(57)【要約】  本発明は、軟部組織のバイオフィルムが形成しているまたは形成することが予期される上皮組織および粘膜を含む軟部組織の処置における使用のためのオキアミからの酵素の混合物に関し、ここで軟部組織は哺乳類動物の軟部組織であり、処置は、バイオフィルムの除去またはバイオフィルムの形成を防ぐことを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟部組織のバイオフィルムが形成されているまたは形成されることが予期される上皮組織および粘膜を含む軟部組織の処置における使用のためのオキアミからの酵素の混合物であって、ここで該軟部組織は哺乳類動物の軟部組織であり、およびここで該処置は該バイオフィルムの除去または該バイオフィルムの形成を防ぐことを含む、前記混合物。
【請求項２】
混合物が、カルボヒドラーゼ、脂肪分解酵素および／またはプロテアーゼ、とくにセリンプロテアーゼ、とくにトリプシン様活性またはキモトリプシン様活性を伴うセリンプロテアーゼ、エンドペプチダーゼおよび／またはエキソペプチダーゼ、とくにカルボキシペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼを含む、請求項１に記載の混合物。
【請求項３】
酵素の混合物が、少なくとも２つの、とくに３つのキモトリプシン様、トリプシン様、エンドペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼ活性を有し、および／または酵素の混合物が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して、１０ｋＤ〜１００ｋＤの範囲の、とくに１５ｋＤ〜６０ｋＤの範囲の、とくに２０ｋＤ〜４０ｋＤの範囲の分子量を有する酵素を含む、請求項１または２に記載の混合物。
【請求項４】
混合物が、本質的にエンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼを含むプロテアーゼからなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項５】
バイオフィルムが、哺乳類動物の炎症性または微生物性状態を引き起こすバイオフィルムであり、処置がこの状態の処置を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項６】
軟部組織が、粘膜、とくにアフタもしくはヘルペス単純ウイルス感染により損傷された粘膜または尿路の粘膜または胃腸管の粘膜、とくに口腔粘膜、食道の粘膜または胃の粘膜、とくにHelicobacter pyloriに侵された胃の粘膜、または皮膚の、とくに真菌症もしくは濾胞ユニットに侵された皮膚の上皮、または移植片の表面上の、移植レセプトの移植片接触部位の表面上のおよび／または移植片の移植片接触部位の表面上の結合組織、あるいは手術または慢性もしくは急性創傷または熱傷の創傷により露出した結合組織である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項７】
移植片が、皮膚代用品、とくに生きている皮膚代用品である、請求項６に記載の混合物。
【請求項８】
軟部組織が食道の粘膜であり、状態が逆流である、請求項６に記載の混合物。
【請求項９】
軟部組織が口腔粘膜であり、状態が放射線または化学療法により誘発された口腔粘膜炎である、請求項６に記載の混合物。
【請求項１０】
処置が、経口投与によるまたは局所適用による、とくに混合物の徐放性製剤の経口投与または局所投与による、請求項１〜９のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１１】
処置が、１日当たり少なくとも４、とくに６、とくに７、とくに８回、混合物の経口投与または局所投与による、請求項１０に記載の混合物。
【請求項１２】
処置が、少なくとも３日間、とくに４日間、とくに５日間、とくに１週間、とくに２週間の処置、または最長１か月の処置である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１３】
混合物のカゼイン−タンパク質分解活性は、混合物のｍｌまたはｇ当たり０．０００３〜３０の範囲、とくに０．００３〜２０の範囲、とくに０．０３〜１０の範囲、とくに０．３〜５の範囲のユニットである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１４】
オキアミがナンキョクオキアミ（Euphausia superba）である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１５】
上皮組織および粘膜を含む軟部組織の処置方法であって、軟部組織が哺乳類動物の軟部組織であり、処置が以下の工程を含む、前記処置方法：
−  該軟部組織がバイオフィルムを含むかどうか決定すること、
−  それがバイオフィルムを含む場合、オキアミからの酵素の混合物を、該バイオフィルムを該混合物と接触させるために、前記バイオフィルムを含む軟部組織の部位へ適用すること、ならびに
−  該混合物と該バイオフィルムとの接触を、バイオフィルムの分解に十分な時間維持すること。
【請求項１６】
混合物が、請求項２〜４のいずれか一項に特定される混合物である、請求項１５に記載の処置方法。
【請求項１７】
バイオフィルムが、前記哺乳類動物の炎症性または微生物性状態を引き起こすバイオフィルムであり、処置がこの状態の処置を含む、請求項１５または１６に記載の処置方法。
【請求項１８】
軟部組織が、粘膜、とくにアフタもしくはヘルペス単純ウイルス感染により損傷された粘膜または尿路の粘膜または胃腸管の粘膜、とくに口腔粘膜、食道の粘膜または胃の粘膜、とくにHelicobacter pyloriに侵された胃の粘膜、または皮膚の、とくに真菌症もしくは濾胞ユニットに侵された皮膚の上皮、または移植片の表面上の、移植レセプトの移植片接触部位の表面上のおよび／または移植片の移植片接触部位の表面上の結合組織、あるいは手術または慢性もしくは急性創傷または熱傷の創傷により露出した結合組織である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の処置方法。
【請求項１９】
移植片が皮膚代用品、とくに生きている皮膚代用品である、請求項１８に記載の処置方法。
【請求項２０】
軟部組織が食道の粘膜であり、状態が逆流である、請求項１８に記載の処置方法。
【請求項２１】
軟部組織が口腔粘膜であり、状態が放射線または化学療法により誘発された口腔粘膜炎である、請求項１８に記載の処置方法。
【請求項２２】
混合物を、経口投与によりまたは局所適用により、とくに混合物の徐放性製剤の経口投与または局所適用により適用する、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の処置方法。
【請求項２３】
混合物を、１日当たり少なくとも４、とくに６、とくに７、とくに８回、経口投与または局所適用により適用する、請求項２２に記載の処置方法。
【請求項２４】
処置が、少なくとも３日間、とくに４日間、とくに５日間、とくに１週間、とくに２週間の処置、または最長１か月の処置である、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の処置方法。
【請求項２５】
混合物のカゼイン−タンパク質分解活性が、混合物のｍｌまたはｇ当たり、０．０００３〜３０の範囲、とくに０．００３〜２０の範囲、とくに０．０３〜１０の範囲、とくに０．３〜５の範囲のユニットである、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の処置方法。
【請求項２６】
オキアミがナンキョクオキアミ（Euphausia superba）である、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオフィルムの除去における使用のためのオキアミからの酵素の混合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Hahn Berg, I.C. et al., Eur. J. Oral. Sci. 2001, 109, pages 316-324から、「オキアミーゼ」と呼ばれるナンキョクオキアミからのプロテアーゼを用いる、インビトロおよびインビボでのデンタルプラークの形態の口内バイオフィルムのタンパク質分解性分解が知られている。プラークは、歯牙の固体表面上に形成する極めて特定のバイオフィルムであり、バイオフィルムは唾液タンパク質、複合微生物性群集、および細菌および唾液起源のポリマーのマトリックスを含む。
【０００３】
Hellgren, K., J. Clin. Dent. 2009, 20, pages 99 - 102から、歯肉炎およびデンタルプラークの低減のためのオキアミーゼチューイングガムの使用は知られている。この文献によると、口内表面への細菌性付着または粘着を限定することを伴うデンタルバイオフィルムの崩壊は、プラーク形成、および結果的には、多くの歯周疾患を防ぐための道となり得る。
【０００４】
US 2005/0025722 A1は、オキアミ由来の多機能性酵素であり得る多機能性酵素の使用を開示する。酵素は、胃腸疾患を引き起こす感染などの微生物性感染の処置のため、創傷感染の処置のため、または急性もしくは慢性炎症の処置のために用い得る。
【０００５】
さらに、創傷の治癒を促進すべく、創傷のデブリドマンのためにオキアミ酵素混合物を使用することが知られている。デブリドマンプロテアーゼ酵素および細胞構造タンパク質および／または細胞付着タンパク質の変性剤の組合せの投与により内的な癌性病変を選択的に破壊するための組成物に関するWO 2008/063229 A2によると、酵素性デブリドマンは、生きていない組織を除去するために身体の外からの酵素の使用を含む。デブリドマン酵素は、細胞の大きな不動構造分子を、溶解および遊走することができるより小さな分子へと切断する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の課題は、オキアミからの酵素の混合物のためのさらなる使用およびさらなる処置方法を提供するものである。
【０００７】
課題は、請求項１および１５の特徴により解決される。有用な態様は、請求項２〜１４および１６〜２６の発明特定事項である。
【０００８】
本発明によると、上皮組織および粘膜を含む軟部組織の処置における使用のためのオキアミからの酵素の混合物が提供される。軟部組織は、バイオフィルムが形成されているまたは形成されることが予期される哺乳類動物の軟部組織である。バイオフィルムが形成されている場合、処置はバイオフィルムの除去を含み、バイオフィルムが形成されることが予期される場合、処置はバイオフィルムの形成を防ぐことを含む。オキアミからの酵素の混合物は、バイオフィルムの形成を除去または防ぐために用いられる。バイオフィルムの除去は通常、バイオフィルムを酵素の混合物と接触させることを含む。バイオフィルムの形成を防ぐことは通常、バイオフィルムの形成が生じると予期される表面を酵素の混合物と接触させることを含む。軟部組織上に形成されるバイオフィルムは、歯牙上にプラークを形成するバイオフィルムを含む唾液タンパク質とは異なる。これはとくに、口腔内の特定の環境およびｐＨに起因する。バイオフィルムは、特定のタンパク質、他の物質、群集として作用する微生物および微生物により排出された細胞外ポリマーを含む表面上のフィルムである。軟部組織上のバイオフィルムは、これらの構成成分に加えて、この軟部組織から排出されたタンパク質および／または糖タンパク質を通常含む。
【０００９】
Rhoads, D.D. et al. “Evidence of Biofilms in wounds and the Potential Ramifications”, Biofilm Club 2007, pages 1 to 15によると、多くの種多様性を伴うバイオフィルムは、炎症反応不良を呈する易感染宿主の創傷において形成される。不十分な炎症反応は、創傷の初期の細菌を効率的に管理しない。結果的に、細菌は創傷内に持続することができ、宿主の自然防衛力を上回ることができるだけでなく、抗菌療法および他の管理戦略に抵抗性でもあるバイオフィルム群集を樹立することができる。バイオフィルムは、成功した治療的手段がバイオフィルム感染を取り除くことを助けることができない限り、炎症段階における創傷を慢性的に維持する。バイオフィルムはさらに、とくに熱傷の創傷における、敗血症を引き起こし得または補助し得る。バイオフィルムは、創傷が細菌および残骸から清められる前後に形成され得る。
【００１０】
James G. A. et al. 2008, Wound Repair and Regeneration 16 (1), pages 37-44によると、５０の慢性創傷検体および１６の急性創傷検体を含む研究が、慢性創傷検体の６０％および急性創傷検体の６％がバイオフィルムを含有したことを明らかにした。慢性創傷検体の分子学的解析は、培養では明らかにされなかった、多様な多微生物性群集および厳格な嫌気性細菌を含む細菌の存在を明らかにした。
【００１１】
本発明者らは驚くべきことに、軟部組織上に形成されるバイオフィルムを、オキアミからの酵素の混合物の使用により、軟部組織を破壊することなく除去することができることを見いだした。彼らはまた、彼らがバイオフィルムに関連すると見出した疾患および他の状態においていくつかの利点を有することも見出した。
【００１２】
混合物は、カルボヒドラーゼ、脂肪分解酵素および／またはプロテアーゼ、とくにセリンプロテアーゼ、とくにトリプシン様活性またはキモトリプシン様活性を伴うセリンプロテアーゼ、エンドペプチダーゼおよび／またはエキソペプチダーゼ、とくにカルボキシペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼを含み得る。混合物は、タンパク質分解、脂肪分解性および炭水化物分裂活性を含むオキアミからの粗抽出液、または主にタンパク質分解活性を有するよう、粗抽出液より精製されたオキアミからの抽出液であり得る。
【００１３】
本発明の態様によると、酵素の混合物は、少なくとも２つの、とくに３つのキモトリプシン様、トリプシン様、エンドペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼ活性を有し、および／または酵素の混合物が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して、１０ｋＤ〜１００ｋＤの範囲の、とくに１５ｋＤ〜６０ｋＤの範囲の、とくに２０ｋＤ〜４０ｋＤの範囲の分子量を有する酵素を含む。
【００１４】
混合物は、本質的にエンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼを含むプロテアーゼからなり得る。
【００１５】
バイオフィルムは、前記哺乳類動物の炎症性または微生物性状態（microbial condition）を引き起こすバイオフィルムであり得、処置はこの状態の処置を含み得る。
【００１６】
本発明の一態様によると、軟部組織は、粘膜、とくにアフタもしくはヘルペス単純ウイルス感染により損傷された粘膜または尿路の粘膜または胃腸管の粘膜、とくに口腔粘膜、食道の粘膜または胃、とくにHelicobacter pyloriに侵された胃の粘膜である。軟部組織は、皮膚の、とくに真菌症または濾胞ユニットに侵された皮膚の上皮でもまたあり得る。濾胞ユニットは、自然発生毛胞であるか、または患者の第二の部位において移植される毛修復患者の第一の部位からの毛（単数または複数）と共に一緒に抽出される２つから４つの毛胞のグルーピングである。濾胞ユニットは、移植の前またはさらには後に酵素の混合物と共に処置され得る。
【００１７】
軟部組織は、移植片の表面上の、移植レセプトの移植片接触部位の表面上のおよび／または移植片の移植片接触部位の表面上の結合組織でまたあり得る。移植片は皮膚代用品、とくに生きている皮膚代用品であり得る。本発明者らは、バイオフィルムが前記接触部位上に形成されること、および移植前のこのバイオフィルムの除去が、多様な成長因子のアクセスを改善し、それにより移植片および移植レセプトの一緒の成長を改善することを見いだした。移植片は、移植される臓器でもあり得る。ドナーからの臓器の除去とそれをレシピエントへの挿入との間の時間に、バイオフィルムが形成し得る。かかる臓器上のバイオフィルムが移植前に除去されない場合、バイオフィルムは、とくに移植を受ける患者の免疫抑制により、移植の後に体内で拡大し得る。軟部組織は、手術により露出した結合組織でもまたあり得る。それは、慢性もしくは急性創傷または熱傷の創傷でもまたあり得る。
【００１８】
もう一つの態様において、軟部組織は食道の粘膜であり、状態は逆流である。
【００１９】
さらなる態様によると、軟部組織は口腔粘膜であり、状態は放射線または化学療法により誘発された口腔粘膜炎である。
【００２０】
処置は、経口投与にまたは局所適用に、とくに混合物の徐放性製剤の経口投与にまたは局所投与により得る。
【００２１】
処置は、１日当たり少なくとも４、とくに６、とくに７、とくに８回、混合物の経口投与または局所投与により得る。
【００２２】
一つのさらなる態様によると、処置は、少なくとも３日間、とくに４日間、とくに５日間、とくに１週間、とくに２週間の処置、または最長１か月の処置である。
【００２３】
混合物のカゼイン−タンパク質分解活性は、混合物のｍｌまたはｇ当たり０．０００３〜３０の範囲、とくに０．００３〜２０の範囲、とくに０．０３〜１０の範囲、とくに０．３〜５の範囲のユニットであり得る。
【００２４】
オキアミは、ナンキョクオキアミ（Euphausia superba）であり得る。
【００２５】
本発明は上皮組織および粘膜を含む軟部組織の処置方法であって、軟部組織が哺乳類動物の軟部組織であり、処置が以下の工程を含む、前記処置方法にさらに関する：
【００２６】
−  該軟部組織がバイオフィルムを含むかどうか決定すること、
−  それがバイオフィルムを含む場合、オキアミからの酵素の混合物を、該バイオフィルムを該混合物と接触させるために、前記バイオフィルムを含む軟部組織の部位へ適用すること、ならびに
−該混合物と該バイオフィルムとの接触を、バイオフィルムの分解に十分な時間維持すること。
【００２７】
混合物は、上で特定される混合物であり得る。一態様において、バイオフィルムは、前記哺乳類動物の炎症性または微生物性状態を引き起こすバイオフィルムであり、処置はこの状態の処置を含む。軟部組織は、粘膜、とくにアフタもしくはヘルペス単純ウイルス感染により損傷された粘膜または尿路の粘膜または胃腸管の粘膜、とくに口腔粘膜、食道の粘膜または胃、とくにHelicobacter pyloriに侵された胃の粘膜、または皮膚の、とくに真菌症もしくは濾胞ユニットに侵された皮膚の上皮、または移植片の表面上の、移植レセプトの移植片接触部位の表面上のおよび／または移植片の移植片接触部位の表面上の結合組織、あるいは手術または慢性もしくは急性創傷または熱傷の創傷により露出した結合組織であり得る。移植片は皮膚代用品、とくに生きている皮膚代用品であることができる。
【００２８】
処置方法の特定の態様において、軟部組織は食道の粘膜であり、状態は逆流である。もう一つの特定の態様において、軟部組織は口腔粘膜であり、状態は放射線または化学療法により誘発された口腔粘膜炎である。
【００２９】
混合物を、経口投与によりまたは局所適用により、とくに混合物の徐放性製剤の経口投与または局所投与により、適用し得る。混合物を、１日当たり少なくとも４、とくに６、とくに７、とくに８回、経口投与によりまたは局所適用により適用することができる。
【００３０】
処置は、少なくとも３日間、とくに４日間、とくに５日間、とくに１週間、とくに２週間の処置、または最長１か月の処置であり得る。
【００３１】
処置方法の一態様において、混合物のカゼイン−タンパク質分解活性は、混合物のｍｌまたはｇ当たり０．０００３〜３０の範囲、とくに０．００３〜２０の範囲、とくに０．０３〜１０の範囲、とくに０．３〜５の範囲のユニットである。オキアミはナンキョクオキアミ（Euphausia superba）であり得る。
【００３２】
例
例１：走査型電子顕微鏡法による慢性創傷におけるバイオフィルムの同定
【００３３】
いくつかのパンチバイオプシー−少なくとも４ｃｍ×５ｃｍ−が取れるのに十分な大きさの治癒していない創傷を有する患者は、実験に参加することに同意する。研究は、走査型電子顕微鏡法を介して、オキアミからの酵素の混合物の適用前後のバイオフィルム構造を決定することに的を絞る。
【００３４】
創傷を、経時的な比較写真をとることができるために、標準化視点から撮影する。次いで、創傷の対立する側の２つの創傷試料をパンチバイオプシーを介して取り、慣用的に受容される手順で試料を固定する。固定を、ｐＨ７．２の０．１Ｍリン酸緩衝の溶液（ＰＢＳ）中の２．５％グルタルアルデヒドにおける培養により実行され得、ＰＢＳでの３回洗浄および脱水が続く。試料を、検体スタブに両面テープでくっつけ、金−プラチナ（５０：５０）イオンコーティングが続く。試料マウンティングを改善するため、試料の背面を除去することができる。試料を、６ｋＶ−１０ｋＶの走査電圧で作動することができる標準走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて可視化する。James G. A. et al. 2008, Wound Repair and Regeneration 16 (1), pages 37-44もまた参照のこと。
【００３５】
この初期の「ベースライン」試料採取の直後に、本発明によるオキアミからの酵素の混合物の溶液の５適用を、２時間間隔で３日間、計１５適用、患者が受ける予定とする。用いるオキアミからの酵素の混合物の溶液は、凍結乾燥されたEuphausia抽出液粉末の６０カゼインユニットを含有するバイアルとして、ＥＰ０１０７６３４Ａ２で開示されるように調製し得、またはArcimboldo AB, Kraeftriket 11, SE-104 05ストックホルム、スウェーデンから購入した標準オキアミーゼ（登録商標）ストック製品であり得、１０ｍｌ滅菌０．９％塩化ナトリウム溶液で再構築され得る。適用のために、滅菌ガーゼを創傷に従って形づくり、溶液に浸し、創傷へ適用する。その後創傷部位を、乾燥を防ぐために閉塞性フィルムでカバーする。毎３適用後に、写真を撮る。
【００３６】
酵素混合物溶液の最後の適用の２時間後に、もう２回のパンチバイオプシーを、第一の２つのバイオプシー部位と近接して取る。試料は、上記のように扱う。
【００３７】
結果：第一セットのＳＥＭ写真は、多微生物性バイオフィルムを明らかに示すだろう。第二セットの写真は、創傷の外観が、酵素混合物適用数の増加に伴い改善することを示すだろう。最後のセットのＳＥＭ写真は、清潔な創傷および構築されたバイオフィルムの欠如を明らかに示すだろう。患者は、移植手順のために入院させるだろう。
【００３８】
例２：組織学的解析
二人の患者が、本発明の酵素の混合物の適用前後に標準組織学的解析を介してバイオフィルムの存在を決定する目的を伴う研究に参加することに同意する。彼らは夫々、いくつかのパンチバイオプシーを取るのに十分な大きさの治癒していない創傷（少なくとも４ｃｍ×５ｃｍ）を有する。二人の患者の創傷を、経時的な比較写真をとることができるように、標準化視点から撮影する。次いで二人の患者の各創傷を、創傷の対立する側で、パンチバイオプシーを介して試料採取する。切除した試料を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色（ＨＥ）のために、それらの最大径で二分することによって、組織学的解析のために調製する。次いで組織をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、４μｍ切片へ切断する。パラフィンをキシレン洗浄で除去し、光学顕微鏡下の解析のために試料を調製するための標準ヘマトキシリンおよびエオシン染色プロトコールが続く。スライドを、マスクされた観察者により、デジタル解析システムを用いて検査し、全ての組織学的切片を評価する。
【００３９】
この初期の「ベースライン」試料採取の直後に、本発明によるオキアミからの酵素の混合物の溶液の５適用を、２時間間隔で３日間、計１５適用、患者が受ける予定とする。用いるオキアミからの酵素の混合物の溶液は、例１で記載されたものと同じであり得る。溶液の適用は、例１で記載されたとおりである。毎３適用後に、写真を撮る。
【００４０】
酵素混合物溶液の最後の適用の２時間後に、もう２回のパンチバイオプシーを、第一の２つのバイオプシー部位と近接して取る。試料は、上記のように扱う。
【００４１】
結果：第一の患者についての第一セットのスライドは、多微生物性バイオフィルムを明らかに示す一方、第二の患者については識別可能な細菌性コロニーがないだろう。第二セットの写真は、両患者について、創傷の外観が、酵素混合物適用数が増加するのに伴って改善していることを示すだろう。第一の  患者の場合、バイオフィルムの分解およびさらには創傷の既知のデブリドマンが生じ、他方で第二の患者の場合、既知のデブリドマンのみが生じる。最後のセットのスライドは、両患者について、構築されたバイオフィルムの欠如、および清潔な創傷を示すだろう。
【００４２】
例３：微生物性シークエンシング
バイオフィルムは多微生物性であり、抗菌処置療法にとっては、病原体が何か、および感染部位に如何なる相対的割合で存在するかを知るために価値がある。
【００４３】
約１０人の患者が、PathoGenius(登録商標) Laboratories, 1004 Garfield Dr., Building #340, Lubbock, Texas 79416から提供されたDecodEX（商標）微生物性シークエンシングを介して、本発明のオキアミからの酵素の混合物の適用前後の創傷細菌構成を研究することに参加することを同意する。彼らは夫々、いくつかのパンチバイオプシーを取るのに十分な大きさの治癒していない創傷（少なくとも４ｃｍ×５ｃｍ）を有する。１０人の患者の創傷を、経時的な比較写真をとることができるように、標準化視点から撮影する。次いで患者の各創傷を、Pathogenius Laboratoriesから提示された指示に従って試料採取する。
【００４４】
一般に：１．鋭匙または他のデブリドマン用具を用いて試料を得る。２．試料（組織または全体的な適用装置チップ）を提供された容器へと配置する、３．試料を提供された発送キット容器でPathogenius Laboratoriesへ送る。
【００４５】
この初期の「ベースライン」試料採取の直後に、本発明によるオキアミからの酵素の混合物の溶液の５適用を、２時間間隔で３日間、計１５適用、患者が受ける予定とする。用いるオキアミからの酵素の混合物の溶液は、例１で記載されたものと同じであり得る。溶液の適用は、例１で記載されたとおりである。毎３適用後に、写真を撮る。
【００４６】
酵素混合物溶液の最後の適用の２時間後に、各患者の創傷を再度、第一の２つの試料採取場所と近接して試料採取する。試料は、上記のように扱う。
【００４７】
結果：第一のセットの表は、患者の大部分が多微生物性バイオフィルム感染を有するが、何人かの患者は多微生物性構成を示さないことを示すだろう。次のセットの写真は、全患者について、創傷の外観が、酵素混合物適用数が増大するのに伴い改善することを示すだろう。最後のセットの表は、創傷の多微生物性汚染度合が徹底的に低減するか、または多微生物性汚染が取り除かれることを示すだろう。
【００４８】
例４：スワビングおよび微生物性シークエンシングを介するバイオフィルム同定
小さな創傷（肛門裂傷）を有し、該創傷からいくつかのバイオプシーが試料採取できない患者が、実験に参加することに同意する。研究は、回収された創傷表面液体のスワビングおよび微生物性シークエンシングを介して、本発明によるオキアミからの酵素の混合物の適用前後の小さな湿創傷におけるバイオフィルム構成を決定するのことに的を絞る。
【００４９】
Pathogenius Laboratoriesからの「２４時間急速スクリーニング（24-Hour Rapid Screening）」試料採取キットを、Staphylococcus（MRSAを含む）、Streptococcus、Haemophilus、Enterococcus(VREを含む)、Pseudomonas、Serratia、Candida、およびさらに多くのものを含む最も一般に同定される微生物（microbe）について検体を検査するために用いるだろう。
【００５０】
患者は、通常とは異なり、排便し、部位を清潔にするよう指示される。次いで清潔にしてから２時間後、経時的な比較写真を撮ることができるように、患者の肛門裂傷を標準化視点から撮影するだろう。次いで、患者の肛門粘膜創傷表面を、Pathogenius Laboratoriesにより提示された指示（一般的なスワビング技術）に従って試料採取する。一般に：滅菌コットンチップされた適用装置を用いて試料を得る。２．試料全体適用装置チップを提供された容器へと配置する、３．試料を提供された発送キット容器でPathogenius Laboratoriesへ送る。
【００５１】
この初期の「ベースライン」試料採取の直後に、本発明によるオキアミからの酵素の混合物の溶液の６適用を、１時間間隔で、患者が受ける予定とする。この間、患者は排便をすることは許されない。用いるオキアミからの酵素の混合物の溶液は、例１で記載されたものと同じであり得る。適用のために、滅菌ガーゼを溶液に浸し、創傷へ適用する。毎３適用後に、写真を撮る。
【００５２】
酵素混合物溶液の最後の適用の１時間後に、肛門裂傷創傷を上記のように再度試料採取する。
【００５３】
結果：第一の表は、多微生物性バイオフィルム感染を示唆するものである創傷のベースライン細菌性構成を示すだろう。次のセットの写真は、創傷の外観が、酵素混合物適用数が増大することに伴い改善することを示すだろう。最後の表は、多微生物性感染度合が徹底的に低減すること、および創傷における細菌性の種族の数が以前よりも下がることを示すだろう。
【００５４】
例５：移植される臓器上のバイオフィルムの形成を防ぐための、本発明によるオキアミからの酵素の混合物の使用
【００５５】
臓器が移植されることが意図されるドナーから臓器を除去した直後、バイオフィルムがその表面に形成され得る。バイオフィルムの形成を防ぐために、臓器を、ドナーからの除去直後に、本発明によるオキアミからの酵素の混合物を含む滅菌０．９％塩化ナトリウム溶液にいれる。臓器の生命維持のために、レシピエントのその輸送の間、これを約４℃のこの溶液に維持する。オキアミからの酵素は、４℃でまだ活性であるため、かかる適用のために予め仕向けられる。さらなる利点は、ヒトの体内で酵素が極めて迅速に不活化することから、移植前に臓器の表面から残留酵素溶液を除去することが必要とされないことである。
【００５６】
例６：Helicobacter pylori（H. pylori)バイオフィルムの除去のための本発明によるオキアミからの酵素の混合物の使用
【００５７】
H. pylori感染の従来の療法への耐性は、しばしばバイオフィルム形成と関連する。H. pyloryにより形成されたバイオフィルムは、細菌を取り巻く複合微生物学的生態系であり、胃の厳しい環境における増殖を許す。ヒト胃粘膜上のH. pyloriバイオフィルムは、胃潰瘍の原因であることが実証されている。
【００５８】
H. pyloriバイオフィルムを分解するために、患者をオメプラゾールで２日間処置して、彼らの胃のｐＨを標準化する。その後、オメプラゾールでの処置は維持され、さらに患者を、酵素の混合物を含むゼラチンカプセルを１日当たり３回７日間投与により、本発明によるオキアミからの酵素の混合物で処置する。バイオフィルム除去の後に、胃のバイオプシーの試料採取およびバイオフィルムの存在についてのバイオプシーの検査が平行して続く。検査は、例１で記載されたとおりに、走査型電子顕微法により実施し得る。
【００５９】
例７：移植後の濾胞ユニットの処置のための本発明によるオキアミからの酵素の混合物の使用
【００６０】
移植されたばかりの濾胞ユニットを伴う患者の皮膚部位を、本発明によるオキアミからの酵素の混合物を適用することにより処置する。部位は、濾胞ユニットが挿入された各場所における小さな創傷を含む。用いられるオキアミからの酵素の混合物の溶液は、例１で記載されたものと同じであり得る。適用のために、滅菌ガーゼを溶液に浸し、部位へ１日当たり２回７日間適用する。この適用により、濾胞ユニットおよび／または創傷に形成したバイオフィルムが除去される、および／または濾胞ユニットおよび／または創傷でのバイオフィルムの形成が防がれ、著しい傷痕形成を伴わず、移植されたばかりの毛の著しい損失を伴わない、相対的に早い治癒をもたらす。
【手続補正書】
【提出日】平成26年6月12日(2014.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類動物の軟部組織上に形成されたバイオフィルムに関係する疾患または起因する炎症状態の処置における使用のためのナンキョクオキアミ（Euphausia superba）からの酵素の混合物であって、該処置は、該バイオフィルムの除去または該バイオフィルムの形成を防ぐことを含む該軟部組織の処置を含み、ここで該混合物は、本質的にエンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼを含むプロテアーゼからなり、ここで該酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して、２０ｋＤ〜４０ｋＤの範囲の分子量を有する酵素を有する、前記混合物。
【請求項２】
混合物が、セリンプロテアーゼ、トリプシン様活性を伴うセリンプロテアーゼ、またはキモトリプシン様活性を伴うセリンプロテアーゼを含む、請求項１に記載の混合物。
【請求項３】
酵素の混合物が、キモトリプシン様および／またはトリプシン様活性を有する、請求項１または２に記載の混合物。
【請求項４】
軟部組織が、上皮組織または粘膜である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項５】
軟部組織が、アフタもしくはヘルペス単純ウイルス感染により損傷された粘膜または尿路の粘膜、胃腸管の粘膜、口腔粘膜、食道の粘膜、胃の粘膜、Helicobacter pyloriに侵された胃の粘膜、皮膚の上皮、真菌症もしくは濾胞ユニットに侵された皮膚の上皮、または移植片の表面上の、移植レセプトの移植片接触部位の表面上のおよび／または移植片の移植片接触部位の表面上の結合組織、あるいは手術または慢性もしくは急性創傷、肛門裂傷または熱傷の創傷により露出した結合組織である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項６】
移植片が、皮膚代用品または生きている皮膚代用品である、請求項５に記載の混合物。
【請求項７】
軟部組織が食道の粘膜であり、疾患または状態が逆流である、請求項５に記載の混合物。
【請求項８】
軟部組織が口腔粘膜であり、疾患または状態が放射線または化学療法により誘発された口腔粘膜炎である、請求項５に記載の混合物。
【請求項９】
処置が、経口投与によるまたは局所適用による、請求項１〜８のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１０】
処置が、混合物の徐放性製剤の経口投与または局所投与による、請求項９に記載の混合物。
【請求項１１】
処置が、１日当たり少なくとも４、６、７、または８回、混合物の経口投与または局所投与による、請求項９または１０に記載の混合物。
【請求項１２】
処置が、少なくとも３日間、４日間、５日間、１週間、または２週間の処置、または最長１か月の処置である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１３】
混合物のカゼイン−タンパク質分解活性は、混合物のｍｌまたはｇ当たり０．０００３〜３０の範囲、０．００３〜２０の範囲、０．０３〜１０の範囲、または０．３〜５の範囲のユニットである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１４】
哺乳類の疾患または炎症性状態の処置方法であって、処置は以下の工程を含む、前記処置方法：
−  軟部組織がバイオフィルムを含むかどうか決定すること、ここで該疾患が該バイオフィルムに関係するまたは炎症状態が該バイオフィルムに起因する、
−  それがバイオフィルムを含む場合、ナンキョクオキアミ（Euphausia superba）からの酵素の混合物を、該バイオフィルムを該混合物と接触させるために、前記バイオフィルムを含む軟部組織の部位へ適用すること、ここで該混合物は、本質的にエンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼを含むプロテアーゼからなり、ここで該酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して、２０ｋＤ〜４０ｋＤの範囲の分子量を有する酵素を有する、ならびに
−  該混合物と該バイオフィルムとの接触を、バイオフィルムの分解に十分な時間維持すること。
【請求項１５】
混合物が、請求項２または３に特定される混合物である、請求項１４に記載の処置方法。
【請求項１６】
軟部組織が、上皮組織または粘膜である、請求項１４または１５に記載の処置方法。
【請求項１７】
軟部組織が、アフタもしくはヘルペス単純ウイルス感染により損傷された粘膜または尿路の粘膜、胃腸管の粘膜、口腔粘膜、食道の粘膜、胃の粘膜、Helicobacter pyloriに侵された胃の粘膜、皮膚の上皮、真菌症もしくは濾胞ユニットに侵された皮膚の上皮、または移植片の表面上の、移植レセプトの移植片接触部位の表面上のおよび／または移植片の移植片接触部位の表面上の結合組織、あるいは手術または慢性もしくは急性創傷、肛門裂傷または熱傷の創傷により露出した結合組織である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の処置方法。
【請求項１８】
移植片が皮膚代用品または生きている皮膚代用品である、請求項１７に記載の処置方法。
【請求項１９】
軟部組織が食道の粘膜であり、疾患または状態が逆流である、請求項１７に記載の処置方法。
【請求項２０】
軟部組織が口腔粘膜であり、疾患または状態が放射線または化学療法により誘発された口腔粘膜炎である、請求項１７に記載の処置方法。
【請求項２１】
混合物を、経口投与によりまたは局所適用により適用する、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の処置方法。
【請求項２２】
混合物を、混合物の徐放性製剤の経口投与または局所適用により適用する、請求項２１に記載の処置方法。
【請求項２３】
混合物を、１日当たり少なくとも４、６、７、または８回、経口投与または局所適用により適用する、請求項２１または２２に記載の処置方法。
【請求項２４】
処置が、少なくとも３日間、４日間、５日間、１週間、または２週間の処置、または最長１か月の処置である、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の処置方法。
【請求項２５】
混合物のカゼイン−タンパク質分解活性が、混合物のｍｌまたはｇ当たり、０．０００３〜３０の範囲、０．００３〜２０の範囲、０．０３〜１０の範囲、または０．３〜５の範囲のユニットである、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の処置方法。
【請求項２６】
移植片の表面上もしくは移植片の移植片接触部位の表面上の結合組織上のバイオフィルムの除去のためのナンキョクオキアミ（Euphausia superba）からの酵素の混合物の使用であって、ここで該混合物は、本質的にエンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼを含むプロテアーゼからなり、ここで該酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して、２０ｋＤ〜４０ｋＤの範囲の分子量を有する酵素を有する、前記使用。
【国際調査報告】
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