(57)【要約】これらに限定されないが、ステロイドまたはケトステロイドを含む分析物を含むケトン化合物またはアルデヒド化合物の、相対的定量、絶対的定量、または両方に対する方法、標識試薬、標識試薬のセット、および標識技法が提供される。分析物は、生物学的マトリクス内の医学的化合物または薬学的化合物であってよい。ケトン化合物またはアルデヒド化合物を標識、分析、および定量化するための方法もまた、質量分析も使用する方法のように開示されている。
2015503753.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的マトリクス由来の分析物の質量分析のための方法であって、
アルデヒド官能基またはケトン官能基を含む分析物を、式（Ｉ）の標識試薬：
Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２  （Ｉ）
（式中、ｎは２、３、４、５、または６であり、Ｙは、
【化１０１】
2015503753.tif 000021
であり、各Ｒ４は、独立して、Ｈであるか、または分枝もしくは直鎖であるＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
ｍは、１〜２０の整数であり、
Ｘはアニオンである）
またはその塩もしくは水和物で誘導体化することにより標識された分析物を形成するステップと、
該標識された分析物を低衝突エネルギーでイオン化することにより１つの優勢なシグネチャーイオンフラグメントを生成するステップと、
該シグネチャーイオンフラグメントを質量分析によって検出するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記シグネチャーイオンフラグメントが、前記分析物および前記標識試薬またはその一部の構造フラグメントを含む中性損失フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記誘導体化ステップの前に、液液抽出、固液抽出またはタンパク質沈殿を使用して、前記分析物を抽出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記誘導体化ステップの前に、前記分析物をクロマトグラフィー分離に供するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記分析物が、ステロイド中のアルデヒド官能基またはケトン官能基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標準化合物を式（Ｉ）の標識試薬で誘導体化することにより標識された標準物質を形成するステップであって、該標識された標準物質が同位体濃縮されるステップと、
前記標識された分析物および該標識された標準物質の両方をイオン化するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記同位体濃縮された標識された標準物質が少なくとも２個の重原子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標識された分析物の相対濃度を、前記標識された標準化合物の相対濃度に対して測定するステップをさらに含む請求項６に記載の方法。
【請求項９】
濃度曲線に基づき前記分析物濃度を求めるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記衝突エネルギーが、約３０〜約１３０ｅｖの範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標識試薬が、構造：
【化１０２】
2015503753.tif 000022
またはその塩もしくは水和物を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記シグネチャーイオンフラグメントが、
【化１０３】
2015503753.tif 000023
（式中、各
【化１０４】
2015503753.tif 000024
は、一重結合または二重結合であり、各
【化１０５】
2015503753.tif 000025
は、不存在または１つもしくはそれよりも多くの結合を示す）を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記分析物が、テストステロンもしくはテストステロン誘導体であり、シグネチャーイオンフラグメントが、１５２．１１の質量を有し、第２のシグネチャーイオンフラグメントが、１６４．１１の質量を有するか、または該分析物が、プロゲステロンもしくはプロゲステロン誘導体であり、該シグネチャーイオンフラグメントが、３１２．２３の質量を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも２つの異なる分析物が、誘導体化され、イオン化され、検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
２つまたはそれよりも多くの式（Ｉ）の化合物：
Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２  （Ｉ）
（式中、ｎは２、３、４、５、または６であり、Ｙは、
【化１０６】
2015503753.tif 000026
であり、ここで、各Ｒ４は、独立して、Ｈであるか、または分枝もしくは直鎖であるＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
ｍは１〜２０の整数であり、
Ｘはアニオンである）
またはその塩もしくは水和物を含む質量標識のセットと、
緩衝剤、試薬、分離カラム、およびアッセイを実行するための指示書のうちの１つまたはそれよりも多くと
を含む、ケトステロイドの分析のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年１月５日に出願された米国仮出願第６１／５８３，４４１号の利益と、それからの優先権とを主張し、それの全内容は、参照によって本明細書で本明細書によって援用されている。
【０００２】
分野
本教示は、液体クロマトグラフィー−質量分析−質量分析ワークフローを使用した部位特異的誘導体化およびシグネチャーイオン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｉｏｎ）の標的化された選択によるケトステロイドを含むケト官能基またはアルデヒド官能基を含む分析物の敏感度および特異度の増強に関する。
【背景技術】
【０００３】
ケトンおよびアルデヒドは、１または２個の他の炭素原子に連結しているカルボニル基を有する極性の化学官能基である。ケトン化合物およびアルデヒド化合物は、工業、農業、および医薬において重要な役割を果たす。ケトンおよびアルデヒドはまたヒトの代謝および生化学においても重要な作用物質である。特に、ケトステロイドは、ケトン含有ステロイド化合物の一分類であり、研究および臨床的診断において際立って価値がある。その理由は、これらの化合物が、ホルモン調節された生物過程において重要な作用物質であり、極めて低濃度で強い生物活性を有するからである。多くのケトステロイドはまた、潜在的に価値のある医薬品であり、体内でのこれらの機能および代謝の分析は、医学的処置および疾患の検出のための診断用技法の両方において有用である。
【０００４】
ケトン化合物およびアルデヒド化合物の分析および測定は困難である。その理由は、これらの化合物が、臨床試料および生体試料、例えば血漿などの中に低レベルで存在可能であるからである。例えばＧＣ−ＭＳ法のような化学的誘導体化後の分析のための標準的クロマトグラフィー技法が、利用可能である。例えば、Ｓｏｎｇ、Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．、７９１巻、１〜２号、（１２７〜１３５頁）２００３年（非特許文献１）を参照されたい。蛍光検出を使用する方法が利用可能であり、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を含む一部の特異的なイムノアッセイが利用可能であるが、これらは普通、多成分分析を提供しない。ＲＩＡに伴う主要な問題は、特異度の欠如と、各ステロイドに対して異なるアッセイを実施する必要とである。
【０００５】
ＬＣ／ＭＳストラテジーの文献中の例では、分析物の誘導体化を利用しているが、イオン化効率が比較的低いので、これらのストラテジーでは、質量分析を使用して臨床現場でアッセイが実行可能となるために必要とされる検出限界を達成することができず、また多重化能力も欠如している。生体試料におけるステロイド分析はまた、様々な内分泌物および代謝障害の評価および臨床検出に対しても重大である。臨床実験は、ステロイドの高生産性スクリーニングのためにラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を現在実施されている。
【０００６】
試料中のケトン化合物およびアルデヒド化合物を測定する試みにより提示された上記難題はまた、対象となる特異的化合物またはケトン分析物もしくはアルデヒド分析物の一団（ａ  ｐａｎｅｌ）について、多数の生体試料を迅速にスクリーニングおよび／または分析したいという望みにより拡大される。質量分析は、迅速なスループットを提供可能であるが、ケトンステロイドおよびアルデヒドステロイドを同定および定量化するための質量分析の使用は、イオン化効率が悪く、イオン化パターンが複雑であり、試料媒体中の同重体化合物および試料の低濃度が質量測定を妨害するので、特に困難である。加えて、高度に疎水性のケトステロイドは、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにおいて逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーを使用する場合、クロマトグラフィーについての難題を提示する。
【０００７】
それゆえ、これらの化合物の生物学的な重要性のため、ケトン化合物およびアルデヒド化合物の迅速かつ効率的な分析および定量のための技法が大いに望まれているが、現在ある技法は、敏感度の欠如、交差反応物質、および化合物の化学的性質に特有の他の難題があるため理想的ではない。
【０００８】
ケトステロイドの敏感、選択的、かつ正確な分析を異常な副腎機能のモニタリングに対して使用可能である。正（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）のＭＳ／ＭＳにおける天然ケトステロイドのイオン化効率は悪い可能性があり、特に幼児および小児のヒト試料を分析する場合、検出限界（ＬＯＤ）が不十分という結果となることが多い。例えば、参照によってその全体が本明細書中に援用されているＫｕｓｈｎｉｒら、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｓｅｒｕｍ  Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５２巻：１号、１２０〜１２８頁、２００６年（非特許文献２）に記載されているように、ケトステロイドのケト官能基を介したケトステロイドの誘導体化によるオキシムの形成を使用することによって、イオン化を改善し、敏感度を増強している。
【０００９】
ＭＲＭ分析およびＭＳ／ＭＳ条件は、クリーンな溶媒中ではうまく働くが、複雑な生体試料を使用する場合、高いバックグラウンド（ＢＫＧ）ノイズ（多くの場合、同じ質量のＱ１／Ｑ３インターフェース由来である）が生成される可能性があり、クロマトグラフィーを複雑にし、検出限界を低減させる。ケトステロイドおよびケト官能基またはアルデヒド官能基を含む他の分析物の敏感かつ特異的な定量のための方法に対する必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｏｎｇ、Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．、７９１巻、１〜２号、（１２７〜１３５頁）２００３年
【非特許文献２】Ｋｕｓｈｎｉｒら、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｓｅｒｕｍ  Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５２巻：１号、１２０〜１２８頁、２００６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
この教示の１つの広範な態様によると、特定の実施形態は、質量分析器システムの作動方法に関する。本方法は、ＭＳ／ＭＳにおけるバックグラウンドノイズが極めて低いケトンおよびアルデヒドの極めて敏感かつ特異的な分析（より高いシグナル／ノイズ比）を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一部の実施形態では、生物学的マトリクス由来の分析物の質量分析のための方法であって、アルデヒド官能基またはケトン官能基を含む分析物を、式（Ｉ）の標識試薬：
Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２  （Ｉ）
（式中、ｎは２、３、４、５、または６であり、Ｙは、
【化１】
2015503753.tif 000003
であり、ここで、各Ｒ４は、独立して、Ｈであるか、または分枝もしくは直鎖であるＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
ｍは、１〜２０の整数であり、
Ｘはアニオンである）
またはその塩もしくは水和物で誘導体化することによって、標識された分析物を形成するステップと、標識された分析物を低から高の衝突エネルギーでイオン化することによって、優勢（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ）なシグネチャーイオンフラグメントを生成するステップと、このシグネチャーイオンフラグメントを質量分析で検出するステップと
を含む方法がここに提供される。一部の実施形態では、衝突エネルギーは、例えば、約６５ｅｖ未満、例えば３０〜１３０ｅｖの範囲などとすることができる。
【００１３】
一部の実施形態では、標識試薬は、
【化２】
2015503753.tif 000004
である。
【００１４】
優勢なシグネチャーイオンフラグメントは、例えば、分析物および標識試薬の構造フラグメント、またはその一部を含む中性損失フラグメントまたは中性損失であってよい。一部の実施形態では、１つより多くの優勢なシグネチャーイオンフラグメントが存在する。一部の実施形態では、２、３、４、または５つの優勢なシグネチャーイオンフラグメントが存在する。
【００１５】
本方法はまた、誘導体化ステップの前に、液液抽出、固液抽出のいずれか、または疎水性溶媒を使用するタンパク質沈殿を使用して、分析物を抽出するステップを含むことができる。代わりに、誘導体化ステップの前に、分析物をクロマトグラフィー分離に供するステップを含むことができる。
【００１６】
一部の実施形態では、分析物はケトステロイドである。生物学的マトリクス、例えば血液、血清、血漿、尿、または唾液などに由来するこのような化合物の分析は、本教示の範囲内である。
【００１７】
一部の実施形態では、シグネチャーイオンフラグメントは、
【化３】
2015503753.tif 000005
（式中、各
【化４】
2015503753.tif 000006
は、一重結合または二重結合であり、各
【化５】
2015503753.tif 000007
は、不存在または１つもしくはそれよりも多くの結合を示す）を含む。分析物がテストステロンまたはテストステロン誘導体である場合、シグネチャーイオンフラグメントは、一部の実施形態では、１６４．２の質量を有するフラグメントイオンと、１５２．２の質量を有する第２のフラグメントイオンとを含むことができる。同様に、分析物がプロゲステロンまたはプロゲステロン誘導体である場合、シグネチャーフラグメントイオンは３１２．２の質量を有することができる。
【００１８】
それゆえ、いくつかの態様は、ケトステロイドと永久に荷電したアミノオキシ試薬（第四級アミノオキシ）との誘導体化化学反応ならびに試薬および誘導体化された化合物の骨格の両方を含むことができる標的化されたフラグメント化を使用することによって、バックグラウンドノイズを減少させるか、または排除することを提供する。容易にイオン化した／イオン化できる分子を用いた誘導体化は、例えば、ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳにおいてより良好なイオン化効率を結果として生じることができ、これによって、対象となる分析物の敏感度および検出を増加させることができる。誘導体化試薬（または試薬の一部）が付加した構造フラグメントが含まれるように、フラグメントイオン（Ｑ３シグネチャーイオン）を慎重に選択した場合、敏感度および選択性の両方を増強可能である。同じＱ１／Ｑ３遷移を有する化合物が検出され、ＢＫＧノイズ妨害を作り出す確率は極めて低い。
【００１９】
一部の実施形態では、複雑な生物学的マトリクス由来のケトステロイドの極めて高敏感度の（低いｐｇ／ｍＬ濃度）定量を可能にするためにケトステロイド分析キットを提供可能である。
【００２０】
本教示は、容易に分離および分析できない化合物、例えば生体試料中の同重体のケトステロイド、例えばテストステロン（Ｔｅ）およびエピテストステロン（ｅｐｉ−Ｔｅ）などの分離および特徴付けを提供する。これらの化合物はＭＳ／ＭＳでは同じフラグメント化パターンとなる可能性があり、したがってクロマトグラフィー分離が必要となり得る。
【００２１】
一部の実施形態では、本明細書中に記載されている方法は、相対濃度、絶対濃度、または両方を測定することができ、１つまたはそれよりも多くのケトンまたはアルデヒド、例えば１種またはそれよりも多くの試料中にケトン基またはアルデヒド基を含むステロイドなどに適用可能である。本発明の方法は、同位体濃縮された内標準（ＩＳ）または同重体の標識試薬、ならびにケトステロイド検出のための化合物に対する同位体置換の選択および標識ストラテジーに応じて、質量差標識試薬を使用可能である。
【００２２】
一部の実施形態では、本発明の方法は、内因性遊離マトリクス中に含まれる公知の量のスパイク添加された分析物を使用して、標準曲線から未知の分析物の濃度を定量化可能である。スパイク添加される分析物は、同位体濃縮されていない極めて純粋な標準物質、または内標準とはＭＲＭ遷移が異なる高純度の同位体濃縮された標準物質であってよい。
【００２３】
一部の実施形態では、本教示は、ケトステロイドおよびケト官能基またはアルデヒド官能基を含む分析物を定量化するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、誘導体化化学反応および液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳＭＳ）ワークフローを含むことができる。本方法は、ケトステロイドの検出限界を有意に増加させることができる永久に荷電したアミノオキシ試薬を使用することを含むことができる。
【００２４】
これらの特徴およびこれから明らかとなる実施形態の他の特徴は、本明細書中に記述および記載されている。
【００２５】
様々な実施形態の詳細な記載が、下記の図を例証として参照して、本明細書において下記で提供されている。当業者であれば下に記載されている図は例示のみを目的とすることを理解する。図は、出願人の教示の範囲を限定することを意図するものでは決してない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、試料の調製、誘導体化、および誘導体化した分析物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を示す方法のフロー図である。
【００２７】
【図２Ａ】図２Ａおよび図２Ｂは、試料の調製、誘導体化、および誘導体化した分析物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を示す２つの方法のフロー図である。テストステロンが、図２Ａおよび図２Ｂの両方に対して例として使用されている。
【図２Ｂ】図２Ａおよび図２Ｂは、試料の調製、誘導体化、および誘導体化した分析物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を示す２つの方法のフロー図である。テストステロンが、図２Ａおよび図２Ｂの両方に対して例として使用されている。
【００２８】
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、０〜５０００ｐｇ／ｍＬのテストステロンの濃度曲線を示している。図３Ａは、誘導体化後に形成される２つの位置異性体を共溶出する高速クロマトグラフィー勾配法を使用して、二重活性炭処理した（Ｄｏｕｂｌｅ  Ｃｈａｒｃｏａｌ  Ｓｔｒｉｐｐｅｄ（ＤＣＳ））ヒト血清中でスパイク添加した濃度曲線を提供している。図３Ｂは、誘導体化後に形成されるＥ／Ｚ異性体を分離するより浅いクロマトグラフィー勾配を使用して、ＤＣＳヒト血清中でスパイク添加した濃度曲線を提供している。統合は、両方の異性体ピーク面積の合計である。
【００２９】
【図４】図４は、本教示の様々な実施形態に従い、ＣＥ＝６２ｅＶを使用したＭＳ／ＭＳフラグメントおよびＱＡＯテストステロンのスペクトルを示し、ここで、シグネチャーイオンは、テストステロン構造および誘導体化した試薬構造の両方からのフラグメントを含む。
【００３０】
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、本教示の様々な実施形態に従い、ＡＰＩ４０００ＴＭＬＣ／ＭＳＭＳを使用して、標的化したＱ３フラグメントのＭＲＭ遷移を使用するＱＡＯ誘導体化したテストステロンのクロマトグラム（図５Ａ）を、中性損失Ｑ３フラグメント（図５Ｂ）と比較して示している。
【００３１】
【図６】図６は、標的化したＭＳ／ＭＳフラグメント化ならびにＱＡＯプロゲステロンのスペクトルおよびＣＥ＝４５ｅＶ  ＡＰＩ４０００ＴＭＬＣ／ＭＳＭＳでのＱＡＯプロゲステロンのＭＳ／ＭＳスペクトルを示している。
【００３２】
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、ＣＥ＝４５ｅＶでのプロゲステロンのＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを示し、ＡＰＩ４０００ＴＭＬＣ／ＭＳＭＳを使用したＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析におけるバックグラウンドノイズの減少を例示している。
【００３３】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、ヒト血清、ＡＰＩ３２００ＴＭＬＣ／ＭＳＭＳにおけるテストステロン分析の代表的なクロマトグラムを示している。図８Ａは、ＳＬＥで抽出し、ＱＡＯ試薬で誘導体化し、処理血清中でスパイク添加したテストステロン（Ｔｅ）の１０ｐｇ／ｍＬ標準である。図８Ｂは、女児の患者、年齢１１才からの試料（ＳＬＥで抽出し、誘導体化したおよそ１０ｐｇ／ｍＬ）である。
【００３４】
【図９】図９は、テストステロン濃度曲線１０〜１００００ｐｇ／ｍＬ（２００μＬ血清、ｄ３Ｔｅおよび５００ｐｇ／ｍＬ１３Ｃ  Ｔｅ内標準（ＩＳ）の増加するスパイク添加した濃度）を提供している。ダイナミックレンジは、ＡＰＩ３２００ＴＭＬＣ／ＭＳＭＳシステムを使用した全ヒト試料の基準値をカバーする。
【００３５】
【図１０】図１０は、ｄ３Ｔｅを検量体として、１３Ｃ  ＴｅをＩＳとして使用した直径１／４’’の濾紙ディスク上のスパイク添加した１０μＬの女性の全血のＤＢＳ濃度曲線５０〜１０００ｐｇ／ｍＬを示している。
【００３６】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＱＡＯ誘導体化した女性の乾燥血斑、１０μＬの全血のクロマトグラムを示している（ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００システム）。その内因性Ｔｅの濃度の測定値はおよそ４３ｐｇ／ｍＬである。図１１Ａは、内標準５００ｐｇ／ｍＬとしての１３Ｃ  Ｔｅのクロマトグラムである。図１１Ｂは、５０ｐｇ／ｍＬのスパイク添加したｄ３Ｔｅのクロマトグラムである。図１１Ｃは、試料中の内因性ｄ０Ｔｅのクロマトグラムである。濃度はおよそ４３ｐｇ／ｍＬと測定された。
【００３７】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、ＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００システムを使用した１０μＬの女性の全血（図１１Ａ〜１１Ｃに提示されたものと同じドナー）由来の誘導体化していないＤＢＳのクロマトグラムを示している。図１２Ａは、ｄ３  Ｔｅ内標準のクロマトグラムである。図１２Ｂは、１０μＬの女性の全血のクロマトグラムである。誘導体化していないＴｅのシグナルは検出できなかった。
【００３８】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｄは、ＱＡＯ誘導体化およびＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００装置を使用した女性の血清（プール）中の遊離テストステロンを分析しているクロマトグラムである。図１３Ａは、内標準として使用した１３Ｃ  Ｔｅを示し、図１３Ｂは、２００μＬの血清を有する全Ｔｅを示している。ｄ３Ｔｅは、濃度曲線において検量体としてスパイク添加されている。図１３Ｃおよび１３Ｄは、３０ＫＤ分子量のカットオフ膜の限外濾過後のＩＳおよび遊離Ｔｅを示している。遊離Ｔｅ濃度は、全テストステロン濃度の１．１３％である０．９４ｐｇ／ｍＬと推定されている。図１３Ｅは、２００μＬの限外濾液（ＵＦ）に対する遊離テストステロンの定量の下限がおよそ１ｐｇ／ｍＬであることを示す濃度曲線である。
【００３９】
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、ＱＡＯ誘導体化およびＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００装置を使用した女性の唾液（１ｍＬ）中の遊離テストステロン濃度の推定を示すクロマトグラムである。２０ｐｇ／ｍＬのｄ３ＴｅをＩＳとして使用。図１４Ａは、２．１ｐｇ／ｍＬであると推定される内因性遊離テストステロンを示し、図１４Ｂは、２０ｐｇ／ｍＬのｄ３テストステロン内標準を示している。
【００４０】
【図１５】図１５は、同重体のケトステロイドの代表的なＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
図は例示のみであり、図についてのすべての言及は、例示目的のみのためになされ、本明細書において下記で記載されている実施形態の範囲を限定することを意図するものでは決してないことを理解されたい。便宜のため、参照番号は、図全体にわたり、類似の成分または特徴を示すために繰り返すことができる（枝番号有りまたはなしで）。
【００４２】
明確にするために、下記の論述はこの教示の実施形態の様々な態様を詳細に説明しているが、特定の具体的な詳細は、省くことが便利または適当である場合にはいつでも省かれると理解されたい。例えば、代替の実施形態における同様のまたは類似の特徴の論述はいくらか省略されることがある。周知の考えまたは概念もまた、略して、非常に詳細まで論述されないこともある。当業者であれば、一部の実施形態は、すべての実施において具体的に記載されている特定の詳細を必要とせず、実施形態の十分な理解を得るためだけに本明細書中に記述されていることもあることを認識されたい。同様に、記載されている実施形態は、本開示の範囲から逸脱することなく、共通の一般的知識に従いわずかな変更または変形を起こしやすいこともあることは明らかである。実施形態の下記の詳細な記載は、本教示の範囲を限定するものと決してみなしてはならない。
【００４３】
本明細書中に記載されている質量分析の技法において分析物として使用されているケトン化合物およびアルデヒド化合物は、様々な生物学的マトリクス、例えば、生理学的流体試料、細胞または組織溶解試料、タンパク質試料、細胞培養試料、発酵培養液培地試料、農業用製品試料、畜産物試料、動物飼料の試料、ヒト消費用食物または飲み物の試料、これらの組合せなど、ならびに分析物中にケトン官能基およびアルデヒド官能基が存在する基本的にいかなる試料の中にも見出される。生物学的マトリクスの例は、生理学的流体、例えば血液、血清、血漿、汗、涙、尿、腹膜流体、リンパ液、経膣分泌物、精液、脊髄液、腹水（ａｓｃｅｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ）、唾液、痰、乳房浸出液、およびこれらの組合せなどを含む。一部の実施形態では、試料は乾燥血斑（ＤＢＳ）から得る。
【００４４】
本発明の技法のケトン化合物およびアルデヒド化合物への適用性を実証するため、ケトステロイドを分析し、下記の実施例において測定する。ケトステロイドの定量は、一般的な臨床試料の生物学的マトリクス中でこれらが低濃度であることから、特に難題を提示している。
【００４５】
本教示は、天然ケトンおよび合成ケトンの両方ならびにアルデヒド分析物に適用可能である。ケトステロイドは、ＤＨＴ、テストステロン、エピテストステロン、デソクシメチルテストステロン（ＤＭＴ）、テトラヒドロゲストリノン（ＴＨＧ）、アルドステロン、エストロン、４−ヒドロキシエストロン、２−メトキシエストロン、２−ヒドロキシエストロン、１６−ケトエストラジオール、１６アルファ−ヒドロキシエストロン、２−ヒドロキシエストロン−３−メチルエーテル、プレドニゾン、プレドニゾロン、プレグネノロン、プロゲステロン、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）、１７  ＯＨプレグネノロン、１７  ＯＨプロゲステロン、１７  ＯＨプロゲステロン、アンドロステロン、エピアンドロステロン、およびＤ４Ａ（デルタ４アンドロステンジオン）を含むがこれらに限定されず、本教示の様々な実施形態において分析可能である。
【００４６】
試料は様々な方法により濃縮可能である。濃縮方法は、血液（新鮮なものまたは乾燥したもの）、血漿、血清、尿、または唾液などの試料のタイプに依存する。例示的濃縮方法として、タンパク質沈殿、液液抽出、固液抽出、および限外濾過法が挙げられる。他の濃縮方法、または２種またはそれよりも多くの濃縮方法の組合せを使用可能である。
標識試薬
【００４７】
それゆえ、分析に対して特異的標識試薬およびシグネチャーイオンフラグメントの選択を使用するケトンまたはアルデヒドの質量分析のための方法がここに提供される。
【００４８】
一部の実施形態では、相対的定量、絶対的定量、または両方のための、生体試料中のケトン化合物および／またはアルデヒド化合物の標識試薬および標識試薬のセットが提供され、これには、一般式（Ｉ）：
【００４９】
Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２  （Ｉ）
（ｎは２、３、４、５、または６であり、Ｙは構造：
【化６】
2015503753.tif 000008
を有し、ここで、各Ｒ４は、独立して、Ｈであるか、または分枝もしくは直鎖であるＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
ｍは１〜２０の整数であり、
Ｘはアニオンである）
を有する標識試薬またはその塩もしくは水和物が含まれる。
【００５０】
一部の実施形態では、ｎは２〜４であり、他の実施形態では、ｎは３であり。一部の実施形態では、Ｙは−Ｎ（ＣＨ３）（＋）である。一部の実施形態では、ｍは１〜１２の整数または１〜５の整数である。一部の実施形態では、各Ｒ４は、独立して、Ｈであるか、または分枝もしくは直鎖であるＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、あるいは各Ｒ４は、独立して、Ｈであるか、または分枝もしくは直鎖であるＣ１〜Ｃ６アルキルである。一部の実施形態では、各Ｒ４は同じである。
【００５１】
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は塩である。一部の実施形態では、塩はＣＦ３ＣＯＯ−；ＣＦ３ＣＦ２ＣＯＯ−；ＣＦ３ＣＦ２ＣＦ２ＣＯＯ−；またはＣＦ３ＳＯ３ＣＯＯ−である。一部の実施形態では、塩は、ペルフルオロカルボン酸塩である。
【００５２】
一部の実施形態では、式Ｉの標識試薬は、
【化７】
2015503753.tif 000009
またはその塩もしくは水和物である。一部の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は塩である。一部の実施形態では、塩はＣＦ３ＣＯＯ−；ＣＦ３ＣＦ２ＣＯＯ−；ＣＦ３ＣＦ２ＣＦ２ＣＯＯ−；またはＣＦ３Ｓ０３ＣＯＯ−である。一部の実施形態では、塩はペルフルオロカルボン酸塩である。
【００５３】
様々な態様では、本教示は、標識された分析物を提供し、この分析物は、少なくとも１つのケトン基と、式（Ｉ）および／または（ＩＩ）の標識試薬とを含むことができる。様々な態様では、本教示は、標識された分析物を提供し、この分析物は、少なくとも１つのアルデヒド基と、本明細書中に記載されている標識とを含むことができる。
【００５４】
様々な実施形態では、式（Ｉ）および／または（ＩＩ）の標識試薬は、内標準（ＩＳ）を標識するために使用される。多くのケトステロイドおよび他のアルデヒド化合物の同位体標識された内標準は市販されていない。加えて、入手可能な標準は、多くの場合高価であり、形態が限定されている。例えばｄ３テストステロンＩＳは、溶液の形でしか購入することができず、報告された濃度からの有意な偏差が見出されることもある。入手可能な場合、１３ＣテストステロンＩＳはさらに安定しているが、Ｑ１およびＱ３の質量が両方とも分析物と異なる。
【００５５】
それゆえ、一部の実施形態では、「重い」（同位体濃縮された）ＱＡＯ試薬は、すべてのケト−ステロイドに対して内標準を提供可能である。一部の実施形態では、ステロイドの一団を分析すべき場合、これらの内標準は特に有利である。それゆえ、標識試薬の同位体濃縮された類似体を使用することができ、定量のために内標準を作ることができる。例えば、炭素の重原子同位体（１２Ｃ、１３Ｃ、および１４Ｃ）、窒素の重原子同位体（１４Ｎおよび１５Ｎ）、酸素の重原子同位体（１６Ｏおよび１８Ｏ）、硫黄の重原子同位体（３２Ｓ、３３Ｓ、および３４Ｓ）、および／または水素の重原子同位体（水素、重水素およびトリチウム）を内標準の調製に使用可能である。米国特許出願公開第２００５／０６８４４６号Ａ１は、同位体濃縮された化合物の合成を開示しており、米国特許第出願公開第２００８／００１４６４２号Ａ１では、質量分析のワークフローおよびストラテジーが開示され、両方ともその全体が参照により本明細書中に援用されている。
【００５６】
同位体濃縮された化合物は、例えば：
【化８】
2015503753.tif 000010
を含み得る。
本方法は、ケトステロイドの定量分析に対するＭＲＭワークフローを使用することを含むことができる。試薬は、個々のケト化合物またはケト化合物の一団の定量分析に対して同位体コード化（ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅ）可能である。ケトステロイドプロファイリングを含む実験において、ＭＳ／ＭＳフラグメント化は、低い衝突エネルギーで標的化することによって、アミノオキシ誘導体化された生成物由来の中性損失シグネチャーイオンを主に生成可能である。ＭＲＭ遷移は、Ｑ１では誘導体化されたステロイドの質量であり、Ｑ３では中性損失フラグメントの質量であってよい。本教示は、一部の実施形態では、誘導体化を介してバックグラウンドノイズを有意に減少させるためのプロセスを提供し、これにより敏感度が結果として改善し、Ｑ３フラグメントの標的化された選択が結果として特異度を改善する。
【００５７】
それゆえ、一部の実施形態では、テストステロンなどのステロイドの同位体標識された内標準のセットがここに提供される。このセットは、本明細書中に記載されているＱＡＯ試薬で標識された公知の濃度のケトステロイドを含む２種またはそれよりも多くの付加物を含み、この２種またはそれよりも多くの付加物の各々が異なる同位体濃縮された類似体を有する。
【００５８】
本教示は、質量差標識セットを含む質量差タグを使用する試薬および方法を含み、このセットのうちの１種またはそれよりも多くの標識は、１種またはそれよりも多くの重原子同位体を含む。質量差標識のセットはまた、異なる全体の質量および異なる主要なレポーター基または質量バランス基を有する標識を調製することによって提供することもできるが、ただしこの場合、質量差タグのセットのすべてのメンバーが同位体濃縮されている必要はない。本発明の試薬および方法は、質量差標識および親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を使用して、１種またはそれよりも多くの試料中のケトン分析物およびアルデヒド分析物の分析を可能にする。本教示は、質量差タグ試薬および質量分析を使用して、このような分析物の定性分析および定量分析のために使用可能である。質量差タグは、非同重体の同位体コード化された試薬を含むがこれらに限定されず、本教示は、同位体濃縮された標準化合物を使用して、または使用せずに、ケトン化合物およびアルデヒド化合物の絶対的定量のための試薬および方法を含む。
【００５９】
それゆえ、一般式（Ｉ）および／または（ＩＩ）の質量差標識のセットがここに提供される。様々な実施形態では、一般式（Ｉ）の同重体の標識のセットが、これらの塩ではない形態および／または水和化されていない形態で提供される。様々な実施形態では、標識の質量は、塩ではない形態および／または水和化されていない形態では、約０．０５ＡＭＵ未満だけ異なる。提供される標識のセットは、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）の２つまたはそれよりも多くの化合物を含み、標識のセット中の化合物のうちの１種またはそれよりも多くは、１種またはそれよりも多くの重原子同位体を含む。様々な実施形態では、重原子同位体は、それぞれ独立して、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３３Ｓ、または３４Ｓである。
【００６０】
式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、これらに限定されないが、モノＴＦＡ塩、モノＨＣｌ塩、ビスＨＣｌ塩、またはビスＴＦＡ塩、またはこれらの水和物を含む、多種多様な塩および水和物の形態で提供可能である。式（Ｉ）の変形が米国特許公開第２０１１／０００３３９５号およびＷＯ２００５／０６８４４６において開示されており、両方とも参照により具体的に援用され、一般的にｉＴＲＡＱ試薬と呼ばれている。
【００６１】
様々な実施形態に従い、同位体、例えば、水素、炭素、窒素、酸素、硫黄、塩素、臭素の同位体などは、バランス基（ｂｌａｎａｃｅ  ｇｒｏｕｐ）またはバランス部分（ｂｌａｎａｃｅ  ｍｏｉｅｔｙ）として使用可能である。例示的なバランス基またはバランス部分はまた、例えば、２００４年１１月４日に公開された米国特許出願公開第２００４／０２１９６８５号Ａ１、２００４年１１月４日に公開された米国特許出願公開第２００４／０２１９６８６号Ａ１、２００４年１１月４日に公開された米国特許出願公開第２００４／０２２０４１２号Ａ１、および２０１０年５月６日に公開された米国特許出願公開第２０１０／０１１２７０８号Ａ１に記載されているものを含むことができ、これらすべては、参照によりその全体が本明細書中に援用されている。
【００６２】
様々な実施形態では、標識のセットの化合物のうちの１種またはそれよりも多くは、２個またはそれよりも多くの重原子；３個またはそれよりも多くの重原子；および／または４個またはそれよりも多くの重原子で同位体濃縮されている。様々な実施形態では、重原子同位体が、少なくとも８０パーセントの同位体の純度、少なくとも９３パーセントの同位体の純度、および／または少なくとも９６パーセントの同位体の純度で存在するよう、式の標識のセットにこの同位体を組み込んだ。
【００６３】
質量差タグの代わりにまたはこれに加えて、同重体タグを使用可能である。同位体濃縮された同重体タグが使用された場合、同重体標識のセットは、１個またはそれよりも多くの重原子同位体を含み得る。同重体標識のセットは、等しいか、または具体的に定義された範囲の合計質量を有することができるが、異なる測定可能な質量の主要なリポーターイオンまたは荷電した分析物を有する。同重体試薬のセットは、質量分析を使用してケトン分析化合物およびアルデヒド分析化合物の定性分析および定量分析の両方を可能にする。例えば、同位体濃縮された同重体タグおよび親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）は、試料中の１種またはそれよりも多くのケトン化合物またはアルデヒド化合物、例えば、特異的なケトステロイドまたはケトステロイドの群などを測定または検出可能である。
【００６４】
同重体標識のセットを含む実施形態では、リンカー基部分は、バランス基と呼ぶことができる。例えば、４つの同重体標識のセットを１種またはそれよりも多くの分析物のセットに加え、組み合わせることによって、組み合わせた試料を形成し、これをＭＳ／ＭＳ分析に供することによって、標識されたケトン化合物またはアルデヒド化合物をフラグメント化し、異なる質量または荷電の分析物の４つのリポーターイオンを生成する。標識は、レポーター基もしくは質量バランス基またはこれらの一部、あるいは質量バランス基単独またはその一部の重原子置換の適当な組合せにより、同重体にすることができる。
分析
【００６５】
本教示は、質量差標識、同重体標識、または両方、および親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を使用する１種またはそれよりも多くの試料中の１種またはそれよりも多くのケトン化合物またはアルデヒド化合物の分析のための試薬および方法を提供可能である。本教示は、１種またはそれよりも多くの試料中の１種またはそれよりも多くの分析物の相対濃度、絶対濃度、または両方を求めるための方法を提供することができ、試料中の複数の分析物、複数の試料中の１種またはそれよりも多くの分析物、またはこれらの組合せの相対濃度、絶対濃度、または両方を、質量差タグ試薬、同重体タグ試薬、または両方、および質量分析を使用して、多重方式で求めることができる方法を提供可能である。
【００６６】
それゆえ、本明細書中に記載されている様々な方法の一部は、図１のフロー図で説明可能である。特に、生物学的マトリクス、例えば血液、血清、血漿、尿、または唾液などの一部であり得る試料は、標識試薬、例えばＱＡＯなどを用いて、アミノオキシ化学反応、これに続く標識された分析物およびＱＡＯ標識された標準物質の混合により、選択および誘導体化可能である。混合物は、例えばＬＣ、例えばＨＰＬＣなどによるクロマトグラフィー分離、続いてＭＲＭによる質量分析に供することができる。同位体濃縮された試薬が内標準として使用される場合、これは誘導体化ステップの後に加えるのが好ましい。
【００６７】
ＭＲＭで測定されたシグネチャーフラグメントイオンは、標識試薬またはその一部が付加している構造フラグメントを含むように慎重に選択可能である。例えば、標識試薬がトリメチルアミンを含む場合、シグネチャーフラグメントイオンは、Ｎ（ＣＨ３）の部分ならびに分析物の骨格の少なくとも一部分を失ったイオンを含み得る。一部の実施形態では、シグネチャーフラグメントイオンを形成するように選択された衝突エネルギーは、低い衝突エネルギーであることで、単一の優勢なシグネチャーフラグメントイオンを生成するようになっている。一部の実施形態では、衝突フラグメントエネルギーには６５が選択される（例えば、３０〜１３０ｅｖの範囲）。
【００６８】
容易にイオン化できる標識試薬の少なくとも一部を含むシグネチャーイオンフラグメントの好適な選択により、質量分析は、標識試薬を添加せずに分析したケトン種またはアルデヒド種のＭＲＭ分析と比較して、有意により低いバックグラウンドノイズで行うことができる。例えば、一部の実施形態では、バックグラウンドノイズを減少させて１００ｐｇ／ｍＬまたはそれよりも低い、または５０ｐｇ／ｍＬまたはそれよりも低い、または１０ｐｇ／ｍＬまたはそれよりも低い定量の下限を得て、ここで生物学的マトリクスから試料を得た。
【００６９】
一部の実施形態では、シグネチャーイオンフラグメントは、分析物骨格の一部分を含み、標識試薬の一部分も含む中性損失フラグメントである。一部の実施形態では、分析されているケトンがテストステロンまたはテストステロン誘導体である場合、シグネチャーイオンフラグメントは、１６４．２および１５２．３のｍ／ｚを有する１種またはそれよりも多くのフラグメントである。これらの実施形態および他の実施形態では、シグネチャーイオンフラグメントは、同位体濃縮されていてもよく、例えば、１６７．２および／または１５５．２のｍ／ｚを有する１３Ｃ濃縮されたフラグメントであってよい。
【００７０】
定量は、１種またはそれよりも多くの分析物および標準物質から誘導されたシグナルの相対的または絶対的測定により可能にすることができる。正電荷は、質量分析で検出されることになるフラグメントイオンとして機能する分析物に移送可能である。
【００７１】
本明細書中に記載されている他の様々な方法は、図２Ａおよび図２Ｂのフロー図により説明可能である。特に、例えば血液、血清、血漿、尿、または唾液などの生物学的マトリクスの一部であるテストステロンまたはその誘導体を含む試料が選択されている。内部テストステロン標準物質、例えば、ｄ３テストステロンなどを場合によって加える。次いで、テストステロン分析物は、例えば、液体／液体抽出または固体／液体抽出により場合によって抽出可能である。試料および場合によって内標準は、アミノオキシ化学反応によりＱＡＯ標識試薬で誘導体化される。図２Ａに記載されている方法では、標識された付加物を、ＱＡＯ標識試薬で同様に標識されたテストステロン標準と組み合わせる。図２Ａおよび図２Ｂに記載されている方法に対して、混合物は、例えばＬＣ、例えばＨＰＬＣなどによるクロマトグラフィー分離、続いてＭＲＭによる質量分析に供され、この場合、ＭＲＭ遷移は１６４．２および／または１５２．３であり、分析される。定量は、１種またはそれよりも多くの分析物および標準物質から誘導されるシグナルの相対的または絶対的測定により可能となる。図２Ｂでは、濃度曲線に基づきＴｅ濃度が求められている。正電荷は、質量分析で検出すべきフラグメントイオンとして機能する分析物に移送される。
【００７２】
定量は、より多くの量の公知の分析物の濃度を内因性遊離マトリクスにスパイク添加して標準曲線を作り出すことによって可能にすることができる。試料の未知の濃度は、濃度曲線の直線回帰から計算する。濃度曲線の直線的プロットは、検量体および内標準の濃度比率と、検量体およびＩＳの面積比との比を含む。代わりに、相対的定量は、公知の量のスパイク添加された内標準を使用した１点キャリブレーション（ｏｎｅ  ｐｏｉｎｔ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）により可能にすることができる。同重体の異性体である試料に対しては、これらの化合物は同じ質量パターンを有し得るので、クロマトグラフィー分離を使用することによって、これらの質量分析の前に試料を分離可能である。生体試料中の同重体のケトステロイドは同様のＱ１／Ｑ３ＭＲＭ遷移を有し得るので、同重体のケトステロイドは、分析物と同じフラグメント化パターンを共有することにより妨害として現れる可能性がある。このようなシナリオでは、同重体のケトステロイドは、好ましくはクロマトグラフィーで分析物から分離する。
【００７３】
標識試薬の追加の利点は、一部の実施形態では、ＭＳＭＳフラグメント化の際に、誘導体化された分析物は、誘導体化された分析物上の電荷でフラグメントイオン（Ｑ３シグネチャーイオン）を生成し、これによって、ＭＳ３分析の実施が可能となることである。
【００７４】
誘導体化された分析物は、質量分析器において敏感度および選択性の両方を増強可能である。例えば、本発明で特許請求された方法を使用して、誘導体化されていない試料の４０〜５０倍の敏感度で、生物学的なマトリクスからテストステロンを検出可能である。一部の実施形態では、ＭＳ／ＭＳ敏感度は化合物に応じて２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、またはさらに１０００倍に増強する。一部の実施形態では、誘導体化後の検出限界は、＜１ｐｇ／ｍＬまで低くすることができる。
【００７５】
様々な実施形態では、試料中の標準化合物のうちの１種またはそれよりも多くを標識するために標準試料に標識を加えるステップは、アミノオキシ基が分析物標準物質のケトン基またはアルデヒド基と共にオキシムを形成する一段階反応を含む。
【００７６】
様々な態様では、本教示は、標識された分析化合物を形成するためにケト分析物を標識するための方法を提供する。様々な実施形態では、本方法は、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）の標識化合物を、ケトン含有化合物と反応させることを含む。具体的には、例示的なケトステロイドを、式Ｉの標識試薬で誘導体化し、ＭｅＯＨ中１０％酢酸中、室温で３０分間特異的に標識し、またはビスケトステロイドに対しては、６０Ｃで６０分間特異的に標識した。
【００７７】
本教示は、自然に産生したケトステロイドならびに合成ケトステロイドの両方に適用可能である。ケトステロイドの例として、ケトン部分を含む任意のステロイド、その代謝物または誘導体、例えば、ケト形態のコルチゾール、１１−デオキシコルチゾール（ｄｅｓｏｘｙｃｏｒｔｉｓｏｌ）（化合物Ｓ）、コルチコステロン、ＤＨＴ、テストステロン、エピテストステロン、デソクシメチルテストステロン（ＤＭＴ）、テトラヒドロゲストリノン（ＴＨＧ）、エストロン、４−ヒドロキシエストロン、２−メトキシエストロン、２−ヒドロキシエストロン、１６−ケトエストラジオール、１６アルファ−ヒドロキシエストロン、２−ヒドロキシエストロン−３−メチルエーテル、プレドニゾン、プレドニゾロン、プレグネノロン、プロゲステロン、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）、１７  ＯＨプレグネノロン、１７  ＯＨプロゲステロン、１７  ＯＨプロゲステロン、アンドロステロン、エピアンドロステロン、Ｄ４Ａ（デルタ４アンドロステンジオン）、２１デオキシコルチゾール、１１デオキシコルチコステロン、アロプレグナノロン、およびアルドステロンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
下記の実施例、図、および表を参照すると、標識ケトステロイド分析物の例、例えば、テストステロン、アルドステレン、プレグネノロン、およびプロゲステロンなどが標識試薬と共に示されている。これらの反応において、アミノオキシ部分は、ステロイド上のケトンまたはアルデヒドと反応して標識化合物上にオキシム基を形成することによって、標識された分析物を生成する。
【００７９】
本明細書中に記載されているように、２種またはそれよりも多くの試料中の１種またはそれよりも多くのケトン化合物またはアルデヒド化合物の濃度を求めるための方法は、異なる標識を各試料に加え、区別をつけて標識された試料を組み合わせ、ＰＤＩＴＭを使用して試料中の分析化合物のうちの１種またはそれよりも多くの濃度を求めることによって提供される。試料のうちの１つは、標準試料、例えば対照試料、基準試料、公知の濃度を有する化合物を有する試料などを含み得る。それゆえ、本方法は、複数の試料から複数の化合物の分析を提供可能である。
【００８０】
様々な実施形態では、１種またはそれよりも多くの標識されたケトン分析化合物またはアルデヒド分析化合物の濃度を求めるステップは、標識されたケトン分析化合物またはアルデヒド分析化合物のうちの１種またはそれよりも多くの絶対濃度を求め、標識されたケトン分析化合物もしくは分析化合物のうちの１種もしくは複数、または両方の組合せの相対濃度を求めることを含む。
【００８１】
特定の方法は、対象となる各試料に、タグのセットから異なるタグを加えることで標識されたケトン分析化合物またはアルデヒド分析化合物の一団を形成することによって、対象となる２種またはそれよりも多くの試料中の１種またはそれよりも多くのケトン化合物またはアルデヒド化合物を標識するステップを含む。タグのセット由来の各タグは、本明細書中に記載されている標識試薬またはその部分を含んでもよい。標識されたケトン分析化合物またはアルデヒド分析化合物のうちの１種またはそれよりも多くは、各分析物の取得元となる試料、または各分析物が含まれている試料に関して区別をつけて標識されていてもよい。標識をケトン化合物またはアルデヒド化合物に加えるステップは、標識の最初の部分が式（Ｉ）または（ＩＩ）で構成される一段階反応を含み得る。
【００８２】
試料のそれぞれの一部分を組み合わせて、親娘イオン遷移モニタリングにより、および伝達されたイオンのうちの１種またはそれよりも多くのイオンシグナルを測定することにより分析される組み合わせた試料およびその一部分を生成可能である。伝達された親イオンのｍ／ｚ範囲は、標識された分析化合物のｍ／ｚ値を含むことができ、伝達された娘イオンのｍ／ｚ範囲は、標識された分析化合物のタグに由来するか、またはイオン化した分析物それ自体であるリポーターイオンのｍ／ｚ値を含む。次いで、対応する伝達リポーターイオンまたは分析物イオンの測定されたイオンシグナルと、標準化合物のうちの１種またはそれよりも多くの測定されたイオンシグナルとの比較に少なくとも基づいて、標識された分析化合物のうちの１種またはそれよりも多くの濃度を求めることができる。イオンシグナル（単数または複数）は、例えば、イオンピークの強度（平均、平均値、最大値など）、イオンピークの面積、またはこれらの組合せに基づくことができる。対象となる２種またはそれよりも多く試料のうちの１種またはそれよりも多くは、１種またはそれよりも多くの標準化合物を含む標準試料となることができる。
【００８３】
一部の実施形態では、ケトン化合物またはアルデヒド化合物の濃度は、対応する標識されたアルデヒドケトン分析化合物−リポーターイオン遷移シグナルの測定されたイオンシグナルを、
（ｉ）標準化合物−リポーターイオンまたは分析物イオン遷移に対する濃度曲線；または
（ｉｉ）標識されたケトン分析化合物またはアルデヒド分析化合物を有する組み合わせた試料中の標準化合物に対する標準化合物−リポーターイオン遷移シグナル
のうちの１種またはそれよりも多くと比較することによって求める。
【００８４】
一部の実施形態では、「親娘イオン遷移モニタリング」または「ＰＤＩＴＭ」は、分析およびワークフロー状態の方法として使用される。ＰＤＩＴＭとは、第１の質量分離器（多くの場合「ＭＳ」または質量分析の第一次元（ｆｉｒｓｔ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）と呼ばれる）の伝達された質量対電荷（ｍ／ｚ）範囲が、分子イオン（多くの場合「親イオン」または「前駆イオン」と呼ばれる）を、イオンフラグメント形成器（例えば、衝突セル、光解離領域など）へ伝達して、フラグメントイオン（多くの場合「娘イオン」と呼ばれる）を生成するように特異的に選択され、第２の質量分離器（多くの場合、「ＭＳ／ＭＳ」または質量分析の第二次元（ｓｅｃｏｎｄ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）と呼ばれる）の伝達されたｍ／ｚ範囲が、１種またはそれよりも多くの娘イオンを検出器（娘イオンシグナルを測定する）に伝達するように選択される技法を指す。この技法は、スペクトルにおける娘イオンの検出が、予想される娘イオン質量に対して検出器を「一時的に待機させる（ｐａｒｋｉｎｇ）」ことによって集中する場合、独自の利点を提供する。モニターされる親イオン質量および娘イオン質量の組合せは、モニターされる「親娘イオン遷移」と呼ぶことができる。モニターされる所与の親イオン−娘イオンの組合せのための検出器での娘イオンシグナルは、「親娘イオン遷移シグナル」と呼ぶことができる。
【００８５】
例えば、親娘イオン遷移モニタリングの一実施形態は、マルチ反応モニタリング（ＭＲＭ）（また選択的反応モニタリングとも呼ばれる）である。ＭＲＭの様々な実施形態では、所与の親娘イオン遷移のモニタリングは、対象となる親イオンを伝達するために、第１の質量分離器（例えば、対象となる親イオンｍ／ｚに対して一時的に待機させた第１の四重極）として使用すること、および対象となる１種またはそれよりも多くの娘イオンを伝達するために、第２の質量分離器（例えば、対象となる娘イオンｍ／ｚに対して一時的に待機させた第２の四重極）を使用することを含む。様々な実施形態では、ＰＤＩＴＭは、親イオンを伝達するために、第１の質量分離器（例えば、対象となる親イオンｍ／ｚに対して一時的に待機させた四重極）を使用すること、および対象となる１種またはそれよりも多くの娘イオンのｍ／ｚ値を含むｍ／ｚ範囲にわたり、第２の質量分離器をスキャニングすることにより実施可能である。
【００８６】
例えば、タンデム質量分析器（ＭＳ／ＭＳ）装置または、さらに一般的には、多次元質量分析器装置は、ＰＤＩＴＭ、例えばＭＲＭを実施するために使用可能である。適切な質量分析器システムの例は、これらに限定されないが、トリプル四重極、四重極−線形イオントラップ、四重極ＴＯＦ、およびＴＯＦ−ＴＯＦのうちの１種またはそれよりも多くを含むものを含む。
【００８７】
それゆえ、ＰＤＩＴＭは、第１の質量分離器およびイオンフラグメント形成器と、第２の質量分離器とを含む質量分析器システムで実施可能である。ＰＤＩＴＭスキャンの伝達された親イオンのｍ／ｚ範囲（第１の質量分離器により選択される）は、標識された分析化合物のうちの１種またはそれよりも多くのｍ／ｚ値を含むように選択され、ＰＤＩＴＭスキャンの伝達された娘イオンのｍ／ｚ範囲（第２の質量分離器により選択される）は、伝達された標識された分析化合物のタグに対応するリポーターイオンのうちの１種またはそれよりも多くのｍ／ｚ値を含むように選択される。
【００８８】
一部の実施形態では、標識された分析物の親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）は、トリプル四重極ＭＳプラットフォームを使用して実施される。ＰＤＩＴＭおよびその使用についてのさらなる詳細は、参照によりその全体が本明細書中に援用されている米国特許出願公開第２００６／０１８３２３８号Ａ１に記載されている。一部の実施形態では、アミノオキシＭＳタグ試薬には、ＭＳＭＳの間に中性損失が生じ、荷電した分析物種であるリポーターイオンを離れる。一部の実施形態では、アミノオキシＭＳタグ試薬は、ＭＳＭＳの間にタグフラグメントであるリポーターイオンを形成する。
【００８９】
それゆえ、様々な実施形態では、１種またはそれよりも多くの試料中の１種またはそれよりも多くのケトン分析化合物またはアルデヒド分析化合物を分析するために、本教示の標識を使用することは、（ａ）１種またはそれよりも多くの分析化合物を各々、標識された分析化合物を提供する式（ＩＩ）の標識のセット由来の異なる標識で標識するステップであって、この標識された分析化合物がそれぞれ、質量バランスまたはリポーターイオン部分を有するステップ；（ｂ）標識された分析化合物のそれぞれの少なくとも一部分を組み合わせて、組み合わせた試料を生成するステップ；（ｃ）組み合わせた試料の少なくとも一部分を親娘イオン遷移モニタリングに供するステップ；（ｄ）伝達された分析物またはリポーターイオンのうちの１種またはそれよりも多くのイオンシグナルを測定するステップ；および（ｅ）対応する分析物またはリポーターイオンの測定されたイオンシグナルと、標準化合物のうちの１種またはそれよりも多くの測定されたイオンシグナルとの比較に少なくとも基づいて、標識されたケトン分析化合物またはアルデヒド分析化合物のうちの１つまたはそれよりも多くの濃度を求めるステップを含む。それゆえ、様々な実施形態では、１種またはそれよりも多くの試料中の複数の分析化合物の濃度は、多重方式で、例えば、２種またはそれよりも多くの標識された分析化合物を組み合わせて、組み合わせた試料を生成し、この組み合わせた試料をＰＤＩＴＭに供し、標識された分析化合物のうちの２種またはそれよりも多くの分析物イオンまたはリポーターイオンをモニタリングすることによって求めることができる。
【００９０】
２種またはそれよりも多くの試料に加えたタグは、１回の実験の測定内でタグのセットから選択される：（ｉ）異なる試料（例えば、対照、処置した試料、時系列の試料）由来の複数のアルデヒド分析化合物またはケトン分析化合物を比較および／または定量化可能である；（ｉｉ）複数の濃度の測定値を、異なる試料から、同じケトン化合物またはアルデヒド化合物について求めることができる；および（ｉｉｉ）臨床試料の異なる分離株をベースライン試料に対して評価可能である、など。
【００９１】
組み合わせた試料の少なくとも一部分をＰＤＩＴＭに供するステップは、組み合わせた試料の一部分をクロマトグラフィーカラム（例えば、ＬＣカラム、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）カラム、またはこれらの組合せ）に充填するステップと、クロマトグラフィーカラムからの溶出液の少なくとも一部分を親娘イオン遷移モニタリングに供するステップと、伝達されたリポーターイオンのうちの１種またはそれよりも多くのイオンシグナルを測定するステップとを含む。
【００９２】
クロマトグラフィーカラムを使用して２種またはそれよりも多くの標識された分析化合物を分離するが、これらは標識化合物の分析部分において異なる。例えば、試料のうちの１種またはそれよりも多くの中に見出された第１の標識されたアルデヒドまたはケトン化合物は、試料のうちの１種またはそれよりも多くの中に見出された第２の標識されたケトン分析化合物からクロマトグラフィーカラムで分離される。２種またはそれよりも多くの異なる標識された分析化合物は、異なる化合物が実質的に共溶出しないように分離される。このようなクロマトグラフィー分離は、例えば、化合物についてのクロマトグラフ保持時間情報を提供することによって、複数の試料中の複数の化合物の分析をさらに促進可能である。
【００９３】
標識された分析化合物のうちの１種またはそれよりも多くの濃度を求めるステップにおいて使用される標準化合物のうちの１種またはそれよりも多くの測定されたイオンシグナルは、多くの方式で得ることができる。様々な実施形態では、１種またはそれよりも多くの同位体濃縮されていない標準化合物をタグで標識し、１種またはそれよりも多くの標識された標準化合物のうちの１種またはそれよりも多くの少なくとも一部分を、標識された分析化合物のそれぞれの少なくとも一部分と組み合わせることによって、組み合わせた試料を生成し、続いてこの組み合わせた試料の少なくとも一部分をＰＤＩＴＭに供し、伝達されたリポーターイオンのうちの１種またはそれよりも多くのイオンシグナルを測定する。
【００９４】
タグのセット由来のタグを１種またはそれよりも多くの標準試料に加えることによって、１種またはそれよりも多くの標識された標準試料を得るが、各標準試料は、タグで標識された１種またはそれよりも多くの同位体的に濃縮されていない標準化合物を含み、１種またはそれよりも多くの標準試料に加えたこのタグは、対象となる試料に加えたタグとは異なる。１種またはそれよりも多くの標識された標準試料のうちの１種またはそれよりも多くの少なくとも一部分を、対象となる試料の各々の少なくとも一部分と組み合わせることによって、組み合わせた試料を生成し、続いてこの組み合わせた試料の少なくとも一部分をＰＤＩＴＭに供し、伝達されたリポーターイオンのうちの１種またはそれよりも多くのイオンシグナルを測定する。
【００９５】
次いで、組み合わせた試料中の１種またはそれよりも多くの標識された標準化合物のうちの１種またはそれよりも多くに対応するリポーターイオンまたは分析物イオンのうちの１種またはそれよりも多くの測定されたイオンシグナルは、標識された分析化合物のうちの１種またはそれよりも多くの濃度を求める際に使用することができ、標準化合物に対するいくつかの値をプロットして濃度曲線を作成するために使用可能である。それゆえ、標識された分析化合物の濃度を求めることは、対応するリポーターイオンまたは分析物イオンの測定されたイオンシグナルと、組み合わせた試料中の１種またはそれよりも多くの標識された標準化合物のうちの１種またはそれよりも多くに対応する１種またはそれよりも多くのリポーターイオンまたは分析物イオンの測定されたイオンシグナルとの比較に少なくとも基づいている。この組み合わせた試料の少なくとも一部分をＰＤＩＴＭに供するステップは、例えば、質量分析器システムへ直接導入するステップ；この組み合わせた試料の少なくとも一部分をクロマトグラフィーカラムへ最初に充填し、続いてクロマトグラフィーカラムからの溶出液の少なくとも一部分をＰＤＩＴＭに供し、伝達されたリポーターイオンのうちの１種またはそれよりも多くのイオンシグナルを測定するステップを含む。
【００９６】
本明細書中に開示されているように、標準化合物でのＰＤＩＴＭを、第１の質量分離器、およびイオンフラグメント形成器と、第２の質量分離器とを含む質量分析器システムで実施可能である。ＰＤＩＴＭスキャン（第１の質量分離器により選択される）の伝達された親イオンｍ／ｚ範囲は、標識された標準化合物のうちの１種またはそれよりも多くのｍ／ｚ値を含むように選択され、ＰＤＩＴＭスキャン（第２の質量分離器により選択される）の伝達された娘イオンｍ／ｚ範囲は、伝達された標準化合物に対応するリポーターイオンまたは分析物イオンのうちの１種またはそれよりも多くのｍ／ｚ値を含むように選択される。
【００９７】
標識された分析化合物のうちの１種またはそれよりも多くの濃度を求めることは、下記の両方に基づくことができる：（ｉ）対応するリポーターイオンまたは分析物イオンの測定されたイオンシグナルと、１種またはそれよりも多くの標準化合物の１つまたはそれよりも多くの濃度曲線に対応する１種またはそれよりも多くのリポーターイオンまたは分析物イオンの測定されたイオンシグナルとの比較、および（ｉｉ）対応するリポーターイオンの測定されたイオンシグナルと、標識されたケトンまたはアルデヒド分析物と組み合わせた１種またはそれよりも多くの標識された標準化合物に対応する１種またはそれよりも多くのリポーターイオンの測定されたイオンシグナルとの比較。第１の濃度を有し、タグのセット由来のタグで標識された同位体濃縮されていない標準化合物が提供され、標識された試料の各々の少なくとも一部分と組み合わせ、組み合わせた試料を生成し、次いでこの組み合わせた試料を本明細書中に記載されているようにさらに分析可能である。
【００９８】
それゆえ、本教示の様々な実施形態では、標準化合物の濃度曲線は、下記により作成可能である：（ａ）第１の濃度を有する同位体的濃縮されたまたは同位体濃縮されていない標準ケトン化合物またはアルデヒド化合物を提供するステップ；（ｂ）前記標準化合物を標識のセット由来の標識で標識するステップであって、前記標識されたケトン標準化合物がリポーターイオン部分を有するステップ；（ｃ）前記標識された標準化合物の少なくとも一部分を、クロマトグラフィーカラムに充填するステップ；（ｄ）前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液の少なくとも一部分を親娘イオン遷移モニタリングに供するステップ；（ｅ）伝達された分析物またはリポーターイオンのイオンシグナルを測定するステップ；（ｆ）１種またはそれよりも多くの異なる標準化合物濃度に対してステップ（ａ）〜（ｅ）を繰り返すステップ；および（ｇ）１種またはそれよりも多くの標準化合物濃度において、前記伝達された分析物またはリポーターイオンの測定されたイオンシグナルに少なくとも基づいて、前記標準化合物に対する濃度曲線を作成するステップ。
【００９９】
本発明の開示は、１種またはそれよりも多くの試料中の１種またはそれよりも多くのケトン分析化合物またはアルデヒド分析化合物の濃度を求めるための方法を提供する。本方法は、１種またはそれよりも多くのケトン化合物またはアルデヒド化合物を、式（Ｉ）のタグのセット由来の異なるタグでそれぞれ標識するステップであって、Ｙ基（Ｙ  ｇｒｏｕｐ）（タグのセット由来の各タグ由来の第四級の窒素であってよい）がリポーターイオン部分を含み、標識された分析化合物のそれぞれの少なくとも一部分を組み合わせて、組み合わせた試料を生成することができ、前記組み合わせた試料の少なくとも一部分を親娘イオン遷移モニタリング（伝達された親イオンｍ／ｚ範囲は、標識された分析化合物のｍ／ｚ値を含み、伝達された娘イオンｍ／ｚ範囲は、標識された分析化合物のタグに対応するリポーターイオンのｍ／ｚ値を含む）に供することができるステップと、伝達されたリポーターイオンのうちの１種またはそれよりも多くのイオンシグナルを測定するステップと、次いで、対応するリポーターイオンの測定されたイオンシグナルと、標準化合物のうちの１種またはそれよりも多くの測定されたイオンシグナルとの比較に少なくとも基づいて、標識された分析化合物のうちの１種またはそれよりも多くの濃度を求めるステップとを含む。イオンシグナル（単数または複数）は、例えば、イオンピークの強度（平均、平均値、最大など）、イオンピークの面積またはこれらの組合せに基づくことができる。
【０１００】
ＰＤＩＴＭは、第１の質量分離器、およびイオンフラグメント形成器と、第２の質量分離器とを含む質量分析器システムを含む、当該技術分野で公知の任意の適切な質量分析器で実施可能である。ＰＤＩＴＭスキャン（第１の質量分離器により選択される）の伝達された親イオンｍ／ｚ範囲は、標識された分析化合物のうちの１種またはそれよりも多くのｍ／ｚ値を含むように選択され、ＰＤＩＴＭスキャン（第２の質量分離器で選択される）の伝達された娘イオンｍ／ｚ範囲は、伝達された標識された分析化合物のタグに対応するリポーターイオンのうちの１種またはそれよりも多くのｍ／ｚ値を含むように選択される。
【０１０１】
１種またはそれよりも多くのケトン化合物試料またはアルデヒド化合物試料は、質量差タグのセットから選択されるタグのうちの１種またはそれよりも多くで標識されることによって、同じ実験の測定内で：（ｉ）異なる試料（例えば、対照、処置した試料）由来の化合物を含む複数のケトンまたはアルデヒドを比較および／または定量化可能である；（ｉｉ）同じ試料由来の同じケトン化合物またはアルデヒド化合物について複数の濃度測定値を求めることができる；ならびに（ｉｉｉ）臨床試料の異なる分離株をベースライン試料に対して評価可能である。
【０１０２】
組み合わせた試料の少なくとも一部分をＰＤＩＴＭに供するステップは、組み合わせた試料を直接質量分析器システムへ導入すること、例えばエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）イオン供給源を使用して、適切な溶液中に組み合わせた試料を導入することを含む。
【０１０３】
組み合わせた試料中の１種またはそれよりも多くの標識された標準化合物のうちの１種またはそれよりも多くに対応するリポーターイオンのうちの１種またはそれよりも多くの測定されたイオンシグナルは、標識された分析化合物のうちの１種またはそれよりも多くの濃度を決定する。標識された分析化合物の濃度を求めることは、対応するフラグメントイオンの測定されたイオンシグナルと、組み合わせた試料中の１種またはそれよりも多くの標識された標準化合物のうちの１種またはそれよりも多くに対応する１種またはそれよりも多くのフラグメントイオンの測定されたイオンシグナルとの比較に少なくとも基づく。この組み合わせた試料の少なくとも一部分をＰＤＩＴＭに供するステップは、例えば、質量分析器システムへの直接導入；この組み合わせた試料の少なくとも一部分をクロマトグラフィーカラムへ最初に充填し、続いて、クロマトグラフィーカラムからの溶出液の少なくとも一部分をＰＤＩＴＭに供し、伝達されたリポーターイオンもしくは分析物イオンまたはこれらの組合せのうちの１種またはそれよりも多くのイオンシグナルを測定することを含むことができる。
【０１０４】
一部の実施形態では、標識された分析化合物のうちの１種またはそれよりも多くの濃度を求めることは、対応する分析物またはリポーターイオンの測定されたイオンシグナルと、１種またはそれよりも多くの標準化合物の１つまたはそれよりも多くの濃度曲線に対応する１種またはそれよりも多くのリポーターイオンの測定されたイオンシグナルとの比較を含む。第１の濃度を有し、タグのセット由来のタグで標識された同位体濃縮されていない標準化合物が提供される。標識された標準化合物の一部分を、親娘イオン遷移モニタリング（伝達された親イオンｍ／ｚ範囲は、標識された標準化合物のｍ／ｚ値を含み、伝達された娘イオンｍ／ｚ範囲は、標識された標準化合物のタグに対応するリポーターイオンまたは分析物イオンのｍ／ｚ値を含む）に供し、リポーターイオンまたは分析物イオンのイオンシグナルを測定する。標識するステップおよびＰＤＩＴＭのステップおよび伝達されたリポーターイオンまたは分析物イオンのイオンシグナルを測定するステップを、第１の濃度と異なる少なくとももう１つの標準化合物濃度について繰り返すことによって、標準化合物に対する濃度曲線を作成する。
【０１０５】
一部の実施形態では、本明細書中に記載されているアミノオキシ試薬のうちの１種またはそれよりも多くを含むキット、例えば、式（Ｉ）または（ＩＩ）の１種またはそれよりも多くの永久に荷電したアミノオキシ化合物を含んだキットを提供可能である。
【０１０６】
一部の実施形態では、本方法は、ケトステロイドの定量分析に対するＭＲＭワークフローを使用することを含むことができる。試薬は、個々のケト化合物またはケト化合物の一団の定量分析に対して同位体コード化可能である。プロファイリングのため、低い衝突エネルギーでのＭＳ／ＭＳフラグメント化を用いた実験は、１つの優勢なシグネチャーイオンを結果として生じる可能性がある。シグネチャーイオンは、アミノオキシ誘導体化された生成物からの中性損失により生じ得る。ＭＲＭ遷移は、Ｑ１では誘導体化されたステロイドの質量であり、Ｑ３では中性損失フラグメントの質量であってよい。低濃度定量に対して、標識試薬および分子の骨格の一部を含むより高い衝突エネルギーでのＭＳ／ＭＳフラグメント化は、誘導体化を介してバックグラウンドノイズを有意に減少させるためのプロセスを提供することができ、これにより敏感度が結果として改善し、Ｑ３フラグメントの標的化された選択が結果として特異度を改善する。
【０１０７】
様々な実施形態に従い、本教示は、生体試料およびクロマトグラフィー分離の多段階式クリーンアップ（ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ  ｃｌｅａｎｕｐ）に関連する問題が存在することなく、バックグラウンドノイズを減少させるか、または排除する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、ケトステロイドと永久に荷電したアミノオキシ試薬（ＱＡＯ）との誘導体化化学反応、ならびに試薬および誘導体化されたステロイドの骨格の両方を含む標的化されたフラグメント化を利用することによって、バックグラウンドノイズを排除する。容易にイオン化した／イオン化できる分子での誘導体化は、ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳにおいてより良好なイオン化効率を結果として生じ、これによって、分析物への敏感度が増加する。Ｑ３シグネチャーイオンであるフラグメントイオンが誘導体化試薬または試薬の一部が付加している構造フラグメントを含むように選択された場合、敏感度および選択性の両方を増強可能である。まったく同じＱ１／Ｑ３遷移を有する化合物が検出され、バックグラウンドノイズ妨害を作り出す確率は極めて低い。同様のＱ１／Ｑ３  ＭＲＭ遷移に対する唯一の可能性があるとすれば、生体試料内の同重体のケトステロイドの存在である。同重体のケトステロイドが妨害として現れるためには、分析物と同じフラグメント化パターンを共有していなければならない。このような稀なシナリオでは、同重体のケトステロイドは、分析物からクロマトグラフィーで分離可能である。
【０１０８】
様々な実施形態に従い、試薬設計のさらなる利点は、ＭＳ／ＭＳフラグメント化において、試薬は、誘導体化された分析物上の電荷で、フラグメントイオン、すなわちＱ３シグネチャーイオンを生成し、これによって、ＭＳ３分析の実施を可能とすることである。一部の実施形態では、本方法は、ケト官能基またはアルデヒド官能基を有するクラスの分子で実施することができ、これらの官能基の検出は、ＭＳ／ＭＳによる超高敏感度分析のための誘導体化により恩恵を受けることができる。
【０１０９】
一部の実施形態では、分析物を検出した後、分析物の相対濃度を標準化合物または標準濃度曲線と比較して測定する。一部の実施形態では、少なくとも１つの分析物の絶対濃度を求める。一部の実施形態では、少なくとも１個の重原子で標識された標準物質を含む検量体が使用される。一部の実施形態では、検量体は少なくとも２個の重水素原子を有する化合物である。
【０１１０】
本教示は、ケトステロイド、およびケト官能基を含むクラスの分子の極めて敏感かつ特異的な分析を提供する。本教示は、例えば、シグネチャーイオンが標識試薬の一部および分子の骨格の一部を含むような慎重な削除により、ＭＳ／ＭＳにおいて極めて低いバックグラウンドノイズで、より高いシグナル対ノイズ比を提供する。
質量分析器
【０１１１】
ＰＤＩＴＭを実施するため、多種多様な質量分析器システムを本教示において使用可能である。適切な質量分析器システムは、２台の質量分離器を含み、イオンフラグメント形成器がこの２台の質量分離器の間のイオンフライト経路に配置されている。適切な質量分離器の例として、四重極、ＲＦマルチポール、イオントラップ、飛行時間（ＴＯＦ）、およびタイミングを合わせたイオン選択器と併用されるＴＯＦが挙げられるが、これらに限定されない。適切なイオンフラグメント形成器として、衝突誘導性解離（ＣＩＤ、また衝突補助解離（ＣＡＤ）とも呼ばれる）、光誘導性解離（ＰＩＤ）、表面誘発性解離（ＳＩＤ）、ポストソース分解、電子ビームとの相互作用（例えば、電子誘導性解離（ＥＩＤ）、電子捕捉解離（ＥＣＤ））、熱放射との相互作用（例えば、熱的／黒体赤外放射解離（ＢＩＲＤ））、ポストソース分解、またはこれらの組合せの原理に従い作動するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
質量分析器のための適切な質量分析システムの例として、トリプル四重極、四重極−線形イオントラップ（例えば、４０００  Ｑ  ＴＲＡＰ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｑ  ＴＲＡＰ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  Ｓｙｓｔｅｍ）、四重極ＴＯＦ（例えば、ＱＳＴＡＲ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  Ｓｙｓｔｅｍ）、およびＴＯＦ−ＴＯＦのうちの１種またはそれよりも多くを含むものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
様々な実施形態では、質量分析器システムは、ＭＡＬＤＩイオン供給源を含む。様々な実施形では、組み合わせた試料の少なくとも一部分を、ＭＡＬＤＩマトリクス物質と混合し、ＭＡＬＤＩイオン化供給源付きの質量分析器を使用して、親娘イオン遷移モニタリングに供する。様々な実施形態では、組み合わせた試料の少なくとも一部分をクロマトグラフィーカラムに充填し、溶出液の少なくとも一部分をＭＡＬＤＩマトリクス物質と混合し、ＭＡＬＤＩイオン化供給源付きの質量分析器を使用して親娘イオン遷移モニタリングに供する。
【０１１４】
質量分析器システムは、親イオンを選択し、そのフラグメント娘イオンを検出するためのトリプル四重極質量分析計を含んでもよい。この実施形態では、第１の四重極は親イオンを選択する。第２の四重極は、複数の低エネルギー衝突が生じ、親イオンのうちの一部のフラグメント化を引き起こすように、十分に高い圧力および電圧で維持される。第３の四重極は、選択された娘イオンを検出器に伝達するように選択される。様々な実施形態では、トリプル四重極質量分析計は、イオン供給源とトリプル四重極の間に配置したイオントラップを含むことができる。このイオントラップは、イオン（例えば、すべてのイオン、特異的なｍ／ｚ範囲を有するイオンなど）を収集し、十分な時間の後、末端電極にパルスを印加して、選択されたイオンがイオントラップを抜け出るようにすることによって、選択されたイオンが第１の四重極に伝達されるよう設定可能である。所望の充填時間は、例えば、イオン数、イオントラップ内の電荷密度、異なるシグネチャーペプチドの溶出の間の時間、負荷サイクル、励起状態種または多荷電イオンの減衰率、またはこれらの組合せに基づいて決定可能である。
【０１１５】
トリプル四重極質量分析計における四重極のうちの１種またはそれよりも多くは、線形イオントラップとして（例えば、末端電極を付加して、四重極内の実質的に細長い円柱状のトラップ容積を提供することによって）構成可能となり得る。様々な実施形態では、第１の四重極は親イオンを選択する。第２の四重極は、複数の低エネルギー衝突が生じて、親イオンの一部のフラグメント化を引き起こすように、十分に高い衝突ガス圧力および電圧で維持される。第３の四重極は、フラグメントイオンをトラップし、充填時間後、末端電極にパルスを印加して、選択された娘イオンがイオントラップを抜け出るようにすることによって、選択された娘イオンが検出器に伝達されるように選択される。所望の充填時間は、例えば、フラグメントイオン数、イオントラップ内の電荷密度、異なるシグネチャーペプチドの溶出の間の時間、負荷サイクル、励起状態種または多荷電イオンの減衰率、またはこれらの組合せに基づいて決定可能である。
【０１１６】
質量分析器システムは、親イオンを選択し、そのフラグメント娘イオンを検出するために、２つの四重極質量分離器およびＴＯＦ質量分析器を含むことができる。様々な実施形態では、第１の四重極が親イオンを選択する。第２の四重極は、複数の低エネルギー衝突が生じて、イオンの一部のフラグメント化を引き起こすように十分に高い圧力および電圧で維持され、ＴＯＦ質量分析器は、例えば、対象となる娘イオンおよび抽出した生成されたイオンクロマトグラムを包含する質量範囲の全域でイオンをモニタリングすることによって、検出器から離れた選択された娘イオンの時間ウィンドウの外側に現れるイオンを偏向することによって、選択された娘イオンの到着時間ウィンドウへと検出器をタイムゲーティング（ｔｉｍｅ  ｇａｔｉｎｇ）することによって、またはこれらの組合せによって、検出用に娘イオンを選択する。
【０１１７】
質量分析器システムは、２つのＴＯＦ質量分析器およびイオンフラグメント形成器（例えば、ＣＩＤまたはＳＩＤなど）を含むことができる。様々な実施形態では、第１のＴＯＦは、イオンフラグメント形成器内への導入のために、親イオンを選択し（例えば、フラグメント生成器から離れた選択された親イオンの時間ウィンドウの外側に現れるイオンを偏向することによって）、第２のＴＯＦ質量分析器は、例えば、対象となる娘イオンおよび抽出した生成されたイオンクロマトグラムを包含する質量範囲の全域でイオンをモニタリングすることによって、検出器から離れた選択され娘イオンの時間ウィンドウの外側に現れるイオンを偏向することによって、選択された娘イオンの到着時間ウィンドウへと検出器をタイムゲーティングすることによって、またはこれらの組合せによって、検出用に娘イオンを選択する。ＴＯＦ分析器は、直線型分析器であっても、または反射型分析器であってもよい。
【０１１８】
質量分析器システムは、対象となる親イオンを選択するための時限式イオン選択器を有する第１の無電界ドリフト領域を含むタンデムＭＳ−ＭＳ装置、娘イオンを生成するためのフラグメント化チャンバー（またはイオンフラグメント形成器）および検出用に選択された娘イオンを伝達するための質量分離器を含むことができる。様々な実施形態では、時限式イオン選択器は、パルス印加イオン偏向器を含む。様々な実施形態では、イオン偏向器は、パルス印加イオン偏向器として使用可能である。質量分離器は、イオン反射器を含むことができる。様々な実施形態では、フラグメント化チャンバーは、イオンのフラグメント化を引き起こし、抽出を遅らせることを目的とする衝突セルである。様々な実施形態では、フラグメント化チャンバーはまた、飛行時間質量分析によるフラグメントイオンの分析のための遅延型抽出イオン源としての役目を果たすことができる。
【０１１９】
一部の実施形態では、イオン化を使用することによって、構造特異的なフラグメントイオンおよびＱ３  ＭＲＭイオンを生成可能である。標識試薬を、構造特異的なフラグメントイオンに完全または部分的に含むことができる。本方法は、Ｑ３  ＭＲＭイオンに対して敏感度および特異度の両方を提供可能である。一部の実施形態では、イオン化を使用することによって、Ｑ３において選択され、次いでフラグメント化されることによって、構造特異的なイオンを生成可能である優位な中性損失フラグメントイオンを生成可能である。次いで、これらのフラグメントイオンは、ＭＳ３と呼ばれる手順において同定および定量化のために使用可能である
キット
【０１２０】
一部の実施形態では、本教示は、ケトン分析化合物またはアルデヒド分析化合物の分析のためのキットを含む。キットは、１種もしくは複数の標識（２種またはそれよりも多くの同位体濃縮された標準物質および１種もしくは複数の試薬を含む）、容器、酵素、緩衝剤ならびに／または使用のための指示書のセットを含む。本教示のキットは、支持体の１つまたはそれよりも多くのセットを含み、各支持体は、切断可能なリンカーを介して支持体に切断可能に連結している異なる同重体標識化合物を含むが、これらに限定されない。切断可能な連結の例は、化学的または光分解的に切断可能なリンカーを含む。支持体は異なる試料と反応させることができ、これによって試料の分析物を、それぞれの支持体に関連する同重体のタグで標識する。異なる試料由来のケトン分析物は、異なる支持体と接触させ、したがって異なるリポーター／リンカー組合せで標識可能である。
【０１２１】
様々な実施形態に従い、キットは、複数の異なるアミノオキシタグ付け試薬、例えば、本明細書中に記載されているような標識試薬のセットを含むことができる。キットは、複数の異なるケト分析物またはアルデヒド分析物、例えば、複数の異なるケトステロイドを分析するように構成することができ、標識は、複数の異なる各々の標識試薬、例えば、それぞれ異なるタイプの分析物に対する異なる試薬で各々を標識することを含むことができる。分析すべき分析物およびその検出のためのキットが構成可能な分析物は、ケト化合物またはアルデヒド化合物、例えば、ケトステロイドを含むことができる。本教示の様々な実施形態に従い、１種またはそれよりも多くのケトン分析物またはアルデヒド分析物をタグ付けするための、１種またはそれよりも多くのアミノオキシＭＳタグ付け試薬を含むキットが提供される。アミノオキシＭＳタグ付け試薬は、本明細書中に記載されている構造のうちの１つを有する化合物を含むことができる。
【０１２２】
キットは、公知のケトン化合物またはアルデヒド化合物、公知のステロイド、公知のケトステロイド、またはこれらの組合せを含む標準物質を含むことができる。標準物質は、公知の濃度の公知の化合物を含むことができる。一部の実施形態では、キット内に含まれるアミノオキシＭＳタグ付け試薬は、同重体タグのセット由来の１種またはそれよりも多くの同重体タグを含むことができる。一部の実施形態では、キットは、同重体タグのセット由来の複数の異なる同重体タグを含むことができる。一部の実施形態では、キット内に含まれるアミノオキシＭＳタグ付け試薬は、永久に荷電したアミノオキシ試薬のセット由来の１種またはそれよりも多くの永久に荷電したアミノオキシ試薬を含むことができる。一部の実施形態では、キットは、永久に荷電したアミノオキシ試薬タグのセット由来の複数の異なる永久に荷電したアミノオキシ試薬タグを含むことができる。
【０１２３】
キットはまた、分析物を標識するための指示書、例えば紙の指示書または電子ファイル、例えばコンパクトディスクにフォーマットされた指示書などを含むことができる。指示書は、アッセイを実行するためのものであってよい。一部の実施形態では、キットは、試料を加えるだけでよい単一の容器中の同種のアッセイを含むことができる。キットの他の成分は、緩衝剤、他の試薬、１種またはそれよりも多くの標準物質、混合容器、１種またはそれよりも多くの液体クロマトグラフィーカラムなどを含むことができる。
【０１２４】
一部の実施形態では、複雑な生物学的マトリクス由来のケトステロイドの極めて高敏感度の定量、例えば低いｐｇ／ｍＬ濃度の範囲での検出を可能にするケトステロイド分析キットが提供される。
定義
【０１２５】
「質量差標識」、「質量差タグ」および「質量差標識試薬」という句は、本明細書中で交換可能なように使用される。「質量差標識のセット」、「質量差タグのセット」という句は交換可能なように使用され、例えば、セットのメンバー（すなわち、個々の「質量差標識」または「質量差タグ」）が実質的に同様の構造的特性および化学的特性を有するが、セットのメンバー間での重同位体濃縮の差異により質量が異なる試薬または化学部分のセットを指す。質量差タグのセットの各メンバーは、イオンフラグメント化に供される際に異なる娘イオンシグナルを生成可能である。イオンフラグメント化は、例えば、不活性ガスとの衝突（例えば、衝突誘導性解離（ＣＩＤ）、衝突活性化解離（ＣＡＤ）など）、解離を生じるフォトンとの相互作用（例えば、光誘導性解離（ＰＩＤ））、表面との衝突（例えば、表面誘発性解離（ＳＩＤ））、解離を生じる電子ビームとの相互作用（例えば、電子誘導性解離（ＥＩＤ）、電子捕捉解離（ＥＣＤ））、熱的／黒体赤外放射解離（ＢＩＲＤ）、ポストソース分解、またはこれらの組合せによるものであり得る。セットのメンバー間を区別するために使用可能である質量差タグまたは質量差標識の娘イオンは、質量差タグまたは質量差標識のリポーターイオンと呼ぶことができる。
【０１２６】
「同重体標識」、「同重体タグ」および「同重体標識試薬」という句は交換可能なように使用される。「同重体標識のセット」、「同重体タグのセット」および「同重体標識試薬のセット」という句は交換可能なように使用され、例えば、セットのメンバー（個々の「同重体標識」、「同重体タグ」または「同重体標識試薬」）が等しい質量を有するが、セットの各メンバーがイオンフラグメント化（例えば、衝突誘導性解離（ＣＩＤ）、光誘導性解離（ＰＩＤ）などにより）に供される際に異なる娘イオンシグナルを生成可能である試薬または化学部分を指す。同重体タグのセットは、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物、またはその塩もしくは水和物形態を含む。セットのメンバー間を区別するために使用可能である同重体タグの娘イオンは、同重体タグまたは荷電した分析物のリポーターイオンになり得る。同重体タグのセットを使用してケトン化合物またはアルデヒド化合物を標識し、実質的にクロマトグラフィーにより区別ができないが、ＣＩＤ後にシグネチャーイオンを生成する標識化合物を生成した。質量標識のセットの個々のメンバーの質量は、等しくても、異なってもよい。個々の同位体置換が同じである場合、質量は等しくなり得る。セットの特異的標識に組み込まれる重元素または軽元素に対して個々の原子を選択する際の差異はまた、同位体濃縮された置換基の特異的原子重量に基づき質量差を生じる可能性もある。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「同位体濃縮された」は、化合物（例えば、標識試薬）が、１種またはそれよりも多くの重原子同位体（例えば、限定されないが、重水素、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３７Ｃｌ、または８１Ｂｒを含む安定した同位体）で合成により濃縮されていることを意味する。同位体濃縮は１００％効率的ではないので、濃縮の状態がより低い化合物の不純物が存在する可能性があり、これらはより低い質量を有することになる。同様に、過剰濃縮（所望しない濃縮）により、および天然の同位体の存在量のばらつきにより、より大きな質量の不純物が存在し得る。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「天然の同位体の存在量」とは、同位体（単数または複数）がもともと自然の地球上で優勢であるかに基づいて、化合物において見出される１種またはそれよりも多くの同位体のレベル（または分布）を指す。例えば、生きている植物物体から得られる自然の化合物は通常約０．６％の１３Ｃを含むことになる。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「塩形態」という用語は、化合物の塩または化合物の塩の混合物を含む。加えて、化合物の両性イオン形態もまた「塩形態」という用語に含まれる。アミン、または他の塩基性基を有する化合物の塩は、例えば適切な有機酸または無機酸、例えば塩化水素、臭化水素酸、酢酸、過塩素酸などとの反応により得ることができる。第四級アンモニウム基を有する化合物はまた、対アニオン、例えば塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、酢酸イオン、過塩素酸イオンなどを含むことができる。カルボン酸、または他の酸性の官能基を有する化合物の塩は、化合物を、適切な塩基、例えば、水酸化物塩基と反応させることによって調製可能である。それゆえ、酸性官能基の塩は、カウンターカチオン（ｃｏｕｎｔｅｒｃａｔｉｏｎ）、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどを有することができる。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「水和物形態」とは、化合物の任意の水和状態、または化合物の１種よりも多くの水和状態の混合物を指す。例えば、本明細書中で論述された標識試薬は、半水化物、一水和物、二水和物などであってよい。さらに、本明細書中に記載されている標識試薬の試料は一水和物、二水和物および半水化物形態を含むことができる。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「優勢な」、例えば、「１つの優勢なシグネチャーイオンフラグメント」とは、フラグメント化プロセス中に作り出されたイオンの少なくとも５０％超がシグネチャーイオンであることを意味する。一部の実施形態では、フラグメント化プロセス中に作り出されるイオンの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％がシグネチャーイオンである。同様に、主にという用語、例えば、「主に中性損失フラグメント化」などは、フラグメント化プロセス中に作り出されるイオンの少なくとも５０％超が中性損失フラグメントであることを意味する。一部の実施形態では、フラグメント化プロセス中に作り出されるイオンの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％が中性損失フラグメントである。
【０１３２】
上記記載は様々な実施形態の例および具体的詳細を提供しているが、記載されている実施形態の一部の特徴および／または機能は、記載されている実施形態の範囲を逸脱することなく修飾が認められると理解されたい。上記記載は、本明細書中の教示を例示することを意図し、その範囲は、本明細書に添付される特許請求の範囲の言語のみで限定される。
【実施例】
【０１３３】
出願人の教示の態様は、下記の実施例を考慮してさらに理解可能であるが、下記の実施例は、出願人の教示の範囲を限定するものと決して解釈されてはならない。
（実施例１）
ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳによる生体試料の分析
【０１３４】
誘導体化の手順：２００μＬのＴｅ血清を、０．１％ギ酸を有する２００μＬの水と混合し、９６ウェルプレート（９６＝−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）内にある間に短パルス真空を適用した。１０分後、試料を９００μＬジクロロメタン（ＤＣＭ）で２回溶出し、乾燥させた。次いで、分析物をメタノール中の試薬ＱＡＯおよび酢酸と反応させ、室温で１５分間インキュベートした。反応は９８％完了し、溶媒中で９３％回収し、ＤＣＳヒト血清中で８７％回収した。
【０１３５】
次いでテストステロンを検出し、内標準により、または検量線から定量化した。３．９４での単一のクロマトグラフィーピークが観察された。この誘導体化は、高生産性の自動化が可能で、２５分しかかからない。この手順はまた、他のステロイド、例えば、プロゲステロンおよびアルドステロンならびに他のケトステロイドなどに対しても適当である。
【０１３６】
ＤＣＳヒト血清中のＱＡＯ−Ｔｅの検出限界を２つの異なるＬＣプロトコルに対して定量化した：「シングルピーク（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｅａｋ）」法および「ダブルピーク（ｄｏｕｂｌｅ  ｐｅａｋ）」法。これら２つのプロトコルは、ＱＡＯ  ＴｅのＥ／Ｚ異性体の共溶出（「シングルピーク」）または分離された溶出（「ダブルピーク」）を可能にするＬＣ勾配により区別される。「ダブルピーク」法は、異性体が確実に分離するようにより浅い勾配を有するのに対して、シングルピーク法は、より迅速な勾配を使用することによりＱＡＯ−Ｔｅの異性体の共溶出を可能にする。
【０１３７】
Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ／０．１％ＦＡ移動相を有するＫｉｎｅｔｅｘ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）Ｃ１８カラム（５０×２．９０、２．６μ）の例として「ダブルピーク」法を使用した。この方法は、ＥおよびＺ異性体が９．４８分および９．２２分で溶出した２つの分離されたピークを提供した。「シングルピーク」法は、Ｈ２）／アセトニトリル／ギ酸アンモニウム（５ｍＭ）／ＦＡ（０．１％）移動相を有するＫｒｏｍａｓｉｌ  Ｃ４カラム（５０×２．０、３．５μ）を使用した。この方法は、３．９４分で溶出する単一の、ウェル形状ピークを提供した。
（実施例２）
ＦｌａｓｈＱｕａｎｔＴＭＭＡＬＤＩＴｒｉｐｐｌｅＱｕａｄｒｏｐｏｌｅ質量分析器によるＱＡＯ−Ｔｅ、ＡＬ、Ｐｒｅｇ、およびＰｒｏｇの特徴付け
ＭＡＬＤＩプレートスポッティングの前に誘導体化されたステロイドをＡＣＮ／Ｈ２Ｏ中で希釈した。ステロイド試料（Ｓ）を過剰のマトリクス（Ｍ）と混合し、ＭＡＬＤＩプレート上で乾燥させた。プレートをイオン源中の試料ステージに載せる。レーザービームは、マトリクス中性（Ｍ）、マトリクスイオン（ＭＨ）＋、（ＭＨ）−、および試料中性（Ｓ）を生成する。ＭＡＬＤＩプレートスポッティング：ステロイド試料を、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  １／１  Ｖ／Ｖ＋０．１％ＴＦＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）中に溶解したＭＡＬＤＩマトリクス、α−シアノ−４−ヒドロキシケイヒ酸（ＣＨＣＡ）と混合した。０．７５μＬを各ウェルにスポットし、空気乾燥した。ＭＡＬＤＩ装置およびＭＲＭ条件：分析を小分子の分析に対して最適化した高反復レーザーであるＦｌａｓｈＬａｓｅｒＴＭ源付きの４０００  ＱＴＲＡＰ（登録商標）（ＡＢＩ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）で実施した。化合物依存性およびＭＲＭパラメーターは表１に記載されている。試料分子は、マトリクスイオンからのプロトン移動によりイオン化する：ＭＨ＋＋Ｓ→Ｍ＋ＳＨ＋、ＭＨ−＋Ｓ→Ｘ＋ＳＨ−。ＦｌａｓｈＬａｓｅｒＴＭ源は、高反復レーザーを備え、標的プレート上にスポットした試料から超高速シグナルを生成する。
【表１】
2015503753.tif 000011
（実施例３）
ＤＣＳヒト血清中のＱＡＯ−テストステロンの特徴付け（ＥＳＩ／ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  ＡＰＩ  ３２００ＴＭＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）
【０１３８】
ＤＣＳヒト血清中のＴｅの試料を抽出し、上に記載の通り誘導体化した。クロマトグラフィー分離を「シングルピーク」および「ダブルピーク」の両方の方法で実施した。「ダブルピーク」法は、ＱＡＯ  Ｔｅの２つのＥ／Ｚ異性体を、３．１６分および３．２６分での溶出で分離することができ、１０ｐｇ／ｍＬの試料は、９のＳ／Ｎ比、４ｐｇ／ｍＬのＬＯＤを提供した。「シングルピーク」法は、３．９２分で溶出する単一の、ウェル形状のピークを提供し、１０ｐｇ／ｍＬ試料は、５．６のＳ／Ｎ比、５．５ｐｇ／ｍＬのＬＯＤを提供した。ブランクでは、ＱＡＯ  Ｔｅの検出可能なピークは見出されなかった。両方の方法に対して、１０ｐｇ／ｍＬでの再現性は１０％ＣＶ（ｎ＝５）未満である。
【０１３９】
ＤＣＳヒト血清中のＱＡＯ−Ｔｅの直線性およびダイナミックレンジを分析した。正確な質量が４０６．４であるＱＡＯ−ｄ３Ｔｅの内標準を使用した。シングルピークおよびダブルピークの両方の方法を、ＤＣＳヒト血清中でスパイク添加した０〜５０００ｐｇ／ｍＬの範囲にわたり分析した。図３Ａおよび３Ｂに示されているように、両方とも直線的な曲線を提供した。
【０１４０】
この範囲は、さらなる試薬の付加により拡大可能である。
（実施例４）
永久に荷電したアミノオキシ試薬を使用したケトステロイドの誘導体化
【０１４１】
テストステロンを本明細書中に記載されている方法に従いＱＡＯ試薬で誘導体化し、ＭＳ／ＭＳを使用して分析した。図４は、シグネチャーイオンが、テストステロン構造および本教示の様々な実施形態に従い誘導体化している試薬構造の両方からのフラグメントを含むＣＥ＝６２  ｅＶを使用したＭＳ／ＭＳフラグメントおよびＱＡＯテストステロンのスペクトルを示している。
【０１４２】
図５Ａおよび５Ｂは、本教示の様々な実施形態に従い、中性損失Ｑ３フラグメントと比較した標的化されたＱ３フラグメントのＭＲＭ遷移を使用するＱＡＯ誘導体化されたテストステロンのクロマトグラムを示している。測定は、中性損失（４０３→３４４、図５Ｂ）対試薬−プラス−骨格フラグメント（４０３→１６４、図５Ａ）のＭＲＭ遷移の使用を含んだ。見ることができるように、バックグラウンドノイズの有意な減少により、試薬およびテストステロン骨格を含むＱ３遷移を使用してより低い検出限界が達成可能である。
【０１４３】
本教示の様々な実施形態に従い、ケトステロイドの標的化されたフラグメント化に本方法を適用する。例えば、図６は、標的化されたＭＳ／ＭＳフラグメント化ならびにＣＥ＝４５  ｅＶでのＱＡＯプロゲステロンのスペクトルおよびＱＡＯテストステロンのＭＳ／ＭＳスペクトルを示している。ＱＡＯプロゲステロンは、２つのケト官能基を保有し、したがってビスＱＡＯプロゲステロンを生じる。
【０１４４】
図７Ａ〜７Ｃは、ＣＥ＝４５  ｅＶでのプロゲステロンのＭＳ／ＭＳスペクトルを示している。図７はまた、実際のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析におけるバックグラウンドノイズの減少を例示している。ＭＲＭ遷移２７２→２１３（図７Ａ）は、ビスＱＡＯプロゲステロンの二重に荷電した種からの中性損失であり、高いバックグラウンドノイズが顕著である。２７２→３１２．５のＭＲＭ遷移（図７Ｂ）は、二重に荷電したビスＱＡＯから、試薬構造の一部およびプロゲステロン構造の一部を含む特異的フラグメントへの遷移である。より低いＱ１の質量からより高いＱ３の質量へのこのＭＲＭ遷移はさらに特異的であり、ＬＣ−ＭＲＭ実験において特異度をさらに改善し、バックグラウンドノイズを減少させ、図７Ｃの拡大において極めて低いバックグラウンドノイズを示している。
（実施例５）
質量差および同重体試薬
【０１４５】
下記は、本教示の様々な実施形態による第４級アミノオキシ質量差試薬の例示的セットである：
【化９】
2015503753.tif 000012
【０１４６】
下記は、本教示の様々な実施形態による第４級アミノオキシ同重体試薬の例示的セットである：
【化１０】
2015503753.tif 000013
（実施例６）
ヒト血清からのテストステロン分析（ＡＰＩ３２００ＴＭＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）
【０１４７】
ＱＡＯ誘導体化およびＡＰＩ３２００ＴＭＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して、ヒト血清試料から得たテストステロン（Ｔｅ）の高敏感度分析を実施した。ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ敏感度は、誘導体化により４０倍増強することが判明した。図９は、１０〜１００００ｐｇ／ｍＬの間のテストステロンに対する濃度曲線を提供している（２００μＬの血清、ｄ３Ｔｅおよび５００ｐｇ／ｍＬの１３Ｃ  Ｔｅ  ＩＳの増加するスパイク添加された濃度）。ダイナミックレンジは、全ヒト試料の基準値をカバーする。最初に２００μＬのヒト血清／血漿試料を抽出することによって、１０ｐｇ／ｍＬのＬＬＯＱおよび５ｐｇ／ｍＬのＬＯＤを達成した。
【０１４８】
この試料調製は、下記のワークフローを用いて、液液抽出（ＬＬＥ）または固液抽出（ＳＬＥ）のいずれかで実施可能である：
【０１４９】
ＬＬＥ：
・内標準（ＩＳ）１００ｐｇを２００μＬの血清／血漿試料へスパイク添加する
・２００μＬの血清／血漿試料を２ｍＬポリプロピレンバイアルに移し、同位体濃縮されたＩＳ（１３Ｃ  Ｔｅ）でスパイク添加し、１ｍＬの抽出溶媒を加える（９０％ヘキサン／１０％酢酸エチル）
・２分間ボルテックス混合し、室温で５分間静置させる。５０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
・０．７ｍＬを上清から、クリーンな２ｍＬポリプロピレンバイアルに移す
・抽出物を蒸発乾燥させる
・ＭｅＯＨ＋５％酢酸中に溶解した１０ｍｇ／ｍＬのＱＡＯ試薬を５０μＬの溶液中で再構成する。
・室温で４５分間ボルテックス混合する
・２０μＬのＨ２Ｏ（ＬＣ／ＭＳグレード）を加える
・ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のため、ポリプロピレンＨＰＬＣバイアルに移す。
・１５μＬを注入する。
【０１５０】
ＳＬＥ：
・ＩＳ（１００ｐｇ）を２００μＬの血清／血漿試料にスパイク添加する
・各ウェルの中に２００ｍｇのセライトを含む９６ウェル固相抽出プレートに、２００μＬの血清／血漿試料を移す。
・５分間待ち、１．３ｍＬのジイソプロピルエーテルを加える。溶媒が固相を介して５分間流れるようにする。
・抽出物を蒸発乾燥させる
・ＭｅＯＨ＋５％酢酸中に溶解した１０ｍｇ／ｍＬのＱＡＯ試薬の５０μＬ溶液中で再構成する。
・室温で４５分間ボルテックス混合する、
・２０μＬのＨ２Ｏ（ＬＣ／ＭＳグレード）を加える
・ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のために試料をポリプロピレンＨＰＬＣバイアルに移す。
・１５μＬを注入する。
【０１５１】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件：ＬＣポンプ、脱ガス装置、オートサンプラーおよびコントローラー：Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００システム。カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＬ−Ｃ１８  ５０×４．６、３μｍ（Ｉｍｔａｋｔ  Ｐｒｏｄ  ＃ＣＬ００２）。周辺温度。移動相は下記の通りである：
Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＦＡ＋５ｍＭ  ＮＨ４ＣＯＯＨ
Ｂ＝アセトニトリル＋０．１％ＦＡ＋５ｍＭ  ＮＨ４ＣＯＯＨ
注入量：１５μＬ
オートサンプラー温度：周辺温度
【０１５２】
勾配は下記の通りである：
【表１Ｂ】
2015503753.tif 000014
【０１５３】
ＭＲＭ遷移およびＭＳ／ＭＳ条件は、供給源温度６００℃およびイオンスプレー電圧＝４５００Ｖを含む。追加の条件が表ＩＩに示されている。
【表２】
2015503753.tif 000015
（実施例７）
ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓを使用し、ＱＡＯ誘導体化を使用した乾燥血斑の抽出および分析
【０１５４】
下記は、乾燥血斑（ＤＢＳ）の抽出および分析についての詳細な記載である：
・全血試料（約８〜１０μＬ）を含む乾燥血斑試料ディスクを、１．５ｍＬポリプロピレンバイアルに入れる。
・２００μＬの抽出溶媒９０％ヘキサン、１０％酢酸エチルを加え、３０分間超音波分解する。
・ＩＳ（ＭｅＯＨ中１０ｐｇ／２０μＬ）を加え、ＭｅＯＨ抽出物を乾燥蒸発させる。ＭｅＯＨ＋５％酢酸中に溶解した１０ｍｇ／ｍＬのＱＡＯ試薬の５０μＬ溶液中で再構成する。
・室温で４５分間ボルテックス混合する。
・２０μＬのＨ２Ｏ（ＬＣ／ＭＳグレード）を加える。
・ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のため、試料をポリプロピレンＨＰＬＣバイアルに移す。
・２０μＬを注入する。
【０１５５】
上記プロトコルを使用して、ＤＢＳ試料に対する濃度曲線が、ｄ３Ｔｅを検量体として、１３Ｃ  ＴｅをＩＳとして使用して、５０〜１０００ｐｇ／ｍＬの濃度範囲に対して、図１０に示されている。１０μＬの女性の全血を直径１／４’’の濾紙ディスク上にスパイク添加した。図１１Ａ〜１１Ｃは、ＱＡＯ誘導体化された女性の乾燥血斑、１０μＬ全血のクロマトグラムを示している。（ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００システム）。その内因性Ｔｅ濃度の測定値は約４３ｐｇ／ｍＬである。図１１Ａは、５００ｐｇ／ｍＬでの、１３Ｃ  Ｔｅを内標準として示している。図１１Ｂは、スパイク添加した５０ｐｇ／ｍＬのｄ３Ｔｅを示している。図１１Ｃは、ＤＢＳ試料中の、測定した内因性ｄ０Ｔｅを示している。１０μＬの全血を使用するＬＬＯＱは、＜５０ｐｇ／ｍＬであることが判明した。
【０１５６】
比較のため、図１２Ａおよび１２Ｂは、ＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００システムを使用して、１０μＬの女性全血（図１１Ａ〜１１Ｃで提示されたものと同じドナー）由来の誘導体化していないＤＢＳを示している。図１２Ｂで示されているように、誘導体化していないＴｅのシグナルは検出することができなかった。
（実施例８）
ＱＡＯ誘導体化ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００を使用した遊離テストステロン（ＦＴ）の分析
【０１５７】
下記は、遊離テストステロン（ＦＴ）分析の詳細な方法について記載している：
・５００μＬの血漿／血清を５００μＬのＰＢＳで希釈し、３０  ＫＤ  ＭＷＣＯカットオフフィルター（Ｃｅｎｔｒｉｆｒｅｅ  ＹＭ  ３０限外濾過デバイス、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に適用する。この膜は、タンパク質結合しているＴｅ（ＳＨＢＧおよびアルブミン）を保持し、この膜にＦＴを通過させる。
・限外濾過デバイスを１〜２時間、２０００ｇで遠心分離する。
５００μＬの水性限外濾液（ＵＦ）を固体液体抽出（ＳＬＥ）で抽出する。
【０１５８】
下記は、詳細な手順について記載している：
・各ウェルの中に４００ｍｇのセライトを含む９６ウェル固相抽出プレートに、５００μＬの限外濾液を適用する。
・５分間待ち、１．５ｍＬのジイソプロピルエーテルを加える。さらに５分間固相を介して溶媒を流す
・抽出物を乾燥蒸発させる
・ＭｅＯＨ＋５％酢酸中に溶解した１０ｍｇ／ｍＬのＱＡＯ試薬の溶液（５０μＬ）中で再構成する。
・室温で４５分間ボルテックス混合する、
・２０μＬのＨ２Ｏ（ＬＣ／ＭＳグレード）を加える
・ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のために、試料をポリプロピレンＨＰＬＣバイアルに移す。
【０１５９】
図１３は、ＱＡＯ誘導体化およびＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００装置を用いて、上記手順を使用した女性の血清（プール）由来の遊離テストステロンを含む試料の分析を提供する。１３Ｃ  ＴｅをＩＳとして使用し、スパイク添加したｄ３Ｔｅを濃度曲線における検量体として使用した。
【０１６０】
５００μＬの血清を使用するＬＬＯＱは、約０．５ｐｇ／ｍＬであることが判明した。
（実施例９）
ＱＡＯ誘導体化ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００を使用する唾液試料からの遊離テストステロンテストステロンの抽出
【０１６１】
ヒト唾液は、遊離テストステロンＴｅしか含まない。これは得るのが簡単な試料であり、抽出手順が簡単である。下記は、詳細な手順を記載している：
・１ｍＬの唾液を微量遠心機のポリプロピレンバイアルへピペットで入れる
・１ｍＬの抽出溶媒９０％ヘキサン／１０％酢酸エチルおよび２０ｐｇの同位体濃縮されたＩＳ（１３Ｃまたはｄ３Ｔｅ）を加える
・５分間ボルテックス混合する
・５分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離する
・上清から５００μＬを除去する
・乾燥させ、ＭｅＯＨ＋５％酢酸中に溶解した１０ｍｇ／ｍＬＱＡＯ試薬の５０μＬ溶液中で再構成する。
・室温で４５分間ボルテックスする混合する、
・２０μＬのＨ２Ｏ（ＬＣ／ＭＳグレード）を加える
・ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のために、試料をポリプロピレンＨＰＬＣバイアルに移す。
【０１６２】
図１３は、ＱＡＯ誘導体化およびＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００装置を用いて、上記手順を使用した女性の唾液（１ｍＬ）中の遊離テストステロン濃度の推定を示している。ワンポイントキャリブレーション、２０ｐｇ／ｍＬのｄ３ＴｅをＩＳとして使用した。
【０１６３】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件：ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００は下記の通り：ＬＣポンプ、脱ガス装置、オートサンプラーおよびコントローラー：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｎｅｘｅｒａ  ３０Ａシステム。カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＬ−Ｃ１８  ５０×４．６、３μｍ（Ｉｍｔａｋｔ  Ｐｒｏｄ  ＃ＣＬ００２）。周辺温度。移動相は下記を含む：
Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＦＡ  Ｂ＝アセトニトリル＋０．１％ＦＡの注入量：２０μＬ
オートサンプラー温度：周辺温度
【０１６４】
勾配は下記の表に従った。
【表３】
2015503753.tif 000016
【０１６５】
最初の１．５分間は、経路をそらして廃棄するようにＶａｌｃｏ弁を設定する。
【０１６６】
ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ条件は下記の通りであった：供給源温度＝６５０℃およびイオンスプレー電圧＝３５００Ｖ。追加のパラメーターが表ＩＶで提供されている。
【表４】
2015503753.tif 000017
【０１６７】
図１４Ａおよび１４Ｂは、内因性遊離テストステロンを示している。試料は、２．１ｐｇ／ｍＬの濃度（図１４Ａ）を提供した。図１４Ｂは、２０ｐｇ／ｍＬのｄ３テストステロン内標準を提供している。
【０１６８】
１、２および３つのケト基を含む様々なタイプのケトステロイドに対する適切なＭＲＭ遷移の他の例が、下記の表Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩにおいてそれぞれ列挙されている。これらの表では、ＮＬ＝中性損失、−５９のトリメチルアミンは、ビス−誘導体が形成された場合、−１１８を同様に失う可能性がある。ビス誘導体に対して、多荷電フラグメントはＱ１（ＭＲＭ１）で検出可能であり、単一荷電または二荷電フラグメントはＱ２（ＭＲＭ２）で検出可能である。後者のシナリオでは、Ｑ３質量は絶対数としてより高い（例えばプロゲステロン：ＭＲＭ遷移２７２．５→３１２．５）。Ｑ３でのより高い「質量」のこれらのＭＲＭ遷移は本来さらに特異的である。ビスケトステロイドフラグメントの別の一般的なタイプは、１つだけのトリメチルアミンの脱離である。ＭＲＭ遷移が二荷電の親イオンの別の二荷電生成物イオンへの変換（これは、１つのトリメチルアミンの脱離である）を反映する場合、絶対的脱離は−３０（例えば１１のデオキシコルチゾールＭＲＭ遷移は２８８．５→２５８．９）である。
【０１６９】
【表５】
2015503753.tif 000018
【０１７０】
【表６】
2015503753.tif 000019
【０１７１】
【表７】
2015503753.tif 000020
【０１７２】
図１５は、２１−デオキシコルチゾールおよび１１−デオキシコルチゾールに対するＭＲＭ遷移の構造特異的フラグメントを使用した同重体ケトステロイドのＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを描写している。他のケトステロイドに対する他のクロマトグラムは、上記の表からのデータを使用して視覚化可能である。
【０１７３】
これらに限定されないが、特許、特許出願、論文、本、専門書、およびウェブページを含む、本出願で引用されたすべての文献および同様の題材は、このような文献および同様の題材のフォーマットにかかわらず、すべての目的のため、これらの全体が参照により明示的に援用されている。これらに限定されないが、定義された用語、用語の使用、記載されている技法などを含む、援用されている文献および同様の題材のうちの１種またはそれよりも多くが本出願と異なるまたは矛盾する場合、本出願が優先される。
【０１７４】
本明細書中で使用されたセクションの表題は、組織的目的のためだけであり、記載されている対象を限定するものと決して解釈されてはならない。
【０１７５】
出願人の教示が様々な実施形態と関連して記載されている場合、出願人の教示はこのような実施形態に限定されることを意図しない。それどころか、当業者であれば理解しているように、出願人の教示は、様々な代替形態、修飾、および同等物を包含する。
【０１７６】
この教示は、その趣旨で述べられていない限り、記載されている順序または要素に限定されると読み取られるべきではない。本教示の範囲を逸脱することなしに、形態および詳細における様々な変更がなされることが可能なことを理解すべきである。例証として、開示されている方法のステップのいずれかを、他の開示されているステップのいずれかと組み合わせることによって、本教示の様々な実施形態に従い環含有化合物を分析する方法を提供可能である。それゆえ、本教示およびこれの同等物の範囲および趣旨内に入るすべての実施形態が請求される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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