(57)【要約】  本明細書には、癌リスクと相関のある体細胞ゲノム変化（ＳＧＡ）などの遺伝マーカーを用いて癌リスクを予測および検出する方法が開示される。本明細書にはこのほか、食道腺癌（ＥＡ）のリスクと相関するＳＧＡの使用に基づいてＥＡリスクを予測および検出する方法が提供される。【選択図】図１
2015519053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の癌リスクを予測する方法であって、
前記対象から遺伝子試料を採取することと、
前記遺伝子試料の少なくとも１つの染色体領域に少なくとも１つの体細胞ゲノム変化（ＳＧＡ）の有無を判定することと、
前記少なくとも１つの染色体領域から少なくとも１つのリスク予測特徴を選択することと、
癌リスクスコアを得ることとを含み、
前記癌リスクスコアが、前記対象の前記癌リスクを予測するものとなる、
方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの染色体領域の前記少なくとも１つのＳＧＡが、第１３染色体の染色体位置２０〜１１５ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；第１５染色体の染色体位置２０〜１０３Ｍｂにあるコピー数増加ＳＧＡ；第１７染色体の染色体位置２５〜８１Ｍｂにあるコピー数増加ＳＧＡ；第１７染色体の染色体位置０〜２３Ｍｂにあるコピー数減少ＳＧＡ；第１７染色体の染色体位置０〜２３ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；および第１８染色体の染色体位置０〜３６Ｍｂにあるコピー数増加ＳＧＡのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの染色体領域の前記少なくとも１つのＳＧＡが、表３に記載されるＳＧＡのうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの染色体領域の前記少なくとも１つのＳＧＡが、表３に記載されるＳＧＡのうちの少なくとも１つから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの染色体領域の前記少なくとも１つのＳＧＡが、表３に記載されるＳＧＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのリスク予測特徴が、表３に記載されるＳＧＡのうちの少なくとも１つから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのリスク予測特徴が、第６染色体の染色体位置１〜２Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー増加ＳＧＡ；第６染色体の染色体位置５〜６Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー増加ＳＧＡ；第１５染色体の染色体位置７０〜７１Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー増加ＳＧＡ；第１７染色体の染色体位置３７〜３８Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー増加ＳＧＡ；第１８染色体の染色体位置１９〜２０Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー増加ＳＧＡ；第２染色体の染色体位置２２６〜２２７Ｍｂにあるホモ接合性欠失ＳＧＡ；第５染色体の染色体位置９３〜９４ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；第６染色体の染色体位置２９〜３０ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；第６染色体の染色体位置１４６〜１４７ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；第７染色体の染色体位置７８〜７９ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；第８染色体の染色体位置１３８〜１３９ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；第１１染色体の染色体位置３８〜３９ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；第１１染色体の染色体位置５０〜５１ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；第１１染色体の染色体位置１１０〜１１１ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；第１３染色体の染色体位置４２〜４３ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；第１７染色体の染色体位置９〜１０ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；第１７染色体の染色体位置１２〜１３ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；第１９染色体の染色体位置４８〜４９ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；第１染色体の染色体位置３６〜３７Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー減少ＳＧＡ；第９染色体の染色体位置０〜１Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー減少ＳＧＡ；第９染色体の染色体位置９〜３４Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー減少ＳＧＡ；第９染色体の染色体位置６５〜６６Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー減少ＳＧＡ；第１２染色体の染色体位置４５〜４６Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー減少ＳＧＡ；第１７染色体の染色体位置８〜９Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー減少ＳＧＡ；Ｘ染色体の染色体位置４２〜４３Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー減少ＳＧＡ；Ｙ染色体の染色体位置１３〜１４Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー減少ＳＧＡ；表３の８６の染色体領域の全コピー減少ＳＧＡの結果の合計；および表３の８６の染色体領域のパネルから得られたＳＧＡ解析の全結果の合計のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのリスク予測特徴を選択することが、前記少なくとも１つのリスク予測特徴に対する重み値の決定をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ロジスティック回帰モデルを用いて前記重み値を決定する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのリスク断言特徴が、表４の２９のリスク予測特徴からなるセットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
表４の２９のリスク予測特徴からなるセットのそれぞれに対する重み値が、（１）７１．５３３、（２）３８．６６４、（３）１１．８６、（４）３１．８１、（５）０．８２２５７、（６）５４．６６、（７）６３．２８７、（８）２．０６２５、（９）２４．６６６、（１０）１０１．０６、（１１）７９．６４６、（１２）６１．３１７、（１３）−２９１．９７、（１４）１２．１３７、（１５）２３．３４８、（１６）−７０．４１２、（１７）９９．２０９、（１８）４７．０５８、（１９）１０９．０８、（２０）６８．９４５、（２１）−２．３９４、（２２）１．６４９、（２３）−２７．８４７、（２４）６．６３６３、（２５）−０．０７８２４６、（２６）８６．３３９、（２７）１．９４２７、（２８）−０．０３３９５２、（２９）０．１１４１５である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
癌リスクスコアを得ることが、式（１）：
【数１】
2015519053.tif 000375
を用いて癌リスクスコアを算出することを含み、
式中、ｘｉが、１〜ｎの前記少なくとも１つのリスク予測特徴であり、βｉが、前記リスク予測特徴ｘｉに割り当てられる重み値である、
請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
癌リスクスコアを得ることが、正規化癌リスクスコアを得ることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
バレット食道であると診断された対象から前記遺伝子試料を採取する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
食道腺癌（ＥＡ）のリスクを有する対象から前記遺伝子試料を採取する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
食道腺癌（ＥＡ）のリスクを有する対象から前記遺伝子試料を採取し、約０．５０以上の正規化癌リスクスコアが対象のＥＡリスクが高いことを予測するものであり、約０．０５〜約０．４９の正規化癌リスクスコアが対象のＥＡリスクが中程度であることを予測するものであり、約０．００〜約０．０４９の正規化癌リスクスコアが対象のＥＡリスクが低いことを予測するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
対象の食道腺癌（ＥＡ）リスクを予測する方法であって、
ＥＡリスクがある対象から遺伝子試料を採取することと、
前記遺伝子試料の少なくとも１つの染色体領域に少なくとも１つの体細胞ゲノム変化（ＳＧＡ）の有無を判定し、前記ＳＧＡが、表３に記載される少なくとも１つのＳＧＡから選択されることと、
前記少なくとも１つの染色体領域から少なくとも１つのリスク予測特徴を選択し、前記少なくとも１つのリスク予測特徴が、表３に記載されるＳＧＡのうちの少なくとも１つから選択されることと、
正規化癌リスクスコアを得、約０．５０以上の正規化癌リスクスコアが対象のＥＡリスクが高いことを予測するものであり、約０．０５〜約０．４９の正規化癌リスクスコアが対象のＥＡリスクが中程度であることを予測するものであり、約０．００〜約０．０４９の正規化癌リスクスコアが対象のＥＡリスクが低いことを予測するものであることと
を含む、方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの染色体領域の前記少なくとも１つのＳＧＡが、第１３染色体の染色体位置２０〜１１５ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；第１５染色体の染色体位置２０〜１０３Ｍｂにあるコピー数増加ＳＧＡ；第１７染色体の染色体位置２５〜８１Ｍｂにあるコピー数増加ＳＧＡ；第１７染色体の染色体位置０〜２３Ｍｂにあるコピー数減少ＳＧＡ；第１７染色体の染色体位置０〜２３ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；および第１８染色体の染色体位置０〜３６Ｍｂにあるコピー数増加ＳＧＡのうちの少なくとも１つを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのリスク予測特徴を選択することが、前記少なくとも１つのリスク予測特徴に対する重み値の決定をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
正規化癌リスクスコアを得ることが、式（１）：
【数２】
2015519053.tif 000376
を用いて癌リスクスコアを算出することを含み、式中、
ｘｉが、１〜ｎの前記少なくとも１つのリスク予測特徴であり；
βｉが、前記リスク予測特徴ｘｉに割り当てられる重み値であり；
前記算出されたリスクスコア（１つまたは複数）が、β０を−３．１０８に設定した後、式（２）：
１／（１＋ｅ−Ｓ）  （２）
を用いて正規化リスク予測スコアを算出することによって、０〜１の範囲に正規化され得る、
請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府による資金提供）
本明細書に記載される研究は、少なくとも一部がＮＩＨ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  Ｇｒａｎｔ番号１ＲＣ１ＣＡ１４６９７３およびＮＩＨ  Ｐ０１  Ｇｒａｎｔ番号２Ｐ０１ＣＡ０９５１９５５による支援を受けたものである。したがって、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本開示は、癌リスクを示す体細胞ゲノム変化（ＳＧＡ）などの遺伝マーカーを用いて癌リスクを予測および検出する方法に関する。より具体的には、本開示は、ＥＡリスクと相関するＳＧＡの使用に基づいて食道腺癌（ＥＡ）のリスクを予測および検出する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１】試料生検のＳＧＡ解析データおよび癌リスク予測モデルに基づいて最初に高リスク群（上の線）、中程度リスク群（中間の線）および低リスク群（下の線）に割り当てられたリスク層別化患者の５年間にわたるＥＡ進行を示すカプラン・マイヤー（ＫＭ）曲線プロットである。
【図２】最初に中程度リスク群に割り当てられ、のちに２回目の内視鏡検査のデータを用いて高リスク群（上の線）、中程度リスク群（中間の線）および低リスク群（下の線）に再び割り当てられた患者のＥＡへの進行を示すＫＭ曲線プロットである。
【図３】ベースライン評価（または１回目の生検）から開始し２５０か月の期間にわたって収集した３つのＥＡリスク群の試料生検データを示す、試料生検のＳＧＡ解析データに基づくＫＭ曲線プロットである。癌リスク予測モデルを用いて、対象を高リスク群（上の線）、中程度リスク群（中間の線）および低リスク群（下の線）の３つのリスク群に層別化した。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
本明細書には対象の癌リスクを予測および検出する方法が開示される。特定の実施形態では、本明細書に開示される方法を用いて対象のＥＡリスクを予測および／または検出し得る。本明細書に開示される方法は、ＳＧＡを含めた特定のバイオマーカーの有無について対象の試料を分析することのほか、対象のＥＡリスクを予測および検出するためのリスクスコアを算出する癌リスク予測モデルを開発する方法を含む。ある実施形態では、対象のＥＡリスクの予測および／または検出を用いて、治療または予防戦略を推奨する、あるいは可能性のある疾患転帰を予測し得る。他の実施形態では、本明細書に開示される方法により、ＥＡリスクのある個人またはＥＡであると診断された個人を様々なリスクのサブグループに評価し、分類し、かつ／または層別化することが可能となり得る。
【０００５】
定義
「体細胞ゲノム変化」またはＳＧＡという用語は、対象の生涯にわたって細胞ゲノムに蓄積されたＤＮＡ配列の変化または異常を指す。ＳＧＡとしては点変異、欠失、遺伝子融合、遺伝子増幅、転座、コピー数増加、コピー数減少、コピーニュートラルなヘテロ接合性喪失、ホモ接合性欠失および染色体再配列が挙げられる。このような変異は場合によって、良性の変異で通常の生存期間中に疾患に進行しないこともあれば、癌などの疾患に至ることもある。
【０００６】
「コピー数」という用語は、１つまたは複数の遺伝子座におけるＤＮＡのコピー数を指す。コピー数の測定により、試料にゲノムコピー数の異常、すなわち、遺伝子座の増幅および欠失を含む異常があるかどうかを評価することができる。増幅および欠失があると、遺伝要素の一部に、要素全体に、または同時に多数の要素に影響を及ぼし得る。コピー数の解析により、必ずしも増幅または欠失の正確な数が決定されるわけではないが、ゲノム変化を含む領域が特定され、その変化が対象の恒常的ゲノムと比較して欠失であるか増幅であるかがわかる。いくつかの実施形態では、対象の健常細胞のコピー数を測定し、同対象の疾患が疑われる細胞または標的とする疾患細胞と比較することができる。
【０００７】
本明細書で使用される「コピー数変異」またはＣＮＶ（生殖系列細胞に使用される）および「コピー数変化」またはＣＮＡ（体細胞に使用される）という用語は、参照ゲノム配列との比較におけるＤＮＡの特定セグメントのコピー数の付加または削除を含めた構造的な遺伝的変異を指す。コピー増加という用語は、対象の恒常的ゲノムと比較してＤＮＡの増加、付加または重複がみられる染色体の部分を指す。コピー増加は、特定の対立遺伝子が増幅または複製された対立遺伝子特異的なコピー増加であり得る。コピー増加にはこのほか、母方染色体および父方染色体が同数複製された染色体の領域または染色体全体を示す均衡型のコピー増加が含まれ得る。コピー減少という用語は、対象の恒常的ゲノムと比較してＤＮＡの減少または欠失がみられる染色体の部分を指す。コピー減少は、特定の対立遺伝子が欠失した対立遺伝子特異的なコピー減少であり得る。
【０００８】
「コピーニュートラルなヘテロ接合性喪失」もしくはｃｎＬＯＨまたは片親性ダイソミーという用語は、母方（母方片親性）または父方（父方片親性）の染色体または染色体領域の重複と他方の対立遺伝子の喪失が同時に起こることによって引き起こされるヘテロ接合性喪失を指す。ある場合には、ｃｎＬＯＨは、初期の有糸分裂エラーおよび同祖接合によって引き起こされる後天的なクローン性の起源を有するものであり得る。あるいは、第一減数分裂または第二減数分裂のエラーにより一方の親から染色体または染色体の一部を２コピー受け取り、他方の親からは染色体を受け取らない場合、ｃｎＬＯＨは恒常的な非クローン性の起源を有するものであり得る。このヘテロ接合性喪失よって非機能的対立遺伝子が生じ得る。ホモ接合性欠失（ＨＤ）という用語は、１対の相同染色体の同じ対立遺伝子または同じ染色体セグメントの両コピーが欠失していることを指す。
【０００９】
核酸アレイ（「アレイ」）とは、固体支持体と結合した核酸プローブを含むものである。アレイは通常、基質表面の異なる既知の位置に結合した複数の異なる核酸プローブを含む。ほかにもＳＮＰアレイ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、バイオチップなどと記載されるこのようなアレイについては、当該技術分野では一般的に記載されている。例えば、ここに挙げたアレイは一般に、機械的な合成方法または光リソグラフィ法と固相合成法との組合せを組み込んだ光指向性の合成方法を用いて作製することができる。平面状のアレイ表面を用いてもよいが、実質的に任意の形状の表面や場合によっては多数の表面上にアレイを形成することもできる。アレイはビーズ、ゲル、ポリマー表面、光ファイバーなどの繊維、硝子をはじめとするしかるべき基質上にある核酸であり得る。ある実施形態では、一塩基多型（ＳＮＰ）を用いてゲノム全体をカバーするようアレイを設計し得る。
【００１０】
「プローブ」とは、表面に固定化され特定の標的によって認識され得る分子のことである。ある実施形態では、プローブは、しかるべき条件下で標的配列の少なくとも一部分と選択的にハイブリダイズすることが可能なＳＮＰマイクロアレイをはじめとする当該技術分野で公知のマイクロアレイとともに使用するよう設計されたオリゴヌクレオチドを指す。一般にプローブ配列は、相補的（すなわち、コード鎖またはセンス鎖（＋）に相補的）であるか、逆相補的（すなわち、アンチセンス鎖（−）に相補的）であるものとして認識されている。プローブは、長さが約１０〜１００ヌクレオチドまたは約１５〜７５ヌクレオチド、あるいは約１５〜５０ヌクレオチドであり得る。
【００１１】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、ワトソン・クリック型塩基対形成または非標準的な塩基対形成によって複合体を形成できる程度に相補的な核酸配列の間での複合体形成を指す。例えば、プライマーが標的配列（鋳型）と「ハイブリダイズする」場合、この複合体（またはハイブリッド）は、ＤＮＡ合成を開始するに例えばＤＮＡポリメラーゼによって必要とされるプライミング機能を果たすのに十分に安定である。安定なハイブリッドを得るために、ハイブリダイズする配列が完全に相補的である必要はない。多くの場合、塩基のミスマッチが約１０％未満であれば安定なハイブリッドが形成される。本明細書で使用される「相補的」という用語は、一般に約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％以上の相補性がみられるアッセイ条件下で相補体と安定な二本鎖を形成するオリゴヌクレオチドを指す。当業者であれば、少なくとも１つの所望のレベルの相補性を有する配列が安定にハイブリダイズし、これより相補性の低い配列がハイブリダイズしないようハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを推定し調節する方法を理解している。ハイブリダイゼーションの条件およびパラメータの例はよく知られている（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，２００１）。
【００１２】
「標識された（した）」および「検出可能な標識で標識された（した）」という用語は互換的に使用され、実体（例えば、ＤＮＡのフラグメント、プライマーまたはプローブ）が、例えば別の実体（例えば、増幅産物）との結合後に可視化され得ることを記述するものである。検出可能な標識は、それが測定可能であり、強度が結合した実体の量と関係のある（例えば、比例している）シグナルを発生するよう選択することができる。プライマーやプローブなど核酸分子を標識および／または検出するための多種多様なシステムがよく知られている。分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫学的手段、電気的手段、光学的手段および化学的手段をはじめとする手段によって直接的または間接的に検出可能な標識を組み込むか、これと結合させることにより、標識核酸を調製することができる。適切な検出可能な薬剤としては、放射性核種、フルオロフォア、化学発光剤、微粒子、酵素、比色標識、磁気標識、ハプテンなどが挙げられる。
【００１３】
「対象」または「患者」という用語は、哺乳動物および非哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、ヒト、チンパンジーなどの霊長類をはじめとする無尾猿および有尾猿種；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜；ウサギ、イヌ、ネコなどの家庭用動物；ラット、マウス、モルモットなどのげっ歯類を含めた実験動物が挙げられる。非哺乳動物の例としては、鳥類および魚類が挙げられる。
【００１４】
「治療する」、「治療すること」および「治療」という用語は、疾患または病態の症状を軽減、寛解または改善すること、さらなる症状を予防すること、症状の基礎となる代謝的原因を改善または予防すること、疾患または病態を抑制すること、例えば、疾患または病態の進展を停止すること、疾患または病態を緩和すること、疾患または病態を消退させること、疾患または病態によって引き起こされる状態を緩和すること、あるいは疾患または病態の症状を予防的および／または治療的に阻止することを意味する。
【００１５】
「連鎖不均衡」という用語は、２つ以上の遺伝子座の対立遺伝子間のランダムでない相関を指す。
【００１６】
ＳＧＡ解析
本明細書に開示される方法により、１つまたは複数のＳＧＡの有無に基づく癌リスクの検出または予測がもたらされる。本明細書に開示される方法に使用するＳＧＡとしては、例えば、コピー増加やコピー減少などのＣＮＡのほか、ｃｎＬＯＨおよびＨＤが挙げられる。一般に、多くのバレット食道患者の体細胞ゲノムにはＳＧＡがある程度みられ、ＥＡに進行しない患者のほとんどが、通常はｃｎＬＯＨレベルの上昇または染色体の大幅に増加および減少をみることなく、長期間にわたってゲノムの完全性が維持される。しかし、癌に進行する患者には、ＥＡに進行するリスクと相関するゲノムの大部分に及ぶＳＧＡの有意な増加、不均一性の増加および高度に関連した染色体事象を認め得る。
【００１７】
本明細書に開示されるＳＧＡは、大きさが単一のヌクレオチドから染色体の一部または全部を含めたＤＮＡセグメントの範囲であり得る。ある実施形態では、本明細書に開示されるＳＧＡは、大きな染色体領域を含めた１キロベース（ｋｂ）から最大１メガベース（Ｍｂ）または数Ｍｂの範囲の大きさであり得る。本明細書に開示される方法に使用するＳＧＡは、１つまたは複数の染色体上に位置し得る。
【００１８】
本明細書に記載されるＳＧＡ解析は、当業者に公知の方法によって実施し得る。例えば、全ゲノムのＤＮＡ配列決定などのＤＮＡ配列決定をベースにした技術を用いて、あるいは１つまたは複数の特定の染色体または特定の染色体位置もしくは領域などのゲノムの特定部分のＤＮＡ配列決定によってＳＧＡ解析を実施し得る。ＳＧＡ解析の方法としてはほかにも、ＤＮＡマイクロアレイ、ＳＮＰアレイ、ＤＮＡチップ、バイオチップ、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）をはじめとするマイクロアレイ技術の使用が挙げられる。さらに、遺伝マーカー、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、マイクロサテライトマーカー、単純配列反復（ＳＳＲ）、単純配列長多型（ＳＳＬＰ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、反復配列多型（ＶＮＴＲ）などを用いてＳＧＡ解析を実施してもよい。本明細書に開示される方法に使用する遺伝マーカーは、優性マーカーであっても共優性マーカーであってもよい。
【００１９】
本明細書に開示される方法は、対象から採取した１つまたは複数の遺伝子試料をＳＧＡ解析に使用することを含む。ある実施形態では、遺伝子試料は、例えば生体液または組織を含み得る。生体液の例としては、例えば、全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、涙または唾液が挙げられる。組織の例としては、例えば、結合組織、筋肉組織、神経組織、上皮組織およびその組合せが挙げられる。特定の実施形態では、腫瘍または癌組織から遺伝子試料を入手し得る。他の実施形態では、前癌組織から遺伝子試料を入手し得る。このような実施形態では、ＥＡの前駆病変、前癌性状態のバレット食道を有する対象から遺伝子試料を入手し得る。また別の実施形態では、対照または参照組織から遺伝子試料を入手し得る。対照または参照試料は、健常組織試料であっても腫瘍または癌組織試料と同じ対象由来の対の健常組織試料であってもよい。一実施形態では、遺伝子試料は、バレット食道を有する対象の血液または胃の試料と対にした同じ対象の食道の組織生検であり得る。
【００２０】
本明細書に開示される方法に使用する遺伝子試料を採取した後、標準的技法、例えばフェノール−クロロホルム抽出、塩析、消化を行わない抽出などに従って、あるいはＤＮＥａｓｙ（登録商標）キットやＱＩＡＡＭＰ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）などの市販のキットを使用することによって、試料からゲノムＤＮＡを抽出し得る。次いで、試料から得られたＤＮＡを修飾または改変して解析しやすくする。
【００２１】
単離ＤＮＡはルーチンの方法を用いて増幅し得る。有用な核酸増幅法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ならびにＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ベースのアッセイおよび逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を含めたＰＣＲのバリエーションが挙げられる。得られた増幅ＤＮＡは、ＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）９６  ＵＦ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎシステム（Ｑｉａｇｅｎ）などのルーチンの技術を用いて精製し得る。精製後、超音波処理またはＤＮアーゼＩなどの酵素による消化を用いて増幅ＤＮＡを断片化することができる。断片化後、検出可能な標識でＤＮＡを標識し得る。
【００２２】
本明細書に開示される方法の特定の実施形態では、増幅し断片化したＤＮＡを検出可能な標識で標識した後、これをマイクロアレイとハイブリダイズさせることができる。マイクロアレイは、本明細書に開示されるＳＧＡ解析に使用することができるオリゴヌクレオチド、遺伝子またはゲノムクローンを含み得る。例えば、マイクロアレイは、一塩基多型（ＳＮＰ）などの変異または多型を検出するオリゴヌクレオチドまたはゲノムクローンを含み得る。特定の実施形態では、ＳＮＰ遺伝子型同定アレイまたはマイクロアレイを用いてＳＧＡ解析を実施し得る。ＳＮＰ遺伝子型同定アレイは、全ゲノムまたは標的とするＳＧＡの解析に使用し得る。マイクロアレイは、当該技術分野で公知のルーチンの技術を用いて作製することができる。あるいは、市販のマイクロアレイを使用することができる。使用することができるマイクロアレイの例には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｏｍｎｉ  Ｑｕａｄ  １  Ｍ  ＳＮＰアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ｓｅｔ  ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．）、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ａＣＧＨ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ４４Ｂ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ  ａＣＧＨマイクロアレイ（Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）などがある。核酸アレイの操作に関する概説としては、Ｓａｐｏｌｓｋｙら（１９９９）“Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ．”  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４：１８７−１９２；Ｌｏｃｋｈａｒｔ（１９９８）“Ｍｕｔａｎｔ  ｙｅａｓｔ  ｏｎ  ｄｒｕｇｓ”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：１２３５−１２３６；Ｆｏｄｏｒ（１９９７）“Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｉｐｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ．”  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １  １：Ａ８７９；Ｆｏｄｏｒ（１９９７）“Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：３９３−３９５；およびＣｈｅｅら（１９９６）“Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  ＤＮＡ  Ａｒｒａｙｓ．”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：６１０−６１４が挙げられ、上記参考文献はいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【００２３】
ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを洗浄して、ハイブリダイズしていない拡散を除去し得る。いくつかの実施形態では、洗浄後、マイクロアレイをリーダーまたはスキャナで解析する。リーダーまたはスキャナの例としては、ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  Ｇ７（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．）、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）、ＧＥＮＥＰＩＸ（登録商標）４０００Ｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）などが挙げられる。マイクロアレイに含まれるプローブから集めたシグナルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社またはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社などから入手できる市販のソフトウェアを用いて解析することができる。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  Ｇ７を用いる場合、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いることができる。ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅは、全プローブからシグナルを検出するＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）スキャナから生データまたは特徴データ（シグナル）を収集し抽出する。マイクロアレイから収集されたデータを用いて、遺伝子試料中に得られた染色体ＤＮＡ上の１つまたは複数の遺伝子座にＳＧＡが存在するかどうかを判定し得る。さらに、マイクロアレイ解析の結果を用いて、癌のリスクと相関するＳＧＡを特定し得る。
【００２４】
本明細書に開示される癌リスクを予測および／または検出する方法は、癌のリスクとの間に有意な相関がある１つまたは複数のＳＧＡの有無について遺伝子試料を解析することを含む。特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、コピー増加、コピー減少、対立遺伝子特異的コピー減少、対立遺伝子特異的コピー増加、ｃｎＬＯＨ、均衡増加およびＨＤのうちの少なくとも１つから選択される１つまたは複数のＳＧＡを有する特定の染色体座または染色体領域の解析を含み得る。本明細書に開示される方法の癌リスクの検出力は、１つまたは複数の染色体上に位置し、それぞれがコピー増加、コピー減少、対立遺伝子特異的コピー減少、対立遺伝子特異的コピー増加、ｃｎＬＯＨ、均衡増加およびＨＤのうちの少なくとも１つから選択される１つまたは複数のＳＧＡを含む２つ以上の染色体座または染色体領域のパネルまたは組合せを用いることによって向上し得る。このような実施形態では、特定のＳＧＡの有無を調べる対象となる染色体領域は、染色体領域を１、２から最大１００またはそれ以上含み得る。例えば、染色体領域のパネルは、コピー増加、コピー減少、ｃｎＬＯＨ、均衡増加およびＨＤまたはその組合せなどの特定のＳＧＡの有無を調べる対象となり得る染色体領域を２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはそれ以上含み得る。
【００２５】
本明細書に開示される方法に従って使用するＳＧＡは、ヒトゲノムの１つまたは複数の染色体領域にみられるものであり得る。本明細書に開示されるヒト染色体領域は、大きさが約１ヌクレオチド〜１００ｋｂ、１ヌクレオチド〜１Ｍｂ、１ヌクレオチド〜１００Ｍｂおよび１ヌクレオチドから最大染色体全体を含むまでの範囲であり得る。本明細書に開示されるＳＧＡは、ヒト細胞中の２３対の染色体（２２対の常染色体と１対の性染色体）のうちの１つまたは複数の短腕または長腕上の位置にみられるものであり得る。例えば、本明細書に開示されるＳＧＡは、ヒト第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２染色体ならびにＸおよびＹ性染色体のうちの１つまたは複数にみられるものであり得る。
【００２６】
本明細書に記載される染色体領域は、その染色体位置、染色体間隔、細胞遺伝学的地図上の位置、染色体配列地図、遺伝子位置などによって同定または標識され得る。ある実施形態では、染色体領域内に１つまたは複数のＳＧＡを同定することによって、特定の染色体領域におけるＳＧＡの存在について陽性のスコアまたは結果を決定し得る。他の実施形態では、目的とする染色体領域の少なくとも１つの約１Ｍｂのセグメントに１つまたは複数の特定のＳＧＡを同定することによって、特定の染色体領域におけるＳＧＡの存在について陽性のスコアまたは結果を決定し得る。特定のＳＧＡが存在する場合、「あり」または「１」とスコア化または報告し、特定のＳＧＡが存在しない場合、「なし」または「０」とスコア化または報告し得る。
【００２７】
本明細書に記載される癌のリスク増大と相関する染色体領域およびＳＧＡは、遺伝子相関研究のための当該技術分野で公知の方法により特定し得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＳＧＡバイオマーカーなどの１つまたは複数の遺伝マーカーにおける遺伝的変異または多型が、個人がＥＡなどの疾患のリスクがあるかどうか、またはそれに感受性であるかどうかを予測するものとなり得る。例えば、全ゲノム相関解析（ＧＷＡＳ）を用いることによって、１つまたは複数の遺伝マーカーと疾患表現型との間の相関を確認し得る。当業者により一般的に知られている通り、ＧＷＡＳとはゲノム全体にわたる遺伝子多型の検査方法のことであり、目的とする形質、表現型または疾患と相関する遺伝子多型を特定するよう考案されたものである。例えば、目的とする疾患を有する個人に特定の遺伝子多型が高頻度または低頻度でみられる場合、その遺伝的変異はその疾患と「相関する」と言うことができる。疾患と相関する多型は一般に、直接疾患を引き起こし、かつ／または疾患もしくは疾患リスクに影響を及ぼし得る１つもしくは複数の遺伝領域もしくは遺伝要素と連鎖不均衡の関係にあり得るものである。
【００２８】
いくつかの実施形態では、症例対照研究を用いて癌のリスク増大と相関し得るＳＧＡバイオマーカーなどの遺伝マーカーを特定し、疾患進行者と非進行者とを分離し識別するのに使用し得るＳＧＡを見出すことができる。統計解析を用いて癌のリスク増大と有意に相関するＳＧＡバイオマーカーのパネルまたは組合せを特定し、１つまたは複数の統計学的方法または演算、単なる具体例として挙げると、ブートストラップ法による逐次前進選択、コックス比例ハザード回帰モデル、後進および前進ステップワイズ変数選択ならびにＲＯＣ（受診者動作特性）曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて、癌リスクと相関する個々のＳＧＡおよび／またはＳＧＡのパネルもしくは組合せを特定し得る。
【００２９】
症例対照研究または症例コホート研究から得られた遺伝子試料中のＳＧＡの統計解析により、ＥＡリスクと相関するＳＧＡバイオマーカーを有する染色体領域を特定し得る。１つのこのような実施形態では、遺伝子試料中のＳＧＡの、例えばブーツストラップ法による逐次前進選択を用いる統計解析を用いて、第１３染色体の染色体位置２０〜１１５ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；第１５染色体の染色体位置２０〜１０３Ｍｂにあるコピー数増加ＳＧＡ；第１７染色体の染色体位置２５〜８１Ｍｂにあるコピー数増加ＳＧＡ；第１７染色体の染色体位置０〜２３Ｍｂにあるコピー数減少ＳＧＡ；第１７染色体の染色体位置０〜２３ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；および第１８染色体の染色体位置０〜３６Ｍｂにあるコピー数増加ＳＧＡのうちの少なくとも１つなどのリスクまたはＥＡと相関するＳＧＡを有する比較的大きい染色体領域または巨大領域を特定し得る。
【００３０】
リスク予測モデル
本明細書に開示される対象の癌リスクを検出または予測する方法は、本明細書に開示される染色体領域の特定の組合せのＳＧＡ解析の基づくリスク予測モデルを含み得る。本明細書に開示される染色体領域のパネルのＳＧＡ解析から得られた結果をスコア化したものを統計解析によってさらに検討した後、これを組み合わせ、癌リスクの検出または予測に使用し得る癌リスク予測特徴のセットにグループ化し得る。特定の実施形態では、染色体領域のパネルはそれぞれ、コピー増加、コピー減少、ｃｎＬＯＨ、均衡増加およびＨＤまたはその組合せのうちの１つまたは複数から選択されるＳＧＡタイプを含み、ここでは、染色体領域のパネルのスコア化した結果を任意に全部または一部組み合せたものを組み合せ、かつ／または加えて、癌リスクの検出または予測に使用し得るリスク予測特徴のセットにし得る。
【００３１】
ある実施形態では、染色体領域のパネルのＳＧＡ解析から得られた結果の合計と、染色体領域のパネルの１つまたは複数のサブセットのＳＧＡ解析から得られた結果とを組み合わせ得る。１つのこのような実施形態では、癌リスクを予測および検出する方法は、１つまたは複数の染色体領域のパネルのＳＧＡ解析の結果の合計を含むリスク予測特徴のセットを含み、のちにこれを染色体領域のコピー増加ＳＧＡの結果の合計、染色体領域のＨＤ  ＳＧＡの結果の合計、染色体領域のｃｎＬＯＨ  ＳＧＡの結果の合計、染色体領域のコピー減少ＳＧＡの結果の合計または染色体領域の均衡増加ＳＧＡの結果の合計のうちの１つまたは複数と組み合わせ得る。単なる例示目的で記載する別のこのような実施形態では、癌リスクを予測および検出する方法は、それぞれが約１Ｍｂである８６の染色体領域のパネルから得られたＳＧＡ解析の結果の合計を含むリスク予測特徴のセットを含み、のちにこれを８６の染色体領域のコピー増加ＳＧＡの結果の合計、８６の染色体領域のＨＤ  ＳＧＡの結果の合計、８６の染色体領域のｃｎＬＯＨ  ＳＧＡの結果の合計、８６の染色体領域のコピー減少ＳＧＡの結果の合計、８６の染色体領域の対立遺伝子特異的コピー増加の合計、８６の染色体領域の対立遺伝子特異的コピー減少の合計および８６の染色体領域の均衡増加ＳＧＡの合計のうちの１つまたは複数と組み合わせ得る。
【００３２】
単独でまたは染色体領域の主要なパネルの結果とともに解析して対象の癌リスクを予測および／または判定し得るＳＧＡのサブセットまたはグループを選択するため、１つまたは複数の染色体領域の主要なパネルのＳＧＡ解析の結果を統計学的に検討し得る。いくつかの実施形態では、染色体領域のパネルのＳＧＡ解析の結果に対して、逐次前進選択とＡＵＣとを組み合わせたものなどの統計学的検討を実施することができ、ここでは、その統計解析の結果を用いて、癌リスクを予測および／または検出するリスク予測特徴のセットを選択する。このような実施形態では、染色体領域のパネルのＳＧＡ解析の結果の統計学的検討を用いて、癌リスクを予測および／または検出する約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５またはそれ以上のリスク予測特徴からなる選択し得る。単なる例示目的で記載する特定の実施形態では、それぞれが約１Ｍｂである約８６の染色体領域のパネルの統計学的検討を用いて、約２９のリスク予測特徴からなるセットを選択し得る。このような実施形態の具体例では、それぞれが１Ｍｂである８６の染色体領域のパネル統計学的検討を用いて、２９のリスク予測特徴からなるセットを選択することができ、ここでは、２９のリスク予測特徴からなるセットは以下に挙げるものであり得る：（１）第６染色体の染色体位置１〜２Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー増加ＳＧＡ；（２）第１５染色体の染色体位置７０〜７１Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー増加ＳＧＡ；（３）第１７染色体の染色体位置３７〜３８Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー増加ＳＧＡ；（４）第１８染色体の染色体位置１９〜２０Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー増加ＳＧＡ；（５）第２染色体の染色体位置２２６〜２２７Ｍｂにあるホモ接合性欠失ＳＧＡ；（６）第６染色体の染色体位置２９〜３０ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；（７）第６染色体の染色体位置１４６〜１４７ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；（８）第７染色体の染色体位置７８〜７９ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；（９）第８染色体の染色体位置１３８〜１３９ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；（１０）第１１染色体の染色体位置３８〜３９ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；（１１）第１１染色体の染色体位置１１０〜１１１ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；（１２）第１３染色体の染色体位置４２〜４３ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；（１３）第１７染色体の染色体位置９〜１０ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；（１４）第１７染色体の染色体位置１２〜１３ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；（１５）第１９染色体の染色体位置４８〜４９ＭｂにあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；（１６）第１染色体の染色体位置３６〜３７Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー減少ＳＧＡ；（１７）第９染色体の染色体位置０〜１Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー減少ＳＧＡ；（１８）第９染色体の染色体位置３３〜３４Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー減少ＳＧＡ；（１９）第１７染色体の染色体位置８〜９Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー減少ＳＧＡ；（２０）第９染色体の染色体位置６５〜６���Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー減少；（２１）Ｘ染色体の染色体位置４２〜４３Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー減少ＳＧＡ；（２２）Ｙ染色体の染色体位置１３〜１４Ｍｂにある対立遺伝子特異的コピー減少ＳＧＡ；（２３）８６の染色体領域の全コピー減少ＳＧＡの結果の合計；および（２４）８６の染色体領域のパネルから得られたＳＧＡ解析の全結果の合計。（２５）第６染色体の染色体位置５〜６にある対立遺伝子特異的コピー増加ＳＧＡ；（２６）第５染色体の染色体位置９３〜９４にあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；（２７）第１１染色体の染色体位置５０〜５１にあるｃｎＬＯＨ  ＳＧＡ；（２８）第７染色体の染色体位置７７〜７８にある対立遺伝子特異的コピー減少ＳＧＡ；（２９）第１２染色体の染色体位置４５〜４６にある対立遺伝子特異的コピー減少ＳＧＡ。
【００３３】
対象の癌リスクを予測および／または検出する方法は、（１）対の試料（一方が正常なＤＮＡを示すものであり、他方が標的組織または器官、すなわち食道由来の試料である）を採取するか、対象由来の標的器官のみを用いる段階：（２）８６の染色体領域のパネル中のＳＧＡの有無について試料を解析する段階；および（３）次いで、８６の染色体領域のパネルから得られたＳＧＡ解析の結果を用いて、本明細書に開示されるリスク予測特徴のセットを選択する段階を含む、癌リスク予測モデルの開発を含む。ある実施形態では、本明細書に開示される方法は予測モデルの開発を含み、その予測モデルに対する重要性または有用性に応じて、本明細書に記載されるリスク予測特徴のセットに重みを付け得る。例えば、各リスク予測特徴に割り当てる重みを対象のＥＡリスクの予測に示すべき予測力に比例するよう設定し得る。このような実施形態では、リスク予測特徴の各セットの重みは、当業者に公知の方法、例えばロジスティック回帰モデル、ニューラルネットワーク、判別分析、ベクターサポートマシンをはじめとする分類のためのモデルなどによって算出される正の係数または負の係数であり得る。
【００３４】
次いで、染色体領域のパネルのＳＧＡ解析の結果および／または選択したリスク予測特徴のセットを用いて、癌リスクスコアを算出する予測モデルを開発し得る。ある実施形態では、式（１）：
【数１】
2015519053.tif 000003
を用いて癌リスクスコア（１つまたは複数）を算出し得る。
【００３５】
上式中、ｘｉは１〜ｎ（ｘ１、ｘ２、Ｘ３．．．ｘｎ）のリスク予測特徴のセットであり、βｉはリスク予測特徴ｘｉ（ｉは１〜ｎの値をとり、ｎはリスク予測特徴のセット中のリスク予測特徴の数である）に割り当てられる重み値である。算出されたリスク予測スコア（１つまたは複数）は、β０を−３．１０８に設定した後、式（２）：
１／（１＋ｅ−Ｓ）  （２）
を用いて基準化リスク予測スコアを算出することによって、０〜１の範囲に正規化し得る。
【００３６】
上式中、ｅは数学で定義されるオイラー数であり、その値は約２．７１８２８１８２８である。
【００３７】
本明細書に開示される方法は、対象のＥＡなどの癌のリスクを予測または検出するのに使用し得る０〜１の範囲の連続値により正規化リスクスコアを算出することを含む。例えば、約０．５０以上の正規化リスクスコアを対象のＥＡリスクが高いことを示すリスクスコアと見なし得る。このような実施形態では、約０．５０、０．５１、０．５２、０．５３、０．５４、０．５５、０．５６、０．５７、０．５８、０．５９、０．６０、０．６１、０．６２、０．６３、０．６４、０．６５、０．６６、０．６７、０．６８、０．６９、０．７０、０．７１、０．７２、０．７３、０．７４、０．７５、０．７６、０．７７、０．７８、０．７９、０．８０、０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７、０．８８、０．８９、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９および１．０の正規化リスクスコアを対象のＥＡリスクが高いことを示すリスクスコアと見なし得る。他の実施形態では、約０．０５〜約０．４９の範囲のリスクスコアを対象のＥＡリスクが中程度であることを示すリスクスコアと見なし得る。このような実施形態では、約０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３０、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４０、０．４１、０．４２、０．４３、０．４４、０．４５、０．４６、０．４７、０．４８および０．４９の正規化リスクスコアを対象のＥＡリスクが中程度であることを示すリスクスコアと見なし得る。また別の実施形態では、約０．０〜約０．０５の範囲の正規化リスクスコアを対象のＥＡリスクが低いことを示すリスクスコアと見なし得る。このような実施形態では、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４および０．０４９の正規化リスクスコアを対象のＥＡリスクが低いことを示すリスクスコアと見なし得る。さらに別の実施形態では、１つまたは複数のリスクグループを用いて、対象をそのリスクスコアに従って層別化し得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のリスクグループを用いて、対象をそのリスクスコアに従って層別化し得る。別の例では、対象をそのＥＡリスクスコアに従って「高リスク」、「中高リスク」」「中程度リスク」、「中低リスク」および「低リスク」の１つまたは複数のグループに層別化し得る。
【００３８】
いくつかの実施形態では、対象の癌リスクを予測および／または検出する方法は、以下に挙げる段階：（１）対象から遺伝子試料を採取する段階；（２）遺伝子試料由来の少なくとも１つの染色体領域に１つまたは複数のＳＧＡの有無を判定する段階；（３）少なくとも１つの染色体領域から少なくとも１つのリスク予測を選択する段階；および（５）少なくとも１つのリスク予測特徴に基づいて癌リスクスコアを得る段階を含み得るものであり、ここでは、癌リスクスコアが対象の癌リスクを予測するものとなる。リスク予測特徴のセットを選択する段階は、染色体領域のパネルのＳＧＡ解析の結果に基づき得るほか、リスク予測特徴の各セットに対する重み値を決定または算出し、この重み値を癌リスクスコアを得る段階に使用することを含み得る。
【００３９】
他の実施形態では、対象の癌リスクを予測および／または検出する方法は、以下に挙げる段階：（１）対象から遺伝子試料を採取する段階；（２）試料から染色体ＤＮＡを単離する段階；（３）試料の染色体ＤＮＡに由来する染色体領域のパネルに１つまたは複数のＳＧＡの有無を判定する段階；（４）ＳＧＡ解析の結果に基づいてリスク予測特徴のセットを選択する段階；および（５）（ａ）リスク予測特徴のセットに重みを付け、（ｂ）式（１）を用いて癌リスクスコアを算出し、（ｃ）式（２）を用いて癌リスクスコアを正規化することによって、リスク予測特徴に基づく癌リスクスコアを得る段階を含み得るものであり、ここでは、約０．５０以上の癌リスクスコアが対象の癌リスクが高いことを示し、約０．０５〜約０．４９の癌リスクスコアが対象の癌リスクが中程度であることを示し、約０．０〜約０．０４９の癌リスクスコアが対象の癌リスクが低いことを示す。
【００４０】
また別の実施形態では、対象のＥＡ癌リスクを予測および／または検出する方法は、以下に挙げる段階：（１）ＥＡリスクのある対象から遺伝子試料を採取する段階；（２）試料から染色体ＤＮＡを単離する段階；（３）試料の染色体ＤＮＡに由来する８６の染色体領域のパネルに１つまたは複数のＳＧＡの有無を判定する段階；（４）８６の染色体領域のパネルのＳＧＡ解析の結果に基づいて２９のリスク予測特徴からなるセットを選択する段階；および（５）（ａ）２９のリスク予測特徴からなるセットに重みを付け、（ｂ）式（１）を用いて癌リスクスコアを算出し、（ｃ）式（２）を用いて癌リスクスコアを正規化することによって、２９のリスク予測特徴からなるセットに基づく癌リスクスコアを算出する段階を含み、ここでは、約０．５０以上の癌リスクスコアが対象の癌リスクが高いことを示し、約０．０５〜約０．４９の癌リスクスコアが対象の癌リスクが中程度であることを示し、約０．０〜約０．０４９の癌リスクスコアが対象の癌リスクが低いことを示す。
【００４１】
本明細書にはほかにも、本明細書に開示される方法を実施するためのキットが提供される。ある実施形態では、キットは、キットの様々な構成要素のキャリアを含み得る。特定のこのような実施形態では、キャリアは、例えばバッグ、箱、管、ラックの形態の容器または支持体であってよく、任意選択で区切られている。キャリアには、輸送および保管時の安全性を確保するために密閉して閉じ込める明確な境界がある。特定の実施形態では、本明細書に開示される方法に使用するキットは、遺伝子試料の収集および調製ならびに本開示による癌リスクの予測および／または判定に有用な様々な構成要素を含み得る。例えば、キットは、本開示による癌リスクの予測および／または判定に有用なオリゴヌクレオチド、プローブ、ＤＮＡマイクロアレイまたはＳＮＰアレイ、注射器、解剖用メスならびに関連する試薬および材料を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示される１つまたは複数のＳＧＡの有無を判定する試薬（例えば、プローブ、プライマーおよび／または抗体）を含む。
【００４２】
本明細書に開示されるキットのオリゴヌクレオチドおよびプローブは、特に限定されないが、放射性同位元素、フルオロフォア、ビオチン、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）、酵素基質、リガンドおよび抗体などを含めた任意の適切な検出マーカーで標識されていてよい。あるいは、本明細書に開示されるキットに含まれるオリゴヌクレオチドおよびプローブは標識されておらず、代わりに、使用時に使用者がオリゴヌクレオチドおよびプローブを標識できるよう１つまたは複数のマーカーが提供される。
【００４３】
ある実施形態では、本明細書に開示されるキットに、特に限定されないが、Ｔａｑポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、標的ＤＮＡ配列の増幅に適した他のプライマー、ＲＮアーゼＡなどを含めた他の様々な組成物および構成要素を提供し得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるキットは、本明細書に開示される方法にキットを使用するための指示書を含み得る。
実施例
【００４４】
実施例１
２４８例の対象から２５年間にわたって収集した食道上皮生検試料を対象に縦断的症例コホート研究を実施した。この症例コホート研究は、食道細胞におけるＳＧＡの発現を特徴付け、対象のＥＡリスクを予測するようデザインされたものである。バレット食道（ＢＥ）を有し追跡期間中に癌に進行した参加者（「進行者」）７９例の生検４７３例およびＢＥを有し追跡期間中に癌に進行しなかった参加者（「非進行者」）１６９例の生検７９９例を含む計１２７２例の生検を検査した（表１）。
【００４５】
【表１】
2015519053.tif 000004
【００４６】
各生検試料を同じ対象の血液または胃組織の試料を含む正常な恒常的対照と対にした。対にした試料を標準的な方法に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｏｍｎｉ  ｑｕａｄ  １Ｍ  ＳＮＰアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて解析し、コピー増加、コピー減少、ｃｎＬＯＨおよびＨＤを含めたＳＧＡを特徴付けた。対にした恒常的対照を用いることにより、ｃｎＬＯＨの検出が可能になり、両親の対立遺伝子の増加（均衡増加）と対立遺伝子特異的増加を区別することができた。ＥＡ発症のリスクとの間に有意な相関のあるＳＧＡバイオマーカーを特定したゲノム全域にわたるＳＮＰアレイ解析の結果を付表Ａに示す。より具体的には、付表Ａは、１Ｍｂゲノムセグメントの特定の染色体位置にある特定のタイプのＳＧＡバイオマーカーの識別名を示している。付表Ａにはこのほか、進行者および非進行者で同定された各ＳＧＡバイオマーカーの頻度およびハザード比が示されている。
【００４７】
実施例２
ゲノム全域にわたるＳＮＰアレイ解析およびＥＡ発症のリスクと相関するＳＧＡバイオマーカーの特定の後（付表Ａ）、さらに解析を実施して、ＥＡリスク予測に使用し得る特定のＳＧＡバイオマーカーのパネルを選択した。ブーツストラップ法による逐次前進選択を用いて、表２に示される６つのゲノム領域（「巨大領域」）をＥＡ予測因子として特定した。
【００４８】
【表２】
2015519053.tif 000005
【００４９】
ＳＮＰアレイ解析および表２に記載した巨大領域の特定に使用したＳＮＰプローブを付表Ｂに示す。付表Ｂの項目にはＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｏｍｎｉ−Ｑｕａｄ  １Ｍ  ＳＮＰアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に用いたＩｌｌｕｍｉｎａ  ＳＮＰ識別子が含まれている。
【００５０】
６つの巨大領域のいずれか１つの任意の１Ｍｂセグメントにおける特定のＳＧＡマーカーの有無を示すスコアを用いて、ＥＡ進行者とＥＡ非進行者とを分離することに成功した。巨大領域１では、コサイン指標（０＝不一致、１＝完全に一致するか関連性がある）によって測定したこの領域の各１Ｍｂ位置間の平均二元相関は０．９３１であった。巨大領域２では、コサイン指標によって測定したこの領域の各１Ｍｂ位置間の平均二元相関は０．７９３である。巨大領域３では、コサイン指標によって測定したこの領域の各１Ｍｂ位置間の平均二元相関は０．７８４であった。巨大領域４では、コサイン指標によって測定したこの領域の各１Ｍｂ位置間の平均二元相関は０．９５０であった。巨大領域５では、コサイン指標によって測定したこの領域の各１Ｍｂ位置間の平均二元相関は０．９１１であった。巨大領域６では、コサイン指標によって測定したこの領域の各１Ｍｂ位置間の平均二元相関は０．７７２であった。全６つの巨大領域にわたって任意の１Ｍｂセグメントの特定のＳＧＡバイオマーカーを組み合わせれば、ＥＡリスク予測およびＥＡ進行者とＥＡ非進行者の分離がさらに向上すると考えられる。
【００５１】
実施例３
ゲノム全域にわたるＳＮＰアレイ解析の結果および実施例１のＳＧＡバイオマーカー（付表Ａ）をさらに検討し、ＥＡリスク予測のためのＳＧＡバイオマーカーを有する１Ｍｂゲノム領域をさらに特定した。付表Ａに記載される各１Ｍｂゲノム領域に対して挙げられているＳＧＡバイオマーカーのタイプ（増加、減少、ｃｎＬＯＨ、均衡増加およびＨＤ）に後退消去および前進ステップワイズ変数選択を含めたステップワイズ回帰法を用いて、１Ｍｂ領域を特定した。回帰分析では最初に２３１の染色体領域を選択し、次いでコックス比例ハザード回帰モデルを用いてこれらを組み合わせて、ＥＡリスクの有意な予測因子となる８６の１Ｍｂ染色体領域を特定した。表３に示される通り、この８６の染色体領域は、１７個のコピー増加、４個のＨＤ、３９個のｃｎＬＯＨ、２３個のコピー減少および３個の均衡増加を含むＳＧＡバイオマーカーによって特定されるものである。ＳＮＰアレイ解析および表３に記載する８６の染色体領域の特定に使用したＳＮＰプローブを付表Ｃに示す。付表Ｃの各項目にはＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｏｍｎｉ−Ｑｕａｄ  １Ｍ  ＳＮＰアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に用いたＩｌｌｕｍｉｎａ  ＳＮＰ識別子が含まれている。
【００５２】
【表３】
2015519053.tif 000006
2015519053.tif 000007
2015519053.tif 000008
【００５３】
表３に記載される１Ｍｂ領域には、実施例２の表２で特定される６つの巨大領域の複数の１Ｍｂゲノム領域が含まれている。より具体的には、実施例２の８つの重複する１Ｍｂ領域であり、表３に記載されているものには、（１）第１５染色体（７０〜７１Ｍｂ）のコピー増加、（２）第１７染色体（３７〜３８Ｍｂ）のコピー増加、（３および４）第１８染色体（１９〜２０Ｍｂ、３０〜３１Ｍｂ）のコピー増加、（５および６）第１３染色体（４２〜４３Ｍｂ、５８〜５９Ｍｂ）のｃｎＬＯＨ、（７）第１７染色体（９〜１０Ｍｂ）のｃｎＬＯＨおよび（８）第１７染色体（８〜９Ｍｂ）のコピー減少がある。実施例２の６つの巨大領域の１Ｍｂ領域を含む表３に記載される１Ｍｂ領域については、示される巨大領域の任意の１Ｍｂ領域を表３に記載されるしかるべきＳＧＡバイオマーカーのタイプに用いてスコア化し得ることに留意するべきである。このほか、表３に記載される１Ｍｂ領域の１つまたは複数のＳＧＡバイオマーカーの有無を示すスコアを個々に用いて、または任意の組合せで組み合わせて、患者のＥＡリスク予測のためのスコアを得ることができることに留意するべきである。
【００５４】
実施例４
実施例３（表３）に記載される８６の染色体領域を用いて、ＥＡリスク予測モデルを開発した。表３に記載される８６の染色体領域およびその相関するＳＧＡのそれぞれについて、１Ｍｂ領域に特定のＳＧＡが存在する場合はあり（またはリスクモデルでは１）のスコアを付け、１Ｍｂ領域に特定のＳＧＡが存在しない場合はなし（またはリスクモデルでは０）のスコアをつける。ＥＡリスク予測モデルの開発の一環として、８６の染色体領域のＳＧＡ解析スコアを以下に挙げる６つのサブセットにグループ化した：
１．１７個のコピー増加領域のＳＧＡスコアの合計。
２．４個のＨＤ領域のＳＧＡスコアの合計。
３．３９個のｃｎＬＯＨ領域のＳＧＡスコアの合計。
４．２３個のコピー減少領域のＳＧＡスコアの合計。
５．３個の均衡増加領域のＳＧＡスコアの合計。
６．全８６領域のＳＧＡスコアの合計。
【００５５】
ＳＧＡ解析スコアの６つのサブセットを用いて、逐次前進選択および曲線下面積（ＡＵＣ）比較によりＥＡリスク予測モデルを決定し、表４に示される２９のＥＡリスク予測特徴からなるセットに至った。
【００５６】
【表４】
2015519053.tif 000009
【００５７】
実施例５
表３の８６の染色体領域のＳＧＡ解析の結果および表４に記載される２９のリスク予測特徴に基づいて、ＥＡリスク予測モデルを開発し、ＥＡリスクスコア（１つまたは複数）を算出した。ＥＡリスクスコアは、式（３）：
【数２】
2015519053.tif 000010
を用いて、実施例１の２４８例の試料について算出した。
【００５８】
式（３）において、ｘｉは１〜２９（ｘｉ、ｘ２、Ｘ３．．．Ｘ２９）のリスク予測特徴のセットであり、βｉはリスク予測特徴ｘｉに割り当てられる重み値である。算出されたリスクスコア（１つまたは複数）は、β０を−３．１０８に設定した後、式（２）を用いて基準化リスク予測スコアを算出することによって、０〜１の範囲に正規化した。
【００５９】
ロジスティック回帰モデルを用いて、表４に記載される２９のリスク予測特徴からなるセットのそれぞれに対して重み値βｉを算出した。割り当てた重み値は、各リスク予測特徴が対象のＥＡリスクの予測に示すべき予測力に比例するよう設定した。表４で番号を付した２９のリスク予測特徴に対して算出した平均重みの組合せは以下の通りである：（１）７１．５３３、（２）３８．６６４、（３）１１．８６、（４）３１．８１、（５）０．８２２５７、（６）５４．６６、（７）６３．２８７、（８）２．０６２５、（９）２４．６６６、（１０）１０１．０６、（１１）７９．６４６、（１２）６１．３１７、（１３）−２９１．９７、（１４）１２．１３７、（１５）２３．３４８、（１６）−７０．４１２、（１７）９９．２０９、（１８）４７．０５８、（１９）１０９．０８、（２０）６８．９４５、（２１）−２．３９４、（２２）１．６４９、（２３）−２７．８４７、（２４）６．６３６３、（２５）−０．０７８２４６、（２６）８６．３３９、（２７）１．９４２７、（２８）−０．０３３９５２および（２９）０．１１４１５。
【００６０】
ロジスティック回帰モデルに加えて、１つに２つのニューロンを用いた隠れ層を１層有するニューラルネットワークを構築することにより、別法でも２９のリスク予測特徴からなるセットに対する重み値を算出した。ニューラルネットワークの隠れ層および出力層にはそれぞれ対数シグモイド関数および線形変換関数を用いた。試料の１０％を交差検証に用いてこの方法を使用することにより、良好な予測結果が得られた。２９のリスク予測特徴からなるセットの隠れニューロン１への重み（入力）は以下の通りであった：（１）−１１．１５３；（２）−７．６３９８；（３）−６．９９３８；（４）−９．７３８８；（５）−１．２５２４；（６）−１３．１２４；（７）−１０．０４３；（８）−４．１９６７；（９）−５．３８３４；（１０）−１３．０８７；（１１）−８．４６３５；（１２）−８．１２６２；（１３）５４．０３；（１４）−２．２０３；（１５）−４．８３９８；（１６）６．３９４２；（１７）−１４．２；（１８）１７．２６１；（１９）−１６．１４９；（２０）−８．１４９７；（２１）３．５９４４；（２２）−８．２７９５；（２３）４．９８０５；（２４）−７．２５８４；（２５）−０．４６７８４；（２６）−１６．５８８；（２７）−７．０６８４；（２８）２３．１４５；および（２９）−１．６９５。
【００６１】
２９のリスク予測特徴からなるセットの隠れニューロン２への重み（入力）のは以下の通りであった：（１）０．８０９３６、（２）−１０．８８３、（３）４．７９４６、（４）７．７２６７、（５）−８．５４９５、（６）−１３．１２２、（７）８．０３５４、（８）−２４．６６、（９）−０．０９９１３５、（１０）−８．９０９２、（１１）１４．６８６、（１２）６．８９９４、（１３）６．９７９４、（１４）−１０．７１８、（１５）−２０．７７８、（１６）２４．４８３、（１７）１２．４０５、（１８）８．６０６、（１９）３．４１５４、（２０）４．７７７３、（２１）６．４４６５、（２２）８．１５６５、（２３）５．１２８２、（２４）−２．２９８５、（２５）−０．５６９０６、（２６）８．８３５、（２７）−６．６３３１、（２８）−１８．４６２および（２９）−３５．０７５。隠れニューロン１および２の重みはそれぞれ−１．８２９９および−０．１２００８であった。２つの隠れニューロン１および２のバイアス値はそれぞれ−８７．７６１および−１．９０２４であった。出力ニューロンのバイアス値は１．０４５１であった。
【００６２】
実施例５に示されるリスク予測モデルおよび２９のリスク予測特徴の重みを用いて、食道上皮生検試料のＥＡリスク予測を算出した。図１に示される通り、１回目の前癌生検試料に基づくカプラン・マイヤー（ＫＭ）曲線プロットは、試料のＥＡリスクスコアが０．５０以上で高リスク群に割り当てられた対象を示す（上の線）。試料のＥＡリスクスコアが０．０５〜０．４９の対象は中程度リスク群に割り当てられた（中間の線）。低リスク群は試料のＥＡリスクスコアが０．０４９以下の対象を示していた（下の線）。
【００６３】
図２に示される通り、２回目の生検（内視鏡検査）試料を用いて、図１の中程度リスク群を高リスク群、中程度リスク群および低リスク群にさらに層別化した。２回目の内視鏡検査では、中程度リスク患者のほとんどが低リスク群に割り当てられ、高リスク群に割り当てられた患者はＥＡに進行するリスクが高いことが正確に予測され、評価後約３０〜３５か月以内にＥＡがみられた（上の線）。
【００６４】
図３は、ベースライン評価（または１回目の生検）から２５０か月の期間にわたって収集した３つのＥＡリスク群の試料生検データを示す。本明細書に開示される癌リスク予測モデルを用いて、対象を高リスク群（上の線）、中程度リスク群（中間の線）および低リスク群（下の線）の３つのリスク群に層別化した。この結果は、対象のＥＡリスクを正確に検出および予測するこのリスク予測モデルの精度が高いことを示している。
【００６５】
実施例６
本明細書に開示されるＥＡリスク予測モデルを用いて、後期ＥＡを有する対象のＥＡリスクを予測および検出した。ＥＡの臨床診断が確認されており、リスク予測モデルの開発に用いた元の研究に参加しなかった対象６例から食道上皮生検試料を入手した。試料を調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｏｍｎｉ−Ｑｕａｄ  １Ｍ  ＳＮＰアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、表３に記載される８６の染色体領域に位置する特定のＳＧＡについて検査した。６例の対象のＳＧＡ解析の結果を表５に示す。
【００６６】
【表５】
2015519053.tif 000011
2015519053.tif 000012
2015519053.tif 000013
【００６７】
ＳＧＡ解析の結果を用いて、表４による２９つのリスク予測特徴からなるセットを開発した。リスク予測モデルに２９のリスク予測特徴からなるセットの値をロジスティック回帰重み値とともに用いで、式（３）に従いリスクスコアを算出した。式（２）を用いてリスクスコアを正規化した。リスクスコアを表６に示す。
【００６８】
【表６】
2015519053.tif 000014
【００６９】
予測されたＥＡリスクスコアは、対象の実際のＥＡ疾患状態を正確に反映している。したがって、この結果は、ＥＡリスク予測モデルを用いて対象のＥＡリスクを正確に予測および検出することに成功したことを示すものである。
【００７０】
付表Ａ
有意なハザード比の１ＭｂゲノムセグメントにおけるＳＧＡの頻度。各１Ｍｂセグメントの項目には、ＳＧＡタイプ、染色体、位置（１Ｍｂゲノムセグメントの評価項目§）、進行者のＳＧＡ頻度（個人）、非進行者のＳＧＡ頻度（個人）および有意な＊ハザード比が含まれている。項目ごとにセミコロンで区切られている。
§（ｘＭｂ＝ｘ−１〜ｘＭｂ）；例えば、「１００Ｍｂ」は９９〜１００Ｍｂのゲノムセグメントに及ぶ。
【化１】
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【００７１】
付表Ｂ
ＳＮＰアレイ解析および表２に記載される巨大領域の特定に使用したＳＮＰプローブを付表Ｂに示す。各巨大領域をＳＧＡタイプ、染色体および染色体位置を表す太字で示し、それに続いてその巨大領域の解析に使用したＳＮＰプローブを記す。付表Ｂに記載されるＳＮＰプローブは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｏｍｎｉ−Ｑｕａｄ  １Ｍ  ＳＮＰアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に使用したそのＳＮＰ識別子により記載されている。
【化２】
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【００７２】
付表Ｃ
ＳＮＰアレイ解析および表３に記載される８６の染色体領域の特定に使用したプローブを付表Ｃに示す。表３に記載される８６の各染色体領域をＳＧＡタイプ、染色体および染色体位置を表す太字で示し、それに続いてその巨大領域の解析に使用したＳＮＰプローブを記す。付表Ｃに記載されるＳＮＰプローブは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｏｍｎｉ−Ｑｕａｄ  １Ｍ  ＳＮＰアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に使用したそのＳＮＰ識別子により記載されている。
【化３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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