(57)【要約】１５個の異なる多糖類・タンパク質接合体を含む免疫原性組成物に係り、各接合体は、運搬体タンパク質に接合された異なる血清型のストレプトコッカス・ニューモニエ、すなわち、血清型１，２，３，４，５，６Ａ，６Ｂ，７Ｆ，９Ｎ，９Ｖ，１４，１８Ｃ，１９Ａ，１９Ｆ及び２３Ｆから製造された莢膜多糖類を含み、アルミニウム系アジュバントを有したワクチンに製剤化された免疫原性組成物は、乳児及び小児において、肺炎球菌疾患に対する適用範囲を増大させる。
2015520227.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理学的に許容されるビークルと共に、１５個の異なる多糖類・タンパク質接合体を含む多価免疫原性組成物であって、
それぞれの接合体が運搬体タンパク質に接合された異なる血清型のストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）由来の莢膜多糖類を含み、前記莢膜多糖類が、血清型１，２，３，４，５，６Ａ，６Ｂ，７Ｆ，９Ｎ，９Ｖ，１４，１８Ｃ，１９Ａ，１９Ｆ及び２３Ｆから製造される多価免疫原性組成物。
【請求項２】
前記運搬体タンパク質が、ＣＲＭ１９７であることを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
アジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記アジュバントが、アルミニウム系アジュバントであることを特徴とする請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム及び水酸化アルミニウムからなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記アジュバントが、リン酸アルミニウムであることを特徴とする請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のうちいずれか１項に記載の免疫原性組成物の免疫学的有効量を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖類接合体に対する免疫反応を誘導するための薬学組成物。
【請求項８】
免疫原性組成物が、２μｇの各糖類、ただし、６Ｂは４μｇ；約３４μｇのＣＲＭ１９７運搬体タンパク質；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバント；並びに賦形剤として、塩化ナトリウム及びコハク酸ナトリウムの緩衝液を含むように製剤化された単一０．５ｍＬ容量であることを特徴とする請求項７に記載の薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１５個の肺炎球菌血清型１，２，３，４，５，６Ａ，６Ｂ，７Ｆ，９Ｎ，９Ｖ，１４，１８Ｃ，１９Ａ，１９Ｆ及び２３Ｆ由来の莢膜多糖類（capsular polysaccharide）を、ＣＲＭ１９７などの運搬体タンパク質に接合して製造された多価免疫原性組成物に関する。本発明による接合体組成物は、医学分野、特に、微生物学、免疫学、ワクチンと係り、免疫接種でもって、嬰児・乳児及び小児そして成人の肺炎球菌による疾患の予防に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）は、肺炎の主要な原因菌である。統計庁「２０１０年主要死亡原因別死亡率推移」によれば、２０１０年肺炎による死亡率は、１０万人当たり１４．９人であり、１０代死亡原因の一つであり、２０００年対比で、８２．９％増加したと分かった。また、２０１２年ＷＨＯによれば、２００８年度に、全世界的に、ＨＩＶ陰性である５歳以下の子供４７６，０００人がストレプトコッカス・ニューモニエによる感染で死亡し、５歳以下子供全体死亡者のうち５％がこの菌による疾患で死亡した。
【０００３】
肺炎球菌による疾患を予防するために、１９７７年、Ｄｒ．Robert Austrianによって、１４価多糖類ワクチンが開発され、その後、２３価多糖類ワクチンに発展した。多価肺炎球菌多糖類ワクチンは、老人及び高危険患者において、肺炎球菌疾患の予防にあたり、有用であると立証された。しかし、乳児及び小児は、ほとんどの肺炎球菌多糖類に対して、免疫反応が良好に起こらないが、これは、Ｔ−cell非依存的免疫反応現象のためである。７価肺炎球菌接合体ワクチン（プレブナール（Prevnar）（登録商標））は、最も発生頻度が高い７個の血清型４，６Ｂ，９Ｖ，１４，１８Ｃ，１９Ｆ及び２３Ｆ由来の莢膜多糖類を含む。２０００年、米国で最初に承認された後、乳児及び小児において、侵襲性疾患及び中耳炎に対して、免疫原性が高くて効果的であると立証された。該ワクチンは、現在全世界８０ヵ国余りの国家で承認されている。
プレブナールは、米国、ヨーロッパ及び全世界の他の地域で、侵襲性肺炎球菌疾患のおおよそ８０ないし９０％、６０ないし８０％、及び４０ないし８０％をそれぞれカバーしている。プレブナールの導入後、数年間蓄積された監視（surveillance）データでは、予想されていたように、米国において、プレブナールに含まれた血清型による侵襲性肺炎球菌疾患が明確に低減した。しかし、一部地域では、血清型適用範囲に限界があり、プレブナールに含まれていない血清型、特に、１９Ａによる侵襲性肺炎球菌疾患は増加した。
２０１０年２月、ＡＣＩＰ（Advisory Committee on Immunization Practices）は、新たに許可された１３価肺炎球菌接合ワクチン（ＰＣＶ−１３）の使用勧告を発表した。
ＰＣＶ−１３は、プレブナールに含まれた７個の血清型（４，６Ｂ，９Ｖ，１４，１８Ｃ，１９Ｆ，２３Ｆ）以外に、６個の追加血清型（１，３，５，６Ａ，７Ｆ，１９Ａ）が含有された肺炎球菌接合体ワクチンである。
米国ＡＢＣｓ（Active Bacterial Core surveillance）調査によれば、５歳以下の子供の発病血清型と知られたＩＰＤ件のうち、全６４％がＰＣＶ１３に含まれており、２００７年の場合、５歳以下の子供で発病した４，６００ ＩＰＤ件のうち、ＰＣＶ７による場合が７０件であるのに対し、ＰＣＶ１３の場合は、２，９００件と、過半数以上を占めている。また、血清型交替が表れながら、incidenceが増大した他の血清型を適用範囲に入れた１５価肺炎球菌接合体ワクチンも開発中である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、免疫接種により、嬰児・乳児、小児及び成人の肺炎球菌による疾患を予防するのに有用な多価免疫原性組成物として、血清型２及び９Ｎを含んだ１５個の肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖類を含む多価免疫原性組成物を提供する。
すなわち、本発明は、血清型２及び９Ｎを含んだ血清型１，２，３，４，５，６Ａ，６Ｂ，７Ｆ，９Ｎ，９Ｖ，１４，１８Ｃ，１９Ａ，１９Ｆ及び２３Ｆを含む１５価肺炎球菌接合体（ＰＣＶ−１５）組成物を提供することを目的にする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一様態によって、生理学的に許容されるビークルと共に、１５個の異なる多糖類・タンパク質接合体を含む多価免疫原性組成物であって、それぞれの接合体が運搬体タンパク質に接合された異なる血清型のストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）由来の莢膜多糖類を含み、上記莢膜多糖類が、血清型１，２，３，４，５，６Ａ，６Ｂ，７Ｆ，９Ｎ，９Ｖ，１４，１８Ｃ，１９Ａ，１９Ｆ及び２３Ｆから製造される多価免疫原性組成物が提供される。
【０００６】
本発明による多価免疫原性組成物において、前記運搬体タンパク質は、ＣＲＭ１９７でもある。本発明による多価免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含んでもよく、例えば、アジュバントがアルミニウム系アジュバントを含んでもよい。前記アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム及び水酸化アルミニウムからなる群から選択され、望ましくは、リン酸アルミニウムである。
【０００７】
本発明の他の様態によって、前記免疫原性組成物の免疫学的有効量を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖類接合体に対する免疫反応を誘導するための薬学組成物が提供される。
一具現例において、前記薬学組成物は、２μｇの各糖類、ただし、６Ｂは、４μｇ、約３４μｇのＣＲＭ１９７運搬体タンパク質、０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバント、並びに賦形剤として、塩化ナトリウム及びコハク酸ナトリウムの緩衝液を含むように製剤化された免疫原性組成物でもある。
【発明の効果】
【０００８】
本発明による多価免疫原性組成物は、血清型２及び９Ｎを含んだ１５個の肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖類を含むことにより、優秀な血清ＩｇＧ力価と機能的抗体活性とを誘導することができる。従って、本発明による多価免疫原性組成物は、嬰児・乳児、小児及び成人の肺炎球菌による疾患を予防するのに有用に使用される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明によるワクチン組成物及び比較例［（プレブナール７価ワクチン（Prevnar）及びプレブナール１３価ワクチン（Prevnar １３）］の二次接種３週後（すなわち、全６週後）に血清型特異的ＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【図２】本発明によるワクチン組成物及び比較例［（プレブナール７価ワクチン（Prevnar）及びプレブナール１３価ワクチン（Prevnar １３）］の二次接種３週後（すなわち、全６週後）に血清型特異的ＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【図３】本発明によるワクチン組成物及び比較例［（プレブナール７価ワクチン（Prevnar）及びプレブナール１３価ワクチン（Prevnar １３）］の二次接種３週後（すなわち、全６週後）に血清型特異的ＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【図４】本発明によるワクチン組成物及び比較例［（プレブナール７価ワクチン（Prevnar）及びプレブナール１３価ワクチン（Prevnar １３）］の二次接種３週後（すなわち、全６週後）に血清型特異的ＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【図５】本発明によるワクチン組成物及び比較例［（プレブナール７価ワクチン（Prevnar）及びプレブナール１３価ワクチン（Prevnar １３）］の二次接種３週後（すなわち、全６週後）に血清型特異的ＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【図６】本発明によるワクチン組成物及び比較例［（プレブナール７価ワクチン（Prevnar）及びプレブナール１３価ワクチン（Prevnar １３）］の二次接種３週後（すなわち、全６週後）に血清型特異的ＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【図７】本発明によるワクチン組成物及び比較例［（プレブナール７価ワクチン（Prevnar）及びプレブナール１３価ワクチン（Prevnar １３）］の二次接種３週後（すなわち、全６週後）に血清型特異的ＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【図８】本発明によるワクチン組成物及び比較例［（プレブナール７価ワクチン（Prevnar）及びプレブナール１３価ワクチン（Prevnar １３）］の二次接種３週後（すなわち、全６週後）に血清型特異的ＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【図９】本発明によるワクチン組成物及び比較例［（プレブナール７価ワクチン（Prevnar）及びプレブナール１３価ワクチン（Prevnar １３）］の二次接種３週後（すなわち、全６週後）に血清型特異的ＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【図１０】本発明によるワクチン組成物及び比較例［（プレブナール７価ワクチン（Prevnar）及びプレブナール１３価ワクチン（Prevnar １３）］の二次接種３週後（すなわち、全６週後）に血清型特異的ＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【図１１】本発明によるワクチン組成物及び比較例［（プレブナール７価ワクチン（Prevnar）及びプレブナール１３価ワクチン（Prevnar １３）］の二次接種３週後（すなわち、全６週後）に血清型特異的ＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【図１２】本発明によるワクチン組成物及び比較例［（プレブナール７価ワクチン（Prevnar）及びプレブナール１３価ワクチン（Prevnar １３）］の二次接種３週後（すなわち、全６週後）に血清型特異的ＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【図１３】本発明によるワクチン組成物及び比較例［（プレブナール７価ワクチン（Prevnar）及びプレブナール１３価ワクチン（Prevnar １３）］の二次接種３週後（すなわち、全６週後）に血清型特異的ＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【図１４】本発明によるワクチン組成物及び比較例［（プレブナール７価ワクチン（Prevnar）及びプレブナール１３価ワクチン（Prevnar １３）］の二次接種３週後（すなわち、全６週後）に血清型特異的ＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【図１５】本発明によるワクチン組成物及び比較例［（プレブナール７価ワクチン（Prevnar）及びプレブナール１３価ワクチン（Prevnar １３）］の二次接種３週後（すなわち、全６週後）に血清型特異的ＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
抗生物質耐性及び多剤耐性を示す一部血清型によって血清型交替（serotype replacement）が示された。また、血清型分布の地域間偏差によって、プレブナール適用範囲が地域によって異なる限界が提起された（Harboe Z B, Benfield T L, Valentiner-Branth P, et. al., Temporal Trends in Invasive Pneumococcal Disease and Pneumococcal Serotypes over 7 Decades. Clin Infect Dis 2010; 50: 329-37）。従って、既存の肺炎球菌接合体ワクチンから、いかなる血清型も除去する理由がなく、むしろ血清型を追加して適用範囲をさらに広げなければならないという必要性がある。
【００１１】
２００８年、ＧＳＰ（Pneumococcal Global Serotype Project）において、１９８０年から２００７年までのＩＰＤデータを収集して発表した報告資料では、血清型２がtop ２０ global serotypeにおいて、血清型１８Ｃに続いて、１１番目に発生頻度が高い血清型として示された。また、Samir K. Sahaらは、血清型２が、バングラデシュにおいて、肺炎球菌性髄膜炎誘発確率が高く、肺炎球菌接合体ワクチンに含まれず、今後脅威になると報告している（Saha S K, Al Emran H M, Hossain B, Darmstadt G L, Saha S, et. al., (2012) Streptococcus pneumonia Serotype-2 Childhood Meningitis in Bangladesh: A Newly Recognized Pneumococcal Infection Threat. PLoS ONE 2012; 7(3): e32134）。従って、血清型２を含めれば、肺炎球菌疾患の数が減少するだけではなく、今後ＰＣＶ−１３接種で示される血清型交替現象にも備えることができるであろう。
【００１２】
肺炎球菌血清型は、年齢によって、異なる分布様相を示す。特に、肺炎球菌接合ワクチン接種対象である０ないし２３ヵ月以下の嬰児では、２４ないし５９ヵ月の小児と比較し、血清型９Ｎの重要性が相対的に増大するということが分かった。
【００１３】
ＰＣＶ−１３に含まれた血清型１３個に続いて、１４番目に一般的に分離株であった。それは、血清型９Ｎを含めれば、全体、特に、嬰児・幼児において、肺炎球菌疾患の減少に寄与することができるということを示唆する。
【００１４】
本発明は、血清型２及び９Ｎを含んだ１５個の肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖類を含む多価免疫原性組成物を提供する。すなわち、本発明は、生理学的に許容されるビークルと共に、１５個の異なる多糖類・タンパク質接合体を含む多価免疫原性組成物であって、それぞれの接合体が運搬体タンパク質に接合された異なる血清型のストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）由来の莢膜多糖類（capsular polysaccharide）を含み、前記莢膜多糖類が血清型１，２，３，４，５，６Ａ，６Ｂ，７Ｆ，９Ｎ，９Ｖ，１４，１８Ｃ，１９Ａ，１９Ｆ及び２３Ｆから製造される多価免疫原性組成物を提供する。
【００１５】
莢膜多糖類は、当業者に公知された標準技術によって製造される。莢膜多糖類は、粘度を低減させるために、または活性化された莢膜多糖類の溶解度を上昇させるために、大きさを小さくすることができる。本発明において、莢膜多糖類は、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型１，２，３，４，５，６Ａ，６Ｂ，７Ｆ，９Ｎ，９Ｖ，１４，１８Ｃ，１９Ａ，１９Ｆ及び２３Ｆから製造される。該肺炎球菌接合体は、別個の過程によって製造され、単一投与剤形として製剤化される。例えば、各肺炎球菌多糖類血清型を大豆基材培地で増殖させ、続いて個々の多糖類を、遠心分離、沈澱、限外濾過を介して精製する。
【００１６】
運搬体タンパク質は、望ましくは、無毒性であって非反応原性であり、十分な量及び純度で得ることができるタンパク質である。前記運搬体タンパク質は、標準接合方法に適するものでなければならない。本発明による多価免疫原性組成物において、前記運搬体タンパク質は、ＣＲＭ１９７でもある。ＣＲＭ１９７は、カザミノ酸基材及び酵母抽出物基材の培地で増殖させたジフテリア菌（Corynebacterium diphtheria）菌株Ｃ７（β１９７）の培養物から分離されたジフテリア毒素の無毒性変異体（すなわち、トキソイド）である。ＣＲＭ１９７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈澱及びイオン交換クロマトグラフィを介して精製される。ＣＲＭ１９７は、米国特許第５，６１４，３８２号によって
組み換え的に製造される。
【００１７】
他のジフテリアトキソイドも、運搬体タンパク質として使用される。他の適当な運搬体タンパク質には、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、コレラトキソイド（ＷＯ ２００４／０８３２５１号）、Ｅ．Coli ＬＴ、Ｅ．Coli ＳＴ及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来の外毒素Ａのような不活性化された細菌毒素が含まれる。細菌外膜タンパク質、例えば、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、フォリン、トレンスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシン（adhesin）タンパク質（ＰｓａＡ）、グループＡまたはグループＢの連鎖球菌由来Ｃ５ａペプチダーゼ、またはインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）タンパク質Ｄも使用される。オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体（ＰＰＤ）のような他のタンパク質も、運搬体タンパク質として使用される。
【００１８】
ＣＲＭ１７３、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５のようなジフテリア毒素の変異体も運搬体タンパク質として使用することができる。
【００１９】
運搬体タンパク質と反応することができる糖類を製造するために、精製された多糖類は、化学的に活性化させる。いったん活性化されれば、各莢膜多糖類を運搬体タンパク質に一つずつ接合させ、糖接合体（glycoconjugate）を形成する。一具現例において、各莢膜多糖類を同一の運搬体タンパク質に接合させる。多糖類の化学的活性化、及びそれに続く運搬体タンパク質への接合は、公知の方法によって遂行される（米国特許第４，６７３，５７４号、同第４，９０２，５０６号）。過ヨード酸塩（過ヨード酸ナトリウム、過ヨード酸カリウムまたは過ヨード酸含む）のような酸化剤で、莢膜多糖類の末端ヒドロキシル基をアルデヒド基で酸化させる。化学的活性化反応は、不規則な、互いに隣接したヒドロキシル基の酸化的分解を起こす。接合は、還元的アミノ化によって達成される。例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムのような還元剤と共に活性化された莢膜多糖類と、運搬体タンパク質を反応させる。未反応のアルデヒド基は、強力な酸化剤を添加して除去することができる。
【００２０】
得られた多糖類・タンパク質接合体は、多様な方法によって精製することができる（すなわち、多糖類・タンパク質接合体の量を富化することができる）。それら方法の例は、濃縮／透析濾過工程、カラムクロマトグラフィ及び多層濾過を含む。精製された多糖類・タンパク質接合体は、それぞれを混合し、本発明の免疫原性組成物に製剤化し、それをワクチンとして使用することができる。当業界で認められた方法を使用して、本発明の免疫原性組成物の製剤化を行うことができる。例えば、１５個の個々の肺炎球菌接合体を、生理学的に許容されるビークルと共に剤形化し、組成物を製造することができる。そのようなビークルの例としては、水、緩衝食塩水、ポリオール（例：グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）及びデキストロース溶液が含まれるが、それらに制限されるものではない。
【００２１】
一具現例において、本発明の免疫原性組成物は、一つ以上のアジュバントを含む。本明細書で定義される「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を増大させるのに使用される物質である。従って、アジュバントは、たびたび免疫反応をブースターするために提供され、当業者に周知されている。組成物の有効性を増大させるのに適切なアジュバントは、以下を含むが、それらに制限されるものではない：
（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例：水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；
（２）水中油型エマルジョン剤形（ムラミルペプチド（以下で定義される）、または細菌細胞壁成分のような他の特定免疫刺激剤を含んでもよく、含まなくともよい）、例えば、（ａ）ＭＦ５９（ＷＯ ９０／１４８３７号）：５％スクアレン（Squalene）、０．５％トゥイーン（Tween）８０及び０．５％スパン（Span）８５を含み（任意に多様な量のＭＴＰ−ＰＥ（必要ではないが、以下を参照）を含む）、Model １１０Ｙマイクロフルオダイザ（microfluidizer）［Microfluidics，Newton，ＭＡ］のようなマイクロフルオダイザを使用して、サブミクロン粒子に剤形化、（ｂ）ＳＡＦ：１０％スクアレン、０．４％トゥイーン８０、５％プルロニック（pluronic）−ブロック重合体Ｌ１２１及びｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照）を含み、サブミクロンエマルジョンに微細流動化（microfluidization）されたり、あるいは渦動させて大粒子サイズのエマルジョンを形成、及び（ｃ）リビ（Ribi）ＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）［Corixa，Hamilton，ＭＴ］：２％スクアレン、０．２％トゥイーン８０、及び米国特許第４，９１２，０９４号に記述された３−Ｏ−脱アシル化されたモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＴＭ）［Corixa］、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなるグループからの一つ以上の細菌細胞壁成分、望ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（デトックス（Detox）ＴＭ）を含む；
（３）Quil Ａまたはスティミュロン（STIMULON）ＴＭＱＳ−２１［Antigenics，Framingham，ＭＡ］（米国特許第５，０５７，５４０号）のようなサポニンアジュバントが使用されたり、あるいはそこから生成された粒子（例：ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体））；
（４）細菌脂質多糖類、合成リピドＡ同族体（例：アミノアルキルグルコースアミンホスフェート化合物（ＡＧＰ））、あるいはその誘導体または同族体［それは、Corixaから購入することができ、米国特許第６，１１３，９１８号に記述されている；１種のそのようなＡＧＰは、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ポスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドで、それはまた、５２９としても知られており（以前には、ＲＣ５２９として知られている）、それは、水性型または安定したエマルジョンとして剤形化される］、
（５）合成ポリヌクレオチド（例：ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号））；
（６）サイトカイン、例えば、インターロイキン（例：ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８など）、インターフェロン（例：ガンマインターフェロン）、顆粒球大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、大食細胞コロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共同刺激分子Ｂ７−１及びＢ７−２など；
（７）野生型コレラ毒素（ＣＴ）または、例えば、ＷＯ ００／１８４３４号による、アミノ酸２９番位置にあるグルタミン酸が、他のアミノ酸、望ましくは、ヒスチジンに置換された、突然変異型コレラ毒素（ＷＯ ０２／０９８３６８号及びＷＯ ０２／０９８３６９号）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．coli熱不安定性毒素（ＬＴ）、特に、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（ＷＯ ９３／１３３０２号及びＷＯ ９２／１９２６５号）のような細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素の無毒化された突然変異体；及び
（８）Complement component Ｃ３ｄのtrimerのような補体。
【００２２】
ムラミルペプチドには、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが含まれるが、それらに制限されるものではない。
【００２３】
特定具現例において、アルミニウム塩が、アジュバントとして使用される。アルミニウム塩アジュバントは、アルミニウム沈澱ワクチン（alum−precipitated vaccine）やアルミニウム吸着ワクチン（alum−adsorbed vaccine）でもある。アルミニウム塩には、水和されたアルミナ、アルミナ水和物、アルミナ３水和物（ＡＴＨ）、アルミニウム水和物、アルミニウム３水和物、アルハイドロゲル、Superfos、Amphojel、水酸化アルミニウム（ＩＩＩ）、ヒドロキシリン酸アルミニウムサルフェート（aluminum phosphate adjuvant（ＡＰＡ））、無定形アルミナなどが含まれるが、それらに制限されるものではない。ＡＰＡは、ヒドロキシリン酸アルミニウムの懸濁液である。塩化アルミニウムとリン酸ナトリウムとを１：１の比率で混合すれば、ヒドロキシリン酸アルミニウムサルフェートが沈澱する。High shear mixerを利用して、沈殿物の大きさを２〜８μｍにした後、生理食塩水で透析して滅菌して製造する。一具現例において、商業的に利用可能なＡｌ（ＯＨ）３（例えば、アルハイドロゲルまたはSuperfos）を使用して、タンパク質を吸着させる。
【００２４】
水酸化アルミニウム１ｍｇ当たり５０〜２００ｇのタンパク質が吸着され、該比率は、タンパク質のｐＩと溶媒のｐＨとに依存的である。低いｐＩのタンパク質は、高いｐＩを有したタンパク質に比べて強く結合する。アルミニウム塩は、２〜３週間徐々に抗原を放出する抗原保存所を形成し、非特異的に大食細胞、補体、先天性免疫のメカニズムを活性化させる。
【００２５】
本発明は、前記免疫原性組成物の免疫学的有効量を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖類接合体に対する免疫反応を誘導するための薬学組成物（例えば、ワクチン製剤）を提供する。
【００２６】
本発明によるワクチン製剤は、全身または粘膜経路で投与することにより、肺炎球菌に感染されやすい者を保護したり、あるいは治療したりするのに使用される。本明細書で定義される「有効量」とは、ストレプトコッカス・ニューモニエに感染される確率、または感染の深刻性を相当に低下させるほどの抗体を誘発するのに必要な投与量をいう。
【００２７】
投与には、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下の経路を介した注射；または口腔／消化管、気道管または泌尿生殖管への粘膜投与が含まれる。一具現例において、肺炎または中耳炎の治療のために、鼻内投与が使用され、それは、肺炎球菌の鼻咽頭保菌をさらに効果的に予防し、初期段階において、感染を弱化させることができるからである。各ワクチン用量において、前記接合体の量は、相当する副作用なしに、免疫保護反応を誘導する量で選択される。そのような量は、肺炎球菌の血清型によってことなる。一般的に、各用量は、０．１ないし１００μｇ、望ましくは、０．１ないし１０μｇ、さらに望ましくは、１ないし５μｇの多糖類を含む。特定ワクチンに対する成分の最適量は、被験者で適切な免疫反応の観察を含む標準研究によって確認される。例えば、動物実験結果を外挿し、人を対象にしたワクチン接種用量を決定することができる。また、経験的に用量を決定することができる。
【００２８】
本発明の一具現例において、本発明のワクチン組成物は、それぞれＣＲＭ１９７に接合された血清型１，２，３，４，５，６Ａ，６Ｂ，７Ｆ，９Ｎ，９Ｖ，１４，１８Ｃ，１９Ａ，１９Ｆ及び２３Ｆの肺炎球菌莢膜多糖類の滅菌液体剤形である。それぞれ０．５ｍＬ用量に、２μｇの各糖類、ただし６Ｂは、４μｇであり、約３４μｇ ＣＲＭ１９７運搬体タンパク質、０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇリン酸アルミニウム）アジュバント、並びに賦形剤として塩化ナトリウム及びコハク酸ナトリウムの緩衝液が含有されるように製剤化される。前記液体は、保存剤なしに、単一容量の注射器内に充填される。振盪すれば、直ちに筋肉内投与することができる均質の白色懸濁液のワクチンになる。
【００２９】
本発明の他の具現例において、本発明の組成物は、単回接種によって投与される。
例えば、本発明のワクチン組成物は、適切な間隔で、２回、３回、４回またはそれ以上投与され、例えば、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月または６ヵ月の間隔で、あるいはそのいかなる組み合わせによっても投与される。免疫接種計画は、プレブナールについて明示されたところによる。例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエによって発生する侵襲性疾患に対して、乳児及び嬰児を対象にした定期接種計画は、生後２ヵ月、４ヵ月、６ヵ月及び１２ヵ月ないし１５ヵ月である。従って、当該様態において、組成物を生後２ヵ月、４ヵ月、６ヵ月及び１２ヵ月ないし１５ヵ月で４回接種する。
【００３０】
本発明の組成物はまた、ストレプトコッカス・ニューモニエ由来の一つ以上のタンパク質を含んでもよい。含めるのに適切なストレプトコッカス・ニューモニエタンパク質の例としては、ＷＯ ０２／０５３７６１号に記述されたタンパク質だけではなく、ＷＯ ０２／０８３８５５号で同定されたタンパク質も含まれる。
【００３１】
本発明の組成物は、当業者に公知された一つ以上の投与経路、非経口、経皮、または粘膜、鼻内、筋肉内、腹腔内、皮内、静脈または皮下の経路などで被験者に投与され、それによって、製剤化することができる。一具現例において、本発明の組成物は、液状製剤であり、筋肉内、腹腔内、表皮、静脈、動脈または皮下の経路を介した注射；または呼吸器粘膜注射で投与することができる。注射用液状製剤は、溶液またはそのような種類を含む。
【００３２】
本発明の組成物は、単回投与用量バイアル、多回投与用量バイアルまたはプレフィルドシリンジの形態で製剤化することができる。液状製剤に使用される、薬剤学的に許容される担体には、水性溶液または非水性溶媒、懸濁液、エマルジョン、オイルがある。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エチルオレートがある。
【００３３】
水性担体は、水、アルコール／水性溶媒、エマルジョンまたは懸濁液、生理食塩水、バッファ溶液を含む。オイルの例としては、植物性オイルまたは動物性オイル、ピーナッツオイル、大豆油、オリーブオイル、ひまわりオイル、肝油、水産油脂（marine oil）のような合成オイル、牛乳や卵から得た脂質がある。薬剤学的組成物は、等張性、高張性または低張性である。しかし、注入剤（infusion）や注射で投与される薬剤学的組成物は、基本的に等張性が望ましい。従って、等張性や高張性が組成物の保存に有利である。薬剤学的組成物が高張性である場合、投与前に等張性になるように希釈することができる。等張化剤は、塩のようなイオン性等張化剤でもあり、炭水化物のような非イオン性等張化剤でもある。イオン性等張化剤には、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムなどが含まれるが、それらに制限されるものではない。非イオン性等張化剤には、ソルビトール、グリセロールなどが含まれるが、それらに制限されるものではない。
【００３４】
望ましくは、最小限１種の、薬剤学的に許容される緩衝液を含む。例えば、薬剤学的組成物が注入剤（infusion）や注射剤である場合、ｐＨ４ないしｐＨ１０、例えば、ｐＨ５ないし９、ｐＨ６ないし８で緩衝能を有する緩衝液によって構成されることが望ましい。緩衝液は、ＴＲＩＳ、アセテート、グルタメート、ラクテート、マレート、タルトレート、ホスフェート、シトレート、カーボネート、グリシネート、ヒスチジン、グリシン、スクシネート、トリエタノールアミンの緩衝液で構成されたグループのうちから選択することができる。
【００３５】
特に、薬剤学的組成物が、非経口投与を目的にする場合、緩衝液は、ＵＳＰに適する緩衝液のうちから選択することができる。例えば、緩衝液は、酢酸、ベンゾ酸、グルコン酸、グリセリン酸、乳酸のような一塩基酸；アコニット酸、アジピン酸（adipic acid）、アスコルビン酸、炭酸（carbonic acid）、グルタミン酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸のような二塩基酸；クエン酸、リン酸のような多塩基酸；アンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミン、ＴＲＩＳのような塩基から構成されたグループのうちから選択することができる。
【００３６】
非経口的投与時、ビークル（皮下、静脈内、動脈内、筋肉内の注射）には、塩化ナトリウム溶液、Ringer’sデキストロース溶液、デキストロース及び塩化ナトリウム、lactated Ringer’s溶液、並びに不揮発性油（fixed oils）が含まれる。静脈内投与用ビークルには、Ringer’s dextrose溶液、またはそのような溶液を基本にした水液と、栄養補充剤と、電解質補充剤とが含まれる。界面活性剤と薬剤学的に適するアジュバントが添加されているか、あるいは添加されていない水と、オイルのような滅菌された液体とがその例である。一般的に、水、生理食塩水、デキストロース溶液、関連糖溶液、プロピレングリコールやポリエチレングリコールのようなグリコール、ポリソルベート８０が、特に注射液に適する。オイルの例としては、動物性及び植物性のオイル、ピーナッツオイル、大豆油、オリーブオイル、ひまわりオイル、肝油、水産油脂のような合成オイル、牛乳や卵から得た脂質がある。
【００３７】
本発明の製剤は、界面活性剤を含んでもよい。望ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（普通、Tweensと呼ばれる）のうち、特に、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０；酸化エチレン（ＥＯ）、酸化プロピレン（ＰＯ）、酸化ブチレン（ＢＯ）の共重合体（例：ＤＯＷＦＡＸＴＭ）；エトキシ（oxy−１，２−ethanediyl）基の反復数が互いに異なるオストキシノール類、特に、オストキシノール−９（Triton−１００）；エチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；レシチンのようなリン脂質；TergitolＴＭ ＮＰシリーズのようなノニルフェノールエトキシレート、ラウリル、セチル、ステアリル、オレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪酸エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤）、特に、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）；ＳＰＡＮｓと知られたソルビタンエーテル、特に、ソルビタントリオレート（Span ８５）及びソルビタンモノラウレートのような界面活性剤を含むが、それらに限られるものではない。Tween ８０は、エマルジョンに含まれるのに望ましい。
【００３８】
Tween ８０／Span ８５のような界面活性剤の混合物も使用することができる。Tween ８０のようなポリオキシエチレンソルビタンエステルと、Triton Ｘ−１００のようなオストキシノールとの組み合わせも適する。Laureth ９と、Tweenあるいはオストキシノールとの組み合わせも有用である。
【００３９】
望ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例：Tween ８０）を０．０１％ないし１％（ｗ／ｖ）、特に、０．１％；オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例：Triton Ｘ−１００）は、０．００１％ないし０．１％、特に、０．００５％ないし０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例：laureth ９）は、０．１％ないし２０％、可能であるならば０．１％ないし１０％、特に、０．１％ないし１％または約０．５％を含む。一具現例において、薬剤学的組成物は、放出調節システムによって伝達される。例えば、静脈内注入、経皮貼布（transdermal patch）、リポソームまたは他の経路によって投与される。一様態において、マイクロスフィアまたはインプラントのような高分子物質が使用される。
【００４０】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本発明の説明のためのものであり、それら実施例によって本発明が制限されるものであると解釈されてはならない。
【実施例】
【００４１】
実施例１．ストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖類の製造
ストレプトコッカス・ニューモニエ培養と莢膜多糖類の精製は、当業者に公知された方法によって行われた。ストレプトコッカス・ニューモニエの各血清型は、受託機関［ＡＴＣＣ：American Type Culture Collection］から入手することができる。莢膜及び非運動性、グラム陽性、lancet-shaped双球菌、血液寒天培地でアルファ溶血現象でストレプトコッカス・ニューモニエを同定した。血清型は、特定抗血清を利用したQuellung testを基で確認した（米国特許第５，８４７，１１２号）。
【００４２】
細胞銀行の製造
菌株を増大させ、動物性起源の成分を除去するために、原種菌（seed stock）を世代か培養した（Ｆ１世代、Ｆ２世代及びＦ３世代）。原種菌を２世代さらに培養した。さらなる第１世代は、Ｆ３バイアルから培養し、後続世代は、さらなる第１世代のバイアルから培養した。冷凍保存剤として、合成グリセロールと共に、種菌バイアルを冷凍保管した（−７０℃以下）。細胞銀行製造のために、すべての培養物を大豆基材培地で増殖させた。冷凍させる前に、遠心分離によって細胞を濃縮させ、使用された培地を除去した後、冷凍保存剤（例：合成グリセロール）を含む新たな培地に細胞ペレットを再懸濁させた。
接種
製造用細胞銀行由来の培養物を使用して、大豆基材培地を含む種菌ビンに接種した。種菌ビンを使用して、大豆基材培地を含む種菌発酵器に接種した。
種菌培養
温度及びｐＨを調節しながら、種菌発酵器で発酵させた。目標吸光度に達した後、大豆基材培地を含む生産発酵器に接種した。
生産培養
生産培養は、醗酵の最後の段階である。温度、ｐＨ及び撹拌速度を調節した。
不活性化
成長が中断された後、不活性化剤を添加して醗酵を終結させた。不活性化後、発酵器の内容物を冷却させてｐＨを調節した。
精製
培養物ブロスを遠心分離して濾過し、細菌細胞残骸を除去した。数回の濃縮／透析濾過作業、沈澱／溶出及び多層濾過を使用して不純物を除去し、莢膜多糖類を精製した。
【００４３】
実施例２．ストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖類とＣＲＭ１９７との接合体製造
異なる血清型多糖類は、異なる経路によって活性化させた後、ＣＲＭ１９７に接合させた。活性化工程は、目標分子量になるように、莢膜多糖類の大きさを小さくし、化学的に活性化させ、限外濾過を介したバッファ交換を含む。精製ＣＲＭ１９７は、活性化された莢膜多糖類と接合され、接合体は、限外濾過を利用して精製し、最終的に０．２２μｍフィルタで濾過する。ｐＨ、温度、濃度及び時間などの工程パラメータは、下記に記載された通りである。
【００４４】
（１）活性化工程
段階１
最終濃度範囲が１。０ないし２．０ｍｇ／ｍＬになるように、それぞれの血清型多糖類を、注射用水、酢酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムに希釈させた。血清型１の場合、水酸化ナトリウム（０．０５Ｍ最終塩基濃度）を添加し、５０℃±２℃で溶液を恒温処理した。２１ないし２５℃に冷却させ、６．０±０．１の目標ｐＨで塩酸を添加することによって、加水分解を中止した。血清型３の場合、塩酸（０．０１Ｍ最終酸濃度）を添加し、５０℃±２℃で溶液を恒温処理した。２１ないし２５℃に冷却させ、６．０±０．１の目標ｐＨで１Ｍリン酸ナトリウムを添加することによって、加水分解を中止した。血清型４の場合、塩酸（０．１Ｍ最終酸濃度）を添加し、４５℃±２℃で溶液を恒温処理した。２１ないし２５℃に冷却させ、６．０±０．１の目標ｐＨで１Ｍリン酸ナトリウムを添加することによって、加水分解を中止した。血清型６Ａの場合、氷酢酸（０．２Ｍ最終酸濃度）を添加し、６０℃±２℃で溶液を恒温処理した。続いて、温度を２１ないし２５℃に低め、６．０±０．１の目標ｐＨになるように、１Ｍ水酸化ナトリウムを添加した。血清型１４、１８Ｃの場合、氷酢酸（０．２Ｍ最終酸濃度）を添加し、９４℃±２℃で溶液を恒温処理した。続いて、温度を２１ないし２５℃に低め、６．０±０．１の目標ｐＨになるように、１Ｍリン酸ナトリウムを添加した。
段階２：過ヨード酸塩反応
肺炎球菌糖類活性化に必要な過ヨード酸ナトリウムモル当量を、全糖類含量を使用して測定した。完全に混合しながら、全ての血清型に対して、２１ないし２５℃で、１６ないし２０時間、酸化反応を進めた。ただし、血清型１，７Ｆ，１９Ｆの場合、温度を１０℃以下にした。
段階３：限外濾過
酸化された糖類を、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ限外濾過フィルタ（血清型１の場合、３０ｋＤａ、血清型１８Ｃの場合、５ｋＤａの限外濾過フィルタ）にもって注射用水で濃縮及び透析濾過した。血清型１の場合、０．９％塩化ナトリウム溶液で、血清型７Ｆの場合、０．０１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で、そして血清型１９Ｆの場合、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で透析濾過した。透過液を廃棄し、残留液を、０．２２μｍフィルタを介して濾過させた。
段階４：凍結乾燥
血清型３，４，５，９Ｎ、９Ｖ及び１４の場合、濃縮された糖類を、ＣＲＭ１９７運搬体タンパク質と混合し、ガラスビン内に充填して凍結乾燥させた後、−２５℃±５℃で保管した。血清型２，６Ａ，６Ｂ，７Ｆ，１９Ａ，１９Ｆ及び２３Ｆの場合、５％±３％スクロース濃度に逹するように計算された特定量のスクロースを添加した。血清型１，１８Ｃは、スクロース添加を要求しなかった。濃縮された糖類をガラスビン内に充填して凍結乾燥させた後、−２５℃±５℃で保管した。
【００４５】
（２）接合工程
血清型１，３，４，５，９Ｎ，９Ｖ，１４及び１８Ｃの場合、水性接合を使用し、血清型２，６Ａ，６Ｂ，７Ｆ，１９Ａ，１９Ｆ及び２３Ｆの場合、ＤＭＳＯ接合を使用した。
段階１：溶解
水性接合
血清型３，４，５，９Ｎ，９Ｖ及び１４の場合、凍結乾燥された活性化された糖類・ＣＲＭ１９７混合物を解凍させ、室温で平衡化させた。続いて、凍結乾燥された活性化された糖類・ＣＲＭ１９７を、血清型によって決められた比率で、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で再構成した。血清型１，１８Ｃの場合、凍結乾燥された糖類を、ＣＲＭ１９７溶液１Ｌ当たりリン酸ナトリウム０．１１Ｌの一般的な比率で、１Ｍ ２塩基性リン酸ナトリウム中のＣＲＭ１９７溶液に再構成した。
ＤＭＳＯ接合
凍結乾燥された活性化された糖類血清型２，６Ａ，６Ｂ，７Ｆ，１９Ａ，１９Ｆ，２３Ｆ、及び凍結乾燥されたＣＲＭ１９７運搬体タンパク質を室温で平衡化させ、ＤＭＳＯで再構成した。
段階２：接合反応
水性接合
血清型１，３，４，５，９Ｎ，９Ｖ，１４及び１８Ｃの場合、糖類１モル当たりシアノ水素化ホウ素ナトリウム１．０ないし１．２モルになるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加することによって、接合反応を開始させた。反応混合物を、２３℃ないし３７℃で、４４ないし９６時間恒温処理した。温度及び反応時間は、血清型によって異なるように調節した。続いて、温度を２３℃±２℃に低め、塩化ナトリウム０．９％を反応器に添加した。糖類１モル当たり水素ホウ素ナトリウム１．８ないし２．２モル当量になるように、水素ホウ素ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加し、混合物を２３℃±２℃で、３ないし６時間恒温処理した。該過程を介して、糖類に存在する反応していない任意のアルデヒドを還元させた。塩化ナトリウム０．９％を使用して混合物を希釈させ、希釈された接合混合物を、１．２μｍ予備フィルタを使用して濾過させた。
ＤＭＳＯ接合
血清型２，６Ａ，６Ｂ，７Ｆ，１９Ａ，１９Ｆ及び２３Ｆの場合、活性化された糖類及びＣＲＭ１９７運搬体タンパク質を、０．８ないし１．２５ｇ糖類／ｇ ＣＲＭ１９７範囲の比率に混合した。活性化された糖類１モルに対して、シアノ水素化ホウ素ナトリウム０．８ないし１．２モル当量の比率で、シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加することによって、接合反応を開始させた。１％（ｖ／ｖ）の目標濃度で、注射用水を反応混合物に添加し、混合物を２３℃±２℃で、１１ないし２７時間恒温処理した。１００ｍｇ／ｍＬの水素ホウ素ナトリウム溶液（活性化された糖類１モル当たり、一般的に、水素ホウ素ナトリウム１．８ないし２．２モル当量）及び注射用水（目標濃度５％ｖ／ｖ）を反応物に添加し、混合物を２３℃±２℃で、３ないし６時間恒温処理した。
該過程を介して、糖類に存在する反応していない任意のアルデヒドを還元させた。続いて、反応混合物を、０．９％塩化ナトリウムで希釈し、希釈された接合体混合物を、１．２μｍフィルタを介して濾過した。
段階３：限外濾過
希釈された接合混合物を、最小２０容積の０．９％塩化ナトリウムまたは緩衝液を使用して、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ限外濾過フィルタで、濃縮及び透析濾過した。透過液を廃棄した。
段階４：滅菌濾過
１００ｋＤａ ＭＷＣＯ透析濾過後の残留液を、０．２２μｍフィルタを介して濾過した。濾過された産物に対して、製造過程中に制御（糖類含量、遊離タンパク質、遊離糖類及び残余シアニド；ＤＭＳＯ接合の場合、残余ＤＭＳＯを追加）を実施した。濾過した残留液に対して、製造過程中に制御を実施し、さらなる濃縮、透析濾過及び／または希釈が必要であるかいなかということを決定した。必要な場合、濾過された接合体を、最終濃度が０．５５ｇ／Ｌ未満になるように、０．９％塩化ナトリウムを使用して希釈させた。該段階で、糖類含量、タンパク質含量、及び糖類：タンパク質比率に対する遊離試験を実施した。接合体を濾過し（０．２２μｍ）、遊離試験（外観、遊離タンパク質、遊離糖類、耐毒素、分子サイズ決定、残余シアニド、残余ＤＭＳＯ、糖類同一性及びＣＲＭ１９７同一性）を実施した。最終バルク濃縮液を、２ないし８℃で冷蔵保管した。
【００４６】
実施例３．多価肺炎球菌接合体ワクチンの製剤化
バッチ容積（batch volume）及びバルク糖類濃度を基準にして、最終バルク濃縮液の必要量を計算した。必要量の０．８５％塩化ナトリウム（生理食塩水）、ポリソルベート８０及びスクシネート緩衝液を、あらかじめレベリングした製剤化容器に添加した後、バルク濃縮液を添加した。十分に混合し、０．２２μｍフィルタを介して濾過した。バルクリン酸アルミニウムの添加中及び添加後に、製剤化されたバルク液を徐々に混合した。ｐＨをチェックし、必要な場合に調節した。製剤化されたバルク製品を、２ないし８℃で保管した。得られたワクチン組成物は、全０．５ｍＬ中に２μｇの各糖類、ただし、６Ｂは４μｇ、約３２μｇのＣＲＭ１９７運搬体タンパク質；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇリン酸アルミニウム）アジュバント；塩化ナトリウム約４．２５ｍｇ；スクシネート緩衝液約２９５μｇ；及びポリソルベート８０約１００μｇを含んでいる。
【００４７】
実施例４．多価肺炎球菌接合体ワクチンの免疫原性評価
多価肺炎球菌ワクチン、すなわち、実施例３で製造されたワクチン組成物（ＳＫ−１５）が、ラビットで免疫反応を誘導する能力を評価するための研究を行った。そのような免疫原性を、血清ＩｇＧ濃度の場合、抗原特異的ＥＬＩＳＡによって、そして抗体機能の場合、ＯＰＡ（opsonophagocytic assay）によって特性化させた。製剤化された各多糖類の計画されたヒト臨床用量（各ＰＳ ２μｇ、例外：６Ｂ ４μｇ）を使用して、０週次及び３週次のニュージーランドホワイト（New Zealand white）ラビットに対して、筋肉内に免疫接種した。接種後、３週間隔で血清を採取した。
【００４８】
血清型特異的ＩｇＧ濃度の測定
各血清型に対する莢膜多糖類（ＰｎＰｓ）を、５００ｎｇ／ウェルで、９６ウェルプレートにコーティングした。各個体別に、同一量の血清を取り、同グループ同士血清をプーリング（pooling）した。血清プール（serum pool）を、Tween ２０、Ｃ−ＰＳ ４μｇ／ｍＬ及び血清型２２Ｆ莢膜多糖類（ＰｎＰｓ ２２Ｆ）４μｇ／ｍＬが含まれた抗体希釈用緩衝液で、１０倍に順次希釈し、３０分間常温で反応させた。プレートを、洗浄用緩衝液で５回洗浄し、あらかじめ吸着及び希釈した血清５０μＬがコーティングされたウェルプレートに入れた後、室温で１８時間反応させた。反応させたウェルプレートを、同じ方法で洗浄し、各ウェルにゴ−ト抗ラビットＩｇ−Ｇホスファターゼコンジュゲート（goat anti-Rabbit IgG-alkaline phosphatase conjugates）（１：５０，０００）を入れた後、室温で２時間反応させた。プレートを、上記ような方法で洗浄し、各ウェルに基質溶液である１ｍｇ／ｍＬ ｐ−ニトロフェニルアミン緩衝液を入れた後、室温で２時間反応させた。
５０μＬの３Ｍ ＮａＯＨを入れて反応を停止させた後、４０５ｎｍ及び６９０ｎｍで吸光度を測定した。比較例として、７価ワクチン（プレブナール７、ファイザー）、１３価ワクチン（プレブナール１３、ファイザー）を使用して同一に評価し、その結果は、図１ないし図１５の通りである。
【００４９】
機能的免疫原性確認試験（ＯＰＡ）
ＯＰＡ assayで血清を分析し、抗体の機能を評価した。各個体別に、同一量の血清を取り、同グループ同士血清をプーリングし、１０倍ずつ希釈した。ストレプトコッカス・ニューモニエを、各血清型別にＴＨＹ培地で培養し、１０００ＣＦＵ／１０μＬになるように希釈した。Opsonization buffer ２００μＬ、希釈血清１０μＬ、希釈ストレプトコッカス・ニューモニエ１０μＬを混合し、室温で１時間反応させた。あらかじめ分化させたＨＬ−６０細胞と補体との混合液を添加し、ＣＯ２培養器（３７℃）で１時間反応させた。温度を低めて食細胞作用を中断させ、反応液５μＬを、あらかじめ３０ないし６０分間乾燥させた寒天培地に塗抹した。ＣＯ２培養器（３７℃）で１２ないし１８時間培養し、群集個数を数えた。ＯＰＡ力価は、５０％死滅が観察される希釈倍数で表現した。比較例として、１３価ワクチン（プレブナール１３、ファイザー）を使用して同一に評価し、その結果は、下記表１ないし３の通りである。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
【表２】
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【００５２】
【表３】
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【００５３】
本発明によるワクチン製剤、及び比較例のワクチン製剤に対する血清型特異的免疫反応を、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ、及び機能的抗体を測定する補体媒介ＯＰＡで評価した。図１ないし図１５に、ＥＬＩＳＡを利用したＩｇＧ測定結果を示し、表１ないし表３に、ＯＰＡを利用した機能性免疫原性測定結果を表示し、各処理グループ間で、免疫反応を比較した。前記結果は、１５価肺炎球菌ワクチン多糖類を接合させれば、プレブナール１３と比べ、同等であるか、あるいはそれより優秀な血清ＩｇＧ力価と機能的抗体活性とを誘導するということを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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