(57)【要約】  本発明は、キノコからβ−グルカンを製造する方法に関する。本発明は、一次粗粉砕工程及び二次微粉砕工程を通じて微粒子化したキノコ粉末を製造して、これを超音波抽出及び熱抽出する一連の工程を通じて、高い収率でβ−グルカンを収得できるため経済的であり、既存のアルカリ処理抽出工程の問題点であるアルカリ中和工程及びこれによる環境汚染を解消することができる。したがって、本発明は、β−グルカンの製造に有用に使用でき、製造されたβ−グルカンは、医薬品、化粧品、健康機能食品及び食品の製造に有用に活用できる。【選択図】図１
2015535310.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）キノコを粉砕機で一次粉砕し、平均粒度５０〜１００μｍの粗粉砕粉末を得る段階と、
（ｂ）段階（ａ）の粗粉砕粉末を二次粉砕し、平均粒度１〜２０μｍの微粉砕粉末を得る段階と、
（ｃ）段階（ｂ）の微粉砕粉末に溶媒を加え、超音波処理して超音波抽出する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）の抽出物に１００〜１６０℃の熱を加え、熱抽出する段階と、
（ｅ）段階（ｄ）で収得した熱抽出物からβ−グルカンを分離する段階と、
を含むことを特徴とするキノコからβ−グルカンを製造する方法。
【請求項２】
前記キノコは、ハナビラタケ、ソウオウ、茶樹茸、スエヒロタケ、霊芝、カバノアナタケ、シイタケ及びマイタケからなる群から選択される請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記段階（ａ）のキノコは、乾燥処理し、水分含量が１〜８％（ｖ／ｗ）である請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記段階（ｂ）は、段階（ａ）の粗粉砕粉末を粉砕機で粉砕して得た微粒子粉末を空気分級機（ａｉｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）で分級し、平均粒度１〜１３μｍの微粉砕粉末を得る請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記空気分級機は、空気分級ホイール速度（ａｉｒ  ｃｌａｓｓｉｆｙｉｎｇ  ｗｈｅｅｌ  ｓｐｅｅｄ）７，０００〜２０，０００ｒｐｍの条件で運行される請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記一次粉砕は、ピンミル、ボールミル、インパクトミル、エッジランナーミル、ローラーミル、振動ボールミル、円錐形粉砕機、ハンマーミルまたはコロイドミルを使用して行い、前記二次粉砕は、ジェットミルまたはディスクミルを使用して行う請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
前記段階（ｅ）のβ−グルカンの分離は、
（ｅ−１）段階（ｄ）で収得した熱抽出物を遠心分離し、上澄み液を分離する段階と、
（ｅ−２）前記上澄み液にアルコール類を加えて、β−グルカン沈殿物を得る段階と、
（ｅ−３）前記沈殿物を分離する段階と、
を含む請求項１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キノコからβ−グルカンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−グルカン（β−ｇｌｕｃａｎ）は、グルコースがベータ結合を通じて三重の螺旋形を形成する高分子の多糖体であって、β−１，４結合あるいはβ−１，６結合の側鎖を有する。穀類やキノコから発見されるβ−グルカンは、β−１，３の主な構造に、β−１，４あるいはβ−１，６側鎖結合により水溶性を示す。
【０００３】
β−グルカンの生理活性効果としては、免疫活性、抗酸化活性、抗癌活性及び抗肥満効能などが報告されている。特に、日本及び米国を中心に、キノコ由来のβ−グルカンの抗癌効能が注目を集めている。β−グルカンの抗癌活性は、癌細胞を直接攻撃することによる非特異的免疫反応によって、大食細胞、自然殺害細胞及びＴ細胞などの免疫細胞の免疫機能を活性化し、癌細胞の増殖を抑制する。また、β−グルカンは、体内の血中コレステロール及びＬＤＬ−コレステロールの濃度を下げると同時に、ＨＤＬ−コレステロールの濃度を上げて、コレステロールの肝蓄積を抑え、かつ脂肪質の消化機能を低下させる効能が知られ、世界的に関心が高まっている。
【０００４】
キノコは、一般に医学的可能性を有した天然物として知られており、中国を始めとした東洋の国では、数百年間腫瘍を始めとした多様な疾患の治療に広く使用されてきた。キノコは、その種類によって抗腫瘍、抗菌及び抗ウイルス活性があると報告されている（非特許文献１参照）。種々のキノコの多糖類分画が抗癌効果に関与するという試験管内研究と生体研究が確立されている。
【０００５】
このようなキノコのうち、ハナビラタケ（Ｓｐａｒａｓｓｉｓ ｃｒｉｓｐａ）は、ヒダナシタケ目（Ａｐｈｙｌｏｐｈｏｒｅｌｅｓ）、ハナビラタケ属（Ｓｐａｒａｓｓｉｓ）に属するキノコであって、韓国、中国、日本、ヨーロッパ及び北アメリカなどの地に自生する。特に、ハナビラタケは、乾燥試料内に４０％以上の高いβ−グルカンを含有しており、薬用キノコ及びβ−グルカン供給源として認められている。ハナビラタケに含有されているβ−グルカンは、健康機能性の優れた１，３−β−グルカン構造が大部分を占めており、ハナビラタケから分離した１，３−β−グルカンの免疫増強及び抗癌効果が報告されている。したがって、ハナビラタケからβ−グルカンを効率的に抽出できる工程が望まれている。
【０００６】
植物体からβ−グルカンを抽出する方法として、特許文献１は、キノコ粉末を、水を利用して７０〜９９℃、ｐＨ１０〜１２で１５〜３０時間抽出する段階、及び前記段階で抽出された抽出物を、有機溶媒を用いて精製する段階を含む水溶性β−グルカンの製造方法を開示している。前記公開特許の製造方法は、キノコにアルカリを処理することを要旨としているが、これによると、アルカリ中和工程が必要であって、工程が複雑で、環境汚染の問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】大韓民国公開特許第２００９−０１２１８２４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｙｏｏｎ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１７，４３８−４４２（１９９４），Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７０，６９９−７０５（１９９７）
【０００９】
本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、キノコからβ−グルカンを効率的に抽出できる方法を開発するために鋭意研究した。その結果、粗粉砕したキノコ粉末を再び微粉砕して収得したキノコ微粉砕粉末に溶媒を加えた後、超音波抽出及び熱抽出する一連の工程を通じて、従来のアルカリまたは酵素処理抽出工程に比べて高い収率でβ−グルカンを抽出及び製造できることを知見し、本発明を完成した。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、キノコからβ−グルカンを製造する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記製造方法で製造されたβ−グルカンを提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一様態によると、本発明は、（ａ）キノコを粉砕機で一次粉砕し、平均粒度５０〜１００μｍの粗粉砕粉末を得る段階と、（ｂ）段階（ａ）の粗粉砕粉末を二次粉砕し、平均粒度１〜２０μｍの微粉砕粉末を得る段階と、（ｃ）段階（ｂ）の微粉砕粉末に溶媒を加え、超音波処理して超音波抽出する段階と、（ｄ）段階（ｃ）の抽出物に１００〜１６０℃の熱を加え、熱抽出する段階と、（ｅ）段階（ｄ）で収得した熱抽出物からβ−グルカンを分離する段階と、を含む、キノコからβ−グルカンを製造（または抽出）する方法を提供する。
【００１５】
本発明者らは、キノコからβ−グルカンを効率的に抽出できる方法を開発するために鋭意研究した。その結果、粗粉砕したキノコ粉末を再び微粉砕して収得したキノコ微粉砕粉末に溶媒を加えた後、超音波抽出及び熱抽出する一連の工程を通じて、従来のアルカリまたは酵素処理抽出工程に比べて高い収率でβ−グルカンを抽出及び製造できることを知見した。
【００１６】
本発明のキノコからβ−グルカンを製造する方法は、大いにキノコの微粉砕粉末を収得する第１工程、前記微粉砕粉末に溶媒を加えて超音波抽出及び熱抽出する第２工程、及び前記抽出物からβ−グルカンを分離する第３工程を含む。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の特徴及び利点を要約すると下記のようである：
（ｉ）本発明は、キノコからβ−グルカンを製造する方法を提供する。
（ｉｉ）本発明は、一次粗粉砕段階及び二次微粉砕段階を通じて微粒子化したキノコ粉末を製造して、これを超音波抽出及び熱抽出する一連の工程を通じて、高い収率でβ−グルカンを製造することができ経済的であり、かつ既存のアルカリ処理抽出工程の問題点であるアルカリ中和工程及びこれによる環境汚染の問題も解消することができる。
（ｉｉｉ）本発明は、β−グルカンの製造に有用に使用でき、製造されたβ−グルカンは、医薬品、化粧品、健康機能食品及び食品の製造に有用に活用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の実施例で行った種々のβ−グルカン抽出工程の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、詳細に説明する。
【００２０】
キノコ微粉砕粉末を収得する第１工程
本発明の第１工程では、キノコを微分化して表面積を増加させることにより、β−グルカンの抽出効率を極大化させる。具体的に、本発明の第１工程は、（ａ）キノコを粉砕機で一次粉砕し、平均粒度５０〜１００μｍの粗粉砕粉末を得る段階と、（ｂ）段階（ａ）の粗粉砕粉末を二次粉砕し、平均粒度１〜２０μｍの微粉砕粉末を得る段階とを含む。
【００２１】
本発明において、前記キノコは、β−グルカンを含有するキノコであれば特に制限なく使用できる。本発明の一具現例によると、前記キノコは、ハナビラタケ、ソウオウ、茶樹茸、スエヒロタケ、霊芝、カバノアナタケ、シイタケ及びマイタケからなる群から選択される１種以上のキノコである。一特定例によると、前記キノコは、ハナビラタケである。
【００２２】
本発明の一具現例によると、前記段階（ａ）のキノコは、粉砕効率を高めるために、粉砕の前に乾燥してもよい。前記乾燥は、当業界に知られた乾燥方法を制限なく使用でき、乾燥方法の例としては、常温常圧乾燥、熱風乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥及び回転式蒸発乾燥が挙げられる。一特定例によると、前記キノコは、水分含量が１〜８％（ｖ／ｗ）になるように乾燥処理される。
【００２３】
本発明の一具現例によると、前記一次粉砕は、ピンミル、ボールミル、インパクトミル、エッジランナーミル、ローラーミル、振動ボールミル、円錐形粉砕機、ハンマーミルまたはコロイドミルを使用して行うことができる。一特定例によると、前記一次粉砕は、ピンミルを使用して行う。
【００２４】
本発明では、一次粉砕処理された粗粉砕粉末を二次粉砕処理し、微粉砕粉末を得る。
【００２５】
本発明の一具現例によると、前記微粉砕粉末は、段階（ａ）の粗粉砕粉末を粉砕機で粉砕して得た微粒子粉末を空気分級機（ａｉｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）で分級して得ることができる。一特定例によると、前記微粉砕粉末は、１〜２０μｍの平均粒度を有して、他の特定例では、１〜１７μｍの平均粒度を有し、また他の特定例では、１〜１６μｍの平均粒度を有して、
また他の特定例では、１〜１５μｍの平均粒度を有し、また他の特定例では、１〜１４μｍの平均粒度を有して、
また他の特定例では、１〜１３μｍの平均粒度を有し、また他の特定例では、１〜１２μｍの平均粒度を有して、また他の特定例では、１〜１１μｍの平均粒度を有する。
【００２６】
本発明の一具現例によると、前記空気分級機の運転条件は、空気分級ホイール速度（ａｉｒ  ｃｌａｓｓｉｆｙｉｎｇ  ｗｈｅｅｌ  ｓｐｅｅｄ）７，０００〜２０，０００ｒｐｍである。一特定例によると、前記空気分級ホイール速度は、８，０００〜２０，０００ｒｐｍであり、他の特定例では、９，０００〜２０，０００ｒｐｍであって、また他の特定例では、１０，０００〜２０，０００ｒｐｍであり、また他の特定例では、１１，０００〜２０，０００ｒｐｍであって、また他の特定例では、１２，０００〜２０，０００ｒｐｍであり、また他の特定例では、１３，０００〜２０，０００ｒｐｍであって、また他の特定例では、１４，０００〜２０，０００ｒｐｍである。
【００２７】
本発明の一具現例によると、前記二次粉砕は、ジェットミルまたはディスクミルを使用して行うことができる。一特定例によると、前記二次粉砕は、ジェットミルを使用して行う。
【００２８】
本発明の他の一具現例によると、前記一次粉砕は、ピンミル、ボールミル、インパクトミル、エッジランナーミル、ローラーミル、振動ボールミル、円錐形粉砕機、ハンマーミルまたはコロイドミルを使用して行い、前記二次粉砕は、ジェットミルまたはディスクミルを使用して行うことができる。一特定例によると、前記一次粉砕は、ピンミルを使用して行い、二次粉砕は、ジェットミルを使用して行う。
【００２９】
超音波抽出及び熱抽出する第２工程
本発明の第２工程は、前記第１工程を通じて収得したキノコ微粉砕粉末から本格的にβ−グルカンを抽出する段階であって、超音波抽出する第１抽出工程及び熱抽出する第２抽出工程を含む。
【００３０】
本発明の超音波抽出（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、第１工程で収得したキノコ微粉砕粉末に抽出溶媒を加えた後、超音波抽出機で抽出する。超音波抽出は、超音波振動による空洞現象（ｃａｖｉａｔｉｏｎ）により非常に大きいエネルギーを発生して、局部温度により、周囲に位置する反応物粒子の運動エネルギーを大きくすることにより、反応に必要な十分なエネルギーと高い圧力を誘導し、混合効果を起こす。超音波抽出工程を利用すると、高い圧力により組織が破壊され、攪拌効果により拡散が容易に起こり、抽出時間の短縮、抽出収率の向上及び有用成分の安全溶出の効果が得られる。
【００３１】
超音波抽出機は、当業界に知られた超音波抽出機であれば制限なく使用でき、超音波抽出の時間は、抽出しようとする試料の量によって変わる。
【００３２】
その後、前記超音波処理して得た抽出物に高温の熱を加えて熱抽出する。熱抽出温度は、試料の量、試料の種類、超音波処理の条件及び時間などを考慮して調節することができる。
【００３３】
本発明の一具現例によると、前記熱抽出は、１００〜１６０℃で行うことができる。一特定例によると、前記熱抽出は、１００〜１５０℃で行い、他の特定例では、１００〜１４０℃で行って、また他の特定例では、１００〜１３５℃で行い、また他の特定例では、１００〜１３０℃で行って、また他の特定例では、１００〜１２５℃で行う。熱抽出する時間は、試料の量、試料の種類、熱抽出温度及び時間、超音波処理の条件及び時間などを考慮して調節することができ、通常的には、１〜１０時間が好ましく、一特定例では、１〜７時間、他の特定例では１〜５時間熱抽出する。
【００３４】
本発明の一具現例によると、前記キノコ微粉砕粉末に加えられる抽出溶媒として、水；メタノール、エタノール、ブタノール、核酸及びエチルアセテートなどの有機溶媒；または前記有機溶媒と水との混合溶媒を使用することができる。一特定例によると、前記抽出溶媒は、水である。前記抽出溶媒の適した量は、キノコ微粉砕粉末重量の１〜５０倍であり、一特定例では、１〜４０倍であって、他の特定例では、１〜３５倍である。
【００３５】
β−グルカンを分離する第３工程
本発明の第３工程は、前記第２工程を通じて収得したβ−グルカン含有抽出物（抽出溶液）からβ−グルカンを分離する段階である。
【００３６】
本発明において、β−グルカンの分離は、（ｉ）前記β−グルカン含有抽出物を、抽出溶媒に含有されているキノコ微粉砕粉末から分離すること、及び（ｉｉ）分離されたβ−グルカン含有抽出物を追加精製し、抽出物からβ−グルカンを分離することを含む。
【００３７】
本発明の一具現例によると、前記β−グルカンの分離は、第２工程で収得した熱抽出物を遠心分離し、上澄み液を分離する段階と、前記上澄み液にアルコール類を加えて、β−グルカン沈殿物を得る段階と、前記沈殿物を分離する段階とを含む。一特定例によると、前記アルコール類は、エタノールまたは酒精である。
【００３８】
本発明の一具現例によると、前記分離された沈殿物を乾燥処理し、粉砕及び均質化して、粉末状のβ−グルカンを製造することができる。前記乾燥処理は、常温常圧乾燥、熱風乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥または回転式蒸発乾燥方法を使用して実施することができる。
【００３９】
下記実施例で証明されたように、本発明は、キノコを微粒子化して微細な粉末にし、これに抽出溶媒を加えた後、超音波抽出及び熱抽出する一連の工程を通じて、従来のアルカリまたは酵素処理抽出方法に比べてβ−グルカンの抽出収率を著しく向上させることができる（表２参照）。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【００４１】
実験材料及び実験方法
１．実験材料
実験に使用した試料は、株式会社ハナバイオテックから購入した。ハナビラタケの粉砕効率を高めるために、熱風乾燥機を利用して３５℃で２４時間乾燥した。乾燥されたハナビラタケは、水分測定器ＭＢ４５（Ｏｈａｕｓ社製、スイス）を利用して水分含量を測定した。乾燥したハナビラタケをピンミル（Ｐｉｎ  ｍｉｌｌ、キョンチャン機械社製、韓国）で粗粉砕した後、流動化ジェットミル（ｆｌｕｉｄｉｚｅｄ  ｂｅｄ  ｏｐｐｏｓｅｄ  ｊｅｔ  ｍｉｌｌ、Ｍｏｄｅｌ  １００−ＡＦＧ、Ａｌｐｉｎｅ社製、ドイツ）を利用して、ＡＣＷＳ（ａｉｒ  ｃｌａｓｓｉｆｙｉｎｇ  ｗｈｅｅｌ  ｓｐｅｅｄ）８，０００ｒｐｍ条件で粉砕した。微粒子化されたハナビラタケ粉砕物は、空気分級システム（ａｉｒ  ｃｌａｓｓｉｆｙｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ，  Ｍｏｄｅｌ  ５０  ＡＴＰ、Ａｌｐｉｎｅ社製、ドイツ）を利用して、ＡＣＷＳを１０，０００〜１４，０００ｒｐｍの条件で分級した。
【００４２】
２．粒度別ハナビラタケ粉砕物からβ−グルカンの抽出
β−グルカン抽出工程は、図１に示した。粒度別ハナビラタケ粉砕物を２０ｇ定量して、蒸留水６００ｍｌ（キノコ粉砕物の３０倍）を加えた後、５分間攪拌（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｔｉｒｒｅｒ  Ｃ−ＭＡＧ  ＨＳ７、ＩＫＡ社製、ドイツ）した。アルカリ処理区は、蒸留水の代わりにアルカリ溶液（１Ｍ  ＮａＯＨ）６００ｍｌを加えて攪拌し、攪拌したキノコ溶液を高圧蒸気滅菌器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ  ＤＳ−６０、トソン科学社製、韓国）を利用して高温高圧抽出（１２１℃、２時間）を行った後、２Ｍアセト酸で中和（ｐＨ７．０）した。
【００４３】
対照区として非処理区は、アルカリ、超音波及び酵素処理をせず、単に攪拌後、高温高圧抽出（１２１℃、２時間）を行った。
【００４４】
超音波処理区は、攪拌した溶液を超音波機器（Ｓｅｅ−ＳｏｎｉｃＩＩ、Ｕｌ  ｔｅｃｈ社製）を利用して、１２０ｗａｔｔ電力で３０秒間隔で超音波処理と非処理を繰り返し、８０分間超音波処理した後、高温高圧抽出（１２１℃、２時間）を行った。
【００４５】
酵素処理区は、高温高圧抽出後、ｐＨを５．０に調節した後、セルラーゼ（Ｃ８５４６、Ｓｉｇｍａ社製、最適条件：ｐＨ５．０、３７℃）８．３ｍｇ（５０  ｕｎｉｔ、キノコ試料ｇ当り５ｕｎｉｔ）を加えて、振とう培養器で３７℃及び１２０ｒｐｍ条件で３０分間振とうして反応した。
【００４６】
各非処理、アルカリ処理、酵素処理及び超音波処理工程によって抽出されたキノコ溶液を８，０００ｇ速度で１０分間遠心分離（Ｊ２−２１Ｍ／Ｅ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、ＢＥＣＫＭＡＮ社製、米国）し、上澄み液を取った。上澄み液に３倍容量のエタノールを加えて、１２時間常温（２０〜４０℃）で沈殿させた。沈殿させたエタノール溶液を超音波粉砕機（Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ２５、ＩＫＡ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、ドイツ）で３分間粉砕した後、８，０００ｇ速度で１５分間遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５８１０Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製、ドイツ）した。遠心分離した上澄み液を除去し、粗β−グルカン（ｃｒｕｄｅ  β−ｇｌｕｃａｎ）沈殿物を取って、５５℃で４８時間乾燥した。乾燥された粗β−グルカン沈殿物の重量を測定し、粉砕して均質化させた後、粉末状態の粗β−グルカンを得た。
【００４７】
３．粗β−グルカン粉末のβ−グルカン含量（％  ｗ／ｗ）測定
Ｍｕｓｈｒｏｏｍ  ａｎｄ  Ｙｅａｓｔ  β−ｇｌｕｃａｎキット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製、アイルランド）を使用し、全体グルカンとグルカン以外の糖含量を求めた後、α−グルカンとグルカン以外の糖含量の差によりβ−グルカン含量（％  ｗ／ｗ）を測定した。粗β−グルカン粉末試料に３７％塩酸を添加し、１００℃で２時間加水分解させた後、２Ｎ  ＫＯＨを利用してｐＨを調整した。加水分解液を２００ｍＭアセト酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で希釈した後、遠心分離した。上澄み液１００μｌを取って、エキソ１，３−β−グルカナーゼとβ−グルコシダーゼを添加し、４０℃で１時間反応した。その後、グルコース確認試薬（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）を添加し、４０℃で２０分間反応させた後、５１０ｎｍで吸光度を測定（ＵＶ／ＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｔｏｍｅｔｅｒ  Ｖ−５３０、ＪＡＳＣＯ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、日本）し、全体グルカンとグルカン以外の糖含量を分析した。
【００４８】
α−グルカンとグルカン以外の糖含量は、試料に２Ｍ  ＫＯＨ  ２ｍｌを入れて、氷の満たされた容器に固定させ、攪拌機（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｔｉｒｒｅｒ  Ｃ−ＭＡＧ  ＨＳ７、ＩＫＡ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、ドイツ）で２０分間攪拌した。１．２Ｍアセト酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．８）８ｍｌを添加し、アミログルコシダーゼ（ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）とインベルターゼ（ｉｎｖｅｒｔａｓｅ）２００μｌを入れて、４０℃ウォーターバス（Ｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ  Ｃ−ＷＢＥ、Ｃｈａｎｇ  Ｓｈｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．）で３０分間反応させた後、遠心分離（１，５００ｇ、１０分間）した。遠心分離した上澄み液１００μｌを取って、２００ｍＭアセト酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）１００μｌとグルコース確認試薬３ｍｌを入れて、４０℃で２０分間反応した後、５１０ｎｍで吸光度を測定した。
【００４９】
全体グルカン、α−グルカン及びβ−グルカンの含量は、下記の数学式により算出した。
【００５０】
［数学式］
全体グルカン（％  ｗ／ｗ）＝ΔＥ×Ｆ／Ｗ×９０
α−グルカン（％  ｗ／ｗ）＝ΔＥ×Ｆ／Ｗ×９．２７
β−グルカン＝全体グルカン−α−グルカン
前記数学式において、
ΔＥ＝ｅａｃｔｉｏｎ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ−ｂｌａｎｋ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ
Ｆ＝１００／ＧＯＰＯＤ  ｒｅａｇｅｎｔ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｆｏｒ  １００μｇ  ｏｆ  Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ
Ｗ＝ｗｅｉｇｈｔ  ｏｆ  ｓａｍｐｌｅ
【００５１】
４．統計処理
実験結果は、ＳＰＳＳ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  Ｓｏｃｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １８．０）統計プログラムを利用し、各実験群の平均±標準偏差で表示して、一元配置分散分析で比較し、ダンカンの多重検定（Ｄｕｎｃａｎ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒａｎｇｅ  ｔｅｓｔ）で各実験群間に有意性をｐ＜０．０５水準で検定した。
【００５２】
実験結果
１．微粒子化されたハナビラタケ粉末の粒度
ハナビラタケ試料を粉砕する前に、水分を乾燥して粉砕効率が高まるようにして、乾燥前後の水分含量は、乾燥前が９．１５％、乾燥後が７．２１％であった。微粒子化する前の、ピンミルで粗粉砕したハナビラタケ粉末の平均粒度は、７３．５３μｍであり、粗粉砕粉末をジェットミルで微粒子化した粉末の平均粒度は、１５．７１μｍであった。ジェットミルで微粒子化したハナビラタケ粉末を、再び回転速度別（１０，０００ｒｐｍ、１２，０００ｒｐｍ及び１４，０００ｒｐｍ）に空気分級した粉末の平均粒度は、１０，０００ｒｐｍ  Ｃｏａｒｓｅ分画（１６．９１μｍ）、１２，０００ｒｐｍ  Ｃｏａｒｓｅ分画（１６．２３μｍ）、１０，０００ｒｐｍ  Ｆｉｎｅ分画（１０．７５μｍ）、１２，０００ｒｐｍ  Ｆｉｎｅ分画（１０．６９μｍ）及び１４，０００ｒｐｍ分画（９．１７μｍ）の順に平均粒度が小さかった（表１）。
【００５３】
【表１】
2015535310.tif 000003
【００５４】
２．条件別β−グルカン抽出効果
表２に示されたように、各処理条件別のβ−グルカンの収率は、３．４３％から最大１１．３８％まで多様であり、単純粉砕した場合よりジェットミルで微粉砕した場合、収率が大きく増大された。各抽出及び試料処理条件別にハナビラタケ粉砕物から抽出された乾燥粗β−グルカンの収率を比較した結果、ジェットミルで微粉砕した場合、７．９０％であって、既存のアルカリ及び酵素処理した場合の４．８０％より６５％程度収率が増加し、超音波処理を並行した場合は、８．３３％まで増加して、収率が７４％まで増加する効果を示した。したがって、ジェットミルと超音波処理によるβ−グルカン抽出時、既存のアルカリ処理工程に代わって、工程を単純化することができ、アルカリ中和工程を省いて、環境汚染を大いに減らすことができる長所がある。
【００５５】
また、ジェットミル処理した場合、粒度によって、粒度が小さいほどβ−グルカン収率が高まることが分かった。アルカリ処理の場合、抽出される粗β−グルカンの平均重量は、他の処理区に比べて著しく高いが、キットで定量した純粋なβ−グルカンの量は少なく、これによると、増加された量は、β−グルカンではなく、アルカリ中和時に形成された塩と推定された。したがって、アルカリ処理抽出方法は、後で純粋なβ−グルカンの製造のために追加的な塩除去工程を経なければならない問題がある。
【００５６】
【表２】
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【００５７】
前記表の略語について説明すると、下記のようである：
Ｐｉｎ−ＮＯ：  ピンミル粗粉砕物非処理区、
Ｐｉｎ−ＥＮ：  ピンミル粗粉砕物酵素処理区、
Ｐｉｎ−ＡＬ：  ピンミル粗粉砕物アルカリ処理区、
Ｐｉｎ−ＡＬＥＮ：  ピンミル粗粉砕物アルカリ及び酵素処理区、
Ｐｉｎ−ＵＬ：  ピンミル粗粉砕物超音波処理区、
Ｊｅｔ−ＮＯ：  ジェットミル微粉砕物非処理区、
Ｊｅｔ−ＵＬ：  ジェットミル微粉砕物超音波処理区、
１０００Ｆ−ＵＬ：  １，０００ｒｐｍ  Ｆｉｎｅ粉砕物超音波処理区、
１０００Ｃ−ＵＬ：  １，０００ｒｐｍ  Ｃｏａｒｓｅ粉砕物超音波処理区、
１２０００Ｆ−ＵＬ：  １２，０００ｒｐｍ  Ｆｉｎｅ粉砕物超音波処理区、
１２０００Ｃ−ＵＬ：  １２，０００ｒｐｍ  Ｃｏａｒｓｅ粉砕物超音波処理区、
１４０００Ｂ−ＵＬ：  １４，０００ｒｐｍ  Ｂａｃｋ  ｆｉｌｔｅｒ−ｍｉｌｌ粉砕物超音波処理区であり；
全てのデータは、平均±標準偏差で表示されて；
他の上付き文字を有する値は、一元分散分析（ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）とダンカンの多重検定で評価されたもので、有意性を持って相異なることを意味する（ｐ＜０．０５）。
【００５８】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図１】
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【国際調査報告】
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2015535310.tif 000007
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