(57)【要約】ＡＴＸＮ３をコードする核酸分子を標的とし、ハイブリダイズして、ＡＴＸＮ３の発現を減少させるオリゴヌクレオチドが開示される。異常なＡＴＸＮ３の発現の減少は、脊髄小脳失調症３型などの一定の疾患の治療に有益である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇ９８７Ｃの一塩基多型を含む配列番号：４の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、ＡＴＸＮ３の発現を調節するものであるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
伸長したＡＴＸＮ３をコードする核酸の発現を調節するものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２および配列番号：２３からなる群から選択されるものである、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１および配列番号：１２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドに少なくとも８０％同一である、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
１４個のヌクレオチド長である、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
少なくとも１５個のヌクレオチド長である、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
少なくとも１６個のヌクレオチド長である、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
少なくとも１８個のヌクレオチド長である、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
Ｇ９８７Ｃの一塩基多型を含む配列番号：４の領域に特異的にハイブリダイズするものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記調節が、ＡＴＸＮ３の発現を少なくとも約５０％まで減少させるものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記調節が、ＡＴＸＮ３の発現を少なくとも約７５％まで減少させるものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記調節が、ＡＴＸＮ３の発現を少なくとも約９０％まで減少させるものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
野生型ＡＴＸＮ３をコードする核酸にハイブリダイズしないものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
野生型ＡＴＸＮ３の発現と比較して、伸長したＡＴＸＮ３の発現を選択的に調節するものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
伸長したＡＴＸＮ３の発現を阻害するものである、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記調節が、ＡＴＸＮ３の発現を下方調節するものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記調節が、伸長したＡＴＸＮ３の発現と比較して、野生型ＡＴＸＮ３の発現を上方調節するものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号：１を含む核酸に特異的にハイブリダイズしないものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
９８７位における配列番号：１を含む核酸にハイブリダイズしないものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
配列番号：５または配列番号：６を含む核酸にハイブリダイズするものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
Ｇ９８７Ｃの一塩基多型に隣接する反復性（ＣＡＧ）ｎ伸長の部分にさらにハイブリダイズするものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
Ｇ９８７Ｃの一塩基多型を含む領域における配列番号：４を含む核酸に特異的にハイブリダイズするものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
９８７位における配列番号：４を含む核酸に特異的にハイブリダイズするものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２および配列番号：２３からなる群から選択されるものである、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
ロックド核酸（ＬＮＡ）単位；２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、および２’−フルオロ−ＤＮＡ単位からなる群から選択される少なくとも１つの糖修飾ヌクレオチドを含む、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
２つまたはそれ以上のＬＮＡモノマー単位を含む、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
ギャップマーである、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
２つまたはそれ以上のＬＮＡモノマー単位が、連続的に相互に関連して配置されるものである、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
ＡＴＸＮ３の発現の調節が、神経機能を回復させるものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
伸長したＡＴＸＮ３の発現に関連する疾患の治療のための、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項３２】
脊髄小脳失調症３型の治療のための、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項３３】
ＡＴＸＮ３の発現を調節するものである、配列番号：７を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
ＡＴＸＮ３の発現を調節するものである、配列番号：８を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
ＡＴＸＮ３の発現を調節するものである、配列番号：９を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
ＡＴＸＮ３の発現を調節するものである、配列番号：１０を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
ＡＴＸＮ３の発現を調節するものである、配列番号：１１を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
Ｇ９８７Ｃの一塩基多型を含む領域における配列番号：４を含む核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、１つまたはそれ以上のＬＮＡモノマー単位を含み、ＡＴＸＮ３の発現を調節するものである、オリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
１４個のヌクレオチド長である、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
１５個のヌクレオチド長である、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
１６個のヌクレオチド長である、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
前記調節が、ＡＴＸＮ３の発現を少なくとも約５０％まで減少させるものである、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
前記調節が、ＡＴＸＮ３の発現を少なくとも約７５％まで減少させるものである、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
前記調節が、ＡＴＸＮ３の発現を少なくとも約９０％まで減少させるものである、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
前記ＡＴＸＮ３が、ＡＴＸＮ３変異型を含むものである、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
前記調節が、ＡＴＸＮ３変異型の発現を阻害するものである、請求項４５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
ＡＴＸＮ３変異型が、伸長したＡＴＸＮ３である、請求項４６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
ＡＴＸＮ３野生型の発現を調節しないものである、請求項４７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
Ｇ９８７Ｃの一塩基多型を含む領域における配列番号：４を含む核酸に特異的にハイブリダイズするものである、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
配列番号：４のフラグメントを含む核酸にハイブリダイズするものであって、前記フラグメントがヌクレオチド９８７を含むものである、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５１】
Ｇ９８７Ｃの一塩基多型を含む領域における配列番号：４を含む核酸に特異的にハイブリダイズするものである、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５３】
２つまたはそれ以上のＬＮＡモノマー単位を含むものである、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５４】
ギャップマーである、請求項５３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５５】
２つまたはそれ以上のＬＮＡモノマー単位が、連続的に相互に関連して配置されるものである、請求項５３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５６】
ＡＴＸＮ３の発現の調節が、神経機能を回復させるものである、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５７】
異常なＡＴＸＮ３の発現に関連する疾患の治療のための、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項５８】
異常なＡＴＸＮ３の発現に関連する疾患が、脊髄小脳失調症３型である、請求項５７に記載のオリゴヌクレオチドの使用。 
【請求項５９】
脊髄小脳失調症３型の治療に有用であるオリゴヌクレオチドであって、Ｇ９８７Ｃの一塩基多型を含む配列番号：４の領域にハイブリダイズし、少なくとも１つのＬＮＡモノマー単位を含むものである、オリゴヌクレオチド。
【請求項６０】
１４個のヌクレオチド長である、請求項５９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６１】
１５個のヌクレオチド長である、請求項５９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６２】
１６個のヌクレオチド長である、請求項５９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６３】
前記オリゴヌクレオチドが、ＡＴＸＮ３の発現を下方調節し、前記ＡＴＸＮ３が、病原性ポリグルタミン伸長を含むものである、請求項５９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６５】
脊髄小脳失調症３型の治療に有用であるオリゴヌクレオチドであって、Ｇ９８７Ｃの一塩基多型を含む領域における配列番号：４にハイブリダイズし、少なくとも１つのＬＮＡモノマー単位を含むものである、オリゴヌクレオチド。
【請求項６６】
ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡの発現の調節方法であって、ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡを請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと、ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡを前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるのに適当な条件下で接触させ、それによりＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡの発現を調節する工程を特徴とする方法。
【請求項６７】
ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡが、病原性ポリグルタミン伸長をコードするものであり、ＡＴＸＮ３の発現の調節が、ＡＴＸＮ３の発現を減少させるものである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
ＡＴＸＮ３の発現の調節方法であって、前記ＡＴＸＮ３が、病原性ポリグルタミン伸長を含むものであり、１つまたはそれ以上のＡＴＸＮ３をコードする核酸を請求項２に記載のオリゴヌクレオチドと、１つまたはそれ以上のヌクレオチドを前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるのに適当な条件下で接触させ、それによりＡＴＸＮ３の発現を調節する工程を特徴とする方法。
【請求項６９】
ＡＴＸＮ３の発現の調節が、ＡＴＸＮ３の発現を減少させるものである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
異常なＡＴＸＮ３の発現に関連する疾患の治療方法であって、前記疾患と診断された対象を選別し、前記対象に請求項２に記載のオリゴヌクレオチドを投与することを特徴とする方法。
【請求項７１】
異常なＡＴＸＮ３の発現に関連する疾患の治療方法であって、前記疾患と診断された対象を選別し、前記対象に請求項３８に記載のオリゴヌクレオチドを投与することを特徴とする方法。
【請求項７２】
Ｇ９８７Ｃの一塩基多型を含む領域における配列番号：４を含む核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つのＬＮＡモノマー単位を含み、配列番号：１を含む核酸に特異的にハイブリダイズしないものである、オリゴヌクレオチド。
【請求項７３】
脊髄小脳失調症３型の治療に有用であるオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記オリゴヌクレオチドが、Ｇ９８７Ｃの一塩基多型を含む領域における配列番号：４を含む核酸にハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのＬＮＡモノマー単位を含むものである、医薬組成物。
【請求項７４】
前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項７３に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
脳室内投与のために製剤化されている、請求項７３に記載の医薬組成物。
【請求項７６】
非経口投与のために製剤化されている、請求項７３に記載の医薬組成物。
【請求項７７】
前記オリゴヌクレオチドが、Ｇ９８７Ｃの一塩基多型を含む領域における配列番号：４を含む核酸にハイブリダイズすることによって、ＡＴＸＮ３の発現を調節するものである、請求項７３に記載の医薬組成物。
【請求項７８】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：１を含む核酸にハイブリダイズしないものである、請求項７７に記載の医薬組成物。
【請求項７９】
前記オリゴヌクレオチドが、Ｇ９８７Ｃの一塩基多型における配列番号：４を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることによって、ＡＴＸＮ３の発現を調節するものである、請求項７３に記載の医薬組成物。
【請求項８０】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：１を含む核酸に特異的にハイブリダイズしないものである、請求項７９に記載の医薬組成物。
【請求項８１】
ＡＴＸＮ３の発現を調節するオリゴヌクレオチドであって、配列番号：１２を含み、少なくとも１つのＬＮＡモノマー単位を含むものである、オリゴヌクレオチド.
【請求項８２】
約１４−２０個のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであって、Ｇ９８７Ｃの一塩基多型またはその天然に存在する変異型を含む配列番号：４の領域の逆相補物に少なくとも８０％相同であるヌクレオチド配列を含むものである、オリゴヌクレオチド。
【請求項８３】
連続ヌクレオチド配列が、配列番号：４の逆相補物と１つ以下のミスマッチを有し、前記ミスマッチが、９８７位ではない、請求項８２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８４】
前記ヌクレオチド配列が、１つまたはそれ以上のヌクレオチド類似体を含むものである、請求項８２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８５】
１つまたはそれ以上のヌクレオチド類似体が、糖修飾ヌクレオチドである、請求項８４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８６】
前記糖修飾ヌクレオチドが、ロックド核酸（ＬＮＡ）単位、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位および２’−フルオロ−ＤＮＡ単位からなる群から選択されるものである、請求項８５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８７】
１つまたはそれ以上のヌクレオチド類似体が、ＬＮＡである、請求項８４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８８】
配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２および配列番号：２３からなる群から選択されるものである、請求項８２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８９】
ギャップマーである、請求項８２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９０】
ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡを発現する細胞においてＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡの発現を阻害するオリゴヌクレオチドであって、前記ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡが、病原性ポリグルタミン伸長をコードするものである、請求項８２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９１】
前記ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡが、トリヌクレオチド繰り返し（ＣＡＧ）ｎ（式中、「ｎ」は５２以上である）を含むものである、請求項９０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９２】
「ｎ」が、８１またはそれ以上である、請求項９１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９３】
請求項８２に記載のオリゴヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド部分を含む、抱合体。
【請求項９４】
請求項８２に記載のオリゴヌクレオチドおよび医薬的に許容される希釈剤、担体、塩または補助剤を含む、医薬組成物。
【請求項９５】
脊髄小脳失調症３型の治療のための、請求項８２に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項９６】
脊髄小脳失調症３型に罹っている対象の治療方法であって、請求項８２に記載のオリゴヌクレオチドを前記対象に投与して、脊髄小脳失調症３型の１つまたはそれ以上の対象症状が改善される工程を特徴とする方法。
【請求項９７】
前記対象症状が、痙攣の軽減、筋緊張の増加および歩行運動の改善からなる群から選択されるものである、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
異常なＡＴＸＮ３を発現する細胞において異常なＡＴＸＮ３の発現を減少させる方法であって、前記細胞を請求項８２に記載のオリゴヌクレオチドと接触させて、異常なＡＴＸＮ３の発現が減少する工程を特徴とする方法。
【請求項９９】
前記ＡＴＸＮ３が、病原性ポリグルタミン伸長を含むものである、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
脊髄小脳失調症３型に罹っている哺乳類の治療方法であって、哺乳類に治療上の有効量のＡＴＸＮ３を標的とするオリゴヌクレオチドを投与することを特徴とし、前記オリゴヌクレオチドが、Ｇ９８７Ｃの一塩基多型を含む配列番号：４の領域にハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドが、１つまたはそれ以上のＬＮＡ単位を含み、前記ＡＴＸＮ３が、病原性ポリグルタミン伸長を含むものである、方法。
【請求項１０１】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２および配列番号：２３からなる群から選択される配列を含むものである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記オリゴヌクレオチドが非経口で投与されるものである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記オリゴヌクレオチドが静脈内に投与されるものである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
前記オリゴヌクレオチドが、標的とする器官または組織にボーラス注入により投与されるものである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０５】
前記オリゴヌクレオチドが、腹腔内に投与されるものである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０６】
ＡＴＸＮ３の発現を調節する、配列番号：１９を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１０７】
ＡＴＸＮ３をコードする核酸にハイブリダイズして、少なくとも約６５℃の解離Ｔｍを有する二本鎖構造を形成するものである、請求項１０６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０８】
ＡＴＸＮ３が、Ｇ９８７Ｃ突然変異を含み、ＡＴＸＮ３の発現の調節が、ＡＴＸＮ３の発現の阻害を含むものである、請求項１０６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０９】
前記オリゴヌクレオチドが、約０．３〜約８１μＭのＩＣ５０濃度においてＡＴＸＮ３の発現を阻害するものである、請求項１０８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１０】
前記オリゴヌクレオチドが、３７℃において血漿中で少なくとも約９６時間安定である、請求項１０６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１１】
ＡＴＸＮ３の発現を調節する、配列番号：２０を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１１２】
ＡＴＸＮ３をコードする核酸にハイブリダイズして、少なくとも約６０℃の解離Ｔｍを有する二本鎖構造を形成するものである、請求項１１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１３】
ＡＴＸＮ３が、Ｇ９８７Ｃ突然変異を含み、ＡＴＸＮ３の発現の調節が、ＡＴＸＮ３の発現の阻害を含むものである、請求項１１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１４】
約０．３〜約８１μＭのＩＣ５０濃度においてＡＴＸＮ３の発現を阻害するものである、請求項１１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１５】
３７℃において血漿中で少なくとも約９６時間安定である、請求項１１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１６】
ＡＴＸＮ３の発現を調節する、配列番号：２１を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１１７】
ＡＴＸＮ３をコードする核酸にハイブリダイズして、少なくとも約６５℃の解離Ｔｍを有する二本鎖構造を形成するものである、請求項１１６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１８】
ＡＴＸＮ３が、Ｇ９８７Ｃ突然変異を含み、ＡＴＸＮ３の発現の調節が、ＡＴＸＮ３の発現の阻害を含むものである、請求項１１６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１９】
約０．３〜約８１μＭのＩＣ５０濃度においてＡＴＸＮ３の発現を阻害するものである、請求項１１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２０】
３７℃において血漿中で少なくとも約９６時間安定である、請求項１１６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２１】
ＡＴＸＮ３の発現を調節する、配列番号：２２を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１２２】
ＡＴＸＮ３をコードする核酸にハイブリダイズして、少なくとも約６０℃の解離Ｔｍを有する二本鎖構造を形成するものである、請求項１２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２３】
ＡＴＸＮ３が、Ｇ９８７Ｃ突然変異を含み、ＡＴＸＮ３の発現の調節が、ＡＴＸＮ３の発現の阻害を含むものである、請求項１２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２４】
約０．３〜約８１μＭのＩＣ５０濃度においてＡＴＸＮ３の発現を阻害するものである、請求項１２３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２５】
３７℃において血漿中で少なくとも約９６時間安定である、請求項１２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２６】
ＡＴＸＮ３の発現を調節する、配列番号：２３を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１２７】
ＡＴＸＮ３をコードする核酸にハイブリダイズして、少なくとも約５５℃の解離Ｔｍを有する二本鎖構造を形成するものである、請求項１２６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２８】
ＡＴＸＮ３が、Ｇ９８７Ｃ突然変異を含み、ＡＴＸＮ３の発現の調節が、ＡＴＸＮ３の発現の阻害を含むものである、請求項１２７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２９】
約０．３〜約８１μＭのＩＣ５０濃度においてＡＴＸＮ３の発現を阻害するものである、請求項１２８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３０】
３７℃において血漿中で少なくとも約９６時間安定である、請求項１２６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３１】
配列番号：１８を含む核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、ＡＴＸＮ３の発現を調節するものであるオリゴヌクレオチド。 
【請求項１３２】
配列番号：１２を含む、請求項１３１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３３】
ＡＴＸＮ３の発現を調節する、配列番号：１２を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１３４】
少なくとも１つのヌクレオチドを含み、該ヌクレオチド類似体が、ロックド核酸である、請求項１３３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３５】
配列番号：１２を含むオリゴヌクレオチドであって、ＡＴＸＮ３の発現を調節し：
（ａ）１および３位のうちの１つまたはそれ以上におけるアデニンヌクレオチドが、オキシ−ＬＮＡであり；
（ｂ）１０位におけるグアニンヌクレオチドが、オキシ−ＬＮＡであり；
（ｃ）９および１１位のうちの１つまたはそれ以上におけるシトシンヌクレオチドが、オキシ−ＬＮＡであり；ならびに
（ｄ）２位におけるチミンヌクレオチドが、オキシ−ＬＮＡである
からなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置で少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項１３６】
１および３位におけるアデニンヌクレオチドが、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであり、２位におけるチミンヌクレオチドが、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであり、９位におけるシトシンヌクレオチドが、Ｃ５−メチルシトシンであり、全てのヌクレオチド間連結基が、ホスホロチオエート化ヌクレオチド間連結基である、請求項１３５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３７】
１位におけるアデニンヌクレオチドが、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであり、９位におけるシトシンヌクレオチドが、Ｃ５−メチルシトシンであり、全てのヌクレオチド間連結基が、ホスホロチオエート化ヌクレオチド間連結基である、請求項１３５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３８】
９および１１位におけるシトシンヌクレオチドが、両方ともＣ５−メチルシトシンであり、１１位におけるシトシンヌクレオチドが、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであり、全てのヌクレオチド間連結基が、ホスホロチオエート化ヌクレオチド間連結基である、請求項１３５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３９】
１０位におけるグアニンヌクレオチドが、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであり、１１位におけるシトシンヌクレオチドが、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであり、９および１１位におけるシトシンヌクレオチドが、両方ともＣ５−メチルシトシンであり、全てのヌクレオチド間連結基が、ホスホロチオエート化ヌクレオチド間連結基である、請求項１３５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４０】
９および１１位におけるシトシンヌクレオチドが、両方ともβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであり、１０位におけるグアニンヌクレオチドが、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであり、９および１１位におけるシトシンヌクレオチドが、両方ともＣ５−メチルシトシンであり、全てのヌクレオチド間連結基が、ホスホロチオエート化ヌクレオチド間連結基である、請求項１３５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４１】
少なくとも１つのヌクレオチドが、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンシトシンからなる群から独立して選択された修飾された核酸塩基である、請求項１３５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４２】
オキシ−ＬＮＡが、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、請求項１３５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４３】
少なくとも１つのヌクレオチド間連結基が、ホスホロチオエート化ヌクレオチド間連結基である、請求項１３５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４４】
全てのヌクレオチド間連結基が、ホスホロチオエート化ヌクレオチド間連結基である、請求項１３５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４５】
医薬として使用するための、請求項１３５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４６】
脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）の治療における使用のための、請求項１３５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４７】
医薬として使用するための、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４８】
脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）の治療における使用のための、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１２年３月１２日に提出した米国仮出願第６１／６０９，７７４号の優先権および利益を請求する。上記出願の全体の教示は、出典明示により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
技術分野
本出願は、タンパク質ａｔａｘｉｎ−３（ＡＴＸＮ３）をコードする核酸を標的とし、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドおよび関連する医薬組成物および前記オリゴヌクレオチドを使用して、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）などの疾患の範囲を治療するためにＡＴＸＮ３の発現を調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
マシャド・ジョセフ病としても知られる脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）は、発症および重症度の変動を伴う常染色体優性進行性神経変性障害である。ＳＣＡ３は、元々、ポルトガル人の先祖、特に、ＳＣＡ３が最も蔓延しているアゾレス諸島の人々（例えば、ＳＣＡ３の発症率は、フロレスの小さな島で１／１４０である）で出現していた（非特許文献１）。ＳＣＡ３は、後に他の数カ国で同定され、現在、最も一般的な優性遺伝性運動失調である。
【０００４】
臨床的に、ＳＣＡ３に罹っている患者には、歩行および四肢の進行性運動失調、構音障害、ならびに錐体路障害、ジストニア、動眼障害、顔舌の弱まり、神経障害、進行性感覚喪失およびパーキンソン病様特徴を含む他の症状の様々な組み合わせが存在する。そのより重度な症状において、ＳＣＡ３は、錐体路（例えば、運動、体性感覚など）および錐体外路（例えば、筋緊張）の両方の神経機能の欠失によって特徴付けられる。罹っている家系内では、運動失調の症状はまた、各新しい罹患した世代でより早期の疾患の発症およびより重度の症状によって特徴付けられる遺伝表現促進が見られる。
【０００５】
ＳＣＡ３の全ての症状は、病原性ポリグルタミン領域をコードする染色体１４ｑ３２．１上のＡＴＸＮ３のコーディング領域における（ＣＡＧ）ｎ鎖（tact）または翻訳されたＡＴＸＮ３タンパク質における鎖の不安定で反複性の遺伝子の伸長に起因する（非特許文献２）。ＡＴＸＮ３のコーディング領域における（ＣＡＧ）ｎ鎖の不安定で反復性の伸長（およびそれによってコードされる病原性ポリグルタミン鎖）は、タンパク質の誤った折り畳みを増加させ、これにより核および細胞質封入体の凝集および形成を生じる（非特許文献３）。誤って折り畳まれたタンパク質の凝集は、ＳＣＡ３およびマシャド・ジョセフ病の特徴だけではなく、アルツハイマー病およびパーキンソン病を含む多くの他の神経変性疾患の共通の特徴である。
【０００６】
ＳＣＡ３の治療に現在利用可能な治療上のアプローチは、対症療法または主に運動と食事改善に基づく治療アプローチに限られている。ＳＣＡ３の治療に適した療法を開発しようとなされた試みは、ＡＴＸＮ３のコーディング領域における（ＣＡＧ）ｎ鎖の伸長を標的としたものである。しかしながら、多くの例において、このような治療は、機能的な野生型対立遺伝子と比較して、病原性ポリグルタミン鎖をコードする変異しまたは異常な対立遺伝子の発現を有効に阻害しえない。例えば、特許文献１および２は、異常な対立遺伝子と野生型対立遺伝子の両方の繰り返し配列に相補的であるが、異常な対立遺伝子を特徴付けるより到達可能で一時的なオープンループ構造に選択的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドを設計することによって、ポリグルタミン伸長をコードする異常な対立遺伝子または転写物を標的とする様々な方法を記載する。同様に、Ｈｕら（非特許文献４）は、オリゴマーが、対立遺伝子の各々を特徴付ける部分的な構造上の相違に基づいて野生型と変異型対立遺伝子を区別しうるかどうかを評価した。ＳＣＡ３の対立遺伝子特異的なサイレンシングは、低分子干渉ＲＮＡ介在技術に関連してＭｉｌｌｅｒら（非特許文献５）によって発表されている。しかしながら、Ｍｉｌｌｅｒらは、野生型と変異型対立遺伝子の一塩基の相違では、特異的な条件が適合しない限り、対立遺伝子特異性を付与するのに十分ではないであろうと結論付けた。
【０００７】
ＳＣＡ３に罹っている患者に対する現在利用可能な治療法が存在しないため、ヒトＳＣＡ３の症状ならびにこれに関連する生存および病的状態を治療し、または少なくとも改善する方法として、ＡＴＸＮ３をコードする核酸の発現を調節し、病原性ポリグルタミン伸長を含むＡＴＸＮ３の発現を抑制し、阻害し、予防し、または減少させる新しい治療法を見出すためにさらなる開発が必要とされている。特に、機能的な野生型対立遺伝子との比較の差異を基にした病原性ポリグルタミン鎖をコードする変異しまたは異常な対立遺伝子を有効に標的とすることができる新たなアンチセンス治療が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００８／０１８７９５Ａ１
【特許文献２】ＷＯ／２００９／０９９３２６Ａ１
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Sudarsky L., et al., Clin. Neurosci. 199５; ３:17−22
【非特許文献２】Kawaguchi Y., et al., Nature Genet. 1994; 8: 221−228
【非特許文献３】Paulson HL, et al., 1997, Neuron 19, ３３３−３44
【非特許文献４】Nat. Biotechnol. 2009; 27(５): 478−484
【非特許文献５】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 200３; 100(12): 719５−7200
【発明の概要】
【００１０】
本明細書において、新規なオリゴヌクレオチド、特に、ロックド核酸（ＬＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、および異常な、変異または伸長したＡＴＸＮ３の発現に関連した疾患（例えば、脊髄小脳失調症３型またはマシャド・ジョセフ病）の治療に有用な治療方法が提供される。本明細書に開示の発明は、変異しまたは異常なＡＴＸＮ３対立遺伝子を発現する細胞または組織を本発明のオリゴヌクレオチドと接触させると、このようなＡＴＸＮ３の発現を調節し、特に、ＡＴＸＮ３の変異型または天然に存在する変異型（例えば、病原性伸長ポリグルタミン鎖を有するものとして特徴付けられるＡＴＸＮ３）の発現を調節するという知見に関するものである。ある実施態様において、異常なＡＴＸＮ３対立遺伝子または転写物の発現の調節は、例えば、プルキンエ細胞または脊髄神経の正常な機能を回復させる。本発明のオリゴヌクレオチドおよび異常なまたは伸長したＡＴＸＮ３の発現を調節するこのようなオリゴヌクレオチドの使用方法は、例えば、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）のような異常なＡＴＸＮ３対立遺伝子または転写物の発現に関連した生存および病的状態を改善し、または該発現を治療する方法を提供する。ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＳＣＡ３患者に投与されると、ＳＣＡ３の症状（例えば、歩行および四肢の進行性運動失調、構音障害、錐体路障害、ジストニア、動眼障害、顔舌の弱まり、神経障害、進行性感覚喪失、嗜眠およびパーキンソン病様特徴）の改善または消散を生じる。
【００１１】
ある態様において、本明細書に開示の方法は、ＡＴＸＮ３標的配列（例えば、哺乳類ＡＴＸＮ３またはそれによってコードされるｍＲＮＡ配列）にハイブリダイズする約８から約５０個のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに関する。ある態様において、このようなオリゴヌクレオチドは、十分な安定性（例えば、十分なハイブリダイゼーション強度をもって、および十分な時間）をもってＡＴＸＮ３標的配列にハイブリダイズして、ＡＴＸＮ３遺伝子産物（例えば、伸長した病原性ポリグルタミン鎖を有することを特徴とするＡＴＸＮ３タンパク質）の発現を阻害し、あるいは調節する。このために特に適当なオリゴヌクレオチドおよびその他が本明細書に記載される。
【００１２】
ある態様において、本発明は、哺乳類ＡＴＸＮ３遺伝子のコーディング領域の逆相補物またはＡＴＸＮ３をコードするｍＲＮＡの相補物に相当する領域を有する少なくとも８０％同一性（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性）を有する約８〜約３０個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチド長）の連続ヌクレオチド配列（第１の領域）を含む、約８〜約５０個のヌクレオチド長（例えば、約８〜３０、８〜２０、１２〜１８、または１４〜１６個のヌクレオチド長）のオリゴヌクレオチドを提供する。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３をコードする核酸配列の一部に少なくとも８０％相補性（例えば、ＡＴＸＮ３  ＤＮＡ、プレ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡをコードする核酸配列の一部に少なくとも８０％相補性）を有する連続ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。本明細書に開示のオリゴヌクレオチドは、変異型ＡＴＸＮ３遺伝子の領域またはこれによってコードされた対応するｍＲＮＡに相補性を有する核酸配列を含んでいてもよい。同様に、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３遺伝子の遺伝子産物（例えば、ＡＴＸＮ３遺伝子によってコードされたｍＲＮＡ）または病原性ポリグルタミン伸長（ＣＡＧ）ｎをコードする領域などの突然変異をコードし、例えば、配列番号：４によってコードされるようなＧ９８７Ｃの一塩基多型を含むその多型または天然に存在する変異型に相補性を有する配列、あるいはその天然に存在する変異型を含んでいてもよい（例えば、ＮＭ＿００４９９３．５によってコードされる転写変異型または一塩基多型（例えば、ＳＮＰ  ＩＤ  ｒｓ１２８９５３５７など））。特に、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３遺伝子またはｍＲＮＡの変異領域をコードする核酸（例えば、ポリグルタミン伸長突然変異をコードする領域および病原性ポリグルタミン伸長領域をコードする領域のすぐ上流および／または下流の領域（例えば、ポリグルタミン伸長領域の位置から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０個またはそれ以上の上流および／または下流のヌクレオチド））に少なくとも８０％の相補性（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相補性）でありうる。
【００１３】
別の態様において、本発明は、約８〜約２０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを提供するものであって、前記オリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３をコードする核酸（例えば、ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡ）の少なくとも８−核酸塩基部分にハイブリダイズするものである。例えば、ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ポリグルタミン伸長領域をコードする核酸（すなわち、ｍＲＮＡ）、あるいはポリグルタミン伸長領域（例えば、病原性（ＣＡＧ）ｎ伸長の３’下流の１塩基に局在し、本明細書では、「Ｇ９８７Ｃ」ＳＮＰまたは突然変異と称されるＧ→Ｃの一塩基多型）をコードする核酸のすぐ周辺および／または隣接する領域にハイブリダイズする。ある実施態様において、前記オリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３をコードする一本鎖核酸分子の領域、例えば、配列番号：４の一部の配列を有する核酸分子、またはその天然に存在する領域に相補性を有する（例えば、ＳＮＰ  ＩＤ  ｒｓ１２８９５３５７）。
【００１４】
ある実施態様において、本発明オリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列またはその一部に相補性を有する配列を含むか、あるいは本発明オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ配列（例えば、プレ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）またはこれによってコードされるその部分にハイブリダイズする。標的とする細胞または組織（例えば、ＳＣＡ３に罹っているか、または罹患している患者の中枢神経系の神経または他の組織）と接触させると、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３の発現を減少させ（特に、変異しまたは異常なＡＴＸＮ３の発現を減少させる）、これにより神経機能を回復させることができる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、変異しまたは異常なＡＴＸＮ３をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）、例えば、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および／または配列番号：１８を含むか、または前記配列によってコードされるｍＲＮＡ、または前記のいずれかの特定部分または領域（例えば、病原性ポリグルタミン伸長をコードする領域）を標的とし、ある実施態様において、前記核酸にハイブリダイズし、これによりＡＴＸＮ３の発現を調節して、その発現が、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３５％、４０％、５０％、または好ましくは、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％もしくは１００％まで減少させ、および／または阻害することができる。
【００１５】
なお別の態様において、本発明は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。ある実施態様において、前記組成物には、１つまたはそれ以上の本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを、前記組成物の送達または安定性を容易にし、または改善するために１つまたはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤、アジュバント、または他の分子と共に含む医薬組成物が含まれうる。ある実施態様において、本発明は、１つまたはそれ以上の本願明細書に記載のオリゴヌクレオチドおよびそれに結合した（例えば、前記オリゴヌクレオチドに共有結合または非共有結合で結合した）少なくとも１つの非ヌクレオチドもしくは非ポリヌクレオチド部分を含む抱合体を供する。オリゴヌクレオチドおよび抱合体、ならびに医薬として使用（例えば、異常なＡＴＸＮ３の発現に関連する疾患（例えば、ＳＣＡ３およびマシャド・ジョセフ病などの運動失調）の治療）するための、前記オリゴヌクレオチドおよび抱合体を含む医薬組成物、ならびに本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、抱合体および／または医薬組成物を哺乳類対象、例えば、ヒト対象（例えば、小児対象（誕生前もしくは後）または成人ヒト対象）に投与することによるこのような疾患の治療方法も開示される。
【００１６】
別の態様において、本発明は、ＳＣＡ３の治療剤の製造のためのオリゴヌクレオチドまたはその抱合体の使用を提供する。医薬としての本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、Ｇ９８７Ｃの一塩基多型を含む配列番号：４またはＳＮＰ  ＩＤ  ｒｓ１２８９５３５７の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）の使用も本発明に包含される。同様に、ＳＣＡ３などの疾患の治療における、または前記治療のための本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＴＸＮ３ポリグルタミン伸長鎖をコードし、または前記鎖に隣接するｍＲＮＡにハイブリダイズするオリヌクレオチド）の使用が提供される。本発明はまた、ＳＣＡ３またはマシャド・ジョセフ病などの変異しまたは異常なＡＴＸＮ３をコードする核酸の発現に関連する病気または障害の治療方法であって、有効量の本発明によるオリゴヌクレオチド、抱合体および／または医薬組成物を、ＳＣＡ３に罹っているか、ＳＣＡ３に罹っている可能性があるか、またはＳＣＡ３によって罹患されているか、もしくはＳＣＡ３に罹患されている対象（例えば、ＳＣＡ３に罹っているか、罹りやすいヒトの乳児または成人患者など）に投与する工程を特徴とする方法を提供する。ある実施態様において、異常なＡＴＸＮ３の発現に関連する病気、疾患または障害は、ＡＴＸＮ３の過剰発現、特に、変異または伸長したＡＴＸＮ３（例えば、（ＣＡＧ）ｎ鎖（式中、「ｎ」は、５２と同等またはそれ以上である）の不安定であり、および／または反復した遺伝学的に病原性の伸長を含むＡＴＸＮ３）の過剰発現に関連する。ある実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、抱合体および医薬組成物は、ＡＴＸＮ３変異型、多型または天然に存在する変異型、例えば、（例えば、配列番号：４またはＳＮＰ  ＩＤ  ｒｓ１２８９５３５７でコードされるような）病原性ポリグルタミン伸長（ＣＡＧ）ｎを含むＡＴＸＮ３変異型、多型または天然に存在する変異型の発現を選択的に調節する。本発明のオリゴヌクレオチドによるこのようなＡＴＸＮ３変異型、多型または天然に存在する変異型の発現の選択的調節は、（例えば、配列番号：１によってコードされるような）野生型ＡＴＸＮ３の発現と比較して、天然において部分的であり、または完全でありうる。例えば、（ヘテロ接合体）ＳＣＡ３を有する患者に投与される場合、本発明のオリゴヌクレオチドは、野生型ＡＴＸＮ３対立遺伝子をコードするｍＲＮＡおよび変異または伸長したＡＴＸＮ３対立遺伝子をコードするｍＲＮＡの両方を標的としうるが、このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、伸長したＡＴＸＮ３対立遺伝子の発現が、野生型ＡＴＸＮ３対立遺伝子の発現より顕著に高い程度で調節されるように、様々な程度で各標的の発現を調節しうる。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、２、４、８、１０、１５、２５、５０、７５、１００、２００またはそれ以上の倍率によって、Ｇ９８７Ｃ転移置換を含む変異したＡＴＸＮ３変異型または多型（例えば、配列番号：４、５または６によってコードされる配列を含むＡＴＸＮ３変異型または多型）の発現を標的とし、減少させ得る一方で；同一のオリゴヌクレオチドは、各々、１、２、４、５、１０、１５、２５、５０、７５、１���０またはそれ以上の倍率によって（例えば、配列番号：１によってコードされるように）野生型ＡＴＸＮ３の発現を減少させる。同様に、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、約１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％またはそれ以上まで（例えば、配列番号：４またはＳＮＰ  ＩＤ  ｒｓ１２８９５３５７によってコードされるように）病原性ポリグルタミン領域を含む変異したＡＴＸＮ３多型または変異型の発現を標的とし、減少させ得る一方で；同一のオリゴヌクレオチドは、約１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％または９０％まで（例えば、配列番号：１によってコードされるような）野生型ＡＴＸＮ３の発現を減少させる。機能的なまたは野生型ＡＴＸＮ３をコードする核酸との比較に基づいて、変異または伸長したＡＴＸＮ３をコードする核酸を標的とし、および／またはハイブリダイズする（例えば、特異的にハイブリダイズする）オリゴヌクレオチドもまた、本明細書に開示される。例えば、マシャド・ジョセフ病に罹っている患者において、本発明のオリゴヌクレオチドは、機能的または野生型ＡＴＸＮ３対立遺伝子の発現と比較して約１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％またはそれ以上に変異または伸長したＡＴＸＮ３対立遺伝子の発現を標的とし、減少させうる。あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドは、変異型ＡＴＸＮ３遺伝子産物またはｍＲＮＡの発現を減少させ、および／または阻害しつつ、（例えば、ＳＣＡ３に罹っている乳児患者において）野生型ＡＴＸＮ３遺伝子産物またはｍＲＮＡの発現を増加させうる。ある実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、抱合体および医薬組成物は、突然変異をコードしていないＡＴＸＮ３の発現に影響することなく、または影響を最小にしつつ（例えば、ＳＣＡ３患者の対立遺伝子においてＡＴＸＮ３病原性（ＣＡＧ）ｎ伸長および／またはＧ９８７Ｃの一塩基多型をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を選択的に標的とし、ハイブリダイズすることによって）変異型ＡＴＸＮ３の発現を減少させ、あるいは阻害する。
【００１７】
ある実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３の遺伝子産物（すなわち、ｍＲＮＡ）、例えば、（例えば、配列番号：４またはＳＮＰ  ＩＤ  ｒｓ１２８９５３５７によってコードされるような）病原性（ＣＡＧ）ｎ突然変異または伸長を含む変異したＡＴＸＮ３多型または変異型によってコードされるｍＲＮＡ遺伝子産物にハイブリダイズする（例えば、特異的にハイブリダイズする）。他の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、変異または伸長したＡＴＸＮ３多型または変異型をコードする核酸の遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）にハイブリダイズするものであって、このようなＡＴＸＮ３多型をコードするヌクレオチドは、病原性（ＣＡＧ）ｎ突然変異または領域（例えば、病原性（ＣＡＧ）ｎ（式中、「ｎ」は、８１と同等である））を含むものである。他の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、（例えば、配列番号：４またはＳＮＰ  ＩＤ  ｒｓ１２８９５３５７によってコードされるような）変異型ＡＴＸＮ３多型または変異型をコードする核酸の遺伝子産物（すなわち、ｍＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズしうる一方で、同一のオリゴヌクレオチドは、（例えば、配列番号：１によってコードされるような）野生型ＡＴＸＮ３をコードする核酸の遺伝子産物（すなわち、ｍＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズしないものである。このような、オリゴヌクレオチドの伸長し、または変異型ＡＴＸＮ３多型をコードした核酸に対する選択的または区別可能なハイブリダイゼーションは、伸長または変異型遺伝子産物の発現を調節できるが、野生型ＡＴＸＮ３遺伝子産物の発現は、保存され、あるいは変化しないままである。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号：１５−２０（またはそのフラグメント）を含む核酸によってコードされるｍＲＮＡを標的とし、選択的にハイブリダイズし得、その結果として、このようなｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現が、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３５％、４０％、５０％、または好ましくは、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、または最も好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％まで減少され、および／または阻害される。
【００１８】
ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヒトＡＴＸＮ３をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）（例えば、受入番号ＮＭ＿００４９９３によってコードされるＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡ、その変異型および多型を含む）にハイブリダイズする。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、（例えば、配列番号：１および／または配列番号：４によってコードされるような）ヒトＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡを標的とし、ハイブリダイズしうる。１つまたはそれ以上の標的配列に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドもまた包含されるものであって、このような標的配列には、ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡ（例えば、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７または配列番号：１８のうちの１つまたはそれ以上を含む標的配列）が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、病原性（ＣＡＧ）ｎ突然変異、伸長を含むヒトＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡに、またはそのフラグメント（例えば、受入番号ＮＭ＿００４９９３によってコードされるＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡ）にハイブリダイズし、それにより標的とするヒトＡＴＸＮ３の発現を調節しうる。あるいは、同一のオリゴヌクレオチドは、病原性（ＣＡＧ）ｎ突然変異または伸長をコードするＡＴＸＮ３多型をコードする核酸に特異的にハイブリダイズしうるが、同一または同様のストリンジェントな条件下で、病原性（ＣＡＧ）ｎ突然変異または伸長を欠いているか、コードしていないヒト野生型をコードする核酸にハイブリダイズしえない。
【００１９】
変異し、伸長し、または異常なＡＴＸＮ３をコードする核酸の発現を阻害する方法、特に、細胞（例えば、プルキンエ細胞または神経細胞）において、変異し、伸長し、または異常なＡＴＸＮ３遺伝子をコードする核酸の遺伝子産物（例えば、伸長したＡＴＸＮ３をコードするｍＲＮＡ）の生成（例えば、転写または翻訳）を阻害する方法もまた、提供される。ある実施態様において、前記方法は、本発明によるオリゴヌクレオチド、抱合体または医薬組成物を患者に投与すること、あるいは細胞もしくは組織を抱合体または医薬組成物と接触させて、このような患者または細胞におけるＡＴＸＮ３（例えば、病原性ポリグルタミン伸長を含むＡＴＸＮ３）の発現を阻害することを特徴とする。
【００２０】
約８〜５０の連続モノマー（例えば、ヌクレオチド）の第１の領域を含み、このような第１の領域が、１つまたはそれ以上の選択された標的配列（例えば、変異または伸長したＡＴＸＮ３をコードするｍＲＮＡを含む標的配列）に少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％同一）である、約８〜５０モノマーのオリゴヌクレオチドもまた開示される。ある実施態様において、前記選択された標的配列は、哺乳類ＡＴＸＮ３をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の領域またはそのフラグメントが含まれうる。ロックドアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、８〜５０、１２〜３０または１２〜２０個のヌクレオチド長が、さらに提供される。例えば、ある実施態様において、オリゴヌクレオチドには、１つまたはそれ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）残基またはモノマー単位（例えば、配列番号：１９、配列番号:２０、配列番号：２１、配列番号：２２または配列番号：２３）が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドが、２つまたはそれ以上のＬＮＡモノマー単位（例えば、２つまたはそれ以上のβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマー単位）を含む場合、このようなＬＮＡモノマー単位は、相互に関連して連続的に配置されるものであるか、あるいは、このようなＬＮＡモノマー単位は、相互に関連して非連続的に配列されうるものである。ある実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。例えば、配列番号：１２を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが本明細書で開示されるものであって、前記オリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３の発現を調節し、前記オリゴヌクレオチドには、下記からなる群から選択される１つまたはそれ以上のヌクレオチドで少なくとも１つのロックド核酸が含まれる：前記オリゴヌクレオチドがＡＴＸＮ３の発現を調節し、前記オリゴヌクレオチドには、（ｉ）１および３位のうちの１つまたはそれ以上におけるアデニンヌクレオチドがオキシ−ＬＮＡであり；（ｉｉ）１０位におけるグアニンヌクレオチドがオキシ−ＬＮＡであり；（ｉｉｉ）９および１１位のうちの１つまたはそれ以上におけるシトシンヌクレオチドがオキシ−ＬＮＡであり；および（ｉｖ）２位におけるチミンヌクレオチドがオキシ−ＬＮＡである：からなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置で少なくとも１つのヌクレオチド類似体が含まれる。
【００２１】
必要に応じて、このようなロックドアンチセンスオリゴヌクレオチドには、１つまたはそれ以上の糖置換、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル糖置換が含まれていてもよい。１つまたはそれ以上の本発明によるオリゴヌクレオチドを含み抱合体もまた、本明細書で提供され、このようなオリゴヌクレオチドには、本発明のオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分が含まれる。
【００２２】
１つまたはそれ以上の本発明によるオリゴヌクレオチドまたは抱合体、ならびに医薬的に許容される希釈剤、担体、塩、溶媒和物またはアジュバントを含む医薬組成物もまた、提供される。１つまたはそれ以上の本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物もまた、提供される。このような医薬組成物は、例えば、標的作用部位に直接注射または吸入により非経口で投与されてもよく、あるいは、腹膜、局所、経口でまたはくも膜下腔内に吸入により投与されてもよい。
【００２３】
変異し、または異常なＡＴＸＮ３をコードする対立遺伝子または核酸の発現を下方調節する（例えば、ＲＮＡレベルで伸長したＡＴＸＮ３の発現を下方調節する）方法、特に、細胞もしくは組織におけるＡＴＸＮ３の変異型または天然に存在する変異型の発現を下方調節する方法が、さらに提供される。このような方法は、インビトロまたはインビボで細胞もしくは組織を、有効量の１つまたはそれ以上の本発明のオリゴヌクレオチド、抱合体または組成物と接触させることを特徴とする。ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドおよび組成物は、哺乳類（例えば、ＳＣＡ３に罹っているか、または罹患しているヒト患者）における変異し、伸長し、または異常なＡＴＸＮ３対立遺伝子の発現を下方調節することができるが、正常な機能の対立遺伝子または野生型対立遺伝子の発現を調節しないか、影響を最小にする。
【００２４】
伸長し、または異常なＡＴＸＮ３の発現または過剰発現に関連する疾患または障害に罹っている疑いがあるか、または罹りやすい動物（例えば、非ヒト動物またはヒト）の治療方法であって、前記動物に、治療上または予防上有効量の１つまたはそれ以上の本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、抱合体または医薬組成物を投与することを特徴とする方法もまた、開示される。さらに、変異し、または異常なＡＴＸＮ３（例えば、ＡＴＸＮ３の変異型または天然に存在する変異型）の発現を阻害するためのオリゴヌクレオチドの使用方法が、本明細書で提供される。
【００２５】
異常なＡＴＸＮ３の発現に関連する疾患の治療方法（例えば、ＳＣＡ３およびマシャド・ジョセフ病などの運動失調）および細胞（例えば、神経）機能を回復する方法もまた、提供される。このような方法は、ＡＴＸＮの異常な対立遺伝子を発現する患部細胞（例えば、神経またはプルキンエ細胞）に、１つまたはそれ以上の本発明のオリゴヌクレオチドを送達し、または前記オリゴヌクレオチドを接触させることを特徴とする。本発明の方法がオリゴヌクレオチドを神経細胞に導入する条件（例えば、トランスフェクションまたはそのままの（gyｍnotic）送達）は、患部細胞における異常なＡＴＸＮ３対立遺伝子の発現を減少させ、それにより正常な細胞機能を取り戻すのに十分である。ある実施態様において、このような方法は、ＡＴＸＮ３多型またはＧ９８７Ｃの一塩基多型を含む天然に存在する変異型の発現を選択的に減少させる。本発明は、ＳＣＡ３およびマシャド・ジョセフ病などの疾患の治療方法であって、有効量の１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドまたはその抱合体もしくは医薬組成物を、それを必要とする患者（例えば、ＳＣＡ３に罹っているヒト乳児患者）に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明は、細胞または組織における変異しまたは異常なＡＴＸＮ３の発現を（例えば、下方調節することによって）阻害する方法であって、前記細胞または組織を、有効量の１つまたはそれ以上の本明細書に記載のオリゴヌクレオチドまたはその抱合体もしくは医薬組成物と接触させて、それにより、変異しまたは異常なＡＴＸＮ３対立遺伝子の発現（例えば、ｍＲＮＡレベルで）を下方調節する工程を特徴とする方法を提供する。
【００２６】
本発明の上記に記載され、多くの他の特徴および付随する有利な点は、記載する実施例と共に、下記の発明の詳細な説明を参照することによってより理解されるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡの病原性（ＣＡＧ）ｎ伸長に由来するＧ９８７Ｃ  一塩基多型の１つのヌクレオチドを含む伸長ＡＴＸＮ３対立遺伝子の領域の一部に相補性を有するオリゴヌクレオチドによる４８時間のそのまま送達による処理を経たＨＥＫ−２９３細胞におけるフラッグでタグを付した変異（ＭＵＴ）レポーター構築物および野生型（ＷＴ）内在性発現レポーター構築物レベルを示す。前記ＨＥＫ−２９３細胞を、蛍ルシフェラーゼ転写物に融合させたＧ９８７Ｃ  ＳＮＰおよび８１（ＣＡＧ）繰り返し構造を有する変異型ＡＴＸＮ３転写物のコーディング領域から構成されるｐＦＬＡＧ−ＡＴＸ３Ｑ８１−ＦＬ−ＦＦルシフェラーゼレポーター構築物で安定的にトランスフェクトし、続いて前記オリゴヌクレオチドを、トランスフェクトされた細胞に１μＭ、５μＭおよび２５μＭの培地濃度でそのまま導入した。次いで、前記細胞を４８時間後に収集し、ｍＲＮＡ発現の割合を、関連ｑＰＣＲアッセイを用いて決定した。結果は、模倣物質（ｍock）で処理した試料のパーセンテージとして表し、１つのオリゴヌクレオチドあたり３回の独立した実験の平均として記載する。示した誤差バーは、標準偏差を表す。図１Ａおよび１Ｂの両方に示されるように、２０個のオリゴヌクレオチドは、内在性ＷＴレポーターと比較して顕著な用量応答と共にＭＵＴレポーター構築物の強力なノックダウンを示した。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、１２個の選択したオリゴヌクレオチドのそのままの送達後にＡＴＸＮ３−Ｑ８１でトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞における伸長ＡＴＸＮ３転写物（ＭＵＴ）および内在性ＡＴＸＮ３（ＷＴ）ｍＲＮＡの発現を示す。この結果を内在性ＧＡＰＤＨレベルで標準化し、模倣物質で処理した試料のパーセントとして表した。該オリゴヌクレオチドは、前記細胞に、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、９μＭ、２７μＭおよび８１μＭの最終濃度の培地を用いてそのまま導入した。続いて、該細胞を、前記オリゴヌクレオチドのそのままの送達後４８時間で収集し、変異型ＡＴＸＮ３転写物（レポーター構築物）および内在ＡＴＸＮ３転写物のｍＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲによって分析した。該結果は、１つのオリゴヌクレオチドあたり３回の独立した実験の平均として記載し、誤差バーは、標準偏差を示す。図２Ａおよび２Ｂに示されるように、評価した１２個全てのオリゴヌクレオチドは、ＷＴレポーター構築物と比較して評価される濃度範囲におけるＭＵＴレポーター構築物の用量依存的にノックダウンを生じることがわかった。
【図３】図３は、リード化合物として選択され、ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡの病原性（ＣＡＧ）ｎ伸長に由来するＧ９８７Ｃ  単一ヌクレオチド多型に位置する１つのヌクレオチドを含む伸長ＡＴＸＮ３対立遺伝子の領域の一部に相補的であるように設計された５つのオリゴヌクレオチドについての半数阻害濃度（ＩＣ５０）曲線を示す。ＨＥＫ−２９３細胞は、蛍ルシフェラーゼ転写物に融合されたＧ９８７Ｃ  ＳＮＰおよび８１（ＣＡＧ）繰り返し構造を有する変異型ＡＴＸＮ３転写物のコーディング領域から構成されたｐＦＬＡＧ−ＡＴＸ３Ｑ８１−ＦＬ−ＦＦルシフェラーゼレポーター構築物で安定的にトランスフェクトし、続いて前記オリゴヌクレオチドを、トランスフェクトされた細胞に、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、９μＭ、２７μＭおよび８１μＭの最終濃度の培地を用いてそのまま導入した。続いて、該細胞を、前記オリゴヌクレオチドのそのままの送達後４８時間で収集し、変異型ＡＴＸＮ３転写物（レポーター構築物）および内在ＡＴＸＮ３転写物のｍＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲによって分析した。プロットしたデータ点は、３回の独立した実験の平均レポーターシグナルを示し、誤差バーは、標準偏差を示す。灰色曲線（◆）は、野生型（ＷＴ）レポーターの適合した応答曲線を示し、黒色曲線（▲）は、伸長または変異型（ＭＵＴ）レポーターの適合した応答曲線を示す。各曲線についての対応するＩＣ５０値を各図に示し、５個の選択したリードオリゴヌクレオチドについての実際の値もまた、表２に記載する。
【図４】図４は、ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡの病原性（ＣＡＧ）ｎ伸長に由来するＧ９８７Ｃの一塩基多型に位置する１つのヌクレオチドを含む伸長ＡＴＸＮ３対立遺伝子の領域の一部に相補的である１２個のオリゴヌクレオチドの各々の安定性を示す。オリゴヌクレオチドの各々を、脳組織を加えた脳脊髄液中で３７℃にて１２０時間インキュベートした。試料は、０、２４、４８、９６および１２０時間で採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。１２個のオリゴヌクレオチドの各々の血漿安定性は、予想された範囲内で十分であることがわかり、特に、全てのオリゴヌクレオチドは、９６時間より長い全体の半減期を有することが知見され、大半のオリゴヌクレオチドは、ほとんど分解産物を生じることがなかった。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、Ｇ９８７Ｃの一塩基多型をコードするヌクレオチドを含み、および前記ヌクレオチド周辺の領域の一部に相補的であるオリゴヌクレオチドを、０、３、７、１０および１４日目にマウスに投与した１６日インビボ耐容性実験の結果を示す。該マウスを１６日目で屠殺し、評価した。投与されるコントロールは、生理食塩水コントロールであった。前記結果は、１個のオリゴヌクレオチドあたり５回の独立した実験の平均として記載し、誤差バーは、標準偏差を示す。図５Ａおよび５Ｂに示されるように、５個の選択したオリゴヌクレオチド（配列番号：１９、２０、２１、２２および２３にそれぞれ対応するＳＨ０６、ＳＨ１０、ＳＨ１３、ＳＨ１６およびＳＨ２０）は、生理食塩水コントロールと比較して肝臓酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の無視できる程度の上昇を生じた。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３の発現を調節することができる特定の治療ツールを提供する。ある実施態様において、本明細書に記載の短い（例えば、通常、約５０、４０、３０、２０、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８個またはそれ以下のヌクレオチド長）一本鎖合成オリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３  ＲＮＡ標的配列（例えば、プレ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に相補性を有する塩基配列を有し、水素結合塩基対によってハイブリッド二本鎖を形成する。例えば、ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３をコードする核酸（例えば、ＡＴＸＮ３をコードするｍＲＮＡ）またはそのフラグメント（例えば、配列番号:５もしくは６）を標的とし、または相補性を有し、それによりＡＴＸＮ３の発現を調節しうる。他の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチド（例えば、ロックド核酸ギャップマー）は、一般に、切断作用様式、またはプレ−ｍＲＮＡの加工またはｍＲＮＡの翻訳に関連する酵素の立体障害によって機能する。このハイブリダイゼーションは、発現（すなわち、標的ｍＲＮＡコードのそのタンパク質産物への翻訳）を阻害し、それによるタンパク質産物による後の効果を生じないようにすることが期待できる。よって、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドおよび方法は、異常なＡＴＸＮ３の発現に関連する１つまたはそれ以上の状態（例えば、疾患もしくは症候群）、例えば、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）などの運動失調を軽減し、または治療するために用いることができる。
【００２９】
ＳＣＡ３は、マシャド・ジョセフ病としても知られ、様々な年齢で発症し、重症化する常染色体優性の進行性神経変性障害である。ＳＣＡ３は、ａｔａｘｉｎ−３をコードする核酸における病原性（ＣＡＧ）ｎトリヌクレオチド伸長によって引き起こされ、ＡＴＸＮ３タンパク質におけるポリグルタミンドメインまたは鎖の伸長を生じる。ＳＣＡ３は、元々、ポルトガル人の先祖、特に、ＳＣＡ３が最も蔓延しているアゾレス諸島の人々（例えば、ＳＣＡ３の発症率は、フロレスの小さな島で１／１４０である）で出現していた。（Sudarsky L., et al., Clin. Neurosci. 199５; ３:17−22.）ＳＣＡ３は、後に他の数カ国で同定され、現在、最も一般的な優性遺伝性運動失調である。
【００３０】
臨床的に、ＳＣＡ３およびマシャド・ジョセフ病は、歩行および四肢の進行性運動失調、構音障害、（錐体路障害、ジストニア、嗜眠、動眼障害、顔舌の弱まり、神経障害、進行性感覚喪失およびパーキンソン病様特徴を含む）他の症状の様々な組み合わせを呈する。そのより重症な形において、ＳＣＡ３は、両方の錐体路（例えば、運動、体性感覚）、錐体外路（例えば、筋緊張）および神経機能の異常によって特徴付けられる。発症する家系内において、運動失調のこの形態はまた、新たに罹患する各世代においてより早期の発症およびより重篤な症状によって特徴付けられる表現促進効果を示す。
【００３１】
臨床的な特徴と同様に、ＳＣＡ３が原因となっている退行性変化はある程度異なる。神経喪失および反応性アストログリオーシスを生じる中枢神経系領域は、終脳、小脳および脳幹核、脊髄の前角、胸髄核および後根神経節から選択される。（Durr A, et al., Ann Neurol 1996; ３9: 490−9.）ＳＣＡ３の分子病態は、ＡＴＸＮ３の正常な機能がほとんど理解されていないことから推測の域を出ていないが、ＳＣＡ３の全ての形態は、染色体１４ｑ３２．１上のＡＴＸＮ３のコーディング領域における（ＣＡＧ）ｎ鎖の不安定で反復性の遺伝学的伸長に起因する。（Kawaguchi Y., et al., Nature Genet. 1994; 8: 221−228.）
【００３２】
ＡＴＸＮ３は、生理学的機能においてユビキチン介在タンパク質分解に関連しているポリユビキチン結合タンパク質である（Doss−Pepe EW, Mol. Cell. Biol. 200３; 2３:6469−648３.）。ＡＴＸＮ３をコードする核酸における伸長（ＣＡＧ）ｎ突然変異の存在は、ＡＴＸＮ３タンパク質のＣ末端領域で長いポリグルタミン鎖を生じ、本明細書では、「ポリグルタミン伸長」または「ポリグルタミン鎖」と称される（Durr A, et al., Ann Neurol 1996; ３9: 490−9.）。本明細書で用いられるように、用語「伸長した」は、ポリグルタミン伸長（例えば、（ＣＡＧ）ｎ（式中、ｎは、５２以上である）を有する伸長した対立遺伝子の存在を意味する。前記ポリグルタミン伸長は、タンパク質の誤った折り畳みを増加させ、核および細胞質内封入体の凝集および形成を生じる。（Paulson HL, et al., 1997, Neuron 19, ３３３−３44.）該ポリグルタミン伸長はまた、プルキンエ細胞および脊髄神経における有害なユビキチン化された核凝集体および封入体の形成に関連する。誤って折り畳まれたタンパク質凝集は、ＳＣＡ３の特徴のみならず、多くの他の神経変性疾患（アルツハイマー病およびパーキンソン病を含む）の共通の特徴でもある。
【００３３】
ＳＣＡ３の優性遺伝パターンのため、ならびにＡＴＸＮ３の機能喪失は、ポリグルタミン伸長と同一の疾患表現形を付与しないことにより有していないため、伸長した対立遺伝子は患部神経において優性毒性を獲得する。（Schｍitt et al., Biocheｍ Biophys Res Coｍｍun 2007; ３62(３):7３4−9.）毒性は、ユビキニン／プロテアソーム機構の浸潤、または折り畳まれないか、もしくは誤って折り畳まれたタンパク質の蓄積、または異常なタンパク質分解から生じる他の調節異常から生じうる。
【００３４】
ＳＣＡ３に罹っていない個体は、通常、本明細書では、「病原性（ＣＡＧ）ｎ伸長」または「病原性伸長」（例えば、（ＣＡＧ）ｎ（式中、ｎ＝約５５−８４またはそれ以上である））と一般に称される約５５−８４またはそれ以上の伸長したグルタミン繰り返し長を示しうるＳＣＡ３患者と比較して、ＡＴＸＮ３タンパク質における約１０−４０の間のグルタミン繰り返し長（例えば、（ＣＡＧ）ｎ（式中、「ｎ」は、約１０−４０である））を示す。（Paulson, HL, Intranuclear inclusions of expanded polyglutaｍine protein in spinocerebellar ataxia type ３/Machado Joseph disease. BIOS Scientific Publishers, Oxford, United Kingdoｍ; Kawaguchi Y., et al. Nat. Genet. 1994;8: 221−228を参照のこと）ポリグルタミン鎖の伸長は、変異型ＡＴＸＮ３タンパク質において毒性の機能獲得を付与し、神経の核内封入体を形成させる。（Schｍidt T, et al., Brain Pathol.1998; 8:669−679）。ポリグルタミン鎖の長さは、ＳＣＡ３の発症時の年齢に反比例する。（Netravathi M., et al., J. Neurol Sci. (2009) 277 1−2:8３−6）。
【００３５】
野生型ＡＴＸＮ３対立遺伝子の機能喪失はまた、ユビキチン介在タンパク質分解に役割を果たしていることを示し、このような機能喪失は、有害でありうる。（Doss−Pepe EW, Mol. Cell. Biol. 200３; 2３:6469−648３.）よって、本発明のオリゴマー化合物が病原性（ＣＡＧ）ｎ伸長を単独で標的とする戦略は、有益ではあり得ない。むしろ、ある実施態様において、変異型（例えば、病原性）ＡＴＸＮ３対立遺伝子の戦略的で特徴的な標的が所望されうる。
【００３６】
一塩基多型（ＳＮＰ）の存在に基づく変異型ＡＴＸＮ３対立遺伝子の戦略的な標的は、野生型および変異型ＡＴＸＮ３対立遺伝子の間の区別を確かなものとすることを示唆している。（Miller VM, et al. Proc Natl Acad Sci. 200３;100:719５−7200.）。このＳＮＰは、変異型ＡＴＸＮ３対立遺伝子の病原性（ＣＡＧ）ｎ伸長の下流または３’に位置する１つのヌクレオチドであり、病原性ポリグルタミン伸長で連鎖不平衡であり、典型的に、病原となった対立遺伝子とともに分離される。（Stevanin G, et al. Aｍ J Huｍ Genet. 199５; ５7:1247−12５0;およびGaspar C, et al. Huｍ Genet. 1996; 98:620−624.）ほとんどのＳＣＡ３患者において、野生型ＡＴＸＮ３対立遺伝子は、９８７位でＧを有するが、伸長／変異型ＡＴＸＮ３対立遺伝子は、９８７位でＣを有する。（Gaspar C, et al. Aｍ J Huｍ Genet. 2001; 68:５2３−５28）。ポリグルタミン伸長をコードする全ての変異型ＡＴＸ３対立遺伝子は、９８７位でＣを有するが、野生型対立遺伝子の約５０％は、この位置にＧを有する。
【００３７】
野生型ＡＴＸＮ３対立遺伝子の発現の減少は、ハプロ不全を生じることがなく、それゆえ、野生型ＡＴＸＮ３対立遺伝子の発現の減少は、有害と考えられていない。よって、ＧからＣへのＳＮＰまたは突然変異（本明細書では、「Ｇ９８７Ｃ」ＳＮＰもしくは突然変異とも称される）の存在は、本発明のオリゴマー化合物を用いて、野生型ＡＴＸＮ３対立遺伝子の機能を保持しつつ、伸長または変異型ＡＴＸＮ３対立遺伝子を区別して標的とする機会を提供する。
【００３８】
よって、ある実施態様において、本開示は、ＳＣＡ３の発症に関連するＡＴＸＮ３をコードする変異型または伸長対立遺伝子の対立遺伝子特異的な標的またはノックダウンに関する。この点に関して具体的に考慮すると、（ＣＡＧ）ｎ繰り返し構造の顕著な不安定性を前提として、（ＣＡＧ）ｎ鎖の重複は当たり前である。以前に記載されるように、正常な対立遺伝子は、約１３〜３６個のＣＡＧ繰り返し構造を含有することが示されているが；ある例において、正常な対立遺伝子は、４７個のＣＡＧ繰り返し構造を含有しうる。ＳＣＡ３疾患病態は、極度の重複とともに伸長した対立遺伝子、例えば、過剰な５２ＣＡＧ繰り返し構造において生じる。（Kawaguchi Y., et al. Nat. Genet. 1994;8: 221−228を参照のこと）
【００３９】
本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、医薬組成物および方法は、例えば、１つまたはそれ以上の異常な核酸分子（例えば、伸長したＡＴＸＮ３）の発現または機能を調節することによって、ＳＣＡ３のような運動失調を軽減し、または治療するために用いることができる。
【００４０】
オリゴヌクレオチド
ある実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、異常なＡＴＸＮ３をコードする核酸（例えば、配列番号：４で提供されるようなＡＴＸＮ３をコードするｍＲＮＡおよび／または配列番号：５および配列番号：６で提供されるようなそのフラグメント）およびこのような核酸の天然に存在する変異型を標的とし、それによりＡＴＸＮ３の発現を調節する。本明細書で用いられるように、用語「オリゴヌクレオチド」は、２つまたはそれ以上のヌクレオチドの共有結合によって形成された分子を意味する。用語オリゴヌクレオチドとしては、一般に、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣物質およびこれらのキメラ組み合わせが挙げられる。本発明に関して、単一ヌクレオチド単位はまた、モノマーまたは単位とも称されうる。ある実施態様において、用語「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、「単位」および「モノマー」は、交換可能に用いられる。ヌクレオチドまたはモノマーの配列を示す場合、塩基配列、例えば、Ａ、Ｔ（またはＵ）、Ｇ、またはＣなどを意味するものと理解される。
【００４１】
ある実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス作用メカニズムにより核酸分子の発現を調節する（例えば、異常なＡＴＸＮ３の発現を調節する）のに有用である。この調節は、例えば、１つまたはそれ以上の標的とする核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、配列番号：４またはＳＮＰ  ＩＤ  ｒｓ１２８９５３５７）に相補性を有し、および／またはハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することによって達成されうる。ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸の特定の領域（例えば、病原性（ＣＡＧ）ｎ伸長のすぐ下流（３’）に位置するＧ９８７Ｃ転移置換に隣接またはこれの周辺のＡＴＸＮ３をコードする核酸の領域）に相補性を有する。ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸の特定の領域（例えば、Ｇ９８７Ｃ  ＳＮＰまたは転移置換をコードするＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡの領域）にハイブリダイズする（例えば、生理学的条件で特異的にハイブリダイズする）ことができる。
【００４２】
本明細書で用いられるように、用語「標的核酸」は、（プレ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡまたはその部分を含む）ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、このようなＤＮＡ、およびこのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡから転写されたものをも包含するものとされる。例えば、ある実施態様において、用語「標的核酸」は、ＡＴＸＮ３をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）、または特に、変異しまたは異常なＡＴＸＮ３をコードする核酸を意味する。本明細書で用いられるように、用語「遺伝子産物」は、遺伝子または核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の発現から生じる生化学的な物質のいずれもを意味し、下記に限定されないが、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質が含まれる。例えば、ある実施態様において、ＡＴＸＮ３遺伝子に関して用いられる場合、用語遺伝子産物は、ＡＴＸＮ３によってコードされたｍＲＮＡを意味する。ある実施態様において、標的核酸には、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号：１８からなる群から選択される核酸配列が含まれる。他の実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：１３、配列番号:１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および／または配列番号：１８のうちの１つまたはそれ以上を含む核酸配列に相補性を有し、および／またはハイブリダイズする。
【００４３】
ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、１つまたはそれ以上の標的核酸（例えば、ＡＴＸＮ３をコードするｍＲＮＡ）に相補性を有し、（例えば、アンチセンス作用メカニズムによって）標的とした核酸の正常な機能を妨げる。特異的にハイブリダイズする本発明のオリゴヌクレオチドによる標的核酸の機能のこの干渉または調節は、一般に、「アンチセンス」と称される。干渉されるＤＮＡの機能には、複製および転写が含まれうる。干渉されるＲＮＡの機能には、機能、例えば、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡの移行、ＲＮＡからタンパク質への翻訳、１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ種を生成するためのＲＮＡのスプライシング、およびそのＲＮＡに関与し、もしくはそのＲＮＡによって促進されうる触媒活性が含まれる。ある実施態様において、標的とする核酸の機能の干渉の全体の効果は、このような標的核酸の産物の発現の調節である。
【００４４】
本明細書で用いられる用語として、「アンチセンス化合物」および「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、核酸分子、特に、標的核酸、例えば、異常なまたは変異型タンパク質または酵素をコードするｍＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補性を有する（例えば、１００％、約９９％、９８％、９７．５％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％の相補性を有する）オリゴヌクレオチドを意味する。ある実施態様において、アンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸にハイブリダイズすることができ、それによりその発現を調節することができる。
【００４５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、約８〜５０個のヌクレオチド長、例えば、８〜３０個のヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列からなるか、または含む。様々な実施態様において、本発明の化合物は、ＲＮＡ単位またはモノマーを含まないが、むしろ、例えば、ＤＮＡ単位またはモノマーおよび／または、ある例において、ＬＮＡ単位またはモノマーを含む。本発明による化合物は、直鎖分子であるか、または直鎖分子として合成されることが好ましい。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、一本鎖分子であり、好ましくは、同一のオリゴヌクレオチド内の同等の領域に相補性を有する短い領域、例えば、少なくとも３、４または５個の連続ヌクレオチド（すなわち、二本鎖）を含まない。これに関して、オリゴヌクレオチドは、必ずしも二本鎖である必要はない。
【００４６】
標的配列
ある実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、調節することができ、あるいは、ある実施態様において、ＡＴＸＮ３の発現を下方調節する（例えば、減少させ、または排除する）ことができる（例えば、異常なまたは変異型ＡＴＸＮ３をコードする核酸の翻訳をｍＲＮＡレベルで下方調節することができる）。これに関して、本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヒト細胞などの哺乳類細胞（例えば、Ａ５４９細胞、ＨｅＬａ細胞、プルキンエ細胞または神経細胞）において、ＡＴＸＮ３の阻害に影響を与えることができる。ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸（例えば、伸長し、変異しまたは異常なＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡ）にハイブリダイズし、正常な発現レベル（例えば、オリゴヌクレオチドまたは抱合体の非存在における発現レベル）と比較して、少なくとも約１０％−１００％の発現の阻害または減少を与える。例えば、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３変異型対立遺伝子を保有する個体に見られるＡＴＸＮ３の正常な発現レベルと比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％または１００％の減少または阻害を与える。ＡＴＸＮ３の発現のある実施態様において、このような調節は、標的とする細胞または組織を、本発明化合物の約０．０４ｎＭ−２５ｎＭの濃度（例えば、約０．８ｎＭ−２０ｎＭの濃度）に露出することによって証明される。同一のまたは異なる実施態様において、標的核酸（例えば、変異型ＡＴＸＮ３をコードするｍＲＮＡ）の発現の阻害は、１００％以下（例えば、約９８％以下の阻害、約９５％以下の阻害、約９０％以下の阻害、約８０％以下の阻害または約７０％以下の阻害）である。ある実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、（例えば、変異しまたは異常なＡＴＸＮ３をコードするｍＲＮＡを標的とし、およびハイブリダイズすることによって）ＡＴＸＮ３の発現をｍＲＮＡレベルで調節することができる。発現の調節（例えば、ｍＲＮＡレベル）は、（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて標的タンパク質に対する適切な抗体を用いたウェスタンブロッティングにより）タンパク質レベルまたは濃度を測定することによって決定することができる。あるいは、発現の調節（例えば、ｍＲＮＡレベル）は、（例えば、ノーザンブロッティングまたは定量ＲＴ−ＰＣＲにより）ｍＲＮＡのレベルまたは濃度を測定することによって決定することができる。ｍＲＮＡレベルまたは濃度の評価による発現を測定する場合、オリゴヌクレオチドの適当な用量または濃度（例えば、約０．０４ｎＭ−２５ｎＭ、または約０．８ｎＭ−２０ｎＭ）を用いた場合の下方調節の程度は、本発明のオリゴヌクレオチド、抱合体または組成物の非存在下で観察される正常レベルまたは濃度と比較して、約１０％以上、約１０−２０％、約２０％以上、約２５％以上、または約３０％以上でありうる。
【００４７】
本発明に関連して、用語「調節する」および「調節」は、遺伝子または遺伝子産物（例えば、ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡ）の発現における増加（例えば、活性化または上方調節）、遺伝子または遺伝子産物（例えば、ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡ）の発現における減少（例えば、下方調節または阻害）、ならびに２つまたはそれ以上の遺伝子産物間の相対的な発現の変化（例えば、野生型ＡＴＸＮ３の発現と比較した変異型ＡＴＸＮ３の発現における減少）のうちの１つまたはそれ以上を意味しうる。本明細書のある記載に関して、下方調節および阻害は、特に、変異または伸長したＡＴＸＮ３（例えば、病原性ポリグルタミン鎖を含むＡＴＸＮ３）の発現の調節に関連する場合、調節の好ましい形である。本明細書のある記載に関して、用語「発現」は、遺伝子または核酸（例えば、ＤＮＡ）からの情報が遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質）の合成で用いられるプロセスを意味し、以下に限定されないが、複製、転写および翻訳のうちの１つまたはそれ以上の工程が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドによって調節されうる発現工程には、例えば、タンパク質の転写、スプライシング、翻訳および翻訳後修飾が含まれうる。
【００４８】
標的、調節および発現に関連する場合、用語「ＡＴＸＮ３」は、ａｔａｘｉｎ−３遺伝子またはその遺伝子産物（例えば、プレ−ｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはタンパク質）を広汎に意味し、変異型および野生型の両方、そのアイソフォームおよび変異型が含まれうる（例えば、ヒトＡＴＸＮ３をコードし、ＡＴＸＮ３タンパク質をコードする核酸）。イタリック体の用語「ＡＴＸＮ３」は、本明細書で用いられるように、典型的に、ａｔａｘｉｎ−３遺伝子を意味する。ＡＴＸＮ３を記載する用語「野生型」は、患者または集団において最も頻繁に観察されるＡＴＸＮ３対立遺伝子、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列または表現形を意味する。例えば、伸長ポリグルタミン鎖をコードする核酸の存在によって特徴付けられる変異型ＡＴＸＮ３対立遺伝子と比較して、用語「野生型」は、このような突然変異を含まないそのままの対立遺伝子を意味する。用語「変異」および「変異型」は、ＡＴＸＮ３を記載する場合、例えば、遺伝子物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の一塩基ヌクレオチドの別のヌクレオチドへの置換を生じる１つまたはそれ以上の転移および転換点突然変異を含む対象または集団において、変化した対立遺伝子、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、または表現形を意味する。突然変異の一例としては、病原性（ＣＡＧ）ｎ伸長に対してすぐ３’側のＧからＣへの転移置換であり、ＮＭ＿００４９９３（同一のＧからＣへの転移置換を含むその変異型および多型を含む）の９８７位に位置し、本明細書では、「Ｇ９８７Ｃ」突然変異またはＳＮＰと称されるＡＴＸＮ３における一塩基多型である。Ｇ９８７Ｃ突然変異は、病原性ポリグルタミン伸長で連鎖不均衡であり、よって、ほとんどのＳＣＡ３患者において、Ｇ９８７Ｃ突然変異は、病原性ポリグルタミン伸長をコードする対立遺伝子で分離される。Ｇ９８７Ｃ突然変異についてのＳＮＰ  ＩＤは、ＳＮＰ  ＩＤ  ｒｓ１２８９５３５７である。用語「変異」および「変異型」はまた、遺伝子物質（ＤＮＡまたはＲＮＡ）における単一の塩基ヌクレオチドから別のヌクレオチドへの置換を生じる転移および転換点突然変異を含むものとされる。このような突然変異は、病原性（ＣＡＧ）ｎ伸長に隣接するＧ９８７Ｃ転移置換（ほとんどのＳＣＡ３患者は、９８７位で（正常な患者のような）Ｇの代わりにＣとして有する）によって例示される。
【００４９】
本明細書で用いられるように、用語「伸長」または「伸長した」は、それらがＡＴＸＮ３またはＡＴＸＮ３をコードする核酸を記載し、または定量化する場合、遺伝子コードにおける反復性遺伝子重複の領域、特に、病原性ポリグルタミン伸長をコードする（ＣＡＧ）ｎトリヌクレオチド繰り返し構造（例えば、領域（ＣＡＧ）ｎ（式中、「ｎ」は約５２以上である）を含むＡＴＸＮをコードする核酸）を含む領域を意味する。伸長の一例として、ＡＴＸＮ３をコードする核酸における不安定な（ＣＡＧ）ｎ繰り返し構造の反復性遺伝子重複であり、翻訳されたＡＴＸＮ３タンパク質産物における病原性ポリグルタミン伸長をコードし、生じるものである。
【００５０】
ＡＴＸＮ３に特に関連する場合、用語「発現を調節する」は、ＡＴＸＮ３遺伝子の遺伝子産物（例えば、野生型および／または変異型ＡＴＸＮ３の遺伝子産物）の活性化、上方調節、下方調節、および／または阻害を意味する。例えば、異常なＡＴＸＮ３をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を標的とし、このような核酸（例えば、ＡＴＸＮ３をコードするｍＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズする本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３の発現を調節することができる。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、マシャド・ジョセフ病またはＳＣＡ３に罹っている患者における野生型および変異型ＡＴＸＮ３の両方の発現を調節することができる。あるいは、好ましい実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、変異または伸長ＡＴＸＮ３の発現を選択的に下方調節し、または阻害することができる（例えば、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、病原性（ＣＡＧ）ｎトリヌクレオチド繰り返し構造の存在によって特徴付けられる変異ＡＴＸＮ３の発現を調節しうる）。
【００５１】
ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、特定の核酸を標的とすることができる。本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する特定の核酸に対する標的は、複数段階プロセスでありうる。このプロセスは、通常、機能が調節される核酸配列の同定から開始される。これは、例えば、発現が特定の障害または疾患状態（例えば、ＳＣＡ３）に関連している核酸（例えば、ｍＲＮＡなど）でありうる。ある実施態様において、標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＴＸＮ３をコードする。ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、（例えば、病原性ポリグルタミン鎖をコードする対立遺伝子を選択的に標的とし、それにより機能的な野生型対立遺伝子と比較した区別に基づいて伸長した対立遺伝子の発現を調節することによって）標的核酸の対立遺伝子特異的な調節を引き起こすことができる。例えば、ある実施態様において、標的核酸には、ＡＴＸＮ３のＧ９８７Ｃ転移置換および／または（ＣＡＧ）ｎ伸長鎖をコードする核酸遺伝子の領域またはフラグメントが含まれうる。あるいは、ある実施態様において、標的核酸は、ＡＴＸＮ３のＧ９８７Ｃ突然変異および／または（ＣＡＧ）ｎ伸長鎖を含むＡＴＸＮ３（または対応するｍＲＮＡ）の特定の領域をコードする。標的プロセスにはまた、１つまたはそれ以上の所望の効果が生じるようなアンチセンス相互作用についての標的遺伝子内の部位の決定が含まれうる。１つまたはそれ以上の所望の効果としては、例えば、遺伝子産物（例えば、野生型および／または変異ｍＲＮＡまたはタンパク質）の発現の調節、同一の遺伝子またはｍＲＮＡあるいは他の遺伝子またはｍＲＮＡにおける他の部位と比較して標的部位についての選択的な結合（例えば、増加した結合親和性）、標的への十分なまたは亢進した送達、ならびに最小限の望ましくない副作用または副作用なしを挙げることができる。ある実施態様において、好ましい標的とする核酸またはｍＲＮＡ部位は、ＡＴＸＮ３および／または隣接領域のＧ９８７Ｃ  ＳＮＰおよび／または（ＣＡＧ）ｎ伸長鎖をコードする。
【００５２】
ポリグルタミン伸長は、脊髄小脳失調症３型の進行に関連する最も一般的な突然変異を示す。上記に記載されるように、用語「ポリグルタミン伸長」は、ＡＴＸＮ３をコードする核酸中に存在しうる（ＣＡＧ）ｎトリヌクレオチド（本明細書では、「病原性（ＣＡＧ）ｎ伸長」（式中、ｎ≧約５２）と称される）によってコードされるグルタミン残基の反復性かつ病原性繰り返し構造を意味する。（ＣＡＧ）ｎ（式中、ｎ≧約５２）によってコードされるポリグルタミン伸長は、ＳＣＡ３に関連しているが、ｎ≦約４７は、より一般的であり、ＳＣＡ３を引き起こすことは非常に稀でありうる。ポリグルタミン伸長はまた、病原性（ＣＡＧ）ｎトリヌクレオチド繰り返し構造のすぐ周辺に位置する領域、例えば、このようなポリグルタミン伸長から２、５、１０、１２、２０、３０、５０、６０、７５、８０、または１００コドン上流および下流（例えば、Ｇ９８７Ｃ突然変異）を測定する領域を意味する。ポリグルタミン伸長は、神経の核内封入体の形成を生じ、ＳＣＡ３の進行に関連する最も一般的な突然変異を示す、ＡＴＸＮ３における毒性の機能獲得を付与する。本発明に関して、用語「一塩基多型」または「ＳＮＰ」は、１つのヌクレオチドが種族メンバー間または個体中の染色体対の間で異なる場合に生じるヌクレオチド配列の変化、例えば、病原性（ＣＡＧ）ｎ伸長の３’末端に位置するＧ９８７Ｃ  ＳＮＰを意味する。
【００５３】
ポリグルタミン伸長は、ＡＴＸＮ３における病原性の機能獲得を与え、それにより、変異または伸長したＡＴＸＮ３対立遺伝子を選択的に下方調節するアンチセンスオリゴマー化合物が残りの（野生型）対立遺伝子の正常なＡＴＸＮ３機能を改善または回復させることが予想される。特に、ＳＣＡ３患者において、本発明のオリゴマー化合物は、変異型ＡＴＸＮ３対立遺伝子の発現が下方調節され、または阻害されるように、区別において、変異型ＡＴＸＮ３対立遺伝子をコードする核酸（すなわち、ｍＲＮＡ）（例えば、配列番号：４またはＳＮＰ  ＩＤ  ｒｓ１２８９５３５７を含む核酸）を標的とし、ハイブリダイズし、一方で、同一の化合物は、野生型対立遺伝子（例えば、配列番号：１）を標的とせず、またはハイブリダイズせず、あるいはこれを極めて少ない程度とし、それにより残りの野生型対立遺伝子の機能を確保する。
【００５４】
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、動物、哺乳類、ヒトまたは細胞のうちの１つまたはそれ以上に送達されうる。標的とする細胞タイプとしては、ある実施態様において、神経細胞、脳細胞、プルキンエ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ−２９３またはＡ５４９細胞が含まれうる。ある実施態様において、（例えば、ＨＥＫ−２９３またはＡ５４９細胞において）用いられるオリゴヌクレオチド濃度は、約０．０２５ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．２７ｎＭ、０．３ｎＭ、０．５ｎＭ、０．８１ｎＭ、０．９ｎＭ、１ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ、４０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭまたはそれ以上でありうる。用いられるオリゴヌクレオチド濃度は、ある実施態様において、（例えば、プルキンエ細胞において）２５ｎＭでありうる。トランスフェクション試薬の非存在下において（例えば、そのままの送達を用いて）、約１μＭ−２５μＭ（例えば、約５μＭなど）のオリゴヌクレオチド濃度を有することを特徴とする培地は、標的遺伝子を下方調節するために用いられうる。
【００５５】
用いられるオリゴヌクレオチド濃度は、ある実施態様において、（例えば、神経細胞において）０．１ｎＭ−１ｎＭでありうる。ある実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、約０．２〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量（例えば、１日、１週間、１ヶ月、４ヶ月、半年または１年ごとにヒトに静脈内または皮下に投与される）で患者に定期的に投与されうる（例えば、少なくとも約０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇの１日または１週間ごとの用量で投与される）。ある実施態様において、細胞を処理するために用いられるオリゴヌクレオチドの適当な濃度の決定は、トランスフェクション試薬（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ）を用いてインビトロ細胞アッセイで行われうることに留意されるべきである。 
【００５６】
ある実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３の強力な阻害剤（すなわち、このような細胞または組織を比較的低い濃度のオリゴヌクレオチドに露出することにより細胞または組織においてＡＴＸＮ３の発現を調節できる）である。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、このようなオリゴヌクレオチドの比較的低い濃度でＡＴＸＮ３（例えば、変異型ＡＴＸＮ３）の発現を減少させ、または阻害することができる。例えば、ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、比較的低い濃度（例えば、トランスフェクションアッセイによって決定される約５ｎＭ以下のＩＣ５０または（２ｎＭ以下などの）約４ｎＭ以下のＩＣ５０）における細胞によりＡＴＸＮ３の発現を阻害しうる。本明細書で用いられるように、用語「ＩＣ５０」は、対象パラメータ（例えば、ＡＴＸＮ３タンパク質の発現）を約５０パーセントまで阻害するのに十分であるオリゴヌクレオチド濃度を意味する。ある実施態様において、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、野生型ＡＴＸＮ３タンパク質の発現と比較して変異型ＡＴＸＮ３タンパク質の発現を選択的に阻害するものとして特徴付けられる。よって、オリゴヌクレオチドは、野生型ＡＴＸＮ３タンパク質の発現を阻害するのに必要とされる濃度と比較して低い濃度（例えば、約２倍低い）で変異型ＡＴＸＮ３タンパク質の発現を阻害することと特徴付けられうる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、変異型および野生型ＡＴＸＮ３タンパク質についてのＩＣ５０における少なくとも２倍の相違を示しうる（例えば、ＳＣＡ３に罹っている哺乳類における正常または野生型タンパク質と比較して、ＡＴＸＮ３変異型タンパク質の発現を阻害するために必要とされるＩＣ５０の少なくとも約２、２．５、３、４、５、６、７、８、９または１０倍の相違）。
【００５７】
よって、本発明は、伸長し、または変異型ＡＴＸＮ３タンパク質および／またはｍＲＮＡを発現する細胞（例えば、変異型ＡＴＸＮ３タンパク質および／またはｍＲＮＡを発現するプルキンエ細胞）において、伸長し、または異常なＡＴＸＮ３タンパク質および／またはＡＴＸＮをコードするｍＲＮＡ、特に、ポリグルタミン伸長を含み、またはコードするＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡの発現を調節する方法（例えば、下方調節または阻害）を提供する。このような方法は、本発明によるオリゴヌクレオチドまたは抱合体を細胞に投与して（あるいはこのような細胞をこのようなオリゴヌクレオチドまたは抱合体と接触させて）前記細胞におけるＡＴＸＮ３タンパク質および／またはｍＲＮＡの発現を下方調節し、または阻害することを特徴とする。ある実施態様において、前記細胞は、インビトロもしくはインビボで哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞でありうる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、伸長または変異したＡＴＸＮ３をコードする核酸を標的とし、その遺伝子産物に特異的にハイブリダイズし、それにより、伸長または変異したＡＴＸＮ３の発現を調節する。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＳＣＡ３患者における野生型および／または変異型ＡＴＸＮ３対立遺伝子の発現を調節しうる。患者（例えば、ヒトまたは哺乳類）、対象（例えば、ヒトまたは哺乳類）、および／または細胞（例えば、ヒトまたは哺乳類）への投与は、インビボ，エクソビボ，またはインビトロで行われうる。例えば、ある実施態様において、医薬的に許容される製剤中および／または医薬的に許容される担体または送達ベヒクル中のオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の方法によって、患者または対象の体に直接投与されてもよい。あるいは、ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、細胞が取り出され、患者または対象の体に戻される前に細胞に投与されてもよい。ある実施態様において、細胞は、取り出され、患者または対象の体に戻される前に培養条件で維持されてもよい。
【００５８】
用語「標的とする核酸」は、本明細書で用いられるように、哺乳類ＡＴＸＮ３をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を意味し、特に、変異しまたは異常なＡＴＸＮ３をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を意味する。例えば、（例えば、配列番号：４によってコードされるような）病原性ポリグルタミン伸長を含むＡＴＸＮ３をコードする標的とする核酸が本明細書で開示される。適切な標的とする核酸としては、ＡＴＸＮ３またはその天然に存在する変異型をコードする核酸、ならびにこれらに由来するＲＮＡ核酸（例えば、配列番号：１５−２０を含むか、またはこれらに相当するｍＲＮＡ標的配列）が含まれ、好ましくは、ｍＲＮＡ、例えば、プレ−ｍＲＮＡであるが、好ましくは、成熟ｍＲＮＡである。ある実施態様において、（例えば、研究または診断用に用いられる場合）「標的核酸」は、上記ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸標的に由来するｃＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドでありうる。本発明によるオリゴヌクレオチドは、標的核酸に、またはこのような標的核酸の遺伝子産物にハイブリダイズすることができる。ある実施態様において、標的核酸配列は、ｃＤＮＡ配列であり、それ自体として、成熟ｍＲＮＡ標的配列に相当するが、ｃＤＮＡ配列において、ウラシルがチミジンに置換されていてもよいものと理解される。
【００５９】
用語「その天然に存在する変異型」は、定められた分類群（例えば、哺乳類、例えば、マウス、サル、好ましくは、ヒト）内の天然に存在するＡＴＸＮ３ポリペプチドまたは核酸配列の変異型を意味する。典型的に、ポリヌクレオチドの「天然に存在する変異型」を示す場合、前記用語にはまた、染色体転座または重複によって染色体で見出されるゲノムＤＮＡをコードするＡＴＸＮ３の対立遺伝子多型、ならびにそこから生じたｍＲＮＡなどのＲＮＡが包含されうる。例えば、ＡＴＸＮ３の天然に存在する変異型には、例えば、配列番号：４、またはその天然に存在する変異型（例えば、ＳＮＰ  ＩＤ  ｒｓ１２８９５３５７）によってコードされるようなＧ９８７Ｃ変異が含まれうる。天然に存在する変異型にはまた、ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡの選択的スプライシングに由来する変異型も含まれうる。特定のポリペプチド配列を示す場合、該用語にはまた、例えば、共翻訳または翻訳後修飾（例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質切断、グリコシル化など）によって加工されうるタンパク質の天然に存在する形が含まれる。
【００６０】
配列
ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号：１もしくは配列番号：４、または配列番号：１もしくは配列番号：４の断片のヌクレオチド配列の逆相補物に相当する連続ヌクレオチド配列を含むか、またはからなる。よって、オリゴヌクレオチドは、配列番号：９、１０、１１、１２、１３または１４からなる群から選択される配列を含むか、またはからなり得るものであって、前記オリゴヌクレオチド（またはその連続ヌクレオチド部分）は、必要に応じて、選択された標的配列に対して、１、２または３個のミスマッチを有していてもよい。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、Ｇ９８７Ｃ  ＳＮＰおよびこのようなＳＮＰの周囲のヌクレオチドを含むＡＴＸＮ３配列領域をコードするヌクレオチド配列の逆相補物に相当する連続ヌクレオチド配列を含むか、またはからなる。例えば、ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、表１で特定される配列（すなわち、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２）を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、表１で特定される標的配列のように、Ｇ９８７Ｃ突然変異を含むＡＴＸＮ３をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の領域（例えば、Ｇ９８７Ｃ突然変異から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上上流および／または下流のヌクレオチドである領域）に相補性を有しうる。例えば、ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、表１で特定されるｍＲＮＡ標的配列（例えば、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７または配列番号：１８）に相補性を有しうる。ある実施態様において、このような相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３の遺伝子産物（すなわち、ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡ）、特に、Ｇ９８７Ｃ  ＳＮＰを含むＡＴＸＮ３の遺伝子産物にハイブリダイズ（例えば、特異的にハイブリダイズ）することができる。
表１
【表１】
2015511821.tif 000003
【００６１】
オリゴヌクレオチドは、哺乳類ＡＴＸＮ３をコードする核酸（例えば、配列番号：１、配列番号：４またはその断片）の等価領域に全て相補的（完全に相補的）である連続ヌクレオチド配列を含むか、またはからなりうる。よって、オリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３をコードする核酸にハイブリダイズできるアンチセンスヌクレオチド配列（すなわち、ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡ）を含みうるか、またはからなりうる。
【００６２】
しかしながら、ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズし、その標的にさらに十分に結合して望ましい効果（例えば、標的ｍＲＮＡの下方調節）を示す場合、１、２、３または４個（またはそれ以上）のミスマッチを許容しうる。ミスマッチは、例えば、ヌクレオチド配列内に存在する、オリゴヌクレオチド配列の長さの延長および／またはヌクレオチド類似体（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ））数の増加によって補填されうる。ある実施態様において、連続ヌクレオチド配列には、標的配列、例えば、哺乳類ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡをコードする核酸の対応領域にハイブリダイズする場合、３以下のミスマッチ（例えば、１以下または２以下のミスマッチ）を含む。ある実施態様において、連続ヌクレオチド配列には、哺乳類ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡをコードする核酸の対応領域などの標的配列にハイブリダイズする場合に１以下のミスマッチが含まれる。
【００６３】
本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号：１５、１６、１７、１８、１９または２０からなる群から選択される配列に少なくとも８０％相補性、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、例えば、少なくとも１００％の相補性を有する。
【００６４】
本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号：４に示される相当する配列の逆相補配列に少なくとも８０％の相同性、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、少なくとも９９％の相同性、例えば、１００％の相同性（同一性）を有する。
【００６５】
本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号：４に示される部分配列に少なくとも８０％の相補性、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％の相補性、少なくとも９７％の相補性、少なくとも９８％の相補性、少なくとも９９％の相補性、例えば、１００％の相補性（完全な相補性）を有する。
【００６６】
ある実施態様において、オリゴヌクレオチド（またはその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号：９、１０、１１、１２、１３もしくは１４、または少なくとも約６−１０個のその連続ヌクレオチドの部分配列からなる群から選択される配列のうちの１つから選択されるか、または含むものである。ある実施態様において、前記オリゴヌクレオチド（またはその連続ヌクレオチド部分）は、その配列と比較して、必要に応じて、１、２または３個のミスマッチを含んでいてもよい。
【００６７】
ある実施態様において、部分配列は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９個の連続ヌクレオチドからなっていてもよく、例えば、約１２−２２個、例えば、約１２−１８個のヌクレオチドである。適切には、ある実施態様において、部分配列は、本発明のオリゴヌクレオチド連続ヌクレオチド配列と同一の長さである。
【００６８】
ある実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、配列番号：９、１０、１１、１２、１３もしくは１４、またはその部分配列によるヌクレオチド配列からなるか、または前記配列を含むものである。
【００６９】
ある実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、配列番号：７によるヌクレオチド配列またはその部分配列からなるか、または前記配列を含むものである。
【００７０】
ある実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、配列番号：８によるヌクレオチド配列またはその部分配列からなるか、または前記配列を含むものである。 
【００７１】
ある実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、配列番号：９によるヌクレオチド配列またはその部分配列からなるか、または前記配列を含むものである。
【００７２】
ある実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、配列番号：１０によるヌクレオチド配列またはその部分配列からなるか、または前記配列を含むものである。
【００７３】
ある実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、配列番号：１１によるヌクレオチド配列またはその部分配列からなるか、または前記配列を含むものである。 
【００７４】
ある実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、配列番号：１２によるヌクレオチド配列またはその部分配列からなるか、または前記配列を含むものである。
【００７５】
本発明のオリゴヌクレオチド（もしくはその領域）および核酸の標的領域（例えば、哺乳類ＡＴＸＮ３タンパク質をコードするｍＲＮＡ）の相補性の程度を決定する際、相補性（または相同性もしくは同一性）の程度は、共に最適に整列するオリゴヌクレオチド配列（もしくはその領域）および標的領域の配列（もしくは標的配列の逆相補配列）の間のパーセンテージ同一性（もしくはパーセンテージ相同性）として表される。前記パーセンテージは、２つの配列の間で同一である整列された塩基数をカウントし、オリゴヌクレオチド中の連続モノマーの合計数で割り、次いで１００を掛けることによって算出される。このような比較において、ギャップが存在する場合、このようなギャップは、ギャップ内のモノマー数が本発明のオリゴヌクレオチドと標的領域とで異なる領域というよりむしろ、ミスマッチにすぎないことが望ましい。本明細書で用いられるように、用語「相同な」および「相同性」は、用語「同一性」および「同一の」と相互に交換可能に用いられる。
【００７６】
用語「に相当」および「に相当する」は、オリゴヌクレオチド（すなわち、核酸塩基または塩基配列）または連続ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列、および（ｉ）核酸標的の逆相補配列の部分配列、例えば、ＡＴＸＮ３タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および／または（ｉｉ）配列番号：１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０またはその部分配列からなる群として本明細書で提供されるヌクレオチド配列のいずれかから選択されるさらなる配列の同等な連続ヌクレオチド配列の間の比較を意味する。ヌクレオチド類似体は、それらの同等なまたは対応するヌクレオチドと直接比較される。（ｉ）または（ｉｉ）におけるさらなる配列に相当する第１の配列は、典型的に、第１の配列の長さについての配列（例えば、連続ヌクレオチド配列）と同一であるか、または、本明細書に記載されるように、ある実施態様において、相当する配列に少なくとも８０％相同性、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％相同性、例えば、１００％相同性（同一性）などでありうる。
【００７７】
１つまたはそれ以上の標的部位が同定されると、標的に対して十分に相補性を有する（すなわち、所望の効果を付与するために十分な特異性をもって十分にハイブリダイズする）オリゴヌクレオチドが選択される。例えば、標的とするＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡの領域を同定する場合、オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ標的、あるいはこのようなｍＲＮＡ標的をコードするＤＮＡに対する相補性に基づいて選択されうる。これに関して、「ハイブリダイゼーション」は、相補性ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合でありうる水素結合を意味する。例えば、アデニン（Ａ）およびチミン（Ｔ）は、水素結合の形成により対となる相補的な核酸塩基である。「相補性」は、本明細書で用いられるように、２つのヌクレオチド間の正確な対形成の能力を意味する。例えば、オリゴヌクレオチドのある位置におけるヌクレオチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同一位置でヌクレオチドと水素結合できる場合、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡは、その位置で互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡは、各分子において十分な数の相当する位置が相互に水素結合できるヌクレオチドによって占有される場合に相互に相補性を有する。よって、「特異的にハイブリダイズできる」および「相補的」は、安定で特異的な結合がオリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間に生じるような十分な相補性の程度または正確な対形成を示すために用いられる用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるその標的核酸に１００％相補的である必要はないことが理解される。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるその標的配列に、例えば、約４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９７．５％、９９％または１００％の相補性を有する。アンチセンス化合物は、標的ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子に対する化合物の結合が標的ＤＮＡもしくはＲＮＡの正常な機能を妨げて、機能または有用性の喪失を引き起こす場合に特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的な結合が望まれる条件下（例えば、インビボアッセイまたは治療処置の場合およびインビトロアッセイの場合における生理学的条件下、これらのアッセイが実施される条件下）でアンチセンス化合物の非標的配列への非特異的な結合を回避するための十分な相補性の程度が存在する。用語「逆相補物」、「逆相補性を有する」および「逆相補性」は、本明細書で用いられるように、所定の核酸分子の同一鎖における別の所定の核酸配列とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド（このような核酸配列に対するその相補性による）を意味する。例えば、５’から３’標的核酸鎖における塩基がＣである場合、３’から５’鎖における対応する塩基は、Ｇである。
【００７８】
標的核酸（例えば、変異型ＡＴＸＮ３タンパク質をコードするｍＲＮＡ）にハイブリダイズし、標的核酸の発現を阻害する本発明のアンチセンスおよび他のオリゴヌクレオチドは、実験により同定され、これらの化合物の配列は、本発明の好ましい実施態様として本明細書で同定される（例えば、表１で特定される配列）。これらの好ましい配列が相補的である標的核酸または部位は、本明細書において、「活性な部位」と称され、標的のための好ましい部位（例えば、表１で特定される標的配列）である。本明細書によって包含される活性な部位の一例には、Ｇ９８７Ｃ  ＳＮＰを取り囲む領域が含まれる。よって、本発明の別の実施態様には、活性な部位の領域にハイブリダイズする化合物が包含され、この活性な部位からすぐ上流および／または下流のヌクレオチドが含まれうる。例えば、Ｇ９８７Ｃ突然変異から約１、２、５、１０、１２、２０、３０、５０、６０、７５、８０、１００またはそれ以上のコドンの上流および／または下流を測定する領域である。
【００７９】
用語「相当するヌクレオチド類似体」および「相当するヌクレオチド」は、ヌクレオチド類似体および天然に存在するヌクレオチドにおける核酸塩基が同一であることを示すものとされる。そのようなものとして、ある実施態様において、ヌクレオチド類似体は、ワトソン−クリック塩基対形成の原理に基づいて、相当するヌクレオチドと対を形成し、またはハイブリダイズする。例えば、ヌクレオチドの２−デオキシリボース単位がアデニンに連結される場合、相当するヌクレオチド類似体は、アデニンに連結した（２−デオキシリボースとは異なる）ペントース単位を含有し、このようなヌクレオチド類似体は、相当するチミン塩基と対を形成し、またはハイブリダイズするであろう。
【００８０】
長さ
オリゴヌクレオチドは、合計５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個の連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか、または前記配列からなりうる。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、合計約８−２５、例えば、約１０−２２、例えば、約１２−１８、例えば、約１３−１７または１２−１６、例えば、約１３、１４、１５、１６個の連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか、またはからなる。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、合計８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか、または前記配列からなる。ある実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、２２個以下のヌクレオチド、例えば、２０個以下のヌクレオチド、例えば、１８個以下のヌクレオチド、例えば、１５、１６または１７個のヌクレオチドからなる。ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドには、２０個以下のヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチド、または連続ヌクレオチド配列長について範囲が与えられる場合、その範囲で与えられる下限および上限の長さ、例えば、１０および３０を含む１０〜３０（またはその間）が含まれることが理解されるべきである。
【００８１】
ヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体
用語「ヌクレオチド」は、本明細書で用いられるように、糖部分、塩基部分および共有結合部分（連結基）、例えば、ホスフェートまたはホスホロチオエート化ヌクレオチド間連結基を含むグリコシドを意味し、天然に存在ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ならびに修飾または置換された糖および／または塩基部分を含む天然に存在しない合成もしくは人工ヌクレオチド（本明細書では「ヌクレオチド類似体」とも称される）の両方を包含する。ある実施態様において、ヌクレオチド類似体には、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間連結の両方が、新規な基、例えば、１つまたはそれ以上のペプチド核酸（ＰＮＡ）によって置換されているオリゴヌクレオチドが含まれうる。ＰＮＡは、一般に、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格によって置換されたオリゴヌクレオチドの糖骨格を有するものとして特徴付けられる。核酸塩基は残され、当該骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接に結合される。
【００８２】
本明細書では、単一ヌクレオチド単位は、モノマーまたは核酸単位とも称されうる。
【００８３】
生化学分野において、用語「ヌクレオシド」は、一般に、糖部分および塩基部分を含むグリコシドを意味するように用いられ、それゆえ、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間のヌクレオチド間連結によって共有結合されるヌクレオチド単位を示すときに用いられうる。生命工学分野において、用語「ヌクレオチド」は、一般に、核酸モノマーまたは単位を示すために用いられ、オリゴヌクレオチドなどに関しては、用語「ヌクレオチド配列」などの塩基を意味し、典型的には、核酸塩基配列（すなわち、糖骨格およびヌクレオシド 間連結の存在は絶対である）を意味する。同様に、特に、１つまたはそれ以上のヌクレオシド間連結基が修飾されているオリゴヌクレオチドの場合、用語「ヌクレオチド」は、「ヌクレオシド」を意味し、例えば、用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド間の連結の存在または形態を特定する際にも用いられうる。
【００８４】
当業者が認識するであろうように、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドには、５’末端基を含んでいても、または含んでいなくてもよいが、５’ヌクレオチド間連結基が含まれない。
【００８５】
天然に存在しないヌクレオチドには、二環ヌクレオチドまたは２’置換ヌクレオチドなどの修飾された糖部分を有するヌクレオチドが含まれる。
【００８６】
ある実施態様において、用語「ヌクレオシド類似体」および「ヌクレオチド類似体」は、交換可能に用いられる。「ヌクレオチド類似体」は、糖および／または塩基部分における修飾によるＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドなどの天然ヌクレオチドの変異型である。類似体は、基本的に、天然ヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現を阻害するために働く方法で機能効果を有しない）オリゴヌクレオチドに関して、天然ヌクレオチドに対して、単に「サイレント」または「同等」でありうる。このような同等な類似体は、例えば、それらが製造するのに容易または安価であるか、または保存または製造条件でより安定であるか、またはタグまたは標識を示す場合に有用でありうる。しかしながら、好ましくは、前記類似体は、（例えば、標的に対する結合親和性を増加させ、および／または細胞内ヌクレアーゼに対する耐性を増加させ、および／または細胞への輸送を容易にすることによって）オリゴヌクレオチドが発現を阻害するように機能する方法で機能効果を有する。ヌクレオシド類似体の具体的な例は、例えば、Freier, et al., Nucl. Acid Res. (1997) 2５: 4429−444３およびUhlｍann, et al., Curr. Opinion in Drug Developｍent (2000) ３(2): 29３−21３および下記：
【化１】
2015511821.tif 000004
によって記載されている。
【００８７】
それゆえ、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドの単純な配列、例えば、好ましくは、２’−デオキシヌクレオチド（本明細書では、一般に「ＤＮＡ」と称される）であるが、リボヌクレオチド（本明細書では、一般に「ＲＮＡ」と称される）、またはこのような天然に存在するヌクレオチドおよび１つまたはそれ以上の天然に存在しないヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド類似体）の組み合わせを含みうるか、またはからなりうる。このようなヌクレオチド類似体は、標的配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を適切に高めうる。適切で好ましいヌクレオチド類似体の例は、国際特許出願ＷＯ２００７／０３１０９１で提供され、本明細書で援用される。
【００８８】
親和性を高めるヌクレオチド類似体、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）または２’−置換糖をオリゴヌクレオチドに取り入れると、特異的に結合するオリゴヌクレオチドの大きさを減少させることができ、また、非特異的または異常な結合が生じる前にオリゴヌクレオチドの大きさの上限を減少させうる。よって、ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオシド類似体を含む。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個のヌクレオチド類似体を含む。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、３−８個のヌクレオチド類似体（例えば、６または７個のヌクレオチド類似体）を含む。ある実施態様において、前記ヌクレオチド類似体のうちの１つは、ＬＮＡであり、例えば、前記ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも３個または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個は、ＬＮＡでありうる。ある実施態様において、前記オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド類似体は、ＬＮＡでありうる。
【００８９】
ヌクレオチドのみからなる好ましいヌクレオチド配列モチーフまたはヌクレオチド配列を示す場合、この配列によって定義される本発明のオリゴヌクレオチドは、このような配列に存在する１つまたはそれ以上のヌクレオチドの代わりに相当するヌクレオチド類似体、例えば、解離または二本鎖安定性の融解温度（Ｔｍ）／オリゴヌクレオチド／標的二本鎖のＴｍを上昇させるＬＮＡ単位または他のヌクレオチド類似体（すなわち、親和性を高めるヌクレオチド類似体）を含むか、またはからなりうることが理解される。本明細書で用いられるように、用語「Ｔｍ」は、融解温度を意味し、相補性二本鎖核酸分子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび相当するｍＲＮＡ標的配列）の集団の半分が一本鎖に解離する温度に関して用いられる。より高いＴｍは、一般に、より安定な二本鎖を示すものである。
【００９０】
ある実施態様において、オリゴヌクレオチドおよび標的配列のヌクレオチド配列間のミスマッチは、好ましくは、親和性を高めるヌクレオチド類似体、例えば、本明細書で称されるような領域Ｂおよび／または本明細書で称されるような領域Ｄの外側の領域で、および／または修飾されていないヌクレオチド、例えば、オリゴヌクレオチドにおけるＤＮＡヌクレオチドの部位で、および／または連続ヌクレオチド配列の５’または３’領域で見出される。
【００９１】
このようなヌクレオチド修飾の例には、２’−置換基を供し、または架橋した（ＬＮＡ）構造を生じ、結合親和性を高め、ヌクレアーゼ耐性をも供しうるための糖部分の修飾が含まれる。ある実施態様において、好ましいヌクレオチド類似体は、オキシ−ＬＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、およびアルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ）、および／またはアミノ−ＬＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびアルファ−Ｌ−アミノ−ＬＮＡ）および／またはチオ−ＬＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−チオ−ＬＮＡおよびアルファ−Ｌ−チオ−ＬＮＡ）および／またはＥＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−ＥＮＡおよびアルファ−Ｌ−ＥＮＡ）などのＬＮＡである。最も好ましくは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【００９２】
ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチド（本明細書に記載の領域ＡおよびＣなど）内に存在するヌクレオチド類似体は、例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、２’−フルオロ−ＡＮＡ単位、ＨＮＡ単位、（Christensen, et al., Nucl. Acids. Res. (2002) ３0: 4918−492５に記載されるような核酸単位を挿入する）ＩＮＡおよび２’ＭＯＥ単位から独立して選択される。ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列に存在する上記タイプのヌクレオチド類似体のうちのわずか１つしか存在しない。
【００９３】
ある実施態様において、ヌクレオチド類似体は、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマーまたはＬＮＡヌクレオチド類似体であり、そのようなものとして、本発明のオリゴヌクレオチドには、これらの３つのタイプの類似体から独立して選択されるヌクレオチド類似体が含まれ、３つのタイプから選択される類似体のうちのわずか１つが含まれうる。ある実施態様において、前記ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも１つは、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の２’−ＭＯＥ−ＲＮＡヌクレオチド単位である。ある実施態様において、前記ヌクレオチド類似体の少なくとも１つは、２’−フルオロＤＮＡ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の２’−フルオロ−ＤＮＡヌクレオチド単位である。
【００９４】
ある実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドには、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）単位、例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＬＮＡ単位、例えば、約３−７または４−８個のＬＮＡ単位、あるいは３、４、５、６または７個のＬＮＡ単位が含まれる。ある実施態様において、全てのヌクレオチド類似体は、ＬＮＡである。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドには、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、および下記のＬＮＡ単位：チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、および／またはＥＮＡ（ベータ−Ｄまたはアルファ−Ｌ立体配置のいずれかまたはそれらの組み合わせ）のうちの１つまたはそれ以上の両方が含まれうる。ある実施態様において、全てのＬＮＡシトシン単位は、５’メチル−シトシンである。本発明のある実施態様において、前記オリゴヌクレオチドには、ＬＮＡおよびＤＮＡ単位の両方が含まれうる。好ましくは、ＬＮＡおよびＤＮＡ単位の組み合わせた合計は、約８−２５個、例えば、１０−２４個、好ましくは、１０−２０個、例えば、１０−１８個、さらにより好ましくは、１２−１６個である。本発明のある実施態様において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列、例えば、連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのＬＮＡからなるか、または含み、残りのヌクレオチド単位は、ＤＮＡ単位である。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドには、ホスホロチオエートなどの修飾されたヌクレオチド間連結を適宜有していてもよいＬＮＡヌクレオチド類似体および天然に存在するヌクレオチド（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ、最も好ましくは、ＤＮＡヌクレオチド）が含まれる。
【００９５】
本明細書で用いられるように、用語「核酸塩基」は、ヌクレオチドの塩基部分を意味し、天然に存在する変異型、ならびに天然に存在しない変異型の両方を包含する。よって、用語「核酸塩基」は、公知のプリンおよびピリミジンヘテロ環だけではなく、これらのヘテロ環類似体および互変異性体を包含するものである。核酸塩基の例としては、以下に限定されないが、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン（pseudoisocytosine）、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および２−クロロ−６−アミノプリンが挙げられる。ある実施態様において、オリゴヌクレオチド中に存在する核酸塩基の少なくとも１つは、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および２−クロロ−６−アミノプリンからなる群から選択される修飾された核酸塩基である。
【００９６】
ある実施態様において、本発明は、１つまたはそれ以上のＣ５−メチルシトシン核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。例えば、配列番号：１２を含むオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、（ｉ）１および３位の１つまたはそれ以上におけるアデニンヌクレオチドが、オキシ−ＬＮＡである；（ｉｉ）１０位におけるグアニンヌクレオチドが、オキシ−ＬＮＡである；（ｉｉｉ）９および１１位のうちの１つまたはそれ以上におけるシトシンヌクレオチドが、オキシ−ＬＮＡである；ならびに（ｉｖ）２位におけるチミンヌクレオチドが、オキシ−ＬＮＡである：からなる群から選択される１つまたはそれ以上のヌクレオチドにおける少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含むものである。
【００９７】
ロックド核酸
本明細書で用いられるように、用語「ＬＮＡ」は、ロックド核酸として知られている二環ヌクレオシド類似体を意味する。これは、ＬＮＡモノマーを意味していてもよく、あるいは、「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」に関して用いられる場合、ＬＮＡは、１つまたはそれ以上のこのような二環ヌクレオチド類似体を含有するオリゴヌクレオチドを意味しうる。ＬＮＡは、例えば、下記に記載されるようなビラジカルＲ４＊−Ｒ２*に示されるように、リボース糖環のＣ２’およびＣ４’間のリンカー基（架橋など）の存在によって特徴付けられる。
【００９８】
本発明の化合物のオリゴヌクレオチドで用いられるＬＮＡは、好ましくは、一般式Ｉの構造を有する。
【化２】
2015511821.tif 000005
式Ｉ
ここで、全てのキラル中心について、非対称基は、ＲまたはＳ配置のいずれかで見出され得；
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（ＲＮ＊）−、−Ｃ（Ｒ６Ｒ６＊）−から選択されるものであって、例えば、ある実施態様において、−Ｏ−であり；
Ｂは、水素、適宜置換されていてもよいＣ１−４−アルコキシ、適宜置換されていてもよいＣ１−４−アルキル、適宜置換されていてもよいＣ１−４−アシルオキシ、核酸塩基（天然に存在するものおよび核酸塩基類似体を含む）、ＤＮＡ挿入剤、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択されるか、あるいは、好ましくは、核酸塩基または核酸塩基類似体であり；
Ｐは、隣接モノマーへのヌクレオチド間連結、または５’−末端基を示し、このようなヌクレオチド間連結または５’−末端基には、置換基Ｒ５または同等に適用可能な置換基Ｒ５＊が含まれてもよく；
Ｐ＊は、隣接モノマーへのヌクレオチド間連結、または３'−末端基を示し；
Ｒ４＊およびＲ２*は、共に、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒａ）−、および＞Ｃ＝Ｚから選択される１〜４個の基／原子からなる二価リンカー基を示すものであって、Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、および−Ｎ（Ｒａ）−から選択され、ＲａおよびＲｂは、各々独立して、水素、適宜置換されていてもよいＣ１−１２−アルキル、適宜置換されていてもよいＣ２−１２−アルケニル、適宜置換されていてもよいＣ２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、適宜置換されていてもよいＣ１−１２−アルコキシ、Ｃ２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ（sulphono）、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡ挿入剤、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択されるものであって、アリールおよびヘテロアリールは、適宜置換されていてもよく、２つのジェミナル置換基ＲａおよびＲｂは共に、適宜置換されていてもよいメチレン（＝ＣＨ２）を示していてもよく、全てのキラル中心について、非対称基は、ＲまたはＳ配置のいずれかで見出されてもよく、ならびに；
存在する置換基Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊、Ｒ６およびＲ６＊の各々は、独立して、水素、適宜置換されていてもよいＣ１−１２−アルキル、適宜置換されていてもよいＣ２−１２−アルケニル、適宜置換されていてもよいＣ２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−１２−アルコキシ、Ｃ２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ（sulphono）、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡ挿入剤、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択されるものであって、アリールおよびヘテロアリールは、適宜置換されていてもよく、２つのジェミナル置換基は共に、オキソ、チオキソ、イミノ、または適宜置換されていてもよいメチレンを示していてもよく；ＲＮは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択され、２つの隣接（ジェミナルではない）置換基は、二重結合を形成するさらなる結合を示していてもよく；ＲＮ＊は、存在し、ビラジカルに関連しない場合、水素およびＣ１−４−アルキルから選択されるものであって；これらの塩基性塩および酸付加塩である。全てのキラル中心について、非対称基は、ＲまたはＳ立体配置のいずれかで見出されうる。
【００９９】
ある実施態様において、Ｒ４*およびＲ２＊は共に、Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲａＲｂ）−、Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−、Ｃ（ＲａＲｂ）−ＮＲａ−、Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｓ−、およびＣ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−からなる群から選択される基からなるビラジカルを示すものであって、各ＲａおよびＲｂは、独立して適宜選択されていてもよい。ある実施態様において、ＲａおよびＲｂは、必要に応じて、水素およびＣ１−６アルキル（例えば、メチルであり、例えば、水素である）からなる群から選択されていてもよい。
【０１００】
ある実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、Ｒ−またはＳ−立体配置のいずれかにおいて、ビラジカル−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−（２’Ｏ−メトキシエチル二環核酸を示す（Seth at al., 2010, J. Org. Cheｍ）。
【０１０１】
ある実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、Ｒ−またはＳ−立体配置のいずれかにおいて、ビラジカル−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−２’Ｏ−エチル二環核酸を示す。
【０１０２】
ある実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、Ｒ−またはＳ−立体配置のいずれかにおいて、ビラジカル−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−を示す。ある実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、ビラジカル−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−を示す。
【０１０３】
ある実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、ビラジカル−Ｏ−ＮＲ−ＣＨ３−を示す。
【０１０４】
ある実施態様において、ＬＮＡ単位は、下記の基：
【化３】
2015511821.tif 000006
から選択される構造を有する。
【０１０５】
ある実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、置換Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、置換Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ アルコキシル、置換Ｃ１−６ アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１−６アミノアルキルまたは置換Ｃ１−６ アミノアルキルからなる群から選択される。全てのキラル中心について、非対称基は、ＲまたはＳ立体配置のいずれかにおいて見出されうる。
【０１０６】
ある実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。
【０１０７】
ある実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６ アルケニル、置換Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、置換Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシル、置換Ｃ１−６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１−６アミノアルキルまたは置換Ｃ１−６アミノアルキルからなる群から選択される。全てのキラル中心について、非対称基は、ＲまたはＳ立体配置のいずれかにおいて見出されうる。
【０１０８】
ある実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３は、水素である。
【０１０９】
ある実施態様において、Ｒ５およびＲ５＊は、各々独立して、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３および−ＣＨ＝ＣＨ２からなる群から選択される。適切には、ある実施態様において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれか一方は、水素であり、もう一方の基（Ｒ５またはＲ５＊の各々）は、Ｃ１−５アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、置換Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ２−６アルケニル、置換Ｃ２−６アルキニルまたは置換アシル（−Ｃ（＝Ｏ）−）からなる群から選択されるものであって；各置換基は、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、置換Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、置換Ｃ２−６アルキニル、ＯＪ１、ＳＪ１、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、ＣＮ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ、Ｊ２またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｘ）Ｎ（Ｈ）Ｊ２（式中、Ｘは、ＯまたはＳである）から独立して選択される置換基で１つまたは複数置換されているものであり；各Ｊ１およびＪ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６ アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６ アルケニル、置換Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６ アルキニル、置換Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アミノアルキル、置換Ｃ１−６アミノアルキルまたは保護基である。ある実施態様において、Ｒ５またはＲ５*のいずれかは、置換Ｃ１−６アルキルである。ある実施態様において、Ｒ５またはＲ５*のいずれかは、置換メチレンであって、好ましい置換基には、Ｆ、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＮ、ＯＪ１、ＳＪ１、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ、Ｊ２またはＮ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｊ２から独立して選択される１つまたはそれ以上の基が含まれる。ある実施態様において、各Ｊ１およびＪ２は、独立して、ＨまたはＣ１−６アルキルである。ある実施態様において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、メチル、エチルまたはメトキシメチルである。ある実施態様において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、メチルである。さらなる実施態様において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、エチレニルである。ある実施態様において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、置換アシルである。ある実施態様において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２である。全てのキラル中心について、非対称基は、ＲまたはＳ立体配置のいずれかにおいて見出されうる。このような５’修飾二環ヌクレオチドは、国際出願ＷＯ２００７／１３４１８１に開示される。
【０１１０】
ある実施態様において、Ｂは、核酸塩基類似体および天然に存在する核酸塩基（例えば、プリンまたはピリミジン、あるいは置換プリンまたは置換ピリミジン）を含む核酸塩基であって、例えば、本明細書で示される核酸塩基、例えば、アデニン、シトシン、チミン、アデニン、ウラシル、および／または修飾もしくは置換された核酸塩基からなる群から選択される核酸塩基、例えば、５−チアゾール−ウラシル、２−チオ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２’チオ−チミン、５−メチルシトシン、５−チオゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、および２，６−ジアミノプリンである。
【０１１１】
ある実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｃ（ＲｅＲｆ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｃ（ＲｃＲｄ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｃ（ＲｅＲｆ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｎ（Ｒｅ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−、および−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｓ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｓ−から選択されるビラジカルを示すものであって、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、ＲｅおよびＲｆは、各々独立して、水素、適宜置換されていてもよいＣ１−１２−アルキル、適宜置換されていてもよいＣ２−１２−アルケニル、適宜置換されていてもよいＣ２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−１２−アルコキシ、Ｃ２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡ挿入剤、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択されるものであって、アリールおよびヘテロアリールは、適宜置換されていてもよく、２つのジェミナル置換基ＲａおよびＲｂは共に、適宜置換されていてもよいメチレン（＝ＣＨ２）を示しうる。全てのキラル中心について、非対称基は、ＲまたはＳ立体配置のいずれかにおいて見出されうる。
【０１１２】
さらなる実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２*は共に、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−、および−ＣＨ（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３）−Ｏ−、および／または、−ＣＨ２−ＣＨ２−、および−ＣＨ＝ＣＨ−から選択されるビラジカル（二価基）を示す。全てのキラル中心について、非対称基は、ＲまたはＳ立体配置のいずれかにおいて見出されうる。
【０１１３】
ある実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２*は共に、ビラジカルＣ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−を示すものであって、ＲａおよびＲｂは、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、置換Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、置換Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシル、置換Ｃ１−６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１−６アミノアルキルまたは置換Ｃ１−６アミノアルキルからなる群から選択され、例えば、水素であり；Ｒｃは、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、置換Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、置換Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシル、置換Ｃ１−６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１−６ アミノアルキルまたは置換Ｃ１−６アミノアルキルからなる群から選択されるものであり、例えば、水素である。
【０１１４】
ある実施態様において、Ｒ４*およびＲ２*は共に、ビラジカルＣ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｏ−を示すものであって、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、およびＲｄは、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、置換Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、置換Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシル、置換Ｃ１−６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１−６アミノアルキルまたは置換Ｃ１−６アミノアルキルからなる群から選択され、例えば、水素である。
【０１１５】
ある実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２*は、ビラジカル−ＣＨ（Ｚ）−Ｏ−を形成するものであって、Ｚは、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、置換Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ２−６アルケニル、置換Ｃ２−６アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオールまたは置換チオからなる群から選択され；置換基の各々は、独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２およびＣＮから選択される適宜保護されていてもよい置換基で１つまたは複数置換されており、各Ｊ１、Ｊ２およびＪ３は、独立して、ＨまたはＣ１−６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＪ１である。ある実施態様において、Ｚは、Ｃ１−６ アルキルまたは置換Ｃ１−６ アルキルである。ある実施態様において、Ｚは、メチルである。ある実施態様において、Ｚは、置換Ｃ１−６アルキルである。ある実施態様において、前記置換基は、Ｃ１−６アルコキシである。ある実施態様において、Ｚは、ＣＨ３ＯＣＨ２−である。全てのキラル中心について、非対称基は、ＲまたはＳ立体配置のいずれかにおいて見出されうる。このような二環ヌクレオチドは、米国特許第７，３９９，８４５号に開示される。ある実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。ある実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３＊は、水素であり、Ｒ５、Ｒ５＊の両方のうちの１つは、上記および国際特許出願ＷＯ２００７／１３４１８１に示されるように水素以外であってもよい。
【０１１６】
ある実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２*は共に、ビラジカルを示すものであって、ビラジカル−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−（式中、Ｒｃは、Ｃ１−１２アルキルオキシである）からなるか、または含む架橋中で置換アミノ基を含むものである。ある実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、ビラジカル−Ｃｑ３ｑ４−ＮＯＲ−を示すものであって、ｑ３およびｑ４は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、置換Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、置換Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシル、置換Ｃ１−６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１−６アミノアルキルまたは置換Ｃ１−６アミノアルキルからなる群から選択されるものであり；各置換基は、ハロゲン、ＯＪ１、ＳＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＣＯＯＪ１、ＣＮ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ１Ｊ２またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｘ＝Ｎ（Ｈ）Ｊ２（Ｘは、ＯまたはＳである）から独立して選択される置換基で１つまたは複数置換され；Ｊ１およびＪ２の各々は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アミノアルキルまたは保護基である。全てのキラル中心について、非対称基は、ＲまたはＳ立体配置のいずれかにおいて見出されうる。このような二環ヌクレオチドは、ＷＯ２００８／１５０７２９に開示される。ある実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、置換Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、置換Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシル、置換Ｃ１−６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１−６アミノアルキルまたは置換Ｃ１−６アミノアルキルからなる群から選択される。ある実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。ある実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３は、水素であり、Ｒ５、Ｒ５＊のうちの１つまたは両方は、上記および国際特許出願ＷＯ ２００７／１３４１８１に示される水素以外であってもよい、ある実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、ビラジカル（二価基）Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−を示すものであって、ＲａおよびＲｂは、各々独立して、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、ＯＪ１、ＳＪ１、ＳＯＪ１、ＳＯ２Ｊ１、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ１、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ１、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ１Ｊ２であるか；あるいはＲａおよびＲｂは共に、＝Ｃ（ｑ３）（ｑ４）であって；ｑ３およびｑ４は、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたは置換Ｃ１−Ｃ１２アルキルであり；各置換基は、独立して、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｏ���１、ＳＪ１、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ１、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ１、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ１Ｊ２から独立して選択される置換基で１つまたは複数置換されており；各Ｊ１およびＪ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アミノアルキルまたは保護基である。このような化合物は、国際特許出願ＷＯ２００９／００６４７８Ａに開示される。
【０１１７】
ある実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は、ビラジカル−Ｑ−を形成するものであって、Ｑは、Ｃ（ｑ１）（ｑ２）Ｃ（ｑ３）（ｑ４）、Ｃ（ｑ１）＝Ｃ（ｑ３）、Ｃ［＝Ｃ（ｑ１）（ｑ２）］−Ｃ（ｑ３）（ｑ４）またはＣ（ｑ１）（ｑ２）−Ｃ［＝Ｃ（ｑ３）（ｑ４）］であり；ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４は、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−１２アルキル、置換Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、置換Ｃ１−１２アルコキシ、ＯＪ１、ＳＪ１、ＳＯＪ１、ＳＯ２Ｊ１、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ１、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＪ１Ｊ２、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ１、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ１Ｊ２であり；各Ｊ１およびＪ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アミノアルキルまたは保護基であり；ならびに、必要に応じて、Ｑが、Ｃ（ｑ１）（ｑ２）（ｑ３）（ｑ４）であり、ｑ３またはｑ４のうちの１つが、ＣＨ３である場合、ｑ３またはｑ４のうちのもう一方またはｑ１およびｑ２のうちの１つのうちの少なくとも１つは、Ｈ以外である。ある実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。全てのキラル中心について、非対称基は、ＲまたはＳ立体配置のいずれかにおいて見出されうる。このような二環ヌクレオチドは、ＷＯ／２００８／１５４４０１に開示される。ある実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、置換Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、置換Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシル、置換Ｃ１−６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１−６アミノアルキルまたは置換Ｃ１−６アミノアルキルからなる群から選択される。ある実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。ある実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３は、水素であり、Ｒ５、Ｒ５＊のうちの１つまたは両方は、上記および国際特許出願ＷＯ／２００７／１３４１８１およびＷＯ２００９／０６７６４７に示される水素以外であってもよい（アルファ−Ｌ−二環核酸類似体）。
【０１１８】
ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチド化合物に用いられるＬＮＡは、好ましくは、一般式ＩＩの構造を有する。
【化４】
2015511821.tif 000007
式ＩＩ
式中、Ｙは、−Ｏ−、−ＣＨ２Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、Ｎ（Ｒｅ）および／または−ＣＨ２−からなる群から選択され；
ＺおよびＺ＊は、独立して、ヌクレオチド間連結、ＲＨ、末端基または保護基から選択され；
Ｂは、天然または非天然ヌクレオチド塩基部分（核酸塩基）を構成し、ＲＨは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択され；Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、ＲｄおよびＲｅは、必要に応じて、独立して、水素、適宜置換されていてもよいＣ１−１２−アルキル、適宜置換されていてもよいＣ２−１２−アルケニル、適宜置換されていてもよいＣ２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−１２−アルコキシ、Ｃ２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡ挿入剤、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドからなる群から選択されてもよく、アリールおよびヘテロアリールは、適宜置換されていてもよく、２つのジェミナル置換基ＲａおよびＲｂは共に、適宜置換されていてもよいメチレン（＝ＣＨ２）を示してもよく；ＲＨは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択される。ある実施態様において、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、ＲｄおよびＲｅは、必要に応じて、独立して、水素およびＣ１−６アルキルからなる群から選択されてもよく、例えば、メチルである。全てのキラル中心について、非対称基は、ＲまたはＳ立体配置のいずれかにおいて見出され、例えば、２つの典型的な立体化学異性体としては、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ異性体が挙げられ、以下のように示されうる：
【化５】
2015511821.tif 000008
特定の典型的なＬＮＡ単位は下記に示される：
【化６】
2015511821.tif 000009
【０１１９】
用語「チオ−ＬＮＡ」は、上記一般式中のＹが、Ｓまたは−ＣＨ２−Ｓ−から選択されるロックドヌクレオチドが含まれる。チオ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ−立体配置の両方でありうる。
【０１２０】
用語「アミノ−ＬＮＡ」には、上記一般式中のＹが、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、および−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−（式中、Ｒは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択される）から選択されるロックドヌクレオチドが含まれる。アミノ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ−立体配置の両方でありうる。
【０１２１】
用語「オキシ−ＬＮＡ」には、上記一般式中のＹが、−Ｏ−を表すロックドヌクレオチドが含まれる。オキシ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ−立体配置の両方でありうる。ある実施態様において、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドには、少なくとも１つのオキシ−ＬＮＡが含まれる。例えば、配列番号：１２を含むオリゴヌクレオチドが本明細書に開示されるものであって、前記オリゴヌクレオチドには、（ａ）１位におけるグアニンヌクレオチドがオキシ−ＬＮＡである；（ｂ）２および３位のうちの１つまたはそれ以上におけるアデニンヌクレオチドがオキシ−ＬＮＡである；（ｄ）１０および１１位のうちの１つまたはそれ以上におけるシトシンヌクレオチドがオキシ−ＬＮＡである；および（ｄ）１２位におけるチミンヌクレオチドがオキシ−ＬＮＡである：からなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置で少なくとも１つのヌクレオチド類似体が含まれる。ある実施態様において、このようなオキシ−ＬＮＡのいずれかまたは全ては、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【０１２２】
用語「ＥＮＡ」には、上記一般式中のＹが、−ＣＨ２−Ｏ−（式中、−ＣＨ２−Ｏ−の酸素原子は、塩基Ｂと比較して２’−位に結合している）であるロックドヌクレオチドが含まれる。Ｒｅは、水素またはメチルである。
【０１２３】
ある典型的な実施態様において、ＬＮＡは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、アルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、ベータ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびベータ−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、特に、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡから選択されるものである。
【０１２４】
ＲＮアーゼ動員（recruitｍent）
オリゴヌクレオチドは、翻訳の立体障害または他の方法などにより標的ｍＲＮＡの非ＲＮアーゼ介在分解により機能しうるが、本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨなどのエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）を動員できることであることが理解される。
【０１２５】
オリゴヌクレオチド、または連続ヌクレオチド配列は、相補的な標的ＲＮＡと二本鎖を形成する場合にＲＮアーゼを動員することができる少なくとも６個の領域、例えば、少なくとも７個の連続ヌクレオチド単位、例えば、少なくとも８個または少なくとも９個の連続ヌクレオチド単位（７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個の連続ヌクレオチドを含む）を含むことが好ましい。ＲＮアーゼを動員することができる連続配列は、本明細書に記載されるようなギャップマーについて称される領域Ｂでありうる。ある実施態様において、領域ＢなどのＲＮアーゼを動員することができる連続配列の大きさは、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個以上のヌクレオチド単位でありうる。
【０１２６】
ＥＰ１２２２３０９は、ＲＮアーゼＨを動員する能力を調べるために用いられうるＲＮアーゼＨ活性を測定するためのインビトロ方法を提供する。オリゴヌクレオチドは、相補的なＲＮＡ標的と共に提供されると、ＥＰ１２２２３０９の実施例９１〜９５によって提供される方法を用いて、２’置換基を有さず、オリゴヌクレオチドの全てのモノマー間にホスホロチオエート連結基を有し、同一の塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーのみを含有するＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを用いて測定される初速度の少なくとも１％、例えば、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％または２０％以上のｐｍｏｌ／ｌ／分で測定される初速度を有する場合、ＲＮアーゼＨを動員できるものとされる。
【０１２７】
ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、相補的なＲＮＡ標的およびＲＮアーゼＨと共に提供されると、ｐｍｏｌ／l／分で測定されるＲＮアーゼＨの初速度は、ＥＰ１２２２３０９の実施例９１〜９５によって提供される方法を用いて、２’置換基を有さず、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間にホスホロチオエート連結基を有する同等のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを用いて測定される初速度の１％以下、例えば、５％以下、例えば、１０％以下または２０％以下である場合、ＲＮアーゼＨを必須として動員できないものとされる。
【０１２８】
他の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、相補的なＲＮＡ標的およびＲＮアーゼＨと共に提供されると、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定されるＲＮアーゼＨの初速度は、ＥＰ１２２２３０９の実施例９１〜９５によって提供される方法を用いて、２’置換基を有さず、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間にホスホロチオエート連結基を有する同等のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを用いて測定される初速度の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、例えば、少なくとも６０％、例えば、少なくとも８０％である場合、ＲＮアーゼＨを動員できるものとされる。
【０１２９】
典型的に、相補的な標的ＲＮＡと二本鎖を形成する場合にＲＮアーゼを動員することができる連続ヌクレオチド単位を形成するオリゴヌクレオチドの領域は、ＲＮＡ標的との二本鎖のようなＤＮＡ／ＲＮＡを形成し、アルファ−Ｌ立体配置であり、特に好ましくは、アルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡであるＤＮＡ単位およびＬＮＡ単位の両方を含むヌクレオチド単位からなる。
【０１３０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体の両方を含むヌクレオチド配列を含んでいてもよく、ギャップマー、ヘッドマー（headｍer）またはミックスマー（ｍixｍer）の形であってもよい。
【０１３１】
「ヘッドマー（headｍer）」は、領域Ｙの５’−末端モノマーが領域Ｘの３’−末端モノマーに連結した連続する領域Ｘおよび領域Ｙを含むオリゴヌクレオチドと定義される。領域Ｘには、ヌクレオシド類似体を動員する非ＲＮアーゼの連続する伸長部分が含まれ、領域Ｙには、ＲＮアーゼによって認識され、切断されるＤＮＡモノマーまたはヌクレオシド類似体モノマーの連続する伸長部分（例えば、少なくとも７個の連続モノマー）が含まれる。
【０１３２】
「テイルマー（tailｍer）」は、領域Ｙの５’−末端モノマーが領域Ｘの３’−末端モノマーに連結した連続する領域Ｘおよび領域Ｙを含むオリゴヌクレオチドと定義される。領域Ｘには、ＲＮアーゼによって認識され、切断されるＤＮＡモノマーまたはヌクレオシド類似体モノマーの連続する伸長部分（例えば、少なくとも７個の連続モノマー）が含まれ、領域Ｘには、ヌクレオシド類似体を動員する非ＲＮアーゼの連続する伸長部分が含まれる。
【０１３３】
他の「キメラ」オリゴヌクレオチドは、「ミックスマー」と呼ばれ、（ｉ）ＲＮアーゼによって認識され、切断されるＤＮＡモノマーまたはヌクレオシド類似体モノマー、および（ｉｉ）ヌクレオシド類似体モノマーを動員する非ＲＮアーゼの代替組成からなる。
【０１３４】
ある実施態様において、標的領域に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高めることに加えて、ヌクレオシド類似体はまた、ＲＮアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＨ）結合および切断を介在するものである。α−Ｌ−ＬＮＡモノマーは、ある程度までＲＮアーゼＨ活性を動員するため、ある実施態様において、α−Ｌ−ＬＮＡモノマーを含有するオリゴヌクレオチドのギャップ領域（例えば、本明細書では、領域Ｂと呼ばれる）は、ＲＮアーゼＨによって認識され、切断されるより少ないモノマーからなり、ミックスマー構築物により可撓性を導入する。
【０１３５】
ギャップマー設計
ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ギャップマーは、ＲＮアーゼ、例えば、ＲＮアーゼＨ、例えば、本明細書では、領域Ｂ（Ｂ）と呼ばれる少なくとも６または７個のＤＮＡヌクレオチドの領域を動員することができるヌクレオチドの連続する伸長部分を含むオリゴヌクレオチドであって、領域Ｂは、親和性を高めるヌクレオチド類似体の領域、例えば、ＲＮアーゼを動員することができるヌクレオチドの連続する伸長部分に対する約１−６個のヌクレオチド類似体５’および３’（これらの領域は、それぞれ、領域Ａ（Ａ）およびＣ（Ｃ）と称される）によって５’および３’の両方に配置される。
【０１３６】
ある実施態様において、ＲＮアーゼを動員することができるモノマーは、ＤＮＡモノマー、アルファ−Ｌ−ＬＮＡモノマー、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡモノマー（ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３４９およびVester et al., Bioorg. Med. Cheｍ. Lett. 18 (2008) 2296 − 2３00を参照のこと）、ＵＮＡ（連結していない核酸）ヌクレオチド（Fluiter et al., Mol. Biosyst., (2009)10: 10３9を参照のこと）からなる群から選択される。ＵＮＡは、典型的に、リボースのＣ２−Ｃ３  Ｃ−Ｃ結合が取り除かれたアンロックド核酸であって、アンロックド「糖」残基を形成するものである。好ましくは、前記ギャップマーには、式（５’から３’）、Ａ−Ｂ−Ｃ、あるいは必要に応じて、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＤまたはＤ−Ａ−Ｂ−Ｃの（ポリ）ヌクレオチド配列が含まれるものであって；領域Ａ（Ａ）（５’領域）は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体、例えば、少なくとも１つのＬＮＡ単位、例えば、約１−６個のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ単位からなるか、または含み、；領域Ｂ（Ｂ）は、（ｍＲＮＡ標的などの相補的なＲＮＡ分子と二本鎖を形成する際に）ＲＮアーゼを動員することができる少なくとも５個の連続ヌクレオチド、例えば、ＤＮＡヌクレオチドからなるか、または含み、；領域Ｃ（Ｃ）（３’領域）は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体、例えば、少なくとも１つのＬＮＡ単位、例えば、１−６個のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ単位からなるか、または含み；領域Ｄ（Ｄ）は、存在する場合、１、２または３個のヌクレオチド単位、例えば、ＤＮＡヌクレオチドからなるか、または含む。
【０１３７】
ある実施態様において、領域Ａは、１、２、３、４、５または６個のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ単位、例えば、約２−５個のヌクレオチド類似体、例えば、２−５個のＬＮＡ単位、例えば、３または４個のヌクレオチド類似体、例えば、３または４個のＬＮＡ単位からなり；および／または領域Ｃは、１、２、３、４、５または６個のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ単位、例えば、２−５個のヌクレオチド類似体、例えば、２−５個のＬＮＡ単位、例えば、３または４個のヌクレオチド類似体、例えば、３または４個のＬＮＡ単位からなる。
【０１３８】
ある実施態様において、Ｂは、ＲＮアーゼを動員することができる５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の連続ヌクレオチド、あるいは、ＲＮアーゼを動員することができる６−１０個、または７−９個、例えば、８個の連続ヌクレオチドからなるか、または含み、ある実施態様において、領域Ｂは、少なくとも１つのＤＮＡヌクレオチド単位、例えば、１−１２個のＤＮＡ単位、好ましくは、４−１２個のＤＮＡ単位、より好ましくは、６−１０個のＤＮＡ単位、例えば、約７−１０個のＤＮＡ単位、最も好ましくは、８、９または１０個のＤＮＡ単位からなるか、または含む。
【０１３９】
ある実施態様において、領域Ａは、３または４個のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡからなり、領域Ｂは、７、８、９または１０個のＤＮＡ単位からなり、ならびに領域Ｃは、３または４個のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡからなる。 このような設計には、（Ａ−Ｂ−Ｃ）３−１０−３、３−１０−４、４−１０−３、３−９−３、３−９−４、４−９−３、３−８−３、３−８−４、４−８−３、３−７−３、３−７−４、４−７−３が含まれ、１または２個のヌクレオチド単位、例えば、ＤＮＡ単位を有していてもよい領域Ｄがさらに含まれてもよい。
【０１４０】
さらなるギャップマー設計は、国際特許ＷＯ２００４／０４６１６０に開示されている。米国仮出願６０／９７７，４０９から優先権を主張する国際特許ＷＯ２００８／１１３８３２は、「ショートマー（shortｍer）」ギャップマーオリゴヌクレオチドを示す。ある実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、このようなショートマーギャップマーであってもよい。
【０１４１】
ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、合計１０、１１、１２、１３または１４個のヌクレオチド単位の連続ヌクレオチド配列からなるものであって、前記連続ヌクレオチド配列は、式（５’−３’）、Ａ−Ｂ−Ｃ、あるいは、必要に応じて、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＤまたはＤ−Ａ−Ｂ−Ｃであり；Ａは、１、２または３個のヌクレオチド類似体単位、例えば、ＬＮＡ単位からなり；Ｂは、相補的なＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ標的）と二本鎖を形成する際にＲＮアーゼを動員することができる７、８または９個の連続ヌクレオチド単位からなり；ならびにＣは、１、２または３個のヌクレオチド類似体単位、例えば、ＬＮＡ単位からなる。存在する場合、Ｄは、単一のＤＮＡ単位からなる。
【０１４２】
ある実施態様において、Ａは、１個のＬＮＡ単位からなる。ある実施態様において、Ａは、２個のＬＮＡ単位からなる。ある実施態様において、Ａは、３個のＬＮＡ単位からなる。ある実施態様において、Ｃは、１個のＬＮＡ単位からなる。ある実施態様において、Ｃは、２個のＬＮＡ単位からなる。ある実施態様において、Ｃは、３個のＬＮＡ単位からなる。ある実施態様において、Ｂは、７個のヌクレオチド単位からなる。ある実施態様において、Ｂは、８個のヌクレオチド単位からなる。ある実施態様において、Ｂは、９個のヌクレオチド単位からなる。ある実施態様において、領域Ｂは、１０個のヌクレオシドモノマーからなる。ある実施態様において、領域Ｂは、１−１０個のＤＮＡモノマーからなる。ある実施態様において、Ｂは、約１−９個のＤＮＡ単位、例えば、２、３、４、５、６、７、８または９個のＤＮＡ単位から構成される。ある実施態様において、Ｂは、ＤＮＡ単位からなる。ある実施態様において、Ｂは、アルファ−Ｌ立体配置における少なくとも１つのＬＮＡ単位、例えば、アルファ−Ｌ−立体配置における２、３、４、５、６、７、８または９個のＬＮＡ単位から構成される。ある実施態様において、Ｂは、少なくとも１つのアルファ−Ｌ−オキシＬＮＡ単位から構成されるか、またはアルファ−Ｌ−立体配置における全てのＬＮＡ単位がアルファ−Ｌ−オキシＬＮＡ単位である。ある実施態様において、Ａ−Ｂ−Ｃ中に存在するヌクレオチド数は、（ヌクレオチド類似体単位−領域Ｂ−ヌクレオチド類似体単位）:１−８−１、１−８−２、２−８−１、２−８−２、３−８−３、２−８−３、３−８−２、４−８−１、４−８−２、１−８−４、２−８−４、または；１−９−１、１−９−２、２−９−１、２−９−２、２−９−３、３−９−２、１−９−３、３−９−１、４−９−１、１−９−４、または；１−１０−１、１−１０−２、２−１０−１、２−１０−２、１−１０−３、３−１０−１からなる群から選択される。ある実施態様において、Ａ−Ｂ−Ｃ中に存在するヌクレオチド数は、２−７−１、１−７−２、２−７−２、３−７−３、２−７−３、３−７−２、３−７−４、および４−７−３からなる群から選択される。ある実施態様において、領域ＡおよびＣの各々は、３個のＬＮＡモノマーから構成され、領域Ｂは、８もしくは９もしくは１０個のヌクレオシドモノマー、好ましくは、ＤＮＡモノマーからなる。ある実施態様において、ＡおよびＣの両方は、各々、２個のＬＮＡ単位からなり、Ｂは、８または９個のヌクレオチド単位、好ましくは、ＤＮＡ単位からなる。様々な実施態様において、他のギャップマー設計には、領域Ａおよび／またはＣが、３、４、５または６個のヌクレオシド類似体、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル−リボース糖（２’−ＭＯＥ）を含有するモノマーまたは２’−フルオロ−デオキシリボース糖を含有するモノマーからなり、領域Ｂは、８、９、１０、１１または１２個のヌクレオシド、例えば、領域Ａ−Ｂ−Ｃが３−９−３、３−１０−３、５−１０−５または４−１２−４モノマーを有するＤＮＡモノマーからなるものが含まれる。さらなるギャップマー設計は、国際特許ＷＯ／２００７／１４６５１１Ａ２に開示されている。
【０１４３】
ヌクレオチド間連結
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのモノマーは、連結基とともに一緒にカップリングされる。適切には、各モノマーは、連結基により３’隣接モノマーに連結される。当業者は、本発明に関連して、オリゴヌクレオチドの末端における５’モノマーが５’連結基を含んでいないが、５’末端基を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよいことを理解する。
【０１４４】
用語「連結基」および「ヌクレオチド間連結」は、２つのヌクレオチドと共有結合することができる基を意味するものとされる。具体的な好ましい例として、リン酸基およびホスホロチオエート基が挙げられる。ある実施態様において、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチド間連結（例えば、配列番号：１９、２０、２１、２２および２３）でホスホロチオエート化ヌクレオチド間連結を有する。本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、連結基によりカップリングされている。適切には、各ヌクレオチドは、連結基により３’隣接ヌクレオチドに連結される。
【０１４５】
適切なヌクレオチド間連結としては、国際出願ＷＯ２００７／０３１０９１に記載のもの、例えば、ＷＯ２００７／０３１０９１の３４頁の１段落目に記載されるヌクレオチド間連結３４が挙げられる。
【０１４６】
ある実施態様において、ヌクレオチド間連結を、その正常なホスホジエステルからヌクレアーゼの攻撃に対してより耐性を有するものに修飾することが望ましく、例えば、ホスホロチオエートまたはボラノリン酸は、ＲＮアーゼＨによって切断され、アンチセンス阻害経路が標的遺伝子の発現を減少させることを可能にする。
【０１４７】
本明細書で提供されるような適切な硫黄（Ｓ）を含有するヌクレオチド間連結が所望されうる。特に、ギャップマーのギャップ領域（Ｂ）のためのホスホロチオエート化ヌクレオチド間連結もまた、好ましい。ホスホロチオエート連結はまた、（必要に応じて、ＡおよびＣ、およびＡもしくはＣ〜Ｄを連結するため、および領域Ｄ内の）隣接領域に用いられてもよい。
【０１４８】
しかしながら、領域Ａ、ＢおよびＣは、ホスホロチオエート以外のヌクレオチド間連結、例えば、ホスホジエステル連結（特に、例えば、ヌクレオチド類似体の使用が、領域ＡおよびＣ内のヌクレオチド間連結をエンドヌクレーゼ分解から保護する場合−例えば、領域ＡおよびＣがＬＮＡヌクレオチドを含む場合）を含んでいてもよい。
【０１４９】
オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド間連結は、標的ＲＮＡのＲＮアーゼＨ切断を可能にするようなホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはボラノリン酸でありうる。ヌクレアーゼ耐性の向上および製造の容易性などの他の理由のため、ホスホロチオエートが好ましい。
【０１５０】
本発明のオリゴヌクレオチドのある態様において、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体は、ホスホロチオエート基によって相互に連結される。
【０１５１】
１または２個の連結などのホスホジエステル連結を、他のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、特に、（典型的には、領域Ａおよび／またはＣにおいて）ヌクレオチド類似体単位の間に、または隣接して含めると、オリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティおよび／または生体分布を改善することができることが認識されている−国際出願ＷＯ２００８／０５３３１４を参照のこと。
【０１５２】
上記に記載の実施態様のようなある実施態様において、適切であり、特に示されていない場合、全ての残りの連結基は、ホスホジエステルまたはホスホロチオエートのいずれか、あるいはこれらの混合物である。ある実施態様において、全てのヌクレオチド間連結基は、ホスホロチオエートである。
【０１５３】
本明細書で提供されるような特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列に関して、様々な実施態様において、連結がホスホロチオエート連結である場合、代わりの連結、例えば、本明細書に記載されるようなものが用いられてもよく、例えば、ホスフェート（ホスホジエステル）連結は、特に、ヌクレオチド類似体間、例えば、ＬＮＡ単位間での連結に用いられてもよいものと理解される。同様に、特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列、例えば、本明細書で提供されるものに関して、Ｃ残基が５’メチル修飾シトシンと注解される場合、様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドに存在するＣのうちの１つまたはそれ以上は、修飾されていないＣ残基でありうる。
【０１５４】
オリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号:９、１０、１１、１２、１３および１４からなる群から選択される配列が含まれうる。ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２および配列番号：２３からなる群から選択される配列が含まれうる。ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、表１または４に記載の配列からなる群から選択されうる。
【０１５５】
抱合体
本発明に関して、用語「抱合体」は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと１つまたはそれ以上の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分との共有結合によって形成された異種分子を示すものとされる。非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の例としては、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたはこれらの組み合わせなどの巨大分子が挙げられる。典型的なタンパク質は、標的タンパク質に対する抗体でありうる。典型的なポリマーは、ポリエチレングリコールでありうる。
【０１５６】
よって、様々な実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的に、ヌクレオチドの連続配列からなるポリヌクレオチド領域およびさらなる非ヌクレオチド領域の両方を含みうる。連続ヌクレオチド配列からなる本発明のオリゴヌクレオチドを示す場合、本化合物には、抱合体構成成分などの非ヌクレオチド構成成分が含まれうる。
【０１５７】
本発明の様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、例えば、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増加させるために用いられうるリガンド／抱合体に連結される。国際特許ＷＯ２００７／０３１０９１は、適当なリガンドおよび抱合体を提供する。
【０１５８】
本発明はまた、本明細書に記載される本発明による化合物、ならびに前記化合物に共有結合している少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含む抱合体を提供する。よって、様々な実施態様において、本発明の化合物が本明細書に開示されるように特定の核酸またはヌクレオチド配列からなる場合、本発明化合物にはまた、前記化合物に共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分（例えば、１つまたはそれ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含まない）が含まれうる。
【０１５９】
抱合は、本発明のオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを高めうる。このような部分としては、以下に限定されないが、抗体、ポリペプチド、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール（dodecandiol）またはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−オ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ｈ−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられる。
【０１６０】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、活性薬物物質、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌薬または抗生物質を活性化するために抱合されうる。
【０１６１】
ある実施態様において、抱合部分は、ステロール、例えば、コレステロールである。
【０１６２】
様々な実施態様において、抱合部分は、例えば、約１−５０個、例えば、２−２０個、例えば、３−１０個のアミノ酸残基の長さの陽性荷電ペプチドなどの陽性荷電ポリマー、および／またはポリアルキレンオキシド、例えば、ポリエチルグリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールを含むか、またはからなる（例えば、国際特許ＷＯ２００８／０３４１２３を参照）。適切には、陽性荷電ポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシドは、ＷＯ２００８／０３４１２３に記載の放出可能なリンカーなどのリンカーにより本発明のオリゴヌクレオチドに結合していてもよい。
【０１６３】
一例として、下記の抱合部分は、本発明の抱合体に用いられてもよい：
【化７】
2015511821.tif 000010
【０１６４】
活性化オリゴヌクレオチド
用語「活性化オリゴヌクレオチド」は、本明細書で用いられるように、オリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上の抱合部分への共有結合を可能にする少なくとも１つの機能的な部分（すなわち、核酸またはモノマー自体ではない部分）に共有結合で連結して（すなわち、機能させる）、本明細書に記載される抱合体を形成している本発明のオリゴヌクレオチドを意味する。典型的には、機能的な部分には、例えば、アデニン塩基の３’−ヒドロキシル基または環外ＮＨ２基によりオリゴヌクレオチドに共有結合できる化学的な基、好ましくは、抱合部分に結合できる親水性末端基（例えば、アミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基）であるスペーサーが含まれる。ある実施態様において、この末端基は保護されていない（例えば、ＮＨ２基）。他の実施態様において、末端基は、例えば、"Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, ３rd edition (John Wiley & Sons, 1999)に記載されるような適する保護基によって保護されている。適切なヒドロキシル保護基の例としては、酢酸エステルなどのエステル、ベンジル、ジフェニルメチルまたはトリフェニルメチルなどのアラルキル基、ならびにテトラヒドロピラニルが挙げられる。適切なアミノ保護基としては、ベンジル、アルファ−メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ならびにトリクロロアセチルまたはトリフルオロアセチルなどのアシル基が挙げられる。ある実施態様において、機能的な部分は、自己切断する。他の実施態様において、機能的な部分は生物分解性である（例えば、米国特許第７，０８７，２２９号を参照のこと）。
【０１６５】
ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、抱合された部分をオリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合させるために５’末端で官能基化される。他の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、３’末端で官能基化することができる。なお他の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、骨格に沿って、またはヘテロ環塩基部分上に官能基化することができる。さらに他の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、５’末端、３’末端、骨格および塩基から独立して選択される１つ以上の位置で官能基化することができる。
【０１６６】
実施態様において、本発明の活性化オリゴヌクレオチドは、合成中に機能的な部分に共有結合する１つまたはそれ以上のモノマーを取り込むことによって合成される。他の実施態様において、本発明の活性化オリゴヌクレオチドは、官能基化されていないモノマーで合成され、前記オリゴヌクレオチドは、合成の完了によって官能基化される。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、アミノアルキルリンカーを含有するヒンダードエステルで官能基化されるものであって、前記アルキル部分は、式（ＣＨ２）ｗを有し、ｗは、１〜１０、好ましくは、約６の整数であり、前記アルキルアミノ基のアルキル部分は、直鎖または分岐鎖であり得、前記官能基は、エステル基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗＮＨ）によりオリゴヌクレオチドに結合している。
【０１６７】
他の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、（ＣＨ２）ｗ−スルフヒドリル（ＳＨ）リンカーを含有するヒンダードエステルで官能基化されるものであって、ｗは、１〜１０、好ましくは、約６の整数であり、前記アルキルアミノ基のアルキル部分は、直鎖または分岐鎖であり得、官能基は、エステル基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗＳＨ）によりオリゴヌクレオチドに結合している。
【０１６８】
ある実施態様において、スルフヒドリル活性化オリゴヌクレオチドは、（ジスルフィド結合の形成により）ポリエチレングリコールまたはペプチドなどのポリマー部分と抱合されている。
【０１６９】
上記に記載される活性化オリゴヌクレオチドを含有するヒンダーエステルは、当該技術分野で公知の方法、特に、国際特許ＷＯ２００８／０３４１２２およびその実施例に開示される方法によって合成することができる。
【０１７０】
さらに他の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、スルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基を、米国特許第４，９６２，０２９号および第４，９１４，２１０号に実質的に記載されるような官能基化試薬（すなわち、保護されているか、または保護されていないスルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基を含む反対末端に親水性スペーサー鎖により連結されている一方末端にホスホラミダイトを有する実質的な直鎖状試薬（linear reagent））を用いて、オリゴヌクレオチドに取り込むことによって官能基化される。このような試薬は、主に、オリゴヌクレオチドのヒドロキシル基と反応する。ある実施態様において、このような活性化オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシル基にカップリングした官能基化試薬を有する。他の実施態様において、活性化されたオリゴヌクレオチドは、３’−ヒドロキシル基にカップリングした官能基化試薬を有する。なお他の実施態様において、本発明の活性化されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの骨格におけるヒドロキシル基にカップリングした官能基化試薬を有する。なおさらなる実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、米国特許第４，９６２，０２９号および第４，９１４，２１０号に記載される官能基化試薬の１つ以上で官能基化される。このような官能基化試薬を合成し、モノマーまたはオリゴヌクレオチドに導入する方法は、米国特許第４，９６２，０２９号および第４，９１４，２１０号に開示されている。
【０１７１】
ある実施態様において、固相に結合したオリゴヌクレオチドの５’−末端は、ジエニルホスホラミダイト誘導体と官能基化し、脱保護されたオリゴヌクレオチドを、例えば、ディールズ・アルダー環化付加反応によりアミノ酸またはペプチドと抱合させる。
【０１７２】
様々な実施態様において、２’−糖置換、例えば、２’−カルバメート置換糖または２’−（Ｏ−ペンチル−Ｎ−フタルイミド）−デオキシリボース糖を含有するモノマーを、オリゴヌクレオチドに取り込むことにより、抱合部分のオリゴヌクレオチドの糖への共有結合が容易になる。他の実施態様において、１つまたはそれ以上のモノマーの２’位にアミノ含有リンカーを有するオリゴヌクレオチドは、例えば、５’−ジメトキシトリチル−２'−Ｏ−（ｅ−フタルイミジルアミノペンチル）−２’−デオキシアデノシン−３’−−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−シアノエトキシホスホラミダイト（例えば、Manoharan, et al., Tetrahedron Letters, (1991) ３4:7171.など）の使用により調製される。
【０１７３】
なおさらなる実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、核酸塩基上（Ｎ６プリンアミノ基上、グアニンの環外Ｎ２上、またはシトシンのＮ４または５位上を含む）にアミンを含有する機能的な部分を有しうる。様々な実施態様において、このような官能基化は、オリゴヌクレオチド合成ですでに官能基化されている市販の試薬を用いて行ってもよい。
【０１７４】
いくつかの機能的な部分は、商業的に利用可能であり、例えば、ヘテロ二官能性およびホモ官能性連結部分は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．（イリノイ州、ロックフォード）から販売されている。他の商業的に利用可能な連結基は、５’−アミノ修飾薬Ｃ６および３’−アミノ修飾試薬であり、これらの両方は、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ヴァージニア州、スターリング）から利用可能である。５’−アミノ修飾薬Ｃ６はまた、ＡＢＩ（カリフォルニア州、フォスターシティのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）からアミノリンク−２としても販売されており、３’−アミノ修飾薬は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、パロアルト）から販売されている。
【０１７５】
医薬組成物
本発明のオリゴヌクレオチドは、医薬製剤および組成物で用いられうる。適切には、このような組成物は、医薬的に許容される溶媒、例えば、水もしくは生理食塩水、希釈剤、担体、塩または補助剤を含む。ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２は、適当で好ましい医薬的に許容される希釈剤、担体および補助剤を提供する。適当な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組み合わせ、プロドラッグ製剤もまたＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２で提供される。
【０１７６】
本発明には、本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物および製剤もまた含まれる。本発明の医薬組成物は、局所または全身治療が望ましいかどうか、および治療される領域によって様々な方法で投与されうる。投与は、局所（眼を含み、膣および直腸送達を含む粘膜）、肺（例えば、散剤またはエアロゾルの吸入または吹送法による（ネブライザーによるものを含む））；気管内、鼻腔内、上皮および経皮）；経口または非経口でありうる。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または注入；あるいは脳内（例えば、くも膜下腔内、脳室内または心室内投与）が含まれる。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられる。
【０１７７】
局所的な投与のための医薬組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点滴、座剤、スプレー剤、液剤および散剤が含まれうる。従来の医薬担体、水性、粉末もしくは油状塩基、充填剤などが必要とされ、または所望されてもよい。好ましい局所製剤には、本発明のオリゴヌクレオチドが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤などの局所送達剤と混合されるものが含まれる。好ましい脂質およびリポソームには、中性（例えば、ジオレオイルフォスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルフォスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルフォスファチジルコリン）陰イオン（例えば、ジミリストイルフォスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）および陽イオン（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルフォスファチジルエタノールアミンＤＯＭＡ）が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドは、リポソーム内にカプセル封入されていてもよく、あるいはそれに対して、特に、陽イオンリポソームに対して複合体を形成していてもよい。あるいは、オリゴヌクレオチドは、脂質、特に、陽イオン性脂質と複合体を形成していてもよい。好ましい脂肪酸およびエステルには、以下に限定されないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート（dicaprate）、トリカプレート（tricaprate）、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１−１０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリドまたはその医薬的に許容される塩が含まれる。局所製剤は、１９９９年５月２０日に提出の米国特許第０９／３１５，２９８号に詳細に記載される。
【０１７８】
経口投与のための組成物および製剤には、散剤もしくは顆粒剤、微粒子製剤、ナノ粒子製剤、水中の懸濁液または溶液、生理食塩水または非水性媒体、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ、錠剤またはミニ錠剤が含まれる。充填剤、香料、希釈剤、乳剤、分散助剤または結合剤が所望されうる。好ましい経口製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが１つまたはそれ以上の浸透促進剤、界面活性剤およびキレート化剤と共に投与されるものである。好ましい界面活性剤には、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩が含まれる。好ましい胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸（glucholic acid）、グリコール酸（glucholic acid）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ナトリウムタウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシデートおよびナトリウムグリコジヒドロフシデートが含まれる。好ましい脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリドまたはその医薬的に許容される塩（例えば、ナトリウム）が含まれる。浸透促進剤の組み合わせ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩も好ましく、特に好ましい組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透促進剤としては、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドは、スプレーされた乾燥粒子を含む顆粒形態において経口で投与されてもよく、あるいは微粒子またはナノ粒子を形成するために複合体化されていてもよい。オリゴヌクレオチド複合体化形成薬剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン（polyoxehane）、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングルコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン、セルロースおよびデンプンが挙げられる。特に好ましい複合体化薬剤としては、チトサン、Ｎ−トリメチルチトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノ−メチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−共−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドのための経口製剤およびそれらの調製は、米国出願第０８／８８６，８２９号（１９９７年７月１日出願）、米国出願第０９／１０８，６７３号（１９９８年７月１日出願）、米国出願第０９／２５６，５１５号（１９９９年２月２３日出願）、米国出願第０９／０８２，６２４号（１９９８年５月２１日出願）および米国出願第０９／３１５，２９８号（１９９９年５月２０日出願）に詳細に記載される。
【０１７９】
非経口、くも膜下腔内、脳室内または心室内投与のための組成物および製剤には、緩衝液、希釈剤および他の適当な添加剤、例えば、以下に限定されないが、浸透促進剤、担体化合物および他の医薬的に許容される担体または賦形剤を含有していてもよい滅菌水溶液が含まれうる。
【０１８０】
本発明の医薬組成物には、以下に限定されないが、溶剤、乳濁液、およびリポソームを含有する製剤が含まれる。これらの組成物は、以下に限定されないが、予め形成された液剤、自己乳化固形物および自己乳化半固形物を含む様々な構成成分から調製されうる。
【０１８１】
単位製剤で利便的に提示されうる本発明の医薬製剤は、医薬業界で周知の従来技術によって製造されうる。このような技術には、活性成分を医薬担体または賦形剤と混合させる工程が含まれる。一般に、製剤は、活性成分を、液体担体もしくは細かく粉砕された固形担体またはその両方と均一かつ密接に混合させ、必要に応じて、製剤を成形することによって製造される。
【０１８２】
本発明の組成物は、多くの可能な製剤のいずれか、例えば、以下に限定されないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ、軟質ゲル、座剤、および注腸剤の中に製剤化されてもよい。本発明の組成物はまた、水性、非水性または混合媒体中に懸濁剤として製剤化されてもよい。水性懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁剤の粘稠性を増加させる物質をさらに含有していてもよい。懸濁剤はまた、安定化剤を含有していてもよい。
【０１８３】
本発明のある実施態様において、医薬組成物は、泡状物として製剤化され、用いられてもよい。医薬上の泡状物としては、例えば、以下に限定されないが、乳濁液、マイクロエマルション、クリーム剤、ゼリー剤およびリポソームなどの製剤が含まれる。これらの製剤は、天然物と基本的に同様であるが最終生成物の構成物質および一貫性によって変化する。このような組成物および製剤の製造は、一般に、医薬および製剤技術の当業者に公知であり、本発明の組成物の製剤化に適用されうる。
【０１８４】
別の態様において、本発明の化合物を、体内の特定の組織、器官または位置に対して標的とする方法が提供される。典型的な標的は、中枢神経系の細胞および組織（例えば、脳細胞および組織、神経細胞、プルキンエ細胞、シュワン細胞、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイト）が含まれる。化合物を標的とする方法は、当該技術分野で周知である。ある実施態様において、化合物は、直接または局所投与によって標的とされる。例えば、血管を標的とする場合、化合物は、例えば、単一バルーンまたは二重バルーンカテーテル、あるいは化合物の持続放出を補助する物質、例えば、Siｍons et al., Nature (1992) ３５9: 67−70に記載されるプルロニックゲルシステムを用いて外膜を介して、血管の細胞内腔の内側から血管の関連部位に直接投与される。化合物の血管への局所送達のための他の持続放出技術としては、ステントの化合物でのコーティングが含まれる。オリゴヌクレオチドの血管への送達方法は、米国特許第６，１５９，９４６号に開示される。
【０１８５】
本発明のアンチセンス化合物には、ヒトを含む動物に投与する際に、生物学的に活性な代謝物またはその残基を（直接または間接に）提供することができる、医薬的に許容される塩、エステル、またはこのようなエステルの塩、あるいは他の化合物が包含される。よって、例えば、本発明化合物のプロドラッグおよび医薬的に許容される塩、このようなプロドラッグの医薬的に許容される塩、および他の生物学的同等物もまた開示される。
【０１８６】
用語「プロドラッグ」は、内在性酵素あるいは他の化学物質および／または条件の作用によって体内またはその細胞内で活性型（すなわち、薬物）に変換される不活性型で調製される治療剤を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ型は、国際特許第ＷＯ１９９３／２４５１０およびＷＯ１９９４／２６７６４、ならびに米国特許第５，７７０，７１３号に開示される方法によってＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として調製される。
【０１８７】
用語「医薬的に許容される塩」は、本発明化合物の生理学的で医薬的に許容される塩（すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、その望ましくない毒物学的な効果を付与しない塩）を意味する。オリゴヌクレオチドについては、医薬的に許容される塩の好ましい例として、下記に限定されないが、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン、例えば、スペルミンおよびスペルミジンなどのカチオンと形成された塩；（ｂ）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などと形成された酸付加塩；（ｃ）有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロ酸などと形成される塩；および（ｄ）塩素、臭素、およびヨウ素などの構成アニオンから形成される塩が挙げられる。
【０１８８】
適用
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療および予防のための研究試薬として用いられうる。研究において、このようなオリゴヌクレオチドは、（典型的には、ｍＲＮＡを分解し、または阻害し、これによりタンパク質形成を妨げることによって）細胞および実験動物における伸長または変異型ＡＴＸＮ３の合成を特異的に阻害し、これにより治療的介入の標的としての標的の機能解析またはその有用性の評価を容易にするために用いられうる。
【０１８９】
診断においては、本発明のオリゴヌクレオチドは、ノーザンブロット、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは同様の技術によって細胞および組織におけるＡＴＸＮ３発現を検出し、定量化するために用いられうる。
【０１９０】
治療においては、ＡＴＸＮ３の発現を調節することによって治療することができる疾患または障害（例えば、ＳＣＡ３）に罹っている疑いがある動物またはヒトは、本発明によるオリゴヌクレオチドを投与することによって治療される。ＡＴＸＮ３の発現に関連する病気または疾患に罹っている疑いがあるか、または罹りやすいヒトの治療などの哺乳類の治療方法であって、治療上または予防上有効な量の１つまたはそれ以上の本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物を投与することを特徴とする方法がさらに提供される。本発明によるオリゴヌクレオチド、抱合体または医薬組成物は、典型的に、有効量で投与される。
【０１９１】
本発明はまた、本明細書に記載の障害の治療剤の製造について記載される本発明の化合物または抱合体の使用、あるいは本明細書に記載の障害の治療方法を提供する。
【０１９２】
本発明はまた、本明細書に記載される疾患の治療方法であって、本明細書に記載されるような本発明による化合物、および／または本発明による抱合体、および／または本発明による医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを特徴とする方法を提供する。
【０１９３】
医薬としての本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、Ｇ９８７Ｃの一塩基多型を含む配列番号：４の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）の使用もまた、本発明に包含される。同様に、ＳＣＡ３などの疾患の治療における、または当該治療のための本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＴＸＮ３ポリグルタミン伸長鎖をコードし、または前記鎖に隣接するｍＲＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）の使用は、本明細書で提供される。
【０１９４】
医療適用
本発明によるオリゴヌクレオチドおよび他の組成物は、ＡＴＸＮ３の変異型の過剰発現または発現に関連する疾患（例えば、脊髄小脳失調症３型）の治療に用いることができる。ある実施態様において、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドおよび組成物は、医薬として使用されうる。他の実施態様において、本明細書で供されるオリゴヌクレオチドは、疾患の治療に、またはために用いられる。例えば、Ｇ９８７Ｃの一塩基多型を含む配列番号：４の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、脊髄小脳失調症３型の治療に用いることができる。本発明は、本明細書に記載される病気、疾患または障害の治療剤の製造における本発明の化合物の使用をさらに提供する。
【０１９５】
一般に述べられているように、本発明のある態様は、変異し、異常な、伸長し、またはその他の異常なＡＴＸＮ３に関連する（例えば、伸長したＡＴＸＮ３の発現に関連する）疾患に罹っているか、罹りやすい哺乳類の治療方法であって、１つまたはそれ以上のＬＮＡ単位を含むＡＴＸＮ３の変異型または天然に存在する変異型の遺伝子産物（例えば、変異または伸長したＡＴＸＮ３をコードするｍＲＮＡ）を標的としたオリゴヌクレオチドの治療上の有効量を哺乳類に投与することを特徴とする方法に関する。本明細書に記載されるような病気または疾患は、ある実施態様において、ＡＴＸＮ３遺伝子またはそのタンパク質産物がＡＴＸＮ３に関連するか、ＡＴＸＮ３と相互作用する遺伝子における突然変異に関連しうる。よって、ある実施態様において、標的とするｍＲＮＡは、ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡの変異型である。
【０１９６】
本発明のある態様は、本明細書に記載される病気または疾患の治療剤の製造のためのオリゴヌクレオチドまたは抱合体の使用に関する。
【０１９７】
本発明の方法は、好ましくは、異常レベルのＡＴＸＮ３によって引き起こされる疾患に対する治療または予防に適用される。他で記載されるように、ある実施態様において、本発明は、異常なレベルのＡＴＸＮ３の治療方法にさらに関するものであって、前記方法は、本発明のオリゴヌクレオチド、または本発明の抱合体または本発明の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを特徴とする。
【０１９８】
本発明はまた、医薬として使用するための、本明細書に定義されるオリゴヌクレオチド、組成物または抱合体に関する。
【０１９９】
本発明は、ＡＴＸＮ３の異常レベルまたはＡＴＸＮ３の変異型（対立遺伝子多型、例えば、本明細書に記載の疾患のうちの１つに関連するものなど）の発現の治療剤の製造のための本明細書で定義される化合物、組成物、または抱合体の使用にさらに関する。
【０２００】
さらに、本発明は、本明細書に記載の疾患または病気に罹っている対象の治療方法に関する。
【０２０１】
治療を必要とする患者は、疾患または病気に罹っているか、または罹っている可能性のある患者である。
【０２０２】
ある実施態様において、用語「治療」は、本明細書で用いられるように、既存の疾患（例えば、本明細書に記載の疾患または病気）、または疾患の予防（すなわち、予防）の両方の治療を意味する。よって、本明細書で記載される治療は、ある実施態様において、予防であるものと認識される。
【０２０３】
本発明のアンチセンス化合物は、診断、治療、予防および研究試薬およびキットとして有用でありうる。治療においては、ＡＴＸＮ３の発現を調節することによって治療することができる疾患または病気に罹っている疑いがある動物、好ましくは、ヒトは、本発明によるオリゴヌクレオチドを投与することによって治療される。本発明のオリゴヌクレオチドは、有効量のオリゴヌクレオチドを適当な医薬的に許容される希釈剤または担体に加えることによって医薬組成物中で用いることができる。
【０２０４】
本発明のアンチセンス化合物は、これらの化合物がＡＴＸＮ３をコードする核酸にハイブリダイズし、サンドウィッチおよび他のアッセイが容易に構築されてこの事実を利用することができるため、研究および診断に有用である。本発明のオリゴヌクレオチドとＡＴＸＮ３をコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当該技術分野で公知の手法によって検出することができる。このような手法には、酵素のオリゴヌクレオチドへの抱合、オリゴヌクレオチドの同位体標識またはその他の適切な検出方法が含まれうる。試料中のＡＴＸＮ３タンパク質またはｍＲＮＡのレベルを検出するためのこのような検出手法を用いるキットもまた、調製されうる。
【０２０５】
本発明のある化合物、組成物および方法は、ある実施態様による特殊性をもって記載されるが、下記の実施例は、本発明の化合物を例示するのみであって、これを限定する意図のものではない。本発明の背景を説明し、その実施に関するさらなる詳細を提供するための本明細書に示される刊行物、参考文献、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号などの各々は、出典明示によりその全体が本明細書に取り込まれるものとされる。
【０２０６】
用語「ａ」および「ａｎ」は、本明細書で用いられるように、明細書および特許請求の範囲において、別段に示されていない限り、複数の対象物を含むものと理解されるべきである。一群のうちの１つまたはそれ以上の構成要素間に「または」を含む請求項または明細書は、別段に示され、または文脈から明らかでない限り、群の構成要素のうちの１つ、１つ以上、または全てが、所定の物または方法中に存在し、用いられ、または関連する場合に満たされるものと考えられる。本発明には、群のうちのちょうど１つの構成要素が所定の物または方法に存在し、用いられ、または関連する実施態様が含まれる。本発明にはまた、群の構成要素のうちの１つ以上、または全てが所定の物または方法に存在し、用いられ、または関連する実施態様が含まれる。さらに、本発明には、全ての変更、組み合わせ、および置換が包含されることが理解されるべきである。列挙される請求項のうちの１つまたはそれ以上からの１つまたはそれ以上の限定、構成要素、節、記述用語などは、別段に示されていないか、または、当業者にとって矛盾または不整合が生じていることが明らかでない限り、同一の基本請求項（あるいは、関連する他の請求項のいずれか）に従属する別の請求項に導入される。構成要素が列挙して示されるとき（例えば、マーカッシュ群または同様の形式）、構成要素の各サブグループもまた開示され、いずれの構成要素もその群から取り除くことができるものと理解されるべきである。一般に、本発明または本発明の態様が特定の構成要素、特徴などを含むものとして示される場合、本発明のある実施態様または本発明の態様は、このような構成要素、特徴などからなるか、または必須としてからなるものと理解されるべきである。簡潔にするため、これらの実施態様は、全ての場合において、本明細書のあまりに多くの用語では特に説明されていないものである。本発明の実施態様または態様は、特定の除外が本明細書に記載されるか否かに関わらず、請求項から明らかに除外することができるものとも理解されるべきである。
【実施例１】
【０２０７】
実施例
下記の実施例は、病原性（ＣＡＧ）ｎ繰り返し構造からの１つのヌクレオチドに位置するＧ９８７Ｃの一塩基多型（ＳＮＰ）を含む変異ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡ転写物を標的とする数種類のオリゴヌクレオチド、ならびにこれらのオリゴヌクレオチドの様々な優れた特性を記載する。特に、実施例１は、変異／伸長ＡＴＸＮ３の発現をノックダウンする２０個のオリゴヌクレオチドの有効性および２０個のオリゴヌクレオチドの選択性（例えば、野生型ＡＴＸＮ３の発現の阻害と比較した変異／伸長ＡＴＸＮ３発現の阻害）を示す。実施例２は、ＩＣ５０値として測定される変異／伸長ＡＴＸＮ３の発現を阻害する１２個のオリゴヌクレオチドの各々の強度、ならびに野生型ＡＴＸＮ３の発現と比較した変異／伸長ＡＴＸＮ３発現を阻害する強度の差異を示す。実施例３は、１２個のオリゴヌクレオチドの各々および伸長Ｇ９８７Ｃ  ＡＴＸＮ３標的配列（完全な相補性）または野生型ＡＴＸＮ３配列（Ｇ９８７Ｃ  ＳＮＰ部位における１つの相補性ミスマッチ）のいずれかの間の融解温度（Ｔｍ）として測定する結合エネルギーを記載する。実施例４は、１２個のオリゴヌクレオチドの血漿安定性として測定されるヌクレアーゼ感受性を示す。実施例５は、標準的な１６日マウス実験における選択したオリゴヌクレオチドについてのインビボ耐容性の評価を記載する。
【０２０８】
実施例１−２０個のオリゴヌクレオチドについての有効性および選択性試験
各々１つまたはそれ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を有する２０個のアンチセンスオリゴヌクレオチドの合計は、ヒトＡＴＸＮ３変異型（すなわち、伸長した）対立遺伝子を選択的に標的とするように設計した。特に、２０ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡの病原性（ＣＡＧ）ｎ伸長からの１つのヌクレオチド位置において「Ｃ」を含む伸長したＡＴＸＮ３対立遺伝子の領域（すなわち、Ｇ９８７Ｃ  ＳＮＰ）ならびにその位置の上流および／または下流のヌクレオチドに選択的に標的とし、ハイブリダイズするように設計した。
【０２０９】
２０個のオリゴヌクレオチドの各々を特徴付けるために、ＨＥＫ−２９３細胞を、８１（ＣＡＧ）繰り返し構造を有するものとして特徴付けられ、蛍ルシフェラーゼ転写物に融合させたＧ９８７Ｃ  ＳＮＰを含ませた変異型ＡＴＸＮ３転写物のコーディング領域から構成されたレポーター構築物（ｐＦＬＡＧ−ＡＴＸＮ３Ｑ８１−ＦＬ−ＦＦルシフェラーゼ）で安定的にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は、読み取りとして用いられ、ＷＳＴ−１アッセイによって測定した細胞増殖および生存率で標準化された変異ＡＴＸＮ３タンパク質の量に相関した。ＷＳＴ−１アッセイは、生存細胞中のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるテトラゾリウム塩ＷＳＴ−１の切断に基づいた細胞増殖および細胞生存率の定量化のための比色分析である。定性的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイは、ＦＬＡＧ配列を標的とすることによってベクター発現産物を特異的に認識するように設計した。さらに、ｑＰＣＲアッセイは、ベクター発現系の一部として含まれないＡＴＸＮ３の５’ＵＴＲを標的とすることによって、内在的に発現されるＡＴＸＮ３産物を特異的に認識するように設計した。
【０２１０】
野生型および伸長／変異型ＡＴＸＮ３の発現におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を調べるために、ｑＰＣＲアッセイは、変異型または野生型（内在性）ＡＴＸＮ３のいずれかの発現を特異的に認識するように最適化した。変異型ＡＴＸＮ３レポーター構築物に関して、ＡＴＸＮ３−レポーター構築物（ＡＴＸＮ３転写物の下流に位置する）の一部であるルシフェラーゼ遺伝子を標的とするｑＰＣＲアッセイを設計し、最適化した。（ＨＥＫ−２９３細胞中で内在的に発現した）野生型対立遺伝子の発現を決定するに際して、内在性ＡＴＸＮ３転写物の５’ＵＴＲを標的とするｑＰＣＲアッセイを設計し、最適化し、標的とする５’ＵＴＲがレポーター構築物中に存在しないため、変異ＡＴＸＮ３対立遺伝子を区別できた。
【０２１１】
オリゴヌクレオチドの各々の有効性および選択性は、１μＭ、５μＭおよび２５μＭの最終濃度の培地への露出によるオリゴヌクレオチドを細胞に導入する手法としてそのままの送達（すなわち、単独での取り込み）を用いて、ｐＦＬＡＧ−ＡＴＸＮ３Ｑ８１−ＦＬ−ＦＦＬｕｃｉｆｅｒａｓｅをトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞で評価した。特に、前記オリゴヌクレオチドは、そのまま送達し、その後、細胞を完全に洗浄して、細胞の表面にまだ接着しているか、または培養管に残っているオリゴヌクレオチドを取り除いた。該細胞を収集し、トランスフェクション後４８時間でｑＰＣＲによってアッセイし、ｍＲＮＡ発現のパーセンテージは、関連ｑＰＣＲアッセイを用いて決定した。全ての実験において、ＰＣＯＮ２と呼ぶオリゴヌクレオチド（１６−ｍｅｒのギャップマーを標的とする蛍ルシフェラーゼ転写物）を変異型ＡＴＸＮ３（レポーター構築物）の陽性コントロールとして含ませ、ＰＣＯＮ１と呼ぶオリゴヌクレオチド（変異型および野生型ＡＴＸＮ３の両方を標的とする１６−ｍｅｒのギャップマー）を陽性コントロールとして含ませ、ＮＣＯＮと呼ぶオリゴヌクレオチド（スクランブルオリゴヌクレオチド）を陰性コントロールとして含ませた。模擬物質で処理した試料を水で置き換えた試験オリゴヌクレオチドの非存在下で評価した。読み出しは、模擬物質で処理した試料と比較した変異型ＡＴＸＮ３転写物（レポーター構築物）および内在性ＡＴＸＮ３転写物のｍＲＮＡレベルのパーセンテージとして行った。
【０２１２】
実施例試験の結果は、模擬物質で処理した試料と比較して発現されるｍＲＮＡのパーセンテージとして図１Ａおよび１Ｂに記載する。２０個のオリゴヌクレオチドは、各々、「ＳＨ」から始まる識別子で同定される。顕著な用量応答による強力なノックダウンは、評価したほとんどのオリゴヌクレオチドで観察され、図１Ａおよび１Ｂに示されるように、はっきりした順位付けを確立しうる。図１Ａおよび１Ｂに示されるように、一定のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの濃度（１μＭ、５μＭまたは２５μＭ）に応じて、模擬物質試料中で観察されるＡＴＸＮ３の発現と比較して、約６０％もしくはそれ以下、５０％もしくはそれ以下、４０％もしくはそれ以下、３０％もしくはそれ以下、２５％もしくはそれ以下、２０％もしくはそれ以下、および１０％もしくはそれ以下まで野生型ＡＴＸＮ３および／または変異型ＡＴＸＮ３の発現を調節した（すなわち、減少され、または減らされる）。さらに、一定のオリゴヌクレオチドは、野生型ＡＴＸＮ３発現と比較して、変異型ＡＴＸＮ３の発現を実質的かつ選択的に減少させる（すなわち、下方調節発現）。例えば、ＳＨ１０と呼ぶオリゴヌクレオチド（配列番号：２０）は、１μＭの濃度で変異型ＡＴＸＮ３レベルを対応する野生型ＡＴＸＮ３レベルの半分近くまで減少させる。５７４４と呼ぶ陽性コントールは、変異型および野生型の両方のＡＴＸＮ３レベルの実質的な阻害を示し、この突然変異部位に関連していないため、ほとんど特異性を示さない。
【０２１３】
前記データにより、２０個のオリゴヌクレオチドの各々が評価した濃度のうちの１つまたはそれ以上において有効性および選択性を有することが示された。この収集データから、１２個のオリゴヌクレオチドが同定され、さらなる特徴付けについて選択された。
【０２１４】
実施例２−１２個のオリゴヌクレオチドについてのＩＣ５０試験
実施例１に記載の実験結果として選択した１２個のオリゴヌクレオチドは、各オリゴヌクレオチドについてのＩＣ５０値を評価することによってそれらの阻害強度についてさらに評価した。選択したオリゴヌクレオチド候補は、上記に記載のレポーター構築物（ｐＦＬＡＧ−ＡＴＸＮ３Ｑ８１−ＦＬ−ＦＦＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ）で安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞中で行ったＩＣ５０決定に付した。
【０２１５】
前記オリゴヌクレオチドは、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、９μＭ、２７μＭ、および８１μＭの最終濃度の培地を用いて、そのまま細胞に導入した。続いて、該細胞をオリゴヌクレオチドの添加後４８時間で収集し、変異型ＡＴＸＮ３転写物（レポーター構築物）のｍＲＮＡおよび内在性ＡＴＸＮ３転写物を抽出し、ｑＰＣＲによって解析した。図２Ａおよび２Ｂは、選択したオリゴヌクレオチドをそのまま送達し、ＡＴＸＮ３−Ｑ８１でトランスフェクトした細胞中での変異型ＡＴＸＮ３転写物（ＭＵＴ）および内在性ＡＴＸＮ３（ＷＴ）ｍＲＮＡの発現を示す。その結果を内在性ＧＡＰＤＨレベルで標準化し、模倣物質で処理した試料のパーセントとして表した。前記実験を３回繰り返し、値は、非線形回帰を用いてＳ字形応答曲線に対するＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍでプロットした。
【０２１６】
この回帰から、レポーターアッセイにおけるＩＣ５０値の概算を調べた。前記ＩＣ５０曲線を図３に示し、対応するＩＣ５０値を下記の表２とする。算出した１２個のオリゴヌクレオチドの選択性は、変異型ＡＴＸＮ３（ＭＵＴ）と内在性ＡＴＸＮ３（ＷＴ）転写物に対するＩＣ５０値の倍数の差（fold difference）として算出し、リード化合物として選択した５個のオリゴヌクレオチドに対するＩＣ５０値を下記の表２に示す。
表２
【表２】
2015511821.tif 000011
【０２１７】
野生型ＡＴＸＮ３転写物と比較した変異／伸長ＡＴＸＮ３レポーターについて選択したオリゴヌクレオチドの選択性に関して、１２個の選択したオリゴヌクレオチドのうちの９個が野生型転写物より変異／伸長レポーターについて約３倍以上の選択性を示した。
【０２１８】
実施例３−野生型または変異型ＡＴＸＮ３にアニールする１２個のオリゴヌクレオチドについての融解温度
上記実施例２に記載の１２個のオリゴヌクレオチド候補の特徴付けの一部として、相補性変異型標的ＲＮＡ（ｃＭＵＴと呼ぶ）からの各オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）を評価した。１２個のオリゴヌクレオチドの各々もまた、（ＣＡＧ）伸長からの１つのヌクレオチドに位置するＧ９８７Ｃ  ＳＮＰに対する単一相補性ミスマッチが含まれる野生型対立遺伝子（ｃＷＴと呼ぶ）を表すＲＮＡに対してテストした。
【０２１９】
１２個のオリゴヌクレオチドの各々についてのＴｍ値を調べ、Ｔｍの変化（ΔＴｍ）は、各オリゴヌクレオチドについての融解およびアニーリング温度の平均を表す。５個の選択したリードオリゴヌクレオチドを示すＴｍデータを表３に表し、ΔＴｍは、ｃＭＵＴ（完全な相補性）およびｃＷＴ（突然変異部位における１つの相補性ミスマッチ）値の間の差異として定義した。
表３
【表３】
2015511821.tif 000012
【０２２０】
ＡＴＸＮ３のＷＴ対立遺伝子に対する１２個のオリゴヌクレオチドを標的とする場合、単一ミスマッチは、病原性（ＣＡＧ）伸長に対する１つのヌクレオチド３’に位置するＧ９８７Ｃ  ＳＮＰにおけるＧ−Ｃミスマッチである。ΔＴｍは、１５．５℃の高さから−８．７℃の低さまでの範囲であり、５個の選択したオリゴヌクレオチドについては、表３に示されるように、ΔＴｍは１２．８℃の高さから９．０℃の低さまでである。
【０２２１】
実施例４−１２個のオリゴヌクレオチドの各々についての血漿安定性
実施例２および３に記載の１２個のオリゴヌクレオチドの特徴付けの一部として、１２個のオリゴヌクレオチドの各々の安定性をアッセイした。特に、１２個のオリゴヌクレオチドの各々を、脳組織を３７℃で１２０時間脳組織を加えた脳脊髄液中でインキュベートし、０、２４、４８、９６および１２０時間で試料を取り出し、解析した。前記試料は、全長オリゴヌクレオチドの喪失および分解産物の出現についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。該試料を、ＰＣＯＮと称される不安定な１８−ｍｅｒの全長ホスホロチオエート陽性コントロールオリゴヌクレオチドと比較した。
【０２２２】
全てのオリゴヌクレオチドの血漿安定性は、予想された範囲内であることを見出した。図４に示されるように、全てのオリゴヌクレオチドは、約９６時間以上の全体の半減期を有することがわかった。
【０２２３】
実施例５−オリゴヌクレオチドについてのインビボ耐容性試験
１２個のオリゴヌクレオチドの各々のインビボ耐容性を１６日マウス実験で試験した。オリゴヌクレオチドの各々を、雌ＮＭＲＩマウスにおけるインビボ耐容性についてテストして、主に望ましくない肝臓効果を評価した。対象動物に、静脈内に１５ｍｇ／ｋｇで０、３、７、１０および１４日目に投薬し、次いで１６日目に屠殺した。マウス血清を試料採取し、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）濃度について分析した。コントロールマウスに生理食塩水コントロールを投与した。図５Ａおよび５Ｂに示されるように、ＳＨ０６（配列番号：１９）、ＳＨ１０（配列番号：２０）、ＳＨ１３（配列番号：２１）、ＳＨ１６（配列番号：２２）およびＳＨ２０（配列番号：２３）と称されるオリゴヌクレオチドは、生理食塩水コントロールと比較して肝臓酵素のレベルの無視できる程度の上昇が示された。
【０２２４】
実施例１−４で同定された特徴付けに基づいて、５個のオリゴヌクレオチド（すなわち、ＳＨ０６、ＳＨ１０、ＳＨ１３、ＳＨ１６およびＳＨ２０と称されるオリゴヌクレオチド）は、伸長（変異）ＡＴＸＮ３の発現を減少させるための対象への投与における使用について優れた特性を有することが示され、リード化合物と称される。上記に記載されるように、選択したオリゴヌクレオチドは、選択しなかったオリゴヌクレオチドの群と比較して優れているものとして選択した。これらの５個のリードオリゴヌクレオチドの配列を下記の表４に示し、β−Ｄ−オキシＬＮＡは、上付文字「ｏ」を右に有する太字の大文字で示し、小文字は、デオキシリボースを示し、「ｓ」および「ｍ」は、ホスホロチオエートおよびＣ５−メチルシトシンにそれぞれ対応する。
表４
【表４】
2015511821.tif 000013
【０２２５】
実施例６−脊髄小脳失調症３型のマウスモデルにおけるオリゴヌクレオチドの治療有効性の証拠
伸長／変異ＡＴＸＮ３の発現に関する疾患病状を減少させる（配列番号：１９、２０、２１、２２および２３の各々に対応する）ＳＨ０６、ＳＨ１０、ＳＨ１３、ＳＨ１６およびＳＨ２０と称されるリードオリゴヌクレオチドの能力は、下記のように調べる。脊髄小脳失調症３型のモデル動物は作出されるか、または選択されうる。好ましい動物モデルは、ＡＴＸＮ３のヒト突然変異と相関する（例えば、Ｇ９８７Ｃ  ＳＮＰを有するものと特徴付けられる伸長したＡＴＸＮ３）。生存中の有効性のための主なエンドポイントとしては、例えば、歩行および四肢の運動失調、構音障害、錐体路障害、ジストニア、動眼障害、顔舌の弱まり、神経障害、進行性感覚喪失、嗜眠およびパーキンソン病様特徴の改善を挙げることができる。疾病表現型および各オリゴヌクレオチドによるその改善は、当該技術分野で公知の様々な方法、例えば、身体検査または組織学的試験によって確認することができる
【０２２６】
調査されるべきパラメータとしては、特に、オリゴヌクレオチドで未処理のマウスより統計学的に良好であるオリゴヌクレオチドで処理したマウスにおいて、歩行および四肢の運動失調、構音障害、錐体路障害、ジストニア、動眼障害、顔舌の弱まり、神経障害、進行性感覚喪失、嗜眠およびパーキンソン病様特徴における改善を挙げることができる。
【０２２７】
本実施例に記載の実験は、（１）疾患ＳＣＡ３またはマシャド・ジョセフ病の有効な治療として変異または伸長ＡＴＸＮ３に対するアンチセンス−ロックド核酸オリゴヌクレオチド、（２）特定の脊髄小脳失調症３型疾患モデルにおける使用および薬物動態的および毒性試験の候補としての使用のためのオリゴヌクレオチドならびに（３）本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの臨床的な投与のための投薬および投与計画の特徴付けをさらに提供することができる。
配列
【表５】
2015511821.tif 000014
2015511821.tif 000015
【０２２８】
配列番号：１
ホモサピエンスＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡ 
NM_00499３
1 gagaggggca gggggcggag ctggaggggg tggttcggcg tgggggccgt tggctccaga
61 caaataaaca tggagtccat cttccacgag aaacaagaag gctcactttg tgctcaacat
121 tgcctgaata acttattgca aggagaatat tttagccctg tggaattatc ctcaattgca
181 catcagctgg atgaggagga gaggatgaga atggcagaag gaggagttac tagtgaagat
241 tatcgcacgt ttttacagca gccttctgga aatatggatg acagtggttt tttctctatt
３01 caggttataa gcaatgcctt gaaagtttgg ggtttagaac taatcctgtt caacagtcca
３61 gagtatcaga ggctcaggat cgatcctata aatgaaagat catttatatg caattataag
421 gaacactggt ttacagttag aaaattagga aaacagtggt ttaacttgaa ttctctcttg
481 acgggtccag aattaatatc agatacatat cttgcacttt tcttggctca attacaacag
５41 gaaggttatt ctatatttgt cgttaagggt gatctgccag attgcgaagc tgaccaactc
601 ctgcagatga ttagggtcca acagatgcat cgaccaaaac ttattggaga agaattagca
661 caactaaaag agcaaagagt ccataaaaca gacctggaac gagtgttaga agcaaatgat
721 ggctcaggaa tgttagacga agatgaggag gatttgcaga gggctctggc actaagtcgc
781 caagaaattg acatggaaga tgaggaagca gatctccgca gggctattca gctaagtatg
841 caaggtagtt ccagaaacat atctcaagat atgacacaga catcaggtac aaatcttact
901 tcagaagagc ttcggaagag acgagaagcc tactttgaaa aacagcagca aaagcagcaa
961 cagcagcagc agcagcagca gcagggggac ctatcaggac agagttcaca tccatgtgaa
1021 aggccagcca ccagttcagg agcacttggg agtgatctag gtgatgctat gagtgaagaa
1081 gacatgcttc aggcagctgt gaccatgtct ttagaaactg tcagaaatga tttgaaaaca
1141 gaaggaaaaa aataatacct ttaaaaaata atttagatat tcatactttc caacattatc
1201 ctgtgtgatt acagcatagg gtccactttg gtaatgtgtc aaagagatga ggaaataaga
1261 cttttagcgg tttgcaaaca aaatgatggg aaagtggaac aatgcgtcgg ttgtaggact
1３21 aaataatgat cttccaaata ttagccaaag aggcattcag caattaaaga catttaaaat
1３81 agttttctaa atgtttcttt ttcttttttg agtgtgcaat atgtaacatg tctaaagtta
1441 gggcattttt cttggatctt tttgcagact agctaattag ctctcgcctc aggctttttc
1５01 catatagttt gttttctttt tctgtcttgt aggtaagttg gctcacatca tgtaatagtg
1５61 gctttcattt cttattaacc aaattaacct ttcaggaaag tatctctact ttcctgatgt
1621 tgataatagt aatggttcta gaaggatgaa cagttctccc ttcaactgta taccgtgtgc
1681 tccagtgttt tcttgtgttg ttttctctga tcacaacttt tctgctacct ggttttcatt
1741 attttcccac aattcttttg aaagatggta atcttttctg aggtttagcg ttttaagccc
1801 tacgatggga tcattatttc atgactggtg cgttcctaaa ctctgaaatc agccttgcac
1861 aagtacttga gaataaatga gcatttttta aaatgtgtga gcatgtgctt tcccagatgc
1921 tttatgaatg tcttttcact tatatcaaaa ccttacagct ttgttgcaac cccttcttcc
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2041 gcaagtctcc ttctgttaga agactaaaca tacgtaccca ccatgaatgt atgatacatg
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2５81 gacaacttcg aaaattataa tatggtatat tgccctcctg gtgtgtggct gcacacattt
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2701 atatctttta tttatgatta taaaatagct ttttcttcga tataacagat tttttaagtc
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３001 ttcattacct ttttccattg aaaagttaca ttaaactttt catacacttg aattgatgag
３061 ctacctaata taaaaatgag aaaaccaata tgcattttaa agttttaact ttagagttta
３121 taaagttcat atatacccta gttaaagcac ttaagaaaat atggcatgtt tgacttttag
３181 ttcctagaga gtttttgttt ttgtttttgt ttttttttga gacggagtct tgctatgtct
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３３61 cggcagattt ttgtattttt ggtagagacg cggtttcatc atgtttggcc aggctggtct
３421 cgaactcctg acctcaggtg atccgcctgc cttggcctcc caaagtgttg ggattacagg
３481 catgagccac tgcgcctggc cagctagaga gtttttaaag cagagctgag cacacactgg
３５41 atgcgtttga atgtgtttgt gtagtttgtt gtgaaattgt tacatttagc aggcagatcc
３601 agaagcacta gtgaactgtc atcttggtgg ggttggctta aatttaattg actgtttaga
３661 ttccatttct taattgattg gccagtatga aaagatgcca gtgcaagtaa ccatagtatc
３721 aaaaaagtta aaaattattc aaagctatag tttatacatc aggtactgcc atttactgta
３781 aaccacctgc aagaaagtca ggaacaacta aattcacaag aactgtcctg ctaagaagtg
３841 tattaaagat ttccattttg ttttactaat tgggaacatc ttaatgttta atatttaaac
３901 tattggtatc atttttctaa tgtataattt gtattactgg gatcaagtat gtacagtggt
３961 gatgctagta gaagtttaag ccttggaaat accactttca tattttcaga tgtcatggat
4021 ttaatgagta atttatgttt ttaaaattca gaatagttaa tctctgatct aaaaccatca
4081 atctatgttt tttacggtaa tcatgtaaat atttcagtaa tataaactgt ttgaaaaggc
4141 tgctgcaggt aaactctata ctaggatctt ggccaaataa tttacaattc acagaatatt
4201 ttatttaagg tggtgctttt tttttttgtc cttaaaactt gatttttctt aactttattc
4261 atgatgccaa agtaaatgag gaaaaaaact caaaaccagt tgagtatcat tgcagacaaa
4３21 actaccagta gtccatattg tttaatatta agttgaataa aataaatttt atttcagtca
4３81 gagcctaaat cacattttga ttgtctgaat ttttgatact atttttaaaa tcatgctagt
4441 ggcggctggg cgtggtagct cacgcctgta atcccagcat tttgggaggc cgaagtgggt
4５01 ggatcacgag gtcgggagtt cgagaccagc ttggccaaaa tggtgaaacc ccatctgtac
4５61 taaaaactac aaaaattagc tgggcgcggt ggcaggtgcc tgtaatccca gctacctggg
4621 agtctgaggc aggagaattg cttgaaccct ggcgacagag gatgcagtga gccaagatgg
4681 tgccactgta ctccagactg ggcgacagag tgagactctg tctcaaaaaa aaaaaaaaaa
4741 tcatgctagt gccaagagct actaaattct taaaaccggc ccattggacc tgtacagata
4801 aaaaatagat tcagtgcata atcaaaatat gataatttta aaatcttaag tagaaaaata
4861 aatcttgatg ttttaaattc ttacgaggat tcaatagtta atattgatga tctcccggct
4921 gggtgcagtg gctcacgcct gtaatcccag cagttctgga ggctgaggtg ggcgaatcac
4981 ttcaggccag gagttcaaga ccagtctggg caacatggtg aaacctcgtt tctactaaaa
５041 atacaaaaat tagccgggcg tggttgcaca cacttgtaat cccagctact caggaggcta
５101 agaatcgcat gagcctagga ggcagaggtt gcagagtgcc aagggctcac cactgcattc
５161 cagcctgccc aacagagtga gacactgttt ctgaaaaaaa aaaatatata tatatatata
５221 tatatgtgtg tatatatata tgtatatata tatgacttcc tattaaaaac tttatcccag
５281 tcgggggcag tggctcacgc ctgtaatccc aacactttgg gaggctgagg caggtggatc
５３41 acctgaagtc cggagtttga gaccagcctg gccaacatgg tgaaacccca tctctactaa
５401 aaatacaaaa cttaagccag gtatggtggc gggcacctgt aatcccagtt acttgggagg
５461 ctgaggcagg agaatcgttt aaacccagga ggtggaggtt gcagtgagct gagatcgtgc
５５21 cattgcactc tagcctgggc aacaagagta aaactccatc ttaaaggttt gtttgttttt
５５81 ttttaatccg gaaacgaaga ggcgttgggc cgctattttc tttttctttc tttctttctt
５641 tctttttttt tttttctgag acggagtcta gctctgctgc ccaggctgga gtacaatgac
５701 acgatgttgg ctcactgcaa cctccacctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc
５761 tcccaagtac ctgggattac aggcacctgc cactacacct ggcgaatatt tgtttttttt
５821 agtagagacg ggcttttacc atgttaggct ggtctcaaac tcctgacctc aggtgatctg
５881 cctgccttgg cctcccaaag tgctgggatt acaggtgcag gccaccacac ccggccttgg
５941 gccactgttt tcaaagtgaa ttgtttgttg tatcgagtcc ttaagtatgg atatatatgt
6001 gaccctaatt aagaactacc agattggatc aactaatcat gtcagcaatg taaataactt
6061 tatttttcat attcaaaata aaaactttct tttatttctg gcccctttat aaccagcatc
6121 tttttgcttt aaaaaatgac ctggctttgt atttttttag tcttaaacat aataaaaata
6181 tttttgttct aatttgcttt catgagtgaa gattattgac atcgttggta aattctagaa
6241 ttttgatttt gttttttaat ttgaagaaaa tctttgctat tattattttt tccaagtggt
6３01 ctggcatttt aagaattagt gctaataacg taacttctaa atttgtcgta attggcatgt
6３61 ttaatagcat atcaaaaaac attttaagcc tgtggattca tagacaaagc aatgagaaac
6421 attagtaaaa tataaatgga tattcctgat gcatttagga agctctcaat tgtctcttgc
6481 atagttcaag gaatgttttc tgaatttttt taatgctttt tttttttttg aaagaggaaa
6５41 acatacattt ttaaatgtga ttatctaatt tttacaacac tgggctatta ggaataactt
6601 tttaaaaatt actgttctgt ataaatattt gaaattcaag tacagaaaat atctgaaaca
6661 aaaagcattg ttgtttggcc atgatacaag tgcactgtgg cagtgccgct tgctcaggac
6721 ccagccctgc agcccttctg tgtgtgctcc ctcgttaagt tcatttgctg ttattacaca
6781 cacaggcctt cctgtctggt cgttagaaaa gccgggcttc caaagcactg ttgaacacag
6841 gattctgttg ttagtgtgga tgttcaatga gttgtatttt aaatatcaaa gattattaaa
6901 taaagataat gtttgctttt cta
【０２２９】
配列番号：２
ホモサピエンスＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡのヌクレオチド９６１−１０２０（ＷＴ；Ｇ９８７Ｃ  ＳＮＰを含まない）
961 cagcagcagc agcagcagca gcagggggac ctatcaggac agagttcaca tccatgtgaa
【０２３０】
配列番号：３
ホモサピエンスＡＴＸＮ３  ｍＲＮＡのヌクレオチド９７７−９９７（ＷＴ；Ｇ９８７Ｃ  ＳＮＰを含まない）
977 agcagcaggg ggacctatca g
【０２３１】
配列番号：４
SNP ID rs1289５３５7
【０２３２】
配列番号：５
変異ホモサピエンスＡＴＸＮ３，ｍＲＮＡのヌクレオチド９６１−１０２０（Ｇ９８７Ｃ  ＳＮＰを含む）
961 cagcagcagc agcagcagca gcagcgggac ctatcaggac agagttcaca tccatgtgaa
【０２３３】
配列番号：６
変異ホモサピエンスＡＴＸＮ３，ｍＲＮＡのヌクレオチド９７７−９９７（Ｇ９８７Ｃ  ＳＮＰを含む）
977 agcagcagcg ggacctatca g
【０２３４】
配列番号：７
５’ − ATAGGTCCCGCTGCT − ３’
【０２３５】
配列番号：８
５’ − TGATAGGTCCCGCTGC − ３’
【０２３６】
配列番号：９
５’ − CTGATAGGTCCCGCTG − ３’
【０２３７】
配列番号：１０
５’ − CTGATAGGTCCCGCT − ３’
【０２３８】
配列番号：１１
５’ − CTGATAGGTCCCGC − ３’
【０２３９】
配列番号：１２
５’ − ATAGGTCCCGC − ３’
【０２４０】
配列番号：１３
ＳＨ０６に対するｍＲＮＡ標的
５’ − AGCAGCGGGACCUAU − ３’
【０２４１】
配列番号：１４
ＳＨ１０に対するｍＲＮＡ標的
５’ − GCAGCGGGACCUAUCA − ３’
【０２４２】
配列番号：１５
ＳＨ１３に対するｍＲＮＡ標的
５’ − CAGCGGGACCUAUCAG − ３’
【０２４３】
配列番号：１６
ＳＨ１６に対するｍＲＮＡ標的
５’ − AGCGGGACCUAUCAG − ３’
【０２４４】
配列番号：１７
ＳＨ２０に対するｍＲＮＡ標的
５’ − GCGGGACCUAUCAG − ３’
【０２４５】
配列番号：１８
ｍＲＮＡ標的
５’ − GCGGGACCUAU − ３’
【０２４６】
配列番号：１９
ＳＨ０６
【化８】
2015511821.tif 000016
【０２４７】
配列番号：２０
ＳＨ１０
【化９】
2015511821.tif 000017
【０２４８】
配列番号：２１
ＳＨ１３
【化１０】
2015511821.tif 000018
【０２４９】
配列番号：２２
ＳＨ１６
【化１１】
2015511821.tif 000019
【０２５０】
配列番号：２３
ＳＨ２０
【化１２】
2015511821.tif 000020
【図１Ａ】
2015511821.tif 000021
【図１Ｂ】
2015511821.tif 000022
【図２Ａ】
2015511821.tif 000023
【図２Ｂ】
2015511821.tif 000024
【図３】
2015511821.tif 000025
【図４】
2015511821.tif 000026
【図５Ａ】
2015511821.tif 000027
【図５Ｂ】
2015511821.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月7日(2014.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2015511821000001.app
【国際調査報告】
2015511821.tif 000029
2015511821.tif 000030
2015511821.tif 000031
2015511821.tif 000032