(57)【要約】  本発明は、ロイシンやイソロイシンなどのアミノ酸を含む混合物からバリンを連続して分離する装置及びそれを用いたバリンの連続分離方法に関し、ロイシンやイソロイシンなどのアミノ酸を含む混合物から高い純度と収率でバリンを連続して分離することができる。【選択図】  図４a
2015506958.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱着剤ポートＤと、
フィードポートＦと、
ラフィネートポートＲと、
抽出物ポートＥと、
前記ポート(Ｄ、Ｆ、Ｒ、Ｅ)とそれぞれ選択的に連結される複数のロータリーバルブ(１０、２０、３０)と、
前記複数のロータリーバルブ(１０、２０、３０)毎にそれぞれ備えられた複数のクロマトグラフィーゾーン(４０、５０、６０)とを含み、
前記複数のロータリーバルブ(１０、２０、３０)は互いに連結され、
前記複数のロータリーバルブ(１０、２０、３０)は、それぞれ複数の連結ポート(１０ａ、１０ｂ、１０ｃ)、(２０ａ、２０ｂ、２０ｃ)、(３０ａ、３０ｂ、３０ｃ)を備え、
前記複数のロータリーバルブ(１０、２０、３０)が回転することにより、前記複数の連結ポート(１０ａ、１０ｂ、１０ｃ)、(２０ａ、２０ｂ、２０ｃ)、(３０ａ、３０ｂ、３０ｃ)のいずれか１つのみ開放され、それに応じて前記ポート(Ｄ、Ｆ、Ｒ、Ｅ)のそれぞれに選択的に連結されるいずれか１つのロータリーバルブ(１０、２０、３０)が切り替えらえることを特徴とするバリンの連続分離装置。
【請求項２】
前記複数のロータリーバルブ(１０、２０、３０)は、所定時間が経過すると回転し、
前記複数のロータリーバルブ(１０、２０、３０)の回転により、前記ポート(Ｄ、Ｆ、Ｒ、Ｅ)に連結されるロータリーバルブ(１０、２０、３０)が切り替えられることを特徴とする請求項１に記載のバリンの連続分離装置。
【請求項３】
前記複数のロータリーバルブ(１０、２０、３０)は、前記所定時間後の回転により第１、第２及び第３位置を循環するように連続して切り替えられ、
前記第１位置では、第１連結ポート(１０ａ、２０ａ、３０ａ)が開放され、
前記第２位置では、第２連結ポート(１０ｂ、２０ｂ、３０ｂ)が開放され、
前記第３位置では、第３連結ポート(１０ｃ、２０ｃ、３０ｃ)が開放されることを特徴とする請求項２に記載のバリンの連続分離装置。
【請求項４】
前記第１位置では、
前記脱着剤ポート脱着剤ポートＤが第１ロータリーバルブ１０の第１連結ポート１０ａを通過して第１クロマトグラフィーゾーン４０に連通し、
前記フィードポートＦが第２ロータリーバルブ２０の第２連結ポート２０ａを通過して第２クロマトグラフィーゾーン５０に連通し、
前記ラフィネートポートＲが第３ロータリーバルブ３０の第３連結ポート３０ａを通過して第３クロマトグラフィーゾーン６０に連通し、
前記抽出物ポートＥが第１ロータリーバルブ１０の第１連結ポート１０ａを通過することを特徴とする請求項３に記載のバリンの連続分離装置。
【請求項５】
前記第１位置で前記フィードポートＦから流入した分離対象混合物は、前記第２クロマトグラフィーゾーン５０を通過することによりバリンとその他の物質に分離され、
前記第１位置で分離された前記バリンは、前記第３ロータリーバルブ３０に流入して前記ラフィネートポートＲから流出し、
前記第１位置で分離された前記その他の物質は、前記第１ロータリーバルブ１０に流入して前記抽出物ポートＥから流出することを特徴とする請求項４に記載のバリンの連続分離装置。
【請求項６】
前記所定時間は、前記分離対象混合物から分離された前記バリンが前記第３ロータリーバルブ３０に流入し、前記その他の物質が前記第３ロータリーバルブ３０に流入しない時間であることを特徴とする請求項５に記載のバリンの連続分離装置。
【請求項７】
前記ロータリーバルブ(１０、２０、３０)が前記第１位置から前記第２位置に回転すると、前記フィードポートＦから流入した分離対象混合物は、前記第３クロマトグラフィーゾーン６０を通過することによりバリンとその他の物質に分離され、
前記第２位置で分離された前記バリンは、前記第１ロータリーバルブ１０に流入して前記ラフィネートポートＲから流出し、
前記第２位置で分離された前記その他の物質は、前記第１位置で分離されたその他の物質と共に前記第２ロータリーバルブ１０に流入し、前記抽出物ポートＥから流出することを特徴とする請求項６に記載のバリンの連続分離装置。
【請求項８】
前記複数のロータリーバルブ(１０、２０、３０)は、連続して回転することにより第１、第２及び第３位置に交互に切り替えられ、
前記第１、第２及び第３位置で前記ポート(Ｄ、Ｆ、Ｒ、Ｅ)が連結される前記ロータリーバルブはそれぞれ異なることを特徴とする請求項１に記載のバリンの連続分離装置。
【請求項９】
前記フィードポートＦから流入した分離対象混合物は、バリンとその他の物質に分離され、
前記複数のロータリーバルブ(１０、２０、３０)が位置を切り替える回転間隔が、前記バリンはいずれか１つのロータリーバルブから他のロータリーバルブに移動し、前記その他の物質は移動していない時間であることを特徴とする請求項８に記載のバリンの連続分離装置。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のバリンの連続分離装置を用いてバリンを連続分離する方法において、
前記脱着剤ポートに脱着剤を注入し、前記フィードポートにバリンを含む混合物を流入して前記フラフィネートポートからバリンを回収する工程を含むことを特徴とするバリンの連続分離方法。
【請求項１１】
前記脱着剤が水であることを特徴とする請求項１０に記載のバリンの連続分離方法。
【請求項１２】
前記回収されたバリンの純度が９０％〜９９％であることを特徴とするバリンの連続分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バリンの連続分離のための装置及びそれを用いたバリンの連続分離方法に関し、より具体的には、ロイシンやイソロイシンなどのアミノ酸を含む混合物からバリンを連続して分離するための装置及びそれを用いたバリンの連続分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バリン(valine)は、ＨＯ２ＣＣＨ(ＮＨ２)ＣＨ(ＣＨ３)２の化学式を有するL−アミノ酸であり、医薬品や化粧品の主要原料の１つとして用いられる。また、動物飼料に利用される重要な成分の一つでもある。これらの理由から、バリンの利用に注目した産業的市場における関心は日増しに大きくなっている。
【０００３】
バリン生産過程は主にコリネバクテリウム(Corynebacterium)の発酵により行われる。これに関して注目すべきは、発酵過程中にバリンだけでなく他の不純物なども共に得られるということである。これらの不純物は、塩、アラニン、ロイシン、イソロイシンなどであり、これらの不純物は全てバリンから分離しなければならない。
【０００４】
従来の技術で用いられるバリンの分離方法としては、イオン排除クロマトグラフィー(特許文献１)、沈殿剤を用いた結晶化方法(特許文献２、３及び４)、化学反応法(特許文献５)などがある。しかし、前記分離方法のうち、イオン排除クロマトグラフィー方法は、ロイシン、イソロイシンなどのアミノ酸の分離が難しく、廃水発生量が多く、結晶化などの後処理工程がさらに必要であるという欠点がある。また、沈殿剤を用いた結晶化方法は、沈殿剤を除去するための工程を必要とするので工程が複雑であり、精製のための後処理工程がさらに必要であるという欠点がある。また、化学反応法は、ロイシンとイソロイシンを全て分離することができるが、濃縮及び加水分解工程を必要とするので工程が複雑であり、溶媒を多量に用いるのでそれを回収する後処理工程に多くの設備を必要とすることから精製工程のコストが上昇する。
【０００５】
一方、クロマトグラフィー分離工程は、吸着剤に基づく分離工程であり、多数のバイオ製品の分離精製段階に広範囲に用いられており、その運用方式によって大きくバッチ(batch)クロマトグラフィー工程と連続疑似移動床(simulated moving bed, SMB)クロマトグラフィー工程に区分される。前記ＳＭＢ工程は、１９６１年に米国のＵＯＰ社が石油化学製品の分離のために最初に開発した工程であり、その性能と分離効率はバッチ工程に比べてはるかに優れることが報告されている。このようなＳＭＢ工程の優位性により、単に石油化学製品の分離精製だけでなく、糖物質、キラル化合物、バイオ製品、医薬品などの高付加製品の分離精製にまで広く用いられている。
【０００６】
従来のほとんどのＳＭＢ工程(４-ゾーンSMB)は、図１に示すように、４つのゾーン(カラム)と４つのポートが配置された構成となっており、４つのポートのうちフィードポートと脱着剤ポートから分離対象混合物と溶媒(脱着剤)がそれぞれ注入される。また、ラフィネート(Raffinate)ポートと抽出物(Extract)ポートから吸着力の弱い物質と強い物質が分離して得られる。このような一連の分離対象混合物と溶媒の注入、そして両成分の回収が連続して行われるようにするために、４つのポートは所定時間間隔で溶媒が流れる方向に応じて動くようになっている。
【０００７】
しかし、前記４-ゾーンＳＭＢ工程は、少なくとも４つのカラムを必要とする。一般に、各カラム毎のバルブと吸着剤はいずれも高価であるため、カラムの数を最小限にすることが好ましい。
【０００８】
よって、図２に示すように、３つのクロマトグラフィーゾーンを有するＳＭＢ(３-ゾーンＳＭＢ)工程が導入されている。図２に示すように、３つのゾーンを用いるので、最小カラム数を４つから３つに減らすことができる。また、４つのポートは、従来の４つのクロマトグラフィーゾーンを有するＳＭＢ構造と同様に配置される。
【０００９】
しかし、前記３-ゾーンＳＭＢ工程において、バリンのように吸着力が弱いために速く移動する低親和性成分は、図２のラフィネートポートから回収されるが、図２のようなラフィネートの濃縮ゾーン(enrichment zone)がないので、過度な希釈が避けられない。すなわち、回収されたバリンの濃度が分離対象混合物中のバリン濃度に比べて低くなると、ＳＭＢ分離工程の後続の後処理工程の運用コストが上昇するという副作用が発生する。よって、このような副作用を克服する新たな構造を有する３-ゾーンＳＭＢ工程の適用が必要とされる。
【００１０】
そこで、本発明者は、上記に鑑みて研究を重ねるなかで、擬似移動層クロマトグラフィー工程を行う装置により、ロイシンやイソロイシンなどのアミノ酸を含む混合物から効率的にバリンを連続的且つ効果的に分離できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開昭６２−２５５４５３号公報
【特許文献２】特開１９９６−３３３３１２号公報
【特許文献３】特開１９９８−２３７０３０号公報
【特許文献４】米国特許第６０７２０８３号明細書
【特許文献５】米国特許第４２６３４５０号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Kang, S.H. et al., Process Biochem., 2010, 45, 1468-1476
【非特許文献２】Lee, K.B. et al., AIChE J., 2008, 54, 2852-2871
【非特許文献３】Nam, H.G. et al., Process Biochem., 2011, 46, 2044-2053
【非特許文献４】Chung, S. F. et al., AIChE J., 1968, 14, 857-866
【非特許文献５】Wilson, E. J. et al., Ind. Eng. Chem. Fundam., 1966, 5, 9-14
【非特許文献６】Wilke, C.R. et al., AIChE J.. 1955, 1, 264-270
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、ロイシンやイソロイシンなどのアミノ酸を含む混合物からバリンを連続して分離する装置及びそれを用いたバリンの連続分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために、図４ａ〜図４ｃに示すように、本発明において、バリンの分離のために用いる装置は、脱着剤ポートＤと、フィードポートＦと、ラフィネートポートＲと、抽出物ポートＥと、３つのロータリーバルブ(１０、２０、３０)と、各ロータリーバルブ(１０、２０、３０)に連結される３つのクロマトグラフィーゾーン(４０、５０、６０)とを含む。
【００１５】
３つのロータリーバルブ(１０、２０、３０)は、それぞれ３つの連結ポート(１０ａ、１０ｂ、１０ｃ)、(２０ａ、２０ｂ、２０ｃ)、(３０ａ、３０ｂ、３０ｃ)を備え、ロータリーバルブ(１０、２０、３０)の回転に応じて各ロータリーバルブ(１０、２０、３０)のいずれか１つの連結ポートのみ開放されることにより、脱着剤ポートＤ、フィードポートＦ、ラフィネートポートＲ、抽出物ポートＥに連通する。
【００１６】
すなわち、脱着剤ポートＤ、フィードポートＦ、ラフィネートポートＲ、抽出物ポートＥに連結される各流路は３つに分岐されるように分岐点を有し、３つのロータリーバルブ(１０、２０、３０)に全て連結されており、いずれかの連結ポートが開放された後に特定のロータリーバルブに連結される。
【００１７】
以下、具体的な作動方式について説明する。
【００１８】
図３は本発明で用いる３つのクロマトグラフィーゾーンを有する擬似移動層(３-ゾーン SMB)工程の構造を示す概略図である。図３に示すように、ポートの移動が脱着剤ポート、フィードポート、ラフィネートポート、抽出物ポートの順になっており、それぞれラフィネート濃度の希釈を防止する濃縮ゾーンを運用することができる。よって、従来の３-ゾーンＳＭＢの問題であるラフィネート濃度の低下を予防できるという利点を有する。また、脱着剤ポートとフィードポートが１つのカラムで連結されている構造であるので、溶媒の使用量を低減することができるという利点もある。
【００１９】
また、本発明においては、図４に示す工程が連続して行われる装置を提供する。図４ａは第１位置における装置を示す図であり、図４ｂは第２位置における装置を示す図であり、図４ｃは第３位置における装置を示す図である。第１、第２、第３位置は連続して循環する。すなわち、本発明による装置は、第１位置、第２位置、第３位置の順に作動し、その後再び第１位置に回帰する方式である。
【００２０】
特定位置への設定は、ロータリーバルブ(１０、２０、３０)の回転により行われる。すなわち、ロータリーバルブ(１０、２０、３０)の第１連結ポート(１０ａ、２０ａ、３０ａ)が開放されることによって第１位置に設定され、さらにロータリーバルブ(１０、２０、３０)が回転することにより第２連結ポート(１０ｂ、２０ｂ、３０ｂ)が開放され、それにより第２位置に設定され、再びロータリーバルブ(１０、２０、３０)が回転することにより第３連結ポート(１０ｃ、２０ｃ、３０ｃ)が開放され、第３位置に設定される。ロータリーバルブ(１０、２０、３０)がさらに回転すると再び第１位置に設定される。
【００２１】
一方、以下では本発明のより良き理解のため一部の連結ポート(１０a、２０b、３０c)は流入ポート(１０a−１、２０b−１、３０c−１)と流出ポート(１０a−２、２０b−２、３０c−２)に分けて図示し、説明する。
【００２２】
図４ａに示す第１位置では、ロータリーバルブ(１０、２０、３０)の第１連結ポート(１０ａ、２０ａ、３０ａ)のみ開放され、第２連結ポート(１０ｂ、２０ｂ、３０ｂ)及び第３連結ポート(１０ｃ、２０ｃ、３０ｃ)は閉鎖される。
【００２３】
第１位置において、脱着剤ポートＤは第１ロータリーバルブ１０に連結され、フィードポートＦは第２ロータリーバルブ２０に連結され、ラフィネートポートＲは第３ロータリーバルブ３０に連結され、抽出物ポートＥは第１ロータリーバルブ１０に連結される。
【００２４】
よって、脱着剤ポートＤから流入する脱着剤は、第１ロータリーバルブ１０及び第１クロマトグラフィーゾーン４０を通過し、その後第２ロータリーバルブ２０に流入する。
【００２５】
フィードポートＦから流入する分離対象混合物は、第１クロマトグラフィーゾーン４０を通過した脱着剤と共に第２ロータリーバルブ２０に流入し、第２クロマトグラフィーゾーン５０を通過する。
【００２６】
本発明において、分離対象混合物はバリンを含んでおり、さらに不純物として塩、アラニン、ロイシン、イソロイシンなどを含んでいる。第２クロマトグラフィーゾーン５０を通過した後、流動速度の差による分離対象混合物の成分の分離が行われる。バリンは他の不純物に比べて吸着力が弱い低親和性(ｌｏｗ−ａｆｆｉｎｉｔｙ)成分であるので、より速く移動する 。よって、その後分離対象混合物はバリンとその他の物質に分離され、それぞれ時間差をおいて第３ロータリーバルブ３０に流入する。
【００２７】
分離しようとするバリンはラフィネートポートＲから流出するが、その他の物質は第３クロマトグラフィーゾーン６０を通過して再び第１ロータリーバルブ１０を通過することにより抽出物ポートＥに流出する。
【００２８】
所定時間(すなわち、ロータリーバルブの回転時間間隔)が経過すると、ロータリーバルブ(１０、２０、３０)が回転して図４ｂに示されるように第２位置に切り替えられる。所定時間の基準については後述する。
【００２９】
図４ｂに示す第２位置では、ロータリーバルブ(１０、２０、３０)の第２連結ポート(１０ｂ、２０ｂ、３０ｂ)のみ開放され、第１連結ポート(１０ａ、２０ａ、３０ａ)及び第３連結ポート(１０ｃ、２０ｃ、３０ｃ)は閉鎖される。
【００３０】
第１位置と比較すると、第２位置では、ポート(Ｄ、Ｆ、Ｒ、Ｅ)に連結されるロータリーバルブ(１０、２０、３０)が１つずつ移動する。
【００３１】
すなわち、第２位置では、脱着剤ポートＤは第２ロータリーバルブ２０に連結され、フィードポートＦは第３ロータリーバルブ３０に連結され、ラフィネートポートＲは第１ロータリーバルブ４０に連結され、抽出物ポートＥは第２ロータリーバルブ２０に連結される。
【００３２】
よって、脱着剤ポートＤから流入する脱着剤は、第２ロータリーバルブ２０及び第２クロマトグラフィーゾーン５０を通過し、その後第３ロータリーバルブ３０に流入する。
【００３３】
フィードポートＦから流入する分離対象混合物は、第２クロマトグラフィーゾーン５０を通過した脱着剤と共に第３ロータリーバルブ３０に流入し、第３クロマトグラフィーゾーン６０を通過する。
【００３４】
しかし、この場合、図４ａに示す第１位置から流入した分離対象混合物のうちその他の物質は流動速度の差により第３ロータリーバルブ３０にまだ流入していない。これを行うため、前述したロータリーバルブの回転時間間隔が調整される。
【００３５】
よって、第２位置で第３ロータリーバルブ３０に流入した分離対象混合物は第３クロマトグラフィーゾーン６０を通過し、その後流動速度の差により分離対象混合物の分離が行われてバリンとその他の物質に分離されるが、分離しようとするバリンは第１ロータリーバルブ１０とラフィネートポートＲを通じて流出するのに対して、残りの物質は第１位置で分離されたものの第３ロータリーバルブ３０にまだ流入していないその他の物質と合わせられてより効果的に第２ロータリーバルブ２０を通過し、その後抽出物ポートＥに流入する。
【００３６】
所定時間が経過すると、ロータリーバルブ(１０、２０、３０)が回転して図４ｃに示す第３位置に切り替えられる。
【００３７】
図４ｃに示す第３位置では、ロータリーバルブ(１０、２０、３０)の第３連結ポート(１０ｃ、２０ｃ、３０ｃ)のみ開放され、第１連結ポート(１０ａ、２０ａ、３０ａ)及び第２連結ポート(１０ｂ、２０ｂ、３０ｂ)は閉鎖される。
【００３８】
第２位置と比較すると、第３位置では、ポート(Ｄ、Ｆ、Ｒ、Ｅ)に連結されるロータリーバルブ(１０、２０、３０)が１つずつ移動する。
【００３９】
第１、第２位置の説明と同様に、分離対象混合物はフィードポートＦから流入し、第３クロマトグラフィーゾーン６０を通過した脱着剤と共に第１ロータリーバルブ１０に流入し、第１クロマトグラフィーゾーン４０を通過するが、この時、図４ｂに示す第２位置で流入した分離対象混合物のうち残りの物質が流動速度の差により第２ロータリーバルブ２０にまだ流入していない時点であるので、同様に共に合わせられて第３ロータリーバルブ３０を通過し、その後抽出物ポートＥに流入する。
【００４０】
分離対象混合物のうち分離しようとするバリンは、第２ロータリーバルブ２０を通過し、その後ラフィネートポートＲに分離される。
【００４１】
所定時間が経過すると、ロータリーバルブ(１０、２０、３０)が回転して再び図４ａに示す第１位置に切り替えられ、上記過程が連続して行われる。
【００４２】
本発明において、前記第１、第２及び第３クロマトグラフィーゾーンに用いられる吸着剤としては、多孔性ポリマーレジンを用いることができ、不溶性ポリスチレンジビニルベンゼンポリマー(insoluble polystyrene divinylbenzene polymer)物質からなるレジンを用いることが好ましい。前記レジンは、表面積が大きく、固有の細孔径分布及び細孔容積分布(pore size and volume distribution)を有し、様々な物質、特に薬学的化合物の精製に有用である。具体的には、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ１６１(Rohm & haas)又はＣｈｒｏｍａｌｉｔｅ ＰＣＧ Ｓｅｒｉｅｓ(Purolite)などを用いることができる。商業的に用いられる前記レジンの粒径は１０〜３００μｍであり、表面積は７００〜９００ｍ２／ｇであり、気孔の大きさは１００〜２００Åであり、細孔容積分布は０．７〜１．５ｍｌ／ｇであり、均等係数(uniformity coefficient)は２未満である。
【００４３】
前記分離対象混合物は、バリン、及びバリンと共に分枝鎖アミノ酸に含まれるイソロイシン又はロイシンを含む混合物であり、微生物発酵により得られたバリン発酵液であることが好ましい。本発明の具体的な実施例においては、精製されたバリン、イソロイシン及びロイシンを人為的に混合した混合液、及び微生物発酵により得られたバリン発酵液を用いた。これは、微生物発酵の際にバリンのみ生産されることはほとんどなく、多くはイソロイシン及びロイシンが共に生産されるからである。
【００４４】
本発明によるバリンの連続分離装置によれば、分離対象混合物のうち分離しようとするバリンはラフィネートポートＲから流出し、その他の物質は流動速度の差だけでなく、ロータリーバルブ(１０、２０、３０)の回転により効果的に分離されて抽出物ポートＥから流出し、バリンを連続して分離することができる。
【００４５】
また、本発明のバリンの連続分離装置の制御において、脱着剤ポートＤ、フィードポートＦ及びラフィネートポートＲの流量を調節し、それと共にロータリーバルブの回転速度を調節することにより制御することができる。前記各ポートの流量は、カラムのｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒ(吸着係数、物質伝達係数、空隙率、物質環境など)を考慮して調節することができる。
【００４６】
また、本発明は前記バリンの連続的分離装置を用いることよってバリンを連続分離する方法において、前記脱着剤ポートを用いて脱着剤を流入し、前記フィードポートにバリンを流入させ、前記ラフィネートポートからバリンを回収する工程を含むことを特徴とするバリンの連続分離法を提供する。前記脱着剤は水であることが好ましい。また、前記方法で回収されたバリンの純度は９０％〜９９％であることを特徴とする。
【００４７】
さらに、本発明の一実施例によれば、本発明によるバリンの連続分離装置により、バリン、ロイシン及びイソロイシンを含む分離対象混合物を分離した結果、回収されたバリンの収率は約９８％以上、純度は約９８％以上であったので、混合物からバリンを効果的に分離できることが確認された。
【発明の効果】
【００４８】
（発明の有益な効果）
本発明は、擬似移動層クロマトグラフィー工程を行う装置により、ロイシンやイソロイシンなどのアミノ酸を含む混合物から高純度及び高収率でバリンを連続して分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】従来の４つのクロマトグラフィーゾーンを有する擬似移動層(４-ゾーンＳＭＢ)クロマトグラフィー工程の構造を示す概略図である。
【図２】従来の３つのクロマトグラフィーゾーンを有するＳＭＢ(３-ゾーンＳＭＢ)工程の構造を示す概略図である。
【図３】本発明で用いる３つのクロマトグラフィーゾーンを有する擬似移動層(３-ゾーンＳＭＢ)工程の構造を示す概略図であり、従来の３-ゾーンＳＭＢと差別化されたポート配置方式に基づいて開発された工程の構造を示すものである。
【図４ａ】本発明で用いる３-ゾーンＳＭＢ工程のための装置の模式図であり、ロータリーバルブの回転に応じた各ゾーンの連結を示すものである。
【図４ｂ】本発明で用いる３-ゾーンＳＭＢ工程のための装置の模式図であり、ロータリーバルブの回転に応じた各ゾーンの連結を示すものである。
【図４ｃ】本発明で用いる３-ゾーンＳＭＢ工程のための装置の模式図であり、ロータリーバルブの回転に応じた各ゾーンの連結を示すものである。
【図５】吸着剤選定のためのパルステストの結果を示す図である。ここで、(ａ)はＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ１６１Ｃ、(ｂ)はＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＣＧ７１Ｃ、(ｃ)はＤＩＡＩＯＮ ＳＫ１Ｂ、ＤはＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−７ＨＰの結果である。
【図６】Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ１６１Ｃ吸着剤に対する階段式フロンタルテストの結果を示す図である。ここで、(ａ)はイソロイシン、(ｂ)はロイシン、(ｃ)はバリンの結果である。
【図７】Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ１６１Ｃ吸着剤における吸着平衡データ(q vs. C)を示す図である。ここで、(ａ)はバリン、(ｂ)はロイシン、(ｃ)はイソロイシンのデータである。
【図８】混合物フロンタルテストのデータとシミュレーション結果を比較した図である。ここで、(ａ)はロイシン、(ｂ)はイソロイシン、(ｃ)はバリンの結果である。
【図９】ＳＭＢ実験の結果であり、ＳＭＢ脱着剤ポートから流出する流出溶液に対するＨＰＬＣ濃度分析の結果を示す図である。ここで、(ａ)はラフィネート濃度分析の結果であり、(ｂ)は抽出物濃度分析の結果である。
【図１０】ＳＭＢ実験により得られたサンプルに対するＨＰＬＣの生データ(raw data)クロマトグラムである。ここで、(ａ)は分離対象混合物、(ｂ)はラフィネート、(ｃ)は抽出物のクロマトグラムである。
【図１１】ＳＭＢ実験の結果であり、カラムプロフィール(６０.５ステップ)を示す図である。ここで、黒色の実線はバリンのシミュレーション結果、灰色の実線はイソロイシンのシミュレーション結果、黒色の点線はロイシンのシミュレーション結果、円形はバリンの実験結果、四角形はイソロイシンの実験結果、菱形はロイシンの実験結果である。
【図１２】Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ ＰＣＧ−６００吸着剤に基づいて行ったＳＭＢ実験の結果であり、ラフィネートポートから流出する流出溶液に対するＨＰＬＣ濃度分析の結果を示す図である。
【図１３】Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ ＰＣＧ−６００吸着剤に基づいて行ったＳＭＢ実験の結果であり、抽出物ポートから流出する流出溶液に対するＨＰＬＣ濃度分析の結果を示す図である。
【図１４】Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ ＰＣＧ−６００吸着剤を用いて行ったＳＭＢ実験の結果であり、カラムプロフィール(44.5ステップ)を示す図である。ここで、黒色の実線はバリンのシミュレーション結果、灰色の実線はロイシンのシミュレーション結果、円形はバリンの実験結果、赤色の三角形はロイシンの実験結果である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
以下、実施例を挙げて本発明の構成及び効果についてより具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５１】
アプローチ方法：バリン精製のクロマトグラフィー適用のための探索
１)モデルベースデザインアプローチ 
新たな分離システムにおける連続工程を開発する上で最優先で考慮すべき事項が２つある。まず、開発期間中に要する費用と期間の最小化である。次に、開発される工程の最適状態が維持され、最大の生産性と最大の分離効率が得られる条件でなければならない。これら２つの条件をどちらも満たすためには、詳細モデル(detailed model)に基づく吸着及び物質伝達現象を正確に把握しなければならず、また、関連する様々なパラメータ値を得なければならない。このような詳細モデル及びパラメータに基づく工程設計のアプローチ方法をモデルベースデザインアプローチ(model-based design approach)という。本発明においても、このようなアプローチ方法によりバリンの連続分離を行うＳＭＢ工程を開発した。
【００５２】
２)コンピュータシミュレーション
モデルベースデザインアプローチの核心となる段階の１つがコンピュータシミュレーションである。これは、カラム内の各成分の吸着及び物質伝達現象に対する詳細モデル式を数値解析的方法で解いてその解を得る過程をいう。このような数値解析的方法は膨大な計算量を要するので、コンピュータを用いて行う。
【００５３】
シミュレーションに用いられるカラムモデル式には多くの種類があるが、そのうち正確性と効率性を考慮して集中質量移動モデル(lumped mass-transfer model)(非特許文献１)を本発明のシミュレーションモデルとした。集中質量移動モデルに基づくコンピュータシミュレーションは、各アミノ酸成分の基礎パラメータの測定と検証だけでなく、ＳＭＢ工程の分離効率の検証にも活用された。さらに、このモデル式はＳＭＢ最適化ツールの製作にも用いた。
【００５４】
３)ＳＭＢ最適化ツール
モデルベースデザインアプローチにおいてコンピュータシミュレーションと共に核心的な役割を果たすものとしてＳＭＢ最適化ツールがある。このツールは、開発されるＳＭＢ工程の最適運転条件を得るために用いられる。この最適化ツールの製作のために優先的に必要なのが最適化アルゴリズムである。現在まで、ＳＭＢなどの複雑な形態の工程最適化においては、統計学的理論に立脚した遺伝子アルゴリズムが最も効率的であることが知られている(非特許文献２)。
【００５５】
本発明においても、バリンの連続分離工程の最適化のために、遺伝子アルゴリズムに基づくＳＭＢ最適化コンピュータプログラムを構築した。遺伝子アルゴリズム自体もこれまで発展を繰り返してきたが、本発明の最適化ツール製作段階においては、最新の遺伝子アルゴリズムといえるＮＳＧＡ−ＩＩ−ＪＧアルゴリズム(非特許文献２)を基本アルゴリズムとして採用した。
【００５６】
ＳＭＢ最適化ツールの製作方法は、マイクロソフト・エクセルのソフトウェアのＶＢＡ(visual basic application)言語を用いて最適化アルゴリズムをコード化(coding)することにより、ＮＳＧＡ−ＩＩ−ＪＧアルゴリズムと詳細モデル式の計算が同時に行われるようにした。
【００５７】
実験の準備
１)材料
分離対象混合物を構成する３つのアミノ酸成分のうち、バリンとロイシンはＦｌｕｋａから購入し、イソロイシンはＳｉｇｍａから購入した。アミノ酸を溶解するために用いた水は３次脱イオン蒸留水(Distilled Deionized Water, DDW)であり、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｓｙｓｔｅｍ(Millipore)により得た。実験に用いた吸着剤は、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ１６１Ｃ(Rohm & haas)、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＣＧ７１Ｃ(Sigma Aldrich)、ＤＩＡＩＯＮ ＳＫ１Ｂ(Mitsubishi Chemical)、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−７ＨＰ(Sigma Aldrich)である。ＨＰＬＣ濃度分析に用いたメタノールは、Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｃｏ．(Muskegon, MI)から購入した。
【００５８】
吸着剤の選定実験及び各物質の基礎パラメータの測定実験に用いたガラス材質のオムニフィットガラスカラム(Omnifit Glass Column)は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏ．(Boonton, NJ)から購入し、前者の実験には長さ１１．６ｃｍ、直径１．５ｃｍのカラムを用い、後者の実験には長さ２１．７ｃｍ、直径２．５ｃｍのカラムを用いた。
【００５９】
２)装置
シングルカラム実験装置
吸着剤の選定実験には、Ｙｏｕｎｇ−Ｌｉｎ ＳＰ９３０ＤポンプとＹｏｕｎｇ−Ｌｉｎ ＵＶ７３０Ｄ検出器を用いた。この２つの装置の制御及びデータ処理は、Ａｕｔｏｃｈｒｏ−３０００ソフトウェアにより行った。各吸着剤で充填されたカラム内にアミノ酸パルスを注入する際に用いたインジェクターはＲｈｅｏｄｙｎｅ ７７２５ｉインジェクターであり、注入量は１００μｌとした。
【００６０】
吸着剤の選定の完了後に行う各アミノ酸の基礎パラメータの測定実験においては、ＦＰＬＣ Ｐ−９２０ポンプ及びＷａｔｅｒｓ ４８６ ＵＶ検出器、並びにＡｍｅｒｓｈａｍ ＦＰＬＣ ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ(Frac-900)を用いた。各詳細装置の制御とデータ収集は、Ｕｎｉｃｏｒｎ ５．１ソフトウェアにより行った。
【００６１】
バリンの連続分離のための３-ゾーンＳＭＢ装置
図４に示す装置を自主的に組み立てて用いた。完成したＳＭＢ実験装置における脱着剤の流量速度と分離対象混合物の流量速度はＹｏｕｎｇ−Ｌｉｎ ＳＰ９３０Ｄポンプを用いてそれぞれ制御し、ラフィネート流量速度はＩｓｍａｔｅｃ ＭＣＰ−ＣＰＦ ＩＳＭ ９１９ポンプを用いて制御した。４つのポートが周期的に移動する効果を得るために、ＳＴ Ｖａｌｃｏ ロータリーバルブ(VICI, Houston, TX)を用いた。図４ａ〜図４ｃは前記ＳＴ ｖａｌｖｅの作動模式図である。実験に用いたＶａｌｃｏ ロータリーバルブはＬａｂｖｉｅｗ ８．０ ソフトウェアにより自動制御した。
【００６２】
ＨＰＬＣ濃度分析装置
ＳＭＢ実験により回収された物質の濃度測定のためにＨＰＬＣ濃度分析装置を用いた。分析用カラムとしては、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ−１８ カラム(２５０×4.6mmID, particle size 5μm)を用いた。ＨＰＬＣ濃度分析に関する全てのデータの収集は、Ｗａｔｅｒｓ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍソフトウェアを用いて処理した。Ｗａｔｅｒｓ ５１５ ＨＰＬＣポンプを用いて移動相の流量速度を制御した。濃度分析のためのサンプルは、Ｒｈｅｏｄｙｎｅ ９７２５ｉインジェクターを用いて分析用カラム内に注入し、注入量は２０μｌとした。試料の検出はＷａｔｅｒｓ ９９６ ＰＤＡ検出器を用いた。
【００６３】
バリンのフロンタルテストにより得られたサンプルの濃度分析は、Ｙｏｕｎｇ−Ｌｉｎ ＳＰ９３０ＤポンプとＹｏｕｎｇ−Ｌｉｎ ＵＶ７３０Ｄ検出器を用いた。Ｙｏｕｎｇ−Ｌｉｎポンプと検出器の制御及びデータ処理は、Ａｕｔｏｃｈｒｏ−３０００ソフトウェアにより行った。実験により得られたサンプルは、Ｒｈｅｏｄｙｎｅ ７７２５ｉインジェクターを用いて分析用カラム内に注入し、注入量は２０μｌとした。
【実施例１】
【００６４】
バリンの分離に適した吸着剤の選定
１)実験方法
バリンからロイシンとイソロイシンを分離する可能性のある４種類の通常の吸着剤、例えば、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ１６１Ｃ(Rohm & haas)、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＣＧ７１Ｃ(Sigma Aldrich)、ＤＩＡＩＯＮ ＳＫ１Ｂ(Mitsubishi Chemical)、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−７ＨＰ(Sigma Aldrich)を用いて、最も適する吸着剤を選定するための実験を一連のパルステスト方式で行った。
【００６５】
前記パルステストの条件は次の通りである。３つのアミノ酸の各濃度は２ｇ／Ｌとし、注入量は１００μｌとした。移動相の流量は２ｍｌ／分とした。
【００６６】
２)実験結果
上記結果を図５に示す。図５に示すように、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ１６１Ｃ吸着剤を除く他の吸着剤は、バリンの選択的分離が難しいことが確認された。上記結果から、バリンを分離するためのＳＭＢ工程の構築には、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ１６１Ｃ吸着剤が最も適することが確認された。
【実施例２】
【００６７】
Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ１６１Ｃカラムの空隙率の測定
１)実験方法
前記実施例１で選定したＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ−ＣＧ１６１Ｃ吸着剤の空隙率を測定した。まず、前記吸着剤をカラムに充填し、その後粒子間空隙率(inter-particle porosity)(ｅｂ)を測定する実験を行った。実施例１と同様の方式で行ったが、実施例１とは異なり、分離しようとする分離対象物質の代わりに粒子間空隙率の測定に適したトレーサー分子をカラム内に注入した。用いたトレーサー分子はブルーデキストランであり、注入濃度は１ｇ／Ｌとし、流量は４ｍｌ／分とし、注入量は５００μｌとした。
【００６８】
２)実験結果
上記実験の結果、カラムの粒子間空隙率の値は０．３９１であった。重要な情報の一つである粒子内空隙率は文献に報告されている値を用いたが、この値は０．７３７である(非特許文献３)。
【実施例３】
【００６９】
Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ１６１Ｃ相におけるバリン、ロイシン、イソロイシンの基礎パラメータの測定
吸着係数の測定
１)実験方法
分離対象混合物の各成分に該当するバリン、ロイシン、イソロイシンの基礎パラメータの測定のために階段式フロンタルテスト(multiple frontal test)を行った。階段式フロンタルテストは、分離しようとする各物質の吸着平衡データを得て、そのデータに基づいて吸着モデル式を作成すると共に関連吸着パラメータを決定するために行われる実験である。
【００７０】
具体的には、階段式フロンタルテストにおいて、２台のポンプを用い、一方のポンプにはＤＤＷ、他方のポンプにはバリン、ロイシン又はイソロイシン溶液を満たした。その後、カラム内の吸着剤相と移動相間の平衡が得られるまで、バリン、ロイシン又はイソロイシン溶液をカラム内部に注入し続けた。平衡状態では吸着剤粒子間の濃度と吸着剤内部の濃度がどちらもカラム内に注入されるバリン、ロイシン又はイソロイシン溶液の濃度と同じ濃度に維持されるので、簡単な物質収支式を立てると吸着剤相における吸着濃度が直ちに得られる。カラム内部の濃度が平衡をなすと、分離対象混合物溶液の比率を前段階より高くし、新たに平衡状態を維持するようにした。再度、この平衡状態に対して物質収支式を立て、吸着剤相における吸着濃度を計算した。このような階段式フロンタルテストを行うことにより、各アミノ酸成分に対するステップタイムをパルステストの結果から得られた滞留時間の２〜３倍に決定した。
【００７１】
また、各アミノ酸成分に対する階段式フロンタルテストは全５段階とし、ステップタイムとしてバリンは４０分、ロイシンは７０分、イソロイシンは７０分に設定した。また、全ての試料の濃度は５ｇ／Ｌ、流量は４ｍｌ／分で一定に維持した。ロイシンとイソロイシンはＵＶ検出器において２０５ｎｍ、２１８ｎｍの波長で実験を行った。それに対して、バリンの場合は、ロイシンやイソロイシンの実験におけるオンライン・モニタリング方式とは異なり、ダイレクトＨＰＬＣ分析方式(カラム流出液を逐一採取してその濃度をＨＰＬＣ装置で分析する方式)を採用した。ＨＰＬＣ分析条件は、１０％メタノール水溶液を移動相として用い、注入量を２０μｌとし、流量を０．５ｍｌ／分とした。分析前に標準溶液を用いて自主的に検量線(calibration curve)を決定した。その結果を図６に示し、それに基づいて吸着平衡データを算出し、その結果を図７に示す。
【００７２】
２)実験結果
図７に示すように、バリン、ロイシン、イソロイシンの全てがＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ１６１Ｃ相で線形吸着関係を示す。よって、各アミノ酸成分を線形吸着モデル式にフィッティングし、そこから線形吸着係数を決定した。決定した吸着係数の値を下記表１に示す。
【００７３】
物質伝達係数の決定
１)実験方法
吸着係数と共にもう一つの重要な基礎パラメータといえる物質伝達係数を下記の方法で決定した。
【００７４】
まず、軸方向分散係数(axial dispersion coefficient)と境膜物質移動係数(film mass-transfer coefficient)は、Ｃｈｕｎｇ ＆ Ｗｅｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ(非特許文献４)とＷｉｌｓｏｎ ＆ Ｇｅａｎｋｏｐｏｌｉｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ(非特許文献５)を用いてそれぞれ予測し、分子拡散係数(molecular diffusivity)は、Ｗｉｌｋｅ ＆ Ｃｈａｎｇ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ(非特許文献６)を用いて計算した。また、粒子内拡散係数(intra-particle diffusivity)は、フロンタル実験のデータと集中質量移動モデルに基づくシミュレーション結果を互いにフィッテイングして決定した。
【００７５】
２)実験結果
前述したように決定された分子拡散率と粒子内拡散率の値を下記表１に示す。
【００７６】
【表１】
2015506958.tif 000003
【００７７】
前述したように決定された吸着係数及び物質伝達係数の値の適正性を確認するために、この値を代入したモデルシミュレーション結果とフロンタル実験結果を比較して図６に示す。
【００７８】
図６に示すように、シミュレーション結果と実験データが一致することが確認された。よって、前述したように決定された基礎パラメータの値は、後続して行われるＳＭＢ工程の最適化に十分に活用することができる。
【実施例４】
【００７９】
混合物フロンタル実験による基礎パラメータの検証
１)実験方法
前記実施例３で決定された基礎パラメータ値の検証のために、混合物フロンタル実験を行った。この実験においては、実施例３とは異なり、３つのアミノ酸を全て含む混合物溶液を分離対象混合物として用いてフロンタル実験を行った。
【００８０】
また、実施例３で決定された基礎パラメータ値と混合物フロンタル実験条件に基づいてモデルシミュレーションを行った。さらに、そのシミュレーション結果を混合物フロンタル実験データと比較した。その結果を図８に示す。
【００８１】
２)実験結果
図８に示すように、実験データとシミュレーション結果が一致することが確認された。これは、実施例３で決定された基礎パラメータ値は、純粋な成分のときだけでなく、混合物状態においても、各アミノ酸のカラム内の挙動を説明することができることを意味する。また、各アミノ酸間の相互作用がほとんどないことを意味する。
【実施例５】
【００８２】
バリンの連続分離のための工程の最適化
最適化過程で重点を置いたのは、目標分離対象物質であるバリンの高純度と高収率を保持しつつバリンの生産性を最大化することである。ここで、バリンの生産性は下記式のように定義される。
【００８３】
(式１)
バリンの生産性(Productivity)＝Ｑｒａｆ×Ｃｒａｆ，ｖａｌｉｎｅ
(上記式において、Ｑｒａｆはラフィネートポートにおける流量速度を意味し、Ｃｒａｆ,ｖａｌｉｎｅはラフィネートポートにおけるバリンの濃度を意味する。)
【００８４】
バリンの生産性を目的関数(objective function)に設定し、バリンの純度と収率を制約条件(constraint)に設定して最適化過程を行った。具体的な最適化過程を要約すると次の通りである。
【００８５】
Ｍａｘ  Ｊ＝Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ［Ｑｆｅｅｄ，Ｑｒａｆ，ｔｓｗ］
Ｓｕｂｊｅｃｔ ｔｏ Ｖａｌｉｎｅ ｐｕｒｉｔｙ＝９８％
Ｖａｌｉｎｅ ｙｉｅｌｄ＝９８％
Ｆｉｘｅｄ ｖａｒｉａｂｌｅｓ  Ｑｄｅｓ＝５ｍＬ／分
Ｃｆｅｅｄ ｆｏｒ ｅａｃｈ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ＝５ｇ／Ｌ
ＬＣ＝２１．７ｃｍ，ｄＣ＝２．５ｃｍ
(上記式において、ＱｆｅｅｄとＱｄｅｓは分離対象混合物の流量速度と脱着剤の流量速度をそれぞれ意味し、ｔｓｗはスイッチングタイムを意味する。)
【００８６】
上記式に従って、本発明の３-ゾーンＳＭＢ装置を用いたバリン分離工程を最適化するために、ＮＳＧＡ−ＩＩ−ＪＧアルゴリズムに基づく最適化コンピュータプログラムを自主的にコード化し、前記コンピュータプログラムをＡｓｐｅｎシミュレーターに接続して該当工程を最適化した。その結果を下記表２に示す。
【００８７】
【表２】
2015506958.tif 000004
【実施例６】
【００８８】
ＳＭＢ実験
こうして得られたデータを用いて、本発明によるバリンの連続分離装置でバリンを分離し、その収率と純度を次のように測定した。
【００８９】
１)実験方法
図４に示す装置と、前記実施例５で得られた最適化条件を用いてＳＭＢ実験を行った。カラムはＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ１６１Ｃを用いた。
【００９０】
まず、実験を始める前に、カラムの連結から行った。ここで、脱着剤(水)の流量速度を２ｍｌ／分に維持し、他のポンプの作動を中止した。それぞれのバルブとカラムを連結した。ここで、カラム内部に空気が入らないように注意した。カラムの全ての連結を終え、その後脱着剤の流量速度を目標値まで増加させた。ＳＭＢ実験は分離対象混合物溶液が注入される時点から始まるので、分離対象混合物ポンプを作動させると同時にＬａｂｖｉｅｗ ８．０ソフトウェアを実行した。Ｌａｂｖｉｅｗ ８．０によりバルブのスイッチングとスイッチングタイムを同時に制御した。
【００９１】
ＳＭＢ実験は周期的定常状態(cyclic steady state)に達するまで行った。２５番目のステップ以降は定常状態に達することが確認された。よって、ＳＭＢ実験は、それよりはるかに多いステップである６０番目のステップまで行った。ＳＭＢ実験が行われている間、ステップ毎に各排出ポートから溶出する溶液の濃度をＨＰＬＣ装置を用いて分析した。また、カラムプロフィールの決定のために、最後のステップで関連サンプルを採取した。このために、ＳＭＢ実験が６０．５ステップに達したときに、駆動している全てのポンプを同時に停止した。そして、バルブに連結されたカラムの下部を開けてカラムから出てくる溶液を回収し、その濃度を分析した。ＨＰＬＣ分析条件は、１０％メタノール水溶液を移動相として用い、注入量を２０μｌとし、流量を０．５ｍｌ／分とした。分析前に標準溶液を用いて自主的に検量線を決定した。その結果を図９に示す。図９において(ａ)はラフィネート濃度分析の結果であり、(ｂ)は抽出物濃度分析の結果である。
【００９２】
２)実験結果
図９の(ａ)に示すように、ラフィネート溶液内のほとんどの成分がバリンであり、不純物に該当するロイシンとイソロイシンはほとんど存在しないことが確認された。これは、バリンの純度が非常に高く維持されていることを意味する。また、図９の(ｂ)に示すように、抽出物濃度分析の結果においてほとんどの成分がロイシンとイソロイシンであり、検出されたバリンの量は無視できるほど少ないことが確認された。これは、抽出物ポートにおけるバリンの損失が非常に少ないことを意味する。
【００９３】
また、前記ＳＭＢ実験を行うと共に該当ＳＭＢ工程に対するコンピュータシミュレーションを同時に行い、その結果をラフィネートと抽出物のＨＰＬＣ濃度分析データと直接比較した。図９に示すように、シミュレーション結果とＳＭＢ実験データが一致することが分かる。
【００９４】
このようなＳＭＢ実験により分離されたバリンの最終純度と収率の定量的測定のために、最後の６つのステップで得られた流出溶液を同じ割合で混合し、その後その溶液についてＨＰＬＣ濃度分析を行った。分析された濃度データに基づいてバリンの純度と収率を計算し、その結果を下記表３に示す。
【００９５】
【表３】
2015506958.tif 000005
【００９６】
前記表３と図９の結果から、本発明のＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ１６１Ｃを用いたＳＭＢ工程は、バリンの連続分離と高純度及び高収率の保持において非常に優れることが確認された。これに関する実験による実証データとして、図１０にＨＰＬＣ濃度分析の生クロマトグラム(HPLＣの生データ)を示す。
【００９７】
まず、分離対象混合物溶液に対するＨＰＬＣの生データ(図１０のａ)においては、３つのアミノ酸成分の全てが大きいサイズのピークを示している。バリンの生産ポートに該当するラフィネートポートの流出液に対するＨＰＬＣの生データ(図１０の(ｂ))においては、バリン成分のみ大きいサイズのピークを明確に示しているのに対して、イソロイシンのピークは非常に小さいサイズを示しており、ロイシンのピークはほとんど見出されなかった。不純物のみ得られるように設定された抽出物ポートの流出液に対するＨＰＬＣの生データ(図１０の(ｃ))においては、バリン成分のピークはほぼ無視できるのに対して、他の２つのアミノ酸成分は大きいサイズのピークを示している。このような一連のＨＰＬＣの生データにより、本発明におけるバリンの連続分離ＳＭＢ実験が成功したことが再度確認された。
【００９８】
前述したラフィネートと抽出物における濃度グラフ以他に、カラムプロフィールデータも重要なＳＭＢ実験データの１つである。このような理由から、カラムプロフィールデータの確保に必要なサンプルを最終スイッチング周期の中間時間、すなわち６０．５ステップで採取した。そのサンプル濃度を分析し、その結果を図１２に示す。図１１に示すように、カラムプロフィールデータもシミュレーション結果と一致することが確認された。これはカラムプロフィールデータもＳＭＢ実験が成功したことを証明するものである。すなわち、ＳＭＢカラム内の各アミノ酸成分のｓｏｌｕｔｅ ｗａｖｅがバリンの高純度及び高収率分離に最大限有利に分布していることが実験的に検証されたものであるといえる。
【００９９】
よって、前述した全てのＳＭＢ実験データ(出口ポートにおける濃度グラフ，カラムプロフィール)により、本発明のＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ１６１Ｃを用いたＳＭＢ工程が産業的規模のバリン連続分離過程に十分に適用できることが分かった。
【０１００】
前述したＳＭＢ工程は、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ１６１Ｃ吸着剤に基づいて最適化され、実験的に検証された。この吸着剤以他に、バリン分離に効果が検証されているＣｈｒｏｍａｌｉｔｅ ＰＣＧ−６００に基づくＳＭＢ工程も最適化を行い、それに対する実験も行った。その結果、Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ ＰＣＧ−６００吸着剤も、ＳＭＢ工程に適用するとバリンの連続分離に十分に活用できることが確認された。
【実施例７】
【０１０１】
実際の発酵混合物における実験
上記実験と同様の方法で実際の発酵混合物を用いて実験を行った。
【０１０２】
実際の発酵混合物内のバリン及びロイシン成分の基礎パラメータ(吸着係数及び物質伝達係数)を測定するために、発酵混合物溶液をＣｈｒｏｍａｌｉｔｅ ＰＣＧ６００Ｃ ｒｅｓｉｎが充填されたシングルカラム内に注入し、カラム流出物の各時間の濃度を測定する混合物フロンタル実験を行った。
【０１０３】
上記実験で得られた濃度プロフィールデータとインバース法(inverse method) を用いてバリンとロイシンの基礎パラメータを決定し、その結果を表４に示す。
【０１０４】
【表４】
2015506958.tif 000006
【０１０５】
表４に示す基礎パラメータに基づいて、実際の発酵混合物からバリンとロイシンを連続して分離するＰＣＧ６００Ｃ−ＳＭＢ工程を最適設計した。このＳＭＢ工程も、本発明の新たなポート配置順序に基づくものであり、カラムの構成は図３に示すように３-ゾーン構造を採用した。
【０１０６】
このようなＰＣＧ６００Ｃ−ＳＭＢ工程の最適化過程で重点を置いたのは、バリンの高収率とロイシンの高除去率を保持しつつバリンの生産性を最大化することである。このような最適化目標を達成するために、バリンの生産性を目的関数に設定し、バリンの収率とロイシンの除去率を制約条件に設定して最適化過程を行った。具体的な最適化過程を要約すると次の通りである。Ｑｄｅｓはバリンの純度及び収率を増加させることのできる範囲内で調節された値である。
【０１０７】
Ｍａｘ  Ｊ＝Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ［Ｑｆｅｅｄ，Ｑｒａｆ，ｔｓｗ］
Ｓｕｂｊｅｃｔ ｔｏ Ｖａｌｉｎｅ ｙｉｅｌｄ＝９７％
Ｌｅｕｃｉｎｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ＝９０％
Ｆｉｘｅｄ ｖａｒｉａｂｌｅｓ  Ｑｄｅｓ＝６ｍＬ／分
ＬＣ＝２１．７ｃｍ，ｄＣ＝２．５ｃｍ
Ｃｏｌｕｍｎ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ＝１−１−２
(上記式において、ＱｆｅｅｄとＱｄｅｓは分離対象混合物の流量速度と脱着剤の流量速度をそれぞれ意味し、ｔｓｗはスイッチングタイムを意味する。)
【０１０８】
上記式によるＰＣＧ６００Ｃ−ＳＭＢ工程を最適化するために、ＮＳＧＡ−ＩＩ−ＪＧアルゴリズムに基づく最適化コンピュータプログラムを自主的にコード化し、前記コンピュータプログラムをＡｓｐｅｎシミュレーターに接続して該当工程を最適化した。最適化結果を表５に示す。
【０１０９】
【表５】
2015506958.tif 000007
【０１１０】
表５の最適化結果を実験的に検証するために、ＰＣＧ６００Ｃ−ＳＭＢ工程装置を自主的に組み立てた。組み立てた工程装置の模式図を図４に示す。
【０１１１】
表２の最適化結果と図４の工程装置を用いて、実際の発酵混合物を対象とするバリン分離ＳＭＢ実験を行った。この実験に用いた実際の発酵混合物内のバリンとロイシンの濃度は、それぞれ７１．８ｇ／Ｌと０．７４２ｇ／Ｌであった。
【０１１２】
実際の発酵混合物を対象とするバリン分離ＳＭＢ実験の結果を図１２〜図１４に示す。図１２のラフィネートの結果に示すように、バリンの高濃度回収がシミュレーションで予測したレベルで行われており、ロイシンの流出濃度レベルは無視できるほど低い。図１３の抽出物の結果に示すように、ロイシンがシミュレーションで予測したレベルで好適に除去されていることが確認された。また、抽出物ポートにおけるバリンの損失は非常に少ないことが確認された。これらの実験結果は、ＰＣＧ６００Ｃ−ＳＭＢ工程によるバリンとロイシンの連続分離において、バリンの高収率とロイシンの高除去率が十分に保持されることを意味するものである。
【０１１３】
図１２及び図１３の結果と共に、図１４のカラムプロフィール結果も、バリンとロイシンの連続分離が成功したことを示すものである。図１４に示すように、各カラム内のバリンとロイシンの濃度分布は、バリンの高収率回収とロイシンの高除去率保持に非常に有利であることが確認された。これらの結果から、実際の発酵混合物内のバリンの９９．７％をラフィネートポートにより回収することができ、それと同時にロイシンの９８．０％を抽出物ポートにより除去することができることが分かる。
【符号の説明】
【０１１４】
Ｄ：脱着剤ポート
Ｆ：フィードポート
Ｒ：ラフィネートポート
Ｆ：抽出物ポート
１０，２０，３０：ロータリーバルブ
４０，５０，６０：クロマトグラフィーゾーン
１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，２０ａ，２０ｂ，２０ｃ，３０ａ，３０ｂ，３０ｃ：連結ポート
【図１】
2015506958.tif 000008
【図２】
2015506958.tif 000009
【図３】
2015506958.tif 000010
【図４ａ】
2015506958.tif 000011
【図４ｂ】
2015506958.tif 000012
【図４ｃ】
2015506958.tif 000013
【図５】
2015506958.tif 000014
【図６】
2015506958.tif 000015
【図７】
2015506958.tif 000016
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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