(57)【要約】  本発明は、ａ）アルカンまたは１−アルカノールを準備するステップ、ｂ）前記アルカンまたは１−アルカノールを、水溶液中で、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼおよび酸素と、少なくとも３時間にわたり接触させるステップ、を含む方法に関する。
2015535426.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
ａ）アルカンまたは１−アルカノールを準備するステップ、
ｂ）前記アルカンまたは１−アルカノールを、水溶液中で、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼおよび酸素と、少なくとも３時間にわたり接触させるステップ、
を含む方法。
【請求項２】
ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼの、アルカンまたは１−アルカノールを相応のα，ω−ジオールへと転化させるための使用。
【請求項３】
前記アルカンまたは１−アルカノールを、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼの存在下で、少なくとも３時間、好ましくは１６時間、最も好ましくは２４時間にわたりインキュベートする、請求項１または２に記載の方法または使用。
【請求項４】
前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼの他に、フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼが存在し、それらフェレドキシンとフェレドキシンレダクターゼの両方が、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼと機能的に相互作用可能である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項５】
前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼが、アルカニボラックス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）由来のＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼ（アクセスコードYP_691921）またはその変異体であり、前記フェレドキシンが、（アクセスコードYP_691921）またはその変異体であり、かつ前記フェレドキシンレダクターゼが、（アクセスコードYP_691923）またはその変異体である、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項６】
前記アルカンまたは１−アルカノールが、１〜７個の、好ましくは１〜４個の炭素原子を有するアルカンである、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項７】
前記アルカンが、ブタンまたはイソブタンである、請求項６に記載の方法または使用。
【請求項８】
前記アルカンまたは１−アルカノールが、１〜７個の炭素原子を有する１−アルカノール、好ましくはブタノールまたはイソブタノールである、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項９】
前記アルカンが、１〜５０バールの、好ましくは１〜２０バールの、最も好ましくは１〜１０バールの分圧で供給される、請求項８に記載の方法または使用。
【請求項１０】
前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼ、フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼを含む群から選択される酵素の少なくとも１種が、前記１種以上の酵素を発現する全細胞触媒の形で供給される、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項１１】
前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼ、フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼを含む群から選択される酵素の全てが、前記酵素を発現する全細胞生体触媒の形で供給される、請求項１０に記載の方法または使用。
【請求項１２】
前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼ、フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼを含む群から選択される酵素の少なくとも１種、好ましくは全てが、組み換え酵素である、および／または過剰発現される、好ましくは過剰発現される、請求項１０または１１に記載の方法または使用。
【請求項１３】
前記全細胞生体触媒が、ＡｌｋＬファミリーのポリペプチド、好ましくはシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のＡｌｋＬ（アクセスコードCAB69081）またはその変異体を発現する、請求項１０から１２までのいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項１４】
前記全細胞生体触媒が、原核細胞、好ましくはＥ．コリである、請求項１０から１３までのいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項１５】
アルカンを相応のα，ω−ジオールへと転化するための、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、以下のステップ：
ａ）アルカンまたは１−アルカノールを準備するステップ、
ｂ）前記アルカンまたは１−アルカノールを、水溶液中で、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼおよび酸素と、少なくとも３時間にわたり接触させるステップ、
を含む方法に関する。
【０００２】
置換されたアルカン、例えばアルコール、アルデヒド、ケトン、カルボン酸およびアミンは、産業上需要のある化合物種であり、それらは、古典的には化石炭素源から作られた化合物の転化によって製造されている。再生可能でない化石燃料の供給がますます制限されているこの時代において、再生可能な資源、すなわち簡単かつ地質学的な時間尺度に対して迅速に埋め合わせられる材料から出発するアルカンおよびその誘導体の生物工学的製造方法にはかなりの関心が寄せられている。
【０００３】
アルカンを置換されたアルカンへと、特に酸化されたアルカンへと転化させる多くの方法が先行技術で報告されている。メタンモノオキシゲナーゼは、メタンの極めて安定なＣ−Ｈ結合中に１つの酸素原子をＮＡＤＨ依存的に挿入してメタノールを形成することを触媒し、そのメタン分解における第一ステップは、メチロサイナス・トリコスポリウム（Methylosinus trichosporium）およびメチロコッカス・カプスラツス（Methylococcus capsulatus）などのメタン資化性菌によって行われる。前記可溶性メタンモノオキシゲナーゼは、一般に広い基質スペクトルを有し、それには、飽和の、および不飽和の、直鎖状の、分枝鎖状の、および環状の、約Ｃ８までの炭化水素、ならびに芳香族の、複素環式の、および塩素化された化合物が含まれる（Merkx M, Kopp DA, Sazinsky MH, Blazyk JL, Mueller J, Lippard SJ (2001), Angew Chem Int Ed Engl 40:2782〜2807; Higgins IJ, Best DJ, Hammond RC. 1980）。メタン利用細菌における新たな発見は、前記細菌の生物圏における重要性と、その商用の可能性を際立たせる。ルブレドキシン依存性アルカンモノオキシゲナーゼ、例えばシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＧＰｏ１由来のアルカンモノオキシゲナーゼは、中鎖長のアルカンの酸化を触媒し、こうして、アルコールとカルボン酸との混合物が得られる（Grant C, Woodley, J. M, and Baganz, F (2011) Enzyme and Microbial Technology 48, 480〜486）。
【０００４】
しかしながら、２つ以上の置換基を有するアルキルは、多くの用途のために、例えば工業ポリマーの製造における架橋剤として必須である一方で、そのような生物工学的アプローチを使用して達成されうる置換度は限られている。アルカンを相応の１−アルカノールへと転化させるための多くの系が報告されているが、相応のα，ω−ジオール、すなわち２つの末端炭素原子にそれぞれ１つのヒドロキシル基を有するアルキル鎖を製造するのに使用されうる生物工学的プロセスは殆ど存在しない。更に、多くのオキシダーゼは、求められるアルコール生成物に不所望なアルデヒドおよびカルボン酸が混ざるほど、前記アルカン基質を過剰に酸化させる傾向にある。最後に、前記酸化は、選択的である必要がある。つまり、好ましくは、末端の炭素原子以外のアルカン炭素原子は、どれも酸化されないことが望ましい。
【０００５】
従って、本発明の基礎を成す課題は、アルカンまたは１−アルカノールを相応のα，ω−ジオールへと転化させることに向けた生物工学的経路であって、過剰酸化の程度が制限され、かつ／または該反応が十分に特異的であり、好ましくは末端炭素原子以外の炭素原子が全く置換されないか、もしくは殆ど置換されないという点で特異的である経路を提供することである。
【０００６】
第一の一態様においては、本発明の基礎を成す前記課題は、以下のステップ：
ａ）アルカンまたは１−アルカノールを準備するステップ、
ｂ）前記アルカンまたは１−アルカノールを、水溶液中で、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼおよび酸素と、少なくとも３時間にわたり接触させるステップ、
を含む方法によって解決される。
【０００７】
第二の一態様においては、本発明の基礎を成す前記課題は、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼの、アルカンまたは１−アルカノールを相応のα，ω−ジオールへと転化させるための使用によって解決される。
【０００８】
前記第一または第二の態様の第一の一実施形態においては、前記課題は、前記アルカンまたは１−アルカノールを、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼの存在下で、少なくとも３時間、好ましくは１６時間、最も好ましくは２４時間にわたりインキュベートする、方法または使用によって解決される。
【０００９】
前記第一または第二の態様の第一の実施形態の一実施形態でもある、前記第一または第二の態様の第二の一実施形態においては、前記課題は、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼの他に、フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼが存在し、それらフェレドキシンとフェレドキシンレダクターゼの両方が、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼと機能的に相互作用可能である、方法または使用によって解決される。
【００１０】
前記第一または第二の態様の第一ないし第二の実施形態の一実施形態でもある、前記第一または第二の態様の第三の一実施形態においては、前記課題は、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼが、アルカニボラックス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）由来のＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼ（アクセスコードYP_691921）またはその変異体であり、前記フェレドキシンが、アルカニボラックス・ボルクメンシス由来のフェレドキシン（アクセスコードYP_691921）またはその変異体であり、かつ前記フェレドキシンレダクターゼが、アルカニボラックス・ボルクメンシス由来のフェレドキシンレダクターゼ（アクセスコードYP_691923）またはその変異体である、方法または使用によって解決される。
【００１１】
前記第一または第二の態様の第一ないし第三の実施形態の一実施形態でもある、前記第一または第二の態様の第四の一実施形態においては、前記課題は、前記アルカンまたは１−アルカノールが、１〜７個の、好ましくは１〜４個の炭素原子を有するアルカンである、方法または使用によって解決される。
【００１２】
前記第一または第二の態様の第一ないし第四の実施形態の一実施形態でもある、前記第一または第二の態様の第五の一実施形態においては、前記課題は、前記アルカンが、ブタンまたはイソブタンである、方法または使用によって解決される。
【００１３】
前記第一または第二の態様の第一ないし第五の実施形態の一実施形態でもある、前記第一または第二の態様の第六の一実施形態においては、前記課題は、前記アルカンまたは１−アルカノールが、１〜７個の炭素原子を有する１−アルカノール、好ましくはブタノールまたはイソブタノールである、方法または使用によって解決される。
【００１４】
前記第一または第二の態様の第一ないし第六の実施形態の一実施形態でもある、前記第一または第二の態様の第七の一実施形態においては、前記課題は、前記アルカンが、１〜５０バールの、好ましくは１〜２０バールの、最も好ましくは１〜１０バールの分圧で供給される気体状アルカンである、方法または使用によって解決される。
【００１５】
前記第一または第二の態様の第一ないし第七の実施形態の一実施形態でもある、前記第一または第二の態様の第八の一実施形態においては、前記課題は、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼ、フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼを含む群から選択される酵素の少なくとも１種が、前記１種以上の酵素を発現する全細胞触媒（whole cell catalyst）の形で供給される、方法または使用によって解決される。
【００１６】
前記第一または第二の態様の第一ないし第八の実施形態の一実施形態でもある、前記第一または第二の態様の第九の一実施形態においては、前記課題は、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼ、フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼを含む群から選択される酵素の全てが、前記酵素を発現する全細胞生体触媒（whole cell biocatalyst）の形で供給される、方法または使用によって解決される。
【００１７】
前記第一または第二の態様の第一ないし第九の実施形態の一実施形態でもある、前記第一または第二の態様の第十の一実施形態においては、前記課題は、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼ、フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼを含む群から選択される酵素の少なくとも１種、好ましくは全てが、組み換え酵素である、および／または過剰発現される、好ましくは過剰発現される、方法または使用によって解決される。
【００１８】
前記第一または第二の態様の第一ないし第十の実施形態の一実施形態でもある、前記第一または第二の態様の第十一の一実施形態においては、前記課題は、前記全細胞生体触媒が、ＡｌｋＬファミリーのポリペプチド、好ましくはシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のＡｌｋＬ（アクセスコードCAB69081）またはその変異体を発現する、方法または使用によって解決される。
【００１９】
前記第一または第二の態様の第一ないし第十一の実施形態の一実施形態でもある、前記第一または第二の態様の第十二の一実施形態においては、前記課題は、前記全細胞生体触媒が、原核細胞、好ましくはＥ．コリ（E.coli）である、方法または使用によって解決される。
【００２０】
第三の一態様においては、本発明の基礎を成す前記課題は、第一もしくは第二の態様または該第一もしくは第二の態様の実施形態のいずれかによる方法の、アルカンを相応のα，ω−ジオールへと転化させるための使用によって解決される。
【００２１】
本発明は、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼを使用することで、アルカンが相応の１−アルカノールへと転化されうるだけでなく、相応のα，ω−ジオールへと転化されうるという驚くべき知見を基礎としている。
【００２２】
本発明は、アルカンまたは１−アルカノールを、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼと接触させるステップを含む、方法または使用を焦点としている。好ましい一実施形態においては、本願で使用される用語「ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼ」とは、オキシダーゼだけでなく、フェレドキシンとフェレドキシンレダクターゼも含む３成分系うちの当初の部分であり、そのオキシダーゼが、アルカン結合部位を有し、かつアルカンのヒドロキシル化が可能である、サイトゾル型シトクロムオキシダーゼを指す。より好ましい一実施形態においては、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼは、アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のシトクロムＰ４５０オキシダーゼ（アクセスコードYP_691921）と少なくとも８０パーセントの、好ましくは９０パーセントの、より好ましくは９５パーセントの、最も好ましくは９９パーセントのアミノ酸配列同一性を有し、かつ更にアルカンヒドロキシラーゼ活性を有する。もう一つの好ましい実施形態においては、前記シトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼは、前記のアミノ酸配列同一性の程度、前記結合部位および前記アルカンヒドロキシラーゼ活性に加えて、アミノ酸配列モチーフＬＬ（Ｉ／Ｌ）（Ｖ／Ｉ）ＧＧＮＤＴＴＲＮを有する。本願を通じて引用されるデータベースコードは、２０１２年１０月１２日にオンラインとなったＮＣＢＩデータベースバージョンのコードを指す。
【００２３】
できる限り効率的に還元剤からの電子の供給をもたらすことで、前記シトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ活性を持続させるために、前記アルカンヒドロキシラーゼを、そのアルカンヒドロキシラーゼと機能的に相互作用するフェレドキシンレダクターゼおよびフェレドキシンと組み合わせて使用することが好ましい。前記フェレドキシンとフェレドキシンレダクターゼは、複数の単離されたポリペプチドであってもよく、または前記シトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼの供給に全細胞生体触媒が使用される場合にはそれらは同時発現されてもよい。フェレドキシンレダクターゼおよび／またはフェレドキシンが、当該シトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼと機能的に相互作用するか否かは、当業者によって、還元剤が、アルカン基質と前記３種のポリペプチド（これらは、複数の単離されたポリペプチドであることが好ましい）の存在下にバックグラウンドレベルを超えて酸化されるかをモニタリングすることによって容易に決定されうる。その一方で、Scheps, D., Malca, H., Hoffmann, B., Nestl, B. M, およびHauer, B. (2011) Org. Biomol. Chem., 9, 6727により記載される酵素アッセイを使用してよく、それは、使用されるポリペプチドが機能的に相互作用すると反応速度の増加を示す。好ましい一実施形態においては、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼ、前記フェレドキシンおよび前記フェレドキシンレダクターゼは、同じ生物に由来するものであり、より好ましくはアルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２に由来するものであり、その場合には、アクセスコードは、それぞれ、YP_691921、YP_691923およびYP_691920である。
【００２４】
好ましい一実施形態においては、本願で使用される用語「接触する」とは、アルカンまたは１−アルカノールとオキシドレダクターゼとを、後者が前者を酸化させられるように直接的な接触にもたらすことを意味する。例えば、前記細胞と前記アルカンまたは１−アルカノールとは、当該細胞とアルカンまたは１−アルカノールについて不透過性の無機膜などの膜によって隔離された異なる区画に存在してはならない。前記アルカンまたは１−アルカノールが固体であるか、または可溶性である場合に、それは、水溶液でオキシドレダクターゼに簡単に加えることができる。前記アルカンまたは１−アルカノールが気体状である場合に、前記細胞を含む水溶液は、前記気体状のアルカンまたは１−アルカノールを含むガスと一緒に散布されてよい。
【００２５】
前記アルカンまたは１−アルカノールが固体である場合には、それを、好適な有機溶剤を使用して溶解させてから、前記水溶液へと添加することができる。好ましい有機溶剤は、生体適合性溶剤、すなわち、使用される細胞の生存を可能にし、かつ／または選択される前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼの活性を可能にする溶剤である。好ましい一実施形態においては、前記溶剤は、５個以上の、より好ましくは８個以上の、最も好ましくは１２個以上の炭素原子を含む脂肪酸またはその誘導体、例えばアルキルエステルである。好ましい一実施形態においては、前記有機溶剤は、ラウリン酸メチルエステルである。
【００２６】
前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼは、組み換えヒドロキシラーゼであってよい。好ましい一実施形態においては、本願で使用されるＣＹＰ１５３ファミリーの組み換えシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼの「組み換え」という用語は、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼをコードする核酸が、それを発現するために使用される生物の内因性核酸ではないか、または実際に内因性でない任意の野生型生物であるが、遺伝子工学を使用して作製されたものであることを意味する。当業者は、好適なプラスミド、核酸エレメント、例えばプロモーター配列およびかかるプラスミドの作製に使用できる方法に精通している。標準的な分子生物学的手法は、例えばSambrook他の（Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されている。
【００２７】
前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼを発現する野生型株が基本的に使用されるので、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼは、組み換え株において過剰発現される。好ましい一実施形態においては、本願で使用される用語「過剰発現」とは、該当するポリペプチドの濃度が、関連の野生型細胞中のその濃度と比較して高められていることを意味する。当業者は、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼの過剰発現のために使用されうる技術、例えばプラスミドのｐＥＴ系またはｐＧＥＸ系の使用に精通している。
【００２８】
前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼは、精製されたポリペプチドまたは単離されたポリペプチドであってよい。好ましい一実施形態においては、本願で使用される「精製された」とは、そのように呼ばれるポリペプチドが、その細胞中での発現の時点よりも純粋であることを意味する。その純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に続き、生成したゲルのクーマシーブルー染色によって判定することができる。好ましい一実施形態においては、前記ポリペプチドは、５０％を上回る、６０％を上回る、７０％を上回る、８０％を上回る、９０％を上回る、９５％を上回る、または９９％を上回る純度を有するが、該ポリペプチドは、原則的には、粗製細胞溶解物から１００％純度のポリペプチドまでの任意の純度の程度で使用されうる。当業者は、タンパク質精製法、例えば親和性クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、およびゲル濾過クロマトグラフィーに精通している。
【００２９】
前記アルカンまたは１−アルカノールは、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼと、該シトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼ活性に適合した環境で接触される。当業者は、酵素活性に関して考慮する必要があり、かつ通常の実験の範囲内で好適な条件を決定することができる標準的なパラメータ、例えばイオン強度、温度および好適な水性緩衝液の組成に精通している。シトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼ活性を維持するのに適した条件は、例えばScheps, D., Malca、H., Hoffmann, B., Nestl, B. M, およびHauer, B. (2011) Org. Biomol. Chem., 9, 6727に記載されている。
【００３０】
前記アルカンまたは１−アルカノールの酸化が、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼにより触媒される場合には、酸素が存在することは必須である。一般に、前記ヒドロキシラーゼは、水溶液中にあり、かつ酸素は、有気条件下で、すなわち分子酸素（Ｏ2）の存在下で反応容器を撹拌することによって導入される。その一方で、前記溶液は、純粋な分子酸素と、または分子酸素を、好ましくは窒素またはアルゴンなどの不活性ガスに加えて含むガス混合物と一緒に散布することができる。酸化されるべきアルカンまたは１−アルカノールが、想定される条件下で気体状であれば、前記アルカンまたは１−アルカノールは、そのような混合物の一部であってよい。好ましい一実施形態においては、前記水溶液は、酸素の供給のために空気と接触される。
【００３１】
好ましい一実施形態においては、分子酸素は、大気圧を上回る分圧で、好ましくは室温（２５℃）で測定された前記分圧で、好ましくは１．５バール超、２バール超、３バール超、４バール超、５バール超、６バール超、７バール超、８バール超、９バール超または１０バール超で存在してよい。
【００３２】
前記本発明の教示は、本願で明示的に言及された、例えば名称もしくはアクセッション番号によって明示的に言及された、または明白に言及されていない正確なアミノ酸配列もしくは核酸配列を有する生物学的巨大分子を使用して実施されるだけでなく、かかる配列の変異体を使用して実施してもよい。好ましい一実施形態においては、本願で使用される用語「変異体」は、参照のアミノ酸配列もしくは核酸配列に対して７０％を上回って、７５％を上回って、８０％を上回って、８５％を上回って、９０％を上回って、９２％を上回って、９４％を上回って、９５％を上回って、９６％を上回って、９７％を上回って、９８％を上回って、または９９％を上回って同一であるアミノ酸配列または核酸配列を含み、その際、好ましくは、タンパク質の機能、例えばタンパク質の触媒活性または分子の折り畳みもしくは構造のために必須なもの以外のアミノ酸は、欠失、置換または挿入による置き換えがなされるか、または必須アミノ酸は、保存的に置き換えがなされる。その技術水準は、２つの所定の核酸配列もしくはアミノ酸配列のアライメントをし、かつ同一性の程度を計算するために使用されうるアルゴリズムを含む（Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 第3版, Thompson他, Nucleic Acids Research 22, 4637〜4680, 1994、およびKatoh他, Genome Information, 16(1), 22〜33, 2005を参照のこと）。前記用語「変異体」は、前記用語「ホモログ」と同義にかつ互換的に使用される。かかる変異体は、アミノ酸配列もしくは核酸配列における欠失、挿入または置換の導入によって、また同様にかかる巨大分子もしくはその変異体を含めた融合によって調製できる。好ましい一実施形態においては、前記用語「変異体」は、アミノ酸配列に関しては、好ましくは、前記配列同一性に加えて、関連の参照配列もしくは野生型配列に関する１もしくは複数の保存的アミノ酸交換を含むアミノ酸配列を含むか、または１もしくは複数の保存的アミノ酸交換を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。好ましい一実施形態においては、アミノ酸配列もしくは核酸配列の変異体における用語「変異体」は、好ましくは前記の配列同一性の程度に加えて、アミノ酸配列もしくは核酸配列それぞれの任意の活性部および／または活性断片か、またはアミノ酸配列の活性部および／または活性断片をコードする任意の核酸配列を含む。好ましい一実施形態においては、本願で使用される用語「活性部」は、全長アミノ酸配列よりも小さいか、または全長アミノ酸配列より小さいものをコードする、それぞれのアミノ酸配列または核酸配列であって、該アミノ酸配列またはコードされるアミノ酸配列それぞれがその必須の生物学的活性の少なくとも幾らかを維持している前記配列を指す。例えば、プロテアーゼの活性部および／または活性フラグメントは、ポリペプチド中のペプチド結合を加水分解可能である。好ましい一実施形態においては、本願で使用される用語「その必須の生物学的活性の少なくとも幾らかを維持」とは、該当するアミノ酸配列が、バックグラウンド活性を上回りかつそれとは異なる生物学的活性を有し、かつ前記活性を特徴付ける動力学的パラメータ、より具体的にはｋcatおよびＫMが、好ましくは３桁以内の、より好ましくは２桁以内の、最も好��しくは１桁以内の、特定の基質に関する参照分子によって表される値である。好ましい一実施形態においては、核酸の変異体における用語「変異体」は、その相補鎖が、好ましくはストリンジェントな条件下で、参照核酸または野生型核酸にハイブリダイズする核酸を含む。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、当業者によって容易に決定でき、かつ一般にプローブ長、洗浄温度および塩濃度に依存した実験的計算値である。一般に、より長いプローブは、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とするが、一方で、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、変性ＤＮＡが相補鎖に再アニーリングする能力が、その溶融温度を下回る環境で存在することに依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間での所望されるホモロジーの程度が高いほど、使用できる相対温度はより高くなる。結果として、より高い相対温度は反応条件をよりストリンジェントにし、その一方でより低い温度はより低いストリンジェンシーにする傾向にある。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細と説明については、F. M. Ausubel (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc.,を参照のこと。更に、当業者は、マニュアル「The DIG System Users Guide for Filter Hybridization」, Boehringer Mannheim GmbH, マンハイム, ドイツ, 1993およびLiebl他のInternational Journal of Systematic Bacteriology 41 :255〜260 (1991)に示される、ハイブリダイゼーションによりどのようにしてＤＮＡ配列を同定するかについての指示に従うことができる。好ましい一実施形態においては、ストリンジェントな条件は、いかなるハイブリダイゼーションにも適用される。すなわち、プローブが標的配列に対して７０％以上同一である場合にのみハイブリダイゼーションが生ずる。標的配列に対してより低い同一性の程度を有するプローブはハイブリダイズしうるが、かかるハイブリッドは不安定であり、ストリンジェントな条件下での洗浄ステップにおいて、例えば塩の濃度を２×ＳＳＣに、または場合によりかつ引き続き０．５×ＳＳＣに下げることで引き離されうるが、その温度は、後ろに行くほど好ましい順序で、約５０℃〜６８℃、約５２℃〜６８℃、約５４℃〜６８℃、約５６℃〜６８℃、約５８℃〜６８℃、約６０℃〜６８℃、約６２℃〜６８℃、約６４℃〜６８℃、約６６℃〜６８℃である。特に好ましい一実施形態においては、前記温度は、約６４℃〜６８℃、または約６６℃〜６８℃である。塩の濃度は、０．２×ＳＳＣへと、または０．１×ＳＳＣへさえも調整することが可能である。参照配列または野生型配列に対して、少なくとも７０％の、８０％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％の同一性の程度を有するポリヌクレオチド断片が単離されうる。好ましい一実施形態においては、本願で使用される、核酸配列のホモログにおける用語「ホモログ」は、遺伝子コードの縮重に沿って、参照核酸配列と同じアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を指す。
【００３３】
その一方で、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼは、単離されたポリペプチドとしてよりはむしろ、全細胞生体触媒として提供されうる。好ましい一実施形態においては、本願で使用される用語「全細胞生体触媒」は、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼを、それとアルカンまたは１−アルカノールとが接触可能なように発現する生存細胞を指す。好ましい一実施形態においては、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼは、細胞外で細胞膜の外側に位置し、こうして前記全細胞生体触媒を取り囲む水溶液に晒される。その一方で、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼは、細胞内で、好ましくは細胞の細胞質中で発現される。当業者は、全細胞生体触媒を慣例のように作製する手法に精通している（例えば、ＵＳ１２／７４２，３１８を参照のこと）。
【００３４】
前記全細胞生体触媒によって発現されたＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼを用いたアルカンのジオールへの転化は、発現されるヒドロキシラーゼの活性によって制限されるだけでなく、使用される全細胞生体触媒の細胞質中に取り込まれる基質の量によって制限される。好ましい一実施形態においては、全細胞生体触媒は、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼに加えて、アルカン基質の取り込みを促進するために、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のａｌｋＬによってコードされるポリペプチド（アクセスコードCAB69081.1）またはその変異体を発現する。ＡｌｋＬを発現する例示的細胞および生物工学的に関連の細胞の細胞質中に基質を取り込むその能力を使用する方法は、ＷＯ２０１１／１３１４２０に記載されている。
【００３５】
α，ω−ジオールが求められている最終生成物でない場合に、そのジオールは、他の下流生成物、例えばジアミンへと、合成触媒または他の酵素により触媒される反応を使用して転化されうる。他の酵素が使用される場合に、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼに加えて、他の酵素、例えばトランスアミナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼなどを含む群からの１または複数を発現する全細胞生体触媒が使用されることが好ましい。他の触媒の例は、ＵＳ１２／７４２，３１８に記載されている。
【００３６】
全細胞生体触媒が、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼと、場合により更に他の酵素を発現する場合に、該全細胞生体触媒は、更に、例えば前記産物の分解または代謝が可能な酵素の欠失または不活性化によって該産物の収率が高まるように改変させることができる。例えば、前記求められる産物がエステルである場合に、１もしくは複数のエステルヒドロラーゼ、好ましくは該細胞に内因性でかつ細胞ゲノム中にコードされているエステルヒドロラーゼを、欠失または不活性化してよい。更に、求められるα，ω−ジオールの末端ヒドロキシル基の１つまたは２つを過剰酸化することができる任意のオキシダーゼを欠失または不活性化することができる。
【００３７】
本発明による教示は、広い範囲の細胞を全細胞生体触媒として使用して実施できる。好ましい一実施形態においては、本願で使用される用語「細胞」は、細菌、古細菌、菌類、藻類などを含む任意の永続的に単細胞の細胞を指す。好ましい一実施形態においては、前記細胞は、細菌細胞、より好ましくはシュードモナス（Pseudomonas）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）およびエシェリキア（Escherichia）を含む群からのいずれか、最も好ましくはエシェリキア・コリ（Eescherichia coli）である。もう一つの好ましい実施形態においては、前記細胞は、下級真核生物、より好ましくはサッカロマイセス（Saccharomyces）、カンディダ（Candida）、ピチア（Picchia）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）およびヤロウィア（Yarrowia）を含む群からの菌類であり、最も好ましくはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerivisiae）である。本願を通じて、用語「細胞」は、用語「微生物」と同義にかつ互換的に使用される。
【００３８】
前記細胞は、単離された細胞、つまり単独の細胞株の純粋培養であってよく、または少なくとも２種の株の混合物を含んでよい。生物工学的に関連した細胞は、商業的に入手可能であり、例えばアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）またはドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）から入手できる。微生物を保持および改変するためのプロトコールは、先行技術から入手でき、例えばSambroke/Fridge/Maniadis (1989): Molecular cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Press, 第２版、およびFuchs/Schlegel (2007), Allgemeine Mikrobiologie, 2008, Georg Thieme出版から入手できる。
【００３９】
好ましい一実施形態においては、本発明による教示の実施に使用される全細胞生体触媒は、低減された脂肪酸分解能を有する。微生物における脂肪酸の分解は、以下の一連の反応および事象によって達成される。まず第一に、脂肪酸は、少なくとも１種の外膜タンパク質と、脂肪酸ＣｏＡリガーゼ活性を有する１種の内膜関連タンパク質とを伴う（Ｅ．コリの場合にはＦａｄＬおよびＦａｄＤのそれぞれを指す）輸送／アシル活性化メカニズムを介して細胞膜を通じて輸送される必要がある。細胞内部で、分解されるべき脂肪酸は、β−酸化経路に付される。第一ステップは、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｅ．コリの場合にはＦａｄＥと呼ばれる）を通じてのアシル−ＣｏＡのエノイル−ＣｏＡへの転化を含む。生ずるエノイル−ＣｏＡは、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｅ．コリの場合にＦａｄＥと呼ばれる）によって触媒された水和および酸化を通じて３−ヒドロキシルアシル−ＣｏＡを介して３−ケトアシル−ＣｏＡへと転化される。最後に、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ（Ｅ．コリの場合にＦａｄＡ）は、３−ケトアシル−ＣｏＡを分解して、アセチル−ＣｏＡと２つの炭素原子分だけ短くなったアシル−ＣｏＡが得られる反応を触媒する。好ましい一実施形態においては、本願で使用される用語「低減された脂肪酸分解能を有する微生物」は、脂肪酸、好ましくは少なくとも８炭素鎖を有する脂肪酸を取り込むおよび／または分解する能力が低減された微生物を指す。微生物の脂肪酸分解能は、様々な様式で低減させることができる。好ましい一実施形態においては、前記微生物は、その野生型と比較して、β−酸化経路に関与する酵素の、例えば脂肪酸またはβ−酸化経路を介した前記脂肪酸分解の一部として形成されるその誘導体と相互作用する、好ましくは基質としての前記脂肪酸またはその誘導体を認識し、そしてそれをβ−酸化経路の一部として形成される全長脂肪酸よりはアセチル−ＣｏＡに近い代謝物へと転化することによって相互作用する酵素の低減された酵素活性を有する。特に好ましい一実施形態においては、これは、脂肪酸インポーター（fatty acid importer）、より具体的には脂肪酸取り込み機構の任意の構成要素を含む。例えば、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、それが脂肪酸−ＣｏＡエステルと相互作用し、該エステルを、脂肪酸−ＣｏＡエステルよりもアセチル−ＣｏＡに近いエノイルＣｏＡに転化するので、β−酸化経路に含まれる。好ましい一実施形態においては、本願で使用される用語「脂肪インター酸化経路（fatty inter oxidation pathway）に含まれる酵素」は、脂肪酸インポーターおよびそれらの構成要素、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび３−ケトン−アシル−ＣｏＡチオラーゼを含む群からの任意のポリペプチドを含む。
【００４０】
本発明による方法は、前記アルカンまたは１−アルカノールを、水溶液中で前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼの存在下にインキュベートすることを含む。このステップは、アルカンまたは１−アルカノールを前記溶液と一時的に接触させることを含むのみならず、実際に該アルカンまたは１−アルカノールをａｌｋＢ型のオキシドレダクターゼの存在下に、酸化反応が生ずるのに十分な時間で、例えば少なくとも１時間、２時間、４時間、５時間、１０時間または２０時間にわたりインキュベートすることを含んでよい。選択される温度は、本発明による細胞が、触媒的に有能に、および／または代謝的に活性に保持される温度、例えば該細胞がＥ．コリ細胞である場合には、１０〜４２℃、好ましくは３０〜４０℃、最も好ましくは３２〜３８℃の温度でなければならない。
【００４１】
酸化されるべき前記アルカンまたは１−アルカノールは、任意のアルカンまたは１−アルカノールであってよい。好ましい一実施形態においては、本願で使用される用語「アルカン」は、式ＣnＨ2n+2［式中、ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０であるか、またはそれより大きい］によって表される任意の化合物を指す。もう一つの好ましい実施形態においては、前記アルカンは、式ＣnＨ2n［式中、ｎは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０であるか、またはそれより大きい］によって表されるシクロアルカンである。好ましい一実施形態においては、前記アルカンまたは１−アルカノールは、室温（２５℃）および大気圧で、気体状のアルカンまたは１−アルカノール、例えばイソブタンである。もう一つの好ましい実施形態においては、本願で使用される用語「１−アルカノール」は、式ＣnＨ2n+2Ｏ［式中、ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０であるか、またはそれより大きい］によって表される任意の化合物を指す。もう一つの好ましい実施形態においては、本願で使用される用語「１−アルカノール」は、式ＣnＨ2nＯ［式中、ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０であるか、またはそれより大きい］によって表される任意の環式化合物を指す。最も好ましい一実施形態においては、前記１−アルカノールは、第一級脂肪族１−アルカノールである。
【００４２】
気体状のアルカンまたは１−アルカノールは、好ましくは、室温（２５℃）で測定された、大気圧を上回る分圧で、例えば１．５バール超、２バール超、３バール超、４バール超、５バール超、６バール超、７バール超、８バール超、９バール超または１０バール超で供給されることが好ましい。存在する全ての気体状化合物、例えば酸素、気体状のアルカンまたは１−アルカノールおよび窒素の合計した全圧は、１．５バール超、２バール超、３バール超、４バール超、５バール超、６バール超、７バール超、８バール超、９バール超または１０バール超であってよい。
【００４３】
用語「水溶液」は、主溶剤として水を含む、前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼを発現する全細胞生体触媒を少なくとも一時的に代謝的に活性におよび／または生存状態に維持するために、または前記ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼを触媒的に有能に維持するために使用できる任意の溶液を含み、かつ必要であれば任意の追加の基質を含む。当業者は、細胞を増殖しかつ細胞を維持するために使用できる多くの水溶液（通常は、培地と呼ばれる）、例えばＥ．コリの場合にはＬＢ培地に精通している。好ましい一実施形態においては、前記水溶液は、有気条件下に維持される。全細胞生体触媒として使用されるべき細胞の増殖のために、最少培地と比較して増殖速度の点で高まるため完全培地を使用することが好ましい。
【００４４】
本発明による方法または使用の実施のための水溶液として、単純な緩衝液または最少培地を、すなわち複合培地とは異なり、細胞を代謝的に活性におよび／または生存状態に維持するのに不可欠な塩と栄養の最少の組み合わせのみしか含まない合理的な単純な組成の培地を使用することが好ましい。例えば、Ｍ９培地を最少培地として使用してよい。酸化されるべき前記アルカンまたは１−アルカノールが水中に制限された可溶性しか有さない場合に、有機溶剤または界面活性剤、例えばTweenまたはTritonを水溶液に添加してよく、または疎水性溶剤を使用して、酸化されるべき前記アルカンまたは１−アルカノールを可溶化してよい。当業者は、様々な水溶液および有機溶液の調製に精通している。
【００４５】
前記反応は、回分方式で、または連続方式で行うことができる。当業者は、適切な発酵器および／または反応容器に精通している。
【００４６】
本発明を、以下の図面および実施例によって更に説明するが、前記実施例に制限されるものではなく、前記図面および実施例から、本発明の更なる特徴、実施形態、態様および利点を理解できる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、実施例１で形成された産物のＧＣ／ＭＳ分析を示す。その際、上部のパネルは、通常のサンプルの分析を示し、下部のパネルに示されるサンプル分析は、標準として合成１，４−ブタンジオールをスパイク添加したサンプルで行われたものである。
【図２】図２は、実施例１における経時的なブタノールおよび１，４−ブタンジオールの生成を示している。
【図３】図３は、実施例２における経時的な１，４−ブタンジオールの生成を示している。
【００４８】
実施例１：  アルカニボラックス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）由来のシトクロムＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼを発現するＥ．コリ  Ｗ３１１０ ｐＣＯＭ１０［Ａｂ＿Ｆｄ／ＣＹＰ１５３−２／ＦｄＯＲ／ａｌｋＬ］を使用したブタンの酸化
カナマイシンを補った２５ｍｌのＬＢ培地（組成：５ｇ／ｌの酵母エキス、１０ｇ／ｌのペプトン、０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、５０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシン）をそれぞれ含む３つの１００ｍｌフラスコに、Ｅ．コリ  Ｗ３１１０ ｐＣＯＭ１０［Ａｂ＿Ｆｄ／ＣＹＰ１５３−２／ＦｄＯＲ／ａｌｋＬ］のそれぞれ１００ｍｌのグリセロール凍結培養物（cryoculture）を使用して接種して、３７℃および２００ｒｐｍで２０時間にわたりインキュベートした。
【００４９】
引き続き、２５ｍｌのそれぞれの培養培地を、７５ｍｌの変性Ｍ９培地（組成：１５ｇ／ｌのグルコース、６．８ｇ／ｌのＮａ2ＰＯ4、３ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、２ｇ／ｌのＮＨ4Ｃｌ、１５ｇ／ｌの酵母エキス、０．４９ｇ／ｌのＭｇＳＯ4*７Ｈ2Ｏ、５０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシン、１５ｍｌの微量元素溶液ＵＳ３。前記微量元素溶液ＵＳ３の組成：３６．５ｇ／ｌの３７％塩化水素酸、１．９１のＭｎＣｌ2*４Ｈ2Ｏ、１．８７ｇ／ｌのＺｎＳＯ4*７Ｈ2Ｏ、０．８４ｇ／ｌのＮａ−ＥＤＴＡ*２Ｈ2Ｏ、０．３ｇ／ｌのＨ3ＢＯ3、０．２５ｇ／ｌのＮａ2ＭｏＯ4*２Ｈ2Ｏ、４．７ｇ／ｌのＣａＣｌ2*２Ｈ2Ｏ、１７．３ｇ／ｌのＦｅＳＯ4*７Ｈ2Ｏ、０．１５ｇ／ｌのＣｕＣｌ2*２Ｈ2Ｏ）に移した。前記フラスコを、３７℃および２００ｒｐｍで２．５時間にわたりインキュベートした。引き続き、温度を２５℃に下げた。２５℃で０．５時間後に、前記培養を０．４ｍＭのジシクロプロピルケトンを使用して誘導した。前記培養を、２５℃および２００ｒｐｍで更に１６時間にわたりインキュベートした。
【００５０】
それらの培養を合し、５０ｍｌのFalconチューブに移し、そして２５℃で５５００ｇにおいて１０分間にわたり遠心分離した。上清を廃棄し、３００ｍｌ培養からのペレットを５０ｍｌの変換バッファー（ｐＨ７）中に再懸濁した（前記変換バッファーの組成：８ｇ／ｌの（ＮＨ4）Ｈ2ＰＯ4、０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．４９ｇ／ｌのＭｇＳＯ4*７Ｈ2Ｏ、５０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシン、１５ｍｌ／ｌの微量元素溶液ＵＳ３；２５％のアンモニア溶液を用いてｐＨを７．０に調整した）。
【００５１】
１３０ｍｌの変換バッファー（ｐＨ７）および約３滴のオートクレーブした抑泡作用物質（Delamex）を含む３００ｍｌの発酵器を構成した。前記発酵器に、２５％のｎ−ブタンと７５％の合成空気とからなる混合物を含む加圧ガスフラスコ（pressure gas flask）（４バール初期圧力）から、０．２μｍの細孔サイズを有する焼結パーレーター（sinterperlator）を介して、約１０ｌN／時間の流速でガスを供給した。前記発酵器を、水浴中で撹拌し、そして該発酵器の温度を、水浴中で３０℃に調整し、そしてマグネティックスターラーを使用して９００ｒｐｍで撹拌した。ｐＨ値を、２．５％のアンモニア水を用いて７．０で維持した。グルコース溶液を、連続的に供給した（グルコース供給速度は、０．３ｇ／ｈである）。廃棄すべき空気を、１５０ｍｌの水を含む氷冷した洗浄瓶に移した。
【００５２】
該発酵器に、再懸濁された前培養ペレット５０ｍｌを使用して接種した。
【００５３】
６００ｎｍでの光学密度によって示される、発酵器中のバイオマスの濃度は、１６であった。１０ｍｌのサンプルを、該発酵器および洗浄瓶から様々な時点で取り出した。発酵器からのサンプルを、１００００ｇおよび室温で１０分間にわたり遠心分離し、そして上清を、０．２μｍのフィルタを使用して濾過した。
【００５４】
１−ブタノールの分析を、ＨＰＬＣ−ＲＩＤおよびＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２００システムを使用してクロマトグラフィーにより実施した。Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈカラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）を使用した。前記システムを、１０ｍＭのＨ2ＳＯ4を流出剤（running agent）として流速０．６ｍｌ／分およびカラム温度４０℃で稼働させた。分析されるべき全ての物質の標準を、超純水中で調製し、そして同じ条件下で測定した。分析は、保持時間値の比較により行った。
【００５５】
１，４−ブタンジオールの分析を、ＧＣ−ＭＳ（TraceGC Ultra/DSQ II、ThermoScientific社製、キャピラリーカラム：３０ｍ×０．２５ｍｍのZB-MAX 膜厚（ｄｆ）：０．２５９ｍ、Ｐ０１３）を使用して定性的に実施した。サンプルのタンパク質沈殿は、冷アセトンを使用して実施した（サンプル／アセトン  １：９）。遠心分離した上清を、ＧＣ−ＭＳ分析にかけた。物質は、測定されたスペクトルとデータベースのスペクトルとを比較することによって同定した。１，４−ブタンジオールは、そのＥＩスペクトルを使用して同定でき、１９．８８分の保持時間にあるピークに帰属させることができた。
【００５６】
その正体の確認のために、サンプルを１０ｍｇ／ｌの１，４−ブタンジオールでスパイク添加した。図１は、１，４−ブタンジオールの特徴的なフラグメントイオンｍ／ｚ７１についてのイオンストリームクロマトグラフィー（ion stream chromatography）を示している。希釈倍率（ＶＦ＝１０）を考慮してスパイク添加したサンプルとスパイク添加していないサンプルのピーク面積を比較することによって１，４−ブタンジオール濃度を１７ｍｇ／ｌで見積もることができた。
【００５７】
実施例２：
１−ブタノールの１，４−ブタンジオールへの酸化
実施例１で使用された菌株は、ブタンのみならず、１−ブタノールを１，４−ブタンジオールへと転化させることを示すことができた。
【００５８】
前シード培養（preseed culture）：１ＬのＬＢ培地（５ｇ／ｌの酵母エキス、１０ｇ／ｌのペプトン、０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１Ｌの水中に溶解、１２１℃で２０分間オートクレーブ）を調製した。
【００５９】
この溶液それぞれ２５ｍｌを、邪魔板を備える３つの１００ｍｌフラスコに移し、濾過により滅菌したカナマイシン溶液（５０ｇ／ｌ）２５μｌを補給し、そしてＥ．コリ  Ｗ３１１０ ｐＣＯＭ１０［Ａｂ＿Ｆｄ／ＣＹＰ１５３−２／ＦｄＯＲ／ａｌｋＬ］のそれぞれ２００ｍｌのグリセロール凍結培養物を使用して接種した。これらの培養を、３７℃および２００ｒｐｍ（振幅２．５ｃｍ）で２０時間にわたりインキュベートした。
【００６０】
シード培養：１Ｌの変性Ｍ９培地を調製した。前記培地は、６．８ｇ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4、３ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、１５ｇ／ｌの酵母エキス、０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、２ｇ／ｌのＮＨ4Ｃｌ、１５ｍｌの微量元素溶液ＵＳ３（１Ｌの該微量元素溶液ＵＳ３は、３６．５ｇのＨＣｌ（３７％）、１．９１ｇのＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ、１．８７ｇのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０．８４ｇのナトリウムＥＤＴＡ×２Ｈ2Ｏ、０．３ｇのＨ3ＢＯ3、０．２５ｇのＮａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ、４．７ｇのＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ、１７．３ｇのＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０．１５ｇのＣｕＣｌ2、１Ｌの水中に溶解）、１ｍｌ（ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ）溶液（２４６．４７ｇ／ｌ）、３０ｍｌのグルコース溶液（５００ｇ／ｌ）を含む。Ｎａ2ＨＰＯ4ないしＮＨ4Ｃｌを含む溶液９５４をオートクレーブにかけ、他の成分は別個に濾過によって滅菌し、そして引き続き添加した。ｐＨは、６．８であった。
【００６１】
１７５ｍｌの変性Ｍ９培地３つを、邪魔版を備える１０００ｍｌの振盪フラスコに移し、濾過により滅菌したカナマイシン溶液（５０ｇ／ｌ）７５μｌを補給し、それぞれ２５ｍｌの前シード培養を接種し、３７℃および２００ｒｐｍ（振幅２．５ｃｍ）でインキュベートした。３７℃で２．５時間後に、温度を２５℃に下げた。２５℃で０．５時間後に、前記培養を、０．４ｍＭのＤＣＰＫを使用して誘導し、そして２５℃で更に１６時間にわたりインキュベートした。
【００６２】
前記振盪フラスコからの培養を、滅菌的にプールし、そして遠心分離用フラスコ中で遠心分離した（６０００ｇ、１０分、２５℃）。上清を廃棄し、そしてペレットを３０ｍｌの７０ｍＭリン酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７）（組成：８ｇ／Ｌの（ＮＨ4）Ｈ2ＰＯ4、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．４９ｇ／ＬのＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、１５ｍｌの微量元素溶液ＵＳ３および５０ｇ／ｌのカナマイシン、ｐＨは５％ＮＨ4ＯＨを用いて調整した）中に再懸濁させた。
【００６３】
生体内変換：
約３滴のオートクレーブにかけた抑泡試薬（Delamex）を含む１５０ｍｌのリン酸アンモニウム緩衝液を、３００ｍｌの滅菌発酵器中に移した。空気は、前記発酵器中に０．２μｍの細孔サイズを有する金属焼結パーレーター（metal sinter perlator）を介して約１０Ｎｌ／ｈの流速で導入した。前記発酵器の温度を、水浴を使用して３０℃で保持し、そしてその内容物をマグネティックスターラーを使用して９００ｒｐｍで撹拌した。排出する空気は、１５０ｍｌの水を含む氷冷した洗浄瓶に通した。
【００６４】
該発酵器に、再懸濁されたバイオマスペレット３０ｍｌを使用して試料採取チューブを介して接種した。ｐＨを、２．５％のアンモニア溶液を用いて７．０で維持した。３０ｇ／ｌのグルコースと５０ｇ／ｌの１−ブタノールを含む供給溶液を、１．１２ｍｌ／ｈの供給速度で連続的に供給した。
【００６５】
６ｍｌのサンプルを、前記発酵器から、それぞれ０．２時間後、２時間後、４時間後、７時間後、２２．５時間後、３０．５時間後および４６．６時間後に取り出した。それらのサンプルを、１００００ｇおよび室温で１０分間にわたり遠心分離し、そして上清を濾過した。クロマトグラフィー分析を、ＧＣ−ＭＳを使用して実施した。１，４−ブタンジオールの標準を、リン酸アンモニウム緩衝液中で調製した。
【００６６】
１，４−ブタンジオールの経時的な濃度を、図３に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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