(57)【要約】本発明は、例えば骨髄細胞および神経芽細胞腫細胞を使用して、培養中の細胞からガングリオシド、例えばＧＭ１を産生するための方法を提供する。方法には、細胞中でガングリオシド、例えばＧＭ１の産生を誘発するための、細胞の神経誘導培地およびクロロキンによる処理、または例えばヒト骨髄細胞の場合、クロロキン単独による処理、ノイラミニダーゼ、またはグルコサミンによる処理が含まれる。継代することなく、ガングリオシド、例えばＧＭ１を産生するための、細胞の長期間で高密度の培養法も提供される。細胞培養物中のガングリオシド、例えばＧＭ１を定量する方法も提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中でガングリオシドを産生する方法であって、
（ａ）該細胞をクロロキンにより処理して、該ガングリオシドを蓄積するステップ、
（ｂ）該クロロキン処理細胞から、該ガングリオシドを単離する、該ガングリオシドを定量する、またはそれらの両方を行うステップ、
を含み、
該細胞が、不死化細胞、間質細胞、および線維芽細胞からなる群から選択され、
該細胞が、ＰＣ１２細胞、ＨＴ２２細胞、ガングリオシドーシスに罹っているヒツジに由来する脳細胞、およびガングリオシドーシスに罹っているヒツジに由来する線維芽細胞ではない、方法。
【請求項２】
前記細胞が、神経芽細胞腫細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ）、間質細胞、および線維芽細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、ＣＨＯ細胞であり、該ＣＨＯ細胞がＣＨＯ−Ｋ１細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、ＨＥＫ細胞であり、該ＨＥＫ細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、線維芽細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記線維芽細胞が、皮膚線維芽細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記線維芽細胞が、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有するヒトに由来する線維芽細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、神経芽細胞腫細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記神経芽細胞腫細胞が、ＳＨＳＹ−５Ｙ、ＳＨＳＹ−Ｓ、およびＳＫ−Ｎ−ＡＳからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が間質細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記間質細胞が骨髄に由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記間質細胞がヒト骨髄に由来する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒト骨髄細胞が、低密度および低酸素での培養法により産生される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ガングリオシドが、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ３、およびＧＴ１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ガングリオシドがＧＭ１である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞をノイラミニダーゼにより処理するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞をグルコサミンにより処理するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞を生化学的に操作してガングリオシド産生を増加させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、クロロキンにより処理されなかった細胞よりも、１０〜２００パーセント、または約１０〜２００パーセント多い量のガングリオシドを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記量が１５〜１２５パーセント、または約１５〜１２５パーセントである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記量が、１５、１９、２８、６３、６５、８３、１０４および１１９パーセント、または約１５、１９、２８、６３、６５、８３、１０４および１１９パーセントからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記量が６５または約６５である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＧＭ１ガングリオシドを産生する方法であって、
（ａ）ヒツジに由来する骨髄細胞を単離するステップ、
（ｂ）神経誘導培地（「ＮＩＭ」）中で該ヒツジ骨髄細胞を培養して、ニューロン様ヒツジ骨髄細胞を産生するステップ、
（ｃ）該ニューロン様ヒツジ骨髄細胞をクロロキンにより処理して、ＧＭ１を蓄積するステップ、および
（ｄ）該クロロキン処理ニューロン様ヒツジ骨髄細胞から、ＧＭ１を単離する、ＧＭ１を定量する、またはそれらの両方を行うステップ、
を含む、方法。
【請求項２４】
前記ニューロン様ヒツジ骨髄細胞をクロロキンにより処理する前記ステップ（ｃ）が、該ニューロン様ヒツジ骨髄細胞を５〜１００マイクロモル濃度の間のクロロキンに接触させるステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ニューロン様ヒツジ骨髄細胞をクロロキンにより処理する前記ステップ（ｃ）が、該ニューロン様ヒツジ骨髄細胞をクロロキンに２〜７２時間の間、接触させるステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヒツジがガングリオシドーシスに罹っている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ＧＭ１ガングリオシドを産生する方法であって、
（ａ）ヒト骨髄細胞をクロロキンにより処理して、ＧＭ１を蓄積するステップ、および
（ｂ）該クロロキン処理ヒト骨髄細胞から、ＧＭ１を単離する、ＧＭ１を定量する、またはそれらの両方を行うステップ、
を含む、方法。
【請求項２８】
前記ヒト骨髄細胞をクロロキンにより処理する前記ステップ（ａ）が、該ヒト骨髄細胞を５〜１００マイクロモル濃度の間のクロロキンに接触させるステップを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヒト骨髄細胞をクロロキンにより処理する前記ステップ（ａ）が、該ヒト骨髄細胞をクロロキンに２〜７２時間の間、接触させるステップを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ヒトがＧＭ１ガングリオシドーシスに罹っている、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
接着細胞集団におけるＧＭ１ガングリオシドの量を定量する方法であって、
（ａ）該接着細胞を、色素、またはその基質と接触すると着色最終産生物を生成する酵素にコンジュゲートされているコレラ−毒素Ｂに接触させるステップ、
（ｂ）該色素または該着色最終産生物により発光されるかまたは吸収される光を測定するステップであって、該色素または着色最終産生物により発光または吸収された該光を使用して、該接着細胞集団における、ＧＭ１ガングリオシドの量を定量するステップ、
を含む、方法。
【請求項３２】
請求項１に記載の方法により産生されるガングリオシド。
【請求項３３】
前記ガングリオシドがＧＭ１である、請求項３２に記載のガングリオシド。
【請求項３４】
疾患または障害を処置する方法であって、請求項３２に記載のガングリオシドを、それを必要とする被験体に投与することを含み、ここで、該疾患または障害が処置される、方法。
【請求項３５】
前記疾患または障害が、ニューロン損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、ギラン−バレー症候群、およびがんからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、培養中の増殖した細胞からガングリオシド、例えばＧＭ１を産生する方法に関する。特に、細胞は、ガングリオシド、例えばＧＭ１の産生を誘発するよう、化学的に処理され、および／または生化学的な操作を受ける、ならびに／あるいは細胞は、高密度で長期培養され、継代が行われることなくガングリオシド、例えばＧＭ１を蓄積する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＭ１ガングリオシドの構造および機能
ＧＭ１は、以下の構造を有するモノシアロガングリオシドである：
【化１】
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【０００３】
ＧＭ１は、神経細胞膜の構成成分であり、いくつかの細胞表面および受容体活性をモジュレートすることが知られており、ニューロン分化および発達、タンパク質のリン酸化反応、ならびにシナプス機能において重要な役割を果たしている。したがって、ＧＭ１は、ニューロン可塑性および修復メカニズム、ならびに脳内におけるニューロトロフィンの放出に強い影響を与える。神経系におけるＧＭ１の役割に加えて、ＧＭ１は、病原体、細胞シグナル伝達、増殖、生存、および分化の内在化に関与している。ＧＭ１は、コレステロールおよびスフィンゴ脂質に富む形質膜内のミクロドメインである脂質ラフトの成分である。さらに、ＧＭ１は、核エンベロープの内膜において、ナトリウム−カルシウム交換輸送体の活性化に関与している。ＧＭ１のカルシウム交換輸送体との相互作用は、核および細胞カルシウムをモジュレートする。細胞生理学におけるＧＭ１の機能の他に、ＧＭ１はコレラ毒素の結合部位として作用する。
【０００４】
ＧＭ１は、実験動物において、様々なタイプの中枢神経系損傷を処置するのに有効であり、重要な生化学的回復および行動回復をもたらすことが知られている。さらに、ＧＭ１による前処置により、様々な神経毒暴露に起因する損傷が阻害される。
【０００５】
ＧＭ１は、パーキンソン病の被験体の短期処置に有効であり、症状にかなりの軽減をもたらすことも示されている。Schneiderら、Neurology、５０巻、１６３０〜１６３６頁（１９９８年）。より最近の５年間の研究により、パーキンソン病の被験体により長期間ＧＭ１を使用しても安全であり、こうした被験体にとって、ある種の臨床的有益性を実現し得ることが示されている。その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Schneiderら、J.  Neurol.  Sci.２９２巻、４５〜５１頁（２０１０年）。ＧＭ１が、ドーパミン系に対して、どのように潜在的な神経保護、神経修復、または神経救済の効果を発揮するのかは不明である。上記文献の５０頁。しかし、ニューロンの形質膜中に取り込まれているＧＭ１は、脂質ラフトの安定性を変化させ、したがって、様々な有益な細胞過程を促進することができるものと推測されている。上記文献。
【０００６】
ガングリオシド
ガングリオシドは、様々な数のシアル酸残基を有する糖鎖を含有している、哺乳動物における主要なグリコスフィンゴ脂質である。多数の様々な糖の亜種がガングリオシド中に存在している。ガングリオシドは、とりわけ、テイーサックス病、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびがんを含む、いくつかの疾患および障害に関与している。
【０００７】
ガングリオシドの生合成は、共通する生合成酵素および基質の使用により、綿密に連携している。例えば、ＧＭ１の産生は、他のガングリオシド、例えばＧＡ１、ＧＤ１ｂおよびＧＴ１ｃを産生するために一般に使用される酵素であるガラクトシルトランスフェラーゼＩＩに依存している。その全体が参照により本明細書に組み込まれているXuら、J.  Lipid  Res、５１巻、１６４３〜１６７５頁（２０１０年）。それらの共通した構造的特徴および成分のため、分解ガングリオシド、特にセラミドおよびスフィンゴシンの回収成分から、新規なガングリオシドが合成されることが多い。上記文献。例えば、セラミド、ガラクトース、ＧａｌＮＡｃ、シアル酸などのコア分子がガングリオシドの合成に必要である。上記文献。その結果、ガングリオシドファミリーメンバーの１つの産生または分解に影響を及ぼす因子は、他のガングリオシドの産生および分解に変化をもたらすことが多い。例えば、ＧＭ１はＧＤ１ａの前駆体であるため、ＧＭ１の増加により、細胞がＧＤ１ａを産生するのに都合がよく、ガングリオシドの正常な割合またはバランスのとれた割合を維持することになる。それらの各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Masonら、Biochem.  J、３８８巻、５３７〜５４４頁（２００５年）；Miller-Podrazaら、Biochem、２１巻：３２６０〜３２６５頁（１９８２年）；Nishioら、J.  Biol.  Chem.、２７９巻：３３３６８〜３３３７８頁（２００４年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Schneiderら、Neurology、５０巻、１６３０〜１６３６頁（１９９８年）
【非特許文献２】Schneiderら、J.  Neurol.  Sci.２９２巻、４５〜５１頁（２０１０年）
【非特許文献３】Xuら、J.  Lipid  Res、５１巻、１６４３〜１６７５頁（２０１０年）
【非特許文献４】Masonら、Biochem.  J、３８８巻、５３７〜５４４頁（２００５年）
【非特許文献５】Miller-Podrazaら、Biochem、２１巻：３２６０〜３２６５頁（１９８２年）
【非特許文献６】Nishioら、J.  Biol.  Chem.、２７９巻：３３３６８〜３３３７８頁（２００４年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＧＭ１産生
ウシの脳に由来するＧＭ１が、過去において臨床的に使用された。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Schneiderら、J.  Neurol.  Sci.２９２巻、４５〜５１頁、４６号（２０１０年）、（「Patients  self-administered...bovine  brain-derived  [GM1]  sodium  salt...」）。しかし、ウシの脳あたりのＧＭ１収率の限界、およびこの方法でＧＭ１を産生するコストにより、商業的な臨床的使用に利用可能なＧＭ１の量が制限されてきた。さらに、ウシ海綿状脳症、すなわち狂牛病などの疾患により、ウシ源のＧＭ１の安全性に関する懸念が提起されている。ＧＭ１ガングリオシドーシスに罹っている（afflicted）ヒツジの脳からＧＭ１を抽出することも記載されているが（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、例えば米国特許第５，５３２，１４１号を参照されたい）、こうした方法は、収率、コストおよび安全性に関する類似した懸念を提起している。
【００１０】
したがって、商業的な臨床的使用のためのＧＭ１を作製する、コスト効率が高く、収率が高く、かつ安全性が高い代替法に対する、満たされていない明確な必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の簡単な概要
本発明は、細胞中でガングリオシドを産生する方法であって、前記細胞をクロロキン（「ＣＬＱ」）により処理して前記ガングリオシドを蓄積するステップ；前記ＣＬＱ処理細胞から、前記ガングリオシドを分離するステップ、前記ガングリオシドを定量するステップ、またはそれらの両方を行うステップを含み、前記細胞が、不死化細胞、間質細胞、および線維芽細胞からなる群から選択され、前記細胞が、ＰＣ１２細胞、ＨＴ２２細胞、ガングリオシドーシスに罹っているヒツジに由来する脳細胞、およびガングリオシドーシスに罹っているヒツジに由来する線維芽細胞ではない、方法を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、ＧＭ１ガングリオシドを産生する方法であって、ヒツジから骨髄細胞を単離するステップ；ニューロン誘導培地（「ＮＩＭ」）中でヒツジ骨髄細胞を培養して、ニューロン様ヒツジ骨髄細胞を産生するステップ；ニューロン様ヒツジ骨髄細胞をＣＬＱにより処理してＧＭ１を蓄積するステップ；およびＣＬＱ処理ニューロン様ヒツジ骨髄細胞からのＧＭ１を定量するステップ、ＧＭ１を単離するステップ、またはそれらの両方を行うステップを含む、方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、ＧＭ１ガングリオシドを産生する方法であって、ヒト骨髄細胞をＣＬＱにより処理してＧＭ１を蓄積するステップ；およびＣＬＱ処理ヒト骨髄細胞からＧＭ１を単離するステップ、ＧＭ１を定量するステップ、またはそれらの両方を行うステップを含む、方法を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、細胞中で、細胞、例えば骨髄細胞をノイラミニダーゼにより処理してガングリオシド、例えばＧＭ１を蓄積するステップ、およびノイラミニダーゼ処理細胞からガングリオシドを単離する、ガングリオシドを定量する、またはそれらの両方を行うステップに関する。
【００１５】
本発明はさらに、細胞中で、細胞、例えば骨髄細胞をグルコサミンにより処理してガングリオシド、例えばＧＭ１を蓄積するステップ、およびグルコサミン処理細胞からガングリオシドを単離する、ガングリオシドを定量する、またはそれらの両方を行うステップに関する。
【００１６】
本発明はさらに、細胞中で、細胞、例えば初代細胞または細胞系に生化学的な操作を行い、ガングリオシド、例えばＧＭ１を蓄積するステップ、および生化学的改変細胞からガングリオシドを単離する、ガングリオシドを定量する、またはそれらの両方を行うステップに関する。
【００１７】
本発明により、ガングリオシド、例えばＧＭ１を産生する方法であって、継代を行うことなく高密度で細胞を培養し、前記ガングリオシドを蓄積する方法も提供される。
【００１８】
本発明はまた、接着細胞の集団において、ガングリオシド、例えばＧＭ１の量を定量する方法であって、色素、またはその基質に接触すると着色最終産生物を生成する酵素にコンジュゲートしたコレラ毒素Ｂに接着細胞を接触させるステップ；および色素または着色最終産生物により発光されるかまたは吸収される光を測定するステップを含み、発光または吸収された光を使用して、接着細胞の集団における、ガングリオシド、例えばＧＭ１の量を定量する、方法に関する。
【００１９】
本発明はさらに、本発明の方法により産生するガングリオシド、例えばＧＭ１を提供する。
【００２０】
本発明は、疾患または障害を処置する方法であって、それを必要とする被験体に本発明の方法により産生するガングリオシド、例えばＧＭ１を投与するステップを含む、方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａ。細胞を、ＧＭ１ガングリオシドーシス（「罹患ヒツジ骨髄細胞」）のヒツジの骨髄から得て、培養物中で増幅（expand）した。対照細胞は、標準培養培地（上の図）中で維持した。「ＮＩＭ中での４８時間のＣＬＱ」（下の図）と名付けた誘発細胞をＮＩＭ中で培養し、次にＣＬＱで４８時間処理した。Ａｌｅｘａ４８８にコンジュゲートしたコレラ毒素Ｂ（「ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８」）により、細胞を染色した。誘発の程度を実証するために、代表的な画像を示している。染色により、ＧＭ１の存在が示されている。処理された下の図の細胞は、ＧＭ１の誘発を示している；染色は一層広がり、かつ強度が強い。多くの細胞において核周囲の染色があることに留意されたい。図１Ｂ。正常なヒツジの骨髄から得られた細胞を、培養中に増幅した。対照細胞は、標準培養培地中で維持した（上の図）。「ＮＩＭ中での４８時間のＣＬＱ」（下の図）と名付けた誘発細胞をＮＩＭ中で培養し、次にＣＬＱで４８時間（ｈ）処理した。ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８により細胞を染色した。誘発の程度を実証するため、培養物または異なるウェルの様々な領域からの画像を示している。染色により、ＧＭ１の存在が示されている。処理された下の図の細胞は、ＧＭ１の誘発を示している；染色は一層広がり、かつ強度が強い。多くの細胞において核周囲の染色があることに留意されたい。
【００２２】
【図２】図２。正常なヒト成人骨髄由来の間質細胞を、標準組織培養フラスコ中でプレート培養した。対照細胞は、標準培養培地（上の図）中で維持した。「ＣＬＱ」と名付けた処理細胞を、アルファＭＥＭ中、ＣＬＱにより４８ｈ処理した（下の図）。誘発の程度を実証するために、代表的な画像を示している。ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８により細胞を染色した。染色により、ＧＭ１の存在が示されている。対照条件に比べて、処理細胞（下の図）におけるＧＭ１シグナルは多く、強度が強い。
【００２３】
【図３】図３。ヒト神経芽細胞腫細胞系、ＳＨＳＹ−５Ｙ、ヒツジ骨髄細胞（「ＳＢＭ」）、およびヒト骨髄細胞（「ＨＢＭ」）の各々に、３種の異なる処理レジメンを施した。（ａ）無血清培地（「ＳＦＭ」）、（ｂ）ＮＩＭ、または（ｃ）ＣＬＱ。各培養物中のＧＭ１量は、西洋わさびペルオキシダーゼ（「ＨＲＰ」）−コンジュゲートコレラ毒素Ｂ（「ＣＴＢ−ＨＲＰ」）を使用して決定した。インキュベートおよび洗浄後に結合を維持したままのＣＴＢ−ＨＲＰにより生成した産生物の量を測定した。各培養物について、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅによる染色からのシグナルも測定した。ＧＭ１シグナル（ＣＴＢ−ＨＲＰにより測定した）をウェル中の細胞数（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅにより測定した）に正規化した。棒グラフのｙ軸は、細胞数に対して正規化した、ＣＴＢ−ＨＲＰを使用する染色の度合いを示しており、これは、各処理レジメンに関して、各細胞系により産生したＧＭ１の量を示している。対照細胞を未処理のままで置き、標準培養培地中で維持した。ＮＩＭおよびＣＬＱによる処理は、最も強力なＧＭ１誘発を示した。
【００２４】
【図４】図４。ノイラミニダーゼにより処理したマウス神経２Ａ神経芽細胞腫細胞中のＧＭ１誘発。神経２Ａ細胞を標準培養培地（対照）中で維持するか、またはノイラミニダーゼにより３時間処理した。処理細胞は、より大きな染色を示しており（図Ｄを参照されたい）、処理細胞によりＧＭ１がより多く蓄積されていることを示している。
【００２５】
【図５】図５。ノイラミニダーゼにより処理した、ヒト成人骨髄間質細胞（ｈＡＢＭ−ＳＣ）中のＧＭ１誘発。ｈＡＢＭ−ＳＣを標準培養培地（対照）中で維持するか、またはノイラミニダーゼにより３時間処理した（処理物）。処理細胞は、より強い染色強度を示し、処理細胞によりＧＭ１がより多く産生されていることを示している。
【００２６】
【図６】図６。高密度、長期培養条件による、マウス神経２Ａ神経芽細胞腫細胞中のＧＭ１誘発。マウス神経２Ａ細胞を高密度でプレート培養した。ウェルの一部分を固定化し、培養物中で３日後、ＧＭ１を染色する一方、他のものは、９日間維持した後、固定化してＧＭ１を染色した。９日間、維持した細胞の染色がより強いことから、ＧＭ１産生がより多いことが示される。
【００２７】
【図７】図７。高密度、長期培養条件による、ヒツジ脳由来の細胞中のＧＭ１誘発。ヒツジ脳由来の細胞を高密度でプレート培養した。ウェルの一部分を固定化し、培養物中で３日後、ＧＭ１を染色する一方、他のものは、９日間維持した後、固定化してＧＭ１を染色した。９日間、維持した細胞の染色がより明るいことから、ＧＭ１産生がより多いことが示される。
【００２８】
【図８】図８。ＣＴＢ−ＨＲＰを使用した、ヒツジＧＭ１の、プレート培養に基づく定量用標準曲線。ＥＬＩＳＡに基づくプレートを様々な量のヒツジＧＭ１により被覆した。プレートを洗浄してブロッキングし、ＨＲＰコンジュゲート−コレラ毒素Ｂと共にインキュベートした。基質を加えて、プレートリーダーを使用して測定される着色産生物を生成させた。シグナル強度は、ウェルあたりに添加されたＧＭ１の量と相関があった。このグラフは、本方法により作製された標準曲線を表わす。ＧＭ１レベルは、この標準曲線を使用して定量することができる。
【００２９】
【図９】図９。ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８を使用した、プレート培養に基づく、ヒツジＧＭ１の定量用標準曲線。ＥＬＩＳＡに基づくプレートを様々な量のヒツジＧＭ１により被覆した。プレートを洗浄してブロッキングし、ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８によりインキュベートした。シグナル強度は、ウェルあたりに添加されたＧＭ１の量と相関があった。このグラフは、本方法により作製された標準曲線を表わす。ＧＭ１レベルは、この標準曲線を使用して定量することができる。
【００３０】
【図１０】図１０。ＣＬＱによる、不死化細胞系中のＧＭ１の誘発。ＳＨＳＹ−５Ｙ、ＳＨＳＹ−Ｓ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｋ１）、およびヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞を２４ウェルの培養プレートでプレート培養した。対照細胞は、それぞれの標準培養培地（図１０の図Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ）中で維持した。「ＣＬＱ」と名付けた処理細胞を標準培養培地に加えたＣＬＱにより、４８〜１２０時間処理した（図１０の図Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ）。誘発の程度を実証するために、代表的な画像を示している。ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８により細胞を染色した。染色により、ＧＭ１の存在が示されている。すべての細胞タイプについて、対照条件と比べて、処理細胞におけるＧＭ１シグナルは一層多く、かつ強度はより強いが、その大きさおよび分布は様々である。
【００３１】
【図１１】図１１。ＣＬＱによる初代細胞系中のＧＭ１の誘発。Ｇａｒｎｅｔ  ＢｉｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社の成人骨髄由来の間質細胞（ＧＢＴ−ＡＢＭＳＣ）、骨髄由来の間質細胞（Ｌｏｎｚａ  ＢＭＳＣ）、脂肪由来の間質細胞（Ｌｏｎｚａ  ＡＤＳＣ）、皮膚線維芽細胞（ｆｂ）、およびＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１  ｆｂ）を有する被験体に由来する線維芽細胞を２４ウェル培養プレートでプレート培養した。対照細胞は、それぞれの標準培養培地（図１１の図Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ）中で維持した。「ＣＬＱ」と名付けた処理細胞を標準培養培地に加えたＣＬＱで、４８〜１２０時間処理した（図１１の図Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｉ）。誘発の程度を実証するために、代表的な画像を示している。ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８により細胞を染色した。染色により、ＧＭ１の存在が示されている。すべての細胞タイプについて、対照条件と比べて、処理細胞におけるＧＭ１シグナルは一層多く、かつ強度はより強いが、その大きさおよび分布は様々である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
序論
本発明は、培養物中の細胞からガングリオシド、例えばＧＭ１を産生する方法を提供する。したがって、本発明の方法は、様々な操作を使用して、細胞培養物中で、ガングリオシド、例えばＧＭ１の産生を増強するか、または誘発するための方法を提供する。本発明の以下の方法を、以下に詳細に説明する。（ａ）細胞をニューロン誘導培地（「ＮＩＭ」）と共に培養し、次いでクロロキン（「ＣＬＱ」）により処理するステップ；（ｂ）培養細胞をクロロキン単独、すなわちＮＩＭによる初期処理を行わないで処理するステップ；（ｃ）培養細胞をノイラミニダーゼにより処理するステップ；（ｄ）培養細胞をグルコサミンにより処理するステップ；（ｅ）細胞を生化学的に改変するステップ；（ｆ）ガングリオシド、例えばＧＭ１を継代することなく、細胞を高密度、長期間培養して、細胞中に細胞に蓄積するステップ。各方法に適切な細胞のタイプ、およびＮＩＭ／ＣＬＱまたはＣＬＱによる処理前に、細胞を単離する方法も議論する。ある種の非独占的な実施形態では、方法（ａ）、および／もしくは（ｃ）、ならびに／または（ｄ）、ならびに／あるいは（ｅ）、ならびに／あるいは（ｆ）、ならびに方法（ｂ）、および／もしくは（ｃ）、ならびにまたは（ｄ）、ならびに／あるいは（ｅ）、ならびに／あるいは（ｆ）を組み合わせて、培養細胞中のガングリオシド産生をさらに増強する。例えば、続いて、ＮＩＭ／ＣＬＱにより最初に培養された細胞をノイラミニダーゼと共に培養するか、または次に、ＮＩＭではなくＣＬＱによる処理細胞をノイラミニダーゼと共に培養する。一部の実施形態では、例えばＮＩＭ、および／もしくはＣＬＱ、ならびに／またはノイラミニダーゼにより化学的処理した後、細胞に、ガングリオシド、例えばＧＭ１を継代することなく、高密度、長期間培養を施し、化学的に処理された細胞中で蓄積する。別の実施形態では、本出願中に開示されている処理の任意の組合せが可能である。
【００３３】
本発明は、やはり以下に詳細に記載されている通り、細胞培養物中のガングリオシド、例えばＧＭ１の量を定量する方法も提供する。
【００３４】
用語「ガングリオシド」は、本発明の一実施形態では、ガングリオシドのすべてを包含する。本発明の別の一実施形態では、ガングリオシドはＧＭ１である。本発明の別の実施形態では、ガングリオシドはＧＭ２である。本発明の別の実施形態では、ガングリオシドはＧＭ３である。本発明の別の実施形態では、ガングリオシドはＧＤ１ａである。本発明の別の実施形態では、ガングリオシドはＧＤ１ｂである。本発明の別の実施形態では、ガングリオシドはＧＤ３である。本発明の別の実施形態では、ガングリオシドはＧＴ１である。
【００３５】
ニューロン誘導培地中で培養することによるガングリオシド産生とその後のＣＬＱによる処理
実施形態では、細胞は、ニューロン誘導培地中で培養することによりガングリオシド、例えばＧＭ１の蓄積を誘発し、次いでクロロキンにより処理する。この組合せ処理は、本明細書では「ＮＩＭ／ＣＬＱ」と略す。実施形態では、本方法において使用するのに適した細胞は、例えば動物のタイプ、および動物の細胞組織源に由来する供給源により特定される。本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ法で使用するための動物源には、以下に限定されないが、ヒト、ヒツジ、ウサギ、マウス、モルモット、ウマ、ブタ、ネコ、およびイヌが含まれる。本発明の実施形態では、間質細胞、例えば骨髄および脂肪由来の細胞；および線維芽細胞、例えばＧＭ１ガングリオシドーシスを有するヒトに由来する線維芽細胞（「ＧＭ１線維芽細胞」）、ならびに動物源（上記列挙した動物源に限定されないが、それらを含む）に由来する皮膚線維芽細胞を、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ法において使用することができる。本明細書で使用する場合、用語「骨髄細胞」および「骨髄由来の細胞」は、同意語で使用される。実施形態では、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ法は、以下に詳細に記載されている動物源に由来する骨髄を単離するために、低密度／低酸素培養により産生される骨髄由来の細胞を利用する。
【００３６】
本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ法において使用するためのさらなる細胞タイプには、不死化細胞が含まれる。他の細胞タイプには、上で列挙した動物源（ヒトを含む）に限定されないがそれらを含む動物源から単離された神経芽細胞腫細胞、および神経芽細胞腫細胞系（以下に限定されないが、ＳＨＳＹ−５Ｙ、ＳＨＳＹ−ＳおよびＳＫ−Ｎ−ＡＳを含む）が含まれる。これらの細胞の増殖速度は速いので、神経芽細胞腫が少なくとも有利である。
【００３７】
実施形態では、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ法において使用される細胞タイプの各々は、処理前、および／もしくは処理中、ならびに／または処理後に、以下に詳細に記載されている低密度／低Ｏ２培養法下で培養される。
【００３８】
実施形態では、本発明の動物細胞源は、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、またはそれらの両方に罹っており、これらの蓄積症は、全身性のガングリオシド蓄積を特徴とするリソソーム貯蔵障害である。実施形態では、ガングリオシドーシスに罹っているヒト、ヒツジ、ネコ、またはイヌに由来する骨髄細胞および線維芽細胞が、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ法において使用される。実施形態では、線維芽細胞は、ＧＭ１線維芽細胞である。さらなる実施形態では、不死化細胞、例えばＣＨＯ細胞およびヒト胎児由来腎臓細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＨＥＫ２９３細胞が本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ法において使用される。別の実施形態では、マウス、ヒツジ、またはヒトに由来する神経芽細胞腫細胞、および神経芽細胞腫細胞系（以下に限定されないが、ＳＨＳＹ−５Ｙ、ＳＨＳＹ−ＳおよびＳＫ−Ｎ−ＡＳを含む）が、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ法において使用される。
【００３９】
実施形態では、ガングリオシドーシスに罹っているヒツジに由来するＰＣ１２細胞、ＨＴ２２細胞、脳細胞、およびガングリオシドーシスに罹っているヒツジに由来する線維芽細胞は、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ法では使用されない。
【００４０】
用語「ニューロン誘導培地」とは、ニューロンの１種または複数の表現型特性と見なされる細胞が、正確な条件下で生じる細胞増殖用溶液を指す。ＮＩＭにより誘発されるニューロン表現型の程度は、以下に限定されないが、最初の細胞タイプ、培地の成分、ＮＩＭ成分の濃度、および時間量を含む複数の要因に依存し、細胞をＮＩＭに接触させる。本発明の実施形態では、適切なニューロン誘導培地により、培養細胞中のガングリオシド、例えばＧＭ１の発現が、標準培養培地中の細胞により発現するレベルを超えて誘発される。
【００４１】
実施形態では、ＮＩＭは、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、レチノイン酸を補給したＢ２７、上皮成長因子、および線維芽細胞増殖因子を含む。これらのＮＩＭ成分は例示的なものであり、さらなるＮＩＭ成分が当分野で公知である。
【００４２】
実施形態では、動物源から単離した後、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ法において使用するための細胞は、標準培養培地、例えば１０％ウシ胎児血清（「ＦＢＳ」）を補給したアルファ−ＭＥＭ増殖培地；１０％ＦＢＳを補給したＭＥＭ／Ｆ−１２；１％非必須アミノ酸（「ＮＥＡＡ」）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１５％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ／Ｆ−１２；０．１ｍＭ  ＮＥＡＡおよび１０％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭ；１０％ＦＢＳを補給したＦ−１２Ｋ；１０％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ；増殖サプリメントを補給したＬｏｎｚａ  ＭＳＣ基本培地；増殖サプリメントを補給したＬｏｎｚａ  ＡＤＳＣ基本培地；サプリメントを含むＬｏｎｚａ線維芽細胞基本培地；または１５％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ中で、２〜２４時間、好ましくは４〜１４時間、好ましくは１２時間、最初に培養する。実施形態では、細胞は、標準（５％ＣＯ２）雰囲気条件下、加湿インキュベーター内で、標準的な細胞播種密度、例えば２，０００〜２０，０００細胞／ｃｍ２、好ましくは８，０００細胞／ｃｍ２において、約３７℃で増殖させる。標準培養培地中で培養した後、培地をＮＩＭにより交換し、細胞をＮＩＭ中で、２〜２４時間の間、好ましくは６〜１８時間の間、または好ましくは８〜１４時間の間、培養される。ＮＩＭによる処理後、ＣＬＱをフラスコに加えて、ＮＩＭによる培養細胞を誘発し、ＧＭ１をさらに産生させる。ＣＬＱを使用し、ＰＣ１２（ラット副腎髄質腫瘍）細胞中に蓄積を誘発する。Yuyamaら、FEBS  Lett.、５８０巻、６９７２〜６９７６頁（２００６年）。しかし、ＣＬＱだけでも、ＨＴ２２（マウスの海馬）細胞中のＧＭ１レベルは適度に増加する。Hirataら、J  Neurochem.１１９巻：８３９〜８４７頁（２０１１年）。実施形態では、細胞がＮＩＭ中で培養されている間、５〜１００マイクロモル濃度の間のＣＬＱ、２０〜６０マイクロモル濃度の間のＣＬＱ、または４０〜５０マイクロモル濃度の間のＣＬＱが培養フラスコに加えられる。実施形態では、５０マイクロモル濃度のＣＬＱが培養フラスコに加えられる。別の実施形態では、３０マイクロモル濃度のＣＬＱが培養フラスコに加えられる。別の実施形態では、２５マイクロモル濃度のＣＬＱが培養フラスコに加えられる。ＣＬＱは、４〜７２時間の間、好ましくは２０〜６０時間の間、好ましくは４８〜６０時間の間、培養細胞に接触させる。実施形態では、ＣＬＱは、４８時間、培養細胞に接触させる。
【００４３】
ヒツジ骨髄細胞などの特定の細胞タイプの場合、ＮＩＭ／ＣＬＱ処理後に、顕著な細胞死が起こる。こうした実施形態では、フラスコ内の死細胞を除去し、残存している生存細胞を、新しい増殖培地、例えば１０％ＦＢＳを補給したアルファ−ＭＥＭ；１０％ＦＢＳを補給したＭＥＭ／Ｆ−１２；１％非必須アミノ酸（「ＮＥＡＡ」）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１５％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ／Ｆ−１２；０．１ｍＭ  ＮＥＡＡおよび１０％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭ；１０％ＦＢＳを補給したＦ−１２Ｋ；１０％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ；増殖サプリメントを補給したＬｏｎｚａ  ＭＳＣ基本培地；増殖サプリメントを補給したＬｏｎｚａ  ＡＤＳＣ基本培地；サプリメントを含むＬｏｎｚａ線維芽細胞基本培地；または１５％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ中で再懸濁し、加湿インキュベーター内で、標準的な細胞密度および５％ＣＯ２雰囲気下、約３７℃で培養する。本発明の実施形態では、新しい増殖培地中、例えば１０％ＦＢＳを補給したアルファ−ＭＥＭ；１０％ＦＢＳを補給したＭＥＭ／Ｆ−１２；１％非必須アミノ酸（「ＮＥＡＡ」）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１５％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ／Ｆ−１２；０．１ｍＭ  ＮＥＡＡおよび１０％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭ；１０％ＦＢＳを補給したＦ−１２Ｋ；１０％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ；増殖サプリメントを補給したＬｏｎｚａ  ＭＳＣ基本培地；増殖サプリメントを補給したＬｏｎｚａ  ＡＤＳＣ基本培地；サプリメントを含むＬｏｎｚａ線維芽細胞基本培地；または１５％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ中での再懸濁が後に続く。上記の条件下で、残存している生存細胞を、再度、ＣＬＱにより処理し、ガングリオシド産生をさらに誘発させる。必要に応じて、浮遊している死細胞をフラスコから取り除き、残存している生存細胞を採集する。追加的な実施形態では、第２の処理は行われず、細胞が採取される。本発明の方法はまた、細胞培養物中のガングリオシド、例えばＧＭ１の量を本発明の方法を使用し、ＮＩＭ単独による処理後か、ＮＩＭとＣＬＱによる処理後のどちらかで定量を行うことも提供する（処理前および処理後）。実施形態では、ガングリオシド、例えばＧＭ１は、本明細書に開示されている方法などの、当分野で公知の方法を使用して単離されて精製される。
【００４４】
本発明の追加的な実施形態では、ＮＩＭ／ＣＬＱ処理により、すべてのガングリオシドの蓄積量が増加する。本発明の実施形態では、ＮＩＭ／ＣＬＱ処理により、ＧＭ１の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ処理により、ＧＭ２の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ処理により、ＧＭ３の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ処理により、ＧＤ１ａの蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ処理により、ＧＤ１ｂの蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ処理により、ＧＤ３の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ処理により、ＧＴ１の蓄積量が増加する。
【００４５】
別の実施形態では、ＮＩＭ／ＣＬＱ処理により、２種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。さらなる実施形態では、ＮＩＭ／ＣＬＱ処理により、３種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。さらなる実施形態では、ＮＩＭ／ＣＬＱ処理により、４種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。さらなる実施形態では、ＮＩＭ／ＣＬＱ処理により、５種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。
【００４６】
本発明の追加的な実施形態では、ＮＩＭ／ＣＬＱ処理すると、ＮＩＭ／ＣＬＱにより処理されなかった細胞と比べて、細胞中のガングリオシド蓄積量は、１０〜２００パーセント、または約１０〜２００パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、ＮＩＭ／ＣＬＱ処理すると、ＮＩＭ／ＣＬＱにより処理されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、１５〜１２５パーセント、または約１５〜１２５パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、ＮＩＭ／ＣＬＱ処理すると、ＮＩＭ／ＣＬＱにより処理されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、３０〜１００パーセント、または約３０〜１００パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、ＮＩＭ／ＣＬＱ処理すると、ＮＩＭ／ＣＬＱにより処理されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、６０〜８０パーセント、または約６０〜８０パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、ＮＩＭ／ＣＬＱ処理すると、ＮＩＭ／ＣＬＱにより処理されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、１５、１９、２８、６３、６５、８３、１０４および１１９パーセント、または約１５、１９、２８、６３、６５、８３、１０４および１１９パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、ＮＩＭ／ＣＬＱ処理すると、ＮＩＭ／ＣＬＱにより処理されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、６５パーセント多くなる。
【００４７】
本発明はさらに、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシドを提供する。
【００４８】
本発明はさらに、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ法により作製されるガングリオシド、例えばＧＭ１を投与することによる、処置を必要としている被験体を処置する方法を提供する。実施形態では、ニューロン損傷を有する被験体が、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、パーキンソン病を有する被験体が、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、アルツハイマー病を有する被験体が、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、脳卒中を有していたか、または有している被験体が、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、ギラン−バレー症候群を有する被験体が、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、がんを有する被験体が、本発明のＮＩＭ／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。
【００４９】
例示的な実施形態では、ガングリオシド、例えばＧＭ１は、正常なヒツジ骨髄由来の細胞およびガングリオシドーシス罹患ヒツジ骨髄由来の細胞中で蓄積する。例示的な実施形態では、ヒツジ骨髄由来の細胞は、以下に記載する低酸素、低密度法により得られる。次に、こうした細胞は、１０％ＦＢＳを含むアルファ−ＭＥＭ増殖培地中、８，０００細胞／ｃｍ２の密度で培養される。約１２時間後、培地を３０ｍｌのＮＩＭにより交換するが、ＮＩＭは、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、レチノイン酸を補給したＢ２７サプリメント、ＥＧＦ（２５マイクログラム／ｍｌ）、およびＦＧＦ（１０ナノグラム／ｍｌ）を含む。約１０時間の後、５０マイクロモル濃度のＣＬＱをフラスコに加える。約７０％の細胞死が、３日目に観察される。浮遊細胞は、ＰＢＳですすぐことにより取り除かれる。生存細胞はトリプシン処理により採集され、沈降させて新しい増殖培地に再懸濁され、新しいフラスコ内に、８，０００細胞／ｃｍ２で播種される。適切な染色物、例えばＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８を用いて染色することによりガングリオシド、例えばＧＭ１の誘発を確認するため、一定分量を取り出して２４ウェルプレート中でプレート培養する。生存細胞をフラスコ中で２日間増幅させ、細胞を採取する。実施形態では、生存細胞は、採取前に、２４時間、５０マイクロモル濃度のＣＬＱにより２回目の処理を行うことができる。細胞採取後に、以下に記載されている方法を使用して、ガングリオシド、例えばＧＭ１を単離して精製することができる。
【００５０】
クロロキンによる処理によるガングリオシド産生
追加的な実施形態では、ガングリオシド、例えばＧＭ１蓄積は、ニューロン誘導培地による最初の培養を行うことなく、クロロキン処理を使用して細胞中で誘発される。この方法も、本明細書では、「ＣＬＱ処理法」または「ＣＬＱ処理」と名付けられる。実施形態では、ＣＬＱ処理法において使用するための細胞の動物源には、以下に限定されないが、ヒト、ウサギ、マウス、モルモット、ウマ、ブタ、ネコおよびイヌが含まれる。本発明の実施形態では、線維芽細胞および間質細胞、例えば骨髄および脂肪由来の細胞、ならびに上で列挙した動物源に限定されないがそれらを含む動物源に由来する、線維芽細胞、例えばＧＭ１線維芽細胞および皮膚線維芽細胞を、本発明のＣＬＱ法において使用することができる。動物源に由来のする細胞を単離する例示的な方法は、以下に詳細に記載されている。実施形態では、以下に記載されている低密度／低酸素培養法により産生される細胞がＣＬＱにより処理されて、ガングリオシド、例えばＧＭ１の産生が誘発される。実施形態では、以下に記載されている低密度／低酸素培養法により産生されるヒト骨髄細胞がＣＬＱにより処理されて、ガングリオシド、例えばＧＭ１の産生が誘発される。
【００５１】
本発明のＣＬＱ処理法の追加的な実施形態では、不死化細胞、例えばＣＨＯ細胞およびヒト胎児由来腎臓細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＨＥＫ２９３細胞が、本発明のＣＬＱ法において使用される。さらなる実施形態では、上で列挙した動物源（ヒトを含む）に限定されないが、それらを含む動物源から単離される神経芽細胞腫細胞、および神経芽細胞腫細胞系（以下に限定されないが、ＳＨＳＹ−５Ｙ、ＳＨＳＹ−ＳおよびＳＫ−Ｎ−ＡＳを含む）が、本発明のＣＬＱ法において使用される。さらなる実施形態では、本発明のＣＬＱ法において使用するための細胞は、ガングリオシドーシスに罹っている動物、例えばＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、もしくはそれらの両方に罹っているヒト、ネコ、またはイヌに由来する。さらなる実施形態では、ガングリオシドーシスに罹っているヒト、ヒツジ、ネコ、またはイヌに由来する骨髄細胞および線維芽細胞が、本発明のＣＬＱ法において使用される。実施形態では、線維芽細胞は、ＧＭ１線維芽細胞である。
【００５２】
実施形態では、本発明のＣＬＱ法において使用される細胞タイプの各々は、処理前、および／もしくは処理中、ならびに／または処理後に、以下に詳細に記載されている低密度／低Ｏ２培養法の下で培養される。
【００５３】
実施形態では、ガングリオシドーシスに罹っているヒツジに由来するＰＣ１２細胞、ＨＴ２２細胞、脳細胞、およびガングリオシドーシスに罹っているヒツジに由来する線維芽細胞は、本発明のＣＬＱ法では使用されない。
【００５４】
実施形態では、所望の供給源に由来する細胞は、標準的な播種密度、例えば２，０００〜２０，０００細胞／ｃｍ２、好ましくは８，０００細胞／ｃｍ２の下で５％ＣＯ２雰囲気条件下、３７℃で、標準増殖培地中、例えば１０％ＦＢＳを補給したアルファ−ＭＥＭ；１０％ＦＢＳを補給したＭＥＭ／Ｆ−１２；１％非必須アミノ酸（「ＮＥＡＡ」）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１５％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ／Ｆ−１２；０．１ｍＭ  ＮＥＡＡおよび１０％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭ；１０％ＦＢＳを補給したＦ−１２Ｋ；１０％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ；増殖サプリメントを補給したＬｏｎｚａ  ＭＳＣ基本培地；増殖サプリメントを補給したＬｏｎｚａ  ＡＤＳＣ基本培地；サプリメントを含むＬｏｎｚａ線維芽細胞基本培地；または１５％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ中で培養する。実施形態では、細胞は２〜４８時間、好ましくは８〜３６時間、好ましくは２４時間培養される。培養後、培養培地は、場合により血清を補給した標準培地で交換する。実施形態では、血清量は、前の培養培地中の血清量よりも少ない。ＣＬＱを培養培地に加える。実施形態では、５〜１００マイクロモル濃度の間のＣＬＱ、２５〜７５マイクロモル濃度の間のＣＬＱ、または４０〜５０マイクロモル濃度の間のＣＬＱが培養フラスコに加えられる。実施形態では、５０マイクロモル濃度のＣＬＱが培養フラスコに加えられる。別の実施形態では、３０マイクロモル濃度のＣＬＱが培養フラスコに加えられる。別の実施形態では、２５マイクロモル濃度のＣＬＱが培養フラスコに加えられる。ＣＬＱは、２〜７２時間の間、好ましくは２０〜６０時間の間、好ましくは３０〜５０時間の間、培養細胞に接触させる。実施形態では、細胞はＣＬＱと共に４８時間インキュベートされて、採取される。追加的な実施形態では、細胞培養物中のガングリオシド、例えばＧＭ１の量は、本発明の方法を使用して定量される。続いて、ガングリオシド、例えばＧＭ１は、以下に記載されている方法などの標準的な方法を使用して細胞培養物から単離して精製することができる。
【００５５】
例示的な実施形態では、アルファ−ＭＥＭ増殖培地（１０％ＦＢＳを含む）中で培養された、ヒト骨髄由来の細胞が、８，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種される。約２４時間後、この培地を血清の少ないアルファ−ＭＥＭ（１％ＦＢＳを含む）で交換し、５０マイクロモル濃度のＣＬＱを加える。細胞を約４８時間インキュベートした後、採取する。
【００５６】
本発明の追加的な実施形態では、ＣＬＱ処理により、すべてのガングリオシドの蓄積量が増加する。本発明の一実施形態では、ＣＬＱ処理により、ＧＭ１の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のＣＬＱ処理により、ＧＭ２の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のＣＬＱ処理により、ＧＭ３の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のＣＬＱ処理により、ＧＤ１ａの蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のＣＬＱ処理により、ＧＤ１ｂの蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のＣＬＱ処理により、ＧＤ３の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のＣＬＱ処理により、ＧＴ１の蓄積量が増加する。
【００５７】
別の実施形態では、ＣＬＱ処理により、２種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。さらなる実施形態では、ＣＬＱ処理により、３種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。さらなる実施形態では、ＣＬＱ処理により、４種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。さらなる実施形態では、ＣＬＱ処理により、５種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。
【００５８】
本発明の追加的な実施形態では、ＣＬＱ処理すると、クロロキンにより処理されなかった細胞と比べて、細胞中のガングリオシド蓄積量は、１０〜２００パーセント、または約１０〜２００パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、ＣＬＱ処理すると、クロロキンにより処理されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、１５〜１２５パーセント、または約１５〜１２５パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、ＣＬＱ処理すると、クロロキンにより処理されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、３０〜１００パーセント、または約３０〜１００パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、ＣＬＱ処理すると、クロロキンにより処理されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、６０〜８０パーセント、または約６０〜８０パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、ＣＬＱ処理すると、クロロキンにより処理されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、１５、１９、２８、６３、６５、８３、１０４および１１９パーセント、または約１５、１９、２８、６３、６５、８３、１０４および１１９パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、ＣＬＱ処理すると、クロロキンにより処理されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、６５パーセント多くなる。
【００５９】
本発明はさらに、本発明のＣＬＱ処理法により産生されるガングリオシドを提供する。
【００６０】
本発明はさらに、本発明のＣＬＱ処理により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１を投与することによる、こうした処置法を必要としている、疾患または障害を有する被験体を処置する方法を提供する。実施形態では、ニューロン損傷を有する被験体が、本発明のＣＬＱ処理法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、パーキンソン病を有する被験体が、本発明のＣＬＱ処理法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、アルツハイマー病を有する被験体が、本発明のＣＬＱ処理法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、脳卒中を有していたか、または有している被験体が、本発明のＣＬＱ処理法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、ギラン−バレー症候群を有する被験体が、本発明のＣＬＱ処理法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、がんを有する被験体が、本発明のＣＬＱ処理法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。
【００６１】
ノイラミニダーゼによる処理によるガングリオシド産生
追加的な実施形態では、過剰のガングリオシド、例えばＧＭ１の産生が、ノイラミニダーゼを単独またはＣＬＱと一緒に使用すると、細胞中で誘発される。ノイラミニダーゼおよびクロロキンによる処理の組合せは、本明細書では「ノイラミニダーゼ／ＣＬＱ」と略す。ノイラミニダーゼは、主要な脳複合体ガングリオシド、例えばＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、およびＧＴ１ｂを無傷細胞中でＧＭ１に変換するシアリダーゼ酵素である。実施形態では、ノイラミニダーゼ処理法において使用するための細胞源には、以下に限定されないが、ヒト、ヒツジ、ウサギ、マウス、モルモット、ウマ、ブタ、ネコおよびイヌが含まれる。本発明の実施形態では、上で列挙した動物源に限定されないが、これらを含む、動物源から単離される細胞（間質細胞、例えば骨髄および脂肪由来の細胞；ならびに線維芽細胞、例えばＧＭ１線維芽細胞および皮膚線維芽細胞）を、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法において使用することができる。本発明の別の実施形態では、これらの動物源の各々から単離される骨髄細胞を、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法において使用することができる。動物源に由来する骨髄を単離する例示的な方法は、以下に詳細に記載されている。実施形態では、以下に記載されている低密度／低酸素培養法により産生される細胞がノイラミニダーゼおよびノイラミニダーゼ／ＣＬＱにより処理されて、ガングリオシド、例えばＧＭ１の産生が誘発される。実施形態では、以下に記載されている低密度／低酸素培養方法により産生されるヒト骨髄細胞がノイラミニダーゼおよびノイラミニダーゼ／ＣＬＱにより処理されて、ガングリオシド、例えばＧＭ１の産生が誘発される。
【００６２】
本発明の追加的な実施形態では、不死化細胞、例えばＣＨＯ細胞およびヒト胎児由来腎臓細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＨＥＫ２９３細胞が、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法において使用される。さらなる実施形態では、上で列挙した動物源（ヒトを含む）に限定されないが、それらを含む動物源から単離される神経芽細胞腫細胞、および神経芽細胞腫細胞系（以下に限定されないが、ＳＨＳＹ−５Ｙ、ＳＨＳＹ−ＳおよびＳＫ−Ｎ−ＡＳを含む）が、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法において使用される。さらなる実施形態では、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼＣＬＱ方法において使用するための細胞は、ガングリオシドーシスに罹っている動物、例えばＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、もしくはそれらの両方に罹っているヒト、ネコ、またはイヌに由来する。さらなる実施形態では、ガングリオシドーシスに罹っているヒト、ヒツジ、ネコ、またはイヌに由来する骨髄細胞および線維芽細胞が、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法において使用される。実施形態では、線維芽細胞は、ＧＭ１線維芽細胞である。
【００６３】
実施形態では、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法において使用される細胞タイプの各々は、処理前、および／もしくは処理中、ならびに／または処理後に、以下に詳細に記載されている低密度／低Ｏ２培養法の下で培養される。
【００６４】
実施形態では、ガングリオシドーシスに罹っているヒツジに由来するＰＣ１２細胞、ＨＴ２２細胞、脳細胞、およびガングリオシドーシスに罹っているヒツジに由来する線維芽細胞が、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法では使用されない。
【００６５】
実施形態では、所望の供給源に由来する細胞は、加湿インキュベーター内で、標準播種密度、例えば２，０００〜２０，０００細胞／ｃｍ２、好ましくは８，０００細胞／ｃｍ２で、標準（５％ＣＯ２）雰囲気条件下、３７℃で、標準増殖培地、例えば、血清（例えば１０％ＦＢＳ）を補給し、１〜４ｍＭグルタミンをさらに補給したアルファ−ＭＥＭ；１０％ＦＢＳを補給したＭＥＭ／Ｆ−１２；１％非必須アミノ酸（「ＮＥＡＡ」）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１５％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ／Ｆ−１２；０．１ｍＭ  ＮＥＡＡおよび１０％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭ；１０％ＦＢＳを補給したＦ−１２Ｋ；１０％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ；増殖サプリメントを補給したＬｏｎｚａ  ＭＳＣ基本培地；増殖サプリメントを補給したＬｏｎｚａ  ＡＤＳＣ基本培地；サプリメントを含むＬｏｎｚａ線維芽細胞基本培地；または１５％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ中で培養する。ノイラミニダーゼを培養培地に加え、細胞をノイラミニダーゼにより１〜５時間、好ましくは２〜４時間、好ましくは３時間処理する。実施形態では、１〜５ユニット／ｍｌの間、好ましくは１ユニット／ｍｌのノイラミニダーゼを培養培地に加える。追加的な実施形態では、細胞培養物中のガングリオシド、例えばＧＭ１の量は、本発明の方法を使用して定量される。ガングリオシド、例えばＧＭ１は、以下に記載されている方法などの標準的な方法を使用して細胞培養物から単離して精製することもできる。
【００６６】
本発明の追加的な実施形態では、ノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により、すべてのガングリオシドの蓄積量が増加する。本発明の一実施形態では、ノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により、ＧＭ１の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により、ＧＭ２の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により、ＧＭ３の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により、ＧＤ１ａの蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により、ＧＤ１ｂの蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により、ＧＤ３の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により、ＧＴ１の蓄積量が増加する。
【００６７】
別の実施形態では、ノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により、２種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。さらなる実施形態では、ノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により、３種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。さらなる実施形態では、ノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により、４種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。さらなる実施形態では、ノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により、５種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。
【００６８】
本発明の追加的な実施形態では、ノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により、ノイラミニダーゼおよびノイラミニダーゼ／ＣＬＱにより処理されなかった細胞と比べて、細胞中のガングリオシド蓄積量は、１０〜２００パーセント、または約１０〜２００パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、ノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により、ノイラミニダーゼおよびノイラミニダーゼ／ＣＬＱにより処理されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、１５〜１２５パーセント、または約１５〜１２５パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、ノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により、ノイラミニダーゼおよびノイラミニダーゼ／ＣＬＱにより処理されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、１５、１９、２８、６３、６５、８３、１０４および１１９パーセント、または約１５、１９、２８、６３、６５、８３、１０４および１１９パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、ノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により、ノイラミニダーゼおよびノイラミニダーゼ／ＣＬＱにより処理されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、６５パーセント多くなる。
【００６９】
本発明はさらに、本発明のノイラミニダーゼ処理法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ処理により産生されるガングリオシドを提供する。
【００７０】
本発明はさらに、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１を投与することによる、こうした処置を必要としている、疾患または障害を有する被験体を処置する方法を提供する。実施形態では、ニューロン損傷を有する被験体が、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、パーキンソン病を有する被験体が、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、アルツハイマー病を有する被験体が、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、脳卒中を有していたか、または有している被験体が、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、ギラン−バレー症候群を有する被験体が、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、がんを有する被験体が、本発明のノイラミニダーゼ法およびノイラミニダーゼ／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。
【００７１】
グルコサミンによる処理によるガングリオシド産生
追加的な実施形態では、過剰のガングリオシド、例えばＧＭ１の産生は、グルコサミンを単独またはＣＬＱと一緒に使用すると、細胞中で誘発される。グルコサミンによる処理とクロロキンによる処理との組合せは、本明細書では「グルコサミン／ＣＬＱ」と略す。ある種の条件下では、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Massonら、Biochem.  J.３８８巻、５３７〜５４４頁（２００５年）により開示されている通り、グルコサミン処理により、ガングリオシド、例えばＧＭ１およびＧＭ２のレベルが向上する。グルコサミン法およびグルコサミン／ＣＬＱ法において使用するための細胞源には、以下に限定されないが、ヒト、ヒツジ、ウサギ、マウス、モルモット、ウマ、ブタ、ネコおよびイヌが含まれる。本発明の実施形態では、線維芽細胞および間質細胞、例えば骨髄および脂肪由来の細胞；ならびに上で列挙した動物源に限定されないがそれらを含む動物源に由来する、線維芽細胞、例えばＧＭ１線維芽細胞および皮膚線維芽細胞を、本発明のグルコサミン法およびグルコサミン／ＣＬＱ法において使用することができる。動物源に由来する細胞を単離する例示的な方法は、以下に詳細に記載されている。実施形態では、以下に記載されている低密度／低酸素培養法により産生される細胞がグルコサミンおよびグルコサミン／ＣＬＱにより処理されて、ガングリオシド、例えばＧＭ１の産生が誘発される。実施形態では、以下に記載されている低密度／低酸素培養法により産生されるヒト骨髄細胞がグルコサミンおよびグルコサミン／ＣＬＱにより処理されて、ガングリオシド、例えばＧＭ１の産生が誘発される。
【００７２】
本発明の追加的な実施形態では、不死化細胞、例えばＣＨＯ細胞およびヒト胎児由来腎臓細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＨＥＫ２９３細胞が、本発明のグルコサミン法およびグルコサミン／ＣＬＱ法において使用される。さらなる実施形態では、上で列挙した動物源（ヒトを含む）に限定されないが、それらを含む動物源から単離される神経芽細胞腫細胞、および神経芽細胞腫細胞系（以下に限定されないが、ＳＨＳＹ−５Ｙ、ＳＨＳＹ−ＳおよびＳＫ−Ｎ−ＡＳを含む）が、本発明のグルコサミン法およびグルコサミン／ＣＬＱ法において使用される。さらなる実施形態では、本発明のグルコサミン法およびグルコサミン／ＣＬＱ法において使用するための細胞は、ガングリオシドーシスに罹っている動物、例えばＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、もしくはそれらの両方に罹っているヒト、ネコ、またはイヌに由来する。さらなる実施形態では、ガングリオシドーシスに罹っているヒト、ヒツジ、ネコ、またはイヌに由来する骨髄細胞および線維芽細胞が、本発明のグルコサミン法およびグルコサミン／ＣＬＱ法において使用される。実施形態では、線維芽細胞は、ＧＭ１線維芽細胞である。
【００７３】
実施形態では、本発明のグルコサミン法およびグルコサミン／ＣＬＱ法において使用される細胞タイプの各々は、処理前、および／もしくは処理中、ならびに／または処理後に、以下に詳細に記載されている低密度／低Ｏ２培養法により培養される。
【００７４】
実施形態では、ガングリオシドーシスに罹っているヒツジに由来するＰＣ１２細胞、ＨＴ２２細胞、脳細胞、およびガングリオシドーシスに罹っているヒツジに由来する線維芽細胞は、本発明のグルコサミン法およびグルコサミン／ＣＬＱ法では使用されない。
【００７５】
実施形態では、所望の供給源に由来する細胞は、加湿インキュベーター内で、標準播種密度、例えば２，０００〜２０，０００細胞／ｃｍ２、好ましくは８，０００細胞／ｃｍ２で、標準（５％ＣＯ２）雰囲気条件下、３７℃で、標準増殖培地、例えば、血清（例えば１０％ＦＢＳ）を補給し、１〜４ｍＭグルタミンをさらに補給したアルファ−ＭＥＭ；１０％ＦＢＳを補給したＭＥＭ／Ｆ−１２；１％非必須アミノ酸（「ＮＥＡＡ」）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１５％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ／Ｆ−１２；０．１ｍＭ  ＮＥＡＡおよび１０％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭ；１０％ＦＢＳを補給したＦ−１２Ｋ；１０％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ；増殖サプリメントを補給したＬｏｎｚａ  ＭＳＣ基本培地；増殖サプリメントを補給したＬｏｎｚａ  ＡＤＳＣ基本培地；サプリメントを含むＬｏｎｚａ線維芽細胞基本培地；または１５％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ中で培養する。Massonら、Biochem.J.３８８巻、５３７〜５４４頁（２００５年）により開示される通り、グルコサミンが培地に添加されて培養される。追加的な実施形態では、細胞培養物中のガングリオシド、例えばＧＭ１の量は、本発明の方法を使用して定量される。ガングリオシド、例えばＧＭ１は、以下に記載されている方法などの標準的な方法を使用して細胞培養物から単離して精製することもできる。
【００７６】
本発明の追加的な実施形態では、グルコサミン処理およびグルコサミン／ＣＬＱ処理により、すべてのガングリオシドの蓄積量が増加する。本発明の一実施形態では、グルコサミン処理およびグルコサミン／ＣＬＱ処理により、ＧＭ１の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のグルコサミン処理およびグルコサミン／ＣＬＱ処理により、ＧＭ２の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のグルコサミン処理およびグルコサミン／ＣＬＱ処理により、ＧＭ３の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のグルコサミン処理およびグルコサミン／ＣＬＱ処理により、ＧＤ１ａの蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のグルコサミン処理およびグルコサミン／ＣＬＱ処理により、ＧＤ１ｂの蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のグルコサミン処理およびグルコサミン／ＣＬＱ処理により、ＧＤ３の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明のグルコサミン処理およびグルコサミン／ＣＬＱ処理により、ＧＴ１の蓄積量が増加する。
【００７７】
別の実施形態では、グルコサミン処理およびグルコサミン／ＣＬＱ処理により、２種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。さらなる実施形態では、グルコサミン処理およびグルコサミン／ＣＬＱ処理により、３種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。さらなる実施形態では、グルコサミン処理およびグルコサミン／ＣＬＱ処理により、４種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。さらなる実施形態では、グルコサミン処理およびグルコサミン／ＣＬＱ処理により、５種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。
【００７８】
本発明の追加的な実施形態では、グルコサミン処理およびグルコサミン／ＣＬＱ処理すると、グルコサミンおよびグルコサミン／ＣＬＱにより処理されなかった細胞と比べて、細胞中のガングリオシド蓄積量は、１０〜２００パーセント、または約１０〜２００パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、グルコサミン処理およびグルコサミン／ＣＬＱ処理すると、グルコサミンおよびグルコサミン／ＣＬＱにより処理されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、１５〜１２５パーセント、または約１５〜１２５パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、グルコサミン処理およびグルコサミン／ＣＬＱ処理すると、グルコサミンおよびグルコサミン／ＣＬＱにより処理されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、３０〜１００パーセント、または約３０〜１００パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、グルコサミン処理およびグルコサミン／ＣＬＱ処理すると、グルコサミンおよびグルコサミン／ＣＬＱにより処理されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、６０〜８０パーセント、または約６０〜８０パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、グルコサミン処理およびグルコサミン／ＣＬＱ処理すると、グルコサミンおよびグルコサミン／ＣＬＱにより処理されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、１５、１９、２８、６３、６５、８３、１０４および１１９パーセント、または約１５、１９、２８、６３、６５、８３、１０４および１１９パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、グルコサミン処理およびグルコサミン／ＣＬＱ処理すると、グルコサミンおよびグルコサミン／ＣＬＱにより処理されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、６５パーセント多くなる。
【００７９】
本発明はさらに、本発明のグルコサミン法およびグルコサミン／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシドを提供する。
【００８０】
本発明はさらに、本発明のグルコサミンおよびグルコサミン／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１を投与することによる、こうした処置を必要としている、疾患または障害を有する被験体を処置する方法を提供する。実施形態では、ニューロン損傷を有する被験体が、本発明のグルコサミン法およびグルコサミン／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、パーキンソン病を有する被験体が、本発明のグルコサミン法およびグルコサミン／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、アルツハイマー病を有する被験体が、本発明のグルコサミン法およびグルコサミン／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、脳卒中を有していたか、または有している被験体が、本発明のグルコサミン法およびグルコサミン／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、ギラン−バレー症候群を有する被験体が、本発明のグルコサミン法およびグルコサミン／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、がんを有する被験体が、本発明のグルコサミン法およびグルコサミン／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。
【００８１】
生化学的操作によるガングリオシド産生
追加的な実施形態では、過剰のガングリオシド、例えばＧＭ１の産生は、生化学的操作を単独またはＣＬＱとの組合せにより、細胞中で誘発される。生化学的操作とクロロキン処理との組合せは、本明細書では「生化学操作／ＣＬＱ」と略す。ある種の条件下で、ある種の酵素レベルが変わることにより、ガングリオシドレベルが向上し、疾患が引き起こされる。ＧＭ１ガングリオシドーシスは、ＧＭ１ガングリオシド、糖タンパク質、およびグリコサミノグリカンから末端β−ガラクトシル残基を加水分解する、リソソームのβ−ガラクトシダーゼ酵素の欠乏により引き起こされる、ＧＭ１のレベル向上により引き起こされる。Christie、「Ganglioside」、ＡＯＣＳ脂質ライブラリー、２０１２年７月２３日が最後の更新である。さらに、ＧＭ２ガングリオシドーシスは、ガングリオシドの分解を触媒する特異的酵素であるβ−Ｎアセチルヘキソサミニダーゼの不十分な活性により引き起こされる。上記文献。さらに、ガングリオシドを一形態から別の形態に変換する酵素の多くが公知である。したがって、これらの酵素の発現および／または活性を変えることにより、特定のガングリオシドの産生を増加することができる。以下に限定されないが、ノックダウン（例えば、ノックダウン）、トランスフェクション（例えば、一過的または永続的）、化学的阻害（例えば、低分子、生物学、および抗体）などの公知方法を本発明の方法のために使用することができる。生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法において使用するための細胞源には、以下に限定されないが、ヒト、ヒツジ、ウサギ、マウス、モルモット、ウマ、ブタ、ネコおよびイヌが含まれる。本発明の実施形態では、線維芽細胞および間質細胞、例えば骨髄および脂肪由来の細胞；ならびに上で列挙した動物源に限定されないがそれらを含む動物源に由来する線維芽細胞、例えばＧＭ１線維芽細胞および皮膚線維芽細胞を、本発明の生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法において使用することができる。動物源由来の細胞を単離する例示的な方法は、以下に詳細に記載されている。実施形態では、以下に記載されている低密度／低酸素培養法により産生される細胞が生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法に使用されて、ガングリオシド、例えばＧＭ１の産生が誘発される。実施形態では、以下に記載されている低密度／低酸素培養法により産生されるヒト骨髄細胞が生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法に使用されて、ガングリオシド、例えばＧＭ１の産生が誘発される。
【００８２】
本発明の追加的な実施形態では、不死化細胞、例えばＣＨＯ細胞およびヒト胎児由来腎臓細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＨＥＫ２９３細胞が、本発明の生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法において使用される。さらなる実施形態では、上で列挙した動物源（ヒトを含む）に限定されないがそれらを含む動物源から単離される神経芽細胞腫細胞、および神経芽細胞腫細胞系（以下に限定されないが、ＳＨＳＹ−５Ｙ、ＳＨＳＹ−ＳおよびＳＫ−Ｎ−ＡＳを含む）が、本発明の生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法において使用される。さらなる実施形態では、本発明の生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法において使用するための細胞は、ガングリオシドーシスに罹っている動物、例えばＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、もしくはそれらの両方に罹っているヒト、ネコ、またはイヌに由来する。さらなる実施形態では、ガングリオシドーシスに罹っているヒト、ヒツジ、ネコ、またはイヌに由来する骨髄細胞および線維芽細胞が、本発明の生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法において使用される。実施形態では、線維芽細胞は、ＧＭ１線維芽細胞である。
【００８３】
実施形態では、本発明の生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法において使用される細胞タイプの各々は、生化学操作前、および／もしくは操作中、ならびに／または操作後に、以下に詳細に記載されている低密度／低Ｏ２培養法の下で培養される。
【００８４】
実施形態では、ガングリオシドーシスに罹っているヒツジに由来するＰＣ１２細胞、ＨＴ２２細胞、脳細胞、およびガングリオシドーシスに罹っているヒツジに由来する線維芽細胞は、本発明の生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法では使用されない。
【００８５】
実施形態では、所望の供給源に由来する細胞は、加湿インキュベーター内で、標準播種密度、例えば２，０００〜２０，０００細胞／ｃｍ２、好ましくは８，０００細胞／ｃｍ２で、標準（５％ＣＯ２）雰囲気条件下、３７℃で、標準増殖培地、例えば、血清（例えば１０％ＦＢＳ）を補給し、１〜４ｍＭグルタミンをさらに補給したアルファ−ＭＥＭ；１０％ＦＢＳを補給したＭＥＭ／Ｆ−１２；１％非必須アミノ酸（「ＮＥＡＡ」）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１５％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ／Ｆ−１２；０．１ｍＭ  ＮＥＡＡおよび１０％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭ；１０％ＦＢＳを補給したＦ−１２Ｋ；１０％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ；増殖サプリメントを補給したＬｏｎｚａ  ＭＳＣ基本培地；増殖サプリメントを補給したＬｏｎｚａ  ＡＤＳＣ基本培地；サプリメントを含むＬｏｎｚａ線維芽細胞基本培地；または１５％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ中で培養する。追加的な実施形態では、細胞培養物中のガングリオシド、例えばＧＭ１の量は、本発明の方法を使用して定量される。ガングリオシド、例えばＧＭ１は、以下に記載されている方法などの標準的な方法を使用して細胞培養物から単離して精製することもできる。
【００８６】
本発明の追加的な実施形態では、生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により、すべてのガングリオシドの蓄積量が増加する。本発明の一実施形態では、生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により、ＧＭ１の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により、ＧＭ２の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により、ＧＭ３の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により、ＧＤ１ａの蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により、ＧＤ１ｂの蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により、ＧＤ３の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により、ＧＴ１の蓄積量が増加する。
【００８７】
別の実施形態では、生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により、２種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。さらなる実施形態では、生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により、３種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。さらなる実施形態では、生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により、４種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。さらなる実施形態では、生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により、５種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。
【００８８】
本発明の追加的な実施形態では、生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により、生化学的な操作を受けなかった、および生化学的操作／ＣＬＱ処理を受けなかった細胞と比べて、細胞中のガングリオシド蓄積量は、１０〜２００パーセント、または約１０〜２００パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により、生化学的な操作を受けなかった、および生化学的操作／ＣＬＱ処理を受けなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、１５〜１２５パーセント、または約１５〜１２５パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により、生化学的に操作を受けなかった、および生化学的操作／ＣＬＱ処理を受けなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、３０〜１００パーセント、または約３０〜１００パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により、生化学的に操作を受けてなかった、および生化学的操作／ＣＬＱ処理を受けなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、６０〜８０パーセント、または約６０〜８０パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により、生化学的に操作を受けなかった、および生化学的操作／ＣＬＱ処理を受けなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、１５、１９、２８、６３、６５、８３、１０４および１１９パーセント、または約１５、１９、２８、６３、６５、８３、１０４および１１９パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により、生化学的に操作を受けなかった、および生化学的操作／ＣＬＱ処理を受けなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、６５パーセント多くなる。
【００８９】
本発明はさらに、本発明の生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシドを提供する。
【００９０】
本発明はさらに、本発明の生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１を投与することによる、こうした処置を必要としている、疾患または障害を有する被験体を処置する方法を提供する。実施形態では、ニューロン損傷を有する被験体が、本発明の生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、パーキンソン病を有する被験体が、本発明の生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、アルツハイマー病を有する被験体が、本発明の生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、脳卒中を有していたか、または有している被験体が、本発明の生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、ギラン−バレー症候群を有する被験体が、本発明の生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、がんを有する被験体が、本発明の生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。
【００９１】
化学的処理を行わず、かつ継代を行わない長期間細胞培養
本発明はさらに、継代を行うことなく、かつニューロン誘導培地、クロロキン、またはノイラミニダーゼ処理を行うことなく、細胞を培養することによる、ガングリオシド、例えばＧＭ１を産生する方法を提供する。高密度、例えば播種時に６０〜９０％集密、または好ましくは播種時に７０〜８０％集密で、長期間培養した細胞は、生存を維持してガングリオシド、例えばＧＭ１をかなりの量で蓄積することが驚くべきことに見いだされた。追加的な実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法は、上で記載している化学的処理および／または生化学操作と組み合わされる。例えば、ＮＩＭ／ＣＬＱにより培養された細胞は、次に、継代を行うことなく高密度−長期間培養が施されるか、またはＣＬＱおよび／もしくはノイラミニダーゼならびに／またはグルコサミンにより処理された細胞は、継代を行うことなく高密度で長期間培養されるか、あるいは細胞は、継代を行うことなく高密度で長期間培養され、次にＮＩＭ／ＣＬＱ、ＣＬＱ、ノイラミニダーゼ、および／またはグルコサミンにより処理される。
【００９２】
本発明の高密度、長期間培養法において使用するための細胞源には、以下に限定されないが、ヒト、ヒツジ、ウサギ、マウス、モルモット、ウマ、ブタ、ネコおよびイヌが含まれる。本発明の実施形態では、線維芽細胞および間質細胞、例えば骨髄および脂肪由来の細胞；ならびに上で列挙した動物源に限定されないがそれらを含む動物源に由来する、線維芽細胞、例えばＧＭ１線維芽細胞および皮膚線維芽細胞を、本発明の高密度、長期間培養法において使用することができる。動物源に由来する細胞を単離する例示的な方法は、以下に詳細に記載されている。実施形態では、以下に記載されている低密度／低酸素培養法により産生されるヒト骨髄細胞が高密度、長期間培養法に使用されて、ガングリオシド、例えばＧＭ１の産生が誘発される。
【００９３】
さらなる実施形態では、上で列挙した動物源（ヒトを含む）に限定されないが、それらを含む動物源から単離される神経芽細胞腫細胞、および神経芽細胞腫細胞系（以下に限定されないが、ＳＨＳＹ−５Ｙ、ＳＨＳＹ−ＳおよびＳＫ−Ｎ−ＡＳを含む）が、本発明の高密度、長期間培養法において使用される。
【００９４】
本発明の追加的な実施形態では、不死化細胞、例えばＣＨＯ細胞およびヒト胎児由来腎臓細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＨＥＫ２９３細胞が、本発明の生化学的操作法および生化学的操作／ＣＬＱ法において使用される。さらなる実施形態では、上で列挙した動物源（ヒトを含む）に限定されないがそれらを含む動物源から単離される神経芽細胞腫細胞、および神経芽細胞腫細胞系（以下に限定されないが、ＳＨＳＹ−５Ｙ、ＳＨＳＹ−ＳおよびＳＫ−Ｎ−ＡＳを含む）が、本発明の高密度、長期間培養法において使用される。さらなる実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法において使用するための細胞は、ガングリオシドーシスに罹っている動物、例えばＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、もしくはそれらの両方に罹っているヒト、ネコ、またはイヌに由来する。さらなる実施形態では、ガングリオシドーシスに罹っているヒト、ヒツジ、ネコ、またはイヌに由来する骨髄細胞および線維芽細胞が、本発明の高密度、長期間培養法において使用される。実施形態では、線維芽細胞は、ＧＭ１線維芽細胞である。
【００９５】
実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法において使用される細胞タイプの各々は、本発明の高密度、長期間培養法で培養する前、および／もしくはその間、ならびに／またはその後に、以下に詳細に記載されている低密度／低Ｏ２培養法の下で培養される。
【００９６】
実施形態では、ガングリオシドーシスに罹っているヒツジに由来するＰＣ１２細胞、ＨＴ２２細胞、脳細胞、およびガングリオシドーシスに罹っているヒツジに由来する線維芽細胞は、本発明の高密度、長期間培養法では使用されない。
【００９７】
こうした方法では、細胞はガングリオシド、例えばＧＭ１を蓄積するよう維持されて、また培養培地を交換するか、または必要に応じて追加の培養培地が添加され細胞生存を維持する。実施形態では、細胞は、加湿インキュベーター内で、５％ＣＯ２雰囲気下、１０％ＦＢＳを補給したアルファ−ＭＥＭ；１０％ＦＢＳを補給したＭＥＭ／Ｆ−１２；１％非必須アミノ酸（「ＮＥＡＡ」）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１５％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ／Ｆ−１２；０．１ｍＭ  ＮＥＡＡおよび１０％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭ；１０％ＦＢＳを補給したＦ−１２Ｋ；１０％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭ；増殖サプリメントを補給したＬｏｎｚａ  ＭＳＣ基本培地；増殖サプリメントを補給したＬｏｎｚａ  ＡＤＳＣ基本培地；サプリメントを含むＬｏｎｚａ線維芽細胞基本培地；または１５％ＦＢＳを補給したＥＭＥＭなどの標準増殖培地中、４日間〜４週間、６日間〜２週間、または９日間〜１２日間、約３７℃で培養する。例示的な実施形態では、培地は３日毎に換えて、細胞生存を維持する。
【００９８】
本発明の本実施形態において使用するための好ましい細胞には、骨髄および脳由来の細胞が含まれる。好ましい脳および骨髄由来の細胞には、以下に記載されている低密度／低酸素条件を使用する、ヒツジおよびヒトから単離される細胞が含まれる。好ましくは、細胞は、ガングリオシドーシスに罹っているヒツジまたはヒトに由来する。本発明の本実施形態において使用するためのさらなる細胞タイプには、不死化細胞、間質細胞、および線維芽細胞が含まれる。さらなる細胞タイプには、神経芽細胞腫細胞、例えば初代細胞、または以下に限定されないが、ＳＨＳＹ−５Ｙ、ＳＨＳＹ−Ｓ、およびＳＫ−Ｎ−ＡＳを含む細胞系が含まれる。実施形態では、高密度−長期培養に続いて、細胞を採取し、ガングリオシド、例えばＧＭ１を細胞から単離および精製する。実施形態では、細胞中のガングリオシド、例えばＧＭ１の量は、本発明の方法を使用して定量される。
【００９９】
本発明の追加的な実施形態では、高密度、長期間培養法により、すべてのガングリオシドの蓄積量が増加する。本発明の一実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法により、ＧＭ１の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法により、ＧＭ２の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法により、ＧＭ３の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法により、ＧＤ１ａの蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法により、ＧＤ１ｂの蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法により、ＧＤ３の蓄積量が増加する。本発明の別の実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法により、ＧＴ１の蓄積量が増加する。
【０１００】
別の実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法により、２種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。さらなる実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法により、３種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。さらなる実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法により、４種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。さらなる実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法により、５種以上のガングリオシドの蓄積量が増加する。
【０１０１】
本発明の追加的な実施形態では、高密度、長期間培養法により、高密度、長期間培養条件下で培養されなかった細胞と比べて、細胞中のガングリオシド蓄積量は、１０〜２００パーセント、または約１０〜２００パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、高密度、長期間培養法により、高密度、長期間培養条件下で培養されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、１５〜１２５パーセント、または約１５〜１２５パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、高密度、長期間培養法により、高密度、長期間培養条件下で培養されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、３０〜１００パーセント、または約３０〜１００パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、高密度、長期間培養法により、高密度、長期間培養条件下で培養されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、６０〜８０パーセント、または約６０〜８０パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、高密度、長期間培養法により、高密度、長期間培養条件下で培養されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、１５、１９、２８、６３、６５、８３、１０４および１１９パーセント、または約１５、１９、２８、６３、６５、８３、１０４および１１９パーセント多くなる。本発明の別の実施形態では、高密度、長期間培養法により、高密度、長期間培養条件下で培養されなかった細胞よりも、ガングリオシド蓄積量は、６５パーセント多くなる。
【０１０２】
本発明はさらに、本発明の長期間培養法により産生されるガングリオシドを提供する。
【０１０３】
本発明はさらに、本発明の長期間培養法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１を投与することによる、こうした処置を必要としている、疾患または障害を有する被験体を処置する方法を提供する。実施形態では、ニューロン損傷を有する被験体が、本発明の長期間培養法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、パーキンソン病を有する被験体が、本発明の長期間培養法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、アルツハイマー病を有する被験体が、本発明の長期間培養法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、脳卒中を有していたか、または有している被験体が、本発明の長期間培養法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、ギラン−バレー症候群を有する被験体が、本発明の長期間培養法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。実施形態では、がんを有する被験体が、本発明の長期間培養法により産生されるガングリオシド、例えばＧＭ１の投与により処置される。
【０１０４】
本発明の方法により産生されるガングリオシド、およびその使用方法
本発明は、本発明の方法により産生されるガングリオシドを提供する。こうしたガングリオシドには、以下に限定されないが、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ３、およびＧＴ１が含まれる。本発明により産生されるガングリオシドは、従来の方法により産生されるガングリオシドとは異なる。
【０１０５】
ガングリオシドは、親水性部位と疎水性部位の両方異なる化学種の非常に複雑な混合物として存在している。その全体が参照により組み込まれている、SonninoおよびChigorno、Biochim  Biophys  Acta  １４６９巻、６３〜７７頁（２０００年）。ガングリオシドは、グリコシド結合位、糖確認（confirmation）、中性糖およびシアル酸の含有量が異なるオリゴ糖構造の非常に大きなファミリーに結合している脂質部位からなる。例えば、市販のＧＭ１ガングリオシドは、長鎖塩基が様々である。実施例１３および表５を参照されたい。したがって、同じガングリオシド、例えば「ＧＭ１」として特徴づけられるガングリオシド間でさえも、構造の多様性が存在する。さらに、ガングリオシド組成は、人種間で異なっており、年齢につれて変化する。それらの各々の全体が参照により組み込まれている、Ikedaら、J.  Lipid  Res.４９巻、２６７８〜２６８９頁（２００８年）；MasseriniおよびFreire、Biochem.２５巻、１０４３〜１０４９頁（１９８６年）；Taketomiら、Acta  Biochim.  Pol.４５巻、９８７〜９９９頁。例えば、天然のＧＭ１は、主にＣ１８：１およびＣ２０：１の長鎖塩基を含有している、不均質な混合物である。上記文献。ヒトでは、ＧＭ１組成は、時間と共に変わる。その全体が参照により組み込まれている、Taketomiら、Acta  Biochim.  Pol.４５巻、９８７〜９９９頁。より詳細には、全スフィンゴシン塩基のｄ２０：１（イコサスフィンゴシン（ｉｃｏｓａｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ））およびｄ２０（イコサ−スフィンガニン）の割合が青年または成人年齢まで急速に増加し、次に、約５０％で一定のままである；この値は、様々な成体の哺乳動物の脳中のＧＭ１のｄ２０：１およびｄ２０の割合よりも高いものであった。上記文献。
【０１０６】
実施形態では、本発明は、本発明の方法により産生されるガングリオシドを提供する。
【０１０７】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の方法により産生されるガングリオシドの投与により、疾患または障害を有する、処置を必要とする被験体を処置する方法を提供する。例示的な疾患または障害には、以下に限定されないが、ニューロン損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、ギラン−バレー症候群、およびがんが含まれる。
【０１０８】
こうした組成物は、非経口形式（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射）により投与することができる。「非経口投与」および「非経口的に投与される」という言い回しは、本明細書で使用する場合、経腸および局所投与以外の投与形式、すなわち、通常、注射によるものを意味し、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、髄膜下、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経器官、皮下、表皮下、関節内、被膜下、蜘蛛膜下、髄腔内、硬膜外、および胸骨内注射および注入を含む。
【０１０９】
本発明により産生されたガングリオシドの使用の文脈において使用される場合、用語「処置する」または「処置」には、以下に限定されないが、治療的処置、および予防的手段または防止的手段が含まれ、この場合、その目的は、パーキンソン病の発症などの、望ましくない生理的変化または障害を防止するか緩和する（低減する）ことである。有益なまたは望ましい臨床的結果には、以下に限定されないが、検出可能か否かにかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の低下、疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延または速度低下、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的か総合的かのどちらかにかかわらない）が含まれる。本文脈における「処置」はまた、仮に処置を受けなかった場合に予期される生存に比べて、生存が延びることも意味する。処置を必要とするものには、状態または障害を既に有するもの、および状態または障害を受けやすいものが含まれ、この場合、状態または障害の発現が防止されるものとする。
【０１１０】
さらに、細胞培養という文脈において使用される場合、用語「処理」には、以下に限定されないが、指定の薬物、化学品、技法、治療および／または方法に、培養細胞を投与するかまたは施用することが含まれる。
【０１１１】
「被験体」もしくは「個体」または「動物」あるいは「患者」あるいは「哺乳動物」とは、診断、予後、予防、または治療が望まれる、任意の被験体、特に哺乳動物の被験体、例えばヒト患者を意味する。
【０１１２】
本発明の方法において使用するための細胞を産生する方法
上記の通り、実施形態では、細胞は本発明の方法に利用される。こうした実施形態では、細胞は低酸素、低密度条件下で培養することにより得ることができる。こうした方法は当分野で公知であり、例えば、それらの各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国公開第２００３／００５９４１４号、同第２００７／０２２４１７７号、および同第２００９／００５３１８３号（米国特許第８，３５４，３７０Ｂ２号として特許取得）に公開されている。一実施形態では、骨髄由来の細胞が、本発明の方法に利用される。こうした実施形態では、骨髄由来の細胞は、低酸素、低密度条件下で培養することにより得ることができる。
【０１１３】
例示的な実施形態では、全骨髄穿刺液をヒツジまたはヒトから得て、固相中で接触させて培養する。例えば、ヒト骨髄細胞は、十分に確立されている技法を使用して得られる腸骨稜および骨髄間質細胞集団の穿刺により、健常なヒトドナーから得られる。所望の場合、全骨髄穿刺液を処理して、次に固相に接触させて培養する単核細胞画分を生成することができる。固相は、例えば、プラスチック（例えば、組織培養処理用プラスチック）とすることができる。
【０１１４】
単核細胞画分は、確立された手順による密度勾配で、全骨髄穿刺液から得ることができる。あるいは、単核細胞画分は、骨髄穿刺液に含有している赤血液細胞の溶解により得られる。溶解は、骨髄と塩化アンモニウムとを混合することにより行うことができる。
【０１１５】
骨髄穿刺液、または骨髄穿刺液の細胞画分は、固相に接触させて培養し、また中間の細胞集団は、細胞が固相に接着する性質に基づいて、得られた細胞培養物から単離する。骨髄穿刺液、または穿刺液の細胞画分は、溶存酸素濃度が約２０％未満、好ましくは約１％〜約１０％の間、最も好ましくは約２％の酸素から約７％の酸素の間で培養される。好ましい実施形態では、溶存酸素濃度は、約５％酸素である。得られた接着細胞集団を増幅し、ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を共発現する、実質的に均質な細胞集団を生成させる。
【０１１６】
骨髄細胞の増幅は、約２５００細胞／ｃｍ２未満、好ましくは約１０００細胞／ｃｍ２未満、最も好ましくは約１００細胞／ｃｍ２未満の播種密度で実施される。特定の実施形態では、増幅ステップにおける最初の細胞密度は、約３０細胞／ｃｍ２〜約５０細胞／ｃｍ２の間である。播種密度は、ｃｍ２あたりの、単核骨髄細胞から得られた接着細胞数になると思われる。
【０１１７】
標準培地調製物を使用して、骨髄細胞を培養することができる。例えば、培地は、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０〜１０％分の選択ＦＢＳ、好ましくは約１０％ＦＢＳを補給したアルファ−ＭＥＭ改変培地（modification）とすることができる。培養ステップは、任意の合理的な時間、例えば約３〜約２５日間、最も好ましくは約３〜約１５日間行うことができる。
【０１１８】
中間の細胞集団は、固相に接着する性質に基づいて、上で記載した細胞培養物から単離する。中間の細胞集団は、本明細書ではコロニー形成単位線維芽細胞様細胞（ＣＦＵ−Ｆ）と呼ばれる、実質的に自己複製細胞にしか増殖を促さない細胞濃度で増殖させる。ＣＦＵ−Ｆ由来の細胞は、限定条件下で副次培養されて、実質的に均質な細胞集団を生成させる。本発明によれば、この増幅により、ＣＤ４９およびＣＤ９０を共発現する実質的に均質な細胞集団が生じる。
【０１１９】
本発明の方法において使用するためのヒツジ脳由来の細胞を単離する方法
上で議論した通り、実施形態では、ヒツジ脳由来の細胞は本発明の方法に利用される。例えば、一部の実施形態では、ヒツジ脳由来の細胞は、本発明の長期間、高密度培養法を用いて培養される。上で述べた通り、一部の実施形態では、ヒツジ脳由来の細胞は、ガングリオシドーシスに罹っているヒツジから単離される。ガングリオシドーシスに罹っているヒツジは、以前に、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，５３２，１４１号に開示されている。ヒツジ脳由来の細胞の単離および培養方法は、当分野、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４７５２２号（ＷＯ２０１１／０２８７９５として公開されている）において開示されている。
【０１２０】
例示的な一実施形態では、細胞は以下のヒツジ脳組織源から単離される：半卵円中心、小脳皮質、海馬、尾状核、大脳皮質（例えば、前頭、頭頂）、および心室壁。組織タイプは各々、ＰＩＰＥＳ緩衝液によりそそがれて、抗生物質／抗真菌剤を含むパパイン／ＤＮアーゼＩ／Ｄｉｓｐａｓｅ（中性プロテアーゼ）中で消化する。酵素は中和され、分離された細胞は細胞ストレーナーに通す。細胞を遠心分離にかけ、５％ＦＢＳおよび抗生物質／抗真菌剤を補給したＤＭＥＭ／Ｆ１２／Ｎ２に再分散する。細胞を数えて、フィブロネクチン被覆フラスコ内で、５％ＦＢＳおよび抗生物質／抗真菌剤、さらにｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌおよびＥＧＦ  ２０ｎｇ／ｍｌ、またはＮｅｕｒｏｃｕｌｔ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−Ａ  ｍｅｄｉｕｍを補給したＤＭＥＭ／Ｆ１２／Ｎ２中で播種した。各培地タイプ中の細胞を、加湿インキュベーター内で、３７℃で増殖させる。実施形態では、細胞は、低酸素状態中、例えば２０％以下、１５％以下、１０％以下、好ましくは４％または５％の酸素中で増殖させたのち、本発明の方法を利用する。
【０１２１】
細胞からガングリオシドを単離する方法
本発明の細胞培養物からのガングリオシドの抽出および精製は、当分野で公知の方法により達成される。例えば、細胞ペレットを最少量の水中、３０分間超音波処理し、ホモジナイズする。試料をクロロホルム：メタノール２：１中、２０体積に希釈する。３０分超音波処理する。２０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離にかけて、細胞物質をペレットにする。デカントして上澄み液を取っておく。水５％を含む、１０体積のクロロホルム：メタノール２：１中でペレットを懸濁する。３０分超音波処理する。上記のように、遠心分離にかけてデカントする。上澄み液を合わせる。クロロホルム：メタノールの添加、超音波処理、遠心分離をさらに２〜３回繰り返し、ガングリオシドのすべてを完全に抽出する。ガングリオシドの大部分は、最初の２回の抽出サイクルで抽出されるはずである。合わせた上澄み液に、０．１Ｎ  ＫＣｌまたはＮａＣｌを０．２体積加える。十分に混合する。２０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離にかけて、層を分離する。上層を取っておく。残存有機（下）層に、メタノール：０．１Ｎ  ＫＣｌまたはＮａＣｌ  １：１を０．２体積加える。十分に混合する。ＫＣｌまたはＮａＣｌの添加、遠心分離、および抽出のステップを繰り返す。残存する有機（下）層に、メタノール：水１：１を０．２体積加える。取っておいた上層を合わせ、濃縮する。得られた抽出物は、ガングリオシドのプール（ｐｏｏｌ）を含んでいる。次に、対象の化学種はカラムクロマトグラフ、例えばセファロースまたはコレラ−毒素Ｂを使用してさらに単離することができる。
【０１２２】
細胞培養物中のガングリオシドの量の定量
本発明は、本発明のガングリオシド産生方法を実施した後、細胞培養物中のガングリオシド、例えばＧＭ１の量を定量する方法も提供する。したがって、本発明は、その定量化のため試料を比較するための、プレート培養に基づくガングリオシド、例えばＧＭ１の定量化用の標準曲線を作製する方法を提供する。
【０１２３】
一部の実施形態では、標準曲線は、ガングリオシド、例えばヒツジまたはヒトＧＭ１などのＧＭ１の希釈液を調製し、この希釈液をＮｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートなどのＥＬＩＳＡ用プレートに添加することにより作製される。このプレートへのガングリオシド、例えばＧＭ１の吸着を可能にするよう、プレートを、例えば８〜２４時間、好ましくは１２〜１６時間、４℃でインキュベートする。インキュベート後、このプレートを洗浄してブロッキングし、ガングリオシド、例えばＧＭ１をＣＴＢに接触させるが、このＣＴＢは色素、またはその基質と接触すると着色最終産生物を産生する酵素にコンジュゲートされている。ＣＴＢコンジュゲートとの接触後、色素、または着色性最終産生物により発光または吸収された光を測定し、この場合、読取値は、上記のプレートを覆っている精製ガングリオシド、例えばＧＭ１での、ガングリオシド、例えばＧＭ１の量を示す。実施形態では、この吸光度を標準的なプレートリーダー上で読み取る。標準曲線は、吸光度に関して試験データを比較するため、吸光度データから作製される。
【０１２４】
続いて、試験ウェルの読取値と比較するために標準曲線を使用し、細胞中に蓄積したガングリオシド、例えばＧＭ１の量を定量するか、または実施形態では、可溶化後、ガングリオシド、例えばＧＭ１の量を定量する。例示的な実施形態では、試験ウェルは、上記試料プレートと同じ方法で洗浄およびブロッキングした接着ガングリオシド含有細胞を含有している。接着細胞をＣＴＢに接触させるが、このＣＴＢは色素、またはその基質と接触すると着色最終産生物を産生する酵素にコンジュゲートされている。色素、または着色性最終産生物により発光または吸収された光を測定し、標準曲線と比較して接着細胞中のガングリオシド蓄積量を決定する。この読取りの終了後、ガングリオシドは、例えばＰＢＳ中の１％ＳＤＳを用いて可溶化して、プレートリーダー上でプレートの再読取りを行うことができる。ガングリオシドは、細胞中の他の分子に結合して、ＣＴＢ結合部位を、検出試薬、例えばＣＴＢ−ＨＲＰまたはＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８に対して接近不能にすることができる。可溶化により、結合ガングリオシドまたは凝集ガングリオシドが放出され、追加の定量値がもたらされる。
【０１２５】
実施形態では、好ましい色素は、緑色蛍光色素などの蛍光色素であり、実施形態では、色素はＦＩＴＣまたはＡｌｅｘａ４８８である。追加的な実施形態では、ＣＴＢにコンジュゲートされている酵素は、西洋わさびペルオキシダーゼ（「ＨＲＰ」）である。ＣＴＢ−ＨＲＰコンジュゲートの場合、ＡＢＴＳ試薬を接着細胞に接触させて、着色産生物を生成し、着色産生物の吸光度を測定する。
【実施例】
【０１２６】
（実施例１）
アルファ−ＭＥＭ増殖培地（１０％ＦＢＳを含む）中のヒツジ骨髄由来の細胞（継代１または２）をＴ−２２５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ番号４３１０８１）に、８，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。
【０１２７】
翌朝、培地をニューロン誘導培地（ＮＩＭ）３０ｍｌ：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地＋Ｂ２７（レチノイン酸、ＥＧＦ（２５ｕｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補給）により交換した。
【０１２８】
その夕方に、クロロキン５０μΜをこのフラスコに加えた。３日目に、約７０％の細胞死が観察された。浮遊細胞はＰＢＳですすぐことにより、フラスコから取り除いた。この細胞にトリプシン処理を行い、生存細胞を採集した。この細胞を沈降させ、新しい増殖培地に再度懸濁した。新しいフラスコに８，０００細胞／ｃｍ２で播種した。一定量を取り出し、Ａｌｅｘａ４８８にコンジュゲートしたコレラ毒素を用いる染色によりＧＭ１誘発を確認するため、２４ウェルプレート中でプレート培養した。図１Ａおよび１Ｂにおいて示される通り、未処理（対照）細胞と比べて、ＮＩＭ／ＣＬＱ（ＮＩＭ中、４８時間のＣＱ）により処理したＳＢＭは、ＧＭ１のかなり強力な染色を有している。
【０１２９】
生存細胞をフラスコ中で２日間増幅させ、次に細胞を採取した。
【０１３０】
あるいは、生存細胞は、採取前に、２４時間、５０ｕＭのＣＬＱにより２回目の処理を行うことができる。
【０１３１】
（実施例２）
標準組織培養フラスコにおいて、成人ヒト骨髄細胞を、アルファ−ＭＥＭ増殖培地（１０％ＦＢＳを含む）中、８０００細胞／ｃｍ２の播種密度で播種した。
【０１３２】
翌日、必要な場合、培地を交換し、５０ｕＭのＣＬＱをこのフラスコに加えた。細胞は４８時間後に採取した。約１０〜２０％の細胞死を観察した。固定化細胞は、ＧＭ１レベルを視覚化するため、ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８により染色した。上の図（対照）と比べ、ＣＬＱ処理細胞（下の図）は、ＧＭ１をかなり多く蓄積していることを示した。
【０１３３】
（実施例３）
この実施例の目的は、ヒト神経芽細胞腫細胞系、ＳＨＳＹ−５Ｙ、ヒツジ骨髄由来の細胞（ＳＢＭ）、およびヒト骨髄由来の細胞（ＨＢＭ）において、ＧＭ１発現を上方調節することであった。
【０１３４】
一研究において、ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞、ＳＢＭ、およびＨＢＭは、２４ウェルプレート中の１０％の血清を含む増殖培地に播種した。翌日、これらの細胞に３種の異なる処理レジメンを施すか、または増殖培地（１０％ＦＢＳを含むＡＭＥＭ）：
無血清培地（ＳＦＭ）
ニューロン誘導培地（ＮＩＭ）
５０ｕＭクロロキン（ＣＬＱ）
中で放置した。
【０１３５】
４８時間後、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ色素１００ｕｌをこのウェルに加え、１時間インキュベートした。プレートリーダーを使用して、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅの吸光度を測定した。次に、このプレートを洗浄して固定化し、ＣＴＢ−ＨＲＰを使用してＧＭ１染色するため処理した。ＣＴＢ−ＨＲＰの値をＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ値に正規化し、この値は生存細胞を示す。
【０１３６】
図３に示される通り、３種の細胞タイプはすべて、ＮＩＭ中で、ＧＭ１発現の上方調節をある程度示した（対照とＮＩＭとの比較）。ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞はＮＩＭ中で約２倍の誘発を示した一方、ＳＢＭＣは約４倍の誘発を示した。ＧＭ１発現の最も劇的な上方調節（約８倍）は、ＨＢＭＣ（ＨＢＭについて、対照とＣｌＱを比較）のＣＬＱ処理で観察された（図３を参照されたい）。
【０１３７】
一連の研究において、ＳＨＳＹ−５Ｙ、ヒツジ骨髄由来の細胞、およびヒト骨髄由来の細胞をガングリオシド経路に作用することが知られている化合物により処理した。クロロキンは、エンドソームからリソソームへの膜トラフィッキングを撹乱する酸性指向剤（ａｃｉｄｏｔｒｏｐｉｃ  ａｇｅｎｔ）である。Ａ２３１８７は、ＣＬＱ処理後に、エクソソーム分泌を促進するカルシウムイオノホアである。Ｎ−アセチルグルコサミンは、ヘキソサミン経路を活性化し、この経路は糖複合体の合成中間体を与える。炭水化物源としてガラクトースに代えると、ガングリオシドの組成物を変えることができる。神経は、他の細胞タイプと比べてＧＭ１をより高いレベルで発現するので、細胞はニューロン分化（ＮＩＭ）を誘発することが知られている化合物および培地で処理することにより、ニューロン表現型へと促される。
【０１３８】
ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞は、２４ウェルプレート中に１０，０００細胞／ウェルで播種して、以下の表１中に列挙されている条件に従って処理した。処理後、細胞を固定化し、ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８により染色して、ＧＭ１を検出した。染色強度、細胞死の数、および他の観察を記録してまとめた。結果を表１に示す。ＮＩＭ２培地によるＳＨＳＹ−５Ｙの処理により、最も強力な染色（＋符号５個）が生じ、細胞死は生じなかった（−符号１個）。グルコサミンおよびＣＬＱ＋Ａ２３１８７（カルシウムイオノホア）処理も、ＣＬＱ＋Ａ２３１８７群において一部の細胞死を伴い、強力なＧＭ１誘発（＋４個）をもたらした。ＣＬＱ単独は、対照の処理細胞よりも多い染色を示した。
【表１−１】
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【表１−２】
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【０１３９】
罹患ヒツジ骨髄細胞（ＳＢＭ）は、２４ウェルプレート中に２０，０００細胞／ウェルで播種して、以下の表２中に列挙されている条件に従って処理した。処理後、細胞を固定化し、ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８により染色して、ＧＭ１を検出した。染色強度、細胞死の数、および他の観察を記録してまとめた。結果を表２に示す。ＮＩＭ培地中でＣＬＱによりＳＢＭ細胞を処理することにより、最も強力な染色（＋符号４個）、および最も多くの細胞死（＋符号３個）が生じた。ＣＬＱ単独もＧＭ１を誘発したが、ＣＬＱ／ＮＩＭほどではなかった。他の条件、すなわち、無血清培地、ＮＩＭ（１）培地、グルコサミン、およびＰＤＧＦも、それ程ではないが、ＧＭ１を誘発した。
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１４０】
ヒト骨髄細胞（ＨＢＭ）は、２４ウェルプレート中に２０，０００細胞／ウェルで播種し、以下の表３中に列挙されている条件に従って処理した。処理後、これらの細胞を固定化し、ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８により染色して、ＧＭ１を検出した。染色強度、細胞死の数、および他の観察を記録してまとめた。結果を表３に示す。ＣＬＱによるＨＢＭ細胞の処理により、最も強力な染色（＋符号５個）が生じ、細胞死は一部生じた（＋符号２個）。ＳＢＭと異なり、ＮＩＭ−ＣＬＱ処理は、大多数の細胞が死んだ。無血清培地単独もＧＭ１を誘発したが、ＣＬＱほどではなかった。
【表３】
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【０１４１】
（実施例４）
マウスＮｅｕｒｏ２Ａ神経芽細胞腫細胞を標準増殖培地（ＤＭＥＭ  Ｆ１２高グルコース、２ｍＭグルタミン、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋１０％ＦＢＳ）中で培養した。細胞を標準培養培地（対照）中で維持するか、またはノイラミニダーゼ１ユニット／ｍｌにより３時間処理した（処理物）。細胞を２％パラホルムアルデヒドにより固定化し、ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８により染色して、ＧＭ１ガングリオシドを検出した。固定化前の細胞培養物の明視野画像を図４の図ＡおよびＣに示している。ＧＭ１の陽性染色を示す蛍光画像を、図４の図ＢおよびＤに示している。ＧＭ１染色は、ノイラミニダーゼによる処理後もマウスＮｅｕｒｏ２Ａ細胞において著しく強力である（図ＢとＤとを比較）。
【０１４２】
（実施例５）
ｈＡＢＭ−ＳＣを基準増殖培地（ＡＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン）中で培養した。細胞を標準培養培地（対照）中で維持するか、またはノイラミニダーゼ１ユニット／ｍｌにより３時間処理した（処理物）。細胞を２％パラホルムアルデヒドにより固定化し、ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８により染色して、ＧＭ１ガングリオシドを検出した。ＧＭ１の陽性染色を示す蛍光画像を、図５に示している。ＧＭ１は、ノイラミニダーゼにより処理した後のｈＡＢＭ−ＳＣにおいてより多く、大きな凝集体として観察されることが多い。
【０１４３】
（実施例６）
マウスＮｅｕｒｏ２Ａ神経芽細胞腫細胞を４０，０００／ｃｍ２より高い、高密度でプレート培養し、標準増殖培地（ＤＭＥＭ  Ｆ１２高グルコース、２ｍＭグルタミン、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋１０％ＦＢＳ）中で培養した。細胞は、標準培養培地（対照）中、３日間または９日間維持した。培地は３日毎に換えた。細胞を２％パラホルムアルデヒドにより固定化し、ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８により染色して、ＧＭ１ガングリオシドを検出した。固定化前の細胞培養物の明視野画像を図ＡおよびＣに示している。ＧＭ１の陽性染色を示す蛍光画像を、図６の図ＢおよびＤに示している。低密度で３日間以内の培養物中に維持されている細胞中のＧＭ１の基底レベルと比べ、高密度で長期間の培養物において維持されているマウスＮｅｕｒｏ２Ａ細胞中では、広範囲に及ぶＧＭ１蓄積が明らかである（図６の図Ｂと図Ｄとを比較）。
【０１４４】
（実施例７）
ヒツジ脳由来の細胞を基準増殖培地（ＡＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン）中で培養した。細胞は、標準培養培地中、３日間または９日間維持した。培地は３日毎に換えた。細胞を２％パラホルムアルデヒドにより固定化し、ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８により染色して、ＧＭ１ガングリオシドを検出した。ＧＭ１の陽性染色を示す蛍光画像を、図７の図ＢおよびＤに示している。低密度で３日間以内の培養物中に維持されている細胞中のＧＭ１の基底レベルと比べ、高密度で長期間の培養物において維持されているヒツジ脳由来の細胞中で、広範囲に及ぶＧＭ１蓄積が明らかである（図７中の図Ｂと図Ｄとを比較）。
【０１４５】
（実施例８）
精製ヒツジＧＭ１の希釈液を調製し、Ｎｕｎｃ  ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに加える（各希釈液１００μｌ）。このプレートを４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄し、ブロッキングした。ＣＴＢ−ＨＲＰ（ウェルあたり７５ｕｌ、１：４０００）を加え、暗室、室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄し、次にＡＢＴＳ試薬（ウェルあたり１００μｌ）を加えた。緑色に発色させた。反応は、停止溶液（ＰＢＳ中の０．１％ＳＤＳ）６６ｕｌにより停止した。信号は、標準プレートリーダー上で読み取る。データをプロットし、標準曲線を図８に示している。感度範囲は、３ｎｇ〜０ｎｇである。
【０１４６】
（実施例９）
精製ヒツジＧＭ１の希釈液を調製し、Ｎｕｎｃ  ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに加えた（各希釈液１００μｌ）。このプレートを４℃で一晩インキュベートする。翌日、プレートを洗浄し、ブロッキングした。ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２００）を加え、暗室、室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄し、信号を標準的なプレートリーダー上で読み取る。次に、ＰＢＳ中の１％ＳＤＳを加えて、１０〜１５分間、ＧＭ１を可溶化する。このプレートを、プレートリーダー上で再度読み取ってデータをプロットし、標準曲線を図９に示している。感度範囲は、５００ｕｇ〜３０ｕｇである。
【０１４７】
（実施例１０）
一人のヒトドナーに由来する骨髄穿刺液を使用して、マスター細胞バンクＭＣＢ１０５を作製した。骨髄の採取は、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社の手順に従い、Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）により実施した。標準医療手技を使用して、ドナーの骨盤骨の後部からの左右両側の穿刺から全体積で１２４ｍＬの骨髄を得た。この穿刺液をヘパリン含有滅菌血液バッグに入れ、温度記録装置および冷パックを有する輸送用容器に入れた。処理は骨髄提供の４時間以内に開始した。
【０１４８】
骨髄処理
骨髄穿刺液の無菌処理のすべてを、クラス１００の生物学的安全キャビネット内で行った。穿刺液を血液バックから２５０ｍＬ無菌容器に移した。血液バックの内容物の体積を測定し、穿刺液の試料を取り出した。ＡＣＫ−ＬＹＳ溶液（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社：ＮＨ４Ｃｌ［８．２９ｇ／Ｌ］、ＫＨＣＯ３［１．０ｇ／Ｌ］、ＥＤＴＡ［０．０３７ｇ／Ｌ］）１０体積をこの穿刺液に加え、赤血球細胞を溶解した。懸濁液を遠心分離にかけ、有核細胞を単離した。上澄み液を廃棄し、細胞をＡＦＧ１０４増殖培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清および４ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むアルファ−ＭＥＭ）により再懸濁し、希釈および遠心分離により、増殖培地を用いてさらに２回洗浄した。最後の洗浄工程後、この細胞をＡＦＧ１０４増殖培地中で再懸濁した。溶解／懸濁液の洗浄後の試料を取り出し、有核細胞を数え、生存率を決定した。単核細胞を骨髄穿刺液から単離し、５個の培養用容器Ｎｕｎｃセルファクトリー（ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｙ）に、６０，０００±２０００細胞／ｃｍ２（上記ファクトリーあたり３．７９ｘ１０８細胞）で播種した。各ファクトリーは、ＡＦＧ１０４増殖培地１リットルを補給した。このセルファクトリーを３７℃のインキュベーター中でインキュベートし、培養物を５％ＣＯ２および４％Ｏ２で通気した。雑菌混入の徴候、およびインキュベーターの培養条件が規格（３７℃±２℃、４．０％±０．５％Ｏ２、５．０％±０．５％ＣＯ２）内にあることを確実とするため、１日２回、培養物をモニターした。７日間の増殖後、培地を各ファクトリーから取り出し、新しい培地と交換した。
【０１４９】
ＭＣＢ１０５となる最初の増幅中の集団倍加数は、９．４集団倍加数と求まった。ＭＣＢ１０５を２ｍＬの一定量として低温バイアルに充てんし、低温で保存して液体窒素の気相中、±−１３０℃で保管した。作業細胞バンク１（ＷＣＢ１）は、ＭＣＢ１０５の増幅したものから作製した。ＷＣＢ１は７．５〜９．５集団倍加数について増幅し、累積集団倍加数１６．９〜１８．９となる。採取した細胞は、０．８〜１ｍＬ（バイアルあたり１０００〜２０００万個の生存細胞）の一定量として低温で保存した低温バイアルに分注し、液体窒素の気相中、±−１３０℃で保管した。
【０１５０】
増幅、低温凍結、および試験処理をＷＣＢ２およびＷＣＢ３について繰り返した。ＷＣＢ２およびＷＣＢ３の各々は、７．５〜９．５集団倍加数であった。この増幅は、ＷＣＢ２については２４．４〜２８．４累積集団倍加数となり、ＷＣＢ３については３１．９〜３７．９累積集団倍加数となった。
【０１５１】
マスター細胞バンク、作業細胞バンク（ＷＣＢ１、ＷＣＢ２、ＷＣＢ３）、およびＧＢＴ００９を低温で保存した低温バイアルに分注し、液体窒素の気相中、−１３０℃で保管した。
【０１５２】
細胞バンクシステム
細胞バンクシステムは、５つの異なるバンキング手順からなる：ＭＣＢ１０５、ＷＣＢ１、ＷＣＢ２、ＷＣＢ３およびＧＢＴ００９。ＭＣＢ１０５は９．４倍加数であった。ＷＣＢはそれぞれ、７．５〜９．５集団倍加数に増幅し、その結果、３回連続ＷＣＢを使用すると、ＧＢＴ００９に関する目標集団倍加数に到達した。したがって、ＭＣＢ１０５は３７．５〜４７．５累積集団倍加まで増幅した。
【０１５３】
この細胞バンクシステムにより、バンクを使い果たした場合、ＭＣＢ１０５から新しいロットのＷＣＢ１、ＷＣＢ２、ＷＣＢ３、およびＧＢＴ００９を作製することが可能になる。例えば、使い切ったＷＣＢ２（ロット＃Ｓ１）は、Ｓ１を作製するために使用したＷＣＢ１（ロット＃Ｆ１〜５）の同一ロットからのバイアルを増幅することにより、ロット＃Ｓ２として再作製することができる。バンクを解凍し、同じ増幅手順および集団倍加数に従う。この増幅処理は、作業細胞バンクすべての確立について同じである。現在のＷＣＢ３バンク（ｌｏｔ＃Ｔ２）は、使い果たした後、ロット＃Ｔ２を作製するために使用したものと同じＷＣＢ２を使用して、ロット＃Ｔ３として再作製されることになる。この方法論により、ＷＣＢ１、ＷＣＢ２、ＷＣＢ３、および最終産生物のバイアルＧＢＴ００９（ロット番号Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７など）の繰り返し作製をすることができる。この手法により、製造工程および細胞産生物における高度の再現性、一貫性、および質が可能になる。細胞バンクはすべて、液体窒素（≦−１３０℃）の気相中で保管される。
【０１５４】
５日間のさらなるインキュベート後（播種後１２日間）、接着コロニーの採取をトリプシン処理により行った。条件を整えた培地を培養物から取り出し、微生物培養液（増殖なし）により、およびマイコプラズマ（非検出物）について試験した。細胞がセルファクトリーに付着している間、それらをｄＰＢＳ（カルシウムまたはマグネシウムを含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）５００ｍＬにより洗浄した。この溶液を除去し、廃棄物として廃棄した。トリプシン−ＥＤＴＡを加え、ファクトリーから細胞を分離した。これらの細胞を滅菌容器に移し、トリプシン処理した細胞の体積に等しい体積のＡＦＧ１０４増殖培地を加えることにより、トリプシン−ＥＤＴＡを中和した。細胞懸濁液を遠心分離にかけ、細胞ペレットを増殖培地に再懸濁した。
【０１５５】
再懸濁した細胞懸濁液の各々をサンプル採取し、細胞数、生存率、および純度について試験した。処理中の試験結果が合格した場合、細胞懸濁液をプールした。プールした懸濁液をサンプル採取し、細胞数、生存率、純度、および同一性について試験した。次に、この懸濁液を遠心分離にかけ、上澄み液をデカントして廃棄した。細胞ペレットを、低温保存用緩衝液、ＣＳＭ−５５（平衡塩溶液、４．５％ｗ／ｖデキシトロース（米国薬局方）（５％ｖ／ｖジメチルスルホキシド（米国薬局方）を含む）、および５％ｖ／ｖヒト血清アルブミン（米国薬局方）からなる低温保管用培地）中で再懸濁した。ＣＳＭ−５５の体積は、懸濁液の細胞数により導かれる。ＣＳＭ−５５を加えて、１ｍＬあたり１００万個の細胞濃度を実現した。細胞をＣＳＭ−５５中に再懸濁した後、この懸濁液をサンプル採取し、低温保存前に、細胞数、生存率、純度、および同一性を確認した。
【０１５６】
クラス１００の生物学的安全キャビネット内で、無菌技法を使用して、ＭＣＢ１０５の２５９個のバイアルに手作業で充てんした。５ｍＬバイアルはそれぞれ、ＣＳＭ−５５細胞懸濁液２ｍＬを含んだ。充てん作業中、充てん済みバイアルの３０番目毎に重量確認を行い、バイアル操作の一貫性を追跡できるようにし、目標体積（１．８〜２．２ｍＬ）からの不一致は観察されなかった。バイアル作業が完了すると、速度制御付き冷凍庫を使用してこれらのバイアルを凍結した。細胞懸濁液を周囲温度から４℃まで冷却した。バイアルが一旦、４℃で平衡化すると、それらのバイアルを−１２０℃まで温度低下させて、永久保管から除かれるまで、この温度に維持した。ＭＣＢ１０５のバイアルは、液体窒素保管庫（−１３０℃）の気相中で保管する。保管用槽は、アクセスを制限した。
【０１５７】
作業細胞バンク（ＷＣＢ１、ＷＣＢ２、ＷＣＢ３）の調製
製造工程には、３種のＷＣＢの連続産生が含まれる。連続する細胞バンクはそれぞれ、以前のバンクからの低温保管された細胞の一定量に由来のもの、すなわちＭＣＢ１０５→ＷＣＢ１→ＷＣＢ２→ＷＣＢ３であった。培養の操作はすべて、能動的な環境モニタリングプログラムを備えたクラス１００の生物学的安全キャビネット内で行った。各細胞バンクの作製は、以前の適切な細胞バンクからの細胞を解凍することにより開始した。ＭＣＢ１０５由来の細胞の一定分量を低温保管庫から取り出して解凍し、ストック細胞懸濁液を作製するＡＦＧ１０４増殖培地中で再懸濁した。このストック溶液からの試料を取り出し、細胞数および生存率に関して試験した。作業細胞バンクをそれぞれ使用するための、培養用容器、Ｎｕｎｃセルファクトリーは、ｃｍ２あたり３０±５で播種し、ＡＦＧ１０４増殖培地を使用して培養した。これらのセルファクトリーを３７℃のインキュベーター中でインキュベートし、培養物を５％ＣＯ２および４％Ｏ２で通気した。７日間の増殖後、培地を各ファクトリーから取り出し、新しい培地と交換した。条件を整えた培地は、微生物培養液について試験した。これらのファクトリーは追加期間インキュベートし、７．５〜９．５倍加数の集団倍加を達成した。
【０１５８】
接着コロニーの単離（採取）はトリプシン処理により行った。条件を整えた培地を培養物から取り出し、微生物培養液による滅菌性、およびマイコプラズマについて試験した。細胞は培養容器に付着している間、これらの細胞をｄＰＢＳにより洗浄した。この溶液を除去し、廃棄物として廃棄した。細胞の除去は、トリプシン−ＥＤＴＡを培養物に添加することにより行い、細胞が培養容器から分離できるようにした。細胞を滅菌容器に移し、トリプシン処理済み細胞にＡＦＧ１０４増殖培地を加えることにより、トリプシン−ＥＤＴＡを中和した。これらの細胞懸濁液を遠心分離にかけ、増殖培地に再懸濁した。再懸濁した細胞懸濁液の試料を各セルファクトリーから取り、処理中の試験（細胞数、生存率、および純度）のために供した。個々のファクトリーからの細胞懸濁液は、プールした細胞懸液と一緒にする前の合格基準を満たした。細胞懸濁化液を合わせ、プールした懸濁液からサンプル採取し、細胞数、生存率、純度、および同一性を確認した。次に、この懸濁液を遠心分離にかけた。遠心分離後、上澄み液をデカントし、細胞ペレットを低温保存用緩衝液、ＣＳＭ−５５に再懸濁し、１ｍＬあたり最大２０００万個の細胞濃度を達成した。この懸濁液をサンプル採取し、細胞数、生存率、純度および同一性を再度確認した。バイアルを、クラス１００の生物学的安全キャビネット中、無菌的かつ手作業により１．０±０．２ｍＬの一定分量で、２ｍＬポリプロピレン製Ｃｏｒｎｉｎｇ低温バイアルに入れて充てんした。重量確認は２５番目のバイアル毎に行い、バイアル作業の一貫性を追跡した。バイアル作業が完了すると、速度制御付き冷凍庫を使用してこれらのバイアルを凍結した。細胞懸濁液を周囲温度から４℃に冷却し、次に、温度を±−１２０℃に下げ、保管庫から除かれるまで、液体窒素（±−１３０℃）の気相中で保持した。
【０１５９】
（実施例１１）
ヒト骨髄由来の間質細胞、脂肪由来の間質細胞、皮膚線維芽細胞、およびＧＭ１ガングリオシドーシスと診断された被験体からの線維芽細胞、ならびに不死化神経芽細胞腫細胞（ＳＨＳＹ−５Ｙ、ＳＨＳＹ−Ｓ、およびＳＫ−Ｎ−ＡＳ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）、ならびにヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）は、商業的供給元から購入した。細胞を標準培養培地中、２０００〜２０，０００細胞／ウェルの密度で、２４ウェルプレート上、一晩培養し、標準培地（対照）中で維持するか、または以下の表４に列挙されている条件に従ってクロロキン（ＣＬＱ）により処理した。細胞は、組織培養インキュベーター内で、Ｎ２によりバランスさせた約５％ＣＯ２および約２１％Ｏ２を含む加湿雰囲気中、約３７℃に維持した。４８〜１２０時間の処理後、細胞を４％パラホルムアルデヒドにより固体化し、ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ４８８により染色して、ＧＭ１ガングリオシドを検出した。ＧＭ１陽性染色を示す蛍光画像が、図１０および１１に示されている。標準培養培地単独中で維持した対照と比べると、ほとんどの細胞タイプで広範囲にわたるＧＭ１蓄積が明らかである。（図１０および１１、ならびに表４）。
【表４−１】
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【０１６０】
（実施例１２）
一匹の正常なヒツジおよび一匹の罹患（ヒツジＧＭ１ガングリオシドーシス）ヒツジ（およそ４か月齢）を、サウスダコタのＨｏｌｌｅｒ  Ｆａｒｍにおいて安楽死させた。骨髄５〜１０ｍｌスクープ（ｓｃｏｏｐ）を各動物の大腿骨から採集し、５０ｍｌの個別にラベルを貼り付けた無菌円錐管に入れた。この管を輸送用溶液（Ｂｒａｉｎ  Ｂｉｔｓ社製のＨｉｂｅｒｎａｔｅ  Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製の１×ペニシリン／ストレプトマイシン）で満たした。試料を氷上、２４時間未満で、Ｍａｌｖｅｒｎ（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）に送付した。受け取り時に、管の外側をきれいにして、無菌生物学的安全キャビネットに移した。輸送用溶液をデカントし、ダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）２５ｍｌを各骨髄に加えた。優しくかつ繰り返して、骨髄／ＤＰＢＳ溶液を粉末化し、細胞懸濁液を作製した。細胞懸濁液をそれぞれ、２本の５００ｍｌ無菌遠心分離管（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に分割した。各遠心分離管に、ＡＣＫ溶解溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１５０ｍｌを加えた。これらの溶液は、この細胞懸濁液を１０〜２０回上下にピペット操作することにより混合した。管にそれぞれ栓をして、２秒間ボルテックスした。これらの細胞懸濁液をＡｌｌｅｇｒａ  ６Ｒ遠心分離器およびスインギングバケットを使用し、小さくブレーキをかけて、１３５０±５０ＲＰＭで１０分間遠心分離にかけた。各試料からの上澄み液を吸引し、廃棄した。残存している細胞ペレットはそれぞれ、１０ｍｌのＡＦＧ１０４増殖培地（ＡＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、４ｍＭ  ｇｌｕｔａｍａｘ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１×ゲンタマイシン）中で再懸濁した。正常なヒツジ骨髄由来の２つの細胞懸濁液を、５０ｍｌの無菌円錐管で合わせた。罹患ヒツジ骨髄由来の２つの細胞懸濁液を、別の５０ｍｌ無菌円錐管で合わせた。ＡＦＧ１０４増殖培地を各細胞懸濁液に加え、最終体積４０ｍｌにした。試料は、Ａｌｌｅｇｒａ  ６Ｒ遠心分離器およびスインギングバケットを使用し、小さくブレーキをかけて、１３５０±５０ＲＰＭで１０分間遠心分離にかけた。上澄み液を廃棄した。細胞ペレットを個別に、２０ｍｌのＡＦＧ１０４増殖培地中で再懸濁した。体積をさらなるＡＦＧ１０４増殖培地で４０ｍｌに調節した。試料は、Ａｌｌｅｇｒａ  ６Ｒ遠心分離器およびスインギングバケットを使用し、小さくブレーキをかけて、１３５０±５０ＲＰＭで１０分間遠心分離にかけた。上澄みを廃棄し、各ペレットを最終体積３０ｍｌのＡＦＧ１０４増殖培地中で再懸濁した。総細胞数および生存率を各試料について決定した。細胞は、Ｔ２２５フラスコの中、ＡＦＧ１０４増殖培地に６０，０００細胞／ｃｍ２で播種した。４％Ｏ２、５％ＣＯ２および３７℃に設定した加湿インキュベーター内で、細胞を培養した。５日目に、培養物に新しいＡＦＧ１０４増殖培地を供給し、８日目（正常ヒツジ骨髄由来の細胞）、または９日目（罹患ヒツジ骨髄由来の細胞）に採取した。この最初の採取を継代１（Ｐ１）またはマスター細胞バンク（ＭＣＢ）と定義した。細胞の一部を凍結保存した。残りの細胞を６０細胞／ｃｍ２で播種し、４％Ｏ２、５％ＣＯ２、および３７℃に設定した加湿インキュベーター内で、ＡＦＧ１０４増殖培地中、５日間培養した。５日目に、それらにＡＦＧ１０４増殖培地を供給し、９日目（正常ヒツジ骨髄由来の細胞）、または８日目（罹患ヒツジ骨髄由来の細胞）を採取した。この２回目の採取を継代２（Ｐ２）または作業細胞バンク１（ＷＣＢ１）と定義した。細胞の一部を凍結保存した。残りの細胞を、６０細胞／ｃｍ２で播種し、４％Ｏ２、５％ＣＯ２、および３７℃に設定した加湿インキュベーター内でＡＦＧ１０４増殖培地中、５日間培養した。５日目に、それらにＡＦＧ１０４増殖培地を供給し、１０日目（正常ヒツジおよび罹患ヒツジの骨髄由来の細胞）に採取した。この次の採取を継代３（Ｐ２）または作業細胞バンク２（ＷＣＢ２）と定義した。正常なヒツジ骨髄由来の細胞に関する倍加時間は、ＭＣＢ、ＷＣＢ１、およびＷＣＢ２について、それぞれ２２．１４、２３．０３、および２６．７１時間であった。罹患ヒツジ骨髄由来の細胞に関する倍加時間は、ＭＣＢ、ＷＣＢ１、およびＷＣＢ２について、それぞれ２２．１９、２２．７７、および２６．３１時間であった。正常なヒツジ骨髄由来の細胞に関する継代あたりの培養倍加数は、ＭＣＢ、ＷＣＢ１、およびＷＣＢ２において、それぞれ８．６７、９．３８、および８．０９であった。罹患ヒツジ骨髄由来の細胞に関する継代あたりの培養倍加数は、ＭＣＢ、ＷＣＢ１、およびＷＣＢ２において、それぞれ８９．７３、８．４３、および８．２１であった。
【０１６１】
発明を実施するための形態の項目は特許請求の範囲を解釈するためのものであり、概要および要約の項目はそのためのものではないことを理解されたい。概要および要約の項目は、１つまたは複数ではあるがすべてではない、発明者により熟慮された例示的な本発明の実施形態を説明することができ、したがって、本発明および添付の特許請求の範囲を決して限定するものではない。
【０１６２】
本発明は、明記された機能およびその関係の実施を例示する機能的なビルディングブロックの一助により、説明されている。これらの機能的なビルディングブロックの境界は、説明の便宜のために、本明細書で任意に規定されている。明記された機能およびその関係が適切に実施される限り、代替的な境界を規定することができる。
【０１６３】
特定の実施形態の上の説明は、他者が当分野の技術の範囲内の知識を応用することにより、過度の実験なしに、本発明の一般概念から逸脱することなく、こうした特定の実施形態の様々な適用を容易に修正および／または改変することができるほど、本発明の一般的な本質を完全に明らかにしていよう。したがって、こうした改変および修正は、本明細書において提示されている教示および指針に基づいて、開示されている実施形態の均等物の意味および範囲内であることを意図している。本明細書における言葉遣いまたは用語は、説明の目的のためのであって、限定するものではなく、したがって本明細書の用語または言い回しは、本教示および指針に照らして、当業者により解釈されるものであることを理解すべきである。
【０１６４】
本発明の幅および範囲は、上記の例示的な実施形態のいずれかにより限定されるべきでなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物によってしか規定されるべきでない。
【０１６５】
（実施例１３）
ウシとヒツジのＧＭＩ間の以下の比較データは、商業的に入手可能なＧＭ１研究用物質（Ａｖａｎｔｉ＆Ｍａｔｒｅｙａ社）およびＦｉｄｉａ社により製造されたＧＭ１物質を試験することにより作製した。Ｆｉｄｉａ社は、以前の臨床試験において使用されたものと同じ物質を製造した。試験はすべて、研究開発環境（非ＧＭＰ装置／試験方法についてバリデートしていない）で行った。分析作業は、現在のところ、ヒツジ由来のＧＭ１医薬品の開発中に行った。
【０１６６】
ＨＰＬＣ法は、ＧＭ１分子の個々のバリアントの相対量を決定するために開発した。結果は、各ＧＭ１分子は、各ＧＭ１分子の非極性テール基を含むアルキル鎖長に違いがあることを示している。ＧＭ１バリアントのプロファイル結果は、以下の表５に示されている。試験したすべてのロットの中で、２種のバリアントが優位を占め、存在している全ＧＭ１バリアントの８０％を超えて構成していることも観察された。これらの２種は、バリアントｄ１８：１  Ｃ１８：０およびｄ２０：１  Ｃ１８：０である。
【表４−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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