(57)【要約】  新生物細胞の試料中の細胞集団内のＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１の発現レベルを決定して前記細胞の静止状態を決定することと、試料においてＤＹＲＫ１が発現されている場合に単独で又は組み合わせの治療法の一部として、有効量のＤＹＲＫ１活性の調節因子を投与することを含む、新生物を患う被験体を治療するための方法である。
2015534584.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
新生物を患う患者を治療するための方法であって、
（ａ）ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が患者試料において発現されているか否かを決定することと、
（ｂ）静止新生物細胞が患者試料中に存在しているか否かを決定することと、
（ｃ）ＤＹＲＫ１が患者試料において発現されており、かつ制止新生物細胞が患者試料中に存在している場合に、患者に有効量のＤＹＲＫ１活性の調節因子（modulator）を投与すること
を含む、方法。
【請求項２】
新生物を患う患者を治療するための方法であって、
（ａ）ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が、患者から収集された最初の患者試料において発現されているか否かを決定することと、
（ｂ）静止新生物細胞の割合が最初の患者試料中に存在することを決定することと、
（ｃ）ＤＹＲＫ１が最初の患者試料において発現されており、かつ最初の患者試料中の静止新生物細胞の割合がゼロより大きい場合に、患者に有効量のＤＹＲＫ１活性の調節因子を投与することと、
（ｄ）ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が、第一の有効量のＤＹＲＫ１活性の調節因子を患者に投与した後に患者から収集された後続の患者試料において発現されているか否かを決定することと、
（ｅ）後続の患者試料中の静止新生物細胞の割合を決定することと、
（ｆ）ＤＹＲＫ１が後続の患者試料において発現されており、かつ最初の患者試料中の静止新生物細胞の割合が後続の患者試料中の静止新生物細胞の割合より大きい場合に、患者に第二の有効量のＤＹＲＫ１活性の調節因子を投与すること
を含む、方法。
【請求項３】
細胞集団内の静止癌細胞の割合を減少させるために十分な期間についてＤＹＲＫ１活性の調節因子を有する静止細胞を含む新生物細胞集団を培養することを含む、新生物細胞集団内の静止細胞の割合を減少させるための方法。
【請求項４】
被験体に有効量の少なくとも一つの追加の治療薬を投与することをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
ＤＹＲＫ１活性の調節因子が特異的ＤＹＲＫ１Ａ阻害物質又は特異的ＤＹＲＫ１Ｂ阻害物質である、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記調節因子が構造式
【化１】
2015534584.tif 000015
又はその薬学的に許容される塩を有する、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記調節因子が構造式
【化２】
2015534584.tif 000016
又はその薬学的に許容される塩を有する、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記調節因子が構造式
【化３】
2015534584.tif 000017
又はその薬学的に許容される塩を有する、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記調節因子が、４ＩＰｈｅ‐Ｃｙｓ‐Ｔｈｒ‐Ａｓｎ‐Ｃｙｓ‐Ｇｌｕ‐Ｔｈｒ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ‐ＢｒＰｈｅ（配列ＩＤ番号：３）、ＢｒＴｙｒ‐Ｃｙｓ‐Ａｌａ‐Ｓｅｒ‐ Ａｓｐ‐Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号：４）、ＢｒＰｈｅ‐Ｉｌｅ‐Ａｓｎ‐Ｔｈｒ‐Ｌｙｓ‐Ｍｅｔ‐Ｍｅｔ‐Ｔｒｐ‐４ＩＰｈｅ（配列ＩＤ番号：５）、ＢｒＰｈｅ‐Ｈｉｓ‐Ａｌａ‐Ｔｈｒ‐Ｌｙｓ‐Ｐｈｅ‐Ａｌａ‐Ａｌａ‐４ＩＰｈｅ（配列ＩＤ番号：６）、若しくは ＢｒＰｈｅ‐Ｉｌｅ‐Ｔｒｐ‐Ｔｙｒ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｎ‐Ａｓｎ‐Ｖａｌ‐４ＩＰｈｅ（配列ＩＤ番号：７）、又はその薬学的に許容される塩である、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ダウン症候群又は早期発症アルツハイマー病から選択される疾患を患う被験体を治療するための方法であって、
（ａ）ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が、患者試料において発現されているか否かを決定することと、
（ｂ）ＤＹＲＫ１が前記患者試料において発現されている場合に、有効量のＤＹＲＫ１活性の調節因子を患者に投与すること
を含む、方法。
【請求項１１】
（ａ）ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が、患者試料において発現されているか否かを決定することと、
（ｂ）静止新生物細胞が患者試料中に存在しているか否かを決定することと、
（ｃ）静止新生物細胞が患者試料中に存在する、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現している患者を治療のために選択することと、
（ｄ）患者に有効量の調節因子を投与すること
を含む、患者内の新生物の治療における使用のためのＤＹＲＫ１活性の調節因子。
【請求項１２】
前記患者試料が最初の患者試料であり、
前記有効量の調節因子が第一の有効量の調節因子であり、
前記ステップ（ｂ）が前記最初の患者試料における静止新生物細胞の割合を決定することをさらに含み、
前記治療が、
（ｅ）ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が、前記ステップ（ｄ）が実行された後に前記患者から収集された後続の患者試料において発現されているか否かを決定することと、
（ｆ）前記後続の患者試料における静止新生物細胞の割合を決定することと、
（ｇ）前記最初の患者試料に存在する静止新生物細胞の割合が前記後続の患者試料における静止新生物細胞の割合より大きい、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現している患者を治療のために選択することと、
（ｈ）患者に第二の有効量の調節因子を投与すること
をさらに含む、請求項１１に記載の調節因子。
【請求項１３】
患者内の新生物の治療における使用のためのＤＹＲＫ１活性の調節因子であって、患者は患者試料においてＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現することが決定されており、静止新生物細胞が前記患者試料に存在することが決定されている、調節因子。
【請求項１４】
前記患者試料が最初の患者試料であり、
前記最初の患者試料中に存在する静止新生物細胞の割合が決定され、
前記治療は第一の有効量の調節因子を投与することを含み、
前記治療は前記第一の有効量の調節因子を投与することに続いて第二の有効量の調節因子を投与することを含み、
患者は後続の患者試料においてＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現することが決定されており、
静止新生物細胞が後続の患者試料中に存在することが決定されており、
前記最初の患者試料に存在する静止新生物細胞の割合が前記後続の患者試料における静止新生物細胞の割合より大きく、
前記後続の患者試料は前記第一の有効量の調節因子を投与した後に収集されている、
請求項１３に記載の調節因子。
【請求項１５】
患者内の新生物の治療における使用のためのＤＹＲＫ１活性の調節因子であって、
患者は最初の患者試料においてＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現することが決定されており、かつ静止新生物細胞の割合が最初の患者試料において決定されており、
前記治療は前記患者に第一の有効量の調節因子を投与することを含み、
前記治療は前記第一の有効量の調節因子を投与することに続いて第二の有効量の調節因子を前記患者に投与することを含み、
前記患者は後続の患者試料においてＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現することが決定されており、かつ静止新生物細胞の割合が後続の患者試料において決定されており、
前記後続の患者試料は前記第一の有効量の調節因子を投与した後に収集されており、
最初の患者試料に存在する静止新生物細胞の割合が前記後続の患者試料における静止新生物細胞の割合より大きい、
調節因子。
【請求項１６】
前記治療が有効量の少なくとも一つの追加の治療薬を被験体に投与することをさらに含む、請求項１１乃至１５のいずれかに記載の調節因子。
【請求項１７】
前記治療が有効量の放射線療法を被験体に施すことをさらに含む、請求項１１乃至１６のいずれかに記載の調節因子。
【請求項１８】
ＤＹＲＫ１活性の調節因子が特異的ＤＹＲＫ１Ａ阻害物質又は特異的ＤＹＲＫ１Ｂ阻害物質である、請求項１１乃至１７のいずれかに記載の調節因子。
【請求項１９】
前記治療がＤＹＲＫ１の発現レベルを決定することをさらに含む、請求項１１乃至１８のいずれかに記載の調節因子。
【請求項２０】
前記調節因子が構造式
【化４】
2015534584.tif 000018
又はその薬学的に許容される塩を有する、請求項１１乃至１９のいずれかに記載の調節因子。
【請求項２１】
前記調節因子が構造式
【化５】
2015534584.tif 000019
又はその薬学的に許容される塩を有する、請求項１１乃至１９のいずれかに記載の調節因子。
【請求項２２】
前記調節因子が構造式
【化６】
2015534584.tif 000020
又はその薬学的に許容される塩を有する、請求項１１乃至１９のいずれかに記載の調節因子。
【請求項２３】
前記調節因子が、４ＩＰｈｅ‐Ｃｙｓ‐Ｔｈｒ‐Ａｓｎ‐Ｃｙｓ‐Ｇｌｕ‐Ｔｈｒ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ‐ＢｒＰｈｅ（配列ＩＤ番号：３）、ＢｒＴｙｒ‐Ｃｙｓ‐Ａｌａ‐Ｓｅｒ‐ Ａｓｐ‐Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号：４）、ＢｒＰｈｅ‐Ｉｌｅ‐Ａｓｎ‐Ｔｈｒ‐Ｌｙｓ‐Ｍｅｔ‐Ｍｅｔ‐Ｔｒｐ‐４ＩＰｈｅ（配列ＩＤ番号：５）、ＢｒＰｈｅ‐Ｈｉｓ‐Ａｌａ‐Ｔｈｒ‐Ｌｙｓ‐Ｐｈｅ‐Ａｌａ‐Ａｌａ‐４ＩＰｈｅ（配列ＩＤ番号：６）、若しくは ＢｒＰｈｅ‐Ｉｌｅ‐Ｔｒｐ‐Ｔｙｒ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｎ‐Ａｓｎ‐Ｖａｌ‐４ＩＰｈｅ（配列ＩＤ番号：７）、又はその薬学的に許容される塩である、請求項１１乃至１９のいずれかに記載の調節因子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願）
本願は、２０１２年１０月１０日に出願された米国仮出願番号６１／７１２，０７９及び２０１３年７月８日に出願された米国仮出願番号６１／８４３，５６５の利益を主張する。上記出願の全体の教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
癌細胞の静止（quiescent）、事実上は癌細胞の睡眠状態は、治療に対する癌の抵抗の主要な機構及び癌再発のための経路として近年認識されている。代替的には癌細胞休眠状態（dormancy）と呼ばれるこの静止は、Ｇ０における停止に起因する。図１に示されるように、典型的には細胞はギャップ段階１（Ｇ１）から有糸分裂周期に入る。合成段階及び短い有糸分裂前（pre-mitotic）間隔の後に、細胞は有糸分裂（Ｍ）により分割されてＧ１への帰還に続く。しかしながら、Ｇ１の代わりに、細胞は休眠（又は静止）段階Ｇ０に入り得る。
【０００３】
静止状態は可逆的であり、細胞型に固有であるか、成長要因又は栄養の欠乏のような環境要因により引き起こされ、あるいは薬理学的静止にあるように誘発され得る。細胞は、細胞分裂周期に入るための信号の受信まで、不確定の期間について静止状態に留まり得る。従来の化学療法又は放射線治療は分裂中の細胞（dividing cell）を標的にするため、Ｇ０状態における静止癌細胞は化学療法に対して感受性がない。典型的には、分裂中の細胞は露出されたＤＮＡに損傷を与えることにより標的化され、有糸分裂又は他の機構を阻害する。静止癌細胞のエネルギー及び栄養要求は、分裂中の癌細胞に対して削減されている。そのため、静止癌細胞は抗血管新生療法に対して感受性がない。
【０００４】
マーク（Mirk）又は小脳関連キナーゼとも呼ばれるＤＹＲＫ１Ｂ、二重特異性チロシンリン酸化反応調節キナーゼ１Ｂは、膵臓癌、結腸癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、骨肉腫及び造血系癌を含むがこれらに限られない複数の癌の細胞において発現される。ＤＹＲＫ１Ｂは、健康な組織においては検出可能なレベルにおいて発現されない。近年の研究は、ＤＹＲＫ１Ｂが静止癌細胞が静止状態に留まることを可能にするために本質的であり、これにより癌細胞の生存を促進することを示唆した。癌細胞におけるＤＹＲＫ１Ｂの発現又は過剰発現は、癌が生存機構としての癌細胞静止に依存していることを示す。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の新生物を患う患者を治療するための方法は、
（ａ）ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が患者試料において発現されているか否かを決定することと、
（ｂ）静止新生物細胞が患者試料中に存在しているか否かを決定することと、
（ｃ）ＤＹＲＫ１が患者試料において発現されており、かつ制止新生物細胞が患者試料中に存在している場合に、患者に有効量のＤＹＲＫ１活性の調節因子（modulator）を投与すること
を含む。
【０００６】
前記方法は、被験体に有効量の少なくとも一つの追加の治療薬を投与することをさらに含んでいてもよい。
【０００７】
前記方法は、被験体に有効量の放射線療法を施すことをさらに含んでいてもよい。
【０００８】
ＤＹＲＫ１活性の調節因子は特異的ＤＹＲＫ１Ｂ阻害物質であってもよい。
【０００９】
ＤＹＲＫ１活性の調節因子は特異的ＤＹＲＫ１Ａ阻害物質であってもよい。
【００１０】
新生物は、膵臓癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、卵巣癌又は骨肉腫から選択される固形癌であってもよい。
【００１１】
ＤＹＲＫ１活性の調節因子は固形癌の外科的切除を経た被験体に投与されてもよい。
【００１２】
前記新生物は造血系癌（hematopoietic cancer）であってもよい。
【００１３】
前記造血系癌は白血病又はリンパ腫から選択されてもよい。
【００１４】
前記造血系癌は急性骨髄性白血病又は慢性骨髄性白血病から選択される白血病であってもよい。
【００１５】
前記被験体は人間であってもよい。
【００１６】
前記被験体は人間でない哺乳類であってもよい。
【００１７】
前記新生物は異種移植片であってもよい。
【００１８】
前記方法は、ＤＹＲＫ１の発現レベルを決定することをさらに含んでいてもよい。
【００１９】
前記調節因子は構造式
【化７】
2015534584.tif 000003
又はその薬学的に許容される塩を有してもよい。
【００２０】
前記調節因子は構造式
【化８】
2015534584.tif 000004
又はその薬学的に許容される塩を有してもよい。
【００２１】
前記調節因子は構造式
【化９】
2015534584.tif 000005
又はその薬学的に許容される塩を有してもよい。
【００２２】
前記調節因子は、４ＩＰｈｅ‐Ｃｙｓ‐Ｔｈｒ‐Ａｓｎ‐Ｃｙｓ‐Ｇｌｕ‐Ｔｈｒ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ‐ＢｒＰｈｅ（配列ＩＤ番号：３）、ＢｒＴｙｒ‐Ｃｙｓ‐Ａｌａ‐Ｓｅｒ‐ Ａｓｐ‐Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号：４）、ＢｒＰｈｅ‐Ｉｌｅ‐Ａｓｎ‐Ｔｈｒ‐Ｌｙｓ‐Ｍｅｔ‐Ｍｅｔ‐Ｔｒｐ‐４ＩＰｈｅ（配列ＩＤ番号：５）、ＢｒＰｈｅ‐Ｈｉｓ‐Ａｌａ‐Ｔｈｒ‐Ｌｙｓ‐Ｐｈｅ‐Ａｌａ‐Ａｌａ‐４ＩＰｈｅ（配列ＩＤ番号：６）、若しくは ＢｒＰｈｅ‐Ｉｌｅ‐Ｔｒｐ‐Ｔｙｒ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｎ‐Ａｓｎ‐Ｖａｌ‐４ＩＰｈｅ（配列ＩＤ番号：７）、又はその薬学的に許容される塩であってもよい。
【００２３】
本発明の別の新生物を患う患者を治療するための方法は、
（ａ）ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が、患者から収集された最初の患者試料において発現されているか否かを決定することと、
（ｂ）静止新生物細胞の割合が最初の患者試料中に存在することを決定することと、
（ｃ）ＤＹＲＫ１が最初の患者試料において発現されており、かつ最初の患者試料中の静止新生物細胞の割合がゼロより大きい場合に、患者に有効量のＤＹＲＫ１活性の調節因子を投与することと、
（ｄ）ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が、第一の有効量のＤＹＲＫ１活性の調節因子を患者に投与した後に患者から収集された後続の患者試料において発現されているか否かを決定することと、
（ｅ）後続の患者試料中の静止新生物細胞の割合を決定することと、
（ｆ）ＤＹＲＫ１が後続の患者試料において発現されており、かつ最初の患者試料中の静止新生物細胞の割合が後続の患者試料中の静止新生物細胞の割合より大きい場合に、患者に第二の有効量のＤＹＲＫ１活性の調節因子を投与すること
を含む。
【００２４】
前記方法は、被験体に有効量の少なくとも一つの追加の治療薬を投与することをさらに含んでいてもよい。
【００２５】
前記ＤＹＲＫ１活性の調節因子は、特異的ＤＹＲＫ１Ａ阻害物質又は特異的ＤＹＲＫ１Ｂ阻害物質であってもよい。
【００２６】
前記調節因子は構造式
【化１０】
2015534584.tif 000006
又はその薬学的に許容される塩を有してもよい。
【００２７】
前記調節因子は構造式
【化１１】
2015534584.tif 000007
又はその薬学的に許容される塩を有してもよい。
【００２８】
前記調節因子は構造式
【化１２】
2015534584.tif 000008
又はその薬学的に許容される塩を有してもよい。
【００２９】
前記調節因子は、４ＩＰｈｅ‐Ｃｙｓ‐Ｔｈｒ‐Ａｓｎ‐Ｃｙｓ‐Ｇｌｕ‐Ｔｈｒ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ‐ＢｒＰｈｅ（配列ＩＤ番号：３）、ＢｒＴｙｒ‐Ｃｙｓ‐Ａｌａ‐Ｓｅｒ‐ Ａｓｐ‐Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号：４）、ＢｒＰｈｅ‐Ｉｌｅ‐Ａｓｎ‐Ｔｈｒ‐Ｌｙｓ‐Ｍｅｔ‐Ｍｅｔ‐Ｔｒｐ‐４ＩＰｈｅ（配列ＩＤ番号：５）、ＢｒＰｈｅ‐Ｈｉｓ‐Ａｌａ‐Ｔｈｒ‐Ｌｙｓ‐Ｐｈｅ‐Ａｌａ‐Ａｌａ‐４ＩＰｈｅ（配列ＩＤ番号：６）、若しくは ＢｒＰｈｅ‐Ｉｌｅ‐Ｔｒｐ‐Ｔｙｒ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｎ‐Ａｓｎ‐Ｖａｌ‐４ＩＰｈｅ（配列ＩＤ番号：７）、又はその薬学的に許容される塩であってもよい。
【００３０】
本発明の新生物細胞集団内の静止細胞の割合を減少させるための方法は、細胞集団内の静止癌細胞の割合を減少させるために十分な期間についてＤＹＲＫ１活性の調節因子を有する静止細胞を含む新生物細胞集団を培養することを含む。
【００３１】
前記ＤＹＲＫ１活性の調節因子は、特異的ＤＹＲＫ１Ａ阻害物質又は特異的ＤＹＲＫ１Ｂ阻害物質であってもよい。
【００３２】
本発明のダウン症候群又は早期発症アルツハイマー病から選択される疾患を患う被験体を治療するための方法は、
（ａ）ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が、患者試料において発現されているか否かを決定することと、
（ｂ）ＤＹＲＫ１が前記患者試料において発現されている場合に、有効量のＤＹＲＫ１活性の調節因子を患者に投与すること
を含む。
【００３３】
本発明の患者内の新生物の治療における使用のためのＤＹＲＫ１活性の調節因子は、治療が
（ａ）ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が、患者試料において発現されているか否かを決定することと、
（ｂ）静止新生物細胞が患者試料中に存在しているか否かを決定することと、
（ｃ）静止新生物細胞が患者試料中に存在する、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現している患者を治療のために選択することと、
（ｄ）患者に有効量の調節因子を投与すること
を含む。
【００３４】
前記調節因子は、
前記患者試料が最初の患者試料であり、
前記有効量の調節因子が第一の有効量の調節因子であり、
前記ステップ（ｂ）が前記最初の患者試料における静止新生物細胞の割合を決定することをさらに含み、
前記治療は、
（ｅ）ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が、前記ステップ（ｄ）が実行された後に前記患者から収集された後続の患者試料において発現されているか否かを決定することと、
（ｆ）前記後続の患者試料における静止新生物細胞の割合を決定すること
（ｇ）前記最初の患者試料に存在する静止新生物細胞の割合が前記後続の患者試料における静止新生物細胞の割合より大きい、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現している患者を治療のために選択することと、
（ｈ）患者に第二の有効量の調節因子を投与すること
をさらに含んでいてもよい。
【００３５】
本発明の患者内の新生物の治療における使用のためのＤＹＲＫ１活性の調節因子は、患者が患者試料においてＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現することが決定されており、静止新生物細胞が前記患者試料に存在することが決定されている。
【００３６】
前記調節因子は、
前記患者試料が最初の患者試料であり、
前記最初の患者試料中に存在する静止新生物細胞の割合が決定され、
前記治療は第一の有効量の調節因子を投与することを含み、
前記治療は前記第一の有効量の調節因子を投与することに続いて第二の有効量の調節因子を投与することを含み、
患者は後続の患者試料においてＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現することが決定されており、
静止新生物細胞が後続の患者試料中に存在することが決定されており、
前記最初の患者試料に存在する静止新生物細胞の割合が前記後続の患者試料における静止新生物細胞の割合より大きく、
前記後続の患者試料は前記第一の有効量の調節因子を投与した後に収集されている。
【００３７】
本発明の別の患者内の新生物の治療における使用のためのＤＹＲＫ１活性の調節因子は、
患者が最初の患者試料においてＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現することが決定されており、かつ静止新生物細胞の割合が最初の患者試料において決定されており、
前記治療は前記患者に第一の有効量の調節因子を投与することを含み、
前記治療は前記第一の有効量の調節因子を投与することに続いて第二の有効量の調節因子を前記患者に投与することを含み、
前記患者は後続の患者試料においてＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現することが決定されており、かつ静止新生物細胞の割合が後続の患者試料において決定されており、
前記後続の患者試料は前記第一の有効量の調節因子を投与した後に収集されており、
最初の患者試料に存在する静止新生物細胞の割合は前記後続の患者試料における静止新生物細胞の割合より大きい。
【００３８】
前記治療は、有効量の少なくとも一つの追加の治療薬を被験体に投与することをさらに含んでいてもよい。
【００３９】
前記治療は、有効量の放射線療法を被験体に施すことをさらに含んでいてもよい。
【００４０】
前記ＤＹＲＫ１活性の調節因子は、特異的ＤＹＲＫ１Ｂ阻害物質であってもよい。
【００４１】
前記ＤＹＲＫ１活性の調節因子は、特異的ＤＹＲＫ１Ａ阻害物質であってもよい。
【００４２】
前記調節因子において、新生物は膵臓癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、卵巣癌又は骨肉腫から選択される固形癌であってもよい。
【００４３】
前記ＤＹＲＫ１活性の調節因子は、固形癌の外科的切除を経た患者に投与されてもよい。
【００４４】
前記調節因子において、新生物は造血系癌であってもよい。
【００４５】
前記造血系癌は白血病又はリンパ腫から選択されてもよい。
【００４６】
前記造血系癌は、急性骨髄性白血病又は慢性骨髄性白血病から選択される白血病であってもよい。
【００４７】
前記治療は、ＤＹＲＫ１の発現レベルを決定することをさらに含んでいてもよい。
【００４８】
前記調節因子は、構造式
【化１３】
2015534584.tif 000009
又はその薬学的に許容される塩を有してもよい。
【００４９】
前記調節因子は、構造式
【化１４】
2015534584.tif 000010
又はその薬学的に許容される塩を有してもよい。
【００５０】
前記調節因子は、構造式
【化１５】
2015534584.tif 000011
又はその薬学的に許容される塩を有してもよい。
【００５１】
前記調節因子は、４ＩＰｈｅ‐Ｃｙｓ‐Ｔｈｒ‐Ａｓｎ‐Ｃｙｓ‐Ｇｌｕ‐Ｔｈｒ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ‐ＢｒＰｈｅ（配列ＩＤ番号：３）、ＢｒＴｙｒ‐Ｃｙｓ‐Ａｌａ‐Ｓｅｒ‐ Ａｓｐ‐Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号：４）、ＢｒＰｈｅ‐Ｉｌｅ‐Ａｓｎ‐Ｔｈｒ‐Ｌｙｓ‐Ｍｅｔ‐Ｍｅｔ‐Ｔｒｐ‐４ＩＰｈｅ（配列ＩＤ番号：５）、ＢｒＰｈｅ‐Ｈｉｓ‐Ａｌａ‐Ｔｈｒ‐Ｌｙｓ‐Ｐｈｅ‐Ａｌａ‐Ａｌａ‐４ＩＰｈｅ（配列ＩＤ番号：６）、若しくは ＢｒＰｈｅ‐Ｉｌｅ‐Ｔｒｐ‐Ｔｙｒ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｎ‐Ａｓｎ‐Ｖａｌ‐４ＩＰｈｅ（配列ＩＤ番号：７）、又はその薬学的に許容される塩であってもよい。
【００５２】
（発明の要旨）
一つの例示的な実施形態において、本発明はＤＴＲＫ１キナーゼが静止状態における癌細胞の維持のために重要であるとの発見に基づいている。より具体的には、出願人はＤＴＲＫ１キナーゼの抑制が、細胞周期の静止状態に入り又は静止状態において蓄積する癌細胞の能力を阻害することを発見した（図５及び図６）。この発見に基づいて、ＤＴＲＫ１活性の調節因子及び治療の方法が開示される。
【００５３】
従って、一つの例示的な実施形態において、本発明は新生物を抱える患者を治療するための方法である。本方法は、（ａ）ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が患者試料において発現されているか否かを決定することと、（ｂ）静止新生物細胞が患者試料中に存在するか否かを決定することと、（ｃ）ＤＹＲＫ１が患者試料において発現されておりかつ静止新生物細胞が患者試料中に存在する場合に、患者に対して有効量のＤＹＲＫ１活性の調節因子を投与することを含む。
【００５４】
別の例示的な実施形態において、本発明は新生物を抱える患者を治療するための方法である。本方法は、（ａ）ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が、患者から収集された最初の患者試料において発現されているか否かを決定することと、（ｂ）最初の患者試料中に存在する静止新生物細胞の割合（fraction）を決定することと、（ｃ）ＤＹＲＫ１が最初の患者試料において発現しており、かつ最初の患者試料中の静止新生物細胞の割合がゼロより大きい場合に、患者に対して第一の有効量のＤＹＲＫ１活性の調節因子を投与することと、（ｄ）ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が、患者に対する第一の有効量のＤＹＲＫ１活性の調節因子の投与後に患者から収集された後続の患者試料において発現されているか否かを決定することと、（ｅ）後続の患者試料中の静止新生物細胞の割合を決定することと、（ｆ）ＤＹＲＫ１が後続の患者試料において発現しており、かつ最初の患者試料中の静止新生物細胞の割合が後続の患者試料中の静止新生物細胞の割合より大きい場合に、患者に対して第二の有効量のＤＹＲＫ１活性の調節因子を投与することを含む。
【００５５】
本発明は、癌、特に固形癌及び造血系癌、ダウン症候群、早期発症アルツハイマー病並びにＨＩＶ‐１の複製（これはＡＩＤＳの治療において有用であり得る）を患う被験体のための治療の方法に関する。
【００５６】
本発明は、当該細胞集団中の静止癌細胞の割合を減少させるのに十分な期間についてＤＹＲＫ１活性の調節因子を有する静止細胞を含む新生物細胞集団を培養することを含む、新生物細胞集団中の静止癌細胞の割合を減少させる方法に向けられている。本発明はさらに、特定の癌細胞の（それらのＲＮＡ／ＤＮＡ含量に基づいて）細胞周期内の細胞集団の分布を定義して、当該特定の細胞内のＤＹＲＫ１Ｂ及び／又はＤＹＲＫ１Ａ蛋白質の発現レベルを測定することにより、静止又は休眠癌細胞の存在を決定するための方法に関する。
【００５７】
他の例示的な実施形態において、本発明は患者内の新生物の治療における使用のためのＤＹＲＫ１活性の調節因子である。ここで前記治療は、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が患者試料において発現されているか否かを決定することと、静止新生物細胞が患者試料中に存在するか否かを決定することと、患者がＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現させておりかつ静止新生物細胞が患者試料中に存在する場合に、有効量の調節因子を投与することを含む。
【００５８】
本発明のさらなる実施形態において、後続の患者試料は調節因子が投与された後に収集される。後続の患者試料は、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が後続の患者試料において発現されているか否かを決定すると共に、後続の患者試料中の静止新生物細胞の割合を決定するために分析される。患者試料中に存在する静止新生物細胞の割合が後続の患者試料中の静止新生物細胞の割合より大きく、患者がＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現させている場合には、第二の有効量の調節因子が投与される。
【００５９】
別の例示的な実施形態において、本発明は患者内の新生物の治療における使用のためのＤＹＲＫ１活性の調節因子に関する。ここで、患者は患者試料においてＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現させていることが決定されており、静止新生物細胞は患者資料中に存在していると決定されている。
【００６０】
別の例示的な実施形態において、本発明は患者内の新生物の治療における使用のためのＤＹＲＫ１活性の調節因子に関する。ここで、患者は最初の患者試料においてＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現させていることが決定されており、静止新生物細胞の割合は最初の患者試料において決定されている。前記治療は第一の有効量の調節因子を患者に投与することを含む。さらにここで、患者は最初の患者試料においてＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現させていることが決定されており、第一の有効量の調節因子を投与した後に収集された後続の患者試料において存在する静止新生物細胞の割合が決定されている。ここで、最初の患者試料における静止新生物細胞の割合は、後続の患者試料における静止新生物細胞の割合より大きい。
【００６１】
上記は、添付の図面に示されるように、本発明の例示的な実施形態のより具体的な以下の説明から明白になるであろう。添付の図面において、同様の参照符号は異なる図を通じて同一の部分を参照する。図面は、本発明の実施形態を図示する際に、必ずしも配置される代わりに拡大縮小、強調されるべきではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
続いて本発明の例示的な実施形態を説明する。
【００６３】
（用語解説）
本明細書において使用されるように、「治療する」、「治療している」又は「治療」の語は、医学的状態が臨床的に受け入れ可能な基準に従って改善される範囲において、医学的状態（例えば癌）に対抗する（counteract）ことを意味する。癌の改善は、１）削減又は停止された腫瘍成長、２）腫瘍縮小、３）寛解、４）転移癌における削減、及び５）再発の防止又は再発における遅延を含み得る。本発明の特定の実施形態において、治療は以下の結果のうちの一以上を部分的又は実質的に達成することを含む。癌の塊又は悪性細胞総数を部分的又は完全に削減すること、固形癌、造血系癌、早期発症アルツハイマー病、若しくはダウン症候群に関連付けられた指標又は臨床症状を改善し又は向上させること、固形癌、造血系癌、早期発症アルツハイマー病、若しくはダウン症候群の進行を遅延させ、阻害し若しくは阻止すること、又は固形癌、造血系癌、早期発症アルツハイマー病、若しくはダウン症候群の発症若しくは進行を部分的若しくは完全に遅延させ、阻害し若しくは阻止すること。
【００６４】
治療は、予防的治療を含む。「予防的治療」とは、対象疾患の臨床症状の前にその発生を阻止、阻害又は削減することを指す。
【００６５】
本明細書において使用されるように、「有効量」とは、対象疾患を治療するために治療的又は予防的に十分である治療薬又は治療薬の組み合わせの量を指す。有効量の例は、典型的には体重の約０．０００１ｍｇ／ｋｇから体重の約５００ｍｇ／ｋｇまでの範囲である。範囲例は、体重の約０．０００１ｍｇ／ｋｇから体重の約５ｍｇ／ｋｇまでの範囲である。例えば、有効量は約０．００５ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇまで変動し得る。他の例において、範囲は約０．０００１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇまでであり得る。さらに他の例においては、有効量は体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇから体重の約５０ｍｇ／ｋｇまで変動し、あるいは体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇから体重の約２０ｍｇ／ｋｇまで変動する。
【００６６】
本明細書において使用されるように、「被験体」の語は哺乳類、例えばヒトを指すが、獣医学的治療の必要における動物、例えばペット（例えばイヌ、ネコ等）、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）及び実験動物（例えばラット、マウス、モルモット等）をも意味し得る。
【００６７】
本明細書において使用されるように、「新生物」は新生組織形成から結果として生じる異常な組織の塊を意味する。「新生組織形成」は、細胞の異常な増殖の過程を意味する。本発明のいくつかの実施形態において、新生物は固形癌であり、あるいは代替的には造血系癌である。新生組織形成は、良性、前悪性又は悪性であり得る。新生物の語は、哺乳類の癌、いくつかの実施形態においては、ヒトの癌及び癌腫、肉腫、腺癌、骨肉腫、リンパ腫、固形及びリンパ癌を含む白血病、腎臓癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、膵臓癌、胃癌、脳腫瘍、頭頸部癌、皮膚癌、子宮癌、睾丸癌、食道癌、並びに肝細胞癌を含む肝臓癌、非ホジキンリンパ腫（例えばバーキット、小細胞及び大細胞リンパ腫）及びホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、白血病、並びに多発性骨髄腫を包含する。
【００６８】
本明細書において使用されるように、患者試料の語句は、例えば生体検査中又は血液試料収集中に患者から採取された細胞集団を含む。
【００６９】
本明細書において使用されるように、「ＤＹＲＫ１の発現レベルを決定する」の語句は、任意の標準的な受け入れ可能な技術を使用する転写物（遺伝子コピー、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ若しくは他の適切なもの）の数の決定又は蛋白質発現の決定のうちの一つ又は全ての適切なもののいずれかを指す。
【００７０】
本明細書において使用されるように、調節因子の語は酵素の活性に影響を与える組成物を意味する。調節因子の例は、阻害物質である。「阻害物質」の語は、酵素の活性を削減する任意の組成物を意味する。阻害物質の例は、化学的分子である。阻害物質の有効性の測定基準はその「抑制濃度５０％」（ＩＣ５０）である。ＩＣ５０は、酵素活性の５０％が当該阻害物質によって阻害される阻害物質の濃度である。
【００７１】
「特異的阻害剤」の語は、その標的について（例えばＤＹＲＫ１Ｂ又はＤＹＲＫ１Ａについて）高い特異性を有する化合物を指す。特定の阻害物質の特異性は、別の標的に対する関心のある標的についての特定の阻害物質のＩＣ５０値の比率として定義される。例えば、ＤＹＲＫ１Ａについて特異性を有するキナーゼ阻害物質は、標的Ｂ（例えばＤＹＲＫ１Ｂ）についてのＩＣ５０値より低い、標的Ａ（例えばＤＹＲＫ１Ａ）についてのＩＣ５０値を有するであろう。例えば、標的ＡについてのＩＣ５０値は、標的Ｂについての同一の阻害物質のＩＣ５０値より少なくとも１０倍低い。他の例において標的ＡについてのＩＣ５０値は１００倍低く、あるいは他の例において１０００倍低い。さらに他の例において、標的ＡについてのＩＣ５０値は、標的Ｂについての同一の阻害物質のＩＣ５０値より１０，０００倍低い。
【００７２】
代替的には「静止癌細胞」と呼ばれる「静止新生物細胞」は、細胞周期の静止又はＧ０状態において存在する癌細胞を意味する。Ｇ０状態において、細胞は細胞分裂を経ない。本明細書において使用されるような「静止新生物細胞の割合」は、細胞周期のＧ０状態において存在する細胞集団の一部を意味する。静止新生物細胞の割合を決定することは、細胞周期の段階内の構成細胞の分布により細胞集団を特徴付けることを含む。Ｇ０状態にある細胞（すなわち静止新生物細胞）の割合は、試料中の全体の細胞集団に対して数値化される。割合は、全体の細胞集団の百分率（すなわち100が乗算された（細胞集団において総数の細胞により除算された静止細胞の数））として表現され得る。細胞周期の段階内のその構成細胞の分布による細胞集団の特徴付けは、当業者に知られた技術により達成され得て、フローサイトメトリー方法、例えば蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を使用するＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量による分析を含み得る。
【００７３】
本発明の特定の実施形態において、治療薬は、細胞毒性薬又は化学療法剤又は個別化医療の抗癌剤である。癌治療において使用される化学療法剤の例は、例えば代謝拮抗剤（例えば葉酸、プリン及びピリミジン誘導体）並びにアルキル化剤（例えばナイトロジェンマスタード、ニトロソ、プラチナ、スルホン酸アルキル、ヒドラジン、トリアゼン、アジリジン、スピンドル毒、細胞毒性薬、トポイソメラーゼ阻害剤及び他のもの）を含む。さらなる例は、アントラサイクリン、植物アルカロイド、細胞増殖抑制剤、細胞毒性剤、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン又は他のサイトカインのような免疫学的修飾因子を含む。例示的な薬剤は、アクラルビシン、アクチノマイシン、アリトレチノン（Alitretinon）、アルトレタミン、アミノプテリン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アトラセンタン、ベロテカン、ベキサロテン、エンダムスチン（endamustine）、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルボコン、カルモフール、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、クロルメチン、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、デシタビン、デメコルチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エファプロキシラル、エレスクロモル、エルサミトルシン、エノシタビン、エピルビシン、エストラムスチン、エトグルシド、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル（５ＦＵ）、ホテムスチン、ゲムシタビン、グリアデルインプラント、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、イロフルベン、イクサベピロン、ラロタキセル、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロニダミン、ロムスチン、ルカントン、マンノスルファン、マソプロコール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、メチルアミノレブリン酸、ミトブロニトール、ミトグアゾン、ミトタン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ネダプラチン、ニムスチン、オブリメルセン、オマセタキシン、オルタタキセル、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ペメトレキセド、ペントスタチン、ピラルビシン、ピクサントロン、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プレドニムスチン、プロカルバジン、ラルチトレキシド、ラニムスチン、ルビテカン、サパシタビン、セムスチン、シチマジーンセラデノベック、ストラタプラチン（Strataplatin）、ストレプトゾシン、タラポルフィン、テガフール・ウラシル、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポシド、テセタキセル（Tesetaxel）、テストラクトン、四硝酸、チオテパ、チアゾフリン、チオグアニン、チピファルニブ、トポテカン、トラベクテジン、トリアジクオン、トリエチレンメラミン、トリプラチン、トレチノイン、トレオスルファン、トロフォスファミド、ウラムスチン、バルルビシン、ベルテポルフィン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビン、ボリノスタット��ゾルビシン及び他の細胞増殖抑制剤又は細胞毒性薬を含む。
【００７４】
本明細書において使用されるように、「治療を選択すること」は、患者試料中の静止新生物細胞を検出すること、及び／又は患者試料においてＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１の発現を確認することを含み得る。被験体から収集された試料からの細胞集団がＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現又は過剰発現する静止細胞を含む場合には、ＤＹＲＫ１活性の調節因子を投与することを含む治療が選択され得る。
【００７５】
さらなる実施形態において、「治療を選択すること」は、被験体から収集された試料からの細胞集団における静止細胞の割合を参照細胞集団において観察された静止細胞の割合と比較すること、並びに／又は被験体から収集された試料からの細胞集団において発現されたＤＹＲＫ１Ｂ及びＤＹＲＫ１Ａから選択されたキナーゼの発現レベルを参照細胞集団において発現されたＤＹＲＫ１Ｂ及び／又はＤＹＲＫ１Ａの発現レベルと比較することをも指す。被験体から収集された試料からの細胞集団が静止細胞を含み、かつＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂを発現又は過剰発現している場合には、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂ調節因子を投与することを含む治療が選択され得る。
【００７６】
（本発明の方法）
本発明は、図２、図３Ａ及び図３Ｂに図示される発見に基づいている。図２は、利用可能な化学療法剤が作用する細胞周期の段階を示すように注釈付けされた真核癌細胞の有糸分裂周期の概要図である。ＤＹＲＫ１Ａ及びＤＹＲＫ１ＢのようなＤＹＲＫ１キナーゼは、癌細胞のＧ０状態における維持のために重要であることが図示されている。図３Ａに示されるように、ＤＹＲＫ１Ｂ発現における増加は、それらの分解と増加した安定性に導くサイクリンＤ１（Ｔｈｒ２８６）及びｐ２７（Ｓｅｒ１０）上の特定の残基のリン酸化をそれぞれ結果として生じる。サイクリンＤ１及びｐ２７蛋白質の全体のレベルのそのような変化は、Ｇ０停止を結果として生じる。近年の研究は、特定の癌において、可逆性のＧ０又はＧ０類似状態において細胞周期の外側にかなりの割合の癌細胞が存在することを証明した（Stanton, K. J.、Sidner, R. A.、 Miller, G. A.、Cummings, O. W.、Schmidt, C. M、Howard, T. J.及びWiebke, E. A.著（２００３年）「Analysis of Ki-67 antigen expression, DNA proliferative fraction, and survival in resected cancer of the pancreas」American Journal of Surgery１８６巻、４８６〜４９２頁）。静止癌細胞は、分裂中の細胞を標的とする細胞毒性薬に対して抵抗性を有し、このことはそれらが癌を再生息させることを可能にする。Ｇ０状態はＧ１状態から区別され、遺伝子発現の特定のプログラムにより維持される。図２に示されるように、生体内において癌細胞の静止状態における長期の滞在を可能にする一つの要因はＤＹＲＫ１Ｂである。図３Ｂ上には、キナーゼＤＹＲＫ１Ｂの活性の阻害は、サイクリンＤ１及びｐ２７の発現における特異的（differential）変化、安定化及び分解を結果として生じる、サイクリンＤ１（Ｔｈｒ２８６）及びｐ２７（Ｓｅｒ１０）上の特定の対応する残基の減少したリン酸化をそれぞれ結果として生じることが図示されている。サイクリンＤ１及びｐ２７発現レベルのこれらの変化は、Ｇ０から機能している（active）細胞周期への細胞の進行を促進する。
【００７７】
ＤＹＲＫ１Ｂ／マーク（Mirk）は、特定の正常組織における生存及び分化を媒介する（mediate）キナーゼの小脳／ＤＹＲＫファミリーのメンバーである（Kentrup, H.、Becker, W.、Heukelbach, J.、Wilmes, A.、Schurmann, A.、Huppertz, C、Kainulainen, H.、Joost, H. G.著（１９９６年）「Dyrk, a dual specificity protein kinase with unique structural features whose activity is dependent on tyrosine residues between subdomains VII and VIII」J Biol Chem２７１巻、３４８８〜３４９５頁、Becker, W.、Weber, Y.、Wetzel, K.、Eirmbter, K.、Tejedor, F. J.、Joost, H. G.著（１９９８年）「Sequence characteristics, subcellular localization, and substrate specificity of D YRK-related kinases, a novel family of dual specificity protein kinases」Journal of Biological Chemistry２７３巻、 ２５８９３〜２５９０２頁）。ＤＹＲＫ１Ｂは、骨格筋細胞及び睾丸において検出可能なレベルにて発現される。ＤＹＲＫＩＢのノックアウトは、発達中の筋肉においてさえマウスにおける明らかな（evident）表現型を生じさせず、ＤＹＲＫＩＢが正常な発達のために必須の遺伝子ではないことを示唆している。この解釈を支持して、正常線維芽細胞はＤＹＲＫＩＢキナーゼレベルの２０倍枯渇後の生存には変更を示さなかった。
【００７８】
このように、ＤＹＲＫ１Ｂは正常細胞の生存のために必須の遺伝子であるように思われないが、化学療法又は細胞傷害性療法による治療を経る患者における特定の癌細胞の生存のために必須である。ＤＹＲＫ１Ｂは、癌細胞を静止状態に保持することによりＤＹＲＫ１Ｂが生存を媒介する特定の悪性癌細胞において発現され又は上方制御される。これらの独特の特性は、ＤＹＲＫ１Ｂが治療的介入のための選択的標的であり得ることを示唆する。加えて、健康であるときにＤＹＲＫ１Ｂを検出可能なレベルにおいて発現しない組織の細胞におけるＤＹＲＫ１Ｂの上昇された発現レベルは、化学療法に対する癌の抵抗性及び非感受性に導き後で癌の成長、再発及び転移を結果として生じるであろう休眠（resting）癌を識別するための診断的マーカーになるであろう。
【００７９】
静止癌細胞は、細胞毒性薬及び放射線療法に非感受性であり、これらの両者は分裂中の細胞を標的とし、そのため休眠中のＧ０状態にある間の細胞に影響を与えない。化学療法および放射線療法レジメンは、それらの毒性の副作用を体内に無制限に維持することができないので、生存している静止癌細胞は細胞周期への再進入の際に癌の再発を引き起こし得て、そのタイミングは予測され得ない。さらに、血流中の転移性癌細胞は、それらの新しい微小環境に適応しながら、休眠又は静止の期間を経験し得る（Chaffer, C. L.及びWeinberg, R. A.著（２０１１年）「A perspective on cancer cell metastasis」Science３３１巻、１５５９〜１５６４頁）。静止癌細胞はそれらのポリリボソームを分解し、これにより翻訳を阻害して全体のＲＮＡ及び蛋白質含量を低減する。これらの縮小された代謝的に不活性の癌細胞は、毛細血管の穴（直径約８μｍ）に入ることが可能であり得るのに対し、周期にある（cycling）癌細胞は通常これよりかなり大きい（２０〜３０μｍ）。Ｇ０状態にある細胞は、分裂中の細胞又は細胞周期分裂のために準備中の細胞、すなわち細胞周期のＧ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ段階にある細胞における全体のＲＮＡレベルより低い全体のＲＮＡレベルを有するため、静止細胞はＲＮＡ含量に従ったフローサイトメトリーにより容易に識別される。図５に示されるように、本発明のいくつかの実施形態において、静止癌細胞の存在はフローサイトメトリーにより検出される。本発明の他の実施形態において、細胞集団中の静止癌細胞の存在の検出は当該細胞集団内の静止癌細胞の割合を決定することを含む。
【００８０】
癌細胞は、静止線維芽細胞と同様に、最終分化又は老化を経る前に、不可逆性の状態に入るか、周期に入ることを再開し得る可逆性の真の静止Ｇ０状態又は休眠状態に入り得る（Coller, H. A., Sang, L.及びRoberts, J. M.（２００６年）「A new description of cellular quiescence」PLoS Biology ４巻、ｅ８３頁）。血清飢餓癌細胞の培養は、Ｇ０細胞において改善されたことが証明されており（Deng, X., Ewton, D. Z.及びFriedman, E. （２００９年）「DYRK1B maintains the viability of quiescent pancreatic cancer cells by reducing levels of reactive oxygen species」Cancer Research６９巻、３３１７〜３３２４頁、Jin, K., Ewton, D. Z.、Park, S., Hu, J.及びFriedman, E.（２００９年）「Mirk regulates the exit of colon cancer cells from quiescence」Journal of Biological Chemistry２８４巻、２２９１６〜２２９２５頁）、活性化キナーゼＤＹＲＫ１Ｂ／マーク及びＣＤＫ阻害物質ｐ２７ｋｉｐ１の高い蛋白質レベルを１０倍まで有すると共に、Ｅ２Ｆ４転写因子を抑制する網膜芽細胞腫蛋白質ファミリーメンバーｐ１３０／Ｒｂ２の高いレベルを１６倍まで有し、これにより細胞が細胞周期に入ることを阻害する。
【００８１】
任意の特定の理論により拘束されることなく、本発明はＤＹＲＫ１の活性の阻害が癌細胞静止を中断させて細胞周期に再び入らせ、これにより癌細胞が放射線療法又は化学療法に対して感受性を有する状態にさせることの発見に基づいている。例示的な実施形態において、ＤＹＲＫ１はＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂである。
【００８２】
例示的な実施形態において、本発明は新生物を患う被験体の治療のための方法を含む。前記方法は、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が試料において発現されているか否かを決定すると共に、静止新生物細胞の存在を決定するために、被験体からの試料、例えば組織試料を分析することを含む。静止細胞が検出され、かつＤＹＲＫ１が組織試料において発現又は過剰発現されている場合には、ＤＹＲＫ１の調節因子が投与される。
【００８３】
代替的には、前記方法は蛋白質発現レベルの決定又は転写（遺伝子コピー、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ若しくは他の適切なもの）の数の決定のいずれか又は両方を使用して、癌細胞集団における静止新生物細胞の割合を決定すると共に、ＤＹＲＫ１の発現のレベルを決定するために、被験体からの試料、例えば組織試料を分析することを含む。特定の実施形態において、本発明は被験体から組織試料を収集することを含む。静止細胞の割合が決定され、かつ組織試料においてＤＹＲＫ１が発現又は過剰発現されている場合には、ＤＹＲＫ１の調節因子が投与される。
【００８４】
そのような方法の例示的実施形態は、図４に示される。方法１００は試料収集のステップ１１２を含み、ステップ１０２における静止細胞の割合（Ｇ１に対するＧ０の割合）の決定に続く。前記決定は既知の技術、例えば蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）のようなフローサイトメトリーにより実行され得る。次に、ＤＹＲＫ１の発現レベルはステップ１０４において任意の既知の技術、例えば免疫組織染色により決定される。
あるいは、ＤＹＲＫ１遺伝子についてのｃＤＮＡ又はｍＲＮＡ転写コーディングのレベル又は遺伝子コピー数は、標準ＰＣＲ又は別の適切な技術により数値化され得る。ステップ１０６において、試料が静止細胞と発現中（若しくはＤＹＲＫ１を過剰発現中）の細胞の両方を含むこと、又は上昇したＤＹＲＫ１遺伝子についてのｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ転写コーディングのレベル若しくは遺伝子コピー数を有することが決定された場合には、ステップ１０８において被験体は適切な量のＤＹＲＫ１活性調節因子により治療される。方法１００は、後の時点において別の試料を収集するオプションのステップ１１０をさらに含み得る。そのような後の試料は、ステップ１１２においてＤＹＲＫ１活性調節因子と共に施される癌治療の進行を監視するために収集された試料と比較され得る。
【００８５】
本発明の方法は、新生物を患う被験体を治療することを含み、前記方法はＤＹＲＫ１活性の調節因子の投与を含む。
【００８６】
別の例示的な実施形態において、本発明は患者内の新生物の治療における使用のためのＤＹＲＫ１活性の調節因子に関する。前記治療は、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が患者試料において発現しているか否かを決定することと、静止新生物細胞が患者試料に存在するか否かを決定することを含む。患者がＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから洗濯されたＤＹＲＫ１を発現しており、かつ静止癌細胞が患者試料中に存在する場合には、有効量の調節因子が投与される。さらなる実施形態において、患者試料は最初の患者試料であり、調節因子が投与された後に後続の患者試料が収集される。後続の患者試料は、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が後続の患者試料において発現されているか否かを決定すると共に、後続の患者試料において静止新生物細胞の割合を決定するために分析される。最初の患者試料中に存在する静止新生物細胞の割合が後続の患者試料中の静止新生物細胞の割合より大きく、かつ患者がＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１を発現する場合には、第二の有効量の調節因子が投与される。
【００８７】
別の例示的実施形態において、本発明はさらに患者内の新生物治療における使用のためのＤＹＲＫ１活性の調節因子に関する。ここで、患者はＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が患者試料において発現していることを決定されており、静止新生物細胞は患者試料中に存在することが決定されている。特定の実施形態において、患者試料は最初の患者試料であり、最初の患者試料における静止新生物細胞の割合は決定されており、治療は第一の有効量の調節因子を投与することを含む。前記実施形態において、患者はＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が後続の患者試料において発現していることを決定されており、静止新生物細胞は後続の患者試料中に存在することが決定されている。後続の患者試料は、第一の有効量の調節因子を投与した後に収集された。さらなる実施形態において、治療は第二の有効量の調節因子を投与することを含み、これは後続の患者試料が収集された後に実行される。
【００８８】
別の例示的な実施形態において、本発明は患者内の新生物の治療における使用のためのＤＹＲＫ１活性の調節因子を含み、ここで患者はＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が最初の患者試料において発現していることを決定されており、最初の患者試料において静止新生物細胞の割合が決定されている。前記治療は、患者に第一の有効量の調節因子を投与することを含む。ここで、患者はＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１が後続の患者試料において発現していることを決定されており、後続の患者試料において存在する静止新生物細胞の割合が決定されている。後続の患者試料は、第一の有効量の調節因子を投与した後に収集された。ここで、最初の患者試料における静止新生物細胞の割合は後続の患者試料における静止新生物細胞の割合より大きい。
【００８９】
本発明において説明されるＤＹＲＫ１の調節因子は、酵素活性測定（assay）により識別されるものを含む。例えば、活性はＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１と、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１のための対応する基質と、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１の調節因子を使用することにより測定され得る。例示的な測定は、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１のための基質についての、水酸基を含む側鎖を有するアミノ酸残基、例えばチロシン残基、セリン残基、トレオニン残基又は前記残基の組み合わせのリン酸化反応に基づき得る。
【００９０】
ＤＹＲＫ１の調節因子、例えばＤＹＲＫ１活性の阻害物質は、潜在的な調節因子の存在においてＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１の活性が測定されるキナーゼ測定により識別され得る。前記測定を実行するための方法は、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１をＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１のための基質に接触させ、その後基質のリン酸化反応を測定することを含む。ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１と、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１のための基質を含む溶液は、反応混合物として交互に参照される。特定の例示的な実施形態において、反応混合物はＤＹＲＫ１活性の調節因子をさらに含み、ここで調節因子はＤＹＲＫ１Ａ特有の阻害物質又はＤＹＲＫ１Ｂ特有の阻害物質であり得て、あるいは代わりにＤＹＲＫ１ＡとＤＹＲＫ１Ｂの両方の阻害物質であり得る。
【００９１】
本発明により使用され得るＤＹＲＫ１Ｂは、キナーゼ活性を有する任意のイソ型のＤＹＲＫ１Ｂを含み、６５ｋＤａのイソ型（すなわちｐ６５）、６９ｋＤａのイソ型（すなわちｐ６９）及び７５ｋＤａのイソ型（すなわちｐ７５）を含む。
【００９２】
ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１の活性を測定するための方法において使用される反応混合物は、溶媒と溶質をさらに含む。適切な溶質は、アデノシン三リン酸、塩化（II）マグネシウム（magnesium (II) chloride）、界面活性剤、還元剤及び緩衝剤を含む。特定の実施形態において、溶液はアデノシン三リン酸、塩化（II）マグネシウム、ブリッジ３５（Brij-35）、ジチオスレイトール及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）塩酸塩を含む。例示的実施形態において、溶媒は水である。溶媒は、１０％未満のジメチルスルホキシドを含み得る。
【００９３】
キナーゼ測定において使用され得るＤＹＲＫ１Ａ及びＤＹＲＫ１Ｂのための基質は、アナスペック，インコーポレイテッド（AnaSpec, Inc.、９４５５５，カリフォルニア州，フレモント，キャンパスドライブ３４８０１（34801 Campus Drive, Fremont, CA 94555））から利用可能であるペプチドダークタイド（DYRKtide）［ＲＲＲＦＲＰＡＳＰＬＲＧＰＰＫ （配列ＩＤ番号：１）］、シグマ・アルドリッチ・コーポレーション（Sigma Aldrich Corporation、６３１０３，ミズーリ州，セント・ルイス，スプルース・ストリート３０５０（3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103））から利用可能である脱リン酸化α‐カゼイン、又はパーキン‐エルマー，インコーポレイテッド（Perkin-Elmer, Inc.、０２４５１，マサチューセッツ州，ウォルサム，ウィンター・ストリート９４０（940 Winter Street, Waltham, MA 02451））から利用可能であるユーライト（商標）‐髄鞘基本蛋白質ペプチド［ＶＴＰＲＴＰＰＰ （配列ＩＤ番号：２）］のようなキナーゼ測定のためのランス（LANCE、登録商標）ウルトラペプチド基質を含む。さらに別の実施例においては、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１のための基質は、蛍光成分を含む。
【００９４】
あるいは（alternately）、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１のための基質は、約２００ナノメートルと９００ナノメートルの間の蛍光発光を有する少なくとも一つの蛍光成分を含む。基質と共に使用され得る蛍光成分の例は、染料のフルオレセイン群のうちのいずれか、例えば５‐ＦＡＭ、又は５‐ＴＡＭＲＡのような染料のローダミン群のうちのいずれか、又は適切な励起及び発光波長を有する任意の他の染料を含む。基質が約２００ナノメートルと９００ナノメートルの間の蛍光発光を有する蛍光成分を含む場合には、基質の測定はペプチドの光学的蛍光を測定することにより適宜実行され得る。
【００９５】
基質がリン酸化されているとき、基質の質量及び電荷並びに質量の電荷に対する比率は変更される。基質は、質量分析法又は電気泳動により測定され得る。リン酸化及び非リン酸化基質の量は、質量分析法、電気泳動、Ｘ線蛍光又は光学的蛍光を使用して測定され得る。
【００９６】
リン酸塩の源、例えばアデノシン三リン酸は放射性リンを含み得る。ＤＹＲＫ１活性を測定するための方法の例示的な実施形態において、ペプチド基質はアデノシン三リン酸の形態の存在下においてキナーゼ酵素と反応し、アデノシン三リン酸はキナーゼ反応中に放射性リン部分をペプチドに与えることが可能であり、前記反応の進行の程度はホスホイメージャー（phosphoimager）シンチレーション計数等のような放射測定方法を使用して測定される。
【００９７】
酵素測定によりＤＹＲＫ１の調節因子を識別するためのさらなる方法において、ペプチド基質は蛍光成分を含むように変更され、キナーゼ酵素と反応し、リン酸化反応の範囲は蛍光異方性、蛍光共鳴エネルギー移動及び時間分解蛍光エネルギー移動等を使用して監視される。
【００９８】
あるいは、ペプチド基質は微分型クロマトグラフ移動度又は代わりに微分型電気泳動移動度を使用して監視されるリン酸化の範囲により、キナーゼ酵素と反応する蛍光成分により変更される。
【００９９】
あるいは、ペプチド基質は、微分型電気泳動移動度又はＸ線蛍光を使用して監視されるリン酸化の範囲により、キナーゼ酵素と反応する。
【０１００】
ＤＹＲＫ１の調節因子を識別するための特定の例示的方法は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、時間分解蛍光共鳴移動（ＴＲ‐ＦＲＥＴ）又はそれらの変形による分析を利用する。例えば、ランサスクリーン（LanthaScreen、商標）キナーゼ活性測定（インビトロジェン，ライフ・テクノロジーズ（Invitrogen, Life Technologies）、１４０７２ニューヨーク州，グランド・アイランド，スタリー・ロード３１７５（3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072））は、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１の阻害物質を検出するために使用され得る。前記測定における反応混合物の成分は、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１、ＡＴＰ、緩衝液及び添加物、ＤＹＲＫ１によりリン酸化されることが可能であるランス（LANCE、登録商標）ウルトラペプチド基質のような基質分子、並びにリン酸化された基質に選択的に結合することが可能な抗体を含む。ここで、リン酸化された基質分子はアレクサフルオール（AlexaFluor、登録商標）６４７のような蛍光受容体により標識されており、抗体はアレクサフルオール６４７又は他の適切な受容体への蛍光エネルギー移動が可能であるテルビウム又は他の基により標識されている。ＦＲＥＴは、蛍光顕微鏡検査法及び当業者に知られた追加の方法により検出され得る。ＦＲＥＴ信号における減少は、阻害物質によるキナーゼ活性の阻害を検出及び測定するために利用される。
【０１０１】
ＤＹＲ１の調節因子を識別するための特定の例示的な方法は、キナーゼ活性の間接的測定を利用する。例えば、プロメガ・コーポレーション（Promega Corporation、米国５３７１１１，ウィスコンシン州，ウッズ・ホロー・ロード・マジソン２８００（2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711 USA））から利用可能であるＡＤＰ‐Ｇｌｏ（商標）キナーゼ測定は、キナーゼ反応中に生成されるアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の発光定量化を利用する。前記測定における反応混合物の成分は、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、緩衝液及び添加物を含み、ＤＹＲＫ１によりリン酸化されることが可能であるダークタイドのような基質分子を含み得る。前記測定は、二つのステップにおいて実行される。最初に、キナーゼ反応後にキナーゼ反応を終了させて残りのＡＴＰを枯渇させるために等量のＡＤＰ‐Ｇｌｏ試薬が加えられる。第二に、ＡＤＰをＡＴＰに変換して同時に新たに合成されたＡＴＰがルシフェラーゼ／ルシフェリン反応を使用して測定されることを可能にするために、キナーゼ検出試薬が加えられる。発生した光は、照度計又は他の適切な機器により測定される。発光の減少は、阻害物質によるキナーゼ活性の阻害に相関している。
【０１０２】
ＤＹＲＫ１の調節因子を識別及び特徴化するための特定の例示的な方法は、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１の阻害物質を検出及び特徴化するために、調節因子のＤＹＲＫ１への結合の検出に依存し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）又は時間分解蛍光エネルギー移動（ＴＲ‐ＦＲＥＴ）による分析を利用する。例えば、ランサスクリーン（LanthaScreen、商標）Ｅｕキナーゼ結合測定（インビトロジェン，ライフ・テクノロジーズ（Invitrogen, Life Technologies）、１４０７２ニューヨーク州，グランド・アイランド，スタリー・ロード３１７５（3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072））が、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１の阻害物質を検出及び特徴化するために使用され得る。前記測定における反応混合物の成分は、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１、ＡＴＰ、緩衝液成分、ＤＹＲＫ１の活性部位に結合することが可能なトレーサー分子及びキナーゼに結合することが可能な抗体を含む。ここで、トレーサー分子はアレクサフルオール（登録商標）６４７のような蛍光受容体に標識されており、抗体はユーロピウムのような蛍光ドナー基により標識されている。Ｅｕにより標識された抗体とアレクサフルオール（登録商標）により標識されたトレーサーのＤＹＲＫ１への同時結合は、蛍光受容体、例えばアレクサフルオール（登録商標）への蛍光ドナー、例えばＥｕからのＦＲＥＴを引き起こす。ＦＲＥＴは、蛍光顕微鏡検査法と当業者に知られた追加の方法により検出され得る。ＦＲＥＴ信号の途絶は、阻害物質によるトレーサーの結合の阻害を検出するために利用される。
【０１０３】
ＤＹＲＫ１Ａ活性の例示的な阻害物質は、小分子複素環式化合物ＴＢＢ（ＣＡＳ：［１７３７４‐２６‐４］）
【化１６】
2015534584.tif 000012
と（Ｓ）‐ＣＲ８（ＣＡＳ：［１０８４８９３‐５６‐０］）
【化１７】
2015534584.tif 000013
を含む。両者は、サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド（Santa Cruz Biotechnology, Inc. 、７５２２０テキサス州，ダラス，フィンネル・ストリート１０４１０（10410 Finnell Street Dallas, Texas 75220））から利用可能である。
【０１０４】
例示的なＤＹＲＫ１Ｂ活性の調整因子は、ペプチド性ＤＹＲＫ１Ｂ阻害物質４ＩＰｈｅ‐Ｃｙｓ‐Ｔｈｒ‐Ａｓｎ‐Ｃｙｓ‐Ｇｌｕ‐Ｔｈｒ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ‐ＢｒＰｈｅ（配列ＩＤ番号：３）と、ＢｒＴｙｒ‐Ｃｙｓ‐Ａｌａ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｐ‐Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号：４）と、ＢｒＰｈｅ‐Ｉｌｅ‐Ａｓｎ‐Ｔｈｒ‐Ｌｙｓ‐Ｍｅｔ‐Ｍｅｔ‐Ｔｒｐ‐４ＩＰｈｅ （配列ＩＤ番号：５）と、ＢｒＰｈｅ‐Ｈｉｓ‐Ａｌａ‐Ｔｈｒ‐Ｌｙｓ‐Ｐｈｅ‐Ａｌａ‐Ａｌａ‐４ＩＰｈｅ（配列ＩＤ番号：６）と ＢｒＰｈｅ‐Ｉｌｅ-Ｔｒｐ−Ｔｙｒ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｎ‐Ａｓｎ‐Ｖａｌ‐４ＩＰｈｅ（配列ＩＤ番号：７）を含む。ここで、ＢｒＰｈｅはBrPheは、ブロモフェニルアラニンであり、例えば４‐ブロモフェニルアラニン、３‐ブロモフェニルアラニン又は２‐ブロモフェニルアラニンである。４ＩＰｈｅは、
４‐ヨードフェニルアラニンを指す。ＢｒＴｙｒは、３，５‐ジブロモチロシンを指す。Ａｌａは、アラニンを指す。Ａｒｇは、アルギニンを指す。Ａｓｎは、アスパラギンを指す。 Ａｓｐは、アスパラギン酸を指す。Ｃｙｓは、システインを指す。Ｇｌｕは、グルタミン酸を指す。Ｇｉｎは、グルタミンを指す。 Ｇｌｙは、グリシンを指す。Ｈｉｓは、ヒスチジンを指す。Ｈｅは、イソロイシンを指す。Ｌｅｕは、ロイシンを指す。Ｌｙｓは、リジンを指す。Ｍｅｔは、メチオニンを指す。Ｐｈｅは、フェニルアラニンを指す。Ｐｒｏは、プロリンを指す。Ｓｅｒは、セリンを指す。Ｔｈｒは、トレオニンを指す。Ｔｒｐは、トリプトファンを指す。Ｔｙｒは、チロシンを指す。Ｖａｌは、バリンを指す。
【０１０５】
代わりの実施形態において、ＤＹＲＫ１Ｂ活性の調節因子は小分子ＤＹＲＫ１Ｂ阻害物質であり、例えば以下の化学式の化合物と薬学的に許容可能なその塩である。
【化１８】
2015534584.tif 000014
【０１０６】
本発明のさらに別の実施形態において、、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１の阻害物質は、ＤＹＲＫ１酵素に対して発生した抗体である。前記抗体はポリクローナル又はモノクローナルであり得て、「抗体」の語はポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を包含することが意図されている。ポリクローナルとモノクローナルの語は、
抗体調製物の均一性を指し、特定の生成の方法に限られることは意図されていない。本明細書において使用される「抗体」の語は、キメラ、ヒト化、霊長類化、ベニヤ又は単鎖抗体の断片を含む抗体の機能的断片をも包含する。機能的断片は、ＤＹＲＫ１に結合する抗原結合断片を含む。そのような断片は、酵素的開裂又は組換え技術により生成され得る。例えば、パパイン、ペプシン又は必要な基質特異性を有する他のプロテアーゼは、断片を生成するために使用され得る。抗体はまた、一以上の終止コドンが天然の終止部位の上流に導入された抗体遺伝子を使用して、種々の切断型の形態により生成され得る。
【０１０７】
本発明の方法を実施するために有用であるＤＹＲＫ１Ｂ調節因子のさらなる例は、米国特許出願公開番号２０１２／０１８４５４２及び２０１２／０１８４５４８により開示されたものを含む。
【０１０８】
本発明のいくつかの実施形態において、新生物を患う被験体を治療するための方法は、被験体に有効量の少なくとも一つの追加の治療薬を投与することをさらに含む。特定の実施形態において、本発明は新生物の治療における使用のためのＤＹＲＫ１活性の調節因子に関し、前記治療は患者に有効量の少なくとも一つの追加の治療薬を投与することをさらに含む。
【０１０９】
特定の実施形態において、少なくとも一つの追加の治療薬は化学療法剤である。化学療法剤は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞増殖抑制剤、細胞毒性剤、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン若しくは他のサイトカインのような免疫学的変性剤、又は他の化学療法剤から選択され得る。本明細書において説明される方法において使用するために適切な化学療法剤の例は、上記に与えられている。化学療法剤は、ＤＹＲＫ１活性の調節因子の前、ＤＹＲＫ１活性の調節因子と同時、又はＤＹＲＫ１活性の調節因子の後に投与され得る。
【０１１０】
本発明の別の実施形態において、方法はＤＹＲＫ１の調節因子と関連して有効量の放射線療法を被験体に施すことをさらに含む。あるいは、新生物の治療において使用するためのＤＹＲＫ１活性の調節因子に関連する本発明の実施形態において、治療はＤＹＲＫ１活性の調節因子に関連して有効量の放射線療法を被験体に施すことをさらに含む。放射線療法は、ＤＹＲＫ１活性の調節因子の前、ＤＹＲＫ１活性の調節因子と同時、又はＤＹＲＫ１活性の調節因子の後に施され得る。
【０１１１】
本発明の別の実施形態において、ＤＹＲＫ１活性の調節因子は免疫療法剤、抗血管新生剤と関連して間又は癌の外科的切除の前若しくは後に投与される。前記薬剤のいずれも、ＤＹＲＫ１活性の調節因子の前、ＤＹＲＫ１活性の調節因子と同時、又はＤＹＲＫ１活性の調節因子の後に投与され得る。
【０１１２】
本発明のいくつかの実施形態において、ＤＹＲＫ１活性の調節因子は癌の外科的切除を経た被験体に投与される。
【０１１３】
本発明の例示的な実施形態において、ＤＹＲＫ１活性の調節因子は特異的ＤＹＲＫ１Ｂ阻害物質である。別の実施形態において、調節因子は特異的ＤＹＲＫ１Ａ阻害物質である。
【０１１４】
本発明の例示的な実施形態において、本発明は新生物を患う被験体を治療するための方法であり、又は代わりに本発明は患者内の新生物の治療における使用のための調節因子である。新生物は、膵臓癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌又は骨肉腫を含み得る固形癌である。本発明の別の実施形態において、新生物は異種移植片である。本発明の代替的な実施形態において、新生物は造血系癌である。本発明のさらなる実施形態において、造血系癌は、白血病又はリンパ腫から選択される。本発明のいくつかの実施形態において、白血病は急性骨髄性白血病または慢性骨髄性白血病である。
【０１１５】
本発明の例示的な実施形態において、被験体から試料を収集することは、血液試料を収集すること又は組織生検を収集することを含む。本発明における被験体は、ヒト又はヒトでない動物であり得る。
【０１１６】
本発明のいくつかの実施形態において、静止がん細胞の存在を決定することは細胞周期の特定の段階内の細胞集団の分布を規定することと、静止癌細胞が存在するか存在しないかを決定することを含む。本発明の別の実施形態において、静止癌細胞の存在を決定することは細胞集団内の静止癌細胞の割合を決定することを含む。本発明のいくつかの実施形態において、細胞集団における静止癌細胞の存在は、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）のような当該分野において公知の任意の技術により決定される。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、ＤＮＡ及びＲＮＡの含量によるフローサイトメトリー分析の特殊なタイプである。例示的な実施形態において、静止癌細胞の割合はＦＡＣＳ分析により決定されるような細胞周期の特定の段階におけるＤＮＡ及びＲＮＡの分布含量により決定される。図５に示されるように、血清飢餓膵臓癌細胞（ＰＡＮＣ‐１）はＧ０状態において細胞の大きな割合（４２％）を有する。ＤＹＲＫ１Ｂ阻害物質による治療後に、Ｇ０状態にある細胞の割合は２７％に減少した。
【０１１７】
本発明のいくつかの実施形態において、ＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１の発現レベルの決定は、免疫組織染色により行われる。他の実施形態において、ＤＹＲＫ１遺伝子についてのｃＤＮＡ又はｍＲＮＡ転写コーディングのレベル又は遺伝子コピー数の決定は、ＰＣＲ又は別の適切な技術により行われる。
【０１１８】
本明細書において提示される方法は、疾患の任意の段階において新生物を患う披験体の治療において有用である。本明細書において説明される方法は、検査された個人のためのもっとも適切な治療を識別及び選択するために使用され得て、必要とされる化学療法剤の最大投与量を削減し、癌の成長、抵抗、転移及び再発を防ぐ。静止状態における滞留を通じて治療に対抗するその細胞の能力について癌のタイプを識別すると、治療はそのような抵抗を軽減するように調整され得る。
【０１１９】
本明細書において開示される方法は、種々のタイプの新生物の治療のために最も適切な治療法を決定するために使用され得る。新生物は、膵臓癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、卵巣癌又は骨肉腫を含む固形癌であり得る。新生物は、白血病又はリンパ腫のような造血系癌であり得る。造血系癌の例は、急性骨髄性白血病又は慢性骨髄性白血病を含む。
【０１２０】
本明細書において開示される方法は、新生物を患う被験体を治療するための治療法を調整するために使用され得る。一つの例示的な実施形態において、本発明は新生物を患う被験体を治療するための方法であって、（ａ）第一の静止新生物細胞の試料中の細胞集団内のＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１の発現レベルを決定し、かつ／又は第一の試料における静止新生物細胞の全体の割合を決定することと、（ｂ）第二の静止新生物細胞の試料中の細胞集団内のＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１の発現レベルを決定し、かつ／又は第二の試料における静止新生物細胞の全体の割合を決定することと、（ｃ）蛋白質、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及び／又は遺伝子コピー数測定のいずれか又は全てを通じてＤＹＲＫ１の発現が確認された場合であって、さらに発現が第一の時点から第二の時点に向かって増加し若しくは静的なままである場合に、追加の有効量の治療薬に関連して有効量のＤＹＲＫ１活性の調節因子を投与することを含む方法である。ここで、第一の試料は第一の時点において収集され、第二の試料は第一の時点より後の第二の時点において収集される。
【０１２１】
本明細書において開示された方法は、ＤＹＲＫ１Ｂを発現する癌の治療の有効性を監視するために使用され得る。本発明の例示的な実施形態において、前記方法は、ＤＹＲＫ１Ｂを発現又は過剰発現するとした患者の癌細胞集団の識別に基づいて、既存の癌治療法の補強を提供する。
【０１２２】
別の例示的な実施形態において、本発明はさらに、細胞集団における静止癌細胞の割合を削減するための方法に関する。前記方法は、細胞集団における静止癌細胞の割合を削減するために十分な期間についてＤＹＲＫ１活性の調節因子を有する細胞集団を培養することを含む。本発明のいくつかの実施形態において、細胞集団は調節因子と共に約１時間から約９６時間培養される。いくつかの実施形態において、培養時間は約１８時間から約１２０時間以上である。ＤＹＲＫ１活性の調節因子は、ＤＹＲＫ１活性の阻害物質又は活性化物質である。本発明のいくつかの実施形態において、ＤＹＲＫ１活性の調節因子は特異的ＤＹＲＫ１Ａ阻害物質又は特異的ＤＹＲＫ１Ｂ阻害物質である。本発明の別の実施形態において、調節因子は特異的ＤＹＲＫ１Ｂ阻害物質である。
【０１２３】
特定の実施形態において、本発明はダウン症候群又は早期発症アルツハイマー病から選択された異常を患う被験体を治療する方法である。そのような方法は、被験体から収集された試料中の細胞集団内のＤＹＲＫ１Ａ又はＤＹＲＫ１Ｂから選択されたＤＹＲＫ１の発現レベルを決定することと、試料においてＤＹＲＫ１が発現されている場合に被験体に有効量のＤＹＲＫ１活性の調節因子を投与することを含む。同時に、静止細胞集団のレベルと細胞を静止状態のままにする能力についてのＤＹＲＫ１調節因子の効果が監視され得る。
【０１２４】
本発明の実施は、別途示されない限り、当該分野の技術内の従来の化学、生化学、分子生物学及び薬理学の方法を私用するであろう。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences 18th Edition」（DR、1985年）、「Short Protocols in Molecular Biology」（Frederick M. Ausubel（編集者）、２００２年）、「Molecular Biology Techniques An Intensive Laboratory Course」（Walt Ream、１９９８年）参照。本明細書において説明されたものと類似又は同等の方法及び材料が、本開示の実施又は試験において使用され得るが、適切な方法及び材料は以下に説明される。紛争の場合には、用語の説明を含む本明細書が調整する（control）であろう。さらに、文脈により別途必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の語は単数形を含む。
【０１２５】
（例証）
以下の例は、制限であることを意図されたものではない。当業者は、本開示に照らして、特定の材料及び開示されたものにおいて多数の変更が行われることを理解し、さらに本発明の精神及び範囲から離れることなく同様又は類似の結果を得るであろう。
【実施例１】
【０１２６】
（ＤＹＲＫ１Ｂキナーゼ阻害物質は、静止癌細胞の蓄積を阻止する。）
ＤＹＲＫ１Ｂキナーゼの役割は、癌細胞を静止状態に維持することであることが示唆された。周期内の癌細胞が可逆的な静止状態に入ることを可能にするＤＹＲＫ１Ｂキナーゼの能力は、膵臓癌細胞Ｐａｎｃ‐１において分析された。Ｐａｎｃ‐１細胞は、ＤＹＲＫ１Ｂキナーゼの上昇された発現レベルを証明した（Deng, X., Ewton, D. Z.、Li, S., Naqvi, A.、Mercer, S. E.、Landas, S.及びFriedman, E. （２００６年）「The kinase Mirk/DYRKIB mediates cell survival in pancreatic ductal adenocarcinoma」Cancer Research ６６巻、４１４９〜４１５８頁、Karhu, R.、Mahlamaki, E.及びKallioniemi, A. （２００６年）「Pancreatic adenocarcinoma -- genetic portrait from chromosomes to microarrays」Genes, Chromosomes and Cancer４５巻、７２１〜７３０頁）。
【０１２７】
Ｐａｎｃ‐１細胞は、４８時間の血清欠乏により静止状態に強制された。Ｐａｎｃ‐１は、ＤＭＥＭ＋０．２％ＦＢＳにおいて４８時間培養された。次に、細胞は新鮮な培地ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（パネルＡ）又は、０．２５μＭのＤＹＲＫ１Ｂ阻害物質Ｒが補充されたＤＭＥＭ＋１−％ＦＢＳ（パネルＢ）に切り換えられた。図５Ａに図示されるように、血清欠乏の結果として、細胞の４８％はＧ０静止状態において識別された。静止細胞の百分率は、フローサイトメトリーＦＡＣＳ分析により識別された。
【０１２８】
次に、図７に図示されたＤＹＲＫ１Ｂ小分子阻害物質ＲはＤＹＲＫ１Ｂキナーゼの活性を阻害するために適用され、静止細胞の百分率が再び分析された。並列Ｐａｎｃ‐１培養物は、ＤＹＲＫ１Ｂキナーゼ阻害物質Ｒにより処理された。ＦＡＣＳ分析は、Ｐａｎｃ‐１細胞の２７％だけがＧ０にあったことを明らかにした。ＤＹＲＫ１Ｂキナーゼの活性の阻害があると、膵臓癌細胞はＧ０静止状態を後にし、細胞周期に進む。ＤＹＲＫ１Ｂ阻害物質Ｒの存在下において静止細胞の数は２７％に削減された一方で、細胞周期のＳ期にある細胞の数は対照細胞（図５Ａにおいて６％）と比較して二倍になった（１３％）。
【０１２９】
ＤＹＲＫ１Ｂキナーゼ活性は、Ｐａｎｃ‐１膵臓癌細胞が静止状態において蓄積するために必要であった。細胞周期内の細胞集団の分布（すなわちＧ０、Ｇ１、Ｓ及びＧ２／Ｍ集団）は、二パラメーターフローサイトメトリーにより分析された。具体的には、ピロニンY及びヘキスト染色の取り込みは、それぞれＲＮＡ及びＤＮＡ含量分布に相関する（Ewton, D. Z.、Hu, J.、Vilenchik, M.、Deng, X.、Luk, K. C、Polonskaia, A.、Hoffman, A. F.、Zipf, K.、Boylan, J. F.及びFriedman, E. A.（２０１１年）「Inactivation of mirk/dyrklb kinase targets quiescent pancreatic cancer cells」Molecular Cancer Therapeutics１０巻、２１０４〜２１１４頁）。
【０１３０】
ＤＹＲＫ１Ｂ阻害物質Ｒの存在は、追加のＰａｎｃ‐１細胞が静止に入ることを阻止した。
【実施例２】
【０１３１】
（ＤＹＲＫ１Ｂキナーゼ活性の阻害は、癌細胞の能力がＧ状態に入ることを阻止することと、細胞が細胞周期に再度入ることを可能にすることを結果として生じる。）
小分子阻害物質Ｒを利用して、ＤＹＲＫ１Ｂ活性の阻害が細胞が静止を脱することを促進して増殖細胞の急増をもたらすか否かを決定するために、一つの実験が行われた。結腸癌細胞株ＳＷ６２０からの周期中の対数期の細胞は、ＤＮＡのヨウ化プロピジウム染色後のフローサイトメトリーによる分析の前に、ＢｒｄＵの１時間のパルスと共に１μＭのＤＹＲＫＩＢ阻害物質Ｒにより２４時間処理された。細胞集団の３８％は、細胞周期のＳ期において検出された。並列培養物は、小分子ＤＹＲＫ１Ｂ阻害物質Ｒにより２４時間処理され、続いて同一のＦＡＣＳ分析が行われた（１時間のＢｒｄＵパルスに続く特定のｍＡＢ‐ＦＩＴＣ及びＰＩ染色）。フローサイトメトリー分析は、ＳＷ６２０細胞におけるＤＹＲＫ１Ｂ活性の阻害の結果として、未処理の対照ＳＷ６２０細胞（図６Ａ）と比較して、Ｓ期細胞の割合が２９％に増加したことを示した（図６Ｂ）。３８％（図６Ａ）と比較して、ＤＹＲＫ１Ｂ阻害に続く細胞のＳ期集団における４９％までの増加（図６Ｂ）は、これらの細胞が増加した量のＤＮＡ合成を有することと、そのためＤＹＲＫ１Ｂ活性の阻害の結果として活性の細胞周期に再度入ったことを示した。
【０１３２】
本発明はその例示的実施形態を参照して具体的に示されて説明されたが、添付の特許請求の範囲により包摂される本発明の範囲から離れることなく、本発明において形態及び詳細における種々の変更が行われ得ることが当業者によって理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】真核細胞の有糸分裂周期の概要図である。
【図２】利用可能な化学療法剤が作用すると信じられている細胞周期の段階を示すために注釈を付けられた、真核癌細胞の有糸分裂周期の概要図である。
【図３Ａ】図３Ａ及び図３Ｂは、Ｇ０／Ｇ１チェックポイントを通じて真核癌細胞進行においてＤＹＲＫ１Ｂが演じると信じられている役割の概要図を集合的に示す。図３Ａは、ＤＹＲＫ１Ｂキナーゼの活性によるサイクリンＤ１及びｐ２７の調節を示す概要図である。
【図３Ｂ】阻害物質によるＤＹＲＫ１Ｂの阻害の際の静止状態を脱して細胞周期に再度入る細胞の概要図である。
【図４】本発明の方法の実施形態を表す模式図である。
【図５】フローサイトメトリーにより測定されるような、それらのＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量分布に従って細胞周期内の細胞集団の分布をそれぞれ示す二つのヒストグラムを表す。パネルＡは、二日間の血清飢餓の後の、ＤＹＲＫ１Ｂを発現させる未治療のヒト膵臓癌（ＰＡＮＣ１）細胞の集合におけるＤＮＡ及びＲＮＡ含量分布のヒストグラムを示す。パネルＢは、二日間の血清飢餓とＤＹＲＫ１Ｂの阻害物質による治療の後の、ＤＹＲＫ１Ｂを発現させるヒト膵臓癌（ＰＡＮＣ１）細胞の集合におけるＤＮＡ及びＲＮＡ含量分布のヒストグラムを示す。
【図６】フローサイトメトリーにより決定される、ＤＹＲＫ１Ｂを発現させる循環（cycling）対数期ヒト結腸癌（ＳＷ６２０）細胞の集合におけるＤＮＡ含量分布をそれぞれ示す二つのヒストグラムを表す。パネルＡは、未治療の循環対数期ヒト結腸癌（ＳＷ６２０）細胞の集合におけるＤＮＡ含量分布のヒストグラムを示す。パネルＢは、ＤＹＲＫ１Ｂの阻害物質により治療された、ＤＹＲＫ１Ｂを発現させる循環対数期ヒト結腸癌（ＳＷ６２０）細胞の集合におけるＤＮＡ含量分布のヒストグラムを示す。
【図７】ＤＹＲＫ１Ｂ低分子阻害物質Ｒの構造を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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