(57)【要約】  内部グロースチャンバ、コアの上流にある、流入口を有する第１端部、コアの下流にある、流出口を有する第２端部を有する取り外し可能なリアクタコアと、培養液流を作り出すためのポンプ手段とを備えるバイオリアクタを開示する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的増殖装置であって、
グロースチャンバユニット（１０）を有するリアクタ（２００）と、
流入口キャップと（６１０）と、
フロー調節膜（６１９）と、
収穫キャップ（６３０）と、
アレイ（６０５）を形成している閉鎖フローチャネル（８１０、９１０）とを備え、
前記閉鎖フローチャネルのマトリックス（６０５）が、開放フローチャネル（７０４、８０１、８０２、９０４）を有する層を貼りあわせることで構成される生物学的増殖装置。
【請求項２】
前記フローチャネルが概して正方形である、請求項１に記載のバイオリアクタ。
【請求項３】
前記フローチャネルが概して卵形である、請求項１に記載のバイオリアクタ。
【請求項４】
前記フローチャネルが底部（７０２）と上部（７０１）との間に垂直の側部（７２１）を伴って形成される、請求項２に記載のバイオリアクタ。
【請求項５】
前記垂直の側部（７２１）と上部（７０１）との間の接合部（７２３）に丸みがついている、請求項４に記載のバイオリアクタ。
【請求項６】
前記アレイの少なくとも１つのフローチャネルが、正方形及び概して卵形から成る群から選択される、請求項１に記載のバイオリアクタ。
【請求項７】
前記グロースチャンバユニットに取り付けられるデジタルメモリ（５４５）をさらに備える、請求項６に記載のバイオリアクタ。
【請求項８】
取り外し可能な細胞回収容器（６６０）をさらに備える、請求項１に記載のバイオリアクタ。
【請求項９】
積み重ねが可能な層に一連の開放フローガイド（９０４、８０３、８０２、７０４）を備えるアレイの層であって、前記層を積み重ねることで前記開放フローガイドを閉じる層。
【請求項１０】
積層体中の前記閉鎖フローチャネルの少なくとも１つが、正方形及び卵形から成る群から選択される、請求項９に記載の層。
【請求項１１】
生物学的増殖システムにおける増殖方法であって、
バイオリアクタの内部グロースチャンバ（ＩＧＣ）の閉鎖フローチャネル内の培養液の流量を制御することを含み、
流量を制御することで前記フローチャネル内でのせん断応力を制限して、中で増殖させている細胞へのせん断応力に起因する損傷を減少させる、生物学的増殖システムにおける増殖方法。
【請求項１２】
前記閉鎖フローチャネル内の培養液流量によって生じるせん断応力が約５Ｐａ未満に制限される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記フローチャネル内での培養液流によって生じるせん断応力が、培養液の流量を介して約７．６Ｐａで３０分未満に制限される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
細胞の栄養及び酸素添加需要量を提供することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
最大の間欠流が得られるようにＩＧＣの長さに沿って栄養又は酸素添加勾配を制限することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
流入口から流出口までの生物学的増殖システムに含まれる前記培養液が約２００μｍｏｌのＯ2を含有し、勾配は約３０％未満である、請求項１１に記載の培養液。
【請求項１７】
流入口から流出口までの生物学的増殖システムに含まれる前記培養液が約２００μｍｏｌのＯ2を含有し、勾配は約３０％未満である、請求項１２に記載の培養液。
【請求項１８】
流入口から流出口までの生物学的増殖システムに含まれる前記培養液が約２００μｍｏｌのＯ2を含有し、勾配は約３０％未満である、請求項１３に記載の培養液。
【請求項１９】
複数のリアクタ（２００）を備える生物学的増殖システムであって、
前記複数のリアクタ（２００）のそれぞれが
フローチャネルのマトリックスを備えたグロースチャンバユニット（１０）と、
流入口（３００）と、
流出口（３１０）と、
前記流入口の上流にある培養液（５１０）送出部と、
前記流入口の上流にある１つ以上のポンプ（５２０）と、
前記流入口の上流にある酸素送出部（５３０）と、
前記流入口の上流にある溶解Ｏ2、温度及びｐＨセンサ（５４０）の少なくとも１つと、
前記流入口の下流にある、溶解Ｏ2及びｐＨを測定するための１つ以上の出力センサ（５５０）
とを有する、生物学的増殖システム。
【請求項２０】
システムをモニタ及び制御すること（５８５）をさらに含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記モニタリング及び制御が、入力センサ、出力センサ、溶解Ｏ2、ｐＨ、培養液、培養液の流量、ポンプ、酸素送出、溶解Ｏ2及び温度の少なくとも１つのモニタリング及び制御である、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
リアクタが取り外し可能である、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２３】
前記グロースチャンバユニットに含まれる前記培養液が約２００μｍｏｌのＯ2を含有し、勾配は約３０％未満である、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２４】
フローチャネル内での培養液流によって生じるせん断応力が、流量によって約７．６Ｐａ未満に制限される、請求項２１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、パリ条約に基づいた最大限の優先権及び便益を２０１２年６月２１日に出願の米国仮特許出願第６１／６６２８５９号及び２０１３年４月５日に出願の第６１／８０８９５４号に対して請求するものであり、これらの出願の中身は参照により、あたかも全てが本明細書に余すことなく記載されたがごとく援用される。
【０００２】
［技術分野］
本開示は、高速増殖バイオリアクタに関する。
【背景技術】
【０００３】
従来の市販のバイオリアクタは、高細胞密度及び大量のバイオマス成長に合わせたものである。以下のインターネットサイトに幾つか例を見つけることができる。
【０００４】
http://pbsbiotech.com/category/press-release/bioreactor/
【０００５】
http://www.ecomagination.com/portfolio/wave-bioreactor-for-biotheraputics-production
【０００６】
http://www.celltainer.com/home.html
【０００７】
http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/IVSSbrochure.pdf
【０００８】
http://www.accentia.net/media/docs/AutovaxlDBrochure.pdf
【０００９】
http://www.fibercellsystems.com/products_cartridges.htm
【００１０】
http://www.applikon-biotechnology.us/index.php?option=com_content&view=category&id=42&layout=blog&Itemid=321
【００１１】
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16929403
【００１２】
http://sim.confex.com/sim/2009/techprogram/P11876.HTM’
【００１３】
http://www.dasgip.com/media/content/catalog/pdf/DASGIP_E-Flyer_Products_DASbox_en.pdf
【００１４】
http://www.millipore.com/catalogue/module/c84539
【００１５】
http://www.fernandocamacho.com/publicaciones/Development%20of%20a%20Prototype%20Hollow%20Fibre%20Bioreactor%20System%20-%20Master%20Thesis.pdf
【００１６】
http://www.bioprocessintl.com/multimedia/archive/00079/BPI_A_090709AR14_O_79769a.pdf
【００１７】
http://www.bioprocessintl.com/multimedia/archive/00078/BPI_A_090702SUPAR04_78862a.pdf
【００１８】
http://www.faqs.org/patents/app/20080299539
【００１９】
http://www.faqs.org/patents/app/20110136225
【００２０】
http://www.faqs.org/patents/app/20090148941
【００２１】
http://www.faqs.org/patents/app/20090053762
【００２２】
http://www.visiongain.com/Report/805/Single-Use-Bioreactors-for-Pharma-World- Market-2012-2022
【００２３】
添付の請求項を含め、本明細書で使用の単語の単数形、例えば単数の不定冠詞、定冠詞には、文脈上明らかにそうではない場合を除いて、対応する複数の指示対象が含まれる。本明細書で引用する参考文献は全て、参照により同程度に、あたかも個々の出版物、特許、公開された特許出願明細書及び配列表並びにこれらの出版物及び特許文書中の数値及び図面が参照により具体的且つ個別に示されて援用されたがごとく援用される。
【００２４】
本明細書で開示の実施例の幾つかの態様は、複数の細胞源を組みわせることができず、また並行／閉鎖系で増殖させなくてはならない場合の個別化細胞増殖に関する。バイオリアクタは、フラスコにおいて従来のやり方で増殖させるには実用的ではない細胞量、例えば各バッチ５００ｘ１０6のサイズに合わせることができる。
【００２５】
本明細書で開示の実施例の幾つかの態様は、１回使い切りの使い捨てカートリッジをベースとした、低コストで、操作者による介入が最小限で済む細胞増殖に関する。幾つかの態様において、カートリッジを装置のアレイに装填し、それぞれを別々にモニタ及び制御することができる。
【００２６】
幾つかの例において、装置及びシステムは汚染を減らすことに取り組んでいるため／減らすことができるため、人間用の生物学的製剤及び医薬品の製造に必要とされる優良製造規範を遵守している。
【００２７】
本明細書で開示のグロースチャンバは、断面が円形、幾何学的又は複雑なパイプであり、このようなチューブ又はパイプは小さい直径を有し、また実質的に直径より長い。模範的なシステムにおける流体力学は、流れが層流、粘性、非圧縮性であり、パイプ内の液体が加速しないという前提で、ハーゲン・ポワズイユの方程式から概算することができる。全流量は、乱流に近いレイノルズ数にならない最高流速によって制限される。したがって、様々な直径を用いて、必要とされる総細胞数及び最高流速にあわせてシステムを制御することができる。グロースチャンバの直径は概して約０．１〜約２ｍｍの範囲、好ましくは約０．５〜約１．５ｍｍの範囲、最も好ましくは約０．９〜約１．１ｍｍの範囲になり得る。
【００２８】
概して管状のグロースチャンバは好ましくは、気体を含めて側壁を通っての材料又は流体の拡散又は移動に耐え、すなわちキャピラリコンパートメントの中と外とで物質の交換が起きない。
【００２９】
細胞のための栄養素供給及びガス交換は、グロースチャンバを一方通行で循環する培養液を介して行われる。従来のバイオリアクタシステムでは、この培養液を枯渇するまで再循環させていた。再循環させると、カートリッジユニット内の細胞の無菌性及びアイデンティティが損なわれてしまう可能性がある。また、装置がより複雑となり、保守要件が増えてしまう可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３０】
内部グロースチャンバ、コアの上流にある、流入口を有する第１端部、コアの下流にある、流出口を有する第２端部を有するリアクタコアと、培養液流を作り出すためのポンプ手段とを備えるバイオリアクタ。
【００３１】
内部グロースチャンバ、流入口を有する第１端部及び流出口を有する第２端部を有するリアクタコアのアレイと、培養液流を作り出すためのポンプ手段と、一般的な未使用培養液供給源とを備えるバイオリアクタシステム。
【００３２】
内部グロースチャンバ、このコアの上流にある、流入口を有する第１端部、コアの下流にある、流出口を有する第２端部を有するリアクタコアと、培養液流を作り出すためのポンプ手段とを備えるバイオリアクタ。
【００３３】
フロー調節グリッド、コアの上流にある培養液に伝熱するための手段、コアの上流にある培養液に酸素添加するための手段並びにコアの上流及び／又は下流にある少なくとも１つのセンサの少なくとも１つをさらに備えるバイオリアクタ。
【００３４】
内部グロースチャンバ、流入口を有する第１端部及び流出口を有する第２端部を有するリアクタコアのアレイと、培養液流を作り出すためのポンプ手段と、一般的な未使用培養液供給源とを備えるバイオリアクタシステム。
【００３５】
本明細書で開示の実施例の幾つかの態様は、グロースチャンバユニット（growth chamber unit）：ＧＣＵを備えたリアクタを有する生物学的増殖装置であり、リアクタは流入口キャップと、フロー調節膜（flow conditioning membrane）と、収穫キャップと、アレイを形成している閉鎖フローチャネルとを有し、この閉鎖フローチャネルのマトリックスは、開放フローチャネルを有する層を貼りあわせることで構成される。幾つかの例において、フローチャネルは概して正方形又は卵形である。幾つかの例において、フローチャネルは底部と上部との間に垂直の側部を伴って形成される。幾つかの例において、垂直の側部（７）と上部との間の接合部には丸みがついている（has a radius）。
【００３６】
本明細書で開示の実施例の幾つかの態様は、グロースチャンバユニット：ＧＣＵを備えたリアクタを有する生物学的増殖装置であり、リアクタは、流入口キャップと、フロー調節膜と、収穫キャップと、アレイを形成している閉鎖フローチャネルとを有し、この閉鎖フローチャネルのマトリックスは、開放フローチャネルを有する層を貼りあわせることで構成され、またＧＣＵに取り付けるデジタルメモリを有する。
【００３７】
本明細書で開示の実施例の幾つかの態様は、積み重ねが可能な層に一連の開放フローガイドを備えるアレイの層であり、層を積み重ねることで開放フローガイドを閉じる。
【００３８】
本明細書で開示の実施例の幾つかの態様は、生物学的増殖システムにおける増殖方法であり、この方法は、バイオリアクタの内部グロースチャンバ（ＩＧＣ）の閉鎖フローチャネル内の培養液の流量を制御することを含み、流量を制御することでフローチャネル内でのせん断応力を制限して、中で増殖させている細胞へのせん断応力に起因する損傷を減少させる。幾つかの例において、閉鎖フローチャネル内の培養液流量によって生じるせん断応力は約５Ｐａ未満に制限される。幾つかの例において、フローチャネル内での培養液流によって生じるせん断応力は、培養液の流量を介して７．６Ｐａで３０分未満に制限される。
【００３９】
本明細書で開示の実施例の幾つかの態様は、生物学的増殖システムにおける増殖方法であり、この方法は、バイオリアクタの内部グロースチャンバ（ＩＧＣ）の閉鎖フローチャネル内の培養液の流量を制御し、流量を制御することでフローチャネル内でのせん断応力を制限して、中で増殖させている細胞へのせん断応力に起因する損傷を減少させ、また細胞の栄養及び酸素添加需要量を提供することを含む。
【００４０】
本明細書で開示の実施例の幾つかの態様は、生物学的増殖システムにおける増殖方法であり、この方法は、バイオリアクタの内部グロースチャンバ（ＩＧＣ）の閉鎖フローチャネル内の培養液の流量を制御し、流量を制御することでフローチャネル内でのせん断応力を制限して、中で増殖させている細胞へのせん断応力に起因する損傷を減少させ、また最大の間欠流が得られるようにＩＧＣの長さに沿って栄養又は酸素添加勾配を制限することを含む。幾つかの例において、流入口から流出口までの生物学的増殖システム内の培養液は２００μｍｏｌのＯ2を含有し、勾配は３０％未満である。幾つかの例において、流入口から流出口までの生物学的増殖システム内の培養液は約２００μｍｏｌのＯ2を含有し、勾配は３０％未満である。
【００４１】
本明細書で開示の実施例の幾つかの態様は生物学的増殖システムであり、それぞれがグロースチャンバユニット、流入口、流出口、流入口の上流にある培養液送出部を備えた複数のリアクタと、流入口の上流にある１つ以上のポンプと、流入口の上流にある酸素送出部と、流入口の上流にある溶解Ｏ2、温度及びｐＨセンサの少なくとも１つと、流入口の下流にある、溶解Ｏ2及びｐＨを測定するための１つ以上の出力センサとを有する。
【００４２】
本明細書で開示の実施例の幾つかの態様は生物学的増殖システムであり、それぞれがグロースチャンバユニット、流入口、流出口、流入口の上流にある培養液送出部を備えた複数のリアクタと、流入口の上流にある１つ以上のポンプと、流入口の上流にある酸素送出部と、流入口の上流にある溶解Ｏ2、温度及びｐＨセンサの少なくとも１つと、流入口の下流にある、溶解Ｏ2及びｐＨを測定し、システムをモニタ及び制御するための１つ以上の出力センサとを有する。幾つかの例において、モニタリング及び制御は入力センサ、出力センサ、溶解Ｏ2、ｐＨ、培養液、培養液の流量、ポンプ、酸素送出、溶解Ｏ2及び温度の少なくとも１つである。
【００４３】
定義
バイオリアクタとは、生物学的に活性な環境を支援する全ての工業的又は工学的装置又はシステムであると言える。一例において、バイオリアクタは化学的工程が行われる容器であり、生物又はそのような生物由来の生化学的に活性な物質が入っている。この工程は好気性又は嫌気性のどちらにもなり得る。これらのバイオリアクタは一般に円柱形である。バイオリアクタが、細胞培養という意味で細胞又は組織を増殖させるための装置又はシステムのことである場合もある。これらの装置は、組織工学又は生化学工学での使用のために開発されている。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】バイオリアクタ断面の例を示す。
【図２】バイオリアクタの長手方向断面図である。フロー調節グリッドが、入口の前、流入ポートの後ろに置かれる。装置の出入り口は、側部から延びる標準的な６．３５ｍｍ（１／４インチ）の流入口及び流出口である。流量の測定は、増殖領域前後での圧力損失を測定することで行われる。
【図３】直接遠心分離をするためにルアーロック付き細胞貯蔵部を取り付けたバイオリアクタの長手方向断面図である。ポートはカートリッジ本体にルアーロックで取り付けられる。
【図４】システム構成における小さいバイオリアクタ／リアクタコアのアレイを示す。
【図５Ａ】バイオリアクタの長手方向断面図である。
【図５Ｂ】バイオリアクタの分解組立図である。
【図５Ｃ】バイオリアクタの破断図である。
【図５Ｄ】バイオリアクタの端面図である。
【図６Ａ】バイオリアクタの分解組立図である。
【図６Ｂ】バイオリアクタの分解組立図である。
【図７】バイオリアクタの分解組立図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
（００５１）  添付の図及び表中における全ての付記は、その参照により、あたかも本明細書において余すことなく記載がなされたがごとく本明細書に援用される。
【００４６】
（００５２）  簡潔明快な図とするために、図中の要素は必ずしも縮尺通りには描かれていないことを理解されたい。例えば、わかりやすくするために、幾つかの要素の寸法を相対的に誇張している。さらに、適宜、図中で参照番号を繰り返し使用することで対応する要素を示している。明細書は、新規であると考えられる本開示の特徴を定義している請求項で締めくくられているが、以下の説明を、同様の参照番号をそのまま使用した図及び表と共に考察することで本開示の教示をより深く理解できると考えられる。
【００４７】
（００５３）  当業者ならば、本明細書の開示でコンピュータシステムによって行われる幾つか演算に言及していることに気付くであろう。コンピュータが実行すると表現されることもある演算である。当然のことながら、そのような演算は象徴的に、ＣＰＵ等のプロセッサによる、データビットを表す電気信号での操作、システムメモリ等の記憶場所でのデータビットの保全、また他の信号処理を含むものとされる。データビットが保全される記憶場所は物理的な位置であり、データビットに対応した特定の電気的、磁気的、光学的又は有機的特性を有する。
【００４８】
（００５４）  ソフトウェアに実装させる場合、本明細書で開示の要素は、必要なタスクを行うためのコードセグメントの幾つかの態様である。コードセグメントは非一時的プロセッサ可読媒体に保存することができ、非一時的プロセッサ可読媒体には、情報を保存可能な全ての媒体が含まれ得る。非一時的プロセッサ可読媒体の例には、電子回路、半導体記憶装置、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、フラッシュメモリ又は他の不揮発性メモリ、光学ディスク、ハードディスク等が含まれる。用語「モジュール」が、ソフトウェア限定のインプリメンテーション、ハードウェア限定のインプリメンテーション又はこれらの組み合わせのことを指す場合もある。さらに、用語「サーバー」が、あるアプリケーションが全体で又は一部実行され得る物理的なサーバー両方のことを指す場合もある。
【００４９】
（００５５）  図１〜４に図示されるように、交換カートリッジとしても機能し得るバイオリアクタユニットは好ましくはプラスチック材料、例えばポリスチレン又は最適な細胞接着用に修飾可能な他の面によって構成される。グロースチャンバユニット（ＧＣＵ）１０は、外方環状壁部１５と、内部グロースチャンバ（ＩＧＣ）１００とを有する。ＧＣＵ１０を備えたリアクタコア２００は、流入口３００及び流出口３１０を有する。幾つかの実施例において、リアクタコアは、流入口３００を有する流入口カバー又はキャップ２１０及び流出口３１０を有する流出口カバー又はキャップ２２０を含む。ある正確な数のポリスチレン被覆ポリメチルメタクリレート繊維（ＰＭＭＡ）を、ポッティング材と共にシリンダに入れる。ポッティング材の硬化後、このバージョンのＧＣＵ１０を所望の長さに切断し、ＰＭＭＡコアを化学的にエッチングすると、最初のＰＭＭＡコアの内径を有する、一連の並行グロースチャンバが残る。ポリスチレン又はＰＭＭＡの代わりに他の材料を同様の工程で使用することができる。幾つかの例においては、ＩＧＣ１００の内面を、細胞増殖を促進するコラーゲン又はフィブロネクチン又は他の基質でコーティングすることができる。装置は、細胞接着及び細胞間相互作用を促進するために水平に、また回転しないように維持されるべきであり、ＩＧＣ１００の下部には細胞が充填される。
【００５０】
（００５６）  ポートのある２つのエンドキャップが、ＧＣＵ１０の一部として形成されている又はＧＣＵ１０の各端部に取り付けられ、リアクタコア２００を形成している。ポートは好ましくはキャップ材料内をある角度（１５〜６０°）でもって通り、操作のしやすさ及び無菌性保持のためにルアーロック結合設計となっている。この角度のついたポート構成により、グロースチャンバ内に進入する前に新鮮な培養液が混ぜ合わされて均一に分散する。
【００５１】
（００５７）  出口キャップ２２０には、カートリッジ本体にルアーロックで連結された、細胞回収のための幅約１０ｍｍ、長さ２０ｍｍの貯蔵部４３０を取り付け得る。細胞回収のための装置の遠心分離を容易にするために、記載の構成に対応可能な遠心分離バケットインサートを形成することができる。
【００５２】
（００５８）  システムの寸法は、最小限のせん断応力でもって細胞の要件を満たす流量を維持しつつも多量の増殖を行う面に望まれるようなものとなる。
【００５３】
（００５９）  ＧＣＵ１０の入口での液体の分散具合を改善するために、フロー調節グリッド又はスクリーン４１０を使用する。このフロー調節グリッドにより、流入ポートはこの調節グリッドの手前に設置されることから、カートリッジ全体にわたって均一に流れが分散する。これによって上部圧力がグリッド面で均一に分散した見掛けの混合チャンバが形成される。
【００５４】
（００６０）  本開示の例示的な構成において、フロー調節グリッドを通る最高流量は乱流となるレイノルズ数には達しない。予想される最大の流れにおけるグリッドでの圧力低下は０．１〜０．２ｃｍ水の範囲であり、オリフィス流についてのベルヌーイの方程式から得られる。
【００５５】
（００６１）  キャピラリ部の前後には、圧力の低下を推定するために２つの小さな計量ポートが設置される。圧力の低下を知ることで、液体の流量、速度又はキャピラリ直径を計算することができる。同じポートを、サンプル抽出又は細胞操作に使用することができる。
【００５６】
（００６２）  流入口は培養液貯蔵部に連結され、この培養液貯蔵部は冷蔵保存することができる。シリコーンゴム（例えば、Ｓｉｌａｓｔｉｃ）から形成される連結チューブを伝熱ユニットの周りに巻きつける。チューブの長さは、培養液流量が最大の場合に酸素添加及び伝熱がきちんと果たされるように計算される。
【００５７】
（００６３）  バイオリアクタの出口には、システムの逆汚染を防止するために、中和装置を回路内に設置することができる。そのような装置は出てきた流れを８０〜９０℃まで温めることができる加熱素子になり得る。あるいは、紫外線源又は化学溶液を同じ目的で使用することができる。使用済みの培養液を、取り外して生物学的廃棄物として廃棄することができる貯蔵部で回収する。
【００５８】
（００６４）  システム５００及びリアクタ装置を利用する場合、バイオリアクタにまず、規定の体積の培養液に懸濁させた最小数の細胞を播種する。細胞がキャピラリ内部の基質に付着するまで装置を水平に維持する。管状要素の構成円形であることから、細胞は播種時、狭い領域（キャピラリ内面の下方約１／３）に沈殿し、これは細胞の増殖を促進する閾値密度にとって極めて重要である。基質は、キャピラリの内面上に堆積させる細胞表面によって認識される生物学的に活性な化合物から成る。基質の例はタンパク質、ラミニン、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、活性な末端を有するシラン、例示した個々の化合物の様々な割合での組み合わせ又はコンストラクトである。
【００５９】
（００６５）  システム５００に連続的又は間欠的に既定の体積の培養液５１０を潅流させ、この既定の体積は、ポンプ５２０で送出可能な最少量から、設計上達成可能な最大細胞数が必要とする量である。
【００６０】
（００６６）  本明細書で開示の実施例の１つの態様は装置内での流量であり、以下の基準に基づいて計算される。
【００６１】
（００６７）  栄養及び酸素添加需要量の少なくとも一方を満たす。発達した層流。培養液の流れが引き起こす細胞の損傷を制限する（せん断応力）。最大間欠流が得られるようにＩＧＣの長さに沿った栄養又は酸素添加勾配を制限する。
【００６２】
（００６８）  添付の図で示される構成において、キャピラリ内での圧力低下０．０２ｐｓｉで、流量は約１６５ｍＬ／日である。約６００ｍＬ／日を必要とする最高細胞密度で、この流量は、一般的な低圧ミニ蠕動ポンプを使用して圧力低下０．０８ｐｓｉで達成することができる。圧力低下を最小限にするように設計された流量調節装置では、１ｐｓｉ未満で動作する小さいポンプで圧力要件を満たすことができる。両端において、ＩＧＣ内の流れは低速、層流となり、予想される細胞の損傷はない。酸素需要量を計算することで、ポンプを絶え間なく作動させずにすみ、ステッピングモータで駆動される蠕動ポンプを、測定された溶解酸素レベル（Ｄ．Ｏ．）〜２／３欠乏レベルに応答してプログラムすることができる。
【００６３】
（００６９）  細胞が単層状に増殖するにつれ、細胞は徐々にＩＧＣの内面の一部を占拠していくため直径が小さくなるが、より顕著なのは、栄養潅流需要量における変化である。したがって、培養液導入前後での細胞の増殖を検出する。測定されるパラメータ：溶解酸素（ＤＯ）、代謝副生成物（乳酸）、ｐＨ又は濁度を用いて総細胞数及び密度を推定することができる。培養液はリアクタコア２００進入時点で実質的に３７℃であるべきであり、Ｏ2飽和度は事前に選択されたレベルであるべきである。リアクタコア進入時、加熱手段（例えば、コイル）及びＯ2送出部５３０はリアクタコア２００の上流に設置される。溶解Ｏ2、温度及びｐＨセンサ５４０もまた、リアクタコア２００の上流に設置される。
【００６４】
（００７０）  センサ及びソフトウェアは、第三者製造業者のＯＥＭパッケージで用意し得る（例えば、ＰｒｅＳｅｎｓ社、ドイツ、http://www.presens.de/engineering-services/oem-solutions.html）。センサをソフトウェアによって処理されるマルチチャネルデータ処理装置に接続し、出力結果でもってポンプ送り出し速度、通気装置及びアラームを制御する。取り込まれたパラメータが細胞集団が必要量まで増殖したことを示したら、培養液をタンパク質分解（ｐｒｏｔｅｏｌｉｔｈｉｃ）酵素に置き換え、細胞を流出口（ｏｕｔｐｕｔ）で回収する。
【００６５】
（００７１）  １つ以上の入力センサ５４０に加えて、溶解Ｏ2及びｐＨを測定するための１つ以上の出力センサ５５０をリアクタコアの下流５８５でモニタする。モニタリングには、培養液、ポンプ、酸素送出、溶解Ｏ2、温度及びｐＨセンサをモニタする上流センサの１つ以上のモニタリングが含まれ得る。このモニタリング及び制御には人間による作業及びコンピュータ制御が含まれ得る。基準を超えた測定値を用いて警報を設定及び作動させる又は修正ステップを開始させ得る。
【００６６】
（００７２）  制御ハードウェア及びソフトウェアは、カートリッジ５４３に取り付ける使い捨てチップに組み込むことができる。あるいは、カートリッジ外部にくる又はカートリッジ及び外付け装置上のコンポーネントとのハイブリッドになり得る。制御システムは、４〜６週間という小さい間隔又はそれより長い間隔で抽出される機能パラメータを記憶するのに十分なメモリを格納すべきである。メモリ又はメモリのコピー５４５はカートリッジに取り付け得る。この構成で、中央システムが使用できる、各カートリッジ上に電子的に配置されるコード（例えば、一意識別名）が得られる。中央システム（概して、図４を参照のこと）は電力を複数のカートリッジに供給し、双方向で通信し、キャリブレーションを行うことができ、またローカル又はネットワークで活用できるレポートを生成することができる。
【００６７】
（００７３）バイオリアクタの計算例
以下の実施例において、発明者は、最高３５０ｘ１０6個の細胞を培養するように設計された１回使い捨てカートリッジのパラメータを提示する。システムパラメータ及び前提を表１に挙げる。
【００６８】
（００７４）
【表１】
2015519922.tif 000003
【００６９】
（００７５）  以下の表（２、３、４、５、６）では、システム出力及び流体力学的パラメータを計算する。式は、パラメータを細かく調節できるようにＥｘｃｅｌのスプレッドシートに含めた。
【００７０】
（００７６）
【表２】
2015519922.tif 000004
【００７１】
（００７７）
【表３】
2015519922.tif 000005
【００７２】
（００７８）
【表４】
2015519922.tif 000006
【００７３】
（００７９）
【表５】
2015519922.tif 000007
【００７４】
（００８０）
【表６】
2015519922.tif 000008
【００７５】
（００８１）
【表７】
2015519922.tif 000009
【００７６】
（００８２）  キャピラリにおける最高液体速度で計算される壁部でのせん断応力は、細胞への損傷作用を有する、文献で引用される値より小さい。
【００７７】
（００８３）  最も重要なパラメータの１つは酸素添加量である。本明細書で開示のシステムを調節することで、全細胞が必要とする量を確保しなくてはならない。
【００７８】
（００８４）  装置内の培養液（５７ｍｌ）は細胞に２．９時間にわたって供給するのに十分な酸素を含有しており、２／３の欠乏（又は培養液中の約１００μｍｏｌのＯ2）と同等である。速度０．０６ｍｍ／秒では、キャピラリでの全交換に約２．７時間かかる。この方式では入口での３５０μｍｏｌの酸素添加及びキャピラリからの出口での約１００μｍｏｌの酸素添加が起きる。得られる勾配は細胞増殖で予期できないものになり得て、回避又は制限されるべきである。
【００７９】
（００８５）  キャピラリに沿った酸素又は栄養勾配を軽減又は回避するために、システムを、マイクロバッチ供給方式に基づいてプログラムすることができる。全キャピラリ体積（５７ｍｌ）を比較的早く、損傷を起こさないせん断応力を引き起こす速度で交換する。これまでの研究は、７．６Ｐａに３０分間曝露すると、生存率が低下することを示している。約５Ｐａのせん断応力が上部圧力を０．０６ｐｓｉから約０．５ｐｓｉに上昇させることで得られ（ポンプ送り出し速度の１０倍の上昇）、３３分での培養液の全交換を引き起こす。
【００８０】
（００８６）  これら極限の間で（２．７時間での交換の連続流、閾値せん断応力での３３分で全交換のバッチ供給）、システムを最適な流量及び酸素添加について調節することができる。それを目的として、システムセンサの出力（溶解酸素センサ、ｐＨ読み取り値）は、ステッピングモータである蠕動ポンプを制御している（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ社）。バッチ供給方式を採用し、例示の構成において培養液を設定された閾値、例えば最初の酸素負荷量の５０％まで又は約２時間消耗させ、次に３０分のより短い時間で交換することで、酸素濃度が最低閾値を下回らないようにする。バッチ供給方式の別の利点は、部品交換等のシステム保全を非供給時に行うことができる点である。
【００８１】
（００８７）  培養液の組成は、より大型のバイオリアクタの場合のように変化させる必要がない。培養液のガス補給は、中空繊維交換器又はＳｉｌａｓｔｉｃチューブによって確保することができるが、計画の細胞密度では過剰な酸素添加需要量は予期されない。超高密度バイオリアクタの場合のようなｐＨの変動は予期されず、培養液を再循環させないため、追加のｐＨ緩衝を必要としない。
【００８２】
（００８８）  バイオリアクタコア２００をシステムから取り外して細胞を収穫／回収することができる。収穫するために、リアクタコア内の培養液をある溶液と交換することで細胞を分離させ、カートリッジをシステムから外し、ポートに無菌ルアーロックキャップを取り付ける。装置全体を遠心分離にかけ、細胞を細胞貯蔵部で回収し得る。次に、細胞貯蔵部４３０を装置から取り外し、無菌ルアーロック保護キャップをしっかり閉める。
【００８３】
（００８９）  他の例においては、バイオリアクタコア２００をシステムから取り外し、しっかりと閉じ、輸送し又は保管し、電離線又は化学線照射に曝露することで細胞の増殖を不活性化又は止めることができる。次に、照射後、リアクタコア２００に別の細胞型の細胞集団、例えば樹状細胞（ＤＣ）をスーパーシード（ｓｕｐｅｒ−ｓｅｅｄ）することができる。樹状細胞（ＤＣ）懸濁液をリアクタコア２００に計量ポートから注入することができる。この手順は、特定のＤＣを作り出すためのオーダーメイド医療と合わせて有用となり得る。
【００８４】
（００９０）  ＤＣでの応用の場合、ＤＣ添加後、細胞接着に１時間かけ、次に通常の供給を、ＤＣ増殖用に配合した培養液を用いて再開する。リアクタコア２００は、ＤＣ収穫時まで同じ回路に維持することができる。
【００８５】
（００９１）  収穫するために、カートリッジ内の培養液をある溶液と交換することで細胞を分離させ、カートリッジをシステムから外し、ポートに無菌ルアーロックキャップを取り付ける。装置全体を遠心分離にかけ、細胞を細胞貯蔵部で回収することができる。細胞貯蔵部をカートリッジから取り外し、無菌ルアーロック保護キャップをしっかり閉める。
【００８６】
（００９２）  図５Ａ〜５Ｄは、キャピラリのアレイを有するバイオリアクタを示し、外方シェル６００内のＧＣＵ１０を含む。本明細書で開示のＣＧＵは、上述したようなシステムと共に使用してもよい。図示のようなアレイ６０５の、平行六面体（parallelepiped）における内径は約２ｍｍである。好ましくは、アレイ内径は約０．５〜約５ｍｍの範囲になり得る。外方シェル６００は厚さ約３ｍｍを有するが、約０．５〜５ｍｍの範囲〜１０ｍｍを超えるものになり得る。アレイチャネルの側部間にある壁部７２１は約０．２〜約１ｍｍの範囲になり得て、成型機から取り外ししやすくするために抜き勾配を有する。しかしながら、ＧＣＵ内の細胞にかかるせん断応力は、細胞を損傷すると知られている閾値を下回っているべきである。
【００８７】
（００９３）  アレイは流入口側６０６及び流出口側６０７のある流路を形成する。第１取付キャッチ６１２がついた流入口キャップ６１０は外方シェル６００上の第１取付ラッチ６２０とつがう。流入口キャップ６１０は、播種ポート６１４（傾斜し得る）及びルアーロックが取り付けられた流入口６１８も有する。フロー調節膜６１９が流入口６１８に対向する透過性バリアを構成する。流出口側６０７は収穫キャップ６３０と、外方シェル６００上の第２取付ラッチ６２５に嵌る第２取付キャッチ６３２を介してつがう。収穫キャップは排気ポート６４０及びルアーロックが取り付けられた流出口６５０も有し、ルアーロックが取り付けられた流出口６５０は容器６６０につながっている。
【００８８】
（００９４）  アレイを構築する際、アレイ内には実質的に平坦な底部７０２と概して垂直の壁部７２１によって形成される長手方向フローガイド又はチャネル７０４を有する上部７０１とを有するサンドイッチ層７００があり、サンドイッチ層を積み重ねてグルー、接着剤又は音波溶接で保持することでフローガイドのアレイ６０５を形成する。一旦層を貼りあわせたら、開放フローガイド７０４は閉じられ、側部、上部及び底部を有し、閉鎖フローガイド（図示せず）閉鎖フローチャネルアレイ６０５が形成される。各層の２つの対向する側面には、シェルショルダ部６０２が形成される。このシェルショルダ部は、他の同様の領域に接着した場合に装置の支持部材となるより太い領域である。垂直の壁部と上部７０１との交差部又は接合部７２３において、連結は実質的に９０度になり得て、あるいは丸みのある断面プロファイルを有し得る。幾つかの例においては、この丸みにより、難しいコーナー部（例えば、９０度の領域）での細胞の回収がより容易となり得る。
【００８９】
（００９５）  図６Ａ、６Ｂは、外方シェル６００の間に湾曲したキャピラリのアレイのＧＣＵを有するバイオリアクタコアの実施例を示す。本明細書で開示のＣＧＵは、上述のシステムと共に使用してもよい。コアを構築する際、サンドイッチ層８００が、丸みのある断面の一連の半円を形成する側部につながる丸みのある底部を有する扇形の上面８０１と（図６Ｂを参照のこと）、同じく丸みのある底部を有する扇形の底面とから形成される。壁部８０３が扇形のチャネルを隔てる。丸みのある上面及び丸みのある底面のそれぞれが開放フローチャネルを形成する。組み立てる場合は、サンドイッチ層を積み重ねてグルー、接着剤又は音波溶接で保持することで閉鎖フローガイド又はフローチャネル（８１０）のアレイ６０５を形成し、ＩＧＣを形成する。このフローチャネルは（図５Ａ〜５Ｄに図示の実施例と比較して）若干丸みのあるコーナー部を有し得る又は丸みは半円ほどにも大きくなり得る。フローチャネルの形状はこの丸みに左右される。この方法を用いて、実質的に卵形、丸みのある又は円形のフローチャネルを形成し得る。
【００９０】
（００９６）  図７は、図５Ａ〜５Ｄの正方形のチャネルアレイの変化形を示し、層の上部及び底部の両方が延びた壁部（７２１）を有し、別の層とつがい、図５Ａ〜５Ｄとは異なる構成で正方形のチャネルを形成する。
【００９１】
（００９７）  図７は、ＧＣＵ及び概して矩形のキャピラリのアレイを外方シェル６００の間に有するバイオリアクタの実施例である。本明細書で開示のＣＧＵは、上述のシステムと共に使用してもよい。コアを構築する場合は、サンドイッチ層９００が、一連の開放チャネルを形成する概して垂直の側部につづく概して平坦な底部を有する歯付き上面９０１と、開放チャネル又はガイド９０４を形成する概して平坦な天井部及び概して垂直の側壁を有する一連の歯付き（又は分割）底面９０２によって形成される。組み立てる場合は、サンドイッチ層を積み重ねてグルー、接着剤又は音波溶接で保持することで閉鎖フローガイド９１０のアレイ６０５を形成し、ＩＧＣを形成する。サンドイッチ層の上面及び底面から延びる垂直の壁部の歯付き構成は整列して描かれており、フローチャネルを形成する。フローチャネルは若干丸みのあるコーナー部又は接合部７２３を有し得て、あるいは丸みは半円ほどにも大きくなり得る。フローチャネルの形状はこの丸みに左右される。この方法を用いて、実質的に卵形、丸みのある又は円形のフローチャネルを形成し得る。
【００９２】
（００９８）  したがって、実施例及び／又はその態様に応用したように、本開示の根本的な新規な特徴について図示、説明及び指摘してきたが、当業者ならば、本開示及び／又は請求項の趣旨から逸脱することなく実施例、開示及びその態様の形態及び詳細における様々な省略、再構成、置き換え及び変更を行い得ることがわかる。例えば、同じ結果を得るための実質的に同じやり方で実質的に同じ機能を果たす要素及び／又は方法ステップの全ての組み合わせが本開示の範囲に含まれることが明確に意図されている。さらに、開示の形態又は実施例に関連して図示及び／又は説明した構造及び／又は要素及び／又は方法ステップは、一般的な設計上の選択の問題として、他のいずれの開示又は記載又は提案される形態又は実施例にも組み込まれ得ることを認識すべきである。したがって、本開示の範囲を限定することは意図されていない。そのような改変は全て、本明細書に添付の請求項の範囲内にあるものとする。
【００９３】
（００９９）  本明細書で引用した全ての出版物、特許、特許出願及び参考文献は参照により、あたかも本明細書において余すことなく記載がなされたかごとく本明細書に援用される。
【００９４】
（０１００）  ３７  ＣＦＲ§１．７２（ｂ）に準拠した要約をつけることで、本発明の技術的開示の本質及び骨子を読者がすぐに確認できるようにした。この要約が請求項の範囲又は意味を解釈又は限定することに用いられないとの理解のもとにこの要約を提出する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2015519922.tif 000015
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2015519922.tif 000017
【図６Ａ】
2015519922.tif 000018
【図６Ｂ】
2015519922.tif 000019
【図７】
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【国際調査報告】
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