(57)【要約】本発明は、骨成長を助長し、骨折、骨欠損、または骨欠損症を治療するために有用な多相３次元印刷組織修復デバイスまたは足場、それを作製する方法、およびそれを使用して、骨成長を助長し、骨折、骨欠損、または骨欠損症を治療するための方法に関する。足場は、微多孔性シェルによって囲まれた相互接続された支柱を含む多孔性骨内部成長領域を有する。足場の端部には、シェルが、骨の端部間に足場を安定させるためのガイドフランジとして延長され得る。足場の中心は、空であり得、潜在的骨髄腔としての役割を果たし得る。多孔性内部成長構造は、例えば、抗生物質、成長因子、分化因子、サイトカイン、薬物、またはこれらの作用因子の組み合わせのうちの１つ以上で浸潤され得る硫酸カルシウム等の可溶性充填剤またはキャリアで浸潤され得る。
2015517879.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微多孔性シェルによって囲まれた相互接続された支柱を含む多孔性骨内部成長構造を有する組織修復デバイスまたは足場。
【請求項２】
前記微多孔性シェルは、骨の１つ以上の端部間に前記組織修復デバイスまたは足場を安定させるためのガイドとして延長されている、請求項１に記載の組織修復デバイスまたは足場。
【請求項３】
空の空間によって画定される中心を有する、請求項１に記載の組織修復デバイスまたは足場。
【請求項４】
前記多孔性内部成長構造は、可溶性充填剤またはキャリアで浸潤されている、請求項１に記載の組織修復デバイスまたは足場。
【請求項５】
前記可溶性充填剤またはキャリアは、硫酸カルシウムである、請求項４に記載の組織修復デバイスまたは足場。
【請求項６】
前記可溶性充填剤またはキャリアは、抗生物質、成長因子、分化因子、サイトカイン、薬物、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上で浸潤されている、請求項４に記載の組織修復デバイスまたは足場。
【請求項７】
前記支柱は、約１００−３５０μｍの直径である、請求項１に記載の組織修復デバイスまたは足場。
【請求項８】
前記支柱は、骨梁の約２倍以内または実質的に同一の直径である、請求項１に記載の組織修復デバイスまたは足場。
【請求項９】
１つ以上の支柱は、少なくとも５００μｍの空間によって、縦方向に分離されている、請求項１に記載の組織修復デバイスまたは足場。
【請求項１０】
多孔性であり、概して、約２０μｍ直径を上回るサイズで存在するメソ細孔を備えている、請求項１に記載の組織修復デバイスまたは足場。
【請求項１１】
前記支柱は、実質的に、線形配列で配列されている、請求項１に記載の組織修復デバイスまたは足場。
【請求項１２】
約８週間生体内に存在後、前記組織修復デバイスまたは足場の少なくとも約２５％が吸収されているような吸収性である、請求項１に記載の組織修復デバイスまたは足場。
【請求項１３】
少なくとも約５０％多孔性である、請求項１に記載の組織修復デバイスまたは足場。
【請求項１４】
約８週間生体内に存在後、前記組織修復デバイスまたは足場の少なくとも約２５％が骨によって置換されているように、骨成長を促進および提供するように動作可能である、請求項１に記載の組織修復デバイスまたは足場。
【請求項１５】
直径約０．１−１μｍを有する微小孔またはナノ細孔を備えている、請求項１に記載の組織修復デバイスまたは足場。
【請求項１６】
１つ以上の微小孔またはナノ細孔は、可溶化コラーゲンで浸潤されている、請求項１５に記載の組織修復デバイスまたは足場。
【請求項１７】
３次元印刷方法によって生成される、請求項１に記載の組織修復デバイスまたは足場。
【請求項１８】
骨成長を助長する、または骨折、骨欠損、または骨欠損症を治療する方法であって、前記方法は、請求項１に記載の微多孔性シェルによって囲まれた相互接続された支柱を含む多孔性骨内部成長構造を有する組織修復デバイスまたは足場を生体内の骨欠損症、骨折、または骨間隙を特徴とする領域に提供することを含む、方法。  
【請求項１９】
骨成長を助長する、または骨折、骨欠損、または骨欠損症を治療するために有用な組織修復デバイスまたは足場を生成する方法であって、前記組織修復デバイスまたは足場は、微多孔性シェルによって囲まれた相互接続された支柱を含む多孔性骨内部成長領域を有し、
前記方法は、
（ａ）軟組織に付着するが、その内部成長を制限するように機能し得る微多孔性シェルを提供することと、
（ｂ）前記多孔性内部成長構造を可溶性充填剤またはキャリアで浸潤することと
を含む、方法。
【請求項２０】
（ｃ）前記多孔性内部成長構造を抗生物質、成長因子、分化因子、サイトカイン、薬物、またはこれらの作用因子の組み合わせのうちの１つ以上で浸潤することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨成長を助長し、骨折、骨欠損、または骨欠損症を治療するために有用な多相３次元印刷組織修復デバイスまたは足場、それを作製する方法、およびそれを使用して、骨成長を助長し、骨折、骨欠損、または骨欠損症を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
頭蓋顔面の形成外科および整形外科分野において、骨および軟組織欠損は、多くの場合、自家組織移植片、処理されたヒト同種移植片材料、または人工（合成）材料を使用して充填されるが、それは全て、欠点を有する。自家材料は、別の外科手術部位から採取されなければならず、処理されたヒト同種移植片は、高価であり、一貫しておらず、かつ疾患伝染のリスクをもたらし得る。人工材料は、時として、良好に機能せず、時として、持続的または恒久的であり、感染する可能性がある。これらの材料は全て、複雑な部位に適合するように成形される必要があるか、または粒状の形態であり、何らかの方法で定位置に固定されなければならない。完璧な骨修復材料、すなわち、複雑な欠損に適合するようにカスタム製作され得、骨修復を刺激し、大きな骨欠損を充填し、かつ最終的に、分解および／または再建し、再生された骨のみを残す材料に関する研究が続けられている。同様の用途に利用可能ないくつかの人工材料として、Ｏｗｅｎ他、ＪＢＭＲ  Ｐａｒｔ  Ａ  ２０１０，Ｃｈｅｎ他、  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１１，Ｋｉｍ他、Ｔｉｓｓ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｂ，２０１０およびＦｕ他、Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ  ２０１１によって説明されるものが挙げられる。
【０００３】
歯槽突起裂またはトリーチャー・コリンズ症候群罹患者のような複雑な頭蓋顔面修復を要する子供は、成人と異なり、頭蓋顔面成長と連動して、骨再生を可能にし得る、完全吸収性材料を要求する。骨移植術は、これらの欠損を修復するために不十分であるため、これらの子供は、骨修復技術における革新を必要としている。理想的骨修復足場は、損失または欠失３次元構造にぴったり適合するような既製品であり、および／またはそのようにカスタム製作される必要がある。全体的細孔サイズ分布を制御しながらの微粒子浸出、相分離／反転、ポロゲン法、およびスピンキャスト等の３次元発泡足場製作技法は、個々の細孔場所、細孔形態、および細孔相互接続性を制御しない。後者は、栄養素および代謝物の交換を助長し、かつ足場を通る骨および血管細胞の伝達を助長するために、その必要性が十分に裏付けられている（Ｌｅｅ他、Ｊ  Ｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｍａｔｅｒ  Ｍｅｄ  ２０１０；２１：３１９５−３２０５）。
【０００４】
有用３次元印刷プロセスである、直接書込（ＤＷ）は、Ｎａｄｋａｒｎｉ他、Ｊ  Ａｍ  Ｃｅｒａｍ  Ｓｏｃ  ２００６；８９：９６−１０３によって詳述されるように、連続フィラメントとしてのコロイドインクの押出成形／堆積に基づく。ＤＷは、骨足場のために要求される格子構造の印刷を可能にするであろう自己支持フィラメント／支柱のために、インク中に最小製作助剤（すなわち、ポリマー）を要求する。足場は、ＸＹ平面上にインクを押出成形し、底部層を「書き込み」、次いで、Ｚ高さまで移動させ、３次元構造が形成されるまで、追加の層を書き込むことによって印刷される。印刷された素地の事後処理として、高温炉内での結合剤の完全燃焼および焼結が要求される。結果として生じる足場は、高分解能かつ非常に再現性がある。
【０００５】
Ｓｉｍｏｎ他、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；８３Ａ：７４７−７５８による以前の研究は、１１ｍｍのウサギの頭頂骨トレフィン欠損をヒドロキシアパタイト（ＨＡ）で充填することから成る。ベータ型リン酸三カルシウム（βＴＣＰ）をＨＡに添加し、骨伝導性および再建可能であることが示されている、二相性コロイドを形成することによって、足場吸収率を増加させることが可能である。さらに、硫酸カルシウム（ＣＳ）が、一時的充填剤として、支柱間の空間を充填するために添加された。ＣＳは、完全吸収性、骨伝導性、血管新生性、および生体適合性であることが知られており（Ｔｈｏｍａｓ他、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；８８Ｂ：５９７−６１０）、足場内において、骨内部成長前面の直前において分解する、充填剤として作用する役割を果たす。
【０００６】
メソ細孔空間および支柱パターンが内部成長骨の形態を決定する方法を決定することは、有用となるであろう。多くの研究が、細孔サイズと骨形成との間の関係を調査するために行われているが、最適細孔サイズは、不明であり、ほとんどの研究は、１００〜４００μｍの範囲であると示唆している（ＬｅＧｅｒｏｓ，Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｌａｔ  Ｒｅｓ２００２；３９５：８１−９８）。ＤＷは、足場内に制御されたメソ細孔サイズの生成を可能にする。頭頂骨欠損のための以前の足場設計の１つは、２５０μｍ〜４００μｍの異なる格子間隔を備える四分円を伴う、１１ｍｍの円盤から成るものであった。生体内で８および１６週間後、より小さい細孔領域は、より大きい細孔領域と異なるパターンの骨成長および足場吸収率をもたらした（Ｒｉｃｃｉ他、Ｊ  Ｃｒａｎｉｏｆａｃ  Ｓｕｒｇ  ２０１２；２３：００−００；Ｒｉｃｃｉ他、“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｂｏｎｅ．”Ｉｎ：  Ｂｏｎｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．  ＪＥ  Ｄａｖｉｅｓ，Ｅｍ２  Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔ．  Ｃａｎａｄａ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３０，３３２−３４４，２０００（非特許文献１））。
【０００７】
広範に及ぶ複雑な骨修復および再生を要求する多くの臨床状況が、容認可能な解決策のない問題を提示し続けている。現在の臨床治療は、精緻かつ複雑な自家移植手技を要求する妥協案であるか、あるいは不完全な同種異系または人工治療選択肢を提示する。あらゆる場合において、これらの複雑な骨修復状況は、具体的部位のために作製されていない材料が、可能な限り良好に欠損内に適合することを要求する。複雑な欠損を修復するためにカスタム製作される潜在性を有する骨伝導性生体材料から成る、３次元足場を印刷するための新しい手段を提供することが望ましいであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｉｃｃｉ他、“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｂｏｎｅ．”Ｉｎ：Ｂｏｎｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第３０章，３３２−３４４，２０００、編者：ＪＥ  Ｄａｖｉｅｓ，Ｅｍ２  Ｉｎｃ．，カナダ、オンタリオ州トロント
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の側面では、本発明は、微多孔性シェルによって囲まれた相互接続された支柱を含む多孔性骨内部成長領域を有する、組織修復デバイスまたは足場を提供する。微多孔性シェルは、軟組織に付着するが、その内部成長を制限するように機能し得る。組織修復デバイスまたは足場の端部には、シェルが、骨の端部間、骨欠損にわたって等、組織修復デバイスまたは足場を安定させるためのガイドフランジとして延長され得るか、あるいは組織修復デバイスまたは足場は、扁平骨の欠損を修復するために使用され得る。組織修復デバイスまたは足場の中心は、空であり得、潜在的骨髄腔としての役割を果たし得る。多孔性内部成長構造は、例えば、硫酸カルシウム等の可溶性充填剤またはキャリアで浸潤され得る。例えば、硫酸カルシウム等のこの可溶性充填剤またはキャリアは、抗生物質、成長因子、分化因子、サイトカイン、薬物、またはこれらの作用因子の組み合わせのうちの１つ以上で浸潤され得る。組織修復デバイスまたは足場は、長骨の皮質骨端間に適合し、大部分が骨内膜表面および骨膜表面に由来する治癒骨を伝導させ得るか、あるいは、例えば、扁平骨の骨欠損またはその近傍で使用され得る。組織修復デバイスまたは足場は、改良された骨プレートまたは骨ねじを使用して、安定され得る。組織修復デバイスまたは足場は、３次元印刷手技によって生成され得、例えば、骨伝導性セラミックから形成され得る。
【００１０】
組織修復デバイスまたは足場は、多相３次元印刷組織修復デバイスであり得る。支柱は、実質的に、円筒形であり得、例えば、約１−１，０００、１０−９００、２０−８００、３０−７００、４０−６００、５０−５００、６０−４００、１００−３５０、１２０−３００、または約２００−２７５μｍの直径であり得る。いくつかの実施形態では、支柱は、約２０−９４０μｍの直径であり得る。いくつかの実施形態では、支柱は、骨梁の約３倍、２倍、または１．５倍以内、あるいは実質的に同一の直径である。いくつかの実施形態では、支柱は、最大１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００μｍ以上、またはさらに１．０ｍｍ以上の空間によって、縦方向に分離され得る。同様に、組織修復デバイスまたは足場は、概して、約１００、７５、５０、３０、２０、１０未満、またはさらに約５、４、３、２、１未満、またはさらに０．５、０．４、０．３、０．２、０．１μｍ未満の直径のサイズで存在し得るメソ細孔を有する多孔性であり得る。支柱は、実質的に、線形配列で配列され得る。組織修復デバイスまたは足場は、実質的に、例えば、約８、１０、１２、１６、１８、２０、２４週間程度、生体内に存在後、組織修復デバイスまたは足場の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％以上が吸収され得るような吸収性であり得る。組織修復デバイスまたは足場は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらにそれ以上の多孔性であり得る。同様に、組織修復デバイスまたは足場は、約８または１６週間、生体内に存在後、組織修復デバイスまたは足場の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％以上が、骨によって置換され得るように、骨成長を促進および提供するように、効率的であり得る。組織修復デバイスまたは足場は、組織修復デバイスまたは足場内あるいは組織修復デバイスまたは足場の領域または区域内において、海綿骨または皮質骨を助長または形成し得る。組織修復デバイスまたは足場は、骨を再建する、または骨の密度を局所的に制御するために使用され得る。
【００１１】
組織修復デバイスまたは足場は、３次元（Ｘ、Ｙ、およびＺ）において支柱間隔を変動させることによって形成される、メソ細孔の勾配を特徴とし得る。ＸおよびＹ次元における間隔は、例えば、１００−９４０μｍの間隔を伴う半径方向またはＶ形状パターンを使用して、達成され得る。Ｚ次元における間隔は、半径方向支柱の複数の層を積層することによって、達成され得る。多孔性内部成長構造は、例えば、硫酸カルシウム等の可溶性充填剤またはキャリアで浸潤され得る。いくつかの実施形態では、多孔性内部成長構造は、例えば、リン酸カルシウムミネラルおよびＩ型コラーゲンタンパク質等、破骨細胞を引き付ける充填剤で浸潤され得る。いくつかの事例では、印刷された組織修復デバイスまたは足場は、約０．１−１μｍの細孔サイズレベルのマイクロ／ナノ多孔性であり得る。細孔は、次いで、いくつかの事例では、可溶化コラーゲンで浸潤され得る。
【００１２】
組織修復デバイスまたは足場は、少なくとも５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ミリメートル以上の距離にわたって、骨成長を助長し、骨折、骨欠損、または骨欠損症を治療するために効果的であり得る。同様に、組織修復デバイスまたは足場は、皮質骨または皮質様骨および小柱骨または小柱様骨両方の成長を助長するために効果的であり得る。そのように成長された骨は、例えば、９５％、９０％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１０％程度の小柱骨または小柱様骨、または正反対に、すなわち、９５％、９０％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１０％程度の皮質骨または皮質様骨等、任意の好適な割合であり得る。組織修復デバイスまたは足場は、５、１０、２０、２５、３０、４０、５０、７５、９０％以上、骨欠損にわたる通常修復時間を削減または短縮するために効果的であり得る。いくつかの事例では、骨欠損は、通常要求される時間の約２分の１、３分の１、または４分の１の時間で修復され得る。多くの事例では、より大きい細孔サイズは、足場の外側部分近傍に見られ、より小さい細孔サイズは、足場の内側部分近傍に見られる。いくつかの事例では、表面積の内側半分を形成する足場の部分は、表面積の外側半分を形成する足場の部分の中間細孔直径サイズまたは面積より５、１０、２０、２５、３０、４０、５０、７５、９０％以上小さい、中間細孔直径サイズまたは面積を有し得る。いくつかの事例では、細孔サイズは、骨成長のタイプ（例えば、所望される骨密度、小柱様骨または皮質様骨）をカスタマイズするように、任意の好適なまたは望ましい構成で構造的に配列される。同様に、いくつかの事例では、組織修復デバイスまたは足場は、欠損に最適に及ぶように所望される組織または骨修復の形状をカスタマイズするように形成および成形される。さらに、いくつかの事例では、組織修復デバイスまたは足場の一部は、実質的に、中空であり得、例えば、組織修復デバイスまたは足場の内部部分の１０、２０、２５、３０、４０、５０、７５、９０％以上は、実質的に、中空であり得る。
【００１３】
第２の側面では、本発明は、微多孔性シェルによって囲まれた相互接続された支柱を含む多孔性骨内部成長領域を有する、組織修復デバイスまたは足場を提供することによって、骨成長を助長する、または骨折、骨欠損、または骨欠損症を治療する方法を提供する。骨成長を助長する、または骨折、骨欠損、または骨欠損症を治療することは、骨の密度を制御する、またはそれに影響を及ぼすことを特徴とし得、あるいは骨、例えば、海綿骨または皮質骨を再建することを特徴とし得る。ほとんどの事例では、組織修復デバイスまたは足場は、骨欠損症、骨折、または骨間隙を特徴とする領域に対して生体内に提供される。微多孔性シェルは、軟組織に付着するが、その内部成長を制限するように機能し得る。組織修復デバイスまたは足場の端部には、シェルが、骨の端部間に組織修復デバイスまたは足場を安定させるためのガイドフランジとして延長され得る。組織修復デバイスまたは足場の中心は、空であり得、潜在的骨髄腔としての役割を果たし得る。多孔性内部成長構造は、例えば、硫酸カルシウム等の可溶性充填剤またはキャリアで浸潤され得る。例えば、硫酸カルシウム等のこの可溶性充填剤またはキャリアは、抗生物質、成長因子、分化因子、サイトカイン、薬物、またはこれらの作用因子の組み合わせのうちの１つ以上で浸潤され得る。組織修復デバイスまたは足場は、長骨の皮質骨端間に適合し、大部分が骨内膜表面および骨膜表面に由来する治癒骨を伝導させ得る。組織修復デバイスまたは足場は、改良された骨プレートまたは骨ねじを使用して、安定され得る。組織修復デバイスまたは足場は、３次元印刷手技によって生成され得、例えば、骨伝導性セラミックから形成され得る。
【００１４】
組織修復デバイスまたは足場は、多相３次元印刷組織修復デバイスであり得る。支柱は、実質的に、円筒形であり得、例えば、約１−１，０００、１０−９００、２０−８００、３０−７００、４０−６００、５０−５００、６０−４００、１００−３５０、１２０−３００、または約２００−２７５μｍの直径であり得る。いくつかの実施形態では、支柱は、約２０−９４０μｍの直径である。いくつかの実施形態では、支柱は、骨梁の約３倍、２倍、または１．５倍以内、あるいは実質的に同一の直径である。いくつかの実施形態では、支柱は、最大１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００μｍ以上、またはさらに１．０ｍｍ以上の空間によって、縦方向に分離され得る。同様に、組織修復デバイスまたは足場は、概して、約１００、７５、５０、３０、２０、１０未満、またはさらに約５、４、３、２、１未満、またはさらに０．５、０．４、０．３、０．２、０．１μｍ未満の直径のサイズで存在し得るメソ細孔を有する多孔性であり得る。支柱は、実質的に、線形配列で配列され得る。組織修復デバイスまたは足場は、実質的に、例えば、約８、１０、１２、１６、１８、２０、２４週間程度、生体内に存在後、組織修復デバイスまたは足場の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％以上が吸収され得るような吸収性であり得る。組織修復デバイスまたは足場は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらにそれ以上の多孔性であり得る。同様に、組織修復デバイスまたは足場は、約８または１６週間、生体内に存在後、組織修復デバイスまたは足場の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％以上が、骨によって置換され得るように、骨成長を促進および提供するように、効率的であり得る。
【００１５】
組織修復デバイスまたは足場は、３次元（Ｘ、Ｙ、およびＺ）において支柱間隔を変動させることによって形成される、メソ細孔の勾配を特徴とし得る。ＸおよびＹ次元における間隔は、例えば、１００−９４０μｍの間隔を伴う半径方向またはＶ形状パターンを使用して、達成され得る。Ｚ次元における間隔は、半径方向支柱の複数の層を積層することによって、達成され得る。多孔性内部成長構造は、例えば、硫酸カルシウム等の可溶性充填剤またはキャリアで浸潤され得る。いくつかの実施形態では、多孔性内部成長構造は、例えば、リン酸カルシウムミネラルおよびＩ型コラーゲンタンパク質等、破骨細胞を引き付ける充填剤で浸潤され得る。いくつかの事例では、印刷された組織修復デバイスまたは足場は、約０．１−１μｍの細孔サイズレベルのマイクロ／ナノ多孔性であり得る。細孔は、次いで、いくつかの事例では、可溶化コラーゲンで浸潤され得る。
【００１６】
組織修復デバイスまたは足場は、少なくとも５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ミリメートル以上の距離にわたって、骨成長を助長し、骨折、骨欠損、または骨欠損症を治療するために効果的であり得る。同様に、組織修復デバイスまたは足場は、皮質骨または皮質様骨および小柱骨または小柱様骨の両方の成長を助長するために効果的であり得る。そのように成長された骨は、例えば、９５％、９０％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１０％程度の小柱骨または小柱様骨、または正反対に、すなわち、９５％、９０％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１０％程度の皮質骨または皮質様骨等、任意の好適な割合であり得る。組織修復デバイスまたは足場は、５、１０、２０、２５、３０、４０、５０、７５、９０％以上、骨欠損にわたる通常修復時間を削減または短縮するために効果的であり得る。いくつかの事例では、骨欠損は、通常要求される時間の約２分の１、３分の１、または４分の１の時間で修復され得る。多くの事例では、より大きい細孔サイズは、足場の外側部分近傍に見られ、およびより小さい細孔サイズは、足場の内側部分近傍に見られる。いくつかの事例では、表面積の内側半分を形成する足場の部分は、表面積の外側半分を形成する足場の部分の中間細孔直径サイズまたは面積より５、１０、２０、２５、３０、４０、５０、７５、９０％以上小さい、中間細孔直径サイズまたは面積を有し得る。いくつかの事例では、細孔サイズは、骨成長のタイプ（例えば、所望される骨密度、小柱様骨または皮質様骨）をカスタマイズするように、任意の好適なまたは望ましい構成で構造的に配列される。同様に、いくつかの事例では、組織修復デバイスまたは足場は、欠損に最適に及ぶように所望される組織または骨修復の形状をカスタマイズするように形成および成形される。
【００１７】
第３の側面では、本発明は、微多孔性シェルによって囲まれた相互接続された支柱を含む多孔性骨内部成長領域を有する、骨成長を助長する、または骨折、骨欠損、または骨欠損症を治療するために有用な組織修復デバイスまたは足場を生成する方法を提供する。本方法は、（ａ）軟組織に付着するが、内部成長を制限するように機能し得る微多孔性シェルを提供することと、（ｂ）多孔性内部成長構造を可溶性充填剤またはキャリアで浸潤することと、随意に、（ｃ）多孔性内部成長構造を抗生物質、成長因子、分化因子、サイトカイン、薬物、またはこれらの作用因子の組み合わせのうちの１つ以上で浸潤することとを特徴とする。可溶性充填剤またはキャリアは、例えば、リン酸カルシウムミネラルおよびＩ型コラーゲンタンパク質等、破骨細胞を引き付ける充填剤であり得る。微多孔性シェルによって囲まれた相互接続された支柱を含む多孔性骨内部成長領域を有する、骨成長を助長する、または骨折、骨欠損、または骨欠損症を治療するために有用な組織修復デバイスまたは足場は、本発明の第１および第２の側面に関して本明細書に説明される特徴を有し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、長骨欠損を再生させるために使用され得る、組織修復デバイスまたは足場設計の概略図であり、欠損におけるその設置および固定を示す。足場は、微多孔性シェル（Ｂ）によって囲まれた相互接続された２５０μｍの円筒形支柱を含み、軟組織に付着するが、内部成長を制限する、多孔性骨内部成長領域（Ａ）を有する。足場の端部には、シェルが、ガイドフランジ（Ｃ）として延長され、骨端間に構造体を安定させ得る。足場の中心（Ｄ）は、潜在的骨髄腔として、空のまま残され得る。多孔性内部成長構造（図面の左上の破線で輪郭が描かれる）は、抗生物質、成長因子、分化因子、サイトカイン、薬物、またはこれらの作用因子の組み合わせのうちの１つ以上で浸潤され得る、可溶性充填剤／キャリア（実施例として、硫酸カルシウム等）で浸潤され得る。足場は、長骨の皮質骨端（Ｅ）間に適合し、大部分が骨内膜表面および骨膜表面（Ｆ）に由来する治癒骨を伝導させ得る。構造体は、改良された骨プレート（Ｇ）および骨ねじ（Ｈ）を使用して安定され得る。
【図２】図２は、連続フィラメントとしてのコロイドインクの押出成形／堆積に基づく、直接書込（ＤＷ）印刷装置を描写する。ＤＷは、骨足場のために要求される格子構造の印刷を可能にする、自己支持フィラメント／支柱のために、インク中に最小製作助剤（すなわち、ポリマー）を要求する。足場は、ＸＹ平面上にインクを押出成形し、底部層を「書き込み」、次いで、Ｚ高さまで移動させ、３次元構造が形成されるまで、追加の層を書き込むことによって印刷される。印刷された素地の事後処理として、高温炉内での結合剤の完全燃焼および焼結が要求される。結果として生じる足場は、高分解能かつ非常に再現性がある。
【図３】図３は、２５０μｍ〜４００μｍの異なる格子間隔を備える四分円を伴う、１１ｍｍの円盤を有する、頭頂骨欠損のための以前の足場設計の１つを描写する。生体内で８および１６週間後、より小さい細孔領域は、より大きい細孔領域と異なるパターンの骨成長および足場吸収率をもたらした。
【図４】図４は、細孔幾何学形状の多様性を増加させるように設計された２つの足場構造、すなわち、（Ａ）小細孔（ＳＰ）および（Ｂ）大細孔（ＬＰ）を描写する。両足場は、片面に層状平行支柱の中実キャップを含み、生物学的に、頭皮からの軟組織内部成長を阻止するための障壁としての役割を果たすが、構造的に、Ｚ方向における足場格子の印刷のためのベースとしての役割を果たした。このベース上に構築された足場設計は、ＳＰおよびＬＰ足場間で異なるが、一般に、１つ以上の半径方向（Ｒ）層と交互する、ネスト化された同心円（ＣＣ）の層から成った。Ｚ方向における多孔率の変動は、半径方向層の１、２、または３スタックの使用に由来し、ＸおよびＹ方向における多孔率は、同一の層内の半径方向支柱間の間隔から生じた
【図５】図５は、形成される固有のメソ細孔体積の略図を提供する。そのような体積のリングは、説明される足場内のＣＣおよびＲ層間の空間を形成する。
【図６】図６は、１Ｚ高さのメソ細孔を通る８週間後のＳＰ足場からの（左）水平スライスを示し、細孔は、同心円（ＣＣ）および半径方向（Ｒ）支柱によって形成される。外側の最大のものを除き、全ての細孔は、マイクロＣＴを用いて評価された。Ｒ支柱が狭くなるにつれて、骨は、支柱に付着し始めた。骨は、同一の足場からの外側リングにおける１Ｚおよび２Ｚ高さメソ細孔の垂直スライスの（右上）画像に示されるように、ＣＣリング間から上向きに成長したため、断続的に見える。（右下）は、１６週間後のＬＰ足場の水平スライスである。吸収された支柱が新しい骨と置換されている、有意な類骨形成（緑色）に留意されたい。
【図７】図７は、０、８、および１６週間後の３つのリングサイズ、すなわち、大、中、および小を有する小細孔足場から観察された１Ｚ高さメソ細孔のパーセンテージを提供する。
【図８】図８は、８週間後のＬＰ足場内の３Ｚメソ細孔の中心を通る垂直スライスおよび中央を通る水平スライスを提供する。
【図９】図９は、０、８、および１６週間後の３つのリングサイズ、すなわち、大、中、および小を有する、小細孔足場から観察された２Ｚ高さメソ細孔のパーセンテージを提供する。
【図１０】図１０は、０、８、および１６週間後の３つのリングサイズ、すなわち、大、中、および小を有する、小細孔足場から観察された３Ｚ高さメソ細孔のパーセンテージを提供する。
【図１１】図１１は、Ａ）大細孔足場、Ｂ）、外側リングの除去前後の小細孔足場、およびＣ）外側リング大メソ細孔の拡大略図を描写する。長方形は、同心円間の３層の半径方向支柱に対応し、矢印は、メソ細孔の４つの開放壁を示す。
【図１２】図１２は、１６週間後の大細孔足場のマイクロＣＴスキャンを提供する。足場は、中心を通る垂直および表在メソ細孔と深部メソ細孔との間の水平の両方からデジタル的に区分されて見られる。足場およびキャップは、より暗く見え、周囲硬組織は、より明るい陰影で見える。
【図１３】図１３は、メソ細孔を通る足場からの水平スライスを示す。
【図１４】図１４は、足場内の３Ｚメソ細孔の中心を通る垂直スライスおよび中央を通る水平スライスを提供する。
【図１５】図１５は、皮質骨および小柱骨両方の成長を実証する、足場を通るスライスを提供する。
【図１６】図１６は、別個の四分円内に異なるサイズのメソ細孔を有する４つの四分円メソ細孔設計を有する、足場を描写する。
【図１７】図１７は、細孔幾何学形状の多様性を増加させるために設計された２つの足場構造、すなわち、（Ａ）小細孔（ＳＰ）および（Ｂ）大細孔（ＬＰ）を描写する。小細孔設計は、０−４１０μｍの細孔寸法を有し、大細孔設計は、２５０−９４０μｍの細孔寸法を有する。
【図１８】図１８は、骨成長を明確に実証する、埋込後８週間における足場損失（再建）の割合対足場体積を図式的に描写する。
【図１９】図１９は、骨成長を明確に実証する、埋込後８週間における利用可能な空間の割合として骨対足場体積を図式的に描写する。
【図２０】図２０は、大細孔（左）および小細孔（右）足場に対する埋込後０および８週間に存在する足場、空間または軟組織、および骨の体積の割合を図式的に描写する。大細孔足場は、６１６μｍのｚ軸を伴う、４２８−６３６μｍ範囲内の細孔サイズを有する。小細孔足場は、４１０μｍのｚ軸を伴う、２５−１８８μｍ範囲内の細孔サイズを有する。
【図２１】図２１は、（ａ）その中に設置された足場を有する、骨欠損の縦方向断面の略図（上）、（ｂ）印刷された足場の端面図の略図（左下）、（ｃ）組織修復デバイスまたは足場に好適な骨欠損の側面図（下中央）、および（ｄ）組織修復デバイスまたは足場に好適な骨欠損の上面図（右下）を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
多相３次元印刷組織修復デバイス（Ｍ３ＤＲＤ）足場は、全て、深刻な短所を有し、複雑な骨欠損を修復するために必要な複雑な設計および形状で生成されることができない、現在の骨移植片技法および骨移植代替物に取って代わるために使用され得る。Ｍ３ＤＲＤは、頭蓋顔面および整形外科の骨修復のための複雑な移植用途のためにカスタム生成されることができる。
【００２０】
多相３次元印刷組織修復デバイス（Ｍ３ＤＲＤ）は、少なくとも１つの構成要素から開始し、可能性として、３つ以上の構成要素を備えるデバイスである（図１）。主要構成要素は、（１）足場、（２）一時的充填剤／キャリア材料、および（３）充填剤／キャリア内に含まれる生体活性分子／薬物である。
【００２１】
（足場）
Ｍ３ＤＲＤのコアは、ロボット堆積または直接書込（ＤＷ）技術と称される３−Ｄ印刷技法を使用して生成され得る、３次元足場である（図２参照）。本技法は、コンピュータ制御された印刷プロセスおよびコロイドインクを使用し、３次元構造を形成する。これらの構造は、自己成分上に形を成すことができるか、またはトモグラフィーデータ（Ｘ線、超音波検査、またはＭＲＩ）から個々の骨欠損を充填するためにカスタム成形されることができる。
【００２２】
インク製作および印刷システム自体は、他の参考文献により詳細に説明されるが、基本的に、本システムは、印刷ノズルから流出するにつれて固体となる、水ベースの流動学的に制御されたインクを使用する。これらのインクは、コロイドインクの取り扱い特性を制御する有機化学物質を含む、水ベースのスラリー中の細かく制御されたセラミック粒子から成る。これは、支持されていない構造要素の最小垂れの有無にかかわらず、３−Ｄ格子状構造が重ねて印刷されることを可能にする。
【００２３】
本システムを使用する場合、第１の層の要素は、ｘ−ｙ−ｚ制御ガントリシステムのｘおよびｙ座標制御システムを使用して、小（約５０−４００μｍ直径）ノズルを通して、支持プレート上にインクを押しつけることによって、印刷され得る。次いで、ｚ制御システムは、１ノズル直径未満だけ、ノズルを若干上方に移動させるために使用される。次いで、次の層が、第１の層を覆って印刷される。これは、３−Ｄ構造全体が終了するまで、層毎に継続される。
【００２４】
構造全体は、乾燥を防止するために、油浴中で印刷され得る。システムは、最大３つの材料が単一構造を印刷するために使用され得るように、３つのノズルおよびインクリザーバを有し得る。褪せやすいインク、すなわち、焼成の間に完全燃焼する材料から全体的になるインクもまた、印刷プロセスの一部として使用され得る。これらは、一時的支持を要求する複雑な部品のための支持構造を印刷するために使用されることができる。
【００２５】
結果として生じる構造は、次いで、油浴から除去され、乾燥され、プログラム可能な炉内で焼成され、最終セラミック構造を生成する。焼成は、現在、約１１００℃で約４時間行われ、これは、実質的に、有機成分を完全燃焼し、セラミック粒子を立体構造へと一緒に焼結させる。これは、精密かつ予測可能な構造を生成するために、印刷プロセスの中に計算されることができる少量の予測可能な収縮を生じさせ得る。
【００２６】
印刷ノズルは、通常、円筒形であり、円筒形ロッド状の印刷された構造を生成し得る。しかしながら、非円筒形構造を生成するように成形されたノズルが、作製され得、該構造は、我々の先行表面改良特許（米国特許第６，４１９，４９１号参照）に基づいて、細胞移動、成長、および分化を制御するために設計されたサイズの表面線条を伴う。
【００２７】
（組成物）
リン酸カルシウムベースの足場が、恒久的、再建可能（骨再建プロセスを通して）、または可溶性の材料、またはこれらのいくつかの組み合わせに基づくインクから作製された。この時点におけるいくつかの有望材料は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）セラミック、リン酸三カルシウムセラミック（ＴＣＰ）、および２つの材料の組み合わせを有する二相性セラミック（ＨＡ／ＴＣＰ）である。ＨＡ材料は、恒久的または非常に長持ちする足場（焼成温度に応じて）を生成し、ＨＡ／ＴＣＰの組み合わせは、長持ちする足場を生成する高ＨＡパーセンテージを伴って変動し得、約９９％ＴＣＰ／１％ＨＡ足場は、破骨細胞活性を通して有意に再建することが示されている足場を生成するために使用されている。いくつかのそのような足場は、円盤の異なる領域内に可変細孔構造を伴う、約３ｍｍ厚の１１ｍｍ直径多孔性円盤と、約１２ｍｍ直径の約０．５ｍｍ厚の中実キャップ構造とを含む。これらは、骨および軟組織応答を試験するために、ウサギの頭頂骨（頭蓋骨）内の１１ｍｍ直径トレフィン孔内に挿入された。これらの足場は、線維組織浸潤を抑制するための中実シェル構成要素と、２７０μｍ直径要素（この直径は、ノズルサイズを使用して変動されることができる）および１００μｍ未満から１０００μｍの最大寸法のサイズの細孔（メソ細孔）サイズを伴う内部格子構造との組み合わせを有するように、効果的に生成され得ることが実証された。ミクロンスケールを上回り、かつミリメートルスケールを下回る、細孔および支柱サイズを伴う、これらの構造体は、メソ構造と称される。ＨＡおよびＴＣＰ組成物による格子構造は、足場内への新しい骨の骨伝導（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ）を助長する。小有機粒子をインクに添加することによって、微多孔性（サブミクロンから約２０μｍ細孔サイズ）足場構成要素もまた、生成されることができる。これらは、線維接続組織に付着するように設計されることができる。中実層、種々のサイズの目の粗いメソ細孔格子、マイクロ構造格子要素、および微多孔性格子要素のこれらの組み合わせを使用することによって、複雑な構造が、骨、骨髄組織、線維組織、および血管の内部成長および形成を伝導させる（ｃｏｎｄｕｃｔ）ために設計および製作されることができる。長骨再生のための足場の実施例は、図１に示される。ＤＷシステムは、足場内に２つ以上の材料を印刷することができるので、恒久的ＨＡ構成要素ならびに再建可能ＴＣＰ要素を伴う足場を印刷するために適している。これは、足場の長期的強度が必要な整形外科用途において適用可能であり得る。
【００２８】
（足場充填剤／キャリア材料および生体活性因子）
この充填剤／キャリア成分は、足場に浸潤し、中実またはほぼ中実（充填剤が微多孔性である場合）複合構造を生成するために使用され得る、セメント、ポリマー、または有機／天然ヒドロゲルベースの材料を有する。この充填剤／キャリア材料は、ある既知のまたは制御率において、可溶性であり、足場により大きな初期力学的強度および安定性を提供し、次いで、分解し、骨または軟組織内部成長を可能および／または刺激し得る（用途および設計に応じて）。充填剤／キャリアは、足場の外側からその中心へと内側に分解し、足場構成要素が暴露されるにつれて、および組織および血管が周囲組織から成長するにつれて、複合材が多孔性となることを可能にし得る。この構成要素はまた、足場の内部部分が、早期治癒の中に通常そこに形成され得る血栓を形成することを防止し得る。この血栓は、口腔および頭蓋顔面部位に感染し得、これらの部位は、多くの場合、非滅菌性である、あるいは肉芽／線維組織または壊死となり、いずれも、骨内部成長を妨害し得る。充填剤／キャリア材料は、本質的に、組織形成を刺激し得るか、あるいは、それは、組み込まれた薬物、成長因子、サイトカイン、または抗生物質を含み得る。
【００２９】
いくつかの例示的充填剤／キャリア材料は、コーティングまたはヒドロゲル充填剤として使用され得る、硫酸カルシウム（焼き石こう）、徐放性硫酸カルシウム（低速溶解バージョンの硫酸カルシウム）、およびキトサン、キチンの誘導体、生物学的に誘導された多糖類である。ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）のような吸収性ポリマー等の他の材料も、充填剤／キャリア材料として使用され得るが、代替として、これらは、充填剤ではなく、足場のためのコーティング材料として使用され得る。したがって、これらは、依然として、足場を強化し、分離材料として作用することができるが、足場を充填し、それを中実構造にするために利用されないであろう。
【００３０】
硫酸カルシウムは、充填剤および薬物キャリア材料として使用され、構造の力学的特性を向上させ、予測可能な方法において、生物学的に活性作用因子を放出し、かつ骨形成に干渉しないことが見出された。このキャリアを使用して調査された生体活性分子は、組み換え型血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む。
【００３１】
（足場メソ構造を使用した足場の力学的特性、骨特性、および足場再建の制御）
頭蓋顔面骨修復において使用するために好適な力学的特性を伴い、いくつかの外部支持を伴って、整形外科修復のために適切である、足場を設計および生成することが可能である。足場メソ構造はまた、足場内に伝導される骨の構造特性および密度を制御するために使用され得る。モデルとして、ウサギの１１ｍｍ直径トレフィン欠損を使用することによって、３つの異なる設計足場が、欠損を充填し、骨再生を検査するために生成された。全ての足場は、同一の材料、すなわち、９９％ＴＣＰ１％ＨＡセラミックから生成され、２７０μｍの直径の同一サイズの印刷された支柱から作製された。全ての足場はまた、医療グレードの硫酸カルシウムで充填され、中実構造として開始された。メソ構造は、足場の層内の支柱間隔を使用し（ｘおよびｙ方向）、ｚ方向に支柱を積層することによって変動された。２５０×２５０μｍ、２５０×４００μｍ、および４００×４００μｍサイズ細孔と称される（ｘおよびｙ方向）開細孔を生成する３つの支柱間隔を含む、あるタイプの足場が、生成された（これらの寸法は、適切である）。「Ｚ」間隔は、若干、１つの支柱の高さ、すなわち、２３０μｍを下回った。マイクロコンピュータ断層撮影によって測定されるように、これらの３つのゾーンは、４６、５６、および７０％の足場体積パーセンテージを有していた。
【００３２】
２つの足場が、異なる間隔の同心リングと交互する半径方向支柱を使用して生成された持続的可変多孔率を有するように生成された。一方の足場は、１ｚおよび２ｚ間隔の層と、５５〜９４％の足場体積を伴うリング形状領域とを有していた。他方の足場は、３ｚ間隔と、４１〜５６％体積の領域とを有していた。したがって、４１〜９４％足場に及ぶ足場体積の範囲が、試験された。全足場において、骨は、８週間までに、欠損の中心まで一貫して成長可能であった（５．５ｍｍ距離にわたる）。
【００３３】
この程度の一貫した骨浸潤は、他の骨伝導性（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）足場では観察されず、これは、足場内の足場要素のサイズおよび編成によるものである。内部成長を行うために、骨梁のサイズ範囲内に多くの小支柱を使用することによって、かつ欠損にわたって骨を直線に伝導させるようにそれらを編成することによって、骨伝導のプロセスを最適化することが可能である。「有向骨伝導（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ）」と称される本プロセスは、このタイプの足場に対して新規である。ランダム細孔編成を伴う足場では、有向骨伝導のプロセスは、観察されず、大欠損にわたる一貫した成長は、生じるのにより長い時間がかかる。本明細書に説明される構造では、８および１６週間における骨体積は、９〜４０％（８週間）および１０〜５６％（１６週間）に及んでいた。骨体積は、足場体積に反比例した。より開放した（より小さい足場体積）足場は、より大きな骨内部成長を示し、骨は、経時的に増加した。足場再建は、５％〜５６％に及び、より多くの再建が、後により開放した足場において観察された。より大量の足場（より小さい細孔を伴う）は、よりコンパクトな層状構造骨を生成し、足場および骨の組み合わせは、ほとんど軟組織を示さず、皮質様構造に類似していた。対照的に、より少量の足場（より大きい細孔を伴う）は、より多孔性の無秩序な骨を生成し、骨および足場の組み合わせは、海綿骨に類似していた。足場に隣接する骨のタイプ（皮質骨または海綿骨）は、少なくとも部分的に、隣接する足場内に成長する骨に影響を及ぼした。
【００３４】
（Ｍ３ＤＲＤ足場の特徴）
総括すると、このデータは、設計されたメソ構造を伴う骨伝導性足場が、広範囲の骨修復用途に好適な力学的特性とともに作製され得ることを示す。これらの足場は、骨細胞または幹細胞増強の必要なく、有意な距離にわたって、骨を再生するために使用されることができる。大欠損にわたって観察された骨伝導率は、広い距離にわたって、効率的に骨を伝導させるように、直線アレイに編成される骨梁のサイズ範囲内の多くの小支柱の使用に基づく「有向骨伝導」によるものである。
【００３５】
足場はまた、結果として生じる骨密度、構造、および足場再建率を制御するために使用されることができる。Ｍ３ＤＲＤ足場は、隣接する骨に微細構造的に近似または一致する骨を再生するように設計されることができる。すなわち、海綿骨が必要とされる場合、海綿骨構造を再生することが可能であり、皮質骨が必要とされる場合、その形状を再生することも可能である。中実キャップ層のような追加の特徴は、軟組織内部成長を上手く防止し得る。ＣＳ充填剤は、一時的に、構造力学特性を向上させ、骨形成を妨害せず、感染症による線維組織内部成長および浸潤を防止し、血管新生を継続可能にし得る。
【００３６】
ＣＳはまた、生体活性分子の制御された放出のために使用されることができる。ＤＷ印刷システムの使用は、ミクロンスケールの精度で、複雑なメソ構造のカスタム設計および印刷を可能にする。これは、既製品印刷構造ならびにＭＲＩまたはＣＴデータに基づく患者内の複雑な欠損を修復するためのカスタム印刷Ｍ３ＤＲＤ足場の両方を可能にする。この技術は、頭蓋顔面および整形外科骨修復／置換分野における広範な用途を有する。
【００３７】
（例示的組織修復デバイスまたは足場）
骨欠損は、現在、複雑な自家移植手技あるいは具体的部位に設計されていない不完全同種異系または人工治療によって充填される。直接書込（ＤＷ）製作は、複雑な骨欠損を修復するためにカスタム製作される潜在性を有する、骨伝導性生体材料である、複雑な多成分二相性（ＣＯＭＢＩ）リン酸カルシウム足場から成る、３−Ｄ足場を印刷することを可能にする。現在の文献は、依然として、骨再生のための最適および閾値細孔要件について討論している。我々は、臨界サイズの（そのままでは閉鎖不可能である）生体内モデルにおいて足場を試験し、骨密度、内部成長の程度、および骨／足場再建に及ぼす影響を研究した。
【００３８】
足場は、全（Ｘ、Ｙ、およびＺ）平面に可変メソ細孔間隔を伴って設計された。細孔サイズを変動させるために、ｚ高さにおける１、２、または３つの重複層の半径方向支柱と交互する、２つの同心円の層の足場設計が、ＤＷによって、１５：８５ＨＡＰ／β−ＴＣＰから製作され、１１００℃で焼結された。硫酸カルシウムの一時的充填剤は、軟組織侵入および／または感染症を防止した。足場は、生体内のトレフィン欠損内に埋め込まれた。８−１６週間後、骨内部成長および足場および骨再建の分析が、マイクロＣＴ（Ｓｃａｎｃｏ医療）によって定量化され、足場は、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）中に埋め込まれ、次いで、光学顕微鏡を用いて組織学的に評価された。
【００３９】
足場体積は、リング区画によって変動するように設計された。骨体積は、より開放し、すなわち、より少ない足場密度領域において大きかった。細孔は、約１００〜９４０ミクロンに及んだ。骨は、全ての様々な高さの層内に成長したが、最大細孔サイズに到達するのはより時間がかかることが認められた。５００ミクロンより大きい細孔も、依然として、以前の文献の見解とは対照的に、良好に骨で充填された。
【００４０】
使用された特定の足場は、３次元印刷されたリン酸カルシウム足場が、８週間以内に、少なくとも１１ｍｍ骨間隙にわたって、骨を成長させることが可能であることを実証した。骨は、９４０μｍ程度の大きい細孔から２０μｍ程度の小さい細孔内にまで成長することができる。骨形態は、足場設計に応じて、小柱骨状または皮質骨状であることができる。足場は、広範囲の臨床用途のための局所的に異なる生物学的および力学的特性とともに設計され得る。
【００４１】
（実施例）
（実施例１）
（材料および方法）
２つの足場構造、すなわち、小細孔（ＳＰ）および大細孔（ＬＰ）が、細孔幾何学形状の多様性を増加させるように設計された。両足場は、片面に層状平行支柱の中実キャップを含み、それは、生物学的に、頭皮からの軟組織内部成長を阻止するための障壁としての役割を果たすが、構造的に、Ｚ方向における足場格子の印刷のためのベースとしての役割を果たした。このベース上に構築された足場設計は、ＳＰおよびＬＰ足場間で異なるが、一般に、１つ以上の半径方向（Ｒ）層と交互する、ネスト化された同心円（ＣＣ）の層から成った。Ｚ方向における多孔率の変動は、半径方向層の１、２、または３スタックの使用に由来し、ＸおよびＹ方向における多孔率は、同一の層内の半径方向支柱間の間隔から生じた。ＳＰおよびＬＰ足場の具体的設計は、図４および５に図示されている。
【００４２】
足場は、１５：８５ＨＡ／β−ＴＣＰのインクを用いて印刷され、１１００℃で焼成された。足場は、次いで、マイクロＣＴ（Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ）において、中分解能でスキャンされ、埋込前の支柱およびメソ細孔の体積を評価した。足場は、次いで、ＣＳで充填され、キャップ上方の１ｍｍリングの足場が、歯科用ドリルで除去され、周縁における阻止された半径方向支柱を開放した。これによって、直径１１ｍｍが残された。
【００４３】
（外科手術手技）
外科手術が、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）承認プロトコルに従って、８匹の成獣のニュージーランドホワイトウサギにおいて行われた。３．０ｃｍ正中矢状切開が、頭部背面の皮膚および軟組織を通して作られた。左右対称１１．０ｍｍ直径トレフィン欠損が、硬膜病変を伴わずに、頭頂骨内の頭蓋幹線のすぐ後方に空けられた。
【００４４】
それぞれ、右および左欠損内へのＬＰおよびＳＰ足場の設置後、軟組織および皮膚は、４−０吸収性縫合糸を用いて閉鎖された。創傷は、滅菌生理食塩水で清浄され、トリプル抗生物質軟膏で処置された。感染症、疼痛、または他の合併症の徴候は、もたらされなかった。７匹が、８週間後、１匹が、１６週間後、安楽死させられた。
【００４５】
（試料分析）
切除されたインプラントが、周囲組織とともに、７０％エタノール中に固定され、マイクロＣＴにおいて、中分解能でスキャンされた。各試料内の着目体積は、固有のメソ細孔体積の各リングによって占有された体積であった（図４および５参照）。全試料の外側体積リングは、骨が非充填欠損内にあるこの空間を充填することが分かっているため、測定されなかった（Ｓｏｈｎ他、Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ２０１０；４０：１８０−１８７）。各ＳＰ足場は、６つの固有のサイズのメソ細孔リング、すなわち、各１Ｚおよび２Ｚ場所に対して３つの同心リング体積を含んでいた。各ＬＰ足場は、３Ｚ場所内の同心リングによって形成される、２つの固有のサイズのメソ細孔体積を含んでいた。メソ細孔の固有のリング毎に、骨、足場、および軟組織／空間に対する体積パーセンテージが、２つの閾値、すなわち、足場（Ｓ）および足場＋骨（ＳＢ）を設定することによって取得された。骨内部成長のパーセンテージは、ＳＢからＳを減算することによって測定され、軟組織／空間のパーセンテージは、１００％からＳＢを減算することによって測定された。足場吸収率は、埋込前に測定された足場体積からＳを減算することによって測定された（図７、９、１０参照）。
【００４６】
試料は、次いで、組織学のために、メタクリル酸メチル中に埋め込まれ、８０μｍ厚のスライスが、各試料のＲ層を通る特定の点で調製された。ＳＰ足場毎に、水平スライス（キャップに平行）が、１Ｚおよび２つの２Ｚメソ細孔区画を通して得られた。ＬＰ足場毎に、水平スライスが、２つの３Ｚメソ細孔を通して得られた。さらに、垂直スライス（キャップに垂直）が、全足場の中心を通して得られた。全スライスは、染色され、デジタル的に撮影された（図６、８参照）。
【００４７】
他の試料は、後方散乱電子撮像（ＢＥＩ）およびＥＤＡＸ評価を用いた走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Ｈｉｔａｃｈｉ）を使用して検査され、無機物組成物を分析した。以前の研究（Ｓｉｍｏｎ他、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８；  ８５Ａ：３７１−３７７）に基づいて、ここで使用された試料サイズは、０．０５未満のｐ値で群間の１５−２０％差を決定するための統計的検出力を有していた。
【００４８】
（結果）
マイクロＣＴおよび組織学的分析によって、全次元のメソ細孔内への骨内部成長が明らかになった。より高い骨のパーセンテージは、ＳＰおよびＬＰ足場の両方の周縁におけるより大きい細孔内で見られた。一般に、より高い足場支柱吸収率は、より高い骨内部成長率を伴う領域内で生じた。それにもかかわらず、ＳＰ足場では、より骨成長が少ないより小さい体積を含む、２Ｚメソ細孔の内側リングにおいて、支柱吸収率は、より高かった。これらのより閉鎖した領域の組織学的結果は、骨が、それらの間ではなく、直接、支柱上に成長したことを示した。１Ｚメソ細孔では、骨は、周縁から内向きに成長を見せなかったが、２Ｚメソ細孔からのＣＣリングの間から成長した。
【００４９】
ＣＳ充填剤は、骨が充填されるにつれて吸収することが認められたが、しかしながら、組織学画像は、島状の沈殿物が残っていることを示し、ＳＥＭ、ＢＥＩ、およびＥＤＡＸは、それがリン酸カルシウム（ＣａＰ）であることを示した。これは、他の研究にも報告されている。ほとんどの動物において、ＣａＰは、骨成長を伝導させ、骨形成と融合することが認められたが、他の動物では、非常に高密度のＣａＰ沈殿物の面積が、骨形成を阻止することが認められた。
【００５０】
（考察）
ＴＣＰから作製され、ＣＳで充填された可変メソ細孔足場は、皮質骨および小柱骨に類似する骨構造を再成長させるための足場の設計を可能にする。組織学の分析は、依然として、継続中であることに留意することが重要である。ＣａＰ沈殿物の大量の蓄積は、ＣａＳが吸収されるにつれて、緊密なメソ細孔空間内に蓄積した飽和溶液Ｃａ２＋およびＰＯ４３−の結果であると考えられる。ＣａＳを分解する酸性の性質はまた、周囲の足場支柱のＴＣＰからのＣａ２＋およびＰＯ４３−の放出を増加させ得る。
【００５１】
８週間後のマイクロＣＴ結果は、約６８−９９％の足場＋骨（ＳＢ）のパーセンテージの勾配および４−１４％の足場吸収率の勾配を示す。最も驚くべきことに、足場吸収率を１４％近く最大化したメソ細孔体積は、体積スペクトルの両端近傍であり、より大きい方は、４２８−６３６μｍ×６１６μｍであり、より小さい方は、１８８−２５３μｍ×４１０μであった。これらの２つの体積のうち、より大きい方は、６７．５６％（４０．１９％Ｂ＋２７．３７％Ｓ）のＳＢをもたらし、より小さい方は、９２．９３％。（２７．２５％Ｂ＋６５．６８％Ｓ）のＳＢをもたらし、それぞれ、小柱骨および皮質骨の骨パーセンテージに非常に類似していた。より小さいメソ細孔は、あまり骨を伝導させなかったが、関連付けられた破骨細胞とともに、直接、支柱表面に沿い、その骨前面を向かわせた方法のため、等しく高支柱吸収率を生じさせたことが認められた。
【００５２】
これらのデータは、骨内部成長／再建と細孔体積との間の関係を実証する。今後の研究では、微小解剖学的に正確な骨を再生するために設計された細孔寸法を使用して、足場設計を試験するであろう。これらの足場の吸収率の制御は、頭蓋顔面奇形を伴う子供の顔面再構築のためのその使用を可能にするであろう。
【００５３】
（実施例２）
（背景）
外傷、疾患、または先天性欠損によって損失された骨の修復は、現在、大量の構造的に複雑な骨の再生を要求する。これは、典型的には、自家骨移植を伴うが、これは、調達後の罹患率、より長い手術時間、および制限された骨可用性のため、不完全プロセスである。さらに、自家移植片の現在の代替物は各々、その独自の固有の欠点を含む。処理されたヒト死体骨および異種骨は、二次外科手術部位の必要性をなくすが、感染症を伝染させ、自己免疫反応を引き起こす危険がある。加えて、リン酸カルシウムセラミックおよびセメント等の人工材料を用いた治療は、骨伝導性および／または骨誘導性であるが、大きな欠損では、力学的に不安定であり、完全骨形成吸収は不可能である。したがって、研究チームは、力学的に安定し、かつ吸収性である、リン酸カルシウム足場を設計することに取り組んできた。
【００５４】
そのような足場材料の１つである、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）およびβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）の二相性複合材は、一般に、二相性リン酸カルシウム（ＢＣＰ）として知られている。骨移植片材料としてのＢＣＰの開発は、ＨＡに優るβ−ＴＣＰの優先的溶解の概念に基づくものであった。
【００５５】
ＢＣＰ足場内への骨内部成長は、欠損または創傷部位内への一次骨形成を模倣したものであり、これは、欠損内への損傷皮質骨および海綿骨の骨内膜表面または骨膜層からの新しい未発達の小柱骨の方向性成長として生じる。しかしながら、これは、足場が骨伝導のための適切な表面化学性質および微構造を有する場合のみ生じ、適切に選択された足場メソ構造（５０−１０００範囲）を用いて、構造的に制御された様式においてのみ生じることができる。
【００５６】
直接書込（ＤＷ）製作等の立体自由造形技術の使用は、大きな複雑な欠損を修復するようにカスタム製作される潜在性を有する骨伝導性生体材料から成る、３−Ｄ足場を印刷することを可能にする。複雑な多成分二相性（ＣＯＭＢＩ）足場が、ＤＷによって生成され、生体外で研究されている。現在の文献は、依然として、骨内部成長のために要求される最適および閾値細孔サイズについて討論している。
【００５７】
ＣＯＭＢＩ足場が、全（Ｘ、Ｙ、およびＺ）平面に段階的メソ細孔間隔を含むように設計された。本研究は、左右対称の臨界サイズの（そのままでは閉鎖不可能である）ウサギの頭頂骨欠損モデル内において、本設計を生体内で試験し、細孔サイズが、骨密度、内部成長の程度、および骨／足場再建に影響をどのように及ぼすかを実証するであろう。
【００５８】
（方法）
一方がより大きい細孔サイズを伴い、一方がより小さい細孔サイズを伴う２つの固有構造の足場が、１、２、または３層の半径方向に配向された支柱を伴う同心円の層をＺ平面において重ねることによって設計された。全ての足場は、一端に、軟組織侵入を防止するための中実キャップと、他端に、内側円形層の結果、開洞を伴って設計された。そのような足場は、ＤＷによって製作され、１５：８５ＨＡＰ／β−ＴＣＰからＣＯＭＢＩ構造として印刷され、次いで、１１００℃で焼結された。外科手術グレードの硫酸カルシウムが、一時的充填剤として使用され、メソ細孔を通した軟組織侵入および／または感染症を防止した。全足場の外側リングが、歯科用ドリルで除去され、印刷プロセス中に半径方向支柱の層化によって作成された外側障壁を開放させた。
【００５９】
８匹のニュージーランドホワイトウサギにおいて、１つの大細孔および１つの小細孔足場が、ウサギのトレフィンモデルによって、左右対称に埋め込まれた。７匹のウサギでは、１４の足場が、分析のために、８週間後に除去された。２つの足場は、分析のために、１６週間後、残りのウサギから除去された。メソ細孔体積の割合としての骨内部成長および足場再建の量が、マイクロＣＴ（Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ）によって定量化された。試料は、アルコールで脱水され、サルチル酸メチルで清浄され、次いで、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）中に埋め込まれた。大細孔足場は、１つの中心垂直スライスおよび３ｚ高さメソ細孔を通した２つの水平スライスに区分された。小細孔足場は、１つの中心垂直スライス、２ｚメソ細孔を通した２つの水平スライス、１ｚメソ細孔を通した１つの水平スライスに区分された。区画は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；Ｓ−３５００Ｎ、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）および光学顕微鏡（Ａｐｅｒｉｏ）を用いた組織学を使用して評価された。
【００６０】
（結果）
足場体積は、リング区画によって変動するように設計された。骨体積は、より開放した、より少ない足場密度の領域において大きかった。細孔は、約１００〜９４０ミクロンに及んだ。骨は、全ての様々な高さの層内に成長したが、最大細孔サイズに到達するためにより時間がかかることが認められた。５００ミクロンより大きい細孔も、依然として、以前の文献の見解とは対照的に、良好に骨で充填された。足場体積は、リング区画によって変動するように設計された。骨体積は、より開放した、より少ない足場密度の領域において大きかった。細孔は、約１００〜９４０ミクロンに及んだ。骨は、全ての様々な高さの層内に成長したが、最大細孔サイズに到達するのはより時間がかかることが認められた。５００ミクロンより大きい細孔も、依然として、以前の文献の見解とは対照的に、良好に骨で充填された。
【００６１】
表１は、Ａ）印刷後の８つの大細孔足場、Ｂ）８週間後の３つの大細孔足場の表在メソ細孔、およびＣ）８週間後の３つの大細孔足場の深部メソ細孔における総体積に対する足場体積の比率に関係する。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
本発明は、具体的実施形態または複数の実施形態の観点から記載されたが、本明細書に開示される本足場および方法は、当業者によって、他の構成に改良または改変され得ることを理解されるであろう。故に、本発明は、広義に解釈され、本明細書に添付の請求項の範囲および精神によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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