(57)【要約】  本発明は、細胞死（例えば癌細胞死）を誘導するための組成物及び方法を提供する。化合物の組み合わせ及び関連する使用方法、例えば、癌の治療及び細胞におけるアポトーシスの選択的誘導における化合物の使用を開示する。開示されている薬物の組み合わせは、他の化合物及び化合物の組み合わせより低い神経毒性作用を有し得る。【選択図】図２
2015511956.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）式（Ｉ）：
【化１】
2015511956.tif 000014
［式中、ＲはＨ又はＭｅである。］
の化合物と、
（ｂ）化合物ＰＡＣ−１：
【化２】
2015511956.tif 000015
と、
（ｃ）薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤又は担体と、
を含む組成物。
【請求項２】
式（Ｉ）のＲはＨである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
式（Ｉ）のＲはＭｅである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
担体は水を含み、任意選択で、緩衝液、シクロデキストリン又はそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
シクロデキストリンは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである、請求項５に記載の組成物。
【請求項６】
癌細胞の成長又は増殖を抑制する方法であって、癌細胞を有効量の請求項１に記載の組成物と接触させ、それにより癌細胞の成長又は増殖を抑制するステップを含む方法。
【請求項７】
癌細胞は、肛門癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、胃癌、頭頸部癌、白血病、肺癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、悪性リンパ腫、神経芽細胞腫、眼癌、骨原性癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、黒色腫、軟部肉腫、甲状腺癌、又はウィルムス腫瘍の細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
癌細胞は乳癌細胞、白血病細胞又はリンパ腫細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
プロカスパーゼ−３をカスパーゼ−３に活性化する方法であって、プロカスパーゼ−３を請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物と接触させるステップを含む方法。
【請求項１０】
前記接触はインビトロでの接触である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記接触はインビボでの接触である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
式（Ｉ）：
【化３】
2015511956.tif 000016
［式中、ＲはＨ又はＭｅである。］
の化合物の活性を増強する方法であって、
癌細胞を、式（Ｉ）の化合物と有効活性化量のＰＡＣ−１：
【化４】
2015511956.tif 000017
との組み合わせと接触させるステップを含み、
前記ＰＡＣ−１は癌細胞に対する式（Ｉ）の化合物の活性を増強する、
方法。
【請求項１３】
癌細胞におけるアポトーシスを誘導する方法であって、
癌細胞を、有効量の式（Ｉ）：
【化５】
2015511956.tif 000018
［式中、ＲはＨ又はＭｅである。］
の化合物及び有効量の化合物ＰＡＣ−１：
【化６】
2015511956.tif 000019
と接触させるステップを含み、
アポトーシスはそれにより癌細胞において誘導される、
方法。
【請求項１４】
癌細胞を式（Ｉ）の化合物及びＰＡＣ−１と同時に接触させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
癌細胞をＰＡＣ−１と接触させる前に癌細胞を式（Ｉ）の化合物と接触させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
癌細胞を式（Ｉ）の化合物と接触させる前に癌細胞をＰＡＣ−１と接触させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
処置の必要な患者における癌を処置する方法であって、
患者に、治療有効量の式（Ｉ）：
【化７】
2015511956.tif 000020
［式中、ＲはＨ又はＭｅである。］
の化合物及び有効量の化合物ＰＡＣ−１：
【化８】
2015511956.tif 000021
を同時又は逐次に投与するステップを含み、
癌は乳癌、白血病又はリンパ腫である、
方法。
【請求項１８】
式（Ｉ）の化合物及び化合物ＰＡＣ−１は同時に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
式（Ｉ）の化合物及び化合物ＰＡＣ−１は逐次に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
式（Ｉ）の化合物は化合物ＰＡＣ−１の前に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
式（Ｉ）の化合物は化合物ＰＡＣ−１の後に投与される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本願は、２０１２年３月２日出願の米国特許仮出願第６１／６０５８１９号に基づいて３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）による優先権を主張するものである。この仮出願は、参照により本明細書に組み入れられる。
【政府支援】
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所により付与された認可番号Ｒ０１−ＣＡ１２０４３９及びＣＡ１２０４３９−Ｓ２の下での政府支援を受けてなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【発明の背景】
【０００３】
アポトーシス、すなわちプログラム細胞死は、すべての多細胞生物の発生及びホメオスタシスにおいて中心的役割を果たしている。癌の一般的な特徴は、天然のアポトーシスシグナルに対する耐性である。癌のタイプに応じて、この耐性は、通常、アポトーシスカスケードにおける主要タンパク質の上方若しくは下方制御によるか、又はこれらのタンパク質をコードする遺伝子の変異による。そのような変化は、ミトコンドリア及びカスパーゼ−９を介する内因性アポトーシス経路と、細胞死受容体及びカスパーゼ−８の作用を伴う外因性アポトーシス経路と、の両方で生じる。例えば、ｐ５３、Ｂｉｍ、Ｂａｘ、Ａｐａｆ−１、ＦＬＩＰ及びその他多くのタンパク質の適正レベルの変化が癌において観察されている。この変化は、不完全なアポトーシスカスケード、すなわち、上流のアポトーシス促進シグナルが十分に伝達されず、実行型カスパーゼであるカスパーゼ−３及びカスパーゼ−７が活性化されないカスケードをもたらす可能性がある。
【０００４】
ほとんどのアポトーシス経路が最終的にプロカスパーゼ−３の活性化を伴うので、上流の遺伝子異常は事実上アポトーシス回路における「遮断」であり、その結果、そのような細胞は異常に増殖する。癌におけるアポトーシスの中心的役割を考慮して、アポトーシスカスケードにおける特異的タンパク質を標的とする治療薬を開発する試みが行われてきた。例えば、カスケードメンバー（例えば、ｐ５３及びＢｃｌファミリーのタンパク質）に対する又はアポトーシス阻害タンパク質（ＩＡＰ）ファミリーのタンパク質に対するペプチド分子又は小分子の結合剤は、Ａｐａｆ−１のオリゴマー化を促進する化合物と同様のアポトーシス促進活性を有する。しかし、そのような化合物はアポトーシスカスケード上の早期（又は中位から高位）のポジションを標的とするので、それらのメンバーの下流のタンパク質に変異のある癌は、それらの化合物のあり得る有益な効果に対して依然として耐性を有し得る。
【０００５】
アポトーシスカスケードの遠位の下流にあるアポトーシス促進タンパク質を直接活性化する小分子を同定することは治療上有益である。このアプローチはカスケード中の比較的低ポジションに関わり、それにより、上流アポトーシス機構に変異のある細胞であっても死滅させることが可能となる。さらに、そのような治療戦略は、そのアポトーシス促進タンパク質が癌細胞において上方制御される場合に成功の可能性がより高くなる。したがって、アポトーシスの下流エフェクタータンパク質であるプロカスパーゼ−３を標的とする小分子の同定は現在の癌治療を著しく促進することになる。
【０００６】
プロカスパーゼ−３がカスパーゼ−３に変換又は活性化されると、活性「実行型」カスパーゼ形態が生成され、これが続いて多数のタンパク質基質の加水分解を触媒する。活性カスパーゼ−３はヘテロダイマーのホモダイマーであり、プロカスパーゼ−３のタンパク質分解によって産生される。インビボにおいて、このタンパク質分解性活性化は、通常、カスパーゼ−８又はカスパーゼ−９の作用を介して生じる。酵素前駆体（プロ酵素）が時期尚早に活性化されないように、プロカスパーゼ−３は、タンパク質分解のＥＴＤ部位（アミノ酸配列：ｉｌｅ−ｇｌｕ−ｔｈｒ−ａｓｐ）へのアクセスを阻止する１２アミノ酸の「セーフティキャッチ」を有する。このセーフティキャッチは、プロカスパーゼ−３がカスパーゼ−９による自己触媒的活性化及びタンパク質分解に抵抗することを可能にする。変異原性試験では、連続する３個のアスパラギン酸残基がセーフティキャッチの重要成分であるように思われることが示されている。セーフティキャッチの部位はｐＨに感受性があるため、（アポトーシス中に生じる）細胞の酸性化の際に、セーフティキャッチはタンパク質分解の部位へのアクセスを可能とし、活性カスパーゼ−３は、カスパーゼ−９の作用によって又は自己活性化機構を介して産生されることができると考えられる。
【０００７】
特定の癌では、プロカスパーゼ−３のレベルは正常組織に比べて上昇する。２０名の結腸癌患者から得た一次単離物の研究では、平均して、プロカスパーゼ−３が、隣接した非癌性組織と比較してそのような単離物において６倍上方制御されたことが示されている。また、プロカスパーゼ−３は、特定の神経芽腫、リンパ腫及び肝癌において上方制御される。さらに、米国国立癌研究所（ＮＣＩ）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｐｒｏｇｒａｍによる癌スクリーニングで使用されている６０細胞株パネルにおけるプロカスパーゼ−３レベルの系統的評価が行われ、特定の肺癌、黒色腫、腎癌及び乳癌が非常に高レベルのプロカスパーゼ−３発現を示すことが明らかとなった。
【０００８】
アポトーシス達成における活性カスパーゼ−３の役割、特定の癌細胞型におけるプロカスパーゼ−３の比較的高いレベル、及びその自己活性化の興味深いセーフティキャッチ媒介性抑制によって、プロカスパーゼ−３を直接修飾する小分子は癌標的治療での大きな適用可能性を有する。
【０００９】
併用療法は癌患者の処置の標準となっている。併用療法の混合薬レジメンの目的は、化学療法薬間の相乗又は相加効果を実現し、それにより処置時間の短縮、毒性の低減、及び患者の生存の増加を促進することである。単一の生化学経路に作用する薬物は、「合成致死性」の遺伝子の組み合わせを模倣し得ることから、相乗又は増強作用に関する特に有力な候補である。例えば、ＤＮＡ損傷修復を促進する酵素であるポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ−１）の阻害剤は、細胞培養、動物モデル及びヒト治験において証明されているようにＤＮＡ損傷剤と共に強力な相乗作用を示す。しかし、依然として、多くの形態の癌を処置するためのより有効な治療法が必要とされており、抗癌薬の新たな相乗的な組み合わせがこの探求に有用であろう。したがって、癌細胞の死滅には有効であるが、正常な宿主組織を該薬物の好ましくない毒性から保護する、新規の細胞毒性薬を同定する必要性がある。
【概要】
【００１０】
本発明は、概して、化合物、組成物、及び治療的処置の方法を提供する。実施形態において、本発明は、種々の癌性疾患及び癌細胞型、例えば、乳癌、リンパ腫、副腎癌、腎癌、黒色腫、白血病、神経芽腫、肺癌、脳癌、及び当技術分野で公知の他の癌に関して適用可能である。本明細書では、特に、細胞死を誘発することができる小分子を含む組成物及び方法が開示される。種々の実施形態において、組成物及び方法は、プログラム細胞死経路のメンバー（例えばプロカスパーゼ−３）と直接的又は間接的に相互作用し得る化合物を含む。一部の実施形態において、組成物及び方法は、プログラム細胞死経路のメンバー（例えばプロカスパーゼ−３）と直接的又は間接的に相互作用する他の化合物と比較して低減された神経毒性を有する。
【００１１】
併用抗癌療法は、異なる生化学経路を標的とする薬物、又は同一経路での異なる標的を攻撃し、「合成致死性」の遺伝子の組み合わせを模倣する薬物から構成され得る。本開示は、併用療法における新規のコンセプト、すなわち、同一の生物学的標的を選択的に活性化するが、それが異なる機序によるものである、２つの化合物による酵素活性化というコンセプトを示すものである。プロカスパーゼ−３活性化薬ＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの組み合わせは、インビトロでのプロカスパーゼ−３酵素活性の活性化における大きな相乗作用を示し、培養下の複数の癌細胞株におけるプロカスパーゼ−３の速やかで劇的な自己成熟を誘導し、培養下の癌細胞におけるアポトーシス死を、相加効果をはるかに上回る程度に強力に誘導する。最後に、ＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの組み合わせは、化合物単独では効果が僅かであるか効果がないマウス腫瘍モデルの腫瘍量が効果的に低減させる。これらのデータは、癌の処置におけるＰＡＣ−１／１５４１Ｂの組み合わせの可能性を示しており、より広く見れば、異なって作用する酵素活性化薬が相乗的に作用して、顕著に増強された生物学的効果をもたらし得ることを示している。
【００１２】
すなわち、本発明は、
（ａ）式（Ｉ）：
【化１】
2015511956.tif 000003
［式中、ＲはＨ又はＭｅである。］
の化合物と、
（ｂ）化合物ＰＡＣ−１：
【化２】
2015511956.tif 000004
と、
（ｃ）薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤又は担体と、
を含む組成物を提供する。一実施形態において、式（Ｉ）のＲはＨである。他の実施形態において、式（Ｉ）のＲはＭｅである。担体は水を含み得、任意選択で、緩衝液、シクロデキストリン又はそれらの組み合わせをさらに含み得る。特定の一実施形態において、シクロデキストリンは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。
【００１３】
また、本発明は、癌細胞の成長又は増殖を抑制する方法であって、癌細胞を有効量の本明細書に記載の化合物又は組成物と接触させ、それにより癌細胞の成長又は増殖を抑制するステップを含む方法を提供する。癌細胞は、肛門癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、胃癌、頭頸部癌、白血病、肺癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、悪性リンパ腫、神経芽細胞腫、眼癌、骨原性癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、黒色腫、軟部肉腫、甲状腺癌、又はウィルムス腫瘍の細胞であり得る。一部の実施形態において、癌細胞は乳癌細胞、白血病細胞又はリンパ腫細胞である。
【００１４】
また、本発明は、プロカスパーゼ−３をカスパーゼ−３に活性化する方法であって、プロカスパーゼ−３を本明細書に記載の化合物又は組成物と接触させるステップを含む方法を提供する。この方法又は本明細書に記載の他の方法に関する接触はインビトロにおけるものであり得、また、接触はインビボにおけるものであり得る。
【００１５】
また、本発明は、式（Ｉ）：
【化３】
2015511956.tif 000005
［式中、ＲはＨ又はＭｅである。］
の化合物の活性を増強する方法であって、癌細胞を、式（Ｉ）の化合物と有効活性化量のＰＡＣ−１：
【化４】
2015511956.tif 000006
との組み合わせと接触させるステップを含み、ＰＡＣ−１は癌細胞に対する式（Ｉ）の化合物の活性を増強する、方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は、癌細胞におけるアポトーシスを誘導する方法であって、癌細胞を、有効量の式（Ｉ）：
【化５】
2015511956.tif 000007
［式中、ＲはＨ又はＭｅである。］
の化合物及び有効量の化合物ＰＡＣ−１：
【化６】
2015511956.tif 000008
と接触させるステップを含み、アポトーシスはそれにより癌細胞において誘導される、方法を提供する。癌細胞は、式（Ｉ）の化合物及びＰＡＣ−１と同時に接触させることができる。あるいは、癌細胞をＰＡＣ−１と接触させる前に癌細胞を式（Ｉ）の化合物と接触させることができ、また、癌細胞を式（Ｉ）の化合物と接触させる前に癌細胞をＰＡＣ−１と接触させることができる。
【００１７】
さらに、本発明は、処置の必要な患者における癌を処置する方法であって、患者に、治療有効量の式（Ｉ）：
【化７】
2015511956.tif 000009
［式中、ＲはＨ又はＭｅである。］
の化合物及び有効量の化合物ＰＡＣ−１:
【化８】
2015511956.tif 000010
を同時又は逐次に投与するステップを含み、癌は乳癌、白血病又はリンパ腫である、方法を提供する。式（Ｉ）の化合物及び化合物ＰＡＣ−１は同時に投与することができる。他の実施形態において、式（Ｉ）の化合物及び化合物のＰＡＣ−１は逐次に投与することができる。一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物ＰＡＣ−１の前に投与される。他の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物ＰＡＣ−１の後に投与される。
【００１８】
すなわち、本発明は、薬物療法で使用するための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。薬物療法は、癌、例えば、乳癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、結腸癌、及び本明細書に記載の他の癌を処置することであり得る。また、本発明は、哺乳動物の疾患（例えば、ヒトの癌）を処置するための医薬を製造するための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。すなわち、本発明は、哺乳動物（例えばヒト）の癌の処置に有用な医薬を製造するための本明細書に記載の化合物の使用を提供する。医薬は、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤又は担体を含み得る。
【００１９】
添付の図面は本明細書の一部を形成し、特定の実施形態又は本発明の種々の態様をさらに例示するために含まれる。いくつかの例では、本発明の実施形態は、本明細書中の詳細な説明と組み合わせて添付の図面を参照することによって最もよく理解され得る。本明細書中の説明及び添付の図面は、本発明のある特定の例又はある特定の態様を示したものであり得る。しかし、例又は態様の一部が本発明の他の例又は態様と組み合わせて使用され得ることは当業者には理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｆｉｇｕｒｅ１：  ＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの構造。
【図２】Ｆｉｇｕｒｅ２：  野生型プロカスパーゼ−３（１μＭ）又はＤ３Ａ変異体（１μＭ）を３７℃で化合物１５４１Ｂ（２５μＭ）とインキュベートし、カスパーゼ−３活性を、図に示した時点でアリコートを採取し、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ基質を用いてそれらを評価することによってモニターした。カスパーゼ−３（１μＭ）を用いて１００％カスパーゼ−３活性を設定した。図中の線は、上から下へ向かってそれぞれ図の凡例に対応する（一番上は、１μＭ  ＰＣ３−ＷＴ＋２５μＭ  １５４１Ｂ）。
【図３】Ｆｉｇｕｒｅ３：  野生型プロカスパーゼ−３（１μＭ）を、ある範囲の濃度のＺｎＳＯ４の存在下で１５４１Ｂ（２５μＭ）と共にインキュベートし、カスパーゼ−３活性をＡｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡ基質を用いてモニターした。図中の線は、上から下へ向かってそれぞれ図の凡例に対応する。
【図４】Ｆｉｇｕｒｅ４：  野生型プロカスパーゼ−３（１μＭ）を、ＺｎＳＯ４（１μＭ）及び１５４１Ｂ（２５μＭ）と共に、あるいは１５４１Ｂ（３０μＭ）及びＰＡＣ−１（５０μＭ）と共にインキュベートし、カスパーゼ−３活性をＡｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡ基質を用いてモニターした。図中の線は、上から下へ向かってそれぞれ図の凡例に対応する。すなわち、ＰＡＣ−１は１５４１Ｂ活性を増強する。
【図５−１】Ｆｉｇｕｒｅ５：  ＰＡＣ−１／１５４１Ｂの組み合わせは、速やかで劇的なプロカスパーゼ−３の成熟及び活性化を誘導する。Ａ：ＰＡＣ−１／１５４１Ｂの組み合わせでの処置後の癌細胞溶解物のカスパーゼ−３／−７様活性。ＳＴＳ＝スタウロスポリン。Ｂ：ＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの組み合わせでの処置後の（細胞シグナル伝達カスパーゼ−３抗体を用いた）各種癌細胞株のウェスタンブロット。
【図５−２】Ｆｉｇｕｒｅ５：  ＰＡＣ−１／１５４１Ｂの組み合わせは、速やかで劇的なプロカスパーゼ−３の成熟及び活性化を誘導する。Ａ：ＰＡＣ−１／１５４１Ｂの組み合わせでの処置後の癌細胞溶解物のカスパーゼ−３／−７様活性。ＳＴＳ＝スタウロスポリン。Ｂ：ＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの組み合わせでの処置後の（細胞シグナル伝達カスパーゼ−３抗体を用いた）各種癌細胞株のウェスタンブロット。
【図６−１】Ｆｉｇｕｒｅ６：  Ａ：ＨＬ−６０（ヒト白血病）；Ｂ：ＥＬ４（マウスリンパ腫）；Ｃ：Ｈｓ５７８Ｔ（ヒト乳癌）；及びＤ：Ｊｕｒｋａｔ（ヒト白血病）細胞株に関する、Ｆｉｇｕｒｅ５Ｂ類似のデータ。
【図６−２】Ｆｉｇｕｒｅ６：  Ａ：ＨＬ−６０（ヒト白血病）；Ｂ：ＥＬ４（マウスリンパ腫）；Ｃ：Ｈｓ５７８Ｔ（ヒト乳癌）；及びＤ：Ｊｕｒｋａｔ（ヒト白血病）細胞株に関する、Ｆｉｇｕｒｅ５Ｂ類似のデータ。
【図７】Ｆｉｇｕｒｅ７：  ＰＡＣ−１は、種々の異なる細胞株において、１５４１Ｂのアポトーシス促進活性を有意に増強する。ＰＡＣ−１／１５４１Ｂの組み合わせは、培養下の速やかな癌細胞死を誘導する。癌細胞株を図に示した濃度のＰＡＣ−１及び１５４１Ｂで処置し、アポトーシス死を評価した。図に示されている通り、データはＵ−９３７、Ａ５４９及びＢＴ−５４９に関するものである。点線は、薬物の組み合わせに関するＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの相加効果を表している。
【図８】Ｆｉｇｕｒｅ８：  ＰＡＣ−１は、種々の異なる細胞株において、１５４１Ｂのアポトーシス促進活性を有意に増強する。プロカスパーゼ−３のカスパーゼ−３への活性化は、ＰＡＣ−１／１５４１Ｂの組み合わせでの処置の際に、Ａ）ＨＬ−６０（ヒト前骨髄球性白血病）、Ｂ）Ｈｓ５７８Ｔ（ヒト乳癌）、Ｃ）Ｕ−８７（ヒト膠芽腫）、及びＤ）ＥＬ４（マウスリンパ腫）細胞株で確認されたが、１５４１Ｂ又はＰＡＣ−１単独では、プロカスパーゼ−３の活性化は確認されないか又は低かった。点線は、薬物の組み合わせに関するＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの相加効果を表している。
【図９−１】Ｆｉｇｕｒｅ９：  ＰＡＣ−１は、種々の異なる細胞株において、１５４１Ｂのアポトーシス促進活性を有意に増強する。追加データ、並びにＦｉｇｕｒｅ７及び８で使用した方法によって得られた種々の濃度におけるデータ。１１Ａ）Ｊｕｒｋａｔ細胞、１１Ｂ）ＥＬ−４細胞、１１Ｃ）ＨＬ−６０細胞、１１Ｄ）Ａ−５４９細胞、及び１１Ｅ）ＢＴ−５４９細胞。点線は、薬物の組み合わせに関するＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの相加効果を表している。凡例は棒グラフの棒に対応するものであり、ここで、最も上の凡例は一番左の棒に対応し、残りの凡例は残りの棒に対応（上〜下の凡例はそれぞれ左〜右の棒に対応）している。
【図９−２】Ｆｉｇｕｒｅ９：  ＰＡＣ−１は、種々の異なる細胞株において、１５４１Ｂのアポトーシス促進活性を有意に増強する。追加データ、並びにＦｉｇｕｒｅ７及び８で使用した方法によって得られた種々の濃度におけるデータ。１１Ａ）Ｊｕｒｋａｔ細胞、１１Ｂ）ＥＬ−４細胞、１１Ｃ）ＨＬ−６０細胞、１１Ｄ）Ａ−５４９細胞、及び１１Ｅ）ＢＴ−５４９細胞。点線は、薬物の組み合わせに関するＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの相加効果を表している。凡例は棒グラフの棒に対応するものであり、ここで、最も上の凡例は一番左の棒に対応し、残りの凡例は残りの棒に対応（上〜下の凡例はそれぞれ左〜右の棒に対応）している。
【図９−３】Ｆｉｇｕｒｅ９：  ＰＡＣ−１は、種々の異なる細胞株において、１５４１Ｂのアポトーシス促進活性を有意に増強する。追加データ、並びにＦｉｇｕｒｅ７及び８で使用した方法によって得られた種々の濃度におけるデータ。１１Ａ）Ｊｕｒｋａｔ細胞、１１Ｂ）ＥＬ−４細胞、１１Ｃ）ＨＬ−６０細胞、１１Ｄ）Ａ−５４９細胞、及び１１Ｅ）ＢＴ−５４９細胞。点線は、薬物の組み合わせに関するＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの相加効果を表している。凡例は棒グラフの棒に対応するものであり、ここで、最も上の凡例は一番左の棒に対応し、残りの凡例は残りの棒に対応（上〜下の凡例はそれぞれ左〜右の棒に対応）している。
【図９−４】Ｆｉｇｕｒｅ９：  ＰＡＣ−１は、種々の異なる細胞株において、１５４１Ｂのアポトーシス促進活性を有意に増強する。追加データ、並びにＦｉｇｕｒｅ７及び８で使用した方法によって得られた種々の濃度におけるデータ。１１Ａ）Ｊｕｒｋａｔ細胞、１１Ｂ）ＥＬ−４細胞、１１Ｃ）ＨＬ−６０細胞、１１Ｄ）Ａ−５４９細胞、及び１１Ｅ）ＢＴ−５４９細胞。点線は、薬物の組み合わせに関するＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの相加効果を表している。凡例は棒グラフの棒に対応するものであり、ここで、最も上の凡例は一番左の棒に対応し、残りの凡例は残りの棒に対応（上〜下の凡例はそれぞれ左〜右の棒に対応）している。
【図９−５】Ｆｉｇｕｒｅ９：  ＰＡＣ−１は、種々の異なる細胞株において、１５４１Ｂのアポトーシス促進活性を有意に増強する。追加データ、並びにＦｉｇｕｒｅ７及び８で使用した方法によって得られた種々の濃度におけるデータ。１１Ａ）Ｊｕｒｋａｔ細胞、１１Ｂ）ＥＬ−４細胞、１１Ｃ）ＨＬ−６０細胞、１１Ｄ）Ａ−５４９細胞、及び１１Ｅ）ＢＴ−５４９細胞。点線は、薬物の組み合わせに関するＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの相加効果を表している。凡例は棒グラフの棒に対応するものであり、ここで、最も上の凡例は一番左の棒に対応し、残りの凡例は残りの棒に対応（上〜下の凡例はそれぞれ左〜右の棒に対応）している。
【図１０】Ｆｉｇｕｒｅ１０：  汎カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（２５μＭ）は、ＭＣＦ−７細胞におけるＰＡＣ−１／１５４１Ｂ媒介性細胞死を防御する。
【図１１】Ｆｉｇｕｒｅ１１：  ＰＡＣ−１／１５４１Ｂの組み合わせは、ＭＣＦ−７細胞（ＭＣＦ−７  ＶＲＬ）に対して僅かな効果しかなかったが、プラスミドを介してプロカスパーゼ−３を発現しているＭＣＦ−７細胞（ＭＣＦ−７  Ｃ３）に対しては劇的なアポトーシス促進効果があった。Ａ）ＭＣＦ−７  ＶＲＬ対ＭＣＦ−７  Ｃ３のウェスタンブロット。Ｂ）種々の濃度の１５４１Ｂを用いたウェスタンブロット。カスパーゼ−３活性化を示している。Ｃ）ＭＣＦ−７細胞死データ；Ｃ３ノックインペア。
【図１２】Ｆｉｇｕｒｅ１２：  Ｕ−９３７細胞におけるＰＡＣ−１（Ａ）の１５４１Ｂとの相乗効果。ＥＬ４細胞（Ｂ）におけるＰＡＣ−１の１５４１ｂとの相乗効果。破線は純粋な相加効果の予測レベルを表す。凡例は棒グラフの棒に対応するものであり、ここで、最も上の凡例は一番左の棒に対応し、残りの凡例は残りの棒に対応（上〜下の凡例はそれぞれ左〜右の棒に対応）している。
【図１３】Ｆｉｇｕｒｅ１３：  ＰＡＣ−１と共に又はＰＡＣ−１なしで漸増濃度の１５４１Ｂで処置されたＵ−９３７細胞の、ウェスタンブロットによるプロカスパーゼ３活性化の分析。
【図１４】Ｆｉｇｕｒｅ１４：  ＰＡＣ−１及び１５４１Ｂによるプロカスパーゼ３の複合活性化を示す機序の概略。
【図１５】Ｆｉｇｕｒｅ１５：  ＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの組み合わせはインビボにおいて抗腫瘍効果を有する。ＥＬ４細胞（マウス当たり１千万個）をマウスに皮下注射し、動物を４群に分け、ビヒクル（２−ヒドロキプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ））、１５４１Ｂ（１７．５ｍｇ／ｋｇ（ＨＰβＣＤ中））、ＰＡＣ−１（１２５ｍｇ／ｋｇ（ＨＰβＣＤ中））、又は１５４１Ｂ＋ＰＡＣ−１（それぞれ１７．５及び１２５ｍｇ／ｋｇ（ＨＰβＣＤ中））で処置した。８日後にマウスを殺処理し、腫瘍を切除して秤量した。エラーバーは標準誤差に等しく、図に示したｐ値はビヒクル対照に対するものである。
【詳細な説明】
【００２１】
癌細胞において多くの場合不活性型で過剰発現されるか又は高いレベルで存在する酵素を活性化することができる化合物が見出されている。この化合物は、癌細胞（例えば、プロカスパーゼ−３が上方制御された細胞又はプロカスパーゼ−３のレベルが上昇する細胞）におけるプログラム細胞死（アポトーシス）を誘導することができる。多くの癌は標準的化学療法に耐性がある。本明細書に記載の併用療法は、癌細胞において上方制御され得る生物学的標的を利用することができ、それにより、アポトーシス機序に欠陥のある細胞でも有効性を示し、組み合わせ化合物のいずれか単独ではそれほど又は全く有効でない条件下においても有効性を示す。また、これらの化合物は癌標的療法において有効であり、ここでは、プロカスパーゼ−３のレベルが低い非癌性細胞に対する副作用が比較的低減されていて、癌細胞の死滅における選択性という利点がある。これらの副作用には、毒性、特に神経毒性が含まれ得る。
【００２２】
本明細書に記載の化合物の組み合わせ、組成物及び方法は、アポトーシス又はプログラム細胞死の調節を介して作用して、癌細胞の処置に有効性を示す。一実施形態において、アポトーシスの調節はアポトーシスの誘導によるものである。種々の実施形態において、化合物の投与は同時であっても逐次であってもよい。
【００２３】
すなわち、本発明は、単一経路内の２つの標的に作用する化合物に基づくのではなく、むしろ同一タンパク質に異なって作用する２つの化合物を介する、増強のための方法を提供する。アポトーシス中、酵素前駆体プロカスパーゼ−３がタンパク質分解によりカスパーゼ−３に活性化され、次いで、この活性カスパーゼ−３が多数の細胞基質を切断してアポトーシスプログラムを実行する。プロカスパーゼ−３タンパク質レベルは種々の腫瘍組織学的検査で上昇するので、プロカスパーゼ−３の薬物媒介性直接活性化は選択的抗癌戦略として非常に有効となり得る。
【００２４】
これまでに、インビトロでのプロカスパーゼ−３の活性及び自己成熟（ａｕｔｏｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）を促進し、培養下の癌細胞におけるアポトーシスを誘導する２つのクラスの化合物が開示されている。プロカスパーゼ活性化化合物−１（ＰＡＣ−１，Ｆｉｇｕｒｅ１）は、抑制性亜鉛イオンのキレート化によってプロカスパーゼ−３の活性を促進し、培養下の癌細胞におけるアポトーシスを誘導し、複数のマウス腫瘍モデルで有効性を示す。最近、化合物１５４１及び１５４１Ｂ（Ｆｉｇｕｒｅ１）がインビトロにおけるプロカスパーゼ−３のカスパーゼ−３への自己成熟を促進し、培養下の癌細胞のアポトーシス死を誘導することが見出されている（Ｗｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，  ８５３−８５８  （２００９））。１５４１／１５４１Ｂ化合物は、化合物の濃度とプロカスパーゼ−３が評価されるシステムの複雑性とにおそらく依存する正確な機序で、オンオフ状態の平衡における結合誘導性シフトによって又はナノフィブリルの形成によってプロカスパーゼ−３を活性化すると思われる。ＰＡＣ−１及び１５４１／１５４１Ｂは、異なる生化学的機序によりプロカスパーゼ−３にそれぞれの活性化効果を発揮し、インビトロにおいて、細胞培養において、及びインビボにおいて相乗効果の可能性を示す。
【００２５】
治療薬及び活性：
Ｆｉｇｕｒｅ１に示されたＰＡＣ−１（２−（４−ベンジルピペラジン−１−イル）−Ｎ−［（２−ヒドロキシ−３−プロパ−２−エニル−フェニル）メチリデンアミノ］アセトアミド）は癌性細胞におけるアポトーシスを選択的に誘導する。ＰＡＣ−１の製造方法は米国特許出願公開第２０１２／００４０９９５号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）に開示されている。
【００２６】
化合物１５４１及び１５４１Ｂ（下記スキーム１）として知られる薬物は、プロ酵素の潜在的活性を促進するプロカスパーゼ−３の「オン状態」立体構造を誘導することによって、あるいはプロ酵素を自己成熟のより良好な基質とするプロカスパーゼ−３の立体構造を誘導することによって、プロカスパーゼ−３の自己成熟を誘導するように作用し得る。また、化合物は、１５４１Ｂナノフィブリルに結合して局所濃度を高めることによってプロカスパーゼ−３の切断を促進し得る。
【００２７】
スキーム１：
式（Ｉ）：
【化９】
2015511956.tif 000011
【００２８】
相乗作用の試験の準備として、１５４１Ｂがどのように作用してプロカスパーゼ−３の自己成熟を誘導するのかを明らかにする試験を行った。その機序をさらに明らかにするため、３つのタンパク質分解切断部位（Ｄ９、Ｄ２８、Ｄ１７５）をアラニンに変異させたプロカスパーゼ−３変異体（Ｄ９Ａ／Ｄ２８Ａ／Ｄ１７５Ａ又は「Ｄ３Ａ」変異タンパク質）を使用した。このＤ３Ａ「非切断」型は、自己プロセシングに対して、また、成熟カスパーゼによるプロセシングに対して完全な耐性がある。Ｄ３Ａは酵素前駆体形態に制限されるので、カスパーゼ基質としてではなく酵素としてのみ作用し得る。これまで、Ｄ３Ａ変異体を使用して、プロカスパーゼ−３自体が潜在的酵素活性を有する（但し、カスパーゼ−３よりも２００倍低い）ことが明らかにされている（Ｂｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２，  １２２９８−１２３１０  （２００３））。１５４１Ｂとインキュベートした際に、野生型プロカスパーゼ−３は予想通り活性化されたが、Ｄ３Ａには１５４１Ｂは効果がなかった（Ｆｉｇｕｒｅ２）。このことは、１５４１Ｂがプロカスパーゼ−３の固有の酵素活性を促進しないことを示している。
【００２９】
インビトロにおける化合物１５４１Ｂのプロカスパーゼ−３に対する活性化効果は、これまで亜鉛を含まない条件下でのみ評価されてきたが、ＰＡＣ−１は、抑制性亜鉛のキレート化を介してプロカスパーゼ−３及びＤ３Ａの両方の触媒活性を促進する。亜鉛は細胞内でプロカスパーゼ−３と共局在し、活性型へのその切断を抑制するので、１５４１Ｂが低濃度の亜鉛の存在下でプロカスパーゼ−３を活性化し得るかどうかを判定することは興味深いことであった。Ｆｉｇｕｒｅ３に示されているように、亜鉛の含有によって、インビトロでプロカスパーゼ−３を活性化する１５４１Ｂの能力は完全に阻害される。しかし、ＰＡＣ−１の添加によって、１５４１Ｂが再度プロカスパーゼ−３を活性化させることが可能となる（Ｆｉｇｕｒｅ４）。これは１５４１ＢのＰＡＣ−１媒介性増強を示している。
【００３０】
ＰＡＣ−１が培養下の癌細胞においてプロカスパーゼ−３の１５４１Ｂ媒介性活性化を同様に増強するかどうかを試験するため、癌細胞株のパネルをＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの組み合わせで処置し、細胞溶解物のカスパーゼ−３／−７活性を蛍光発生カスパーゼ基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣでモニターした。Ｆｉｇｕｒｅ５Ａに示されているように、共処置（ｃｏ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）によって、ＰＡＣ−１又は１５４１Ｂ単独と比較してＤＥＶＤａｓｅ切断が顕著に速やかにかつ劇的に増加した。この組み合わせは、スタウロスポリン（ＳＴＳ，１μＭ）により誘導された活性に匹敵するか又はそれを上回るカスパーゼ活性を誘導する。Ｕ−９３７（ヒトリンパ腫）、Ａ−５４９（ヒト肺癌）及びＢＴ−５４９（ヒト乳癌）溶解物のＤＥＶＤａｓｅ活性をＦｉｇｕｒｅ５に示す。ＨＬ−６０（ヒト白血病）、Ｊｕｒｋａｔ（ヒト白血病）、Ｈｓ５７８Ｔ（ヒト乳癌）及びＥＬ４（イヌリンパ腫）細胞株と類似のデータが得られた。
【００３１】
ＤＥＶＤａｓｅ活性の上昇が、化合物の共処置によって促進されたプロカスパーゼ−３のカスパーゼ−３への切断亢進の結果であったかどうかを決定するために、ＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの組み合わせで処置された細胞をウェスタンブロットにより評価した。Ｆｉｇｕｒｅ５Ｂに示されているように、プロカスパーゼ−３のカスパーゼ−３への劇的な活性化は、ＰＡＣ−１／１５４１Ｂの組み合わせでの処置の際にＵ−９３７、Ａ５４９及びＢＴ−５４９細胞株で観察されたが、１５４１Ｂ又はＰＡＣ−１単独では、評価した時間及び濃度においてプロカスパーゼ−３活性化は低いか又は全く認められなかった。ＨＬ−６０、ＥＬ４、Ｈｓ５７８Ｔ及びＪｕｒｋａｔ細胞における類似の結果をＦｉｇｕｒｅ６Ａ〜Ｄに示す。
【００３２】
プロカスパーゼ−３のカスパーゼ−３への切断がアポトーシスにおける重要な事象の１つであることから、培養下の種々の癌細胞株のアポトーシス死を誘導する能力についてＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの組み合わせを評価した。これらの評価は、Ｆｉｇｕｒｅ５（いずれの化合物も単一の薬物としては有意な効果を示さなかった。）で観察されたカスパーゼ活性化のタイミングを考慮して短いインキュベーション時間で実施した。ＰＡＣ−１は１５４１Ｂのアポトーシス促進活性を有意に増強するが、これをアネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム染色によるフローサイトメトリーを用いて評価し（Ｕ−９３７、ＨＬ−６０及びＪｕｒｋａｔの懸濁細胞株）、あるいは細胞死を接着細胞株でのスルホローダミンＢ染色によって評価した（Ａ５４９及びＢＴ５４９）。Ｕ−９３７、Ａ５４９及びＢＴ−５４９細胞に関する細胞死データをＦｉｇｕｒｅ７に示す。ＨＬ−６０、Ｈｓ５７８Ｔ、Ｕ−８７及びＥＬ４に関する細胞死データをＦｉｇｕｒｅ８Ａ〜Ｄに示す。Ｊｕｒｋａｔ、ＥＬ４、ＨＬ−６０、Ａ５４９及びＢＴ５４９細胞に関する細胞死データをＦｉｇｕｒｅ９Ａ〜Ｅに示す。各グラフ中の点線は、薬物の組み合わせに関するＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの相加効果を表す。
【００３３】
ＰＡＣ−１／１５４１Ｂの組み合わせのアポトーシス促進効果は汎カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈで阻止されるが、これは細胞死機序におけるカスパーゼの関与と整合している（Ｆｉｇｕｒｅ１０）。プロカスパーゼ−３の活性化と、薬物の組み合わせにより誘導される細胞死と、の関係をさらに調べるため、プロカスパーゼ−３を発現していない細胞株のＭＣＦ−７細胞を使用した。ＰＡＣ−１／１５４１Ｂの組み合わせは、ＭＣＦ−７細胞（ＭＣＦ−７  ＶＲＬ）に対する効果は僅かであったが、プラスミドを介してプロカスパーゼ−３を発現しているＭＣＦ−７細胞（ＭＣＦ−７  Ｃ３）に対しては劇的なアポトーシス促進効果を有していた。Ｆｉｇｕｒｅ１１Ａ〜Ｃを参照されたい。
【００３４】
上述のように、化合物１５４１Ｂは、ＰＡＣ−１及び関連化合物に関する作用機序と同様の亜鉛キレート化機序を介してプロカスパーゼ−３を活性化するのではない。むしろ、１５４１はアロステリックな結合及び活性化機序によって作動する。ＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの組み合わせは、Ｕ−９３７及びＥＬ４腫瘍細胞株について示されているように、リンパ腫及び白血病の処置に関する相乗的な組み合わせであることも見出された。ＰＡＣ−１は、２つのリンパ腫／白血病細胞株において１５４１Ｂと相乗的に働き、それらの化合物の組み合わせでの処置の際の細胞死率は、相加効果に基づいて予想される細胞死率よりも顕著に高いことが実証されている（Ｆｉｇｕｒｅ１２）。ウェスタンブロット分析は、高レベルのプロカスパーゼ−３活性化が上記組み合わせで実現され（Ｆｉｇｕｒｅ１３）、Ｆｉｇｕｒｅ１４に示される機序と整合することを実証している。
【００３５】
この二重プロカスパーゼ−３活性化戦略の治療的有用性を調べるため、ＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの組み合わせをマウス腫瘍モデルで試験した。ＥＬ４同系モデルを選択した。ＰＡＣ−１及び１５４１Ｂは相乗的に作用してこの細胞株に対して劇的な細胞死を誘導する。また、このモデルは、腫瘍の急速な成長により興味深い処置モデルである。
【００３６】
ＥＬ４（マウスリンパ腫）細胞を移植したＣ５７／ＢＬ６マウスを、ＰＡＣ−１単独（１２５ｍｇ／ｋｇ）、１５４１Ｂ単独（１７．５ｍｇ／ｋｇ）、及びＰＡＣ−１＋１５４１Ｂ（それぞれ１２５ｍｇ／ｋｇ及び１７．５ｍｇ／ｋｇ）を用いて、３日間一日一回処置した。選択された用量は最大耐用量（ＭＴＤ）試験に基づいていた（ＭＴＤ試験に関する表１及び表２を参照）。
【００３７】
【表１】
2015511956.tif 000012
【００３８】
【表２】
2015511956.tif 000013
【００３９】
ビヒクル処置したマウスの腫瘍が最大サイズ（〜１５００ｍｍ３）に達した８日後、すべてのマウスを殺処理し、腫瘍を切除し、秤量した。Ｆｉｇｕｒｅ１５に示されているように、１５４１Ｂ処置では効果がなく、ＰＡＣ−１処置では、このモデルにおける腫瘍成長に対する効果は僅かであった。しかし、ＰＡＣ−１及び１５４１Ｂの組み合わせは腫瘍成長を劇的に遅延させた。
【００４０】
異なる標的に作用する薬物の組み合わせを利用する抗癌戦略には明らかな利益があるが、本明細書に記載の試験は、同一の生物学的標的に異なる機序を介して作用する化合物で劇的な相乗効果が認められることを実証している。酵素の活性化を求める場合、この多重標的化戦略は特別な利点を有し得る。インビトロで示されているように、１５４１Ｂは亜鉛存在下ではプロカスパーゼ−３を活性化できないが、ＰＡＣ−１の添加によって、１５４１Ｂが再度その効果を発揮することが可能となる。ＰＡＣ−１はプロカスパーゼ−３の不安定な抑制性亜鉛をキレート化し、その結果、この酵素前駆体を刺激して１５４１Ｂによる強力かつ効率的な活性化をもたらす。
【００４１】
同様に、細胞培養下では、いずれの化合物も６〜１２時間では有意な細胞死効果を示さないが、ＰＡＣ−１／１５４１Ｂの組み合わせでは細胞死の（相加効果よりも大きい）劇的な促進が観察される。ウェスタンブロット及び細胞溶解物中のカスパーゼ−３酵素活性によって示されるように、この細胞死は、プロカスパーゼ−３のカスパーゼ−３への速やかな変換を誘導するＰＡＣ−１／１５４１Ｂの能力と関係している。
【００４２】
ＰＡＣ−１は哺乳動物において安全であり、ＰＡＣ−１誘導体はリンパ腫のペット用イヌの第Ｉ相臨床試験において有効であった（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０，  ７２３２−７２４１（２０１０））。したがって、観察された１５４１Ｂとの相乗作用は重要な臨床的影響を有するはずである。小分子による酵素の活性化に対する関心が急速に高まってきている。本明細書に記載のデータは、活性化機序が異なる２つの小分子を用いる標的化戦略が目的の生物学的効果を劇的に促進する一般的なアプローチであり、その効果により重要な臨床的影響を及ぼすはずであることを示している。
【００４３】
本発明の方法：
本発明は、癌細胞におけるアポトーシスを選択的に誘導する方法であって、癌細胞のプロカスパーゼ−３分子を修飾可能な化合物の組み合わせを癌細胞に投与するステップを含み、化合物の組み合わせはＰＡＣ−１及び式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１５４１又は化合物１５４１Ｂ）である、方法を提供する。また、癌細胞におけるアポトーシスを選択的に誘導する方法であって、癌細胞のプロカスパーゼ−３分子を修飾可能な化合物の組み合わせを癌細胞に投与するステップを含み、化合物の組み合わせはＰＡＣ−１及び式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１５４１又は化合物１５４１Ｂ）であり、癌細胞は処置の必要な患者体におけるものである、方法を提供する。
【００４４】
本発明は、上記化合物の組み合わせがＰＡＣ−１及び式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１５４１又は化合物１５４１Ｂ）であるさらなる方法を提供する。すなわち、本発明は、癌細胞を処置する方法であって、（ａ）プロカスパーゼ活性化化合物による癌細胞の処置に対する潜在的な感受性を同定するステップと、（ｂ）プロカスパーゼ活性化化合物の組み合わせの有効量に癌細胞を暴露するステップと、を含む方法を提供する。また、癌細胞を処置する方法であって、（ａ）プロカスパーゼ活性化化合物による癌細胞の処置に対する潜在的な感受性を同定するステップと、（ｂ）プロカスパーゼ活性化化合物の組み合わせの有効量に癌細胞を暴露するステップと、を含み、プロカスパーゼ活性化化合物はプロカスパーゼ−３及びプロカスパーゼ−７の少なくとも１つを活性化することができる、方法を提供する。さらに、癌細胞における死を誘導する（例えば、癌細胞を死滅させる）方法であって、癌細胞のプロカスパーゼ−３分子を活性化することができる化合物の組み合わせを癌細胞に投与するステップを含む方法が提供される。
【００４５】
さらに、本発明は、ＰＡＣ−１及び式（Ｉ）の化合物の組み合わせの有効量を含む医薬を提供する。そのような医薬は、細胞のアポトーシスを誘導する方法において使用することができる。一部の実施形態において、化合物の組み合わせは、感知可能な神経毒性作用を患者にもたらす程度に血液脳関門を通過するものではない。本発明の方法は、１種又は複数の細胞を、インビボ又はインビトロで本明細書に記載の化合物の組み合わせの有効量と接触させるステップを含む。また、本発明は、細胞を処置する方法であって、細胞を本明細書に記載の化合物の組み合わせの有効量と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００４６】
定義：
本明細書において、記載された用語は以下の意味を有する。本明細書で使用されている他のすべての用語及びフレーズは、当業者が理解し得るそれらの通常の意味を有する。そのような通常の意味は、専門用語辞典（例えば、Ｈａｗｌｅｙ’ｓ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  １４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｂｙ  Ｒ．Ｊ．Ｌｅｗｉｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２００１）を参照することによって得ることができる。
【００４７】
明細書中で「一実施形態」、「実施形態」などに言及される場合、記載されている実施形態は特定の態様、特徴、構造、成分又は特性を含み得るが、すべての実施形態が必ずしもその態様、特徴、構造、成分又は特性を含むわけではないことを示す。また、そのようなフレーズは、明細書の他の部分で言及されている同じ実施形態を意味し得るが、必ずしもそれを意味するわけではない。さらに、特定の態様、特徴、構造、成分又は特性がある実施形態に関連して記載されている場合、そのような態様、特徴、構造、成分又は特性を他の実施形態に影響させ、関連付けることは、明示的に記載されているかどうかに関わらず当業者の知識の範囲内である。
【００４８】
文脈上明らかに他の意味に解すべき場合でない限り、単数形（“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”）には複数の意味が含まれる。したがって、例えば、「化合物」（“ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ”）と言う場合、複数のそのような化合物が含まれ、化合物Ｘには複数の化合物Ｘが含まれる。また、請求項は任意選択の要素を除外するように記載され得ることに留意されたい。この説明は、請求項の要素の記載又は「否定的」限定の使用に関連して、排他的な用語（例えば、「単独で」（“ｓｏｌｅｌｙ”）、「のみ」（“ｏｎｌｙ”））の使用の前提となることを意図したものである。
【００４９】
用語「及び／又は」は、該用語が関連している項目のいずれか１つ、項目の任意の組み合わせ、又は項目のすべてを意味する。「１つ又は複数の」というフレーズは、特にそれが使用される文脈で解釈する場合、当業者によって容易に理解される。例えば、フェニル環の１個又は複数の置換基とは、１〜５個、あるいは例えばフェニル環が二置換の場合は１〜４個を意味する。
【００５０】
用語「約」は、指定された値の±５％、±１０％、±２０％、又は±２５％の変動を意味し得る。例えば、「約５０」パーセントは、一部の実施形態では、４５〜５５パーセントの変動を生じ得る。整数の範囲に関して、「約」という用語は、記載された範囲の両端の整数よりも１つ若しくは２つ大きい整数及び／又は１つ若しくは２つ小さい整数を含み得る。特に断らない限り、本明細書において、用語「約」は、個々の成分、組成物又は実施形態の機能の点で同等である、記載された範囲に近い値（例えば重量パーセント）を含むものとする。
【００５１】
当業者によって理解されるように、成分の量、特性（例えば分子量）、反応条件などを表現するものを含むすべての数値は近似値であり、すべての場合に任意選択で用語「約」により修飾されるものとする。これらの値は、本明細書の教示を利用する当業者が得ようとする所望の特性に応じて変わり得る。また、そのような値は、それぞれの試験測定において見られる標準偏差から必然的に生じる変動を内在的に含むことも理解される。
【００５２】
（特に書面による説明を提供するという観点から）当業者によって理解されるように、本明細書に記載されているすべての範囲は、任意の及びすべての可能性のある部分範囲及びその部分範囲の組み合わせ、並びに範囲を構成する個別の値、特に整数値を包含する。記載されている範囲（例えば、重量パーセント又は炭素基）には、該範囲内の各々の特定の値、整数、小数、又はアイデンティティが含まれる。記載されているいかなる範囲も、少なくとも該範囲が２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、又は１０分の１まで分割されることが十分に記載されており、それが可能であることは容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書に記載の各範囲は、下位３分の１、中位３分の１、上位３分の１などに容易に分けることができる。また、当業者により理解されるように、「多くても」、「少なくとも」、「より大きい」、「以下」、「以上」などの表現はすべて、記載された数値を含み、そのような用語は、上述の部分範囲まで分割できる範囲を指す。同様に、本明細書に記載されているすべての比率は、当該より広い比率の範囲内にあるすべての部分比率を含む。したがって、ラジカル及び置換基に関する特定の値及び範囲は説明目的でのみ記載されており、それらは、ラジカル及び置換基に関して規定される他の値又は規定される範囲内の他の値を除外するものではない。
【００５３】
メンバーが一般的な方法で（例えばマーカッシュグループとして）一緒にグループ化されている場合、本発明は、記載されているグループの全体だけでなく、グループの各メンバーを個別に包含し、また、メイングループ中のすべての可能なサブグループも包含することは当業者であれば容易に理解するであろう。また、本発明は、メイングループを包含するだけでなく、メイングループにおいて１つ又は複数のグループメンバーが存在しない場合も包含する。すなわち、本発明は、記載されたグループのメンバーのうちのいずれか１つ又は複数の明確な除外も想定している。したがって、但し書きは、開示されたすべてのカテゴリー又は実施形態に適用することができ、それにより、（例えば、明示的な否定的限定で使用される場合のように、）記載された要素、種又は実施形態のいずれか１つ又は複数をそのようなカテゴリー及び実施形態から除外することができる。
【００５４】
用語「接触」は、例えば、溶液中、反応混合物中、インビトロ又はインビボで、例えば、生理的反応、化学的反応又は物理的変化をもたらすために、触れさせる、接触させる、又は極めて近接した位置に置くことを指す。
【００５５】
「同時に」とは、（１）時間的に同時に、あるいは（２）同一の処置スケジュール中の異なる時に、ということを意味する。
【００５６】
「逐次に」とは、引き続き他の活性薬物の投与が行われる方法で使用されるある活性薬物の投与を意味する。ある活性薬物の投与後、次の活性薬物は実質的に第１の薬物の直後に投与することができ、また、次の活性薬物は第１の活性薬物の薬効時間後に投与することができる。薬効時間は、第１の活性薬物の投与からの最大の利益を実現するために与えられた時間の量である。
【００５７】
「有効量」とは、疾患、障害及び／又は状態を処置するために有効な量、あるいは、記載された効果（例えば、活性化又は抑制）などをもたらすための有効な量を意味する。例えば、有効量とは、処置されている状態又は症状の進行又は重症度を低減するのに有効な量であり得る。治療有効量の決定は当業者の能力の範囲内にある。用語「有効量」は、例えば、宿主における疾患又は障害の処置又は防止に、あるいは疾患又は障害の症状の処置に有効である、本明細書に記載の化合物の量又は本明細書に記載の化合物の組み合わせの量を含むものとする。したがって、「有効量」とは、概して、所望の効果が得られる量を意味する。一実施形態において、有効量とは、細胞又は対象（例えば患者）に単回投与又は複数回投与を行う際、成長若しくは増殖の抑制、死滅の誘導、又は過剰増殖性細胞の成長の阻害において、単独で又は医薬担体との組み合わせで有効である、本明細書に記載の活性薬物の量を意味する。そのような成長抑制又は死滅は、そのような処置がない場合に予想される程度を超える対象（例えば患者）の生存の延長として、あるいはそのような処置がない場合と比較した対象の予後の改善として反映され得る。
【００５８】
用語「処置すること」（“ｔｒｅａｔｉｎｇ”）、「処置する」（“ｔｒｅａｔ”）及び「処置」（“ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”）には、（ｉ）疾患、病態若しくは医学的状態の発症を防止すること（例えば予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ））；（ｉｉ）疾患、病態若しくは医学的状態を抑制すること又はその進行を抑止すること；（ｉｉｉ）疾患、病態若しくは医学的状態を軽減すること；及び／又は（ｉｖ）疾患、病態若しくは医学的状態に随伴する症状を減弱させることが含まれる。したがって、用語「処置する」（“ｔｒｅａｔ”）、「処置」（“ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”）及び「処置すること」（“ｔｒｅａｔｉｎｇ”）は予防まで及び得るものであり、処置している状態又は症状の進行又は重症度を防止する、低下させる、中止させる又は逆転させることを含み得る。したがって、用語「処置」（“ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”）は医学的、治療的及び／又は予防的投与を適宜含み得る。一部の実施形態において、用語「処置」（“ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”）、「処置する」（“ｔｒｅａｔ”）又は「処置された」（“ｔｒｅａｔｅｄ”）とは、（ｉ）腫瘍の成長若しくは再成長の防止（予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ））、（ｉｉ）目的の症状若しくは疾患の低減若しくは除去（治療（ｔｈｅｒａｐｙ））、又は（ｉｉｉ）腫瘍の除去若しくは破壊（治癒（ｃｕｒｅ））を意味し得る。
【００５９】
用語「抑制する」（“ｉｎｈｉｂｉｔ”）、「抑制すること」（“ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ”）及び「抑制（“ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ”）とは、疾患、感染、症状又は細胞群の成長又は進行を、遅延、停止又は逆転させることを意味する。抑制は、例えば、処置又は接触がない場合の成長又は進行と比較して、約２０％以上、４０％以上、６０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は９９％以上であり得る。さらに、用語「誘導する」（“ｉｎｄｕｃｅ”）、「抑制する」（“ｉｎｈｉｂｉｔ”）、「増強する」（“ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ”）、「上昇させる」（“ｅｌｅｖａｔｅ”）、「増加する」（“ｉｎｃｒｅａｓｅ”）、「減少する」（“ｄｅｃｒｅａｓｅ”）などは、２つの状態間の定量的差異を示し、しかも、２つの状態間の少なくとも統計学的に有意な差を意味し得る。例えば、「過剰増殖性細胞の成長を抑制するのに有効な量」とは、細胞の成長率が、一部の実施形態において、無処置細胞と少なくとも統計学的に有意に異なり得ることを意味する。本明細書において、そのような用語は例えば増殖率に適用することができる。
【００６０】
過剰増殖性細胞（例えば腫瘍細胞）の「成長又は増殖を抑制する」というフレーズは、その成長及び転移を遅延、中断、抑止又は中止することを意味するが、必ずしも新生物の成長の完全な除去を示すものではない。
【００６１】
用語「癌」（“ｃａｎｃｅｒ”）とは、概して、異常細胞の制御されない成長によって発症する１００種以上の疾患の群のいずれかを意味する。癌は、固形腫瘍及びリンパ腫、並びに非固形癌（例えば白血病）の形態をとり得る。正常細胞（これは、成熟まで複製し、その後、必要な場合にのみ、損傷した細胞を交換する。）とは異なり、癌細胞は際限なく成長・分裂して近傍の細胞を押し出し、最終的に身体の他の部分にまで広がる。
【００６２】
本発明は、癌及び癌性状態を処置するための方法を提供する。用語「癌性状態」（“ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ”）とは、速い増殖又は新生物形成を特徴とする異常な状態に細胞がある任意の状態に関する。癌性状態は悪性又は非悪性（例えば前癌状態）であり得る。「癌性状態」をさらに説明するために、「過剰増殖性」（“ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ”）、「過形成性」（“ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ”）、「過形成」（“ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ”）、「悪性」（“ｍａｌｉｇｎａｎｔ”）、「腫瘍性」（“ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ”）及び「新生物形成」（“ｎｅｏｐｌａｓｉａ”）という用語を使用することができる。これらの用語は互換的に使用することができ、病理組織学上のタイプ、浸潤性の段階、又は癌の決定（例えば、悪性及び非悪性）に関わらず、すべてのタイプの過剰増殖性成長、過形成性成長、癌性成長若しくは発癌プロセス、転移組織、又は悪性に形質転換した細胞、組織若しくは器官を含むものとする。
【００６３】
用語「新生物形成」は、正常な増殖制御に対する応答性の損失を生じる新たな細胞成長（例えば腫瘍性細胞成長）を意味する。「過形成」は、細胞が異常に高い速度で成長していることを意味する。しかし、これらの用語は、文脈上明らかなように、互換的に使用可能であり、概して、細胞が異常な細胞成長速度を示していることを指す。「新生物形成」及び「過形成」は腫瘍（これは、良性、前悪性、上皮内癌、悪性、固形、又は非固形であり得る。）を含む。本発明の範囲内にある癌性状態としては、例えば、肛門癌、移行細胞膀胱癌、骨癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、胃癌、頭頸部癌、カポジ肉腫、白血病、肺癌（例えば、気管支肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、悪性リンパ腫、神経芽細胞腫、骨原性癌（例えば骨の癌）、眼癌（例えば、網膜芽細胞腫及び他の眼部の癌）、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、皮膚癌（例えば黒色腫）、軟部肉腫、甲状腺癌、及びウィルムス腫瘍が挙げられる（それらに限定されない）。本発明の範囲内にある非悪性の過剰増殖性状態（例えば前癌状態）の他の例としては、腺腫、軟骨腫、内軟骨腫、線維腫、筋腫、粘液腫、神経鞘腫、骨芽細胞腫、骨軟骨腫、骨腫、乳頭状腫瘍などが挙げられる（それらに限定されない）。
【００６４】
用語「白血病」又は「白血病性癌」は、造血系及び免疫系（血液系及びリンパ系）のすべての癌又は新生物形成を意味する。これらの用語は、血液及び骨髄における白血球及びその前駆体の乱れた増殖及び発生を特徴とする、造血器官の進行性の悪性疾患を意味する。骨髄腫は、血液及び骨髄細胞の他のタイプの腫瘍を指す。リンパ腫はリンパ組織の腫瘍を指す。白血病の例には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が含まれる。
【００６５】
医薬製剤：
本明細書に記載の化合物を使用して、例えば、該化合物を薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤又は担体と組み合わせることによって、治療用医薬組成物を製造することができる。化合物は、塩又は溶媒和物の形態で担体に添加することができる。例えば、化合物が安定な非毒性の酸又は塩基の塩を形成するのに十分に塩基性又は酸性である場合、塩としての化合物の投与は適切であり得る。薬学的に許容可能な塩の例は、生理学的に許容可能な陰イオンを形成する酸と共に形成される有機酸付加塩であり、例えば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩、及びβ−グリセロリン酸塩である。さらに、適切な無機塩、例えば、塩酸塩、ハロゲン化物、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、及び炭酸塩の塩も形成され得る。
【００６６】
薬学的に許容可能な塩は、当技術分野で周知の標準的な手順を使用して、例えば、十分に塩基性の化合物（例えばアミン）を適切な酸と反応させて生理学的に許容可能なイオン化合物を提供することによって得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム）塩又はアルカリ土類金属（例えばカルシウム）塩も類似の方法により調製することができる。
【００６７】
本明細書に記載の化合物は、医薬組成物として製剤化し、種々の形態で哺乳動物宿主、例えばヒト患者に投与することができる。形態は、選択した投与経路、例えば、静脈内、筋肉内、局所又は皮下経路による経口又は非経口投与に特に適合させることができる。
【００６８】
本明細書に記載の化合物は、薬学的に許容可能なビヒクル（例えば、不活性希釈剤又は同化可能な食用担体）と組み合わせて全身投与され得る。活性薬物の溶解性は、シクロデキストリン、例えば２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを使用することによって増大させることができる。経口投与の場合、化合物は、ハード又はソフトシェルゼラチンカプセルに封入するか、又は錠剤に圧縮するか、又は患者の食餌に直接組み入れることができる。また、化合物は、１つ又は複数の賦形剤と組み合わせることが可能であり、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ、ウエハースなどの形態で使用することができる。このような組成物及び調製物は、通常、少なくとも０．１％の活性化合物を含有する。組成物及び調製物の割合は変動し得、好都合なことに所定の単位剤形の重量の約１％〜約６０％、又は約２％〜約２５％であり得る。そのような治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、有効用量レベルが得られるような量である。
【００６９】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは次の１つ又は複数を含み得る：結合剤、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプン又はゼラチン；賦形剤、例えばリン酸二カルシウム；崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸；及び潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム。甘味料（例えば、スクロース、フルクトース、ラクトース、アスパルテーム）又は着香料（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、チェリーフレーバー）を添加してもよい。単位剤形がカプセルである場合、上記のような材料の他に、液体担体（例えば、植物油、ポリエチレングリコール）を含有し得る。コーティング剤として、あるいは固体単位剤形の物理的形態を変えるように、他の種々の材料が存在していてもよい。例えば、錠剤、丸剤又はカプセル剤はゼラチン、ワックス、セラック又は糖でコーティングすることができる。シロップ剤又はエリキシル剤は、活性化合物、甘味料としてのスクロース又はフルクトース、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、色素、並びに香料（例えば、チェリー又はオレンジフレーバー）を含有し得る。任意の単位剤形の調製に使用されるすべての材料は、使用量において、薬学的に許容可能で実質的に非毒性であるものとする。さらに、活性化合物は徐放性製剤及びデバイスに組み入れることができる。
【００７０】
活性化合物は、点滴又は注射によって静脈内又は腹腔内に投与することができる。活性化合物又はその塩の溶液は、必要に応じて非毒性界面活性剤と混合して、水中で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、又はその混合物中で、あるいは薬学的に許容可能な油中で調製することができる。通常の保存及び使用の条件下で、製剤は、微生物の成長を防止するための防腐剤を含有し得る。
【００７１】
注射又は点滴に適した医薬剤形は、滅菌水溶液、分散液、又は注射若しくは点滴用滅菌溶液若しくは分散液の即時調製に適合していて、任意選択でリポソームに封入された活性成分を含む滅菌粉末を含み得る。最終的な剤形は、滅菌済み、液体で、製造及び保存の条件下で安定しているものとすべきである。液体担体又はビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、植物油、非毒性グリセリルエステル、又はそれらの適切な混合物を含む溶媒又は液体分散媒体であり得る。適切な流動度は、例えば、リポソームの形成によって、又は（分散液の場合には）必要とされる粒子サイズの維持によって、又は界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チオメルサール）によって実現することができる。多くの場合、等張剤（例えば、糖、緩衝液、塩化ナトリウム）を含めるのが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及び／又はゼラチンによって実現することができる。
【００７２】
注射用滅菌溶液は、必要に応じて上記の種々の他の成分と共に適切な溶媒に必要量の活性化合物を添加する（そして、任意選択で引き続き濾過滅菌を行う）ことによって調製することができる。注射用滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥（これによって、活性成分及び予め滅菌濾過した溶液に存在する所望のさらなる成分の粉末が得られる。）を含み得る。
【００７３】
本明細書に記載の化合物の有用な用量は、それらのインビトロ活性及び動物モデルにおけるインビボ活性を比較することによって決定することができる。マウス及び他の動物における有効用量からヒトの有効用量を推定する方法は当技術分野で公知である。例えば、米国特許第４９３８９４９号（Ｂｏｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）を参照されたい。処置における使用のために必要とされる化合物又はその活性塩若しくは誘導体の量は、選択される特定の化合物又はその塩だけでなく、投与経路、処置されている状態の性質、並びに患者の年齢及び症状によっても変動し、最終的には担当の医師又は臨床医の判断で決定される。
【００７４】
化合物の組み合わせは、好都合なことに単位剤形で投与することができ、例えば、単位剤形当たり１００〜５０００ｍｇ／ｍ２、３００〜４０００ｍｇ／ｍ２、３７０〜３７００ｍｇ／ｍ２、５０〜７５０ｍｇ／ｍ２、又は７５０〜４０００ｍｇ／ｍ２の活性成分を含有する。また、各化合物は、個別に又は組み合わせで、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、又は約１０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、若しくは約１５０ｍｇ／ｋｇ、あるいは上記の値のいずれか１つから上記の値の他のいずれか１つまでの範囲で投与することができる。また、化合物は、単独で又は組み合わせで、約１μｍｏｌ／Ｌ〜約２５μｍｏｌ／Ｌ、又は約１０μｍｏｌ／Ｌ、又は約１５μｍｏｌ／Ｌの定常状態血漿薬物濃度をもたらすように対象に投与することもできる。
【００７５】
一部の実施形態において、本発明は、約１０ｎＭ〜約１００μＭの有効濃度での化合物を提供する。他の実施形態において、有効濃度は、約２００ｎＭ〜約５０μＭ、約５００ｎＭ〜約４０μＭ、約７５０ｎＭ〜約２５μＭ、約１μＭ〜約２０μＭ、又は約１μＭ〜約１０μＭである。他の実施形態において、有効濃度は、例えば、直接プロカスパーゼ活性化アッセイ、細胞アポトーシス誘導アッセイ又は動物臨床治療評価における５０％活性濃度のような値とみなされる。一実施形態において、そのような値は約２００μＭ以下である。他の実施形態において、そのような値は約１０ｎＭ以上かつ約１０μＭ以下である。好都合なことに、所望の用量は、単回用量又は適切な間隔で投与される分割用量（例えば、１日当たり２回、３回、４回又はそれ以上の部分用量）の形をとり得る。部分用量自体も、例えば不連続な緩く間隔をあけた複数の投与回数にさらに分割され得る。
【００７６】
本明細書に記載の化合物は有効な抗腫瘍剤であり得、単一薬物の投与と比較して高い効力及び／又は低減された毒性を有し得る。本発明は、哺乳動物の癌を処置する治療的方法であって、癌に罹患した哺乳動物に有効量の本明細書に記載の化合物又は組成物を投与するステップを含む方法を提供する。哺乳動物としては、霊長類、ヒト、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギなどが挙げられる。癌は、任意の種々のタイプの悪性新生物、とりわけ、例えば、結腸癌、乳癌、黒色腫及び白血病を意味し、概して、望ましくない細胞増殖、例えば、制御されない増殖、分化の欠如、局所組織浸潤、及び転移を特徴とする。
【００７７】
癌を処置する本発明の化合物の能力は、当技術分野で公知のアッセイを用いて判定することができる。例えば、処置プロトコールの設計、毒性評価、データ解析、腫瘍細胞死滅の定量化、及び移植腫瘍スクリーンの使用の生物学的意義が知られている。さらに、癌を処置する化合物の能力は、上記アッセイ並びに本明細書で引用された引用文献及び特許文献に記載のアッセイを用いて判定することができる。
【００７８】
また、本発明は化合物のプロドラッグ形態を提供する。インビボで変換されてＰＡＣ−１又は式（Ｉ）の化合物が得られるすべての化合物がプロドラッグである。プロドラッグを形成する多く方法が当技術分野で周知である。プロドラッグ及びそれを調製する方法の例は、とりわけ、Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  １９８５）；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．４２，  ａｔ  ｐｐ．３０９−３９６，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｋ．Ｗｉｄｄｅｒ，ｅｔ．ａｌ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８５）；  Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｋｒｏｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ５，  “Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ”，  ｂｙ  Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，  ａｔ  ｐｐ．１１３−１９１，  １９９１；  Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｖｏｌ．８，  ｐ．１−３８  （１９９２）；  Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｖｏｌ．７７，  ｐ．２８５  （１９８８）；及び  Ｎｏｇｒａｄｙ（１９８５）  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐａｇｅｓ  ３８８−３９２）に見出される。
【００７９】
さらに、一部の実施形態において、ＰＡＣ−１は、ＰＡＣ−１誘導体又は他の阻害剤、例えば、米国特許第７６３２９７２号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許出願公開第２０１２／００４０９９５号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）及び同２００７／００４９６０２号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、及び米国特許出願第１２／５９７２８７号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）に記載の化合物に交換可能である。本明細書の開示と組み合わせて使用可能である、癌治療に有用な化合物、方法及び技術は、前述の文献、並びに米国特許第６３０３３２９号（Ｈｅｉｎｒｉｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、同第６４０３７６５号（Ａｌｎｅｍｒｉ）、同第６８７８７４３号（Ｃｈｏｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）及び同第７０４１７８４号（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、及び米国特許出願公開第２００４／０１８０８２８号（Ｓｈｉ）に記載されている。
【００８０】
試験を行い、癌細胞株を評価する方法は、Ｐｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００６，  ２（１０），  ５４３−５５０；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２００９，  ３８８，  １４４〜１５８；及び  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１０，  ７０（１８），  ７２３２−７２４１に記載のようにして実施することができる。
【００８１】
以下の実施例は、本発明の説明を意図したものであり、その範囲を限定するように解釈されるべきではない。当業者は、本発明を実施することができる他の多くの方法を実施例が示唆していることを容易に理解するであろう。本発明の範囲内で多くの変更及び修正がなされ得ることは理解されるべきである。
【実施例】
【００８２】
実施例１（医薬剤形）：
以下の製剤は、本明細書に記載の組み合わせ化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物（以下「化合物Ｘ」という。）を治療的又は予防的に投与するために使用され得る代表的な医薬剤形を示す。
【００８３】
（ｉ）錠剤１                        ｍｇ／錠剤
化合物Ｘ                        ２００．０
ラクトース                        ７７．５
ポビドン                          １５．０
クロスカルメロースナトリウム      １２．０
微結晶性セルロース                ９２．５
ステアリン酸マグネシウム            ３．０
４００．０
【００８４】
（ｉｉ）錠剤２                      ｍｇ／錠剤
化合物Ｘ                        １２０．０
微結晶性セルロース              ４１０．０
デンプン                          ５０．０
デンプングリコール酸ナトリウム    １５．０
ステアリン酸マグネシウム            ５．０
６００．０
【００８５】
（ｉｉｉ）カプセル剤                ｍｇ／カプセル剤
化合物Ｘ                        １１０．０
コロイド状二酸化ケイ素              １．５
ラクトース                      ４６５．５
α化デンプン                    １２０．０
ステアリン酸マグネシウム            ３．０
７００．０
【００８６】
（ｉｖ）注射剤１（１ｍｇ／ｍＬ）    ｍｇ／ｍＬ
化合物Ｘ                            １．０
二塩基性リン酸水素ナトリウム      １２．０
一塩基性リン酸ナトリウム            ０．７
塩化ナトリウム                      ４．５
１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液        ｑ．ｓ．（７．０〜７．５にｐＨ調整）
注射用蒸留水                        ｑ．ｓ．ａｄ  １ｍＬ
【００８７】
（ｖ）注射剤２（１０ｍｇ／ｍＬ）    ｍｇ／ｍＬ
化合物Ｘ                          １０．０
一塩基性リン酸ナトリウム            ０．３
二塩基性リン酸ナトリウム            １．１
ポリエチレングリコール４００    ２００．０
０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液        ｑ．ｓ．（７．０〜７．５にｐＨ調整）
注射用蒸留水                        ｑ．ｓ．ａｄ  １ｍＬ
【００８８】
（ｖｉ）エアロゾル剤                ｍｇ／缶
化合物Ｘ                              ２０
オレイン酸                            １０
トリクロロモノフルオロメタン      ５０００
ジクロロジフルオロメタン        １００００
ジクロロテトラフルオロエタン      ５０００
【００８９】
これらの製剤は、薬学分野で周知の従来の手順によって調製することができる。異なる量及びタイプの活性成分（「化合物Ｘ」）に適合するように周知の製薬技術に従って上記医薬組成物が変更可能であることは理解されよう。エアロゾル製剤（ｖｉ）は、標準的な定量エアゾールディスペンサーと組み合わせて使用され得る。また、特定の成分及び割合は説明目的で示されているものである。成分は適切な同等物に変更され得、割合は、当該剤形の所望の特性に応じて変更され得る。
【００９０】
特定の実施形態について上記の実施形態及び実施例を参照して説明したが、そのような実施形態は例示的なものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。変更及び修正は、添付の特許請求の範囲で規定されているより広範な態様の発明から逸脱することなく、当技術分野における通常の技術に従って行うことができる。
【００９１】
すべての刊行物、特許、及び特許文献は、参照により個別に組み入れられるように、参照により本明細書に組み入れられる。本開示と整合しない限定はそれらから理解されるべきではない。本発明は、種々の具体的な好ましい実施形態及び技術に関連して記載されている。しかし、本発明の精神及び範囲内で多くの変更及び修正がなされ得ることは理解されるべきである。
【図１】
2015511956.tif 000022
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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