(57)【要約】本発明は、健康上の利益を伴う組成物に一般に関する。特に、本発明は、肝臓障害の処置又は予防に関する。本発明の主題は、肝臓障害の処置又は予防に使用するための４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物である。本発明の更なる主題は、肝臓の第２相酵素の不十分な活性に関連付けられた肝臓障害の処置又は予防に使用するための、４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓障害の処置又は予防に使用するための４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物であって、医薬として使用されない、組成物。
【請求項２】
肝臓障害が、肝炎、肝線維症、胆汁うっ滞性肝疾患、炎症性肝臓傷害；薬物に誘導される肝毒性及びエタノールに媒介される肝毒性を含む生体異物毒性；肝性脳症、脂肪肝疾患、虚血再灌流肝臓傷害、肝不全、遺伝性高チロシン血症１型；肝炎、アフラトキシン及び化学的毒素により誘導される肝細胞癌を含む肝細胞癌、；第１相に入り込む毒素の過度の過負荷と非効率的な第２相経路に起因する環境過敏症、薬物不耐症、慢性疲労症候群及び線維筋痛症；肝臓の病的解毒並びにこれらの組合せから成る群より選択される、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
障害が、肝臓における第２相酵素の不十分な活性に関連付けられている、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
第２相酵素が、ヘムオキシゲナーゼ１、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼキノン１、グルタチオン還元酵素、グルタミン酸システインリガーゼ、グルタチオンＳ−転移酵素、ＵＤＰ−グルクロノシル転移酵素及びこれらの組合せから成る群より選択される、請求項３に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
肝臓における第１相酵素の活性が増大している及び／又は肝臓における第２相酵素の活性が低減している対象に投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
肝臓解毒を必要としている対象に投与される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
過体重である及び／又は２型糖尿病を患っている対象に投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
４−オキソ−２−ペンテン酸が天然源から得られた、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
４−オキソ−２−ペンテン酸が、ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５又はビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００から得ることができる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５又はビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００が、約６０〜１８０℃、好ましくは約８０〜１６０℃で熱処理される、請求項９に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
組成物１ｋｇ当たり少なくとも１ｍｇ、好ましくは組成物１ｋｇ当たり少なくとも１０ｍｇ、例えば組成物１ｋｇ当たり５０ｍｇ〜５０ｇの量で４−オキソ−２−ペンテン酸を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
体重１ｋｇ当たり２μｇ〜２０ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸、好ましくは体重１ｋｇ当たり２０μｇ〜２ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸、例えば体重１ｋｇ当たり４０μｇ〜１ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸に相当する一日量で投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
経口投与又は経腸投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
ヒト、ペット又は家畜に投与される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
食品組成物、食品添加剤、機能性食品、飲料、栄養製剤、経管製剤、牛乳又は水中で再構成される粉末状組成物、及びペット食品組成物から成る群より選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［説明］
本発明は一般に、健康上の利益を有する組成物に関する。詳細には、本発明は、肝臓障害の処置又は予防に関する。本発明の主題は、肝臓障害の処置又は予防に使用するための４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物である。本発明の更なる主題は、肝臓の第２相酵素の不十分な活性に関連付けられた障害の処置又は予防に使用するための、４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物である。
【０００２】
肝臓は、体内で最大の器官である。肝臓は身体の化学工場として働き、血餅を作り出す物質を生成する体内の化学物質のレベルを調節することによって多数の生命機能を実施する。数多くの身体のプロセスにおける肝臓の重要な役割のため、肝機能に関連付けられた障害は、健康不良の主要な原因である。Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒｕｓｔによれば、肝疾患は、心疾患、癌、脳卒中及び呼吸器疾患に続いてイングランド及びウェールズで５番目に「大きな死因」である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｉｔｉｓｈｌｉｖｅｒｔｒｕｓｔ．ｏｒｇ．ｕｋ、２０１１年１１月１日視察済み）。人々は肝臓が７０％損傷しても生存することができるが、肝疾患による罹患率並びに肝臓に関連した健康不良による莫大な経済的及び人的代価という大きな重荷がある。
【０００３】
肝臓は、生体内変化及び後続する生体異物の解毒を担う主要な器官である。生体異物は、体内に見出されるが通常生成されない又は体内に存在すると想定されない化学物質である。生体異物という用語は、通常の濃度よりはるかに高い濃度で存在する物質も指す。尿の脂肪親和性生体異物は、排泄するためには水溶性にしなければならない。体内での水溶性化合物への脂肪親和性化合物の生体内変化は通常、２つの段階：官能化及び後続するコンジュゲーションにより起きる。官能化は、酸素を用いて反応部位を形成し、第１相解毒と呼ばれる。コンジュゲーションは、反応部位への水溶性基の付加を起こし、第２相解毒と呼ばれる。第２相解毒を触媒するいくつかの酵素、例えばヘムオキシゲナーゼ１、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼキノン１、グルタチオン還元酵素、グルタミン酸システインリガーゼ、グルタチオンＳ−転移酵素及びＵＤＰ−グルクロノシル転移酵素がある。肝臓でのこれらの第２相酵素の活性は、解毒における肝臓の主要な役割のため特に重要である。
【０００４】
肝臓障害を処置するための現在の治療介入は、非常に限定されている。原因を特定することができる場合、原因を取り除くことが予防及び／又は処置で重要な役割を担う。例えば、障害が過剰なアルコール消費又は肥満に起因する場合には、禁酒又は適当な生活様式及び食生活の変更が重要である。人々には同様に、ウイルス性肝炎による感染を回避するための予防措置を採るよう助言すべきである。
【０００５】
酸化ストレス及び炎症は、肝疾患の発症において主要な役割を担うため、酸化ストレス及び炎症を標的とする化合物が肝臓障害の処置又は予防のために提案されてきた。例えば、オルチプラズ（４−メチル−５−（２−ピラジニル）−３−ジチオールチオン）は、アフラトキシンに誘導される肝細胞癌の発癌をラットで減少させることに加えて、α−ナフチルイソチオシアネート（ＡＮＩＴ）に誘導される胆汁うっ滞からマウスの肝臓を保護することも示してきた。合成トリペルテノイドの２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアン−１，９−ジエン−２８−オイック酸（ＣＤＤＯ）は、対応するメチル（ＣＤＤＯ−Ｍｅ）エステル及びイミダゾール（ＣＤＤＯ−Ｉｍ）エステルと相まって肝臓保護につながり得る（Ｃ．Ｄ．Ｋｌａａｓｓｅｎら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２４４、５７〜６５（２０１０年））。しかしながら、これらの化合物は、望ましくない効果も生じさせる恐れがあり、例えば、オルチプラズを用いた臨床試験は、顕著な副作用を示した（Ｙ．Ｚｈａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ３、８８５〜８９３（２００４年））。したがって、従来技術で説明した薬物の欠点を有さず肝臓障害を処置又は予防するための更なる組成物を利用できるようにすることが望ましいであろう。特に、天然源から有効成分を得られる有効な組成物を見出すことは、非常に望ましいであろう。
【０００６】
結果として、現況技術を改善すること、特に、肝臓障害を処置又は予防に使用するための代替的組成物を提供することが本発明の目的であった。本発明者らは、本発明の目的が独立請求項の主題により達成され得ることを見出して驚いた。従属請求項は、本発明の着想をさらに発展させている。
【０００７】
したがって、本発明は、肝臓障害の処置又は予防に使用するための４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物を提供する。
【０００８】
本発明は、肝臓障害の処置又は予防のための組成物の調製への４−オキソ−２−ペンテン酸の使用も提供する。
【０００９】
本発明の範囲内の「処置」は、低減、阻害、緩和又は回復を指す。
【００１０】
４−オキソ−２−ペンテン酸は、ＣＡＳ番号４７４３−８２−２及び下記の式
【化１】
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を有する。
【００１１】
本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸がＮｒｆ２を活性化することを見出して驚いた。Ｎｒｆ２（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ２）−ｌｉｋｅ  ２）は、細胞での抗酸化剤応答の主要な調節剤である。野生型マウスの肝臓よりＮｒｆ２欠損マウスの肝臓の方が酸化性／求電子性ストレスに誘導される様々な病理に影響されやすいため、肝臓でのＮｒｆ２の重要性は良く認識されている（Ｃ．Ｄ．Ｋｌａａｓｓｅｎら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２４４、５７〜６５（２０１０年））。転写因子Ｎｒｆ２は、細胞質ゾルの細胞に見出され、阻害剤Ｋｅａｐ１に結合している。Ｋｅａｐ１に結合しているとき、Ｎｒｆ２はまた、プロテアソーム、したがってその低い基礎濃度により迅速に分解される。酸化ストレスが生じた際、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１から放出される。Ｎｒｆ２濃度が増大し、Ｎｒｆ２は核の中に転座する。Ｎｒｆ２は、解毒酵素及び抗酸化剤タンパク質をコードする遺伝子の発現を刺激することにより、酸化ストレス及び求電子性作用物質への抵抗性を増大させる。
【００１２】
反応性酸素種及び酸化ストレスは、肝臓病の発生において重要な役割を担う（Ｙ．−Ｐ．Ｗａｎｇら、Ｗｏｒｌｄ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｉｇｅｓｔｏｌｏｇｙ、１８、１９０７〜１９１１（２０１０年））。肝臓でのＮｒｆ２の活性化は、肝臓障害を処置又は予防することが知られている。例えば、Ａｌｅｋｓｕｎｅｓ（Ｌ．Ｍ．Ａｌｅｋｓｕｎｅｓら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、３５、４５９〜４７３（２００７年））及びＫｌａａｓｓｅｎ（Ｃ．Ｄ．Ｋｌａａｓｓｅｎら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２４４、５７〜６５（２０１０年））による最近の総説は、胆汁うっ滞性肝疾患、炎症性肝臓傷害、パラセタモール肝毒性、アフラトキシンに誘導される癌腫、化学物質に誘導される発癌、エタノールに媒介される肝毒性、肝線維症、肝細胞アポトーシス及び重金属毒性を含む障害の処置、並びに高脂肪食に誘導される体重、脂肪量及び肝脂質蓄積の増大の予防にＮｒｆ２活性化を関連付けてきた。
【００１３】
Ｎｒｆ２の活性化は、薬理学的手段により達成することができる。例えば、（上述した）オルチプラズ、ＣＤＤＯ、ＣＤＤＯ−Ｍｅ及びＣＤＤＯ−Ｉｍは、Ｎｒｆ２活性化による肝臓保護につながる（Ｃ．Ｄ．Ｋｌａａｓｓｅｎら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２４４、５７〜６５（２０１０年））。
【００１４】
食品中に存在するＮｒｆ２活性化化合物が説明されてきた。こうしたＮｒｆ２活性化化合物には、ウコンの主成分であるクルクミン（米国特許出願公開第２００９／００４２９８０号）、ブドウに見出されるレスベラトロール（Ｃｈｅｎ  ＣＹら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００５年６月１７日、３３１（４）：９９３〜１０００）、ブロッコリーに見出されるスルフォラファン（Ｆ．Ｅｌｂａｒｂｒｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｌａｎｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５、４７３〜４８４、（２０１１年））、リンゴに見出されるクェルセチン（Ｔａｎｉｇａｗａ  Ｓら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２００７年６月１日、４２（１１）：１６９０〜７０３）、大豆及びコーヒーに見出されるゲニステイン、ケールに見出されるケンペロール、イチゴ及びラズベリーに見出されるエラグ酸、並びに緑茶に見出されるエピカテキンフラボノイド（Ｂ．Ｈ．Ｊ．Ｊｕｕｒｌｉｎｋ、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、７９、２６６〜２８２（２００１年））が挙げられる。これらはすべて、Ｎｒｆ２を活性化することに加えて、第２相酵素を誘導することも報告されてきた。しかしながら、Ｎｒｆ２活性化化合物は上記の食品中に低レベルで存在し、そのため、大量の天然源材料が顕著な量のＮｒｆ２活性化化合物を抽出するのに必要とされるであろう。クルクミン、レスベラトロール、スルフォラファン及びクェルセチンの非常に低い水溶解度は、それらの生物学的利用能を冒す。したがって、Ｎｒｆ２を活性化する更なる化合物、特に、天然源から顕著な量で得ることができる化合物及び良好な水溶性を有する化合物を同定する必要が依然としてある。
【００１５】
Ｎｒｆ２は、第２相酵素の誘導を媒介することが知られている。したがって、本発明者らは、肝臓の第２相酵素をコードする遺伝子の発現を４−オキソ−２−ペンテン酸が刺激するかを調査した。本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸が、次の第２相酵素の肝臓細胞（肝細胞）中での遺伝子発現を活性化したことを見出した：ヘムオキシゲナーゼ１、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼキノン１、グルタチオン還元酵素、グルタミン酸システインリガーゼ、グルタチオンＳ−転移酵素及びＵＤＰ−グルクロノシル転移酵素。
【００１６】
肝臓の第２相酵素の不十分な活性は、環境過敏症、薬物不耐症、肝臓の病的解毒、慢性疲労症候群及び線維筋痛症等の障害に関連付けられてきた。４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物は、これらの障害を処置する方法を提供する。
【００１７】
転写因子核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の阻害は、急性及び慢性の肝臓傷害を予防することが示されてきた（Ｐ．Ｍｕｒｉｅｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、２９、９１〜１００（２００９年））。ＮＦ−κＢは、慢性免疫応答及び炎症性疾患における枢要な転写因子である（Ｐ．Ｊ．Ｂａｒｎｅｓら、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３３６、１０６６〜１０７８（１９９７年））。ＮＦ−κＢは、サイトカイン、タンパク質キナーゼＣ活性化剤、ウイルス、免疫刺激、及びとりわけ反応性酸素種を含む、数多の刺激により活性化される（Ｆ．Ｌｕｆｔ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、３、６１〜６７（２００１年））。ＮＦ−κＢは、Ｒｅｌタンパク質のホモ二量体及びヘテロ二量体から成る。優勢なトランス活性化形態のＮＦ−κＢは、ｐ６５及びｐ５０ヘテロ二量体から成る。ＮＦ−κＢの活性化は、リン酸化、及び後続する特異的ＩκＢキナーゼによる抑制性タンパク質ＩκＢのタンパク質分解を伴う。遊離したＮＦ−κＢは核に入り込み、炎症に関与する数多の遺伝子のプロモーター領域のκＢ部位に結合する。
【００１８】
グルココルチコイド（Ａｄｃｏｃｋら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２６８、Ｃ３３１〜Ｃ３３８（１９９５年））等、ＮＦ−κＢの阻害剤が同定されてきたが、グルココルチコイドは、全身的に与えられた場合にエンドクリン及び代謝性副作用をもたらす。ヘパリンもＮＦ−κＢを阻害することが報告されたが（国際公開第２００１１９３７６号）、ヘパリン誘導血小板減少症を引き起こす、潜在的な副作用を有する。
【００１９】
本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸がＮＦ−κＢ活性化を阻害するかを調査した。炎症誘発性ストレス（ＬＰＳ及びｒｈＴＮＦ−α）にさらされたヒト結腸細胞及びヒト単球／マクロファージを用いたとき、本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸がＮＦ−κＢ活性化を阻害することを見出した。
【００２０】
本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸を天然源、例えばいくつかの熱処理された細菌菌株から得ることができることを見出して驚いた。例えば、ビフィドバクテリウム・ブレヴェ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）ＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５及びビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）の細菌調製物は両方とも、６時間９０℃で加熱されたときに４−オキソ−２−ペンテン酸を産生した。４−オキソ−２−ペンテン酸は、熱処理された細菌調製物を遠心分離及びろ過した後、可溶性画分の中にあることが見出された。
【００２１】
ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５を、ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ  ＮＡＴＩＯＮＡＬＥ  ＤＥ  ＣＵＬＴＵＲＥＳ  ＤＥ  ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＥＳ（ＣＮＣＭ）、ＩＮＳＴＩＴＵＴ  ＰＡＳＴＥＵＲ、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅ、２００７年１１月１５日によって沈着した。
【００２２】
ビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡから商標ＡＴＣＣ１５７００の下で購入することができる。
【００２３】
結果として、本発明は、肝臓障害の処置又は予防に使用するための４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物であって、医薬として使用されない組成物に部分的に関する。医薬は、薬局で調製又は調剤されて医療処置に使用される、薬物又は薬剤である（＜ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｔｈｅｆｒｅｅｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ．ｃｏｍ／ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ／＞［２０１２年７月１７日に検索済み］）。本発明は、肝臓障害の処置又は予防に使用するための４−オキソ−２−ペンテン酸を含む食品組成物であってよい。肝臓障害は、肝炎、肝線維症、胆汁うっ滞性肝疾患、炎症性肝臓傷害；薬物に誘導される肝毒性及びエタノールに媒介される肝毒性を含む生体異物毒性；肝性脳症、脂肪肝疾患、虚血再灌流肝臓傷害、肝不全、遺伝性高チロシン血症１型；肝炎、アフラトキシン及び化学的毒素に誘導される肝細胞癌を含む肝細胞癌；第１相に入り込む毒素の過度の過負荷と非効率的な第２相経路に起因する環境過敏症、薬物不耐症、慢性疲労症候群及び線維筋痛症；肝臓の病的解毒並びにこれらの組合せから成る群より選択することができる。これらの障害はすべて、酸化ストレス成分があるので、ＮＦ−κＢ阻害としばしば組み合わせられる肝臓でのＮｒｆ２活性化により処置することができる。例えば、４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物は、肝臓でのＮｒｆ２活性化により処置できる障害の処置又は予防に使用することができる。
【００２４】
肝炎は肝臓の炎症である。肝炎ウイルスとして知られた一群のウイルスは、世界の肝炎の大部分の事例を引き起こしているが、毒素、その他の感染及び自己免疫疾患にも起因することがある。
【００２５】
肝線維症は、肝臓での固い線維性瘢痕組織の蓄積を指し、肝臓の炎症又は肝臓への毒による直接的な攻撃の一結果である。
【００２６】
胆汁うっ滞は、胆汁が肝臓から十二指腸まで流れることができなくなった状態である。胆汁うっ滞は、多数の薬剤の副作用として起きることがある。Ｎｒｆ２活性化剤は、胆汁酸の蓄積により引き起こされる酸化ストレスを減少させるだけでなく、Ｂｓｅｐ（胆汁酸塩排出ポンプ（ｅｆｆｌｕｘ  ｐｕｍｐ））タンパク質の調節を介して有毒な胆汁酸を動かしやすくして排泄することも行うため、胆汁うっ滞性肝疾患の処置に有用であることが示されてきた。
【００２７】
肝臓細胞死は、炎症性応答をトリガーし得る。この炎症性応答に関して中心的なことは、反応性酸素種（ＲＯＳ）形成の促進である。炎症は、微生物感染及び組織外傷に対する自然免疫応答の極めて重要な部分である。しかしながら、過剰な炎症性応答は、炎症性肝臓傷害につながる恐れがある。
【００２８】
いくつかの化合物は、肝臓に有毒であり肝臓障害につながると判明することがある。このような肝臓毒の例には、リポ多糖、パラセタモール（アセトアミノフェン）アナボリックステロイド、いくつかの抗生物質及び糖質コルチコイド等の薬物、エタノール、ブロモベンゼン、四塩化炭素、チオアセトアミド、フロセミド、ファロイジン、ヒ素、ペンタクロロフェノール（ＰＣＢ）、ピラゾール、マレイン酸ジエチル、パラコート、コルヒチン、並びに過剰な量の鉄、マンガン、アルミニウム、水銀、カドミウム、ベリリウム及びヒ素等のいわゆる「重金属」が挙げられる。
【００２９】
肝性脳症は、通常肝臓から除去される有毒な物質が血流中に蓄積することにより引き起こされる、錯乱、意識レベル変調又は昏睡の発生である。
【００３０】
脂肪肝疾患は、トリグリセリド脂肪の大型液胞が脂肪症のプロセスにより肝臓細胞の中に蓄積（肝脂質蓄積）する状態である。複数の原因があるものの、脂肪肝は、世界中でアルコールを過剰に摂取している人々及び（インスリン抵抗性の影響がある又は影響がない）肥満の人々に起きる、単一の疾患だと考えることができる。脂肪の蓄積には、肝臓の進行性炎症が伴うこともある。アルコールの寄与に応じて、脂肪肝は、アルコール性脂肪肝疾患又は非アルコール性脂肪肝疾患（又はアルコール性脂肪症若しくは非アルコール性脂肪症）と呼ばれることがある。
【００３１】
再灌流傷害は、ある期間の虚血又は酸素の欠乏の後に血液供給が組織に戻ったときに引き起こされる、組織障害である。虚血再灌流肝臓傷害は、輸液蘇生が後続する、肝臓手術、移植及び出血性ショックを含むいくつかの臨床背景により起き、顕著な罹患率及び死亡率につながる。虚血再灌流肝臓傷害は、内因性抗酸化剤の消耗が伴う顕著な酸化ストレスを特徴とする。
【００３２】
肝細胞癌（悪性肝癌とも呼ばれている）は、最も一般的な種類の肝臓癌である。肝細胞癌の大部分の事例は、ウイルス性感染又は肝硬変のいずれかに続発する。肝細胞癌は、発展途上国圏の全域の人間用食料品に遍在する汚染物質である、アフラトキシンにさらされることにより引き起こされ得る。アフラトキシンにさらされると、Ｂ型肝炎ウイルスに慢性的に感染している人々の肝臓癌の危険性が倍に増える。肝細胞癌は、除草剤、塩化ビニル及びヒ素等の化学的毒素によっても誘導され得る。化学発癌は多因子的であるが、酸化ストレスは、細胞形質転換の主要な構成要素である。
【００３３】
肝不全は、肝臓が正常な合成機能及び代謝機能を正常な生理の一部として実施することができないことである。
【００３４】
チロシン血症１型は、肝腎チロシン血症としても知られ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼという酵素の欠損により引き起こされる。
【００３５】
肝臓の病的解毒は、第１相解毒経路と第２相解毒経路とが均衡しておらず、第２相に対して第１相が増大している状態を指す。環境過敏症、薬物不耐症、慢性疲労症候群及び線維筋痛症は、第１相に入り込む毒素の過度の過負荷と非効率的な第２相とに起因し得る。環境過敏症又は多種化学物質過敏症は、個人が環境化学物質又はある種の外来性化学物質に耐えることができないことにより引き起こされる、慢性再発性疾患である。慢性疲労症候群は、継続中の労作に起因しておらず、安静により実質的に軽減されず、その他の医学的状態により引き起こされてもいない、その他の特定の症状が最低６か月間伴う持続性疲労により一般に規定されている、顕著に衰弱させる医学的障害又は一群の障害である。慢性疲労症候群は、筋痛性脳脊髄炎、ウイルス感染後疲労症候群又は慢性疲労免疫機能障害症候群とも呼ばれることがある。線維筋痛症は、圧力に対する疼痛を伴う応答の強大化である、広範囲に及ぶ慢性の疼痛及び異痛症を特徴とする、医学的障害である。上述したすべての肝臓障害の処置又は予防に使用するための組成物を提供することは、有利である。
【００３６】
本発明は、肝臓の第２相酵素の不十分な活性に関連付けられた障害の処置又は予防に使用するための、４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物を提供する。本発明の範囲内の「第２相酵素の不十分な活性」は、第２相解毒経路が正常で健常に機能することを達成又は維持するのに不十分な活性、かき乱された第１相解毒経路のレベルを適正に均衡若しくは補償するのに不十分な活性、並びに／又は薬物、プロドラッグ及び毒素を含む生体異物の処理を介して慢性疾患を制御、低減若しくは予防するのに不十分な活性を含む。
【００３７】
第２相酵素は、ヘムオキシゲナーゼ１、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼキノン１、グルタチオン還元酵素、グルタミン酸システインリガーゼ、グルタチオンＳ−転移酵素、ＵＤＰ−グルクロノシル転移酵素及びこれらの組合せから成る群より選択することができる。これらの第２相酵素の不十分な活性に関連付けられた障害を処置又は予防できるようにすることは、有利である。
【００３８】
ヘムオキシゲナーゼ（Ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ又はｈａｅｍ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ）は、ヘムの分解を触媒する酵素である。ヘムオキシゲナーゼは、ビリベルジン、鉄及び一酸化炭素を生成する。３つの公知のヘムオキシゲナーゼのアイソフォームがある。ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）は、酸化ストレス、低酸素症、重金属及びサイトカイン等のストレスに応答して誘導され得るアイソフォームである。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼキノン１（Ｎｑｏ１）は、細胞質ゾルフラビンタンパク質である。Ｎｑｏ１は、超過酸化物を掃除することにより細胞内酸化ストレスを防ぐことに加えて、内因性及び外因性の化学物質の二電子還元性代謝及び解毒も触媒する。グルタチオン還元酵素（Ｇｓｒ）は、グルタチオンジスルフィドを細胞における重要な抗酸化剤のグルタチオンに還元する酵素である。グルタミン酸システインリガーゼ（ＧＣＬ）は、グルタチオン生合成経路の最初の酵素である。ＧＣＬにより、グルタチオン合成の律速段階が実施される。ＧＣＬは、２つのタンパク質：触媒特性のすべてを有するグルタミン酸システインリガーゼ触媒サブユニット（Ｇｃｌｃ）と、Ｇｃｌｃの触媒効率を増大させるグルタミン酸システインリガーゼ調節サブユニット（Ｇｃｌｍ）とから成る、ヘテロ二量体酵素である。グルタチオンＳ−転移酵素（Ｇｓｔ）ファミリーの酵素は、多数の細胞質ゾルタンパク質、ミトコンドリアタンパク質及びミクロソームタンパク質から成る。Ｇｓｔ酵素は、グルタチオンによる化学物質及び求電子性種のコンジュゲーションを触媒する。これらのコンジュゲートは、続いてメルカプツレートに分解され、身体から排泄される。ＵＤＰ−グルクロノシル転移酵素（ＵＧＴ）酵素は、第２相解毒経路の主要部分である、グルクロン酸による外因性及び内因性の化学物質のコンジュゲーションを触媒する。
【００３９】
本発明の組成物は、肝臓における第１相酵素の活性が増大している及び／又は肝臓における第２相酵素の活性が低減している対象に有利に投与することができる。第１相酵素の活性と第２相酵素の活性は通常、第２相酵素がコンジュゲートして除去することになる反応性中間体を第１相酵素が生成することによって均衡すべきである。対応して第２相酵素が増大することなく増大した第１相酵素の活性、又は低減された第２相酵素の活性は、この均衡を狂わせ、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質への損傷を引き起こし得る、より高いレベルの反応性中間体につながる。増大した第１相酵素の活性は、例えば、タバコの煙の多環式炭化水素及び高温でグリルした肉のアリールアミンにより引き起こされ得る。これらは、Ｃｙｐ１Ａ１及びＣｙｐ１Ａ２酵素を誘導し、第２相酵素の誘導がほとんどない又は全くない第１相活性の大幅な増大につながる。第２相酵素の阻害の一般的な機構は、必須補因子の消耗である。ヒトにおいて、硫酸化は、補因子状態が損なわれることによる阻害に特に影響されやすい。硫酸塩貯蔵量は、硫黄含有アミノ酸又は無機硫酸塩の食事による摂取を介して維持しなければならない。第１相酵素活性と第２相酵素活性との不均衡は、第２相酵素経路を活性化する組成物を投与することにより相殺することができる。
【００４０】
肝臓での毒素装入の増大は、系を簡単に打ち負かし、解毒酵素活性に関して競合することにより、解毒の阻害につながる恐れがある。第１相解毒経路及び第２相解毒経路が装入過多になったならば、体内に毒素の蓄積があることになる。これらの毒素の多くは脂溶性であり、身体の脂肪部分に取り込まれて数年間留まることがある。脳及び内分泌腺は脂肪器官であり、脂溶性毒素が蓄積する一般的な部位でもある。これにより、脳機能障害の症状及びホルモンの不均衡が生じる恐れがある。したがって、本発明が、肝臓解毒を必要としている対象に投与される、４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物をも提供することが有利である。
【００４１】
過体重又は肥満は、我々の今日の共同体における顕著な重荷を代表している、周知の障害である。「過体重」は、成人のヒトが２５〜３０のボディマス指数（ＢＭＩ）を有することだと規定されている。「ボディマス指数」は、メートル単位でのヒトの身長の二乗でｋｇ単位でのヒトの体重を割った比として計算される。
【００４２】
「肥満」は、動物、特にヒト及びその他のほ乳類の脂肪組織に貯蔵された天然のエネルギー貯蔵量が、特定の健康状態又は増大した死亡率が伴う程度にまで増大した状態である。「肥満の」は、成人のヒトが３０超のＢＭＩを有することだと規定されている。
【００４３】
脂肪肝疾患は、個体群における肥満及び２型糖尿病の発生増大に関する慢性肝疾患の最も重要な原因として台頭しつつある。非脂肪組織は、トリアシルグリセロール貯蔵用の容量が限定されており、栄養過剰の条件下では、過度の脂質が蓄積し、脂肪毒性として知られた応答である細胞機能障害及び／又は細胞死をトリガーし得る高レベルの飽和脂肪酸を決定付ける。この現象は、反応性酸素種レベルの上昇を伴う。とりわけ、こうした酸化還元の不均衡は、顕著なグルタチオン消耗を特徴とする（Ｌ．Ａ．Ｖｉｄｅｌら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１２、５５５〜５５８（２００６年））。グルタチオンの形成は、第２相酵素の活性化により促進され、Ｎｒｆ２活性化剤は、高脂肪食に誘導される肝脂質蓄積の増大を低減することが知られている（Ｓ．Ｓｈｉｎら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ６２０、１３８〜１４４（２００９年））。したがって、本発明が、過体重である及び／又は２型糖尿病を患っている対象に投与される、４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物をも提供することが有利である。
【００４４】
本発明では、４−オキソ−２−ペンテン酸を得ることができ、例えば天然源から得ることができる。多数の人々が、化学原料から工業的に合成される材料の安全性について懸念しており、これらの材料が摂取されることになる場合は特に、天然源から得られた材料を好んでいる。
【００４５】
驚くべきことに、本発明者らは、いくつかの系統の細菌が４−オキソ−２−ペンテン酸の天然源をもたらすことを見出した。特に、本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸をビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５又はビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）（ビフィドバクテリウム・ブレヴェの基準系統）から得ることができることを見出した。大量の４−オキソ−２−ペンテン酸の生成が例えば生物反応器を用いて実現可能であるとき、４−オキソ−２−ペンテン酸の天然供給源として細菌を使用することは、特に有利である。したがって、本発明では、４−オキソ−２−ペンテン酸が入手可能になり得、例えばビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５又はビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）から得られる。
【００４６】
細菌は、商業的な生成プロセスにより約６０〜１８０℃、好ましくは約８０〜１６０℃、例えば約１１０〜１５０℃で熱処理することができる。本発明者らは、これらの温度での熱処理が、許容される時間内で満足な収率の４−オキソ−２−ペンテン酸をもたらしたことを見出した。理論に拘束されることを望むわけではないが、熱処理の温度を増大させると、４−オキソ−２−ペンテン酸の形成の速度が増大するが、分解の速度も増大すると理解されている。したがって、これらの温度は、４−オキソ−２−ペンテン酸の形成の速度と分解との間に良好なバランスを与える。
【００４７】
４−オキソ−２−ペンテン酸を含む一般的な組成物は、少なくとも１ｍｇ／組成物１ｋｇの量で４−オキソ−２−ペンテン酸を含み得る。一般に、組成物が少なくとも１０ｍｇ／組成物１ｋｇの量で、例えば組成物１ｋｇ当たり５０ｍｇ〜５０ｇの量で４−オキソ−２−ペンテン酸を含むならば好ましい。
【００４８】
投与しようとする４−オキソ−２−ペンテン酸の最適量は、熟練技術者ならば容易に決定することができる。
【００４９】
治療用途では、組成物は、障害及び／又はその合併症の症状を少なくとも部分的に治癒又は停止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療有効用量」と規定されている。この目的に有効な量は、障害の重症度並びに患者の重量及び全身状態等、当業者に知られたいくつかの因子に依存する。予防用途では、本発明による組成物は、障害を進行させる危険性を少なくとも部分的に低減するのに十分な量で、特定の障害の危険性に影響されやすい又は危険性がある患者に投与される。このような量は、「予防有効用量」であると規定されている。さらに、正確な量は、患者の健康状態及び重量等のいくつかの患者特異的因子に依存する。
【００５０】
４−オキソ−２−ペンテン酸は、本発明の枠組みにおいて、治療有効用量及び／又は予防有効用量で投与することができる。組成物は、体重１ｋｇ当たり２μｇ〜２０ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸、好ましくは体重１ｋｇ当たり２０μｇ〜２ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸、例えば体重１ｋｇ当たり４０μｇ〜１ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸に対応する一日量で投与することができる。
【００５１】
肝臓障害は動物並びにヒトを冒し得、例えば、肝炎は動物における一般的な肝疾患である。ネコにおける最も一般的な肝臓障害の一種が、ネコ脂肪肝症候群としても知られたネコ肝リピドーシスである。小さい小型犬もまた、肝リピドーシスに感染しやすいことがある。脂肪肝疾患は、家畜、例えば乳牛及びニワトリにおいても一般的である。ヒトに対するのと類似した方法により、動物の肝臓を損傷し得る多数の毒素があり、パラセタモール、アスピリン、アナボリックステロイド、化学療法薬物、いくつかの抗生物質、糖質コルチコイド、麻酔剤、寄生虫防除剤及びフェニルブタゾン等の薬物が挙げられる。いくつかの肝臓障害に特に影響されやすくなることにつながる、代謝機構の差異が種の間に存在する。例えば、ネコは、第２相酵素のグルクロニル転移酵素のいくつかの型を欠いているため、モルヒネ及びフェノール等の化合物をコンジュゲートする能力が損なわれている。イヌは、糖質コルチコイド薬物に特に敏感であり、複数回投与療法後に肝臓で典型的な病変を発生する。
【００５２】
したがって、ヒト、ペット又は家畜に投与される組成物を提供することは利点である。伴侶動物の場合、このような療法は、動物の総合的な生活の質を改善し、所有者の満足を向上させ、所有者と伴侶動物との絆を向上させる。本発明の一実施形態は、ヒト、ペット又は家畜に投与される組成物を提供する。
【００５３】
組成物の性質は特に限定されない。組成物は、経口投与又は経腸投与用の組成物であってよい。組成物は、例えば、食品組成物、食品添加剤、機能性食品、飲料、栄養製剤、経管製剤、牛乳又は水中で再構成すべき粉末状組成物、及びペット食品組成物から成る群より選択することができる。
【００５４】
本発明による食品組成物は特徴が多様であり、例えば、牛乳、ヨーグルト、チーズ、発酵乳、牛乳を主体とする発酵製品、アイスクリーム、穀類を主体とする製品又は発酵した穀類を主体とする製品、牛乳を主体とする粉末、チルドした飲物又は常温保存可能な飲物、菓子類、動物飼料、特に飼育動物用の動物飼料である。
【００５５】
食品組成物は、タンパク質源、炭水化物源、脂質源、ミネラル源及び／又はビタミン源をさらに含んでいてもよい。タンパク質、炭水化物、脂質、ミネラル及び／又はビタミンの存在は、いくつかの利点を有することがある。これらの化合物は、最終製品の味及び口触りに一般に寄与する。これらの化合物は、身体が肝臓障害に冒されたとき、緊急に必要になることがある栄養素を身体に供給することもする。これらの化合物は、完全栄養処方としての本発明の組成物の配合も可能にし、その結果、更なる栄養が必要にならない。
【００５６】
水溶性の化合物には、液剤として経口投与することを含めて、いくつかの方法により好都合に投与されるという利点がある。４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物は、水を主体とすることができ、例えば組成物は、水に溶解した４−オキソ−２−ペンテン酸を含んでいてよい。
【００５７】
当業者ならば、明細書で開示されている本発明のすべての特徴を自由に組み合わせることができることは理解されよう。特に、本発明の異なる実施形態について説明した特徴は、組み合わせることができる。本発明の更なる利点及び特徴は、下記の図及び非限定的な例から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）の粗調製物の正規化したルシフェラーゼ活性（ＯＤ５０、６時間９０℃で加熱）を示す図である。結果は、技術的トリプリケートの平均±ＳＤとしてｙ軸に表されている。ｘ軸値は、試料の最終希釈物である。
【図２】ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５の粗調製物の正規化したルシフェラーゼ活性（ＯＤ５０、６時間９０℃で加熱）を示す図である。結果は、技術的トリプリケートの平均±ＳＤとしてｙ軸に表されている。ｘ軸値は試料の最終希釈物である。
【図３】Ｎｒｆ２誘導倍率（棒）と、０〜２００μＭの４−オキソ−２−ペンテン酸の用量範囲によってインキュベートしたＡＲＥｃ３２細胞の細胞生存率％（線）とを示す図である。Ｎｒｆ２誘導倍率は、４−オキソ−２−ペンテン酸の存在下でのＡＲＥｃ３２ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）と、さらされなかった細胞の基礎ルシフェラーゼ活性との比である。ＡＴＰ定量化により測定した細胞生存率は、対照（無処理）細胞の相対的な百分率として表されている。結果は、技術的トリプリケートの平均±ＳＤとして表されており、４回の独立した実験の代表である。
【図４】は、Ｎｒｆ２誘導倍率（棒）と、２．５〜５０％ｖ／ｖのビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５の「純粋調製物」の用量範囲によってインキュベートしたＡＲＥｃ３２細胞の細胞生存率％（線）とを示す図である。その他の詳細は図３と同様である。
【図５】ある用量範囲の４−オキソ−２−ペンテン酸によって２４時間インキュベートした肝細胞中の第２相酵素に関する、遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイルを示す図である。結果は、技術的デュプリケートで実施した２回の実験の代表であり、平均±ＳＤとして表されている。
【図６】ＬＰＳによって刺激されたＨＴ−２９クローン３４細胞の上澄み中で測定した、ＳＥＡＰ（中実な棒）及びＩＬ−８（縞が入った棒）の生成により見積もった、ＮＦ−κＢ活性を示す図である。細胞生存率は、線で示されている。細胞は、ある用量範囲の４−オキソ−２−ペンテン酸にさらされた。結果は、技術的トリプリケートにより実施した、２回の独立した実験の平均±ＳＤとして表されている。
【図７】ある用量範囲の４−オキソ−２−ペンテン酸の存在下での２４時間にわたる、ＬＰＳ刺激した（０．５μｇ／ｍｌ）ＴＨＰ−１青色細胞のＮＦ−κＢ活性（棒）及び細胞生存率（線）を示す図である。結果は、技術的トリプリケートにより実施した、２回の独立した実験の平均±ＳＤとして表されている。
【図８】水に溶解した４−オキソ−２−ペンテン酸標準物質の一般的なクロマトグラムを示す図である。ｍ／ｚ  １１３→６９の遷移反応に伴うＳＲＭが高くなるほど、一方では、ｍ／ｚ  １１３→４１の遷移反応に対応するＳＲＭが低くなる。保持時間は、分により表されている（ｘ軸）。信号強度（ｙ軸）は、Ｃｐｓにより表されている。
【図９】９０℃（円○（円）で示している）、１２０℃（三角△（三角）で示している）及び１４０℃（四角□（四角）で示している）で２分、１５分、３０分及び６０分加熱した、ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５（ＯＤ４０）の粗調製物のＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いた、４−オキソ−２−ペンテン酸定量化を示す図である。
【００５９】
実施例１：４−オキソ−２−ペンテン酸及び細菌画分によるＮｒｆ２活性化
Ｎｒｆ２レポーターアッセイ
Ｎｒｆ２の活性化を、Ｎｒｆ２レポーターアッセイを用いて測定した。このアッセイは、ＡＲＥの制御下のルシフェラーゼ遺伝子構築体を含む安定にトランスフェクションしたＭＣＦ７（乳腺癌）細胞株である、ＣＲＸ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｄｕｎｄｅｅ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）製のＡＲＥｃ３２細胞株に基づいている。ルシフェラーゼは、ルシフェリンを基質として作用して蛍光を生成する酵素である。Ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）等の抗酸化性分子は、ＡＲＥに結合しているＮｒｆ２の活性化によりルシフェラーゼ転写を誘導する。ルシフェラーゼ活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）製のルシフェラーゼキットを用いて測定する。ルシフェラーゼ活性は、Ｎｒｆ２の活性化に比例する。
【００６０】
細菌画分によるＮｒｆ２活性化
３つの細菌菌株を使用して、微生物：ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５（ＮＣＣ２９５０）、ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３９１４（ＮＣＣ４６６）及びビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）（ＮＣＣ２７９１）によるＮｒｆ２の活性化を調査した。ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３９１４を、ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ  ＮＡＴＩＯＮＡＬＥ  ＤＥ  ＣＵＬＴＵＲＥＳ  ＤＥ  ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＥＳ（ＣＮＣＭ）、ＩＮＳＴＩＴＵＴ  ＰＡＳＴＥＵＲ、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅ、２００８年２月５日によって沈着した。
【００６１】
各系統において、０．０５％システインを有する１０ｍｌのＭＲＳ寒天に２０μｌのグリセロールストックを播種し、嫌気性条件下３７℃で一晩インキュベートして、前培養物を形成した。次いで更なる培養物を、１０ｍｌのＭＲＳに０．０５％システインを前培養物と一緒に播種することにより作製した（０．１において最終的ＯＤ６００を調節した）。培養物を嫌気性条件下１６時間３７℃でインキュベートして、Ｐ２培養物を形成した。０．０５％システインを有する２００ｍｌのＭＲＳにＰ２培養物（０．１において最終的ＯＤ６００を調節した）を播種し、ボトルを嫌気性条件下１６時間３７℃でインキュベートした。
【００６２】
ＯＤ６００を測定し、培養物を３３００ｇにおいて１０分遠心分離し、細菌ペレットを冷たい１×  ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で２回洗浄して、１×  ＰＢＳによってＯＤ５０に正規化した。
【００６３】
各細菌菌株について２つの方法により細菌画分：「粗調製物」及び「純粋調製物」を得た。
【００６４】
細菌「粗調製物」を次のようにして得た。５ｍｌのＯＤ５０細菌調製物を、加熱ブロック（Ｔｅｃｈｎｅ、Ｓｔａｆｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ製のＤｒｉ−Ｂｌｏｃｋ  ＤＢ−３加熱ブロック）中で、６時間９０℃で加熱した。加熱した細菌調製物を、３３００ｇにおいて１０分＋４℃で遠心分離し、上澄みを、０．２２μｍシリンジフィルターを用いてろ過し、更なる分析まで＋４℃で貯蔵した。
【００６５】
細菌「純粋調製物」を次のようにして得た。５ｍｌのＯＤ５０細菌調製物を、３３００ｇにおいて１０分＋４℃で遠心分離し、細菌ペレットを、５ｍｌの水によって再懸濁した。細菌細胞を、冷蔵室内でｍｉｎｉ  ｂｅａｄ  ｂｅａｔ（ＭＢＢ）装置を用いて粉砕した（最大速度における９０秒の６サイクル、各サイクル間には１０分の中断）。粉砕した細胞を、１時間３３００ｇにおいて＋４℃で遠心分離し、ペレットを、５ｍｌの１×  ＰＢＳによって再懸濁し、加熱ブロック中で、６時間９０℃で加熱した。加熱した調製物を１０分３３００ｇにおいて＋４℃で遠心分離した。上澄みを、０．２２μｍシリンジフィルターを用いてろ過し、更なる分析まで＋４℃で貯蔵した。
【００６６】
「ＯＤ５０懸濁液」の生存細菌数を、スポット法を用いた平板培養により測定し、乾燥重量を、下記の設定にしたハロゲン水分分析器（Ｍｅｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ、Ｇｒｅｉｆｅｎｓｅｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定した：乾燥温度１６０℃、段階乾燥は作動する。
【００６７】
Ｎｒｆ２活性化を測定するために、試料は、１０個の独立した希釈物（１／２、１／４、１／６、１／１０、１／１５、１／２０、１／２５、１／３０、１／４０及び１／５０）を用いてＡＲＥｃ３２細胞（９６ウェルプレートに蒔いた）において試験し、５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で、２４時間３７℃でインキュベートした。ルシフェラーゼ活性及び細胞生存率（ＡＴＰ測定）を、ルシフェラーゼ及びＰｒｏｍｅｇａ製のＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏキットを用いて測定した。
【００６８】
各試行において、相対発光単位（ＲＬＵ）により測定したすべてのウェルのルシフェラーゼ活性を、すべてのプレートの細胞のみのルシフェラーゼ活性の平均によって正規化した。とりわけ、正規化手順により試験された全ての試料は、データに影響しないことが見出されており、この観察は、異なる試行において測定した試料の比較を可能にしている。
【００６９】
各試料において、Ｎｒｆ２活性化を次のようにして計算した。
【００７０】
１）Ｎｒｆ２誘導倍率
【数１】
2015518371.tif 000004
【００７１】
Ｎｒｆ２誘導倍率は、選別目的に非常に有用である。しかしながら、Ｎｒｆ２誘導倍率は、試料希釈物を考慮に入れていないため定性的測定のみである。
【００７２】
２）試料当たりルシフェラーゼ含量
【数２】
2015518371.tif 000005
【００７３】
「試料当たりルシフェラーゼ含量」は、Ｎｒｆ２活性化も反映するが、この計算が試料希釈物を考慮に入れているため、類似したＮｒｆ２誘導倍率でＮｒｆ２を活性化する２つの試料を区別することができる。試料当たりルシフェラーゼ含量は、Ｎｒｆ２を活性化する分子の量を反映することにより、Ｎｒｆ２活性化の半定量化を可能にする。
【００７４】
【表１】
2015518371.tif 000006
【００７５】
【表２】
2015518371.tif 000007
【００７６】
表Ａ及び表Ｂに示したように、Ｂ．ブレヴェ  ＡＴＣＣ１５７００（商標）とＢ．ブレヴェ  ＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５の粗調製物は両方とも、最大Ｎｒｆ２誘導（Ｎｒｆ２  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）は類似しているが、ルシフェラーゼ含量／試料値は異なる。試料当たりルシフェラーゼ含量値の差異は、それらの対応するＮｒｆ２活性化パターン（図１及び図２を参照されたい）を反映している。
【００７７】
一方、ビフィドバクテリウム・ブレヴェ  ＣＮＣＭ  Ｉ−３９１４は、Ｎｒｆ２を顕著に活性化しておらず、比較表Ｃを参照されたい。
【００７８】
【表３】
2015518371.tif 000008
【００７９】
【表４】
2015518371.tif 000009
【００８０】
４−オキソ−２−ペンテン酸によるＮｒｆ２活性化
４−オキソ−２−ペンテン酸（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ−照合番号Ｌ０２１８５）を、Ｎｒｆ２レポーターアッセイにより試験した。異なる用量の４−オキソ−２−ペンテン酸を、２４時間かけてＡＲＥｃ３２細胞に施用し、次いでルシフェラーゼ活性を上述したようにして定量化した。細胞生存率も、細胞Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏキット（ＡＴＰ定量化）を用いて測定した。
【００８１】
図３に示したように、４−オキソ−２−ペンテン酸分子は、用量に依存した方法でＮｒｆ２を強く活性化することが見出された。ＡＲＥｃ３２細胞の生存性は、７０μＭ未満の用量の４−オキソ−２−ペンテン酸により冒されなかった。Ｎｒｆ２活性化の最適な用量は、約４０〜５０μＭであった。比較用に、図４は、ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５の細菌画分が類似した方法でＮｒｆ２を活性化することを示している。
【００８２】
実施例２：肝臓の中での第２相酵素をコードする遺伝子の発現の刺激
肝細胞を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラット（１９０〜２４０ｇ）から肝潅流により単離した。細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ）、１％ＩＴＳ＋、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）及び２５ｎＭ  デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）を追加した、２．５ｍｌのウイリアムスＥ培地の中に、２５０００００細胞／皿（６ｃｍ）で蒔いた。一晩のインキュベーション後、培地を取り除き、検体を含む２．５ｍｌの新鮮な培地を加えた。皿を５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で、２４時間３７℃でインキュベートした。
【００８３】
インキュベーションの終了時、細胞上澄みを、細胞生存率の指標であるＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）測定用に回収した。細胞を、２．５ｍｌの冷たいＰＢＳ  １Ｘで１回洗浄し、次いでペトリ皿から擦って取り外した。次いで細胞を１．５ｍｌエッペンチューブに移し、１分間４℃において７０００ｇで遠心分離した。
【００８４】
ＲＮＡ抽出用の細胞溶解物を、４００μｌのＲＮＡ溶解緩衝液（１％ｖ／ｖ  β−メルカプトエタノールを有するＲＡ−１）を細胞に加え激しく混合する（ボルテックス）ことにより得た。全ＲＮＡを、２０分のＤＮＡＳＥ処置及び６０μｌの溶出容量というわずかな変更を加えた製造業者の指示に従って、細胞溶解物から抽出した（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡ２キット、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００８５】
全ＲＮＡを、Ｒｉｂｏｇｒｅｎキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）を用いて定量化し、品質を、Ｂｉｏｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いたキャピラリー電気泳動により見積もった。
【００８６】
逆転写反応を、ランダムヘキサマープライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の逆転写試薬）の存在下で、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素を用いて実施した。遺伝子発現の定量化を、あらかじめ設計しておいたＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。各ｑＰＣＲ反応は、５０ｎｇのｃＤＮＡについて技術的デュプリケートで行った。２つのハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ及びβアクチン）の算術平均を、正規化のために使用した。
【００８７】
ｍＲＮＡ遺伝子発現の計算は、△△Ｃｔ方法に基づいている：
正規化したｍＲＮＡ発現＝２−△Ｃｔ×Ｆ
△Ｃｔ＝Ｃｔ（ｇｏｉ）−平均ＣＴ（ｈｋ）
Ｆ＝１００００００（妥当な数を得るのに用いる固定係数）
ｇｏｉ＝対象遺伝子
ｈｋ＝ハウスキーピング遺伝子
【００８８】
【表５】
2015518371.tif 000010
【００８９】
図５に見られるように、４−オキソ−２−ペンテン酸は、肝臓の第２相酵素遺伝子：ヘムオキシゲナーゼ１、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼキノン、グルタチオンシンテターゼ、グルタミン酸システインリガーゼ触媒サブユニット、グルタチオン−Ｓ−転移酵素及びＵＤＰ−グルクロノシル転移酵素（ＵＧＴ）を増大させた。グルタチオンペルオキシダーゼ１、グルタチオンペルオキシダーゼ２及びグルタチオンシンテターゼの発現レベルは、４−オキソ−２−ペンテン酸の存在に影響されなかった。ＬＤＨ測定は、細胞生存率が影響されなかったことを示していた。
【００９０】
結果として、提供されたデータにより、本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸を肝臓の第２相酵素の不十分な活性に関連付けられた障害の処置又は予防のために使用することができると結論できる。
【００９１】
実施例３：４−オキソ−２−ペンテン酸（抗炎症性効果）によるＮＦ−κＢ活性化の阻害
本発明者らは、炎症誘発性ストレス（ＬＰＳ及びｒｈＴＮＦ−α）下でＮＦ−κＢ活性化を阻害する、４−オキソ−２−ペンテン酸の能力を見積もった。２つのインビトロ系：ヒト結腸細胞（ＨＴ−２９クローン３４）及びヒト単球／マクロファージ（ＴＨＰ−１青色細胞）を使用した。
【００９２】
ＨＴ−２９クローン３４
ヒト結腸腺癌腫ＨＴ−２９クローン３４細胞株（継代４２〜５０）は、ＮＦ−κＢ／ＳＥＡＰレポータープラスミドを安定にトランスフェクションした、粘着細胞である。この粘着細胞を、１％の安定なＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養し、１０％の熱不活性化した（１時間５６℃）Ｆｏｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）及び５００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＰＡＡ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）を５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で、３７℃で追加した。培地は、細胞単層が約９０％集密に到達するまで、２日毎に新しくした。細胞は、１×  Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いて継代培養した。
【００９３】
１００００細胞／ウェルを、平底で縁無しの９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ、Ｋｒｅｍｓｍｕｅｎｓｔｅｒ、Ａｕｓｔｒｉａ）中の２００μｌの培地に蒔いた。培養の３〜４日後（すなわち、細胞が約７０〜８０％集密に到達した後）、培地を除去し、用量範囲の４−オキソ−２−ペンテン酸（３〜４００μＭ）を含む（又は含んでいない）１８０μｌの実験媒体（ＬＰＳ刺激のみのためのｓＣＤ１４及びＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）の供給源として５０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び５％の人乳を追加したＤＭＥＭ高グルコース）を細胞に加え、プレートを５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で、４時間３７℃で予備インキュベートした。ＬＰＳ０５５：Ｂ５又はｒｈＴＮＦ−α（それぞれ最終１００ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌ）を含む（又は含んでいない）２０μｌの実験媒体を加え、プレートを５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で、２４時間３７℃でインキュベートした。
【００９４】
次いで細胞培養上澄みを、Ｐｈｏｓｐｈａｌｉｇｈｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＩＬ−８シングルプレックス（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）キットをそれぞれ用いて、ＮＦ−κＢ活性の測定（分泌型アルカリホスファターゼ及びＩＬ−８生成の測定）のために収集した。
【００９５】
細胞生存率を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＡＴＰを測定することにより決定した。簡単に言うと、残留しているＨＴ−２９クローン３４粘着細胞を、１２０μｌのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（１×  ＰＢＳ中に２回予備希釈済み）と一緒に、水平方向に振とうしながら（２５０ｒｐｍ）１０分室温でインキュベートし、発光を、ゲイン値を３５００に設定してＰｏｌａｒｓｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ、Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１０００ミリ秒測定した。
【００９６】
ＬＰＳが存在しないとき、ＮＦ−κＢ活性は、試験した用量の４−オキソ−２−ペンテン酸と一緒にインキュベートしたＨＴ−２９クローン３４細胞の細胞培養上澄み中には観察されなかった（ＳＥＡＰ又はＩＬ−８検出に基づいている）。
【００９７】
ＨＴ−２９クローン３４細胞の細胞生存率の測定は、約５０μＭより高い４−オキソ−２−ペンテン酸の用量における、細胞生存率の減少を示した（図６）。
【００９８】
炎症応答がＬＰＳによりトリガーされる場合、４−オキソ−２−ペンテン酸は、用量に依存した方法でＮＦ−κＢ活性を阻害する（図６）。４−オキソ−２−ペンテン酸は、ＳＥＡＰとＩＬ−８の分泌の両方に影響し、最良の阻害は、５０μＭ  ４−オキソ−２−ペンテン酸）の場合であった。類似した結果は、それほど顕著ではないが、ｒｈＴＮＦ−αによって刺激した細胞にも観察された。
【００９９】
ＴＨＰ−１青色
ヒト単球／マクロファージＴＨＰ−１青色細胞（継代１６〜２０）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を、５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で３７℃において、１０％の熱不活性化ＦＣＳ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）及び５００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を追加した、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミン、４．５ｇ／Ｌのグルコース及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む改変ＲＰＭＩ培地（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中で培養した。
【０１００】
２０００００細胞／ウェルを、９６ウェル平底透明プレート中の１００μｌの培地に蒔いた。５％ＣＯ２／空気インキュベーター中の３７℃でのインキュベーションの２４時間後、用量範囲の４−オキソ−２−ペンテン酸（５〜２００μＭ）を含む（又は含んでいない）８０μｌの培地を細胞に加え、５時間３７℃で予備インキュベートした。ＬＰＳ０５５：Ｂ５（Ｓｉｇｍａ）（最終１００ｎｇ／ｍｌ）を含む（又は含んでいない）２０μｌの培地を加え、プレートを５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で、１６時間３７℃でインキュベートした。
【０１０１】
細胞培養上澄みを、分泌型アルカリホスファターゼのレベルに比例するＮＦ−κＢ活性測定のために、９６ウェルプレートに慎重に移した。簡単に言うと、１００μｌの上澄みを、９６ウェルプレート中で１５０μｌのＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合し、３７℃で３時間インキュベートしてから、Ｓｕｎｒｉｓｅマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて６２０ｎｍでＯＤを測定した。細胞生存率を、上述したようにしてＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏキットを用いて測定した。
【０１０２】
ＬＰＳによって刺激したとき、強いＮＦ−κＢ阻害が、約４０〜７５μＭの用量の４−オキソ−２−ペンテン酸に応答して得られた。４−オキソ−２−ペンテン酸は、７５μＭより高い用量では細胞に有毒である（図７）。
【０１０３】
ＨＴ−２９クローン３４細胞及びＴＨＰ−１青色細胞によって生じたデータは、４−オキソ−２−ペンテン酸が炎症誘発性ストレス下でＮＦ−κＢ活性化を阻害することを指し示している。
【０１０４】
実施例４：ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる４−オキソ−２−ペンテン酸の定量化
４−オキソ−２−ペンテン酸を定量化するために、高速液体クロマトグラフィーをエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法（ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）と結びつけるものである、高い処理能力の分析法を開発した。
【０１０５】
方法論
４−オキソ−２−ペンテン酸標準物質をＡｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ、ＵＳＡ）から購入した。ＨＰＬＣグレード水、メタノール及び酢酸をＬｉｃｈｒｏｓｏｌｖ（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＨＰＬＣバイアル及び２ｍｍインサートをＡｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）から購入した。４−オキソ−２−ペンテン酸は、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌまで水に可溶であることが見出された。４−オキソ−２−ペンテン酸標準物質化合物を水に可溶化して１０ｍｇ／ｍｌの最終的なストック溶液にし、水にさらに希釈して校正曲線を作成した。
【０１０６】
ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析を、３２００Ｑ  ＴＲＡＰ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に連結した乱流クロマトグラフィー（ＴＦＣ）システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により実施した。使用した分析カラムは、室温において６００μｌ／分の一定の流量で運転する、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入したＨｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄ  ＡＱ（３×５０ｍｍ、５μｍ）であった。移動相は、０．０５％酢酸を含む水である溶媒Ａと、０．０５％酢酸を含むメタノールである溶媒Ｂとによって構成されていた。グラジエントプログラムは、０分では０％Ｂで、４０秒（０〜０．６７分）間０％Ｂに保持し、１８０秒（０．６７〜３．６７分）で５０％Ｂに増大させ、１０秒（３．６７〜３．８３分）で５０〜９０％Ｂに増大させ、１２０秒（５．８３分）間９０％Ｂに保持し、０％Ｂに戻していく前に、さらに３００秒（５．８３〜１０．８３分）間保持するというものであった。注入体積は５μｌであった。
【０１０７】
ＭＳデータ取得は、エレクトロスプレー陰イオン化モードにより実現した。ＭＳ調節は、溶媒Ａ及び溶媒Ｂ（８０／２０のｖ：ｖ、０．６ｍｌ／分）から構成されるＨＰＬＣフローと混合した４−オキソ−２−ペンテン酸標準物質の溶液（５μｇ／ｍｌの水溶液）を、Ｔ型連結器を用いて１０μｌ／分の流量で注入することにより実施した。窒素を、噴霧器及びカーテンガス（ｃｕｒｔａｉｎ  ｇａｓ）のために使用した。界面加熱器（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｈｅａｔｅｒ）を作動させてブロックソース温度を７００℃に維持し、キャピラリー電圧を−４．５ｋＶに設定した。窒素は、媒体圧力選択における衝突気体としても使用した。ＭＳ／ＭＳ検出を、選択した反応監視（ＳＲＭ）取得モードを用いて実現した。２つの最も強烈なフラグメントイオンを、５０ｍｓの一定の滞留時間（１１０ｍｓの合計走査時間）を用いて、ｍ／ｚ  １１３→６９（１１ｅＶの衝突エネルギー）及びｍ／ｚ  １１３→４１（２６ｅＶの衝突エネルギー）を走査することにより選択した。脱クラスター化電圧を−２９Ｖに設定した。定量的分析は、最も強烈なＳＲＭ信号を用いて実施したが、２回目の遷移は、標準溶液から計算した適当な面積比に基づいた分析物確認のために使用した。データ処理は、Ａｎａｌｙｓｔ  １．５．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。
【０１０８】
ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＰＢＳ及び水中の４−オキソ−２−ペンテン酸の検出
４−オキソ−２−ペンテン酸を１×  ＰＢＳ又は水に可溶化し、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる検出を、上記の部分で説明したようにして実施した。ｍ／ｚ  １１３→６９の遷移反応に伴うＳＲＭは、１．２５分の保持時間における遷移ｍ／ｚ  １１３→４１に伴うＳＲＭに比較して、より強烈な信号を明らかにした。両方の遷移に関して類似した保持時間が、分析の妥当性を確認したときに観察された（図８）。分子４−オキソ−２−ペンテン酸を、１×  ＰＢＳ（データは図示せず）と水の両方で検出することに成功した（図８）。
【０１０９】
４−オキソ−２−ペンテン酸標準曲線の確立
細菌画分中の４−オキソ−２−ペンテン酸の量を正確に定量化するために、標準曲線を、１×  ＰＢＳ又はＨＰＬＣグレード水等の簡便な媒体中の４−オキソ−２−ペンテン酸に関して確立した。商業的な４−オキソ−２−ペンテン酸を、異なる用量で１×  ＰＢＳ及び水に懸濁した。次いでＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ法を使用して、見積もった用量の４−オキソ−２−ペンテン酸を定量化した。良好な線形性が、４−オキソ−２−ペンテン酸（０．１〜２５μｇ／ｍｌ）の量と、１×  ＰＢＳとＨＰＬＣグレード水の両方で得られた強度（ｃｐｓで表している）との間に観察された。
【０１１０】
細菌画分中の４−オキソ−２−ペンテン酸の定量化
４−オキソ−２−ペンテン酸を、実施例１の熱処理した細菌調製物中で定量化した。すべての試料を、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析前にＨＰＬＣグレード水に希釈した（３希釈物／試料）。結果は表Ｅに要約している。
【０１１１】
【表６】
2015518371.tif 000011
【０１１２】
実施例５：ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５からの４−オキソ−２−ペンテン酸の生成への加熱温度及び時間の影響
熱処理の際のビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５からの４−オキソ−２−ペンテン酸の生成を特性決定するために、様々な温度を用いて速度実験を実施した。この実験に使用したバイオマスの「マスターストック」は、嫌気性のｐＨ調整した条件下で、３７℃の生物反応器中でＭＲＳ培地によって生成した。増殖培養（１６時間）の後、培地を除去し、細胞を１×  ＰＢＳで２回洗浄し、１０％グリセロールを有する１×  ＰＢＳ中でＯＤ１３４（１．５Ｅ＋１０ｃｆｕ／ｍｌ）まで濃縮し、次いで５０ｍｌの一定分量にして−８０℃で貯蔵した。
【０１１３】
次いでビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５の「実用バイオマス（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｂｉｏｍａｓｓ）」を、次のようにしてバイオマスマスターストックから調製した。バイオマスを１×  ＰＢＳで２回洗浄し、１×  ＰＢＳ中でＯＤ４０に調節した。
【０１１４】
昇温装置（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｈｅａｔｉｎｇ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）（ＴＨＡ）を使用して、異なる加熱時間及び温度の効果を調査した。このシステムは、生成環境中に見出される一般的な装置の小型版である。蒸気を使用して、バイオマスのカートリッジを含む保持管を加熱する。９０℃、１２０℃及び１４０℃の試料温度を、最大６０分の期間をかけて施用した。次いで、熱処理した５ｍｌの各バイオマスを１０分５０００ｇで遠心分離し、上澄みをろ過し（０．２μｍ）、４−オキソ−２−ペンテン酸含量をＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより定量化した。生じた４−オキソ−２−ペンテン酸の量は、図９に示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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