(57)【要約】  本発明は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による侵襲性真菌感染症の体外診断法に関する。本発明は：・哺乳動物由来の液生体サンプルであって、特に、タンパク質および／または脂質および／または塩および／または前記タンパク質および／または脂質および／または塩と複合体を形成することができる多糖および／またはオリゴ糖および／または単糖を含む生物学的サンプルを提供し、・前記サンプルを生物学的液体で処理して前記多糖および／またはオリゴ糖および／または単糖を抽出し、・多糖、オリゴ糖および／または単糖の内の少なくとも１つで、真菌微生物由来の少なくとも一つの関心対象の化合物の有無をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いて判定し、・前記サンプルに前記所与の関心対象の化合物が存在する場合、前記哺乳動物が侵襲性真菌感染症でかかっていると推論すること、を含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性真菌微生物に起因する侵襲性真菌感染症の体外診断法であって、
哺乳動物から得られ、タンパク質および／または脂質および／または塩および／または前記タンパク質および／または脂質および／または塩と複合体を形成しやすい多糖および／またはオリゴ糖および／または単糖を含む生物学的液体のサンプルを提供し、
前記多糖および／またはオリゴ糖および／または単糖を抽出するために前記サンプルを処理し、
前記多糖、オリゴ糖および／または単糖の内の少なくとも１つで、前記真菌微生物由来の所与の関心対象の化合物の有無をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いて判定し、
前記関心対象の化合物が前記サンプルに存在する場合、哺乳動物は侵襲性真菌感染症にかかっていると推定することを含む方法。
【請求項２】
前記多糖および／またはオリゴ糖および／または単糖を前記生物学的サンプルから抽出するために、
前記タンパク質および／または前記脂質の大部分の沈殿／凝集によって前記サンプルに含まれる前記複合体を生物学的液体から分離し、
前記サンプルを遠心分離して上清を固相から分離し、
上清を回収し、
上清中に含まれる前記多糖および／またはオリゴ糖および／または単糖が特に逆相クロマトグラフィーによって任意の残留タンパク質および任意の残留脂質から分離され、前記多糖および／またはオリゴ糖および／または単糖が特に吸収クロマトグラフィーによって前記塩から分離される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記複合体を解離させるために、錯化剤、特に塩基、特にＥＤＴＡを添加し、結果として得られる混合物を沸点まで、特に１００℃〜１４０℃の温度、具体的には１２０℃の温度まで加熱する請求項２記載の方法。
【請求項４】
最初に逆相クロマトグラフィーを実施し、続いて吸収クロマトグラフィーを実施する請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
疎水性相を含むカラムを逆相クロマトグラフィーのために使用し、活性炭を含むカラムを吸収クロマトグラフィーのために使用する請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記関心対象の化合物が１０００未満のｍ／ｚ比を有することを特徴とする、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記複合体の解離から生じる前記多糖および／またはオリゴ糖の鎖を切断するために、添加される前記複合体に対して反応しやすい少なくとも１つの酵素の添加および／または化学処理を行い、結果として前記関心対象の化合物の量が潜在的に増加する、請求項１〜６の何れか一項に記載の少なくとも１つの酵素
【請求項８】
前記関心対象の化合物が、以下のモノマーおよびオリゴマー：［Ｎ−アセチル−グルコサミンβ−（１，４）Ｎ−アセチル−グルコサミン］ｎ（この式中のｎは１以上で１０以下の整数）、糖、２〜１０個の単糖を含むオリゴ糖、特にヘキソースオリゴマー、特にヘキソースダイマー；グルカン、特に［グルコースβ−（１，３）グルコース］ｎ、［グルコースβ−（１，６）グルコース］ｎ（この式中のｎは１以上で１０以下の整数）タイプのグルカン；マンナン、特に［マンノースα−（１，２）マンノース］ｎ、［マンノースα−（１，３）マンノース］ｎ、［マンノースα−（１，６）マンノース］ｎ、および［マンノースβ−（１，２）マンノース］ｎ（この式中は１以上で１０以下のｎは整数）タイプのマンナン、ガラクタン、ガラクタマンナン（galactamannan）、アリビノガラクタン（aribinogalactan）、およびグルクロンキシロマンナン（glucuronexilomannan）から選択される請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記関心対象の化合物が、前記哺乳動物の免疫系の作用後に前記病原性真菌微生物によって産生される化合物であり、特にトレハロースである請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記病原性真菌微生物が、カンジダ（Candida）種、特にＣ．アルビカンス、アスペルギルス（Aspergillus）種、フザリウム（Fusarium）種、トリコスポロン（Trichosporon）種、サッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、アクレモニウム（Acremonium）種、スケドスポリウム（Scedosporium）種、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、スポロトリックスシェンキイ（Sporothrix schenckii）およびニューモシスチス・ジロヴェチ（Pneumocystis jirovecii）ならびに前記哺乳動物の免疫系の作用に反応してトレハロースを産生する病原性真菌微生物から選択される、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
所与の前記関心対象の化合物について得られるシグナルの強度を前記標準化合物から得られるシグナルと比較することによって、前記サンプルに含まれる所与の前記関心対象の化合物の量を確定することができるように、既知量の少なくとも１つの標準サンプルを前記サンプルに添加する、請求項１〜１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ユビキタス内因性シグナルの強度と対する前記所与の関心対象の化合物に対応するシグナルの強度の比が決定され、前記内因性シグナルが前もって同定され、場合によってサンプルが得られた生物学的液体の種類に特異的であり、その結果、前記サンプルに含まれる前記所与の前記関心対象の化合物を定量化できる請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物学的液体が、動脈または静脈血、血清、生殖粘膜液、気道液、特に気管支肺胞洗浄から得られる液体、気管支吸引、気管吸引、吐出物、痰、皮膚および外皮を収集するために用いられた液体、浸出液、閉鎖腔からの液体、特に脳脊髄液体、胃腸管または尿液および生検断片の摩砕から得られる液体から選択される請求項１〜１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３の何れか一項に記載の方法を適用可能にするキットであって、
・少なくとも、逆相クロマトグラフィーを実行可能にする疎水性固相を含む第１支持体と、
・少なくともインプット開口部、アウトプット開口部ならびに前記インプット開口部とアウトプット開口部との間に配置された固体活性炭充填物を含む第２の容器と、を含むキット。
【請求項１５】
等量の活性炭と珪藻土とを混合することによって前記充填物を調製する請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記疎水性固相が分割された形態で存在し、磁性材料を含む請求項１４または１５に記載のキット。
【請求項１７】
場合によって放射性同位体で標識された、単糖、二糖および三糖から選択される所与の量の標準化合物、特に重水素化トレハロースを含む請求項１４〜１６の何れか一項に記載のキット。
【請求項１８】
生物学的液体に含まれる多糖および／またはオリゴ糖および／または単糖により形成される複合体と反応することができる所与の量の酵素をさらに含む請求項１４〜１７の何れか一項に記載のキット。
【請求項１９】
疎水性固相を含む前記支持体が逆相クロマトグラフィーを実行可能にし、前記活性炭充填物を含む前記容器が互いに独立して以下の部品：プレート、ウェル、カラム、チューブおよび複数のウェルを含むプレートから選択される請求項１４〜１８の何れか一項に記載のキット。
【請求項２０】
ＭＡＬＤＩプレートも含む、請求項１４〜１９の何れか一項に記載のキット。
【請求項２１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による侵襲性真菌感染症の体外診断ための、多糖、オリゴ糖および単糖ならびにトレハロースから選択される関心対象の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（MALDI-TOF Spectrometry）による侵襲性真菌感染症（invasive fungal infection）の体外診断法に関する。本発明の方法では、サンプルに含まれ、侵襲性真菌感染症の診断用のマーカーとして使用される関心対象の化合物を定量化することができる。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ．アルビカンス（C. albicans）等の酵母が健常者の粘膜に存在することは多いが、通常はそれらが特定の疾患または症状を引き起こすことはない。体が弱ると酵母が増殖して血液系に移行し、その場合には侵襲性または全身性感染症が言及される。Ｃ．アルビカンスの場合、ヒトのカンジダ血症（Ｃ．アルビカンスに起因する真菌血症）はその４０％が死に至る。侵襲性真菌疾患（IFD）すなわち侵襲性真菌感染症は一般的で深刻な院内疾患である。有効な医療法はあるものの、病院がそれを行うには費用面で益々難しく、ＩＦＤの罹患率は減少していない。真菌をサンプリングするために患者の感染した局所的部位へリスクなしに接近することは不可能なことが多く、従来の菌学的方法（単離／同定）は多くの場合不完全である。また、血液培養はＩＦＤの症例のほぼ半分で陰性である。いわゆる分子生物学的方法（ＰＣＲ）はこれらの問題を解決しない。加えて、（診断に基づく）抗真菌性治療を早期に導入することが患者の生存に影響することが確認されている。従来の菌学の付加的または代替的診断法の内、患者血清中の循環グリカン（すなわち、感染した患者の血清に含まれる真菌グリカン）を検出する方法を臨床医は評価している。このグリカンは微生物（microcetes）またはその前駆体の細胞壁に由来するものであり、商業的免疫学的検査で検出することができる。また、Platelia（登録商標）カンジダ抗原試験では、カンジダとアスペルギルスの夫々に由来するマンナンやガラクタマンナン（galactamannan）を検出することができる。例えば、商標Fungitell（登録商標）で販売される生化学キットは、カンジダとアスペルギルスに共通のグルカンを検出することができる。
【０００３】
上記２種類の「キット」の各々は多くの異なる試薬と内部標準を含んでいる。特に血清を試験する目的である場合、バッチ毎に較正曲線を作製する必要があり、試薬の消費が増加する。このような較正が必要であるため、経済的な理由から（不十分な試薬のため）調査が場合によっては行われない可能性がある。例えば、Fungitell（登録商標）では較正のために９個のウェル（well）を使用し、そして１つの血清を試験するために技術者を半日拘束することは困難である。これらの試験には特にプログラムされた自動分析装置へのアクセスが要求され、情報システムとのインターフェースを有しており、それらの要求にできるだけ応えるとき、そのシステムは１人の患者の緊急の実用的使用が更に複雑になる。
【０００４】
したがって、これらの試験の全てにおいて時間および／または被験者に関する要求が特に多い。加えて、ある一定数の偽陽性結果が生じ、これが診断を妨げている。ＩＦＤ、例えば高トリグリセリド血症の危険に晒された患者において、ヘモグロビン（収集時に溶血する血清）の存在もしくは頻繁な代謝性異常またはビリルビンもしくは低蛋白血症の存在によって妨害されるグルカン（複数可）の生化学測定には、このことは特に当てはまる。
【０００５】
最後に、真菌以外の生物による多重感染の集中治療を受けている入院患者の偽陽性結果が何度も報告されている。これらの患者の血清中で循環する物質は分子ベースで特性化されていないので、Ｐ−Ｄ−グルカンを検出する際の偽陽性反応の機序の種類が分かっていない。これらの偽陽性結果があるため、治療の必要がない一部の患者に抗真菌性抗生物質療法が施され、このためにこの患者の入院期間が延びている。偽陰性結果の場合、感染が真菌性ではなく細菌性であると解釈され、患者は抗菌抗生物質療法を施され、このことは有害であり、致命的な場合がある。
【０００６】
加えて、Fungitell（登録商標）キットは、稀少になりつつある動物であるカブトガニ由来の血液を使用しているが、現在、カブトガニを飼育することができない。したがって、カブトガニは自然環境で捕獲される。血液サンプルをカブトガニから採取した後で放つが、放たれたカブトガニの２０％は生きられない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の１つの目的は、侵襲性真菌感染症の体外診断法の提案である。
【０００８】
他の目的は、上述の偽陰性や偽陽性という検査結果を回避するために役立つ体外診断法の提案である。
【０００９】
本発明は、病原性真菌微生物に起因する侵襲性真菌感染症の体外診断法に関し、この診断法は、
・哺乳動物から得られる、タンパク質および／または脂質および／または塩および／または多糖および／またはオリゴ糖および／または単糖と複合体を形成しやすい前記タンパク質および／または脂質および／または塩、および／または前記多糖および／またはオリゴ糖および／または単糖が含まれる生物学的液体のサンプルを提供し、
・前記多糖および／またはオリゴ糖および／または単糖を抽出する前記サンプルを処理し、
・前記真菌微生物由来の少なくとも１つの所与の関心対象の化合物中の多糖および／またはオリゴ糖および／または単糖の有無を確認するためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析を使用し、
・前記サンプルに前記所与の関心対象の化合物が存在するとき、前記哺乳動物は侵襲性真菌感染症に罹っていると結論付ける。
【００１０】
したがって、発明者の１つの利点は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で、複雑な生物学的液体中に宿主哺乳動物ではなく病原性微生物由来の糖、特に多糖、オリゴ糖および単糖から選択された化合物の存在が検出可能であることを示したことである。本発明者の他の利点は、関心対象の化合物が侵襲性真菌感染症の診断用マーカーであることを示したことである。関心対象の化合物（マーカー）の存在は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって得られたスペクトルの可視のピークによって表される。病原性真菌微生物由来の上記化合物がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって生物学的液体から検出できることが明白ではなかった。また、この関心対象の化合物が侵襲性真菌感染症を表せることも明白ではなかった。関心対象の化合物を検出するには量が少なすぎることや、関心対象の化合物を表すシグナルが生物学的液体、特に血清で見られる何千もの信号の中に隠れていることも考えられる。また、糖（多糖、オリゴ糖および単糖）は生物学的液体中の脂質、タンパク質と塩と複合体を形成し、したがって、検出するのが困難である。
【００１１】
所与の微生物に起因する侵襲性真菌感染症の診断に用いられる関心対象の化合物の１つを表している重要なピーク（複数可）が、例えば、所与の病原性真菌微生物（複数可）に感染している哺乳動物由来の生物学的液体のサンプルで本願において記載された実験的なプロトコルを再現することによって最初に特定される。
【００１２】
本発明の方法は、それらを標識する必要なしに上記関心対象の化合物を検出することができる。
【００１３】
幾つかの関心対象の化合物であって、そのうちの１つが多糖、オリゴ糖または単糖に属する化合物が同時に存在することを検出するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を本発明の方法に従って使用することが可能である。関心対象の化合物の全てが、本発明によれば、後述するような糖でもあり得る。
【００１４】
有利には、前記生物学的サンプルから前記多糖および／またはオリゴ糖および／または単糖を抽出するために、
・前記タンパク質および／または前記脂質の大部分の沈殿／凝固によって生物学的液体から前記サンプルに含まれる前記複合体を解離し、
・前記サンプルを遠心分離し、上清を固相から分離し、
・上清を回収し、
・上清に含まれる前記多糖および／またはオリゴ糖および／または単糖を特に逆相クロマトグラフィーによって残留蛋白質および残留脂質から分離し、前記多糖および／またはオリゴ糖および／または単糖を特に吸収クロマトグラフィーの実行によって前記塩から分離する。
【００１５】
本発明によれば、最初に関心対象の化合物を塩から分離することができ、次いで、それを残留蛋白質および／または残留脂質から分離するか、これらの工程を逆の順序で実施することが可能である。
【００１６】
有利には、前記複合体を解離させるために、錯化剤、特に塩基、特にＥＤＴＡが添加され、その混合物が沸騰加熱される。その温度は１００℃〜１４０℃、具体的には略１２０℃である。加熱時間はサンプルのサイズや、加熱に使われる技術や、サンプルを含む受容器に応じて当業者が調節可能である。サンプルの全量を沸騰させる必要がある。加熱時間は特にサンプルに含まれる糖を分解しないように調節される。一例として、加熱時間は３分〜７分である。
【００１７】
本発明の方法は、試薬の観点から特には確実かつ非常に安価である。分析適合性に関して、技術時間は、既存のキットに使用に必要である時間程度である。ＥＤＴＡ等の錯化剤は、加熱と組み合わせて前記生物学的液体中に存在する複合体を解離させることができる。錯化剤は、特に二価陽イオンに依存するレクチンから糖を放出することができる。
【００１８】
特定の使用方法によれば、最初に逆相クロマトグラフィーを適用し、続いて吸収クロマトグラフィーを行う。
【００１９】
有利には、疎水性相を含むカラムを逆相クロマトグラフィーのために使用し、活性炭を含むカラムを吸収クロマトグラフィーのために使用する。
【００２０】
疎水性カラムは、例えばオクタデシル基（C18）に結合している任意の固体支持体で充填されたカラムであってもよい。支持体はポリマーまたは多孔質シリカであってもよい。これらのカラムのサイズおよび容積は、処理される血清の容積によって変わる。活性炭を含むカラムは同じ重量の活性炭とセライト（珪藻土）とを含んでもよく、これによって単糖および二糖を溶出液中で回収することが可能になり、他の糖類はカラム中に保持される。
【００２１】
関心対象の化合物のサイズおよび分子量は本発明によって限定されない。例えば、関心対象の化合物は１０００未満のｍ／ｚ比であってもよい。関心対象の化合物は二糖、特にｍ／ｚシグナル＝３６５を示すヘキソースダイマーであってもよい。侵襲性真菌感染症のマーカーであるこの関心対象の化合物は、例えばトレハロースであってもよい。
【００２２】
有利には、前記錯化剤を添加した後、多糖および／またはオリゴ糖鎖を切断させることができる少なくとも１つの酵素を添加し、前記関心対象の化合物を切断するために化学処理を適用し、その結果、関心対象の前記化合物の量が潜在的に増加する。エンドマンノシダーゼ（endomanosidase）の使用は、それらの質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）シグナルの強度を増加させるために、オリゴマンノシド（oligomanoside）を遊離させることができる。アセトリシス等の化学処理もこの状況で考慮することができる。これらのポリマーから短鎖を放出させるために、ガラクトマンナン、グルカン、そしてさらにはキチン（真菌の壁の３つの主な化合物）に関して同様に作業することも可能である。
【００２３】
このように、マンノシダーゼ後の三糖からのシグナル強度の増大によってシグナルは循環マンナンに帰属される。
【００２４】
この分析プロセスはエキソグリコシダーゼの作用によって補完されてもよく、それに基づく結論はシグナルの消失に反する。したがって、関連する病原体は、生物学的液体のサンプルに存在するオリゴ糖の種類によって確定することができる。
【００２５】
有利には、前記関心対象の化合物の添加後、以下の単糖およびオリゴ糖から選択される：［Ｎ−アセチル−グルコサミンβ−（１，４）Ｎ−アセチル−グルコサミン］ｎ（この式中のｎは１以上で１０以下の整数）、２〜１０個の単糖を含むオリゴ糖、特にヘキソースオリゴマー、特にヘキソースダイマー；特に［グルコース、β−（１，３）グルコース］ｎ、［β−（１，６）グルコース、β−（１，６）グルコース］ｎ（この式中のｎは１以上で１０以下の整数）のグルカン；マンナン、特に［マンノース、α−（１，２）マンノース］ｎ、［マンノース、α−（１，３）マンノース］ｎ、［マンノース、α−（１，６）マンノース］ｎ、および［マンノース、β−（１，２）マンノース］ｎ（この式中のｎは１以上で１０以下の整数）タイプのマンナン、ガラクトマンナン、ガラクタン、アラビノガラクタン、およびグルクロノキシロマンナンから選択される。
【００２６】
本発明の特定の使用方法によると、関心対象の化合物は、病原性真菌微生物によって産生される化合物であり、さらに具体的にはトレハロースである。
【００２７】
マーカーとして使用される関心対象の化合物は、ヘキソースダイマー、特にトレハロース（ｍ／ｚ＝３６５）であってもよい。そのような種類の関心対象の化合物は、病原菌の感染症、特にＣ．アルビカンスの感染症の良好なマーカーであることが判明している。
【００２８】
病原性真菌微生物は、前記哺乳動物の免疫系の作用に反応してトレハロースを産生することができる病原性真菌微生物、カンジダ（Candida）種、特にＣ．アルビカンス、アスペルギルス（Aspergillus）種、フザリウム（Fusarium）種、トリコスポロン（Trichosporon）種、サッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、アクレモニウム（Acremonium）種、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、スポロトリックスシェンキイ（Sporothrix schenckii）およびニューモシスチス・ジロヴェチ（Pneumocystis jirovecii）から選択することができる。
【００２９】
有利には、病原性真菌微生物は哺乳動物の免疫系の作用に反応してトレハロースを産生する上記病原性真菌微生物から選択される。
【００３０】
有利には、前記標準化合物について得られたシグナルと関心対象の前記所与の化合物について得られたシグナルの強度を比較することによって、前記サンプルに含まれる前記関心対象の化合物の量を確認することができるように、既知量の少なくとも１つの標準化合物を前記サンプルに添加する。化合物は処理される前にサンプルに添加してもよい。本発明によれば、標準化合物として、分析されるオリゴ糖に近いｍ／ｚ値を有する化合物を使用することが可能である。ｍ／ｚ値がある区間（関心対象の化合物のｍ／ｚ−５；関心対象の化合物のｍ／ｚ＋５）に含まれるか、またはこの区間の境界値にある場合、関心対象の化合物のｍ／ｚ値と類似していると見なされる。
【００３１】
有利には、標準化合物は、検出される化合物の挙動と同じように使用されるカラム上でクロマトグラフ的に挙動する。この場合、加熱段階の後で、２本のカラムに通す前に、添加することができる。健常であるか病的であるにかかわらず、標準カラムは生物学的液体の中に存在する化合物であってはならない。標準カラムは、微生物汚染から生じると確認されやすくてはならない。有利には、これらの目的のために、おそらくは放射性同位元素で標識された二糖または三糖が使用される。例えば、重水素化トレハロース（ＭＷ  ２Ｈトレハロース＝３５６＋Ｎａ＝３７９）を標準化合物として使用してもよい。
【００３２】
他の実施の形態によれば、前記所与の関心対象の化合物と対応するシグナルのシグナル強度とユビキタス内因性シグナルの強度との比を決定し、前記内因性シグナルは前もって同定され、おそらくはサンプルを得た生物学的液体の種類に特異的であり、その結果、前記サンプルに含まれる関心対象の前記所与の化合物を定量化することができる。
【００３３】
これは、実際に生物学的液体の種類で関心対象の化合物を定量化するのに用いられる可能性がある全ての血清サンプルに存在する一定シグナル（ユビキタスシグナルと言われる）を同定したことが本発明者のもう一つの利点である。当業者は、生物学的液体の所与のタイプの（好ましくは、感染していないか、感染していないと思われる）幾つかのサンプルに関してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行うことによって、ユビキタスシグナルを容易に同定することができる。ユビキタスシグナルは、シグナルがこの種類の液体の全てのサンプルで見いだされる一定シグナルであり、上述のシグナルの強度は液体のタイプを表し、上述のシグナルの強度はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析から得られるスペクトログラムの上に現れるピークの高さである。
【００３４】
したがって、本発明によれば、生物学的液体は、動脈または静脈血、血清、生殖粘膜液、気道液、特に気管支肺胞洗浄から得られる液体、気管支吸引、気管吸引、吐出物、痰、皮膚および外皮を収集するために用いられた液体、浸出液、閉鎖腔からの液体、特に脳脊髄液体、胃腸管または尿管および生検断片の摩砕から得られる液体から選択されてもよい。
【００３５】
また、本発明は、本発明の方法を可能にするキットに関する。一実施の形態のキットは、
・逆相クロマトグラフィーを実行可能にする固形疎水性相からなる少なくとも第１の支持体と、
・インプット開口部と、アウトプット開口部と、前記インプット開口部と前記アウトプット開口部との間に配置される粉末状活性炭の充填物を含む少なくとも第２容器と、を含んでいる。
【００３６】
刊行物：Ｗｈｉｓｔｌｅｒ  ａｎｄ  Ｄｕｒｓｏ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １９５０に記載された当業者に周知の原理に基づいて、同じ量の商業的な活性炭セライト（登録商標）（珪藻土）を混合することによって充填物が調製されてもよい。
【００３７】
固体疎水性相は分割された形態で存在してもよく、前記生物学的液体と接触した後に磁石で固相を除去することが可能になるように磁性材料を含んでもよい。例えば、固体疎水性相は、鉄または磁性材料を含み、疎水性材料で覆われる複数のビードの形態であってもよい。分割された形態の固体疎水性相は、生物学的液体のサンプルと接触して配置される。それらを混合してもよい。ビードは大きな接触面面積を提供する。ある接触時間後、例えば磁石を生物学的液体と固体疎水性相のビードの混合物中に浸漬することによって、固体疎水性相が磁石で除去され、ビードは磁石に付着し、それによって処理された生物学的液体を容易に分離することができる。
【００３８】
もう一つの実施の形態によれば、キットは場合によって放射性同位体で標識された単糖、二糖および三糖から選択される所定の量の標準化合物、特に重水素化トレハロースを含んでもよい。
【００３９】
有利には、キットは生物学的液体に含まれる多糖および／またはオリゴ糖および／または単糖によって形成される複合体と反応することができる所与の量の酵素をふくんでもよい。
【００４０】
前記逆相クロマトグラフィーが適用されることを可能にする固体疎水性相を含む支持体は、プレート（plate）、ウェル（well）、カラム（column）、チューブ（tube）、または多数のウェルを含むプレートであってもよい。
【００４１】
固体活性炭充填物用の容器は、前記支持体の選択とは無関係に、ウェル、カラム、チューブまたは多くのウェルを含むプレートであってもよい。
【００４２】
有利には、本発明のキットはＭＡＬＤＩプレートも含んでいる。
【００４３】
また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による侵襲性真菌感染症の体外診断のために、本発明は、多糖、オリゴ糖および単糖の中から選択される関心対象の化合物、特にトレハロースの使用を含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
本発明、その特性、特定の特徴、様々な利点は、以下に記載した非網羅的一例として示された特定の操作法について言及した説明を添付図面を参照して読むことによってより明らかになる：
【図１】図１ａ〜１ｄは、夫々表１に記載されるＧ２５、Ｇ３２、Ｇ４２およびＧ４９血清から調製したＭＡＬＤＩプレートの分析により本発明の方法によって得られた質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を表し、血清のサンプルに存在する化合物は、スペクトルのピーク（シグナル）によって表され、スペクトルのＸ軸はピークによって表される化合物のｍ／ｚ比（質量単位−ＭＵ）を表している。Ｙ軸は、シグナル高さ（ピークの高さ）の強度を示し、サンプルに含まれる、示された化合物の量に相当し、１００％の値は、全ての血清からのユビキタス内因性シグナルに起因する。
【図２ａ】図２ａは、表１で同定された血清サンプルに含まれるマンナンの量（ｎｇ／ｍＬ）を垂直軸上に表し、Ｘ軸上にPlatelia（登録商標）Ｃ．アルビカンス・キットを使用することによって得られる量を示している。
【図２ｂ】図２ｂは、表１の血清のサンプルに含まれるグルカンの量（ｎｇ／ｍＬ）を表し、グルカンの量はＹ軸上に示され、一方、血清番号はＸ軸に示され、前記量は、Fungitell（登録商標）キットを使用して測定される、
【図２ｃ】図２ｃは、表１からサンプルの各々に含まれるヘキソースオリゴマー（２つのヘキソースから形成され、以下に詳細に記載されるオリゴマー）の量を表している。ユビキタスシグナルの前記オリゴマーの量（パーセンテージ）はＹ軸およびＸ軸上の群で示され、前記量は、前記オリゴマーから得られるピーク高さの、ユビキタスシグナルについて得られるピーク高さの比×１００で表される。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
定義
本発明によれば、哺乳動物は限定されず、ヒトであっても他の任意の哺乳動物であってもよい。したがって、本発明はヒト用医薬と獣医用医薬の両方に適用される。
【００４６】
本発明によれば、オリゴ糖と多糖はグリコシド結合で互いに結合する単糖であると定義される。オリゴ糖は２〜１０個の単糖から構成され、多糖は１０個を超える単糖から構成される。
【００４７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光計は、ＭＡＬＤＩマトリクス支援レーザー脱離イオン化法がＴＯＦ（飛行時間）質量分析計）と連結された質量分析計である。この種の機器は、病院環境をはじめとして明らかに比較的広範で利用可能である。
【００４８】
本発明によれば、関心対象の化合物の存在がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光法によって得られる質量スペクトルの目に見えるピークによって定義される。したがって、当業者は、そのスペクトルの目に見える重大なピークの存在を認識することができる。特に、本発明によれば、重要なピークが参照ピークの強度の１％以上、有利には３％以上、さらに有利には少なくともほぼ５％であってもよい。
【００４９】
本発明によれば、「侵襲性真菌感染症」という用語は、哺乳動物末梢血中の酵母（キノコ）の存在に起因する感染症と、血液および少なくとも１つの組織を傷つける感染症を纏めたものである。例えば、酵母の血管外血行性伝播から生じる、肝障害および腎障害が起こり得るＣ．アルビカンスの感染症の場合、「侵襲性真菌感染症」という用語はカンジダ血症および侵襲性カンジダ症を纏めたものである。
【００５０】
本発明によれば、関心対象の化合物の存在はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光法によって得られる質量スペクトル上の目に見えるピークの存在によって定義される。当業者は、そのようなスペクトルの上で目に見えるので、したがって重大なピークの存在も認めることができる。特に、重要なピークは、本発明によれば、参照ピークの強度の１％以上、有利には３％以上、さらに有利には少なくともほぼ５％であってもよい。
【００５１】
本発明によれば、「侵襲性真菌感染症」という用語は、末梢哺乳動物血液中の酵母（キノコ）の存在に起因するそれらの感染症と、血液および少なくとも１つの組織を傷つける感染症とをまとめたものである。例えば、酵母の血管外血行性伝播から生じる、肝障害および腎障害が起こり得るＣ．アルビカンスの感染症の場合、「侵襲性真菌感染症」という用語は、カンジダ血症および侵襲性カンジダ症をまとめたものである。
【００５２】
本発明によれば、自発的または微生物自身もしくは宿主酵素による解重合／分解の結果として放出される、宿主生物学的液体中に存在する病原性微生物の残留物質である病原性真菌微生物由来の化合物であって、関心対象の化合物は、病原性真菌微生物由来の多糖または糖蛋白もしくは糖脂質のグリカン対由来である可能性がある。関心対象の化合物は、病原性真菌微生物の壁由来であるか、または壁の分解生成物、病原性真菌微生物によって分泌／排出または発現され、前記微生物が宿主細胞によって破壊されると放出される化合物である可能性がある。それは感染した哺乳動物と前記病原性真菌微生物との間の相互作用から生じる化合物であってもよい。
【００５３】
「病原性真菌微生物」という用語は、その遺伝機構が哺乳動物によって産生されるものと異なる多糖またはオリゴ糖配列を可能にする真菌（酵母）を意味するか、またはそれらの体内で生理学的に存在しない量のそれらが産生されることを意味している。本発明によれば、「生物学的液体」という用語は、生きている生物、特に哺乳動物、さらに具体的にはヒト由来であり、水、少なくとも１種類のタンパク質および／または１種類の液体および／または例えば、ナトリウムまたはカリウム等のイオンの形態で存在する少なくとも１種類のミネラル塩を含む任意の液体を指し、イオンはおそらくは金属イオンである。本発明によれば、塩はイオンの形態のミネラル塩であると定義される。
【００５４】
Ｃ．アルビカンスに起因する真菌感染症に関した下記実験は、研究される１つ、または複数の病原性真菌微生物によって人工的に感染させた哺乳動物を用いて行ってもよい。下記実験は、研究される病原微生物（複数可）に起因する侵襲性真菌感染症のマーカーとして使用するのに適した関心対象の化合物（複数可）を確立し、関心対象の前記化合物（複数可）を特性化して、その感染症との関係を確立するために使用できる。
【００５５】
実験
第１段階：  グリカンを検出する生物学的サンプルが処理される段階であり、下記手順が血清に適用される。
・３００ｐＬの試験サンプルを１．５ｍｌの滅菌マイクロチューブに入れる。
・１００μＬの処理溶液（ＥＤＴＡ酸溶液）を各試験管中に添加する。
・ボルテックス混合する。
・密封されたマイクロチューブを加熱ブロック上に置き、１２０℃で６分間連動ジャンプさせる。
・試験管を取り出して１０，０００ｇで１０分間遠心分離する。
・上清（１５０μｌ）を無菌１．５ｍｌマイクロチューブに移す。
質量分析によってグリカンを検出する後処理を上清に関して実施する。このプロセスでは、凝固して塊になるタンパク質複合体のマンナンおよびガラクトマンナンが放出／分離され、グルカン（Fungitell（登録商標）キット）の比色測定を全く変えず、これによって同じ未処理のサンプルから得られるものと一致した結果が得られる。反対に、この処理は過剰なタンパク質、トリグリセリド、ビリルビンおよび／またはヘモグロビンによる干渉を排除する。
【００５６】
第２段階：  上清を処理し、質量分析前にオリゴ糖を精製し、濃縮する。
１００μＬの上清を５容積のアセトニトリル（ＡＮＣ）および水の溶液（７５：２５、ｖｏｌ／ｖｏｌ）で予め調整し、１０容積の水で洗浄した、固相抽出（ＳＰＥ）カートリッジ（ｒｅｆ  ＳＰＥ−Ｃ１８：Ｃ１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Waters））（１容積））（１つのカラムは疎水性充填物を含む）上に入れる。集めた上清をカートリッジに入れた後、カートリッジを２容積の水ですすぎ、これを集める。Ｃ１８カラム溶出液を５容積のＡＮＣ／Ｈ２Ｏ（２５：７５、ｖｏｌ／ｖｏｌ）で予め調整し、次いで１０容積の水ですすいだ、同じ重量の商業的な活性炭とセライト（登録商標）（等容積）との混合物を含むＳＰＥカートリッジ上に載せた。上清をカートリッジに通過させた後、カートリッジを２０容積の水ですすぎ、溶出液を捨てる。カラムを２容積のＡＮＣ／Ｈ２Ｏ（２５：７５、ｖｏｌ／ｖｏｌ）ですすぐ。最初の１００μＬを不合格とし、次の３００μＬを集める。溶出液（ＡＮＣ／Ｈ２Ｏ）を乾燥する。
【００５７】
第３段階：  質量分析によりオリゴ糖を分析する。
質量分析にはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｖｏｙａｇｅｒ  Ｅｌｉｔｅ  ＤＥＳ−ＴＲ分光光度計（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，  ＭＡ）が使用される。乾燥抽出物を水中に溶解させ、１μＬ溶液をジヒドロ安息香酸溶液の１μＬ溶液（ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ５０／５０中１０ｍｇ／ｍｌ）でスパイクする。１μＬの溶液をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦプレート（フープ状の９６ウェルステンレスプレートによって適用）上に堆積させ、５０℃で結晶化させる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は陽性リフレクトロンモード、つまり取得パラメータを使用してリフレクトロン様式が１，０００未満のｍ／ｚ比を有する中性オリゴ糖から最適化された取得パラメータを使用するリフレクトロンモードで実施される。データ収集後、混合物中のオリゴグルカンの存在は、生成した付加物（Ｍ＋Ｎａ）＋を観察することで確認される。診断のための関心対象の質量（Ｍ）は、方程式Ｍ  Ｈｅｘｎ＝１８０＋［１６２］（ｎ−１）＋２３によって算出される。分子群の相対的な定量化は、Ｍ  Ｈｅｘｎシグナル、すなわちユビキタス内因性シグナルの比の算出、または第２段階の第１相におけるサンプルに添加された外部標準で実施される。現在まで、診断のための興味深いシグナルはＭ  Ｈｅｘ２＝３６５である。テキスト中でさらに示される分析例は３６５／３６１のシグナル比の算出に基づいている。
【００５８】
ヒト血清の分析
本発明の方法がリール地方大学病院に入院している患者の内、以下の基準に基づいて選択された患者の１２の血清に適用された。
ｉ）少なくとも１つのＣ．アルビカンス血液培養（C. albicans blood culture）によって証明され、入院中に全身性カンジダ症（systemic candidiasis）を発症した患者。
ｉｉ）一方または両方について陽性であり、血液培養サンプルが陽性であると判明する１週間前または判明後２週間以内に採取された血清サンプルに関して診断を導き、確定した血液グルカンまたはマンナン試験の検出が要請された患者。
ｉｉｉ）法律上の理由のために１年間−２０℃で貯蔵された残留血清の内、最少量１ｍｌが利用可能なもの。
【００５９】
下記の表１は上記の基準を満たし、したがってＩＦＤに罹っている１２人の患者の血清に関してPlatelia（登録商標）抗原およびFongitell（登録商標）キットを使用して得られる結果を纏めたものである。
【００６０】
【表１】
2015526711.tif 000003
【００６１】
本発明の方法が上記血清サンプルに適用された。その結果は図１ａ〜１ｄおよび２ａ〜２ｃに見ることができる。
【００６２】
図１ａ〜１ｄに示されるように、本発明の方法を適用した表１の血清Ｇ２５、Ｇ３２、Ｇ４２およびＧ４９に関して実施されたＭＡＬＤＩプレート分析では、最初に全血清に関してｍ／ｚ質量＝３６１に対応する高強度シグナルを示した。このシグナルは未知の血清構成要素を表し、シグナル強度を較正するために使用される。第２に、シグナルは、ｍ／ｚ比＝３６５を表す位置で、全ての上記の血清のスペクトルで見られる。シグナルはヘキソースダイマーと対応し、シグナルは前記ユビキタスシグナルに近いので、標準的校正シグナルとして有効に使用可能である。
【００６３】
加えて、健常な患者(結果は示さず)から採取される血清から本発明の方法によって調製されるＭＡＬＤＩプレートスペクトルは、ｍ／ｚ比＝３６５を示すシグナルを含まないが、ｍ／ｚ比＝３６１によってリプリントされるユビキタスシンボルを含んでいる。したがって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光法によって検出可能な充分な量で存在するヘキソースダイマーが直接または間接的にＣ．アルビカンス病原体から生じると推論することができる。
【００６４】
図２ａ〜２ｃは、市販のキットで得られる結果と本発明による方法を使用して得られる結果を示している。
【００６５】
下記表２は、本発明の方法を適用する血清サンプルから得られる定量的結果を示している。
【００６６】
本発明の方法は、血清サンプルに存在するマンナンの検出とグルカンのための方法に等しいと見なすことができる。換言すれば、上述のヘキソース・ダイマー（ｍ／ｚ＝３６５）に対応するシグナルは、関係する血清サンプルのマンナンおよびグルカンの存在に対して少なくとも特徴的であるとみなすことができる。加えて、グルカン血症とマンナン血症の両方に罹っている患者では、ｍ／ｚ＝３６１に対応するピーク高さに対するｍ／ｚ＝３６５に対応しているピークの高さは、検出されるマンナンおよびグルカンの量と相対的に関連している。両商業試験で陰性だった血清Ｇ４に関して、本発明の方法では陰性であった（ｍ／ｚ＝３６５のシグナルはない）。反対に、マンナンを検出することができず、検出されるグルカンのレベルが非常に低いかまたは０であった患者Ｇ５、Ｇ６およびＧ１５に関しては、ｍ／ｚ比＝３６５を示す明瞭なシグナルが確認できる。
【００６７】
【表２】
2015526711.tif 000004
【００６８】
したがって、本発明の方法は、これらの試験の陽性によって存在が示される、存在する物質を検出することによってPlatelia（登録商標）カンジダ・アルビカンスとFungitell（登録商標）試験の両方を置換することができる。加えて、市販のキットでグルカンおよびマンナンを含まないと判明した血清でさえ、本発明の方法によってｍ／ｚ＝３６５を示すシグナルを検出することができる。したがって、本発明の方法は上述の市販のキットより感受性が高く、かつ信頼性が高い。これは「反射」分析モードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ・Ｍ／Ｓ装置で得られた結果であり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ「線状」分析モードでも同じ結果が得られる。
【００６９】
ｍ／ｚ＝３６５を生じる関心対象の物質の特性化
ｍ／ｚピーク＝３６５によって表される侵襲性真菌感染症の診断用のマーカーとして使用される関心対象の化合物の構造を確定するために、侵襲性カンジダ症で苦しんでいる患者の上清または血清をプレメチル化（ｐｒｅ−ｍｅｔｈｙｌａｔｅ）した。したがって、侵襲性カンジダ症で苦しんでいる患者からの血清を、上記定義の段階１および２にしたがって処理し、第２段階で得られた溶出液中に含まれ、水中に溶解させた糖を次いでプレメチル化した。プレメチル化技術は当業者には公知であり、以下の刊行物「Ｃｉｕｃａｎｕ  Ｉ，  Ｋｅｒｅｋ  Ｆ．  １９８４．  “Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅ−ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ．”  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ．  １３１：２０９−２１７」で特に記載されている。ＭＡＬＤＩプレートを次いで、上記第３段階で記載されるプロトコルにしたがって調製する。プレメチル化された糖から得られる［Ｍ＋Ｎａ］＋シグナルはｍ／ｚ値＝４７７で現れ、それは実際、プレメチル化されたヘキソース二糖に相当する。
【００７０】
プレメチル化を受けた、最初の２つの上記段階にしたがって処理された侵襲性カンジダ症患者からの血清はクロマトグラフィーピークを示す（フレームイオン化検出器を用いた気相式クロマトグラフィー、ＦＩＤ−ＧＣ：Ａｌｌｔｅｃｈ  ＥＣＯＮＯ−ＣＡＰ  ＥＣ−１、無極キャピラリーカラム［３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５ｕｍ］。１８０℃から３３０℃までの温度勾配で実行時間＝２８．８分はプレメチル化トレハロース（αＧｌｃ１−１αＧｌｃ）に対する保持時間と同じ保持時間に相当する。ＧＣＥＩ／ＭＳ（電子衝撃質量分析に連結した気相クロマトグラフィー、ＳＧＥ  ＳｏｌＧｅｌ−１ｍｓ［３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ］、侵襲性カンジダ症と診断された患者からの血清のＧＣ／ＦＩＤに使用したものと同じ実験条件、前記段階の最初の３０にしたがって処理し、プレメチル化を受けたもの）は、プレメチル化トレハロース（αＧｌｃ−１αＧｌｃ）と同じＩＥＭＳフラグメンテーションスペクトルを示す。このことから、ｍ／ｚ＝３６５のシグナルによって表されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって同定される関心対象の化合物が二糖、さらに詳細にはトレハロースであると結論づけられる。したがって、この関心対象の化合物は、侵襲性真菌感染症、さらに詳細にはＣ．アルビカンスに起因する侵襲性感染の診断用のマーカーとして使用することができる。
【００７１】
関心対象の化合物の真菌起源および侵襲性真菌感染症とのその関係の確認
体外実験
Ｐｌｕｓｋｏｔａらによって記載された方法（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００８  Ｓｅｐ  １；１８１（５）：３６０９−１９）にしたがってチオグリコール酸塩の腹腔内注射を受けたマウスの腹腔からマウス好中球顆粒球を集めた。この注射の６時間後に、マウスを二酸化炭素吸入によって屠殺し、腹腔を切開した。５ｍｌの氷冷ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）溶液を用いて、顆粒球を腹腔洗浄によって集めた。
起こり得るマクロファージによる汚染を減らすために、５％の二酸化炭素含有雰囲気中、３７℃のインキュベーター中で、ウシ胎児血清で覆われた培養組織を含むペトリ皿で細胞を培養した。非接着顆粒球を上清から集め、血球計で計数し、遠心分離（２．２５０ｇで１０分間）し、次いでハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｆｒａｎｃｅによって販売）中に再懸濁させた。ヒト顆粒球を、酸性クエン酸ブドウ糖液（１容積の１５４Ｍのクエン酸塩および２容積の２％ブドウ糖（ｐＨ＝４．６））で健常ボランティアから採取された血球から単離した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ装置で遠心分離することによって単離した後、デキストラン中で赤血球を沈降させ、残存赤血球の低張溶解（hypotonic lysis）をおこなった。
【００７２】
顆粒球によるＣ．アルビカンスの破壊の評価
Ｃ．アルビカンス株ＳＣ５３１４由来の酵母（１０６単位）を、０．１ＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシ・エチルピペラジン−Ｎ−２’−エタンスルホン酸）ｐＨ７を含む０．２５ｍｌの溶液の中に懸濁させ、３×１０６のヒト顆粒球と１：３の比で１６４０ｒｐｍにて混合した。顆粒球（酵母）の混合物を、１〜２時間おだやかに混合しながら３７℃でインキュベートした。３０分毎に、混合物の３００μＬのアリコートを取り出し、ｍ／ｚ＝３６５に対応する関心対象の化合物の有無を検出するために使用した。関心対象の化合物は、上記と同じ条件下でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光法によって検出された。ｍ／ｚ＝３６５の関心対象の化合物に対応するシグナルが、ヒトおよびネズミ顆粒球の両方について約２時間後に現れ、関心対象の化合物が、Ｃ．アルビカンスと、真菌病原体に対する哺乳動物の防衛細胞の最前線である顆粒球との間の相互作用からおそらく生じるということを示す。
【００７３】
マウスにおける体内実験
動物：  ６〜８週令の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを本願で記述される全ての実験に使用した。全てのマウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（フランス）から供給され、動物実験は全てリール大学地方病院センター動物実験倫理委員会によって承認され、実験および他の科学的目的のために使用される動物の保護に関する欧州指針８６／６０９／ＥＥＣに合致したプロトコルにしたがって実施した。
【００７４】
各々１０匹のマウスの４群を形成した。マウス群は全て実験の開始日であるＤ１から１４日間飼育した。Ｄ＝１４にはマウスは全て頸椎脱臼によって屠殺し、心臓穿刺によって血液を採取した。血清サンプルをこれらの血液サンプルから得、ｍ／ｚ＝３６５に対応する関心対象の化合物を検出するために使用するまで−２０℃で保管した。群０は対照群であった。すなわち、この群はいかなる治療も受けなかった１０匹のマウスを含んでいた。マウスはＣ．アルビカンスで自然に（通常）コロニーを形成しない。
【００７５】
群１には、１日目から１４日目まで与えた飲料水に１．５％のＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム、ＭＷ３６〜５０ｋＤａ; ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ, ＬＬＣ, Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えることによって腸炎を誘発させた群であった。この群は、Ｃ．アルビカンスでコロニーを形成しなかった。群２のマウスには、１０７単位のＣ．アルビカンスを含む２００ｍｌの（ＱＰＳ）をＤ１に経口投与した。Ｄ１からＤ１４まで与えた飲料水中に１．５％のＤＳＳ（ナトリウム硫酸デキストラン、ＭＷ３６〜５０ｋＤａ; ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ, ＬＬＣ, Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えることによって、群２のマウスでも腸炎症を誘発させた。腸炎症を誘発するＤＳＳの投与は、マウスをその胃腸管における多数の酵母の成長に対して寛容にする。このモデルは、カンジダ属で広範囲にコロニーを形成する入院患者を再現する。これらは放射線治療または化学治療を受けた患者であり、彼らの腸壁は損傷を受けている。
【００７６】
群３の１０匹のマウスは、Ｄ１に０．１ｍｌの滅菌食塩水に含まれる１０４単位のＣ．アルビカンス株ＳＣ５３１４の静注を尾静脈中から受けた。この群は侵襲性カンジダ症を引き起こす広範囲に及ぶカンジダ血症を模倣し、カンジダ症はマウスでは致命的であり、入院患者ではカンジダ血症（侵襲性真菌感染症）に相当し、治療を受けない場合は通常、致命的である。マウスの４つの群からの血清におけるマンナンの有無は、Platelia（登録商標）Ｃ．アルビカンス・キットを使用して検査した。下記表３は、上述の群０〜３の各々の血清中に存在するマンナンの平均測定値を示している。表３のマウス群０〜３は血清中に含まれる平均マンナン濃度である。
【００７７】
【表３】
2015526711.tif 000005
【００７８】
表３の結果は、Platelia（登録商標）カンジダ・アルビカンス試験が、群３からマウスでカンジダ血症にかかっていないコロニー形成マウスの場合も陽性だったことを示している。
【００７９】
次いで、ｍ／ｚ＝３６５に対応する関心対象の化合物の有無が各群のマウス由来の血清で検出された。患者血清について記載したのと同じ実験プロトコルを使用した。関心対象の化合物を表すｍ／ｚ＝３６５シグナルは、群０、１または２に属するマウス由来の血清では検出されなかった；ｍ／ｚ＝３６５シグナルは、群３のマウスにおける本発明の方法の最初の２段階にしたがって前処理された血清の各々で、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光法によってのみ検出された。その結果、本発明の方法は侵襲性真菌感染症を確実に診断し、侵襲性真菌感染症と胃腸管の広範囲のコロニー形成とを区別し、このことは上述の市販キットではできないことである。
【図１ａ】
2015526711.tif 000006
【図１ｂ】
2015526711.tif 000007
【図１ｃ】
2015526711.tif 000008
【図１ｄ】
2015526711.tif 000009
【図２ａ】
2015526711.tif 000010
【図２ｂ】
2015526711.tif 000011
【図２ｃ】
2015526711.tif 000012
【国際調査報告】
2015526711.tif 000013
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