(57)【要約】  本発明は、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける新たな方法に関する。本方法は、細孔およびＲｅｃＤヘリカーゼを用いる。ヘリカーゼは、細孔を介する標的ポリヌクレオチドの移動を制御する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドが細孔を介して移動し、ＲｅｃＤヘリカーゼが細孔を介する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドを、膜貫通細孔およびＲｅｃＤヘリカーゼと接触させるステップと、
（ｂ）ポリヌクレオチドが細孔に対して移動するときに、１または複数の測定を行うステップであって、測定値が、標的ポリヌクレオチドの１または複数の特徴を示し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるステップと
を含む方法。
【請求項２】
１または複数の特徴が、（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的ポリヌクレオチドが、メチル化により、酸化により、損傷により、１もしくは複数のタンパク質で、または１もしくは複数の標識、タグ、もしくはスペーサーで修飾されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
標的ポリヌクレオチドの１または複数の特徴が、電気的測定および／または光学的測定により測定される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
電気的測定が、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定、または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）標的ポリヌクレオチドが細孔を介して移動し、ＲｅｃＤヘリカーゼが細孔を介する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドを、膜貫通細孔およびＲｅｃＤヘリカーゼと接触させるステップと、
（ｂ）ポリヌクレオチドが細孔に対して移動するときに細孔を通過する電流を測定するステップであって、電流が、標的ポリヌクレオチドの１または複数の特徴を示し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）が、ポリヌクレオチドが細孔を介して移動するときに１または複数の測定を行うことを伴う、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
細孔を隔てて電圧を印加して、細孔とヘリカーゼとの間の複合体を形成するステップをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチドの少なくとも一部が二本鎖である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細孔が、膜貫通タンパク質細孔または固体状態細孔である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
膜貫通タンパク質細孔が、ヘモリシン、ロイコシジン、マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）のポリンＡ（ＭｓｐＡ）、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）属オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）、およびＷＺＡから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号２に示される８つの同一のサブユニット、または（ｂ）７つのサブユニットのうちの１または複数が、配列の全体にわたりアミノ酸同一性に基づいて配列番号２と少なくとも５０％の相同性を有し、細孔活性を保持するその変異体から形成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号４に示される７つの同一のサブユニットから形成されるα−ヘモリシン、または（ｂ）７つのサブユニットのうちの１または複数が、配列の全体にわたりアミノ酸同一性に基づいて配列番号４と少なくとも５０％の相同性を有し、細孔活性を保持するその変異体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＲｅｃＤヘリカーゼが、
・アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号８）［式中、Ｘ１は、Ｇ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ２は、任意のアミノ酸であり、Ｘ３は、Ｐ、Ａ、Ｓ、またはＧであり、Ｘ４は、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｓ、またはＣであり、Ｘ５は、ＧまたはＡであり、Ｘ６は、ＫまたはＲであり、Ｘ７は、ＴまたはＳである］；および／または
・アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−（Ｘ６）３−Ｑ−Ｘ７（配列番号９、１０、および１１）［式中、Ｘ１は、Ｙ、Ｗ、またはＦであり、Ｘ２は、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、Ｃ、またはＶであり、Ｘ３は、任意のアミノ酸であり、Ｘ４は、ＴまたはＮであり、Ｘ５は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｖ、またはＩであり、Ｘ６は、任意のアミノ酸であり、Ｘ７は、ＧまたはＳである］
を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＲｅｃＤヘリカーゼが、以下のモチーフ：
（ａ）  ＧＧＰＧＴＧＫＴ（配列番号１９）および／またはＷＡＶＴＩＨＫＳＱＧ（配列番号２０）；
（ｂ）  ＧＧＰＧＴＧＫＳ（配列番号２２）および／またはＹＡＬＴＶＨＲＡＱＧ（配列番号２３）；
（ｃ）  ＧＧＰＧＶＧＫＴ（配列番号２６）および／またはＹＡＩＳＶＨＫＳＱＧ（配列番号２７）；
（ｄ）  ＧＧＰＧＴＧＫＴ（配列番号１９）および／またはＹＣＩＳＶＨＫＳＱＧ配列番号（２９）；
（ｅ）  ＧＧＰＧＶＧＫＴ（配列番号２６）および／またはＹＡＡＴＩＨＫＳＱＧ（配列番号３１）；
（ｆ）  ＧＧＰＧＣＧＫＳ（配列番号３３）および／またはＹＡＭＴＩＨＲＳＱＧ（配列番号３４）；
（ｇ）  ＧＧＰＧＴＧＫＳ（配列番号２２）および／またはＹＡＶＳＩＨＫＳＱＧ（配列番号３６）；
（ｈ）  ＧＧＰＧＶＧＫＴ（配列番号２６）および／またはＹＡＴＳＶＨＫＳＱＧ（配列番号３８）；
（ｉ）  ＧＧＰＧＴＧＫＴ（配列番号１９）および／またはＹＡＶＳＶＨＫＳＱＧ（配列番号４０）；
（ｊ）  ＧＧＰＧＶＧＫＴ（配列番号２６）および／またはＹＡＴＳＩＨＫＳＱＧ（配列番号４３）；または
（ｋ）  ＧＧＰＧＴＧＫＳ（配列番号２２）および／またはＹＡＬＴＶＨＲＧＱＧ（配列番号４５）
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＲｅｃＤヘリカーゼが、表４もしくは５に示されるヘリカーゼのうちの１つ、またはその変異体である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＲｅｃＤヘリカーゼが、
（ａ）配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２、および４４のうちのいずれか１つに示される配列；または
（ｂ）配列の全体にわたりアミノ酸の同一性に基づいて当該配列と少なくとも２５％の相同性を有し、ヘリカーゼ活性を保持するその変異体
を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＲｅｃＤヘリカーゼが、ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼが、
・アミノ酸モチーフＨ−（Ｘ１）２−Ｘ２−Ｒ−（Ｘ３）５〜１２−Ｈ−Ｘ４−Ｈ（配列番号４６〜５３）［式中、Ｘ１およびＸ３は、任意のアミノ酸であり、Ｘ２およびＸ４は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、およびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択される］；または
・アミノ酸モチーフＧ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｈ−（Ｘ８）６〜１２−Ｈ−Ｘ９（配列番号５４〜６０）［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ９は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、およびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択され、Ｘ４は、ＤまたはＥであり、Ｘ８は、任意のアミノ酸である］
をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼが、以下のモチーフ：
（ａ）  ＧＹＡＧＶＧＫＴ（配列番号６２）、ＹＡＩＴＡＨＧＡＱＧ（配列番号６３）およびＨＤＴＳＲＤＱＥＰＱＬＨＴＨ（配列番号６４）；
（ｂ）  ＧＩＡＧＡＧＫＳ（配列番号６６）、ＹＡＬＮＶＨＭＡＱＧ（配列番号６７）およびＨＤＴＮＲＮＱＥＰＮＬＨＦＨ（配列番号６８）；
（ｃ）  ＧＡＡＧＡＧＫＴ（配列番号７０）、ＹＣＩＴＩＨＲＳＱＧ（配列番号７１）およびＨＥＤＡＲＴＶＤＤＩＡＤＰＱＬＨＴＨ（配列番号７２）；
（ｄ）  ＧＦＡＧＴＧＫＳ（配列番号７５）、ＹＡＴＴＶＨＳＳＱＧ（配列番号７６）およびＨＥＴＳＲＥＲＤＰＱＬＨＴＨ（配列番号７７）；
（ｅ）  ＧＲＡＧＡＧＫＴ（配列番号７９）、ＹＡＴＴＩＨＫＳＱＧ（配列番号８０）およびＧＭＶＡＤＷＶＹＨＤＮＰＧＮＰＨＩＨ（配列番号８１）；
（ｆ）  ＧＡＡＧＴＧＫＴ（配列番号８３）、ＹＡＳＴＡＨＫＳＱＧ（配列番号８４）およびＨＳＴＳＲＡＱＤＰＨＬＨＳＨ（配列番号８５）；
（ｇ）  ＧＨＡＧＡＧＫＴ（配列番号８７）、ＹＡＧＴＴＨＲＮＱＧ（配列番号８８）およびＨＡＳＳＲＥＱＤＰＱＩＨＳＨ（配列番号８９）；
（ｈ）  ＧＬＡＧＴＧＫＴ（配列番号９１）、ＹＡＶＴＳＨＳＳＱＧ（配列番号９２）およびＨＤＴＡＲＰＶＮＧＹＡＡＰＱＬＨＴＨ（配列番号９３）；
（ｉ）  ＧＰＡＧＡＧＫＴ（配列番号９５）、ＹＡＩＴＡＨＲＡＱＧ（配列番号９６）およびＨＹＤＳＲＡＧＤＰＱＬＨＴＨ（配列番号９７）；
（ｊ）  ＧＷＡＧＶＧＫＴ（配列番号９９）、ＹＡＶＴＡＤＨＭＱＧ（配列番号１００）およびＨＬＣＧＲＬＤＰＱＩＨＮＨ（配列番号１０１）；
（ｋ）  ＧＶＡＧＡＧＫＴ（配列番号１０３）、ＹＡＬＴＩＤＳＡＱＧ（配列番号１０４）およびＨＭＴＳＧＤＧＳＰＨＬＨＶＨ（配列番号１０５）；
（ｌ）  ＧＹＡＧＴＧＫＳ（配列番号１０７）、ＹＡＡＴＩＨＫＡＱＧ（配列番号１０８）およびＧＭＩＡＤＬＶＮＶＨＷＤＩＧＥＤＧＫＡＫＰＨＡＨ（配列番号１０９）；
（ｍ）  ＧＩＡＧＡＧＫＳ（配列番号６６）、ＹＡＬＮＡＨＭＡＱＧ（配列番号６７）およびＨＤＴＮＲＮＱＥＰＮＬＨＦＨ（配列番号１１１）；
（ｎ）  ＧＶＡＧＡＧＫＳ（配列番号１１５）、ＹＡＬＮＡＨＭＡＱＧ（配列番号６７）およびＨＤＴＮＲＮＱＥＰＮＡＨＦＨ（配列番号１１６）；
（ｏ）  ＧＧＡＧＶＧＫＳ（配列番号１１８）、ＹＡＩＮＶＨＩＡＱＧ（配列番号１１９）およびＨＤＶＳＲＮＮＤＰＱＬＨＶＨ（配列番号１２０）；
（ｐ）  ＧＩＡＧＡＧＫＳ（配列番号６６）、ＹＡＬＮＭＨＭＡＱＧ（配列番号１２２）およびＨＤＴＳＲＡＬＤＰＱＧＨＩＨ（配列番号１２３）；
（ｑ）  ＧＶＡＧＡＧＫＳ（配列番号１１５）、ＹＡＬＮＡＨＭＡＱＧ（配列番号６７）およびＨＤＴＳＲＡＬＤＰＱＧＨＩＨ（配列番号１２３）；
（ｒ）  ＧＲＡＧＴＧＫＴ（配列番号１２６）、ＦＡＳＴＡＨＧＡＱＧ（配列番号１２７）およびＨＥＡＳＲＮＬＤＰＱＬＨＳＨ（配列番号１２８）；
（ｓ）  ＧＹＡＧＴＧＫＴ（配列番号１３０）、ＹＡＭＴＳＨＡＡＱＧ（配列番号１３１）およびＨＤＩＳＲＤＫＤＰＱＬＨＴＨ（配列番号１３２）；
（ｔ）  ＧＬＡＧＴＧＫＴ（配列番号９１）、ＹＡＱＴＶＨＡＳＱＧ（配列番号１３４）およびＨＮＴＳＲＤＬＤＰＱＴＨＴＨ（配列番号１３５）；
（ｕ）  ＧＦＡＧＴＡＫＴ（配列番号１３７）、ＹＶＱＴＡＦＡＡＱＧ（配列番号１３８）およびＨＥＴＳＲＡＱＤＰＱＬＨＴＨ（配列番号１３９）；
（ｖ）  ＧＹＡＧＴＡＫＴ（配列番号１４１）、ＹＶＤＴＡＦＡＡＱＧ（配列番号１４２）およびＨＧＴＳＲＡＱＤＰＱＬＨＴＨ（配列番号１４３）；
（ｗ）  ＧＹＡＧＴＡＫＴ（配列番号１４１）、ＹＡＳＴＡＦＡＡＱＧ（配列番号１４５）およびＨＧＴＳＲＡＬＤＰＱＬＨＳＨ（配列番号１４６）；
（ｘ）  ＧＳＡＧＳＧＫＴ（配列番号１４８）、ＹＡＶＴＳＹＳＡＱＧ（配列番号１４９）およびＨＤＴＡＲＰＶＧＧＹＡＡＰＱＬＨＴＨ（配列番号１５０）；
（ｙ）  ＧＥＡＧＴＧＫＴ（配列番号１５３）、ＹＡＨＴＳＹＫＥＱＧ（配列番号１５４）およびＨＥＴＮＲＥＮＥＰＱＬＨＮＨ（配列番号１５５）；
（ｚ）  ＧＹＡＧＶＡＫＴ（配列番号１５７）、ＹＶＬＴＮＹＫＶＱＧ（配列番号１５８）およびＱＰＳＳＲＡＮＤＰＡＬＨＴＨ（配列番号１５９）；
（ａａ）  ＧＳＡＧＴＧＫＴ（配列番号１６１）、ＹＳＬＴＡＮＲＡＱＧ（配列番号１６２）およびＨＳＭＳＲＡＧＤＰＥＭＨＮＨ（配列番号１６３）；
（ｂｂ）  ＡＧＡＧＴＧＫＴ（配列番号１６５）、ＹＡＧＴＶＹＡＡＱＧ（配列番号１６６）およびＨＹＴＴＲＥＧＤＰＮＩＨＴＨ（配列番号１６７）；または
（ｃｃ）  ＡＰＡＧＡＧＫＴ（配列番号１６９）、ＹＡＶＴＶＨＡＡＱＧ（配列番号１７０）およびＨＥＴＳＲＡＧＤＰＨＬＨＴＨ（配列番号１７１）
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼが、表６もしくは７に示されるヘリカーゼのうちの１つ、またはその変異体である、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼが、（ａ）配列番号６１、６５、６９、７３、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８のうちのいずれか１つに示される配列、または（ｂ）配列の全体にわたりアミノ酸の同一性に基づいて当該配列と少なくとも１０％の相同性を有し、ヘリカーゼ活性を保持するその変異体を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも０．３Ｍの塩濃度を用いて実行され、塩が、場合によって、ＫＣｌである、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
塩濃度が、少なくとも１．０Ｍである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサーを形成する方法であって、細孔とＲｅｃＤヘリカーゼとの間で複合体を形成し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサーを形成するステップを含む方法。
【請求項２６】
複合体が、（ａ）細孔とヘリカーゼとを、標的ポリヌクレオチドの存在下で接触させ、（ａ）細孔を隔ててポテンシャルを印加することにより形成される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ポテンシャルが、電圧ポテンシャルまたは化学ポテンシャルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
複合体が、細孔をヘリカーゼへと共有結合的に連結することにより形成される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
細孔を介する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するためのＲｅｃＤヘリカーゼの使用。
【請求項３０】
標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットであって、（ａ）細孔と、（ｂ）ＲｅｃＤヘリカーゼとを含むキット。
【請求項３１】
両親媒性層を含むチップをさらに含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３２】
試料中の標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための解析装置であって、複数の細孔および複数のＲｅｃＤヘリカーゼを含む解析装置。
【請求項３３】
複数の細孔を支持することが可能であり、細孔およびヘリカーゼを用いてポリヌクレオチドの特徴付けを実施するのに作動可能なセンサーデバイスと、
特徴付けを実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバーと、
材料を、少なくとも１つのリザーバーからセンサーデバイスへと、制御可能な形で供給するように構成された流体力学系と、
それぞれの試料を受容するための複数の容器であって、流体力学系が、試料を、容器からセンサーデバイスへと、選択的に供給するように構成された容器と
を含む、請求項３２に記載の解析装置。
【請求項３４】
標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
（ａ）ＲｅｃＤヘリカーゼが、標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドをＲｅｃＤヘリカーゼと接触させるステップと、
（ｂ）ＲｅｃＤヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御するときに、１または複数の測定を行うステップであって、測定値が、標的ポリヌクレオチドの１または複数の特徴を示し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるステップと
を含む方法。
【請求項３５】
（ａ）１もしくは複数の特徴が、請求項２に記載の通りであるか、
（ｂ）標的ポリヌクレオチドが、請求項３もしくは９に記載の通りであるか、
（ｃ）１もしくは複数の特徴が、請求項４もしくは５に記載の通りに測定されるか、
（ｄ）ＲｅｃＤが、請求項１４から２２のいずれか一項に記載の通りであるか、または
（ｅ）方法が、請求項２３もしくは２４のいずれかに記載の通りに実行される、
請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ポリヌクレオチドを特徴付ける間に標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための、ＲｅｃＤヘリカーゼの使用。
【請求項３７】
ポリヌクレオチドの一部または全部を配列決定する間に標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための、ＲｅｃＤヘリカーゼの使用。
【請求項３８】
試料中の標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための解析装置であって、ＲｅｃＤヘリカーゼを含むことを特徴とする解析装置。
【請求項３９】
標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットであって、（ａ）標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための解析装置と、（ｂ）ＲｅｃＤヘリカーゼとを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける新たな方法に関する。本方法は、細孔およびＲｅｃＤヘリカーゼを用いる。ヘリカーゼは、細孔を介する標的ポリヌクレオチドの移動を制御する。
【背景技術】
【０００２】
今日、広範な適用にわたり、迅速で廉価なポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の配列決定法および同定法が必要とされている。既存の技法は、それらが大量のポリヌクレオチドを作製するための増幅法に主に依拠し、かつ、シグナルを検出するための大量の専門的蛍光化学物質を必要とするために、遅速かつ高価である。
【０００３】
膜貫通細孔（ナノ細孔）は、ポリマーおよび多様な低分子のための、直接的な電気的バイオセンサーとしての大きな潜在的可能性を有する。特に、近年では、潜在的なＤＮＡ配列決定法としてのナノ細孔に焦点が当てられている。
【０００４】
ナノ細孔を隔ててポテンシャルを印加すると、ヌクレオチドなどの解析物が、一定の時間にわたりバレル内で一過性に滞留するとき、電流の流れに変化が見られる。ナノ細孔によるヌクレオチドの検出は、署名および持続が公知の電流変化を示す。「鎖配列決定」法では、単一のポリヌクレオチド鎖に細孔を通過させ、ヌクレオチドの同一性を導く。鎖配列決定は、細孔を介するポリヌクレオチドの移動を制御するために、ヌクレオチドハンドリングタンパク質の使用を伴いうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、ＲｅｃＤヘリカーゼが、とりわけ、電圧などのポテンシャルを印加するときに、細孔を介するポリヌクレオチドの移動を制御しうることを裏付けた。ヘリカーゼは、標的ポリヌクレオチドを、印加された電圧から生じる電界と逆向きに、またはこれと同じ向きに、制御された段階的な形で移動させることが可能である。驚くべきことに、ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドを特徴付けるのに有利な高い塩濃度、特に、鎖配列決定を用いてその配列を決定するのに有利な高い塩濃度でも機能することが可能である。これについては、以下でより詳細に論じる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明は、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドが細孔を介して移動し、ＲｅｃＤヘリカーゼが細孔を介する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドを、膜貫通細孔およびＲｅｃＤヘリカーゼと接触させるステップと、
（ｂ）ポリヌクレオチドが細孔に対して移動するときに、１または複数の測定を行うステップであって、測定値が、標的ポリヌクレオチドの１または複数の特徴を示し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるステップと
を含む方法を提供する。
【０００７】
本発明はまた、
・標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサーを形成する方法であって、細孔とＲｅｃＤヘリカーゼとの間で複合体を形成し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサーを形成するステップを含む方法；
・細孔を介する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するためのＲｅｃＤヘリカーゼの使用；
・標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットであって、（ａ）細孔と、（ｂ）ＲｅｃＤヘリカーゼとを含むキット；ならびに
・試料中の標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための解析装置であって、複数の細孔および複数のＲｅｃＤヘリカーゼを含む解析装置；
・標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
（ａ）ＲｅｃＤヘリカーゼが標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドをＲｅｃＤヘリカーゼと接触させるステップと、
（ｂ）ＲｅｃＤヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御するときに、１または複数の測定を行うステップであって、測定値が、標的ポリヌクレオチドの１または複数の特徴を示し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるステップと
を含む方法：
・ポリヌクレオチドを特徴付ける間に標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための、ＲｅｃＤヘリカーゼの使用；
・ポリヌクレオチドの一部または全部を配列決定する間に標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための、ＲｅｃＤヘリカーゼの使用；
・試料中の標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための解析装置であって、ＲｅｃＤヘリカーゼを含むことを特徴とする解析装置；ならびに
・標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットであって、（ａ）標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための解析装置と、（ｂ）ＲｅｃＤヘリカーゼとを含むキット
も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】Ａ）ナノ細孔を介するＤＮＡの移動を制御するためのヘリカーゼの使用についての例示的な概略図である。コレステロールタグを含有するプライマーとアニーリングされたｓｓＤＮＡ基質を、二重層のシス側へと添加する。コレステロールタグが二重層に結合すると、二重層の表面において基質が濃縮される。シスコンパートメントへと添加されたヘリカーゼが、ＤＮＡに結合する。二価の金属イオンおよびＮＴＰ基質の存在下で、ヘリカーゼが、ＤＮＡに沿って移動する。印加された電圧下で、ＤＮＡ基質がナノ細孔により捕捉される。印加されるポテンシャルの力の下で、ＤＮＡに結合したヘリカーゼが、細孔の上部に接触して、制御されないＤＮＡのさらなる移行を阻止するまで、ＤＮＡは細孔内に引き込まれる。この後、ヘリカーゼは、制御された形でナノ細孔を介してＤＮＡを移動させるように進む。  この概略図は、ＤＮＡをナノ細孔へと導入する２つの可能な方法を示す。１つの方式（上欄）では、ヘリカーゼが、ナノ細孔内に捕捉されたＤＮＡを、印加された電界の向きに移動させ、他の方式（下欄）では、ヘリカーゼが、捕捉されたＤＮＡを、ナノ細孔から、印加された電界の向きと逆向きに引き出す。印加された電界と同じ向きに移動するとき、ＤＮＡは、膜のトランス側へと移動する。上欄および下欄のいずれにおいても、トランス側の矢印は、ＤＮＡの動きの向きを指し示し、シス側の矢印は、ＤＮＡに照らしたヘリカーゼの動きの向きを指し示す。電界と逆向きに移動するとき、ＤＮＡは膜のシス側へと差し戻され、ヘリカーゼが解離しない限りにおいて、ＤＮＡは、シス側へと完全に移行しうる。適切なリーダーの使用など、基質のデザインにより、方法の一方または両方を同時に用いることができる。ヘリカーゼのＲｅｃＤファミリーは、ＤＮＡに沿って５’〜３’向きに移動する。したがって、電界と同じ向きにＤＮＡを移動させるには、５’側を下向きにしたＤＮＡの捕捉が要求され、電界と逆向きにＤＮＡを移動させるには、３’側を下向きにしたＤＮＡの捕捉が要求される。Ｂ）例で用いられるＤＮＡ基質のデザインを示す図である。
【図２】ヘリカーゼは、制御された形でナノ細孔を介してＤＮＡを移動させ、ＤＮＡがナノ細孔（ＭｓｐＡ−（Ｂ２）８）内を移動するときに、電流の段階的な変化をもたらしうることを示す図である。例示的なヘリカーゼ−ＤＮＡイベント（１４０ｍＶ、４００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、０．６０ｎＭの４００マーＤＮＡ（配列番号１７２、１７３、および１７４）、１００ｎＭのＴｒａ１  Ｅｃｏ（配列番号６１）、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＭｇＣｌ２）である。上図）電流を時間と対比させた、Ｔｒａ１  ４００マーＤＮＡイベントの収集の区間を示す図である。細孔開口時の電流は、約１００ｐＡである。印加されるポテンシャル（＋１４０ｍＶ）の力の下で、ＤＮＡが、ナノ細孔により捕捉される。酵素が連結されたＤＮＡは、酵素が細孔を介してＤＮＡを移動させるときの電流の段階的な変化を示す、長い遮断（この条件では、約２５ｐＡにおける）を結果としてもたらす。中図）酵素によるＤＮＡの捕捉と、ＤＮＡが細孔内に引き込まれるときの段階的な電流変化とを示す、ヘリカーゼにより制御されたＤＮＡイベントのうちの１つについての拡大図である。下図）ＤＮＡがナノ細孔を介して移動するときの電流の段階的な変化についてのさらなる拡大図である。
【図３】ＭｓｐＡ−Ｂ２（８）ナノ細孔を介する、ＴｒａＩ  Ｅｃｏ（配列番号６１）ヘリカーゼにより制御された４００マーＤＮＡ（配列番号１７２、１７３、および１７４の４００マーＤＮＡ）の移動イベントについてのさらなる例を示す図である。下図）鎖がナノ細孔を介して移動するときの、ＤＮＡの異なる区間に由来する電流の段階的な変化を示すイベントの区間の拡大図である。
【図４Ａ】酵素活性を調べるための蛍光アッセイを示す図である。Ａ）カスタムの蛍光基質を用いて、ハイブリダイズしたｄｓＤＮＡを置換するヘリカーゼの能力についてアッセイしたことを示す図である。１）蛍光基質鎖（５０ｎＭの最終濃度）が、５’側のｓｓＤＮＡ突出と、ハイブリダイズしたｄｓＤＮＡの４０塩基の区間とを有することを示す図である。アッパー主鎖は、３’端においてカルボキシフルオレセイン基剤を有し、ハイブリダイズした相補体は、５’端にｂｌａｃｋ−ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ−１）基剤を有する。ハイブリダイズすると、フルオレセインからの蛍光が、局所のＢＨＱ−１により消光され、基質は、本質的に非蛍光基質となる。蛍光基質の短鎖と相補的な１μＭの捕捉鎖が、アッセイに含まれる。２）ＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）の存在下で、基質へと添加されたヘリカーゼ（１００ｎＭ）が、蛍光基質の５’側テールに結合し、主鎖に沿って移動し、示される通りに相補鎖を置換することを示す図である。３）ＢＨＱ−１との相補鎖が完全に置換されると、主鎖上のフルオレセインが蛍光発光することを示す図である。４）過剰な捕捉鎖が、相補的なＤＮＡと優先的にアニーリングして、初期基質の再アニーリングおよび蛍光の喪失を防止することを示す図である。
【図４Ｂ】酵素活性を調べるための蛍光アッセイを示す図である。Ｂ）１００ｍＭ〜１Ｍの異なる濃度のＫＣｌを含有する緩衝液（配列番号２８および３５のＲｅｃＤ  ＮｔｈおよびＲｅｃＤ  Ｄｔｈ；ｐＨ８．０の１００ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｎＭの蛍光基質ＤＮＡ、１μＭの捕捉ＤＮＡ）中のＲｅｃＤヘリカーゼ活性の初期比率についてのグラフである。
【図５】異なるＴｒａ１  ヘリカーゼ、ＴｒｗＣ  Ｃｂａ（＋１４０ｍＶ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、０．６ｎＭの４００マーＤＮＡ（配列番号１７２、１７２、および１７３）、１００ｎＭのＴｒｗＣ  Ｃｂａ（配列番号６５）、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＭｇＣｌ２）を用いる、ヘリカーゼにより制御されたＤＮＡイベントの例を示す図である。上図）電流を時間と対比させた、ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  ４００マーＤＮＡイベントの収集の区間を示す図である。細孔開口時の電流は、約１００ｐＡである。印加されるポテンシャル（＋１４０ｍＶ）の力の下で、ＤＮＡが、ナノ細孔により捕捉される。酵素が連結されたＤＮＡは、酵素が細孔を介してＤＮＡを移動させるときの電流の段階的な変化を示す、長い遮断（この条件では、約２５ｐＡにおける）を結果としてもたらす。下図）下方の出力波形は、ＤＮＡイベント区間の拡大を示す図であり、ＤＮＡが細孔内に引き込まれるときの、配列依存性の段階的な電流変化を示す。
【図６】ＴｒｗＣ（Ａｔｒ）（配列番号１４４）ヘリカーゼを用いる、ヘリカーゼにより制御されたＤＮＡの移動を示す電流出力波形の例を示す図である。
【図７】ＴｒｗＣ（Ｓａｌ）（配列番号１４０）ヘリカーゼを用いる、ヘリカーゼにより制御されたＤＮＡの移動を示す電流出力波形の例を示す図である。
【図８】ＴｒｗＣ（Ｃｃｒ）（配列番号１３６）ヘリカーゼを用いる、ヘリカーゼにより制御されたＤＮＡの移動を示す電流出力波形の例を示す図である。
【図９】ＴｒｗＣ（Ｅｃｏ）（配列番号７４）ヘリカーゼを用いる、ヘリカーゼにより制御されたＤＮＡの移動を示す電流出力波形の例を示す図である。
【図１０】ＴｒｗＣ（Ｏｍａ）（配列番号１０６）ヘリカーゼを用いる、ヘリカーゼにより制御されたＤＮＡの移動を示す電流出力波形の例を示す図である。
【図１１】ＴｒｗＣ（Ａｆｅ）（配列番号８６）ヘリカーゼを用いる、ヘリカーゼにより制御されたＤＮＡの移動を示す電流出力波形の例を示す図である。下方の出力波形は、ヘリカーゼにより制御されたＤＮＡ移動の拡大部を示す図である。
【図１２】ＴｒｗＣ（Ｍｐｈ）（配列番号９４）ヘリカーゼを用いる、ヘリカーゼにより制御されたＤＮＡの移動を示す電流出力波形の例を示す図である。下方の出力波形は、ヘリカーゼにより制御されたＤＮＡ移動の拡大部を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
開示される作製物および方法の異なる適用は、当技術分野における特定の必要に合せて調整しうることを理解されたい。また、本明細書で用いられる用語は、本発明の特定の実施形態だけについて記載することを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。
【００１０】
加えて、本明細書および付属の特許請求の範囲で用いられる単数形の「ある（a）」、「ある（an）」、および「その」は、文脈により別段であることが明らかに指示されない限りにおいて、複数の指示対象も含む。したがって、例えば、「細孔」に対する言及は、２つ以上のこのような細孔を含み、「ヘリカーゼ」に対する言及は、２つ以上のこのようなヘリカーゼを含み、「ポリヌクレオチド」に対する言及は、２つ以上のこのようなポリヌクレオチドを含むなどである。
【００１１】
前出であれ、後出であれ、本明細書で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【００１２】
本発明の方法
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法を提供する。本方法は、標的ポリヌクレオチドが細孔を介して移動し、ＲｅｃＤヘリカーゼが、細孔を介する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドを、膜貫通細孔およびＲｅｃＤヘリカーゼと接触させるステップを含む。次いで、ポリヌクレオチドが、細孔に対して移動するときに、当技術分野で公知の標準的な方法を用いて、標的ポリヌクレオチドの１または複数の特徴を測定する。標的ポリヌクレオチドの１または複数の特徴は、ポリヌクレオチドが、細孔を介して移動するときに測定することが好ましい。ステップ（ａ）および（ｂ）は、細孔を隔ててポテンシャルを印加することにより実行することが好ましい。以下でより詳細に論じられる通り、印加されるポテンシャルは、細孔とヘリカーゼとの間における複合体の形成を結果としてもたらすことが典型的である。印加されるポテンシャルは、電圧ポテンシャルでありうる。代替的に、印加されるポテンシャルは、化学ポテンシャルでもありうる。この例は、両親媒性層を隔てて塩勾配を用いることである。塩勾配は、Holdenら、J Am Chem Soc.、2007年7月、11;129(27):8650〜5において開示されている。
【００１３】
場合によっては、ポリヌクレオチドが細孔に対して移動するときに細孔を通過する電流を用いて、標的ポリヌクレオチドの配列を決定する。これは、鎖配列決定である。
【００１４】
本方法は、複数の利点を有する。第１に、本発明者らは、ＲｅｃＤヘリカーゼの耐塩性が驚くほどに高いので、本発明の方法は、驚くほど高い塩濃度で実行しうることを示した。鎖配列決定の文脈では、電圧オフセットを加えて、標的ポリヌクレオチドを捕捉し、移行させ、結果として得られる、ポリヌクレオチドが細孔に対して移動するときの配列依存性の電流変化を測定するための導電性溶液を創出するのに、塩などの電荷担体が必要である。測定シグナルは、塩の濃度に依存性であるので、高い塩濃度を用いて、収集されるシグナルの大きさを増大させることが有利である。高い塩濃度は、高いシグナル対ノイズ比をもたらし、ヌクレオチドの存在を示す電流を、通常の電流変動のバックグラウンドに抗して同定することを可能とする。鎖配列決定のためには、１００ｍＭ過剰の塩濃度、例えば、４００ｍＭ、６００ｍＭ、または８００ｍＭ過剰の塩濃度が理想的である。本発明者らは、驚くべきことに、ＲｅｃＤヘリカーゼが、例えば、１Ｍなど、極めて高い塩濃度で有効に機能することを示した。本発明は、１Ｍ、例えば、２Ｍ過剰の塩濃度で有効に機能するヘリカーゼを包摂する。
【００１５】
第２に、電圧を加えると、ＲｅｃＤヘリカーゼは、驚くべきことに、標的ポリヌクレオチドを、２つの向きに、すなわち、印加された電圧から生じる電界と同じ向きに移動させる場合もあり、これと逆向きに移動させる場合もある。よって、本発明の方法は、２つの好ましい方式のうちの１つにより実行することができる。標的ポリヌクレオチドが細孔に対して移動する向き、すなわち、電界の向きであるか、またはこれと逆向きであるかに応じて、異なるシグナルが得られる。これについては、以下でより詳細に論じる。
【００１６】
第３に、ＲｅｃＤヘリカーゼは、細孔を介して標的ポリヌクレオチドを移動させるとき、一度に１つのヌクレオチドを移動させることが典型的である。したがって、ＲｅｃＤヘリカーゼは、シングルベースのラチェットのように機能しうる。これは、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの全てではないにせよ、実質的に全てを、細孔を用いて同定しうるために、当然ながら、標的ポリヌクレオチドを配列決定する場合に有利である。
【００１７】
第４に、ＲｅｃＤヘリカーゼは、一本鎖ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドの移動を制御することが可能である。これは、本発明に従い、多様な異なる標的ポリヌクレオチドを特徴付けうることを意味する。
【００１８】
第５に、ＲｅｃＤヘリカーゼは、印加された電圧から生じる電界に対して極めて抵抗性が高いと考えられる。本発明者らは、「アンジップ」（unzipping）条件下におけるポリヌクレオチドの移動が極めてわずかであることを見ている。アンジップ条件は、ヌクレオチドの非存在下、例えば、ＡＴＰの非存在下で存在することが典型的である。アンジップモードで作動するとき、ヘリカーゼは、標的配列が、印加された電圧の影響下で、細孔を介してあまりに急速に移動することを阻止するブレーキのように作用する。これは、印加された電圧から生じる電界と逆向きにポリヌクレオチドを移動させる場合の望ましくない「逆行」移動に由来する複雑さが見られないことを意味するために、重要である。
【００１９】
第６に、ＲｅｃＤヘリカーゼは、作製が容易であり、ハンドリングが容易である。したがって、それらの使用は、簡単で廉価な配列決定法に寄与した。
【００２０】
本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための方法である。核酸などのポリヌクレオチドは、２つ以上のヌクレオチドを含む高分子である。ポリヌクレオチドまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組合せを含みうる。ヌクレオチドは、自然発生の場合もあり、人工の場合もある。標的ポリヌクレオチド中の１または複数のヌクレオチドは、酸化することもでき、メチル化することもできる。標的ポリヌクレオチド中の１または複数のヌクレオチドは、損傷される場合もある。標的ポリヌクレオチド中の１または複数のヌクレオチドは、例えば、標識またはタグで修飾される場合もある。標的ポリヌクレオチドは、１または複数のスペーサーを含みうる。
【００２１】
ヌクレオチドは、核酸塩基、糖、および少なくとも１つのリン酸基を含有することが典型的である。核酸塩基は、複素環であることが典型的である。核酸塩基には、プリンおよびピリミジンが含まれるがこれらに限定されず、より特定すると、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、およびシトシンが含まれるがこれらに限定されない。糖は、五炭糖であることが典型的である。ヌクレオチドの糖には、リボースおよびデオキシリボースが含まれるがこれらに限定されない。ヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドであることが典型的である。ヌクレオチドは、一リン酸、二リン酸、または三リン酸を含有することが典型的である。リン酸は、ヌクレオチドの５’側に連結される場合もあり、ヌクレオチドの３’側 に連結される場合もある。
【００２２】
ヌクレオチドには、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、およびデオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）が含まれるがこれらに限定されない。ヌクレオチドは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、またはｄＣＭＰから選択されることが好ましい。
【００２３】
ヌクレオチドは、非塩基性でありうる（すなわち、核酸塩基を欠く場合がある）。
【００２４】
ポリヌクレオチドは、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある。ポリヌクレオチドの少なくとも一部は、二本鎖であることが好ましい。
【００２５】
ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸でありうる。標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの１つの鎖とハイブリダイズしたＲＮＡの１つの鎖を含みうる。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、またはヌクレオチド側鎖を伴う他の合成ポリマーなど、当技術分野で公知の任意の合成核酸でありうる。
【００２６】
本方法を用いて、標的ポリヌクレオチドの全体を特徴付けることもでき、標的ポリヌクレオチドの一部だけを特徴付けることもできる。標的ポリヌクレオチドは、任意の長さでありうる。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、または少なくとも５００ヌクレオチド対の長さでありうる。ポリヌクレオチドは、１０００ヌクレオチド対以上、５０００ヌクレオチド対以上の長さの場合もあり、１０００００ヌクレオチド対以上の長さの場合もある。
【００２７】
標的ポリヌクレオチドは、任意の適切な試料中に存在する。本発明は、標的ポリヌクレオチドを含有することが公知であるかまたはこれを含有することが疑われる試料に対して実行することが典型的である。代替的に、本発明を試料に対して実行して、試料中のそれらの存在が公知であるかまたは予測される１または複数の標的ポリヌクレオチドの同一性を確認することもできる。
【００２８】
試料は、生物学的試料でありうる。本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、任意の生物または微生物から得られるかまたは抽出される試料に対して実行することができる。生物または微生物は、古細菌、原核生物、または真核生物であることが典型的であり、５つの生物界：植物界、動物界、真菌界、モネラ界、および原生生物界のうちの１つに属することが典型的である。本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、任意のウイルスから得られるか、または任意のウイルスから抽出される試料に対して実行することができる。試料は、流体試料であることが好ましい。試料は、患者の体液を含むことが典型的である。試料は、尿、リンパ、唾液、粘液、または羊水でありうるが、血液、血漿、または血清であることが好ましい。試料はヒト由来であることが典型的であるが、代替的に、ウマ、ウシ、ヒツジ、またはブタなどの市販用に飼育された動物など、別の哺乳動物に由来する場合もあり、代替的に、ネコまたはイヌなどのペットの場合もある。代替的に、植物由来の試料は、穀類、マメ科植物、果実、または、野菜など、市販用の作物、例えば、コムギ、オオムギ、オートムギ、キャノーラ、トウモロコシ、ダイズ、コメ、バナナ、リンゴ、トマト、バレイショ、ブドウ、タバコ、マメ、ヒラマメ、サトウキビ、ココア、綿花から得られることが典型的である。
【００２９】
試料は、非生物学的試料でありうる。非生物学的試料は、流体試料であることが好ましい。非生物学的試料の例には、手術時洗浄液、飲用水、海水、または河川水などの水、および実験室検査用の試薬が含まれる。
【００３０】
試料は、アッセイする前に、例えば、遠心分離により、または望ましくない分子もしくは赤血球などの望ましくない細胞を濾過して取り除く膜を通過させることにより処理することが典型的である。試料は、採取して速やかに測定することができる。試料はまた、アッセイ前に、好ましくは−７０℃未満で保存することも典型的である。
【００３１】
膜貫通細孔とは、膜をある程度まで貫通する構造である。膜貫通細孔は、水和イオンなどのイオンが、印加されるポテンシャルにより駆動されて、膜を隔てて流動するかまたは膜内を流動することを許容する。膜貫通細孔は、イオンが、膜の一方の側から膜の他の側へと流動しうるように、膜全体を貫通することが典型的である。しかし、膜貫通細孔は、膜を貫通しなくともよい。膜貫通細孔は、一方の末端で閉止させることもできる。例えば、細孔は、それに沿ってイオンが流動するか、またはその中をイオンが流動する、膜内のウェルでありうる。
【００３２】
本発明に従い、任意の膜を用いることができる。当技術分野では、適切な膜が周知である。膜は、両親媒性層であることが好ましい。両親媒性層とは、リン脂質など、少なくとも１つの親水性部分および少なくとも１つの親油性部分または疎水性部分の両方を有する両親媒性の分子から形成される層である。両親媒性層は、単層の場合もあり、二重層の場合もある。両親媒性層は、平面状の脂質二重層または支持物を伴う二重層であることが典型的である。
【００３３】
両親媒性層は、脂質二重層であることが典型的である。脂質二重層は、細胞膜のモデルであり、ある範囲にわたる実験的研究のための優れたプラットフォームとして用いられる。例えば、脂質二重層は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、単一チャネル記録による膜タンパク質の探索のために用いることができる。代替的に、脂質二重層は、ある範囲にわたる物質の存在を検出するためのバイオセンサーとしても用いることができる。脂質二重層は、任意の脂質二重層でありうる。適切な脂質二重層には、平面状の脂質二重層、支持物を伴う二重層、またはリポソームが含まれるがこれらに限定されない。脂質二重層は、平面状の脂質二重層であることが好ましい。適切な脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３号（ＷＯ２００８／１０２１２１として公開されている）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開されている）、および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開されている）において開示されている。
【００３４】
当技術分野では、脂質二重層を形成するための方法が公知である。適切な方法については、実施例において開示する。脂質二重層は一般に、その界面に対して垂直な開口部のいずれの側の水溶液／空気間界面上にも脂質単層が運ばれるＭｏｎｔａｌおよびＭｕｅｌｌｅｒ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、1972; 69: 3561〜3566）の方法により形成される。
【００３５】
ＭｏｎｔａｌおよびＭｕｅｌｌｅｒの方法は、費用効果が高く、比較的簡単な方法であって、タンパク質への細孔の挿入に適する、良質の脂質二重層を形成する方法であるためによく知られている。二重層形成の他の一般的な方法には、チップディッピング、二重層の塗布、およびリポソーム二重層のパッチクランピングが含まれる。
【００３６】
好ましい実施形態では、脂質二重層を、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開されている）において記載される通りに形成する。
【００３７】
別の好ましい実施形態では、膜が、固体状態層である。固体状態層は、生物由来ではない。言い換えれば、固体状態層は、生物または細胞など、生物学的環境に由来するのでもなく、生物学的環境から単離されるのでもなく、生物学的に入手可能な構造の合成製造形でもない。固体状態層は、マイクロエレクトロニクス材料、Ｓｉ３Ｎ４、Ａｌ２Ｏ３、およびＳｉＯなどの絶縁材料、ポリアミドなどの有機ポリマーおよび無機ポリマー、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）などのプラスチック、または２成分添加養生型シリコーンゴムなどのエラストマー、およびガラスが含まれるがこれらに限定されない、有機材料および無機材料の両方から形成することができる。固体状態層は、グラフェンなどの単原子層から形成することもでき、原子数個だけの厚さの層から形成することもできる。適切なグラフェン層は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７号（ＷＯ２００９／０３５６４７として公開されている）において開示されている。
【００３８】
本方法は、（ｉ）細孔を含む人工の両親媒性層、（ｉｉ）単離された自然発生の、細孔を含む脂質二重層、または（ｉｉｉ）その中に細孔を挿入された細胞を用いて実行することが典型的である。本方法は、人工の脂質二重層など、人工の両親媒性層を用いて実行することが典型的である。層は、細孔に加えて、他の膜貫通タンパク質および／または膜内タンパク質のほか、他の分子も含みうる。適切な装置および条件については、以下で論じる。本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて実行することが典型的である。
【００３９】
ポリヌクレオチドは、膜へとカップリングすることができる。これは、任意の公知の方法を用いて行うことができる。膜が、脂質二重層などの両親媒性層（上記で詳細に論じた）である場合は、ポリヌクレオチドを、膜内に存在するポリペプチドまたは膜内に存在する疎水性アンカーを介して、膜へとカップリングすることが好ましい。疎水性アンカーは、脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブ、またはアミノ酸であることが好ましい。
【００４０】
ポリヌクレオチドは、膜へと直接カップリングすることができる。ポリヌクレオチドは、リンカーを介して膜へとカップリングすることが好ましい。好ましいリンカーには、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびポリペプチドなどのポリマーが含まれるがこれらに限定されない。ポリヌクレオチドを膜へと直接カップリングする場合は、膜とヘリカーゼとの間の距離のために、特徴付けの試行をポリヌクレオチドの末端まで続行することができないので、一部のデータが失われるであろう。リンカーを用いる場合は、ポリヌクレオチドを完全に処理することができる。リンカーを用いる場合、リンカーは、任意の位置において、ポリヌクレオチドへと連結することができる。リンカーは、テールポリマーにおいて、ポリヌクレオチドへと連結することが好ましい。
【００４１】
カップリングは、安定的な場合もあり、一過性の場合もある。特定の適用では、カップリングが一過性の性格であることが好ましい。安定的カップリング分子を、ポリヌクレオチドの５’端または３’端へと直接連結した場合は、特徴付けの試行を、二重層とヘリカーゼの活性部位との間の距離のために、ポリヌクレオチドの末端まで継続することができないので、一部のデータが失われるであろう。カップリングが一過性である場合に、カップリングされる末端が、二重層からランダムに遊離すれば、ポリヌクレオチドを完全に処理することができる。膜との安定的連結または一過性連結を形成する化学基については、以下でより詳細に論じる。コレステロール鎖または脂肪酸アシル鎖を用いて、ポリヌクレオチドを、脂質二重層などの両親媒性層へと一過性にカップリングすることができる。ヘキサデカン酸など、６〜３０炭素原子の長さの任意の脂肪酸アシル鎖を用いることができる。
【００４２】
好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドを、両親媒性層へとカップリングする。ポリヌクレオチドの、合成脂質二重層へのカップリングは、多様な異なるテザリング戦略により既に実行されている。これらを、以下の表１にまとめる。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
ポリヌクレオチドは、チオール基、コレステロール基、脂質基、およびビオチン基などの反応性基を付加するのに容易に適合可能な、合成反応における修飾ホスホルアミダイトを用いて官能化することができる。これらの異なる連結化学反応は、ポリヌクレオチドのための一連の連結選択肢をもたらす。各異なる修飾基は、ポリヌクレオチドをわずかに異なる形でテザリングし、カップリングは常に恒久的ではないので、ポリヌクレオチドの二重層への滞留時間に差違がもたらされる。一過性カップリングの利点については、上記で論じられている。
【００４５】
ポリヌクレオチドのカップリングはまた、反応性基をポリヌクレオチドへと付加しうるという条件で、他の多数の手段によっても達成することができる。ＤＮＡのいずれかの末端への反応性基の付加については、既に報告されている。チオール基は、ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰγＳを用いて、ｓｓＤＮＡの５’側へと付加することができる（Grant, G. P.およびP. Z. Qin（2007）「A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids」、Nucleic Acids Res、35(10): e77）。ビオチン、チオール、およびフルオロフォアなど、化学基のより多様な選択は、修飾オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡの３’側へと組み込む末端のトランスフェラーゼを用いて付加することができる（Kumar, A., P. Tchenら（1988）「Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyl transferase」、Anal Biochem、169(2): 376〜82）。
【００４６】
代替的に、反応性基は、連結が、ハイブリダイゼーションを介して達成されうるように、既に二重層へとカップリングされたＤＮＡと相補的なＤＮＡの短い小部分の付加であると考えることができるであろう。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩを用いるｓｓＤＮＡの短い小部分のライゲーションが、報告されている（Troutt, A. B.、M. G. McHeyzer-Williamsら（1992）、「Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity」、Proc Natl Acad Sci U S A、89(20): 9823〜5）。代替的に、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡを、天然のｄｓＤＮＡへとライゲーションし、次いで、熱変性または化学的変性により、２つの鎖を分離することもできるであろう。天然のｄｓＤＮＡへは、ｓｓＤＮＡの小部分を二重鎖の末端の一方または両方へと付加することも可能であり、ｄｓＤＮＡを二重鎖の末端の一方または両方へと付加することも可能である。次いで、二重鎖を溶融させると、ｓｓＤＮＡを５’端、３’端、または両側におけるライゲーションまたは修飾に用いた場合も、ｄｓＤＮＡをライゲーションに用いた場合も、各一本鎖に５’側修飾または３’側修飾が施されるであろう。ポリヌクレオチドが合成鎖である場合は、カップリング化学反応を、ポリヌクレオチドの化学合成時に組み込むことができる。例えば、反応性基を連結したポリヌクレオチドは、プライマーを用いて合成することができる。
【００４７】
ゲノムＤＮＡの区間を増幅するための一般的な技法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いている。ＰＣＲでは、２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、同じＤＮＡ区間の多数のコピーを生成させることができるが、この場合、各コピーについて、二重鎖内の各鎖の５’側が、合成ポリヌクレオチドとなろう。コレステロール、チオール、ビオチン、または脂質などの反応性基を有するアンチセンスプライマーを用いることにより、増幅される標的ＤＮＡの各コピーは、カップリングのための反応性基を含有することになる。
【００４８】
膜貫通細孔は、膜貫通タンパク質細孔であることが好ましい。膜貫通タンパク質細孔とは、膜をある程度まで貫通するタンパク質構造である。膜貫通タンパク質細孔は、イオンが、印加されるポテンシャルにより駆動されて、膜を隔てて流動するかまたは膜内を流動することを許容する。膜貫通タンパク質細孔は、解析物などのイオンが、膜の一方の側から膜の他の側へと流動することを許容する、ポリペプチドまたはポリペプチドの集合体であることが典型的である。しかし、膜貫通タンパク質細孔は、膜を貫通しなくともよい。膜貫通タンパク質細孔は、一方の末端で閉止させることもできる。例えば、膜貫通細孔は、それに沿ってイオンが流動するか、またはその中をイオンが流動する、膜内のウェルを形成しうる。膜貫通タンパク質細孔は、ヌクレオチドなどの解析物が、膜を隔てて流動するかまたは膜内を流動することを許容することが好ましい。膜貫通タンパク質細孔は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドを、細孔を介して移動させる。
【００４９】
膜貫通タンパク質細孔は、単量体の場合もあり、オリゴマーの場合もある。細孔は、６つ、７つ、８つ、または９つのサブユニットなど、複数の反復サブユニットから構成されることが好ましい。細孔は、六量体、七量体、八量体、または九量体の細孔であることが好ましい。
【００５０】
膜貫通タンパク質細孔は、その中をイオンが流動しうる、バレルまたはチャネルを含むことが典型的である。細孔のサブユニットは、中心軸を取り囲み、膜貫通βバレルもしくは膜貫通βチャネルまたは膜貫通αへリックスバンドルもしくは膜貫通αチャネルに鎖を供与することが典型的である。
【００５１】
膜貫通タンパク質細孔のバレルまたはチャネルは、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸などの解析物との相互作用を促すアミノ酸を含むことが典型的である。これらのアミノ酸は、バレルまたはチャネルの狭窄部の近傍に配置することが好ましい。膜貫通タンパク質細孔は、アルギニン、リシン、もしくはヒスチジンなどの１もしくは複数の正に帯電したアミノ酸、またはチロシンもしくはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を含むことが典型的である。これらのアミノ酸は、細孔と、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸との間の相互作用を促すことが典型的である。
【００５２】
本発明に従い用いられる膜貫通タンパク質細孔は、βバレル細孔またはαへリックスバンドル細孔に由来しうる。βバレル細孔は、β鎖から形成されるバレルまたはチャネルを含む。適切なβバレル細孔には、α−ヘモリシン、炭疽菌毒素、およびロイコシジンなどのβ毒素、ならびにマイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）のポリン（Ｍｓｐ）、例えば、ＭｓｐＡ、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、およびナイセリア（Neisseria）属オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）など、細菌の外膜タンパク質／ポリンが含まれるがこれらに限定されない。αへリックスバンドル細孔は、αへリックスから形成されるバレルまたはチャネルを含む。適切なαへリックスバンドル細孔には、内膜タンパク質ならびにＷＺＡおよびＣｌｙＡ毒素などのα外膜タンパク質が含まれるがこれらに限定されない。膜貫通細孔は、Ｍｓｐに由来する場合もあり、α−ヘモリシン（α−ＨＬ）に由来する場合もある。
【００５３】
膜貫通タンパク質細孔は、Ｍｓｐ、好ましくはＭｓｐＡに由来することが好ましい。このような細孔は、オリゴマーであり、Ｍｓｐに由来する７つ、８つ、９つ、または１０の単量体を含むことが典型的である。細孔は、同一の単量体を含む、Ｍｓｐに由来するホモオリゴマー細孔でありうる。代替的に、細孔は、他の単量体と異なる少なくとも１つの単量体を含む、Ｍｓｐに由来するヘテロオリゴマーの細孔でもありうる。細孔は、ＭｓｐＡまたはその相同体もしくはパラログに由来することが好ましい。
【００５４】
Ｍｓｐに由来する単量体は、配列番号２またはその変異体に示される配列を含む。配列番号２は、Ｍｓｐ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８突然変異体である。配列番号２には、以下の突然変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４Ｒ、およびＥ１３９Ｋを含む。配列番号２の変異体とは、配列番号２のアミノ酸配列に照らして変異し、細孔を形成するその能力を保持するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。細孔を形成する変異体の能力は、当技術分野で公知の任意の方法を用いてアッセイすることができる。例えば、変異体を、他の適切なサブユニットと共に両親媒性層へと挿入し、オリゴマー化して細孔を形成するその能力を決定することができる。当技術分野では、サブユニットを両親媒性層などの膜内に挿入するための方法が公知である。例えば、サブユニットは、それが脂質二重層へと拡散し、脂質二重層へと結合し、機能的状態へとアセンブルされることにより挿入されるように、精製形態で、脂質二重層を含有する溶液中に懸濁させることができる。代替的に、サブユニットは、M.A. Holden、H. Bayley.、J. Am. Chem. Soc.、2005、127、6502〜6503、および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開されている）において記載されている「ピックアンドプレイス」法を用いて、膜内に直接挿入することもできる。
【００５５】
配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたり、変異体は、アミノ酸の同一性に基づいて、配列番号２の配列と少なくとも５０％相同であることが好ましい。変異体は、配列の全体にわたり、アミノ酸の同一性に基づいて、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％相同でありうることがより好ましく、少なくとも９５％、９７％、または９９％相同でありうることがより好ましい。１００以上、例えば、１２５、１５０、１７５、または２００以上の連続アミノ酸の連なりにわたり、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％のアミノ酸同一性を認めることができる（「堅い相同性」）。
【００５６】
当技術分野における標準的な方法を用いて、相同性を決定することができる。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するのに用いうる、例えば、そのデフォルトの設定で用いうるＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Devereuxら（1984）Nucleic Acids Research、12、387〜395ページ）を提供している。例えば、Altschul S. F.（1993）、J Mol Evol、36：290〜300; Altschul, S.Fら（1990）、J Mol Biol、215：403〜10において記載される通り、ＰＩＬＥＵＰアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、相同性を計算するのに用いることもでき、配列を整列する（同等な残基または対応する配列を同定する（それらのデフォルト設定であることが典型的である）など）のに用いることもできる。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通して一般に入手可能である。
【００５７】
配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８突然変異体である。この変異体は、ＭｓｐＡと比較した、ＭｓｐＢ単量体、ＭｓｐＣ単量体、またはＭｓｐＤ単量体における突然変異のうちのいずれかを含みうる。ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ、およびＭｓｐＤの成熟形態を、配列番号５〜７に示す。特に、この変異体は、ＭｓｐＢに存在する以下の置換：Ａ１３８Ｐを含みうる。この変異体は、ＭｓｐＣに存在する以下の置換：Ａ９６Ｇ、Ｎ１０２Ｅ、およびＡ１３８Ｐのうちの１または複数を含みうる。この変異体は、ＭｓｐＤに存在する以下の突然変異：Ｇ１の欠失、Ｌ２Ｖ、Ｅ５Ｑ、Ｌ８Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｗ２１Ａ、Ｄ２２Ｅ、Ｋ４７Ｔ、Ｉ４９Ｈ、Ｉ６８Ｖ、Ｄ９１Ｇ、Ａ９６Ｑ、Ｎ１０２Ｄ、Ｓ１０３Ｔ、Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１３６Ｋ、およびＧ１４１Ａのうちの１または複数を含みうる。変異体は、Ｍｓｐ  Ｂ、Ｍｓｐ  Ｃ、およびＭｓｐ  Ｄに由来する突然変異および置換のうちの１または複数の組合せを含みうる。この変異体は、突然変異Ｌ８８Ｎを含むことが好ましい。配列番号２の変異体は、ＭＳ−Ｂ１の全ての突然変異に加えて、突然変異Ｌ８８Ｎを有し、ＭＳ−Ｂ２と称する。本発明で用いられる細孔は、ＭＳ−（Ｂ２）８であることが好ましい。
【００５８】
配列番号２のアミノ酸配列に対しては、上記で論じたアミノ酸置換に加えて、アミノ酸置換、例えば、最大で１、２、３、４、５、１０、２０、または３０カ所の置換を施すことができる。保存的置換は、アミノ酸を、化学構造が類似するか、化学的特性が類似するか、または側鎖容量が類似する他のアミノ酸で置きかえる。導入されるアミノ酸は、それらにより置きかえられるアミノ酸と、極性、親水性、疎水性、塩基性度、酸性度、中性度、または電荷が類似しうる。代替的に、保存的置換では、既存の芳香族アミノ酸または脂肪族アミノ酸の代わりに、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入することもできる。当技術分野では、保存的アミノ酸変化が周知であり、以下の表２で規定される２０の主要アミノ酸の特性に従い選択することができる。アミノ酸の極性が類似する場合はまた、これも、アミノ酸側鎖についての、表３のヒドロパシースケールに照らして決定することができる。
【００５９】
【表２】
2015503917.tif 000003
【００６０】
【表３】
2015503917.tif 000004
【００６１】
加えて、配列番号２のアミノ酸配列のうちの１または複数のアミノ酸残基を、上記のポリペプチドから欠失させることもできる。最大で１、２、３、４、５、１０、２０、または３０以上の残基を欠失させることができる。
【００６２】
変異体は、配列番号２の断片を含みうる。このような断片は、細孔形成活性を保持する。断片は、少なくとも５０、１００、１５０、または２００アミノ酸の長さでありうる。このような断片を用いて、細孔を作製することができる。断片は、配列番号２の細孔形成ドメインを含むことが好ましい。断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８、および１３４のうちの１つを含まなければならない。断片には、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８、および１３４の全てを含むことが典型的である。
【００６３】
代替的に、または加えて、１または複数のアミノ酸を、上記のポリペプチドへと付加することもできる。伸長は、配列番号２のアミノ酸配列またはそのポリペプチド変異体もしくは断片のアミノ末端において施すこともでき、配列番号２のアミノ酸配列またはそのポリペプチド変異体もしくは断片のカルボキシ末端において施すこともできる。伸長は、ごく短いことが可能であり、例えば、１〜１０アミノ酸の長さでありうる。代替的に、伸長は、より長い場合もあり、例えば、最大で５０または１００アミノ酸でありうる。本発明に従うアミノ酸配列には、担体タンパク質を融合させることもできる。他の融合タンパク質については、以下でより詳細に論じる。
【００６４】
上記で論じた通り、変異体とは、配列番号２のアミノ酸配列に照らして変異し、細孔を形成するその能力を保持するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変異体は、細孔形成の一因となる配列番号２の領域を含有することが典型的である。βバレルを含有するＭｓｐの細孔形成能力は、各サブユニット内のβシートによりもたらされる。配列番号２の変異体は、βシートを形成する配列番号２内の領域を含むことが典型的である。結果として得られる変異体が、細孔を形成するその能力を保持する限りにおいて、１または複数カ所の修飾を、βシートを形成する配列番号２の領域へと施すことができる。配列番号２の変異体は、そのαへリックス領域内および／またはループ領域内に、置換、付加、または欠失など、１または複数カ所の修飾を含むことが好ましい。
【００６５】
Ｍｓｐに由来する単量体を修飾して、例えば、ヒスチジン残基（ｈｉｓｔタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、またはｆｌａｇタグを付加することにより、それらの同定または精製の一助とすることもでき、天然ではポリペプチドがこのような配列を含有しない細胞からのそれらの分泌を促進するシグナル配列を付加することにより、それらの同定または精製の一助とすることもできる。遺伝子タグの導入に対する代替法は、細孔表面の天然の位置または操作された位置において、タグを化学的に反応させることである。この例は、ゲルシフト試薬を、細孔の外側において、操作されたシステインへと反応させることであろう。これは、ヘモリシンのヘテロオリゴマーを分離するための方法として裏付けられている（Chem Biol.、1997年7月; 4(7):497〜505）。
【００６６】
Ｍｓｐに由来する単量体は、明示的標識で標識することができる。明示的標識は、細孔の検出を可能とする任意の適切な標識でありうる。適切な標識には、蛍光分子、放射性同位元素、例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチド、およびビオチンなどのリガンドが含まれるがこれらに限定されない。
【００６７】
Ｍｓｐに由来する単量体はまた、Ｄ−アミノ酸を用いても作製することができる。例えば、Ｍｓｐに由来する単量体は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含みうる。これは、このようなタンパク質またはペプチドをもたらすための、当技術分野における通常法である。
【００６８】
Ｍｓｐに由来する単量体は、ヌクレオチドの識別を促す１または複数の特定の修飾を含有する。Ｍｓｐに由来する単量体はまた、それらが細孔形成に干渉しない限りにおいて、他の非特異的修飾も含有しうる。当技術分野では、多数の非特異的側鎖修飾が公知であり、Ｍｓｐに由来する単量体の側鎖へと施すことができる。このような修飾には、例えば、アルデヒドを伴う反応によるアミノ酸の還元的アルキル化の後、ＮａＢＨ４を伴う還元、メチルアセトイミデートを伴うアミジン化、または無水酢酸を伴うアシル化が含まれる。
【００６９】
Ｍｓｐに由来する単量体は、当技術分野で公知の標準的な方法を用いて作製することができる。Ｍｓｐに由来する単量体は、合成により施すこともでき、組換え手段により施すこともできる。例えば、細孔は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける翻訳および転写（ＩＶＴＴ）により合成することができる。細孔をもたらすのに適する方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開されている）、同第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開されている）、または同第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開されている）において論じられている。細孔を膜内に挿入するための方法が論じられている。
【００７０】
膜貫通タンパク質細孔はまた、α−ヘモリシン（α−ＨＬ）に由来することも好ましい。野生型のα−ＨＬ細孔は、７つの同一の単量体またはサブユニットから形成される（すなわち、α−ＨＬ細孔は七量体である）。α−ヘモリシン−ＮＮの１つの単量体またはサブユニットの配列を、配列番号４に示す。膜貫通タンパク質細孔は、各々が配列番号４に示される配列またはその変異体を含む７つの単量体を含むことが好ましい。配列番号４のアミノ酸１、７〜２１、３１〜３４、４５〜５１、６３〜６６、７２、９２〜９７、１０４〜１１１、１２４〜１３６、１４９〜１５３、１６０〜１６４、１７３〜２０６、２１０〜２１３、２１７、２１８、２２３〜２２８、２３６〜２４２、２６２〜２６５、２７２〜２７４、２８７〜２９０、および２９４は、ループ領域を形成する。配列番号４の残基１１３および１４７は、α−ＨＬのバレルまたはチャネルの狭窄部の一部を形成する。
【００７１】
このような実施形態では、各々が配列番号４に示される配列またはその変異体を含む７つのタンパク質または単量体を含む細孔は、本発明の方法で用いられることが好ましい。７つのタンパク質は、同じ（ホモ七量体）場合もあり、異なる（ヘテロ七量体）場合もある。
【００７２】
配列番号４の変異体は、配列番号４のアミノ酸配列に照らして変異し、その細孔形成能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質である。細孔を形成する変異体の能力は、当技術分野で公知の任意の方法を用いてアッセイすることができる。例えば、変異体を、他の適切なサブユニットと共に、脂質二重層などの両親媒性層へと挿入し、オリゴマー化して細孔を形成するその能力を決定することができる。当技術分野では、サブユニットを脂質二重層などの両親媒性層に挿入するための方法が公知である。適切な方法については、上記で論じられている。
【００７３】
変異体は、ヘリカーゼへの共有結合的連結またはヘリカーゼとの相互作用を促す修飾を含みうる。変異体は、ヘリカーゼへの連結を促す１または複数の反応性システイン残基を含むことが好ましい。例えば、変異体は、配列番号４の８、９、１７、１８、１９、４４、４５、５０、５１、２３７、２３９、および２８７位のうちの１または複数、ならびに／または配列番号４のアミノ末端もしくはカルボキシ末端において、システインを含みうる。好ましい変異体は、配列番号４の８、９、１７、２３７、２３９、および２８７位において、システインによる残基の置換を含む（Ａ８Ｃ、Ｔ９Ｃ、Ｎ１７Ｃ、Ｋ２３７Ｃ、Ｓ２３９Ｃ、またはＥ２８７Ｃ）。変異体は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開されている）、同第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開されている）、または同第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開されている）において記載されている変異体のうちのいずれか１つであることが好ましい。
【００７４】
変異体はまた、ヌクレオチドとの任意の相互作用を促す修飾も含みうる。
【００７５】
変異体は、生物、例えば、ブドウ球菌（Staphylococcus）属の細菌が天然で発現させる、自然発生の変異体でありうる。代替的に、変異体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発現させることもでき、組換えにより大腸菌（Escherichia coli）などの細菌に発現させることもできる。変異体にまた、組換え法により作製される非自然発生の変異体も含みうる。配列番号４のアミノ酸配列の全長にわたり、変異体は、アミノ酸の同一性に基づいて、配列番号４の配列と少なくとも５０％相同であることが好ましい。変異体は、配列の全体にわたり、アミノ酸の同一性に基づいて、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％相同でありうることがより好ましく、少なくとも９５％、９７％、または９９％相同でありうることがより好ましい。２００以上、例えば、２３０、２５０、２７０、または２８０以上の連続アミノ酸の連なりにわたり、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％のアミノ酸同一性を認めることができる（「堅い相同性」）。相同性は、上記で論じた通りに決定することができる。
【００７６】
配列番号４のアミノ酸配列に対しては、上記で論じたアミノ酸置換に加えて、アミノ酸置換、例えば、最大で１、２、３、４、５、１０、２０、または３０カ所の置換を施すことができる。保存的置換は、上記で論じた通りに施すことができる。
【００７７】
加えて、配列番号４のアミノ酸配列のうちの１または複数のアミノ酸残基を、上記のポリペプチドから欠失させることもできる。最大で１、２、３、４、５、１０、２０、または３０以上の残基を欠失させることができる。
【００７８】
変異体は、配列番号４の断片でありうる。このような断片は、細孔形成活性を保持する。断片は、少なくとも５０、１００、２００、または２５０アミノ酸の長さでありうる。断片は、配列番号４の細孔形成ドメインを含むことが好ましい。断片は、配列番号４の残基１１９、１２１、１３５、１１３、および１３９を含むことが典型的である。
【００７９】
代替的に、または加えて、１または複数のアミノ酸を、上記のポリペプチドへと付加することもできる。伸長は、配列番号４のアミノ酸配列またはその変異体もしくは断片のアミノ末端において施すこともでき、配列番号４のアミノ酸配列またはその変異体もしくは断片のカルボキシ末端において施すこともできる。伸長は、ごく短いことが可能であり、例えば、１〜１０アミノ酸の長さでありうる。代替的に、伸長は、より長い場合もあり、例えば、最大で５０または１００アミノ酸でありうる。細孔または変異体には、担体タンパク質を融合させることもできる。
【００８０】
上記で論じた通り、配列番号４の変異体とは、配列番号４のアミノ酸配列に照らして変異し、細孔を形成するその能力を保持するアミノ酸配列を有するサブユニットである。変異体は、細孔形成の一因となる配列番号４の領域を含有することが典型的である。βバレルを含有するα−ＨＬの細孔形成能力は、各サブユニット内のβ鎖によりもたらされる。配列番号４の変異体は、β鎖を形成する配列番号４内の領域を含むことが典型的である。β鎖を形成する配列番号４のアミノ酸については、上記で論じられている。結果として得られる変異体が、細孔を形成するその能力を保持する限りにおいて、１または複数カ所の修飾を、β鎖を形成する配列番号４の領域へと施すことができる。配列番号４のβ鎖領域へと施しうる特定の修飾については、上記で論じられている。
【００８１】
配列番号４の変異体には、そのαへリックス領域内および／またはループ領域内に、置換、付加、または欠失など、１または複数カ所の修飾を含むことが好ましい。αへリックスおよびループを形成するアミノ酸については、上記で論じられている。
【００８２】
上記で論じた通り、変異体を修飾して、その同定または精製の一助とすることができる。
【００８３】
α−ＨＬに由来する細孔は、Ｍｓｐに由来する細孔に言及する上記で論じた通りに施すことができる。
【００８４】
一部の実施形態では、膜貫通タンパク質細孔を、化学修飾する。細孔は、任意の部位において、任意の形で、化学修飾することができる。膜貫通タンパク質細孔は、分子を１または複数のシステインへと連結すること（システイン連結）、分子を１または複数のリシンへと連結すること、分子を１または複数の非天然アミノ酸へと連結すること、エピトープの酵素修飾、または末端の修飾により化学修飾することが好ましい。当技術分野では、このような修飾を実施するのに適する方法が周知である。膜貫通タンパク質細孔は、任意の分子を連結ことにより化学修飾することができる。例えば、細孔は、色素またはフルオロフォアを連結することにより化学修飾することができる。
【００８５】
細孔内の任意の数の単量体を化学修飾することができる。上記で論じた通り、単量体のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０など、１または複数を化学修飾することが好ましい。
【００８６】
システイン残基の反応性は、隣接する残基を修飾することにより増強することができる。例えば、アルギニン残基、ヒスチジン残基、またはリシン残基を塩基性基で挟むと、システインチオール基のｐＫａは、反応性の大きなＳ−基のｐＫａへと変化する。システイン残基の反応性は、ｄＴＮＢなどのチオール保護基により保護することができる。リンカーを連結する前に、これらを、細孔の１または複数のシステイン残基と反応させることができる。
【００８７】
国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開されている）、同第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開されている）、または同第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開されている）において開示されている通り、分子（それにより細孔を化学修飾する）は、細孔へと直接連結することもでき、リンカーを介して連結することもできる。
【００８８】
本発明に従う任意のＲｅｃＤヘリカーゼを用いることができる。当技術分野では、ＲｅｃＤヘリカーゼの構造が公知である（FEBS J.、2008年4月；275(8):1835〜51; Epub、2008年3月9日、「ATPase activity of RecD is essential for growth of the Antarctic Pseudomonas syringae Lz4W at low temperature」、Satapathy AK、Pavankumar TL、Bhattacharjya S、Sankaranarayanan R、Ray MK; EMS Microbiol Rev.、2009年5月；33(3):657〜87、「The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification」、Garcillan-Barcia MP、Francia MV、de la Cruz F; J Biol Chem.、2011年4月8日;286(14):12670〜82; Epub、2011年2月2日、「Functional characterization of the multidomain F plasmid TraI relaxase-helicase」; Cheng Y、McNamara DE、Miley MJ、Nash RP、Redinbo MR）。
【００８９】
ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（本明細書の以下では、ＲｅｃＤ様モチーフＩと称する；配列番号８）［式中、Ｘ１は、Ｇ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ２は、任意のアミノ酸であり、Ｘ３は、Ｐ、Ａ、Ｓ、またはＧであり、Ｘ４は、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｓ、またはＣであり、Ｘ５は、ＧまたはＡであり、Ｘ６は、ＫまたはＲであり、Ｘ７は、ＴまたはＳである］を含むことが典型的である。Ｘ１は、Ｇあることが好ましい。Ｘ２は、Ｇ、Ｉ、Ｙ、またはＡであることが好ましい。Ｘ２は、Ｇであることがより好ましい。Ｘ３は、ＰまたはＡであることが好ましい。Ｘ４は、Ｔ、Ａ、Ｖ、またはＣであることが好ましい。Ｘ４は、Ｔ、Ｖ、またはＣであることが好ましい。Ｘ５は、Ｇであることが好ましい。Ｘ６は、Ｋであることが好ましい。Ｘ７は、ＴまたはＳであることが好ましい。ＲｅｃＤヘリカーゼは、Ｑ−（Ｘ８）１６〜１８−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（本明細書の以下では、伸長ＲｅｃＤ様モチーフＩと称する；それぞれに１６、１７、および１８のＸ８が存在する配列番号９、１０、および１１）［式中、Ｘ１〜Ｘ７は、上記で規定した通りであり、Ｘ８は、任意のアミノ酸である］を含むことが好ましい。伸長ＲｅｃＤ様モチーフＩ（配列番号９）には、１６のＸ８残基が存在すること（すなわち、（Ｘ８）１６）が好ましい。（Ｘ８）１６に適する配列は、配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２、および４４において同定することができる。
【００９０】
ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＧ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｘａ−Ｇ−Ｋ−Ｘｂ（本明細書の以下では、ＲｅｃＤモチーフＩと称する；配列番号１２）［式中、Ｘａは、Ｔ、Ｖ、またはＣであり、Ｘｂは、ＴまたはＳである］を含むことが好ましい。Ｘａは、Ｔであることが好ましい。Ｘｂも、Ｔであることが好ましい。Ｒｅｃ−Ｄヘリカーゼは、配列Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｋ−Ｔ（配列番号１９；表５を参照されたい）を含むことが好ましい。ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＱ−（Ｘ８）１６〜１８−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｘａ−Ｇ−Ｋ−Ｘｂ（本明細書の以下では、伸長ＲｅｃＤモチーフＩと称する；それぞれに１６、１７、および１８のＸ８が存在する配列番号１３、１４、および１５）［式中、ＸａおよびＸｂは、上記で規定した通りであり、Ｘ８は、任意のアミノ酸である］を含むことがより好ましい。伸長ＲｅｃＤモチーフＩ（配列番号１３）には、１６のＸ８残基が存在すること（すなわち、（Ｘ８）１６）が好ましい。（Ｘ８）１６に適する配列は、配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２、および４４において同定することができる。
【００９１】
ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−（Ｘ６）３−Ｑ−Ｘ７（本明細書の以下では、ＲｅｃＤ様モチーフＶと称する；配列番号１６）［式中、Ｘ１は、Ｙ、Ｗ、またはＦであり、Ｘ２は、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、Ｃ、またはＶであり、Ｘ３は、任意のアミノ酸であり、Ｘ４は、Ｔ、Ｎ、またはＳであり、Ｘ５は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｖ、またはＩであり、Ｘ６は、任意のアミノ酸であり、Ｘ７は、ＧまたはＳである］を含むことが典型的である。Ｘ１は、Ｙであることが好ましく、Ｘ２は、Ａ、Ｍ、Ｃ、またはＶであることが好ましく、Ｘ２は、Ａであることがより好ましく、Ｘ３は、Ｉ、Ｍ、またはＬであることが好ましく、Ｘ３は、ＩまたはＬであることがより好ましい。Ｘ４は、ＴまたはＳであることが好ましい。Ｘ４は、Ｔであることがより好ましい。Ｘ５は、Ａ、Ｖ、またはＩであることが好ましい。Ｘ５は、ＶまたはＩであることがより好ましい。Ｘ５は、Ｖであることが最も好ましい。（Ｘ６）３は、Ｈ−Ｋ−Ｓ、Ｈ−Ｍ−Ａ、Ｈ−Ｇ−Ａ、またはＨ−Ｒ−Ｓであることが好ましい。（Ｘ６）３は、Ｈ−Ｋ−Ｓであることがより好ましい。Ｘ７は、Ｇであることが好ましい。ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸａ−Ｘｂ−Ｘｃ−Ｘｄ−Ｘｅ−Ｈ−Ｋ−Ｓ−Ｑ−Ｇ（本明細書の以下では、ＲｅｃＤモチーフＶと称する；配列番号１７）［式中、Ｘａは、Ｙ、Ｗ、またはＦであり、Ｘｂは、Ａ、Ｍ、Ｃ、またはＶであり、Ｘｃは、Ｉ、Ｍ、またはＬであり、Ｘｄは、ＴまたはＳであり、Ｘｅは、ＶまたはＩである］を含むことが好ましい。Ｘａは、Ｙであることが好ましい。Ｘｂは、Ａであることが好ましい。Ｘｄは、Ｔであることが好ましい。Ｘｅは、Ｖであることが好ましい。ＲｅｃＤヘリカーゼは、（１）ＲｅｃＤ様モチーフＩおよびＶ（配列番号８および１２）、（２）ＲｅｃＤモチーフＩおよびＲｅｃＤ様モチーフＶ（配列番号１２および１６）、（３）ＲｅｃＤモチーフＩおよびＶ（配列番号１２および１７）、（４）伸長ＲｅｃＤ様モチーフＩおよびＲｅｃＤ様モチーフＶ（配列番号９、１０、または１１、および１６）、（５）伸長ＲｅｃＤモチーフＩおよびＲｅｃＤ様モチーフＶ（配列番号１３、１４、または１５、および１６）、または（６）伸長ＲｅｃＤモチーフＩおよびＲｅｃＤモチーフＶ（配列番号１３、１４、または１５、および１７）を含むことが好ましい。
【００９２】
好ましいＲｅｃＤモチーフＩを、以下の表５に示す。好ましいＲｅｃＤ様モチーフＩを、以下の表７に示す。好ましいＲｅｃＤ様モチーフＶを、以下の表５および７に示す。
【００９３】
ＲｅｃＤヘリカーゼは、以下の表４に示されるヘリカーゼのうちの１つまたはその変異体であることが好ましい。
【００９４】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【表４−１３】
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【表４−１４】
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【表４−１５】
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【表４−１６】
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【表４−１７】
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【表４−１８】
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【表４−１９】
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【００９５】
ＲｅｃＤヘリカーゼは、以下の表５に示されるヘリカーゼのうちの１つまたはその変異体であることがより好ましい。ＲｅｃＤヘリカーゼは、表５に示されるヘリカーゼのうちの１つの配列、すなわち、配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２、および４４のうちの１つ、またはその変異体を含むことがより好ましい。
【００９６】
【表５−１】
2015503917.tif 000024
【表５−２】
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【００９７】
上記の表中の全ての配列は、ＲｅｃＤ様モチーフＶを含む（示される通り）。ＲｅｃＤモチーフＶを含むのは、配列番号１８、２５、２８、３０、３５、３７、３９、および４２だけである（示される通り）。
【００９８】
ＲｅｃＤヘリカーゼは、ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼであることが好ましい。ＴｒａＩヘリカーゼおよびＴｒａＩ亜群ヘリカーゼは、２つのＲｅｃＤヘリカーゼドメイン、リラクサーゼドメイン、およびＣ末端ドメインを含有しうる。ＴｒａＩ亜群ヘリカーゼは、ＴｒｗＣヘリカーゼであることが好ましい。ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼは、以下の表６に示されるヘリカーゼのうちの１つまたはその変異体であることが好ましい。
【００９９】
ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼは、上記で規定したＲｅｃＤ様モチーフＩ（配列番号８）および／または上記で規定したＲｅｃＤ様モチーフＶ（配列番号１６）を含むことが典型的である。ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼは、ＲｅｃＤ様モチーフＩ（配列番号８）およびＲｅｃＤ様モチーフＶ（配列番号１６）の両方を含むことが好ましい。ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼは、以下の２つのモチーフのうちの１つをさらに含むことが典型的である。
・アミノ酸モチーフＨ−（Ｘ１）２−Ｘ２−Ｒ−（Ｘ３）５〜１２−Ｈ−Ｘ４−Ｈ（本明細書の以下では、ＭｏｂＦモチーフＩＩＩと称する；全ての可能なＭｏｂＦモチーフＩＩＩ（全ての可能な数のＸ３を含めた）を示す配列番号４６〜５３）［式中、Ｘ１およびＸ３は、任意のアミノ酸であり、Ｘ２およびＸ４は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、およびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択される］。（Ｘ１）２は、当然ながら、Ｘ１ａ−Ｘ１ｂである。Ｘ１ａとＸ１ｂとは、同じアミノ酸の場合もあり、異なるアミノ酸の場合もある。Ｘ１ａは、ＤまたはＥであることが好ましい。Ｘ１ｂは、ＴまたはＤであることが好ましい。（Ｘ１）２は、ＤＴまたはＥＤであることが好ましい。（Ｘ１）２は、ＤＴであることが最も好ましい。（Ｘ３）５〜１２中の５〜１２のアミノ酸は、同じ場合もあり、異なる場合もある。Ｘ２およびＸ４は、独立に、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、およびＴから選択される。Ｘ２およびＸ４は、帯電していないことが好ましい。Ｘ２およびＸ４は、Ｈでないことが好ましい。Ｘ２は、Ｎ、Ｓ、またはＡであることがより好ましい。Ｘ２は、Ｎであることが最も好ましい。Ｘ４は、ＦまたはＴであることが最も好ましい。（Ｘ３）５〜１２は、６または１０残基の長さ（配列番号４７および５１）であることが好ましい。（Ｘ３）５〜１２の適切な実施形態は、以下の表７に示される配列番号６１、６５、６９、７３、７４、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８（すなわち、配列番号７８および１０６以外の全ての配列）に由来しうる。ＭｏｂＦモチーフＩＩＩの好ましい実施形態を、以下の表７に示す。
・アミノ酸モチーフＧ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｈ−（Ｘ８）６〜１２−Ｈ−Ｘ９（本明細書の以下では、ＭｏｂＱモチーフＩＩＩと称する；全ての可能なＭｏｂＱモチーフＩＩＩ（全ての可能な数のＸ８を含めた）を示す配列番号５４〜６０）［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ９は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、およびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択され、Ｘ４は、ＤまたはＥであり、Ｘ８は、任意のアミノ酸である］。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ９は、独立に、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、およびＴから選択される。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ９は、帯電していないことが好ましい。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ９は、Ｈでないことが好ましい。（Ｘ８）６〜１２中の６〜１２のアミノ酸は、同じ場合もあり、異なる場合もある。（Ｘ８）６〜１２の適切な実施形態は、以下の表７に示される配列番号７８および１０６に由来しうる。ＭｏｂＦモチーフＩＩＩの好ましい実施形態を、以下の表７に示す。
【０１００】
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
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【表６−８】
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【表６−９】
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【表６−１０】
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【表６−１１】
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【表６−１２】
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【表６−１３】
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【表６−１４】
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【表６−１５】
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【表６−１６】
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【表６−１７】
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【０１０１】
ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼは、以下の表７に示されるヘリカーゼのうちの１つまたはその変異体であることがより好ましい。ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼは、表７に示されるヘリカーゼのうちの１つの配列、すなわち、配列番号６１、６５、６９、７３、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８のうちの１つ、またはその変異体を含むことがより好ましい。
【０１０２】
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【０１０３】
配列番号７８および１０６が、ＭｏｂＱモチーフＩＩＩを含むのに対し、表７中の他の配列は、ＭｏｂＦモチーフＩＩＩを含む。
【０１０４】
ＴｒａＩヘリカーゼは、配列番号６１に示される配列またはその変異体を含むことが好ましい。
【０１０５】
ＲｅｃＤヘリカーゼの変異体とは、野生型ヘリカーゼのアミノ酸配列に照らして変異し、ポリヌクレオチド結合活性を保持するアミノ酸配列を有する酵素である。特に、配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２、４４、６１、６５、６９、７３、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８のうちのいずれか１つの変異体とは、配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２、４４、６１、６５、６９、７３、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列に照らして変異し、ポリヌクレオチド結合活性を保持するアミノ酸配列を有する酵素である。配列番号１８または６１の変異体とは、配列番号１８または６１のアミノ酸配列に照らして変異し、ポリヌクレオチド結合活性を保持するアミノ酸配列を有する酵素である。変異体は、ヘリカーゼ活性を保持する。当技術分野では、ヘリカーゼ活性を測定するための方法が公知である。ヘリカーゼ活性はまた、実施例で記載される通りに測定することもできる。変異体は、以下で論じられる２つの方式のうちの少なくとも１つにおいて働かなければならない。変異体は、いずれの方式でも働くことが好ましい。変異体は、ヘリカーゼをコードするポリヌクレオチドのハンドリングを促す修飾、ならびに／または高い塩濃度および／もしくは室温でのその活性を促す修飾を含みうる。変異体は、上記で論じたモチーフの外側の領域において、野生型ヘリカーゼと異なることが典型的である。しかし、変異体は、これらの（１または複数の）モチーフ内に修飾を含みうる。
【０１０６】
配列番号１８または６１など、配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２、４４、６１、６５、６９、７３、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列の全長にわたり、変異体は、アミノ酸の同一性に基づいて、その配列と少なくとも１０％相同であることが好ましい。変異体ポリペプチドは、配列の全体にわたり、アミノ酸の同一性に基づいて、配列番号１８または６１など、配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２、４４、６１、６５、６９、７３、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上相同であることが可能であることがより好ましく、少なくとも９５％、９７％、または９９％相同であることがより好ましい。１５０以上、例えば、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００以上の連続アミノ酸の連なりにわたり、少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を認めることができる（「堅い相同性」）。相同性は、上記で論じた通りに決定される。変異体は、配列番号２および４に対して言及しながら上記で論じた形のうちのいずれかにより、野生型配列と異なりうる。
【０１０７】
特に、変異体は、配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２、４４、６１、６５、６９、７３、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８の断片を含みうる。このような断片は、ポリヌクレオチド結合活性を保持する。断片は、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約６５０、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、または少なくとも約１０００アミノ酸の長さでありうる。断片の長さは、野生型配列の長さに依存するであろう。以下でより詳細に論じられる通り、断片は、当該野生型配列のＲｅｃＤ様モチーフＩおよび／またはＲｅｃＤ様モチーフＶを含むことが好ましい。
【０１０８】
上記で論じた通り、ＴｒａＩヘリカーゼおよびＴｒａＩ亜群ヘリカーゼは、リラクサーゼドメインを含む。リラクサーゼドメインは、ＭｏｂＦモチーフＩＩＩまたはＭｏｂＱモチーフＩＩＩを含み、ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼのアミノ（Ｎ）末端において見出されることが典型的である。配列番号６１、６５、６９、７３、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８の好ましい断片など、ＴｒａＩヘリカーゼおよびＴｒａＩ亜群ヘリカーゼの好ましい断片は、野生型配列のＮ末端ドメインを欠く。Ｎ末端ドメインは、タンパク質のうちのＮ末端側の約３分の１に対応することが典型的である。配列番号６１（これは、１７５６アミノ酸の長さである）では、Ｎ末端ドメインが、約５５０〜約６００アミノ酸の長さなど、約５００〜約７００アミノ酸の長さであることが典型的である。配列番号６５、６９、および７３（これらはそれぞれ、９７０、９４３、および９６０アミノ酸の長さである）では、Ｎ末端ドメインが、約３２０〜約３４０アミノ酸の長さなど、約３００〜約３５０アミノ酸の長さであることが典型的である。
【０１０９】
配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２、４４、６１、６５、６９、７３、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８のアミノ酸配列に対しては、アミノ酸置換、例えば、最大で１、２、３、４、５、１０、２０、または３０カ所の置換を施すことができる。上記で論じた通り、置換は、保存的置換であることが好ましい。配列番号４１のアミノ酸位置Ｋ５５５、Ｒ５５４、Ｔ６４４、Ｒ６４７、Ｐ６６６、Ｍ６６７、Ｈ６４６、Ｎ６０４、Ｎ５９６、Ｙ５９８、Ｖ４７０、Ｇ３９１、Ｈ４０９、Ｔ４０７、Ｒ４１０、およびＹ４１４において、１または複数の置換を施すことができる。配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４２、４４、６１、６５、６９、７３、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８では、配列番号４１のアミノ酸位置Ｋ５５５、Ｒ５５４、Ｔ６４４、Ｒ６４７、Ｐ６６６、Ｍ６６７、Ｈ６４６、Ｎ６０４、Ｎ５９６、Ｙ５９８、Ｖ４７０、Ｇ３９１、Ｈ４０９、Ｔ４０７、Ｒ４１０、およびＹ４１４に対応する１または複数のアミノ酸位置において、置換を施すことができる。異なるタンパク質配列内の対応するアミノ酸位置を決定することは、簡単である。例えば、タンパク質は、それらの相同性に基づき、配列決定することができる。相同性は、上記で論じた通りに決定することができる。
【０１１０】
配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２、４４、６１、６５、６９、７３、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８のうちのいずれか１つの断片などの変異体は、当該野生型配列のＲｅｃＤ様モチーフＩ（またはＲｅｃＤモチーフＩ）および／またはＲｅｃＤ様モチーフＶ（またはＲｅｃＤモチーフＶ）を含むことが好ましい。配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２、４４、６１、６５、６９、７３、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８のうちのいずれか１つの断片などの変異体は、当該野生型配列のＲｅｃＤ様モチーフＩ（またはＲｅｃＤモチーフＩ）およびＲｅｃＤ様モチーフＶ（またはＲｅｃＤモチーフＶ）を含むことが好ましい。例えば、配列番号１８の変異体は、ＲｅｃＤモチーフＩであるＧＧＰＧＴＧＫＴ（配列番号１９）およびＲｅｃＤモチーフＶであるＷＡＶＴＩＨＫＳＱＧ（配列番号２０）を含むことが好ましい。配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２、４４、６１、６５、６９、７３、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８の各々のＲｅｃＤ様モチーフＩおよびＶ（またはＲｅｃＤモチーフＩおよびＶ）を、表５および７に示す。しかし、配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２、４４、６１、６５、６９、７３、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８のうちのいずれか１つの変異体は、異なる野生型配列に由来するＲｅｃＤ様モチーフＩ（またはＲｅｃＤモチーフＩ）および／またはＲｅｃＤ様モチーフＶ（またはＲｅｃＤモチーフＶ）を含みうる。例えば、配列番号２８または配列番号３５の変異体は、配列番号２１のＲｅｃＤモチーフＩおよびＲｅｃＤ様モチーフＶ（それぞれ、ＧＧＰＧＴＧＫＳおよびＹＡＬＴＶＨＲＡＱＧ；配列番号２２および２３）を含みうる。配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２、４４、６１、６５、６９、７３、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８のうちのいずれか１つの変異体は、表５および７に示される好ましいモチーフのうちのいずれか１つを含みうる。配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２、４４、６１、６５、６９、７３、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８のうちのいずれか１つの変異体はまた、当該野生型配列のＲｅｃＤ様モチーフＩおよびＶ内の修飾も含みうる。２つのモチーフを規定する場合に適する修飾は、上記で論じられている。本段落における議論は、配列番号６１、６５、６９、７３、７４、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８におけるＭｏｂＦモチーフＩＩＩ、ならびに配列番号７８および１０６におけるＭｏｂＱモチーフＩＩＩにも同様にあてはまる。特に、配列番号６１、６５、６９、７３、７４、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８のうちのいずれか１つの断片などの変異体は、当該野生型配列のＭｏｂＦモチーフＩＩＩを含むことが好ましい。配列番号７８または１０６の断片などの変異体は、当該野生型配列のＭｏｂＱモチーフＩＩＩを含むことが好ましい。配列番号６１、６５、６９、７３、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８のうちのいずれか１つの断片などの変異体は、当該野生型配列のＲｅｃＤ様モチーフＩ（またはＲｅｃＤモチーフＩ）、ＲｅｃＤ様モチーフＶ（またはＲｅｃＤモチーフＶ）、およびＭｏｂＦモチーフＩＩＩまたはＭｏｂＱモチーフＩＩＩを含むことが好ましい。
【０１１１】
ヘリカーゼは、細孔へと共有結合的に連結することもできる。ヘリカーゼは、細孔へと共有結合的に連結しないことが好ましい。細孔へと電圧を加えると、ヘリカーゼは、標的ポリヌクレオチドを配列決定することが可能なセンサーの形成を結果としてもたらすことが典型的である。これについては、以下でより詳細に論じる。
【０１１２】
本明細書で記載されるタンパク質のうちのいずれか、すなわち、膜貫通タンパク質細孔またはＲｅｃＤヘリカーゼを修飾して、例えば、ヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、ｆｌａｇタグ、ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグ、またはＭＢＰタグを付加することにより、それらの同定または精製の一助とすることもでき、天然ではポリペプチドがこのような配列を含有しない細胞からのそれらの分泌を促進するシグナル配列を付加することにより、それらの同定または精製の一助とすることもできる。遺伝子タグの導入に対する代替法は、細孔表面またはヘリカーゼ表面の天然の位置または操作された位置において、タグを化学的に反応させることである。この例は、ゲルシフト試薬を、細孔の外側において、操作されたシステインへと反応させることであろう。これは、ヘモリシンのヘテロオリゴマーを分離するための方法として裏付けられている（Chem Biol.、1997年7月; 4(7):497〜505）。
【０１１３】
細孔および／またはヘリカーゼは、明示的標識で標識することができる。明示的標識は、細孔の検出を可能とする任意の適切な標識でありうる。適切な標識には、蛍光分子、放射性同位元素、例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチド、およびビオチンなどのリガンドが含まれるがこれらに限定されない。
【０１１４】
タンパク質は、合成により作製することもでき、組換え手段により作製することもできる。例えば、細孔および／またはヘリカーゼは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける翻訳および転写（ＩＶＴＴ）により合成することができる。細孔および／またはヘリカーゼのアミノ酸配列を修飾して、非自然発生のアミノ酸を含めるか、またはタンパク質の安定性を増大させることができる。タンパク質を合成手段により作製する場合、このようなアミノ酸を作製時に導入することができる。細孔および／またはヘリカーゼはまた、合成または組換えによる作製の後に変化させることもできる。
【０１１５】
細孔および／またはヘリカーゼはまた、Ｄ−アミノ酸を用いても作製することができる。例えば、細孔またはヘリカーゼは、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含みうる。これは、このようなタンパク質またはペプチドをもたらすための、当技術分野における通常法である。
【０１１６】
細孔および／またはヘリカーゼはまた、それらが細孔形成またはヘリカーゼ機能に干渉しない限りにおいて、他の非特異的修飾も含有しうる。当技術分野では、多数の非特異的側鎖修飾が公知であり、（１または複数の）タンパク質の側鎖へと施すことができる。このような修飾には、例えば、アルデヒドを伴う反応によるアミノ酸の還元的アルキル化の後、ＮａＢＨ４を伴う還元、メチルアセトイミデートを伴うアミジン化、または無水酢酸を伴うアシル化が含まれる。
【０１１７】
細孔およびヘリカーゼは、当技術分野で公知の標準的な方法を用いて作製することができる。当技術分野における標準的な方法を用いて、細孔またはヘリカーゼをコードするポリヌクレオチド配列を誘導および複製することができる。細孔またはヘリカーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的な技法を用いて、細菌宿主細胞において発現させることができる。細孔および／またはヘリカーゼは、ポリペプチドを組換え発現ベクターからｉｎ  ｓｉｔｕで発現させることにより、細胞内で作製することができる。発現ベクターは場合によって、ポリペプチドの発現を制御するための誘導的プロモーターを保有する。これらの方法は、Sambrook, J.およびRussell, D.（2001）、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYにおいて記載されている。
【０１１８】
細孔および／またはヘリカーゼは、任意のタンパク質用液体クロマトグラフィーシステムによる、タンパク質を産生する生物からの精製後に、大スケールで作製することもでき、組換え発現後に大スケールで作製することもできる。典型的なタンパク質用液体クロマトグラフィーシステムには、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡシステム、Ｂｉｏ−Ｃａｄシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＢｉｏＬｏｇｉｃシステム、およびＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣシステムが含まれる。
【０１１９】
本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドの１または複数の特徴の測定を伴う。本方法は、２つ、３つ、４つ、または５つ以上の標的ポリヌクレオチドの特徴の測定を伴いうる。１または複数の特徴は、（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択することが好ましい。本発明に従い、（ｉ）〜（ｖ）の任意の組合せを測定することができる。
【０１２０】
（ｉ）では、標的ポリヌクレオチドと細孔との間の相互作用の数を用いてポリヌクレオチドの長さを測定することができる。
【０１２１】
（ｉｉ）では、ポリヌクレオチドの同一性を、多数の形で測定することができる。ポリヌクレオチドの同一性は、標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴って測定することもでき、標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴わずに測定することもできる。前者は、簡単であり、ポリヌクレオチドを配列決定し、これにより、ポリヌクレオチドを同定する。後者は、複数の形で行うことができる。例えば、ポリヌクレオチド中の特定のモチーフの存在を測定することができる（ポリヌクレオチドの残りの配列の測定を伴わない）。代替的に、方法において、特定の電気的および／または光学的シグナルを測定することにより、標的ポリヌクレオチドを、特定の供給源に由来するものとして同定することもできる。
【０１２２】
（ｉｉｉ）では、ポリヌクレオチドの配列を、既に記載されている通りに決定することができる。適切な配列決定法、特に、電気的測定を用いる配列決定法は、Stoddart Dら、Proc Natl Acad Sci、12;106(19):7702〜7、Lieberman KRら、J Am Chem Soc.、2010;132(50):17961〜72、および国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号において記載されている。
【０１２３】
（ｉｖ）では、二次構造を多様な形で測定することができる。例えば、方法が電気的測定を伴う場合は、滞留時間の変化または細孔を介して流れる電流の変化を用いて、二次構造を測定することができる。これは、一本鎖ポリヌクレオチド領域と二本鎖ポリヌクレオチド領域との識別を可能とする。
【０１２４】
（ｖ）では、任意の修飾の存在または非存在を測定することができる。本方法は、標的ポリヌクレオチドが、メチル化により、酸化により、損傷により、１もしくは複数のタンパク質で、または１もしくは複数の標識、タグ、もしくはスペーサーで修飾されているか否かを決定するステップを含むことが好ましい。特定の修飾は、細孔との特異的な相互作用を結果としてもたらし、これは、以下で記載する方法を用いて測定することができる。例えば、メチルシトシンは、シトシンから、それが各ヌクレオチドと相互作用するときに細孔を介して流れる電流に基づき識別することができる。
【０１２５】
多様な異なる種類の測定を行うことができる。これには、限定せずに述べると、電気的測定および光学的測定が含まれる。可能な電気的測定には、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定（Ivanov APら、Nano Lett.、2011年1月12日;11(1):279〜85）、およびＦＥＴ測定（国際出願第ＷＯ２００５／１２４８８８号）が含まれる。光学的測定は、電気的測定と組み合わせることができる（Soni GVら、Rev Sci Instrum.、2010年1月;81(1):014301）。測定は、細孔を介して流れるイオン性電流の測定などの膜貫通電流測定でありうる。
【０１２６】
Stoddart Dら、Proc Natl Acad Sci、12;106(19):7702〜7; Lieberman KRら、J Am Chem Soc.、2010;132(50):17961〜72；および国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号において記載されている標準的な単一チャネルの記録装置を用いて電気的測定を行うことができる。代替的に、例えば、国際出願第ＷＯ２００９／０７７７３４号および国際出願第ＷＯ２０１１／０６７５５９号において記載されているマルチチャネルシステムを用いて電気的測定を行うこともできる。
【０１２７】
好ましい実施形態では、本方法は、
（ａ）標的ポリヌクレオチドが細孔を介して移動し、ＲｅｃＤヘリカーゼが細孔を介する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドを、膜貫通細孔およびＲｅｃＤヘリカーゼと接触させるステップと、
（ｂ）ポリヌクレオチドが細孔に対して移動するときに細孔を通過する電流を測定するステップであって、電流が、標的ポリヌクレオチドの１または複数の特徴を示し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるステップと
を含む。
【０１２８】
本方法は、細孔が膜内に挿入された膜／細孔系を探索するのに適する任意の装置を用いて実行することができる。本方法は、膜貫通細孔センシングに適する任意の装置を用いて実行することができる。例えば、装置は、水溶液とチャンバーを２つの部分へと分離する隔壁とを含むチャンバーを含む。隔壁は、開口部を有し、ここに、細孔を含有する膜が形成される。
【０１２９】
本方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２号（ＷＯ２００８／１０２１２０）において記載されている装置を用いて実行することができる。
【０１３０】
本方法は、ポリヌクレオチドが細孔に対して移動するときに細孔を通過する電流を測定するステップを伴いうる。したがって、装置はまた、膜および細孔を隔ててポテンシャルを印加し、電気的シグナルを測定することが可能な電気回路も含みうる。本方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを用いて実行することができる。本方法は、電圧クランプの使用を伴うことが好ましい。
【０１３１】
本発明の方法は、ポリヌクレオチドが細孔に対して移動するときに細孔を通過する電流を測定するステップを伴いうる。当技術分野では、膜貫通タンパク質細孔内のイオン性電流を測定するのに適する条件が公知であり、実施例でも開示する。本方法は、膜および細孔を隔てて電圧を加えることにより実行することが典型的である。用いられる電圧は、＋２Ｖ〜−２Ｖであることが典型的であり、−４００ｍＶ〜＋４００ｍＶであることが典型的である。用いられる電圧は、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶ、および０ｍＶから選択される下限と、＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶ、および＋４００ｍＶから独立に選択される上限とを有する範囲内にあることが好ましい。用いられる電圧は、１００ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲内にあることがより好ましく、１２０ｍＶ〜２２０ｍＶの範囲内にあることが最も好ましい。加えるポテンシャルの増大を用いることにより、細孔による異なるヌクレオチドの間の識別能を増大させることが可能である。
【０１３２】
本方法は、金属塩、例えば、アルカリ金属塩、ハロゲン化物塩、例えば、アルカリ金属塩化物塩などの塩化物塩など、任意の電荷担体の存在下で実行することが典型的である。電荷担体には、イオン性液体または有機塩、例えば、テトラメチル塩化アンモニウム、トリメチルフェニル塩化アンモニウム、フェニルトリメチル塩化アンモニウム、または１−エチル−３−メチルイミダゾリウム塩化物が含まれうる。上記で論じた例示的な装置では、塩が、チャンバー内の水溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、または塩化セシウム（ＣｓＣｌ）を用いることが典型的である。ＫＣｌが好ましい。塩濃度は、飽和濃度でありうる。塩濃度は、３Ｍ以下であることが可能であり、０．１〜２．５Ｍ、０．３〜１．９Ｍ、０．５〜１．８Ｍ、０．７〜１．７Ｍ、０．９〜１．６Ｍ、または１Ｍ〜１．４Ｍであることが典型的である。塩濃度は、１５０ｍＭ〜１Ｍであることが好ましい。上記で論じた通り、ＲｅｃＤヘリカーゼは、驚くほどに高い塩濃度下で働く。本方法は、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍ、または少なくとも３．０Ｍなど、少なくとも０．３Ｍの塩濃度を用いて実行することが好ましい。高い塩濃度は、高いシグナル対ノイズ比をもたらし、ヌクレオチドの存在を示す電流を、通常の電流変動のバックグラウンドに抗して同定することを可能とする。
【０１３３】
本方法は、緩衝液の存在下で実行することが典型的である。上記で論じた例示的な装置では、緩衝液が、チャンバー内の水溶液中に存在する。本発明の方法では、任意の緩衝液を用いることができる。緩衝液は、ＨＥＰＥＳであることが典型的である。別の適する緩衝液は、トリス−ＨＣｌ緩衝液である。本方法は、４．０〜１２．０、４．５〜１０．０、５．０〜９．０、５．５〜８．８、６．０〜８．７、もしくは７．０〜８．８、または７．５〜８．５のｐＨで実行することが典型的である。用いられるｐＨは、約７．５であることが好ましい。
【０１３４】
本方法は、０℃〜１００℃、１５℃〜９５℃、１６℃〜９０℃、１７℃〜８５℃、１８℃〜８０℃、１９℃〜７０℃、または２０℃〜６０℃で実行することができる。本方法は、室温で実行することが典型的である。本方法は場合によって、約３７℃など、酵素機能を支援する温度で実行する。
【０１３５】
本方法は、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似体およびヘリカーゼの作用を促す酵素共因子の存在下で実行することが典型的である。遊離ヌクレオチドは、上記で論じた個別のヌクレオチドのうちのいずれかの１または複数でありうる。遊離ヌクレオチドには、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、およびデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）が含まれるがこれらに限定されない。遊離ヌクレオチドは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、またはｄＣＭＰから選択されることが好ましい。遊離ヌクレオチドは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）であることが好ましい。酵素共因子とは、ヘリカーゼが機能することを可能とする因子である。酵素共因子は、二価の金属カチオンであることが好ましい。二価の金属カチオンは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、またはＣｏ２＋であることが好ましい。酵素共因子は、Ｍｇ２＋であることが最も好ましい。
【０１３６】
標的ポリヌクレオチドは、ＲｅｃＤヘリカーゼおよび細孔と、任意の順序で接触させることができる。標的ポリヌクレオチドを、ＲｅｃＤヘリカーゼおよび細孔と接触させる場合はまず、標的ポリヌクレオチドに、ヘリカーゼとの複合体を形成させることが好ましい。細孔を隔てて電圧を加える場合は次いで、標的ポリヌクレオチド／ヘリカーゼ複合体に、細孔との複合体を形成させ、細孔を介するポリヌクレオチドの移動を制御させる。
【０１３７】
上記で論じた通り、ＲｅｃＤヘリカーゼは、細孔に対して２つの方式で働きうる。第１に、本方法は、それが、細孔を介して標的配列を、印加された電圧から生じる電界と同じ向きに移動させるように、ＲｅｃＤヘリカーゼを用いて実行することが好ましい。この方式では、ＤＮＡの５’端を細孔内にまず捕捉し、それが二重層のトランス側へと最終的に移行しきるまで、標的配列が細孔を電界と同じ向きに通過するように、酵素によりＤＮＡを細孔へと移動させる。代替的に、本方法は、酵素により、細孔を介して標的配列を、印加された電圧から生じる電界と逆向きに移動させるように実行することも好ましい。この方式では、ＤＮＡの３’端を細孔内にまず捕捉し、それが二重層のシス側へと最終的に差し戻されるまで、標的配列が細孔から印加された電界と逆向きに引き出されるように、酵素によりＤＮＡを細孔へと移動させる。
【０１３８】
本発明の方法は、ＭｓｐＡに由来する細孔および配列番号６１に示される配列またはその変異体を含むヘリカーゼを伴うことが最も好ましい。ＭｓｐＡおよび配列番号６１に言及しながら上記で論じた実施形態のうちのいずれかを、組合せで用いることができる。
【０１３９】
他の方法
本発明はまた、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサーを形成する方法も提供する。本方法は、細孔とＲｅｃＤヘリカーゼとの間で複合体を形成するステップを含む。複合体は、標的ポリヌクレオチドの存在下で細孔とヘリカーゼとを接触させ、次いで、細孔を隔ててポテンシャルを印加することにより形成することができる。上記で記載した通り、印加されるポテンシャルは、化学ポテンシャルの場合もあり、電圧ポテンシャルの場合もある。代替的に、複合体は、細孔をヘリカーゼへと共有結合的に連結することによっても形成することができる。当技術分野では、共有結合的連結のための方法が公知であり、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開されている）および同第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開されている）において開示されている。この複合体が、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサーである。本方法は、Ｍｓｐに由来する細孔とＲｅｃＤヘリカーゼとの間で複合体を形成するステップを含むことが好ましい。本発明の方法に言及しながら上記で論じた実施形態のいずれも、本方法に同様に適用される。
【０１４０】
キット
本発明はまた、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットも提供する。キットは、（ａ）細孔と、（ｂ）ＲｅｃＤヘリカーゼとを含む。本発明の方法に言及しながら上記で論じた実施形態のいずれも同様に、キットに適用される。
【０１４１】
キットは、脂質二重層などの両親媒性層を形成するのに必要とされるリン脂質などの膜の成分もさらに含みうる。
【０１４２】
本発明のキットは加えて、上記で言及した実施形態のうちのいずれかの実行を可能とする、１または複数の他の試薬または器具も含む。このような試薬または器具には、以下：（１または複数の）適切な緩衝液（水溶液）、試料を対象から得る手段（注射針を含む容器または器具など）、ポリヌクレオチドを増幅し、かつ／もしくは発現させる手段、上記で規定した膜、または電圧装置もしくはパッチクランプ装置のうちの１または複数が含まれる。試薬は、流体試料により試薬を再懸濁させるように、キット内に乾燥状態で存在させることができる。キットには場合によってまた、本発明の方法でキットを用いることを可能とする指示書、またはどの患者のために本方法を用いうるかについての詳細も含みうる。キットには場合によって、ヌクレオチドも含みうる。
【０１４３】
装置
本発明はまた、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための装置も提供する。装置は、複数の細孔および複数のＲｅｃＤヘリカーゼを含む。装置は、本発明の方法を実施するための指示書もさらに含むことが好ましい。装置は、アレイまたはチップなど、ポリヌクレオチド解析のための任意の従来の装置でありうる。本発明の方法に言及しながら上記で論じた実施形態のいずれも同様に、本発明の装置に適用可能である。
【０１４４】
装置は、本発明の方法を実施するように設定することが好ましい。
【０１４５】
装置は、
膜および複数の細孔を支持することが可能であり、細孔およびヘリカーゼを用いてポリヌクレオチドの特徴付けを実施するのに作動可能なセンサーデバイスと、
特徴付けを実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバーと、
材料を、少なくとも１つのリザーバーから、センサーデバイスへと、制御可能な形で供給するように構成された流体力学系と、
それぞれの試料を受容するための複数の容器であって、流体力学系が、試料を、容器からセンサーデバイスへと、選択的に供給するように構成された容器と
を含むことが好ましい。装置は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開されている）、同第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９号（ＷＯ２０１０／１２２２９３として公開されている）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２２０６号（未公開）、または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９号（ＷＯ００／２８３１２として公開されている）において記載されている装置のうちのいずれかでありうる。
【０１４６】
細孔を伴わない特徴付け
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドを、ＲｅｃＤヘリカーゼは用いるが、細孔は用いずに、部分的または完全に配列決定するなどして、特徴付ける。特に、本発明はまた、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、ＲｅｃＤヘリカーゼにより、標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドを、ＲｅｃＤヘリカーゼと接触させるステップを含む方法も提供する。本方法では、標的ポリヌクレオチドを、膜貫通細孔などの細孔と接触させないことが好ましい。ＲｅｃＤヘリカーゼにより、ポリヌクレオチドの移動を制御し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるので、本方法は、１または複数の測定を行うステップを伴う。測定は、標的ポリヌクレオチドの１または複数の特徴を示す。本発明に従い、任意のこのような測定を行うことができる。このような測定には、限定せずに述べると、電気的測定および光学的測定が含まれる。これらについては、上記で詳細に論じられている。細孔を欠く方法でも、細孔ベースの本発明の方法に言及しながら上記で論じた実施形態のうちのいずれかを用いることができる。例えば、上記で論じたＲｅｃＤヘリカーゼのうちのいずれかを用いることができる。
【０１４７】
本発明はまた、ＲｅｃＤヘリカーゼを含む解析装置も提供する。本発明はまた、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットであって、（ａ）標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための解析装置と、（ｂ）ＲｅｃＤヘリカーゼとを含むキットも提供する。これらの装置およびキットは、膜貫通細孔などの細孔を含まないことが好ましい。適切な装置については、上記で論じられている。
【０１４８】
以下の実施例では、本発明について例示する。
【実施例１】
【０１４９】
この例では、ナノ細孔を介する無傷のＤＮＡ鎖の移動を制御するための、ＴｒａＩヘリカーゼ（ＴｒａＩ  Ｅｃｏ；配列番号６１）の使用について例示する。この例を通して使用される一般的な方法および基質を、図１に示し、図面のキャプションに記載する。
【０１５０】
材料および方法
プライマーは、ＰｈｉＸ１７４の約４００ｂｐの断片を増幅するようにデザインした。これらのプライマーの５’端の各々は、５０ヌクレオチドの非相補的領域、ホモポリマーの連なり、または１０ヌクレオチドのホモポリマー区間の反復単位を含んでいた。これらは、ナノ細孔を介する制御された鎖の移行についての識別子のほか、移行の配向性を決定する識別子としても用いられる。加えて、フォワードプライマーの５’端を「キャッピング」して、４つの２’−Ｏ−メチル−ウラシル（ｍＵ）ヌクレオチドを含め、リバースプライマーの５’端を化学的にリン酸化させた。次いで、これらのプライマー修飾は、ラムダエクソヌクレアーゼを用いる、アンチセンス鎖だけの優先的に制御された消化を可能とする。ｍＵキャッピングが、センス鎖をヌクレアーゼ消化から保護するのに対し、アンチセンス鎖の５’側のＰＯ４は、ヌクレアーゼ消化を促進する。したがって、ラムダエクソヌクレアーゼを伴うインキュベーション後には、二重鎖のうちのセンス鎖だけが、ここでは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）として無傷を維持する。次いで、創出されたｓｓＤＮＡを、既に記載されている通りにＰＡＧＥ精製した。
【０１５１】
本実施例で記載される全ての実験において用いられるＤＮＡ基質のデザインを、図１Ｂに示す。ＤＮＡ基質は、ナノ細孔による捕捉の一助となる５０Ｔの５’側リーダーを伴う、ＰｈｉＸに由来するｓｓＤＮＡの４００塩基の区間からなる（配列番号１７２）。５０Ｔのリーダーの直後に、二重層の表面においてＤＮＡを濃縮し、したがって、捕捉効率を改善する３’側コレステロールタグを含有するプライマー（配列番号１７３）が、この鎖へとアニーリングされる。この鎖の３’端にさらなるプライマー（配列番号１７４）を用いて、３’端による鎖の捕捉の一助とする。
【０１５２】
緩衝液：４００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ
ナノ細孔：大腸菌（E.coli）ＭＳ（Ｂ２）８  ＭｓｐＡ  ＯＮＬＰ３４７６ＭＳ−（Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｄ９３Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８
酵素：ＴｒａＩ  Ｅｃｏ（配列番号６１；ＯＮＬＰ３５７２、約４．３μＭ）２３．３μｌ→１００ｎＭの最終濃度。
【０１５３】
電気的測定値は、１，２−ジフィタノイル−グリセロ−３−ホスホコリン脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）二重層内に挿入された単一のＭｓｐＡナノ細孔から収集した。二重層は、Ｍｏｎｔａｌ−Ｍｕｅｌｌｅｒ法により、厚さ２０μｍのＰＴＦＥ膜内に、直径約１００μｍの開口部を挟んで形成し（カスタムのＤｅｌｒｉｎチャンバー内で）、これにより、２つの１ｍＬ緩衝液を分離した。全ての実験は、言明された緩衝液中で実行した。単一チャネル電流は、１４４０Ａのデジタイザーを装備したＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で測定した。シスコンパートメント（これに、ナノ細孔および酵素／ＤＮＡの両方を添加する）を、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ｈｅａｄｓｔａｇｅのアース端子へと接続し、トランスコンパートメントを、ｈｅａｄｓｔａｇｅの活性電極へと接続するように、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極は、緩衝液へと接続した。二重層内の単一の細孔を達成した後、ＤＮＡポリヌクレオチドおよびヘリカーゼを、５０μＬの緩衝液へと添加し、５分間にわたりプレインキュベートした（ＤＮＡ＝１２．０ｎＭ、酵素＝２μＭ）。このプレインキュベーションミックスを、電気生理学チャンバーのシスコンパートメント内の９５０μＬの緩衝液へと添加して、ＭｓｐＡナノ細孔内のヘリカーゼ−ＤＮＡ複合体の捕捉を誘発した（ＤＮＡ＝０．６ｎＭ、酵素＝０．１μＭの最終濃度とした）。必要に応じて、二価の金属（１ｍＭのＭｇＣｌ２）およびＮＴＰ（１ｍＭのＡＴＰ）を、シスコンパートメントへと付加することにより、ヘリカーゼのＡＴＰアーゼ活性を誘発した。実験は、ポテンシャルを＋１４０ｍＶで一定として実行した。
【０１５４】
結果および考察
図１に示される通り、ヘリカーゼ−ＤＮＡ基質をＭｓｐＡナノ細孔へと付加すると、図２および３に示す通り、特徴的な電流の遮断がもたらされる。ヘリカーゼを結合させないＤＮＡは、ナノ細孔と一過性に相互作用して、短命（＜＜１秒間）の電流遮断をもたらす。図２および３に示す通り、ヘリカーゼを結合させ、かつ、活性（すなわち、ＡＴＰアーゼの作用下でＤＮＡ鎖に沿って移動する）のヘリカーゼを伴うＤＮＡは、電流の段階的な変化を伴う長い特徴的な遮断レベルをもたらす。ナノ細孔内の異なるＤＮＡモチーフは、固有の電流の遮断レベルを生じさせる。所与の基質について、ＤＮＡ配列を反映する特徴的な電流遷移パターンが観察される（図３における例）。
【０１５５】
図１に示される実装では、ＤＮＡが、鎖に沿ったランダムな位置においてヘリカーゼにより捕捉されるので、ＤＮＡ鎖は、ランダムな出発点から配列決定される。
【０１５６】
耐塩性
この種のナノ細孔による鎖配列決定実験は一般に、イオン性塩を必要とする。イオン性塩は、電圧オフセットを加えて、ＤＮＡを捕捉し、移行させ、結果として得られる、ＤＮＡがナノ細孔を通過するときの配列依存性の電流変化を測定するための導電性溶液を創出するのに必要である。測定シグナルは、イオンの濃度に依存性であるので、収集されるシグナルの大きさを増大させるためには、高濃度のイオン性塩を用いることが有利である。ナノ細孔による配列決定には、１００ｍＭのＫＣｌによる過剰塩濃度が理想的であり、４００ｍＭ以上のＫＣｌによる塩濃度が好ましい。
【０１５７】
しかし、多くの酵素（一部のヘリカーゼおよびＤＮＡモータータンパク質を含めた）は、高塩濃度条件に対して耐性でない。高塩濃度条件下において、酵素は、アンフォールドするか、もしくは構造的完全性を失うか、または適正に機能できなくなる。公知の研究されたヘリカーゼについての最新の文献は、ほぼ全てのヘリカーゼが、約１００ｍＭのＫＣｌ／ＮａＣｌを超える塩濃度で機能できなくなり、４００ｍＭ以上のＫＣｌによる条件で適正な活性を示すヘリカーゼは報告されていないことを示す。耐塩性の種に由来する類似する酵素の、潜在的に好塩性の変異体も存在するが、それらは、標準的な発現系（例えば、大腸菌（E. coli））において発現させ、精製するのが極めて困難である。
【０１５８】
本発明者らは、驚くべきことに、本実施例では、ＴｒａＩが、極めて高レベルの塩に至る耐塩性を提示することを示す。本発明者らは、蛍光実験でも、ナノ細孔実験でも、酵素が、４００ｍＭのＫＣｌ〜１ＭのＫＣｌによる塩濃度で機能性を保持することを見い出す。
【０１５９】
操作のフォワード方式およびリバース方式
大半のヘリカーゼは、一本鎖のポリヌクレオチド基質に沿って、単一方向的に移動し、各ＮＴＰアーゼの回転に応じた特定の数の塩基を移動させる。異なる方式でのヘリカーゼの移動を利用して、ＤＮＡをナノ細孔内に制御された形で送り込むことができる。図１では、操作の２つの基本的な「フォワード」方式および「リバース」方式について例示する。フォワード方式では、ＤＮＡをヘリカーゼにより細孔へと、印加された電界の力の下でＤＮＡが移動するのと同じ向きに送り込む。この向きを、トランス側の矢印で示す。５’〜３’ヘリカーゼであるＴｒａＩでは、この操作のために、ヘリカーゼがナノ細孔の上部に接触し、次いで、ＤＮＡを、ヘリカーゼの制御下で、ナノ細孔へと、印加されるポテンシャルに由来する電界と同じ向きに送り込む、すなわち、シス側からトランス側へと移動させるまで、ＤＮＡの５’端をナノ細孔内に捕捉することが要求される。リバース方式では、ＤＮＡの３’端を捕捉することが要求される。その後、ヘリカーゼが、印加されるポテンシャルに由来する電界と逆向きにナノ細孔から差し戻される、すなわち、トランス側からシス側へと移動して糸通しされるＤＮＡを引き出すように進む。図１は、ＴｒａＩ  Ｅｃｏを用いるこれらの２つの操作方式を示す。
【実施例２】
【０１６０】
この例では、酵素活性を調べるための蛍光アッセイを用いて、ＲｅｃＤヘリカーゼの耐塩性について例示する。
【０１６１】
カスタムの蛍光基質を用いて、ハイブリダイズしたｄｓＤＮＡを置換するヘリカーゼの能力についてアッセイした（図４Ａ）。図４Ａの１）に示す通り、蛍光基質鎖（５０ｎＭの最終濃度）は、５’側のｓｓＤＮＡ突出と、ハイブリダイズしたｄｓＤＮＡの４０塩基の区間とを有する。アッパー主鎖は、３’端においてカルボキシフルオレセイン基剤を有し、ハイブリダイズした相補体は、５’端においてＢｌａｃｋ−Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ−１）基剤を有する。ハイブリダイズすると、フルオレセインからの蛍光が、局所のＢＨＱ−１により消光され、基質は、本質的に非蛍光基質となる。短鎖の蛍光基質と相補的な１μＭの捕捉鎖を、アッセイに含める。２）に示す通り、ＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）の存在下で、基質へと添加されたヘリカーゼ（１００ｎＭ）は、蛍光基質の５’側テールに結合し、主鎖に沿って移動し、示される通りに相補鎖を置換する。３）に示す通り、ＢＨＱ−１との相補鎖が完全に置換されると、主鎖上のフルオレセインが蛍光発光する。４）に示す通り、過剰な捕捉鎖が、相補的なＤＮＡと優先的にアニーリングして、初期基質の再アニーリングおよび蛍光の喪失を防止する。
【０１６２】
基質ＤＮＡ：３’端の近傍にカルボキシフルオレセインを伴う配列番号１７５および５’端にＢｌａｃｋ−Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ-１を伴う配列番号１７６
捕捉ＤＮＡ：配列番号１７７
【０１６３】
図４Ｂのグラフは、１００ｍＭ〜１Ｍの異なる濃度のＫＣｌを含有する緩衝液（ｐＨ８．０の１００ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｎＭの蛍光基質ＤＮＡ、１μＭの捕捉ＤＮＡ）中の２つのＲｅｃＤヘリカーゼ（ＲｅｃＤ  ＮｔｈおよびＲｅｃＤ  Ｄｔｈ；配列番号２８および３５）の活性の初期比率を示す。ヘリカーゼは、１Ｍで働く。
【実施例３】
【０１６４】
本実施例では、異なるＴｒａＩヘリカーゼ、すなわち、ＴｒｗＣ  Ｃｂａ（配列番号６５）を用いた。全ての実験は、既に実施例１で記載した通りに、同じ実験条件（細孔＝ＭｓｐＡ  Ｂ２、ＤＮＡ＝４００マー配列番号１７２、１７３、および１７４、緩衝液＝４００ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ８．０の１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＭｇＣｌ２）下で実行した。図５は、この酵素を用いる、ヘリカーゼにより制御されたＤＮＡイベントの２つの典型的な例を示す。
【実施例４】
【０１６５】
本実施例では、多数の異なるＴｒｗＣヘリカーゼ（ＴｒｗＣ（Ａｔｒ）（配列番号１４４）、ＴｒｗＣ（Ｓａｌ）（配列番号１４０）、ＴｒｗＣ（Ｃｃｒ）（配列番号１３６）、およびＴｒｗＣ（Ｅｃｏ）（配列番号７４））を、ＤＮＡ（配列番号１７８、１７９（３’端に／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／ＴＴ／３ＣｈｏｌＴＥＧ／を伴う）、および１８０）の、Ｍｓｐナノ細孔である（ＭＳ−（Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｄ９３Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８、すなわち、Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを伴う配列番号２の８回反復配列内の移動を制御するためのそれらの能力について調べた。
【０１６６】
材料および方法
緩衝液：６２５ｍＭのＫＣｌ、７５ｍＭのフェロシアン化カリウム、２５ｍＭのフェリシアン化カリウム、ＴｒｗＣ（Ａｔｒ）、ＴｒｗＣ（Ｅｃｏ）、およびＴｒｗＣ（Ｃｃｒ）には、ｐＨ８．０の１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓであり、ＴｒｗＣ（Ｓａｌ）には、ｐＨ９．０の１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ
酵素：全て１００ｎＭの最終濃度である、ＴｒｗＣ（Ａｔｒ）（１００ｎＭ）またはＴｒｗＣ（Ｓａｌ）（１００ｎＭ）またはＴｒｗＣ（Ｃｃｒ）（１００ｎＭ）またはＴｒｗＣ（Ｅｃｏ）（１００ｎＭ）
【０１６７】
電気的測定値は、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極の代わりに白金電極を用いたことを除き、実施例１で記載した通りに、１，２−ジフィタノイル−グリセロ−３−ホスホコリン脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）二重層内に挿入された単一のＭｓｐＡナノ細孔から収集した。二重層内の単一の細孔を達成した後、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）およびｄＴＴＰ（ＴｒｗＣ（Ａｔｒ）、ＴｒｗＣ（Ｃｃｒ）、およびＴｒｗＣ（Ｅｃｏ）に５ｍＭ）またはＡＴＰ（ＴｒｗＣ（Ｓａｌ）に１ｍＭ）を、シスチャンバーへと添加し、＋１２０ｍＶのポテンシャルを印加して、対照実験を５分間にわたり試行した。ＤＮＡポリヌクレオチド（配列番号１７９および１８０とハイブリダイズさせた配列番号１７８；０．１ｎＭ）を、シスチャンバーへと添加し、＋１２０ｍＶのポテンシャルを印加して、別の対照実験を５分間にわたり試行した。最終的に、適切なヘリカーゼ（全て１００ｎＭの最終濃度で添加された、ＴｒｗＣ（Ａｔｒ）、ＴｒｗＣ（Ｓａｌ）、ＴｒｗＣ（Ｃｃｒ）またはＴｒｗＣ（Ｅｃｏ））を、電気生理学チャンバーのシスコンパートメントへと添加して、ＭｓｐＡナノ細孔内のヘリカーゼ−ＤＮＡ複合体の捕捉を誘発した。実験は、ポテンシャルを＋１２０ｍＶで一定として実行した。
【０１６８】
結果および考察
被験ヘリカーゼの各々について、ヘリカーゼにより制御されたＤＮＡ移動が観察された。例示的な出力波形を、それぞれ、図６〜９に示す。
【実施例５】
【０１６９】
本実施例では、多数の異なるＴｒｗＣヘリカーゼ（ＴｒｗＣ（Ｏｍａ）（配列番号１０６）、ＴｒｗＣ（Ａｆｅ）（配列番号８６）、およびＴｒｗＣ（Ｍｐｈ）（配列番号９４））を、ＤＮＡ（ＴｒｗＣ（Ｏｍａ）には配列番号１７２〜１７４であり、ＴｒｗＣ（Ａｆｅ）およびＴｒｗＣ（Ｍｐｈ）には配列番号１８２（３’端にコレステロールタグを伴う）とハイブリダイズした配列番号１８１）の、ＭｓｐＡナノ細孔である（ＭＳ−（Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｄ９３Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８、すなわち、Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを伴う配列番号２の８回反復配列内の移動を制御するためのそれらの能力について調べた。
【０１７０】
緩衝液：６２５ｍＭのＫＣｌ、７５ｍＭのフェロシアン化カリウム、２５ｍＭのフェリシアン化カリウム、ｐＨ８．０の１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ
酵素：全て１００ｎＭの最終濃度である、ＴｒｗＣ（Ｏｍａ）、ＴｒｗＣ（Ａｆｅ）、およびＴｒｗＣ（Ｍｐｈ）
【０１７１】
電気的測定値は、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極の代わりに白金電極を用いたことを除き、実施例１で記載した通りに、１，２−ジフィタノイル−グリセロ−３−ホスホコリン脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）二重層内に挿入された単一のＭｓｐＡナノ細孔から収集した。二重層内の単一の細孔を達成した後、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）を、シスチャンバーへと添加し、１２０ｍＶのポテンシャルを印加して、対照実験を５分間にわたり試行した。最終濃度０．１５ｎＭのＤＮＡポリヌクレオチド（ＴｒｗＣ（Ｏｍａ）には、配列番号１７２〜１７４（実施例１における場合と同様）、またはＴｒｗＣ（Ａｆｅ）およびＴｒｗＣ（Ｍｐｈ）には、配列番号１８２とハイブリダイズした配列番号１８１）、および最終濃度１００ｎＭの適切なヘリカーゼ（ＴｒｗＣ（Ｏｍａ）、ＴｒｗＣ（Ａｆｅ）、およびＴｒｗＣ（Ｍｐｈ））を、シスチャンバーへと添加し、＋１２０ｍＶのポテンシャルを印加して、別の対照実験を１０分間にわたり試行した。最終的に、ＡＴＰ（１ｍＭ）を電気生理学チャンバーのシスコンパートメントへと付加することにより、ヘリカーゼのＡＴＰアーゼ活性を誘発した。実験は、ポテンシャルを＋１２０ｍＶで一定として実行した。
【０１７２】
結果および考察
被験ヘリカーゼの各々について、ヘリカーゼにより制御されたＤＮＡ移動が観察された。例示的な出力波形を、それぞれ、図１０〜１２に示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１７３】
配列番号１は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−Ｂ１突然変異体をコードする、コドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。この突然変異体は、シグナル配列を欠き、以下の突然変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４Ｒ、およびＥ１３９Ｋを含む。
配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−Ｂ１突然変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示す。この突然変異体は、シグナル配列を欠き、以下の突然変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４Ｒ、およびＥ１３９Ｋを含む。
配列番号３は、α−ヘモリシン−Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ（α−ＨＬ−ＮＮ；Stoddartら、PNAS、2009; 106(19): 7702〜7707）の１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号４は、α−ＨＬ−ＮＮの１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号５〜７は、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ、およびＭｓｐＤのアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、ＲｅｃＤ様モチーフＩの配列を示す。
配列番号９、１０、および１１は、伸長ＲｅｃＤ様モチーフＩの配列を示す。
配列番号１２は、ＲｅｃＤモチーフＩの配列を示す。
配列番号１３、１４、および１５は、伸長ＲｅｃＤモチーフＩの配列を示す。
配列番号１６は、ＲｅｃＤ様モチーフＶの配列を示す。
配列番号１７は、ＲｅｃＤモチーフＶの配列を示す。
配列番号１８〜４５は、表５のＲｅｃＤヘリカーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４６〜５３は、ＭｏｂＦモチーフＩＩＩの配列を示す。
配列番号５４〜６０は、ＭｏｂＱモチーフＩＩＩの配列を示す。
配列番号６１〜１７１は、表７に示されるＴｒａＩヘリカーゼおよびＴｒａＩ亜群ヘリカーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７２〜１８２は、実施例で用いられる配列を示す。
【図１】
2015503917.tif 000047
【図２】
2015503917.tif 000048
【図３】
2015503917.tif 000049
【図４Ａ】
2015503917.tif 000050
【図４Ｂ】
2015503917.tif 000051
【図５】
2015503917.tif 000052
【図６】
2015503917.tif 000053
【図７】
2015503917.tif 000054
【図８】
2015503917.tif 000055
【図９】
2015503917.tif 000056
【図１０】
2015503917.tif 000057
【図１１】
2015503917.tif 000058
【図１２】
2015503917.tif 000059
【配列表】
2015503917000001.app
【国際調査報告】
2015503917.tif 000060
2015503917.tif 000061
2015503917.tif 000062