(57)【要約】  本発明は、骨障害診断、及び化学化合物のリスク階層化のための毒物学的評価の分野に関する。具体的には、本発明は骨障害を診断するための方法に関する。本発明は、化合物が、対象においてそうした骨障害を誘導し得るかどうかを判定するための方法及び骨障害を治療するための薬物を同定する方法にも関する。さらに本発明は、骨障害を診断するための装置及びキットに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨障害を診断するための方法であって、
(a)骨障害を患っていることが疑われる対象の試験サンプルにおいて表1a、1b、1c、1d、2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(b)ステップ(a)で測定した量を参照と比較して、それによって骨障害を診断するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記対象が、骨障害を誘導し得ることが疑われる化合物と接触させられている、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
対象において化合物が骨障害を誘導し得るかどうかを判定するための方法であって、
(a)骨障害を誘導し得ることが疑われる化合物と接触させられた対象のサンプルにおいて、表1a、1b、1c、1d、2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(b)ステップ(a)で測定した量を参照と比較して、それによって化合物の骨障害誘導能力を判定するステップ
を含む、上記方法。
【請求項４】
前記化合物が、過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物である、請求項2又は3に記載の方法。
【請求項５】
前記参照が、(i)骨障害を患う対象若しくは対象群、又は(ii)過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられた対象若しくは対象群に由来する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
試験サンプル及び参照中のバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨障害の指標になる、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記参照が、(i)骨障害を患っていないことが分かっている対象若しくは対象群、又は(ii)過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられていない対象若しくは対象群に由来する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記参照が、対象集団のバイオマーカーについて計算された参照である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
参照と比較して試験サンプル中において異なるバイオマーカーの量が、骨障害の指標になる、請求項7又は8に記載の方法。
【請求項１０】
骨障害を治療するための物質を同定するための方法であって、
(a)骨障害を治療し得ると推測される候補物質と接触させられた、骨障害を患う対象のサンプルにおいて、表1a、1b、1c、1d、2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(b)ステップ(a)で測定した量を参照と比較して、それによって骨障害を治療し得る物質を同定するステップ
を含む、上記方法。
【請求項１１】
前記参照が、(i)骨障害を患う対象若しくは対象群、又は(ii)過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられた対象若しくは対象群に由来する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
試験サンプルと参照の間で異なるバイオマーカーの量が骨障害を治療し得る物質の指標になる、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記参照が、(i)骨障害を患っていないことが分かっている対象若しくは対象群、又は(ii)過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられていない対象若しくは対象群に由来する、請求項10に記載の方法。
【請求項１４】
前記参照が、対象集団のバイオマーカーについて計算された参照である、請求項10に記載の方法。
【請求項１５】
試験サンプル及び参照中のバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨障害を治療し得る物質の指標になる、請求項13又は14に記載の方法。
【請求項１６】
対象のサンプルにおいて骨障害を診断するための、表1a、1b、1c、1d、2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカー又は前記バイオマーカー用の検出剤の使用。
【請求項１７】
骨障害を患っていることが疑われる対象のサンプルにおいて骨障害を診断するための装置であって、
(a)サンプル中に存在するバイオマーカーの量の測定を可能にする、表1a、1b、1c、1d、2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカー用の検出剤を含む分析ユニットと、それと作動可能に連結された、
(b)分析ユニットで測定された前記少なくとも1つのバイオマーカーの量を格納された参照と比較することを可能にし、それによって骨障害が診断される、格納された参照及びデータ処理装置を含む評価ユニットと
を含む、装置。
【請求項１８】
前記格納された参照が、骨障害を患っていることが分かっている対象若しくは対象群に由来する参照、又は過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられた対象若しくは対象群に由来する参照であり、前記データ処理装置が、分析ユニットで測定された少なくとも1つのバイオマーカーの量を格納された参照と比較するための指示を実行し、参照と比較して試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨障害が存在することの指標になるか、又は参照と比較して異なる、試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの量が、骨障害が存在しないことの指標になる、請求項17に記載の装置。
【請求項１９】
前記格納された参照が、骨障害を患っていないことが分かっている対象若しくは対象群に由来する参照、又は過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられていない対象若しくは対象群に由来する参照であり、前記データ処理装置が、分析ユニットで測定された少なくとも1つのバイオマーカーの量を格納された参照と比較するための指示を実行し、参照と比較して異なる、試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの量が、骨障害が存在することの指標になるか、又は参照と比較して試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨障害が存在しないことの指標になる、請求項17に記載の装置。
【請求項２０】
表1a、1b、1c、1d、2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカー用の検出剤、及び少なくとも1つのバイオマーカーに関するスタンダードであって、その濃度が、(i)骨障害を患っていることが分かっている対象若しくは対象群、又は過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられた対象若しくは対象群に由来するか、(ii)骨障害を患っていないことが分かっている対象若しくは対象群、又は過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられていない対象若しくは対象群に由来する上記スタンダードを含む、骨障害診断のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨障害診断、及び化学化合物のリスク階層化のための毒物学的評価の分野に関する。詳細には、本発明は骨障害を診断するための方法に関する。本発明は、化合物が、対象においてそうした骨障害を誘導し得るかどうかを判定するための方法及び骨障害を治療するための薬物を同定する方法にも関する。さらに、本発明は骨障害を診断するための装置及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は、35%の有機基質及び65%のミネラル、主にヒドロキシアパタイトからなる。有機基質は、90%まで1型コラーゲンで、及び10%まで非コラーゲンタンパク質で作られている。非コラーゲンタンパク質の約半分は、オステオカルシン(骨のGlaタンパク質)、オステオネクチン及びオステオポンチン並びに骨シアロタンパク質を均等な割合で含む(Marcusら、1996年)。
【０００３】
成人では、骨格の5〜10%は毎年再構築され、骨芽細胞によって確立される骨形成及び破骨細胞によって実施される骨吸収によって均衡が保たれる。骨芽細胞は、間葉系幹細胞に由来する。それらは非コラーゲン並びに1型コラーゲンタンパク質を合成し、有機基質の石灰化を管理する。多核性破骨細胞は、造血幹細胞を起源とする。それらは、水素イオンの排出、及び続くこの細胞型のタンパク質分解酵素による露出した有機骨基質の分解によって、骨組織のミネラル除去を開始する(Bilezikianら、1996年)。
【０００４】
骨粗しょう症(すなわち、骨質量の減少)は、欧州、日本及び米国で75,000,000人を超える人々に影響を及ぼす。それは、男性より女性で3倍一般的である。実質的な骨量減少は、65才の男性及び50才の女性で通常始まる(Rizzoli及びBonjour、1999年)。欧州では、50才を超える女性の数は、1990〜2025年に30〜40%増加すると推定される。この傾向は、世界の他の地域でさらにより顕著である。1990年に、主に骨粗しょう症の結果として、概算で1,300,000〜1,700,000件の股関節骨折が世界中で起こった。この数字は、2025年には少なくとも3,000,000に増加すると予想される(Cooperら、1992年; Gullbergら、1997年)。
【０００５】
骨代謝障害は、その原因により(i)原発性ミネラル化欠陥及び(ii)有機骨基質の減少に分類することができる。
【０００６】
(i)骨格ミネラル化は、カルシウム又はリン酸の栄養欠乏、並びに日光への皮膚の曝露の減少を原因とするビタミンD不足によるカルシトリオールの合成の減少によって低下する。この疾患は、子供ではくる病、成人では骨軟化症と呼ばれている。骨のミネラル除去は、副甲状腺ホルモン(PTH)の活性増加によって引き起こされることもある。副甲状腺機能亢進症(HPT)は、副甲状腺の腫瘍によるか(原発性HPT)、又はカルシウムの腸管吸収の減少若しくは腎臓からのその損失の増加へのフィードバックとして(二次性HPT)起こることがある。持続的な二次性HPTは、自律的PTH分泌を有する副甲状腺組織の過形成をもたらすことがある(三次性HPT)。
【０００７】
(ii)全身性骨粗しょう症の主要な原因は、更年期女性及び男性でのエストロゲン又はアンドロゲンの欠乏である(Greendaleら、1997年; Slemendaら、1997年)。骨粗しょう症の他の内分泌系の理由は、甲状腺ホルモン活性の増加(Brittoら、1994年)及び高濃度の投与された医原性の又は内因性の糖質コルチコイド(クッシング症候群)(Adinoff及びHollister、1983年; Canalis、1996年)であり得る。低タンパク摂取量及び腎機能不全による多量のタンパク質減損も骨粗しょう症を悪化させる因子であり(Bonjourら、1997年)、加えて一部の薬物(コレスチラミン(脂質低下薬; Compston及びHorton、1978年)、シクロスポリン(免疫抑制薬; Shaneら、1993年)、フェノバルビトン及びカルバマゼピン(抗てんかん薬; Weinsteinら、1984年)など)の投与並びにエタノール及びタバコの高消費も悪化因子である。
【０００８】
ヒトでの骨代謝障害の診断は、従来のX線撮影法並びに一重又は二重のエネルギーX線吸収分析法(SXA、DXA又はDEXA)並びに定量的コンピューター断層撮影法(QCT)及び定量的超音波(QUS)などの臨床方法で骨ミネラル密度を測定することによって確立することができる(WHO、2003年)。
【０００９】
血液及び尿中の臨床病理パラメータを測定することは、骨質量減少の理由を見出すのに役立ち得る。それらは、診断スクリーニングツールとして、及び抗骨粗しょう症療法のモニタリングのために適用されてもよい(Delmasら、2000年)。
【００１０】
臨床病理パラメータは、(i)骨形成及び(ii)骨吸収マーカー並びに(iii)ミネラル化パラメータに分類することができる。
【００１１】
(i)骨形成マーカーは、骨特異的アルカリ性ホスファターゼ、オステオカルシン(=骨のglaタンパク質;インタクト又はN-mid断片)、I型コラーゲンプロペプチド(PINP及びPICP)である。
【００１２】
(ii)骨吸収パラメータは、尿のヒドロキシプロリン、ピリジノリン及びデオキシピリジノリン、ヒドロキシリシン(及びそのグリコシド)、I型コラーゲンテロペプチド(NTX、CTX、ICTP)、骨のシアロタンパク質、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ5b型(骨TRAP)である。
【００１３】
(iii)骨ミネラル化マーカーは、尿のカルシウム及びリン酸、副甲状腺ホルモン(PTH)、カルシトニン、25ヒドロキシ-ビタミンD、1,25ジヒドロキシ-ビタミンDである。
【００１４】
記載したパラメータの全てではないがいくつかは、ヒト及び齧歯動物で測定することができる。
【００１５】
現在、骨代謝への化合物の影響を推定するために、いくつかの時点で血清/血漿及び尿の以降の検査で、上記の一群の臨床病理パラメータを測定しなければならない。単一のルーチン測定で骨代謝への影響に対する答えを与えるために、簡単で高感度な技術が必要である(Adinoff, A.D.、Hollister, J.R. (1983) Steroid-induced fractures and bone loss in patients with asthma。N Engl J Med、309巻, 265〜268頁; Bilezikian, J.P.、Raisz, L.G.、Rodan, G.A.、(編) Principles of bone biology、San Diego、CA、Academic Press、1996年; Bonjour, J.P.、Schuerch, M.A.、Chevalley, T.、Ammann, P.、Rizzoli, R. (1997) Protein intake, IGF-1 and osteoporosis。Osteoporosis International、1997年、7巻 (suppl 3)、S36〜S42頁; Britto, J.M.、Fenton, A.J:、Holloway, W.R.、Nicholson G.C. (1994) Osteoblasts mediate thyroid hormone stimulation of osteoclastic bone resorption。Endocrinology、134巻、169〜176頁;Canalis, E. (1996) Mechanisms of glucocorticoid action in bone: implications to glucocorticoid-induced osteoporosis。Clin Endocrinol Metab、81巻、3441〜3447頁; Compston, J.E.、Horton, L.W. (1978) Oral 25-hydroxyvitmain D3 in treatment of osteomalacia associated with ileal resction and cholestyramine therapy
。Gastroenterology、74巻、900〜902頁; Cooper, C.、Campion, G.、Melton L.J. (1992) Hip fractures in the elderly: a worldwide projection。Osteoporosis International、2巻、285〜289頁; Delmas, P.D.、Eastell, R.、Garnero, P.、Seibel, M.J.、Stepan, J. (2000)、The use of biochemical markers of bone turnover in osteoporosis。Osteoporosis International、Suppl 6、S2〜S17頁;Greendale, G.A.、Edelstein, S.、Barrett-Connor, E. (1997) Endogenous sex steroids and bone mineral density in older women and men: the Rancho Bernardo study、Journal of Bone & Mineral Research、12巻、1833〜1843頁; Gullberg, B.、Johnell, O.、Kanis, J.A. (1997) Worldwide projections for hip fracture。Osteoporosis International、7巻、407〜413頁; Marcus, R.、Feldman, D.、Kelsey, J. (編) Osteoporosis、San Diego、CA、Academic Press、1996年; Rizzoli, R.、Bonjour, J.P. (1999) Determinants of peak bone mass and mechanisms of bone loss。Osteoporosis International、9巻(suppl. 2)、S17〜S23頁; Shane, E.、Rivas, M.D.C.、Silverberg, S.J.、Kim, T.S.、Staron, R.B.、Bilezikian, J.P. (1993) Osteoporosis after cardiac transplantation。Am J Med、94巻(3号)、257〜264頁; Slemenda, C.W.、Longcope, C.、Zhou, L.、Peacock, M.、Johnston, C.C. (1997) Sex steroids and bone mass in older men。Positive associations with serum estrogens and negative associations with androgens.、J Clin Invest、100巻(7号)、1755〜1759頁; Weinstein, R.S.、Bryce, G.F.、Sappington, L.J.、King, D.W:、Gallagher, B.B. (1984) Decreased serum ionized calcium and normal vitamin D metabolite levels with anticonvulsant drug treatment。J Clin Endocrinol Metab、58巻(6号)、1003〜1009頁; WHO Technical Report Series No. 921 Prevention and Management of Osteoporosis、Geneva、2003年)を参照。
【００１６】
骨障害、特にその初期発生を効率的及び確実に判定するための高感度で特異的な方法は利用できないが、それにもかかわらず高く評価されるであろう。骨障害の重要性は、リンパ球新生を含む造血に関するその結果を考慮すると明白になり得る。さらに、欧州共同体のあらゆる種類の産業で使用されている化学化合物は、例えば、現在、REACH(化学物質の登録、評価、認可(Registration, Evaluation and Authorisation of Chemicals))を順守する必要がある。他の国では、例えば米国の物質安全データシート(MSDS)などの、類似の毒性リスクアセスメントを実施する必要がある。化合物がミネラル化に関する骨障害を誘導する可能性は、その化合物にとって高いリスクとみなされ、したがって、その化合物は限定された用途のため、及び高いセキュリティ基準に従うときにだけ利用可能となることが理解される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
化学化合物の毒物学的な性質、特に骨障害を効率的且つ信頼できる様式で評価するための感受性が高く且つ特異的な方法はまだ利用可能でないが、それにもかかわらず高く評価されるであろう。
【００１８】
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、前述のニーズを満たす手段及び方法を提供することと考えることができる。この技術的課題は、特許請求の範囲で特徴づけられ且つ本明細書の以下に記載される実施形態によって解決される。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
したがって、本発明は、骨障害を診断するための方法であって、
(a)骨障害を患っていることが疑われる対象の試験サンプルにおいて、表1a、1b、1c、1d、2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(b)ステップ(a)で測定した量を参照と比較して、それによって骨障害を診断するステップ
を含む、上記方法に関する。
【００２０】
本発明の方法の特定の実施形態では、骨障害の診断方法であって、
(a)骨障害を患っていることが疑われる雄又は雌対象を選択するステップ、
(b)前記選択された対象から試験サンプルを得るステップ、
(c)分析に備えて前記サンプルを前処理するステップ、
(d)前記試験サンプル中の表1a、1b、1c、1d、2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(e)ステップ(d)で測定された量を参照と比較するステップ、及び
(f)ステップ(e)の比較に基づいて、骨障害又はその症状のモニタリング、確認又は分類により骨障害を診断するステップ
を含む、上記方法が提供される。
【００２１】
前述の方法の好ましい実施形態では、前記対象は、骨障害を誘導し得ることが疑われる化合物と接触させられている。
【００２２】
本発明は、対象において化合物が骨障害を誘導し得るどうかを判定するための方法であって、
(a)骨障害を誘導し得ることが疑われる化合物と接触させた対象のサンプルにおいて、表1a、1b、1c、1d、2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(b)ステップ(a)で測定した量を参照と比較して、それによって化合物の骨障害誘導能力を判定するステップ
を含む、上記方法にも関する。
【００２３】
本発明の方法の特定の実施形態では、化合物が対象で骨障害を誘導し得るかどうかを判定する方法であって、
(a1) (i)雄又は雌対象を選択するステップ、
(ii)前記対象を、骨障害を誘導し得ることが疑われる化合物と接触させるステップ、又は
(a2)骨障害を誘導し得る化合物と接触させた雄又は雌対象を選択するステップ、
(b)前記選択された対象から試験サンプルを得るステップ、
(c)分析に備えて前記サンプルを前処理するステップ、
(d)前記試験サンプル中の表1a、1b、1c、1d、2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(e)ステップ(d)で測定された量を参照と比較するステップ、及び
(f)ステップ(e)の比較に基づき、化合物が骨障害を誘導し得るか否かについて確認するステップ
を含む、上記方法が提供される。
【００２４】
前記の方法の好ましい実施形態では、前記化合物は、過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物である。
【００２５】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、前記参照は、(i)骨障害を患う対象若しくは対象群、又は(ii)過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられた対象若しくは対象群に由来する。前記方法のより好ましい実施形態では、試験サンプル及び参照中のバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨障害の指標になる。
【００２６】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、前記参照は、(i)骨障害を患っていないことが分かっている対象若しくは対象群、又は(ii)過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられていない対象若しくは対象群に由来する。前記方法のより好ましい実施形態では、参照と比較して試験サンプル中において異なるバイオマーカーの量が、骨障害の指標になる。
【００２７】
本発明の方法のさらに別の実施形態では、前記参照は、対象集団のバイオマーカーについて計算された参照である。前記方法のより好ましい実施形態では、参照と比較して試験サンプル中において異なるバイオマーカーの量が、骨障害の指標になる。
【００２８】
本発明は、骨障害を治療するための物質を同定する方法であって、
(a)骨障害を治療し得ると推測される候補物質と接触させられた骨障害を患う対象のサンプルにおいて、表1a、1b、1c、1d、2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(b)ステップ(a)で測定した量を参照と比較して、骨障害を治療し得る物質を同定するステップ
を含む上記方法も企図する。
【００２９】
本発明の方法の特定の実施形態では、骨障害を治療するための物質の同定方法であって、
(a1) (i)雄又は雌対象を選択するステップ、
(ii)前記対象を、骨障害が誘発されるように骨障害を誘導し得ることが疑われる化合物と接触させるステップ、又は
(a2)骨障害を患っている雄又は雌を選択するステップ、
(b)前記選択された対象から試験サンプルを得るステップ、
(c)分析に備えて前記サンプルを前処理するステップ、
(d)前記試験サンプル中の表1a、1b、1c、1d、2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(e)ステップ(d)で測定された量を参照と比較するステップ、及び
(f)ステップ(e)の比較に基づいて、骨障害を治療するための物質を同定し、選択するステップ
を含む、上記方法が提供される。
【００３０】
前述の方法の好ましい実施形態では、前記参照は、(i)骨障害を患う対象若しくは対象群、又は(ii)過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられた対象若しくは対象群に由来する。前記方法のより好ましい実施形態では、試験サンプルと参照との間で異なるバイオマーカーの量が、骨障害を治療し得る物質の指標になる。
【００３１】
前述の方法の別の好ましい実施形態では、前記参照は、(i)骨障害を患っていないことが分かっている対象若しくは対象群、又は(ii)過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられていない対象若しくは対象群に由来する。前記方法のより好ましい実施形態では、試験サンプル及び参照中のバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨障害を治療し得る物質の指標になる。
【００３２】
前述の方法のさらに別の好ましい実施形態では、前記参照は、対象集団におけるバイオマーカーについて計算された参照である。前記方法のより好ましい実施形態では、試験サンプル及び参照中のバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨障害を治療し得る物質の指標になる。
【００３３】
本発明は、対象のサンプルにおいて骨障害を診断するための、表1a、1b、1c、1d、2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカー又は前記バイオマーカー用の検出剤の使用にも関する。
【００３４】
さらに、本発明は、骨障害を患っていることが疑われる対象のサンプルにおいて骨障害を診断するための装置であって、
(a)サンプル中に存在するバイオマーカーの量の測定を可能にする、表1a、1b、1c、1d、2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つの前記バイオマーカー用の検出剤を含む分析ユニットと、それと作動可能に連結された、
(b)分析ユニットで測定された前記少なくとも1つのバイオマーカーの量を格納された参照と比較することを可能にし、それによって骨障害が診断される、格納された参照及びデータ処理装置を含む評価ユニットと
を含む上記装置に関する。
【００３５】
本発明の装置の好ましい実施形態では、前記格納された参照は、骨障害を患っていることが分かっている対象若しくは対象群に由来する参照、又は過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられた対象若しくは対象群に由来する参照であり、前記データ処理装置は、分析ユニットで測定された少なくとも1つのバイオマーカーの量を格納された参照と比較するための指示を実行し、参照と比較して試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨障害が存在することの指標となるか、又は参照と比較して異なる、試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの量が、骨障害が存在しないことの指標になる。
【００３６】
本発明の装置の別の好ましい実施形態では、前記格納された参照は、骨障害を患っていないことが分かっている対象若しくは対象群に由来する参照、又は過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられていない対象若しくは対象群に由来する参照であり、前記データ処理装置は、分析ユニットで測定された少なくとも1つのバイオマーカーの量を格納された参照と比較するための指示を実行し、参照と比較して異なる、試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの量が、骨障害が存在することの指標となるか、又は、参照と比較して試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨障害が存在しないことの指標になる。
【００３７】
さらに、本発明は、表1a、1b、1c、1d、2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカー用の検出剤、及び少なくとも1つのバイオマーカー用のスタンダードであって、その濃度が骨障害を患っていることが分かっている対象若しくは対象群に由来する又は骨障害を患っていないことが分かっている対象若しくは対象群に由来する上記スタンダードを含む骨障害診断のためのキットに関する。
【００３８】
詳細には、本発明は、骨ミネラル化障害の診断方法であって、
(a)骨ミネラル化障害を患っていることが疑われる対象の試験サンプルにおいて、表1a、1b、1c、又は1dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(b)ステップ(a)で測定された量を参照と比較して、それによって骨ミネラル化障害を診断するステップ
を含む、上記方法に関する。
【００３９】
本発明の方法の特定の実施形態では、骨ミネラル化障害の診断方法であって、
(a)骨ミネラル化障害を患っていることが疑われる雄又は雌対象を選択するステップ、
(b)前記選択された対象から試験サンプルを得るステップ、
(c)分析に備えて前記サンプルを前処理するステップ、
(d)前記試験サンプル中の表1a、1b、1c又は1dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(e)ステップ(d)で測定された量を参照と比較するステップ、及び
(f)ステップ(e)の比較に基づいて、骨ミネラル化障害又はその症状のモニタリング、確認又は分類により骨ミネラル化障害を診断するステップ
を含む、上記方法が提供される。
【００４０】
前述の方法の好ましい実施形態では、前記対象は、骨ミネラル化障害を誘導し得ることが疑われる化合物と接触させられる。
【００４１】
本発明は、対象において化合物が骨ミネラル化障害を誘導し得るかどうかを判定する方法であって、
(a)骨ミネラル化障害を誘導し得ることが疑われる化合物と接触させられた対象のサンプルにおいて、表1a、1b、1c、又は1dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(b)ステップ(a)で測定された量を参照と比較して、化合物の骨ミネラル化障害誘導能力を判定するステップ
を含む、上記方法にも関する。
【００４２】
本発明の方法の特定の実施形態では、化合物が対象で骨ミネラル化障害を誘導し得るかどうかを判定する方法であって、
(a1) (i)雄又は雌対象を選択するステップ、
(ii)前記対象を、骨ミネラル化障害を誘導し得ることが疑われる化合物と接触させるステップ、又は
(a2)骨ミネラル化障害を誘導し得る化合物と接触させられた雄又は雌対象を選択するステップ、
(b)前記選択された対象から試験サンプルを得るステップ、
(c)分析に備えて前記サンプルを前処理するステップ、
(d)前記試験サンプル中の表1a、1b、1c又は1dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(e)ステップ(d)で測定された量を参照と比較するステップ、及び
(f)ステップ(e)の比較に基づき、化合物が骨ミネラル化障害を誘導し得るか否かについて同定するステップ
を含む、上記方法が提供される。
【００４３】
前述の方法の好ましい実施形態では、前記化合物は、過塩素酸ナトリウム及びフッ化ナトリウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物である。
【００４４】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、前記参照は、(i)骨ミネラル化障害を患っている対象若しくは対象群、又は(ii)過塩素酸ナトリウム及びフッ化ナトリウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられた対象若しくは対象群に由来する。前記方法のより好ましい実施形態では、試験サンプル及び参照中のバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨ミネラル化障害の指標となる。
【００４５】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、前記参照は、(i)骨ミネラル化障害を患っていないことが分かっている対象若しくは対象群、又は(ii)過塩素酸ナトリウム及びフッ化ナトリウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられていない対象若しくは対象群に由来する。前記方法のより好ましい実施形態では、参照と比較して試験サンプル中において異なるバイオマーカーの量が、骨ミネラル化障害の指標となる。
【００４６】
本発明の方法のさらに別の実施形態では、前記参照は、対象集団のバイオマーカーについて計算された参照である。前記方法のより好ましい実施形態では、参照と比較して試験サンプル中において異なるバイオマーカーの量が、骨ミネラル化障害の指標となる。
【００４７】
本発明は、骨ミネラル化障害を治療するための物質を同定する方法であって、
(a)骨ミネラル化障害を治療し得ると推測される候補物質と接触させられた骨ミネラル化障害を患っている対象のサンプルにおいて、表1a、1b、1c、及び1dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(b)ステップ(a)で測定された量を参照と比較して、それによって骨ミネラル化障害を治療し得る物質を同定するステップ
を含む上記方法も企図する。
【００４８】
本発明の方法の特定の実施形態では、骨ミネラル化障害を治療するための物質の同定方法であって、
(a1) (i)雄又は雌対象を選択するステップ、
(ii)前記対象を、骨ミネラル化障害が誘発されるように骨ミネラル化障害を誘導し得ることが疑われる化合物と接触させるステップ、又は
(a2)骨ミネラル化障害を患っている雄又は雌を選択するステップ、
(b)前記選択された対象から試験サンプルを得るステップ、
(c)分析に備えて前記サンプルを前処理するステップ、
(d)前記試験サンプル中の表1a、1b、1c又は1dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(e)ステップ(d)で測定された量を参照と比較するステップ、及び
(f)ステップ(e)の比較に基づいて、骨ミネラル化障害を治療するための物質を同定し、選択するステップ
を含む、上記方法が提供される。
【００４９】
前述の方法の好ましい実施形態では、前記参照は、(i)骨ミネラル化障害を患っている対象若しくは対象群、又は(ii)過塩素酸ナトリウム及びフッ化ナトリウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられた対象若しくは対象群に由来する。前記方法のより好ましい実施形態では、試験サンプル及び参照において異なるバイオマーカーの量が、骨ミネラル化障害を治療し得る物質の指標となる。
【００５０】
前述の方法の別の好ましい実施形態では、前記参照は、(i)骨ミネラル化障害を患っていないことが分かっている対象若しくは対象群、又は(ii)過塩素酸ナトリウム及びフッ化ナトリウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられていない対象若しくは対象群に由来する。前記方法のより好ましい実施形態では、試験サンプル及び参照中のバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨ミネラル化障害を治療し得る物質の指標となる。
【００５１】
前述の方法のさらに別の好ましい実施形態では、前記参照は、対象集団におけるバイオマーカーについて計算された参照である。前記方法のより好ましい実施形態では、試験サンプル及び参照中のバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨ミネラル化障害を治療し得る物質の指標となる。
【００５２】
本発明は、対象のサンプルにおいて骨ミネラル化障害を診断するための、表1a、1b、1c、又は1dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカー又は前記バイオマーカー用の検出剤の使用にも関する。
【００５３】
さらに本発明は、骨ミネラル化障害を患っていることが疑われる対象のサンプルにおいて骨ミネラル化障害を診断するための装置であって、
(a)サンプル中に存在するバイオマーカーの量の測定を可能にする、表1a、1b、1c、又は1dのいずれか1つから選択される少なくとも1つの前記バイオマーカー用の検出剤を含む分析ユニットと、それと作動可能に連結された、
(b)分析ユニットで測定された前記少なくとも1つのバイオマーカーの量を格納された参照と比較することを可能にし、それによって骨ミネラル化障害が診断される、格納された参照及びデータ処理装置を含む評価ユニットと
を含む上記装置に関する。
【００５４】
本発明の装置の好ましい実施形態では、前記格納された参照は、骨ミネラル化障害を患っていることが分かっている対象若しくは対象群に由来する参照、又は過塩素酸ナトリウム及びフッ化ナトリウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられた対象若しくは対象群に由来する参照であり、前記データ処理装置は、分析ユニットで測定された少なくとも1つのバイオマーカーの量を格納された参照と比較するための指示を実行し、参照と比較して試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨ミネラル化障害が存在することの指標となるか、又は参照と比較して異なる試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの量が、骨ミネラル化障害が存在しないことの指標となる。
【００５５】
本発明の装置の別の好ましい実施形態では、前記格納された参照は、骨ミネラル化障害を患っていないことが分かっている対象若しくは対象群に由来する参照、又は過塩素酸ナトリウム及びフッ化ナトリウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられていない対象若しくは対象群に由来する参照であり、前記データ処理装置は、分析ユニットで測定された少なくとも1つのバイオマーカーの量を格納された参照と比較するための指示を実行し、参照と比較して異なる試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの量が骨ミネラル化障害が存在することの指標となるか、又は参照と比較して試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨ミネラル化障害が存在しないことの指標となる。
【００５６】
さらに本発明は、骨ミネラル化障害診断のためのキットであって、表1a、1b、1c、及び1dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカー用の検出剤、並びに少なくとも1つのバイオマーカー用のスタンダードであって、その濃度が骨ミネラル化障害を患っていることが分かっている対象若しくは対象群に由来する、又は骨ミネラル化障害を患っていないことが分かっている対象若しくは対象群に由来する上記スタンダードを含む上記キットに関する。
【００５７】
詳細には、本発明は、骨芽細胞活性の阻害の診断方法であって、
(a)骨芽細胞活性の阻害を患っていることが疑われる対象の試験サンプルにおいて、表2a、2b、2c及び2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(b)ステップ(a)で測定された量を参照と比較して、それによって骨芽細胞活性の阻害を診断するステップ
を含む、上記方法に関する。
【００５８】
本発明の方法の特定の実施形態では、骨芽細胞活性の阻害の診断方法であって、
(a)骨芽細胞活性の阻害を患っていることが疑われる雄又は雌対象を選択するステップ、
(b)前記選択された対象から試験サンプルを得るステップ、
(c)分析に備えて前記サンプルを前処理するステップ、
(d)前記試験サンプル中の表2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(e)ステップ(d)で測定された量を参照と比較するステップ、及び
(f)ステップ(e)の比較に基づいて、骨芽細胞活性の阻害又はその症状のモニタリング、確認又は分類により骨芽細胞活性の阻害を診断するステップ
を含む、上記方法が提供される。
【００５９】
前述の方法の好ましい実施形態では、前記対象は、骨芽細胞活性の阻害を誘導し得ることが疑われる化合物と接触させられる。
【００６０】
本発明は、対象において化合物が骨芽細胞活性の阻害を誘導し得るかどうかを判定するための方法であって、
(a)骨芽細胞活性の阻害を誘導し得ることが疑われる化合物と接触させられた対象のサンプルにおいて、骨芽細胞活性の阻害を誘導し得ることが疑われる化合物と接触させられた対象の試験サンプル中の、表2a、2b、2c及び2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(b)ステップ(a)で測定された量を参照と比較して、それによって化合物の骨芽細胞活性の阻害誘導能力を判定するステップ
を含む、上記方法にも関する。
【００６１】
本発明の方法の特定の実施形態では、化合物が対象で骨芽細胞活性の阻害を誘導し得るかどうかを判定する方法であって、
(a1) (i)雄又は雌対象を選択するステップ、
(ii)前記対象を、骨芽細胞活性の阻害を誘導し得ることが疑われる化合物と接触させるステップ、又は
(a2)骨芽細胞活性の阻害を誘導し得る化合物と接触させられた雄又は雌対象を選択するステップ、
(b)前記選択された対象から試験サンプルを得るステップ、
(c)分析に備えて前記サンプルを前処理するステップ、
(d)前記試験サンプル中の表2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(e)ステップ(d)で測定された量を参照と比較するステップ、及び
(f)ステップ(e)の比較に基づき、化合物が骨芽細胞活性の阻害を誘導し得るか否かについて同定するステップ
を含む、上記方法が提供される。
【００６２】
前述の方法の好ましい実施形態では、前記化合物は、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物である。
【００６３】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、前記参照は、(i)骨芽細胞活性の阻害を患っている対象若しくは対象群、又は(ii)カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられた対象若しくは対象群に由来する。前記方法のより好ましい実施形態では、試験サンプル及び参照中のバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨芽細胞活性の阻害の指標となる。
【００６４】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、前記参照は、(i)骨芽細胞活性の阻害を患っていないことが分かっている対象若しくは対象群、又は(ii)カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられていない対象若しくは対象群に由来する。前記方法のより好ましい実施形態では、参照と比較して試験サンプル中において異なるバイオマーカーの量が、骨芽細胞活性の阻害の指標となる。
【００６５】
本発明の方法のさらに別の実施形態では、前記参照は、対象集団のバイオマーカーについて計算された参照である。前記方法のより好ましい実施形態では、参照と比較して試験サンプル中において異なるバイオマーカーの量が、骨芽細胞活性の阻害の指標となる。
【００６６】
本発明は、骨芽細胞活性の阻害を治療するための物質を同定する方法であって、
(a)骨芽細胞活性の阻害を治療し得ると推測される候補物質と接触させられた骨芽細胞活性の阻害を患っている対象のサンプルにおいて、表2a、2b、2c及び2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(b)ステップ(a)で測定された量を参照と比較して、骨芽細胞活性の阻害を治療し得る物質を同定するステップ
を含む、上記方法も企図する。
【００６７】
本発明の方法の特定の実施形態では、骨芽細胞活性の阻害を治療するための物質の同定方法であって、
(a1) (i)雄又は雌対象を選択するステップ、
(ii)前記対象を、骨芽細胞活性の阻害が誘発されるように、骨芽細胞活性の阻害を誘導し得ることが疑われる化合物と接触させるステップ、又は
(a2)骨芽細胞活性の阻害を患っている雄又は雌を選択するステップ、
(b)前記選択された対象から試験サンプルを得るステップ、
(c)分析に備えて前記サンプルを前処理するステップ、
(d)前記試験サンプル中の表2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
(e)ステップ(d)で測定された量を参照と比較するステップ、及び
(f)ステップ(e)の比較に基づいて、骨芽細胞活性の阻害を治療するための物質を同定し、選択するステップ
を含む、上記方法が提供される。
【００６８】
前述の方法の好ましい実施形態では、前記参照は、(i)骨芽細胞活性の阻害を患っている対象若しくは対象群、又は(ii)カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられた対象若しくは対象群に由来する。前記方法のより好ましい実施形態では、試験サンプル及び参照において異なるバイオマーカーの量が、骨芽細胞活性の阻害を治療できる物質の指標となる。
【００６９】
前述の方法の別の好ましい実施形態では、前記参照は、(i)骨芽細胞活性の阻害を患っていないことが分かっている対象若しくは対象群、又は(ii)カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられていない対象若しくは対象群に由来する。前記方法のより好ましい実施形態では、試験サンプル及び参照中において本質的に同一であるバイオマーカーの量が、骨芽細胞活性の阻害を治療し得る物質の指標となる。
【００７０】
前述の方法のさらに別の好ましい実施形態では、前記参照は、対象集団におけるバイオマーカーについて計算された参照である。前記方法のより好ましい実施形態では、試験サンプル及び参照中のバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨芽細胞活性の阻害を治療し得る物質の指標となる。
【００７１】
本発明は、対象のサンプルにおいて骨芽細胞活性の阻害を診断するための、表2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカー又は前記バイオマーカー用の検出剤の使用にも関する。
【００７２】
さらに、本発明は、骨芽細胞活性の阻害を患っていることが疑われる対象のサンプルにおいて骨芽細胞活性の阻害を診断するための装置であって、
(a)サンプル中に存在するバイオマーカーの量の測定を可能にする、表2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカー用の検出剤を含む分析ユニットと、それと作動可能に連結された、
(b)分析ユニットで測定された前記少なくとも1つのバイオマーカーの量を格納された参照と比較することを可能にし、それによって骨芽細胞活性の阻害が診断される、格納された参照及びデータ処理装置を含む評価ユニットと
を含む上記装置に関する。
【００７３】
本発明の装置の好ましい実施形態では、前記格納された参照は、骨芽細胞活性の阻害を患っていることが分かっている対象若しくは対象群に由来する参照、又はカルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられた対象若しくは対象群に由来する参照であり、前記データ処理装置は、分析ユニットで測定された少なくとも1つのバイオマーカーの量を格納された参照と比較するための指示を実行し、参照と比較して試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨芽細胞活性の阻害が存在することの指標となるか、又は参照と比較して異なる試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの量が、骨芽細胞活性の阻害が存在しないことの指標となる。
【００７４】
本発明の装置の別の好ましい実施形態では、前記格納された参照は、骨芽細胞活性の阻害を患っていないことが分かっている対象若しくは対象群に由来する参照、又はカルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられていない対象若しくは対象群に由来する参照であり、前記データ処理装置は、分析ユニットで測定された少なくとも1つのバイオマーカーの量を格納された参照と比較するための指示を実行し、参照と比較して異なる試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの量が、骨芽細胞活性の阻害が存在することの指標となるか、又は参照と比較して試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨芽細胞活性の阻害が存在しないことの指標となる。
【００７５】
さらに、本発明は、骨芽細胞活性の阻害診断のためのキットであって、表2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される少なくとも1つのバイオマーカー用の検出剤、及び濃度が骨芽細胞活性の阻害を患っていることが分かっている対象若しくは対象群に由来するか、又は骨芽細胞活性の阻害を患っていないことが分かっている対象若しくは対象群に由来する、少なくとも1つのバイオマーカー用のスタンダードを含むキットに関する。
【００７６】
詳細には、本発明は以下の具体的な方法、使用、デバイス及びキットも企図する。
【００７７】
以下の定義及び説明は、前記の本発明の実施形態全て及び以下に記載する実施形態に準用する。
【００７８】
本発明に従って言及される方法は、基本的に前述のステップから構成されてもよいし、さらなるステップを含んでもよい。さらなるステップは、サンプルの前処理又はこの方法によって得られた診断結果の評価に関し得る。好ましいさらなる評価ステップは、本明細書の他の個所に記載される。この方法は、ある程度又は完全に自動化により補助することができる。例えば、バイオマーカー量の測定に係るステップは、ロボット化及び自動化読取装置によって自動化することができる。同様に、量の比較に係るステップも、実行の際に、自動的に比較するプログラムコードを含む、コンピューターなどの適切なデータ処理装置によって自動化することができる。そうした場合の参照は、格納された参照から、例えばデータベースから提供される。好ましくは、この方法は、対象のサンプルについてex vivoで行われる方法であり、すなわちヒト又は動物の体について実施しない方法であることを理解されたい。
【００７９】
本明細書で使用する用語「診断」は、対象が、本明細書で言及する中毒、疾患若しくは障害などの状態を患っている、又はそうした状態に関する素因を有する確率を評価することを指す。素因の診断は、対象がその後に既定の時間窓内にその状態を発症する見込みの予後又は予測として時にみなされる場合もある。当業者に理解されるように、そうした評価は、診断される対象の100%について正確であることが好ましいが、通常はそうではない可能性がある。しかし、この用語は、統計的に有意な対象の一部を、その状態を患っている又はその状態に関する素因を有すると同定できることを必要とする。ある一部が統計的に有意かどうかは、様々な周知の統計的な評価ツール、例えば、信頼区間の決定、P値の決定、スチューデントのt検定、マンホイットニー検定などを使用して、当業者であれば容易に判定することができる。詳細は、Dowdy及びWearden、Statistics for Research、John Wiley & Sons、New York 1983に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%である。P値は、好ましくは、0.2、0.1、0.05である。
【００８０】
本発明による診断は、ある状態又はその症状及びその素因のモニタリング、確認及び分類も含む。モニタリングは、既に診断された状態又は素因の経過を追うことを指す。モニタリングは、例えば、その状態若しくは素因の進行の判定、その状態の進行に対する特定の治療の影響の判定、又は素因を有する対象における、その状態の発症に対する予防的治療若しくは食事療法などの予防策の影響の判定を包含する。前記治療、予防的措置又は食事療法は調整することができ、調整の影響はモニタリングの態様として調査することができる。さらに、状態又はその素因の進行をモニタリングする場合は、前記モニタリングは、モニタリング頻度を決定すること、並びにさらなるモニタリング措置、例えばさらなる生化学的又は他の健康パラメータの測定を推奨及び/又は実行することを含むこともできる。確認とは、他の指標又はマーカーを用いて既に判定されている状態又は状態の素因の診断を強化又は立証することに関する。確認は、確認された状態又はその素因に基づく、治療的措置の投与又は調節を一態様に含むこともできる。分類とは、(i)状態を、例えば状態に付随する症状の強度に対応する異なるクラスに割り当てること、又は(ii)状態に付随する異なる段階、疾患若しくは障害を識別することに関する。分類は、分類された状態、症状又はその素因に基づく、治療的措置の投与又は調節を一態様に含むこともできる。状態の素因は、リスクの程度、すなわち対象が後でその状態を発症する確率に基づいて分類することができる。さらに、分類は、好ましくは、本発明の方法によって試験される化合物に作用様式を割り当てることも含む。具体的には、本発明の方法によって、作用様式がまだ知られていない化合物の特異的な作用様式の判定が可能になる。これは、好ましくは、少なくとも1つのバイオマーカーに関して測定された量又は前記化合物の代表的なバイオマーカープロファイルを、参照として作用様式が知られている化合物に関して測定されたバイオマーカーの量又はバイオマーカープロファイルと比較することによって達成される。化合物の分子標的が同定されるので、作用様式の分類によって、より一層信頼できる化合物の毒性評価が可能になる。疾患又は状態を診断することを目指す本発明の方法は、毒性作用について化合物をスクリーニングするために、及びそれに関する報告のために、並びに化合物の開発、例えば安全性の向上、又は薬物の開発、又は有効濃度の特定において用いることができる。
【００８１】
本発明に従って、骨障害を誘導し得ると、化合物を同定することもできる。好ましくは、そのような同定は、化合物の製造、取扱い、保管及び/又は輸送並びにその用途に関する提案も含む。そのような提案には、製造、取扱い、保管、輸送及び/又は用途のための安全プロトコルを確立すること、その潜在毒性に従って化合物のラベル表示をすること、ヒト、動物及び/又は環境への曝露を制限することが含まれる。さらに、化合物が骨障害を誘発すると同定される場合は、LD50/LC50及び/又はED50/EC50値などの安全性レベル及び派生閾値が好ましくは決められる。
【００８２】
本明細書で用いられる用語「骨障害」は、緻密であるか海綿状の骨組織に影響を及ぼすあらゆる骨障害に関連する。本明細書で用いられる骨組織とは、好ましくは、ミネラル、特に炭酸化ヒドロキシアパタイトを包含する強固な型の結合組織及び軟骨である。ほとんどの骨は、高密度の外側シャフトを形成する緻密な骨組織並びに棒状及び板状骨構造の内部の海綿状ネットワークを形成する小柱骨組織を含む。3つの細胞型、すなわち骨芽細胞、骨細胞及び破骨細胞が中心となって骨形成に関与する。骨芽細胞は、骨細胞の間葉系前駆体細胞である。骨細胞は、ミネラル化骨組織の成熟細胞である。破骨細胞は、ミネラル化骨組織からミネラルを除去する(骨吸収)ことが可能であり、したがって、骨の増殖及び再構成に関与するマクロファージ様細胞である。発達中の骨及び成熟した骨の内部でのミネラル化過程は、様々な内因性及び外因性因子によって支配される。骨芽細胞の成熟若しくは活性の障害、ミネラル化の障害及び/又は破骨細胞活性の障害によるミネラル化過程の障害は、オステオパシーとも呼ばれる様々な骨障害をもたらす。本明細書で言及される骨障害には、好ましくは、ミネラル化障害並びに/又は骨芽細胞の活性及び/若しくは成熟の阻害が付随する。ミネラル化障害を有する好ましい、顕著な骨障害は、骨粗しょう症である。骨粗しょう症は、骨ミネラル密度(BMD)の低下及び骨構築の悪化と関連する。ミネラル化障害を有する別の好ましい障害は、骨減少症である。骨減少症も、BMDの低下を伴う。さらに、ミネラル化障害を有するさらなる骨代謝障害には、骨のページェット病、骨軟化、低ホスファターゼ血症又は嚢胞性線維性骨炎が含まれる。本明細書で言及される骨障害は、骨ミネラル化障害並びにそれと関連する症状及び結果に加えて、骨の骨芽細胞活性の阻害を包含する。
【００８３】
好ましくは、本明細書で使用する骨障害は、化学化合物又は薬物の投与で誘導されるか、その投与の結果であり、すなわち、いわゆる毒素誘導性骨障害である。
【００８４】
骨障害の前述の発現の症状及び臨床徴候は、当業者に周知であり、毒性学の標準的な書籍、例えば、H. Marquardt、S. G. Schafer、R. O. McClellan、F. Welsch (編)、「Toxicology」、第13章: The Liver、1999、Academic Press、Londonに詳細に記載されている。
【００８５】
好ましくは、骨障害にミネラル化障害が付随する場合は、本発明の方法によって測定される少なくとも1つのバイオマーカーは、表1a、1b、1c及び1dのいずれか1つから選択される。
【００８６】
同じく好ましくは、骨障害に骨芽細胞の活性及び/又は成熟の阻害が付随する場合は、本発明の方法によって測定される少なくとも1つのバイオマーカーは、表2a、2b、2c及び2dのいずれか1つから選択される。
【００８７】
各バイオマーカーが、診断について見かけ上統計的に独立した予測因子であるので、表に記載されているバイオマーカーの2種以上の組合せは、さらに診断を強化することが本発明によって見出された。さらに、マーカー存在量に対する他の組織からの影響が相殺されるので、骨障害に対する特異性も有意に増大する。したがって、本明細書で使用する用語「少なくとも1」は、好ましくは、添付の表のいずれか1つで言及されるバイオマーカーの、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9又は少なくとも10の組合せを指す。好ましくは、それらの表のいずれか1つで列挙される全てのバイオマーカーは、本発明の方法に従って組み合わせて測定される。
【００８８】
以下では、好ましいバイオマーカー及びバイオマーカー群が下の表で言及される骨障害及び対象のために規定される。
【００８９】
表1a及び1b(骨ミネラル化障害):フェニルアラニン、myo-イノシトール-2-リン酸、リゾホスファチジルコリン(C17:0)、エイコサン酸(C20:1)No 02又はグルコース。
【００９０】
表1c及び1d(骨ミネラル化障害): TAG No 07、ピルビン酸、ヘプタデカン酸(C17:0)、TAG(C18:1、C18:2)又は馬尿酸。
【００９１】
表2a及び2b(骨の骨芽細胞阻害剤):イソロイシン、ケトロイシン、ロイシン、ドデカノール又はリン酸(無機及び有機のリン酸)。
【００９２】
表2c及び2d(骨の骨芽細胞阻害剤): TAG(C16:0、C18:1、C18:3)、エステル型コレステロールNo 01、トレオニン、18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロン又はTAG(C16:0、C18:2)。
【００９３】
したがって好ましくは、少なくとも1つのバイオマーカーは、前述の群から選択される少なくとも1つのバイオマーカーであるか、又は少なくとも1つのバイオマーカーは、前述のバイオマーカーの群からなる若しくはそれを含むバイオマーカーの組合せである。前述のバイオマーカー及びバイオマーカーの組合せは、より詳細に付属の実施例で記載されるように、特に高い診断価値を有する重要なバイオマーカーとして同定された。
【００９４】
さらに、他のバイオマーカー又は既知の代謝物、遺伝子変異、転写産物及び/若しくはタンパク質の量若しくは酵素活性を含めた臨床的パラメータをさらに加えて測定することができる。本発明の方法によって測定することができるこのような追加的な臨床的又は生化学的パラメータは、当技術分野で周知である。
【００９５】
本明細書で使用する用語「バイオマーカー」は、サンプル中の存在又は濃度が、ある状態、好ましくは本明細書で言及する骨障害の有無又は強さの指標になる化学化合物を指す。好ましくは、該化学化合物は、代謝物又はそれに由来するアナライトである。アナライトは、生物で見出される実際の代謝物と同一であり得る化学化合物である。しかし、この用語は、内因的に生成される、又は単離若しくはサンプルの前処理の間、若しくは本発明の方法の実施の結果として、例えば、精製及び/若しくは測定ステップの間に生成される代謝物の誘導体も含む。特定の場合では、アナライトは、溶解度などの化学的性質によりさらに特徴づけられる。前記性質のため、アナライトは、精製及び/又は測定プロセス中に得られる極性又は脂質画分中に生じ得る。したがって、化学的性質、及び好ましくは溶解度は、精製及び/又は測定プロセス中に得られる極性又は脂質画分のいずれかの中にアナライトを生じさせるだろう。したがって、前記化学的性質、特に、精製及び/又は測定プロセス中に得られる極性画分又は脂質画分のいずれかの中のアナライトの発生率として考慮される溶解度は、アナライトをさらに特徴づけ、その同定を補助するだろう。こうした化学的性質をどのように判定及び考慮することができるかについての詳細は、以下に記載される付属の実施例に見出される。好ましくは、アナライトは、定性的及び定量的な様式で代謝物を表し、これによって、対象又は少なくとも前記対象の試験サンプル中の代謝物の有無又は量に関する決定が必然的に可能になる。バイオマーカー、アナライト及び代謝物は、本明細書では単数形で言及されるが、これらの用語の複数形も含み、すなわち、同一分子種の複数のバイオマーカー、アナライト又は代謝物分子を指す。さらに、本発明によるバイオマーカーは、必ずしも1つの分子種に対応するとは限らない。むしろ、バイオマーカーは、化合物の立体異性体又は鏡像異性体を含み得る。さらに、バイオマーカーは、異性体分子のある生物学的クラスの異性体の和を表すこともできる。前記異性体は、場合によっては同一の分析的特徴を示すものとし、したがって、以下に記載される付属の実施例で適用されるものを含めた種々の分析方法によって区別できない。しかし、異性体は、少なくとも同一の和公式パラメータを有するので、例えば脂質の場合には、脂肪酸及び/又はスフィンゴ塩基部分において、同一の鎖長並びに同一の二重結合数を有する。
【００９６】
本明細書で使用する用語「試験サンプル」は、本発明の方法による骨障害の診断に使用されるサンプルを指す。好ましくは、前記試験サンプルは生物サンプルである。生物源からのサンプル(すなわち生物サンプル)は、複数の代謝物を通常含む。本発明の方法で使用する好ましい生物サンプルは、体液、好ましくは、血液、血漿、血清、唾液、胆汁、尿若しくは脳脊髄液からのサンプル、又は例えば生検によって、細胞、組織若しくは臓器から、好ましくは肝臓から得られるサンプルである。より好ましくは、サンプルは、血液、血漿又は血清サンプルであり、最も好ましくは、血漿サンプルである。生物サンプルは、本明細書の他の個所で明記される対象に由来する。前述の様々な種類の生物サンプルを得るための技術は、当技術分野で周知である。例えば、血液サンプルは採血によって得ることができるが、組織又は臓器サンプルは、例えば生検によって得られる。
【００９７】
好ましくは、前述のサンプルは、前処理してから本発明の方法で使用する。より詳細に以下に記載するように、前記前処理は、化合物を遊離若しくは分離するか又は過剰な材料若しくは廃物を除去するのに必要となる処理を含み得る。適切な技術は、遠心分離、抽出、分画、限外濾過、タンパク質沈殿、それに続く化合物の濾過及び精製並びに/又は濃縮を含む。さらに、化合物の分析に適した形状又は濃度で化合物を提供するために、他の前処理が行われる。例えば、ガスクロマトグラフィー連結質量分析を本発明の方法で使用する場合は、前記ガスクロマトグラフィーより前に化合物を誘導体化することが必要となる。適切且つ必要な前処理は、本発明の方法の実施に使用する手段に依存し、当業者に周知である。先に記載したように前処理されたサンプルも、本発明によって使用される用語「サンプル」に含まれる。
【００９８】
本明細書で使用する用語「対象」は、動物、好ましくは哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、サル又はウシなど、さらに、好ましくはヒトに関する。より好ましくは、対象はげっ歯類であり、最も好ましくはラットである。本発明の方法を適用して診断することができる他の動物は、魚類、鳥類又は爬虫類である。好ましくは、前記対象は、骨障害を誘導し得ることが疑われる化合物と接触したか、又は接触させられたものである。骨障害を誘導することが疑われる化合物と接触させる対象は、例えば化合物の毒性に関するスクリーニングアッセイで使用されるラットなどの実験動物でもよい。骨障害を誘導し得る化合物と接触したことが疑われる対象は、適切な療法を選択するために診断される対象でもあり得る。好ましくは、本発明で使用する骨障害を誘導し得る化合物は、過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムである。
【００９９】
好ましくは、対象が雌である場合は、本発明の方法によって測定される少なくとも1つのバイオマーカーは、表1a又は1bのいずれか1つから選択される。
【０１００】
好ましくは、対象が雄である場合は、本発明の方法によって測定される少なくとも1つのバイオマーカーは、表1c、1d、2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される。
【０１０１】
本明細書で使用する用語「量を測定する」は、バイオマーカー、すなわち代謝物又はアナライトの少なくとも1つの特徴的な特性を測定することを指す。本発明による特徴的な特性は、生化学的性質を含めた、バイオマーカーの物理的及び/又は化学的性質を特徴づける特性である。そうした性質としては、例えば、分子量、粘性、密度、電荷、スピン、光学活性、色、蛍光、化学発光、元素組成、化学構造、他の化合物と反応する能力、生物学的読み取りシステム(例えばレポーター遺伝子の誘導)で応答を惹起する能力などが挙げられる。前記性質に関する値は、特徴的な特性としての役割を果たすことができ、当技術分野で周知の技術によって測定することができる。さらに、特徴的な特性は、標準的な操作、例えば乗算、除算又は対数計算などの数学的計算によってバイオマーカーの物理的及び/又は化学的性質の値から導かれる任意の特性でもよい。最も好ましくは、少なくとも1つの特徴的な特性によって、バイオマーカー及びその量の測定及び/又は化学的な同定が可能になる。したがって、特性値は、好ましくは、特性値が導かれるバイオマーカーの存在量に関する情報も含む。例えば、バイオマーカーの特性値は、質量スペクトルのピークでもよい。そうしたピークは、バイオマーカーの特徴的な情報、すなわちm/z(質量電荷比)情報及びサンプル中の前記バイオマーカーの存在量(すなわちその量)に関する強度値を含有する。
【０１０２】
先に論じたように、本発明の方法によって測定される少なくとも1つのバイオマーカーは、好ましくは、定量的に又は半定量的に測定することができる。定量的な測定については、バイオマーカーの絶対量又は正確な量のいずれかが測定されるか、又は本明細書の上記の特徴的な特性に関して測定された値に基づいて、バイオマーカーの相対量が測定される。相対量は、バイオマーカーの正確な量が測定できない又は測定すべきでない場合に、測定することができる。前記の場合では、バイオマーカーの存在量が第2の量で前記バイオマーカーを含む第2のサンプルに対して増大又は低下しているのかを判定することができる。したがって、バイオマーカーの定量分析は、バイオマーカーの半定量分析と呼ばれることもある分析も含む。
【０１０３】
さらに、本発明の方法で使用される測定は、好ましくは、先に言及された分析ステップより前に、化合物分離ステップの使用を含む。好ましくは、前記化合物分離ステップによって、サンプルに含まれる少なくとも1つのバイオマーカーの時間分解分離がもたらされる。したがって、本発明に従って好んで使用される適切な分離技術には、全てのクロマトグラフィー分離技術、例えば、液体クロマトグラフィー(LC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ガスクロマトグラフィー(GC)、薄層クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。こうした技術は、当技術分野で周知であり、当業者であれば容易に適用することができる。最も好ましくは、LC及び/又はGCが本発明の方法で想定されるクロマトグラフィー技術である。バイオマーカーのそうした測定に適切な装置は、当技術分野で周知である。好ましくは、質量分析が使用され、特に、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)、液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)、直接注入質量分析若しくはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析(FT-ICR-MS)、キャピラリー電気泳動質量分析(CE-MS)、高速液体クロマトグラフィー連結質量分析(HPLC-MS)、四重極質量分析、MS-MS又はMS-MS-MSなどの任意の逐次連結質量分析、誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MS)、熱分解質量分析(Py-MS)、イオン移動度質量分析又は飛行時間型質量分析(TOF)が使用される。最も好ましくは、以下で詳細に記載されるように、LC-MS及び/又はGC-MSが使用される。前記技術は、例えば、Nissen 1995、Journal of Chromatography A、703: 37〜57、US 4,540,884又はUS 5,397,894に開示されており、その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。質量分析技術の代わりとして又はそれに加えて、以下の技術を化合物の測定に使用することができる:核磁気共鳴(NMR)、磁気共鳴画像(MRI)、フーリエ変換赤外分析(FT-IR)、紫外(UV)分光、屈折率(RI)、蛍光検出、放射化学的検出、電気化学的検出、光散乱(LS)、分散ラマン分光法又は炎イオン化検出(FID)。こうした技術は当業者に周知であり、容易に適用することができる。好ましくは、本発明の方法は、自動化によって補助されるだろう。例えば、サンプルの処理又は前処理は、ロボットによって自動化することができる。データの処理及び比較は、好ましくは、適切なコンピュータープログラム及びデータベースによって補助される。先に本明細書に記載した自動化によって、ハイスループットアプローチで本発明の方法を使用することが可能になる。
【０１０４】
さらに、バイオマーカーは、特異的な化学的又は生物学的アッセイによって測定することもできる。前記アッセイは、サンプル中のバイオマーカーの特異的な検出を可能にする手段を含む。好ましくは、前記手段は、他の化合物と反応するバイオマーカーの能力、又は生物学的読み取りシステム(例えばレポーター遺伝子の誘導)において応答を惹起するその能力に基づいて、バイオマーカーの化学構造を特異的に認識することができるか、又はバイオマーカーを特異的に同定することができる。バイオマーカーの化学構造を特異的に認識することができる手段は、好ましくは、バイオマーカーに特異的に結合する検出剤、より好ましくは、化学構造物と特異的に相互作用する抗体又は他のタンパク質、例えば受容体又は酵素又はアプタマーである。例えば、特異的な抗体は、抗原としてバイオマーカーを使用して、当技術分野で周知の方法によって得ることができる。本明細書で言及する抗体には、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方、及びそれらのフラグメント、例えば、抗原又はハプテンと結合することができるFv、Fab及びF(ab)2フラグメントが含まれる。本発明は、所望の抗原特異性を示す非ヒトドナー抗体のアミノ酸配列をヒトアクセプター抗体の配列と組み合わせた、ヒト化ハイブリッド抗体も含む。さらに、単鎖抗体が包含される。ドナー配列は、少なくともドナーの抗原結合アミノ酸残基を通常含むが、他の構造的及び/又はドナー抗体の機能的に関連性のあるアミノ酸残基もまた含んでもよい。そうしたハイブリッドは、当技術分野で周知のいくつかの方法によって調製することができる。代謝物を特異的に認識することができる適切なタンパク質は、好ましくは、前記バイオマーカーの代謝変換に関与する酵素である。前記酵素は、バイオマーカー、例えば代謝物を基質として使用してもよいし、基質をバイオマーカー、例えば代謝物に変換してもよい。さらに、前記抗体は、バイオマーカーを特異的に認識するオリゴペプチドを生成するための基盤として使用することができる。こうしたオリゴペプチドは、例えば、酵素の結合ドメイン又は前記バイオマーカーに対するポケットを含む。適切な抗体及び/又は酵素に基づくアッセイは、RIA(放射免疫測定法)、ELISA(酵素結合免疫吸着測定法)、サンドイッチ酵素免疫試験、電気化学発光サンドイッチ免疫測定法(electrochemiluminescence sandwich immunoassays)(ECLIA)、解離促進ランタニド蛍光免疫測定法(dissociation-enhanced lanthanide fluoro immuno assay)(DELFIA)又は固相免疫試験でもよい。バイオマーカーに特異的に結合するアプタマーは、当技術分野で周知の方法で生成することができる(Ellington 1990、Nature 346:818〜822; Vater 2003、Curr Opin Drug Discov Devel 6(2): 253〜261)。さらに、バイオマーカーは、他の化合物と反応するその能力に基づいて、すなわち特異的な化学反応によって、同定することもできる。さらに、バイオマーカーは、生物学的読み取りシステムで応答を惹起するその能力のため、サンプル中で測定することができる。生物学的な応答は、サンプルに含まれる代謝物の存在及び/又は量を示す読み取り値として検出される。生物学的な応答は、例えば、細胞又は生物の遺伝子発現誘導又は表現型応答でもよい。
【０１０５】
用語「参照」は、少なくとも1つのバイオマーカーの特徴的な特性の値を指し、好ましくは、骨障害と相関し得る前記バイオマーカーの量の指標になる値を指す。
【０１０６】
好ましくは、そうした参照は、骨障害を患っている対象若しくは対象群に由来するサンプル、又は過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)若しくは炭酸カルシウムに接触させられた対象若しくは対象群に由来するサンプルから得られる。対象又は対象群は、化合物が生物学的に利用可能である限り、局所又は全身の各投与様式で前記化合物に接触させることができる。
【０１０７】
好ましくは、前記の化合物は、下記の付随する実施例及び表に記載されているように、参照が由来する対象又は対象群の個体に投与することができる。
【０１０８】
特に、本明細書で言及される過塩素酸ナトリウム又はフッ化ナトリウムは、ミネラル化障害を誘導し得る化合物であるが、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムは、骨芽細胞の活性及び/又は成熟の阻害を誘導し得る。
【０１０９】
或いは、とはいえ同様に好ましいことであるが、参照は、過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)若しくは炭酸カルシウムに接触させられていない対象若しくは対象群に由来するサンプル、又は骨障害に関して、より好ましくは他の疾患に関しても、健康な対象若しくはそうした対象の群に由来するサンプルから得ることができる。
【０１１０】
参照は、バイオマーカーの量について上で記載したように測定することができる。特に、好ましくは、参照は、本明細書で言及する一群の対象のサンプルから得られ、これは、その群の各個体由来のサンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーそれぞれの相対量又は絶対量を別々に測定し、その後に、本明細書の他の個所で言及される統計的技術を使用して、前記相対量若しくは絶対量の中央値若しくは平均値又はそれらから得られる任意のパラメータを決定することによって得られる。或いは、好ましくは、本明細書で言及するように、参照は、対象群のサンプル混合物由来のサンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーそれぞれに対する相対量又は絶対量を測定することによって得ることができる。好ましくは、そうした混合物は、前記群の各個体から得られるサンプル由来の等容量の部分からなる。
【０１１１】
さらに、また好ましくは、参照は計算された参照でもよく、最も好ましくは、個体集団に由来する少なくとも1つのバイオマーカーのそれぞれの相対量又は絶対量の平均値又は中央値でもよい。前記個体集団は、本発明の方法によって調査される対象が生じる集団である。しかし、計算された参照を決定するために調査する対象集団は、好ましくは、見かけ上健康な対象(例えば未処理)からなるか、又は前記集団内に試験対象が存在することに起因する平均値又は中央値の有意な変化に対して統計的に耐えるのに十分な大きさの、見かけ上健康な多数の対象を含むことを理解されたい。前記集団の個体の少なくとも1つのバイオマーカーの絶対量又は相対量は、本明細書の他の個所で明記されるように測定することができる。適切な参照値、好ましくは平均値又は中央値を計算する方法は、当技術分野で周知である。適切な参照を計算するための他の技術としては、受信者動作特性(ROC)曲線計算を用いる最適化が挙げられ、これは、当技術分野で同様に周知であり、対象の所与のコホートに基づく所与の特異性及び感受性を有するアッセイ系について、容易に実施することができる。先に言及した集団又は対象群は、複数の対象、好ましくは、少なくとも5、10、50、100、1,000又は10,000の対象、最大で集団全てまでを含む。より好ましくは、この文脈において言及される対象群は、所与の集団を統計的に代表する大きさを有する対象群、すなわち統計的に代表的なサンプルである。本発明の方法によって診断される対象及び前記複数の対象の対象は同一種であり、好ましくは同じ性別であることを理解されたい。
【０１１２】
より好ましくは、参照は、データベースなどの適切なデータ記憶媒体に格納されるので、その後の診断にも利用可能である。これによって、骨障害の素因を効率的に診断することが可能になる。なぜなら、対応する参照サンプルが得られた対象が(実際に)骨障害を発症したことが、(その後に)一度確認されれば、適切な参照結果をデータベース中で同定することができるからである。
【０１１３】
用語「比較する」は、少なくとも1つのバイオマーカーの定性的又は定量的な測定量が、参照と同一であるか又はそれと異なるかを評価することを指す。
【０１１４】
参照結果が、骨障害を患う対象若しくは対象群に由来するサンプル、又は過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)若しくは炭酸カルシウムと接触させられた対象若しくは対象群に由来するサンプルから得られた場合は、骨障害は、試験サンプル及び前述の参照から得られる量の間の同一度又は類似度に基づいて、すなわち、少なくとも1つのバイオマーカーに関する同一の定性的又は定量的な組成に基づいて診断することができる。同一の量は、統計的に有意な様式で異ならない量を含み、好ましくは、少なくとも参照の1から99パーセンタイル、5から95パーセンタイル、10から90パーセンタイル、20から80パーセンタイル、30から70パーセンタイル、40から60パーセンタイルの区間内、より好ましくは、参照の50、60、70、80、90又は95パーセンタイルである。骨障害を患う対象若しくは対象群に由来するサンプルから得られる参照、又は過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)若しくは炭酸カルシウムと接触させられた対象若しくは対象群に由来するサンプルから得られる参照は、骨障害を診断するために、又は対象において化合物が骨障害を誘導し得るかどうかを判定するために、本発明の方法で適用することができる。そのような場合では、好ましくは、参照と本質的に同一である、少なくとも1つのバイオマーカーの量が、骨障害又は骨障害を誘導し得る化合物が存在する指標となり、一方で、参照と異なる、少なくとも1つのバイオマーカーの量が、骨障害又は骨障害を誘導し得る化合物が存在しないことの指標になる。
【０１１５】
さらに、骨障害を患う対象若しくは対象群に由来するサンプルから得られる参照、又は過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)若しくは炭酸カルシウムと接触させられた対象若しくは対象群に由来するサンプルから得られる参照は、骨障害を治療するための物質を同定するのに適用することができる。そのような場合では、好ましくは、参照と異なる、少なくとも1つのバイオマーカーの量が、骨障害を治療するのに適した物質の指標となり、一方で、参照と本質的に同一である、少なくとも1つのバイオマーカーの量が、骨障害を治療できない物質の指標になる。
【０１１６】
参照結果が、過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)若しくは炭酸カルシウムに接触させられていない対象若しくは対象群のサンプルか、又は骨障害を患っていない対象若しくは対象群のサンプルから得られる場合は、前記骨障害は、試験サンプルから得られる試験量と前述の参照の差異、すなわち、少なくとも1つのバイオマーカーに関する定性的又は定量的な組成における差異に基づいて診断することができる。
【０１１７】
上で明記した計算された参照が使用される場合も、同じことが当てはまる。
【０１１８】
差異は、少なくとも1つのバイオマーカーの絶対量又は相対量の増大(バイオマーカーのアップレギュレーションといわれることもある。実施例も参照されたい。)でもよいし、前記量のいずれかの低下若しくは検出可能なバイオマーカーの量が存在しないこと(バイオマーカーのダウンレギュレーションといわれることもある。実施例も参照されたい。)でもよい。好ましくは、相対量又は絶対量の差異は有意であり、すなわち、参照の45から55パーセンタイル、40から60パーセンタイル、30から70パーセンタイル、20から80パーセンタイル、10から90パーセンタイル、5から95パーセンタイル、1から99パーセンタイルの区間外である。
【０１１９】
過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)若しくは炭酸カルシウムに接触させられていない対象若しくは対象群に由来するサンプルから得られる参照、又は骨障害を患っていない対象若しくは対象群に由来するサンプルから得られる参照は、骨障害を診断するために、又は対象において化合物が骨障害を誘導し得るかどうかを判定するために、本発明の方法で適用することができる。そのような場合では、好ましくは、参照と異なる、少なくとも1つのバイオマーカーの量が、骨障害又は骨障害を誘導し得る化合物が存在することの指標となり、一方で、参照と本質的に同一である、少なくとも1つのバイオマーカーの量が、骨障害又は骨障害を誘導し得る化合物が存在しないことの指標になる。さらに、過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)若しくは炭酸カルシウムに接触させられていない対象若しくは対象群に由来するサンプルから得られる参照、又は骨障害を患っていない対象若しくは対象群に由来するサンプルから得られる参照は、骨障害を治療するための物質を同定するのに適用することができる。そのような場合では、好ましくは、参照と本質的に同一である、少なくとも1つのバイオマーカーの量が、骨障害を治療するのに適した物質の指標となり、一方で、参照と異なる、少なくとも1つのバイオマーカーの量が、骨障害を治療するのに適さない物質の指標になる。
【０１２０】
好ましい参照は、付属の表で言及されるもの又は以下の付属の実施例で生成することができるものである。さらに、相対的差異、すなわち個々のバイオマーカーに対する量の増大又は低下は、好ましくは、以下の表に列挙されるものである。さらに、好ましくは、観察される差異の程度、すなわち増大又は低下は、好ましくは、以下の表に示される因子による増大又は低下である。
【０１２１】
好ましくは、表1a、1c、2a又は2cから選択される場合の少なくとも1つのバイオマーカーは、過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)若しくは炭酸カルシウムと接触させられなかった対象若しくは対象群に由来するサンプル、又は前記表に示す健全な対象若しくは対象群から得られるサンプルから得られる参照に対して増加する。
【０１２２】
好ましくは、表1b、1d、2b又は2dから選択される場合の少なくとも1つのバイオマーカーは、過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)若しくは炭酸カルシウムと接触させられなかった対象若しくは対象群に由来するサンプル、又は前記表に示す健全な対象若しくは対象群から得られるサンプルから得られる参照に対して低下する。
【０１２３】
好ましくは、比較は自動化によって補助される。例えば、2つの異なるデータセット(例えば、特徴的な特性の値を含むデータセット)を比較するためのアルゴリズムを含む適切なコンピュータープログラムを使用することができる。そうしたコンピュータープログラム及びアルゴリズムは、当技術分野で周知である。上記にもかかわらず、手動で比較することもできる。
【０１２４】
用語「骨障害を治療するための物質」は、本明細書の他の個所で言及される骨障害を誘導する生物学的機序を直接的に妨げることができる化合物を指す。或いは、骨障害に付随する症状の発症又は進行を妨げることができる化合物も好ましい。本発明の方法によって同定される物質は、有機及び無機化学物質、例えば、小分子、ポリヌクレオチド、siRNA、リボザイム若しくはマイクロRNA分子を含めたオリゴヌクレオチド、ペプチド、抗体を含めたポリペプチド又は他の人工的若しくは生物学的な高分子、例えばアプタマーなどでもよい。好ましくは、この物質は、薬物、プロドラッグ、又は薬物若しくはプロドラッグを開発するためのリード物質として適する。したがって本発明の一態様では、方法は、さらなる臨床開発のために、同定及び選択される物質、薬物、プロドラッグ、又は薬物若しくはプロドラッグの候補を同定及び/又は確認することを含むステップをさらに含むことができる。そのような臨床開発は、好ましくは、物質の薬理学的研究、物質の毒性判定、全てのフェーズの臨床試験を含む動物及びヒトの薬物試験を含むことができる。
【０１２５】
本発明の方法が、骨障害の療法のための薬物の同定、又は化合物の毒物学的評価(すなわち、化合物が骨障害を誘導し得るかどうかの判定)のために使用されることになる場合は、統計的理由のために、複数の対象の試験サンプルが調査され得ることを理解されたい。好ましくは、試験対象のそうしたコホート内のメタボロームは、例えば調査化合物以外の因子によって引き起こされる差異を回避するために、できるだけ類似しているべきである。前記方法に使用する対象は、好ましくはげっ歯類などの実験動物、より好ましくはラットである。前記実験動物は、好ましくは、本発明の方法が終了した後で屠殺されることをさらに理解されたい。コホート試験の対象及び参照動物の全ては、いかなる異なる環境上の影響も回避するために、同一条件下で維持される。そうした動物を提供する適切な条件及び方法は、WO2007/014825に詳細に記載されている。前記条件は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
したがって、骨障害、特に骨ミネラル化障害並びにそれと関連する症状及び結果並びに/又は骨芽細胞活性の阻害を治療するための物質を同定することを目指す本発明の方法は、好ましくはさらなるステップを含む。好ましくは、さらなるステップには、ED50/EC50及び/又はLD50/LC50閾値などのその薬理学的及び/又は毒性学的パラメータを同定するために物質で前臨床試験を実施すること、例えば物質の治療的効能及び安全性、並びに同定された物質の薬学的に許容される形の製剤を判定するための臨床試験を実施することが含まれる。物質は、好ましくは、局所又は全身投与のために製剤化することができる。従来通り、薬物は筋肉内又は皮下に投与される。しかし、物質の性質及び作用様式によっては、他の経路によっても投与することができる。物質は、好ましくは、従来の剤形での投与のために製剤化され、同定された物質を標準の薬用担体と従来の手順に従って組み合わせることによって調製される。これらの手順は、所望の調製物に適するように、成分を混合、造粒及び圧縮、又は溶解することを含むことができる。薬学的に許容される担体又は希釈剤の形及び性状は、組み合わされる有効成分の量、投与経路及び他の周知の変数によって決定されることが理解される。担体は、製剤の他の成分に適合し、そのレシピエントに有害でないという意味において許容されるものでなければならない。使用される医薬用担体には、固体、ゲル又は液体が含まれてもよい。限定するものではないが、固体担体の例は、乳糖、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。限定するものではないが、液体担体の例は、リン酸緩衝生理食塩溶液、シロップ、油、水、乳剤、各種の湿潤剤などである。同様に、担体又は希釈剤には、この分野において周知であるタイムディレイ材料、例えば単独又はワックスと一緒のモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルが含まれてもよい。前記好適な担体は、上記のもの、及び当技術分野で周知である他のものを含む。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvaniaを参照されたい。希釈剤は、組合せの生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。限定するものではないが、そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンガー液、ブドウ糖溶液及びハンク溶液である。さらに、医薬組成物又は製剤は、他の担体、アジュバント、又は非毒性、非治療的、非免疫原性の安定剤などを含むこともできる。薬物として物質の製剤化は、品質、医薬の安全性及び効果を確保するために、GMP規格の条件下などで行われることを理解すべきである。
【０１２７】
好ましくは、本発明の方法は本発明の装置で実施され得る。本明細書で使用する装置は、少なくとも前述のユニットを含む。装置のユニットは、互いに作動可能に連結される。作動的にユニットを連結する方法は、装置中に備えられるユニットの種類に依存する。例えば、少なくとも1つのバイオマーカーを定性的又は定量的に自動的に測定するための手段が分析ユニット中に適用される場合は、その自動的に作動するユニットによって得られるデータは、診断を容易にするために、評価ユニットによって、例えば、データ処理装置であるコンピューターで動作するコンピュータープログラムによって処理することができる。好ましくは、そのような場合は、これらのユニットは単一装置に備えられる。しかし、分析ユニットと評価ユニットは、物理的に離れていてもよい。そのような場合では、作動的な連結は、データ伝達を可能にする、ユニット間の有線接続及び無線接続によって達成することができる。無線接続は、無線LAN(WLAN)又はインターネットを使用することができる。有線接続は、ユニット間の光及び非光ケーブル接続によって達成することができる。好ましくは、有線接続に使用するケーブルは、ハイスループットなデータ転送に適する。
【０１２８】
少なくとも1つのバイオマーカーを測定するための好ましい分析ユニットは、本明細書の他の個所で明記されるような、少なくとも1つのバイオマーカーを特異的に認識する検出剤、例えば抗体、タンパク質又はアプタマーなど、及び前記検出剤を試験サンプルと接触させる区域を含む。検出剤は、接触のために区域上に固定化してもよいし、サンプルを添加した後に前記区域に加えてもよい。好ましくは、分析ユニットは、検出剤と少なくとも1つのバイオマーカーの複合物の量を定性的及び/又は定量的に測定するように適合させる。検出剤が少なくとも1つのバイオマーカーへ結合する際に、少なくとも1つのバイオマーカー、検出剤のいずれか又は両方の少なくとも1つの測定可能な物理的又は化学的性質が変化し、その結果、好ましくは分析ユニットに含まれる検出器によって前記変化を測定できることを理解されたい。しかし、試験ストライプなどの分析ユニットを使用する場合は、検出器及び分析ユニットは、測定のためだけに結合させられる分離したコンポーネントでもよい。少なくとも1つの測定可能な物理的又は化学的性質において検出された変化に基づいて、分析ユニットは、本明細書の他の個所で明記される少なくとも1つのバイオマーカーに関する強度値を計算することができる。次いで、さらに処理及び評価するために、前記強度値を評価ユニットに伝達することができる。最も好ましくは、本明細書の他の個所で明記される検出剤を使用して、少なくとも1つのバイオマーカーの量をELISA、EIA又はRIAに基づく技術によって測定することができる。或いは、本明細書で言及する分析ユニットは、好ましくは、クロマトグラフィー装置などのバイオマーカーを分離するための手段、及び分光測定装置などのバイオマーカーを測定するための手段を含む。適切な装置は、詳細に先に記載されている。本発明のシステムで使用する化合物分離用の好ましい手段としては、クロマトグラフィー装置、より好ましくは液体クロマトグラフィー装置、HPLC装置及び/又はガスクロマトグラフィー装置が挙げられる。化合物測定用の好ましい装置は、質量分析装置、より好ましくは、GC-MS、LC-MS、直接注入質量分析装置、FT-ICR-MS、CE-MS、HPLC-MS、四重極質量分析装置、(MS-MS若しくはMS-MS-MSを含めた)逐次連結質量分析装置、ICP-MS、Py-MS又はTOFを含む。好ましくは、分離及び測定の手段は互いに連結される。最も好ましくは、LC-MS及び/又はGC-MSが、本発明によって言及される分析ユニットで使用される。
【０１２９】
好ましくは、本発明の装置の評価ユニットは、本明細書の他の個所で明記されるような比較を実施するためのルールを実行するように適合させたデータ処理装置又はコンピューターを含む。さらに、好ましくは、評価ユニットは、参照を格納したデータベースを含む。本発明で使用するデータベースは、適切な記憶媒体のデータ集合を含む。さらに、データベースは、好ましくはデータベース管理システムをさらに含む。好ましくは、データベース管理システムは、ネットワーク型、階層型又はオブジェクト指向型データベース管理システムである。さらに、データベースは、連邦データベースでもよいし、統合データベースでもよい。より好ましくは、データベースは、分散(連邦)システムとして、例えばクライアントサーバシステムとして実装される。より好ましくは、データベースは、検索アルゴリズムが、試験データセットをデータ集合に含まれるデータセットと比較できるように構築される。具体的には、そうしたアルゴリズムを使用することによって、骨障害の指標になる類似又は同一のデータセットについてデータベースを検索することができる(例えばクエリ検索)。したがって、同一又は類似のデータセットをデータ集合中に同定することができる場合は、試験データセットは骨障害と関係があることになる。評価ユニットは、好ましくは、骨障害の確定診断に基づく治療的若しくは予防的な介入又は生活習慣の適応に関する助言を有するさらなるデータベースを含んでもよいし、それに作動可能に連結されてもよい。好ましくは、骨障害を治療又は予防するために、試験サンプルを得た対象に対する適切な助言を特定する目的で、評価ユニットによって得られた診断結果を用いて前記のさらなるデータベースを自動的に検索することができる。
【０１３０】
本発明の装置の好ましい実施形態では、前記格納された参照は、骨障害を患っていることが分かっている対象若しくは対象群に由来する参照、又は過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられた対象若しくは対象群に由来する参照であり、前記データ処理装置は、分析ユニットで測定された少なくとも1つのバイオマーカーの量を格納された参照と比較するための指示を実行し、参照と比較して試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨障害が存在することの指標になるか、又は参照と比較して異なる、試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの量が、骨障害が存在しないことの指標になる。
【０１３１】
本発明の装置の別の好ましい実施形態では、前記格納された参照は、骨障害を患っていないことが分かっている対象若しくは対象群に由来する参照、又は過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられていない対象若しくは対象群に由来する参照であり、前記データ処理装置は、分析ユニットによって測定された少なくとも1つのバイオマーカーの量を格納された参照と比較するための指示を実行し、参照と比較して異なる、試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの量が、骨障害が存在することの指標となり、又は参照と比較して試験サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの本質的に同一な量が、骨障害が存在しないことの指標になる。
【０１３２】
したがって、助言を行うエキスパートシステムが含まれる場合は特に、メディカルスタッフ又は実験室スタッフ又は患者が特別な医学知識なしで装置を使用することもできる。この装置は、携帯型に適合させることができるので、患者の近くでの用途にも適する。
【０１３３】
用語「キット」は、好ましくは別々に又は単一の容器内に提供される、前述のコンポーネントの集合を指す。容器は、本発明の方法の実施に関する指示も含む。こうした指示は、取扱説明書の形でもよいし、コンピューター又はデータ処理装置上に実装される場合には、本発明の方法で言及される比較を実施でき、それに応じて診断を確定するためのコンピュータープログラムコードによって提供されてもよい。コンピュータープログラムコードは、データ記憶媒体若しくは装置、例えば光若しくは磁気記憶媒体(例えば、コンパクトディスク(CD)、CD-ROM、ハードディスク、光記録媒体若しくはディスケット)上に、又はコンピューター若しくはデータ処理装置上に直接的に提供することができる。本発明のキットに関して言及される「スタンダード」は、溶液中に存在する又は既定の溶液量中に溶解されている場合は、少なくとも1つのバイオマーカーの量であり、(i)骨障害を患っていることが分かっている対象若しくは対象群、若しくは過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられた対象若しくは対象群中に存在する少なくとも1つのバイオマーカーの量、又は(ii)骨障害を患っていないことが分かっている対象若しくは対象群、若しくは過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)及び炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と接触させられていない対象若しくは対象群に由来する少なくとも1つのバイオマーカーの量に類似している。
【０１３４】
好都合なことに、本明細書に明記される少なくとも1つのバイオマーカーの量によって、骨障害、具体的には過塩素酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、カルシトニン(サケ)又は炭酸カルシウムによって誘導される骨障害の診断が可能になることが、本発明の根底となる研究において見出されている。本方法の特異性及び正確性は、前述のバイオマーカーの数を増加させて測定することによって又はさらにその全てを測定することによって、より一層向上する。こうした特異的なバイオマーカーに関するメタボロームの定量的及び/又は定性的組成の変化は、骨障害の他の徴候が臨床的に明らかになる前でさえ、骨障害の指標になる。骨障害を診断するのに現在使用されている形態的、生理的及び生化学的なパラメータは、本発明で提供するバイオマーカー測定と比較すると、特異性及び感受性が低い。本発明によって、化合物の骨障害を、より効率的且つ確実に評価することができる。さらに、前述の知見に基づいて、骨障害の療法に有用な薬物のスクリーニングアッセイが実行可能である。概して、本発明は、骨障害を診断するために、化合物が骨障害を誘導し得るかどうかを判定するために、又は骨障害を治療し得る物質を同定するために、表1a、1b、1c、1d、2a、2b、2c又は2dのいずれか1つから選択される対象のサンプルの少なくとも1つのバイオマーカー又は前記バイオマーカー用の検出剤の使用を企図する。さらに、本発明は概して、骨障害の治療に対して感受性である対象を同定するために、対象のサンプルの少なくとも1つのバイオマーカー、又はそのバイオマーカーの検出剤の使用を企図する。本発明のこの文脈において使用するのに好ましい検出剤は、本明細書の他の個所で言及されるものである。さらに好都合なことに、発明の方法は装置中に実装することができる。さらに、本方法を実施できるようにするキットを提供することができる。
【０１３５】
本発明は、表1a、1b、1c、1d、2a、2b、2c又は2dのいずれか1つに列挙されるバイオマーカーに対する特性値を含むデータ集合にも関する。用語「データ集合」は、物理的及び/又は論理的にグループ化され得るデータの集合を指す。したがって、データ集合は、単一のデータ記憶媒体又は互いに作動可能に連結された物理的に離れたデータ記憶媒体に実装することができる。好ましくは、データ集合は、データベースによって実装される。したがって、本発明で使用するデータベースは、適切な記憶媒体上にデータ集合を含む。さらに、好ましくは、データベースはデータベース管理システムをさらに含む。好ましくは、データベース管理システムは、ネットワーク型、階層型又はオブジェクト指向型のデータベース管理システムである。さらに、データベースは、連邦データベースでも統合データベースでもよい。より好ましくは、データベースは、分散(連邦)システムとして、例えばクライアントサーバシステムとして実装される。より好ましくは、データベースは、検索アルゴリズムが試験データセットをデータ集合に含まれるデータセットと比較できるように構築される。具体的には、そうしたアルゴリズムを使用することによって、骨障害の指標になる類似の又は同一のデータセットについてデータベースを検索することができる(例えばクエリ検索)。したがって、同一又は類似のデータセットをデータ集合中に同定することができる場合は、試験データセットは骨障害と関係があることになる。結果として、データ集合から得られる情報を使用して、対象から得られる試験データセットに基づいて骨障害を診断することができる。
【０１３６】
さらに、本発明は、前記データ集合を含むデータ記憶媒体に関する。本明細書で使用する用語「データ記憶媒体」は、CD、CD-ROM、ハードディスク、光記録媒体又はディスケットなどの単一の物理エンティティに基づくデータ記憶媒体を包含する。さらにこの用語は、好ましくはクエリ検索に適切な方法で、前述のデータ集合を提供するように互いに作動可能に連結された、物理的に離れたエンティティからなるデータ記憶媒体をさらに含む。
【０１３７】
本発明はまた、
(a)本発明のデータ記憶媒体と、
(b)それに作動可能に連結された、サンプルの少なくとも1つのバイオマーカーの特性値を比較するための手段と
を含むシステムに関する。
【０１３８】
本明細書で使用する用語「システム」は、互いに作動可能に連結された異なる手段に関する。前記手段は、単一装置に実装されてもよいし、又は互いに作動可能に連結された物理的に離れた装置に実装されてもよい。好ましくは、バイオマーカーの特性値を比較するための手段は、上で言及したような比較アルゴリズムに基づいて作動する。好ましくは、データ記憶媒体は、前述のデータ集合又はデータベースを含み、各記憶データセットが骨障害の指標になる。したがって、本発明のシステムによって、試験データセットがデータ記憶媒体に格納されるデータ集合に含まれるかどうかを特定することが可能になる。結果として、本発明のシステムは、骨障害診断の診断手段として適用することができる。本システムの好ましい実施形態では、サンプルのバイオマーカーの特性値を測定するための手段が含まれる。用語「バイオマーカーの特性値を測定するための手段」は、好ましくは、質量分析装置、ELISA装置、NMR装置又はアナライトについて化学的若しくは生物学的アッセイを実施するための装置などの、バイオマーカーを測定するための前述の装置に関する。
【０１３９】
先に言及した全ての参考文献は、その開示内容全体及び先の記述で明確に言及したその具体的な開示内容に関して、参考により本明細書に組み込むものとする。
【０１４０】
以下の実施例は、本発明を説明する目的のためにすぎない。これらは、いかなる観点においても本発明の範囲を限定するものと何ら解釈されるべきでない。
【実施例】
【０１４１】
実施例:骨障害に関連するバイオマーカー
5匹の雄及び雌ラットの群に、指示化合物(化合物、投与量及び投与詳細について以下の表10を参照のこと)を28日間にわたって1日1回投与した。
【０１４２】
本研究の各投与群は、性別あたり5匹のラットからなっていた。各5匹の雄及び雌の動物の追加的な群を対照とした。処理期間の開始前に、供給時に62〜64日齢の動物を、居住及び環境条件に7日間順応させた。動物集団の全ての動物を、同一の一定温度(20〜24±3℃)及び同一の一定湿度(30〜70%)下で維持した。動物集団の動物は、不断給餌させた。使用する餌には、化学物質又は微生物の混入物は基本的に含まれていなかった。飲料水も自由に与えた。したがって、欧州飲料水指令(European Drinking Water Directive)98/83/EGに規定されている通り、水には、化学物質及び微生物の混入物は含まれていなかった。照明期間は、12時間明期、続いて12時間暗期(6:00から18:00までの12時間明期及び18:00から6:00までの12時間暗期)とした。本研究は、ドイツ動物保護法及び欧州理事会指令86/609/EEに従って、AAALACに認可された実験室で実施した。試験系は、げっ歯類での28日間反復投与経口毒性試験について化学物質を試験するために、OECD 407指針に従ってアレンジした。以下の表1から9の試験物質(化合物)を、上の表10に記載されるように用量決定し、投与した。
【０１４３】
7日目、14日目及び28日目の朝に、絶食させた麻酔下の動物の眼窩後静脈叢から採血した。抗凝血剤としてEDTAを用いて、各動物から1mlの血液を採取した。このサンプルを遠心分離して、血漿を生成した。全ての血漿サンプルをN2雰囲気で覆い、次いで分析まで-80℃で保管した。
【０１４４】
質量分析に基づく代謝物プロファイリング分析のために、血漿サンプルを抽出し、極性及び非極性(脂質)画分を得た。GC-MS分析のために、非極性画分を酸性条件下でメタノールで処理して、脂肪酸メチルエステルを得た。O-メチル-ヒドロキシアミン塩酸塩及びピリジンを用いて両画分をさらに誘導体化してオキソ基をO-メチルオキシムに変換し、その後にシリル化剤を用いて誘導体化してから分析した。LC-MS分析では、両画分を適切な溶媒混合液中で再構成した。HPLCは、逆相分離カラムによってグラジエント溶出で実施した。WO2003073464に記載されるように、フルスクリーン分析と並行して、標的及び高感度MRM(多重反応モニタリング)プロファイリングを可能にする質量分析検出を適用した。
【０１４５】
ステロイド及びその代謝物は、オンラインのSPE-LC-MS(固相抽出LC-MS)によって測定した。カテコールアミン及びその代謝物は、Yamadaら(Yamada 2002、Journal of Analytical Toxicology、26(1): 17〜22))によって記載されるように、オンラインのSPE-LC-MSによって測定した。
【０１４６】
総合的な分析検証ステップに続いて、各アナライトに関するデータを、プールサンプル由来のデータに対して標準化した。これらのサンプルは、プロセス変動を説明するために、全プロセスを通して並行して処理した。性別、処理期間及び代謝物に対して特異的な処理群値の有意性を、処理群の平均と対応する未処理の対照群の平均をWELCH試験を用いて比較することによって判定し、対照に対する処理比及びP値を用いて定量化した。
【０１４７】
毒性パターン毎の最も重要なバイオマーカーを、以下の表のアナライトの序列化によって同定した。したがって、所与のパターンの参照処理における代謝変化(表に示す)を、関係のない処理における同一代謝物の変化と比較した。各代謝物について、参照及び対照処理からT値を得て、Welch試験によって比較して、これら2群に有意差があるかどうかを評価した。それぞれのT値の最大絶対値を選んで、そのパターンに対する最も重要な代謝物を示した。
【０１４８】
ラットを処理した後の、骨障害の指標になる血漿代謝物群の変化を以下の表に示す。
【表１】
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【表２】
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【表３】
2015517087.tif 000004
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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