(57)【要約】  低減されたベンゾジアゼピン系ＣＮＳ活性を有するＧＡＢＡ作動性薬化合物を用いて、炎症及び気道狭窄を治療する新規な方法が提供される。α４及びα５ＧＡＢＡＡ受容体を選択的に標的とする新規な化合物、及びそれらの化合物を気管支収縮及び炎症を治療するために使用する方法が本明細書において提供される。【選択図】図１
2015529254.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2015529254.tif 000021
並びに、その全ての異性体及び塩
［式中、Ｒ３は、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−５シクロアルキル、アダマンチル、又はＨから選択され、
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲＮ−、又は−ＮＲＮＣ（Ｏ）−であり、
ＲＮはＨ又はＣ１−４アルキルから選択され、
Ｒ４はＣ１−４アルキルから選択され、
Ｒ５はＨ又はＣ１−４アルキルから選択され、
又はＲ４及びＲ５は一緒に４〜５個の構成原子の環を形成し、
Ｒ８は、Ｃ１−４アルキル又はＣ１−４シクロアルキルから選択され、
但し、
ＸがＯであり、Ｒ８がＣＨ３であり、かつＲ４及びＲ５は４員炭素環又は５員炭素環を形成する場合、Ｒ３はＨ、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、又は−ＣＨ２ＣＨ３でなく、
ＸがＯであり、Ｒ８がＣＨ３であり、かつＲ４及びＲ５は４員炭素環又は５員炭素環を形成する場合、Ｒ３は−ＣＨ（ＣＦ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＦ３）（ＣＨ３）、又は−ＣＨ２ＣＦ３ではない］。
【請求項２】
Ｒ４及びＲ５が環を形成する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記環が炭素環である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記環が複素環である、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
前記環が５個の構成原子を有する、請求項２又は３に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ３が水素の代わりに少なくとも１個の重水素（２Ｈ）を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ８が水素の代わりに少なくとも１個の重水素（２Ｈ）を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ３が少なくとも１個のハロゲンにより置換されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
前記少なくとも１個のハロゲンがフルオロである、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ３が、Ｈ、−ＣＨ３、ｉ−ブチル、−ＣＨ（ＣＦ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＦ３）ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＤ３）ＣＨ３、−ＣＦ（ＣＤ３）ＣＨ３、イソプロピル、ｔ−ブチル、−ＣＨ（ＣＦ３）２、シクロプロピル、−ＣＨ２ＣＤ３、−ＣＤ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＤ（ＣＦ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＤ（ＣＦ３）ＣＨ３、−ＣＤ（ＣＤ３）ＣＨ３、−ＣＦ（ＣＤ３）ＣＨ３又は−ＣＤ（ＣＨ３）２である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ３が、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、又はシクロプロピル基である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ８が、イソプロピル、シクロプロピル、メチル、エチル、ｔ−ブチル、又はＣＤ３である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｘ−Ｒ３が、−Ｎ（ＣＦ３）ＣＨ３、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨＣ（ＣＨ３）３、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−ＳＣ（ＣＨ３）３、
【化２】
2015529254.tif 000022
である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
前記化合物が、Ｒ異性体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
前記化合物が、Ｓ異性体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記化合物が、式（ＩＩＡ）又は（ＩＩＢ）の化合物：
【化３】
2015529254.tif 000023
並びに、その全ての異性体及び塩
［式中、Ｒ８は、−ＣＤ３、−ＣＨ３、エチル、ｔ−ブチル、又はシクロプロピルであり、
Ｒ３は、Ｈ、−ＣＨ３、イソブチル、−ＣＨ（ＣＦ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＦ３）ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＤ３）ＣＨ３、−ＣＦ（ＣＤ３）ＣＨ３、イソプロピル、ｔ−ブチル、−ＣＨ（ＣＦ３）２、シクロプロピル、−ＣＨ２ＣＤ３、−ＣＤ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＤ（ＣＦ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＤ（ＣＦ３）ＣＨ３、−ＣＤ（ＣＤ３）ＣＨ３、−ＣＦ（ＣＤ３）ＣＨ３、又は−ＣＤ（ＣＨ３）２であり、ｎは、１又は２である］である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記化合物が、式（ＩＩＩＡ）又は（ＩＩＩＢ）の化合物：
【化４】
2015529254.tif 000024
並びに、その全ての異性体及び塩
［式中、Ｒ８は、−ＣＤ３、−ＣＨ３、エチル、ｔ−ブチル、又はシクロプロピルであり、
Ｘ−Ｒ３は、−Ｎ（ＣＦ３）ＣＨ３、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨＣ（ＣＨ３）３、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−ＳＣ（ＣＨ３）３、
【化５】
2015529254.tif 000025
であり、ｎは、１又は２である］である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１８】
以下の化合物：
【化６】
2015529254.tif 000026
から選択される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記化合物が、以下の化合物：
【化７】
2015529254.tif 000027
から選択される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２１】
前記組成物がエアロゾル製剤である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記組成物が経口製剤である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
低減されたベンゾジアゼピン系ＣＮＳ効果を有するＧＡＢＡ作動性薬剤の有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む、気道狭窄を低減する方法。
【請求項２４】
低減されたベンゾジアゼピン系ＣＮＳ効果を有するＧＡＢＡ作動性薬剤の有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む、肺炎症を低減する方法。
【請求項２５】
低減されたベンゾジアゼピン系ＣＮＳ効果を有するＧＡＢＡ作動性薬剤の有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む肺炎症と関連した危険因子を有する被験者における疾患の発症を低減する方法。
【請求項２６】
低減されたベンゾジアゼピン系ＣＮＳ効果を有するＧＡＢＡ作動性薬剤の有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む肺疾患を治療する方法を。
【請求項２７】
該気道狭窄又は該肺炎症が、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、嚢胞性線維症、肺線維症、気管支拡張症、線維化性肺胞炎、ウェゲナー肉芽腫症、内因性肺胞炎又は感染を併発するか、あるいは該肺疾患がこれらの疾患のいずれかである請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
低減されたベンゾジアゼピン系ＣＮＳ効果を有するＧＡＢＡ作動性薬剤の有効量を、それを必要とする被験者に投与する自己免疫疾患を有する被験者における炎症を低減する方法。
【請求項２９】
前記自己免疫疾患が、関節炎、糖尿病、狼瘡及びクローン病から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＧＡＢＡ作動性薬剤がソフトドラッグである、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＧＡＢＡ作動性薬剤が式（Ｉ）の化合物：
【化８】
2015529254.tif 000028
並びに、その全ての異性体及び塩
［式中、Ｒ３は、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−５シクロアルキル、アダマンチル、又はＨから選択され、
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲＮ−、又は−ＮＲＮＣ（Ｏ）−であり、
ＲＮはＨ又はＣ１−４アルキルから選択され、
Ｒ４はＣ１−４アルキルから選択され、
Ｒ５はＨ又はＣ１−４アルキルから選択され、
又はＲ４及びＲ５は一緒に４〜５個の構成原子の環を形成し、
Ｒ８は、Ｃ１−４アルキル又はＣ１−４シクロアルキルから選択される］である、請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
Ｒ４及びＲ５が環を形成する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記環が炭素環である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記環が複素環である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記環が５個の構成原子を有する、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
Ｒ３が水素の代わりに少なくとも１個の重水素（２Ｈ）を含む、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
Ｒ８が水素の代わりに少なくとも１個の重水素（２Ｈ）を含む、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
Ｒ３が少なくとも１個のハロゲンにより置換されている、請求項３１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも１個のハロゲンがフルオロである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
Ｒ３が、Ｈ、−ＣＨ３、ｉ−ブチル、−ＣＨ（ＣＦ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＦ３）ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＤ３）ＣＨ３、−ＣＦ（ＣＤ３）ＣＨ３、イソプロピル、ｔ−ブチル、−ＣＨ（ＣＦ３）２、シクロプロピル、−ＣＨ２ＣＤ３、−ＣＤ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＤ（ＣＦ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＤ（ＣＦ３）ＣＨ３、−ＣＤ（ＣＤ３）ＣＨ３、−ＣＦ（ＣＤ３）ＣＨ３又は−ＣＤ（ＣＨ３）２である、請求項３１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
Ｒ３が、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、又はシクロプロピル基である、請求項３１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
Ｒ８が、イソプロピル、シクロプロピル、メチル、エチル、ｔ−ブチル、又はＣＤ３である、請求項３１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
Ｘ−Ｒ３が、−Ｎ（ＣＦ３）ＣＨ３、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨＣ（ＣＨ３）３、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−ＳＣ（ＣＨ３）３、
【化９】
2015529254.tif 000029
である、請求項３１〜４２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４４】
前記化合物が、Ｒ異性体である、請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記化合物が、Ｓ異性体である、請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＧＡＢＡ作動性薬剤が、式（ＩＩＡ）又は（ＩＩＢ）の化合物：
【化１０】
2015529254.tif 000030
並びに、その全ての異性体及び塩
［式中、Ｒ８は、−ＣＤ３、−ＣＨ３、エチル、ｔ−ブチル、又はシクロプロピルであり、
Ｒ３は、Ｈ、−ＣＨ３、イソブチル、−ＣＨ（ＣＦ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＦ３）ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＤ３）ＣＨ３、−ＣＦ（ＣＤ３）ＣＨ３、イソプロピル、ｔ−ブチル、−ＣＨ（ＣＦ３）２、シクロプロピル、−ＣＨ２ＣＤ３、−ＣＤ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＤ（ＣＦ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＤ（ＣＦ３）ＣＨ３、−ＣＤ（ＣＤ３）ＣＨ３、−ＣＦ（ＣＤ３）ＣＨ３、又は−ＣＤ（ＣＨ３）２であり、ｎは、１又は２である］である、請求項２３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＧＡＢＡ作動性薬剤が、式（ＩＩＩＡ）又は（ＩＩＩＢ）の化合物：
【化１１】
2015529254.tif 000031
並びに、その全ての異性体及び塩
［式中、Ｒ８は、−ＣＤ３、−ＣＨ３、エチル、ｔ−ブチル、又はシクロプロピルであり、
Ｘ−Ｒ３は、−Ｎ（ＣＦ３）ＣＨ３、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨＣ（ＣＨ３）３、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−ＳＣ（ＣＨ３）３、
【化１２】
2015529254.tif 000032
であり、ｎは、１又は２である］である、請求項２３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＧＡＢＡ作動性薬剤が、以下の化合物：
【化１３】
2015529254.tif 000033
から選択される、請求項２３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＧＡＢＡ作動性薬剤が、以下の化合物：
【化１４】
2015529254.tif 000034
から選択される、請求項２３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＧＡＢＡ作動性薬剤が、
【化１５】
2015529254.tif 000035
から選択される請求項２３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１２年９月２１日に出願された米国仮出願第６１／７０３，９０２号の優先権を主張し、この特許出願の全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府支援の研究又は開発に関する記述
本発明は、ＮＩＨ助成金番号ＭＨ−０４６８５１、ＭＨ−０９６４６３、ＧＭ０６５２８１及びＧＭ０９３１３７の下で米国政府の支援で行われた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
気管支収縮性疾患は、世界的に主要な健康問題である。これには、慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease：ＣＯＰＤ）、気管支肺異形成症（bronchopulmonary dysplasia：ＢＰＤ）が含まれ、βアドレナリン作動薬、吸入コルチコステロイド、及び吸入抗コリン作用薬等の既存の治療法があるにもかかわらず、気管支収縮性疾患は極めて広く流行している。喘息の患者数だけで全世界で３億人である。この喘息は、患者を重症急性気道狭窄に罹り易くするので気道平滑筋弛緩を促進できる新たな機構があれば臨床的価値がある。
【０００４】
このように、気管支収縮性疾患に対する効果的な治療薬及び治療法に対する需要と必要性は引き続き存在する。これらの疾患を治療する新しい薬理学的方法は限定されている。α−アドレナリン受容体アゴニスト及び抗コリン作用薬が急性気道狭窄の治療のために現在使用されている唯一の薬剤であり、急性気道平滑筋弛緩の促進薬に関しては、治療の限界は特に明らかである。
【発明の概要】
【０００５】
一態様において、本発明は、式（Ｉ）による化合物：
並びに、その全ての異性体及び塩を提供し、
【０００６】
【化１】
2015529254.tif 000003
【０００７】
式中、
Ｒ３は、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−５シクロアルキル、アダマンチル、又はＨから選択され；
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲＮ−、又は−ＮＲＮＣ（Ｏ）−であり、
ＲＮは、Ｈ又はＣ１−４アルキルから選択され、
Ｒ４は、Ｃ１−４アルキルから選択され、
Ｒ５はＨ又はＣ１−４アルキルから選択され、
又はＲ４及びＲ５は一緒に４〜５個の構成原子の環を形成し、
Ｒ８は、Ｃ１−４アルキル又はＣ１−４シクロアルキルから選択される。
【０００８】
一態様において、本発明は、式（Ｉ）の化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、経口製剤又はエアロゾル製剤であってもよい。
【０００９】
一態様において、本発明は、低減されたベンゾジアゼピン系ＣＮＳ効果を有するＧＡＢＡ作動性薬剤の有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む気道狭窄を低減する方法を提供する。
【００１０】
一態様において、本発明は、低減されたベンゾジアゼピン系ＣＮＳ効果を有するＧＡＢＡ作動性薬剤の有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む肺炎症を低減する方法を提供する。
【００１１】
一態様において、本発明は、低減されたベンゾジアゼピン系ＣＮＳ効果を有するＧＡＢＡ作動性薬剤の有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む肺炎症と関連した危険因子を有する被験者における疾患の発症を低減する方法を提供する。
【００１２】
一態様において、本発明は、低減されたベンゾジアゼピン系ＣＮＳ効果を有するＧＡＢＡ作動性薬剤の有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む肺疾患を治療する方法を提供する。
【００１３】
本発明の他の側面は、詳細な説明及び添付の図面を考察することによって明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１はＲＴ−ＰＣＲ生成物の代表的な画像を示す。これらの画像はヒト及びモルモットの気管気道平滑筋から採取した気道平滑筋細胞のレーザー捕獲顕微切断法（laser capture microdissection）後の特定のＧＡＢＡＡサブユニットに対応する（bp＝base pairs：塩基対、ＡＳＭ＝airway smooth muscle：気道平滑筋、Ｈｕ＝human：人間、ＧＰ＝guinea pig：モルモット、neg＝negative：ネガティブ、及びpos＝positive：ポジティブ）。２つの分離された個別のヒト及びモルモットの気管を代表するものである。
【図２】図２はマウス気管輪のアセチルコリン（Ａｃｈ）誘発性収縮のＧＡＢＡＡα４−選択的配位子ＣＭＤ−４５による弛緩を示す。野生型ノックアウトマウスはこの弛緩を示すが、ＧＡＢＡＡα４ノックアウトマウスは示さない：野生型媒体対照（０．１％ＤＭＳＯ）との比較で、＊＊ｐ＜０．０１（ｎ＝４）。
【図３Ａ】図３Ａは相対蛍光変化を誘発するＴＨＩＰ（０〜１０ｍＭ）の用量応答曲線（ＥＣ５０＝２４５μＭ）（ｎ＝１２）を示す。
【図３Ｂ】図３ＢはＧＡＢＡＡ受容体拮抗作用の条件下でのＴＨＩＰ誘起蛍光変化の減衰の説明図である。ＴＨＩＰの添加により誘発される相対蛍光単位（relative fluorescence unit：ＲＦＵ）の経時変化の代表的な付随記録図を示す。下段図：ＤＭＳＯ媒体（０．１％；陰性対照）に続くＴＨＩＰ（５００μＭ）の注入に追随するＲＦＵ変化、上段図：ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニスト・ピクロトキシン（２００μＭ：０．１％ＤＭＳＯ溶液）に続くＴＨＩＰ（５００μＭ）の注入に追随するＲＦＵ変化。
【図３Ｃ】図３Ｃは２つの異なるＴＨＩＰ濃度（５００μＭ及び１ｍＭ）におけるＴＨＩＰに誘発された膜電位の変化のピクロトキシン（ピクロ）媒介拮抗作用（一群当たりｎ＝１２、ＴＨＩＰ単独との比較で、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）を示す。
【図４Ａ】図４Ａは１０μＭのＴＨＩＰへの暴露後のヒト気道平滑筋細胞から誘発される電流を編集・平滑化した記録図（ｐＡ／ｍｓ）を示す（−６７０．４＋２７．６ｐＡの平均電流で、全細胞構成の１１／１２配列を代表する）。各配列は、３００Ｍｏｈｍ超の最小シール抵抗を有するマイクロ流体流動（FluxionＴＭ）自動パッチクランププラットフォームに並列全細胞構成で同時に保持された２０個のヒト気道平滑筋細胞から成る。
【図４Ｂ】図４Ｂは全細胞構成で−８０ｍＶの固定電圧で保持されたヒト気道平滑筋細胞からの電流を誘起するＴＨＩＰの用量応答曲線（０〜３００μＭ）（ＥＣ５０＝１５μＭ）を示す。データは４回の別々の実験から取得された。
【図４Ｃ】図４Ｃは塩化物を含まない緩衝液又はガバジンによるＴＨＩＰ誘起全電流の減衰を示す。典型的な図は制御された条件（ＣｓＣｌ／ＴＨＩＰ ２５μＭ）、選択的ＧＡＢＡＡ受容体拮抗作用（ガバジン／ＴＨＩＰ ２５μＭ）、及び緩衝液から塩化物除去（グルコン酸セシウム／ＴＨＩＰ ２５μＭ））のもとで−８０ｍＶの固定電圧で保持されたヒト気道平滑筋細胞のＴＨＩＰ誘起電流の時間変化を示す。
【図５Ａ】図５Ａは編集されたイソプロテレノール濃度−応答曲線を示す。イソプロテレノール単独処理（ＥＣ５０＝３２．８ｎＭ；ｎ＝８、△）を単一濃度５００μＭのＴＨＩＰ後イソプロテレノール処理（ＥＣ５０＝７．６ｎＭ；ｎ＝８、■）及び５００μＭのガバジンによる前処理後に単一濃度５００μＭのＴＨＩＰと共にイソプロテレノール処理（ＥＣ５０＝１１．８ｎＭ；ｎ＝８、○）と比較した。選択的ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットの活性化によってイソプロテレノール応答のＥＣ５０が有意に数倍減少し、このＴＨＩＰ媒介弛緩促進効果はＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストの前処理によって無効にされる。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＴＨＩＰ処理は、また低濃度のイソプロテレノール（１０ｎＭ）においても、有意な弛緩の増強をもたらし［筋力：初期アセチルコリンに誘発された力の７６．５±８．５％（ｎ＝８）（イソプロテレノール単独）に対し、２２．９±１３．２％（ｎ＝８）（ＴＨＩＰ＋イソプロテレノール）（ｐ＜０．０１）］、一方、ガバジンによる前処理は、このＴＨＩＰ効果を相殺した［筋力：５３．１±１１．４％（Ｎ＝８）（ｐ＞０．０５、イソプロテレノール単独と比較）］ことを示す。＊＊ｐ＜０．０１、「ｎ．ｓ．」＝有意ではない。
【図６】図６は編集されたイソプロテレノール濃度−応答曲線を示す。イソプロテレノール単独処理（ＥＣ５０＝１５．８ｎＭ；ｎ＝６：△）、単一濃度２００μＭのタウリン後イソプロテレノール処理（ＥＣ５０＝２．４ｎＭ；ｎ＝７：■）、及び２００μＭのガバジンによる前処理後に単一濃度２００μＭのタウリンと共にイソプロテレノール処理（ＥＣ５０＝４．７ｎＭ；ｎ＝７：○）と比較した。タウリン処理により、イソプロテレノール応答のＥＣ５０が数分の１に減少し、この弛緩促進効果は、ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストの前処理によって有意に、しかし部分的に相殺される（各々ｐ＜０．０５）。
【図７Ａ】図７Ａは、１０ｍＭのＴＥＡによる収縮に続くＣＭＤ−４５による直接弛緩（上段図）を、０．１％ＤＭＳＯ媒体対照（下段図）と比較して示す代表的記録図（筋力／時間）である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、０．１％ＤＭＳＯ媒体対照による処理と比較し、ＣＭＤ−４５が１０ｍＭのＴＥＡの媒介収縮に続いて添加後１５分で有意な自発的弛緩を誘発する［筋力＝５４．３±１４．３％（ｎ＝１３）（ＣＭＤ−４５処理直後の初期のＴＥＡに誘発された力に対する割合）対筋力＝９９．１±９．５％（媒体対照のみ（ｎ＝１３）；＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１］ことを示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、０．１％ＤＭＳＯ媒体対照による処理と比較し、ＣＭＤ−４５が、また１μＭの物質Ｐの媒介収縮に続いて添加後１５分で有意な自発的弛緩を誘発する［筋力＝６１．３±１６．９％（ｎ＝１０）（ＣＭＤ−４５処理直後の初期のＴＥＡに誘発された力に対する割合）対筋力＝８９．５±５．３％（媒体対照のみ（ｎ＝１０）；＊＊＊＝ｐ＜０．００１］ことを示す。
【図８】図８は、マウスの体外での気管輪における気道平滑筋力を示す。
【図９】図９は、モルモットの体外での気管輪における気道平滑筋力を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、本発明による種々の化合物を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、本発明による種々の化合物を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、本発明による種々の化合物を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、本発明による種々の化合物を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、本発明による種々の化合物を示す。
【図１２】図１２は、α４又はα６ＧＡＢＡＡＲに有利な機能的選択な偏りを示す化合物を示す。選択性は、α４又はα６を有するＧＡＢＡＡＲの作用によって、他のα−サブタイプの場合よりも大きな内向き電流（即ち、アゴニスト活性）を示す用量応答曲線によって定量される。
【図１３】図１３は、ＧＡＢＡＡアゴニストであるＣＭＤ−４５及びＸＨＥ（ＩＩ）−０７４の、ヒトジャーカットＥ６−１細胞に対する膜の分極効果を示す。挿入図は種々の用量における内向き整流電流（ｍＡ）を示す。化合物は０．１μＭのＧＡＢＡで試験される。曲線は示された用量における４回測定の平均と標準偏差である。
【図１４】図１４は、本発明の化合物の種々の合成スキームを示す。
【図１５】図１５は、本発明による種々の化合物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
最近の研究により、喘息肺の病態生理に関与する細胞型の表面に機能的γ−アミノ酪酸型Ａ受容体（ＧＡＢＡＡＲ）が存在することが示された。重要なことは、ＧＡＢＡＡＲシグナル伝達は、気道平滑筋（ＡＳＭ）の収縮状態、炎症過程、及び気道上皮細胞（ＡＥＣ）の増殖に影響を及ぼすことができることである。局所的に肺に作用するＧＡＢＡＡＲシグネル伝達に対する認識が高まっているにも関わらず、ＧＡＢＡＡＲの応答を統合して標的とする戦略を喘息治療のための治療法として開発、或いは利用することはこれまで行われていなかった。従って、本発明者らは、ヒト肺細胞型を系統的にプロービングし、ＡＥＣの肥大を刺激することなくＡＳＭ及び免疫／炎症細胞に対して抑制的なアゴニストを特定することによって、新規な喘息治療法を特定することを意図する。
【００１６】
内因性気道平滑筋ＧＡＢＡＡ受容体の活性化によって、α−アドレナリン受容体媒介性弛緩が促進され、これらのＧＡＢＡＡ受容体のα−サブユニット成分がα４及びα５サブユニットに限定されていることが気道平滑筋の分子分析によって分かる。
【００１７】
本発明は、免疫／炎症細胞及び気道平滑筋のリンパ組織に発現する特定のイオンチャンネル型（配位子開口型）のイオンチャンネルに結合し、その結果、収縮を緩和できる新規な化合物を提供する。この新規な知見は、気道平滑筋収縮を緩和するためのシグナル伝達経路及びタンパク質標的について詳細に説明するものであり、気道狭窄、肺炎症、及び自己免疫疾患に関連する炎症に対する新規な治療法の開発に繋がる可能性がある。このように、とりわけ、本発明は、気道狭窄、肺炎症、及び自己免疫疾患に関連する炎症に対する新規な治療法の選択肢を提供する新規化合物、並びに様々な疾患を治療するためのこれらの化合物の使用方法を提供する。
【００１８】
定義
具体的な官能基及び化学用語の定義を以下により詳細に説明する。本発明の目的に対し、化学元素は、「化学及び物理のハンドブックCASバージョン（CAS version, Handbook of Chemistry and Physics）」、第７５版の表紙の裏の元素周期表に従い特定され、具体的な官能基は、一般にそこに定義されている通りである。また、有機化学の一般的原理、並びに具体的な官能性部分及び反応性は、Thomas Sorrell著「有機化学（Organic Chemistry）」（University Science Books、Sausalito、1999）、Smith及びMarch著「マーチの最新有機化学（March’s Advanced Organic Chemistry）」（第５版、John Wiley & Sons社、ニューヨーク、2001）、Larock著「有機変換大全（Comprehensive Organic Transformations）」（VCH Publishers社、ニューヨーク、1989）、並びに、Carruthers著「有機合成の近代的手法（Some Modern Methods of Organic Synthesis）」（第３版、Cambridge University Press、ケンブリッジ、1987）に記載されており、それらの全体の内容を参照によって本明細書に組み込む。
【００１９】
用語「アシル」は、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、アリールカルボニル、又はヘテロアリールカルボニルである置換基を指し、いずれも更に、（例えば、１個以上の置換基で）置換されていてもよい。
【００２０】
用語「アルキル」は、示された数の炭素原子を含む、直鎖又は分岐の炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１−Ｃ１２のアルキル基は、アルキル基が１から１２（両端を含む）の炭素原子を有することができることを示し、Ｃ１−Ｃ４アルキル基は、アルキル基が１から４（両端を含む）の炭素原子を有することができることを示している。アルキル基は任意に置換されていてもよい。Ｃ１−Ｃ４アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、及びｔ−ブチルが挙げられる。
【００２１】
用語「アルケニル」は、１つ以上の二重結合を有する直鎖又は分枝の炭化水素鎖を指す。アルケニル基の例としては、アリル、プロペニル、２−ブテニル、３−ヘキセニル及び３−オクテニル等の基が挙げられるが、これらに限定されない。二重結合炭素の１個は、任意にアルケニル置換基の結合点であってもよい。アルケニル基は任意に置換されていてもよい。
【００２２】
用語「アルキニル」は、１つ以上の三重結合を有する直鎖又は分枝の炭化水素鎖を指す。アルキニル基の例としては、エチニル、プロパルギル、及び３−ヘキシニルが挙げられるが、これらに限定されない。三重結合炭素の１個は、任意に、アルキニル置換基の結合点であってもよい。アルキニル基は任意に置換されていてもよい。
【００２３】
用語「アリール」は、置換可能な任意の環原子が（例えば、１個以上の置換基で）置換されていてもよい芳香族単環式、二環式、又は三環式炭化水素環系を指す。アリール部分の例としては、フェニル、ナフチル、及びアントラセニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
用語「アリールアルキル」は、アルキル水素原子がアリール基で置き換えられたアルキル部分を意味する。アリールアルキルは、２個以上の水素原子がアリール基で置き換えられた基を含む。アリールアルキル基の例としては、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、９−フルオレニル、ベンズヒドリル、及びトリチル等の基が挙げられる。
【００２５】
本明細書で使用する用語「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素（例えば、３、４、５、６又は７個の炭素原子）を有する非芳香族の、飽和又は部分的に不飽和の環式基、二環式基、三環式基又は多環式炭化水素基を指す。任意の環原子が（例えば、１個以上の置換基で）置換されていてもよい。シクロアルキル基は、縮合環を含むことができる。縮合環は、１個以上の共通の炭素原子を共有する環である。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、メチルシクロヘキシル、アダマンチル、ノルボルニル、及びノルボルネニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
本明細書で使用する用語「ハロ」又は「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素のいずれかの基を指す。
本明細書で使用する用語「ハロアルキル」は、１個以上の水素原子がハロゲンで置き換えられたアルキルを指し、全ての水素がハロゲンで置き換えられたアルキル部分（例えば、ＣＦ３等のペルフルオロアルキル）を含む。
【００２７】
本明細書で使用する用語「ヘテロアリール」は、芳香族５〜８員の単環式、８〜１２員の二環式、又は１１〜１４員の三環式環系を指し、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子、二環式の場合は１〜６個のヘテロ原子、又は三環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子は独立してＯ、Ｎ、Ｓ、Ｐ及びＳｉから選択される（例えば、単環式、二環式、又は三環式に対して、炭素原子、並びに独立してＯ、Ｎ、Ｓ、Ｐ及びＳｉから選択されるそれぞれ１〜３、１〜６、又は１〜９個のヘテロ原子）。任意の環原子が（例えば、１個以上の置換基で）置換されていてもよい。ヘテロアリール基は、１個以上の共通の原子を共有する環である縮合環を含むことができる。ヘテロアリール基の例としては、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソキサゾール、フラン、チアゾール、イソチアゾール、チオフェン、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、インドール、イソインドール、インドリジン、インダゾール、ベンゾイミダゾール、フタラジン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、フェナジン、ナフチリジン及びプリン等の基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書で使用する用語「ヘテロシクリル」は、非芳香族の、飽和又は部分的に不飽和の３〜１０員の単環式、８〜１２員の二環式、又は１１〜１４員の三環式環系を指し、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子、二環式の場合は１〜６個のヘテロ原子、又は三環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子は独立してＯ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、及びＰから選択される（例えば、単環式、二環式、又は三環式に対して、炭素原子及び独立して、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、及びＰから選択されるそれぞれ１〜３、１〜６、又は１〜９個のヘテロ原子）。任意の環原子が（例えば、１個以上の置換基で）置換されていてもよい。ヘテロシクリル基は、１個以上の共通の原子を共有する環である縮合環を含有することができる。ヘテロシクリル基の例としては、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロピラン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ピロリン、ピリミジン、ピロリジン、インドリン、テトラヒドロピリジン、ジヒドロピラン、チアントレン、ピラン、ベンゾピラン、キサンテン、フェノキサチイン、フェノチアジン、フラザン、ラクトン、アゼチジノン及びピロリジノン等のラクタム、スルタム、並びにスルトン等の基が挙げられる。
【００２９】
用語「ヒドロキシ」は、−ＯＨ基を指す。用語「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル基を指す。用語「アリールオキシ」は、−Ｏ−アリール基を指す。用語「ハロアルコキシ」は、−Ｏ−ハロアルキル基を指す。
【００３０】
用語「置換基」は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基、アリールアルキル基、又はヘテロアリール基の任意の原子に「置換した」基を指す。適切な置換基としては、限定されないが、アシル、アシルアミド、アシルオキシ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、カルボキシ、シアノ、エステル、ハロ、ヒドロキシ、イミノ、ニトロ、オキソ（例えば、Ｃ＝Ｏ）、ホスホナート、スルフィニル、スルホニル、スルホナート、スルホンアミノ、スルホンアミド、チオアミド、チオール、チオキソ（例えば、Ｃ＝Ｓ）、及びウレイドが挙げられる。複数の態様において、基への置換基は、独立して前記の置換基の任意の１つ又は任意の組合せである。複数の態様において、置換基それ自体が上記置換基のいずれか１つで置換されていてもよい。
【００３１】
上記の置換基は、本明細書では略記されてもよく、例えば、略語のＭｅ、Ｅｔ、及びＰｈは、それぞれメチル、エチル、及びフェニルを表す。有機化学者によって使用される略語のより包括的なリストは、The Journal of Organic Chemistryの各巻の第１号に掲載されている。このリストは、典型的には、標準略語一覧表（Standard List of Abbreviations）と題する表に示されている。前記リストに含まれる略語及び当業者の有機化学者によって使用される全ての略語は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３２】
化合物については、その基及び置換基は、例えば、転位、環化、脱離等による自発的な変換を起こさない安定な化合物が得られるように、許容される原子価数及び置換基から選択してよい。
【００３３】
左から右に書かれた従来の化学式によって置換基が特定される場合、右から左に構造を書いた結果の置換基も任意に包含する。例えば、−ＣＨ２Ｏ−は、所望により−ＯＣＨ２−でもある。
【００３４】
本技術分野で使用される慣例に従い、基：
【００３５】
【化２】
2015529254.tif 000004
【００３６】
は、核又は骨格構造への部分即ち置換基の結合点である結合を示すために本明細書中の構造式では使用される。
疾患を治療するという点では、本明細書で使用する用語「有効量」は、細胞の治療、即ち、被験者の疾患の治療、軽減、緩和或いは改善を行う際に被験者に単一又は複数の用量投与する場合の効果的な化合物の量又は効果的な化合物を含む組成物の量を指す。化合物又は組成物の有効量は、用途に応じて変えることができる。疾患を治療するという点では、有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体での所望の応答を誘発する化合物の能力等の要因に依存し得る。一例では、化合物の有効量とは、化合物で処理していない細胞（細胞の培養物）或いは被験者等の対照と比較して所定のパラメータにおいて統計的に有意な変化を生じる量である。
【００３７】
極く当然のことであるが、本明細書に記載の任意の数値（例えば、範囲）は、下限値から上限値までの全ての値を含む、即ち、最低値と最高値との間の列挙される可能な全ての組み合わせは、本出願に明確に記載されていると見なされる。例えば、濃度範囲が１％〜５０％と記載されている場合、２％〜４０％、１０％〜３０％、或いは１％〜３％等の値は、本明細書に明示されていると意図される。これらは、具体的に意図されるものの例に過ぎない。
【００３８】
化合物
本発明の化合物は、式（Ｉ）に従う化合物：
【００３９】
【化３】
2015529254.tif 000005
【００４０】
並びに、その全ての異性体及び塩であってもよく、
式中、Ｒ３は、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−５シクロアルキル、アダマンチル、又はＨから選択され、
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲＮ−、又は−ＮＲＮＣ（Ｏ）−であり、
ＲＮはＨ又はＣ１−４アルキルから選択され、
Ｒ４はＣ１−４アルキルから選択され、
Ｒ５はＨ又はＣ１−４アルキルから選択され、
又はＲ４及びＲ５は一緒に４〜５個の構成原子の環を形成し、
Ｒ８は、Ｃ１−４アルキル又はＣ１−４シクロアルキルから選択される。
【００４１】
いくつかの態様では、１個以上の水素を重水素で置き換えてもよい。
好ましくは、Ｒ３は、ｔ−ブチル又はシクロプロピルである。いくつかの態様では、
Ｒ３は、フルオロなどの１個以上のハロゲンで置換されたアルキル基である。特定の態様では、Ｒ３は、Ｈ、−ＣＨ３、イソブチル、−ＣＨ（ＣＦ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＦ３）ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＤ３）ＣＨ３、−ＣＦ（ＣＤ３）ＣＨ３、イソプロピル、ｔ−ブチル、−ＣＨ（ＣＦ３）２、シクロプロピル、−ＣＨ２ＣＤ３、−ＣＤ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＤ（ＣＦ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＤ（ＣＦ３）ＣＨ３、−ＣＤ（ＣＤ３）ＣＨ３、−ＣＦ（ＣＤ３）ＣＨ３、及び−ＣＤ（ＣＨ３）２である。
【００４２】
好ましくは、Ｒ８は、イソプロピル、シクロプロピル、メチル、エチル、ｔ−ブチル、又はＣＤ３である。
好ましくは、Ｘは、−Ｏ−又はＮＲＮ−である。
【００４３】
好ましくは、Ｒ４及びＲ５は、４員環又は５員環を形成する。環は炭素環又は複素環であってもよい。
好ましくは、Ｘ−Ｒ３は、−Ｎ（ＣＦ３）ＣＨ３、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨＣ（ＣＨ３）３、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−ＳＣ（ＣＨ３）３、
【００４４】
【化４】
2015529254.tif 000006
【００４５】
である。
好ましくは、化合物はＳ−異性体でもよい。あるいは、化合物はＲ−異性体でもよい。
別の態様では、本発明の化合物は、式（ＩＩＡ）又は（ＩＩＢ）：
【００４６】
【化５】
2015529254.tif 000007
【００４７】
の化合物であり、
式中、Ｒ８は、−ＣＤ３、−ＣＨ３、エチル、ｔ−ブチル、又はシクロプロピルであり、
Ｒ３は、Ｈ、−ＣＨ３、イソブチル、−ＣＨ（ＣＦ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＦ３）ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＤ３）ＣＨ３、−ＣＦ（ＣＤ３）ＣＨ３、イソプロピル、ｔ−ブチル、−ＣＨ（ＣＦ３）２、シクロプロピル、−ＣＨ２ＣＤ３、−ＣＤ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＤ（ＣＦ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＤ（ＣＦ３）ＣＨ３、−ＣＤ（ＣＤ３）ＣＨ３、−ＣＦ（ＣＤ３）ＣＨ３、又は−ＣＤ（ＣＨ３）２であり、
ｎは、１又は２である。
【００４８】
いくつかの態様では、本発明の化合物は、式（ＩＩＩＡ）又は（ＩＩＩＢ）：
【００４９】
【化６】
2015529254.tif 000008
【００５０】
の化合物であり、
式中、Ｒ８は、−ＣＤ３、−ＣＨ３、エチル、ｔ−ブチル、又はシクロプロピルであり、
Ｘ−Ｒ３は、−Ｎ（ＣＦ３）ＣＨ３、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨＣ（ＣＨ３）３、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−ＳＣ（ＣＨ３）３、
【００５１】
【化７】
2015529254.tif 000009
【００５２】
であり、ｎは、１又は２である。
いくつかの側面において、本発明の化合物は、ＧＡＢＡＡ受容体のα４サブユニット及びα５サブユニットを選択的に標的とする。いくつかの態様では、ＧＡＢＡＡ受容体のα４及びα５ベンゾジアゼピンのアロステリック調節部位に対して選択的であるＧＡＢＡＡ受容体のアロステリック調節剤である。いくつかの側面において、本発明の化合物が血液脳関門を通過する能力は限定的か全くない。
【００５３】
本発明の化合物については、その基及び置換基は、例えば、転位、環化、脱離等による自発的な変換を起こさない安定な化合物が得られるように、許容される原子価数及び置換基から選択してよい。
【００５４】
左から右に書かれた従来の化学式によって置換基が特定される場合、右から左に構造を書いた結果の置換基も任意に包含する。例えば、−ＣＨ２Ｏ−は、所望により−ＯＣＨ２−でもある。
【００５５】
本発明の化合物は、１個以上の同位体濃縮原子が存在する点のみで異なる化合物を含む。例えば、化合物は、重水素又は三重水素によって水素が置き換えられている、或いは、１３Ｃ濃縮炭素又は１４Ｃ濃縮炭素によって炭素が置き換えられている点以外は本構造を有してもよい。
【００５６】
本発明の化合物は、塩、例えば、薬学的に許容される塩の形態であってもよい。用語「薬学的に許容される塩」は、化合物に存在する特定の置換基に依存して、比較的毒性の低い酸又は塩基を用いて調製される活性化合物の塩を含む。本発明の化合物の適切な薬学的に許容される塩としては、例えば、本発明の化合物の溶液を、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、炭酸、又はリン酸等の薬学的に許容される酸の溶液と混合することによって形成される酸付加塩が挙げられる。更に、本発明の化合物が酸性部分を持つ場合、適切なその薬学的に許容される塩は、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩又はカリウム塩）、アルカリ土金属塩（例えば、カルシウム塩又はマグネシウム塩）、及び適切な有機配位子で形成される塩（例えば、四級アンモニウム塩）を含むことができる。
【００５７】
化合物の中性形態は、塩を塩基又は酸と接触させ、従来の方法で親化合物を単離することによって再生することができる。化合物の親形態は、極性溶媒中での溶解度等の特定の物理特性において様々な塩形態とは異なるが、その他の点では、塩は、本開示の目的に対して化合物の親形態と同等である。
【００５８】
塩形態に加えて、本発明は、同様にプロドラッグ形態の本発明の化合物を提供してもよい。化合物のプロドラッグは、生理的条件の下で容易に化学反応を起こし、活性化合物を提供する化合物である。プロドラッグは、生体外環境において化学的又は生化学的方法により本発明の化合物に変換することができる。例えば、プロドラッグは、適切な酵素又は化学試薬と共に経皮パッチリザーバ内に入れると、ゆっくりと本発明の化合物に変換することができる。
【００５９】
本発明の化合物は、例えば、本明細書に記載の立体異性体の濃縮鏡像異性体であってもよい。本明細書で使用される濃縮鏡像異性体は、分子構造が互いに鏡像関係である一対の化学化合物のどちらかを意味する。例えば、化合物の鏡像異性体過剰率は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であってもよい。
【００６０】
本発明の化合物の調製は、選択された立体中心に対応する選択された立体化学を有する化合物の異性体、例えば、Ｒ異性体又はＳ異性体を濃縮することができる。例えば、その化合物は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の選択された立体中心の選択された立体化学を有する化合物に相当する純度を有していてもよい。化合物は、例えば、選択された立体中心で、Ｒ又はＳ等の選択された立体化学を有する構造が濃縮されている本明細書に開示された化合物の調製を含むことができる。
【００６１】
いくつかの態様では、本発明の化合物の調製は、化合物のジアステレオマーである異性体（対象異性体）を濃縮することができる。本明細書で使用されるジアステレオマーは、同じ化合物の別の立体異性体である鏡像異性体ではない２つ以上のキラル中心を有する化合物である立体異性体を指す。例えば、この化合物は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の選択されたジアステレオマーを有する化合物に相当する純度を有する。
【００６２】
化合物の一定の立体中心での構造について具体的な表示がない場合には、構造の任意の1つ又は構造の混合物が意図される。
化合物は、ラセミ形態として、又は立体特異的合成若しくは分割のいずれかにより個々のエナンチオマー若しくはジアステレオマーとして調製してもよい。化合物は、例えば、光学活性塩基による塩形成により立体異性体対を形成し、続いて分別結晶化して遊離酸を再生する等の標準的技術によって、成分のエナンチオマー又はジアステレオマーに分割してもよい。化合物は、また立体異性体のエステル又はアミドを形成し、次いで、クロマトグラフィー分離及びキラル補助剤の除去によって分離してもよい。あるいは、化合物は、キラルＨＰＬＣカラムを用いて分割してもよい。エナンチオマーも、またリパーゼ（脂肪分解酵素）を用い、対応するエステルのラセミ体の速度論的光学分割から得ることできる。
【００６３】
本発明の化合物はまた、選択的な生物学的特性を高めるために、適切な官能基を付加することにより修飾することができる。そのような修飾は、当技術分野で公知であり、所定の生体系（例えば、血液、リンパ系、中枢神経系）への生物学的浸透の増加、経口利用可能性の増大、注射による投与を可能にするための溶解度の増加、代謝の改変、及び／又は排出速度の変更等が挙げられる。これらの修飾の例としては、ポリエチレングリコールによるエステル化、ピバリン酸若しくは脂肪酸置換基による誘導体化、カルバマートへの変換、芳香環のヒドロキシル化、及び芳香環中のヘテロ原子置換等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明の化合物は、「ソフトドラッグ」として構成されてもよい。ソフトドラッグは、所望の治療効果を達成した後に、不活性種への予測可能かつ制御可能な生体内で代謝を受ける生物学的に活性な化合物と定義することができる。すなわち、本発明の化合物は、肺又は他の標的組織における化合物の急速な代謝を可能にする部分を含んでもよい。肺では、いくつかのチトクロムのアイソフォーム（イソ型）が、他の生体内変換酵素、例えば、スルホトランスフェラーゼ、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、エステラーゼ、ペプチダーゼ、シクロオキシゲナーゼ、及びフラビンモノオキシゲナーゼと共に存在する。広範囲の生体内変換酵素は広範囲の化学的に異なる基質、例えば、不安定なエステル基の代謝を可能にする。ソフトドラッグは、置換基部分のない化合物よりも短い全身半減期を持ち、望ましくない全身作用（ＣＮＳ組織への分布）を制限できる。
【００６５】
合成
式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物は、市販の出発物質を用いて合成することができる。合成例を以下に示す。
【００６６】
【化８】
2015529254.tif 000010
【００６７】
本発明の化合物への様々な経路を図１４に示す。
本明細書中の式の化合物を合成する他の方法は当業者には明らかである。化合物の合成に有用な合成化学変換及び保護基に関する反応（保護及び脱保護）は、技術分野で公知であり、例えば、R. Larock著「有機変換大全（Comprehensive Organic Transformations）」（VCH Publishers社、1989）、T.W. Greene及びP.G.M. Wuts著「有機合成における保護基（Protective Groups in Organic Synthesis）」（第２版、John Wiley and Sons社、1991）、L. Fieser及びM. Fieser著「有機合成のためのフィーザー及びフィーザーの試薬（Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis）」（John Wiley and Sons (1994)）、並びに、L. Paquette編「有機合成用試薬百科事典（Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis）」（John Wiley and Sons (1995)）、及びそれらの改訂版が挙げられる。
【００６８】
化合物の評価
化合物は、受容体結合研究及び生体内の方法を含む多くの方法を使用して分析することができる。
【００６９】
例えば、化合物のＧＡＢＡＡサブユニット選択性は、例えば、競合結合試験を用いて評価することができる。そのような試験法は、Choudhary et al. Mol Pharmacol. 1992, 42, 627-33、Savic et al. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry, 2010, 34, 376-386に記載されている。それらの試験法には、［３Ｈ］フルニトラゼパム等のＧＡＢＡＡ受容体に結合することが知られている放射性標識化合物の使用が含まれる。膜タンパク質を採取し、放射性標識化合物と共にインキュベーションし、非特異的結合を、この放射性標識化合物と別の非標識化合物（例えば、ジアゼパム）との結合を比較することによって評価することができる。結合した放射能を液体シンチレーション計数によって定量化することができる。膜タンパク質濃度は、市販（例えば、Bio-Rad社；ハーキュリーズ、カリフォニア州）の試験キットを用いて決定することができる。
【００７０】
化合物はまた、アフリカツメガエル卵母細胞における電気生理学的試験で評価することができる。ＧＡＢＡを添加する前に化合物を卵母細胞に予め施用し、次いで、ピーク応答が観察されるまでＧＡＢＡを化合物と共に同時施用することができる。施用の間に、脱感作からの完全な回復を確実にするために卵母細胞を洗浄することができる。電流測定には、卵母細胞を微小電極で突き刺し、電圧クランプを用いて記録を行うことができる。
【００７１】
本明細書に記載の化合物は、内因性気道平滑筋のＧＡＢＡＡ受容体に結合し、α−アドレナリン受容体媒介性弛緩を促進するＧＡＢＡＡ受容体配位子であってもよい。これは、α４及びα５サブユニットのベンゾジアゼピンのアロステリック調節部位に対する標的が増加するためである。化合物は、ＧＡＢＡＡ／α１、ＧＡＢＡＡ／α２、及びＧＡＢＡＡ／α３に比較して、ＧＡＢＡＡ／α４及び／又はＧＡＢＡＡ／α５のアロステリック調節部位に対して、少なくとも２倍、適切には少なくとも５倍、有利には、少なくとも１０倍の選択的効力を有してもよい。しかしながら、ＧＡＢＡＡ／α４及び／又はＧＡＢＡＡ／α５のベンゾジアゼピンのアロステリック調節結合部位に対して選択的ではない化合物も本発明の範囲内に包含される。このような化合物は、他のＧＡＢＡＡ受容体のベンゾジアゼピンのアロステリック調節部位では効力が低下するので、機能的な選択性を示す。
【００７２】
選択的又は優先的な治療薬は、ＧＡＢＡＡ／α４サブユニット又はＧＡＢＡＡ／α５サブユニット表面のベンゾジアゼピンのアロステリック調節部位に比較して、ＧＡＢＡＡ受容体表面の他のベンゾジアゼピンのアロステリック調節部位に対して結合親和性又は効力が小さい。あるいは、この薬剤は、同等の親和性を持つすべてのＧＡＢＡＡ受容体表面のベンゾジアゼピンのアロステリック調節部位を標的とするが、ＧＡＢＡＡ／α４及びＧＡＢＡＡ／α５受容体表面のベンゾジアゼピンのアロステリック調節部位に対して、その他のＧＡＢＡＡ受容体表面のものに対するよりも優先的に効力を発揮する。本発明の選択的薬剤のベンゾジアゼピンのアロステリック調節部位に結合する能力は、また、ＧＡＢＡＡ／α２受容体及びＧＡＢＡＡ／α３受容体表面に比較して、その他のＧＡＢＡＡ受容体表面の方が高い場合も低い場合もある。
【００７３】
化合物を評価するための他の方法は当業者に公知である。化合物の望ましくない副作用（毒性）を評価するために神経機能又は筋肉機能の障害の明白な徴候について動物を観察することができる。マウスにおいて、回転棒試験法（Dunham, M. S. et al. J. Amer. Pharm. Ass. Sci. Ed. 1957, 46, 208-209）が、筋肉又は神経の最小の障害を明らかにするために用いられる。マウスを６ｒｐｍで回転する棒に載せると、マウスは長期間その平衡を維持することができる。１分間の間に、この回転棒から３回落ちた場合、マウスは中毒症状を起こしていると考えられる。ラットでは、最小の運動障害は、異常な非協調歩行に現れる運動失調により分かる。毒性の評価に用いるラットは、試験薬物を投与する前に検査を受ける。というのは、個々の動物が、歩行、平衡、置き直し反応他において特殊性を有する可能性があり、それを被験物質に起因すると誤る可能性があるからである。ＭＭＩに加えて、動物は、円形又はジグザグ歩行、異常姿勢、脚の異常な広がり、震え、多動、診査行動の欠如、嗜眠、昏迷、カタレプシー、置き直し反応の欠如、及びに筋緊張の変化を示す可能性がある。
【００７４】
組成物及び投与経路
別の態様において、本発明は、薬学的に許容される担体と組み合わせて本発明の１つ以上の化合物を含む医薬組成物を提供する。このような組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、滅菌非経口溶液又は懸濁液、定量エアロゾル又は液体スプレー、点滴剤、アンプル、自動注入デバイス又は座薬などの単位剤形であってもよく、それらは、経口、非経口、鼻内、舌下又は直腸投与、或いは吸入若しくはガス注入による投与のために行われる。また、化合物が連続的に適切な量の薬剤を送達するように設計された経皮パッチに組み込むことができることも想定される。錠剤等の固体組成物を調製するために、主要な活性成分を、医薬担体（例えば、コーンスターチ、乳糖、蔗糖、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム又はガム等の従来の錠剤化成分）及び他の医薬希釈剤（例えば、水）と混合し、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩の均一な混合物を含む固体予備処方組成物を形成する。これらの予備処方組成物を均質であるという場合は、有効成分が組成物全体に均一に分散され、組成物が容易に、例えば錠剤、ピル及びカプセル等の等しく有効な単位剤形に細分できることを意味する。この固体予備処方組成物は、次いで、本発明の活性成分を０．１〜約５００ｍｇ含有する上記に記載の種類の単位剤形に細分される。典型的な単位剤形は、活性成分を１〜１００ｍｇ、例えば、１、２、５、１０、２５、５０又は１００ｍｇを含有する。新規組成物の錠剤又は丸剤は、被覆され又は別な方法で調合され、持効性作用の利点を与える剤形を提供することができる。例えば、錠剤又は丸剤は、内層投薬成分及び外層投薬成分を、後者が前者を覆う外被の形態で含むことができる。この２つの成分は、冑内での分解を抑え、内層成分が十二指腸を無傷に通過するか遅れて放出されるように働く腸溶層により分離することができる。腸溶層又は被覆層のために各種材料が使用され得るが、それらの材料には多数のポリマー酸並びにポリマー酸のシェラック、セチルアルコール及び酢酸セルロースの等の物質との混合物が含まれる。
【００７５】
本発明の新規組成物を配合した経口投与又は注射投与用の液体剤形には、水溶液、適切には、付香されたシロップ剤、水性若しくは油性懸濁剤、及び食用油（例えば、綿実油、ゴマ油、ココナツ油、落花生油若しくは大豆油）並びにエリキシルや類似の医薬用ベヒクルを含む付香乳化物が含まれる。水性懸濁剤用の適切な分散剤又は懸濁剤としては、合成及び天然ゴム、例えばトラガント、アラビアゴム、アルギナート、デキストラン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン又はゼラチンが挙げられる。
【００７６】
適当な１日用量は約０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０５〜５ｍｇ／ｋｇである。化合物を１日１〜４回に分けて、或いは、例えば、経皮パッチを使用することによって連続的に投与することができる。
【００７７】
経腸投与（例えば、経鼻、口腔、直腸、又は特に経口投与）用及び非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、硬膜外、又は髄腔内投与）用の医薬組成物が好適である。医薬組成物は、約１％〜約９５％の活性成分、又は約２０％〜約９０％の活性成分を含む。
【００７８】
冠動脈内、脳室内、又は末梢血管注射／点滴を含む非経口投与に対しては、例えば、使用する直前に調製できるサブユニット選択的ＧＡＢＡＡ受容体アゴニストの溶液及び懸濁液又は分散液、特に等張水性溶液、分散液又は懸濁液を使用することが好ましい。医薬組成物は滅菌してもよく、それに加えてあるいはそれに代えて、賦形剤、例えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤及び／又は乳化剤、可溶化剤、増粘剤、浸透圧調節するための塩、及び／又は緩衝剤を含んでもよく、それ自体が公知の方法である、例えば、慣用の溶解、凍結乾燥等の方法によって調製される。
【００７９】
経口医薬製剤については、適切な担体は、特に充填剤（例えば、乳糖、蔗糖、マンニトール又はソルビトール等の糖、セルロース製剤、及び／又はリン酸カルシウム）、及び結合剤（デンプン、セルロース誘導体及び／又はポリビニルピロリドン等）、及び／又は所望により、崩壊剤、流動調節剤、及び滑剤（例えば、ステアリン酸又はその塩及び／又はポリエチレングリコール）である。錠剤コアには、所望により、適当な腸溶性被覆を施すことができる。染料又は顔料を、例えば、識別目的、或いは活性成分の様々な用量を示す目的で錠剤又は錠剤被膜に添加してもよい。経口投与のための医薬組成物には、またゼラチンからなる硬質カプセル、及びまたゼラチン及びグリセロール又はソルビトール等の可塑剤からなる軟質密封カプセルが含まれる。カプセルは、顆粒の形態の活性成分、又は油等の適当な液体賦形剤に溶解若しくは懸濁された活性成分を含有してもよい。
【００８０】
例えば、長期間（例えば、１〜２０日間）にわたって投与することを可能にする経皮パッチを使用する経皮投与も同様に検討される。
使用方法
本発明は、低減されたベンゾジアゼピン系ＣＮＳ効果を有するＧＡＢＡ作動性薬剤の有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む気道狭窄を低減する方法を提供する。いくつかの態様では、ＧＡＢＡ作動性薬剤は、式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物である。いくつかの態様では、気道狭窄は麻酔中に起こる。
【００８１】
本発明は、更に、低減されたベンゾジアゼピン系ＣＮＳ効果を有するＧＡＢＡ作動性薬剤の有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む肺炎症を低減する方法を提供する。いくつかの態様では、ＧＡＢＡ作動性薬剤は、式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物である。いくつかの態様では、肺炎症は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、嚢胞性線維症、肺線維症、気管支拡張症、線維化性肺胞炎、ウェゲナー肉芽腫症、内因性肺胞炎又は感染と関連している。感染はウイルス病原体、細菌病原体及び／又は真菌病原体によって当然引き起こされる。
【００８２】
患者における肺炎症は、肺機能障害、特に激しい活動或いは運動による息切れ、咳、又は呼吸困難によって裏付けられる。胸部Ｘ線、ＣＴスキャン、及び肺機能検査等の多種多様な診断手段を用いて炎症性肺疾患を診断する。肺機能検査及び運動試験を用いて、炎症によって損なわれた肺の容量を測定することができる。炎症のより明確な診断のために肺からの組織試料を採取することができる。これは、気管支鏡検査（気管支生検）又は気管支肺胞洗浄又は外科的肺生検によって採取することができる。組織学的には、炎症によって痰及び気管支肺胞洗浄液又は肺実質又は気道中のマクロファージ、リンパ球、又は多形核細胞の数が明らかに増加する。免疫／炎症細胞の肺への移行と活性化は、種々の炎症及び常駐細胞によって分泌されるプロテアーゼ、サイトカイン、及びケモカイン等の様々な媒介物質によって調節される。
【００８３】
別の側面において、本発明は、肺炎症に関連する危険因子を有する被験者における疾患の発症を低減する方法を提供する。低減されたベンゾジアゼピン系ＣＮＳ効果を有するＧＡＢＡ作動性薬剤の有効量は、それを必要とする被験者に投与される。適切には、ＧＡＢＡ作動性薬剤は、式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物である。
【００８４】
多くの要因が炎症性肺疾患を発症する可能性を高める可能性がある。即ち、要因として喘息等の疾患と関係する血縁者を有する低出生体重（従って、遺伝的素因）、特定の遺伝子変異（例えば、ＣＦＴＲ遺伝子等）の存在、肥満、喫煙、又は喫煙への暴露（子宮内暴露を含む）、排気ガスへの暴露、他の種類の環境汚染、或いは工業薬品或いは農薬への暴露等が挙げられる。
【００８５】
いくつかの態様では、肺炎症は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、嚢胞性線維症、肺線維症、気管支拡張症、線維化性肺胞炎、ウェゲナー肉芽腫症、内因性肺胞炎又は感染と関連している。感染は、ウイルス病原体、細菌病原体及び／又は真菌病原体によって適切に引き起こされる。
【００８６】
本発明は、また、低減されたベンゾジアゼピン系ＣＮＳ効果を有するＧＡＢＡ作動性薬剤の有効量を、それを必要とする被験者に投与する肺疾患を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、ＧＡＢＡ作動性薬剤は、式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物である。いくつかの態様において、肺疾患は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、嚢胞性線維症、肺線維症、気管支拡張症、線維化性肺胞炎、ウェゲナー肉芽腫症、内因性肺胞炎又は感染から選択される。感染は、ウイルス病原体、細菌病原体及び／又は真菌病原体によって適切に引き起こされる。
【００８７】
本発明は、更に、低減されたベンゾジアゼピン系ＣＮＳ効果を有するＧＡＢＡ作動性薬剤の有効量を、それを必要とする被験者に投与する自己免疫疾患を有する被験者における炎症を低減する方法を提供する。いくつかの態様において、ＧＡＢＡ作動性薬剤は、式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物である。いくつかの態様において、自己免疫疾患は、関節炎、糖尿病、狼瘡及びクローン病から選択される。
【００８８】
以下の非限定的な実施例により、いくつかの側面及び態様の単なる例示であること、及び開示に従って実施された特定の実験を示すことを意図している。
実施例
統計解析：各々の試験順列は内部実験的な対照を含んでいる。適切な場合には、ボンフェローニ事後比較を用いて一元配置分散分析法（ANOVA）の反復測定を採用した。また、用量応答曲線を、プリズム４．０ソフトウェア（グラフパッド（GraphPad）社；サンジエゴ、カルフォニア州）のシグモイド用量応答解析機能を用いて評価した。この解析機能は、ヒルモデルによる４変数ロジスティック方程式：Ｙ＝最小値＋（Ｅｍａｘ−最小値）／（１＋１０（用量−ｌｏｇＥＣ５０））（式中、最小値は、最初の静止筋肉の緊張を表す）を使用する。２つの実験群のみを比較する場合は、両側スチューデントのｔ−検定を用いた。データは平均±ＳＥＭとして提示される。全ての場合にｐ＜０．０５を有意とみなした。
【００８９】
動物実験：すべての動物実験は、コロンビア大学施設内動物管理及び使用委員会によって承認された。
実施例１：（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１−カルボン酸エチル（６）の合成
【００９０】
【化９】
2015529254.tif 000011
【００９１】
５−メトキシアントラニル酸（２）
２−ニトロ−５−メトキシ安息香酸（１）（２５．０ｇ、１２６ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（６００ｍＬ）溶液に、パラジウム炭素（１０％、１．５ｇ）を添加した。反応フラスコを脱気し、その後、溶液上をアルゴンで充満させ、次いで、風船を用いて水素を充填した（溶液が水素で確実に飽和するように３度繰り返した）。反応混合物を周囲温度で６時間撹拌した。反応が完了した（ＴＬＣ、シリカゲル）後、セライト床上で溶液を濾過してパラジウムを除去した。固体を酢酸エチルで洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、９６％の収率で黄色固体として（２）を得た。融点：１４７−１４９℃；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：３．６６（ｓ，３Ｈ），６．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．９４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，３．０Ｈｚ），７．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），８．４０（ｂｓ，２Ｈ）．この物質を次の実験に直接使用した。
【００９２】
５−メトキシイサト酸無水物（３）
５−メトキシアントラニル酸（２）（１５．０ｇ、８９．６ｍｍｏｌ）を、Ｈ２Ｏ（８００ｍＬ）及び濃塩酸（６ｍＬ）の混合液に溶解し、続いてトリホスゲン（３９．８ｇ、１３４．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応が完了する（ＴＬＣ、シリカゲル）まで内容物を周囲温度で３〜４時間撹拌した。完了後、白色固体が溶液から沈殿した。固体を濾過により回収し、Ｈ２Ｏ（２Ｌ）で洗浄した。固体を真空下で乾燥し、純粋な（３）を収率８３％（１４．７ｇ）で得た。融点：２３７−２３９℃；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：３．６５（ｓ，３Ｈ），７．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），７．３５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２．７Ｈｚ），７．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），１１．６１（ｂｓ，１Ｈ）．この物質を次の実験に直接使用した。
【００９３】
（Ｓ）−２，３−ジヒドロ−７−メトキシ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５，１１（１０Ｈ、１１ａＨ）−ジオン（５）
５−メトキシイサト酸無水物（３）（１０．４ｇ、５３．８ｍｍｏｌ）とＬ−プロリン（４）（６．８２ｇ、５９．２ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（７０ｍＬ）中の混合物を１６０℃で撹拌しながら２時間加熱した。温度が８０℃を超えると、白濁した反応混合物は透明な褐色の溶液になった。反応の完了後（ＴＬＣ、シリカゲル）、溶液を室温まで冷却した。それを、氷水１００ｍＬに注ぎ、白色固体として（５）を得た。固形物を真空濾過により集め、氷冷水で洗浄した（２０ｍＬで２回）。ろ液を酢酸エチルで抽出し、溶媒を減圧で除去し、固体（５）を得た。固体を合わせ、８０℃で４時間、真空乾燥器で乾燥させた。（５）の収率は、９５％（１１．０ｇ）であった。融点：２１４−２１６℃；［α］Ｄ２５＝＋４４４．４０（ｃ＝１％，ＣＨ２Ｃｌ２）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．８２−２．０１（ｍ，３Ｈ），２．５０−２．５１（ｍ，１Ｈ），３．４０−３．４９（ｍ，１Ｈ），３．５６−３．６３（ｍ，１Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ），４．０７−４．１０（ｍ，１Ｈ），７．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．１３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，３．０Ｈｚ），７．２６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），１０．３０（ｂｓ，１Ｈ）．この物質を次の実験に直接使用した。
【００９４】
（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１−カルボン酸エチル（６）
よく乾燥した反応フラスコを完全に脱気し、アルゴンを勢いよく流した。次に、（Ｓ）−２，３−ジヒドロ−７−メトキシ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５，１１−（１０Ｈ、１１ａＨ）−ジオン（５）（１０ｇ、４６．３ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（２００ｍＬ）液をフラスコに充填した。この濁った溶液を０℃に冷却した。カリウムｔ−ブトキシド（６．７５ｇ、６０．２ｍｍｏｌ）をこのフラスコに添加し、この溶液を０℃で４０分間撹拌した。次いでクロロリン酸ジエチル（１１．２ｇ、６４．８２ｍｍｏｌ）をゆっくりと−３５℃の反応混合物に加え、それを０℃で１時間かけて撹拌した。混濁した反応混合物は透明な琥珀色溶液となった。同様にして更にカリウムｔ−ブトキシド（０．６７５ｇ、６．０ｍｍｏｌ）、及びクロロリン酸ジエチル（１．１２ｇ、６．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃で３０分間攪拌した。出発物質（５）が完全に消費された（ＴＬＣ）後、反応物を−７８℃まで冷却し、次いでイソシアノ酢酸エチル（７．３ｇ、６４．８２ｍｍｏｌ）及びカリウムｔ−ブトキシド（６．７５ｇ、６０．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で８時間撹拌した。反応をＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（２０ｍＬ）で停止させた。ＴＨＦを減圧下で除去し、水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（１００ｍＬで３回）。合わせた有機層を分離させ、食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。ＣＨ２Ｃｌ２を減圧下で除去し、得られた暗褐色のペースト状の液体残留物を、エーテルで洗浄して粗生成物（６）を得た。この粗製固形物をＣＨ２Ｃｌ２で再結晶して純粋な白色結晶として（６）を５４％（８．５ｇ）の収率で得た。融点：１９５−１９７℃（文献報告値：１７５−１７６℃）１；［α］Ｄ２５＝＋１８．００（ｃ＝０．５％，ＣＨ２Ｃｌ２）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．４４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．１５−２．３５（ｍ，３Ｈ），３．４９−３．６１（ｍ，２Ｈ），３．７５−３．８５（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），４．４１（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），４．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），７．１５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，３．０Ｈｚ），７．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），７．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１４．３，２４．３，２８．４，４６．６，５３．４，５５．８，６１．２，１１４．５，１１９．７，１２４．６，１２６．０，１２７．３，１３０．６，１３５．８，１３７．６，１５９．４，１６２．６，１６３．７；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ１８Ｈ１９Ｎ３Ｏ４Ｎａに対する計算値：３６４．１２７３；実測値：３６４．１２７９。
【００９５】
実施例２：（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１−カルボン酸（７）の合成：
【００９６】
【化１０】
2015529254.tif 000012
【００９７】
（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１−カルボン酸エチル（６）（２．１２ｇ、６．２１ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（４ｍＬ）及びＨ２Ｏ（３ｍＬ）の混合液に溶解後、ＮａＯＨ（１．２ｇ、３１．０ｍｍｏｌ）を溶液に添加した。この反応混合物を５０℃まで１５分間加熱し、ＥｔＯＨを減圧下で除去した。残った水性溶液を０℃で１０分間撹拌し、次いで、この溶液に濃ＨＣｌをｐＨが３〜４になる（ｐＨ試験紙）まで滴下した。生成した淡黄色の沈殿物を溶液中に放置し、室温で２時間撹拌した。固体の（７）を濾過により回収し、冷水で洗浄し（５ｍＬで２回）、水層もまた室温で１０時間放置し、更なる（７）を得た。固体を合わせ、８０℃の乾燥器で７時間乾燥させ、純粋な（７）を８０％の収率で得た。融点：２１０−２１１℃；［α］Ｄ２５＝＋８．００（ｃ＝０．２５％，ＣＨ３ＯＨ）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：２．０３−２．１６（ｍ，３Ｈ），３．５０−３．６３１（ｍ，３Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），４．８４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．３１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，３．０Ｈｚ），７．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），７．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），８．２１（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：２４．９，２８．７，４７．３，５３．６，５６．８，１１５．３，１１９．９，１２６．７，１２７．０，１２８．６，１３１．０，１３７．５，１３７．５，１５９．５，１６４．０，１６５．３；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｍ＋Ｈ）＋，Ｃ１６Ｈ１６Ｎ３Ｏ４に対する計算値：３１４．１１４１；実測値：３１４．１１４１。
【００９８】
実施例３：（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１−カルボン酸イソプロピル（８）の合成：
【００９９】
【化１１】
2015529254.tif 000013
【０１００】
熱をかけて乾燥した反応フラスコを完全に脱気し、アルゴンを勢いよく流した。顆粒状Ｌｉ（０．０９１ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ溶液（５ｍＬ）に加えた。次いで、乾燥したｉＰｒＯＨ（１ｍＬ、１３．２ｍｍｏｌ）を、注射器を用いてフラスコに導入し、反応混合物を５０℃に加熱し、この温度に３０分間保持した。（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１−カルボン酸エチル（６）（０．４５ｇ、１．３２ｍｍｏｌ）を上記の濁った溶液に加え、反応液を５０℃で２０分間保持した。反応が完了した（ＴＬＣ、シリカゲル）後、フラスコを室温まで放冷し、ＴＨＦを減圧下で除去した。氷水（１０ｍＬ）を残留物に加え、溶液をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を水（１０ｍＬで２回）及び食塩水（１５ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、固体として（８）を８０％の収率で得た。融点：２１５−２１７℃（文献報告値：１５３−１５４℃）１；［α］Ｄ２５＝＋８．００（ｃ＝０．５％，ＣＨ２Ｃｌ２）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．４１−１．４３（ｍ，６Ｈ），２．１５−２．３６（ｍ，３Ｈ），３．５１−３．６１（ｍ，２Ｈ），３．７５−３．８２（ｍ，１Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），４．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），５．２２−５．３１（ｍ，１Ｈ），７．１５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，３．０Ｈｚ），７．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），７．８２（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：２１．８，２１．９，２４．４，２８．４，４６．６，５３．５，５５．９，６８．８，１１４．５，１１９．８，１２４．７，１２６．１，１２７．７，１３０．６，１３５．９，１３７．４，１５９．５，１６２．３，１６３．７；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ１９Ｈ２１Ｎ３Ｏ４Ｎａに対する計算値：３７８．１４３０；実測値：３７８．１４２４。
【０１０１】
実施例４：（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１−カルボン酸ｔ−ブチル（９）の合成：
【０１０２】
【化１２】
2015529254.tif 000014
【０１０３】
よく乾燥した反応フラスコを完全に脱気してアルゴンで充填し、乾燥したＴＨＦを加えた。顆粒状Ｌｉ（０．１００ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ溶液（６ｍＬ）に加えた。次いで、乾燥ｔＢｕＯＨ（１．４ｍＬ、１４．６ｍｍｏｌ）をフラスコに導入し、反応混合物を５０℃に加熱し、５０℃に３０分間保持した。（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１−カルボン酸エチル（６）（０．５ｇ、１．４６ｍｍｏｌ）を上記の濁った溶液に加え、反応液を５０℃で２０分間保持した。反応が完了した（ＴＬＣ、シリカゲル）後、フラスコを室温まで冷却し、ＴＨＦを減圧下で除去した。氷水（１０ｍＬ）を残留物に加え、それを次にＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を水（１０ｍＬ×２回）及び食塩水（１５ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー［シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（７：３）］によって精製し、３０％の収率で固体として（９）を得た。融点：１１５−１１７℃（１１９−１２１℃）１；［α］Ｄ２５＝＋３６．００（ｃ＝０．５％，ＣＨ２Ｃｌ２）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．６３（ｓ，９Ｈ），２．１４−２．３３（ｍ，３Ｈ），３．４７−３．５９（ｍ，２Ｈ），３．７４−３．８１（ｍ，１Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），４．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），７．１４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，３．０Ｈｚ），７．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），７．８３（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：２４．４，２８．２，２８．４，４６．７，５３．５，５５．９，８２．０，１１４．５，１１９．８，１２４．６，１２６．２，１２９．０，１３０．６，１３５．７，１３６．５，１５９．４，１６２．３，１６３．８；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ２０Ｈ２３Ｎ３Ｏ４Ｎａに対する計算値：３９２．１５８６；実測値：３９２．１５７４。
【０１０４】
実施例５：（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］−ベンゾジアゼピン−１−カルボン酸１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロプ−２−イル（１０）の合成：
【０１０５】
【化１３】
2015529254.tif 000015
【０１０６】
（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１−カルボン酸（７）（０．１５ｇ、０．４ｍｍｏｌ）、カルボニルジイミダゾール（０．０９３ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）及び乾燥トルエン（０．３ｍＬ）を加熱乾燥した封管に入れた。この懸濁液を６５℃で１時間撹拌し、次いで室温に冷却した。出発物質が存在しないことを、ＴＬＣ（シリカゲル）により確認した。この溶液を１０分間、０℃に冷却し、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン−２−オール（０．７５ｍＬ、６ｍｍｏｌ）を懸濁液に添加し、管をしっかり閉めた。懸濁液は透明な溶液になり、この混合物を２時間室温で撹拌した。反応を氷冷水（３ｍＬ）で停止し、ＥｔＯＡｃで抽出した（５ｍＬで２回）。合わせた有機層を食塩水（５ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をカラムクロマトグラフィー［シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）］で精製し、７２％の収率で固体として純粋な（１０）を得た。融点：２０４−２０５℃；［α］Ｄ２５＝＋１６．６７（ｃ＝０．３％，ＣＨ２Ｃｌ２）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：２．２０−２．２４（ｍ，３Ｈ），２．１５−２．３６（ｍ，３Ｈ），３．３０−３．４０（ｍ，１Ｈ），３．５１−３．６１（ｍ，１Ｈ），３．７８−３．８５（ｍ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），４．７７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），５．９４−６．０６（ｓｅｐ，１Ｈ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），７．１５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２．７Ｈｚ），７．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），７．８９（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：２４．３，２８．３，４６．６，５３．４，５５．９，６６．７，１１４．７，１１９．９，１２４．３，１２４．６，１２５．６，１３０．６，１３６．８，１４０．６，１５９．４，１５９．７，１６３．６；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ１９Ｈ１５Ｆ６Ｎ３Ｏ４Ｎａに対する計算値：４８６．０８６４；実測値：４８６．０８７５。
【０１０７】
実施例６：（Ｓ）−１１，１２，１３．１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］−ベンゾジアゼピン−１−カルボン酸メチル（１１）の合成：
【０１０８】
【化１４】
2015529254.tif 000016
【０１０９】
（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１−カルボン酸（７）（０．１ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）、塩化チオニル（０．３７ｍＬ、５．１２ｍｍｏｌ）及び乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）の混合物を、加熱乾燥した丸底フラスコに、アルゴン下で入れた。この懸濁液をアルゴン雰囲気下で、６０℃で１時間還流させた。溶液は透明な黄色に変化した。出発物質が存在しないことをＴＬＣ（シリカゲル）によって確認した。有機溶媒及び過剰の塩化チオニルを減圧下で蒸発させた。乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）を用い、この蒸発を数回繰り返した。その後、得られた黄色の残留物を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶解し、この溶液を０℃で１０分間、アルゴン下で冷却した。乾燥メタノール溶液（２ｍＬ）、続いてＥｔ３Ｎ（０．２ｍＬ、１．６ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、室温で７時間撹拌した。反応が完了した（ＴＬＣ、シリカゲル）後、溶媒を減圧下で除去した。残留物を氷冷水（５ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬで２回）で抽出した。合わせた有機層を食塩水（５ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をカラムクロマトグラフィー［シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（７：３）］によって精製し、７０％の収率で固体として純粋な（１１）を得た。融点：１８０−１８２℃；［α］Ｄ２５＝＋８．００（ｃ＝０．２５％，ＣＨ２Ｃｌ２）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：２．１６−２．３５（ｍ，３Ｈ），３．５２−３．６１（ｍ，２Ｈ），３．７５−３．８１（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．９４（ｓ，３Ｈ），４．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），７．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２．７Ｈｚ），７．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），７．８８（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：２４．４，２８．４，４６．６，５２．２，５３．４，５５．９，１１４．５，１１９．８，１２４．７，１２５．９，１２６．９，１３０．６，１３５．９，１３７．９，１５９．５，１６２．９，１６３．７．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ１７Ｈ１７Ｎ３Ｏ４Ｎａに対する計算値：３５０．１１１７；実測値：３５０．１１２５。
【０１１０】
実施例７：Ｎ−シクロプロピル（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１−カルボキサミド（１２）の合成：
【０１１１】
【化１５】
2015529254.tif 000017
【０１１２】
（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１−カルボン酸（７）（０．１ｇ、０．３ｍｍｏｌ）、カルボニルジイミダゾール（０．０５７ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）及び乾燥トルエン（０．２５ｍＬ）の混合物を加熱乾燥したマイクロ波沸騰管に入れた。この懸濁液に１００℃で２分間（１分間×２回）マイクロ波を照射した。出発物質が存在しないことは、ＴＬＣ（シリカゲル）により確認した。溶液を０℃で１０分間冷却した。シクロプロピルアミン（０．０２７ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）及びＤＢＵ（０．０６３ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を懸濁液に添加し、管をしっかり閉めた。懸濁液は透明な溶液になり、混合物を８０℃で１分間、マイクロ波を照射した。反応物を氷冷水（３ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した（５ｍＬで２回）。合わせた有機層を食塩水（５ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をカラムクロマトグラフィー［シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（７：３）］によって精製し、５５％の収率で固体として純粋な（１２）を得た。融点１８９−１９０℃；［α］Ｄ２５＝−６．６７（ｃ＝０．３％，ＣＨ２Ｃｌ２）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．６１−０．６６（ｍ，２Ｈ），０．８２−０．８８（ｍ，２Ｈ），２．１７−２．２４（ｍ，２Ｈ），２．３１−２．４３（ｍ，１Ｈ），２．８１−２．８９（ｍ，１Ｈ），３．４９−３．５９（ｍ，１Ｈ），３．７４−３．８８（ｍ，２Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），４．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．１５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２．８Ｈｚ），７．２６−７．３０（ｍ，１Ｈ），７．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），７．６５（ｂｓ，１Ｈ），７．７３（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：６．５，６．６，２２．３，２４．６，２８．８，４６．６，５３．６，５５．８，１１４．４，１１９．６，１２４．４，１２６．３，１３０．０，１３０．７，１３４．５，１３５．３，１５９．３，１６３．７，１６３．８；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ１９Ｈ２０Ｎ４Ｏ３Ｎａに対する計算値：３７５．１４３３；実測値：３７５．１４４０。
【０１１３】
実施例８：Ｎ−メチル（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１−カルボキサミド（１３）の合成：
【０１１４】
【化１６】
2015529254.tif 000018
【０１１５】
（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１−カルボン酸（７）（０．１７ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）、塩化チオニル（０．６ｍＬ、８．１４ｍｍｏｌ）及び乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）の混合物を、加熱乾燥した丸底フラスコにアルゴン中で入れた。この懸濁液をアルゴン雰囲気下で、６０℃で１時間還流させた。溶液は透明な黄色に変化した。出発物質が存在しないことをＴＬＣ（シリカゲル）によって確認した。有機溶媒及び過剰の塩化チオニルを減圧下で蒸発させた。乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）を用い、この蒸発を数回繰り返した。その後、得られた黄色の残留物を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２で（１０ｍＬ）に溶解し、この溶液をアルゴン下で、０℃で１０分間冷却した。メチルアミンの３３重量％無水エタノール溶液（３ｍＬ）に続いてＥｔ３Ｎ（０．３ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、室温で７時間撹拌した。反応が完了した（ＴＬＣ、シリカゲル）後、溶媒を減圧下で除去した。残留物を氷冷水（５ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（８ｍＬで３回）。合わせた有機層を食塩水（５ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、７５％の収率で固体として純粋な（１３）を得た。融点：１８０−１８２℃；［α］Ｄ２５＝＋３．７０（ｃ＝０．５％，ＣＨ２Ｃｌ２）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：２．１３−２．２４（ｍ，２Ｈ），２．３０−２．４１（ｍ，１Ｈ），２．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．４９−３．５９（ｍ，１Ｈ），３．７４−３．８８（ｍ，２Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），４．７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．１４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，３．０Ｈｚ），７．２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．４９（ｂｓ，１Ｈ），７．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），７．６９（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：２４．６，２５．９，２８．８，４６．７，５３．６，５５．９，１１４．４，１１９．７，１２４．５，１２６．４，１３０．５，１３０．７，１３４．６，１３５．１，１５９．３，１６２．９，１６３．８．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ１７Ｈ１８Ｎ４Ｏ３Ｎａに対する計算値：３４９．１２７７；実測値：３４９．１３００。
【０１１６】
実施例９：Ｎ，Ｎ−ジメチル（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１−カルボキサミド（１４）の合成：
【０１１７】
【化１７】
2015529254.tif 000019
【０１１８】
（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１−カルボン酸（７）（０．１５ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）、塩化チオニル（０．５５ｍＬ、７．５２ｍｍｏｌ）及び乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）の混合物をよく加熱乾燥した丸底フラスコに入れた。この懸濁液をアルゴン雰囲気下で、６０℃で１時間還流させた。溶液は透明な黄色に変化した。出発物質が存在しないことをＴＬＣ（シリカゲル）によって確認した。有機溶媒及び過剰の塩化チオニルを減圧下で蒸発させた。乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）を用い、この蒸発を数回繰り返した。得られた黄色の残留物を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶解し、この溶液をアルゴン下で、０℃で１０分間冷却した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンの１１％エタノール溶液（５ｍＬ）に続いてＥｔ３Ｎ（０．２８ｍＬ、２．３５ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、室温で７時間撹拌した。反応が完了した（ＴＬＣ、シリカゲル）後、溶媒を減圧下で除去した。残留物を氷冷水（５ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（８ｍＬで３回）。合わせた有機層を食塩水（５ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー［中性アルミナ、１００％ＥｔＯＡｃ］によって精製し、７０％の収率で固体として純粋な（１４）を得た。融点１８６−１８８℃；［α］Ｄ２５＝＋５２．００（ｃ＝０．２５％，ＣＨ２Ｃｌ２）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：２．０１−２．０８（ｍ，２Ｈ），２．２５−２．３８（ｍ，１Ｈ），２．８９−２．９４（ｍ，１Ｈ），３．０８（ｓ，３Ｈ），３．１４（ｓ，３Ｈ），３．６３−３．８２（ｍ，２Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），４．７３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４，３．０Ｈｚ），７．１５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２．９Ｈｚ），７．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．９Ｈｚ），７．９７（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：２３．９，２７．８，３５．３，３９．１，４７．２，５２．３，５５．８，１１４．９，１１９．７，１２４．２，１２６．１，１３０．１，１３１．０，１３２．０，１３４．８，１５９．１，１６４．２，１６５．７．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｍ＋Ｈ）＋，Ｃ１８Ｈ２１Ｎ４Ｏ３に対する計算値：３４１．１６１４；実測値：３４１．１６２９。
【０１１９】
実施例１０：（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１−カルボン酸Ｓ−エチル（１５）の合成：
【０１２０】
【化１８】
2015529254.tif 000020
【０１２１】
（Ｓ）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１−カルボン酸（７）（０．１５ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）、塩化チオニル（０．５５ｍＬ、７．５２ｍｍｏｌ）及び乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）の混合物をよく加熱乾燥した丸底フラスコに入れた。この懸濁液をアルゴン雰囲気下で、６０℃で１時間還流させた。溶液は透明な黄色に変化した。出発物質が存在しないことをＴＬＣ（シリカゲル）によって確認した。有機溶媒及び過剰の塩化チオニルを減圧下で蒸発させた。乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）を用い、この蒸発を数回繰り返した。次いで得られた黄色の残留物を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶解し、この溶液をアルゴン中、０℃で１０分間冷却した。エタンチオール（２ｍＬ）に続いてＥｔ３Ｎ（０．２８ｍＬ、２．３５ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、室温で７時間撹拌した。反応が完了した（ＴＬＣ、シリカゲル）後、溶媒を減圧下で除去した。残留物を氷冷水（５ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（８ｍＬで３回）。合わせた有機層を食塩水（５ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物をカラムクロマトグラフィー［シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（８：２）］で精製し、７０％の収率で固体として純粋な（１５）を得た。融点：２２８−２３０℃；［α］Ｄ２５＝−１４．２９（ｃ＝０．２８％，ＣＨ２Ｃｌ２）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．３４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．１７−２．２３（ｍ，３Ｈ），３．００（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），３．４２−３．５８（ｍ，２Ｈ），３．７４−３．８１（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），４．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２．９Ｈｚ），７．３１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．９Ｈｚ），７．８０（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１４．６，２３．０，２４．４，２８．６，４６．５，５３．３，５５．９，１１４．５，１１９．８，１２４．５，１２５．９，１３０．６，１３２．５，１３４．６，１３５．５，１５９．５，１６３．６，１８８．１．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｍ＋Ｈ）＋，Ｃ１８Ｈ１９Ｎ３Ｏ３ＳＮａに対する計算値：３８０．１０４５；実測値：３８０．１０４７。
【０１２２】
実施例１１．α４−ＧＡＢＡＡＲに対する選択性の決定
α４−ＧＡＢＡＡＲに対する選択活性の偏りを有する２つの化合物を同定した（図１２）。パッチクランプ試験は、単一αサブユニットを含むＧＡＢＡＡＲの活性化作用（agonism）に起因する塩素イオン流に誘発される内向き電流を定量化するために用いられた。これらの結果は、ＧＡＢＡＡＲの受容体−配位子相互作用の機能的活性をきめ細かく判別する能力を示す。これらの研究は、また、α４及びα６−ＧＡＢＡＡＲに対して優先的な選択活性の偏りを有する新規な８−メトキシイミダゾベンゾジアゼピンである我々の化合物ＣＭＤ−４５の効力を示す（図１２）。これらの結果は、α４含有ＧＡＢＡＡＲを標的とすることが、純粋な過分極剤（テトラエチルアンモニウム）或いはＧ結合した収縮アゴニスト（Ｐ物質）の収縮効果に打ち勝つことによって、自発的なＡＳＭ弛緩を誘起するという仮説を支持する。
【０１２３】
実施例１２：ＧＡＢＡＡアゴニストであるＣＭＤ−４５及びＸＨＥ（ＩＩ）−０７４のヒトジャーカットＥ６−１細胞に対する膜分極効果
両化合物のＧＡＢＡの増強について、自動パッチクランプ（IonFlux）により、ＣＤ４＋Ｔリンパ球細胞株（ジャーカットＥ６−１）を用いて調べた。手動パッチクランプ試験とは対照的に、この高処理量システムは、１日当たり２０試験条件を超える用量依存効力試験が可能である。予備の試験法開発研究では、過分極膜の用量−応答信号をＣＭＤ−４５又はＸＨｅ−ＩＩＩ−７４（α４−選択アゴニスト）への暴露で発生することができる（図１３）。
【０１２４】
参考例１：レーザー捕獲顕微切断法
気道平滑筋のＧＡＢＡＡサブユニットを薬理学的に標的とするためには正確なサブユニットの同定が必要であるので、我々の結果が他の細胞によって汚染されていないことを更に確実に保証するために、ＲＴ−ＰＣＲ分析の前のＲＮＡ単離のための周囲の上皮、神経、血管構造、及び線維芽細胞のない気道平滑筋細胞を選択するために、レーザー捕獲顕微切断法（laser capture microdissection：ＬＣＭＤ）が使用された。内在性のＧＡＢＡＡサブユニットの発現の種間保存をモルモット及びヒトの気道の両方からの気道組織を比較することにより確認した。気管輪をＯＣＴ（登録商標）化合物に包埋し、イソペンタン／ドライアイスを使用して凍結保存した。凍結切片（６μｍ）を、単一の１ｍｍのＰＥＮ膜が塗布されたスライド（PALM microlaser technologies社）表面に置き、ＬＣＭＤ染色キット（カタログ番号AM1935；Ambion社）を用いてＲＮＡのために処理した。染色された気道平滑筋の組織学的確認に基づいてレーザー解剖を行い、他の細胞種からの汚染を最小限にするように気道平滑筋層の中央部分のみを採取した。気道平滑筋ＲＮＡを、Micro scale RNA isolation kit（登録商標）（カタログ番号AM1931；Ambion社）よって単離し、ｍＲＮＡとゲノム由来のＰＣＲ産物とを区別するために大きなゲノムイントロンに隣接するプライマー設計を採用したＧＡＢＡＡサブユニット特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。モルモットと人間の脳からのＲＮＡを陽性対照として、投入ｃＤＮＡを欠いた試料（水ブランク）を陰性対照として用いた。
【０１２５】
レーザー捕獲顕微切断法により、天然組織から気道平滑筋細胞の形態を示す細胞のみの正確な試料採取ができた。遺伝子特異的プライマーの使用によって、α４及びα５サブユニットをコードするｍＲＮＡが、制限はあるが大量に発現すること（及び他のＧＡＢＡＡのαサブユニットをコードするｍＲＮＡが発現しないこと−結果は示さず）が分かる。更に、典型的なシナプス外表現型のＧＡＢＡＡ受容体を形成するのに必要な相補的サブユニット（β、γ、δ）の存在も確認した（図１）。気道平滑筋細胞内に存在するＧＡＢＡＡ受容体αサブユニットが、ヒトとモルモットの試料間で定性的な一致を示しているので、この知見は機能器官浴試験のためのモルモット気道の使用の妥当性を裏付けている。
【０１２６】
参考例２：培養ヒト気道平滑筋細胞
上記のように調製したヒト不死化気管支平滑筋細胞株を、１０％ウシ胎児血清、０．２５ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子、１ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子、ＩＴＳ添加物（１ｍｇ／ｍｌのインスリン、０．５５ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、０．６７μｇ／ｍｌのセレン酸ナトリウム）及び抗生物質（１００ユニット／ｍｌのペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ）を含有するＭ１９９培地（Gibco）で、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿雰囲気中、３７℃で集密状態まで増殖させた。試験の２４時間前に、細胞に血清及び増殖因子を含まない培地を与えた。
【０１２７】
参考例３：モルモット気管輪器官浴の調製
雄のハートレーモルモット（約４００ｇ）を腹腔内ペントバルビタール（１００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。気管を取り出し、解剖顕微鏡下で切断して２軟骨性部分で構成される閉鎖輪にした。気管内腔表面を綿でそっと擦って上皮を除去した。プロスタノイドの内因性放出による緊張作用を阻害するため、インドメタシンを１０μＭ含む冷たいクレブス−ヘンゼライト（ＫＨ）緩衝液（ＮａＣｌ：１１８ｍＭ、ＫＣｌ：５．６ｍＭ、ＣａＣｌ２：０．５ｍＭ、ＭｇＳＯ４：０．２４ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４：１．３ｍＭ、ＮａＨＣＯ３：２５ｍＭ、グルコース：５．６ｍＭ、ｐＨ７．４）（器官浴中の最終ＤＭＳＯ濃度：０．０１％）に組織を入れた。
【０１２８】
組織を、水ジャケット（３７℃）付き２ｍｌ器官浴（Radnoti Glass Technology社；カルフォニア州、モンロビア）の中に吊るし、ＢｉｏＰａｃハードウェア及びＡｃｑｋｎｏｗｌｅｄｇｅソフトウェア（Biopac Systems社；カルフォニア州、ゴレタ）を介してコンピュタに接続したＧｒａｓｓＦＴ０３張力変換器（Grass Telefactor社、ロードアイランド州、ウェストワーウィック）に取り付けた。ＫＨ緩衝液は９５％酸素／５％二酸化炭素を連続的に気泡供給し、１５分毎に新鮮なＫＨ緩衝液に変更することで、組織を１ｇ等頂力に１時間平衡化した。
【０１２９】
実施例１３：ネズミ気管輪のアセチルコリン（Ａｃｈ）誘発性収縮のＧＡＢＡＡα４−選択的配位子ＣＭＤ−４５緩和
成体雄のＣ５７／Ｂ１６野生型マウス、またはＧＡＢＡＡα４サブユニットが全体的に欠損している雄の成体マウス（ピッツバーグ大学のGregg Homanics博士から入手）をペントバルビタールナトリウムの過剰投与により安楽死させた。気管を迅速に除去し、改変クレブス−ヘンゼライト緩衝液（組成：ＮａＣｌ：１１５ｍＭ、ＫＣｌ：２．５ｍＭ、ＣａＣｌ２：１．９１ｍＭ、ＭｇＳＯ４：２．４６ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４：１．３８ｍＭ、ＮａＨＣＯ３：２５ｍＭ、Ｄ−グルコース：５．５６ｍＭ（ｐＨ７．４））に入れた。結合組織を解剖顕微鏡下で除去し、気管を軸方向に半分に切断した。半分にした気管をそれぞれ筋運動記録器浴（myograph bath）（DMT社；ミシガン州、アナーバー（Ann Arbor））の各室で、半分の一方は媒体処理に、他方は薬物（即ち、ＣＭＤ−４５）処理に使用した。３７℃で酸素（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）を気泡供給しながら、緩衝液を１５分毎に交換して、組織を５ｍＮの静止張力で１時間保持した。張力をＡｃｋｎｏｗｌｅｄｇｅソフトウェアに接続したＢｉｏｐａｃハードウェアを用いて連続して記録した。この平衡期間に続いて、３つのアセチルコリン用量応答曲線（アセチルコリン：１００ｎＭ〜１ｍＭ）を作成した。これらの用量応答曲線に基づいてアセチルコリンのＥＣ５０をそれぞれの気管輪について決定した。
【０１３０】
弛緩試験において、気管輪は決定されたＥＣ５０まで収縮し、筋力は一定になった。単一の濃度の媒体（０．１％ＤＭＳＯ）又はＣＭＤ−４５（１００μＭ）を加え、連続的な筋力を３０分間以上にわたって測定した。データは、アセチルコリンのＥＣ５０濃度で到達した初期の筋力に対する３０分時の残存緊張として表される。各「ｎ」は、単一マウスの気管部分を表す。図２を参照。
【０１３１】
実施例１４：膜電位蛍光試験
ＧＡＢＡＡ受容体の活性化が、培養ヒト気道平滑筋細胞における膜電位変化を誘発するか否かを決定するために、ＦＬＩＰＲ体外蛍光色素試験（Molecular Devices社）を使用した。ヒト気道平滑筋細胞（参考例１及び２に記載と同様に調製）を９６ウェルの黒壁プレートで１００％密集状態になるまで増殖させ、温めた（３７℃）低塩化物緩衝液（Ｄ−グルコン酸ナトリウム：１６０ｍＭ、Ｄ−グルコン酸カリウム：４．５ｍＭ、ＣａＣｌ２：２ｍＭ、ＭｇＣｌ２：１ｍＭ、Ｄ−グルコース：１０ｍＭ、及びＨＥＰＥＳ：１０ｍＭから成り、ｐＨ７．４）で４回洗浄した。ＦＬＩＰＲ青色色素の原液（１００％染料）を、１００ｍｌの低塩化物緩衝液（試験緩衝液）により１瓶（１２５ｍｇ）を再構成することにより調製した。更に再構成した着色色素５０％作業用原液を試験緩衝液で１：１に希釈して調製し、３７℃で２０分間かけて細胞に添加するのに用いた（９０μｌ／ウェル）。すべての試薬を試験緩衝液に溶解した。第１の対照（試験緩衝液）を添加する前に、基線蛍光を３分間測定した。３分後、用量応答を決定のために気道平滑筋細胞を種々の濃度のＴＨＩＰ（０〜１０ｍＭ）に暴露した。溶液の添加に続く膜電位変化によって生じた蛍光を、試験緩衝液のみで誘発される変化を差し引いた後に定量した。後続のアンタゴニスト試験に関しては、注入される第１の溶液は、試験緩衝液、媒体対照（最終０．０５％ＤＭＳＯ）、又はＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストのピクロトキシン（最終２００μＭ）であり、それに続いてＴＨＩＰ（０．５又は１ｍＭ）となる。
【０１３２】
ＴＨＩＰは、ＥＣ５０が２４５μＭである蛍光増強の用量依存性（図３Ａ）を示した（ｎ＝１２；３つの独立した細胞培養物にて、１つの濃度ついて４回繰り返した）。
これらの結果が、染料自体と直接作用するＧＡＢＡ模倣物によって生成されるいかなる非特異的蛍光変化に起因するものではないことを保証するために、我々の薬物が色素のみの存在下での蛍光に対しては効果を示さないことを示す無細胞試験を行った。ピクロトキシンは、非特異的蛍光変化を示さなかったので、ＴＨＩＰ媒介膜電位変化に拮抗するために使用した（図３Ｂ）。ＴＨＩＰ介在膜電位変化のピクロトキシン拮抗作用は、ＧＡＢＡＡ受容体にて非競合的アンタゴニストとして作用するその能力と合致して、高用量ＴＨＩＰ（１ｍＭ及び０．５ｍＭ）の条件下でさえも持続した（図３Ｃ）。
【０１３３】
実施例１５：ヒト気道平滑筋細胞の電気生理学
膜電位差の色素知見を確証するために、α４含有ＧＡＢＡＡ受容体の標的とする活性化が適切な電気生理学的変化を誘起するか否かを評価した。試験の当日に、ヒト気道平滑筋細胞（参考例１及び２に記載の方法と同様にして調製）を、コラゲナーゼＩＶ型（シグマＣ５１３８：５００単位／ｍｌ）を有するコラーゲン被覆プレートから放出した。細胞を外部緩衝液（ＮａＣｌ：１４７ｍＭ、ＭｇＣｌ２：２ｍＭ、ＣａＣｌ２：２ｍＭ、ＨＥＰＥＳ：１０ｍＭ、右旋性グルコース：１０ｍＭ；ｐＨ７．２；モル浸透圧濃度：３２０ｍＯｓｍ）に再懸濁し、球形状の細胞が得られるように室温で揺動した。約１００万個の細胞を、遠心分離（３００ｘｇ、３分間）して外部緩衝液中で２回洗浄し、２０個の細胞が並列の全細胞構成の規則正しい配列の各実験群を有する流動マイクロ流体プレートに充填（最終体積４００μＬ）した。適切な細胞膜シールの生成（４０〜１２０ＭΩ）に続いて、ＴＨＩＰ（０．３μＭ〜３００μＭ）に対する用量応答の電圧クランプ条件（−８０ｍＶ）での全細胞記録を得た。独立した試験において、細胞も２０μＭのガバジン（ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニスト）及び２５μＭのＴＨＩＰと同時に一緒に処理された。更に、ＴＨＩＰ誘発電流が塩素イオン流出に起因することを確認するために、独立した実験において、−８０ｍＶでの外向き電流の量を下げるために、細胞内緩衝液（ＭｇＣｌ２：４ｍＭ、ＥＧＴＡ：１０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ：１０ｍＭ、ＣｓＣｌ：１３０ｍＭ、Ｍｇ−ＡＴＰ：４ｍＭ、ＣｓＯＨ：１０ｍＭ、ｐＨ７．２、２９０ｍＯｓＭ）を、１４０ｍＭのＣｓＣｌを１４０ｍＭのグルコン酸セシウムに置き換えることで改変した。
【０１３４】
２０個のヒト気道平滑筋細胞が並行して全細胞構成を同時に達成できるマイクロ流体プラットフォームを使用して、１０μＭのＴＨＩＰに暴露された場合の強固な電流が示された（図４Ａ）。更に、ＴＨＩＰの段階的な添加（０〜３００μＭ）によって、ＴＨＩＰのＥＣ５０は約１５μＭである（図Ｂ）ことが実証された。これは、不均質なα４／α５ＧＡＢＡＡ受容体サブユニット発現を示す気道平滑筋細胞の混合集団と一致する結果であった。電流が、ＧＡＢＡＡ受容体のＴＨＩＰ媒介活性化に対して実際に２次的なものであったことを確認するために、２つの実験検証を行った。第１に、ＧＡＢＡＡ受容体拮抗作用（ガバジン：２５μＭ）の条件下では、ＴＨＩＰ誘起電流（２５μＭ）の減衰が実証された。第２に、緩衝液から塩化物を除去（但し、等浸透圧のグルコン酸塩に置き換え）した後、ＴＨＩＰが電流を誘起する能力が失われた（図４Ｃ）。
【０１３５】
実施例１６：予備収縮負荷
平衡に達した後、カプサイシン類似体Ｎ−バニリルノナンアミド（最終１０μＭ）を参考例３に従って準備した器官浴に添加し、非アドレナリン性、非コリン性（ＮＡＮＣ）神経を最初は活性化させ、次いで消耗させた。Ｎ−バニリルノナンアミドに誘起された力が基線に戻った後（約５０分）、気管輪を洗浄し、次いで、アセチルコリン濃度が累積増加する（０．１μＭ〜０．１ｍＭ）２つの循環に供し、個々の気管輪に必要なアセチルコリンのＥＣ５０濃度を測定した。処理群間の偏りを避けるために、組織をアセチルコリンのＥＣ５０の個々の計算値で収縮させ、類似したＥｍａｘ値を有する組織を無作為に個々の実験内での処理に割り当てた。広範囲にＫＨ緩衝液を変化（８〜９回）させ、組織を等張静止張力（約１．０ｇ）で安定化させた。他の収縮促進経路の交絡の影響を除去するために、各浴は、次の収縮負荷の２０分前に、アンタゴニストの補充を受けた。アンタゴニストには、ピリラミン（１０μＭ、Ｈ１ヒスタミン受容体アンタゴニスト）、及びテトロドトキシン（１μＭ；内因性神経媒介性のコリン作動効果又はＣ線維効果のアンタゴニスト）が含まれる。
【０１３６】
実施例１７：２つのα４サブユニット含有ＧＡＢＡＡ受容体選択的アゴニストの、アセチルコリンのＥＣ５０収縮刺激に続くβ２アドレナリン受容体を介した気道平滑筋弛緩についての生体内評価
モルモット（ＧＰ）気管輪は、アセチルコリンのＥＣ５０濃度で収縮し、力の増加が定常状態の平坦域に到達した（通常は１５分）。気管輪を無作為に３つのグループの内の１つ、即ち、イソプロテレノール処理した対照、α４ＧＡＢＡＡ選択的アゴニスト（タウリン又はＴＨＩＰ）の存在下でイソプロテレノールの用量応答、又はＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストで前処理した後、α４サブユニット選択的アゴニストの存在下でイソプロテレノールの用量応答のいずれかに割り当てた。すべてのグループで１／２ログの増分（０．１ｎＭ〜１０μＭ）でイソプロテレノールの濃度を累積的に増加した。イソプロテレノール媒介弛緩に対する選択的ＧＡＢＡＡ活性化の効果を測定するために、α４選択的アゴニスト（５００μＭのＴＨＩＰ又は２００μＭのタウリン）の単回投与を、この投与計画の下で控えめの有効濃度（１０−８．５Ｍ）のイソプロテレノールの直前に、研究群に投与した。ＴＨＩＰ又はタウリンの効果が、非ＧＡＢＡＡ受容体の活性化によって誘発される非特異的効果に起因するものではないことを確認するために、第三のグループは、外因性アセチルコリンによる収縮試験の１５分前に、選択的ＧＡＢＡＡアンタゴニストであるガバジンの単回投与で前処理された。
【０１３７】
ＴＨＩＰによる選択的α−サブユニットＧＡＢＡＡ受容体活性化は、アセチルコリン収縮の後のイソプロテレノールの弛緩効果を有意に増強した（図５Ａ）。モルモット気管輪において、ＴＨＩＰ及びイソプロテレノールによる同時処理の結果、イソプロテレノール弛緩の濃度−応答曲線が、イソプロテレノール単独での処理の場合と比較して有意に左方向にシフトした［ＥＣ５０＝７．６ｎＭ（ｎ＝８）対ＥＣ５０＝３２．８ｎＭ（ｎ＝８）、ｐ＜０．００１］。観察されたＥＣ５０のシフトがＧＡＢＡＡ受容体の選択的かつ特異的な活性化に起因することを証明するために、選択的なアンタゴニストであるガバジンによる前処理を行った。ガバジンによる前処理により、アセチルコリン収縮刺激後のイソプロテレノール媒介弛緩のＴＨＩＰ増強作用を有意に相殺し［ＥＣ５０＝１１．８±０．６ｎＭ（ｎ＝８）対ＥＣ５０＝７．６±０．５ｎＭ（ｎ＝８）、ｐ＜０．０１］、濃度−応答曲線を基線方向に有意に戻した［ＥＣ５０＝１１．８±０．６ｎＭ（ｎ＝８）対ＥＣ５０＝３２．８ｎＭ（ｎ＝８）、ｐ＞０．０５］。イソプロテレノールの濃度−応答曲線のＥＣ５０の有意なシフトに加え、ＴＨＩＰ処理により、低濃度のイソプロテレノール（１０ｎＭ）でさえも、有意な弛緩の増強がもたらされ［筋力：初期アセチルコリンに誘発された力の２２．９±１３．２％（ｎ＝８）（ＴＨＩＰ＋イソプロテレノール）対７６．５±８．５％（ｎ＝８）（イソプロテレノール単独）、ｐ＜０．０１］、一方、ガバジンによる前処理は、このＴＨＩＰ効果を相殺した［筋力：５３．１±１１．４％（ｎ＝８）、ｐ＞０．０５（イソプロテレノール単独に比較し）］（図５Ｂ）。それぞれの場合において、ｎは、処理群における個々の環の合計数を表す。
【０１３８】
上記ＴＨＩＰで概説したものと同じ枠組みを利用して、タウリン（２００μＭ）が、アセチルコリンにより予め収縮した気道平滑筋のイソプロテレノール媒介性弛緩を増強することを見出した（図６）。タウリン及びイソプロテレノールとの同時処理によって、イソプロテレノール単独での処理と比較してイソプロテレノール弛緩濃度−応答曲線は有意に左方向へシフトした［ＥＣ５０＝２．４ｎＭ（ｎ＝７）（同時処理）対１５．８ｎＭ（ｎ＝６）（単独処理）、ｐ＜０．０１］。α４含有ＧＡＢＡＡ受容体の活性化がタウリンの効果の重要な構成要素であることを実証するために、タウリンの効果を阻害するためにＧＡＢＡＡ選択的アンタゴニストであるガバジン（２００μＭ）を実験的交換に使用した。ＴＨＩＰ研究で見られるように、ガバジンによる前処理はタウリンが提供するイソプロテレノール媒介弛緩の増強を有意に相殺した［ＥＣ５０＝４．７ｎＭ（ｎ＝７）対ＥＣ５０＝２．４ｎＭ（ｎ＝７）；ｐ＜０．０５］。しかし、タウリン媒介弛緩におけるＧＡＢＡＡ受容体活性化の部分的な役割と一致して、ガバジンはタウリン処理によってもたらされる弛緩を完全には相殺しなかった。［ＥＣ５０＝４．７ｎＭ（ｎ＝７）対１５．８ｎＭ（ｎ＝６）；ｐ＜０．０５］。各ｎは、処理群の個々の環の合計数を表す。
【０１３９】
実施例１８：塩化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）又は物質Ｐの媒介収縮後に気道平滑筋を直接的に弛緩する新規８−メトキシイミダゾベンゾジアゼピン（１３）（ＣＭ−Ｄ−４５；第３α４サブユニット含有ＧＡＢＡＡ受容体選択的アゴニスト）の生体外評価
様々な収縮作用薬を用いて、α４サブユニット含有ＧＡＢＡＡ受容体活性化の直接弛緩効果を測定するために、参考例３に従って調製したモルモットの気管輪をＴＥＡ（１０ｍＭ）又は物質Ｐ（１μＭ）の単回用量で収縮させた。生成された筋力の平坦域に続いて、ＣＭ−Ｄ−４５（２００μＭ）又は媒体対照（０．１％ＤＭＳＯ）の単回用量を器官浴緩衝液に加え、達成した弛緩の割合を実験内対応対照と比較して１５分間かけて評価した。
【０１４０】
ＴＥＡ（１０ｍＭ）によって生成された力の平坦域に続いて、ＣＭ−Ｄ−４５（２００μＭ）を添加した結果、対応するＤＭＳＯ（媒体）処理対照に比較し、直接的な弛緩が起こった（図７Ａ）。ＴＥＡ−前収縮気道平滑筋をＣＭ−Ｄ−４５で処理することにより、１５分間にわたり、初期筋力が有意に減少した（未処理レベルからの残存グラム張力として報告され、０．１％ＤＭＳＯ処理組織：９９．９％＋９．５；ｎ＝１３；ｐ＜０．０００１に対し、５４．３％＋１４．３；ｎ＝１４であった）。物質Ｐを使用したニューロキニン受容体媒介性の気道平滑筋収縮負荷でも同様の結果が達成された。前と同じように、ＣＭＤ−４５処理は、対応媒体対照（８９．５２％＋１．９；ｎ＝８；ｐ＜０．００１）と比較して、前収縮気道平滑筋の有意な直接弛緩を誘発し（６１．３％＋５．３；ｎ＝１０）、この効果が特定の収縮剤に限定されるものではないことを示している。各ｎは、処理群の個々の気管輪の合計数を表す。
【０１４１】
実施例１９：マウスの生体外気管輪における気道平滑筋収縮
すべての動物管理実施要綱は、コロンビア大学施設内動物管理使用委員会（the Columbia University Institutional Animal Care and Use Committee：ＩＡＣＵＣ）によって承認された。遺伝的にＧＡＢＡＡα４サブユニットが欠損しているＣ５７野生型マウス又はＣ５７マウス（雄、約２０ｇ）を１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールで麻酔した。気管を除去し、半分に分割して閉鎖気管輪とし、４℃の生理的緩衝液中に吊るした。閉鎖気管輪を、３７℃で泡立て酸素供給（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）しながら０．５ｇの静止張力で筋運動記録器（ＤＭＴ（登録商標））中に吊し、緩衝液を１５分毎に交換しながら、１時間かけて静止張力で平衡状態した。気道平滑筋収縮力の連続的なデジタル記録は、ＡｃｋｎｏｗｌｅｄｇｅＶ７．３．３ソフトウェアに接続したＢｉｏｐａｃハードウェアで行った。予備収縮負荷は、緩衝液を交換し、各用量応答の間に静止張力をリセットして、アセチルコリン用量応答（０．１ｎＭ〜１００μＭ）を３回行った。マウスの気管輪はアセチルコリンにより収縮した（各気管輪に対してＥＣ５０濃度）。収縮力の安定化に続いて、ＧＡＢＡＡα４／α６選択サブユニットアゴニスト又はそれらの媒体を使用した。ＧＡＢＡＡα４配位子又は媒体対照（０．１％ＤＭＳＯ）を添加した後、種々の時点での残存収縮力の割合として弛緩を測定した。５０μＭのＸｈｅ−ＩＩＩ−７４による弛緩の結果は、１００μＭのＣＭ−Ｄ−４５によって与えられる弛緩と同程度であった（図８参照）。
【０１４２】
実施例２０：モルモットの生体外気管輪における気道平滑筋力
雄のダンキンハートレー種モルモット（４００ｇ）を１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールで麻酔した。気管を摘出し、それぞれが２軟骨性部分からなる８つの閉鎖円形輪に分割した。外膜及び上皮を、顕微鏡下で切除した。閉鎖気管輪を３７℃で酸素（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）を気泡供給しながら１ｇの静止張力で、ＧｒａｓｓＦＴ０３張力変換器に接続された２ｍｌのＲａｄｎｏｔｉ器官浴に吊るし、緩衝液を１５分毎に交換しながら、１時間かけて静止張力の平衡状態にした。気道平滑筋収縮力の連続的なデジタル記録は、ＡｃｋｎｏｗｌｅｄｇｅＶ７．３．３ソフトウェアに接続したＢｉｏｐａｃハードウェアで行った。予備収縮負荷は、緩衝液を交換し、各用量応答の間に静止張力をリセットして、アセチルコリン用量応答（０．１ｎＭ〜１００μＭ）を３回行った。モルモットの気管輪はアセチルコリンにより収縮した（各気管輪に対してＥＣ５０濃度）。収縮力が安定した後、ＧＡＢＡＡα５選択的負の調節因子又はＧＡＢＡＡ非選択アンタゴニストであるガバジンを緩衝液に添加した。ＰＷＺ−０２９によって示される力の増加は、気道の筋緊張の維持におけるα５含有ＧＡＢＡＡ受容体の役割を示している。
【０１４３】
実施例２１：ヒト気道平滑筋研究
コロンビア大学の施設内治験審査委員会（Institutional Review Board：ＩＲＢ）に従って、我々は健康なヒトのドナー肺の廃棄された領域を使用する（Ｃ．Ｆ．Ｒ（連邦規則集第４５巻）の４６の規定の下ではヒト対象研究とみなされない）。使用可能な際には、上皮層を下層にある筋層から切除し、すぐに器官浴研究のために処理する。機能的な器官浴の研究では、気管又は第一世代の気管支（軟骨輪の隣接する小さな部分を含む）からの無傷の気道平滑筋細片をむしろ無傷の気管輪よりもよく使用される。簡単に言えば、筋収縮が下方の固定留め具と上方の変換器との間の垂直面に一直線に並んで、筋力の時間に対して連続的なデジタル記録が得られるように、組織は、下方の固定留め金と上方のＧｒａｓｓＦＴ０３張力変換器（Grass Telefactor社；ロードアイランド州、ウェストワーウィック）に取り付けられる。組織はＴＥＡ又はアセチルコリンのいずれかで予備収縮負荷を受ける（ＥＣ５０において）。次いで、ヒト気道平滑筋細片は、古典的な収縮媒介物質（アセチルコリン、ヒスタミン、ロイコトリエンＤ４、物質Ｐ、塩化カリウム又はＴＥＡ）で収縮し、安定した収縮になった後、次いで、試験化合物（新規ＧＡＢＡＡＲアゴニスト及び対照（媒体、ガバジン、ムシモール））を使用して、収縮が保持されている間に弛緩促進効果を測定する。続いて起こるＡＳＭ力の変化を処理後１５分間測定し、誘発収縮によって得た平坦域から生じる筋力変化の百分率として表す。両側スチューデントのｔ−検定を用い、データは平均±ＳＥＭとして提示される。Ｐ≦０．０５は有意とみなされる。
【０１４４】
実施例２２．アレルゲン誘発喘息モデル
化合物の効力は、ウィスコンシン大学ミルウォーキー校の施設内動物管理使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee：ＩＡＣＵＣ）によって承認された実施要綱に準拠した急性ＯＶＡ負荷モデルで評価される。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、未処理（対照）のままか、又は０日目及び７日目にＯＶＡ（ミョウバン中の１０μｇを腹腔内投与）の負荷、引き続き１４日目及び１６日目にエアロゾルＯＶＡ（１％溶液）の負荷をかけられる。少なくとも２用量の試験化合物（又は媒体対照）を一群１０匹の各群の各々に、１３〜１７日目に腹腔内投与する。試験化合物の最大開始用量は、通常のマウスにおける段階的な「最大無毒性量（No Observed Adverse Events Level：ＮＯＡＥＬ）」研究から予め決定する（観察は体重変化、呼吸、無気力、ＣＮＳ徴候及び胃腸障害を含み、脳をＬＣ−ＭＳ（80）による化合物の定量のため、ＮＯＡＥＬにて回収する。長期にわたるＡＨＲの評価は、Ｂｕｘｃｏ２室気道力学（ＮＡＭ）システム（Buxco社；コネチカット州、シャロン）を用い、製造業者の指示に従い、噴霧された媒体（ＰＢＳ）又はメタコリンの倍加濃度（０．６２５〜１０ｍｇ／ｍｌ）に暴露後０、１３及び１７日目に行う。特定の気道抵抗（ｓＲＡＷ）は、FinePointe Softwareを用いて計算する。最終ＡＨＲの評価後、マウスを安楽死させ、採血し、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を（１ｍｌのＰＢＳで）採取する。次いで、肺を摘出し、肺葉を分離する。ホルマリン固定パラフィン切片を一方の肺葉（大・小気道を含む）から調製し、標準Ｈ＆Ｅ染色（一般的な組織病理学及び炎症用）及びＰＡＳ染色（基底膜の細胞／ｍｍとして、粘液細胞用）のための処理をする。他の切片は、α−平滑筋アクチンに対するモノクロール抗体（Abcam社）又はＭＵＣ５ＡＣ（Abcam社）及び蛍光標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（Life Technologies社）を用いた免疫組織化学染色のための処理をされる。ＡＳＭ肥大を試験するために、マウスに１００μｇの５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ；Invitrogen社）の腹腔内注射を安楽死の９６時間前に行う。ＥｄＵは、アルキンチミジンの類似体であり、活性合成中にＤＮＡの中に組み込まれる。ＥｄＵの取り込み（染色された核）は、パラフィン肺切片を、アジド−フルオロフォア（Alexa Fluor 594；Invitrogen社）で処理し、続いて蛍光顕微鏡で検出する。すべての組織学的製剤は顕微鏡検査及び評点のために盲検とする。肺ホモジネートは、サイトカイン分布について、他方の肺葉の血清は、ＯＶＡ特異的ＩｇＥについて試験する（82）。サイトカインは、多重免疫試験装置（Bio-PlexＴＭ；Bio-Rad社；当初は、広範囲のＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトキシンを代表する２３種のサイトキシンからなる一群が使用されるが、後で節約のために実験結果に基づいて数を減らしてもよい）。ＢＡＬＦ細胞も記載通りに計数される（83）。両側スチューデントのｔ−検定又はマン−ホイットニーノンパラメトリック検定をｐ≦０．０５での統計的有意性を決定するために使用する。
【０１４５】
実施例２３：ウイルス誘発性喘息モデル
慢性肺疾患におけるＧＡＢＡＡＲ化合物の効力は、ウイルス誘発性喘息モデルで研究される。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（生後６〜２０週齢；一群１０匹）に、０日目に２×１０５ｐｆｕのセンダイウイルス（SeV）（５２株；ATCC社）又はＵＶ−不活性化センダイウイルス（UV-SeV）（69）を接種する。マウスの体重と活動は毎日監視され、慢性疾患は、接種後（post-inoculation:Ｐ−Ｉ）４９日までに十分に発症している。４つの実験群は、接種後４９日〜５６日の間に、試験化合物（又は媒体）の腹腔内投与を受けて準備される。予防的研究のために、１３日〜２１日の間に処置ための投与を行い、４９日〜５６日に疾患の評価を行う。これは、ＲＳＶ暴露後の幼年期の治療に対応する投与計画をモデル化するためのものである（このようにして、ウイルス感染後の初期又は急性感染後段階の免疫調節がその後の炎症性肺炎疾患の発症に影響するかを調査する）。メタコリンに応答した連続した非侵襲的なＡＨＲの評価（sRAW）は、全ての群において接種後１３、４９及び５６日目に行う。５６日目のＡＨＲの評価後、動物を安楽死させ、ＢＡＬＦ、血液、及び組織試料を得る。ＢＡＬＦを１ｍｌのＰＢＳに回収して遠心分離し、その細胞上清を上記のようにサイトカイン分析ために回収する。細胞ペレットをＲＰＭＩに再分散し、示差細胞計測（Diff-Quik）及び流動血球計算ために試料を採取する。流動血球計算については、細胞調製物は、Ｍ２マクロファージのためのマウスＣＤ１ｄ（Invitrogen社）及びＭａｃ−３（BD社）、或いはＮＫＴ細胞のためのＣＤ３及びＮＫ１．１（共にInvitrogen社）に対するフルオロフォア標識モノクローナル抗体によって染色される。抗体標識した細胞をＦＡＣＳキャリバー機器（BD Biosciences社）によって調べ、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Tree Star社；オレゴン州、アッシュランド）で分析する（69、70、84）。全ての他の肺組織及び生化学試験が行われ、データの分析がＯＶＡモデルと同様にして行われる。
【０１４６】
実施例２４：ＣＯＰＤモデル
ＧＡＢＡＡＲ化合物の効力は、ヒトＣＯＰＤのモデルとしてマウスのＬＰＳ肺負荷によって検討される。ＬＰＳは、タバコの煙、大気汚染、及び有機粉塵中の汚染物質として存在する炎症誘発性刺激物質である。ヒトにおいては、ＬＰＳを含んだ粉塵に慢性的に暴露されると、肺機能が低下する。急性モデルでは、ＬＰＳは、好中球の増加、並びに気管支肺胞洗浄液中の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ−１、及び他の媒介物質の増加を伴う混合炎症反応を誘発する。投与の前に、各試験化合物は緩衝溶液媒体（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で希釈し、滅菌濾過される。試験化合物を、各々の指示日に総体積で１００μｌを腹腔内投与する（従って３回投与）。最後の化合物の腹腔内投与の約１時間後に、非外科的手段によりマウスにＬＰＳを気管内に与える。マウスを、最初にケタミン塩酸塩／キシラジン塩酸塩溶液（カタログ番号K113;Sigma社;50mg/kgのケタミン塩酸塩）の皮下注射によって麻酔する。ＬＰＳ（カタログ番号L2880;Sigma社；型055:B5）を５０μＬの滅菌０．９％食塩水に溶解し、套管及び注射器（２５μｌを２回）によって気管内に注入（２０μｇのＬＰＳ／マウス）後、１００μｌの空気を注入する。偽処置マウスに５０μｌの滅菌０．９％食塩水を注入する。気管注入処置後、マウスを直立位置に１０分間保持して流体が肺全体に広がるようにする。マウスを麻酔から回復させ、頸椎のＣＯ２窒息によって２４時間後に屠殺する。血液を、ＥＤＴＡ含有管に心臓穿刺を介して収集し、直ちに、遠心分離（２０００ｘｇ、１０分間、４℃）し、血漿を−８０℃で保存した。肺組織を摘出し、ＲＮＡ単離及びＭＰＯ分析のために凍結する。免疫組織化学的分析のために肺組織を１０％リン酸緩衝ホルマリン（ｐＨ７．４）中に入れられる。
【０１４７】
実施例２５：免疫関節炎モデル
一群８〜１０匹の８〜１０週齢雄性ＤＢＡ／１Ｊマウス（ジャクソン・ラボラトリーズ社；米国、メイン州、バーハーバー）を５０％完全フロイトアジュバンドの２００ｍｇのウシＩＩ型コラーゲン（ｂＣＩＩ）（コンドレックス社；米国、ワシントン州、レイモンド）の尾の基部への皮内投与をして免疫した。マウスを同様に２１日後に不完全フロイトアジュバンドの１００ｍｇのｂＣＩＩで追加免疫する。対照マウス群はｂＣＩＩを含まない偽免疫で処置する。食物及び水の消費量、体重、並びに臨床的に観察可能な関節の炎症を、処置過程全体を通して評価する。最初の免疫化後から始めて、８週間にわたり、週３回、本発明のＧＡＢＡＡ受容体剤をマウスに投与する。化合物の投与は、実施例２２に記載の方法で決定される。個々の対照及び実験マウスの血清コラーゲン特異的ＩｇＧ、ＩｇＧ１、及びＩｇＧ２ａ抗体は、最終免疫から８週間後にマイクロタイタープレートＥＬＩＳＡによって特徴づけられる。ＥＬＩＳＡでは、ｂＣＩＩをプレートウェルの被覆用抗原として使用し、アイソタイプ特異的フルオロフォア結合ウサギ抗マウス抗体を一次抗体の結合の定量のために使用する。ＥＬＩＳＡプレートのウェルは、標準的な蛍光プレートリーダーを使用して読み取られる。化合物の効力は、対照マウスと比較して、処置群での臨床関節の炎症の減少及び／又はｂＣＩＩに対するＩｇＧ抗体価の減少によって証明される。
【０１４８】
実施例２６．自己免疫性糖尿病モデル
非肥満糖尿病（NOD）は、糖尿病の研究に３０年間使用されてきた。ＮＯＤマウスは、膵島炎、膵島の白血球浸潤によって特徴付けられる。膵臓インスリン含量の減少は、１２週齢の雌で自発的に起こり、雄の場合には数週間遅れて起こる。糖尿病マウスは、低インスリン血症で、かつ高グルカゴン血症であり、膵島β細胞の選択的破壊を示す。本発明の化合物は投与経路（ＰＯ、ＩＰ、ＩＭ、ＳＣ））の１つを介して、２８日間、ＱＤ又はＢＩＤ投与され、一方、対照動物は同様に媒体を投与される。用量は実施例２２に記載したように決定される。一群に８〜１０匹のマウスが割り当てられる。動物の体重、摂餌量、飲水量、及び血液又は尿グルコースを１週間に２回、監視され、測定される。尿グルコースは一般に入手可能な試験片（Bayer Diastix）を用いて測定することができる。化合物の効力は、対照群に対する処置群におけるこれらの１つ以上の臨床的指標の減少によって証明される。
【０１４９】
本明細書に引用された全ての特許、刊行物及び参考文献は、参照により完全に組み込まれる。本開示および組み込まれた特許、刊行物及び参考文献の間に矛盾がある場合には、本開示が優先する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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