(57)【要約】  本発明は、インビトロで培養し得る新規なケラチン生成細胞、およびＤＰＰ−４阻害剤と組み合わせて、急性および慢性の創傷の治療に使用することができる製品を調製するためのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチンと組み合わせて使用するための、不死化されず、かつインビトロの細胞培養法によって少なくとも１５０回倍加し得ることを特徴とする、創傷（特に、糖尿病性創傷）を治療するためのケラチン生成細胞。
【請求項２】
包皮の上皮部分から単離された、請求項１に記載の使用のためのケラチン生成細胞。
【請求項３】
ＫＣ−ＢＩ−１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２５１４）培養物からの細胞、またはこれに由来するケラチン生成細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の使用のためのケラチン生成細胞。
【請求項４】
ａ．ウシ胎仔血清の非存在下で、および／または
ｂ．支持細胞の非存在下で、および／または
ｃ．上皮増殖因子（ＥＧＦ）の非存在下で
複製することができない、請求項１から３のいずれか１項に記載の使用のためのケラチン生成細胞。
【請求項５】
テロメラーゼ活性をほとんどまたは全く有さない、好ましくは不死化されたケラチン生成細胞、好ましくは、細胞株ＨａＣａＴと比較してテロメラーゼ活性をほとんどまたは全く有さない、請求項１から４のいずれか１項に記載の使用のためのケラチン生成細胞。
【請求項６】
インビトロの細胞培養法によって少なくとも２００回複製することができることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載の使用のためのケラチン生成細胞。
【請求項７】
インビトロの細胞培養法によって少なくとも２５０回複製することができることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載の使用のためのケラチン生成細胞。
【請求項８】
インビトロの細胞培養法によって少なくとも３００回複製することができることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載の使用のためのケラチン生成細胞。
【請求項９】
治療における、例えば、同時使用、逐次的使用または別々の使用のための、特に、創傷（特に、糖尿病性創傷）を治療するための、ＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチン、ならびに請求項１から８のいずれか１項に記載のケラチン生成細胞でコーティングされている担体からなる組成物または製品（例えば、ＢＡＷＤ）を含む、組み合わせ医薬、医薬組成物、キットまたは医療用製品であって、
ａ．前記担体にケラチン生成細胞が部分的に定着している、または
ｂ．前記担体にケラチン生成細胞が完全に定着している、
前記組み合わせ医薬、医薬組成物、キットまたは医療用製品。
【請求項１０】
担体が、医薬組成物を調製するために使用し得る生体適合性担体材料であることを特徴とする、請求項９に記載の組み合わせ医薬、医薬組成物、キットまたは医療用製品。
【請求項１１】
担体材料が、疎水性または親水性の生分解性膜であることを特徴とする、請求項１０に記載の組み合わせ医薬、医薬組成物、キットまたは医療用製品。
【請求項１２】
担体がエステル化されたヒアルロン酸のポリマー、好ましくは、明確な幾何形状の穿孔ポリマーフィルムであり、ポリマーフィルムが、１０〜５００μｍの厚さを有し、ポリマーフィルムに１０〜１０００μｍの寸法の穴が穿孔されており、穴が、明確な一定のサイズを有し、規則正しい列を形成し、これらが５０〜１０００μｍの一定の間隔で互いに分離されていることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の組み合わせ医薬、医薬組成物、キットまたは医療用製品。
【請求項１３】
担体材料が、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリデプシペプチド、ポリエーテルエステル、ポリアミノ酸またはポリホスファゼン、特に、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレン−カーボネート）またはポリ（ジオキサノン）であり、前記ポリマーが穿孔されているまたは穿孔されていないことを特徴とする、請求項１０または１１に記載の組み合わせ医薬、医薬組成物、キットまたは医薬。
【請求項１４】
請求項１から８に記載のケラチン生成細胞または請求項９から１３に記載の組成物または医療用製品を凍結保存するための方法であって、ケラチン生成細胞または組成物もしくは医療用製品を、−２０℃〜−１９６℃、好ましくは−６０〜−８０℃の温度で凍結保存する、前記方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法によって処理された、請求項１から８のいずれか１項に記載のケラチン生成細胞または請求項９から１３のいずれか１項に記載のケラチン生成細胞および担体を含む組成物もしくは医療用製品。
【請求項１６】
創傷を治療するための、請求項１から８および１５のいずれか１項に記載のケラチン生成細胞または請求項１０から１３および１５のいずれか１項に記載の組合せ医薬の使用。
【請求項１７】
創傷が好ましくは、熱傷および／または潰瘍である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
創傷が好ましくは、第２度熱傷である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
創傷が好ましくは、下腿潰瘍、好ましくは、静脈性下腿潰瘍のタイプの慢性の、治癒が困難な下腿の潰瘍である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】
創傷が好ましくは、糖尿病によって生じた潰瘍である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２１】
創傷が好ましくは、褥瘡性潰瘍である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２２】
創傷治癒に対する有益な効果を有する１種もしくは複数種の他の物質の使用への補充としての、または創傷治癒に対する有益な効果を有する１種もしくは複数種の他の物質の使用と併せた、請求項１５から２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
他の物質が、親水コロイド被覆材である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
他の物質が、抗微生物物質、例えば、抗生剤である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２５】
創傷（特に、糖尿病性創傷）を治療するための、請求項１から８のいずれか１項に記載のケラチン生成細胞と組み合わせて使用するための、ＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチン。
【請求項２６】
リナグリプチンが局所的に投与または適用され、ケラチン生成細胞が局所的に投与または適用される、請求項１から８のいずれか１項に記載の使用のためのケラチン生成細胞、請求項９から１３のいずれか１項に記載の組合せ医薬、または請求項２５に記載の使用のためのＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチン。
【請求項２７】
リナグリプチンが経口的に投与され、ケラチン生成細胞が局所的に投与または適用される、請求項１から８のいずれか１項に記載の使用のためのケラチン生成細胞、請求項９から１３のいずれか１項に記載の組合せ医薬、または請求項２５に記載の使用のためのＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチン。
【請求項２８】
ケラチン生成細胞およびＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチンが、同じ局所適用形態に、例えば、同じ、生物学的に活性な創傷被覆材（ＢＡＷＤ）中に存在する、請求項９から１３のいずれか１項に記載の組み合わせ医薬または組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性または慢性の創傷、特に、糖尿病性創傷（例えば、糖尿病性足病変または潰瘍）の治療に使用するための、インビトロで培養し得る、ＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチンと組み合わせてもよいケラチン生成細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケラチン生成細胞と併せて生物学的に活性な創傷被覆材を生成するためのこの担体材料の特定の適合性は、動物モデル（Ｌａｍら、１９９９年）およびヒト（Ｈａｒｒｉｓら、１９９９年）において既に示されてきた。上皮細胞の改善された移動および分化は別として、ヒアルロン酸エステルからなるマトリックスは、血管形成およびコラーゲン生成に対してプラスの効果を有する。しかし、マトリックスとしてヒアルロン酸エステルとまた共に使用される創傷被覆材は、自家ケラチン生成細胞、ならびに／またはケラチン生成細胞および線維芽細胞から得た複雑な構造の皮膚同等物でコーティングされている。したがって、これらはいくつかの不都合に見舞われる。これらの不都合は、本明細書に記載のような有利な同種異系ケラチン生成細胞の使用によって特に克服し得る。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、急性または慢性の創傷、特に、糖尿病性創傷（例えば、糖尿病性足病変または潰瘍）の治療に使用するための、インビトロで培養し得る、ＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチンとまたはリナグリプチン以外のものと組み合わせてもよいケラチン生成細胞に関する。
さらに、本発明は、例えば、急性または慢性の創傷、特に、糖尿病性創傷（例えば、糖尿病性足病変または潰瘍）の治療に使用することができる医薬組成物または医療品（例えば、生物学的に活性な創傷被覆材、ＢＡＷＤ）の調製に使用するための、ＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチンと組み合わせたこれらのケラチン生成細胞を意図する。
さらに、本発明は、このようなケラチン生成細胞およびＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチン、および任意選択で１種または複数種の薬学的に許容される担体を含有する、医薬組成物または医療用製品（例えば、局所使用のための医薬組成物、または生物学的に活性な創傷被覆材、ＢＡＷＤ）に関する。
さらに、本発明は、急性または慢性の創傷、特に、糖尿病性創傷（例えば、糖尿病性足病変または潰瘍）を治療する方法であって、有効量のこのようなケラチン生成細胞およびＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチンを、それを必要としている患者に投与または適用する（例えば、このような活性構成要素の同時局所適用による、例えば、同じ局所適用形態などでの同時局所適用による）ことを含む、方法に関する。
このように、本発明は医学の分野において、特に、組織工学による創傷治癒の分野においてなされた。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】培養時間の関数としての、ケラチン生成細胞ＫＣ−ＢＩ−１の細胞複製。これは、９４日の培養期間に亘るケラチン生成細胞ＫＣ−ＢＩ−１の細胞複製の回数（ＣＰＤ＝累積的集団倍加）を示す。９４日の観察期間以内で、細胞は、おおよそ７５回倍加した。これは、細胞複製あたり１．２５日、または１０日あたり１２．５の平均倍加時間に対応する。
【図２】１０カ月の期間に亘るケラチン生成細胞ＫＣ−ＢＩ−１の倍加。これは、細胞継代１〜６７代に応じた集団倍加（ＰＤ）として表す、１０カ月に亘るケラチン生成細胞ＫＣ−ＢＩ−１の細胞複製を示す。
【図３】相対的なテロメラーゼ活性の決定。これは、細胞株ＨｅＬａの活性と比較した、継代１代、１２代、１８代、４０代および５７代後の、ケラチン生成細胞ＫＣ−ＢＩ−１についての相対的なテロメラーゼ活性を示す。図は、不死化された細胞株ＨｅＬａと比較して、ケラチン生成細胞ＫＣ−ＢＩ−１のテロメラーゼ活性がほとんどないまたはわずかしかないことを示している。
【図４】継代５代および６０代後のケラチン生成細胞ＫＣ−ＢＩ−１の形態。光学顕微鏡下で見て、ケラチン生成細胞ＫＣ−ＢＩ−１は、細胞継代５代（培養時間２５日）と細胞継代６０代（培養時間３００日）との間で形態的な差異を示さない。
【図５】ケラチン生成細胞含有ヒアルロン酸マトリックスの適用による、糖尿病マウスの創傷における強固な肉芽組織の誘発を示す（ヒアルロン酸マトリックス単独と比較）。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本発明の範囲内において、それぞれが本明細書に定義されているような、ＤＰＰ−４阻害剤、好ましくは、リナグリプチンと組み合わせてもよいケラチン生成細胞が、本発明の目的に適するものとなる特性を有することをこのたび見出した。
リナグリプチン、および本発明の（例えば、ＢＡＷＤの形態の）ケラチン生成細胞は、組み合わせた場合に特に、創傷（特に、糖尿病性創傷）の治療に特に適するいくつかの固有の特徴を保持する。例えば、リナグリプチンは炎症を減弱させ、糖尿病性創傷の上皮形成（創傷閉鎖、再上皮形成）を促進する。さらなる例のために、本発明のケラチン生成細胞（特に、ヒトケラチン生成細胞（ＫＣ−ＢＩ−１）のＢＡＷＤ、および担体としてヒアルロン酸マトリックス）は、慢性的に障害された創傷からの機能的で新たな組織の形成を促進および増加させ（例えば、増殖因子を放出することによって）、新たな組織は、糖尿病の表現型および強力な高血糖の存在にも関わらず、血管新生し（多数の新たな血管によって特徴付けられる）、創傷治癒（再上皮形成）を改善させる。
このように、本発明は、例えば、治療における同時使用、逐次的使用または別々の使用のための、それぞれが本明細書に記載のような、ケラチン生成細胞（特に、ヒトケラチン生成細胞、特に、例えば、ＢＡＷＤの形態のＫＣ−ＢＩ−１）およびＤＰＰ−４阻害剤（特に、リナグリプチン）を含む、またはこれらから本質的になる、組み合わせ医薬または組成物を提供する。
本発明はさらに、患者（特に、ヒト患者）において創傷（特に、糖尿病性創傷）を治療する方法であって、それぞれが本明細書に記載のような、有効量のケラチン生成細胞（特に、ヒトケラチン生成細胞、特に、例えば、ＢＡＷＤの形態のＫＣ−ＢＩ−１）およびＤＰＰ−４阻害剤（特に、リナグリプチン）を、特に組み合わせて、例えば交互に、患者に投与または適用することを含む、方法を提供する。
【０００６】
本発明の範囲内で、本発明による組合せまたは併用使用は、活性構成要素または成分の同時投与、逐次的投与または別々の投与を想定し得ることを理解すべきである。
これに関連して、本発明の意味の範囲内の「組合せ」または「併用」は、これらに限定されないが、固定されたおよび固定されていない（例えば、遊離の）形態（キットを含めた）ならびに使用、例えば、構成要素または成分の同時使用、逐次的使用または別々の使用を含み得る。
【０００７】
本発明の併用投与は、活性構成要素を一緒に投与することによって、例えば、これらを同時に１つの単一の製剤もしくは剤形で、または２つの別々の製剤もしくは剤形で投与することによって起こり得る。代わりに、投与は、活性構成要素を逐次的に、例えば、２つの別々の製剤または剤形で連続的に投与することによって起こり得る。
本発明の併用療法のために、活性構成要素は、別々に投与し（これはこれらが別々に製剤されることを意味する）、または一緒に製剤し得る（これはこれらが同じ調製物もしくは同じ剤形で製剤されることを意味する）。したがって、本発明の組合せの１つの要素の投与は、組合せの他の要素の投与の前、併行的、または続いて起こり得る。
本発明の意味の範囲内のＤＰＰ−４阻害剤は、これらに限定されないが、本明細書の上および下で記述したこれらのＤＰＰ−４阻害剤のいずれか、好ましくは、経口的におよび／または皮下におよび／または局所的に活性なＤＰＰ−４阻害剤を含む。
【０００８】
第１の実施形態（実施形態Ａ）において、ＤＰＰ−４阻害剤は、本発明との関連で、
式（Ｉ）
【化１】
2015518843.tif 000002
または式（ＩＩ）
【化２】
2015518843.tif 000003
または式（ＩＩＩ）
【化３】
2015518843.tif 000004
または式（ＩＶ）
【化４】
2015518843.tif 000005
［式中、Ｒ１は、
（［１，５］ナフチリジン−２−イル）メチル、（キナゾリン−２−イル）メチル、（キノキサリン−６−イル）メチル、（４−メチル−キナゾリン−２−イル）メチル、２−シアノ−ベンジル、（３−シアノ−キノリン−２−イル）メチル、（３−シアノ−ピリジン−２−イル）メチル、（４−メチル−ピリミジン−２−イル）メチル、または（４，６−ジメチル−ピリミジン−２−イル）メチル
を意味し、Ｒ２は、３−（Ｒ）−アミノ−ピペリジン−１−イル，（２−アミノ−２−メチル−プロピル）−メチルアミノまたは（２−（Ｓ）−アミノ−プロピル）−メチルアミノを意味する］
の任意のＤＰＰ−４阻害剤またはその薬学的に許容される塩である。
【０００９】
第１の実施形態（実施形態Ａ）に関して、好ましいＤＰＰ−４阻害剤は、下記の化合物および薬学的に許容されるその塩のいずれかまたは全てである。
【００１０】
・１−［（４−メチル−キナゾリン−２−イル）メチル］−３−メチル−７−（２−ブチン−１−イル）−８−（３−（Ｒ）−アミノ−ピペリジン−１−イル）−キサンチン（ＷＯ２００４／０１８４６８、例２（１４２）を比較されたい）：
【化５】
2015518843.tif 000006
【００１１】
・１−［（［１，５］ナフチリジン−２−イル）メチル］−３−メチル−７−（２−ブチン−１−イル）−８−（（Ｒ）−３−アミノ−ピペリジン−１−イル）−キサンチン（ＷＯ２００４／０１８４６８、例２（２５２）を比較されたい）：
【化６】
2015518843.tif 000007
【００１２】
・１−［（キナゾリン−２−イル）メチル］−３−メチル−７−（２−ブチン−１−イル）−８−（（Ｒ）−３−アミノ−ピペリジン−１−イル）−キサンチン（ＷＯ２００４／０１８４６８、例２（８０）を比較されたい）：
【化７】
2015518843.tif 000008
【００１３】
・２−（（Ｒ）−３−アミノ−ピペリジン−１−イル）−３−（ブタ−２−イニル）−５−（４−メチル−キナゾリン−２−イルメチル）−３，５−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｄ］ピリダジン−４−オン（ＷＯ２００４／０５０６５８、例１３６を比較されたい）：
【化８】
2015518843.tif 000009
【００１４】
・１−［（４−メチル−キナゾリン−２−イル）メチル］−３−メチル−７−（２−ブチン−１−イル）−８−［（２−アミノ−２−メチル−プロピル）−メチルアミノ］−キサンチン（ＷＯ２００６／０２９７６９、例２（１）を比較されたい）：
【化９】
2015518843.tif 000010
・１−［（３−シアノ−キノリン−２−イル）メチル］−３−メチル−７−（２−ブチン−１−イル）−８−（（Ｒ）−３−アミノ−ピペリジン−１−イル）−キサンチン（ＷＯ２００５／０８５２４６、例１（３０）を比較されたい）：
【化１０】
2015518843.tif 000011
【００１５】
・１−（２−シアノ−ベンジル）−３−メチル−７−（２−ブチン−１−イル）−８−（（Ｒ）−３−アミノ−ピペリジン−１−イル）−キサンチン（ＷＯ２００５／０８５２４６、例１（３９）を比較されたい）：
【化１１】
2015518843.tif 000012
【００１６】
・１−［（４−メチル−キナゾリン−２−イル）メチル］−３−メチル−７−（２−ブチン−１−イル）−８−［（Ｓ）−（２−アミノ−プロピル）−メチルアミノ］−キサンチン（ＷＯ２００６／０２９７６９、例２（４）を比較されたい）：
【化１２】
2015518843.tif 000013
【００１７】
・１−［（３−シアノ−ピリジン−２−イル）メチル］−３−メチル−７−（２−ブチン−１−イル）−８−（（Ｒ）−３−アミノ−ピペリジン−１−イル）−キサンチン（ＷＯ２００５／０８５２４６、例１（５２）を比較されたい）：
【化１３】
2015518843.tif 000014
・１−［（４−メチル−ピリミジン−２−イル）メチル］−３−メチル−７−（２−ブチン−１−イル）−８−（（Ｒ）−３−アミノ−ピペリジン−１−イル）−キサンチン（ＷＯ２００５／０８５２４６、例１（８１）を比較されたい）：
【化１４】
2015518843.tif 000015
【００１８】
・１−［（４，６−ジメチル−ピリミジン−２−イル）メチル］−３−メチル−７−（２−ブチン−１−イル）−８−（（Ｒ）−３−アミノ−ピペリジン−１−イル）−キサンチン（ＷＯ２００５／０８５２４６、例１（８２）を比較されたい）：
【化１５】
2015518843.tif 000016
・１−［（キノキサリン−６−イル）メチル］−３−メチル−７−（２−ブチン−１−イル）−８−（（Ｒ）−３−アミノ−ピペリジン−１−イル）−キサンチン（ＷＯ２００５／０８５２４６、例１（８３）を比較されたい）：
【化１６】
2015518843.tif 000017
【００１９】
これらのＤＰＰ−４阻害剤は、極めて優れた効力および持続性効果と、好ましい薬理学的特性、受容体選択性および好ましい副作用プロファイルとを兼ね備えるため、または他の医薬活性物質と併用するときに予想外の治療上の利点もしくは改善をもたらすため、構造的に同等のるＤＰＰ−４阻害剤と区別される。これらの調製は、記述した公開資料に開示されている。
【００２０】
第２の実施形態（実施形態Ｂ）において、ＤＰＰ−４阻害剤は、本発明との関連で、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、アログリプチン、ゲミグリプチン、オマリグリプチン、エボグリプチン（ｅｖｏｇｌｉｐｔｉｎ）、（２Ｓ）−１−｛［２−（５−メチル−２−フェニル−オキサゾール−４−イル）−エチルアミノ］−アセチル｝−ピロリジン−２−カルボニトリル、
（２Ｓ）−１−｛［１，１，−ジメチル−３−（４−ピリジン−３−イル−イミダゾール−１−イル）−プロピルアミノ］−アセチル｝−ピロリジン−２−カルボニトリル、
（Ｓ）−１−（（２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＳ）−２−アミノ−９，１０−ジメトキシ−１，３，４，６，７，１１ｂ−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ピリド［２，１−ａ］イソキノリン−３−イル）−４−フルオロメチル−ピロリジン−２−オン、
（３，３−ジフルオロピロリジン−１−イル）−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−（４−（ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−イル）ピロリジン−２−イル）メタノン、
（１（（３Ｓ，４Ｓ）−４−アミノ−１−（４−（３，３−ジフルオロピロリジン−１−イル）−１，３，５−トリアジン−２−イル）ピロリジン−３−イル）−５，５−ジフルオロピペリジン−２−オン、
（２Ｓ，４Ｓ）−１−｛２−［（３Ｓ，１Ｒ）−３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イルメチル）シクロペンチルアミノ］−アセチル｝−４−フルオロピロリジン−２−カルボニトリル、
（Ｒ）−２−［６−（３−アミノ−ピペリジン−１−イル）−３−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミジン−１−イルメチル］−４−フルオロ−ベンゾニトリル、
５−｛（Ｓ）−２−［２−（（Ｓ）−２−シアノ−ピロリジン−１−イル）−２−オキソ−エチルアミノ］−プロピル｝−５−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−２，８−ジカルボン酸ビス−ジメチルアミド、
３−｛（２Ｓ，４Ｓ）−４−［４−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）ピペラジン−１−イル］ピロリジン−２−イルカルボニル｝チアゾリジン、
［（２Ｒ）−１−｛［（３Ｒ）−ピロリジン−３−イルアミノ］アセチル｝ピロリジン−２−イル］ボロン酸、
（２Ｓ，４Ｓ）−１−［２−［（４−エトキシカルボニルビシクロ［２．２．２］オクタ−１−イル）アミノ］アセチル］−４−フルオロピロリジン−２−カルボニトリル、
２−（｛６−［（３Ｒ）−３−アミノ−３−メチルピペリジン−１−イル］−１，３−ジメチル−２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−５−イル｝メチル）−４−フルオロベンゾニトリル、
６−［（３Ｒ）−３−アミノ−ピペリジン−１−イル］−５−（２−クロロ−５−フルオロ−ベンジル）−１，３−ジメチル−１，５−ジヒドロ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−２，４−ジオン、および
（Ｓ）−２−メチルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボン酸｛２−［（２−シアノピロリジン−１−イル）−２−オキソエチルアミノ］−２−メチルプロピル｝アミド、
からなる群から選択されるＤＰＰ−４阻害剤、またはその薬学的に許容される塩である。
【００２１】
本発明の実施形態Ａの上記のＤＰＰ−４阻害剤の中でより好ましいＤＰＰ−４阻害剤は、１−［（４−メチル−キナゾリン−２−イル）メチル］−３−メチル−７−（２−ブチン−１−イル）−８−（３−（Ｒ）−アミノ−ピペリジン−１−イル）−キサンチン、特に、その遊離塩基（リナグリプチンまたはＢＩ１３５６としてもまた公知である）である。
【００２２】
好ましくは、本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、リナグリプチン、シタグリプチン、ビルダグリプチン、アログリプチン、サクサグリプチン、テネリグリプチン、アナグリプチン、ゲミグリプチンおよびデュトグリプチン、または本明細書において記述したＤＰＰ−４阻害剤の１つの薬学的に許容される塩、またはそのプロドラッグからなる群から選択される。
【００２３】
本発明の範囲内で強調される特に好ましいＤＰＰ−４阻害剤は、リナグリプチンである。「リナグリプチン」という用語は、本明細書において用いられるように、その水和物および溶媒和物、ならびにその結晶形態を含めた、リナグリプチンまたは薬学的に許容されるその塩を指し、好ましくは、リナグリプチンは、１−［（４−メチル−キナゾリン−２−イル）メチル］−３−メチル−７−（２−ブチン−１−イル）−８−（３−（Ｒ）−アミノ−ピペリジン−１−イル）−キサンチンを指す。結晶形態は、ＷＯ２００７／１２８７２１に記載されている。リナグリプチンの製造方法は、例えば、特許出願ＷＯ２００４／０１８４６８およびＷＯ２００６／０４８４２７に記載されている。リナグリプチンは、極めて優れた効力および持続性効果と、好ましい薬理学的特性、受容体選択性および好ましい副作用プロファイルとを合わせ、または治療における予想外の治療上の利点または改善をもたらすため、構造的に比較できるＤＰＰ−４阻害剤から区別される。
【００２４】
実施形態Ａに関して、本発明の実施形態ＡによるＤＰＰ−４阻害剤のための合成方法は、当業者に公知である。有利なことには、本発明の実施形態ＡによるＤＰＰ−４阻害剤は、文献において記載されているような合成法を使用して調製することができる。このように、例えば、式（Ｉ）のプリン誘導体は、これらの開示が本明細書において組み込まれているＷＯ２００２／０６８４２０、ＷＯ２００４／０１８４６８、ＷＯ２００５／０８５２４６、ＷＯ２００６／０２９７６９またはＷＯ２００６／０４８４２７において記載されているようにして得ることができる。
式（ＩＩ）のプリン誘導体は、例えば、これらの開示が本明細書において組み込まれているＷＯ２００４／０５０６５８またはＷＯ２００５／１１０９９９において記載されているようにして得ることができる。
式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）のプリン誘導体は、例えば、これらの開示が本明細書において組み込まれているＷＯ２００６／０６８１６３、ＷＯ２００７／０７１７３８またはＷＯ２００８／０１７６７０において記載されているようにして得ることができる。本明細書の上記で特に記述されるこれらのＤＰＰ−４阻害剤の調製は、それと関連して記述される公開資料に開示されている。特定のＤＰＰ−４阻害剤の多形結晶の修飾および製剤は、それぞれ、これらの開示のその全体が本明細書において組み込まれているＷＯ２００７／１２８７２１およびＷＯ２００７／１２８７２４に開示されている。メトホルミンまたは他の組合せパートナーを有する特定のＤＰＰ−４阻害剤の製剤は、その開示内容がその全体が本明細書中に組み込まれているＷＯ２００９／１２１９４５に記載されている。
【００２５】
実施形態Ｂに関して、実施形態ＢのＤＰＰ−４阻害剤のための合成方法は、科学文献および／または公開された特許文献、特に、本明細書において引用したものに記載されている。
一実施形態において、本発明によるＤＰＰ−４阻害剤は好ましくは、経口的に投与される。
ＤＰＰ−４阻害剤の適切な用量および剤形は、当業者が決定してもよく、本明細書または関連する参照文献に記載されているものを含み得る。
温血の脊椎動物、特に、ヒトにおける医療用製品用途のために、本発明の化合物は通常、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量、好ましくは、いずれの場合にも、１日１〜４回で、０．０１〜１５ｍｇ／ｋｇまたは０．１〜１５ｍｇ／ｋｇで使用される。この目的のために、他の活性物質と併用してもよい化合物は、１種または複数種の不活性な従来の担体および／または希釈剤と共に、例えば、トウモロコシデンプン、ラクトース、グルコース、微結晶性セルロース、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、クエン酸、酒石酸、水、水／エタノール、水／グリセロール、水／ソルビトール、水／ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、セチルステアリルアルコール、カルボキシメチルセルロースまたは脂肪物質、例えば、ハードファットまたは適切なこれらの混合物と共に、従来のガレヌス調製物、例えば、単純なもしくはコーティングされた錠剤、カプセル剤、散剤、懸濁剤または坐剤中に一緒に組み込み得る。
本明細書に定義されているようなＤＰＰ−４阻害剤を含む本発明による医薬組成物は、このように当技術分野で記載されている通りであり、所望の投与経路に適した薬学的に許容される製剤賦形剤を使用して当業者によって調製される。このような賦形剤の例には、希釈剤に限定されずに、結合剤、担体、充填剤、滑沢剤、流動促進剤、結晶化遅延剤、崩壊剤、可溶化剤、着色剤、ｐＨ調節剤、界面活性剤および乳化剤が含まれる。
【００２６】
本発明のＤＰＰ−４阻害剤の経口製剤または剤形は、公知の技術によって調製し得る。
本発明の実施形態ＡによるＤＰＰ−４阻害剤の医薬組成物または剤形（例えば、経口錠剤）は典型的には、賦形剤として（活性成分に加えて）、例えば、好ましくは、それぞれが本明細書の下記に開示されている、１種または複数種の希釈剤、結合剤、崩壊剤、および滑沢剤を含有し得る。一実施形態において、崩壊剤は、任意選択であり得る。
【００２７】
実施形態Ａによる化合物のために適した希釈剤の例には、セルロースパウダー、リン酸水素カルシウム、エリトリトール、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、マンニトール、アルファ化デンプンまたはキシリトールが含まれる。
実施形態Ａによる化合物のために適した滑沢剤の例には、タルク、ポリエチレングリコール、ベヘン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、水添ヒマシ油またはステアリン酸マグネシウムが含まれる。
実施形態Ａによる化合物のために適した結合剤の例には、コポビドン（ビニルピロリドン（ｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎ）と他のビニル誘導体との共重合体）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎ）（ポビドン）、アルファ化デンプン、または低置換度ヒドロキシプロピルセルロース（Ｌ−ＨＰＣ）が含まれる。
実施形態Ａによる化合物のために適した崩壊剤の例には、トウモロコシデンプンまたはクロスポビドンが含まれる。
【００２８】
本発明の実施形態ＡによるＤＰＰ−４阻害剤の（経口）調製物または剤形を調製する適切な方法は、
粉末混合物中での適切な打錠賦形剤との活性物質の直接の打錠；
適切な賦形剤との造粒、およびそれに続く適切な賦形剤との混合、およびそれに続く打錠、およびフィルムコーティング；あるいは
カプセルへの粉末混合物または顆粒のパッキング
である。
適切な造粒方法は、
強力ミキサーにおける湿式造粒、それに続く流動床乾燥；
ワンポット造粒；
流動床造粒；あるいは
適切な賦形剤との乾式造粒（例えば、ローラー圧縮による）、およびそれに続く打錠またはカプセルへのパッキング
である。
【００２９】
本発明の実施形態ＡによるＤＰＰ−４阻害剤の経口使用のための例示的な組成物（例えば、錠剤コア）は、第１の希釈剤であるマンニトール、さらなる結合剤特性を有する第２の希釈剤としてアルファ化デンプン、結合剤であるコポビドン、崩壊剤であるトウモロコシデンプン、および滑沢剤としてステアリン酸マグネシウムを含み、コポビドンおよび／またはトウモロコシデンプンは、任意選択であり得る。
本発明の実施形態ＡによるＤＰＰ−４阻害剤の錠剤は、フィルムコーティングしてもよく、好ましくは、フィルムコートは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、タルク、二酸化チタンならびに酸化鉄（例えば、赤色および／または黄色）を含む。
別の実施形態において、本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、局所使用（ｔｏｐｉｃ  ｕｓｅ）を目的とするものであり、したがって、例えば、軟膏剤の形態であり得る。このような局所調製物は典型的には、局所調製物のための適切な担体材料、例えば、グリセリド、半合成および合成グリセリド、硬化油、液体ワックス、流動パラフィン、液体脂肪アルコール、ステロール、ポリエチレングリコールならびに／またはセルロース誘導体と共に、活性成分を含む。
本発明のＤＰＰ−４阻害剤の剤形、製剤および投与についての詳細について、科学文献および／または公開された特許文献、特に、本明細書において引用したものを参照する。
さらなる実施形態において、本発明によるＤＰＰ−４阻害剤は、局所的に投与し得る。別の実施形態において、ケラチン生成細胞は好ましくは、また局所的に投与される。
ケラチン生成細胞と組み合わせてもよいＤＰＰ−４阻害剤の（例えば、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ペースト剤、ゲル剤、被覆材、パッチ剤の形態の）局所調製物は典型的には、局所調製物のための適切な担体材料と共に活性成分を含む。
局所クリーム剤または軟膏剤タイプの調製物の担体材料の例には典型的には、（これらに限定されないが）皮膚軟化剤または柔軟剤、乳化剤または増粘剤、保湿剤および／または保湿剤、ゲル化剤、保存剤、油、ワックス、溶媒、香料、色素、抗酸化剤、消泡剤、安定化剤、ｐＨ調整剤など、例えば、グリセリド、半合成および合成グリセリド、硬化油、液体ワックス、流動パラフィン、液体脂肪アルコール、ステロール、ポリエチレングリコールおよび／またはセルロース誘導体が含まれる。
被覆材またはパッチ剤の担体材料の例には典型的には、生体適合性の合成または天然の材料であり得る（これらに限定されないが）ポリマーマトリックス材料が含まれる。
【００３０】
第１の実施形態（実施形態Ａ）に関して、本明細書において実施形態Ａで記述したＤＰＰ−４阻害剤に典型的に必要な投与量は、いずれの場合にも１日１〜４回で、静脈内に投与されるとき０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは、０．２５ｍｇ〜５ｍｇであり、経口的に投与されるとき０．５ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは、２．５ｍｇ〜５０ｍｇ、または０．５ｍｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは、２．５ｍｇ〜１０ｍｇ、または１ｍｇ〜５ｍｇである。このように、例えば、経口的に投与したときの１−［（４−メチル−キナゾリン−２−イル）メチル］−３−メチル−７−（２−ブチン−１−イル）−８−（３−（Ｒ）−アミノ−ピペリジン−１−イル）−キサンチンの投与量は、患者毎に１日当たり０．５ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは、患者毎に１日当たり２．５ｍｇ〜１０ｍｇ、または１ｍｇ〜５ｍｇである。
本明細書において実施形態Ａで記述したＤＰＰ−４阻害剤を含む医薬組成物で調製した剤形は、０．１〜１００ｍｇの投与量範囲の活性成分を含有する。このように、例えば、１−［（４−メチル−キナゾリン−２−イル）メチル］−３−メチル−７−（２−ブチン−１−イル）−８−（３−（Ｒ）−アミノ−ピペリジン−１−イル）−キサンチンの特定の経口の投薬強度は、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇおよび１０ｍｇである。
【００３１】
本発明のＤＰＰ−４阻害剤の特別の実施形態は、低用量レベルで、例えば、患者毎に１日当たり＜１００ｍｇ、または＜７０ｍｇの経口用量レベルで、患者毎に１日当たり、好ましくは、＜５０ｍｇ、より好ましくは、＜３０ｍｇ、または＜２０ｍｇ、さらにより好ましくは、１ｍｇ〜１０ｍｇ、特に、１ｍｇ〜５ｍｇ（より特定すると、５ｍｇ）で治療的に効果的な、これらの経口的に投与されるＤＰＰ−４阻害剤を指し（必要である場合、同じサイズでもよい１〜４つの単回用量、特に、１つまたは２つの単回用量に分割される）、優先的に、経口的に１日１回または２回（より優先的に１日１回）投与され、有利なことには、１日の何時でも、食物と共に、または伴わずに投与される。このように、例えば、１日の経口量である５ｍｇのＢＩ１３５６は、１日の何時でも、食物と共に、または伴わず、１日１回の投薬レジメン（すなわち５ｍｇのＢＩ１３５６、１日１回）、または１日２回の投薬レジメン（すなわち、２．５ｍｇのＢＩ１３５６、１日２回）で与えることができる。
【００３２】
本発明による組合せまたは組成物中の活性構成要素の投与量は変化し得るが、活性成分の量は、適切な剤形が得られるようなものとする。したがって、選択される投与量および選択した剤形は、所望の治療効果、投与経路および治療の期間によって異なるものとする。組合せのための投与量範囲は、単一の薬剤のための最大の許容される用量からより低い用量でよい。
本発明の意味の範囲内のケラチン生成細胞は、これらに限定されないが、本明細書中で上述したおよび後述するこれらのケラチン生成細胞のいずれかを含む。
本発明の好ましいケラチン生成細胞は、この開示が本明細書において組み込まれているＷＯ０３／０３３６８６において開示されているものである。
本発明は、不死化されておらず、かつインビトロの細胞培養法によって少なくとも１５０回複製することができる、高い増殖能を有するケラチン生成細胞を指す。これは、約１０４４の細胞増殖係数をもたらす。対応するケラチン生成細胞は、創傷、例えば、糖尿病性創傷（例えば、糖尿病性足病変または潰瘍）の治療のためのこれらの有利な特性をまだ保持する。
【００３３】
本発明による使用のためのケラチン生成細胞は、主としてドナーから単離されたケラチン生成細胞であり、インビトロで培養可能であり、単離および最初の培養は、例えば、１９７５年にＲｈｅｉｎｗａｌｄおよびＧｒｅｅｎによって記載された工程によって任意の当業者が行い得る。
これに関連して、本発明は好ましくは、包皮の上皮部分から単離したケラチン生成細胞を指す。ヒト起源のケラチン生成細胞、特に、ブダペスト協定による特許の手続の目的のために２００１年６月２７日にＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ［Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］、ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙにおいて受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２５１４にて寄託された培養物ＫＣ−ＢＩ−１のケラチン生成細胞が、本発明の目的のために好ましい。本発明はまた、ＫＣ−ＢＩ−１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２５１４）培養物に由来するケラチン生成細胞を指す。このように、本発明はまた、当初の培養物ＫＣ−ＢＩ−１を二次継代および／またはサブクローニングすることによって生じ、かつ／または生じ得る全ての細胞および培養物を指す。
【００３４】
本発明のケラチン生成細胞の培養を、、例としてケラチン生成細胞ＫＣ−ＢＩ−１と関連して記載する（例１）。例１において特定した自然培地の使用、および支持細胞の使用、好ましくは、致死的な放射線を浴びたマウスの３Ｔ３線維芽細胞の使用は、培養のために有利である。ウシ胎仔血清の量は、２〜１０％とする。支持細胞の調製は当業者には公知であり、例えば、例２において記載された工程によって行い得る。本発明によるケラチン生成細胞の８０％の最大コンフルエンスでの継代培養は特に有利である。ケラチン生成細胞は、３５〜３８℃にて、好ましくは、３７℃にて、＞９０％、好ましくは、９５％の相対湿度で、および５〜９％のＣＯ2飽和で培養し得る。
【００３５】
例１に記載されている工程によって、ケラチン生成細胞、特に、包皮の上皮部分からのヒトケラチン生成細胞についての集団倍加時間は、１〜２日である（図１）。細胞は、実質的に一定の複製速度で多数の継代に亘り培養することができる（図２）。しかし、本発明は、ケラチン生成細胞ＫＣ−ＢＩ−１に制限されず、むしろ、下記の実施形態Ｅ１〜Ｅ８による任意のケラチン生成細胞を意図する。
例えば、本発明による使用のためのケラチン生成細胞は、下記の実施形態Ｅ１〜Ｅ８にのようなケラチン生成細胞である。
Ｅ１：不死化されておらず、かつインビトロの細胞培養法によって少なくとも１５０回倍加し得ることを特徴とする、ケラチン生成細胞。
Ｅ２：包皮の上皮部分から単離される、実施形態Ｅ１によるケラチン生成細胞。
Ｅ３：ＫＣ−ＢＩ−１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２５１４）培養物からの細胞、またはこれに由来するケラチン生成細胞であることを特徴とする、実施形態Ｅ１によるケラチン生成細胞。
Ｅ４：ウシ胎仔血清の非存在下で、および／または
支持細胞の非存在下で、および／または
上皮増殖因子（ＥＧＦ）の非存在下で
複製することができない、実施形態Ｅ１〜Ｅ３によるケラチン生成細胞。
Ｅ５：好ましくは、不死化されたケラチン生成細胞（好ましくは、細胞株ＨａＣａＴ）と比較してテロメラーゼ活性をほとんどまたは全く有さない、実施形態Ｅ１〜Ｅ４によるケラチン生成細胞。
Ｅ６：インビトロの細胞培養法によって少なくとも２００回複製することができることを特徴とする、実施形態Ｅ１〜Ｅ５によるケラチン生成細胞。
Ｅ７：インビトロの細胞培養法によって少なくとも２５０回複製することができることを特徴とする、実施形態Ｅ１〜Ｅ６によるケラチン生成細胞。
Ｅ８：インビトロの細胞培養法によって少なくとも３００回複製することができることを特徴とする、実施形態Ｅ１〜Ｅ７によるケラチン生成細胞。
【００３６】
さらなる例のために、本発明による使用のためのケラチン生成細胞は、実施形態Ｆ１によるこのようなケラチン生成細胞である。
Ｆ１：ケラチン生成細胞であって、不死化されておらず、かつインビトロの細胞培養法によって少なくとも１５０回複製し得、かつＫＣ−ＢＩ−１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２５１４）培養物からの細胞、またはこれに由来するケラチン生成細胞であることを特徴とし、
ａ．ウシ胎仔血清の非存在下で、および／または
ｂ．支持細胞の非存在下で、および／または
ｃ．上皮増殖因子（ＥＧＦ）の非存在下で
複製することができず、前記ケラチン生成細胞のテロメラーゼ活性は、細胞株ＨａＣａＴのテロメラーゼ活性よりも少なくとも２分の１低く、
由来するケラチン生成細胞は、当初のＫＣ−ＢＩ−１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２５１４）培養物を二次継代および／またはサブクローニングすることによって生じ、かつ／または生じ得る細胞および培養物である、ケラチン生成細胞。
特定の実施形態において、本発明による組合せ、組成物、方法および使用は、組合せに関し、ＤＰＰ−４阻害剤およびケラチン生成細胞は好ましくは、表１における記入事項によって選択される。
【００３７】
【表１】
2015518843.tif 000018
【００３８】
本発明と関連して「不死化されていない」という表現は、最初に単離されたケラチン生成細胞、および、培養されたケラチン生成細胞が自発的に形質転換しておらず、かつ／または研究上公知の分子生物学的、化学的または物理的方法によって形質転換されていないことを意味する。後者は、例えば、ウイルス因子もしくは配列、化学的変異原物質を使用して、または例えば、照射または異なる工程の組合せによって細胞が処理されていないことを意味する。
「不死化されていない」ケラチン生成細胞はまた、形質転換腫瘍細胞株（Ｈａｒｌｅ−ＢａｃｈｏｒおよびＢｏｕｋａｍｐ、１９９３年）と比較して、または不死化された細胞株、好ましくは、細胞株ＨｅＬａと比較して、前記ケラチン生成細胞が、テロメラーゼ活性がないか、または大幅に低減したテロメラーゼ活性を有することを意味する（図３を参照されたい）。不死化されたケラチン生成細胞株ＨａＣａｔと比較して、これはまた特に当てはまる。
「不死化されていない」という表現はまた、前記ケラチン生成細胞が、例えば、不死化されたケラチン生成細胞が複製できる（Ｓｃｈｏｏｐら、１９９９年）ようには、ウシ胎仔血清の非存在下で、および／または支持細胞の非存在下で、および／または上皮増殖因子ＥＧＦの非存在下で複製することができないことを意味する。
しかし、「不死化されていない」という表現はまた、前記ケラチン生成細胞が、細胞複製の増加につれ、これらの特徴的な表現型を変化させないことを意味する（図４を参照されたい）。
「不死化されていない」とはまた、前記ケラチン生成細胞が、ヌードマウス、好ましくは、ＢＡＬＢ／ｃへの移植の後に正常な分化プロファイルを示すことを意味する。ここで「正常な分化能」とは、最終分化したケラチン生成細胞となり、かつ自家ケラチン生成細胞と同様に基底層上の上皮層および角質層を形成するケラチン生成細胞の能力を意味する。
【００３９】
本発明はまた、不死化されず、かつインビトロの細胞培養法によって少なくとも２００回複製することができるケラチン生成細胞を指す。本発明はさらに、不死化されず、かつインビトロの細胞培養法によって少なくとも２５０回複製することができるケラチン生成細胞を指す。本発明はまた、不死化されず、かつインビトロの細胞培養法によって少なくとも３００回複製することができるケラチン生成細胞を指す。
これらのケラチン生成細胞は、１つのみのドナーまたは少数のみのドナーから複製することができる。１つの供与から出発して、例えば、１０44個の細胞を、１５０回の細胞複製の後で生成し得、１０77個の細胞を、２５０回の細胞複製の後で生成し得、１０90個の細胞を、３００回の細胞複製の後で生成し得る。このように、一定の検証できる質の生物学的に活性な創傷治癒凝集物の調製のために大量の標準化された細胞材料を生成することが可能である。対応する量の標準化された細胞材料は、例えば、本発明による特性を有するケラチン生成細胞から生成される、凍結保存された細胞バンクから出発して複製し得る。
ケラチン生成細胞の単離は少数のドナー、好ましくは、１つのドナーに限定されるため、生物学的に活性な創傷治癒被覆材を調製するための出発材料として標準化された細胞材料を使用することによって、可能性のあるレシピエントへの感染の危険性はまた低減する。
このように、これによって、現在、従前のケラチン生成細胞の単に制限された継代からなる重大な不都合が克服される。
【００４０】
本発明はさらに、本発明のケラチン生成細胞であると本明細書において言及され、または本明細書において記述される、ケラチン生成細胞でコーティングされた担体を含む医薬組成物または医療用製品に関する。「コーティングされた」とは、本発明の目的に関して、本発明のケラチン生成細胞が担体の表面に部分的または全体に定着していることを意味する。部分的に定着された担体は、担体が創傷治療のために使用することができる前に短い培養時間を必要とするため特に適している。
【００４１】
本発明のケラチン生成細胞のための適切な担体は、薬学的に許容し得る生体適合性担体材料であることを特徴とする（例えば、医薬組成物を調製するために使用し得る）。疎水性の生体適合性担体材料を、例えば、ＷＯ９１／１３６３８において記載されているように使用し得る。しかし、主に親水性特性を有する担体材料を使用することがまた可能である。
好ましい本発明の実施形態は、エステル化されたヒアルロン酸（例えば、ベンジルエステル化されたヒアルロン酸）のポリマーを含有するような担体材料の使用を含む。特に好ましい実施形態において、明確な幾何形状の穿孔ポリマーフィルムからなるエステル化されたヒアルロン酸のポリマーを使用する。ポリマーフィルムは、例えば、１０〜５００μｍの厚さを有し、１０〜１０００μｍの寸法の穴が穿孔されており、穴は、所定の一定のサイズのものであり、５０〜１０００μｍの一定の間隔で互いに分離されている規則正しい列を形成する。この種類のフィルムは、ＥＰ０４６２４２６に記載されている。穿孔担体材料は、特定の方向で創傷上に置かれる生物学的に活性な創傷被覆材を必要としないため特に適している。例３は、例として、本発明のケラチン生成細胞が定着した明確な幾何形状のエステル化されたヒアルロン酸の穿孔担体マトリックスの調製を記載する。担体マトリックスは、ドイツにおいて製品名「Ｌａｓｅｒｓｋｉｎ」で市販されているＭｅｓｓｒｓ  Ｆｉｄｉａ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｌｔｄ．、Ａｂａｎｏ  Ｔｅｒｍｅ、Ｉｔａｌｙによって作製された製品である。
【００４２】
ケラチン生成細胞と併せて生物学的に活性な創傷被覆材を生成するためのこの担体材料の特定の適合性は、動物モデル（Ｌａｍら、１９９９年）およびヒト（Ｈａｒｒｉｓら、１９９９年）において既に示されてきた。上皮細胞の改善された移動および分化は別として、ヒアルロン酸エステルからなるマトリックスは、血管形成およびコラーゲン生成に対してプラスの効果を有する。しかし、マトリックスとしてヒアルロン酸エステルとまた共に使用される創傷被覆材は、自家ケラチン生成細胞、ならびに／またはケラチン生成細胞および線維芽細胞から得た複雑な構造の皮膚同等物でコーティングされている。したがって、これらはいくつかの不都合に見舞われる。これらの不都合は、本明細書に記載のような有利な同種異系ケラチン生成細胞の使用によって特に克服し得る。
【００４３】
本発明の別の実施形態は、担体としての再吸収可能なポリマー、例えば、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリデプシペプチド、ポリエーテルエステル、ポリアミノ酸またはポリホスファゼン、特に、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレン−カーボネート）および／またはポリ（ジオキサノン）から選択される１種または複数種と一緒に、本発明のケラチン生成細胞を含む医薬組成物または医療用製品に関する。これらのポリマーは、穿孔および非穿孔の両方でよい。
【００４４】
例えば、本発明のケラチン生成細胞を含有する医薬組成物または医療用製品は、下記の実施形態Ｅ９〜Ｅ１３によるこのような組成物または製品である。
Ｅ９：実施形態Ｅ１〜Ｅ８の１つによるケラチン生成細胞でコーティングされている担体を含むか、これからなる若しくはこれらから本質的になる医薬組成物または医療用製品であって、
ａ．前記担体にケラチン生成細胞が部分的に定着している；または
ｂ．前記担体にケラチン生成細胞が全体的に定着している、
前記医薬組成物または医療用製品。
Ｅ１０：担体が薬学的に許容し得る生体適合性担体材料であることを特徴とする、実施形態Ｅ９による医薬組成物または医療用製品。
Ｅ１１：担体材料が疎水性または親水性の生分解性膜であることを特徴とする、実施形態Ｅ１０による医薬組成物または医療用製品。
Ｅ１２：実施形態Ｅ１０またはＥ１１による医薬組成物または医療用製品であって、担体がエステル化されたヒアルロン酸のポリマー、好ましくは、所定の幾何形状の穿孔ポリマーフィルムであることを特徴とし、
前記ポリマーフィルムは、１０〜５００μｍの厚さを有し、１０〜１０００μｍの寸法の穴が穿孔されており、前記穴は、所定の一定のサイズを有し、規則正しい列を形成し、５０〜１０００μｍの一定の間隔で互いに分離されている、医薬組成物または医療用製品。
Ｅ１３：実施形態Ｅ１０またはＥ１１による医薬組成物または医療用製品であって、担体材料が、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリデプシペプチド、ポリエーテルエステル、ポリアミノ酸またはポリホスファゼン、
ａ．特に、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレン−カーボネート）またはポリ（ジオキサノン）であることを特徴とし、
ｂ．前記ポリマーは穿孔されている、または
ｃ．前記ポリマーは穿孔されていない、
前記医薬組成物または医療用製品。
【００４５】
さらなる例のために、本発明のケラチン生成細胞を含有する組成物または製品は、下記の実施形態Ｆ２〜Ｆ６によるこのような組成物または製品である。
Ｆ２：実施形態Ｆ１によるケラチン生成細胞でコーティングされている担体を含み、これからなり、またはこれから本質的になる医薬組成物または医療用製品であって、
ａ．前記担体にケラチン生成細胞が部分的に定着している；または
ｂ．前記担体にケラチン生成細胞が全体的に定着している、
前記医薬組成物または医療用製品。
Ｆ３：担体が薬学的に許容し得る生体適合性担体材料であることを特徴とする、実施形態Ｆ２による医薬組成物または医療用製品。
Ｆ４：担体材料が疎水性または親水性の生分解性膜であることを特徴とする、実施形態Ｆ２による医薬組成物または医療用製品。
Ｆ５：実施形態Ｆ３またはＦ４による医薬組成物または医療用製品であって、担体がエステル化されたヒアルロン酸のポリマー、好ましくは、明確な幾何形状の穿孔ポリマーフィルムであることを特徴とし、前記ポリマーフィルムは、１０〜５００μｍの厚さを有し、１０〜１０００μｍの寸法の穴が穿孔されており、穴は、所定の一定のサイズを有し、規則正しい列を形成し、これらは５０〜１０００μｍの一定の間隔で互いに分離されている、医薬組成物または医療用製品。
Ｆ６：実施形態Ｆ３またはＦ４による医薬組成物または医療用製品であって、担体材料が、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリデプシペプチド、ポリエーテルエステル、ポリアミノ酸またはポリホスファゼン、
ａ．特に、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレン−カーボネート）またはポリ（ジオキサノン）であることを特徴とし、
ｂ．前記ポリマーは穿孔されている、または
ｃ．前記ポリマーは穿孔されていない、前記医薬組成物または医療用製品。
【００４６】
さらに、本発明は、適切な担体（例えば、穿孔されたエステル化されたヒアルロン酸ポリマーマトリックス）、およびＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチンと一緒に、本発明のケラチン生成細胞（例えば、少なくとも１つの実施形態Ｅ１〜Ｅ８またはＦ１によるこのようなケラチン生成細胞）を含有する、医薬組成物または医療用製品（例えば、局所使用のための医薬組成物、または生物学的に活性な創傷被覆材、ＢＡＷＤ）に関する。
さらに、本発明は、本発明のケラチン生成細胞（例えば、少なくとも１つの実施形態Ｅ１〜Ｅ８またはＦ１によるこのようなケラチン生成細胞）でコーティングされている担体（例えば、本明細書に記載のような）、およびＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチンからなる医薬組成物または医療用製品を含有する、医薬組成物または医療用製品（例えば、局所使用のための医薬組成物、または生物学的に活性な創傷被覆材、ＢＡＷＤ）に関する。
【００４７】
さらに、本発明は、少なくとも１つの実施形態Ｅ９〜Ｅ１３またはＦ２〜Ｆ６による医薬組成物または医療用製品、およびＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチンを含有する、医薬組成物または医療用製品（例えば、局所使用のための医薬組成物、または生物学的に活性な創傷被覆材、ＢＡＷＤ）に関する。
さらに、本発明は、
ａ）本発明のケラチン生成細胞（例えば、少なくとも１つの実施形態Ｅ１〜Ｅ８またはＦ１によるこのようなケラチン生成細胞）、および任意選択で薬学的に許容される担体（例えば、エステル化されたヒアルロン酸マトリックス）、例えば、少なくとも１つの実施形態Ｅ９〜Ｅ１３またはＦ２〜Ｆ６による医薬組成物または医療用製品、ならびに
ｂ）ＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチン、
を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる、組み合わせ医薬、医薬組成物または医療用製品（例えば、局所使用のための医薬組成物、または生物学的に活性な創傷被覆材、ＢＡＷＤ）に関する。
【００４８】
さらに、本発明は、
ａ）本発明のケラチン生成細胞（例えば、少なくとも１つの実施形態Ｅ１〜Ｅ８またはＦ１によるこのようなケラチン生成細胞）、および任意選択で１種または複数種の薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物または医療用製品、ならびに
ｂ）ＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチン、および任意選択で１種または複数種の薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物または医療用製品
を含む、キットまたは製品に関する。
【００４９】
本発明のケラチン生成細胞を−２０℃〜−１９６℃の温度で、好ましくは、−１８０℃未満の温度で凍結保存する方法をまた提供する。前記ケラチン生成細胞は、当業者によく知られている標準化された方法によって冷凍することができる。ＤＭＳＯは、とりわけ、凍結防止剤として使用し得る。他の凍結防止剤、例えば、グリセロール、ヒドロキシエチルデンプンまたは２つの組合せ、およびこれらとＤＭＳＯとの組合せを使用することもまた可能である。適切な方法は、例えば、ＷＯ９６／２４０１８、ＵＳ５，８９１，６１７またはＵＳ５，２９８，４１７に記載されている。
これらの対応する担体を伴うケラチン生成細胞が、−２０℃〜−１９６℃、好ましくは、−６０℃〜−８０℃の温度で凍結保存されることを特徴とする、本発明のケラチン生成細胞でコーティングされている担体の凍結保存をまた提供する。凍結保存の利点は、大量に得られた生成物を貯蔵して、このように臨床使用の前に無作為抽出によって質の均一性について検査することができることである。最終的に、貯蔵をすることによって、医学的目的のために急な予告でも創傷治癒凝集物が利用可能であることを確実にする。
本発明のこのようなケラチン生成細胞含有製品のために適した凍結防止剤は、例えば、７〜１３％（ｗ／ｗ）の濃度のヒドロキシエチルデンプンである。しかし、ＤＭＳＯまたはグリセロール、ならびに様々な凍結防止剤、特に、ヒドロキシエチルデンプン、ＤＭＳＯおよび／またはグリセロールの組合せを使用することもまた可能である。トレハロースを凍結防止剤として使用することもまた可能である。
２〜５分以内で３７℃から−５〜−１０℃、好ましくは、−６〜−８℃への温度の急速な低減の後、担体および本発明のケラチン生成細胞を含む製品は、適正な温度で１５〜３０分間、好ましくは、２３〜２６分間平衡化させる。次いで、製品を、＜１℃／分、好ましくは、０．２〜０．６℃／分、最も好ましくは、０．４℃／分の冷凍速度で、例えば、−６０〜−８０℃の温度に冷却する。
【００５０】
例４は、例として、ＫＣ−ＢＩ−１でコーティングしたヒアルロン酸エステルの担体マトリックスの凍結保存を記載する。しかし、凍結保存の他の方法、例えば、ＷＯ９５／７０７６１１、ＷＯ９６／２４０１８、ＥＰ０２９６４７５に記載されている方法を使用することもまた可能である。このリストは、網羅的であると見なすべきではなく、生体適合性担体およびケラチン生成細胞からなる製品を凍結保存する方法が、現時点の技術水準の部分であることを単に示す。
本発明はさらに、創傷、例えば、糖尿病性創傷（例えば、糖尿病性足病変もしくは潰瘍）、および／または熱傷の治療において使用するための、本発明による医薬組成物または医療用製品に関する。
本発明はさらに、創傷、例えば、糖尿病性創傷（例えば、糖尿病性足病変もしくは潰瘍）、および／または熱傷の治療において使用するための医療用製品を調製するための、本発明による医薬組成物または医療用製品の使用に関する。
本発明はまた、ＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチンと組み合わせてもよい本明細書で記載する本発明のケラチン生成細胞の医学的使用、および／あるいはＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチンと組み合わせてもよい本明細書で記載する担体オプションを伴う前記ケラチン生成細胞の組成物または製品、特に、創傷、例えば、糖尿病性創傷（例えば、糖尿病性足病変または潰瘍）を治療するためのこれらの使用に関する。
【００５１】
本発明の一実施形態は、熱傷および／または潰瘍の治療における、ＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチンと組み合わせてもよい、本発明のケラチン生成細胞、および／または担体を伴う前記ケラチン生成細胞の組成物または製品の使用に関する。
治療し得る熱傷は、好ましくは、第２度熱傷であり、一方、潰瘍は、好ましくは、下腿潰瘍、好ましくは、静脈性下腿潰瘍もしくは糖尿病性潰瘍タイプの治癒が困難である下腿の慢性潰瘍、およびまた褥瘡性潰瘍である。
医学的使用は、創傷治癒に対する有益な効果を有する当技術分野において公知の従来の治療との、本発明による活性化合物、組合せ、組成物または製品の併用使用および／または補充的使用を含む。これは、創傷治癒に対して有益な効果を有する１種または複数種の他の物質の併用使用および／または補充的使用を意味する。親水コロイド被覆材による静脈性下腿潰瘍の補充的治療および／または併用治療、ならびに／あるいは抗微生物物質のさらなる使用、例えば、抗生物質の投与について記述を行い得る。組み合わせたＲｅｇｒａｎｅｘ（商標）（カルボキシメチルセルロース中のヒト組換え血小板由来増殖因子）を使用した、または組み合わせたＮｏｒＬｅｕ3−アンジオテンシン（１−７）を使用した糖尿病性創傷の治療についてさらに記述を行い得る。
【００５２】
本発明はまた、創傷の治療のための、例えば、熱傷および／または潰瘍の治療のための、例えば、第２度熱傷、下腿潰瘍（静脈性）、糖尿病性潰瘍または褥瘡性潰瘍；特に、糖尿病性創傷（例えば、糖尿病性足病変または潰瘍）の治療のための医薬を調製するための、ＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチンと組み合わせてもよい、少なくとも本発明のケラチン生成細胞を含有する本発明による組合せ、組成物または製品、ならびに／あるいは生体適合性担体および前記ケラチン生成細胞の組成物または製品に関する。
本発明はさらに、これらの創傷を治療する方法であって、ＤＰＰ−４阻害剤、特に、リナグリプチンと組み合わせてもよい、本発明のケラチン生成細胞、ならびに／またはケラチン生成細胞および担体を含む本発明の生成物が治療される創傷上に置かれることを特徴とする、前記方法に関する。ケラチン生成細胞および生成物は新鮮なまま、または凍結保存後に使用し得る。創傷を治療する対応する方法を例５において記載する。
【実施例】
【００５３】
（例１）
ＫＣ−ＢＩ−１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２５１４）培養物を一例とした、本発明によるケラチン生成細胞を培養する方法
１．材料
ケラチン生成細胞ＫＣ−ＢＩ−１；放射線照射した３Ｔ３−マウスの線維芽細胞（支持細胞、調製については、例２を参照されたい）；細胞培養培地Ｋ／１（組成については、下記を参照されたい）；ＥＤＴＡ（０．０２％）；トリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％／０．０１％）；細胞培養フラスコ（Ｔ−フラスコ）：２５ｃｍ2、８０ｃｍ2、１７５ｃｍ2
【００５４】
２．細胞の融解
２．１  支持細胞の融解
細胞を急速に融解し、５〜１０ｍｌの予熱したＫ／１培地中に置く。対応する量の支持細胞を、適切な細胞培養フラスコ中に移し、Ｋ／１培地を継ぎ足す。
２５ｃｍ2のＴ−フラスコ、０．５×１０6個の細胞、培地の最終容量：５〜６ｍｌ
８０ｃｍ2のＴ−フラスコ、１．５×１０6個の細胞、培地の最終容量：２０ｍｌ
１７５ｃｍ2のＴ−フラスコ、３．５×１０6個の細胞、培地の最終容量：５０ｍｌ
支持細胞は、直ちにまたは２４時間以内に使用し得る。
２．２  ケラチン生成細胞の融解
細胞を急速に融解し、５〜１０ｍｌの予熱したＫ／１培地中に置く。対応する量の細胞を既に支持細胞を含有する細胞培養フラスコに加え、新鮮な培地を継ぎ足す。
２５ｃｍ2のＴ−フラスコ、０．１５×１０6個の細胞；培地の最終容量：６〜１０ｍＬ
８０ｃｍ2のＴ−フラスコ、０．４×１０6個の細胞；培地の最終容量：２０ｍＬ
１７５ｃｍ2のＴ−フラスコ、１×１０6個の細胞；培地の最終容量：５０ｍＬ
【００５５】
３．０  培養
細胞を、３５〜３９℃、好ましくは、３７℃にてインキュベートする。相対湿度は、＞９０％、好ましくは、９５％であり、ＣＯ2濃度は、５〜９％である。ケラチン生成細胞を、８０％の最大コンフルエンスで二次培養する。
このために、細胞培養上清を廃棄する。支持細胞を０．０２％ＥＤＴＡ（２〜１０ｍｌ）で２回すすぎ、３７℃にて５〜１０分間インキュベートし、次いで、これを軽く叩く（または、これを振盪する）ことによって細胞培養フラスコから剥離する。次いで、ケラチン生成細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％／０．０１％、１〜６ｍｌ）で５〜１０分間３７℃にて処理し、軽く叩くことによって注意深く剥離する。必要に応じて、細胞スパチュラを使用して残りの細胞を注意深くかき落とす。トリプシン／ＥＤＴＡ溶液をＫ／１培地を加えることによって中和し、細胞を注意深く上下にピペッティングすることによって分離する。細胞を２．２において特定した細胞数で播種する。細胞培養培地Ｋ／１を、３日目に、次いで２日毎に変更する。
【００５６】
４．０  Ｋ／１培地の調製
全ての構成要素および原液を、表１において示した順序で次々に合わせる。混合物をＷＦＩ（注射用水）で１リットルにする。次いで、ｐＨを、ＮａＯＨまたはＨＣｌで７．０〜７．２に調節する。モル浸透圧濃度は、３２０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇであるはずである。最終的に、培地Ｋ／１を無菌濾過する。
４．１  原液の調製
トリヨードチロニン
１３．６ｍｇのトリヨードチロニンを１ｍｌの０．１ＮａＯＨに溶解し、９９ｍｌのＰＢＳをここに加える。最終の溶液をＰＢＳ中で１：１００に希釈する。１ｍｌのこの溶液が１リットルの培地毎に必要である。
【００５７】
ＥＧＦ
１ｍｇのＥＧＦを、１００ｍｌのＷＦＩに溶解する。１ｍｌのこの溶液が１リットルの培地毎に必要である。
ｒｈ−インスリン（ｐＨ＜４．０でのみ可溶性）
５ｇのｒｈ−インスリンを０．９ＬのＷＦＩに加え、ｐＨを６ＭのＨＣｌで２．５に調節する。ｒｈ−インスリンが溶解した後、１ＭのＮａＯＨでｐＨを８．０に調節する。混合物を、ＷＦＩで１リットルにする。１ｍｌのこの溶液が１リットルの培地毎に必要である。
【００５８】
４．２  培地の組成
【表２】
2015518843.tif 000019
しかし、細胞は、新鮮な生検材料から、例えば、包皮の上皮部分からも培養し得る。未分化の増殖性のケラチン生成細胞の初代単離は、１９７５年にＲｈｅｉｎｗａｌｄおよびＧｒｅｅｎによって記載された方法を使用して行い得る。
使用される支持細胞は、例えば、例２に記載した細胞であり得る。他の致死的な線維芽細胞、好ましくは、他のげっ歯類線維芽細胞、最も好ましくは、細胞株３Ｔ３の子孫を使用することがまた考えられる。
【００５９】
（例２）
ケラチン生成細胞を培養するための放射線照射した３Ｔ３支持細胞の調製
１．材料
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡから入手できるマウスの３Ｔ３線維芽細胞（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ９２、３Ｔ３−スイスアルビノ、接触阻害された線維芽細胞）、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）；ＰＢＳ；０．２％トリプシン溶液；０．０４％ＥＤＴＡ溶液；細胞培養フラスコ（Ｔ−フラスコ）：２５ｃｍ2、８０ｃｍ2、１７５ｃｍ2
２．細胞の融解
細胞を急速に融解し、５〜１０ｍｌの予熱した培地に加える。ＤＭＳＯ含有培地を、遠心分離の後で除去する。細胞を、５〜１０ｍｌの培地に懸濁させる。細胞数を決定した後、細胞を、１０3〜１０4個の細胞／ｃｍ2の密度で適切な細胞培養フラスコ中に播種する。これらを、３５〜３９℃で、好ましくは、３７℃でインキュベートする。相対湿度は、＞９０％、好ましくは、９５％であり、ＣＯ2濃度は、５〜９％である。
【００６０】
３．細胞の培養
細胞を増殖について毎日検査する。細胞密度は、７０〜８０％の最大コンフルエンスを超えてはならない。必要に応じて、２〜４日毎に継代培養を行う。このために、培地を廃棄し、細胞を適切な量のＥＤＴＡおよびトリプシンの１：２混合物（０．５〜５ｍｌ）で洗浄する。次いで、剥離した細胞を、３．５〜２０ｍｌの培地に溶解する。細胞を、１０3〜１０4個の細胞／ｃｍ2の密度で再播種する。
４．支持細胞の照射
支持細胞に、約６０Ｇｙの線量（137Ｃｓ源で６０００ラド）の放射線を照射する。
放射線照射細胞および放射線照射していない細胞のどちらも標準的な方法を使用して液体窒素中で凍結保存し、長期間貯蔵することができる。
【００６１】
（例３）
担体マトリックス（この例ではＬａｓｅｒｓｋｉｎ）を、ＫＣ−ＢＩ−１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２５１４）培養物からのケラチン生成細胞でコーティングする方法
本発明による生物学的に活性な創傷治癒被覆材の調製をこれから例として記載する。本明細書において記載する創傷治癒被覆材は、本発明によるケラチン生成細胞ＫＣ−ＢＩ−１およびＬａｓｅｒｓｋｉｎ、生体が再吸収可能なヒアルロン酸エステルの担体マトリックス、からなる。
しかし、本発明は、本明細書に記載されている組合せに制限されない。むしろ、請求項１から８において列挙した新規な特性を有する任意のケラチン生成細胞をコーティングのために使用し得る。
医薬組成物を調製するために使用し得る生体適合性担体材料であることを条件として、他の適切な担体マトリックスを使用することも可能である。例えば、ＷＯ９１／１３６３８に記載されているような疎水性の生体適合性担体材料を使用し得る。しかし、さらに、主に親水性特性を有する担体材料を使用することがまた可能である。
【００６２】
本発明の別の好ましい実施形態は、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリデプシペプチド、ポリエーテルエステル、ポリアミノ酸またはポリホスファゼン、特に、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレン−カーボネート）またはポリ（ジオキサノン）からなる再吸収可能なポリマーと一緒に本発明によるケラチン生成細胞を使用すること、および前記ポリマーからなる穿孔フィルムを使用することを含む。
【００６３】
１．材料
Ｋ／１培地（例１を参照されたい）；ＰＢＳ、０．０４％ＥＤＴＡ（ＰＢＳで０．０２％に希釈）；トリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％／０．０１％）；無菌Ｒｏｕｘ皿（Ｔ２５ｃｍ2、Ｔ８０ｃｍ2、Ｔ１７５ｃｍ2）、Ｌａｓｅｒｓｋｉｎ（Ｍｅｓｓｒｓ．Ｆｉｄｉａ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｓｒｌ、Ａｂａｎｏ  Ｔｅｒｍｅ、Ｉｔａｌｙ）、１４４×２１のペトリ皿（表面積１４５ｃｍ2）中；３Ｔ３支持細胞；本発明によるケラチン生成細胞、例えば、ＫＣ−ＢＩ−１。
【００６４】
２．生物学的に活性な創傷治癒ドレッシング材の培養
２．１．材料
放射線照射した支持細胞、例えば、例２において記述したマウスの３Ｔ３線維芽細胞；ストックからの本発明によるケラチン生成細胞；ペトリ皿中の８．５ｃｍ×８．５ｃｍの小片のＬａｓｅｒｓｋｉｎ（最終生成物）；Ｋ／２培地
２．２．３Ｔ３支持細胞の播種
例２によって調製した支持細胞を、約１５，０００〜２５，０００個の細胞／ｃｍ2の播種密度（おおよそ３×１０6個の細胞／ペトリ皿に対応）でＬａｓｅｒｓｋｉｎ上に置く。次いで、ペトリ皿を、３７℃のインキュベーターにおいて、３５〜３７℃にて＞９０％相対湿度および５〜１１％ＣＯ2、好ましくは、７〜９％でインキュベートする。ケラチン生成細胞を、同じ日に、または遅くても翌日に（２４時間後）支持細胞ローン（ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌａｗｎ）上に播種する。
【００６５】
２．３．ケラチン生成細胞の播種および培養
生物学的に活性な創傷治癒被覆材を、本発明によるケラチン生成細胞を用いて調製する。ケラチン生成細胞の継代培養は、例えば、下記のように行い得る。
サブコンフルエント培養物を、０．０２％ＥＤＴＡで１回すすぐ（８０ｃｍ2のＲｏｕｘ皿：８ｍＬ；１７５ｃｍ2のＲｏｕｘ皿：１０ｍｌ）。次いで、支持細胞を、０．０２％ＥＤＴＡと共に３７℃にて５〜１０分間インキュベートし（８０ｃｍ2のＲｏｕｘ皿：８ｍＬ；１７５ｃｍ2のＲｏｕｘ皿：１０ｍｌ）、注意深く振盪することによって剥離する。
ケラチン生成細胞を、例１におけるように、トリプシン／ＥＤＴＡ混合物（０．０５％／０．０１％）（８０ｃｍ2のＲｏｕｘ皿：２〜３ｍＬ；１７５ｃｍ2のＲｏｕｘ皿：５〜６ｍｌ）で剥離し、次いで、細胞培養培地に溶解し（８０ｃｍ2のＲｏｕｘ皿：７〜８ｍＬ；１７５ｃｍ2のＲｏｕｘ皿：１４〜１５ｍｌ）、注意深く上下にピペッティングすることによって分離する。
本発明によるケラチン生成細胞を、支持細胞を装荷したＬａｓｅｒｓｋｉｎフィルムに約１５，０００〜２５，０００個の細胞／ｃｍ2の播種密度（おおよそ３×１０6個の細胞／ペトリ皿に対応する）で適用する。次いで、細胞を、３５〜３９℃にて、好ましくは、３７℃にて、３０〜１００％のコンフルエンス、好ましくは、８０〜１００％のコンフルエンスまでインキュベートする。相対湿度は、＞９０％、好ましくは、９５％であり、ＣＯ2濃度は、５〜９％である。
【００６６】
（例４）
本発明による生物学的に活性な創傷治癒被覆材を凍結保存する方法
ケラチン生成細胞が担体マトリックスに３０〜１００％、好ましくは、８０〜１００％のコンフルエンスまで定着した後、本発明による製品は、制御条件下にて適切な容器、例えばヒートシール可能なＰＰバッグ中で凍結し得る。これを行うために、培養培地を注意深く除去し、２〜６℃の温度にて２０ｍｌのＫ／２凍結保存用培地で置き換える。次いで、製品を無菌状態下にてパッケージし、下記の手順によって冷凍する。
２〜５分以内に温度を−５〜−１０℃、好ましくは、−６〜−８℃に急速に低下させた後、製品を、対応する温度で１５〜３０分間、好ましくは、２３〜２５分間平衡化させる。次いで、製品を、＜１℃／分、好ましくは、０．２〜０．６℃／分、最も好ましくは、０．４℃／分の冷凍速度で、例えば、−６０〜−８０℃の温度に冷却する。製品を、−６０〜−８０℃で貯蔵する。
Ｋ／２凍結保存用培地：
７〜１３％（ｗ／ｗ）のヒドロキシエチルデンプンと混合したＫ／１増殖培地（例１を参照されたい）。
【００６７】
（例５）
静脈性下肢潰瘍を一例とした、創傷をカバーするための、本発明によるケラチン生成細胞が定着した担体マトリックスの使用の例
１．新たに調製した創傷治癒被覆材の輸送
ケラチン生成細胞がＬａｓｅｒｓｋｉｎ上で３０〜１００％、好ましくは、８０〜１００％のコンフルエンスまで増殖した後、培養物を、適切な量、好ましくは、３０ｍｌのＫ／３輸送培地で１回または複数回すすぐ。生物学的に活性な創傷治癒被覆材を、適切な量、好ましくは、２０ｍｌのＫ／３輸送培地で輸送する。ペトリ皿の上部空間に５〜１０％ＣＯ2の空気混合物を短時間供給し、接着テープ、例えばパラフィルムで密封し、輸送ボックス中で直ちに診療所に搬送する。
Ｋ／３輸送培地：
ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含まない増殖培地Ｋ／１（例１を参照されたい）。しかし、例えば、リン酸−ホウ酸ベース、例えばＰＢＳをベースとする、またはＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）もしくはＭＥＳ（［２−Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）をベースとする、単純な生理食塩水を使用することがまた可能である。
２．凍結保存された創傷治癒被覆材の輸送
凍結保存された創傷治癒被覆材は典型的には、診療所にドライアイス上で供給し得る。しかし、他の形態の輸送が可能であるが、ただし、創傷治癒被覆材は、−６０℃未満の温度で輸送される。
凍結保存された創傷治癒被覆材を、急速に融解する。次いで、凍結保存用培地を除去し、被覆材を、Ｋ／３輸送培地（上記を参照されたい）または別の適切な生理学的溶液、例えば、リンゲル液で１回または複数回すすぐ。
【００６８】
３．治療的使用
次いで、被覆材を創傷の上に置く。非穿孔担体材料を使用するとき、細胞が創傷に面しているように創傷治癒被覆材は正確に配置しなくてはならない。担体（例えば、Ｌａｓｅｒｓｋｉｎ）の両側にケラチン生成細胞が定着することを可能とする穿孔担体を使用することは、治療される創傷上に特定の方向で本発明による創傷治癒被覆材を置く必要がないことを意味する。治療の成功次第で、治療は、何回も繰り返し得る。
【００６９】
（例６）
ケラチン生成細胞ＫＣ−ＢＩ−１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２５１４）の遺伝的特性決定
ＫＣ−ＢＩ−１細胞を、上記の本発明の方法を使用して、いくつかの継代に亘って二次培養した。次いで、継代４代、１３代および１２１代からの細胞を、遺伝学的分析に供し、１５の異なる遺伝子座（ＣＳＦ１ＰＯ、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、ＦＧＡ、Ｐｅｎｔａ  Ｄ、Ｐｅｎｔａ  Ｅ、ＴＨ０１、ＴＰＯＸおよびｖＷＡ）の長さの多型を調査した。分析は、当技術分野において公知の方法を使用して行った。このために、メーカーの指示によって、Ｍｅｓｓｒｓ  Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって生成された父性を決定するための試験（ＰｏｅｗｅｒＰｌｅｘ１６システム）を使用して、対応する対立遺伝子を増幅した。対立遺伝子は、断片長を決定することによって同定し得る（長さの基準であるＩＬＳ６００は、上記のキットの部分である）。集団における対立遺伝子頻度についてのデータは、対応する表に見出すことができる。
【００７０】
分析は、分析した細胞継代の全てについての全ての遺伝子座における全ての対立遺伝子の一致を示した。このように、データは、ＫＣ−ＢＩ−１細胞が遺伝学的に分類されることを可能とする。＞９９．９９９％の分類確率を、対立遺伝子頻度から決定した。
【００７１】
ＤＮＡ長多型の決定：
【表３】
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【００７２】
生物学的に活性な創傷被覆材は、糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにおける創傷治癒を改善させる
糖尿病性潰瘍は糖尿病の重大な臨床的合併症であり、治療法の選択肢は限定されている。生物学的に活性な創傷被覆材（ＢＡＷＤ）は、薬理学的に活性なヒトケラチン生成細胞（ＫＣＢＩ１）および担体であるＬａｓｅｒｓｋｉｎ（商標）（Ｆｉｄｉａ）、穿孔ヒアルロン酸マトリックスからなる。ＫＣＢＩ１は、ヒト包皮から単離した広範に特性決定された安全で高度に増殖性のケラチン生成細胞株である。
・ＫＣＢＩ１の単一細胞懸濁液を、補充物、例えば、ＥＧＦ、アデニン、インスリン、ヒドロコルチゾン、フォルスコリン、およびウシ胎仔血清を含有する標準的なケラチン生成細胞培地中の６０Ｇｙの致死的な放射線照射した３Ｔ３支持細胞層のマトリックス上で培養した。ケラチン生成細胞および支持細胞についての細胞播種は、それぞれ、６０００個／ｃｍ2および１０,０００個／ｃｍ2であった。細胞はコンフルエントになるまでＬａｓｅｒｓｋｉｎマトリックス上で７日間培養した。
・実験の前に、８ｍｍのパンチを作製し、細胞層が創傷の上になるように適用した。これらを、Ｃｕｔｉｃｅｒｉｎ（Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆ）およびＴｅｇａｄｅｒｍ（３Ｍ  Ｍｅｄｉｃａ）でカバーした。
【００７３】
動物への創傷
・１２週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｄｂ／ｄｂマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｗｉｇａ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙから）を、個々に檻に入れた、体重についてモニターし、傷をつけた。マウスを麻酔し、６つの全層創傷（直径５ｍｍ、３〜４ｍｍ離れている）を、各マウスの背中に作製した3
・皮膚の生検標本は、傷害後３日目および１０日目に動物から得た
・地域の倫理動物審査委員会のガイドラインおよび承認によって全ての動物実験を行った
【００７４】
マウスの処置
・各実験群は、７匹の個々のｄｂ／ｄｂマウスからなった
・創傷を負わせた直後に、各マウスは、ヒアルロン酸マトリックス単独（２つの後側の創傷）、ヒアルロン酸およびヒトケラチン生成細胞層（ＢＡＷＤ、２つの中央の創傷）を使用して、背中の皮膚創傷を被覆するか、または被覆しなかった（２つの前側の創傷）。創傷組織を、手術後の３日目および１０日目に屠殺したマウスから単離した
・全てのｄｂ／ｄｂマウスの血中グルコースレベルは＞４００ｍｇ／ｄＬであり、時間と共に変化しなかった
創傷を単離し、傷害後１０日目に組織学的に（免疫組織化学）および直接のＲＮＡ配列決定によって分析した。
【００７５】
ＢＡＷＤで処置した創傷は、創傷閉鎖の顕著な進歩を示した。創傷は、創縁からの再上皮形成、高い細胞充実性を伴う強固な肉芽組織（図５）、および多数の新たに形成された血管の存在を示した。対照的に、対照創傷は、肉芽組織および血管形成を伴わない重度の損なわれた状態が持続した。創傷を負わせた後１０日目におけるヒトＶＥＧＦおよびＩＬ−８ｍＲＮＡ転写物の発現は、適用したヒトケラチン生成細胞がマウスの創傷組織において生存可能であったことを示唆した。重要なことに、重度の糖尿病の表現型の存在下でＢＡＷＤによって推進される著しい改善が起こったため、データは組織再生がマウスの糖尿病の状態に依存していなかったことを示す。要約すれば、糖尿病性潰瘍についての新規な治療法についてのこの研究は、根底にある病態生理学的過程に関わらず、重度の糖尿病の表現型の存在下でＢＡＷＤが創傷修復を刺激することを示唆する。
【００７６】
参考文献
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【図１】
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【図３】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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