(57)【要約】  本発明は、オリゴヌクレオチドを可逆的にコンジュゲートする新規なアプローチであって、ジエン部分で標識したオリゴヌクレオチド及びジエノフィル部分で標識した標的対象を得るステップと、上記ジエン部分で標識したオリゴヌクレオチド及び上記ジエノフィル部分で標識した標的対象を溶液中で第１の温度で加熱するステップであって、コンジュゲートを生成するディールスアルダー反応を生じさせるステップと、上記コンジュゲートを第２の温度に加熱するステップであって、上記ジエン部分で標識したオリゴヌクレオチド及び上記ジエノフィル部分で標識した標的対象を再生するレトロディールスアルダー反応を生じさせるステップとを含む、新規なアプローチを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドを可逆的にコンジュゲートする方法であって、
ジエン部分で標識したオリゴヌクレオチド及びジエノフィル部分で標識した標的対象を得るステップと、
前記ジエン部分で標識したオリゴヌクレオチド及び前記ジエノフィル部分で標識した標的対象を溶液中で第１の温度で加熱するステップであって、コンジュゲートを生成するディールスアルダー反応を生じさせるステップと、
前記コンジュゲートを第２の温度に加熱するステップであって、前記ジエン部分で標識したオリゴヌクレオチド及び前記ジエノフィル部分で標識した標的対象を再生するレトロディールスアルダー反応を生じさせるステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記溶液が水溶液又は水性／有機溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の温度が約２０℃であり、前記第２の温度が約７５℃である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ジエン部分がフラン基を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ジエノフィル対象がマレイミド基を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記標的対象が支持体を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記支持体が固体支持体、ゲル、ナノ粒子、タンパク質、炭水化物、可溶性ポリマー又はそれらの混合物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的対象が支持体とカップリングするリガンドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記リガンドがビオチンを含み、前記支持体がアビジン又はストレプトアビジンを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチド及び前記ジエン部分がスクアレート基を介して連結される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドを可逆的にコンジュゲートする方法であって、
ジエノフィル部分で標識したオリゴヌクレオチド及びジエン部分で標識した標的対象を得るステップと、
前記ジエノフィル部分で標識したオリゴヌクレオチド及び前記ジエン部分で標識した標的対象を溶液中で第１の温度で加熱するステップであって、コンジュゲートを生成するディールスアルダー反応を生じさせるステップと、
前記コンジュゲートを第２の温度に加熱するステップであって、前記ジエノフィル部分で標識したオリゴヌクレオチド及び前記ジエン部分で標識した標的対象を再生するレトロディールスアルダー反応を生じさせるステップと、
遊離したフラン−オリゴヌクレオチドを、前記と同じか又は他の１つ若しくは複数のジエノフィルで再標識するステップと、
任意選択的に、レトロディールスアルダーとディールスアルダーとのコンジュゲーション−脱コンジュゲーション反応のプロセスを繰り返すステップと
を含む、方法。
【請求項１２】
前記溶液が水溶液又は水性／有機溶液である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の温度が約２０℃〜４０℃であり、前記第２の温度が約７５℃である、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ジエン部分がフラン基を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
１つ又は複数の前記ジエノフィル対象がマレイミド基を含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的対象が支持体を含む、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記支持体が固体支持体、ゲル、ナノ粒子、タンパク質、炭水化物、可溶性ポリマー又はそれらの混合物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的対象が支持体とカップリングするリガンドを含む、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記リガンドがビオチンを含み、前記支持体がアビジン又はストレプトアビジンを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチド及び前記ジエノフィル部分がスクアレート基を介して連結される、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、オリゴヌクレオチドを他の対象にコンジュゲートする分野に関する。より具体的には、本発明は、レトロディールスアルダー反応をオリゴヌクレオチド用途における切断可能なリンカーとして利用する組成物及び方法に関する。
【０００２】
［優先権の主張及び関連特許出願］
本願は、２０１２年５月２１日付で出願された米国仮出願第６１／６４９７５３号（その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）の優先権の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
多大な労力が、診断及び研究用の試薬並びに有力な治療薬としてのオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体の用途に向けられている。結果として、治療剤又は診断用薬剤としてのオリゴヌクレオチドの使用が急速に増加している。これらの用途のほとんどにおいて、オリゴヌクレオチドを別の分子対象とコンジュゲートする。
【０００４】
オリゴヌクレオチド（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）を小分子、ペプチド、タンパク質、他のオリゴヌクレオチド、ポリマー、更には固体表面等の他の対象に付着させる大抵の方法では、オリゴヌクレオチドと所望の物質とを不可逆的に付着させる場合に応じたリンカー部分が用いられている。かかるコンジュゲーションを達成するのに利用可能な様々な化学的方法については、非特許文献１による概説を参照されたい。これらの方法は奏功しているが、ほとんどがその後のコンジュゲーションパートナからのオリゴヌクレオチドの除去を可能にするものではない。
【０００５】
例えば、多くのオリゴヌクレオチドベースの薬物には高分子量ＰＥＧ（４０Ｋ）がコンジュゲートしている。ＰＥＧの付着は免疫原性を低減するか、又はコンジュゲートの安定性若しくは半減期を増大させることができる。ＰＥＧオリゴヌクレオチドコンジュゲートを作製する様々な方法が、非特許文献１及び非特許文献２に記載されている。ＰＥＧ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの作製に用いられる典型的なＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）ベースのコンジュゲーション方法では、切断可能でないリンカーが生成する。サイズの大きいＰＥＧ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは質量スペクトル分析を妨げ、不純物の特性化を行うのが不可能となっている。このような状況では、オリゴヌクレオチドと標的対象との可逆的な付着及び分離を可能にするのが望ましい。
【０００６】
その後の脱コンジュゲーションを可能にするには、切断可能なリンカーを用いる他のコンジュゲーション方法を用いる必要がある。しかしながら、チオール−ジスルフィドベースの切断可能な可逆的リンカーしか現在利用可能でない。チオール−ジスルフィドベースの方法は、タンパク質コンジュゲーション化学及びオリゴヌクレオチドコンジュゲーションに広く用いられている。チオール−ジスルフィドベースのコンジュゲーションはいくつかの欠点を有する。これらのリンカーは多くの求核試薬及び求電子試薬に対して不安定である。コンジュゲーションには、オリゴヌクレオチド−Ｓ−ＳＲを反応性オリゴヌクレオチド−ＳＨ（すなわちチオール）へと変換する還元剤が必要である。オリゴヌクレオチド−ＳＨ種は酸化的に不安定であり、不活性雰囲気下で反応及び操作を行い、オリゴヌクレオチド−Ｓ−Ｓ−オリゴヌクレオチド二量体化又は出発オリゴヌクレオチドジスルフィド（オリゴ−Ｓ−ＳＲ）の再形成を回避するのに注意を払わなくてはならない。チオール標識オリゴヌクレオチドの単離又は貯蔵は、その酸化不安定性のために実際的ではない。
【０００７】
加えて、チオール−ジスルフィド化学は同じコンジュゲート基ＳＨを有する２つの種をコンジュゲートするものである。これはコンジュゲーションの際に混合二量体形成を引き起こし得る。このため、オリゴヌクレオチドと他の対象とを可逆的にコンジュゲートすることができるより良好な方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Goodchild, Bioconjugate Chemistry, 1:165-187 (1990)
【非特許文献２】Zalipsky, Bioconjugate Chem., 6:150 (1995)
【発明の概要】
【０００９】
本発明の一態様は、オリゴヌクレオチドを可逆的にコンジュゲートする方法に関する。本発明の一実施の形態に従う方法は、ジエン部分で標識したオリゴヌクレオチド及びジエノフィル部分で標識した標的対象を得るステップと、ジエン部分で標識したオリゴヌクレオチド及びジエノフィル部分で標識した標的対象を溶液中で第１の温度で加熱するステップであって、コンジュゲートを生成するディールスアルダー反応を生じさせる、ステップと、コンジュゲートを第２の温度に加熱するステップであって、ジエン部分で標識したオリゴヌクレオチド及びジエノフィル部分で標識した標的対象を温度、ジエン及びジエノフィルの濃度に応じた比率で再生するレトロディールスアルダー反応を生じさせる、ステップとを含む。
【００１０】
本発明の一実施の形態に従う別の方法は、ジエノフィル部分で標識したオリゴヌクレオチド及びジエン部分で標識した標的対象を得るステップと、ジエノフィル部分で標識したオリゴヌクレオチド及びジエン部分で標識した標的対象を溶液中で第１の温度で加熱するステップであって、コンジュゲートを生成するディールスアルダー反応を生じさせる、ステップと、コンジュゲートを第２の温度に加熱するステップであって、ジエノフィル部分で標識したオリゴヌクレオチド及びジエン部分で標識した標的対象を温度、ジエン及びジエノフィルの濃度、並びにそれらを過剰にレトロディールスアルダー反応混合物に添加したか否かに応じた比率で再生するレトロディールスアルダー反応を生じさせる、ステップとを含む。
【００１１】
上記のいずれの方法も水溶液中で行うことができ、第１の温度を２０℃とすることができ、第２の温度を７５℃とすることができる。上記の方法のいずれにおいても、ジエン部分はフランを含んでいてもよく、ジエノフィル対象はマレイミドを含んでいてもよい。上記の方法のいずれにおいても、標的対象は支持体を含んでいてもよく、支持体は固体支持体又は可溶性ポリマーであり得る。上記の方法のいずれにおいても、標的対象は支持体とカップリングするリガンドを含んでいてもよく、リガンドはビオチンを含んでいてもよく、支持体はアビジン又はストレプトアビジンを含んでいてもよい。
【００１２】
本発明の他の態様及び利点は以下の記載及び添付の特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ディールスアルダー反応及びレトロディールスアルダー反応の概略図である。
【図２】本発明の一実施形態に従うフラン標識オリゴヌクレオチドを調製する方法を示す図である。
【図３】本発明の一実施形態に従うオリゴヌクレオチド誘導体をコンジュゲートするディールスアルダー反応を示す図である。
【図４】本発明の一実施形態に従うオリゴヌクレオチド誘導体を脱コンジュゲートするレトロディールスアルダー反応を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態に従う、オリゴヌクレオチド誘導体をコンジュゲートし、支持体の固定化による精製を容易にするディールスアルダー反応、及び付加物を脱コンジュゲートし、オリゴヌクレオチド誘導体を再生するレトロディールスアルダー反応を示す図である。
【図６】レトロディールスアルダーのフラン−オリゴヌクレオチドを別のディールスアルダー反応に再度使用することができることを示す図である。
【図７】本発明の一実施形態に従う方法を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
定義
他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中で使用される核酸化学、生化学、遺伝学及び分子生物学の用語及び記号は、当該技術分野の標準的な論文及び教科書、例えばKornberg and Baker, DNA Replication, Second Edition (W.H. Freeman, New York, 1992)、Lehninger, Biochemistry, Second Edition (Worth Publishers, New York, 1975)、Strachan and Read, Human Molecular Genetics, Second Edition (Wiley-Liss, New York, 1999)、Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogs: A Practical Approach (Oxford University Press, New York, 1991)、Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984)、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.sup.nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)等に従う。ただし、或る特定の用語を明確にし、参照しやすいように下記に規定する。
【００１５】
「ヌクレオシド」という用語は本明細書中で使用される場合、修飾された若しくは天然のデオキシリボヌクレオシド若しくはリボヌクレオシド、又はその任意の化学修飾を指す。ヌクレオシドの修飾としては、２’位、３’位及び５’位の糖修飾、５位及び６位のピリミジン修飾、２位、６位及び８位のプリン修飾、環外アミンでの修飾、５−ブロモ−ウラシルの置換等が挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオシドを好適に保護及び誘導体化して、当該技術分野で既知の方法、例えばヌクレオシドホスホロアミダイトモノマーを用いた固相自動合成、Ｈ−ホスホネートカップリング又はリン酸トリエステルカップリングによるオリゴヌクレオチド合成を可能にすることができる。
【００１６】
「ヌクレオチド」という用語は本明細書中で使用される場合、修飾された又は天然のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは、１つ又はいくつかのリン酸又は置換リン酸が５’位、２’位又は３’位に付着した上記で規定したようなヌクレオシドである。ヌクレオチドは通常、チミジン、シチジン、グアノシン、アデニン及びウリジンを含むプリン及びピリミジンを含む。
【００１７】
「オリゴヌクレオチド」は本明細書中で使用される場合、上記で規定したような複数の連結ヌクレオチド単位から形成されるポリヌクレオチドを指す。ヌクレオチド単位は各々、リン酸連結基を介して互いに連結したヌクレオシド単位を含む。オリゴヌクレオチドという用語はまた、ホスホロチオエート結合等のリン酸結合以外の結合を介して互いに連結した複数のヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドは天然のものであっても又は天然のものでなくてもよい。好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは１〜１０００のヌクレオチドを有する。オリゴヌクレオチドは合成物であっても、又は酵素的に作製されたものであってもよく、いくつかの実施形態では１０ヌクレオチド長〜５０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマー（すなわちオリゴリボヌクレオチドであり得る）又はデオキシリボヌクレオチドモノマーを含み得る。オリゴヌクレオチドは例えば１０〜２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜５００、又は５００を超えるヌクレオチド長であり得る。
【００１８】
「ジエン」又は「ジエン部分」という用語は本明細書中で使用される場合、２つのコンジュゲート二重結合を有する分子を指す。ジエンは、分子の構造が付加環化反応を容易にするように制約されていれば、コンジュゲートしていなくてもよい（Cookson, J. Chem. Soc., 5416 (1964)を参照されたい）。これらの二重結合を形成する原子は炭素若しくはヘテロ原子、又はそれらの任意の組合せであり得る。
【００１９】
「ジエノフィル」又は「ジエノフィル部分」という用語は本明細書中で使用される場合、アルケン基、又は炭素とヘテロ原子との間の二重結合、又は２個のヘテロ原子間の二重結合を有する分子を指す。ジエノフィルは置換若しくは非置換アルケン、又は置換若しくは非置換アルキンを含むが、これらに限定されない任意の基であり得る。通常、ジエノフィルは式Ｃ＝Ｃ−Ｚ又はＺ’−Ｃ＝Ｃ−Ｚ（式中、Ｚ及びＺ’はＣＨＯ、ＣＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯ−アリール、ＣＮ、ＮＯ２等の電子求引基である）の置換アルケンである。ジエノフィルの他の例としては、式Ｒ２−Ｃ＝Ｘ（式中、Ｘは酸素、窒素、リン及び硫黄からなる群から選択されるヘテロ原子である）を有する化合物が挙げられる。例えば、アミノ酸又はリシン含有ペプチド等の第１級アミノ基を有する分子を、ホルムアルデヒドとの反応によって効率的なジエノフィルへと変換して、対応するイミニウム塩を得ることができ、これを水性溶媒中の穏和な条件下でジエン基とのディールスアルダー付加環化に供することができる。
【００２０】
本発明の実施形態は、オリゴヌクレオチドと他の分子対象とを可逆的にコンジュゲートする方法に関する。オリゴヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ又は混合ＤＮＡ／ＲＮＡを含み得る。本発明の実施形態は、（例えばフラン、アントラセン及び他の好適なジエンと、マレイミド及び他の好適なジエノフィルとの間の）ディールスアルダー反応が可逆的であり、多くの場合、（例えば熱、光及びｐＨ変化等の適用による）穏和な条件下で容易に可逆的であるということに基づく。易可逆性により、オリゴヌクレオチドを一時的にコンジュゲート又は脱コンジュゲートすることが可能である。
【００２１】
例えば、上で述べた質量分析をＰＥＧコンジュゲートオリゴヌクレオチドに対して行う際の難点は、質量分析前のオリゴヌクレオチドからのＰＥＧの脱コンジュゲーションによって克服することができる。具体例としては、フラン−オリゴヌクレオチドとマレイミド修飾ＰＥＧとのコンジュゲーションは、熱の適用によって切断することができる安定なコンジュゲートをもたらし、遊離したフランオリゴヌクレオチドを容易に分析し、不純物をＬＣＭＳ法により特性化することができる。このため、高分子量コンジュゲートの分析の問題は、簡単なディールスアルダー−レトロディールスアルダー反応の組合せを用いて解決することができる。
【００２２】
分子をコンジュゲートするディールスアルダー反応の使用は既知である。例えば、Pieken et al.に対して発行された米国特許第６，７３７，２３６号は、ディールスアルダー反応又は１，３−双極性付加環化等の付加環化反応を用いて高分子を他の分子対象にコンジュゲートする方法を開示している。ディールスアルダー反応については、ジエン部分を含有する分子（例えばフラン）を、ジエノフィルを含有する別の分子（例えば二重結合含有部分）とカップリングする。
【００２３】
しかしながら、ディールスアルダー反応のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを放出させるレトロディールスアルダー反応の使用は示されていない。本発明の実施形態は、オリゴヌクレオチドを標的対象に一時的にコンジュゲートし、第２の正（forward）ディールスアルダー反応において添加したジエノフィルに応じてオリゴヌクレオチド誘導体を効率的に再生するか、又は新たな誘導体を生じさせる非常に効率的な方法を提供する。
【００２４】
硫黄ベースの切断可能な可逆的連結化学とは異なり、ディールスアルダー反応の試薬（例えばフラン標識オリゴヌクレオチド）は安定であり、容易に単離することができる。本明細書に記載のディールスアルダー反応及びレトロディールスアルダー反応では、任意の好適なジエン及びジエノフィルを使用することができる。例えば、本発明の実施形態では、ジエンとしてフラン又はフラン類似体、及びジエノフィルとしてマレイミド又はその類似体を使用することができる。ディールスアルダー反応においては、カップリングに関わる２つの基は異なる（例えば、フラン／マレイミド（ジエン／ジエノフィル））。このため、（チオールジスルフィドアプローチにおいて見られるような）望ましくない二量体形成を回避することができる。
【００２５】
本発明の実施形態は水性媒体中でのディールスアルダー反応を含む。ディールスアルダー反応が水溶液中でより効率的であることが知られている（Rideout and Breslow, J. Am. Chem. Soc., 102:7816 (1980)）。例えば、３，５−ヘキサジエン酸ナトリウム及び４，６−ヘプタジエン酸ナトリウム等の単純なジエンは、常温の水中で様々なジエノフィルとのディールスアルダー反応に容易に供することができ（Grieco et al., J. Org. Chem., 48:3137 (1983)）、本来困難なアセチレンジカルボン酸ジメチルの電子不足フランとの付加環化が、水中の非常に穏和な条件下で非常に良好な収率で進行する（Saksena et al., Heterocycles, 35:129 (1993)）。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドがジエン部分を含有し、標的対象がジエノフィルを含み得る。他の実施形態では、これらを逆転することができる。すなわち、オリゴヌクレオチドがジエノフィルを含有し、標的対象がジエンを含有していてもよい。説明を明確にするために、以下の記載では、オリゴヌクレオチドがジエン（例えばフラン）を含有し、標的対象がジエノフィル（例えばマレイミド）を含有する例を用いる。当業者は、本発明の実施形態が逆の構成（すなわち、オリゴヌクレオチド上のジエノフィル及び標的対象上のジエン）も含むことを理解するであろう。さらに、以下の例ではジエンとしてフラン、及びジエノフィルとしてＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を使用することができる。この場合も、例におけるこれらの特定の分子の使用は説明を明確にするためであり、発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００２７】
ディールスアルダー反応は［４＋２］付加環化反応であり、４−π電子系（ジエン）及び２−π電子系（ジエノフィル）を含む。この反応は穏和な条件下で急速に行うことができ、反応を広範な反応物を用いて生じさせることができる。ディールスアルダー反応の概説は、"Advanced Organic Chemistry," (March. J., ed.) 761-798, McGraw Hill, N.Y. (1977)に見ることができる。ディールスアルダー反応は容易に可逆的であり、逆の反応はレトロディールスアルダー反応と称される。
【００２８】
図１は、基本的なディールスアルダー反応及び対応するレトロディールスアルダー反応の例を示す。この例では、フランがジエン成分として働き、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）がジエノフィルとして働く。ディールスアルダー反応は熱によって触媒され得る。例えば、（４＋２）付加環化反応は、溶液を４０℃に選択期間加熱することによって達成することができる。この期間は特定のジエン及びジエノフィル、並びに使用する反応媒体に応じて異なり得る。当業者であれば、過度の実験を行うことなく適当な期間を見出すことが可能である。例えば、反応の進行、次いで反応が完了するか又は所望の程度に達した時点での反応の終了をモニタリングするのに好適な手段を用いることができる。ディールスアルダー反応は２つの立体異性体（エキソ体及びエンド体）を生成し、その一方又は両方を本発明の実施形態に使用することができる。
【００２９】
上で述べたように、ディールスアルダー反応は可逆的である。レトロディールスアルダー反応も熱によって触媒することができる。例えば、ディールスアルダー付加物は、溶液を７５℃に選択期間加熱することによって解離することができる。この場合も、当業者は過度の実験を行うことなく好適な期間を容易に決定することができる。
【００３０】
本発明の実施形態は、図１に示す場合と同様にオリゴヌクレオチドを標的対象にコンジュゲートするのにディールスアルダー反応を利用する。標的対象は他のオリゴヌクレオチド、タンパク質／ペプチド、炭水化物又は支持体（例えば樹脂、ガラスビーズ、電磁ビーズ、マトリックス表面等の固体支持体を含み得る）等の任意の所望の標的であり得る。本発明のいくつかの実施形態に従うと、オリゴヌクレオチドをフラン等のジエンにカップリングし、標的対象をジエノフィルにカップリングすることができ、又はその逆も同様である。ジエン含有オリゴヌクレオチド誘導体を、標的対象に付着した好適なジエノフィルと図１に示すものと同様の条件下で、例えば水溶液中で４０℃に選択期間加熱することによって反応させることができる。
【００３１】
本発明の実施形態に従うと、オリゴヌクレオチド誘導体（ジエン又はジエノフィルを含有する）を任意の好適な方法を用いて調製することができる。例えば、オリゴヌクレオチドはジエン又はジエノフィルとカップリングする官能基を用いて合成することができる。官能基は例えばアミノ基、カルボキシル基、チオール基等であり得る。代替的には、カップリングに核酸塩基上の環外アミノ基を用いてもよい。
【００３２】
官能基をオリゴヌクレオチドに付着させる様々な方法が既知である（概説としては、Goodchild, Bioconjugate Chemistry, 1:165-187 (1990)を参照されたい）。化学的に反応性の官能基をオリゴヌクレオチドに（例えば５’末端に）付着させた後、これらの反応性官能基を様々なコンジュゲートとのカップリングに使用することができる。例えば、第１級脂肪族アミノ基をオリゴヌクレオチド合成の最終段階でオリゴヌクレオチドの５’末端に組み込むことができる。オリゴヌクレオチドの５’末端に連結する試薬は市販されている。例えば、５’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６がGlen Research Corp.（Sterling，Va.）から入手可能である。
【００３３】
オリゴヌクレオチドを修飾して反応性官能基をもたらすのに使用される試薬は、ホスホロアミダイトの形態であってもよく、これを固体支持体に付着した完全長オリゴヌクレオチドの遊離５’−ヒドロキシル基にカップリングすることができる。このカップリングは、別のヌクレオチドモノマーへの付着と同様であり得る。例としては、Theison et al., Tetrahedron Lett., 33:5033-5036 (1992)を参照されたい。
【００３４】
オリゴヌクレオチドを反応性官能基（例えばアミノ基又はチオール基）で誘導体化した後、直接の又は別の仲介物質を介したジエン又はジエノフィルとのカップリングに使用することができる。
【００３５】
図２は、仲介物質（例えばスクアレート（ＳＱ））を介してフラン標識オリゴヌクレオチドを調製する例を示す。この例ではＳＱが示されるが、当該技術分野で既知の任意の好適な仲介物質を使用することができる。図２に示されるように、ＳＱはアミノ基に非常に穏和な条件下、例えば中性ｐＨの水中でカップリングすることができる。温和な反応条件がオリゴヌクレオチドを含む生体材料のカップリングに望ましい。このカップリングでは、過剰なＳＱを使用して、ＳＱ部分の一置換（すなわち、ＳＱ上の２つの有力なアミノ反応性部位の一方のみがオリゴヌクレオチドにカップリングする）を促すことができる。
【００３６】
ＳＱをアミノ連結オリゴヌクレオチドにカップリングした後、過剰なＳＱを当該技術分野で既知の任意の手段によって除去することができる。例えば、ＳＱは小分子であるため、サイズ排除ゲル濾過又は分子量カットオフ膜濾過等、分子サイズに基づいて分離することができる。
【００３７】
この例では、カップリングの後、反応混合物を後処理して、小分子種（過剰なスクアレート及び小オリゴヌクレオチド不良種）を、例えばエッペンドルフチューブ内の３Ｋ分子量カットオフ膜（又はより大規模のコンジュゲーションについてはより大きな限外濾過ユニット）を用いた限外濾過によって除去することができる。限外濾過を用いると、小分子成分／不純物を遠心分離によって迅速に除去することができる。
【００３８】
フランカップリング誘導体を生成するために、ＳＱ−オリゴヌクレオチドのモノコンジュゲートを過剰な５−メチルフルフリルアミンで処理することができる。この場合も、このカップリング反応は穏和な条件下、例えばｐＨ９．２の水性緩衝剤中で行うことができる。反応物を、分子量カットオフ膜（例えば３Ｋ分子量カットオフ膜）を用いて再度後処理することができる。最終残余分を乾燥させて（例えば凍結乾燥して）、フラン−ＳＱ−オリゴヌクレオチド１を得ることができる。最終生成物１をＬＣＭＳによって確認すると、液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣＭＳ）によって判断される収率が９０％を超えることが見出された。
【００３９】
上記の例は、オリゴヌクレオチド及びフランの両方に対するアミノ基を用いたカップリングを可能にするスクアレート（ＳＱ）を介したフランとオリゴヌクレオチドとの連結を示す。当業者であれば、代替手段がフラン誘導体をアミノ標識オリゴヌクレオチドに直接カップリングすることであることも理解するであろう。例えば、フラン誘導体はオリゴヌクレオチド誘導体上のアミノ基との反応のために官能基を含有し得る。かかる官能基には、活性化カルボキシルエステル（例えばＮＨＳエステル）、無水物、ハロゲン化アシル、アルデヒド又はハロゲン化物が含まれ得る。これらのタイプの化学的修飾は当該技術分野で既知である。
【００４０】
さらに、上記の例ではフラン誘導体とカップリングする仲介物質（例えばスクアレート）との反応にアミノ標識オリゴヌクレオチドを用いるが、他のオリゴヌクレオチドが他の官能基を含有していてもよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、アミノ基を含有するフラン誘導体とのカップリングに使用され得るアミノ反応性基（例えばカルボキシル基、アルデヒド基又はハロゲン化物）で誘導体化することができる。当業者であれば、本発明の範囲を逸脱しない様々な修飾及び変更が可能であることを理解するであろう。
【００４１】
フラン含有オリゴヌクレオチドは利用可能であれば、ジエノフィル部分を含有する標的分子とのコンジュゲートに使用することができる。一般的なジエノフィルは通常、二重結合、特に電子求引基に隣接した二重結合を含む。生体分子で一般に使用されるジエノフィルとしては、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）等のマレイミド誘導体が挙げられる。
【００４２】
図３は、フラン含有オリゴヌクレオチドをジエノフィル（すなわちＮＥＭ）にコンジュゲートする例を示す。この例では、単離フラン−ＳＱ−オリゴヌクレオチド１を水に溶解し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した過剰なＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を添加した。得られた混合物を４０℃に保った。４０℃で３時間後、反応混合物をサンプリングし、直接ＬＣＭＳによって分析した。反応は正確に進行し、期待されるディールスアルダー付加物（おそらくはエキソ体及びエンド体の混合物であるが、エキソ体のみを図３に示す）が９０％を超える収率で得られた。この場合も、ディールスアルダー付加物２は上記の限外濾過（ＵＦ）スピンカートリッジ法によって単離することができる。
【００４３】
上記の例ではエチルマレイミド（ＮＥＭ）をジエノフィルとして使用するが、他のジエノフィルを使用してもよい。例えば、ＮＥＭ誘導体をオリゴヌクレオチドとカップリングする標的分子に連結することができる。この場合、ディールスアルダー反応がフラン−オリゴヌクレオチドとジエノフィル−標的分子との間で起こり、オリゴヌクレオチド及び標的分子が共有的に連結する。
【００４４】
ジエノフィル及び標的分子は直接又はリンカーを介して連結することができる。任意の好適なリンカー、例えばアルキルベースのリンカー、ＰＥＧリンカー等をこの目的で使用することができる。当業者であれば、本発明の実施形態がこの目的の任意の特定のリンカーに限定されないことを理解するであろう。
【００４５】
オリゴヌクレオチドを標的分子と共有的に連結した後、本来の目的に（例えば検出又は精製を容易にするために）使用することができる。その目的に適うのであれば、レトロディールスアルダー反応を介してコンジュゲートを逆転し、標的分子からオリゴヌクレオチドを放出させてもよい。
【００４６】
レトロディールスアルダー反応の例を図４に示す。示されるように、ディールスアルダー付加物の溶液（例えば、図３に示す合成後の限外濾過（ＵＦ）精製の残余分）を適当な容量（例えば５００μＬ）まで希釈することができる。溶液を７５℃に加熱し、レトロディールスアルダー反応を生じさせた。反応物を経時的にサンプリングし、ＬＣＭＳによって分析した。７５℃で３時間後、レトロディールスアルダー反応が完了し、フラン−オリゴヌクレオチド１が９０％を超える収率で生成した。
【００４７】
オリゴヌクレオチド誘導体の回収が望ましい場合、反応混合物を任意の好適な手段、例えば上記の３Ｋ  ＵＦスピンカートリッジを用いた限外濾過によって後処理することができる。濾過の残余分を凍結乾燥して、オリゴヌクレオチド誘導体を得ることができる。凍結乾燥固体を水に取り、ＬＣＭＳによって分析した。この分析のＬＣＭＳデータから、フラン−ＳＱ−オリゴヌクレオチドが回収されることが明らかとなった。
【００４８】
フラン誘導体とジエノフィル誘導体（ＮＥＭ）との間の反応の真に可逆的な性質を示すために、１の水溶液（上記のレトロディールスアルダー反応により回収された）をＤＭＳＯ中の過剰なＮＥＭで再度処理した。この混合物を４０℃で加熱した。３時間後、混合物をＬＣＭＳによって分析した。期待されているように、レトロディールスアルダー生成物１がディールスアルダー生成物２へと順調に再変換された（反応スキーム３）。
【００４９】
これらの例から、フラン−ＳＱ−オリゴヌクレオチド１が良好な収率でディールスアルダー付加環化反応を受けるだけでなく（リンカー性能における要件）、ディールスアルダー生成物２を単に７５℃に短時間加熱することによって１へと再変換することも可能である（良好な切断可能なリンカーの要件）ことが示される。出発フランをディールスアルダー付加物２（本質的には保護フラン及びマレイミド）から放出させた後、再度コンジュゲーション反応に使用することができる。これらの例から、標的分子を可逆的に連結又は標識するためにこれらのフラン−オリゴヌクレオチド誘導体を使用することができることが明らかに示される。
【００５０】
オリゴヌクレオチドをコンジュゲート及び脱コンジュゲートすることが可能であることにより、本発明の実施形態を多くの用途に用いることが効率的に可能となる。例えば、これらの方法はオリゴヌクレオチド誘導体の精製に用いることができる。図５はかかる用途の例を示す。
【００５１】
本発明の実施形態を用いてオリゴヌクレオチドを標的に共有的に連結することができる。図５に示されるように、標的対象はオリゴヌクレオチドを固定化する支持体であり得る。一つのアプローチでは、ＮＥＭ誘導体を支持体（例えば可溶性ポリマー、固体ポリマー、電磁ビーズ、固体表面又は樹脂）に直接連結することができる。ディールスアルダー反応の後、オリゴヌクレオチドを固体支持体に結合し、結合していない不純物を洗い流すことができる。次いで、所望のオリゴヌクレオチド誘導体を、固体支持体を（例えば７５℃で）加熱してレトロディールスアルダー反応を生じさせることによって回収することができる。
【００５２】
代替的なアプローチでは、ＮＥＭ誘導体を支持体とカップリングするリガンド（例えば、ストレプトアビジン又はアビジンを有する支持体とカップリングするリガンドとしてのビオチン）に結合することができる。ディールスアルダー反応の後、付加物（又はコンジュゲート）を、ストレプトアビジンで誘導体化した支持体（例えば可溶性ポリマー、固体ポリマー、電磁ビーズ、固体表面又は樹脂）を用いて処理する。これにより、オリゴヌクレオチド誘導体が支持体上に固定化する。結合していない不純物を洗い流した後、所望のオリゴヌクレオチドをレトロディールスアルダー反応によって（例えば７５℃で加熱することによって）放出させることができる。
【００５３】
図６は、レトロディールスアルダー反応により遊離したフラン標識オリゴヌクレオチドを、同じ若しくは異なるジエノフィル又はジエノフィルの混合物との別のディールスアルダー反応に使用することができることを示す。
【００５４】
図７は、本発明の方法を示すフローチャートを示す。示されるように、方法６０は、ジエン部分で標識したオリゴヌクレオチドを得ることを含む（工程６１）。次いで、このオリゴヌクレオチド誘導体をジエノフィル部分で標識した標的対象と反応させ、ディールスアルダー反応を生じさせる（工程６２）。その後（例えば付加物を本来の目的に供した後）、付加物をレトロディールスアルダー反応が生じる温度に加熱し、ジエン部分で標識したオリゴヌクレオチドを再生する（工程６３）。回収したジエン−オリゴヌクレオチドは、同じ又は別のジエノフィルで処理することによってディールスアルダー付加物へと再変換することができる。上記の例ではジエン部分で標識したオリゴヌクレオチドを示しているが、ジエン部分で標識した標的対象とカップリングするジエノフィルで標識したオリゴヌクレオチドを使用することも可能である。
【実施例】
【００５５】
フラン−オリゴヌクレオチド合成
【化１】
2015518722.tif 000002
１．５ｇのフランカルボン酸を４０ｍＬのＡＣＮに溶解した。これに２．３ｍＬのトリエチルアミン、続いて３．０ｇのジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）を添加した。この混合物を室温で３．５時間撹拌した。ＴＬＣによる反応混合物の分析により、新たなスポット（ＫＭｎＯ４染色）及びフランカルボン酸がほとんど残存しないことが示された。ＡＣＮを回転蒸発によって除去し、残存する油を塩化メチレンに取り、０．５Ｍ重炭酸ナトリウムで２回及び０．５Ｍ  ＮａＣｌで１回洗浄した。塩化メチレン溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた固体をシリカゲルクロマトグラフィ（６０／４０ヘキサン／酢酸エチル）によって精製した。生成物含有画分を合わせ、およそ２０ｍＬまで回転蒸発させた。ヘキサンを白色の固体が結晶化し始めるまでこの溶液に滴加した。この混合物を４℃に一晩置いた。結晶化した物質を濾過して、真空乾燥後に１．５ｇの生成物を得た（収率７２％）。１ＨＮＭＲ分析により、生成物が所望のフランＮＨＳエステルであることが示された。
【００５６】
２５ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ＝９．２）中のおよそ１０μＭの上記のように調製した５’アミンを有するオリゴヌクレオチド（ＲＮＡ  ２０ｍｅｒ（２０量体）又はＤＮＡ  ２７ｍｅｒ（２７量体））を、ＡＣＮ中の過剰なフランＮＨＳエステルで処理した（スキームＡ）。これにより、ＬＣＭＳ分析によって示されるように出発５’アミノ標識オリゴヌクレオチド種のフラン−オリゴヌクレオチドへの完全な変換が生じた。得られたフラン−オリゴヌクレオチドを限外濾過した（ＮａＣｌ交換し、水に対して透析濾過した）後、凍結乾燥した。
【００５７】
【化２】
2015518722.tif 000003
２．６ｇのフランＮＨＳエステルを４０ｍＬのＡＣＮに溶解した。これに１．６ｍＬのトリエチルアミン、続いて１．５ｇのアミノヘキサノールを添加した。この混合物を室温で２時間撹拌した。ＴＬＣによる反応混合物の分析により、新たなスポット（ＫＭｎＯ４染色）及びフランカルボン酸ＮＨＳエステルが全く残存しないことが示された。ＡＣＮを回転蒸発によって除去し、残存する油を酢酸エチルに取り、０．５Ｍ重炭酸ナトリウムで２回及び０．５Ｍ  ＮａＣｌで１回洗浄した。酢酸エチル溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて、２．６ｇ（収率９６％）のオフホワイト色の固体を得た。１ＨＮＭＲ分析により生成物が所望の生成物であることが示された。
【００５８】
フランホスホロアミダイトをスキームＢに示すように合成した。１００ｍＬ容の丸底フラスコ内の２．３ｇのフランアルコールに７０ｍＬのＡＣＮを添加し、フランアルコールが溶解するまでこの混合物を穏やかに撹拌し、加温した。この撹拌溶液に３２ｇのジイソプロピルエチルアミン、続いて３．２ｇのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホロアミドクロリド（phosphoramidous chloride）をゆっくりと添加した。この混合物を室温で４時間撹拌した。ＡＣＮを回転蒸発によって除去し、残存する油を塩化メチレンに取り、０．５Ｍ重炭酸ナトリウムで２回及び０．５Ｍ  ＮａＣｌで１回洗浄した。塩化メチレン溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた油を、酢酸エチルを用いるシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。生成物含有画分を合わせ、回転蒸発させて、３．６ｇ（収率８５％）の褐色の油を得た（ＴＬＣによる単一スポット）。３１ＰＮＭＲにより、１４７ｐｐｍにフランホスホロアミダイトに一致した１つのピークのみが示された。また、１ＨＮＭＲ分析により油が所望のフランホスホロアミダイトであることが確認された。
【００５９】
フランアミダイトをＲＮＡ  ２０ｍｅｒ、ＤＮＡ  ２７ｍｅｒ、ＤＮＡ  ５７ｍｅｒ及びＲＮＡ  ９３ｍｅｒの固相オリゴヌクレオチド合成における最後の５’末端アミダイトとして使用した。フラン標識オリゴヌクレオチド（２０ｍｅｒ、２７ｍｅｒ及び５７ｍｅｒ）を切断し、濃アンモニア及び／又はメチルアミン水溶液を用いてＤＮＡを脱保護し、ＲＮＡ  ２０ｍｅｒを濃アンモニア、続いてＴＥＡ  ３ＨＦ中で脱保護した。ＴＣ保護ＲＮＡホスホロアミダイトを用いて作製した９３ｍｅｒ  ＲＮＡをエチレンジアミン中で脱保護した。ＬＣＭＳによる粗混合物の分析により、フランアミダイトが良好な収率（９５％超）でカップリングされ、脱保護条件に対して安定であることが示された。
【００６０】
マレイミドとフラン−オリゴヌクレオチドとのディールスアルダーコンジュゲーション
【化３】
2015518722.tif 000004
Ｎ−エチルマレイミドとのディールスアルダー反応
２．３ｍＭフラン−ＤＮＡ  ２７ｍｅｒのリン酸ナトリウム緩衝水溶液（ｐＨ＝７）に、ＤＭＳＯ（総量で５％）に溶解した過剰なＮ−エチルマレイミドを添加した。この混合物を４０℃に２時間置いた（スキームＣを参照されたい）。反応混合物のＬＣＭＳ分析により、フラン−オリゴヌクレオチドが９５％を超える収率でディールスアルダー付加物に変換されたことが示された。
【００６１】
Ｎ−シクロヘキシルマレイミドとのディールスアルダー反応
１．３ｍＭフラン−ＤＮＡ  ２７ｍｅｒのリン酸ナトリウム緩衝水溶液（ｐＨ＝７）に、ＤＭＳＯ（総量で７０％）に溶解した過剰なＮ−エチルマレイミドを添加した。この混合物を４０℃に２０時間置いた（スキームＣを参照されたい）。反応混合物のＬＣＭＳ分析により、フラン−オリゴヌクレオチドがおよそ９０％の収率でディールスアルダー付加物に変換されたことが示された。
【００６２】
６−マレイミドヘキサン酸とのディールスアルダー反応
５ｍＭフラン−ＤＮＡ  ２７ｍｅｒのリン酸ナトリウム緩衝水溶液（ｐＨ＝７）に、ＤＭＳＯ（総量で１０％）に溶解した過剰なＮ−エチルマレイミドを添加した。この混合物を４０℃に５時間置いた（スキームＣを参照されたい）。反応混合物のＬＣＭＳ分析により、フラン−オリゴヌクレオチドが９５％を超える収率でディールスアルダー付加物に変換されたことが示された。
【００６３】
マレイミド−フラン−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのレトロディールスアルダー及びマレイミドとの再コンジュゲーション
【化４】
2015518722.tif 000005
フラン−ＤＮＡ−マレイミドディールスアルダーコンジュゲートのレトロディールスアルダー反応
ディールスアルダー反応混合物を、Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋスピンフィルタを用いて水に対して限外濾過した。これにより過剰なマレイミドを除去した。限外濾過したおよそ０．５ｍＭのフラン−オリゴヌクレオチドＮ−エチルマレイミドディールスアルダー生成物の溶液を７０℃で加熱した（スキームＤにおける最初の反応）。ＬＣＭＳ分析により、７時間の加熱後に全てのディールスアルダー付加物が元のフラン−オリゴヌクレオチドへと再変換されたことが示された。この混合物をＡｍｉｃｏｎ  ３Ｋスピンフィルタを用いて限外濾過し、遊離Ｎ−エチルマレイミドを除去した。
【００６４】
Ｎ−エチルマレイミドとの第２のディールスアルダー反応
限外濾過したレトロディールスアルダー反応混合物、又は１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７）に取った（５ｍＭ〜１ｍＭのフランオリゴヌクレオチド濃度）、限外濾過したレトロディールスアルダー反応混合物の凍結乾燥サンプルに、ＤＭＳＯ（５容量％のＤＭＳＯ）中の過剰なＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を添加した。４０℃で３時間〜１８時間（濃度に応じて異なる）加熱すると、ＬＣＭＳ分析によって示されるように再生したフラン−オリゴヌクレオチドがＮ−エチルマレイミドディールスアルダー付加物へと完全に再変換された（スキームＤを参照されたい）。
【００６５】
レトロディールスアルダー反応を別のマレイミド種の存在下で行うことによる異なるディールスアルダー付加物のｉｎ−ｓｉｔｕ生成
【化５】
2015518722.tif 000006
初期ディールスアルダー付加物の形成及び単離、続く過剰なＮ−エチルマレイミドの存在下で７０℃でのレトロディールスアルダー
２００ｍｇのフランＤＮＡ  ２７ｍｅｒを２．５ｍＬの１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７）に溶解した。これに１００μＬのＤＭＳＯに溶解した５０ｍｇのマレイミドヘキサン酸を添加した。この透明な溶液を４０℃に置いた。３時間後のＬＣＭＳ分析により、反応が完了した（９４％）ことが示された。希釈した反応混合物を、２Ｋ  Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ限外濾過膜を用いて水に対して限外濾過した。残余分を凍結乾燥して、１８０ｍｇの白色の固体を得た。ＬＣＭＳ分析により、期待されるｍ／ｚ及びディールスアルダー付加物のクロマトグラフプロファイルが得られた。
【００６６】
６ｍｇの凍結乾燥固体を１５０μＬの１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７）に溶解した。この透明な溶液に５ｍｇのＮ−エチルマレイミドを含有する２０ｕＬのＤＭＳＯを添加した。この混合物を７０℃に加熱した。１時間後のＬＣＭＳ分析により、反応混合物がおよそ１０％のフラン−ＤＮＡ  ２７ｍｅｒ、５０％の出発フラン−ＤＮＡ  ２７ｍｅｒ−マレイミドヘキサン酸ディールスアルダー付加物及び４０％の新たなＮ−エチルマレイミドディールスアルダー付加物からなることが示された。７０℃で３時間後に、これらの種の相対量はおよそ１０％のフラン−ＤＮＡ  ２７ｍｅｒ、４０％の出発フラン−ＤＮＡ  ２７ｍｅｒ−マレイミドヘキサン酸ディールスアルダー付加物及び５０％の新たなＮ−エチルマレイミドディールスアルダー付加物であった。スキームＥを参照されたい。
【００６７】
ビオチンマレイミド及びストレプトアビジンアガロースを用いたディールスアルダー／レトロディールスアルダー反応によるオリゴヌクレオチド精製
【化６】
2015518722.tif 000007
粗フラン−オリゴヌクレオチドの限外濾過した（塩交換／水に対して透析濾過した）水溶液（リン酸緩衝剤（ｐＨ＝６〜７））（スキームＦを参照されたい）を、ＤＭＳＯに溶解した過剰なビオチンマレイミドと混合した。この溶液を４０℃に一晩（１５時間）置いた。反応溶液のＬＣＭＳ分析により、ディールスアルダー反応が９０％を超える変換まで進んだことが示された。３Ｋ膜を用いて反応混合物を限外濾過し、未反応のビオチンマレイミド及び全ての他の小分子種を除去した。
【００６８】
得られた限外濾過オリゴヌクレオチド（限外濾過残余分）を、アガロース固体支持体上の過剰なストレプトアビジンに添加した。この混合物をおよそ２５℃で４時間静置した。固体支持体を濾過し、ＵＶ活性物質が溶出しなくなるまで水で洗浄した。濾液のＬＣＭＳ分析により、合成の不良及びビオチンマレイミドとのディールスアルダー反応を受けていない非常に少量のフラン−オリゴヌクレオチドのみが示された。
【００６９】
洗浄したアガロース固体支持体を水に取り、７０℃に８時間加熱した。支持体の濾過及び洗浄により精製フラン−オリゴヌクレオチドが生成し、全ての非フラン含有種をおよそ８０％のフラン−オリゴヌクレオチド回収率で除去した。
【００７０】
レトロディールスアルダー反応により得られた遊離フラン−ＤＮＡを１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７）中で１ｍＭとし、ＤＭＳＯに溶解した過剰なＮＥＭ（１０容量％）を添加した。この混合物を４０℃で６時間加熱した。ＬＣＭＳ分析により、全てのフラン−ＤＮＡが、期待されるディールスアルダー付加物に再変換されたことが示された。
【００７１】
ＰＥＧマレイミドとフラン−オリゴヌクレオチドとのディールスアルダー反応及びレトロディールスアルダー反応
【化７】
2015518722.tif 000008
５ｍｇの凍結乾燥フラン−ＤＮＡ  ２７ｍｅｒ（スキームＧを参照されたい）を、１００ｕＬの１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７）に溶解した。２０ｍｇの２Ｋ  ＰＥＧマレイミドを２００ｕＬの温ＤＭＳＯに溶解した。フランオリゴ溶液をＰＥＧ混合物に添加し、得られた透明な溶液を４０℃で４８時間加熱した。この混合物を陰イオン交換ＨＰＬＣによって分析したところ、２Ｋ  ＰＥＧディールスアルダー生成物が形成されたことが示された。
【００７２】
反応混合物を水で２０倍に希釈した。この混合物を７０℃に２０時間加熱した。陰イオン交換ＨＰＬＣによるこの溶液の分析により、２Ｋ  ＰＥＧディールスアルダー付加物がフラン−オリゴ２７ｍｅｒへと戻ったことが示された。
【００７３】
マレイミド標識シリカを用いたディールスアルダー／レトロディールスアルダー反応によるオリゴヌクレオチド精製
【化８】
2015518722.tif 000009
２．５ｍｇのメチルフランオリゴヌクレオチド誘導体（上記のスキームＨに示す）を、２００ｕＬの２００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）に溶解した。この透明な溶液に７０ｍｇのマレイミド−シリカ固体を添加した。この懸濁液を２５℃に１８時間置いた。反応混合物のサンプルのＬＣＭＳ分析により、それほど多くのメチルフラン標識オリゴヌクレオチドが残存せず、混合物が非フラン標識オリゴヌクレオチドのみを含有することが示された。
【００７４】
反応混合物を希釈し、ビーズを濾過によって除去した。ビーズをＵＶ活性物質が洗浄液中に見られなくなるまで水及びメタノール水溶液で洗浄した。次いで、樹脂を３００ｕＬの水＋２００ｕＬのメタノールに取った。この混合物を７０℃で加熱した。３時間後に、反応混合物をＬＣＭＳによって分析したところ、洗浄液がメチルフラン−オリゴヌクレオチドのみを含有することが示された。
【００７５】
上記の実施例はオリゴヌクレオチドと連結したフランを用いて示したが、当業者であれば、本発明の範囲を逸脱することなく他のジエンを（フランの代わりに）使用することができることを理解するであろう。さらに、上記の実施例はオリゴヌクレオチド上のジエン及び標的に連結したジエノフィルを用いて示したが、本発明の実施形態はジエノフィルで標識したオリゴヌクレオチドも含み、標的がジエンで修飾される。上記の実施例はオリゴヌクレオチドに付着した単一のフランを用いて示したが、多数のジエノフィル及び／又はジエン（望まれない限り内部反応から保護した）とオリゴヌクレオチドとの付着を行ってもよく、これによりそのように標識したオリゴヌクレオチドを、多数の正ディールスアルダー反応及びレトロディールスアルダー反応が行われる用途に用いることが可能となる。
【００７６】
本発明の実施形態の利点は以下の１つ又は複数を含み得る。本発明の実施形態は、ディールスアルダー反応及びレトロディールスアルダー反応を用いてオリゴヌクレオチドを可逆的にコンジュゲートする効率的な方法を提供する。反応は穏和な条件下で行うことができ、収率は非常に良好である。例えば、ディールスアルダー反応は単に２つの反応物の溶液を２０℃に加温することによって生じさせることができ、レトロディールスアルダー反応はディールスアルダー付加物を７５℃に加熱することによって生じさせることができる。遊離したフランオリゴヌクレオチドを単離し、再度繰り返して又は異なるマレイミド誘導体とともに使用することができる。オリゴヌクレオチド誘導体を単離し、再度単離するこの能力により、コンジュゲーション基を変化させる簡単な手段がもたらされる。
【００７７】
溶液中のジエノフィル、フラン−オリゴヌクレオチド、フラン−オリゴヌクレオチド−マレイミドディールスアルダー生成物の濃度を制御することによって、出発フラン−オリゴヌクレオチドと生じ得るディールスアルダー付加物との比率（存在するジエノフィルの数及び濃度に応じて異なる）が制御される。この反応動態は、オリゴヌクレオチドベースのコンビナトリアルケミストリ用途、並びにオリゴヌクレオチドベースのデバイス及びアッセイに使用することができる。
【００７８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において、文脈上明白に他の指示がない限り、数量を特定していない単数形（the singular forms "a," "an," and "the")は複数の指示対象を含む。
【００７９】
他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等の任意の方法及び材料を本開示の実施又は試験に用いてもよいが、好ましい方法及び材料は本明細書に記載している。本明細書に挙げた方法は、開示した特定の順序に加えて論理的に可能な任意の順序で行うことができる。
【００８０】
本発明を限定数の実施形態に関して記載したが、本開示の利益を得る当業者は、本明細書に開示の本発明の範囲を逸脱しない他の実施形態を考案することができることを理解するであろう。したがって、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとする。
【００８１】
援用記載
特許、特許出願、特許公報、定期刊行物、書籍、論文、ウェブコンテンツ等の他の文献の参照及び引用を本開示において行った。かかる文献は全て、その全体があらゆる目的のために引用することにより本明細書の一部をなすものとする。引用することにより本明細書の一部をなすと述べられているが、本明細書に明示的に記載される既存の定義、言説又は他の開示事項と抵触する任意の事項又はその一部は、引用事項と本開示の事項との間に抵触が生じない限りにおいてのみ引用される。抵触の場合には、本開示を好ましい開示として支持することによって抵触が解決される。
【００８２】
均等物
本明細書に開示の代表的な例は本発明の説明を助けることを意図し、本発明の範囲を限定することを意図するものでも、そのように解すべきものでもない。実際に、本明細書に提示及び記載されるものに加えて、本発明及びその多くの更なる実施形態の様々な変更が、先の実施例並びに本明細書に引用される科学文献及び特許文献の参照を含む本明細書の全内容から当業者に明らかとなるであろう。先の実施例は、その様々な実施形態及びその均等物において本発明の実施に適用することができる重要な追加情報、例示及び指針を含む。
【図１】
2015518722.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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