(57)【要約】  知覚能力低下、記憶学習能力低下、思考能力低下、集中力低下、注意力低下、判断能力低下、うつ症状、及びこれらに起因する運動パフォーマンス低下などの脳機能の低下の予防または改善剤を提供する。  シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を有効成分として含有する脳神経細胞の保護剤。シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を有効成分として含有する脳機能低下の予防または改善剤。
2015535241.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を有効成分として含有する脳神経細胞保護剤。
【請求項２】
シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を有効成分として含有する脳機能低下の予防または改善剤。
【請求項３】
脳機能低下が、知覚能力低下、記憶学習能力低下、思考能力低下、集中力低下、注意力低下、判断能力低下、うつ症状、及びこれらに起因する運動パフォーマンス低下からなる群から選ばれる１以上の脳機能低下である請求項２に記載の脳機能低下の予防または改善剤。
【請求項４】
シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を有効成分として経口的に摂取させることを特徴とする、脳機能低下の予防または改善方法。
【請求項５】
シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を有効成分として含有する経口剤を摂取させることを特徴とする、脳機能低下の予防または改善方法。
【請求項６】
シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を有効成分として経口的に摂取させることを特徴とする、脳機能低下の予防または改善方法、ただし該予防または改善方法は医師によるヒトに対する手術方法、治療方法または診断方法を含まない。
【請求項７】
シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を有効成分として含有する経口剤を摂取させることを特徴とする、脳機能低下の予防または改善方法、ただし該予防または改善方法は医師によるヒトに対する手術方法、治療方法または診断方法を含まない。
【請求項８】
脳神経細胞保護に使用するためのシトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩。
【請求項９】
脳機能低下の予防または改善に使用するためのシトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩。
【請求項１０】
脳機能低下が、知覚能力低下、記憶学習能力低下、思考能力低下、集中力低下、注意力低下、判断能力低下、うつ症状、及びこれらに起因する運動パフォーマンス低下からなる群から選ばれる１以上の脳機能低下である請求項９に記載のシトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩。
【請求項１１】
脳神経細胞保護剤の製造のためのシトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩の使用。
【請求項１２】
脳機能低下の予防または改善剤の製造のためのシトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩の使用。
【請求項１３】
脳機能低下が、知覚能力低下、記憶学習能力低下、思考能力低下、集中力低下、注意力低下、判断能力低下、うつ症状、及びこれらに起因する運動パフォーマンス低下からなる群から選ばれる１以上の脳機能低下である請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を有効成分として含有する脳機能低下の予防または改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳は運動・知覚など神経を介する情報伝達の最上位中枢であり、感情・情緒・理性などヒトの精神活動においても重要な役割を果たしている。脳外傷、脳血管障害、脳炎、低酸素症などを原因として生じる高次脳機能障害は、記憶障害、注意障害、遂行機能障害、社会的行動障害など多岐に渡り、脳の損傷部位によって特徴が分かれる。また、疲労によっても脳機能が低下する可能性が報告されており（非特許文献１）、記憶学習能力、注意集中力、判断能力などの低下につながることが考えられる。
【０００３】
虚血性の脳血管疾患は、脳神経細胞死を招き、脳機能を低下させることが知られている。この要因として、神経血管機能不全、内皮細胞変性、脳血流低下などが挙げられ（非特許文献２）、血管内皮細胞での正常な一酸化窒素（ＮＯ）産生の低下および脳血流の低下が脳神経細胞死および脳機能低下を招いていることが考えられる。すなわち、血管内皮細胞でのＮＯ産生の増強および脳血流を促進することにより、脳神経細胞を保護すること、および脳機能の低下を予防または改善することが期待できる。
【０００４】
シトルリンは、生体内でタンパク質の合成原料としては使われず、遊離の状態で存在するアミノ酸の一種である。体内ではアルギニン前駆体としてアルギニン生合成や、ＮＯの供給に関わるＮＯサイクルの構成因子として重要な役割を果たしている。摂取したシトルリンは、大部分が腎臓でアルギニンに変換され、全身に効率良くアルギニンが供給されることが知られている（非特許文献３）。
【０００５】
アルギニンは、ＮＯ合成酵素の直接的な基質となるアミノ酸である。また、肝臓においては尿素回路の中間体でもあり、体内で産生したアンモニアを解毒するのに重要な役割を担っている。アルギニンを基質に合成されるＮＯは、血管弛緩作用、酸化ＬＤＬ抑制作用、血小板凝集抑制作用、抗平滑筋細胞増殖作用、抗酸化作用など、正常な血管機能を維持するための多様な生理活性を発揮する。
【０００６】
シトルリンの摂取により、血管拡張因子であるＮＯ産生を介した抗動脈硬化作用および血流改善効果が報告されており（非特許文献４）、シトルリンは、ＮＯを産生させ血流を改善する食品素材として米国を中心に用いられている。また、シトルリンは欧州では、抗疲労用の医薬品として、シトルリン−リンゴ酸塩の形態で用いられている。
【０００７】
シチコリンは、動物や酵母などにおいてコリンリン酸とシチジン三リン酸から生合成される水溶性物質であり、細胞膜の構成成分であるホスファチジルコリンや神経伝達物質であるアセチルコリンなどの生合成に関与している。また経口摂取したシチコリンは、腸管吸収の間に一度、コリンとウリジンとに分解され、脳内で再構築されることが知られている（非特許文献５）。
【０００８】
シチコリンの摂取により、急性脳梗塞の予後改善作用（非特許文献６）、アルツハイマー型認知症における認知機能改善作用（非特許文献７）などが報告されている。このような機能性から、日本では脳代謝・意識障害・膵炎改善用途の医療用医薬品、海外では脳機能向上もしくは改善用途の食品素材として使用されている。
【０００９】
これまでに、シトルリン経口摂取による注意集中力向上（特許文献１）、アルギニンの腹腔内投与による記憶学習能力改善（非特許文献８）が報告されている。しかしながら、シトルリンまたはその塩にシチコリンおよびその塩を組み合わせることにより、相乗的な脳機能低下の予防または改善効果が得られることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００９／０９６５０５号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】「産業衛生学雑誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  ｈｅａｌｔｈ）」、２００７年、第４９巻、ｐ．２０３−２０８
【非特許文献２】「ニューロサイエンス（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）」１９９９年、９１巻、ｐ．２０３−２１０
【非特許文献３】「アミノ  アシッズ（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）」２００５年、第２９巻、ｐ．１７７−２０５
【非特許文献４】「ピー  エヌ  エー  エス（ＰＮＡＳ）」２００５年、第１０２巻、ｐ．１３６８１−１３６８６
【非特許文献５】「ジャーナル  オブ  ニューロサイエンス  リサーチ（Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」１９９９年、第５８巻、第５号、ｐ．６９７−７０５
【非特許文献６】「ストローク（Ｓｔｒｏｋｅ）」２００２年、第３３巻、ｐ．２８５０−２８５７
【非特許文献７】「メソッズ  アンド  ファインディングス  イン  エクスペリメンタルアンド  クリニカル  ファーマコロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」１９９９年、第２１巻、第９号、ｐ．６３３−６４４
【非特許文献８】「サイコファーマコロジー（Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」２００３年、第１６７巻、ｐ．２９１−２９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、知覚能力低下、記憶学習能力低下、思考能力低下、集中力低下、注意力低下、判断能力低下、うつ症状、及びこれらに起因する運動パフォーマンス低下などの脳機能低下の予防または改善剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、下記の（１）〜（１３）に関する
（１）シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を有効成分として含有する脳神経細胞保護剤。
（２）シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を有効成分として含有する脳機能低下の予防または改善剤。
（３）脳機能低下が、知覚能力低下、記憶学習能力低下、思考能力低下、集中力低下、注意力低下、判断能力低下、うつ症状、およびこれらに起因する運動パフォーマンス低下からなる群から選ばれる１以上の脳機能低下である（２）記載の脳機能低下の予防または改善剤。
（４）シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を有効成分として経口的に摂取させることを特徴とする、脳機能低下の予防または改善方法。
（５）シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を有効成分として含有する経口剤を摂取させることを特徴とする、脳機能低下の予防または改善方法。
（６）シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を有効成分として経口的に摂取させることを特徴とする、脳機能低下の予防または改善方法、ただし該予防または改善方法は医師によるヒトに対する手術方法、治療方法または診断方法を含まない。
（７）シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を有効成分として含有する経口剤を摂取させることを特徴とする、脳機能低下の予防または改善方法、ただし該予防または改善方法は医師によるヒトに対する手術方法、治療方法または診断方法を含まない。
（８）脳神経細胞保護に使用するためのシトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩。
（９）脳機能低下の予防または改善に使用するためのシトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩。
（１０）脳機能低下が、知覚能力低下、記憶学習能力低下、思考能力低下、集中力低下、注意力低下、判断能力低下、うつ症状、及びこれらに起因する運動パフォーマンス低下からなる群から選ばれる１以上の脳機能低下である（９）に記載のシトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩。
（１１）脳神経細胞保護剤の製造のためのシトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩の使用。
（１２）脳機能低下の予防または改善剤の製造のためのシトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩の使用。
（１３）脳機能低下が、知覚能力低下、記憶学習能力低下、思考能力低下、集中力低下、注意力低下、判断能力低下、うつ症状、及びこれらに起因する運動パフォーマンス低下からなる群から選ばれる１以上の脳機能低下である（１２）に記載の使用。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を有効成分として含有する、安全で効果的な、脳機能低下の予防または改善剤を提供することができる。本発明の剤により、シトルリンまたはその塩とシチコリンまたはその塩を併用することにより、相乗的かつ効果的に記憶行動を改善することができ、優れた脳機能低下の予防または改善剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、マウスに各濃度の試料を７日間投与した後のＹ字迷路試験における自発的交替行動割合（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）を示したものである。平均±標準誤差．Ｎ＝４〜６。異なる記号間では有意差があることを示す。
【図２】図２は、マウスに各濃度の試料を７日間投与した後の受動的回避試験における明室に留まった時間（Ｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅ）を示したものである。平均±標準誤差．Ｎ＝４〜６。異なる記号間では有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。
【図３】図３は、マウスに各濃度の試料を７日間投与した後の新規物体認識試験における既存物体と新規物体の探索回数の割合を示したものである。平均±標準誤差．Ｎ＝４〜６。※※は、既存物体と新規物体とで有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【図４】図４は、マウスに各濃度の試料を１２日間投与した後の海馬中の神経細胞生存率を示したものである。平均±標準誤差．Ｎ＝８。異なる記号間では有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明で用いられるシトルリンとしては、Ｌ−シトルリンおよびＤ−シトルリンがあげられるが、Ｌ−シトルリンが好ましい。シトルリンは、化学的に合成する方法、発酵生産する方法等により取得することができる。また、シトルリンは、市販品を購入することにより取得することもできる。シトルリンを化学的に合成する方法としては、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１２２，４７７（１９３８）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６，４１０（１９４１）に記載の方法があげられる。
【００１７】
Ｌ−シトルリンを発酵生産する方法としては、例えば、特開昭５３−０７５３８７号公報、特開昭６３−０６８０９１号公報に記載の方法があげられる。また、Ｌ−シトルリンおよびＤ−シトルリンは、シグマ−アルドリッチ社等より購入することもできる。
【００１８】
シトルリンの塩としては、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等があげられる。酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、乳酸塩、α−ケトグルタル酸塩、グルコン酸塩、カプリル酸塩等の有機酸塩があげられる。
【００１９】
金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等があげられる。
アンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩があげられる。
【００２０】
有機アミン付加塩としては、モルホリン、ピペリジン等の塩があげられる。
【００２１】
アミノ酸付加塩としては、グリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の塩があげられる。上記のシトルリンの塩のうち、リンゴ酸塩が好ましく用いられるが、他の塩、または２以上の塩を適宜組み合わせて用いてもよい。
【００２２】
本発明で用いられるシチコリン（Ｃｉｔｉｄｉｎｅ−５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ  （ＣＤＰ−ｃｈｏｌｉｎｅ））は、どのような製造法によって得られたものであってもよい。シチコリンの製造法としては、化学的合成法（特公昭３９−６５４１号公報、特公昭４２−１３８４号公報、特公昭６３−６５５８号公報等）、酵母などの微生物菌体を用いる酵素法（特公昭４８−２３５８号公報、特公昭４８−４０７５７号公報、特公昭４８−４０７５８号公報、特開昭５３−１０９９９６号公報、特開昭５４−１４５９３号公報、特開昭６３−３１３５９４号公報等）などの方法があげられる。また、シチコリンは、シグマ−アルドリッチ社等より購入することもできる。
【００２３】
本発明の脳機能低下の予防または改善剤に含まれるシチコリンは、それらの塩として該剤中に存在してもよい。シチコリンの塩としては、上記のシトルリンの塩と同様のものがあげられる。
【００２４】
また、本発明では、生体内でシチコリンの合成に関わる物質、例えば、コリンやウリジン等をシチコリンの代りに使用することもできる。
【００２５】
本発明の脳機能低下の予防または改善剤中の、シトルリンまたはその塩とシチコリンまたはその塩との組成比は、質量比で１：１００〜１００：１、好ましくは１：５０〜５０：１、とりわけ好ましくは１０：１〜１：１０である。
【００２６】
本発明の脳機能低下の予防または改善剤としては、シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩をそのまま投与することも可能であるが、通常各種の製剤として提供するのが望ましい。
【００２７】
製剤は、有効成分としてシトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を含有するが、更に任意の有効成分を含有していてもよい。また、それら製剤は、有効成分を薬理学的に許容される一種またはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
【００２８】
製剤の投与形態は、経口投与または、例えば静脈内、腹膜内もしくは皮下投与等の非経口投与をあげることができるが、経口投与が好ましい。
【００２９】
投与する剤形としては、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、浸剤・煎剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、流エキス剤等の経口剤、注射剤、点滴剤、クリーム剤、坐剤等の非経口剤のいずれでもよいが、経口剤として好適に用いられる。
【００３０】
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、蔗糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、パラオキシ安息香酸メチル等のパラオキシ安息香酸誘導体、安息香酸ナトリウム等の保存剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類などを添加して製剤化することができる。
【００３１】
また、経口投与に適当な、例えば錠剤、散剤および顆粒剤等は、乳糖、白糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトール等の糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシ等の澱粉、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機物、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等の植物末等の賦形剤、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油等の滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロース、ゼラチン、澱粉のり液等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤などを添加して製剤化することができる。
【００３２】
また、経口摂取または投与に適当な製剤には、一般に飲食品に用いられる添加剤、例えば甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物等が添加されてもよい。
【００３３】
また、経口摂取または投与に適当な製品形態または製剤は、例えば摂取期間、摂取回数、摂取量など摂取当たりの単位包装形態の錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、浸剤・煎剤、カプセル剤、ドリンク剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、流エキス剤に加工製造することができる。例えば「１回摂取当たりの単位包装形態」とは、１回当たりに摂取する量が予め定められた形態であり、「１週間〜３ヶ月間当たりの単位包装形態」とは、１週間〜３ヶ月間で摂取する量が含まれている形態である。単位包装形態としては、例えば、パック、包装、ボトル等で一定量を規定する形態が挙げられる。
【００３４】
例えば「１回摂取当たりの単位包装形態」としては、製品形態または製剤がドリンク剤であるような場合５０ｍｇ以上のシトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩が懸濁あるいは溶解したドリンクが１回摂取あたり飲み切りの形態でビン等に入れられている形態が挙げられる。
【００３５】
例えば「１週間〜３ヶ月間当たりの単位包装形態」としては、１日１回摂取で、１日摂取量が３００ｍｇであり、シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を５０ｍｇ含む錠剤の場合、４２〜５４０錠が包装された形態などが挙げられる。
【００３６】
非経口投与に適当な、例えば注射剤は、好ましくは受容者の血液と等張であるシトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩溶液とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。
【００３７】
また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した防腐剤、保存剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１種またはそれ以上の補助成分を添加することができる。
【００３８】
本発明の脳機能低下の予防または改善剤中のシトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩の濃度は、製剤の種類、該製剤の投与により期待する効果等に応じて適宜選択される。シトルリンまたはその塩として、通常は０．１〜９０質量％、好ましくは０．５〜７０質量％、特に好ましくは１〜５０質量％である。シチコリンまたはその塩として、通常は０．１〜９０質量％、好ましくは０．５〜７０質量％、特に好ましくは１〜５０質量％である。
【００３９】
本発明の脳機能低下の予防または改善剤中の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なる。通常、成人一日当り、シトルリンまたはその塩として、通常は５０ｍｇ〜３０ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１０ｇ、特に好ましくは２００ｍｇ〜３ｇとなるように一日一回ないし数回投与する。また通常、成人一日当り、シチコリンまたはその塩として、通常は５０ｍｇ〜３０ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１０ｇ、特に好ましくは２００ｍｇ〜３ｇとなるように、一日一回ないし数回投与する。
【００４０】
摂取または投与期間は、特に限定されないが、通常は１日間〜１年間、好ましくは１週間〜３ヶ月間である。
【００４１】
本発明の脳機能低下の予防または改善剤は、脳神経細胞を保護するために使用することがきる。本発明の脳機能低下の予防または改善剤は、脳神経細胞死から進展する脳機能低下の予防または改善に使用することができる。機能低下の予防または改善から期待される効果として、例えば、知覚能力低下、記憶学習能力低下、思考能力低下、集中力低下、注意力低下、判断能力低下、うつ症状、認知機能低下、およびこれらに起因する運動パフォーマンス低下の予防または改善に使用することができる。
【００４２】
よって、それらの症状の発生を予防したい者または該症状を呈する者に本発明の脳機能低下の予防または改善剤を投与することにより、該症状を予防または改善することができる。
【００４３】
さらに本発明においては、脳機能低下の予防または改善剤を製造するために、シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を使用され得る。
【００４４】
さらにまた本発明は、脳神経細胞を保護するための方法を包含する。本発明の方法は、脳神経細胞を保護する必要のある被験体に、該被験体の脳神経細胞を保護するのに十分な量のシトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を摂取させる、または投与する工程を含む。
【００４５】
さらにまた本発明は、脳機能低下の予防または改善方法を包含する。本発明の方法は、脳機能低下の予防または改善させる必要のある対象者に、該対象者の脳機能低下の予防または改善に十分な量のシトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を摂取させる、または投与する工程を含む。
【実施例】
【００４６】
以下に、シトルリン、およびシチコリンの脳機能の予防もしくは改善に関する試験例を示す。
【００４７】
試験例
１０週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア株式会社、一匹当たり平均体重約２５ｇ程度）を１週間の予備飼育した後、実験に供した。Ｌ−シトルリンおよびシチコリンは協和発酵バイオ株式会社製を用いた。
【００４８】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを偽手術群（第１群）、２血管閉塞群に分け、２血管閉塞群のマウスの両総頚動脈をハロタン麻酔下で２０分間閉塞した。再灌流後１日目に、２血管閉塞群をさらに蒸留水投与群（第２群）、低用量Ｌ−シトルリン投与群（４０ｍｇ／ｋｇ：第３群）、低用量シチコリン投与群（４０ｍｇ／ｋｇ：第４群）、高用量Ｌ−シトルリン投与群（１００ｍｇ／ｋｇ：第５群）、高用量シチコリン投与群（１００ｍｇ／ｋｇ：第６群）、低用量Ｌ−シトルリンと低用量シチコリンの併用投与群（各４０ｍｇ／ｋｇ：第７群）に群分けし、１２日間、各試料を経口投与した。投与開始から一週間後にＹ字迷路試験、受動的回避試験、新規物体認識試験により、学習記憶改善効果を検討した。学習記憶機能評価後に海馬を摘出し、海馬中の神経細胞生存率を評価した。
【００４９】
Ｙ字迷路試験
Ｙ字迷路試験には３本のアーム（５０×１６×３２ｃｍ）で接続されたＹ字型迷路装置を用いた。マウスをＹ字迷路のいずれかのアームの先端に置き、８分間、迷路内を自由に探索させ、マウスが移動したアームを順に記録した。マウスが測定時間内に各アームに移動した回数を計数し、これを総進入数とした。この内、連続して異なる三つのアームを選択した組み合わせを調べ、この数を自発的交替行動数とした。自発的交替行動数を総進入数から２を引いた数で割り、それに１００を掛けて求めた値を自発的交替行動変化率（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）とし、これを自発的交替行動の指標とした。
【００５０】
図１に示すように、第１群と比較して第２群で自発的交替行動変化率の低値を示した。単独で自発的交替行動変化率を改善しない濃度範囲の第３群と第４群の試料を併用した第７群においては、自発的交替行動変化率が第２群と比較して高値を示し、第５群および第６群と同等の記憶行動改善効果が認められた。
【００５１】
受動的回避試験
受動的回避試験は暗室（２５×２５×２５ｃｍ）と明室（１４×１０×２５ｃｍ）で構成され、暗室の床に電気刺激装置を設置した箱を用いて実施した。訓練施行では、マウスが明室から暗室に移動した際、扉を閉め、電気刺激（０．３ｍＡ、２秒間）を与えた。訓練施行から２４時間後、マウスを再び明室に入れ、明室に留まった時間（Ｌａｔｅｎｃｙｔｉｍｅ）を計測した。明室に留まる時間の測定は最大３００秒とした。
【００５２】
図２に示すように、第１群と比較して第２群で有意な明室に留まった時間の低値を示した。単独で明室に留まった時間を改善しない濃度範囲の第３群と第４群の試料を併用した第７群においては、明室に留まった時間が第２群と比較して高値を示し、第５群および第６群と同等の記憶行動改善効果が認められた。
【００５３】
新規物体認識試験
新規物体認識試験はオープンフィールド装置（３５×２５×３５ｃｍ）にマウスを個別
に２日間馴化させた後、実施した。訓練施行では、二つの同一物体を対称に置いた装置内で、マウスを１０分間自由に探索させた。１時間後に片一方の物体を新規物体に置き換え、再び５分間自由に探索させた。探索行動は、マウスが物体の上に立つこと、鼻が物体に触れること、もしくは物体から１ｃｍ以内で臭いを嗅ぐことと定義した。総探索回数に対する既存物体と新規物体の探索回数の割合を算出し、視覚的認知記憶の指標とした。
【００５４】
図３に示すように、第１群でみられた新規物体の探索回数の増加が、第２群では認められなかった。単独で新規物体の探索回数の増加が認められない濃度範囲の第３群と第４群の試料を併用した第７群においては、新規物体の探索回数が有意に増加し、第５群および第６群と同等の顕著な記憶行動改善効果が認められた。
【００５５】
海馬中の神経細胞生存率評価
両総頚動脈閉塞処置から１２日後、マウスをペントバルビタールナトリウムにより麻酔をかけ、体内の血液がなくなるまで氷冷のリン酸緩衝液（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）で灌流した。その後、直ちに４％パラホルムアルデヒドを含んだ固定液で灌流した。脳組織を４℃で２４時間固定し、５０μｍの厚さで冠状切片を作製した。海馬領域を含む連続切片をＰＢＳに溶解したヨウ化プロピジウム（ＰＩ，５μｍｏｌ／Ｌ）を用いて染色し、蛍光顕微鏡を用いて観察を行った。海馬ＣＡ１領域の錐状体細胞層の生存神経細胞と非生存神経細胞をブレグマの後方１．４〜１．８ｍｍの区分から計数し、ＰＩにより核が染色され、通常の形態特性を持った細胞を生存神経細胞と定義した。細胞生存率は第１群の生存神経細胞の平均数の割合から算出した。
【００５６】
図４に示すように、第１群と比較して第２群で海馬中の神経細胞生存率の有意な減少が認められた。単独で海馬中の神経細胞生存率を改善しない濃度範囲の第３群と第４群の試料を併用した第７群においては、海馬中の神経細胞生存率が第２群と比較して有意に高値を示し、第５群および第６群と同等の神経細胞保護効果が認められた。
【００５７】
これらのことから、シトルリンとシチコリンを併用することにより、相乗的かつ効果的に記憶行動を改善することが明らかとなり、本発明の剤は優れた脳機能低下の予防または改善剤であることが示された。
【００５８】
以下に、本発明の実施例を示す。
【００５９】
［実施例１］
シトルリンおよびシチコリンを含有する錠剤の製造
Ｌ−シトルリン１２０ｋｇ、シチコリン１２０ｋｇ、環状オリゴ糖１９ｋｇ、セルロース５７ｋｇおよびプルラン１ｋｇを流動層造粒乾燥機で造粒した。得られた造粒物とステアリン酸カルシウム３ｋｇとをコニカルブレンダーで混合した後、ロータリー圧縮成形機で圧縮成形して錠剤を製造する。
【００６０】
［実施例２］
シトルリンおよびシチコリンを含有する腸溶錠剤の製造
実施例１で製造する錠剤の表面をシェラック溶液でコーティングして腸溶錠剤を製造する。
【００６１】
［実施例３］
シトルリンおよびシチコリンを含有する腸溶カプセルの製造
Ｌ−シトルリン１２０ｋｇ、シチコリン１２０ｋｇ、環状オリゴ糖１９ｋｇ、セルロース５７ｋｇ、ステアリン酸カルシウム３ｋｇおよびプルラン１ｋｇを、コニカルブレンダーで混合する。得られる混合物２０ｋｇと０．２ｋｇの二酸化ケイ素とを混合攪拌して得られた混合物をカプセル充填機に投入、ハードカプセルに充填してハードカプセルを得る。得られるハードカプセルの表面をツェイン溶液でコーティングして腸溶カプセルを製造する。
【００６２】
［実施例４］
シトルリンおよびシチコリンを含有する飲料の製造（１）
Ｌ−シトルリン１．２８ｋｇ、シチコリン１．２８ｋｇ、エリスリトール３ｋｇ、クエン酸０．０５ｋｇ、人工甘味料３ｇ、香料０．０６ｋｇを液温７０℃で水５０Ｌに攪拌溶解し、クエン酸でｐＨを３．３に調整後、プレート殺菌を用いて滅菌して瓶に充填後、パストライザー殺菌し、飲料を製造する。
【００６３】
［実施例５］
シトルリンおよびシチコリンを含有する飲料の製造（２）
Ｌ−シトルリン２０ｍｇ、シチコリン２０ｍｇ、Ｌ−アルギニン２０ｍｇと適当量の果糖ぶどう糖液糖、食塩、クエン酸、香料、クエン酸Ｎａ、乳酸Ｃａ、ピロリン酸鉄、グルコン酸Ｃａ、塩化Ｋ、塩化Ｍｇ、甘味料とを配合し５５５ｍｌの飲料を製造する。
【００６４】
［実施例６］
シトルリンおよびシチコリンを含有する飲料の製造（３）
Ｌ−シトルリン１００ｍｇ、シチコリン１００ｍｇ、Ｌ−アルギニン１００ｍｇ、Ｌ−アラニン２．５ｍｇ、Ｌ−グリシン  ２．５ｍｇ、Ｌ−ロイシン２．５ｍｇ、Ｌ−イソロイシン  １．３ｍｇ、Ｌ−バリン  １．３ｍｇと適当量の香料、甘味料を配合し３００ｍｌの飲料を製造する。
【００６５】
本出願は、２０１２年１０月３０日付で出願された日本特許出願（特願２０１２−２３８５４２）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明により、シトルリンまたはその塩、およびシチコリンまたはその塩を有効成分として含有する、知覚能力低下、記憶学習能力低下、思考能力低下、集中力低下、注意力低下、判断能力低下、うつ症状、及びこれらに起因する運動パフォーマンス低下などの脳機能低下の予防または改善剤が提供される。本発明の剤により、シトルリンまたはその塩とシチコリンまたはその塩を併用することにより、相乗的かつ効果的に記憶行動を改善することができ、優れた脳機能低下の予防または改善剤を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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