(57)【要約】  本発明は、ヒトｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメインと結合する抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント、そのようなｃ−Ｍｅｔ抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントを含む組成物およびキット、ならびにヒトｃ−Ｍｅｔを発現もしくは過剰発現する腫瘍を有する患者の同定および／または抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬による患者の治療奏功の改善を助けるヒトｃ−Ｍｅｔの検出のために前記抗体またはそれらの抗原結合フラグメントを使用する方法に関する。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、かつ、前記ＨＣＶＲがＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ここで、前記ＬＣＤＲ１がＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１）のポリペプチドを含み、前記ＬＣＤＲ２がＶＹＮＡＫＰＬＡＥ（配列番号２）のポリペプチドを含み、前記ＬＣＤＲ３がＣＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号３）のポリペプチドを含み、前記ＨＣＤＲ１がＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＹ（配列番号４）のポリペプチドを含み、前記ＨＣＤＲ２がＧＦＨＰＧＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号５）またはＧＦＨＰＲＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）のポリペプチドを含み、かつ、前記ＨＣＤＲ３がＴＲＧＹＹＹＤＧＳＦＴＹ（配列番号７）のポリペプチドを含む、ヒトｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（配列番号２４）と特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記ＬＣＤＲ１がＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２がＶＹＮＡＫＰＬＡＥ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３がＣＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１がＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＹ（配列番号４）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２がＧＦＨＰＧＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号５）またはＧＦＨＰＲＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣＤＲ３がＴＲＧＹＹＹＤＧＳＦＴＹ（配列番号７）のポリペプチドである、請求項１記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記ＨＣＤＲ２がＧＦＨＰＧＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号５）のポリペプチドを含む、請求項１または２記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記ＨＣＤＲ２がＧＦＨＰＲＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）のポリペプチドを含む、請求項１または２記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記ＨＣＤＲ２がＧＦＨＰＧＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号５）のポリペプチドである、請求項１、２、または３記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記ＨＣＤＲ２がＧＦＨＰＲＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）のポリペプチドである、請求項１、２、または４記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含み、前記ＬＣＶＲが配列番号８のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣＶＲが配列番号９または配列番号１０のポリペプチドである、請求項２記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記ＬＣＶＲが配列番号８のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣＶＲが配列番号９のポリペプチドである、請求項７記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記ＬＣＶＲが配列番号８のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣＶＲが配列番号１０のポリペプチドである、請求項７記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣが配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣが配列番号１２または配列番号１３のポリペプチドである、請求項２または７記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記ＬＣが配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣが配列番号１２のポリペプチドである、請求項１０記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記ＬＣが配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣが配列番号１３のポリペプチドである、請求項１０記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、各重鎖が配列番号１２のポリペプチドである、請求項２、７、または１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、各重鎖が配列番号１３のポリペプチドである、請求項２、７、または１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントと、許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、組成物。
【請求項１６】
１以上の付加的診断薬をさらに含む、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントを含むキット。
【請求項１８】
前記抗体と結合する二次抗体を含む容器をさらに含む、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
ヒト細胞により発現または過剰発現されたヒトｃ−Ｍｅｔを検出する方法であって、
（ａ）前記細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；
（ｂ）結合していないまたは非特異的に結合した抗体、またはその抗原結合フラグメントを除去する工程；および
（ｃ）ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合している抗体、またはその抗原結合フラグメントを検出し、かつ、任意選択により定量する工程
を含む、方法。
【請求項２０】
前記ヒト細胞がホルマリン固定およびパラフィン包埋される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記検出が直接的または間接的免疫組織化学により実施される、請求項１９または２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療の分野に関する。より詳しくは、本発明は、ヒトｃ−Ｍｅｔ（ＭＥＴとも呼ばれる）と結合して、ヒトｃ−Ｍｅｔタンパク質を発現または過剰発現する腫瘍を有する患者の同定および／または抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬による患者の治療奏功の改善を助ける、ヒトｃ−Ｍｅｔの標識、マーキング、または同定を必要とする診断技術、例えば、イメージング、予後または予測的適用に有用な、検出可能なｃ−Ｍｅｔ／抗ｃ−Ｍｅｔ抗体複合体を形成する抗体、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質ｃ−Ｍｅｔは、受容体チロシンキナーゼスーパーファミリーのメンバーであり、分散因子（ＳＦ）としても知られる肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の受容体である。成熟ヒトｃ−Ｍｅｔタンパク質は、完全細胞外αサブユニットと、細胞外リガンド結合ドメイン、１回膜貫通ドメインおよび細胞質チロシンキナーゼドメインから構成されるβサブユニットから構成される。
【０００３】
ＨＧＦによるヒトｃ−Ｍｅｔの活性化は、浸潤性の細胞表現型に関連する特徴、すなわち、増殖、遊走、形態形成、生存、およびプロテアーゼ合成を増強することが示されている。ヒトｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路は、ヒト癌において最も頻繁に調節不全を受ける経路の１つであり、実質的に、全てのタイプの固形腫瘍に関連している。ヒトｃ−Ｍｅｔの刺激、過剰発現、または突然変異は、結腸癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、膵臓癌、胆管癌、脳癌、甲状腺癌、腎臓癌、胃癌、ならびに黒色腫および肉腫を含む多くのタイプの癌に見られる。ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達軸のこれらの生化学的および遺伝学的異常は癌患者における不良な臨床転帰および薬剤耐性と相関している。
【０００４】
腫瘍形成の初期段階およびその後の疾病播種の調節におけるヒトｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路の役割のため、ヒトｃ−Ｍｅｔは、開発中のＨＧＦまたはｃ−Ｍｅｔの小分子および抗体アンタゴニストを用いた癌療法の魅力的な標的と考えられる。開発中のヒトｃ−Ｍｅｔに対する小分子および抗体アンタゴニストがあるとすれば、患者の癌のヒトｃ−Ｍｅｔ分析のために診断抗体が必要とされる。
【０００５】
特許文献１は、ＭＥＴ４と呼ばれるモノクローナル抗体を開示しており、これはヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤと結合すること、およびホルマリン固定およびパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）腫瘍組織においてｃ−Ｍｅｔを染色できることが報告されている。
【０００６】
ヒトｃ−Ｍｅｔに対する小分子または抗体アンタゴニストで処置する前、処置中、または処置後のいずれかに、癌患者の腫瘍細胞におけるヒトｃ−Ｍｅｔの発現または過剰発現レベルを評価するためには、膜局在型ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤと特異的に結合することができる、別のヒトｃ−Ｍｅｔ診断抗体が必要とされる。さらに、治療用抗ｃ−Ｍｅｔ剤による処置を受けている癌患者の腫瘍細胞におけるヒトｃ−Ｍｅｔの発現または過剰発現レベルを評価するためには、ｃ−Ｍｅｔが治療用抗ｃ−Ｍｅｔ剤とすでに結合している場合にヒトｃ−Ｍｅｔと特異的に結合することができるヒトｃ−Ｍｅｔ診断抗体が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００９／０２９５９１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ヒトｃ−Ｍｅｔ診断抗体には、ヒトｃ−Ｍｅｔに対する特異性および選択性も極めて重要である。ヒトＲＯＮ（ＭＳＴ１Ｒとも呼ばれる）などのｃ−Ｍｅｔの近縁受容体チロシンキナーゼファミリーメンバーとの交差反応性の回避が、ヒトｃ−Ｍｅｔ診断抗体にとって決定的に重要である。従って、膜局在型ヒトｃ−Ｍｅｔと特異的かつ選択的に（例えば、ヒトＲＯＮと有意な結合なく）結合することができるヒトｃ−Ｍｅｔ診断抗体も必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
よって、本発明は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、かつ、前記ＨＣＶＲがＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ここで、前記ＬＣＤＲ１がＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１）のポリペプチドを含み、前記ＬＣＤＲ２がＶＹＮＡＫＰＬＡＥ（配列番号２）のポリペプチドを含み、前記ＬＣＤＲ３がＣＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号３）のポリペプチドを含み、前記ＨＣＤＲ１がＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＹ（配列番号４）のポリペプチドを含み、前記ＨＣＤＲ２がＧＦＨＰＧＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号５）またはＧＦＨＰＲＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）のポリペプチドを含み、かつ、前記ＨＣＤＲ３がＴＲＧＹＹＹＤＧＳＦＴＹ（配列番号７）のポリペプチドを含む、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、かつ、前記ＨＣＶＲがＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ここで、前記ＬＣＤＲ１がＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１）のポリペプチドを含み、前記ＬＣＤＲ２がＶＹＮＡＫＰＬＡＥ（配列番号２）のポリペプチドを含み、前記ＬＣＤＲ３がＣＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号３）のポリペプチドを含み、前記ＨＣＤＲ１がＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＹ（配列番号４）のポリペプチドを含み、前記ＨＣＤＲ２がＧＦＨＰＧＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号５）のポリペプチドを含み、かつ、前記ＨＣＤＲ３がＴＲＧＹＹＹＤＧＳＦＴＹ（配列番号７）のポリペプチドを含む、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、かつ、前記ＨＣＶＲがＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ここで、前記ＬＣＤＲ１がＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１）のポリペプチドを含み、前記ＬＣＤＲ２がＶＹＮＡＫＰＬＡＥ（配列番号２）のポリペプチドを含み、前記ＬＣＤＲ３がＣＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号３）のポリペプチドを含み、前記ＨＣＤＲ１がＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＹ（配列番号４）のポリペプチドを含み、前記ＨＣＤＲ２がＧＦＨＰＲＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）のポリペプチドを含み、かつ、前記ＨＣＤＲ３がＴＲＧＹＹＹＤＧＳＦＴＹ（配列番号７）のポリペプチドを含む、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、かつ、前記ＨＣＶＲがＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ここで、前記ＬＣＤＲ１がＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２がＶＹＮＡＫＰＬＡＥ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３がＣＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１がＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＹ（配列番号４）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２がＧＦＨＰＧＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号５）またはＧＦＨＰＲＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣＤＲ３がＴＲＧＹＹＹＤＧＳＦＴＹ（配列番号７）のポリペプチドである、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、かつ、前記ＨＣＶＲがＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ここで、前記ＬＣＤＲ１がＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２がＶＹＮＡＫＰＬＡＥ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３がＣＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１がＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＹ（配列番号４）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２がＧＦＨＰＧＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号５）のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣＤＲ３がＴＲＧＹＹＹＤＧＳＦＴＹ（配列番号７）のポリペプチドである、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、かつ、前記ＨＣＶＲがＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ここで、前記ＬＣＤＲ１がＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２がＶＹＮＡＫＰＬＡＥ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３がＣＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１がＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＹ（配列番号４）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２がＧＦＨＰＧＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号５）のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣＤＲ３がＴＲＧＹＹＹＤＧＳＦＴＹ（配列番号７）のポリペプチドである、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合する抗体を提供する。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、かつ、前記ＨＣＶＲがＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ここで、前記ＬＣＤＲ１がＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２がＶＹＮＡＫＰＬＡＥ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３がＣＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１がＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＹ（配列番号４）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２がＧＦＨＰＲＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣＤＲ３がＴＲＧＹＹＹＤＧＳＦＴＹ（配列番号７）のポリペプチドである、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、かつ、前記ＨＣＶＲがＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ここで、前記ＬＣＤＲ１がＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２がＶＹＮＡＫＰＬＡＥ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３がＣＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１がＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＹ（配列番号４）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２がＧＦＨＰＲＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣＤＲ３がＴＲＧＹＹＹＤＧＳＦＴＹ（配列番号７）のポリペプチドである、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合する抗体を提供する。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含み、前記ＬＣＶＲが配列番号８のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣＶＲが配列番号９または配列番号１０のポリペプチドである、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。さらなる実施形態では、本発明は、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含み、前記ＬＣＶＲが配列番号８のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣＶＲが配列番号９のポリペプチドである、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態では、本発明は、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含み、前記ＬＣＶＲが配列番号８のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣＶＲが配列番号１０のポリペプチドである、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣが配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣが配列番号１２または配列番号１３のポリペプチドである、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。さらなる実施形態では、本発明は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣが配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣが配列番号１２のポリペプチドである、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態では、本発明は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣが配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣが配列番号１３のポリペプチドである、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、各重鎖が配列番号１２のポリペプチドである、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合する抗体を提供する。一実施形態では、本発明は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、各重鎖が配列番号１３のポリペプチドである、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合する抗体を提供する。
【００２０】
本発明は、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントと、許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む組成物を提供する。より詳しくは、本発明の組成物は、１以上の付加的診断薬をさらに含む。
【００２１】
本発明は、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを含むキットを提供する。一実施形態では、本発明のキットは、本発明の抗体と特異的に結合する二次抗体を含む容器をさらに含む。さらなる実施形態では、本発明のキットは、本発明の抗体と特異的に結合する二次抗体を含む容器をさらに含む。好ましくは、前記二次抗体は、抗マウスＩｇＧ１抗体などの抗マウスＩｇＧ抗体である。
【００２２】
一実施形態では、本発明は、ヒト細胞により発現または過剰発現されたヒトｃ−Ｍｅｔを検出する方法であって、（ａ）前記細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；（ｂ）結合していないまたは非特異的に結合した抗体、またはその抗原結合フラグメントを除去する工程；および（ｃ）ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合している抗体、またはその抗原結合フラグメントを検出し、かつ、任意選択により定量する工程を含む方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、ヒト細胞により発現または過剰発現されたヒトｃ−Ｍｅｔを検出する方法であって、（ａ）前記細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；（ｂ）結合していないまたは非特異的に結合した抗体、またはその抗原結合フラグメントを除去する工程；および（ｃ）ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合している抗体、またはその抗原結合フラグメントを検出し、かつ、任意選択により定量する工程を含み、前記ヒト細胞がホルマリン固定およびパラフィン包埋されている方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、ヒト細胞により発現または過剰発現されたヒトｃ−Ｍｅｔを検出する方法であって、（ａ）前記細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；（ｂ）結合していないまたは非特異的に結合した抗体、またはその抗原結合フラグメントを除去する工程；および（ｃ）ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合している抗体、またはその抗原結合フラグメントを検出し、かつ、任意選択により定量する工程を含み、前記検出が直接的または間接的免疫組織化学（ＩＨＣ）により実施される、方法を提供する。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、患者において抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬の投与に対する奏功を決定またはモニタリングする方法であって、（ａ）抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬の投与前に患者から単離された第１のサンプルにおいて、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを用いてヒトｃ−Ｍｅｔの量を測定する工程；（ｂ）抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬の投与後に患者から単離された第２のサンプルにおいて、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを用いてヒトｃ−Ｍｅｔの量を測定する工程；（ｃ）第１のサンプルに比べて第２のサンプルでヒトｃ−Ｍｅｔの低下があったかどうかを判定する工程を含み、ヒトｃ−Ｍｅｔの低下が、前記患者が抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬に奏功していることを示す、方法を提供する。
【００２４】
一実施形態では、本発明は、患者において抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬の投与に対する奏功を判定またはモニタリングする方法であって、（ａ）抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬の投与前に患者から単離された第１のサンプルにおいて、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを用いてヒトｃ−Ｍｅｔの量を測定する工程；（ｂ）抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬の投与後に患者から単離された第２のサンプルにおいて、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを用いてヒトｃ−Ｍｅｔの量を測定する工程；（ｃ）第１のサンプルに比べて第２のサンプルでヒトｃ−Ｍｅｔの低下があったかどうかを判定する工程を含み、ヒトｃ−Ｍｅｔの低下が、前記患者が抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬に奏功していることを示し、かつ、前記抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬が、２本の軽鎖および２本の重鎖を含む抗体であり、前記軽鎖のそれぞれが配列番号２０のポリペプチドからなり、かつ、前記重鎖のそれぞれが配列番号２２のポリペプチドからなる、方法を提供する。
【００２５】
一実施形態では、本発明は、患者において抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬の投与に対する奏功を判定またはモニタリングする方法であって、（ａ）抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬の投与前に患者から単離された第１のサンプルにおいて、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを用いてヒトｃ−Ｍｅｔの量を測定する工程；（ｂ）抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬の投与後に患者から単離された第２のサンプルにおいて、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを用いてヒトｃ−Ｍｅｔの量を測定する工程；（ｃ）第１のサンプルに比べて第２のサンプルでヒトｃ−Ｍｅｔの低下があったかどうかを判定する工程を含み、ヒトｃ−Ｍｅｔの低下が、前記患者が抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬に奏功していることを示し、かつ、前記抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬がＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドまたは６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−３−（２−メチル−２Ｈ−インダゾール−５−イルチオ）−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジンである、方法を提供する。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または小分子ｃ−Ｍｅｔ治療化合物による癌の治療奏功の診断、予後および／または予測に使用するための本発明の抗体を提供する。
【００２７】
一実施形態では、本発明は、
（ａ）ヒト細胞内または細胞上のヒトｃ−Ｍｅｔの検出、および任意選択による定量；
（ｂ）患者におけるヒトｃ−Ｍｅｔを発現または過剰発現する腫瘍細胞の検出、および任意選択による定量；
（ｃ）患者の血液サンプルにおけるヒトｃ−Ｍｅｔを発現または過剰発現する循環腫瘍細胞の検出、および任意選択による定量；
（ｄ）癌患者由来の体液におけるヒトｃ−Ｍｅｔを発現または過剰発現する腫瘍細胞の検出、および任意選択による定量；
（ｅ）ある個体がヒトｃ−Ｍｅｔが発現または過剰発現される組織または器官の癌を有するかどうかの評価；
（ｆ）抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬による治療に好適な腫瘍を有する患者の選択；または
（ｇ）抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬による治療に対する奏功の判定
のための、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
【００２８】
さらなる実施形態では、本発明は、ヒトｃ−Ｍｅｔの検出、および任意選択による定量がＩＨＣにより実施される場合の本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントの使用を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、抗ｃ−Ｍｅｔ薬剤が、２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、前記軽鎖のそれぞれが配列番号２０のポリペプチドからなり、かつ、前記重鎖のそれぞれが配列番号２２のポリペプチドからなる抗体であるか、または抗ｃ−Ｍｅｔ薬剤がＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドもしくは６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−３−（２−メチル−２Ｈ−インダゾール−５−イルチオ）−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジンである場合の、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
【００２９】
一実施形態では、本発明は、抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または小分子ｃ−Ｍｅｔ治療化合物による治療のために、ヒトｃ−Ｍｅｔが発現または過剰発現される腫瘍を有する患者を選択する方法であって、（ａ）前記腫瘍のサンプルを本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；（ｂ）結合していないまたは非特異的に結合した抗体、またはその抗原結合フラグメントを除去する工程；および（ｃ）ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤと特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを検出し、かつ、任意選択により定量する工程を含み、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤと特異的に結合した抗体、またはその抗原結合フラグメントの存在が、前記患者を抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または小分子ｃ−Ｍｅｔ治療化合物による治療に適当であるとして同定する、方法を提供する。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または小分子ｃ−Ｍｅｔ治療化合物の投与に対する患者の奏功を予測する方法であって、（ａ）前記患者由来の腫瘍のサンプルを本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；（ｂ）結合していないまたは非特異的に結合した抗体、またはその抗原結合フラグメントを除去する工程；および（ｃ）ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤと特異的に結合している抗体、またはその抗原結合フラグメントを検出し、かつ、任意選択により定量する工程を含み、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤと特異的に結合した抗体、またはその抗原結合フラグメントの存在が、前記患者が抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または小分子ｃ−Ｍｅｔ治療化合物の投与に奏功し得ることを示す、方法を提供する。
【００３１】
一実施形態では、本発明は、癌を治療する方法            であって、（ａ）その治療の必要がある患者を選択する工程（ここで、前記患者は、ヒトｃ−Ｍｅｔを本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントで検出することにより決定した場合に、ヒトｃ−Ｍｅｔが発現または過剰発現される腫瘍を有する）；および（ｂ）前記患者を抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬で治療する工程を含み、前記抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬が、２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、前記軽鎖のそれぞれが配列番号２０のポリペプチドからなり、かつ，前記重鎖のそれぞれが配列番号２２のポリペプチドからなる抗体であるか、または前記抗ｃ−Ｍｅｔ剤がＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドもしくは６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−３−（２−メチル−２Ｈ−インダゾール−５−イルチオ）−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジンである、方法を提供する。本発明の方法の様々な実施形態では、治療される癌は、胃癌、非小細胞肺癌、結腸癌、胆管癌、頭頸部癌、または腎臓癌である。本発明の方法の様々な実施形態では、ヒトｃ−Ｍｅｔの検出は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１１のポリペプチドであり、かつ各重鎖が配列番号１２のポリペプチドである抗体によるか、または２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、各重鎖が配列番号１３のポリペプチドである抗体による。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、患者において癌を治療する方法であって、患者由来の生体サンプルにおけるヒトｃ−Ｍｅｔの存在を検査する工程、および前記サンプルが、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを用いた検出により決定した場合に、ヒトｃ−Ｍｅｔに関して陽性判定であれば、前記患者に治療上有効な量の抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬を投与する工程を含み、前記抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬が、２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、前記軽鎖のそれぞれが配列番号２０のポリペプチドからなり、かつ、前記重鎖のそれぞれが配列番号２２のポリペプチドからなる抗体であるか、または前記抗ｃ−Ｍｅｔ剤がＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドもしくは６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−３−（２−メチル−２Ｈ−インダゾール−５−イルチオ）−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジンである、方法を提供する。本発明の方法の様々な実施形態では、治療される癌は、胃癌、非小細胞肺癌、結腸癌、胆管癌、頭頸部癌、または腎臓癌である。本発明の方法の様々な実施形態では、ヒトｃ−Ｍｅｔの検出は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、各重鎖が配列番号１２のポリペプチドである抗体によるか、または２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、各重鎖が配列番号１３のポリペプチドである抗体による。本発明の方法の様々な実施形態では、前記生体サンプルは、ホルマリン固定およびパラフィン包埋される。
【００３３】
一実施形態では、本発明は、患者において癌を治療する方法であって、治療上有効な量の抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬を患者に投与する工程を含み、ただし、前記患者由来の生体サンプルが、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを用いた検出により決定した場合に、ヒトｃ−Ｍｅｔに関して陽性判定であれば、その患者が治療のために選択され、前記抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬が、２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、前記軽鎖のそれぞれが配列番号２０のポリペプチドからなり、かつ、前記重鎖のそれぞれが配列番号２２のポリペプチドからなる抗体であるか、または前記抗ｃ−Ｍｅｔ剤がＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドもしくは６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−３−（２−メチル−２Ｈ−インダゾール−５−イルチオ）−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジンである、方法を提供する。本発明の方法の様々な実施形態では、治療される癌は、胃癌、非小細胞肺癌、結腸癌、胆管癌、頭頸部癌、または腎臓癌である。本発明の方法の様々な実施形態では、ヒトｃ−Ｍｅｔの検出は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、各重鎖が配列番号１２のポリペプチドである抗体によるか、または２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、各重鎖が配列番号１３のポリペプチドである抗体による。本発明の方法の様々な実施形態では、前記生体サンプルは、ホルマリン固定およびパラフィン包埋される。
【００３４】
一実施形態では、本発明は、（ａ）その治療の必要がある患者を選択する工程（ここで、前記患者は、ヒトｃ−Ｍｅｔを本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントで検出することにより決定した場合に、ヒトｃ−Ｍｅｔが発現または過剰発現される腫瘍を有する）、および（ｂ）前記患者を抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬で治療する工程を含む癌の治療において使用するための抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬を提供し、前記抗ｃ−ｍｅｔ治療薬は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、前記軽鎖のそれぞれが配列番号２０のポリペプチドからなり、かつ、前記重鎖のそれぞれが配列番号２２のポリペプチドからなる抗体であるか、または前記抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬は、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドもしくは６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−３−（２−メチル−２Ｈ−インダゾール−５−イルチオ）−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジンである。癌の治療に使用するための本発明の様々な実施形態では、癌は胃癌、非小細胞肺癌、結腸癌、胆管癌、頭頸部癌、または腎臓癌である。癌の治療に使用するための本発明の様々な実施形態では、ヒトｃ−Ｍｅｔは、２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、各重鎖が配列番号１２のポリペプチドである抗体で、または２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、各重鎖が配列番号１３のポリペプチドである抗体で検出される。
【００３５】
一実施形態では、本発明は、患者由来の生体サンプルを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを実施する工程、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを用いた検出によりヒトｃ−Ｍｅｔの存在を判定する工程、およびヒトｃ−Ｍｅｔが存在すれば、前記患者に治療上有効な量の抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬を投与する工程を含む癌の治療に使用するための抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬を提供し、前記抗ｃ−Ｍｅｔ治療薬は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、前記軽鎖のそれぞれが配列番号２０のポリペプチドからなり、かつ、前記重鎖のそれぞれが配列番号２２のポリペプチドからなる抗体であるか、または前記抗ｃ−Ｍｅｔ  治療薬は、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドもしくは６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−３−（２−メチル−２Ｈ−インダゾール−５−イルチオ）−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジンである。癌の治療に使用するための本発明の様々な実施形態では、癌は胃癌、非小細胞肺癌、結腸癌、胆管癌、頭頸部癌、または腎臓癌である。癌の治療に使用するための本発明の様々な実施形態では、ヒトｃ−Ｍｅｔは、２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、各重鎖が配列番号１２のポリペプチドである抗体、または２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、各重鎖が配列番号１３のポリペプチドである抗体で検出される。
【００３６】
本発明の方法の様々な実施形態では、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントの、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤへの結合の検出は、ＩＨＣ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、またはＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイ技術によって実施される。より好ましくは、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントの、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤへの結合の検出はＩＨＣにより実施される。
【００３７】
本発明のこの態様のさらなる実施形態では、ヒト細胞はホルマリン固定およびパラフィン包埋することができ、検出は直接的または間接的ＩＨＣにより実施され得る。間接的ＩＨＣは、ｃ−Ｍｅｔと結合する二次的酵素コンジュゲートモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは競合モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントの使用を含むことができ、ｃ−Ｍｅｔは、前記酵素の発色基質の使用によって検出することができる。
【００３８】
別の実施形態では、本発明の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントは、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するために使用され得る。ＣＴＣは、腫瘍から遊離し、移動中も血流内で生存し、遠隔部位で新たな成長を開始する腫瘍細胞である。ＣＴＣは腫瘍が検出される前に患者に見出すことができるので、ＣＴＣの検出は有用である。ＣＴＣはまた、有意な割合の患者で癌腫が再発する際にも見られ、ＣＴＣは一部の患者において原発腫瘍の除去後も持続する。ＣＴＣは原発腫瘍ならびに転移腫瘍のクローンに由来すること、およびＣＴＣは腫瘍進行の全ステージにおいて腫瘍量を反映し得ることを示唆する証拠がある。従って、早期診断および予後判定における潜在的役割の他、ＣＴＣは腫瘍進行に伴う遺伝的および表現型的変化の同定、それによる標的化療法をガイドする補助に主要な役割を果たし得る。より詳しくは、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ＣＴＣを捕捉、同定および／または定量することができるアッセイ、例えば、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）ＣＴＣ  Ｔｅｓｔ（Ｖｅｒｉｄｅｘ  ＬＬＣ、サンディエゴ、ＣＡ）、磁気活性化セルソーティングシステム（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＭＡＣＳ（登録商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、ドイツ）、Ｄｙｎａｌ磁気ビーズ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、カナダ）、ＣＴＣ  Ｃｈｉｐｓ（Ｏｎ−Ｑ−ｉｔｙ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、またはＳｌｅｉｊｆｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｉｔｓ  ｗａｙ  ｔｏ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ？  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，  ４３  （１８）：２６４５−５０  （２００７）；  Ｌａｃｒｏｉｘ  Ｍ．，  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ，  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ．，  １３  （４）：１０３３−６７  （２００６）；およびＰａｎｔｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，  ８  （５）：３２９−４０  （２００８））に記載されているものなどのＣＴＣの単離および検出のための当技術分野で公知の他の任意の試験において有用であり得る。現在のところ、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）ＣＴＣが、循環腫瘍細胞を検出および列挙するための自動試験としてＵＳＦＤＡにより承認されている唯一の診断試験である（Ｆｅｄ．  Ｒｅｇ．  ６９（９１）：２６０３６−３８  （２００４））。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）試験からの結果は、転移性前立腺癌（Ｄａｎｉｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｃａｓｔｒａｔｉｏ��−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  １３（２３）：７０５３−５８  （２００７））、結腸直腸癌（Ｃｏｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．    Ｃｌｉｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ６  （２）：１２５−３２  （２００６））、および乳癌（Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ，  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．，  ３５１（８）：７８１−９１  （２００４））の疾病進行および治療効力をモニタリングするために使用されている。本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、例えば、本明細書、特に下記の表１に記載されている抗体ＩまたはＩＩは、このような方法、例えばＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）試験で使用することができ、場合によっては、ｃ−Ｍｅｔが介在する癌に関する療法の開始時および治療経過の任意の時点で実施され得る。好ましくは、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、このような方法において、限定されるものではないが、ＥＰＣＡＭ、ＤＡＰＩ、ＣＤ４５、および／またはサイトケラチン（限定されるものではないが、サイトケラチン７、８、１８、および／または１９を含む）を含む他のポリペプチドに特異的な抗体とともに使用可能である。このような試験から作出された情報は、例えば疾病進行および治療効力のモニタリングを可能とすることにより、その予後値に有用であり得、早期（および進行中）の治療判断を可能とし得る。さらに、検出可能なように標識された本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントおよび治療用抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（ＷＯ／２０１０／０５９６５４に開示されているものなど）の同時結合を可能にすることにより、治療用抗ｃ−Ｍｅｔ抗体による治療の中断、すなわち、診断抗体をｃ−Ｍｅｔに結合させるための治療抗体の「ウォッシュアウト」は必要とされない。結果として、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、必要に応じ、診断モニタリングと並行した、中断のない治療処置を可能とする。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「ｃ−Ｍｅｔ」または「ヒトｃ−Ｍｅｔ」は、ヒトｃ−Ｍｅｔを意味し、ｃ−Ｍｅｔの構造は次のように模式的に示される。
【００４０】
2015519335.tif 000002
【００４１】
ヒトｃ−Ｍｅｔ  ＥＣＤでは、成熟タンパク質は配列番号２４のポリペプチドである。ＳＥＭＡドメインは、ヒトｃ−ＭｅｔのＮ末端のおよそ５００のアミノ酸残基からなり、α鎖（配列番号２４のアミノ酸残基１〜２８３、すなわち（配列番号２５）とβ鎖の一部（配列番号２４のアミノ酸残基２８４〜４９５、すなわち（配列番号２６））を含む。
【００４２】
一実施形態では、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤと特異的に結合する。別の実施形態では、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ＩＰＴドメインと特異的に結合する。さらなる実施形態では、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、成熟ヒトｃ−Ｍｅｔ  ＥＣＤ（配列番号２４）のアミノ酸５１７〜５３８（含む）内で特異的に結合する。
【００４３】
「抗体」の一般構造は、当技術分野で周知である。ＩｇＧ型の抗体では、鎖内および鎖間ジスルフィド結合を介して架橋されている４本のアミノ酸鎖（２本の「重」鎖と２本の「軽」鎖）が存在する。ある種の生物系で発現された場合、非改変型ヒトＦｃ配列を有する抗体はこのＦｃ領域でグリコシル化される。抗体は他の位置でも同様にグリコシル化され得る。当業者ならば、本発明の抗体がこのようなグリコシル化を含み得ることを認識するであろう。抗体のサブユニット構造および三次元構造は当技術分野で周知である。各重鎖は、Ｎ末端重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」）および重鎖定常領域（「ＨＣＣＲ」）から構成される。重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＡでは、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）から構成され、ＩｇＭおよびＩｇＥでは、４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」）および軽鎖定常領域（「ＬＣＣＲ」）から構成される。各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。
【００４４】
本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、当技術分野で周知の技術、例えば、組換え技術、ファージディスプレー技術、合成技術、もしくはこのような技術の組合せ、または当技術分野において容易に分かる他の技術を用いて作製することができる。抗体および抗原結合フラグメントの作製および精製方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｃｈａｐｔｅｒｓ  ５−８  ａｎｄ  １５，  ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３１４−２に見出すことができる。
【００４５】
本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ヒトゲノム配列由来のフレームワークおよび定常領域と同一または実質的に同一（実質的にヒト）であるヒト起源のフレームワーク、ヒンジ領域、および定常領域を有するように設計された、操作された抗体である。完全ヒト型のフレームワーク、ヒンジ領域、および定常領域は、ヒト生殖細胞系配列ならびに自然発生する体細胞突然変異を有する配列および／または操作された突然変異を有する配列である。本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、１以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を内包する完全ヒト型のフレームワーク、ヒンジ、または定常領域に由来のフレームワーク、ヒンジ、または定常領域を含み得る。さらに、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である。
【００４６】
本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、比較的高レベルのｃ−Ｍｅｔを発現する腫瘍細胞を有する癌患者の同定を助けるための診断法として有用であり得る。さらに、このような抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントは、ＷＯ２０１０／０１１５３８および米国特許出願第１３／１８８４９６号に記載されている小分子ｃ−Ｍｅｔ治療化合物などのｃ−Ｍｅｔ標的治療薬、例えば、以下の構造１および２、ならびに限定されるものではないが、Ｃ８−Ｈ２４１およびＭｅｔＭＡｂを含め、ＷＯ２０１０／０５９６５４およびＷＯ２００６／０１５３７１に記載されているものなどの抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体を用いた癌患者の治療をモニタリングし、かつ、任意選択により最適化するために使用され得る。より具体的には、本発明の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントは、抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体Ｃ８−Ｈ２４１（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＡＳ）＃１３６５２８７−９７−３）を用いた癌患者の治療をモニタリングし、かつ、任意選択により最適化するために使用され得る。前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｃ８−Ｈ２４１は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、前記軽鎖のそれぞれが配列番号２０のポリペプチドからなり、かつ、前記重鎖のそれぞれが配列番号２２のポリペプチドからなる。あるいは、前記抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、前記軽鎖のそれぞれが配列番号２０のポリペプチドからなり、かつ、前記重鎖のそれぞれが配列番号２１のポリペプチドからなる。より具体的には、本発明の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントは、抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体ＭｅｔＭＡｂを用いた癌患者の治療をモニタリングし、かつ、任意選択により最適化するために使用され得る。本明細書で使用する場合、「ＭｅｔＭＡｂ」は、配列番号２７に示されるような軽鎖および配列番号２８に示されるような重鎖を有するヒト化一腕５Ｄ５（ＯＡ−５Ｄ５；オナルツズマブ、ＣＡＳ＃１１３３７６６−０６−９）抗体を意味するものとする。ＭｅｔＭＡｂは哺乳類細胞または大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）で生産可能であり、哺乳類細胞としてはＨＥＫ  ２９３  ＥＢＮＡ細胞を含み得る。より具体的には、本発明の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントは、構造１および構造２として下記に示される小分子ｃ−Ｍｅｔ治療化合物、またはその薬学上許容される塩を用いた癌患者の治療をモニタリングし、かつ、任意選択により最適化するために使用され得る。
【００４７】
構造１：Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド
【化１】
2015519335.tif 000003
【００４８】
構造２：６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−３−（２−メチル−２Ｈ−インダゾール−５−イルチオ）−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン
【化２】
2015519335.tif 000004
【００４９】
「特異的に結合する」という句は、ｃ−Ｍｅｔ抗体、またはその抗原結合フラグメントの、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤに対する親和性に関して本明細書で使用する場合、特に断りのない限り、本質的に本明細書に記載のとおりに２５℃での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーの使用を含め、当技術分野で公知の一般的方法により決定した場合に、約１×１０−８Ｍ未満、好ましくは約１×１０−９Ｍ未満のＫＤを意味するものとする。本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントに関して本明細書で使用される「選択的」という用語は、２５℃での表面プラズモン共鳴により測定した場合に、その抗体、またはその抗原結合フラグメントが、限定されるものではないがヒトＲＯＮを含む、ヒトチロシンキナーゼファミリーの少なくとも１つのメンバーと結合する場合の約１０００分の１、５００分の１、２００分の１、１００分の１、５０分の１、１０分の１、または約５分の１のＫＤでヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤと結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを意味する。加えて、またはあるいは、本発明のｃ−Ｍｅｔ選択的抗体、またはその抗原結合フラグメントは、本明細書の以下の実施例３〜７に記載されるイムノアッセイ法によりアッセイした場合に、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤと結合するが、限定されるものではないがヒトＲＯＮを含む、ヒトチロシンキナーゼファミリーの少なくとも１つのメンバーとは結合しないか、または最小の結合しかしない。
【００５０】
ヒトｃ−Ｍｅｔの量が、正常ヒト細胞または非腫瘍ヒト組織におけるヒトｃ−Ｍｅｔの量よりもヒト細胞、ＣＴＣ、または腫瘍組織サンプルに関して有意に多いと判定された場合には、ヒトｃ−Ｍｅｔは、ヒト細胞、ＣＴＣ、または腫瘍組織サンプルの内部またはその上で過剰発現されている。
【００５１】
本明細書に開示された抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントは、細胞内もしくは細胞上、または組織、器官、体液などにおける細胞内もしくは細胞上に存在するヒトｃ−Ｍｅｔの発現、過剰発現、またはレベルの検出に、ならびに診断、予後、および／または患者モニタリング手法に有用である。「体液」という用語は、血液、血清、血漿、リンパ液、骨髄、尿、唾液、涙、脳脊髄液、母乳、羊水、胆汁、尿、気管支液、腹水、膿、および他の任意の生体産物など、正常または罹患被験体の身体に由来する任意の体液または他の材料を意味する。また、この用語の意味の範囲内には、器官または組織抽出液、被験体由来のいずれかの細胞または組織調製物がインキュベートされた培養液も含まれる。
【００５２】
安定で検出可能な抗原−抗体複合体を形成するために当業者が使用可能な、当技術分野で周知の方法がある（検出可能な抗原／抗体複合体の形成を可能とする条件については、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （最新版），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。特に、ＷＯ２０１０／０５９６５４には、限定されるものではないが、本明細書で抗体Ｉおよび抗体ＩＩと呼ばれる抗体を含め、本発明の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントの結合を可能とし得る条件の例が記載されている。ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤと結合した、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む組成物もまた、本明細書で教示されるか、または限定されるものではないが、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，同書、またはＷＯ２０１０／０５９６５４に開示されている方法を含む当技術分野で一般に公知の方法を用いて検出、標識、および／または同定することができる。
【００５３】
ヒトｃ−Ｍｅｔなどの特定のタンパク質は、例えば、限定されるものではないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定アッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインＡイムノアッセイなどの技術を用いた、例えば、限定されるものではないが、競合的および非競合的アッセイ系を含む、様々なイムノアッセイ法によって測定することができる。一般に免疫およびイムノアッセイ法に関する総説としては、Ｓｔｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｒｒ  （編）  （１９９１）  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （第７版）を参照。さらに、本発明のイムノアッセイは多くの構成で実施することができ、それらは、Ｍａｇｇｉｏ  （編）  （１９８０）  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌｏｒｉｄａ；  Ｇｏｓｌｉｎｇ  Ｊ  Ｐ  ２０００  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ）  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ＆  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｕｓ，  １９９６  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ；  Ｔｉｊａｎ  （１９８５）  “Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，”   Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；  Ｗｉｌｄ，  Ｄ．  （編），  ２００１  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  （第２版）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂ  Ｇｒｏｕｐ；  Ｊａｍｅｓ  Ｔ．  Ｗｕ，  ２０００  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ａｓｓａｙ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ，  Ｔｒｏｕｂｌｅｓｈｏｏｔｉｎｇ，  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ａｍｅｒ  Ａｓｓｎ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｒｏｕｓｓｅａｕ  ＆  Ｂｅａｕｄｅｔ  （編）  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌｏｒｉｄａ；およびＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，前掲に包括的に総説されている。Ｃｈａｎ  （編）  （１９８７）  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｒｌａｎｄｏ，  ＦＬ；  Ｐｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ  （編）  （１９９１）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ；およびＮｇｏ  （編）  （１９８８）  Ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹもまた参照。
【００５４】
イムノアッセイは、技術分野で公知の様々な方法によって実施することができる。簡単に述べると、ヒトｃ−Ｍｅｔ  ＥＣＤを測定するためのイムノアッセイは、競合的または非競合的いずれかの結合アッセイであり得る。競合的結合アッセイでは、被分析サンプルが、固相表面に結合された捕捉剤上の特異的結合部位をめぐって標識アナライトと競合する。好ましくは、前記捕捉剤は、本明細書に記載されるようにヒトｃ−Ｍｅｔ  ＥＣＤと特異的に反応性のある抗体である。捕捉剤に結合された標識アナライトの濃度は、サンプル中に存在する遊離のアナライトの量に反比例する。
【００５５】
競合結合イムノアッセイでは、サンプル中に存在する標的タンパク質（すなわち、ヒトｃ−Ｍｅｔ  ＥＣＤ）が、本発明の抗体との結合をめぐって標識タンパク質と競合する。本発明の抗体は、結合していない標識タンパク質から結合している標識タンパク質の分離を果たすために固相表面に結合させることができる。あるいは、競合結合アッセイは液相で行ってもよく、結合していない標識タンパク質から結合している標識タンパク質を分離するために当技術分野で公知の様々な技術を使用することができる。分離の後、結合している標識タンパク質の量が測定される。サンプル中に存在するタンパク質の量は、結合している標識タンパク質の量に反比例する。
【００５６】
あるいは、分離工程が必要とされない均一イムノアッセイを行ってもよい。これらのイムノアッセイでは、タンパク質上の標識が前記タンパク質の、その特異的結合組成物への結合によって変化される。標識タンパク質におけるこの変化は標識によって発せられるシグナルの低減または増強をもたらし、従って、イムノアッセイの終了時に標識を測定することでタンパク質の検出または定量が可能となる。
【００５７】
競合アッセイはまた、細胞が１２５Ｉ−標識抗体などの、そのタンパク質に対して既知の結合親和性を有する標識抗体、および結合組成物に対する結合親和性が測定される試験サンプルと接触させ、インキュベートされる場合に特に有用である。次に、結合型および遊離型の標識結合組成物が分離されて、タンパク質結合の程度が評価される。結合した試験化合物の量は、既知のソースに結合している標識結合相手の量に反比例する。多くの技術のいずれか１つを用いて結合タンパク質を遊離タンパク質から分離し、タンパク質結合の程度を評価することができる。この分離工程は一般に、フィルターへの接着とその後の洗浄、プラスチックへの接着とその後の洗浄、または細胞膜の遠心分離などの手順を含み得る。また、生細胞を用いて、ヒトｃ−Ｍｅｔ介在機能（例えば、セカンドメッセンジャーレベル、例えば、細胞増殖；リン酸イノシトールプールの変化、ルシフェラーゼ型アッセイを用いた転写；およびその他）に対する薬物の効果をスクリーニングすることもできる。例えば近接感知検出系などのいくつかの検出方法は、分離工程の排除を可能とする。
【００５８】
また、ヒトｃ−Ｍｅｔの定性または定量分析は、本発明の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントを用いた様々な非競合的イムノアッセイ法によって行うことができる。例えば、ツーサイト（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ）固相サンドイッチイムノアッセイが使用され得る。このタイプのアッセイでは、抗体が固相支持体と結合される。第２のタンパク質結合組成物（抗体であってもよく、タンパク質の異なる部位と特異的に結合する）が標識される。タンパク質上の両方の部位に結合が起こった後、結合していない標識結合組成物が除去され、固相に結合した標識結合組成物の量が測定される。結合した標識結合組成物の量は、サンプル中のタンパク質の量に正比例する。
【実施例】
【００５９】
実施例１：抗体発現および精製
抗体ＩおよびＩＩの重鎖および軽鎖可変領域のポリペプチド、全長重鎖および軽鎖アミノ酸配列、およびそれをコードするヌクレオチド配列は、以下の「アミノ酸およびヌクレオチド配列」と題された節に挙げられている。さらに、軽鎖および重鎖ＣＤＲポリペプチドは表１に示される。
【００６０】
限定されるものではないが、抗体ＩおよびＩＩを含む、本発明の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントは、標準的なトランスフェクション手順を用いてＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞（Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、＃９０５００１３０）で一時的に発現させることができる。トランスフェクション後、トランスフェクト細胞を、ジェネティシン（Ｇ４１８）およびトブラマイシンを含有する標準的な無血清培地にて、３７℃で４８〜１２０時間培養する。抗体を６０ｍｌのｒプロテインＡセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；＃１７−１２７９−０４）で、周知の手順および／または製造者の説明書に従って精製し、さらに、濃縮し、移動相としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＸＫ５０／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製することができる。次に、この抗体調製物を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ、ＰＶＤＦ膜、０．２２μｍ、３３ｍｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；＃ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）を用いて濾過し、４〜８℃で保存することができる。
【００６１】
【表１】
2015519335.tif 000005
【００６２】
実施例２：抗体ＩおよびＩＩの結合動態および親和性
ヒトｃ−Ｍｅｔ  ＥＣＤに対する本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントの結合動態および親和性は、当技術分野で公知の方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００、またはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ＮＪ）などの表面プラズモン共鳴バイオセンサーの使用により決定することができる。特記しない限り、全ての試薬および材料はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入することができ、測定は２５℃で行うことができる。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）装置はＨＢＳ−ＥＰ＋ランニングバッファー（１０ｍＭ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０；＃ＢＲ−１００６−６９）でプライミングし、分析温度は２５℃に設定することができる。キャプチャー法を採用するために、４つの全フローセル上の固定化ヤギ抗マウスＦｃ抗体（標準的なＮＨＳ−ＥＤＣアミンカップリングを用いて作製）を含有するＣＭ５チップを使用することができる。本発明の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントは、ＨＢＳ−ＥＰ＋ランニングバッファーへの希釈により５マイクログラム／ｍＬで調製することができる。この分析のために、ＦｃおよびＦｌｉｓタグを有するｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ（ｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓ）をＣＨＯ細胞から発現させ、精製することができる（配列番号２３）。ヒトｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓは、ＨＢＳ−ＥＰ＋ランニングバッファーへの希釈により２００ｎＭ〜１．５６ｎＭ（２倍希釈を使用）の範囲の終濃度で調製することができる。各分析サイクルは、（１）本発明の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントのサンプルのフローセル２、３、および４への捕捉、（２）全てのフローセルへの、５０マイクロリットル／分での２５０マイクロリットル（３００秒）のヒトｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤの注入、（３）解離相をモニタリングするための、２０分間のＨＢＳ−ＥＰ＋ランニングバッファー流の復帰、（４）３０マイクロリットル（３６秒）のグリシンｐＨ１．５注入によるチップ表面の再生、（５）５０マイクロリットル（６０秒）のＨＢＳ−ＥＰ＋ランニングバッファー注入によるチップ表面の平衡化、からなり得る。データは標準的な二重参照を用いて処理し、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００評価ソフトウエア、バージョン４．１を使用して１：１結合モデルに当てはめ、結合速度（ｋｏｎ、単位Ｍ−１ｓ−１）、解離速度（ｋｏｆｆ、単位ｓ−１）、およびＲｍａｘ（単位ＲＵ）を決定することができる。平衡解離定数（ＫＤ）は、関係式ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎから計算することができ、単位はモルである。
【００６３】
本質的にこの実施例２に記載のとおりに行った実験では、抗体ＩおよびＩＩはヒトｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤと、極めて高い結合親和性（ＫＤ）で結合する（表２参照）。抗体ＩＩはｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤと、抗体Ｉの５倍を超える結合親和性で結合する。
【００６４】
【表２】
2015519335.tif 000006
【００６５】
実施例３：抗体ＩおよびＩＩはＣ８−Ｈ２４１と同時にヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤと結合する
表面プラズモン共鳴
本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントが抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体（例えば、ＷＯ／２０１０／０５９６５４に開示されているＣ８−Ｈ２４１など）と同時にヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤに結合することができるかどうかを調べるために、当技術分野で公知の方法に従って、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００、またはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ＮＪ）などの表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いて結合実験を行うことができる。特記しない限り、全ての試薬および材料はＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）から購入することができる。この分析のために、ＦｃおよびＦｌｉｓタグを有するｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ（ｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓ）をＣＨＯ細胞から発現させ、精製することができる（配列番号２３）。測定は全て２５℃で行うことができる。ＨＢＳ−ＥＰ＋バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０；＃ＢＲ−１００６−６９）をランニングバッファーおよびサンプルバッファーとして使用することができる。マウスＩｇＧ１抗ポリヒスチジン抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｂ０５０）は、ヒトｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓを捕捉するためにアミンカップリングキットを用いて、７０００応答単位（Ｒｕ）のレベルでＣＭ５センサーチップのフローセル１〜４上に固定することができる。まず、ヒトｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓをフローセル２に注入することができる。本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを最初に５０ｎＭで注入して、チップ表面のｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓを完全に飽和させることができる。その後、Ｃ８−Ｈ２４１をすぐに注入することができる。結合応答単位を用いて結合化学量論を計算することができる。同時結合がこれら２つの抗体の添加順序に依存しないことを示すために、結合順序を実験の過程で数回、逆転または変更することができる。
【００６６】
本質的に実施例３に記載のとおりに行った実験では、各ｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓは、１．１の抗体Ｉおよび０．８のＣ８−Ｈ２４１（ヒトＩｇＧ４サブタイプ）抗ｃ−Ｍｅｔ抗体と結合する。抗体ＩＩでは、各ｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓは、１．５の抗体ＩＩおよび０．９のＣ８−Ｈ２４１（ＣＡＳ＃１３６５２８７−９７−３）抗ｃ−Ｍｅｔ抗体と結合する。あらゆる添加順序の組合せは、抗体ＩおよびＩＩがＣ８−Ｈ２４１の存在下でｃＭｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓと結合し得ることを示す。これらのデータは、抗体ＩおよびＩＩならびにｍＡｂ  Ｃ８−Ｈ２４１（ヒトＩｇＧ４サブタイプ）が同時にヒトｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓと結合できることを示し、このことは、抗体Ｉおよび抗体ＩＩは、ウォッシュアウト期間を必要とせずに、Ｃ８−Ｈ２４１による治療を進めながら、患者サンプルにおけるｃ−Ｍｅｔレベルを検出するために使用可能であることを示している。
【００６７】
ＦＡＣＳ
細胞表面ｃ−Ｍｅｔ受容体を測定するように設計されたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、本発明の抗体が細胞表面上のヒトｃ−Ｍｅｔを染色可能であり、同時にＣ８−Ｈ２４１も結合されるかどうかを決定するために行うことができる。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析は、ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｃ８−Ｈ２４１と本発明の抗体が細胞表面ｃ−Ｍｅｔに同時に結合することを証明するために使用可能である。
【００６８】
Ｃ８−Ｈ２４１  ｃ−Ｍｅｔ抗体は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８モノクローナル抗体標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、＃Ａ−２０１８１）で標識することができる。ヒト胃腫瘍ＭＫＮ４５細胞（日本健康科学財団、ヒューマンサイエンス研究資源バンク（Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｂａｎｋ）、＃ＪＣＲＢ０２５４）は、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１１８３５）、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１００８２）；２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃２５０３０）；１００Ｕ／５００ｍＬペニシリンＧ、および１００マイクログラム／５００ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１５１４０）中で培養することができる。Ｔ７５フラスコからのＭＫＮ４５細胞を、５ｍＬの酵素不含細胞解離溶液（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、＃Ｓ−０１４−Ｂ）で解離させることができる。これらの細胞を室温で５分間インキュベートした後に遠沈管に回収し、培養培地で１回洗浄し、次いで、結合バッファー（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ））中でさらに洗浄することができる。これらの細胞に５マイクログラム／ｍＬの本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、またはその抗原結合フラグメントを含有する１００マイクロリットルの結合バッファーを加えることができる。これらの細胞を３０分間インキュベートした後に、１ｍＬの結合バッファーで洗浄することができる。次に、５マイクログラム／ｍＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ａ２１２３６）標識抗ｍＩｇＧを含有する１００マイクロリットルの結合バッファーを加え、氷上で３０分間インキュベートすることができる。その後、１０マイクロリットルの５０マイクログラム／ｍＬ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識Ｃ８−Ｈ２４１（終濃度５マイクログラム／ｍＬ）を上記の染色溶液に加え、氷上で３０分間インキュベートすることができる。次に、これらの細胞を結合バッファーで２回洗浄し、ＤＰＢＳ中に再懸濁させることができる。細胞表面ｃ−Ｍｅｔに結合する抗体を、各サンプルに関して２０，０００イベントを取得するＦＡＣＳ分析により分析することができる。
【００６９】
本質的にこの実施例３に記載のとおりに行ったＦＡＣＳ実験では、９８．６８％のＭＫＮ４５細胞がＣ８−Ｈ２４１（ＣＡＳ＃１３６５２８７−９７−３）および抗体Ｉの両方で染色される。９８．６４％のＭＫＮ４５細胞がＣ８−Ｈ２４１および抗体ＩＩの両方で染色される。これらの結果は、抗体Ｉおよび抗体ＩＩは、ウォッシュアウト期間を必要とせずに、Ｃ８−Ｈ２４１による治療を進めながら、患者サンプルにおけるｃ−Ｍｅｔレベルを検出するために使用可能であることを示している。
【００７０】
実施例４：抗体ＩおよびＩＩはＭｅｔＭＡｂと同時にヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤと結合する
本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントがＭｅｔＭＡｂと同時にヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤに結合することができるかどうかを調べるために、当技術分野で公知の方法に従って、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００、またはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ＮＪ）などの表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いて結合実験を行うことができる。特記しない限り、全ての試薬および材料はＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）から購入することができる。この分析のために、ＦｃおよびＦｌｉｓタグを有するｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ（ｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓ）をＣＨＯ細胞から発現させ、精製することができる。測定は全て２５℃で行うことができる。ＨＢＳ−ＥＰ＋バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０；＃ＢＲ−１００６−６９）をランニングバッファーおよびサンプルバッファーとして使用することができる。マウスＩｇＧ１抗ポリヒスチジン抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｂ０５０）は、ヒトｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓを捕捉するためにアミンカップリングキットを用いて、６５００応答単位（Ｒｕ）のレベルでＣＭ５センサーチップのフローセル１〜４上に固定することができる。まず、ヒトｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓをフローセル２に注入することができる。本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを最初に５００ｎＭで注入して、チップ表面のｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓを完全に飽和させることができる。その後、ＭｅｔＭＡｂをすぐに注入することができる。結合応答単位を用いて結合化学量論を計算することができる。同時結合がこれら２つの抗体の添加順序に依存しないことを示すために、結合順序を実験の過程で数回、逆転または変更することができる。
【００７１】
本質的にこの実施例４に記載のとおりに行った実験では、各ｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓは、ＨＥＫ  ２９３  ＥＢＮＡ細胞で発現された１．５の抗体Ｉおよび１．３のＭｅｔＭＡｂと結合する。抗体ＩＩでは、各ｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓは、１．３の抗体ＩＩおよび１．４のＭｅｔＭＡｂと結合する。あらゆる添加順序の組合せは、抗体ＩおよびＩＩがＭｅｔＭＡｂの存在下でｃＭｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓと結合し得ることを示す。これらのデータは、抗体ＩおよびＩＩ、またはＭｅｔＭＡｂが同時にヒトｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓと結合できることを示す。さらに、これらのデータは、これらの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のエピトープが異なることを示している。
【００７２】
実施例５：血液サンプルにおける循環腫瘍細胞に関する診断アッセイ
本発明の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントの、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）への結合は、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）ＡｕｔｏＰｒｅｐ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ、およびＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（登録商標）またはＣｅｌｌＳｐｏｔｔｅｒ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して決定することができる。ＣＴＣにおけるｃ−Ｍｅｔ受容体発現の検出は、前記アナライザーのオープンチャネル（４番目のチャネル）を使用することができる。このオープンチャネルは、ＦＩＴＣ（フルオレセイン）またはＰＥ（フィコエリトリン）のいずれかと同様の励起／発光波長を有する蛍光色素の使用を可能とする。全ての試薬は、特に断りのない限り、Ｖｅｒｉｄｅｘ  ＬＬＣ（ラリタン、ＮＪ）から購入することができる。
【００７３】
Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）蛍光色素およびチオコンジュゲーション化学キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ、＃ＬＫ２６）を本発明の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントとのコンジュゲーションに使用することができる。Ｒ−ＰＥコンジュゲート抗体は、ＣＴＣにおけるｃ−Ｍｅｔの染色に使用する前に、ＩｇＧ用のプロテインＧ親和性カラムを用いてさらに精製することができる。Ｒ−ＰＥをコンジュゲートした本発明の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントは、このＣＴＣアッセイで最適濃度およびＰＥチャネル獲得時間に関して評価することができる。
【００７４】
ＣＴＣは、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、サイトケラチン８、１８、１９陽性で核（ＤＡＰＩ染色）を伴い、かつ、ＣＤ４５（白血球のマーカー）陰性である細胞と定義することができる。ＣＴＣは、抗ＥｐＣＡＭ抗体免疫磁性ビーズの添加によって７．５ｍｌの患者血液サンプルから富化することができる。これらの富化ＣＴＣの洗浄後、これらの細胞は、サイトケラチン、核およびＣＤ４５に対する抗体で免疫蛍光的に染色することができる。Ｒ−ＰＥがコンジュゲートされた本発明の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントは、この細胞染色工程の一部としてアッセイ手順に加えることができる。抗体は、Ｖｅｒｉｄｅｘ  ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（商標）ＣＸＣキットに含まれるＴｕｍｏｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｕｐに添加することができ、その後、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）ＡｕｔｏＰｒｅｐ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍを用いて患者サンプルを分析することができる。あるいは、Ｖｅｒｉｄｅｘ  Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  ＣｅｌｌＣａｐｔｕｒｅ（商標）ＣＴＣキットを用いて、使用者が抗体をＤＡＰＩおよびＦＩＴＣ染色液と同時に手で加えてもよい。ＭａｇＮｅｓｔ（登録商標）デバイス内のサンプルカートリッジに含まれるＣＴＣは、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（登録商標）で可視化することができ、細胞の画像を、このシステムに提供されているソフトウエアを用いてコンピューターにキャプチャーすることができる。
【００７５】
種々のレベルのｃ−Ｍｅｔ発現に対するＣＴＣアッセイの感受性を実証するために、ＳＫＢＲ３、Ｈ４４１、ＳＫＯＶ３、ＭＮＫ４５、およびＳＮＵ５細胞株を選択することができる。ＳＫＢＲ３細胞（乳癌細胞株）は、検出可能なレベルのｃ−Ｍｅｔ受容体を発現しない。Ｈ４４１細胞（肺癌細胞株）は、中レベルのｃ−Ｍｅｔ受容体を発現する。ＳＫＯＶ３細胞（卵巣癌細胞株）は、低レベルのｃ−Ｍｅｔ受容体を発現する。ＭＮＫ４５およびＳＮＵ５（両方とも胃癌細胞株）は、高レベルのｃ−Ｍｅｔ受容体を発現する。
【００７６】
本質的にこの実施例５に記載のとおりに行った実験では、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の最適濃度は、１回の試験当たり０．１マイクログラムであることが分かり、最適ＰＥ獲得時間は０．００５〜０．００７秒であった。抗体ＩおよびＩＩは、中レベルおよび高レベルのｃ−Ｍｅｔを発現する細胞株ではｃ−Ｍｅｔ発現を検出することができるが、ｃ−Ｍｅｔ陰性の細胞株では染色を示さない。
【００７７】
Ｃ８−Ｈ２４１およびＭｅｔＭＡｂとの同時結合
ｃ−Ｍｅｔ標的療法で処置されている患者においてＣＴＣアッセイが使用される場合、治療薬が診断用ｃ−Ｍｅｔ抗体に干渉するどうかを判定することが重要である。この抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体ＭｅｔＭＡｂまたはＣ８−Ｈ２４１の診断試験性能への干渉は、試験サンプルに添加された培養細胞に治療薬を加えた後、本質的にこの実施例５に記載のとおりのＣＴＣアッセイを用い、Ｒ−ＰＥがコンジュゲートされた本発明の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントを使用してｃ−Ｍｅｔに対する染色を行うことにより評価することができる。ＭｅｔＭＡｂまたはＣ８−Ｈ２４１抗体は、１０％ＣｅｌｌＳａｖｅ保存剤を含有するＶｅｒｉｄｅｘ希釈バッファーに希釈した培養細胞に加えることができる（０、１０、３０、および９０μｇ／ｍＬ）。試験サンプルは、Ｖｅｒｉｄｅｘ  Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  ＣｅｌｌＣａｐｔｕｒｅ（商標）ＣＴＣキットを用いて、そのキットに提供されている説明書または当技術分野で公知のそれ以外の手順に従って、ＣＴＣに関してアッセイすることができる。簡単に述べれば、サンプルのＥｐＣａｍ陽性細胞を富化した後、ＦＩＴＣ抗サイトケラチン８、１８、および１９、ＤＡＰＩ、ならびに０．１μｇ  Ｒ−ＰＥ−抗体ＩまたはＩＩで染色することができる。これらの染色細胞は、ＭａｇＮｅｓｔ（登録商標）デバイス内に配置されているサンプルカートリッジ内に入れることができ、このカートリッジをＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（登録商標）でスキャンすることができる。細胞画像をキャプチャーすることができ、ＣＴＣと同定された細胞をＰＥチャネルでｃ−Ｍｅｔ染色に関して評価する。
【００７８】
Ｃ８−Ｈ２４１（ＣＡＳ＃１３６５２８７−９７−３）は、抗体ＩまたはＩＩに干渉しない（表３および４）。ＨＥＫ  ２９３  ＥＢＮＡ細胞で発現されたＭｅｔＭＡｂは、中程度のｃ−Ｍｅｔ発現を有する細胞では抗体Ｉとわずかに干渉し得るが、高レベルのヒトｃ−Ｍｅｔを有する細胞では干渉しない。ＰＥコンジュゲート抗体Ｉで染まるｃ−Ｍｅｔ陽性Ｈ４４１細胞の％にはわずかな減少が見られ、これはＭｅｔＭＡｂの漸増用量と相関している（表５）。これは高ＭＥＴ発現細胞株であるＭＫＮ４５には見られない。ＭｅｔＭＡｂは、抗体ＩＩに干渉しない（例えば、表６参照）。外見上、ＰＥチャネルにおける画質はＭｅｔＭＡｂ有りでも無しでも一致を維持し、高いパーセンテージのＨ４４１細胞が最大ＭｅｔＭＡｂ用量でｃ−Ｍｅｔ陽性を維持していた。
【００７９】
これらの結果は、患者選択としてのＣＴＣアッセイでの、また、臨床試験でＭｅｔＭＡｂまたはＣ８−Ｈ２４１処置患者における治療奏功の診断抗体としての、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントの使用を支持する。
【００８０】
【表３】
2015519335.tif 000007
【００８１】
【表４】
2015519335.tif 000008
【００８２】
【表５】
2015519335.tif 000009
【００８３】
【表６】
2015519335.tif 000010
【００８４】
実施例６：ヒトｃ−Ｍｅｔの免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ
本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ホルマリン固定、パラフィン包埋されている正常または新生物性のヒト組織においてヒトｃ−Ｍｅｔを検出するために使用可能である。
【００８５】
簡単に記載すれば、ヒト組織または癌細胞のスライドは、６０℃で少なくとも１時間または最大１６時間焼き付けた後、リニアステーナー（Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  ＸＬ  ＳＴ５０１０、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて、一連のキシレン、エタノール、および水処理で再水和および脱パラフィンすることにより作製することができる。抗体ＩＩの細胞外ドメインエピトープは、１２５℃に達した高圧デクローキングチャンバー（ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒ）にて、Ｄｉｖａクエン酸抗原賦活バッファー（ＤＶ２００４Ｇ１、Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を用い、細胞または組織内で３０秒間賦活化することができる。
【００８６】
ｃ−Ｍｅｔシグナルは、Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  ＩＩＩ自動スライド染色装置にて、Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  Ｒｅｆｉｎｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒキット（ＤＳ９８００、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出することができる。簡単に述べれば、スライドをＰｅｒｏｘｉｄｅ  Ｂｌｏｃｋ（３〜４％過酸化水素、ＤＳ９８００の成分、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で５分間、ＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎ  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ（ＰＶ６１２２、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で１０分間、抗体ＩＩで１５分間、Ｐｏｓｔ−Ｐｒｉｍａｒｙ（ウサギ抗マウスＩｇＧ、ＤＳ９８００の成分、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で８分間、ポリマー（抗ウサギポリ−ＨＲＰ−ＩｇＧ、ＤＳ９８００の成分から、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で８分間、ＤＡＢ色素原（ＤＳ９８００の成分、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で１０分間、およびヘマトキシリン対比染色剤（ＤＳ９８００の成分、Ｌｅｃｉａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で５分間処理することができる。抗体ＩＩは、ＩＨＣプロトコールにおいて、２マイクログラム／ｍＬの濃度で使用することができる。スライドはリニアステーナー（Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  ＸＬ  ＳＴ５０１０、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて水からエタノール、キシレンへと脱水した後、常法に従ってカバーガラスをかけることができる。
【００８７】
本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントがヒトＲＯＮのＥＣＤよりもヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤに選択性があるかどうか決定するために、予備的な吸収／遮断実験を行うことができる。２マイクログラム／ｍＬの本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを、２００倍モル過剰量のｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓ（配列番号２３）またはヒトＲＯＮのＥＣＤ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１９４７−ＭＳ−０５０）のいずれかとともに回転装置上で４℃にて一晩インキュベートすることができる。一晩のインキュベーション後、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、実施例６で上記したとおりにヒト組織または癌細胞株のスライドに対して試験することができる。
【００８８】
本質的にこの実施例６に記載のとおりに行った実験では、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤは抗体ＩＩの免疫反応性を遮断するが、ヒトＲＯＮのＥＣＤは抗体ＩＩ染色の免疫反応性を遮断しない。これらの知見は、ヒトＲＯＮよりもヒトｃ−ＭＥＴへの抗体ＩＩの選択性を裏付ける。
【００８９】
ヒト腫瘍細胞株の染色では、６千万個の細胞を採取し、ホルマリン固定し、ヒストゲル中へ処理することができる。これらのヒストゲル細胞ペレットをパラフィンブロックに包埋し、円筒形に抜き取り（ｃｏｒｅｄ）、細胞マイクロアレイとなるように設計することができ、これをパラフィンブロックに再包埋した後、ミクロトームにより切断してスライドとすることができる。これらのスライドを、実施例６で上記したとおりにＩＨＣアッセイプロトコールを用いて、免疫組織化学的に染色し、対比染色を行うことができる。ＭＫＮ４５細胞（ヒト胃癌腫）およびＨ４４１細胞（ヒト肺腺癌）は高ｃ−ＭＥＴ発現株として使用可能であり；Ｕ８７ＭＧ細胞（ヒト膠芽腫−星状細胞腫）、Ｈ１２９９（ヒト非小細胞肺癌）、およびＣｏｌｏ２０５細胞（ヒト結腸腺癌）はｃ−ＭＥＴの中間発現株として使用可能であり；ＳＫＢＲ３（ヒト乳癌）およびｃ−ＭＥＴトランスフェクトＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（ヒトｃ−ＭＥＴ組換えタンパク質でトランスフェクトされたマウス胚性繊維芽細胞）はｃ−ＭＥＴの低発現株として使用可能である。ＲＯＮトランスフェクトＮＩＨ  ３Ｔ３細胞およびｍｏｃｋ  ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（マウス胚性線維芽細胞）を非ｃ−ＭＥＴ発現陰性対照として使用する。
【００９０】
本質的にこの実施例６に記載のとおりに行った実験では、抗体ＩＩは、様々な細胞株で異なるレベルの免疫染色を示す：ＭＫＮ４５およびＨ４４１細胞は１００％が強い細胞質および膜染色で、ほとんど陰性の核を伴う；Ｕ８７ＭＧ、Ｈ１２９９、およびＣｏｌｏ２０５細胞は１００％が中程度〜強い細胞質および膜染色で、ほとんど陰性の核を伴う；およびＳＫＢＲ３の５０％およびｃ−ＭＥＴトランスフェクトＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の９０％は弱い〜中程度の細胞質および膜染色で、ほとんど陰性の核を伴う。ｍｏｃｋおよびＲＯＮトランスフェクトＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は、ｃ−Ｍｅｔ染色に対してかすかな細胞質の赤みを示すだけで、陰性と見なされる。
【００９１】
ヒト腫瘍組織および正常ヒト組織の染色では、組織マイクロアレイからの切片を帯電スライドガラスにマウントし、実施例６で上記したとおりにＩＨＣプロトコールで染色することができる。抗体ＩＩによる免疫染色の結果は、病理学者によりスコア化することができる。本質的にこの実施例６に記載のとおりに行った実験では、抗体ＩＩは非小細胞肺癌（ｎ＝３００）、胃癌（ｎ＝６１）、胆管癌（ｎ＝５８）、卵巣癌（ｎ＝１５）、前立腺癌（ｎ＝２５６）、および腎臓の腎細胞癌（ｎ＝１４０）に対して試験した。腫瘍種ごとに、また、同じ腫瘍組織の異なる領域で多様な免疫組織化学的染色パターン（散在、限局的、不定）が見られる。全体的に見れば、抗体ＩＩは腫瘍細胞膜を染色し、細胞質染色の変動成分が混在する。腫瘍細胞核は、ヘマトキシリン対比染色剤を取り込みつつ、一貫して陰性染色である。新生物性組織と同様に、抗体ＩＩによる試験後の正常ヒト組織（結腸癌、腎臓癌、子宮癌、肝臓癌、および肺癌）におけるｃ−ＭＥＴの全体的なパターンは免疫反応性であり、すなわち、細胞質性および膜性であるが、核は一貫して陰性である。
【００９２】
実施例７：ヒトｃ−Ｍｅｔの第２の免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ
本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、両方とも商業的に入手される組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）形式でのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ヒト生検材料およびＦＦＰＥヒト生検材料の切片全体においてヒトｃ−Ｍｅｔを検出するために使用可能である。
【００９３】
簡単に記載すれば、ヒト組織または癌細胞のスライドは、６０℃で少なくとも３０分間または最大２時間焼き付けて残留水を完全に除去することにより作製することができる。脱パラフィン化し、抗体ＩＩの細胞外ドメインエピトープは、９７℃に達したＤａｋｏ  ＰＴ  Ｌｉｎｋユニットにて、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）ＦＬＥＸ標的賦活化溶液、低ｐＨ（Ｋ８００５、Ｄａｋｏ）を用い、細胞または組織内で２０分間賦活化することができる。
【００９４】
ｃ−Ｍｅｔシグナルは、Ｄａｋｏ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｌｉｎｋ  ４８自動スライド染色装置にて、Ｄａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）ＦＬＥＸ＋マウス（Ｋ８００２、Ｄａｋｏ）可視化系を用いて検出することがでできる。簡単に述べれば、スライドを、ペルオキシダーゼ−ブロッキング試薬（Ｋ８００２の成分、Ｄａｋｏ）で５分間、抗体ＩＩで１５分間、マウス（リンカー）試薬（シグナル増幅剤、Ｋ８００２の成分、Ｄａｋｏ）で１５分間、ＨＲＰポリマー試薬（Ｋ８００２の成分、Ｄａｋｏ）で２０分間、ＤＡＢ色素原／基質検量線用溶液（Ｋ８００２の成分から、Ｄａｋｏ）で１０分間、およびヘマトキシリン対比染色剤（Ｋ８００８、Ｄａｋｏ）で５分間処理することができる。抗体ＩＩは、ＩＨＣプロトコールにおいて、２μｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。スライドを水、９５％エタノール、１００％エタノール、キシレンで脱水した後、常法に従ってカバーガラスをかけることができる。
【００９５】
ヒト腫瘍細胞株の染色では、６千万個の細胞を採取し、ホルマリン固定し、ヒストゲル中へ処理することができる。これらのヒストゲル細胞ペレットをパラフィンブロックに包埋し、円筒形に抜き取り（ｃｏｒｅｄ）、細胞マイクロアレイとなるように設計することができ、これをパラフィンブロックに再包埋した後、ミクロトームにより切断してスライドとすることができる。これらのスライドを、実施例７で上記したとおりにＩＨＣアッセイプロトコールを用いて、免疫組織化学的に染色し、対比染色を行うことができる。ＲＯＮトランスフェクトＮＩＨ  ３Ｔ３細胞およびｍｏｃｋ  ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（マウス胚性線維芽細胞）を非ｃ−ＭＥＴ発現陰性対照として使用する。
【００９６】
本質的にこの実施例７に記載のとおり行った実験では、抗体ＩＩはＲＯＮを超える選択性を示す。顕微鏡による質的分析では、ｍｏｃｋトランスフェクトＮＩＨ  ３Ｔ３細胞およびＲＯＮトランスフェクトＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の両方が、抗体ＩＩによるＲＯＮ染色の不在を示し、陰性と見なされ、量的にはデジタル画像解析により、ｍｏｃｋトランスフェクトＮＩＨ  ３Ｔ３細胞およびＲＯＮトランスフェクトＮＩＨ  ３Ｔ３細胞に関して画素数を比較した場合、抗体ＩＩはＲＯＮからの選択性がある（表７および表８）。
【００９７】
【表７】
2015519335.tif 000011
【００９８】
【表８】
2015519335.tif 000012
【００９９】
本質的にこの実施例７に記載のとおりに行った実験では、抗体ＩＩは腫瘍細胞膜を染色し、細胞質染色の変動成分が混在する。腫瘍細胞核は、ヘマトキシリン対比染色剤を取り込みつつ、一貫して陰性染色である。新生物性組織と同様に、抗体ＩＩによる試験後の正常ヒト組織におけるｃ−ＭＥＴ免疫反応性の全体的なパターンは細胞質性および膜性であるが、核は一貫して陰性である。抗体ＩＩにより染色可能な（ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｓｔａｉｎｅｄ  ｗｈｅｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＩＩ）、保存されている非新生物性ヒトＦＦＰＥ生検としては、限定されるものではないが、ＩＩ型肺細胞（サブセット）、血管内皮、前立腺および子宮腺の基底細胞、胚中心Ｂ細胞（中心芽細胞）、基底層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｂａｓｌｅ）の細胞、集合尿細管（限局的）の細胞、肝細胞、ならびに子宮内膜、消化管、気道、および卵巣の限局性腺上皮が挙げられる。抗体ＩＩにより染色されない、保存されている非新生物性ＦＦＰＥヒト生検としては、限定されるものではないが、神経網、休止Ｔ細胞、有棘層の最浅層、前立腺上皮の管腔細胞、および小脳皮質の分子層が挙げられる。
【０１００】
アミノ酸およびヌクレオチド配列
配列番号  １          （ＬＣＤＲ１）    
ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ
配列番号  ２          （ＬＣＤＲ２）    
ＶＹＮＡＫＰＬＡＥ
配列番号  ３          （ＬＣＤＲ３）    
ＣＱＨＨＹＧＴＰＦＴ
配列番号  ４        （ＨＣＤＲ１）    
ＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＹ
配列番号  ５        （ＨＣＤＲ２）    
ＧＦＨＰＧＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ
配列番号  ６        （ＨＣＤＲ２）    
ＧＦＨＰＲＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ
配列番号  ７        （ＨＣＤＲ３）    
ＴＲＧＹＹＹＤＧＳＦＴＹ
配列番号  ８        （ＬＣＶＲ）    
ＥＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡＷＹＱＲＫＱＧＲＳＰＱＬＬＶＹＮＡＫＰＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＦＳＬＫＩＮＳＬＱＰＥＤＦＧＴＹＹＣＱＨＨＹＧＴＰＦＴＦＧＳＧＴＲＬＥＩＫ
配列番号  ９        （ＨＣＶＲ）    
ＥＶＱＬＱＱＳＧＴＶＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＹＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＦＨＰＧＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧＫＡＫＬＴＡＶＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＮＥＤＳＡＶＹＹＣＴＲＧＹＹＹＤＧＳＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
配列番号  １０      （ＨＣＶＲ）    
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配列番号  １１      （ＬＣ）    
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配列番号  １２      （ＨＣ）    
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配列番号  １３      （ＨＣ）    
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配列番号  １４      （ＬＣＶＲ  ＤＮＡ）    
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配列番号  １５      （ＨＣＶＲ  ＤＮＡ）    
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配列番号  １６      （ＨＣＶＲ  ＤＮＡ）    
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配列番号  １７      （ＬＣ  ＤＮＡ）    
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配列番号  １８      （ＨＣ  ＤＮＡ）    
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配列番号  １９      （ＨＣ  ＤＮＡ）    
ＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＴＧＴＡＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＴＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＡＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＣＡＴＣＣＴＣＧＴＡＡＴＡＧＴＧＧＴＡＣＴＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＣＧＣＣＡＧＴＡＣＴＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＡＡＴＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＣＡＡＧＧＧＧＴＴＡＴＴＡＣＴＡＣＧＡＴＧＧＴＴＣＧＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＧＣＣＧＣＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＡＧＣＡＧＣＡＣＡＴＧＧＣＣＴＡＧＣＧＡＧＡＣＣＧＴＧＡＣＡＴＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＴＴＣＴＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＧＣＣＣＡＧＡＧＡＣＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＡＧＣＣＴＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＧＴＧＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＧＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＴＧＴＴＧＴＧＧＴＡＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＡＡＣＴＴＣＣＣＡＴＣＡＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＡＡＴＧＣＡＧＧＧＴＣＡＡＣＡＧＴＧＣＡＧＣＴＴＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＣＡＧＡＣＣＧＡＡＧＧＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＡＡＧＧＡＴＡＡＡＧＴＣＡＧＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＴＧＡＴＡＡＣＡＧＡＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＡＣＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＣＡＧＣＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＴＣＴＴＡＣＴＴＣＧＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＡＴＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＧＴＧＴＴＡＣＡＴＧＡＧＧＧＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＣＡＴＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＡＣＴＣＴＣＣＴＧＧＴＡＡＡ
配列番号  ２０      （ＬＣ  −  Ｃ８−Ｈ２４１）                      
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＶＹＳＧＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号  ２１      （ＨＣ  −  Ｃ８−Ｈ２４１  −  ＩｇＧ２）    
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＮＷＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＭＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号  ２２      （ＨＣ−Ｃ８−Ｈ２４１−ＩｇＧ４）    
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＮＷＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
配列番号  ２３      （ヒトｃＭｅｔ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓ）      
ＭＫＡＰＡＶＬＡＰＧＩＬＶＬＬＦＴＬＶＱＲＳＮＧＥＣＫＥＡＬＡＫＳＥＭＮＶＮＭＫＹＱＬＰＮＦＴＡＥＴＰＩＱＮＶＩＬＨＥＨＨＩＦＬＧＡＴＮＹＩＹＶＬＮＥＥＤＬＱＫＶＡＥＹＫＴＧＰＶＬＥＨＰＤＣＦＰＣＱＤＣＳＳＫＡＮＬＳＧＧＶＷＫＤＮＩＮＭＡＬＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳＥＶＨＣＩＦＳＰＱＩＥＥＰＳＱＣＰＤＣＶＶＳＡＬＧＡＫＶＬＳＳＶＫＤＲＦＩＮＦＦＶＧＮＴＩＮＳＳＹＦＰＤＨＰＬＨＳＩＳＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭＦＬＴＤＱＳＹＩＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹＰＩＫＹＶＨＡＦＥＳＮＮＦＩＹＦＬＴＶＱＲＥＴＬＤＡＱＴＦＨＴＲＩＩＲＦＣＳＩＮＳＧＬＨＳＹＭＥＭＰＬＥＣＩＬＴＥＫＲＫＫＲＳＴＫＫＥＶＦＮＩＬＱＡＡＹＶＳＫＰＧＡＱＬＡＲＱＩＧＡＳＬＮＤＤＩＬＦＧＶＦＡＱＳＫＰＤＳＡＥＰＭＤＲＳＡＭＣＡＦＰＩＫＹＶＮＤＦＦＮＫＩＶＮＫＮＮＶＲＣＬＱＨＦＹＧＰＮＨＥＨＣＦＮＲＴＬＬＲＮＳＳＧＣＥＡＲＲＤＥＹＲＴＥＦＴＴＡＬＱＲＶＤＬＦＭＧＱＦＳＥＶＬＬＴＳＩＳＴＦＩＫＧＤＬＴＩＡＮＬＧＴＳＥＧＲＦＭＱＶＶＶＳＲＳＧＰＳＴＰＨＶＮＦＬＬＤＳＨＰＶＳＰＥＶＩＶＥＨＴＬＮＱＮＧＹＴＬＶＩＴＧＫＫＩＴＫＩＰＬＮＧＬＧＣＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦＶＱＣＧＷＣＨＤＫＣＶＲＳＥＥＣＬＳＧＴＷＴＱＱＩＣＬＰＡＩＹＫＶＦＰＮＳＡＰＬＥＧＧＴＲＬＴＩＣＧＷＤＦＧＦＲＲＮＮＫＦＤＬＫＫＴＲＶＬＬＧＮＥＳＣＴＬＴＬＳＥＳＴＭＮＴＬＫＣＴＶＧＰＡＭＮＫＨＦＮＭＳＩＩＩＳＮＧＨＧＴＴＱＹＳＴＦＳＹＶＤＰＶＩＴＳＩＳＰＫＹＧＰＭＡＧＧＴＬＬＴＬＴＧＮＹＬＮＳＧＮＳＲＨＩＳＩＧＧＫＴＣＴＬＫＳＶＳＮＳＩＬＥＣＹＴＰＡＱＴＩＳＴＥＦＡＶＫＬＫＩＤＬＡＮＲＥＴＳＩＦＳＹＲＥＤＰＩＶＹＥＩＨＰＴＫＳＦＩＳＧＧＳＴＩＴＧＶＧＫＮＬＮＳＶＳＶＰＲＭＶＩＮＶＨＥＡＧＲＮＦＴＶＡＣＱＨＲＳＮＳＥＩＩＣＣＴＴＰＳＬＱＱＬＮＬＱＬＰＬＫＴＫＡＦＦＭＬＤＧＩＬＳＫＹＦＤＬＩＹＶＨＮＰＶＦＫＰＦＥＫＰＶＭＩＳＭＧＮＥＮＶＬＥＩＫＧＮＤＩＤＰＥＡＶＫＧＥＶＬＫＶＧＮＫＳＣＥＮＩＨＬＨＳＥＡＶＬＣＴＶＰＮＤＬＬＫＬＮＳＥＬＮＩＥＷＫＱＡＩＳＳＴＶＬＧＫＶＩＶＱＰＤＱＮＦＴＬＥＶＬＦＱＧＰＤＩＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＥＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＲＩＤＹＫＤＤＤＤＫＨＶＨＨＨＨＨＨ
配列番号  ２４      （ヒトｃ−Ｍｅｔ  ＥＣＤ）      
ＥＣＫＥＡＬＡＫＳＥＭＮＶＮＭＫＹＱＬＰＮＦＴＡＥＴＰＩＱＮＶＩＬＨＥＨＨＩＦＬＧＡＴＮＹＩＹＶＬＮＥＥＤＬＱＫＶＡＥＹＫＴＧＰＶＬＥＨＰＤＣＦＰＣＱＤＣＳＳＫＡＮＬＳＧＧＶＷＫＤＮＩＮＭＡＬＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳＥＶＨＣＩＦＳＰＱＩＥＥＰＳＱＣＰＤＣＶＶＳＡＬＧＡＫＶＬＳＳＶＫＤＲＦＩＮＦＦＶＧＮＴＩＮＳＳＹＦＰＤＨＰＬＨＳＩＳＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭＦＬＴＤＱＳＹＩＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹＰＩＫＹＶＨＡＦＥＳＮＮＦＩＹＦＬＴＶＱＲＥＴＬＤＡＱＴＦＨＴＲＩＩＲＦＣＳＩＮＳＧＬＨＳＹＭＥＭＰＬＥＣＩＬＴＥＫＲＫＫＲＳＴＫＫＥＶＦＮＩＬＱＡＡＹＶＳＫＰＧＡＱＬＡＲＱＩＧＡＳＬＮＤＤＩＬＦＧＶＦＡＱＳＫＰＤＳＡＥＰＭＤＲＳＡＭＣＡＦＰＩＫＹＶＮＤＦＦＮＫＩＶＮＫＮＮＶＲＣＬＱＨＦＹＧＰＮＨＥＨＣＦＮＲＴＬＬＲＮＳＳＧＣＥＡＲＲＤＥＹＲＴＥＦＴＴＡＬＱＲＶＤＬＦＭＧＱＦＳＥＶＬＬＴＳＩＳＴＦＩＫＧＤＬＴＩＡＮＬＧＴＳＥＧＲＦＭＱＶＶＶＳＲＳＧＰＳＴＰＨＶＮＦＬＬＤＳＨＰＶＳＰＥＶＩＶＥＨＴＬＮＱＮＧＹＴＬＶＩＴＧＫＫＩＴＫＩＰＬＮＧＬＧＣＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦＶＱＣＧＷＣＨＤＫＣＶＲＳＥＥＣＬＳＧＴＷＴＱＱＩＣＬＰＡＩＹＫＶＦＰＮＳＡＰＬＥＧＧＴＲＬＴＩＣＧＷＤＦＧＦＲＲＮＮＫＦＤＬＫＫＴＲＶＬＬＧＮＥＳＣＴＬＴＬＳＥＳＴＭＮＴＬＫＣＴＶＧＰＡＭＮＫＨＦＮＭＳＩＩＩＳＮＧＨＧＴＴＱＹＳＴＦＳＹＶＤＰＶＩＴＳＩＳＰＫＹＧＰＭＡＧＧＴＬＬＴＬＴＧＮＹＬＮＳＧＮＳＲＨＩＳＩＧＧＫＴＣＴＬＫＳＶＳＮＳＩＬＥＣＹＴＰＡＱＴＩＳＴＥＦＡＶＫＬＫＩＤＬＡＮＲＥＴＳＩＦＳＹＲＥＤＰＩＶＹＥＩＨＰＴＫＳＦＩＳＧＧＳＴＩＴＧＶＧＫＮＬＮＳＶＳＶＰＲＭＶＩＮＶＨＥＡＧＲＮＦＴＶＡＣＱＨＲＳＮＳＥＩＩＣＣＴＴＰＳＬＱＱＬＮＬＱＬＰＬＫＴＫＡＦＦＭＬＤＧＩＬＳＫＹＦＤＬＩＹＶＨＮＰＶＦＫＰＦＥＫＰＶＭＩＳＭＧＮＥＮＶＬＥＩＫＧＮＤＩＤＰＥＡＶＫＧＥＶＬＫＶＧＮＫＳＣＥＮＩＨＬＨＳＥＡＶＬＣＴＶＰＮＤＬＬＫＬＮＳＥＬＮＩＥＷＫＱＡＩＳＳＴＶＬＧＫＶＩＶＱＰＤＱＮＦＴ
配列番号  ２５      （ＥＣＤのヒトｃ−Ｍｅｔ  αサブユニット）    
ＥＣＫＥＡＬＡＫＳＥＭＮＶＮＭＫＹＱＬＰＮＦＴＡＥＴＰＩＱＮＶＩＬＨＥＨＨＩＦＬＧＡＴＮＹＩＹＶＬＮＥＥＤＬＱＫＶＡＥＹＫＴＧＰＶＬＥＨＰＤＣＦＰＣＱＤＣＳＳＫＡＮＬＳＧＧＶＷＫＤＮＩＮＭＡＬＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳＥＶＨＣＩＦＳＰＱＩＥＥＰＳＱＣＰＤＣＶＶＳＡＬＧＡＫＶＬＳＳＶＫＤＲＦＩＮＦＦＶＧＮＴＩＮＳＳＹＦＰＤＨＰＬＨＳＩＳＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭＦＬＴＤＱＳＹＩＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹＰＩＫＹＶＨＡＦＥＳＮＮＦＩＹＦＬＴＶＱＲＥＴＬＤＡＱＴＦＨＴＲＩＩＲＦＣＳＩＮＳＧＬＨＳＹＭＥＭＰＬＥＣＩＬＴＥＫＲＫＫＲ
配列番号：  ２６      （ＥＣＤのヒトｃ−Ｍｅｔ  βサブユニット）    
ＳＴＫＫＥＶＦＮＩＬＱＡＡＹＶＳＫＰＧＡＱＬＡＲＱＩＧＡＳＬＮＤＤＩＬＦＧＶＦＡＱＳＫＰＤＳＡＥＰＭＤＲＳＡＭＣＡＦＰＩＫＹＶＮＤＦＦＮＫＩＶＮＫＮＮＶＲＣＬＱＨＦＹＧＰＮＨＥＨＣＦＮＲＴＬＬＲＮＳＳＧＣＥＡＲＲＤＥＹＲＴＥＦＴＴＡＬＱＲＶＤＬＦＭＧＱＦＳＥＶＬＬＴＳＩＳＴＦＩＫＧＤＬＴＩＡＮＬＧＴＳＥＧＲＦＭＱＶＶＶＳＲＳＧＰＳＴＰＨＶＮＦＬＬＤＳＨＰＶＳＰＥＶＩＶＥＨＴＬＮＱＮＧＹＴＬＶＩＴＧＫＫＩＴＫＩＰＬＮＧＬＧ
配列番号：  ２７      （ＭｅｔＭＡｂ  ＬＣ）  
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤ
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配列番号：  ２８      （ＭｅｔＭＡｂ  ＨＣ）  
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＬＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＭＩＤＰＳＮＳＤＴＲＦＮＰＮＦＫＤＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＹＲＳＹＶＴＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ
ＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【配列表】
2015519335000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月10日(2014.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、かつ、前記ＨＣＶＲがＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ここで、前記ＬＣＤＲ１がＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１）のポリペプチドを含み、前記ＬＣＤＲ２がＶＹＮＡＫＰＬＡＥ（配列番号２）のポリペプチドを含み、前記ＬＣＤＲ３がＣＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号３）のポリペプチドを含み、前記ＨＣＤＲ１がＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＹ（配列番号４）のポリペプチドを含み、前記ＨＣＤＲ２がＧＦＨＰＧＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号５）またはＧＦＨＰＲＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）のポリペプチドを含み、かつ、前記ＨＣＤＲ３がＴＲＧＹＹＹＤＧＳＦＴＹ（配列番号７）のポリペプチドを含む、ヒトｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（配列番号２４）と特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記ＬＣＤＲ１がＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２がＶＹＮＡＫＰＬＡＥ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３がＣＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１がＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＹ（配列番号４）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２がＧＦＨＰＧＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号５）またはＧＦＨＰＲＮＳＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣＤＲ３がＴＲＧＹＹＹＤＧＳＦＴＹ（配列番号７）のポリペプチドである、請求項１記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含み、前記ＬＣＶＲが配列番号８のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣＶＲが配列番号９または配列番号１０のポリペプチドである、請求項２記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣが配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、前記ＨＣが配列番号１２または配列番号１３のポリペプチドである、請求項２または３記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、各重鎖が配列番号１２のポリペプチドである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１１のポリペプチドであり、かつ、各重鎖が配列番号１３のポリペプチドである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントと、許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントを含むキット。
【請求項９】
ヒト細胞により発現または過剰発現されたヒトｃ−Ｍｅｔを検出する方法であって、
（ａ）前記細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；
（ｂ）結合していないまたは非特異的に結合した抗体、またはその抗原結合フラグメントを除去する工程；および
（ｃ）ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号２４）と特異的に結合している抗体、またはその抗原結合フラグメントを検出し、かつ、任意選択により定量する工程
を含む、方法。
【請求項１０】
前記ヒト細胞がホルマリン固定およびパラフィン包埋される、請求項９記載の方法。
【国際調査報告】
2015519335.tif 000013
2015519335.tif 000014