競合するように、イオン交換材料を取り囲むバッファーのイオン強度を変更することにより、イオン交換樹脂から分子を溶出させることである。
本発明によれば、「分離ユニット」は、クロマトグラフィーによる分離ステップを実行することができる設備である。分離ユニットは、典型的には、吸着剤マトリックスで充填されたクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィーカートリッジである。クロマトグラフィーカラムは、当業者に公知である。それらは、典型的には、液体入口および液体出口のための末端接続器具（end-fitting）を備えたカラムチューブを含む。カラムチューブは、好適なクロマトグラフィーマトリックスで充填される。
【００４６】
本発明によれば、「連続的（continuous）」プロセスとは、バッチモードで実行されないプロセスである。本発明による連続的プロセスにおいて、新たな試料は、１または２以上の分離ユニットに連続的に、間に任意の中断なしでロードされる。本発明による連続的プロセスにおいて、フィードが停止されることはない。
本発明によれば、「半連続的プロセス」とは、フィードが少なくとも一回、典型的には数回、逐次的な様式で中断されるプロセスである。
本発明によれば、「逐次的（sequential）」とは、２回または３回以上である。
【００４７】
本発明によれば、「接続線」は、それらを通して液体を流すために好適である任意のチューブ、ホース、パイプまたはチャネルである。接続線は、１または２以上の弁により断続されていてもよい。接続線は、直線状であっても分枝状であってもよい。
本発明によれば、装置の２つの部分が「流体接続（fluid connection）にある」場合、それは、装置の２つの部分の間に、液体が一方の部分から他方へ流れることができるような接続線が存在することを意味する。この接続線は、直接的であっても、あるいは１または２以上の弁により、分離ユニットまたは装置の他の部分により、断続されていてもよい。用語「流体接続にある」とは、永続的である流体接続を包含するが、それはまた、永続的でなく、接続線を通る液体のフローが、必要な場所であればどこでも開始して停止することができるように、例えば１または２以上の弁により断続される接続線から作られるものも包含する。典型的には、流体接続にある装置の部分のほとんどは、永続的ではない流体接続を有する。例えば、バッファーリザーバが分離ユニットと流体接続にある場合、これは、バッファーのカラムへのフローは必要な場合に実現することができるが、典型的には、必要な時に液体のフローを停止させ、必要な時に開始することができるように、リザーバと分離ユニットとの間の接続線に位置する少なくとも１つの弁が存在することを意味する。
【００４８】
液体のフローが、液体接続にある装置の２つの部分の間で実際に実現され、したがって液体が、２つの部分の間の接続線を貫流していれば、これらの２つの部分は、「流体連通」にある。その結果、本発明による「流体連通」とは、液体が接続線を貫流することによって、「流体接続」が実際に用いられている状態を記述する。システムの２つの部分が部分的に流体連通にある場合、それは、流体連通が永続的でなく、液体は、一方の部分から他方へ永続的には流動せず、一部の時間にのみ流動することを意味する。典型的には、システムの２つの部分の間の液体のフローは、液体のフローを指揮する弁の補助により開始および／または停止される。
【００４９】
「流体入口」または「入口」は、液体の導入を可能にする任意の手段である。分離ユニット入口は、例えば、接続線を接続することができる、クロマトグラフィーカラムの末端接続器具である。入口はまた、接続線における液体の導入を提供する弁であってもよい。入口はまた、接続線の末端であってもよい。
「出口」または「流体出口」は、液体の取出しを可能にする任意の手段である。分離ユニット出口は、例えば、接続線を接続することができる、クロマトグラフィーカラムの末端接続器具である。出口はまた、接続線における液体の導入を提供する弁であってもよい。出口はまた、接続線の末端であってもよい。
【００５０】
「流体選択弁」は、任意の接続された流体とシステムの部分との間で選択的に流体連通を可能にする任意の手段である。流体選択弁は、例えば、接続線を接続することおよび選択的に選択することができる、分離ユニット入口より前にある弁であって、選択された線と分離ユニット入口との間の流体連通を可能にすることができるものである。流体選択弁は、例えば、接続線を接続することおよび選択的に選択することができる、分離ユニット出口の後にある弁であって、選択された線と分離ユニット出口との間の流体連通を可能にすることができるものである。流体選択弁はまた、接続線における液体の導入を提供する弁であってもよい。流体選択弁はまた、接続線の末端であってもよい。
「溶媒選択弁」は、任意の接続された溶媒リザーバとシステムの部分との間で選択的に流体連通を可能にする、流体選択弁である。溶媒選択弁は、例えば、溶媒リザーバから接続線を接続することができ、選択的に選択することができる、溶媒ポンプより前にある弁であって、選択された溶媒とポンプとの間の流体連通を可能にするものである。
【００５１】
「流体選択弁」および「溶媒選択弁」は、同一の型のものであっても異なる型のものであってもよい。
溶媒送達システムは、液体の送達を可能にするシステムである。典型的には、装置の溶媒送達システムは、少なくとも１つのリザーバ、および、液体をリザーバから該リザーバと液体接続にある装置の別の部分へと輸送する少なくとも１つのポンプを含む。当業者には公知であるが、液体がリザーバから分離ユニットへと移動される場合は毎回、これは、ポンプの補助により行われる。ポンプはまた、２または３以上のリザーバから来る２または３以上の液体の流れを混合するために用いることができる。
【００５２】
用語「フィード」は、分離されるべき２つ以上の化合物を含有する液体をいう。この文脈において、用語「化合物」は、分子、化学的化合物（chemical compound）、細胞などの任意の実体に対して、広い意味で使用されている。典型的には、フィードは、標的分子を含有する試料である。
用語「ブレークスルー」とは、充填されたクロマトグラフィーカラムなどのクロマトグラフィーマトリックスまたは分離ユニットへのフィードの添加の間に、マトリックス上に吸着される化合物が、最初にアウトフローに現れる時点を意味する。言い換えれば、「ブレークスルー」は、標的化合物の損失が始まる時点である。
用語「再生」は本明細書において、クロマトグラフィーマトリックスを処理して、これをクロマトグラフィーで再び有用にするプロセスを意味する。したがって「再生」は、化合物の溶出としても知られている結合した化合物の放出、ならびに適切な吸着バッファーを使用する再平衡化を含む。後述するように、「再生」はまた、定置洗浄（ＣＩＰ）を含んでよい。
【００５３】
用語「フロープログラミング」とは、フィードをクロマトグラフィーカラムに適用する間の、フィード流量における意図的な変化を意味する。
用語「キャプチャー」とは、クロマトグラフィー法の文脈において、多量の標的化合物を捕獲（キャプチャー）する最初のクロマトグラフィーステップを意味する。
「完全結合」とは、例えば充填されたクロマトグラフィーカラムのクロマトグラフィーマトリックスが、多量の目的化合物を吸着したために、与えられた条件下でそれ以上吸着することができなくなった時点を意味する。典型的には、完全結合は、マトリックスが、対応する静的結合容量測定の間に推定されたその元の容量の６０％以上を吸着したときに到達される。
【００５４】
ローディング時間とは、充填されたクロマトグラフィーカラムなどの吸着剤を飽和させて、その「完全結合」状態にするのに必要な時間を意味する。
用語「平均粒子径」またはｄ５０は、累積粒子径分布の５０％での、平均粒子径分布値を意味する。
用語「平均細孔サイズ」とは、累積細孔サイズ分布の５０％での、平均細孔サイズ分布値を意味する。
【００５５】
本明細書で使用する場合、用語「清澄化する」、「清澄化」および「清澄化ステップ」は、懸濁粒子およびまたはコロイドを除去して、標的分子含有溶液の、ＮＴＵ（比濁分析濁度単位）で測定される濁度を低減するプロセスステップを指す。清澄化は、遠心分離、沈降または濾過を含む、種々の手段によって達成することができる。遠心分離は、バッチまたは連続モードで行うことができ、一方濾過は、通常のフロー（例えばデプス濾過）またはタンジェンシャルフローモードで行うことができる。今日の産業で使用されるプロセスにおいて、遠心分離には典型的にはデプスフィルターが続き、これは、遠心分離により除去されていない可能性のある不溶性の不純物を除去することを目的とする。さらに、清澄化効率を向上させるための方法を使用することができ、例えば沈殿である。不純物の沈殿は種々の手段により、例えばフロキュレーション、ｐＨ調整（酸沈殿）、温度変化、刺激応答性ポリマーまたは小分子による相変化、またはこれらの方法の任意の組み合わせにより、行うことができる。本明細書に記載の一部の態様において、清澄化は、遠心分離、濾過、デプス濾過および沈殿の２または３以上の任意の組み合わせを含む。一部の態様において、本明細書に記載のプロセスおよびシステムは、遠心分離の必要性を取り除く。
【００５６】
用語「沈殿させる」、「沈殿している」または「沈殿」は本明細書において用いる場合、望ましくない不純物の性質を改変して、それらをより容易に可溶性の標的分子から分離されるようにする、清澄化で使用されるプロセスを指し、例えば、化合物を可溶性の状態から沈殿させて不溶性の状態にすること、または細かい粒子を溶液から凝集させること（agglutinating）および／または凝集させること（aggregating）によって、それらの沈下および／または濾過および／または遠心分離が改善され、したがって濁度の低減が達成される。これは典型的には、望ましくない不純物を含む、大きな凝集粒子および／または不溶性の錯体を形成することによって達成される。これらの粒子は、それらを可溶性の標的分子を含有する液相から、濾過または遠心分離などによってより容易に分離することができるような特性（例えば密度またはサイズ）を有している。いくつかのケースでは相変化が行われて、望ましくない不純物を可溶性標的分子からより容易に分離することができるようになっている。相変化による沈殿は、ポリマーまたは小分子などの沈殿剤を添加することによって行うことができる。特定の態様において、沈殿剤は、スマートポリマーとも称される刺激応答性ポリマーである。本明細書に記載の一部の態様において、沈殿剤（precipitant）または沈殿剤（precipitating agent）は凝集剤である。フロキュレーションは、本明細書で使用する場合、性能が典型的には使用される凝集剤濃度に依存するところの（「用量依存性」）、沈殿を実行する一方法である。典型的な凝集剤は、逆に荷電した不純物と錯体化するポリカチオンなどの、高分子電解質である。
【００５７】
本明細書に記載の一部の態様において、清澄化には、標的分子と１または２以上の不純物とを含む試料への沈殿剤の添加が用いられる。いくつかの場合には、溶液条件の変化（例えば、温度、ｐＨ、塩分など）を用いて、例えば刺激応答性ポリマーの場合のように、沈殿を開始させることができる。１または２以上の不純物を含む沈殿物質ならびに沈殿剤は除去され、それによって標的分子を液相中に回収し、ここで液体は次に典型的には、標的分子を精製するためにさらなるプロセスステップに供される。
沈殿は、精製されるべき標的分子を発現する細胞培養物を含むバイオリアクター内で直接行ってもよく、ここで沈殿剤は、バイオリアクターに直接添加される。代替的に沈殿剤は、別の容器内で、典型的には標的分子を含有する細胞培養物に添加してもよい。
【００５８】
沈殿した物質を除去するための、当業者に周知の多くの方法があり、例えば遠心分離、濾過または沈下、またはそれらの任意の組合せなどである。
本明細書で使用される「沈下」という用語は、沈殿した物質が重力の影響下で容器の底に移動する、沈降プロセスを指す。沈下に続いて、液相または上清のデカンテーションおよび／または濾過を行うことができる。
【００５９】
本明細書において互換的に使用される用語「（単数）刺激」または「（複数）刺激」は、刺激応答性ポリマーによる応答を生じさせる、環境における物理的または化学的変化を意味する。したがって、かかるポリマーは刺激に応答性であり、この刺激はポリマーの溶解性の変化をもたらす。本明細書で使用される１または２以上のポリマーが応答する刺激の例としては、例えば、温度変化、伝導率の変化および／またはｐＨの変化を含むが、これらに限定されない。一部の態様において、刺激は、試料への錯化剤または錯体形成塩の添加を含む。様々な態様において、刺激は一般に、ポリマーの試料への添加後に添加される。なお、刺激はまた、ポリマーの試料への添加中またはその前に添加してもよい。
【００６０】
本明細書で用いられる用語「刺激応答性ポリマー」は、刺激を加えた後に物理的および／または化学的特性の変化を示す、ポリマーまたはコポリマーを指す。典型的な刺激応答は、ポリマーの溶解性の変化である。例えば、ポリマーのポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は、約３５℃より下の温度で水溶性であるが、約３５℃の温度で水に不溶性となる。特定の態様において、刺激応答性ポリマーは、多価イオン刺激（例えばリン酸の刺激）に応答する、ポリアリルアミンまたはポリビニルアミンポリマーである。
一部の態様において、細胞培養物は、１または２以上の不純物を除去するために、デプスフィルターにかけられる。
【００６１】
本明細書で用いられる用語「デプスフィルター」または「デプス濾過」は、単にフィルター表面だけでなく、フィルター媒体全体に粒子状物質を保持することができるフィルターを指す。本明細書に記載の一部の態様において、１または２以上のデプスフィルターは、清澄化のプロセスステップで使用される。
一部の態様において、清澄化は、後に精製プロセスにおけるプロセスステップで使用されるフィルターまたはデバイスの汚染をもたらし得る、試料中の可溶性および／または不溶性不純物の除去をもたらし、これにより、全体的な精製プロセスをより経済的にする。
【００６２】
用語「フロースループロセス」、「フロースルーモード」、および「フロースルー操作」は、本明細書において交換可能に用いられて分離技術を指し、ここで、バイオ医薬製剤中に１または２以上の不純物と共に含有される少なくとも１つの標的分子（例えば、Ｆｃ領域を含有するタンパク質または抗体）が、通常は１または２以上の不純物に結合するが標的分子には通常結合しない（すなわち貫流する）材料を、貫流することが意図されている。
本明細書において用いられる用語「結合および溶出モード」および「結合および溶出プロセス」とは、試料中に含有される少なくとも１つの標的分子（例えば、Ｆｃ領域を含有するタンパク質）を好適な樹脂または媒質（例えばアフィニティークロマトグラフィー用媒質またはカチオン交換クロマトグラフィー用媒質）に結合させて、それをその後に溶出させる、分離技術を指す。
【００６３】
発明の詳細な説明
本発明は、高い結合容量を短い滞留時間で可能とする連続クロマトグラフィープロセスのための方法を、初めて提供する。
したがってこれは、高速であるだけでなく、経済的な精製（キャプチャー）技術であり、指定のステップの生産性を通常は＞２倍増加させる。我々の新規で革新的な方法論では、生産性（ｇ（標的分子）／ｍｌ（充填床）／ｈ（生成時間））は、バッチプロセスの１つより通常６〜１０倍高い範囲である。
【００６４】
方法
本発明による方法は、特定タイプのクロマトグラフィーマトリックスと、特定タイプの連続クロマトグラフィープロセスとの組み合わせに基づく。
本発明の方法で使用されるクロマトグラフィーマトリックスは、粒子状吸着剤である。平均吸着剤粒子径（ｄ５０）は、３０〜２００μｍの間である。細孔は、４０ｎｍ〜３００ｎｍの間の平均細孔サイズを有する。
【００６５】
好ましい態様において、粒子の平均サイズは４０〜１２０μｍ、より好ましくは５５〜１００μｍである。別の好ましい態様において、粒子は、平均細孔サイズが５０〜１５０ｎｍ、最も好ましくは６０〜１００ｎｍの範囲の細孔を有する。
平均細孔サイズの値と平均粒子サイズの値は、集団の半分がこの値の上にあり、半分がこの値の下にある値として定義される。粒子径分布に対して、この平均細孔サイズはｄ５０と呼ばれる。
ｄ５０とは、この直径より半分が上、半分が下に分布が分かれる、ミクロン単位で表したサイズである。ｄ５０は、累積サイズ分布の５０％に相当する。
【００６６】
粒子サイズ推定のための標準的な方法は、イメージングおよび画像解析、光散乱技術、ふるい分け技術、沈降技術、音響分光技術などであってよい。（K.K. Unger et al. “Particled packed columns and monolithic columns in high-performance liquid chromatography−comparison and critical appraisal” J. Chrom. A. 1184 (2008) 393−415）。平均粒子径の値の推定に使用される特徴付け方法は、光散乱であった。本発明によれば、レーザー回折が直径３０ｎｍまでの粒子について用いられ、単一粒子光学感知（ＳＰＯＳ）が、０．５ｎｍ〜４００ｎｍの間の直径を有する粒子に使用される。
細孔サイズは、インバースサイズ排除クロマトグラフィー、水銀侵入、ガス吸着技術などによって測定することができる（M. Thommes et al., “Textural characterization of native and n-alky-bonded silica monoliths by mercury intrusion/extrusion, inverse size exclusion chromatography and nitrogen sorption”, J. Chrom. A, 2008）。
【００６７】
細孔容積は、細孔サイズ推定に使用したものと同じ方法によって推定することができる。本発明によれば、平均細孔サイズ推定および平均細孔容積推定のために、マトリックスが乾燥状態の場合はその物理特性が変化するので、乾燥状態においては測定することができないマトリックスに対して、インバースサイズ排除クロマトグラフィーを用いる。乾燥状態で測定することができるマトリックスに対しては、窒素吸着法が使用される。
【００６８】
粒子は、規則的または不規則に形成することができる。これらはクロマトグラフィー吸着剤に適した任意の材料で作ることができ、例えば多糖（例えばアガロースおよびセルロース）；および他の機械的に安定なマトリックス、例えばシリカ（例えば、孔制御ガラス）、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、セラミック粒子、または、親水性置換されたアルキルビニルエーテル（例えば１，２−エタンジオールモノビニルエーテル、１，３−プロパンジオールモノビニルエーテル、１，４−ブタンジオールモノビニルエーテル、１，５−ペンタンジオールモノビニルエーテル、１，６−ヘキサンジオールモノビニルエーテル、ジエチレングリコールモノビニルエーテル、またはシクロヘキサンジメタノールモノビニルエーテル）のコポリマー、および架橋剤（例えばジビニルエチレン尿素（１，３−ジビニルイミダゾリン−２−オン）またはジビニルプロピレン尿素（１，３−ジビニルテトラヒドロピリミジン−２−オン））、および上記のいずれかの誘導体である。親水性置換されたアルキルビニルエーテルのコポリマーの例は、EP1910433に開示されている。好ましいのは、高剛性を示すために、１０００ｃｍ／ｈを超える速度を適用可能な材料である。
【００６９】
本発明による方法は、好ましくは、アフィニティーまたはイオン交換クロマトグラフィーに基づいているため、クロマトグラフィーマトリックスとして使用される粒子は、典型的には、プロテインＡまたはその機能性バリアントなどのアフィニティーリガンド、またはイオン交換リガンドを担持する。
本発明による方法は、同一のクロマトグラフィーマトリックスを有する少なくとも３つの分離ユニットであって、これらが、液体が少なくとも、１つの分離ユニットから後続のものへと、および最後のものから第１の分離ユニットへと流れることができるように接続された、前記分離ユニットの使用に基づく。すなわち、システムのすべての分離ユニットが、サークル状に接続されている（図１）。
【００７０】
方法は、以下のステップを含む：
ａ）同一のマトリックス、好ましくはアフィニティーまたはイオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有する少なくとも３つの分離ユニットであって、これらが、液体が少なくとも、１つの分離ユニットから後続のものへと、および最後のものから第１の分離ユニットへと流れることができるように接続された、前記分離ユニットを提供すること；
ｂ）試料を第１の分離ユニット上にフィードして、試料がこの分離ユニット上（ここで試料は、標的分子がこの分離ユニットに結合することを可能とするｐＨおよび伝導率にある）にロードされる間、前記分離ユニットは、ローディング時間の少なくとも一部において次の分離ユニットと流体連通しており、これにより前記第１分離ユニットに結合していない標的分子が、次の分離ユニットに（図２ａ）、ロードされている分離ユニットともロードされている分離ユニットと流体連通しているものとも異なる１つの分離ユニットを少なくとも溶出（図２ｃ）、および再平衡化（図２ｅ）するのと同時に、結合することができるようにすること。これは、クロマトグラフィー分離プロセスで必要とされる洗浄、溶出、および再平衡化などの他のプロセスステップが、分離ユニットと流体連通していない１または２以上の分離ユニットまたはロードされているユニット上で実施されることを意味する。
【００７１】
ｃ）フィードを、次の分離ユニットへと切り替えること。これは、その時丁度ロードされた分離ユニットが完全にロードされたときに、この分離ユニットへの試料のフィードが停止され、中断なしの同時のシステム弁の操作により、フィードはサークル内の次の分離ユニットへと向けられる（図３ｂ）。サークル内の次の分離ユニットは、ローディング時間の少なくとも一部の前に、ロードされた分離ユニットの出口に接続されていたものである。したがって、この分離ユニットには、第１の分離ユニットに結合しなかった標的分子が、既に部分的にロードされている。
ｄ）試料を次の分離ユニット上にフィードして、試料が前記次の分離ユニット上（ここで試料は、標的分子が前記次の分離ユニットに結合することを可能とするｐＨおよび伝導率にある）にロードされている間、前記次の分離ユニットは、ローディング時間の少なくとも一部において、次の後の分離ユニットと流体連通しており、これにより前記次の分離ユニットに結合していない標的分子が、次の後の分離ユニットに、ロードされている分離ユニットともロードされている分離ユニットと流体連通しているものとも異なる１つの分離ユニットを少なくとも溶出および再平衡化するのと同時に、結合することができるようにすること、
ｅ）ステップｃ）およびｄ）を１または２回以上繰り返すこと。
【００７２】
本発明の連続法が実行される時間の間、フィードが停止されることはなく、これは８００ｃｍ／ｈを超える速度を有する。好ましくは、これは１０００ｃｍ／ｈを超える速度を有する。
また、分離ユニットのクロマトグラフィーマトリックスは、平均粒子径が３０〜２００μｍで、平均細孔径が４０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の粒子を含む。
好ましい態様において、追加の洗浄ステップを行って（図２ｂ）、分離ユニットから混入物を洗浄することができる。
【００７３】
好ましい態様において、洗浄は、２または３以上の異なる洗浄バッファーを用いて２または３以上のステップで行われる。例えば、第１洗浄バッファーによる第１洗浄ステップを、分離ユニットから未結合または弱く結合した標的分子を洗浄するために用いることができ（図２ａ）、第２洗浄バッファーによる第２洗浄ステップは、分離ユニットから混入物を洗浄するために用いることができる（図２ｂ）。
好ましい態様において、未結合または弱く結合した標的分子を含む溶液は、通常は洗浄段階の間に、フィードストック溶液または専用の出口へと、方向を変えることができる。
【００７４】
好ましい態様において、未結合または弱く結合した標的分子を含む溶液は、通常は洗浄段階の間に、別の分離ユニットへと、方向を変えることができる。
別の好ましい態様において、定置洗浄は（図２ｄ）、結合した標的分子の溶出の後で再平衡化ステップの前に行われる。
別の好ましい態様において、単一の溶媒送達システムは、フィード送達専用にすることができる（図４）。
好ましい態様において、標的分子がロードされる分離ユニットは所定の条件において最大にロードされ、これは、完全結合までロードされることを意味する。
【００７５】
本発明の一態様において、標的分子がロードされる分離ユニットは、全ローディング時間の間、別の分離ユニットと流体連通している。
別の態様において、ロードされる分離ユニットは、ローディング時間の一部のみの間、別の分離ユニットと流体連通している。好ましい態様において、前記２つの分離ユニットは、ローディング時間の後半の全体または一部の間のみ、流体連通している。これは、ローディングが開始されると、一般的に全ての標的分子がロードされた分離ユニットに結合するという事実による。この分離ユニットが部分的に既にロードされている場合にのみ、標的分子が分離ユニットに結合せず、これを通過することもある。バッチクロマトグラフィーでは、典型的には、あまりにも多くの標的分子が分離ユニットを通過し始めた場合に、ローディングが停止される。本発明による方法では、標的分子が分離ユニットに結合せずにこれを通過し始める、少なくともローディングのこの最後の段階の間に、前記分離ユニットの出口が別の分離ユニットの入口に接続され、このため第１分離ユニットに結合していない標的分子は、第２ユニットに結合する。当業者は、ローディングの間に、ロードされる分離ユニットに結合していない標的分子の量が、前記分離ユニットの出口を別の分離ユニットの入口に接続することが必要となる程度に高くなる時を、容易に決定することができる。
【００７６】
一態様において、洗浄される１分離ユニットまたは複数分離ユニットの出口は、別の分離ユニットの入口と液体連通しており、前記洗浄により除去された標的分子は失われることなく、別の分離ユニット上にロードされる。このアプローチは、システムが４または５以上の分離ユニットを含む場合に、特に適している。
一態様において、洗浄される１分離ユニットまたは複数分離ユニットの出口は、前の分離ユニットと液体連通しており、前記洗浄により除去された標的分子は失われることなく、前の分離ユニット上にロードされる。
【００７７】
一態様において、かかる方法は、以下のステップを含む：
ａ）同一のアフィニティーまたはイオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有する少なくとも４つの分離ユニットであって、これらが、液体が、１つの分離ユニットから後続のものへと、および最後のものから第１の分離ユニットへと流れることができるように接続された、前記分離ユニットを提供すること；
ｂ）試料を第１の分離ユニット上にフィードして、試料がこの分離ユニット上（ここで試料は、標的分子がこの分離ユニットに結合することを可能とするｐＨおよび伝導率にある）にロードされる間、前記分離ユニットは、ローディング時間の少なくとも一部において次の分離ユニットと流体連通しており、これにより前記第１分離ユニットに結合していない標的分子が、次の分離ユニットに（図５ａ）、前の分離ユニットと液体連通している１つの分離ユニットを洗浄してこの洗浄により除去された標的分子が失われずに前の分離ユニットにロードされるようにするのと、少なくとも同時に、結合することができるようにすること（図６ａ）。次に逐次的に、ロードされる分離ユニットともロードされる分離ユニットと流体連通しているものとも異なる１つの分離ユニットを、溶出（図６ｃ）、および再平衡化（図６ｅ）すること。これは、クロマトグラフィー分離プロセスで必要とされる洗浄、溶出、および再平衡化などの他のプロセスステップが、分離ユニットと流体連通していない１または２以上の分離ユニットまたはロードされているユニット上で実施されることを意味する。
【００７８】
ｃ）フィードを、次の分離ユニットへと切り替えること。これは、その時丁度ロードされた分離ユニットが完全にロードされたときに、この分離ユニットへの試料のフィードが停止され、中断なしの同時のシステム弁の操作により、フィードはサークル内の次の分離ユニットへと向けられる（図５ｂ）。サークル内の次の分離ユニットは、ローディング時間の少なくとも一部の前に、ロードされた分離ユニットの出口に接続されていたものである。したがって、この分離ユニットには、第１の分離ユニットに結合しなかった標的分子が、既に部分的にロードされている。
【００７９】
ｄ）試料を次の分離ユニット上にフィードして、試料が前記次の分離ユニット上（ここで試料は、標的分子が前記次の分離ユニットに結合することを可能とする第１のｐＨおよび伝導率にある）にロードされている間、前記次の分離ユニットは、ローディング時間の少なくとも一部において、次の後の分離ユニットと流体連通しており、これにより前記第１分離ユニットに結合していない標的分子が、次の後の分離ユニットに（図６ｂ）、前の分離ユニットと液体連通している１つの分離ユニットを洗浄してこの洗浄により除去された標的分子が失われずに前の分離ユニットにロードされるようにするのと、少なくとも同時に、結合することができるようにすること。次に逐次的に、ロードされる分離ユニットともロードされる分離ユニットと流体連通しているものとも異なる１つの分離ユニットを、溶出および再平衡化すること。これは、クロマトグラフィー分離プロセスで必要とされる洗浄、溶出、および再平衡化などの他のプロセスステップが、分離ユニットと流体連通していない１または２以上の分離ユニットまたはロードされているユニット上で実施されることを意味する。
ｅ）ステップｃ）およびｄ）を１または２回以上繰り返すこと。
【００８０】
上記ステップｂ）からｅ）に記載され図６に図示されているプロセスはまた、ローディングのために３つの分離ユニットを接続することによっても、実施することができる。すなわち、例えば分離ユニット１がロードされる場合、これは分離ユニット２と流体連通しており、分離ユニット３は分離ユニット２と流体連通しているが、しかし分離ユニット１、２および３はこの間、分離ユニット４とは流体連通していないことを意味する。分離ユニット１、２および３が流体連通しており、これらがロードされる場合、分離ユニット４は典型的にはスタンバイモードにある。当業者であれば、マトリックスの種類、試料の種類、流量などの特定のプロセスパラメータに基づいて、３つの分離ユニットをローディング用に接続するのが有利か、または２つのみなのかを決めることができる。図１は、以下に記載の連続クロマトグラフィー法に適した、３つの分離ユニットシステムを概略的に示す。システムは、溶媒送達システム（図４に示すように、少なくとも２つの）、３つの分離ユニット、溶媒送達システムと分離ユニットの間の流体連通チャネル、分離ユニットの入口と出口、溶媒のフローを分離ユニットへおよび分離ユニットから方向を変えるための切替え弁を有する。任意に、図１は、必要なプロセスステップまたはサブステップのために必要な溶媒を選択する、溶媒送達システムの前の溶媒選択弁を示す。当業者による決定は、選択された用途およびその要件に基づく溶媒送達システムや分離ユニットの種類、および溶媒フローを制御する手段など特定のプロセスパラメータに基づき、行うことができる。
【００８１】
図２ａ−ｅは、３つのカラムのシステムによる、本発明の方法のステップを概略的に示す。図２ａでは、フィードは分離ユニット１の入口に切替えられて分離ユニット１を貫流し、これにより標的分子の少なくとも一部は分離ユニット１に結合する。分離ユニット１の出口は、分離ユニット２の入口と液体連通しており、こうして分離ユニット１に結合しなかったフィードの全部分は分離ユニット２をさらに通り抜ける。これにより、分離ユニット１に結合しなかった標的分子が、分離ユニット２に結合することが可能となる。分離ユニット２の出口は、廃物に接続される。分離ユニット１および２にロードする間、前にロードされた分離ユニット３は例えば洗浄され（図２ａおよび図２ｂ）、溶出され（図２ｃ）、定置洗浄（図２ｄ）および再平衡化（図２ｅ）、および、必要となり得てかつローディングとは異なる他の全てのプロセスステップに供される。分離ユニット３の出口は、収集タンクにまたは前記洗浄によって除去された弱く結合または未結合の標的分子がさらに処理される別のユニットに接続することができる（図２ａ）。標的分子が分離ユニット３から溶出されている限り、分離ユニット３の出口は標的分子収集タンク（図２ｃに「生成物」として示す）または標的分子がさらに処理される別のユニットに（図２ｃに図示されず）接続される。他のプロセスステップについては、分離ユニット３の出口は、図２ｂ、図２ｄおよび図２ｅに示すように出口の一つに接続されている。任意に、分離ユニット３における定置洗浄および再平衡化ステップは、図２ｄおよび図２ｅに示すように、逆流モードで実行することができる。
【００８２】
図３ｂに示す次のステップにおいて、フィードは分離ユニット２の入口に切替えられて分離ユニット２を貫流し、これにより標的分子の少なくとも一部は分離ユニット２に結合する。分離ユニット２の出口は、分離ユニット３の入口と液体連通しており、こうして分離ユニット２に結合しなかったフィードの全部分は分離ユニット３をさらに通り抜ける。これにより、分離ユニット２に結合しなかった標的分子が、分離ユニット３に結合することが可能となる。分離ユニット３の出口は、廃物に接続される。分離ユニット２および３にロードする間、前にロードされた分離ユニット１は例えば洗浄され、溶出され、定置洗浄および再平衡化、および、必要となり得てかつローディングとは異なる他の全てのプロセスステップに供される。分離ユニット１の出口は、収集タンクにまたは前記洗浄によって除去された弱く結合または未結合の標的分子がさらに処理される別のユニットに接続することができる。標的分子が分離ユニット１から溶出されている限り、分離ユニット１の出口は、標的分子収集タンクまたは標的分子がさらに処理される別のユニットに接続される。他のプロセスステップについては、分離ユニット１の出口は、出口の一つに接続される。任意に、分離ユニット１における定置洗浄および再平衡化ステップは、逆流モードで実行することができる。
【００８３】
図３ｃに示す次のステップにおいて、フィードは分離ユニット３の入口に切替えられて分離ユニット３を貫流し、これにより標的分子の少なくとも一部は分離ユニット３に結合する。分離ユニット３の出口は、分離ユニット１の入口と液体連通しており、こうして分離ユニット３に結合しなかったフィードの全部分は分離ユニット１をさらに通り抜ける。これにより、分離ユニット３に結合しなかった標的分子が、分離ユニット１に結合することが可能となる。分離ユニット１の出口は、廃物に接続される。分離ユニット３および１にロードする間、前にロードされた分離ユニット２は例えば洗浄され、溶出され、定置洗浄および再平衡化、および、必要となり得てかつローディングとは異なる他の全てのプロセスステップに供される。分離ユニット２の出口は、収集タンクにまたは前記洗浄によって除去された弱く結合または未結合の標的分子がさらに処理される別のユニットに接続することができる。標的分子が分離ユニット２から溶出されている限り、分離ユニット２の出口は、標的分子収集タンクまたは標的分子がさらに処理される別のユニットに接続される。他のプロセスステップについては、分離ユニット２の出口は、出口の一つに接続される。任意に、分離ユニット２における定置洗浄および再平衡化ステップは、逆流モードで実行することができる。
【００８４】
次のステップにおいて、フィードは分離ユニット１に再度切替えられ（図３ａ）、図２ａ−ｅに記載されたプロセスステップが再度実行される。典型的には、プロセスステップは３回以上実行される。
図２ａ−ｅおよび図３ａ−ｃに示すプロセスの記載からわかるように、フィードは停止されることはなく、各プロセスステップにおいて（図２ａ−ｅには１つのプロセスステップが示されている）、標的分子は少なくとも１つの分離ユニットから溶出される。
本発明の別の態様において、ロードされた分離ユニットを洗浄して、未結合または弱く結合した標的分子を除去するために使用される洗浄液は、ロードされた分離ユニットから溶出される場合に、選択されたシステムの出口に向けられるのではなく、別の分離ユニットの入口に向けられる。これにより、洗浄中に、ロードされた分離ユニットから溶出され得る標的分子が、出口に行くのではなく、別の分離ユニットに結合することを保証する。
【００８５】
図６ａ−ｅは、４つのカラムのシステムによる、本発明の方法のステップを概略的に示す。図６ａでは、フィードは分離ユニット１の入口に切替えられて分離ユニット１を貫流し、これにより標的分子の少なくとも一部は分離ユニット１に結合する。分離ユニット１の出口は、分離ユニット２の入口と液体連通しており、こうして分離ユニット１に結合しなかったフィードの全部分は分離ユニット２をさらに通り抜ける。これにより、分離ユニット１に結合しなかった標的分子が、分離ユニット２に結合することが可能となる。分離ユニット２の出口は、廃物に接続される。分離ユニット１および２にロードする間、前にロードされた分離ユニット４は、例えば洗浄され（図６ａおよび図６ｂ）、溶出され（図６ｃ）、定置洗浄（図６ｄ）および再平衡化（図６ｅ）、および、必要となり得てかつローディングとは異なる他の全てのプロセスステップに供される。分離ユニット４の洗浄段階または洗浄段階の一部の間、分離ユニット４の出口は、分離ユニット３と流体連通しており、該分離ユニット３においては、前記洗浄によって除去された弱く結合または未結合の標的分子であって、分離ユニット４に結合しないものが、分離ユニット３をさらに通り抜ける。これにより、分離ユニット４に結合しなかった標的分子が、分離ユニット３に結合することが可能となる（図６ａ）。また、分離ユニット４の出口は分離ユニット３の入口と（図６ａには図示されず）、または分離ユニット３の出口と（図６ａ）、流体連通することができる。さらに、分離ユニット３は分離ユニット２と、流体連通することができる（図６ｂ−ｅ）。標的分子が分離ユニット４から溶出されている限り、分離ユニット４の出口は標的分子収集タンク（図６ｃに「生成物」として示す）または標的分子がさらに処理される別のユニットに（図６ｃに図示されず）接続される。他のプロセスステップについては、分離ユニット４の出口は、図６ｂ、図６ｄおよび図６ｅに示すように出口の一つに接続されている。任意に、分離ユニット４における定置洗浄および再平衡化ステップは、図４ｄおよび図４ｅに示すように、逆流モードで実行することができる。
【００８６】
図５ｂに示す次のステップにおいて、フィードは分離ユニット２の入口に切替えられて分離ユニット２を貫流し、これにより標的分子の少なくとも一部は分離ユニット２に結合する。分離ユニット２の出口は、分離ユニット３の入口と液体連通しており、こうして分離ユニット２に結合しなかったフィードの全部分は、分離ユニット３をさらに通り抜ける。これにより、分離ユニット２に結合しなかった標的分子が、分離ユニット３に結合することが可能となる。分離ユニット３の出口は、廃物に接続される。分離ユニット２および３にロードする間、前にロードされた分離ユニット１は、例えば洗浄され、溶出され、定置洗浄および再平衡化、および、必要となり得てかつローディングとは異なる他の全てのプロセスステップに供される。分離ユニット１の洗浄段階または洗浄段階の一部の間、分離ユニット１の出口は、分離ユニット４と流体連通しており、該分離ユニット４においては、前記洗浄によって除去された弱く結合または未結合の標的分子であって、分離ユニット１に結合しないものが、分離ユニット４をさらに通り抜ける。これにより、分離ユニット１に結合しなかった標的分子が、分離ユニット４に結合することが可能となる。また、分離ユニット１の出口は分離ユニット４の入口と、または分離ユニット４の出口と流体連通することができる。さらに、分離ユニット４は分離ユニット３と、流体連通することができる。標的分子が分離ユニット１から溶出されている限り、分離ユニット１の出口は、標的分子収集タンクまたは標的分子がさらに処理される別のユニットに接続される。他のプロセスステップについては、分離ユニット１の出口は、出口の一つに接続される。任意に、分離ユニット１における定置洗浄および再平衡化ステップは、逆流モードで実行することができる。
【００８７】
図５ｃに示す次のステップにおいて、フィードは分離ユニット３の入口に切替えられて分離ユニット３を貫流し、これにより標的分子の少なくとも一部は分離ユニット３に結合する。分離ユニット３の出口は、分離ユニット４の入口と液体連通しており、こうして分離ユニット３に結合しなかったフィードの全部分は、分離ユニット４をさらに通り抜ける。これにより、分離ユニット３に結合しなかった標的分子が、分離ユニット４に結合することが可能となる。分離ユニット４の出口は、廃物に接続される。分離ユニット３および４にロードする間、前にロードされた分離ユニット２は、例えば洗浄され、溶出され、定置洗浄および再平衡化および、必要となり得てかつローディングとは異なる他の全てのプロセスステップに供される。分離ユニット２の洗浄段階または洗浄段階の一部の間、分離ユニット２の出口は、分離ユニット１と流体連通しており、該分離ユニット１においては、前記洗浄によって除去された弱く結合または未結合の標的分子であって、分離ユニット２に結合しないものが、分離ユニット１をさらに通り抜ける。これにより、分離ユニット２に結合しなかった標的分子が、分離ユニット１に結合することが可能となる。また、分離ユニット２の出口は分離ユニット１の入口と、または分離ユニット１の出口と流体連通することができる。さらに、分離ユニット１は分離ユニット４と、流体連通することができる。標的分子が分離ユニット２から溶出されている限り、分離ユニット２の出口は、標的分子収集タンクまたは標的分子がさらに処理される別のユニットに接続される。他のプロセスステップについては、分離ユニット２の出口は、出口の一つに接続される。任意に、分離ユニット２における定置洗浄および再平衡化ステップは、逆流モードで実行することができる。
【００８８】
図５ｄに示す次のステップにおいて、フィードは分離ユニット４の入口に切替えられて分離ユニット４を貫流し、これにより標的分子の少なくとも一部は分離ユニット４に結合する。分離ユニット４の出口は、分離ユニット１の入口と液体連通しており、こうして分離ユニット４に結合しなかったフィードの全部分は、分離ユニット１をさらに通り抜ける。これにより、分離ユニット４に結合しなかった標的分子が、分離ユニット１に結合することが可能となる。分離ユニット１の出口は、廃物に接続される。分離ユニット４および１にロードする間、前にロードされた分離ユニット３は、例えば洗浄され、溶出され、定置洗浄および再平衡化および、必要となり得てかつローディングとは異なる他の全てのプロセスステップに供される。分離ユニット３の洗浄段階または洗浄段階の一部の間、分離ユニット３の出口は、分離ユニット２と流体連通しており、該分離ユニット２においては、前記洗浄によって除去された弱く結合または未結合の標的分子であって、分離ユニット３に結合しないものが、分離ユニット２をさらに通り抜ける。これにより、分離ユニット３に結合しなかった標的分子が、分離ユニット２に結合することが可能となる。また、分離ユニット３の出口は分離ユニット２の入口と、または分離ユニット２の出口と流体連通することができる。さらに、分離ユニット２は分離ユニット１と、流体連通することができる。標的分子が分離ユニット３から溶出されている限り、分離ユニット３の出口は、標的分子収集タンクまたは標的分子がさらに処理される別のユニットに接続される。他のプロセスステップについては、分離ユニット３の出口は、出口の一つに接続される。任意に、分離ユニット３における定置洗浄および再平衡化ステップは、逆流モードで実行することができる。
【００８９】
次のステップにおいて、フィードは分離ユニット１に再度切替えられ（図５ａ）、図６ａ−ｅに記載されたプロセスステップが再度実行される。典型的には、プロセスステップは３回以上実行される。
３つの分離ユニットを有するシステムでは、典型的には、プロセス内のある時間において、１つの分離ユニット１が完全にロードされ、洗浄の必要があり、１つの分離ユニット２は、完全にロードされるためにフィードに接続され、１つの分離ユニット３は、溶出および再平衡化されている。本発明によれば、分離ユニット２のローディング時間の少なくとも一部において、分離ユニット２の出口は分離ユニット３の入口と流体連通して、未結合の標的分子が分離ユニット３に結合できるであろう。この流体接続は典型的には、ローディング時間の一部の間にのみ必要とされ、ローディングの開始時には、分離ユニット１の出口は分離ユニット２の入口に接続することが、さらに可能である（図７ａ）。かかるケースにおいて、分離ユニット２について２つの流体連通、すなわち、１つはフィードの流れを含有し、もう１つは、前記洗浄段階の間に分離ユニット１から除去された、弱く結合または未結合の標的分子を含有する流体連通が可能であろう（図７ａ）。この流体連通は、ロードされた分離ユニット１の洗浄の間維持されるべきであり、これにより、洗浄中に分離ユニット１から溶出する可能性のある標的分子を、分離ユニット２にキャプチャーすることができる。洗浄の完了後、分離ユニット１と２の間の流体連通は停止される。分離ユニット１が、追加の洗浄（例えば、標的分子以外の分子の除去）（図７ｂ）、ＣＩＰ、溶出、再平衡化などの別のステップに供されている間、分離ユニット３の入口は、分離ユニット２の出口に接続されて、これにより、ローディング時間の少なくとも一部において、分離ユニット２と３の間の流体連通により、分離ユニット２から溶出される未結合の標的分子が、分離ユニット３に結合することができる。フィードが次の分離ユニットおよびそれぞれの分離ユニットにシフトされる場合に、同じステップが実行されることが、容易に理解できる。
【００９０】
好ましい態様において、本発明の方法に供される試料は、清澄化された試料である。すなわち、試料は、本発明による結合および溶出クロマトグラフィープロセス用の分離ユニットにローディングされる前に、清澄化ステップに供されることを意味する。
清澄化ステップは、標的分子から、１または２以上の可溶性および／または不溶性の不純物を分離することを意図している。例えば、細胞および細胞デブリなどの不溶性不純物を試料から除去して、溶液中に標的分子および他の可溶性の不純物を含有する清澄液が得られる。清澄化ステップは、以下の１または２以上を単独または任意の組み合わせで含んでよい：遠心分離、沈下、および／または濾過、好ましくはタンジェンシャルフロー濾過またはデプス濾過。好ましくは、清澄化ステップは遠心分離を含まず、濾過および／または沈下のみを含む。好ましい態様において、濾過は、デプス濾過である。
【００９１】
一部の態様において、デプスフィルターは、１または２以上の不溶性不純物を取り除くために用いられる。デプスフィルターは、単に媒質の表面上だけでなく媒質全体において粒子を保持するための、多孔質濾過媒質を用いるフィルターである。かかるデプスフィルターの一般的なクラスは、結合（または他の手段で固定）されて、複雑な、入り組んだ流路の迷路を形成する線維のランダムマトリックスを含むものである。これらのフィルターでの粒子の分離は、一般に、線維マトリックスによる捕捉、またはこれへの吸着をもたらす。細胞培養ブロスおよび他のフィードストックの生物学的処理のために最も頻繁に用いられるデプスフィルター媒質は、通常、セルロース繊維、ＤＥ（珪藻土）などのフィルター補助剤、および正に荷電された樹脂結合剤からなる。
【００９２】
多孔質デプスフィルターが異方性である場合に、粒子性不純物の一次除去において特に良好な結果が達成されることが見出されている。一部の態様において、細孔は、＞約２５μｍと評価される名目細孔サイズを有する。一部の態様において、デプスフィルターは、少なくとも２つの段階的な不織布の層を含み、ここで、段階的な層は、約０．３ｃｍ〜約３ｃｍの合計の厚みを有する。
一部の態様において、デプスフィルターは、不織布、セルロースおよび珪藻土の段階的な層の複合体を含む。不織布は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ナイロンまたはそれらの組み合わせを含む。
例示的なデプスフィルターは、本明細書において参考として援用される米国仮出願第61/571994号において見出すことができる。
一部の態様において、遠心分離および／またはタンジェンシャルフロー濾過ステップは、デプス濾過ステップに先立ち用いられる。代替的に、遠心分離および／またはタンジェンシャルフロー濾過ステップを必要とすることなく、デプス濾過ステップを行うことができる。
【００９３】
一態様において、遠心分離および／または濾過および／または沈下による清澄化に先立ち、試料を、沈澱組成物で前処理して、望ましくない混入物を沈澱させて試料から取り除く。沈澱組成物は、試料からHCP’s、ＤＮＡ、ホルモンなどの混入物を沈澱させることができる沈澱剤を、少なくとも含む。沈澱剤は、水性および／または可溶性の状態から非水性および／または不溶性の状態への化合物の沈澱を引き起こすか、あるいは、溶液から微粒子を凝集（aggregate）および凝集（agglutinate）させて、液相からのそれらの沈下および溶液の濁度の減少をもたらす
好適な沈澱剤の例は、有機酸（例えばオクタン酸）、無機酸（例えばＨＣｌ）、ｐＨを酸性に向かって実質的に低下させる他の酸性剤、塩（例えば安息香酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムなど）、酸性溶媒中で沈澱する他の一価の塩または有機酸である。沈澱剤の他の例は、カプリル酸などの短鎖脂肪酸である。穏和に酸性な条件においては、カプリル酸などの短鎖脂肪酸の付加は、典型的には、非ＩｇＧタンパク質を沈澱させるが、一方、ＩｇＧは沈澱しない。
【００９４】
他の好適な沈澱剤は、多価電解質ポリマーである（例えば、本明細書において参考として援用される国際ＰＣＴ特許出願第WO2008/091740号を参照）。
好ましい態様において、１または２以上の不純物を沈殿させるために、刺激応答性ポリマーを用いる。かかる刺激応答性ポリマーの例は、例えば、本明細書において参考として援用される米国公開第20080255027号、同第20090036651号、同第20090232737号および同第20110020327号において見出すことができる。刺激応答性ポリマーは、一般に、ｐＨ、温度および／または塩濃度などの特定のプロセス条件のセットの下で、水ベースの溶媒中で可溶性であり、かかる条件のうちの１または２以上の変化により不溶性となり、その後沈澱する。例示的な刺激応答性ポリマーとして、限定されないが、ポリアリルアミン、ベンジル基で修飾されたポリアリルアミン、またはポリビニルアミンおよびベンジル基で修飾されたポリビニルアミンが挙げられ、ここで、刺激はリン酸またはクエン酸である。
【００９５】
沈澱組成物はさらに、洗剤（Triton X-100、triton X-114、NP-40、Tween-20、OTD、SDS、CHAPS）、および／またはポリエチレングリコール（PEG）（PEG-1000、PEG 10000）および／またはポリビニルアルコールおよび／または多価電解質を含んでもよい。
沈澱した混入物を、次いで、試料を分離ユニット上にロードする前に、清澄化により試料から取り除く。
好ましい態様において、沈澱の後に、遠心分離のステップを行うことなくデプス濾過を行い、清澄化された試料を提供する。
【００９６】
好ましい態様において、試料の清澄化は、その期間の少なくとも一部の間、本発明の方法によるクロマトグラフィー精製と同時に行う。言い換えれば、標的分子を含有する液体試料は、全試料容積が清澄化されるまで待つために清澄化後にプールタンク中に貯蔵されることはなく、しかし清澄化された試料が清澄化プロセスからもたらされると直ちに、それを連続的に本発明の方法のための試料溶液として用いて、分離ユニット上にロードされる。
したがって、本発明の方法はまた、清澄化された試料溶液を用いる場合は、試料溶液の全容積を貯蔵することができるプールタンクの使用を必要としない。好ましくは、プールタンクを用いないか、試料溶液の全容積の２５％未満、好ましくは１０％未満を貯蔵することができるプールタンクのみを用いる。
【００９７】
別の態様において、本発明による方法を用いて精製された標的分子は、ウイルス不活化および／またはフロースルー精製などのさらなるプロセスステップに供される。
ウイルス不活化は、ウイルスを不活化するか、または感染できなくし、これは特に標的分子の治療的使用が意図されている場合に重要である。
多くのウイルスは、化学的変化によって不活化することができる脂質またはタンパク質の被覆を含む。単純にウイルスを不活化するのではなく、いくつかのウイルス不活化のプロセスは、ウイルスを完全に変性することができる。ウイルスを不活化する方法は、当業者によく知られている。より広く使用されているウイルス不活化プロセスには、例えば、以下の１または２以上の使用が含まれる：溶媒／洗剤による不活化（例えばTriton X100による）；低温殺菌（加熱）；酸性ｐＨ不活化；および紫外線（ＵＶ）不活化。２または３以上のこれらのプロセスを組み合わせることが可能である；例えば、高温で酸性ｐＨ不活化を行うなど。
【００９８】
完全かつ効果的なウイルス不活化を確実にするため、ウイルス不活化は多くの場合、ウイルス不活化剤と試料の適切な混合を確実にするために定常的に撹拌しながら、長期間にわたって行われる。例えば、今日の産業で使用される多くのプロセスでは、キャプチャーステップからの出力または溶出液はプールタンクに回収され、長期間にわたってウイルス不活化に供される（例えば、＞１〜２時間、続いて多くの場合、一晩の貯蔵）。
ウイルス不活化に要する時間は、インラインのウイルス不活化を行うことにより、またはこのステップのプールタンクの代わりに、サージタンクを使用することにより、大幅に低減される。
【００９９】
好ましい態様において、ウイルスの不活化は酸性ｐＨの使用を用い、ここで、本発明の方法による結合および溶出クロマトグラフィーステップからの出力が、サージタンクまたはインラインのいずれかを用いて、ウイルス不活化のために酸性ｐＨへ曝露される。ウイルス不活化に用いるｐＨは、典型的には５．０未満、または好ましくは３．０〜４．０の間である。一部の態様において、ｐＨは約３．６以下である。インライン法を用いたウイルス不活化のために使用される時間は、１０分以下、５分以下、３分以下、２分以下、または約１分以下のいずれかであることができる。サージタンクの場合には、不活化に要する時間は、典型的には１時間未満、好ましくは３０分未満である。
任意にウイルス不活化に供された本発明の結合および溶出クロマトグラフィー法からの出力は、次に、フロースルー精製に供されてもよい。
【０１００】
好ましい態様において、フロースルー精製プロセスステップは、１または２以上の不純物の除去を意図したフロースルー精製を実現するための、２または３以上のステップまたはデバイスまたは方法を使用する。
好ましい態様において、本明細書に記載のフロースルー精製プロセスは、フロースルーモードで実施される１または２以上の次のステップを含む：活性炭；アニオン交換クロマトグラフィー；カチオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除、ウイルス濾過またはこれらの組み合わせ。一部の態様において、１または２以上の弁、インラインスタティックミキサーおよび／またはサージタンクをこれらのステップの間に使用して、溶液条件を変更することができる。
好ましい態様において、フロースルー精製は、少なくとも一つのフロースルーアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）ステップを用い、ここでは、標的分子を含有する試料中に依然として残っている１または２以上の不純物は、アニオン交換クロマトグラフィーマトリックスに結合し、一方標的分子は貫流する。
【０１０１】
用いることのできる例示のアニオン交換マトリックスとしては、限定はされないが、第四級アンモニウムイオンに基づくもの、ならびに第一、第二、および第三級アミンに基づくものなどの弱アニオン交換体が挙げられる。
フロースルー精製ステップにおいて使用されるマトリックスは、粒子、膜、繊維多孔質材料またはモノリス材料の形態であり得る。活性炭の場合には、例えば多孔質繊維材料などの多孔性材料に含浸させることができる。当業者は、これらのマトリックスを保持するための適切な分離ユニット、例えばカラムまたはカートリッジなどを知っている。また、１つの分離ユニットに２または３以上の異なるマトリックスを、例えばカチオン交換マトリックスとアニオン交換マトリックスを組み合わせることも可能である。分離ユニットはまた、例えば、Millistak（登録商標）Podなどのように使い捨てであってもよい。
好ましい態様において、フロースルー精製ステップにおいて使用されるマトリックスは膜ベースのマトリックスで、これは膜吸着器とも称される。膜吸着器は、好ましくは、当技術分野で周知の相分離方法によって作られた多孔質膜シートである。
【０１０２】
好ましい態様において、フロースルー精製ステップは、少なくともアニオン交換ステップおよび活性炭ステップを含む。活性炭ステップは、アニオン交換クロマトグラフィーに先立ち、クロマトグラフィーと組み合わせて、またはクロマトグラフィーの後に、実施してよく、好ましくはアニオン交換ステップに先立って実施される。一部の態様において、活性炭は、セルロース媒体で充填される。代替的に、活性炭をアニオン交換マトリックスと組み合わせることができ（例えばカラムまたはカートリッジにおいて）、それによって、標的分子を含む試料から１または２以上の不純物をさらに除去する。
【０１０３】
好ましい態様において、フロースルー精製はさらに、サイズ排除に基づく凝集体の除去および／またはウイルス濾過のための１または２以上の追加のフロースルーステップを含む。一部の態様において、試料を、凝集体の除去のために、正常フロー濾過モードの操作において、吸着デプスフィルターまたは荷電もしくは改変された微孔質層（単数または複数）を通過させる。一部の態様において、追加のフロースルーステップは、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）マトリックスを使用する。
フロースルーカチオン交換ステップ（ＣＥＸ）の使用は、抗体凝集体などの不純物に対する親和性および容量を高めるために、溶液のｐＨの低下を必要とする場合がある。かかるｐＨの低下は、三方弁、Ｔ型コネクタ、スタティックミキサー、または当技術分野で周知の他の適切なデバイスを介して、酸を含有する適当な溶液の単純なインライン添加によって行うことができる。また、小さなサージ容器を用いて、追加の混合およびサンプリングのためのアクセスを提供することができる。バッグ、容器、またはタンクの形態であってもよいサージ容器の容積は、通常は、フロースルーの設定で処理される流体体積よりもかなり少なく、例えば流体体積の１０％以下である。
【０１０４】
全体のフロースルー精製操作（本明細書に記載のアニオン交換クロマトグラフィーステップおよび１または２以上の追加のステップを含む）は、好ましくは、フロースループロセスステップの間でプールタンクを使用することなく、連続的に行われる。
好ましい態様において、フロースルーステップは、試料を、活性炭マトリックス、アニオン交換マトリックス、カチオン交換マトリックスおよびサイズ排除マトリックスと接触させることを含む。好ましくは、バッファー交換は、これをカチオン交換マトリックスに通す前に行われる。
【０１０５】
清澄化ステップが本発明の方法の前に実施されるか、および／またはフロースルー精製ステップが本発明の方法の実施後に行われる場合、好ましい態様において、少なくとも清澄化および結合−溶出クロマトグラフィーステップは、それらの持続時間の少なくとも一部において重なって実施される。非常に好ましくは、清澄化ステップと結合−溶出クロマトグラフィーステップは、それらの持続時間の少なくとも一部において重なり、また結合−溶出クロマトグラフィーステップとフロースルー精製ステップは、それらの持続時間の少なくとも一部において重なる。
好ましい態様において、本発明の結合−溶出クロマトグラフィー法および、すべてのさらなる任意のプロセスステップは、プロセスステップ中に試料溶液を貯蔵するためのタンクを用いずに実施され、該タンクは、最初にプロセスに供された試料体積の２５％より多く、好ましくは１０％未満を有するものである。
【０１０６】
システム
本発明はまた、少なくとも１つの標的分子を分離するための液体クロマトグラフィーシステム（図１）であって、該システムがサークル状に接続された少なくとも３つの分離ユニットから構成され、各分離ユニットはカラムに充填されたクロマトグラフィーマトリックスを含む、前記システムに向けられる。各分離ユニットには、液体の入口と出口のための手段が設けられている。前記入口用の手段は、少なくとも、溶媒送達システムと、サークル内の前の分離ユニットの出口に、接続されている。
前記出口用の手段は、少なくとも、リザーバまたは廃物と、サークル内の次の分離ユニットの出口に接続されている。好ましい態様において、サークル内の各分離ユニットの出口は、サークル内の各分離ユニットの入口に接続され、こうして任意の選択された分離ユニットの出口と、任意の別の選択された分離ユニットの入口との間の流体連通が可能となる。
本発明によるシステムにおいて、接続線は、好ましくは、各流体入口および各流体出口に近接して分岐している。
【０１０７】
サークル内の１つの分離ユニットの出口と次の分離ユニットの入口の間に位置する全ての接続線には、入口流れを選択するための「オン−オフ」弁が提供され、ここで入口流れは、溶媒送達システムに直接接続されるか、または前のカラムの出口に直接接続される。さらに、すべての出口には溶媒流れの方向を選択するための「オン−オフ」弁が提供され、ここで前記溶媒は、廃物または溶媒リザーバに、または別の分離ユニットの入口に向けることができる。このセットアップでは、第１キャプチャー分離ユニットからの（ローディングの最後における）浸出生成物の、第２分離ユニット（ちょうど再平衡化されて、キャプチャーの準備完了）へのキャプチャーを可能とする。これにより、標的分子の損失なしに、より高いスループットと結合容量の使用が可能となる。
【０１０８】
さらに、溶媒送達システムの前の溶媒の選択は、溶媒選択弁と少なくとも２つの、さらに４またはそれ以上の入口によって、実施される。
一態様において、好ましくは、オン／オフ弁は、この線を介した溶媒のフローを停止するために、この接続線上に配置されている。さらにシステムは、ちょうど２つの溶媒送達システムを含むことができるが、しかしこれは上記の３つのカラムの方法によっても実施可能である（図４）。
別の態様において、本発明によるシステムは、４つの分離ユニットを含んでもよい（図５ａ；図６ａ）
別の好ましい態様において、装置はさらに、１または２以上の検出器を含む。検出器は、カラムの間の試料輸送の制御のため、試料の品質を分析するため、モニタリングのためなどに用いることができる。
【０１０９】
検出器は、好適な場所であればどこにでも配置でき、典型的には、分離カラムの流体入口の前および／または流体出口の後に配置される。適切な検出器の例は、ｐＨ検出器、ＵＶ検出器、赤外線検出器、または伝導率を測定する検出器である。
別の好ましい態様において、装置はさらに、コンピュータシステムを含む。検出器ならびにポンプおよび弁は、コンピュータシステムに接続される。このコンピュータシステムは、ポンプおよび弁および検出器の制御を可能にする。好ましくは、コンピュータシステムは、装置を部分的または完全な自動化モードで使用することが可能な、ソフトウェアおよびアルゴリズムを含む。
別の好ましい態様において、装置は、イベント（例えば、検出器信号）を制御用のトリガとして使用することができる、コンピュータシステムを含む。
【０１１０】
システムは、さらに、フィルターユニット、検出ユニット、またはクロマトグラフィー分離手順に必要なもしくは好適な他の機器を含んでもよい。
本発明による装置は、カラム、弁、リザーバ、およびクロマトグラフィーシステムで通常使用される他の機器を含む。分離ユニットは例えば、それぞれのクロマトグラフィーマトリックスが充填され、溶媒入口および出口に適した先端接続器具を有する、ステンレス鋼カラム、プラスチックカラムまたはガラスカラムであってよい。
本発明による装置は、同一のクロマトグラフィーマトリックスを有する、３個以上、好ましくは３、４または５個、最も好ましくは３個の分離ユニットを含む。
【０１１１】
装置はまた、溶媒送達システムとも呼ばれる、少なくとも２つのバッファーリザーバおよび少なくとも２つのポンプであって、例えば標的分子のローディング、洗浄および溶出に必要なバッファーの貯蔵および供給を提供するものも含む。典型的には、すべての分離ユニットは、少なくとも１つのバッファーリザーバに接続された少なくとも１つの流体入口を有する。
非常に好ましい態様において、本発明の装置は、３つの分離ユニットと２つの溶媒送達システムを有する。
以下では、装置および方法の説明は、同一のクロマトグラフィーマトリックスを有する３つのキャプチャー分離ユニットの装置に焦点を当てている。これは限定を意味せず、説明をより包括的にするためである。当業者は、上記のように３つより多くのユニットを有するシステムに対しても、記述を移行することができる。
【０１１２】
別の態様において、装置は、他のバッファー、定置洗浄、再平衡化などのために追加のリザーバを含むことができる。
典型的には、リザーバおよび分離ユニットは、接続線、弁およびポンプを介して接続される。ポンプ前の溶媒の選択のための好ましい溶媒選択弁は、多数の溶媒入口およびポンプに直接接続することができる１つの溶媒出口を有する弁である。必要な入口の数量は、個々の用途に特定的に使用される様々なバッファーの量に対応する。溶媒のフローを保証する任意のポンプを使用することができ、蠕動ポンプ、アイソクラティックポンプ、グラジエントポンプ、高圧ポンプ等、低圧ポンプ等を含む。システム部分の流体入口の前の、流体導入を選択するための好ましい流体選択弁は、多数の流体入口およびシステム部分の流体入口に接続することができる１つの出口を有する弁である。システム部分の流体出口の後の、流体取り出しの選択用の好ましい流体選択弁は、多数の流体出口およびシステム部分の流体出口に接続することができる１つの入口を有する弁である。
【０１１３】
好ましい態様において、少なくとも一つの溶媒送達システムはフィードストックリザーバに接続されて、装置に一定のフィードストックの流れを確保する。これにより、連続的なフィード流に関して連続操作を可能にする。フィード流の範囲は、与えられた時間範囲内でのカラムへの結合を確保するために制御され得る。通常、アフィニティー用途に対して、フィード流の中の標的分子の量は、フィード流の決定的な基準である。
別の好ましい態様においては、フィードの流量を制御して各カラムの生産性を向上させ、より好ましくはフィードの流量は、フィード流中の標的分子の量に応じてある範囲内に維持される。
別の好ましい態様において、１または２以上の追加の液体流の流量が制御される。
【０１１４】
その他の問題
別の好ましい態様において、装置はさらに、定置洗浄のための追加のリザーバを含む。定置洗浄（ＣＩＰ）は、当業者に知られた技術である。定置洗浄とは、クロマトグラフィーマトリックスからの、非常に緊密に結合、沈殿または変性された物質の除去である。かかる混入物がクロマトグラフィーマトリックスから除去されない場合、これらは、カラムのクロマトグラフィー特性に影響を与え、結合容量を低下させ、次のランにおいて現れて、これはサイクル間での混入物または生成物のキャリーオーバーをもたらす可能性がある。
標準のＣＩＰプロトコルは、典型的には、以下のような成分を含む水性バッファーの１〜３カラム容積を用いた１〜５回の洗浄を含む。
−  ６Ｍの塩酸グアニジン、
−  １０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＯＨ、
−  １０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＯＨおよび１ＭのＮａＣｌ、
−  ５０ｍＭのＮａＯＨおよび１ＭのＮａ２ＳＯ４、
−  １５０ｍＭのリン酸溶液、
−  ６Ｍの尿素、
−  ２０％エタノール、
−  ２０％エタノールおよび０．５Ｍの酢酸、
−  ２０％エタノールおよび２Ｍの酢酸、
−  １％のTweenまたはTriton（登録商標）界面活性剤X-100など。
ＮａＯＨなどの成分の濃度、カラムへのＣＩＰバッファーの接触時間、ならびにＣＩＰを実施する頻度は、当業者により調整および決定することができる。
【０１１５】
本発明による装置は、好ましくは、ＣＩＰバッファーを含有する少なくとも１つのリザーバを有する。ＣＩＰバッファーは、適切な場合、すべての分離ユニットのＣＩＰのために使用することができる。次にバッファーリザーバは、ＣＩＰバッファーのフローを独立して各カラムに向けることができるように、すべての分離ユニットと液体接続している。定置洗浄の洗浄は、各分離サイクルの後に行うことができる。典型的には、ＣＩＰは、試料に応じて、したがって分離ユニットを汚染する可能性のある混入物の量および種類に応じて、２、３、４、５、６、７、８、９または１０番目の分離リサイクル毎に実施される。
別の好ましい態様において、装置は、吸着剤から結合した不純物を部分的または完全に除去するための、追加のリザーバを備える（洗浄）。不純物の精製、特にＨＣＰおよびＤＮＡの除去は、バイオ医薬化合物中の宿主細胞のＤＮＡレベルがＦＤＡによって規制されているために、バイオ医薬化合物の生産に重要な役割を果たしている。ロードされた吸着剤を種々の溶液にさらに暴露することにより、吸着剤に結合したＨＣＰの数およびＤＮＡレベルを低減することができる。この技術は当業者に知られている。標準の洗浄プロトコルは、典型的には、以下のような成分を含む水性バッファーの１〜２０カラム体積での、１〜１０回の洗浄を含む。
【０１１６】
−  ０．０２Ｍ〜２ＭのＮａＣｌ、
−  ０．０２Ｍ〜２ＭのＮａＣｌおよびＮａ２ＳＯ４、
−  ０．０２Ｍ〜２ＭのＮａ２ＳＯ４、
−  ０．０２Ｍ〜２ＭのＣａＣｌ２、
−  ０．０２Ｍ〜２ＭのＭｇＣｌ２、
−  ０．０２Ｍ〜２ＭのＭｇＳＯ４、
−  １０〜２０％の有機溶媒、
−  １０〜２０％のポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコール、
−  アルギニンおよびグリシンなどの０．５Ｍのアミノ酸、
−  ０．１〜１％のTweenまたはTriton（登録商標）界面活性剤X-100など。
【０１１７】
ＮａＣｌなどの成分の濃度、カラムへの洗浄バッファーの接触時間、バッファーのｐＨ値、および洗浄を実施する頻度は、当業者により調整および決定することができる。
別の好ましい態様において、洗浄ステップは異なるバッファーを使用して行われる。
別の好ましい態様において、各吸着剤は、複数の洗浄ステップにより洗浄される。
一態様において、システムは、１つのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを有する３または４以上の分離ユニットを含む。好適なアフィニティーマトリックスは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬまたはプロテインｒ官能基を有するマトリックスである（例えばProsep（登録商標）Highcap（Merck Millipore）、Prosep（登録商標）Ultra Plus（Merck Millipore）、Poros（登録商標）Prot A（Life Technologies）、A650F (Tosoh）、MabSelect（登録商標）Sure（GE））。
【０１１８】
本発明の装置で使用されるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、平均直径が４０〜２００μｍの粒子を含み、好ましい直径および細孔サイズは、本発明による方法を記述する際に上に記されている。
粒子は、規則的または不規則に形成することができる。これらは、多糖（アガロース、セルロースなど）などのクロマトグラフィーの吸着剤として適した任意の材料から、および以下のようなその他の機械的に安定なマトリックスから作ることができる：シリカ（例えば、孔制御ガラス）、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、セラミック粒子または親水性置換されたアルキルビニルエーテル、例えば１，２−エタンジオールモノビニルエーテル、１，３−プロパンジオールモノビニルエーテル、１，４−ブタンジオールモノビニルエーテル、１，５−ペンタンジオールモノビニルエーテル、１，６−ヘキサンジオールモノビニルエーテル、ジエチレングリコールモノビニルエーテル、またはシクロヘキサンジメタノールモノビニルエーテルなどの、コポリマー、および架橋剤、例えばジビニルエチレン尿素（１，３−ジビニルイミダゾリン−２−オン）またはジビニルプロピレン尿素（１，３−ジビニルテトラヒドロピリミジン−２−オン）、および上記のいずれかの誘導体。親水性置換されたアルキルビニルエーテルのコポリマーの例は、EP1910433に開示されている。好ましいのは、１０００ｃｍ／ｈを超える速度を適用可能な高剛性を示す材料である。
【０１１９】
別の好ましい態様において、記載された装置は、バイオリアクター、灌流バイオリアクター、および／または部分的な不純物除去のために適用される精製方法であって、例えばデプスフィルター、遠心分離、清澄化、沈降、一定のフィード流を保証する変動技術などに、接続することができる。これは、連続フィード流を必要とする方法の必要性のために必須であるばかりでなく、より短い処理時間を提供し、生成物の品質を維持し（低レベルの凝集など）、一方で標的分子の生成および／またはフィード流精製および標的分子キャプチャーの間の、長い貯蔵時間を回避する。
【０１２０】
別の好ましい態様において、生成物出口の流れは、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、ＳＥＣクロマトグラフィーのモード、デプス濾過、沈降、変動技術などの別の精製技術に直接接続することができ、または、リザーバ、サージバッグ、貯蔵バッグなどに収集することができる。
別の好ましい実験において、生成物出口流れは、１つの吸着剤からの少なくとも１つの溶出プールが適合するリザーバに接続され、ここで、プールされた溶液からの連続または半連続的な取り出しが行われて、続く精製技術への直接接続を可能とする。これにより、続く精製技術に対して標的濃度、ｐＨおよび伝導率の値の点でより安定な条件（標準的なクロマトグラフィー溶出プロファイルと比較して）を保証するだけでなく、短い全精製プロセスを可能とするためにより少ない量の処理標的分子がさらなる技術によって直接精製されるので、より迅速な処理をも保証するであろう。
【０１２１】
別の好ましい態様において、最適な操作を保証するために、適切なカラムの直径および長さを選択しなければならない。より好ましくは、吸着床の高さは１０ｃｍ未満、より好ましくは４〜６ｃｍの高さであるべきである。これにより、工業規模用途では３ｂａｒを超えるべきでない、カラムの圧力降下に影響を与える。利点は、圧力限界を超えることなく、１０００ｃｍ／ｈ以上での操作である。
上および下で引用される全ての出願、特許および刊行物、ならびに、２０１２年４月２３日に出願された対応するＥＰ出願EP 12002828.7、ならびに、２０１２年６月２９日に出願された対応する米国仮出願61/666,453の開示の全体は、本明細書に参照により組み込まれる。
【０１２２】
例Ｉ
ＰＵＰ上＞１００サイクルのｍＡｂ−ｘ（１ｍｇ／ｍｌ）の連続的精製と対応するデータ
溶液の全成分の２１％を構成する（分析ＳＥＣにより）１ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を有する細胞培養溶液（SP 2/0）中のモノクローナル抗体ｍＡｂ−ｘ（ここで、ＨＣＰの量は抗体６０００００ｎｇ／ｍｇであった（酵素免疫測定アッセイSP 2/0により））を、ＰｒｏｔＡ樹脂（ＰＵＰ）上で以下の条件下で精製した。クロマトグラフィーカラム：ＰＵＰ樹脂を１６×５５ｍｍカラム中に充填した；カラムを次いで、２５ｍＭのＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）で３３．３ｍｌ／分にて平衡化した。合計３つのカラムに充填した。試料の調製のために：モノクローナル抗体細胞培養液を０．４５μｍのフィルターを通して濾過した。溶液の伝導率は、約１６ｍＳ／ｃｍおよびｐＨ６．４であった。３つのカラム全てを連続クロマトグラフィーシステムに接続し、第１カラムと第２カラムの間の接続、および第２カラムと第３カラムの間の接続、および第３カラムと第１カラムの間の接続を可能とした。全実験は３つのステップに分けられる。第１のステップが開始されると、第１カラムが第２カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を１５００ｃｍ／ｈでロードし、この間第３カラムは、２５ｍＭのTRISおよび１．５ＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ７）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ２．７）で１５００ｃｍ／ｈにて溶出し、次にカラムクリーニングを１５０ｍＭのリン酸で１５００ｃｍ／ｈにて行い、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて再平衡化する。
【０１２３】
第２のステップが開始されると、第２カラムが第３カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を１５００ｃｍ／ｈでロードし、この間第１カラムは、２５ｍＭのTRISおよび１．５ＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ７）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ２．７）で１５００ｃｍ／ｈにて溶出し、次にカラムクリーニングを１５０ｍＭのリン酸で１５００ｃｍ／ｈにて行い、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて再平衡化する。
第３のステップが開始されると、第３カラムが第１カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を１５００ｃｍ／ｈでロードし、この間第２カラムは、２５ｍＭのTRISおよび１．５ＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ７）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ２．７）で１５００ｃｍ／ｈにて溶出し、次にカラムクリーニングを１５０ｍＭのリン酸で１５００ｃｍ／ｈにて行い、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて再平衡化する。
【０１２４】
指名のステップは少なくとも１００回繰り返され、定常状態動作は第２のサイクルで得られた。ＵＶシグナルトレースは図９に示され、各単一サイクルにおいて各カラムが通る全てのプロセスステップＵＶトレースを示す。ロードされた第１カラムの洗浄から開始して、同時にシリーズの次のカラムと、シリーズの次の後のカラムが一緒にローディングされる。指名されたカラムがまだロードされているときに、以前にロードされたカラムが溶出され（第１ピーク）、ＣＩＰされ、再平衡化される。１８分において、次のカラムのローディングが完了し、ロードはシリーズの次の後のカラムに、続いて第１にカラム切り替えられ、その結果、洗浄、溶出（第２ピーク）、ＣＩＰおよび再平衡化を含む、次のカラムに必要なプロセスが進められる。同時に、次の後のカラムおよび第１カラムがロードされる。３６分において、次の後のカラムのローディングが完了し、ロードは第１カラムに、続いて次のカラムに切り替えられ、その結果、洗浄、溶出（第３ピーク）、ＣＩＰおよび再平衡化を含む、次の後のカラムに必要なプロセスが進められる。
【０１２５】
溶出画分は７〜９ｍｇ／ｍｌの抗体を含有し（図１０参照）、＞３５ｍｇ／ｍｌの充填床結合容量および＜５％の標的分子の損失および５０ｇ／ｍｌ／ｈの平均生産性（バッチ操作の生産性９．６ｇ／ｍｌ／ｈと比較）をもたらし、これは全成分の９９．９％を構成しており（分析ＳＥＣによる）、ここでＨＣＰ量は１２０〜２５０ｐｐｍであった（酵素免疫測定アッセイSP 2/0により）（図１１参照）。浸出ＰｒｏｔＡの量はすべての実験を通して安定であり、１０〜６０ｐｐｍの間の値が得られた。
【０１２６】
例ＩＩ
以下の実施例は、バッチおよび記載の連続クロマトグラフィー法についての、滞留時間に対する結合容量値の依存性の潜在的な差を探索するために行った。図８に示すように、標準的なバッチ操作について、１％のブレークスルー値まで測定された結合容量値は、滞留時間の減少と共に減少し、＜０．４５分の滞留時間で＜２０ｍｇ／ｍｌの結合容量値がもたらされた。対照的に、連続クロマトグラフィー法についての結合容量値は、測定された＞０．２分の滞留時間の範囲において、＞３５ｍｇ／ｍｌのままであった。この例は、純粋なｍＡｂ−ｘの例で異なる初期力価（１ｍｇ／ｍｌおよび５ｍｇ／ｍｌ）について実施された。
これらの結果に基づき、フィードストック例を以下に示す。
【０１２７】
ａ）ｍＡｂ−ｙ（０．５ｍｇ／ｍｌ）のＰＵＰ上での連続精製
溶液中の全成分の９％を構成する（分析ＳＥＣによる）０．５ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を有する、細胞培養（ＣＨＯ）溶液中のモノクローナル抗体ｍＡｂ−ｙ（ここでＨＣＰ量は抗体２５００００ｎｇ／ｍｇであった（酵素免疫測定アッセイＣＨＯにより））を、以下の条件のもとでＰｒｏｔＡ樹脂（ＰＵＰ）上で精製した。クロマトグラフィーカラム：ＰＵＰ樹脂は１６×５５ｍｍカラムに充填した：カラムを次に２５ｍＭのＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）で３３．３ｍｌ／分で平衡化した。合計３つのカラムに充填した。試料の調製のために：モノクローナル抗体細胞培養液を０．４５μｍのフィルターを通して濾過した。溶液の伝導率は、約１４ｍＳ／ｃｍおよびｐＨ６．８であった。３つのカラム全てを連続クロマトグラフィーシステムに接続し、第１カラムと第２カラムの間の接続、および第２カラムと第３カラムの間の接続、および第３カラムと第１カラムの間の接続を可能とした。全実験は３つのステップに分けられる。
【０１２８】
第１のステップが開始されると、第１カラムが第２カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を１５００ｃｍ／ｈでロードし、この間第３カラムは、２５ｍＭのTRISおよび０．０５ＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ７）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも５ＣＶ洗浄し、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ２．８）で１５００ｃｍ／ｈにて溶出し、次にカラムクリーニングを１５０ｍＭのリン酸で１５００ｃｍ／ｈにて行い、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．０）で１５００ｃｍ／ｈにて再平衡化する。
第２のステップが開始されると、第２カラムが第３カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を１５００ｃｍ／ｈでロードし、この間第１カラムは、２５ｍＭのTRISおよび０．０５ＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ７）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも５ＣＶ洗浄し、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ２．８）で１５００ｃｍ／ｈにて溶出し、次にカラムクリーニングを１５０ｍＭのリン酸で１５００ｃｍ／ｈにて行い、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて再平衡化する。
【０１２９】
第３のステップが開始されると、第３カラムが第１カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を１５００ｃｍ／ｈでロードし、この間第２カラムは、２５ｍＭのTRISおよび０．０５ＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ７）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも５ＣＶ洗浄し、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ２．８）で１５００ｃｍ／ｈにて溶出し、次にカラムクリーニングを１５０ｍＭのリン酸で１５００ｃｍ／ｈにて行い、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて再平衡化する。
指名のステップは少なくとも２回繰り返した。
溶出画分は、＞３７ｍｇ／ｍｌの充填床結合容量および＜５％の標的分子の損失および１３６．１２ｇ／ｍｌ／ｈの平均生産性（バッチ操作の生産性７．１２ｇ／ｍｌ／ｈと比較）をもたらし、これは全成分の９９．９％を構成しており（分析ＳＥＣによる）、ここで平均ＨＣＰ量は１３００ｐｐｍであった（酵素免疫測定アッセイＣＨＯにより）。
【０１３０】
【表１】
2015520667.tif 000003
実験条件を２つの個別のバッチのケースと比較した：該バッチケースにおいては、バッチ精製の標準的な条件を、４分の滞留時間を用いてローディングに適用し、洗浄、溶出、ＣＩＰおよび再平衡条件は上記と同じであった。２番目のケースについては、標準バッチ操作のローディングは０．２２分の滞留時間で実施した。このケースで得られた生産性は、１９．４ｇ／ｍｌ／ｈであった。
【０１３１】
ｂ）ＰＵＰ上のｍＡｂ−ｚ（１ｍｇ／ｍｌ）の連続精製
溶液の全成分の１４％を構成する（分析ＳＥＣにより）１ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を有する細胞培養溶液（CHO-DG44）中のモノクローナル抗体ｍＡｂ−ｚ（ここで、ＨＣＰの量は抗体２０００００ｎｇ／ｍｇであった（酵素免疫測定アッセイＣＨＯにより））を、ＰｒｏｔＡ樹脂（ＰＵＰ）上で以下の条件下で精製した。クロマトグラフィーカラム：ＰＵＰ樹脂を１６×５５ｍｍカラム中に充填した；カラムを次いで、２５ｍＭのＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）で３３．３ｍｌ／分にて平衡化した。合計３つのカラムに充填した。試料の調製のために：モノクローナル抗体細胞培養液を０．４５μｍのフィルターを通して濾過した。溶液の伝導率は、約１３ｍＳ／ｃｍおよびｐＨ６．２であった。３つのカラム全てを連続クロマトグラフィーシステムに接続し、第１カラムと第２カラムの間の接続、および第２カラムと第３カラムの間の接続、および第３カラムと第１カラムの間の接続を可能とした。全実験は３つのステップに分けられる。第１のステップが開始されると、第１カラムが第２カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を１５００ｃｍ／ｈでロードし、この間第３カラムは、２５ｍＭのTRISおよび０．０５ＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ７）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも５ＣＶ洗浄し、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ２．８）で１５００ｃｍ／ｈにて溶出し、次にカラムクリーニングを１５０ｍＭのリン酸で１５００ｃｍ／ｈにて行い、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．０）で１５００ｃｍ／ｈにて再平衡化する。
【０１３２】
第２のステップが開始されると、第２カラムが第３カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を１５００ｃｍ／ｈでロードし、この間第１カラムは、２５ｍＭのTRISおよび０．０５ＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ７）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも５ＣＶ洗浄し、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ２．８）で１５００ｃｍ／ｈにて溶出し、次にカラムクリーニングを１５０ｍＭのリン酸で１５００ｃｍ／ｈにて行い、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて再平衡化する。
第３のステップが開始されると、第３カラムが第１カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を１５００ｃｍ／ｈでロードし、この間第２カラムは、２５ｍＭのTRISおよび０．０５ＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ７）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも５ＣＶ洗浄し、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ２．８）で１５００ｃｍ／ｈにて溶出し、次にカラムクリーニングを１５０ｍＭのリン酸で１５００ｃｍ／ｈにて行い、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて再平衡化する。
【０１３３】
指名のステップは少なくとも２回繰り返した。
溶出画分は、＞３７ｍｇ／ｍｌの充填床結合容量および＜５％の標的分子の損失および２７１．４ｇ／ｍｌ／ｈの平均生産性（バッチ操作の生産性１４．２７ｇ／ｍｌ／ｈと比較）をもたらし、これは全成分の９９．９％を構成しており（分析ＳＥＣによる）、ここで平均ＨＣＰ量は１５５１ｐｐｍであった（酵素免疫測定アッセイＣＨＯにより）。
【表２】
2015520667.tif 000004
【０１３４】
実験条件を２つの個別のバッチのケースと比較した：該バッチケースにおいては、バッチ精製の標準的な条件を、４分の滞留時間を用いてローディングに適用し、洗浄、溶出、ＣＩＰおよび再平衡条件は上記と同じであった。２番目のケースについては、標準バッチ操作のローディングは０．２２分の滞留時間で実施した。このケースで得られた生産性は、４５．１３ｇ／ｍｌ／ｈであった。
【０１３５】
ｃ）ＰＵＰ上のｍＡｂ−ｗ（２．４ｍｇ／ｍｌ）の連続精製
溶液の全成分の３５％を構成する（分析ＳＥＣにより）２．４ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を有する細胞培養溶液（ＮＨ０）中のモノクローナル抗体ｍＡｂ−ｚ（ここで、ＨＣＰの量は抗体３５００００ｎｇ／ｍｇであった（酵素免疫測定アッセイＮＨ０により））を、ＰｒｏｔＡ樹脂（ＰＵＰ）上で以下の条件下で精製した。クロマトグラフィーカラム：ＰＵＰ樹脂を１６×５５ｍｍカラム中に充填した；カラムを次いで、２５ｍＭのＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）で３３．３ｍｌ／分にて平衡化した。合計３つのカラムに充填した。試料の調製のために：モノクローナル抗体細胞培養液を０．４５μｍのフィルターを通して濾過した。溶液の伝導率は、約１７ｍＳ／ｃｍおよびｐＨ５．８であった。３つのカラム全てを連続クロマトグラフィーシステムに接続し、第１カラムと第２カラムの間の接続、および第２カラムと第３カラムの間の接続、および第３カラムと第１カラムの間の接続を可能とした。全実験は３つのステップに分けられる。第１のステップが開始されると、第１カラムが第２カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を１０３２ｃｍ／ｈでロードし、この間第３カラムは、２５ｍＭのTRISおよび０．０５ＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ７）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも５ＣＶ洗浄し、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ２．８）で１５００ｃｍ／ｈにて溶出し、次にカラムクリーニングを１５０ｍＭのリン酸で１５００ｃｍ／ｈにて行い、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．０）で１５００ｃｍ／ｈにて再平衡化する。
【０１３６】
第２のステップが開始されると、第２カラムが第３カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を１０３２ｃｍ／ｈでロードし、この間第１カラムは、２５ｍＭのTRISおよび０．０５ＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ７）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも５ＣＶ洗浄し、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ２．８）で１５００ｃｍ／ｈにて溶出し、次にカラムクリーニングを１５０ｍＭのリン酸で１５００ｃｍ／ｈにて行い、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて再平衡化する。
第３のステップが開始されると、第３カラムが第１カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を１０３２ｃｍ／ｈでロードし、この間第２カラムは、２５ｍＭのTRISおよび０．０５ＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ７）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも５ＣＶ洗浄し、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ２．８）で１５００ｃｍ／ｈにて溶出し、次にカラムクリーニングを１５０ｍＭのリン酸で１５００ｃｍ／ｈにて行い、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて再平衡化する。
指名のステップは少なくとも２回繰り返した。
溶出画分は、＞３０ｍｇ／ｍｌの充填床結合容量および＜５％の標的分子の損失および４０７．２４ｇ／ｍｌ／ｈの平均生産性（バッチ操作の生産性３４．９７ｇ／ｍｌ／ｈと比較）をもたらし、これは全成分の９９．９％を構成しており（分析ＳＥＣによる）、ここで平均ＨＣＰ量は９００ｐｐｍであった（酵素免疫測定アッセイＮＨ０により）。
【０１３７】
【表３】
2015520667.tif 000005
実験条件を２つの個別のバッチのケースと比較した：該バッチケースにおいては、バッチ精製の標準的な条件を、４分の滞留時間を用いてローディングに適用し、洗浄、溶出、ＣＩＰおよび再平衡条件は上記と同じであった。２番目のケースについては、標準バッチ操作のローディングは０．３２分の滞留時間で実施した。このケースで得られた生産性は、１０１．９５ｇ／ｍｌ／ｈであった。
【０１３８】
ｄ）ＰＵＰ上のｍＡｂ−ｘ（３．５ｍｇ／ｍｌ）の連続精製
溶液の全成分の４５％を構成する（分析ＳＥＣにより）３．５ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を有する細胞培養溶液（SP 2/0）中のモノクローナル抗体ｍＡｂ−ｘ（ここで、ＨＣＰの量は抗体４５００００ｎｇ／ｍｇであった（酵素免疫測定アッセイSP 2/0により））を、ＰｒｏｔＡ樹脂（ＰＵＰ）上で以下の条件下で精製した。クロマトグラフィーカラム：ＰＵＰ樹脂を１６×５５ｍｍカラム中に充填した；カラムを次いで、２５ｍＭのＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）で３３．３ｍｌ／分にて平衡化した。合計３つのカラムに充填した。試料の調製のために：モノクローナル抗体細胞培養液を０．４５μｍのフィルターを通して濾過した。溶液の伝導率は、約１７ｍＳ／ｃｍおよびｐＨ５．８であった。３つのカラム全てを連続クロマトグラフィーシステムに接続し、第１カラムと第２カラムの間の接続、および第２カラムと第３カラムの間の接続、および第３カラムと第１カラムの間の接続を可能とした。全実験は３つのステップに分けられる。第１のステップが開始されると、第１カラムが第２カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を９２０ｃｍ／ｈでロードし、この間第３カラムは、２５ｍＭのTRISおよび０．０５ＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ７）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも５ＣＶ洗浄し、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ２．８）で１５００ｃｍ／ｈにて溶出し、次にカラムクリーニングを１５０ｍＭのリン酸で１５００ｃｍ／ｈにて行い、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．０）で１５００ｃｍ／ｈにて再平衡化する。
【０１３９】
第２のステップが開始されると、第２カラムが第３カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を９２０ｃｍ／ｈでロードし、この間第１カラムは、２５ｍＭのTRISおよび０．０５ＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ７）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも５ＣＶ洗浄し、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ２．８）で１５００ｃｍ／ｈにて溶出し、次にカラムクリーニングを１５０ｍＭのリン酸で１５００ｃｍ／ｈにて行い、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて再平衡化する。
第３のステップが開始されると、第３カラムが第１カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を９２０ｃｍ／ｈでロードし、この間第２カラムは、２５ｍＭのTRISおよび０．０５ＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ７）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも５ＣＶ洗浄し、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ２．８）で１５００ｃｍ／ｈにて溶出し、次にカラムクリーニングを１５０ｍＭのリン酸で１５００ｃｍ／ｈにて行い、次に２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で１５００ｃｍ／ｈにて再平衡化する。
指名のステップは少なくとも２回繰り返した。
溶出画分は、＞５７．１ｍｇ／ｍｌの充填床結合容量および、ローディングにおける＜５％の標的分子の損失と溶出における＜５％の標的分子の損失をもたらし、９０％の生成物回収と５７２ｇ／ｍｌ／ｈの平均生産性（バッチ操作の生産性４６．１９ｇ／ｍｌ／ｈと比較）をもたらし、これは全成分の９９．９％を構成しており（分析ＳＥＣによる）、ここでＨＣＰ量は２１００ｐｐｍであった（酵素免疫測定アッセイSP 2/0により）。
【０１４０】
【表４】
2015520667.tif 000006
4
実験条件を２つの個別のバッチのケースと比較した：該バッチケースにおいては、バッチ精製の標準的な条件を、４分の滞留時間を用いてローディングに適用し、洗浄、溶出、ＣＩＰおよび再平衡条件は上記と同じであった。２番目のケースについては、標準バッチ操作のローディングは０．３６分の滞留時間で実施した。このケースで得られた生産性は、８８．７ｇ／ｍｌ／ｈであった。
【０１４１】
例ＩＩＩ
MabSelect Sureなどの他の材料も、本出願において用いることができるが、ただし、操作条件は上述のＰＵＰ材料についての条件と同じではないことを考慮すべきである。一例として、MabSelect Sureは通常５００ｃｍ／ｈで、およびMabSelect Xtraは３００ｃｍ／ｈで適用される。３つの異なる材料（ＰＵＰ、MabSelect Xtra、MabSelect Sure）および２つの異なるｍＡｂ力価（１ｍｇおよび５ｍｇ／ｍｌ）についての、バッチ操作および我々の連続的アプローチの、達成可能な結合容量の差を示す下の図を参照されたい。
【０１４２】
溶液の全成分の１０％を構成する（分析ＳＥＣにより）０．６８ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を有する細胞培養溶液（SP 2/0）中のモノクローナル抗体ｍＡｂ−ｘ（ここで、ＨＣＰの量は抗体４５００００ｎｇ／ｍｇであった（酵素免疫測定アッセイSP 2/0により））を、ＰｒｏｔＡ樹脂（MabSelect Sure）上で以下の条件下で精製した。クロマトグラフィーカラム：MabSelect Sure樹脂を１０×６０ｍｍカラム中に充填した；カラムを次いで、２５ｍＭのＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）で２０ｍｌ／分にて平衡化した。合計３つのカラムに充填した。試料の調製のために：モノクローナル抗体細胞培養液を０．４５μｍのフィルターを通して濾過した。溶液の伝導率は、約１６ｍＳ／ｃｍおよびｐＨ６．８であった。３つのカラム全てを連続クロマトグラフィーシステムに接続し、第１カラムと第２カラムの間の接続、および第２カラムと第３カラムの間の接続、および第３カラムと第１カラムの間の接続を可能とした。全実験は３つのステップに分けられる。第１のステップが開始されると、第１カラムが第２カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を９１７．２ｃｍ／ｈでロードし、この間第３カラムは、５０ｍＭの酢酸塩および１．５ＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ６．８）で１０００ｃｍ／ｈにて少なくとも５ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭの酢酸塩バッファー（ｐＨ６．８）で１０００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ３．２）で溶出し、次にカラムクリーニングを５０ｍＭの水酸化ナトリウムで行い、次に５０ｍＭの酢酸塩バッファー（ｐＨ６．８）で再平衡化する。
【０１４３】
第２のステップが開始されると、第２カラムが第３カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を９１７．２ｃｍ／ｈでロードし、この間第１カラムは、５０ｍＭの酢酸塩および１．５ＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ６．８）で１０００ｃｍ／ｈにて少なくとも５ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭの酢酸塩バッファー（ｐＨ６．８）で１０００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ３．２）で溶出し、次にカラムクリーニングを５０ｍＭの水酸化ナトリウムで行い、次に５０ｍＭの酢酸塩バッファー（ｐＨ６．８）で再平衡化する。
第３のステップが開始されると、第３カラムが第１カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を９１７．２ｃｍ／ｈでロードし、この間第２カラムは、５０ｍＭの酢酸塩および１．５ＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ６．８）で１０００ｃｍ／ｈにて少なくとも５ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭの酢酸塩バッファー（ｐＨ６．８）で１０００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ３．２）で溶出し、次にカラムクリーニングを５０ｍＭの水酸化ナトリウムで行い、次に５０ｍＭの酢酸塩バッファー（ｐＨ６．８）で再平衡化する。
指名のステップは少なくとも２回繰り返した。
【０１４４】
溶出画分は、＞３８ｍｇ／ｍｌの充填床結合容量および、ローディングにおける＜５％の標的分子の損失と溶出における〜２％の標的分子の損失をもたらし、９３％の生成物回収と１０２ｇ／ｍｌ／ｈの平均生産性（バッチ操作の生産性１２．１ｇ／ｍｌ／ｈと比較）をもたらし、これは全成分の９９．９％を構成しており（分析ＳＥＣによる）、ここでＨＣＰ量は１２０〜１５０ｐｐｍであった（酵素免疫測定アッセイSP 2/0により）。
【表５】
2015520667.tif 000007
【０１４５】
例ＩＶ
前述したように、上記の連続クロマトグラフィーの概念は、異なるクロマトグラフィーモード（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）で用いることができる。この記載されたアプローチの可能性について、結合容量対滞留時間のスケールで表した図１３を参照のこと。Eshmuno Sを充填した単一カラムの操作では、ｍＡｂｘに対する結合容量は、物質移動抵抗のために滞留時間の減少と共に減少する。連続クロマトグラフィーアプローチでは、結合容量は、一定の滞留時間の値まで減少せず、より短い滞留時間においてより高い生産性の可能性を示す。さらに、結合容量の値は調査された滞留時間窓においてより高い。このケースについての例を以下に示す：
溶液の全成分の９８％を構成する（分析ＳＥＣにより）５．５ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を有するpost-ProtA溶出プール溶液中のモノクローナル抗体ｍＡｂ−ｙ（ここで、ＨＣＰの量は抗体２０００ｎｇ／ｍｇ（酵素免疫測定アッセイＣＨＯにより）であった）を、イオン交換樹脂（Eshmuno S）上で以下の条件下で精製した。クロマトグラフィーカラム：Eshmuno S樹脂を１６×６３ｍｍカラム中に充填した；カラムを次いで、５０ｍＭの酢酸塩バッファー（ｐＨ４．５）で３３ｍｌ／分にて平衡化した。合計４つのカラムに充填した。
【０１４６】
試料の調製のために：post-ProtA溶液を０．４５μｍのフィルターを通して濾過した。溶液の伝導率は、約２ｍＳ／ｃｍおよびｐＨ４．８であった。したがって、３または４のカラムを連続クロマトグラフィーシステムに接続し、第１カラムと第２カラムの間の接続、および第２カラムと第３カラムの間の接続、および第３カラムと第１カラムの間の接続を可能とするか、または、第１カラムと第２カラムの間の接続、および第２カラムと第３カラムの間の接続、および第３カラムと第４カラムの間の接続、および第４カラムと第１カラムの間の接続を可能とした。
【０１４７】
３つのカラムのアプローチについての全実験は、３つのステップに分けられる。第１のステップが開始されると、第１カラムが第２カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を８１０ｃｍ／ｈでロードし、この間第３カラムは、５０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ４．５）で１０００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭのTRISバッファー、２５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で溶出し、次にカラムクリーニングを５００ｍＭの水酸化ナトリウムで行い、次に５０ｍＭの酢酸塩バッファー（ｐＨ４．５）で再平衡化する。
第２のステップが開始されると、第２カラムが第３カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を８１０ｃｍ／ｈでロードし、この間第１カラムは、５０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ４．５）で１０００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭのTRISバッファー、２５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で溶出し、次にカラムクリーニングを５０ｍＭの水酸化ナトリウムで行い、次に５０ｍＭの酢酸塩バッファー（ｐＨ４．５）で再平衡化する。
第３のステップが開始されると、第３カラムが第１カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を８１０ｃｍ／ｈでロードし、この間第２カラムは、５０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ４．５）で１０００ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、次に５０ｍＭのTRISバッファー、２５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で溶出し、次にカラムクリーニングを５０ｍＭの水酸化ナトリウムで行い、次に５０ｍＭの酢酸塩バッファー（ｐＨ４．５）で再平衡化する。
指名のステップは少なくとも２回繰り返した。
【０１４８】
したがって、４つのカラムのアプローチについての全実験は、４つのステップに分けられる。第１のステップが開始されると、第１カラムが第２カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を８１０ｃｍ／ｈでロードし、この間第４カラムは、５０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ４．５）で８１０ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、これを第３カラムに接続し、次に第３カラムを第２カラムに接続し、そして第４カラムを、５０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ４．５）で１０００ｃｍ／ｈにて洗浄し、次に５０ｍＭのTRISバッファー、２５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で溶出し、次にカラムクリーニングを５００ｍＭの水酸化ナトリウムで行い、次に５０ｍＭの酢酸塩バッファー（ｐＨ４．５）で再平衡化する。
【０１４９】
第２のステップが開始されると、第２カラムが第３カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を８１０ｃｍ／ｈでロードし、この間第１カラムは、５０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ４．５）で８１０ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、これを第４カラムに接続し、次に第４カラムを第３カラムに接続し、そして第１カラムを、５０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ４．５）で１０００ｃｍ／ｈにて洗浄し、次に５０ｍＭのTRISバッファー、２５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で溶出し、次にカラムクリーニングを５００ｍＭの水酸化ナトリウムで行い、次に５０ｍＭの酢酸塩バッファー（ｐＨ４．５）で再平衡化する。
第３のステップが開始されると、第３カラムが第４カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を８１０ｃｍ／ｈでロードし、この間第２カラムは、５０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ４．５）で８１０ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、これを第１カラムに接続し、次に第１カラムを第４カラムに接続し、そして第２カラムを、５０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ４．５）で１０００ｃｍ／ｈにて洗浄し、次に５０ｍＭのTRISバッファー、２５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で溶出し、次にカラムクリーニングを５００ｍＭの水酸化ナトリウムで行い、次に５０ｍＭの酢酸塩バッファー（ｐＨ４．５）で再平衡化する。
【０１５０】
第４のステップが開始されると、第４カラムが第１カラムに接続される。このカラムのグループに、調製された試料を８１０ｃｍ／ｈでロードし、この間第３カラムは、５０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ４．５）で８１０ｃｍ／ｈにて少なくとも３ＣＶ洗浄し、これを第２カラムに接続し、次に第２カラムを第１カラムに接続し、そして第３カラムを、５０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ４．５）で１０００ｃｍ／ｈにて洗浄し、次に５０ｍＭのTRISバッファー、２５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で溶出し、次にカラムクリーニングを５００ｍＭの水酸化ナトリウムで行い、次に５０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ４．５）で再平衡化する。
【０１５１】
指名のステップは少なくとも２回繰り返した。
溶出画分は、＞５５ｍｇ／ｍｌの充填床結合容量および、ローディングにおける＜５％の標的分子の損失と溶出における〜４％の標的分子の損失をもたらし、３カラムの概念について９１％の生成物回収、および４カラムの概念について９６％の回収をもたらした。３カラムの概念についての６６６ｇ／ｍｌ／ｈの平均生産性、および４カラムの概念についての７２０ｇ／ｍｌ／ｈの平均生産性は（バッチ操作の生産性７６．８ｇ／ｍｌ／ｈと比較）、全成分の９９．９％を構成しており（分析ＳＥＣによる）、ここでＨＣＰ量は４００〜４３０ｐｐｍであった（酵素免疫測定アッセイＣＨＯにより）。
【表６】
2015520667.tif 000008
【図１】
2015520667.tif 000009
【図２−１】
2015520667.tif 000010
【図２−２】
2015520667.tif 000011
【図２−３】
2015520667.tif 000012
【図２−４】
2015520667.tif 000013
【図２−５】
2015520667.tif 000014
【図３−１】
2015520667.tif 000015
【図３−２】
2015520667.tif 000016
【図３−３】
2015520667.tif 000017
【図４】
2015520667.tif 000018
【図５−１】
2015520667.tif 000019
【図５−２】
2015520667.tif 000020
【図５−３】
2015520667.tif 000021
【図５−４】
2015520667.tif 000022
【図６−１】
2015520667.tif 000023
【図６−２】
2015520667.tif 000024
【図６−３】
2015520667.tif 000025
【図６−４】
2015520667.tif 000026
【図６−５】
2015520667.tif 000027
【図７−１】
2015520667.tif 000028
【図７−２】
2015520667.tif 000029
【図８】
2015520667.tif 000030
【図９】
2015520667.tif 000031
【図１０】
2015520667.tif 000032
【図１１】
2015520667.tif 000033
【図１２】
2015520667.tif 000034
【図１３】
2015520667.tif 000035
【図１４】
2015520667.tif 000036
【図１５】
2015520667.tif 000037
【国際調査報告】
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2015520667.tif 000039
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