(57)【要約】  改変された蛋白質輸送体の使用によって生細胞の細胞質基質まで化合物および薬物を送達するための新規手法が、開示される。改変された蛋白質輸送体がポアおよびポア特異的送達蛋白質を含み、改変された蛋白質輸送体の１つ以上に薬物などの試薬が取り付けられる。
2015519344.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生細胞内の分子的な相互作用を妨害する方法であって、
生細胞を、ポア形成蛋白質と試薬に連結されたポア特異的送達蛋白質を含む融合分子と接触させることを含み、試薬が生細胞内の分子的な相互作用を妨害するための有効量で生細胞の細胞質基質まで送達される、前記方法。
【請求項２】
標的化された生細胞の細胞質基質まで試薬を送達するための方法であって、
標的化された生細胞を、ポア形成蛋白質と接触させることを含み、ポア形成蛋白質が細胞標的シグナルを有し、細胞標的シグナルは、ポア形成蛋白質を、標的化された生細胞まで標的化し、試薬に連結されたポア特異的送達蛋白質を含む融合分子と接触させることを含み、試薬が標的化された生細胞の細胞質基質まで送達される、前記方法。
【請求項３】
生細胞の細胞質基質まで、試薬を送達するための方法であって、
生細胞を、ポア形成蛋白質と試薬に連結されたポア特異的送達蛋白質を含む融合分子と接触させることを含み、試薬が、試薬を生細胞の細胞質基質まで送達するための有効量で、生細胞の細胞質基質まで送達され、試薬が、標識された化合物、ハロゲン化合物、モルフォリノ、治療用ＲＮＡ、蛋白質ミミック、抗体ミミック、鏡像生体分子もしくはモノボディ、または改変された蛋白質骨格である、前記方法。
【請求項４】
試薬が、標識された化合物、ハロゲン化合物、モルフォリノ、治療用ＲＮＡ、蛋白質ミミック、抗体ミミック、鏡像生体分子もしくはモノボディ、または改変された蛋白質骨格である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
標識された化合物が、ビオチンまたはクリックケミストリー試薬によって標識されたペプチドである、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
ハロゲン化合物が、フッ素化されたペプチドである、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
蛋白質ミミックが抗体ミミックである、請求項３または４に記載の方法。
【請求項８】
試薬が、生細胞の細胞質基質まで、生細胞内の分子的な相互作用を妨害するための有効量で送達される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項９】
分子的な相互作用が蛋白質‐蛋白質結合の相互作用であり、試薬が蛋白質‐蛋白質結合を阻害する、請求項１または８に記載の方法。
【請求項１０】
分子的な相互作用が核酸‐蛋白質結合の相互作用であり、試薬が核酸‐蛋白質結合を阻害する、請求項１または８に記載の方法。
【請求項１１】
分子的な相互作用が蛋白質の機能であって、試薬が蛋白質の機能を阻害する、請求項１または８に記載の方法。
【請求項１２】
分子的な相互作用が核酸の機能であって、試薬が核酸の機能を阻害する、請求項１または８に記載の方法。
【請求項１３】
ポア形成蛋白質が細胞標的シグナルを有する、請求項１または３に記載の方法。
【請求項１４】
細胞標的シグナルが細胞表面の受容体に結合するペプチドである、請求項２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞表面の受容体に結合するペプチドが、Ｈｅｒ２に結合するペプチドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
試薬が、抗体ミミック、鏡像生体分子、またはモノボディである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
試薬に連結されたポア特異的送達蛋白質を含み、試薬が、標識された化合物、ハロゲン化合物、モルフォリノ、治療用ＲＮＡ、蛋白質ミミック、抗体ミミック、鏡像生体分子もしくはモノボディ、または改変された蛋白質骨格である、融合分子。
【請求項１８】
標識された化合物が、ビオチンまたはクリックケミストリー試薬によって標識されたペプチドである、請求項１７に記載の融合蛋白質。
【請求項１９】
ハロゲン化合物が、フッ素化されたペプチドである、請求項１７に記載の融合蛋白質。
【請求項２０】
融合分子を調製するための方法であって、
ポア特異的送達蛋白質とペプチドチオエステルとのライゲーション反応を、ＳｒｔＡ酵素の存在下において行って、ポア特異的送達蛋白質‐ＣＯＳＲ生成物を生成することと、
ポア特異的送達蛋白質‐ＣＯＳＲ生成物をＣ末端蛋白質ドメインと反応させることとを含み、
Ｃ末端蛋白質ドメインがシステインをＮ末端に有し、ポア特異的送達蛋白質とＣ末端蛋白質ドメインとを連結する化学実体を有する修飾された蛋白質を生成する、前記方法。
【請求項２２】
細胞標的シグナルに連結されたポア形成蛋白質を含む、ペプチド。
【請求項２３】
ポア形成蛋白質に連結されたポア特異的結合ペプチドをさらに含む、請求項２２に記載のペプチド。
【請求項２４】
試薬が、ポア特異的結合ペプチドのＣ末端に連結される、請求項２３に記載のペプチド。
【請求項２５】
請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のペプチドを発現するための核酸ベクターを含む、組成物。
【請求項２６】
ポア形成蛋白質、ポア特異的送達蛋白質、ペプチドチオエステル、および、融合蛋白質を調製して融合蛋白質を生細胞まで送達するための取扱説明を、一緒にまたは別々の区画に収容する容器、を含むキット。
【請求項２７】
ＳｒｔＡ酵素をさらに含み、それが任意にＳｒｔＡ＊であり得る、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
ペプチドチオエステルがＧｎ‐Ｘａａ‐ＣＯＳＲであり、ｎが１〜６であり、Ｘａａがアミノ酸である（配列番号１〜４）、請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項２９】
ペプチドチオエステルがＧｎ‐Ｘａａ‐ＣＯＳＲであり、ｎが３〜５であり、ＸａａがＧｌｙ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＬｅｕである（配列番号５〜７）、請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項３０】
ペプチドチオエステルがＧＧＧＧＧ‐Ｘａａ‐ＣＯＳＲであり、ＸａａがＧｌｙ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＬｅｕである（配列番号７）、請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項３１】
ペプチドチオエステルがＧｎ‐Ｘｍ‐ＣＯＳＲ（配列番号８）であり、ｎが１〜６であり、ｍが１〜６であり、Ｘが天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸である、請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項３２】
ＸがＤ‐アミノ酸である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
ペプチドチオエステルがＧｎ‐Ｙ‐ＣＯＳＲ（配列番号９〜１１）であり、ｎが１〜６であり、Ｙは非アミノ酸の化学実体である、請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項３４】
ＹがＰＥＧユニットである、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
試薬を生細胞の細胞質基質まで送達するための方法であって、
生細胞を、ポア形成蛋白質と試薬に連結されたポア特異的送達蛋白質を含む融合分子と接触させることを含み、
試薬が、標的化された生細胞の細胞質基質まで送達され、
融合分子が、連続流通式の酵素的ライゲーション反応を用い、Ｎ末端のポア特異的送達蛋白質と前記試薬を含むペプチドチオエステルとを、システイントランスペプチダーゼ酵素を含む固定相越しに流通させ、Ｎ末端蛋白質‐ＣＯＳＲ生成物が形成され、Ｃ末端蛋白質を前記固定相越しに流通させることによって調製され、
Ｃ末端蛋白質ドメインはシステインをそのＮ末端に有し、Ｎ末端のポア特異的送達蛋白質とＣ末端の蛋白質ドメインとを連結する化学実体を有する修飾された蛋白質を生成し、
連結された分子が融合分子である、前記方法。
【請求項３６】
システイントランスペプチダーゼ酵素がソルターゼである、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１２年５月２１日に出願された米国仮出願第６１／６４９，４２１号および２０１２年５月２１日に出願された米国仮出願第６１／６４９，８６６号からの米国特許法第１１９条（ｅ）の下における優先権を主張し、それらの両方の全内容は本明細書において参照により援用される。
【０００２】
細胞の細胞質基質までの生体分子の送達のための多目的な基盤が、本発明によって提供される。
【背景技術】
【０００３】
細胞質基質までの蛋白質の送達は、形質膜のバリアまたはエンドソームからの放出の効率の悪さゆえに、達成することが困難であった。一方、多くの細菌毒素は、それらの触媒性の構成要素を哺乳類細胞の細胞質基質まで輸送する機構を発達させて来た。炭疽菌毒素は、３つの構成要素（非特許文献１）（トランスロカーゼである防御抗原（ＰＡ）ならびに２つの酵素性因子である致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ）（非特許文献２））を用いる一例である。ＰＡは宿主細胞上の受容体に結合し（非特許文献３、４）、フリンファミリーのプロテアーゼによって切断される（非特許文献５、６）。生ずる断片ＰＡ６３は、自己集合して環状の７量体および８量体のプレポア（prepore）になり（非特許文献７、８）、ＬＦおよびＥＦと高親和性で複合体を形成する。複合体は次にエンドソームまでエンドサイトーシスされ、酸性化がプレポアの立体構造の再編成を誘発して、イオン伝導性のβバレルの膜貫通ポア（pore）を形成させる。ポアは次にＬＦおよびＥＦを細胞質基質までトランスロケーションして、それらの選択的な標的蛋白質に対して作用させる（非特許文献９、１０）（図６）。図６は、細胞内への炭疽菌毒素の進入のモデルである。
【０００４】
ＬＦは、２６３残基のＮ末端ドメイン（ＬＦＮ）によって、ナノモルの親和性でＰＡの表面に結合する。ＰＡ８（ＬＦＮ）４プレポア複合体の結晶構造は、ＬＦＮの第一のαヘリックスおよびβストランド（α１β１）がアンフォールディングして、２つの隣接するＰＡサブユニットの間にある裂け目（αクランプと呼ばれる）にドッキングし、基質を把握するための重要な取っ手をトランスロカーゼに提供することを示している（非特許文献１１）。ＬＦＮは、エンドソーム内の酸性のｐＨ下においてさらに部分的にアンフォールディングされ、そのＮ末端は、ＰＡ６３ポア中のＦ４２７残基の疎水性の七つ組（φクランプと呼ばれる）に結合し、蛋白質のアンフォールディングおよびトランスロケーションをＮからＣ末端の方向に狭いβバレルのチャネルを通して開始する（非特許文献１２〜１６）。
【０００５】
αクランプおよびφクランプの両方とも幅広いアミノ酸配列と相互作用し、幅広い化学上の複雑性および構成上の柔軟性をＰＡ６３ポアに提供する。ジフテリア毒素のＡ鎖（ＤＴＡ）、シュードモナスの外毒素Ａおよび志賀毒素の触媒ドメイン（非特許文献１７、１８）、ならびにいくつかの他の蛋白質のＬＦＮ融合物が、遺伝子組み換え的に発現されており、ＰＡ６３ポアを通して首尾よくトランスロケーションされている。より最近の研究は、ＬＦＮのＮ末端へのＤ‐アミノ酸およびシステイン酸の取り込みが、ポアを通してのトランスロケーションに及ぼす効果を示している（非特許文献１９）。非天然の化学実体（chemical entity）をトランスロケーションする点においてのＰＡ６３ポアの能力は、あまり利用されて来てはいない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Young, J. A. T.; Collier, R. J. In Annual Review of Biochemistry 2007; Vol. 76, P.243.
【非特許文献２】Leppla, S. H. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America-Biological Sciences 1982, 79, 3162.
【非特許文献３】Bradley, K. A.; Mogridge, J.; Mourez, M.; Collier, R. J.; Young, J. A. T. Nature 2001, 414, 225.
【非特許文献４】Scobie, H. M.; Rainey, G. J. A.; Bradley, K. A.; Young, J. A. T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003, 100, 5170.
【非特許文献５】Klimpel, K. R.; Molloy, S. S.; Thomas, G.; Leppla, S. H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992, 89, 10277.
【非特許文献６】Molloy, S. S.; Bresnahan, P. A.; Leppla, S. H.; Klimpel, K. R.; Thomas, G. J. Biol. Chem. 1992, 267, 16396.
【非特許文献７】Milne, J. C.; Furlong, D.; Hanna, P. C.; Wall, J. S.; Collier, R. J. J. Biol. Chem. 1994, 269, 20607.
【非特許文献８】Kintzer, A. F.; Thoren, K. L.; Sterling, H. J.; Dong, K. C.; Feld, G. K.; Tang, II; Zhang, T. T.; Williams, E. R.; Berger, J. M.; Krantz, B. A. J. Mol. Biol. 2009, 392, 614.
【非特許文献９】Duesbery, N. S.; Webb, C. P.; Leppla, S. H.; Gordon, V. M.; Klimpel, K. R.; Copeland, T. D.; Ahn, N. G.; Oskarsson, M. K.; Fukasawa, K.; Paull, K. D.; Vande Woude, G. F. Science 1998, 280, 734.
【非特許文献１０】Vitale, G.; Pellizzari, R.; Recchi, C.; Napolitani, G.; Mock, M.; Montecucco, C. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 248, 706.
【非特許文献１１】Feld, G. K.; Thoren, K. L.; Kintzer, A. F.; Sterling, H. J.; Tang, II; Greenberg, S. G.; Williams, E. R.; Krantz, B. A. Nat. Struct. Mol. Biol. 2010, 17, 1383.
【非特許文献１２】Zhang, S.; Finkelstein, A.; Collier, R. J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004, 101, 16756.
【非特許文献１３】Krantz, B. A.; Melnyk, R. A.; Zhang, S.; Juris, S. J.; Lacy, D. B.; Wu, Z. Y.; Finkelstein, A.; Collier, R. J. Science 2005, 309, 777.
【非特許文献１４】Krantz, B. A.; Finkelstein, A.; Collier, R. J. J. Mol. Biol. 2006, 355, 968.
【非特許文献１５】Basilio, D.; Juris, S. J.; Collier, R. J.; Finkelstein, A. J. Gen. Physiol. 2009, 133, 307.
【非特許文献１６】Finkelstein, A. Philos. Trans. R. Soc. B-Biol. Sci. 2009, 364, 209.
【非特許文献１７】Arora, N.; Leppla, S. H. Infect. Immun. 1994, 62, 4955.
【非特許文献１８】Arora, N.; Klimpel, K. R.; Singh, Y.; Leppla, S. H. J. Biol. Chem. 1992, 267, 15542.
【非特許文献１９】Pentelute, B. L.; Sharma, O.; Collier, R. J. Angewandte Chemie-International Edition 2011, 50, 2294.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現行の技術は、標的化された低分子薬物の送達については、限られている。本発明は、新規で改善された手法を、標的化された低分子および薬物の送達に提供する。その手法は、一部の態様においては、独特な化学反応および十分に定義された最終構造を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一部の態様においては、本発明は、生細胞内の分子的な相互作用を妨害する方法であって、ポア形成蛋白質と試薬に連結されたポア特異的送達蛋白質を含む融合分子と生細胞を接触させることによる。試薬は、生細胞の細胞質基質まで、生細胞内の分子的な相互作用を妨害するための有効量で送達される。
【０００９】
別の態様においては、本発明は、標的化された生細胞の細胞質基質まで試薬を送達するための方法であって、標的化された生細胞を、ポア形成蛋白質（ポア形成蛋白質は細胞標的シグナルを有し、細胞標的シグナルは、標的化された生細胞までポア形成蛋白質を標的化する）と試薬に連結されたポア特異的送達蛋白質を含む融合分子と接触させることによる。試薬は、標的化された生細胞の細胞質基質まで送達される。
一部の実施形態においては、試薬は、標識された化合物、ハロゲン化合物、モルフォリノ、治療用ＲＮＡ、蛋白質ミミック、抗体ミミック、鏡像生体分子もしくはモノボディ（monobody）、または改変された（engineered）蛋白質骨格である。
【００１０】
さらに別の態様においては、本発明は、試薬を生細胞の細胞質基質まで送達するための方法であって、ポア形成蛋白質と試薬に連結されたポア特異的送達蛋白質を含む融合分子と生細胞を接触させることによっており、試薬は、試薬を生細胞の細胞質基質まで送達するための有効量で生細胞の細胞質基質まで送達され、試薬は、標識された化合物、ハロゲン化合物、モルフォリノ、治療用ＲＮＡ、蛋白質ミミック、抗体ミミック、鏡像生体分子もしくはモノボディ、または改変された蛋白質骨格である。
【００１１】
標識された化合物は、ビオチンまたはクリックケミストリー試薬によって標識されたペプチドであり得る。一部の実施形態においては、ハロゲン化合物が、フッ素化されたペプチドである。別の実施形態においては、蛋白質ミミックが抗体ミミックである。
試薬は、一部の実施形態においては、生細胞の細胞質基質まで、生細胞内の分子的な相互作用を妨害するための有効量で送達される。分子的な相互作用は、一部の実施形態においては、蛋白質‐蛋白質結合の相互作用であり、試薬は蛋白質‐蛋白質結合を阻害する。別の実施形態においては、分子的な相互作用は核酸‐蛋白質結合の相互作用であり、試薬は核酸‐蛋白質結合を阻害する。さらに別の実施形態においては、分子的な相互作用は蛋白質機能であり、試薬は蛋白質機能を阻害する。別の実施形態においては、分子的な相互作用は核酸機能であり、試薬は核酸機能を阻害する。
【００１２】
ポア形成蛋白質は、一部の実施形態によっては、細胞標的シグナルを有する。細胞標的シグナルは、細胞表面の受容体に結合するペプチドであり得る。一部の実施形態においては、細胞表面に結合するペプチドは、Ｈｅｒ２に結合するペプチドである。別の実施形態においては、試薬が、抗体ミミック、鏡像生体分子、またはモノボディである。
試薬が、標識された化合物、ハロゲン化合物、モルフォリノ、治療用ＲＮＡ、蛋白質ミミック、抗体ミミック、鏡像生体分子もしくはモノボディ、または改変された蛋白質骨格である、試薬に連結されたポア特異的送達蛋白質の融合分子が、本発明の別の態様によって提供される。一部の実施形態においては、標識された化合物は、ビオチンまたはクリックケミストリー試薬によって標識されたペプチドである。別の実施形態においては、ハロゲン化合物は、フッ素化されたペプチドである。
【００１３】
本発明は、別の態様においては、融合分子を調製するための方法であって、ポア特異的送達蛋白質とペプチドチオエステルとのライゲーション反応をＳｒｔＡ酵素存在下において実施して、ポア特異的送達蛋白質‐ＣＯＳＲ生成物を生成し、ポア特異的送達蛋白質‐ＣＯＳＲ生成物をＣ末端蛋白質ドメインと反応させることによっており、Ｃ末端蛋白質ドメインはシステインをＮ末端に有し、ポア特異的送達蛋白質とＣ末端蛋白質ドメインとを連結する化学実体を有する修飾された蛋白質を生成する。
【００１４】
別の態様によっては、キットが提供される。そのキットは、ポア形成蛋白質、ポア特異的送達蛋白質、ペプチドチオエステル、および融合蛋白質を調製して融合蛋白質を生細胞まで送達するための取扱説明を、一緒にまたは別々の区画に収容する容器を含む。一部の実施形態においては、キットは、ＳｒｔＡ酵素をさらに含む。
【００１５】
一部の実施形態においては、ペプチドチオエステルはＧｎ‐Ｘａａ‐ＣＯＳＲであり、ｎは１〜６であり、Ｘａａは任意のアミノ酸である（配列番号１〜４）。別の実施形態においては、ペプチドチオエステルはＧｎ‐Ｘａａ‐ＣＯＳＲであり、ｎは３〜５であり、ＸａａはＧｌｙ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＬｅｕである（配列番号５〜７）。さらに別の実施形態においては、ペプチドチオエステルはＧＧＧＧＧ‐Ｘａａ‐ＣＯＳＲであり、ＸａａはＧｌｙ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＬｅｕである（配列番号７）。一部の実施形態においては、ペプチドチオエステルはＧｎ‐Ｘｍ‐ＣＯＳＲであり、ｎが１〜６であり、ｍが１〜６であり、Ｘが天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸である（配列番号８）。ＸはＤ‐アミノ酸であり得る。さらに別の実施形態においては、ペプチドチオエステルはＧｎ‐Ｙ‐ＣＯＳＲであり、ｎは１〜６であり、Ｙは非アミノ酸の化学実体である（配列番号９〜１１）。ＹはＰＥＧユニットであり得る。
【００１６】
本発明は、その利用について、次の説明に記載または図面に図示される構造の詳細および構成要素の構成に限定されない。本発明は、他の実施形態、および種々の方法による実行または実施が可能である。また、本明細書において用いられる語法および術語は、説明の目的のためであって、限定するものと見なされるべきではない。「含む（including）」、「含む（comprising）」または「有する」、「含む（containing）」、「含む（involving）」、およびそれらの変形の本明細書における使用は、その後に挙げられる項目およびそれらの同等物、ならびに更なる項目を包含することを意味する。
図面は単に例示的であり、本明細書に開示される本発明の実施に必須ではない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｓｏｒｔａｇｇｉｎｇ反応のＬＣＭＳによる解析を示す。出発原料（ａ）、精製された生成物であるＳＴｖ１（ｂ）およびＳＴｖ２（ｃ）の全イオン電流、およびデコンボリューションされた質量（差込図）。（ｄ〜ｆ）は、対応する荷電状態シリーズを示す。
【図２】ＬＣＭＳによって解析された、ＳＴｖ９〜１３の全イオン電流およびデコンボリューションされた質量（差込図）を示す。
【図３】ＳＴｖ１〜９のＣＨＯ‐Ｋ１細胞内へのトランスロケーションを示す。（ａ）細胞は、ＳＴｖ１〜６と一緒に、ＰＡ存在下または非存在下において３０分間インキュベーションされた。（ｂ）細胞は、ＳＴｖ７〜９と一緒に、ＰＡ存在下において４時間インキュベーションされた。各データポイントは３回の試験の平均を表している。
【図４】ＳＴｖ１０〜１４のＣＨＯ‐Ｋ１細胞内へのトランスロケーションを示す。（ａ）細胞は、ＳＴｖ１０〜１３と一緒に、ＰＡ存在下または非存在下において３０分間インキュベーションされた。（ｂ）細胞は、ＳＴｖ１４と一緒に、ＰＡ存在下において４時間インキュベーションされた。各データポイントは３回の試験の平均を示す。
【図５】ＳＴｖによって処理されたＣＨＯ‐Ｋ１細胞から調製された細胞溶解物のイムノブロット分析を示す。
【図６】細胞内への炭疽菌毒素の進入のモデルを示す。
【００１８】
【図７】ＳｒｔＡ＊によって媒介される、非天然の化学実体のＬＦＮ‐ＤＴＡへのライゲーションを示す。
【図８】ＳＴｖ１〜９を調製するために用いられたペプチドアナログを示す。
【図９】ＳＴｖ１０〜１４を調製するために用いられた蛋白質アナログを示す。
【図１０】炭疽菌の致死毒素に基づいた送達基盤を示す。１０Ａは、細胞内への進入の機序を示す。星印は、送達されるべき生体分子を表している。１０Ｂは、バリアントをＬＦＮに取り付けるために用いられたＳｏｒｔａｇｇｉｎｇ化学反応を示す。
【図１１】非天然の修飾を有するペプチドの、ＣＨＯ‐Ｋ１細胞内への送達。（１１Ａ）は、送達されるべきペプチドアナログを示す。（１１Ｂ）は、ＳＴｖ１〜６によってＰＡ存在下において３０分間処理された９６穴プレート中の細胞を示す。ＰＡまたはＬＦＮ‐ＤＴＡのみの条件においては、蛋白質合成阻害は検出されなかった。（１１Ｃ）は、ＳＴｖ７〜９によってＰＡ存在下において４時間処理された細胞を示す。
【図１２】蛋白質の送達および検出をＣＨＯ‐Ｋ１細胞において示す。（１２Ａ）送達されるべき蛋白質アナログ。（１２Ｂ）は、ＳＴｖ１０〜１３によってＰＡ存在下において３０分間処理された細胞を示す。（１２Ｃ）は、ＳＴｖ１４およびＳＴｖ１４ｍｕｔによってＰＡ存在下において４時間処理された細胞を示す。（１２Ｄ）は、１００ｎＭのＬＦＮ‐Ｄ‐アフィボディ（affibody）‐アルキンおよびＬＦＮ‐Ｄ‐アフィボディ‐ビオチンによって、４０ｎＭのＰＡまたはＰＡ（Ｆ４２７Ｈ）存在下において２４時間処理されたＣＨＯ‐Ｋ１細胞を示す。それらは、抗ＬＦ抗体もしくはストレプトアビジン‐ＩＲＤｙｅ６８０またはゲル内蛍光検出によって分析された。（１２Ｅ）は、送達された物質のウエスタンブロットによる定量を示す。
【００１９】
【図１３】細胞のプロセスを乱すための、Ｄ‐ペプチドおよびモノボディの送達を示す。（１３Ａ）は、ＬＦＮ‐ＤＰＭＩ、ＬＦＮ‐ＤＰＭＩ‐ビオチン、およびＬＦＮ‐ＨＡ４‐７ｃ１２の構築物を示している。（１３Ｂ）は、ストレプトアビジンアガロースビーズを用いるＭＤＭ２のプルダウンを、ＰＡ存在下においてＬＦＮ‐ＤＰＭＩによって処理されたＵ８７細胞において示している（３）。ＰＡ存在下においてＬＦＮ‐アフィボディ‐ビオチン（１）、およびＰＡ（Ｆ４２７Ｈ）と一緒にＬＦＮ‐ＤＰＭＩ（２）によって処理されたＵ８７細胞が、負の対照として用いられた。（１３Ｃ）は、ｐ５３、ＭＤＭ２、およびｐ２１のウエスタンブロット分析を、各構築物による処理後２４時間のＵ８７において示す。細胞は、２４時間、２０ｎＭのＰＡ（１）、２０ｎＭのＰＡ（２）もしくはＰＡ（Ｆ４２７Ｈ）（３）存在下における１５０ｎＭのＬＦＮ‐ＭＰ１、２０ｎＭのＰＡ（４）もしくはＰＡ（Ｆ４２７Ｈ）（５）存在下における１５０ｎＭのＬＦＮ‐ＤＰＭＩ、またはＰＡ（６）もしくはＰＡ（４２７Ｈ）（７）存在下における１５０ｎＭのＬＦＮ‐ＤＰＭＩ‐ビオチンによって処理された。（１３Ｄ）は、Ｋ５６２細胞のウエスタンブロット分析および共免疫沈降を示す。細胞は、無処理（１）、または、２４時間、２０ｎＭのＰＡ（３）またはＰＡ（Ｆ４２７Ｈ）（２）存在下における５０ｎＭのＬＦＮ‐ＨＡ４‐７ｃ１２、もしくはＰＡ存在下におけるＬＦＮ‐ｍＨＡ４‐７ｃ１２処理（４）によって処理された。細胞溶解物が、抗Ａｂｌアガロースビーズによる免疫沈降にかけられた。ビーズに結合した蛋白質は、抗Ａｂｌ（上）および抗ＬＦ（下）を用いるイムノブロットによって、分離および分析された。５０ｎＭのＬＦＮ‐ＨＡ４‐７ｃ１２蛋白質が、共ＩＰの正の対照として細胞溶解物に添加された（１’）。（１３Ｅ）各アナログによって処理され、アポトーシスについて分析されたＫ５６２細胞のＴＵＮＥＬ蛍光のヒストグラム（上）、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の定量（ｎ＝９または３）（下）。強度は、イマチニブによって処理されたＫ５６２細胞（１００％に任意設定された）および未処理細胞（０％に任意設定された）に対して正規化された。
【００２０】
【図１４】細胞質基質におけるプロセスを制御するための、融合モルフォリノの細胞内への輸送および送達を現す一連のグラフである。融合モルフォリノは、ＣＨＯ‐Ｋ１細胞と一緒に９０分間（１４Ａ）または４時間（１４Ｂ）インキュベーションされた。トランスロケーションは３Ｈ‐Ｌｅｕの取り込みを用いて測定される。
【図１５】ペプチド‐低分子の融合分子の、ポアを通して生細胞の細胞質基質中までのトランスロケーションを現すグラフである。
【図１６】ＬＦＮ‐ＤＴＡ‐ドキソルビシンおよびＬＦＮ‐ＤＴＡ‐ドセタキセルの、ＰＡポアを通してＣＨＯ細胞の細胞質基質中までのトランスロケーションを現すグラフである。
【図１７】ＰＡの受容体結合ドメインを修飾してＨＥＲ２受容体を標的化することが、細胞毒性薬物であるＤＯＸおよびＤＯＣの、ＨＥＲ２を発現するＢＴ４７４乳癌細胞への送達をもたらし得ることを証明するグラフである。
【図１８】ＣＨＯ‐Ｋ１を用いる細胞生存性試験を現すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
化合物および薬物を、生細胞の細胞質基質まで、改変された蛋白質輸送体の使用によって送達するための新規手法が開示される。その方法は、一対の試薬（ポア形成蛋白質およびポア特異的送達蛋白質）を含み、それらは一緒に機能して、薬物または他の化合物の、細胞の細胞質基質中へのエンドサイトーシスおよび放出をもたらす。この強力な技法は、広範な種類の天然に存在しない化合物をその細胞に送達するために訴えられ得る。これは、以前には、深刻な送達の難問に行き当たっていた。本明細書において提供される方法は、研究、診断、および治療処置にとっての新たな可能性を提供する。以下に提供される実施例において、本発明者は、高度に効率的な化学酵素的ライゲーションの戦略を利用して、細胞毒性薬物、例えばドキソルビシンおよびドセタキセルを１対の試薬、例えばＬＦＮまたはＰＡに積んだ。同種の十分に定義された蛋白質‐薬物コンジュゲートが、これらの研究において得られた。ポア形成蛋白質は対応する細胞表面の受容体に結合するので、オリゴマーのプレポアを作り、次に、受容体によって媒介されるエンドサイトーシスを受ける。送達ペプチドは次にプレポアのオリゴマーに結合し、その後で内在化が起こる。この送達システムは、１回のエンドサイトーシスが複数コピーの送達ペプチド‐薬物コンジュゲートを送達できるので、有利である。本明細書に記載の実験は、ＬＦＮにコンジュゲーションされた薬物がポアを通して細胞質基質中まで首尾よくトランスロケーションしたことを示した。本発明は、その方法が改変されて、標的および細胞に特異的な送達を達成できるという発見も含んでいる。これは、ポア形成蛋白質を改変して標的化の成分を付加し、細胞特異的な受容体を標的化するようにすることによって達成され得る。例えば、実施例においては、ポアの受容体結合ドメインを改変してＨＥＲ２受容体を標的化することによって、ＨＥＲ２を発現するＢＴ４７４乳癌細胞まで細胞毒性薬物が送達され得ることが証明された。
【００２２】
その最も基本において、本発明は、生体分子を細胞の細胞質基質まで送達するための単純な基盤である。この送達基盤は、送達ペプチドまたはポア特異的送達蛋白質と呼ばれる蛋白質の無毒性形態に基づいており、これは、対応する（cognate）ポア形成蛋白質と特異的に相互作用して特異的な内在化を達成する。生細胞まで送達されるべき積み荷は、トランスペプチダーゼのソルターゼＡ（Sortase A）または他の化学反応を用いて、送達ペプチドに共有結合的に連結され得る。ポア形成蛋白質を積まれた細胞がいったん送達されると、積み荷および送達ペプチドは、防御抗原存在下において細胞の細胞質基質まで輸送される。
【００２３】
この多目的の送達基盤は、研究および薬物送達にとっての新たな可能性を開く。研究環境においては、本方法は、当該化合物が細胞の内側まで適切な構成または標識とともに送達され得ないせいで、以前には可能でなかった場合に、化合物が細胞内プロセスに及ぼす影響の研究を可能にする。
従って、本発明は、一部の態様においては、試薬を生細胞の内側まで送達するための方法である。細胞は、生細胞の任意の種類であり得る。例えば、生細胞は真核細胞および原核細胞を含む。生細胞の例は、ヒト、霊長類、イヌ、猫、馬、ウシ、ブタ、七面鳥、ヤギ、魚、サル、ニワトリ、ラット、マウス、ヒツジ、植物、細菌、藻類、および酵母に由来する細胞を含むが、それらに限定されない。細胞は、正常細胞、癌細胞、または遺伝子改変された細胞であり得る。
【００２４】
試薬は低分子の任意の種類である。一部の実施形態においては、試薬は、天然に存在しない低分子である。天然に存在しない低分子は、本明細書において用いられる場合、天然に見られない配列を有する、１つ以上の非天然の化学種または実体を含む、または天然に見られる分子の天然に存在する形態から切り詰められているという点において、天然に存在する分子とは異なる分子を指す。天然に見られない配列を有する分子は、例えば、独特なアミノ酸またはヌクレオチド配列を有するペプチドまたは核酸であり得る。独特なアミノ酸またはヌクレオチド配列は、天然に存在する配列に似ているが天然に存在する配列と、１ユニットほどであっても違っている配列であり得る。１ユニットの違いは、異なるアミノ酸またはヌクレオチドであり得、または天然に存在するアミノ酸もしくはヌクレオチドの改変された変形であり得、または標識された変形であり得る。標識された変形は、例えば、ヌクレオチドバックボーンの修飾、例えばホスホロチオエートによる連結またはメチル基もしくはハロゲンなどの更なる分子であり得る。
【００２５】
非天然の化学種（species）または実体（entity）は、本明細書において用いられる場合、対象の蛋白質の特定の位置において通常は見られない化合物を指す。非天然の実体は、従って、蛋白質中のその特定の位置において通常は見られるアミノ酸でない限りは、天然に存在するアミノ酸を含み得る。非天然の化学種または実体は、本明細書においてはＸａａまたはＸｍとも呼ばれ、天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、例えばＤ型アミノ酸、標識されたプローブ、ペプチドミメティック、およびＰＥＧユニットを含むが、それらに限定されない。当該実体の挿入は、適切な反応相手の取り付けに依存する。一部の実施例においては、非天然の化学種または実体は、１つ以上のヘム基、ロドプシン分子、ビタミン、ビオチン、脂肪酸、脂質、炭水化物、ポリマー、または無機元素、イオン、もしくはクラスターである。
【００２６】
低分子は、ペプチド、核酸、多糖、および低分子量有機化合物を含むがそれらに限定されず、典型的には８００ダルトン未満である。低分子は、バイオポリマー、例えば蛋白質、核酸、または多糖に結合して、バイオポリマーの活性または機能を変える能力がある。
場合によっては、試薬はペプチドである。ペプチドまたは蛋白質またはポリペプチドは、本明細書において用いられる場合、少なくとも２つのモノマーのポリマーを指し、モノマーはアミノ酸であり、場合によってはアミノ酸残基と呼ばれ、アミド結合によって１つに連結される。本発明の目的のためには、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「蛋白質」は、全３種類が本明細書に記載の方法の複数態様において用いられ得るので、大体において交換可能である。
【００２７】
本明細書において用いられる場合、アミノという用語は、保護されたまたは保護されていない側鎖を有するアミノ酸を指す。アミノ酸は、キラルなアミノ酸のＬおよびＤ異性体を含む。本明細書に記載されるアミノ酸配列、例えば「ＬＰＸＴＧ」（配列番号１２）は、文脈から別様に示されない限りは、Ｎ末端からＣ末端までのアミノ酸残基を左から右へ並べている。本明細書において用いられる場合、用語「側鎖」は、アミノ酸のα炭素原子における置換基を指す。
本発明の試薬の例は、治療用分子、例えば、薬物もしくは薬物アナログ、標識された化合物、治療用もしくは阻害性核酸、ハロゲン化合物、蛋白質ミミック、抗体ミミック、鏡像生体分子、モノボディ、および／または改変された蛋白質骨格を含む。
ハロゲン化合物は、１つ以上のハロゲン分子を含むように修飾された化合物である。例えば、フッ素化または塩素化された化合物はハロゲン化合物である。
【００２８】
抗体ミミックまたはミメティックは、抗体のように抗原に特異的に結合できるが、構造上は抗体に似ていない有機化合物である。それらの化合物は、ペプチド、核酸、低分子、またはそれらの組み合わせであり得、抗体に優るいくつかの利点、例えば、より良い溶解性、組織浸透性、ならびに熱および酵素に対する安定性を有する。抗体ミミックの一部の例は、アフィボディ分子（骨格はプロテインＡのＺドメインである）、アフィリン（Affilin）（骨格はγ‐Ｂクリスタリンユビキチンである）、アフィチン（Affitin）（骨格はＳａｃ７ｄ（スルフォロブス・アシドカルダリウス由来）である）、アンチカリン（Anticalin）（骨格はリポカリンである）、アビマー（Avimer）（骨格は種々の膜受容体のドメインである）、ＤＡＲＰｉｎ（骨格はアンキリンリピートモチーフである）、フィノマー（Fynomer）（骨格はＦｙｎのＳＨ３ドメインである）、Ｋｕｎｉｔｚ低分子ドメインペプチド（骨格は種々のプロテアーゼインヒビターのＫｕｎｉｔｚドメインである）、およびモノボディ（骨格はフィブロネクチンの１０番目のＩＩＩ型ドメインである）を含むが、それらに限定されない。
【００２９】
場合によっては、試薬は核酸である。本発明の方法において有用な核酸は、モルフォリノ、アンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）経路、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、および当分野において公知の他の低分子干渉核酸系分子を含む。一実施形態においては、ベクター系ＲＮＡｉの様式（例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ‐ｍｉｒ発現構築物）が用いられて、細胞内における遺伝子（例えば標的核酸）の発現を低下させる。一部の実施形態においては、本発明の治療用組成物は、ｓｈＲＮＡなどの低分子干渉核酸を発現する、単離されたプラスミドベクター（例えば、当分野において公知または本明細書に開示の、任意の単離されたプラスミドベクター）を含む。単離されたプラスミドは、低分子干渉核酸をコードする遺伝子に操作可能に連結された、特定のプロモーターを含み得る。場合によっては、単離されたプラスミドベクターは、人間に感染できるウィルス中にパッケージングされる。例示的なウィルスは、アデノウィルス、レトロウィルス、レンチウィルス、アデノ随伴ウィルス、および当分野において公知および本明細書に記載の他のものを含む。
【００３０】
広範なＲＮＡｉ系の様式、例えばｓｉＲＮＡ系オリゴヌクレオチドおよび／または改変されたｓｉＲＮＡ系オリゴヌクレオチドが用いられて、細胞における遺伝子の発現を阻害し得る。改変ｓｉＲＮＡ系オリゴヌクレオチドは、効能、標的の親和性、安全性の特徴、および／または安定性を変えるように、例えば、それらを細胞内における分解に対して耐性または部分的に耐性にするように、改変されたものである。修飾、例えばホスホロチオエートが、例えば、オリゴヌクレオチドになされて、ヌクレアーゼ分解に対する耐性、結合親和性、および／または吸収性を増大させ得る。さらに、疎水性化およびバイオコンジュゲーションはｓｉＲＮＡの送達および標的化を向上させ（Ｄｅ  Ｐａｕｌａら著、ＲＮＡ、第１３巻（４）、ｐ．４３１〜５６、２００７年）、リボ‐ジフルオロトルイルヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡは遺伝子サイレンシング活性を保持する（Ｘｉａら、ＡＳＣ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、第１巻（３）、ｐ．１７６〜８３、（２００６年））。アミドによって連結されたリボヌクレオシドを有するｓｉＲＮＡが創出されており、Ｓ１ヌクレアーゼ分解に対して未修飾ｓｉＲＮＡよりも耐性である（Ｒ．Ｉｗａｓｅら著、２００６年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．、第５０巻、ｐ．１７５〜１７６）。さらに、２'糖位置とホスホジエステルによる連結とにおけるｓｉＲＮＡの修飾は、効率の低下無しに、改善された血清中安定性を付与する（Ｃｈｏｕｎｇら著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第３４２巻（３）、ｐ．９１９〜９２６、２００６年）。遺伝子（例えば、ＣＳＣ関連遺伝子）の発現を阻害するために用いられ得る他の分子は、センスおよびアンチセンス核酸（一本または二本鎖）、リボザイム、ペプチド、ＤＮＡザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、三重螺旋を形成するオリゴヌクレオチド、抗体、およびアプタマー、ならびにそれらの改変された形態を含み、遺伝子、ＲＮＡ転写物、または蛋白質中の配列を対象とする。
【００３１】
モルフォリノは、遺伝子発現を加減するために用いられるオリゴヌクレオチドである。モルフォリノによって用いられる機序は、ＲＮＡの塩基対を形成する表面の小さい（約２５塩基の）部分の妨害を、典型的には、遺伝子機能をノックダウンするために含む。モルフォリノオリゴは、選ばれた標的部位に特異的に結合して、細胞の構成要素のその標的部位へのアクセスを妨害する。結果として、分子のこの種類が用いられて、翻訳、スプライシング、ｍｉＲＮＡまたはそれらの標的、およびリボザイム活性を妨害し得る。例えば、翻訳開始複合体を立体的に妨害することによって、モルフォリノは多くの標的配列の発現をノックダウンできる。
【００３２】
用いられ得る他の核酸分子は、センスおよびアンチセンス核酸（一本または二本鎖）を含む。アンチセンス核酸は、修飾または未修飾ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマー核酸を含み、主として、マッチする配列に特異的に結合することによって機能し、ペプチド合成の調節をもたらす（Ｗｕ‐Ｐｏｎｇ著、１９９４年１１月、ＢｉｏＰｈａｒｍ、ｐ．２０〜３３）。アンチセンス核酸は、ワトソン・クリック塩基対の形成によって標的ＲＮＡに結合し、結合された配列のリボソームによる翻訳を、立体的な妨害またはＲＮａｓｅＨ酵素の活性化によって妨げることによって、遺伝子発現を妨害する。アンチセンス分子は、ＲＮＡのプロセシングまたは核から細胞質までの輸送に干渉することによって、蛋白質合成も変化させ得る（ＭｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙおよびＲｏｔｈ著、１９９６年、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ、第７巻、ｐ．１５１〜１９０）。
【００３３】
本明細書において用いられる場合、用語「アンチセンス核酸」は、核酸を表し、それはオリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾されたオリゴリボヌクレオチド、または修飾されたオリゴデオキシリボヌクレオチドであり、それらは、生理条件下において、特定の遺伝子を含むＤＮＡまたはその遺伝子のｍＲＮＡ転写物にハイブリダイゼーションし、それによって、その遺伝子の転写および／またはそのｍＲＮＡの翻訳を阻害する。アンチセンス分子は、標的遺伝子または転写物とのハイブリダイゼーションによって、標的遺伝子の転写または翻訳に干渉するように設計される。当業者には当然のことながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドの的確な長さとその標的に対するその相補性の程度とは、選ばれた具体的な標的、例えば標的の配列およびその配列を構成する具体的な塩基に応じて異なるであろう。
【００３４】
一部の実施形態においては、本発明の阻害性核酸は、核酸標的に対して１００％同一である。別の実施形態においては、核酸標的に対して、少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、または５０％同一である。用語「％同一」は、２つのヌクレオチド配列間の配列同一性を指す。同一性（％）は、比較の目的のためにアラインメントされ得る各配列中における所与の位置を比較することによって、計算され得る。同一性（％）という表現は、比較配列どうしによって共有される位置における同一のアミノ酸または核酸の数の関数を指す。種々のアラインメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが用いられ得、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＥＮＴＲＥＺ‐ＦＡＳＴＡを含む。ＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列分析パッケージ（ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン）の一部として利用可能であり、例えばデフォルトの設定によって用いられ得る。ＥＮＴＲＥＺは、国立生物工学情報研究センター（国立医学図書館、国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ）を通じて利用可能である。一実施形態においては、２つの配列の同一性（％）は、ＧＣＧプログラムによって、ギャップの重み１として測定され得る。例えば、各アミノ酸ギャップは、あたかも２つの配列間における１アミノ酸またはヌクレオチドのミスマッチであるかのように重み付けされる。
【００３５】
アラインメントの他の技法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２６６巻：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６年）、ドリトル編、アカデミック・プレス社（ハーコート・ブレイス社グループ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）に記載されている。好ましくは、配列中のギャップを許容するアラインメントプログラムが用いられて、配列をアラインメントする。スミス‐ウォーターマンは、配列アラインメント中のギャップを許容するアルゴリズムの１つの種類である。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第７０巻、ｐ．１７３〜１８７（１９９７年）参照。また、ニードルマン‐ブンシュアラインメント法を用いるＧＡＰプログラムが用いられて、配列をアラインメントし得る。それに代わる検索戦略はＭＰＳＲＣＨソフトウェアを用い、これはＭＡＳＰＡＲコンピュータ上で作動する。ＭＰＳＲＣＨはスミス‐ウォーターマンアルゴリズムを用いて、超並列コンピュータ上で配列をスコア付けする。この手法は、遠縁のマッチを選び出す能力を改善し、特に、小さいギャップおよびヌクレオチド配列エラーに対して寛容である。核酸にコードされたアミノ酸配列が用いられて、蛋白質およびＤＮＡデータベースの両方を検索できる。
【００３６】
本発明において有用な阻害性核酸は、通常は、１つ以上の標的遺伝子との部分的または完全な相補性を有するように設計される。「遺伝子発現の阻害」は、標的遺伝子由来の蛋白質および／またはｍＲＮＡ生成物の存在しないことまたはレベルの観察可能な低下を指す。「特異性」は、細胞の他の遺伝子に及ぼす明らかな影響無しに、標的遺伝子を阻害する能力を指す。阻害の結果は、細胞または生物の外面的な特性の検査によって、または、生化学的技法、例えばＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼプロテクション、ノザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現の観察、抗体との結合、酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング、放射性免疫試験（ＲＩＡ）、他の免疫試験、および蛍光によって作動する細胞分析（ＦＡＣＳ）によって、確認され得る。細胞株または個体におけるＲＮＡによって媒介される阻害については、遺伝子発現が、好都合には、その蛋白質生成物が容易に試験されるレポーターまたは薬物耐性遺伝子の使用によって試験される。かかるレポーター遺伝子は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、βグルコロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、およびそれらの誘導体を含む。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、およびテトラマイシンに対する耐性を付与する、複数の選択マーカーが利用可能である。
【００３７】
試験に応じて、遺伝子発現の量の定量は、本発明によって処理されていない細胞と比較して、１０％、３３％、５０％、９０％、９５％、または９９％よりも大きい阻害の程度を測定することを可能にする。一例として、阻害の効率は、細胞内の遺伝子産物の量を算定することによって測定され得る。ｍＲＮＡが、阻害性核酸用に用いられる部位の外側にあるヌクレオチド配列を有する、ハイブリダイゼーションプローブによって検出され得る。または、翻訳されたポリペプチドが、その部位のポリペプチド配列に対して作製された抗体によって検出され得る。
【００３８】
試薬は、標識された化合物でもあり得る。標識された化合物は、天然に存在するまたは天然に存在しない任意の低分子であり、検出可能な標識を含む。検出可能な標識は、本明細書において用いられる場合、部分（moiety）であり、その存在は直接的または間接的に確認され得る。一部の例においては、標識の検出は、標識によるエネルギーの放出を含む。標識は、特定の波長の光子または他の原子の粒子を放出および／または吸収するその能力によって、直接的に検出され得る（例えば、放射能、ルミネッセンス、光学もしくは電子密度など）。標識は、それ自体で特定の波長の光を放出または吸収し得る別の部分を、結合、リクルート、および場合によっては切断するその能力によって、間接的に検出され得る（例えば、ビオチン、アビジン、エピトープタグ、例えばＦＬＡＧエピトープ、酵素タグ、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼなど）。間接的な検出の一例は、基質を切断して可視の生成物にする第１の酵素標識の使用である。その標識は、薬品、ペプチド、または核酸分子の種類であり得るが、それに限定されない。標識は、イメージングの技法、例えばＰＥＴ同位体、シンチグラフィ、ＮＭＲなどと併せて用いられ得る任意の公知の標識を含む。他の検出可能な標識は、３２Ｐもしくは３Ｈなどの放射性同位体、蛍光色素などのルミネッセンスマーカー、光学もしくは電子密度マーカーなど、またはＦＬＡＧエピトープもしくはＨＡエピトープなどのエピトープタグ、ビオチン、アビジン、および西洋ワサビペルオキシダーゼ、β＊‐ガラクトシダーゼ、ナノ粒子などの酵素タグを含む。当業者に公知の多くの異なる標識および標識の方法がある。本発明において用いられ得る標識の種類の例は、結合対（ビオチン‐アビジン）、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド金属、ナノ粒子、化学発光化合物、および生物発光化合物を含む。
【００３９】
試薬は、Ｌ‐蛋白質またはＤ‐蛋白質であり得る。さらに、試薬は環状ペプチドであり得る。一部の実施形態においては、試薬はＤ‐蛋白質でも環状ペプチドでもない。
天然に存在するポア‐送達蛋白質の対を用いる細胞内輸送に関与する機構は、典型的には配列特異的であるので、送達ペプチドとは非常に異なる分子または試薬が、細胞内送達のプロセスを妨害すること無く送達ペプチドに取り付けられ得るということは意外であった。以下に示すデータは、広範な種類の低分子が細胞の細胞質基質まで首尾よく送達され得、且つ重要なことに、細胞内において機能的であることを立証している。本発明のシステムは、従って、試薬を細胞内に導入して、広範な機能を細胞内において作り出すために用いられ得る。
【００４０】
本発明の方法が用いられて、例えば、細胞における分子的な相互作用を妨害し得る。分子的な相互作用は、細胞内の分子による任意の種類の機能である。機能は、単一の分子に基づき得る。例えば、ｍＲＮＡなどの分子が細胞内に存在し得る。本発明のシステムが用いられて、そのｍＲＮＡの機能、安定性、アクセス性、または翻訳に、直接的または間接的に相互作用して、干渉するような、治療用ＲＮＡ、ＤＮＡ、モルフォリノ、または蛋白質を細胞まで送達し得る。同様に、本発明のシステムが用いられて、細胞の蛋白質の機能を妨害し得る。例えば、蛋白質は酵素であり得る。試薬は細胞の細胞質基質まで送達され得、試薬は、酵素の安定性または適切なフォールディングを維持する酵素の構成要素を妨害することによって、酵素活性を妨害する分子である。機能または細胞内相互作用は、２つ以上の細胞の構成要素も含み得る。例えば、分子的な相互作用は蛋白質‐蛋白質結合の相互作用であり得る。分子的な相互作用の妨害は、蛋白質‐蛋白質結合を直接または間接的に阻害する試薬の細胞質基質への送達によって達成され得る。その代わりに、分子的な相互作用は、核酸‐蛋白質結合の相互作用であり得る。分子的な相互作用の妨害は、核酸‐蛋白質結合を直接または間接に阻害する試薬の細胞質基質への送達によって、達成され得る。
【００４１】
試薬は、直接的に細胞質基質の分子に、好ましくは選択的に結合し得る。本明細書において用いられる場合、用語「選択的結合」および「特異的結合」は、試薬に関して交換可能に用いられ、他の分子に対するよりも大きい親和性で、標的の細胞質基質の分子に結合する試薬の能力を指す。すなわち、標的の細胞質基質の分子に選択的に結合する試薬は、標的の細胞質基質の分子に結合するのと同程度且つ同じ親和性で他の分子に結合することはしない。一部の実施形態においては、本発明の試薬は、専ら、標的の細胞質基質の分子に結合する。本明細書において用いられる場合、標的の細胞質基質の分子に選択的または特異的に結合する結合試薬は、（あるとしても）より少ない親和性で他の分子に結合する。より少ない親和性は、少なくとも１０％少ない、２０％少ない、３０％少ない、４０％少ない、５０％少ない、６０％少ない、７０％少ない、８０％少ない、９０％少ない、または９５％少ない、を含み得る。
【００４２】
本方法は、ポア形成蛋白質と試薬に連結されたポア特異的送達蛋白質を含む融合分子と生細胞を接触させることによって達成され得る。ポア形成蛋白質は、本明細書において用いられる場合、自己集合して環状のオリゴマー形態（例えば、７量体または８量体のオリゴマー）になって細胞膜にポアを形成できるペプチドである。
ポア形成蛋白質は、ポア特異的送達蛋白質に結合する能力がある。ポア形成蛋白質は、試薬に取り付けられたポア特異的送達蛋白質との複合体を形成する。いったん複合体が形成されると、ポア特異的送達蛋白質‐試薬はエンドサイトーシスされる。エンドソームの酸性化は、ポア形成蛋白質のオリゴマーの立体構造の再編成を誘発してトランスロカーゼにし、これはアンフォールディングして、ポア特異的送達蛋白質‐試薬を細胞質基質に渡す。
【００４３】
一式のポア形成蛋白質とポア特異的送達蛋白質との、天然に存在する例が存在する。例えば、多くの細菌毒素は、ポア形成蛋白質とポア特異的送達蛋白質とを、単一の蛋白質中にまとめて、または一緒になって機能する別々の蛋白質中に、含んでいる。例えば、ジフテリア毒素は、ポア形成蛋白質とポア特異的送達蛋白質とを両方含む単一の蛋白質である。対照的に、炭疽菌毒素は、複数のペプチドからなっており、それらは、ポア形成蛋白質（炭疽菌毒素においては防御抗原またはＰＡと呼ばれる）およびポア特異的送達蛋白質（炭疽菌毒素においては浮腫因子（ＥＦ）または致死因子（ＬＦ））を構成する。本発明の方法において有用なそれらのペプチドを含む天然に存在する毒素は、炭疽菌毒素、ジフテリア毒素、百日咳毒素、コレラ毒素、ボツリヌス神経毒素、志賀毒素、志賀様毒素、シュードモナスの外毒素、破傷風毒素、および外毒素Ａを含むが、限定されない。ポア形成蛋白質は、天然に存在する毒素のポア形成蛋白質であり得、または、１つ以上の天然に存在しない実体を含む改変されたポア形成蛋白質であり得る。
【００４４】
ポア特異的結合ペプチドは、ペプチドおよび任意の関連する取り付けられた積み荷のポアを通しての輸送を可能にするような方法で、ポアと相互作用するペプチドである。ポア特異的結合ペプチドはポア配列と相互作用するが、天然に存在する配列とは異なっている様々なペプチド配列が用いられ得る。従って、ポア特異的結合ペプチドは、天然に存在する毒素の断片、そのバリアント、または合成ペプチド配列であり得る。例示的なポア特異的結合ペプチドは、
Χ１‐Ｙ１‐Χ２‐Ｙ２‐Χ３‐Ｙ３‐Χ４‐Ｙ４（配列番号１３）
または
Ｙ１‐Ｘ１‐Ｙ２‐Ｘ２‐Ｙ３‐Ｘ３‐Ｙ４‐Ｘ４（配列番号１４）
を含むアミノ酸配列を有し、
Ｘは負に荷電したアミノ酸であり、Ｙは正に荷電したアミノ酸である。一部の実施形態においては、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、ＥおよびＤ、またはＥおよびＤのＤ‐アミノ酸異性体から選択される。別の実施形態においては、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４は、Ｋ、Ｒ、およびＨ、またはＫ、Ｒ、およびＨのＤ‐アミノ酸異性体から選択される。一部の実施形態においては、ポア特異的結合ペプチドは、長さが８〜５０アミノ酸のペプチドである。その代わりに、ペプチドは、長さが１０〜４０、１５〜３０、または２０〜２５アミノ酸であり得る。本発明のポア特異的結合ペプチドの例は、次を含む。
【００４５】
種々の試薬は、公知の遺伝子組み換えおよびライゲーション技法を用いて合成され得る。代替的には、試薬は、新規技法を用いて調製され得る。同時係属中の米国特許出願第６１／６４９，８６６号と、米国特許出願第６１／６４９，８６６号の優先権を主張する本願と同時に出願されたＰＣＴ出願において十分に説明されており、それらのそれぞれは参照によってその全体が援用される。それらに記載の方法は、ペプチド配列を迅速且つハイスループット式にライゲーションするための新規方法を含む。生成した生成物は、直接的にまたはリンカーを介して１つに連結された複数の化合物である。ポア特異的結合ペプチドは、この方法論を用いて試薬にカップリングされ得る。
【００４６】
リンカーが用いられて、ポア特異的結合ペプチドと試薬とを連結し得る。リンカーは、任意選択で、細胞質基質区画における切断を受けやすくあり得る。リンカー分子（「リンカー」）は、ペプチドであり得、それは１つ〜複数のアミノ酸からなり、または非ペプチド分子であり得る。本発明に有用なペプチドリンカー分子の例は、グリシンに富むペプチドリンカー（例えば米国特許第５，９０８，６２６号参照）を含み、アミノ酸残基の半数超はグリシンである。好ましくは、かかるグリシンに富むペプチドリンカーは、約２０個またはより少ないアミノ酸からなる。
【００４７】
リンカー分子は、非ペプチドまたは部分的なペプチド分子も含み得る。例えば、ペプチドは、周知のクロスリンク分子、例えばグルタルアルデヒドまたはＥＤＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州ロックフォード）を用いて、他の分子に連結され得る。二官能性のクロスリンク分子は、２つの異なる反応性部位を有するリンカー分子である。例えば、二官能性のリンカー分子の反応性部位の１つは、ペプチド上にある官能基と反応して共有結合的な連結を形成し得、他方の反応性部位は、別の分子上にある官能基と反応して共有結合的な連結を形成し得る。分子をクロスリンクするための通常の方法は、概説されている（例えばＭｅａｎｓおよびＦｅｅｎｅｙ著、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、第１巻、ｐ．２〜１２（１９９０年）参照）。
【００４８】
ホモ二官能性のクロスリンカー分子は、化学的に同じである２つの反応性部位を有する。ホモ二官能性のクロスリンカー分子の例は、限定無しに、グルタルアルデヒド、Ｎ，Ｎ'‐ビス（３‐マレイミド‐プロピオニル‐２‐ヒドロキシ‐１，３‐プロパンジオール（スルフヒドリルに特異的なホモ二官能性のクロスリンカー）、一部のＮ‐スクシンイミドエステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル（discuccinimyidyl suberate）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）、および可溶性のビススルホン酸、ならびにそれらの塩を含む（例えば、Ｐｉｅｒｃｅケミカルズ社、イリノイ州ロックフォード、シグマアルドリッチ社、ミズーリ州セントルイス参照）。
【００４９】
好ましくは、二官能性のクロスリンカー分子はヘテロ二官能性のリンカー分子であって、リンカーが少なくとも２つの異なる反応性部位を有し、それらのそれぞれはペプチドまたは他の分子に別々に連結され得ることを意味する。かかるヘテロ二官能性のリンカーの使用は、反応性部位のそれぞれの選ばれたペプチド配列への、化学的に別々で段階的な付加（有向性の連結）を可能にする。本発明に有用なヘテロ二官能性のリンカー分子は、限定無しに、ｍ‐マレイミドベンゾイル‐Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｇｒｅｅｎら著、Ｃｅｌｌ、第２８巻、ｐ．４７７〜４８７（１９８２年）およびＰａｌｋｅｒら著、米国科学アカデミー紀要、第８４巻、ｐ．２４７９〜２４８３（１９８７年）参照）、ｍ‐マレイミド‐ベンゾイルスルホスクシンイミドエステル、マレイミド酪酸Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル、およびＮ‐スクシンイミジル３‐（２‐ピリジル‐ジチオ）プロピオナート（例えば、Ｃａｒｌｏｓら著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第１７３巻、ｐ．７２３〜７３７（１９７８）、シグマアルドリッチ社、ミズーリ州セントルイスを参照）を含む。
【００５０】
試薬を特定の細胞に送達することが望ましいときには、試薬は、細胞または組織の特定の種類に対して標的化され得る。典型的には、ポア形成蛋白質は、細胞標的シグナルに結合される。細胞標的シグナルは、本明細書において用いられる場合、細胞または組織の特定の種類に関連した細胞表面の分子を特異的に認識して結合する分子である。例えば、細胞標的シグナルは、細胞表面の受容体を認識して結合し得、従って、細胞表面の受容体に結合するペプチドと呼ばれる。細胞表面に結合するペプチドは、Ｈｅｒ２に結合するペプチド、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死蛋白質１（ＰＤ１）、ＢおよびＴリンパ球のアテニュエータ（ＢＴＬＡ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、ＣＤ１６０、ＰＤ１ホモログ（ＰＤ１Ｈ）、ＣＤ２８、誘導性共役刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ１３７（４‐１ＢＢとしても公知）、ＣＤ２７、ＯＸ４０、グルココルチコイドによって誘導されるＴＮＦＲ関連蛋白質（ＧＩＴＲ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦＲ）、膜貫通活性化因子、ＣＡＭＬ相互作用因子（ＴＡＣＩ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７リガンドメンバー、ＡＰＲＩＬ（増殖誘発リガンド）、Ｂ７Ｈ１（Ｂ７ホモログ１）、ＧＩＴＲＬ（ＧＩＴＲリガンド）、ＨＶＥＭ（ヘルペスウィルスの進入のメディエーター）、ＩＴＡＭ（免疫受容体活性化チロシンモチーフ）、ＩＴＩＭ（免疫受容体抑制性チロシンモチーフ）、ＩＴＳＭ（免疫受容体互換性チロシンモチーフ）、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）、ＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０リガンド）、ＰＩ３Ｋ（ホスホイノシチド３‐キナーゼ）、ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）、ＴＲＡＦ、またはＴＮＦＲ関連因子、に結合するペプチドを含むが、これらに限定されない。
【００５１】
本発明は、本発明の方法によって有用な組成物にも関する。本発明の例示的な組成物は、試薬に連結されたポア特異的送達蛋白質の融合分子であり、試薬は、標識された化合物、ハロゲン化合物、モルフォリノ、治療用ＲＮＡ、蛋白質ミミック、抗体ミミック、鏡像生体分子もしくはモノボディ、または改変された蛋白質骨格である。
ペプチドは、例えば、ＰＥＧ分子に連結され得る。かかる分子はＰＥＧ化ペプチドと呼ばれる。
【００５２】
本発明の別の組成物は、細胞標的シグナルにコンジュゲーションされたポア形成蛋白質である。組成物は、ペプチドまたはペプチドを発現する核酸の形態であり得る。例えば、組成物は、細胞標的シグナルにコンジュゲーションされたポア形成蛋白質を発現するための要素を含む、核酸発現ベクターであり得る。種々の好適なベクターが、細胞内において遺伝子物質を発現するために利用可能である。具体的な条件用の治療用薬剤を送達するための適切なベクターの選択、および選択された発現ベクターの細胞内への挿入の条件の最適化は、当業者の範囲内である。
【００５３】
本明細書において用いられる場合、「ベクター」は、その中に所望の配列が制限反応およびライゲーションによって宿主細胞内における発現のために挿入され得る、いくつもの核酸分子のうち任意のものであり得る。ベクターは典型的にはＤＮＡからなるが、ＲＮＡベクターも利用可能である。ベクターは、プラスミド、ファージミド、およびウィルスゲノムを含むが、それらに限定されない。発現ベクターは、その中に所望のＤＮＡ配列が制限反応およびライゲーションによって挿入され、制御配列に操作可能に連結されてＲＮＡ転写物として発現され得るものである。
組成物は、対象、組織、または細胞に対して、担体または医薬的に許容される担体中において送達され得る。対象は、ヒト対象またはヒトでない対象であり得る。
【００５４】
本発明の医薬組成物は、１つ以上の薬剤の有効量を、医薬的に許容される担体中に溶解または分散されて含む。「医薬的または薬理学的に許容される」という表現は、動物、例えば適宜ヒトに投与されたときに、有害性、アレルギー性、または他の予想外の反応を生じない分子実体および組成物を指す。さらに、動物（例えばヒト）への投与のためには、製剤は、ＦＤＡのＯｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって求められる無菌性、発熱性、一般安全性、および純度の規格を満たすべきことは理解されよう。化合物は、通常は、ヒトへの投与に好適である。この用語は、化合物または組成物が無毒性であって十分に純粋であるので、化合物または組成物の更なる操作がヒトへの投与前に必要とされない、ということを要求する。
【００５５】
本明細書において用いられる場合、「医薬的に許容される担体」は、当業者に公知であろう（例えば、参照により本明細書に援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０年）参照）任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗細菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑剤、甘味料、着香剤、色素、同種の物質、およびそれらの組み合わせを含む。任意の従来の担体が活性成分と非適合性である場合を除いて、治療用または医薬組成物へのその使用が想定される。化合物は無菌であり得、または無菌ではなくあり得る。
【００５６】
本明細書において記載される化合物は、種々の種類の担体を含み得る。これは、固体、液体、またはエアロゾル形状で投与されるかどうか、および、注射などの投与経路用に無菌である必要があるかどうかによって異なる。本発明は、静脈内、皮内、動脈内、病巣内、腫瘍内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸腔内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、外用、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、血管内、粘膜、心膜内、さい帯内、眼内、経口、外用、局所、吸入（例えばエアロゾル吸入）、注射、点滴、持続点滴、局所潅流、標的細胞の直接的な浸浴、カテーテル、ラバージュ、クリーム、脂質組成物（例えばリポソーム）、または当業者に公知であろう他の方法もしくは前述のものの任意の組み合わせ（例えば、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０年）参照）によって、投与され得る。特定の実施形態においては、腹腔内注射が想定される。
【００５７】
任意の場合に、組成物は種々の抗酸化剤を含んで、１つ以上の構成要素の酸化を遅延させ得る。さらに、微生物の作用の防止は、種々の抗細菌および抗真菌剤などの防腐剤によってもたらされ得、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。
【００５８】
薬剤は、遊離塩基、中性、または塩の形態の組成物へと製剤化され得る。医薬的に許容される塩は、酸付加塩、例えば、蛋白質性の組成物の自由なアミノ基によって形成、あるいは、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、もしくはマンデル酸などの有機酸によって形成されるものを含む。自由なカルボキシル基によって形成される塩は、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは鉄の水酸化物、または、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカインなどの有機塩基にも由来し得る。
【００５９】
組成物が液体形状である実施形態においては、担体は、溶媒または分散質であり得、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリコール、プロピレングリコール、液状のポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）、およびそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、例えば液体状のポリオールまたは脂質などの担体中への分散による要求される粒径の維持によって、例えばヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用によって、またはそれらの組み合わせ、かかる方法によって、維持され得る。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム、またはそれらの組み合わせを含むことが好ましいであろう。
【００６０】
本発明の化合物は、直接的に組織に投与され得る。直接的な組織投与は、直接注射によって達成され得る。化合物は１回投与され得、またはその代わりに、複数回の投与によって投与され得る。もしも複数回投与される場合には、化合物は、異なる経路によって投与され得る。例えば、最初の（または最初の数回の）投与は、患部組織に直接的になされ得、以降の投与は全身的であり得る。
【００６１】
本発明の製剤は、医薬的に許容される溶液として投与され得、通常は、医薬的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性の担体、アジュバント、および任意選択で他の治療用成分を含み得る。通常は、医薬組成物は、本発明の化合物と医薬的に許容される担体とを含む。核酸、低分子、ペプチド、モノクローナル抗体、および抗体断片にとって医薬的に許容される担体は、当業者には周知である。本明細書において用いられる場合、医薬的に許容される担体は、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉しない、無毒性の物質を意味する。
【００６２】
医薬的に許容される担体は、希釈剤、増量剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および当分野において周知の他の物質を含む。例示的な医薬的に許容される担体は、特にペプチドについて、米国特許第５，２１１，６５７号明細書に記載されている。かかる製剤は、通常は、塩、緩衝剤、防腐剤、適合性の担体、および任意選択で他の治療用薬剤を含み得る。医薬品に用いられるとき、塩は医薬的に許容されるべきである。しかし、医薬的に許容されない塩が好都合に用いられてそれらの医薬的に許容される塩を調製し得、本発明の範囲から除外されない。かかる薬理学的および医薬的に許容される塩は、次の酸から調製されるものを含むが、それらに限定されない。塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、蟻酸、マロン酸、コハク酸など。また、医薬的に許容される塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、またはカルシウム塩として調製され得る。
【００６３】
本発明の化合物は、固体、半固体、液体、またはガスの形状、例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、デポジトリ、吸入剤、および注射剤として、経口、非経口、または外科的投与用の通常の方法で、製剤に処方され得る。本発明は、例えばインプラントによる、局所投与用に製剤化される医薬組成物も含み、遅延または制御放出用に設計されたものを含む。
経口投与に好適な組成物は、別々の単位、例えばカプセル、錠剤、トローチ剤として提供され得、それぞれは活性薬剤の所定量を含有する。他の組成物は、水性液体または非水性液体としての懸濁液、例えばシロップ、エリキシル、またはエマルションを含む。
【００６４】
経口投与のためには、化合物は、活性化合物を当分野において周知の医薬的に許容される担体と組み合わせることによって、容易に製剤化され得る。かかる担体は、本発明の化合物が錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして、治療される対象による経口摂取用に、製剤化されることを可能にする。経口使用のための医薬製剤は固体の賦形剤として得ることができる。任意選択で、得られた混合物を粉砕し、所望される場合には適当な助剤を添加した後に、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠のコアを得る。好適な賦形剤は、具体的には、糖などの増量剤、例えばラクトース、ショ糖、マンニトール、またはソルビトール、セルロース調製物、例えば、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望される場合には、崩壊剤、例えば、クロスリンクされたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩が添加され得る。任意選択で、経口製剤は、内部の酸性条件を中和するために、サリンまたは緩衝液としても製剤化され得、または担体無しに投与され得る。
【００６５】
糖衣剤のコアは、適当なコーティングを備える。この目的のためには、濃糖溶液が用いられ得、これは、任意選択でアラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適当な有機溶媒もしくは溶媒混合物を含み得る。染料または顔料が、識別、活性化合物用量の種々の組み合わせの特徴とするために、錠剤または糖衣コーティングに添加され得る。
経口的に用いられ得る医薬製剤は、ゼラチンから作られたかみ合わせ式ハード（push fit）カプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤から作られたソフト（soft sealed）カプセルを含む。かみ合わせ式カプセルは、活性成分を、ラクトースなどの増量剤、澱粉などの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、ならびに、任意選択で、安定剤と混合して含み得る。ソフトカプセルにおいては、活性化合物は、適当な液体、例えば脂肪油、流動パラフィン、または液体状のポリエチレングリコール中に溶解または懸濁され得る。さらに、安定化剤が添加され得る。経口投与用に製剤されたマイクロスフェアも用いられ得る。かかるマイクロスフェアは当分野において十分に明らかにされている。経口投与のための全ての製剤は、かかる投与に適当な服用量であるべきである。
【００６６】
頬側投与のためには、組成物は、従来の方法で製剤された錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
吸入による投与のためには、本発明による使用のための化合物は、好都合には、高圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーの提供の形態として、適当な高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適当なガスを用いて、送達され得る。高圧エアロゾルの場合には、剤形は、所定量を送達するためのバルブを提供することによって、定まり得る。例えば、吸入器または吹き付け器中の使用されるゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、当該化合物と適当な粉末基剤、例えばラクトースまたは澱粉との粉末混合物を含んで製造され得る。エアロゾル送達システムを調製するための技法は、当業者には周知である。通常は、かかるシステムは、活性薬剤の生物学的特性をあまり損なわないであろう成分を利用するべきである（例えば、参照により援用される、ＳｃｉａｒｒａおよびＣｕｔｉｅ著、「Ａｅｒｏｓｏｌｓ」、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１９９０年、ｐ．１６９４〜１７１２参照）。当業者は、エアロゾルを生成するための種々のパラメータおよび条件を、過度の実験作業に頼ること無しに、容易に決定できる。
【００６７】
化合物は、全身送達することが望ましいときには、注射、例えばボーラス注射または持続点滴による非経口投与のために製剤化され得る。注射のための製剤は、アンプルなどの単位剤形として、または複数用量容器として、添加された防腐剤と一緒に提供され得る。組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルションなどの形態をとり得、製剤化用の薬剤、例えば懸濁、安定、および／または分散剤を含み得る。
【００６８】
非経口投与のための製剤は、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルションを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、水、アルコール性／水性溶液、エマルション、または懸濁液、例えばサリンおよび緩衝化された媒質を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖、ブドウ糖、および塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または脂肪油（fixed oil）を含む。静脈内用のビヒクルは、液体および栄養補充剤、電解質補充剤（例えば、リンゲルのブドウ糖に基づくもの）などを含む。防腐剤および他の添加物、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなども存在し得る。より低い用量は、投与の他の形態、例えば静脈内投与からもたらされる。対象における反応が、使用された当初の用量においては不十分である場合には、より大用量（または、有効には、別のより局所的な送達経路による、より大用量）が、患者の抵抗力が許す限りまで用いられ得る。１日あたり複数の投与が、化合物の適切な全身濃度を達成するために想定される。
【００６９】
非生分解性および生分解性のポリマーマトリックスは両方とも、本発明の薬剤を対象に投与するために用いられ得る。生分解性のマトリックスが好ましい。かかるポリマーは、天然または合成ポリマーであり得る。合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、放出が所望される期間に基づいて選択され、通常は数時間から１年以上の部類である。典型的には、数時間から３〜１２ヶ月の範囲の期間かけての放出が、最も望ましい。ポリマーは、任意選択で、その重量の最大約９０％を水中において吸収できるヒドロゲルの形態であり、さらには、任意選択で、多価イオンまたは他のポリマーとクロスリンクされる。
【００７０】
本発明は、本発明の方法を達成するように組み合わされた、本明細書に記載の種々の試薬からなるキットも含む。キットは、例えば、標的に結合するペプチドと任意選択で連結された１つ以上のポア形成蛋白質、およびポア特異的な結合ペプチドを含み得る。キットは、さらに、試験用希釈剤、標準、対照、および／または検出可能な標識を含み得る。試験用の希釈剤、標準、および／または対照は、具体的なサンプルマトリックス用に最適化され得る。試薬は、例えば、抗体、核酸、標識された第２の試薬、またはその代わりには、もしも第１の試薬が標識されている場合には、標識された試薬と反応できる酵素性もしくは試薬結合性の試薬を含む。当業者は、本発明の試薬が、当分野において周知の確立されたキット構成の１つに容易に組み込まれ得ることを直ちに認識するであろう。
【００７１】
本明細書において用いられる場合、「プロモーションされる」は業務を行うあらゆる方法を含み、教育、病院内および他の臨床訓練、製薬産業の活動、例えば、医薬品の販売、ならびに任意の宣伝または他のプロモーション活動、例えば、癌の治療または解析に関連する本発明の組成物に関する紙媒体、口頭、および任意の形式の電子通信、の方法を含む。
【００７２】
「取扱説明」は、プロモーションの一部を示し得、典型的には、本発明の組成物の包装上にあるまたはそれに附属した紙媒体の取扱説明を含み得る。取扱説明は、任意の方法で提供される任意の口頭または電子的な取扱説明も含み得る。
従って、本明細書に記載の薬剤は、一部の実施形態においては、医薬用または診断用または研究用のキットに組み込まれて、治療、診断、または研究用途におけるそれらの使用を容易にし得る。キットは、本発明の構成要素を収容する１つ以上の容器と使用の取扱説明とを含み得る。具体的には、かかるキットは、本明細書に記載の１つ以上の薬剤を、それらの薬剤の所期の治療用用途および適切な投与を記載する取扱説明と一緒に含み得る。一部の実施形態においては、キット中の薬剤は、具体的な用途およびそれらの薬剤の投与の方法に好適な医薬製剤および用量としてあり得る。
【００７３】
キットは、医師による本明細書に記載の方法の使用を容易にするように設計され得、多くの形態をとり得る。キットの組成物のそれぞれは、適宜、液体形状（例えば、溶液）、または固体形状（例えば、乾燥粉末）で提供され得る。場合によっては、組成物の一部は、例えば、必ずしもキットに備わっていない適当な溶媒または他の化学種（例えば、水または細胞培養培地）の添加によって、構成可能または別様に（例えば活性形態に）加工処理可能であり得る。本明細書において用いられる場合、「取扱説明」は、取扱説明および／またはプロモーションの一部を示し得、典型的には、本発明の包装上にあるまたはそれに附属する紙媒体の取扱説明を含み得る。取扱説明は、取扱説明がキットに関連するということをユーザがはっきり認識するように、任意の方法で提供される任意の口頭または電子的な取扱説明、例えば、視聴覚器具（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、インターネット、および／またはウェブ型通信なども含み得る。紙媒体の取扱説明は、医薬またはバイオ製品の製造、使用、または販売を取り締まる行政当局によって指定された様式であり得、その取扱説明は、ヒトへの投与向けの製造、使用、または販売の当局による認可も反映し得る。
【００７４】
キットは、本明細書に記載の構成要素の任意の１つ以上を、１つ以上の容器中に含み得る。一例としては、一実施形態においては、キットは、キットの１つ以上の構成要素を混合および／またはサンプルを単離し混合、ならびに対象に適用するための取扱説明を含み得る。キットは、本明細書に記載の薬剤を収容する容器を含み得る。それらの薬剤は、無菌的に調製され、シリンジ中に容器詰めされ、冷蔵出荷され得る。その代わりに、バイアルまたは他の容器中に、保管のために収容され得る。第２の容器は、無菌的に調製された他の薬剤を有し得る。その代わりに、キットは、予め混合された上でシリンジ、バイアル、チューブ、または他の容器中において出荷される活性薬剤を含み得る。
【００７５】
本発明は、その利用について、次の説明に記載または図面に図示される構造の詳細および構成要素の構成に限定されない。本発明は、他の実施形態、および種々の方法による実行または実施が可能である。また、本明細書において用いられる語法および術語は、説明の目的のためであって、限定するものと見なされるべきではない。「含む（including）」、「含む（comprising）」、または「有する」、「含む（containing）」、「含む（involving）」、およびそれらの変形の本明細書における使用は、その後に挙げられる項目およびそれらの同等物、ならびに更なる項目を包含することを意味する。
本発明は次の実施例によってさらに例示されるが、それらは、決してさらに限定するものとして解釈されるべきではない。本願において引用された出典の全ての全内容（参考文献、発行済み特許、公開済み特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）は、参照によって本明細書に明示的に援用される。
【実施例】
【００７６】
いくつもの本発明の方法が実験的に試験された。そのデータは次の実施例において示されている。簡潔なまとめが先ず提供される。多様な一連の積み荷が研究され、非天然のアミノ酸を含むペプチド、鏡像生体分子、および抗体ミミック様に振る舞うように改変された蛋白質骨格を含んだ。この基盤は癌細胞に適用され、ｐ５３／ＭＤＭ２が鏡像ペプチドによって標的化された。別の場合には、タンデムモノボディによって、癌蛋白質Ｂｃｒ‐Ａｂｌを標的化して妨害した。全てのバリアントは細胞の細胞質基質まで送達され、細胞内環境におけるプロセスを研究するための重要なツール、ならびに診断および治療用のユーティリティを提供した。
【００７７】
本明細書に記載される場合、炭疽菌の致死毒素の無毒性形態は、細胞の細胞質基質までの生体分子送達用に転用された。開発された送達基盤は、炭疽菌の致死毒素に由来する２つの無毒性蛋白質、すなわち防御抗原（ＰＡ、８３ｋＤａ）と致死因子のＮ末端ドメイン（ＬＦＮ、約３０ｋＤａ）とからなる。細胞死を担うＣ末端の触媒ドメインは除去された。オリゴグリシンＮ末端を有する積み荷が、ＬＦＮのＣ末端にあるＬＰＳＴＧＧ（配列番号１５）に、トランスペプチダーゼのソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）によって共有結合的に取り付けられ、Ｓｏｒｔａｇｇｉｎｇされたバリアント（ＳＴｖ）のＬＦＮ‐積み荷を生成した。送達は、ＰＡが宿主細胞の受容体に結合して、フリンファミリーのプロテアーゼによって切断されてＰＡ６３を形成するときに起こる。ＰＡ６３は自己集合して環状の７量体および８量体のオリゴマーになり、ＬＦＮ‐積み荷と複合体を形成し（Ｋｄ＝１ｎＭ）、それらは次にエンドサイトーシスされる。エンドソームの酸性化は、ＰＡオリゴマーの立体構造の再編成を誘発してトランスロカーゼにし、これはアンフォールディングして、ＬＦＮ‐積み荷を細胞質基質まで通す。
【００７８】
ＬＦＮのＣ末端への非天然の化学実体の取り付けを達成するために、ストレプトコッカス・アウレウス由来のカルシウム依存性の酵素であるソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）が利用された２０。ＳｒｔＡは、短いペプチドモチーフＬＰＸＴＧ（配列番号１２）を認識し、トレオニン‐グリシン結合を切断する。チオアシルによって連結された酵素‐基質中間生成物は、次に、Ｎ末端のオリゴグリシンモチーフと反応でき、共有結合の形成を切断の部位においてもたらす２１。オリゴグリシンモチーフは雑多な修飾を許容するので、ＳｒｔＡは、種々の分子を対象の蛋白質に取り付けるために、広く利用されて来た２２〜２６。最近の研究は、野生型のＳｒｔＡと比較してかなり高い触媒活性を有する、進化したＳｒｔＡ（ＳｒｔＡ＊）を報告した２７。
【００７９】
本研究においては、ＳｒｔＡ＊が、一連の非天然の化学実体のＬＦＮ‐ＤＴＡへの容易な取り付けに用いられた。ＤＴＡは、蛋白質合成を妨害するその能力によって、細胞質基質中に導入されたときに、トランスロケーションのレポーターとして働く（図７）。図７は、ＳｒｔＡ＊によって媒介される非天然の化学実体のＬＦＮ‐ＤＴＡへのライゲーションを示している。得られるＳｒｔＡ＊によってタグ付けされたバリアント（ＳＴｖ）は、種々の非天然のアミノ酸によって修飾されたペプチド、環状ペプチド、低分子シングルドメイン蛋白質、およびそれらの鏡像体の、ＬＦＮ‐ＤＴＡコンジュゲートを含んでいる。それらのＳＴｖのトランスロケーション特性が研究され、ＰＡ６３ポアが、非天然の化学実体のほとんどの送達において、少数の例外を除いて効率的であることが見いだされた。この研究は、ＰＡ６３ポアの無差別性に関する理解をもたらし、さらに重要なことには、新規化学実体の細胞質基質中への送達用に、炭疽菌毒素の輸送体を乗っ取る可能性を顕示した。腫瘍細胞へのＰＡ標的化における最近の進展と結びついて、本発明者のシステムは、広範な種々の生物活性な化学実体を、細胞の選ばれた種類まで送達するための理想的な基盤を提供する。
【００８０】
本明細書において説明されるデータは、種々の非天然のアミノ酸を含有するペプチドおよび蛋白質が、炭疽菌毒素の送達基盤を通して細胞内に送達され得ることを証明する。非天然の化学実体をＬＦＮにコンジュゲーションするための強力で確実な方法は、ＰＡ６３ポアの送達能力を探るかぎである。本発明においては、ＳｒｔＡによって媒介されるライゲーションが用いられ、ＳＴｖの容易な調製のための単純なワンポット法が開発された。Ｓｏｒｔａｇｇｉｎｇ反応は水性の緩衝溶液中において行われ、蛋白質はそれらの自然な構造を維持し、さらなる再フォールディングがライゲーション後に要求されることはない。ＬＦＮ‐ＤＴＡのＣ末端への小さいエピトープＬＰＸＴＧ（配列番号１５）の取り込みは、ＤＴＡ活性によって示された通り、蛋白質の機能の乱れをほとんど起こさなかった。オリゴグリシンペプチド（≧３００μΜ）およびオリゴグリシン蛋白質（≧１００μΜ）の比較的高い濃度が、ライゲーション効率を最大化してＬＰＸＴＧ（配列番号１５）タグの加水分解を最小化するためには必要であるが、それらのペプチドおよび蛋白質は、それらの濃度において容易に調製されて可溶である。
【００８１】
試験されたＳＴｖのうちでは、全ての直鎖ペプチドが、取り付けられた非アミノ酸、低分子アフィボディおよびＧＢ１蛋白質、ならびにそれらの鏡像体にかかわらず、ＰＡ６３ポアを通してＬＦＮ‐ＤＴＡと同じくらい効率的にトランスロケーションされた。これらの結果は、ＰＡ６３ポアが、トランスロケーションされるべき基質に関して相対的に無差別であるということを示唆している。アンフォールディングおよびトランスロケーションが、いったん酸性のｐＨおよび正の膜電位下においてαクランプおよびφクランプとの相互作用を通じてＬＦＮによって開始されると、それらの２つのクランプは、後続部分をつかんで活発にアンフォールディングすることができ、化学修飾および立体化学について高い許容性がある。
【００８２】
しかしながら、取り付けられた環状ペプチドおよび１０ＦＮ３を有するＳＴｖは、ＬＦＮ‐ＤＴＡと比較して、ＥＣ５０が１〜２ｌｏｇ単位シフトしていた。ＰＡ６３によって形成される推定された１４ストランドのβバレルの、約１５Å幅の内孔は、トランスロケーションされるべき化学構造のサイズを限定してしまう４０。調製された環状ペプチドは、その環に１０アミノ酸を含んでおり、それらはペプチドのより広がった形状を制限し得るプロリンを含んでいた。１０ＦＮ３の場合には、βシート骨格の高い安定性は、ポア中における高いアンフォールディングの障壁に寄与する。力に依存するアンフォールディングの機序においては、βシート部分が律速的な機械的ブレークポイントであることが多い。これは、ＬＦＮのβシートのサブドメインにおいて示されている４１。興味深いことに、ＳＴｖ１４ｍｕｔは、１０ＦＮ３と同じ蛋白質骨格だがループ内に変異を含んでおり、ＬＦＮ‐ＤＴＡと同じくらい効率的にトランスロケーションされ得る。１０ＦＮ３変異体の構造および安定性は未だ明らかにされていないが、βシート構造の向きおよびトポロジーの考え得る変化が、アンフォールディングの力を下げる主要な決定要因であり得る４２。
【００８３】
イムノブロットの結果は細胞毒性の結果と一致しており、他のＳＴｖと比較して、ＳＴｖ１４のより少量が細胞質までトランスロケーションされた。イムノブロットの検出限界ゆえに、ＳＴｖ８およびＳＴｖ９は、ＳＴｖ１４と比較してもさらに高いＥＣ５０を有したものの、検出不可能なトランスロケーションの量を有した。一方で、アフィボディおよびＧＢ１のＬおよびＤ型の両方を有するＳＴｖは、ＬＦＮ‐ＤＴＡおよびペプチドコンジュゲートよりも大量のトランスロケーションを示した。構造的には、アフィボディは全てαヘリックスを含み、ＧＢ１は部分的にαヘリックスである。ヘリックス構造が、構造不定のペプチドに比べて立体構造のエントロピーを減らすことによって、かなりの速度論的利点をトランスロケーションに提供し、且つαクランプが基質を把握するための取っ手も提示するということが示唆された１１。トランスロケーション中におけるαヘリックスの速度論的利点は、イムノブロットサンプル用の細胞のＳＴｖによる延長された処理（一晩）の間に弱められ得た。
【００８４】
アフィボディおよびモノボディは、多数の標的蛋白質またはペプチドに高親和性でもって結合するように改変された抗体を模倣するための改変にとって、強力な骨格として働いた。それらの２つの骨格の細胞内へのＰＡ６３ポアを通した効率的なトランスロケーションは、機能的な抗体ミミックを送達して細胞内蛋白質を標的化する有望な方法を提供する。さらに重要なことに、それらの鏡像体の送達は、それらの蛋白質の安定性および免疫原性の問題に対処するであろう。
残る問題は、細胞質基質に到達した後の、それらの蛋白質の適切なフォールディングに関する。細胞毒性試験は、ＬＦＮに融合されたＤＴＡが、適切にフォールディングされて機能的であることを示唆している。これは、Ｌ‐蛋白質が細胞質基質において適切にフォールディングされるであろうということを示唆している。これらの試験が用いられて、細胞にトランスロケーションした蛋白質の機能を検出し、それらの再フォールディング状態を確認し得る。
【００８５】
種々の非天然の機能的なペプチドおよび蛋白質を細胞に送達する能力と一緒になって、ＰＡを特定の細胞系列に対して標的化することは、この送達基盤を治療用用途においてより魅力的にするであろう。ウロキナーゼまたはマトリックスメタロプロテアーゼに富む細胞に対してＰＡを標的化することは、蛋白質加水分解の活性化部位を変えることによって達成されている４４、４５。さらに最近、ＰＡは、その自然の受容体に結合する機能を変異させてＥＧＦに融合させることによって、ＥＧＦＲ受容体を指向するように変えられた。ＰＡの標的化における進歩によって、この送達システムは、具体的な用途のためのより多くの順応性およびモジュール性を提供する。
【００８６】
ＰＡおよびＬＦＮに基づく送達基盤は、広範な種類の生体分子を細胞質基質まで輸送するための強力なツールを提供する。主要なプレーヤーであるＰＡ、ＬＦＮ、およびＳｒｔＡは、大腸菌内において機能的であり、容易に発現されて約１００ｍｇの物質をもたらす。ナノモル濃度のＰＡおよびＬＦＮ‐積み荷が細胞に添加され、一定時間後には、積み荷のナノモル濃度が細胞質基質に到達した。いくつもの対照および試験が容易に用いられて、細胞内への輸送を確認し得る。エンドソーム脱出は、主に、ＬＦＮがＰＡオリゴマーと相互作用してトランスロケーションを開始することに依存していた。効率は、環状ペプチドまたは熱的に安定な蛋白質によってのみ変化した。初めての機会として、この基盤は、鏡像蛋白質の細胞内への送達を可能にし、基盤のモジュール性は、細胞質基質中における存在を確認するためのビオチンまたはクリック反応の使用を見越している。鏡像ペプチドおよび蛋白質は、変化した免疫原性を有するようであり、蛋白質加水分解に対して安定である。これは、細胞質基質におけるそれらの生物学的特性に関する問題に対処することを可能にする。送達システムの細胞内への組み立ておよび進入を媒介する宿主細胞の受容体は、ほとんどの細胞種上に見いだされる。コピー数は１０，０００〜４０，０００の範囲である。送達は、宿主細胞の受容体によって媒介されるので、本基盤は、特定の細胞種を標的化するように調整され得る。これは、ＰＡをＥＧＦおよびＨＥＲ２受容体に対して標的化することによって示された。
【００８７】
基盤の有用性をさらに立証するために、癌細胞の細胞質基質におけるプロセスが乱された。強力なＤ‐ペプチドが細胞質基質まで送達されて、ｐ５３／ＭＤＭ２の蛋白質‐蛋白質相互作用を妨害し、別の場合には、抗体ミミック融合物によって、Ｂｃｒ‐Ａｂｌ癌蛋白質の機能を乱した。
次の実験は本発明に従って実施された。本発明はそれらの実験によってさらに例示されるが、それらは、決してさらに限定するものとして解釈されるべきではない。
【００８８】
実施例１：非天然のペプチドおよび蛋白質の調製
先ず、直鎖ペプチドが、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ‐ブチルオキシカルボニル）インサイチュ中和固相ペプチド合成によって、非天然のアミノ酸、例えばＤ‐アミノ酸、β‐アラニン、Ｎ‐メチルアラニン、プロパルギルグリシン、およびフッ素化されたフェニルアラニンを用いて調製された（図８）。図８は、ＳＴｖ１〜９を調製するために用いられたペプチドアナログを示す。Ｌ‐およびＤ‐環状ペプチドアナログも調製され、ＳＰＰＳおよび分子内のネイティブ・ケミカル・ライゲーション（ＮＣＬ）によって行われた。それらの非天然の部分は、蛋白質加水分解による分解に対するペプチドの安定性を改善することが示されており、しばしばその生物学的活性を上昇させ、または化学修飾用の新たな部位を提供する。
【００８９】
３つのモデル蛋白質、すなわちアフィボディ、プロテインＧＢ１、およびモノボディが、作業対象に選択された（図９）。図９は、ＳＴｖ１０〜１４を調製するために用いた蛋白質アナログを示す。低分子の３ヘリックスバンドルドメインのアフィボディは、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメイン（Ｚドメイン）に基づいており、多数の標的蛋白質またはペプチドに高親和性で結合するように改変されている２８〜３２。プロテインＧＢ１ドメイン（ＧＢ１）は、十分に定義された二次構造の構成要素を有し、徹底的に解析されている３３。単量体βサンドイッチモノボディは、１０番目のヒトフィブロネクチンのＩＩＩ型ドメイン（１０ＦＮ３）に基づき、抗体を模倣するための改変用の強力な骨格として役立って来た３４〜３８。それらのシステイン不含蛋白質は小さく、全化学合成が可能である。これらの蛋白質は、ＬおよびＤ型として、遺伝子組み換え的（Ｌ‐ＡＢおよび１０ＦＮ３）または化学的に（Ｄ‐ＡＢ、Ｌ‐ＧＢ１、およびＤ‐ＧＢ１）、３セグメント手法を用いて調製された。ここで、Ｄ‐アフィボディは、ＮＣＬ部位由来の２つのシュードホモグルタミンを含んでいた。鏡像蛋白質は、インビボにおけるそれらの低い免疫原性および高い蛋白質加水分解耐性ゆえに、潜在的な治療用途にとって興味深い３９。
【００９０】
実施例２：ＬＦＮ‐ＤＴＡへのペプチド／蛋白質のＳｏｒｔａｇｇｉｎｇ
非天然のペプチドが、ワンポット法によって、ＳｒｔＡ＊を用いてＬＦＮ‐ＤＴＡに取り付けられた（図８）。ＬＦＮ‐ＤＴＡ‐ＬＰＳＴＧＧ（配列番号１６）が、より高い発現収率およびＳＵＭＯの除去後の本来のＮ末端の生成のために、ＳＵＭＯ‐蛋白質融合物として発現された。Ｎ末端のＳＵＭＯタグは、ＳＵＭＯプロテアーゼによって先ず除去された。次に、ＬＦＮ‐ＤＴＡ‐ＬＰＳＴＧＧ（配列番号１６）を、ＳｒｔＡ＊、Ｎｉ‐ＮＴＡアガロースビーズ、およびオリゴグリシンペプチドと一緒に３０分間室温でインキュベーションした。反応混合物の上清の簡単な濃縮によって、本発明者はＳＴｖ生成物を高純度で単離した。これは、高分解能ＬＣＭＳによって解析された（図１）。蛋白質のＬＦＮ‐ＤＴＡへのＳｏｒｔａｇｇｉｎｇは同じ方法に従ったが、ただし、ゲル濾過という追加のステップを行って、余分なオリゴグリシン蛋白質反応物を取り除き、ＳＴｖ１０〜１４をもたらした（図９）。高度に純粋なＬＦＮ‐ＤＴＡ‐蛋白質のコンジュゲートは、高分解能ＬＣ‐ＭＳによっても解析された（図２）。
【００９１】
実施例３：ＳＴｖ１〜１４のトランスロケーション特性の解析
ＳＴｖ１〜１４の細胞質基質中までのトランスロケーション特性の解析は、蛋白質合成阻害をＣＨＯ‐Ｋ１細胞において測定することによって達成された。ＣＨＯ‐Ｋ１細胞は、ＳＴｖによってＰＡ存在下において処理され、次に、３Ｈ‐Ｌｅｕを補充したロイシン不含培地を用いて追跡された。細胞質基質まで送達されるＳＴｖの量は、３Ｈ‐Ｌｅｕ取り込みの減少によって示された。
【００９２】
ＳＴｖ１〜１４の構造は次の配列を有した。
Ｇ５ＡＫＦＲＰＤＳＮＶＲＧ（全てＬ）（ＳＴｖ１、配列番号１７）
Ｇ５ＡＫＦＲＰＤＳＮＶＲＧ（全てＤ）（ＳＴｖ２、配列番号１８）
Ｇ５（β‐Ａｌａ）ＫＦＲＰＤＳＮＶＲＧ（ＳＴｖ３、配列番号１９）
Ｇ５（Ｎ‐Ｍｅ‐Ａｌａ）ＫＦＲＰＤＳＮＶＲＧ（ＳＴｖ４、配列番号２０）
Ｇ５（ｐｒｏｐａｒｌ‐Ｇｌｙ）ＫＦＲＰＤＳＮＶＲＧ（ＳＴｖ５、配列番号２１）
Ｇ５ＡＫ（Ｔｒｉ‐Ｆｌｕｏｒｏ‐Ｆ）ＲＰＤＳＮＶＲＧ（ＳＴｖ６、配列番号２２）
Ｇ５ＡＫ（Ｃｙｓ）ＦＲＰＤＳＮＶＲＧ（全てＬ）（ＳＴｖ７、配列番号２３）
Ｇ５ＡＫ（Ｃｙｓ）ＦＲＰＤＳＮＶＲＧ（ＣＯＳＲ）（全てＬ）（ＳＴｖ８、配列番号２４）
Ｇ５ＡＫ（Ｃｙｓ）ＦＲＰＤＳＮＶＲＧ（ＣＯＳＲ）（全てＤ）（ＳＴｖ９、配列番号２５）
Ｇ５‐アフィボディ（全てＬ）（ＳＴｖ１０、配列番号２６）
Ｇ５‐アフィボディ（全てＤ）（ＳＴｖ１１、配列番号２７）
Ｇ５‐ＧＢ１（全てＬ）（ＳＴｖ１２、配列番号２８）
Ｇ５‐ＧＢ１（全てＤ）（ＳＴｖ１３、配列番号２９）
Ｇ５‐ＦＮ３（ＳＴｖ１４、配列番号３０）
【００９３】
本発明者が含めた非天然の化学実体を有する直鎖ペプチド（ＳＴｖ２〜６）について、ＰＡ６３ポアは、それらの全てをＬＦＮ‐ＤＴＡ対照と同じくらい効率的にトランスロケーションできた（図３Ａ）。しかし、環状ペプチドは、蛋白質合成阻害において、ＬＦＮ‐ＤＴＡ対照と比較して、１０倍超のＥＣ５０を示した（図３Ｂ）。
蛋白質アフィボディおよびＧＢ１については、ＰＡ６３ポアは、両方をＬＦＮ‐ＤＴＡと同じくらい効率的にトランスロケーションした。さらに興味深いことに、それらの鏡像形態も、ＰＡ６３ポアを通して効率的にトランスロケーションされた（図４Ａ）。これは、ひとたびトランスロケーションがＬＦＮによって開始されると、ＰＡ６３ポアは容易にアンフォールディングして、蛋白質をその立体化学にかかわらずトランスロケーションできるということを示唆している。対照的に、ＳＴｖ１４は、蛋白質合成阻害において、ＬＦＮ‐ＤＴＡと比較して、１０倍高いＥＣ５０を示した（図４Ｂ）。これは、１０ＦＮ３の非常に安定な構造によって課されるアンフォールディングの障壁を示唆している。
【００９４】
ＳＴｖの細胞質へのトランスロケーションは、ＳＴｖによって処理されたＣＨＯ‐Ｋ１細胞から調製された細胞溶解液をイムノブロットすることによって、さらに解析された。表面に結合したＳＴｖはトリプシンによって消化されて洗除され、細胞内のＳＴｖのみを検出されるべく残した。イムノブロットの結果は、ＳＴｖの細胞質内へのトランスロケーションを確認し、さらに、細胞にトランスロケーションされた蛋白質の異なるレベルを、取り付けられたペプチドまたは蛋白質に応じて示した（図５）。ＳＴｖ１４は、他のバリアントと比較して、大分低い量のトランスロケーションを示した。細胞内にトランスロケーションしたＳＴｖ８およびＳＴｖ９の量は、恐らく検出限界以下であり、検出されなかった（データは示さない）。
【００９５】
実施例４：修飾を含む積み荷のトランスロケーションの研究
モデル研究が行われ、非天然の修飾、例えばＤ‐アミノ酸、β‐アラニン、Ｎ‐メチルアラニン、プロパルギルグリシン、フッ素化されたフェニルアラニン、および環状アナログを含む積み荷のトランスロケーションを研究した。Ｓｏｒｔａｇｇｉｎｇされたバリアント１（ＳＴｖ１）はモデル化合物としての役を果たし、ＬＦＮ‐ＤＴＡのＣ末端に取り付けられるペプチドは変更した。ＤＴＡ（ジフテリア毒素Ａ鎖）は、ＥＦ‐２のＡＤＰリボース化を触媒して蛋白質合成を阻害するので、細胞質基質性のレポーターとしての役を果たした。Ｎｉ‐ＮＴＡ存在下における３０分のＳｏｒｔａｇｇｉｎｇ反応は、大した精製を必要とせず、単離された生成物の収率＞５０％をもたらした。送達を研究するために、各ＳＴｖが、１０ｎＭのＰＡ存在下において３０分間、ＣＨＯ‐Ｋ１細胞に添加された。細胞は、次に、３Ｈ‐Ｌｅｕを補充した培地によって処理された。蛋白質合成から判断して、本発明者は、ＳＴｖが細胞質基質まで送達されたかどうかを確認し、その効率を未修飾ＬＦＮ‐ＤＴＡおよびＳＴｖ１のそれと比較する。全ての直鎖バリアントは、正の対照であるＬＦＮ‐ＤＴＡおよびＳＴｖ１と同じくらい良好にトランスロケーションし、非天然の機能性が、基盤に対する大きな妨害無しにＣ末端に付加され得ることを示唆した。環状は恐らく、ＰＡの約１２Åの内孔直径により、ＰＡの約ＸÅの内孔直径による。
【００９６】
実施例５：抗体ミミック（アフィボディ）、プロテインＧＢ１、およびモノボディの送達
次に、抗体ミミック（アフィボディ）、プロテインＧＢ１、およびモノボディの送達が研究された。全ての３つのバリアントは、蛋白質工学およびバイオテクノロジーにおいて広く用いられており、高度に特異的で、強力で、システイン不含の抗体ミミックを生ずる。高度に純粋なＳＴｖが得られ、ＣＨＯ‐Ｋ１細胞内へのそれらの送達が、蛋白質合成阻害試験を用いて測定された。ＳＴｖ１０およびＳＴｖ１２は、正の対照のＬＦＮ‐ＤＴＡに匹敵するレベルで細胞に進入した。しかしながらＳＴｖ１４は１０倍非効率的であった。ＳＴｖ１４における１０ＦＮ３の高い熱安定性（アンフォールディング温度８８℃）がトランスロケーション効率に影響したのかどうかを研究するために、低下した熱安定性を有するＳＴｖ１４変異体が試験された。結果は、これがトランスロケーションをＬＦＮ‐ＤＴＡのレベルまで回復させたことを示し、１０ＦＮ３の高い熱安定性がトランスロケーションの効率に影響したことを示唆した。
【００９７】
実施例６：鏡像バリアントはＰＡを通してトランスロケーションする
鏡像バリアントの輸送を研究するために、アフィボディおよびプロテインＧＢ１の鏡像体が化学合成され、ＬＦＮ‐ＤＴＡへＳｏｒｔａｇｇｉｎｇされた。鏡像バリアントがＰＡを通してトランスロケーションしたことが見いだされ、積み荷の立体化学がトランスロケーションを変えないということを示唆した。Ｄ‐蛋白質が細胞質基質中において健全なままであることを確認するために、ＬＦＮ‐Ｄ‐アフィボディ‐アルキンおよびＬＦＮ‐Ｄ‐アフィボディ‐ビオチンが調製され、それらのトランスロケーション特性が研究された。アルキンおよびビオチン基は、Ｄ‐アフィボディのＣ末端に取り付けられた。ＣＨＯ‐Ｋ１細胞が、各バリアントによって、ＰＡまたはトランスロケーション変異体ＰＡ［Ｆ４２７Ｈ］存在下において処理された。ＰＡ［Ｆ４２７Ｈ］は負の対照である。なぜなら、ＰＡによる複合体の形成および内在化は依然として起こるが、積み荷のエンドソーム脱出は阻止されるからである。これは、細胞質基質の物質とエンドソームおよびリソソームの区画にある物質との識別を可能にする。抗ＬＦ抗体によるウェスタンブロットは、ＬＦＮ‐Ｄ‐アフィボディ‐アルキンおよびＬＦＮ‐Ｄ‐アフィボディ‐ビオチンが細胞質基質まで送達されたことを示唆し、物質の少量がＰＡ［Ｆ４２７Ｈ］条件においては観察された。トランスロケーションは、ＬＦＮ‐Ｄ‐アフィボディ‐ビオチンについて、ＩＲ６８０色素にコンジュゲーションされたストレプトアビジンによってブロットすることによって、さらに確認された。アルキンがトランスロケーション後にもまだ存在していることを確認するために、溶解物が回収され、Ｃｕ（Ｉ）によって触媒されるアジ化物‐アルキニルのクリック反応が用いられて、Ｄ‐アフィボディ‐アルキンをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４（インビトロジェン（商標）から市販されている）によって標識した。ゲル内蛍光によって、フルオロフォア陽性のバンドが正しい分子量のところに観察された。これらの結果は、鏡像蛋白質が細胞の細胞質基質まで送達され、積み荷に取り付けられたアルキンまたはビオチン基が検出に用いられ得ることを示唆している。
【００９８】
実施例７：細胞質基質まで送達される積み荷の量の測定
細胞質基質まで送達された積み荷の量を測定するために、ウエスタンブロットの抗ＬＦのバンドの強度が定量された。この試験においては、ＣＨＯ‐Ｋ１細胞が、各バリアントおよびＰＡによって２４時間処理された。表面に結合したＳＴｖはトリプシンによって消化されて洗除され、細胞内画分のみを残した。負の対照はＰＡ［Ｆ４２７Ｈ］であり、検出された物質の大部分が実際に細胞質基質画分であることを確認するために用いられた。図１２Ｄの結果は、ＳＴｖの細胞質内へのトランスロケーションを確認し、蛋白質合成阻害試験から得られた送達データと相関する積み荷物質の様々な量を示した。この研究に基づくと、送達された量は平均で１ｆｇ／細胞であった。これは、１２０００分子／細胞およびＣＨＯ‐Ｋ１細胞内３０ｎＭ（１個のＣＨＯ‐Ｋ１細胞が約０．５ｐＬ）に相当する。
【００９９】
実施例８：癌細胞の細胞質基質における、ＭＤＭ２に結合する送達されたＤ‐ペプチドによる、ｐ５３／ＭＤＭ２の蛋白質‐蛋白質相互作用の妨害
インヒビターＤ‐ペプチド（ＤＰＭＩ）は、蛋白質加水分解に対して耐性であり、ＭＤＭ２に対して０．４５ｎＭのＫｄを有する。ＤＰＭＩが、ＬＦＮおよびＬＦＮ‐ＤＴＡへとＳｏｒｔａｇｇｉｎｇされた。蛋白質合成阻害は、ＬＦＮ‐ＤＴＡコンジュゲートが、ＣＨＯ‐Ｋ１およびｐ５３含有ヒト膠芽腫Ｕ８７細胞（ＳＩ）において、ＰＡを通してトランスロケーションしたことを示唆した。ウエスタンブロットによれば、Ｕ８７細胞に送達された積み荷の量は３５０ｎＭ／細胞であった。これは、４５００００分子に相当する。ストレプトアビジン／ビオチンによるプルダウンが用いられて、細胞の細胞期質中における送達されたＬＦＮ‐ＤＰＭＩのＭＤＭ‐２への結合を、ビオチン積み荷のバリアントの使用によって確認した。ＬＦＮ‐ＤＰＭＩ‐ビオチンはストレプトアビジンアガロースビーズによって細胞溶解物から捕捉され、溶出物は抗ＬＦおよび抗ＭＤＭ２抗体によってイムノブロットされた。図１３Ｂに示されるように、ＭＤＭ‐２は、送達されたＬＦＮ‐ＤＰＭＩ‐ビオチンによってプルダウンされた。一方、ＭＤＭ２は、ＰＡ［Ｆ４２７Ｈ］条件を含む様々な対照実験においては検出されなかった。
【０１００】
実施例９：ＬＦＮ‐ＤＰＭＩがＵ８７細胞においてｐ５３／ＭＤＭ２相互作用に及ぼす、阻害的な効果の研究
ｐ５３／ＭＤＭ２相互作用の妨害は、ｐ５３蛋白質の安定化および蓄積、ならびにｐ５３によって制御される蛋白質、例えばＭＤＭ２およびｐ２１の活性化および発現をもたらす。ｐ５３、ＭＤＭ２、およびｐ２１の蛋白質レベルが、ＬＦＮ‐ＤＰＭＩの送達後のＵ８７細胞において、各抗体を用いるイムノブロットによって分析された。次の一次および二次抗体が、この分析に用いられた。ヤギ抗ＬＦ（ＳａｎｔａＣｒｕｚのｂＤ‐１７）、ウサギ抗ＭＤＭ２（ＳａｎｔａＣｒｕｚのＮ‐２０）、ウサギ抗ｐ２１（ＳａｎｔａＣｒｕｚのＣ‐２１）、マウス抗ｐ５３（ＳａｎｔａＣｒｕｚのＤＯ‐１）、ヤギ抗マウスＩＲｄｙｅ６８０ＲＤ（Ｌｉｃｏｒ）、ヤギ抗ウサギＩＲｄｙｅ８００ＣＷ（Ｌｉｃｏｒ）、およびロバ抗ヤギＩＲｄｙｅ６８０ＬＴ（Ｌｉｃｏｒ）。ＰＡ［Ｆ４２７Ｈ］対照と比較して、ｐ５３、ＭＤＭ２、およびｐ２１の増大したレベルが観察され、送達されたＬＦＮ‐ＤＰＭＩがｐ５３経路を乱したことを示唆した。まとめると、これらの結果は、鏡像ペプチドが癌細胞の細胞質基質まで送達されて、重要な蛋白質‐蛋白質相互作用を妨害するために用いられ得るということを示唆している。
【０１０１】
実施例１０：細胞のプロセスを乱すための抗体ミミックの送達
癌蛋白質Ｂｃｒ‐ＡｂｌのＳｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメインにナノモルの親和性で結合するタンデムな１０ＦＮ３モノボディが、抗体ミミックが送達されて細胞のプロセスを乱し得るかどうかを確認するために、研究された。モノボディＨＡ４および７ｃ１２は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）Ｋ５６２細胞において過剰発現されたときに、キナーゼ活性をやや阻害し、アポトーシスを誘導することが報告された。ＬＦＮ‐ＨＡ４‐７ｃ１２およびＬＦＮ‐ＤＴＡバリアントが調製され、Ｋ５６２細胞の細胞質基質中へのそれらの進入が研究された。蛋白質合成阻害試験は、ＰＡがタンデムモノボディを効率的にＫ５６２細胞内にトランスロケーションしたことを示した。ウエスタンブロット分析は、約１．２ｆｇすなわち１４０００分子のＬＦＮ‐ＨＡ４‐７ｃ１２が細胞質基質に到達し、約１０ｎＭの濃度をもたらしたことを示した。これは、ＡｂｌのＳＨ２ドメインに対するＬＦＮ‐ＨＡ４‐７ｃ１２の測定されたＫｄ（１２ｎＭ）とも矛盾しない。本発明者は、ＳＨ２に対するＨＡ４‐７ｃ１２の結合変異体（元の配列中において、ＨＡ４：Ｙ８７Ａ、７ｃ１２：Ｙ６２Ｅ／Ｆ８７Ｋ）も研究し、ＬＦＮ‐ｍＨＡ４‐７ｃ１２が野生型のレベルでトランスロケーションしたことを見いだした。
【０１０２】
実施例１１：融合モノボディは細胞内にトランスロケーションして、細胞質基質におけるプロセスを制御できる
送達されたＬＦＮ‐ＨＡ４‐７ｃ１２がその標的に細胞質基質中において結合したかどうかを研究するために、Ｋ５６２細胞溶解物が抗Ａｂｌ抗体による免疫沈降にかけられた。抗ＬＦ抗体による溶解物のイムノブロット分析は、結合物に相当する蛋白質バンドを、ＬＦＮ‐ＨＡ４‐７ｃ１２およびＰＡによって処理された細胞について示した。一方、そのバンドは、ＰＡ［Ｆ４２７Ｈ］またはＬＦＮ‐ｍＨＡ４‐７ｃ１２が用いられたときには無かった。この結果は、モノボディ融合物が、Ｂｃｒ‐Ａｂｌに細胞の細胞質基質において結合したことを示唆している。結合がアポトーシス性の細胞死をもたらすかどうかを試験するために、Ｋ５６２細胞は、ＬＦＮ‐ＨＡ４‐７ｃ１２によってＰＡ存在下において処理された。４日後には、大量のアポトーシスが観察された。これは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）によって測定された。細胞は、構成要素の何れによっても単独では影響されなかった。ＬＦＮ‐ｍＨＡ４‐７ｃ１２は、単独で細胞に添加されたときに毒性であったことが見いだされ、従ってＰＡ［Ｆ４２７Ｈ］およびＬＦＮ‐ＭＰ１が負の対照としての役を果たした。このデータは、融合モノボディが細胞内にトランスロケーションして、細胞質基質におけるプロセスを制御できることを示唆している。
【０１０３】
実施例１２：融合モルフォリノは細胞内にトランスロケーションされて、細胞質基質におけるプロセスを制御し得る
融合モルフォリノは、次の合成スキームに基づいて作製された。
【化１】
2015519344.tif 000003
【０１０４】
モルフォリノオリゴヌクレオチドは、３'ジスルフィド標識とともにＧｅｎｅｔｏｏｌｓ社から購入された。ジスルフィドは還元され、次にモルフォリノは、Ｎ末端Ｇｎ（ｎ＝３〜５）を有するブロモペプチドに、ワンポット反応によって直接的にライゲーションされる。Ｇｎ‐モルフォリノは、ＬＦＮ‐ＬＰＳＴＧＧ（配列番号３１）またはＬＦＮ‐ＤＴＡ‐ＬＰＳＴＧＧ（配列番号３２）へ、実施例２と同様の条件によってＳｏｒｔａｇｇｉｎｇされる。生成物は２０％の収率で単離される。
合成された分子は、ＬＣ‐ＭＳを用いて分析された。融合モルフォリノは、ＣＨＯ‐Ｋ１細胞と一緒に９０分間または４時間インキュベーションされた。トランスロケーションは３Ｈ‐Ｌｅｕの取り込みを用いて測定された。これらの試験の結果は図１４Ａおよび１４Ｂに示されている。ＬＦＮ‐ＤＴＡ‐モルフォリノコンジュゲートは、ＬＦＮ‐ＤＴＡよりも約１００倍非効率的にトランスロケーションする。
【０１０５】
実施例１３：本発明の複数の融合蛋白質の合成
【化２】
2015519344.tif 000004
【０１０６】
モデルペプチド‐低分子構築物のオンレジン合成：モデル研究に用いられた、親ペプチドであるＧｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｅｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ‐Ａｌａ‐Ａｒｇ‐Ｌｅｕ（配列番号３３）は、速い流速のカップリング／脱保護条件下において、インサイチュ中和Ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニルクロライド）プロトコールを用いて、ＭＢＨＡレジン上で合成された。リシン側鎖のアロック保護基は、保護されたレジンのテトラキストリフェニル‐ホスフィンパラジウム［０］［Ｐｄ（ＰＰｈ３）４］による処理によって、フェニルシラン［ＰｈＳｉＨ３］存在下において除去された。側鎖のリシンの自由なアミノ基は、次に、各カルボン酸（酢酸、安息香酸、ナフトリック（naphtholic）酸、アントラセン‐９‐カルボン酸、および５‐アセナフテンカルボン酸）にカップリングされた。ペプチドの精製は、ＲＰ‐ＨＰＬＣ用Ｃ１８結合シリカカラムを用いて達成された。解析は、高分解能ＬＣ‐ＭＳを用いて行われた。
【０１０７】
【化３】
2015519344.tif 000005
【０１０８】
モデルペプチド‐低分子のＬＦＮ‐ＤＴＡへの酵素的ライゲーション：モデルペプチド‐低分子（図１３Ａ）が、実施例２において前述されたようにＬＦＮ‐ＤＴＡにコンジュゲーションされた。簡潔には、ペプチド‐低分子サンプル［５００μΜ］、ＬＦＮ‐ＤＴＡ‐ＬＰＳＴＧＧ‐Ｈｉｓ（配列番号３４）［５０μΜ］、およびＳｒｔＡ＊［５μΜ］は、ソルターゼ緩衝液［ｐＨ＝７．２５］中において、ニッケルビーズ上において、３０分間室温で混合された。３０Ｋフィルターを用いるビーズの除去および上清の濃縮は、純粋な構築物をもたらした。これはＬＣ‐ＭＳグラフによって示された（図Ｄ）。
【０１０９】
【化４】
2015519344.tif 000006
【０１１０】
精製された構築物は、ＬＣ‐ＭＳによって分析された。
【化５】
2015519344.tif 000007
【０１１１】
モデルＬＦＮ‐低分子はＰＡポアを通してトランスロケーションする：
【化６】
2015519344.tif 000008
【０１１２】
本研究の結果が図１５に示されている。モデルペプチド‐低分子構築物は、ポアを通して首尾よくトランスロケーションした。
【０１１３】
実施例１４：化学療法用薬物を含む融合分子
化学療法用薬物を含む融合分子が実施された。化学療法用薬物が細胞質基質まで送達され、機能上活性であったことが証明された。
【０１１４】
ＬＦＮ‐ＤＴＡ‐ドキソルビシンの化学酵素的合成：
図Ａ：マレイミドプロピオン酸のＮ‐スクシンイミジルエステルが、マレイミドプロピオン酸とＮ‐ヒドロキシスクシンイミドとを、Ｎ‐Ｎ'‐ジシクロヘキシカルボイイミド（ＤＣＣ）存在下、無水ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）中において０℃、アルゴン雰囲気下で反応させることによって得られた。次に、室温まで８時間かけて徐々に温めた。反応混合物のＴＬＣ（５：１、ＣＨ２Ｃｌ２／メタノール）およびＬＣ‐ＭＳ分析は、出発原料の消費および所望の生成物の形成を確認した。
【０１１５】
ドキソルビシン（ＤＯＸ）塩酸塩およびマレイミドプロピオン酸のＮ‐スクシンイミジルエステルが、ＤＭＦ中に取られ、１時間、Ν，Ν‐ジイソプロピルエチルアミンＤＩＥＡの存在下において反応させられた。このとき、ＴＬＣ分析（５：１のＣＨ２Ｃｌ２／メタノール）は、反応の完了と主生成物の形成とを示唆した。反応混合物は、ＤＣＭによる希釈によってクエンチされ、次に連続的な水系抽出を行い、ＤＭＦと未反応のドキソルビシンとを除去した。まとめられた有機相は、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）によって乾燥され、無機塩が濾過除去され、乾燥状態まで減圧濃縮された。粗生成物が、シリカフラッシュクロマトグラフィー（５：１のＣＨ２Ｃｌ２／メタノール）によって精製され、チオール反応性のＤＯＸ誘導体であるマレイミド‐ＤＯＸを８２％の収率でもたらした。生成物の同一性は、１Ｈ‐ＮＭＲおよび高分解能ＬＣ‐ＭＳによって確認された。
【０１１６】
【化７】
2015519344.tif 000009
【０１１７】
ＬＦＮ‐ＤＴＡ‐ドキソルビシンの化学酵素的合成
Ｃ末端システインを含有する担体ペプチドであるＧｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｅｕ‐Ａｒｇ‐Ａｒｇ‐Ｌｅｕ‐Ａｒｇ‐Ａｌａ‐Ｃｙｓ（配列番号３５）が、上記のように合成された。システインアミノ酸の硫黄は、ペプチドおよびマレイミド‐ＤＯＸをＤＭＦ中において５時間３６℃で撹拌することによって、修飾されたＤＯＸ上のマレイミド部分と選択的に反応させられた。次に１０時間室温においた。反応混合物はＲＰ‐ＨＰＬＣによって精製され、ペプチド‐ＤＯＸコンジュゲートを８８％の収率でもたらした。
【０１１８】
【化８】
2015519344.tif 000010
ＬＦＮ‐ＤＴＡ‐ドキソルビシンの化学酵素的合成：ペプチド‐ＤＯＸのＬＦＮ‐ＤＴＡへの酵素的ライゲーション：実施例１３、図Ｃに記載の通り。
【０１１９】
実施例１４の説明
ＬＦＮ‐ＤＴＡ‐ドセタキセルの化学酵素的合成
【化９】
2015519344.tif 000011
【０１２０】
ＬＦＮ‐ＤＴＡ‐ドセタキセルの化学酵素的合成
ドセタキセル（ＤＯＣ）およびマレイミドプロピオン酸が無水ＤＣＭ中に取られ、その後、向山試薬および過剰なトリエチルアミンの添加を０℃において行った。反応混合物は、室温までゆっくりと温められ、１６時間撹拌された。そのとき、ＴＬＣ分析（２０：１のＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ）は、出発原料の消費および主生成物の形成を示唆した。反応は、エタノールの添加およびさらなる１０分間の撹拌によってクエンチされた。続いて、乾燥状態まで濃縮した。粗生成物はシリカフラッシュクロマトグラフィーにかけられ、マレイミド‐ＤＯＣを７５％の収率でもたらした。生成物の同一性は１Ｈ‐ＮＭＲおよび高分解能ＬＣ‐ＭＳによって確認された。
【化１０】
2015519344.tif 000012
【０１２１】
ＬＦＮ‐ＤＴＡ‐ドセタキセルの化学酵素的合成
Ｃ末端システインを含む担体ペプチド、Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｅｕ‐Ａｒｇ‐Ａｒｇ‐Ｌｅｕ‐Ａｒｇ‐Ａｌａ‐Ｃｙｓ（配列番号３５）が、上記のように合成された。システインアミノ酸の硫黄は、ペプチドおよびマレイミド‐ＤＯＸをＤＭＦ中において５時間３６℃で撹拌することによって、修飾されたＤＯＣ上のマレイミド部分と選択的に反応させられた。続いて１０時間室温においた。反応混合物は、ＲＰ‐ＨＰＬＣによって精製され、ペプチド‐ＤＯＸコンジュゲートを９３％の収率でもたらした。
【化１１】
2015519344.tif 000013
【０１２２】
ＬＦＮ‐ＤＴＡ‐ドセタキセルの化学酵素的合成
ペプチド‐ＤＯＣのＬＦＮ‐ＤＴＡへの酵素的ライゲーション：実施例１３、図Ｃにおいて上記の通り。
【化１２】
2015519344.tif 000014
【０１２３】
ＬＦＮ‐ＤＴＡ‐ドキソルビシンおよびＬＦＮ‐ＤＴＡ‐ドセタキセルは、ＰＡポアを通してトランスロケーションされた（ＣＨＯ細胞による）。
【化１３】
2015519344.tif 000015
【０１２４】
ＣＨＯ‐Ｋ１
ＬＦＮ‐デオキシルビシン（Deoxyrubicn）およびＬＦＮ‐ドセタキセルは両方とも、ＰＡポアを通してトランスロケーションできた。興味深いことに、構造的に平らなドキソルビシンは、剛直なコアを含んでいるドセタキセルと比較して、相対的に良好にトランスロケーションした（ウエスタンブロットによっても確認された）。これは、細胞質基質内にＰＡポアを用いて送達され得る分子構造の範囲および限界に関連して、重要な発見であった。さらに、本発明者の知る限りこれは、糖部分を含有する蛋白質がＰＡポアを通してトランスロケーションすることが示された、最初であった。本研究の結果は図１６に示されている。
ＬＦＮ‐ＤＴＡ‐ドキソルビシンおよびＬＦＮ‐ＤＴＡ‐ドセタキセルの、ＢＴ４７４細胞までの、ＰＡ‐Ｈｅｒ２ポアを通しての標的化された送達が証明された。
【０１２５】
ＢＴ４７４
本発明者は、ＰＡの受容体結合ドメインを修飾してＨＥＲ２受容体を標的化することによって、細胞毒性薬物であるＤＯＸおよびＤＯＣを、ＨＥＲ２を発現するＢＴ４７４乳癌細胞まで送達できることを証明した。結果は図１７に示されている。
【化１４】
2015519344.tif 000016
【０１２６】
ＬＦＮ‐ドキソルビシンおよびＬＦＮ‐ドセタキセルが、細胞毒性研究のために、上記のように調製され、次の構造を有した。
【化１５】
2015519344.tif 000017
【０１２７】
ＣＨＯ‐Ｋ１を用いる細胞生存性試験
ＣＨＯ‐Ｋ１細胞が、９６穴プレートに２，０００の密度でまかれた。細胞は、２０ｎＭのＰＡ存在下のＬＦＮ‐ＤＯＣまたはＬＦＮ‐ＤＯＣのみによって、濃度範囲３．９〜５００ｎＭで４時間処理された。４時間後に培地が除去された。細胞はＰＢＳによって洗浄され、新鮮な培地と一緒にさらなる４４時間インキュベーションされた。４４時間後に、細胞はＭＴＳ試薬と一緒に一定時間インキュベーションされ、生存可能な細胞は、４９０ｎｍの吸光度を測定することによって定量された。結果は、ＬＦＮ‐ＤＯＣ、ＰＡと一緒のインキュベーションによる細胞の生存性の低下を示し、細胞質基質までのＤＯＣの送達が細胞増殖を阻害することを示唆した。結果は図１８に示されている。
【０１２８】
ＬＦＮ‐ドセタキセルコンジュゲートのためのさらに安定なリンカーが、次の通り調製された。
【化１６】
2015519344.tif 000018
【０１２９】
ＬＦＮ‐ドセタキセルコンジュゲートのための別の安定なリンカーは、次である。
【化１７】
2015519344.tif 000019
【０１３０】
次のＰＡ‐低分子構築物は、本明細書に記載のペプチド‐ドキソルビシンおよびペプチド‐ドセタキセルの合成の方法を用いて調製され得る。
【０１３１】
ＰＡ‐薬物コンジュゲートの調製：
ＬＰＳＴＧＧ（配列番号１５）タグは、ＰＡのＣ末端に導入されて、遺伝子組み換え的に発現される。Ｎ末端のオリゴグリシンを有する、ペプチド‐ＤＯＸおよびペプチド‐ＤＯＣまたは対象の任意のペプチド‐低分子が、次に、ＳｒｔＡ＊によって媒介されるライゲーションによって、精製されたＰＡ‐ＬＰＳＴＧＧ（配列番号１５）にコンジュゲーションされ、ＰＡ‐薬物およびＰＡ‐低分子生成物を得る。
【化１８】
2015519344.tif 000020
【０１３２】
次の実施例１５〜１８のそれぞれは、同時係属中の特許出願にも含まれている。それは、本願と同時に出願され、米国仮出願第６１／６４９，４２１号および第６１／６４９，８６６号（何れも２０１２年５月２１日に出願された）の優先権の主張を同じくし、参照によって援用される。データは、同時係属中の特許出願において提供されている。
【０１３３】
実施例１５：流通式のＳｏｒｔａｇｇｉｎｇは低い求核剤濃度で実施され得る
流通式のＳｏｒｔａｇｇｉｎｇの見込みを低い求核剤の濃度において証明するために、蛋白質基質のｅＧＦＰ‐ＬＰＳＴＧＧ‐Ｈｉｓ６（配列番号３６）、グリシン求核剤のＧＧＧＧ‐ＬＲＬ‐ＣＯＮＨ２（配列番号３７）、およびＳｒｔＡ＊‐Ｈｉｓ６（配列番号３８）を利用する、モデルの流通式の基盤が設計された。ここでＳｒｔＡ＊は最適化されたバリアントであり、野生型のＳｒｔＡに比べて改善された反応速度を見せる。次に、マイクロリアクターが、０．０２０’’ＨＰ‐ＰＦＡチューブの小片、ステンレス鋼フィルターフリット、プレカラムフィルタ、およびフィンガータイトフィッティングから構築された。マイクロリアクターの出口チューブは吸引マニホールドに繋がれ、ＳｒｔＡ＊酵素（ソルターゼ緩衝液中）と一緒にプレインキュベーションされたＮｉ‐ＮＴＡアガロースビーズのスラリーが、マイクロリアクターの本体に吸入された。２００μｇのｅＧＦＰ‐ＬＰＳＴＧＧ‐Ｈｉｓ６（配列番号３６）と２０μΜのＧ５ＬＲＬとの混合物を８００μｌのソルターゼ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ８．２）中に含むシリンジが、ＳｒｔＡ＊マイクロリアクターを通して（以降では装填分（load fraction）と呼ばれる）、６５μｌ／分でシリンジポンプを介して流通された。次に、１ｍＬの２０μΜのＧ５ＬＲＬをソルターゼ緩衝液中に含むシリンジ（以降では追加分（push fraction）と呼ばれる）が、同様に、マイクロリアクターを通して流通されて、高純度の物質を良好な収率でもたらした。ＳｒｔＡ＊上のＨｉｓ６アフィニティタグおよびｅＧＦＰ‐ＬＰＳＴＧＧ‐Ｈｉｓ６（配列番号３６）は、両方の蛋白質がレジンに結合したままであることを保証した。有効なペプチド転移のときにのみ、ｅＧＦＰ‐ＬＰＳＴ‐Ｇ５ＬＲＬライゲーション生成物がマイクロリアクターから放出される。
【０１３４】
設計された流通式のリアクターを従来の回分式化学反応と比較するために、Ｓｏｒｔａｇｇｉｎｇ反応が、ｅＧＦＰ構築物およびモデルペプチドを用いて行われた（５０μΜのｅＧＦＰ‐ＬＰＳＴＧＧ‐Ｈｉｓ６、２０μΜのＧ５ＬＲＬ、３．５μΜのＳｒｔＡ＊、ソルターゼ緩衝液、２０分）。所望のライゲーション生成物（ｅＧＦＰ‐ＬＰＳＴ‐Ｇ５ＬＲＬ）（配列番号３９）が回分式アフィニティ精製によって単離できたかどうかを評価するために、Ｎｉ‐ＮＴＡスラリー（新たに、緩衝液をソルターゼ緩衝液と交換した）と一緒に、１０分間、波動形揺動振とう器（nutating mixer）上においてインキュベーションされた。ＬＣＭＳ分析は、回分式Ｓｏｒｔａｇｇｉｎｇ反応が最小限の所望の生成物を提供したということを明らかにした。Ｎｉ‐ＮＴＡ処理は、未反応の出発原料を首尾よく除去したが、かなりの二量体形成が観察された。
【０１３５】
流通式のＳｏｒｔａｇｇｉｎｇ反応が２０μＭの求核剤バッチ中において成功した後に、ライゲーション効率が、一連のＧ５ＬＲＬ（配列番号４０）濃度（２．５〜４０μΜ）を調べることによって研究された。連続流通下のＳＭＬは、一貫して、所望のライゲーション構築物（ｅＧＦＰ‐ＬＰＳＴＧ５ＬＲＬ）（配列番号３９）を、不純物無く、比較の回分式反応よりも高い収率でもたらした。従来のＳｏｒｔａｇｇｉｎｇ反応は３００〜５００μΜ求核剤の系において機能するが、高効率のライゲーションが、１０〜２０μΜの範囲の求核剤濃度において、連続流通によるソルターゼによって媒介されるライゲーションについて観察された。
【０１３６】
実施例１６：異なる蛋白質基質との確実なバイオコンジュゲーション
ｅＧＦＰの流通式実験は、確実なＳｏｒｔａｇｇｉｎｇを、低いマイクロモルの求核剤濃度においてさえも証明した。それらの観察結果が蛋白質特異的でないことを確認するために、別のＳｏｒｔａｇｇｉｎｇ基質、すなわち炭疽菌毒素の致死因子のＮ末端ドメイン（ＬＦＮ）が研究された。構築物のＬＦＮ‐ＬＰＳＴＧＧ‐Ｈｉｓ６（配列番号４１）が発現され、アフィニティクロマトグラフィーによって精製され、ＬＦＮ‐ＬＰＳＴＧＧ‐Ｈｉｓ６（配列番号４１）とＧ５ＬＲＬ（配列番号４０）との間の流通式ライゲーション（２０μΜ）を探るために用いられた。モデルｅＧＦＰ研究において用いられたものと同一の流通のプロトコールが用いられたが、ＬＦＮ‐ＬＰＳＴＧＧ‐Ｈｉｓ６がｅＧＦＰ‐ＬＰＳＴＧＧ‐Ｈｉｓ６（配列番号３６）の代わりに蛋白質基質としての役を果たした。高効率で高純度のライゲーションが観察された。これは、リアクターのフロースルー中に副生成物または出発原料混入の存在しないことによって証明された。必要な求核剤の濃度の下限は、Ｇ５ＬＲＬ（配列番号４０）濃度（２．５〜４０μΜ）をスクリーニングすることによって探索された。流通式反応は、ＬＦＮ‐ＬＰＳＴＧＧ‐Ｈｉｓ６（配列番号４１）とＧ５ＬＲＬ（配列番号４０）との間の回分式反応に対して比較された（５０μΜのＬＦＮ‐ＬＰＳＴＧＧ‐Ｈｉｓ６（配列番号４１）、２０μΜのＧ５ＬＲＬ（配列番号４０）、３．５μΜのＳｒｔＡ＊‐Ｈｉｓ、ソルターゼ緩衝液、２０分）。比較すると、回分式のＳｏｒｔａｇｇｉｎｇは、最小限の生成物形成とかなりの量のＬＦＮ‐ＬＰＳＴＧＧ‐Ｈｉｓ６（配列番号４１）の加水分解および環化とを示した。回分式反応のＮｉ‐ＮＴＡ後処理は、未反応のＬＦＮ‐ＬＰＳＴＧＧ‐Ｈｉｓ６（配列番号４１）の完全な除去を示したが、加水分解および環化の副生成物は除去されなかった。これは、Ｔ‐Ｇ結合の切断によって、それらがもはやＨｉｓ６アフィニティタグを含まないからである。
【０１３７】
実施例１７：種々のグリシン求核剤についての基盤の効率
本基盤がグリシン求核剤の濃度の作業範囲を広げたことを証明し、確実なバイオコンジュゲーションを種々の蛋白質基質について証明したので、この基盤の効率が種々のグリシン求核剤について評価された。２種類のグリシン求核剤、すなわち１）蛋白質求核剤および２）貧弱な溶解性の求核剤は、Ｓｏｒｔａｇｇｉｎｇを、ある状況においては困難にしてきた。蛋白質基質ＬＦＮ‐ＬＰＳＴＧＧ‐Ｈｉｓ６（配列番号４１）が、蛋白質求核剤のＧ５‐アフィボディ（ＭＷ６９２５．６）と一緒に、流通式のＳｏｒｔａｇｇｉｎｇにかけられて、所望のコンジュゲートＬＦＮ‐ＬＰＳＴＧ５‐アフィボディ（配列番号４２）を高純度で且つ良好な収率でもたらした。同様に、蛋白質求核剤であるＧ５‐フィブロネクチン３（配列番号４３）（ＭＷ１１０２２．２）が用いられて、所望の構築物ＬＦＮ‐ＬＰＳＴＧ５‐フィブロネクチン３（配列番号４４）を高純度で良好な収率でもたらした。最後に、ペプチド求核剤であるＧ５‐２Ｄｐｉｃｏ（配列番号４５）（比較的不溶なフッ素含有ペプチド）が首尾よくコンジュゲーションされて、所望のＬＦＮ‐ＬＰＳＴＧ５‐２Ｄｐｉｃｏ（配列番号４６）を形成した。
【０１３８】
実施例１８：蛋白質ループへの合成ペプチドの挿入
本方法は、二重ライゲーションと同時の蛋白質断片の相補とを用いて、蛋白質ループ中へ合成ペプチドを挿入する。これは、多くの蛋白質の断片の相補性に基づく。蛋白質は、通常は柔軟なループ部位において分割され、相補し再集合して安定で機能的な蛋白質になり得る２つの断片にされる。本発明者は、ＬＰＳＴＧＧ（配列番号１５）タグおよびシステインをそれぞれＮ末端断片（Ｎ）およびＣ末端断片（Ｃ）に組み込む。本発明者はＳｒｔＡを用いて、合成ペプチドチオエステルをＮ断片に取り付ける（Ｓｏｒｔａｇｇｉｎｇ）。これは、次に、Ｎ末端のシステインを有するＣ断片と、相補性によって支援されるＮＣＬ下において反応できる。ループ部位は伸長において寛容であるので、最終生成物は、自然なフォールディングを、ループへの合成ペプチドの同時の挿入とともにもたらすことになる。
【０１３９】
１０番目のヒトフィブロネクチンのＩＩＩ型ドメイン（１０ＦＮ３）を用いる研究が、モデル研究として行われた。１０ＦＮ３は、３つの異なるループであるＦＧループ、ＣＤループ、およびＢＣループにおいて２つの断片に分割された。生じた断片Ａ‐Ｆ、ＡＢＣ、Ｄ‐Ｇ、ＡＢ、およびＣ‐Ｇは、ＳＵＭＯ融合物として発現された。一方、断片Ｇは固相ペプチド合成によって合成された。ＦＧループにおいて分割された１０ＦＮ３の場合には、ＳＵＭＯは、ＳＵＭＯプロテアーゼによって取り除かれる最初のものであり、Ａ‐Ｆ＿ＬＰＳＴＧＧ（配列番号４７）（１）を生じた。これは、次に、ＳｒｔＡを用いてＧ５‐ＣＯＳＲ（２）と反応させられた。Ａ‐Ｆ＿ＬＰＳＴＧ５ＣＯＳＲ（配列番号４８）（３）の生成後に、断片Ｇ（４）を混合物に添加して、ＮＣＬを受けさせた。１０ＦＮ３のＦＧループに挿入されたＧ５を含む生成物（Ａ‐Ｆ＿Ｇ５＿Ｇ）（５）は、次に、アニオン交換カラムによって精製された。ＣＤループまたはＢＣループにおいて分割された１０ＦＮ３の場合には、本発明者は、ワンポットの二重ライゲーションを、二重にＨｉｓタグ付けされたＮ末端断片を用いて行い、これはＳｒｔＡおよびＮｉ‐ＮＴＡの存在下においてＧ５‐ＣＯＳＲおよびＣ末端断片と反応した。簡単な洗浄および続いてのＳＵＭＯの切断によって、本発明者は、ＣＤループ（６）またはＢＣループ（７）に挿入されたＧ５を有する全長蛋白質を、上清から、更なる精製無しに得た。
【０１４０】
円二色性が用いられて、二重ライゲーションの生成物を解析した。全ての３つの生成物は野生型の１０ＦＮ３のそれに似たＣＤスペクトルを有しており、生成物が正しくフォールディングされたことを示唆している。ＣＤによって監視された熱変性は、生成物が、野生型の１０ＦＮ３のそれに類似のＴｍまたは熱安定性を有することを示唆した。１０ＦＮ３バリアントの結合特性は、種々の合成ペプチドをループ部位に挿入することによって微調整された。
【０１４１】
【表１】
2015519344.tif 000021
【表２】
2015519344.tif 000022
【０１４２】
本願において引用された出典の全ての全内容（参考文献、発行済み特許、公開済み特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）は、参照によって本明細書に明示的に援用される。
本発明の少なくとも１つの実施形態のいくつかの側面を記載して来たが、当然のことながら、種々の変更、改変、および改良が当業者に容易に想到されるであろう。かかる変更、改変、および改良は、本開示の一部として意図されており、本発明の趣旨および範囲に含まれるものと見なされる。従って、上述の記載および図面は例に過ぎない。
【図１Ａ−１Ｃ】
2015519344.tif 000023
【図１Ｄ−１Ｆ】
2015519344.tif 000024
【図２Ａ−２Ｄ】
2015519344.tif 000025
【図３Ａ−３Ｂ】
2015519344.tif 000026
【図４Ａ−４Ｂ】
2015519344.tif 000027
【図５−７】
2015519344.tif 000028
【図８】
2015519344.tif 000029
【図９】
2015519344.tif 000030
【図１０Ａ−１０Ｂ】
2015519344.tif 000031
【図１１Ａ】
2015519344.tif 000032
【図１１Ｂ−１１Ｃ】
2015519344.tif 000033
【図１２Ａ】
2015519344.tif 000034
【図１２Ｂ−１２Ｃ】
2015519344.tif 000035
【図１２Ｄ−１２Ｅ】
2015519344.tif 000036
【図１３Ａ−１３Ｃ】
2015519344.tif 000037
【図１３Ｄ−１３Ｅ】
2015519344.tif 000038
【図１４Ａ−１４Ｂ】
2015519344.tif 000039
【図１５−１６】
2015519344.tif 000040
【図１７−１８】
2015519344.tif 000041
【配列表】
2015519344000001.app
【国際調査報告】
2015519344.tif 000042
2015519344.tif 000043
2015519344.tif 000044
2015519344.tif 000045
2015519344.tif 000046
2015519344.tif 000047