(57)【要約】  本発明は、血清中の遊離銅を定量する新規な方法に関する。特に、アルツハイマー病及びウィルソン病並びに他の形態の遊離銅ホメオスタシス不全の患者の血清サンプル中の遊離銅を定量する、高い感度及び正確度を備えた方法に関する。本発明はまた、フィルター装置及びクマリン蛍光プローブを含む、血清中の遊離銅を定量するためのキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液サンプル中の遊離銅の濃度を測定するインビトロの方法であって、
ａ）２００〜５００μＬ／分の濾過速度を使用して、０．１〜０．５μｍのポアサイズを有するメンブレンフィルターを用いて該サンプルの全血から血清を分離するステップと；
ｂ）クマリン蛍光プローブを使用して、ステップａ）で得られた血清サンプル中の遊離銅の濃度を測定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記メンブレンフィルターが、０．１〜０．２μｍのポアサイズを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クマリン蛍光プローブが、０．１〜１０μＭの濃度範囲で使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記クマリン蛍光プローブが、ＨＥＰＥＳ：ＤＭＳＯ溶液中で使用される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップｂ）が、校正曲線を作製するさらなるステップを含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ステップｂ）において、４３０ｎｍの励起波長（λｅｘ）及び４９０ｎｍの吸収波長（λｅｍ）が使用される、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記分離ステップが、前記メンブレンフィルターを含むフィルター装置を使用して行われる、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記フィルター装置が、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）で鋳型成形による装置である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記フィルター装置（１）が、
−  １つ又は複数のマイクロチャネルを含む底部（２）と；
−  蓋部（３）とをさらに含み、
前記メンブレンフィルター（４）が、該蓋部に組み込まれ、該マイクロチャネルより上にある、請求項７から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記メンブレンフィルターが、ポリカルボナートメンブレンフィルターである、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記クマリン蛍光プローブが、以下の一般構造式を有する化合物から選択される、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【化１】
2015535345.tif 000007
（式中、
Ｒ１は、Ｎ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、ｎは、０〜５であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、シクロへキシルである）
【請求項１２】
前記クマリン蛍光プローブが、以下の構造式を有する化合物から選択される、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【化２】
2015535345.tif 000008
【請求項１３】
ステップｂ）で測定した値を閾値（カットオフ）と比較し、遊離銅の濃度がより高いとアルツハイマー病の臨床診断が確認されるさらなるステップｃ）を含む、アルツハイマー病の疑いのある患者においてアルツハイマー病の臨床診断を確認するための請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記閾値が、０．５〜５０μＭである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者が、銅の表現型機能障害を有する、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法のステップａ）及びｂ）を、引き続き採取された前記患者の血液サンプルで繰り返し、前記患者の血清サンプル中の遊離銅の濃度の時間的推移を評価する、患者のアルツハイマー病の予後診断のための請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ステップｂ）で定量した値を閾値（カットオフ）と比較するさらなるステップｃ）であり、遊離銅の濃度がより高いと軽度認知障害（ＭＣＩ）からアルツハイマー病への移行が示唆されるステップｃ）を含む、軽度認知障害を患っている患者において軽度認知障害からアルツハイマー病への移行を予測するための請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記閾値が、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記閾値が、０．５〜３μＭである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記閾値が、１．６μＭである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
血清中の遊離銅を検出するキットであって、０．１〜０．５μｍのポアサイズを有するメンブレンフィルターを備える１個又は複数個のフィルター装置と、１個又は複数個のクマリン蛍光プローブとを含む、キット。
【請求項２２】
既値の遊離銅を有する対照の１つ又は複数のアリコートをさらに含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記フィルター装置が、
−  １つ又は複数のマイクロチャネルを含む底部（２）と；
−  蓋部（３）とをさらに含み、
前記メンブレンフィルター（４）が、該蓋部に組み込まれ、該マイクロチャネルより上にある、請求項２１又は２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記フィルター装置が、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）の鋳型成形による装置である、請求項２１から２３までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
前記クマリン蛍光プローブが、以下の一般構造式を有する化合物から選択される、請求項２１から２４までのいずれか一項に記載のキット。
【化３】
2015535345.tif 000009
（式中、
Ｒ１は、Ｎ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、ｎは、０〜５であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、シクロへキシルである）
【請求項２６】
前記クマリン蛍光プローブが、以下の構造式を有する化合物から選択される、請求項２１から２５までのいずれか一項に記載のキット。
【化４】
2015535345.tif 000010
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、「遊離(free)」銅、すなわち、セルロプラスミンに構造上結合されていない血清銅の一部であり、最近では血清中の「不安定(labile)」銅とも呼ばれている「遊離」銅を測定する新規な方法に関する。特に、アルツハイマー病患者の血清サンプル中の遊離銅を測定する、高い感度及び正確度を有する方法に関する。本発明はまた、フィルター装置及びクマリン蛍光プローブを含む、血清中の遊離銅を定量するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血清銅の測定は、多くの疾患、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）のような疾患において根本的に重要である。アルツハイマー病は、記憶喪失及び進行性認知症を特徴とする神経障害である。この疾患の遅発型形態は、散発性であり、複合的な病因を有し、最も広く受け入れられているリスク因子として家族性及び年齢がある。この疾患の原因は、神経原線維変化におけるβアミロイド（Ａβ）ペプチド及びタウタンパク質の脳内での凝集に密接に関連していると思われる。さらに、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）遺伝子のε４アレルは、たとえそれがある割合のアルツハイマー病の遺伝性を説明するに過ぎず、確認すべきいくつかの遺伝的リスク因子が残されているとは言え、アルツハイマー病のリスクを増加させ、発病年齢を低下させることが証明されている。「アミロイドカスケード」は、最も一般に知られているアルツハイマー仮説と言われているが、最近、この疾患に関し新たな詳細が明らかになるにつれ、多様な形態をとっていることがわかった。実際、様々な病原性経路が、アルツハイマー病の発症及び進行に寄与すると仮定されている。例えば、疾患カスケードに関わる病原性経路には、Ａβオリゴマー及び有毒なタウ凝集体の他に、酸化障害、異常性炎症又はエネルギー代謝障害が指摘されており、ターゲットとすべき必要がある。主に金属酸化還元反応による酸化ストレスがアルツハイマー病脳に損傷をもたらし得るという多くの証拠がある。具体的には、Ａβペプチドの過剰な金属化が、酸化ストレス及びＨ２Ｏ２産生の酸化還元サイクル、Ａβオリゴマー形成及び沈降の基礎になり得ることが提案されている。金属ホメオスタシスの障害が不安定銅の貯蔵をまねいて、この銅が脳の銅貯蔵所に供給される恐れがあり、これにより、Ａβ−酸化ストレスサイクルが始まって、アルツハイマー病カスケードへの多面的影響が引き起こされる可能性がある。この見解は、現在、アルツハイマー病において銅がわずかではあるが有意に増加したこと、セルロプラスミンに結合されていない銅（「遊離」銅とも呼ばれる）の血清プールでの特異的で比較的に大きな増加がアルツハイマー病のいくつかの典型的な徴候及び脳脊髄液マーカーに関連すること、並びに非常に軽度の認知障害を訴えている対象においてはすでに明白であることを示す様々な方面からの証拠によって支持されている。銅の機能障害が、たとえこの疾患の唯一の決定因子として仮定することができなくても、確かな臨床的、疫学的、実験的、メタ分析及び遺伝的証拠によって支持されていると思われるので、アルツハイマー病の重要なリスク因子としての、関連があるというよりはむしろ原因となる役割を担っていると言うことができる。
【０００３】
セルロプラスミンは、血液中で主に銅を運搬するタンパク質であり、血清中の主要なフェロキシダーゼタンパク質であり、銅原子６個と構造的に結合して活性ホロ型タンパク質を形成する。これが循環銅の８５〜９５％を占めることがあり、残りが遊離銅である。実際、以前の研究において、本発明者らは、以下のような計算で、銅及びセルロプラスミンの測定から遊離銅を推定していた。血清銅濃度は、プラットフォームＨＧＡ８００を有する黒鉛炉を備えたＡａｎａｌｙｓｔ  ３００  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ原子吸光分光光度計を利用する原子吸光分光分析（ｓｐｒｅｔｔｒｏｓｃｏｐｙ）技術を用いて、又はＡｂｅら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、１９８９年（Ｒａｎｄｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｒｕｍｌｉｎ、ＵＫ）の比色法に従って測定することにより、二重チェックした。セルロプラスミンは、Ｗｏｌｆ  Ｐｌ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｓｃｉ、１９８２年による免疫比濁アッセイ（Ｈｏｒｉｂａ  ＡＢＸ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、フランス）によって分析した。各血清銅とセルロプラスミンの対に関しては、セルロプラスミンに結合されている銅（ＣＢ）の量及びセルロプラスミンに結合されていない銅（「遊離」銅）の量を、Ｗａｌｓｈら、Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２００３年に開示の標準手順に従ってコンピュータ計算した。この計算は、「遊離」銅をμｍｏｌ／Ｌで表し、セルロプラスミンが０．３％の銅を含有するという証拠に基づいている。
【０００４】
さらに、本発明者らは、最近、以前の方法に従って、基質としてｏ−ジアニシジン（ｄｉａｎｓｉｄｉｎｅ）二塩酸塩を利用するセルロプラスミン酸化酵素活性を自動測定する手順を提起した。実際、本発明者らの以前の研究で示したように、免疫学的に得られたセルロプラスミンの値は、酵素的に、つまり、タンパク質の酸化酵素活性をモニタリングして得られた値よりも高くなることがよく知られている。これは、アポ型セルロプラスミンが生物学的に不活性だからである。結果として、上述の方法及び計算によって導かれた遊離銅の値は低く見積もられる。
【０００５】
しかし、標準セルロプラスミン溶液に基づいた酵素法によるセルロプラスミンの定量化は、そのコスト、市販のセルロプラスミンの純度の変動、及び血清酵素を国際単位（ＵＩ）で報告するという一般的な勧告のために、現況技術では採用の検討がされていない。以前、本発明者らは、商業規格のタンパク質（ヒト血清セルロプラスミン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の酸化酵素活性からセルロプラスミン量の定量化を試みたが、このタンパク質の酸化酵素活性を分光学的に検査したところ、日毎の（ｄａｙ−ｔｏ−ｄａｙ）アッセイではタンパク質の吸光度ピークが減衰することが明らかになり、遊離銅値の推定に必要となるタンパク質量の定量化に酵素検出を使用すると信頼度が低下した。
【０００６】
Ｈｙｏ  Ｓｕｎｇ  Ｊｕｎｇら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９年）は、生物系の遊離銅を定量するための様々なクマリンプローブの合成及び使用を開示していた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の範囲は、従来技術の方法で生じる遊離銅の過小推定又は過大推定を回避して、血清中の遊離銅を直接測定する新規な方法及びキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、血清中の遊離銅を測定するインビトロの方法及びキットに関する。実施例にも示すように、本発明者らは、全血から血清を分離するいくつかの方法を使用すると、１０％〜２０％の遊離銅の損失が起こることを見出した。さらに、本発明者らは、銅を結合しやすい様々な蛍光プローブを使用すると、プローブと血清との間に非特異的相互作用が起こることを見出した。
【０００９】
本明細書に記載する本発明は、フィルター膜を使用して全血から血清を分離するためのいくつかのパラメータの選択、及び遊離銅を検出するための特定クラスのスイッチオフ蛍光プローブの選択に基づくものである。本出願で設定した条件下でクマリン蛍光プローブを使用すると、血液サンプル中の遊離銅を、全血から血清を分離する間の遊離銅の損失を回避して、高い正確度及び感度で測定することが可能になる。
【００１０】
したがって、本発明の一目的は、以下のステップを含む、血液サンプル中の遊離銅の濃度を測定するインビトロの方法である：
ａ）２００〜５００μＬ／分の濾過速度を使用して、０．１〜０．５μｍのポアサイズを有するメンブレンフィルターで前記サンプルの全血から血清を分離するステップ；
ｂ）クマリン蛍光プローブを使用して、ステップａ）で得られた血清サンプル中の遊離銅の濃度を測定するステップ。
【００１１】
本発明の別の一目的は、上記ステップａ）及びｂ）と、ステップｂ）で定量した値を閾値（カットオフ）と比較し、遊離銅の濃度がより高いとアルツハイマー病の臨床診断が確認されるさらなるステップｃ）を含む、アルツハイマー病の疑いのある患者においてアルツハイマー病の臨床診断を確認するために遊離銅の濃度を測定するインビトロの方法である。
【００１２】
本発明の別の一目的は、上記方法のステップａ）及びｂ）を、引き続き採取された前記患者の血液サンプルで繰り返し、前記患者の血清サンプル中の遊離銅の濃度の時間的推移を評価する、患者のアルツハイマー病の予後診断のために遊離銅の濃度を測定するインビトロの方法である。
【００１３】
本発明の別の一目的は、上記ステップａ）及びｂ）と、ステップｂ）で定量した値を閾値（カットオフ）と比較し、遊離銅の濃度がより高いと軽度認知障害（ＭＣＩ）からアルツハイマー病への移行が示唆されるさらなるステップｃ）を含む、軽度認知障害を患っている患者において軽度認知障害からアルツハイマー病への移行を予測するために遊離銅の濃度を測定するインビトロの方法である。
【００１４】
本発明の別の一目的は、血清中の遊離銅を検出するためのキットであって、０．１〜０．５μｍのポアサイズを有するメンブレンフィルターを備えた１個又は複数個のフィルター装置と、１個又は複数個のクマリン蛍光プローブを含むキットである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＨＥＰＥＳ：ＤＭＳＯ（９：１）中にＣｕ＋＋（１０−４Ｍ）が存在する場合のクマリン蛍光プローブ、７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−Ｎ−（（ピリジン−２−イル）メチル）−２Ｈ−クロメン−３−カルボキサミド（λｅｘ＝４３０ｎｍ、λｅｍ４９０ｎｍ）の校正曲線を示す図である。
【図２】ＨＥＰＥＳ：ＤＭＳＯ（９５：５）と共にＣｕ＋＋（１０−５Ｍ）が存在する場合のクマリン蛍光プローブ、７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−Ｎ−（（ピリジン−２−イル）メチル）−２Ｈ−クロメン−３−カルボキサミド（λｅｘ＝４３０ｎｍ、λｅｍ４９５ｎｍ）の校正曲線を示す図である。
【図３】受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図である。本発明の一実施形態に従って７０２個のサンプルを分析した。この曲線から、本発明を使用すると、アルツハイマー病の診断が高い特異性（８０％）及び離散感度（discrete sensitivity）（６０％）で得られることが分かる。
【図４】本発明の一実施形態で使用するフィルター装置を示す図である。
【図５】遊離血清銅レベルに準じて、アルツハイマー病の影響を受けている患者のミニメンタルステート検査の悪化の確率を予測するモデル図である。円は、患者の遊離血清銅の値を表す。線は、ミニメンタルステート検査Ｅの悪化の予測確率のモデルを表す。個々のアルツハイマー病患者の遊離銅レベルは、ｚスコア、すなわち、平均値からの標準偏差で表す。今回の研究パネルからの、２．１μｍｏｌ／Ｌの遊離銅値に対応する、ｚスコアが−０．１３８より高い患者らは、このようなレベルより低い「遊離」銅値を有する患者らよりも悪化する確率が高くなった。
【図６】遊離銅による、軽度認知障害対象と健常な対照及びアルツハイマー患者との相違を示す図である。アルツハイマー病グループも考慮すると、銅及び遊離銅は、健常者から軽度認知障害対象を経てアルツハイマー病患者に向かって明瞭な傾きを示した。この傾きは、アルツハイマー病グループの遊離銅の急激な増大のために、すべての銅の場合（イータ二乗＝４．９％）よりも遊離銅（イータ二乗＝１４．５％）の場合において明白であった（Ｓｑｕｉｔｔｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ａｌｚ．Ｄｉｓｅａｓｅ、２０１１年）。
【図７】遊離銅はまた、軽度認知障害を訴えており、アルツハイマー病認知症の完全な診断症状を発症するであろう対象のパーセンテージを予測することができる。遊離銅が＞１．６μＭの軽度認知障害対象は、アルツハイマー病への移行パーセンテージがより高く、年間１７％であり、遊離銅が≦１．６μＭの軽度認知障害対象に関しては、年間１０％である。カプラン−マイヤー統計分析から、遊離銅が＞１．６μＭの軽度認知障害対象は、遊離銅が≦１．６μＭの対象よりもアルツハイマー病への移行割合が高く、遊離銅が≦１．６μＭの軽度認知障害対象の２５〜３０％が３年半以内に移行するのに比べ、アルツハイマー病におけるその移行パーセンテージは、最初の２年以内で２４〜３５％であることが確認されている。注目すべきは、この分析を５年の追跡調査に制限すると、遊離銅が≦１．６μＭの軽度認知障害対象におけるアルツハイマー病への移行パーセンテージは５０％未満であるが、遊離銅が＞１．６μＭの軽度認知障害コホートにおいては患者の半分が４〜６年以内に移行している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
前に示したように、本発明は、血液サンプル中の遊離銅の濃度を測定するインビトロの方法に関する。本発明の説明では、用語「遊離銅(free copper)」は、セルロプラスミンに構造上結合されていない体循環における銅を意味する。最近、これは、アルブミン、小ペプチド、アミノ酸、及び他の微量要素に不安定結合し(labile bound)、それらの間で容易に交換可能であるという性質を指して、「不安定(labile)」銅とも呼ばれる。遊離銅は、血液脳関門を越えて、脳の中の組織に容易に達することができる低分子量の銅である。これはまた、ウィルソン病、銅中毒症又は蓄積症の系列疾患の臨床診断を下すのに利用する７個のマーカーのうちの１個である。
【００１７】
全血から血清を分離するために、本方法は、０．１〜０．５μｍ、好ましくは０．１〜０．２μｍ、より好ましくは０．１〜０．１５μｍのポアサイズを有するメンブレンフィルターを使用して血液サンプルを濾過して、全血から血清を分離する第１のステップ（ａ）を含む。メンブレンフィルターは、例えばポリカルボナートメンブレンフィルターである。
【００１８】
濾過速度は、２００〜５００μｌ／分、例えば、２５０、３００、３５０、４００、４５０μｌ／分である。
【００１９】
本発明の一実施形態によれば、メンブレンフィルターは、フィルター装置内にある。本発明の方法での使用に適したフィルター装置の例（図４）は、１つ又は複数のマイクロチャネルを含む底部２と、蓋部３とを含み、前記メンブレンフィルター４は、前記蓋部に組み込まれ、前記マイクロチャネルより上にある。メンブレンフィルターは、２層を接合する前に蓋部に組み込まれる。
【００２０】
本発明の一実施形態によれば、フィルター装置は、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）の鋳型成形による装置である。
【００２１】
本発明の別の一実施形態によれば、フィルター装置は、Ｔｈｏｒｓｌｕｎｄ  Ｓ．ら、Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ（２００６年）に開示のマイクロ流体装置であり、これを参照により本明細書に組み込む。
【００２２】
分離ステップａ）を実施する前に、全血から血清を分離するのにより適したサンプルを得るために、血液サンプルに、当技術分野で公知の１つ又は複数の任意選択のステップを施してもよい。
【００２３】
本方法は、（ｂ）クマリン蛍光プローブを使用して、ステップ（ａ）で得られた血清サンプル中の遊離銅を測定する第２のステップを含む。クマリン蛍光プローブは、［Ｃｕ＋＋］に結合すると蛍光発光の減衰を記録することができるキレート蛍光プローブである。クマリン蛍光プローブは、例えば、以下の一般構造式を有する化合物から選択することができる。
【化１】
2015535345.tif 000002
（式中、
Ｒ１は、Ｎ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、ｎは、０〜５であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、シクロへキシルである）
【００２４】
本発明の一実施形態によれば、前記クマリン蛍光プローブは、Ｒ１がＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２（但し、ｎ＝１）であり、Ｒ２がＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、シクロヘキシルである上述の群から選択され、オルト位、パラ位又はメタ位にある。
【００２５】
本発明の別の一実施形態によれば、前記クマリン蛍光プローブは、Ｒ１がＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２（但し、ｎ＝２）であり、Ｒ２がＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、シクロヘキシルである上述の群から選択され、オルト位、パラ位又はメタ位にある。
【００２６】
本発明の別の一実施形態によれば、前記クマリン蛍光プローブは、Ｒ１がＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２（但し、ｎ＝３）であり、Ｒ２がＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、シクロヘキシルである上述の群から選択され、オルト位、パラ位又はメタ位にある。
【００２７】
本発明の別の一実施形態によれば、前記クマリン蛍光プローブは、Ｒ１がＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２（但し、ｎ＝４）であり、Ｒ２がＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、シクロヘキシルである上述の群から選択され、オルト位、パラ位又はメタ位にある。
【００２８】
本発明の別の一実施形態によれば、前記クマリン蛍光プローブは、Ｒ１がＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２（但し、ｎ＝５）であり、Ｒ２がＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、シクロヘキシルである上述の群から選択され、オルト位、パラ位又はメタ位にある。
【００２９】
本発明の別の一実施形態によれば、前記クマリン蛍光プローブは、以下の構造式を有する７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−Ｎ−（（ピリジン−２−イル）メチル）−２Ｈ−クロメン−３−カルボキサミドである。
【化２】
2015535345.tif 000003
【００３０】
クマリン蛍光プローブは、例えば、ＰＢＳ又はＨｅｐｅｓのような緩衝液に混合されたＥｔＯＨ、ＭｅＯＨ、ＤＭＳＯのような有機溶媒中で使用することができる。一実施形態では、クマリン蛍光プローブは、ＨＥＰＥＳ：ＤＭＳＯ溶液中で使用する。
【００３１】
クマリン蛍光プローブは、好ましくは０．１〜１０μＭの濃度範囲、例えば、１、２．５、５．０、９μＭで使用する。本発明者らは、この範囲において、サンプル中の遊離銅の濃度と蛍光発光との間に直接的相関があり、励起波長（λｅｘ）が例えば４３０ｎｍ、吸収波長が（λｅｍ）４９０ｎｍであることを見出した。
【００３２】
血清中の遊離銅の濃度を測定するために、ステップｂ）は、蛍光の減少と遊離銅の濃度を結ぶ校正曲線を作製するさらなるステップを含んでもよい。この曲線を作製するために、既知の濃度の遊離銅の１つ又は複数のアリコートを使用することができる。好ましくは、この曲線は、０．１〜１０μＭの範囲にある（図１を参照）。
【００３３】
先に報告したように、アルツハイマー病を患っている患者では、セルロプラスミンに結合されていない血清銅（「遊離」銅）の、わずかな増加ではあるが、アルツハイマー病患者と健常な高齢の対象（アルツハイマー病の初期段階にある対象でも）との相違を示すのに通常十分な増加が見られる。
【００３４】
したがって、本発明の一目的は、上記ステップａ）及びｂ）と、ステップｂ）で測定した値を閾値（カットオフ）と比較し、遊離銅の濃度がより高いとアルツハイマー病の臨床診断が確認されるさらなるステップｃ）を含む、アルツハイマー病の疑いのある患者においてアルツハイマー病の臨床診断を確認するためのインビトロの方法である。
【００３５】
遊離銅の閾値（カットオフ）は、例えば、健常な個体及びアルツハイマー病の個体の一組のサンプル（統計的に有意）の濃度を処理することで得られるＲＯＣ曲線（受信者動作特性）によって決定することができる。このような処理から、例えば０．５〜５０μＭ、例えば、１、５、８、１０、１５、２０、３０、３５、４０、４５μＭのある特定の閾値が得られた。
【００３６】
好ましくは、前記診断方法は、疾患形態が散発性のアルツハイマー病患者の約６０％に見られる「銅の表現型機能障害」のアルツハイマー病の疑いのある患者におけるアルツハイマー病の臨床診断のための確認試験として使用される。
【００３７】
Ｓｑｕｉｔｔｉら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（２００９年）が示すように、患者のアルツハイマー病の予後をモニタリングするため、並びに軽度認知障害（軽度認知障害）からアルツハイマー病への移行を予測するためには、前記患者の血清中の遊離銅の濃度を測定することが重要である。具体的には、遊離銅は、線形回帰モデルによるベースラインのミニメンタルステート検査に対して調整されたミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）において年変化を予測する。これは、ミニメンタルステート検査での年変化を＜３又は≧３ポイントに分けた場合、性別、年齢、及び教育歴のみによるミニメンタルステート検査の悪化の予測確率が２．４％であったのを、２３％のミニメンタルステート検査の悪化の予測確率へと上昇させた（ＯＲ＝１．２３；９５％ＣＩ＝１．０３〜１．４７；ｐ＝．０２２）；このケースでは、遊離銅はより深刻な退化が起こるかどうかの唯一の予測因子であった（図５）。
【００３８】
軽度認知障害の臨床状態は、記憶障害を特徴としており、これは客観的測定で検証できるが、認知症の定義を与えるものではない。正確な診断の重要性は、状態が軽いにもかかわらず、軽度認知障害がアルツハイマー病の前兆と通常考えられているということにある。これは軽度認知障害からアルツハイマー病へ進行する割合が統計的に高いためである。
【００３９】
通常、健常な状態からアルツハイマー病への年間の移行割合は、０．１７％〜３．８６％の範囲である。軽度認知障害からアルツハイマー病への移行割合は、著しくより高く、臨床経過（clinical series）に応じて６％〜４０％の範囲である。あるケースでは、軽度認知障害が、認知症に進行しない良性状態の場合がある。遊離銅は、軽度認知障害対象と健常な対照個体とを区別し、これは、この２つの群の平均を比較することで明らかになる（図６）。遊離銅はまた、軽度認知障害を訴えており、アルツハイマー病認知症の完全な診断に発展するであろう対象のパーセンテージを予測することができる。遊離銅が＞１．６μＭの軽度認知障害対象は、アルツハイマー病への移行パーセンテージがより高く、年間１７％であり、遊離銅が≦１．６μＭの軽度認知障害対象に関しては、年間１０％である。カプラン−マイヤー統計分析では、遊離銅が＞１．６μＭの軽度認知障害対象は、遊離銅が≦１．６μＭの対象よりもアルツハイマー病への移行割合が高く、遊離銅が≦１．６μＭの軽度認知障害対象の２５〜３０％が３年半以内に移行するのに比べ、遊離銅が＞１．６μＭの軽度認知障害対象では、アルツハイマー病におけるその移行パーセンテージは最初の２年以内で２４〜３５％であることが確認されている。注目すべきは、この分析を５年の追跡調査に制限すると、遊離銅が≦１．６μＭの軽度認知障害対象におけるアルツハイマー病への移行パーセンテージは５０％未満であるが、遊離銅が＞１．６μＭの軽度認知障害群においては患者の５０％が４〜６年以内に移行している（図７）。
【００４０】
したがって、本発明の別の一目的は、上記ステップａ）及びｂ）と、ステップｂ）で定量した値を閾値（カットオフ）と比較し、遊離銅の濃度がより高いと軽度認知障害からアルツハイマー病への移行が示唆されるさらなるステップｃ）を含む、軽度認知障害（ＭＣＩ）を患っている患者において軽度認知障害からアルツハイマー病への移行を予測するために遊離銅の濃度を測定するインビトロの方法である。この閾値は、例えば０．５〜３μＭ、好ましくは１．６μＭである。
【００４１】
前記予測方法のステップａ）及びｂ）は、上述のステップａ）及びｂ）のいずれの実施形態によっても実施することができる。
【００４２】
本発明の別の一目的は、上述のステップａ）及びｂ）の任意の実施形態によって、本方法のステップａ）及びｂ）を、様々な時期に採取した前記患者のより多くのサンプルで行い、各サンプルから得られた定量化データを、別の定量化データと比較して、それにより前記患者の血清サンプル中の遊離銅の濃度の時間的推移を構築する、患者のアルツハイマー病の予後診断のためのインビトロの方法である。
【００４３】
本発明の別の一目的は、血清中の遊離銅を検出するキットであって、０．１〜０．５μｍ、好ましくは０．１〜０．２μｍ、より好ましくは０．１〜０．１５μｍのポアサイズを有するメンブレンフィルターを備えた１個又は複数個のフィルター装置と、１個又は複数個のクマリン蛍光プローブとを含むキットである。
【００４４】
キットのフィルター装置は、本発明の説明に開示したいずれのフィルター装置でもよく、例えば、１つ又は複数のマイクロチャネルを含む底部２と、蓋部３とを含み、メンブレンフィルター４が、前記蓋部に組み込まれ、前記マイクロチャネルより上にあるフィルター装置である。キットでは、本願の詳細な説明に開示した任意のクマリン蛍光プローブと組み合わせて任意のメンブレンフィルターを使用することができる。
【００４５】
一実施形態では、キットは、既値の遊離銅を有する対照の１つ又は複数のアリコートをさらに含み、これらの対照を校正曲線の作製に使用することができる。
【実施例】
【００４６】
１．クマリン蛍光プローブの合成
クマリン蛍光プローブの合成は、参照により本明細書に組み込むＨｙｏ  Ｓｕｎｇ  Ｊｕｎｇら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９年）に報告されるように、以下のスキームを使用して行った：
【化３】
2015535345.tif 000004
試薬：Ａ：ピペリジン、酢酸（Ａｃｅｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）；Ｂ：ＮａＯＨ／Ｈ２Ｏ；ＥｔＯＨ、ＨＣｌ；Ｃ：２−（アミノメチル）−ピリジン、ＤＣＣ／ＤＭＡＰ。
【００４７】
２．クマリン蛍光プローブの分光学的性質の評価
プローブの吸収スペクトル及び発光スペクトルを、いくつかの溶媒を使用して、ＬＳ５５  ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ分光蛍光計で記録した。評価した有機溶媒は、ｐＨ７．２の、ＥｔＯＨ、ＭｅＯＨ、ＤＭＳＯを含むＰＢＳ、Ｈ２Ｏ又はＨｅｐｅｓ緩衝液である。水性環境中のプローブの挙動とスペクトルのデータの評価の両方を考慮したところ、最良の結果は、Ｈｅｐｅｓ：ＤＭＳＯ（９５：５）の混合物で得られた。これらのデータから、いくつかのアッセイを行い、生物学的サンプル中の［Ｃｕ＋＋］の結合に有用であろうプローブの適切な濃度を確立した。ＨＥＰＥＳ：ＤＭＳＯ（９：１）中にＣｕ＋＋（１０−４Ｍ）が存在する場合の蛍光プローブ（λｅｘ＝４３０ｎｍ、λｅｍ４９０ｎｍ）の校正曲線を図１に示している。これにより、試験溶液でのプローブの有用な濃度が実証された。
【００４８】
３．分光学的及び生物学的性質の最適化
９６ウェル／プレートを使用して、方法を改良することを考えた。これにより、作業時間が短縮され、様々な操作に対して最も実用的な方法を行うことが可能になる。このために、我々は、Ｖｉｃｔｏｒ  ＩＩＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、プローブの実験条件をチェックした。励起波長及び吸収波長は、我々が蛍光計で事前に測定したものと明らかに似ている（λｅｘ＝３８０ｎｍ、λｅｍ＝４９５ｎｍ）。最適な用量は、１０−５Ｍである。実際、Ｖｉｃｔｏｒ  ＩＩＩを使用した際の、濃度が１０−４Ｍでのプローブの校正曲線は、良好な相関性を示したが、蛍光シグナルが非常に高く、特に低い用量において差が認められなかった。したがって、ＣｕＣｌ２の用量を増加させることでプローブの校正曲線を構築して、プローブのスイッチオフを評価し、銅イオンの濃度の定量に有用な式を見出した。ＣｕＣｌ２のこれらの用量は、０、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、５、７、１０、１５、２０μＭを使用した。ＨＥＰＥＳ：ＤＭＳＯ（９５：５）と共にＣｕ＋＋（１０−５Ｍ）が存在する場合の蛍光プローブ（λｅｘ＝４３０ｎｍ、λｅｍ４９５ｎｍ）の校正曲線を図２に示す。非常に良好な相関性が用量：０．１μＭ〜１０μＭの範囲に見出した。
【００４９】
４．血清サンプル中の遊離銅を精製するためのいくつかの方法を示す比較例：
既知の濃度の遊離銅を含む血液サンプルを、以下のステップを使用して処理した：
Ａ．超遠心分離機、１時間、４００００ｒｐｍ
Ｂ．アセトニトリルでの処理及び超遠心分離機
Ｃ．ステップ１：サンプルをアセトニトリル（１０％）で処理；ステップ２：遠心分離、３０分、１４０００ｒｐｍ；ステップ３：様々な型のフィルタリング装置：
−  Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００カットオフ５０００ダルトンＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）膜。
−  Ｖｉｖａｓｐｉｎ２カットオフ１００００ダルトンＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）膜。
−  Ｖｉｖａｓｐｉｎ２カットオフ１００００ダルトンＲＣ  Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（再生セルロース）膜。
【００５０】
本発明者らは、これらのフィルターを用いて以下のこれらの結果を得た：
−  サンプル番号１８７４＝０．９０４μＭ
−  サンプル番号１８７６＝６．５５μＭ
−  サンプル番号２０４５＝４．９７μＭ
【００５１】
これらのフィルターを使用することで、いくつかの状況が明示された：
１．使用したフィルターの接着性（推定される銅の損失は１０％〜２０％、投与が行われたサンプルに対しても同様）；
２．プローブと血清との間の非特異的相互作用。
これらの問題は、例えば、参照により本明細書に組み込むＴｈｏｒｓｌｕｎｄ  Ｓ．ら、Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ（２００６年）８：７３〜７９頁に開示されるマイクロ流体装置を使用することで克服された。この文献では、ポリカーボナート（ｐｏｌｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）膜が使用されている。
【００５２】
５．ＲＯＣ曲線を使用しての本方法の感度及び特異性の評価
研究はＩＲＢによって承認され、すべての被験者又は法定後見人がインフォームドコンセントに署名した。表１に、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の作成に使用した研究集団の人口統計学的、臨床的及び分子的特性を報告した。７０２個のサンプルを本発明の一実施形態に従って分析した。ＲＯＣ曲線から、本発明を使用すると、アルツハイマー病の診断が高い特異性（８０％）及び離散系感度（６０％）で得られることが分かる。アルツハイマー病患者サンプルは、２５以下のミニメンタルステート検査スコアを有し、２００２年１月〜２０１１年６月にローマ、ティベリーナ島のファーテベネフラテッリ病院、神経科学科に入院していた、ほぼ確実にアルツハイマー病であろうと診断（ＮＩＮＣＤＳ−アルツハイマー病ＲＤＡ診断基準）された個体からなるものであった。この調査に関わったアルツハイマー病患者の約８５％が、以前の研究にも関わっていた。２個のグループにおいて、患者の平均では、年齢に関してはわずかに差があったが、性別に関しては一致させた。アルツハイマー病患者は、神経学的な神経画像処理（磁気共鳴画像法又はコンピュータ断層撮影）及び広範な神経心理学的評価並びに日常検査を受けた。対照サンプルは、神経学的及び精神医学的疾患の臨床的証拠を有さない高齢のボランティアからなるものであった。患者と対照の両方を、銅代謝に影響を与えることが知られている状態が存在するかどうかについて評価し、酸化ストレスの生物学的変数（例えば、真性糖尿病、炎症性疾患、心不全又は呼吸不全の最近の既往症、慢性的な肝不全又は腎不全、悪性腫瘍、及びアルコール中毒の最近の既往症）を除外した。すべての被験者が、微量金属、酸化ストレスの生物学的変数、及びＡＰＯＥ遺伝子型解析のアッセイを受けた。ＲＯＣ曲線（図３）から、遊離銅がアルツハイマー病を診断するための裏付け試験として優れた信頼性を有することが明らかになった。遊離銅の感度及び特異性を、アルツハイマー病の診断を下すために臨床上の慣例手順で最もよく使用される２種の裏付け試験、すなわち、内側側頭葉萎縮（ＭＴＡ）及びＡＰＯＥのものと比較すると、この考え方はいっそう強いものとなる（表２）。
【００５３】
前記サンプルの全血からの血清の分離は、Ｔｈｏｒｓｌｕｎｄ  Ｓ．ら、Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ（２００６年）に開示されるマイクロ流体装置を使用して行った。
【００５４】
これらのデータは、以下のことを示唆している：
−  この方法は、最近改訂された、Ｄｕｂｏｉｓら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（２００７年）のＮＩＮＣＤＳ−アルツハイマー病ＲＤＡ診断基準に従うアルツハイマー病診断のための裏付け試験に有用である。
−  この方法は、表２に報告するように、両方の神経変性病状の初期段階からのアルツハイマー病診断を定義するのに、ＡＰＯＥ及びＭＴＡなどの他の方法よりも優れている。
【表１】
2015535345.tif 000005
【表２】
2015535345.tif 000006
【００５５】
遊離銅は、アルツハイマー病患者と対照とを区別するのに、アルツハイマー病の診断を下すために最もよく使用される神経画像処理（ＭＴＡ）及び遺伝子検査（ＡＰＯＥ）による裏付け及び非侵襲的マーカーであるＭＴＡ及びＡＰＯＥよりも高い信頼性を有する。
【図２】
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【図４】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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