(57)【要約】本発明は、病変性前庭障害の治療に使用するカルシニューリン阻害剤に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
病変性前庭障害の治療に使用するカルシニューリン阻害剤。
【請求項２】
前記カルシニューリン阻害剤がタクロリムスまたはその誘導体である、請求項１に記載の病変性前庭障害の治療に使用するカルシニューリン阻害剤。
【請求項３】
前記タクロリムス誘導体がピメクロリムスである、請求項２に記載の病変性前庭障害の治療に使用するカルシニューリン阻害剤。
【請求項４】
前記カルシニューリン阻害剤がシクロスポリンＡまたはその誘導体である、請求項１に記載の病変性前庭障害の治療に使用するカルシニューリン阻害剤。
【請求項５】
前記シクロスポリンＡ誘導体がボクロスポリンである、請求項４に記載の病変性前庭障害の治療に使用するカルシニューリン阻害剤。
【請求項６】
前記カルシニューリン阻害剤がＣＮ５８５（６−（３，４−ジクロロフェニル）−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルチオ）−２−フェニル−ピリミジン）である、請求項１に記載の病変性前庭障害の治療に使用するカルシニューリン阻害剤。
【請求項７】
前記病変性前庭障害が、前庭神経炎、ウイルス性ニューロン炎、内耳炎、ウイルス性内リンパ性内耳炎、薬物中毒性難聴、メニエール病、内リンパ水腫、病変性前庭不全を伴う頭部外傷、迷路出血、慢性または急性内耳感染症、重症迷路、気圧障害、自己免疫性内耳疾患、慢性メニエール病、老年性前庭（ｐｒｅｓｂｙｖｅｓｔｉｂｕｌｉａ）および中毒性前庭障害からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の病変性前庭障害の治療に使用するカルシニューリン阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病変性前庭障害の治療に使用するカルシニューリン阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
前庭障害に関する序論
前庭（内耳）障害は浮動性めまい、回転性めまい、平衡失調、聴力変化、嘔気、疲労、不安、集中力低下をはじめとする症状を引き起こし、日常的な機能、作業能力、家族や友人との関係および生活の質に深刻な影響を及ぼす可能性がある。
【０００３】
例えば、前庭神経炎は非神経性めまいによる入院の主たる原因である。その病因はほとんど明らかにされていないため、疫学的調査の結果はその入手源によって差がみられる（発生率は、年間１０００００人当たり新症例数３．５〜５０であると考えられている）。過去には、前庭神経の炎症、単純ヘルペスウイルス１型の再活性化または内耳虚血のいずれかが前庭神経炎の原因であるとされていた。現時点ではウイルス原因説が支持されている。このような状況では、単純ヘルペスウイルス１型の再活性化でめまい発作の反復性が説明されよう。しかし、炎症の病態生理学的機序の関与が確立されたに過ぎない。
【０００４】
このほか高齢者の転倒の大部分に前庭障害が関与していると考えられ、その予防が優先事項となっている。実際、高齢者の転倒はフランスにおける健康保険の総予算の１％超を占め（ＩＮＳＥＥ  １９９０）、６５歳以上の高齢者の３０％、８０歳以上の高齢者の５０％に影響を及ぼしている。高齢者の転倒が６５歳以上における事故による死亡の２／３に関与しており、ある年の死亡リスクを４倍増大させている。
【０００５】
前庭障害の病因
前庭障害の病因はほとんど明らかにされていないが、前庭障害が前庭器官に関係のある大きな病態群を構成していることが広く受け入れられている。前庭障害はその推定される発生源によって区別され、それに従えば（１）病変性前庭障害と（２）非病変性前庭障害とに分類することができる。
【０００６】
１）病変性前庭障害は、内耳細胞および／または前庭神経の病変が存在するか、障害の経過中に発生する前庭障害を指す。この場合、前庭に臨床機能検査（ＶＯＲ、ＶＮＧ）を用いて観察できる程度の障害がみられる。病変性前庭障害としては以下のものが挙げられる：
・内耳および／または前庭神経の炎症が可逆的および／または不可逆的ダメージを引き起こす前庭障害。このグループに属する病態の１つの例に前庭神経炎がある；
・内耳液が冒される（内リンパの質、組成および／または圧力に異常がみられる）前庭障害。このような障害では通常、疾患の経過中に病変が発生する。このグループに属する病態の例にはメニエール病および続発性内リンパ水腫がある。これらは現在、耳鳴および聴力損失を引き起こすとされている；
・前庭末端器官の損傷または病変によって引き起こされる前庭障害。この病態の例には、局所虚血、興奮毒性、側頭骨に影響を及ぼす外傷またはゲンタマイシンおよびシスプラチンなどの薬物による前庭有毛細胞の聴覚毒性損傷によって引き起こされるめまいがある。
【０００７】
２）非病変性前庭障害は、内耳細胞および／または前庭神経に病変が観察されず、一過性で多くの場合は反復性のめまい発作によって裏付けられる前庭障害を指す。この場合、めまい発作間に機能検査（ＶＯＲ、ＶＮＧ）を用いて評価される前庭の機能には健常な前庭と差がみられない。非病変性前庭障害としては以下のものが挙げられる：
・内耳の一部分の内部で破片が採取される前庭障害。この耳石と呼ばれる破片は炭酸カルシウムの小さな結晶でできており、その位置がずれると脳に誤ったシグナルが送られる。この病態の例には頭位性めまいがある；
発生源が不明で耳鳴も聴力損失も伴わない反復性の前庭障害。
【０００８】
前庭機能低下の評価
患者において前庭末端器官の形態機能的変化を直接評価することはできない（ＭＲＩによって検知できる大きな病変は除く）。逆に、前庭の機能低下を評価するのに現時点では間接的な評価方法が用いられている。このような検査方法は一般に、ＥＮＴ（耳鼻咽喉科）の診療所／病院で実施される。本発明者らはその中でも、前庭眼振記録（ｖｅｓｔｉｂｕｌｏｎｙｓｔａｇｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＶＮＧ）ならびに温度眼振検査または回転検査、頭部衝撃試験（ｈｅａｄ  ｉｍｐｕｌｓｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ）（ＨＩＴ）および前庭筋誘発電位（ＶＥＭＰ）を用いる前庭動眼反射（ＶＯＲ）の評価を取り上げる。
【０００９】
前庭障害の治療
現在用いられている前庭障害の治療法は主として、制吐剤を用いて自律神経系の反応を抑えながら前庭麻痺薬（ｖｅｓｔｉｂｕｌｏｐｌｅｇｉｃ  ｄｒｕｇ）を用いてめまい発作を軽減することに焦点を当てたものである。前庭神経炎の場合（細菌またはウイルス感染が原因であると考えられる場合）、副腎皮質ステロイド剤および抗ウイルス剤が、推定される前庭機能障害の原因を治療することによって前庭ダメージの拡散を抑えるために間接的に用いられる唯一の薬剤である。ほとんどの前庭不全には確立された病因論がないため、その効果は未だ議論の的であり、患者の長期的な転帰を改善せずに初期のピーク発作の消失のみ改善することが推奨されている。例えば、前庭神経炎後の回復は通常、全面的なものではない。患者６０例を対象とした試験では、水平半規管の不全麻痺が、症状発現から１か月後では約９０％、６か月後では８０％に認められ、最終的に温度反応が正常になったのはわずか４２％であった。この病態の発生率に基づくと、米国で年間約４０００人に他の機序によっては十全に補えない実質的で恒久的な片側の前庭動眼反射の動的不全が発症することになる。この不全は歩行中、特に罹患した耳の方向に頭を動かす際に視覚障害および体位平衡失調を引き起こす。
【００１０】
したがって、内耳細胞および／または前庭神経の機能的変化が多様な発生源の炎症、病変または損傷に起因する病変性前庭障害の発生頻度および／または重症度を予防、軽減または治療する保護的または修復的治療法が必要とされている。
【００１１】
驚くべきことに、本発明者らは、カルシニューリン阻害剤が内耳細胞および前庭神経をダメージまたは変性から保護することによって、前庭病変を予防または治療できることを発見した。
【発明の概要】
【００１２】
したがって、本発明は病変性前庭障害に治療に使用するカルシニューリン阻害剤に関する。
【００１３】
本発明の一実施形態では、カルシニューリン阻害剤はシクロスポリンＡまたはその誘導体である。本発明の一実施形態では、シクロスポリンＡ誘導体はボクロスポリンである。
【００１４】
本発明の一実施形態では、カルシニューリン阻害剤はタクロリムスまたはその誘導体である。本発明の一実施形態では、タクロリムス誘導体はピメクロリムスである。
【００１５】
本発明の一実施形態では、カルシニューリン阻害剤はＣＮ５８５（６−（３，４−ジクロロフェニル）−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルチオ）−２−フェニル−ピリミジン）である。
【００１６】
本発明の一実施形態では、前記病変性前庭障害は前庭神経炎、ウイルス性ニューロン炎、内耳炎、ウイルス性内リンパ性内耳炎、薬物中毒性難聴、メニエール病、内リンパ水腫、病変性前庭不全を伴う頭部外傷、迷路出血、慢性または急性内耳感染症、重症迷路、気圧障害、自己免疫性内耳疾患、慢性メニエール病、老年性前庭（ｐｒｅｓｂｙｖｅｓｔｉｂｕｌｉａ）および中毒性前庭障害からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】末梢前庭系の前庭神経節（Ａ）、内襞（Ｂ）および卵形嚢（Ｃ）におけるカルシニューリン発現を示す図である。
【図２】興奮毒性により誘発した持続性前庭不全に対する損傷後の２．５ｍｇ／ｋｇ全身ＦＫ−５０６治療（ｎ＝７、白のヒストグラムバー）対偽治療（ｎ＝８、黒のヒストグラムバー）の有意な保護効果を示すヒストグラムである。
【図３】興奮毒性により誘発した持続性前庭不全に対する損傷後の５０ｍｇ／ｋｇ全身シクロスポリンＡ（ｎ＝９、白のヒストグラムバー）対偽治療（ｎ＝１１、黒のヒストグラムバー）の有意な保護効果を示すヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明者らは、カルシニューリンの阻害が前記障害の臨床病理学的機序を模倣する動物モデルの病変性前庭障害の治療をもたらすことを観察した。理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、細胞損傷後の過剰なカルシウム流入がカルシニューリンの活性化を引き起こすという説を提唱する。病的なカルシニューリン活性化によりコフィリンが活性化して細胞骨格タンパク質アクチンの脱重合を引き起こし、これにより細胞腫大および機能的なシナプス結合の喪失が起こる。さらに、カルシニューリンを介したミトコンドリアからのシトクロームｃおよびＡＩＦ（アポトーシス誘導因子）の放出が、それぞれカスパーゼ依存性細胞死およびカスパーゼ非依存性細胞死を引き起こし得る。機能的なシナプス結合の喪失および細胞死が機能障害をもたらす。さらに、カルシニューリンによるＮＦＡＴの転移が神経変性炎症性応答の動員および活性窒素種の産生を増大させる。したがって、カルシニューリン活性を阻害すれば病変性前庭障害の治療が可能になると考えられる。
【００１９】
したがって、本発明の１つの目的は、病変性前庭障害の治療に使用するカルシニューリン阻害剤を提供することである。
【００２０】
本発明のもう１つの目的は、病変性前庭障害における病変の治療に使用するカルシニューリン阻害剤を提供することである。
【００２１】
本明細書で使用される「治療」という用語は、器官、組織または細胞の機能の不全または消失を引き起こす疾患、障害または病態の有害作用または症状を少なくとも１つ予防すること（すなわち、生じないようにすること）、軽減することまたは緩和することを指す。したがって、本発明目的は、前庭末端器官の機能または一部の機能を回復させる、したがって前庭機能を回復させることによって、病変性前庭障害の終焉または対象の病態の改善をもたらすことである。本発明はほかにも、何らかの病変の出現または既に存在する病変の増大を予防することを目的とする。
【００２２】
したがって、本発明は病変性前庭障害に罹患している対象の前庭神経回路網または前庭機能を治療、保護、回復する方法を提供し、前記方法は、対象に治療有効量のカルシニューリン阻害剤を投与することを含む。
【００２３】
本明細書で使用される「病変性前庭障害または不全」という用語は、内耳細胞および／または前庭神経の病変が存在するか、障害の経過中に発生する前庭障害を指す。この場合、前庭の機能に障害がみられる。病変性前庭障害としては以下のものが挙げられる：
・感染により内耳および／または前庭神経が炎症を起こし、可逆的および／または不可逆的ダメージを引き起こす前庭障害。このグループに属する病態の１つの例に前庭神経炎がある；
・内耳液が冒される（内リンパの質、組成および／または圧力に異常がみられる）前庭障害。このような障害では通常、疾患の経過中に病変が発生する。このグループに属する病態の例にはメニエール病および続発性内リンパ水腫がある；
・前庭末端器官の損傷または病変によって引き起こされる前庭障害。この病態の例には、局所虚血、興奮毒性、側頭骨に影響を及ぼす外傷またはゲンタマイシンおよびシスプラチンなどの薬物による前庭有毛細胞の聴覚毒性損傷によって引き起こされるめまいがある。
【００２４】
本発明で考慮される病変性前庭障害の例としては、特に限定されないが、前庭神経炎、ウイルス性ニューロン炎、内耳炎、ウイルス性内リンパ性内耳炎、薬物中毒性難聴、メニエール病、内リンパ水腫、病変性前庭不全を伴う頭部外傷、迷路出血、慢性または急性内耳感染症、重症迷路、気圧障害、自己免疫性内耳疾患、老年性前庭（ｐｒｅｓｂｙｖｅｓｔｉｂｕｌｉａ）、中毒性前庭障害が挙げられる。
【００２５】
一実施形態では、病変性前庭障害は前庭神経炎である。
【００２６】
一実施形態では、病変性前庭障害はウイルス性ニューロン炎である。
【００２７】
一実施形態では、病変性前庭障害は内耳炎である。
【００２８】
一実施形態では、病変性前庭障害はウイルス性内リンパ性内耳炎である。
【００２９】
一実施形態では、病変性前庭障害は薬物中毒性難聴である。
【００３０】
一実施形態では、病変性前庭障害はメニエール病である。
【００３１】
一実施形態では、病変性前庭障害は内リンパ水腫である。
【００３２】
一実施形態では、病変性前庭障害は病変性前庭不全を伴う頭部外傷である。
【００３３】
一実施形態では、病変性前庭障害は迷路出血である。
【００３４】
一実施形態では、病変性前庭障害は慢性または急性内耳感染症である。
【００３５】
一実施形態では、病変性前庭障害は重症迷路である。
【００３６】
一実施形態では、病変性前庭障害は気圧障害である。
【００３７】
一実施形態では、病変性前庭障害は自己免疫性内耳疾患である。
【００３８】
一実施形態では、病変性前庭障害は老年性前庭（ｐｒｅｓｂｙｖｅｓｔｉｂｕｌｉａ）である。
【００３９】
一実施形態では、病変性前庭障害は中毒性前庭障害である。
【００４０】
本発明の一実施形態では、病変性前庭障害は自己免疫性内耳疾患ではない。
【００４１】
本発明では、大きな病変にＭＲＩを用いて、あるいは前庭の機能喪失の評価が可能な間接的な評価方法によって、病変性前庭障害を確認し得る。このような方法は一般に、ＥＮＴ（耳鼻咽喉科）の診療所／病院で実施されるものであり、前庭眼振記録（ｖｅｓｔｉｂｕｌｏｎｙｓｔａｇｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＶＮＧ）ならびに温度眼振検査または回転検査、頭部衝撃試験（ｈｅａｄ  ｉｍｐｕｌｓｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ）（ＨＩＴ）または前庭筋誘発電位（ＶＥＭＰ）を用いる前庭動眼反射（ＶＯＲ）の評価がこれに含まれる。前庭動眼反射（ＶＯＲ）の機能は変位時に網膜上の視像を安定させることである。このＶＯＲの測定することにより、前庭系の機能を調べるのに便利な方法が得られる。このパラダイムは基本的に、赤外光投射法による眼球運動の監視に基づくものである（ＳｔｒｕｐｐおよびＢｒａｎｄｔ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００９，２９（５）：５０９−５１９）。水平方向および垂直方向の眼球反応を誘発するために、患者を暗所で垂直軸および前後軸を回るよう正弦波状に揺り動かす。前庭の機能に何らかの異常があれば、ＶＮＧの結果に変化がみられる。ＶＯＲおよびＶＮＧのほかにも、同様に前庭の障害に関連する体の姿勢偏移を検知するのに姿勢動揺検査法が用いられる。機能イメージング（ＭＲＩまたはＣＡＴ（コンピュータ体軸断層撮影法）およびその派生物）などの形態機能的検査を用いて、前庭末端器官内部の深部病変を検知することができる。前庭不全の動物モデルには、特別に適合させたＶＮＧ、ＶＯＲおよび体位検査を用いて前庭の損傷または病変の大きさを評価する。固定組織（前庭神経節および前庭末端器官）に従来の光学顕微鏡または電子顕微鏡を用いて組織学的検査を実施することが可能である。このような検査は主としてげっ歯類で実施されている。
【００４２】
本明細書で使用される「対象」という用語は、げっ歯類、ネコ、イヌおよび霊長類などの哺乳動物を意味する。本発明の対象はヒトであることが好ましい。
【００４３】
一実施形態では、本発明は、病変性前庭障害の治療に使用するカルシニューリン阻害剤に関する。
【００４４】
別の実施形態では、本発明は、病変性前庭障害に罹患している対象の前庭機能を回復させる方法に使用するカルシニューリン阻害剤に関する。前記回復は、上述したＶＮＧまたはＶＯＲ評価を用いて評価することができる。
【００４５】
本明細書で使用される「カルシニューリン阻害剤」は、カルシニューリンに関連する生物活性またはカルシニューリン−ＮＦＡＴｃ経路、カルシニューリン−コフィリン経路もしくはカルシニューリン−ＢＡＤ経路の阻害またはダウンレギュレーションをもたらす任意の薬物または化合物を指す。
【００４６】
タンパク質ホスファターゼ２Ｂ（ＰＰ２Ｂ）とも呼ばれるカルシニューリンは、酵素サブユニットＡと調節サブユニットＢの２つのサブユニットからなる細胞質Ｓｅｒ／Ｔｈｒタンパク質ホスファターゼである。サブユニットＡにはカルモジュリン結合部位と、酵素の触媒中心を遮断する自己阻害ドメインとが含まれている。Ｃａ２＋イオン／カルモジュリンがカルシニューリンと結合すると、コンホメーションの変化とそれによる活性中心の脱マスキングが起こる。カルシニューリンは様々なタンパク質を脱リン酸化することができ、このようなタンパク質にはアクチン−脱重合因子コフィリン、Ｂｃｌ−２関連細胞死促進因子（ＢＡＤ）タンパク質およびＮＦＡＴｃ（活性化Ｔ細胞の核因子）ファミリーＮＦＡＴｃ１〜ＮＦＡＴｃ４の転写因子がある。
【００４７】
したがって、カルシニューリンの発現、特にそのサブユニットの１つの発現を阻害することによってカルシニューリン活性を阻害することができる。カルシニューリン発現の阻害は当該技術分野で公知の任意の手段、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸類似体、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、疑似相補的ＰＮＡ（ｐｃＰＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡｉ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは核酸アプタマーなどの化学合成オリゴヌクレオチドによって達成することができる。
【００４８】
あるいは、カルシニューリンサブユニット同士またはカルシニューリンとその基質との相互作用を阻害する化合物、例えばコフィリン、ＢＡＤまたはＮＦＡＴによってカルシニューリン活性を阻害することもできる。前記相互作用の阻害は当該技術分野で公知の任意の手段、例えば、有機小分子、ペプチド、ペプチドアプタマーまたは抗体によって達成することができる。
【００４９】
別の実施形態では、カルシニューリン阻害剤はコフィリン／ＢＡＤ／ＮＦＡＴ活性、特にコフィリン／ＢＡＤ／ＮＦＡＴ脱リン酸化を阻害するか、コフィリン／ＢＡＤ／ＮＦＡＴ発現を阻害する薬物または化合物である。
【００５０】
本発明では、カルシニューリン阻害剤は様々な入手源、性質および組成のものであってよい。カルシニューリン阻害剤は単離状態または他の物質との混合物の状態の任意の有機または無機物質、例えば脂質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小分子などであってよい。
【００５１】
本発明の一実施形態では、カルシニューリン阻害剤は小分子である。前記小分子の例は、参照により本明細書に組み込まれるＳｉｅｂｅｒら（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ２００９，７：２５）に記載されており、特に限定されないが、カルシニューリン活性を阻害することができるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）およびＣｓＡ誘導体、例えば［（Ｒ）α−メチルサルコシン３］ＣｓＡ、［ジメチルアミノエチルチオサルコシン３］ＣｓＡ、［ＭｅＢｍ２ｔ］１−ＣｓＡ、ＩＳＡ２４７（ボクロスポリン）など；カルシニューリン活性を阻害することができるＦＫ５０６（タクロリムス）およびその誘導体、例えばＦＫ５２０（アスコマイシン）、ピメクロリムス（ＳＤＺ  ＡＭ  ９８１、３３−エピ−クロロ−３３デスオキシ−アスコマイシン）、Ｌ−７３２，５３１（３２−Ｏ−（１−ヒドロキシエチルインドール−５−イル）−アスコマイシン）、Ｌ−６８５，８１８（ＦＫ５０６ＢＤ）およびＶ−１０，３６７など；ＦＭＰＰ（リン酸４−（フルオロメチル）フェニル）、チルホスチン、ノルカンタリジン、オカダ酸、エンドタール、ケンプフェロール、バルビツール酸塩、１，５−ジベンゾイルオキシメチル−ノルカンタリジン、ゴッシポール、Ｌｉｅ１２０、ＰＤ１４４７９５、ジベルフィン（ｄｉｂｅｒｕｆｉｎ）、ジピリダモール、ＮＣＩ３、ＩＮＣＡ化合物、ＢＴＰまたは３，５−ビス（トリフルオロメチル）ピラゾール、ＢＴＰ１、ＢＴＰ２（ＹＭ−５８４８３）、ＢＴＰ３、ＢＴＰ  Ａ−２８５２２２、ＳＴ１９５９、ＡＭ４０４、ＵＲ−１５０５、トリフルサール、ロコグラミド（ｒｏｃｏｇｌａｍｉｄｅ）誘導体、ＷＩＮ５３０７１、トリフルオペラジン、ＫＲＭ−ＩＩＩ、カフェー酸フェニルエチルエステル（ＣＡＰＥ）、ＹＭ−５３７９２、キナゾリンジオン、ピロロピリミジンジオン、ＮＦＡＴ−６８、ＮＦＡＴ−１３３、プニカラギン、インペラトリン、キノロンアルカロイドがこれに含まれる。
【００５２】
本発明の別の実施形態では、カルシニューリン阻害剤はペプチドである。前記ペプチドの例は、参照により本明細書に組み込まれるＳｉｅｂｅｒら（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ２００９，７：２５）に記載されており、特に限定されないが、ＡＩＤ４２４−５２１、ＡＩＤ４５７−４８２、ＡＩＤ４２０−５１１、ＡＩＤ３２８−５１１、１１Ｒ−ＡＩＤ４５７−４８２などのＡＩＤフラグメント（カルシニューリンの自己阻害ドメインに由来する）などの；ＰｘＩｘＩＴペプチド（ＮＦＡＴｃにみられる保存されたカルシニューリンドッキングモチーフＰｘＩｘＩＴに由来する）、ＶＩＶＩＴ  １６ｍｅｒオリゴペプチド、ＮＦＡＴｃ２１０６−１２１−ＳＰＲＩＥＩＴペプチド、ＡＫＡＰ７９３３０−３５７ペプチド、ＲＣＡＮＩペプチド、ＲＣＡＮＩ−４１４１−１９７−エキソン７、ＲＣＡＮ１−４１４３−１６３−ＣＩＣペプチド、ＬｘＶＰｃＩペプチド、ＲＣＡＮＩ−４９５−１１８−ＳＰ反復ペプチド、ＶａｃＡペプチド、Ａ２３８ＬおよびＡ２３８Ｌ２００−２１３がこれに含まれる。ペプチドのまた別の例にはｐＳ３ペプチド（コフィリンリン酸化ドメインに由来する）（参照により本明細書に組み込まれるＦｉｇｇｅら，２０１２、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、４９（２）：１９６を参照されたい）。
【００５３】
本発明の一実施形態では、カルシニューリン阻害剤は、カルシニューリン活性を阻害することができるＣｓＡまたはＣｓＡ誘導体、例えば［（Ｒ）α−メチルサルコシン３］ＣｓＡ、［ジメチルアミノエチルチオサルコシン３］ＣｓＡ、［ＭｅＢｍ２ｔ］１−ＣｓＡ、ＩＳＡ２４７（ボクロスポリン）などである。
【００５４】
本発明の一実施形態では、カルシニューリン阻害剤は、カルシニューリン活性を阻害することができるＦＫ５０６（タクロリムス）またはＦＫ５０６誘導体、例えばＦＫ５２０（アスコマイシン）、ＦＫ５２３、ピメクロリムス（ＳＤＺ  ＡＭ  ９８１、３３−エピ−クロロ−３３デスオキシ−アスコマイシン）、Ｌ−７３２，５３１（３２−Ｏ−（１−ヒドロキシエチルインドール−５−イル）−アスコマイシン）、Ｌ−６８５，８１８（ＦＫ５０６ＢＤ）、Ｌ−７３２−７３１、１５−０−ＤｅＭｅ−ＦＫ−５２０、メリダマイシン、３１−Ｏ−デメチル−ＦＫ５０６、Ｖ−１０，３６７、Ｌ−６８３，５９０、Ｌ−６８５，８１８、Ｃ１８−ＯＨ−アスコマイシン；９−デオキソ−３１−Ｏ−デメチル−ＦＫ５０６など；Ｌ−６８８，６１７；Ａ−１  １９４３５；ＡＰ１９０３である。一実施形態では、カルシニューリン阻害剤は、３６−メチル−ＦＫ５０６と３６−フルオロ−ＦＫ５２０とからなるリストから選択されないものである。
【００５５】
本発明の一実施形態では、前記カルシニューリン阻害剤はカルシニューリン阻害剤ＶＩＩＩ／ＣＮ５８５（６−（３，４−ジクロロフェニル）−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルチオ）−２−フェニル−ピリミジン）である。
【００５６】
本発明の一実施形態では、カルシニューリン阻害剤はトロピセトロンではない。
【００５７】
本発明の一実施形態では、カルシニューリン阻害剤はオンダンセトロンではない。
【００５８】
本発明の一実施形態では、カルシニューリン阻害剤は、米国特許出願公開第２００９／１８６４２２号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている、カルシニューリンとＮＦＡＴとの間のタンパク質間相互作用を阻害することができるＮＦＡＴの保存された調節ドメインに由来するペプチドである。ＮＦＡＴの保存された調節ドメインにはヒトＮＦＡＴ１のアミノ酸残基３９６〜６７８、ヒトＮＦＡＴ２のアミノ酸残基４１４〜６９６、ヒトＮＦＡＴ２ｂのアミノ酸残基４０１〜６８３、ヒトＮＦＡＴ３のアミノ酸残基４０５〜６８６、ヒトＮＦＡＴ４のアミノ酸残基４１９〜７００がある。
【００５９】
本発明の一実施形態では、カルシニューリン阻害剤は、欧州特許第１９７５１７４号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＬｘＶＰペプチドである。前記ＬｘＶＰペプチドは、Ｒ１がチロシンまたはフェニルアラニンであり、Ｒ２がアラニンまたはセリンであり、Ｒ３がプロリンであるアミノ酸配列Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−Ｖ−Ｐ−Ｒ３を含む。好ましくは、ＬｘＶＰｃ１が配列ＤＱＹＬＡＶＰＱＨＰＹＱＷＡＫ（配列番号１）を有し、ＬｘＶＰｃ３が配列ＤＱＦＬＳＶＰＳＰＦＴＷＳＫＰ（配列番号２）を有し、ＬｘＶＰｃ４が配列ＭＤＹＬＡＶＰＳＰＬＡＷＳＫＡ（配列番号３）を有する。
【００６０】
本発明の一実施形態では、前記カルシニューリン阻害剤は、国際公開第２００９／１０５７５５号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているラディシコールまたはポコニンの誘導体、中間体または類似体のＢＡＤ阻害剤である。
【００６１】
本発明の一実施形態では、前記カルシニューリン阻害剤は、コフィリン阻害剤のククルビタシンＥである。
【００６２】
本発明の一実施形態では、カナダ特許公開第２７０９１３２号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている、ＢＡＤポリペプチドの発現を阻害するカルシニューリン阻害剤はｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである。ｓｈＲＮＡの例としては、特に限定されないが、ＣＴＣＡＣＴＡＣＣＡＡＡＴＧＴＴＡＡＴ（配列番号４）、ＧＡＧＴＧＡＣＣＴＴＣＧＣＴＣＣＡＣＡ（配列番号５）、ＧＡＧＴＴＴＧＴＧＧＡＣＴＣＣＴＴＴＡ（配列番号６）、ＧＴＧＣＴＣＡＣＴＡＣＣＡＡＡＴＧＴＴ（配列番号７）、ＧＡＣＴＴＧＧＡＣＴＴＧＧＡＴＧＴＡＡ（配列番号８）が挙げられる。ｓｉＲＮＡの例としては、特に限定されないが、ＧＡＵＣＧＧＡＡＣＵＵＧＧＧＣＡＧＧＧ（配列番号９）、ＣＡＧＡＧＵＵＵＧＡＧＣＣＧＡＧＵＧＡ（配列番号１０）、ＧＡＧＣＵＣＣＧＧＡＧＧＡＵＧＡＧＵＧ（配列番号１１）、ＵＵＧＵＧＧＡＣＵＣＣＵＵＵＡＡＧＡＡ（配列番号１２）が挙げられる。
【００６３】
本発明のまた別の目的は病変性前庭障害を治療する方法に関するものであり、この方法は、必要とする対象にカルシニューリン阻害剤を投与することを含む。
【００６４】
本発明のまた別の目的は、病変性前庭障害に罹患している対象の前庭機能を回復させる方法に関するものであり、この方法は、必要とする対象にカルシニューリン阻害剤を投与することを含む。
【００６５】
以下に明記するように、カルシニューリン阻害剤を医薬組成物の形態で投与することができる。
【００６６】
前記カルシニューリン阻害剤は治療有効量で投与するのが好ましい。
【００６７】
本発明の化合物および組成物の１日使用量は妥当な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されよう。任意の特定の患者に対する具体的な治療上有効な投与レベルは、治療する障害および障害の重症度；用いる具体的な化合物の活性；用いる具体的な組成物；患者の年齢、体重、全般的健康状態、性別および食事；具体的な化合物の投与時間、投与経路および排泄速度；治療期間；用いる具体的な阻害剤と組み合わせてまたは同時に使用する薬物；などの医療分野でよく知られた因子を含めた様々な因子によって決まる。例えば、所望の治療効果を得るのに必要なレベルよりも低いレベルの化合物投与量から開始し、所望の効果が得られるまで投与量を徐々に増加させることが当業者の技能範囲内ではよく知られている。しかし、製品の１日量は成人１人に対して０．０１〜１，０００ｍｇ／日の広い範囲にわたって変化し得る。治療の対象となる患者への投与量を症状に合わせて調節するには、組成物は有効成分を０．０１ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１．０ｍｇ、２．５ｍｇ、５．０ｍｇ、１０．０ｍｇ、１５．０ｍｇ、２５．０ｍｇ、５０．０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇおよび５００ｍｇ含有するのが好ましい。例えば、ＦＫ５０６の投与量は、経口投与では０．００１ｍｇ／（ｋｇ・日）〜１０ｍｇ／（ｋｇ・日）、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／（ｋｇ・日）、さらに好ましくは０．１〜１ｍｇ／（ｋｇ・日）、静脈内注射では０．００１〜１ｍｇ／（ｋｇ・日）、好ましくは０．０１〜０．５ｍｇ／（ｋｇ・日）であり得る。特定の実施形態では、血中ＦＫ５０６濃度が５〜４０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１５〜２０ｎｇ／ｍｌである。したがって、上記血中ＦＫ５０６濃度が得られるようＦＫ５０６の投与量を調節することができる。経口製剤（Ｎｅｏｒａｌ；Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ）でのシクロスポリンＡの投与量は０．１ｍｇ／（ｋｇ・日）〜１０ｍｇ／（ｋｇ・日）、好ましくは０．１ｍｇ／（ｋｇ・日）〜１ｍｇ／（ｋｇ・日）であり得る。
【００６８】
カルシニューリン阻害剤を薬学的に許容される補形剤および任意選択で生分解性ポリマーなどの徐放マトリックスと組み合わせて、治療用組成物を形成することができる。
【００６９】
「薬学的に」または「薬学的に許容される」という用語は、必要に応じて、哺乳動物、特にヒトに投与したときに有害反応、アレルギー反応をはじめとする好ましくない反応を引き起こさない分子的実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または補形剤は、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または任意のタイプの助剤を指す。
【００７０】
本発明の医薬組成物では、有効成分が単独でまたは別の有効成分と組み合わせ、従来の医薬補助物との混合物として単位投与形態で動物およびヒトに投与され得る。適切な単位投与形態は、錠剤、ゲル剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤および経口懸濁剤または液剤などの経口経路形態、舌下およびバッカル投与形態、噴霧剤、埋植物、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、髄腔内および鼻腔内投与形態ならびに経直腸投与形態を含む。
【００７１】
好ましくは、医薬組成物は注射可能な製剤用に薬学的に許容される溶媒を含有する。これらは、特に等張で無菌の生理食塩水（リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどまたは上記塩の混合物）または場合に応じて無菌水または生理的食塩水を加えて注射用液剤にすることができる乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得る。
【００７２】
注射用途に適した医薬形態としては、無菌水溶液または分散液；ゴマ油、ラッカセイ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌注射用液または分散液の即時調製用の無菌粉末が挙げられる。いずれの場合にも、その形態は無菌であり、かつ容易に注射することができる流体でなければならない。それは製造および保管の条件下で安定であり、かつ細菌および真菌などの微生物の汚染活動から保護されていなければならない。
【００７３】
ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水を用いて、本発明の化合物を遊離塩基または薬理学的に許容される塩として含む溶液を調製することができる。このほか、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物ならびに油を用いて分散液を調製することができる。通常の保管および使用条件下では、ここに挙げた調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含有する。
【００７４】
カルシニューリン阻害剤は中性または塩形成の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される塩）および無機酸、例えば塩酸、リン酸などまたは有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などとともに形成される塩が挙げられる。このほか、遊離カルボキシル基とともに形成される塩を無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄などおよび有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから得ることができる。
【００７５】
担体はほかにも、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合は必要な粒子径の維持によって、また界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって微生物の活動を防ぐことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むのが好ましい。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に使用することによって、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
【００７６】
無菌注射用液剤は、必要な量の有効成分を必要に応じて数種の上に挙げた他の成分とともにしかるべき溶媒に組み込んだ後、ろ過滅菌することによって調製することができる。分散液剤は一般に、基本的な分散媒と、上に挙げた他の成分のうち必要とされる成分とを含有する無菌溶媒に種々の無菌有効成分を組み込むことによって調製することができる。無菌注射用液剤を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥法および凍結乾燥法であり、この方法では、有効成分と任意の追加の所望成分との粉末がその予め滅菌ろ過した溶液から得られる。
【００７７】
製剤化した後、投与剤形に適合する方法で、かつ治療効果の得られる量で溶液が投与される。製剤は、上で述べたタイプの注射用液剤などの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどを用いてもよい。
【００７８】
例えば、水溶液での非経口投与では、溶液を必要に応じて適切に緩衝し、最初に液体希釈剤を十分な量の塩類またはブドウ糖で等張化しなければならない。このような特定の水溶液は静脈内，筋肉内，皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、本開示を踏まえれば、使用できる無菌水性溶剤が当業者にはわかるであろう。例えば、１投与量を等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶かし、皮下注入液１０００ｍｌに加えるか、提案される注入部位に注射することができる。治療する対象の状態に応じて投与量が多少変化するであろう。いずれにしても、投与の担当者が個々の対象に適した投与量を決定することになろう。
【００７９】
静脈内または筋肉内注射などの非経口投与用に製剤化した本発明の化合物のほか、他の薬学的に許容される形態としては、例えば、錠剤をはじめとする経口投与のための固形；リポソーム製剤；持効カプセル剤；および現在使用されている他の任意の形態が挙げられる。
【００８０】
特定の実施形態では、カルシニューリン阻害剤を鼓膜から内耳に直接投与し得る。この投与様式は、前庭に直接的で長時間にわたる効果をもたらすのに好ましいものであり得る。したがって、好ましい実施形態では、カルシニューリン阻害剤をゲル製剤として投与し、前記アンタゴニストまたは阻害剤を内耳で長時間放出させる。
【００８１】
以下の図面および実施例により本発明を詳細に説明する。しかし、ここに挙げる実施例および図面は、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００８２】
以下の実施例により本発明を詳細に説明する。
【００８３】
実施例１
材料および方法
動物
１９０〜２２０ｇの成体雌Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラット（ＣＥＲＪ、Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、仏農業省の規則および欧州共同体理事会指令に従い実験を実施した。
【００８４】
ヘッドポスト（ｈｅａｄ  ｐｏｓｔ）手術
雌Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラットの頭蓋にケタミン−キシラジン深麻酔下でセルフタッピング外科用ねじおよびシアノアクリレートを用いて、一部が歯科用アクリルで覆われた２個の逆向き３ｍｍボルトを外科的に固定した。各個体を１週間回復させた後、実験前の週に、持続時間を増加させながら頭部を固定する訓練（５〜１０分）を４回実施した。
【００８５】
前庭興奮毒性病変
外科用顕微鏡を用いた観察下、各ラットにベンジルアルコール１０ｍｇ／ｍＬを加えた１５ｍＭカイニン酸生理的血清溶液５０μＬ（ｔ＝０時間）およびベンジルアルコール１０ｍｇ／ｍＬを加えた１５ｍＭカニン酸（ｋａｎｉｃ  ａｃｉｄ）生理的血清溶液（ｔ＝２時間）を鼓膜から注射した。
【００８６】
前庭不全の判定
ｔ＝１時間において、それぞれ０〜４の段階で採点する５種類の古典的な基準、すなわち回旋運動、首振り運動、頭位傾斜度、尾部懸垂反射（ｔａｉｌ−ｈａｎｇｉｎｇ  ｒｅｆｌｅｘ）不全および空中立ち直り反射不全を用いて、鼓膜から注射した各個体の行動面に関連する前庭不全を判定した。治療前の合計スコア（全５種類の基準のスコアの合計）が７以上の個体のみを試験に含めた。
【００８７】
赤外線ビデオ眼振検査
ｔ＝１時間およびｔ＝２４時間に暗所、頭部固定条件下でＩＳＣＡＮ  ＥＴＬ−２００赤外線ビデオ眼球運動記録システムを用いて自発性眼球運動を記録した。比較のため、ｔ＝２４時間における各グループの自発性眼振の頻度をｔ＝１時間における自発性眼振の頻度の平均値（治療前値）に正規化した。
【００８８】
カルシニューリン阻害剤による治療
ｔ＝１時間における行動実験および赤外線ビデオ眼振検査の後直ちに、二重盲検無作為条件下でラットに血清（偽治療群）またはＦＫ−５０６・一水和物２．５ｍｇ／ｋｇ（カルシニューリン阻害剤治療群）を腹腔内注射した後、次の操作までケージに戻した。
【００８９】
免疫組織化学
ラットにペントバルビタール（０．４％）で深麻酔をかけた後、ヘパリンＰＢＳ（０．０１Ｍ）、次いで固定液（４％パラホルムアルデヒド、１％ピクリン酸および５％ショ糖）で経心灌流した。側頭骨を同じ溶液で後固定した後、ＰＢＳ中で解剖した。前庭末端器官を４％アガロースで包埋し、ビブラトーム（ＨＭ６５０Ｖ、Ｍｉｃｒｏｍ）で厚さ４０μｍの切片に薄切した。４％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で浮遊切片を透過処理し、０．５％魚ゼラチン、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１％ＢＳＡのブロッキング溶液によるプレインキュベーションにより非特異的結合を防止した。次いで、ブロッキング溶液で希釈した神経フィラメント（マウスＮ５２、１：２００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）およびカルシニューリンＡＢ（ウサギ、１：１０００、Ｓｗａｎｔ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に対する一次抗体とともに試料を一晩インキュベートした。ブロッキング溶液に溶かした蛍光二次抗体Ａｌｅｘａ  ４８８抗マウスおよびＡｌｅｘａ  ５９４抗ウサギ（ともに１：７００、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）で特異的標識を明らかにした。マウントする前に、組織をＤＡＰＩ（１：５０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）で染色した。走査型共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ  ５  ＬＩＶＥ  ＤＵＯ、Ｚｅｉｓｓ）を用いて試料を分析した。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で最終的な画像処理を行った。
【００９０】
データ解析
ＭａｔＬａｂ  Ｒ２０１１ｂ（Ｔｈｅ  Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に書かれたカスタムルーチンを用いて、ｔ＝１時間（治療前）およびｔ＝２４時間（慢性不全）に記録された眼球運動記録のトレースにおける自発性眼振の頻度を測定した。ｔ＝２４時間で測定された自発性眼振の頻度をグループ（偽治療群／ＦＫ−５０６群）のｔ＝１時間における平均頻度に正規化した。ＳｉｇｍａＰｌｏｔ  １１（ＳｙＳｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）でスチューデントｔ検定を用いて、統計的有意差を判定した。ＳｉｇｍａＰｌｏｔ  １１（ＳｙＳｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）でデータを可視化した。
【００９１】
カルシニューリン活性の特異的阻害が興奮毒性前庭ダメージをｉｎ  ｖｉｖｏで軽減する
メニエール病（過興奮性）、前庭神経炎（炎症）、椎骨脳底発作（虚血）および外傷性頭部傷害などの病態における末梢前庭系へのダメージは、過剰な細胞内カルシウム蓄積が二次シグナル伝達カスケードの有害な活性化を引き起こす機序を介して起こる。
【００９２】
本発明者らは、鼓膜から内耳への興奮性毒物カイニン酸（カイニン酸塩）の適用を用いて臨床病理学的機序を模倣した動物モデルを対象に、カルシウム／カルモジュリン活性化ホスファターゼカルシニューリンの阻害が前庭損傷の開始後にＦＫ−５０６（タクロリムス）で治療した動物における持続性の自発性眼振を有意に減少させることをここに示す。
【００９３】
末梢前庭系におけるカルシニューリン発現
図１Ａは、前庭神経節では、ニューロン特異的構造タンパク質神経フィラメント（緑）を発現する前庭一次ニューロンの神経細胞体（矢頭）にカルシニューリン（赤）が発現することを示している。核はＤＡＰＩ（青）で標識されている。
【００９４】
図１Ｂは、前庭内襞（半規管の感覚上皮）では、感覚有毛細胞（白枠矢印）の層にカルシニューリン（赤）が発現することを示している。核はＤＡＰＩ（青）で標識されている。
【００９５】
図１Ｃは、卵形嚢では，感覚有毛細胞（白枠矢印）の層にカルシニューリン（赤）が発現することを示している。核はＤＡＰＩ（青）で標識されている。
【００９６】
興奮毒性損傷後のカルシニューリン阻害剤ＦＫ−５０６による慢性自発性眼振頻度の減少
図は、ＦＫ−５０６治療群の正規化した慢性自発性眼振の頻度がｔ＝２４時間において２６．９±１１．８％であったことを示している。この値は、偽治療群のｔ＝２４時間における正規化した慢性自発性眼振の頻度４７．２±１５．２％と有意に異なっている（ｐ＝０．０１４）。このことは、二重盲検無作為条件下、カルシニューリン阻害剤ＦＫ−５０６（タクロリムス）２．５ｍｇ／ｋｇの単回全身（腹腔内）注射が興奮毒性損傷後の持続性前庭不全（暗所での自発性眼振として定量化）を４３％減少させることを示している。
【００９７】
実施例２
方法
動物
２２０〜２５０ｇの雌Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラット（ＣＥＲＪ、Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、仏農業省の規則および欧州共同体理事会指令第８６／６０９／ＥＥＣ、ＯＪＬ３５８に従い全実験を実施した。
【００９８】
ヘッドポスト（ｈｅａｄｐｏｓｔ）手術
ケタミン１００ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン８ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した後、後肢をつまんでも引っ込め反射がみられないことにより確認される深麻酔下、眼球運動記録時に固定するためのヘッドポスト（ｈｅａｄｐｏｓｔ）を各個体の頭蓋に外科的に固定した。頭皮を矢状切開した後、方形構造で頭蓋内に固定した４本の４．７ｍｍセルフタッピング式骨接合用ネジ（Ｆｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の周囲にプラスチック製のリング（外径１５ｍｍ×内径１０．５ｍｍ×高さ５ｍｍ；Ｂａｎｂｕｒｙ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｆｉｔｔｉｎｇｓ、Ｂａｎｂｕｒｙ、ＵＫ）を置いた。リングの内側に露出した頭蓋にシアノアクリレート接着剤を塗り、歯科用アクリルを用いて２個の逆向き３ｍｍボルトを矢状正中線上に固定した。露出した頭皮切開部分に消毒液（Ｂｅｔａｄｉｎｅ）を塗り、観察下で麻酔から回復させた後、ラットを飼育ケージに戻した。
【００９９】
頭部拘束順応
ヘッドポスト（ｈｅａｄｐｏｓｔ）手術の１週間後、軽度のイソフルラン麻酔後に各個体にトレーニングを４回実施した。ラットを柔らかく「すっぽり収まる」拘束具（Ｌｏｍｉｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｍａｌｏｎｅ  ＮＹ、ＵＳＡ）に入れ、頭部のみを露出させた。５分、７分、７分および１０分の訓練時間（１週間を通して）の間、眼球運動記録ステージの拘束具にヘッドポスト（ｈｅａｄｐｏｓｔ）の２個の逆向きボルトをしっかりと固定し、のちの記録時の不安を軽減した。
【０１００】
片側前庭不全の誘発
ｔ＝０時間にイソフルラン麻酔下、正円窓を透過処理するベンジルアルコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を含有する２０ｍＭカイニン酸（Ａｂｃａｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）生理的血清溶液の経鼓膜注射液５０μＬを１０ｍｇ／ｍＬで左側中耳に注射して、片側に興奮毒性前庭損傷を与えた。観察下でラットを右側の麻酔から回復させた。
【０１０１】
シクロスポリンＡ治療
ｔ＝１時間に盲検無作為条件下、２０％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ／２％ＥｔＯＨ／１％Ｔｗｅｅｎ８０／７７％生理的血清の溶液に溶かしたカルシニューリン阻害剤シクロスポリンＡ（Ａｂｃａｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与による薬理学的治療を実施し、この実験では盲検状態の実験者が治療前の機能特徴付けの直後に各個体を治療した。
【０１０２】
行動実験
最初の興奮毒性損傷後ｔ＝１時間（治療前）および２４時間に、片側前庭傷害に特徴的な５種類の行動不全の基準について正常行動（０）から最大限の障害（４）を異なる等級で採点し（回旋運動、首振り運動、尾部懸垂反射（ｔａｉｌ−ｈａｎｇｉｎｇ  ｒｅｆｌｅｘ）、空中立ち直り反射および頭位傾斜度）、その合計スコアを用いて前庭不全を評価した。カイニン酸塩による発作活性開始の常同的徴候を示した個体はいずれも、致死量のペントバルビタールを用いて直ちに安楽死させ、全データを解析から除外した。
【０１０３】
ビデオ眼振検査の記録
最初の興奮毒性損傷後ｔ＝１時間（治療前）および２４時間に、げっ歯類用のコンピュータ制御された赤外線眼球運動記録装置（ＥＴＬ−２００、ＩＳＣＡＮ  Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ  ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて自発性眼振を記録した。各時点で瞳孔の位置に基づいて検知される眼球運動を２分間記録し、のちの解析にオフラインでＡＳＣＩＩ形式にて保存した。
【０１０４】
データ解析および統計
ＭａｔＬａｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）に書かれたカスタムルーチンを用いて各個体、時点および治療条件でのビデオ眼振検査記録の記録から自発性眼振の頻度を決定した。治療前のグループ平均値に正規化した眼振頻度およびスチューデントｔ検定を用いて、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（Ｓｙｓｔａｔ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）で眼振データのプロットおよび統計解析をすべて行った。検知された差はいずれもｐ＜０．０５で有意であるとした。データの値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．で表した。
【０１０５】
結果：シクロスポリンＡ治療によって興奮毒性により誘発された前庭不全が軽減される
盲検無作為条件下、ｔ＝１時間において中等度ないし重度の前庭機能不全（不全スコアが７以上）が認められる個体にシクロスポリンＡ（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）または対応する偽治療溶液を投与した（「方法」を参照されたい）。
【０１０６】
カスタムソフトウェアルーチンを用いて、記録された自発性頻度を決定し、治療前（ｔ＝１時間）および持続性（ｔ＝２４時間）の頻度を治療前のグループ平均値に正規化してからプロットした（図３）。
【０１０７】
図３は、ｔ＝２４時間、暗条件下において、偽治療個体（ｎ＝１１、黒のヒストグラムバー）では急性（ｔ＝１時間）の眼振頻度の４１．３±６．５％が保持されていたのに対して、シクロスポリンＡを５０ｍｇ／ｋｇ投与した個体（ｎ＝９、白のヒストグラムバー）では持続性眼振（ｔ＝２４時間）の頻度がこれより低く、急性治療前値の２１．９±５．９％を示すにとどまった。
【０１０８】
ｔ＝２４時間における持続性前庭不全（暗条件下での自発性眼振の頻度によって決定されたもの）のこの統計的に有意な（ｐ＝０．０４４）４７％の減少は、病変性前庭不全のラットモデルにおける全身カルシニューリン阻害剤投与の保護的治療効果を明白に示すものである。
【図１】
2015511242.tif 000002
【図２】
2015511242.tif 000003
【図３】
2015511242.tif 000004
【国際調査報告】
2015511242.tif 000005
2015511242.tif 000006