(57)【要約】  本発明は、ＴＧＦ−β２発現を抑制するｓｈＲＮＡに関する。  本発明によれば、ＴＧＦ−β２発現を抑制するｓｈＲＮＡを用いた抗腫瘍組成物を提供することができる。
2015506696.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または２に表される塩基配列を標的配列とし、ＴＧＦ−β２発現を抑制するｓｈＲＮＡ。
【請求項２】
配列番号３または４に表される請求項１に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載のｓｈＲＮＡを有効成分として含む抗腫瘍組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のｓｈＲＮＡを発現する組換え発現ベクター。
【請求項５】
配列番号５に表されるトップストランド（ｔｏｐ  ｓｔｒａｎｄ）と、配列番号６に表されるボトムストランド（ｂｏｔｔｏｍ  ｓｔｒａｎｄ）と、を有するＤＮＡを含む請求項４に記載の組換え発現ベクター。
【請求項６】
配列番号７に表されるトップストランド（ｔｏｐ  ｓｔｒａｎｄ）と、配列番号８に表されるボトムストランド（ｂｏｔｔｏｍ  ｓｔｒａｎｄ）と、を有するＤＮＡを含む請求項４に記載の組換え発現ベクター。
【請求項７】
Ｕ６プロモーターを含むベクターにＤＮＡを組換えさせて収得する請求項４に記載の組換え発現ベクター。
【請求項８】
ｐＳＰ７２△Ｅ３−ｓｈ−ｈｕｍａｎ  ＴＧＦ−β２またはｐＳＰ７２△Ｅ３−ｓｈ−ｍｏｕｓｅ  ＴＧＦ−β２である請求項４に記載の組換え発現ベクター。
【請求項９】
請求項４に記載の組換え発現ベクターを有効成分とする抗腫瘍組成物。
【請求項１０】
請求項４に記載の組換え発現ベクターを導入したアデノウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＧＦ−β２発現を抑制するｓｈＲＮＡ及びこれを含む抗腫瘍組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＧＦ−β２は、ＴＧＦ−β１と同様に、細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、そしてマクロファージなどの増殖と分化を抑制してますます大きくなる腫瘍に対する免疫応答を阻害するだけでなく、多機能の分泌タンパク質で細胞の形態（ｔｙｐｅ）と時期によって増殖抑制、複製、浸潤、転移、細胞死滅、免疫応答、そして血管生成など多様な役割を行うだけでなく、ＴＧＦ−β１のように、ＴＧＦ−β２も信号経路を非活性化させるか、あるいは細胞周期の非正常的な調節などに起因して、ＴＧＦ−β２による増殖抑制作用に抵抗性を生じる腫瘍が進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）する後期に至ると、ＴＧＦ−β２は腫瘍をさらに発展させる役割をすることになる。よって、人体の免疫体系を克服して増殖した腫瘍細胞はＴＧＦ−β２を分泌することで、免疫監視から自由であり同時に増殖と浸潤転移及び血管生成にプラス要因として作用することになる。ＴＧＦ−β２がＴＧＦ−β１とは明白に異なった作用をする点は以下である。ＴＧＦ−β２がＦｏｘｐ３を誘導して免疫抑制誘導を著しく進行させるとのことと、腫瘍の転移、新生血管形成、そして増殖などにも影響を及ぼして悪性としての腫瘍進行を誘導することである。
【０００３】
ＴＧＦ−β２に係る先行研究である、非特許文献１には、人間ＴＧＦ−β２のコーディング配列に対する合成１８−ｍｅｒホスホチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を用い、腫瘍の免疫抑制除去、腫瘍の大きさ減少、リンパ節への転移及び血管形成減少などが観察されたが、その効果は不十分であった。
【０００４】
非特許文献２には、ｍｕｒｉｎｅのＴＧＦ−β２に対するｓｈＲＮＡを、ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＡＡＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＡＡＴＴＡＧＴＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＧＡＴＴＴＡＴＡＣＡＣＣＴＴＧＣＣＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ（ｔａｒｇｅｔ）で製作し、さらにＴＧＦ−β２  ｓｈＲＮＡを生成するレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）を製作したが、レンチウイルスが染色体にインテグレーション（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）して癌がなくなった後にも正常細胞には引き続き伝達される副作用が大きな問題となった。
【０００５】
【非特許文献１】Schlingensiepen et al、 Transforming growth factor-beta2 gene silencing with trabedersen(AP 12009) in pancreatic cancer、 Cancer Sci 102: 1193-1200、2011.
【非特許文献２】Chenyu Zhanget al、 Transforming growth factor-β2 is a molecular determinant for site-specific melanoma metastasis in the brain、 Cancer Res.2009 February 1;69(3):828-35.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明者は、上記のような問題点を解決するために研究努力した結果、人間ＴＧＦ−β２またはマウスＴＧＦ−β２の沈黙（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を効果的に誘導するターゲットを選定してｓｈＲＮＡを製作し、これをアデノウイルスに搭載させて既存の非ウイルス性製剤によるｓｈＲＮＡの伝達能力を画期的に改善させることで、本発明が完成された。
【０００７】
したがって、本発明は、配列番号１または２と表される塩基配列を標的配列とし、ＴＧＦ−β２発現を抑制するｓｈＲＮＡを提供することにその目的がある。
【０００８】
本発明は、また、前記ｓｈＲＮＡを有効成分として含む抗腫瘍組成物を提供することに他の目的がある。
【０００９】
本発明は、また、前記ｓｈＲＮＡ発現する組換え発現ベクターを提供することにさらに他の目的がある。
【００１０】
本発明は、また、前記組換え発現ベクターを有効成分とする抗腫瘍組成物を提供することにさらに他の目的がある。
【００１１】
本発明は、また、前記組換え発現ベクターが導入されたアデノウイルスを提供することにさらに他の目的がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、前記課題を解決するための手段として、配列番号１または２に表される塩基配列を標的配列とし、ＴＧＦ−β２発現を抑制するｓｈＲＮＡを提供する。
【００１３】
本発明は、前記課題を解決するための他の手段として、前記ｓｈＲＮＡを有効成分で含む抗腫瘍組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、前記課題を解決するためのさらに他の手段として、前記ｓｈＲＮＡ発現用の組換え発現ベクターを提供する。
【００１５】
本発明は、前記課題を解決するためのさらに他の手段として、前記組換え発現ベクターを有効成分として含む抗腫瘍組成物を提供する。
【００１６】
本発明は、前記課題を解決するためのさらに他の手段として、前記組換え発現ベクターが導入されたアデノウイルスを提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、ＴＧＦ−β２発現を抑制する新たなｓｈＲＮＡを製作し、遺伝子伝達体としてアデノウイルスを使用して感染率を増加させることで、従来技術と比較して特異性、伝達能及び発現抑制能を大きく向上させた。
【００１８】
すなわち、本発明により、ＴＧＦ−β２発現を抑制するｓｈＲＮＡを含む抗腫瘍組成物が提供される。特に、大部分の癌細胞において伝達効率性が優れたアデノウイルスに標的性を付与することで、すべての癌に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｅ３シャトルベクターであるｐＳＰ７２ΔＥ３／ｓｉ−ｎｅｇａｔｉｖｅベクターを示す図である。
【図２】ＴＧＦ−β２  ｓｈＲＮＡが、シャトルベクターでサブクローニング（ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ）された後に、アデノウイルスバックボーンであるｄｌ３２４と相同組換えする過程の模式図である。
【図３】実際に、組換えが容易なバクテリアから相同組換えされたコロニーの選択のために、（ａ）はアデノウイルスのＥ３部位のＰＣＲ結果を示すものであり、（ｂ）はアデノウイルスのＩＸ遺伝子部位のＰＣＲ結果を示すものであり、（ｃ）は相同組換えされたアデノウイルスゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡのトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）可能可否を確認するＰａｃＩ切断後の断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）ＤＮＡが出現する結果を示すものである。
【図４】ＨｉｎｄIII切断パターン（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ）で最終組換えされたコロニーを選択確認したものである。
【図５】図４の選択されたコロニーがｓｈＲＮＡ  ｈＴＧＦ−β２塩基配列を有しているか否かを配列分析で確認した結果である。
【図６】実施例２の人間ＴＧＦ−β２  ｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスによるＴＧＦ−β２発現抑制能をリアルタイム−ＰＣＲで確認したものである。
【図７】実施例２のマウスＴＧＦ−β２  ｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスによるＴＧＦ−β２発現抑制能をリアルタイム−ＰＣＲで確認したものである。
【図８】実施例２のマウスＴＧＦ−β２  ｓｈＲＮＡを発現するシャトルベクターによるＴＧＦ−β２発現抑制能をリアルタイム−ＰＣＲで確認したものである。
【図９】実施例２の人間ＴＧＦ−β２  ｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスによるＴＧＦ−β２発現抑制能をＥＬＩＳＡで確認したものである。
【図１０】ｐＢＳＫII−３４８４ベクター（ａ）、ｐＣＡ１４−３４８４ベクター（ｂ）、ｐＣＡ１４−ＣＭＶ−３４８４ベクター（ｃ）、及びｐＣＡ１４−ＣＭＶ−３４８４−ΔＥ１Ｂ５５ベクター（ｄ）を示すものである。
【図１１】ｄｌ３２４アデノウイルスからｄｌ３２４−ＣＭＶ−３４８４−ｓｈＴＧＦ−β２アデノウイルスを製作する過程を示す模式図である。
【図１２】マウスｓｈＴＧＦ−β２が含まれた相同組換え過程を示すものであって、Ｅ３スクリーニングで相同組換えされたコロニーを選択確認し（ａ）、ＨｉｎｄIII切断パターンによる相同組換えされたクローン（１、２、４）を選択確認し（ｂ）、前記クローン１、２、４のＤＮＡをＰａｃＩで切断した場合、クローン１だけがまともに相同組換えされたことを確認（ｃ）したものである［Ｃ：対照群、ｄｌ３２４−△Ｅ３−ｓｈ−ｍＴＧＦβ２、Ｓ：シャトルベクターｐＣＡ１４−ＣＭＶ−３４８４−△Ｅ１Ｂ５５、１〜６：相同組換えされたコロニー］。
【図１３】人間ｓｈＴＧＦ−β２が含まれた相同組換え過程を示すものであって、ＨｉｎｄIII切断パターン（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎ）で相同組換えされたコロニーを選択確認（ａ）、ＰａｃＩ切断後に相同組換えされたコロニーを最終選択確認（ｂ）したものである［Ｃ：対照群、ｄｌ３２４−△Ｅ３−ｓｈ−ｍＴＧＦβ２、１〜３：相同組換えされたコロニー］。
【図１４】実施例４の腫瘍選択的複製可能アデノウイルスの癌細胞から細胞溶血を確認したものである。
【図１５】人間ＴＧＦ−β２  ｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスと人間ＴＧＦ−β１  ｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスによるｈＴＧＦ−β１、２、３発現抑制能をリアルタイム−ＰＣＲ結果として比較したものである。
【図１６】人間ＴＧＦ−β２  ｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスと人間ＴＧＦ−β１  ｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスによるＴＧＦ−β１、２、３発現抑制能をＥＬＩＳＡ結果として比較したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）は、標的遺伝子の発現を選択的に抑制する天然のメカニズムである。配列特異的なｍＲＮＡ分解の媒介者は、より長いｄｓＲＮＡからリボヌクレアーゼIIIの切断により生産された１９〜２３ヌクレオチドの小さな干渉ＲＮＡである。細胞質のＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）はｓｉＲＮＡに結合し、そのｓｉＲＮＡのうち、１本鎖に相補的な配列を含むｍＲＮＡの分解を指示する。哺乳動物においてＲＮＡ干渉の適用は、治療遺伝子沈黙（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）の効能を有する。ｓｉＲＮＡの長所を有しながらも、ｓｉＲＮＡは試験管内で製造しなければならなく、ノックダウン遺伝子を、通常的に６〜１０日間一時的形質感染によって伝達されるべきであるとのことから臨床適用に制限を有する。本発明に係るｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ−ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）発現システムが上記のような短所を解決することができる。
【００２１】
ｓｈＲＮＡは、１本鎖のＲＮＡにおいて部分的に回文状の塩基配列を含むことで、分子内で２本鎖の構造を有し、ヘアピンのような構造となる約２０塩基以上の分子である。
【００２２】
本発明は、ＴＧＦ−β２発現を抑制するｓｈＲＮＡに関し、下記配列を標的配列とすることを特徴とする。
【００２３】
マウス標的配列：５’−ＧＧＡＴＴＧＡＡＣＴＧＴＡＴＣＡＧＡＴＣＣＴＴＡＡ−３’［配列番号１］
【００２４】
人間標的配列：５’−ＧＧＡＴＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡ−３’［配列番号２］
【００２５】
本発明において、ＴＧＦ−β２発現を抑制するｓｈＲＮＡは、ＴＧＦ−β２遺伝子の一部に相補的な配列を有し、ＴＧＦ−β２遺伝子のｍＲＮＡを分解したり、翻訳を抑制したりすることができる。相補性が８０〜９０％の場合には、ｍＲＮＡの翻訳を抑制することができ、１００％の場合には、ｍＲＮＡを分解させることができる。
【００２６】
したがって、本発明においてＴＧＦ−β２発現を抑制するｓｈＲＮＡは、マウスｍＲＮＡの４９４〜５１８番目のヌクレオチドに、人間ｍＲＮＡの５７８〜６０２番目のヌクレオチドに対する相補的な配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは１００％相同性を有する塩基配列を含むことができる。
【００２７】
一態様として、マウスのｓｈＲＮＡは、配列番号１（標的配列）に示された塩基配列とその相補的な塩基配列からなっていて、人間のｓｈＲＮＡは配列番号２（標的配列）に示された塩基配列とその相補的な塩基配列からなることができる。前記のそれぞれの塩基配列とその相補的な塩基配列は、４〜１０ｂｐのループ領域により回文的に（ｐａｌｉｎｄｒｏｍ）連結されてヘアピン構造を形成することができる。
【００２８】
本発明のｓｈＲＮＡの具体的な例としては、下記配列を含むことができる：
【００２９】
配列番号１のマウス標的配列とするｓｈＲＮＡ：５’−ＧＧＡＴＴＧＡＡＣＴＧＴＡＴＣＡＧＡＴＣＣＴＴＡＡ  ｔｃｔｃ  ＴＴＡＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＡＣＡＧＴＴＣＡＡＴＣＣ−３’［配列番号３］
【００３０】
配列番号２の人間標的配列のためのｓｈＲＮＡ：５’−ＧＧＡＴＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡ  ｔｃｔｃ  ＴＴＧＡＧＡＡＴＣＴＧＡＴＡＴＡＧＣＴＣＡＡＴＣＣ−３’[配列番号４］。
【００３１】
ＲＮＡｉによりＴＧＦ−β２の発現を抑制する物質としては、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造で構成されたｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）を使用することができる。
【００３２】
ＲＮＡｉによりＴＧＦ−β２の発現を抑制する物質は、人工的に化学合成してもよく、センス鎖及びアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆方向に連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより実験室条件（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でＲＮＡを合成して製作してもよい。実験室条件で合成する場合、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及びＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンス及びセンスＲＮＡを合成することができる。これらを実験室条件でアニーリングした後に、細胞に導入するとＲＮＡｉが誘発され、ＴＧＦ−β２  ｍＲＮＡの分解を誘導する。細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム法、または各種トランスフェクション試薬（例えば、ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、  ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及びｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎなど）を用いた方法によって行われる。
【００３３】
ＲＮＡｉによりＴＧＦ−β２の発現を抑制する物質としては、ｓｈＲＮＡまたは前記ＤＮＡを含む発現ベクターを用いてもよく、前記発現ベクターを含む細胞を用いてもよい。前記発現ベクターや細胞の種類は特に限定しないが、既に医薬として使用されている発現ベクターや細胞が好ましい。
【００３４】
本発明では、配列番号１または２に表される塩基配列を標的配列とするｓｈＲＮＡが用いられる。
【００３５】
したがって、本発明は、前記ｓｈＲＮＡ発現用の組換え発現ベクターを含む。
【００３６】
本発明の組換えベクターは、当該分野に公知された組換えＤＮＡ方法によって構成される。
【００３７】
本発明においてｓｈＲＮＡを伝達するのに有用なウイルス（またはウイルスベクター）としては、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスなどがあり、腫瘍のように制限的な発現誘導が必要な理由として、アデノウイルスが好ましい。
【００３８】
アデノウイルスに前記ｓｈＲＮＡを導入するために、ｓｈＲＮＡ配列に基づいて下記のＤＮＡを製作することができる。
【００３９】
＜マウス標的配列に対するＤＮＡ＞
トップストランド：５’−ｇａｔｃｃ  ＧＧＡＴＴＧＡＡＣＴＧＴＡＴＣＡＧＡＴＣＣＴＴＡＡ  ｔｃｔｃ  ＴＴＡＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＡＣＡＧＴＴＣＡＡＴＣＣ  ｔｔｔｔ  ａ−３’［配列番号５］
【００４０】
ボトムストランド：５’−ａｇｃｔｔ  ａａａａ  ＧＧＡＴＴＧＡＡＣＴＧＴＡＴＣＡＧＡＴＣＣＴＴＡＡ  ｇａｇａ  ＴＴＡＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＡＣＡＧＴＴＣＡＡＴＣＣ  ｇ−３’［配列番号６］
【００４１】
＜人間標的配列に対するＤＮＡ＞
トップストランド：５’−ｇａｔｃｃ  ＧＧＡＴＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡ  ｔｃｔｃ  ＴＴＧＡＧＡＡＴＣＴＧＡＴＡＴＡＧＣＴＣＡＡＴＣＣ  ｔｔｔｔ  ａ−３’［配列番号７］
【００４２】
ボトムストランド：５’−ａｇｃｔｔ  ａａａａ  ＧＧＡＴＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡ  ｇａｇａ  ＴＴＧＡＧＡＡＴＣＴＧＡＴＡＴＡＧＣＴＣＡＡＴＣＣ  ｇ−３’［配列番号８］
【００４３】
また、本発明においてｓｈＲＮＡを伝達するのに有用な非ウイルスベクターとしては、上述のウイルスベクターを除いた通常に遺伝子療法に用いるすべてのベクターを意味し、そのような例としては、真核細胞で発現可能な多様なプラスミド及びリボソームなどがある。
【００４４】
一方、本発明においてＴＧＦ−β２発現を抑制するｓｈＲＮＡは、伝達された細胞に適切に転写されるために、少なくともプロモーターに作動可能に連結されることが好ましい。前記プロモーターは真核細胞で機能するプロモーターであればどれでもよいが、Ｕ６プロモーターがＲＮＡ重合酵素IIIとしてｓｍａｌｌ  ｓｉｚｅ  ＲＮＡを生成するのに有利な理由として特に好ましい。ＴＧＦ−β２発現を抑制するｓｈＲＮＡの効率的な転写のために必要に応じてリーダー配列、ポリアデニル化配列、プロモーター、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）、アップストリーム（ｕｐｓｔｒｅａｍ）活性化配列、シグナルペプチド配列及び転写終結因子を含む調節配列をさらに含むことができる。
【００４５】
ここで、用いられる用語「作動可能に連結された」とは、核酸配列との間の結合が機能的に連関されていることを意味する。任意の核酸配列が作動可能に連結された場合は、任意の核酸配列が他の核酸配列と機能的に関連性を有するように位置している場合である。本発明において、任意の転写調節配列がｓｈＲＮＡの転写に影響を及ぼす場合、前記転写調節配列が前記ｓｈＲＮＡと作動可能に連結されているという。
【００４６】
また、本発明は、前記配列番号３または４のＴＧＦ−β２発現を抑制するｓｈＲＮＡ、配列番号５に表されるトップストランド（ｔｏｐ  ｓｔｒａｎｄ）と、配列番号６に表されるボトムストランド（ｂｏｔｔｏｍ  ｓｔｒａｎｄ）を含むＤＮＡまたは配列番号７に表されるトップストランド（ｔｏｐ  ｓｔｒａｎｄ）と、配列番号８に表されるボトムストランド（ｂｏｔｔｏｍ  ｓｔｒａｎｄ）を含むＤＮＡまたはこれを発現する組換え発現ベクターを有効成分として含む抗腫瘍組成物に関する。
【００４７】
本発明の抗腫瘍組成物の投与経路は、特に限定されず、経口投与または非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患者への局所投与、皮膚投与など）のいずれか１つの投与経路に投与してもよい。経口投与の適当な製剤形態としては、固形または液体の形態が可能であって、非経口投与の適当な製剤形態としては、注射剤、点滴剤、坐剤、外用剤、点眼剤、点鼻剤などの形態が可能である。本発明の抗腫瘍組成物は、その製剤形態によって、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を含んでもよい。薬学的に許容可能な添加剤の具体的な例としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑択剤、抗酸化剤、保存剤、安定化剤、等張化剤、着色剤、矯味剤、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、充填剤、増量剤、緩衝剤、送達担体、キャリア、賦形剤及び／または薬学的アジュバントなどがあげられる。
【００４８】
経口用の固形製剤形態の本発明の抗腫瘍組成物としては、例えば、有効成分に賦形剤を加え、それと共に、必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑択剤、着色剤または矯味剤などの製剤用添加物を加えた後、通常方法で、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤として調製することができる。経口用液体製剤形態の本発明の抗腫瘍組成物としては、有効成分として、矯味剤、安定化剤、または保存剤などの製剤用添加物１種または２種以上を加え、通常方法により、内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などとして調製することができる。
【００４９】
本発明の抗腫瘍組成物を液体製剤として処方するために用いる溶媒としては、水性または非水性のいずれでもよい。液体製剤は当該分野に周知の方法により調製することができる。例えば、注射剤は、生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水などの溶剤に溶解した後、濾過紙などに濾過滅菌し、続いて滅菌容器（例えば、アンプルなど）に充填して調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含んでもよい。
【００５０】
また、非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法を使用してもよい。本発明で使用することができるキャリアとしては、中性、緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンを含む生理食塩水などがあげられる。
【００５１】
ＴＧＦ−β２発現を抑制するｓｈＲＮＡ発現ベクターなど遺伝子送逹については、適用される細胞内においてＴＧＦ−β２発現を抑制するｓｈＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ発現ベクターを発現させている限り、特に方法は限定しないが、例えば、ウイルスベクター、リポソームを用いた遺伝子導入を利用することが可能である。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、 レンチウイルス などの動物ウイルスがあげられる。
【００５２】
ＲＮＡｉによりＴＧＦ−β２発現を抑制する物質は、細胞に直接注入してもよい。
【００５３】
本発明の抗腫瘍組成物の有効成分は治療学的有効量として用い、前記組成物の投与量は、使用目的、疾患の中毒度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、または有効成分として用いる物質の種類などを考慮して当業者が決定することができる。例えば、有効成分として、大人１ｋｇ当たり約１×１０１０〜１×１０１２ｐａｒｔｉｃｌｅｓである。本発明の抗腫瘍組成物の投与頻度は、例えば、１日１回〜数ヶ月に１回であればよい。
【００５４】
本発明のｓｈＲＮＡは、ＴＧＦ−β２発現を抑制するので、本発明の薬剤学的組成物は、腫瘍と係る多様な疾病または疾患、例えば癌、具体的には、脳癌、胃癌、肺癌、乳房癌、卵巣癌、肝臓癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、食道癌、膵臓癌、膀胱癌、前立腺癌、大腸癌、結腸癌及び子宮頸部癌などの予防及び治療に利用される。本明細書において用語「治療」は（ｉ）腫瘍細胞形成の予防；（ｉｉ）腫瘍細胞の除去による腫瘍と係る疾病または疾患の抑制；及び（ｉｉｉ）腫瘍細胞の除去による腫瘍と係る疾病または疾患の軽減を意味する。よって、本明細書において用語「治療学的有効量」は上記の薬理学的効果を達成するのに十分な量を意味する。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明に係る実施例で本発明をより詳しく説明されるが、本発明の範囲が下記実施例によって制限されない。
実施例１：ｓｈＲＮＡ製造−ＴＧＦ−β２の沈黙（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を効果的に誘導するターゲット選定
【００５６】
本発明は、ＴＧＦ−β２の沈黙（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を誘導するために、センス２５ｍｅｒ／アンチセンス２５ｍｅｒ（４個塩基を有するループを中に含む）に基づいたｓｈＲＮＡを製作し、アデノウイルスで発現させるためにシャトルベクターに導入し、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）ウイルスを製作した。
【００５７】
ｓｈＲＮＡ  ＴＧＦ−β２の特異性検証のために、スクランブルド（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ｓｈＲＮＡを有するシャトルベクターも同時に製作した。従来方法と比較して特異性と発現抑制能が大きく向上した。
【００５８】
このために、ＴＧＦ−β２のｓｈＲＮＡ最小１０ｎＭでマウスのＴＧＦ−β２  ｍＲＮＡを７５％以上抑制する効果があるｓｈＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲ方法を介して確保した。
【００５９】
このために、マウス用ｓｈＲＮＡは、皮膚癌細胞であるＢ１６Ｆ１０にトランスフェクションさせ、２４時間が過ぎた後に減少される程度を調査した。
【００６０】
次は、実験方法である。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで多様な種類の候補ｓｈＲＮＡ  １０ｎＭを３０％  Ｂ１６Ｆ１０にトランスフェクションし、２４時間培養後、確認（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を介してマウスＴＧＦ−β２に対して５個のｓｈＲＮＡスクリーニングの結果、ターゲットに該当されるｓｈＲＮＡにおいて７３．７５％の沈黙（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）効果を確認した。
【００６１】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのために、正方向プライマーとしては、５’−ＧＴＧＡＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＴＣＧＡＣ−３’［配列番号９］と逆方向プライマーとしては、５’−ＣＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＧＣＴＴＴＴＡ−３’［配列番号１０］であって、反応条件は、次のように行った。
【００６２】
１段階：逆転写（４２℃  ５ｍｉｎ、９５℃  １０ｓｅｃ）、
２段階：ＰＣＲ反応（９５℃  ５ｓｅｃ、６０℃  ２０ｓｅｃ）５０ｃｙｃｌｅｓ、
３段階：分離（６０℃−＞９５℃）で行った。
【００６３】
確認（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）実験結果、１０個の標的配列候補のうち、下記表１に基づいて下記ターゲットを選定した。
【００６４】
マウス標的配列：５’−ＧＧＡＴＴＧＡＡＣＴＧＴＡＴＣＡＧＡＴＣＣＴＴＡＡ−３’［配列番号１］
【００６５】
【表１】
2015506696.tif 000003
【００６６】
注）ｃｔ：ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ，  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎに到達するのに所要されたサイクル数、小さいほど元のｍＲＮＡ量は多くなる。
【００６７】
△ｃｔ：ＴＧＦ−β２用ｃｔからａｃｔｉｏｎ用ｃｔを引いた値。
△△ｃｔ：ＴＧＦ−β２  ｓｈＲＮＡ処理サンプルの△ｃｔから対照群のＴＧＦ−β２の△ｃｔを引いた値。
２−△△ｃｔ：２のマイナス指数の△△ｃｔ値
発現抑制率：２−△△ｃｔを百分率で表したものである。
【００６８】
前記標的配列に対して２５／２５＋４ループを有するｓｈＲＮＡを合成し、これらの標的配列に対する抑制効果をリアルタイムＰＣＲで確認した。
【００６９】
マウス標的配列（配列番号１）とするｓｈＲＮＡ：５’−ＧＧＡＴＴＧＡＡＣＴＧＴＡＴＣＡＧＡＴＣＣＴＴＡＡ  ｔｃｔｃ  ＴＴＡＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＡＣＡＧＴＴＣＡＡＴＣＣ−３’［配列番号３］
【００７０】
上述のリアルタイムＰＣＲによって選定された配列番号３の塩基配列をアデノウイルスで発現させるために、両端にＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII塩基サイトを挿入し、中間にｔｃｔｃの４個の塩基を有するループ（ｌｏｏｐ）を有するように製作した。すなわち、マウスｓｈＲＮＡの基本的な構造は５’−２５ｍｅｒ−ループ（４ｍｅｒ）−２５ｍｅｒ−３’で構成されている。
【００７１】
これに基づいて、アデノウイルスに導入するための下記の２本鎖のＤＮＡストランド（ｓｔｒａｎｄ）を製作してｓｈＲＮＡ生成を誘導した。
【００７２】
トップストランド：５’−ｇａｔｃｃ  ＧＧＡＴＴＧＡＡＣＴＧＴＡＴＣＡＧＡＴＣＣＴＴＡＡ  ｔｃｔｃ  ＴＴＡＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＡＣＡＧＴＴＣＡＡＴＣＣ  ｔｔｔｔ  ａ−３’［配列番号５］
【００７３】
ボトムストランド：５’−ａｇｃｔｔ  ａａａａ  ＧＧＡＴＴＧＡＡＣＴＧＴＡＴＣＡＧＡＴＣＣＴＴＡＡ  ｇａｇａ  ＴＴＡＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＡＣＡＧＴＴＣＡＡＴＣＣ  ｇ−３’［配列番号６］
【００７４】
人間ＴＧＦ−β２抑制のためのリアルタイムＰＣＲ用プライマーは次のようである。
【００７５】
正方向プライマー：５’−ＧＣＴＧＣＣＴＡＣＧＴＣＣＡＣＴＴＴＡＣＡＴ−３’［配列番号１１］
【００７６】
逆方向プライマー：５’−ＡＴＡＴＡＡＧＣＴＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧ−３’［配列番号１２］
【００７７】
反応条件は、１段階：逆転写（４２℃  ５ｍｉｎ、９５℃  １０ｓｅｃ）、２段階：ＰＣＲ反応（９５℃  ５ｓｅｃ、６０℃  ２０ｓｅｃ）５０ｃｙｃｌｅｓ、３段階：分離（６０℃−＞９５℃）で行った。
【００７８】
確認（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）実験結果、３個の標的配列候補のうち、下記表２に基づいて下記ターゲットを選定した。
【００７９】
人間標的配列：５’−ＧＧＡＴＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡ−３’［配列番号２］
【００８０】
【表２】
2015506696.tif 000004
【００８１】
前記標的配列に対して２５／２５＋４ループを有するｓｈＲＮＡを合成し、これらの標的配列に対する抑制効果をリアルタイムＰＣＲで確認した。
【００８２】
人間標的配列（配列番号２）のためのｓｈＲＮＡ：５’−ＧＧＡＴＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡ  ｔｃｔｃ  ＴＴＧＡＧＡＡＴＣＴＧＡＴＡＴＡＧＣＴＣＡＡＴＣＣ−３’［配列番号４］
【００８３】
上述のリアルタイムＰＣＲにより選定された配列番号４の塩基配列をアデノウイルスで発現させるために、両端にＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII塩基サイトを挿入し、中間にｔｃｔｃの４個の塩基を有するループを有するように製作した。すなわち、人間ｓｈＲＮＡの基本構造は、５’−２５ｍｅｒ−ループ（４ｍｅｒ）−２５ｍｅｒ−３’で構成されている。
【００８４】
これに基づいて、アデノウイルスに導入させるための下記２本鎖のＤＮＡを製作した。
【００８５】
トップストランド：５’−ｇａｔｃｃ  ＧＧＡＴＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡ  ｔｃｔｃ  ＴＴＧＡＧＡＡＴＣＴＧＡＴＡＴＡＧＣＴＣＡＡＴＣＣ  ｔｔｔｔ  ａ−３’［配列番号７］
【００８６】
ボトムストランド：５’−ａｇｃｔｔ  ａａａａ  ＧＧＡＴＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡ  ｇａｇａ  ＴＴＧＡＧＡＡＴＣＴＧＡＴＡＴＡＧＣＴＣＡＡＴＣＣ  ｇ−３’［配列番号８］
実施例２：ターゲット配列に対するｓｈＲＮＡ発現する複製不能アデノウイルスベクター製作
【００８７】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを介して確認された最も効果的に発現を抑制するｓｈＲＮＡ塩基配列をセンスとアンチセンス配列がｔｃｔｃあるいはｔｃｔｃｔｃを間に置いて位置するようにし、両端にＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII制限酵素塩基配列を有した塩基で構成された、オリゴヌクレオチドと相補的なオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成して合体（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）させた後、Ｅ３シャトルベクターであるｐＳＰ７２ΔＥ３／ｓｉ−ｎｅｇａｔｉｖｅベクター［図１、ｐＳＰ７２ｃｌｏｎｉｎｇベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にアデノウイルスＥ３Ｌ（２６５９１−２８５８８）とＥ３Ｒ（３０５０４−３１０５７）を挿入し、Ａｍｂｉｏｎ社のｐｓｉｌｅｎｃｅｒ  ２．１−Ｕ６  ｈｙｇｒｏで−ＥｃｏＲＩ−Ｕ６  ｐｒｏｍｏｔｅｒ＋−ＢａｍＨＩ−ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｓｈＲＮＡ用塩基配列であるａｃｔａｃｃｇｔｔｇｔｔａｔａｇｇｔｇｔｔｃａａｇａｇａｃａｃｃｔａｔａａｃａａｃｇｇｔａｇｔｔｔｔｔｔｇｇａａ−ＨｉｎｄIIIが入った形態のｐＳＰ７２ΔＥ３／ｓｉ−ｎｅｇａｔｉｖｅ（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）］を製作した。
【００８８】
人間またはマウスのｓｈＲＮＡ  ＴＧＦ−β２導入のために、まず、上記のｐＳＰ７２ΔＥ３／ｓｉ−ｎｅｇａｔｉｖｅプラスミドをＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで処理した後、人間またはマウスのｓｈＲＮＡ  ＴＧＦ−β２を挿入させてｐＳＰ７２ΔＥ３−ｓｈ−ｈｕｍａｎ  ＴＧＦ−β２またはｐＳＰ７２ΔＥ３−ｓｈ−ｍｏｕｓｅ  ＴＧＦ−β２を製作した［図２］。陰性対照群アデノウイルスとしては、両端にＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIを有するようにし、スクランブルド（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）塩基配列（ａｃｔａｃｃｇｔｔｇｔｔａｔａｇｇｔｇ）とｌｏｏｐ（ｔｔｃａａｇａｇａ）を製作した。
【００８９】
アデノウイルスのＥ３部位ＰＣＲで養成クローン（＃１、２、５、６、７、８、９）だけを選択した後、［図３の（ａ）：ｄｌ３２４／ＩＸアデノウイルスバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）ゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡとｐＳＰ７２−ｓｈ−ｈＴＧＦ−β２シャトルベクターとの相同組換え後、ｓｈ−ｈＴＧＦ−β２が含まれたクローンを選択するＰＣＲ結果、図３の（ｂ）：ｄｌ３２４／ＩＸアデノウイルスバックボーンゲノムＤＮＡとｐＳＰ７２−ｓｈ−ｈＴＧＦ−β２シャトルベクターとの相同組換え後、ＩＸ遺伝子有無を介して図３の（ａ）で確認されたｓｈ−ｈＴＧＦ−β２が含まれたクローンのうちからゲノムＤＮＡも含まれたクローンを再び選択するＰＣＲ結果］、図３の（ｃ）で示すように、ＨｉｎｄIII切断パターン（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎ）で最終の相同組換え体を選択した［図４］。
【００９０】
次に、図３及び図４を詳細に説明する。
【００９１】
図３の（ａ）において、ｄｌ３２４／ＩＸレーンはｄｌ３２４バックボーンであり；シャトルレーンはｐＳＰ７２−ｓｈ−ｈＴＧＦ−β２である。レーン１〜１０は、ｄｌ３２４バックボーンとｐＳＰ７２−ｓｈ−ｈＴＧＦ−β２との間の相同組換え後、バクテリアクローン（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｌｏｎｅ）から得たプラスミドをＥ３部位に増幅させた結果を示すもので、約２ｋｂに相当するバンドが示されればｐｏｓｉｔｉｖｅである。Ｅ３部分をＰＣＲしたとき、Ｅ３部分のないｄｌ３２４バックボーンでは２ｋｂに相当するバンドが示されないが、Ｅ３部分に、Ｕ６プロモーターとｓｈ−ｈＴＧＦ−β２とのｓｈコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）が挿入されたシャトルベクターの場合、ＰＣＲすると２ｋｂのプロダクト（ｐｒｏｄｕｃｔ）の大きさ（ｓｉｚｅ）が示されることにより相同組換えされたか否かを確認することができる。
【００９２】
図３の（ｂ）において、ｄｌ３２４／ＩＸレーンはｄｌ３２４バックボーンであり；シャトルベクターはｐＳＰ７２−ｈＴＧＦ−β２である。図３の（ａ）で確認されたｓｈ−ｈＴＧＦ−β２が含まれたクローン（＃１、２、５、６、７、８、９）のうちからゲノムＤＮＡも含まれたクローンを再び選択するＰＣＲ結果で相同組換えされたことを確認する、図３の（ａ）に続いて連続的な選択実験により両方でｐｏｓｉｔｉｖｅしたクローンが相同組換えされたことを意味する。ＩＸ遺伝子部分をＰＣＲしたとき、ＩＸ遺伝子を有するｄｌ３２４バックボーンとＩＸ遺伝子を有しないシャトルベクターとの差を用いて相同組換えされたか否かを確認した。その結果、＃１、２、６、７だけが再び選択された。
【００９３】
図３の（ｃ）は、バックボーンとサンプルとをＨｉｎｄIIIでカットティング（ｃｕｔｔｉｎｇ）したときに変化するパターンとの差により相同組換えされたか否かを最終的に確認したものである。レーン１〜３は前記＃１クローン由来ＤＮＡであり、レーン４〜６は＃２クローン、レーン７〜９は＃６クローンで得たＤＮＡをＤＨ５ａというコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）に再びトランスフォーメーション（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）して得た子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）クローンで各母体（ｐａｒｅｎｔａｌ）クローンから来由されたそれぞれの３個のＤＮＡのうち＃１クローンだけが既存のｄｌ３２４−ＩＸ（もっぱら左側一番目ｌａｎｅ）とは異なったＨｉｎｄIIIパターンを示した。これは、バックボーンアデノウイルスＤＮＡがシャトルベクターと相同組換えをなしたことを意味し、よって、本発明は＃１クローンに基づいている。
【００９４】
図４は、ｐＰｏｌｙ２というプラスミドにＰａｃＩ部位に挿入されているＡｄ−ｄｌ３２４−ＩＸ−ｓｈ−ｈＴＧＦ−β２をＰａｃＩで切断してｐＰｏｌｙ２がまともに切断されたか否かを確認することで、ウイルス生産に要求される最終コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を決定する実験である。図３の（ｃ）から確認した＃１クローンに属する３個のＤＮＡは、ＰａｃＩで切断時すべて約２ｋｂに相当するｐＰｏｌｙ２バックボーンＤＮＡが全部出てしまった。これらが、それぞれのｓｈＲＮＡ  ｈＴＧＦ−β２塩基配列を有しているか否かを配列分析して確認した結果、すべてのクローンで同一のｓｈＲＮＡ  ｈＴＧＦ−β２塩基配列を有することを確認した（図５）。その後、これらをＰａｃＩ切断後に一緒に２９３Ａ細胞にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）してアデノウイルスを生産した。
【００９５】
すなわち、前記方法で製作されたＥ３シャトルベクターをそれぞれのＸｍｎＩ制限酵素で処理して単一鎖に作った後、ＳｐｅＩ制限酵素を処理して単一鎖となった複製不能アデノウイルスであるｄｌ３２４とともに、大膓菌ＢＪ５１８３で同時に形質転換させて遺伝子相同組換えを誘導した。相同組換えされたプラスミドＤＮＡを収得してＨｉｎｄIII制限酵素で処理してＤＮＡパターンの変化を確認し、最終的に配列分析して相同組換え有無を確認した後、確認されたプラスミドをＰａｃＩで切断した後、２９３細胞株に形質転換してｓｈＲＮＡ  ＴＧＦ−β２を発現する複製不能アデノウイルスを製作した（複製可能アデノウイルスにｓｈＲＮＡを製作する場合には、ｓｈＲＮＡによる抑制効果と細胞リシース（ｌｙｓｉｓ）効果とが混在されていて、抑制効果だけを明確に確認することができなかったので、複製不能アデノウイルスを製作した）。このアデノウイルスは、２９３細胞株で増殖させてＣｓＣｌ変化度（ｇｒａｄｉｅｎｔ）で濃縮して限界希釈培養法（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）または溶菌斑検査（ｐｌａｑｕｅ  ａｓｓａｙ）でウイルス力価を決定した。
【００９６】
最終ウイルス力価（ｖｉｒｕｓ  ｔｉｔｅｒ）は、限界希釈適正法（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）により２．５×１０９ｐｆｕ／ｍｌであった。
実施例３：癌細胞での効果確認−ｓｈＲＮＡ発現するアデノウイルスによるＴＧＦ−β２発現抑制確認
【００９７】
１）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで確認
ＴＧＦ−β２発現抑制確認は、人間の場合、人間前立腺癌細胞であるＤＵ−１４５に実施例２のアデノウイルス１〜１００ｍｏｉで感染させて２日後、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）で細胞をリーシス（ｌｙｓｉｓ）させ、クロロホルム、イソプロパノール、エタノールなどを連続的に処理してＲＮＡを収穫した後、ＴＧＦ−β２  ｍＲＮＡ発現抑制の程度をリアルタイムＰＣＲで確認した。
【００９８】
マウスの場合、マウス黒色腫細胞であるＢ１６Ｆ１０に、実施例２のアデノウイルス１００、５００、１０００ｍｏｉで感染させ、その後の過程は人間の場合と同様に実施した。
【００９９】
人間ＴＧＦ−β２抑制のためのリアルタイムＰＣＲ用プライマーは、正方向プライマー：５’−ＧＣＴＧＣＣＴＡＣＧＴＣＣＡＣＴＴＴＡＣＡＴ−３’［配列番号１１］と逆方向プライマー：５’−ＡＴＡＴＡＡＧＣＴＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧ−３’［配列番号１２］を用い、ＡＢ  ｐｏｗｅｒＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＮＡ−ｔｏ−Ｃｔ  １ｓｔｅｐ  ｋｉｔを用いてＲＴ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ（１２５Ｘ）０．２μｌ、ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍｉｘ（２ｘ）１２．５μｌ、Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（１００ｐＭ）０．５μｌ、  ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（１００ｐＭ）０．５μｌ、  ＲＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）５μｌ、  Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ  ６．３μｌで総体積は２５μｌとなるようにし、反応条件は、次の表３のようである。
【０１００】
マウスＴＧＦ−β２抑制のためのリアルタイムＰＣＲ用プライマーは、正方向プライマー：５’−ＧＴＧＡＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＴＣＧＡＣ−３’［配列番号９］と逆方向プライマー：５’−ＣＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＧＣＴＴＴＴＡ−３’［配列番号１０］を用い、ＡＢ  ｐｏｗｅｒＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＮＡ−ｔｏ−Ｃｔ  １ｓｔｅｐ  ｋｉｔを用いてＲＴ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ（１２５Ｘ）０．２μｌ、ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍｉｘ（２ｘ）１２．５μｌ、Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（１００ｐＭ）０．５μｌ、ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（１００ｐＭ）０．５μｌ、ＲＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）５μｌ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ  ６．３μｌで総体積は２５μｌとなるようにし、反応条件は、次の表３のようである。
【０１０１】
【表３】
2015506696.tif 000005
【０１０２】
人間ＴＧＦ−β２のｓｈＲＮＡ確認結果、１ｍｏｉのアデノウイルスで７３％の沈黙（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）効果を示すなど、５０ｍｏｉのアデノウイルスで９０％以上のＴＧＦ−β２発現抑制が観察された［表４、図６］。
【０１０３】
【表４】
2015506696.tif 000006
【０１０４】
マウスＴＧＦ−β２のｓｈＲＮＡ確認結果、１０００ｍｏｉのアデノウイルスで５０％の沈黙（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）効果を示した［図７］。人間と比較して相対的に低い抑制率は、マウス細胞に対するアデノウイルスの低い感染率に起因したものと見られる。これに対する確認は、マウスｓｈＴＧＦ−β２が発現するプラスミドをトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）することで,発現されたｓｈＲＮＡが効果的にＴＧＦ−β２  ｍＲＮＡを抑制するものと確認した［図８］。
【０１０５】
２）ＥＬＩＳＡで確認
上述のアデノウイルス１、５、１０、５０ｍｏｉ感染後、２日間人間の実施例２の前立腺癌細胞に培養しながら最後の２４時間は無血清バッジに分泌されたＴＧＦ−β２量を測定した。
【０１０６】
ＴＧＦ−β２のｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスを１ｍｏｉだけ感染しても一日間に分泌されるＴＧＦ−β２はほとんど検出されなかった［表５、図９］。これは、ＴＧＦ−β２のｓｈＲＮＡが非常に効果的にＴＧＦ−β２のｍＲＮＡを分解していることを意味する。
【０１０７】
【表５】
2015506696.tif 000007
実施例４：腫瘍選択的殺傷アデノウイルス製作
【０１０８】
複製不能なアデノウイルスでＴＧＦ−β２に対するｓｈＲＮＡの効果を確認した後、このｓｈＲＮＡを発現しながら腫瘍選択的に細胞を殺傷するアデノウイルスを製作した。腫瘍選択的殺傷複製可能なアデノウイルスを作る前にアデノウイルスのＥ１Ａ部分に多様な遺伝子を入れることができるシャトルベクターを製作しようと、ｐＢＳＫＩＩプラスミド［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、  ＵＳＡ］にＥ１ＡとＥ１Ｂ５５ｋＤａ遺伝子を含み、多様な酵素部位（Ｅｎｚｙｍｅ  ｓｉｔｅ）を含むｐＢＳＫII−３４８４合成遺伝子を製作した［図１０の（ａ）］。合成された遺伝子を相同組換え確認を容易にするためのｐＣＡ１４シャトルベクターに導入するための形態に変えるためにｐＢＳＫII−３４８４をＰＣＲしてＦｓｐIで制限酵素を処理した後に、ブランティング（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）酵素でブラントエンド（ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ）を作って再びＢａｍＨIで処理した。ｐＣＡ１４［Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ、  Ｃａｎａｄａ］は、ＳｓｐIで制限酵素を用いて切った後、ブランティング酵素を用いてブラントエンドを作った後に、ＢｇｌIIを処理して同一伝達制限酵素（Ｉｓｏｓｃｈｉｚｏｍｅｒ）であるＢａｍＨIとＢｇｌII、そして両端のブラントエンドを介して合成した遺伝子を挿入してシャトルベクターｐＣＡ１４−３４８４を製作した［図１０の（ｂ）］。その後に、ＣＭＶプロモーター遺伝子をＫｐｎIとＸｈｏIでｐＣＡ１４−３４８４に挿入してｐＣＡ１４−ＣＭＶ−３４８４を製作した［図１０の（ｃ）］。そして、ｐＣＡ１４−ＣＭＶ−３４８４でＥｃｏＲＩとＳａｌＩ制限酵素によりＥ１Ｂ５５ｋＤａ部分を切断し、ブランティング（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）した後、再び連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）されたｐＣＡ１４−ＣＭＶ−３４８４−ΔＥ１Ｂ５５を得た［図１０の（ｄ）］。製作されたシャトルベクターｐＣＡ１４−ＣＭＶ−３４８４−ΔＥ１Ｂ５５をＸｍｎＩで切断してｌｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏｎさせた後、ＩＸ遺伝子のないｄｌ３２４−ＢｓｔＢI−ｈｕｍａｎ  ｓｈＴＧＦ−β２（または、ｍｏｕｓｅ  ｓｈＴＧＦ−β２）をＢｓｔＢＩで切断した後、大膓菌ＢＪ５１８３で同時に形質転換させて相同組換えを誘導した。
【０１０９】
相同組換えされたプラスミドＤＮＡを収得してＨｉｎｄIII制限酵素で処理してＤＮＡパターンの変化を確認し、最終的に配列分析して相同組換え有無を確認した後、確認されたプラスミドをＰａｃＩで切断した後、２９３細胞株に形質転換して腫瘍を選択的に殺傷しながら人間（またはマウス）ＴＧＦ−β２の発現を抑制するｄｌ３２４−ＣＭＶ−３４８４−ｓｈＴＧＦ−β２アデノウイルスを製作した［図１１］。
【０１１０】
図１２は、実際マウスｓｈＴＧＦ−β２が含まれた腫瘍選択的複製可能アデノウイルス製作のための相同組換え過程を示すものであって、Ｅ３スクリーニング結果、１、２、４、５、６クローンがｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｌｏｎｅで１次選択され（ａ）、ＨｉｎｄIII切断パターン（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ）で相同組換えされたコロニーを選択し、１、２、４番コロニーのすべてを対照区とパターン比較した結果、組換えされたものと確認され（ｂ）、ＰａｃＩ切断後、１、２、４コロニーのうちの１番だけＰａｃＩで切断して２ｋｂ程度のバンドを確認することで、１番コロニーのＤＮＡが相同組換えされたｄｌ３２４−ＣＭＶ−３４８４−△Ｅ１Ｂ５５−△Ｅ３−ｓｈ−ｍＴＧＦ−β２のＤＮＡであることを確認することができた（ｃ）。
【０１１１】
図１３は、人間ｓｈＴＧＦ−β２が含まれた腫瘍選択的複製可能アデノウイルス製作のための相同組換え過程を示すものであって、ＨｉｎｄIII切断パターンによる相同組換えされたクローン（１、２、３）が選択され（ａ）、前記クローン１、２、３のＤＮＡをＰａｃＩで切断した場合、クローンＤＮＡ１、２、３すべてが切断されて２ｋｂ程度のバンドが確認されており、これは、１、２、３コロニーのＤＮＡが相同組換えされたｄｌ３２４−ＣＭＶ−３４８４−ΔＥ１Ｂ５５−ΔＥ３−ｓｈ−ｈＴＧＦ−β２のＤＮＡを確認することができた（ｂ）。
実施例５：細胞溶血確認
【０１１２】
複製可能なアデノウイルスの細胞殺傷能を確認するために、２４ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に各種類の細胞を４×１０４から１×１０５まで細胞の大きさに応じて細胞数を定めた後、分株して培養した後、翌日ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒとＣＭＶプロモーターを有した複製可能なアデノウイルスをＭＯＩごとに感染させて養成対照群である２９３Ａ細胞株から最も低いＭＯＩで細胞がウイルスによってすべて死んだときに実験を終了して、各プレートに死なないで生きていた細胞をクリスタルバイオレットで染色した。３．７％パラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍ  ａｌｄｅｈｙｄｅ）で細胞を５分間常温で固定した後、０．０５％のクリスタルバイオレットにより常温で３０分間染色した後、水で洗浄して染色された細胞を観察した。２つの種類の腫瘍殺傷ウイルスでウイルスの腫瘍殺傷効果を比較した結果、プロモーターによる殺傷効果との差は大きくないものと示され、２つとも腫瘍選択性が優れるものとして確認された。
【０１１３】
図１４は、腫瘍選択的複製可能アデノウイルス（ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒとＥ１Ｂ  ５５ＫＤａが発現されないｄｌ３２４−ＣＭＶ−３４８４とｓｕｒｖｉｖｉｎｇ  ｐｒｏｍｏｔｅｒにより選択性を付与し、５５ＫＤａが発現されるｄｌ３２４−ｈＳｕｒｖｉｖｉｎ−３４８４）が正常細胞（ＢＪ細胞）では、複製が起きないのに対し、多様な種類の人間癌細胞では複製が起きて細胞の溶血が起きることを示したものである。
実施例６：癌細胞での効果確認
【０１１４】
Ａ３７５メルラノ−マ細胞株で人間ｓｈ−ＴＧＦ−β１またはｓｈ−ＴＧＦ−β２を発現する実施例２の複製不能アデノウイルスを１、５、１０、５０、１００ｍｏｉで感染させてから細胞内に存在するＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３ｍＲＮＡの水準をリアルタイムＰＣＲ方法で行った。
【０１１５】
その結果、ＴＧＦ−β１のｓｈＲＮＡを発現する場合、細胞内ＴＧＦ−β１  ｍＲＮＡを減少させるものの、ＴＧＦ−β２  ｍＲＮＡやＴＧＦ−β３  ｍＲＮＡが増加する傾向を示した。一方、ＴＧＦ−β２のｓｈＲＮＡを発現する場合、細胞内ＴＧＦ−β２  ｍＲＮＡを効果的に減少させると共に、ＴＧＦ−β２  ｍＲＮＡやＴＧＦ−β３  ｍＲＮＡが減少する傾向を示した［図１５］。これは、細胞内の補償効果側面による効能低下の心配が、少なくともＴＧＦ−β２のｓｈＲＮＡを発現する場合には、その現象がなかっただけでなく、他のＴＧＦ−βのｉｓｏｔｙｐｅも抑制させる付随効果も有することができる長所となる。これと同様な結果がＥＬＩＳＡを用いてＴＧＦ−βタンパク質の発現減少効果パターンにもリアルタイムＰＣＲで同様に現れた［図１６］。
【０１１６】
これは、ＴＧＦ−β２に対するｓｈＲＮＡ発現するアデノウイルスが、ＴＧＦ−β１に対するｓｈＲＮＡ発現するアデノウイルスよりも発現抑制効果が相対的に優れることを確認させたことである。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３（ａ）】
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【図１３（ｂ）】
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【図１６】
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【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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