(57)【要約】  本明細書に提供されるのは、担体タンパク質及び修飾された大腸菌抗原のO抗原 O121を含むバイオコンジュゲートである。また本明細書に提供されるのは、該バイオコンジュゲートの使用、例えば、サルモネラ・エンテリカ亜種I血清型チフィ(チフス菌)によって引き起こされる疾患を含む、サルモネラ・エンテリカによって引き起こされる疾患の治療及び/又は予防である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体タンパク質及び修飾された大腸菌O121 O-抗原を含むバイオコンジュゲート。
【請求項２】
前記修飾された大腸菌O121 O-抗原が、前記担体タンパク質のグリコシル化部位内のAsnに共有結合しており、ここで、該グリコシル化部位が、アミノ酸配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr(ここで、X及びZは、Pro以外の任意のアミノ酸であり得る)を含む、請求項1記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３】
前記グリコシル化部位が、組換え技術によって改変されており、天然の担体タンパク質中には存在しない、請求項2記載のバイオコンジュゲート。
【請求項４】
前記担体タンパク質が、アミノ酸配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr(ここで、X及びZは、Pro以外の任意のアミノ酸であり得る)を各々有する2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のグリコシル化部位を含む、請求項2記載のバイオコンジュゲート。
【請求項５】
前記担体タンパク質が、緑膿菌の外毒素A、CRM197、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の解毒化された溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの解毒化された変異体、コレラ毒素Bサブユニット、コレラ毒素、コレラ毒素の解毒化された変異体、大腸菌satタンパク質、大腸菌satタンパク質のパッセンジャードメイン、C.ジェジュニのAcrA、及びC.ジェジュニの天然糖タンパク質、髄膜炎菌のピリン、NMB0088、亜硝酸還元酵素(AniA)、ヘパリン結合抗原(NHBA)、H因子結合タンパク質(fHBP)、アドヘシンNadA、Ag473、表面タンパク質A(NapA)、サルモネラ・エンテリカの抗原からなる群から選択される、請求項1記載のバイオコンジュゲート。
【請求項６】
前記修飾された大腸菌O121 O-抗原が:
【化１】
2015529214.tif 000023
を含む、請求項1記載のバイオコンジュゲート。
【請求項７】
前記修飾された大腸菌O121 O-抗原が:
【化２】
2015529214.tif 000024
を含む、請求項1記載のバイオコンジュゲート。
【請求項８】
前記修飾された大腸菌O121 O-抗原が:
【化３】
2015529214.tif 000025
を含む、請求項1記載のバイオコンジュゲート。
【請求項９】
前記修飾された大腸菌O121 O-抗原が:
【化４】
2015529214.tif 000026
を含む、請求項1記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか一項記載のバイオコンジュゲートを含む免疫原性組成物。
【請求項１１】
サルモネラ・エンテリカ感染の治療又は予防において使用するための請求項10記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
チフス菌感染の治療又は予防において使用するための請求項10記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
対象におけるサルモネラ・エンテリカ感染の治療又は予防方法であって、それを必要としている対象に、請求項10記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１４】
対象におけるチフス菌感染の治療又は予防方法であって、それを必要としている対象に、請求項10記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１５】
バイオコンジュゲートを作製するための原核宿主生物であって:
a.アミノ酸配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr(ここで、X及びZは、Pro以外の任意の天然アミノ酸であり得る)を含む少なくとも1つのグリコシル化部位を含む担体タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列;並びに
b.オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列;
を含み、
ここで、該原核宿主生物は、修飾された大腸菌O121 O抗原を産生するように組換え技術によって改変されており、該オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、該修飾された大腸菌O121 O抗原を該グリコシル化部位のAsnに転移する、前記原核宿主生物。
【請求項１６】
大腸菌である、請求項15記載の原核宿主生物。
【請求項１７】
大腸菌株K12である、請求項15記載の原核宿主生物。
【請求項１８】
前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、カンピロバクター・ジェジュニのPglBである、請求項15記載の原核宿主生物。
【請求項１９】
請求項1記載のバイオコンジュゲートを作製する方法であって:
a.請求項15〜18のいずれか一項記載の原核宿主生物を培養すること;及び
b.該バイオコンジュゲートを単離すること
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2012年9月10日に出願された米国仮特許出願第61/698,843号に対する優先権を主張する。
【０００２】
(1.序論)
本明細書に提供されるのは、修飾された大腸菌(Escherichia coli)抗原である、大腸菌血清型O121由来のO抗原である。また本明細書に提供されるのは、修飾された大腸菌O121 O-抗原の使用、例えば、疾患の治療及び/又は予防、例えば、サルモネラ・エンテリカ亜種I血清型チフィ(Salmonella enterica subspecies I serovar Typhi)(チフス菌(S. typhi))によって引き起こされる疾患を含む、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)によって引き起こされる疾患の治療及び/又は予防における修飾された大腸菌O121 O-抗原の使用である。
【背景技術】
【０００３】
(2.背景)
腸チフスは、依然として、約216,000〜500,000件の死亡を含め、毎年22,000,000〜33,000,000件発生する重大な公衆衛生問題である[Crump, J.A., Luby, S.P., Mintz, E.D.の文献:腸チフスの世界的負担(The global burden of typhoid fever.)、Bull World Health Organ 82(5), 346-353(2004)]。このヒト全身性感染症の原因病原体であるサルモネラ・エンテリカ亜種I血清型チフィ(チフス菌)は、汚染した水及び食料を通して糞口感染する。したがって、腸チフスは、衛生状態が未だに悪い発展途上地域の風土病である。これには、アジア、アフリカ、及び南米の多くの国々が含まれ、そこでは、学童及び若年成人が最も高い頻度で冒される[Bhan, M.K., Bahl, R., Bhatnagar, S.の文献:腸チフス及びパラチフス(Typhoid and paratyphoid fever.)、Lancet 366(9487), 749-762(2005)]。腸チフスの抗菌処置は、チフス菌の多剤耐性株の出現により、次第に複雑になってきた[Mirza, S.H., Beeching, N.J., Hart, C.A.の文献:多剤耐性腸チフス:世界的問題(Multi-drug resistant typhoid: a global problem.)、J Med Microbiol 44(5), 317-319(1996)]。
【０００４】
高リスク集団のワクチン接種は、腸チフスの制御及び予防のための最も有望な戦略であると考えられる。現在、2つの認可された腸チフスワクチン:経口投与される弱毒化全細胞生ワクチンTy21a及び精製Vi多糖非経口ワクチンがある。Ty21aワクチンには、いくつかの不利な点がある:(i)このチフス菌株の弱毒化表現型に寄与する突然変異が完全には明確になっていない[Hone, D.M., Attridge, S.R., Forrest, B., Morona, R., Daniels, D., LaBrooy, J.T., Bartholomeusz, R.C., Shearman, D.J., Hackett, J.の文献:チフス菌Ty2のgalE via(Vi抗原陰性)突然変異体は、ヒトで病原性を保持する(A galE via (Vi antigen-negative) mutant of Salmonella typhi Ty2 retains virulence in humans.)、Infect Immun 56(5), 1326-1333(1988)]、(ii)弱毒化株は、理論上、病原性に復帰することができる、及び(iii)Ty21aは、ごくわずかしか免疫原性がなく、3〜4回の初期投与及び5年毎の追加投与を必要とする[Levine, M.M., Ferreccio, C., Black, R.E., Germanier, R.の文献:腸溶性コートカプセル製剤中のTy21a経口腸チフス生ワクチンの大規模実地試験(Large-scale field trial of Ty21a live oral typhoid vaccine in enteric-coated capsule formulation.)、Lancet 1(8541), 1049-1052(1987); Black, R.E., Levine, M.M., Ferreccio, C., Clements, M.L., Lanata, C., Rooney, J., Germanier, R.の文献:対照実地試験における腸溶性コートカプセル剤中の1又は2用量のTy21aチフス菌ワクチンの有効性(Efficacy of one or two doses of Ty21a Salmonella typhi vaccine in enteric-coated capsules in a controlled field trial.)、Chilean Typhoid Committee. Vaccine 8(1), 81-84(1990); Murphy, J.R., Grez, L., Schlesinger, L., Ferreccio, C., Baqar, S., Munoz, C., Wasserman, S.S., Losonsky, G., Olson, J.G., Levine, M.M.の文献:幼児用チフス菌Ty21aワクチンの免疫原性(Immunogenicity of Salmonella typhi Ty21a vaccine for young children.)、Infect Immun 59(11), 4291-4293(1991); Levine, M.M., Ferreccio, C., Cryz, S., Ortiz, E.の文献:無作為化対照実地試験におけるTy21a腸チフスワクチンの腸溶性コートカプセル剤及び液体製剤の比較(Comparison of enteric-coated capsules and liquid formulation of Ty21a typhoid vaccine in randomised controlled field trial.)、Lancet 336(8720), 891-894(1990); Levine, M.M., Ferreccio, C., Abrego, P., Martin, O.S., Ortiz, E., Cryz, S.の文献:弱毒化腸チフス経口生ワクチンTy21aの有効性の持続期間Duration of efficacy of Ty21a, attenuated Salmonella typhi live oral vaccine.)、Vaccine 17 Suppl 2, S22-27(1999)]。Vi多糖ワクチンの有用性は、その年齢に関連した免疫原性、及び多糖に対する免疫応答がT細胞非依存的であるという事実によって限定される。それゆえ、免疫記憶を樹立することができず、再ワクチン接種によって、ブースター応答が誘発されない[Weintraub, A.の文献:細菌多糖抗原の免疫学(Immunology of bacterial polysaccharide antigens.)、Carbohydr Res 338(23), 2539-2547(2003)、Landy, M.の文献: Vi抗原に関する研究。VI.精製Vi抗原によるヒトの免疫(Studies on Vi antigen. VI. Immunization of human beings with purified Vi antigen.)、Am J Hyg 60(1), 52-62(1954)]。これらの欠点のために、現在の腸チフスワクチンを、明確に規定され、忍容性が良好で、かつ免疫原性が高いワクチンに置き換えることが望ましい。
【０００５】
多糖ワクチンの不利な点は、糖質をタンパク質担体にコンジュゲートすること(コンジュゲートワクチン)によって克服することができる。コンジュゲートされると、多糖は、T細胞依存性抗原のように振る舞う。組換え緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(EPA)に共有結合した精製Vi多糖は、幼児においてチフス菌に対する防御免疫応答を誘導することが示されている[Szu, S.C., Taylor, D.N., Trofa, A.C., Clements, J.D., Shiloach, J., Sadoff, J.C., Bryla, D.A., Robbins, J.B.の文献: Vi莢膜多糖-タンパク質コンジュゲートワクチンの実験的及び予備的臨床特性評価(Laboratory and preliminary clinical characterization of Vi capsular polysaccharide-protein conjugate vaccines.)、Infect Immun 62(10), 4440-4444(1994); Lin, F.Y., Ho, V.A., Khiem, H.B., Trach, D.D., Bay, P.V., Thanh, T.C., Kossaczka, Z., Bryla, D.A., Shiloach, J., Robbins, J.B., Schneerson, R., Szu, S.C.の文献:2歳から5歳の子供における腸チフスViコンジュゲートワクチンの有効性(The efficacy of a Salmonella typhi Vi conjugate vaccine in two-to-five-year-old children.)、N Engl J Med 344(17), 1263-1269(2001)]。しかしながら、コンジュゲートワクチンの産生は、複雑な多工程プロセスである。まず、組換えタンパク質担体及び多糖抗原を産生する別々の細菌株を培養しなければならない。多糖及びタンパク質担体は、これら2つの成分を化学的に結合する前に、異なる手順によって精製しなければならない。最後の工程は、最終生成物を得るためのさらなる精製工程を含む。この面倒な産生プロセスには不利な点がある:(i)相当なロスが生じ得る場合、いくつかの精製工程が必要とされる、及び(ii)化学的結合のランダムな性質のために、生成物は、均一な構造ではなく、様々な複合糖質の混合物であり、様々な有効性プロファイルを有する可能性がある。
【０００６】
したがって、チフス菌感染を含む、対象のサルモネラ・エンテリカ感染を治療及び予防する改善された方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
(3.概要)
一態様において、本明細書に提供されるのは、担体タンパク質及び修飾された大腸菌O121 O-抗原を含むバイオコンジュゲートである。
【０００８】
ある実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートの修飾された大腸菌O121 O-抗原は、担体タンパク質のグリコシル化部位内のアスパラギン残基(Asn)に共有結合しており、ここで、該グリコシル化部位は、アミノ酸配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr(ここで、X及びZは、Pro以外の任意のアミノ酸であり得る)を含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートの担体タンパク質は、天然には(例えば、その正常/天然、又は「野生型」状態では)、グリコシル化部位を含まない。ある実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートの担体タンパク質は、1以上のグリコシル化部位を含むように改変されており、例えば、該担体タンパク質は、アミノ酸配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr(ここで、X及びZは、Pro以外の任意のアミノ酸であり得る)を含む1以上のグリコシル化部位を含むように改変されている。例えば、本明細書に記載の方法に従って使用される担体タンパク質は、アミノ酸配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr(ここで、X及びZは、Pro以外の任意のアミノ酸であり得る)を各々有する1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、又はそれより多くのグリコシル化部位を含んでいてもよく;ここで、該グリコシル化部位のうちのいくつか(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、もしくは9つ)又は全ては、該担体タンパク質に組換え技術によって導入されている。
【０００９】
本明細書に記載の方法(例えば、チフス菌感染の治療及び/又は予防)で使用するのに好適な任意の担体タンパク質を、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの作製に使用することができる。例示的な担体タンパク質としては、限定するものではないが、緑膿菌の外毒素A(EPA)、CRM197、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌(S. aureus)の解毒化された溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの解毒化された変異体、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、コレラ毒素、コレラ毒素の解毒化された変異体、大腸菌satタンパク質、大腸菌satタンパク質のパッセンジャードメイン、C.ジェジュニのAcrA、及びC.ジェジュニの天然糖タンパク質が挙げられる。
【００１０】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、担体タンパク質及び修飾された大腸菌O121 O-抗原を含むバイオコンジュゲートであり、ここで、該修飾された大腸菌O121 O-抗原は:
【化１】
2015529214.tif 000002
を含む。
【００１１】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、担体タンパク質及び修飾された大腸菌O121 O-抗原を含むバイオコンジュゲートであり、ここで、該修飾された大腸菌O121 O-抗原は:
【化２】
2015529214.tif 000003
を含む。
【００１２】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、担体タンパク質及び修飾された大腸菌O121 O-抗原を含むバイオコンジュゲートであり、ここで、該修飾された大腸菌O121 O-抗原は:
【化３】
2015529214.tif 000004
を含む。
【００１３】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、担体タンパク質及び修飾された大腸菌O121 O-抗原を含むバイオコンジュゲートであり、ここで、該修飾された大腸菌O121 O-抗原は:
【化４】
2015529214.tif 000005
を含む。
【００１４】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを産生することができる原核宿主細胞である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、バイオコンジュゲートを作製するのに有用な原核宿主細胞であり、ここで、該原核宿主細胞は:(i)アミノ酸配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr(ここで、X及びZは、Pro以外の任意の天然アミノ酸であり得る)を含む少なくとも1つのグリコシル化部位を含む担体タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列;並びに(ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含み;ここで、該原核宿主細胞は、Und-PP修飾された大腸菌O121 O-抗原(すなわち、本明細書に記載の修飾された大腸菌O121 O-抗原のいずれか)を産生するように組換え技術によって改変されており、該オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、該修飾された大腸菌O121 O-抗原を該グリコシル化部位のAsnに転移する。具体的な実施態様において、本明細書に記載の原核宿主細胞は、大腸菌宿主細胞である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の原核宿主細胞は、大腸菌株K12宿主細胞である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の宿主細胞、例えば、大腸菌宿主細胞内に組換え技術によって導入されるオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)のPglBである。
【００１５】
ある実施態様において、本明細書に記載の宿主細胞は、異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼに加えて、異種核酸配列(すなわち、その天然(natural)/天然(native)状態、例えば、その「野生型」状態の該宿主細胞とは通常関連していない核酸配列、例えば、遺伝子)を含む。そのような追加の異種核酸配列は、グリコシル化オペロン、例えば、原核生物グリコシル化オペロンに属することが知られている遺伝子をコードする核酸を含み得る。具体的な実施態様において、そのような追加の異種核酸配列は、カンピロバクター・ジェジュニのpglクラスターに属する遺伝子を含むか、又はカンピロバクター・ジェジュニのpglクラスター全体を含む。
【００１６】
ある実施態様において、本明細書に記載の宿主細胞は、1以上の遺伝子欠失及び/又は1以上の遺伝子不活化を含む、すなわち、該宿主細胞の遺伝的背景は、該宿主細胞と通常関連している遺伝子(例えば、1以上の「野生型」遺伝子)のうちの1つもしくは複数を不活性もしくは機能不全にするか、又は遺伝子を完全に取り除くように修飾されている。具体的な実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの作製に使用される宿主細胞は、wbqG遺伝子の突然変異又は欠失を有する大腸菌宿主細胞である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの作製に使用される宿主細胞は、wbqC遺伝子の突然変異又は欠失を有する大腸菌宿主細胞である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの作製に使用される宿主細胞は、wbqE遺伝子の突然変異又は欠失を有する大腸菌宿主細胞である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの作製に使用される宿主細胞は、wbqG遺伝子及びwbqC遺伝子の突然変異又は欠失を有する大腸菌宿主細胞である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの作製に使用される宿主細胞は、wbqG遺伝子及びwbqE遺伝子の突然変異又は欠失を有する大腸菌宿主細胞である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの作製に使用される宿主細胞は、wbqG遺伝子、wbqC遺伝子、及びwbqE遺伝子の突然変異又は欠失を有する大腸菌宿主細胞である。
【００１７】
ある実施態様において、大腸菌のO121遺伝子クラスター(例えば、大腸菌O121参考株CCUG 11422のO121遺伝子クラスター; Fratamicoらの文献、2003, J. Clin. Microbiol. 41(7):3379-3383に記載されているO121遺伝子クラスター)を本明細書に記載の宿主細胞内に導入する(例えば、組換え技術によって導入する)。ある実施態様において、該O121遺伝子クラスターを、O抗原を産生しない宿主細胞内に導入し、例えば、該宿主細胞は、それがO抗原を産生しないような形で修飾されている。ある実施態様において、該O121遺伝子クラスターの1以上の遺伝子を機能的に不活化する(例えば、欠失させる、該遺伝子を不活化するように突然変異させる、など)。具体的な実施態様において、本明細書に記載の宿主細胞内に導入されるO121遺伝子クラスターのwbqG遺伝子を機能的に不活化する(例えば、欠失させる)。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の宿主細胞内に導入されるO121遺伝子クラスターのwbqG遺伝子及び/又はwbqE遺伝子を機能的に不活化する(例えば、欠失させる)。具体的な実施態様において、そのような宿主細胞を用いて、修飾された大腸菌O121 O-抗原(すなわち、本明細書に記載の修飾された大腸菌O121 O-抗原のいずれか)を産生する。
【００１８】
ある実施態様において、上記の遺伝子欠失のうちの1つもしくは複数に加えて、又はその代わりに、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの作製に使用される宿主細胞は、以下の遺伝子:waaL(例えば、Feldmanらの文献、2005, PNAS USA 102:3016-3021参照)、脂質Aコア生合成クラスター、ガラクトースクラスター、アラビノースクラスター、コロン酸(colonic acid)クラスター、莢膜多糖クラスター、ウンデカプレノール-p生合成遺伝子、und-P再利用遺伝子、ヌクレオチド活性化糖生合成に関与する代謝酵素、腸内細菌一般抗原クラスター、及びgtrABSクラスターのようなプロファージO抗原修飾クラスターのうちの1つ又は複数の欠失/不活化を含む。
【００１９】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートを作製する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートを作製する方法は、本明細書に記載の宿主細胞をタンパク質の産生に好適な条件下で培養すること、及び該バイオコンジュゲートを単離することを含む。当業者は、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを宿主細胞によって産生させ、その後、単離することができるような宿主細胞の成長の維持に好適な条件を認識しているであろう。そのような方法は、本明細書に提供される作業実施例によってさらに包含される(第6節参照)。
【００２０】
また別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを含む組成物、例えば、免疫原性組成物である。ある実施態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、本明細書に記載のバイオコンジュゲート及び1以上のさらなる成分、例えば、アジュバントを含む。
【００２１】
さらなる態様において、本明細書に提供されるのは、サルモネラ・エンテリカの感染を治療又は予防する方法であって、サルモネラ・エンテリカに感染したか、又はサルモネラ・エンテリカに感染するリスクのある対象に、本明細書に記載のバイオコンジュゲート、又はその組成物(例えば、免疫原性組成物)を投与することを含む、方法である。具体的な実施態様において、該サルモネラ・エンテリカは、サルモネラ・エンテリカ亜種I血清型チフィ(チフス菌)である。
(3.1  慣例及び略語)
大腸菌O121  大腸菌血清型O121
PglB  細菌オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglB
Und-PP  ウンデカプレニルピロホスフェート
ELISA  酵素結合免疫吸着アッセイ
EPA  緑膿菌外毒素A
Vi  α-1,4-結合N-アセチルガラクトサミンウロン酸(D-GalNAcA)残基の莢膜多糖線状酸性ホモポリマー
viaB  Vi生合成遺伝子クラスター
ABC輸送体  ATP結合カセット
wzy  ポリメラーゼ遺伝子
大腸菌O121 wbqG  d-GalNAcANの代わりに2-アセトアミド-2-デオキシ-d-ガラクツロネート(d-GalNAcA)を含有する大腸菌O121 wbqG O抗原突然変異体
CPS  莢膜多糖
D-GalNAcAN  N-アセチルガラクトサミンウロンアミド
残基a  (1→3)-α-D-GlcNAc
残基b  (1→4)-α-D-GalNAcA
残基c  (1→4)-α-D-GalNAcAN(C-3で60％O-アセチル化されている)
残基c'  (1→4)-α-D-GalNAcA(C-3で30〜40％O-アセチル化されている)
残基d  (1→3)-β-D-Qui4NAcGly
LPS  リポ多糖
2AB  2-アミノベンズアミド
MS  質量分析
m/z  質量対電荷比
(CID) MS-MS  衝突誘起解離質量分析-質量分析
Da  ダルトン、質量の単位
kDa  キロダルトン
waaL  O抗原リガーゼ遺伝子
Und-PP  ウンデカプレニルピロホスフェート
Dol-PP  ドリコリルピロホスフェート
wzz  O抗原鎖長調節遺伝子
ECA  腸内細菌一般抗原
CWP  細胞壁多糖
ELISA  酵素結合免疫吸着アッセイ
A600  600nmでの光学密度
MES  MES泳動バッファー中で使用される2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸
TBAP  テトラブチルアンモニウムホスフェート
TFA  トリフルオロ酢酸
PEG  ポリエチレングリコール
CHCA  α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸
IPTG  イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド
CTAB  臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム
rpm  毎分回転数
BCA  ビシンコニン酸アッセイ
Vi-Tyr  チラミン化Vi多糖
HRP  西洋ワサビペルオキシダーゼ
TMB  3,3',5,5'-テトラメチベンジジン(tetramethybenzidine)
【図面の簡単な説明】
【００２２】
(4.図面の説明)
【図１】チフス菌Vi多糖、及び大腸菌O121 O抗原の反復単位の構造。O121 O抗原クラスターコード遺伝子wbqGの突然変異は、修飾されたO多糖構造の発現をもたらす。GalNAcA: 2-アセトアミド-2-デオキシ-D-ガラクツロン酸; GalNAcAN: 2-アセトアミド-2-デオキシ-D-ガラクツロンアミド; Qui4N: 4-アミノ-4,6-ジデオキシ-D-グルコース。
【００２３】
【図２】大腸菌O121及びそのwbqG突然変異体派生物のO多糖分析。(A) O121野生型O抗原遺伝子クラスターを発現する大腸菌W3110細胞又はそのwbqG突然変異体派生物由来のLPSをSDS-PAGEにより分離し、銀で染色したか、又はニトロセルロース膜に転写した後、抗O121及び抗Vi抗体で検出した。wbqGの突然変異は、抗Vi血清と反応する修飾されたO抗原の構築をもたらす。(B) Und-PP結合グリカンを、O121野生型O抗原遺伝子クラスターを発現する大腸菌SCM6細胞又はそのwbqG突然変異体派生物から抽出し、その後、2AB標識し、GlycoSep Nカラムを用いる順相HPLCにより分離した。個々のピーク画分を質量分析により分析した。同定されたグリカン構造を示す。■: N-アセチルヘキソサミン;
【化５】
2015529214.tif 000006
◇:ヘキスロン酸; ◇N:ヘキスロンアミド; Ac:アセチル; NAc: N-アセチル。
【００２４】
【図３】順相HPLCにより分離されたグリカン種のCID MS-MSスペクトル。CID MS-MSスペクトルは、図2Bに見られる、以下の保持時間:(A)58.8分、(B)65.1分、(C)67.2分、及び(D)73.5分を有する個々のピーク画分中に同定されたグリカン種に対応する。
【００２５】
【図４】細菌のN-グリコシル化系を用いた複合糖質の産生。細菌オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglB、改変された担体タンパク質EPA、及び抗原性多糖(大腸菌O121、大腸菌O121 wbqG突然変異体、志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)O1)の合成を推進する遺伝子を共発現させることにより、複合糖質を大腸菌CLM24で産生させた。精製複合糖質を、SDS-PAGE、次いで、クマシーブルー染色、又はニトロセルロース膜への転写後の抗EPA、抗O121、及び抗Vi抗体を用いるウェスタンブロットにより解析した。
【００２６】
【図５】複合糖質を用いた免疫研究。マウスの群を、水酸化アルミニウムの存在下、精製複合糖質で免疫した。対照群を精製Vi多糖で免疫した。(A)67日目に回収された血清の抗O121全免疫グロブリン力価。(B)67日目に回収された血清の抗Vi抗体力価。データは、個別(●)及び平均(-)力価として表されている。O121wbqG-EPAコンジュゲートで免疫した1匹の動物は、O121-LPS特異的抗体応答を生じさせなかったが、同じ動物は、抗Vi抗体力価の有意な上昇を示した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
(5.詳細な説明)
一態様において、本明細書に提供されるのは、担体タンパク質及び修飾された大腸菌O121 O-抗原を含むバイオコンジュゲートである。
【００２８】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを産生することができる原核宿主細胞である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、バイオコンジュゲートを作製するのに有用な原核宿主細胞であり、ここで、該原核宿主細胞は:(i)アミノ酸配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr(ここで、X及びZは、Pro以外の任意の天然アミノ酸であり得る)を含む少なくとも1つのグリコシル化部位を含む担体タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列;並びに(ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含み;ここで、該原核宿主細胞は、Und-PP修飾された大腸菌O121 O-抗原(すなわち、本明細書に記載の修飾された大腸菌O121 O-抗原のいずれか)を産生するように組換え技術によって改変されており、ここで、該オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、該修飾された大腸菌O121 O-抗原を該グリコシル化部位のAsnに転移する。
【００２９】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートを作製する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートを作製する方法は、本明細書に記載の宿主細胞をタンパク質の産生に好適な条件下で培養すること、及び該バイオコンジュゲートを単離することを含む。
【００３０】
また別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを含む組成物、例えば、免疫原性組成物である。さらなる態様において、本明細書に提供されるのは、サルモネラ・エンテリカの感染を治療又は予防する方法であって、サルモネラ・エンテリカに感染したか、又はサルモネラ・エンテリカに感染するリスクのある対象に、本明細書に記載のバイオコンジュゲート、又はその組成物(例えば、免疫原性組成物)を投与することを含む、方法である。具体的な実施態様において、該サルモネラ・エンテリカは、サルモネラ・エンテリカ亜種I血清型チフィ(チフス菌)である。
【００３１】
(5.1  宿主細胞)
任意の宿主細胞を用いて、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを産生することができる。具体的な実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを産生するために使用される宿主細胞は、原核宿主細胞である。例示的な原核宿主細胞としては、限定するものではないが、エシェリキア属(Escherichia)の種、シゲラ属(Shigella)の種、クレブシエラ属(Klebsiella)の種、キサントモナス属(Xhantomonas)の種、サルモネラ属(Salmonella)の種、エルシニア属(Yersinia)の種、ラクトコッカス属(Lactococcus)の種、ラクトバチルス属(Lactobacillus)の種、シュードモナス属(Pseudomonas)の種、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種、ストレプトマイセス属(Streptomyces)の種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)の種、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)の種、バチルス属(Bacillus)の種、及びクロストリジウム属(Clostridium)の種が挙げられる。具体的な実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを産生するために使用される宿主細胞は、大腸菌(E. coli)宿主細胞(例えば、大腸菌株K12又はCLM 24及びそれらの派生物)である。
【００３２】
ある実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを産生するために使用される宿主細胞を、異種核酸、例えば、1以上の担体タンパク質をコードする異種核酸(例えば、第5.2節参照)及び/又は1以上のタンパク質をコードする異種核酸、例えば、1以上のタンパク質をコードする遺伝子(例えば、第5.1.1節参照)を含むように改変する。具体的な実施態様において、グリコシル化経路(例えば、原核生物及び/又は真核生物グリコシル化経路)に関与するタンパク質をコードする異種核酸を本明細書に記載の宿主細胞内に導入してもよい。そのような核酸は、限定するものではないが、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ及び/又はグリコシルトランスフェラーゼを含むタンパク質をコードし得る。異種核酸(例えば、担体タンパク質をコードする核酸及び/又は他のタンパク質、例えば、グリコシル化に関与するタンパク質をコードする核酸)を、当業者に公知の任意の方法、例えば、電気穿孔、熱ショックによる化学的形質転換、自然形質転換、ファージ形質導入、及びコンジュゲーションを用いて、本明細書に記載の宿主細胞内に導入することができる。具体的な実施態様において、異種核酸を、プラスミドを用いて、本明細書に記載の宿主細胞内に導入し、例えば、異種核酸を、プラスミド(例えば、発現ベクター)によって、宿主細胞内で発現させる。
【００３３】
ある実施態様において、さらなる修飾を(例えば、組換え技術を用いて)本明細書に記載の宿主細胞に導入してもよい。例えば、競合又は干渉する可能性のあるグリコシル化経路の一部を形成する(例えば、宿主細胞内に組換え技術によって導入されるグリコシル化に関与する1以上の異種遺伝子と競合するか又は該異種遺伝子に干渉する)タンパク質をコードする宿主細胞核酸(例えば、遺伝子)を、それらを不活性/機能不全にするように、宿主細胞バックグラウンド(ゲノム)中で欠失させるか、又は修飾することができる(すなわち、欠失させられる/修飾される宿主細胞核酸は、機能的タンパク質をコードしない、又はいかなるタンパク質もコードしない)。ある実施態様において、核酸を本明細書に提供される宿主細胞のゲノムから欠失させる場合、それらを望ましい配列、例えば、糖タンパク質産生に有用である配列に置き換える。宿主細胞内で欠失させる(及び場合により、他の所望の核酸配列と置き換える)ことができる例示的な遺伝子としては、糖脂質生合成に関与する宿主細胞の遺伝子、例えば、waaL(例えば、Feldmanらの文献、2005、PNAS USA 102:3016-3021参照)、脂質Aコア生合成クラスター、ガラクトースクラスター、アラビノースクラスター、コロン酸クラスター、莢膜多糖クラスター、ウンデカプレノール-p生合成遺伝子、und-P再利用遺伝子、ヌクレオチド活性化糖生合成に関与する代謝酵素、腸内細菌一般抗原クラスター、及びgtrABSクラスターのようなプロファージO抗原修飾クラスターが挙げられる。具体的な実施態様において、本明細書に記載の宿主細胞を、それらが、本明細書に記載の修飾された大腸菌O121 O-抗原以外のO抗原を産生しないように修飾する(例えば、本明細書に記載の修飾された大腸菌O121 O-抗原以外のO抗原を産生する宿主細胞装置を欠失させる/不活化する)。
【００３４】
具体的な実施態様において、本明細書に記載の宿主細胞のゲノムを、本明細書に記載のバイオコンジュゲートと関連するようになる抗原の産生に関与する1以上の遺伝子が、該宿主細胞によってもはや産生されなくなるように修飾することができる。例えば、通常の状況下であれば、本明細書に記載のバイオコンジュゲートと関連するであろう抗原性側鎖の産生に関与する1以上の遺伝子を欠失させることができる。任意の特定の作動理論に束縛されることを意図するものではないが、本明細書に記載の修飾された大腸菌O121 O-抗原(例えば、抗原性側鎖)以外の、本明細書に記載のバイオコンジュゲートと関連するようになる抗原の産生に関与する遺伝子をコードする核酸の不活化/欠失は、本明細書に記載の修飾された大腸菌O121 O-抗原に対する特異的免疫応答を増大させ/増強し、それにより、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの抗原性を増大させると考えられる。具体的な実施態様において、本明細書に記載の宿主細胞は、AcGly側鎖(すなわち、図1の残基d)の不活化/欠失をもたらす、突然変異した/欠失した/不活化されたwbqC遺伝子を保有する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の宿主細胞は、突然変異した/欠失した/不活化されたwbqE遺伝子を保有する。
【００３５】
具体的な実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの作製に使用される宿主細胞は、wbqG遺伝子の突然変異又は欠失を有する大腸菌宿主細胞である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの作製に使用される宿主細胞は、wbqC遺伝子の突然変異又は欠失を有する大腸菌宿主細胞である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの作製に使用される宿主細胞は、wbqE遺伝子の突然変異又は欠失を有する大腸菌宿主細胞である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの作製に使用される宿主細胞は、wbqG遺伝子及びwbqC遺伝子の突然変異又は欠失を有する大腸菌宿主細胞である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの作製に使用される宿主細胞は、wbqG遺伝子及びwbqE遺伝子の突然変異又は欠失を有する大腸菌宿主細胞である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの作製に使用される宿主細胞は、wbqG遺伝子、wbqC遺伝子、及びwbqE遺伝子の突然変異又は欠失を有する大腸菌宿主細胞である。そのような宿主細胞は、本明細書に記載の修飾のいずれかをさらに含むことができ、例えば、該宿主細胞は、担体タンパク質をコードし、及び/もしくはタンパク質グリコシル化に関与する1以上の遺伝子(例えば、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ)をコードする異種核酸を含み、並びに/又は該宿主細胞は、遺伝子欠失/不活化(例えば、waaLの欠失)をさらに含み得る。
【００３６】
ある実施態様において、大腸菌のO121遺伝子クラスター(例えば、大腸菌O121参考株CCUG 11422のO121遺伝子クラスター; Fratamicoらの文献、2003, J. Clin. Microbiol. 41(7):3379-3383に記載されているO121遺伝子クラスター)を本明細書に記載の宿主細胞内に導入する(例えば、組換え技術によって導入する)。ある実施態様において、該O121遺伝子クラスターを、O抗原を産生しない宿主細胞内に導入し、例えば、該宿主細胞は、それがO抗原を産生しないような形で修飾されている。ある実施態様において、該O121遺伝子クラスターの1以上の遺伝子を機能的に不活化する(例えば、欠失させる、該遺伝子を不活化するように突然変異させる、など)。具体的な実施態様において、本明細書に記載の宿主細胞内に導入されるO121遺伝子クラスターのwbqG遺伝子を機能的に不活化する(例えば、欠失させる)。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の宿主細胞内に導入されるO121遺伝子クラスターのwbqG遺伝子及び/又はwbqE遺伝子を機能的に不活化する(例えば、欠失させる)。具体的な実施態様において、そのような宿主細胞を用いて、修飾された大腸菌O121 O-抗原(すなわち、本明細書に記載の修飾された大腸菌O121 O-抗原のいずれか)を産生させる。
【００３７】
(5.1.1  グリコシル化装置)
ある実施態様において、本明細書に提供される宿主細胞を修飾して、該宿主細胞が、本明細書に記載の修飾された大腸菌O121 O-抗原を産生することができるようなグリコシル化装置を発現させる。さらにより具体的な実施態様において、該宿主細胞のグリコシル化装置を改変して、UndPP結合型の修飾された大腸菌O121 O-抗原を産生させる。
【００３８】
理論によって束縛されるものではないが、UndPP結合型の修飾された大腸菌O121 O-抗原は、その後、宿主細胞の細胞質から宿主細胞のペリプラズム空間へと反転する。さらに、理論によって束縛されるものではないが、該修飾された大腸菌O121 O-抗原は、その後、担体タンパク質上のUndPPから担体タンパク質のグリコシル化部位のAsnに転移される。
【００３９】
ある実施態様において、修飾された大腸菌O121 O-抗原をUndPP上に生成させるように、グリコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を宿主細胞内に導入する(例えば、組換え手法を用いて導入する)。当業者は、任意の好適な異種グリコシルトランスフェラーゼを本明細書に記載の方法に従って使用することができることを容易に認識するであろう。具体的な実施態様において、C.ジェジュニ由来のグリコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を宿主細胞内に導入する。
【００４０】
ある実施態様において、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を本明細書に記載の宿主細胞内に導入する。当業者は、任意の好適な異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼを本明細書に記載の方法に従って使用することができることを容易に認識するであろう。具体的な実施態様において、C.ジェジュニ由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を該宿主細胞内に導入する。別の具体的な実施態様において、C.ジェジュニ由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglbを本明細書に記載の宿主細胞内に導入する。
【００４１】
あるより具体的な実施態様において、異種グリコシル化オペロンを本明細書に記載の宿主細胞内に導入する。ある実施態様において、異種グリコシル化オペロンは、1以上の突然変異を保有する、すなわち、該オペロン中の遺伝子のうちの1つ又は複数は、遺伝子を不活化し/欠失させるように突然変異させられている。具体的な実施態様において、C.ジェジュニ由来のグリコシル化オペロンをコードする異種核酸を該宿主細胞内に導入する。
【００４２】
(5.2  担体タンパク質)
バイオコンジュゲートの産生において使用するのに好適な任意の担体タンパク質を本明細書で使用することができる。例示的な担体タンパク質としては、限定するものではないが、緑膿菌の外毒素A(EPA)、CRM197、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の解毒化された溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの解毒化された変異体、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、コレラ毒素、コレラ毒素の解毒化された変異体、大腸菌satタンパク質、大腸菌satタンパク質のパッセンジャードメイン、C.ジェジュニのAcrA、及びC.ジェジュニの天然糖タンパク質が挙げられる。
【００４３】
ある実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの作製に使用される担体タンパク質を修飾し、例えば、該タンパク質がより低毒性となり、及び又はグリコシル化をより受けやすくなる、などのように修飾する。具体的な実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの作製に使用される担体タンパク質を、該担体タンパク質中のグリコシル化部位の数が、より低濃度のタンパク質を、例えば、免疫原性組成物中、そのバイオコンジュゲート形態で投与することを可能にする形で最大化されるように修飾する。したがって、ある実施態様において、本明細書に記載の担体タンパク質を、(例えば、その天然(native)/天然(natural)、例えば、「野生型」状態の該担体タンパク質と関連するグリコシル化部位の数と比べて)、該担体タンパク質と通常関連する1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、又はそれよりも多くのグリコシル化部位を含むように修飾する。具体的な実施態様において、グリコシル化部位の導入を、タンパク質の一次構造中のどこかにグリコシル化コンセンサス配列を挿入することによって達成する。そのようなグリコシル化部位の導入は、例えば、新たなアミノ酸をタンパク質の一次構造に付加する(すなわち、グリコシル化部位を全てもしくは一部付加する)ことによって、又はグリコシル化部位を生成させるために、タンパク質中の既存のアミノ酸を突然変異させる(すなわち、アミノ酸をタンパク質に付加するのではなく、グリコシル化部位を形成させるように、タンパク質の選択されたアミノ酸を突然変異させる)ことによって達成することができる。当業者は、タンパク質をコードする核酸配列の修飾を含む当技術分野で公知の手法、例えば、組換え手法を用いて、タンパク質のアミノ酸配列を容易に修飾することができることを認識するであろう。具体的な実施態様において、グリコシル化コンセンサス配列を、担体タンパク質の特定の領域、例えば、タンパク質の表面構造、タンパク質のNもしくはC末端、及び/又はタンパク質の基部のジスルフィド架橋によって安定化されるループに導入する。ある実施態様において、さらに効率の良いグリコシル化のために、古典的な5アミノ酸のグリコシル化コンセンサス配列をリジン残基によって伸長させてもよく、したがって、挿入されたコンセンサス配列は、挿入されるべき、又はアクセプタータンパク質アミノ酸に代わる、5、6、又は7個のアミノ酸をコードし得る。
【００４４】
ある実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの作製に使用される担体タンパク質は、「タグ」、すなわち、担体タンパク質の単離及び/又は同定を可能にするアミノ酸の配列を含む。例えば、タグを本明細書に記載の担体タンパク質に付加することは、そのタンパク質の精製、それゆえ、タグ化担体タンパク質を含むバイオコンジュゲートの精製において有用であり得る。本明細書で使用することができる例示的なタグとしては、限定するものではないが、ヒスチジン(HIS)タグ(例えば、ヘキサヒスチジン-タグ、又は6×His-タグ)、FLAG-タグ、及びHAタグが挙げられる。ある実施態様において、本明細書で使用されるタグは、例えば、それらがもはや必要なくなった場合、例えば、タンパク質が精製された後、化学的薬剤によるか又は酵素的手段による除去によって除去可能である。
【００４５】
(5.3  修飾された大腸菌O121 O-抗原)
本明細書に記載のバイオコンジュゲートは、修飾された大腸菌O121 O-抗原を含み、その場合、本明細書に記載の方法を用いた該抗原の修飾(例えば、wbqG遺伝子の欠失)の結果として、該修飾された大腸菌O121 O-抗原は、サルモネラ・エンテリカVi多糖、特に、サルモネラ・エンテリカ亜種I血清型チフィ(チフス菌)Vi多糖との構造的類似性を含有する。理論によって束縛されることを意図するものではないが、本明細書に提供される修飾された大腸菌O121 O-抗原とサルモネラ・エンテリカVi多糖との類似性のために、そのような修飾された大腸菌O121 O-抗原は、特に、該修飾された大腸菌O121 O-抗原をバイオコンジュゲートとして投与する場合、対象(例えば、ヒト対象)のサルモネラ・エンテリカによる感染を治療及び/又は予防する方法で使用するのに好適である。当業者は、本発明者らの発見に基づいて、任意の修飾された大腸菌O121 O-抗原が、本明細書に記載の方法に従って使用するのに好適であり、該修飾された大腸菌O121 O-抗原が、サルモネラ・エンテリカVi多糖、例えば、サルモネラ・エンテリカ亜種I血清型チフィ(チフス菌)Vi多糖との類似性を維持する限り、該抗原を本明細書に記載のバイオコンジュゲートの作製に使用することができることを認識するであろう。
【００４６】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、修飾された大腸菌O121 O-抗原であり、ここで、該修飾された大腸菌O121 O-抗原は、以下の構造:
【化６】
2015529214.tif 000007
を含む。
【００４７】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、修飾された大腸菌O121 O-抗原であり、ここで、該修飾された大腸菌O121 O-抗原は、以下の構造:
【化７】
2015529214.tif 000008
を含む。
【００４８】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、修飾された大腸菌O121 O-抗原であり、ここで、該修飾された大腸菌O121 O-抗原は、以下の構造:
【化８】
2015529214.tif 000009
を含む。
【００４９】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、修飾された大腸菌O121 O-抗原であり、ここで、該修飾された大腸菌O121 O-抗原は、以下の構造:
【化９】
2015529214.tif 000010
を含む。
【００５０】
(5.4  バイオコンジュゲート)
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の宿主細胞によって産生されるバイオコンジュゲートであり、ここで、該バイオコンジュゲートは、担体タンパク質及び修飾された大腸菌O121 O-抗原を含む。本明細書で言及されるように、バイオコンジュゲートは、担体タンパク質及び修飾された大腸菌O121 O-抗原を含み、ここで、該修飾された大腸菌O121 O-抗原は、担体タンパク質のアスパラギン(ASN)残基に共有結合されている(例えば、担体タンパク質のグリコシル化部位で結合している)。
【００５１】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、担体タンパク質及び修飾された大腸菌O121 O-抗原を含むバイオコンジュゲートであり、ここで、該修飾された大腸菌O121 O-抗原は:
【化１０】
2015529214.tif 000011
を含む。
【００５２】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、担体タンパク質及び修飾された大腸菌O121 O-抗原を含むバイオコンジュゲートであり、ここで、該修飾された大腸菌O121 O-抗原は:
【化１１】
2015529214.tif 000012
を含む。
【００５３】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、担体タンパク質及び修飾された大腸菌O121 O-抗原を含むバイオコンジュゲートであり、ここで、該修飾された大腸菌O121 O-抗原は:
【化１２】
2015529214.tif 000013
を含む。
【００５４】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、担体タンパク質及び修飾された大腸菌O121 O-抗原を含むバイオコンジュゲートであり、ここで、該修飾された大腸菌O121 O-抗原は:
【化１３】
2015529214.tif 000014
を含む。
【００５５】
ある実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートを単離する、すなわち、該バイオコンジュゲートを、当技術分野で公知の及び/又は本明細書に記載のバイオコンジュゲートの産生方法を用いて本明細書に記載の宿主細胞によって産生させ、産生されたバイオコンジュゲートを単離及び/又は精製する。ある実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％純粋であり、例えば、他の夾雑物などを含まない。
【００５６】
ある実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートは、担体タンパク質のグリコシル化部位に付着した修飾された大腸菌O121 O-抗原に関して均質であり、例えば、該バイオコンジュゲートは、担体タンパク質の全てのグリコシル化部位で同じ修飾された大腸菌O121 O-抗原を発現する。
【００５７】
ある実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートは、担体タンパク質のグリコシル化部位に付着した修飾された大腸菌O121 O-抗原に関して均質ではなく、例えば、該バイオコンジュゲートは、担体タンパク質のグリコシル化部位で異なる修飾された大腸菌O121 O-抗原を発現する。
【００５８】
ある実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートは、2以上のグリコシル化部位を保有し、ここで、担体タンパク質の各々のグリコシル化部位がグリコシル化されている(すなわち、担体タンパク質のグリコシル化部位の100％がグリコシル化されている)、すなわち、修飾された大腸菌O121 O-抗原が各々のグリコシル化部位に付着している。ある実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートは、2以上のグリコシル化部位を保有し、ここで、担体タンパク質のグリコシル化部位の全てがグリコシル化されているわけではなく、例えば、担体タンパク質のグリコシル化部位の約又は少なくとも10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、又は95％がグリコシル化されているが、担体タンパク質のグリコシル化部位の全てがグリコシル化されているわけではない(すなわち、修飾された大腸菌O121 O-抗原が各々のグリコシル化部位に付着しているというわけではない)。ある実施態様において、グリコシル化されている担体タンパク質のグリコシル化部位の全てが、同じ修飾された大腸菌O121 O-抗原を含む(すなわち、同じ修飾された大腸菌O121 O-抗原で修飾されている)。
【００５９】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、バイオコンジュゲートの集団である。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、バイオコンジュゲートの集団であり、ここで、該集団内のバイオコンジュゲートの担体タンパク質中の第一のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、又は100％がグリコシル化されている。具体的な実施態様において、各々のバイオコンジュゲートの第一のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、又は100％が、該集団内の他のバイオコンジュゲートと同じ修飾された大腸菌O121 O-抗原でグリコシル化されている(すなわち、全てのバイオコンジュゲートが、担体タンパク質の第一のグリコシル化部位で同じ修飾された大腸菌O121 O-抗原を有する)。ある実施態様において、該集団内のバイオコンジュゲートの担体タンパク質中の第二のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、又は100％がグリコシル化されている。具体的な実施態様において、各々のバイオコンジュゲートの第二のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、又は100％が、該集団内の他のバイオコンジュゲートと同じ修飾された大腸菌O121 O-抗原でグリコシル化されている(すなわち、全てのバイオコンジュゲートが、担体タンパク質の第二のグリコシル化部位で同じ修飾された大腸菌O121 O-抗原を有する)。ある実施態様において、該集団内のバイオコンジュゲートの担体タンパク質中の第三のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、又は100％がグリコシル化されている。具体的な実施態様において、各々のバイオコンジュゲートの第三のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、又は100％が、該集団内の他のバイオコンジュゲートと同じ修飾された大腸菌O121 O-抗原でグリコシル化されている(すなわち、全てのバイオコンジュゲートが、担体タンパク質の第三のグリコシル化部位で同じ修飾された大腸菌O121 O-抗原を有する)。ある実施態様において、該集団内のバイオコンジュゲートの担体タンパク質中の第四のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、又は100％がグリコシル化されている。具体的な実施態様において、各々のバイオコンジュゲートの第四のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、又は100％が、該集団内の他のバイオコンジュゲートと同じ修飾された大腸菌O121 O-抗原でグリコシル化されている(すなわち、全てのバイオコンジュゲートが、担体タンパク質の第四のグリコシル化部位で同じ修飾された大腸菌O121 O-抗原を有する)。ある実施態様において、該集団内のバイオコンジュゲートの担体タンパク質中の第五のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、又は100％がグリコシル化されている。具体的な実施態様において、各々のバイオコンジュゲートの第五のグリコシル化部位の少なくとも50％、55���、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、又は100％が、該集団内の他のバイオコンジュゲートと同じ修飾された大腸菌O121 O-抗原でグリコシル化されている(すなわち、全てのバイオコンジュゲートが、担体タンパク質の第五のグリコシル化部位で同じ修飾された大腸菌O121 O-抗原を有する)。
【００６０】
(5.5  組成物)
(5.5.1  宿主細胞を含む組成物)
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の宿主細胞を含む組成物である。そのような組成物を、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを作製する方法で使用することができ、例えば、該組成物を、タンパク質の産生に好適な条件下で培養することができる。その後、該バイオコンジュゲートを該組成物から単離することができる。
【００６１】
本明細書に提供される宿主細胞を含む組成物は、本明細書に記載の宿主細胞の維持及び生存に好適な追加の成分を含むことができ、宿主細胞によるタンパク質の産生に必要な又は有益な追加の成分、例えば、誘導性プロモーター用の誘導物質、例えば、アラビノース、IPTGをさらに含むことができる。
【００６２】
(5.5.2  バイオコンジュゲートを含む組成物)
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを含む組成物である。そのような組成物を、疾患の治療及び予防方法で使用することができる。具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物を、サルモネラ・エンテリカに感染した対象(例えば、ヒト対象)の治療に使用する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物を、サルモネラ・エンテリカ亜種I血清型チフィ(チフス菌)に感染した対象(例えば、ヒト対象)の予防治療に使用する。
【００６３】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のバイオコンジュゲートのうちの1つ又は複数を含む免疫原性組成物である。本明細書に提供される免疫原性組成物を、該組成物が投与される宿主内の免疫応答を誘発するために使用することができる。したがって、本明細書に記載の免疫原性組成物をワクチンとして使用することができ、したがって、医薬組成物として製剤化することができる。具体的な実施態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物を、サルモネラ・エンテリカによる対象(例えば、ヒト対象)の感染の予防に使用する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物を、サルモネラ・エンテリカ亜種I血清型チフィ(チフス菌)による対象(例えば、ヒト対象)の感染の予防に使用する。
【００６４】
本明細書に記載のバイオコンジュゲートを含む組成物は、医薬投与で使用するのに好適な任意の追加の成分を含み得る。具体的な実施態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、一価製剤である。他の実施態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、多価製剤である。例えば、多価製剤は、本明細書に記載の複数のバイオコンジュゲートを含む。
【００６５】
ある実施態様において、本明細書に記載の組成物は、防腐剤、例えば、水銀誘導体のチメロサールをさらに含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、0.001％〜0.01％のチメロサールを含む。他の実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、防腐剤を含まない。
【００６６】
ある実施態様において、本明細書に記載の組成物(例えば、免疫原性組成物)は、アジュバントを含むか、又はアジュバントと組み合わせて投与される。本明細書に記載の組成物と組み合わせて投与するためのアジュバントは、該組成物の投与の前に、その投与と同時に、又はその投与の後に投与し得る。いくつかの実施態様において、「アジュバント」という用語は、本明細書に記載の組成物とともに又はその一部として投与した場合には、バイオコンジュゲートに対する免疫応答を強化、増強、及び/又はブーストするが、該化合物を単独で投与した場合には、バイオコンジュゲートに対する免疫応答を生じさせない化合物を指す。いくつかの実施態様において、アジュバントは、ポリバイオコンジュゲートペプチドに対する免疫応答を生じさせ、アレルギー又は他の有害反応を生じさせない。アジュバントは、例えば、リンパ球動員、B及び/又はT細胞の刺激、並びにマクロファージの刺激を含むいくつかのメカニズムによって、免疫応答を増強することができる。アジュバントの具体的な例としては、アルミニウム塩(ミョウバン)(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及び硫酸アルミニウム)、3 De-O-アセチル化モノホスホリル脂質A(MPL)(GB 2220211号参照)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、ポリソルベート80(Tween 80; ICL Americas社)、イミダゾピリジン化合物(国際公開WO2007/109812として刊行された国際出願PCT/US2007/064857号参照)、イミダゾキノキサリン化合物(国際公開WO2007/109813号として刊行された国際出願PCT/US2007/064858号参照)、及びサポニン、例えば、QS21(ワクチン設計:サブユニット及びアジュバントアプローチ(Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach)(Powell & Newman編、Plenum Press, NY, 1995)中のKensilらの文献;米国特許第5,057,540号参照)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、該アジュバントは、フロイントアジュバント(完全又は不完全)である。他のアジュバントは、任意にモノホスホリル脂質Aなどの免疫刺激剤と組み合わせた、水中油型エマルジョン(例えば、スクアレン又はピーナツ油)である(Stouteらの文献、N. Engl. J. Med. 336, 86-91(1997)を参照されたい)。別のアジュバントは、CpGである(Bioworld Today, Nov. 15, 1998)。
【００６７】
(5.6  使用)
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象における感染を治療する方法であって、該対象に、本明細書に記載のバイオコンジュゲート又はその組成物を投与することを含む、方法である。具体的な実施態様において、本明細書に記載の感染を治療する方法は、それを必要としている対象に、本明細書に記載のバイオコンジュゲート又はその組成物の有効量を投与することを含む。
【００６８】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象における免疫応答を誘導する方法であって、該対象に、本明細書に記載のバイオコンジュゲート又はその組成物を投与することを含む、方法である。具体的な実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要としている対象に、本明細書に記載のバイオコンジュゲート又はその組成物の有効量を投与することを含む。
【００６９】
具体的な実施態様において、バイオコンジュゲート又はその組成物が投与される対象は、感染、例えば、細菌感染を有するか、又はそれに罹りやすい。別の具体的な実施態様において、バイオコンジュゲート又はその組成物が投与される対象は、サルモネラ・エンテリカに感染しているか、又はそれに感染しやすい。別の具体的な実施態様において、バイオコンジュゲート又はその組成物が投与される対象は、サルモネラ・エンテリカ亜種I血清型チフィに感染しているか、又はそれに感染しやすい。
【００７０】
別の実施態様において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを用いて、例えば、診断及び研究目的で使用するための抗体を作製することができ、例えば、そのような抗体は、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを含む免疫原性組成物、又はサルモネラ・エンテリカ感染の治療において使用される任意の他の組成物の投与が、サルモネラ・エンテリカを死滅させるか又は中和するのに十分な宿主免疫応答をもたらすかどうかを決定する際に有用である(例えば、そのような抗体を血清殺菌アッセイで使用することができる)。
【００７１】
(5.7  アッセイ)
(5.7.1  免疫応答を誘導するバイオコンジュゲートの能力を評価するためのアッセイ)
S.エンテリカのVi多糖と交差反応することができる対象における免疫応答を生じさせる本明細書に記載のバイオコンジュゲートの能力を、当業者に公知の又は本明細書に記載の任意の手法を用いて評価することができる。いくつかの実施態様において、S.エンテリカのVi多糖と交差反応することができる対象における免疫応答を生じさせるバイオコンジュゲートの能力を、対象(例えば、マウス)又は対象の組を本明細書に記載のバイオコンジュゲートで免疫し、さらなる対象(例えば、マウス)又は対象の組を対照(PBS)で免疫することによって評価することができる。そのような対象は、疾患の動物モデル、例えば、腸チフスの動物モデルとなることができる(例えば、Libbyらの文献、2010, PNAS USA 107(35):15589-15594を参照されたい)。その後、該対象又は対象の組に病原性S.エンテリカを投与することができ、該病原性S.エンテリカが該対象又は対象の組で疾患(例えば、腸チフス)を引き起こす能力を決定することができる。当業者は、対照で免疫された対象又は対象の組がS.エンテリカの投与後に疾患(例えば、腸チフス)に罹るが、本明細書に記載のバイオコンジュゲートで免疫された対象又は対象の組が疾患に罹患しない場合、該バイオコンジュゲートは、S.エンテリカのVi多糖と交差反応することができる対象における免疫応答を生じさせることができることを認識するであろう。S.エンテリカのVi多糖と交差反応する抗血清を誘導する本明細書に記載のバイオコンジュゲートの能力を、例えば、免疫アッセイ、例えば、ELISAによって試験することができる。
【００７２】
(5.7.2  血清殺菌アッセイ)
S.エンテリカのVi多糖と交差反応することができる対象における免疫応答を生じさせる本明細書に記載のバイオコンジュゲートの能力を、血清殺菌アッセイ(SBA)を用いて評価することができる。そのようなアッセイは当技術分野で周知であり、簡潔に述べると、対象(例えば、マウス)に、そのような抗体を誘発する化合物を投与することによって、関心対象の標的(例えば、S.エンテリカのVi多糖)に対する抗体を生成させ、及び単離する工程を含む。その後、該抗体の殺菌能力を、例えば、当該細菌(例えば、S.エンテリカ)を該抗体及び補体の存在下で培養し、該細菌を死滅させ及び/又は中和する該抗体の能力を、例えば、標準的な微生物学的手法を用いてアッセイすることによって評価することができる。
【実施例】
【００７３】
(6.実施例)
この実施例は、修飾された大腸菌O121 O-抗原を首尾良く開発することができること、及びそのような抗原を含むバイオコンジュゲートの投与が、サルモネラ・エンテリカのVi多糖と交差反応する抗体の産生をマウスで誘発することができることを示す。
【００７４】
(6.1  材料及び方法)
((a)細菌株、プラスミド、及び培養条件)
この実施例に記載される細菌株及びプラスミドを表1に掲載する。該プラスミドの構築を以下に記載する。大腸菌株を、LB培地(1リットル当たり、10gのトリプトン、5gの酵母抽出物、及び5gのNaCl)又はLB寒天(1リットル当たり15gの寒天を添加したLB培地)中、37℃で成長させた。チフス菌BRD948を、1％v/v Aro-ミックス(10mlのddH2O中、40mgのL-フェニルアラニン、40mgのL-トリプトファン、10mgの4-アミノ安息香酸、及び10mgの2,3-ジヒドロキシ安息香酸)並びに1％v/v Tyr-ミックス(10mlのddH2O中、40mgのL-チロシン二ナトリウム塩)を補充したLB培地中、37℃で培養した。適切な場合、培地は、テトラサイクリン(20μg ml-1)、スペクチノマイシン(80μg ml-1)、又はアンピシリン(100μg ml-1)を含んでいた。
【表１】
2015529214.tif 000015
【００７５】
((b)DNA操作)
プラスミドDNAを、NucleoSpin Plasmid又はNucleoBond Xtra Maxi Plusキット(Macherey-Nagel)を用いて単離した。全染色体DNAを、NucleoSpin Tissueキット(Macherey-Nagel)を用いて単離した。制限酵素(Fermentas)、エビアルカリホスファターゼ(Fermentas)、T4 DNAリガーゼ(Fermentas)、及びPhusion High-Fidelity DNAポリメラーゼ(Finnzyme)を製造業者の指示に従って用いた。PCR断片及び制限断片を、クローニング用に、NucleoSpin Extract IIキット(Macherey-Nagel)を用いて精製した。DNAシークエンシングは全て、Synergene Biotech GmbH(Switzerland)により達成され、合成オリゴヌクレオチドは、Microsynth AG(Switzerland)に発注された。
【００７６】
((c)プラスミド構築)
プラスミド1は、
【化１４】
2015529214.tif 000016
と
【化１５】
2015529214.tif 000017
のアニーリングから形成され、EcoRIで消化したPLAFR1[Friedman, A.M., Long, S.R., Brown, S.E., Buikema, W.J., Ausubel, F.M.の文献:広域宿主範囲のコスミドクローニングベクターの構築及び根粒菌突然変異体の遺伝子解析におけるその使用(Construction of a broad host range cosmid cloning vector and its use in the genetic analysis of Rhizobium mutants.)、Gene 18(3), 289-296(1982)]に連結され、それにより、ユニークなAscI及びSpeI単一制限部位を導入する、合成オリゴヌクレオチドカセットを含む。大腸菌O121 O抗原クラスターを、プライマー
【化１６】
2015529214.tif 000018
及び
【化１７】
2015529214.tif 000019
を用いて大腸菌O121(CCUG 11422)から調製されたゲノムDNAから増幅させた。消化されたPCR断片を、AscI/SpeIで消化したプラスミド1に連結して、プラスミド2を生じさせた。プラスミド3は、
【化１８】
2015529214.tif 000020
と
【化１９】
2015529214.tif 000021
のアニーリングから形成された合成オリゴヌクレオチドカセットを単一の制限部位PmlIに挿入し、wbqGのオープンリーディングフレームを破壊することによって構築された。
【００７７】
((d)LPS解析)
1のA600に相当する終夜培養物の細胞を回収し、Laemmliの文献[Laemmli, U.K., Favre, M.の文献:バクテリオファージT4の頭部の成熟。I. DNAパッケージング事象(Maturation of the head of bacteriophage T4. I. DNA packaging events.)、J Mol Biol 80(4), 575-599(1973)]に従って、100μlの1×試料バッファーに再懸濁させ、95℃で10分間煮沸した。プロテイナーゼK(Fermentas)を200μg/mlの最終濃度まで添加し、試料を60℃で1時間インキュベートした。プロテイナーゼKで消化した全細胞溶解物由来のLPS分子種を、製造業者の指示に従って、Invitrogen製の12％BisTris NuPAGEゲルとMES泳動バッファーとを用いて、SDS-PAGEにより分離した。LPSを銀染色により可視化した[Tsai, C.M., Frasch, C.E.の文献:ポリアクリルアミドゲル中でリポ多糖を検出するための高感度銀染色(A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels.)、Anal Biochem 119(1), 115-119(1982)]。O抗原の免疫学的特性を、標準的な方法を用いるウェスタンブロットにより解析した。大腸菌O121 O抗原の構造は、志賀赤痢菌7型O抗原と同一であり、それゆえ、抗志賀赤痢菌7型血清をReagensia AB(Sweden)から購入し、1:100希釈で用いた。抗Viポリクローナル抗体をMurex Biotech Ltd(England)から購入し、1:100希釈で用いた。
【００７８】
((e)ウンデカプレニルピロホスフェート(Und-PP)結合O抗原グリカンの分析)
O抗原グリカンを、いくつかの多糖遺伝子クラスター中に染色体欠失を含む大腸菌株SCM6で分析した。SCM6細胞を、O抗原クラスターをコードするプラスミド及びwecA発現プラスミド(プラスミド4)で形質転換することにより、O多糖を発現させた。O抗原特異的シグナルを同定するために、空のプラスミドで形質転換したSCM6を陰性対照として用いた。これらの株を振盪フラスコ中で一晩成長させた。400のA600に相当する細胞を回収し、0.9％NaClで1回洗浄し、凍結乾燥させた。ボルテックス処理及び氷上で10分間のインキュベーションを複数回繰り返すことにより、脂質を、乾燥した細胞から95％メタノール(MeOH)で抽出した。懸濁液をddH2Oの添加により85％MeOHに変換し、一定の間隔でボルテックス処理しながら、氷上で10分間、さらにインキュベートした。遠心分離後、上清を回収し、抽出物をN2下で乾燥させた。乾燥した脂質を、10mMテトラブチルアンモニウムホスフェート(TBAP)を含む1:1のメタノール/水(M/W)に溶解させ、C18 SepPakカートリッジ(Waters社, Milford, MA)に供した。該カートリッジを10ml MeOHで調整し、次いで、1:1のM/W中の10mlの10mM TBAPで平衡化した。試料を充填した後、該カートリッジを1:1のM/W中の10mlの10mM TBAPで洗浄し、5mlのMeOH、次いで、5mlの10:10:3のクロロホルム/メタノール/水(C/M/W)で溶出させた。合わせた溶出画分をN2下で乾燥させた。
【００７９】
乾燥した試料をGloverらの文献[Glover, K.J., Weerapana, E., Imperiali, B.の文献:原核生物N結合型グリコシル化のためのウンデカプレニルピロホスフェート結合七糖のインビトロ構築(In vitro assembly of the undecaprenylpyrophosphate-linked heptasaccharide for prokaryotic N-linked glycosylation.)、Proc Natl Acad Sci U S A 102(40), 14255-14259(2005)]に従って50％n-プロパノール中の2mlの1Mトリフルオロ酢酸(TFA)に溶解させ、50℃に15分間加熱することにより、脂質試料を加水分解した。加水分解された試料をN2下で乾燥させ、4mlの3:48:47のC/M/Wに溶解させ、C18 SepPakカートリッジ(Waters社, Milford, MA)に供して、加水分解されたグリカンから脂質を分離した。該カートリッジを10mlのMeOHで調整し、次いで、10mlの3:48:47のC/M/Wで平衡化した。試料を該カートリッジに適用し、フロースルーを回収した。該カートリッジを4mlの3:48:47のC/M/Wで洗浄し、合わせたフロースルー画分を、SpeedVacを用いて乾燥させた。
【００８０】
乾燥した試料を、Biggeらの文献[Bigge, J.C., Patel, T.P., Bruce, J.A., Goulding, P.N., Charles, S.M., Parekh, R.B.らの文献: 2-アミノベンズアミド及びアントラニル酸を用いたグリカンの非選択的かつ効率的な蛍光標識(Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide and anthranilic acid.)、Analytical biochemistry 230(2), 229-238(1995)]に従って、2-アミノベンズアミド(2AB)で標識した。グリカン浄化を、Merryらの文献[Merry, A.H., Neville, D.C., Royle, L., Matthews, B., Harvey, D.J., Dwek, R.A., Rudd, P.M.の文献:ヒドラジノ分解によって糖タンパク質から遊離した無傷の2-アミノベンズアミド標識O-グリカンの回収(Recovery of intact 2-aminobenzamide-labeled O-glycans released from glycoproteins by hydrazinolysis.)、Analytical biochemistry 304(1), 91-99(2002)]に記載されているペーパーディスク法を用いて行った。2AB標識グリカンの分離を、Royleらの文献[Royle, L., Mattu, T.S., Hart, E., Langridge, J.I., Merry, A.H., Murphy, N., Harvey, D.J., Dwek, R.A., Rudd, P.M.の文献:分析及び構造データベースは、マイクログラム量の糖タンパク質由来のO-グリカンをシークエンシングするための戦略を提供する(An analytical and structural database provides a strategy for sequencing O-glycans from microgram quantities of glycoproteins.)、Analytical biochemistry 304(1), 70-90(2002)]に従ってGlycoSep N順相カラムを用いるが、3溶媒系に変更されたHPLCにより実施した。溶媒A: 80％アセトニトリル中の10mMギ酸アンモニウムpH 4.4。溶媒B: 40％アセトニトリル中の30mMギ酸アンモニウムpH 4.4。溶媒C: 0.5％ギ酸。カラム温度を30℃とし、2AB標識グリカンを蛍光(λex＝330nm、λem＝420nm)により検出した。勾配条件: 0.4ml分-1の流速で160分かけて100％Aから100％Bへの線形勾配とし、次いで、2分間100％Bから100％Cとし、2分かけて100％Aに戻し、1ml分-1の流速で100％Aで15分間泳動させ、その後、5分間、流速を0.4ml分-1に戻す。試料をddH2O中で注入した。
【００８１】
O抗原特異的グリカンを同定するために、空のプラスミド対照を保有する細胞の2ABグリカンプロファイルを、O抗原クラスターを保有する細胞から得られたトレースから減算した。O抗原特異的ピークを収集し、2ABグリカンをMALDI SYNAPT HDMS Q-TOFシステム(Waters社, Milford, MA)で分析した。試料を5:95のアセトニトリル/水に溶解させ、80:20のメタノール/水中の20mg ml-1のDHBで1:1にスポットした。較正をPEG(調合済み溶液、Waters社, Milford, MA)を用いて行い、60:40:0.1のアセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸中の5mg ml-1のα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(CHCA, Sigma-Aldrich, Switzerland)で1:3にスポットした。装置に200Hz固体UVレーザーを搭載した。質量スペクトルを陽イオンモードで記録した。MSMSの場合:レーザーエネルギーを200Hzの発射率で240で固定し、衝突ガスをアルゴンとした。衝突エネルギープロファイルを用いて、m/zに応じて、衝突エネルギーに傾斜を付けた。組み合わせ、バックグラウンド減算し、スムージングした(Savitzsky Golay)スペクトルを、MassLynx v4.0ソフトウェア(Waters社, Milford, MA)を用いてセンタリングした。
【００８２】
((f)複合糖質の産生及び精製)
オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglB、改変された受容体タンパク質EPA(緑膿菌の外毒素A)、及びウンデカプレニル-ピロホスフェート(Und-PP)結合グリカンを産生する遺伝子クラスターを大腸菌内で発現させることにより、複合糖質の産生を達成した。PGVXN114(PglBを発現する)、PGVXN150(C末端His6タグ化EPAを発現する)、及びプラスミド2(O121抗原クラスター)又はプラスミド3(O121 wbqG突然変異体抗原)を大腸菌株Clm24中に共形質転換した[Feldman, M.F., Wacker, M., Hernandez, M., Hitchen, P.G., Marolda, C.L., Kowarik, M., Morris, H.R., Dell, A., Valvano, M.A., Aebi, M.の文献:大腸菌内での多様なO抗原リポ多糖構造によるN結合型タンパク質グリコシル化の改変(Engineering N-linked protein glycosylation with diverse O antigen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli.)、Proc Natl Acad Sci U S A 102(8), 3016-3021(2005)]。細胞を、シェーカーインキュベーター(180rpm)内で、抗生物質が補充されたLB培地中、37℃で培養した。振盪フラスコ発現培養物を、誘導されていない終夜培養物から0.05のA600になるまで植菌した。PglB及び担体タンパク質EPAの発現を、IPTG(1mM)及びL-アラビノース(0.02％w/v)により、0.4〜0.6のA600で誘導した。最初の誘導から4時間後、二回目の一時的なL-アラビノース(0.02％w/v)を添加した。終夜インキュベーション(19〜22時間の全誘導時間)の後、細胞を回収した。ペレットを0.9％NaClで洗浄し、50のA600と等しい濃度で再懸濁バッファー(25％スクロース、10mM EDTA、200mM Tris HCl pH 8.0)に懸濁させた。細胞懸濁液を、シェーカー上で、4℃で20分間インキュベートした。遠心分離後、細胞ペレットを同じ容量の浸透圧衝撃バッファー(10mM Tris HCl pH 8.0)に再懸濁させた。該懸濁液を、シェーカー上で、4℃で30分間インキュベートし、10,000gで20分間遠心分離して、スフェロブラストを除去した。ペリプラズムタンパク質を含む上清を回収し、C末端ヘキサヒスチジンタグを含む組換えEPAを、HisTrap粗FF 1mlカラム(GE Healthcare, Switzerland)を用いて精製した。抽出物を5×HT結合バッファー(2.5M NaCl、150mM Tris HCl pH 8.0、50mMイミダゾール)で希釈して、結合条件を最適化し、MgCl2を50mMの最終濃度まで添加した。抽出物を濾過し、1×HT結合バッファーで平衡化したHisTrap粗FFカラムに適用した。充填後、カラムを、20mMイミダゾールを含む同じバッファーで洗浄して、未結合のタンパク質を除去した。タンパク質を、HT溶出バッファー(0.5Mイミダゾールを含むHT結合バッファー)を用いて、カラムから溶出させた。
【００８３】
その後、糖タンパク質を、Resource Q 1mlカラム(GE Healthcare, Switzerland)を用いて、グリコシル化されていないEPAから分離した。EPAを含むHisTrap溶出画分をプールし、RQ結合バッファー(20mM L-ヒスチジン、pH 6.0)で10倍希釈した。希釈したEPA試料を、RQ結合バッファーで平衡化した陰イオン交換カラムに適用した。該カラムを、25カラム容量中、0％〜32.5％のRQ溶出バッファー(1M NaClを含むRQ結合バッファー)の線形勾配で溶出させ、0.5ml画分をAkta FPLC(Amersham Biosciences)を用いて回収した。該画分をSDS-PAGEにより解析し、タンパク質をクマシーブルーで染色した。糖タンパク質を含む画分をプールし、製造業者の指示に従って、いくつかの濃縮及び希釈工程を実施することにより、30kDaメンブレン(Millipore)を備えたAmicon Ultra-4遠心分離フィルターユニットを用いて、バッファーをPBSに交換した。最終精製タンパク質試料の濃度を1mg ml-1に調整した。
【００８４】
((g)大腸菌O121 LPSの精製)
大腸菌O121(CCGU 11422)培養物のLPSを、別所に記載されているフェノール抽出により精製した[Apicella, M.A.の文献:リポ多糖の単離及び特徴付け(Isolation and characterization of lipopolysaccharides.)、Methods Mol Biol 431, 3-13(2008)]。
【００８５】
((h)Vi多糖の精製及びチラミンによる修飾)
Vi多糖を、以前に記載されている改変法[Demil, P., D'Hondt, E., Hoecke, C.V.の文献:チフス菌組成物(Salmonella Typhi vaccine compositions.)、欧州特許EP1107787号(2003)]により、チフス菌BRD948から精製した。簡潔に述べると、チフス菌BRD948を、Aro-及びTyr-ミックスが補充されたLB培地中で成長させた。シェーカーインキュベーター(180rpm)内での37℃での終夜インキュベーションの後、培養物を60℃に1時間加熱し、遠心分離した。Viを0.1％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム(CTAB, Sigma, H6269)で上清から沈殿させた。セライト上に吸着する多糖-CTAB複合体の形成を可能にするために、20g l-1のセライト545(Sigma, 20199-U)を添加し、混合物を室温(RT)で1時間撹拌した。該セライトを、フリット(Socochim S.A.)を備えた適当なサイズのリザーバ(Extract-clean EV SPE Reservoir, Socochim S.A.)に注ぎ入れた。該カラムを、10カラム容量(CV)の0.05％CTAB、10CVの20％エタノール、50mMリン酸ナトリウムバッファーpH 6.0、及び14CVの45％エタノールで重力流により連続的に洗浄して、吸着した不純物を除去した。Vi多糖を1.5CVの50％エタノール、0.4M NaClで最終的に溶出させた。溶出後、多糖を、80％の最終濃度までのエタノールの添加及びRTで20分間のインキュベーションにより沈殿させた。最後に、沈殿した多糖を、15000gで20分間の遠心分離により回収し、80％エタノールで2回洗浄し、凍結乾燥させた。
【００８６】
精製Vi多糖のタンパク質及び核酸含量を、それぞれ、ビシンコニン酸アッセイ(BCA)及びUV分光法により決定した。O-アセチル含量を、アセチルコリンを標準として測定した[Hestrin, S.の文献:アセチルコリン及び他のカルボン酸誘導体とヒドロキシルアミンとの反応、並びにその分析応用(The reaction of acetylcholine and other carboxylic acid derivatives with hydroxylamine, and its analytical application.)、J Biol Chem 180(1), 249-261(1949)]。
【００８７】
Viのマイクロタイタープレートへの結合効率を増大させるために、多糖をチラミン化した(Vi-Tyr)。塩酸チラミン(30mg ml-1, Sigma)を10mgの精製Viに添加した。100μlの0.5M N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミドHCl(Sigma)を添加し、混合物をpH 4.9〜5.1で3時間インキュベートした。反応混合物をddH2Oに対して透析した。
【００８８】
((i)免疫研究)
6〜8週齢の7匹のCB6F1雌マウスの群を免疫実験で用いた。マウスを、アジュバントとしてのミョウバン(Rehydragel LV-水酸化アルミニウム, General Chemical)又は5μgのVi多糖(Typhim Vi, Sanofi Pasteur MSD)とともに、20μgの複合糖質で皮下免疫した。複合糖質のアジュバント化を免疫直前に行った。簡潔に述べると、精製複合糖質をPBSで200μg ml-1の最終濃度まで希釈し、ミョウバン(Al3+の最終量は0.6mg ml-1に相当する)を添加し、溶液を室温で1時間穏やかに混合した。免疫を、1、22、及び57日目に行った。マウスの群は、通常、20μgのコンジュゲート(タンパク質)に相当する、100μl用量のワクチンを受けた。2回目の免疫の10日後及び最後の免疫の10日後に、血液試料を回収した。
【００８９】
((j)酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA))
平底96ウェルマイクロタイタープレート(Nunc immuno PolySorb)に、PBSに希釈した50μlの5μg ml-1大腸菌O121 LPS又は5μg ml-1のチラミン化Vi(Vi-Tyr)を、4℃で一晩コーティングした。コーティング溶液を流して捨て、プレートを4000mlの洗浄バッファー(0.05％Triton X 100を含む1×PBS)に浸漬させ、その中で激しく撹拌した。この洗浄工程を少なくとも4回行った。その後、プレートを、マイクロプレートローター中で、上下反対に配置し、スピンさせることにより乾燥させた。この洗浄手順は、さらなる洗浄工程で常に適用された。各ウェルを300μlのブロッキングバッファー(2.5％BSA(グロブリン不含BSA、Sigma, A7030)を含む1×PBS)で完全に満たし、プレートシェーカー上で、室温(RT)で2時間インキュベートした。プレートを洗浄し、乾燥させた後、希釈バッファー(0.5％BSAを含む1×PBS)中のマウス血清の希釈液をプレートに添加し(100μl)、プレートシェーカー上で、RTで1時間インキュベートした。全免疫グロブリン(Ig)を検出するために、希釈バッファーに1:2000希釈した100μlの西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗マウスIg(Sigma)を各ウェルに添加し、プレートを、プレートシェーカー上で、RTで1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、乾燥させた後、反応を、100μlのUltra TMB基質(3,3',5,5'-テトラメチベンジジン(tetramethybenzidine)液体基質、Pierce)を用いて15分間進行させ、100μlの2M硫酸の添加により停止させた。光学密度(OD)を450nmで測定した。
【００９０】
終点力価を決定するために、95％信頼水準を[Frey, A., Di Canzio, J., Zurakowski, D.の文献:免疫アッセイのための統計的に定義された終点力価決定法(A statistically defined endpoint titer determination method for immunoassays.)、J Immunol Methods 221(1-2), 35-41(1998]に従って定義した。陰性試料として、免疫前血清のプールを用いた。
【００９１】
(6.2  結果)
((a)大腸菌O121 wbqG突然変異体O多糖の解析)
大腸菌O121 wbqG突然変異体によって産生されるO多糖がチフス菌Vi莢膜多糖に特異的な抗体によって認識されるかどうかをまず調べた。大腸菌O121 O抗原遺伝子クラスターをクローニングし、wbqGのオープンリーディングフレームを、停止コドンを含むオリゴカセットの挿入により破壊した。クローニングされたプラスミドを大腸菌K-12株W3110中に形質転換し、リポ多糖(LPS)を、SDS-PAGE及び銀染色によって、又はニトロセルロース膜への転写後にウェスタンブロットによって解析した(図2A)。以前に報告されているように、wbqG遺伝子の突然変異は、O抗原発現を消失させなかった[King, J.D., Vinogradov, E., Tran, V., Lam, J.S.の文献:緑膿菌O6及び大腸菌O121 O抗原におけるウロンアミド糖の生合成(Biosynthesis of uronamide sugars in Pseudomonas aeruginosa O6 and Escherichia coli O121 O antigens.)、Environ Microbiol 12(6), 1531-1544(2010)]。しかしながら、銀染色ポリアクリルアミドゲル中で可視化されたwbqG突然変異体のLPSプロファイルは、いくつかの点で野生型と異なっていた:(i)重合したO抗原を含むバンドの染色は、野生型LPSと比べてより薄い、(ii)脂質A-コアに結合した1つのO抗原反復単位(コア＋1RU)からなるバンドはより強く染色された、及び(iii) O抗原を含むバンドは、野生型LPSの同等のバンドよりも速く移動した。オーバーエクスポーズした銀染色SDS-PAGEゲルを解析することにより、両方のLPSプロファイルは、脂質A-コアに結合した平均12個のO抗原反復単位を含むと推定された。LPSのウェスタンブロット解析により、抗O121血清がwbqG突然変異体O抗原と反応することが明らかになった。wbqG突然変異体O多糖は、抗Vi血清によって認識された。
【００９２】
発現されたO抗原反復単位の構造を確認するために、及びO-アセチル化の程度を決定するために、糖脂質を、O121野生型O抗原又はwbqG突然変異体O抗原のどちらかを発現する大腸菌SCM6株から抽出した。脂質結合オリゴ糖を、C18 SepPakカラムを用いて精製し、弱酸による処理によって、Und-PP結合グリカンを特異的に遊離させた。C18 SepPakカラムを再び使用する追加の精製工程の後、グリカンを2-アミノベンズアミド(2AB)で標識し、その後、GlycoSep Nカラムを用いる順相HPLCにより分離した。図2Bは、単一の反復単位及び短い重合O抗原が溶出すると考えられるクロマトグラムの一部を示している。2AB標識グリカン種と推定されるものを含む画分を質量分析(MS)により分析した(図3)。MSによって同定されたグリカン構造を図2Bに示す。
【００９３】
O121野生型O抗原を発現するSCM6細胞から調製された2AB標識グリカンのクロマトグラムは、58.8分で溶出するピークを特徴とした。このピーク画分中で、1083という質量対電荷比(m/z)を有する分子を同定した。65.1分の保持時間を有するピーク画分は、1041というm/zを有する種を主に含んでいた。この検出されたm/zは、アセチル化されていない2AB標識O121野生型サブユニットの単一の電荷を有するナトリウム付加物に対応した。2つの検出された質量の差は、O-アセチル基とヒドロキシル基の質量差である42Daに相当した。これら2つの種を衝突誘起解離(CID) MS-MSに供した。1083というm/zを有する前駆体から得られた単一の電荷を有する一連のフラグメントイオン(図3A)は、残基cにO-アセチル基を含む、2AB標識O121野生型O抗原反復単位由来のグリコシド分解産物と一致した。一方、1041というm/zを有する分子種のCID MS-MSスペクトルは、アセチル化されていない2AB標識O121サブユニットに対応した(図3B)。
【００９４】
wbqG突然変異体多糖を発現するSCM6細胞から調製された2AB標識グリカンのクロマトグラムから、2つの顕著なピークが明らかになった。67.2分の保持時間を有するピーク画分中で、1084というm/zを有する分子が検出された。この測定された質量は、58.8分で溶出するO121野生型トレースの対応するピーク中で測定された質量と1Daだけ異なっていた。同様に、1042というm/zが、73.5分の保持時間を有する2AB標識分子について測定された。これらの前駆体イオンのCID MS-MS(図3C及び3D)から、O121野生型2AB標識グリカンから得られたスペクトルと似ているフラグメンテーションパターンが得られた。測定された1Daという質量差は、グリカン構造の残基cに帰属した。1Daという質量差は、酸基とアミド基の計算質量差に相当し、wbqG突然変異体O抗原の公表されている構造と一致した[King, J.D., Vinogradov, E., Tran, V., Lam, J.S.の文献:緑膿菌O6及び大腸菌O121 O抗原におけるウロンアミド糖の生合成(Biosynthesis of uronamide sugars in Pseudomonas aeruginosa O6 and Escherichia coli O121 O antigens.)、Environ Microbiol 12(6), 1531-1544(2010)]。
【００９５】
重合した2AB標識O抗原サブユニットは、O121野生型トレース中に同定された。可変的にO-アセチル化された2つのサブユニットは、それぞれ、保持時間83.1分、86.9分、及び90.6分のピーク画分中に同定された。二重にアセチル化された種がまず溶出し、次に、1つアセチル化された形態及びアセチル化されていない形態が溶出した。アセチル化された形態とアセチル化されていない形態が分離しているために、O-アセチル化の程度を決定することができた。両方の株において、単一反復単位の約50％がO-アセチル化されていた。
【００９６】
ペプチドグリカン単量体の前駆体もO121野生型トレース中のいくつかのピーク中に同定された(図2B)。ペプチドグリカン前駆体もウンデカプレニルピロホスフェート上で構築され、O抗原サブユニットに使用された方法で精製及び標識されると考えられる。
【００９７】
((b)複合糖質の産生)
O121 wbqG突然変異体の構造を確認し、Vi抗原に対して作製された抗体と交差反応することが示された。次に、wbqG突然変異体O多糖が、Viに結合する抗体を誘発することができるかどうかを決定した。複合糖質を免疫研究用に調製した。細菌オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglB、改変されたペリプラズム担体タンパク質EPA(トキソイド組換え緑膿菌外毒素A)、及び大腸菌O121野生型抗原又はwbqG突然変異体抗原のどちらかを、大腸菌K12派生物のCLM24内で発現させることにより、糖タンパク質を産生した[Feldman, M.F., Wacker, M., Hernandez, M., Hitchen, P.G., Marolda, C.L., Kowarik, M., Morris, H.R., Dell, A., Valvano, M.A., Aebi, M.の文献:大腸菌内での多様なO抗原リポ多糖構造によるN結合型タンパク質グリコシル化の改変(Engineering N-linked protein glycosylation with diverse O antigen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli.)、Proc Natl Acad Sci U S A 102(8), 3016-3021(2005)]。CLM24株は、O抗原リガーゼ(WaaL)を欠いている。それゆえ、O抗原の脂質A-コアへの転移が遮断され、Und-PP結合O抗原基質が内膜のペリプラズム面に蓄積し、PglB触媒によるタンパク質受容体内の特異的アスパラギン残基への転移のためのO抗原供与体が提供される。さらに、大腸菌K12派生物は、機能的な内在性O抗原遺伝子クラスターを欠いている[Liu, D., Reeves, P.R.の文献:大腸菌K12はそのO抗原を回復する(Escherichia coli K12 regains its O antigen.)、Microbiology 140(Pt 1), 49-57(1994); Feldman, M.F., Marolda, C.L., Monteiro, M.A., Perry, M.B., Parodi, A.J., Valvano, M.A.の文献:大腸菌O抗原構築に関与する推定上のポリイソプレノール結合型糖トランスロカーゼ(Wzx)の活性は、O反復の化学構造と無関係である(The activity of a putative polyisoprenol-linked sugar translocase (Wzx) involved in Escherichia coli O antigen assembly is independent of the chemical structure of the O repeat.)、J Biol Chem 274(49), 35129-35138(1999)]。それゆえ、プラスミドにコードされたO抗原遺伝子クラスターを、混合したO抗原集団を産生することなく発現させることができる。別所に記載されているように、ペリプラズムへのSec依存性分泌のためのN末端シグナル配列及び親和性クロマトグラフィーによる精製のためのC末端ヘキサヒスチジンタグを有するEPAをタンパク質受容体として用いた[Ihssen, J., Kowarik, M., Dilettoso, S., Tanner, C., Wacker, M., Thony-Meyer, L.の文献:大腸菌における糖タンパク質ワクチンの産生(Production of glycoprotein vaccines in Escherichia coli.)、Microb Cell Fact 9, 61(2010)]。EPAは、2つの改変されたN-グリコシル化部位を含む。低コピープラスミドPGVXN114をIPTG誘導性tacプロモーターの制御下でのPglBの発現に用いた。
【００９８】
PglB及びEPAの誘導後、新たに合成された糖タンパク質を、ニッケル親和性クロマトグラフィーにより、ペリプラズム抽出物から精製した。負電荷を有する多糖が複合糖質中に存在するため、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、グリコシル化された形態とグリコシル化されていない形態を分離した。2つの種の分離に基づいて、O121野生型O多糖遺伝子クラスターを発現する培養物では、全EPAの約70％がグリコシル化されていることが分かった。グリコシル化効率は、wbqG突然変異体O抗原を発現する培養物でより低かったが、全担体タンパク質の35％がグリカン修飾を含んでいた。
【００９９】
精製複合糖質をSDS-PAGEにより分離し、クマシーブルー染色によるか、又は抗EPA、抗O121、及びニトロセルロース膜への転写後の抗Vi抗体を用いるウェスタンブロットによって可視化した(図4)。クマシーブルー染色により、グリコシル化されていないEPAの質量(70kDa)と同じ質量のバンドを、精製されたO121多糖-EPAコンジュゲート(O121-EPA)中に検出することができた。該コンジュゲートは、抗EPA血清によっても認識されるが、抗O121血清によっては認識されない。それゆえ、グリコシル化されていないEPAは、複合糖質調製物においてほとんど除去された。主に、100〜130kDaに密集したバンドのラダーをクマシーブルー染色により検出した。これらのバンドは、抗EPA血清と反応し、修飾された形態のEPAであることが示された。これらのより大きなポリペプチドは、抗O121特異的抗体でも検出されるが、志賀赤痢菌O1抗原(O1-EPA)([Ihssen, J., Kowarik, M., Dilettoso, S., Tanner, C., Wacker, M., Thony-Meyer, L.の文献:大腸菌における糖タンパク質ワクチンの産生(Production of glycoprotein vaccines in Escherichia coli.)、Microb Cell Fact 9, 61(2010)]に記載されている)で修飾されたEPAは、該抗体で検出されず、共発現された多糖による担体の修飾が示された。wbqG突然変異体O多糖でグリコシル化されたEPA(O121wbqG-EPA)は、抗Vi抗体でさらに染色された。
【０１００】
SDS-PAGE解析によって明らかにされているように、主にモノグリコシル化されたEPA、すなわち、2つの改変されたグリコシル化部位のうちの1つにおいて対応するO-多糖で修飾されたEPAが精製された。微量のジグリコシル化されたEPAを、ウェスタンブロットにより、精製されたO121wbqG-EPA試料中で検出することができた(図4)。ジグリコシル化された形態のEPAは、130kDaよりもわずかに大きいバンドの二番目に薄いラダーとして泳動する。図2Aに見られるように、発現したO-抗原は、平均12個の反復単位を有するモード鎖長分布を示す。精製複合糖質が、12反復単位の平均長の単一の多糖鎖を含むモノグリコシル化EPAからなっていたと仮定して、糖対タンパク質重量比を0.15:1であると推定した。
【０１０１】
((c)マウスにおける複合糖質の免疫原性及び多糖特異的抗体応答の評価)
次に、コンジュゲートワクチンで免疫したときにマウスで誘発される免疫応答を評価した。精製複合糖質の用量範囲及びアジュバント化を決定するために、パイロット実験を小グループのCB6F1マウスで実施した。これらから、ミョウバンと組み合わせた20μgのタンパク質(約3μgの多糖)が再現性良く免疫原性であることが立証された。その後、CB6F1マウスのグループ(1グループ当たり7匹)を、1、22、及び57日目に、O121-EPA、O121wbqG-EPA、又は5μgの精製Vi多糖(Typhim Vi, Sanofi Pasteur MSD)で皮下免疫した。マウスを32及び67日目に試採血し、血清を抗O121 LPS及び抗Vi全免疫グロブリン(Ig)の存在について試験した。67日までに、血清Ig抗O121 LPS力価の顕著な上昇が、どちらかのコンジュゲートで免疫した14匹の動物中13匹で観察された(図5A)。O121wbqG-EPAで免疫したマウスのグループ中の1匹は、血清変換を示さなかった。興味深いことに、同じ動物は、血清Ig抗Vi力価の顕著な上昇を生じさせた(図5B)。予想通り、精製Vi多糖で免疫した対照グループは、検出可能な抗O121 LPS応答を示さなかったが、血清Ig抗Vi力価の顕著な上昇を示した。
【０１０２】
(6.3  考察)
この実施例は、ウンデカプレニルピロホスフェート(Und-PP)結合グリカンの新規の分析方法を記載している。記載されている手順は、真核細胞のドリチルピロホスフェート(Dol-PP)結合オリゴ糖を分析するために使用された方法に基づいている。主な変更としては、細菌糖脂質の最適化された抽出手順及び弱酸加水分解によるグリカン遊離前の精製工程が挙げられる。細菌Und-PP結合グリカンの精製戦略は、この脂質担体上に構築される膨大な種類の異なる糖構造によってさらに複雑になる。Und-PP結合グリカンの特定のサブクラスを分析するために使用される適切な発現株の選択が極めて重要である。この実施例では、Und-PP結合O多糖を分析した。Und-PP結合O抗原は、LPS生合成の中間体種に相当するので、O抗原リガーゼ(ΔwaaL)を欠く大腸菌株を用いた。それゆえ、Und-PP結合O多糖は、脂質A-コアに転移されず、この脂質中間体の蓄積をもたらす。O抗原をwaaL陽性株で発現させた場合、おそらくは、この糖脂質種の迅速な代謝回転のために、2AB標識Oグリカンを同定することができなかった。さらに、O抗原は、高分子量の重合構造であり、質量分析による分析がますます困難になる。それゆえ、O抗原サブユニットの効率的な重合に関与するO抗原鎖長調節因子(wzz)遺伝子の突然変異を含有する株バックグラウンドを選択した。これにより、主に単一の反復単位及び短い重合O抗原の産生が生じ、そのため、MS分析が簡単になった。いくつかの他の多糖構造も、ペプチドグリカン前駆体、莢膜多糖、及び腸内細菌一般抗原(ECA)のようにUnd-PP上に構築され、これにより、Oグリカン種の同定及び特徴付けが複雑になり得る。したがって、全ての主要な多糖遺伝子クラスターに欠失を含む大腸菌株SCM6をO抗原発現に用いた。
【０１０３】
この改変法を用いて、O121 wbqG突然変異体O多糖を分析した。この実施例は、Kingらによって公表された構造を裏付けるものである[King, J.D., Vinogradov, E., Tran, V., Lam, J.S.らの文献:緑膿菌O6及び大腸菌O121 O抗原におけるウロンアミドの生合成(Biosynthesis of uronamide sugars in Pseudomonas aeruginosa O6 and Escherichia coli O121 O antigens.)、Environ Microbiol 12(6), 1531-1544(2010)]。さらに、組換え発現されたwbqG突然変異体O抗原構造が、おそらくはC-3で修飾された、O-アセチル化N-アセチルガラクトサミンウロン酸を含有することが明らかにされた。それゆえ、この突然変異体O多糖は、Vi多糖にも存在する構造モチーフを含有する。Vi多糖のO-アセチル基は免疫優勢エピトープを形成し、Viの免疫原性はO-アセチル化の程度と密接に関連する[Szu, S.C., Bystricky, S.の文献:チフス菌由来のポリガラクツロナン、その誘導体、及びVi抗原の物理的、化学的、抗原性、及び免疫学的特徴付け(Physical, chemical, antigenic, and immunologic characterization of polygalacturonan, its derivatives, and Vi antigen from Salmonella typhi)、Methods Enzymol 363, 552-567(2003); Szu, S.C., Li, X.R., Stone, A.L., Robbins, J.B.の文献: Vi莢膜多糖の構造と免疫学的特性の関係(Relation between structure and immunologic properties of the Vi capsular polysaccharide.)、Infect Immun 59(12), 4555-4561(1991)]。
【０１０４】
この実施例は、wbqG突然変異体O多糖が、Vi抗原に対して作製された抗体と交差反応することを初めて示している。
【０１０５】
同様に、大腸菌O121野生型又はwbqG突然変異体のO多糖及び緑膿菌の外毒素A(O121-EPA/O121wbqG-EPA)から構成される複合糖質をこの実施例で調製した。EPAは、腸チフスコンジュゲートワクチン中で免疫原性担体として使用されることに既に成功している[Szu, S.C., Taylor, D.N., Trofa, A.C., Clements, J.D., Shiloach, J., Sadoff, J.C., Bryla, D.A., Robbins, J.B.の文献: Vi莢膜多糖-タンパク質コンジュゲートワクチンの実験的及び予備的臨床特性評価(Laboratory and preliminary clinical characterization of Vi capsular polysaccharide-protein conjugate vaccines.)、Infect Immun 62(10), 4440-4444(1994)]。複合糖質で免疫したマウスのグループは両方とも、グリカン特異的抗体応答を生じさせた。O121wbqG-EPAコンジュゲートで免疫した7匹のマウスうちの6匹は、血清免疫グロブリン(Ig)抗O121 LPS力価の顕著な上昇を示し、ウロンアミド基以外の他の抗原性決定基が抗O121 LPS特異的免疫応答を誘導するのに重要であることを示した。O121wbqG-EPAコンジュゲートで免疫した1匹の動物の抗体は、大腸菌O121 LPSではなく、むしろVi多糖と反応した。これは、この動物が、Vi構造に似ている、残基b及びc'によって構成されるエピトープ(図1)に対する抗体応答を生じさせたことを示している。しかしながら、このグループの他の動物は、O121-LPS特異的エピトープ、おそらくは、顕著な表面露出側鎖を含む残基dに対する抗体を惹起した。O121グリカン構造のさらなる最適化は、免疫時のVi特異的免疫応答を向上させるであろう。
【表２】
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【０１０６】
本明細書に記載の実施態様は、単に例示的であることが意図されており、当業者は、本明細書に記載の具体的な手順の多くの等価物を認識するか、又はルーチンの実験だけを用いて、それらを確認することができるであろう。そのような等価物は全て、本発明の範囲内にあると考えられ、以下の特許請求の範囲によって包含される。
【０１０７】
本明細書に引用される全ての参考文献(特許出願、特許、及び刊行物を含む)は、あたかも各々の個々の刊行物又は特許又は特許出願が、あらゆる目的のために引用により完全に本明細書中に組み込まれることが具体的かつ個別的に示されるのと同じ程度まで、引用により完全に及びあらゆる目的のために本明細書中に組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年6月3日(2015.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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