(57)【要約】  本発明は、グルカゴン、油相及び水相を含有し、水中油滴型ナノエマルジョンを提供する。前記グルカゴンは物理的に及び化学的に安定であり、前記ナノエマルジョンは、低血糖治療のための、手動注入による又はポンプによる投与に適している。
2015503565.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルカゴン、
油相、及び
水相、
を含む水中油滴型ナノエマルジョン組成物であって、３７℃で３〜７日貯蔵後にグルカゴンが凝集せず、そしてその濃度の７５％以上が維持され、そして前記油相は約２００ｎｍ未満の平均直径を有する油滴の形態である、前記水中油滴型ナノエマルジョン組成物。
【請求項２】
前記油相がリン脂質及び油を含む、請求項１に記載のナノエマルジョン組成物。
【請求項３】
前記油相が、ナノエマルジョンの約１０〜２０重量％であり、そしてリン脂質濃度が油の濃度以上である、請求項２に記載のナノエマルジョン組成物。
【請求項４】
５０％以上のグルカゴンが非共有結合的に油相と結合している、先行する請求項いずれか一項に記載のナノエマルジョン組成物。
【請求項５】
総液滴表面積が、前記ナノエマルジョンに含まれるグルカゴンのミリグラム当たりの臨界液滴表面積を超える、先行する請求項いずれか一項に記載のナノエマルジョン組成物。
【請求項６】
臨界液滴表面積が３．０×１０６ｍｍ２である、請求項５に記載のナノエマルジョン組成物。
【請求項７】
ナノエマルジョンのイオン含有量が、臨界イオン含有量より低く、前記臨界イオン含有量は、０．１２重量％ＮａＣｌ水溶液の導電率と等しい、先行する請求項いずれか一項に記載のナノエマルジョン組成物。
【請求項８】
前記ナノエマルジョンが、レシチン重量の５％未満のリゾレシチン含量を有する、卵又はダイズレシチンで製造される、先行する請求項いずれか一項に記載のナノエマルジョン組成物。
【請求項９】
油が中鎖油、植物油、又はそれらの組み合わせである、請求項２〜８いずれか一項に記載のナノエマルジョン組成物。
【請求項１０】
前記ナノエマルジョンのｐＨが、約２．７〜約７．５の間である、先行する請求項いずれか一項に記載のナノエマルジョン組成物。
【請求項１１】
前記ナノエマルジョンが０．２ミクロンフィルターを通して濾過可能である、先行する請求項いずれか一項に記載のナノエマルジョン組成物。
【請求項１２】
グルカゴン約０．２５〜１．５ｍｇ／ｍＬ、リン脂質約１０〜１７．５重量％、油約０．５〜５重量％、及び水相を含むナノエマルジョンであって、油滴が約２００ｎｍ未満の平均直径を有し、そしてグルカゴンが凝集せず、そしてその濃度の７５％以上が３７℃で３〜７日貯蔵後に維持される、前記ナノエマルジョン。
【請求項１３】
グルカゴン約１ｍｇ／ｍＬ、レシチン約１０重量％、中鎖油約０．５〜５重量％、及び水相を含むナノエマルジョンであって、３７℃で３〜７日貯蔵後にグルカゴンが凝集せず、そしてその濃度の７５％以上が維持され、そして
（ａ）５０％以上のグルカゴンは、非共有結合的に油相と結合しており、
（ｂ）総液滴表面積は、前記ナノエマルジョンに含有されるグルカゴンのミリグラム当たりの液滴表面積である、臨界液滴表面積又は３．０×１０６ｍｍ２を超えており、
（ｃ）ナノエマルジョンの導電率は、０．１５％塩化ナトリウム水溶液について測定される導電率より低く、及び
（ｄ）ｐＨは約２．７〜約７．５の間である、
、前記ナノエマルジョン。
【請求項１４】
ＥＤＴＡ、メチオニン、フルクトース、デキストロース、システイン、グルタチオン若しくはその塩又はそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの酸化防止剤をさらに含む、先行する請求項いずれか一項に記載のナノエマルジョン組成物。
【請求項１５】
ＥＤＴＡ、ベンジルアルコール、パラベン、メタ重亜硫酸ナトリウム、クレゾール、若しくはその塩又はそれらの組合せからなる群から選択される抗菌保存剤をさらに含む、先行する請求項いずれか一項に記載のナノエマルジョン組成物。
【請求項１６】
グルカゴン、リン脂質、中鎖油、及び糖を含有する凍結乾燥された乾燥組成物であって、水と混合すると、先行する請求項いずれか一項に記載のナノエマルジョン組成物を形成する、前記乾燥組成物。
【請求項１７】
グルカゴン、リン脂質、中鎖油、及び糖を含有する凍結乾燥された乾燥組成物であって、水と混合すると、ナノエマルジョン組成物を形成し、前記ナノエマルジョン組成物は、３７℃で３〜７日貯蔵後にグルカゴンが凝集せず、そしてその濃度の７５％以上を維持し、（ａ）５０％以上のグルカゴンは、非共有結合的に油相と結合しており、
（ｂ）総液滴表面積は、前記ナノエマルジョンに含有されるグルカゴンのミリグラム当たりの液滴表面積である、臨界液滴表面積又は３．０×１０６ｍｍ２を超えており、
（ｃ）ナノエマルジョンの導電率は、０．１５％塩化ナトリウム水溶液について測定される導電率より低く、及び
（ｄ）ｐＨは約２．７〜約７．５の間である、
、前記乾燥組成物。
【請求項１８】
組成物が、バイアル又はシリンジにおいて提供される、上記請求項いずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
グルカゴンが、ポンプから又はシリンジから注射針を介して、皮下、筋肉内、又は静脈内の経路を通して投与される、上記請求項いずれか一項に記載の前記組成物。
【請求項２０】
ナノエマルジョンがすぐ注入できる、請求項１、１２又は１３に記載の組成物。
【請求項２１】
凍結乾燥された乾燥組成物が、注入前に水と混合される、請求項１６又は１７に記載の組成物。
【請求項２２】
(ｅ)グルカゴンと水相とを混ぜ合わせる工程
(ｆ)リン脂質及び油を添加する工程
(ｇ)混合及び均質化し、約２００ｎｍ以下の平均直径を有する油滴を有するナノエマルジョンを形成する工程、並びに
(ｈ)ナノエマルジョンを０．２ミクロンのフィルターに通す工程
を含む、先行する請求項いずれか一項に記載のナノエマルジョンの製造方法。
【請求項２３】
(ｅ)グルカゴンと水相とを混ぜ合わせる工程
(ｆ)リン脂質及び油を添加する工程
(ｇ)混合及び均質化し、約２００ｎｍ以下の平均直径を有する油滴を有するナノエマルジョンを形成する工程
(ｈ)ナノエマルジョンを０．２ミクロンのフィルターに通す工程、並びに
(ｉ)前記ナノエマルジョンを凍結乾燥する工程
を含む、請求項１６又は１７に記載の乾燥組成物の製造方法。
【請求項２４】
先行する請求項いずれか一項に記載の組成物を患者へ投与することを含む、グルカゴンを必要とする患者の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願に関する相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１１年１２月２９日に出願された米国特許仮出願第６１／５８１，６１０号に対する優先権を主張するものであり、その全てはあらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の分野】
【０００２】
この開示は、安定化させたグルカゴンナノエマルジョンに関する。
【発明の背景】
【０００３】
グルカゴンは、膵臓により分泌されるホルモンであり、２９アミノ酸一本鎖からなるポリペプチドであり、そして３４８５ダルトンの分子量を有する。合成及び組み換えグルカゴンの両方が、医薬品としての使用が可能となる適切な純度で使用可能である。グルカゴンは経口では吸収されず、そしてそれゆえに注入により投与される。
【０００４】
医学的に、グルカゴンは、低血糖症（正常な血糖濃度より低いことによって特徴付けられる）を治療するために使用される。低血糖症は、１型糖尿病患者及びインスリンユーザーにおいて一般的である。軽度の低血糖症は、不安、発汗、震え、動悸、吐き気、及び蒼白を引き起こす。重度の低血糖症では、脳は、エネルギーのために必要とされるブドウ糖が不足しており、それが発作、昏睡、又は死にすらつながる。重度の低血糖症は、現在の治療の標準であるグルカゴン注入のための即時の医学的介入を必要とする、生命を脅かす緊急事態である。
【０００５】
注入するときに、グルカゴンは肝臓を刺激し、貯蔵されたグリコーゲンをグルコースに変化させ、前記グルコースは血中に放出される。グルカゴンの作用開始は注入後５〜２０分で行われる。血中のグルカゴンの半減期は３〜６分であり、これはインスリンに類似している。
【０００６】
グルカゴンは７．１の等電点を有し、そして従って、生理的ｐＨ（ｐＨ４〜８）においては水に不溶性であり、そして中性ｐＨの水溶液中で沈殿する。ｐＨ３又はそれ未満の水溶液においては、最初は可溶性であるが、１時間以内に凝集しゲルを形成する。ゲル化したグルカゴンペプチドは、疎水性並びにペプチドの電位を形成する鎖間及び鎖内水素結合により誘導される、βシート原線維を主に構成する（Ｃｈｏｕ, Ｐ.Ｙ. ｅｔ ａｌ. １９７５. Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４（１１）：２５３６−２５４１）。ゲルが皮下注射器を詰まらせる、さらに、もし静脈内投与される場合には血管を詰まらせるので、凝集したグルカゴンは注入に不適切である。凝集プロセスを遅らせるために酸性（ｐＨ２〜４）製剤が、比較的に凝集のない、短時間の状態でのグルカゴンを維持するために、一般的に使用される。そのような酸性の製剤は、グルカゴンが凝集するので、製造後すぐに注入しなければならない（Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｓｅｒｔ ｆｏｒ ＧｌｕｃａＧｅｎ（登録商標） Ｈｙｐｏｋｉｔ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ［ｇｌｕｃａｇｏｎ ［ｒＤＮＡ ｏｒｉｇｉｎ］）。
【０００７】
その物理的不安定性に加えて、グルカゴンは様々なタイプの化学分解を受ける。水溶液中で、急速に分解し、複数の分解産物を形成する。少なくとも１６のグルカゴンの分解産物が、９、１５、及び２１位のアスパラギン酸の切断、並びに３、２０、及び２４位のグルタミニルアミド分解などの主要な分解経路とともに報じられている（Ｋｉｒｓｃｈ, Ｌ.Ｅ., ｅｔ ａｌ. ２０００.Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ, ２０３：１１５−１２５）。グルカゴンの化学分解は、急速かつ複雑である。例えば、グルカゴンを溶解しそしてその凝集を防止するために必要な酸性溶液（ｐＨ２〜４）において、約５〜７０％のグルカゴンが、３７℃で２４時間以内に非常に多くの分解産物に分解する（米国特許出願公開第２０１１／００９７３８６５号）。水性環境中におけるグルカゴン劣化を防止することは非常に困難であり、水性環境においてアスパラギン酸の切断及びアミド分解を遅らせるための効果的な方法はまだ開発されていない。この不安定性は、現在利用可能なグルカゴン製剤の医学的有用性を制限している。
【０００８】
グルカゴンは、重度の低血糖症の治療用に適用される。グルカゴンの化学的不安定性を回避するために、現在利用可能なグルカゴン医薬品（例えば、ＧｌｕｃａＧｅｎ Ｈｙｐｏｋｉｔ（グルカゴン塩酸塩）Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社、及びＧｌｕｃａｇｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ｒＤＮＡ ｏｒｉｇｉｎ）Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社）は、凍結乾燥されており、そして２パートのキットとして提供されている。１つのパートは、凍結乾燥固体の塊（「ケーキ」）内において、グルカゴン１ｍｇ（１単位）とラクトース４９ｍｇを含有するバイアルであり、そしてもう一方のパートは、グリセリン１２ｍｇ／ｍＬ、水、及び塩酸を含む希釈液を含有するシリンジである。凍結乾燥は、アスパラギン酸切断、グルタミニル脱アミド化、及び任意の水依存性分解経路を防止することにより、無水環境を提供し安定したグルカゴンを維持する。グルカゴンキットを使用するために、最初に、ケーキを含むバイアルに、シリンジから希釈剤を注入し、次にグルカゴンを溶解するために、前記バイアルをゆっくりと旋回させる。次に、液体状に戻した（reconstituted）グルカゴン溶液を同じシリンジ内に戻し、これで注入の準備ができる。この溶液のｐＨは約２．０〜３．５である。液体状に戻したグルカゴン溶液は不安定であり、そしてメーカーは、液体状に戻した後にそれらをすぐに使用すること及び使用しなかった部分は破棄することを推奨している。従って、グルカゴンキットは、一回及び即時のみの使用を意図している。
【０００９】
２パートのグルカゴンキットの適切な使用は、キット成分のストックを取ってキャップシールを取り除き、、バイアルに希釈剤を注入し、グルカゴンケーキを液体状に戻し、グルカゴン溶液を抜き取り、そして投与することを含む、複雑な多段階の手順が必要である。この面倒な手順では、通常の人ですら実行するのが難しいかもしれない。低血糖症によって無能となっている者にとっては、このタスクは、極めて困難又は不可能である可能性がある。タイムリーなグルカゴン救助療法における投与の遅れが死亡につながる可能性がある。悲しいことに、１型糖尿病を持つ個々の死亡の６〜１０％が低血糖症の結果である（Ｃｒｙｅｒ, Ｐ.Ｅ.２００８. Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５７（１２）：３１６９−３１７６）。従って、安定しており及びすぐ注入できる液体グルカゴン製剤は、緊急の低血糖症の救助のために非常に望ましく、命を救う可能性を秘めているだろう。
【００１０】
インスリンポンプは、インスリン依存性糖尿病患者によって、１０年以上にわたって広く使用されている。これらのポンプは、患者へのインスリンの連続的な流れを提供する。食後に、食後血糖上昇を一時的にカバーするために、ユーザが手動でインスリンの流れを増やすことができ、そして次に、ゆっくりとした基礎的維持流量にダイアルして戻す。これらのポンプは腹部の表面に直接取り付けられそして皮下に挿入された小さな針（例えば、Ｉｎｓｕｌｅｔ社のＯｍｎｉｐｏｄ）に直接インスリンを送達することができ、又は身体に近接させて外部に着用しそして皮下に移植された針を通した微細なチューブを経由してインスリンを送達することができる（例えばＯｎｅｔｏｕｃｈ（登録商標）Ｐｉｎｇ（Ａｎｉｍａｓ社）、Ｒｅｖｅｌ（商標）（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ社）、など）。皮下注射針は、決まった場所に最長で一週間まで残すことができる。
【００１１】
ポンプの使用を制約する環境条件は、インスリンとそのようなポンプによって提供される任意の液体が体温で又は体温に近い温度（３０〜３７℃）で、少なくとも３〜７日間、安定でなければならないことを必要とする。より新しいいわゆる人工膵臓デバイスは、連続的に患者のグルコースレベル（いわゆる連続グルコースモニタリング又は「ＣＧＭ」）を読み取る能力を有するように組み込まれ、そしてインスリンポンプの出力を必要なレベルまでリアルタイムで調整する目的でその情報を使用するように開発されてきた。しかしながら、あまりにも多くのインスリンがポンプで送達されたときは、インスリンのみの人工膵臓の現在のバージョンは、既に投与されたインスリンからの血糖の低下及び切迫した低血糖症に迅速に対抗する効果的な手段を有していない。正常な個体では、肉体は、天然グルカゴンを放出することによって急速な血糖低下に対抗するが、１型糖尿病患者においては、アルファ細胞活性低下により、そのような機能が損なわれている。
【００１２】
２ホルモンクローズドループポンプ（A bi-hormonal closed loop pump）又は真人工膵臓（true artificial pancreas）は、ＣＧＭ結合したインスリンポンプであり、患者にインスリン及びグルカゴンの両方を送達することができる。血糖が低血糖症のレベルに達するか又は達することが予期される場合、２ホルモンクローズドループポンプがグルカゴンを送達し、低血糖症に対抗する。１型糖尿病ではない個体の膵臓により実行されるように、この機能は、患者の血糖値を正常血糖レベルの範囲内に高度に調整することができる。
【００１３】
真２ホルモンクローズドループポンプは、体温で又は体温に近い温度で少なくとも３〜７日安定である液体グルカゴン製剤を必要とする。さらに、製剤は送達針が注入される部位に刺激を与えたり、不快感や痛みを引き起こしてはならない。そのため、人工膵臓用グルカゴン製剤は、例えば低ｐＨ又はリゾレクチンなどの刺激性又は溶血性として知られている成分を含有してはならない。現在入手可能な２パート型グルカゴンキット用製剤、並びに他の新興のグルカゴン製剤の多くは、これらの基準を満たしていない。
【００１４】
グルカゴン注入はまた、特定の放射線検査手順の間に、胃腸運動を抑制するために適用されている。この用途のためのグルカゴン用量は、２パートのエマージェンシーキットにおいて１ｍｇ未満という状態になる。２パート型グルカゴンキットは一度だけ使用することができ、未使用の部分を廃棄するので、２パートのレスキューキットが想定の手順のために使用されるたびに、かなりの廃棄物が発生する。従って、液体形態において安定であり、複数回投与用バイアルにおいて提供可能な新規製剤が非常に望ましい。このような複数回投与可能な液体製剤には、微生物の増殖を防止するための抗菌保存剤が含まれている必要がある。
【００１５】
要約すると、グルカゴン用の以下：
１．重度の低血糖症患者救助のための迅速な投与を可能にするために、液体であり及びすぐ注入可能である。
２．２ホルモンインスリン／グルカゴンポンプの実用化を可能にするために、体温で又は体温に近い温度（３０〜３７℃）で、少なくとも３〜７日安定である。
３．通常の貯蔵温度（５℃又は２５℃）において、商業用医薬品のための貯蔵寿命の要件である１〜２年の間、安定である。
４．胃腸放射線検査のように少量の適用のための廃棄物を減少させるため、同じバイアルからの複数回投与を提供することが可能である。
の組成物の多大なニーズが存在する。
【００１６】
上記要件の４つ全てを満たすことができる既知のグルカゴン組成物は、従来技術においては存在しない。最も安定化させたグルカゴン製剤は、溶液状態でのグルカゴンの凝集又はゲル化を防止するために、すなわち物理的不安定性に対処するために、開発されている。いくつかのアプローチではグルカゴン凝集の減少に成功しているように見える一方で、グルカゴンの化学分解に対処するための試みはほとんどなされていない。任意のグルカゴン組成物は、許容可能なレベルにまで化学分解を減少させることなく、薬剤製品としての限られた用途を有することとなる。
【００１７】
グルカゴンの凝集、ゲル化、又は沈殿を防止するために、最も知られている製剤には、グルカゴンを溶解して透明な溶液を形成する、水溶性界面活性剤、洗剤、又は周知の薬物可溶化剤を使用する。これらの試みは：最大で６倍モル過剰量までの一価のカチオン性又はアニオン性界面活性剤の使用（英国特許第１２０２６０７号）；鶏卵リゾレシチン（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ, ａ. Ｂ. ａｎｄ Ｅｄｅｌｈｏｃｈ, Ｈ. Ｊ. １９７２. Ｂｉｏｌ. ＣｈＥｍ. ２４７：４９８６−４９９１）；リゾレクチン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ, Ｒ. Ｍ., ｅｔ ａｌ. １９８２. Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２１：１２１７−１２２８）；低ｐＨにおけるアニオン性洗剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のミセル（Ｗｕ, Ｃ.−Ｓ. Ｃ. ａｎｄ Ｙａｎｇ, Ｊ. Ｔ. １９７８. Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９:２１１７−２１２２）及び中性ｐＨにおけるＳＤＳミセル（Ｂｒｏｗｎ, Ｌ. Ｒ. ａｎｄ Ｗｕｔｈｒｉｃｈ, Ｋ. １９８０. Ｂｉｏｃｈｉｍ. Ｂｉｏｐｈｙｓ. Ａｃｔａ ６０３：２９８−３１２）；シクロデキストリン（Ｍａｔｉｌａｉｎｅｎ, Ｌ., ｅｔ ａｌ.２００８. Ｊ. Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ. ９７（７）：２７２０−９及び Ｍａｔｉｌａｉｎｅｎ, Ｌ. ｅｔ ａｌ. ２００９. Ｅｕｒ. Ｊ. Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ. ３６（４−５）：４１２−２０）；リゾリン脂質（エタノールアミン、コリン、セリン、若しくはスレオニンの１−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエートエステル）又はその他の洗剤、例えばセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）及びＳＤＳなど（欧州特許第１０６１９４７号）；及びリゾリン脂質−スクロースのコンビネーション（欧州特許出願第２０１１／００９７３８６号）を含んでいる。
【００１８】
グルカゴン凝集問題に対処するための以前の試みは、特定の水溶性界面活性剤又は洗剤の使用に基づいている。使用される水溶性界面活性剤の一般的な一例は、リゾリン脂質又はリゾレシチンである。接頭後「リゾ（lyso）」は、様々なリン脂質について、１又は２位のいずれかにおいて、脂肪酸２個のうちの１つが存在しないことを示すために使用される（図２）。レシチンは、天然に存在するリン脂質の混合物であり、そして同様に、リゾレシチンは天然源からのリゾリン脂質の混合物である。
【００１９】
一般的に水に不溶性であり、油性であり、及び洗剤様特性を欠いている、脂肪酸２個含有（すなわち、ジアシル）リン脂質又はレシチンとは異なり、単一の脂肪酸（すなわち、モノアシル）リゾリン脂質は水溶性であり、その洗剤の特性のために油性物質を溶解することができる。ＣＴＡＢ及びＳＤＳは、一般的に家庭用洗剤で使用される長い炭素の一本鎖（モノアシルリン脂質など）を含む高度に水溶性の界面活性剤である。
【００２０】
公知の製剤に用いられる水溶性界面活性剤の構造的多様性にも関わらず、全てが同じ機構によってグルカゴンを可溶化する。それらは、水とグルカゴン分子間の疎水性相互作用を減少させ、凝集又はβシートグルカゴンを撹乱し、そして界面活性剤によって形成されたミセルにグルカゴンを組み込む。このような界面活性剤で可溶化したグルカゴンの最終組成物は、実際は溶液である。グルカゴン溶液組成物は、グルカゴン救助用又はポンプ用に好適であると考えられていたので、従来技術の望ましい目標であると考えられていた一方で、その他の液体組成物、例えばエマルジョンは適していないと見なされていた。例えば、Ｓｔｅｉｎｅｒ, Ｓ., ｅｔ ａｌ（米国特許出願公開第２０１１／００９７３８６号）は、その推定される本質的に高い粘性のために、エマルジョンはポンプ使用用のグルカゴンのための好ましい製剤ではないと指摘した。
【００２１】
問題であることに、水溶性界面活性剤は、一般に、注入可能な薬剤における使用にとっては毒性が強すぎるか又は刺激性である。例えば、リゾリン脂質又はリゾレシチンは、その溶血特性のために赤血球を溶解することが長い間知られている（Ｗｉｌｂｕｒ, Ｋ.Ｍ., ｅｔ ａｌ.１９４３. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２２（３）：２３３‐２４９）。リゾリン脂質又はリゾレシチンのボーラス皮下注入は、このように、局所的組織損傷や大きな痛みを注入部位に引き起こす。リゾレシチンに基づいたグルカゴンの皮下注入長期化及び継続化は、２ホルモンインスリン／グルカゴンポンプの使用中に発生する可能性があるように、針挿入部位の痛みや炎症を悪化させる。さらに、本発明の時点で、リゾリン脂質、リゾレクチン、ＳＤＳ、又はＣＴＡＢはいずれも、皮下注入可能な薬剤における使用用では、ＦＤＡによって承認されていない（すなわち、いずれもＦＤＡの非活性成分リストに掲載されていない）。さらに、水溶性界面活性剤をベースとする先行技術の組成物は効果的にグルカゴン凝集を減少させるものの、これらのアプローチのいずれにおいても、溶液中でグルカゴンの化学分解を遅らせることが示されていない。実際には、モノマーの又は脱凝集のグルカゴンの方が、凝集の又はβ−シートの形態よりも水溶液中でイオンや水分子による攻撃を受けやすいので、水溶性界面活性剤はグルカゴン分解を促進する可能性を有する。
【００２２】
Ｋｏｒｎｆｅｌｔ, ｅｔ ａｌ.（米国特許第５６５２２１６号）は、グルカゴン及び安定化量（stabilizing amount）の薬学的に許容される両性電解質、例えばアミノ酸若しくはジペプチド又はそれらの混合物などを含む酸性医薬製剤（すなわち、ｐＨ２．８）を記載する。安定化量は、アミノ酸であるメチオニン（分子量＝１４９）のための１４．９ｎｇ／ｍＬ〜７．４５μｇ／ｍＬに等しい０．１〜５０マイクロモルの範囲で定義された。Ｋｏｒｎｆｅｌｔ, ｅｔ ａｌ.の発明がグルカゴンの物理的及び化学的安定性の両方に対処している一方で、皮下注入の場合に酸性組成物は刺激性であり、さらに注入部位の連続的な及び長期間の痛みに患者が苦しむため、ポンプの使用には望ましくない。Ｋｏｒｎｆｅｌｔ, ｅｔ ａｌ.（同様）は、エマルジョン組成物の使用又はグルカゴン用のエマルジョン組成物における両性電解質の使用について開示していない。
【００２３】
従って、任意の水溶性界面活性剤、酸性、毒性又は刺激性の薬剤を使用することなく、グルカゴンを物理的及び化学的に安定化させることができる液体組成物の必要性が依然として存在する。本発明の驚くべき特徴は、この点やその他の必要性に対処している。
【発明の概要】
【００２４】
最初の態様においては、本発明はグルカゴン、油相、及び水相を含む水中油滴型ナノエマルジョン組成物を提供し、前記グルカゴンは、３７℃で３〜７日貯蔵後に凝集せずそしてその濃度の７５％以上を維持し、そして前記油相は約２００ｎｍ未満の平均直径を有する油滴の形態である。
【００２５】
第二の態様においては、本発明は、グルカゴン、リン脂質、中鎖油、及び糖を含有する、凍結乾燥された乾燥組成物を提供し、水で混合するときに、前記凍結乾燥された乾燥組成物が本発明のナノエマルジョンを形成することを特徴とする。
【００２６】
第三の態様においては、本発明は、本発明のナノエマルジョンの製造方法を提供する。前記方法は：グルカゴンと水相とを混ぜ合わせる工程；リン脂質及び油を添加する工程；混合及び均質化し、約２００ｎｍ以下の平均直径を有する油滴を有するナノエマルジョンを形成する工程；並びにナノエマルジョンを０．２ミクロンのフィルターに通す工程、を含む。本発明の乾燥組成物の製造方法は、ナノエマルジョンを凍結乾燥する工程をさらに含む。
【００２７】
第四の態様においては、本発明は、グルカゴンを必要とする患者の治療方法を提供する。前記方法は、本発明の組成物を患者へ投与することを含む。
【００２８】
本発明は、水中油滴型ナノエマルジョンの油滴により、グルカゴンが可溶化されそして凝集のない状態が維持されることができるという驚くべき発見に関し、前記ナノエマルジョン中の油滴は、特定の最小値、又は「臨界液滴表面積（Critical Droplet Surface Area）」を超える総液滴表面積（Total Droplet Surface Area）を有する。
【００２９】
本発明は、水中油滴型ナノエマルジョンの油滴により、グルカゴンが化学的に安定化するという驚くべき発見に関し、前記グルカゴンの５０％より多くは油滴と結合し、そしてそのようなナノエマルジョンにおける溶解したイオン濃度の総量は、特定のリミット又は「臨界イオン含量制限（Critical Ion Content Limit）」より少ない。
【００３０】
１つの実施態様では、ナノエマルジョンは、任意の添加された有機溶媒、リゾレシチン、リゾリン脂質、水溶性界面活性剤、又はシクロデキストリンを有さず、そしてそれにもかかわらず、グルカゴンを可溶化しそして凝集のない状態で維持することができる。油滴が水に不溶性であり、そして完全に界面活性剤又は洗剤の性質を欠いているので、ナノエマルジョン組成物によって提供される可溶化又は脱凝集メカニズムは、可溶化／脱凝集グルカゴンのための溶剤、リゾレシチン、リゾリン脂質、水溶性界面活性剤、又はシクロデキストリンに依存する、先行技術に開示されている他の組成物とは異なる。従って、ナノエマルジョン組成物は、以前から知られているシステム及び方法に基づいては予期できないものであり、予測できないものであった。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】グルカゴン構造の概略図である。
【００３２】
【図２】リン脂質及びリゾリン脂質の構造を示す。Ｒ１又はＲ２は脂肪酸のアルキル鎖を示し、そしてＸは、コリン、グリセロール、エタノールアミン、又はセリンであり、それぞれにおいて、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、又はホスファチジルセリン（ＰＳ）である。レシチンはＰＣと他のリン脂質との混合物である。ＰＣ又は７５重量％以上のＰＣを含有するレシチンは、本発明のナノエマルジョン用のリン脂質に好ましい。下記に示すのは、、米国特許出願第２０１１／００９７３８６号の好ましい安定剤である、ホスファチジルコリン（ジミリストイル−ホスファチジルコリン又はＤＭＰＣ）及びリゾホスファチジルコリン（リゾミリストイル−ホスファチジルコリン又はＬＭＰＣ）の例である。
【００３３】
【図３】新たに製造され（パネル１）そして分解されたグルカゴンサンプル（パネル２）の代表的なクロマトグラムを示している。この分析方法は、グルカゴンの主要な分解産物、すなわち、多数のアスパラギンの切断及びグルタミニルアミド分解産物及び酸化産物（パネル２）を分離し、定量することが可能である。図３。パネル３は、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社からのＧｌｕｃａｇｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ｒＤＮＡ ｏｒｉｇｉｎ）と、本発明のナノエマルジョン（Ｆ−２２）で、２５℃で２ヶ月保存後に存在する分解産物の程度を比較したものである。
【００３４】
【図４】様々なｐＨ値にわたる、本発明のナノエマルジョンの４０℃におけるグルカゴン分解速度のプロファイルである。
【００３５】
【図５】本発明のグルカゴンナノエマルジョンの半透明な外観を描いた写真（Ｆ−２２）である。
【００３６】
【図６】凍結乾燥されたグルカゴンナノエマルジョン（Ｆ−２２）の外観、及び（前記凍結乾燥ナノエマルジョンに水を添加した後）液体状に戻した液体ナノエマルジョンの半透明な外観を示したものである。
【００３７】
【図７】グルカゴンナノエマルジョン（Ｆ−２２）の、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ社からのＧｌｕｃａｇｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ｒＤＮＡ ｏｒｉｇｉｎ）と比較した、マウスにおける薬力学的プロファイルを示す（実施例１５参照）。
【発明の詳細な説明】
【００３８】
Ｉ．概要
本発明は液体でありすぐ注入できる組成物に関し、前記組成物中のグルカゴンは物理的及び化学的のどちらにおいても安定である。具体的には、本発明は、グルカゴンを含有し、グルカゴンから必然的に成り、又はグルカゴンから成る水中油滴型ナノエマルジョン組成物、すなわち、
（ａ）実質的にゲル化又は沈殿していないグルカゴンを含まない液体であり、
（ｂ）中性又は弱酸性であり、
（ｃ）低粘度であり、そして微細な針を通して容易に注入可能であり、
（ｄ）リゾリン脂質又はリゾレシチンを含む、任意の水溶性界面活性剤を含まず、
（ｅ）３７℃で少なくとも３〜７日間物理的に及び化学的に安定しており、
（ｆ）通常の貯蔵温度（すなわち５℃又は２５℃）で少なくとも１年間物理的及び化学的に安定であり、並びに
（ｇ）同じバイアルから複数回の投与を可能にする、
を開示する。
【００３９】
ＩＩ．定義
本明細書で使用される種々の用語は以下の定義を有するものとする。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「約（about）」は、目標値の両側から１０％の広がりをカバーする範囲の量を記載している。例えば、「約１００（about 100）」は、９０と１１０を含む９０〜１１０の間の任意の値を意味する。
【００４１】
本明細書で用いられる語句「許容可能な注入性基準（Acceptable Injectability Criterion）」は、特定のシリンジ／針構成からの液体製剤の注入性の定量的な定義である。本発明においては、許容可能な注入性基準は、２８Ｇ１／２インチ針を備え付けた３ｍｍＩ．Ｄ．インスリンシリンジから、特定の液体約０．９ｃｃ／分を押し出すための、１．５ポンドの力である（例えば、ｕ−１００ ３／１０ｃｃインスリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ, Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ.）２８Ｇ １／２針（Ｂｅｃｔｏｎ, Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ.））。この基準は、シリンジに対する人間の手によって得られるか又は医療デバイスポンプにより送達される押出速度によって、快適に投与することができる通常の力を表す。
【００４２】
本明細書で用いられる「凝集グルカゴン（aggregated glucagon）」又は「グルカゴン凝集（glucagon aggregation）」とは、グルカゴンを含有する液体組成物に、可視のグルカゴン粒子、繊維、又はゲル化が存在することを意味する。グルカゴン凝集物、繊維、又はゲルは、０．２ミクロンのフィルター膜を通過することができない。
【００４３】
本明細書で用いられる「抗菌保存剤（antimicrobial preservative）」は、細菌及び真菌の増殖を阻害するために、液体組成物に添加することができる医薬添加剤である。本発明において有用な抗菌保存剤としては、クレゾール、フェノール、ベンジルアルコール、エタノール、クロロブタノール、パラベン、イミドウレア、ベンザルコニウムクロリド、ＥＤＴＡ若しくはその塩又はそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
「抗酸化剤（antioxidant）」は、活性薬物又は不活性成分の酸化を防止するための、液体組成物に添加することができる医薬添加剤である。抗酸化剤には、還元剤、金属イオンキレート剤、及び不活性ガスが含まれる。
【００４５】
用語「水相（aqueous phase）」は、水溶性添加剤、例えばｐＨ調整剤、緩衝剤、抗酸化剤、抗菌保存剤、エマルジョン中の張性／浸透圧修飾剤を含有する水溶液を意味する。本発明のエマルジョンにおいて、水相は、油滴が懸濁しておりそして分散相とも呼ばれる連続相である。水相は、限外濾過工程によって油相から分離することができ、前記限外濾過工程は、水相を、より望ましい組成を有する他の水相、例えばより低いイオン含有量を有する水溶液と交換することを可能にする（実施例６のように）。特定の実施態様において、好ましい水相は、ペプチドを含まずさらに水溶性イオンである種の最小量を含有する。
【００４６】
本明細書で用いられる「身体の又は身体に近い温度（body or near body temperature）」は３０°〜４０℃の間である。
【００４７】
本明細書で用いられる「化学的安定性（chemical stability）」又は「化学的に安定（chemically stable）」は、２〜８℃で１年後にそして３７℃で３〜７日後に最初のグルカゴンの７５％以上を維持している組成物の状態を意味する。
【００４８】
本明細書で用いられる「臨界液滴表面積（Critical Droplet Surface Area）」は、グルカゴン１ミリグラムを溶解しそして安定化させるのに必要な、本発明のナノエマルジョンの最小総液滴表面積である。本発明のナノエマルジョンによれば、臨界液滴表面積は、総液滴表面積において約３．０×１０６ｍｍ２と推定される（実施例１）。例えば、グルカゴン濃度１ｍｇ／ｍＬで本発明のナノエマルジョンを製造するために、このようなナノエマルジョンは１ミリリットルごとに、総液滴表面積約３．０×１０６ｍｍ２を含有しなければならない。別の例として、グルカゴン濃度０．５ｍｇ／ｍＬで本発明のナノエマルジョンを製造するために、このようなナノエマルジョンは１ミリリットルごとに、少なくとも総液滴表面積約１．５×１０６ｍｍ２を含有しなければならない。臨界液滴表面積を達成するために、ナノエマルジョンは、十分な量の油相を含有しなければならず、そして前記油相は、十分に小さい油滴に変換（reduce）されなければならない。特定の実施態様では、油相の濃度は約２０％であり、そして平均液滴直径は、可溶化されたグルカゴン１ｍｇ毎に約２００ｎｍ以下である。別の実施態様では、油相の濃度は、約１０％〜２０％の間であり、そして平均液滴直径は可溶化されたグルカゴン１ｍｇ毎に約１００〜２００ｎｍの間である。好ましい実施態様では、油相の濃度が約１５％であり、そして平均液滴直径は可溶化されるべきグルカゴン１ｍｇ毎に１５０ｎｍ未満である。
【００４９】
本明細書で用いられる「臨界イオン含量制限（Critical Ion Content Limit）」は、グルカゴンが化学的に及び物理的に安定なまま維持される本発明のナノエマルジョンにおいて、非ペプチドの及び水溶性のイオンが許容される最大量である。臨界イオン含量制限より高ければ、グルカゴンの化学的及び物理的安定性に悪影響を及ぼす可能性がある。エマルジョン中の全体的な非ペプチドの及び水溶性のイオン濃度は、導電率を測定することによって推定することができる。本発明の臨界イオン含量制限の値は、同一の測定条件で測定して、水中の０．１２％塩化ナトリウム水溶液について測定されたものと同等の導電率として定量的に定義される。
【００５０】
本明細書で使用される「洗剤（detergents）」は、水で油性物質を溶解し、洗浄するために用いることのできる水溶性界面活性剤である。
【００５１】
本明細書で使用される「導電率（electrical conductivity）」は、電流を伝導する材料の能力測定を意味する。水中では、導電率は、溶解したイオンによって媒介されそして溶解したイオン量の合計に比例する。グルカゴンエマルジョン又は水溶液の導電率は、μＳｉｅｍｅｎｓ／ｃｍ又はμＳ／ｃｍ単位で導電率計を用いて測定される（実施例６）。導電率測定は、温度、個々の導電率計、及び試料容器に大きく依存している。このため、比較測定には同じメートル容器構成（same meter-container configuration）を使用し、そして同じ温度で行わなければならない。導電率測定のために、既知のＮａＣｌ濃度を有する規格溶液が、導電率計を校正するために使用される。次にエマルジョンの溶解イオン濃度は、同じ導電率のメートル容器構成を使用して測定され、塩化ナトリウム水溶液の濃度の単位（例えば、ＮａＣｌ ％ ｗ／ｖ ｉｎ ｗａｔｅｒ）で表される。
【００５２】
本明細書で使用される「エマルジョン（emulsion）」は、油相と水相との非混和性（immiscible）混合物である。典型的なエマルジョンは、光学的に不透明であり、そしてより透明で安定した本発明のナノエマルジョンとは対照的である、有限な安定性を有する。
【００５３】
本明細書で使用する「濾過可能（filterable）」は、特定の孔サイズ、例えば、０．２ミクロンのフィルター膜を通過する液体の能力を意味する。
【００５４】
本明細書において、用語「微細な針（fine needle）」は、皮下、静脈、又は他のタイプの注入用シリンジ又はポンプで使用される中空、小径の皮下注射針を含む。針の外径は、ニードルゲージシステムによって示される。スタブニードルゲージ方式（Stubs Needle Gauge system）によれば、一般的な医療使用における皮下注射針は、７（最大）〜３３（最小）ゲージ（Ｇ）の範囲となる。本明細書では、「微細な針」には、従って、２１〜３３Ｇ、好ましくは２５Ｇ〜３１Ｇ、そして最も好ましくは２７Ｇ〜３１Ｇの範囲の針が含まれる。
【００５５】
本明細書で使用される用語「注入可能な（injectable）」は、液体が上記で定義した許容可能な注入性の基準を満たしていることを意味する。
【００５６】
本明細書で使用される「グルカゴン（glucagon）」は、完全長ペプチドであり、グルカゴンはＣ１５３Ｈ２２５Ｎ４３Ｏ４９Ｓの実験式を有し、分子量は３４８３ダルトンであり、そして２９アミノ酸残基から成る一本鎖ポリペプチドである。前記グルカゴンのアミノ酸配列が図１に示される。
【００５７】
本明細書で使用される「レシチン（lecithin）」は、天然源に由来するリン脂質の混合物である。注入可能なレシチンには、精製されそして他の有害な生物学的反応を引き起こす刺激性、アレルギー性、炎症剤又は薬剤を実質的に含まない、卵又はダイズ由来のレシチンが含まれる。本発明にとって好ましいレシチンには、ホスファチジルコリン（ＰＣ）を７５％より多く含有し、水に不溶性であり、そしてリゾレシチンを基本的に含まないものが含まれる（すなわち、リゾレシチンを１〜４重量％以下含有する）。好ましいレシチンの例には、商品名ＬＩＰＯＩＤ Ｓ ７５、 ＬＩＰＯＩＤ Ｓ １００、 ＬＩＰＯＩＤ Ｅ ８０、及びＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ ９０ Ｇのレシチン製品が含まれるがこれらに限定されない。
【００５８】
本明細書で使用される、後述のようにリゾホスファチジルコリンが含まれる「リゾリン脂質（lysophospholipids）」は、リン脂質分子の部分的な加水分解の結果として、リン脂質から誘導される化合物の種であり、前記部分的な加水分解は、脂肪酸基の１つを除去するものである（図２）。リゾリン脂質は、天然に存在し及び合成的に製造されることができる。リン脂質とは異なり、リゾリン脂質は、水溶性界面活性剤特性を有し、そして神経ミエリン及び細胞膜を含む種々の親油性物質を溶解することができる。リゾリン脂質は、溶血を引き起こすことが知られており、さらにそのような生物学的活性を有することから、注入用として安全ではない。代表的な合成リゾリン脂質には、米国特許出願第２０１１／００９７３８６号及び欧州特許第１０６１９４７号に開示されているようにリゾミリストイルホスファチジルコリン（ＬＭＰＣ）、ミリストイルリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣＭ）、リゾパルミトイルホスファチジルコリン（ＬＰＰＣ）が含まれる。
【００５９】
本明細書で使用される、「リゾホスファリジルコリン（lysophosphatidylcholines）」として知られる「リゾレシチン（lysolecithins）」は、リゾリン脂質のサブクラスであり、そしてレシチンの部分的な加水分解により形成され、前記レシチンの部分的な加水分解は脂肪酸基の１つを除去するものである。前記加水分解は、一般的には、ホスホリパーゼＡ２の酵素作用の結果である。リゾレシチンは、リゾリン脂質と同じ水溶性、洗浄性、及び溶血特性の多くを共有している。
【００６０】
本発明によれば、（リゾレシチンを含む）リゾリン脂質は好ましくなく、グルカゴン用の注入可能なエマルジョン組成物には敬遠されなければならない。このような水溶性界面活性剤は、エマルジョンの油滴を溶解させ、グルカゴンと油滴との結合を破壊することができ、そして結果として低減されたグルカゴンの物理的及び化学的安定性の低下が生じる。また、リゾリン脂質及びリゾレシチンも溶血性であることが知られており、注入により与えられた場合は、人間に有毒である。
【００６１】
本明細書で使用される「平均液滴表面積（Mean Droplet Surface Area）」は、球体の表面積用の方程式：Ａ＝４πｒ２を用いて測定された、エマルジョン中の油滴の平均半径を用いて計算される液滴の表面積であり、前記式中Ａは平均液滴表面積であり、ｒはエマルジョンの油滴の平均半径であり、前記液滴の平均半径は、典型的には動的光散乱技術を用いて測定される。
【００６２】
本明細書で使用される「平均液滴体積（Mean Droplet Volume）」は、球体の体積用の方程式：Ｖ＝（４／３）πｒ３を用いて測定された、エマルジョン中の油滴の平均半径を用いて計算される液滴の体積であり、前記式中Ｖは平均液滴体積であり、ｒは油滴の平均半径であり、前記油滴の平均半径は、典型的には動的光散乱技術を用いて測定される。
【００６３】
本明細書で用いられる液滴の「平均半径（mean radius）」又は「平均直径」は、動的光散乱技術又はレーザー回折法を用いたエマルジョンの測定値である。典型的な平均半径／直径の値は、ナノメートルで報告される。
【００６４】
本明細書で使用される、「中鎖トリグリセリド（medium chain triglycerides）」（「ＭＣＴｓ」）としても知られる「中鎖油（medium chain oil）」は、グリセロールの中鎖（炭素数６〜１２）脂肪酸エステルである。ＭＣＴは、天然供給源に由来するか、又は合成的に製造することができる。好ましいＭＣＴの例としては、ＣＲＯＤＡＭＯＬ ＧＴＣＣ−ＰＮ、Ｍｉｇｌｙｏｌ ８１２、又はＮｅｏｂｅｅｓ Ｍ−５の商品名のＭＣＴ製品が含まれる。
【００６５】
用語「金属イオンキレート剤又はキレート剤（metal ion chelating agent or chelator）」は、注入可能な製品において使用しても安全である金属イオンキレート剤を含む。金属イオンキレート剤は、金属イオンに結合することによって機能し、そしてそれによって酸化、加水分解、又は他の分解反応における金属イオンの触媒効果を減少させる。本発明において有用な金属キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、エデト酸塩）、グリシン、及びクエン酸並びにそれぞれの塩又はそれらの混合物を含んでもよい。
【００６６】
本明細書で使用される「ナノエマルジョン（nanoemulsion）」は、臨界液滴表面積を超える総液滴表面積を有する水中油滴型エマルジョンである。総液滴表面積は、油相の濃度に比例し、そして液滴のサイズに反比例する。臨界液滴表面積を超えるために、ナノエマルジョンは、十分小さなサイズの液滴において十分に高い濃度で油相が含有されている必要がある。
【００６７】
本明細書で使用される「中性ｐＨ（neutral pH）」は４〜８、好ましくは５．２〜７．２の範囲である。「弱酸性（Slightly acidic）」は、約２．５〜４、好ましくは２．７〜３．５の範囲のｐＨを意味する。
【００６８】
本明細書で使用される「油（oil）」は、身体温度、例えば、約３７℃で液体でありさらに注射可能な薬剤に使用するための薬理学的に許容されるトリグリセリド（例えば、トリアシルグリセロール又はトリアシルグリセリド）の単一物又は混合物を意味する。トリグリセリドは、グリセロール及び三脂肪エステルから誘導されるエステルである。「油」は、天然源に由来するか又は合成的に製造することができる。例としては、植物油、動物油、天然原料の中鎖油、又はトリカプリリン、トリオレイン、又は合成油のトリミリスチンが挙げられる。本発明では、好ましい油は植物油でありそして、より好ましい油は、中鎖油である。
【００６９】
本明細書で使用される「水中油滴型エマルジョン（oil-in-water emulsion）」は、油相が小滴の形態（分散相）であるエマルジョンであり、前記小滴は、水相（連続相）中に懸濁又は分散している。
【００７０】
本明細書で使用される「油相（oily phase）」は、油及びリン脂質を含む、エマルジョンの水非混和性相を意味する。油相はまた、抗酸化剤及び抗菌保存剤などを含む他の親油性添加剤並びに本発明のナノエマルジョン中のグルカゴンを含有してもよい。特定の実施態様では、油相は直径のサイズ２００ｎｍ未満、好ましくは１５０ｎｍ未満、そして最も好ましくは１００ｎｍ未満の小さな油滴で存在する。
【００７１】
本明細書で使用される「オスモル濃度（osmolality）」は、溶液のキログラム当たりの溶質のミリオスモルを単位とする溶液の濃度である。好ましい本発明のナノエマルジョンのオスモル濃度は２８０〜７００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲である。
【００７２】
本明細書で用いられる「エマルジョンの水相中のグルカゴンの割合」は、水相中のグルカゴンの量をエマルジョン中の総量で割ったものの測定であり、すなわち、エマルジョンの水相中のグルカゴンの百分率は、水相中のグルカゴンの量をエマルジョン中のグルカゴンの量で割り、１００を乗じたものである。エマルジョンの水相におけるグルカゴンの量は、最初に限外濾過によって油相から水相を分離した後に、ＨＰＬＣ法で分離された水相中のグルカゴン濃度を分析することにより決定することができる（実施例２及び１０）。
【００７３】
本明細書において、用語「ｐＨ緩衝剤（pH buffering agent）」又は「ｐＨ緩衝塩（pH buffer salt）」は、例えばアンモニウム、ナトリウム又はカリウムのような対イオンを有する、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、重炭酸塩などの、イオン化可能なｐＨ緩衝塩を含む。
【００７４】
本明細書で使用される「リン脂質（phospholipid）」は、脂肪酸２個を有するグリセロール及び小有機分子（例えば、コリン、エタノールアミン、グリセロール、セリン又はなし（図２に「ｘ」部分として記載））に共有結合で結合されたリン酸イオン１個の、任意のトリエステルを意味する。代表的なリン脂質は、従って、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、及びホスファチジン酸（ＰＡ）を含む。脂肪酸は、一般に、様々な飽和度の約１０〜約１８の炭素原子を有し、本発明では、「リン脂質」は、単一のリン脂質種又はいくつかのリン脂質の混合物のいずれかを指すことができる。本発明において有用なリン脂質は、天然源から得られるか又は合成的に作製することができる。天然由来のリン脂質はレシチンと称される。合成リン脂質の例は、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール、ナトリウム塩（ＤＭＰＧ、Ｎａ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン、ナトリウム塩（ＤＰＰＳ、Ｎａ）が挙げられる。特定の実施態様において、本発明のための好ましい合成リン脂質は、水に不溶性のホスファチジルコリン、例えば、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）及びそれらの混合物である。
【００７５】
本明細書で使用される、「物理的安定性（physical stability）」又は「物理的に安定（physically stable）」は、グルカゴンを含有する液体組成物中にグルカゴンのゲル、繊維、又は沈殿物が実質的に存在せず、そして前記組成物が、「許容可能な注入性基準」を満たすか又は前記組成物が０．２又は０．４５ミクロンフィルターを通して濾過可能であることを意味する。
【００７６】
本明細書で使用される、本発明において有用な「還元剤（reducing agents）」は、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、パルミチン酸アスコルビル、メタ重亜硫酸塩、没食子酸プロピル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、トコフェロール、メチオニン、クエン酸、クエン酸塩、還元糖、例えばグルコース、フルクトース、グリセルアルデヒド、ガラクトース、ラクトース、マルトース、それらの塩又は混合物を含むが、これらに限定されない。
【００７７】
本明細書で使用する用語「実質的に含まない（substantially free）」は、組成物の総重量の１％未満を意味する。
【００７８】
本明細書で使用される「糖（sugar）」は、本発明のエマルジョンの浸透圧又は張性を調整するために、液体組成物に添加することができる炭水化物添加剤（単数又は複数）を意味する。本発明に有用な糖としては、単糖類、二糖類、多糖類、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、ポリオール、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、セルロース及びセルロース誘導体、又はそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、特定の実施態様では、糖は、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、ラクトース、フルクトース、キシロース、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、デキストロース、デキストラン、又はそれらの混合物である。他の実施態様において、好ましい糖はスクロース又はグリセロールである。
【００７９】
本明細書で使用される「溶液（solution）」は、１つの相のみからなる透明で均質な混合物を意味する。
【００８０】
本明細書で使用される「界面活性剤（surfactants）」は、液体の表面張力又は２つの液体間の界面張力を低下させる化合物を指す。
【００８１】
本明細書で使用する用語「張性／浸透圧修飾剤（tonicity/osmotic modifying agent）」は、注入可能な薬理学的活性剤に添加することができ、そして浸透圧を調節するために使用される医薬添加剤を含む。本発明において有用な張性／浸透圧改質剤としては、ラクトース、トレハロース、スクロース、ソルビトール、グリセロール、マンニトール、及びそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
本明細書で用いられる「総液滴表面積」（Total Droplet Surface Area）」は、ナノエマルジョンの体積におけるすべての油滴の総表面積である。この数は、油滴の総数に平均液滴表面積を乗じることにより推定される。
【００８３】
本明細書で使用される、エマルジョン中の「油滴の総数（Total Number of Oil Droplets）」は、油相の体積の合計を、エマルジョンの平均液滴体積で割ることによって計算される。
【００８４】
本明細書で使用される「限外濾過（ultrafiltration）（UF）」は、静水圧が液体を半透膜に対して押し込む、様々な膜濾過技術を意味する。水及び低分子量の溶質、例えば、水溶性のイオンは、膜を通過する一方で、懸濁した固体、高い分子量又は大きなサイズの油滴又は溶質は保持される。この分離プロセスは、高分子溶液、特にタンパク質溶液を精製及び濃縮用の産業及び研究において一般に使用される。限外濾過は、それが保持する分子の大きさの点を除いて、透析濾過、精密濾過、ナノ濾過またはガス分離とは、根本的に異なるものではない。限外濾過は、タンジェンシャルフロー（tangential flow）又はデッドエンド（dead-end mode）モードで使用されている。限外濾過は、グルカゴンの化学的安定性を向上させるために、望ましくないイオンを除去し、水相を洗浄すると同時に、グルカゴンが結合した油滴を保持するために使用することができる。
【００８５】
本明細書で使用される「植物油」は、植物の種子又はナッツ由来の油を指す。代表的な植物油としては、アーモンド油、ルリジサ油、ブラックカラント種油、コーン油、サフラワー油、大豆油、ゴマ油、綿実油、落花生油、オリーブ油、ナタネ油、ヤシ油、パーム油、キャノーラ油などが含まれるが、これらには限定されない。植物油は、典型的には、脂肪酸３個（通常、炭素約１４〜約２２の長さであり、そして数と位置が変化する不飽和結合を有し、これらは油の供給源に依存する）がグリセロール上のヒドロキシル基でエステル結合を形成するときに形成される、長鎖トリグリセリドを含有する。特定の実施態様では、高度に精製されたグレードの植物油（「超精製（super refined）」とも呼ばれる）は、一般に、医薬品グレードの水中油滴型エマルジョンの安全性及び安定性を確保するために使用される。
【００８６】
本明細書で使用される「水溶性（water-soluble）」は、水１０重量部毎に溶質１重量部以上の程度の均質な溶液を形成するために、水に溶解することができる固体の又は液体の溶質を記載している。
【００８７】
本明細書で使用される「水溶性界面活性剤（water-soluble surfactants）」は、水ともう一方の液体の間の又は水と固形物間の界面を低下させることにより、クリアでありそして一層の水溶液を形成する、化合物の可溶化を補助する化合物である。例えば、リゾレシチンは水溶性界面活性剤でありそしてレシチンは水溶性界面活性剤ではない。
【００８８】
「クロスフロー濾過（cross flow filtration）」としても知られている、本明細書で使用される「タンジェンシャルフロー濾過（tangential flow filtration）」は、濾過されたもの、例えば、エマルジョンの水相が反対側に放出される一方でフィードが半透膜を通過しさらに固形物又はエマルジョン滴はフィルターにトラップされるデッドエンド濾過とは異なる。タンジェンシャルフロー濾過では、供給流の大部分はフィルターに垂直移動するよりむしろフィルタの表面を横切って接線方向に移動する。タンジェンシャルフロー濾過の主な利点は、フィルターケーキ（フィルタを詰まらせる可能性がある）がタンジェンシャルフローによる濾過プロセス中に実質的に洗い流されることである。前記タンジェンシャルフローは、フィルタユニットが動作することができる時間の長さを増加させる。タンジェンシャルフロー濾過は、時には、「ダイアフィルトレーション」と交換可能に使用される。半透膜は、固体又は膜の孔サイズよりも大きいサイズ、例えば１０３〜１０６ダルトンの範囲の油滴を保持しながら、特定の小分子若しくはイオンの拡散又は強制的な拡散による通過を可能にする膜である。特定の実施態様において、本発明のエマルジョンのための好ましいタンジェンシャルフロー濾過膜の孔径は、３Ｋ〜１００Ｋ ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）の間である。
【００８９】
ＩＩＩ．発明の組成物
本発明はグルカゴン、油相、及び水相を含む水中油滴型ナノエマルジョン組成物を提供する。いくつかの実施態様では、本発明はグルカゴン、油相、及び水相を含む水中油滴型ナノエマルジョン組成物を提供し、前記油相は２００ｎｍ未満の平均直径を有する油滴の形態で存在する。いくつかの実施態様では、本発明はグルカゴン、油相、及び水相を含む水中油滴型ナノエマルジョン組成物を提供し、前記グルカゴンは、３７℃で３〜７日貯蔵後に凝集せずそしてその濃度の７５％以上を維持し、そして前記油相は約２００ｎｍ未満の平均直径を有する油滴の形態で存在する。
【００９０】
ナノエマルジョンは、任意の適切な量のグルカゴンを含有することができる。一般に、ナノエマルジョンは、グルカゴンを約０．０１〜約２ｍｇ／ｍＬの量で含有する。本発明のナノエマルジョン組成物は、例えば、グルカゴン０．１〜１．５ｍｇ／ｍＬ、又はグルカゴン０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬを含有することができる。ナノエマルジョン組成物は、グルカゴンを約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．６ｍｇ／ｍＬ、約０．７ｍｇ／ｍＬ、約０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．９ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ、約１．３ｍｇ／ｍＬ、約１．４ｍｇ／ｍＬ、及び約１．５ｍｇ／ｍＬ含有することができる。
【００９１】
いくつかの実施態様では、本発明のナノエマルジョン組成物は、油相６．１〜２９重量％を含有し、より好ましくは１０〜２０重量％を含有する。ナノエマルジョン組成物は、油相を約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、約１９重量％、又は約２０重量％を含有することができる。
【００９２】
いくつかの実施態様では、ナノエマルジョン組成物は、水相及び油相を含み、前記油相は、グルカゴン、油及びリン脂質を含む。いくつかの実施態様では、油相は、リン脂質及び油を含有する。
【００９３】
いくつかの実施態様では、ナノエマルジョン組成物は、水相中にグルカゴン、油及びリン脂質を含み、前記グルカゴンは凝集、ゲル化、又は沈殿しない形態で維持される。
【００９４】
ナノエマルジョンは任意の適切な量の油を含有することができる。一般に、ナノエマルジョンは油を約０．１〜約１０重量％含有する。いくつかの実施態様では、ナノエマルジョン組成物は、油を０．２５〜７．５重量％、さらに好ましくは１〜５重量％含有する。ナノエマルジョンは、油の混合物を約０．５重量％、約０．７５重量％、約１．０重量％、約１．２５重量％、約１．５重量％、約１．７５重量％、約２重量％、約２．５重量％、約３重量％、約４重量％、又は約５重量％含有することができる。
【００９５】
一般に、油相中の油は、単独又は組み合わせのトリグリセリド（例えば、鳥グリセロール又はトリアシルグリセリド）であり、体温において液体でありそして注入可能な薬剤における使用において薬学的に許容可能である。油は、天然源由来であり又は合成的に製造することができる。油の例としては、天然原由来である植物油、動物油、中鎖油、又は合成油であるトリカプリリン、トリオレイン、若しくはトリミリスチンが含まれるが、これらに限定されない。代表的な植物油としては、アーモンド油、ルリジサ油、ブラックカラント種油、コーン油、サフラワー油、大豆油、ゴマ油、綿実油、落花生油、オリーブ油、ナタネ油、ヤシ油、パーム油、キャノーラ油等が含まれるが、これらに限定されない。「中鎖トリグリセリド」（「ＭＣＴ」）としても知られる「中鎖油」は、グリセロールの中鎖（炭素数６〜１２）脂肪酸エステルである。ＭＣＴは、天然供給源由来か、又は合成的に製造されたもののどちらであってもよい。
【００９６】
いくつかの実施態様では、油は、植物油、例えばゴマ油、ヒマシ油、コーン油、又は大豆油である。いくつかの実施態様では、油は合成油である。いくつかの実施態様では、油は、中鎖油である。本発明のいくつかの実施態様では、油は、中鎖油、植物油、又はそれらの組合せであるナノエマルジョンを提供する。
【００９７】
ナノエマルジョンは、任意の適切な量のリン脂質を含有することができる。いくつかの実施態様では、本発明のナノエマルジョン組成物は、リン脂質５〜２０重量％、より好ましくは７．５〜１２．５重量％を含む。ナノエマルジョンは、リン脂質又はリン脂質の混合物を、例えば、約７．５重量％、約８重量％、約８．５重量％、約９重量％、約９．５重量％、約１０重量％、約１０．５重量％、約１１重量％、約１１．５重量％、約１２重量％又は約１２．５重量％を含有することができる。本発明のいくつかの実施態様では、油相がナノエマルジョンの１０〜２０重量％でありそしてリン脂質濃度は油の濃度よりも多いナノエマルジョンを提供する。
【００９８】
任意の適切なリン脂質が、本発明のナノエマルジョンにおいて使用されることができる。適切なリン脂質には、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、及びホスファチジン酸（ＰＡ）が含まれる。本発明において有用なリン脂質は、天然源から得られるか又は合成的に製造することができる。天然由来のリン脂質は、レシチンと称される。合成リン脂質は、ＤＭＰＣ；ＤＳＰＥ；ＤＭＰＧ、Ｎａ；ＤＰＰＳ、Ｎａ；ＤＬＰＣ；ＤＭＰＣ；ＤＰＰＣ；ＤＳＰＣ；及びＰＯＰＣ；が本明細書において記載される。
【００９９】
いくつかの実施態様では、リン脂質はレシチンである。いくつかの実施態様では、レシチンは卵レシチン又はダイズレシチンである。いくつかの実施態様では、ナノエマルジョンは水相及び油相を含み、油相はグルカゴン、中鎖油、及び卵又はダイズ由来のレシチンを含有する。発明のいくつかの実施態様は、レシチン重量の５％未満の残留リゾレシチン含量を有する、卵又はダイズレシチンで製造されたナノエマルジョンを提供する。
【０１００】
一般に、本発明のナノエマルジョンは、約７０〜約９５重量％の水相を含有する。いくつかの実施態様では、本発明のナノエマルジョン組成物は、７１〜９２重量％、より好ましくは８０〜９０重量％の水相を含む。ナノエマルジョンは、例えば、水相を約８０重量％、約８１重量％、約８２重量％、約８３重量％、約８４重量％、約８５重量％、約８６重量％、約８７重量％、約８８重量％、約８９重量％、又は約９０重量％含むことができる。
【０１０１】
いくつかの実施態様において、ナノエマルジョン組成物１ミリリットル毎に、グルカゴン０．５〜２ｍｇ、油５〜１００ｍｇ、リン脂質５０〜２００ｍｇ、及び水相７００〜９００ｍｇを含有する。
【０１０２】
本発明のナノエマルジョンは、任意の好適なｐＨを有することができる。一般に、本発明のナノエマルジョンは、ｐＨが約２．７〜約８の間である。より好ましくは、ｐＨが約２．７〜約７．２の間である。ｐＨは、例えば、約２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．７、３．９、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、又は７．２とすることができる。ナノエマルジョンのｐＨは、成分を混合しさらに酸又は塩基を添加することによって、及び／又は限外濾過、透析、ゲル濾過、又は別の適切な技術を用いて、ナノエマルジョンの水相を望ましいｐＨの別の水相と取り換えることにより獲得することができる。本発明のいくつかの実施態様は、ｐＨが約２．７〜約７．５のナノエマルジョンを提供する。いくつかの実施態様では、ナノエマルジョンは中性ｐＨを有する。
【０１０３】
驚くべきことに、グルカゴンの安定化は、ナノエマルジョン中の油滴のサイズ及び表面積に依存することが見出された。任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ナノエマルジョン組成物の各液滴が、親水性の「頭部」及び親油性の「尾部」からなる双極性分子であるリン脂質に富む表面コーティングを有する油性コアから構成されていると考えられている（図２）。油滴表面上のリン脂質が、非凝集形態でグルカゴンが存在し得る環境を提供することによって、エマルジョン中にグルカゴンを可溶化すると考えられている。グルカゴンは、不溶性で、実質的に水相には見られず（実施例１０に示すように）、そして、純粋な油に不溶であるので、グルカゴンが選択的に油滴コアを分割するとは考えにくい。むしろ、グルカゴン分子は、油滴表面におけるリン脂質の層内に存在すると考えられている。このように、液滴は、おそらくリン脂質とグルカゴン分子の層で被覆されている。油相及び水相の両方からのこのペプチドの熱力学的除外のために、液滴の表面はこのようにグルカゴンの局在がデフォルトとなる。グルカゴン分子は、油滴表面に局在化することによって、他の点では、エマルジョンからグルカゴンを沈殿させるであろうβシート形成及び／又は凝集を誘導するであろう、疎水性及び水素結合の影響をあまり受けない。
【０１０４】
従って、総液滴表面積は、本発明のナノエマルジョンの重要な組成上の特徴となる。総液滴表面積は、液滴の総数にエマルジョン中の個々の液滴の平均表面積を乗じることによって推定することができる。油相体積が一定の場合、総液滴表面積は液滴の大きさに反比例する、すなわち、液滴が小さいほどより大きな液滴総表面積を有する。
【０１０５】
本発明のナノエマルジョン中の液滴の総数は、油相の総体積を液滴の平均体積で割ることによって計算することができる。油相体積が一定の場合、液滴の合計数は液滴の大きさに反比例する、すなわち、液滴が小さいほどより多い液滴数を有する。以下の表１は、油相濃度が固定された場合の、総液滴表面積及び平均液滴サイズに対する液滴の数の関係を示している。
【表１】
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【０１０６】
従って、グルカゴンを可溶化するために十分な液滴表面積を生み出すために、（１）液滴の数を増加させるために油相濃度を増加させる、及び／又は（２）液滴のサイズを減少させることができる。しかしながら、油相濃度は約２０％の上限までのみ増加させることができ、前記上限を超えると、狭いゲージの皮下注射針を介して注入するにはあまりにも粘度が高くなる。液滴サイズは平均直径約５０〜１００ｎｍの下限を有すると考えられ、前記下限を下回ると目的を達成することが困難となり、もし達成しても、凝集しサイズが戻るであろう不安定な液滴になる。油相濃度もまた下限を有する。例えば、油相濃度が１０％未満に低減される場合、エマルジョンは、１ｍｇ／ｍＬでグルカゴンを可溶化することができなくなる。本理論によれば、所望の濃度で非凝集グルカゴンを維持するために、本発明のナノエマルジョンは、十分に高い油相濃度と十分に小さい液滴サイズを有する必要があり−そして、上記の総液滴表面積の値により、これらの２つの特徴は組み合わされ、表され、そして評価されることができる。
【０１０７】
確かに私達は、約３．０Ｅ＋０６ｍｍ２の総液滴表面積が、ミリグラム単位のグルカゴンを可溶化するために又はグルカゴンを凝集させないために必要とされていることを見出した。従って、この３．０Ｅ＋０６ｍｍ２の値は、「臨界液滴表面積」と呼ばれる。不十分な油相及び／又は大きな液滴の両方又はいずれかのために、総液滴表面積が臨界液滴表面積より低い場合は、エマルジョンは凝集したグルカゴン又は不溶のグルカゴンを含有する可能性がある（実施例１参照）。
【０１０８】
それゆえに、、標的とするグルカゴン濃度１ｍｇ／ｍｌで、凝集のない形態でグルカゴンを可溶化するために、本発明のナノエマルジョンにおいて、ナノエマルジョン組成物は、グルカゴン１ｍＬの総液滴表面積が、臨界液滴表面積を上回るか又は等しくならなければならない。
【０１０９】
従って、本発明のいくつかの実施態様は、グルカゴン及び油滴を含有するナノエマルジョンを提供し、前記ナノエマルジョンの総液滴表面積はグルカゴン１ｍｇあたり３．０Ｅ＋０６ｍｍ２以上である。いくつかの実施態様では、ナノエマルジョン組成物は、グルカゴン及び油滴を含有し、油滴濃度は約２０重量％以下でありそして平均液滴直径は２００ｎｍ以下である。
【０１１０】
いくつかの実施態様においては、ナノエマルジョン組成物は、グルカゴン、水相、及び油相を含み、前記油相は前記ナノエマルジョンの約１０〜２０重量％でありそして総液滴表面積はグルカゴン１ｍｇあたり３．０Ｅ＋０６ｍｍ２と等しいか、又はそれより大きい。
【０１１１】
いくつかの実施態様において、ナノエマルジョン組成物は、水相に懸濁されたグルカゴン及び油滴を含み、油相の濃度は１０〜２０重量％でありそして平均液滴直径は約１００〜１５０ｎｍである。ナノエマルジョン組成物は、ナノエマルジョン１ｍＬ当たり約１ｍｇのグルカゴンまでの濃度で、グルカゴンを可溶化するために使用されることができる。
【０１１２】
いくつかの実施態様において、エマルジョン組成物は、水相中にグルカゴン及び油滴を含み、油相濃度は約１５重量％でありそして平均液滴直径１５０ｎｍ未満である。ナノエマルジョン組成物は、ナノエマルジョン１ｍＬ当たり約１ｍｇのグルカゴンまでの濃度で、グルカゴンを可溶化するために使用されることができる。
【０１１３】
驚くべきことに、本発明のナノエマルジョン組成物によって、グルカゴンが化学的に安定化されそしてその様々な分解経路が許容可能なレベルに抑制されることが見出された。具体的には、油滴表面に局在化したグルカゴンを有することによって、エマルジョン組成物は、前記油滴が存在しない前記溶液組成物と比較して、大幅に改善されたグルカゴンの化学的安定性を示した。
【０１１４】
グルカゴンの主要な分解経路は、アスパラギン酸の９、１５、及び２１位の切断、並びに３、２０、及び２４位のグルタミニルアミド分解であり、これらの分解経路は多くの分解産物に導く（Ｋｉｒｓｃｈ, Ｌ.Ｅ., ｅｔ ａｌ. ２０００.Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ, ２０３：１１５−１２５）。アスパラギン酸切断及びグルタミニルアミド分解の両方は、中間生成物である環状無水物（環状イミド）を得るための、ペプチド結合のプロトン化したカルボニル炭素上の、イオン化された側鎖カルボン酸の求核攻撃を含む（Ａｎｊａｌｉ, Ｂ., ｅｔ ａｌ. ２００５. Ｊ. Ｐｈａｒｍ. Ｓｃｉ. ９４： １９１２−１９２７）。ペプチド結合及び側鎖中における特定の柔軟性が、分子を曲げそして環状イミドの５員環を形成するために必要とされるであろう。
【０１１５】
任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ナノエマルジョン組成物中のグルカゴン分子が、油滴表面に局在化されることにより柔軟性を失い、そして従って、アスパラギン酸切断及びグルタミニアミド分解を受ける可能性があまりなくなると考えられている。エマルジョン液滴によるグルカゴンの結果として生じる明白な化学的安定化は、広く使用されている実用的な医療製品に必要な貯蔵寿命及び安定性（例えば、５℃で１年間及び３７℃で３〜７日間）を有する組成物を得ることを可能にするので、商業的に価値のある液体グルカゴン医薬製品にとって重要な利点である。このような本発明の油滴が存在しない場合、グルカゴンははるかに速い速度で分解する。実施例１２及び１３は、油滴を含有しない、酸性溶液中（実施例１２）又は従来技術において開示されている水溶液組成物中よりも、本発明のナノエマルジョン組成物中において、グルカゴンがはるかに安定であることを示している（例えば、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｇｌｕｃａｇｅｎ Ｈｙｐｏｋｉｔ 及び米国特許出願公開第２０１１／００９７３８６号）。今日まで、適切に安定しており（例えば、５℃で１年間及び３７℃で３〜７日間）、水性で、そしてすぐ注入できる液体のグルカゴン医薬品を提供する公知の液体組成物は、存在しなかった。
【０１１６】
従って、本発明のいくつかの実施態様は、水相中にグルカゴン、油、及びリン脂質を含むナノエマルジョンを提供し、前記グルカゴンの５０％より多くは、分割して又は油相と非共有結合的に結合して維持されている。いくつかの実施態様では、グルカゴンの９０％より多くは、油相と非共有結合的に結合している。いくつかの実施態様においては、総液滴表面積が、前記ナノエマルジョンに含まれるグルカゴンのミリグラム当たりの臨界液滴表面積を超える。いくつかの実施態様では、臨界液滴表面積は、前記ナノエマルジョンにおけるグルカゴンの１ミリグラム当たり３．０×１０６ｍｍ２である。
【０１１７】
本発明のナノエマルジョンにおいて、グルカゴンは、ナノエマルジョン組成物中の非ペプチドイオンを最小化又は除去することによってさらに化学的に安定することができる。イオン例えば、ナトリウム、塩素、及び酢酸のイオンの残留量は、一般にペプチド精製プロセスの結果として、製造されたペプチド中に見出される。基本的には、合成又はＤＮＡ組換え方法によって製造された全ての市販のペプチドは、イオン１〜１０重量％を対イオン又は残留イオンとして含有する。ペプチド原料に付随する（accompany）これらのイオン種は、このように「非ペプチドイオン（non-peptide ions）」と呼ばれる。
【０１１８】
追加の非ペプチドイオンを、イオン性安定化剤、可溶化剤、ｐＨ緩衝剤種、及びｐＨ調整剤の添加の結果として、最終的なグルカゴン製剤に導入することができる。例えば、アミノ酸安定剤（米国特許第５，６５２，２１６号）、ｐＨ緩衝液としてのリン酸塩又は酢酸塩、（欧州特許第１，０６１，９４７号）、可溶化剤としてのリゾレシチン（米国特許出願第２０１１／００９７３８６号）、又は市販の薬剤に見られるようなヒドロニウム若しくは塩化物イオン（例えば、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社製のＧｌｕｃａＧｅｎ Ｈｙｐｏｋｉｔ（グルカゴン塩酸塩）キット、及びＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社製のＧｌｕｃａｇｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ｒＤＮＡ ｏｒｉｇｉｎ））の使用である。そのような非ペプチドイオンは、通常は水に又はエマルジョンの水相に可溶性であり、それらの全体的な濃度は、本発明の最終組成物の導電率によって定量される。以前から知られているグルカゴン組成物は、水溶液中でイオン化したグルカゴンを含有し、そしてイオン性可溶化剤に依存しているので、得られた最終組成物は必然的により高い全体的なイオン濃度が含まれているか、又は本発明のナノエマルジョンに比べて著しく高い導電率を有する。
【０１１９】
驚くべきことに、本発明の発明者は、非ペプチドイオンがグルカゴンの化学的安定性に有害であることを見出した（実施例６）。従って、可能な限り、イオン性賦形剤（例えば、ナトリウム、塩素、可溶化剤、ｐＨ緩衝剤など）の使用を避け、及び／又は任意の対イオン及び／又はグルカゴン原料中に含まれる非ペプチドイオンを除去することが非常に望ましい。従って、本発明のナノエマルジョン組成物は、イオンに寄与する賦形剤（ion-contributing excipients）、例えば、イオン性ｐＨ緩衝剤、ｐＨ調整剤、張度調整剤、又は界面活性剤などの使用を回避する。
【０１２０】
対イオン及び／又は残留イオンがナノエマルジョンの水相中に優先的に存在するため、限外濾過分離プロセス、例えば透析、ダイアフィルトレーション、又はタンジェンシャルフロー濾過を用いてナノエマルジョンの水相とイオンを含まない水相とを交換することによって、これらのイオンは、除去されることができる（実施例６）。このような処理の後、対イオン及び／又はナノエマルジョン中の残留イオンの濃度が大幅に低減される。
【０１２１】
いくつかの実施態様では、本発明のナノエマルジョン組成物は、水相中にグルカゴンと油滴を含み、ナノエマルジョンの導電率は、同じ条件下で０．１５％ＮａＣｌ水溶液について測定されるものより低い。
【０１２２】
いくつかの実施態様では、ナノエマルジョン組成物は、水相中にグルカゴンと油滴を含み、非ペプチドイオンの含有量の合計は、ナノエマルジョン総重量の０.４％より低い。
【０１２３】
いくつかの実施態様では、ナノエマルジョン組成物は、水相中にグルカゴンと油滴を含み、前記ナノエマルジョンは、前記水相とイオンを含まない又は低イオンの水溶液とを交換することにより非ペプチドイオンを除去するために、膜濾過処理が施されている。
【０１２４】
本発明のいくつかの実施態様は、臨界イオン含有量より低いイオン含有量を有するナノエマルジョンを提供し、前記臨界イオン含有量は、０．１２重量％ＮａＣｌ水溶液の導電率と等しい。
【０１２５】
水性ビヒクル（vehicles）においては、グルカゴンは２７メチオニンの酸化を受けると考えられている。従って、特定の酸化防止剤の存在は、グルカゴンの安定性をさらに向上させることができる。いくつかの実施態様においては、上述したように、ナノエマルジョンはＥＤＴＡ、メチオニン、フルクトース、デキストロース、システイン、グルタチオン若しくはその塩又はそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの酸化防止剤をさらに含有する。いくつかの実施態様では、前記ナノエマルジョンは、メチオニン、システイン、デキストロース、フルクトース、ラクトース、及びエデト酸の塩（ＥＤＴＡ）を含む群から選択される、酸化防止剤を含有する。いくつかの実施態様において、前記ナノエマルジョン組成物は、メチオニン、ＥＤＴＡ、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、ナノエマルジョンは、メチオニン約０．１〜１％、ＥＤＴＡ約０．００１〜０．０１パーセント、又はそれらの組み合わせを含む。
【０１２６】
ナノエマルジョンは、抗菌保存剤を必要に応じて含有することができる。このような防腐剤は、前記組成物が同じバイアル（複数回投与バイアル形式）からの複数回の投与を提供することを可能にすることができる。いくつかの実施態様において、ナノエマルジョン組成物は、クレゾール、パラベン、フェノール、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、安息香酸、ベンジルアルコール、クロロブタノール、チメロサール、ソルビン酸、ソルビン酸、ＥＤＴＡ又はそれらの組み合わせからなる群から選択される抗菌保存剤を含有する。いくつかの実施態様において、ナノエマルジョン組成物は、ＥＤＴＡ、ベンジルアルコール、パラベン、メタ重亜硫酸ナトリウム、クレゾール、又はその塩及びそれらの組合せから選択される抗菌保存剤を含有する。いくつかの実施態様において、ナノエマルジョン組成物は、抗菌保存剤としてクレゾールを含有する。抗菌保存剤の任意の適切な量は、ナノエマルジョンに含めることができる。
【０１２７】
いくつかの実施態様において、水相は、酸化防止剤、金属イオンキレート剤、抗菌保存剤、非イオン性糖、及び水を含有する。いくつかの実施態様において、エマルジョンは、任意の水溶性界面活性剤、例えば、リゾリン脂質、リゾレシチン、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、又はシクロデキストリンを含まない。
【０１２８】
一般に、本発明は、許容可能な注入性基準を満たしたグルカゴンを含むナノエマルジョン組成物を提供する。いくつかの実施態様において、ナノエマルジョン組成物は、水性ビヒクル中にグルカゴン、油、及びリン脂質を含み、そして前記ナノエマルジョンは、微細な針を通して容易に注入可能である。
【０１２９】
いくつかの実施態様においては、本発明は、０．２又は０．４５ミクロンの細孔膜を通して濾過されることができ、そして濾過により滅菌されることができ、このように熱又は放射線を用いて無菌プロセス又は最終滅菌の必要性を排除する。いくつかの実施態様において、ナノエマルジョンは、０．２ミクロンのフィルターを通して濾過可能である。
【０１３０】
本発明のナノエマルジョン組成物は、有利な安定性によって特徴付けられる。いくつかの実施態様において、ナノエマルジョン組成物は物理的に安定であり、そしてナノエマルジョンを５℃で１年間保存した後に、凝集、ゲル化、又は沈殿したグルカゴンを含有しない。
【０１３１】
いくつかの実施態様では、ナノエマルジョン組成物は物理的に安定であり、そしてナノエマルジョンを３０〜３７℃で３〜７日間保存した後に、凝集、ゲル化、又は沈殿したグルカゴンを含有しない。
【０１３２】
いくつかの実施態様では、ナノエマルジョン組成物は物理的に安定であり、そしてナノエマルジョンを５℃で１年間保存した後及び３０〜３７℃で３〜７日間保存した後に、凝集、ゲル化、又は沈殿したグルカゴンを含有しない。
【０１３３】
いくつかの実施態様では、ナノエマルジョン組成物は水相中にグルカゴン及び油滴を含み、前記グルカゴンの５０％より多くは、油滴に付着するか又は非共有結合的に結合しておりそして前記グルカゴンは５℃で１年間化学的に安定である。
【０１３４】
いくつかの実施態様では、ナノエマルジョン組成物は水相中にグルカゴン及び油滴を含み、前記グルカゴンの５０％より多くは、油滴に付着するか又は非共有結合的に結合しておりそして前記グルカゴンは３７℃で３〜７日間化学的に安定である。
【０１３５】
いくつかの実施態様では、ナノエマルジョン組成物は水相中にグルカゴン及び油滴を含み、前記グルカゴンの５０％より多くは、油滴に付着するか又は非共有結合的に結合しておりそして前記グルカゴンは３７℃で３〜７日間及び５℃で１年間化学的に安定である。
【０１３６】
いくつかの実施態様では、ナノエマルジョン組成物は水相中にグルカゴン及び油滴を含み、前記グルカゴンの５０％より多くは、油滴に付着するか又は非共有結合的に結合している。エマルジョンにおいて、前記グルカゴンは３７℃で３〜７日間及び５℃で１年間物理的に安定である。
【０１３７】
いくつかの実施態様において、本発明は、２〜８℃で少なくとも１年間又は体温で若しくは体温に近い温度（３０〜３７℃）で３〜７日間、物理的に安定であるグルカゴンを含有するナノエマルジョン組成物を提供する。
【０１３８】
いくつかの実施態様において、本発明は、２〜８℃で少なくとも１年間又は体温で若しくは体温に近い温度（３０〜３７℃）で３〜７日間、化学的に安定であるグルカゴンを含有するナノエマルジョン組成物を提供する。
【０１３９】
いくつかの実施態様において、本発明は、２〜８℃で少なくとも１年間又は体温で若しくは体温に近い温度（３０〜３７℃）で３〜７日間、物理的に及び化学的に安定であるグルカゴンを含有するナノエマルジョン組成物を提供する。
【０１４０】
本発明のナノエマルジョン組成物は、それらの物理的及び化学的安定性をさらに改善するために、凍結乾燥されることができる。凍結乾燥された組成物は、注入前に液体ナノエマルジョンを形成するために液体状に戻される。凍結乾燥ナノエマルジョンは、バイアルまたはシリンジ中の乾燥した塊である「凍結乾燥ケーキ（lyophile cake）」として提供され、室温で貯蔵した場合に少なくとも１年間、安定であることが意図される。使用前に、凍結乾燥された組成物は、水で液体状に戻され、例えば、上述した液体ナノエマルジョン組成物として、同一の物理的又は化学的安定性を有するナノエマルジョンを再形成する。
【０１４１】
従って、本発明のいくつかの実施態様は、グルカゴン、リン脂質、中鎖油、及び糖を含有する凍結乾燥された乾燥組成物を提供し、水と混合すると、前記凍結乾燥された乾燥組成物は上述のようにナノエマルジョンを形成する。本発明のいくつかの実施態様は、グルカゴン、リン脂質、中鎖油、及び糖を含有する凍結乾燥された乾燥組成物を提供し、前記凍結乾燥された乾燥組成物は、水と混合すると、ナノエマルジョンを形成し、前記ナノエマルジョン中のグルカゴンは、３７℃で３〜７日貯蔵後に凝集せずその濃度の７５％以上を維持し、５０％以上のグルカゴンは非共有結合的に油相と結合し；総液滴表面積は前記ナノエマルジョンに含有されるグルカゴンのミリグラム当たりの液滴表面積である、臨界液滴表面積又は３．０×１０６ｍｍ２を超え；前記ナノエマルジョンの導電率は、０．１５％塩化ナトリウム水溶液について測定される導電率より低く、ｐＨは約２．７〜約７．５の間である。
【０１４２】
いくつかの実施態様において、ナノエマルジョン組成物は凍結乾燥されていない。いくつかの実施態様では、ナノエマルジョンは、すぐに注入される。例えば、エマルジョン組成物は、皮下、筋肉内又は静脈内経路を介しており、又は２ホルモン、インスリン／グルカゴンポンプ用途用であり、すぐ注入できる注射形式として好適であり、半透明で均質な液体として５℃で保存することができる。いくつかの実施態様では、エマルジョン組成物（又は液体状に戻したエマルジョン）は手動により又は２ホルモン、インスリン／グルカゴンポンプにより、病状の治療として、皮下、筋肉内又は静脈内経路を介して送達される。いくつかの実施態様では、凍結乾燥された組成物は、注入前に水と混合される。いくつかの実施態様においては、ナノエマルジョン及び凍結乾燥された組成物は、バイアル又はシリンジで提供される。
【０１４３】
いくつかの実施態様においては、本発明は、
グルカゴン０．１〜１．５ｍｇ／ｍＬ；
油０．５〜７．５重量％；
１個以上のリン脂質５〜２０重量％；並びに
残りの重量を補うための水相であり、前記水相は、（ａ）前記ナノエマルジョンが約２００ｎｍより小さい平均直径の油滴を含有し、及び（ｂ）５０％以上のグルカゴンが非共有結合的に液滴と結合している、
を含む、水中油滴型ナノエマルジョンを提供する。
【０１４４】
いくつかの実施態様においては、本発明は、
グルカゴン０．１〜１．５ｍｇ／ｍＬ；
油０．５〜７．５重量％；
１個以上のリン脂質５〜２０重量％；並びに
残りの重量を補うための水相であり、前記水相は、（ａ）前記ナノエマルジョンが約２００ｎｍより小さい平均直径の油滴を含有し、（ｂ）５０％以上のグルカゴンが非共有結合的に液滴と結合しており、及び（ｃ）非ペプチドの及び水溶性のイオンの合計が臨界イオン含有量を超えない、
を含む、水中油滴型ナノエマルジョンを提供する。
【０１４５】
いくつかの実施態様においては、本発明は、
グルカゴン０．１〜１．５ｍｇ／ｍＬ；
油０．５〜７．５重量％；
１個以上のリン脂質５〜２０重量％；並びに
残りの重量を補うための水相であり、前記水相は、（ａ）前記ナノエマルジョンが約２００ｎｍより小さい平均直径の油滴を含有し、（ｂ）５０％以上のグルカゴンが非共有結合的に液滴と結合しており、（ｃ）非ペプチドの及び水溶性のイオンの合計が臨界イオン含有量を超えず、及び（ｄ）ｐＨは２．７〜７．５の間である、
を含む、水中油滴型ナノエマルジョンを提供する。
【０１４６】
いくつかの実施態様においては、ナノエマルジョン組成物は、グルカゴン０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬ、中鎖油０．５〜１０重量％、卵レシチン５〜１５重量％、メチオニン０．１〜１重量％、ＥＤＴＡ二ナトリウム水和物０．００２５〜０．１重量％を含み、前記組成物はｐＨ２．７〜７の間である。
【０１４７】
いくつかの実施態様においては、ナノエマルジョン組成物は、グルカゴン約１ｍｇ／ｍＬ、中鎖油０．５〜５％、卵レシチン１０％、メチオニン０．３〜１％、ＥＤＴＡ二ナトリウム水和物０．００５重量％を含み、前記組成物はｐＨ２．７〜７の間である。
【０１４８】
いくつかの実施態様においては、ナノエマルジョン組成物は、グルカゴン約１ｍｇ／ｍＬ、中鎖油０．５〜５重量％、卵レシチン１０重量％、メチオニン０．３〜１重量％、ＥＤＴＡ二ナトリウム水和物０．００５重量％を含み、前記組成物中の油相は、平均直径が２００ｎｍより小さい油滴で存在する。
【０１４９】
いくつかの実施態様においては、ナノエマルジョン組成物は、グルカゴン約１ｍｇ／ｍＬ、中鎖油１〜５重量％、卵レシチン１０重量％、メチオニン０．３重量％、ＥＤＴＡ二ナトリウム水和物０．００５重量％を含み、前記組成物中の総液滴表面積は、臨界液滴表面積を超える。
【０１５０】
いくつかの実施態様においては、ナノエマルジョン組成物は、グルカゴン約１ｍｇ／ｍＬ、中鎖油０．５〜５％、卵レシチン１０％、メチオニン０．３％、ＥＤＴＡ二ナトリウム水和物０．００５％を含み、前記組成物中のグルカゴンの少なくとも５０％は油相に存在する。
【０１５１】
いくつかの実施態様においては、ナノエマルジョン組成物は、グルカゴン約１ｍｇ／ｍＬ、中鎖油０．５〜５％、卵レシチン１０％、メチオニン０．３〜１％、ＥＤＴＡ二ナトリウム水和物０．００５％を含み、前記組成物中の導電率は、０．１５％ＮａＣｌ水溶液の導電率以下である。
【０１５２】
いくつかの実施態様においては、本発明のナノエマルジョン組成物は、グルカゴン約１ｍｇ／ｍＬ、中鎖油０．５〜５重量％、卵レシチン約１０重量％、スクロース約１０重量％、メチオニン０．３％、ＥＤＴＡ二ナトリウム水和物約０．００５５重量％、及び組成物の残りの重量を補うための十分な水を含む。
【０１５３】
いくつかの実施態様においては、本発明のナノエマルジョン組成物は、グルカゴン約１ｍｇ／ｍＬ、中鎖油０．５〜５重量％、卵レシチン約１０重量％、スクロース約１０重量％、メチオニン０．３重量％、ＥＤＴＡ二ナトリウム水和物約０．００５５重量％、及び組成物の残りの重量を補うための十分な水を含有し、（ａ）前記ナノエマルジョンが約２００ｎｍより小さい平均直径の油滴を含有し、（ｂ）５０％以上のグルカゴンが非共有結合的に液滴と結合している。
【０１５４】
いくつかの実施態様において、本発明のナノエマルジョン組成物は、グルカゴン約１ｍｇ／ｍＬ、中鎖油約０．５〜５重量％、卵レシチン約１０重量％、スクロース約１０重量％、メチオニン約０．３％、ＥＤＴＡ二ナトリウム水和物約０．００５５重量％、及び組成物の残りの重量を補うための十分な水を含み、（ａ）前記ナノエマルジョンが約２００ｎｍより小さい平均直径の油滴を含有し、（ｂ）５０％以上のグルカゴンが非共有結合的に液滴と結合しており、（ｃ）非ペプチドの及び水溶性のイオンの含量の合計が、臨界イオン含有量を超えない。
【０１５５】
いくつかの実施態様において、本発明のナノエマルジョン組成物は、グルカゴン約１ｍｇ／ｍＬ、中鎖油約０．５〜５重量％、卵レシチン約１０重量％、スクロース約１０重量％、メチオニン約０．３重量％、ＥＤＴＡ二ナトリウム水和物約０．００５５重量％、及び組成物の残りの重量を補うための十分な水を含み、（ａ）前記ナノエマルジョンが約２００ｎｍより小さい平均直径の油滴を含有し、（ｂ）５０％以上のグルカゴンが非共有結合的に液滴と結合しており、及び（ｃ）非ペプチドの及び水溶性のイオンの含量の合計が、臨界イオン含有量を超えず、及び（ｄ）前記組成物は中性ｐＨである。
【０１５６】
いくつかの実施態様において、本発明のナノエマルジョン組成物は、グルカゴン約１ｍｇ／ｍＬ、中鎖油約０．５〜５重量％、卵レシチン約１０重量％、スクロース約１０重量％、メチオニン約０．３重量％、ＥＤＴＡ二ナトリウム水和物約０．００５５重量％、及び組成物の残りの重量を補うための十分な水を含み、前記組成物中の総液滴表面積は、臨界液滴表面積を超える。
【０１５７】
いくつかの実施態様において、本発明のナノエマルジョン組成物は、グルカゴン約１ｍｇ／ｍＬ、中鎖油約０．５〜５重量％、卵レシチン約１０重量％、スクロース約１０重量％、メチオニン約０．３重量％、ＥＤＴＡ二ナトリウム水和物約０．００５５重量％、及び組成物の残りの重量を補うための十分な水を含み、前記ナノエマルジョンは、実質的にリゾリン脂質又はリゾレシチンを含んでいない。
【０１５８】
ＩＶ．ナノエマルジョン及び凍結乾燥された組成物の製造方法
１つの実施態様においては、本発明はグルカゴンを含むナノエマルジョン組成物の製造方法を提供する。前記方法は、
工程１．金属イオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ二ナトリウム水和物）、酸化防止剤（例えば、メチオニン）、糖（例えば、スクロース）、及びグルカゴンを水中（例えば注入用の水）又は希釈した酸（例えば１〜１０ｍＭのＨＣｌ）の中で混ぜ合わせ、混合し、そして溶解させ、水溶液を形成する；
工程２．油（例えば中鎖油）又はリン脂質（例えば卵レシチン）、及び目標の総重量又は体積になるまで計算した量の水相を混ぜ合わせ、そして全ての固体が溶解又は分散し一次エマルジョンを形成するまで激しく混合する；
工程３．一次エマルジョンを均質機に通し、約２００ｎｍより小さい平均直径の液滴を有するナノエマルジョンを得る；
工程４．ナノエマルジョンを０．２ミクロンフィルターに通して滅菌する；及び
工程５．濾過したナノエマルジョンをバイアル又はシリンジに充填する。
【０１５９】
いくつかの実施態様において、グルカゴン、油、及びリン脂質を最初に混合し、そして揮発性溶剤、例えばエタノールに溶解し、透明な溶液を形成する。溶媒は、熱、真空又は不活性ガス、例えば窒素の流れ、で乾燥することにより除去され、乾燥した油相を形成する。油相を水相と混合し、そして上記の２〜５の工程を経て実施される。
【０１６０】
いくつかの実施態様では、付加的なイオン添加剤は、ナノエマルジョン中のイオン濃度が臨界イオン含有量まで増加することを避けるために、上記のいずれの工程においても添加されていない。これは、任意のｐＨ緩衝塩の回避を含む。これはまた、グルカゴン原料中の全てのイオンの含有量が、グルカゴン原料総重量の約５％より大きくてはならないことも必要としている。
【０１６１】
万が一、組成物が臨界イオン含有量を超えた場合に、一次エマルジョン（工程２により生産される）又はナノエマルジョン（工程３により生産される）は、イオン含有量を臨界イオン含有量未満に減少させるために、限外濾過工程を任意に受けることができる。限外濾過工程は、工程２又は工程３の後に行うことができる。
【０１６２】
いくつかの実施態様では、限外濾過工程は、グルカゴン原料及び他の原料からの外来の対イオンを多く含有するエマルジョンの水相を、臨界イオン含有量より低いイオン含有量とするための、イオンを含まない又は少量のイオンを含有する新しい水相に取り換えるために、エマルジョンの一次エマルジョン又はナノエマルジョンに適用される。約１倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍の水相の典型的なボリューム交換が、不必要である溶解イオンを枯渇させるために必要とされる。少量のエマルジョンについては、ダイアフィルトレーション装置、例えば、アミコン攪拌セル（Amicon Stirred Cell）を、不要なイオンを臨界イオン含有量未満に減少させるために使用することができる。大きなスケールにおいては、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）装置、例えば、ミリポアペリコンＴＦＦカセット（Millipore Pellicon TFF cassette）（ミリポア社）を使用することができる。約３Ｋ、１０Ｋ、３０Ｋ、５０Ｋ、又は１００ＫのＭＷＣＯを有する半透膜を、不必要である溶解イオンの通過を可能にする一方で油滴及び結合したグルカゴンを保持するために、使用することができる。
【０１６３】
いくつかの実施態様において、高せん断、高エネルギー、又は高圧均質機（マイクロフルイディクス・インターナショナル・コーポレーション社から入手可能なマイクロフルダイザー）を、一次エマルジョン中の油滴直径を５００ｎｍより大きいものから、約２００ｎｍ未満、好ましくは約１５０ｎｍ未満、最も好ましくは約１００ｎｍ未満に減少させることにより、一次エマルジョンからナノエマルジョンに変換するために使用することができる。油滴サイズの減少は、ナノエマルジョンの粘度を大いに減少させ、注入性を向上させ、そして、グルカゴンナノエマルジョンの物理的及び化学的安定性に要求される臨界液滴表面積を超える、十分な液滴表面積を生成する。高圧の均質化は、エマルジョンの特性に大きな変化を引き起こす。例えば、本発明の一次エマルジョンは、一般的には、白色であり、不透明であり、濃く（thick）、そしてクリーム様の液体であり、０．２ミクロンフィルターでは濾過できず、そしてそれゆえに注入に適していない。一方で、ナノエマルジョンは、半透明であり、絹のように滑らかであり、薄く（thin）、そして粘度が著しく低下した水のような液体である（図５）。ナノエマルジョンは０．２ミクロンフィルターを介して容易に濾過することができる（実施例１及び６）。
【０１６４】
従って、バイアル又はシリンジ中に充填する前に組成物を滅菌する本発明のいくつかの態様において、ナノエマルジョンは、０．２又は０．４５ミクロン滅菌フィルター膜を通して濾過される。滅菌フィルターを通して濾過可能であることは、液体形態でグルカゴンを滅菌する他の方法がないため、非常に望ましい。γ線照射、高温処理、ガス処理（例えば、エチレンオキシド）又はＵＶ光照射滅菌を含む、他の一般的な滅菌方法は、グルカゴンの化学的完全性に、許容できない損傷を引き起こす可能性がある。濾過は、液体組成物を滅菌するための最も穏やかで便利な方法であり、そしてこの滅菌方法は、本発明のナノエマルジョンによって実現可能となる。
【０１６５】
ナノエマルジョンが０．２又は０．４５ミクロンフィルターを通して容易に濾過可能であるという事実は、凝集、ゲル化、又は沈殿したグルカゴンがないことを示す。さらに、本発明のナノエマルジョンは、体温又は体温に近い温度で３〜７日経過後の平均液滴サイズが２００ｎｍ未満であり、濾過可能のままである（実施例８）。これとは対照的に、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社のＧｌｕｃａｇｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ製品は、液体状に戻された後に急速にゲル化しそして濾過不能となる。リゾリン脂質ベースのグルカゴン組成物（米国特許出願第２０１１／００９７３８６号又はヨーロッパ特許第１０６１９４７）もまた、体温又は体温に近い温度で７日間経過後に濾過可能ではない（実施例１３）。
【０１６６】
このように、本発明のいくつかの実施態様は、本明細書に記載のナノエマルジョンのいずれかを調製する方法を提供する。
工程は：
（ａ）グルカゴン及び水相を混ぜ合わせる工程、
（ｂ）リン脂質及び油を添加する工程、
（ｃ）直径が２００ｎｍ以下の平均液滴サイズを有するナノエマルジョンを形成するために、混合及び均質化する工程、及び
（ｄ）ナノエマルジョンを０．２ミクロンフィルターに通して滅菌する工程、
を含む。
【０１６７】
いくつかの実施態様では、本発明のナノエマルジョンは、物理的及び化学的安定性をさらに改善するために、上述の製造方法における工程５の後に凍結乾燥される。凍結乾燥ナノエマルジョンはバイアル又はシリンジに乾燥した塊、「凍結乾燥ケーキ」として提供され、これは少なくとも１年間室温で安定であることが意図される（図６）。前記凍結乾燥ケーキは、前記液状ナノエマルジョン組成物と同じ物理的又は化学的安定性を有するナノエマルジョンを再び形成するために、使用の前に水で液体状に戻される（図６）。
【０１６８】
従って、本発明のいくつかの実施態様は、本明細書に記載の乾燥組成物を製造する方法を提供する。前記方法は：グルカゴン及び水相を混ぜ合わせる工程、
（ａ）リン脂質及び油を添加する工程、
（ｂ）直径が２００ｎｍ以下の平均液滴サイズを有するナノエマルジョンを形成するために、混合及び均質化する工程、
（ｃ）ナノエマルジョンを０．２ミクロンフィルターに通して滅菌する工程、及び
（ｄ）ナノエマルジョンを凍結乾燥する工程、
を含む。
【０１６９】
Ｖ．使用及び投与方法
別の態様において、本発明は、グルカゴンを必要とする患者の治療方法を提供する。この方法は、患者にナノエマルジョン、上記液体状に戻した凍結乾燥組成物のいずれかを投与することを含む。いくつかの実施態様では、本発明のナノエマルジョンは、皮下注射針が取り付けられた予め充填された注射器で提供され、すぐ注入できる。この特徴は、緊急低血糖救助のために特に望ましい。重度の低血糖を反転させるために使用される典型的な用量は、１ｍｇ／ｍＬのナノエマルジョン１ｍＬである。
【０１７０】
いくつかの実施態様では、本発明のナノエマルジョンは、静脈内、筋肉内又は皮下注射を通して投与される。いくつかの実施態様において、グルカゴンは、ポンプから又はシリンジから注射針を介して、皮下、筋肉内又は静脈内経路を通して投与される。
【０１７１】
いくつかの実施態様では、本発明のナノエマルジョンは、カートリッジ（リザーバー）又はバイアルに充填され、そしてポンプに取り付けられ、そしてその液体内容物は、糖尿病状態の治療においてポンプから皮下注入により送達される。ポンプ内のグルカゴンを使用するために、ポンプカートリッジ（メーカーによる予めの充填又はエンドユーザによる自己充填により得られる）は、ポンプ装置に装填（load）されている。使用期間の終了時（例えば、２〜７日）に、残っているグルカゴンナノエマルジョンは廃棄され、新鮮なグルカゴンナノエマルジョンがポンプに供給される。皮下注入により送達されるグルカゴンの投与量は患者の必要性によって決定される。プロトタイプのインスリン−グルカゴン２ホルモンポンプの研究では、２４時間の期間にわたる血糖コントロールを達成するために使用されるグルカゴンの量は、０．１２０〜０．３７７ミリグラムであることが報告された（Ｅｌ−Ｋｈａｔｉｂ, ｅｔ ａｌ.２０１０. Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌ. Ｍｅｄ. ２：２７ｒａ２７）。
【０１７２】
いくつかの実施態様では、本発明のナノエマルジョンは、抗菌保存剤を含有し、そしてバイアル又は注入デバイス（すなわち、予め充填されたオートインジェクターや他の構成中の、シリンジ又はバイアル）に充填される。バイアル／シリンジは、複数回投与のための十分な量を含有しており、内容物は、複数回の注入で患者に投与されていてもよい。それぞれの注入において、内容物は、少量及び変化する量が注入される。この複数回及び量が変化する投与の特徴は、グルカゴンの少ない用量が使用される、放射線検査中の胃腸運動を抑制するための特定の放射線の手順のために特に望ましい。ナノエマルジョン中への抗菌保存剤の添加により、同じ予め充填されたシリンジを使用した複数回少用量又は複数回注入を排除するためにバイアルに複数の穴を開けた後の潜在的な微生物の増殖を防ぐことができる。抗菌保存剤はまた、体温に近い温度に数日間ナノエマルジョンを触れさせる、２ホルモンポンプ投与のためにも望ましい。
【０１７３】
いくつかの実施態様では、本発明のナノエマルジョンは、バイアル又は注射器中の乾燥した塊（「凍結乾燥ケーキ」）として提供され、これは、少なくとも１年間室温で保存されることが意図される。前記凍結乾燥ケーキは、以前と同じ物理的又は化学的安定性を有しそして前記液状ナノエマルジョン組成物と同じ方法で使用することができるナノエマルジョンを再形成するために、使用の前に水で液体状に戻される。
【０１７４】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解されるであろう。
【０１７５】
実施例１
グルカゴンを含有する、物理的に安定なナノエマルジョンの製造
表２におけるエマルジョン組成物をグルカゴンを可溶化するために製造した。それぞれの組成物は、固有の「Ｆ」のナンバーでコード化された。
【表２】
2015503565.tif 000004
【０１７６】
スクロース１０ｇ及びＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物５．５ｍｇを計量し、ＤＩ水を添加して１００ｇとし、そしてすべての固体を溶解することによって、水相を調製した。
【０１７７】
エマルジョンを：
１．プラスチックバイアルで、卵レシチン、中鎖油、及びグルカゴンを計量する；
２．５０％バッチサイズのエタノールを添加する；
３．混合し、全ての固形物を溶解する；
４．真空乾燥して、スピードバック（SpeedVac）を使用して残留しているエタノールの含量を乾燥重量の５％未満に除去する；
５．最終バッチ重量となるまで水相を添加する；
６．混合し、白色で不透明な一次エマルジョンを形成する；
７．目に見える油滴が、２００倍の倍率の光学顕微鏡を用いても見えなくなるまで、一次エマルジョンを均質化する；
８．それぞれのエマルジョンを０．２ミクロンフィルターに通す；
９．エマルジョンをガラスバイアルに充填し、そしてゴム栓でバイアルを密封する；及び
１０．−２０、２〜８、２５、及び４０℃にそれぞれ配置する、
ことにより製造した。
【０１７８】
エマルジョンを、外観；ｐＨ；エマルジョンが凝集したグルカゴンを含有しているか、又は濾過するには粘度が高すぎるかどうかを決定するための、０．２ミクロンフィルターによる濾過性；及びマルバーンゼータサイザーナノモデル（Malvern Zetasizer Model Nano）を用いた動的光散乱法による平均液滴サイズ；について試験した。試験結果を表３に要約する。
【表３】
2015503565.tif 000005
【０１７９】
総液滴表面積（ｍｍ２）が臨界液滴表面積（３．０Ｅ＋０６ｍｍ２）を超えた場合にのみ、ナノエマルジョン（Ｆ−１又はＦ−３）が０．２ミクロンフィルターを通過し、そしてグルカゴン凝集物を含まないようである。油相がＦ−１のように２０重量％を超えると、エマルジョンの粘度が高くなりすぎそして濾過することが困難になるので、油相濃度は２０重量％未満が好ましい。Ｆ−４は、油相が少ないために（約１０％）グルカゴンを完全には可溶化せず、このことは、Ｆ−４の総液滴表面積（２．２Ｅ＋０６ｍｍ２）はグルカゴン１ｍｇを可溶化するのに不十分であるという結果となる。Ｆ−３（約１ｍｇ／ｍＬのグルカゴン、油５重量％、平均液滴直径１１８ｎｍのリン脂質１０重量％、及びミリグラム当たりの総液滴表面積が３．８Ｅ＋０６ｍｍ２である可溶化グルカゴンを含有する）は物理的に安定であり、濾過可能であり、そして凝集グルカゴンがないナノエマルジョンである。
【０１８０】
この研究は、卵レシチン、中鎖油、及び水相を含油するナノエマルジョンの形成を支持し、前記ナノエマルジョン中の油相の合計は約１０％と２０％の間でありそして油の濃度はリン脂質の濃度以下であり、そしてナノエマルジョン中の総液滴表面積は臨界表面積を超え、グルカゴンを可溶化することができ、そして０．２ミクロンフィルターで濾過可能な液体組成物を形成する。
【０１８１】
実施例２
ＨＰＬＣ法及びＨＰＬＣによるグルカゴン分解生成物の決定
逆相ＨＰＬＣ法は、本発明のナノエマルジョン中のグルカゴン及びその分解生成物の濃度を試験するために開発された。この方法を使用して、ナノエマルジョン中のグルカゴンの化学的安定性を評価した。ＨＰＬＣ法の条件を以下に示す。表４にＨＰＬＣ勾配を要約する。
カラム：４．６×２５０ｍｍ、Ｃ−８
移動相Ａ：水中に０．０５体積％のトリフルオロ酢酸
移動相Ｂ：アセトニトリル中の水の０．０５体積％のトリフルオロ酢酸
カラム温度：３５℃
波長：２１４ｎｍ
オートサンプラー温度：５℃
【表４】
2015503565.tif 000006
【０１８２】
新たに製造された（パネル１）及び分解された（パネル２）グルカゴンそれぞれの代表的なＨＰＬＣクロマトグラムが図３に示される。この方法は、グルカゴンの主要な分解生成物、すなわち、多くのアスパラギン酸の切断及びグルタミニルアミド分解による分解生成物並びに酸化物（パネル２）を分離し、そして定量することが可能である。図３では、パネル３は、本発明のナノエマルジョン（Ｆ−２２）とＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社のＧｌｕｃａｇｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ製品との間の分解生成物の量の違いを示している。この例に示すように、開発されたＨＰＬＣ分析法は、グルカゴンが水性環境において様々な分解生成物を形成する傾向があること、そして本発明のナノエマルジョン（Ｆ−２２）が、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社のＧｌｕｃａｇｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎよりも優れた化学的安定性を示すことを明らかにした。
【０１８３】
実施例３
中性における、ナノエマルジョンのグルカゴンの化学的安定性改善
実施例１のＦ−３ナノエマルジョン組成物の新しいバッチを調製し、そして複数の小さな部分に分割した。各部分をＮａＯＨでｐＨ５〜７．５の間に調整し、ガラスバイアル中に充填し、密封し、そしてグルカゴンの化学分解を加速するために４０℃に配置した。１、１１、３０、及び４５日後に、実施例２に記載のように、それぞれの組成物を、ＨＰＬＣ法を用いてグルカゴン濃度を分析した。グルカゴンの減少の平均速度を計算し、そして試験されたｐＨ範囲にわたる相対的安定性を示すために使用した。下記の表５は、異なるｐＨ値におけるｍｇ／ｍＬ／日のグルカゴン減少速度を示している。ｐＨ対減少速度のプロファイルは図４に示されている（上のパネル）。
【表５】
2015503565.tif 000007
【０１８４】
第二のｐＨ対速度試験では、Ｆ−３ナノエマルジョン組成物を、低ｐＨ範囲（ｐＨ２．４〜６．８）で調製した。減少速度の結果は表６に、そしてｐＨ対減少速度のプロファイルは図４に示される（下のパネル）。
【表６】
2015503565.tif 000008
【０１８５】
データは、グルカゴンが、ｐＨ５．５〜７．２の間でより安定であることを示している。
Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社のＧｌｕｃａｇｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎのケース（ｐＨ２〜４）であるｐＨ５．５未満では、グルカゴンはあまり安定ではない。加えて、ｐＨ７．２より上の値では、グルカゴンはさらに不安定となる。米国特許出願２０１１／００９７３８６は、グルカゴンの安定性に悪影響を与える可能性があるｐＨ４又は７．５でのリゾリン脂質可溶化グルカゴン組成物（請求項１）を開示する。本発明のナノエマルジョン組成物については、好ましいｐＨ範囲はｐＨ２．４〜７．２であり、より好ましくは２．７〜６．８である。
【０１８６】
実施例４
組成物に対してアミノ酸を加えることによる、グルカゴンの化学的安定性改善
以下の組成物を、レシチンと油を溶解するためにエタノールを使用しなかったこと以外は、上記実施例１の方法を用いて調製した。
【表７】
2015503565.tif 000009
【０１８７】
各組成物をガラスバイアルに充填し、密封し、そしてグルカゴンの化学分解を加速するために４０℃に配置した。５日後、上記実施例２に記載のように、組成物を、ＨＰＬＣ法を用いてグルカゴン濃度について分析した。各組成物中の５日後のグルカゴン回収（最初の濃度の百分率）が下記表８に提供される。
【表８】
2015503565.tif 000010
【０１８８】
データは、グルカゴンの化学的安定性が、メチオニンにより増大することそしてグリシンにより減少することの両方を示している。この発見は、全てのアミノ酸（又は両性電解質）がグルカゴンを安定させることができるということを主張する、Ｋｏｒｎｆｅｌｔら（米国特許５，６５２，２１６号）による教示を支持していない。驚くべきことに、メチオニンは、グルカゴンを安定させ、そして両性電解質であること以外のメカニズムによってよって安定化を行う。本実施例に示すように、グルカゴンエマルジョンに対する非選択的なアミノ酸の添加は、アミノ酸がグルカゴン分解を加速させるために、望ましくない可能性がある。
【０１８９】
実施例５
酸化防止剤を加えることによる、グルカゴン組成物の化学的安定性改善
以下の組成物を、レシチンと油を溶解するためにエタノールを使用しなかったこと以外は、上記実施例１の方法を用いて調製した。酸化防止剤を、還元糖及び還元アミノ酸から選択した。
【表９】
2015503565.tif 000011
【０１９０】
各組成物をガラスバイアルに充填し、密封し、そしてグルカゴンの化学分解を加速するために４０℃に配置した。６及び２３日後、上記実施例２に記載のように、組成物を、ＨＰＬＣ法を用いてグルカゴン濃度について分析した。グルカゴンの減少の平均速度を計算し、そして酸化防止剤存在下における相対的安定性を示すために使用した。表１０は、ｍｇ／ｍＬ／日のグルカゴン減少速度をリストアップしている。
【表１０】
2015503565.tif 000012
【０１９１】
グルカゴン減少速度データは、選択された特定の酸化防止剤が組成物に添加された場合に、他のものが速度を加速させる一方で、グルカゴン分解を遅くすることができたことを示唆した。メチオニン単独又はフルクトース若しくはデキストロースとの組み合わせは、グルカゴンの安定化に最も効果的であると思われた。ラクトースは、一方では、グルカゴンの安定性にとって有害であり、従って望ましくないものである。
【０１９２】
実施例６
ナノエマルジョン中の非ペプチド、水溶性イオン含量を減少させることによる、グルカゴンの化学的安定性改善
水溶性のイオンを、少なくとも３つの供給源：（１）グルカゴン原料からの対イオン又は残留イオンとして；（２）追加の不活性成分、例えば油、リン脂質、酸化防止剤などからの対イオン又は残留イオンとして；及び（３）ナノエマルジョンのｐＨを調整するために使用する酸又は塩基、からナノエマルジョン組成物中に導入することができる。本研究（ＢＡＣＨＥＭ、ロット１０１７２１９）に使用されたグルカゴン原料は、合計で３．６９％の既知のイオン（アンモニウム０．８５％、塩素２．６％、及び酢酸０．２４％）を含有している。ナノエマルジョン中のこれらの「外来イオン（extraneous ions）」の全体的な濃度は、ナノエマルジョンの導電率によって測定することができる。
【０１９３】
外来イオンは一般に水溶性であり、そしておそらく、ナノエマルジョンの水相中に残るので、限外濾過工程を使用して、外来イオンを含有する水相を低いイオン含有量の又はイオンを含まない水溶液に交換することによってそれらを除去することができる。限外濾過は、外来イオンを含有する水相を通過させながら油滴を保持する膜を使用する。本研究では、ナノエマルジョン中のグルカゴンの分解速度に対するそのような外来イオンの全濃度を評価する。ナノエマルジョン組成物３つ（Ｆ−２２、Ｆ−２３、及びＦ−２９、全てｐＨ約５．２において）は、実施例４と同様の方法を用いて、以下に示す組成を有するように調製した。
【表１１】
2015503565.tif 000013
【０１９４】
各組成物をガラスバイアルに充填し、密封し、そしてグルカゴンの化学分解を加速するために３７℃に配置した。１、３、及び７日後、上記実施例２に記載のＨＰＬＣ法を用いて、組成物を、グルカゴン濃度について分析した。グルカゴンの減少に基づいて、グルカゴン減少の平均速度を計算し、そしてグルカゴンの安定性に対する外来イオン濃度の影響を示すために使用した。各組成物について、全体のイオン濃度は導電率計(Ｏａｋｔｏｎ，ＣＯＮ １１，Ｅｕｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製)を用いて測定し、同じ導電率径により測定された、同じ導電率を有するＮａＣｌ水溶液濃度を用いて表現した。以下の表１２は、ｍｇ／ｍＬ／日のグルカゴン減少速度及び各組成物の測定された導電率をリストアップしている。
【表１２】
2015503565.tif 000014
【０１９５】
この研究は、驚くべきことに、外来イオンが非常に重要な経路であるグルカゴン化学分解を促進することを示した。Ｆ−２３のようなＮａＣｌ少量（０．０５８％又は１０ｍＭ）の添加は、Ｆ−２２と比較して、測定される導電率をほぼ倍増させ、そしてグルカゴン分解速度を約４４％増加させる結果となる。限外濾過による外来イオンの除去は、一方では、ほとんど検出不可能なレベルにまで導電率を減少させ、そしてグルカゴン分解速度を５０％より多く減少させる。０．１１％ＮａＣｌ水溶液と等しい測定導電率を有するＦ−２３では、３７℃で７日後に最初のグルカゴン濃度における約９％が減少する。最大許容損失を示す１０％の減少により、本実施例の研究は、グルカゴンナノエマルジョン中のイオン濃度を最小にすることが必要であることを示している。従って、この研究は、グルカゴン用の化学的に安定であるナノエマルジョンを調製するためには、対イオン又は残存イオンが減少した又はそれらを含まない、好ましくは原料の合計重量の５％未満；（２）任意のイオン化可能な酸又は塩基、例えばｐＨ調整用ＨＣｌ及びＮａＯＨを含む、任意の不必要な塩又は外来イオンの導入を排除；及び／又は（３）外来イオンを限外濾過により組成物から除去、しなければならない。グルカゴン用の好ましいナノエマルジョンは、０．１２％ＮａＣｌ水溶液が有する測定導電率、すなわち、３７℃７日後のグルカゴンのおおよその減少を約１０％に限定する臨界イオン含有量以下の測定導電率の値を有しなければならない。
【０１９６】
実施例７
マイクロフルダイザーを用いた、液体の及び凍結乾燥されたナノエマルジョンの調製
以下の組成を有するＦ−２２を、以下の組成を有する４０ｇバッチサイズで調製した：
【表１３】
2015503565.tif 000015
【０１９７】
製剤を以下：
１．清浄なガラスボトルにエデト酸二ナトリウム二水和物、メチオニン、及びスクロースを計量する；
２．ＤＩ水を添加する；
３．混合し、固形物を溶解させ、水相を得る；
４．グルカゴンを別の容器に計量する；
５．最終グルカゴン濃度を達成するために、計算された量の水相を添加し、よく混合してグルカゴンを分散させ一次エマルジョンを形成する；
６．最大２５ＫのＰＳＩの圧力で動作するマイクロフルダイザー（モデル１１０ＥＨ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社）に一次エマルジョンを通過させる；
７．動的光散乱装置（ゼータサイザーナノ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて測定された平均液滴直径が約１００ｎｍとなるまで工程を継続する；
８．０．２ミクロンフィルター（Ｍｉｌｌｉｆｌｉｐ、ミリポア社）を通してナノエマルジョンを濾過する；
９．Ｆ−２２の貯蔵及び安定性分析のために、ガラスバイアルに濾過したナノエマルジョンを充填し、そしてゴム栓でいくつかのバイアルをクリンプシール（crimp-sealing）する；
１０．棚型凍結乾燥機（モデルＤｕｒａ−ｄｒｙ／Ｄｕｒａ−ｓｔｏｐ ＭＰ、ＦＴＳ社）を使用して、液体Ｆ−２２を含有する他のバイアルをいくつか凍結乾燥させる。
により調整した。
【０１９８】
最終的なＦ−２２ナノエマルジョンの導電率を臨界イオン含有量（すなわち、０．１２％ＮａＣｌ水溶液と同等の導電率）より低い約０．０６％ＮａＣｌと同等であると決定し、そして液滴表面積は臨界液滴表面積（すなわち、グルカゴン１ミリグラム当たり３．０Ｅ＋６ｍｍ２）を超えている３．８Ｅ＋６ｍｍ２として算出した。酸又は塩基によるｐＨ調整は、製造工程中に実施されなかった。
【０１９９】
液体の及び凍結乾燥されたＦ−２２の、初期の及び安定性試験の結果を、表１４〜２９に要約する。
【表１４】
2015503565.tif 000016
【表１５】
2015503565.tif 000017
【表１６】
2015503565.tif 000018
【表１７】
2015503565.tif 000019
【表１８】
2015503565.tif 000020
【表１９】
2015503565.tif 000021
【表２０】
2015503565.tif 000022
【表２１】
2015503565.tif 000023
【表２２】
2015503565.tif 000024
【表２３】
2015503565.tif 000025
【表２４】
2015503565.tif 000026
【表２５】
2015503565.tif 000027
【表２６】
2015503565.tif 000028
【表２７】
2015503565.tif 000029
【表２８】
2015503565.tif 000030
【表２９】
2015503565.tif 000031
【０２００】
上記のデータは、Ｆ−２２は本発明によるナノエマルジョンのためのすべての重要な要件すなわち、（１）中性ｐＨ、（２）２００ｎｍ未満の平均液滴サイズ、（３）５０％より多い、油滴と結合したグルカゴン（実施例１０）、（４）臨界液滴表面積より大きな総液滴表面積、及び（５）臨界イオン含有量より少ないイオン含有量を有し及び維持する。従って、Ｆ−２２は、優れた物理的及び化学的安定性を示した。物理的に、液体でありそしてすぐ注入できる形態のＦ−２２は、２〜８℃で又は２５℃でグルカゴン凝集又は沈殿のいずれの兆候も示さず、ｐＨ、半透明の外観、サブミクロンの液滴サイズ、液滴サイズ分布、及びゼータ電位を維持する。化学的には、Ｆ−２２は、２ヶ月間、同じ貯蔵条件下におけるグルカゴンの検出可能な減少を示さなかった。、４０℃では、Ｆ−２２は少なくとも１ヶ月安定であり、これは、体温又は体温に近い温度（３０〜３７℃）での１週間の十分な安定性、及び歩行できる２ホルモンインスリン／グルカゴンポンプ用途における使用の適性を示唆している。凍結乾燥されたＦ−２２は、液体のＦ−２２よりもさらに安定したであると考えられる。凍結乾燥されたＦ−２２は、このように直ちに注入液となるように水で液体状に戻し、何ヶ月にもわたって複数回使用されることができる、注入可能な液体として考えることができる。
【０２０１】
実施例８
体温でのグルカゴンナノエマルジョンの７日間の安定性の実証
実施例７で記載されたＦ−２２を体温（３７℃）で７日間、安定性について試験した。試験結果を以下の表に示す：
【表３０】
2015503565.tif 000032
【０２０２】
この研究からのデータは、本発明（例えば、Ｆ−２２）により調製したナノエマルジョンが体温で７日間安定であり、２ホルモンインスリン／グルカゴンポンプ用途での使用に適したものであることを実証している。
【０２０３】
実施例９
Ｆ−２２ナノエマルジョンの注入性評価
上記実施例７に従って調製したＦ−２２の注入性を評価した。「注入性」とは、一定のレートで設定された、皮下注入針／シリンジから液体組成物を排出するために必要なピーク力の測定である。力を（デジタルフォースゲージモデルＨＰ−５０、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｌａｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）で測定した。皮下注入針／シリンジの構成は、２８ＧＸ１／２ｉｎ ＢＤ Ｍｉｃｒｏ−Ｆｉｎｅ（登録商標） ＩＶ （オレンジ）常時取り付け針（permanently attached needle）を備える１／２ ｍＬ ＢＤ Ｌｏ−Ｄｏｓｅ（登録商標） Ｕ−１００インスリンシリンジから構成される。注入速度は、シリンジポンプを用いて約０．９ｍＬ／ｍＬで設定した。ピーク力の結果を以下の表に示す。
【表３１】
2015503565.tif 000033
【０２０４】
Ｆ−２２は、非常に微細な皮下針を通してインスリンシリンジからナノエマルジョンを注入するために、非常に緩やかなピーク力を必要とする。約１ポンド注入力のピークはユーザによって手動で容易に自分で適用するか、又は医療装置のポンプによって適用することができる。注入性（ピーク力によって測定される）は、３７℃で９日間保存した後に変化せず、これは、これらの条件を経験させた後、製剤中の粘度変化がないことを示唆している。
【０２０５】
実施例１０
Ｆ−２２ナノエマルジョンの油相及び水相間のグルカゴンのパーティショニング
この研究は、水相及び油相間のグルカゴンの比率若しくは分配、又は水性相に残留するグルカゴン割合を計算するために、Ｆ−２２のナノエマルジョンの水相中のグルカゴン濃度を決定する目的で行った。実施例７に従い調製したＦ−２２ナノエマルジョンの水相を、３，０００ＭＷＣＯ膜（ウルトラセル３，０００ＭＷＣＯ膜を備えるアミコンウルトラ０．５ｍＬ遠心フィルター、ミリポア社）を用いて油相から分離した。分離を、遠心分離によって達成した。Ｆ−２２の遠心濾過は、その重量の約５０％を除去した。無色透明であったろ液を回収し、実施例２の分析方法を用いてグルカゴン含量について試験した。
【表３２】
2015503565.tif 000034
【０２０６】
結果は、Ｆ−２２の水相には残留レベル（約１％）のグルカゴンのみが見出され、グルカゴンの９９％以上は油相と結合しているか又は油相に存在することを示している。この研究結果は、本発明のナノエマルジョン組成物において、グルカゴンは水相には本質的に存在しないということを、明白に示している。この見解は、新規であり、そしてグルカゴンが水相中に可溶化しているというグルカゴン組成物の先行技術（とりわけ、英国特許第１２０２６０７号；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ａ. Ｂ. ａｎｄ Ｅｄｅｌｈｏｃｈ, Ｈ. Ｊ. １９７２. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２４７： ４９８６−４９９１；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ, Ｒ. Ｍ., ｅｔ ａｌ. １９８２. Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２１：１２１７−１２２８；Wｕ, Ｃ.−Ｓ. Ｃ. ａｎｄ Ｙａｎｇ, Ｊ. Ｔ. １９７８. Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９： ２１１７−２１２２；Ｂｒｏｗｎ, Ｌ. Ｒ. ａｎｄ Ｗｕｔｈｒｉｃｈ, Ｋ. １９８０. Ｂｉｏｃｈｉｍ. Ｂｉｏｐｈｙｓ. Ａｃｔａ ６０３： ２９８−３１２；Ｍａｔｉｌａｉｎｅｎ, Ｌ., ｅｔ ａｌ.２００８. Ｊ. Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ. ９７（７）：２７２０−９；Ｍａｔｉｌａｉｎｅｎ, Ｌ. ｅｔ ａｌ. ２００９. Ｅｕｒ. Ｊ. Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ. ３６（４−５）：４１２−２０；欧州特許第１０６１９４７号；米国特許出願第２０１１／００９７３８６号；米国特許第５，６５２，２１６号）とは対照的である。
【０２０７】
実施例１１
Ｆ−２８（Ｆ−２２にｍ−クレゾールを添加）の組成物、調製、及び安定性
抗菌保存剤を含有するナノエマルジョン組成物（Ｆ−２８）を、実施例７の方法を用いて調製したＦ−２２組成物に０．２５重量％のｍ−クレゾールを添加することにより調製した。Ｆ−２２及びＦ−２８を隣り合わせてで、３７℃貯蔵後の安定性を試験しそしてデータを表３３〜３６に要約した。
【表３３】
2015503565.tif 000035
【表３４】
2015503565.tif 000036
【表３５】
2015503565.tif 000037
【表３６】
2015503565.tif 000038
【０２０８】
これらの結果は、Ｆ−２８は、３７℃においてＦ−２２に匹敵する安定性プロファイルを有することを示し、このことは、ナノエマルジョン中のグルカゴンの安定性に影響を与えることなく、本発明のナノエマルジョンに抗菌保存剤、例えばｍ−クレゾールを添加で
きることを示している。
【０２０９】
実施例１２
Ｆ−２２及びＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ社のＧｌｕｃａｇｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ｒＤＮＡ ｏｒｉｇｉｎ）の調製及び安定性比較
Ｆ−２２の安定性を商業用グルカゴン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社のＧｌｕｃａｇｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ｒＤＮＡ ｏｒｉｇｉｎ）ロットＬＤＪＦ０１ＥＡ）の調製と並行して、実施例２に記載のＨＰＬＣと同じ方法を採用して試験した。Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社のグルカゴンは２パートのキットで提供した。１つのバイアルはグルカゴン凍結乾燥物を含有しそして付属シリンジは液体状に戻すための酸性溶液の希釈剤を含んでいる。この実施例の安定性の研究は、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社の凍結乾燥した形態を使用して行われ、そして同じ貯蔵温度（２５℃）でＦ−２２と比較した。ＨＰＬＣの結果を表３７及び３８に示しそして代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを図３に提供する。
【表３７】
2015503565.tif 000039
【表３８】
2015503565.tif 000040
【０２１０】
この安定性の比較は、本発明（Ｆ−２２）のグルカゴンナノエマルジョンが、液体又は凍結乾燥形態のいずれにおいても、商業用薬剤であるＧｌｕｃａｇｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ｒＤＮＡ ｏｒｉｇｉｎ）Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社）より化学的に安定であることを明白に示した。Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社のグルカゴンは、非常に限られた物理的安定性を有し；提供された酸性溶液（ｐＨ２〜４）を使用して凍結乾燥物を液体状に戻した後のわずか数時間のうちに、グルカゴンの凝集が生じた
【０２１１】
実施例１３
Ｆ−２２及びＢＩＯＤ９０１製剤の安定性比較
Ｆ−２２の安定性を、米国特許出願第２０１１／００９７３８６号に教示されているような、リゾリン脂質が可溶化されているｐＨが中性の製剤の安定性と比較した。この製剤（ＢＩＯＤ９０１）を前述した特許出願の実施例３に従って調製した。ＢＩＯＤ９０１は、グルカゴン１ｍｇ／ｍＬ、リゾ−ミリストイル−ホスホコリン（ＬＭＰＣ）２ｍｇ／ｍＬ、グルコース４５ｍｇ／ｍＬ、ｍ−クレゾール２ｍｇ／ｍＬを含有し、そしてその後にｐＨを７に調整した塩基性溶液中で製造される。アルカリ（例えば、ＮａＯＨ）をｐＨを上昇させるため（７以上）に最初に使用し、そして次に酸（例えばＨＣｌ）をｐＨを７に戻すために使用した。ＢＩＯＤ９０１は最初は透明な液体であったが、３７℃１日貯蔵後には沈殿物でかすんでいた。比較のために、Ｆ−２２及びＢＩＯＤ９０１を、３７℃で７日間横並びに保存し、そして実施例２に記載したものと同じＨＰＬＣ法を用いて分析した。ＨＰＬＣの結果を表３９に示す。
【表３９】
2015503565.tif 000041
【０２１２】
実施例１３は、本発明のナノエマルジョン組成物では、グルカゴンの安定性が、グルカゴンを可溶化させるために水溶性リゾリン脂質を活用した先行技術の水溶液組成物（米国特許出願第２０１１／００９７３８６号）よりも実質的に優れていることを実証した。このように、Ｆ−２２は、潜在的に刺激性のリゾリン脂質を使用せず複数日数のポンプ送達形式での使用を可能にするために、体温又は体温に近い温度（３０〜３７℃）における十分な安定性をより提供することが可能となります。
【０２１３】
実施例１４
予見的な組成物（Prophetic Compositions）の調製及びその使用
以下の組成物は、化学的及び物理的に安定でありｐＨが中性の、グルカゴン用のナノエマルジョンを提供するために期待される。臨界液滴表面積よりも大きな総液滴表面積及び臨界イオン含有量よりも少ない全体イオン含有量を生産するための、実施例１又は７に記載されているような工程と同じ又は同様の工程を使用して、各組成物を、製造することができる。これらの組成物は、必要に応じて、さらに改善された安定性のために凍結乾燥することができる。各組成物は、低血糖の救助、複数回投与、又は治療のポンプ用途で使用することができる。
【表４０】
2015503565.tif 000042
【表４１】
2015503565.tif 000043
【０２１４】
実施例１５
Ｆ−２２及びＧｌｕｃａｇｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ｒＤＮＡ ｏｒｉｇｉｎ、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社）のマウスにおける薬力学的研究（Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ Ｓｔｕｄｙ）
本研究の目的は、Ｆ−２２及びＧｌｕｃａｇｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ｒＤＮＡ ｏｒｉｇｉｎ、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社、ロットＡ８３６６８７Ｃ）間で、以下のマウスにおける皮下注入について、薬力学又はＰＤ（すなわち、時間に対する血中グルコース）を比較することであった。Ｃ５７ＢＬ／６、オス、８〜９週齢、体重２０〜２３の合計８個体のマウスを本研究において使用した。動物を順応させ、そして薬剤を投与する前に、５日間毎日尾部で採血を行った。マウスを無作為に２グループに分け１６時間絶食させた。本研究を通して食料は除去したが、水は与えた。血中グルコースを、ハンドヘルドグルコースメーター（ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ、Ｌｉｆｅｓｃａｎ, Ｍｉｌｐｉｔａｓ, Ｃａ）を用いて尾部採血サンプルで測定した。血液サンプルを、尾の先端（１〜２ｍｍ）の小さなセクションをハサミで切り取り採取した。血液サンプル（５〜１０μＬ）をグルコース試験ストリップ上に直接回収した。通常は、血液の最初の一滴を捨て、二番目のものを試験した。Ｆ−２２又はＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ社のグルカゴンを通常の生理食塩水で２０μｇ／ｍＬに希釈し、そして希釈後１時間以内に２００μｇ／ｋｇの用量で投与した。基線グルコースサンプル（投与前）は、グルカゴン注入の５分前に採取した。血中グルコース濃度を、注入後１０分、２０分、３０分、４５分、６０分、９０分、１２０分、１８０分及び２４０分で測定した。全ての動物を注入部位の反応について試験し、炎症又は感染の兆候は、注入後５日以内に観察されなかった。
【０２１５】
本研究では、２つの試験製剤の同等のＰＤプロファイルを実証し（図７）、このことは、ナノエマルジョン組成物（Ｆ−２２）及び商業用薬剤（Ｇｌｕｃａｇｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ｒＤＮＡ ｏｒｉｇｉｎ、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社））の同じ薬力学又は薬物動態的特性を実証した。
【０２１６】
本発明の多くの改良や変形は、前述の詳細な説明から当業者に自明であり、そして添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。本明細書で引用された全ての参考文献の教示は参照により具体的に援用される。
【図１】
2015503565.tif 000044
【図２】
2015503565.tif 000045
【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2015503565.tif 000052
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