(57)【要約】本発明は、生物学的試料内に存在する生物学的分子を孔隙に迅速に吸収させることができる多孔性固体相を用いて生物学的試料から核酸増幅反応用生物学的分子を迅速に分離し、これを増幅し、生物学的試料内で標的配列の存否を迅速に確認する方法を提供する。
2015526091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料に多孔性固体相を接触させて前記生物学的試料内に存在する生物学的分子を前記多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階を含む、
前記生物学的試料から核酸増幅反応用生物学的分子を迅速に分離する方法。
【請求項２】
前記生物学的試料は、動物、植物、細菌又はカビ由来であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ウイロイド（ｖｉｒｏｉｄ）、ウイルス、細菌、カビ又は微細藻類であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸増幅反応は、ｃＤＮＡの合成、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ又はＲＴ-ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記多孔性固体相は、炭化セルロース類又は紙を粒子形態で丸めたもの、天然又は合成ゼオライト、ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｌｅｎｅ）、ポリカーボネート（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ポリプロピレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｈｙｌｅｎｅ）、多孔性金属粒子、多孔性ゴム、ガラス繊維を粒子形態で丸めた細工性ガラス、石灰、貝殻、陶器の切片及び酸化物材質のセラミックからなる群より選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記酸化物材質のセラミックの主成分は、Ａｌ２Ｏ３、Ｆｅ２Ｏ３、ＬＴＣＣ（Ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏ-ｆｉｒｅｄ ｃｅｒａｍｉｃ）、ＰｂＯ又はＺｎＯであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記多孔性固体相は、正六面体、直六面体、球、円柱、棒状（ｂａｒ ｔｙｐｅ）、棒の片方の末端に溝がある棒状又は先端が尖っている棒状であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階の生物学的分子を吸収させた多孔性固体相を核酸増幅反応のための鋳型として添加し、標的プライマセットを用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階と
を含む生物学的試料で標的配列を増幅する方法。
【請求項９】
前記核酸増幅反応は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階の生物学的分子を吸収させた多孔性固体相に逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を添加して逆転写酵素反応を行う段階と、
（ｃ）前記逆転写酵素反応物を核酸増幅反応のための鋳型として添加し、標的プライマセットを用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階と
を含む生物学的試料で標的配列を増幅する方法。
【請求項１１】
（ａ）生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階の生物学的分子を吸収させた多孔性固体相を核酸増幅反応のための鋳型として添加し、標的プライマセットを用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階と、
（ｃ）前記増幅産物を検出する段階と
を含む、生物学的試料内で標的配列の存否を迅速に確認する方法。
【請求項１２】
（ａ）生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階の生物学的分子を吸収させた多孔性固体相に逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を添加して逆転写酵素反応を行う段階と、
（ｃ）前記逆転写酵素反応物を核酸増幅反応のための鋳型として添加し、標的プライマセットを用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階と、
（ｄ）前記増幅産物を検出する段階と
を含む、生物学的試料内で標的配列の存否を迅速に確認する方法。
【請求項１３】
生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に迅速に吸収させることができる多孔性固体相と、標的プライマセットと、増幅反応を行うための試薬を含む、生物学的試料内で標的配列を増幅するための核酸増幅反応用キット。
【請求項１４】
前記増幅反応を行うための試薬は、逆転写酵素、ＤＮＡ重合酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝溶液を含むことを特徴とする請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記多孔性固体相は、炭化セルロース類、紙を粒子形態で丸めたもの、天然又は合成ゼオライト、ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｌｅｎｅ）、ポリカーボネート（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ポリプロピレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｈｙｌｅｎｅ）、多孔性金属粒子、多孔性ゴム、ガラス繊維を粒子形態で丸めた細工性ガラス、石灰、貝殻、陶器の切片及び酸化物材質のセラミックからなる群より選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
生物学的試料内に存在する生物学的分子を孔隙に迅速に吸収させることができる多孔性固体相を含む、生物学的試料から核酸増幅反応用生物学的分子を迅速に分離するためのキット。
【請求項１７】
生物学的試料内に存在する生物学的分子を孔隙に迅速に吸収させることができる多孔性固体相を含む、生物学的試料から核酸増幅反応用生物学的分子を迅速に分離するための組成物。
【請求項１８】
前記多孔性固体相は、炭化セルロース類、紙を粒子形態で丸めたもの、天然又は合成ゼオライト、ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｌｅｎｅ）、ポリカーボネート（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ポリプロピレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｈｙｌｅｎｅ）、多孔性金属粒子、多孔性ゴム、ガラス繊維を粒子形態で丸めた細工性ガラス、石灰、貝殻、陶器の切片及び酸化物材質のセラミックからなる群より選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的試料から核酸増幅反応用生物学的分子を迅速に分離するための多孔性固体相及びその用途に関し、更に詳細には、生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階を含む生物学的試料から核酸増幅反応用生物学的分子を迅速に分離する方法、生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させた多孔性固体相を直接添加したり、逆転写酵素反応を行った後、核酸増幅反応のための鋳型として用いて標的配列を増幅する段階を含む生物学的試料で標的配列を増幅する方法及び前記方法を用いて生物学的試料内で標的配列の存否を迅速に確認する方法、生物学的試料内に存在する生物学的分子を孔隙に迅速に吸収させることができる多孔性固体相を含む、生物学的試料から核酸増幅反応用生物学的分子を迅速に分離するためのキット及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
動植物に病気を引き起こす病源体を検出する方法のうち最も広く利用されるものとして、病源体の固有蛋白質を検出する血清学的診断法と核酸を検出する分子生物学的診断法が挙げられる。分子生物学的診断法で広く利用される方法は、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法であり、検出感度が高く、誰でも容易に利用できるという長所がある。ＰＣＲを行うためには、まず鋳型として利用される遺伝体を対象組織から抽出しなければならない。ＤＮＡを抽出する現在の方法としては、フェノール／クロロホルムを用いる方法、塩析する方法、カオトロピック塩及びシリカ樹脂を用いる方法、親和性樹脂を用いる方法、イオン交換クロマトグラフィー法及び磁性ビーズを用いる方法などが挙げられる。これらの方法は、米国特許第５０５７４２６号、第４９２３９７８号、ＥＰ特許第０５１２７６７  Ａ１号、及びＥＰ第０５１５４８４Ｂ号、ＷＯ第９５／１３３６８号、ＷＯ第９７／１０３３１号、及びＷＯ第９６／１８７３１号などに記述されている。これらは固体支持体上に核酸を吸収させた後、核酸を分離（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）する方法について記載している。従来用いられる方法においては、核酸を単離するために一定種類の溶媒を用いた。
【０００３】
ＰＣＲを用いてＤＮＡやＲＮＡ鋳型から目的部位を増幅することは、ＤＮＡ分子マーカー、プローブの製作、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡライブラリの製作、病源体の検定などのような多様な分野に応用され得る。一例として、病源体の遺伝体を増幅する場合、検体内の病源体の存在有無を目的とする産物の増幅有無により容易に判読できる。病源体の診断に利用される場合、ＰＣＲは特異度と検出感度が非常に高いが、多量の試料を一度に検査するのには多くの困難が伴う。これは多様な検体からＰＣＲ鋳型を迅速に分離するのにはまだ時間とコストが多くかかるためである。様々な組織からＤＮＡやＲＮＡを分離する多様な方法が報告されており、血痕、髪の毛、上皮細胞、葉片を対象に沸かす方法、ＮａＯＨ処理ＶＣ-キャプチャ、熱抽出、電子レンジ抽出、ＮａＯＨ抽出などの方法を用いてＰＣＲが可能なように簡単に遺伝体が得られる方法も報告されている。しかしながら、これらの方法は遺伝体の抽出効率が均一でなく、ＰＣＲ反応の再現性が低いという短所がある。ＰＣＲ技法の有する高い特異度と検出感度を阻害せず、多様な検体からＰＣＲ鋳型用生物学的分子を簡単、かつ大量に抽出できれば、ＰＣＲの活用度が現在よりも遥かに高くなるということは誰でも容易に予測できる。
【０００４】
一方、韓国公開特許第２００５-００８８１６４号には、核酸単離方法が開示されており、日本公開特許第２００７-５０６４０４号には、核酸分子を検出するための迅速な方法が開示されているが、本発明のように生物学的試料から多孔性固体相を用いて核酸増幅反応用生物学的分子を迅速に分離する方法については明らかに示されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上記のような要求により導き出されたものであって、本発明者は、生物学的試料としてＣＭＶ（ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）に感染した唐辛子の葉に多孔性固体相である酸化物材質の多孔性セラミックキューブを金属ピンＶの頭部側の扁平な部分で圧力を加えて接触させて唐辛子の試料内に存在するＲＮＡ、ｇＤＮＡ及びウイルス粒子を多孔性セラミックキューブの孔隙に吸収させた後、吸収された生物学的分子に対して別途の溶媒を用いた溶出過程なしに多孔性セラミックキューブを直接鋳型としてＰＣＲチューブに入れ、ＣＭＶ特異プライマで増幅させた結果、ＣＭＶに感染した唐辛子であることが確認できた。以上のような方法を精製したＣＭＶ粒子、ＣＭＶに感染したＲＮＡ全体、精製した唐辛子ゲノムＤＮＡに適用してセラミックキューブの材質と製作温度によって前記遺伝体を効率的に吸収してＰＣＲとｃＤＮＡの合成に利用できることを確認した。また、本発明のＬＴＣＣキューブを用いてタバコの葉から分離した核酸を鋳型としてｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＲＴ-ＰＣＲと大腸菌を対象にＢＡＣプラスミドの増幅を成功裏に行った。
【０００６】
これにより、本発明は、生物学的試料内に存在する生物学的分子の迅速な分離によって標的配列の存否を迅速に診断できるようにすることで、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明は、生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階を含む生物学的試料から核酸増幅反応用生物学的分子を迅速に分離する方法を提供する。
【０００８】
また、本発明は、生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させた多孔性固体相を直接添加したり、ｃＤＮＡの合成のための逆転写酵素反応を行った後、核酸増幅反応のための鋳型として用いて標的配列を増幅する段階を含む生物学的試料で標的配列を増幅する方法及び前記方法を用いて生物学的試料内で標的配列の存否を迅速に確認する方法を提供する。
【０００９】
更に、本発明は、生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に迅速に吸収させることができる多孔性固体相を含む生物学的試料内で標的配列を増幅するための核酸増幅反応用キットを提供する。
【００１０】
また、本発明は、生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に迅速に吸収させることができる多孔性固体相を含む、生物学的試料から核酸増幅反応用生物学的分子を迅速に分離するためのキット及び組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、生物学的試料内に存在する生物学的分子の迅速な分離によって標的配列の存否を迅速に診断できるようにするので、目的とするゲノムＤＮＡの増幅、ｃＤＮＡの合成、病源体の感染有無などを迅速、かつ正確に判別するのに容易に利用され得るという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】多孔性セラミックキューブを用いた遺伝体の吸着とＲＴ-ＰＣＲ／ＰＣＲ鋳型としての活用模式図を示す。Ａ：多孔性セラミックキューブ、Ｂ：多孔性セラミックキューブを拡大した図であって、１立方ミリメートル（１ｍｍ３）のキューブ表面に孔隙の大きさが変わるように材料と製作温度を異にして１４種のキューブを製作する、Ｃ：植物体の葉に１個のキューブを乗せ、ピンＶの頭部面でキューブを押圧して組織が破砕されると同時にキューブの孔隙に遺伝体が吸収されるように設計する、Ｄ：遺伝体が吸収された１個のキューブをＲＴ-ＰＣＲ或いはＰＣＲ鋳型として使用、Ｅ：ＰＣＲ産物をアガロースジェルから確認。
【図２】陶器の切片を用いて生物学的試料から核酸増幅反応のためのＤＮＡ／ＲＮＡ鋳型を分離した結果を示す。Ａ：約１ｍｍ３サイズの陶器の破片を製造するのに用いた陶器の切片（１〜８）であって、６は陶器の切片５の矢印部位を意味する。Ｂ：Ｃａｐｓｉｃｕｍａｎｎｕｕｍ ＣＭ３３４の唐辛子の葉に８種類の陶器の破片を乗せ、ピンＶで押圧した後、これをＰＣＲ鋳型として使用。ＴｓｃａｒプライマでＰＣＲを行った結果。Ｃ：ＣＭ３３４の唐辛子の葉で精製したｇＤＮＡ（１ｕｇ/ｕｌ）をＡから得た８種類の陶器の破片で吸収し、これをＰＣＲ鋳型として使用。ＴｓｃａｒプライマでＰＣＲを行った結果、レーンＭ；１ｋｂＤＮＡラダー、レーンＰＣ；ＣＭ３３４の唐辛子の葉で精製したｇＤＮＡ（１ｕｇ/ｕｌ）１ｕｌをＰＣＲ鋳型として使用。Ｄ：ＲＴ-ＰＣＲによるＴｏｍａｔｏ  ｓｐｏｔｔｅｄ  ｗｉｌｔ  ｖｉｒｕｓ（ＴＳＷＶ）の検出、レーンＭ；１ｋｂ  ＤＮＡラダー、レーンＮＣ；健全なＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｒｕｓｔｉｃａタバコの葉から分離した１ｕｌの総ＲＮＡを逆転写反応鋳型として使用、レーンＰＣ；ＴＳＷＶを人工的に感染させたタバコの葉から分離した１ｕｌの総ＲＮＡを逆転写反応鋳型として使用。レーン１〜８；８種の陶器の破片をＴＳＷＶに感染したＮ.ｒｕｓｔｉｃａタバコの葉に押圧して生物学的分子（ここでは、ウイルス粒子或いはＲＮＡ）を吸収させた後、これを逆転写反応用鋳型として使用する。矢印は、予想したＰＣＲ産物の大きさを意味する。
【図３】ゲノムＤＮＡの増幅が最も効率よく行われた図２Ａの４の陶器の破片（Ａ）とそれぞれの酸化物材質で製造された多孔性セラミックキューブの表面を電子顕微鏡（ＳＥＭ）で拡大した写真である。何れも１万倍拡大した写真であって、材料と製作温度によって表面形態、孔隙の大きさと個数に差がある。１〜１４：順に表１に記録された材料、ｂａｒ：１ｕｍ。
【図４】それぞれの酸化物材質で製造された多孔性セラミックキューブを用いて唐辛子の葉からＣＭＶ ＲＮＡ及びゲノムＤＮＡを分離してＲＴ-ＰＣＲ／ＰＣＲ反応を行った結果である。Ａ：キュウリモザイクウイルス（ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）総ＲＮＡを対象にＲＴ-ＰＣＲを行った結果、Ｂ：唐辛子の葉で精製したゲノムＤＮＡを対象にＰＣＲを行った結果。レーンＭ：１ｋｂ  ＤＮＡラダー、レーンＰＣ：ＡではＣＭＶに感染した唐辛子の葉から分離した１ｕｌの総ＲＮＡをＲＴ-ＰＣＲ鋳型として使用する。レーン１〜１４：順に表１に記録された材料。ＢではＣＭ３３４の唐辛子から分離した１ｕｌのゲノムＤＮＡをＰＣＲ鋳型として使用する。
【図５】それぞれの酸化物材質で製造された多孔性セラミックキューブを用いてＣＭＶに感染した唐辛子の葉及び精製したＣＭＶ粒子を対象に生物学的分子の吸収率を調べた結果である。Ａ：ＣＭＶ感染唐辛子の葉、Ｂ：精製したＣＭＶ（レーンＰＣ１：ＣＭＶ感染したＣＭ３３４の総ＲＮＡ１ｕｌを鋳型として使用。レーンＰＣ２：ＣＭＶ感染したＮｉｃｏｔｉａ  ｔａｂａｃｃｕｍ  Ｘａｎｔｈｉ-ｎｃの総ＲＮＡ１ｕｌを鋳型として使用）。レーン１〜１４：順に表１に記録された材料。
【図６】唐辛子の葉を対象に本発明で製造した多様な多孔性セラミックキューブを用いてＤＮＡの増幅効率を分析した結果である。レーンＭ：１ｋｂ  ＤＮＡラダー、レーン１〜１４：順に表１に記録された材料、レーンＰＣ：精製した１ｕｌのｇＤＮＡを鋳型として使用。
【図７】本発明のＬＴＣＣ多孔性セラミックキューブの製作温度がＰＣＲ増幅に及ぼす影響を分析した結果である。レーンＭ：１ｋｂ  ＤＮＡラダー、レーンＰＣ：精製した１ｕｌのｇＤＮＡを鋳型として使用、レーン３０〜３４：３０（ＬＴＣＣ、６５０℃）、３１（ＬＴＣＣ、７００℃）、３２（ＬＴＣＣ、７５０℃）、３３（ＬＴＣＣ、８００℃）、３４（ＬＴＣＣ、８５０℃）。
【図８】製作温度によるＬＴＣＣ多孔性セラミックキューブの表面（Ａ〜Ｅ）と内部（Ｆ〜Ｊ）の切断面を示す。Ａ〜Ｊ：１０、０００倍で観察したＳＥＭ写真。３０〜３４：３０（ＬＴＣＣ、６５０℃）、３１（ＬＴＣＣ、７００℃）、３２（ＬＴＣＣ、７５０℃）、３３（ＬＴＣＣ、８００℃）、３４（ＬＴＣＣ、８５０℃）
【図９】製作温度によるＬＴＣＣ多孔性セラミックの物質吸収能力とろ過能力を調べた結果である。キューブの表面（Ａ〜Ｅ）と内部（Ｆ〜Ｊ）の切断面を５０００倍のＳＥＭ及び２５０倍のＴＥＭでそれぞれ観察して金ナノ粒子及びポリスチレン粒子の混合液分布を調べた。３０〜３４：３０（ＬＴＣＣ、６５０℃）、３１（ＬＴＣＣ、７００℃）、３２（ＬＴＣＣ、７５０℃）、３３（ＬＴＣＣ、８００℃）、３４（ＬＴＣＣ、８５０℃）
【図１０】製作温度によるＬＴＣＣ多孔性セラミックの物質吸収能力とろ過能力を調べた結果である。ＬＴＣＣ多孔性セラミックキューブの内部に吸収された金ナノ粒子及びポリスチレン粒子を溶出させた後、３５００倍のＴＥＭでその分布を調べた。３３（ＬＴＣＣ、８００℃）、３４（ＬＴＣＣ、８５０℃）
【図１１】キューブ表面の特性がＰＣＲ産物の増幅効率に及ぼす影響を調べた結果である。Ａ〜Ｃ：１０００倍で撮影したＳＥＭ写真。Ａ、３３（ＬＴＣＣ、８００℃）キューブ研磨しない；Ｂ、３３を４８時間研磨；Ｃ、３３を７２時間研磨。ＤとＥ：レーンＭ、１ｋｂ  ＤＮＡラダー；レーンＰＣ、精製した１ｕｌのｇＤＮＡを鋳型として使用；レーン３９、３３（ＬＴＣＣ、８００℃）キューブ研磨しない；レーン４１、３３を４８時間研磨；レーン４２、３３を７２時間研磨。プライマ１０（Ｄ）と１４６（Ｅ）を使用する。
【図１２】本発明のＬＴＣＣキューブを用いてタバコの葉から分離した生物学的分子を鋳型としたマルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＲＴ-ＰＣＲの結果である。レーンＭ：１ｋｂ  ＤＮＡラダー、レーン１〜３はそれぞれＣＭＶ（４７３ｂｐ）、ＣＩＹＶＶ（８０６ｂｐ）、ＣＭＶ（４７３ｂｐ）＋ＣＩＹＶＶ（８０６ｂｐ）のＲＴ-ＰＣＲ産物。
【図１３】本発明のＬＴＣＣキューブを用いて大腸菌を対象にＢＡＣプラスミド増幅した結果である。レーンＭ：１ｋｂ  ＤＮＡラダー、レーン１〜４は１ｕｌ、２ｕｌ、３ｕｌ、４ｕｌの大腸菌培養液を鋳型として使用する。５〜８は大腸菌を吸収させた多孔性セラミックキューブ（８、ＬＴＣＣ、８５０℃）を１つ、２つ、３つ、４つそれぞれ入れて鋳型として使用する。ＰＣＲバンドの厚さが一定である、即ち均一に大腸菌が吸収され、１個のキューブに吸収された鋳型は４個の場合と殆ど差がない。このとき、プライマ濃度を高くすれば、４個使用するとき、ＰＣＲバンドが１個よりも遥かに厚くなる。１〜４は大腸菌培養溶液の粘度が高いため、一定に添加されない結果を示す。
【図１４】生物学的分子を吸収させるために利用可能な多孔性セラミックの形態を示す。Ａ；単一シンプル構造（四角、円形など）、Ｂ；材料吸収率を高めるために単一シンプル構造の内部にホール状の空間を形成させた構造、Ｃ；表面気孔サイズ及び互いに異なる材料が複合化した構造、Ｄ；密度が異なる２重構造（左側）及び内部に孔隙を含む構造（右側）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の目的を達成するために、本発明は、生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階を含む生物学的試料から核酸増幅反応用生物学的分子を迅速に分離する方法を提供する。
【００１４】
本発明の一実現例に係る方法において、前記生物学的試料は、動物、植物、細菌又はカビ由来であってもよく、好ましくは植物又は動物であってもよいが、これに制限されない。
【００１５】
本発明において、生物学的試料に多孔性固体相を接触させる方法としては、生物学的試料の形態が液相である場合は、単純接触によって多孔性固体相への吸収を誘導する方法を意味し、固体相の場合は、多孔性固体相をピンＶで刺して細胞が破壊される際に出てくる生物学的分子を吸収させる方法を意味するが、この方法のみに制限されるものではない。
【００１６】
本発明の一実現例に係る方法において、前記生物学的分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ウイロイド（ｖｉｒｏｉｄ）、ウイルス、細菌、カビ又は微細藻類であってもよく、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡであってもよいが、これに制限されない。
【００１７】
本発明の生物学的分子は、動物の場合、多様なソース（ｓｏｕｒｃｅ）から得られ、例えば、筋肉、表皮、血液、骨、臓器から得られ、最も好ましくは、筋肉又は血液から得られるが、これに制限されない。植物の場合、各種器官抽出物から得られ、例えば、葉、花、幹、根、実り、種子から得られ、最も好ましくは、葉、種子又は花から得られるが、これに制限されない。微生物の場合、菌叢、菌糸体又はウーズ（ｏｏｚｅ）から得られ、最も好ましくは、これらが集中的に棲息する所（病斑の発生部位）から得られるが、これに制限されない。ウイルス、細菌、カビ又は微細藻類の場合、孔隙の大きさを適切に調節した多孔性固体相を接触させてこれらの一部粒子又は細胞全体を孔隙内に吸収させ、これを鋳型としてＰＣＲ反応させれば、ＰＣＲ反応段階のうち、高温変性段階（略９４〜９６℃）で組織破壊によって内部の核酸が放出され得るため、目的遺伝子の分析が可能である。
【００１８】
また、本発明の生物学的分子は、核酸分子の基本構成単位であるヌクレオチドだけでなく、その塩基が変形した類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）を含むことができる。
【００１９】
本発明の方法において、分離された生物学的分子がｇＤＮＡである場合、セラミック棒の先端を生物学的試料に接触させて吸着できる。出発物質がｍＲＮＡである場合には、これにセラミック棒の先端を生物学的試料に接触させ、先端に吸着された総ＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いてｃＤＮＡとして合成する。前記総ＲＮＡは、植物や動物細胞から分離されたものであるため、ｍＲＮＡの末端にはポリ-Ａテールを有しており、このような配列特性を用いたオリゴｄＴプライマ及び逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを容易に合成できる。また、ウイルスの場合、ポリ-Ａテールがある場合、前記と同様の方法でｃＤＮＡを合成するが、トバモウイルスのようにポリ-Ａテールがない場合、当業界における公知の多様な方法によって目的ＲＮＡに特異的なアンチセンスプライマ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）を用いてｃＤＮＡを合成できる。
【００２０】
本発明の方法において、前記少量の生物学的分子は、鋳型として利用できる当業界における公知の多様な方法に応用され得る。例えば、本発明に応用され得る技術は、ＣＡＰＳ又はＳＣＡＲ分子マーカー、蛍光標識子を用いるＨＲＭ、ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ、ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ  ＰＣＲ、同時に多様な病源体の検出に利用されるｍｕｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ、直接的ＤＮＡ配列決定、単一-鎖コンファーメイション分析（ＳＳＣＡ、Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ.,ＰＮＡＳ,ＵＳＡ８６：２７７６（１９８９））、ＲＮａｓｅ保護分析（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ., Ｇｅｎｏｍｉｃｓ,７：１６７（１９９０））、変性勾配ジェル電気泳動（ＤＧＧＥ、Ｗａｒｔｅｌｌ  ａｌ.,Ｎｕｃｌ.Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ., １８：２６９９（１９９０））、ヌクレオチドミスマッチを認識する蛋白質（例えば、Ｅ.ｃｏｌｉのｍｕｔＳ蛋白質）を利用する方法（Ｍｏｄｒｉｃｈ,Ａｎｎ.Ｒｅｖ.Ｇｅｎｅｔ.,２５：２２９-２５３（１９９１））、対立型-特異ＰＣＲを含むが、これに限定されるものではない。
【００２１】
核酸増幅技術が適用される場合に、本発明のウイルス検出のためには適したプライマをデザインすることが重要である。しかしながら、逆転写反応（ＲＴ）及びＰＣＲを、同一のチューブで行われるよりもＲＴとＰＣＲがそれぞれ異なるチューブで行われるときに、鋳型の増幅量を増やすことができ、ウイルス検定結果の信頼性を高めることができる。本発明の好適な実現例によれば、本発明は、セラミックブロックに吸収されたヌクレオチドとマッチするようにデザインされたジェノタイピング（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）プライマを用いて組織内のウイルスの有無を分析する方法を提供する。
【００２２】
本発明による核酸増幅は、ＤＮＡ分子マーカーの製作、プローブの製作、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡライブラリの製作、病源体の検定などに利用され得るが、これに制限されない。
【００２３】
本発明の一実現例に係る方法において、前記核酸増幅反応は、ｃＤＮＡの合成、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）、マルチプレックス（ｍｕｌｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ、逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ-ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、核酸配列ベース増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ-ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、転写ベース増幅システム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）又はＱβ複製酵素（ｒｅｐｌｉｃａｓｅ）による増幅又は当業界に公知となっている核酸分子を増幅するための任意のその他の適当な方法がある。前記において、ＰＣＲとは重合酵素を用いて標的核酸に特異的に結合するプライマ対から標的核酸を増幅する方法をいう。このようなＰＣＲ方法は、当業界によく知られており、商業的に利用可能なキットを用いることもできる。
【００２４】
本発明の一実現例に係る方法において、前記多孔性固体相は、炭化セルロース類、紙を粒子形態で丸めたもの、天然又は合成ゼオライト、ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｌｅｎｅ）、ポリカーボネート（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ポリプロピレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｈｙｌｅｎｅ）、多孔性金属粒子、多孔性ゴム、ガラス繊維を粒子形態で丸めた細工性ガラス、石灰、貝殻、陶器の切片又は酸化物材質のセラミックであってもよく、好ましくは酸化物材質のセラミックであってもよいが、これに制限されない。
【００２５】
本発明の一実現例に係る方法において、前記酸化物材質のセラミックは、Ａｌ２Ｏ３、Ｆｅ２Ｏ３、ＬＴＣＣ（Ｌｏｗ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｃｏ-ｆｉｒｅｄ  ｃｅｒａｍｉｃ）、ＰｂＯ又はＺｎＯを主成分として製造されたセラミックであり得るが、これに制限されない。
【００２６】
本発明の一実現例に係る方法において、前記多孔性固体相は、正六面体、直六面体、球、円柱、棒状（ｂａｒ  ｔｙｐｅ）、棒の片方の末端に溝がある棒状、先端が尖っている棒状、棒の片方の末端に溝があり、先端が尖っている棒状、又は棒の片方の末端に溝があり、先端が尖っており、先端が尖っている側の内部に大きな孔隙を有する棒状であり得るが、これに制限されない。
【００２７】
本発明の多孔性固体相として酸化物材質のセラミックを用いる場合、その孔隙の大きさを調節できるが、同じ酸化物材質で多孔性セラミックを製造する場合、製作温度によって孔隙の大きさ及び孔隙数を調節でき、目的とする生物学的分子の種類によって最適化した多孔性セラミックを利用することによって、ＰＣＲ又はＲＴ-ＰＣＲ反応を効果的に行えるようにする。このような多孔性セラミックの孔隙の大きさは、対象の生物学的試料において目的とする生物学的分子を選択的に吸収できるように多孔性固体相の大きさを適切に調節できる。また、前記酸化物材質のセラミックの外形の大きさは、ＰＣＲ用チューブに容易に入れる程度の大きさであれば、特に制限されないが、例えば、１ｍｍ３であり得ることができるが、これに制限されない。
【００２８】
また、本発明は、
（ａ）生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階の生物学的分子を吸収させた多孔性固体相を核酸増幅反応のための鋳型として添加し、標的プライマセットを用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階とを含む生物学的試料で標的配列を増幅する方法を提供する。
【００２９】
本発明の一実現例に係る方法において、前記核酸増幅反応は、前述した通りである。
【００３０】
更に、本発明は、
（ａ）生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階の生物学的分子を吸収させた多孔性固体相に逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を添加して逆転写酵素反応を行う段階と、
（ｃ）前記逆転写酵素反応物を核酸増幅反応のための鋳型として添加し、標的プライマセットを用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階とを含む生物学的試料で標的配列を増幅する方法を提供する。
【００３１】
また、本発明は、
（ａ）生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階の生物学的分子を吸収させた多孔性固体相を核酸増幅反応のための鋳型として添加し、標的プライマセットを用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階と、
（ｃ）前記増幅産物を検出する段階とを含む、生物学的試料内で標的配列の存否を迅速に確認する方法を提供する。
【００３２】
更に、本発明は、
（ａ）生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階の生物学的分子を吸収させた多孔性固体相に逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を添加して逆転写酵素反応を行う段階と、
（ｃ）前記逆転写酵素反応物を核酸増幅反応のための鋳型として添加し、標的プライマセットを用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階と、
（ｄ）前記増幅産物を検出する段階とを含む、生物学的試料内で標的配列の存否を迅速に確認する方法を提供する。
【００３３】
本発明の方法は、前記増幅産物を検出する段階を含む。前記増幅産物の検出は、ＤＮＡチップ、ゲル電気泳動、放射性測定、蛍光測定又は燐光測定によって実行され得るが、これに制限されない。増幅産物を検出する方法の１つとして、ゲル電気泳動を行える。ゲル電気泳動は、増幅産物の大きさによってアガロースゲル電気泳動又はアクリルアミドゲル電気泳動を利用できる。また、蛍光測定方法は、プライマの５’-末端にＣｙ-５又はＣｙ-３を標識してＰＣＲを行えば、標的配列が検出可能な蛍光標識物質で標識され、このように標識された蛍光は、蛍光測定器を用いて測定できる。また、放射性測定方法は、ＰＣＲの実行時に３２Ｐ又は３５Ｓなどのような放射性同位元素をＰＣＲ反応液に添加して増幅産物を標識した後、放射性測定器具、例えば、ガイガー計数器（Ｇｅｉｇｅｒ  ｃｏｕｎｔｅｒ）又は液体閃光計数器（ｌｉｑｕｉｄ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて放射性を測定できる。
【００３４】
また、本発明は、生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に迅速に吸収させることができる多孔性固体相と、標的プライマセットと、増幅反応を行うための試薬を含む、生物学的試料内で標的配列を増幅するための核酸増幅反応用キットを提供する。
【００３５】
本発明の前記核酸増幅反応用キットは、マイクロＲＮＡの分離、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの分離又はｃＤＮＡの合成に利用される試薬を含むことができるが、これに制限されない。
【００３６】
本発明の一実現例に係るキットにおいて、前記増幅反応を行うための試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、バッファなどを含むことができる。また、本発明のキットは、最適な反応実行条件を記載した使用者案内書を追加で含むことができる。案内書は、キットの使用法、例えば、ＰＣＲ緩衝液の製造方法、提示される反応条件などを説明する印刷物である。案内書は、パンフレット又は広告紙形態の案内冊子、キットに付着されたラベル、及びキットを含むパッケージの表面上に説明を含む。また、案内書は、インターネットのように電気媒体により公開されたり、提供される情報を含む。
【００３７】
本発明の一実現例に係るキットにおいて、前記核酸増幅反応は、ｃＤＮＡの合成、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ又はＲＴ-ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）であり得るが、これに制限されない。また、前記多孔性固体相は、前述した通りである。
【００３８】
また、本発明は、生物学的試料内に存在する生物学的分子を孔隙に迅速に吸収させることができる多孔性固体相を含む、生物学的試料から核酸増幅反応用生物学的分子を迅速に分離するためのキットを提供する。
【００３９】
本発明の一実現例に係るキットにおいて、前記核酸増幅反応は、ｃＤＮＡの合成、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ又はＲＴ-ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）であり得るが、これに制限されない。また、前記多孔性固体相は、前述した通りである。
【００４０】
また、本発明は、生物学的試料内に存在する生物学的分子を孔隙に迅速に吸収させることができる多孔性固体相を含む、生物学的試料から核酸増幅反応用生物学的分子を迅速に分離するための組成物を提供する。前記組成物は、有効成分として本発明の生物学的試料内に存在する生物学的分子を孔隙に迅速に吸収させることができる多孔性固体相を含み、生物学的試料内に存在する生物学的分子を前記多孔性固体相の孔隙に迅速に吸収させて核酸増幅反応に利用できるものである。前記多孔性固体相は、前述した通りである。
【００４１】
本発明の一実現例に係る組成物において、前記核酸増幅反応は、ｃＤＮＡの合成、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ又はＲＴ-ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）であり得るが、これに制限されない。また、前記多孔性固体相は、前述した通りである。
【００４２】
以下、本発明を実施形態によって詳細に説明する。但し、下記の実施形態は、本発明を例示するだけであって、本発明の内容が下記の実施形態に限定されるものではない。
【００４３】
実施形態１．多孔性セラミックキューブを用いた遺伝体の吸着とＲＴ-ＰＣＲ／ＰＣＲ鋳型としての活用
本発明の多孔性セラミックキューブを用いた遺伝体の吸着とＲＴ-ＰＣＲ／ＰＣＲ鋳型としての活用模式図を図１に示した。本発明では、１立方ミリメートル（１ｍｍ３）のキューブ表面に孔隙の大きさが変わるように表１に記載された主成分を材料で製作温度を異にして１４種のキューブを製作し、その多孔性セラミックキューブを拡大したものを図１Ｂに示した。キューブは多孔性であるので、孔隙よりも小さな物質を非選択的に吸収するが、孔隙の大きさを異にして（一般に高い温度でセラミックを製作する場合、孔隙が小さくなる）組織が破砕される際に出てくる様々な物質の中から所望のものを選択的に吸収、即ち孔隙の大きさによってＰＣＲ阻害物質を最大限排除できる孔隙の大きさで超微細ろ過（ｕｌｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）機能をキューブに付与することに目的がある。
【００４４】
本発明では、前記製作した１個の多孔性セラミックキューブを植物体の葉に乗せ、ピンＶの頭部面でキューブを押圧して組織が破砕されると同時に、キューブの孔隙に遺伝体が吸収されるように設計し、前記遺伝体が吸収された１個のキューブをＲＴ-ＰＣＲ或いはＰＣＲ鋳型として用いた結果をアガロースジェルから確認した（図１Ｅ）。
【００４５】
実施形態２．陶器の切片を用いた生物学的試料から核酸増幅反応のためのＤＮＡ／ＲＮＡ鋳型の分離
青磁と白磁を含む７種類の陶器の切片をニッパ（ｎｉｐｐｅｒ）で細かく破砕し、釉薬を含まない部位のうち、大きさが約１ｍｍ３の破片を選んで遺伝体の吸着材料として用いた。図２Ａの５番の陶器の切片の場合、釉薬が塗布された部位によって黄色と灰色とに区分されたが、これらのそれぞれから得た黄土色の破片は５と、灰色の破片は６と表記した。Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ  ＣＭ３３４の唐辛子の葉にそれぞれの陶器の破片を乗せ、ピンＶの扁平な頭部分で陶器の破片を軽く押圧してｇＤＮＡを吸収するようにした。唐辛子の毛茸と関連する分子マーカーを検定できるプライマプリミックスが添加されたＰＣＲチューブにｇＤＮＡを吸収させたそれぞれの陶器の破片をチューブ当たり１個ずつ添加した。ＰＣＲプリミックスは、１０ｐｍｏｌセンスプライマ（Ｔｓｃａ-Ｆ：ＡＡＡＣＧＣＣＡＴＣＡＴＴＣＧＴＴＴＴＣ：配列番号１）０.５ｕｌ、１０ｐｍｏｌアンチセンスプライマ（Ｔｓｃａ-Ｒ：ＣＡＴＧＡＡＡＧＴＴＧＡＣＣＣＧＡＡＣＡ：配列番号２）０.５ｕｌ、４ｕｌのｒＴａｑ-Ｍｉｘ、１５ｕｌのＤＷで構成され、ＰＣＲ産物は９４℃で３分間変性させた後（９４℃／３０秒、５９℃／３０秒、７２℃／６０秒）で３５回増幅し、７２℃／５分間反応させた後、ＥｔＢｒを含む１％のアガロースゲル相で電気泳動して目的ＰＣＲ産物の増幅有無を確認した。
【００４６】
その結果、図２Ｂのように、陶器の破片４、５、６ではＰＣＲ産物が増幅されることが確認できた。ゲノムＤＮＡの増幅が最も効率よく行われた陶器の破片４の表面を電子顕微鏡で観察した結果、陶器内の孔隙が多様な大きさで分布することが確認できた（図３のＡ）。しかしながら、陶器の破片の表面や面積を同一に調節できない状況で陶器の破片の種類とＰＣＲ産物の増幅効率を明確に区別するのには多少困難があった。
【００４７】
従って、それぞれの陶器の破片が唐辛子のｇＤＮＡをある程度吸収し、これが実際にＰＣＲに適用できるかを確認するために、葉の代わりに精製したＣＭ３３４のｇＤＮＡ（１ｕｇ／ｕｌ）を材料として用いた。精製したｇＤＮＡを１ｕｌずつプラスチックペトリ皿の表面に落とした後、それぞれの陶器の破片でｇＤＮＡを吸収し、これらのＰＣＲ用鋳型として用いた。図２Ｃのように、１ｕｌのＣＭ３３４のｇＤＮＡを鋳型として用いた陽性対照区（ＰＣ）と同様に同一の大きさのＰＣＲ産物が全ての処理区で増幅されることが確認でき、これらの濃度には多少差があったが、これは用いた陶器の破片の大きさや表面積が均一でないことに起因することが判断された。一方、ｇＤＮＡを吸収した前記陶器の破片は、ＰＣＲ増幅用鋳型として使用できることを確認したが、これらを植物ウイルスの診断に活用できるかについての可能性を調べた。ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて陰性と陽性対照区用ＲＮＡを精製するために、ウイルスに感染していない健全なＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｒｕｓｔｉｃａタバコの葉（ＮＣ用）とＴｏｍａｔｏ  ｓｐｏｔｔｅｄ  ｗｉｌｔ  ｖｉｒｕｓ（ＴＳＷＶ）を人工的に感染させたＮｉｃｏｔｉａｎａｒｕｓｔｉｃａタバコの葉（ＰＣ用）からＲＮＡ全体を分離し、これを逆転写反応用鋳型として用いた。ＴＳＷＶに感染したタバコの葉にそれぞれの陶器の破片を乗せ、ピンＶで押圧してＲＮＡ或いはウイルス粒子を吸収させ、これらのフラグメントを１個ずつ、１０ｐｍｏｌアンチセンスプライマＴＳＮＣＰＲ（５’-ＴＣＡＡＧＣＡＡＧＴＴＣＴＧＣＧＡＧＴＴ-３’：配列番号３）０.５ｕｌが添加された逆転写反応用ＲＴ-プリミックス（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｐｒｅｍｉｘ、ＥＬＰＩＳ-Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｋｏｒｅａ）にチューブ当たり１個ずつ添加した。４２℃で１時間逆転写反応を行った後、反応液１ｕｌをＰＣＲ用鋳型として用いた。ＰＣＲプリミックスは、１０ｐｍｏｌセンスプライマ（Ｔｓｃａ-Ｆ ＡＡＡＣＧＣＣＡＴＣＡＴＴＣＧＴＴＴＴＣ：配列番号４）０.５ｕｌ、１０ｐｍｏｌアンチセンスプライマ（Ｔｓｃａ-Ｒ ＣＡＴＧＡＡＡＧＴＴＧＡＣＣＣＧＡＡＣＡ：配列番号５）０.５ｕｌ、４ｕｌのｒＴａｑ-Ｍｉｘ、１０ｕｌのＤＷで構成された。ＰＣＲ反応は９４℃で３分間変性させ、（９４℃／３０秒、５０℃／３０秒、７２℃／６０秒）で３５回増幅し、７２℃／５分間反応させた後、ＥｔＢｒを含む１％のアガロースゲル相で電気泳動して目的ＰＣＲ産物（７７７ｂｐ）の増幅有無を確認した。図２Ｄのように、４番と６番陶器の破片を除いた残りの陶器の破片処理区で予想するＲＴ-ＰＣＲ産物が成功裏に増幅されることが確認できた。これは陶器の破片に吸収されたＴＳＷＶ  ＲＮＡ或いはＴＳＷＶ粒子だけでもＴＳＷＶ検定が可能であることを意味し、図２Ｂに明示されたｇＤＮＡよりもＲＴ-ＰＣＲでＰＣＲ産物が、より増幅が効率よく行われたのは、逆転写反応によってＰＣＲ鋳型が更に多く生成されたためであると判断された。以上の結果から陶器の破片を一定の大きさで製作し、これを生物学的分子を吸収するために用いれば、より優れた結果が得られることが判断された。
【００４８】
実施形態３．酸化物材質の多孔性セラミックキューブの種類による生物学的分子の吸収率の調査
表１に記載された酸化物を主成分として製造されたそれぞれの多孔性セラミックキューブの表面を電子顕微鏡（ＳＥＭ）で拡大した写真を図３に示した。セラミック主成分及び製作温度によって表面と孔隙の大きさに差があるので、目的とする生物学的分子の吸収率を高めるためには、セラミックキューブの最適な孔隙の大きさ及び数を有するように製作して使用しなければならない。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
（１）ＣＭＶに感染したカプシクム・アンヌームＣＭ３３４の唐辛子の葉から分離した総ＲＮＡとＣＭ３３４唐辛子から分離したゲノムＤＮＡ対象
酸化物材質の多孔性セラミックキューブの種類による生物学的分子の吸収効率を調べるために、ＣＭＶに感染した唐辛子の葉から分離した総ＲＮＡとＣＭ３３４の唐辛子から分離したゲノムＤＮＡをそれぞれのセラミックキューブで吸収させた後、これをＲＴ-ＰＣＲとＰＣＲ用鋳型として用いた。ＣＭＶはＲＴ-ＰＣＲプリミックス（ＲＴａｍｐ１、Ｂｉｏｃｕｂｅｓｙｓｔｅｍ、Ｋｏｒｅａ）にセンス（５’-ＴＡＣＡＴＴＧＡＧＴＣＧＡＧＴＣＡＴＧ-３’：配列番号６）及びアンチセンス（５’-ＴＧＧＡＡＴＣＡＧＡＣＴＧＧＧＡＣＡ-３’：配列番号７）プライマをそれぞれ２５ｐｍｏｌの濃度で添加し、５０℃／２０分、９４℃／１０分、（９４℃／３０秒、５５℃／３０秒、７２℃／６０秒）３５回、７２℃／５分間反応させた後、ＥｔＢｒを含む１％のアガロースゲル相で電気泳動して目的ＰＣＲ産物（６７０ｂｐ）の増幅有無を確認した（図４Ａ）。ｇＤＮＡの場合、カプシクム・アンヌームＣＭ３３４（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ  ＣＭ３３４）唐辛子の葉から分離した高濃度（１００uｇ）のｇＤＮＡを多孔性セラミックキューブでそれぞれ吸収させ、ＰＣＲチューブ当たり１個ずつ添加した。ＰＣＲプリミックスは、１０ｐｍｏｌセンスプライマ（Ｔｓｃａ-Ｆ：ＡＡＡＣＧＣＣＡＴＣＡＴＴＣＧＴＴＴＴＣ：配列番号８）０.５ｕｌ、１０ｐｍｏｌアンチセンスプライマ（Ｔｓｃａ-Ｒ：ＣＡＴＧＡＡＡＧＴＴＧＡＣＣＣＧＡＡＣＡ：配列番号９）０.５ｕｌ、４ｕｌのｒＴａｑ-Ｍｉｘ、１５ｕｌのＤＷで構成され、ＰＣＲ産物は９４℃で３分間変性させた後（９４℃／３０秒、５９℃／３０秒、７２℃／６０秒）で３５回増幅し、７２℃／５分間反応させた後、ＥｔＢｒを含む１％のアガロースゲル相で電気泳動して目的ＰＣＲ産物の増幅有無を確認した。ウイルスＲＮＡの場合も４Ａのように、１４種セラミックキューブは何れも類似する結果を示した（図４Ａ）。反面、精製されたｇＤＮＡを用いたＰＣＲ反応の効率は、キューブの材質と製作温度によって異なって現れた（図４Ｂ）。レーン１（Ａｌ２Ｏ３、１４５０℃）とレーン２（Ａｌ２Ｏ３、１５５０℃）では増幅量に大きな差がなく、低い温度で製作されたレーン３（Ｆｅ２Ｏ３、８００℃）とレーン４（Ｆｅ２Ｏ３、８５０℃）では増幅が殆ど行われなかったが、高温で製作したレーン５（Ｆｅ２Ｏ３、９００℃）では弱く増幅された。レーン６（ＬＴＣＣ、６５０℃）は増幅されなかったが、レーン７（ＬＴＣＣ、７５０℃）とレーン８（ＬＴＣＣ、８５０℃）では強く増幅された。レーン９（ＰｂＯ、１０００℃）とレーン１１（ＰｂＯ、１２５０℃）は増幅量が少ないが、レーン１０（ＰｂＯ、１１５０℃）は強く増幅された。レーン１２（ＺｎＯ、８００℃）とレーン１４（ＺｎＯ、１０００℃）は殆ど増幅されなかったが、レーン１３（ＺｎＯ、９００℃）は弱く増幅された。以上のような結果を総合してみると、キューブ材料と製作温度によってゲノムＤＮＡの吸収率に差があり、レーン８（ＬＴＣＣ、８５０℃）、レーン１１（ＰｂＯ、１２５０℃）、レーン１４（ＺｎＯ、１０００℃）のように孔隙が殆どない構造では本実験で用いたＰＣＲ条件では検出されない程度に少ない量のゲノムＤＮＡが吸収されることが判断された��
【００５１】
（２）ＣＭＶに感染した唐辛子の葉と精製したＣＭＶ粒子対象
多孔性セラミックキューブの種類による生物学的分子の吸収効率を調べるために、ＣＭＶに感染した唐辛子の葉と精製したＣＭＶ粒子をそれぞれのセラミックキューブで吸収させた後、これをＲＴ-ＰＣＲとＰＣＲ用鋳型として用いた。ＣＭＶはＲＴ-ＰＣＲプリミックス（ＲＴａｍｐ１、Ｂｉｏｃｕｂｅｓｙｓｔｅｍ、Ｋｏｒｅａ）にＣＭＶ粒子対象特異的プライマセットインセンス（５’-ＴＡＣＡＴＴＧＡＧＴＣＧＡＧＴＣＡＴＧ-３’：配列番号１０）及びアンチセンスプライマ（５’-ＴＧＧＡＡＴＣＡＧＡＣＴＧＧＧＡＣＡ-３’：配列番号１１）をそれぞれ２０ｐｍｏｌの濃度で添加し、５０℃／２０分、９４℃／１０分、（９４℃／３０秒、５５℃／３０秒、７２℃／６０秒）３５回、７２℃／５分間反応させた後、ＥｔＢｒを含む１％のアガロースゲル相で電気泳動して目的ＰＣＲ産物（６７０ｂｐ）の増幅有無を確認した。精製したウイルスを多孔性セラミックキューブで吸収させたとき、ＰＣＲ産物がより多く増幅されたが、両処理区間のＰＣＲ産物増幅の様相は類似している（図５）。
【００５２】
（３）多孔性セラミックキューブの製作温度及び材質による生物学的分子の吸収率
図５Ａのレーン１、２は、主成分はＡｌ２Ｏ３で同一であるが、製作温度は１４５０℃、１５５０℃であり、レーン３、４、５の主成分はＦｅ２Ｏ３で同一であるが、製作温度は８００℃、８５０℃、９００℃でＡｌ２Ｏ３及びＦｅ２Ｏ３をそれぞれ１５５０℃及び９００℃で製作した多孔性セラミックキューブを用いてＤＮＡを分離させた場合、ＰＣＲ効率が高く現れた。レーン６、７、８も主成分はＬＴＣＣ（Ｌｏｗ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｃｏ-ｆｉｒｅｄ ｃｅｒａｍｉｃ）で同一であるが、製作温度は６５０℃、７５０℃、８５０℃であり、レーン６は全く増幅されていない結果を示し、レーン８が７よりも増幅がより効率よく行われることが明らかになった。
【００５３】
（４）多孔性セラミックキューブを用いた唐辛子ＤＮＡの増幅効率の分析
カプシクム・アンヌームｓｒ１０（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ  ｓｒ１０）唐辛子の葉上に多孔性セラミックキューブを１つ乗せ、ピンＶの頭部分で押圧してそれぞれのキューブでｇＤＮＡを吸収させ、これをＰＣＲチューブ当たり１個ずつ添加した。ＰＣＲ反応液は２Ｘ  ＰＣＲプリミックス（ｇＤａｍｐ１、Ｂｉｏｃｕｂｅｓｙｓｔｅｍ、Ｋｏｒｅａ）１０ｕｌに１０ｐｍｏｌセンスプライマ（Ｐｒｉｍｅｒ  １０-Ｆ：５’-ＴＧＧＣＴＴＡＴＣＧＡＡＧＧＡＧＣＣＡＴ-３’：配列番号１２）０.５ｕｌ、１０ｐｍｏｌアンチセンスプライマ（Ｐｒｉｍｅｒ  １０-Ｒ：５’-ＡＧＡＴＧＡＡＡＣＣＡＡＡＧＣＣＴＣＣＡ-３’：配列番号１３）０.５ｕｌ、ｇＤＮＡが吸収された１個のキューブ、９ｕｌのＤＷを添加して準備し、陽性対照区ではキューブの代わりに精製したｇＤＮＡ（２０ｎｇ／ｕｌ）２ｕｌと７ｕｌのＤＷを添加して準備した。ＰＣＲ産物は、９４℃で３分間変性させた後、９４℃／３０秒、５８℃／３０秒、７２℃／６０秒で３５回、７２℃／５分間反応させて増幅し、ＥｔＢｒを含む１％のアガロースゲル相で電気泳動して目的ＰＣＲ産物の増幅有無を確認した。その結果、レーン５（Ｆｅ２Ｏ３、９００℃）、レーン８（ＬＴＣＣ、８５０℃）、レーン９（ＰｂＯ、１０００℃）、１０（ＰｂＯ、１１５０℃）及びレーン１４（ＺｎＯ、１０００℃）は増幅が効率よく行われ、レーン６（ＬＴＣＣ、６５０℃）、レーン７（ＬＴＣＣ、７５０℃）及びレーン８（ＬＴＣＣ、８５０）とレーン１２（ＺｎＯ、８００℃）、レーン１３（ＺｎＯ、９００℃）及びレーン１４（ＺｎＯ、１０００℃）は、製作温度によって増幅効率が明確に区別された（図６）。
【００５４】
実施形態４．製作条件によるＬＴＣＣ多孔性セラミックキューブ
（１）ＬＴＣＣ多孔性セラミックキューブの製作温度がＰＣＲ増幅に及ぼす影響
反復実験の結果、ＺｎＯよりもＬＴＣＣ材料で製作温度によるｇＤＮＡ増幅の差は明確に現れた（図６参照）。製作温度によるｇＤＮＡの増幅効率をより綿密に調べるために、ＬＴＣＣ多孔性セラミックキューブ５種（３０〜３４）を新たに製作した。製作温度は６５０〜８５０℃で５０℃間隔で製作した（３０（ＬＴＣＣ、６５０℃）、３１（ＬＴＣＣ、７００℃）、３２（ＬＴＣＣ、７５０℃）、３３（ＬＴＣＣ、８００℃）、３４（ＬＴＣＣ、８５０℃））。この際に用いたプライマは、センスプライマ（Ｐｒｉｍｅｒ  １０-Ｆ：５’-ＴＧＧＣＴＴＡＴＣＧＡＡＧＧＡＧＣＣＡＴ-３’：配列番号１２）、アンチセンスプライマ（Ｐｒｉｍｅｒ  １０-Ｒ：５’-ＡＧＡＴＧＡＡＡＣＣＡＡＡＧＣＣＴＣＣＡ-３’：配列番号１３）とセンスプライマ（Ｐｒｉｍｅｒ  １４６-Ｆ：５’-ＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＣＡ-３’：配列番号１４）、アンチセンスプライマ（Ｐｒｉｍｅｒ  １４６-Ｒ：５’-ＴＧＧＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＧＧＧＡＴＣＴ-３’：配列番号１５）の２種類を用いた。ＰＣＲ産物は９４℃で３分間変性させた後、９４℃／３０秒、５８℃／３０秒、７２℃／６０秒で３５回、７２℃／５分間反応させて増幅し、ＥｔＢｒを含む１％のアガロースゲル相で電気泳動して目的ＰＣＲ産物の増幅有無を確認した（図７）。
【００５５】
ＰＣＲ結果を示した図７を詳察すると、レーン３０（ＬＴＣＣ、６５０℃）の場合、２種類のプライマとも図６のレーン６（ＬＴＣＣ、６５０℃）のようにｇＤＮＡの増幅が行われなかった。レーン３１（ＬＴＣＣ、７００℃）ではプライマ１０では弱く増幅されたが、プライマ１４６では増幅が効率よく行われた。レーン３２（ＬＴＣＣ、７５０℃）とレーン３３（ＬＴＣＣ、８００℃）ではプライマの両方で増幅が非常に効率よく行われた。反面、レーン３４（ＬＴＣＣ、８５０℃）ではレーン３１（ＬＴＣＣ、７００℃）と類似する結果を示したが、これはプライマによってＰＣＲ増幅の効率が変わリ得ることを示唆するものである。以上の結果から多孔性セラミックキューブをＬＴＣＣで製作するとき、適した製作温度は７５０℃〜８００℃であることが分析された。
【００５６】
（２）製作温度によるＬＴＣＣ多孔性セラミックキューブの表面（Ａ〜Ｅ）と内部（Ｆ〜Ｊ）の切断面
製作温度によるキューブの特性を調べるために、５種のＬＴＣＣ多孔性セラミックキューブを製作し、これらの表面（図８Ａ〜Ｅ）と内部（図８Ｆ〜Ｊ）の切断面、物質吸収能力及びろ過能力をＳＥＭとＴＥＭでそれぞれ調べた。キューブの表面（図８Ａ〜Ｅ）と内部（図８Ｆ〜Ｊ）の切断面の製造温度が増加するほど滑らかな傾向を示した。両場合ともポアサイズはｕｍ水準ではほぼ類似し、温度が高いほどポア数が減少する傾向を示した。
【００５７】
（３）製作温度によるＬＴＣＣ多孔性セラミックキューブの物質吸収能力とろ過能力の分析
ポア数が減少するということは、分子吸収量が少なくなるものと理解できるが、より明確な資料を得るために、製作温度が異なるＬＴＣＣ多孔性セラミックキューブの物質吸収能力とろ過能力を人為的に製作した金ナノ粒子（平均直径が４０ｎｍ）とポリスチレン粒子（平均サイズ直径が２ｕｍ、５ｕｍ、３８〜４５ｕｍ、Ｂｅａｄｓ＆Ｍｉｃｒｏ、Ｋｏｒｅａ）の混合液を用いて調べた。直径が異なる前記２種類の物質の混合液２０ｕｌ当たり同一温度で製造した１０個のキューブを浸漬し、マイクロピペットとフィルタペーパを用いて余液を完全に除去した。同一のチューブに滅菌水を１０ｕｌ添加した後、６５℃で３０分間定置し、１０秒間ボルテックスした後、残ったキューブの表面特性と洗浄液（ｗａｓｈｉｎｇ）の粒子分布を観察した（ＳＥＭは５０００倍、ＴＥＭは２５０倍）。
【００５８】
キューブの表面を５０００倍で観察した結果、図９Ｄ及び９Ｅで容易に観察できたポアに類似する大きさの粒子（概略的な直径が１ｕｌ以内）が集中的に分布し（図９Ｄ及び９Ｅ）、３３及び３４キューブの表面で明確に区分された。キューブ洗浄液をＴＥＭで観察したとき、直径が３８ｕｍ以上の粒子は、全ての処理区で希に観察された（資料提示せず）。これはキューブ表面に付いた混合液が完全に除去されないことから発生した結果であると判断された。一方、直径が２〜５ｕｍの粒子も全ての処理区では均等に観察され、３０（ＬＴＣＣ、６５０℃）処理区では他の処理区に比べて溶出された粒子の量が遥かに多く（図９Ｆ）、他の処理区では直径が概略２ｕｍの粒子が主に観察された（図９Ｇ〜Ｊ）。ＤＮＡの増幅結果が最も良好な３３（ＬＴＣＣ、８００℃）キューブ処理区では、他の処理区に比べて２ｕｍ以下の粒子が主に分布した。
【００５９】
図９の結果は、合成粒子が多孔性セラミックキューブの吸収力により受動的にポア中に吸い込まれて入るだけでなく、同時にポアの直径によって粒子が選択的に吸い込まれ得ることを意味するが、実際に３３と３４キューブの洗浄液をより高い倍率で観察したとき、溶出された粒子直径は２６ｎｍから５００ｎｍ程度（図１０Ａ及び図１０Ｂ）で非常に一定の大きさで分布した。これはポアサイズを一定に調節する場合、特定サイズの粒子を選択的に吸収できることを示唆するものである。
【００６０】
（４）キューブの表面の特性がＰＣＲ産物の増幅効率に及ぼす影響
表面の粗さとポア数が生物学的分子（ここでは、ｇＤＮＡ）の吸収量にどれだけ影響を与えるかを調べた。ＤＮＡの増幅結果が最も良好な３３（ＬＴＣＣ、８００℃）キューブの表面を４８時間と７２時間研磨し、これらの表面特性とＰＣＲの増幅効率を比較した。
【００６１】
唐辛子の葉上に１つの多孔性セラミックキューブを乗せ、ピンＶの頭部分で押圧してそれぞれのキューブで吸収させ、これをＰＣＲチューブ当たり１個ずつ添加した。ＰＣＲ反応液は、２Ｘ  ＰＣＲプリミックス（ｇＤａｍｐ１、Ｂｉｏｃｕｂｅｓｙｓｔｅｍ、Ｋｏｒｅａ）１０ｕｌに１０ｐｍｏｌセンスプライマ０.５ｕｌ、１０ｐｍｏｌアンチセンスプライマ０.５ｕｌ、ｇＤＮＡが吸収された１個のキューブ、９ｕｌのＤＷを添加して準備し、陽性対照区ではキューブの代わりに精製したｇＤＮＡ（２０ｎｇ／ｕｌ）２ｕｌと７ｕｌのＤＷを添加して準備した。ＰＣＲ産物は９４℃で３分間変性させた後、９４℃／３０秒、５８℃／３０秒、７２℃／６０秒で３５回、７２℃／５分間反応させて増幅し、ＥｔＢｒを含む１％のアガロースゲル相で電気泳動して目的ＰＣＲ産物の増幅有無を確認した。
【００６２】
キューブそれぞれの表面を観察した結果、表面の粗い程度は４８時間、７２時間、０時間の順に増加し、ポア数は４８時間処理区が他の処理区に比べて少なく観察された。これらの試料を用いてＰＣＲ用プライマ１０番と１４６番でＤＮＡの増幅効率を調べた結果、４８時間研磨区では非研磨区に比べてＰＣＲの増幅効率が低かったが、７２時間処理区ではＰＣＲ産物の増幅効率が類似するか、多少高く現れた（図１１）。
【００６３】
以上の結果から、製作温度はキューブ表面の粗さと表面積及びポアサイズに影響を与えることが判断された。また、製作温度によるキューブの特性変化は、生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子（ここでは、ｇＤＮＡ或いは核）を多孔性固体相の孔隙に吸収する段階でＰＣＲ反応に利用される鋳型と反応抑止物質の吸収量全体に影響を与えると判断できる。しかしながら、何よりも重要な特性変化は、製作温度が多孔性キューブに存在するポアの数或いは大きさ、そして表面積を調節することで、ＰＣＲ阻害物質を選択的に除去するだけでなく、ＰＣＲに必要な十分な量の初期鋳型を獲得するのに多くの影響を与えるという点である。
【００６４】
実施形態５．本発明のＬＴＣＣキューブを用いてウイルスに複合感染したタバコの葉から分離した生物学的分子を鋳型としたマルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＲＴ-ＰＣＲ
ＣＭＶ（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）とＣｌＹＶＶ（Ｃｌｏｖｅｒ  ｙｅｌｌｏｗ  ｖｅｉｎ  ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）をタバコ（Ｎ.ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）に複合感染させてウイルスを増殖させた後、複合感染したタバコの葉上に多孔性セラミックキューブ（３３、ＬＴＣＣ、８００℃）を１つ乗せ、ピンＶの頭部分で押圧してキューブで生物学的分子（ウイルス粒子又はウイルスｉｎｔｅｒｍｉｄｉａｔｅ  ｆｏｒｍ）を吸収させた。鋳型が吸収されたキューブをＰＣＲチューブ当たり１個ずつ添加し、ＲＴ-ＰＣＲ反応液を分注した。各ウイルスを単独で検出する場合、ＲＴ-ＰＣＲ反応液はＲＴ-ＰＣＲプリミックス（ＲＴａｍｐ１、Ｂｉｏｃｕｂｅｓｙｓｔｅｍ、Ｋｏｒｅａ）に１０ｐｍｏｌセンスプライマ１ｕｌ、１０ｐｍｏｌアンチセンスプライマ１ｕｌ、鋳型が吸収された１個のキューブ、１８ｕｌのＤＷを添加して準備した。マルチプレックスＲＴ-ＰＣＲでは該当ウイルスのプライマを前記のように添加した後、６ｕｌのＤＷを添加して準備した。ＰＣＲ産物は９４℃で３分間変性させた後、５２℃／２０分、９４℃／３０秒、６８℃／３０秒、７２℃／６０秒で３５回、７２℃／５分間反応させて増幅し、ＥｔＢｒを含む１％のアガロースゲル相で電気泳動して目的ＰＣＲ産物の増幅有無を確認した。ＲＴ-ＰＣＲに用いたプライマはＣＭＶの場合、ＤＰＵ１センスプライマ（５’-ＣＧＴＣＧＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＴＣＣＧ-３’：配列番号１６）とＤＰｄ２アンチセンスプライマ（５’-ＡＧＣＧＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＡＡＡＧＡＴ-３’：配列番号１７）を用い、ＣｌＹＶＶの場合、２Ｆセンスプライマ（５’-ＴＡＡＧＡＧＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＧＡ-３’：配列番号１８）と２Ｒアンチセンスプライマ（５’-ＧＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＧＧＴＡＡＣＡ-３’：配列番号１９）を用いた。図１２の結果により、これは多孔性セラミックキューブに吸収された鋳型として現在の反応液でマルチプレックスＲＴ-ＰＣＲが十分に可能であることを意味した。
【００６５】
実施形態６．本発明のＬＴＣＣキューブを用いて大腸菌を対象にＢＡＣプラスミドの増幅
多孔性セラミックキューブは、吸収能力と共にろ過効果があると分析されたが、これを細菌培養液をキューブに吸収させ、これを鋳型として用いたとき、ＰＣＲが成功裏に行われるかによって確認した。ＢＡＣコロニーを滅菌された楊枝で大腸菌培養用液体バッチ５ｍｌに接種し、陽性対照区で１５時間培養した大腸菌を、増殖液１ｕｌ、２ｕｌ、３ｕｌ、４ｕｌを鋳型として用いた。ラップを実験台上に扁平に敷き、ラップ上に大腸菌培養液を１０ｕｌずつ分注した後、多孔性セラミックキューブ（３４、ＬＴＣＣ、８５０℃）を１つ、２つ、３つ、４つそれぞれ入れて大腸菌を吸収させた。ピンＶで大腸菌が吸収されたキューブを取り上げ、ピンＶに付いた余液をティッシュで除去した後、それぞれのキューブをＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲ反応液を添加した。ＰＣＲ反応液は、２Ｘ  ＰＣＲプリミックス（ｇＤａｍｐ１、Ｂｉｏｃｕｂｅｓｙｓｔｅｍ、Ｋｏｒｅａ）１０ｕｌに１０ｐｍｏｌセンスプライマ（Ｐｒｉｍｅｒ：５’-ＧＴＣＡＡＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＧＣＴＡＴＧＴＣＴ-３’：配列番号２０）１ｕｌ、１０ｐｍｏｌアンチセンスプライマ（Ｐｒｉｍｅｒ：５’-ＣＡＣＴＡＴＡＧＡＧＡＡＣＴＡＧＧＴＡＴＧＴＣＧＴＴＧ-３’：配列番号２１）１ｕｌ、鋳型が吸収された１〜４個のキューブは、９５℃で３分間変性させた後、９５℃／３０秒、５８℃／３０秒、７２℃／６０秒で３０回、７２℃／１０分間反応させて増幅し、ＥｔＢｒを含む１％のアガロースゲル相で電気泳動して目的ＰＣＲ産物の増幅有無を確認した（図１３）。培養液を直接ＰＣＲ鋳型として用いたとき、添加した鋳型の量によってＰＣＲ増幅産物量が比例的に増加しなかった。反面、培養液が吸収された多孔性セラミックキューブ処理区ではＰＣＲ増幅産物の量が一定であった。これは１個の多孔性セラミックキューブに吸収された鋳型だけでも現在の反応液でＰＣＲ増幅が十分に発生したことを意味した。従って、細菌を鋳型とするＰＣＲ増幅にも多孔性セラミックキューブが成功裏に利用され得ることを意味した。
【００６６】
実施形態７．生物学的分子を吸収させるために利用可能な多孔性セラミックの形態
本発明では目的に応じて生物学的試料から生物学的分子を効率的に吸収させるために、図１４のような構造が利用可能である。基本構造として孔隙のある正六面体、円柱、球又は直六面体が可能であり（図１４Ａ）、吸収力を高めるために内部に大きな孔隙を含む形態が可能である（図１４Ｂ）。図１４Ａの構造では単に表面孔隙に遺伝体を選択的に吸収するが、図１４Ｂの場合は、図１４Ａよりも吸収率を高めて吸収する遺伝体の量を多くする構造である。これはホール外壁の孔隙サイズが一定にならなければならず、ホールの機能は吸収力を高めると同時に、ＰＣＲプライマを予め入れて置いてＰＣＲ段階を短縮できる。これは後で初期鋳型の量を多く必要とするゲノムＤＮＡ用ＰＣＲに適している。
【００６７】
また、図１４Ｃの中間及び右側に示した構造は、生物学的分子を吸収させた後、溝がある右側部位に少しだけ力を加えてこの部分が離脱してＰＣＲチューブに容易に入るようにしたものであるが、キューブの大きさがあまりにも小さいため、実際の製品を生産する際に利用できる構造として四角形の場合、棒の先端側１ｍｍ３程度で容易に離脱し得るように溝部分を一部切断したものであり、棒の頭部分は取っ手用として製作したプラスチック棒が挟まれる部位である。図１４Ｄの終端が鋭い形状を有する構造は、種子や樹木を対象とする場合、刺しやすくするための構造であるが、棒が同一材質で構成されているとき、棒全体に遺伝体が流入するおそれがあるため、棒部分の大きさだけ吸収力を高め、ＰＣＲチューブに入る先端部に遺伝体が集まるようにするために材料を異にして設計が可能であり、汚染防止及び吸収力の増加に非常に効果的である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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