(57)【要約】本発明は、新規改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスに関する。本発明はまた、前記ＭＶＡウイルスを培養するための方法、及び前記ＭＶＡウイルスを生産するための方法に関する。さらに、本発明は、前記ＭＶＡウイルスと、１つ以上の薬学的に許容しる賦形剤、希釈剤及び／又は担体とを含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、前記ＭＶＡウイルスを含むワクチンに関する。加えて、本発明は、医薬に使用するための前記ＭＶＡウイルスに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ３Ｌ遺伝子産物及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子産物をコードする核酸配列を含む改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、前記核酸配列が、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも１つの突然変異を含む、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルス。
【請求項２】
核酸配列がＡ９Ｌ遺伝子産物をさらにコードし、前記核酸配列が、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項３】
（ｉ）ＭＶＡウイルスが、Ａ３Ｌ遺伝子産物及びＡ９Ｌ遺伝子産物をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも１つの突然変異を含むか、又は
（ｉｉ）ＭＶＡウイルスが、Ａ３４Ｒ遺伝子産物及びＡ９Ｌ遺伝子産物をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも１つの突然変異を含む、請求項２に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項４】
ＭＶＡウイルスが、Ａ３Ｌ遺伝子産物、Ａ３４Ｒ遺伝子産物及びＡ９Ｌ遺伝子産物をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも１つの突然変異を含む、請求項２に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項５】
（ｉ）アミノ酸配列改変が、配列番号１のＡ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３４〜６４４又はそれに対応するアミノ酸位置に及ぶ領域内にあり、
（ｉｉ）アミノ酸配列改変が、配列番号２のＡ３４Ｒ遺伝子産物のアミノ酸位置８１〜９１又はそれに対応するアミノ酸位置に及ぶ領域内にあり、及び／又は
（ｉｉｉ）アミノ酸配列改変が、配列番号３のＡ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７０〜８０又はそれに対応するアミノ酸位置に及ぶ領域内にある、請求項１〜４に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項６】
（ｉ）アミノ酸配列改変が、Ａ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３９又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、
（ｉｉ）アミノ酸配列改変が、Ａ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３８又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、
（ｉｉｉ）アミノ酸配列改変が、Ａ３４Ｒ遺伝子産物のアミノ酸位置８６又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、
（ｉｖ）アミノ酸配列改変が、Ａ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７５又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、及び／又は
（ｖ）アミノ酸配列改変が、Ａ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７４又はそれに対応するアミノ酸位置にある、請求項５に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項７】
アミノ酸配列改変がアミノ酸欠失又はアミノ酸置換であり、
（ｉ）Ａ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３９若しくはそれに対応するアミノ酸位置のＨが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ若しくはＷ、負のアミノ酸、好ましくはＤ若しくはＥ、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはＳ、Ｔ、Ｎ若しくはＱで置換されており、
（ｉｉ）Ａ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３８若しくはそれに対応するアミノ酸位置のＲが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ若しくはＷ、負のアミノ酸、好ましくはＤ若しくはＥ、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはＳ、Ｔ、Ｎ若しくはＱで置換されており、
（ｉｉｉ）Ａ３４Ｒ遺伝子産物のアミノ酸位置８６若しくはそれに対応するアミノ酸位置のＤが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ若しくはＷ、正のアミノ酸、好ましくはＲ、Ｈ若しくはＫ、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはＳ、Ｔ、Ｎ若しくはＱで置換されており、
（ｉｖ）Ａ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７５若しくはそれに対応するアミノ酸位置のＫが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ若しくはＷ、負のアミノ酸、好ましくはＤ若しくはＥ、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはＳ、Ｔ、Ｎ若しくはＱで置換されており、並びに／又は
（ｖ）Ａ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７４若しくはそれに対応するアミノ酸位置のＫが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ若しくはＷ、負のアミノ酸、好ましくはＤ若しくはＥ、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはＳ、Ｔ、Ｎ若しくはＱで置換されている、請求項５又は６に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項８】
アミノ酸置換が
（ｉ）Ａ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３９又はそれに対応するアミノ酸位置のＨのＹによるアミノ酸置換（Ｈ６３９Ｙ  Ａ３Ｌ遺伝子産物突然変異体）、
（ｉｉ）Ａ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３８又はそれに対応するアミノ酸位置のＲのＹによるアミノ酸置換（Ｒ６３８Ｙ  Ａ３Ｌ遺伝子産物突然変異体）、
（ｉｉｉ）Ａ３４Ｒ遺伝子産物のアミノ酸位置８６又はそれに対応するアミノ酸位置のＤのＹによるアミノ酸置換（Ｄ８６Ｙ  Ａ３４Ｒ遺伝子産物突然変異体）、
（ｉｖ）Ａ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７５又はそれに対応するアミノ酸位置のＫのＥによるアミノ酸置換（Ｋ７５Ｅ  Ａ９Ｌ遺伝子産物突然変異体）、及び／又は
（ｖ）Ａ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７４又はそれに対応するアミノ酸位置のＫのＥによるアミノ酸置換（Ｋ７４Ｅ  Ａ９Ｌ遺伝子産物突然変異体）である、請求項７に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項９】
アミノ酸置換が
（ｉ）Ａ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３９又はそれに対応するアミノ酸位置のＨのＹによるアミノ酸置換、及びＡ３４Ｒ遺伝子産物のアミノ酸位置８６又はそれに対応するアミノ酸位置のＤのＹによるアミノ酸置換（Ｈ６３９Ｙ  Ａ３Ｌ／Ｄ８６Ｙ  Ａ３４Ｒ遺伝子産物突然変異体）、
（ｉｉ）Ａ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３９又はそれに対応するアミノ酸位置のＨのＹによるアミノ酸置換、及びＡ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７５又はそれに対応するアミノ酸位置のＫのＥによるアミノ酸置換（Ｈ６３９Ｙ  Ａ３Ｌ／Ｋ７５Ｅ  Ａ９Ｌ遺伝子産物突然変異体）、
（ｉｉｉ）Ａ３４Ｒ遺伝子産物のアミノ酸位置８６又はそれに対応するアミノ酸位置のＤのＹによるアミノ酸置換、及びＡ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７５又はそれに対応するアミノ酸位置のＫのＥによるアミノ酸置換（Ｄ８６Ｙ  Ａ３４Ｒ／Ｋ７５Ｅ  Ａ９Ｌ遺伝子産物突然変異体）、又は
（ｉｖ）Ａ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３９又はそれに対応するアミノ酸位置のＨのＹによるアミノ酸置換、Ａ３４Ｒ遺伝子産物のアミノ酸位置８６又はそれに対応するアミノ酸位置のＤのＹによるアミノ酸置換、及びＡ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７５又はそれに対応するアミノ酸位置のＫのＥによるアミノ酸置換（Ｈ６３９Ｙ  Ａ３Ｌ／Ｄ８６Ｙ  Ａ３４Ｒ／Ｋ７５Ｅ  Ａ９Ｌ遺伝子産物突然変異体）である、請求項７又は８に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項１０】
（ｉ）Ｈ６３９Ｙ突然変異を有するＡ３Ｌ遺伝子産物が配列番号４のアミノ酸配列を有するか、又は前記アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のその変異体であって、前記変異体が、アミノ酸位置６３９又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸Ｙを含むこと、
（ｉｉ）Ｄ８６Ｙ突然変異を有するＡ３４Ｒ遺伝子産物が配列番号５のアミノ酸配列を有するか、又は前記アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のその変異体であって、前記変異体が、アミノ酸位置８６又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸Ｙを含むこと、及び／又は
（ｉｉ）Ｋ７５Ｅ突然変異を有するＡ９Ｌ遺伝子産物が配列番号６のアミノ酸配列を有するか、又は前記アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のその変異体であって、前記変異体が、アミノ酸位置７５又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸Ｅを含むこと、を特徴とする、請求項７〜９に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項１１】
異種核酸配列をさらに含む、請求項１〜１０に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項１２】
異種核酸配列が、抗原、特に抗原のエピトープ、診断用化合物又は治療用化合物をコードする配列から選択される、請求項１１に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項１３】
鳥類細胞内で生産的に複製可能な、請求項１〜１２に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項１４】
霊長類細胞、より好ましくはヒト細胞内では生産的に複製不可能な、請求項１〜１３に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項１５】
請求項１〜１４に記載のＭＶＡウイルスのゲノム。
【請求項１６】
請求項１〜１４に記載のＭＶＡウイルス又は請求項１５に記載のゲノムを含む、細胞。
【請求項１７】
非接着／懸濁細胞である、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
鳥類細胞である、請求項１６又は１７に記載の細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１４に記載のＭＶＡウイルスを培養するための方法であって、
（ｉ）請求項１６〜１８に記載の細胞を提供する工程、
（ｉｉ）該細胞を培養する工程、及び
（ｉｉｉ）該ＭＶＡウイルスを単離する工程
を含む、方法。
【請求項２０】
細胞を細胞増殖培地中で培養し、続いてウイルス生産培地中で培養するか、又は細胞を細胞増殖培地中でのみ培養する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
無細胞上清及び／又は細胞溶解物からＭＶＡウイルスを単離する、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１４に記載のＭＶＡウイルスを生産するための方法であって、
（ｉ）ＭＶＡウイルスを細胞に感染させる工程、
（ｉｉ）該細胞を培養する工程、
（ｉｉｉ）該ＭＶＡウイルスを単離する工程、及び
（ｉｖ）Ａ３Ｌ遺伝子産物及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記核酸配列が前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも１つの突然変異を含むＭＶＡウイルスが検出されるまで、工程（ｉｉｉ）で単離されたＭＶＡウイルスを用いて工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を繰り返す工程
を含む、方法。
【請求項２３】
Ａ９Ｌ遺伝子産物をさらにコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも１つの突然変異を含む核酸配列を含むＭＶＡウイルスが検出されるまで、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を繰り返す、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞をウイルス生産培地中で培養する、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜１４に記載のＭＶＡウイルス又は請求項１５に記載のゲノムと、１つ以上の薬学的に許容しる賦形剤、希釈剤及び／又は担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１〜１４に記載のＭＶＡウイルス又は請求項１５に記載のゲノムを含む、ワクチン。
【請求項２７】
医薬に使用するための、請求項１〜１４に記載のＭＶＡウイルス又は請求項１５に記載のゲノム。
【請求項２８】
ワクチン接種に使用するための、請求項２７に記載のＭＶＡウイルス又はゲノム。
【請求項２９】
核酸配列を含むＭＶＡウイルスであって、Ａ３Ｌ遺伝子及び／又はＡ９Ｌ遺伝子が機能欠失している、ＭＶＡウイルス。
【請求項３０】
Ａ３４Ｒ遺伝子がさらに機能欠失している、請求項２９に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項３１】
機能欠失遺伝子が異種核酸配列で置換されている、請求項２９又は３０に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項３２】
異種核酸配列が、抗原、特に抗原のエピトープ、診断用化合物又は治療用化合物をコードする配列から選択される、請求項３１に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項３３】
好ましくはアミノ酸配列改変を含むＡ３Ｌ遺伝子産物、Ａ９Ｌ遺伝子産物及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子産物を含む、請求項２９〜３２に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項３４】
ＭＶＡウイルスのＡ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子を含む細胞であって、前記遺伝子を発現する、細胞。
【請求項３５】
（ｉ）ＭＶＡウイルスのＡ３Ｌ遺伝子が、遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも１つの突然変異を含み、
（ｉｉ）ＭＶＡウイルスのＡ９Ｌ遺伝子が、遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも１つの突然変異を含み、及び／又は
（ｉｉｉ）ＭＶＡウイルスのＡ３４Ｒ遺伝子が、遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも１つの突然変異を含む、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３６】
請求項２９〜３３に記載のＭＶＡウイルスをさらに含む、請求項３４又は３５に記載の細胞。
【請求項３７】
鳥類細胞である、請求項３４〜３６に記載の細胞。
【請求項３８】
異種核酸配列に作動可能に連結されたＭＶＡウイルスのＡ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子を含む、核酸分子。
【請求項３９】
（ｉ）ＭＶＡウイルスのＡ３Ｌ遺伝子が、遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも１つの突然変異を含み、
（ｉｉ）ＭＶＡウイルスのＡ９Ｌ遺伝子が、遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも１つの突然変異を含み、及び／又は
（ｉｉｉ）ＭＶＡウイルスのＡ３４Ｒ遺伝子が、遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも１つの突然変異を含む、請求項３８に記載の核酸分子。
【請求項４０】
リコンビナントＭＶＡウイルスを生産するための方法であって、
（ｉ）細胞を提供する工程、
（ｉｉ）請求項２９〜３３に記載のＭＶＡウイルス及び請求項３８又は３９に記載の核酸分子を該細胞に導入する工程、及び
（ｉｉｉ）該ＭＶＡウイルスの核酸配列と該核酸分子との間の相同組換えを可能にする条件下で該細胞を培養し、それにより該リコンビナントＭＶＡウイルスを得る工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスに関する。本発明はまた、前記ＭＶＡウイルスを培養するための方法、及び前記ＭＶＡウイルスを生産するための方法に関する。さらに、本発明は、前記ＭＶＡウイルスと、１つ以上の薬学的に許容しる賦形剤、希釈剤及び／又は担体とを含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、前記ＭＶＡウイルスを含むワクチンに関する。加えて、本発明は、医薬に使用するための前記ＭＶＡウイルスに関する。
【０００２】
発明の背景
ワクチンは、利用可能で最も有効なヒト治療行為の１つであり、非常に広範囲の感染性疾患から保護する。しかしながら、いくつかの潜在的及び慢性的な病原体に対しては、防御免疫又は治療免疫を依然として高めることができない。抗体反応を主に誘発する従来のアプローチは成功していない。理由としては、エピトープが可変性であり得るか、微生物腐敗によって頻繁に遮蔽若しくは保護され得るか、又は病原体が抗体にアクセス不可能なように隠れることが挙げられる。
【０００３】
不活性化ビリオン又は精製サブユニットによるワクチン接種と比較して、生ワクチンは、免疫系の細胞区画にも関与する広範な応答を誘導する。しかしながら、免疫不全者数の増加及び国際的流動性の拡大により、複製可能な株の使用は、より病原性の形態への復帰などのリスクを伴い得るか（Zurbriggen et al. 2008 in Appl Environ Microbiol 74, 5608-5614）、又はワクチンのレシピエント及び接触者の両方で深刻な有害事象である（Kemper et al. 2002 in Eff Clin Pract 5, 84-90; Parrino and Graham 2006 in J Allergy Clin Immunol 118, 1320-1326）。
【０００４】
最新のベクター化ワクチン（Excler et al. 2010 in Biologicals 38, 511-521; Plotkin 2009 in Clin Vaccine Immunol 16, 1709-1719）は、弱毒化感染の利点と、ヒト又は動物レシピエントでは複製不可能な宿主制限ベクターに固有の強い安全性プロファイルとを併せ持つ。特に有望な超弱毒化ベクターは、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスを含む宿主制限ポックスウイルスである。超弱毒化ポックスウイルスは臨床試験で安全性が実証されており（Cebere et al. 2006 in Vaccine 24, 417-425; Dorrell et al. 2007 in Vaccine 25, 3277-3283; Gilbert et al. 2006 in Vaccine 24, 4554-4561; Mayr 2003 in Comp Immunol Microbiol Infect Dis 26, 423-430; Webster et al. 2005 in Proc Natl Acad Sci U S A 102, 4836-4841）、依然として効率的な免疫応答刺激因子である（Drillien et al. 2004 in J Gen Virol 85, 2167-2175; Liu et al. 2008 in BMC Immunol 9, 15; Ryan et al. 2007 in Vaccine 25, 3380-3390; Sutter and Moss 1992 in Proc Natl Acad Sci U S A 89, 10847-10851; Sutter et al. 1994 in Vaccine 12, 1032-1040）。特に、ＭＶＡウイルスは、Poxviridae科のオルトポックスウイルス属のメンバーであるワクシニアウイルスに関係している。ＭＶＡウイルスは、漿尿膜ワクシニアアンカラ（ＣＶＡ）ウイルスのニワトリ胚線維芽細胞で５１６連続継代することによって作製された。ニワトリ由来の物質を生産基質として繰り返し継代することによる弱毒化過程中に、ＭＶＡウイルスは、複数の部位においてゲノムＤＮＡの約１５％を喪失した（Mayr and Munz 1964 in Zentralbl Bakteriol Orig 195, 24-35; Meyer et al. 1991 in J Gen Virol 72 ( Pt 5), 1031-1038）。ＭＶＡウイルスは分析されて、野生型ＣＶＡ株に対するゲノムの変化が決定されている。合計３１，０００塩基対に及ぶゲノムＤＮＡの６つの主な欠失（欠失Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ及びＶＩ）が同定されている（Meyer, et al. 1991 in J Gen Virol 72 ( Pt 5), 1031-1038）。それは、厳密には、鳥類細胞に制限された宿主細胞になった。親ワクシニアウイルスは広い宿主範囲を有するのに対して、ＭＶＡウイルスは非常に狭い宿主範囲を有する。例えば、ＭＶＡは、ヒト細胞及び非ヒト霊長類細胞では複製しない。ヒトＨｅＬａ細胞株では、複製妨害は、ゲノムパッケージングにおける規定の工程で起こると思われる（Sancho et al. 2002 in J Virol 76, 8318-8334）。加えて、細胞株ＨＥＫ２９３及びＶｅｒｏは、好ましい生産系ではない。得られるＭＶＡウイルスは有意に非病原性であったことが、様々な動物モデルでさらに示された（Mayr and Danner 1978 in Dev Biol Stand 41, 225-234）。加えて、ＭＶＡ株は、ヒト天然痘疾患に対する予防接種ワクチンとして臨床試験で試験されている（Mayr 2003 in Comp Immunol Microbiol Infect Dis 26, 423-430）。これらの研究では、高リスク患者を含む１２０，０００人超のヒトが参加しており、ＭＶＡは、ＣＶＡと比較して低下した病原性又は感染力を有していたが、優れた免疫原性を維持していたことが判明した。
【０００５】
しかしながら、ＭＶＡウイルスの十分な供給を提供するのは困難である。一方、ＭＶＡウイルスは、レシピエントにおいて非常に低レベルで複製するか又は全く複製しないので、高用量で投与されなければならない。一方、現在利用可能なＭＶＡウイルス生産系は時間がかかる高価なものであり、製薬業界の要求を満たすことができない。
【０００６】
上述のように、ＭＶＡの研究及び生産は、鳥類細胞に依存している。現在のところ、鳥類宿主に適合されたワクチン株は、孵化鶏卵又はこのような卵から調製された線維芽細胞でのみ生産される。この技術は、要求の厳しい臨床生産過程への一次動物由来物質の連続注入、及びＳＰＦ（特定病原体除去）ドナー集団の維持費用を含むさらなる不利点を伴う。孵化卵の採取からワクチン生産までの時間が短いため、外来物質の試験は最終バルクで実施される（Philipp and Kolla 2010 in Biologicals 38, 350-351）。時折、品質試験によって混入が確認された場合には、完成したワクチンロットを廃棄しなければならない（Enserink 2004 in Science 306, 385）。
【０００７】
最近、発展途上国又は新興工業国における工業的応用及びワクチンプログラムを促進するために、本発明の発明者らは、鳥類基質に依存するワクチン株に対して完全に許容性の宿主細胞株を設計及び作製した（Jordan et al. 2009 in Vaccine 27, 748-756）。本発明者らはまた、これらのウイルスのための高効率で十分に拡張可能な化学的に定義された生産方法を開発した（Jordan et al. 2011 in Biologicals 39, 50-58）。
【０００８】
今回初めて、身近な上記技術を用いて、本発明者らは、化学的に定義された懸濁培養液におけるウイルス生産で課せられる非常に人工的な条件下において、既に適合された超弱毒化ＭＶＡウイルスの次世代の安定単離株を、同じ超弱毒化ウイルスに対して完全に許容性の細胞基質で特性決定した。これは異例の実験であり、その結果は驚くべきものである。Principles of Virology (ISBN-10: 1555814433）に記載されているように、連続継代の動機は、一般に、最初は低許容性の基質にウイルスを適合させることである：「正常宿主の細胞以外の細胞における成長によって、又は非生理的温度での繁殖によって、低病原性（弱毒化）ウイルスを選択し得る。これらの選択条件下でより良く繁殖することができる突然変異体が、ウイルス複製中に生じる。このような突然変異体を単離し、精製し、続いて適切なモデルで病原性について試験すると、いくつかのものは親よりも低病原性であり得る」。
【０００９】
上記特性決定の結果、構造タンパク質の点突然変異を有する新規ＭＶＡウイルスが同定された。この結果は、特定の宿主細胞内における選択よりも、人工的な培養条件下におけるウイルス繁殖と一致している。新規ＭＶＡウイルスは、化学的に定義された懸濁培養液中で、公知のＭＶＡウイルス株と比較して有益な特性（例えば、増加した感染活性、及び細胞外空間における多数の感染単位）を示す。前記有益な特性は、前記ＭＶＡウイルスの工業的な生産を改善する。特に、それらは、新規ＭＶＡウイルス株を高収率で生産することを可能にする。加えて、この新規ＭＶＡウイルス株は無細胞上清から直接単離し得るので、精製が容易になり、従って、前記ＭＶＡウイルスを生産するバイオリアクターのロジスティック及び操作が容易になる。そして、これにより、ＭＶＡウイルスの生産コストが削減される。
【００１０】
発明の概要
第１の態様では、本発明は、Ａ３Ｌ遺伝子産物及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子産物をコードする核酸配列を含む改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、前記核酸配列が、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも１つの突然変異を含む改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスに関する。
【００１１】
第２の態様では、本発明は、第１の態様のＭＶＡウイルスのゲノムに関する。
【００１２】
第３の態様では、本発明は、第１の態様のＭＶＡウイルス又は第２の態様のゲノムを含む細胞に関する。
【００１３】
第４の態様では、本発明は、第１の態様のＭＶＡウイルスを培養するための方法であって、
（ｉ）第３の態様の細胞を提供する工程、
（ｉｉ）該細胞を培養する工程、及び
（ｉｉｉ）該ＭＶＡウイルスを単離する工程
を含む方法に関する。
【００１４】
第５の態様では、本発明は、第１の態様のＭＶＡウイルスを生産するための方法であって、
（ｉ）ＭＶＡウイルスを細胞に感染させる工程、
（ｉｉ）該細胞を培養する工程、
（ｉｉｉ）該ＭＶＡウイルスを単離する工程、及び
（ｉｖ）Ａ３Ｌ遺伝子産物及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも１つの突然変異を含む核酸配列を含むＭＶＡウイルスが検出されるまで、工程（ｉｉｉ）で単離されたＭＶＡウイルスを用いて工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を繰り返す工程
を含む方法に関する。
【００１５】
第６の態様では、本発明は、第１の態様のＭＶＡウイルス又は第２の態様のゲノムと、１つ以上の薬学的に許容しる賦形剤、希釈剤及び／又は担体とを含む医薬組成物に関する。
【００１６】
第７の態様では、本発明は、第１の態様のＭＶＡウイルス又は第２の態様のゲノムを含むワクチンに関する。
【００１７】
第８の態様では、本発明は、医薬に使用するための第１の態様のＭＶＡウイルス又は第２の態様のゲノムに関する。
【００１８】
第９の態様では、本発明は、核酸配列を含むＭＶＡウイルスであって、Ａ３Ｌ遺伝子及び／又はＡ９Ｌ遺伝子が機能欠失しているＭＶＡウイルスに関する。
【００１９】
第１０の態様では、本発明は、ＭＶＡウイルスのＡ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子を含む細胞であって、前記遺伝子を発現する細胞に関する。
【００２０】
第１１の態様では、本発明は、異種核酸配列に作動可能に連結されたＭＶＡウイルスのＡ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子を含む核酸分子に関する。
【００２１】
第１２の態様では、本発明は、リコンビナントＭＶＡウイルスを生産するための方法であって、以下
（ｉ）細胞を提供する工程、
（ｉｉ）第９の態様のＭＶＡウイルス及び第１１の態様の核酸分子を該細胞に導入する工程、及び
（ｉｉｉ）該ＭＶＡウイルスの核酸配列と該核酸分子との間の相同組換えを可能にする条件下で該細胞を培養し、それにより該リコンビナントＭＶＡウイルスを得る工程
を含む方法に関する。
【００２２】
本発明のこの概要は、本発明の全ての特徴を説明しているわけではない。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明を以下で詳細に説明する前に、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール及び試薬は変化し得るので、本発明はこれらに限定されないことを理解すべきである。本明細書で使用される専門用語は特定の実施態様のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解すべきである。特に定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
【００２４】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)に記載されているように定義される。
【００２５】
いくつかの文献は、本明細書の本文を通して引用される。本明細書で引用される各文献（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書、GenBankアクセッションナンバーの配列提出物などを含む）は、上記又は下記にかかわらず、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書におけるいかなる内容も、本発明は、先行発明によるこのような開示に対する先行権を有しないという自認と解釈されるべきではない。
【００２６】
以下、本発明の要素を説明する。これらの要素を特定の実施態様を用いて記載するが、それらを任意の方法及び任意の数で組み合わせて、さらなる実施態様を作り得ることを理解すべきである。様々に記載されている実施例及び好ましい実施態様は、本発明を明記されている実施態様のみに限定するものと解釈すべきではない。本説明は、明記されている実施態様を任意の数の開示されている要素及び／又は好ましい要素と組み合わせた実施態様をサポート及び包含すると理解すべきである。さらに、本出願における全ての記載されている要素の任意の順列及び組み合わせは、文脈上特に指示がない限り、本出願の説明によって開示されているとみなすべきである。
【００２７】
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上特に必要がない限り、「含む（comprise）」という単語並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などの変化形は、示されている整数若しくは工程又は整数若しくは工程のグループを含み、いかなる他の整数又は工程も整数又は工程のグループも除外しないことを意味すると理解されよう。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される「a」、「an」及び「the」という単数形は、文脈上特に明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【００２８】
本明細書で使用される「弱毒化ウイルス」という用語は、目的のレシピエント（例えば、ヒト又は動物レシピエント）における病原性が低下したウイルスを指す。このような特性は、ウイルスを狭い温度範囲又は狭い宿主範囲及び他の人工的な複製環境（化学的に定義された培地を含む）に適合させることによって達成され得る。このようなウイルスの複製は、目的のレシピエント（例えば、ヒト又は動物レシピエント）由来の細胞内、又は組織環境から取り出された細胞内に限定される。それは、目的のレシピエント以外では（例えば、許容細胞培養液又は実験動物内では）高力価に複製し得る。弱毒化ウイルス株の例は、重度の麻疹疾患から保護するために投与されるEnderの弱毒化麻疹ウイルスEdmonston株、又は１９７０年代に世界保健機関（ＷＨＯ）の痘根絶キャンペーンで使用されたワクシニアウイルス株である。
【００２９】
本明細書で使用される「高度弱毒化ウイルス」という用語は、目的のレシピエント（例えば、ヒト又は動物レシピエント）における病原性が妨害されたウイルスを指す。このような特性は、ウイルスを狭い温度範囲又は狭い宿主範囲及び他の人工的な複製環境（化学的に定義された培地を含む）に適合させることによって達成され得る。このようなウイルスの複製は、目的のレシピエント（例えば、ヒト又は動物レシピエント）由来の細胞内、又は組織環境から取り出された細胞内で妨害される。それは、目的のレシピエント以外では（例えば、許容細胞／細胞培養液又は実験動物内では）高力価に複製し得る。本発明のＭＶＡウイルスは、高度弱毒化ウイルスである。それは、ヒト細胞又は非ヒト霊長類細胞内では複製しない。
【００３０】
本明細書で使用される「宿主制限ウイルス」という用語は、特定の宿主生物内（例えば、鳥類細胞などの細胞内、又は実験動物などの動物内）で（のみ又は主に）複製するウイルスを指す。それは、他の生物内（例えば、鳥類細胞以外の細胞内）では複製しないか、又は非常に低レベルで複製するに過ぎない。宿主制限ウイルスは、宿主生物内（例えば、鳥類細胞内）でウイルスを「（連続）ウイルス継代」することによって得られ得る。本発明のＭＶＡウイルスは、鳥類細胞に制限される。それは、ヒト細胞内では複製しない。
【００３１】
本明細書で使用される「ウイルス継代」という用語は、ウイルスを一連の宿主生物（例えば、細胞又は動物、例えば実験動物）に感染させることを含む過程を指す。ウイルスを加える度にいくらかインキュベーションし、次いで、インキュベーションしたウイルスを次の宿主生物に感染させる。この過程は、「連続ウイルス継代」とも表記され得る。例えば、連続ウイルス継代により、（高度）弱毒化ウイルス及び／又は宿主制限ウイルスの作製が可能になる。本発明のＭＶＡウイルスは、高度弱毒化ウイルスである。それは、鳥類細胞に制限される。それは、ヒト細胞又は非ヒト霊長類細胞内では複製しない。
【００３２】
宿主生物（例えば、鳥類細胞などの細胞又は実験動物などの動物）が「許容性」という用語によって規定される場合、それは、ウイルスが前記生物の防御を回避することができ、細胞に侵入して前記細胞内で複製し、前記細胞から脱出することができるという事実を指す。通常、ウイルスが前記生物の細胞内因性防御及び／又は前記生物の免疫系の１つ又はいくつかをモデュレーションした場合に、これが起こる。
【００３３】
本明細書で使用される「レシピエント」という用語は、ウイルスを受け入れ得る（例えば、ウイルスをワクチン接種し得る）被験体を指す。被験体は、ヒト又は動物であり得る。前記動物は、哺乳類種のメンバー、例えばイヌ、ネコ、オオカミ、イタチ、齧歯類（例えば、マウス、ラット又はハムスター）、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、コウモリ（例えば、オオコウモリ又はココウモリ）又は非ヒト霊長類（例えば、類人猿などのサル）であり得る。特に、本発明のＭＶＡウイルスは、ヒトレシピエント又は非ヒト霊長類レシピエントでは複製しない。
【００３４】
本明細書で使用される「宿主生物」という用語は、ウイルスの生産及び／又は適合に使用され得る生物を指す。宿主生物は、細胞又は動物、例えば実験動物であり得る。細胞は、鳥類細胞（例えば、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞、例えばアヒル網膜（ＣＲ）細胞）であり得る。動物、特に実験動物は、鳥類（例えば、ニワトリ、ウズラ、ガチョウ又はアヒル）、イヌ、イタチ、齧歯類（例えば、マウス、ラット又はハムスター）、ヒツジ、ヤギ、ブタ、コウモリ（例えば、オオコウモリ又はココウモリ）又は非ヒト霊長類（例えば、類人猿などのサル）であり得る。特に、本発明のＭＶＡウイルスは、鳥類細胞内（例えば、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞内）で、又は鳥類で（例えば、ニワトリ、ウズラ、ガチョウ又はアヒルで）複製する。
【００３５】
本明細書で使用される「感染」という用語は、ウイルスが細胞内で複製してウイルス粒子を産生する能力を指す。感染力は、ウイルス負荷を検出することによって、又はヒト若しくは動物における疾患進行を観察することによって評価され得る。
【００３６】
本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、レシピエント（例えば、ヒト又は動物レシピエント）で防御免疫を誘発するのに使用され得る薬剤を指す。いくつかの個体は、ロバストな免疫応答も防御免疫応答も、又はいくつかの場合ではいかなる免疫応答も開始することができない場合があるので、有効であるためには、ワクチンは、免疫集団の一部で免疫を誘発し得る。この不能性は、レシピエントの遺伝的背景、又は免疫不全状態（後天性又は先天性のいずれか）若しくは免疫抑制（例えば、化学療法による処置又は免疫抑制薬の使用に起因する）の理由から生じ得る。ワクチンの有効性は、動物モデルで立証され得る。本発明のワクチンは、第１の態様のＭＶＡウイルス又は第２の態様のゲノムを含む。これに関して、ＭＶＡウイルスそれ自体がワクチンであり得ることに留意すべきである。それは、痘に対する保護を付与する。しかしながら、前記ウイルスは、レシピエントでさらなる防御免疫が誘発され得る異種核酸配列（例えば、抗原、特に抗原のエピトープをコードする配列）をさらに含み得る。異種核酸配列を含むＭＶＡウイルスは、リコンビナントＭＶＡウイルスとも表記され得る。
【００３７】
本明細書で使用される「ワクチン接種」という用語は、感染性ウイルス（例えば、前記感染性ウイルスの弱毒化型又は不活性型）をレシピエント（例えば、ヒト又は動物レシピエント）に負荷して、特異的免疫を誘導することを意味する。本発明では、第１の態様のＭＶＡウイルス又は第２の態様のゲノムをレシピエントに負荷して、痘に対する免疫を誘導する。しかしながら、本発明との関連では、「ワクチン接種」という用語はまた、異種核酸配列をさらに含むＭＶＡウイルスをレシピエントに負荷することを包含する。異種配列は、さらなる防御免疫を誘発すべき配列である。それは、抗原、特に抗原のエピトープをコードし得る。異種核酸配列を含むＭＶＡウイルスは、リコンビナントＭＶＡウイルスとも表記され得る。
【００３８】
前記ウイルスに対して異種のこのようなエピトープの例は、例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フラビウイルス、パラミクソウイルス、ハンタウイルス若しくはフィロウイルスなどの他のウイルスのタンパク質由来のエピトープ、又は腫瘍及びガンの発症に関連するタンパク質由来のエピトープを包含する。ワクチンをレシピエントの体内に投与した後、エピトープが発現されて免疫系に提示され、これらのエピトープに対する特異的免疫応答が誘導され得る。従って、レシピエントは、エピトープを含有するタンパク質に対して免疫される。
【００３９】
本明細書で使用される「異種核酸配列」という用語は、天然には通常見られない核酸配列であって、ウイルス、特に本発明のＭＶＡウイルスに密接に関連する核酸配列を指す。異種核酸配列を含むウイルスは、リコンビナントウイルスとも表記され得る。
【００４０】
本明細書で使用される「保護する」という用語は、レシピエント（例えば、ヒト）における疾患（例えば、痘）の発症又は継続を必要に応じて予防若しくは処置するか、又はその両方をすることを意味する。
【００４１】
本明細書で使用される「防御免疫」は、免疫（ワクチン接種）された被験体において、例えば、多量の病原体（例えば、ポックスウイルスなどのウイルス）若しくは感染細胞を排除若しくは軽減するか、又は感染症の任意の他の測定可能な緩和をもたらすのに有効な体液性（抗体）免疫若しくは細胞性免疫又はその両方を含む。
【００４２】
上述のように、本発明の発明者らは、化学的に定義された懸濁培養液におけるウイルス生産で課せられる非常に人工的な条件下において、既に適合された超弱毒化ＭＶＡウイルスの次世代の安定単離株を、同じ超弱毒化ウイルスに対して完全に許容性の細胞基質で特性決定した。上記特性決定の結果、構造タンパク質の点突然変異を有する新規ＭＶＡウイルスが同定された。新規ＭＶＡウイルスは、化学的に定義された懸濁培養液中で、公知のＭＶＡウイルス株と比較して有益な特性（例えば、増加した感染活性、及び細胞外空間における多数の感染単位）を示す。前記有益な特性は、前記ＭＶＡウイルスの工業的な生産を改善する。特に、それらは、新規ＭＶＡウイルス株を高収率で生産することを可能にする。加えて、この新規ＭＶＡウイルス株は無細胞上清から直接単離し得るので、精製が容易になり、従って、前記ＭＶＡウイルスを生産するバイオリアクターのロジスティック及び操作が容易になる。そして、これにより、ＭＶＡウイルスの生産コストが削減される。
【００４３】
従って、本発明の第１の態様は、Ａ３Ｌ遺伝子産物及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子産物をコードする核酸配列を含む（突然変異）改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、前記核酸配列が、前記遺伝子産物（すなわち、前記Ａ３Ｌ遺伝子産物及び／又は前記Ａ３４Ｒ遺伝子産物）の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸配列改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つの突然変異）を含む（突然変異）改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスに関する。
【００４４】
上記遺伝子産物をコードする核酸配列は、各前記遺伝子産物の１つの／少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸配列改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ又は３つの突然変異）を含むことに留意すべきである。
【００４５】
前記アミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸改変）は、アミノ酸欠失（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸欠失）、アミノ酸挿入（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸挿入）、アミノ酸付加（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸付加）及び／又はアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸置換）であり得る。「アミノ酸置換（amino acid replacement）」はまた、本明細書では「アミノ酸置換（amino acid substitution）」とも表記され得る。本明細書で使用される「アミノ酸挿入」という用語は、Ａ３Ｌ遺伝子産物、Ａ３４Ｒ遺伝子産物及び／又はＡ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸配列内で起こるアミノ酸改変を指すが、本明細書で使用される「アミノ酸付加」という用語は、Ａ３Ｌ遺伝子産物、Ａ３４Ｒ遺伝子産物及び／又はＡ９Ｌ遺伝子産物のＮ末端又はＣ末端で起こるアミノ酸改変を指す。
【００４６】
一実施態様では、ＭＶＡウイルスは、Ａ３Ｌ遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記Ａ３Ｌ遺伝子産物の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ又は３つの突然変異）を含む核酸配列を含む。別の実施態様では、ＭＶＡウイルスは、Ａ３４Ｒ遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記Ａ３４Ｒ遺伝子産物の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ又は３つの突然変異）を含む核酸配列を含む。
【００４７】
好ましくは、核酸配列は、Ａ９Ｌ遺伝子産物をさらにコードし、前記核酸配列は、前記遺伝子産物の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ又は３つの突然変異）を含む。
【００４８】
より好ましくは、
（ｉ）ウイルスは、Ａ３Ｌ遺伝子産物及びＡ９Ｌ遺伝子産物をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、前記遺伝子産物（すなわち、前記Ａ３Ｌ遺伝子産物及び前記Ａ９Ｌ遺伝子産物）の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つの突然変異）を含む、
（ｉｉ）ウイルスは、Ａ３４Ｒ遺伝子産物及びＡ９Ｌ遺伝子産物をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、前記遺伝子産物（すなわち、前記Ａ３４Ｒ遺伝子産物及び前記Ａ９Ｌ遺伝子産物）の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つの突然変異）を含む、又は
（ｉｉｉ）ウイルスは、Ａ３Ｌ遺伝子産物、Ａ３４Ｒ遺伝子産物及びＡ９Ｌ遺伝子産物をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、前記遺伝子産物（すなわち、前記Ａ３Ｌ遺伝子産物、前記Ａ３４Ｒ遺伝子産物及び前記Ａ９Ｌ遺伝子産物）の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つの突然変異）を含む。
【００４９】
上記遺伝子産物をコードする核酸配列は、各前記遺伝子産物の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ又は３つの突然変異）を含むことに留意すべきである。
【００５０】
前記アミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸改変）は、アミノ酸欠失（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸欠失）、アミノ酸挿入（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸挿入）、アミノ酸付加（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸付加）及び／又はアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸置換）であり得る。
【００５１】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、このような突然変異ＭＶＡウイルスが非突然変異ＭＶＡウイルスよりも高収率で生産され得ることを見出した。
【００５２】
（ｉ）アミノ酸配列改変（例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換）は、配列番号１のＡ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３４〜６４４、好ましくはアミノ酸位置６３６〜６４２又はそれらに対応するアミノ酸位置に及ぶ領域内にあり、
（ｉｉ）アミノ酸配列改変（例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換）は、配列番号２のＡ３４Ｒ遺伝子産物のアミノ酸位置８１〜９１、好ましくはアミノ酸位置８３〜８９又はそれらに対応するアミノ酸位置に及ぶ領域内にあり、及び／又は
（ｉｉｉ）アミノ酸配列改変（例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換）は、配列番号３のＡ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７０〜８０、好ましくはアミノ酸位置７２〜７８又はそれらに対応するアミノ酸位置に及ぶ領域内にあることが好ましい。
【００５３】
従って、アミノ酸配列改変（例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換）は、（ｉ）配列番号１のＡ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３若しくは６４４又はそれらに対応するアミノ酸位置、（ｉｉ）配列番号２のＡ３４Ｒ遺伝子産物のアミノ酸位置８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０若しくは９１又はそれらに対応するアミノ酸位置、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号３のＡ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９若しくは８０又はそれらに対応するアミノ酸位置にあり得る。
【００５４】
本発明との関連では、２つ以上の遺伝子産物中のアミノ酸残基は、その残基がその遺伝子産物構造で類似位置を占めている場合に、互いに「対応する」と言われる。当技術分野で周知であるように、２つ以上の遺伝子産物中の類似位置は、アミノ酸配列又は構造類似性に基づいて遺伝子産物の配列をアライメントすることによって決定され得る。このようなアライメントツールは当業者に周知であり、例えば、ワールドワイドウェブで入手することができ、例えば標準的な設定（好ましくは、Ａｌｉｇｎ  ＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  １０．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  ０．５）を使用するClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw)又はAlign (http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)である。当業者であれば、十分なアライメントを実現するためにはいずれかの配列内にギャップを導入することが必要であり得ることを理解する。２つ以上の遺伝子産物中のアミノ酸残基は、その残基が最良の配列アライメントでアライメントされている場合に、「対応する」と言われる。２つの遺伝子産物間の「最良の配列アライメント」は、アライメントされた同一残基の数を最大にするアライメントと定義される。２つのアライメント配列間の配列類似性、好ましくは同一性が１０、２０又は３０アミノ酸長にわたって３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満に低下する場合、「最良の配列アライメントの領域」は終了し、それにより、類似性スコアを決定するための比較配列の長さの境界及び限度が決定される。
【００５５】
（ｉ）アミノ酸配列改変（例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換）は、Ａ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３９又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、
（ｉｉ）アミノ酸配列改変（例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換）は、Ａ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３８又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、
（ｉｉｉ）アミノ酸配列改変（例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換）は、Ａ３４Ｒ遺伝子産物のアミノ酸位置８６又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、
（ｉｖ）アミノ酸配列改変（例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換）は、Ａ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７５又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、並びに／又は
（ｖ）アミノ酸配列改変（例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換）は、Ａ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７４又はそれに対応するアミノ酸位置にあることがさらに好ましい。
【００５６】
アミノ酸配列改変はアミノ酸欠失又はアミノ酸置換であり、
（ｉ）Ａ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３９若しくはそれに対応するアミノ酸位置のＨが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ若しくはＷ、負のアミノ酸、好ましくはＤ若しくはＥ、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはＳ、Ｔ、Ｎ若しくはＱで置換されており、
（ｉｉ）Ａ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３８若しくはそれに対応するアミノ酸位置のＲが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ若しくはＷ、負のアミノ酸、好ましくはＤ若しくはＥ、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはＳ、Ｔ、Ｎ若しくはＱで置換されており、
（ｉｉｉ）Ａ３４Ｒ遺伝子産物のアミノ酸位置８６若しくはそれに対応するアミノ酸位置のＤが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ若しくはＷ、正のアミノ酸、好ましくはＲ、Ｈ若しくはＫ、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはＳ、Ｔ、Ｎ若しくはＱで置換されており、
（ｉｖ）Ａ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７５若しくはそれに対応するアミノ酸位置のＫが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ若しくはＷ、負のアミノ酸、好ましくはＤ若しくはＥ、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはＳ、Ｔ、Ｎ若しくはＱで置換されており、並びに／又は
（ｖ）Ａ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７４若しくはそれに対応するアミノ酸位置のＫが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ若しくはＷ、負のアミノ酸、好ましくはＤ若しくはＥ、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはＳ、Ｔ、Ｎ若しくはＱで置換されていることがより好ましい。
【００５７】
アミノ酸置換は、
（ｉ）Ａ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３９又はそれに対応するアミノ酸位置のＨのＹによるアミノ酸置換（Ｈ６３９Ｙ  Ａ３Ｌ遺伝子産物突然変異体）、
（ｉｉ）Ａ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３８又はそれに対応するアミノ酸位置のＲのＹによるアミノ酸置換（Ｒ６３８Ｙ  Ａ３Ｌ遺伝子産物突然変異体）、
（ｉｉｉ）Ａ３４Ｒ遺伝子産物のアミノ酸位置８６又はそれに対応するアミノ酸位置のＤのＹによるアミノ酸置換（Ｄ８６Ｙ  Ａ３４Ｒ遺伝子産物突然変異体）、
（ｉｖ）Ａ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７５又はそれに対応するアミノ酸位置のＫのＥによるアミノ酸置換（Ｋ７５Ｅ  Ａ９Ｌ遺伝子産物突然変異体）、及び／又は
（ｖ）Ａ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７４又はそれに対応するアミノ酸位置のＫのＥによるアミノ酸置換（Ｋ７４Ｅ  Ａ９Ｌ遺伝子産物突然変異体）であることがさらにより好ましい。
【００５８】
アミノ酸置換は、
（ｉ）Ａ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３９又はそれに対応するアミノ酸位置のＨのＹによるアミノ酸置換、及びＡ３４Ｒ遺伝子産物のアミノ酸位置８６又はそれに対応するアミノ酸位置のＤのＹによるアミノ酸置換（Ｈ６３９Ｙ  Ａ３Ｌ／Ｄ８６Ｙ  Ａ３４Ｒ遺伝子産物突然変異体）、
（ｉｉ）Ａ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３９又はそれに対応するアミノ酸位置のＨのＹによるアミノ酸置換、及びＡ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７５又はそれに対応するアミノ酸位置のＫのＥによるアミノ酸置換（Ｈ６３９Ｙ  Ａ３Ｌ／Ｋ７５Ｅ  Ａ９Ｌ遺伝子産物突然変異体）、
（ｉｉｉ）Ａ３４Ｒ遺伝子産物のアミノ酸位置８６又はそれに対応するアミノ酸位置のＤのＹによるアミノ酸置換、及びＡ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７５又はそれに対応するアミノ酸位置のＫのＥによるアミノ酸置換（Ｄ８６Ｙ  Ａ３４Ｒ／Ｋ７５Ｅ  Ａ９Ｌ遺伝子産物突然変異体）、又は
（ｉｖ）Ａ３Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置６３９又はそれに対応するアミノ酸位置のＨのＹによるアミノ酸置換、Ａ３４Ｒ遺伝子産物のアミノ酸位置８６又はそれに対応するアミノ酸位置のＤのＹによるアミノ酸置換、及びＡ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸位置７５又はそれに対応するアミノ酸位置のＫのＥによるアミノ酸置換（Ｈ６３９Ｙ  Ａ３Ｌ／Ｄ８６Ｙ  Ａ３４Ｒ／Ｋ７５Ｅ  Ａ９Ｌ遺伝子産物突然変異体）であることがさらにより好ましい。
【００５９】
（ｉ）Ｈ６３９Ｙ突然変異を有するＡ３Ｌ遺伝子産物は配列番号４のアミノ酸配列を有するか、又は前記アミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９９％、例えば少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％同一のその変異体であって、アミノ酸位置６３９又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸Ｙを（依然として）含む変異体であり、
（ｉｉ）Ｄ８６Ｙ突然変異を有するＡ３４Ｒ遺伝子産物は配列番号５のアミノ酸配列を有するか、又は前記アミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９９％、例えば少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％同一のその変異体であって、アミノ酸位置８６又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸Ｙを（依然として）含む変異体であり、及び／又は
（ｉｉｉ）Ｋ７５Ｅ突然変異を有するＡ９Ｌ遺伝子産物は配列番号６のアミノ酸配列を有するか、又は前記アミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９９％、例えば少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％同一のその変異体であって、アミノ酸位置７５又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸Ｅを（依然として）含む変異体であることが最も好ましい。
【００６０】
配列同一性は、（ｉ）配列番号４の各参照アミノ酸配列の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、３００、４００、５００、６００アミノ酸又はそれ以上の連続するストレッチにわたって少なくとも８５％、９０％、９５％又は９９％であるか、（ｉｉ）配列番号５の各参照アミノ酸配列の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０アミノ酸又はそれ以上の連続するストレッチにわたって少なくとも８５％、９０％、９５％又は９９％であるか、又は（ｉｉｉ）配列番号６の各参照アミノ酸配列の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０アミノ酸又はそれ以上の連続するストレッチにわたって少なくとも８５％、９０％、９５％又は９９％であることが特に好ましい。配列同一性は、配列番号４、配列番号５又は配列番号６の各参照アミノ酸配列の全長にわたって少なくとも８５％であるか、全長にわたって少なくとも９０％であるか、全長にわたって少なくとも９５％であるか、又は全長にわたって少なくとも９９％であることがさらに特に好ましい。
【００６１】
好ましくは、上記変異体は、機能的に活性な変異体である。これは、アミノ酸配列中の（さらなる）変異が、培養中に、公知のＭＶＡウイルスと比較した本発明のＭＶＡウイルスの有益な特性（例えば、増加した感染活性、及び／又は細胞外空間における多数の感染単位）に悪影響を与えないことを意味する。前記有益な特性は、例えば、本発明のＭＶＡウイルスを高収率で生産することを可能にする。前記有益な特性が上記変異体に依然として存在することを試験するための実験は、実験セクションに記載されている。
【００６２】
ＭＶＡの上記Ａ３Ｌ遺伝子産物（Ｐ４ｂタンパク質とも称される）は３つの主なコアタンパク質の１つであり、球状の非感染性未成熟ビリオン（ＩＶ）が細胞内成熟ビリオン（ＩＭＶ）に成熟する間に、Ｉ７Ｌコードウイルスプロテアーゼによってプロセシングされる。ＭＶＡのＡ３Ｌ遺伝子産物は、非常に初期の段階におけるビリオンの形態形成に寄与して、感染性ＩＭＶへの移行における正確な凝縮及び膜再構成を可能にする。さらに、ＭＶＡの上記Ａ３４Ｒ遺伝子産物は、細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）の外膜を不安定化するので、細胞外空間における感染活性及びウイルスの拡散に極めて重要である。ＥＥＶは、ウイルスが遠位部位に拡散するのを可能にするビヒクルとして進化してきた。ＥＥＶのさらなる膜は、ターゲット細胞との融合を媒介するために備わっているのではなく、ＩＭＶ（実際のウイルス感染単位）を放出するためには破壊されなければならない。加えて、ＭＶＡのＡ３４Ｒ遺伝子産物は、細胞結合エンベロープウイルス（ＣＥＶ）が産生細胞から離れる速度をモデュレーションする。さらに、ＭＶＡのＡ９Ｌ遺伝子産物は、Ａ３Ｌ遺伝子産物のように、ＭＶＡ成熟の初期段階に関与する。それは、ＩＭＶのコアの正確な凝縮に重要な因子である。
【００６３】
好ましくは、ＭＶＡウイルスは、単離されたＭＶＡウイルスである。本明細書で使用される「単離されたＭＶＡウイルス」という用語は、そのネイティブな環境又は培養環境から取り出されたウイルスを指す。従って、単離されたＭＶＡウイルスは、一部又は全部の細胞成分（すなわち、ウイルスが天然に存在する細胞又はそれが培養される細胞の成分（例えば、細胞質成分又は膜成分））を含まなくてもよい。それはまた、一部又は全部の培養成分（例えば、培養培地又は培養関連不純物、例えば培養残物）を含まなくてもよい。
【００６４】
単離されたＭＶＡウイルスは、さらに精製され得る。従って、より好ましくは、ＭＶＡウイルスは、精製されたＭＶＡウイルスである。本明細書で使用される「精製されたＭＶＡウイルス」という用語は、無関係な物質（すなわち、ウイルスが得られるネイティブな物質、例えば細胞残屑、細胞残骸、細胞タンパク質、細胞ＤＮＡ分子及び／又は細胞ＲＮＡ分子を含む混入物質）の存在を低減又は排除する条件下で単離されたウイルスを指す。精製されたＭＶＡウイルスは、好ましくは、細胞及び／又は培養成分を実質的に含まない。本明細書で使用される「実質的に含まない」という用語は、物質の分析試験との関連で操作上使用される。混入物質を実質的に含まない精製されたＭＶＡウイルスは、好ましくは少なくとも５０％純粋であり、より好ましくは少なくとも９０％純粋であり、さらにより好ましくは少なくとも９９％又は１００％純粋である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、及び当技術分野で公知の他の方法によって評価され得る。
【００６５】
ＭＶＡウイルスは、異種核酸配列をさらに含むことが好ましい。「異種核酸配列」という用語は、上で定義されている。異種核酸配列の発現は、ＭＶＡウイルスプロモーターの転写コントロール下にあり得る。異種核酸配列は、ＭＶＡウイルスの核酸配列に挿入される。本発明の好ましい実施態様では、異種核酸配列は、ＭＶＡウイルスの核酸配列／ゲノムの非必須領域に挿入される。本発明のより好ましい実施態様では、異種核酸配列は、ＭＶＡの核酸配列／ゲノムの天然に存在する欠失部位（例えば、欠失部位Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ又はＶＩ）に挿入される。異種核酸配列をＭＶＡウイルスゲノムに挿入する方法は当業者に公知である。
【００６６】
異種核酸配列は、抗原、特に抗原のエピトープ、診断用化合物又は治療用化合物をコードする配列から選択されることがより好ましい。「エピトープ（抗原決定基としても公知である）」という用語は、免疫系によって、具体的には抗体、Ｂ細胞又はＴ細胞によって認識される抗原の部分を指す。
【００６７】
抗原又はエピトープは、前記抗原又はエピトープに対する免疫応答を誘導するためのワクチンとして有用であり得る。前記ウイルスに対して異種のこのような抗原の例は、例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フラビウイルス、パラミクソウイルス、ハンタウイルス若しくはフィロウイルスなどの他のウイルスのタンパク質、又は腫瘍及びガンの発症に関連するタンパク質、例えばＨｅｒ２／ｎｅｕ又はＭＵＣ−１を包含する。前記ウイルスに対して異種のこのようなエピトープの例は、例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フラビウイルス、パラミクソウイルス、ハンタウイルス若しくはフィロウイルスなどの他のウイルス由来のタンパク質由来のエピトープ、又は腫瘍及びガンの発症に関連するタンパク質由来のエピトープ、例えばＨｅｒ２／ｎｅｕ又はＭＵＣ−１の細胞外ペプチドを包含する。
【００６８】
治療用化合物は、治療効果を有する任意の化合物であり得る。例えば、治療用化合物は、組織成長、細胞成長、細胞分化に影響を与えるか若しくはこれに関与する化合物、免疫応答などの生物学的作用を引き起こすことができる化合物、又は１つ以上の生物学的過程において任意の他の役割を果たし得る化合物であり得る。特に、前記化合物は、抗菌化合物、抗ウイルス化合物、抗真菌化合物、免疫抑制化合物、成長因子、酵素、抗炎症化合物又は抗アレルギー化合物であり得る。治療用化合物はまた、アンチセンス核酸であり得る。
【００６９】
診断用化合物は、診断効果を有する任意の化合物であり得る。例えば、診断用化合物は、マーカー／レポータータンパク質、例えば抗体、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ、又は抗生物質耐性付与タンパク質、例えばアンピシリンに対するｂｌａ（β−ラクタマーゼ）、若しくはネオマイシン若しくはＧ４１８に対するｎｐｔ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）であり得る。前記マーカー／レポータータンパク質は、例えば、ハイブリダイゼーション技術、蛍光顕微鏡法又はＥＬＩＳＡアッセイを使用することによってウイルスを同定又は単離するのに使用され得る。加えて、ウイルスに含まれる抗生物質耐性付与タンパク質は、抗生物質選択に対する耐性を感染細胞に付与する。
【００７０】
既に上述のように、ＭＶＡウイルスは、高度弱毒化ウイルスである。本発明の一実施態様では、ＭＶＡウイルスは、鳥類細胞内で産生的に複製可能である。本明細書で使用される「産生的複製」という用語は、ウイルスが細胞変性効果を引き起こし、最終的には感染培養物中で大量の細胞死を引き起こすレベルまで複製することを意味し得る。再産生的複製の場合、培養物に感染させるために追加したウイルスよりも多くのウイルスを、感染培養物から少なくとも一度は回収し得る。産生的複製とは対照的に、再産生的複製は、細胞変性効果を伴わずに非常に低レベルで起こり得、最終的には生存培養物中のウイルスの消失につながり得る。
【００７１】
前記鳥類細胞は、好ましくは、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞（例えば、アヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞）である。前記鳥類細胞（例えば、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞、例えばアヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞）は、一次細胞（又は一次細胞培養物由来の細胞）、二次細胞（又は二次細胞培養物由来の細胞）又は不死化細胞（細胞株由来の細胞）であり得る。本明細書で使用される「一次細胞」又は「一次細胞培養物」という用語は、通常は、老化、培養停止又は細胞死に悩む前に、５０回の集団倍加を超えて継代することができない細胞又は培養物を指す。本明細書で使用される「二次細胞」又は「二次細胞培養物」という用語は、一次細胞又は一次細胞培養物に直接由来する細胞又は培養物を指す。集団倍加の制限は、依然として当てはまる。本明細書で使用される「不死化細胞」又は「不死化細胞培養物」という用語は、可能な細胞倍加の回数によって制限されない細胞又は培養物及びその子孫を指す。細胞培養物は、一次細胞、二次細胞又は不死化細胞（すなわち、細胞株の細胞）からなり得る。本発明の好ましい実施態様では、細胞は、ＣＲ又はＣＲ．ｐＩＸ細胞株に由来する。ＣＲ及びＣＲ．ｐＩＸ細胞株は、ワクチン生産のために設計された不死化バリケン（Ｍｕｓｃｏｖｙ  ｄｕｃｋ）網膜細胞（Jordan, et al. 2009 in Vaccine 27, 748-756）に由来する。ＣＲ．ｐＩＸ細胞株は、アデノウイルスｐＩＸタンパク質をコードする遺伝子がそのゲノムにさらに安定的に組み込まれており、前記遺伝子を発現する。本発明の他の好ましい実施態様では、細胞は、ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞である。前記細胞は、一次細胞である。
【００７２】
本発明の別の実施態様では、ＭＶＡウイルスは、哺乳類細胞内では産生的に複製不可能であり、前記哺乳類細胞は、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、フルーツコウモリＲ０５Ｔ細胞、フルーツコウモリＲ０５Ｒ細胞及びフルーツコウモリＲ０６Ｅ細胞ではない。Ｒ０５Ｔ細胞、Ｒ０５Ｒ細胞及びＲ０６Ｅ細胞は、Egyptian rousette由来の一次細胞の不死化によって得られた細胞である。これらは、非常に数少ないＭＶＡ許容性の哺乳類細胞株の１つである（Jordan et al. 2009 in Virus Res 145, 54-62）。本発明の好ましい実施態様では、ＭＶＡウイルスは、霊長類細胞、より好ましくはヒト細胞内では産生的に複製不可能である。
【００７３】
本発明のＭＶＡウイルスは、配列番号１のアミノ酸改変前アミノ酸配列を有するＡ３Ｌ遺伝子産物、及び／又は配列番号２のアミノ酸改変前アミノ酸配列を有するＡ３４Ｒ遺伝子産物をコードする核酸配列を含み得る。前記核酸配列は、配列番号３のアミノ酸改変前アミノ酸配列を有するＡ９Ｌ遺伝子産物をさらにコードし得る。
【００７４】
さらに、各Ａ３Ｌ遺伝子は配列番号７の突然変異前核酸配列を有し得、各Ａ３４Ｒ遺伝子は配列番号８の突然変異前核酸配列を有し得、及び／又は各Ａ９Ｌ遺伝子は配列番号９の突然変異前核酸配列を有し得る。
【００７５】
さらに、突然変異Ａ３Ｌ遺伝子は配列番号１０の核酸配列を有し得、突然変異Ａ３４Ｒ遺伝子は配列番号１１の核酸配列を有し得、及び／又は突然変異Ａ９Ｌ遺伝子は配列番号１２の核酸配列を有し得る。
【００７６】
加えて、本発明のＭＶＡウイルスは、アクセッションナンバーＡＹ６０３３５５（バージョンＡＹ６０３３５５．１及びＧＩ：４７０８８３２６）の突然変異前核酸配列を含み得る。
【００７７】
第２の態様では、本発明は、第１の態様の（突然変異）ＭＶＡウイルスのゲノムに関する。
【００７８】
第３の態様では、本発明は、第１の態様の（突然変異）ＭＶＡウイルス又は第２の態様のゲノムを含む細胞に関する。第１の態様の（突然変異）ＭＶＡウイルス又は第２の態様のゲノムを含む細胞は、宿主細胞とも表記され得る。前記細胞は、第１の態様のＭＶＡウイルスを培養するためのものであり得る。前記細胞は、第１の態様のＭＶＡウイルスが複製することができる任意の細胞であり得る。前記細胞は、霊長類細胞、特にヒト細胞ではないことが好ましい。前記細胞は、鳥類細胞であることがさらに好ましい。前記鳥類細胞は、好ましくは、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞（例えば、アヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞）である。前記鳥類細胞（例えば、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞、例えばアヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞）は、一次細胞（又は一次細胞培養物由来の細胞）、二次細胞（又は二次細胞培養物由来の細胞）又は不死化細胞（細胞株由来の細胞）であり得る。「一次細胞」、「一次細胞培養物」、「二次細胞」、「二次細胞培養物」、「不死化細胞」又は「不死化細胞培養物」という用語の定義については、本発明の第１の態様を参照のこと。本発明の好ましい実施態様では、細胞は、ＣＲ又はＣＲ．ｐＩＸ細胞株に由来する。ＣＲ及びＣＲ．ｐＩＸ細胞株は、ワクチン生産のために設計された不死化バリケン網膜細胞（Jordan, et al. 2009 in Vaccine 27, 748-756）に由来する。ＣＲ．ｐＩＸ細胞株は、アデノウイルスｐＩＸタンパク質をコードする遺伝子がそのゲノムにさらに安定的に組み込まれており、前記遺伝子を発現する。本発明の他の好ましい実施態様では、細胞は、ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞である。前記細胞は、一次細胞である。
【００７９】
好ましくは、細胞は、単離された細胞である。本明細書で使用される「単離された細胞」という用語は、そのネイティブな環境又は培養環境から取り出された細胞を指す。従って、単離された細胞は、一部又は全部のネイティブな成分又は培養成分（すなわち、細胞が天然に存在する生物の成分（例えば、器官、特に組織）又はそれが培養される有機体の成分（例えば、培養培地又は培養物関連不純物、例えば培養残物））を含まなくてもよい。
【００８０】
第１の態様のＭＶＡウイルスを細胞に感染させ得るか、又は第２の態様のゲノムで細胞をトランスフェクションし得る。細胞に感染させる技術又は細胞をトランスフェクションする技術は当業者に公知である。
【００８１】
細胞は、非接着／懸濁細胞であることがさらに好ましい。一般に、懸濁液又は接着培養物中で細胞を成長させ得る。血流中に存在する細胞（例えば、造血細胞）などのいくつかの細胞は、表面に付着せずに懸濁液中で自然に生存する。接着細胞（例えば、一次細胞）は、組織培養プラスチック担体又はマイクロ担体などの表面を必要とし、これらを細胞外マトリックス成分でコーティングして、接着特性を増加させ、成長及び分化に必要な他のシグナルを提供し得る。固形組織由来のほとんどの細胞は、接着性である。接着細胞は、通常、細胞生物学研究ではその元の形態で使用される。懸濁培養液中で生存することができるように改変された細胞もあり、接着条件が可能にするよりも高密度にそれらを成長させ得る。接着条件下では、成長は、すなわち、生産収率を制限し得る表面積によって制限される。このような懸濁液適合細胞又は非接着成長適合細胞は、通常、バルクタンパク質の生産又はバッチ回収に使用される。非接着条件下では、成長は、培養培地中の細胞の濃度によって制限されるので、より容易なスケールアップが可能になる。
【００８２】
「非接着」及び「懸濁液」という用語は、本明細書で互換的に使用される。本発明との関連では、「非接着細胞」及び「懸濁細胞」という用語は、表面（例えば、組織培養プラスチック担体又はマイクロ担体）に付着せずに懸濁培養液中で生存することができる細胞を指す。前記細胞は、表面に付着せずに懸濁液中で自然に生存し得る細胞であり得る。前記細胞はまた、表面（例えば、組織培養プラスチック担体又はマイクロ担体）に付着せずに懸濁培養液中で生存することができるように改変又は適合された細胞であり得る。上述のように、ほとんどの細胞は、それらの元の形態、非改変形態又は非適合形態の接着細胞である。通常、接着条件が可能にするよりも高密度に非接着細胞を成長させ得る。従って、それは、工業規模での（例えば、バイオリアクター環境又は撹拌培養での）培養により適切である。細胞は、通常、非接着細胞培養に適合されなければならない。元の細胞は、無血清条件下及び／又は適切な表面の非存在下ではアポトーシスを受けるので、この適合は、漸減量の血清（例えば、１０％から０％までの希釈系列のウシ胎仔血清（ＦＣＳ））と共に継代することにより、不可逆的に改変された細胞集団を選択することを必要とする長期的な過程である。適合された非接着細胞は、当技術分野で公知である。当業者であれば、細胞を接着状態から非接着状態に移行させるためのプロトコールを認識している（例えば、Appl Microbiol Biotechnol. 2008 Mar;78(3):391-9. Epub 2008 Jan 9を参照のこと）。
【００８３】
それとは対照的に、本明細書で使用される「接着細胞」という用語は、組織培養プラスチック担体又はマイクロ担体などの表面を必要とする細胞を指す。前記表面を細胞外マトリックス成分でコーティングして、接着特性を増加させ、成長及び分化に必要な他のシグナルを提供し得る。前記細胞は定期的な継代を必要とするが、倒立顕微鏡下における容易な目視検査を可能にする。前記細胞は、（例えば、トリプシンを用いて）酵素的に解離され得る。加えて、接着細胞の成長は、生産収率を制限し得る表面積によって制限される。
【００８４】
本発明の好ましい実施態様では、非接着／懸濁細胞は、無血清条件下で成長する。本明細書で使用される「無血清条件」という用語は、動物血清を欠く培地中で細胞が成長する条件を指す。代わりに、細胞は、いかなる動物由来成分も欠く培地中、好ましくは、生物学的成分のいかなる複合混合物も含まない培地（いわゆる「化学的に定義された培地」）中で成長する。
【００８５】
第４の態様では、本発明は、第１の態様の（突然変異）ＭＶＡウイルスを培養するための方法であって、
（ｉ）第３の態様の細胞を提供する工程、
（ｉｉ）該細胞を培養する工程、及び
（ｉｉｉ）該（突然変異）ＭＶＡウイルスを単離する工程
を含む方法に関する。
【００８６】
第３の態様の細胞は、第１の態様の（突然変異）ＭＶＡウイルス又は第２の態様のゲノムを含む。工程（ｉｉ）では、細胞を細胞増殖培地中で培養し、続いてウイルス生産培地中で培養し得るか、又は工程（ｉｉ）では、細胞を細胞増殖培地中で（のみ）培養し得る。好ましくは、工程（ｉｉ）では、細胞を細胞増殖培地中で（のみ）培養する。単一培地の使用は、ＭＶＡウイルス培養過程、特に工業的なＭＶＡウイルス培養過程を容易にするという利点を有する。例えば、それは、前記ＭＶＡウイルスを生産するバイオリアクターのロジスティック及び操作を容易にする。
【００８７】
細胞を細胞増殖培地中で１日間〜３日間、例えば１日間、２日間又は３日間培養し、続いて細胞をウイルス生産培地中で１日間〜１０日間、例えば１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間又は１０日間培養することが好ましい。細胞を増殖培地中でのみ１日間〜１０日間、例えば１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間又は１０日間培養することも好ましい。
【００８８】
本明細書で使用される「細胞増殖培地」という用語は、例えば、継代によってその培地中の８×１０＾５個の細胞のシードが、例えば２００リットルバイオリアクターに十分な約４×１０＾８個の細胞になり得るように、少なくとも１０回の細胞倍加のための細胞分裂を支援する培地を指す。本明細書で使用される「増殖細胞」という用語は、分裂細胞（すなわち、４８時間以内に少なくとも１回の倍加速度で、さらに少なくとも１０回の細胞倍加により分裂し得る細胞）を指す。
【００８９】
細胞増殖培地は、血清を含まないことが好ましい。無血清培地は、特に動物血清を欠く。代わりに、細胞は、いかなる動物由来成分も欠く培地中、好ましくは、生物学的成分のいかなる複合混合物も含まない培地（いわゆる「化学的に定義された培地」）中で成長する。細胞増殖培地は、低タンパク質含有量及び／又は低塩含有量を有することがさらに好ましい。好ましくは、（低）タンパク質含有量は、１０〜２５０ng/ml、より好ましくは５０〜２００ng/ml、さらにより好ましくは５０〜１５０ng/ml、最も好ましくは５０〜１００ng/mlの範囲内、例えば１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０又は２５０ng/mlである。好ましくは、（低）塩含有量は、１５０〜３５０mOsm/kg、より好ましくは１８０〜３５０mOsm/kg、さらにより好ましくは２００〜３２０mOsm/kg、最も好ましくは２５０〜３００mOsm/kgの範囲内、例えば１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０又は３５０mOsm/kgである。上記細胞増殖培地は、グルコースを含むことがさらに好ましい。好ましくは、グルコース含有量は、１〜６g/l、より好ましくは２．５〜５．５g/l、さらにより好ましくは３．５〜５g/l、最も好ましくは４〜４．５g/lの範囲内、例えば１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５又は６g/lである。従って、本発明の一実施態様では、細胞増殖培地は血清を含まず、低タンパク質含有量を有し、低塩含有量を有する。本発明の別の好ましい実施態様では、細胞増殖培地は血清を含まず、低タンパク質含有量を有し、低塩含有量を有し、グルコースをさらに含む。好ましい量は、上に記載されている。
【００９０】
本明細書で使用される「ウイルス生産培地」という用語は、増殖細胞の培養でウイルスの生産を増強する培地を指す。ウイルス生産培地を追加することによって、細胞凝集が誘導され、培養物中の細胞増殖は少なくとも２倍減少するか、又は完全に停止する。ウイルス生産培地は、ＣａＣｌ２、ＭｇＳＯ４及び／又はＮａＣｌを含むことが好ましい。好ましくは、ＣａＣｌ２含有量は、１５０〜２５０mg/l、より好ましくは１８０〜２５０mg/l、最も好ましくは２００〜２２０mg/lの範囲内、例えば１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５又は２５０mg/lであり、ＭｇＳＯ４含有量は、５０〜１５０mg/l、より好ましくは７０〜１５０mg/l、最も好ましくは９０〜１２０mg/lの範囲内、例えば５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５又は１５０mg/lであり、及び／又はＮａＣｌ含有量は、５０００〜７５００mg/l、より好ましくは６０００〜７０００mg/l、最も好ましくは６５００〜６８００mg/lの範囲内、例えば５０００、５５００、６０００、６５００、７０００又は７５００mg/lである。例えば、ウイルス生産培地は、２０５mg/lのＣａＣｌ２、１００mg/lのＭｇＳＯ４及び／又は６５００mg/lのＮａＣｌの塩含有量を含み得る。
【００９１】
好ましくは、工程（ｉｉ）では、細胞を撹拌培養又はバイオリアクターで培養する。バイオリアクターは、一般に、化学反応器と同様に、それらの混合特徴に応じて分類される。前記バイオリアクターは、（強混合型）撹拌タンク反応器又はプラグフロー（管状）反応器であり得る。理想的な強混合型バイオリアクターでは、混合は、反応器によって流体（細胞及び培養培地）が均一になるのに十分な強度であると想定される。好ましい実施態様では、バイオリアクターは、フェドバッチバイオリアクター、バッチバイオリアクター若しくは連続バイオリアクターであるか、又は培養は、バッチ培養法、フェドバッチ培養法又は連続培養法である。供給物ストリーム及び生成物ストリームが連続的に供給されてシステムから回収される場合、バイオリアクターは、通常、連続的と称される。原則として、反応器は連続的な再循環フローを有し得るが、栄養素の供給又は生成物の回収は非連続的である；それは、依然としてバッチバイオリアクターである。フェドバッチバイオリアクターは、通常、間欠送りを有する。それは、実行中に培地を回収してもよいし、又は培地を回収しなくてもよい。本明細書で使用される「フェドバッチ培養」という用語は、規定量の細胞を適切な培養培地中に提供し、懸濁液中で長時間（典型的には、４〜１０日間）（この時間中は培地を除去しない）培養する細胞培養法を指し得る。しかしながら、培養過程開始後のある時点において、さらなる成分を培養物に提供する。提供される成分は、典型的には、培養過程中に枯渇した細胞用栄養サプリメントを含む。フェドバッチ培養は、典型的には、死細胞と生細胞との比が臨界値未満に低下する時点で停止する。
【００９２】
第１の態様のＭＶＡウイルスは、無細胞上清及び／又は細胞溶解物から単離され得る。無細胞上清及び／又は細胞溶解物からの第１の態様のＭＶＡウイルスの単離は、当業者に容易に利用可能な標準的手順に従って実施され得る。好ましくは、第１の態様のＭＶＡウイルスは、無細胞上清から単離される。すなわち、本発明の発明者らは、無細胞上清から第１の態様のＭＶＡウイルスを直接単離し得ることを示したが、これが、ＭＶＡウイルス単離過程、特に工業的なＭＶＡウイルス培養過程を容易にする。そして、これにより、ＭＶＡウイルスの生産コストが削減される。例えば、ＭＶＡウイルスを単離するための細胞溶解はもはや必要とされない。このように、細胞物質、特に細胞ＤＮＡがＭＶＡウイルス単離株に混入するのを減少させ得る。その結果として、ウイルス調製に関する世界保健機関のＤＮＡ限界値がより容易に得られ得る。
【００９３】
ウイルスの様々な単離手順は、当技術分野で公知である。本発明に有用な単離手順は、単離されるべきウイルスに干渉しない。例えば、インペラの剪断力及び単離中に生じる他の要因に対する長時間の曝露は回避すべきである。工程（ｉｉｉ）における単離は、遠心分離、沈降及び／又はろ過を介して、例えば遠心分離及びろ過を介して、沈降及びろ過を介して、沈降及び遠心分離を介して、又は遠心分離、沈降及びろ過を介して細胞からウイルスを分離することによって達成されることが好ましい。前記細胞で培養されたウイルスを単離するために、当業者であれば、適切な分離パラメータ、例えば分離に遠心分離を使用する場合には加速力／Ｇ力及び／若しくは時間、分離にろ過を使用する場合にはフィルタサイズ、並びに／又は分離に沈降を使用する場合には沈降時間を容易に適合／調整し得る。
【００９４】
第５の態様では、本発明は、第１の態様の（突然変異）ＭＶＡウイルスを生産するための方法であって、
（ｉ）ＭＶＡウイルスを細胞に感染させる工程、
（ｉｉ）該細胞を培養する工程、
（ｉｉｉ）該ＭＶＡウイルスを単離する工程、及び
（ｉｖ）Ａ３Ｌ遺伝子産物及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物（すなわち、前記Ａ３Ｌ遺伝子産物及び／又は前記Ａ３４Ｒ遺伝子産物）の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸配列改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つの突然変異）を含む核酸配列を含む（突然変異）ＭＶＡウイルスが検出されるまで、工程（ｉｉｉ）で単離されたＭＶＡウイルスを用いて工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を繰り返す工程
を含む方法に関する。
【００９５】
上記遺伝子産物をコードする核酸配列は、各前記遺伝子産物の１つの／少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸配列改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ又は３つの突然変異）を含むことに留意すべきである。
【００９６】
前記アミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸改変）は、アミノ酸欠失（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸欠失）、アミノ酸挿入（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸挿入）、アミノ酸付加（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸付加）及び／又はアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸置換）であり得る。
【００９７】
好ましくは、Ａ９Ｌ遺伝子産物をさらにコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸配列改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ又は３つの突然変異）を含む核酸配列を含むＭＶＡウイルスが検出されるまで、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を繰り返す。
【００９８】
より好ましくは、
（ｉ）Ａ３Ｌ遺伝子産物及びＡ９Ｌ遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物（すなわち、前記Ａ３Ｌ遺伝子産物及び前記Ａ９Ｌ遺伝子産物）の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つの突然変異）を含む核酸配列を含むＭＶＡウイルスが検出されるか、
（ｉｉ）Ａ３４Ｒ遺伝子産物及びＡ９Ｌ遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物（すなわち、前記Ａ３４Ｒ遺伝子産物及び前記Ａ９Ｌ遺伝子産物）の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つの突然変異）を含む核酸配列を含むＭＶＡウイルスが検出されるか、又は
（ｉｉｉ）Ａ３Ｌ遺伝子産物、Ａ３４Ｒ遺伝子産物及びＡ９Ｌ遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物（すなわち、前記Ａ３Ｌ遺伝子産物、前記Ａ３４Ｒ遺伝子産物及び前記Ａ９Ｌ遺伝子産物）の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つの突然変異）を含む核酸配列を含むＭＶＡウイルスが検出される。
【００９９】
上記遺伝子産物をコードする核酸配列は、各前記遺伝子産物の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ又は３つの突然変異）を含むことに留意すべきである。
【０１００】
前記アミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸改変）は、アミノ酸欠失（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸欠失）、アミノ酸挿入（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸挿入）、アミノ酸付加（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸付加）及び／又はアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸置換）であり得る。
【０１０１】
アミノ酸改変の好ましい実施態様については、本発明の第１の態様を参照のこと。
【０１０２】
工程（ｉ）で提供されるＭＶＡウイルスは、Ａ３Ｌ遺伝子産物、Ａ３４Ｒ遺伝子産物及びＡ９Ｌ遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす突然変異を含まない核酸配列を特に含む。それは、本発明の第１の態様で言及される好ましいアミノ酸改変を特に含まない。
【０１０３】
工程（ｉ）におけるＭＶＡウイルスは、アクセッションナンバーＡＹ６０３３５５（バージョンＡＹ６０３３５５．１及びＧＩ：４７０８８３２６）の核酸配列を含み得る。
【０１０４】
工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を少なくとも２回、好ましくは少なくとも７回、より好ましくは少なくとも１４回、最も好ましくは少なくとも２０回、例えば少なくとも２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回又は２０回繰り返すことが好ましい。
【０１０５】
細胞をウイルス生産培地中で培養することがさらに好ましい。「ウイルス生産培地」という用語の定義及び「ウイルス生産培地」の好ましい実施態様については、本発明の第４の態様を参照のこと。
【０１０６】
工程（ｉｉ）では、ウイルスをウイルス生産培地中で１日間〜１０日間、例えば１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間又は１０日間培養し得る。好ましい培養条件及び単離形態については、本発明の第４の態様も参照のこと。
【０１０７】
工程（ｉ）における細胞は、ＭＶＡウイルスが複製することができる任意の細胞であり得る。前記細胞は、霊長類細胞、特にヒト細胞ではないことが好ましい。前記細胞は、鳥類細胞であることがさらに好ましい。前記鳥類細胞は、好ましくは、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞（例えば、アヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞）である。前記鳥類細胞（例えば、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞、例えばアヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞）は、一次細胞（又は一次細胞培養物由来の細胞）、二次細胞（又は二次細胞培養物由来の細胞）又は不死化細胞（又は細胞株由来の細胞）であり得る。「一次細胞」、「一次細胞培養物」、「二次細胞」、「二次細胞培養物」、「不死化細胞」又は「不死化細胞培養物」という用語の定義については、本発明の第１の態様を参照のこと。本発明の好ましい実施態様では、細胞は、ＣＲ又はＣＲ．ｐＩＸ細胞株に由来する。ＣＲ及びＣＲ．ｐＩＸ細胞株は、不死化バリケン（Ｍｕｓｃｏｖｙ  ｄｕｃｋ）網膜細胞（Jordan, et al. 2009 in Vaccine 27, 748-756）に由来する。ＣＲ．ｐＩＸ細胞株は、アデノウイルスｐＩＸタンパク質をコードする遺伝子がそのゲノムにさらに安定的に組み込まれており、前記遺伝子を発現する。本発明の他の好ましい実施態様では、細胞は、ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞である。前記細胞は、一次細胞である。
【０１０８】
第６の態様では、本発明はまた、第１の態様のＭＶＡウイルス又は第２の態様のゲノムと、１つ以上の薬学的に許容しる賦形剤、希釈剤及び／又は担体とを含む医薬組成物に関する。
【０１０９】
上述のように、第１の態様の（突然変異）ＭＶＡウイルスは、高度に宿主制限的であるので、高度に弱毒化されている。従って、それは、広範囲のレシピエントを処置するのに理想的である。
【０１１０】
「宿主制限」、「高度弱毒化」及び「レシピエント」という用語は、上で定義されている。好ましくは、レシピエントは、霊長類、より好ましくはヒトである。
【０１１１】
「賦形剤」という用語は、本明細書で使用される場合、有効成分ではない医薬組成物中の全ての物質を示すことを意図する。賦形剤の例としては、限定されないが、結合剤、潤滑剤、増粘剤、表面活性剤、保存剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤及び／又は着色剤が挙げられる。治療用途の許容しうる担体及び／又は希釈剤は製薬分野で周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)に記載されている。適切な担体の例としては、限定されないが、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス及び／又はココアバターが挙げられる。適切な希釈剤の例としては、限定されないが、エタノール、グリセロール及び／又は水が挙げられる。薬学的な賦形剤、希釈剤及び／又は担体は、目的の投与経路及び標準的な薬務に関して選択され得る。医薬組成物は、適切な結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、コーティング剤及び／又は可溶化剤をさらに含み得る。適切な結合剤の例としては、限定されないが、デンプン、ゼラチン、天然糖、例えばグルコース、無水ラクトース、フリーフローラクトース、β−ラクトース、コーンシロップ、天然ゴム及び合成ゴム、例えばアカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース及び／又はポリエチレングリコールが挙げられる。適切な潤滑剤の例としては、限定されないが、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及び／又は塩化ナトリウムが挙げられる。保存剤、安定剤、色素、抗酸化剤、懸濁化剤及び／又は香味剤も医薬組成物に含まれ得る。保存剤の例としては、限定されないが、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及び／又はｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。
【０１１２】
本発明によって意図される医薬組成物は、当業者に周知の様々な方法で製剤化及び／又は投与され得る。好ましくは、本発明の医薬組成物は、液体形態、例えば注射液などの溶液の形態である。前記溶液は、例えば、筋肉内注射又は非経口注射され得る。当業者であれば、医薬組成物の投与様式、用量及び投与回数を公知の方法で最適化し得る。
【０１１３】
第７の態様では、本発明はさらに、第１の態様のＭＶＡウイルス又は第２の態様のゲノムを含むワクチンに関する。
【０１１４】
上述のように、第１の態様の（突然変異）ＭＶＡウイルスは、高度に宿主制限的であるので、高度に弱毒化されている。従って、それは、広範囲のレシピエントを処置するのに理想的である。「宿主制限」、「高度弱毒化」、「レシピエント」及び「ワクチン」という用語は、上で定義されている。好ましくは、レシピエントは、霊長類、より好ましくはヒトである。これに関して、ＭＶＡウイルスそれ自体がワクチンであり得ることに留意すべきである。それは、痘に対する保護を付与する。しかしながら、前記ウイルス又は前記ゲノムは、レシピエントで防御免疫、特にさらなる防御免疫が誘発され得る異種核酸配列（例えば、抗原、特に抗原のエピトープをコードする配列）をさらに含み得る。「異種核酸配列」という用語は、上で定義されている。このような抗原の例は、例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フラビウイルス、パラミクソウイルス、ハンタウイルス若しくはフィロウイルスなどの他のウイルスのタンパク質、又は腫瘍及びガンの発症に関連するタンパク質、例えばＨｅｒ２／ｎｅｕ又はＭＵＣ−１を包含する。このようなエピトープの例は、例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フラビウイルス、パラミクソウイルス、ハンタウイルス若しくはフィロウイルスなどの他のウイルス由来のタンパク質由来のエピトープ、又は腫瘍及びガンの発症に関連するタンパク質由来のエピトープ、例えばＨｅｒ２／ｎｅｕ又はＭＵＣ−１の細胞外ペプチドを包含する。異種核酸配列を含むＭＶＡウイルスは、リコンビナントＭＶＡウイルスとも表記され得る。ワクチンをレシピエントの体内に投与した後、抗原、特にエピトープが発現されて免疫系に提示され、前記抗原、特にエピトープに対する特異的免疫応答が誘導され得る。従って、レシピエントは、前記抗原、特にエピトープに対して免疫される。
【０１１５】
好ましくは、第１の態様のＭＶＡウイルス又は第２の態様のゲノムを含むワクチンは、ポックスウイルスワクチン、インフルエンザウイルスワクチン、肝炎ウイルスワクチン、例えばＣ型肝炎ウイルスワクチン、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ワクチン、フラビウイルスワクチン、パラミクソウイルスワクチン、ハンタウイルスワクチン及び／又はフィロウイルスワクチンである。それはまた、乳ガン、黒色腫、膵臓ガン又は前立腺ガンに対するワクチン接種に使用され得る。
【０１１６】
本発明によって意図されるワクチンは、当業者に周知の様々な方法で製剤化及び投与され得る。好ましくは、本発明のワクチンは、液体形態、例えば注射液などの溶液の形態である。前記溶液は、例えば、筋肉内注射又は非経口注射され得る。当業者であれば、ワクチンの投与様式、用量及び投与回数を公知の方法で最適化し得る。ワクチンの製剤化又は調製のために、第１の態様のＭＶＡウイルス、特にリコンビナントＭＶＡウイルスは、生理学的に許容しうる形態に変換される。これは、（Stickl et al. 1974 in Dtsch Med Wochenschr 99, 2386-2392）によって記載されているように）痘に対するワクチン接種に使用されるポックスウイルスワクチンの調製における経験に基づいて行われ得る。前記ワクチンは、ヒトを含む霊長類などの免疫不全レシピエントで免疫応答を誘導するのに特に有用である。本明細書で使用される「免疫不全」という用語は、不完全な免疫応答しか示さないか、又は感染性病原体に対する防御効率が低下しているレシピエントの免疫系の状態を説明するものである。
【０１１７】
第８の態様では、本発明は、医薬に使用するための第１の態様のＭＶＡウイルス又は第２の態様のゲノムに関する。好ましくは、第１の態様のＭＶＡウイルス又は第２の態様のゲノムは、ワクチン接種及び／又は治療に使用するためのものである。特に、第１の態様のＭＶＡウイルス又は第２の態様のゲノムをレシピエントに負荷して、特異的免疫を誘導する。好ましくは、レシピエントは、霊長類、より好ましくはヒトである。ヒトなどの前記霊長類は、免疫不全であり得る。これに関して、ＭＶＡウイルスそれ自体がワクチンであり得ることに留意すべきである。それは、痘に対する保護を付与する。しかしながら、前記ウイルス又は前記ゲノムは、レシピエントで防御免疫、特にさらなる防御免疫が誘発され得る異種核酸配列（例えば、抗原、特に抗原のエピトープをコードする配列）をさらに含み得る。「ワクチン接種」、「レシピエント」、「異種核酸配列」という用語は、上で定義されている。好ましい抗原、特にエピトープは、本発明の第１及び第７の態様に記載されている。好ましくは、前記ＭＶＡウイルス又はゲノムは、ポックスウイルス、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フラビウイルス、パラミクソウイルス、ハンタウイルス、フィロウイルス、腫瘍及び／又はガン、例えば乳ガン、黒色腫、膵臓ガン又は前立腺ガンに対するワクチン接種に使用するためのものである。
【０１１８】
あるいは又は加えて、第１の態様のＭＶＡウイルス又は第２の態様のゲノムをレシピエントに負荷して、治療効果を誘発する。上述のように、前記ウイルス又はゲノムに含まれる異種配列は、治療用化合物をコードし得る。例えば、治療用化合物は、組織成長、細胞成長、細胞分化に影響を与えるか若しくはこれに関与する化合物、免疫応答などの生物学的作用を引き起こすことができる化合物、又は１つ以上の生物学的過程において任意の他の役割を果たし得る化合物であり得る。特に、前記化合物は、抗菌化合物、抗ウイルス化合物、抗真菌化合物、免疫抑制化合物、成長因子、酵素、抗炎症化合物又は抗アレルギー化合物であり得る。治療用化合物はまた、アンチセンス核酸であり得る。
【０１１９】
当業者であれば、ワクチン接種の様式、ワクチン接種の用量及びワクチン接種の回数を公知の方法で最適化し得る。ワクチンは、当業者に周知の様々な方法で製剤化及び投与され得る。好ましくは、ワクチンは、液体形態で投与される。好ましくは、ワクチンは、例えば、筋肉内注射又は非経口注射される。第１の態様のＭＶＡウイルス又は第２の態様のゲノムは、薬学的有効量でレシピエントに投与されることが好ましい。「薬学的有効量」という用語は、特定の投与経路で免疫応答を誘発するのに有効なＭＶＡウイルス又はゲノムの量を指す。
【０１２０】
第９の態様では、本発明は、核酸配列を含むＭＶＡウイルスであって、Ａ３Ｌ遺伝子及び／又はＡ９Ｌ遺伝子が機能欠失しているＭＶＡウイルスに関する。好ましくは、Ａ３４Ｒ遺伝子がさらに機能欠失している。
【０１２１】
より好ましくは、
（ｉ）Ａ３Ｌ遺伝子及びＡ９Ｌ遺伝子が機能欠失しているか、
（ｉｉ）Ａ３Ｌ遺伝子及びＡ３４Ｒ遺伝子が機能欠失しているか、
（ｉｉｉ）Ａ９Ｌ遺伝子及びＡ３４Ｒ遺伝子が機能欠失しているか、又は
（ｉｖ）Ａ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及びＡ３４Ｒ遺伝子が機能欠失している。
【０１２２】
（非欠失）Ａ３Ｌ遺伝子は配列番号７の核酸配列を有し得、（非欠失）Ａ３４Ｒ遺伝子は配列番号８の核酸配列を有し得、及び／又は（非欠失）Ａ９Ｌ遺伝子は配列番号９の核酸配列を有し得る。さらに、ＭＶＡウイルスは、アクセッションナンバーＡＹ６０３３５５（バージョンＡＹ６０３３５５．１及びＧＩ：４７０８８３２６）の欠失前核酸配列を含み得る。
【０１２３】
本発明との関連では、上記Ａ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子の「機能欠失」という用語は、これらの遺伝子が、各Ａ３Ｌ遺伝子産物、Ａ９Ｌ遺伝子産物及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子産物の生物学的活性が減少（好ましくは、無効化又は改変）される程度に欠失していると理解すべきである。例えば、生物学的活性は、生物学的に活性な（非欠失）Ａ３Ｌ遺伝子産物、Ａ９Ｌ遺伝子産物及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子産物と比較して少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０又は２００％減少され得る。
【０１２４】
このような機能欠失は、Ａ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及び／若しくはＡ３４Ｒ遺伝子を部分的に欠失することによって、Ａ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及び／若しくはＡ３４Ｒ遺伝子を完全に欠失することによって、並びに／又は１つ以上の終止コドンをＡ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及び／若しくはＡ３４Ｒ遺伝子を導入することによって達成され得る。
【０１２５】
生物学的に活性な（非欠失）Ａ３Ｌ遺伝子産物、Ａ９Ｌ遺伝子産物及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子産物と比較した各Ａ３Ｌ遺伝子産物、Ａ９Ｌ遺伝子産物及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子産物の生物学的活性の減少又は消失は、当業者に公知の様々な実験で試験され得る。生物学的に活性な（非欠失）Ａ３Ｌ遺伝子産物、Ａ９Ｌ遺伝子産物及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子産物と比較した各Ａ３Ｌ遺伝子産物、Ａ９Ｌ遺伝子産物及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子産物の生物学的活性の減少又は消失を検出する一方法は、実施例６に記載されているように、コメットアッセイを行うことである。コメットアッセイでは、適切な少数のウイルス（例えば、宿主細胞１個当たりウイルス０．０１〜０．００１個）を接着許容細胞の細胞単層に感染させる。Ａ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子が欠失しているウイルス由来の子孫は、最初の感染細胞から脱出せず、小さくて限定的な円形のプラーク（細胞変性効果を示す隣接細胞凝集体）をもたらすか、又はいかなるプラークも全くもたらさないであろう。活性なＡ３Ｌ遺伝子産物、Ａ９Ｌ遺伝子産物及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子産物を備えるウイルスは、肉眼でも明確に視認可能なプラークをもたらすであろう；プラークは２〜７日以内に拡大し、最終的には細胞単層を完全に消費するであろう。
【０１２６】
Ａ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及びＡ３４Ｒ遺伝子の遺伝子産物の説明に関しては、本発明の第１の態様を参照のこと。
【０１２７】
好ましくは、ＭＶＡウイルスは、単離されたＭＶＡウイルスである。本明細書で使用される「単離されたＭＶＡウイルス」という用語は、そのネイティブな環境又は培養環境から取り出されたウイルスを指す。従って、単離されたＭＶＡウイルスは、一部又は全部の細胞成分（すなわち、ウイルスが天然に存在する細胞又はそれが培養される細胞の成分（例えば、細胞質成分又は膜成分））を含まなくてもよい。それはまた、一部又は全部の培養成分（例えば、培養培地又は培養関連不純物、例えば培養残物）を含まなくてもよい。
【０１２８】
単離されたＭＶＡウイルスは、さらに精製され得る。従って、より好ましくは、ＭＶＡウイルスは、精製されたＭＶＡウイルスである。本明細書で使用される「精製されたＭＶＡウイルス」という用語は、無関係な物質（すなわち、ウイルスが得られるネイティブな物質、例えば細胞残屑、細胞残骸、細胞タンパク質、細胞ＤＮＡ分子及び／又は細胞ＲＮＡ分子を含む混入物質）の存在を低減又は排除する条件下で単離されたウイルスを指す。精製されたＭＶＡウイルスは、好ましくは、細胞及び／又は培養成分を実質的に含まない。本明細書で使用される「実質的に含まない」という用語は、物質の分析試験との関連で操作上使用される。混入物質を実質的に含まない精製されたＭＶＡウイルスは、好ましくは少なくとも５０％純粋であり、より好ましくは少なくとも９０％純粋であり、さらにより好ましくは少なくとも９９％又は１００％純粋である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、及び当技術分野で公知の他の方法によって評価され得る。
【０１２９】
機能欠失遺伝子は、異種核酸配列によって置換されることがさらに好ましい。例えば、機能欠失Ａ３Ｌ遺伝子は異種核酸配列によって置換され、機能欠失Ａ９Ｌ遺伝子は異種核酸配列によって置換され、及び／又は機能欠失Ａ３４Ｒ遺伝子は異種核酸配列によって置換される。異種核酸配列をＭＶＡウイルスゲノムに挿入する方法は当業者に公知である。異種核酸配列の発現は、ＭＶＡウイルスプロモーターの転写コントロール下にあり得る。
【０１３０】
「異種核酸配列」という用語は、上で定義されている。好ましくは、異種核酸配列は、抗原、特に抗原のエピトープ、診断用化合物又は治療用化合物をコードする配列から選択される。
【０１３１】
抗原又はエピトープは、前記抗原又はエピトープに対する免疫応答を誘導するためのワクチンとして有用であり得る。前記ウイルスに対して異種のこのような抗原の例は、例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フラビウイルス、パラミクソウイルス、ハンタウイルス若しくはフィロウイルスなどの他のウイルスのタンパク質、又は腫瘍及びガンの発症に関連するタンパク質、例えばＨｅｒ２／ｎｅｕ又はＭＵＣ−１を包含する。前記ウイルスに対して異種のこのようなエピトープの例は、例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フラビウイルス、パラミクソウイルス、ハンタウイルス若しくはフィロウイルスなどの他のウイルスのタンパク質由来のエピトープ、又は腫瘍及びガンの発症に関連するタンパク質由来のエピトープ、例えばＨｅｒ／２又はＭＵＣ−１の細胞外ペプチドを包含する。
【０１３２】
治療用化合物は、治療効果を有する任意の化合物であり得る。例えば、治療用化合物は、組織成長、細胞成長、細胞分化に影響を与えるか若しくはこれに関与する化合物、免疫応答などの生物学的作用を引き起こすことができる化合物、又は１つ以上の生物学的過程において任意の他の役割を果たし得る化合物であり得る。特に、前記化合物は、抗菌化合物、抗ウイルス化合物、抗真菌化合物、免疫抑制化合物、成長因子、酵素、抗炎症化合物又は抗アレルギー化合物であり得る。治療用化合物はまた、アンチセンス核酸であり得る。
【０１３３】
診断用化合物は、診断効果を有する任意の化合物であり得る。例えば、治療用化合物は、マーカー／レポータータンパク質、例えば抗体、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ、又は抗生物質耐性付与タンパク質、例えばアンピシリンに対するｂｌａ（β−ラクタマーゼ）、若しくはネオマイシン若しくはＧ４１８に対するｎｐｔ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）であり得る。前記マーカー／レポータータンパク質は、例えば、ハイブリダイゼーション技術、蛍光顕微鏡法又はＥＬＩＳＡアッセイを使用することによってウイルスを同定又は単離するのに使用され得る。加えて、ウイルスに含まれる抗生物質耐性付与タンパク質は、抗生物質選択に対する耐性を感染細胞に付与する。
【０１３４】
本発明の好ましい実施態様では、ウイルスは、Ａ３Ｌ遺伝子産物、Ａ９Ｌ遺伝子産物及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子産物を含み、前記遺伝子産物は、好ましくは、１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸配列改変）を含む。本発明の一実施態様では、ウイルスは、Ａ３Ｌ遺伝子産物を含み、前記遺伝子産物は、１つの／少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）を含む。本発明の別の実施態様では、ウイルスは、Ａ９Ｌ遺伝子産物を含み、前記遺伝子産物は、１つの／少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）を含む。本発明のさらなる実施態様では、ウイルスは、Ａ３４Ｒ遺伝子産物を含み、前記遺伝子産物は、１つの／少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）を含む。
【０１３５】
本発明のより好ましい実施態様では、ウイルスは、
（ｉ）１つの／少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）を含むＡ９Ｌ遺伝子産物、及び１つの／少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）を含むＡ３４Ｒ遺伝子産物、
（ｉｉ）１つの／少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）を含むＡ９Ｌ遺伝子産物、及び１つの／少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）を含むＡ３Ｌ遺伝子産物、
（ｉｉｉ）１つの／少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）を含むＡ３４Ｒ遺伝子産物、及び１つの／少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）を含むＡ３Ｌ遺伝子産物、又は
（ｉｖ）１つの／少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）を含むＡ９Ｌ遺伝子産物、１つの／少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）を含むＡ３４Ｒ遺伝子産物、及び１つの／少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）を含むＡ３Ｌ遺伝子産物を含む。
【０１３６】
前記アミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸改変）は、アミノ酸欠失（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸欠失）、アミノ酸挿入（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸挿入）、アミノ酸付加（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸付加）及び／又はアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸置換）であり得る。「アミノ酸置換（amino acid replacement）」はまた、本明細書では「アミノ酸置換（amino acid substitution）」とも表記され得る。本明細書で使用される「アミノ酸挿入」という用語は、Ａ３Ｌ遺伝子産物、Ａ３４Ｒ遺伝子産物及び／又はＡ９Ｌ遺伝子産物のアミノ酸配列内で起こるアミノ酸改変を指すが、本明細書で使用される「アミノ酸付加」という用語は、Ａ３Ｌ遺伝子産物、Ａ３４Ｒ遺伝子産物及び／又はＡ９Ｌ遺伝子産物のＮ末端又はＣ末端で起こるアミノ酸改変を指す。アミノ酸改変の好ましい実施態様については、本発明の第１の態様を参照のこと。
【０１３７】
第１０の態様では、本発明は、ＭＶＡウイルスのＡ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子を含む細胞であって、前記遺伝子を発現する細胞に関する。
【０１３８】
細胞は、
（ｉ）Ａ３Ｌ遺伝子及びＡ９Ｌ遺伝子、
（ｉｉ）Ａ３Ｌ遺伝子及びＡ３４Ｒ遺伝子、
（ｉｉｉ）Ａ９Ｌ遺伝子及びＡ３４Ｒ遺伝子、又は
（ｉｖ）Ａ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及びＡ３４Ｒ遺伝子を含むことが好ましい。
【０１３９】
前記細胞はまた、リコンビナント細胞とも表記され得る。特に、前記遺伝子は、ＭＶＡウイルス／ＭＶＡウイルスゲノムから単離される（すなわち、前記遺伝子は、ＭＶＡウイルス／ＭＶＡウイルスゲノム内に／その一部に含まれない）。
【０１４０】
前記細胞は、ＭＶＡウイルスのＡ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子でトランスフェクションされ得る。ＭＶＡウイルスのＡ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子は、前記細胞内で安定的に維持され得るか、又は前記細胞内に一時的に存在し得る。好ましくは、ＭＶＡウイルスのＡ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子は、前記細胞内で安定的に維持される。
【０１４１】
Ａ３Ｌ遺伝子は配列番号７の核酸配列を有し得、Ａ３４Ｒ遺伝子は配列番号８の核酸配列を有し得、及び／又はＡ９Ｌ遺伝子は配列番号９の核酸配列を有し得る。
【０１４２】
細胞は、第９の態様のＭＶＡウイルスをさらに含むことが好ましい。前記細胞は、第９の態様のＭＶＡウイルスの機能欠失遺伝子（すなわち、Ａ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子）の遺伝子産物（すなわち、Ａ３Ｌ遺伝子産物、Ａ９Ｌ遺伝子産物及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子産物）をin transで提供することができる。例えば、（ｉ）Ａ３Ｌ遺伝子が第９の態様のＭＶＡウイルスで機能欠失している場合、Ａ３Ｌ遺伝子を含む細胞であって、前記遺伝子を発現する細胞は、Ａ３Ｌ遺伝子産物をin transで提供することができ、（ｉｉ）Ａ９Ｌ遺伝子が第９の態様のＭＶＡウイルスで機能欠失している場合、Ａ９Ｌ遺伝子を含む細胞であって、前記遺伝子を発現する細胞は、Ａ９Ｌ遺伝子産物をin transで提供することができ、及び／又は（ｉｉｉ）Ａ３４Ｒ遺伝子が第９の態様のＭＶＡウイルスで機能欠失している場合、Ａ３４Ｒ遺伝子を含む細胞であって、前記遺伝子を発現する細胞は、Ａ３４Ｒ遺伝子産物をin transで提供することができる。
【０１４３】
Ａ３Ｌ遺伝子産物は配列番号１のアミノ酸配列を有し得、Ａ３４Ｒ遺伝子産物は配列番号２のアミノ酸配列を有し得、及び／又はＡ９Ｌ遺伝子産物は配列番号３のアミノ酸配列を有し得る。
【０１４４】
（ｉ）ＭＶＡウイルスのＡ３Ｌ遺伝子は、前記遺伝子産物の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸配列改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ又は３つの突然変異）を含み、
（ｉｉ）ＭＶＡウイルスのＡ９Ｌ遺伝子は、前記遺伝子産物の少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸配列改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ又は３つの突然変異）を含み、及び／又は
（ｉｉｉ）ＭＶＡウイルスのＡ３４Ｒ遺伝子は、前記遺伝子産物の少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸配列改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ又は３つの突然変異）を含むことがさらに好ましい。
【０１４５】
前記アミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸改変）は、アミノ酸欠失（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸欠失）、アミノ酸挿入（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸挿入）、アミノ酸付加（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸付加）及び／又はアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸置換）であり得る。アミノ酸改変の好ましい実施態様については、本発明の第１の態様を参照のこと。
【０１４６】
従って、前記細胞は、第９の態様のＭＶＡウイルスの機能欠失遺伝子（すなわち、Ａ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子）の遺伝子産物（すなわち、Ａ３Ｌ遺伝子産物、Ａ９Ｌ遺伝子産物及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子産物）をin transで提供することができるだけではない（上記を参照のこと）。それはまた（あるいは）、第９の態様のＭＶＡウイルスの機能欠失遺伝子（すなわち、Ａ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子）の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変を有する遺伝子産物（すなわち、Ａ３Ｌ遺伝子産物、ここで、遺伝子産物は１つの／少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）を含む、１つの／少なくＡ９Ｌ遺伝子産物、ここで、遺伝子産物は１つの／少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）を含む、Ａ３４Ｒ遺伝子産物、ここで、遺伝子産物は１つの／少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸改変）を含む、をin transで提供することができる。従って、前記細胞は、アミノ酸配列改変を有しないＡ３Ｌ遺伝子産物、Ａ９Ｌ遺伝子産物及び／若しくはＡ３４Ｒ遺伝子産物を含む（非突然変異）ＭＶＡウイルスを生産するためのものであるか、又はアミノ酸配列改変を有するＡ３Ｌ遺伝子産物、Ａ９Ｌ遺伝子産物及び／若しくはＡ３４Ｒ遺伝子産物を含む（突然変異）ＭＶＡウイルスを生産するためのものである。アミノ酸改変の好ましい実施態様については、本発明の第１の態様を参照のこと。
【０１４７】
前記細胞は、ヒト細胞若しくは霊長類細胞などの哺乳類細胞又は鳥類細胞であり得る。前記鳥類細胞は、好ましくは、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞（例えば、アヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞）である。前記鳥類細胞（例えば、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞、例えばアヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞）は、一次細胞（又は一次細胞培養物由来の細胞）、二次細胞（又は二次細胞培養物由来の細胞）又は不死化細胞（又は細胞株由来の細胞）であり得る。「一次細胞」、「一次細胞培養物」、「二次細胞」、「二次細胞培養物」、「不死化細胞」又は「不死化細胞培養物」という用語の定義については、本発明の第１の態様を参照のこと。本発明の好ましい実施態様では、細胞は、ＣＲ又はＣＲ．ｐＩＸ細胞株に由来する。ＣＲ及びＣＲ．ｐＩＸ細胞株は、不死化バリケン網膜細胞（Jordan, et al. 2009 in Vaccine 27, 748-756）に由来する。ＣＲ．ｐＩＸ細胞株は、アデノウイルスｐＩＸタンパク質をコードする遺伝子がそのゲノムにさらに安定的に組み込まれており、前記遺伝子を発現する。本発明の他の好ましい実施態様では、細胞は、ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞である。前記細胞は一次細胞である。
【０１４８】
第１１の態様では、本発明は、好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたＭＶＡウイルスのＡ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及び／又はＡ３４Ｒ遺伝子を含む核酸分子に関する。本発明の一実施態様では、核酸分子は、好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたＡ３Ｌ遺伝子を含む。本発明の別の実施態様では、核酸分子は、好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたＡ９Ｌ遺伝子を含む。本発明のさらなる実施態様では、核酸分子は、好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたＡ３４Ｒ遺伝子を含む。
【０１４９】
核酸分子は、
（ｉ）好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたＡ３Ｌ遺伝子、及び好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたＡ９Ｌ遺伝子、
（ｉｉ）好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたＡ３Ｌ遺伝子、及び好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたＡ３４Ｒ遺伝子、
（ｉｉｉ）好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたＡ９Ｌ遺伝子、及び好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたＡ３４Ｒ遺伝子、又は
（ｉｖ）好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたＡ３Ｌ遺伝子、好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたＡ９Ｌ遺伝子、及び好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたＡ３４Ｒ遺伝子を含むことが好ましい。
【０１５０】
核酸分子は、リコンビナント核酸分子とも表記され得る。特に、上記遺伝子は、ＭＶＡウイルス／ＭＶＡウイルスゲノムから単離される（すなわち、前記遺伝子は、ＭＶＡウイルス／ＭＶＡウイルスゲノム内に／その一部に含まれない）。
【０１５１】
Ａ３Ｌ遺伝子は配列番号７の核酸配列を有し得、Ａ３４Ｒ遺伝子は配列番号８の核酸配列を有し得、及び／又はＡ９Ｌ遺伝子は配列番号９の核酸配列を有し得る。
【０１５２】
「作動可能に連結された」という用語は、例えば、フレームシフト若しくは終止コドンを回避することによって、又はｍＲＮＡの５’キャップ構造とは独立して翻訳の開始を可能にする内部リボソーム侵入部位を介して異種核酸を分離することによって、対応する構築物のインフレーム発現が実行され得るように、Ａ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子又はＡ３４Ｒ遺伝子が異種核酸配列に連結されていることを意味する。このような内部リボソーム侵入部位は当技術分野で公知であり、例えば、ポリオウイルス又は脳心筋炎ウイルスのゲノムＲＮＡに由来し得る。
【０１５３】
「異種核酸配列」という用語は、上で定義されている。好ましくは、異種核酸配列は、抗原、エピトープ、診断用化合物又は治療用化合物をコードする配列から選択される。より好ましくは、異種核酸配列は、診断用化合物をコードする配列である。診断用化合物は、診断効果を有する任意の化合物であり得る。例えば、治療用化合物は、マーカー／レポータータンパク質、例えば抗体、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ、又は抗生物質耐性付与タンパク質、例えばアンピシリンに対するｂｌａ（β−ラクタマーゼ）、若しくはネオマイシン若しくはＧ４１８に対するｎｐｔ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）であり得る。前記マーカー／レポータータンパク質は、例えば、ハイブリダイゼーション技術、蛍光顕微鏡法又はＥＬＩＳＡアッセイを使用することによってウイルスを同定又は単離するのに使用され得る。加えて、ウイルスに含まれる抗生物質耐性付与タンパク質は、抗生物質選択に対する耐性を感染細胞に付与する。抗原、エピトープ又は治療用化合物の好ましい実施態様については、本発明の第１の態様を参照のこと。
【０１５４】
好ましくは、
（ｉ）ＭＶＡウイルスのＡ３Ｌ遺伝子は、前記遺伝子産物の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸配列改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ又は３つの突然変異）を含み、
（ｉｉ）ＭＶＡウイルスのＡ９Ｌ遺伝子は、前記遺伝子産物の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸配列改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ又は３つの突然変異）を含み、及び／又は
（ｉｉｉ）ＭＶＡウイルスのＡ３４Ｒ遺伝子は、前記遺伝子産物の１つの／少なくとも１つのアミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ又は３つのアミノ酸配列改変）をもたらす少なくとも１つの突然変異（例えば、１つ、２つ又は３つの突然変異）を含む。
【０１５５】
前記アミノ酸配列改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸改変）は、アミノ酸欠失（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸欠失）、アミノ酸挿入（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸挿入）、アミノ酸付加（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸付加）及び／又はアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つのアミノ酸置換）であり得る。アミノ酸改変の好ましい実施態様については、本発明の第１の態様を参照のこと。
【０１５６】
第１２の（twelth）態様では、本発明は、リコンビナントＭＶＡウイルスを生産するための方法であって、
（ｉ）細胞を提供する工程、
（ｉｉ）第９の態様のＭＶＡウイルス及び第１１の態様の核酸分子を該細胞に導入する工程、及び
（ｉｉｉ）該ＭＶＡウイルスの核酸配列と該核酸分子との間の相同組換えを可能にする条件下で該細胞を培養し、それにより該リコンビナントＭＶＡウイルスを得る工程
を含む方法に関する。
【０１５７】
前記細胞は、ヒト細胞若しくは霊長類細胞などの哺乳類細胞又は鳥類細胞であり得る。前記鳥類細胞は、好ましくは、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞（例えば、アヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞）である。前記鳥類細胞（例えば、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞、例えばアヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞）は、一次細胞（又は一次細胞培養物由来の細胞）、二次細胞（又は二次細胞培養物由来の細胞）又は不死化細胞（又は細胞株由来の細胞）であり得る。「一次細胞」、「一次細胞培養物」、「二次細胞」、「二次細胞培養物」、「不死化細胞」又は「不死化細胞培養物」という用語の定義については、本発明の第１の態様を参照のこと。本発明の好ましい実施態様では、細胞は、ＣＲ又はＣＲ．ｐＩＸ細胞株に由来する。ＣＲ及びＣＲ．ｐＩＸ細胞株は、不死化バリケン網膜細胞（Jordan, et al. 2009 in Vaccine 27, 748-756）に由来する。ＣＲ．ｐＩＸ細胞株は、アデノウイルスｐＩＸタンパク質をコードする遺伝子がそのゲノムにさらに安定的に組み込まれており、前記遺伝子を発現する。本発明の他の好ましい実施態様では、細胞は、ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞である。前記細胞は一次細胞である。
【０１５８】
好ましくは、第９の態様のＭＶＡウイルスを前記細胞に感染させ、及び／又は第１１の態様の核酸分子で前記細胞をトランスフェクションする。当業者であれば、リコンビナントＭＶＡウイルスを得るための、ＭＶＡウイルスの核酸配列と核酸分子との間の相同組換えを可能にする条件を認識している。加えて、当業者であれば、相同組換えが成功したかを評価するための実験試験を認識している。
【０１５９】
本発明の様々な改変及び変形は、本発明の範囲から逸脱することなく当業者には明らかであろう。特定の好ましい実施態様に関して本発明を説明したが、特許請求の範囲に記載されている本発明は、このような特定の実施態様に不当に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際、記載されている本発明の実施態様の様々な改変であって、関連分野の当業者に明らかな改変は、本発明によって包含されることを意図する。
【０１６０】
以下の図面及び実施例は本発明の単なる例示であり、添付の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲を何ら限定するものではないと解釈すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】（Ａ）ＭＶＡの盲目継代（以前の継代のインプットウイルス濃度は不明）。感染時において、目標ＭＯＩは０．０１〜０．１であったか、又は細胞２×１０＾６個／mLに対するインプットウイルスを２×１０＾４〜２×１０＾５pfu/mLとした。（Ｂ）各継代を０．０５の規定ＭＯＩで開始し、高継代ＭＶＡ及び低継代ＭＶＡを常に平行して調査したことを除いて、（Ａ）に示されている実験を繰り返した。急激な産生量増加は、再産生性を示す継代１０のＭＶＡからやはり始まることに留意する。（Ｃ）ピーク力価は、通常、感染４８時間後に得られた。これらの産生量のみがこのチャートに示されている。個々の実験の参照継代では産生量が一定であり（滴定法の変動内、太字の記号）、継代数が増加するにつれて産生量が段階的に〜急激に改善することに留意する。（Ｄ）感染４８時間後における高継代ＭＶＡと低継代ＭＶＡとの産生量比。パネル（Ｃ）からのデータを用いて、計算を実施した。１という比は類似の特性を示し、継代１０〜継代２３のＭＶＡについて観察される。
【図２】ここでは、漿尿膜ワクシニアアンカラ（ＣＶＡ、GenBankエントリＡＭ５０１４８２）（高度弱毒化改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）の親ウイルス）のゲノム中の突然変異の位置が記載されている。配向のための選択した制限酵素部位（restricion enzyme sites）、逆位末端リピート及び欠失部位が示されている（Meyer, et al. 1991 in J Gen Virol 72 ( Pt 5), 1031-1038）（ローマ数字付の淡色の四角形）。影響を受けた遺伝子（Ａ３Ｌ、Ａ９Ｌ及びＡ３４Ｒ）は、太枠で示されている。破線は、関連する配列の変化を示す。コード鎖が示されており、英数字は、株ＭＶＡ−ＣＲにおける各遺伝子のＤＮＡ及びアミノ酸レベルで突然変異を表す。
【図３】図１に部分的に示されているデータに異なる系統の名称を追加した。（Ａ）ＭＶＡの盲目継代（以前の継代のインプットウイルス濃度は不明）。感染時において、目標ＭＯＩは０．０１〜０．１であったか、又は細胞２×１０＾６個／mLに対するインプットウイルスを２×１０＾４〜２×１０＾５pfu/mLとした。この実験では、ＭＶＡ−Ａ２を、単離株ＭＶＡ−Ｘ１４及びＭＶＡ−Ｘ２０につながる系統ＭＶＡ−Ｘに継代した。（Ｂ）各継代を０．０５の規定ＭＯＩで開始し、高継代ＭＶＡ及び低継代ＭＶＡを常に平行して調査したことを除いて、（Ａ）に示されている実験を繰り返した：低継代のスレッドをＭＶＡ−Ａ２で開始し、参照高継代のスレッドをＭＶＡ−Ｘ１４で開始した。急激な産生量増加は、再産生性を示す継代１０のＭＶＡからやはり始まることに留意する。（Ｃ）ピーク力価は、通常、感染４８時間後に得られた。これらの産生量のみがこのチャートに示されている。個々の実験の参照継代では産生量が一定であり（滴定法の変動内、太字の記号）、継代数が増加するにつれて産生量が段階的に〜急激に改善することに留意する。このコントロール実験では、ＭＶＡ−Ａ２は系統ＭＶＡ−ＣＲにつながり、ＭＶＡ−Ｘ１４は系統ＭＶＡ−Ｙにつながる。単離株ＭＶＡ−Ａ２、ＭＶＡ−ＣＲ７及びＭＶＡ−ＣＲ１１のゲノムＤＮＡを配列決定した。（Ｄ）Ａ３４Ｒにおける遺伝子型Ｇ２５６Ｔは、本発明者らによって富化されている：ＭＶＡ−Ｘ１４、ＭＶＡ−Ｙ２３及びＭＶＡ−ＣＲ１１では、ＢｓａＷＩ耐性が突然現れて継続的に蓄積することに留意する。未消化ＰＣＲアンプリコンは、非テンプレートコントロールと一緒に（Ｆ）に示されている。（Ｅ）感染４８時間後における高継代ＭＶＡと低継代ＭＶＡとの産生量比。パネル（Ｃ）からのデータを用いて、計算を実施した。１という比は類似の特性を示し、継代１０〜継代２３のＭＶＡについて観察される。
【図４Ａ】ＭＶＡ−ＣＲは新規の株であり、ＭＶＡ−ＣＲ１９はこの株の純粋単離株である。（Ａ）プラーク精製、続いて診断的な制限酵素消化と進めた。（Ｂ）従来のシークエンスクロマトグラムは、ウイルス単離株ＭＶＡ−ＣＲ１９が、３つの遺伝子Ａ３Ｌ、Ａ９Ｌ及びＡ３４Ｒの全てにおいて純粋な新規遺伝子型であることを実証している。
【図４Ｂ】ＭＶＡ−ＣＲは新規の株であり、ＭＶＡ−ＣＲ１９はこの株の純粋単離株である。（Ａ）プラーク精製、続いて診断的な制限酵素消化と進めた。（Ｂ）従来のシークエンスクロマトグラムは、ウイルス単離株ＭＶＡ−ＣＲ１９が、３つの遺伝子Ａ３Ｌ、Ａ９Ｌ及びＡ３４Ｒの全てにおいて純粋な新規遺伝子型であることを実証している。
【図５】クリスタルバイオレットで染色した細胞単層におけるＭＶＡ−Ａ２及びＭＶＡ−ＣＲ１９の巨視的なプラーク表現型。ＭＶＡ−Ａ２感染ＣＲ細胞が円形のプラークにより点状に見える感染７２時間後において、ＭＶＡ−ＣＲ１９ではコメットが既に現れていることに留意する。感染９６時間後において、培養物はＭＶＡ−ＣＲ１９感染後のＣＰＥが強烈であり、従って、細胞塊の大規模な消失により、全体的な染色強度はより弱いと思われる。この時点では、コメットは、ＭＶＡ−Ａ２感染後においても見られる。哺乳類Ｒ０５Ｔ培養物では、逆の関係が見られる：親ＭＶＡ−Ａ２感染後においてのみ、プラークは感染１２０時間後に顕著であり、コメットのような形状である。ＭＶＡ−ＣＲ１９単離株は、この細胞株では高度に弱毒化されていると思われる。左のパネルは、肉眼で見られるプラークを示し（スケールバーは０．５cm）、右のパネルは、４０倍初期倍率後の細胞を示す（スケールバーは１００μm）。
【図６】４０倍初期倍率時のプラーク表現型。ＭＶＡ−ＣＲ１９を感染させたＣＲ細胞（上の列）では、プラークは、ＭＶＡ−Ａ２と比較して顕著であることに留意する；混合遺伝子型では、突然変異が支援機能を既に発揮しているかのように、ＭＶＡ−ＣＲ１１によって引き起こされるプラークサイズは中間である。ＭＶＡ−Ａ２（下の列）よりも弱毒化されていると思われるＭＶＡ−ＣＲ１９を含むＲ０５Ｔ細胞では、逆の状況が観察された；やはり、ＭＶＡ−ＣＲ１１は中間の位置にある。
【図７】懸濁培養液中のＣＲ産生細胞からのウイルス放出。Ａ２及びＣＲ１９はＭＶＡ単離株を指し、ＣＤ−Ｕ３及びＣＤ−ＶＰ４は、ウイルス生産のために追加した１容量の対応する培地を指し、細胞増殖はＣＤ−Ｕ３中で常に実施した。（Ａ）ウイルス生産培地を追加した場合（太字の記号）又はウイルス生産培地を追加しなかった場合（白色の記号）の細胞増殖培地における単離株ＭＶＡ−Ａ２及びＭＶＡ−ＣＲ１９の複製速度。１０＾５pfu/mLの破線はインプットウイルスに対応し、ＭＯＩは５である。（Ｂ）感染４８時間後の上清又は完全溶解物における感染単位の分布（上清及び細胞結合ウイルス）。白色の柱は完全溶解物のpfu/mLを示し、黒色の柱は、細胞上清中に放出された感染単位の濃度を示す。柱の上の円グラフは、完全溶解物（ＬＹＳ）と比較した無細胞空間（ＳＮ）中の感染単位を指す。（Ａ）に示されている曲線は、３回の独立した並列実験の平均であり、４つの独立した曲線を比較する際の明瞭性を維持するために、標準偏差は示さない。（Ｂ）では、４８時間の時点の値について、３回の反復の標準偏差を示す。これらのデータ点を得るのに使用したサンプルは、パネル（Ａ）の速度からのものである。
【図８】血清の存在下で培養した接着産生細胞からのウイルス放出。白色の柱は完全溶解物のpfu/mLを示し、黒色の柱は、細胞上清中に放出された感染単位の濃度を示し、柱の上の円グラフは、溶解物中の無細胞ウイルスの割合を示す。感染ＣＲ又はＣＲ．ｐＩＸ細胞では感染４８時間後（４８ｈ  ｐ．ｉ．）において、及びＲ０５Ｔ細胞では感染１４４時間後（１４４ｈ  ｐ．ｉ．）において、ＭＶＡ−Ａ２又はＭＶＡ−ＣＲ１９について培養物をアッセイした。
【図９】血清依存性接着ＣＲ細胞及び哺乳類Ｒ０５Ｔ細胞におけるＭＶＡの連続世代。ＭＶＡ−Ｂは接着ＣＲ細胞由来の系統であり、ＭＶＡ−ＲはＲ０５Ｔ細胞由来の系統である。（Ａ）前世代の力価を知らずに連続感染を実施した。インプットウイルスの生じた変動を下（黒色）の曲線に示し、産生量を上の曲線に示す。単位は、pfu/mLのｌｏｇ１０である。（Ｂ）産生量をインプットウイルスで割ることにより、各世代のウイルスの増幅（amplificaton）を表す。ＭＶＡ−Ｘ（上の破線曲線）は、図１に示されている化学的に定義された懸濁培養液由来の系統である。世代数が多くなると増幅がより大きくなることが示され、ピーク値は、インプットウイルス１pfu当たり１００００個の感染性子孫ウイルスである。
【図１０】化学的に定義された懸濁環境に対する優れた特異性。株ＭＶＡ−Ｂ及びＭＶＡ−ＲにおけるＡ３Ｌ  Ｃ１９１５Ｔ、Ａ９Ｌ  Ａ２２３Ｇ及びＡ３４Ｒ  Ｇ２５６Ｔ領域の配列。アヒル又はフルーツコウモリ起源の接着培養物で継代した２系統は野生型配列を維持しており、ここに記載されているオープンリーディングフレームにはいかなる遺伝子型変化の兆候も全くない。
【図１１】マイクロフォーカスアッセイのための染色後のＶｅｒｏ細胞の様子。フォーカスは、平行して単離したＭＶＡ−Ｂ２０（接着バリケン細胞株から得られたもの）よりもＭＶＡ−Ｒ１８（Egyptian rousette由来の細胞で継代することによって得られたウイルス株又は系統）の滴定で顕著である。霊長類起源の細胞で新たに起こった複製が限定的であることは、ワクチン株としてより優れた免疫刺激の可能性を示している。
【図１２】ＭＶＡ−ＣＲ単離株ＭＶＡ−ＣＲ１１及びＭＶＡ−ＣＲ１９の弱毒化。パネル（Ａ’）は単離株ＭＶＡ−ＣＲ１１の複製特性を示しており、やはり（Ａ）示されている単離株ＭＶＡ−ＣＲ１９に対して中間の位置にある。パネル（Ｂ）は、ＭＶＡ−ＣＲ１９によって引き起こされた感染非鳥類細胞における細胞変性効果の例（又は、細胞変性効果の非存在）を示す。２００倍初期倍率の画像（スケールバーは２０μm）は、チャート（Ａ）の９日目の細胞を示す。
【０１６２】
【表１】
2015535687.tif 000002
2015535687.tif 000003
2015535687.tif 000004
【０１６３】
実施例
実施例１：化学的に定義された懸濁培養液におけるＭＶＡの連続単離株
本実施例では、本発明者らは、このウイルスに対して既に完全に許容性の細胞株において、連続世代のＭＶＡの特性を調査した。化学的に定義された培地及びビリオン安定化成分（例えば、孵化卵の最小限精製溶解物に含まれる豊富な細胞外タンパク質及び脂質、又は脊椎動物細胞培養物に一般的に見られるウシ血清サプリメント）の非存在によって、選択的環境を課す。
【０１６４】
ＤＮＡウイルスから予想される安定性を確認するために、本発明者らは、ＣＲ細胞株でＭＶＡを継代した。実験のために、本発明者らは、アクセッションナンバーＡＹ６０３３５５（バージョンＡＹ６０３３５５．１及びＧＩ：４７０８８３２６）のＭＶＡ株を使用した。用いた懸濁培養液及び化学的に定義された手順は、規制当局が提案する制約の十分に範囲内であり、以前に開発及び提示したものである（Jordan, et al. 2011 in Biologicals 39, 50-58）。ここで簡潔に説明すれば、超弱毒化ポックスウイルスを高力価に生産するために、ＣＤ−Ｕ３培地中のＣＲ又はＣＲ．ｐＩＸ懸濁培養物を細胞４×１０＾６個／mLに増殖させた。１容量のＣＤ−ＶＰ４ウイルス生産培地を追加し、示されている感染多重度（ＭＯＩ）（通常は０．０１〜０．１の範囲内）までウイルスと共に培養物をインキュベーションした。ＣＲ及びＣＲ．ｐＩＸ細胞株は不死化バリケン網膜細胞（Jordan, et al. 2009 in Vaccine 27, 748-756）に由来し、ワクチン生産のために設計した。ＣＤ−Ｕ３培地（PAA, catalog #T1250,3001）は改良型のＣＤ−Ｕ２細胞増殖培地であり、ＣＤ−ＶＰ４（Biochrom catalog #F9127）は、ウイルス複製中にこの増殖培地を補完するために開発されたウイルス生産培地である（Jordan, et al. 2011 in Biologicals 39, 50-58）。以下の実施例に記載されている全ての培養を、８％ＣＯ２富化雰囲気中、３７℃で実施した。振幅５cm並びに１８０rpm（振盪チューブの場合）及び１５０rpm（振盪フラスコの場合）の振盪インキュベータ（Infors）内で、懸濁培養物をインキュベーションした。
【０１６５】
規定の間隔で懸濁培養物からサンプルを取り出し、出力１０％で３．２mmソニファアーチップに電力供給するBranson S250-Dユニットを用いて４５秒間超音波処理することによって、その中の感染性ウイルスを通常通り放出させた。
【０１６６】
５％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２培地（Gibco）中の８０％コンフルエントＶｅｒｏ単層に系列希釈のウイルス調製物を追加することによって、感染単位数を決定した。ＭＶＡはＶｅｒｏ細胞内では複製することができないので、このような基質を使用してインプットウイルスのみを厳密に定量することが可能になる。４８時間後、メタノールで細胞を固定し、１％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳで１：１０００希釈したポリクローナルワクシニアウイルス抗体（Quartett Immunodiagnostika, Berlin, Germany）と共にインキュベーションした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで２回の洗浄工程を実施し、ワクシニア特異的抗体に対する二次抗体を１：１０００で追加する。この二次抗体は、ＡＥＣ試薬（３−アミノ−９−エチル−カルバゾール；０．０１５％Ｈ２Ｏ２を含有する０．３mg/mlの０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０））と共にインキュベーションすると呈色反応を触媒するペルオキシダーゼ酵素にカップリングされている。光学顕微鏡検査によって感染フォーカスを同定し、陽性色素反応をもたらす最大希釈のＭＶＡ懸濁液からプラーク形成単位／mlを計算する。全ての滴定を並列反復で実施した（１サンプル当たり合計４つの滴定値が得られる）。
【０１６７】
一次ニワトリ細胞における増殖に既に適合されたＭＶＡを不死（一次ではない）培養物（これは同時に、ニワトリに由来しない鳥類生産基質である）に連続曝露したのはこれが最初である。さらに、本発明者らは、血清、アルブミン、又はウイルスを安定化すると予想される他の成分を追加せずに、化学的に定義された培養培地中で継代を実施した。
【０１６８】
図１Ａ／３Ａに示されているように、継代の増加と共に産生量が徐々に増加している。直前の各世代からのウイルス産生量が推定されるようにこの最初の実験を実施し、この推定値を用いて、本発明者らは、０．０１〜０．１のＭＯＩで次の培養物に感染させようとした。滴定を評価することができるまでに必要な時間が原因で、真のＭＯＩは継代によって異なっており、本発明者らの場合（継代がウイルス複製に対する弱毒化効果又は抑制効果も有し得る）では、継代の増加と共に産生量及びＭＯＩが増加した。完全に許容性の細胞株におけるＭＶＡの驚くべき潜在的な継代効果を発見した後、本発明者らは、よりストリンジェントな条件下で実験を繰り返した。
【０１６９】
前の各継代の感染４８時間後に単離したウイルスを用いて各継代のＭＯＩを０．０５に調整することによって、図１Ｂ〜１Ｃに示されているデータを得た。図１Ａ／３Ａの最初の実験の最後から２番目の継代１４のウイルスを高継代参照として使用した。従って、この繰り返し実験では、ＭＶＡ特性の任意の変化が確認される。
【０１７０】
図１Ｂは、様々な継代の速度を重ね合わせて示す。各実験について、低継代ＭＶＡ及び高継代ＭＶＡから開始して、独立したデュプリケイトの２回の独立した平行感染を定量した。低継代ウイルスで開始した継代１０及び１１のスレッドでは、本発明者らは、１０＾８pfu/mL〜１０＾９pfu超/mLの範囲内の（既に高い）産生量からの強い変化に注目した。
【０１７１】
効果をより良く可視化するために、図１Ｃは、継代数に対する４８時間のピークウイルス力価のみを示す。継代１４から開始したＭＶＡ継代は約３．４×１０＾９pfu/mL前後であるのに対して、１０未満のＭＶＡ継代は３．８×１０＾８pfu/mLの範囲内である。継代１０及び１１のウイルスは、３．６６×１０＾９pfu/mLの平均ピーク値まで急に複製する。ウイルス力価の決定は変動を伴うので、図１Ｄ／３Ｄは、特定の各継代に関する低継代ウイルスと高継代ウイルスとの比を示す。高継代ウイルスの複製特性は依然として安定であるので、このアプローチは、力価の偏差に対して標準化する。大きな数字は高継代ウイルスの利点を示し、１という比は、低継代ウイルス及び高継代ウイルスの特性が非常に類似するか又は同一であることを示す。
【０１７２】
図１Ｄのデータは、低継代ウイルスの各世代の産生量が高継代ウイルスの産生量に近づいていることを示す。実験開始時には２０倍超の量の高継代ウイルスが放出されるのに対して、継代１０の後にはこの数が同等まで減少する。この特定の実験では、高継代表現型へのさらなる工程が継代８で開始する。安定した超高産生量のウイルスが継代１０で得られ、継代１１で維持されていることが示されている。継代１４から開始する独立参照系統から開始して８継代にわたって、全体的な安定性が実証されている。
【０１７３】
実施例２：ＭＶＡゲノムＤＮＡの配列決定
本発明者らは次に、選択したウイルス継代のＤＮＡ配列を決定した：記載されているように（Jordan, et al. 2011 in Biologicals 39, 50-58）、ＣＤ−Ｕ３及びＣＤ−ＶＰ４培地の１：１混合物中、細胞２×１０＾６個／mLのＡＧＥ１．ＣＲ培養物１００mLにＭＶＡを０．０１のＭＯＩで感染させた。４８時間後、２００×ｇで遠心分離することによって、感染細胞を除去した。ポリエチレングリコールを澄明上清に（１３％w/vストック純水溶液から）８％まで追加した。氷上で３０分間インキュベーションした後、懸濁液を６６００×ｇで６０分間遠心分離し、ウイルス粒子を含有する半透明のペレットを５００μLのＰＢＳに再懸濁した。
【０１７４】
製造業者の説明書に従って、８単位のTurbo DNase (Ambion)で余分なウイルスＤＮＡを消化し、次いで、DNA blood mini preparation kit (Qiagen)を用いて全ＤＮＡ（大部分がウイルスゲノム）を単離した。
【０１７５】
予想産生量を計算するために、１７８ｋｂｐのＭＶＡゲノム及び６６０g/mol／ＤＮＡ  ｂｐが、１．１７×１０＾８ｇのＤＮＡ／ウイルスmolに対応する。６．０２×１０＾２３／molをＮＡで割ると、１．９５×１０＾（−１６）ｇのＤＮＡ／ＭＶＡ粒子となる。産生量を１０＾８pfu/mLと仮定すると、１．９５×１０＾（−８）ｇのウイルスＤＮＡ／mL又は１９．５ng/mLと予想され得る。
【０１７６】
本発明者らはこの調製で約８μgの全ＤＮＡを得、多重ｑＰＣＲを実施して、ウイルスゲノムＤＮＡと細胞ＤＮＡとの比をさらに推定した。ＣｇＴＴＴＴｇＣＡＴＣＡＴＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＴ（配列番号１３）、６ＦＡＭ−ＡｇｇＣＡＴＡＡＡＣｇＡＴＴｇＣＴｇＣＴｇＴＴＣＣＴＣＴｇＴ−ＢＨＱ１（配列番号１４）及びｇＣｇｇｇＴｇＣＴｇｇＡｇＴｇＣＴＴ（配列番号１５）を用いて、細胞内成熟ウイルスの膜タンパク質ＭＶＡ１２８Ｌの遺伝子（GenBank＃Ｕ９４８４８のｂｐ１２０８１１〜１２０８９８）に対するｑＰＣＲによって、ＭＶＡレベルを定量した。細胞ＤＮＡの検出のために、ＴｇＡＣＴＣＣｇｇＴＣＣＴＴＣＴＡＡＣＡＣＡ（配列番号１６）、ＹＡＫ−ＣＣＣｇｇＴｇｇＴＣＣＣｇＣＴｇＴｇＣ−ＢＨＱ１（配列番号１７）及びＴＣＡＣｇｇＣＡＡＣＴｇｇＴＴＴＡＡＴｇｇ（配列番号１８）を用いて、Ｅ１Ａトランス遺伝子を定量した。２５μLの最終反応容量中、１００nMプライマー及び８０nMプローブを２００μM  ｄＮＴＰ及び１×濃縮Taq Man Universal PCR Master Mix (#4324018, Applied Biosystems)と混合した。ABI Prism 7000において、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、並びに９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクルの熱サイクルを実施した。典型的なＣｔ値は、ＭＶＡについては１６であり、細胞ＤＮＡについては３３であった。Ｃｔ値の差異は相対分子濃度の差異を示すので、ウイルスＤＮＡと宿主ＤＮＡとの比は、ゲノム全体の配列決定に適切な２＾（３３−１６）又は１３００００：１である。
【０１７７】
Roche/454 GS FLX+技術を用いて、配列を得た。各ゲノムの５０倍の被覆度で継代２、７及び１１のゲノムウイルスＤＮＡ（図１に示されている）を配列決定し、非強制的（ガイド配列なし）アルゴリズムを使用してアセンブルした。３つの継代のアライメントにより、ポックスウイルスから予想されるように極めて高い配列保存性が明らかになった。ヌクレオチドリピート中の単一塩基欠失の数は、配列決定用人工物（例えば、ｔｔｔｔｔａｔ−ａａａａｔａａ対ｔｔｔｔｔａｔａａａａａｔａａ）を表している可能性が高いので、さらなる分析に含めなかった。
【０１７８】
非人工物の定義に適合する点突然変異はわずか３つであり、検討継代１１のウイルスゲノムでこれらを発見した。３つの点突然変異は全てがコード領域内にあり、それぞれが異なる構造タンパク質に影響を与え、それぞれがアミノ酸組成を変化させた。本発明者らは、これらの変化を非常に重要で完全に予想外のものであると考える。このように、本発明者らは新規ＭＶＡ株を回収し、残りの本文では本発明者らはこれをＭＶＡ−ＣＲと称する。
【０１７９】
ＭＶＡ−ＣＲで発見した３つの突然変異の第１は、配向目的でここで使用したＣＶＡ株（GeneBank＃ＡＭ５０１４８２）のｂｐ  １１１５６１位にある。この突然変異は、一般的なポックスウイルスゲノムの表記法の１つ（Meyer, et al. 1991 in J Gen Virol 72 ( Pt 5), 1031-1038; Rosel et al. 1986 in J Virol 60, 436-449）によれば、Ａ３Ｌと称される遺伝子のコード配列中のヌクレオチド１９１５におけるＣからＴへのトランジション（Ｃ１９１５Ｔと略される）である。遺伝子産物は、主なコアタンパク質Ｐ４ｂ前駆体である。Ｃ１９１５Ｔ突然変異は、アミノ酸配列において、コドン６３９のＨｉｓ（ＣＡＵ）からＴｙｒ（ＵＡＵ）への変化を引き起こす。ポックスウイルスゲノムでは、Ａ３Ｌ遺伝子はアンチセンス方向にあるので、コード配列におけるＣ１９１５ＴがＣＶＡのゲノムＤＮＡにおけるＧ１１１５６１Ａに対応することに留意する。
【０１８０】
第２の突然変異は、Ａ９Ｌによってコードされる１０．６ｋビリオン膜タンパク質のコード配列におけるＡ２２３Ｇトランジションであり、ＣＶＡのゲノムＤＮＡにおけるＴ１１９１５１Ｃトランジションである。Ａ２２３Ｇ突然変異は、コドン７５をＬｙｓ（ＡＡＧ）からＧｌｕ（ＧＡＧ）に変化させる。
【０１８１】
第３の突然変異は、Ａ３４ＲによってコードされるＥＥＶ膜糖タンパク質のコード配列におけるＧ２５６Ｔトランスバージョンであり、ＣＶＡのゲノムＤＮＡにおけるＧ１４４４１７Ｔトランスバージョンである。Ｇ２５６Ｔ突然変異は、コドン８６をＡｓｐ（ＧＡＴ）からＴｙｒ（ＵＡＵ）に変化させる。
【０１８２】
本実験で使用したＭＶＡのゲノム（アクセッションナンバーＡＹ６０３３５５（バージョンＡＹ６０３３５５．１及びＧＩ：４７０８８３２６））における位置：Ａ３Ｌ、相補鎖のｂｐ  １００３３４〜ｂｐ  １０２２６８；Ａ９Ｌ、相補鎖のｂｐ  １０７８５５〜ｂｐ  １０８１３９；及びＡ３４Ｒ、ゲノム鎖の１２９０７８．．１２９５８４。使用した株は、番号＃ＶＲ−１５０８でAmerican Type Culture Collection (ATCC)から入手可能なウイルスである。
【０１８３】
３つの突然変異は全て、感染性粒子の成分であるＭＶＡのタンパク質に影響を与える。影響を受けるタンパク質のより詳細な機能は、以下のとおりである：
【０１８４】
Ａ３Ｌ遺伝子産物：Ａ３Ｌ遺伝子産物Ｐ４ｂは、３つの主なコアタンパク質の１つであり、球状の非感染性未成熟ビリオン（ＩＶ）が細胞内成熟ビリオン（ＩＭＶ）に成熟する間に、Ｉ７Ｌコードウイルスプロテアーゼによってプロセシングされる（Byrd et al. 2002 in J Virol 76, 8973-8976）。Ｐ４ｂタンパク質は、非常に初期の段階におけるビリオンの形態形成に寄与する。それは、感染性ＩＭＶへの移行における正確な凝縮及び膜再構成に関与する（Heljasvaara et al. 2001 in J Virol 75, 5778-5795; Kato et al. 2004 in Virology 330, 127-146）。
【０１８５】
Ａ９Ｌ遺伝子産物：Ｐ４ｂに類似するこの遺伝子産物は、ＭＶＡ成熟の初期段階に関与する。それは、ＩＭＶのコアの正確な凝縮に重要な因子である（Yeh et al. 2000 in J Virol 74, 9701-9711）。
【０１８６】
Ａ３４Ｒ遺伝子産物：細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）は、ウイルスが遠位部位に拡散するのを可能にするビヒクルとして進化してきた。ＥＥＶのさらなる膜は、ターゲット細胞との融合を媒介するために備わっているのではなく、ＩＭＶ（ワクシニアウイルスの実際の感染単位）を放出するためには破壊されなければならない。Ａ３４Ｒ欠失突然変異体を用いた研究では、ＥＥＶの外膜を不安定化することによって、この因子が、細胞外空間における感染活性及びワクシニアウイルスの拡散に極めて重要であることが実証された（Husain et al. 2007 in Virology 366, 424-432）。Ａ３４Ｒタンパク質は、Ａ３３Ｒタンパク質及びＢ５Ｒタンパク質と共に（Blasco et al. 1993 in J Virol 67, 3319-3325; Katz et al. 2002 in J Virol 76, 11637-11644; Meiser et al. 2003 in J Gen Virol 84, 1383-1392）、細胞結合エンベロープウイルス（ＣＥＶ）が産生細胞から離れる速度をモデュレーションする。
【０１８７】
上記突然変異を有するＭＶＡウイルスは、以前に全く記載されていない。従って、安定鳥類細胞株の化学的に定義された懸濁培養液中でＭＶＡを継代することにより、２つの内在性タンパク質（Ａ３Ｌ遺伝子産物及びＡ９Ｌ遺伝子産物）が変化して実際の感染実体（成熟ウイルス）が改善された。これらの変化は感染力を増加させ、成熟速度を改善し、及び／又は血清の予想安定化成分が含まれない環境における安定性を増加させる。加えて、細胞外形態のウイルスの特性をモデュレーションするＡ３４Ｒ遺伝子産物において、点突然変異が検出された。この変化は脱離速度を増加させ、成熟粒子の感染力を遮蔽する外側のウイルスエンベロープの安定性を減少させる。
【０１８８】
実施例３：確認実験
本発明者らの予想外の発見の原因が配列決定用人工物であることを排除するために、本発明者らは確認実験を実施した。調製物中のＭＶＡ−ＣＲの存在を確認するために、本発明者らは、さらなる配列決定反応用に、影響を受ける全てのオープンリーディングフレームを増幅するためのプライマーを設計した。KOD HiFi DNA polymerase (TOYOBO Novagen)を用いて、５５℃で２０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の増幅（Ａ３Ｌの場合には１２０秒間）及び９４℃で２０秒間の変性を３６サイクル行うＰＣＲを実施した。Ａ９Ｌのコード配列を増幅するためのプライマー（ｆ＝フォワード及びｒ＝リバース）は、ＧＣＡＡＡＣＧＣＧＡＴＡＡＧＧＡＴＡＣＧ（ａ９ｌｆ）（配列番号１９）及びＡＡＧＣＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＴＡＧＡＣＧ（ａ９ｌｒ）（配列番号２０）であり、Ａ３４Ｒのコード配列を増幅するためのプライマーは、ｇＣｇｇＡＡＴＣＡＴＣＡＡＣＡＣＴＡＣＣＣ（ａ３４ｒｆ）（配列番号２１）及びＴＡＡＴＡＡＣＡＡＡＣｇＣｇｇＣｇＴＣＣＡＴｇｇＣ（ａ３４ｒｒ）（配列番号２２）であった。かなり大きなＡ３Ｌオープンリーディングフレームの配列決定は、いくつかのプライマーを用いて行った：ＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＣＴＴＡＧＧ（ａ３ｌｆ）（配列番号２３）及びＡＴＧＧＡＡＧＣＣＧＴＧＧＴＣＡＡＴＡＧ（ａ３ｌｒ）（配列番号２４）を用いて増幅を実施し、ＴＧＡＧＡＧＣＴＣＧＣＡＴＣＡＡＴＣ（ａ３ｌｆ２）（配列番号２５）、ＡＴＣＧＧＡＣＴＧＴＣＧＧＡＴＧＴＴＧＴＧ（ａ３ｌｆ３）（配列番号２６）及びＣＴＡＧＡＡＴＣＧＧＴＧＡＣＣＡＡＣＴＣ（ａ３ｌｒ３）（配列番号２７）を用いて配列決定を実施した。
【０１８９】
偶然にも、Ａ３４Ｒにおける突然変異Ｄ８６Ｙは、ＡｃｃＩ制限酵素のターゲット部位を導入する：ｃｃｇｇａｔａｃｔからｃｃＧ／ＴＡＴＡＣｔに（太字は突然変異であり、大文字は制限ターゲット部位である）。同時に、野生型のＢｓａＷＩ部位は、ａｇＡ／ＣＣＧＧＡｔからａｇａｃｃｇｔａｔへの突然変異Ｄ８６Ｙによって失われる。７７２ｂｐのＡ３４ＲアンプリコンをＡｃｃＩで消化すると、親ＭＶＡの場合には３９９及び３７３ｂｐが生じ、ＭＶＡ−ＣＲの場合には３９９、３１６及び５７ｂｐが生じる。逆に、ＢｓａＷＩで消化すると、親ＭＶＡの場合には４５２及び３２０ｂｐが生じ、ＭＶＡ−ＣＲの場合には７７２ｂｐ全体が生じる。ＴＡＥ緩衝液中、３％アガロースゲル電気泳動によって、フラグメントを分離した。
【０１９０】
図３Ｄは、Ａ３４ＲにおけるＤ８６Ｙ変異がＭＶＡ−ＣＲ１１集団の一部であることを示す。それは、Ｘ１４系統でも独立して得られた。この結果は、ここで発見された突然変異が偶然の出来事ではなく、実際にはウイルス複製中の環境に関連することを裏付けている。
【０１９１】
本発明者らはまた、増幅フラグメントの従来の配列決定によってこれらの驚くべき結果を確認した。サブクローニングせずに精製ＰＣＲ反応物で配列決定を意図的に直接実施したので、図４に示されているクロマトグラムは、平均的な配列（すなわち、最も豊富な配列だけではなく配列変異の存在も）を反映すると予想される。アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲ産物を分離し、単一の顕著なシグナルを含有するゲルスライスを切り出し、製造業者の説明書に従ってQIAquick Gel Extraction kit (Qiagen)を使用してその中のＤＮＡ混合物を単離することによって、ＰＣＲ反応物の精製を実施した。増幅にも使用したのと同じプライマーを用いて、配列決定を実施した。
【０１９２】
本発明者らは、ＭＶＡ−ＣＲ１１及び独立Ｘ１４系統において、観察された３つの突然変異の全てが存在することを確認した。
【０１９３】
実施例４：新規ＭＶＡ−ＣＲ株の単離及び精製
純粋なＭＶＡ−ＣＲウイルスを得るために、本発明者らは次に、プラーク精製を実施した：５％ＦＣＳ（Biochrom）を含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２培地中の６ウェルプレートの１ウェル当たり１×１０＾６個の接着ＣＲ細胞を播種した。２４時間後、合計でわずか１０＾４pfuのＭＶＡ−ＣＲ１６（これは、化学的に定義されたＣＲ懸濁培養液中でさらに５世代にわたって継代したＭＶＡ−ＣＲ１１の子孫である）を追加した。少数の感染単位を感染させることにより、十分に分離したプラークを得ることが可能になる。３０分後、５％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２培地中の０．８％の低ゲル化アガロース（Sigma #A9045）と培養培地を交換した。アガロースオーバーレイは、個々のプラークが互いに混入しないように、感染単層によって放出される子孫ウイルスの拡散を防止する。オーバーレイはまた、中空針を用いて小さな（約２mmの直径）アガロースコアを再生することによって、子孫ウイルスの単離を可能にする。細胞変性効果のフォーカスからこのようなアガロースコアを採取し、１２ウェルプレートにおける最大培養密度８０％の新鮮接着細胞単層に移し、各アガロースコアを別個のウェルに入れた。ウイルスはアガロースコアから拡散し、ウェル中の細胞に感染し、この手順によって得られたウイルスは、（理論的には）単一の初期プラークに由来するので精製されたと考えられる。しかしながら、一部のウイルスは凝集する傾向があり、ポックスウイルスでは問題も発生するので、特定の宿主培養物はウイルス混合物に感染している可能性がある。図４に示されているように、ＭＶＡ−Ａ２から１７世代離れたこの調製物の単離株＃９（従って、ＭＶＡ−ＣＲ１７＊と称される。アスタリスクは、さらなる操作としてのプラーク精製を意味する）を純粋であると考え、さらなるプラーク精製のために選択した。第２ラウンドにより、所望のＡ３４Ｒ遺伝子型が得られた。この第２ラウンドの単離株＃１を選択し、化学的に定義されたＣＲ培養液中で増幅した。フラグメントをサブクローニングせずにＰＣＲからＡ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及びＡ３４Ｒ遺伝子を直接配列決定したところ、純粋でユニークな新規集団が明らかになった。
【０１９４】
要約すると、化学的に定義された過程から得られたウイルスを不死化細胞株で繰り返し単離することによって、本発明者らは、新規ワクシニアウイルス株を取得してさらに精製した。微生物学的定義による株は、「純粋培養における単一単離の子孫であって、［．．．］他の単離株と［．．．］表現型特徴及び遺伝子型特徴によって区別され得る子孫」を意味する（van Belkum et al. 2007 in Clin Microbiol Infect 13 Suppl 3, 1-46）。本発明者らは、これを株ＭＶＡ−ＣＲと称する。この株の十分に精製された最初の実際的なメンバーはＭＶＡ−ＣＲ１９であり、区別可能な特徴は、Ａ３Ｌ遺伝子におけるＣ１９１５Ｔ、Ａ９Ｌ遺伝子におけるＡ２２３Ｇ、及びＡ３４Ｒ遺伝子におけるＧ２５６Ｔ（数字は全て、コード鎖に関するものである）からなる群より選択される突然変異の少なくとも１つである。
【０１９５】
実施例５：ＭＶＡ−ＣＲの特性（産生量）
ＭＶＡ−ＣＲを含有する調製物の産生量は、親株を含有する集団と比較してほぼ１０倍大きい。これは、極めて重要な特性である。ＭＶＡベースのワクチンの超弱毒化は重要な安全特徴であるが、投与コスト要件を犠牲にする：ワクチン接種１回当たり１０＾８感染単位のＭＶＡが、免疫系の効率的な刺激に必要であると推定され（Coulibaly et al. 2005 in Virology 341, 91-101; Gilbert, et al. 2006 in Vaccine 24, 4554-4561）、感染性疾患に対する世界的なプログラムのために、高度弱毒化ポックスウイルスの数億回の投与が毎年必要とされ得る。比較のために、鳥類細胞でも生産される複製能が制限された低度弱毒化株としては、はしか、おたふく風邪及び黄熱病に対するワクチンが挙げられる；これらは、１用量当たり１０＾３〜５．５×１０＾４感染単位しか必要としない（Sanofi PasteurのYF-VAX（登録商標）及びMerckのM-M-R（登録商標）IIの添付文書からの情報）。天然痘に対するルーチンなワクチン接種におけるワクシニア株Dryvaxの防御用量は、２．５×１０＾５感染単位であり（Rotz et al. 2001 in MMWR Recomm Rep 50, 1-25; quiz CE21-27）、ＭＶＡベースのワクチンの推奨用量よりも４００倍少ない。従って、全ての目的のワクチンを得るためには、ＭＶＡベースのワクチンのための高効率でロバストな新規生産系が必要であり、技術進歩を補完するために新規ＭＶＡ株が必要である。
【０１９６】
実施例６：ＭＶＡ−ＣＲの特性（宿主細胞からの脱出）
等しく重要な別の特性は、ウイルス調製物の純度に関する。連続細胞株由来の任意のワクチンについて、宿主細胞由来の成分を枯渇させるための調製物の精製が必要とされる。残存ＤＮＡに関して、１用量当たり１０ngの最大レベル（Hess et al. 2012 in Vaccine 30, 2715-2727）が許容可能であると考えられる。従来のＭＶＡのかなりの割合は、非常に細胞結合性である。本発明者らが同定した新規突然変異は、宿主細胞からのウイルスの放出及び解離を促進する。ＥＥＶの外膜を不安定化すると、細胞外容積に存在するウイルス（ＩＭＶに対応するビリオン）の実際の感染単位の量が多くなった。
【０１９７】
確認のために、非弱毒化ワクシニアウイルスについて以前に記載されている「コメットアッセイ」（McIntosh and Smith 1996 in J Virol 70, 272-281）を行った。このようなアッセイにより、ウイルスが宿主細胞から脱出する能力が可視化される：円形のプラークは強力な細胞結合を示すのに対して、細長いコメット様のプラークは、子孫ウイルスが宿主細胞から解離して、より遠位部位で感染を開始することを示唆している。本発明者らの実験では、１×１０＾６個の接着ＣＲ細胞又は１．５×１０＾６個のＲ０５Ｔ細胞をＴ２５フラスコに播種した。Ｒ０５Ｔは、Egyptian rousette由来の一次細胞の不死化によって得られた細胞株である。これは、非常に数少ないＭＶＡ許容性の哺乳類細胞株の１つであり（Jordan, et al. 2009 in Virus Res 145, 54-62）、ここに記載されている実験では参照としての役割を果たす。２４時間後、５００００pfuのＭＶＡ−Ａ２又はＭＶＡ−ＣＲ１９を追加した。フラスコをインキュベータに入れ、少なくとも７２時間静置して、放出されたウイルスがごく近傍で確実に再感染して、主なプラークと依然として結合し得るようにした。０．２容量の１０％ホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液を培地に直接追加することによって、細胞単層を固定した。図５に示されているように、０．０５％クリスタルバイオレット（Sigma）水溶液で染色した後、様々なプラーク形態のＭＶＡ−Ａ２及びＭＶＡ−ＣＲ１９が肉眼でも見える。
【０１９８】
図６は、ＭＶＡ−Ａ２、ＭＶＡ−ＣＲ１１又はＭＶＡ−ＣＲ１９を感染させたＣＲ細胞及びＲ０５Ｔ細胞の単層における典型的なプラークを４０倍初期倍率で示す。この高倍率において、本発明者らは、Ｒ０５ＴではＭＶＡ−ＣＲ１９の弱毒化がより大きいことをより明確に観察し、ＣＲ細胞ではＭＶＡ−ＣＲ１９によって引き起こされた顕著なプラークが存在することを確認した。
【０１９９】
本発明者らは次に、接着培養物におけるプラーク表現型が、化学的に定義された感染細胞培養物内でもウイルス移動性がより大きいことの指標であるかを調べた。従って、本発明者らは、今回は無細胞上清（「ＳＮ」と略される）を得るためにサンプルを２００×ｇで５分間遠心分離した以外は実施例１に記載されているように、単離株ＭＶＡ−Ａ２及びＭＶＡ−ＣＲ１９をＣＲ．ｐＩＸ懸濁培養物に感染させた。細胞ペレットを廃棄し、感染力を増加させるために、ＳＮ中のウイルスを３回の凍結／解凍サイクル（−８５℃／３７℃）に供してＥＥＶの外膜を破裂させた。
【０２００】
さらに、本発明者らは、ＣＤ−ＶＰ４ウイルス生産培地を追加せずにＣＤ−Ｕ３細胞増殖培地のみの単相プロセスにおいてもウイルス複製を試験した。本発明者らは、ＣＤ−ＶＰ４を感染時に追加する二相プロセスが、超弱毒化ポックスウイルスの産生量を有意に増加させることを以前に示した（Jordan, et al. 2011 in Biologicals 39, 50-58）。この理由により、図７Ａに示されている複製速度の比較が、単離株ＭＶＡ−ＣＲ１９が単相プロセスにおいて二相環境と同様に効率的に複製することを示すことは非常に驚くべきことであった（灰色の曲線）。ＭＶＡ−Ａ２については、予想された少なくとも１０倍の差異が確認された（黒色の曲線、単相プロセスについては白色の記号）。
【０２０１】
従って、本発明者らは、宿主細胞からのＭＶＡの放出を促進する機能獲得型突然変異を得た。これは、図７（本発明者らは、上清（ＳＮ）及び完全溶解物中の感染単位を比較している）に示されているデータでも確認される。パネルＢのチャートについては、感染４８時間後において、ＳＮだけではなく完全細胞懸濁液の超音波処理溶解物由来のウイルスもアッセイした。無細胞区画（単相プロセスでは７４．０％、二相プロセスでは３７．５％）では、感染性ＭＶＡ−ＣＲ１９ウイルスの割合がＭＶＡ−Ａ２（それぞれ３．６％及び４．９％）と比較して高い。
【０２０２】
ウイルス生産培地の存在下では、より多くのＭＶＡ−ＣＲ１９ウイルスが宿主細胞内で捕捉されるという事実は、細胞凝集を誘導してウイルスの細胞間拡散を促進するという本発明者らの意図と一致する。この観察結果は、図８（顕著な差異はほとんどないが、全ての試験した培養物においてＭＶＡ−ＣＲ１９の放出がＭＶＡ−Ａ２と比較して促進されている）に示されている接着培養物でも確認される。前述のように、ＥＥＶの外膜はＭＶＡの感染力に干渉するので、ＭＶＡ−ＣＲの細胞外感染力の増加の理由の１つは、この成分の安定性の減少によるものである。撹拌せず、ビリオンを安定化するウシ胎児血清の存在下では、ＭＶＡ−ＣＲ１９のこの外膜はより長い時間間隔にわたって保持されて、ＭＶＡ−ＣＲ１９のこの潜在的な利点が平準化される。さらに、これらは細胞接着を促進することが公知であるように（Attramadal 1969 in J Periodontal Res 4, 166）、接着培養物用に設計した培地中では、二価陽イオンの濃度が上昇している。Ｍｇ２＋及びＣａ２＋濃度の増加は、おそらくは原形質膜に対するウイルスエンベロープの結合を増強して、化学的に定義された懸濁培養液中のＭＶＡ−ＣＲについて本発明者らが観察した利点がやはり平準化される。
【０２０３】
従って、ＭＶＡ−ＣＲ１９は、宿主細胞からの脱出能力が増加している。しかしながら、完全に予想外で驚くべきことは、（本発明者らが単離株ＭＶＡ−ＣＲ１９を用いて得た）ＭＶＡ−ＣＲ株の純度の増加と共に、Ｒ０５Ｔ細胞株における弱毒化が高まる（これは、この細胞株中の完全に閉じ込められた小さなフォーカスによって明らかになる）と思われる明らかな傾向である。この特性は極めて有益である：新規ＭＶＡ−ＣＲ株は依然として高度に弱毒化されていると同時に、産生細胞からより容易に脱出する。全細胞溶解物の代わりに無細胞上清をハーベストバルクとして使用し得るので、細胞外ウイルスの割合の増加は精製を非常に容易にする。さらに、真の単相生産プロセスが可能である：細胞増殖にも使用されるのと同じ培養培地中で、ＭＶＡ−ＣＲを高力価に生産し得る。グルコース及び他の栄養素を提供するため、又はｐＨをレギュレーションするために少量（培養容積の５〜２０％未満）のフィードを追加する以外は、ウイルス生産培地はもはや必要とされない。
【０２０４】
実施例７：ＭＶＡ−ＣＲの特性（化学的に定義されたプロセスに対する特異性）
株ＭＶＡ−ＣＲの出現を駆動する選択圧をさらに特性決定するために、本発明者らはまた、実施例１に記載されている最初の実験に酷似する実験において、接着ＣＲ及びＲ０５Ｔ細胞株から連続世代のＭＶＡを単離した。接着ＣＲ細胞株を使用して、ＭＶＡ−ＣＲの出現が、培養条件に加えて宿主細胞の特徴によっても影響を受けるかを調べた。選択の特異性及び親ＭＶＡの安定性の試験と同じく、ＭＶＡ許容性の哺乳類細胞株であるＲ０５Ｔは参照としての役割を果たす。
【０２０５】
本実験のために、１．５×１０＾６個のＣＲ．ｐＩＸ細胞及び１×１０＾６個のＲ０５Ｔ細胞を各世代のＴ２５フラスコに播種した。０．１の推定ＭＯＩまで感染を実施した。後の段階で滴定によって決定した実際のインプットウイルスを図９Ａに示す。連続ウイルス世代について、完全な細胞変性効果を有するＣＲ培養物を感染４８時間〜７２時間後に回収し、Ｒ０５Ｔ培養物を７２時間〜９６時間に回収した。実施例１に記載されているように、超音波処理によって、溶解物からウイルスを放出させた。
【０２０６】
図９Ｂは、それぞれ懸濁ＣＲ培養物、接着ＣＲ培養物又は接着Ｒ０５Ｔ培養物から得られた各世代のインプットウイルスと放出された子孫ウイルスとの比によって、ウイルスの増幅を示す。実施例１に記載されている第１の実験から、懸濁液における増幅を計算するためのデータを得る。３回の実験の線形回帰直線は、ウイルス複製効率が世代数と共に増加することを示しているが、これは、３つの系の全てにおいてＭＶＡのいくらかの適合を示唆している。ＭＶＡの同族ニワトリ宿主から最も離れた哺乳類Ｒ０５Ｔ細胞において、この効果は最大であると思われる。
【０２０７】
しかしながら、この研究の真に驚くべきかつ極めて強力な確証は、ＭＶＡは血清依存性培養物に適合されるが、これら２つの系のいずれにおいても、Ａ３４ＲにおけるＧ２５６Ｔ遺伝子型は出現も蓄積もしないという事実である。これは、最終的には、実施例３で確立したのと同じ方法によって図９のパネルＣに示されている。
【０２０８】
Ａ３Ｌ遺伝子、Ａ９Ｌ遺伝子及びＡ３４Ｒ遺伝子の配列決定によって、図９Ｃに示されている観察結果を確認した。図１０に示されているように、アヒル又はフルーツコウモリ由来の接着細胞株で継代したウイルスでは、新規ＭＶＡ−ＣＲ遺伝子型が出現又は蓄積する兆候は全くない。
【０２０９】
増幅速度の連続増加は、Ｒ０５Ｔ由来のＭＶＡで最大である。さらに、感染単位の決定において、本発明者らは、ＭＶＡ−Ｒ株、例えば図１１に示されているＭＶＡ−Ｒ１８単離株が、並行して単離したＭＶＡ−Ｂ２０と比較して強いシグナルと、多くの場合には複数の細胞が関与するフォーカスとを発生することを観察した（ＣＲ細胞ではＭＶＡの複製がより速い結果、１２週間の実験の終了時点では２世代先行している）。いくつかの細胞が関与するフォーカス及びより強い染色から、通常の非許容性Ｖｅｒｏ指標細胞株では複製が制限されるという結論が導かれる。ここで調べた全てのＣＲ由来の株（ＭＶＡ−Ｂ、ＭＶＡ−Ｘ、ＭＶＡ−Ｙ及びＭＶＡ−ＣＲプロパ）とは対照的に、ＭＶＡ−Ｒ株は、哺乳類系ではほとんど弱毒化されていないと思われる。このようなウイルスは、株ＭＶＡ−ＣＲ以外にも他の望ましい特性を有し得る：それは、感染部位における複製が制限されるのでより免疫原性であり得、それは、動物（特に、狂犬病ワクチン接種のために触れるのが困難な翼手類）におけるベクター化ワクチンの骨格として極めて適切であり得る。
【０２１０】
要約すると、化学的に定義された懸濁培養液におけるＭＶＡの複製は、ＭＶＡ−ＣＲ出現の主な駆動力である。通常、寄生虫（ウイルス）及び宿主の相互作用は、選択的環境を形成する。しかしながら、ここでは、人工的な化学的に定義された培地、懸濁培養液又は両方の組み合わせ（これは、工業的なワクチン生産の要件を最も満たす）は明らかに、最初の野生型ＭＶＡ遺伝子型のＭＶＡ−ＣＲへのトランスフォーメーションの主な駆動力である。
【０２１１】
実施例８：ＭＶＡ−ＣＲの特性：弱毒化
弱毒化は、親集団と比較したウイルス集団の複製能の喪失を表す。ワクシニアウイルスと比較して、ＭＶＡは、ほとんどの哺乳類細胞、特に霊長類（ヒトを含む）細胞における複製能を喪失している。この特性は、免疫不全ヒトレシピエントにおいてもＭＶＡをワクチンベクターとして適用することを可能にする重要な特徴である。
【０２１２】
ＭＶＡ−ＣＲの弱毒化が維持されているかを試験するために、本発明者らは、ＭＶＡ−Ａ２、ＭＶＡ−ＣＲ１１及びＭＶＡ−ＣＲ１９をＣＲ細胞株、Ｖｅｒｏ細胞株及びＲ０５Ｔ細胞株の接着単層に感染させた。６ウェルプレートの１ウェル当たりそれぞれ５×１０＾５個（ＣＲ）、２×１０＾５個（Ｒ０５Ｔ）及び１×１０＾５個（Ｒ０６Ｅ及びＶｅｒｏ）で細胞を播種し、ＭＶＡを０．１のＭＯＩまで追加した。プレートを凍結し、示されている時点でその解凍溶解物を超音波処理することによって、細胞溶解物を調製した。全てのサンプルを−８５℃で保存し、実験終了時に、上記のようにＶｅｒｏ細胞におけるマイクロフォーカスアッセイで一緒に滴定した。図１２における複製データは、株ＭＶＡ−ＣＲが完全に弱毒化されてＶｅｒｏでは複製せず、Ｒ０６Ｅ（Egyptian rousette由来の細胞株でもある）では非常に遅く複製し、Ｒ０５Ｔでは中程度に複製し、ＣＲ培養物では非常に高い産生力で複製することを裏付けている。ＭＶＡ−Ａ２については、類似の複製表現型を以前に確認した（Jordan et al. 2012 in Viruses 4, 889-900）。
【図２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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