(57)【要約】  本発明は、抗原特異的免疫応答を誘発する方法、抗原に対する免疫細胞結合力を増強する方法、抗原に対して特異的な免疫細胞の数を増加する方法、感染を予防または処置する方法およびワクチン接種の方法に関し、該方法は、インターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストと抗原、特にｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖから選択されるＨＩＶ−１抗原を組み合わせて投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における抗原特異的免疫応答を誘発する方法であって、対象に抗原をインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストと組み合わせて投与することを含む方法。
【請求項２】
対象における抗原に対する免疫細胞の結合力を高める方法であって、対象に抗原をインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストと組み合わせて投与することを含む方法。
【請求項３】
対象における抗原に特異的な免疫細胞の数を増やす方法であって、対象に抗原をインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストと組み合わせて投与することを含む方法。
【請求項４】
免疫細胞がＴリンパ球である、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
免疫細胞がＣＤ８＋  Ｔリンパ球である、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
抗原がウイルス抗原である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
抗原がヒト免疫不全ウイルス抗原である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
抗原がｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖ遺伝子産物またはこれらの任意の組み合わせから選択されるヒト免疫不全ウイルス抗原である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
抗原およびインターロイキン−４受容体アンタゴニストが対象に逐次投与される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
抗原およびインターロイキン−４受容体アンタゴニストが対象に同時に投与される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
抗原およびインターロイキン−４受容体アンタゴニストが初回抗原薬剤として対象に投与される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該投与が抗原をコードするポリヌクレオチド、インターロイキン−４受容体アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドまたは両者の投与を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
該ポリヌクレオチドのいずれか１個以上が組み換えウイルスの成分である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＩＬ−４Ｒアンタゴニストがインターロイキン−４受容体アルファ鎖(ＩＬ−４Ｒα)に結合し、ＩＬ−４Ｒシグナル伝達を阻止できるＩＬ−４Ｒαアンタゴニストである、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＩＬ−４Ｒアンタゴニストがシグナルペプチドを欠き、残基１２１での変異、残基１２４での変異、１２３位より後での１個以上の残基の欠失、インターロイキン−４遺伝子のエクソン２によりコードされるフラグメントの欠失またはこれらの任意の組み合わせから選択される１個以上の変異を含むヒトインターロイキン−４分子である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
対象への追加抗原薬剤の投与を含み、ここで、追加抗原薬剤が抗原およびＩＬ−４Ｒアンタゴニストを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
追加抗原薬剤の抗原およびＩＬ−４Ｒアンタゴニストを同時に投与する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
追加抗原薬剤の抗原およびＩＬ−４Ｒアンタゴニストを逐次投与する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
追加抗原薬剤の投与が、抗原をコードするポリヌクレオチド、ＩＬ−４Ｒアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドまたは両者の投与を含む、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
該ポリヌクレオチドのいずれか１個以上が組み換えウイルスの成分である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＩＬ−４Ｒアンタゴニストがインターロイキン−４受容体アルファ鎖(ＩＬ−４Ｒα)に結合し、ＩＬ−４Ｒシグナル伝達を阻止できるＩＬ−４Ｒαアンタゴニストである、請求項１６〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
追加抗原薬剤のＩＬ−４Ｒアンタゴニストがシグナルペプチドを欠き、残基１２１での変異、残基１２４での変異、１２３位より後での１個以上の残基の欠失、インターロイキン−４遺伝子のエクソン２によりコードされるフラグメントの欠失またはこれらの任意の組み合わせから選択される１個以上の変異を含む、ヒトインターロイキン−４分子である、請求項１６〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
変異がＲ１２１Ｄ、Ｙ１２４Ｄ、インターロイキン−４遺伝子のエクソン２によりコードされるフラグメントの欠失またはこれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１５または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
(ｉ)抗原および／または抗原をコードするポリヌクレオチド；および
(ii)インターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストおよび／またはＩＬ−４Ｒアンタゴニストをコードするポリヌクレオチド
を含む、組成物。
【請求項２５】
該ポリヌクレオチドのいずれか１個以上が組み換えウイルスの成分である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
抗原がウイルス抗原である、請求項２４または請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
抗原がｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖ遺伝子産物またはこれらの任意の組み合わせから選択されるヒト免疫不全ウイルス抗原である、請求項２４〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
ＩＬ−４Ｒアンタゴニストがインターロイキン−４受容体アルファ鎖(ＩＬ−４Ｒα)に結合し、ＩＬ−４Ｒシグナル伝達を阻止できるＩＬ−４Ｒαアンタゴニストである、請求項２４〜２７のいずれかに記載の組成物。
【請求項２９】
ＩＬ−４Ｒアンタゴニストがシグナルペプチドを欠き、残基１２１での変異、残基１２４での変異、１２３位より後での１個以上の残基の欠失、インターロイキン−４遺伝子のエクソン２によりコードされるフラグメントの欠失またはこれらの任意の組み合わせから選択される１個以上の変異を含むヒトインターロイキン−４分子である、請求項２４〜２８のいずれかに記載の組成物。
【請求項３０】
変異がＲ１２１Ｄ、Ｙ１２４Ｄ、インターロイキン−４遺伝子のエクソン２によりコードされるフラグメントの欠失またはこれらの任意の組み合わせから選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
該ポリヌクレオチドのいずれか１個以上が組み換えウイルスの成分である、請求項２４〜３０のいずれかに記載の組成物。
【請求項３２】
組み換えウイルスがポックスウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス(例えばＮＹＶＡＣ)、鶏痘ウイルス、カナリアポックスウイルスおよび改変ワクシニアアンカラ(ＭＶＡ)ウイルスからなる群から選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
対象における感染の予防または処置方法であって、対象に請求項２４〜３２のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項３４】
対象に感染のワクチン接種をする方法、対象に請求項２４〜３２のいずれかに記載の組成物の初回抗原薬剤および追加抗原薬剤を投与することを含む、方法。
【請求項３５】
感染がヒト免疫不全ウイルス感染であり、組成物がｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖ遺伝子産物またはこれらの任意の組み合わせから選択されるヒト免疫不全ウイルス抗原を含む、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
組み換えウイルスがポックスウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス(例えばＮＹＶＡＣ)、鶏痘ウイルス、カナリアポックスウイルスおよび改変ワクシニアアンカラ(ＭＶＡ)ウイルスからなる群から選択される、請求項１３または請求項２０に記載の方法。
【請求項３７】
組み換えウイルスが、対象においてインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストを一過性に発現する、請求項１３、２０または３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照による取り込み
本出願は、２０１２年６月５日出願のオーストラリア仮特許出願番号２０１２９０２３４５に基づく優先権を主張し、その全内容を相互引用により本明細書に包含させる。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般に免疫学の分野に関する。より具体的には、本発明は、抗原特異的免疫応答を増強するための組成物および方法に関する。本組成物および方法には、感染症を含むが、これに限定されない種々の疾患への予防および／または処置における特定の適用が発見された。
【背景技術】
【０００３】
背景
強力な抗ウイルス性粘膜ＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)が、ウイルスワクチンにより誘発される免疫応答の主因子であると広く思われている。特に、粘膜表面における局所抗ウイルス免疫応答の重要性はますます明らかになってきている。抗ウイルスＴ細胞応答の強度だけでなく、‘質’または結合力も、ウイルス感染、特に既存の免疫化戦略に対して抵抗性であることが証明されている感染に対する防御に重要である可能性を示す証拠も増えてきている。Ｔ細胞応答の質は、標的細胞上のＭＨＣ−ペプチド複合体に対するＴ細胞の機能的結合力に反映され得る。高結合力ＣＴＬは低濃度の抗原を認識できるが、低結合力ＣＴＬは、低濃度の抗原ではエフェクター機能が不十分である。高結合力ＣＴＬが低結合力Ｔ細胞と比較して感染を浄化する機能的能力が高いことは確立されている。しかしながら、高および低結合力ＣＴＬの相対比は、感染の経過中に変わることが観察されている。それにもかかわらず、低結合力Ｔ細胞よりも高結合力ＣＴＬが感染を浄化する高い能力を有することは認識されている。
【０００４】
例えば、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)の場合、ＨＩＶが通常最初に遭遇する場所である生殖器および直腸組織における局所抗ウイルス免疫応答は重要である。消化管における局所免疫応答も、そこがＨＩＶ複製の主要な部位であることを考えれば、重要である。初期ＨＩＶ暴露部位(粘膜)での高結合力抗ウイルスＴ細胞の存在は、粘膜ＣＤ４＋  Ｔ細胞枯渇を減少させ、ＨＩＶ感染を局所制御する可能性を提供する。極低レベルのウイルス抗原を発現する標的細胞(例えば細胞の感染後早期に)を認識し、低濃度の標的抗原でより速く標的細胞溶解を開始させる能力が証明されていることに鑑み、高結合力ＣＴＬを誘発するワクチン戦略は、感染に対する大きな防御を提供する可能性が高い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
高結合力ＣＴＬを誘発させる抗ウイルスワクチンに対する要求がある。特に、多くのウイルスで感染の初期点である粘膜表面で高結合力ＣＴＬを誘発できる抗ウイルスワクチンに対する要求がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要約
本発明者らは、抗ウイルスワクチンにより誘発される抗原特異的Ｔリンパ球の強度および結合力の両者を、インターロイキン−４(ＩＬ−４)の利用可能性を一過性に低下させることおよび／またはＩＬ−４機能を一過性に阻害することにより高めることができることを発見した。
【０００７】
第一の面において、本発明は、対象における抗原特異的免疫応答を誘発する方法であって、対象に抗原をインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストと組み合わせて投与することを含む、方法を提供する。
【０００８】
第二の面において、本発明は、対象における抗原に対する免疫細胞の結合力を高める方法であって、対象に抗原をインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストと組み合わせて投与することを含む、方法を提供する。
【０００９】
第三の面において、本発明は、対象における抗原に特異的な免疫細胞の数を増やす方法であって、対象に抗原をインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストと組み合わせて投与することを含む、方法を提供する。
【００１０】
上記の面の一態様において、本方法は対象に初回抗原薬剤および追加抗原薬剤を投与することを含み、当該投与は、対象に抗原をインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストと組み合わせて投与することを含む。
【００１１】
上記の面の一態様において、本方法は対象に初回抗原薬剤を投与することを含み、ここで、当該初回抗原薬剤は抗原およびＩＬ−４Ｒアンタゴニストを含む。
【００１２】
上記の面の一態様において、本方法は対象に追加抗原薬剤を投与することを含み、ここで、追加抗原薬剤は抗原およびＩＬ−４Ｒアンタゴニストを含む。
【００１３】
上記の面の一態様において、追加抗原およびＩＬ−４Ｒアンタゴニストを、逐次または同時に投与してよい。
【００１４】
上記の面の一態様において、初回抗原薬剤の投与は、抗原をコードするポリヌクレオチド、ＩＬ−４Ｒアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドまたは両者の投与を含む。
【００１５】
上記の面の一態様において、追加抗原薬剤の投与は、抗原をコードするポリヌクレオチド、ＩＬ−４Ｒアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドまたは両者の投与を含む。
【００１６】
上記の面の一態様において、初回抗原薬剤におけるポリヌクレオチドのいずれか一個以上は、組み換えウイルスの成分であり得る。
【００１７】
上記の面の一態様において、追加抗原薬剤におけるポリヌクレオチドのいずれか一個以上は、組み換えウイルスの成分であり得る。
【００１８】
上記の面の一態様において、初回抗原薬剤の組み換えウイルスは、ポックスウイルスである。
【００１９】
上記の面の一態様において、追加抗原薬剤の組み換えウイルスはポックスウイルスである。
【００２０】
上記の面の一態様において、初回抗原薬剤の組み換えウイルスは、ワクシニアウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス(例えばＮＹＶＡＣ)、鶏痘ウイルス、カナリアポックスウイルスおよび改変ワクシニアアンカラ(ＭＶＡ)ウイルスからなる群から選択されるポックスウイルスである。
【００２１】
上記の面の一態様において、追加抗原薬剤の組み換えウイルスは、ワクシニアウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス(例えばＮＹＶＡＣ)、鶏痘ウイルス、カナリアポックスウイルスおよび改変ワクシニアアンカラ(ＭＶＡ)ウイルスからなる群から選択されるポックスウイルスである。
【００２２】
上記の面の一態様において、初回抗原薬剤のＩＬ−４Ｒアンタゴニストは、インターロイキン−４受容体アルファ鎖(ＩＬ−４Ｒα)に結合し、ＩＬ−４Ｒシグナル伝達を阻止できるＩＬ−４Ｒαアンタゴニストである。
【００２３】
上記の面の一態様において、追加抗原薬剤のＩＬ−４Ｒアンタゴニストは、インターロイキン−４受容体アルファ鎖(ＩＬ−４Ｒα)に結合し、ＩＬ−４Ｒシグナル伝達を阻止できるＩＬ−４Ｒαアンタゴニストである。
【００２４】
上記の面の一態様において、初回抗原薬剤のＩＬ−４Ｒアンタゴニストは、シグナルペプチドを欠き、残基１２１での変異、残基１２４での変異、１２３位より後での１個以上の残基の欠失、インターロイキン−４遺伝子のエクソン２によりコードされるフラグメントの欠失またはこれらの任意の組み合わせから選択される１個以上の変異を含む、ヒトインターロイキン−４分子である。
【００２５】
上記の面の一態様において、追加抗原薬剤のＩＬ−４Ｒアンタゴニストは、シグナルペプチドを欠き、残基１２１での変異、残基１２４での変異、１２３位より後での１個以上の残基の欠失、インターロイキン−４遺伝子のエクソン２によりコードされるフラグメントの欠失またはこれらの任意の組み合わせから選択される１個以上の変異を含む、ヒトインターロイキン−４分子である。
【００２６】
上記の面の一態様において、初回抗原薬剤のＩＬ−４Ｒアンタゴニストは、Ｒ１２１Ｄ、Ｙ１２４Ｄ、インターロイキン−４遺伝子のエクソン２によりコードされるフラグメントの欠失またはこれらの任意の組み合わせから選択される変異を含む、ヒトインターロイキン−４分子である。
【００２７】
上記の面の一態様において、追加抗原薬剤のＩＬ−４Ｒアンタゴニストは、Ｒ１２１Ｄ、Ｙ１２４Ｄ、インターロイキン−４遺伝子のエクソン２によりコードされるフラグメントの欠失またはこれらの任意の組み合わせから選択される変異を含む、ヒトインターロイキン−４分子である。
【００２８】
上記の面の一態様において、投与は、抗原をコードするポリヌクレオチド、インターロイキン−４受容体アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドまたは両者の投与を含む。
【００２９】
上記の面の一態様において、該ポリヌクレオチドのいずれか１個以上は、組み換えウイルスの成分である。
【００３０】
上記の面の一態様において、組み換えウイルスは、ポックスウイルスである。
【００３１】
上記の面の一態様において、組み換えウイルスは、ワクシニアウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス(例えばＮＹＶＡＣ)、鶏痘ウイルス、カナリアポックスウイルスおよび改変ワクシニアアンカラウイルスからなる群から選択されるポックスウイルスである。
【００３２】
上記の面の一態様において、組み換えウイルスは、対象においてインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストを一過性に発現する。
【００３３】
上記の面の一態様において、対象へのインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストと組み合わせた抗原の投与は、対象におけるＣＤ１０３＋、ｂ２２０＋、ＣＤ８α＋細胞の数を減らすおよび／または対象におけるＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１０３−、ｂ２２０−、ＣＤ８α−細胞の数を増やす。ＣＤ１０３＋、ｂ２２０＋、ＣＤ８α＋細胞および／またはＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１０３−、ｂ２２０−、ＣＤ８α−細胞は抗原特異的であり得る。抗原はＨＩＶ抗原(例えばＨＩＶ  ｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ抗原)であり得る。
【００３４】
第四の面において、本発明は、対象における抗原に対する特異的免疫応答を誘発するための医薬の製造における抗原およびインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストの使用を提供する。
【００３５】
第五の面において、本発明は、対象における抗原に特異的な免疫細胞の結合力を増加するための医薬の製造における抗原およびインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストの使用を提供する。
【００３６】
第六の面において、本発明は、対象における抗原に特異的な免疫細胞の数を増やすための医薬の製造における抗原およびインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストの使用を提供する。
【００３７】
第七の面において、本発明は、対象における抗原に対する特異的免疫応答の誘発に使用するための抗原およびインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストを提供する。
【００３８】
第八の面において、本発明は、対象における抗原に特異的な免疫細胞の結合力の増加に使用するための抗原およびインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストを提供する。
【００３９】
第九の面において、本発明は、対象における抗原に特異的な免疫細胞の数の増加に使用するための抗原およびインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストを提供する。
【００４０】
第四、五、六、七、八および九の面における一態様において、抗原は、抗原をコードするポリヌクレオチドとして提供される。
【００４１】
第四、五、六、七、八および九の面における一態様において、インターロイキン−４受容体アンタゴニストは、インターロイキン−４受容体アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドとして提供される。
【００４２】
第四、五、六、七、八および九の面における一態様において、該ポリヌクレオチドのいずれか１個以上は、組み換えウイルスの成分である。
【００４３】
第四、五、六、七、八および九の面における一態様において、組み換えウイルスは、ポックスウイルスである。
【００４４】
第四、五、六、七、八および九の面における一態様において、組み換えウイルスは、ワクシニアウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス(例えばＮＹＶＡＣ)、鶏痘ウイルス、カナリアポックスウイルスおよび改変ワクシニアアンカラウイルスからなる群から選択されるポックスウイルスである。
【００４５】
第四、五、六、七、八および九の面における一態様において、組み換えウイルスは、対象においてインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストを一過性に発現する。
【００４６】
第四、五および六の面の一態様において、医薬はワクチンである。
【００４７】
第四、五および六の面の一態様において、医薬は第一成分および第二成分を含むワクチンであり、ここで、第一成分はインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストを含み、第二成分は抗原を含み、第一成分と第二成分は対象への同時のまたは逐次投与用であるかそのために製剤される。
【００４８】
第七、八および九の面の一態様において、抗原およびインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストは、ワクチンの成分である。
【００４９】
第四、五、六、七、八および九の面における一態様において、ワクチンは、初回抗原薬剤、追加抗原薬剤または両者として対象に投与するかまたは対象への投与のために製剤されている。
【００５０】
第四、五、六、七、八および九の面の一態様において、ワクチンは、対象への投与により、対象におけるＣＤ１０３＋、ｂ２２０＋、ＣＤ８α＋細胞の数の減少および／または対象におけるＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１０３−、ｂ２２０−、ＣＤ８α−細胞の数の増加ができる。ＣＤ１０３＋、ｂ２２０＋、ＣＤ８α＋細胞および／またはＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１０３−、ｂ２２０−、ＣＤ８α−細胞は抗原特異的であり得る。抗原はＨＩＶ抗原(例えばＨＩＶ  ｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ抗原)であり得る。
【００５１】
第一、二、三、五、六、八および九の面の一態様において、免疫細胞は、Ｔリンパ球である。
【００５２】
第一、二、三、五、六、八および九の面の一態様において、免疫細胞は、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球である。
【００５３】
第一、二、三、五、六、八および九の面の一態様において、免疫細胞は、細胞毒性ＣＤ８＋  Ｔリンパ球である。
【００５４】
上記の面の一態様において、抗原は、ウイルス抗原である。
【００５５】
上記の面の一態様において、抗原は、ヒト免疫不全ウイルス抗原である。
【００５６】
上記の面の一態様において、抗原は、ｇｐ１２０  ｅｎｖ、ｇｐ１４０  ｅｎｖ、ｇｐ１６０  ｅｎｖ、ｐ１８、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖおよびｎｅｆ遺伝子産物およびこれらの組み合わせから選択されるヒト免疫不全ウイルス抗原である。
【００５７】
上記の面の一態様において、抗原は、ｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖ遺伝子産物またはこれらの任意の組み合わせから選択されるヒト免疫不全ウイルス抗原である。
【００５８】
上記の面の一態様において、抗原は、ｇａｇ／ｐｏｌ組み合わせまたはｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖ組み合わせ遺伝子産物から選択されるヒト免疫不全ウイルス抗原である。
【００５９】
上記の面の一態様において、抗原およびインターロイキン−４受容体アンタゴニストは、対象に逐次投与される。
【００６０】
上記の面の一態様において、抗原およびインターロイキン−４受容体アンタゴニストは、対象に同時に投与される。
【００６１】
上記の面の一態様において、抗原およびインターロイキン−４受容体アンタゴニストは、初回抗原薬剤として対象に投与される。
【００６２】
上記の面の一態様において、ＩＬ−４Ｒアンタゴニストは、インターロイキン−４受容体アルファ鎖(ＩＬ−４Ｒα)に結合し、ＩＬ−４Ｒシグナル伝達を阻止できるＩＬ−４Ｒαアンタゴニストである。
【００６３】
上記の面の一態様において、ＩＬ−４Ｒアンタゴニストは、シグナルペプチドを欠き、残基１２１での変異、残基１２４での変異、１２３位より後での１個以上の残基の欠失、インターロイキン−４遺伝子のエクソン２によりコードされるフラグメントの欠失またはこれらの任意の組み合わせから選択される１個以上の変異を含むヒトインターロイキン−４分子である。
【００６４】
第十の面において、本発明は、
(ｉ)抗原および／または抗原をコードするポリヌクレオチド；および
(ii)インターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストおよび／またはＩＬ−４Ｒアンタゴニストをコードするポリヌクレオチド
を含む組成物を提供する。
【００６５】
第十一の面において、本発明は、対象における感染を予防または処置するための医薬の製造における抗原およびインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストの使用を提供する。
【００６６】
第十二の面において、本発明は、対象に感染のワクチン接種をするための医薬の製造における抗原およびインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストの使用を提供する。
【００６７】
第十三の面において、本発明は、対象における感染を予防または処置するために使用する抗原およびインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストを提供する。
【００６８】
第十四の面において、本発明は、対象に感染のワクチン接種をするための抗原およびインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストの使用を提供する。
【００６９】
第十一の面の一態様において、医薬はワクチンである。
【００７０】
第十三の面の一態様において、抗原およびインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストは、ワクチンの成分である。
【００７１】
第十一および十三の面の一態様において、ワクチンは第一成分および第二成分を含み、ここで、第一成分はインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストを含み、第二成分は抗原を含み、第一成分と第二成分は対象への同時のまたは逐次投与用であるかそのために製剤される。
【００７２】
第十一および十三の面の一態様において、ワクチンは初回抗原薬剤、追加抗原薬剤または両者として対象に投与するためであるまたは対象に投与するために製剤される。
【００７３】
第十二の面の一態様において、医薬は初回抗原薬剤、追加抗原薬剤または両者として対象に投与するためであるまたは対象に投与するために製剤される。
【００７４】
第十四の面の一態様において、抗原およびインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストは初回抗原薬剤、追加抗原薬剤または両者として対象に投与するためであるまたは対象に投与するために製剤される。
【００７５】
第十一および十三の面の一態様において、ワクチンは、対象への投与により、対象におけるＣＤ１０３＋、ｂ２２０＋、ＣＤ８α＋細胞の数の減少および／または対象におけるＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１０３−、ｂ２２０−、ＣＤ８α−細胞の数の増加ができる。ＣＤ１０３＋、ｂ２２０＋、ＣＤ８α＋細胞および／またはＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１０３−、ｂ２２０−、ＣＤ８α−細胞は抗原特異的であり得る。抗原はＨＩＶ抗原(例えばＨＩＶ  ｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ抗原)であり得る。
【００７６】
第十二および十四の面の一態様において、該ワクチンは対象におけるＣＤ１０３＋、ｂ２２０＋、ＣＤ８α＋細胞の数の減少および／または対象におけるＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１０３−、ｂ２２０−、ＣＤ８α−細胞の数の増加ができる。ＣＤ１０３＋、ｂ２２０＋、ＣＤ８α＋細胞および／またはＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１０３−、ｂ２２０−、ＣＤ８α−細胞は抗原特異的であり得る。抗原はＨＩＶ抗原(例えばＨＩＶ  ｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ抗原)であり得る。
【００７７】
第十一、十二、十三および十四の面の一態様において、抗原は、抗原をコードするポリヌクレオチドとして提供される。
【００７８】
第十一、十二、十三および十四の面の一態様において、インターロイキン−４受容体は、インターロイキン−４受容体アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドとして提供される。
【００７９】
第十、十一、十二、十三および十四の面の一態様において、該ポリヌクレオチドのいずれか１個以上は、組み換えウイルスの成分である。
【００８０】
第十、十一、十二、十三および十四の面の一態様において、組み換えウイルスは、ポックスウイルスである。
【００８１】
第十、十一、十二、十三および十四の面の一態様において、組み換えウイルスは、ワクシニアウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス(例えばＮＹＶＡＣ)、鶏痘ウイルス、カナリアポックスウイルスおよび改変ワクシニアアンカラウイルスからなる群から選択されるポックスウイルスである。
【００８２】
第十一、十二、十三および十四の面の一態様において、組み換えウイルスは、対象においてインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストを一過性に発現する。
【００８３】
第十、十一、十二、十三および十四の面の一態様において、抗原はウイルス抗原である。
【００８４】
第十、十一、十二、十三および十四の面の一態様において、抗原は、ｇｐ１２０  ｅｎｖ、ｇｐ１４０  ｅｎｖ、ｇｐ１６０  ｅｎｖ、ｐ１８、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖおよびｎｅｆ遺伝子産物から選択されるヒト免疫不全ウイルス抗原またはこれらの組み合わせである。
【００８５】
第十、十一、十二、十三および十四の面の一態様において、抗原はｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖ遺伝子産物またはこれらの任意の組み合わせから選択されるヒト免疫不全ウイルス抗原である。
【００８６】
第十、十一、十二、十三および十四の面の一態様において、抗原はｇａｇ／ｐｏｌ組み合わせまたはｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖ組み合わせ遺伝子産物から選択されるヒト免疫不全ウイルス抗原である。
【００８７】
第十、十一、十二、十三および十四の面の一態様において、ＩＬ−４Ｒアンタゴニストはインターロイキン−４受容体アルファ鎖(ＩＬ−４Ｒα)に結合し、ＩＬ−４Ｒシグナル伝達を阻止できるＩＬ−４Ｒαアンタゴニストである。
【００８８】
第十、十一、十二、十三および十四の面の一態様において、ＩＬ−４Ｒアンタゴニストがシグナルペプチドを欠き、残基１２１での変異、残基１２４での変異、１２３位より後での１個以上の残基の欠失、インターロイキン−４遺伝子のエクソン２によりコードされるフラグメントの欠失またはこれらの任意の組み合わせから選択される１個以上の変異を含むヒトインターロイキン−４分子である。
【００８９】
第十、十一、十二、十三および十四の面の一態様において、変異はＲ１２１Ｄ、Ｙ１２４Ｄ、インターロイキン−４遺伝子のエクソン２によりコードされるフラグメントの欠失またはこれらの任意の組み合わせから選択される。
【００９０】
第十五の面において、本発明は、対象における感染の予防または処置方法であって、対象に第十の面の組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【００９１】
第十六の面において、本発明は対象に感染のワクチン接種をする方法であって、第十の面の組成物の初回抗原薬剤および追加抗原薬剤を投与することを含む、方法を提供する。
【００９２】
第十五および十六の面の一態様において、感染はヒト免疫不全ウイルス感染であり、組成物はｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖ遺伝子産物またはこれらの任意の組み合わせから選択されるヒト免疫不全ウイルス抗原を含む。
【００９３】
第十一、十二、十三および十四の面の一態様において、感染はヒト免疫不全ウイルス感染であり、抗原はｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖ遺伝子産物またはこれらの任意の組み合わせから選択されるヒト免疫不全ウイルス抗原である。
【００９４】
図面の簡単な説明
本発明の好ましい態様を、添付する図面を参照して、例としてのみ、ここに記載し、図面は次のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ＦｓｅＩからＨｉｎｄIII部位の配列を含み、鶏痘ウイルス初期／後期プロモーターを組み入れたＭＶＡ１６４とＭＶＡ１６５の間に作製した遺伝子間挿入部位を含むＭＶＡ  ｄｅｌ−III合成ベクター配列を示す。
【００９６】
【図２】ＦｓｅＩからＨｉｎｄIII(上流Ｔ５ＮＴ初期転写終止シグナルを含む)を含む複数クローニング部位がＦ８ＬとＦ７ＬのＯＲＦの間に挿入されている、ＭＶＡ“ＨｉｎｄIII  Ｆ”挿入部位を示す。
【００９７】
【図３】マカクザルでの発現に最適化した合成ＳＩＶ  ｍａｃ２３９  ｇａｇ／ｐｏｌ配列を示す。配列は、クローニングを促進するために、遺伝子の上流に合成ポックスウイルス初期／後期プロモーターおよび下流に初期転写ターミネーター配列(Ｔ５ＮＴ)を制限エンドヌクレアーゼ部位と隣接して含む。遺伝子は、重複領域翻訳中のフレームシフトに起因する融合タンパク質として発現される。
【００９８】
【図４】ＩＬ−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニスト(ＩＬ−４Ｃ１１８)と共ワクチン接種後のＨＩＶ  ＫｄＧａｇ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞結合力を示す経時的グラフである。ＦＰＶ  ＨＩＶ  ＩＬ−４Ｃ１１８／ＶＶ  ＨＩＶ  ＩＬ−４Ｃ１１８＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ抗原および変異体ＩＬ−４Ｃ１１８をコードする組み換え鶏痘ウイルスで初回ワクチン接種、続いてＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ抗原および変異体ＩＬ−４Ｃ１１８をコードする組み換えワクシニアウイルスで追加免疫ワクチン接種。ＦＰＶ  ＨＩＶ／ＶＶ  ＨＩＶ＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ(ＩＬ−４受容体アンタゴニストを含まず)をコードする組み換え鶏痘で初回ワクチン接種、続いてＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌをコードする組み換えワクシニアウイルス(ＩＬ−４受容体アンタゴニストを含まず)で追加免疫ワクチン接種。
【００９９】
【図５】ＩＬ−４受容体アンタゴニストと共ワクチン接種後のＨＩＶ  ＫｄＧａｇ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞結合力およびＨＩＶ  ＫｄＧａｇ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の強度を示す棒グラフである。ＦＰＶ  ＨＩＶ／ＶＶ  ＨＩＶ＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌをコードする組み換え鶏痘(ＩＬ−４受容体アンタゴニストを含まず)で初回ワクチン接種、続いてＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌをコードする組み換えワクシニアウイルス(ＩＬ−４受容体アンタゴニストを含まず)で追加免疫ワクチン接種；ＦＰＶ  ＨＩＶ  ＩＬ−４Ｃ１１８／ＶＶ  ＨＩＶ＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ抗原および変異体ＩＬ−４Ｃ１１８をコードする組み換え鶏痘ウイルスで初回ワクチン接種、続いてＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌをコードする組み換えワクシニアウイルス(ＩＬ−４受容体アンタゴニスト含まず)で追加免疫ワクチン接種；ＦＰＶ  ＨＩＶ／ＶＶ  ＨＩＶ  ＩＬ−４Ｃ１１８＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ抗原および変異体ＩＬ−４Ｃ１１８をコードする組み換えワクシニアウイルスで初回ワクチン接種、続いてＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌをコードする組み換え鶏痘ウイルス(ＩＬ−４受容体アンタゴニストを含まず)で追加免疫ワクチン接種；ＦＰＶ  ＨＩＶ  ＩＬ−４Ｃ１１８／ＶＶ  ＨＩＶ  ＩＬ−４Ｃ１１８＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ抗原および変異体ＩＬ−４Ｃ１１８をコードする組み換え鶏痘ウイルスで初回ワクチン接種、続いてＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ抗原および変異体ＩＬ−４Ｃ１１８をコードする組み換えワクシニアウイルスで追加免疫ワクチン接種。
【０１００】
【図６】ＩＬ−４受容体アンタゴニストとの共ワクチン接種後のＨＩＶＫｄＧａｇ特異的全身性(脾臓)ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫を示す棒グラフである。灰色棒＝ＩＬ−４受容体アンタゴニスト(ＩＬ−４Ｃ１１８)およびＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ抗原をコードする組み換えウイルスワクチンを使用して初回および追加免疫ワクチン接種。黒色棒−ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ抗原のみをコードする組み換えウイルスワクチン(ＩＬ−４受容体アンタゴニストを含まず)を使用して初回および追加免疫ワクチン接種。
【０１０１】
【図７】ＩＬ−４受容体アンタゴニスト(ＩＬ−４Ｃ１１８)初回−追加免疫ワクチン接種後のＨＩＶ  ＫｄＧａｇ特異的粘膜(生殖器−直腸節)ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫を示す棒グラフである。ＦＰＶ  ＨＩＶ  ＩＬ−４Ｃ１１８／ＶＶ  ＨＩＶ  ＩＬ−４Ｃ１１８＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ抗原および変異体ＩＬ−４Ｃ１１８をコードする組み換え鶏痘ウイルスで初回ワクチン接種、続いてＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ抗原および変異体ＩＬ−４Ｃ１１８をコードする組み換えワクシニアウイルスで追加免疫ワクチン接種；ＦＰＶ  ＨＩＶ／ＶＶ  ＨＩＶ＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌをコードする組み換え鶏痘(ＩＬ−４受容体アンタゴニストを含まず)で初回ワクチン接種、続いてＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌをコードする組み換えワクシニアウイルス(ＩＬ−４受容体アンタゴニスト含まず)で追加免疫ワクチン接種。
【０１０２】
【図８】体重減少およびＣＤ８＋  Ｔ細胞応答で評価した、ＩＬ−４受容体アンタゴニストまたはインターロイキン１３(ＩＬ−１３)受容体アンタゴニスト存在下または非存在下の、粘膜インフルエンザ−ＫｄＧａｇ負荷後の防御免疫レベルを示す２個のグラフである。ＩＬ−１３ノックアウトマウスにおける、ＦＰＶ  ＨＩＶ  ＩＬ−４Ｃ１１８／ＶＶ  ＨＩＶ  ＩＬ−４Ｃ１１８＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ抗原および変異体ＩＬ−４Ｃ１１８をコードする組み換え鶏痘ウイルスで初回ワクチン接種、続いてＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ抗原および変異体ＩＬ−４Ｃ１１８をコードする組み換えワクシニアウイルスで追加免疫ワクチン接種；ＦＰＶ  ＨＩＶ／ＶＶ  ＨＩＶ＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌをコードする組み換え鶏痘(ＩＬ−４受容体アンタゴニスト含まず)で初回ワクチン接種、続いてＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌをコードする組み換えワクシニアウイルス(ＩＬ−４受容体アンタゴニストを含まず)で追加免疫ワクチン接種；ＦＰＶ  ＨＩＶΔ１０／ＶＶ  ＨＩＶΔ１０＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ抗原およびＩＬ−１３Ｒａ２可溶性受容体をコードする組み換え鶏痘ウイルスで初回ワクチン接種、続いてＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ抗原およびＩＬ−１３Ｒａ２可溶性受容体をコードする組み換えワクシニアウイルスで追加免疫ワクチン接種；ＦＰＶ  ＨＩＶ／ＶＶ  ＨＩＶ  (ＩＬ  １３  −／−)＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌをコードする組み換え鶏痘(ＩＬ−４受容体アンタゴニストを含まず)で初回ワクチン接種、続いてＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌをコードする組み換えワクシニアウイルス(ＩＬ−４受容体アンタゴニストを含まず)で追加免疫ワクチン接種；(ｎ＝６〜１４／群；エラーバー＝ＳＥＭ)。
【０１０３】
【図９】追加免疫８週間後にＥＬＩＳｐｏｔで測定した記憶全身性および粘膜ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を示す２個のグラフである。ＦＰＶ  ＨＩＶ／ＶＶ  ＨＩＶ＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌをコードする組み換え鶏痘(ＩＬ−４受容体アンタゴニスト含まず)で初回ワクチン接種、続いてＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌをコードする組み換えワクシニアウイルス(ＩＬ−４受容体アンタゴニストを含まず)で追加免疫ワクチン接種；ＦＰＶ  ＨＩＶ  ＩＬ−４Ｃ１１８／ＶＶ  ＨＩＶ  ＩＬ−４Ｃ１１８＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ抗原および変異体ＩＬ−４Ｃ１１８をコードする組み換え鶏痘ウイルスで初回ワクチン接種、続いてＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ抗原および変異体ＩＬ−４Ｃ１１８をコードする組み換えワクシニアウイルスで追加免疫ワクチン接種。
【０１０４】
【図１０】初回ワクチン接種２４時間後肺粘膜におけるＡＰＣサブセットの評価に使用した抗原提示細胞(ＡＰＣ)サブセットゲーティング戦略を設定する一連のドットプロットである。Ｒ１＝総ＡＰＣサブセット；Ｒ２＝前方散乱(ＦＳＣ)ダブレット除去；Ｒ３＝側方散乱(ＳＳＣ)ダブレット除去；Ｒ５＝ＭＨＣ  II＋上でゲート開閉する細胞；ＣＤ１１ｃ＋＝ＡＰＣサブセット；ＡＰＣ＝抗原提示細胞；ＤＣ＝樹状細胞；ＣＤ１１ｃ＝ＤＣマーカー；１Ａｄ＝ＭＨＣ  II細胞マーカー。
【０１０５】
【図１１】初回ワクチン接種２４時間後肺粘膜におけるＣＤ１０３関連抗原提示細胞サブセットを評価する一連のドットプロットである。ＦＰＶ−ＨＩＶ＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現する鶏痘ウイルスまたはＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖ遺伝子を発現する鶏痘ウイルス；ＶＶ−ＨＩＶ＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現するワクシニアウイルス；ＭＶＡ−ＨＩＶ＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現する改変ワクシニアアンカラ；ＦＰＶ−ＨＩＶ  ＩＬ−１３ＫＯ＝対照ワクチンＦＰＶ−ＨＩＶを与えたＩＬ−１３ノックアウト動物；ＦＰＶ−ＨＩＶ  ＩＬ−１３Ｒα２＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子および可溶性ＩＬ−１３Ｒａ２を共発現する鶏痘ウイルスまたはＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖ遺伝子および可溶性ＩＬ−１３Ｒａ２を共発現する鶏痘ウイルス；ＦＰＶ−ＨＩＶ  Ｃ１１８＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子およびＩＬ−４アンタゴニストを共発現する鶏痘ウイルスまたはＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖ遺伝子を発現する鶏痘ウイルスおよびＩＬ−４アンタゴニスト；ＣＤ１１ｂ＝樹状細胞マーカー；ＣＤ１０３＝肺／皮膚特異的Ｔ細胞マーカー；ＩＬ−１３ＫＯ＝ＩＬ−１３−／−遺伝子ノックアウトマウス。
【０１０６】
【図１２】初回ワクチン接種２４時間後肺粘膜におけるＢ２２０関連抗原提示細胞サブセットを評価する一連のドットプロットである。ＦＰＶ−ＨＩＶ＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現する鶏痘ウイルスまたはＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖ遺伝子を発現する鶏痘ウイルス；ＶＶ−ＨＩＶ＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現するワクシニアウイルス；ＭＶＡ−ＨＩＶ＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現する改変ワクシニアアンカラ；ＦＰＶ−ＨＩＶ  ＩＬ−１３ＫＯ＝対照ワクチンＦＰＶ−ＨＩＶを与えたＩＬ−１３ノックアウト動物；ＦＰＶ−ＨＩＶ  ＩＬ−１３Ｒα２＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子および可溶性ＩＬ−１３Ｒａ２を共発現する鶏痘ウイルスまたはＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖ遺伝子および可溶性ＩＬ−１３Ｒａ２を共発現する鶏痘ウイルス；ＦＰＶ−ＨＩＶ  Ｃ１１８＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子およびＩＬ−４アンタゴニストを共発現する鶏痘ウイルスまたはＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖ遺伝子を発現する鶏痘ウイルスおよびＩＬ−４アンタゴニスト；ＶＶ−ＩＬ１３ＫＯ＝対照ワクチンＶＶ−ＨＩＶを与えたＩＬ−１３ノックアウト動物；ＶＶ−ＨＩＶ  ＩＬ−１３Ｒα２＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子および可溶性ＩＬ−１３Ｒａ２を共発現するワクシニアウイルス；ＣＤ１１ｂ＝樹状細胞マーカー；Ｂ２２０＝Ｂ細胞マーカー；Ｃ１１８＝ＩＬ−４アンタゴニスト。
【０１０７】
【図１３】初回ワクチン接種２４時間後肺粘膜におけるＣＤ８関連抗原提示細胞サブセットを評価する一連のドットプロットである。ＦＰＶ−ＨＩＶ＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現する鶏痘ウイルスまたはＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖ遺伝子を発現する鶏痘ウイルス；ＶＶ−ＨＩＶ＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現するワクシニアウイルス；ＭＶＡ−ＨＩＶ＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現する改変ワクシニアアンカラ；ＦＰＶ−ＨＩＶ  ＩＬ−１３ＫＯ＝対照ワクチンＦＰＶ−ＨＩＶを与えたＩＬ−１３ノックアウト動物；ＦＰＶ−ＨＩＶ  ＩＬ−１３Ｒα２＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子および可溶性ＩＬ−１３Ｒａ２を共発現する鶏痘ウイルスまたはＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖ遺伝子および可溶性ＩＬ−１３Ｒａ２を共発現する鶏痘ウイルス；ＦＰＶ−ＨＩＶ  Ｃ１１８＝ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子およびＩＬ−４アンタゴニストを共発現する鶏痘ウイルスまたはＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖ遺伝子を発現する鶏痘ウイルスおよびＩＬ−４アンタゴニスト。ＣＤ１１ｂ＝樹状細胞マーカー；ＣＤ８α＝樹状細胞マーカー。
【０１０８】
【図１４】ＨＩＶ−ＩＬ−４Ｒアンタゴニストアジュバントワクチン接種後にｐ２４Ｇａｇに対する血清ＩｇＧ１応答が増強されていることを証明する棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１０９】
定義
本明細書で使用する限り、単数表現は、他に具体的な記載がない限り、複数表現も含む。例えば、用語“ウイルス”は複数のウイルスを提供する。
【０１１０】
ここで使用する用語“含む”は、“包含する”を意味する。“含み”および“含んで”のような用語“含む”の変形は、それに対応して変えられた意味を有する。それゆえに、例えば、組み換えウイルスを“含む”ワクチンは、排他的に該組み換えウイルスを含んでもよく、１種以上の付加的成分(例えば別のタイプの組み換えウイルス)を含んでもよい。
【０１１１】
ここで使用する“治療有効量”は、その意味の中に、所望の治療効果を提供するために本発明において使用するために、非毒性であるが、十分な量の薬剤または組成物を含む。必要な正確な量は、処置する種、対象の年齢および一般的状態、処置する状態の重症度、投与する具体的薬剤、投与方法などのような因子により対象毎に変わる。それゆえに、全態様に適用可能な正確な“有効量”を特定することは不可能である。しかしながら、如何なる場合でも、適当な“有効量”は、当業者が日常的な実験のみを使用して決定できる。
【０１１２】
ここで使用する用語“対象”は、ウシ、ウマ、ヒツジ、霊長類、鳥類および齧歯類種を含む、経済的に、社会的にまたは研究上重要なあらゆる動物を含む。従って、“対象”は例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物のような哺乳動物であり得る。
【０１１３】
ここで使用する用語“ＩＬ−４アンタゴニスト”は、例えば、ＩＬ−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)およびＩＬ−４受容体アルファ鎖(ＩＬ−４Ｒα)アンタゴニストを含む、ＩＬ−４の産生および／または生物学的機能を阻止または阻害できるあらゆる薬剤を包含する。
【０１１４】
ここで使用する用語“ＩＬ−４Ｒのアンタゴニスト”、“ＩＬ−４Ｒアンタゴニスト”および“インターロイキン−４受容体アンタゴニスト”は交換可能に使用し、同じ意味を有する。これらの用語は、ＩＬ−４ＲαまたはＩＬ−４Ｒαを含む受容体複合体により開始される(すなわちこれらを介して直接開始する)細胞シグナル伝達経路の活性化および／または継続を阻止または阻害できるあらゆる薬剤を含む。ある態様において、ＩＬ−４Ｒアンタゴニストは、ＩＬ−４Ｒα介在細胞シグナル伝達を開始せずにＩＬ−４Ｒαと結合し、それにより該アンタゴニスト非存在下で、そうでなければＩＬ−４Ｒ受容体複合体を活性化できるＩＬ−４Ｒαと１種以上のリガンド(例えばＩＬ−４および／またはＩＬ−１３)の間の結合相互作用を阻止または改変する薬剤であり得る。他の態様において、ＩＬ−４Ｒアンタゴニストは、ＩＬ−４Ｒαの１個以上のリガンド(例えばＩＬ−４および／またはＩＬ−１３)と結合し、それによりリガンドとＩＬ−４Ｒαの間の結合相互作用を遮断または改変できる薬剤であり得る。他の態様において、ＩＬ−４Ｒアンタゴニストは、ＩＬ−４ＲαまたはＩＬ−４Ｒαを含む受容体複合体により開始される(すなわちこれらを介して開始する)細胞シグナル伝達経路を阻害または遮断できる薬剤であり得る。例えば、薬剤は、ＩＬ−４ＲαまたはＩＬ−４Ｒαを含む受容体複合体により開始される(すなわちこれらを介して開始する)シグナル伝達経路における下流タンパク質または分子と相互作用できまたは活性を修飾できる。
【０１１５】
免疫細胞／免疫細胞集団およびある抗原の文脈においてここで使用する用語“結合力”は、免疫細胞／免疫細胞集団において抗原特異的応答を誘発するために必要な抗原の量または濃度を意味する。
【０１１６】
ここで使用する用語“抗体”および“抗体群”は、ＩｇＧ(ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む)、ＩｇＡ(ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む)、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭおよびＩｇＹ、一本鎖全抗体およびその抗原結合フラグメントを含む、全抗体を含む。抗原結合抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ(ａｂ’)２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖｓ(ｓｃＦｖ)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ(ｓｄＦｖ)およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントを含むが、これらに限定されない。抗体は任意の動物起源であり得る。一本鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独でまたはヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの全体または一部と組み合わせて含み得る。また包含されるのは、可変領域およびヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの組み合わせであり得る。抗体は、生物学的分子に特異的に結合するモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、多特異的、ヒト化およびヒトモノクローナルおよびポリクローナル抗体であり得る。
【０１１７】
ここで使用する用語“タンパク質”、“ポリペチド”および“ペプチド”は、各々、ペプチド結合により一緒に結合されたアミノ酸からなるポリマーをいい、交換可能に使用する。本発明の目的で、“ポリペチド”は完全長タンパク質または完全長タンパク質の一部を構成し得る。
【０１１８】
ここで使用する用語“ポリヌクレオチド”は、天然ヌクレオチドのアナログとして知られるデオキシリボヌクレオチド塩基、リボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーおよびこれらの混合物をいう。
【０１１９】
ここで使用する用語“ヌクレオチド配列”はＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列および相補的(ｃＤＮＡ)配列を含むと理解される。
【０１２０】
ここで使用する用語“親ウイルス”は、本発明の組み換えウイルスを形成するために外来性遺伝子材料を取り込むように修飾できるウイルスをいうと理解される。
【０１２１】
ここで使用する用語“組み換えウイルス”は、少なくとも１個の外来性ヌクレオチド配列を含む“親ウイルス”をいうと理解される。
【０１２２】
ここで使用する用語“外来性ヌクレオチド配列”は、組み換えウイルスの文脈で使用するとき、組み換えウイルスを形成するために親ウイルスのゲノムに挿入される何らかのヌクレオチド配列を包含すると理解される。
【０１２３】
ここで使用する用語“免疫原性”は、例えば、ヌクレオチド配列、ポリペチド、外来性ヌクレオチド配列、外来性ポリペチド、抗原またはエピトープのようなある成分の文脈で使用するとき、該作用因子が、単独でまたは他の作用因子と組み合わせて作用して、免疫応答を誘発する、存在する免疫応答を増強するまたは存在する免疫応答を変える能力を有することを意味する。
【０１２４】
免疫応答の“誘発”は、ここでは、免疫応答の刺激および予め存在している免疫応答の増強を含むことを意図すると理解される。
【０１２５】
ここで使用する用語“キット”は、材料を配送するための何らかの配送系をいう。このような送達系は、反応試薬(例えば適当な容器中のラベル、対照サンプル、支持物質など)および／または支持物質(例えば、緩衝液、アッセイの実施に関する指示書など)の一つの場所から他の場所への保存、輸送または配送を可能にする系を含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または支持物質を含む箱のような１個以上の筺体を含み得る。用語“キット”は、細分化されたおよび組み合わされたキットの両者を含む。
【０１２６】
ここで使用する用語“細分化されたキット”は、各々全キット成分の一部を含む、２個以上の別々の容器を含む配送系をいう。容器は、意図するレシピエントに一体としてまたは個別に配送され得る。各々全キット成分の一部を含む、２個以上の別々の容器を含む任意の配送系が、用語“細分化されたキット”に含まれる。
【０１２７】
ここで使用する“組み合わされたキット”は、一容器(例えば所望の成分の各々を収容した１個の箱)に反応アッセイの成分の全てを含む、配送系をいう。
【０１２８】
ここで、記載の数値に関連した用語“約”の使用は、記載した数値および記載した値の±１０％以内の数値を含むと解釈する。
【０１２９】
ここでの用語“間”は、数値範囲を参照するとき、該範囲の両端の数値を含む。例えば、１０残基〜２０残基長の間のポリペチドは、１０残基長のポリペチドおよび２０残基長のポリペチドを含む。
【０１３０】
本明細書での先行文献についての何らかの記載またはこれらの文献に由来するまたはこれらの文献に基づくここでの見解は、これらの文献または由来する見解が関連する分野で共通する一般知識の一部であることを認めるものではない。
【０１３１】
記載の目的で、ここに引用する全ての文献は、特に断らない限り、その全体を引用により本明細書に包含させる。
【０１３２】
詳細な記載
次の詳細な記載は、当業者が本発明を実施することを可能とするのに十分詳細に本発明の例示的態様を述べる。記載する種々の態様の特性または制限は、本発明の他の態様または全体としての本発明を必ずしも制限しない。従って、次の詳細な記載は、本発明の範囲を限定するものではなく、これは特許請求の範囲によってのみ規定される。
【０１３３】
ウイルス抗原に対して高結合力Ｔリンパ球応答および／またはかなり強い強度のＴリンパ球応答を誘発できるワクチンは、本分野で非常に求められている。粘膜表面がウイルス進入の最初の関門であることを考慮すると、これらの部位で誘発応答が可能なワクチンも望ましい。本発明者らは、抗原特異的Ｔリンパ球応答の結合力および／または強度を、ＩＬ−４を阻害することにより、すなわち、ＩＬ−４の利用率を減少させるおよび／またはＩＬ−４機能を阻害することにより、顕著に高めることができることを確認した。これは、長期的に正常ＩＬ−４レベルおよび機能が回復できるように、一過性に行い得る。
【０１３４】
従って、本発明のある面は、免疫細胞応答の強度を増強するおよび／または標的の感染病原体に対する免疫細胞結合力を増強することができる組成物、ワクチンおよび医薬を提供する。本組成物は、感染病原体に対する免疫を誘発できる免疫原性成分を、ＩＬ−４の産生および／または活性を阻害できる成分と共に含む。あるいは、免疫原性成分およびＩＬ−４の産生および／または活性を阻害できる成分を、同時または逐次投与用の別の組成物で提供してよい。本発明の組成物をキットで提供してよい。
【０１３５】
本発明の他の面は、対象における抗原特異的免疫応答を誘発する方法に関する。本方法は、１種以上の本発明の組成物の投与を含み、対象における抗原に対する免疫細胞の結合力の増加および／または抗原に特異的な免疫細胞の数の増加に有効であり得る。
【０１３６】
本発明のさらに別の面は、ここに提供する組成物、ワクチンおよび医薬の投与による、感染を予防および／または処置する方法に関する。本方法は、予防的および／または治療的ワクチンの投与を含み得る。
【０１３７】
インターロイキン−４(ＩＬ−４)アンタゴニスト
当分野の当業者に知られるとおり、ＩＬ−４は、２個の別々の受容体複合体に結合できる免疫調節性サイトカインである。Ｉ型受容体複合体は、インターロイキン−４受容体アルファ(ＩＬ−４Ｒα)鎖および共通ガンマ鎖(γｃ)を含む。II型受容体複合体はＩＬ−４Ｒα鎖を含むが、γｃはＩＬ−１３タンパク質受容体アルファ１(ＩＬ−１３Ｒα１)鎖またはＩＬ−１３タンパク質受容体２(ＩＬ−１３Ｒα２)鎖に置き換わっている。いずれの場合も、ＩＬ−４Ｒα鎖のみがＩＬ−４に結合でき、ＩＬ−４Ｒα鎖とγｃ、ＩＬ−１３Ｒα１またはＩＬ−１３Ｒα２のヘテロ二量体化も細胞シグナル伝達開始に必要である(ＩＬ−４Ｒα／γｃおよびＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−１３Ｒα１の場合、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介する)。
【０１３８】
本発明の組成物および方法は、ＩＬ−４産生および／または機能のアンタゴニストを用いる。本明細書の実施例において証明されるとおり、ＩＬ−４アンタゴニストは、同時投与した抗原の免疫細胞応答の強度および／または結合力を顕著に増加／増強することが判明した。理論に縛られないが、免疫応答の局所環境におけるＩＬ−４産生および／または機能の阻害が、抗原特異的ＣＴＬ産生および／または機能に対する阻害作用を減少させるとの仮説が立てられる。従って、特定の抗原と同時投与したとき、ＩＬ−４アンタゴニストは、抗原特異的細胞(例えば抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔリンパ球)の強度および／または結合力を大きくし得る。
【０１３９】
ここで考慮するＩＬ−４アンタゴニストは、ＩＬ−４の産生および／または生物学的機能を阻止または阻害できる何らかの薬剤を包含する。ＩＬ−４の生物学的機能の多くが、ＩＬ−４Ｒとの結合相互作用を介して仲介されることを考えると、多くのＩＬ−４産生および／または機能のアンタゴニストもＩＬ−４Ｒのアンタゴニストである(そしてその逆もそうである)。
【０１４０】
ＩＬ−４アンタゴニストは、ＩＬ−４との結合相互作用によりＩＬ−４の産生および／または生物学的機能を阻害し得る。アンタゴニストとＩＬ−４の結合相互作用はＩＬ−４が他の分子(例えばＩＬ−４Ｒα)と結合するかまたは他に相互作用することを阻害し、それによりＩＬ−４機能および／または産生を阻害する。この場合、ＩＬ−４とアンタゴニストの結合相互作用の親和性は、ＩＬ−４とそれが他の方法で結合し得る他の分子の結合相互作用より高い可能性がある。非限定的例として、可溶性形態のＩＬ−４受容体をＩＬ−４アンタゴニストとして使用し得る。これらは、ＩＬ−４と高親和性で結合するように変異され得る(例えば可溶性ＩＬ−４Ｒは、排他的にＩＬ−４Ｒα鎖の細胞外ドメインからなる)。抗体もＩＬ−４アンタゴニストとして使用し得る。抗体はＩＬ−４Ｒ(例えばＩＬ−４Ｒα)、または、ＩＬ−４Ｒαのリガンド(例えばＩＬ−４)に結合親和性を有し得る。
【０１４１】
これに加えてまたはこれとは別に、ＩＬ−４アンタゴニストは、ＩＬ−４Ｒにより(すなわち介して)開始されるシグナル伝達経路における下流タンパク質または分子のいずれか１個以上の発現および／または機能の阻止または阻害によりＩＬ−４の産生および／または生物学的機能を阻害し得る。例えば、薬剤は、ＩＬ−４ＲまたはＩＬ−４Ｒαを含む受容体複合体により(すなわち介して)開始されるシグナル伝達経路における下流タンパク質または分子と相互作用しても、活性を修飾してもよい。
【０１４２】
これに加えてまたはこれとは別に、ＩＬ−４アンタゴニストは、ＩＬ−４Ｒまたはその成分(例えばＩＬ−４Ｒα)との結合相互作用によりＩＬ−４の産生および／または生物学的機能を阻害し得る。この場合、結合相互作用は一般にＩＬ−４Ｒを介して仲介される細胞シグナル伝達を開始しないが、結合親和性は、一般に他のリガンドがＩＬ−４Ｒまたはその成分(例えばＩＬ−４Ｒα)に結合するまたはＩＬ−４Ｒを介する細胞シグナル伝達を開始できる方法で結合する能力を阻止する。
【０１４３】
非限定的例として、ＩＬ−４アンタゴニストはＩＬ−４Ｒまたはその成分(例えばＩＬ−４Ｒα)と結合するものであり得る。これらのＩＬ−４アンタゴニストは、それゆえに、またＩＬ−４ＲアンタゴニストおよびＩＬ−４Ｒαアンタゴニストでもある。結合相互作用は、一般にＩＬ−４Ｒを介して相当レベルの細胞シグナル伝達を誘発せず、または、いかなる細胞シグナル伝達も誘発しないが、相互作用の親和性は、ＩＬ−４Ｒの他のリガンド(例えばＩＬ−４および／またはＩＬ−１３)がＩＬ−４Ｒ(例えばＩＬ−４Ｒα)に結合するまたはＩＬ−４Ｒを介する細胞シグナル伝達を開始できる方法で結合する能力を阻止するのに十分な強度である。
【０１４４】
ある態様において、ＩＬ−４アンタゴニストは、ＩＬ−４Ｒαと結合する(そしてゆえにまたＩＬ−４Ｒαのアンタゴニストである)。細胞シグナル伝達を実質的に起動せずにＩＬ−４Ｒαと結合し、同時にＩＬ−４Ｒα(またはＩＬ−４Ｒαを含むＩＬ−４Ｒ)とそのリガンドの相互作用を阻止する任意のＩＬ−４アンタゴニストを、本発明の組成物および方法で使用し得る。このカテゴリーのアンタゴニストは、本分野の当業者に周知であり、例えば、細胞シグナル伝達を開始することなくＩＬ−４Ｒαと結合でき、そうしてＩＬ−４Ｒ機能を遮断するＩＬ−４Ｒαの修飾リガンド(例えば変異体ＩＬ−４分子)を含む。修飾ＩＬ−４Ｒαリガンドの具体的および非限定的例は、１個以上のＣ末端残基の欠失(例えばここに記載するＩＬ−４Ｃ１１８のようなマウスＩＬ−４の分泌形態におけるチロシン残基１１９の欠失または置換)のようなＣ末端変異および他の哺乳動物ＩＬ−４相同体における同等な変異；ヒトまたはマカクＩＬ−４の分泌形態における１２４位のチロシンの欠失または置換(例えばここに記載するＩＬ−４Ｃ１２３)および他の哺乳動物ＩＬ−４相同体における同等な変異；ＩＬ−４遺伝子のエクソン２によりコードされる残基が欠失したもののようなスプライスバリアント(例えばヒトにおけるＩＬ−４デルタ２および他の哺乳動物ＩＬ−４相同体における同等な変異)；およびヒトＩＬ−４タンパク質の成熟分泌形態の１２１位および／または１２４位および他の哺乳動物ＩＬ−４相同体の同等な位置における変異(例えばヒトにおけるＩＬ−４Ｙ１２４Ｄ変異体またはＲ１２１Ｄ／Ｙ１２４Ｄ  ＩＬ−４変異体；マウスにおけるＱ１１６Ｄ／Ｙ１１９Ｄ  ＩＬ−４変異体またはＹ１１９Ｄ変異体)を有するＩＬ−４を含む。ＩＬ−４Ｒα特異的抗体が、細胞シグナル伝達を実質的に起動せずにＩＬ−４Ｒαと結合するように設計できることも意図される。
【０１４５】
ＩＬ−４Ｒ結合相互作用および／またはＩＬ−４Ｒ介在細胞シグナル伝達を決定するための多くの方法が利用可能であり、当分野の当業者に周知である。非限定的例は、表面プラズモン共鳴法、蛍光共鳴エネルギー移動(ＴＲ−ＦＲＥＴ)、化学的免疫共沈降、生物発光共鳴エネルギー転移(ＢＲＥＴ)、電気泳動移動度シフトアッセイ(ＥＭＳＡ)により測定するＩＬ−４依存性ＳＴＡＴ６活性化などを含む。
【０１４６】
抗原
本発明の組成物および方法は、免疫応答を刺激するために抗原を使用する。誘発される抗原特異的免疫応答は、ＩＬ−４アンタゴニスト(例えばＩＬ−４Ｒαアンタゴニスト)存在下で増強される。
【０１４７】
抗原は、内在性(自己)抗原および外来性(異種)抗原を含む、対象における免疫応答を刺激できる任意の分子(例えばタンパク質、ペプチド、多糖類など)であり得る。抗原の組み合わせを用い得る。
【０１４８】
ある態様において、抗原はペプチド抗原である。ペプチド抗原は、目的の標的抗原に対する免疫応答の刺激に適するサイズであり得る。用いるペプチドのサイズは、Ｔ細胞および／またはＢ細胞エピトープ処理要件のために最適化し得る。当分野の当業者は、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ制限Ｔ細胞エピトープが、一般に８〜１０アミノ酸残基長の間であり、クラスII制限Ｔ細胞エピトープが一般に１２〜２５アミノ酸残基長の間であることを認識する。隣接残基は、いずれの場合も最適タンパク質プロセシングのために含まれ得る(例えばクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープについて２〜３天然隣接アミノ酸残基)。クラスII制限エピトープは、クラスII  ＭＨＣ分子に特異的に結合する中央９〜１０アミノ酸残基コアを、結合の安定化に作用するコアのいずれかの側の隣接残基と共に含み得る。
【０１４９】
直線状Ｂ細胞エピトープは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５または３０アミノ酸残基であり得る。Ｂ細胞エピトープのサイズはおそらく約５００、２００、１００、８０、６０、５０または４０アミノ酸残基長より小さい。
【０１５０】
本発明の組成物または方法で使用するペプチドのサイズは、抗原提示細胞によりＴリンパ球および／またはＢリンパ球にペプチドに含まれるエピトープの提示をさせるのに適し得る。
【０１５１】
有効な抗原性ペプチドを同定および選択する技術(例えば免疫応答を誘発できる最小ペプチド配列)は、当分野の当業者に周知である。非限定的例として、Rappuoli and Bagnoli (Eds), (2011), “Vaccine Design: Innovative Approaches and Novel Strategies”, Caister Academic Press, UK; and Agudelo and Patarroyo, (2010), “Quantum chemical analysis of MHC-peptide interactions for vaccine design”, Mini Rev Med Chem; 10(8):746-58を記載し、この内容全体を引用により本明細書に包含させる。
【０１５２】
ある態様において、抗原はウイルス抗原であり得る。抗原を形成し得るウイルス成分は、例えば、外被、被膜、莢膜、カプシド、毒素、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびこれらの組み合わせを含む。抗原を形成し得るウイルスの特定のタイプに関する特定の限定は存在しない。非限定的例は、単純ヘルペスウイルスＩおよびII型、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルスのようなヘルペスウイルス(例えばヒトヘルペスウイルス(ＨＨＶ)１〜８型)；肝炎ウイルス(例えばＡ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎)；オルトミクソウイルス(例えばインフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型、Ｃ型およびそこからの組み換え型)；フラビウイルス(例えばデングウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、黄色熱ウイルス)；コロナウイルス(例えばＳＡＲＳウイルス)；パラミクソウイルス(例えばヘンドラウイルス、麻疹ウイルス、センダイウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器多核体ウイルス)；腸ウイルス(例えばコクサッキーウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス)；トガウイルス(例えば風疹ウイルス)；アデノウイルス(例えば４型および７型)；パピローマウイルス(例えばヒトパピローマウイルス)；フィロウイルス(例えばエボラウイルス)；ブニヤウイルス(例えばハンタウイルス、フレボウイルス)；ラブドウイルス(例えば水疱性口内炎ウイルス；狂犬病ウイルスのようなリッサウイルス)；およびレトロウイルス(例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶおよびビスナウイルスのようなレンチウイルス)を含む。
【０１５３】
あるウイルスの何らかの適切な抗原を使用し得る。単純ヘルペスウイルス抗原の非限定的例は、最初期タンパク質、糖タンパク質Ｂ、糖タンパク質ＤおよびＶＺＶ抗原９ＰＩおよびｇｐIIを含む。肝炎ウイルス由来の抗原の非限定的例は、Ｓ、ＭおよびＬ外被タンパク質およびプレＳ表面抗原を含む。適切なインフルエンザウイルス抗原の非限定的例は、赤血球凝集素、ノイラミニダーゼおよび他のインフルエンザウイルス外被タンパク質を含む。日本脳炎ウイルス抗原の非限定的例は、タンパク質Ｅ、Ｍ−Ｅ、Ｍ−Ｅ−ＮＳ  １、ＮＳ  １およびＮＳ  １−ＮＳ２Ａを含む。麻疹ウイルス抗原の非限定的例は、麻疹ウイルス融合タンパク質を含む。風疹ウイルスの抗原の例は、タンパク質ＥｌおよびＥ２を含むが、これらに限定されない。ロタウイルス抗原の例は、ＶＰ７ｓｃを含む。呼吸器多核体ウイルス抗原の非限定的例は、ＲＳＶ融合タンパク質およびＭ２タンパク質を含む。狂犬病ウイルス抗原の例は、狂犬病ウイルス糖タンパク質および狂犬病ウイルス核タンパク質を含むが、これらに限定されない。パピローマウイルス抗原の非限定的例は、ＬｌおよびＬ２カプシドタンパク質および子宮頸癌と関連するＥ６／Ｅ７抗原関連を含む。
【０１５４】
ある態様において、ウイルス抗原はレトロウイルス由来である。レトロウイルスはヒト免疫不全ウイルス(例えばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２)であり得る。ＨＩＶから適切な抗原の非限定的例は、ｇｐ１２０  ｅｎｖ、ｇｐ１４０  ｅｎｖ、ｇｐ１６０  ｅｎｖ、ｐ１８、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖおよびｎｅｆ遺伝子およびこれらの組み合わせの遺伝子産物におけるものを含む。例えば、抗原はＨＩＶ−１  ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｏｌまたはｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖ遺伝子産物であり得る。
【０１５５】
組成物
本発明の組成物は、標的病原体に対する免疫を誘導できる免疫原性成分(例えば抗原)を、ＩＬ−４の産生および／または活性を阻害できる成分と共に含む。
【０１５６】
あるいは、免疫原性成分(例えば抗原)およびＩＬ−４の産生および／または活性を阻害できる成分は、同時または逐次投与のために製剤された別の組成物で提供され得る。
【０１５７】
−  ポリペチドおよびタンパク質
本発明の組成物は、ＩＬ−４アンタゴニスト(例えばＩＬ−４Ｒαアンタゴニスト)および／または標的病原体に対して免疫を誘発できる免疫原性成分(例えば抗原)を含む。
【０１５８】
本組成物は、宿主細胞および組織のアンタゴニストおよび／または免疫原性成分に対する直接暴露を促進する注射、吸入または局所投与のために製剤し得る。ある態様において、アンタゴニストおよび／または免疫原性成分はナノ粒子(例えば、米国特許番号７,６１１,６９０、７,８５８,５９６および８,０４８,４０４に記載の方法参照)で提供できる。これに加えてまたはこれとは別に、組成物は、微粒子銃による送達に適する乾燥粉末形態に製剤し得る(例えば、米国特許番号５,５８４,８０７、５,８６５,７９６および６,０１０,４７８に記載のもののようなガス駆動粒子加速による方法；および米国特許番号５,２９９,１６３、５,３８３,８５１および５,９９３,４１２に記載のようなガス駆動無針注入による方法参照)。
【０１５９】
−  核酸構築物
本発明の組成物は、ＩＬ−４アンタゴニストおよび／または標的病原体に対して免疫を誘発できる免疫原性成分(例えば抗原)をコードするポリヌクレオチドを発現できる核酸構築物を含む。ＩＬ−４アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドは、免疫原性成分をコードするポリヌクレオチドと同じ構築物にあっても異なる構築物にあってもよい。核酸構築物は、例えば、発現ベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、フォスミド、コスミド、組み換えウイルスまたは外来性配列の挿入、細胞への導入と続く導入配列の発現に適する何らかの他のベクター構築物であり得る。
【０１６０】
構築物はレプリコン粒子ベースのワクチンベクターであり得る。非限定的例は、シンドビスウイルス(ＳＩＮ)、セムリキ森林ウイルス(ＳＦＶ)およびベネズエラウマ脳炎ウイルス(ＶＥＥ)に由来するアルファウイルスレプリコン粒子ベースのワクチンベクターを含む。
【０１６１】
ＩＬ−４アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドおよび／または免疫原性成分(例えば抗原)は、制御ポリヌクレオチド配列(例えばプロモーター配列、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ｃ／ｓ−制御領域、リボソーム結合配列、転写および翻訳開始部位などのような転写および／または翻訳制御配列)に操作可能に結合し得る。プロモーターは構成的または誘導型であり得る。制御ポリヌクレオチド配列は、構築物の投与が意図される細胞または組織タイプと発現に関して適合性であり得る。
【０１６２】
プロモーターは、下流ポリヌクレオチド配列の転写を開始するために細胞の転写機構により認識されるＤＮＡ配列を意味すると理解される。適切なプロモーターの非限定的例は、アデノウイルス、ポリオーマウイルス、ＣＭＶ(例えばサイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター)、ＳＶ４０、ラウス肉腫ウイルス(例えば末端反復配列プロモーター)、トリ肉腫ウイルス、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、Ｂ型肝炎ウイルスレトロウイルスＬＴＲ領域のようなある真核ウイルスで見られるような構成的プロモーター；ＥＦ−１アルファプロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、アクチンプロモーターおよび免疫グロブリンプロモーターのような真核生物遺伝子に存在するプロモーター；テトラサイクリンプロモーター、ＮＦカッパＢ／ＵＶ光、Ｃｒｅ／ｌｏｘ、熱ショックプロモーター、制御可能ＲＮＡポリメラーゼIIプロモーターのような発現のために物質または外来性シグナルを必要とする誘導型プロモーター(ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００６／１３５４３６参照)；ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００６／０１２２２１に記載のＰＳプロモーターのような組織特異的プロモーター；および５Ｓ  ＡＲＮ、ＡＲＮ  ７ＳＬ  ＡＲＮｔ、ＡＲＮｓｎ、Ｈ１およびＵ６遺伝子からのＲＮＡ  ｐｏｌ  IIIプロモーターのような構成的ＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーターを含む。他の非限定的例は、ヒト伸長因子１αプロモーターおよびヒトユビキチンｃプロモーターを含む。
【０１６３】
核酸構築物は、当分野で知られる任意の適切な方法を使用して、標的細胞および組織への送達のために製剤し得る。
【０１６４】
ある態様において、構築物を、ネイキッドＤＮＡの形態での送達のために製剤し得る(例えば、米国特許番号６,２６５,３８７、６,９７２,０１３および７,９２２,７０９に記載の技術参照)。
【０１６５】
−  組み換えウイルス
ある態様において、本発明の組成物に含まれる核酸構築物は、組み換えウイルスの形態であり得る。ウイルスは、１個以上の外来性タンパク質または外来性タンパク質成分をコードするポリヌクレオチドを発現するように遺伝的修飾され得る。例えば、組み換えウイルスを、ＩＬ−４アンタゴニスト(例えばＩＬ−４Ｒαアンタゴニスト)および／または１個以上の抗原を含む免疫原性成分をコードするポリヌクレオチドを発現するように改変され得る。
【０１６６】
本発明の組み換えウイルスは、外来性遺伝子材料を取り込むように“親”ウイルスを修飾することにより製造し得る。ここでの具体的タイプの組み換えウイルス(例えば組み換え鶏痘ウイルス、ワクシニアウイルスまたはポックスウイルス)の記載は、外来性遺伝子材料を取り込むように修飾されている、示すタイプの親ウイルスを意味する。
【０１６７】
本発明の組み換えウイルスを産生するために使用する親ウイルスのタイプの具体的タイプに特に制限はない。適切な親ウイルスの非限定的例は、レトロウイルス(例えばＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＭＷ、ＣＡＥＶおよびＳＩＶのようなレンチウイルス)、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス、アルファウイルス(例えばＶＥＥ)、フラビウイルスおよびポックスウイルス(例えばワクシニアウイルス、鳥類ポックスウイルス(例えば鶏痘ウイルス)およびトリポックスウイルス)を含む。
【０１６８】
組み換えウイルスは、生存または生存弱毒化組み換えウイルスであり得る。一般に、組み換えウイルスは、感染している宿主細胞において複製可能である点で、複製可能意義である。
【０１６９】
本発明の組み換えウイルスは、少なくとも１個の外来性ヌクレオチド配列を含む。本発明の状況において、ヌクレオチド配列がＤＮＡ、ＲＮＡおよび相補的(ｃＤＮＡ)配列を含むことは理解される。
【０１７０】
ここで使用する外来性ヌクレオチド配列は、組み換えウイルスを形成するために親ウイルスのゲノムに挿入されている何らかのヌクレオチド配列をいう。ある態様において、外来性ヌクレオチド配列は、異なる微生物(例えば異なるウイルス)からのＩＬ−４アンタゴニスト(例えばＩＬ−４Ｒαアンタゴニスト)および／または免疫原性分子(例えば抗原)をコードする。
【０１７１】
外来性ヌクレオチド配列の長さについて何らかの特異的限定を与えないが、ある態様において、配列は約１０〜１５、１５〜２５、２０〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３５〜４５、４０〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２７５、２７５〜３５０、３５０〜５００、５００〜７５０、７５０〜１０００、１０００〜１２５０、１２５０〜１５００、１５００〜１７５０、１７５０〜２０００、２０００〜２５００、２５００〜３０００ヌクレオチド長の間または３０００ヌクレオチド長を超える長さであり得る。
【０１７２】
本発明の組み換えウイルスは、同じ外来性配列の複製および／または異なる外来性配列の組み合わせを含む、複数の外来性ポリヌクレオチド配列を含み得る(例えばＩＬ−４アンタゴニスト(例えばＩＬ−４Ｒαアンタゴニスト)をコードするポリヌクレオチドおよび１個以上の抗原を含む免疫原性成分をコードするポリヌクレオチド)。
【０１７３】
外来性ポリヌクレオチド配列がウイルスゲノムに挿入される位置に関して特定の制限はなく、これは主に特定のポリヌクレオチドおよび親ウイルスによる。しかしながら、外来性配列が、ウイルス機能、複製および／または翻訳ウイルスポリペチドのタンパク質プロセシングに対する悪影響を最小限にするウイルスゲノムに挿入されるのが好ましい。
【０１７４】
外来性ポリヌクレオチドを、ウイルスの読み取り枠(ＯＲＦ)に挿入し得る。例えば、ポリヌクレオチドを、２個のウイルス遺伝子間の接合部に挿入し得る。あるいは、ポリヌクレオチドを、ＯＲＦではない領域内でウイルスゲノムに挿入し得る。例えば、ポリヌクレオチドを、２種の異なるＯＲＦ間、ＯＲＦの５’(例えば５’非翻訳領域(５’−ＵＴＲ)内)またはＯＲＦの３’(例えば３’非翻訳領域(３’−ＵＴＲ)内)の非コーディング配列に挿入し得る。
【０１７５】
親ウイルスに挿入された外来性ポリヌクレオチドは、タンパク分解的開裂部位をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列を含み得る。タンパク分解的開裂部位は、単ポリペチドの成分として翻訳されるならば、コード化ポリペチドの他のウイルスコード化ポリペチドからの開裂および遊離の促進に有利であり得る。適切なタンパク分解的開裂部位をコードする配列および他の配列にそれを取り込む方法は当分野で周知であり、標準的教則本に記載されている。
【０１７６】
本発明の組み換えウイルスは、親ウイルスおよび／または異なる外来性ウイルスからの外来性配列の翻訳を促進するための少なくとも１個の内在性または外来性ヌクレオチド配列(例えば５’キャップ、配列内リボソーム進入部位など)を含む。
【０１７７】
親ウイルスに挿入された外来性ポリヌクレオチドは、感染細胞内(例えば小胞体に)および／または感染細胞外へのコード化ＩＬ−４アンタゴニストおよび／または免疫原性成分(例えば抗原)の輸送を指示するシグナルペプチドを含み得る。
【０１７８】
本発明の組み換えウイルスは、当分野の当業者に知られる標準的分子生物学技術および組み換え核酸テクノロジーを使用して産生し得る。使用する具体的方法は、使用する親ウイルスおよび挿入すべき具体的外来性ポリヌクレオチドによる。外来性ヌクレオチド配列の親ウイルスへの挿入は、分子生物学の標準的技術を使用して達成できる。適切な技術は、例えば、Sambrook et al., (1989), “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York; and Ausubel et al. (Eds), (2000-2010), “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Inc.を含む、標準的教則本に記載されている。本明細書の実施例にも、外来性ヌクレオチド配列を親ウイルスに挿入する方法の具体的ガイダンスを提供する。これらの減速を使用して、多様な外来性ヌクレオチド配列のいずれかを親ウイルスゲノムに挿入し得る。
【０１７９】
非限定的例として、遺伝的組換えを使用して、ベクターからの外来性ポリヌクレオチドを、親ウイルスに、相同または異種組み換え事象により伝達し得る。外来性ポリヌクレオチドを、親ウイルスからの配列が隣接するベクターに提供し得る。外来性ポリヌクレオチドまたは隣接配列は、選択可能マーカーを含み得る。宿主細胞のベクターおよび親ウイルスへの感染により、組み換え事象は、親ウイルスの内在性配列をベクター由来の外来性配列に置き換えるために働き得る。こうして製造した組み換えウイルスを、選択可能マーカーを使用して選択し得る。
【０１８０】
これに加えてまたはこれとは別に、ゲノム内の標的位置に挿入された１個以上の外来性ｃＤＮＡ配列を有する親ウイルスゲノムのｃＤＮＡコピーを含む組み換えウイルス相補的ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)構築物を産生し得る。これは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を介するウイルスゲノムのｃＤＮＡフラグメントの産生および／またはフラグメントを含むプラスミドのクローニングにより達成できる。種々のゲノムフラグメントを、例えば、他のフラグメントの末端とライゲートできる突出末端を製造するためにゲノムｃＤＮＡフラグメントを開裂する、例えば、適当な制限部位を使用することにより一緒に合わせ得る。この方法で、ＲＮＡポリメラーゼのために適切に配置されたプロモーター配列と共に所望の位置に挿入された外来性ｃＤＮＡ配列を有するウイルスゲノムｃＤＮＡコピーを、構築物できる。組み換えｃＤＮＡ構築物のＲＮＡコピーを、続いて適当なＲＮＡポリメラーゼを使用して製造し得る。次いで、ウイルスＲＮＡ転写物を適当な技術(例えばエレクトロポレーション)を使用して適当な細胞株(例えばＢＨＫ−２１細胞またはベロ細胞)にトランスフェクトでき、その後、組み換えウイルスの産生が起こり得る。
【０１８１】
親株から組み換えウイルスを製造する適切な方法のさらなる非限定的例は、米国特許番号５,２１９,７４０、５,２１９,７４０、７,２５０,２９９および７,６０８,２７３に開示のもののようなレトロウイルス系、米国特許番号６,４６５,６３４および７,８１１,８１２に記載のもののようなアルファウイルス系、米国特許番号５,７４４,１４０および８,１２４,３９８に記載のもののようなフラビウイルス系、米国特許番号５,１７３,４１４、７,０２２,５１９および７,１２５,７０５に記載のもののようなアデノ随伴ウイルス系、米国特許番号６,９０５,８６２、７,９８９,４２５および６,４６８,７７１に記載のもののようなアデノウイルスベースの系、米国特許番号７,０１５,０２４および７,３３８,６６２に記載のもののようなポックスウイルス系および米国特許番号５,８７１、７４２および６,３４０,４６２に記載のもののようなトリポックスウイルス系を含む。
【０１８２】
−  組み換えウイルスの例
本発明のある態様は、組み換えポックスウイルス(すなわちポックスウイルス科)および特にポックスウイルスのコードポックスウイルス亜科のものを含む組成物に関する。このようなウイルスの使用は、そのゲノムが大外来性ＤＮＡ配列の取り込みに対応できる点で、有利であり得る。これにより、完全タンパク質(例えばＩＬ−４Ｒα受容体アンタゴニストを含むＩＬ−４アンタゴニストおよび／または抗原を含む免疫原性ペプチド)をコードする異種遺伝子配列が発現するようにこれらのウイルスを改変することが可能となる。これらのウイルスの使用はまたヒトを含む動物における好都合な安全性プロファイルによっても有利であり得る。
【０１８３】
非限定的例として、修飾ワクシニアウイルスアンカラ(ＭＶＡ)およびＮＹＶＡＣのような弱毒化ワクシニアウイルを親株として使用して、組み換えポックスウイルスを創成し得る。親ウイルスは、その産生に１個以上の病原性遺伝子が除去されるかまたは不活性化されていてよい。
【０１８４】
これに加えてまたはこれとは別に、カナリアポックスウイルスベクター(ＡＬＶＡＣ)または鶏痘(ＴＲＯＶＡＣ)に基づくトリポックスウイルスベクターのような宿主制限株を親株として使用して、組み換えポックスウイルスを作製し得る。
【０１８５】
組み換えポックスウイルスを、一過性方法で、例えば、免疫化の局在化部位でＩＬ−４アンタゴニスト(例えばＩＬ−４Ｒα受容体アンタゴニスト)を発現する能力を提供するために、本発明の組成物で使用し得る。抗原のような免疫原性成分と同時投与したとき(例えば同一または異なるポックスウイルスでコード化)、ＩＬ−４アンタゴニスは、高結合力を有する抗原特異的免疫細胞(例えばＣＤ８＋  Ｔリンパ球)の誘導を増強し得る。組み換えポックスウイルスに対して発生した免疫応答は、最終的にウイルスを浄化し、それゆえに、ＩＬ−４アンタゴニストが、永続的ではなく一過性に発現されることを意味し、安全性プロファイルを改善する。
【０１８６】
例示的態様において、本発明の組成物は、１個または一連の組み換えワクシニアおよび／または鶏痘ウイルスを含み得る。組み換えウイルスは、ＩＬ−４アンタゴニスト(例えばＩＬ−４Ｒα受容体アンタゴニスト)、感染性微生物(例えば病原性ウイルス)からの少なくとも１個の抗原または両者をコードする外来性ポリヌクレオチド配列を含み得る。抗原はウイルス抗原(例えばレトロウイルス抗原)であり得る。抗原はＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２由来の抗原であり得る。抗原は、ｇｐ１２０  ｅｎｖ、ｇｐ１４０  ｅｎｖ、ｇｐ１６０  ｅｎｖ、ｐ１８、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖおよびｎｅｆ遺伝子の任意の１個以上またはこれらの組み合わせによりコード化され得る。ＩＬ−４アンタゴニストは、細胞シグナル伝達を開始することなく、ＩＬ−４Ｒに結合する能力を付与する変異を含むＩＬ−４の変異形態であり得る。例えば、変異は、残基１２１および／または１２４(例えばＩＬ−４の成熟分泌ヒトのＲ１２１Ｄおよび／またはＹ１２４Ｄ)または他の種からのＩＬ−４相同体における対応する位置であり得る。変異は、ＩＬ−４遺伝子のエクソン２によりコードされる残基のいくつかまたは全ての欠失であり得る。
【０１８７】
−  製剤、医薬およびワクチン
本発明の組成物および医薬は、当業者に知られる方法を使用して製造し得る。適切な方法の非限定的例は、Gennaro et al. (Eds), (1990), “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, USAに記載されている。
【０１８８】
本発明の組成物および医薬は、薬学的に許容される担体、添加物、希釈剤および／またはアジュバントを含み得る。ここで意図される“薬学的に許容される”担体、添加物、希釈剤および／またはアジュバントは、一般にヒトまたは非ヒト動物のような特定のレシピエントに投与したときに顕著な有害反応を生じない物質である。薬学的に許容される担体、添加物、希釈剤およびアジュバントは、一般にまた組成物または医薬の他の成分と適合性でもある。適切な添加物、希釈剤および担体の非限定的例は、“Handbook of Pharmaceutical Excipients” 4th Edition, (2003) Rowe et al. (Eds), The Pharmaceutical Press, London, American Pharmaceutical Association, Washingtonに見ることができる。
【０１８９】
本発明の組成物および医薬をワクチンとして製剤し得る。本発明のワクチンは、予防的ワクチン(すなわち感染予防の目的で投与するワクチン)および治療的ワクチン(すなわち感染処置の目的で投与するワクチン)の両者を含む。本発明のワクチンは、それゆえに、レシピエントに予防、改善、緩和または治療目的で投与し得る。
【０１９０】
本発明の組成物および医薬は、注射による投与に適する形態、経口摂取に適する製剤(例えば、カプセル剤、錠剤、カプレット剤、エリキシル剤)、局所投与に適する軟膏剤、クリーム剤またはローション剤の形態、点眼剤としての送達に適する形態、鼻腔内吸入または経口吸入によるような吸入による投与に適するエアロゾル形態または非経腸投与、すなわち、皮下、筋肉内または静脈内注射に適する形態であり得る。
【０１９１】
アジュバントまたは生体応答修飾物質のような補足活性成分も本発明の組成物および医薬に含ませてよい。アジュバントを本発明の医薬組成物に入れてよいが、必ずしもアジュバントを必要としない。このような場合、アジュバント使用に起因する反応源性問題を避け得る。
【０１９２】
一般に、本発明の組成物または医薬の状況におけるアジュバント活性は、組成物または医薬中の免疫原性成分(例えば抗原)により誘発された免疫応答を増強する能力(量的または質的)を含むが、これに限定されない。これは、免疫応答を生じるために必要な免疫原性成分の投与量またはレベルの減少および／または所望の免疫応答を生じるために必要な免疫化の数または頻度の減少を可能にする。
【０１９３】
任意の適切なアジュバントを本発明の組成物または医薬に入れてよい。例えば、アルミニウムベースのアジュバントを利用し得る。適切なアルミニウムベースのアジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。使用し得るアルミニウムベースのアジュバントの他の具体例は、欧州特許番号１２１６０５３および米国特許番号６,３７２,２２３に記載されている。他の適切なアジュバントは、フロインド不完全アジュバントおよび完全アジュバント(Difco Laboratories, Detroit, Mich.)；Merckアジュバント６５(Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.)；ＡＳ−２(SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.)；水酸化アルミニウムゲル(ａｌｕｍ)またはリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖類；カチオンまたはアニオン誘導体化多糖類；ポリホスファゼン；生分解性マイクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびクイルＡ；欧州特許番号０３９９８４３、米国特許番号７,０２９,６７８およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／００６９３９に記載のものを含む水中油型エマルジョン；および／またはさらなるサイトカイン類、例えばＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−２、−７または−１２、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、モノホスホリルリピドＡ(ＭＰＬ)、コレラ毒素(ＣＴ)またはその構成物サブユニット、熱不安定性エンテロトキシン(ＬＴ)またはその構成物サブユニット、トール様受容体リガンドアジュバント、例えばリポ多糖(ＬＰＳ)およびその誘導体(例えばモノホスホリルリピドＡおよび３−デアシル化モノホスホリルリピドＡ)、ムラミルジペプチド(ＭＤＰ)および呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)のＦタンパク質を含む。
【０１９４】
方法
本発明は、対象における抗原特異的免疫応答を誘発する方法を提供する。本方法は、対象における投与した抗原に対する免疫細胞の結合力の増加および／また投与した抗原に特異的な免疫細胞の数の増加に有効である。本方法は予防、改善、緩和および／または治療的目的で行い得る。例えば、本方法は、対象の感染を予防するため(すなわちワクチン接種)および／または対象の感染を処置するために使用し得る(例えばウイルス感染、レトロウイルス感染、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２感染)。
【０１９５】
本方法は、本発明の組成物、医薬またはワクチンの１種以上の投与を必要とする。従って、本方法は、例えば、上の“インターロイキン−４(ＩＬ−４)アンタゴニスト”の表題のセクションの下に記載したもののいずれか１個以上のようなＩＬ−４アンタゴニストの投与を含み得る。例えば、本方法は、ＩＬ−４に結合するアンタゴニストまたはＩＬ−４Ｒαに結合するアンタゴニストのようなＩＬ−４Ｒアンタゴニストの投与を含み得る。本方法はまた、１個以上の抗原を含む成分のような免疫原性成分の投与も筆よとする。適切な抗原の非限定的例は、上の“抗原”の表題のセクションの下に記載したもののいずれか１個以上を含む。抗原は、ウイルスのような病原性微生物由来であり得る。例えば、本方法は、ｇｐ１２０  ｅｎｖ、ｇｐ１４０  ｅｎｖ、ｇｐ１６０  ｅｎｖ、ｐ１８、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖおよびｎｅｆ遺伝子およびこれらの組み合わせ(例えばｇａｇ／ｐｏｌ、ｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖ)によりコードされる抗原を含む、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２由来の抗原の投与を含み得る。
【０１９６】
本方法は、ＩＬ−４アンタゴニストと免疫原性成分の同時投与を含み、または、ＩＬ−４アンタゴニスト、続いて免疫原性成分(またはその逆)の逐次投与を含む。同時投与のとき、ＩＬ−４アンタゴニストおよび免疫原性成分を同一組成物または別の組成物に提供し得る。本組成物は、ＩＬ−４アンタゴニストおよび／または免疫原性成分をコードするポリヌクレオチド配列を含む１個以上の核酸構築物または組み換えウイルスを含み得る(例えば組み換えワクシニアウイルス、組み換え鶏痘ウイルスおよび／または組み換えＭＶＡウイルスのような１個以上の組み換えポックスウイルス)。適切な核酸構築物および組み換えウイルスの非限定的例は、上の“核酸構築物”、“組み換えウイルス”および“組み換えウイルスの例”なる表題のサブサブセクションに示す。
【０１９７】
本発明者らは、抗原特異的免疫細胞応答の強度および／または免疫細胞の抗原に対する結合力が、抗原に対する免疫応答の局所環境におけるＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒシグナル伝達の一過性拮抗作用によりさらに改善できることを同定した。例えば、高結合力抗原特異的免疫細胞(例えば記憶ＣＤ８＋  Ｔ細胞)の産生は、抗原の初期投与時点で、ＩＬ−４アンタゴニスト(例えばＩＬ−４Ｒαアンタゴニスト)の一過性発現(例えば１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１４日または２１日未満の間)により改善し得る。
【０１９８】
投与のための製剤の例は、上の“製剤およびワクチン”なる表題のサブサブセクションに記載する。投与量および投与経路の例は、下の“投与量および投与経路”なる表題のサブセクションに記載する。
【０１９９】
一般に、組成物、医薬およびワクチンを、対象に治療有効量で投与する。“治療有効量”は、その意味の中に、非毒性であるが、所望の治療効果を提供するために本発明において使用するために十分量の活性成分を含む。必要な正確な量は、処置する種、対象の年齢および一般的状態、処置する状態の重症度、予防する感染の性質、投与する具体的薬剤、投与方法などのような因子により対象毎に変わる。それゆえに、正確な“治療有効量”を特定することは不可能である。しかしながら、如何なる場合でも、適当な“治療有効量”は、当業者が日常的な実験のみを使用して決定できる。
【０２００】
ここで意図する“対象”は、哺乳動物(例えばヒト)および、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、鳥類、霊長類および齧歯類を含むが、これらに限定されない社会的、経済的または研究上の重要性を有するあらゆる種の個体を含む。
【０２０１】
本発明の方法を使用して、ＩＬ−４アンタゴニストと同時投与した抗原に対して対象の抗原特異的免疫応答を誘発し得る。抗原特異的免疫応答は、Ｔリンパ球(例えばＣＤ８＋  Ｔリンパ球)を含み得る。ここで意図する抗原特異的免疫応答の“誘発”は、免疫応答の刺激ならびに予め存在する免疫応答の修飾(例えば免疫応答の増強または活性化)を含むことは理解される。抗原とＩＬ−４アンタゴニストの同時投与は、ＩＬ−４アンタゴニストなしの抗原投与を超えて、抗原に特異的な免疫応答を増強し得る。
【０２０２】
これに加えてまたはこれとは別に、本発明の方法を使用して、対象へのＩＬ−４アンタゴニストと同時投与した抗原に対する免疫細胞の結合力を増加し得る。免疫細胞はＴリンパ球(例えばＣＤ８＋  Ｔリンパ球)であり得る。抗原に対する免疫細胞結合力を増加させることにより、免疫細胞／免疫細胞集団において応答を誘発するのに必要な抗原の量または濃度が減る。抗原とＩＬ−４アンタゴニストの同時投与は、ＩＬ−４アンタゴニストなしの抗原の投与により達成される結合力を超えて、抗原に対する免疫細胞の結合力を増加させ得る。
【０２０３】
これに加えてまたはこれとは別に、本発明の方法を使用して、対象における抗原に特異的な免疫細胞の数を増やし得る。免疫細胞はＴリンパ球(例えばＣＤ８＋  Ｔリンパ球)であり得る。抗原とＩＬ−４アンタゴニストの同時投与は、ＩＬ−４アンタゴニストなしの抗原の投与により達成される数を超えて、抗原に特異的な免疫細胞の数を増やし得る。
【０２０４】
抗原特異的免疫応答の誘導ならびに抗原特異的免疫細胞の数および結合力は、当分野の当業者に知られる一般的方法を使用して決定できる。方法の例は、固相不均一アッセイ(例えば酵素結合免疫吸着測定法)、溶液相アッセイ(例えば電気化学発光アッセイ)、増幅発光近接均質アッセイ、フローサイトメトリー、細胞内サイトカイン染色、機能的Ｔ細胞アッセイ、機能的Ｂ細胞アッセイ、機能的単球−マクロファージアッセイ、四量体結合および解離アッセイ、五量体結合および解離アッセイ、樹状および細網内皮細胞アッセイ、ＮＫ細胞応答測定、酸化バーストアッセイ、細胞毒性特異的細胞溶解アッセイおよび食作用およびアポトーシス評価を含むが、これらに限定されない。
【０２０５】
本方法は、抗原とインターロイキン−４受容体アンタゴニストの初回抗原薬剤投与およびその後の抗原とインターロイキン−４受容体アンタゴニストの追加抗原薬剤投与を含み得る。例えば、追加抗原薬剤を初回抗原薬剤後少なくとも７日目、１４日目、２１日目または２８日目、少なくとも１ヶ月目、２ヶ月目、３ヶ月目、４ヶ月目、５ヶ月目または６ヶ月目または少なくとも１年目、２年目、３年目、４年目または５年目に投与し得る。初回ワクチン投与量の抗原とＩＬ−４アンタゴニストを別々にまたは逐次に投与してよい。追加抗原薬剤とＩＬ−４アンタゴニストを別々にまたは逐次に投与してよい。初回および追加抗原薬剤を同一または異なる経路で投与してよい。例えば、初回薬剤および追加抗原薬剤はいずれも粘膜(例えば鼻腔内)、筋肉内、静脈内または皮下投与してよい。あるいは、初回抗原薬剤を粘膜抗原特異的免疫細胞を誘発するために粘膜(例えば鼻腔内)投与し、追加抗原薬剤を全身性抗原特異的免疫細胞を誘発するために筋肉内、皮下または静脈内投与してよい。
【０２０６】
投与量および投与経路
本発明の組成物、医薬およびワクチンを、非経腸(例えば静脈内、脊髄内、皮下または筋肉内)、経口、局所または粘膜経路(例えば鼻腔内)を含むが、これらに限定されない標準的経路でレシピエントに投与できる。
【０２０７】
組成物、医薬およびワクチンを、他の付加的治療剤を含まずまたは組み合わせてレシピエントに投与し得る。治療剤と投与する態様において、投与は同時でも逐次でもよい(すなわち組成物／医薬／ワクチン投与、続いて薬剤の投与またはその逆)。
【０２０８】
一般に、組成物、医薬およびワクチンを、投与経路およびレシピエントの身体特性(健康状態を含む)と適合性の方法でおよび所望の効果(すなわち治療的有効、免疫原性および／または保護的)を誘発する方法で製剤し得る。例えば、本発明の組成物、医薬およびワクチンの適当な投与量は、対象の身体特性(例えば年齢、体重、性別)組成物、医薬またはワクチンを単剤療法またはアジュバント両方のいずれで使用するか、患者のＭＨＣ制限のタイプ、ウイルス感染の進行(すなわち病状)および当業者が認識し得る他の因子を含むが、これらに限定されない多様な因子により得る。適当な投与量の決定に際して考慮すべき種々の一般的考察は、例えば、Gennaro et al. (Eds), (1990), “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, USA；およびGilman et al., (Eds), (1990), “Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics”, Pergamon Pressに記載されている。
【０２０９】
当業者は、日常的な実験により、所望の治療的結果のために本発明の組成物、医薬またはワクチンに含まれるここに記載する抗原および／またはＩＬ−４アンタゴニストの有効な、非毒性量を決定できる。一般に、本発明の組成物、医薬またはワクチンを、患者に約５０マイクログラム〜約５mgの活性成分の量で投与し得る。投与量は、約５０マイクログラム〜約５００マイクログラムの活性成分の量であり得る。一般に、有効な投与量は約０.０００１mg〜約１０００mgの活性成分／kg体重／２４時間；典型的に、約０.００１mg〜約７５０mg／kg体重／２４時間；約０.０ｌmg〜約５００mg／kg体重／２４時間；約０.１mg〜約５００mg／kg体重／２４時間；約０.１mg〜約２５０mg／kg体重／２４時間；または約１.０mg〜約２５０mg／kg体重／２４時間の範囲と予測される。より典型的に、有効な投与量範囲は、約１.０mg〜約２００mg／kg体重／２４時間；約１.０mg〜約１００mg／kg体重／２４時間；約１.０mg〜約５０mg／kg体重／２４時間；約ｌ.０mg〜約２５mg／kg体重／２４時間；約５.０mg〜約５０mg／kg体重／２４時間；約５.０mg〜約２０mg／kg体重／２４時間；または約５.０mg〜約１５mg／kg体重／２４時間の範囲と予測される。
【０２１０】
典型的に、処置適用において、処置は疾患状態または状態の期間であり得る。さらに、当業者には当然であるが、個々の投与の最適量および間隔を、処置する疾患状態または状態の性質および程度、形態、投与経路および部位および処置する特定の個体の性質により決定する。最適条件を慣用技術を使用して決定できる。
【０２１１】
多くの場合(例えば予防的適用)、本発明の組成物、医薬またはワクチンを数回または複数回投与することが望ましいことがある。例えば、組成物、医薬またはワクチンを、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれ以上の回数投与し得る。投与は約１〜約１２週間隔であり、ある態様において約１〜約４週間隔であり得る。定期的再投与は、特定の標的抗原に対する反復性暴露の場合に望ましい。
【０２１２】
当業者にはまた当然であるが、最適投与経過を、慣用の治療経過決定試験を使用して表かできる。
【０２１３】
２個以上の物を、対象に“共に”投与するとき、これらは、一組成物で同時にまたは別の組成物で同時にまたは別の組成物で別の時間に投与してよい。
【０２１４】
本発明のある態様は、複数の別の投与量で組成物、医薬またはワクチンを投与することを含む。従って、ここに記載する予防方法(すなわちワクチン接種)および感染処置方法は、例えば、一定期間にわたり、対象に複数の別の投与量を投与することを含む。従って、ここに記載する予防方法(すなわちワクチン接種)および感染処置方法は、初回抗原薬剤投与を含む。初回抗原薬剤の後追加抗原薬剤があり得る。追加抗原薬剤は再ワクチン接種を目的とし得る。種々の態様において、組成物、医薬またはワクチンを、少なくとも１回、２回、３回またはそれ以上投与する。
【０２１５】
キット
組成物、医薬およびワクチンを含む本発明の方法の実施に適する薬剤を、キットにおける成分として提供し得る。
【０２１６】
本発明のキットは、例えば、投与デバイス、緩衝液および／または希釈剤のような、本発明の方法の実施を助けるための成分を含み得る。キットは、種々の成分を収容するための容器および本発明の方法におけるキット成分の使用の指示を含み得る。
【０２１７】
キットは、ここで定義する細分化されたキットまたは組み合わされたキットであり得る。細分化されたキットは、別々の容器に収容された薬物を含み、小ガラス容器、プラスチック容器などを含み得る。このような容器は、薬物の相互汚染を避けながら薬物の一区画から他の区画への効率的移動を可能とし、各溶液の薬物または溶液の一区画から他への定量的形式での添加を可能とし得る。典型的に、本発明のキットはまた適当な方法を実施するためのキット成分を使用するための指示も含む。
【０２１８】
例えば、キットは、第一容器および第二容器を含み得る。第一容器は、ＩＬ−４アンタゴニスト(例えばＩＬ−４Ｒαに結合するアンタゴニスト)を含み得る。第二容器は、免疫原性作用剤(例えば１個以上のウイルス抗原)を含むまたはコードする成分を含み得る。キットは、例えば、キットの成分を、本発明の方法の実施を必要とする対象に投与することを助ける１個以上のデバイスを含む、１個以上の他の容器も含んでよい。
【０２１９】
多くの変更および／または修飾を、広く記載する本発明の性質または範囲から逸脱することなく具体的態様に開示した本発明に成し得ることは当業者に認識される。本態様は、それゆえに、全体として、限定邸でなく、説明的と見なすべきである。
【実施例】
【０２２０】
本発明を、ここで次の具体例を参照して記載し、これは本発明の範囲をいかなる方法でも限定すると解釈してはならない。
【０２２１】
実施例１：ワクチンの製造
−マウスＩＬ−４変異体配列の設計および製造
マウスＩＬ−４Ｃ１１８  ｃＤＮＡを総脾臓ＲＮＡから、遺伝子特異的プライマーおよびOne-Step RT-PCRキット(QIAGEN)を使用して増幅した。
【０２２２】
順方向プライマー5' GGATCCACCATGGGTCTCAACCCCCAGCTA 3'(配列番号１)は、クローニングを促進するためのBamHI(GGATCC)制限部位およびメチオニン開始コドンが重複するコンセンサスコザック翻訳開始配列(CCACCATGG)を含んだ。
【０２２３】
逆方向プライマー5' GAATTCTAATCCATTTGCATGATGCTC 3'(配列番号２)は、成熟分泌タンパク質の１１８位後のアミノ酸配列で中途で停止させるためにインフレーム停止コドン(ＴＡＧ)の挿入を含んでおり、これは、完全遺伝子配列によりコードされる２０アミノ酸シグナルペプチドを欠く。成熟分泌タンパク質のアミノ酸１１８は、ゆえに、完全遺伝子配列のコドン１３８位に対応する(これは、アミノ末端切断可能シグナルペプチドを含む)。停止コドン挿入は、２個の末端アミノ酸１１９および１２０の欠失を創成し、細胞シグナル伝達に必要な１１９位の必須チロシンを除去する。逆方向プライマーはまたＤＮＡサブクローニングを促進するためのＥｃｏＲＩ制限部位を含む。
【０２２４】
４３１ｂｐ  ＰＣＲフラグメント(配列番号３)を、Ｕ尾状ベクターpDriveに直接ライゲートし、ＱＩＡＧＥＮ  ＥＺコンピテント細胞(QIAGEN)に形質転換した。ＰＣＲフラグメントを、下流ＨｉｎｄIII部位を付加するためにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間にサブクローン化し、続いてＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントとして、ベクターに含まれる鶏痘ウイルス初期／後期プロモーターＡＴＧコドンとインフレームでｐＡＦ０９(引用文献７参照)にサブクローン化した。マウスＩＬ−４Ｃ１１８  ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントも、ワクシニアウイルスＰ７.５初期／後期プロモーターの下流にｐＴＫ７.５Ａ(引用文献９参照)にサブクローン化した。
【０２２５】
−  ＩＬ−４Ｃ１１８を共発現するＦＰＶ−ＨＩＶおよびＶＶ−ＨＩＶワクチンの構築
ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ(ｍｕｔ)抗原およびマウスＩＬ−４Ｃ１１８を共発現する組み換えウイルスを、親ウイルスＦＰＶ−ＨＩＶ  ０８６およびＶＶ−ＨＩＶ  ３３６を使用して構築した(引用文献参照１)。組み換えＦＰＶを、鶏胚皮膚(ＣＥＳ)細胞培養をＦＰＶ−ＨＩＶ  ０８６(ＭＯＩ０.０５)で感染させ、続いてリポフェクタミン２０００(Invitrogen, USA)を使用してｐＡＦ０９−ＩＬ−４Ｃ１１８にトランスフェクトした。ｒＦＰＶを、ＭＸ−ＨＡＴ(２.５mg／mlミコフェノール酸、２５０mg／mlキサンチン、１００mg／mlヒポキサンチン、０.４mg／mlアミノプテリンおよび３０mg／mlチミジン)を含む最小必須培地(ＭＥＭ)でＣＥＳ細胞上でウイルスを継代することにより選択し、ｇｐｔ(キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ)遺伝子を発現するウイルスを選択した。組み換えウイルスを含むプラークを、Ｘ−ｇａｌ(２００mg／ml)を含む寒天重層(ＭＥＭ中１％寒天)を使用して同定し、ｌａｃＺ遺伝子の共発現を検出した。青色染色プラークを採り、３〜４プラーク精製ラウンドを選択培地下で実施した。組み換えウイルスを、ＩＬ−４Ｃ１１８遺伝子の存在および野生型ウイルスの非存在についてＰＣＲで確認した。
【０２２６】
同様に、ｒＶＶを、Ｈ１４３Ｂ  ＴＫ細胞をＶＶ−３３６(ＭＯＩ０.０５)で感染させ、ｐＴＫ７.５Ａ−ＩＬ−４Ｃ１１８でトランスフェクトすることにより構築した。組み換えウイルスを、ＨＡＴ添加物を含むＭＥＭを使用して選択して、ベクターに含まれる単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子を発現するウイルスを選択した。ウイルスを選択下にプラーク精製し、純度はｒＦＰＶに類似すると確認された。
【０２２７】
マウスＩＬ−４Ｃ１１８を共発現する組み換えＦＰＶ−０９２(ＨＩＶ  ｇａｇｐｏｌおよびｅｎｖ)およびＶＶ３３７(ＨＩＶ  ｅｎｖ)(引用文献１参照)を、上記方法を使用して同様に構築した。
【０２２８】
製造したＩＬ−４Ｃ１１８組み換えウイルスの簡単な明細を下に記載する。上記のとおり、各々の構築は引用文献１に記載され、CSIRO生物試薬カタログから商業的に入手可能である(http://asnet1-mi.act.csiro.au/index.aspx参照)。
【０２２９】
(ｉ)ＦＰＶ０８６は、ＰＥ／Ｌ(ｆｐｖ初期／後期)の制御下にＨＩＶ−１サブタイプＢ  ｇａｇｐｏｌ(特異的変異を有する)を発現し、ｐＫＧ１０ａを使用して、ＦＰＶ−Ｍ３のＦ６,７,９座に挿入された組み換え鶏痘ウイルスである；
(ii)ＶＶ３３６は、ｐＪｍｃｓを使用してＶＶ−ＷＲ−Ｌ９２９のＴＫ座に挿入された、ＰＥ／Ｌ(ｆｐｖ初期／後期)の制御下にＨＩＶサブタイプＡ／Ｅ  ｇａｇｐｏｌ(特異的変異を有する)を発現するＴＫ陰性組み換えワクシニアウイルスである；
(iii)ＦＰＶ０９２は、ＰＥ／Ｌ(ｆｐｖ初期／後期)の制御下にＨＩＶ−１サブタイプＡＥ  ｇａｇｐｏｌ(特異的変異を有する)を発現し、ｐＫＧ１０ａを使用してＦＰＶ−０９０(ＡＥ  ｅｎｖ)のＦ６,７,９座に挿入された組み換え鶏痘ウイルスである；
(iv)ＶＶ３３７は、ｐＪｍｃｓを使用してＶＶ−ＷＲ−Ｌ９２９のＴＫ座に挿入された、ＰＥ／Ｌ(ｆｐｖ初期／後期)の制御下にＨＩＶサブタイプＡ／Ｅ  ｅｎｖ(特異的変異を有する)を発現するＴＫ陰性組み換えワクシニアウイルスである。
【０２３０】
−  マカクＩＬ４Ｃ１２３ワクチン
天然マカクＩＬ−４ｃＤＮＡ配列を、GenBankデータベースから得た(GenBank/NCBI参照配列: NM_001032904−配列番号８〜９参照)。合成ＤＮＡ配列を、停止コドンが成熟分泌タンパク質上のアミノ酸１２３の直後に挿入され、組み換え変異体タンパク質からカルボキシル末端配列を除去するように設計した(配列番号４)。マウスおよびヒトＩＬ４タンパク質と同様、細胞シグナル伝達に必要な１２４位の必須チロシンを欠失した。
【０２３１】
ＤＮＡ配列を次のとおり修飾した。ＢａｍＨＩ部位およびコザック配列を含む独特な上流配列を、それぞれサブクローニングを促進し、タンパク質の効率的翻訳を確実にするために挿入した。ＨｉｎｄIII部位も、発現ベクターへのクローニングを促進するために３’末端に含めた。ＤＮＡ配列を、Genscript USA Inc.による注文により合成した。合成ＤＮＡを、上記のとおりｐＡＦ０９のＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄIII部位の間にサブクローン化し、組み換え鶏痘ウイルスをＳＩＶ  ｇａｇｐｏｌ遺伝子をコードするＦＰＶ０８９を使用して単離した。ＦＰＶ０８９は、ＰＥ／Ｌ(ｆｐｖ初期／後期)の制御下にＳＩＶ  ｇａｇｐｏｌを発現し、ｐＫＧ１０ａを使用してＦＰＶ−Ｍ３のＦ６,７,９座に挿入された組み換え鶏痘ウイルスである。ＦＰＶ０８９の構築は引用文献１に記載され、CSIRO生物試薬カタログから商業的に入手可能である(http://asnet1-mi.act.csiro.au/index.aspx参照)。
【０２３２】
マカクＩＬ−４Ｃ１２３およびＳＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の改変ワクシニアアンカラウイルスへの挿入および発現のために、一連の新規ベクターを、遺伝子間挿入部位を使用する、選択可能マーカー遺伝子(引用文献８参照)としてＧＦＰ−ブラストサイジンＳデアミナーゼ(ＢＳＤ)融合遺伝子を使用する、ＭＶＡ“ｄｅｌ−III”(図１  −  配列番号１０)およびワクシニア“ＨｉｎｄIII−Ｆ領域”(図２  −  配列番号１１)に基づき開発した(図１および２参照)。合成ＳＩＶ  ｍａｃ２３９  ｇａｇ／ｐｏｌ配列を使用し、これは、マカクザルでの発現に最適化されていた(図３  −  配列番号１２)。配列は、クローニングを促進するために、遺伝子の上流に合成ポックスウイルス初期／後期プロモーターおよび下流に初期転写ターミネーター配列(Ｔ５ＮＴ)を制限エンドヌクレアーゼ部位と隣接して含む。遺伝子は、重複領域翻訳中のフレームシフトに起因する融合タンパク質として発現される。
【０２３３】
上で製造したマカクＩＬ４Ｃ１２３ワクチンが、例えば、作製した変異体ＩＬ−４配列成しでＳＩＶｇａｇｐｏｌ遺伝子を含む類似のまたは同一のワクチンと比較して、本ワクチンを投与したマカクでＳＩＶに対する免疫応答誘発を改善することが意図され、予測される。より具体的に、本ワクチンが、ＳＩＶ  ｇａｇｐｏｌ遺伝子産物に対する抗原特異的Ｔ細胞結合力を改善するおよび／または抗原特異的Ｔ細胞応答の強度を改善することが意図され、予測される。
【０２３４】
−  ヒトＩＬ−４変異体配列の設計
ヒトＩＬ−４配列も、マカクおよびヒトにおけるＩＬ−４遺伝子およびタンパク質の高レベルの配列相同性の点から、残基１２３に変異を有して設計した。
【０２３５】
ヒトＩＬ−４ｍＲＮＡ配列の非限定的例はGenBank/NCBI参照配列: NM_000589.2に提供される。配列番号１３は、ヒトＩＬ−４の成熟分泌形態のｍＲＮＡおよびアミノ酸配列を提供する。
【０２３６】
配列番号５は、変異体ＩＬ−４タンパク質(ＩＬ−４Ｃ１２３)をコードするヒトＩＬ−４ＤＮＡ配列を提供する。ヒトＩＬ−４Ｃ１２３を、タンパク質が成熟分泌タンパク質のアミノ酸１２３位の後で停止し、その後の２４アミノ酸シグナルペプチドを欠失するように、コドン１４８位に停止コドン(ＴＧＡ)を挿入することにより設計した。成熟分泌タンパク質上のアミノ酸１位は、ｍＲＮＡのコドン２５位に対応する。これにより、細胞シグナル伝達に必要な１２４位の必須チロシンを欠く変異体ＩＬ−４が産生される。このタンパク質がシグナル伝達成しにＩ型およびII型ＩＬ−４Ｒの両者と結合し、内在性ＩＬ−４およびＩＬ−１３による活性化を阻止することが意図され、予測される。
【０２３７】
上記配列は、ワクチンの状況で使用するとき、ヒト細胞における発現状況のために最適化されている(配列番号６)。コドン最適化により、稀なＦｓｅＩ制限部位(ＧＧＣＣＧＧＣＣ)が産生された。この制限部位を、鶏痘およびＭＶＡベクターへのサブクローニング工程で使用し、従って、アミノ酸配列を変えることなく提案された最適化ヒトＩＬ４Ｃ１２３配列から除去された(配列番号７)。
【０２３８】
これらの配列によりコードされるヒトＩＬ−４タンパク質変異体が、何らかの顕著な程度でＩＬ−４受容体介在細胞シグナル伝達を開始させることなく、ＩＬ−４受容体と結合できるＩＬ−４受容体アンタゴニストであると予想および予測される。
【０２３９】
さらに、ヒトＩＬ−４タンパク質配列の任意の１個以上を、抗原／抗原コード化配列と組み合わせて含むヒトワクチンが、例えば、ヒトＩＬ−４タンパク質変異体含まず、抗原／抗原コード化とを含む類似のまたは同一のワクチンを投与したヒトと比較して、本ワクチンを投与したヒトにおいて、抗原に対する免疫応答誘発を改善することが意図され、予測される。より具体的に、このようなヒトワクチンは、それを投与したヒトにおいて改善された抗原特異的Ｔ細胞結合力および／または改善された抗原特異的Ｔ細胞応答の強度を誘発することが意図され、予測される。
【０２４０】
実施例２：ＩＬ−４アンタゴニストワクチン接種は高結合力ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発する
(ｉ)材料および方法
−  マウスの免疫化：無菌６〜７週齢雌ＢＡＬＢ／ｃ(Ｈ−２ｄ)を、Animal Breeding Establishment, John Curtin School of Medical Research(ＪＣＳＭＲ)から得た。全ての動物を、オーストラリア国立大学動物実験倫理ガイドラインに従い、維持および使用した。マウスを、表１に記載のとおり穏やかなメトキシフルオラン麻酔下、２週間離して、ワクチン接種のｉ.ｎ.／ｉ.ｍ.複合粘膜全身性経路を使用して、１×１０７pfu  ｒＦＰＶ、続いてＨＩＶ−１抗原または／およびＩＬ−４Ｒアンタゴニストを発現する１×１０７pfu  ｒＶＶで初回−追加免疫した。追加免疫ワクチン接種６週間後の防御免疫を評価するために、マウスに、Ranasinghe et al 2011(引用文献２参照)に記載のとおり、ノイラミニダーゼ柄におけるＨＩＶのＫｄＧａｇ１９７−２０５エピトープを発現するインフルエンザウイルスＰＲ８(A/Puerto Rico/8/1934(H1N1))(先の試験より高投与量)を、鼻腔内に７５プラーク形成単位(ＰＦＵ)で負荷した。これは、逆遺伝子工学を使用して構築した(引用文献３および４)。体重を、負荷後１０日間モニターした。
【０２４１】
【表１】
2015520175.tif 000002
全てのｒＦＰＶおよびｒＶＶ構築物はＨＩＶ−１  ｇａｇ／ｐｏｌ抗原をコードする。表１に記載する全てのウイルスは、引用文献１に記載のとおりＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ(ｍｕｔ)タンパク質を発現するＦＰＶ−０８６およびＶＶ−３３６を使用して構築した。
ｉ.ｎ.＝鼻腔内、ｉ.ｍ.＝筋肉内。
【０２４２】
−  四量体染色および解離アッセイ：アロフィコシアニン結合ＫｄＧａｇ１９７−２０５四量体を、The John Curtin School of Medical ResearchのBio-Molecular Resource Facilityで合成した。２〜５×１０６脾細胞または粘膜リンパ球を抗ＣＤ８ａ−ＦＩＴＣ抗体(BD PharMigen, San Diego, CA)およびＡＰＣ結合ＫｄＧａｇ１９７−２０５四量体で室温で染色し、先に記載されたとおり分析した(引用文献２および５参照)。
【０２４３】
同様に、ＫｄＧａｇ１９７−２０５四量体染色後、解離アッセイを先に記載されたとおり実施した(引用文献２参照)。プレートをサンプルあたり５時点で評価するよう配置した(０〜６０分)。５０μg／mlの抗Ｈ−２Ｋｄ競合的結合抗体(BD PharMigen, San Diego, USA)を各ウェルに添加して、解離した四量体が再結合するのを阻止し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。各時点で、細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液に移して反応を停止させ、洗浄し、０.５％パラホルムアルデヒドを含む１００μlのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。１００,０００事象をFACs Caliburフローサイトメーター(Becton-Dickinson, San Diego, USA)で獲得し、Cell Quest Proソフトウエアを使用して分析した。
【０２４４】
−  ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ：ＩＦＮ−γまたはＩＬ−２  ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を、先に記載されたとおりＩＦＮ−γまたはＩＬ−２捕獲ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより測定した(引用文献２および６参照)。簡単にいうと、２×１０５脾臓またはＧＮ細胞を、５μg／mlのマウス抗ＩＦＮ−γまたはＩＬ−２捕獲抗体(BD PharMigen, San Diego, CA)で被覆した９６ウェルMillipore PVDFプレート(Millipore, MA, Ireland)に添加し、Ｈ−２Ｋｄ免疫優性ＣＤ８＋  Ｔ細胞エピトープ、Ｇａｇ１９７−２０５−AMQMLKETI(配列番号１４)(ＪＣＳＭＲのBio-Molecular Resource Facilityで合成)の存在下、ＩＬ−２またはＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔでそれぞれ１２時間または２２時間刺激した。ＣｏｎＡ刺激細胞(Sigma, USA)を陽性対照として使用し、非刺激細胞を陰性対照として使用した。両ＥＬＩＳｐｏｔアッセイについて、全工程を正確に先に記載されたとおり行った(引用文献２および５参照)。プロットしたデータを１０６  Ｔ細胞あたりのＳＦＵとして表し、平均値±ＳＤを示す。非刺激細胞数を、データプロット前に各刺激値から減算した。全例全例背景ＳＦＵ数は極めて低かった。
【０２４５】
−  細胞内サイトカイン分析(ＩＣＳ)：ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α産生ＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞をRanasinghe et al.に記載のとおり分析した(引用文献２および５参照)。簡単にいうと、２×１０６リンパ球をAMQMLKETI(配列番号１４)ペプチドで３７℃で１６時間刺激し、さらにブレフェルジンＡ(eBioscience, CA, USA)と４時間インキュベートした。細胞をＣＤ８−ＡＰＣ(BD PharMigen, San Diego, CA)で表面染色し、固定し、透過性化して、ＩＦＮ−γ−ＦＩＴＣおよびＴＮＦ−α−ＰＥ(BD PharMigen, San Diego, CA)で細胞内染色した。サンプルあたり総１００,０００ゲート開閉事象を、FACS Caliburフローサイトメーター(Becton Dickinson, San Diego, CA)を使用して回収し、得られた結果をCell Quest Proソフトウエアを使用して分析した。グラフへのプロット前に非刺激背景をデータから減算した。
【０２４６】
−  データの統計分析：ＳＤまたはＳＥＭを計算し、ｐ値を両側２サンプル等分散または不等分散スチューデントｔ検定を使用して決定した。０.０５未満のｐ値を有意と見なした。特に断らない限り実験を最低３回繰り返した。
【０２４７】
(ii)結果
−  ＩＬ−４可溶性アンタゴニストを共発現するＨＩＶ−１ワクチンは、高結合力および高強度の全身性および粘膜ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発できる：ｉ.ｎ.／ｉ.ｍ.初回−追加免疫戦略を、ＨＩＶが粘膜の疾患であり、持続した粘膜および全身性免疫のいずれも望ましいために、この試験で選択した。データは、ＩＬ−４Ｒアンタゴニスト(ＩＬ−４Ｃ１１８)を共発現するＨＩＶワクチン(ＦＰＶ−ＨＩＶ−ＩＬ−４Ｃ１１８／ＶＶ−ＨＩＶ−ＩＬ−４Ｃ１１８)での初回−追加免疫が、長期にわたる高結合力ＫｄＧａｇ１９７−２０５特異的ＣＴＬ(図４)を誘発することを示す。ＦＰＶＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌおよびＶＶＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌをワクチン接種したＩＬ−４−／−マウスは、１４日間高結合力ＣＤ８  Ｔ細胞を産生できるが、高結合力記憶ＣＤ８  Ｔ細胞を８週間産生することはできない。それゆえにＩＬ−４が正常免疫機能の細胞環境において必要であるが、ＩＬ−４Ｃ１１８によるＩＬ−４Ｒの一過性阻害は、高い保護で長期にわたる高結合力ＣＴＬを誘発できると仮説立てられる(図９)。データはまた初回免疫におけるＩＬ−４Ｃ１１８が高結合力ＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞サブセットの産生に有益であったことも示す(図４)。対照的に、受容体を追加免疫(ｉ.ｎ. ＦＰＶ−ＨＩＶ／ＶＶ−ＨＩＶ−ＩＬ−４Ｃ１１８)にしか入れなかったならば、Ｔ細胞結合力は、ＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の強度増加が観察されても、対照ｉ.ｎ. ＦＰＶ−ＨＩＶ／ｉ.ｍ. ＶＶ−ＨＩＶワクチン接種にとほぼ同等であった(図５)。
【０２４８】
ｉ.ｎ. ＦＰＶ−ＨＩＶ−ＩＬ−４Ｃ１１８／ｉ.ｍ. ＶＶ−ＨＩＶ−ＩＬ−４Ｃ１１８ワクチン戦略も高いＩＦＮ−γ産生全身性(図６)および粘膜(図７)ＫｄＧａｇ１９７−２０５特異的ＣＴＬを誘発した。さらに興味深いことに、高いＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生する生殖器−直腸(粘膜)ＣＴＬ(図７)は、この性質のワクチンでＩＬ−２の誘発が困難な課題であるために、ＨＩＶワクチンの展望として心躍るものである(通常多機能性、特異的ＩＬ−２産生は防御免疫の証明と見なされる)。ＩＬ−４アンタゴニストワクチン戦略は、高いＨＩＶ特異的エフェクターＴ細胞免疫だけでなく、全身性および粘膜区画の両者で記憶ＣＤ８  Ｔ細胞も誘発する(図９)。
【０２４９】
−  ＨＩＶ−１  ＩＬ−４アンタゴニストワクチン戦略は頑強な防御免疫を産生できる：追加免疫８週目に、マウスにＫｄＧａｇ１９７−２０５免疫優性エピトープを発現する７５pfuのインフルエンザウイルスを負荷し、体重を１０日間毎日モニターした。体重を維持し、インフルエンザウイルス感染に屈していないマウスを、防御免疫の指標と見なした(引用文献２参照)。負荷後、対照ｉ.ｎ  ＦＰＶ−ＨＩＶ／ｉ.ｍ. ＶＶ−ＨＩＶ免疫化を受けたＩＬ−１３−／−マウスは、同じワクチンを受けた野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスと逆に、顕著な体重減少はなかった(図８Ｂ)。興味深いことに、ｉ.ｎ. ＦＰＶ−ＨＩＶ−ＩＬ−４Ｃ１１８／ｉ.ｍ. ＶＶ−ＨＩＶ−ＩＬ−４Ｃ１１８ワクチンを受けたマウスは、対照ワクチンを受けたＩＬ−１３−／−マウスまたは可溶性ＩＬ−１３阻害剤ワクチン(ｉ.ｎ. ＦＰＶ−ＨＩＶ−ＩＬ−１３ＲΔ１０／ｉ.ｍ. ＶＶ−ＨＩＶ−ＩＬ−１３ＲΔ１０)で試験したマウスの行動と極めて類似した(図８Ａおよび８Ｂ)。負荷５日後から、上記３ワクチン接種群の回復率は、対照ワクチン接種された野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスより有意に高かった(ｐ＜０.０５)。上記保護的データは、ｉ.ｎ. ＦＰＶ−ＨＩＶ／ｉ.ｍ. ＶＶ−ＨＩＶワクチンを受けたＩＬ−１３−／−マウスまたはｉ.ｎ. ＦＰＶ−ＨＩＶ−ＩＬ−１３ＲΔ１０／ｉ.ｍ. ＶＶ−ＨＩＶ−ＩＬ−１３ＲΔ１０を受けたＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＤ８＋  Ｔ脾細胞の解離速度(図４)およびまた観察されたエフェクター／記憶粘膜および全身性免疫応答(ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２産生により測定)と十分に相関した(図６、７および９)。非免疫化マウスは、７日目までに最大２０〜２４％の体重減少を示し、負荷１０日目までに回復の徴候を示した(図８Ｂ)。１０日目に、ＩＬ−４アンタゴニストワクチンは、対照ワクチン接種戦略と比較して、有意に高いＩＦＮ−γ応答を示した。データは、明らかに、ＩＬ−４アンタゴニストワクチン戦略が優れた防御免疫を産生できることを示す。
【０２５０】
−  マウスにおける初回および／または追加免疫ＩＬ−４アンタゴニストワクチンにより誘発されたＴ細胞応答の強度および結合力：初回および／または追加免疫ワクチン段階でのＣＤ８＋  Ｔ細胞結合力および強度に対するＩＬ−４アンタゴニスト投与の影響を決定するために実験を行った。
【０２５１】
Ｔ細胞応答を四量体染色により測定した。図５に示すとおり、ＩＬ−４アンタゴニストＩＬ−４Ｃ１１８を共発現するＨＩＶワクチンでの追加免疫[(ｉ)ＦＰＶ−ＨＩＶ−ＩＬ−４Ｃ１１８／(ii)ＶＶ−ＨＩＶ；または(ｉ)ＦＰＶ−ＨＩＶ−ＩＬ−４Ｃ１１８／(ii)ＶＶ−ＨＩＶ−ＩＬ−４Ｃ１１８]は高結合力ＣＴＬを誘発した。ＩＬ−４アンタゴニストＩＬ−４Ｃ１１８と共発現するＨＩＶワクチンでの初回および追加免疫[(ｉ)ＦＰＶ−ＨＩＶ−ＩＬ−４Ｃ１１８／(ii)ＶＶ−ＨＩＶ−ＩＬ−４Ｃ１１８]は、高結合力および高強度の両者を備えたＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘発した。しかしながら、追加抗原薬剤のみへのＩＬ−４アンタゴニスト送達[(ｉ)ＦＰＶ  ＨＩＶ／(ii)ＶＶ  ＨＩＶＩＬ−４Ｃ１１８]は高強度のＣＤ８＋  Ｔ細胞応答しか誘発せず、高結合力を誘発しなかった。
【０２５２】
−  マウスにおける初回および追加免疫ＩＬ−４アンタゴニストワクチンにより誘発される全身性Ｔ細胞応答：ＩＬ−４アンタゴニストでの初回および追加免疫により誘発される全身性ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫のレベルを決定するために実験を行った。図６に示すとおり、細胞内サイトカイン染色は、初回および追加免疫ワクチン接種で送達したＩＬ−４アンタゴニスト(ＩＬ−４Ｃ１１８)(灰色棒)は、全身性ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋  ＩＦＮγ＋  Ｔ細胞を増強できることを示す。
【０２５３】
−  マウスにおける初回および追加免疫ＩＬ−４アンタゴニストワクチンにより誘発される粘膜Ｔ細胞応答：ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、ＩＬ−４アンタゴニストでの初回および追加免疫により誘発される粘膜ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫のレベルを決定した。図７に示すとおり、ＥＬＩＳＰＯＴデータは、初回および追加免疫ワクチン接種で送達されたＩＬ−４アンタゴニスト(ＩＬ−４Ｃ１１８)が、ＩＦＮγ＋およびインターロイキン２(ＩＬ−２)の両者を発現できるＨＩＶ特異的粘膜ＣＤ８＋  Ｔ細胞を増強できることを示す。
【０２５４】
実施例３：ＦＰＶ  ＨＩＶ  ＩＬ−４アンタゴニストワクチンの評価
(ｉ)材料および方法
−  肺抗原提示試験のためのマウスの免疫化：無菌６〜７週齢雌ＢＡＬＢ／ｃ(Ｈ−２ｄ)を、Animal Breeding Establishment, John Curtin School of Medical Research(ＪＣＳＭＲ)から得た。全ての動物を、オーストラリア国立大学(ＡＮＵ)動物実験倫理ガイドラインに従い、維持および使用した。マウス(ｎ＝３〜５)に、穏やかなメトキシフルオラン麻酔下、１×１０７pfuの種々の組み換えＦＰＶ、ＶＶまたはＭＶＡ  ＨＩＶワクチン構築物で鼻腔内免疫化した(上記実施例１および２参照)。送達直前に、ウイルスをリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で最終体積２５μl／マウスに希釈し、２０〜３０秒超音波処理して、均一ウイルス懸濁液を得た。
【０２５５】
ＦＰＶ初期／後期プロモーターおよびＨＩＶ  ｇａｇｐｏｌを、ＦＰＶ０９２からプライマーおよびＰＣＲ
FseIFPVel GGGCCGGCCCATTTAGTATCCTAAAATTGAATTG
SalIKG10a CCTTTTTAACAACCATGGGTCGAC
を使用して増幅した。
【０２５６】
生成物をＭＶＡベクターＧＦＰ−ＢＳＤとライゲートし、カセット選択を、図２に記載のとおりｐＭＶＡ“Ｆ部位”構築に使用した。組み換えＭＶＡ−ＨＩＶ  ｇａｇｐｏｌを、ニワトリ皮膚細胞上のブラストサイジン耐性により選択し、ｇａｇについてＧＦＰ発現およびＰＣＲにより確認した。
【０２５７】
−  肺細胞サンプル調製：肺サンプルを最初に小片に切断し、２mg／mL  コラゲナーゼ(Sigma, USA)、２.４mg／mL  ディスパーゼ(GIBCO, USA)および５単位／mL  ＤＮＡｓｅ(Calbiochem, USA)を含む２mLの完全ＲＰＭＩ緩衝液中、３７℃で１時間、穏やかにボルテックス処理しながら消化させた。続いて、先に記載されたとおり、サンプルを細胞濾過器で濾過し、完全ＲＰＭＩで濯ぎ、赤血球を溶解させ、無菌ガーゼで濾過して、残骸を除去した(引用文献２、１０および１１参照)。我々は、消化が幾つかの表面マーカーの発現を下方制御し得ることを観察していたため、その後、単一細胞懸濁液を４℃で最低４〜６時間維持してアッセイ前に回復させた。
【０２５８】
−  ＦＡＣＳを使用した抗原提示細胞の評価：ＢＡＬＢ／ｃおよびＩＬ−１３  ＫＯマウスを対照ＦＰＶ−ＨＩＶを使用して免疫化し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの他の群を種々のワクチンで免疫化した。ワクチン接種２４時間後、マウスを屠殺し、肺を採取し、上記のとおり単一細胞懸濁液を調製した。各サンプルから、４×１０６細胞を等分し、最初に細胞をＦｃブロック抗体(抗マウスCD16/CD32 Fc Block, BD Biosciences, USA)と、２０分、４０℃でインキュベートし、細胞を蛍光標識抗ＭＨＣII  Ｉ−Ａｄ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、Ｂ２２０、ＣＤ８ａ、ＣＤ１０３(Biolegend, USAまたはe-Biosciences, USA)抗体で３０分、４０℃で表面染色した。細胞を固定し、サンプルあたり総５００,０００ゲート開閉事象をFortessaフローサイトメーター(Becton Dickinson, San Diego, CA)を使用して回収し、得られた結果をCell Quest Proソフトウエアを使用して分析した。
【０２５９】
−  抗体試験のためのマウスの免疫化：無菌６〜７週齢雌ＢＡＬＢ／ｃ(Ｈ−２ｄ)を、Animal Breeding Establishment, John Curtin School of Medical Research(ＪＣＳＭＲ)から得た。全ての動物を、オーストラリア国立大学(ＡＮＵ)動物実験倫理ガイドラインに従い、維持および使用した。マウス(ｎ＝５)に、穏やかなメトキシフルオラン麻酔下、ワクチン接種のｉ.ｎ.／ｉ.ｍ.複合粘膜全身性経路を使用して、２週間離して、１×１０７pfu  ｒＦＰＶ、続いてＨＩＶ−１抗原または／およびＩＬ−４アンタゴニスを発現する１×１０７pfu  ｒＶＶで、初回−追加免疫した。送達直前、ｒＦＰＶおよびｒＶＶをリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で希釈し、２０〜３０秒超音波処理して、均一ウイルス懸濁液を得て、鼻腔内ｒＦＰＶを最終体積２０〜２５μlで得て、ｉ.ｍ. ｒＦＰＶまたはｒＶＶを、四頭筋あたり５０μlで送達した。
【０２６０】
−  血清採取：血清を、免疫前マウスおよびまた追加免疫２〜８週間後のマスから回収した。血液を尾静脈穿刺により採取し、血清を遠心により分離し、アッセイまで−２０℃で保存した。
【０２６１】
ＨＩＶ−１  ｐ２４  Ｇａｇ特異的血清酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)：ＥＬＩＳＡを使用して、ＨＩＶ−１  ｐ２４  Ｇａｇ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ血清抗体力価を決定した。Falcon Microtest IIIプレート(Becton Dickinson, Oxnard, CA)を、ホウ酸緩衝液(Pierce)中、ＨＩＶ−１  ｐ２４  Ｇａｇ(NIH AIDS Research and Reference Reagent Programから恵与)で、一夜、４℃でコートした。プレートを０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液(ＰＢＳＴ)で５回洗浄し、非特異的結合部位を５％脱脂乳／ＰＢＳＴ、２００μl／ウェルで２時間、３７℃で遮断した。次いでプレートを先のとおり洗浄し、５％脱脂乳／ＰＢＳＴで希釈した血清サンプルを５０μl体積で各ウェルに添加した。血清サンプルを１／５０から１／４００に２倍希釈した。プレートを１.５時間、３７℃でインキュベートし、示すとおりＰＢＳＴで洗浄した。１％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳＴ(Sigma)(ＢＳＡ／ＰＢＳＴ)で１：５００希釈した二次抗体であるビオチン結合抗マウスＩｇＧ１または抗マウスＩｇＧ２ａ(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)を５０μl体積で各ウェルに添加し、一夜、４℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１：１０００希釈した５０μlのホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(HRP-SA, Amersham Life Science)を各ウェルに添加した。プレートを３７℃で１.５時間インキュベートし、ＰＢＳで５回洗浄し、ジメチルスルホキシド(Sigma)に溶解し、ＴＭＢクエン酸／リン酸基質緩衝液(Sigma)で希釈した０.０１mg／ml  テトラメチル−ベンジジン(ＴＭＢ)(Sigma)基質で抗体を検出した。各ウェルの光学密度(ＯＤ)を４０５nmで１５分および３０分に読んだ。
【０２６２】
(ii)結果
鼻腔内ＩＬ−４アンタゴニスト初回免疫が、ｉ.ｎ.送達後どのように高結合力ＣＤ８  Ｔ細胞を誘発するかを評価するために、肺粘膜のＡＰＣサブセットを評価した。ＢＡＬＢ／ｃおよびＩＬ−１３−／−マウス(ｎ＝３)を、種々のワクチンで上記のとおり鼻腔内免疫化した。免疫化２４時間後、肺を取り、細胞を上記のとおり染色した。
【０２６３】
図１０は、肺粘膜におけるＡＰＣサブセットの評価に使用した抗原提示細胞(ＡＰＣ)サブセットゲーティング戦略を設定する一連のドットプロットを提供する。ＦＡＣＳプロットは、生存細胞上で予めゲート開閉し、続いて前方散乱(ＦＳＣ)および側方散乱(ＳＳＣ)に基づきダブレット除去し、ＭＨＣII  Ｉ−Ａｄ＋およびＣＤ１１ｃ＋集団上でゲート開閉した細胞を示す、上部パネル(Ｒ５ゲート)。次いで、ＭＨＣII  Ｉ−Ａｄ＋ＣＤ１１ｃ＋ゲートを使用して、種々のレベルのＣＤ１１ｂ、Ｂ２２０、ＣＤ１０３、ＣＤ８を発現する肺ＡＰＣサブセットを分析した。
【０２６４】
マウスからの肺粘膜のＣＤ１０３関連抗原提示細胞サブセットを、初回ワクチン接種２４時間後評価した。図１１に示すとおり、鼻腔内(ｉ.ｎ.)ＦＰＶ−ＨＩＶ−Ｃ１１８送達は、野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスまたは対照ワクチンを受けたＩＬ−１３−／−(ノックアウト)マウスと比較して、肺粘膜におけるＩＡｄ＋  ＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ１０３−  ＡＰＣサブセットの上昇およびＩＡｄ＋  ＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ１１ｂ−  ＣＤ１０３＋集団減少を誘発した。データは、ＩＡｄ＋  ＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ１０３−集団が高結合力ＣＴＬ誘発に重要な役割を有することを示す。一般にｉ.ｎ. ＦＰＶ抗原刺激は、ｒＶＶまたはｒＭＶＡベクターと比較して、肺粘膜で高いＣＤ１１ｂおよび低いＣＤ１０３を発現するＡＰＣサブセットを誘発する(上部パネル)。
【０２６５】
Ｂ２２０関連抗原提示細胞サブセットを、初回ワクチン接種２４時間後肺粘膜で評価した(図１２)。鼻腔内ＦＰＶ−ＨＩＶ−Ｃ１１８送達は、野生型ＢＡＬＢ／ｃ(上左パネル)またはＦＰＶ−ＨＩＶ対照ワクチンを投与されたＩＬ−１３−／−マウス(横中央列、左から二番目のパネル)と比較して、肺粘膜におけるＩＡｄ＋  ＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ１１ｂ＋  ｂ２２０−(横中央列の最右パネルの上部左集団参照)抗原提示細胞サブセットを誘発する。同様に、ＦＰＶ−ＨＩＶ−Ｃ１１８送達は、ＩＡｄ＋  ＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ１１ｂ−  ＣＤ８−であるＡＰＣサブセットを増加させた。鼻腔内組み換えＦＰＶベクターは、ＶＶ−ＨＩＶまたはＭＶＡ−ＨＩＶと比較して、低いＩＡｄ＋  ＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ１１ｂ−  ｂ２２０＋を誘発した(横中央列の最右パネルにおける下部右集団参照)。
【０２６６】
図１２における上部右矢印(ａ)は、ＶＶまたはＭＶＡ初回免疫と比較した鼻腔内ＦＰＶ初回免疫の重要さを強調する。図１２における中央右矢印(ｂ)は、ＩＬ−４ＲアンタゴニストアジュバントＦＰＶ−ＨＩＶワクチンの鼻腔内送達が、肺粘膜において優れたＣＤ１１＋ｂ２２０−樹状細胞サブセットを誘発し、ＦＰＶ−ＨＩＶ−Ｃ１１８抗原刺激が最高ＩＡｄ＋  ＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ１１ｂ＋Ｂ２００−樹状細胞パーセンテージを誘発することを示す。図１２における下右矢印(ｃ)は、ＶＶの鼻腔内送達が、肺粘膜におけるＣＤ１１ｂ−  Ｂ２００＋  ＤＣサブセットを増強することを示す。鼻腔内ＦＰＶ初回免疫が、追加免疫よりも初回ワクチン接種で誘発される、高結合力ＣＤ８  Ｔ細胞の誘発に有益であることを明らかに証明する。
【０２６７】
肺粘膜におけるＣＤ８関連抗原提示細胞サブセットも、初回ワクチン接種２４時間後に評価した(図１３)。鼻腔内ＦＰＶ−ＨＩＶ−Ｃ１１８送達は、野生型ＢＡＬＢ／ｃ(上左パネル)またはＦＰＶ−ＨＩＶ対照ワクチンを与えたＩＬ−１３−／−マウス(下左パネル)と比較して、肺粘膜において、ＩＡｄ＋  ＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ１１ｂ−  ＣＤ８＋である樹状細胞を低いパーセンテージで誘発した(下右パネルにおける下右集団  −  矢印はＣＤ１１ｂ−ＣＤ８＋細胞を示す)。同様に、ＦＰＶ−ＨＩＶ−Ｃ１１８送達は、増加したＩＡｄ＋  ＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ８−であるＡＰＣサブセットを誘発した(下右パネル  −  上部左集団)。鼻腔内組み換えＦＰＶ−ＨＩＶ、ＶＶ−ＨＩＶまたはＭＶＡ−ＨＩＶワクチン接種は、ＩＡｄ＋  ＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ１１ｂ−  ＣＤ８＋であるＤＣを同等のパーセンテージで誘発し、使用したベクターがこのＤＣサブセットに影響しなかったことを示唆した。
【０２６８】
図１４は、ＨＩＶ  ＩＬ−４Ｒアンタゴニストアジュバントワクチン接種後のｐ２４Ｇａｇに対する血清ＩｇＧ１応答増強を証明する(追加免疫ワクチン接種２週間後)。これらの応答は、最適抗体応答が、ワクチン接種４〜８週間後に観察されるため、経時的に増加することが予測される。観察された応答ｏは、対照ワクチンを与えたＩＬ−１３  ＫＯマウスまたはＩＬ−１３Ｒａ２アジュバントワクチン(引用文献１１)を与えた群よりはるかに高かった。
【０２６９】
(iii)考察
これらの結果およびさらなる観察は少なくとも次の点を強調する：
Ａ. 新規ＦＰＶ  ＨＩＶ  ＩＬ−４アンタゴニストワクチンは、鼻腔内(ｉ.ｎ.)送達されたとき、ワクチン接種１２〜２４時間後に肺粘膜に独特な抗原提示細胞(ＡＰＣ)サブセットを動員でき、これが高結合力ＣＴＬの誘発を担う可能性が高い。データは、ＦＰＶ−ＨＩＶ−ＩＬ−４アンタゴニストワクチン後に誘導されたＡＰＣサブセットＩＡｄ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１０３−ｂ２２０−ＣＤ８−が、Ｔ細胞結合力調節に重要な役割を有することを示唆する(図１０〜１３)。これらのワクチンは、対照ＦＰＶ−ＨＩＶワクチンを与えたＩＬ−１３−／−マウスの場合極めて類似した挙動を取る(図１１〜１３)。現在のＡＰＣデータは、ＩＬ−４およびＩＬ−１３枯渇細胞環境が、肺粘膜に独特なＡＰＣサブセットを化学誘引でき、高結合力ＣＤ８  Ｔ細胞の誘発を促進することを明らかに示す；
【０２７０】
Ｂ. 鼻腔内ｒＦＰＶ抗原刺激が、組み換えワクシニアまたは改変ワクシニアアンカラ(ＭＶＡ)と比較して異なるＡＰＣサブセットを肺粘膜に動員でき、初回免疫ベクターも結合力修飾に重要な役割を有することを示唆する(図１〜３)。具体的に、ＶＶおよびＭＶＡ後に誘発されるＩＡｄ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１０３＋集団は、結合力に負の意味合いを有する；
【０２７１】
Ｃ. ｒＦＰＶは、優れた安全な鼻腔内送達ベクターであり、マウスで血液脳関門を通過しない(データは示していない)；
【０２７２】
Ｄ. 鼻腔内ＦＰＶ  ＨＩＶ  ＩＬ−４アンタゴニスト(Ｃ１１８)抗原刺激／ｉ.ｍ. ＶＶ  ＨＩＶ  Ｃ１１８追加免疫ワクチン接種戦略はまた、追加免疫ワクチン接種２週間後でさえ、ｐ２４  ｇａｇ  ＩｇＧ１抗体応答増強を誘発できる。これらの応答は、通常追加免疫ワクチン接種４〜８週間後さらに増強される。
【０２７３】
実施例１、２および３の引用文献
1. Coupar, B.E.H., et al. Fowlpox virus vaccines for HIV and SIV clinical and pre-clinical trials. Vaccine 24, 1378-1388 (2006).
2. Ranasinghe, C., et al. A comparative analysis of HIV-specific mucosal/systemic T cell immunity and avidity following rDNA/rFPV and poxvirus-poxvirus prime boost immunisations. Vaccine 29, 3008-3020 (2011).
3. Cukalac, T., et al. Narrowed TCR diversity for immunised mice challenged with recombinant influenza A-HIV Env (311-320) virus. Vaccine. 27, 6755-6761 Epub 2009 Sep 6758 (2009).
4. Sexton, A., et al. Evaluation of recombinant influenza virus-simian immunodeficiency virus vaccines in macaques. J Virol. 83, 7619-7628 Epub 2009 May 7613 (2009).
5. Ranasinghe, C., et al. Evaluation of fowlpox-vaccinia virus prime-boost vaccine strategies for high-level mucosal and systemic Iimmunity against HIV-1. Vaccine 24, 5881-5895 (2006).
6. Ranasinghe, C., et al. Mucosal HIV-1 pox virus prime-boost immunization Induces high-avidity CD8+ T cells with regime-dependent cytokine/granzyme B profiles. J Immunol. 178, 2370-2379 (2007).
7. Heine, G & Boyle, D. Infectious bursal disease virus structural protein VP 2 expressed by a fowlpox virus recombinant confers protection against disease in chickens. Archives of Virology. 131, 277-292 (1993).
8. Wong, YC., et al. Engineering recombinant poxviruses using a compact GFP-blasticidin resistance fusion gene for selection. Journal of Virological Methods. 171, 295-298 (2011).
9. Coupar B.E.H., et al. A general method for the construction of recombinant vaccinia viruses expressing multiple foreign genes. Gene 68:1-10 (1988).
10.  Xi Y, Day SL, Jackson RJ, Ranasinghe C. Role of novel type I interferon epsilon in viral infection and mucosal immunity. Mucosal Immunol 2012 May 23;5(6):610-22
11. Ranasinghe C, Trivedi S, Stambas J, Jackson RJ. Unique IL-13Rα2 based HIV-1 vaccine strategy to enhance mucosal immunity, CD8+ T cell avidity and protective immunity. Mucosal Immunol 2013;13th Feb Advance online.
【図１−１】
2015520175.tif 000003
【図１−２】
2015520175.tif 000004
【図１−３】
2015520175.tif 000005
【図２−１】
2015520175.tif 000006
【図２−２】
2015520175.tif 000007
【図２−３】
2015520175.tif 000008
【図３−１】
2015520175.tif 000009
【図３−２】
2015520175.tif 000010
【図３−３】
2015520175.tif 000011
【図３−４】
2015520175.tif 000012
【図３−５】
2015520175.tif 000013
【図５】
2015520175.tif 000014
【図６】
2015520175.tif 000015
【図１０】
2015520175.tif 000016
【図４】
2015520175.tif 000017
【図７】
2015520175.tif 000018
【図８】
2015520175.tif 000019
【図９】
2015520175.tif 000020
【図１１】
2015520175.tif 000021
【図１２】
2015520175.tif 000022
【図１３】
2015520175.tif 000023
【図１４】
2015520175.tif 000024
【配列表】
2015520175000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年7月17日(2014.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における抗原特異的免疫応答を誘発する方法であって、対象に抗原をインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストと組み合わせて投与することを含み、
該投与が、対象における初回抗原薬剤および追加抗原薬剤の抗原およびインターロイキン−４受容体アンタゴニストをコードする１個以上のポリヌクレオチドの発現を含み、
１個以上のポリヌクレオチドを組み換えウイルスの構成要素として投与し、そして
初回抗原薬剤および追加抗原薬剤の組み換えウイルスが対象におけるインターロイキン−４受容体アンタゴニストを一過性に発現する、
方法。
【請求項２】
対象における抗原に対する免疫細胞の結合力を高める方法であって、対象に抗原をインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストと組み合わせて投与することを含み、
該投与が、対象における初回抗原薬剤および追加抗原薬剤の抗原およびインターロイキン−４受容体アンタゴニストをコードする１個以上のポリヌクレオチドの発現を含み、
１個以上のポリヌクレオチドを組み換えウイルスの構成要素として投与し、そして
初回抗原薬剤および追加抗原薬剤の組み換えウイルスが対象におけるインターロイキン−４受容体アンタゴニストを一過性に発現する、
方法。
【請求項３】
対象における抗原に特異的な免疫細胞の数を増やす方法であって、対象に抗原をインターロイキン−４受容体(ＩＬ−４Ｒ)アンタゴニストと組み合わせて投与することを含み、
該投与が、対象における初回抗原薬剤および追加抗原薬剤の抗原およびインターロイキン−４受容体アンタゴニストをコードする１個以上のポリヌクレオチドの発現を含み、
１個以上のポリヌクレオチドを組み換えウイルスの構成要素として投与し、そして
初回抗原薬剤および追加抗原薬剤の組み換えウイルスが対象におけるインターロイキン−４受容体アンタゴニストを一過性に発現する、方法。
【請求項４】
免疫細胞がＴリンパ球、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球および／またはＢリンパ球である、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
抗原特異的免疫応答が該抗原に特異的なＴリンパ球および／またはＢリンパ球を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗原がウイルス抗原である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
抗原がヒト免疫不全ウイルス抗原である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
抗原がｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖ遺伝子産物またはこれらの任意の組み合わせから選択されるヒト免疫不全ウイルス抗原である、求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
初回抗原薬剤の抗原およびインターロイキン−４受容体アンタゴニストが対象に逐次投与される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
初回抗原薬剤の抗原およびインターロイキン−４受容体アンタゴニストが対象に同時に投与される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
初回刺激および／または追加抗原薬剤のＩＬ−４Ｒアンタゴニストが、インターロイキン−４受容体アルファ鎖(ＩＬ−４Ｒα)に結合し、ＩＬ−４Ｒシグナル伝達を阻止できるＩＬ−４Ｒαアンタゴニストである、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
初回刺激および／または追加抗原薬剤のＩＬ−４Ｒアンタゴニストが、シグナルペプチドを欠き、残基１２１での変異、残基１２４での変異、１２３位より後での１個以上の残基の欠失、インターロイキン−４遺伝子のエクソン２によりコードされるフラグメントの欠失またはこれらの任意の組み合わせから選択される１個以上の変異を含む、ヒトインターロイキン−４分子である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
追加抗原薬剤の抗原およびＩＬ−４Ｒアンタゴニストを同時に投与する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
追加抗原薬剤の抗原およびＩＬ−４Ｒアンタゴニストを逐次投与する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
変異がＲ１２１Ｄ、Ｙ１２４Ｄ、インターロイキン−４遺伝子のエクソン２によりコードされるフラグメントの欠失またはこれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
(ｉ)抗原をコードするポリヌクレオチド；および
(ii)ＩＬ−４Ｒアンタゴニストをコードするポリヌクレオチド
を含む組成物であって、
ここで、組成物が対象への初回抗原薬剤および追加抗原薬剤投与のために製剤され、
各該ポリヌクレオチドが組み換えウイルスの構成要素であり、そして
各該投与量の組み換えウイルスが組成物を投与した対象にインターロイキン−４受容体アンタゴニストを一過性に発現させる、組成物。
【請求項１７】
抗原がウイルス抗原である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
抗原がｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖ遺伝子産物またはこれらの任意の組み合わせから選択されるヒト免疫不全ウイルス抗原である、請求項１６または請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ＩＬ−４Ｒアンタゴニストがインターロイキン−４受容体アルファ鎖(ＩＬ−４Ｒα)に結合し、ＩＬ−４Ｒシグナル伝達を阻止できるＩＬ−４Ｒαアンタゴニストである、請求項１６〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
ＩＬ−４Ｒアンタゴニストがシグナルペプチドを欠き、残基１２１での変異、残基１２４での変異、１２３位より後での１個以上の残基の欠失、インターロイキン−４遺伝子のエクソン２によりコードされるフラグメントの欠失またはこれらの任意の組み合わせから選択される１個以上の変異を含むヒトインターロイキン−４分子である、請求項１６〜１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
変異がＲ１２１Ｄ、Ｙ１２４Ｄ、インターロイキン−４遺伝子のエクソン２によりコードされるフラグメントの欠失またはこれらの任意の組み合わせから選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
組み換えウイルスがポックスウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス(例えばＮＹＶＡＣ)、鶏痘ウイルス、カナリアポックスウイルス、アデノウイルス、生存−弱毒化ウイルスおよび改変ワクシニアアンカラ(ＭＶＡ)ウイルスからなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２３】
対象における感染の予防または処置方法であって、対象に初回抗原薬剤および追加抗原薬剤の請求項１６〜２２のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２４】
対象に感染のワクチン接種をする方法であって、対象に初回抗原薬剤および追加抗原薬剤の請求項１６〜２２のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２５】
感染がヒト免疫不全ウイルス感染であり、組成物がｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖ遺伝子産物またはこれらの任意の組み合わせから選択されるヒト免疫不全ウイルス抗原を含む、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
組み換えウイルスがポックスウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス(例えばＮＹＶＡＣ)、鶏痘ウイルス、カナリアポックスウイルス、アデノウイルス、生存−弱毒化ウイルスおよび改変ワクシニアアンカラ(ＭＶＡ)ウイルスからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
抗原およびインターロイキン−４受容体が同じポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１〜１５または２３〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
初回抗原薬剤および追加抗原薬剤の組み換えウイルスが、対象におけるインターロイキン−４受容体アンタゴニストを１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日より短い期間一過性に発現する、請求項１〜１５または２３〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
初回抗原薬剤を対象に粘膜投与し、追加抗原薬剤を対象に筋肉内、皮下または静脈内投与する、請求項１〜１５、２３〜２８に記載の方法。
【請求項３０】
抗原およびインターロイキン−４受容体が同じポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１６〜２２のいずれかに記載の組成物。
【請求項３１】
各該投与量の組み換えウイルスが組成物を投与した対象に１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日より短い期間インターロイキン−４受容体アンタゴニストを一過性に発現する、請求項１６〜２２または３０のいずれかに記載の組成物。
【請求項３２】
初回抗原薬剤を粘膜投与用に製剤し、追加抗原薬剤を筋肉内、皮下または静脈内投与用に製剤する、請求項１６〜２２、３０または３１のいずれかに記載の組成物。
【国際調査報告】
2015520175.tif 000025
2015520175.tif 000026
2015520175.tif 000027
2015520175.tif 000028
2015520175.tif 000029