(57)【要約】  本発明は、HIV感染及びAIDSを含むレトロウイルス感染の治療のための活性物質の新規な組合せ及び当該レトロウイルス感染の新規な治療方法に関する。特に、本発明は、液性免疫を刺激する化合物及び/又は対象において細胞媒介性免疫応答を誘発するペプチド;並びに免疫調節化合物及び/又は保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤の新規な投与における使用及び組合せに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1) 対象において細胞媒介性免疫応答を誘発する１又はそれより多いペプチド及び/又は対象において液性免疫を刺激する化合物;及び(2) 保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤及び/又は免疫調節化合物を別々に、任意の順序で逐次的に又は同時に投与することを含む、ヒトレトロウイルス、例えば免疫不全ウイルスI (HIV)感染を該ウイルス、例えばHIVに感染したヒトにおいて治療する方法。
【請求項２】
対象において細胞媒介性免疫応答を誘発する１又はそれより多いペプチドの投与を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象において液性免疫を刺激する化合物を投与することを含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象において液性免疫を刺激する化合物が、HIV gp120のC5ドメインとgp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとの会合を安定化する抗体を誘導する免疫原である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
免疫調節化合物を投与することを含む請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤の投与を含む請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
前記免疫調節化合物が、抗-PD1抗体、例えばMDX-1106 (Merck)、THALOMID (登録商標) (タリドミド)、抗-PD1抗体、シクロホスファミド、レバミゾール、レナリドミド、CC-4047 (ポマリドミド)、CC-11006 (Celgene)及びCC-10015 (Celgene)並びにWO2007028047、WO2002059106及びWO2002094180のいずれか１つに記載される免疫調節化合物から選択される請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
前記免疫調節化合物が、4-(アミノ)-2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-イソインドリン-1,3-ジオン及び3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリジン-2,6-ジオンから選択される請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
前記免疫調節化合物がレナリドミドである請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
前記保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤が、M344 (4-(ジメチルアミノ)-N-[7-(ヒドロキシアミノ)-7-オキソヘプチル]ベンズアミド)、キダミド(CS055/HBI-800)、4SC-202, (4SC)、レスミノスタット(4SC)、ヒドロキサム酸、例えばボリノスタット(SAHA)、ベリノスタット(PXD101)、LAQ824、トリコスタチンA及びパノビノスタット(LBH589); ベンズアミド、例えばエンチノスタット(MS-275)、CI994及びモセチノスタット(MGCD0103)、環状テトラペプチド(例えばトラポキシン、例えばトラポキシンB)及びデプシペプチド、例えばロミデプシン(ISTODAX)、求電子性ケトン及び脂肪酸化合物、例えばフェニルブチレート、バルプロ酸、オキサムフラチン、ITF2357 (ジェネリックのジビノスタット)、アピシジン、MC1293、CG05及びCG06; NF-カッパB、プロストラチン、オーラノフィン、ブリオスタチン、非腫瘍形成性フォルボールエステル、DPP (12-デオキシフォルボール-13-フェニルアセテート)、PMA及びフォルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)を含む転写因子を活性化する化合物; P-TEF-bキナーゼ及びヘキサメチルビスアセタミド(HMBA)を含むHIV mRNA伸長を活性化する化合物; IL-7; 抗-CD3/CD28 - T-細胞を刺激する抗体を含むT-細胞を刺激する因子; チルフォスチンA、チルフォスチンB及びチルフォスチンCを含むキナーゼ阻害剤; SF1670 (Echelon Bioscience)を含むPTEN (ホスファターゼ及びテンシンのホモログ)遺伝子阻害剤、ジスルフィラム(DSF)、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤、bpV(HOpic)、bpV(phen)及びbpV(pic) (Calbiochem; EMD Millipore)を含むプロテインチロシンホスファターゼ阻害剤、Toll-様受容体-9 (TLR9)作動薬及びToll-様受容体-7 (TLR9)作動薬を含むToll-様受容体作動薬、ケルセチン、リポ酸、ナトリウムブチレート、TNF-α、PHA及びTatから選択される請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記保有宿主浄化剤がロミデプシンである請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞媒介性免疫応答を誘発する１又はそれより多いペプチドが、以下のアミノ酸配列(ここで、各HIV特異的ペプチドの末端は遊離カルボキシル-若しくはアミノ-基、アミド、アシル又はアセチルであってもよい):
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4Xaa5 Xaa6 Ala Xaa8 Xaa9 Gln Thr Pro Trp Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Val Xaa20 (配列番号47);
(ここで、1位のXaaはLys又はArgであり、
2位のXaaはAla, Gly, Ser又はArgであり、
3位のXaaはLeu又はMetであり、
4位のXaaはGly又はArgであり、
5位のXaaはPro, Thr, Val, Ser, Gln又はAlaであり、
6位のXaaはGly, Ala, Lys, Arg, Gln又はGluであり、
8位のXaaはThr又はSerであり、
9位のXaaはLeu又はIleであり、
14位のXaaはThr, Ser又はValであり、
15位のXaaはAla又はSerであり、
16位のXaaはCys又はSerであり、
17位のXaaはGln又はLeuであり、
18位のXaaはGly, Glu又はArgであり、
20位のXaaはGly又はArgである);
Xaa1 Xaa2 Xaa3Xaa4 Xaa5 Gly Leu Asn Pro Leu Val [Gly]n Xaa12 Xaa13 Tyr Xaa15 Pro Xaa17 Xaa18 Ile Leu Xaa21 Xaa22 (配列番号50);
(ここで、1位のXaaはArg, Lys若しくはAspであるか又は存在せず、
2位のXaaはTrp, Gly, Lys又はArgであり、
3位のXaaはIle, Leu, Val又はMetであり、
4位のXaaはIle, Val又はLeuであり、
5位のXaaはLeu, Met, Val又はProであり、
12位のXaaはArg又はLysであり、
13位のXaaはMet又はLeuであり、
15位のXaaはSer, Cys又はGlnであり、
17位のXaaはThr, Val, Ile, Ser又はAlaであり、
18位のXaaはSer, Gly又はThrであり、
21位のXaaはAsp, Glu, Cys又はGlyであり、
22位のXaaはGlyであるか又は存在せず、
n = 0, 1, 2又は3);
Xaa1 Xaa2 Xaa3Pro Ile Pro Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11Xaa12 [Gly]n Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 (配列番号55);
(ここで、1位のXaaはAsn, Ser, Gly, His, Ala, Pro若しくはArgであるか又は存在せず、
2位のXaaはAsn, Ala又はLysであり、
3位のXaaはPro, Gln, Gly, Ile又はLeuであり、
7位のXaaはVal又はAlaであり、
8位のXaaはGly又はLysであり、
9位のXaaはGlu, Asp, Lys, Phe又はThrであり、
10位のXaaはIle, Met, Val又はLeuであり、
11位のXaaはTyr若しくはLeuであるか又は存在せず、
12位のXaaはSerであるか又は存在せず、
13位のXaaはArgであるか又は存在せず、
14位のXaaはAsp, Arg, Trp若しくはAlaであるか又は存在せず、
15位のXaaはIleであるか又は存在せず、
16位のXaaはTyrであるか又は存在せず、
17位のXaaはLys又はArgであり、
18位のXaaはArg, Lys又はAspであり、
19位のXaaはTrp又はGlyであり、
20位のXaaはIle, Met, Val, Gln又はAlaであり、
21位のXaaはIle, Val又はAlaであり、
22位のXaaはLeu, Met又はValであり、
23位のXaaはGly又はCysであり、
24位のXaaはLeuであるか又は存在せず、
n = 1, 2又は3)及び
Xaa1 Xaa2  Ile Ile Xaa5 Xaa6Xaa7 Xaa8 Xaa9 Leu Xaa11 [Gly]n [Arg]m Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 (配列番号61);
(ここで、1位のXaaはPro, Lys若しくはArgであるか又は存在せず、
2位のXaaはGlu, Arg, Phe又はLysであり、
5位のXaaはPro又はThrであり、
6位のXaaはMet, Thr又はNleuであり、
7位のXaaはPhe又はLeuであり、
8位のXaaはSer, Thr, Ala又はMetであり、
9位のXaaはAla, Glu又はLeuであり、
11位のXaaはSerであるか又は存在せず、
12位のXaaはAla若しくはArgであるか又は存在せず、
13位のXaaはIle若しくはLeuであるか又は存在せず、
14位のXaaはSer, Ala若しくはLeuであるか又は存在せず、
15位のXaaはTyr, Glu又はAspであり、
16位のXaaはGly又はAspであり、
17位のXaaはAla又はLeuであり、
18位のXaaはThr, Ile, Val, Leu又はAsnであり、
19位のXaaはPro, Thr又はSerであり、
20位のXaaはTyr, Phe, Nleu, His又はGlnであり、
21位のXaaはAsp, Asn, Leu又はAlaであり、
22位のXaaはLeu, Ile, Val又はAsnであり、
23位のXaaはAsn, Tyr, Cys又はGlyであり、
24位のXaaはThr, Met, Ile, Ala若しくはValであるか又は存在せず、
25位のXaaはGlyであるか又は存在せず、
互いに独立して、n = 1, 2又は3、及びm= 0, 1, 2又は3)
の群より選択される少なくとも１つのHIV-特異的ペプチド又は該HIV特異的ペプチドのいずれか１つの塩である請求項１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
前記HIV-特異的ペプチドの２又はそれより多いCys残基が、鎖内-又は鎖間ジスルフィド結合、１又はそれより多いヘテロ原子、例えばO, N及びSが介在していてもよい-S-(CH2)p-S-又は-(CH2)p-架橋(ここで、p = 1〜8)の部分を形成し得るか、及び/又は前記ペプチド配列が固体支持体に固定されている請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
配列番号47のアミノ酸配列が、配列番号48及び配列番号49の群より選択される請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号50のアミノ酸配列が、配列番号51、配列番号52、配列番号53及び配列番号54の群より選択される請求項１２〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
配列番号55のアミノ酸配列が、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59及び配列番号60の群より選択される請求項１２〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
配列番号61のアミノ酸配列が、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65及び配列番号66の群より選択される請求項１２〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つのHIV-特異的ペプチドが、配列番号47、配列番号50、配列番号55及び配列番号61の各群より選択される２つ、３つ又は４つのペプチドを少なくとも含む請求項１２〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのHIV-特異的ペプチドが、配列番号49、配列番号52、配列番号57及び配列番号64のペプチド若しくはそれらの塩からなるか又は当該ペプチド若しくはそれらの塩を含む請求項１２〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫原が、
−  0〜4アミノ酸の置換を含む、HIV gp120のC5ドメインの13アミノ酸残基アミノ酸配列のアミノ酸配列、その部分配列又は前記アミノ酸配列若しくは部分配列のインベルソ-、レトロ-若しくはレトロ-インベルソ型を含むアミノ酸配列を含む第１のペプチド、及び
−  gp41の膜貫通ドメインに存在するか若しくはgp120の定常C2ドメインに存在するアミノ酸ストレッチを含むか、又は配列番号6〜13のいずれか１つに存在するアミノ酸ストレッチを含むか、又はgp41の膜貫通ドメインに存在するか若しくはgp120の定常C2ドメインに存在するアミノ酸ストレッチのインベルソ-、レトロ-若しくはレトロ-インベルソ型を含む少なくとも１つの第２のペプチド、
を含むペプチド多量体であり、
ここで、前記ペプチド多量体は、HIV gp120のC5ドメインとgp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとに結合し、それらの会合を安定化させることができる抗体を誘導することができ、gp120のC5のN-末端アミノ酸を欠いている請求項４〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のペプチドが、式I:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13       (I)
(式中、X1はThrであり、X2はLys, Arg, Har及びGluから選択され, X3はAla及びValから選択され, X4はArg, Har, Lys及びCit (シトルリン)から選択され, X5はArg, Har, Lys及びCitから選択され, X6はArg, Har, Lys及びCitから選択され, X7はVal, Leu, Ile及びNle (ノルロイシン)から選択され, X8はVal, Leu, Ile及びNleから選択され, X9はGln, Glu, Asn及びAspから選択され, X10はArg, Har及びCitから選択され, X11はGlu及びAspから選択され, X12はLysであり、X13はArg, Har及びCitから選択される)を有するアミノ酸配列を含むか、式Iのアミノ酸配列の部分配列を含むか、又は前記アミノ酸配列又は部分配列のインベルソ-, レトロ-又はレトロ-インベルソ型を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第１のペプチドが、式Iを有するアミノ酸配列のN-末端に結合したジペプチドAla-Proを更に含む請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
第１のペプチドが、式Iを有するアミノ酸配列のC-末端に結合したジペプチドX14-X15 (式中、X14はAla及びVal から選択され、X15はVal, Leu及びNle から選択される)を更に含む請求項２０〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも第２のペプチドが、式:
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-Z13-Z14-Z15-Z16-Z17     (III)
(式中、Z1はAspであり, Z2はArgであり, Z3はProであり, Z4はGlu又はGlyであり, Z5はGly又はArgであり, Z6はIleであり, Z7はGluであり, Z8はGluであり, Z9はGluであり, Z10はGlyであり, Z11はGlyであり, Z12はGluであるか又は存在せず, Z13はArg又はGlnであり, Z14はAsp又はGlyであり, Z15はArg又はLysであり, Z16はAsp又はGlyであり、Z17はArgである)を有するアミノ酸配列を含むか、又は式(III)の部分配列を含む請求項２０〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
第２のペプチドが、式IIIからの少なくとも5つの連続したアミノ酸残基を含む請求項２０〜２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２６】
第１のペプチド及び少なくとも１つの第２のペプチドが、リンカーを介して結合している請求項２０〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２７】
リンカーが、ビス-マレイミドリンカー、ジスルフィドリンカー、ポリエチレングリコール(PEG)リンカー、グリシンリンカー、リシンリンカー及びアルギニンリンカーからなる群より選択される請求項２０〜２６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２８】
第１のペプチド及び少なくとも１つの第２のペプチドの少なくとも一方が、N-又はC-末端修飾、例えばアミド化、アシル化又はアセチル化を含む請求項２０〜２７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２９】
前記ペプチド多量体が、キャリア分子、例えば免疫原性キャリアにカップリングしている請求項２０〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３０】
キャリアが、ウイルス様粒子である請求項２０〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３１】
第１のペプチドが、配列番号1, 2, 3, 4, 5, 38, 41及び44からなる群より選択されるか、又はそれらのフラグメントであるか、又は配列番号1, 2, 3, 4, 5, 38, 41及び44から選択されるペプチド若しくはそれらのフラグメントのインベルソ-, レトロ-若しくはレトロ-インベルソ型であり、
第２のペプチドが、配列番号6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 37, 39, 40, 42, 43, 45, 46からなる群より選択されるか、又はそれらのフラグメントであるか、又は配列番号6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 37, 39, 40, 42, 43, 45, 46から選択されるペプチド若しくはそれらのフラグメントのインベルソ-, レトロ-若しくはレトロ-インベルソ型であり、及び/又は
ペプチド多量体が、配列番号1〜46を有するペプチドから選択される
請求項２０〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
前記ペプチド多量体が、最大70アミノ酸を含む請求項２０〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３３】
前記ペプチド多量体が、少なくとも6個のアミノ酸残基を含む請求項２０〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３４】
前記ペプチド多量体が、6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69及び70アミノ酸残基からなる群より選択されるアミノ酸残基数からなる請求項２０〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３５】
前記ペプチド多量体が、配列番号28と配列番号29, 31及び33のいずれか１つとの間で、配列番号30と配列番号29, 31及び33のいずれか１つとの間で、又は配列番号32と配列番号29, 31及び33との間でジスルフィド結合したペプチドからなる群より選択されるか;又は
配列番号38と配列番号39, 配列番号40; 配列番号42, 配列番号43及び配列番号68のいずれか１つとの間で、又は配列番号41と配列番号39, 配列番号40; 配列番号42及び配列番号43のいずれか１つとの間でシステイン-リシン結合したペプチドからなる群より選択される
請求項３０〜３４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチド多量体が:
【化１】
2015520179.tif 000025
【化２】
2015520179.tif 000026
【化３】
2015520179.tif 000027
【化４】
2015520179.tif 000028
【化５】
2015520179.tif 000029
【化６】
2015520179.tif 000030
【化７】
2015520179.tif 000031
【化８】
2015520179.tif 000032
からなる群より選択されるか、又はそれらのいずれか１つの塩である請求項２０〜３５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３７】
前記ペプチド多量体が、(H-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gly-Gly-Cys(2-オキソ-エチル)-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala -Gly-Glu-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-NH2) (H-Gly-Lys-Gly-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu- Gly-Gly-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Gly-Gly-Gln-Asp-Arg-Asp-Arg-NH2)酢酸塩(Cys(2-オキソ-エチル)10 (A-鎖)とLys2 (B-鎖)との間でアミド結合)である請求項２０〜３６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３８】
a)  対象において細胞媒介性免疫応答を誘発する１又はそれより多いペプチド及び/又は対象において液性免疫を刺激する化合物;及び
b)  保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤及び/又は免疫調節化合物
を含む組成物。
【請求項３９】
(i)対象において細胞媒介性免疫応答を誘発する１又はそれより多いペプチド及び(ii)対象において液性免疫を刺激する化合物の少なくとも一方; 及び (iii)保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤、及び(iv)免疫調節化合物の少なくとも一方を含み; 任意に１又はそれより多い医薬的に許容され得るアジュバント、希釈剤又はキャリアと組み合わせられた医薬組成物。
【請求項４０】
成分(i)及び(ii)の少なくとも一方並びに成分(iii)及び(iv)の少なくとも一方を含み、ここで少なくとも２つの成分は互いに別々に製剤化されており、任意に各成分は医薬的に許容され得るアジュバント、希釈剤又はキャリアと混合されて製剤化されているキット。
【請求項４１】
請求項２〜３７のいずれか１つに記載の、対象において細胞媒介性免疫応答を誘発する１又はそれより多いペプチド及び/又は対象において液性免疫を刺激する化合物; 並びに保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤及び/又は免疫調節化合物を含む請求項３８〜４０のいずれか１つに記載の組成物又はキット。
【請求項４２】
前記ヒトレトロウイルス感染が、HTLV-1 (ヒトT-リンパ球指向性ウイルス), HTLV-II (ヒトT-リンパ球指向性ウイルス), HIV-1及びHIV-2を含むヒト免疫不全ウイルス、及びそれらの任意のサブタイプから選択される請求項１〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４３】
前記ヒトレトロウイルス感染が、ヒト免疫不全ウイルス-1感染である請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HIV感染及びAIDSを含むレトロウイルス感染の治療のための活性物質の新規な組合せ及び当該レトロウイルス感染の新規な治療方法に関する。特に、本発明は、液性免疫を刺激する化合物及び/又は対象において細胞媒介性免疫応答を誘発するペプチド; 並びに免疫調節化合物及び/又は保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を併用する新規な治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、AIDSが単純に慢性的細胞変性ウイルス感染の結果としてのCD4+ T-リンパ球喪失によって引き起こされるよりもむしろHIV-1によって誘導される免疫学的疾患であるという概念を支持する大量の研究的証拠が蓄積されている。したがって、HIV-1によって誘導される慢性的な免疫刺激も標的とする介入を開発することが重要である(Sommerfelt 2011, Recent Translational Research in HIV/AIDS Ed. Dr. Yi-Wei Tang. ISBN 979-953-307-189-2. pp 493-510)。
【０００３】
HIV-1感染を根絶するための抗レトロウイルス療法(ART)の失敗は、HIV-1が潜伏中の保有宿主において休止したままであるという観察結果にある。潜在的に感染した休眠中のCD4+細胞(ナイーブ又は長寿の記憶細胞のいずれか)は、転写レベルでサイレントなHIV-1を保有し、HIV-1感染の支配的な保有宿主に相当する。その他の細胞、例えばマクロファージ、樹状細胞及び星状細胞(これらでは、HIV-1感染はCD4-非依存的メカニズムによって起こる)もまた、保有宿主として機能し得る(Alexakiら, 2008, Curr. HIV Res. 6:388-400においてレビューされている。HIV-1感染根絶のための主な難題に相当するのはこれらの潜伏中の保有宿主である。根絶のためのアプローチは、ART存在下における潜在的に感染した細胞(例えば記憶細胞)の選択的活性化によって保有宿主を浄化し、放出されたウイルスが近隣の細胞に感染し複製し得ないようにする試みを含む(Richmanら, 2009, Science 323:1304-1307)。剤には、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、IL-2及びIL-7のようなサイトカイン並びにブリオスタチン、プロテインキナーゼCアクチベータを含む(Kovochichら, 2011, PLoS ONE 6 (4):e18270)。治療ワクチンは、ARTがアクセスしにくい場所、例えばウイルス存在領域に相当するリンパ組織(Pantaleoら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9838-42; Foxら, 1991, J. Infect. Dis. 164:1051-57)及び中枢神経系(Alexakiら, 2008, Curr. HIV Res. 6:388-400) に浸透することができるという利点を有する。このことは、ウイルス自体及びHIVに関連付けられる免疫活性化の両方を標的化する治療介入に関する。
【０００４】
TNF-αの異常な産生に関連付けられる疾患を治療するために安全かつ効果的に用いることができる化合物を提供することを目的とする数多くの研究が行われている(例えばMarriott, J.B.ら, Expert Opin. Biol. Ther. (4): 1-8 (2001); G.W. Mullerら, Journal of Medicinal Chemistry, 39(17): 3238-3240 (1996);及びG.W. Mullerら, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 8: 2669-2674 (1998)を参照)。いくつかの研究は、LPSで刺激されたPBMCによるTNF-α産生を強力に阻害する能力について選択された化合物の群に着目している(L.G. Corralら, Ann. Rheum. Dis., 58 (補足I): 1107-1113 (1999))。しばしば免疫調節化合物と呼ばれるこれらの化合物は、TNF-αを強力に阻害するだけでなく、LPSで誘導された単球IL1B及びIL12産生を著しく阻害する。LPSで誘導されたIL6もまた、部分的にではあるが、免疫調節化合物によって阻害される。これらの化合物は、LPSで誘導されたIL10の強力な刺激因子である。具体例としては、限定されないが、US 6281230及びUS 6316471に記載されるような置換2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)フタルイミド及び置換2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-1-オキソイソインドールを含む。単球/マクロファージの機能は、感染に対する防御の第１段階として機能する先天性免疫系の一部である。宿主の単球及びマクロファージをモジュレートすることによって、免疫調節化合物は、ウイルス感染、例えばインフルエンザに対する応答の動態を変化させることができる。
【０００５】
ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)は、ヒストンタンパク質上のN-アセチル化リシンアミノ酸からアセチル基を除去する酵素のクラスである。現在、哺乳動物において18種類のHDACが同定されている。それらは、細胞レベルでの局在、機能及び配列類似性に基づいて、４つのクラスに分けられる。クラスIは、主に核において見られるHDAC1, 2, 3及び8を含む。クラスIIのHDAC (HDAC4, 5, 6, 7, 9及び10)は、主に細胞質において見られるが、核及び細胞質間を行き来し得る; クラスIIaは４つのHDAC (HDAC4, 5, 7及び9)を含み、クラスIIbは２つのHDAC (HDAC6及び10)を含む。これらは細胞質においてのみ発現される。普遍的に発現されるHDAC11は、クラスI及びクラスII両方のHDACと配列類似性を有し、クラスIVに相当する。(「サーチュインファミリー」とも呼ばれる)クラスIIIは、ヒストンに原則的に作用しないNAD+依存性タンパク質の一員である。
【０００６】
以前の研究は、HIV-1 gp120のカルボキシ末端のC5ドメインを指向する抗体がより低い免疫活性化及びより遅い疾患進行に関連付けられていることを示す(Loomis-Priceら. 1998 J. Inf Dis. 178 :1306-1316 ; Warren RQら. 1991 J. Clin Immunol 11: 13-21; Lifson ら. 1991 J. Inf. Dis 163 :959-965)。実際、疾患進行は、このドメインに対する液性(すなわち、抗体)応答が失われる場合に加速することが示された(Wongら. 1993 J.Inf. Dis 168: 1523-1527)。更に、5％のHIV-感染個体が該当する長期無進行者(LTNP)は、HIV-1 gp120のカルボキシ末端C5ドメインに対する液性応答を維持し、ある程度ウイルス負荷があるにも拘らず、抗レトロウイルス療法なしで数年間生きることができる(Lieglerら. 1998 J. Infec. Dis. 178: 669-79; Gougeonら. 1996 J. Immunol 156:3509-20; Muro-Cachoら. 1995 J. Immunol 154 :5555-66 ; Easterbrookら. 1999 J. Infect 28:71-73)。
gp120のC5ドメインは、13アミノ酸の長さである(gp120のアミノ酸残基499〜511、参照配列B.FR 83.HXB2 - TKAKRRVVQREKRを有する)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的
本発明の実施態様の目的は、HIV感染及びAIDSを含むレトロウイルス感染の予防及び/又は治療に用いることができる治療剤の効果的な組合せ及び方法を提供することである。
本発明の実施態様の目的は、HIV感染及びAIDSの予防及び/又は治療及び/又は根絶における免疫調節化合物及び/又は保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤の使用によるHIV治療ワクチンの効果を高めることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の要約
本発明者らは、対象において液性及び/又は細胞媒介性免疫応答を刺激する化合物を含む治療ワクチンの効果と、免疫調節化合物及び/又は保有宿主浄化剤(reservoir purging agent)とを組み合わせることが有利であることを見出した。
【０００９】
よって、第１の側面において、本発明は、(1)対象において液性免疫を刺激する化合物及び/又は対象において細胞媒介性免疫応答を誘発する１又はそれより多いペプチド;及び(2)免疫調節化合物及び/又は保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を別々に、任意の順序で逐次的に、又は同時に投与することを含む、ヒトレトロウイルス感染、例えばヒト免疫不全ウイルスI (HIV)感染を該ウイルスに感染したヒトにおいて治療する方法に関する。
【００１０】
第２の側面において、本発明は、
ａ）対象において液性免疫を刺激する化合物及び/又は対象において細胞媒介性免疫応答を誘発する１又はそれより多いペプチド;及び
ｂ）免疫調節化合物及び/又は保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤
を含む組成物に関する。
【００１１】
更なる側面において、本発明は、(1)対象において液性免疫を刺激する化合物及び/又は対象において細胞媒介性免疫応答を誘発する１又はそれより多いペプチドを；(2)免疫調節化合物及び/又は保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤と組み合わせて任意の順序で逐次的に、又は同時に投与することを含む、ヒトレトロウイルス感染、例えば免疫不全ウイルスI (HIV)の発症リスク又は病的効果を該ウイルス、例えばHIVに感染したヒトにおいて低減及び/又は遅延させる方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の詳細な開示
定義
「１つ(one, a又はan)」のような用語が本開示において用いられるとき、そうでないと記載されていない限り、それらは「少なくとも１つ」又は「１又はそれより多い」を意味する。更に、用語「含む(comprising)」は、「含む(including)」を意味するものとし、よって明記されるもの以外の構成要素、特徴、条件又は工程の存在を許容する。
【００１３】
本発明に従う組合せによって治療され得るヒトレトロウイルスは:
HTLV-1 (元々ヒトT-細胞白血病ウイルスと呼ばれていた‐現在ではヒトT-リンパ球指向性ウイルスと呼ばれている);
HTLV-II (ヒトT-細胞白血病ウイルス、現在ではヒトT-リンパ球指向性ウイルスとも呼ばれている);
HIV-1 (初期にはLAV - リンパ腺症ウイルスとも呼ばれ、ヒトT-リンパ球指向性ウイルスIII、すなわちHTLV-IIIとも呼ばれる);
HIV-2 (HTLV-IVとも呼ばれている); 及び上記のウイルスのいずれかのサブタイプ;
を含む。
【００１４】
そうでないと記載されない限り、「HIV」は、一般に、ヒト免疫不全ウイルス1を指す。
「HIV疾患」は、インフルエンザ様の症状としてしばしば顕在化する急性HIV感染並びに早期及び中間期ステージの症候性疾患(皮疹、疲労、寝汗、若干の体重減少、口の潰瘍並びに皮膚及び爪の真菌感染のようないくつかの非特徴的症状を有する)を含むいくつかのステージから構成される。ほとんどのHIV感染者は、これらのような軽度症状を、より重篤な病的状態を発症する前に経験する。一般に、最初の軽度症状が現れるまでに５〜７年かかると考えられている。HIV疾患が進行するにつれ、未だAIDS (HIV疾患の後期ステージ)と診断されなくとも完全に病的状態となり得る個体もある。典型的な問題として、口又は膣の慢性的鵞口瘡(真菌発疹又は斑)、口(口唇ヘルペス)又は生殖器の再発性ヘルペス水疱、持続的発熱、持続性下痢及び顕著な体重減少を含む。「AIDS」は、後期ステージのHIV疾患であり、免疫系の有効性を進行性に低減させ、個体を日和見感染及び腫瘍に感染しやすくする状態である。
【００１５】
本明細書中で用語「gp120」を用いるとき、gp160 (これは最終的にHIV env遺伝子の唯一の発現産物となる)の約120 kDaのN-末端糖タンパク質の酵素的切断産物を意味する。gp120は、感染性HIVビリオンに「棘(spike)」を形成し、gp41に非共有結合する。
【００１６】
「gp41」は、gp160の約41 kDaの糖タンパク質のC-末端酵素的切断産物を指す。gp41は、HIV感染細胞膜又はビリオンに位置する。gp41は、gp120に非共有結合するN-末端膜貫通ドメインを有する。この膜貫通ドメインは、本明細書中で「gp41の膜貫通ドメイン」又は「tm-gp41」と称される。この用語の範囲には、例えば式IIIに規定されるもののような、当該配列の天然に存在する変異型が含まれる。
【００１７】
「C5」又は「C5ドメイン」は、gp120の13個のC-末端アミノ酸残基を指す。
「C2」又は「C2ドメイン」は、gp120中の保存された領域を指す。C2領域は、gp120の内部近傍ドメイン(inner proximal domain)中のC5と逆平行のβ-シートを形成する。
【００１８】
「HIVの病的効果を低減させるか及び/又は遅延させる」とは、本発明との関連において、本発明の方法の使用が、本発明に従って治療されるHIV感染個体において見られる有病率の統計的に顕著な低減及び/又は遅延を提供することを指すものとする。つまり、AIDSを特徴付ける疾患症状の開始の時点が治療されていないコントロールと比較して遅いか、及び/又は疾病顕在化の数が本発明の治療を受けていないコントロールと比較して低減される。
【００１９】
表現「HIV gp120のC5ドメインと、gp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとの会合」とは、C5がtm-g41及びC2の両方又は一方と非共有的に相互作用することができることを意味する。tm-gp41との相互作用は分子間であり、C2との相互作用は分子内である。
【００２０】
HIV gp120のC5ドメインと、gp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとの会合を「安定化させることができる物質」は、gp41との分子間結合及び/又はC2との分子内結合からのC5の遊離を妨げるか又は統計的に低減させる物質である。一般的に、このような物質は、この効果を発揮することができる物質であるが、重要な例は抗体、抗体フラグメント及び抗体アナログである。しかしながら、C5とtm-gp41及び/又はC2との複合体に対して適切な結合親和性を有するその他の分子もまた、本発明に従う物質である‐正確な分子フォーマットは、結合特性よりも重要性が低く、本発明によれば、このような物質は受容体又は受容体アナログであり得るが、低分子の安定化物質もまた本発明の物質として機能することができるということもあり得る。
【００２１】
本明細書中の用語「抗体」は、最も広義に用いられ、具体的には、それらが所望の生物学的活性を有する(すなわち、上記の物質として機能する)限り、全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体(例えば二特異的抗体)及び抗体フラグメントを含む。抗体産生に関連する様々な技術は、例えばHarlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)に記載されている。
【００２２】
「抗体フラグメント」又は「抗体アナログ」は、全長抗体の一部、好ましくはその抗原-結合領域又は可変領域を含む。抗体フラグメント/アナログの例は、Fab, Fab', F(ab)2, F(ab’)2, F(ab)3, Fv (典型的には、抗体の一つのアームのVL及びVHドメイン), 単鎖Fv (scFv), dsFv, Fdフラグメント(典型的には、VH及びCH1ドメイン)及びdAb (典型的には、VHドメイン)フラグメント; VH, VL, VhH及びV-NARドメイン; ミニボディ(minibodies), ダイアボディ(diabodies), トリアボディ(triabodies), テトラボディ(tetrabodies)及びカッパボディ(kappa bodies) (例えばIllら, Protein Eng 1997;10: 949-57を参照); ラクダIgG; IgNAR;及び抗体フラグメントから形成された多特異的抗体フラグメント及び１又はそれより多い単離されたCDR又は機能的パラトープ(ここで、単離されたCDR又は抗原-結合残基又はポリペプチドは、機能的抗体フラグメントを形成するように会合するか又は結合することができる)を含む。様々なタイプの抗体フラグメントは、例えばHolliger及びHudson, Nat Biotechnol 2005; 23, 1126-1136; WO2005/040219に記載又はレビューされており、米国特許出願20050238646及び20020161201に公開されている。
【００２３】
本明細書中で用いられる用語「抗体誘導体」は、例えば１又はそれより多いアミノ酸が第２の分子に抗体を結合させるために、例えばアルキル化、PEG化、アシル化、エステル生成又はアミド生成等によって化学的に改変されている全長抗体又は好ましくは少なくともその抗原-結合領域又は可変領域を含む抗体フラグメントを含む。これは、限定されないが、PEG化抗体、システイン-PEG化抗体及びそのバリアントを含む。
【００２４】
本明細書において用いられる「コンジュゲート」は、本発明に従って用いられる物質、例えば第２の物質と結合又は連結した抗体誘導体、例えば細胞毒性物質、検出可能な物質等を含む。コンジュゲートは、共有結合したペプチド(コンジュゲートの例は、ペプチド結合によって結合した２つのペプチドを含む融合ペプチドであるから、この場合のコンジュゲートは、核酸フラグメントからの発現産物であり得る)から構成され得るが、コンジュゲートは、化学的接合(伝統的な例はグルタルアルデヒドを用いる接合である)によって共有結合したペプチドの組合せでもあり得る。より複雑な接合の別の例は、本発明の物質若しくはペプチド多量体又はその他の化学物質がキャリア分子に結合し、その後本発明の他の物質、ペプチド多量体又はその他の化学物質にカップリングしている例(例えばこのような化学物質がポリ-リシンキャリア(リシン「ツリー」)に結合している場合)である。
【００２５】
「ヒト化」抗体は、非ヒトイムノグロブリンに由来する最小配列を含むヒト/非ヒトキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域の残基が非ヒト種、例えばマウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非-ヒトの霊長類の超可変領域(ドナー抗体)の残基によって置き換えられているヒトイムノグロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの例において、ヒトイムノグロブリンのフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非-ヒトの残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体でもドナー抗体でも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能を更に洗練させるために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全ての又は実質的に全ての超可変ループが非-ヒトイムノグロブリンのものに対応し、全ての又は実質的に全てのFR残基がヒトイムノグロブリン配列のものである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、任意に、イムノグロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトイムノグロブリンのものの少なくとも一部も含み得る。更なる詳細は、例えばJonesら, Nature 321:522-525 (1986); Riechmannら, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), WO 92/02190, 米国特許出願20060073137及び米国特許6,750,325, 6,632,927, 6,639,055, 6,548,640, 6,407,213, 6,180,370, 6,054,297, 5,929,212, 5,895,205, 5,886,152, 5,877,293, 5,869,619, 5,821,337, 5,821,123, 5,770,196, 5,777,085, 5,766,886, 5,714,350, 5,693,762, 5,693,761, 5,530,101, 5,585,089及び5,225,539を参照されたい。
【００２６】
参照抗体の「生物学的特徴」を有する抗体は、同じ抗原に結合するその他の抗体と該抗体とを区別する、参照抗体の１又はそれより多い生物学的特徴を有するものである。
用語「ペプチド」は、本発明との関連において、2〜10アミノ酸残基の短いペプチド、11〜100アミノ酸残基のオリゴペプチド及び100アミノ酸残基よりも多いポリペプチドの全てを意味するものとする。ペプチド中のアミノ酸に言及するとき、その他の情報が提供されない限り、アミノ酸はL-アミノ酸であることが意図される。アミノ酸は、そうでないと記載されない限り、標準的な３文字又は１文字表記で表される。本明細書中で言及されるいくつかの非常用のアミノ酸は、通常Harと略されるホモアルギニン、通常Nle又はNlと略されるノルロイシン、通常Lys(Me)と略されるN-ε-メチル化Lys、通常Cit又は１文字で「B」と略されるシトルリン、通常Dprと略されるジアミノプロピオン酸及び通常Dpr(Ser)と略されるセリニルジアミノプロピオン酸を含む。
【００２７】
「タンパク質」は、少なくとも１つのペプチドを含む機能的な生体分子を指すものとする;少なくとも２つのペプチドを含むとき、これらは共有結合したか又は非共有結合した複合体を形成し得る。タンパク質中のポリペプチドは、グリコシル化及び/又は脂質付加されていてもよいし、及び/又は補欠分子族を含んでいてもよい。
【００２８】
「ペプチド多量体」は、互いに非天然の配置にある少なくとも２つのペプチドによって構成されている分子を指す。例としては、それらのアミノ酸の少なくとも１つの側鎖を介して共有結合しているか又はそれらの末端を介して(例えばペプチド結合によって)結合しているが、天然には現れない配置にある同一又は異なるタンパク質からのペプチドである。ペプチド多量体の典型例は以下に記載する。
【００２９】
ペプチドの「バリアント」又は「アナログ」は、参照ペプチド、典型的には天然又は「親」ポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドを指す。ペプチドバリアントは、天然アミノ酸配列中の特定の位置における１又はそれより多いアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を有し得る。
「保存的」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の物理化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当業者に公知であり、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えばリシン, アルギニン, ヒスチジン), 酸性側鎖を有するアミノ酸(例えばアスパラギン酸, グルタミン酸), 非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸(例えばグリシン, アスパラギン, グルタミン, セリン, スレオニン, チロシン, システイン, トリプトファン), 非極性側鎖を有するアミノ酸(例えばアラニン, バリン, ロイシン, イソロイシン, プロリン, フェニルアラニン, メチオニン), β-分枝側鎖を有するアミノ酸(例えばスレオニン, バリン, イソロイシン)及び芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えばチロシン, フェニルアラニン, トリプトファン, ヒスチジン)を含む。保存的アミノ酸置換の特定の形態は、遺伝子コードによってコードされる通常の20アミノ酸ではないアミノ酸によるものを含む。本発明の好ましい実施態様は合成ペプチドの使用を伴うので、本明細書中に開示されるペプチド中にこのような「非天然に生じる」アミノ酸残基を提供することに問題はなく、それによって、より短いか又はより長い飽和炭素鎖を有するアミノ酸残基の側鎖中の天然飽和炭素鎖を交換することが可能となる - 例えば、リシンは側鎖-(CH2)nNH3(ここで、nは4ではない)を有するアミノ酸で置換され得、アルギニンは側鎖-(CH2)nNHC(=NH2)NH2(ここで、nは3ではない)を有するアミノ酸で置換され得る等。類似して、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸及びグルタミン酸は、側鎖-(CH2)nCOOH (ここで、n＞2)を有するアミノ酸残基で置換され得る。
【００３０】
ペプチドの「レトロ型」は、N-〜C-末端方向のアミノ酸の順序が逆転しているペプチドの型である。例えば、ALDFRのレトロ型は、ペプチドRFDLAである。
「インベルソ」型は、インベルソ型中の各アミノ酸がペプチド中の対応するアミノ酸と比較して反対の立体配置を有することによって特徴付けられる。よって、ペプチドがL-アミノ酸から構成される場合、インベルソ型はD-アミノ酸から構成される。
ペプチドの「レトロ-インベルソ」型は、インベルソ型及びレトロ型の両方であるペプチドの型である。L-ala - L-Arg - L-Lysのレトロ-インベルソ型は、D-Lys - D-Arg - D-alaである。
【００３１】
２つのアミノ酸配列に関して、用語「実質的に同一」とは、該配列が例えば既定のギャップウェイトを用いるプログラムGAP又はBESTFITによって最適にアライメントされるとき、少なくとも約50, 少なくとも約60, 少なくとも約70, 少なくとも約80, 少なくとも約90, 少なくとも約95, 少なくとも約98又は少なくとも約99パーセントの配列同一性を有することを意味する。１つの実施態様において、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、様々な置換, 欠失及びその他の改変(保存的アミノ酸置換を含む)に割り当てられた類似性の尺度を用いて類似した配列を適合させる。例えば、公衆に入手可能なGCGソフトウェアは、既定のパラメータを用いて、密接に関連するポリペプチド(例えば異なる生物種からの相同性ポリペプチド)間又は野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性又は配列同一性を決定することができるプログラム、例えば「Gap」及び「BestFit」を含む。例えばGCG Version 6.1.を参照されたい。ポリペプチド配列は、既定又は推奨のパラメータを用いるFASTA又はClustalWを用いて比較することもできる。GCG Version 6.1.中のプログラムであるFASTA (例えばFASTA2及びFASTA3)は、クエリー配列とサーチ配列との間の最良のオーバーラップ領域のアライメント及びパーセント配列同一性を提供する(Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98; Pearson, Methods Mol. Biol. 2000;132:185-219)。配列を様々な生物からの多数の配列を含むデータベースと比較するとき、又は推定するときに好適な別のアルゴリズムは、既定パラメータを用いるコンピュータプログラムBLAST、特にblastpである。例えば、Altschulら, J. Mol. Biol. 1990;215:403-410; Altschulら, Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-402 (1997) (それぞれ参照によって本明細書中に組み込まれる)を参照されたい。実質的に同一の２つのアミノ酸配列中の「対応する」アミノ酸の位置は、本明細書に記載されるタンパク質解析ソフトウェアのいずれかによって、典型的には既定パラメータを用いて、アライメントされたものである。
【００３２】
用語「部分配列」とは、一般に、それぞれ天然に生じるアミノ酸配列又は核酸配列から直接由来する少なくとも３つのアミノ酸又は該当するときには少なくとも３つのヌクレオチドの連続したストレッチを意味する。しかしながら、本発明のペプチド多量体について論じるとき、部分配列は、１又は２アミノ酸と短くてもよい。なぜなら、本発明のペプチド多量体は、異なるペプチドドメインからのアミノ酸(ここで、該アミノ酸は一緒になって抗体に対する構造エピトープを少なくとも形成している)を含むからである。それゆえ、このような構造エピトープは、C5からの４アミノ酸と、tm-gp41からのわずか１又は２アミノ酸とから構成され得る‐ここで重要な点は、この２つのドメインからの複合エピトープが安定化され得ること、すなわちインビボでこのエピトープに結合する抗体がC5とtm-gp41及び/又はC2との間の配置を安定化することである。
【００３３】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれるときに「動作可能に連結」している。例えば、プレ配列又は分泌リーダーについてのDNAは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現される場合に、該ポリペプチドについてのDNAに動作可能に連結している; プロモータ又はエンハンサは、当該コード配列の転写に影響を与える場合に、コード配列に動作可能に連結している; あるいは、リボソーム結合部位は、転写を促進するように位置する場合にコード配列に動作可能に連結している。一般に、「動作可能に連結」とは、連結しているDNA配列が隣接していること、分泌リーダーである場合には隣接し、かつ読み枠内にある(in reading phase)ことを意味する。しかしながら、エンハンサは、隣接している必要はない。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプタ又はリンカーが慣用のプラクティスに従って用いられる。
【００３４】
「単離された」分子は、それが見出される組成物中で、それが属する分子のクラスに関して優勢な種である分子である(すなわち、単離された分子は、組成物中で分子タイプの少なくとも約50％を構成し、典型的には組成物中で少なくとも約70%, 少なくとも約80%, 少なくとも約85%, 少なくとも約90%, 少なくとも約95%又はそれより多い分子種、例えばペプチドを構成する)。共通に、抗体分子の組成物は、組成物中に存在する全てのペプチド種との関連においては抗体分子に関して又は提案する使用との関連においては少なくとも実質的に活性なペプチド種に関して、98％〜99％の抗体分子の同質性を示す。
【００３５】
本発明に関連して、「治療」又は「治療する(こと)」は、文脈上矛盾しない限り、疾患又は障害の１又はそれより多い症状又は臨床的に関連付けられる顕在化を予防、緩和、管理(managing)、治癒又は低減することをいう。例えば、疾患又は障害の症状又は臨床的に関連付けられる顕在化が同定されていない患者の「治療」は、予防治療である一方、疾患又は障害の症状又は臨床的に関連付けられる顕在化が同定されている患者の「治療」は、一般には、予防治療を構成しない。
【００３６】
用語抗原は、免疫系の特異的認識成分(抗体、T-細胞)によって認識される物質を指す。
用語「免疫原」は、本発明との関連において、個体において当該免疫原を標的とする適応免疫応答を誘導することができる物質を指すものとする。本発明との関連においては、免疫原は、当該免疫原と反応する抗体を誘導する。言い換えれば、免疫原は、免疫を誘導することができる抗原である。
【００３７】
用語「エピトープ」、「抗原決定基」及び「抗原部位」は、本明細書において互換可能に用いられ、当該エピトープがMHC分子と複合体を形成するときに、(「B-細胞エピトープ」としても公知の抗体結合性エピトープの場合には)抗体によって又は(T-細胞受容体結合性エピトープ、すなわち「T-細胞エピトープ」の場合には)T-細胞レセプターによって認識される抗原又は免疫原中の領域を指す。
【００３８】
用語「免疫原的有効量」は、当該技術における通常の意味、すなわち免疫原と免疫学的特徴を共有する病原性物質と顕著に闘う(engage)免疫応答を誘導することができる該免疫原の量という意味を有する。
用語「ワクチン」は、免疫原を含み、病的状態の発症リスクを低減することができるか又は病的状態の治癒(又は少なくともその症状の緩和)に役立つ治療上有効な免疫応答を誘導することができる免疫応答を誘導することができる組成物に使用される。
【００３９】
用語「医薬的に許容され得る」は、当該技術における通常の意味を有する。すなわち、問題の疾患を治療するときにヒトに使用される医薬の一部として受容され得る物質として使用される。よって、この用語は、事実上、治療対象の状態を改善させるよりもむしろ悪化させる高度に毒性の物質の使用を排除する。
【００４０】
「Tヘルパーリンパ球エピトープ」(THエピトープ)は、MHCクラスII分子に結合するペプチドであり、MHCクラスII分子に結合した抗原提示細胞(APC)の表面に存在し得る。「免疫学的キャリア」は、一般に、１又は多くのTHエピトープを含み、T-ヘルパーリンパ球を確実に活性化及び増殖させることによって、それがカップリングしている抗原に対する免疫応答を増大させる物質である。公知の免疫学的キャリアの例は、破傷風及びジフテリア毒素並びにキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)である。
【００４１】
用語「アジュバント」は、ワクチン技術における通常の意味を有する。すなわち、1)それ自体ではワクチンの免疫原を指向する特異的免疫応答を開始することができないが、2)それにも拘らず当該免疫原を指向する免疫応答を増強することができる物質である。あるいは、言い換えれば、アジュバント単独を用いるワクチン接種は免疫原を指向する免疫応答を生じず、当該免疫原を用いるワクチン接種は当該免疫原を指向する免疫応答を生じ得るか又は生じ得ないが、免疫原とアジュバントとを併用するワクチン接種は、当該免疫原単独によって誘導されるものよりも強力な当該免疫原を指向する免疫応答を誘導する。
【００４２】
細胞媒介性免疫(CMI)を誘発するペプチド
ワクチン接種は、感染前に特定の病原体を指向する免疫応答を刺激することを目的とする。個体が病原体に曝露されたとき、感染の確立を妨げる記憶細胞が惹起される。したがって、ワクチンは、先天性免疫とは似つかない長期存続性かつ記憶性の適応免疫応答を刺激する。適応免疫系には２つの主要な武器が存在するのである。液性免疫は、ウイルス粒子に結合することができる抗体及び感染を中和することができる特定の抗体の産生に関与する。細胞媒介性免疫は、ヒト白血球抗原(HLA)クラスIとの関連においてウイルス性のエピトープを曝露している感染細胞を殺傷し、そうして感染細胞を排除する細胞毒性T細胞の産生をもたらす。
【００４３】
本明細書中で用いられるように、細胞媒介性免疫応答を誘発するペプチドとは、抗原-特異的細胞毒性T-リンパ球の活性化を誘発するペプチドをいう。これらのペプチドは、ヒト白血球抗原(HLA)クラスIとの関連においてウイルス性のエピトープを曝露している感染細胞を殺傷し、そうして感染細胞を排除する細胞毒性T-細胞の産生をもたらす細胞毒性T-リンパ球免疫(CTL)応答を誘発する。細胞媒介性免疫(CMI)は、食細胞、ナチュラルキラー細胞(NK)、抗原-特異的細胞毒性T-リンパ球の活性化及び抗原に応答しての様々なサイトカインの放出にも関与し得る。
【００４４】
これらのペプチドは、HTLエピトープを含むペプチドを誘導するヘルパーTリンパ球(HTL)であり得る。「HTL誘導性ペプチド」は、HTL応答を誘導することができるHLAクラスII結合性ペプチドである。これらのペプチドもまた、他の実施態様においては、HTL誘導性ペプチドに加えて、又はその代替物として、CTLエピトープを含むCTL誘導性ペプチドであり得る。「CTL誘導性ペプチド」は、CTL応答を誘導することができるHLAクラスI結合性ペプチドである。
【００４５】
本発明に従って用いられる細胞媒介性免疫応答を誘発するペプチドは、限定されないが、国際特許出願WO0052040, WO 2012/092934又はWO 2012/072088 (これらの特許出願は参照により本明細書中に組み込まれる)のいずれかに記載のペプチドを含む。
【００４６】
HIV-特異的ペプチド
いくつかの側面において、本発明による方法及び組成物は、細胞媒介性免疫応答を誘発する１又はそれより多いペプチドを使用するか又は含む。いくつかの実施態様において、このペプチドは、少なくとも１つのHIV-特異的ペプチドである。
【００４７】
細胞媒介性免疫応答を誘発するペプチドの１つの側面は、HIV gag p24の保存された領域に基づくHIV-特異的ペプチド、少なくとも１つの前記ペプチドを含む遊離型又はキャリア-結合型の抗原に関する。
本発明に従って用いられるHIV-特異的ペプチドは、HIV-1-エピトープの独自性(感度及び特異性)を維持する特性を有するHIV-1コアタンパク質であるp24の保存された領域に由来し得る。更に、本発明に従って用いられる新たなペプチドは、細胞毒性Tリンパ球(CTL)に拮抗性であると認められる効果を有さず、少なくとも１つの潜在的なCTLエピトープを有するものである。
【００４８】
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられ、上記の基準を満たすHIV-特異的ペプチドは、以下の群(ここで、各HIV特異的ペプチドの末端は、遊離のカルボキシル-又はアミノ-基、アミド、アシル又はアセチルであり得る);
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Ala Xaa8 Xaa9Gln Thr Pro Trp Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17Xaa18 Val Xaa20 (配列番号47);
ここで、1位のXaaはLys又はArgであり、
2位のXaaはAla, Gly, Ser又はArgであり、
3位のXaaはLeu又はMetであり,
4位のXaaはGly又はArgであり, 
5位のXaaはPro, Thr, Val, Ser, Gln又はAlaであり,
6位のXaaはGly, Ala, Lys, Arg, Gln又はGluであり,
8位のXaaはThr又はSerであり,
9位のXaaはLeu又はIleであり,
14位のXaaはThr, Ser又はValであり,
15位のXaaはAla又はSerであり,
16位のXaaはCys又はSerであり,
17位のXaaはGln又はLeuであり,
18位のXaaはGly, Glu又はArgであり,
20位のXaaはGly又はArgである;
【００４９】
Xaa1 Xaa2Xaa3 Xaa4 Xaa5 Gly Leu Asn Pro Leu Val [Gly]n Xaa12 Xaa13 Tyr Xaa15 Pro Xaa17 Xaa18 Ile Leu Xaa21 Xaa22 (配列番号50);
ここで、1位のXaaはArg, Lys若しくはAspであるか又は存在せず,
2位のXaaはTrp, Gly, Lys又はArgであり, 
3位のXaaはIle, Leu, Val又はMetであり,
4位のXaaはIle, Val又はLeuであり,
5位のXaaはLeu, Met, Val又はProであり,
12位のXaaはArg又はLysであり,
13位のXaaはMet又はLeuであり、
15位のXaaはSer, Cys又はGlnであり、
17位のXaaはThr, Val, Ile, Ser又はAlaであり、
18位のXaaはSer, Gly又はThrであり、
21位のXaaはAsp, Glu, Cys又はGlyであり、
22位のXaaはGlyであるか又は存在せず、
n = 0, 1, 2又は3;
【００５０】
Xaa1 Xaa2 Xaa3Pro Ile Pro Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11Xaa12 [Gly]n Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 (配列番号55);
ここで、1位のXaaはAsn, Ser, Gly, His, Ala, Pro若しくはArgであるか又は存在せず、
2位のXaaはAsn, Ala又はLysであり、
3位のXaaはPro, Gln, Gly, Ile又はLeuであり、
7位のXaaはVal又はAlaであり、
8位のXaaはGly又はLysであり、
9位のXaaはGlu, Asp, Lys, Phe又はThrであり、
10位のXaaはIle, Met, Val又はLeuであり、
11位のXaaはTyr若しくはLeuであるか又は存在せず、
12位のXaaはSerであるか又は存在せず、
13位のXaaはArgであるか又は存在せず、
14位のXaaはAsp, Arg, Trp若しくはAlaであるか又は存在せず、
15位のXaaはIleであるか又は存在せず、
16位のXaaはTyrであるか又は存在せず、
17位のXaaはLys又はArgであり、
18位のXaaはArg, Lys又はAspであり、
19位のXaaはTrp又はGlyであり、
20位のXaaはIle, Met, Val, Gln又はAlaであり、
21位のXaaはIle, Val又はAlaであり、
22位のXaaはLeu, Met又はValであり、
23位のXaaはGly又はCysであり、
24位のXaaはLeuであるか又は存在せず、
n = 1, 2又は3, 及び
【００５１】
Xaa1 Xaa2  Ile Ile Xaa5 Xaa6Xaa7 Xaa8 Xaa9 Leu Xaa11 [Gly]n [Arg]m Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 (配列番号61);
ここで、1位のXaaはPro, Lys若しくはArgであるか又は存在せず、
2位のXaaはGlu, Arg, Phe又はLysであり、
5位のXaaはPro又はThrであり、
6位のXaaはMet, Thr又はNleuであり、
7位のXaaはPhe又はLeuであり、
8位のXaaはSer, Thr, Ala又はMetであり、
9位のXaaはAla, Glu又はLeuであり、
11位のXaaはSerであるか又は存在せず、
12位のXaaはAla若しくはArgであるか又は存在せず、
13位のXaaはIle若しくはLeuであるか又は存在せず、
14位のXaaはSer, Ala若しくはLeuであるか又は存在せず、
15位のXaaはTyr, Glu又はAspであり、
16位のXaaはGly又はAspであり、
17位のXaaはAla又はLeuであり、
18位のXaaはThr, Ile, Val, Leu又はAsnであり、
19位のXaaはPro, Thr又はSerであり、
20位のXaaはTyr, Phe, Nleu, His又はGlnであり、
21位のXaaはAsp, Asn, Leu又はAlaであり、
22位のXaaはLeu, Ile, Val又はAsnであり、
23位のXaaはAsn, Tyr, Cys又はGlyであり、
24位のXaaはThr, Met, Ile, Ala若しくはValであるか又は存在せず、
25位のXaaはGlyであるか又は存在せず、
互いに独立してn = 1, 2又は3及びm= 0, 1, 2又は3
又は該HIV特異的ペプチドのいずれかの塩から選択される。
【００５２】
HIV-特異的ペプチド配列は、配列番号47, 配列番号50, 配列番号55又は配列番号61の配列群から選択される少なくとも１つのペプチドを含む場合、特に良好な抗原として機能する能力を有する。抗原性は、例えば二量体化又は重合体化及び/又は固相への固定化によって種々のペプチドの比若しくは濃度又はペプチドのサイズを調節することによって、調整することができる。抗原は、架橋、例えば鎖のCys残基間のジスルフィド架橋又はO, S又はN等の１又はそれより多いヘテロ原子が場合により介在しているC1〜C8アルキレン等の架橋によって結合しているか又は好ましくは結合していない本発明に従って用いられる２又はそれより多いポリペプチド配列を含む。単量体、二量体又はオリゴマーの形態にある鎖は、固相に固定され得る。固定を促進するための<<腕>>を得るために、更なるアミノ酸が末端に付加されてもよい。
【００５３】
本発明に従って用いられるHIV-特異的ペプチド中の全てのアミノ酸がD-又はL-体であり得るが、自然に生じるL-体が好ましい。
HIV-特異的ペプチド配列のC-及びN-末端は、末端NH2-基及び/又はCOOH-基の改変によって天然の配列から逸脱し得、それらは、例えば、アシル化、アセチル化、アミド化又はキャリア又は別の分子のための結合部位を付与するために改変されていてもよい。ペプチドのC-末端がアミドであるとき、適切なアミドは、式-C(O)-NRxRy(式中、Rx及びRyは、独立して、水素及びC1-6アルキル(当該アルキル基は、１又はそれより多いフッ素原子で置換されていてもよい)から選択され、例えば-CH3, -CH2CH3及び-CF3であり得、言及し得る具体的なアミド基は-C(O)NH2である)を有するものを含む。ペプチドのN-末端がアセチル化されているとき、適切なアセチル化N-末端は、式-NH-C(O)Rz (式中、Rzは、水素、C1-6 アルキル(当該アルキル基は、１又はそれより多いフッ素原子で置換されていてもよい)であり、例えば-CH3, -CH2CH3及び-CF3であり得るか又はフェニルであり得る)のものを含む。
【００５４】
本発明に従って用いられるHIV-特異的ペプチドは、6〜50アミノ酸、好ましくは10〜30アミノ酸からなる。それらは、特定された位置におけるアミノ酸の全ての天然の変異をカバーする。
本発明に従って用いられるポリペプチド抗原は、遊離型又はキャリア結合型である。ペプチドが任意に結合しているキャリア又は固相は、広範多種の公知のキャリアから選択され得る。キャリア又は固相は、ワクチン中の診断用抗原又は免疫付与(immunizing)成分としての固定されたポリペプチドの用途に関して選択されるべきである。
【００５５】
例えば診断目的で用いることができるキャリアの例は、共重合体、例えばスチレン-ジビニルベンゼンの磁性粒子又はラテックス, ヒドロキシル化スチレン-ジビニルベンゼン, ポリスチレン, カルボキシル化ポリスチレン, カーボンブラック粒子, 活性化されていないか又はポリスチレン若しくはポリビニルクロリド活性化ガラス, エポキシ-活性化多孔性磁性ガラス, ゼラチン若しくは多糖粒子又はその他のタンパク質粒子, 赤血球,モノ-若しくはポリクローナル抗体又はこのような抗体のfabフラグメントである。
【００５６】
１つの実施態様において、本発明に従って使用するためのワクチンは、配列番号47, 50, 55及び61のペプチドを含む抗原を含み、より好ましくはペプチドは1:1:1:1 w/wの比で存在する。
【００５７】
更なる好ましい実施態様において、本発明に従って使用するためのワクチンは、以下のペプチド:
RALGPAATLQTPWTASLGVG (配列番号49)
RWLLLGLNPLVGGGRLYSPTSILG (配列番号52)
RAIPIPAGTLLSGGGRAIYKRTAILG (配列番号57)
及び
RFIIPNlFTALSGGRRALLYGATPYAIG (配列番号64) (6位のNlは、ノルロイシンである)
又はその塩、特に酢酸塩を含む。
【００５８】
いくつかの実施態様において、本発明に従って使用するためのペプチド又はその塩、特に酢酸塩は、以下のように、C-末端において改変されている:
RALGPAATLQTPWTASLGVG-NH2(配列番号49)
RWLLLGLNPLVGGGRLYSPTSILG-NH2(配列番号52)
RAIPIPAGTLLSGGGRAIYKRTAILG-NH2(配列番号57)
及び
RFIIPNlFTALSGGRRALLYGATPYAIG-NH2 (配列番号64) (6位のNlは、ノルロイシンである)。
【００５９】
配列の１つは、B-細胞エピトープを含み、液性免疫系を活性化する一方、その他の配列はCTL-エピトープに寄与し、CTL-エピトープのフレーム内に組み込まれたアミノ酸の変化は、結合増大を達成するために設計される。その他のアミノ酸の変化は、ペプチドの合成を促進するため及び/又はペプチドの可溶性を増大するために行われている。
【００６０】
対象において液性免疫を刺激する化合物、例えばC5関連の化合物:
本発明は、対象において液性免疫を刺激する化合物の使用にも関する。液性免疫は、ウイルス粒子に結合することができる抗体及び感染を中和することができる特定の抗体の産生を含む。
【００６１】
本発明に従って使用される対象において液性免疫を刺激するペプチドは、限定されないが、国際特許出願WO2011/000962, WO00/52040, WO 2012/092934又はWO 2012/072088 (これらの特許出願は、参照により本明細書中に組み込まれる)のいずれかに記載されるペプチドを含む。
【００６２】
いくつかの実施態様において、これらの化合物は、HIV gp120のC5ドメインと、gp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとの会合を安定化することができる物質である。その他の実施態様において、これらの化合物は、HIV gp120のC5ドメインと、gp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとの会合を安定化させる抗体を誘導する免疫原である。
【００６３】
本発明の１つの側面は、ヒトレトロウイルス感染、例えば免疫不全ウイルスI (HIV)の病的効果を、このようなウイルス、例えばHIVに感染したヒトにおいて低減及び/又は遅延するための方法及び組成物に関し、上記の方法は、HIV gp120のC5ドメインと、gp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとの会合を安定化することができる物質の有効量を投与することを含む。
【００６４】
別の側面は、非常に類似しているが、後天性免疫不全症候群(AIDS)を発症するリスクを低減する組成物及び方法に関し、上記の方法は、HIV gp120のC5ドメインと、gp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとの会合を安定化することができる物質の有効量を投与することを含む。
【００６５】
これらの側面は、主に、本発明に従ってHIV感染長期非進行者に特徴的な抗体を模倣することができる物質を用いてレトロウイルス感染、例えばHIVに感染した個体を治療することを目的とする - これは、本発明に係る発見の最も直接的な治療上の利用である。１つの側面がレトロウイルス感染、例えばHIVの病的効果を低減すること又はAIDS症状の顕在化にかかる時間を延長させることを目的とする場合、その他の側面は、完全に、AIDSを発症するリスクを低減することを目的とし、したがって、抗レトロウイルス療法で現在予防治療されている個体において用いられ得る。
【００６６】
１つの実施態様において、本発明のこれら第１の側面における物質は、gp41の膜貫通ドメインに由来するアミノ酸配列及びC2ドメインに由来するアミノ酸配列から独立して選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む分子であり、ここで、少なくとも１つのアミノ酸配列はC5ドメインに結合し、任意に、少なくとも１つのD-アミノ酸を含む; 特定の実施態様において、アミノ酸配列中の全てのアミノ酸はD-アミノ酸である。分子は、好ましくはペプチドであり、特定の実施態様においては、このペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸配列からなる。アミノ酸配列は、典型的には、最大10アミノ酸残基、例えば最大9、最大8、最大7、最大6、最大5アミノ酸残基を含む。したがって、好ましい分子は、4, 5, 6, 7, 8, 9又は10アミノ酸残基を有するペプチドである。したがって、少なくとも１つの分子の特定の実施態様は、配列番号34, 35, 36, 37, 39, 40, 42, 43及び45を有するか又は含むペプチドであり、これらは全て、部分的に又は完全にD-アミノ酸からなり得る。式IIIを有するペプチドを含む分子もまた、少なくとも１つの分子の興味深い実施態様である。
【００６７】
１つの実施態様において、本発明の第１の側面における物質は、抗体、抗体フラグメント又は抗体アナログから選択される。抗体は、完全なヒト抗体、ヒト化抗体若しくはキメラ抗体又はそれらの誘導体であってもよい。典型的には、抗体は、IgA、IgD、IgG、IgE又はIgMである - 抗体は、モノクローナル又はポリクローナルのいずれであってもよい。抗体フラグメントは、典型的には、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、Fab'-SHフラグメント、F(ab)2フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fvフラグメント、重鎖Ig (ラマ又はラクダIg)、VHHフラグメント、単一ドメインFV及び一本鎖抗体フラグメントから選択され、抗体アナログは、典型的には、scFV、dsFV、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、カッパボディ、IgNAR、tandAb、BiTE及び多特異的抗体から選択される。
【００６８】
本発明のこれら第１の側面の１つの実施態様において、物質は、アミノ酸ストレッチTZ1AKRRVVZ2REKR (ここで、Z1はK, R又はEであり、Z2はQ又はEである)中の１又はそれより多いアミノ酸残基と、gp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメイン中のアミノ酸ストレッチ中の１又はそれより多いアミノ酸残基とに結合し、それらの間の会合を安定化させる。このC5からのアミノ酸ストレッチは、公知の複数のHIVクレード間で高度に保存されており、したがって、上記の物質によるこのストレッチとの効果的な相互作用が大いに有利であると考えられる。
【００６９】
本発明の更なる側面は、HIV gp120のC5ドメインと、gp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとの会合を安定化する抗体を誘導する免疫原の有効量を投与することを含む、HIVに感染したヒトにおいてヒト免疫不全ウイルスI (HIV)のリスクを低減するか又はその病的効果を低減するか及び/若しくは遅延する方法に関する一方、その他の側面は、同一の手段を用いる予防方法に関する。言い換えれば、１つの側面は治療上活性な免疫療法に関する一方、別の側面はAIDSを含むHIV疾患の予防的免疫療法に関する。これはHIV感染の予防も伴う。
【００７０】
これら特定の側面は、HIV LTNP個体において見られるもののように、平均的なHIV感染個体において同一タイプの抗体レパートリーを誘導することが実施可能であるという認識に基づく。当該領域から構成されるHIVに存在する抗体結合性エピトープを模倣するペプチド多量体を製造するためにC5並びにtm-gp41及び/又はC2の両方におけるペプチド領域を注意深く選択することによって、所望の免疫を誘導するワクチンを製造することが可能となる - 興味深いことに、このアプローチは、古典的な意味における中和抗体を得るようにワクチン接種することを目的としない。
【００７１】
１つの実施態様において、免疫原は、本発明のこれらの側面について論じられるときには下記のペプチド多量体、下記の組成物, その他の側面について論じられる核酸フラグメント, その他で論じられるウイルス又はプラスミドベクターを含む組成物から選択される。
【００７２】
これらの側面に共通して、それらは全て、C5ドメインとC2及び/又はgp41の膜貫通ドメインとの標的化された会合に配列TZ1AKRRVVZ2REKR (ここで、Z1はK, R又はEであり、Z2はQ又はEである)中の少なくとも１つアミノ酸及び１つのアミノ酸が関与しgp41の膜貫通ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸又はgp120の定常C2ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸が関与する実施態様を含む。上記で説明したように、この特定の配列は、公知のHIVクレードにおいて極端によく保存されており、したがって、標的化を最も実行可能なのがこの配列とtm-gp41又はC2との間の相互作用である。
【００７３】
本発明に従って用いられる免疫原は、(1)ペプチド多量体を含んでいてもよく、上記の多量体は、
−  0〜4つのアミノ酸置換を含むHIV gp120のC5ドメインの13アミノ酸残基アミノ酸配列のアミノ酸配列、その部分配列又は上記のアミノ酸配列若しくは部分配列のインベルソ-, レトロ-若しくはレトロ-インベルソ型を含むアミノ酸配列を含む第１のペプチド、及び
−  gp41の膜貫通ドメインに存在するか若しくはgp120の定常C2ドメインに存在するアミノ酸ストレッチを含むか、又は配列番号6〜13のいずれか１つに存在するアミノ酸ストレッチを含むか、又はgp41の膜貫通ドメインに存在するか若しくはgp120の定常C2ドメインに存在するアミノ酸ストレッチのインベルソ-, レトロ-若しくはレトロ-インベルソ型を含む少なくとも１つの第２のペプチド、
を含み、ここで、上記のペプチド多量体は、HIV gp120のC5ドメインとgp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとに結合し、その会合を安定化させることができる抗体を誘導することができ、上記のペプチド多量体は、gp120中のC5のN-末端アミノ酸を欠いている。
【００７４】
言い換えれば、この側面は、C5中の相互作用領域とtm-gp41及び/又はC2中の相互作用領域とを特徴付けるエピトープに３次元的な類似性を有するペプチド多量体に関する。本発明に従って用いられるペプチド多量体は、HIV LTNP個体に見られる抗体と同一の特徴を有する抗体を誘導することができる有用な免疫原であるが、ペプチド多量体は、診断/予後ツールとしても有望である。レトロ-, インベルソ-及びレトロ-インベルソペプチドを含ませることは、とりわけ、HIVの対応物と比較してタンパク質分解の面から安定なペプチド及び全く外来のペプチドの産生を可能にする。
【００７５】
ペプチド多量体の１つの実施態様において、上記第１のペプチドは、式Iを有するアミノ酸配列:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13       (I) 
(ここで、X1はThrであり, X2はLys, Arg, Har及びGluから選択され, X3はAla及びValから選択され, X4はArg, Har, Lys及びCit (シトルリン)から選択され, X5はArg, Har, Lys及びCitから選択され, X6はArg, Har, Lys及びCitから選択され, X7はVal, Leu, Ile及びNle (ノルロイシン)から選択され, X8はVal, Leu Ile及びNleから選択され, X9はGln, Glu, Asn及びAspから選択され, X10はArg, Har及びCitから選択され, X11はGlu及びAspから選択され, X12はLysであり, X13はArg, Har及びCitから選択される)を含むか、又は
式Iのアミノ酸配列の部分配列を含むか、又は上記のアミノ酸配列若しくは部分配列のインベルソ-, レトロ-若しくはレトロ-インベルソ型を含む。第１のペプチドは、式Iを有するアミノ酸配列のN-末端に結合したジペプチドAla-Proを更に含んでいてもよいか、及び/又は第１のペプチドは、式Iを有するアミノ酸配列のC-末端に結合したジペプチドX14-X15(ここで、X14はAla及びValから選択され、X15はVal, Leu及びNleから選択される)を更に含んでいてもよい。
【００７６】
特に、興味深いC5に由来するペプチドは、実施例の前置きに記載されており、本発明に従って用いられるペプチド多量体の第１のペプチドの実施態様を構成する。
【００７７】
多くの天然に生じるgp41及びgp120変異体が観察されているので、第２のペプチドがgp41の膜貫通ドメインに存在するか又はgp120の定常C2ドメインに存在するアミノ酸ストレッチを含むと記載するとき、このことは、当該アミノ酸ストレッチがこのような天然に生じる型において存在することを指すものとする。よって、少なくとも第２のペプチドは、gp41に由来するとき、特定の実施態様において、式:
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-Z13-Z14-Z15-Z16-Z17     (III)
-(ここで、Z1はAspであり, Z2はArgであり, Z3はProであり, Z4はGlu又はGlyであり, Z5はGly又はArgであり, Z6はIleであり, Z7はGluであり, Z8はGluであり, Z9はGluであり, Z10はGlyであり, Z11はGlyであり, Z12はGluであるか又は存在せず, Z13はArg又はGlnであり, Z14はAsp又はGlyであり, Z15はArg又はLysであり, Z16はAsp又はGlyであり、Z17はArgである)を有するアミノ酸配列を含むものであるか、又は
式(III)の部分配列、例えば少なくとも5アミノ酸残基(例えば少なくとも6, 少なくとも7, 少なくとも8, 少なくとも9, 少なくとも10, 少なくとも11, 少なくとも12, 少なくとも13, 少なくとも14, 少なくとも15及び少なくとも16アミノ酸残基)を有する部分配列を含む。更に、第２のペプチドのこの実施態様は、gp41に見られる対応するアミノ酸配列と少なくとも80％の配列同一性をもたらすアミノ酸置換を含み得る。
【００７８】
特に興味深いC2及びgp41並びにgp120に由来するペプチドは、実施例の前置きに記載されており、本発明に従って用いられるペプチド多量体の第２のペプチドの実施態様を構成する。
【００７９】
ペプチド多量体の特定の実施態様において、第１のペプチド及び少なくとも１つの第２のペプチドは、リンカーを介して結合している; リンカーは、ペプチドリンカー、例えばグリシン、リシン又はアルギニンリンカー、ポリヒスチジンタグ、プロテインG及びプロテインAであり得るが、ビス-マレイミドリンカー、ジスルフィドリンカー又はポリエチレングリコール(PEG)リンカーを用いることも可能である。実用では、ペプチド化学において有用であることが見出された任意のリンカーが本発明によるリンカーとしても有用である。よって、本発明は、互いにコンジュゲートされたか又は融合された「単純な」直鎖状ペプチドの使用だけでなく、C5及びgp120のその他の領域又はgp41に由来する個々のペプチドが非-ペプチドリンカー、例えば相補性核酸、核酸誘導体又はアナログ、例えばPNA、LNAによって結合しているペプチド多量体も考慮する。複数タイプのリンカーの使用もまた本発明の範囲内であり、例えば鎖内ジスルフィドリンカーを含む直鎖状ペプチドを使用することも本発明に従う使用の一部である。
具体的には、本発明に従って用いられる興味深いペプチド多量体は、実施例の前置きに記載されている。
【００８０】
特定の実施態様において、ペプチド多量体中の少なくとも１つの第１のペプチド及び少なくとも１つの第２のペプチドは、N-又はC-末端修飾、例えばアミド化, アシル化又はアセチル化を含む。ペプチドのC-末端がアミドであるとき、適切なアミドは、式-C(O)-NRxRy (ここで、Rx及びRyは、独立して、水素及びC1-6アルキル(アルキル基は、１又はそれより多いフッ素原子で置換されていてもよい)から選択され、例えば-CH3, -CH2CH3及び-CF3であり、具体的に言及され得るアミド基は、-C(O)NH2である)を有するものを含む。ペプチドのN-末端がアセチル化されているとき、適切なアセチル化N-末端は、式-NH-C(O)Rz (ここで、Rzは水素、C1-6アルキル(アルキル基は、１又はそれより多いフッ素原子で置換されていてもよく、例えば-CH3, -CH2CH3及び-CF3である)又はフェニルである)のものを含む。
【００８１】
ペプチド多量体がワクチン剤として考慮されるので、ある実施態様において、それらは、キャリア分子、例えば免疫原性キャリアとカップリングしている。よって、ペプチド多量体のペプチドは、(例えばCLIP技術によって)組換え融合物として又は(例えばヘテロ二官能クロスリンカーを用いて)配向されたか又は配向されていない化学的結合によって、その他の分子と結合していてもよい。例えばジフテリア毒素、(診断及び予後の実施態様において好都合な)ラテックス粒子及び(診断及び予後の実施態様においても好都合な)磁性粒子、ポリリシン構築物などのようなキャリア分子への結合は全て、本発明に従って用いられる可能性のあるキャリア分子である。
【００８２】
免疫原性キャリアは、キャリアタンパク質、例えば当該技術において好都合に用いられるもの(例えばジフテリア又は破傷風毒素、KLHなど)から好都合に選択されるが、ある集団のより大きな割合においてT-細胞免疫を誘導することができるより短いペプチド(T-ヘルパーエピトープ)を用いることも可能である。このようなT-ヘルパーエピトープについての詳細は、WO 00/20027 (参照により本明細書に組み込まれる)に見出すことができる - そこで論じられている全ての免疫学的キャリア及び「無差別」の(すなわち、普遍的な)T-ヘルパーエピトープは、本発明における免疫原性キャリアとして有用である。
【００８３】
ある実施態様において、キャリアは、ウイルス様粒子、すなわち感染性のないビリオンと共通の特性を有する粒子である。このようなウイルス様粒子は、化学的に提供されてもよいし(例えばJennings及びBachmann Ann Rev Pharmacol. Toxicol. 2009. 49:303-26 Immunodrugs: 慢性疾患のためのVLP-ベースの治療ワクチン)、又はクローニング技術を用いて融合タンパク質を生成してもよい(例えばPeabodyら. J. Mol. Biol. 2008; 380: 252-63. RNAファージMS2のウイルス様粒子に対する多様なペプチドの免疫原性ディスプレイ)。別の例は、元々Immune ResponseCorporationによって製造されたHIVワクチンである「リミューン」であり、これは、ウイルスゲノムを破壊するために放射線照射されているホルマリン不活性化HIVからなる。この会社は、現在広く用いられている殺傷ポリオワクチンを生成するために同一の技術を用いていたJonas Salkによって興された。しかしながら、HIV固定時に、ビリオン表面にgp41だけを残してgp120は脱落した。このことは、C5とリミューン粒子のgp41との結合を得ることがなお可能であるはずであるから、本明細書に開示されるC5-由来ペプチドとリミューン粒子を直接混合することついての可能性を開く。
【００８４】
ペプチド多量体に関する側面の実施態様は、第１のペプチドが、配列番号1, 2, 3, 4及び5若しくはそのフラグメント又は配列番号1, 2, 3, 4及び5から選択されるペプチド若しくはそのフラグメントから選択されるインベルソ-, レトロ-又はレトロ-インベルソ型からなる群より選択され、第２のペプチドが、配列番号6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13若しくは46若しくはそのフラグメント又は配列番号6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13若しくは46から選択されるペプチド若しくはそのフラグメントのインベルソ-, レトロ-又はレトロ-インベルソ型から選択されるものも含む。上述のとおり、このような場合において、フラグメントは、ペプチド多量体がC5とgp41及び/又はC2との会合を安定化する抗体を誘導する能力を提供する限り、非常に短くてもよい。多くの興味深い本発明のペプチド多量体が実施例の前置きに列挙されている。
【００８５】
１つの実施態様において、本発明に従って用いられるペプチド多量体は、最大70アミノ酸、例えば最大69, 最大68, 最大67, 最大66, 最大65, 最大64, 最大63, 最大62, 最大61, 最大60, 最大59, 最大58, 最大57, 最大56, 最大55, 最大54, 最大53, 最大52, 最大51, 最大50, 最大49, 最大48, 最大47, 最大46, 最大45, 最大44, 最大43, 最大42, 最大41, 最大40, 最大39, 最大38, 最大37, 最大36, 最大35, 最大34, 最大33, 最大32, 最大31, 最大30, 最大29, 最大28, 最大27, 最大26, 最大25, 最大24, 最大23, 最大22, 最大21, 最大20, 最大19, 最大18, 最大17, 最大16, 最大15, 最大14, 最大13, 最大12, 最大11, 最大10, 最大9, 最大8及び最大7アミノ酸を含む。
【００８６】
１つの実施態様において、本発明に従って用いられるペプチド多量体は、少なくとも6アミノ酸残基、例えば少なくとも7, 少なくとも8, 少なくとも9, 少なくとも10, 少なくとも11, 少なくとも12, 少なくとも13, 少なくとも14, 少なくとも15, 少なくとも16, 少なくとも17, 少なくとも18, 少なくとも19, 少なくとも20, 少なくとも21, 少なくとも22, 少なくとも23, 少なくとも24, 少なくとも25, 少なくとも26, 少なくとも27, 少なくとも28, 少なくとも29, 少なくとも30, 少なくとも31, 少なくとも32, 少なくとも33, 少なくとも34, 少なくとも35, 少なくとも36, 少なくとも37, 少なくとも38, 少なくとも39, 少なくとも40, 少なくとも41, 少なくとも42, 少なくとも43, 少なくとも44, 少なくとも45, 少なくとも46, 少なくとも47, 少なくとも48, 少なくとも49, 少なくとも50, 少なくとも51, 少なくとも52, 少なくとも53, 少なくとも54, 少なくとも55, 少なくとも56, 少なくとも57, 少なくとも58, 少なくとも59, 少なくとも60, 少なくとも61, 少なくとも62, 少なくとも63, 少なくとも64, 少なくとも65, 少なくとも66, 少なくとも67, 少なくとも68及び少なくとも69アミノ酸残基を含む。
【００８７】
１つの実施態様において、本発明に従って用いられるペプチド多量体は、6アミノ酸残基、7アミノ酸残基、8アミノ酸残基、9アミノ酸残基、10アミノ酸残基、11アミノ酸残基、12アミノ酸残基、13アミノ酸残基、14アミノ酸残基、15アミノ酸残基、16アミノ酸残基、17アミノ酸残基、18アミノ酸残基、19アミノ酸残基、20アミノ酸残基、21アミノ酸残基、22アミノ酸残基、23アミノ酸残基、24アミノ酸残基、25アミノ酸残基、26アミノ酸残基、27アミノ酸残基、28アミノ酸残基、29アミノ酸残基、30アミノ酸残基、31アミノ酸残基、32アミノ酸残基、33アミノ酸残基、34アミノ酸残基、35アミノ酸残基、36アミノ酸残基、37アミノ酸残基、38アミノ酸残基、39アミノ酸残基、40アミノ酸残基、41アミノ酸残基、42アミノ酸残基、43アミノ酸残基、44アミノ酸残基、45アミノ酸残基、46アミノ酸残基、47アミノ酸残基、48アミノ酸残基、49アミノ酸残基、50アミノ酸残基、51アミノ酸残基、52アミノ酸残基、53アミノ酸残基、54アミノ酸残基、55アミノ酸残基、56アミノ酸残基、57アミノ酸残基、58アミノ酸残基、59アミノ酸残基、60アミノ酸残基、61アミノ酸残基、62アミノ酸残基、63アミノ酸残基、64アミノ酸残基、65アミノ酸残基、66アミノ酸残基、67アミノ酸残基、68アミノ酸残基、69アミノ酸残基又は70アミノ酸残基からなる。
【００８８】
上記のペプチドは、医薬的に許容され得る希釈剤、ビヒクル及び/又は１又はそれより多い免疫学的アジュバントと任意に組み合わせて、本明細書に記載される組成物を含む免疫原性組成物(例えばワクチン組成物)として、本発明に従って用いられ得る。
【００８９】
免疫原性組成物の製剤化は、当該技術において標準的な成分、例えば免疫学的アジュバントの使用を含む。下記するこれらのアジュバントとは別に、免疫原性組成物は、当該技術において一般的に教示されるようにして製剤化される:
ペプチド配列を活性成分として含むワクチンの製剤化は、米国特許4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792;及び4,578,770 (全て参照により本明細書中に組み込まれる)に例示されるように、当該技術において一般に十分に理解されている。典型的には、このようなワクチンは、溶液又は懸濁液のいずれかである注入可能な物質として製造される; 注入前に液体に加えて溶液又は懸濁液とするのに適した固体として製造されてもよい。製剤は、乳化されていてもよい。活性な免疫原性成分は、活性成分と混合可能な医薬的に許容され得る賦形剤としばしば混合される。適切な賦形剤は、例えば水, 食塩水, デキストロース, グリセロール, エタノールなど及びそれらの組合せである。加えて、所望により、ワクチンは、少量の副次的物質、例えば湿潤剤若しくは乳化剤、pH緩衝剤又はワクチンの効果を増強するアジュバント(アジュバントの詳細は下記を参照されたい)を含んでいてもよい。
【００９０】
ワクチンは、従来、注入によって非経口的に、例えば皮下、皮内又は筋肉内に投与される。その他の投与形態に適した別の製剤は、坐剤及びいくつかの場合において、経口, バッカル, 舌下, 腹腔内, 膣内, 肛門, 硬膜外, 髄腔内及び頭蓋内用の製剤を含む。坐剤は、伝統的なバインダ及びキャリア、例えばポリアルカレングリコール又はトリグリセリドを含んでいてもよい; このような坐剤は、0.5％〜10％、好ましくは1〜2％の範囲の活性成分を含む混合物から製剤化されてもよい。経口製剤は、このような通常用いられる賦形剤、例えばマンニトール, ラクトース, デンプン, ステアリン酸マグネシウム, サッカリン酸ナトリウム, セルロース, 炭酸マグネシウムなどの医薬グレードを含む。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸薬、カプセル剤、放出持続性製剤又は散剤であり、10〜95％、好ましくは25〜70％の活性成分を含む。
【００９１】
ペプチド及びペプチド多量体は、天然の形態又は塩の形態としてワクチンに製剤化されてもよい。医薬的に許容され得る塩は、(ペプチドの遊離アミノ基と形成される)酸付加塩(これは無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸又は有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸, マンデリン酸などと形成される)を含む。遊離カルボキシル基と形成された塩は、無機塩、例えばナトリウム, カリウム, アンモニウム, カルシウム又は水酸化鉄及び有機塩、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール, ヒスチジン, プロカイン等に由来していてもよい。
【００９２】
ワクチンは、投与される製剤と混合可能な様式で投与され、このような量は治療上効果的かつ免疫原性である。投与量は、例えば個体の免疫系が免疫応答を増大する能力及び所望の免疫の程度を含めて、治療対象に依存する。適切な投与量の範囲は、ワクチン接種につき数百マイクログラムの活性成分のオーダー、好ましくは約0.1μg〜2,000μgの範囲(より多量な1〜10 mgの範囲でさえも考慮される)、例えば約0.5μg〜1,000μgの範囲、好ましくは1μg〜500μgの範囲、とりわけ約10μg〜100μgの範囲である。初回投与及びブースタ投与の適切なレジメンは変化し得るが、初回投与後の予防接種又はその他の投与が典型的である。
【００９３】
いくつかのペプチド及びペプチド多量体は、ワクチン中で十分に免疫原性であるが、その他のいくつかについて、免疫応答は、ワクチンがアジュバント物質を更に含む場合に増強される。したがって、本明細書に記載される免疫原性分子は、アジュバントと共に製剤化することができる:
【００９４】
組み合わせられるアジュバントは、液性応答を誘導することが公知であり、i) 塩の懸濁液(例えばアルミニウムイオン又はカルシウムイオンを含む多様な塩), ii) 水中油型エマルジョン(例えばスクアランベース又はスクアレンベースの多様なエマルジョン), iii) 油中水滴型エマルジョン(例えばモンタニドISA51又はISA720), iv) 中性リポソーム, v) カチオン性リポソーム, vi) ミクロスフェア, vii) 免疫刺激性複合体(例えばISCOM又はISCOMATRIX), viii) パターン認識受容体作動薬 (例えばC-型レクチン受容体(CLR), NOD-様受容体(NLR), RIG-様ヘリカーゼ(RLH), 骨髄性細胞で発現される惹起性受容体(TREM)及びToll-様受容体(TLR)の作動薬), ix) サポニン(すなわち、キラジャ  サポナリア(Quillaja saponaria)又はプラチコドン  グランディフロラム(Platycodon grandiflorum)に由来するサポニン), x) ビロソーム/ウイルス様粒子(例えば), xi) エンテロトキシン(すなわちコレラ毒素、CTA1-DD又は大腸菌(Esherichia coli) 易熱性エンテロトキシン)及びそれらの組合せを含む。
【００９５】
その他の適切なアジュバントは、応答-選択的C5a作動薬、例えばHung CYらに記載されるEP54及びEP67を含む。ヒト補体フラグメントC5a作動薬は、コクシジオイデス(Coccidioides)感染に対するワクチン免疫を増強する(Vaccine (2012)及びKollessery Gら)。コンホメーションが偏った応答-選択的C5a作動薬であるEP54及びEP67を含む腫瘍-特異的ペプチドベースのワクチンは、同系マウスモデルにおいて、攻撃的な大きなB細胞リンパ腫を防御する(Vaccine(2011) 29: 5904-10)。
【００９６】
よって、ワクチンについてアジュバント効果を得る様々な方法が公知である。原理及び方法は、「アジュバントの理論及び応用(The Theory and Practical Application of Adjuvants)」, 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (編集), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6、及び「ワクチン：次世代の免疫アジュバント(Vaccines: New Generationn Immunological Adjuvants)」, 1995, Gregoriadis Gら (編集), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9 (いずれも参照により本明細書中に組み込まれる)に詳説されているが、多数のより新しい刊行物もまた、アジュバントを組み込む技術に取り組んでいる: Roestenberg Mら, PLoS One. 2008;3(12):e3960. Epub 2008 Dec 18; Relyveld E及びChermann JC, Biomed Pharmacother. 1994;48(2):79-83; Hsu FJら, Blood. 1997 May 1;89(9):3129-35; Galli Gら, Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 May 12;106(19):7962-7. Epub 2009 Apr 27; Bojang KAら, Lancet. 2001 Dec 8;358(9297):1927-34; Odunsi Kら, Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Jul 31;104(31):12837-42. Epub 2007 Jul 25; Patel GB and Sprott GD; Crit Rev Biotechnol. 1999;19(4):317-57. レビュー; Agger EMら, PLoS One. 2008 Sep 8;3(9):e3116; Kirby DJら J Drug Target. 2008 May;16(4):282-93; Florindo HFら, Vaccine. 2008 Aug 5;26(33):4168-77. Epub 2008 Jun 17; Sun HXら, Vaccine. 2009 May 28; Guy B, Nat Rev Microbiol. 2007 Jul;5(7):505-17. レビュー; Vandepapeliere Pら, Vaccine. 2008 Mar 4;26(10):1375-86. Epub 2008 Jan 14; Ghochikyan Aら、Vaccine. 2006 Mar 20;24(13):2275-82. Epub 2005 Dec 5; Xie Yら, Vaccine. 2008 Jun 25;26(27-28):3452-60. Epub 2008 May 1; Chung YCら, Vaccine. 2008 Mar 28;26(15):1855-62. Epub 2008 Feb 25; Maier Mら, Vaccine. 2005 Oct 25;23(44):5149-59; Sundling Cら, J Gen Virol. 2008 Dec;89(Pt 12):2954-64。
【００９７】
形質転換細胞によって本発明に従って用いられるペプチドを組換えにより製造するとき、必須であるというには程遠いが、発現産物を培養培地中にエクスポートするか又は形質転換細胞の表面に担持するかのいずれかが便利である。
【００９８】
有効な産生細胞が同定されているとき、それに基づいて、本発明に従って用いられるベクターを保有し、本発明に従って用いられる核酸フラグメントを発現する安定な細胞株を樹立することが好ましい。好ましくは、この安定な細胞株は、ペプチド発現産物を分泌又は担持し、それによってその精製を促進する。
【００９９】
一般に、宿主細胞と相性の良い種に由来するレプリコン及びコントロール配列を含むプラスミドベクターが、宿主との関係において用いられる。ベクターは、通常、複製部位及び形質転換細胞における表現型の選択を可能とするマーカー配列を保有する。例えば、大腸菌(E. coli)は、典型的には、ある大腸菌の種に由来するプラスミドであるpBR322を用いて形質転換される(例えばBolivarら, 1977を参照されたい)。pBR322プラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、よって、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。pBRプラスミド若しくはその他の微生物のプラスミド又はファージもまた、原核微生物による発現のために用いることができるプロモータを含むか、又はそれを含むように改変されていなければならない。
【０１００】
組換えDNA構築物において最も共通して用いられるこれらのプロモータは、β-ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)及びラクトースプロモータ系(Changら, 1978; Itakuraら, 1977; Goeddelら, 1979)及びトリプトファン(trp)プロモータ系(Goeddelら, 1979; EP-A-0 036 776)を含む。これらが最も共通して用いられる一方、その他の微生物のプロモータが発見及び利用されており、これらのヌクレオチド配列に関する詳細が公開されている。
【０１０１】
原核生物に加えて、真核微生物、例えば酵母培養物が用いられてもよく、この場合においても、プロモータは、発現を駆動することができなければならない。多くのその他の株が一般に利用可能であるが、サッカロマイセス  セレビシエ(Saccharomyces cerevisiase)又は一般的なパン酵母が真核微生物の中でも最も共通して用いられる。サッカロマイセスにおける発現のために、例えばプラスミドYRp7が共通して用いられる(Stinchcombら, 1979; Kingsmanら, 1979; Tschemperら, 1980)。
【０１０２】
酵母ベクターにおける適切なプロモータ配列は、3-ホスホグリセレートキナーゼ(Hitzmanら, 1980)又はその他の糖分解酵素(Hessら, 1968; Hollandら, 1978)、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼのプロモータを含む。適切な発現プラスミドを構築するにあたって、これらの遺伝子に関連付けられるターミネータ配列も、mRNAのポリアデニル化及び終結のために、発現ベクター中に、発現させたい配列の3’に組み込まれる。
【０１０３】
転写が成長条件によって制御されるという更なる利点を有するその他のプロモータは、アルコールデヒドロゲナーゼ2, イソシトクロムC, 酸性ホスファターゼ, 窒素代謝に関連付けられる分解酵素及び上記のグリセルアルデヒド-3-ホスファターゼデヒドロゲナーゼ、並びにマルトース及びガラクトース資化を担う酵素のプロモータ領域である。酵母と相性の良いプロモータ、複製起点及びターミネータ配列を含むプラスミドベクターが好適である。
【０１０４】
微生物に加えて、多細胞生物に由来する細胞の培養物を宿主として用いてもよい。原則的に、脊椎動物又は無脊椎動物の培養物からのこのような細胞培養物が機能し得る。このような有用な宿主細胞株の例は、VERO及びHeLa細胞, チャイニーズハムスター子宮(CHO)細胞株及びW138, BHK, COS-7 293, スポドプテラ  フルギペルダ(Spodoptera frugiperda: SF)細胞, ドロソフィラ  メラノガスター(Drosophila melanogaster)細胞株(例えばシュナイダー2 (S2))及びMDCK細胞株である。
【０１０５】
このような細胞の発現ベクターは、通常、(必要な場合には)複製起点、発現される遺伝子の前に位置するプロモータを、必要なリボソーム結合部位、RNAスプライシング部位、ポリアデニル化部位及び転写ターミネータ配列と共に含む。
【０１０６】
哺乳類細胞の使用について、発現ベクターの制御機能は、ウイルス性の物質によってしばしば提供される。例えば、共通に用いられるプロモータは、ポリオーマ、アデノウイルス2、及び最も頻繁にはサルウイルス40 (SV40)に由来する。SV40ウイルスの前期及び後期プロモータが、いずれもSV40ウイルスの複製起点も含むフラグメントとしてウイルスから容易に得られるので、特に有用である(Fiersら, 1978)。HindIII部位からウイルスの複製起点に位置するBglI部位に向かうおよそ250 bpの延長配列を含むことを前提として、より小さいか又はより大きいSV40フラグメントが用いられてもよい。さらに、所望の遺伝子配列に通常関連付けられるプロモータ又は制御配列を利用することもまた、このような制御配列が宿主細胞系と相性が良いことを条件として、可能であり、しばしば望ましい。
【０１０７】
複製起点は、外来の起点(例えばSV40又はその他のウイルス(例えば、その他のポリオーマウイルス, アデノウイルス, VSV, BPV)に由来し得る)を含むベクターの構築によって提供されてもよいし、又は宿主細胞の染色体複製機構によって提供されてもよい。ベクターが宿主細胞の染色体に組み込まれる場合、しばしば後者で充分である。
【０１０８】
上記で詳説したポリペプチドベースワクチンの投与経路及び投与スキームについて、これらは本発明の核酸ワクチンにも適用することができ、ポリペプチドの投与経路及び投与スキームに関連する上記の全ての議論が核酸に変更すべきところは変更して当てはまる。これに加えて、核酸ワクチンは静脈内及び動脈内にも投与することができるとすべきである。さらに、いわゆる遺伝子銃の使用及び/又はエレクトロポレーションの使用によって核酸ワクチンを投与することができることが当該技術において周知であり、それゆえ、これらの投与形態及び等価な投与形態が本発明の一部とみなされる。
【０１０９】
通常条件下において、核酸フラグメントは、ウイルスプロモータの制御下で発現するベクターの形態で導入される。本発明に従って用いられるベクターのより詳細な議論については、上記を参照されたい。また、核酸ワクチンの製剤化及び使用に関する詳細な開示については、Donnelly JJら, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648及びDonnelly JJら, 1997, Life Sciences 60: 163-172 (いずれの文献も参照により本明細書中に組み込まれる)を参照する。
【０１１０】
ペプチド免疫原又は核酸免疫原の使用の代替は、生免疫原技術の使用である。これは、本発明の核酸フラグメント又はベクターを用いて形質転換されている非病原性の微生物を投与することを伴う。非病原性の微生物は、(継代又は組換えDNA技術による病原性発現産物の除去によって減弱された)適切な減弱細菌株、例えばマイコバクテリウム  ボビス(Mycobacterium bovis) BCG., 非病原性のストレプトコッカス種(Streptococcus spp.), 大腸菌、サルモネラ種(Salmonella spp.), ビブリオ  コレラ(Vibrio cholerae)、シゲラ(Shigella)等であり得る。当該技術において標準的な生ワクチンの製造に関するレビューは、例えばSaliou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496及びWalker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990 (いずれも参照により本明細書中に組み込まれる)に見出すことができる。このような生ワクチンにおいて用いられる核酸フラグメント及びベクターの詳細については、下記の議論を参照されたい。
【０１１１】
細菌性生免疫原の代替としては、本発明に従って用いられる核酸フラグメントが、良性ウイルスワクチンベクター、例えばワクチニア株又はその他の適切なポックスウイルスに組み込まれ得る。
【０１１２】
通常、非病原性の微生物又はウイルスは、対象に１回だけ投与されるが、特定の場合において、保護的免疫を維持するために、寿命において１回以上微生物/ウイルスを投与することが必要であり得る。ポリペプチドワクチン接種について上記で詳説されるような免疫付与スキームが生又はウイルスワクチンを用いるときに有用であることでさえ考慮される。
【０１１３】
あるいは、生又はウイルス免疫付与は、以前の又はその後のポリペプチド及び/又は核酸免疫付与と組み合わせられる。例えば、生又はウイルスワクチンを用いる初回免疫付与後のポリペプチド又は核酸アプローチを用いるブースタ免疫付与が可能である。
【０１１４】
実施例の前置き
配列及び略称の概略:
C5-配列:
APTKAKRRVVQREKRAV (配列番号1)      
APTKAKRRVVEREKRAV(配列番号2)     
APTRAKRRVVQREKRAV(配列番号3)     
APTRAKRRVVEREKRAV(配列番号4)     
APTEAKRRVVEREKRAV(配列番号5)     
WWGCAKRRVCGGAKRRVVQREKRA (配列番号44)
(配列番号44の下線を付したアミノ酸残基は、ジスルフィドリンカーによって結合している; N-末端のWは、好ましくはD-アミノ酸であり、C-末端のAは、アミド化されてもよい; ペプチドは、これら２つの改変を有するとき、BI450-AdjBT_1と称される)。
【０１１５】
C5-複合体形成配列:
DRPEGIEEEGGERDR (ここで、アミノ酸4はGであり得、及び/又はアミノ酸5はRであり得、及び/又はアミノ酸13はQであり得、及び/又はアミノ酸14はGであり得、及び/又はアミノ酸15はKであり得る; 配列番号6); 
DRPEGIENNGGERDR (配列番号7、ここで、アミノ酸4はGであり得、及び/又はアミノ酸5はRであり得、及び/又はアミノ酸13はQであり得、及び/又はアミノ酸14はGであり得、及び/又はアミノ酸15はKであり得る); 
DRPEGIENNGGERDRDR (ここで、アミノ酸4はGであり得、及び/又はアミノ酸5はRであり得、及び/又はアミノ酸13はQであり得、及び/又はアミノ酸14はGであり得、及び/又はアミノ酸15はKであり得、及び/又はアミノ酸16はGであり得る); 配列番号46)。
【０１１６】
VERYLKDQQLLG (配列番号8); 
VERYLKDEELLG (配列番号9); 
VERYLKDNNLLG (配列番号10);
QLLLNGSLAEEEIVI (配列番号11)
QLLLNGSLAEEEVVIV (配列番号12)
QLLLNSLAEEEVVI (配列番号13)
GGAIVNGSLADDDIVI (配列番号37、本明細書中で204dとも称される)
WWGCIEEEGCGGIEEEGGERDR (配列番号45: 下線を付したアミノ酸残基は、ジスルフィドリンカーによって結合している; N-末端のWは、好ましくはD-アミノ酸であり、C-末端のRは、アミド化されていてもよい; ペプチドは、これら２つの改変を有するとき、BI450-AdjBT_2と称される)。
【０１１７】
ポリペプチドI:
(Z-SEQ c5-Z-SEQc5)n
n=1,2,3,4
【０１１８】
ポリペプチドII:
(Z-SEQ cx-Z-SEQcx)n
n=1,2,3,4
【０１１９】
ペプチド複合体:
【化１】
2015520179.tif 000002
【０１２０】
【化２】
2015520179.tif 000003
【０１２１】
ポリペプチドIの例は、限定されないが、以下の配列であり得る:
APTKAKRGGGAPTRAKRGGGAPTEAKR (配列番号14)
RVVEREKGGGAKRRVVGGGRVVQREK (配列番号15)
GGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAV (配列番号16)
CGGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAV (配列番号17)
GGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKR (配列番号18)
CGGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKR (配列番号19)
GGAKRRVVGGAKRRVV (配列番号20)
GCGAKRRVVGGAKRRVV (配列番号21)
【０１２２】
ポリペプチドIIの例は、限定されないが、以下の配列であり得る: 
GGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRDR (配列番号22)
CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRDR (配列番号23)
GGDQQLLGGAEEEIVGGGERDR (配列番号24)
CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGG (配列番号25)
GGAEEEVVGGDQQLL (配列番号26)
CGGAEEEVVGGDQQLL (配列番号27)
【０１２３】
ジスルフィド結合した構築物の例は、限定されないが、以下の結合したペプチド配列であり得る:
【化３】
2015520179.tif 000004
【化４】
2015520179.tif 000005
【化５】
2015520179.tif 000006
【０１２４】
上記のジスルフィド結合した構築物は、例えば、チオール非保護ペプチドを用いる2-ピリジンスルフェニル(SPyr)-保護システイン-含有ペプチドの滴定によって合成され得る。これは、ジスルフィド結合したペプチドのヘテロ二量体を選択的に生成し、ホモ二量体の形成を妨げる点でより優れた手順であることが証明されている(Schutz Aら, Tetrahedron, Volume 56, Issue 24, 9 June 2000, Pages 3889-3891)。配列番号28が配列番号31若しくは33とジスルフィド結合しているか、配列番号30が配列番号29若しくは33とジスルフィド結合しているか、配列番号32が配列番号29若しくは31とジスルフィド結合している類似の構築物もまた、本発明の範囲内である。
【０１２５】
その他の結合した構築物の例は、限定されないが、以下の結合したペプチド配列(すべてBachem (UK) Ltdから得られたものである)であり得る:
【化６】
2015520179.tif 000007
(ペプチドは、下線を付したCys及びLys残基を介して結合している; 構築物全体を本明細書中でBI400-Bと称する)。
【０１２６】
【化７】
2015520179.tif 000008
(ペプチドは、下線を付したCys及びLys残基を介して結合している; 構築物全体を本明細書中でBI400-Bu1と称する)。
【０１２７】
【化８】
2015520179.tif 000009
(ペプチドは、下線を付したCys及びLys残基を介して結合している; 構築物全体を本明細書中でBI400-Bu2と称する)。
【０１２８】
【化９】
2015520179.tif 000010
(ペプチドは、下線を付したCys及びLys残基を介して結合している; 構築物全体を本明細書中でBI400-Bu3と称する)。
【０１２９】
Cys-Lysリンカーは、典型的には、一方のペプチドにおける(2-オキソ-エチル)誘導体化システインと他方のペプチドにおけるリシンとのアミド結合という形で成立する。
配列番号38が配列番号42, 43, 68とCys-Lys結合しているか、又は配列番号41が配列番号39若しくは40とCys-Lys結合している類似の構築物もまた、本発明の範囲内である。
【０１３０】
低分子阻害剤:
DQQLL (配列番号34)
AKRRVV (配列番号35)
AEEEVV (配列番号36)
配列番号34〜36は、好ましくは、部分的に又は完全にD-アミノ酸から構成される。
【０１３１】
HIV gp120のC5ドメインと、gp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとの会合を安定化する抗体を誘導する１つの好ましい免疫原は、以下の構造の化合物である: 
【化１０】
2015520179.tif 000011
【０１３２】
この化合物は:
【化１１】
2015520179.tif 000012
と記載されてもよい。
【０１３３】
この好ましいC5化合物は、31アミノ酸(A-鎖)及び22アミノ酸(B-鎖)を有する２つの直鎖状ペプチドのアミド鎖からなる。各鎖は、N-末端に遊離アミノ基及びC-末端にアミド基を有する。鎖は、A-鎖のCys(2-オキソ-エチル)10とB-鎖のLys2とのアミド結合を介して共有結合している。アキラルなGlyを除く全てのアミノ酸残基は、L-体である。
【化１２】
2015520179.tif 000013
【０１３４】
好ましいC5化合物(実施例においてVacc-C5とも称される)は、酢酸塩として提供されてもよい。カウンターイオンである酢酸塩は、ペプチド分子の塩基性の基にイオン結合する。
【０１３５】
免疫調節化合物
本明細書で用いられるように、及びそうでないと記載しない限り、用語「免疫調節化合物」は、LPSによって誘導される単球TNF-a, IL-1B, IL-12, IL-6, MIP-la, MCP-1, GM-CSF, G-CSF及び/又はCOX-2の産生を阻害する特定の有機低分子、COX-2阻害剤及びエトリコキシブを包含する。その他の免疫調節化合物は、ウイルス増殖抑制剤であるVS411 (ジダノシン + ヒドロキシウレア)を含む。具体的な免疫調節化合物については、本明細書の他の部分に記載する。
【０１３６】
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられる免疫調節化合物は、T細胞の共刺激因子であり、細胞増殖を用量依存的に劇的に増大する。１つの実施態様において、本明細書で提供される免疫調節化合物は、CD4+ T細胞サブセットに対してよりもCD8+ T細胞サブセットに対して大きな共刺激効果を有し得る。１つの実施態様において、骨髄性細胞応答に対する抗炎症性を有する化合物は、なお効果的にT細胞を共刺激し、より多量のIL-2, IFN-γを産生し、T細胞増殖及びCD8+ T細胞の細胞毒性作用を増強する。１つの実施態様において、特定の理論によって限定されないが、本明細書で提供される免疫調節化合物は、サイトカイン活性化を介して非直接的に及びナチュラルキラー(「NK」)細胞及びナチュラルキラーT (「NKT」)細胞に直接的にの両方で作用することができ、NK細胞の能力を増大し、限定されないがIFN-γのような有益なサイトカインを産生及びNK及びNKT細胞の細胞毒性活性を増強することができる。
【０１３７】
１つの実施態様において、免疫調節化合物の具体例は、限定されないが、置換されたスチレンのシアノ及びカルボキシ誘導体、例えばUS 5929117に開示されるもの; 1-オキソ-2-(2,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3イル)イソインドリン及び1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3-イル)イソインドリン、例えばUS 5874448及びUS 5955476に記載されるもの; US 5798368に記載されるテトラ置換された2-(2,6-ジオキソピペリジン(piperdin)-3-イル)-1-オキソイソインドリン; 1-オキソ及び1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)イソインドリン (例えばタリドミドの4-メチル誘導体), 置換された2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)フタルイミド及び限定されないがUS 5635517, US 6281230, US 6316471, US 6403613, US 6476052及びUS 6555554に開示されるものを含む置換された2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-1-オキソイソインドール; インドリン環の4-又は5-位において置換された1-オキソ及び1,3-ジオキソイソインドリン (例えばUS 6380239に記載される4-(4-アミノ-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)-4-カルバモイルブタン酸); 2-位において2,6-ジオキソ-3-ヒドロキシピペリジン-5-イルで置換されたイソインドリン-1-オン及びイソインドリン-1,3-ジオン (例えばUS 6458810に記載される2-(2,6-ジオキソ-3-ヒドロキシ-5-フルオロピペリジン-5-イル)-4-アミノイソインドリン-1-オン); US 5698579及びUS 5877200に開示される非-ポリペプチド環状アミドのクラス; 及びイソインドール-イミド化合物、例えば2003年3月6日に公開された米国特許公開番号2003/0045552、2003年5月22日に公開された米国特許公開番号2003/0096841、WO2007028047、WO2002094180及びWO 02/059106に記載されるもの)を含む。ここで特定された各特許及び各特許出願の全体が参照により本明細書中に組み込まれる。１つの実施態様において、免疫調節化合物は、タリドミドを含まない。
【０１３８】
１つの実施態様において、本明細書で提供される免疫調節化合物は、限定されないが、US 5635517 (参照により本明細書中に組み込まれる)に記載されるような、ベンゾ環(benzo ring)中のアミノで置換された1-オキソ-及び1,3 ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)イソインドリンを含む。
【０１３９】
１つの実施態様において、本明細書で提供されるその他の具体的な免疫調節化合物は、置換された2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)フタルイミド及び置換された2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-1-オキソイソインドールのクラス、例えばUS 6281230; US 6316471; US 6335349; US 6476052及びWO 98/03502に記載されるもの(これら各々が参照により本明細書中に組み込まれる)に属する。
【０１４０】
１つの実施態様において、本明細書で提供されるその他の具体的な免疫調節化合物は、米国特許出願公開番号US 2003/0096841及びUS 2003/0045552、及びWO 02/059106 (これら各々が参照により本明細書に組み込まれる)に開示されるイソインドール-イミドのクラスに属する。
【０１４１】
１つの実施態様において、本明細書で提供されるその他の具体的な免疫調節化合物は、米国特許出願公開番号US 2002/0045643及びWO 98/54170、及び米国特許番号6,395,754 (これら各々が参照により本明細書中に組み込まれる)に開示されるイソインドール-イミドのクラスに属する。
【０１４２】
１つの実施態様において、本明細書で提供されるその他の具体的な免疫調節化合物は、限定されないが、1-オキソ-2-(2,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3イル)イソインドリン及び1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3-イル)イソインドリン、例えばUS 5874448及びUS 5955476 (これら各々が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるものを含む。
【０１４３】
１つの実施態様において、本明細書で提供されるその他の具体的な免疫調節化合物は、限定されないが、US 5798368 (参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるテトラ置換された2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-1-オキソイソインドリンを含む。
【０１４４】
１つの実施態様において、本明細書で提供されるその他の具体的な免疫調節化合物は、限定されないが、US 6403613 (参照により本明細書に組み込まれる)に開示される1-オキソ及び1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)イソインドリンを含む。
【０１４５】
１つの実施態様において、本明細書で提供されるその他の具体的な免疫調節化合物は、限定されないが、US 6380239及び2004年7月28日に提出された米国出願番号10/900,270 (参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるインドリン環の4-又は5-位において置換された1-オキソ及び1,3-ジオキソイソインドリンを含む。
【０１４６】
１つの実施態様において、本明細書で提供されるその他の具体的な免疫調節化合物は、限定されないが、US 6458810 (参照により本明細書に組み込まれる)に記載される2-位において2,6-ジオキソ-3-ヒドロキシピペリジン-5-イルで置換されたイソインドリン-1-オン及びイソインドリン-1,3-ジオンを含む。
【０１４７】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤及びその他の保有宿主浄化剤
本明細書中で用いられるように、用語「ヒストンデアセチラーゼ阻害剤」、「HDACi」は、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物をいう。
それらの化学的構造に基づいて、HDACiは、４つの異なるクラスに更に分けられている(レビューとして、例えばDokmanovic & Marks, J. Cell. Biochem., 96, 293-304, 2005を参照されたい): 
- ヒドロキサム酸 (トリコスタチンA, ボリノスタット = SAHA) 
- 環状テトラペプチド (デプシペプチド) 
- 短鎖脂肪酸 (バルプロ酸, フェニルブチレート) 
- ベンズアミド (エンチノスタット)。
【０１４８】
これらの化合物は、一般に、クラスI、II及びIVのヒストンデアセチラーゼに対して(所定のHDACに対して多かれ少なかれ特異的な化合物に依存して)活性である。
HDACiによるヒストンデアセチラーゼの阻害は、超アセチル化ヌクレオソームコアヒストンの蓄積を誘導する。このクロマチンリモデリングは、生物学的プロセス、例えば細胞周期のアレスト、分化及び/又はアポトーシスによって癌細胞の増殖を阻害することができる遺伝子発現のモジュレーションをもたらす(レビューとして、例えばMarks & Xu, J. Cell. Biochem., 107, 600-608, 2009; Federico & Bagella, J. Biomed. Biotechnol, 2011:475641を参照されたい)。
【０１４９】
保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、限定されないが、例えばToll-様受容体-9 (TLR9)作動薬, ケルセチン, トリコスタチンA, リポ酸, ヒドロキサム酸, バルプロ酸, ナトリウムブチレート, ボリノスタット, ロミデプシン, TNF-α, PHA, Tat, インターフェロンガンマ(IFN-γ), CD154, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-7若しくはIL-7R作動薬, IL-9若しくはIL-9R作動薬, 5-ヒドロキシナフタレン-1,4-ジオン(5HN), 潜伏中のHIVの発現を制御するmiRNAに対して生じるsiRNA又はアンタゴmir (antagomir；抗-miRNAアンチセンス), 転写因子YY1及び/又はcMycを標的する短鎖ヘアピンRNA (shRNA), ケトシンのようなヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤, ヌクレオチドアナログメチル化阻害剤である5-アザシチジン, 5-アザ-2'-デオキシシチジン, 5-フルオロ-2'-デオキシシチジン及びゼブラリジンを含むDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤, 非-ヌクレオシドDNAメチル化阻害剤であるプロカイン, プロカインアミド, ヒドララジン及びRG108を含む。
【０１５０】
本発明に従う適切なヒストンデアセチラーゼ阻害剤(HDACi)は、限定されないが、M344 (4-(ジメチルアミノ)-N-[7-(ヒドロキシアミノ)-7-オキソヘプチル]ベンズアミド), キダミド(CS055/HBI-800), 4SC-202, (4SC), レスミノスタット (4SC), ヒドロキサム酸、例えばボリノスタット (SAHA), ベリノスタット (PXD101), LAQ824, トリコスタチンA及びパノビノスタット (LBH589); ベンズアミド、例えばエンチノスタット (MS-275), CI994, 及びモセチノスタット (MGCD0103), 環状テトラペプチド(例えばトラポキシン、例えばトラポキシンB)及びデプシペプチド、例えばロミデプシン(ISTODAX), 求電子性ケトン及び脂肪酸化合物、例えばフェニルブチレート, バルプロ酸, オキサムフラチン, ITF2357 (ジェネリックのジビノスタット), アピシジン, MC1293, CG05及びCG06を含む。
【０１５１】
その他の適切な保有宿主浄化剤は、限定されないが、WO2013050422, WO2012051492 A3及びBartonら, Clinical Pharmacology & Therapeutics (2013); 93 1, 46-561のいずれかに記載されるものを含み、限定されないが、PMA, プロストラチン, ブリオスタチン及びTNF-αを含む群より選択されるNF-カッパ-B-誘導因子、及び/又はb) TSA, SAHA, MS-275, アミノスベロイルヒドロキサム酸, M-カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサメート, LAQ-824, LBH-589, ベリノスタット (PXD-101 ), パノビノスタット (LBH-589), M-カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサメートの桂皮ヒドロキサム酸アナログ, IF2357, アリールオキシアルカン酸ヒドロキサミド, デプシペプチド, アピシジン, 環状ヒドロキサム酸-含有ペプチド分子群, FK-228, red FK, ヒドロキサム酸に脂肪鎖によって結合した環状ペプチドミミック, ブチレート, フェニルブチレート, ナトリウムブチレート, バルプロ酸, ピバロイルオキシメチルブチレート, 5 NOX-275及びMGCD0103を含む種々のファミリー(ヒドロキサメート, 環状ペプチド、脂肪酸及びベンズアミド)から選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む。
【０１５２】
上記のウイルス保有宿主浄化剤のいずれかは、単独で、又はその他の適切なウイルス保有宿主浄化剤のいずれか１つ、例えば別のクラスのHIV 誘導因子と併用してもよい。
【０１５３】
DNAメチル化は、おそらくは受動的なヒストン修飾と一緒になって、プロウイルスのサイレントな状態での「固定」にも寄与し、活性状態に戻ることを困難とし得る。これらの観察結果は、HDAC、HMT又はDNAメチル化阻害剤が、有効なcARTと一緒になって、宿主の免疫系によって耐え得るレベルにまで潜伏期の保有宿主のプールを低減/排除することを目的とする良好な抗-潜伏薬候補を構成することを示唆している。
【０１５４】
よって、適切な免疫調節化合物又は浄化剤は、5-アザシチジン (アザシチジン), シネフンギン, 5-アザ-2'-デオキシシチジン (5-アザ-CdR, デシタビン), 1-3-ダラビノフラノシル-5-アザシトシン(ファザラビン)及びジヒドロ-5-アゼシチジン(DHAC), 5-フルオロデオキシシチジン(FdC), 2-Hピリミジノンを含む二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド, ゼブラリン、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(ODN), MG98, (-)-エピガロカテキン-3-ガレート, ヒドララジン, プロカイン及びプロカインアミドを含む２つのクラス(非-ヌクレオシド及びヌクレオシド脱メチル化剤)から選択されるDNAメチル化阻害剤であってもよい。
【０１５５】
本発明に従って用いられるその他の適切な免疫調節化合物又は浄化剤は、TSA, SAHA, MS-275, アミノスベロイルヒドロキサム酸, M-カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサメート, LAQ-824, LBH-589, ベリノスタット (PXD-101 ), パノビノスタット (LBH-589), M-カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサメートの桂皮ヒドロキサム酸アナログ, IF2357, アリールオキシアルカン酸ヒドロキサミド, デプシペプチド, アピシジン, 環状ヒドロキサム酸-含有ペプチド分子群, FK-228, red FK, ヒドロキサム酸に脂肪鎖によって結合した環状ペプチドミミック, ブチレート, フェニルブチレート, ナトリウムブチレート, バルプロ酸, ピバロイルオキシメチルブチレート, 5 NOX-275及びMGCD0103を含む種々のファミリーのHDACI (ヒドロキサメート, 環状ペプチド, 脂肪酸及びベンズアミド)から選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む。
【０１５６】
本発明に従って用いられるその他の適切な免疫調節化合物又は浄化剤は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤(ケトシン及びBIX-01294); Enhances of Zeste 2 (EZH2)阻害剤 - 例えば単独で用いられるか又はその他のクラスの免疫調節化合物又は浄化剤と併用される3-デアザネプラノシンA (DZNep)を含む。
【０１５７】
本発明の方法において、(i)対象において細胞媒介性免疫応答を誘発する１又はそれより多いペプチド及び/又は(ii)対象において液性免疫を刺激する化合物;並びに(iii)保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤、及び/又は(iv)免疫調節化合物を含む成分の各々は、同時に、逐次的に又は別々に、任意の順序で投与され得る。
【０１５８】
よって、本発明は、成分(i)及び(ii)の少なくとも一方並びに成分(iii)及び(iv)の少なくとも一方を、任意に１又はそれより多い医薬的に許容され得るアジュバント、希釈剤又はキャリアと組み合わせて含む医薬組成物を提供する。
【０１５９】
類似して、本発明は、任意に各成分が医薬的に許容され得るアジュバント、希釈剤又はキャリアと混合されて製剤化されている成分(i)及び(ii)の少なくとも一方並びに成分(iii)及び(iv)の少なくとも一方を含む組合せ製品も提供する。本発明のこの側面において、組合せ製品は、単一の(組合せの)医薬製剤又はキットのいずれかであり得る。キットにおいて、いくつか又は全ての成分は、別々に製剤化されていてもよく、それぞれがその他と併せて投与するのに適切な剤形で提供されてもよい。
【０１６０】
成分は、上記のような１又はそれより多い更なる成分と併せて使用するために、例えば使用説明書と共に提供されてもよい。
【０１６１】
治療用量のHDACi、例えばウイルスワクチンの免疫効果を増強するのに十分な量が、本発明の方法において哺乳動物に投与される。HDACiは、例えば経口, 皮下, 静脈内, 腹腔内, 鼻内, 腸内, 局所, 舌下, 筋肉内, 動脈内, 髄内, 髄腔内, 吸入, 眼内, 経皮, 膣内又は直腸内の手段を含む適切な投与方法を用いて投与され得る。
【０１６２】
その他の適切な保有宿主浄化剤は、限定されないが、NF-カッパB, プロストラチン, オーラノフィン, ブリオスタチン, 非腫瘍形成性フォルボールエステル, DPP (12-デオキシフォルボール-13-フェニルアセテート), PMA及びフォルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)を含む転写因子を活性化する化合物; P-TEF-bキナーゼ及びヘキサメチルビスアセタミド (HMBA)を含むHIV mRNA伸長を活性化する化合物; 抗-CD3/CD28を含むT-細胞刺激因子 - T-細胞刺激性Ab; チルフォスチンA, チルフォスチンB及びチルフォスチンCを含むキナーゼ阻害剤; TLR-7作動薬; SF1670 (Echelon Bioscience)を含むPTEN (ホスファターゼ及びテンシンホモログ)遺伝子阻害剤, ジスルフィラム(DSF), アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤, bpV(HOpic), bpV(phen)及びbpV(pic) (Calbiochem; EMD Millipore)を含むプロテインチロシンホスファターゼ阻害剤を含む。
【０１６３】
HIVを標的するペプチドで刺激されたT-細胞によって、HIV-1に潜在的に感染した細胞の活性化及び排除は、Shanら(Immunity, 2012, Vol. 36, Issue 3, pp. 491-501)に記載される方法によって研究することができる。この研究において、著者らは、Yangら(J Clin Invest. 2009, 119 (11):3473-3486)に記載される潜在HIV-1感染モデルを生成する方法を用いている。その他のウイルス潜伏モデルが存在し、類似の様式で用いられ得る(Salehら. Blood 2007; 110:4161-4. Salehら. Retrovirology 2011; 8:80.)。さらに、Shanらは、HDAC阻害剤であるSAHAを用いて、潜在感染細胞を活性化するが、原則的に、この方法は、類似の様式で潜伏中のHIV-1のその他のアクチベータを研究するために用いられ得る。簡潔には: 初代CD4+及びCD8+ T-細胞の単離のための末梢血がHIV-1-感染ドナー及び健常成人ボランティアから得られ、Bcl-2形質導入及びその後の(GFPを発現する)HIV-1レポーターウイルス感染に用いられた(Yangら, 2009, J Clin Invest., 119 (11):3473-3486)。CD8+ T-細胞は、単離され、任意にHIV-1特異的ペプチドで刺激され、インビトロで感染した自家CD4+ T-細胞と共培養された。残りのGFP+ CD4+ T-細胞の画分は、FACSによって測定された。この手順は、CD8+ CTL媒介性の活性化CD4+ T-細胞殺傷を実証した。
【０１６４】
本発明の具体的な実施態様
上記のとおり、本発明の１つの側面は、
ａ）対象において液性免疫を刺激する化合物及び/又は対象において細胞媒介性免疫応答を誘発する１又はそれより多いペプチドを; 
ｂ）免疫調節化合物及び/又は保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤と組み合わせて
含む組成物に関する。
【０１６５】
いくつかの実施態様において、本発明による組成物は、対象において細胞媒介性免疫応答を誘発する１又はそれより多いペプチドを含む。
いくつかの実施態様において、本発明による組成物は、対象において液性免疫を刺激する化合物を含む。いくつかの実施態様において、この化合物は、対象において液性免疫を刺激し、HIV gp120のC5ドメインと、gp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとの会合を安定化することができる物質である。いくつかの実施態様において、この化合物は、対象において液性免疫を刺激し、HIV gp120のC5ドメインと、gp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとの会合を安定化する抗体を誘導する免疫原である。いくつかの実施態様において、この対象において液性免疫を刺激する化合物は、国際特許出願WO2011/000962, WO0052040, WO 2012/092934又はWO 2012/072088 (これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる)のいずれか１つに記載されるペプチドである。
【０１６６】
いくつかの実施態様において、本発明に従う組成物は、免疫調節化合物を含む。
いくつかの実施態様において、本発明に従う組成物は、保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を含む。
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられる免疫調節化合物は、抗-PD1 抗体、例えばMDX-1106 (Merck), THALOMID (登録商標)(タリドミド), 抗-PD1 抗体, シクロホスファミド, レバミゾール, レナリドミド, CC-4047 (ポマリドミド), CC-11006 (Celgene)及びCC-10015 (Celgene)及びWO2007028047, WO2002059106及びWO2002094180のいずれか１つに記載される免疫調節化合物から選択される。
【０１６７】
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられる免疫調節化合物は、4-(アミノ)-2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-イソインドリン-1,3-ジオン及び3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリジン-2,6-ジオンから選択される。
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられる免疫調節化合物は、鏡像異性的に純粋である。
【０１６８】
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられる保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤は、M344 (4-(ジメチルアミノ)-N-[7-(ヒドロキシアミノ)-7-オキソヘプチル]ベンズアミド), キダミド(CS055/HBI-800), 4SC-202, (4SC), レスミノスタット (4SC), ヒドロキサム酸、例えばボリノスタット (SAHA), ベリノスタット (PXD101), LAQ824, トリコスタチンA及びパノビノスタット (LBH589); ベンズアミド、例えばエンチノスタット (MS-275), CI994及びモセチノスタット (MGCD0103), 環状テトラペプチド(例えばトラポキシン、例えばトラポキシンB)、及びデプシペプチド、例えばロミデプシン(ISTODAX), 求電子性ケトン、及び脂肪酸化合物、例えばフェニルブチレート, バルプロ酸, オキサムフラチン, ITF2357 (ジェネリックのジビノスタット), アピシジン, MC1293, CG05及びCG06; NF-カッパB, プロストラチン, オーラノフィン, ブリオスタチン, 非腫瘍形成性フォルボールエステル, DPP (12-デオキシフォルボール-13-フェニルアセテート), PMA及びフォルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)を含む転写因子を活性化する化合物; P-TEF-bキナーゼ及びヘキサメチルビスアセタミド(HMBA)を含むHIV mRNA伸長を活性化する化合物; IL-7; 抗-CD3/CD28を含むT-細胞刺激因子 - T-細胞刺激性Ab; チルフォスチンA, チルフォスチンB及びチルフォスチンCを含むキナーゼ阻害剤; SF1670 (Echelon Bioscience)を含むPTEN (ホスファターゼ及びテンシンホモログ)遺伝子阻害剤, ジスルフィラム(DSF), アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤, bpV(HOpic), bpV(phen)及びbpV(pic) (Calbiochem; EMD Millipore)を含むプロテインチロシンホスファターゼ阻害剤, Toll-様受容体-9 (TLR9)及びToll-様受容体-7 (TLR9)作動薬を含むToll-様受容体作動薬, ケルセチン, リポ酸, ナトリウムブチレート, TNF-α, PHA, Tatから選択される。
【０１６９】
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられる細胞媒介性免疫応答を誘発する１又はそれより多いペプチドは:
Xaa1Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6Ala Xaa8 Xaa9 Gln Thr Pro Trp Xaa14 Xaa15Xaa16 Xaa17 Xaa18 Val Xaa20   (配列番号47);
ここで、ペプチド誘導体の1位のXaaはLys又はArgであり、
2位のXaaはAla, Gly, Ser又はArgであり,
3位のXaaはLeu又はMetであり,
4位のXaaはGly又はArgであり, 
5位のXaaはPro, Thr, Val, Ser, Gln又はAlaであり,
6位のXaaはGly, Ala, Lys, Arg, Gln又はGluであり,
8位のXaaはThr又はSerであり,
9位のXaaはLeu又はIleであり,
14位のXaaはThr, Ser又はValであり,
15位のXaaはAla又はSerであり,
16位のXaaはCys又はSerであり,
17位のXaaはGln又はLeuであり
18位のXaaはGly, Glu又はArgであり, 
20位のXaaはGly又はArgである;
【０１７０】
Xaa1 Xaa2Xaa3 Xaa4 Xaa5 Gly Leu Asn Pro Leu Val [Gly]n Xaa12 Xaa13 Tyr Xaa15 Pro Xaa17 Xaa18 Ile Leu Xaa21 Xaa22 (配列番号50)
ここで、1位のXaaはArg, Lys若しくはAspであるか又は存在せず、
2位のXaaはTrp, Gly, Lys又はArgであり, 
3位のXaaはIle, Leu, Val又はMetであり、
4位のXaaはIle, Val又はLeuであり、
5位のXaaはLeu, Met, Val又はProであり、
12位のXaaはArg, Lysであり、
13位のXaaはMet又はLeuであり、
15位のXaaはSer, Cys又はGlnであり、
17位のXaaはThr, Val, Ile, Ser又はAlaであり、
18位のXaaはSer, Gly又はThrであり、
21位のXaaはAsp, Glu, Cys又はGlyであり、
22位のXaaはGlyであるか又は存在せず、
n = 0, 1, 2又は3;
【０１７１】
Xaa1 Xaa2 Xaa3Pro Ile Pro Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11Xaa12 [Gly]n Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 (配列番号55)
ここで、1位のXaaはAsn, Ser, Gly, His, Ala, Pro若しくはArgであるか又は存在せず、
2位のXaaはAsn, Ala又はLysであり、
3位のXaaはPro, Gln, Gly, Ile又はLeuであり、
7位のXaaはVal又はAlaであり、
8位のXaaはGly又はLysであり、
9位のXaaはGlu, Asp, Lys, Phe又はThrであり、
10位のXaaはIle, Met, Val又はLeuであり、
11位のXaaはTyr若しくはLeuであるか又は存在せず、
12位のXaaはSerであるか又は存在せず、
13位のXaaはArgであるか又は存在せず、
14位のXaaはAsp, Arg, Trp若しくはAlaであるか又は存在せず、
15位のXaaはIleであるか又は存在せず、
16位のXaaはTyrであるか又は存在せず、
17位のXaaはLys又はArgであり、
18位のXaaはArg, Lys又はAspであり、
19位のXaaはTrp又はGlyであり、
20位のXaaはIle, Met, Val, Gln又はAlaであり、
21位のXaaはIle, Val又はAlaであり、
22位のXaaはLeu, Met又はValであり、
23位のXaaはGly又はCysであり、
24位のXaaはLeuであるか又は存在せず、
n = 1, 2又は3、及び
【０１７２】
Xaa1 Xaa2  Ile Ile Xaa5 Xaa6Xaa7 Xaa8 Xaa9 Leu Xaa11 [Gly]n [Arg]m Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 (配列番号61)
ここで、1位のXaaはPro, Lys若しくはArgであるか又は存在せず、
2位のXaaはGlu, Arg, Phe又はLysであり、
5位のXaaはPro又はThrであり、
6位のXaaはMet, Thr又はNleuであり、
7位のXaaはPhe又はLeuであり、
8位のXaaはSer, Thr, Ala又はMetであり、
9位のXaaはAla, Glu又はLeuであり、
11位のXaaはSerであるか又は存在せず、
12位のXaaはAla若しくはArgであるか又は存在せず、
13位のXaaはIle若しくはLeuであるか又は存在せず、
14位のXaaはSer, Ala若しくはLeuであるか又は存在せず、
15位のXaaはTyr, Glu又はAspであり、
16位のXaaはGly又はAspであり、
17位のXaaはAla又はLeuであり、
18位のXaaはThr, Ile, Val, Leu又はAsnであり、
19位のXaaはPro, Thr又はSerであり、
20位のXaaはTyr, Phe, Nleu, His又はGlnであり、
21位のXaaはAsp, Asn, Leu又はAlaであり、
22位のXaaはLeu, Ile, Val又はAsnであり、
23位のXaaはAsn, Tyr, Cys又はGlyであり、
24位のXaaはThr, Met, Ile, Ala若しくはValであるか又は存在せず、
25位のXaaはGlyであるか又は存在せず、
互いに独立して、n = 1, 2又は3及びm= 0, 1, 2又は3
のアミノ酸配列群から選択される少なくとも１つのHIV-特異的ペプチド又はそれらの塩であり、各HIV特異的ペプチドの末端は、遊離カルボキシル-又はアミノ基, アミド, アシル, アセチルであり得る。いくつかの実施態様において、上記HIV-特異的ペプチドの２又はそれより多いCys残基は、鎖内-又は鎖間ジスルフィド結合、１又はそれより多いヘテロ原子、例えばO, N及びS介在していてもよい-S-(CH2)p-S-又は-(CH2)p-架橋 (ここで、p = 1〜8)の一部を形成し得るか、及び/又は上記のペプチド配列は、固体支持体に固定されている。いくつかの実施態様において、配列番号47のアミノ酸配列は、配列番号48及び配列番号49の群から選択される。いくつかの実施態様において、配列番号50のアミノ酸配列は、配列番号51, 配列番号52, 配列番号53及び配列番号54の群から選択される。いくつかの実施態様において、配列番号55のアミノ酸配列は、配列番号56、配列番号57, 配列番号58, 配列番号59及び配列番号60の群から選択される。いくつかの実施態様において、配列番号61のアミノ酸配列は、配列番号62, 配列番号63, 配列番号64, 配列番号65及び配列番号66の群から選択される。
【０１７３】
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられる少なくとも１つのHIV-特異的ペプチドは、配列番号47, 配列番号50, 配列番号55及び配列番号61の群の各々から選択される少なくとも２, ３又は４つのペプチドを含む。
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられる少なくとも１つのHIV-特異的ペプチドは、配列番号49, 配列番号52, 配列番号57及び配列番号64のペプチドからなるか、又は当該ペプチドを含む。
【０１７４】
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられる、HIV gp120のC5ドメインと、gp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとの会合を安定化することができる少なくとも１つの物質は、gp41の膜貫通ドメインに由来するアミノ酸配列及びC2ドメインに由来するアミノ酸配列から独立して選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む分子であり、ここで、少なくとも１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのD-アミノ酸を任意に含むC5ドメインに結合する。いくつかの実施態様において、この分子は、ペプチドである。いくつかの実施態様において、このペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸配列からなる。いくつかの実施態様において、gp41の膜貫通ドメインに由来するアミノ酸配列は、最大10アミノ酸残基のアミノ酸配列を有する。
【０１７５】
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられる、HIV gp120のC5ドメインと、gp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとの会合を安定化することができる少なくとも１つの物質は、抗体、抗体フラグメント又は抗体アナログから選択される。いくつかの実施態様において、この抗体は、完全なヒト抗体、ヒト化抗体若しくはキメラ抗体又はその誘導体である。いくつかの実施態様において、抗体は、IgA, IgD, IgG, IgE又はIgMである。いくつかの実施態様において、抗体フラグメントは、Fabフラグメント, Fab'フラグメント, Fab'-SH フラグメント, F(ab)2 フラグメント, F(ab')2 フラグメント, Fv フラグメント, 重鎖Ig (ラマ又はラクダIg), VHHフラグメント, 単一ドメインFV及び一本鎖抗体フラグメントから選択される。いくつかの実施態様において、抗体アナログは、scFV, dsFV, ミニボディ, ダイアボディ, トリアボディ, カッパボディ, IgNAR, tandAb, BiTE及び多特異的抗体から選択される。
【０１７６】
いくつかの実施態様において、HIV gp120のC5ドメインと、gp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとの会合を安定化することができる少なくとも１つの物質は、アミノ酸ストレッチTZ1AKRRVVZ2REKR (ここで、Z1はK, R又はEであり、Z2はQ又はEである)中の１又はそれより多いアミノ酸残基とgp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメイン中のアミノ酸ストレッチ中の１又はそれより多いアミノ酸残基とに結合し、それらの会合を安定化する。
【０１７７】
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられる上記の免疫原は、
−  0〜4アミノ酸置換を含むHIV gp120のC5ドメインの13アミノ酸残基アミノ酸配列のアミノ酸配列、その部分配列又は上記のアミノ酸配列若しくは部分配列のインベルソ-, レトロ-又はレトロ-インベルソ型を含むアミノ酸配列を含む第１のペプチド、及び
−  gp41の膜貫通ドメインに存在するか又はgp120の定常C2ドメインに存在するアミノ酸ストレッチを含むか、又は配列番号6〜13のいずれか１つに存在するアミノ酸ストレッチを含むか、gp41の膜貫通ドメインに存在するか又はgp120の定常C2ドメインに存在するアミノ酸ストレッチのインベルソ-, レトロ-又はレトロ-インベルソ型を含む少なくとも１つの第２のペプチドを含み、ここで、上記のペプチド多量体は、HIV gp120のC5ドメインとgp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとに結合し、それらの会合を安定化させることができる抗体を誘導することができ、上記のペプチド多量体は、gp120のC5のN-末端アミノ酸を欠いている、
ペプチド多量体である。
【０１７８】
いくつかの実施態様において、第１のペプチドは、式I:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13       (I) 
(式中、X1はThrであり、X2はLys, Arg, Har及びGluから選択され, X3はAla及びValから選択され, X4はArg, Har, Lys及びCit (シトルリン)から選択され, X5はArg, Har, Lys及びCitから選択され, X6はArg, Har, Lys及びCitから選択され, X7はVal, Leu, Ile及びNle (ノルロイシン)から選択され, X8はVal, Leu, Ile及びNleから選択され, X9はGln, Glu, Asn及びAspから選択され, X10はArg, Har及びCitから選択され, X11はGlu及びAspから選択され, X12はLysであり、X13はArg, Har及びCitから選択される)を有するアミノ酸配列を含むか、又は式Iのアミノ酸配列の部分配列を含むか、又は上記のアミノ酸配列若しくは部分配列のインベルソ-, レトロ-又はレトロ-インベルソ型を含む。
【０１７９】
いくつかの実施態様において、第１のペプチドは、式Iを有するアミノ酸配列のN-末端に結合しているジペプチドAla-Proを更に含む。
いくつかの実施態様において、第１のペプチドは、式Iを有するアミノ酸配列のC-末端に結合しているジペプチドX14-X15 (式中、X14はAla及びValから選択され、X15はVal, Leu及びNleから選択される)を更に含む。
【０１８０】
いくつかの実施態様において、少なくとも第２のペプチドは、式:
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-Z13-Z14-Z15-Z16-Z17     (III)
(式中、Z1はAspであり, Z2はArgであり, Z3はProであり, Z4はGlu又はGlyであり, Z5はGly又はArgであり, Z6はIleであり, Z7はGluであり, Z8はGluであり, Z9はGluであり, Z10はGlyであり, Z11はGlyであり, Z12はGluであるかであるか又は存在せず、Z13はArg又はGlnであり, Z14はAsp又はGlyであり, Z15はArg又はLysであり, Z16はAsp又はGlyであり、Z17はArgである)を有するアミノ酸配列を含むか、又は式(III)の部分配列を含む。
【０１８１】
いくつかの実施態様において、第２のペプチドは、式IIIからの少なくとも5つの連続したアミノ酸残基を含む。
いくつかの実施態様において、第１のペプチド及び少なくとも１つの第２のペプチドは、リンカーを介して結合している。いくつかの実施態様において、リンカーは、ビス-マレイミドリンカー、ジスルフィドリンカー、ポリエチレングリコール(PEG)リンカー、グリシンリンカー、リシンリンカー及びアルギニンリンカーからなる群より選択される。
【０１８２】
いくつかの実施態様において、少なくとも１つの第１のペプチド及び少なくとも１つの第２のペプチドは、N-若しくはC-末端修飾、例えばアミド化、アシル化又はアセチル化を含む。
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられるペプチド多量体は、キャリア分子、例えば免疫原性キャリアにカップリングしている。いくつかの実施態様において、キャリアは、ウイルス様粒子である。
【０１８３】
いくつかの実施態様において、第１のペプチドは、配列番号1, 2, 3, 4, 5, 38, 41及び44若しくはそのフラグメント又は配列番号1, 2, 3, 4, 5, 38, 41及び44若しくはそのフラグメントから選択されるペプチドのインベルソ-, レトロ-若しくはレトロ-インベルソ型からなる群より選択され、第２のペプチドは、配列番号6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 37, 39, 40, 42, 43, 45, 46若しくはそのフラグメント又は配列番号6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 37, 39, 40, 42, 43, 45, 46若しくはそのフラグメントから選択されるペプチドのインベルソ-, レトロ-若しくはレトロ-インベルソ型からなる群より選択され、及び/又は、ペプチド多量体は、配列番号1〜46を有するペプチドから選択される。
【０１８４】
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられるペプチド多量体は、最大70アミノ酸を含む。
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられるペプチド多量体は、少なくとも6アミノ酸残基を含む。
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられるペプチド多量体は、6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69及び70アミノ酸残基からなる群より選択されるアミノ酸残基数からなる。
【０１８５】
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられるペプチド多量体は、配列番号28と配列番号29, 31及び33のいずれか１つとの間、配列番号30と配列番号29, 31及び33のいずれか１つとの間又は配列番号32と配列番号29, 31及び33のいずれか１つとの間でジスルフィド結合したペプチドからなる群より選択されるか;又は
配列番号38と配列番号39, 配列番号40; 配列番号42, 配列番号43及び配列番号68のいずれか１つとの間又は配列番号41と配列番号39, 配列番号40; 配列番号42及び配列番号43のいずれか１つとの間でシステイン-リシン結合したペプチドからなる群より選択される。
【０１８６】
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられるペプチド多量体は:
【化１３】
2015520179.tif 000014
【化１４】
2015520179.tif 000015
【化１５】
2015520179.tif 000016
【化１６】
2015520179.tif 000017
【化１７】
2015520179.tif 000018
【化１８】
2015520179.tif 000019
【化１９】
2015520179.tif 000020
【化２０】
2015520179.tif 000021
からなる群より選択される。
【０１８７】
いくつかの実施態様において、本発明に従って用いられるペプチド多量体は、(H-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gly-Gly-Cys(2-オキソ-エチル)-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Gly-Glu-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-NH2) (H-Gly-Lys-Gly-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Gly-Gly-Gln-Asp-Arg-Asp-Arg-NH2) 酢酸塩(Cys(2-オキソ-エチル)10 (A-鎖)及びLys2 (B-鎖)間のアミド結合)から選択される。
【０１８８】
本発明の別の側面は、(1)対象において液性免疫を刺激する化合物及び/又は対象において細胞媒介性免疫応答を誘発する１又はそれより多いペプチドを; (2)免疫調節化合物及び/又は保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤と組み合わせて、任意の順序で逐次的に又は同時に投与することを含む、ヒトレトロウイルス感染、例えば免疫不全ウイルスI(HIV)の病的効果が生じるリスク又は該病的効果を、該ウイルス、例えばHIVに感染したヒトにおいて低減するか及び/又は遅延する方法に関する。いくつかの実施態様において、ヒトレトロウイルス感染は、HTLV-1 (ヒトT-リンパ球指向性ウイルス), HTLV-II (ヒトT-リンパ球指向性ウイルス), HIV-1及びHIV-2を含むヒト免疫不全ウイルス及びそれらのサブタイプから選択される。いくつかの実施態様において、免疫調節化合物は上記で定義されたとおりである。いくつかの実施態様において、保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤は上記で定義されたとおりである。いくつかの実施態様において、細胞媒介性免疫応答を誘発する１又はそれより多いペプチドは上記で定義されたとおりである。いくつかの実施態様において、対象において液性免疫を刺激する化合物は上記で定義されたとおりである。
【実施例】
【０１８９】
実施例1
本発明に従って用いられる細胞媒介性免疫(CMI)を誘発するペプチド又は対象において液性免疫を刺激するペプチドは、国際特許出願 WO0052040, WO 2012/092934又はWO 2012/072088に記載されるような、直鎖状配列についての慣用技術を用いて合成した。
具体的には、対象において液性免疫を刺激する化合物は、WO2011/000962に記載されるように、HIV gp120のC5ドメインと、gp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとの会合を安定化する抗体を誘導することによって、製造した。
【０１９０】
また、対象において液性免疫を刺激する化合物は、WO2011/000962に記載されるように、HIV gp120のC5ドメインと、gp41の膜貫通ドメイン及び/又はgp120の定常C2ドメインとの会合を安定化することによって製造した。
本発明に従って用いられる免疫調節化合物及び保有宿主浄化剤、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤は、当業者に周知であり、商業的に入手可能である。
【０１９１】
直鎖状配列についての慣用技術を用いるペプチドの合成
APTKAKRRVVQREKRの製造
F-moc合成の一般記載(Athertonら. 1978 J. Chem. Soc. Chem Commun 539；以下「合成の一般記載」と称する)に従って、対応する開始点から、アミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC)：90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 1822.2
実験上の分子量: 1823.0 ES+
【０１９２】
APTKAKRの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析  ：理論上の分子量: 769.6
実験上の分子量: 760.7 ES+
【０１９３】
APTRAKRの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析  ：理論上の分子量: 797.6
実験上の分子量: 797.6 ES+
【０１９４】
APTEAKRの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 770.9
実験上の分子量: 770.9 ES+
【０１９５】
RVVEREKの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 914.1
実験上の分子量: 913.9 ES+
【０１９６】
RVVQREKの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 913.1
実験上の分子量: 913.0 ES+
【０１９７】
AKRRVVの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 726.9
実験上の分子量: 726.9 ES+
【０１９８】
DRPEGIEEEGGERDRの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 1742.1
実験上の分子量: 1742.8
【０１９９】
VERYLKDQQLLGの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 1460.7
実験上の分子量: 1460.1
【０２００】
VERYLKDEELLGの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 1462.6
実験上の分子量: 1463.0
【０２０１】
VERYLKDNNLLGの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 1432.6 
【０２０２】
QLLLNGSLAEEEIVIの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 1639.9
【０２０３】
QLLLNGSLAEEEVVIの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 1625.9
【０２０４】
QLLLNSLAEEEVVIの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 1568.8
【０２０５】
APTKAKRGGGAPTRAKRGGGAPTEAKRの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 2647.0
実験上の分子量: 2646.3 ES+
【０２０６】
RVVEREKGGGAKRRVVGGGRVVQREKの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 2862.3
実験上の分子量: 2863.3 ES+
【０２０７】
GGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAVの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 2590.1
【０２０８】
CGGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAVの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量:2693.2
【０２０９】
GGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKRの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 2476.9
【０２１０】
CGGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKRの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 2580.0
【０２１１】
GGAKRRVVGGAKRRVVの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 1665.0
【０２１２】
GCGAKRRVVGGAKRRVVの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 1768.1
【０２１３】
GGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRDRの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 3127.2
【０２１４】
CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRDRの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 3230.4
【０２１５】
GGDQQLLGGAEEEIVGGGERDRの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 2242.4
【０２１６】
CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 2402.5
【０２１７】
GGAEEEVVGGDQQLLの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 1499.6
【０２１８】
CGGAEEEVVGGDQQLLの製造
合成の一般記載に従って、対応する開始点からアミド型のペプチドを合成した。
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 1602.7
【０２１９】
本発明に従って用いられる複合体化C5関連ペプチドの合成:
【化２１】
2015520179.tif 000022
の製造
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 5750.4
実験上の分子量: 
【０２２０】
【化２２】
2015520179.tif 000023
の製造
純度(HPLC): 90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 4965.6
実験上の分子量: 
【０２２１】
【化２３】
2015520179.tif 000024
の製造
純度(HPLC):  90％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量: 3410.9
実験上の分子量: 
【０２２２】
以下に、C5-ペプチドの合成及び精製手順の概要を記載する。この生成物の製造工程及び質の改善を最終的にもたらし得る経験は、なお限られている。
SPPSの合成は、樹脂の15 mモル(A-鎖)及び30 mモル(B-鎖)を用いて開始した。粗製C5-ペプチドの一部の精製後、16.6 gの最終生成物を得た。
【０２２３】
ステージ1: 固相ペプチド合成
A-鎖のアミノ酸配列(H-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gly-Gly-Cys-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Gly-Glu-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-NH2)及びB-鎖(H-Gly-Lys-Gly-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Gly-Gly-Gln-Asp-Arg-Asp-Arg-NH2)は、Fmoc-ストラテジ(W.C. Chan及びP.D. White; Solid Phase Peptide Synthesis - A Practical Approach, Oxford University Press Inc., New York, 2000, ISBN 978-0-19-963724-9)を用いる標準的な固相ペプチド合成(SPPS)によって組み立てる。
【０２２４】
SPPSリアクターに固相を移し、Fmoc-脱保護を用いて合成サイクルを開始する。脱保護工程の後、適切な活性化剤の存在下における以下のN-α-保護AA誘導体又はアミノ酸配列に従うジペプチドのカップリングにより、ペプチド鎖を伸長させる。副産物としての長いペプチド配列の形成を避けるために、反応していないペプチド鎖の体系的なアセチル化(キャップ工程)をすべてのカップリング工程後に行うことができる。
【０２２５】
１回の工程の各々について、溶媒及び/又は試薬を添加し、反応混合物を撹拌し、次いで濾過して溶媒及び/又は試薬を樹脂から除去する。SPPSサイクルの１回工程は、反応が不完全である場合には繰り返してもよい。固相がA-鎖又はB-鎖の完全なアミノ酸配列を保有するまで、SPPSサイクルを繰り返す。
【０２２６】
A-鎖について、最終のFmoc-脱保護を行い、減圧下にペプチド樹脂を乾燥させることによってSPPSを完了させる。
B-鎖は、Lys2におけるブロモアセチルリンカーで更に改変されている。この手順は、適切な活性化剤の存在下に、Lys2の側鎖保護基を選択的に切断し、ブロモ酢酸をLys2にカップリングさせることからなる。カップリング反応が不完全である場合、再カップリングの手順を行うことができる。次いで、減圧下にペプチド樹脂を乾燥させることによってSPPSを完了させる。
【０２２７】
ステージ2: 酸に不安定な保護基の切断を含む樹脂からの切断
樹脂からのペプチドの切断及び酸に不安定な保護基の同時の切断は、水の存在下にTFAで処理することによって達成される。所望によりスカベンジャーを添加し、反応性カチオンをトラップし、側鎖の基のアルキル化を避ける。濾過及びTFAで樹脂を洗浄後、IPE中で産物を沈殿させる。それらを濾過し、IPEで洗浄し、減圧下に乾燥させる。
【０２２８】
ステージ3: 分取HPLC (TFA系)による中間体の精製
ACN勾配溶出液(TFA系)を用いる逆相カラム分取HPLCによって前のステージで得られたA-鎖及びB-鎖を精製し、λ = 220 nmでUV検出する。
一部のペプチドを水又は水及び酢酸の混合物に溶解させ、カラムに負荷する。その後、TFA系のACN勾配を開始する。回収した画分をHPLC分析により確認し、直ちにプールする。
TFA系を用いて副次的画分を再精製することができる。最後に、適切な純度を有するプールした画分を凍結乾燥させる。
【０２２９】
ステージ4: A-鎖及びB-鎖のカップリング
(塩酸の添加によってpH 8.5に調整された) TRISバッファー中のA-鎖(1等量)溶液に水性TFA中のB-鎖(1等量)溶液を添加することによって、２つのペプチド鎖のカップリングを行う。反応混合物をpH＞8に維持するために、更なるTRISバッファーを添加する。次いで、反応混合物を撹拌し、HPLC分析によって反応の進行をモニタリングする。完了後、TFAの添加によって、反応混合物のpHをおよそpH 3に低下させる。
【０２３０】
ステージ5: 分取HPLC(TFA系)による精製
ACN勾配溶出液(TFA系)を用いる逆相カラム分取HPLCによって、前のステージで得られたC5-ペプチドを精製し、λ = 220 nmでUV検出する。
一部のC5-ペプチドをカラムに直接負荷する。その後、TFA系のACN勾配を開始する。回収した画分をHPLC分析によって確認し、直ちにプールする。
TFA系を用いて、副次的画分を再精製することができる。最後に、適切な純度を有するプールした画分を凍結乾燥させる。
【０２３１】
ステージ6: イオン交換, 精密濾過及び凍結乾燥
C5-ペプチド製造の最後のステージは、前のステージで得られたTFA塩から酢酸塩へのイオン交換である。
TFA精製からの凍結乾燥された物質を5％酢酸に溶解させ、溶液をイオン交換樹脂(アセテート型)に負荷する。溶出は、5％酢酸を用いて行い、TLCによって確認する。生成物の溶液を0.2 μmのメンブレンフィルタで濾過し、凍結乾燥させ、白色からオフホワイトの物質として最終生成物を得る。
【０２３２】
本発明に従う組成物及び方法において用いられる、細胞媒介性免疫応答を誘発するHIV-特異的ペプチドの製造
本発明に従って用いられるペプチドは、直鎖状のアミノ酸配列を製造する公知の方法、例えば組換えDNA技術によって製造することができる。本発明に従って用いられるペプチド又は上記のペプチドの多量体をコードする核酸配列を、発現ベクターに導入する。適切な発現ベクターは、例えば、複製及び発現に必要な制御領域を含むプラスミド、コスミド、ウイルス及びYAC (酵母人工染色体)である。発現ベクターは、宿主細胞で発現するために刺激してもよい。適切な宿主細胞は、例えば細菌、酵母細胞及び哺乳動物細胞である。かかる技術は当該技術において周知であり、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989によって記載されている。その他の周知の技術は、分解又は液相若しくは好ましくは固相(樹脂)において１つのアミノ酸残基を次の残基にカップリングさせることによる、例えばいわゆるMerrifield合成による合成である。例えばBarany and Merrifield in the peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol.2, E. Gross and Meinhofer, Ed. (Acad.Press, N.Y., 1980), Kneib-Coronier and Mullen Int. J. Peptide Protein Res.,30, p.705-739 (1987)及びFields and Noble Int.J.Peptide Protein Res., 35, p.161-214 (1990)を参照されたい。
【０２３３】
結合したか又は環状のペプチドが望まれるとき、アミノ酸配列は、適切な直鎖状アミノ酸配列が合成される場合には１つのペプチド配列内又は２つのペプチド配列間の２つのシステイン残基を環状化又は結合するために、化学的酸化工程に供される(Akajiら, Tetrahedron Letter, 33, 8, p.1073-1076, 1992を参照されたい)。
【０２３４】
以下に記載される実施例において製造される全てのペプチド誘導体は、標準的なプログラムを用いて、Milligen 9050 Peptide Synthesizerで合成した。用いた樹脂は、理論上0,20 meq/gの負荷を有するTenta Gel P RAM (RAPP POLYMERE GmbH, Tubingen)であった。合成の最終生成物は、真空下に一晩乾燥させた。次いで、スカベンジャーとしてのエタンジチオール(5％)及び水(5％)の存在下に(1,5時間RTで)、90％トリフルオロ酢酸で処理することによって、ペプチドを樹脂から切断した。次いで、樹脂を濾過し、更なるトリフルオロ酢酸(100％) (2 x 20 ml)を用いてフィルターを洗浄した。合わせた濾物を真空下における蒸発(RTにおける水浴)にかけ、エチルエーテル(200 ml)を用いて残渣を粉砕し、沈殿した生成物を濾過した。氷酢酸(100 ml)でフィルター上の固体を素早く溶解させ、これをメタノール中の20％酢酸1,5 lに添加し、かすかなブラウン色になるまでメタノール中のヨウ素液(0,1 M)で処理した。次いで、アセテート型(15g)のDowex 1 x 8 ion exchange (Bio-Rad, Richmond, CA)を添加し、混合物を濾過した。濾物を蒸発させ、酢酸からの残渣を凍結乾燥させた。次いで、Kromasil (登録商標)100 - 5 C8 (EKA Nobel, Surte, Sweden)充填カラムを用いる逆相液体クロマトグラフィによって、0,1％トリフルオロ酢酸水溶液中のアセトニトリルを含む適切な系中で生成物を精製した。Kromasil (登録商標)100 - 5 C8カラム(EKA Nobel, Surte, Sweden)を備えた高速液体クロマトグラフィ(HPLC) (Beckman System Gold, USA)分析によって、カラムから回収した試料を分析した。純粋な物質を含む画分をプールし、溶媒を蒸発させ、酢酸からの生成物を凍結乾燥させた。最終のHPLC分析を最終生成物について行い、アミノ酸分析及び質量分析(LDI-MS)によってペプチドの構造を確認した。
【０２３５】
合成中に用いられる全てのアミノ酸はL-アミノ酸であり、それらは、α-アミノ基におけるフルオレニルメトキシ-カルボニル基で保護した。側鎖は、以下のように保護した:
Cys (Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), Thr(tBu)。
括弧内の略称は:
Trt = トリフェニルメチル
t-Bu = tert.ブチル
OtBu = tert.ブチルエステル
アミノ酸誘導体は、Bachem AG, Switzerlandによって供給された。
【０２３６】
K A L G P G A T L Q T P W T A C Q G V G - NH2 (配列番号48)の製造
アミド型のペプチドは、合成の一般記載に従って、対応する開始物質から合成した。純度は、HPLC分析によって測定し、アミノ酸分析及び質量分析(LDI-MS)によって構造を確認した。
純度(HPLC)：  87％
【０２３７】
R A L G P A A T L Q T P W T A S L G V G (配列番号49)の製造
アミド型のペプチドは、合成の一般記載に従って、対応する開始物質から合成した。純度は、HPLC分析によって測定し、アミノ酸分析及び質量分析(LDI-MS)によって構造を確認した。
純度(HPLC)：  95％より高い
分子量 (遊離塩基): 1966 
分子式 : C88H144O25N26
【０２３８】
W I I P G L N P L V G G G K L Y S P T S I L C G - NH2 (配列番号51)の製造
アミド型のペプチドは、合成の一般記載に従って、対応する開始物質から合成した。純度は、HPLC分析によって測定し、アミノ酸分析及び質量分析(LDI-MS)によって構造を確認した。
純度 (HPLC) : 95%
質量スペクトル分析：  理論上の分子量 : 2454.9
実験上の分子量 : 2454.8  ES+
【０２３９】
R W L L L G L N P L V G G G R L Y S P T S I L G (配列番号52)の製造
アミド型のペプチドは、合成の一般記載に従って、対応する開始物質から合成した。純度は、HPLC分析によって測定し、アミノ酸分析及び質量分析(LDI-MS)によって構造を確認した。
純度 (HPLC) : 95％より高い
分子量 (遊離塩基) : 2552
分子式 : C119H195O29N33
【０２４０】
K I L L G L N P L V G G G R L Y S P T S I L G (配列番号53)、R L L L G L N P L V G G G R L Y S P T T I L G (配列番号54)及びN I P I P V G D I Y G G G D I Y K R W Q A L C L (配列番号70)の製造。アミド型のペプチドは、合成の一般記載に従って、対応する開始物質から合成する。純度は、HPLC分析によって測定し、アミノ酸分析及び質量分析(LDI-MS)によって構造を確認する。
【０２４１】
R N I P I P V G D I Y G G G D I Y K R W Q A L C L (配列番号56)の製造
アミド型のペプチドは、合成の一般記載に従って、対応する開始物質から合成した。純度は、HPLC分析によって測定し、アミノ酸分析及び質量分析(LDI-MS)によって構造を確認した。
純度(HPLC)：  85％
質量スペクトル分析：  理論上の分子量 : 2817.3
実験上の分子量 : 2813.7 ES+
【０２４２】
R A I P I P A G T L L S G G G R A I Y K R W A I L G (配列番号57)の製造
アミド型のペプチドは、合成の一般記載に従って、対応する開始物質から合成した。純度は、HPLC分析によって測定し、アミノ酸分析及び質量分析(LDI-MS)によって構造を確認した。
純度 (HPLC)：  95％より高い
分子量 (遊離塩基) : 2707
分子式 : C125H208O29N38
【０２４３】
A L P I PA G F I Y G G G R I Y K R W Q A L G (配列番号58)、K I P I P V G F I G G G W I Y K R W A I L G (配列番号59)及びK I P I P V G T L L S G G G R I Y K R W A I L G (配列番号60)の製造。アミド型のペプチドは、合成の一般記載に従って、対応する開始物質から合成する。純度は、HPLC分析によって測定し、アミノ酸分析及び質量分析(LDI-MS)によって構造を確認する。
【０２４４】
K F I I P Nl F S A L G G A I S Y D L N T Nl L N C I (配列番号62)の製造
アミド型のペプチドは、合成の一般記載に従って、対応する開始物質から合成した。配列中のNlはノルロイシンである。純度は、HPLC分析によって測定し、アミノ酸分析及び質量分析(LDI-MS)によって構造を確認した。
純度 (HPLC)：  80％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量 : 2783.3
実験上の分子量 : 2783.3 ES+
【０２４５】
K F I I P Nl F S A LS G G G A I S Y D L N T F L N C I G (配列番号63)の製造
アミド型のペプチドは、合成の一般記載に従って、対応する開始物質から合成した。配列中のNlはノルロイシンである。純度は、HPLC分析によって測定し、アミノ酸分析及び質量分析(LDI-MS)によって構造を確認した。
純度(HPLC)：  80％より高い
質量スペクトル分析：  理論上の分子量 : 2932.4
実験上の分子量 : 2931.8 ES+
【０２４６】
R F I I P Nl F T A L S G G R R A L L Y G A T P Y A I G (配列番号64)の製造
アミド型のペプチドは、合成の一般記載に従って、対応する開始物質から合成した。配列中のNlはノルロイシンである。純度は、HPLC分析によって測定し、アミノ酸分析及び質量分析(LDI-MS)によって構造を確認した。
純度 (HPLC) : 95％より高い
分子量 (遊離塩基) : 2894
分子式 : C137H217O32N37
【０２４７】
K I I  P Nl F S A L G G G R L L Y G A T P Y A I G (配列番号65)、R I I P Nl F T A L S G G G R L L Y G A T P Y A I G (配列番号66)及びW I I P Nl F S A L G G A I S Y D L N T Nl L N C I (配列番号71)の製造。アミド型のペプチドは、合成の一般記載に従って、対応する開始物質から合成する。純度は、HPLC分析によって測定し、アミノ酸分析及び質量分析(LDI-MS)によって構造を確認する。
【０２４８】
ジスルフィド架橋による二量体化
上記に例示のペプチド配列を酸化工程により結合し、システイン残基がジスルフィド架橋を形成しているジペプチドを形成する。架橋は; 
A) I2を用いて酸化。酢酸/メタノール(1:4)に等量のペプチドを溶解させ、メタノール中の0.1 M I2を添加し、二量体の混合物を得たか、又は
B) [Cys(Spy)16]-配列番号48による酸化。2,3mMの配列番号48のペプチドを2 M AcOH (aq)及び2-プロパノール(1:1)中に溶解し、2,2ジチオジピリジン(3 eqv)で処理し、[Cys(Spy)16]-配列番号48を得たか、のいずれかの方法で形成させた。等量の[Cys(Spy)16]-配列番号48及び配列番号51のペプチドを10 mM NH4Oac (aq pH=6, 5)及びメタノール(5:2)中に溶解させ、配列番号67の二量体を得た。
ペプチドの純度をHPLC分析によって測定し、アミノ酸分析によってペプチドの構造を確認した。ペプチド含有量(遊離アミノ酸ベース)は80％であった。
純度 (HPLC)；  92％。
【０２４９】
実施例2
配列番号49, 52, 57及び64のペプチドを含むワクチンを製造した。凍結-乾燥させたペプチドを滅菌水に4 mg/mlの最終濃度で溶解させた。塩の最終濃度は、0,9％であった。顆粒細胞-マクロファージ-コロニー刺激因子(GM-CSF)製剤も、製造業者の取扱説明書に従って、0.3 mg/mlの最終濃度に調整した。２つの溶液を皮内投与する。典型的な注入用量は、100μlである。
【０２５０】
実施例3
抗原溶液又は懸濁液は、等量のBehringの完全又は不完全フロイントアジュバントと混合し、次いで注入用シリンジに吸入及び激しく圧出することによって、又は、ホモジネータを用いて、細かく乳化する。エマルジョンは、少なくとも30分間安定なままでなければならない。抗原-アジュバントのエマルジョンは、皮下に蓄積注入するのが最良である。
【０２５１】
実施例4
毒性データ
例示のジペプチドを0,9％NaClに希釈し、濃度4 mg/mlの試験溶液とする。NMFI雌性マウスに100μg/kg体重の用量で注入によりペプチドを投与する。毒性効果は観察されず、ペプチドは毒性でないと見做される。
毒性研究は、ワクチンのペプチド組成物について、マウス及びラットにおいて行われる。研究のためのマウスを選択し、第２の一般に用いられるげっ歯類の種から比較データを得る。試験物質は、生理的食塩水で再構成するための凍結乾燥された物質を含む１バイアルとして供給される４つのペプチドの混合物であり、用量レベルはトータルのペプチド負荷の観点から表される。個々のペプチドは、0.0075 mg/kg体重、0.075 mg/kg体重及び0.75 mg/kg体重(これらはヒトにおいて意図される用量の最大500倍である)の各ペプチドの用量レベルを与える1:1:1:1の比で存在する。試験用の動物を各10個体(雄性５個体及び雌性５個体)の４群に分ける; 食塩水対照群並びに低、中及び高用量群。試験組成物は、3 ml/分の投与速度で尾静脈内注入することによって、１回投与される。15及び16日目に、ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注入によって動物を屠殺する。
これらの研究結果は、マウス及びラットに投与された用量レベルが都合の悪い反応を誘発していないこと、及び効果レベルが3 mg/kgを超えていないことを示した。
【０２５２】
実施例5
HIV-1によって誘導される抗体の検出のためのイムノアッセイ
磁性粒子試薬を製造業者推奨のプロトコルに従って製造する。用いたのは、Dynal ASを製造業者とするDynabeadsである。リガンドでコーティングされた磁性粒子を試薬1と称する。本発明に従って用いられるペプチドを、予め活性化させた磁性粒子表面に共有結合的にカップリングさせる。磁性粒子表面にペプチドを物理的に吸着させることも可能である。試薬1中の粒子濃度は、1 mg/ml〜15 mg/mlの範囲内である。粒子サイズは、0,2μm〜15μmの間で変動する。ペプチド濃度は、0,01 mg/mg粒子〜1 mg/mg粒子の範囲内である。
【０２５３】
抗ヒトIgアルカリホスファターゼ(AP)コンジュゲート抗体試薬は、Dako ASの推奨プロトコルに従って製造する。このプロトコルは、当該技術分野において標準の手順である。この試薬を試薬2と称する。
フェノールフタレイン-モノホスフェート基質溶液は、Fluka AGの推奨プロトコルに従って製造する。このプロトコルは、当該技術分野において標準の手順である。この試薬を試薬3と称する。
用いる洗浄及びインキュベーションバッファーは、以下の更なる化合物を含む標準的な0,05M tris-ベースのバッファーである; Tween 20 (0,01％〜0,1％), グリセロール(0,1％〜10％)及び塩化ナトリウム(0,2％〜0,1％)。
【０２５４】
アッセイ手順は、1滴の試薬1を2滴の洗浄バッファーと各ウェル中で混合するインキュベーション工程を含む。混合後、30μlの試料を添加し、溶液を5分間インキュベートする。磁性粒子は、磁石によってトラップすることができ、磁石を離す前に液体を除去する。次いで、ウェルを4滴の洗浄バッファーで２回洗浄し、試薬2と共にインキュベートする。1滴の試薬2を2滴の洗浄バッファーと共に添加し、溶液を5分間インキュベートする。磁性粒子は、磁石によってトラップすることができ、磁石を離す前に液体を除去する。次いで、洗浄工程を繰り返し、試薬3と共にインキュベートする。2滴の試薬3を各ウェルに添加し、溶液を3分間インキュベートする。結果は、白色をバックグラウンドとして読み取ることができる。良好な結果は赤色(3+ = 強い赤色)である一方、良好でない結果は、陰性対照において得られるように、澄んだ明黄色/ブラウンの溶液である。
【０２５５】
HIVウイルス又はHIV-特異的ペプチド若しくはタンパク質、例えば本発明のペプチドのいずれかによって誘導された抗体の検出においては、イムノアッセイキットを用いることができた。
【０２５６】
上記の実施例は、本発明を説明することを意図しているに過ぎない。当業者は、請求の範囲に記載される本発明の概念及び範囲を逸脱することなく、本明細書中に記載されるペプチド、抗原及びワクチンを改変することができることが理解されなければならない。
【０２５７】
本発明に従って用いられるポリペプチドは、国際特許出願WO2011/000962, WO0052040, WO 2012/092934又はWO 2012/072088のいずれかに具体的に記載される少なくとも１つのペプチド(限定されないが、配列番号47, 配列番号50, 配列番号55及び配列番号61並びに配列番号28と配列番号29, 31及び33との間、配列番号30と配列番号29, 31及び33との間、又は配列番号32と配列番号29, 31及び33との間でジスルフィド結合しているペプチド; 又は配列番号38と配列番号39, 配列番号40; 配列番号42, 配列番号43及び配列番号68との間又は配列番号41と配列番号39, 配列番号40; 配列番号42及び配列番号43との間でシステイン-リシン結合しているペプチドであるペプチド多量体から選択される)を含み(これらは抗原を形成する)、予防又は治療用ワクチンの活性成分は、1型ヒト免疫不全ウイルス(HIV-1)に対する保護を提供する。ワクチンは、宿主(ヒト又は脊椎動物)の免疫系の保護又は刺激において有益な効果を有する化合物、例えばインターロイキン、インターフェロン、顆粒細胞マクロファージ成長因子、造血成長因子又はこれらに類似するものを含み得る。好ましくは、ワクチン組成物は、アジュバント又はビヒクルを更に含み、より好ましくは、アジュバント又はビヒクルは、ミョウバン、フロイントアジュバント(完全又は不完全)又は水酸化ナトリウムと合わせら得るモノホスホリルリピドA (MPL (登録商標))である。アジュバント/ビヒクルの最適量は、選択されるタイプに依存する。
【０２５８】
ペプチド又はワクチン製剤は、保存前に凍結乾燥することができる。ワクチンは、好ましくは、使用可能な状態にある１又はそれより多い投与単位を含むアンプル中に低温で保存され得る。本発明に従って用いられるペプチドの典型的な投与単位は、1μg〜1mg/kg体重、好ましくは2μg〜0.15 mg/kg体重の濃度範囲である。当業者は、適切な用量が患者の体重、疾患のタイプ、状態の重篤度、投与経路及びいくつかのその他の要素に依存することを理解するであろう。ワクチンは、最大12回投与され得、注入の場合、典型的には約３回投与される。注入溶液の製造において、ペプチドについての最終濃度1 mg/ml及び0,9％塩化ナトリウムとなるように、滅菌塩化ナトリウム溶液にペプチドを溶解させる。典型的には、注入容量は、100μl〜200μl (2 x 100μl)である。ペプチドは、好ましくは、適切なアジュバント及び/又は顆粒細胞-マクロファージ成長因子、例えばLeucomax (登録商標)(Shering Plough)と共に投与される。適切な投与は、皮内, 皮下, 静脈内, 経口, 筋肉内, 鼻内, 粘膜又はその他の適切な経路であり得る。ブースタ投与は、保護を維持するために必要とされ得る。当業者には、本発明に従うワクチン組成物が感染の予防だけでなく、感染の治療にも有用であることが理解されるであろう。
【０２５９】
実施例6
実施例8のペプチド組成物及びVacc-C5の組合せを試験する臨床研究は、既存の臨床データに基づいて構築することができた。Vacc-C5ワクチン接種法は、0.33x106 IUの顆粒細胞-マクロファージコロニー-刺激因子(GM-CSF)の皮内投与後10分間の300μgのVacc-C5を皮内経路による送達であり得た。ワクチン接種法は、1, 2, 4, 12, 13, 22及び23週間、週１回であり得た。免疫成熟期の後、ペプチド組成物のワクチン接種スケジュールは、0.33x106 IU GM-CSFの皮内注入後10分間皮内経路で与えられる300μg/ペプチドであり得た。ペプチド組成物は、27, 28, 29, 30, 42, 44週に非経口的に投与され得、プロトコルを通じて、臨床的及び免疫学的パラメータ、例えば遅延型過敏反応(DTH), 血清学的パラメータ、例えばVacc-C5抗体応答についてのELISA及び細胞性パラメータ、例えばELISPOT又はペプチド組成物若しくは対応する天然抗原についての増殖が測定され得た。あるいは、ペプチド組成物及びVacc-C5 (例えばペプチド組成物のペプチドについて300μg及び300μgのVacc-C5)は、同一の注入物中で組み合わせて、1, 2, 3, 4, 16及び18週に週１回GM-CSFの皮内注入後10分間投与し、プロトコルを通じて、臨床的及び免疫学的パラメータ、例えばDTH, 血清学的パラメータ、例えばVacc-C5抗体応答についてのELISA及び細胞性パラメータ、例えばELISPOT又はペプチド組成物若しくは対応する天然抗原についての増殖が測定され得た。アジュバントは、いずれの臨床研究においても、GM-CSFに代えて、ISA51, ISA720, Provax又はその他の認可されたか若しくは未認可のアジュバントでもあり得た。
【０２６０】
実施例7
増殖、多機能性、IL-2分泌及びIFN-γ産生増大のためのIMiDと併せたペプチドの試験
本発明に従って用いられるペプチドと共に予めインキュベートされた樹状細胞を用いる刺激時の多機能性HIV-特異的T-細胞の拡大は、Keersmaeckerら(J. Virol., 2012 86:9351-9360)によって記載される方法及びそこで参照される方法によって研究することができ、HIVタンパク質であるGag又はNefは、本発明に従って用いられるペプチドと共にインキュベートされ、その後共培養物中のT-細胞を刺激するために用いられる。
【０２６１】
Keersmaeckerらは、Gag-又はNef-特異的ペプチドを提示する樹状細胞を用いるインビトロT-細胞刺激中のIMiD(レナリドミド (IMiD3; CC-5013)及びポマリドミド(IMiD1; CC-4047)の存在が、多くのT-細胞機能改善をもたらすことを見出した；例えば、多機能性HIV特異的CD8+ T細胞の溶解能増大、より低い抗原ペプチド濃度におけるGag抗原エピトープのより良好な認識、多機能性CD4+ T-細胞数の増大を伴うCD4+ T細胞増殖の低減、CD8 T-細胞によるIL-2細胞の増大、抗原刺激後のCD8+ T-細胞及びCD4 T-細胞による検出可能なIFN-γ産生であった。
【０２６２】
「免疫調節性薬剤の存在下におけるmRNAでエレクトロポレーションされた樹状細胞を用いる刺激時の多機能性HIV-特異的T細胞の拡大」
Brenda De Keersmaecker, Sabine D. Allard, Patrick Lacor, Rik Schots, Kris Thielemans及びJoeri L. Aerts
J. Virol. September 2012 86:9351-9360; 2012年6月20日付で公開、doi:10.1128/JVI.00472-12
【０２６３】
実施例8
レナリドミド及びHDAC阻害剤と組み合わせられた4つのペプチドを含むペプチド組成物の試験のために示唆された臨床研究プロトコル
１）アジュバントとしてのGM-CSF及びレナリドミド (CC-5013)を含むペプチド組成物、又は
２）アジュバントとしてのGM-CSFを含むペプチド組成物及びレナリドミド(CC-5013)のプラセボ
３）プラセボ
のいずれかを用いる1, 2, 3及び4週における免疫付与(４回の初回免疫付与及び２回のブースタ免疫付与)及び12及び13週におけるブースタ免疫付与。
【０２６４】
示唆された用量：
ペプチド組成物: 0.6, 0.9, 1.2及び1.5 mg (各ペプチドの等モル量)
レナリドミド: 5,10及び25 mg
Vacc-C5: 100, 300及び900μg。
【０２６５】
レナリドミド(CC-5013)群にランダム化された対象は、ペプチド組成物を用いる免疫付与の２日前から毎日、及び各免疫付与の当日に、単回経口用量のレナリドミド(CC-5013)を摂取する。
この臨床試験計画に従って用いられるペプチド組成物は、配列番号49, 配列番号52, 配列番号57及び配列番号64からなる。
【０２６６】
20週目に、全ての研究群における対象は、1, 3及び5日目(すなわち週3回)に、バックグラウンドARTを維持しつつ8週間隔週で(最大28週まで)、20 mgのパノビノスタット (LBH589)を経口的に受ける。その後の24週間は追跡期間である(最大52週)。この研究の完了時に、対象は、更なる観察研究(ARTを中断し、ウイルスコントロールに対する治療研究の効果を評価する)に参加するよう促され得る。研究のこの部分への加入は任意であり、潜伏中のHIV-1保有宿主に対する治療研究の効果によって決定する(治療中断の最大期間: 16週)。
【０２６７】
要するに:
研究群1: ペプチド組成物 + IMiD + HDAC (パノビノスタット)
研究群2: ペプチド組成物 + HDAC (パノビノスタット)
研究群3: HDAC (パノビノスタット)
【０２６８】
本発明に従う組合せ治療の結果としてのウイルス保有宿主の喪失は、例えば、Lehrmanら(The Lancet (366), 2005, pp. 549-555)に記載される手順及びそこで参照される手順に従って定量され得る。簡潔には、これは、治療前、治療中及び治療後に得られた患者の血液試料中の; 刺激された潜在感染細胞からのp24発現、血漿中のHIV RNA濃度(ウイルス負荷)の測定及びインテグレートされたHIV DNAのリアルタイムPCR分析を含む。
【０２６９】
実施例9
DC/ T-細胞増殖アッセイ
樹状細胞(DC)は、健常な血液ドナーからのバフィコート製剤から単離された単球から生成した。簡潔には、末梢血単核細胞を密度勾配遠心分離により分離し、次いで、製造業者の取扱説明書に従って、Dynabeadsに接触していないヒト単球(Dynabeads Untouched Human Monocytes; Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、単球をネガティブ選択により単離した。X-VIVO15培地(Lonza, Basel, Switerland)中のIL-4 (20 ng/ml; Immunotools, Friesoythe; Germany)及びGM-CSF (100 ng/ml; Immunotools)と共に5〜6日間単球を培養し、未成熟DCを生成させた。サイトカインを2〜3日毎に補充した。IFN-γ (1000 IU/ml), TNF-α (50 ng/ml), IL-1β (25 ng/ml) IFN-α (3000 IU/ml)を用いて24時間細胞を成熟させた。成熟後、10μg/mlのペプチドを用いて2時間37℃でDCをパルスし、広範囲にわたって洗浄し、蛍光色素(VPD450, BD biosciences, Sam Jose, CA)で標識した末梢血単球細胞(PBMC)と共培養した。適切なコントロールと並行して、様々なDC:T細胞比を試験した。共培養開始時に、IMiDを含むか又は含まないウェルにIL-2 (50U/ml)及びIL-7 (50ng/mL) (Both, Immunotools)を添加した。6〜10日目に、フローサイトメトリによってT細胞増殖のレベルを分析した。Luminex法を用いて共培養ウェルからの上清を調べ、抑制活性を確立させた。
【０２７０】
実施例10
免疫研究
ウサギの免疫付与
0、2及び6週目に、50% V/Vのフロイントアジュバント(すなわち、プライミングに用いる完全フロイントアジュバント、その後のブーストに用いる不完全フロイントアジュバント)中の500μgのBI400-BからなるBI400-B ワクチン1 mlを用いて、雌性ニュージーランドシロウサギに皮内経路で免疫付与した。動物は、任意に、例えば免疫付与の２日前から毎日単回用量の免疫調節剤(IMiD)を受け、各免疫付与の当日にELISA用に個体の血清を単離した。
【０２７１】
ヒト血清についての直接ELISA
50〜100μlの(冷コーティングバッファー - 0.05M Na2CO3 pH9.6; CBと称する -中で、コーティングの1〜3日前に各ペプチドについて16μg/mlで予めインキュベートされた)BI400-015及び-201の混合物又はCB単独(バックグラウンドコントロール)を用いて、マイクロタイタープレートのウェルを4℃で一晩コーティングした。次いで、洗浄バッファー(PBS + 1% v/v Triton-X100; WBと称する)でマイクロタイタープレートを３回洗浄し、200μl/ウェルのブロッキングバッファー(PBS + 1% w/v BSA)を用いて、室温(RT)で2hブロッキングした。次いで、WBで３回プレートを洗浄し、50〜70μl/ウェルのヒト(希釈バッファー(PBS + 1% v/v Triton-X100 + 1% w/v BSA; DBと称する)中1:1〜1:250の範囲の系列希釈液)を添加し、37℃で1hインキュベートした。次いでWBで６回プレートを洗浄し、70μl/ウェルのアルカリホスファターゼ-コンジュゲートプロテインG (DB中3μg/ml; Calbiochem 539305)を用いてRTで1hインキュベートした。次いでWBで６回プレートを洗浄し、100μl/ウェルの0.3％ w/vフェノールフタレインモノホスフェート(Sigma P-5758)を用いて、室温で10〜60分インキュベートした。最後に、100μl/ウェルのクエンチ溶液(0.1M TRIS + 0.1M EDTA + 0.5M NaOH + 0.01% w/v NaN3; pH14)を添加することによってプレートをクエンチし、ELISAリーダー(ASYS UVM 340)を用いて550 nmで読み取った。
【０２７２】
BI400-Bを用いる免疫付与後のウサギ血清についての競合ELISA
50〜100μlの(冷コーティングバッファー - 0.05M Na2CO3 pH9.6; CBと称する -中で、コーティングの1〜3日前に各ペプチドについて16μg/mlで予めインキュベートされた)BI400-015及び-201の混合物又はCB単独(バックグラウンドコントロール)を用いて、マイクロタイタープレートのウェルを4℃で一晩コーティングした。次いで、洗浄バッファー(PBS + 1% v/v Triton-X100; WBと称する)でプレートを３回洗浄し、200μl/ウェルのブロッキングバッファー(PBS + 1% w/v BSA)を用いて、室温(RT)で2hブロッキングした。次いでWBで３回プレートを洗浄し、400-SEQ.B, BI400-015, BI400-201, BI400-204d, 組換えgp41 (Shin-Won Scientific, SWO 102 gp41), BI301-23 (非関連のタンパク質; コントロール), ペプチドなし(すなわちPBS; コントロール), LTNP-血清プール(最終濃度1:10に希釈)又は血液ドナーの血清プール(最終濃度1:10に希釈; コントロール)の系列希釈液(10〜1000μMの最終濃度範囲)と共に(4℃で一晩)予めインキュベートされた60〜100μl/ウェルのウサギ血清試料(最終濃度1:10〜1:250に希釈)を添加し、37℃で1hインキュベートした。次いでWBで６回プレートを洗浄し、70μl/ウェルのアルカリホスファターゼ-コンジュゲートヤギ-抗-ウサギ-Ig (6μg/ml; Dako D0487)と共にRTで1hインキュベートした。次いでWBで６回プレートを洗浄し、100μl/ウェルの0.3％ w/vフェノールフタレインモノホスフェート(Sigma P-5758)を用いて、RTで10〜60分インキュベートした。最後に、100μl/ウェルのクエンチ溶液(0.1M TRIS + 0.1M EDTA + 0.5M NaOH + 0.01% w/v NaN3; pH14)を添加することによってプレートをクエンチし、ELISAリーダー(ASYS UVM 340)を用いて550 nmで読み取った。
【０２７３】
実施例11
以下の実施例で用いられる本発明に従うペプチドは、Sheppard, (1978) J.Chem.Soc., Chem. Commun., 539のFmoc-ストラテジをc-末端アミドとして用いて、Schafer-Nが合成した。
【０２７４】
細胞浸透アッセイ
ビオチニル化されたペプチドの細胞内染色
ヒトPBMCの染色には、96-ウェルU-底ポリスチレンプレート(NUNC, カタログ番号: 163320)を用いた。簡潔には、8μlのN-又はC-末端でビオチニル化された本発明に従うペプチド(すなわち、各ペプチドについて試験された5mM, 2.5mM及び1.25mM)を、血液ドナーからの40μlのPBMC (12.5 x 106 細胞/ml)と共に37℃で2hインキュベートした。次いで、150μlのCellwash (BD, カタログ番号: 349524)で細胞を３回洗浄し、100μlのトリプシン-EDTA (Sigma, カタログ番号: T4424)で各細胞ペレットを再懸濁し、次いで37℃で5分間インキュベートした。次いで、150μlのCellwash (BD, カタログ番号: 349524)を用いて、トリプシン処理した細胞を３回洗浄し、BD Cytofix/Cytoperm (商標)＋(BD, カタログ番号: 554715)で再懸濁し、次いで、製造業者に従って4℃で20分間インキュベートした。次いで、150μlのPermWash (BD, カタログ番号: 554715)を用いて、細胞を２回洗浄した。次いで、ストレプトアビジン-APC (BD, カタログ番号: 554067)及び抗-hCD11c (eBioscience, カタログ番号: 12-0116)を用いて、製造業者に従って、4℃で30分間細胞を染色し、ビオチニル化されたペプチド及び樹状細胞をそれぞれ可視化した。次いで、150μlのPermWashを用いて細胞を３回洗浄し、染色バッファー(BD, カタログ番号: 554656)に再懸濁し、フローサイトメトリを行った。樹状細胞は、リンパ球領域外のCD11c+事象としてゲートした(すなわち、リンパ球よりも高いFSC及びSSCシグナル)。HTSローダーを有するFACSCanto IIフローサイトメーターを用いて全200 000細胞を得、全細胞及び樹状細胞の両方について、ペプチド-蛍光(すなわちGeoMean)に関するヒストグラムを作成した。
【０２７５】
ビオチニル化されたペプチドの細胞外染色
ヒトPBMCの染色には、96-ウェルU-底ポリスチレンプレート(NUNC, カタログ番号: 163320)を用いた。簡潔には、表1又は表2に従う8μlのN-又はC-末端でビオチニル化されたペプチド(すなわち、各ペプチドについて試験された5mM, 2.5mM及び1.25mM; 全てのペプチドは、商業上の供給者によって、固相合成により製造された)を、40μlの血液ドナーからのPBMC (12.5 x 106 細胞/ml)を用いて37℃で2hインキュベートした。次いで、150μlのCellwash (BD, カタログ番号: 349524)を用いて細胞を３回洗浄し、次いで、ストレプトアビジン-APC (BD, カタログ番号: 554067)及び抗-hCD11c (eBioscience, カタログ番号: 12-0116)を用いて、製造業者に従って、4℃で30分間染色し、ビオチニル化されたペプチド及び樹状細胞をそれぞれ可視化した。次いで、150μlのCellwash (BD, カタログ番号: 349524)を用いて３回細胞を洗浄し、染色バッファー(BD, カタログ番号: 554656)に再懸濁し、フローサイトメトリを行った。樹状細胞は、リンパ球領域外のCD11c+事象としてゲートした(すなわち、リンパ球よりも高いFSC及びSSCシグナル)。HTSローダーを有するFACSCanto IIフローサイトメーターを用いて全200 000細胞を得、全細胞及び樹状細胞の両方について、ペプチド-蛍光(すなわちGeoMean)に関するヒストグラムを作成した。
【０２７６】
本発明に従うCMIペプチドは、その天然の対応物と比べて、細胞に入る能力が改善されていることがはっきりと見られた。
データは、FACS Duvaソフトウェアによって算出された、試験された各々のペプチドのgeomean-値である。Geomean値は、トリプシン処理/細胞固定/細胞浸透による:
【０２７７】
実施例12
あるいは、陽性CTL応答は、ELISPOTアッセイによってアッセイされ得る。
【０２７８】
ELISPOTアッセイによるヒトIFN-γ細胞毒性T-細胞(CTL)応答
簡潔には、1日目に、フラスコ(430 000 PBMC/cm2)中で2h、37℃、5% CO2下で、覆うことができる量の培養培地(L-グルタミンを補ったRPMI 1640 Fisher Scientific; カタログ番号. PAAE15-039 (MedProbe カタログ番号. 13E17-605E, 10%胎児ウシ血清(FBS), Fisher Scientific カタログ番号. A15-101)及びペニシリン/ストレプトマイシン(Fisher Acientific カタログ番号. P11-010)中で、HCV患者からのPBMC試料をインキュベートし、単球を付着させた。付着しなかった細胞を単離し、洗浄し、次に使用するまでFBS中の10% V/V DMSO中で凍結させた。付着した細胞を培養培地で注意深く洗浄し、３日目まで37℃で、最終濃度2μg/mlのhrGM-CSF (Xiamen amoytop biotech co, カタログ番号: 3004.9090.90)及び1μg/mlのhrIL-4 (Invitrogen, カタログ番号: PHC0043)、及び任意に免疫調節剤(IMiD)を含む培養培地中でインキュベートし、次いでこの手順を６日目に繰り返した。７日目に、0.5μg/ウェルの抗-ヒトγインターフェロンでコーティングされたELISPOT (Millipore multiscreen HTS)プレートに、培養した樹状細胞(5 000〜10 000/ウェル)を、融解させた付着していない自家細胞(200 000/ウェル), 抗原試料(ペプチド抗原について1〜8μg/mlの最終濃度; コンカナバリンA (Sigma, カタログ番号: C7275)又はPHA (Sigma, カタログ番号: L2769))について5μg/mlの最終濃度及び抗-アネルギー抗体(抗-PD-1 (eBioscience, カタログ番号: 16-9989-82)及び抗-PD-L1 (eBioscience, カタログ番号: 16-5983-82)の両方について0.03〜0.05μg/mlの最終濃度)と共に添加した。プレートを一晩インキュベートし、製造業者に従って、スポットを作製した。ELISPOTリーダー(CTL-ImmunoSpot(登録商標) S5 UV Analyzer)を用いてスポットを読み取った。
【０２７９】
実施例13
ELISPOTアッセイによるインフルエンザ特異的M2e応答
１日目に、血液ドナーからのPBMC試料を融解させ、温められた培地で洗浄し、フラスコ(250000PBMC/cm2)中で24時間37℃、5% CO2下で、覆うことができる量の培養培地(ウルトラ-グルタミン, Lonza, BE12-702F701; 10%胎児ウシ血清(FBS), Fisher Scientific カタログ番号. A15-101; ペニシリン/ストレプトマイシン, Fisher Scientific カタログ番号. P11-010を含むRPMI 1640)中でインキュベートし、融解後の細胞を戻した。２日目に、96ウェル平底Falcon Microtest組織培養プレートに、容量200μlの完全培地中500 000細胞/ウェルで細胞を添加した。別のウェルに、6日間37℃、5% CO2下で、２回の記載された刺激及び任意に免疫調節剤(IMiD)を加えたか、又はコントロールとしての培地と共に放置した。インキュベーションの６日後、1μg/mlの天然インフルエンザM2eタンパク質でコーティングしたELISPOT (Millipore multiscreen HTS)プレートに100μlの細胞懸濁液を移した。24時間インキュベーション後、PBS + 0,05% Tween20で４回、及びPBS (200μl/ウェル)で５回、プレートを洗浄した。マウス抗-ヒトIgG又はIgMビオチン(Southern Biotech 9040-08及び9020-08)を0.5% FBSを有するPBSに希釈し、90分間37℃でインキュベートした。上記の洗浄を繰り返し、80μlのストレプトアビジン-アルカリ-ホスファターゼ(Sigma Aldrich, S289)を各ウェルに添加し、暗中室温で60分間インキュベートした。次いで、PBS + 0.05% Tween20で２回、及びPBS (200μl/ウェル)で４回ウェルを洗浄し、基質であるVector Blue Alkaline Phosphatase Substrate kit III (Vector Blue, SK-5300 )を添加し、7分間室温で発色させた。流水で反応を停止し、プレートを乾燥させ、ELISPOTリーダー(CTL-ImmunoSpot(登録商標)S5 UV Analyzer)によってスポットを数えた。
【０２８０】
ELISAによるインフルエンザ特異的M2e応答
100μlの(8μg/mlの冷コーティングバッファー - 0.05M Na2CO3 pH9.6; CBと称する -中で1〜3日間予めインキュベートした)上記の抗原又はCB単独(バックグラウンドコントロール)を用いて、マイクロタイタープレートのウェルを4℃でコーティングした。次いで、マイクロタイタープレートを洗浄バッファー(PBS + 1% v/v Triton-X100; WBと称する)で３回洗浄し、200μl/ウェルのブロッキングバッファー(PBS + 1% w/v BSA)を用いて2h室温(RT)でブロッキングした。次いで、WBで３回プレートを洗浄し、50〜70μl/ウェルのヒト(又はウサギ若しくはヒツジ)血清(希釈バッファー(PBS + 1% v/v Triton-X100 + 1% w/v BSA; DBと称する)中1:5〜1:250の範囲の系列希釈液)を添加し、37℃で1hインキュベートした。次いで、WBで６回プレートを洗浄し、70μl/ウェルのアルカリホスファターゼ-コンジュゲートプロテインG (DB中3μg/ml; Calbiochem 539305)又はヤギ抗-マウスIgGビオチン(1μg/ml, Southern Biotech, 1030-08)と共にRTで1hインキュベートした。ヤギ抗-マウスIgGビオチンの場合、上記の工程を更に１回行ってプレートを洗浄し、100μlのストレプトアビジン-アルカリ-ホスファターゼ(1μg/ml, Sigma Aldrich, S289)を添加し、1時間RTでインキュベートした。次いで、WBで６回プレートを洗浄し、100μl/ウェルの0.3% w/vフェノールフタレインモノホスフェート(Sigma P-5758)と共に室温で10〜60分間インキュベートした。最後に、100μl/ウェルのクエンチ溶液(0.1M TRIS + 0.1M EDTA + 0.5M NaOH + 0.01% w/v NaN3; pH14)を添加することによってプレートをクエンチし、ELISAリーダー(ASYS UVM 340)を用いて550 nmで測定した。次いで、血清の強度、すなわち液性免疫応答の規模を、記載された光学密度(OD)値をもたらす血清希釈率又は記載された血清希釈率におけるOD値として記録した。
【配列表】
2015520179000001.app
【国際調査報告】
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