(57)【要約】  本発明は、遺伝子導入分野に、そして特に、血管組織への遺伝子送達のための血清型Ａｄ４９のアデノウイルスベクターの使用に関する。
2015518851.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管細胞または組織への遺伝子送達方法であって、前記血管細胞または組織をアデノウイルス遺伝子送達ビヒクルと接触させる工程を含み、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが、Ａｄ４９主カプシド・タンパク質を含む、前記方法。
【請求項２】
遺伝子導入を必要とする被験体の血管細胞または組織への遺伝子導入方法であって、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルを被験体に投与する工程を含み、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが、Ａｄ４９主カプシド・タンパク質を含む、前記方法。
【請求項３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
血管細胞または組織が、被験体への導入のために意図される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
血管細胞または組織を提供し、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルと細胞または組織を接触させて遺伝子修飾された細胞または組織を提供し、そして遺伝子修飾された細胞または組織を被験体に導入する工程を含み、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが、Ａｄ４９主カプシド・タンパク質を含む、療法または予防法。
【請求項６】
血管細胞または組織がある長さの血管を含む、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
ある長さの血管が、伏在静脈、内乳動脈（例えば左内乳動脈）、胃大網動脈（例えば右胃大網動脈）、または下腹壁動脈に由来する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
血管新生または脈管形成の調節、末梢血管疾患の予防または治療、再狭窄の予防または治療、血管手術から生じる合併症の予防または治療、静脈移植失敗の予防または治療、血管細胞増殖の調節、血管細胞アポトーシスの調節、血管細胞遊走の調節、あるいはアテローム形成、アテローム性動脈硬化症または血管閉塞の予防または治療、のために遺伝子導入を行う、先行する請求項いずれか一項記載の方法。
【請求項９】
血管細胞または組織への遺伝子送達のためのアデノウイルス遺伝子送達ビヒクルの使用であって、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが、Ａｄ４９主カプシド・タンパク質を含む、前記使用。
【請求項１０】
血管細胞または組織への遺伝子送達のためのアデノウイルス遺伝子送達ビヒクルであって、Ａｄ４９主カプシド・タンパク質を含む、前記ビヒクル。
【請求項１１】
血管細胞または組織への遺伝子送達のための薬剤調製における、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルの使用であって、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが、Ａｄ４９主カプシド・タンパク質を含む、前記使用。
【請求項１２】
アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが、Ａｄ４９ヘキソン・タンパク質を有する、先行する請求項のいずれか一項記載の方法、使用またはアデノウイルス遺伝子送達ビヒクル。
【請求項１３】
アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが、Ａｄ４９ペントン・タンパク質を有する、先行する請求項のいずれか一項記載の方法、使用またはアデノウイルス遺伝子送達ビヒクル。
【請求項１４】
アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが、Ａｄ４９ファイバー・タンパク質を有する、先行する請求項のいずれか一項記載の方法、使用またはアデノウイルス遺伝子送達ビヒクル。
【請求項１５】
アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルがキメラである、先行する請求項のいずれか一項記載の方法、使用またはアデノウイルス遺伝子送達ビヒクル。
【請求項１６】
アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが、Ａｄ４９ヘキソン・タンパク質、Ａｄ４９ペントン・タンパク質およびＡｄ４９ファイバー・タンパク質を有する、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法、使用またはアデノウイルス遺伝子送達ビヒクル。
【請求項１７】
アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが複製適格性でない、先行する請求項のいずれか一項記載の方法、使用またはアデノウイルス遺伝子送達ビヒクル。
【請求項１８】
遺伝子送達ビヒクル内に含有される核酸が、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３またはＥ４領域から１またはそれより多い機能性アデノウイルス遺伝子を欠く、請求項１６記載の方法、使用またはアデノウイルス遺伝子送達ビヒクル。
【請求項１９】
核酸が機能性アデノウイルス遺伝子をまったく含有しない、請求項１７または請求項１８記載の方法、使用またはアデノウイルス遺伝子送達ビヒクル。
【請求項２０】
遺伝子送達ビヒクルによって運搬される核酸ペイロードが、サイトカイン、抗体、免疫刺激因子、抗血管新生因子、血管新生因子、抗炎症タンパク質、血管リモデリング制御因子、血管細胞に関するアポトーシス促進性因子、またはメタロプロテアーゼ阻害剤をコードする異種遺伝子を含む、先行する請求項のいずれか一項記載の方法、使用またはアデノウイルス遺伝子送達ビヒクル。
【請求項２１】
遺伝子送達ビヒクルによって運搬される核酸ペイロードが、ターゲット遺伝子のｍＲＮＡまたはＤＮＡにハイブリダイズすることが可能な、あるいは共抑制によってターゲット遺伝子の発現を阻害することが可能な核酸をコードする異種遺伝子を含む、先行する請求項のいずれか一項記載の方法、使用またはアデノウイルス遺伝子送達ビヒクル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入の分野に、そして特に、血管組織への遺伝子送達のためのアデノウイルスベクターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノウイルス（Ａｄ）は、遺伝子療法において、最も広く用いられているベクターである。これらは、広い範囲の分裂細胞および非分裂細胞を感染させる能力を有し、高力価まで容易に産生され、そして組換えウイルスの構築に用いられるよく特徴付けられた株（特に、遺伝子療法に一般的に用いられるもの、例えばＡｄ２、Ａｄ５）を有する利点を持つ。第一世代のＥ１／Ｅ３欠失ベクターは、〜８ｋｂの挿入物を収容することが可能である一方、ヘルパー依存性Ａｄは、最大３７ｋｂの外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）遺伝物質を収容可能である１６。
【０００３】
Ａｄは、１９５３年、咽頭扁桃細胞から最初に単離され、そして培養され、そして今日まで、５５のヒト・アデノウイルス血清型が同定されてきており、そして６つの種（Ａ〜Ｆ）にグループ分けされている。これらの血清型の大部分は、上気道の軽度の感染、胃腸炎または結膜炎を引き起こす。さらに、野生型（ＷＴ）アデノウイルスは、米国軍隊入隊者に対するワクチンとして用いられてきており、そして非常にわずかな副作用しか引き起こさないことが示されてきている。これは、Ａｄがヒト遺伝子療法に使用するために安全なウイルスであるという見解に寄与するが、高用量のアデノウイルスは、圧倒的な免疫反応を引き起こしうる１７、１８、１９。しかし、局所ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子導入は、これらの問題を減少させる。
【０００４】
ベクターとして臨床的にＡｄを用いる重大な限界は、大部分のヒトにおいて、中和抗体が高率であらかじめ存在し、該抗体が循環中への投与に際して迅速な中和を引き起こすことである。さらに、循環中への投与に際して、ウイルス粒子の大部分は、肝臓によって迅速に捕捉され、したがって意図される目的のために十分な度合いまで、ターゲット細胞または組織に到達できない。さらに、これらの問題を克服する試みとして、ベクター投薬量を増加させることは、不適切であり、そしてときには毒性であり、またはさらには致死性であることが立証されてきている。
【０００５】
アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）は、血管遺伝子導入のために広く用いられており、血管遺伝子導入の場合、過剰な平滑筋細胞増殖を防止する療法的導入遺伝子の送達は、新生内膜肥厚を防止することも可能であり、そしてしたがって冠動脈バイパス術後の移植失敗を防止しうる。しかし、アデノウイルスの血管壁への取り込み、およびＡｄ５を通じて仲介される遺伝子導入の生じるレベルは、比較的劣っており、そしてウイルスの高い投入力価が必要となる。さらに、患者の有意な比率が、Ａｄ５に対するあらかじめ存在する中和抗体を提示する。
【０００６】
まとめると、Ａｄ５のこれらの最適とは言えない特性によって、臨床設定における血管遺伝子療法の進行および解釈が制限される。したがって、より効率的なベクターの同定および発展が必要とされる。
【０００７】
ある研究者は、まったく別のウイルスタイプに基づくベクターに乗り換えている。引き続きアデノウイルスを選択している研究者は、免疫反応を回避し、そして肝臓からベクターを脱ターゲット化し、そして該ベクターを関心対象の細胞および組織に再ターゲット化するために、キメラ・ヒトＡｄ（Ａｄ偽型）、非ヒトＡｄ、または低い血清有病率のＡｄベクターの使用を含む戦略を採用してきている。
【０００８】
しかし、ヒト・アデノウイルス科は広範であり、多くのまれな、そして十分に研究されていないアデノウイルスを有する（現在５５の既知の血清型がある）。現在、新規ベクターとして使用するためには、これらの向性または潜在能力に関してほとんど知られておらず、その実際的な適用が深刻に制限されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ここに、まれなＤ種アデノウイルスであるアデノウイルス血清型４９（Ａｄ４９）が、血管組織に対して、驚くほど高い向性および感染性を有し、血管遺伝子送達のために理想的なものとなっていることを発見した。形質導入は迅速であり、血管手術中に提供される非常に限られた機会において、ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子送達を実現可能にする。さらに、集団の大部分は、Ａｄ４９に対してほとんどまたはまったく、あらかじめ存在する免疫を持たず、これによって、Ａｄ４９はｉｎ  ｖｉｖｏで行われる遺伝子送達に、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる方法として適したものとなる。
【００１０】
したがって、第一の側面において、本発明は、血管細胞または組織への遺伝子送達方法であって、前記血管細胞をアデノウイルス遺伝子送達ビヒクルと接触させる工程を含み、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが、Ａｄ４９主カプシド・タンパク質を含む、前記方法を提供する。
【００１１】
方法はｉｎ  ｖｉｖｏで実行可能である。こうした側面において、本発明は、遺伝子導入を必要とする被験体への遺伝子導入方法であって、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルを被験体に投与する工程を含み、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが、Ａｄ４９主カプシド・タンパク質を含む、前記方法を提供する。
【００１２】
方法はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでも実行可能である。例えば、方法を、被験体への導入が意図される血管細胞または組織、例えば血管組織移植片に適用することも可能である。
【００１３】
したがって、本発明は、血管細胞または組織を提供し、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルと細胞または組織を接触させて遺伝子修飾された細胞または組織を提供し、そして遺伝子修飾された細胞または組織を被験体に導入する工程を含み、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが、Ａｄ４９主カプシド・タンパク質を含む、療法または予防法を提供する。
【００１４】
用語「血管（ｖａｓｃｕｌａｒ）」は、本明細書において、血管（ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ）、主に静脈（ｖｅｉｎｓ）および動脈（ａｒｔｅｒｉｅｓ）を指すが、文脈が許す場合は、他の管タイプ、例えば細動脈、細静脈および毛細血管も含む。
【００１５】
形質転換されるべき血管細胞または組織は、１またはそれより多い血管内皮細胞（ＥＣ）および／または１またはそれより多い血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）を含むことも可能である。ある長さの血管、例えばある長さの静脈または動脈を含むことも可能である。
【００１６】
細胞または組織は、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルと接触させる前に、被験体から（またはより頻度が落ちるが、第三者ドナーから）、例えば同じ外科手術の一部として、得られていることも可能である。こうした方法は、一般的に、ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子送達法と称される。こうした場合、ある長さの血管は、典型的には外植片であり、例えば伏在静脈、内乳動脈（例えば左内乳動脈）、胃大網動脈（例えば右胃大網動脈）、および下腹壁動脈に由来するものである。
【００１７】
こうしたｅｘ  ｖｉｖｏ法において、血管外植片の移植は、抽出後できる限り速やかに行われることが望ましい。実際のところ、これによって、遺伝子送達には、１時間またはそれ未満、そしてしばしば３０分またはそれ未満しか許されない。したがって、外植片は、ドナーから抽出した１時間以内、ドナーから抽出した４５分以内、３０分以内、１５分以内、１０分以内、５分以内または１分以内に、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルと接触させることも可能である。
【００１８】
あるいは、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルと接触させる前に、ある期間、例えば１時間またはそれより長い期間、数日または数週間、細胞または組織をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養しておくことも可能である。例えば１またはそれより多い幹細胞から、適切な培養条件下の増殖および分化によって、細胞または組織が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されていることも可能である。こうした場合、幹細胞は、細胞または組織を投与しようとする被験体と同系であってもよい。例えば、これらは、直接または間接的に、被験体自身から得られていてもよい。あるいは、これらは、直接または間接的に、第三者ドナーから得られていてもよい。
【００１９】
血管細胞または組織を、適切な形質導入が達成されるのに必要な程度に長く、遺伝子送達ビヒクルと接触させることも可能である。しかし、しばしば、１時間またはそれ未満の期間、例えば４５分またはそれ未満、３０分またはそれ未満、１５分またはそれ未満、あるいは１０分またはそれ未満が十分でありうる。例えば、１０分間〜１時間、１５分間〜１時間、３０分間〜１時間、４５分間〜１時間、１０分間〜４５分間、１５分間〜４５分間、３０分間〜４５分間、１０分間〜３０分間、１５分間〜３０分間または１０分間〜１５分間の期間、血管細胞または組織を遺伝子送達ビヒクルと接触させてもよい。
【００２０】
血管細胞または組織が外植片である場合、外植片を、ドナーから抽出した後、そしてレシピエント被験体内に移植する前に、適切な期間、遺伝子送達ビヒクルと接触させてもよい。
【００２１】
手術方法全体としての目的は、冠動脈疾患（ＣＡＤ）の予防または治療であることも可能である。方法は、血管移植工程を含むことも可能である。したがって、方法は、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）または経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）の工程を含むことも可能である。
【００２２】
血管細胞または組織への遺伝子導入の目的は、例えばワクチン接種または遺伝子療法であってもよい。
遺伝子療法適用には、血管新生または脈管形成の調節、例えば血管新生または脈管形成の促進（すなわち例えば虚血の治療のための療法的血管新生／脈管形成）、あるいは血管新生または脈管形成の阻害（例えば癌または炎症性状態の治療において、血管新生または脈管形成が望ましくない状況において）、末梢血管疾患の予防または治療、再狭窄の予防または治療（例えばステント内再狭窄）、血管手術から生じる合併症の予防または治療（例えば上に記載するようなＣＡＢＧまたはＰＴＣＡ後）、静脈移植失敗の予防または治療、血管細胞増殖の調節（例えば望ましくない血管細胞増殖、例えば新生内膜肥厚の阻害）、血管細胞アポトーシスの調節（例えば阻害または刺激）、血管細胞遊走の調節（例えば阻害または刺激）、あるいはアテローム形成、アテローム性動脈硬化症または血管閉塞の予防または治療、が含まれることも可能である。
【００２３】
これらの多様な適用は、必ずしも互いに排他的ではないことが認識されるであろう。
意図される治療部位は、血管移植であってもよい。
さらなる側面において、本発明は、血管細胞または組織への遺伝子送達のためのアデノウイルス遺伝子送達ビヒクルの使用であって、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが、Ａｄ４９主カプシド・タンパク質を含む、前記使用を提供する。
【００２４】
さらなる側面において、本発明は、血管細胞または組織への遺伝子送達のためのアデノウイルス遺伝子送達ビヒクルであって、Ａｄ４９主カプシド・タンパク質を含む、前記ビヒクルを提供する。
【００２５】
さらなる側面において、本発明は、血管細胞または組織への遺伝子送達のための薬剤調製における、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルであって、Ａｄ４９主カプシド・タンパク質を含む、前記ビヒクルを提供する。
【００２６】
上記の方法の特徴は、本発明のこれらの側面に等しく適用可能であることが認識されるであろう。
本発明の上記側面のいずれにおいても、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルは、Ａｄ４９ヘキソン・タンパク質、ペントン・タンパク質、またはファイバー・タンパク質を有することも可能である。
【００２７】
例えば、該ビヒクルは、Ａｄ４９ヘキソン・タンパク質およびペントン・タンパク質、Ａｄ４９ヘキソン・タンパク質およびファイバー・タンパク質、またはＡｄ４９ペントン・タンパク質およびファイバー・タンパク質を有してもよい。
【００２８】
例えば、該ビヒクルは、Ａｄ４９ヘキソン・タンパク質、ペントン・タンパク質およびファイバー・タンパク質を有してもよい。
アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルは、キメラであってもよく、すなわち、１またはそれより多い異なるアデノウイルス科または血清型由来の１またはそれより多い主カプシド・タンパク質を所持してもよい。
【００２９】
特に、遺伝子送達ビヒクルをｉｎ  ｖｉｖｏで用いようとする場合、対象レシピエントがあらかじめ存在する免疫をほとんどまたはまったく持たないタンパク質で、カプシドが構成されることが望ましい可能性もある。Ａｄ４９を除けば、適切な血清型には、Ａｄ１１、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４８、Ａｄ５０およびサル・アデノウイルスが含まれうる。遺伝子送達ビヒクルは、（例えば肝細胞に比較して）血管細胞に関する向性を維持するために十分なＡｄ４９主カプシド構成要素を保持しなければならないが、他のカプシド構成要素は、Ａｄ４９以外の１またはそれより多い血清型、例えばＡｄ３５に由来してもよい。
【００３０】
例えば、遺伝子送達ビヒクルは；
Ａｄ４９ヘキソン・タンパク質、ならびに１またはそれより多くの他の血清型由来のペントンおよびファイバー・タンパク質；
Ａｄ４９ペントン・タンパク質、ならびに１またはそれより多くの他の血清型由来のヘキソンおよびファイバー・タンパク質；
Ａｄ４９ファイバー・タンパク質、ならびに１またはそれより多くの他の血清型由来のペントンおよびヘキソン・タンパク質；
Ａｄ４９ヘキソンおよびペントン・タンパク質、ならびに１またはそれより多くの他の血清型由来のファイバー・タンパク質；
Ａｄ４９ヘキソンおよびファイバー・タンパク質、ならびに１またはそれより多くの他の血清型由来のペントン・タンパク質；
Ａｄ４９ペントンおよびファイバー・タンパク質、ならびに１またはそれより多くの他の血清型由来のヘキソン・タンパク質
を含むことも可能である。
【００３１】
遺伝子送達ビヒクルがＡｄ４９ヘキソン・タンパク質を含有することが望ましい可能性もある。
いかなる個々のウイルス粒子も、典型的には、いかなる個々のタンパク質の混合物も含有しないことが認識されるであろう。すなわち、１つのウイルス粒子中のすべてのヘキソン・タンパク質は、典型的には同じ血清型のものであろうし、また、すべてのペントンおよびファイバー・タンパク質も同様であろう。しかし、これは常に当てはまる必要はなく；いくつかの状況においては、ウイルス粒子が１より多い血清型の１またはそれより多いタンパク質を含有することが望ましい可能性もある。ウイルス粒子集団は、この点で、均質であってもまたは不均質であってもよい。
【００３２】
遺伝子送達ビヒクルは、ターゲット細胞または組織に送達するための核酸ペイロードを運搬する。核酸ペイロードは、通常、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子である。核酸ペイロードは、典型的には、ターゲット血管細胞または組織内への導入およびそこでの発現が意図される、異種遺伝子（すなわち野生型アデノウイルスには見られない遺伝子）を含む。したがって、異種遺伝子は、ターゲット細胞または組織において、異種遺伝子を発現するために機能性である転写単位の一部であることも可能である。したがって、異種遺伝子を、プロモーター、ならびに他の適切な転写および翻訳制御シグナルに機能可能であるように連結することも可能である。異種遺伝子はまた、「導入遺伝子」と称されることも可能である。核酸ペイロードおよびその異種遺伝子のターゲット細胞または組織への導入は、「形質導入」と称される。
【００３３】
核酸ペイロードは、典型的には、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクル内にパッケージングされて、そしてターゲット血管細胞または組織において適切にプロセシングされるために必要なさらなる要素を含有する。これらには、アデノウイルス反転末端反復（ＩＴＲ）配列および適切なパッケージング・シグナルが含まれることも可能である。
【００３４】
核酸ペイロードはまた、選択可能マーカー、すなわち形質導入細胞の容易な検出を可能にする産物をコードする遺伝子も含有してもよい。例には、蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）、可視反応産物を産生する酵素（例えばベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）の遺伝子、および抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
【００３５】
アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルは、典型的には複製適格性ではない。すなわち、該核酸は、ウイルス複製に必要なアデノウイルス遺伝子（および他の遺伝子要素）のすべては含有しない。典型的には、核酸は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３またはＥ４領域から１またはそれより多い機能性アデノウイルス遺伝子を欠く。これらの遺伝子は、欠失されてもよいし、あるいは例えば異種遺伝子または選択マーカーを含む転写単位の挿入によって不活性化されていてもよい。いくつかの態様において、核酸は、機能性アデノウイルス遺伝子をまったく含有せず、この場合、存在する唯一のウイルス構成要素は、ＩＴＲおよびパッケージング・シグナルであることも可能である。機能性アデノウイルス遺伝子を持たない遺伝子導入ビヒクルが好ましい可能性もあり、これはこうしたビヒクルが、ウイルスタンパク質合成の結果として、形質導入されたターゲット細胞または組織に対して宿主免疫反応を発展させるリスクを減少させるためである。
【００３６】
異種遺伝子は、本明細書において、導入しようとするターゲット細胞または組織に対して「外因性」であると称される。異種遺伝子が、ターゲット細胞または組織のゲノムにおいて同等物を持たない場合、例えばターゲット細胞または組織において遺伝子によってすでにコードされているのではない産物（ＲＮＡおよび／またはタンパク質）をコードする場合、外因性遺伝子はまた、ターゲット細胞または組織に対して異種性であると見なされることも可能である。異種遺伝子は、血管細胞に導入することが望ましいいかなる遺伝子産物をコードしていてもよい。
【００３７】
いくつかのタイプの遺伝子は、遺伝子療法の方法で使用するために周知であり、そしてこれには、療法タンパク質、例えばＴＰＡ、ＥＰＯ、サイトカイン、抗体、あるいはその機能性断片または誘導体、ならびに免疫刺激因子、例えば腫瘍特異的抗原、サイトカイン等をコードするものが含まれる。
【００３８】
以下の例は、本発明のために特に関心が持たれる可能性もある。
抗血管新生因子、例えばエンドスタチン、アンギオテンシン、ＡＴＦ−ＢＰＴＩ  ＣＤＴ−６、ドミナントネガティブＶＥＧＦ突然変異体、ＶＥＧＦ、ＦＧＦに対する抗体、またはその機能性断片等。
【００３９】
ＶＥＧＦ（例えばアイソフォーム１２１、１５９、２０６または１６５）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２、３、４および５を含むＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＩＧＦ、ｄｅｌ−１（発生制御内皮遺伝子座１）、一酸化窒素シンターゼ（例えば誘導性ＮＯＳ、ｉＮＯＳとしても知られる）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド等を含む、血管新生促進性（または脈管形成性）因子。これらの遺伝子の多くは、血管新生および虚血の治療に対する遺伝子療法アプローチの候補として、文献において提唱されてきている。ＶＥＧＦおよび一酸化窒素シンターゼは、再狭窄の阻害に有効であることが示されてきている。ＶＥＧＦは、一酸化窒素シンターゼおよび／またはプロスタサイクリンの導入を通じて作用し、したがって、ＶＳＭＣ増殖および遊走を阻害する可能性もある。
【００４０】
抗炎症性タンパク質、例えば可溶性ＣＤ４０、ＦａｓＬ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ならびにＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ５２、ＩＬ−２、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ等に対する抗体またはその機能性断片もしくは誘導体（例えば分泌される一本鎖抗体）、あるいは自己反応性Ｔ細胞上のＴ細胞受容体。ＰＭＬのドミナントネガティブ突然変異体もまた、免疫反応を阻害するために使用可能である。
【００４１】
さらに、炎症促進性サイトカインのアンタゴニスト、例えばＩＬ−１ＲＡ（受容体アンタゴニスト）および可溶性受容体、例えばｓｉＬ−１ＲＩ、ｓｉＬ−１ＲＩＩ、ｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩを用いてもよい。増殖および／または免疫反応阻害性遺伝子、例えばｃｅＮＯＳ、Ｂｃｌ３、カクタスおよびＩＫＢα、βまたはγ。
【００４２】
アポトーシス促進性タンパク質、例えばｐ５３、メタロプロテアーゼ阻害剤（例えばＴＩＭＰ１〜３）およびニワトリ貧血ウイルスのＶＰ３タンパク質をコードする遺伝子もまた使用可能である。さらに、自殺遺伝子、例えばＨＳＶ−ＴＫ、シトシン・デアミナーゼ、ニトロレダクターゼおよびリナメラーゼ（ｌｉｎａｍｅｒａｓｅ）を用いてもよい。ｐ５３は、ＳＭＣにおいてアポトーシスを誘導して、ヒト伏在静脈移植片における新生内膜肥厚を防止する際の使用が示唆されてきている。ＴＩＭＰ、例えばＴＩＭＰ３は、ＳＭＣアポトーシスを誘導することによって、ならびにＳＭＣの遊走を阻害することによって、新生内膜肥厚を阻害することが示されてきている。ＴＩＭＰはまた、再狭窄の阻害にも有効であることも示されてきている。
【００４３】
新生内膜肥厚、アテローム形成、血管閉塞またはアテローム性動脈硬化症を防止するかまたは阻害するために有効なポリペプチドをコードする他の遺伝子もまた、関心対象である。これらには、Ｎｏｇｏ−Ｂなどの血管リモデリング制御因子が含まれる。
【００４４】
異種遺伝子はまた、核酸遺伝子産物、例えばターゲット細胞または組織において、内因性遺伝子の発現を制御することが可能なものをコードすることも可能である。こうした制御核酸には、デコイ・オリゴデオキシヌクレオチドおよびターゲット遺伝子のｍＲＮＡまたはＤＮＡにハイブリダイズするか、あるいは共抑制によって発現を阻害することが可能な核酸、例えばリボザイム、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ等が含まれる。転写因子Ｅ２Ｆに対して向けられる制御核酸（デコイ・オリゴヌクレオチド）は、ウサギにおいて、新生内膜肥厚および血管移植片アテローム性動脈硬化症を阻害することが示されてきている。
【００４５】
本発明はここで、付随する図および実施例を参照することによって、例として、そして限定ではなく、より詳細に記載されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ｈＳＭＣの培養における、Ａｄ５、Ａｄ３５およびＡｄ４９に関する形質導入用量応答。ウイルスを１〜１０，０００ｖｐ／細胞に希釈し、そして細胞と３時間インキュベーションした。細胞を洗浄し、そして培地を補充した。感染４８時間後、ｅＧＦＰ発現のＦＡＣＳ定量化前に、細胞を視覚化し、そして写真撮影した。
【図２】ｈＳＭＣにおける導入遺伝子発現に対するＡｄ５、Ａｄ３５およびＡｄ４９の限定された曝露期間の効果。ｈＳＭＣに１ｋまたは１０ｋ／細胞のＡｄ５、Ａｄ３５またはＡｄ４９で１０〜６０分間形質導入した。４８時間後、ルシフェラーゼ発現を定量化した。＊ｐ＜０．０００１、対Ａｄ５、＃ｐ＜０．０００１  対Ａｄ３５。
【図３】ＨｅｐＧ２細胞のＡｄ仲介形質導入に対する中和血清の効果。細胞を１０ｋ  ｖｐ／細胞で、そしてＣＡＢＧを受けている患者由来の中和血清の存在下または非存在下で感染させた（総数１０３試料）。感染４８時間後、中和を、９０％より高く、Ａｄ仲介性ルシフェラーゼ発現を減少させる能力として、形質導入に対する効果を評価した。
【図４】Ａｄ５およびＡｄ４９感染性に対するＡｄ４９ノブ・タンパク質の効果。ある範囲の用量のノブ・タンパク質と細胞をインキュベーションし、そして続いて形質導入に対する効果を確立することによって、Ａｄ４９ノブおよびＡｄ５ノブの、Ａｄ４９およびＡｄ５感染性に対する効果を定量化した。
【図５】Ａｄ５またはＡｄ４９を用いた、マウス大動脈のｅｘ  ｖｉｖｏ形質導入。大動脈をＣ５７／ｂ６マウスから外科的に単離し、そして等しいサイズの切片に分けた後、Ａｄ５、Ａｄ４９（どちらもルシフェラーゼを発現）またはＰＢＳのいずれかに、１０９ｖｐ／血管（パネルＡおよびＣ）または１０９および１０１０ｖｐ／血管（パネルＢ）で、３７℃で１時間曝露した（曝露期間が１０〜１８０分間で多様であったＣ以外）。血管をＤ−ルシフェリンに浸し、そしてＩＶＩＳスペクトルを用いて画像化した。
【図６】Ａｄ５またはＡｄ４９を用いたブタ伏在静脈のｅｘ  ｖｉｖｏ形質導入。ブタ伏在静脈を等しいサイズの切片に分けた後、Ａｄ５、Ａｄ４９（ルシフェラーゼを発現）またはＰＢＳのいずれかに、１０９または１０１０ｖｐ／血管で、３７℃で１時間曝露した（Ａ）。１ｘ１０１１ｖｐのＡｄ５またはＡｄ４９を、ブタ伏在静脈管腔内に導入し、そして３７℃で１時間インキュベーションした（図Ｂ）。感染４８時間後、血管をＤ−ルシフェリンに浸し、そしてＩＶＩＳスペクトルを用いて画像化した。
【図７】Ａｄ５またはＡｄ４９を用いたヒト内乳動脈のｅｘ  ｖｉｖｏ形質導入。冠動脈バイパス移植術に由来する過剰な臨床材料を、等しいサイズの切片に切った後、１０９ｖｐ／血管の用量で、Ａｄ５、Ａｄ４９またはＰＢＳのいずれかに曝露した。血管をＤ−ルシフェリンに浸し、そしてＩＶＩＳスペクトルを用いて画像化した。
【図８】Ａｄ４９ヘキソン・タンパク質配列（タンパク質ＩＤ＝ＡＢＤ５２３９５．１；  ＧＩ：８８８１０１８２）
【図９】Ａｄ４９ファイバー・タンパク質配列（タンパク質ＩＤ＝ＡＢＤ５２４００．１；  ＧＩ：８８８１０１８７）
【図１０】Ａｄ４９ペントン・タンパク質配列（タンパク質ＩＤ＝ＡＢＤ５２３９１．１；  ＧＩ：８８８１０１７８）
【発明を実施するための形態】
【００４７】
アデノウイルスおよびアデノウイルスベクター
アデノウイルスは、ヒトを含む多様な哺乳動物種を感染させる直鎖二本鎖ＤＮＡゲノムを含有する非エンベロープ型ウイルスである。
【００４８】
ゲノムは、典型的には、長さおよそ３０〜３８ｋｂであり、そしていわゆる初期（Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３、Ｅ４）および後期（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５）遺伝子を含むいくつかの遺伝子をコードし、これに５’および３’反転末端反復（ＩＴＲ）が隣接する。該ゲノムはまたパッケージング・シグナルも含有する。
【００４９】
ゲノムは、３つの主要タンパク質、すなわちペントン、ヘキソン、およびファイバーで構成されるカプシドに封入されている。ヘキソンは、カプシドの最も豊富な構造構成要素であり（ウイルスの総タンパク質質量の６３％を占める）１７、そして２４０の三量体カプソメアで構成される。他の２つのタンパク質は、１２の五量体ペントン・ベースおよびファイバー・タンパク質（１２ペントン・ベースから突き出す三量体桿体様構造）である。ファイバーは、一次細胞係留相互作用を仲介する、Ｃ末端球状ノブ様構造を含有する。これらのタンパク質は、一緒に、二本鎖３６ｋｂ  ＤＮＡゲノムを取り巻く、非エンベロープ型カプシド（７０〜９０ｎｍの直径）の正二十面体形状を形成する（２０中に概説）。
【００５０】
Ａｄファイバー・タンパク質は、いくつかの異なる宿主細胞受容体と相互作用するように構築されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡｄ感染の方法は、特にＡｄ５（Ｃ種）に関して、よく定義されている。Ａｄは、宿主細胞の細胞受容体、ならびにウイルスファイバー・タンパク質およびペントン・ベースの相互作用によって駆動されるエンドサイトーシスを通じて、宿主細胞内に内在化する。大部分のＡｄ種の最初の相互作用は、ファイバー・ノブ・ドメインおよび膜糖タンパク質コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）の間のものである。Ｂを除くすべてのＡｄ種は、タイトジャンクションに制御されるファイバー・ノブ・ドメインを用いて、ＣＡＲと相互作用可能であるが、いくつかのＤ種Ａｄはまた、シアル酸も用いる。Ｂ種ＡｄはＣＤ４６を利用する。ウイルス内在化は、ファイバー・タンパク質のＮ末端で、ペントン・ベース中のＲＧＤモチーフによるαｖβ３およびαｖβ５インテグリンの結合を通じて刺激される２１、２２。
【００５１】
アデノウイルスは、ターゲット細胞または組織に核酸ペイロードを送達する遺伝子導入ベクターとして頻繁に用いられる。ペイロードは、通常、直鎖ｄｓＤＮＡ分子を含むかまたは該分子からなり、これは次に、ターゲット細胞または組織に導入し、そしてそこで発現させることが望ましい異種遺伝子（しばしば導入遺伝子と称される）を含む。
【００５２】
こうしたベクターによって運搬される核酸ペイロードは、一般的に、ウイルス複製に必須の１またはそれより多い遺伝子、特に１またはそれより多い初期遺伝子を欠く。ウイルス遺伝子は、典型的には、ウイルスゲノムから欠失され、そして単数または複数の異種遺伝子によって置き換えられる。これらのベクターは、したがって、複製不全であり、そして親と同一のウイルス子孫の生成を生じる産生性感染が不可能である（同じ細胞をまた、ベクターゲノム中に存在する不全を補完可能なヘルパーウイルスと一緒に感染させない限り）。
【００５３】
現在まで、アデノウイルスベクターの３つの世代が生成されてきている。第一世代はＥ１遺伝子を欠いた。第二世代はＥ１および／またはＥ３の欠失と、Ｅ２および／またはＥ４の欠失を組み合わせた。第三世代は、ＩＴＲおよびパッケージング・シグナルのみを保持し、残りのゲノムは異種ＤＮＡによって置換され、そしてしばしば「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」または「ガット化（ｇｕｔｔｅｄ）」ベクター、または「ヘルパー依存性アデノウイルス」と呼ばれ、これはこれらがすべてのウイルスタンパク質を供給するために、ヘルパーアデノウイルスに頼るためである。総説には、Ａｌｂａら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ８，  １３４７−１３５３，  ２００５）を参照されたい。最小限のベクター、パッケージング細胞および付属技術の概説はまた、ＷＯ９９／５５１３２（ＰＣＴ／ＮＬ００／００２３５）に見られうる。
【００５４】
効率的なパッケージングのため、核酸ペイロードの長さは、通常、カプシドに適切な野生型アデノウイルスゲノムの長さのおよそ７５〜１０５％である。Ａｄ４９ゲノムは、長さおよそ３５．２ｋｂであり、したがって、Ａｄ４９に基づくベクターで用いられる核酸は、典型的には、長さおよそ２６．５〜３７ｋｂであろう。
【００５５】
異種遺伝子（およびその転写単位）は、通常、パッケージングに最適な長さより短く、したがって、核酸ペイロードの残りは、いわゆる「詰め物」配列で構成されるであろう。これは、典型的には、非コード配列（例えばイントロン配列）であるが、異種遺伝子の維持および発現に干渉しうる、反復配列、組換えホットスポットおよび外来性の制御要素などの要素は含まない。
【００５６】
アデノウイルス血清型４９
今日まで、ヒト・アデノウイルスの６つの異なる下位群が提唱されてきており、これは全部で５５の別個のアデノウイルス血清型を含む。血清型は、動物抗血清（ウマ、ウサギ）での定量的中和によって決定されるような免疫学的独自性に基づいて定義される。
【００５７】
血清型は、他との交差反応を持たず、またどちらの方向でも、＞１６の相同対異種力価比を示す。中和が、いずれかまたは両方の方向で、２つのウイルス間の特定の度合いの交差反応を示す（８または１６の相同対異種力価比）場合、（Ａ）赤血球凝集阻害に際する交差反応の欠如によって示されるように、赤血球凝集素が関連しないか、または（Ｂ）ＤＮＡ中に実質的な生物物理／生化学相違が存在する場合、血清型の独自性が仮定される（Ｆｒａｎｃｋｉら，  １９９１，  Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｓｕｐｐｌ．  ２：１４０−１４４）
いくつかのごく最近同定された血清型は、ＨＩＶ感染患者から最初に単離された（例えば、Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒら，  １９８８，  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １５８，  ８０４−８１３；  Ｓｃｈｎｕｒｒら  １９９３，  Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌ．  ３６，  ７９−８３）。よく理解されない理由のために、こうした免疫力が低下した患者の大部分は、免疫適格個体から、まれにしか、またはまったく単離されないアデノウイルスを脱落させる（Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒら  １９８８，  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ  １５８，  ８０４−８１３；  Ｄｅ  Ｊｏｎｇら，  １９９８，  Ｌａｎｃｅｔ  １（８３３７）：１２９３−１２９６）。
【００５８】
アデノウイルス血清型４９の全ゲノム配列は、寄託番号ＤＱ３９３８２９．１で、ＧｅｎＢａｎｋに提供される。
主Ａｄ４９カプシド・タンパク質の例となる配列を、図８（ヘキソン）、９（ファイバー）および１０（ペントン）に提供する。
【００５９】
用語「Ａｄ４９ヘキソン・タンパク質」は、本明細書において、図８に提供されるヘキソン配列と同じパターンの、他のアデノウイルス血清型由来のヘキソン・タンパク質との血清学的反応性を示す、ヘキソン・タンパク質を意味する。さらに、またはあるいは、Ａｄ４９ヘキソン・タンパク質は、図８に提供するヘキソン配列、あるいはその配列に少なくとも９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を有するか、あるいはいずれかの機能性断片である。
【００６０】
用語「Ａｄ４９ファイバー・タンパク質」は、本明細書において、図９に提供するファイバー配列と同じパターンの、他のアデノウイルス血清型由来のファイバー・タンパク質との血清学的反応性を示すファイバー・タンパク質を意味する。さらにまたはあるいは、Ａｄ４９ファイバー・タンパク質は、図９に提供するファイバー配列、あるいはその配列に少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を有するか、あるいはいずれかの機能性断片である。
【００６１】
用語「Ａｄ４９ペントン・タンパク質」は、本明細書において、図１０に提供するペントン配列と同じパターンの、他のアデノウイルス血清型由来のペントン・タンパク質との血清学的反応性を示すペントン・タンパク質を意味する。さらにまたはあるいは、Ａｄ４９ペントン・タンパク質は、図１０に提供するペントン配列、あるいはその配列に少なくとも９８％、または９９％の同一性を有する配列を有するか、あるいはいずれかの機能性断片である。
【００６２】
特に、ヘキソン、ファイバーおよびペントン配列における保存的置換（提供する参照配列に比較した際）は、機能に実質的な効果を持たずに、特によく許容されうる。
保存的置換は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス中で陽性とスコア付けされるアミノ酸クラスおよび／または置換内の置換と定義されうる。
【００６３】
１つの分類にしたがうと、アミノ酸クラスは、酸性、塩基性、非荷電極性および非極性であり、酸性アミノ酸はＡｓｐおよびＧｌｕであり；塩基性アミノ酸はＡｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓであり；非荷電極性アミノ酸はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒであり；そして非極性アミノ酸はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＴｒｐおよびＣｙｓである。
【００６４】
別の分類にしたがうと、アミノ酸クラスは、小分子親水性、酸／酸アミド／親水性、塩基性、小分子疎水性および芳香族であり、小分子親水性アミノ酸はＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＧｌｙであり；酸／酸アミド／親水性アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＧｌｎであり；塩基性アミノ酸はＨｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓであり；小分子疎水性アミノ酸はＭｅｔ、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌであり；そして芳香族アミノ酸はＰｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐである。
【００６５】
ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス中で陽性とスコア付けされる置換は、以下の通りである：
【００６６】
【表１】
2015518851.tif 000003
【００６７】
参照配列に関するパーセント（％）アミノ酸配列同一性は、配列を整列させ、そして必要であればギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を達成し、そしていかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさずに、参照配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。公的に入手可能な整列プログラムＭＵＳＬＥ（Ｅｄｇａｒ，  ２００４，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２（５）：１７９２−１７９７）を用い、デフォルトパラメータを用いて、％同一性値を決定することも可能である。ＭＵＳＣＬＥによって決定されるようなマッチした同一の残基の数を参照配列残基総数（整列スコアを最大にするために、プログラムによって参照配列内に導入されたギャップを無視する）で割って、１００を乗じることによって、％アミノ酸配列同一性値を決定する。
【００６８】
図９の配列を有するファイバー・タンパク質および図１０の配列を有するペントン・タンパク質と組み合わせたヘキソン・タンパク質は、それぞれ、図８〜１０に示す配列を有するヘキソン、ファイバーおよびペントン・タンパク質で構成されるカプシドを有する、そうでなければ同一の遺伝子導入ビヒクルのものによって提供されるレベルの５０％またはそれより高い値（そして好ましくは６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれより高い値）で、血管ＳＭＣまたはＥＣ形質導入を仲介することが可能な機能性アデノウイルス粒子を形成することが可能である。
【００６９】
図８の配列を有するヘキソン・タンパク質および図１０の配列を有するペントン・タンパク質と組み合わせたファイバー・タンパク質は、それぞれ、図８〜１０に示す配列を有するヘキソン、ファイバーおよびペントン・タンパク質で構成されるカプシドを有する、そうでなければ同一の遺伝子導入ビヒクルのものによって提供されるレベルの５０％またはそれより高い値（そして好ましくは６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれより高い値）で、血管ＳＭＣまたはＥＣ形質導入を仲介することが可能な機能性アデノウイルス粒子を形成することが可能である。
【００７０】
図８の配列を有するヘキソン・タンパク質および図９の配列を有するファイバー・タンパク質と組み合わせたペントン・タンパク質は、それぞれ、図８〜１０に示す配列を有するヘキソン、ファイバーおよびペントン・タンパク質で構成されるカプシドを有する、そうでなければ同一の遺伝子導入ビヒクルのものによって提供されるレベルの５０％またはそれより高い値（そして好ましくは６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれより高い値）で、血管ＳＭＣまたはＥＣ形質導入を仲介することが可能な機能性アデノウイルス粒子を形成することが可能である。
【００７１】
各場合で、血清不含培地中、３７℃、９６ウェルプレート形式で、ウェルあたり２ｘ１０４細胞の初代ヒト血管ＳＭＣを用いて、形質導入レベルを決定することも可能である。細胞を細胞あたり１０４ウイルス粒子と３０分間インキュベーションした後、ＰＢＳで洗浄する。次いで、細胞を元来の条件下（血清不含培地、３７℃）で４８時間維持した後、形質導入レベルを決定する。
【００７２】
導入遺伝子の発現レベルを測定し、ウェル中の細胞数または総タンパク質に対して適切に標準化することによって、形質導入レベルを決定することも可能である。発現を直接（絶対タンパク質濃度として）、または例えば酵素活性を通じて間接的に評価してもよい。
【００７３】
アッセイ中で使用するために適した導入遺伝子はルシフェラーゼであり、これはＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターの調節下で発現させることも可能である。ルシフェラーゼアッセイは、ＡＴＰ−Ｍｇ２＋の存在下、ルシフェリン基質に対する酵素の作用によって産生される光の強度を測定する。当業者は、こうした決定のために適したプロトコルをよく知っており、そして用いる正確なプロトコルは重要ではない。例には、Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）から商業的に入手可能なルシフェラーゼアッセイ系が含まれる。
【００７４】
遺伝子導入ビヒクルは、必要に応じて他のアデノウイルスタンパク質を含むことも可能であり、これには非主要カプシド・タンパク質、酵素等が含まれる。例示のみのため、他のＡｄ４９タンパク質は、以下のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号を有する（が、当業者は、望ましい場合、異なるタンパク質を有するウイルスベクターを生成することが十分に可能であろう）：
【００７５】
【化１】
2015518851.tif 000004
【００７６】
特定の態様において、遺伝子送達ビヒクルは、アデノウイルス血清型５由来のＥ４−ｏｒｆ６遺伝子を含む。これによって、一般的に用いられるＡｄ５−Ｅ１補完細胞株、例えばＨＥＫ２９３またはＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＥ１欠失Ａｄ４９ウイルスの増殖が可能になる。例えば、やはり、Ａｄ４９に基づくベクターの産生に関して、さらなる詳細を提供する、ＷＯ０３／１０４４６７、およびＬｅｍｃｋｅｒｔら（２００６）２８を参照されたい。他の態様において、Ｅ１欠失Ａｄ４９ウイルスは、Ａｄ５のＥ４−ｏｒｆ６を含まず、この場合、Ｅ１および適合性Ｅ４ｏｒｆ６の両方を発現する細胞株、例えばＡｄ５由来のＥ１およびＥ４ｏｒｆ６の両方を発現する２９３−ＯＲＦ６細胞株において、ベクターを補完することも可能である（例えば、２９３−ＯＲＦ６細胞の生成を記載する、Ｂｒｏｕｇｈら，  １９９６，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０：６４９７−５０１；各々、こうした細胞株を用いて、Ｅ１欠失非下位群Ｃアデノウイルスベクターの生成を記載する、Ａｂｒａｈａｍｓｅｎら，  １９９７，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７１；８９４６−５１およびＮａｎら，  ２００３，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：３２６−３６を参照されたい）し、あるいはＡｄ４９由来のＥ１を発現する補完細胞を用いることも可能である（例えばＷＯ  ００／７００７１、ＷＯ  ０２／４０６６５を参照されたい）。
【００７７】
心臓血管疾患のための遺伝子療法
冠動脈疾患（ＣＡＤ）を含む心臓血管疾患（ＣＶＤ）は、先進国世界において、死亡の主因である。世界的には、毎年、約１７１０万人の人々がＣＶＤのために死亡し、これはすべての死の２９％に相当する。また、２０３０年までには、この率は増加して２３６０万に達すると概算されている１。
【００７８】
ＣＡＤの病理生理学的プロセスは、管腔内のアテローム性動脈硬化巣の存在の結果として、冠動脈が狭窄することで始まり；プラークは、内部の炎症活性のために破裂して、急性血栓を生じる可能性もある２。その結果、虚血性心疾患（ＩＨＤ）が現れる可能性もあり、これは心筋が損傷を受け、そして次いで心臓自体への血液供給が減少するため、効率的に機能することが不可能となり、心筋梗塞（ＭＩ）および心不全を導く状態である３。
【００７９】
ＣＡＤ症状を軽減するために用いられる主な外科的介入法は、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）および経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）である。ＣＡＢＧにおいて、患者の脚由来の伏在静脈を、手技において移植血管として用いるが、これに対する主な限界は、手術の１０年以内に最大５０％まで症状が再出現し、そしてひいては再度の介入手術が必要となり４、６、最終的に各反復バイパス手術での閉塞リスクがより高くなることである７。
【００８０】
ＣＡＢＧにおいて、移植血管として、動脈供給源、例えば左内乳動脈（ＬＩＭＡ）、橈骨動脈、右胃大網動脈、および下腹壁動脈もまた用いられてきている４、８が、移植のための動脈供給源の使用には、それ自体の限界があり、例えば手術の期間および技術的困難が増加し、移植のために利用可能な血管の長さが短く、そしてまた、特に橈骨動脈を移植片として用いる場合には、動脈痙攣が起こる可能性がある４ことである。これらの方法は、より長い平均余命を有するより若い患者で、より多く用いられる傾向がある９。ＣＡＤを治療するために用いられる他の外科的介入法には、ＰＴＣＡ（バルーン血管形成術としても知られる）およびステント（血管形成術後、詰まった動脈を開いたままに維持するため、拡張可能な金属管を用いる）が含まれる。しかしこれらの方法もまた、再狭窄のため、手技後に血管の顕著な再狭窄に悩まされる。
【００８１】
血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）は、血管の中央層を形成し、そして局所環境における変化、例えば血流、ＣＡＢＧにおいて用いられた伏在静脈の内腔に対するストレス、およびバルーンＰＴＣＡによって引き起こされるものなどの傷害に反応して、表現型をリモデリングする能力を有する。これらの変化は、ＶＳＭＣを分化状態から脱分化状態にシフトさせ、そしてこの調節は、新生内膜病変の形成で終わる６、１１、１２。
【００８２】
新生内膜肥厚は、血管系の中央層から内膜層へのＶＳＭＣの遊走および増殖によって引き起こされ、そして静脈移植片をアテローム性動脈硬化症加速に感受性にする１３。このプロセスは、損傷を受けた内皮細胞および平滑筋細胞、凝集血小板、ならびにマクロファージによって放出されるサイトカインおよび増殖因子によって誘導される１４、１５。この意味で、初期段階での新生内膜形成の阻害は、静脈移植片閉塞およびアテローム形成の防止のために重要である。
【００８３】
新生内膜病変形成を防止し、そして静脈移植片の寿命を延長させるため、静脈移植片壁への療法的遺伝子導入は、後の移植失敗を防止する潜在能力を有する可能性もある。静脈移植片は、外植された静脈が、実際の移植プロセス前に、ｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入されることが可能であり、したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入に関連する多くの制限および困難を回避するという事実のために、遺伝子療法の完璧なターゲットと見なされる。
【００８４】
メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、血管ＳＭＣ遊走および増殖を誘導し、これは後の静脈移植失敗における血管新生内膜形成を導く。Ｇｅｏｒｇｅらは、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤３（ＴＩＭＰ−３）の過剰発現が、ＭＭＰの効果を遮断し、そしてＶＳＭＣアポトーシスを誘導することによって、ＭＭＰに制御効果を有することを示してきている２３。
【００８５】
ＶＳＭＣ遊走および増殖を制御して、したがって内膜肥厚および内膜細胞数の減少を導くため、腫瘍抑制因子遺伝子ｐ５３を過剰発現することによるＶＳＭＣアポトーシスの誘導もまた調べられてきている２４。新生内膜形成を減少させる別の方法は、血管リモデリングの制御因子であると考えられているタンパク質Ｎｏｇｏ−Ｂを過剰発現させることである。Ｎｏｇｏ−Ｂは、血管傷害後に失われ、そしてこれを過剰発現させることによって、ブタおよびネズミ新生内膜モデルにおいて、ＶＳＭＣの増殖および遊走の減少が見られた２５。
【実施例】
【００８６】
材料および方法
細胞培養
Ｃｌｙｄｅｂａｎｋ病院で冠動脈バイパス移植術を受け、インフォームドコンセントを提出した患者から得たヒト伏在静脈セグメントから、平滑筋細胞および内皮細胞を調製した。倫理的認可は、西グラスゴー倫理委員会から得た。
【００８７】
ヒト伏在静脈内皮細胞（ＨＳＶＥＣ）および平滑筋細胞（ＨＳＶＳＭＣ）をヒト伏在静脈の中央外植片から得て、そして増殖させ、そしてそれぞれ、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；  ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、英国）を補った内皮細胞完全培地（ＴＣＳ  Ｃｅｌｌ  Ｗｏｒｋｓ、英国）、ならびに２０％ＦＣＳおよび１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭ／ｌ  Ｌ−グルタミンを補った４５００ｍｇ／ｌグルコースを含むダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。
【００８８】
ヒト胚性腎臓ＨＥＫ２９３細胞およびＨｅｐＧ２細胞を、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％（体積／体積）ＦＣＳ（ＦＳＣ；  ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補った最小必須培地中で培養した。
【００８９】
単層として細胞を培養し、そして培地を３〜４日ごとに交換した。細胞をおよそ８０％集密でルーチンに維持し、過剰増殖および表面接触の喪失を防止した。継代プロセスにおいて、細胞を１０ｍｌ  ＰＢＳ中で洗浄し、そしてフラスコから細胞が脱離するまで、３ｍｌのＴＥ（トリプシン−ＥＤＴＡ、Ｇｉｂｃｏ、英国ペイズリー）中、３７℃でおよそ３分間インキュベーションした。その後、ＴＥの効果を相殺するため、５ｍｌの完全培地を添加した。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって細胞を収集し、そして次いで、継代または植え付けのため、完全培地中に再懸濁した。植え付け前に、血球計数器を用いて細胞を計数して、必要な植え付け密度であることを確実にした。
【００９０】
ｈＳＭＣ上のアデノウイルス受容体のＦＡＣＳ分析
主要アデノウイルス受容体ＣＡＲ、ＣＤ４６およびデスモグレイン２、ならびに共受容体αｖβ３およびαｖβ５の発現レベルをＦＡＣＳによって評価した。簡潔には、１ｘ１０５  ｈＳＭＣ細胞をＰＢＳ中で洗浄し、そして適切な抗体（ＲｍｃＢ（マウスモノクローナル抗ＣＡＲ）、ＭＥＭ−２５８（マウスモノクローナル抗ＣＤ４６）、６Ｄ８（マウスモノクローナル抗ＤＳＧ−２）、ＬＭ６０９（マウスモノクローナル抗αｖβ３）、Ｐ１Ｆ６（マウスモノクローナル抗αｖβ５）またはマウスＩｇＧ対照）いずれかの１：５００希釈を含有する血清不含培地中、氷上で１時間、再懸濁した。１時間後、細胞をペレットにし、洗浄し、そしてａｌｅｘａ−４８８標識ウサギ抗マウス二次抗体中、氷上で１時間再懸濁した。最後に細胞を再びペレットにし、ＰＢＳ中で洗浄し、そして血清不含培地中に再懸濁して、そしてＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ２上で分析した。陰性対照（ＩｇＧ染色細胞）が１％未満陽性に染色されるように、細胞をゲート処理した。
【００９１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞形質導入アッセイ
ウェルあたり２ｘ１０４  ｈＳＭＣを含む、９６ウェル形式で、形質導入実験を行った。血清不含培地中の実験（レジェンドを参照されたい）に応じて、１０００〜１００００ＶＰ／細胞の範囲の用量で、細胞をアデノウイルスに感染させた。３７℃で、実験に応じて、１０分間〜３時間の範囲の期間、細胞を感染させ（別個の図レジェンドを参照されたい）、ＰＢＳで洗浄し、そして感染４８時間後に採取するまで維持した。いくつかの実験において、５μｇ／１０５細胞の組換えＡｄ５ノブ・タンパク質（ＣＡＲ受容体をブロッキングする）または２．５μｇ／ｍｌのＣＤ４６ブロッキングＭＥＭ２５８抗体のいずれかを用いて、細胞をブロッキングした（氷上で１時間）。これらの実験において、アデノウイルス（１００ｖｐ／細胞）の存在下、ブロッキング剤を細胞上でさらに１時間、氷上で１時間、放置した後、ウイルス／ブロッキング剤を細胞から取り除き、細胞を冷ＰＢＳ中で洗浄し、そして完全培地中でさらに４８時間培養した後、ルシフェラーゼ発現に関してアッセイした。製造者の指示にしたがって、ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を定量化した。ｅＧＦＰを発現するアデノウイルスを用いるいくつかの実験において、蛍光顕微鏡を用いて細胞を画像化し、そしてｅＧＦＰに関して陽性である細胞の割合を、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏを用いて定量化した。Ｗａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ２ルミノメーター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国マサチューセッツ州ボストン）を用いて、ルシフェラーゼ活性を定量化した。ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国ウィンスフォード）を用いて、タンパク質濃度を計算した。値を、タンパク質ミリグラムあたりの相対光単位（ＲＬＵ）として表す。
【００９２】
血清中和研究
Ａｄ５、Ａｄ４９およびＡｄ３５に対するあらかじめ存在する免疫レベルを評価するため、グラスゴー・コホート内のＣＡＢＧを経ている患者由来の２．５％血清の存在下または非存在下で、各ベクターのルシフェラーゼ発現型の１００００ｖｐ／細胞に、Ａ５４９細胞を感染させた。ルシフェラーゼ発現を先に記載するように計測し、そしてタンパク質に対して標準化した。血清対照に比較した形質導入の％変化を計算し、そして９０％より高く形質導入を減少させた血清を、非常に中和性であると見なした。
【００９３】
組換えアデノウイルス・ノブ・タンパク質の産生および精製
Ａｄ４９ノブ配列（Ａｄ５ヒンジ領域および６ｘＨＩＳタグを用いて、ｇｅｎｅＡＲＴによって生成）またはＡｄ５ノブ配列を、ｐＱＥ誘導性発現ベクター内にクローニングした。タンパク質産生をＩＰＴＧで誘導し、そしてアフィニティ・クロマトグラフィによって精製し、そして増加する濃度のイミジゾール（ｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）で溶出させた。非変性（ｎａｔｕｒｉｎｇ）または変性条件下で、精製タンパク質を泳動することによって、ノブ・タンパク質が三量体化する能力を確認した。次いで、三量体タンパク質を形質導入アッセイに用いて、先に記載するように、Ａｄ５またはＡｄ４９仲介性形質導入に競合させた。
【００９４】
ネズミ、ブタおよびヒト血管におけるｅｘ  ｖｉｖｏ形質導入アッセイ
ネズミ（大動脈）、ブタ（伏在）およびヒト（内乳）血管試料をトリミングして、外膜組織を取り除き、ほぼ等しいサイズの片に切り、ＰＢＳ中で洗浄し、そして血清不含培地中、実験に応じて、１０分間〜３時間の範囲の期間（標準は１時間）、ルシフェラーゼを発現する１０９または１０１０ｖｐのＡｄ５またはＡｄ４９に感染させた。感染４８時間後、試料をＤ−ルシフェリンに浸し、そしてＩＶＩＳスペクトルを用いて画像化した。
【００９５】
結果
ヒト平滑筋細胞（ｈＳＭＣ）およびヒト内皮細胞（ｈＥＣ）の培養上でのアデノウイルス受容体発現の評価
ＦＡＣＳ分析を使用して、適切なアイソタイプマッチ対照とともに、ｈＳＭＣおよびｈＥＣ上の既知のアデノウイルス受容体の発現レベルを確認した（表１）。Ｃ種Ａｄ５受容体（ＣＡＲ）の発現は、どちらの細胞タイプでも驚くほど低いことが見出され、一方、Ｂ種受容体（ＣＤ４６）は、実質的により高いことが見出された。さらに、本発明者らは、Ｂ種アデノウイルスＡｄ３、７、１１および１４の最近同定された主要受容体であるデスモグレイン−２（ＤＳＧ−２）、ならびに他の受容体および共受容体の発現を定量化した。本発明者らは、低レベルのＤＳＧ−２発現、および中程度のレベルのインテグリンを観察した。
【００９６】
【表２】
2015518851.tif 000005
【００９７】
表１：ＳＭＣ上およびＥＣにおける受容体および共受容体発現
主要Ａｄ５受容体ＣＡＲの発現がｈＳＭＣおよびｈＥＣ上で低レベルであることは、形質導入効率を有意に制限し、効率的な遺伝子導入のためには、非常に高い用量を必要とするであろう。ＣＤ４６結合、またはこれらの細胞タイプ上に存在する、他の定義されていない高発現受容体に基づくベクターは、血管細胞への療法的遺伝子導入のために、より効率的であろう。
【００９８】
血管遺伝子導入のための別のＡｄ血清型の潜在能力の評価
本発明者らは、初代血管ｈＳＭＣおよびＥＣの培養において、Ａｄ５、Ａｄ２６、Ａｄ３５、Ａｄ４８、Ａｄ４９およびＡｄ５０に基づくルシフェラーゼ発現アデノウイルスベクターを用いて、形質導入アッセイを行った。
【００９９】
本発明者らの予備的知見（未提示）に基づき、本発明者らは、Ａｄ５、Ａｄ３５およびＡｄ４９で研究を続けた。用量反応実験（１〜１０，０００ｖｐ／細胞）をｈＳＭＣで行った。感染の４８時間後、細胞を視覚化し、そして写真撮影し（未提示）、そしてｅＧＦＰ発現に関して陽性である細胞の％をＦＡＣＳによって定量化した（図１を参照されたい）。
【０１００】
ＣＤ４６を利用するＡｄ３５は、Ａｄ５と比較した際、ｈＳＭＣにおいて、有意により高いレベルの形質導入を仲介することが可能である。受容体使用が未知であるＡｄ４９は、試験したすべての用量で、Ａｄ５またはＡｄ３５よりも、有意により高いレベルの形質導入を示す。Ａｄ４９はまた、血管内皮細胞を形質導入することが可能であることも見出された（データ未提示）。
【０１０１】
Ａｄへの限定された期間の曝露後の、ｈＳＭＣ培養における形質導入の評価
バイパス移植法は、患者に移植片を再導入する前に、血管へのｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子導入を行うため、〜３０分間の臨床的ウィンドウを提供する。したがって、選択される遺伝子療法剤が、この臨床的ウィンドウ内で、そのＤＮＡペイロードを送達可能であることが重要である。したがって、本発明者らは、Ａｄ５、Ａｄ３５またはＡｄ４９の１０００または１００００ｖｐ／細胞のいずれかと、ｈＳＭＣの初代培養を、１０〜６０分間の期間、インキュベーションし、そして感染４８時間後にルシフェラーゼ活性レベルを評価した（図２）。Ａｄ４９は、試験したどちらの用量でも、そして評価したすべての曝露時点に渡って、Ａｄ５およびＡｄ３５よりも、ｈＳＭＣにおいて、有意にそして実質的により高いレベルの導入遺伝子発現を仲介した。
【０１０２】
Ａｄ４９は、ターゲット細胞との限定された接触時間後であっても、ｈＳＭＣにおいて高効率形質導入を仲介する。
Ａｄ５、Ａｄ３５およびＡｄ４９に対する、あらかじめ存在する免疫のレベルの評価
野生型病原体に対する以前の曝露によって獲得された、あらかじめ存在する抗ベクター免疫は、これらのウイルスに基づく遺伝子療法剤の臨床効率を限定する可能性もある。これらのベクターに対するあらかじめ存在する免疫のレベルを評価するため、本発明者らは、ルシフェラーゼ発現Ａｄ５、Ａｄ３５およびＡｄ４９をインキュベーションし、そしてＨｅｐＧ２細胞（２０，０００細胞／ウェル、１０，０００ｖｐ／細胞）を感染させる前に、ＣＡＢＧ法を受けている患者（スコットランド・コホート）由来の２．５％血清とインキュベーションすることによって、形質導入アッセイを行った。Ａｄが仲介するルシフェラーゼ発現に対する血清の効果を感染４８時間後に定量化した。血清を３群：中和（すなわち血清不含対照に対して、９０％より高くルシフェラーゼ発現を減少させる）、ルシフェラーゼ発現に影響なし（すなわち血清不含対照の１０〜１００％）または増進（すなわちルシフェラーゼ発現が血清不含対照のものの１００％より高い）に分けた（図３）。
【０１０３】
Ａｄ３５およびＡｄ４９（特に）はどちらも、Ａｄ５よりも、スコットランド集団において、あらかじめ存在する抗ベクター免疫のレベルがはるかにより低いことが立証された。
【０１０４】
ＡＤ４９仲介性形質導入のブロッキングに対するＡｄ４９ファイバー・ノブ・タンパク質の効果
本発明者らは、Ａｄ４９の細胞感染性が、ファイバー・ノブ相互作用を通じて仲介されるかどうかを確立しようと試みた。したがって、本発明者らは、Ａ４９ノブ配列（Ａｄ５ヒンジ領域および６ｘＨＩＳタグを含むｇｅｎｅＡＲＴによって生成）を、ｐＱＥ誘導性発現ベクター内にクローニングした。ＩＰＴＧでタンパク質産生を誘導し、そしてアフィニティ・クロマトグラフィによってタンパク質を精製し、そして増加する濃度のイミジゾールで溶出した。本発明者らは、組換えタンパク質が三量体化することを確認した（データ未提示）。次いで、本発明者らは、１００μｇ／１０５細胞〜０．００１μｇ／１０５細胞を用いて、Ａｄ５またはＡｄ４９のいずれかの形質導入に対する組換えＡｄ５およびＡｄ４９ノブ・タンパク質の効果を研究した。Ａｄ５ノブ・タンパク質は、Ａｄ５によって仲介される形質導入を効率的に、そして用量依存性に阻害したが、Ａｄ４９形質導入には影響がなかった。興味深いことに、Ａｄ４９ノブ・タンパク質は、Ａｄ４９形質導入に対して影響がなかったが、Ａｄ５ノブ・タンパク質よりも１〜２対数より高い用量ではあるものの、ＣＡＲ仲介性Ａｄ５感染性を阻害することが可能であった（図４）。
【０１０５】
これらのデータは、Ａｄ４９ノブ・タンパク質がＣＡＲに結合し、そしてＣＡＲ仲介性Ａｄ５感染性をブロッキングする（Ａｄ５ノブよりも１〜２対数より低いアフィニティではあるものの）が、Ａｄ４９の感染性をブロッキングすることができないことを示唆し、Ａｄ４９形質導入がノブ相互作用に依存しないことが示唆される。
【０１０６】
Ａｄ５およびＡｄ４９を用いたマウス大動脈のｅｘ  ｖｉｖｏ形質導入
臨床バイパス移植において、血管系への効率的な遺伝子導入を仲介するための剤としてのＡｄ４９の潜在能力を確かめるため、本発明者らは、Ｃ５７マウスから大動脈を単離し、３つの等しいサイズの切片に切り、そして次いで、Ａｄ５−Ｌｕｃ、Ａｄ４９−ＬｕｃまたはＰＢＳのいずれかの１０９ｖｐの溶液内に、３７℃で１時間、浸すことによって、各片をｅｘ  ｖｉｖｏで処理した後、培地を取り除き、そして血管を完全培地中でさらに２時間培養した。血管をＤ−ルシフェリンに浸し、そしてＩＶＩＳを用いて画像化することによって、生じたルシフェラーゼ発現を定量化した（図５Ａ）。Ａｄ４９は、Ａｄ５より有意により高いレベルの遺伝子発現を仲介することが見出された。２用量のＡｄ５およびＡｄ４９、１０９ｖｐ／血管および１０１０ｖｐ／血管を用いて、この実験を反復した（図５Ｂ）。最後に、本発明者らは、１０９ｖｐのＡｄ４９−Ｌｕｃを用いて経時実験を行い、そして血管をウイルスに１０〜１８０分間曝露した（図５Ｃ）。
【０１０７】
これらのデータによって、Ａｄ４９はＡｄ５よりもｅｘ  ｖｉｖｏで血管系を形質導入する際に有意により効率的であり、そしてＡｄ４９取り込みおよび形質導入は、迅速で、臨床的に適切なウィンドウ内で起こることが示唆される。
【０１０８】
Ａｄ５およびＡｄ４９を用いた、ブタ伏在静脈のｅｘ  ｖｉｖｏ形質導入
前臨床巨大動物モデルを用いて、上に概略した研究を拡張するため、本発明者らは、ブタから予備の伏在静脈を単離し、そして１０９または１０１０ｖｐのＡｄ５またはＡｄ４９を用いて、上記のように血管に形質導入した。本発明者らは、Ａｄ５に比較してＡｄ４９で処理した血管において、形質導入がより高いレベルであり、特に試験した、より低い用量ではそうであったことに注目した（図６Ａ）。さらに、本発明者らは、管腔居住実験を行い、これによって、１０１１ｖｐのＡｄ５またはＡｄ４９のいずれかをブタ伏在静脈の管腔内に導入した（図６Ｂ）。１時間インキュベーションした後、血管をＰＢＳで洗浄し、そしてさらに４８時間培養した後、ＩＶＩＳを用いてルシフェラーゼ発現の定量化を行った。
【０１０９】
これらのデータは、Ａｄ４９が、ｅｘ  ｖｉｖｏ法において、ブタ血管系に効率的に形質導入可能であり、そして特により低い用量で、Ａｄ５よりもより効率的であることを示唆する。本発明者らのデータは、ＣＤ４６のブタ・アイソフォームが、Ｂ種アデノウイルス（例えばＡｄ３５）での形質導入を防止するために、ヒト型と十分に異なることを示唆したため、これはまた、Ａｄ４９によって利用される受容体（単数または複数）がＣＤ４６ではないというさらなる証拠も提供する。
【０１１０】
Ａｄ５およびＡｄ４９を用いた、ヒト内乳動脈のｅｘ  ｖｉｖｏ形質導入
Ａｄ４９が、バイパス移植術由来の過剰な組織から得られる血管細胞に形質導入可能である効率を評価するため、本発明者らは、先行するセクションに記載するように、１０９ｖｐのＡｄ５またはＡｄ４９を用いて、内乳動脈の切片のｅｘ  ｖｉｖｏ形質導入を行った。図７に示すように、Ａｄ４９は、同じ用量のＡｄ５と比較して、血管において、より高いレベル（〜２５ｘより高い）で導入遺伝子発現を仲介した。
【０１１１】
Ａｄ４９は、ヒト血管組織にｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入する際に非常に効率的である。
本発明は、上述の例示的な態様と組み合わせて記載されてきているが、本開示を提供された際に、多くの同等の修飾および変動が、当業者には明らかであろう。したがって、示す本発明の例示的な態様は、例示的であり、そして限定的ではないと見なされる。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、記載する態様に対する多様な改変が行われうる。本明細書に引用するすべての文書は、本明細書に明確に援用される。
【０１１２】
参考文献
【０１１３】
【化２−１】
2015518851.tif 000006
【０１１４】
【化２−２】
2015518851.tif 000007
【０１１５】
【化２−３】
2015518851.tif 000008
【図５】
2015518851.tif 000009
【図６】
2015518851.tif 000010
【図７】
2015518851.tif 000011
【図８】
2015518851.tif 000012
【図９】
2015518851.tif 000013
【図１０】
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【図１】
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【図２】
2015518851.tif 000016
【図３】
2015518851.tif 000017
【図４】
2015518851.tif 000018
【配列表】
2015518851000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年11月29日(2013.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管細胞または組織への遺伝子送達方法であって、前記血管細胞または組織をアデノウイルス遺伝子送達ビヒクルと接触させる工程を含み、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが、Ａｄ４９ヘキソン・タンパク質、Ａｄ４９ペントン・タンパク質およびＡｄ４９ファイバー・タンパク質を含む、前記方法。
【請求項２】
遺伝子導入を必要とする被験体の血管細胞または組織への遺伝子導入方法であって、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルを被験体に投与する工程を含み、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが、Ａｄ４９ヘキソン・タンパク質、Ａｄ４９ペントン・タンパク質およびＡｄ４９ファイバー・タンパク質を含む、前記方法。
【請求項３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
血管細胞または組織が、被験体への導入のために意図される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
血管細胞または組織を提供し、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルと細胞または組織を接触させて遺伝子修飾された細胞または組織を提供し、そして遺伝子修飾された細胞または組織を被験体に導入する工程を含み、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが、Ａｄ４９ヘキソン・タンパク質、Ａｄ４９ペントン・タンパク質およびＡｄ４９ファイバー・タンパク質を含む、療法または予防法。
【請求項６】
血管細胞または組織がある長さの血管を含む、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
ある長さの血管が、伏在静脈、内乳動脈（例えば左内乳動脈）、胃大網動脈（例えば右胃大網動脈）、または下腹壁動脈に由来する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
血管新生または脈管形成の調節、末梢血管疾患の予防または治療、再狭窄の予防または治療、血管手術から生じる合併症の予防または治療、静脈移植失敗の予防または治療、血管細胞増殖の調節、血管細胞アポトーシスの調節、血管細胞遊走の調節、あるいはアテローム形成、アテローム性動脈硬化症または血管閉塞の予防または治療、のために遺伝子導入を行う、先行する請求項いずれか一項記載の方法。
【請求項９】
血管細胞または組織への遺伝子送達のためのアデノウイルス遺伝子送達ビヒクルの使用であって、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが、Ａｄ４９ヘキソン・タンパク質、Ａｄ４９ペントン・タンパク質およびＡｄ４９ファイバー・タンパク質を含む、前記使用。
【請求項１０】
血管細胞または組織への治療的または予防的な遺伝子送達の方法における使用のためのアデノウイルス遺伝子送達ビヒクルであって、Ａｄ４９ヘキソン・タンパク質、Ａｄ４９ペントン・タンパク質およびＡｄ４９ファイバー・タンパク質を含む、前記ビヒクル。
【請求項１１】
血管細胞または組織への遺伝子送達のための薬剤調製における、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルの使用であって、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが、Ａｄ４９ヘキソン・タンパク質、Ａｄ４９ペントン・タンパク質およびＡｄ４９ファイバー・タンパク質を含む、前記使用。
【請求項１２】
アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルが複製適格性でない、先行する請求項のいずれか一項記載の方法、使用またはアデノウイルス遺伝子送達ビヒクル。
【請求項１３】
遺伝子送達ビヒクル内に含有される核酸が、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３またはＥ４領域から１またはそれより多い機能性アデノウイルス遺伝子を欠く、請求項１２記載の方法、使用またはアデノウイルス遺伝子送達ビヒクル。
【請求項１４】
核酸が機能性アデノウイルス遺伝子をまったく含有しない、請求項１２または請求項１３記載の方法、使用またはアデノウイルス遺伝子送達ビヒクル。
【請求項１５】
遺伝子送達ビヒクルによって運搬される核酸ペイロードが、サイトカイン、抗体、免疫刺激因子、抗血管新生因子、血管新生因子、抗炎症タンパク質、血管リモデリング制御因子、血管細胞に関するアポトーシス促進性因子、またはメタロプロテアーゼ阻害剤をコードする異種遺伝子を含む、先行する請求項のいずれか一項記載の方法、使用またはアデノウイルス遺伝子送達ビヒクル。
【請求項１６】
遺伝子送達ビヒクルによって運搬される核酸ペイロードが、ターゲット遺伝子のｍＲＮＡまたはＤＮＡにハイブリダイズすることが可能な、あるいは共抑制によってターゲット遺伝子の発現を阻害することが可能な核酸をコードする異種遺伝子を含む、先行する請求項のいずれか一項記載の方法、使用またはアデノウイルス遺伝子送達ビヒクル。
【国際調査報告】
2015518851.tif 000019
2015518851.tif 000020
2015518851.tif 000021