(57)【要約】  本発明は、工業微生物学およびアルコール生産分野に関する。本発明はまた、改変経路を通じて発酵産物を生成できる微生物の開発、および微生物の使用にも関する。本発明はまた、細胞生存度および生産性を改善する方法、および発酵産物の収率を増大させる再循環および酸洗浄の使用にも関する。
2015503350.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ブタノール産生菌を提供するステップと、
（ｂ）ブタノールが有効収率で生成される条件下で、前記ブタノール産生菌を１つまたは複数の炭素基質と接触させるステップと；
（ｃ）前記ブタノール産生菌を収集するステップと；
（ｄ）ブタノールを少なくとも約６ｇ／Ｌの濃度で回収するステップと；
（ｅ）ブタノールが（ｂ）の有効収率の少なくとも約９０％である有効収率で生成される条件下で、（ｃ）の収集されたブタノール産生菌を１つまたは複数の炭素基質と接触させるステップと；
（ｆ）ステップ（ｃ）〜（ｅ）を反復するステップと；
任意選択的に、（ｃ）の収集されたブタノール産生菌を、少なくとも約０．３％のブタノールの存在下で少なくとも約１時間にわたり約２．０以下のｐＨ条件に曝露するステップと
を含んでなる、ブタノールを生産する方法。
【請求項２】
前記ブタノール産生菌が、イソブタノール産生菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生成されたブタノールが、イソブタノール、１−ブタノール、２−ブタノール、２−ブタノン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップｃ）〜ｅ）が少なくとも１０回繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ブタノール産生菌が、改変ブタノール生合成経路を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記改変ブタノール生合成経路が、改変イソブタノール生合成経路である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記改変ブタノール経路が、ＥＣ  ２．２．１．６、ＥＣ  １．１．１．８６、ＥＣ  ４．２．１．９、ＥＣ  ４．１．１．７２、ＥＣ  １．１．１．１、ＥＣ  １．１．１．２６５、ＥＣ  １．１．１．２、ＥＣ  １．２．４．４、ＥＣ  １．３．９９．２、ＥＣ
１．２．１．５７、ＥＣ  １．２．１．１０、ＥＣ  ２．６．１．６６、ＥＣ  ２．６．１．４２、ＥＣ  １．４．１．９、ＥＣ  １．４．１．８、ＥＣ  ４．１．１．１４、ＥＣ  ２．６．１．１８、ＥＣ  ２．３．１．９、ＥＣ  ２．３．１．１６、ＥＣ  １．１．１３０、ＥＣ  １．１．１．３５、ＥＣ  １．１．１．１５７、ＥＣ  １．１．１．３６、ＥＣ  ４．２．１．１７、ＥＣ  ４．２．１．５５、ＥＣ  １．３．１．４４、ＥＣ  １．３．１．３８、ＥＣ  ５．４．９９．１３、ＥＣ  ４．１．１．５、ＥＣ  ２．７．１．２９、ＥＣ  １．１．１．７６、ＥＣ  １．２．１．５７、およびＥＣ  ４．２．１．２８の酵素番号を有する一群の酵素から選択される、少なくとも１つのポリペプチドを含んでなる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記改変ブタノール経路が、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、バリンデヒドロゲナーゼ、バリンデカルボキシラーゼ、ωトランスアミナーゼ、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、イソブチリル−ＣｏＡムターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、アセトニンアミナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセトインキナーゼ、アセトインリン酸アミナーゼ、アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼ、アミノブタノールキナーゼ、ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、およびブタンジオールデヒドラターゼの酵素群から選択される、少なくとも１つのポリペプチドを含んでなる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ブタノール産生菌が、酵母である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵母が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、またはピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）のメンバーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵母が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ブタノール産生菌が、ＰＮＹ８６０の誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ブタノール産生菌が、さらにピルビン酸デカルボキシラーゼを発現しない、または発現が低下している、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ブタノール産生菌が、さらにグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを発現しない、または発現が低下している、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ブタノール産生菌が、さらにリン酸ジエステラーゼを発現しない、または発現が低下している、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記リン酸ジエステラーゼがＰＤＥ１である、請求項に１５記載の方法。
【請求項１７】
前記ブタノール産生菌が、さらにＢＤＨ１を発現しない、または発現が低下している、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｅ）において、ブタノールが、（ｂ）の有効収率の少なくとも約９９％で生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ブタノール産生菌が、（ｂ）の接触させるステップにおいて、少なくとも約２ｇｄｃｗ／Ｌの細胞密度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
（ｂ）のブタノール産生菌が、少なくとも１０回の反復する（ｃ）〜（ｅ）のステップにわたり、その比生産性を維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
（ｂ）において、ブタノールが、少なくとも約０．１ｇ／ｇｄｃｗ／ｈの有効速度で生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
（ｂ）の接触させるステップが、抽出剤の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記炭素基質が、オリゴ糖類、多糖類、単糖類、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記炭素基質が、フルクトース、グルコース、乳糖、マルトース、ガラクトース、スクロース、デンプン、セルロース、原材料、エタノール、乳酸、コハク酸、グリセロール、コーンマッシュ、サトウキビ、バイオマス、キシロースおよびアラビノースなどのＣ５糖、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
（ｂ）および（ｅ）の接触させるステップが、嫌気的または微好気的条件下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記改変イソブタノール生合成経路が、
ａ．ピルビン酸からアセト乳酸への
ｂ．アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への
ｃ．２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への
ｄ．α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの、および
ｅ．イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項２７】
前記基質から産物への変換の１つまたは複数が、補助因子としてＮＡＤＨを利用する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
約２未満のｐＨを有し、改変イソブタノール経路を含んでなるスクロース利用イソブタノール産生菌を含んでなる、組成物。
【請求項２９】
前記スクロース利用イソブタノール産生菌が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、またはピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）のメンバーである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記スクロース利用イソブタノール産生菌が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記スクロース利用イソブタノール産生菌が、ＰＮＹ８６０の誘導体である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
前記スクロース利用イソブタノール産生菌が、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への基質から産物への変換を触媒する改変酵素を含んでなる、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３３】
前記発現低下が、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の挿入、変異、置換、および／または欠失の結果である、請求項１３に記載の方法。
【請求項３４】
前記発現低下が、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の挿入、変異、置換、および／または欠失の結果である、請求項１４に記載の方法。
【請求項３５】
前記発現低下が、リン酸ジエステラーゼをコードする遺伝子の挿入、変異、置換、および／または欠失の結果である、請求項１５に記載の方法。
【請求項３６】
前記リン酸ジエステラーゼが、ＰＤＥ１である、請求項に３５記載の方法。
【請求項３７】
前記発現低下が、ＢＤＨ１をコードする遺伝子の挿入、変異、置換、および／または欠失の結果である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３８】
前記ブタノール産生菌が、さらにアセト乳酸還元酵素をコードする遺伝子を発現しない、または発現が低下している、請求項１３、１４、１５、１６、１７、３３、３４、３５、３６、または３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記発現低下が、ＹＭＲ２２６Ｃをコードする遺伝子の挿入、変異、置換、および／または欠失の結果である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
結果として得られた株の遺伝子型が、ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ  ｐｄｃ５Δ：：ｋｉｖＤ（ｙ）  ｆｒａ２Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６−ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ  ｂｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ  ｙｍｒ２２６ｃΔ／ｐＷＺ００９，ｐＷＺ００１である、請求項１３に記載の方法。
【請求項４１】
リン酸ジエステラーゼおよび／またはリン酸ジエステラーゼ活性の低下または排除を含んでなる、ブタノールを生成する微生物。
【請求項４２】
微生物が、リン酸ジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチド中の、挿入、欠失、変異、および／または置換を含んでなる、請求項４１に記載の微生物。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが、酵素番号ＥＣ  ３．１．４．１７に相当するリン酸ジエステラーゼ活性を有する、請求項４１または４２に記載の微生物。
【請求項４４】
前記リン酸ジエステラーゼ活性を有するポリペプチドが、ＰＤＥ１である、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項４５】
前記微生物が、改変ブタノール生合成経路をさらに含んでなる、請求項４１に記載の微生物。
【請求項４６】
前記改変ブタノール生合成経路が、改変イソブタノール生合成経路である、請求項４５に記載の微生物。
【請求項４７】
前記改変イソブタノール生合成経路が、
（ａ）ピルビン酸からアセト乳酸；
（ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸；
（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸から２−ケトイソ吉草酸；
（ｄ）２−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド；および
（ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノール
からなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、請求項４６に記載の微生物。
【請求項４８】
前記改変イソブタノール生合成経路が、アセト乳酸シンターゼ活性、ケト酸レダクトイソメラーゼ活性、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性、ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性、およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、請求項４７に記載の微生物。
【請求項４９】
前記微生物が、さらにピルビン酸デカルボキシラーゼを発現しない、または発現が低下している、請求項４５に記載の微生物。
【請求項５０】
前記発現低下が、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の挿入、変異、置換、および／または欠失の結果である、請求項４９に記載の微生物。
【請求項５１】
前記ピルビン酸デカルボキシラーゼが、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５０に記載の微生物。
【請求項５２】
前記微生物が、さらにグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを発現しない、または発現が低下している、請求項４５に記載の微生物。
【請求項５３】
前記発現低下が、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の挿入、変異、置換、および／または欠失の結果である、請求項５２に記載の微生物。
【請求項５４】
前記微生物が、さらにＢＤＨ１を発現しない、または発現が低下している、請求項４５に記載の微生物。
【請求項５５】
前記発現低下が、ＢＤＨ１をコードする遺伝子の挿入、変異、置換、および／または欠失の結果である、請求項５４に記載の微生物。
【請求項５６】
前記微生物が、さらにアセト乳酸還元酵素をコードする遺伝子を発現しない、または発現が低下している、請求項４５〜５５のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５７】
前記発現低下が、ＹＭＲ２２６Ｃをコードする遺伝子の挿入、変異、置換、および／または欠失の結果である、請求項５６に記載の微生物。
【請求項５８】
前記微生物が酵母細胞である、請求項４５〜５７のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５９】
前記酵母細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される酵母属のメンバーである、請求項５８に記載の微生物。
【請求項６０】
（ａ）アルコール発酵から微生物を収集するステップと；
（ｂ）前記微生物を富栄養培地と接触させるステップと
を含んでなる、細胞生存度および生産性を改善する方法。
【請求項６１】
（ａ）アルコール発酵から微生物を収集するステップと；
（ｂ）前記微生物を低ｐＨ条件に曝露するステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）からの微生物を収集するステップと；
（ｄ）前記微生物を富栄養培地と接触させるステップと
を含んでなる、細胞生存度および生産性を改善する方法。
【請求項６２】
（ａ）請求項４５〜５９のいずれか一項に記載のアルコール産生微生物を提供するステップと；
（ｂ）アルコールが生成される条件下で、前記微生物を１つまたは数複の炭素基質と接触させるステップと；
（ｃ）前記微生物を収集するステップと；
（ｄ）前記アルコールを回収するステップと；
（ｅ）ステップ（ｃ）の微生物を富栄養培地と接触させるステップと；
（ｆ）ステップ（ｅ）の微生物を収集するステップと；
（ｇ）アルコールが生成される条件下で、前記微生物を１つまたは数複の炭素基質と接触させるステップと；
（ｈ）任意選択的に、ステップ（ｃ）〜（ｇ）を反復するステップと
を含んでなる、アルコールを生産する方法。
【請求項６３】
（ａ）請求項４５〜５９のいずれか一項に記載のアルコール産生微生物を提供するステップと；
（ｂ）前記アルコールが生成される条件下で、前記微生物を１つまたは数複の炭素基質と接触させるステップと；
（ｃ）前記微生物を収集するステップと；
（ｄ）前記アルコールを回収するステップと；
（ｅ）ステップ（ｃ）の微生物を低ｐＨ条件に曝露するステップと；
（ｆ）ステップ（ｅ）からの微生物を収集するステップと；
（ｇ）ステップ（ｆ）の微生物を富栄養培地と接触させるステップと；
（ｈ）ステップ（ｇ）の微生物を収集するステップと；
（ｉ）前記アルコールが生成される条件下で、ステップ（ｉ）の微生物を１つまたは複数の炭素基質と接触させるステップと；
（ｊ）任意選択的に、ステップ（ｃ）〜（ｉ）を反復するステップ
を含んでなる、アルコールを生産する方法。
【請求項６４】
前記微生物を富栄養培地と接触させるステップが、好気的条件下で実施される、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ｐＨが約２以下である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記ｐＨが約２以下である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記ｐＨが約２〜約４である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６８】
前記ｐＨが約２〜約４である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、およびヘキサノールから選択される、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項７０】
前記ブタノールが、１−ブタノール、２−ブタノール、２−ブタノン、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、またはその混合物から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
富栄養培地と、請求項４５〜５９のいずれか一項に記載の微生物とを含んでなる組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、２０１１年１２月３０日に出願された米国仮出願第６１／５８１，８７７号明細書；２０１２年５月９日に出願されたインド国特許出願第１４２３／ＤＥＬＮＰ／２０１２号明細書；および２０１２年８月９日に出願された米国仮出願第６１／６８１，２３０号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
配列表
参照によって本明細書に援用する、明細書と共に提出された配列表（ＣＬ５１９６ＷＯＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ）に提供される配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含有する特許出願の要件−配列規則」）に準拠して、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（２００９）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（α−βｉｓ）、および実施細則の第２０８節および付録Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載される規則に従う。
【０００３】
本発明は、工業微生物学およびアルコール生産分野に関する。本発明また、改変経路を通じて発酵産物を生成できる微生物の開発、および微生物の使用にも関する。本発明はまた、細胞生存度および生産性を改善する方法、および発酵産物の収率を増大させる再循環および酸洗浄の使用にも関する。
【背景技術】
【０００４】
ブタノールは重要な工業化学物質であり、燃料添加剤として、プラスチック工業における原材料化学物質として、および食物および香料工業における食物等級抽出剤として有用である。毎年１００〜１２０億ポンドのブタノールが、石油化学製品に由来する出発原料を使用して、化学的合成によって生産される。オキソ合成、一酸化炭素の接触水素化（非特許文献１）、およびメタノールとｎ−プロパノールのゲルベ縮合（非特許文献２）などのブタノール異性体イソブタノールの化学合成法が知られている。これらの工程は、石油化学製品に由来する出発原料を利用する。植物由来原料からのイソブタノール生産は、化石燃料の使用を最小化し得て、当該技術分野における進歩に相当する。さらに植物由来材料またはその他のバイオマス原料を使用した化学物質および燃料の生産は、生態系に優しく持続可能である、石油化学的方法の代替法を提供する。
【０００５】
イソブタノールは、酵母発酵の副産物として、生物学的に生産されてもよい。それは、この真菌群によるアミノ酸の不完全代謝の結果として形成する、「フーゼル油」の構成要素である。イソブタノールは、特にＬ−バリンの異化作用から生成される。Ｌ−バリンのアミン基が窒素源として使われた後に、結果として生じるα−ケト酸は脱炭酸されて、いわゆるエールリッヒ経路の酵素によってイソブタノールに還元される（非特許文献３）。
【０００６】
遺伝子工学および代謝工学などの技術を利用して、微生物を改変し、植物由来材料またはその他のバイオマス原料から、特定の製品を生産してもよい。微生物は、例えば生合成経路をコードする遺伝子の挿入などの遺伝子の挿入、遺伝子の欠失またはプロモーターなどの調節因子の修飾によって、改変されてもよい。微生物はまた、細胞生産性および収率を改善するために、生合成経路の副産物を排除するために、および／または株の改良のために、操作されてもよい。イソブタノールをはじめとするブタノール異性体を生産するための改変生合成経路を発現する微生物の例は、特許文献１および特許文献２に記載される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７，８５１，１８８号明細書
【特許文献２】米国特許第７，９９３，８８９号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．７１６−７１９
【非特許文献２】Ｃａｒｌｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｔａｌ．Ａ．Ｃｈｅｍ．２２０：２１５−２２０，２００４
【非特許文献３】Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２５７５２−２５７５６，１９９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし発酵中のエタノールおよびブタノールなどのアルコールへの曝露は、細胞生存度、細胞生産性、および製品収量に対して悪影響を及ぼし得る。これらのアルコールの蓄積は、細胞成長を阻害して、最終的にこれらのアルコールの発酵生産に影響を及ぼし得る。したがってこれらのアルコール存在下で改善された細胞成長および生産を示す微生物の開発、ならびに細胞生存度および細胞生産性を維持しおよび／または改善する方法に対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、このような方法の開発、ならびに微生物中の改変経路を通じて、改善された細胞生存度および細胞生産性で、発酵産物を生成できる微生物の開発を対象とする。
【００１１】
本発明はまた、（ａ）アルコールを生成する微生物を提供するステップと；（ｂ）アルコールが生成される条件下で、微生物を１つまたは数複の炭素源と接触させるステップと；（ｃ）微生物を収集するステップと；（ｄ）アルコールを回収するステップと；（ｅ）アルコールが生成される条件下で、ステップ（ｃ）の収集された微生物を１つまたは複数の炭素源と接触させるステップと；（ｆ）ステップ（ｃ）〜（ｅ）を反復するステップと；任意選択的に、ステップ（ｃ）の微生物を低ｐＨ条件に曝露するステップとを含んでなる、アルコールを生産する方法を対象とする。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）〜（ｅ）を少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも１００回、またはそれを上回る回数にわたり繰り返す。
【００１２】
本発明はまた、（ａ）ブタノール産生菌を提供するステップと、；（ｂ）ブタノールが有効収率で生成される条件下で、ブタノール産生菌を１つまたは複数の炭素源と接触させるステップと；（ｃ）ブタノール産生菌を収集するステップと；（ｄ）ブタノールを回収するステップと；（ｅ）ブタノールがステップ（ｂ）の有効収率の少なくとも約９０％である有効収率で生成される条件下で、（ｃ）の収集されたブタノール産生菌を１つまたは複数の炭素源と接触させるステップと；（ｆ）ステップ（ｃ）〜（ｅ）を反復するステップと；任意選択的に、ステップ（ｃ）の収集されたブタノール産生菌を低ｐＨ条件に曝露するステップとを含んでなる、ブタノールを生産する方法も対象とする。いくつかの実施形態では、（ｃ）の収集されたブタノール産生菌が、少なくとも約０．３％ブタノールの存在下で少なくとも約１時間にわたり、約２．０以下のｐＨ条件に曝露される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）のブタノールが、少なくとも約６ｇ／Ｌの濃度で回収される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｅ）において、ブタノールが、ステップ（ｂ）の有効収率の少なくとも約９９％である有効収率で生成される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）〜（ｅ）を少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも１００回、またはそれを上回る回数にわたり繰り返す。
【００１３】
本発明はまた、（ａ）アルコール発酵から微生物を収集するステップと；（ｂ）微生物を富栄養培地と接触させるステップとを含んでなる、細胞生存度および生産性を改善する方法を対象とする。本発明はまた、（ａ）アルコール発酵から微生物を収集するステップと；（ｂ）微生物を低ｐＨ条件に曝露するステップと；（ｃ）微生物を収集するステップと；（ｄ）収集された微生物を富栄養培地と接触させるステップとを含んでなる、細胞生存度および生産性を改善する方法を対象とする。
【００１４】
本明細書に記載される別の本発明の方法は、（ａ）アルコールを生成する微生物を提供するステップと；（ｂ）アルコールが生成される条件下で、１つまたは数複の炭素基質に微生物を接触させるステップと；（ｃ）微生物を収集するステップと；（ｄ）アルコールを回収するステップと；（ｅ）ステップ（ｃ）の微生物を富栄養培地と接触させるステップと；（ｆ）ステップ（ｅ）の微生物を収集するステップと；（ｇ）アルコールが生成される条件下で、ステップ（ｆ）の微生物を１つまたは複数の炭素基質と接触させるステップと；（ｈ）任意選択的に、ステップ（ｃ）〜（ｇ）を反復するステップとを含んでなる、アルコールを生産する方法である。
【００１５】
本発明はまた、（ａ）アルコールを生成する微生物を提供するステップと；（ｂ）アルコールが生成される条件下で、微生物を１つまたは数複の炭素基質と接触させるステップと；（ｃ）微生物を収集するステップと；（ｄ）アルコールを回収するステップと；（ｅ）ステップ（ｃ）の微生物を低ｐＨ条件に曝露するステップと；（ｆ）ステップ（ｅ）からの微生物を収集するステップと；（ｇ）ステップ（ｆ）の微生物を富栄養培地と接触させるステップと；（ｈ）ステップ（ｇ）の微生物を収集するステップと；（ｉ）アルコールが生成される条件下で、微生物を１つまたは数複の炭素基質と接触させるステップと；（ｊ）任意選択的に、ステップ（ｃ）〜（ｉ）を反復するステップとを含んでなる、アルコールを生産する方法も対象とする。
【００１６】
本明細書に記載される工程および方法のいくつかの実施形態では、微生物を富栄養培地と接触させるステップは、好気的条件下で実施してもよい。本明細書に記載される工程および方法のいくつかの実施形態では、ｐＨは約２以下である。本明細書に記載される工程および方法のいくつかの実施形態では、ｐＨ条件は約２〜約４であってもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、少なくとも約１時間にわたり、約２．０以下のｐＨ条件に曝露されてもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および工程によって生成されるアルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、およびヘキサノールである。いくつかの実施形態では、ブタノールは、１−ブタノール、２−ブタノール、２−ブタノン、イソブタノール、またはその混合物であってもよい。
【００１８】
いくつかの実施形態では、微生物に細胞再循環を実施してもよい。いくつかの実施形態では、微生物を少なくとも５回再循環させてもよい。いくつかの実施形態では、微生物を少なくとも１０回再循環させてもよい。いくつかの実施形態では、再循環するステップ中に、微生物を酸洗浄してもよい。いくつかの実施形態では、再循環するステップ後に、微生物を酸洗浄してもよい。
【００１９】
本明細書に記載される工程および方法のいくつかの実施形態では、炭素基質と接触させるステップは、抽出剤の存在下で実施してもよい。いくつかの実施形態では、炭素基質と接触させるステップは、嫌気的条件で実施してもよい。いくつかの実施形態では、炭素基質と接触させるステップは、微好気的条件で実施してもよい。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、第１の接触であってもよい。いくつかの実施形態では、再循環は、嫌気的条件で実施してもよい。いくつかの実施形態では、再循環は、微好気的条件で実施してもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態では、炭素基質は、オリゴ糖類、多糖類、単糖類、およびそれらの混合物からなる群から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、炭素基質は、フルクトース、グルコース、乳糖、マルトース、ガラクトース、スクロース、デンプン、セルロース、原材料、エタノール、乳酸、コハク酸、グリセロール、コーンマッシュ、サトウキビ、バイオマス、キシロースおよびアラビノースなどのＣ５糖、およびそれらの混合物からなる群から選択されてもよい。
【００２１】
いくつかの実施形態では、微生物は、組換え宿主細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、ブタノール産生菌であってもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、イソブタノール産生菌であってもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、ブタノール生合成経路を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、タノール生合成経路は、イソブタノール生合成経路であってもよい。いくつかの実施形態では、イソブタノール生合成経路は、（ａ）ピルビン酸からアセト乳酸；（ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸；（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸から２−ケトイソ吉草酸；（ｄ）２−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド；および（ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールからなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、イソブタノール生合成経路は、アセト乳酸シンターゼ、ケト酸レダクトイソメラーゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ、および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなってもよい。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ブタノール生合成経路は、イソブタノール生合成経路であってもよい。いくつかの実施形態では、イソブタノール生合成経路は、（ａ）ピルビン酸からアセト乳酸；（ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸；（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸；（ｄ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡ；（ｅ）イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒド；および（ｆ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールからなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、イソブタノール生合成経路は、アセト乳酸シンターゼ活性；アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性；アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性；分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ活性；アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性；および／または分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリヌクレオチドをコードするポリペプチドを含んでなってもよい。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ブタノール生合成経路は、１−ブタノール生合成経路であってもよい。いくつかの実施形態では、１−ブタノール生合成経路は、（ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ；（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ；（ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡ；（ｄ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡ；（ｅ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒド；および（ｆ）ブチルアルデヒドから１−ブタノールからなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、１−ブタノール生合成経路は、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ活性；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性；クロトナーゼ活性；ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性；ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、および／またはブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリヌクレオチドをコードするポリペプチドを含んでなってもよい。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ブタノール生合成経路は、２−ブタノール生合成経路であってもよい。いくつかの実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、（ａ）ピルビン酸からα−アセト乳酸；（ｂ）α−アセト乳酸からアセトイン；（ｃ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノール；（ｄ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸；（ｅ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノン；および（ｆ）−ブタノンから２−ブタノールからなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、アセト乳酸シンターゼ活性；アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性；アセトニンアミナーゼ活性；アミノブタノールキナーゼ活性；アミノブタノールリン酸ホスホリラーゼ活性；および／またはブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリヌクレオチドをコードするポリペプチドを含んでなってもよい。
【００２５】
いくつかの実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、（ａ）ピルビン酸からα−アセト乳酸；（ｂ）α−アセト乳酸からアセトイン；（ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオール；（ｄ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノン；および（ｅ）２−ブタノンから２−ブタノールからなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、アセト乳酸シンターゼ活性；アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性；ブタンジオールデヒドロゲナーゼ活性；ジアールデヒドラターゼ活性；および／またはブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリヌクレオチドをコードするポリペプチドを含んでなってもよい。
【００２６】
いくつかの実施形態では、基質から産物への変換の１つまたは複数は、補助因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを利用してもよい。いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨが助因子である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、微生物のブタノール経路は、以下の酵素番号を有する酵素群から選択されるポリペプチドの少なくとも１つを含んでなってもよい：ＥＣ  ２．２．１．６、ＥＣ  １．１．１．８６、ＥＣ  ４．２．１．９、ＥＣ  ４．１．１．７２、ＥＣ
１．１．１．１、ＥＣ  １．１．１．２６５、ＥＣ  １．１．１．２、ＥＣ  １．２．４．４、ＥＣ  １．３．９９．２、ＥＣ  １．２．１．５７、ＥＣ  １．２．１．１０、ＥＣ  ２．６．１．６６、ＥＣ  ２．６．１．４２、ＥＣ  １．４．１．９、ＥＣ  １．４．１．８、ＥＣ  ４．１．１．１４、ＥＣ  ２．６．１．１８、ＥＣ  ２．３．１．９、ＥＣ  ２．３．１．１６、ＥＣ  １．１．１３０、ＥＣ  １．１．１．３５、ＥＣ  １．１．１．１５７、ＥＣ  １．１．１．３６、ＥＣ  ４．２．１．１７、ＥＣ  ４．２．１．５５、ＥＣ  １．３．１．４４、ＥＣ  １．３．１．３８、ＥＣ  ５．４．９９．１３、ＥＣ  ４．１．１．５、ＥＣ  ２．７．１．２９、ＥＣ  １．１．１．７６、ＥＣ  １．２．１．５７、およびＥＣ  ４．２．１．２８。
【００２８】
いくつかの実施形態では、微生物の改変ブタノール経路は、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、バリンデヒドロゲナーゼ、バリンデカルボキシラーゼ、ωトランスアミナーゼ、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、イソブチリル−ＣｏＡムターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、アセトニンアミナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセトインキナーゼ、アセトインリン酸アミナーゼ、アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼ、アミノブタノールキナーゼ、ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、およびブタンジオールデヒドラターゼの酵素群から選択される、少なくとも１つのポリペプチドを含んでなってもよい。
【００２９】
いくつかの実施形態では、微生物またはブタノール産生菌は、ｃＡＭＰ情報伝達経路の１つまたは複数の構成要素の発現および／または活性を変化させる、１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物またはブタノール産生菌は、１つまたは複数のリン酸ジエステラーゼの発現および／または活性を変化させる１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物またはブタノール産生菌は、リン酸ジエステラーゼおよび／またはリン酸ジエステラーゼ活性の低下または排除を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物またはブタノール産生菌は、リン酸ジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中に、修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物またはブタノール産生菌は、リン酸ジエステラーゼ活性を有するポリヌクレオチドをコードする内在性ポリペプチド中に、挿入、欠失、変異、および／または置換を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、リン酸ジエステラーゼ活性を有するポリペプチドは、酵素番号ＥＣ  ３．１．４．１７に相当してもよい。いくつかの実施形態では、リン酸ジエステラーゼ活性を有するポリペプチドは、ＰＤＥ１であってもよい。
【００３０】
いくつかの実施形態では、微生物またはブタノール産生菌は、ピルビン酸デカルボキシラーゼを発現しない、または発現が低下している。いくつかの実施形態では、発現低下は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子中の挿入、欠失、変異、および／または置換の結果である。いくつかの実施形態では、微生物またはブタノール産生菌は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中に、修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物またはブタノール産生菌は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリヌクレオチドをコードする内在性ポリペプチド中に、挿入、欠失、変異、および／または置換を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドは、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。
【００３１】
いくつかの実施形態では、微生物またはブタノール産生菌は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを発現しない、または発現が低下している。いくつかの実施形態では、発現低下は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子中の挿入、欠失、変異、および／または置換の結果である。いくつかの実施形態では、微生物またはブタノール産生菌は、ＢＤＨ１を発現しない、または発現が低下している。いくつかの実施形態では、発現低下は、ＢＤＨ１をコードする遺伝子中の挿入、欠失、変異、および／または置換の結果である。いくつかの実施形態では、微生物またはブタノール産生菌は、アセト乳酸還元酵素をコードする遺伝子を発現しない、または発現が低下している。いくつかの実施形態では、発現低下は、ＹＭＲ２２６ｃをコードする遺伝子中の挿入、欠失、変異、および／または置換の結果である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、微生物またはブタノール産生菌は、酵母細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される酵母属のメンバーであってもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であってもよい。
【００３３】
本発明はまた、本明細書に記載される微生物またはブタノール産生菌を含んでなる組成物を対象とする。いくつかの実施形態では、組成物はまた、富栄養培地も含んでなる。いくつかの実施形態では、組成物は、約２以下のｐＨを有してもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、約２〜約４のｐＨを有してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＰＮＹ８６０株の四分子切開プレートを描写する。胞子生存度は、次のとおりである：４＋：０−、ｎ＝１５；３＋：１−、ｎ＝２；２＋：２−、ｎ＝１；１＋：３−、ｎ＝０；０＋：４−、ｎ＝０；活力度およびコロニーサイズは、いくらか変動するが、微小コロニーはなかった。
【図２】ＰＮＹ８６０の胞子子孫である２つの四分子からの４つのコロニーの交雑型分析からのＰＣＲ産物がある、アガロースゲルを描写する。レーン１はＰＮＹ８６０である。レーン２はＰＮＹ８６０−１Ａである。レーン３はＰＮＹ８６０−１Ｂである。レーン４はＰＮＹ８６０−１Ｃである。レーン５はＰＮＹ８６０−１Ｄである。レーン６はＰＮＹ８６０−２Ａである。レーン７はＰＮＹ８６０−２Ｂである。レーン８はＰＮＹ８６０−２Ｃである。レーン９はＰＮＹ８６０−２Ｄである。
【図３】異なるイソブタノール生合成経路を描写する。「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」、「ｆ」、「ｇ」、「ｈ」、「ｉ」、「ｊ」、および「ｋ」と標識されるステップは、下述の基質から産物への変換に対応する。例えば「ａ」は、アセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよく；「ｂ」は、例えばアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼによって触媒されてもよく；「ｃ」は、例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されてもよく；「ｄ」は、例えば分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒されてもよく；「ｅ」は、例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよく；「ｆ」は、例えば分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼによって触媒されてもよく；「ｇ」は、例えばアセチル化アルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよく；「ｈ」は、例えばトランスアミナーゼまたはバリンデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよく；「ｉ」は、例えばバリンデカルボキシラーゼによって触媒されてもよく；「ｊ」は、例えばωトランスアミナーゼによって触媒されてもよく；および「ｋ」は、例えばイソブチリル−ＣｏＡムターゼによって触媒されてもよい。
【図４】１−ブタノール生合成経路を描写する。「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」、および「ｆ」と標識されるステップは、下述の基質から産物への変換に対応する。例えば「ａ」は、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによって触媒されてもよく；「ｂ」は、例えば３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよく；「ｃ」は、例えばクロトナーゼによって触媒されてもよく；「ｄ」は、例えばブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよく；「ｅ」は、例えばブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよく；および「ｆ」は、例えばブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい。
【図５】２−ブタノールおよび２−ブタノン生合成経路を描写する。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、発酵産物を生成する微生物と、有利な経済加工条件によって高い速度および力価でブタノールなどの発酵産物を生産するための最適化とを対象とする。
【００３６】
アルコールの発酵生産中に、微生物を例えば、アルコール毒性、酸化的ストレス、浸透圧ストレス、およびｐＨ、温度、および栄養素利用性のゆらぎをはじめとする、様々なストレス条件に曝露してもよい。これらのストレス条件の影響は、細胞成長の阻害および細胞生存度の低下を引き起こしてもよく、それは究極的に発酵生産性および生成物収率の低下をもたらし得る。微生物の代謝過程を調節することで、これらのストレス条件に適応する能力は、効率的なアルコール生産を維持するのに有利である。例えば特定のストレス作用物質に曝露された際、微生物は、成長、情報伝達、転写、および／または翻訳後活性などの特定の代謝過程を変更することで、これらのストレス条件に応答してもよい。
【００３７】
酵母中では、３’−５’環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）情報伝達経路が、細胞成長と増殖、栄養素利用性への応答、細胞周期の進行、代謝および形態形成、細胞防御、およびストレス応答の主要制御因子である。通常の状態では、グルコースなどの作動薬が、Ｇタンパク質共役型受容体経路を介してアデニル酸シクラーゼを活性化し、ｃＡＭＰのレベル増大をもたらして、それは次にタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）を活性化し（すなわちｃＡＭＰがＰＫＡの調節サブユニットに結合する）、例えばＭｓｎ２ｐ／Ｍｓｎ４ｐおよびＹａｐ１ｐによって媒介される、ストレス応答の抑制を究極的にもたらす。ストレス条件下では、ｃＡＭＰのレベルはＲａｓ／ｃＡＭＰ経路によって下方制御され、これらのｃＡＭＰのより低いレベルは、ストレス応答阻害からの解放をもたらす。したがって酵母の細胞ストレス耐性のためには、ｃＡＭＰレベルの制御が重要である。
【００３８】
Ｒａｓ／ｃＡＭＰ経路は、いくつかのストレス応答に関与し、ひいては酵母のストレス耐性の主要な決定因子である。一例として、Ｒａｓ／ｃＡＭＰ経路は、浸透圧ストレス、高浸透圧ストレス、および凍結と解凍に対する細胞応答調節に関与する（Ｐａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３２７：３１１−３１９，２００５）。
【００３９】
ｃＡＭＰのレベルは、アデニル酸シクラーゼ活性を通じたその合成と、環状ヌクレオチドリン酸ジエステラーゼ（ＰＤＥ）による加水分解を通じたその分解とによって調節される。２つのリン酸ジエステラーゼ、ＰＤＥ１およびＰＤＥ２が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で同定されている（Ｎｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７（１０）：３６２９−３６３６，１９８７）。ＰＤＥ１は低親和性ｃＡＭＰリン酸ジエステラーゼであり、ＰＤＥ２は高親和性ｃＡＭＰリン酸ジエステラーゼである。ＰＤＥ１は、ＰＫＡ阻害をもたらすｃＡＭＰを加水分解することで、作動薬誘導ｃＡＭＰシグナル伝達の下方制御（例えば一過性の適応条件）において、役割を有することが示されている。ＰＤＥ１活性は、ＰＫＡ媒介リン酸化によって調節され、すなわちＰＫＡによるＰＤＥ１のリン酸化は、リン酸ジエステラーゼの活性増大をもたらす（Ｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １０：９１−１０４，１９９９）。したがってＰＤＥ１妨害による、ｃＡＭＰレベルとＰＫＡ活性の調節は、酵母のストレス耐性を制御する効率的な手段であり得る。
【００４０】
代案エネルギー源としての持続可能なバイオ燃料に対する感心の再燃と、効率的で環境に優しい生産方法の開発に対する願望があることから、発酵工程を使用したアルコール生産は、現行の合成法の実現可能な選択肢である。しかし特定収率でアルコール（例えばエタノール、ブタノール）を生成するいくつかの微生物は、低いアルコール毒性閾値もまた有する。したがってアルコールの商業的生産のための発酵工程の開発は、アルコール毒性によって制限されている。上述したように、アルコール毒性は、微生物中で、例えば細胞成長の阻害と細胞生存度の低下に至る、ストレス応答を生じ得る。
【００４１】
本発明は、細胞生存度の改善および／またはアルコール耐性の増大がある微生物を対象とする。いくつかの実施形態では、ｃＡＭＰ情報伝達経路の１つまたは複数の構成要素の発現および／または活性を変化させる、１つまたは複数の修飾を通じて、細胞生存度の改善および／またはアルコール耐性の増大を示すように、微生物を改変してもよい。いくつかの実施形態では、ｃＡＭＰ情報伝達経路の１つまたは複数の構成要素は、リン酸ジエステラーゼであってもよい。いくつかの実施形態では、リン酸ジエステラーゼはＰＤＥ１であってもよい。
【００４２】
いくつかの実施形態では、発現および／または活性を変化させる１つまたは複数の修飾は、ｃＡＭＰ情報伝達経路の１つまたは複数の構成要素をコードする、１つまたは複数の内在性遺伝子発現の排除または低下であってもよい。いくつかの実施形態では、発現および／または活性を変化させる修飾は、リン酸ジエステラーゼをコードする内在性遺伝子発現の排除または低下であってもよい。いくつかの実施形態では、発現および／または活性を変化させる修飾は、ＰＤＥ１をコードする内在性遺伝子発現の排除または低下であってもよい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、微生物は、ｃＡＭＰ情報伝達経路の１つまたは複数の構成要素の発現および／または活性を変化させる、１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、１つまたは複数のリン酸ジエステラーゼの発現および／または活性を変化させる１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、ＰＤＥ１の発現および／または活性を変化させる１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。
【００４４】
いくつかの実施形態では、微生物は、ｃＡＭＰ情報伝達経路の１つまたは複数の構成要素をコードする、１つまたは複数の内在性遺伝子の発現を排除または低下させる、１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、リン酸ジエステラーゼをコードする内在性遺伝子の発現を排除または低下させる、１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、ＰＤＥ１をコードする内在性遺伝子の発現を排除または低下させる、１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、リン酸ジエステラーゼの活性を排除または低下させる、１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、ＰＤＥ１の活性を排除または低下させる、１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。
【００４５】
いくつかの実施形態では、微生物は、ｃＡＭＰ情報伝達経路およびブタノール生合成経路の１つまたは複数の構成要素の発現および／または活性を変化させる、１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、１つまたは複数のリン酸ジエステラーゼおよびブタノール生合成経路の発現および／または活性を変化させる、１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、ＰＤＥ１およびブタノール生合成経路の発現および／または活性を変化させる、１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、ブタノール生合成経路は、１−ブタノール生合成経路、２−ブタノール生合成経路、２−ブタノン生合成経路、またはイソブタノール生合成経路であってもよい。
【００４６】
いくつかの実施形態では、微生物は、ｃＡＭＰ情報伝達経路およびブタノール生合成経路の１つまたは複数の構成要素をコードする、１つまたは複数の内在性遺伝子の発現を排除または低下させる、１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、リン酸ジエステラーゼおよびブタノール生合成経路をコードする内在性遺伝子の発現を排除または低下させる、１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、ＰＤＥ１およびブタノール生合成経路をコードする内在性遺伝子の発現を排除または低下させる、１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、リン酸ジエステラーゼおよびブタノール生合成経路の活性を排除または低下させる１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、ＰＤＥ１およびブタノール生合成経路の活性を排除または低下させる１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、ブタノール生合成経路は、１−ブタノール生合成経路、２−ブタノール生合成経路、２−ブタノン生合成経路、またはイソブタノール生合成経路であってもよい。
【００４７】
本発明は、本明細書で提供される微生物を含んでなる組成物を対象とする。例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、ｃＡＭＰ情報伝達経路の１つまたは複数の構成要素の発現および／または活性を変化させる、１つまたは複数の修飾を含んでなる微生物を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、１つまたは複数のリン酸ジエステラーゼの発現および／または活性を変化させる、１つまたは複数の修飾を含んでなる微生物を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、ＰＤＥ１の発現および／または活性を変化させる、１つまたは複数の修飾を含んでなる微生物を含んでなってもよい。
【００４８】
いくつかの実施形態では、組成物は、ｃＡＭＰ情報伝達経路およびブタノール生合成経路の１つまたは複数の構成要素の発現および／または活性を変化させる、１つまたは複数の修飾を含んでなる微生物を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、１つまたは複数のリン酸ジエステラーゼおよびブタノール生合成経路の発現および／または活性を変化させる、１つまたは複数の修飾を含んでなる微生物を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、ＰＤＥ１およびブタノール生合成経路の発現および／または活性を変化させる、１つまたは複数の修飾を含んでなる微生物を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、ブタノール生合成経路は、１−ブタノール生合成経路、２−ブタノール生合成経路、２−ブタノン生合成経路、またはイソブタノール生合成経路であってもよい。
【００４９】
いくつかの実施形態では、微生物は、親細胞と比較して、アルコール生成量の増大を示す。いくつかの実施形態では、アルコール生成は、例えばブロス力価（ブロス１リットルあたりの生成アルコールグラム数）、アルコール収率（消費基質１グラムあたりの生成アルコールグラム数）、容積生産性（毎時１リットルあたりの生成アルコールグラム数）、比生産性（毎時組換え細胞バイオマス１グラムあたりの生成アルコールグラム数）、またはそれらの組み合わせを測定することで判定してもよい。
【００５０】
本発明はまた、アルコール発酵中の微生物の細胞成長および細胞生存度を改善および／または維持する方法も対象とする。いくつかの実施形態では、方法は、微生物（例えば親細胞）を得るステップと、ｃＡＭＰ情報伝達経路の１つまたは複数の構成要素の発現および／または活性を変化させる、１つまたは複数の修飾を導入するステップとを含んでなる。いくつかの実施形態では、方法は、微生物を得るステップと、ｃＡＭＰ情報伝達経路の１つまたは複数の構成要素をコードする、１つまたは複数の内在性遺伝子の発現を排除または低下させる、１つまたは複数の修飾を導入するステップとを含んでなる。いくつかの実施形態では、方法は、微生物を得るステップと、リン酸ジエステラーゼをコードする、１つまたは複数の内在性遺伝子の発現を排除または低下させる、１つまたは複数の修飾を導入するステップとを含んでなる。いくつかの実施形態では、方法は、微生物を得るステップと、ＰＤＥ１をコードする内在性遺伝子の発現を排除または低下させる１つまたは複数の修飾を導入するステップとを含んでなる。いくつかの実施形態では、方法は、微生物を得るステップと、リン酸ジエステラーゼ活性を排除または低下させる、１つまたは複数の修飾を導入するステップとを含んでなる。いくつかの実施形態では、方法は、微生物を得るステップと、ＰＤＥ１活性を排除または低下させる、１つまたは複数の修飾を導入するステップとを含んでなる。
【００５１】
本発明はまた、発酵工程によってアルコールを生産する方法も対象とする。いくつかの実施形態では、方法は、アルコールが生成される条件下で、本明細書で提供される微生物を培養するステップと、アルコールを回収するステップとを含んでなる。いくつかの実施形態では、アルコールは、ブタノールであってもよい。いくつかの実施形態では、アルコールは、１−ブタノール、２−ブタノール、２−ブタノン、イソブタノール、またはｔｅｒｔ−ブタノールであってもよい。
【００５２】
微生物汚染が、発酵工程における問題となり得る。例えば原材料によって、発酵工程に細菌が取り込まれることもある。細菌は、酵母よりも迅速に分裂する傾向があるので、これは顕著なレベルの微生物汚染をもたらし得る。さらに、細胞再循環を用いて、発酵工程の効率を改善してもよい。例えば発酵容器（または発酵槽）内に酵母を再導入することで、所望の発酵産物の生成からそれた、細胞成長への糖類の顕著な転用なしに、発酵容器内の酵母濃度を継続的に高レベルに維持する。細胞再循環を使用して、容積変換率を増大させてもよい。発酵性糖からブタノールへの変換の容積速度の増大は、遠心分離などによって、収集発酵ブロスから酵母を継続的に分離し、次に酵母を再循環させて発酵槽に戻すことで達成し得る。しかしこのような反復する再酵母循環の結果として、細菌などの望まれない微生物もまた、酵母と共に再循環されることもある。これらの微生物汚染は、栄養素について競合し得て、栄養素の枯渇は、酵母の細胞成長を抑制することもある。さらに微生物汚染は、酵母代謝を阻害し得る。例えば微生物は、細胞生存度に悪影響を及ぼす代謝産物を生成することもあり、発酵産物の収率低下をもたらすこともある。
【００５３】
発酵工程における汚染の制御は、細胞懸濁液の酸洗浄によって実施してもよい。酸処理の１つの目的は、細胞生存度または発酵能力の実質的低下なしに、低ｐＨ条件に耐えられない混入微生物を破壊することである。しかしｐＨ変化条件は、細胞成長阻害と細胞生存度低下に至るストレス応答を微生物に生じ得る。本発明は、低ｐＨ条件の存在下において改善された細胞生存度がある微生物、ならびに発酵工程によるアルコールを生産する方法を対象とし、方法は、微生物を再循環するステップと、微生物懸濁液酸洗浄するステップとを含む。例えば方法は、（ａ）微生物を提供するステップと；（ｂ）アルコールが生成される条件下で、微生物を１つまたは数複の炭素基質と接触させるステップと；（ｃ）微生物を収集するステップと；（ｄ）アルコールを回収するステップと；（ｅ）アルコールが生成される条件下で、収集された微生物を１つまたは数複の炭素基質と接触させるステップと；（ｆ）微生物を低ｐＨ条件に曝露するステップとを含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）〜（ｅ）を繰り返してもよい。
【００５４】
酸処理および／または細胞循環に曝露された微生物は、細胞生存度および生産性の喪失を有することもある。微生物の細胞生存度および生産性を維持するために、富栄養培地を添加して、微生物を富栄養培地中で一定期間培養することで、微生物を再生してもよい。再生期後、微生物を遠心分離によって収集し、継続的な発酵のために、新鮮な生産培地に再懸濁してもよい。
【００５５】
本発明はまた、アルコール発酵で利用するための微生物を再生する方法を対象とする。再生に続いて、微生物を発酵工程に再循環させてもよい。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）微生物を提供するステップと；（ｂ）アルコールが生成される条件下で、微生物を１つまたは数複の炭素基質と接触させるステップと；（ｃ）微生物を収集するステップと；（ｄ）アルコールを回収するステップと；（ｅ）微生物を富栄養培地と接触させるステップと；（ｆ）ステップ（ｅ）からの微生物を収集するステップと；（ｂ）アルコールが生成される条件下で、微生物を１つまたは数複の炭素基質と接触させるステップとを含んでなる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）〜（ｅ）を繰り返してもよい。いくつかの実施形態では、炭素基質との第１の接触は、抽出剤の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、抽出剤は、例えばステップ（ｂ）および（ｇ）に含まれてもよい。
【００５６】
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）微生物を提供するステップと；（ｂ）アルコールが生成される条件下で、微生物を１つまたは数複の炭素基質と接触させるステップと；（ｃ）微生物を収集するステップと；（ｄ）収集された微生物を低ｐＨ条件に曝露するステップと；（ｅ）ステップ（ｄ）の微生物を収集するステップと；（ｆ）ステップ（ｅ）の微生物を富栄養培地と接触させるステップと；（ｇ）ステップ（ｆ）の微生物を収集するステップと；（ｈ）アルコールが生成される条件下で、ステップ（ｇ）の微生物を１つまたは複数の炭素基質と接触させるステップとを含んでなる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）〜（ｈ）を繰り返してもよい。いくつかの実施形態では、方法は、アルコールを回収するステップをさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、炭素基質との第１の接触は、抽出剤の存在下で行われる。
【００５７】
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めて本出願が優先される。また文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語には複数形が含まれるものとし、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。本明細書で参照される全ての刊行物、特許、およびその他の参考文献は、あらゆる目的のために、その内容全体を参照によって援用する。
【００５８】
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義が、本明細書で提供される。
【００５９】
本明細書の用法では、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、または任意のその他のバリエーションは、記述される整数または整数群の包含を暗示するが、任意のその他の整数または整数群の排除を暗示しないものと理解される。例えば要素の一覧を含んでなる組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、これらの構成要件のみに必ずしも限定されず、明示的に列挙されることもこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有でもないその他の要素を含んでもよい。さらに特に断りのない限り、「ｏｒ」は排他的ｏｒでなく包括的ｏｒを指す。例えば条件ＡまたはＢは、以下のいずれかによって満たされる：Ａが真で（または存在し）Ｂが偽であり（または存在せず）、Ａが偽で（または存在せず）Ｂが真であり（または存在する）、ＡおよびＢの双方が真である（または存在する）。
【００６０】
本明細書の用法では、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」という用語、または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」などのバリエーションは、明細書および特許請求の範囲全体を通じた用法で、あらゆる列挙された整数または整数群の包含を示唆するが、追加的な整数また整数群は、特定の方法、構造、または組成物に追加できない。
【００６１】
本明細書の用法では、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語、または「から本質的になる」または「から本質的になる」などのバリエーションは、明細書および特許請求の範囲全体を通じた用法で、あらゆる列挙された整数または整数群の包含と、特定の方法の基本的または新規特性、構造、または組成物を実質的に変化させない、あらゆる列挙された整数または整数群の包含を示唆する（例えばＭ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２１１１．０３を参照されたい）。
【００６２】
さらに本発明の構成要件または構成要素に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、構成要件または構成要素の事例数（すなわち発生）に関して非制限的であることが意図される。したがって「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈すべきであり、構成要件または構成要素の単数語形は、数が単数であることを明らかに意味する場合を除いて、複数もまた含む。
【００６３】
「発明」または「本発明」という用語は、本明細書の用法では非限定的用語であり、特定の発明のいずれかの単一実施形態を指すことは意図されず、本出願に記載される全ての可能な実施形態を包含する。
【００６４】
本明細書の用法では、本発明で用いられる成分または反応物質の量を修飾する「約」という用語は、例えば実際の濃縮物または調製溶液の作成で使用される、典型的な測定および液体取り扱い手順を通じて；これらの手順における不注意による誤りを通じて；組成物作成または方法実施で用いられる成分の、生産、供給元または純度の差異などを通じて、生じ得る数量の変動を指す。「約」という用語はまた、特定の最初の混合物から生じる組成物の異なる平衡条件のために、異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されるか否かを問わず、特許請求の範囲には量の同等物が含まれる。一実施形態では、「約」という用語は、報告される数値の１０％以内、好ましくは報告される数値の５％以内を意味する。
【００６５】
場合によっては、「バイオマス」は、本明細書の用法では、典型的に単位ｇ／Ｌ乾燥細胞重量（ｄｃｗ）で提供される、発酵産物産生微生物の細胞バイオマスを指す。
【００６６】
「発酵産物」という用語は、エタノールおよびブタノールなどのアルコール（例えば低級アルキルアルコール）、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、イソブチレートなどをはじめとするが、これに限定されるものではない、あらゆる所望の対象産物を含む。
【００６７】
「アルコール」という用語は、発酵工程において微生物によって生成され得る、あらゆるアルコールを指す。アルコールとしては、１〜１０個の炭素原子がある、あらゆる直鎖または分枝の飽和または不飽和アルコール分子（例えば低級アルキルアルコール）が挙げられる。例えばアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、およびヘキサノールが挙げられる。
【００６８】
「ブタノール」という用語は、１−ブタノール、２−ブタノール、２−ブタノン、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、またはそれらの混合物を指す。イソブタノールはまた、２−メチル−１−プロパノールとしても知られている。
【００６９】
「ブタノール生合成経路」という用語は、本明細書の用法では、１−ブタノール、２−ブタノール、２−ブタノン、またはイソブタノールを生成する酵素経路を指す。例えばイソブタノール生合成経路は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書で開示される。
【００７０】
「イソブタノール生合成経路」という用語は、イソブタノールを生成する酵素経路を指す。時折「イソブタノール生合成経路」は、「イソブタノール生成経路」の同意語として使用される。
【００７１】
「１−ブタノール生合成経路」という用語は、本明細書の用法では、１−ブタノールを生成するための酵素経路を指す。
【００７２】
「２−ブタノール生合成経路」という用語は、本明細書の用法では、２−ブタノールを生成するための酵素経路を指す。
【００７３】
「２−ブタノン生合成経路」という用語は、本明細書の用法では、２−ブタノンを生成するための酵素経路を指す。
【００７４】
「抽出剤」という用語は、本明細書の用法では、発酵ブロスからアルコールを抽出するのに使用してもよい、１つまたは複数の溶媒を指す。いくつかの実施形態では、溶媒は有機溶剤であってもよい。
【００７５】
「組換え宿主細胞」は、遺伝子操作されて生合成経路を発現する宿主細胞と定義され、宿主細胞は、未改変宿主細胞と比較してより多量の生合成産物を生成し、あるいは未改変宿主細胞によって通常生成されない生合成産物を生成する。「組換え微生物宿主細胞」という用語は、組換え宿主細胞という用語と区別なく使用されることもある。
【００７６】
「発酵性炭素基質」という用語は、本明細書で開示されるものなどの、微生物によって代謝されることができる炭素源を指す。適切な発酵性炭素基質としては、グルコースまたはフルクトースなどの単糖類；乳糖またはスクロースなどの二糖類；オリゴ糖類；デンプン、セルロース、リグノセルロース、またはヘミセルロースなどの多糖類；１炭素基質、脂肪酸；またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７７】
「リン酸ジエステラーゼ」という用語は、リン酸ジエステル結合の加水分解を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。例えば、リン酸ジエステラーゼは、環状ヌクレオチド、３’−５’−環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）および３’−５’−環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）を加水分解する。酵素はＥＣ  ３．１．４．１７として知られており、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＡ６４１３９、ＣＡＡ９６９６８）、サッカロミセス・パラドクサス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＢＹ０１００００１４）、サッカロミセス・ミカタエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｋａｔａｅ）（ＡＡＢＺ０１００００１８、ＡＡＣＨ０１０００６３６）、サッカロミセス・クドリアブゼビイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｕｒｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）（ＡＡＣＩ０２０００３０４）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）（ＡＡＣＡ０１００００１４）、バンデルワルトジマ・ポリスポラ（Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ  ｐｏｌｙｓｐｏｒａ）（ＸＭ００１６４２７００、ＡＡＸＮ０１０００２２２、ＮＺ＿ＡＡＺＮ０１０００２２２）、チゴサッカロミセス・ルーキシ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）（ＮＣ０１２９９４）から入手できる。
【００７８】
「発酵培地」と言う用語は、本明細書の用法では、水、糖類（発酵性炭素基質）、溶解固形分、遊離固形分、発酵産物を生成する微生物、発酵産物、および発酵容器内に保持される材料の全てのその他の構成物のいずれかの混合物を意味し、発酵容器内では、存在する微生物によって、発酵性炭素基質から発酵産物、水、および二酸化炭素（ＣＯ２）への反応によって、発酵産物が生成される。時折、本明細書の用法では、「発酵ブロス」および「発酵混合物」という用語は、「発酵培地」の同意語として使用され得る。
【００７９】
「好気的条件」という用語は、本明細書の用法では、酸素存在下の成長条件を意味する。
【００８０】
「微好気的条件」という用語は、本明細書の用法では、低い溶存酸素レベルの成長条件を意味する例えば酸素レベルは、空気飽和の約１％未満であってもよい。
【００８１】
「嫌気的条件」という用語は、本明細書の用法では、酸素不在下の成長条件を意味する。多数の発酵工程では、工程開始時には初期酸素量が存在するが、このような酸素は、工程の大部分が検出可能な酸素不在下で起こるように、発酵過程中に枯渇するものと理解される。
【００８２】
「炭素基質」という用語は、本明細書で開示される微生物によって代謝されることができる炭素源を指す。炭素基質の非限定的例は、本明細書で提供され、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、エタノール、乳酸、コハク酸、グリセロール、二酸化炭素、メタノール、グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、アラビノース、デキストロース、およびそれらの混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８３】
「ブタノール産生菌」および「イソブタノール産生菌」という用語は、本明細書の用法では、それぞれブタノールまたはイソブタノールを生成できる微生物を指す。
【００８４】
「スクロース利用イソブタノール産生菌」という用語は、明細書の用法では、スクロースからイソブタノールを生成できる微生物を指す。このような微生物は、典型的に、改変イソブタノール生合成経路を含んでなる組換え微生物である。
【００８５】
本明細書の用法では、「収率」という用語は、ｇ／ｇでの炭素源あたりの生成物量を指す。収率は、グルコースを炭素源として、例示されてもよい。特に断りのない限り、収率は、理論的収率の百分率として表されるものと理解される微生物または代謝経路に関して、「理論的収率」は、生成物を生成するのに使用される代謝経路の化学量によって決まる、総基質量あたりで生じ得る最大生成物量と定義される。例えばグルコースからイソプロパノールへの典型的な変換の理論的収率は、０．３３ｇ／ｇである。したがって２９．７ｇ／ｇのグルコースからのイソプロパノールの収率は、理論値の９０％または理論的収率の９０％として表される。本開示では、収率はグルコースを炭素源として例示される一方で、本発明はその他の炭素源に応用し得て、使用される炭素源に応じて収率が変動してもよいものと理解される。当業者は、様々な炭素源について収率を計算し得る。
【００８６】
「有効力価」という用語は、本明細書の用法では、発酵培地１リットルあたりの発酵によって生成されるアルコールの総量を指す。アルコールの総量は、（ｉ）発酵培地中のアルコールの量；（ｉｉ）有機抽出剤から回収されるアルコールの量；および（ｉｉｉ）ガスストリッピングが使用される場合は、気相から回収されるアルコールの量を含む。
【００８７】
「有効速度」という用語は、本明細書の用法では、発酵１時間あたり発酵培地１リットルあたりの発酵によって生成されるアルコールの総量を指す。
【００８８】
「有効収率」という用語は、本明細書の用法では、本明細書に記載される微生物によって消費される発酵性炭素基質の単位当たりで生成されるアルコールの量を指す。
【００８９】
「比生産性」という用語は、本明細書の用法では、単位時間当たり細胞の１ｇの乾燥細胞重量あたりで生成されるアルコールのｇ数を指す。
【００９０】
「誘導体」および「類似体」という用語は、本発明の酵素と異なるが、その不可欠な特性を保つポリペプチドを指す。「誘導体」という用語は、また、本発明の宿主細胞と異なるが、その不可欠な特性を保つ宿主細胞を指してもよい。一般に、誘導体および類似体は、全体的に非常に類似し、多くの領域では、本発明の酵素と同一である。「由来する」、「誘導体」、および「類似体」という用語は、本発明の酵素に言及する場合、対応する天然ポリペプチドの活性またはその触媒ドメインの活性の少なくとも一部を維持する、あらゆるポリペプチドを含む。
【００９１】
本明細書で開示される酵素の誘導体は、天然ポリペプチドには見られない特徴を示すように、改変されていてもよいポリペプチドである。誘導体は、化学的に、酵素的に、またはその他の適切な手段によって、天然アミノ酸以外の部分（例えば酵素または放射性同位体などの検出可能な部分）との置換（例えばアミノ酸置換）によって、共有結合的に修飾され得る。誘導体の例としては、天然タンパク質配列ベースであるが改変されている、融合タンパク質、またはタンパク質が挙げられる。例えばタンパク質は、特定のアミノ酸配列、および／または特定の二次、三次、および／または四次構造の知識によってデザインし得る。誘導体は、天然または合成である先の配列の知識に基づいて改変されたタンパク質を含み、次にそれを必須ではないが往々にして任意選択的に修飾して、いくつかの改善された機能を与える。次にこれらの配列またはタンパク質は、特定のタンパク質またはアミノ酸配列に由来すると言われる。本発明のいくつかの実施形態では、誘導体は、誘導体が「由来する」配列と、少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、または少なくとも約９９％の同一性を維持してもよい。本発明のいくつかの実施形態では、分子遺伝子技術を使用して、酵素の一部または全部のＤＮＡ配列を増幅して新しい宿主細胞に入れた場合、酵素は、特定種に天然に見られる酵素に由来すると言われる。
【００９２】
ポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本明細書の用法では、「ポリペプチド」という用語は、単数形「ポリペプチド」ならびに複数形「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としてもまた知られている）によって直線的に連結するモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸のあらゆる鎖または鎖群を指し、生成物の特定長を指さない。したがって２つ以上のアミノ酸の鎖または鎖群を指すために使用されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、またはあらゆるその他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはそれと同義的に使用されてもよい。ポリペプチドは、天然生物学的起源に由来してもよく、または組換え技術によって作成されてもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されない。それは化学合成をはじめとする、あらゆる様式で作成されてもよい。本発明で使用されるポリペプチドは、完全長ポリペプチドおよびその断片を含んでなる。
【００９３】
本明細書の用法では、「活性低下」または「発現低下」は、活性または発現低下をもたらす変化に先だつ、同一ポリペプチドの生物学的活性または発現と比較した場合の、既知の生物学的活性またはポリペプチド発現のあらゆる測定可能な低下を指す。このような変化としては、本明細書に記載されるようなポリペプチドの、またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾が挙げられる。本明細書で開示される活性またはポリペプチド発現の低下は、当該技術分野で周知の、本明細書で開示される方法によって判定し得る。
【００９４】
本明細書の用法では、「活性排除」または「発現排除」は、活性または発現の排除をもたらす変化に先だつ、同一ポリペプチドの生物学的活性または発現と比較した場合の、既知の生物学的活性またはポリペプチド発現の撤廃を指す。このような変化としては、本明細書に記載されるようなポリペプチドの、またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾が挙げられる。活性または発現の排除は、活性または発現の排除をもたらす変化に先だつ、同一ポリペプチドの生物学的活性または発現と比較した場合の、測定可能でない生物学的活性またはポリペプチド発現を含む。本明細書で開示される活性またはポリペプチド発現の排除は、当該技術分野で周知の、本明細書で開示される方法によって判定し得る。
【００９５】
本明細書の用法では、「活性増大」または「発現増大」は、活性または発現低下をもたらす変化に先だつ、同一ポリペプチドの生物学的活性または発現と比較した場合の、既知の生物学的活性またはポリペプチド発現のあらゆる測定可能な増大を指す。このような変化としては、本明細書に記載されるようなポリペプチドの、またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾が挙げられる。本明細書で開示される活性またはポリペプチド発現の増大は、当該技術分野で周知の、本明細書で開示される方法によって判定し得る。
【００９６】
「単離」ポリペプチドまたはその断片、変種、または誘導体とは、その天然環境にないポリペプチドが意図される。特定レベルの精製は、必要ない。例えば単離ポリペプチドは、その固有のまたは天然環境から取り出され得る。宿主細胞中で発現される、組換え的に生成されたポリペプチドおよびタンパク質は、本発明の目的で単離されていると見なされ、任意の適切な技術によって分離、分画、または部分的または実質的に精製された天然または組換えポリペプチドについても同様である。
【００９７】
本発明のポリペプチドは、約１０、２０、２５、５０、７５、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、またはそれを上回るアミノ酸のサイズであってもよい。ポリペプチドは、規定の三次元構造を有してもよいが、それらは必ずしもこのような構造を有しない。規定の三次元構造があるポリペプチドは折り畳まれたと称され、規定の三次元構造を持たず、むしろ多数の異なる立体構造を取り得るポリペプチドは、折り畳まれていないと称される。
【００９８】
前述のポリペプチド誘導体、類似体、または変異体、およびそれらのあらゆる組み合わせもまた、本発明のポリペプチドに含まれる。「活性変異体」、「活性断片」、「積極的誘導体」、および「類似体」という用語は、本発明のポリペプチドを指す。本発明のポリペプチドの変異体としては、アミノ酸置換、欠失、および／または挿入が原因で改変されたアミノ酸配列がある、ポリペプチドが挙げられる。変異体は、天然または非天然であってもよい。非天然変異体は、技術分野で既知の変異誘発技術を使用して、作り出されてもよい。変種ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失および／または付加を含んでなってもよい。本発明のポリペプチドの誘導体は、天然ポリペプチドには見られない、追加的な特性を示すように改変されているポリペプチドであってもよい。例としては、融合タンパク質が挙げられる。変種ポリペプチドはまた、本明細書で「ポリペプチド類似体」と称されてもよい。本明細書の用法では、ポリペプチドの「誘導体」は、機能性側鎖基の反応によって化学的に誘導体化された、１つまたは複数の残基を有する対象ポリペプチドを指す。「誘導体」には、２０個の標準アミノ酸の天然アミノ酸誘導体の１つまたは複数を含有するペプチドもまた含まれる。例えば、プロリンを４−ヒドロキシプロリンで置換してもよく；リジンを５−ヒドロキシリジンで置換してもよく；ヒスチジンを３−メチルヒスチジンで置換してもよく；セリンをホモセリンで置換してもよく；リジンをオルニチンで置換してもよい。
【００９９】
「断片」は、親完全長配列と配列は同一であるが、長さがより短い、本発明で使用されるポリペプチドまたは他の酵素のユニークな部分である。断片は、最高で、アミノ酸残基を１個除いた、規定配列の全長を含んでなってもよい。例えば、断片は、約５〜約１０００個の連続アミノ酸残基を含んでなってもよい。断片は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２５０または少なくとも５００個の連続アミノ酸残基長であってもよい。断片は、分子の特定領域から優先的に選択されてもよい。例えばポリペプチド断片は、一定の規定配列に示されるように、ポリペプチドの最初の１００または２００個のアミノ酸から選択される、一定長さの連続アミノ酸を含んでなってもよい。明らかにこれらの長さは例示的であり、配列表、表、および数値をはじめとする規格によって支持される任意選択の長さが、本実施形態に包含されてもよい。
【０１００】
代案としては、遺伝コード中の「重複」を利用することで、これらの同一または類似ポリペプチドをコードする組換え変異体を合成し、または選択してもよい。様々な制限酵素認識部位を生じるサイレント変化などの様々なコドン置換を導入して、プラスミドまたはウイルスベクターへのクローニング、または宿主細胞系内での発現を最適化してもよい。
【０１０１】
アミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸を、同様の構造および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置換する、すなわち保存的アミノ酸置換の結果であってもよく、またはそれらは、１つのアミノ酸を、異なる構造および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置換する、すなわち非保存的アミノ酸置換の結果であり得る。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて実施してもよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ；極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ；正に帯電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられ；負に帯電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。代案としては、これらのいずれかのアミノ酸の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、または両親媒性の相違を選択することで、「非保存的」アミノ酸置換を実施し得る。「挿入」または「欠失」は、約１〜約２０個のアミノ酸、より好ましくは約１〜約１０個のアミノ酸の範囲であってもよい。許容される変動は、組換えＤＮＡ技術を使用して、ポリペプチド分子中に体系的に、アミノ酸の挿入、欠失、または置換を施し、得られた組換え変異体を活性についてアッセイすることで、実験的に判定してもよい。
【０１０２】
本明細書の用法では、（ポリペプチドに関する）「変異体」という用語は、例えば変異誘発などの組換えＤＮＡ技術を使用して作成された、アミノ酸挿入、欠失、変異、および置換によって、具体的に列挙された本発明のポリペプチドと異なるポリペプチドを指す。対象活性を消滅させることなく、どのアミノ酸残基を置換、付加、または欠失させてもよいかを判断する指標は、特定のポリペプチドの配列を例えば酵母または細菌の相同的なポリペプチドと比較して、高相同性領域（保存領域）に起こるアミノ酸配列変化の数を最小化することで、またはアミノ酸をコンセンサス配列で置換することで、見出してもよい。
【０１０３】
例えば本発明のクエリーのアミノ酸配列と、少なくとも９５％「同一」のアミノ酸またはポリペプチド配列を有するポリペプチドとは、対象ポリペプチド配列が、クエリーアミノ酸配列の各個の１００アミノ酸あたり最高５つのアミノ酸改変を含んでもよいこと以外は、対象ポリペプチドのアミノ酸配列がクエリー配列と同一であることが意図される。換言すれば、クエリーアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るには、対象配列中の最高５％のアミノ酸残基が挿入され、欠失し、または別のアミノ酸で置換されてもよい。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置で、またはこれらの末端位置間のどこかで起きてもよく、参照配列内の残基間に個々に、または参照配列内の１つまたは複数の連続基として散在する。
【０１０４】
実際に、任意の特定のポリペプチドが、参照ポリペプチドと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラムを使用して慣習的に判定し得る。大域的配列アラインメントとも称される、クエリー配列（例えば本発明の配列）と対象配列間の最良の全体的一致を判定する好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇ，ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５，１９９０）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して判定されてもよい。配列アラインメントにおいては、クエリーおよび対象配列は、どちらもヌクレオチド配列またはどちらもアミノ酸配列のいずれかである。前記大域的配列アラインメントの結果が、％同一性である。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントで使用される、好ましいパラメータは、Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｅｎｇｔｈ、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ−０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さのどちらか短い方である。
【０１０５】
内部欠失のためではなくＮまたはＣ末端欠失のために、被験配列がクエリー配列より短い場合、結果に手動補正を施すべきである。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが％同一性を計算する際に、被験配列のＮおよびＣ末端トランケーションを考慮しないためである。クエリー配列との比較で、ＮおよびＣ末端トランケート型の対象配列では、％同一性は、対象配列のＮおよびＣ末端であって対応する対象残基と整合／整列しない、クエリー配列の残基数を、クエリー配列の全塩基の百分率として計算することで、補正される。残基が整合／整列するかどうかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって判定される。次に、規定のパラメータを使用して上のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された％同一性から、この百分率を差し引き、最終％同一性スコアを得る。本発明の目的で使用されるのは、この最終％同一性スコアである。クエリー配列と整合／整列しない、対象配列のＮおよびＣ末端残基のみが、％同一性スコアを手動調節する目的で考慮される。すなわち、対象配列の最も遠いＮおよびＣ末端残基の外には、クエリー残基のみが位置する。
【０１０６】
例えば９０個のアミノ酸残基の対象配列を１００個の残基のクエリー配列と整列して、％同一性を判定する。欠失は、対象配列のＮ末端で起こり、したがってＦＡＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ末端の最初の１０個の残基の整合／整列を示さない。１０個の不対残基は、配列の１０％（ＮおよびＣ末端の不整合残基数／クエリー配列中の残基総数）に相当するので、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される％同一性スコアから１０％が差し引かれる。残りの９０個の残基が完全に整合するならば、最終％同一性は９０％になる。別の例では、９０個の残基の対象配列を１００個の残基のクエリー配列と比較する。この例では、欠失は内部欠失であるので、クエリーと整合／整列しない残基は、対象配列のＮまたはＣ末端にはない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算される％同一性は、手動補正されない。再度、ＦＡＳＴＤＢアラインメントで示される、対象配列のＮおよびＣ末端外に位置して、クエリー配列と整合／整列しない残基のみが、手動補正される。本発明の目的では、その他の手動補正は行われない。
【０１０７】
本発明で使用するのに適したポリペプチドおよびその他の酵素、およびそれらの断片は、ポリヌクレオチドによってコードされる。「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸ならびに複数の核酸を包含することが意図され、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）などの単離核酸分子またはコンストラクトを指す。ポリヌクレオチドは、従来型リン酸ジエステル結合または非従来型結合（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）などに見られるアミド結合）を含んでなってもよい。ポリヌクレオチドは、完全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列、または非翻訳５’および３’配列およびコード配列をはじめとするその断片を含有してもよい。ポリヌクレオチドは、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい、あらゆるポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成され得る。例えばポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ；一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ；一本鎖および二本鎖ＲＮＡ；および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ；一本鎖またはより典型的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよい、ＤＮＡとＲＮＡを含んでなる、ハイブリッド分子から構成されてもよい。「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的修飾形態を包含する。
【０１０８】
「核酸」という用語は、例えば、ポリヌクレオチド中に存在する、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片などの任意選択の１つまたは複数の核酸断片を指す。本発明によるポリヌクレオチドは、さらに合成的に生成された分子を含む。本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞に天然であっても、または異種であってもよい。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節因子であってもよく、またはそれを含んでもよい。
【０１０９】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、常態ではポリペプチドをコードする核酸を含んでなるポリヌクレオチドは、１つまたは複数のコード領域と作動可能に結合する、プロモーターおよび／またはその他の転写または翻訳制御要素を含んでもよい。作動可能な結合では、遺伝子産物発現が制御配列の影響または制御下に置かれるように、例えばポリペプチドである遺伝子産物のコード領域が、１つまたは複数の制御配列と結合する。（ポリペプチドコード領域とそれに結合するプロモーターなどの）２つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘発が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらし、２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物発現を誘導する発現制御配列の能力に干渉しない、またはＤＮＡテンプレートが転写される能力に干渉しなければ、「作動的に結合する」。したがってプロモーターが核酸の転写をもたらすことができれば、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に結合する。プロモーターに加えて、例えばエンハンサー、オペレーター、抑制因子、および転写終結シグナルなどのその他の転写制御要素が、ポリヌクレオチドと作動可能に結合し得る。適切なプロモーターおよびその他の転写制御領域は、本明細書に記載され、当該技術分野で周知である。
【０１１０】
ポリヌクレオチド配列は「単離された」と称し得て、それはその天然環境から取り出されている。例えば、酵素活性（例えば基質をキシルロースに変換する能力）を有するポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードして、ベクター中に含有される異種ポリヌクレオチドは、本発明の目的では、単離されていると見なされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液中の（部分的または実質的）精製ポリヌクレオチドが挙げられる。本発明に従った単離ポリヌクレオチドまたは核酸としては、合成的に生成された分子がさらに挙げられる。ＤＮＡポリマーの形態の単離ポリヌクレオチド断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数の部分を含んでなってもよい。
【０１１１】
「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質として発現されることができ、任意選択的に、コード配列に先行する（５’非コード配列）および後続する（３’非コード配列）制御配列を含む、核酸断片を指す。
【０１１２】
本明細書の用法では、「コード領域」または「ＯＲＦ」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる、核酸の部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、コード領域が存在する場合、その一部と見なされてもよいが、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’および３’非翻訳領域などのあらゆる側面に位置する配列などは、コード領域の一部でない。「適切な制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列中、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または結合コード配列の翻訳に影響を及ぼす、ヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造を含んでもよい。
【０１１３】
多様な翻訳制御要素が、当業者に知られている。これらとしては、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、およびウイルス系由来要素（特に配列内リボソーム進入部位、またはＩＲＥＳ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であってもよい。
【０１１４】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド分泌を誘導する、分泌型またはシグナルペプチドをコードする、追加的なコード領域と結合していてもよい。
【０１１５】
ここでの用法では「形質転換」は、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物のゲノムへの核酸断片の転移を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「組換え」または「形質転換」生物と称される。
【０１１６】
「発現」と言う用語は、ここでの用法では、発明の核酸断片から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもよい。
【０１１７】
「過剰発現」という用語は、本明細書の用法では、宿主細胞中の核酸またはタンパク質レベルの増大を指す。したがって過剰発現は、宿主細胞中の内在性配列の転写または翻訳レベルの増大に起因し得て、または宿主細胞中への異種配列導入に起因し得る。過剰発現はまた、核酸またはタンパク質配列の安定性の増大に起因し得る。
【０１１８】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる起源に由来する、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、直鎖または環状の、自己複製配列、ゲノム一体化配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、その中では、いくつかのヌクレオチド配列が独自構造に連結されまたは組換えされており、それは適切な３’非翻訳配列と共に、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞に導入できる。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する、特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含み、遺伝子に加えて、その外来遺伝子の外来宿主における増大された発現を可能にする要素を有する、特定のベクターを指す。
【０１１９】
「人工」という用語は、例えば化学合成オリゴヌクレオチドなどの、合成、または非宿主細胞由来の組成物を指す。
【０１２０】
「天然」という用語は、存在する場合、それ自身の制御配列と共に、天然に見られるポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドの形態を指す。
【０１２１】
「内在性」という用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドに関して使用される場合、生物のゲノム中のその自然な位置にある、または天然ポリペプチドでは、ゲノム中のこの位置から転写および翻訳される、天然ポリヌクレオチドまたは遺伝子を指す。
【０１２２】
「異種」という用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドに関して使用される場合、常態では宿主生物に見られない、ポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドを指す。「異種ポリヌクレオチド」は、対応する天然ポリヌクレオチドと異なる形態で、生物源に再導入された未変性コーディング領域、またはその一部を含む。「異種遺伝子」は、例えば生物のゲノム中のその自然な位置でない、対応する天然遺伝子と異なる形態で、起源生物に再導入された天然コード領域、またはその一部を含む。例えば異種遺伝子としては、天然宿主に再導入された非天然調節領域をはじめとする、キメラ遺伝子の一部である未変性コーディング領域が挙げられる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。「異種ポリペプチド」は、対応する天然ポリペプチドと異なる形態で、生物源に再導入された天然ポリペプチドを含む。異種ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、例えば遺伝子移入によって宿主生物に導入されてもよい。
【０１２３】
本明細書の用法では、「修飾」という用語は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの活性変化をもたらす、本明細書で開示されるポリヌクレオチドの変化、ならびにポリペプチドの活性変化をもたらす、本明細書で開示されるポリペプチドの変化を指す。このような変化は、欠失、変異（例えば突然変異誘発、ランダム変異誘発、ミューテーター遺伝子によって引き起こされる変異誘発、またはトランスポゾン変異誘発）、置換、挿入、細胞内所在変化、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの状態変更（例えばメチル化、リン酸化、またはユビキチン化）、補助因子除去、化学修飾、共有結合修飾、ＵＶまたはＸ線照射、相同組換え、有糸分裂組換え、プロモーター置換法、および／またはそれらの組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、当該技術分野で周知の方法によって作成し得る。どのヌクレオチドまたはアミノ酸残基が修飾され得るかを判断する指標は、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列と、例えば酵母または細菌の相同的なポリヌクレオチドまたはポリペプチド群とを比較して、高相同性領域（保存領域）またはコンセンサス配列に加える修飾数を最大化することで、見出してもよい。
【０１２４】
本明細書の用法では、（ポリヌクレオチドに関する）「変異体」という用語は、例えば変異誘発などの組換えＤＮＡ技術を使用して作成された、ヌクレオチド挿入、欠失、変異、および置換によって、具体的に列挙された本発明のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドを指す。同一または類似ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド変種は、遺伝コード中の「重複性」を使用することで、合成または選択してもよい。様々な制限酵素認識部位を生じるサイレント変化などの様々なコドン置換を導入して、発現のためのプラスミドまたはウイルスベクターへのクローニングを最適化してもよい。ポリヌクレオチド配列中の変異は、ポリペプチドに、またはポリペプチドのあらゆる部分の特性を改変するためにポリペプチドに付加されたその他のペプチドのドメインに、反映されてもよい。
【０１２５】
「組換え遺伝子発現因子」という用語は、タンパク質のコード配列に先行する（５’非コード配列）および後続の（３’終止配列）制御配列を含む、１つまたは複数の特定のタンパク質を発現する核酸断片を指す。キメラ遺伝子は、組換え遺伝子発現因子である。オペロンのコード領域は、作動可能に連結するプロモーターおよび終結領域と共に、組換え遺伝子発現因子を構成してもよい。
【０１２６】
「制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列中、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または結合コード配列の翻訳に影響を及ぼす、ヌクレオチド配列を指す。制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、抑制因子、転写終結シグナル、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造が挙げられる。
【０１２７】
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できる核酸配列を指す。一般にコード配列は、プロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、またはさらには合成核酸断片を含んでなってもよい。当業者は、異なる組織または細胞タイプ中で、または異なる発達段階で、または異なる環境的または生理的な条件に答えて、異なるプロモーターが、遺伝子発現を誘導してもよいことを理解する。ほとんどの場合にほとんどの細胞型で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。他方では、「誘導性プロモーター」は、プロモーター特異的シグナルまたは分子によってプロモーターが誘発または活性化された場合に、遺伝子を発現させる。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないこともあるので、異なる長さのＤＮＡ断片が、同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。例えばＦＢＡ１遺伝子のプロモーター領域に由来する断片を指すために、「ＦＢＡ１プロモーター」を使用し得るものと理解される。
【０１２８】
「ターミネーター」という用語は、本明細書の用法では、コード配列下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これは、ポリアデニル化認識配列と、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードするその他の配列とを含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことで特徴付けられる。３’領域は、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響し得る。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないこともあるので、異なる長さのＤＮＡ断片が、同一のターミネーター活性を有してもよいことが認識される。例えばＣＹＣ１遺伝子のターミネーター領域に由来する断片を指すために、「ＣＹＣ１ターミネーター」を使用し得るものと理解される。
【０１２９】
「作動的に結合する」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターは、コード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動的に結合する（すなわちコード配列は、プロモーターの転写調節下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンスオリエンテーションで、制御配列に作動的に結合し得る。
【０１３０】
ここでの用法では「形質転換」という用語は、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物のゲノムへの核酸断片の転移を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」生物と称される。
【０１３１】
様々な宿主の形質転換のための、遺伝子または核酸分子のコード領域に言及する「コドン最適化」という用語は、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映する、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変更しない、遺伝子または核酸分子コード領域のコドン改変を指す。このような最適化としては、その生物の遺伝子でより頻繁に使用される１つまたは複数のコドンによって、少なくとも１つ、または２つ以上、またはかなり大きい数のコドンを置換することが挙げられる。
【０１３２】
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含んでなるヌクレオチド配列の偏向は、遺伝子をコードする配列の多様性を可能にする。各コドンは３個のヌクレオチドからなり、ＤＮＡを構成するヌクレオチドは４つの特定塩基に限定されるので、ヌクレオチドの６４個の可能な組み合わせがあり、その内６１個がアミノ酸をコードする（残りの３個のコドンは、翻訳終了シグナルをコードする）。いずれのコドンがいずれのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝コード」は、本明細書で表１（すなわち、標準遺伝コード）として再現される。その結果、多数のアミノ酸が、２個以上のコドンによって指定される。例えばアミノ酸、アラニンおよびプロリンは４個の三つ組み、セリンおよびアルギニンは６個の三つ組みによってコードされるのに対し、トリプトファンおよびメチオニンは１個の三つ組みのみによってコードされる。この縮重が、ＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、広範囲にわたるＤＮＡ塩基組成の変動を可能にする。
【０１３３】
【表１】
2015503350.tif 000003
【０１３４】
多数の生物は、成長するペプチド鎖への特定アミノ酸挿入をコードする、特定のコドン使用についてバイアスを示す。生物間のコドン選択、またはコドンバイアス、コドン使用頻度の差は、遺伝コードの縮重によって提供され、文献で多数の生物において十分に立証されている。コドンバイアスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、それは次に、特に翻訳されるコドンの特性、および特定の移転ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の可用性に左右されると思われる。細胞における選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般にペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適遺伝子発現のために調整してもよい。
【０１３５】
多種多様な動物、植物、および微生物種で利用できる多数の遺伝子配列を所与として、コドン使用頻度の相対的頻度を計算することが可能である。コドン使用頻度表は、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／の「コドン使用頻度データベース」で容易に入手でき、これらの表はいくつかの方法で応用し得る（例えばＮａｋａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８：２９２，２０００を参照されたい）。ＧｅｎＢａｎｋリリース１２８．０［２００２年２月１５日］から計算された酵母のコドン使用頻度表は、下で表２として転載する（遺伝子サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子のコドン使用頻度表）。この表はｍＲＮＡ命名法を使用し、表は、ＤＮＡに見られるチミン（Ｔ）の代わりに、ＲＮＡに見られるウラシル（Ｕ）を使用する。表２では、頻度が、全ての６４個のコドンでなく、各アミノ酸について計算されるように適応されている。
【０１３６】
【表２】
2015503350.tif 000004
【０１３７】
【表３】
2015503350.tif 000005
【０１３８】
【表４】
2015503350.tif 000006
【０１３９】
この表または同様の表を利用することで、当業者は、あらゆる所与のポリペプチド配列に頻度を適用して、コード領域がコドン最適化された核酸断片を生成し得るが、それは所与の種に最適のコドンを使用して、ポリペプチドをコードする。
【０１４０】
コドンを最適化頻度で無作為に割り当てて、所与のポリペプチド配列をコードすることは、各アミノ酸についてコドン頻度を計算し、次にコドンをポリペプチド配列に無作為に割り当てることにより、手動で成し得る。それに加えて、当業者は、様々なアルゴリズム、およびコンピュータソフトウェアプログラムを容易に利用できる。例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手できるＬａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商標）パッケージ中の「ＥｄｉｔＳｅｑ」機能、ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．，（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から入手できるＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ中のｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ機能、およびＡｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標），Ｉｎｃ．，（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手できるＧＣＧ−Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ中の「ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｅ」機能。さらに、コード領域配列をコドン最適化するのに、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｐｈｐ？ｌａｎｇ＝ｅｎｇ（Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ  ＧｍｂＨ，ＢａｄＡｂｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の「ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」機能、およびｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｅｍｂｏｓｓ／ｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑで利用できる「ｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ」機能などの様々な資源が公的に利用可能である。初歩的アルゴリズムを構築し、所与の頻度に基づいてコドンを割り当てることもまた、当業者によって、基本的数学機能を用いて容易に達成され得る。
【０１４１】
コドン最適化コード領域は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｍｂｃ．ｅｄｕ／ｃｏｄｏｎ／ｓｇｄ／（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｃｏｕｎｔｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）の「合成遺伝子デザイナー」などのソフトウェアパッケージをはじめとする、当業者に知られている様々な方法によって、デザインされ得る。
【０１４２】
ポリヌクレオチドまたは核酸断片は、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で、核酸断片の一本鎖形態が、その他の核酸断片とアニールし得る場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子などの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、特にその中の第１１章と表１１．１で例示される。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件を調節して、（遠縁の生物からの相同的な配列などの）中程度に類似した断片から、（近縁関係にある生物からの機能酵素を複製する遺伝子などの）類似性の高い断片までをスクリーニングし得る。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の１つの組は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを室温で１５分間に始まり、次２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを４５℃で３０分間で繰り返し、次に０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを５０℃で３０分間を２回繰り返す、ひと続きの洗浄を使用する。より望ましいストリンジェントな条件のセットはより高い温度を使用し、その中では、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での２回の３０分間の洗浄温度が６０℃に増大されたことを除いて、洗浄は上と同一である。高度にストリンジェントな条件の別の好ましいセットは、６５℃における０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の最後の洗浄を使用する。ストリンジェントな条件の追加的なセットは、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーションと、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳと、それに続く０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄を含む。
【０１４３】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要するが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で周知の変数である核酸の長さと相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸がハイブリダイズするためのＴｍ値は、より大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに相当する）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順で低下する。長さが１００個を超えるヌクレオチドのハイブリッドについて、Ｔｍを計算する方程式が誘導されている（例えば前出のＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，９．５０−９．５１参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（例えば前出のＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１１．７−１１．８参照）。一実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最短長は、少なくとも約１５ヌクレオチドであり；より好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチドであり；最も好ましくは、長さは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに当業者は、プローブ長などの要素次第で、必要に応じて温度および洗浄液塩濃度を調節してもよいことを認識する。
【０１４４】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、当業者による配列の手動評価、またはＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９３）などのアルゴリズムを使用したコンピュータによる自動配列比較と同定のいずれかによって、ポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分な、ポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなる部分である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列が、既知のタンパク質または遺伝子と相同的であると推定的に同定するためには、１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、配列依存性の遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離法（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリダイゼーション）において、２０〜３０個の隣接ヌクレオチドを含んでなる、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用してもよい。これに加えて、プライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、１２〜１５個の塩基の短鎖オリゴヌクレオチドをＰＣＲ中で増幅プライマーとして使用してもよい。したがってヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、配列を構成する核酸断片を明確に同定および／または分離するのに十分な配列を含んでなる。本明細書は、特定の真菌タンパク質をコードする、完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者は、本明細書で報告される配列の便益を有して、当業者に知られている目的のために、開示される配列の全部または実質的な部分を使用できる。したがって本発明は、本明細書で提供される完全配列、ならびに上で定義される配列の実質的な部分を含んでなる。
【０１４５】
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係性を記述するために使用される。例えばＤＮＡに関しては、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。
【０１４６】
「％同一性」と言う用語は、当該技術分野で公知のように、配列を比較して判定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。当該技術分野では「同一性」はまた、場合によっては、このような一連の配列間の一致によって測定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）で開示されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない、公知の方法によって、容易に計算され得る。
【０１４７】
同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良の整合を与えるようにデザインされる。％同一性および％類似性を判定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムで体系化されている。配列アラインメントおよび％同一性の計算は、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商標）バイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを使用して実施してもよい。配列の多重アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖとラベルされるアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３，１９８９；Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１，１９９２で開示される）に相当して、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商標）バイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムにある「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法」をはじめとする、アルゴリズムのいくつかの変種を包含する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を使用して実施してもよい。複数のアラインメントでは、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列の％同一性の計算のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸では、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを使用した配列のアラインメント後、同プログラムの配列距離表を見ることで、％同一性を得ることが可能である。「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗとラベルされるアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３，１９８９；Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１，１９９２に記載される）に相当し、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラムにある。多重アラインメントのためのデフォルトパラメータは、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＷｅｉｇｈｔＭａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢであってもよい。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを使用した配列のアラインメント後、同プログラムの配列距離表を見ることで、％同一性を得ることが可能である。
【０１４８】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用なあらゆるコンピュータアルゴリズム、またはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販されることもあり、または独立して開発されることもある。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎバージョン９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）；ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本出願の文脈内では、特に断りのない限り、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、分析結果は、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。本明細書での用法では、「デフォルト値」とは、ソフトウェアを初期化した際に、初めからロードされる値またはパラメータのあらゆる組を意味する。
【０１４９】
本発明の参照ヌクレオチド配列と、例えば少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００個のヌクレオチドあたり、最高５つの点変異を含んでもよいこと以外は、参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中の最高５％のヌクレオチドが、欠失されまたは別のヌクレオチドで置換されてもよく、または参照配列中の全ヌクレオチドの最高５％までのいくつかのヌクレオチドが、参照配列中に挿入されてもよい。
【０１５０】
実際に、任意選択の特定の核酸分子またはポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、公知のコンピュータプログラムを使用して慣習的に特定し得る。大域的配列アラインメントとも称される、クエリー配列（例えば本発明の配列）と対象配列間の最良の全体的一致を判定する好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５，１９９０）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して判定され得る。配列アラインメントでは、クエリーおよび被験配列は、どちらもＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ウラシル（Ｕ）をチミン（Ｔ）に変換することで比較し得る。前記大域的配列アラインメントの結果が、％同一性である。％同一性を計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントで使用される好ましいパラメータは、Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ−３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または被験ヌクレオチド配列長のどちらか短い方である。
【０１５１】
内部欠失のためではなく５’または３’欠失のために、被験配列がクエリー配列より短い場合、結果に手動補正を施すべきである。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが％同一性を計算する際に、被験配列の５’および３’トランケーションを考慮しないためである。クエリー配列と比較して、５’または３’末端でトランケートされた対象配列では、クエリー配列の全塩基の百分率として、整合／整列しない対象配列の５’および３’のクエリー配列の塩基数を計算することで、％同一性が補正される。ヌクレオチドが整合／整列するかどうかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって判定される。次に、規定のパラメータを使用して上のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された％同一性から、この百分率を差し引き、最終％同一性スコアを得る。本発明の目的で使用されるのは、この補正スコアである。ＦＡＳＴＤＢアラインメントで示されるように、クエリー配列と整合／整列しない、対象配列の５’および３’塩基の外部の塩基のみが、％同一性スコアを手動調節する目的で計算される。
【０１５２】
例えば９０個の塩基の対象配列を１００個の塩基のクエリー配列と配列比較して、％同一性を判定する。欠失は対象配列の５’末端に存在し、したがってＦＡＳＴＤＢアラインメントは、５’末端の最初の１０個の塩基の整合／整列を示さない。１０個の不対塩基は、配列の１０％（５’および３’末端の不整合塩基数／クエリー配列中の塩基総数）に相当するので、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される％同一性スコアから１０％が差し引かれる。残りの９０個の塩基が完全に整合するならば、最終％同一性は９０％になる。別の例では、９０個の塩基の対象配列を１００個の塩基のクエリー配列と比較する。この例では、欠失は内部欠失であるので、クエリーと整合／整列しない塩基は、対象配列の５’または３’にはない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算される％同一性は、手動補正されない。再度、クエリーと整合／整列しない対象配列の５’および３’塩基のみが、手動補正される。本発明の目的では、その他の手動補正は行われない。
【０１５３】
本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に記載される。追加的な方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ  Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に記載される。
【０１５４】
標的遺伝子の遺伝子発現を増大させ、または低下させる方法は、当業者に良く知られている。酵母中の遺伝子発現方法は、例えばＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ  Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）に記載されるように、当該技術分野で公知である。発現を増大させる方法としては、ゲノム中に、または標的タンパク質を発現するプラスミド上に、組み込まれる遺伝子数を増大させること、および天然プロモーターよりも高度に発現させるプロモーターを使用することが挙げられる。発現のために構築されたキメラ遺伝子中で作動可能に連結してもよいプロモーターとしては、例えば、ＦＢＡ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨ１、およびＧＰＭ１などの構成的プロモーター、およびＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、およびＣＵＰ１などの誘導性プロモーターが挙げられる。発現のためにキメラ遺伝子コンストラクトで使用されてもよい適切な転写ターミネーターとしては、ＦＢＡ１ｔ、ＴＤＨ３ｔ、ＧＰＭ１ｔ、ＥＲＧ１０ｔ、ＧＡＬ１ｔ、ＣＹＣ１ｔ、およびＡＤＨ１ｔが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１５５】
適切なプロモーター、転写ターミネーター、およびコード領域は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクターにクローン化して、酵母細胞に形質転換してもよい。これらのベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および酵母株の双方における増殖を可能にする。典型的に、ベクターは、選択可能なマーカーと、所望の宿主中で自律複製または染色体への組み込みができるようにする配列とを含有する。酵母で使用されるプラスミドは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点（例えばｐＭＢ１）、酵母２μ複製起点、および栄養的選択マーカーを含有する、シャトルベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、およびｐＲＳ４２６（米国微生物系統保存機関，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）である。これらの４つのベクターの選択マーカーは、ＨＩＳ３（ベクターｐＲＳ４２３）、ＴＲＰ１（ベクターｐＲＳ４２４）、ＬＥＵ２（ベクターｐＲＳ４２５）、およびＵＲＡ３（ベクターｐＲＳ４２６）である。発現ベクターの構築は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の標準分子クローニング技術、または酵母中のｇａｐ修復組換え法のいずれかによって実施してもよい。
【０１５６】
発現を低下させる方法としては、コードする遺伝子の遺伝子修飾を使用することが挙げられる。発現を低下させまたは排除するために標的遺伝子を遺伝子修飾する多数の方法が当業者に知られており、酵母などの産生宿主細胞を作成するのに使用されてもよい。使用されてもよい修飾としては、タンパク質をコードする遺伝子全体または遺伝子部分の欠失；タンパク質が発現しない、またはより低レベルで発現するようにする、コード遺伝子（例えばプロモーターまたはコード領域内のいずれか）へのＤＮＡ断片の挿入；機能性タンパク質が発現しないようにする、停止コドンまたはフレームシフトを付加する変異のコード領域への導入；および非機能性またはより低活性のタンパク質が発現されるように、アミノ酸を変化させる１つまたは複数の変異のコード領域への導入が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、標的遺伝子の発現は、アンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡの発現によってブロックしてもよく、共抑制をもたらすコンストラクトを導入してもよい。さらに、変異によって、転写物の合成または安定性を低下させてもよい。同様に、変異によって、タンパク質がｍＲＮＡから翻訳される効率を調節してもよい。これらの全ての方法は、標的タンパク質をコードする公知のまたは同定された配列を利用して、当業者によって容易に実施されてもよい。
【０１５７】
標的コード配列を取り囲むＤＮＡ配列もまた、いくつかの改変手順において有用である。特に、例えば標的遺伝子のコード配列を取り囲むＤＮＡ配列は、相同組換えを使用した改変方法に有用である。この方法では、標的遺伝子の側面に位置する配列は、選択可能なマーカー遺伝子と境を接して配置され、マーカー遺伝子が標的遺伝子を置き換える、相同組換えを媒介する。また選択可能なマーカー遺伝子と境を接する、部分的標的遺伝子配列および標的遺伝子側面に位置する配列を使用して、マーカー遺伝子が標的遺伝子の一部を置き換える、相同組換えを媒介してもよい。さらに、選択可能なマーカーは、対応する部位特異的リコンビナーゼの発現に続いて、耐性遺伝子が再活性化することなく標的遺伝子から切除されるように、部位特異的組換え部位と境を接してもよい。部位特異的組換えは、標的タンパク質の発現を妨害する組換え部位を後に残す。当業者には周知のように、相同組換えベクターを構築して、選択可能なマーカーの切除に続いて、標的遺伝子中に欠失を残してもよい。
【０１５８】
欠失は、Ｗａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｙｅａｓｔ  １０：１７９３−１８０８，１９９４）に記載される有糸分裂組換えを使用して作成してもよい。この方法は、２０ｂｐ程度に短くてもよいゲノム領域間の選択可能なマーカーを含有して、標的ＤＮＡ配列に結合する、ＤＮＡ断片を調製することを伴う。このＤＮＡ断片は、酵母ゲノムで組換え得るゲノム領域を含む、マーカー遺伝子末端とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、選択可能なマーカー遺伝子のＰＣＲ増幅によって調製し得る。線状ＤＮＡ断片は、酵母に効率的に形質転換されて、ゲノムに遺伝子組換えされ、標的ＤＮＡ配列の欠失を含む遺伝子置換をもたらし得る（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖ１９４，ｐｐ  ２８１−３０１，１９９１に記載されるように）。
【０１５９】
さらに、プロモーター置換方法を使用して、内在性転写制御要素を交換して、発現を調節する別の手段を可能にしてもよい（例えばＭｎａｉｍｎｅｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １１８：３１−４４，２００４を参照されたい）。
【０１６０】
さらに無作為の変異誘発を使用して、標的遺伝子がコードする活性を妨害してもよく、活性が低下した株を同定するスクリーニングがそれに続く。この種の方法を使用する上で、標的遺伝子コード領域のＤＮＡ配列は、または活性に影響を及ぼすゲノムのあらゆるその他の領域は、既知でなくてもよい。遺伝子変異を作り出す方法は、当該技術分野で一般的かつ周知であり、変異体作成の実施に適用されてもよい。一般に使用されるランダム遺伝子修飾法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．で概説される）としては、突然変異誘発、変異誘発によって引き起こされるミューテーター遺伝子、化学変異誘発、ＵＶまたはＸ線照射、またはトランスポゾン変異誘発が挙げられる。
【０１６１】
酵母の化学変異誘発は、通常、スルホン酸エチル（ＥＭＳ）、亜硝酸、硫酸ジエチル、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソ−グアニジン（ＭＮＮＧ）の内１つのＤＮＡ変異原による、酵母細胞の処理を伴う。これらの変異誘発法は、Ｓｐｅｎｃｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，１９９６，Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）で概説されている。Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されるようにして、ＥＭＳによる化学的突然変異誘発を実施してもよい。紫外線（ＵＶ）光またはＸ線の照射もまた使用して、酵母細胞にランダム変異誘発を引き起こし得る。ＵＶ照射による変異誘発の主要効果は、ＤＮＡ複製の忠実度を妨害するピリミジン二量体の形成である。酵母のＵＶ変異誘発のプロトコルは、Ｓｐｅｎｃｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，１９９６，Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）にある。ミューテーター表現型の導入もまた使用して、酵母中でランダム染色体変異を生じさせ得る。一般的なミューテーター表現型は、遺伝子ＰＭＳ１、ＭＡＧ１、ＲＡＤ１８またはＲＡＤ５１の１つまたは複数の破壊を通じて得られ得る。非ミューテーター表現型の復元は、野生型対立遺伝子の挿入によって、容易に得られ得る。これらの、またはその他の既知のランダム変異誘発法のいずれかから生成された改変細胞の収集物を、活性低下についてスクリーニングしてもよい。
【０１６２】
リン酸ジエステラーゼの修飾
本発明のいくつかの実施形態では、微生物は、リン酸ジエステラーゼ活性の低下または排除を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物はまた、本明細書でさらに詳しく説明するように、イソブタノール生合成経路、１−ブタノール生合成経路、２−ブタノール生合成経路、または２−ブタノン生合成経路を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、イソブタノール生合成経路は、（ａ）ピルビン酸からアセト乳酸；（ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸；（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸から２−ケトイソ吉草酸；（ｄ）２−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド；および（ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールからなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、イソブタノール生合成経路は、アセト乳酸シンターゼ活性、ケト酸レダクトイソメラーゼ活性、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性、ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性、およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなってもよい。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、微生物は、１−ブタノール生合成経路を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、１−ブタノール生合成経路は、（ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ；（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ；（ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡ；（ｄ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡ；（ｅ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒド；および（ｆ）ブチルアルデヒドから１−ブタノールからなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、１−ブタノール生合成経路は、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ活性；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性；クロトナーゼ活性；ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性；ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、および／またはブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなってもよい。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、微生物は、２−ブタノール生合成経路を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、（ａ）ピルビン酸からα−アセト乳酸；（ｂ）α−アセト乳酸からアセトイン；（ｃ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノール；（ｄ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸；（ｅ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノン；および（ｆ）−ブタノンから２−ブタノールからなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、アセト乳酸シンターゼ活性；アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性；アセトニンアミナーゼ活性；アミノブタノールキナーゼ活性；アミノブタノールリン酸ホスホリラーゼ活性；および／またはブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなってもよい。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、（ａ）ピルビン酸からα−アセト乳酸；（ｂ）α−アセト乳酸からアセトイン；（ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオール；（ｄ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノン；および（ｅ）２−ブタノンから２−ブタノールからなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、アセト乳酸シンターゼ活性；アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性；ブタンジオールデヒドロゲナーゼ活性；ジアールデヒドラターゼ活性；および／またはブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなってもよい。
【０１６６】
本発明のいくつかの実施形態では、微生物は、リン酸ジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子の修飾または妨害、またはリン酸ジエステラーゼ活性を有するポリペプチドの修飾または妨害を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、リン酸ジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドまたは遺伝子中の、またはリン酸ジエステラーゼ活性を有する内在性ポリペプチド中の、挿入、欠失、変異、および／または置換を含んでなってもよい。このような修飾、中断、挿入、欠失、変異、および／または置換は、リン酸ジエステラーゼ活性の低下または排除をもたらしてもよい。なおも別の実施形態では、ポリヌクレオチド、遺伝子、またはリン酸ジエステラーゼ活性を有するポリペプチドは、酵素番号ＥＣ  ３．１．４．１７に相当してもよい。
【０１６７】
本明細書で開示される微生物中における修飾または不活性化の標的になり得る、リン酸ジエステラーゼポリヌクレオチド、遺伝子、およびポリペプチドの例としては、配列番号１〜３が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１６８】
本明細書で開示される微生物中における修飾または不活性化の標的としてもよい、リン酸ジエステラーゼポリヌクレオチド、遺伝子、およびポリペプチドのその他の例としては、配列番号１〜３と、少なくとも約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する、リン酸ジエステラーゼポリヌクレオチド、遺伝子、および／またはポリペプチドが挙げられるが、これに限定されるものではなく、このようなポリヌクレオチドまたは遺伝子はリン酸ジエステラーゼ活性をコードし、またはこのようなポリペプチドはリン酸ジエステラーゼ活性を有する。本明細書で開示される微生物中における修飾または不活性化の標的としてもよいリン酸ジエステラーゼポリヌクレオチド、遺伝子、およびポリペプチドのさらに他の例としては、配列番号１〜３の活性変異体、断片、または誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではなく、このようなポリヌクレオチドまたは遺伝子はリン酸ジエステラーゼ活性をコードし、またはこのようなポリペプチドはリン酸ジエステラーゼ活性を有する。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、その他のリン酸ジエステラーゼポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチドの配列は、本明細書で開示される配列および当該技術分野で入手できる配列を使用して、当業者に良く知られている文献および／またはバイオインフォマティクスデータベース中で同定されてもよい。例えばこのような配列は、リン酸ジエステラーゼをコードする既知のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列で、公的に利用できるデータベースをＢＬＡＳＴ検索することで、同定してもよい。このような方法では、同一性は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重量マトリックスのデフォルトパラメータを使用して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいてもよい。
【０１７０】
さらに、本明細書で開示されるまたは技術分野で既知のリン酸ジエステラーゼポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を使用して、自然界のその他のリン酸ジエステラーゼホモログを同定してもよい。例えば本明細書で開示されるリン酸ジエステラーゼコード核酸断片を使用して、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離してもよい。配列依存プロトコルを使用する相同遺伝子の単離は、技術分野で周知である。配列依存性プロトコルの例としては、核酸ハイブリダイゼーション法；核酸増幅技術の様々な使用によって例示されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法［例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：１０７４，１９８５；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２，１９９２］；およびライブラリー構築と相補性によるスクリーニング法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される微生物に関連したリン酸ジエステラーゼポリヌクレオチド、遺伝子、および／またはポリペプチドは、改変されまたは妨害されてもよい。発現を低下させまたは排除するために標的遺伝子を遺伝子修飾および破壊する多数の方法が当業者に知られており、本明細書に記載される微生物を作成するのに使用されてもよい。使用し得る修飾としては、リン酸ジエステラーゼポリペプチドをコードする遺伝子全体または遺伝子部分の欠失；タンパク質が発現しない、またはより低レベルで発現するようにする、コード遺伝子（プロモーターまたはコード領域内のいずれか）へのＤＮＡ断片の挿入；機能性タンパク質が発現しないようにする、停止コドンまたはフレームシフトを付加する変異のコード領域への導入；および／または非機能性またはより低活性のタンパク質が発現されるように、アミノ酸を変化させる１つまたは複数の変異のコード領域への導入が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現をアンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡの発現によってブロックしてもよく、共抑制をもたらすコンストラクトを導入し得る。いくつかの実施形態では、変異によって、転写物の合成または安定性を低下させてもよい。いくつかの実施形態では、変異によって、タンパク質がｍＲＮＡから翻訳される効率を調節してもよい。これらの方法は、標的タンパク質をコードする公知のまたは同定された配列を利用して、当業者によって容易に実施されてもよい。
【０１７２】
リン酸ジエステラーゼ活性を低下させまたは排除するための、本明細書で開示される微生物中におけるリン酸ジエステラーゼの修飾は、当該技術分野で公知の方法を使用して確認してもよい。例えば特定のリン酸ジエステラーゼの妨害は、リン酸ジエステラーゼ遺伝子内部および外部のプライマーを使用するＰＣＲスクリーニングによって、またはリン酸ジエステラーゼ遺伝子配列のためにデザインされたプローブを使用するザンブロット法によって、確認してもよい。代案としては、リン酸ジエステラーゼ活性を測定する酵素アッセイ法を利用し得る（例えば、Ｂｒｉｄｇｅ−Ｉｔ（登録商標）ＰＤＥアッセイ、Ｍｅｄｉｏｍｉｃｓ，ＬＬＣ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ＰＤＥ−Ｇｌｏ（商標）リン酸ジエステラーゼアッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｙｏｕｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１７：３６−４０，２０１１）。
【０１７３】
生合成経路
使用されてもよいイソブタノール生産のための生合成経路としては、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，８５１，１８８号明細書に記載されるものが挙げられる。一実施形態では、イソブタノール生合成経路は、
ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からアセト乳酸への；
ｂ）例えばアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼによって触媒されてもよい、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への；
ｃ）例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されてもよい２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への；
ｄ）例えば分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ によって触媒されてもよい、α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換；および
ｅ）例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなってもよい。
【０１７４】
別の実施形態では、イソブタノール生合成経路は、
ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からアセト乳酸への；
ｂ）例えばケトール酸レダクトイソメラーゼによって触媒されてもよい、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への；
ｃ）例えばジヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されてもよい、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への；
ｄ）例えばトランスアミナーゼまたはバリンデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、α−ケトイソ吉草酸からバリンへの；
ｅ）例えばバリンデカルボキシラーゼによって触媒されてもよい、バリンからイソブチルアミンへの；
ｆ）例えばω−トランスアミナーゼによって触媒されてもよい、イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの；および
ｇ）例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなってもよい。
【０１７５】
別の実施形態では、イソブタノール生合成経路は、
ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からアセト乳酸への；
ｂ）例えばアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼによって触媒されてもよい、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への；
ｃ）例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されてもよい、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への；
ｄ）例えば分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡへの；
ｅ）例えばアシル化（ａｃｅｌｙｌａｔｉｎｇ）アルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの；および
ｆ）例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなってもよい。
【０１７６】
使用されてもよい１−ブタノール生産のための生合成経路としては、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８号明細書に記載されるものが挙げられる。一実施形態では、１−イソブタノール生合成経路は、
ａ）例えばアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによって触媒されてもよい、アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへの；
ｂ）例えば３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの；
ｃ）例えばクロトナーゼによって触媒されてもよい、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへの；
ｄ）例えばブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへの；
ｅ）例えばブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへの；および
ｆ）例えばブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなってもよい。
【０１７７】
使用されてもよい２−ブタノールの生成のための生合成経路としては、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０号明細書および米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書に記載されるものが挙げられる。一実施形態では、２−イソブタノール生合成経路は、
ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からα−アセト乳酸への；
ｂ）例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されてもよい、α−アセト乳酸からアセトインへの；
ｃ）例えばアセトニンアミナーゼによって触媒されてもよい、アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの；
ｄ）例えばアミノブタノールキナーゼによって触媒されてもよい、３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールホスフェートへの；
ｅ）例えばアミノブタノールホスフェートホスホリラーゼによって触媒されてもよい、３−アミノ−２−ブタノールホスフェートから２−ブタノンへのおよび，
ｆ）例えばブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、ブチルアルデヒドから２−ブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなってもよい。
【０１７８】
別の実施形態では、２−イソブタノール生合成経路は、
ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からα−アセト乳酸への；
ｂ）例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されてもよい、α−アセト乳酸からアセトインへの；
ｃ）例えばブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、アセトインから２，３−ブタンジオールへの；
ｄ）例えばジジアールデヒドラターゼによって触媒されてもよい、２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの；および，
ｅ）例えばブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、ブタノンから２−ブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなってもよい。
【０１７９】
使用されてもよい２−ブタノンの生成のための生合成経路としては、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０号明細書および米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書に記載されるものが挙げられる。一実施形態では、２−ブタノン生合成経路は、
ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からα−アセト乳酸への；
ｂ）例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されてもよい、α−アセト乳酸からアセトインへの；
ｃ）例えばアセトニンアミナーゼによって触媒されてもよい、アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの；
ｄ）例えばアミノブタノールキナーゼによって触媒されてもよい、３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールホスフェートへの；および，
ｅ）例えばアミノブタノールホスフェートホスホリラーゼによって触媒されてもよい、３−アミノ−２−ブタノールホスフェートから２−ブタノンへの
基質から生成物への変換を含んでなってもよい。
【０１８０】
別の実施形態では、２−ブタノン生合成経路は、
ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からα−アセト乳酸への；
ｂ）例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されてもよい、α−アセト乳酸からアセトインへの；
ｃ）例えばブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、アセトインから２，３−ブタンジオールへの；
ｄ）例えばジオールデヒドラターゼによって触媒されてもよい、２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの
基質から生成物への変換を含んでなってもよい。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、植物由来炭素源からブタノールを生産してもよく、ブタノール生成のための標準石油化学的工程に付随する、環境に対する悪影響を回避する。いくつかの実施形態では、ブタノールを生産する方法は、ブタノール経路を含んでなる組換え宿主細胞を利用する。いくつかの実施形態では、ブタノール生合成経路は、組換え宿主細胞に異種である、少なくとも１つのポリヌクレオチド、少なくとも２つのポリヌクレオチド、少なくとも３つのポリヌクレオチド、または少なくとも４つのポリヌクレオチドを含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞中における、ブタノール生合成経路の基質から生成物への各変換は、異種ポリペプチドによって触媒される。いくつかの実施形態では、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への基質から産物への変換を触媒するポリペプチド、および／またはイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドは、補助因子としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）を利用できる。
【０１８２】
「アセトヒドロキシ酸シンターゼ」、「アセト乳酸シンターゼ」、および「アセト乳酸シンセターゼ」（「ＡＬＳ」と略される）という用語は、本明細書において同義的に使用され、ピルビン酸からアセト乳酸およびＣＯ２への変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。アセト乳酸シンターゼの例は、ＥＣ番号２．２．１．６で知られている（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。これらの未改変酵素は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１５６１８（配列番号４）、Ｚ９９１２２（配列番号５）、ＣＡＢ０７８０２（配列番号２７２）、クレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５０７９（配列番号６）、Ｍ７３８４２（配列番号７））、およびラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５１６１（配列番号８）、Ｌ１６９７５（配列番号９））をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの起源から入手できる。
【０１８３】
「ケトール酸レダクトイソメラーゼ」（「ＫＡＲＩ」）、「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ」、および「アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ」という用語は、同義的に使用されて、（Ｓ）−アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への反応を触媒できる酵素活性を有するポリペプチド（またはポリペプチド）を指す。例証的ＫＡＲＩ酵素は、ＥＣ番号ＥＣ  １．１．１．８６（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ）に分類されてもよく、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１８２２２（配列番号１０）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号１１））、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１３４５９（配列番号１２）、ＮＣ＿００１１４４（配列番号１３））、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＦ３０２１０（配列番号１４）、ＢＸ９５７２２０（配列番号１５））、およびバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４７８９（配列番号１６）、Ｚ９９１１８（配列番号１７））をはじめとするが、これに限定されるものではない、無数の微生物から入手できる。ＫＡＲＩとしては、アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）ＫＡＲＩ変種「Ｋ９Ｇ９」および「Ｋ９Ｄ３」（それぞれ配列番号１８および１９）が挙げられる。ケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００８／０２６１２３０号明細書、米国特許出願公開第２００９／０１６３３７６号明細書、および米国特許出願公開第２０１０／０１９７５１９号明細書、および国際公開第２０１１／０４１４１５号パンフレットに記載される。その中で開示されるＫＡＲＩの例は、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）コレラ、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＡＯ１、およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＰＦ５変異体からのものである。いくつかの実施形態では、ＫＡＲＩは、ＮＡＤＨを利用する。いくつかの実施形態では、ＫＡＲＩは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）を利用する。
【０１８４】
「アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ」および「ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ」（「ＤＨＡＤ」）」という用語は、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。例証的アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼは、ＥＣ番号４．２．１．９で知られている。このような酵素は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿０２６２４８（配列番号２０）、ＮＣ０００９１３（配列番号２１））、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１２５５０（配列番号２２）、ＮＣ００１１４２（配列番号２３））、Ｍ．マリパルディス（Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＦ２９８７４（配列番号２４）、ＢＸ９５７２１９（配列番号２５））、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４１０５（配列番号２６）、Ｚ９９１１５（配列番号２７））、Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、およびアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）をはじめとするが、これに限定されるものではない，無数の微生物から入手できる。参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１０／００８１１５４号明細書、および米国特許第７，８５１，１８８号明細書は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）からのＤＨＡＤをはじめとするジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）を記載する。
【０１８５】
「分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ」、「α−ケト酸デカルボキシラーゼ」、「α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ」、または「２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ」（「ＫＩＶＤ」）という用語は、α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドおよびＣＯ２への変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。例証的分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼはＥＣ番号４．１．１．７２として知られており、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＳ４９１６６（配列番号２８）、ＡＹ５４８７６０（配列番号２９）；ＣＡＧ３４２２６（配列番号３０）、ＡＪ７４６３６４（配列番号３１）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４６１３４６（配列番号３２）、ＮＣ＿００３１９７（配列番号３３））、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿１４９１８９（配列番号３４）、ＮＣ＿００１９８８（配列番号３５））、Ｍ．カセオリティカス（Ｍ．ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（配列番号３６）、およびＬ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）（配列番号３７）をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの起源から入手できる。
【０１８６】
「分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ」（「ＡＤＨ」）という用語は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。例証的分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼはＥＣ番号１．１．１．２６５で知られているが、その他のアルコールデヒドロゲナーゼ（具体的にはＥＣ  １．１．１．１または１．１．１．２）にもまた分類されてもよい。アルコールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＰＨ依存性またはＮＡＤＨ依存性であってもよい。このような酵素は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１０６５６（配列番号３８）、ＮＣ＿００１１３６（配列番号３９）、ＮＰ＿０１４０５１（配列番号４０）、ＮＣ＿００１１４５（配列番号４１））、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１７４８４（配列番号４２）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号４３））、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９８９２（配列番号４４）、ＮＣ＿００３０３０（配列番号４５）；ＮＰ＿３４９８９１（配列番号４６）、ＮＣ＿００３０３０（配列番号４７））をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの起源から入手できる。米国特許出願公報第２００９／０２６９８２３号明細書は、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）からのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）である、ＳａｄＢについて記載する。アルコールデヒドロゲナーゼとしては、ウマ肝臓ＡＤＨおよびベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨもまた挙げられる（参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１１／０２６９１９９号明細書によって記載されるように）。
【０１８７】
「ブタノールデヒドロゲナーゼ」という用語は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換、または２−ブタノンおよび２−ブタノールの変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。ブタノールデヒドロゲナーゼは、幅広いアルコールデヒドロゲナーゼファミリーのサブセットである。ブタノールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ依存性であってもよい。ＮＡＤ依存性酵素はＥＣ  １．１．１．１として知られており、例えばロドコッカス・ルーバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＤ３６４７５、ＡＪ４９１３０７）から入手できる。ＮＡＤＰ依存性酵素はＥＣ  １．１．１．２として知られており、例えばピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ２５５５６、ＡＦ０１３１６９）から入手できる。さらにブタノールデヒドロゲナーゼは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ４１７４８４、ＮＣ＿０００９１３）から入手でき、シクロヘキサノールデヒドロゲナーゼはアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）種（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＧ１００２６、ＡＦ２８２２４０）から入手できる。「ブタノールデヒドロゲナーゼ」という用語は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかを補助因子として使用して、ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの変換を触媒する酵素も指す。ブタノールデヒドロゲナーゼは、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿１４９３２５、ＮＣ＿００１９８８；注記：この酵素はアルデヒドおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性の双方を持つ）；ＮＰ＿３４９８９１、ＮＣ＿００３０３０；およびＮＰ＿３４９８９２、ＮＣ＿４８４）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１７−４８４、ＮＣ＿０００９１３）から入手できる。
【０１８８】
「分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ」という用語は、典型的に電子受容体としてＮＡＤ＋
（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を使用して、α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡ（イソブチリル−補酵素Ａ）への変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。例証的分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．４．４で知られている。このような分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼは４つのサブユニットを含んでなり、全てのサブユニットからの配列は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４３３６（配列番号４８）、Ｚ９９１１６（配列番号４９）；ＣＡＢ１４３３５（配列番号５０）、Ｚ９９１１６（配列番号５１）；ＣＡＢ１４３３４（配列番号５２）、Ｚ９９１１６（配列番号５３）；およびＣＡＢ１４３３７（配列番号５４）、Ｚ９９１１６（配列番号５５））およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ６５６１４（配列番号５６）、Ｍ５７６１３（配列番号５７）；ＡＡＡ６５６１５（配列番号５８）、Ｍ５７６１３（配列番号５９）；ＡＡＡ６５６１７（配列番号６０）、Ｍ５７６１３（配列番号６１）；およびＡＡＡ６５６１８（配列番号６２）、Ｍ５７６１３（配列番号６３））をはじめとするが、これに限定されるものではない、無数の微生物から入手できる。
【０１８９】
「アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ」という用語は、典型的にＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかを電子供与体として使用して、イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。例証的アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１．１０および１．２．１．５７で知られている。このような酵素は、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＤ３１８４１（配列番号６４）、ＡＦ１５７３０６（配列番号６５））、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿１４９３２５（配列番号６６）、ＮＣ＿００１９８８（配列番号６７）；ＮＰ＿１４９１９９（配列番号６８）、ＮＣ＿００１９８８（配列番号６９））、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ８９１０６（配列番号７０）、Ｕ１３２３２（配列番号７１））、およびサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿１４５４８６（配列番号７２）、ＮＣ＿００６４６１（配列番号７３））をはじめとするが、これに限定されるものではない、複数起源から入手できる。
【０１９０】
「トランスアミナーゼ」という用語は、アラニンまたはグルタミン酸のいずれかをアミン供与体として使用して、α−ケトイソ吉草酸からＬ−バリンへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。例証的トランスアミナーゼは、ＥＣ番号２．６．１．４２および２．６．１．６６で知られている。このような酵素は、いくつかの起源から入手できる。アラニン依存性酵素の起源の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿０２６２３１（配列番号７４）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号７５））およびバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿０９３７４３（配列番号７６）、ＮＣ＿００６３２２（配列番号７７））が挙げられるが、これに限定されるものではない。グルタミン酸依存性酵素の起源の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿０２６２４７（配列番号７８）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号７９））、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１２６８２（配列番号８０）、ＮＣ＿００１１４２（配列番号８１））およびメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿２７６５４６（配列番号８２）、ＮＣ＿０００９１６（配列番号８３））が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１９１】
「バリンデヒドロゲナーゼ」という用語は、典型的にＮＡＤ（Ｐ）Ｈを電子供与体として、アンモニアをアミン供与体として使用し、α−ケトイソ吉草酸からＬ−バリンへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。例証的バリンデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．４．１．８および１．４．１．９で知られており、このような酵素は、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿６２８２７０（配列番号８４）、ＮＣ＿００３８８８（配列番号８５））およびバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４３３９（配列番号８６）、Ｚ９９１１６（配列番号８７））をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの起源から入手できる。
【０１９２】
「バリンデカルボキシラーゼ」という用語は、Ｌ−バリンからイソブチルアミンおよびＣＯ２への変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。例証的バリンデカルボキシラーゼは、ＥＣ番号４．１．１．１４で知られている。このような酵素は、例えばストレプトミセス・ビリディファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＮ１０２４２（配列番号８８）、ＡＹ１１６６４４（配列番号８９））などのストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に見られる。
【０１９３】
「ωトランスアミナーゼ」という用語は、適切なアミノ酸をアミン供与体として使用して、イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。例証的ωトランスアミナーゼはＥＣ番号２．６．１．１８で知られており、アルカリゲネス・デニトリフィカンス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）（ＡＡＰ９２６７２（配列番号９０）、ＡＹ３３０２２０（配列番号９１））、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿２９４４７４（配列番号９２）、ＮＣ＿００７３４７（配列番号９３））、シューワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿７１９０４６（配列番号９４）、ＮＣ＿００４３４７（配列番号９５））、およびＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＮ６６２２３（配列番号９６）、ＡＥ０１６７７６（配列番号９７））をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの起源から入手できる。
【０１９４】
「アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ」という用語は、２分子のセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡおよび補酵素Ａ（ＣｏＡ）への変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。例証的アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼは、短鎖アシルＣｏＡとアセチル−ＣｏＡに対する基質選択性（順方向での反応）がある、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼであり、Ｅ．Ｃ．２．３．１．９に分類される［Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ］；しかしより広い基質範囲の酵素（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１６）も同様に機能性である。アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼブは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１６７２８、ＮＣ＿０００９１３；ＮＣＢＩアミノ酸配列、ＮＣＢＩヌクレオチド配列）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９４７６．１、ＮＣ＿００３０３０；ＮＰ＿１４９２４２、ＮＣ＿００１９８８）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３９０２９７、ＮＣ＿０００９６４）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１５２９７、ＮＣ＿００１１４８）などのいくつかの起源から入手できる。
【０１９５】
「３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」という用語は、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。例証的３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨ−依存性であってもよく、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対する基質選択性がある。例証的酵素は、それぞれＥ．Ｃ．１．１．１．３５およびＥ．Ｃ．１．１．１．３０に分類されてもよい。さらに３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、ＡＤＰＨ依存性であってもよく、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対する基質選択性がああり、それぞれＥ．Ｃ．１．１．１．１５７およびＥ．Ｃ．１．１．１．３６に分類される。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９３１４、ＮＣ＿００３０３０）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＢ０９６１４、Ｕ２９０８４）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿２９４４８１、ＮＣ＿００７３４７）、およびアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２１９７３、Ｊ０４９８７）などのいくつかの起源から入手できる。
【０１９６】
「クロトナーゼ」という用語は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡおよびＨ２Ｏへの変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。例証的クロトナーゼは、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対する基質選択性を有してもよく、それぞれＥ．Ｃ．４．２．１．１７およびＥ．Ｃ．４．２．１．５５に分類されてもよい。クロトナーゼは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１５９１１、ＮＣ＿０００９１３）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９３１８、ＮＣ＿００３０３０）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１３７０５、Ｚ９９１１３）、およびアエロモナス・カビアエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＢＡＡ２１８１６、Ｄ８８８２５）などのいくつかの起源から入手できる。
【０１９７】
「ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」という用語は、クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。例証的ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨ依存性、ＮＡＤＰＨ依存性、またはフラビン依存性であってもよく、それぞれＥ．Ｃ．１．３．１．４４、Ｅ．Ｃ．１．３．１．３８、およびＥ．Ｃ．１．３．９９．２に分類されてもよい。ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４７１０２、ＮＣ＿００３０３０）、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：Ｑ５ＥＵ９０、ＡＹ７４１５８２）、ストレプトミセス・コリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｌｌｉｎｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ９２８９０、Ｕ３７１３５）、およびストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＡ２２７２１、ＡＬ９３９１２７）などのいくつかの起源から入手できる。
【０１９８】
「ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ」という用語は、補助因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用して、ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（またはポリペプチド）を指す。ＮＡＤＨに対する選択性があるブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、Ｅ．Ｃ．１．２．１．５７として知られており、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＤ３１８４１、ＡＦ１５７３０６）およびＣ．アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿１４９３２５、ＮＣ＿００１９８８）から入手できる。
【０１９９】
「イソブチリル−ＣｏＡムターゼ」という用語は、ブチリル−ＣｏＡからイソブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（またはポリペプチド）を指す。この酵素は、補助因子として補酵素Ｂ１２を使用する。例証的イソブチリル−ＣｏＡムターゼは、ＥＣ番号５．４．９９．１３で知られている。これらの酵素は、ストレプトミセス・シンナモネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ０８７１３（配列番号９８）、Ｕ６７６１２（配列番号９９）；ＣＡＢ５９６３３（配列番号１００）、ＡＪ２４６００５（配列番号１０１））、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ７０６４５（配列番号１０２）、ＡＬ９３９１２３（配列番号１０３）；ＣＡＢ９２６６３（配列番号１０４）、ＡＬ９３９１２１（配列番号１０５））、およびストレプトミセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿８２４００８（配列番号１０６）、ＮＣ＿００３１５５（配列番号１０７）；ＮＰ＿８２４６３７（配列番号１０８）、ＮＣ＿００３１５５（配列番号１０９））をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかのストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に見られる。
【０２００】
「アセト乳酸デカルボキシラーゼ」という用語は、α−アセト乳酸からアセトインへの変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。例証的アセト乳酸デカルボキシラーゼはＥＣ  ４．１．１．５として知られており、例えば、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２２２２３、Ｌ０４４７０）、クレブシエラ・テリゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５０５４、Ｌ０４５０７）およびクレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＵ４３７７４、ＡＹ７２２０５６）から入手できる。
【０２０１】
「アセトインアミナーゼ」または「アセトイントランスアミナーゼ」という用語は、アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド）を指す。アセトインアミナーゼは、補助因子ピリドキサール５’−リン酸またはＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを利用してもよい。得られた生成物は、３位に（Ｒ）または（Ｓ）立体配置を有してもよい。ピリドキサールリン酸依存性酵素は、アラニンまたはグルタミン酸などのアミノ酸をアミノ供与体として使用してもよい。ＮＡＤＨ依存性酵素およびＮＡＤＰＨ依存性酵素は、アンモニアを第２の基質として使用してもよい。アミノアルコールデヒドロゲナーゼとしてもまた知られている、ＮＡＤＨ依存性アセトインアミナーゼの適切な例が、Ｉｔｏ，ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，４３２，６８８号明細書）によって記載される。ピリドキサール依存性アセトインアミナーゼの一例は、Ｓｈｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｍ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：２８４８−２８５３（２００２））によって記載される、アミン：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（アミン：ピルビン酸トランスアミナーゼとも称される）である。
【０２０２】
「アセトインキナーゼ」という用語は、アセトインからホスホアセトインへの変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。アセトインキナーゼは、反応中で、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）またはホスホエノールピルビン酸をリン酸供与体として利用してもよい。例えば、同様の基質ジヒドロキシアセトン上で類似反応を触媒する酵素としては、ＥＣ  ２．７．１．２９で知られている酵素が挙げられる（Ｇａｒｃｉａ−Ａｌｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１３０３７−１３０４６，２００４）。
【０２０３】
「アセトインリン酸アミナーゼ」という用語は、ホスホアセトインから３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸への変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。アセトインリン酸アミナーゼは、補助因子ピリドキサール５’−リン酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用してもよい。得られた生成物は、３位に（Ｒ）または（Ｓ）立体配置を有してもよい。ピリドキサールリン酸依存性酵素は、アラニンまたはグルタミン酸などのアミノ酸を使用してもよい。ＮＡＤＨ依存性酵素およびＮＡＤＰＨ依存性酵素は、アンモニアを第２の基質として使用してもよい。ホスホアセトインに対するこの反応を触媒する酵素の報告はないが、同様の基質セリノールリン酸に対して類似反応を起こすと提案されるピリドキサールリン酸依存性酵素がある（Ｙａｓｕｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．６７：４９９９−５００９，２００１）。
【０２０４】
「アミノアルコールＯ−リン酸リアーゼ」とも称される「アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼ」という用語は、３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸から２−ブタノンへの変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。アミノブタノールリン酸ホスホ−リアーゼは、補助因子ピリドキサール５’−リン酸を利用してもよい。同様の基質１−アミノ−２−プロパノールリン酸上での類似反応を触媒する酵素の報告がある（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＪ．１３４：１６７−１８２，１９７３）。米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０号明細書は、生物エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）からのアミノブタノールリン酸ホスホリアーゼを記載する。
【０２０５】
「アミノブタノールキナーゼ」という用語は、３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２ブタノールＯ−リン酸への変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。アミノブタノールキナーゼは、ＡＴＰをリン酸供与体として利用してもよい。３−アミノ−２−ブタノール上で、この反応を触媒する酵素の報告はないが、同様の基質エタノールアミンおよび１−アミノ−２−プロパノール上で類似反応を触媒する酵素の報告がある（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，前出）。米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書は、実施例１４において、エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）亜株アトロセプチカ（Ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）のアミノアルコールキナーゼを記載する。
【０２０６】
「アセトイン還元酵素」としてもまた知られている「ブタンジオールデヒドロゲナーゼ」という用語は、アセトインから２，３−ブタンジオールへの変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。ブタンジアールデヒドロゲナーゼは、幅広いアルコールデヒドロゲナーゼファミリーのサブセットである。ブタンジオールデヒドロゲナーゼ酵素は、アルコール生成物中の（Ｒ）または（Ｓ）立体配置の生成に対する特異性を有してもよい。（Ｓ）特異的ブタンジオールデヒドロゲナーゼはＥＣ  １．１．１．７６として知られており、例えばクレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＢＢＡ１３０８５、Ｄ８６４１２）から入手できる。（Ｒ）特異的ブタンジオールデヒドロゲナーゼはＥＣ  １．１．１．４として知られており、例えばバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号．ＮＰ８３０４８１、ＮＣ＿００４７２２；ＡＡＰ０７６８２、ＡＥ０１７０００）、およびラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＫ０４９９５、ＡＥ００６３２３）から入手できる。
【０２０７】
「ジアールデヒドラターゼ」または「プロパンジオールデヒドラターゼ」としてもまた知られている「ブタンジオールデヒドラターゼ」という用語は、２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。ブタンジオールデヒドラターゼは、補助因子アデノシルコバラミンを利用してもよい（補酵素ＢｗまたはビタミンＢ１２としてもまた知られている；しかしビタミンＢ１２は、補酵素Ｂ１２でないコバラミンのその他の形態もまた指してもよい）。アデノシルコバラミン依存性酵素はＥＣ  ４．２．１．２８として知られており、例えば、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡ０８０９９（αサブユニット）、Ｄ４５０７１；ＢＡＡ０８１００（βサブユニット）、Ｄ４５０７１；およびＢＢＡ０８１０１（γサブユニット）、Ｄ４５０７１（全ての３つのサブユニットが活性に必要であることに留意されたい）］、およびクレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ９８３８４（αサブユニット）、ＡＦ１０２０６４；ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ９８３８５（βサブユニット）、ＡＦ１０２０６４、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ９８３８６（γサブユニット）、ＡＦ１０２０６４）から入手できる。その他の適切なジアールデヒドラターゼとしては、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＢ８４１０２（大型サブユニット）、ＡＦ０２６２７０；ＡＡＢ８４１０３（中型サブユニット）、ＡＦ０２６２７０；ＡＡＢ８４１０４（小型サブユニット）、ＡＦ０２６２７０）；およびラクトバチルス・コリノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＣ８２５４１（大型サブユニット）、ＡＪ２９７７２３；ＣＡＣ８２５４２（中型サブユニット）；ＡＪ２９７７２３；ＣＡＤ０１０９１（小型サブユニット）、ＡＪ２９７７２３）から入手できるＢ１２依存性ジアールデヒドラターゼ  ；およびラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）からの酵素（特にＣＮＲＺ７３４株およびＣＮＲＺ７３５株、Ｓｐｅｒａｎｚａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．（１９９７）４５：３４７６−３４８０）、および対応する酵素をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。ジアールデヒドラターゼ遺伝子を単離する方法は、当該技術分野で周知である（例えば米国特許第５，６８６，２７６号明細書）。
【０２０８】
「ピルビン酸デカルボキシラーゼ」（ＰＤＣ）という用語は、ピルビン酸からアセトアルデヒドおよび二酸化炭素への脱炭酸を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号４．１．１．１で知られている。これらの酵素は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＡ９７５７５（配列番号１１０）、ＣＡＡ９７７０５（配列番号１１２）、ＣＡＡ９７０９１（配列番号１１４））をはじめとするいくつかの酵母に見られる。
【０２０９】
本明細書で提供されるイソブタノール生合成経路を含んでなる微生物は、１つまたは複数の追加的な修飾をさらに含んでなってもよいことが、理解されるであろう。米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書（参照によって援用する）は、細胞質ゾル局在化アセト乳酸シンターゼの発現と、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の実質的排除とのために、酵母を遺伝子操作することで、増大されたピルビン酸からアセト乳酸への変換を開示する。いくつかの実施形態では、微生物は、米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書（参照によって本明細書に援用される）に記載されるような、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる修飾、および／またはピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子の妨害、またはピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子発現を制御する調節因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の妨害、および米国特許出願公開第２０１０／０１２０１０５号明細書（参照によって本明細書に援用される）に記載されるような、エントナー・ドウドロフ経路または還元当量均衡を通じた炭素流増大を提供する微生物の修飾を含んでなってもよい。その他の修飾としては、ピルビン酸利用生合成経路の一段階を触媒するポリペプチドをコードする、少なくとも１つポリヌクレオチドの組み込みが挙げられる。その他の修飾としては、アセト乳酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチド中の少なくとも１つの欠失、変異、および／または置換が挙げられる。いくつかの実施形態では、アセト乳酸還元酵素活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＹＭＲ２２６ｃ（配列番号１３０、１３１）またはその相同体である。追加的な修飾としては、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよび／またはアルデヒドオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチド中の挿入、欠失、変異、および／または置換が挙げられる。いくつかの実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＡＬＤ６またはその相同体である。酵母産生宿主細胞がｐｄｃ−である、グルコース抑制の低下効果を有する遺伝子修飾については、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１１／０１２４０６０号明細書に記載される。いくつかの実施形態では、欠失されまたは下方制御されるピルビン酸デカルボキシラーゼは、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ピルビン酸デカルボキシラーゼは、表３の酵素から選択される（ＰＤＣ標的遺伝子コード領域およびタンパク質の配列番号）。いくつかの実施形態では、微生物は、グリセルアルデヒド−３−リン酸からグリセリン酸塩１，３、ビスホスフェートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドの欠失または下方制御を含有してもよい。いくつかの実施形態では、この反応を触媒する酵素は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロ��ナーゼである。
【０２１０】
【表５】
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【０２１１】
酵母は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子を有してもよい。例えば、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａｇｌａｂｒａｔａ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）には、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする１つの遺伝子がある一方で、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）には、ＰＤＣ１、ＰＣＤ５、およびＰＤＣ６遺伝子によってコードされるピルビン酸デカルボキシラーゼの３つのイソ酵素がある。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、少なくとも１つのＰＤＣ遺伝子が不活性化されていてもよい。酵母細胞が、２つ以上の発現される（活性）ＰＤＣ遺伝子を有する場合、活性ＰＤＣ遺伝子のそれぞれは修飾され、または不活性化され、それによってｐｄｃ細胞を生じさせてもよい。例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中では、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子が修飾または不活性化されてもよい。使用される発酵条件下で、ＰＤＣ遺伝子が活性でない場合、このような遺伝子を修飾または不活性化する必要はない。
【０２１２】
配列番号１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、または１２８のピルビン酸デカルボキシラーゼと、少なくとも約７０〜７５％、少なくとも約７５〜８５％、少なくとも約８０〜８５％、少なくとも約８５％〜９０％、少なくとも約９０％〜９５％、または少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する、ピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質をコードするものなどのその他の標的遺伝子は、文献中で、および当業者に周知のバイオインフォマティクスデータベース中で、同定してもよい。
【０２１３】
微生物は、（ａ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド；および（ｂ）（ｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドをコードする、内在性遺伝子中の少なくとも１つの欠失、変異、および／または置換；および／または（ｉｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドをコードする、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドをさらに含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドは、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、またはＣＣＣ１によってコードされる。ＡＦＴ１およびＡＦＴ２は、参照によって本明細書に援用する、国際公開第２００１／１０３３００号パンフレットに記載される。いくつかの実施形態では、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドは、構成的変異体ＡＦＴ１  Ｌ９９Ａ、ＡＦＴ１  Ｌ１０２Ａ、ＡＦＴ１  Ｃ２９１Ｆ、またはＡＦＴ１  Ｃ２９３Ｆである。
【０２１４】
検出法
本明細書で開示されるのは、炭素基質からのブタノールの生産と、微生物（例えば組換え宿主細胞）の使用とに適した方法および工程である。炭素基質を利用してイソブタノールを生成する能力は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，８５１，１８８号明細書で記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない、当該技術分野で公知の方法を使用して確認し得る。例えばイソブタノールを生成するためのスクロース利用を確認するために、いくつかの当該技術分野で公知の方法によって、培地中のイソブタノール濃度を測定し得る。例えば特定の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法は、屈折率（ＲＩ）検出があるＳｈｏｄｅｘ（商標）ＳＨ−Ｇガードカラム付きＳｈｏｄｅｘ（商標）ＳＨ−１０１１カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を利用した。クロマトグラフィーの分離は、流速０．５ｍＬ／分の移動相として０．０１ＭＨ２ＳＯ４を使用して、カラム温度５０℃で達成された。イソブタノールは、使用された条件下で４６．６分間の滞留時間を有した。代案としては、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法が利用できる。例えば特定のＧＣ方法は、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）付きのＨＰ−ＩＮＮＯＷａｘカラム（３０ｍ×０．５３ｍｍ内径、１μｍフィルム厚、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を利用した。キャリアガスは、上部圧一定の１５０℃における測定で、流速４．５ｍＬ／分のヘリウムであった；注入器スプリットは、２００℃で１：２５であった；オーブン温度は、４５℃で１分間、１０℃／分で４５〜２２０℃、および２２０℃で５分間であり；ＦＩＤ検出は、２６ｍＬ／分のヘリウムメークアップガスにより２４０℃で用いられた。イソブタノールの滞留時間は、４．５分間であった。
【０２１５】
ブタノール生成
本明細書で開示されるのは、ブタノールの生産と、微生物（例えば組換え宿主細胞）の使用とに適した方法および工程、および細胞生存度および生産性を改善する方法である。
【０２１６】
「細胞再循環」または「細胞再循環」という用語は、遠心分離などによって、酵母またはその他の微生物（例えば組換え宿主細胞）を発酵ブロスから分離し、次に酵母を発酵槽に戻して再循環させる工程を指す。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、細胞再循環ステップが、少なくとも約２回、少なくとも約３回、少なくとも約４回、少なくとも約５回、少なくとも約１０回、少なくとも約２０回、少なくとも約３０回、少なくとも約４０回、少なくとも約５０回、少なくとも約７５回、少なくとも約１００回、少なくとも約１２５回、少なくとも約１５０回、少なくとも約１７５回、少なくとも約２００回、少なくとも約２５０回、少なくとも約３００回、少なくとも約４００回、少なくとも約５００回、またはそれを上回る回数繰り返される。
【０２１８】
「酸洗浄（ａｃｉｄ  ｗａｓｈｉｎｇ）」、「酸洗浄された（ａｃｉｄ  ｗａｓｈｅｄ）」、または「酸洗浄（ａｃｉｄ  ｗａｓｈ）」という用語は、細胞懸濁液のあらゆる酸洗浄を指す。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液は、酵母またはその他の微生物（例えば組換え宿主細胞）の懸濁液であってもよい。酸洗浄は、微生物汚染の存在に起因する、炭素基質からブタノールまたはその他の発酵産物への効率的な変換に関連する、先行技術における困難さを克服する。酸洗浄は、参照によって本明細書に援用する、国特許出願公開第２０１１／０２０７１９２号明細書に記載される。
【０２１９】
酸洗浄ステップ中に、微生物汚染は、酸の添加によって、約２．０未満のｐＨに曝露される。ｐＨは約１を超えてもよいが、３．０未満である。これは、例えば少なくとも約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８または２．９のｐＨまたはそれらの間のあらゆるｐＨなどの全てのサブ値を含み、本発明の範囲内に含まれる。用いられてもよいｐＨ範囲の例としては、少なくとも約１．０〜少なくとも約３．０、少なくとも約１．０〜少なくとも約２．９、少なくとも約１．０〜少なくとも約２．８、少なくとも約１．０〜少なくとも約２．７５、少なくとも約１．０〜少なくとも約２．５、少なくとも約１．０〜少なくとも約２．４、少なくとも約１．０〜少なくとも約２．３、少なくとも約１．０〜少なくとも約２．２、少なくとも約１．０〜少なくとも約２．１、または少なくとも約１．０〜少なくとも約２．０が挙げられる。
【０２２０】
本発明の一実施形態では、酸は、硫酸、塩酸、亜硫酸、リン酸および硝酸からなる群から選択される鉱酸である。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、酸洗浄ステップが、少なくとも約２回、少なくとも約３回、少なくとも約４回、少なくとも約５回、少なくとも約１０回、少なくとも約２０回、少なくとも約３０回、少なくとも約４０回、少なくとも約５０回、少なくとも約７５回、少なくとも約１００回、少なくとも約１２５回、少なくとも約１５０回、少なくとも約１７５回、少なくとも約２００回、少なくとも約２５０回、少なくとも約３００回、少なくとも約４００回、少なくとも約５００回、またはそれを上回る回数繰り返される。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞には、細胞再循環中に酸洗浄ステップが実施される。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞には、細胞再循環後に酸洗浄ステップが実施される。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞には、各細胞再循環毎に酸洗浄ステップが実施される。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞には、少なくとも約２回の細胞再循環ステップ毎に、少なくとも約３回の細胞再循環ステップ毎に、少なくとも約４回の細胞再循環ステップ毎に、少なくとも約５回の細胞再循環ステップ毎に、少なくとも約６回の細胞再循環ステップ毎に、少なくとも約７回の細胞再循環ステップ毎に、少なくとも約８回の細胞再循環ステップ毎に、少なくとも約９回の細胞再循環ステップ毎に、少なくとも約１０回の細胞再循環ステップ毎に、少なくと約１５回の細胞再循環ステップ毎に、少なくとも約２０回、またはを上回る回数の細胞再循環毎に、酸洗浄ステップが実施される。
【０２２３】
「再生」という用語は、遠心分離などによって、酵母またはその他の微生物（例えば組換え宿主細胞）を発酵ブロスから分離して、富栄養培地に一定期間曝露する工程を指す。
【０２２４】
「富栄養培地」という用語は、炭素基質、窒素、ミネラル、微量成分、およびビタミンのいずれかを含有してもよい、培地、製剤、または組成物を指す。例えば富栄養培地は、ビオチン、パントテン酸、葉酸、ナイアシン、アミノ安息香酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、カリウム（例えばリン酸カリウム）、ホウ酸、カルシウム、クロム、銅（例えば硫酸銅）、ヨウ化物（例えばヨウ化カリウム）、鉄（例えば塩化第二鉄）、リチウム、マグネシウム（例えば硫酸マグネシウム）、マンガン（例えば硫酸マンガン）、モリブデン、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、バナジウム、亜鉛（例えば硫酸亜鉛）、酵母抽出物、大豆ペプトンなどのいずれかを含有してもよい。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、再生工程は、少なくとも約２回、少なくとも約３回、少なくとも約４回、少なくとも約５回、少なくとも約１０回、少なくとも約２０回、またはそれを上回る回数繰り返されてもよい。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞には、酸洗浄ステップ後に、再生工程が実施される。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞には、各酸洗浄後に、再生工程が実施される。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞には、少なくとも約２回の洗浄ステップ毎に、少なくとも約３回の酸洗浄ステップ毎に、少なくとも約４回の酸洗浄ステップ毎に、少なくとも約５回の酸洗浄ステップ毎に、少なくとも約６回酸洗浄ステップ毎に、少なくとも約７回の酸洗浄ステップ毎に、少なくとも約酸洗浄ステップ毎に、少なくとも約９回の酸洗浄ステップ毎に、少なくとも約１０回、またはそれを上回る回数の酸洗浄ステップ毎に、再生工程が実施される。
【０２２７】
本発明の一実施形態は、
（ａ）アルコールを生成する微生物を提供するステップと；
（ｂ）アルコールが生成される条件下で、微生物を１つまたは数複の炭素源と接触させるステップと；
（ｃ）微生物を収集するステップと；
（ｄ）アルコールを回収するステップと；
（ｅ）アルコールが生成される条件下で、ステップ（ｃ）の微生物を１つまたは複数の炭素源と接触させるステップと；
（ｆ）ステップ（ｃ）〜（ｅ）を反復するステップと；
任意選択的に、ステップ（ｃ）の収集された微生物を低ｐＨ条件に曝露するステップと
を含んでなる、アルコールを生産する方法を対象とする。
【０２２８】
本発明の一実施形態は、
（ａ）ブタノールを生成する微生物を提供するステップと；
（ｂ）ブタノールが有効収率で生成される条件下で、微生物を１つまたは複数の炭素基質と接触させるステップと；
（ｃ）微生物を収集するステップと；
（ｄ）ブタノールを回収するステップと；
（ｅ）ブタノールが有効収率で生成される条件下で、ステップ（ｃ）の微生物を１つまたは複数の炭素基質と接触させるステップと；
（ｆ）ステップ（ｃ）〜（ｅ）を反復するステップと；
任意選択的に、ステップ（ｃ）の微生物を低ｐＨ条件に曝露するステップと
を含んでなる、ブタノールを生産する方法を対象とする。
【０２２９】
本発明の一実施形態は、
（ａ）アルコールを生成する微生物を提供するステップと；
（ｂ）微生物を、アルコールが生成される条件下で１つまたは数複の炭素基質と接触させるステップと；
（ｃ）微生物を収集するステップと；
（ｄ）アルコールを回収するステップと；
（ｅ）ステップ（ｃ）の微生物を富栄養培地と接触させるステップと；
（ｆ）ステップ（ｅ）の微生物を収集するステップと；
（ｇ）アルコールが生成される条件下で、ステップ（ｆ）の微生物を１つまたは複数の炭素基質と接触させるステップと；
（ｈ）ステップ（ｃ）〜（ｇ）を反復するステップと
を含んでなる、アルコールを生産する方法を対象とする。
【０２３０】
本発明の一実施形態は、
（ａ）ブタノールを生成する微生物を提供するステップと；
（ｂ）ブタノールが有効収率で生成される条件下で、微生物を１つまたは複数の炭素基質と接触させるステップと；
（ｃ）微生物を収集するステップと；
（ｄ）ブタノールを回収するステップと；
（ｅ）ステップ（ｃ）の微生物を富栄養培地と接触させるステップと；
（ｆ）ステップ（ｅ）の微生物を収集するステップと；
（ｇ）ブタノールが有効収率で生成される条件下で、ステップ（ｆ）の微生物を１つまたは複数の炭素基質と接触させるステップと；
（ｈ）ステップ（ｃ）〜（ｇ）を反復するステップと
を含んでなる、ブタノールを生産する方法を対象とする。
【０２３１】
本発明の一実施形態は、
（ａ）アルコールを生成する微生物を提供するステップと；
（ｂ）アルコールが生成される条件下で、微生物を１つまたは数複の炭素基質と接触させるステップと；
（ｃ）微生物を収集するステップと；
（ｄ）アルコールを回収するステップと；
（ｅ）ステップ（ｃ）の微生物を低ｐＨ条件に曝露するステップと；
（ｆ）ステップ（ｅ）からの微生物を収集するステップと；
（ｇ）ステップ（ｆ）の微生物を富栄養培地と接触させるステップと；
（ｈ）ステップ（ｇ）の微生物を収集するステップと；
（ｉ）アルコールが生成される条件下で、ステップ（ｈ）の微生物を１つまたは複数の炭素基質と接触させるステップと；
（ｊ）任意選択的に、ステップ（ｃ）〜（ｉ）を反復するステップと
を含んでなる、アルコールを生産する方法を対象とする。
【０２３２】
本発明の一実施形態は、
（ａ）ブタノールを生成する微生物を提供するステップと；
（ｂ）ブタノールが有効収率で生成される条件下で、微生物を１つまたは複数の炭素基質と接触させるステップと；
（ｃ）微生物を収集するステップと；
（ｄ）ブタノールを回収するステップと；
（ｅ）ステップ（ｃ）の微生物を低ｐＨ条件に曝露するステップと；
（ｆ）ステップ（ｅ）からの微生物を収集するステップと；
（ｇ）ステップ（ｆ）の微生物を富栄養培地と接触させるステップと；
（ｈ）ステップ（ｇ）の微生物を収集するステップと；
（ｉ）ブタノールが有効収率で生成される条件下で、ステップ（ｈ）の微生物を１つまたは複数の炭素基質と接触させるステップと；
（ｊ）任意選択的に、ステップ（ｃ）〜（ｉ）を反復するステップと
を含んでなる、ブタノールを生産する方法を対象とする。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、ｐＨは約２．０以下である。いくつかの実施形態では、ｐＨ条件は約２〜約４であってもよい。いくつかの実施形態では、収集された微生物は、少なくとも約１時間にわたり、約２．０以下のｐＨ条件に曝露されてもよい。いくつかの実施形態では、生成されるアルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、またはヘキサノールである。いくつかの実施形態では、ブタノールは、イソブタノール、１−ブタノール、２−ブタノール、または２−ブタノンである。
【０２３４】
ブタノールが生成されるいくつかの実施形態では、ブタノールが、少なくとも約６ｇ／Ｌの濃度で回収される。いくつかの実施形態では、第２の接触させるステップ（例えばステップ（ｅ）、（ｇ）、（ｉ））の有効収率は、第１の接触させるステップ（例えばステップ（ｂ））の有効収率の少なくとも約９０％である。いくつかの実施形態では、第２の接触させるステップ（例えばステップ（ｅ）、（ｇ）、（ｉ））の有効収率は、第１の接触させるステップ（例えばステップ（ｂ））の有効収率の少なくとも約９９％である。いくつかの実施形態では、微生物は少なくとも約１時間にわたり、および／または少なくとも約０．３％ブタノールの存在下で、曝露される。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、微生物を少なくとも５回再循環させる。いくつかの実施形態では、微生物を少なくとも１０回再循環させる。いくつかの実施形態では、再循環ステップ中に微生物を酸洗浄する。いくつかの実施形態では、再循環ステップ後に微生物を酸洗浄する。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、所望のイソブタノール生成後に、微生物を収集してもよい。収集は、例えば遠心分離をはじめとする、当該技術分野で公知のあらゆる方法によって実施してもよい。いくつかの実施形態では、収集された微生物を酸性条件に曝露して、次に酸洗浄ステップにおいて、炭素基質に再度接触させてもよい。細胞再循環を用いる、本発明のいくつかの実施形態では、酸処理細胞を炭素基質に再度接触させる前に、発酵ブロスから分離された細胞懸濁液に、酸を添加してもよい。いくつかの実施形態では、収集された微生物を富栄養培地に一定期間曝露して収集し、炭素基質に再度接触させてもよい。いくつかの実施形態では、富栄養培地への曝露に先だって、微生物を酸洗浄してもよい。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、炭素基質との第１の接触は、嫌気的条件で実施してもよい。いくつかの実施形態では、炭素基質との第１の接触は、微好気的条件で実施してもよい。いくつかの実施形態では、再循環は嫌気的条件で実施してもよい。いくつかの実施形態では、再循環は微好気的条件で実施してもよい。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、炭素基質は、オリゴ糖類、多糖類、単糖類、およびそれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、炭素基質は、フルクトース、グルコース、乳糖、マルトース、ガラクトース、スクロース、デンプン、セルロース、原材料、エタノール、乳酸、コハク酸、グリセロール、コーンマッシュ、サトウキビ、バイオマス、キシロースおよびアラビノースなどのＣ５糖、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、イソブタノールが生成される条件下で、微生物を炭素基質と接触させる。いくつかの実施形態では、適切な培地と共に、所与の細胞密度の微生物を発酵容器に添加してもよい。いくつかの実施形態では、培地は炭素基質を含有してもよく、または炭素基質は別に添加してもよい。いくつかの実施形態では、炭素基質は、イソブタノール生産開始時および／または生産中に、あらゆる濃度で存在してもよい。いくつかの実施形態では、炭素基質の最初の濃度は約６０〜８０ｇ／Ｌの範囲である。発酵の適切な温度は当業者に知られており、用いられる微生物の属および／または種に左右される。いくつかの実施形態では、適切な温度は２５℃〜４３℃の範囲である。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、接触は、少なくとも約９０％のスクロースが利用されるまで、または所望のイソブタノール有効力価に達するまで行われる。いくつかの実施形態では、イソブタノール有効力価は、少なくとも約４０ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、少なくとも約６０ｇ／Ｌ、少なくとも約７０ｇ／Ｌ、少なくとも約８０ｇ／Ｌ、少なくとも約９０ｇ／Ｌ、少なくとも約１００ｇ／Ｌ、または少なくとも約１１０ｇ／Ｌである。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、微生物は、３０℃〜３７℃の温度範囲で培養されてもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、１〜５時間培養されてもよい。いくつかの実施形態では、微生物は、振盪機（Ｉｎｎｏｖａ  ４４Ｒ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＴ，ＵＳＡ）内で撹拌しながら（例えば１００〜４００ｒｐｍ）培養されてもよい。
【０２４２】
微生物と炭素基質の間の接触時間は、イソブタノールが生成されるあらゆる長さでもよい。いくつかの実施形態では、微生物を１つまたは複数の炭素基質と接触させるステップは、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約１２０時間、少なくとも約１４４時間、少なくとも約１６８時間、少なくとも約１９２時間、少なくとも約２１６時間、またはそれを上回る。いくつかの実施形態では、接触させるステップ後に、微生物を酸洗浄する。いくつかの実施形態では、接触は８時間未満である。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、微生物は、炭素基質との第１の接触において、少なくとも約０．５ｇｄｃｗ／Ｌの細胞密度で存在する。いくつかの実施形態では、微生物は、イソブタノール生産のために炭素基質と接触させるのに先だって、少なくとも約６ｇｄｃｗ／Ｌの細胞密度で培養されてもよい。いくつかの実施形態では、炭素基質と接触させるのに先だって、細胞密度は、少なくとも約２０ｇｄｃｗ／Ｌ、少なくとも約２５ｇｄｃｗ／Ｌ、または少なくとも約３５ｇｄｃｗ／Ｌであってもよい。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、微生物は、少なくとも約０．１ｇ／ｇｄｃｗ／ｈの比生産性を有する。いくつかの実施形態では、炭素基質との第１の接触の間に、ブタノールが少なくとも約０．１ｇ／ｇｄｃｗ／ｈの有効速度で生成される。いくつかの実施形態では、炭素基質との第１の接触は、抽出剤の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、微生物は、少なくとも約１．０ｇ／ｇｄｃｗ／ｈの糖取り込み速度を維持する。いくつかの実施形態では、微生物は、少なくとも約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈの糖取り込み速度を維持する。いくつかの実施形態では、グルコース利用速度は、少なくとも約２．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈである。いくつかの実施形態では、スクロース取り込み速度は、少なくとも約２．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈである。いくつかの実施形態では、合わせたグルコースおよびフルクトース取り込み速度は、少なくとも約２．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈである。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、炭素基質との第１の接触は、抽出剤の存在下で行われてもよい。いくつかの実施形態では、抽出剤の存在下での炭素基質との第１の接触は、嫌気的条件下で行われる。いくつかの実施形態では、抽出剤の存在下での炭素基質との第１の接触は、微好気的条件下で行われる。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、微生物は、少なくとも約９０％の有効収率、少なくとも約９１％の有効収率、少なくとも約９２％の有効収率、少なくとも約９３％の有効収率、少なくとも約９４％の有効収率、少なくとも約９５％の有効収率、少なくとも約９６％の有効収率、少なくとも約９７％の有効収率、少なくとも約９８％の有効収率、または少なくとも約９９％の有効収率でブタノールを生成する。いくつかの実施形態では、微生物は、少なくとも約５５％〜少なくとも約７５％の有効収率、少なくとも約５０％〜少なくとも約８０％の有効収率、少なくとも約４５％〜少なくとも約８５％の有効収率、少なくとも約４０％〜少なくとも約９０％の有効収率、少なくとも約３５％〜少なくとも約９５％の有効収率、少なくとも約３０％〜少なくとも約９９％の有効収率、少なくとも約２５％〜少なくとも約９９％の有効収率、少なくとも約１０％〜少なくとも約９９％の有効収率または少なくとも約１０％〜少なくとも約１００％の有効収率でブタノールを生成する。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、微生物は、組換え宿主細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、ブタノール生合成経路を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、ブタノール生合成経路は、イソブタノール生合成経路である。いくつかの実施形態では、イソブタノール生合成経路は、（ａ）ピルビン酸からアセト乳酸；（ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸；（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸から２−ケトイソ吉草酸；（ｄ）２−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド；および（ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールからなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる。いくつかの実施形態では、イソブタノール生合成経路は、アセト乳酸シンターゼ活性、ケト酸レダクトイソメラーゼ活性、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性、ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性、およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、イソブタノール生合成経路は、（ａ）ピルビン酸からアセト乳酸；（ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸；（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸；（ｄ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡ；（ｅ）イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒド；および（ｆ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールからなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、イソブタノール生合成経路は、アセト乳酸シンターゼ活性；アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性；アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性；分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ活性；アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性；および分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリヌクレオチドをコードするポリペプチドを含んでなる。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、ブタノール生合成経路を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、１−ブタノール生合成経路は、（ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ；（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ；（ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡ；（ｄ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡ；（ｅ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒド；および（ｆ）ブチルアルデヒドから１−ブタノールからなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、１−ブタノール生合成経路は、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ活性；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性；クロトナーゼ活性；ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性；ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、およびブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリヌクレオチドをコードするポリペプチドを含んでなってもよい。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、ブタノール生合成経路を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、（ａ）ピルビン酸からα−アセト乳酸；（ｂ）α−アセト乳酸からアセトイン；（ｃ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノール；（ｄ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸；（ｅ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノン；および（ｆ）−ブタノンから２−ブタノールからなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる。いくつかの実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、アセト乳酸シンターゼ活性；アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性；アセトニンアミナーゼ活性；アミノブタノールキナーゼ活性；アミノブタノールリン酸ホスホリラーゼ活性；およびブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリヌクレオチドをコードするポリペプチドを含んでなる。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、（ａ）ピルビン酸からα−アセト乳酸；（ｂ）α−アセト乳酸からアセトイン；（ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオール；（ｄ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノン；および（ｅ）２−ブタノンから２−ブタノールからなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、アセト乳酸シンターゼ活性；アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性；ブタンジオールデヒドロゲナーゼ活性；ジアールデヒドラターゼ活性；およびブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリヌクレオチドをコードするポリペプチドを含んでなる。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、基質から産物への変換の１つまたは複数は、補助因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ利用する。いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨが好ましい補助因子である。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞のブタノール経路は、以下の酵素番号を有する酵素群から選択されるポリペプチドの少なくとも１つを含んでなってもよい：ＥＣ  ２．２．１．６、ＥＣ  １．１．１．８６、ＥＣ  ４．２．１．９、ＥＣ  ４．１．１．７２、ＥＣ  １．１．１．１、ＥＣ  １．１．１．２６５、ＥＣ  １．１．１．２、ＥＣ  １．２．４．４、ＥＣ  １．３．９９．２、ＥＣ  １．２．１．５７、ＥＣ  １．２．１．１０、ＥＣ  ２．６．１．６６、ＥＣ  ２．６．１．４２、ＥＣ  １．４．１．９、ＥＣ  １．４．１．８、ＥＣ  ４．１．１．１４、ＥＣ  ２．６．１．１８、ＥＣ  ２．３．１．９、ＥＣ  ２．３．１．１６、ＥＣ  １．１．１３０、ＥＣ  １．１．１．３５、ＥＣ  １．１．１．１５７、ＥＣ  １．１．１．３６、ＥＣ  ４．２．１．１７、ＥＣ  ４．２．１．５５、ＥＣ  １．３．１．４４、ＥＣ  １．３．１．３８、ＥＣ  ５．４．９９．１３、ＥＣ  ４．１．１．５、ＥＣ  ２．７．１．２９、ＥＣ  １．１．１．７６、ＥＣ  １．２．１．５７、およびＥＣ  ４．２．１．２８。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞のブタノール経路は、以下の酵素群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含んでなる：アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、バリンデヒドロゲナーゼ、バリンデカルボキシラーゼ、ωトランスアミナーゼ、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、イソブチリル−ＣｏＡムターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、アセトニンアミナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセトインキナーゼ、アセトインリン酸アミナーゼ、アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼ、アミノブタノールキナーゼ、ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、およびブタンジオールデヒドラターゼ。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、生合成経路からの酵素は細胞質ゾルに局在化する。いくつかの実施形態では、通常はミトコンドリアに局在化する生合成経路からの酵素が、細胞質ゾルに局在化する。いくつかの実施形態では、ミトコンドリア標的配列を除去することで、生合成経路からの酵素が細胞質ゾルに局在化する。いくつかの実施形態では、例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，８５１，１８８号明細書に記載される新しい開始コドンを作成することで、ミトコンドリア標的が除去される。いくつかの実施形態では、細胞質ゾルに局在化する生合成経路からの酵素はＤＨＡＤである。いくつかの実施形態では、細胞質ゾルに局在化する生合成経路からの酵素はＫＡＲＩである。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、ｃＡＭＰ情報伝達経路の１つまたは複数の構成要素の発現および／または活性を変化させる、１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、１つまたは複数のリン酸ジエステラーゼの発現および／または活性を変化させる１つまたは複数の修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、リン酸ジエステラーゼおよび／またはリン酸ジエステラーゼ活性の低下または排除を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、リン酸ジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中に、修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、リン酸ジエステラーゼ活性を有するポリヌクレオチドをコードする内在性ポリペプチド中に、挿入、欠失、変異、および／または置換を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、リン酸ジエステラーゼ活性を有するポリペプチドは、酵素番号ＥＣ  ３．１．４．１７に相当する。いくつかの実施形態では、を有するポリペプチドリン酸ジエステラーゼ活性は、ＰＤＥ１である。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼを発現しない、または発現が低下している。いくつかの実施形態では、発現低下は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子中の挿入、欠失、変異、および／または置換の結果である。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中に、修飾を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリヌクレオチドをコードする内在性ポリペプチド中に、挿入、欠失、変異、および／または置換を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドは、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを発現しない、または発現が低下している。いくつかの実施形態では、発現低下は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子中の挿入、欠失、変異、および／または置換の結果である。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、ＢＤＨ１を発現しない、または発現が低下している。いくつかの実施形態では、発現低下は、ＢＤＨ１をコードする遺伝子中の挿入、欠失、変異、および／または置換の結果である。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、アセト乳酸還元酵素をコードする遺伝子を発現しない、または発現が低下している。いくつかの実施形態では、発現低下は、ＹＭＲ２２６ｃをコードする遺伝子中の挿入、欠失、変異、および／または置換の結果である。
【０２５９】
本発明はまた、本明細書に記載される組換え宿主細胞を含んでなる組成物を対象とする。いくつかの実施形態では、組成物はまた富栄養培地も含んでなる。いくつかの実施形態では、組成物は少なくとも約２のｐＨを有してもよい。いくつかの実施形態では、組成物は約２以下のｐＨを有してもよい。いくつかの実施形態では、組成物は約２〜約４のｐＨを有してもよい。いくつかの実施形態では、組成物の組換え宿主細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、またはピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）のメンバーであってもよい。いくつかの実施形態では、組成物の組換え宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への基質から産物への変換を触媒する改変酵素を含んでなってもよい。
【０２６０】
ブタノール産生菌
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、ブタノール産生菌（ｂｕｔａｎｏｌｇｅｎ）であってもよい。いくつかの実施形態では、ブタノール産生菌は、イソブタノール産生菌であってもよい。いくつかの実施形態では、適切なイソブタノール産生菌としては、遺伝子修飾および組換え遺伝子発現に有用なあらゆる酵母宿主が挙げられる。いくつかの実施形態では、イソブタノール産生菌宿主細胞は、分裂酵母属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、またはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のメンバーであってもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クリベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クリベロミセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、クリベロミセス・マルキシアナス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、またはラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）であってもよい。なおも別の実施形態では、宿主細胞は酵母宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のメンバーである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、クリベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）またはシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母は当該技術分野で公知であり、米国微生物系統保存機関（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、オランダ微生物株保存センター（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、ＬｅＳａｆｆｒｅ、ＧｅｒｔＳｔｒａｎｄＡＢ、Ｆｅｒｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｍａｒｔｒｅｘ、およびＬａｌｌｅｍａｎｄをはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な供給元から入手できる。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）としては、ＢＹ４７４１、ＣＥ��．ＰＫ１１３−７Ｄ、Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）酵母、Ｆｅｒｍ  Ｐｒｏ（登録商標）酵母、Ｂｉｏ−Ｆｅｒｍ（登録商標）ＸＲ酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｉｇｅ  Ｂａｔｃｈ  Ｔｕｒｂｏアルコール酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｏｔ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｔｕｒｂｏ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｒｅｅｎ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｏｌｄ酵母、Ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）酵母、ＢＧ−１、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、およびＣＢＳ７９６１が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２６１】
「ＰＮＹ８６０」は、米国微生物系統保存機関Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  １０８０１，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９において、２０１１年７月２１日にブダペスト条約の下にＡＴＣＣに寄託されて、特許寄託名ＰＴＡ−１２００７を有する、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来株を指す。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、イソブタノール産生菌はＰＮＹ８６０の誘導体である。いくつかの実施形態では、イソブタノール産生菌は、ＰＮＹ８６０株の半数体誘導体である。いくつかの実施形態では、イソブタノール産生菌は、ＰＮＹ８６０の非胞子形成誘導体である。いくつかの実施形態では、イソブタノール産生菌は、ＰＮＹ８６０の非交雑誘導体である。
【０２６３】
炭素基質
適切な炭素基質としては、フルクトースまたはグルコースなどの単糖類；乳糖、マルトース、ガラクトース、またはスクロースなどのオリゴ糖類；デンプンまたはセルロースなどの多糖類、またはその混合物、そして乳清透過液、コーンスティープリーカー、甜菜糖蜜、および大麦麦芽などの再生可能原料からの未精製混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。その他の炭素基質としては、エタノール、乳酸、コハク酸、またはグリセロールが挙げられる。
【０２６４】
「糖」としては、フルクトースまたはグルコースなどの単糖類；乳糖、マルトース、ガラクトース、またはスクロースなどのオリゴ糖類；デンプンまたはセルロースなどの多糖類；キシロースおよびアラビノースなどのＣ５糖類；およびそれらの混合物が挙げられる。
【０２６５】
さらに炭素基質は、主要生化学的中間体への代謝的変換が実証されている、二酸化炭素、またはメタノールなどの一炭素基質であってもよい。一および二炭素基質に加えて、メチロトローフ生物は、代謝活性のために、メチルアミン、グルコサミンおよび多様なアミノ酸などの、いくつかのその他の炭素含有化合物を利用することもまた知られている。例えばメチロトローフ酵母は、メチルアミンからの炭素を利用して、トレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］，７ｔｈ（１９９３），４１５−３２，Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ
，Ｄｏｎ  Ｐ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の様々な種が、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５−４８９，１９９０）。したがって本発明で用いられる炭素源は、多種多様な炭素含有基質を包含してもよく、微生物の選択によってのみ制限されることが考察される。
【０２６６】
前述の炭素基質およびそれらの混合物の全てが、本発明で適切であることが検討されるが、いくつかの実施形態では、Ｃ５糖類を利用するように修飾された酵母細胞にとって、炭素基質は、グルコース、フルクトース、およびスクロース、またはこれらと、キシロースおよび／またはアラビノースなどのＣ５糖類との混合物である。スクロースは、サトウキビ、甜菜、キャッサバ、サトウモロコシ、およびそれらの混合物などの再生可能な糖原料に由来してもよい。グルコースおよびデキストロースは、コーン、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、およびそれらの混合物などの穀物をはじめとする、デンプンベースの原材料の糖化を通じて、再生可能な穀物原料に由来してもよい。さらに例えば参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２００７／００３１９１８Ａ１号明細書に記載されるように、発酵性糖類は、前処理および糖化工程による再生可能なセルロース系またはリグノセルロース系バイオマスに由来してもよい。バイオマスとしては、セルロースを含んでなり、任意選択的にヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および／または単糖類をさらに含んでなる、材料が挙げられる。バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質などの追加的な成分を含んでなってもよい。バイオマスは単一起源に由来してもよく、またはバイオマスは２つ以上の起源に由来する混合物を含んでなり得る；例えばバイオマスは、トウモロコシ穂軸とトウモロコシ茎葉の混合物、または草と葉の混合物を含んでなってもよい。バイオマスとしては、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙業汚泥、庭ごみ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これに限定されるものではない。バイオマスの例としては、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉などの作物残渣、トウモロコシ茎葉、草本、小麦、麦藁、大麦、大麦藁、乾草、稲藁、スイッチグラス、古紙、糖サトウキビバガス、モロコシ、大豆、穀物製粉から得られる成分、葉、木片、おがくず、家畜糞尿、およびそれらの混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、炭素基質はトウモロコシに由来するグルコースである。いくつかの実施形態では、炭素基質は小麦に由来するグルコースである。いくつかの実施形態では、炭素基質はサトウキビに由来するスクロースである。
【０２６８】
適切な炭素源に加えて、発酵培地は、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、および本明細書に記載される培養物の成長と酵素経路の促進に適する、当業者に知られているその他の構成要素を含有してもよい。
【０２６９】
発酵条件
典型的に細胞は、適切な培地中で約２０℃〜約４０℃の範囲の温度で培養される。本発明の適切な成長培地としては、サブローデキストロース（ＳＤ）ブロス、酵母培地（ＹＭ）ブロス、または酵母窒素原礎培地と硫酸アンモニウムと（炭素／エネルギー源として）デキストロースとを含むブロス、または最大量のサッカロをミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を培養するための最適比率のペプトンと酵母抽出物とデキストロースとの配合物であるＹＰＤ培地などの、一般的な商業的に調製された培地が挙げられる。その他の規定培地または合成増殖培地もまた使用してよく、特定の微生物の成長に適した培地は、微生物学または発酵化学当業者に知られている。例えば環状アデノシン２’：３’一リン酸など、異化代謝産物抑制を直接または間接的に調節することが知られている作用薬の使用もまた、発酵培地中に組み込まれてもよい。
【０２７０】
発酵のための適切なｐＨ範囲は、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ９．０である。一実施形態では、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．０が、初期条件のために使用される。酵母の発酵のための適切なｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ３．０〜約ｐＨ９．０である。一実施形態では、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８．０が、初期条件のために使用される。その他の微生物の発酵のための適切なｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ３．０〜約ｐＨ７．５である。一実施形態では、約ｐＨ４．５〜約ｐＨ６．５が、初期条件のために使用される。
【０２７１】
発酵は、好気的または嫌気的条件下で実施してもよい。一実施形態では、発酵のために、嫌気的または微好気的条件を使用してもよい。
【０２７２】
工業的バッチおよび連続発酵
イソブタノール、またはその他の発酵産物は、バッチ発酵法を使用して生産されてもよい。古典的なバッチ発酵は閉鎖システムであり、そこでは培養液の組成が発酵の初めに設定され、発酵プロセス中に人為的に変更されない。標準バッチ系の変法が、流加系である。流加発酵工程もまた本発明で使用するのに適し、発酵が進行するにつれて、基質が徐々に添加されることを除いては、典型的なバッチ系を含んでなる。流加バッチ系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があって、培地中に限定量の基材を有することが望ましい場合に有用である。バッチおよび流加発酵は一般的で、当該技術分野で周知であり、例はＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．，ｏｒ  Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：２２７，１９９２にある。
【０２７３】
イソブタノール、またはその他の発酵産物はまた、連続発酵法を使用して生成されてもよい。連続発酵は開放系であり、限定発酵培地が発酵容器（例えばバイオリアクター）に連続的に添加されて、同時に処理のために等しい量の熟成培地が取り出される。連続発酵は、一般に、細胞が主に対数成長期にある一定の高密度に培養を維持する。連続発酵は、細胞成長または最終生成物濃度に影響を及ぼす、１つの要素またはいくつもの要素の調節を可能にする。連続発酵工程のために栄養素と増殖因子を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化する技術は、工業微生物学の技術分野で周知であり、多様な方法が前出のＢｒｏｃｋに詳述される。
【０２７４】
イソブタノール、またはその他の発酵産物の生産は、バッチ、流加、または連続工程を使用して実施してもよく、あらゆる既知の発酵様式が適切であることが意図される。さらにホールセル触媒として基質上に細胞を固定化し、イソブタノール生産のための発酵条件に置いてもよいことが考察される。
【０２７５】
発酵培地からのイソブタノール単離法
生物生産されたイソブタノールまたはその他の発酵性アルコールは、ＡＢＥ発酵技術分野で公知の方法を使用して発酵培地から単離してもよい（例えばＤｕｒｒｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９−６４８（１９９８）、Ｇｒｏｏｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１−７５（１９９２）およびその中の参考文献を参照されたい）。例えば遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって、発酵培地から固形物を除去してもよい。次に蒸留、共沸性蒸留、液−液抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、浸透気化法またはそれらの組み合わせなどの方法を使用して、イソブタノールを発酵培地から単離してもよい。
【０２７６】
イソブタノールは水と低沸点の共沸混合物を形成するので、蒸留を使用して、混合物がその共沸性組成物になるまで分離してもよい。蒸留を別の分離方法と組み合わせて使用して、共沸混合物周辺での分離を得てもよい。イソブタノールを単離して精製するために組み合わせて使用してもよい方法としては、デカンテーション、液体−液体抽出、吸着、および膜ベースの技術が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらにイソブタノールは、共留剤を使用した共沸蒸留を使用して単離してもよい（例えばＤｏｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｍａｌｏｎｅ，Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１を参照されたい）。
【０２７７】
イソブタノール−水混合物は不均一共沸混合物を形成するので、蒸留をデカンテーションと組み合わせて使用して、イソブタノールを単離し精製してもよい。この方法では、イソブタノール含有発酵ブロスを共沸組成物近くまで蒸留する。次に共沸性混合物を濃縮し、デカンテーションによってイソブタノールを発酵培地から分離する。デカントされた水相を還流としての蒸留カラムに戻してもよい。例えば第２の蒸留カラム中での蒸留によって、イソブタノールに富む有機相をさらに精製してもよい。
【０２７８】
イソブタノールは、蒸留と組み合わせた液体−液体抽出を使用して、発酵培地から単離してもよい。この方法では、適切な溶剤での液体−液体抽出を使用して、イソブタノールが発酵ブロスから抽出される。次にイソブタノール含有有機相を蒸留して、イソブタノールを溶剤から分離する。
【０２７９】
吸着と組み合わせた蒸留もまた使用して、イソブタノールを発酵培地から単離してもよい。この方法では、イソブタノール含有発酵ブロスを共沸組成物近くに蒸留し、次に分子ふるいなどの吸着材の使用によって残留水を除去する（Ａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ｔｏ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｌｕｔｅ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｎ  Ｓｔｏｖｅｒ，Ｒｅｐｏｒｔ  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−３２４３８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊｕｎｅ  ２００２）。
【０２８０】
さらに浸透気化法と組み合わせた蒸留を使用して、発酵培地からイソブタノールを単離、精製してもよい。この方法では、イソブタノール含有発酵ブロスを共沸性組成物近くまで蒸留し、次に親水性膜を通じた浸透気化法によって水を除去する（Ｇｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．２４５：１９９−２１０，２００４）。それぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１１／０１６２９５３号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０１６２９５４号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０２８８３４５号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０２８８３４４号明細書；および米国特許出願公開第２０１１／０３１５５４１号明細書に記載されるものはじめとする、その他の蒸留法を用いてもよい。
【０２８１】
原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）（抽出発酵とも称される）を使用して、イソブタノールまたはその他の発酵性アルコールが生成されるに従って、それを発酵容器から除去してもよく、それによって微生物がイソブタノールを高収率で生成できるようにする。１つのＩＳＰＲ法では、当該技術分野で液液抽出と説明される、発酵性アルコールを除去するステップを有する。一般に例えばイソブタノール発酵に関しては、イソブタノール濃度が毒性レベルに達する前に、微生物を含む発酵培地を有機抽出剤（例えば有機抽出剤）と接触させる。抽出剤と発酵培地は、二相混合物を形成する。イソブタノールは有機抽出剤相に分配され、微生物を含有する水相中の濃度が低下し、それによって阻害性イソブタノールに対する微生物の曝露が制限される。
【０２８２】
液−液抽出は、例えばその開示全体を本明細書に組み込んだ、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書に記載される方法に従って実施してもよい。米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書は、液−液抽出を使用して発酵ブロスからイソブタノールを生産して回収する方法について記載し、方法は、発酵ブロスに水不混和性抽出剤を接触させて、水相と有機相を含んでなる二相混合物を形成するステップを含んでなる。典型的に抽出剤は、飽和、一価不飽和、多不飽和Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸エステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であってもよい。ＩＳＰＲの抽出剤は、非アルコール抽出剤であってもよい。ＩＳＰＲ抽出剤は、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、アルキルアルカノール，１−ウンデカノール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ウンデカナール、ラウリンアルデヒド、２０−メチルウンデカナール、トリオクチル酸化ホスフィン、およびそれらの混合物などの外来性有機抽出剤であってもよい。その他の抽出剤および方法は、それぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１０／０１４３９９４号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０１４３９９５号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０１４３９９２号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０１４３９９３号明細書；米国特許出願公開第２０１１／００９７７７３号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０１５９５５８号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０１３６１９３号明細書に記載される。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、発酵培地中のエステルを、有機酸（例えば脂肪酸）とアルコールを有機酸でエステル化できる触媒とに接触させることで、アルコールが形成されてもよい。このような実施形態では、有機酸は、その中にアルコールエステルが分配される、ＩＳＰＲ抽出剤の役割を果たしてもよい。有機酸は、発酵容器に提供されてもよく、および／または発酵容器に供給される発酵性炭素を提供するバイオマスに由来してもよい。原材料中に存在する脂質は、触媒的に有機酸に加水分解されてもよく、同一触媒（例えば酵素）が有機酸をアルコールでエステル化してもよい。触媒は、発酵前に原材料に提供されてもよく、または原材料供給の前またはそれと同時に発酵容器に提供されてもよい。触媒を発酵容器に提供する場合、脂質の有機酸への加水分解と、発酵容器内に存在するアルコールによる実質的に同時の有機酸のエステル化によって、アルコールエステルが得られてもよい。原材料に由来しない有機酸および／または天然油もまた、発酵容器に供給されてもよく、天然油が有機酸に加水分解される。アルコールでエステル化されないあらゆる有機酸が、ＩＳＰＲ抽出剤の役割の一部を果たしてよい。アルコールエステルを含有する抽出剤を発酵培地から分離してもよく、アルコールを抽出剤から回収してもよい。いくつかの実施形態では、抽出剤は、発酵容器内に再循環させてもよい。したがってイソブタノール生成の場合、例えばイソブタノールからエステルへの変換は、発酵培地中の遊離イソブタノール濃度を低下させ、ブタノール濃度増大の毒性効果から微生物を遮蔽する。これに加えて、脂質は触媒的に有機酸に加水分解されてもよく、それによってＩＳＰＲ抽出剤中の脂質の蓄積速度が低下するので、未分画穀物をその中の脂質を分離させることなく原材料として使用してもよい。それぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０２２１８０２号明細書；米国特許出願公開２０１０／０２７９３７０第号明細書；米国特許出願公開第号明細書２０１１／００９７７７３；米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４４号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４３号明細書；米国特許出願公開第２０１２／００３５３９８号明細書；米国特許出願公開第２０１２／０２１１３４８号明細書；および米国特許出願公開第２０１２／０１５６７３８号明細書に記載されるものをはじめとする、その他のアルコール生成物回収率および／またはＩＳＰＲ方法を用いてもよい。
【０２８４】
原位置生成物除去は、バッチ様式または連続様式で実施してもよい。ＩＳＰＲの連続様式では、生成物は発酵漕（例えば反応装置）から絶えず取り出される。バッチ式のＩＳＰＲでは、一定容積の有機抽出剤が発酵容器に添加され、抽出剤は工程中に取り出されない。ＩＳＰＲでは、有機抽出剤発を、酵開始時に発酵培地と接触させて、二相性発酵培地を形成させてもよい。代案としては、有機抽出剤は、微生物が、培養物の光学濃度測定によって判定してもよい所望の成長量を達成した後に、発酵培地と接触させてもよい。さらに有機抽出剤は、発酵培地中のアルコールレベルが事前選択されたレベルに達した時点で、発酵培地と接触させてもよい。本発明のいくつかの実施形態によるイソブタノール生産の場合、イソブタノールを有機酸でエステル化してイソブタノールエステルを生成させ、結果的に発酵容器内のイソブタノール濃度を低下させるように、イソブタノール濃度が毒性レベルに達する前の時点で、有機酸抽出剤を発酵培地と接触させ得る。エステル含有有機相は、イソブタノールエステルの所望の有効力価が達成された後に、発酵容器から取り出してもよい（そして水相を構成する発酵ブロスから分離し得る）。いくつかの実施形態では、エステル含有有機相は、発酵容器内の利用可能発酵性糖の発酵が実質的に完了した後に、水相から分離される。あらゆる段階のイソブタノール力価は、例えば参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書に記載されるような、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはガスクロマトグラフィーなどの当該技術分野で公知の方法によって測定し得る。
【実施例】
【０２８５】
本発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は、本発明の実施形態を示しながら、例証としてのみ提供されるものと理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を見極め得て、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明に様々な変更と修正を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。
【０２８６】
一般方法
実施例で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９）ａｎｄ  ｂｙ  Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂ．ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７）に記載される。
【０２８７】
細菌培養の維持および成長に適した材料および方法もまた、技術分野で周知である。以下の実施例で使用するのに適した技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．，１９９４）または  Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ（Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）に記載される。細菌細胞の増殖および維持のために使用される、全ての試薬、制限酵素および材料は、特に断りのない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＨｉＭｅｄｉａ（Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ）、ＳＤ  Ｆｉｎｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａ）、またはタカラバイオ株式会社（日本、滋賀県）から得られた。
【０２８８】
略称の意味は、次の通りである。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「ｍｇ／ｍＬ」はミリリットルあたりミリグラムを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し，「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｋｇ」はキログラムを意味し、「Ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味して「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学濃度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍの波長で測定された光学濃度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は重力定数もまた意味し得て、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「％」はパーセントを意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／容積パーセントを意味し、「％ｖ／ｖ」は容積／容積パーセントを意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ｇ／Ｌ」は１リットルあたりグラムを意味し、「μｇ／Ｌ」は１リットルあたりマイクログラムを意味し、「ｎｇ／μＬ」はマイクロリットルあたりナノグラムを意味し、「ｐｍｏｌ／μＬ」はマイクロリットルあたりピコモルを意味し「ＲＰＭ」は毎分回転数を意味し、「μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ」はミリグラムあたり毎分マイクロモルを意味し、「ｗ／ｖ」は容積あたり重量を意味し、「ｖ／ｖ」は容積あたり容積を意味する。
【０２８９】
実施例１
ＰＤＥ１欠失があるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株の構築
ＰＮＹ１５００株は、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＣＢＳ  ８３４０；オランダ微生物株保存センター（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から誘導されて、ＵＲＡ３およびＨＩＳ３遺伝子の欠失を含有する。
【０２９０】
ＵＲＡ３欠失
内在性ＵＲＡ３コード領域を欠失させるために、ｕｒａ３：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットをｐＬＡ５４テンプレートＤＮＡ（配列番号１３２）からＰＣＲ増幅した。ｐＬＡ５４は、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターおよびｋａｎＭＸマーカーを含有し、ｌｏｘＰ部位で挟まれて、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えおよびマーカー除去を可能にする。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、およびプライマーＢＫ５０５およびＢＫ５０６（配列番号１３３および１３４）を使用して実施した。各プライマーのＵＲＡ３部分は、ＵＲＡ３プロモーター上流の５’領域およびコード領域下流の３’領域に由来し、ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰマーカーの組み込みは、ＵＲＡ３コード領域の置換をもたらした。ＰＣＲ産物は、標準遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を使用してＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄに形質転換され、形質転換体は、３０℃でＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）、１００μｇ／ｍＬ）含有ＹＰＤ上で選択された。プライマーＬＡ４６８およびＬＡ４９２（配列番号１３５および１３６）を使用して、ＰＣＲにより形質転換体をスクリーニングして正しい組み込みを確認し、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ  ｕｒａ３Δ：：ｋａｎＭＸと命名した。
【０２９１】
ＨＩＳ３欠失
ＨＩＳ３欠失は、Ａｋａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｙｅａｓｔ  ２３：３９９−４０５，２００６）から適応された無瘢痕欠失手順によって作成した。無瘢痕欠失のためのＰＣＲカセットは、４つの断片Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃを組み合わせ、オーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲカセットは、プロモーター（ＵＲＡ３遺伝子の２５０ｂｐ上流）およびターミネーター（ＵＲＡ３遺伝子の１５０ｂｐ下流）領域がある天然ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤＵＲＡ３遺伝子からなる、選択可能な／逆選択可能なマーカーＵＲＡ３（断片Ｕ）を含有する。各５００ｂｐ長さの断片ＡおよびＣは、標的遺伝子のすぐ上流の５００ｂｐ（断片Ａ）、および標的遺伝子の３’の５００ｂｐ（断片Ｃ）に相当した。相同組換えによる、染色体へのカセット組み込みのために、断片ＡおよびＣを使用した。断片Ｂ（５００ｂｐ長さ）は標的遺伝子のすぐ下流の５００ｂｐに相当し、ＵＲＡ３マーカー切除のために使用され、相同組換えによる染色体からの断片Ｃは、断片Ｂに対応する配列の直接反復として、染色体へのカセット組み込みに際して生じた。
【０２９２】
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製されたＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡをテンプレートとして、無瘢痕ＨＩＳ３欠失のためのＰＣＲカセットのための４つの断片を増幅した。ＨＩＳ３断片Ａは、ＨＩＳ３断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１３７）とプライマーｏＢＰ４５３（配列番号１３８）によって増幅した。ＨＩＳ３断片Ｂは、ＨＩＳ３断片Ａの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５４（配列番号１３９）、およびＨＩＳ３断片Ｕの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５５（配列番号１４０）によって増幅した。ＨＩＳ３断片Ｕは、ＨＩＳ３断片Ｂの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５６（配列番号１４１）、およびＨＩＳ３断片Ｃの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５７（配列番号１４２）によって増幅した。ＨＩＳ３断片Ｃは、ＨＩＳ３断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５８（配列番号１４３）、およびプライマーｏＢＰ４５９（配列番号１４４）によって増幅した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって精製した。ＨＩＳ３断片ＡとＨＩＳ３断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１３７）およびｏＢＰ４５５（配列番号１４０）で増幅することで、ＨＩＳ３断片ＡＢをオーバーラップＰＣＲによって作成した。ＨＩＳ３断片ＵとＨＩＳ３断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ４５６（配列番号１４１）およびｏＢＰ４５９（配列番号１４４）で増幅することで、ＨＩＳ３断片ＵＣをオーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）がそれに続いた。ＨＩＳ３断片ＡＢとＨＩＳ３断片ＵＣとを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１３７）およびｏＢＰ４５９（配列番号１４４）で増幅することで、ＨＩＳ３  ＡＢＵＣカセットをオーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって精製した。
【０２９３】
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄｕｒａ３Δ：：ｋａｎＭＸのコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して、ＨＩＳ３  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上に、３０℃で播種した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ４６０（配列番号１４５）およびｏＢＰ４６１（配列番号１４６）を用いたＰＣＲによって、ｈｉｓ３ノックアウトがある形質転換体をスクリーニングした。正しい形質転換体をＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄｕｒａ３Δ：：ｋａｎＭＸｈｉｓ３Δ：：ＵＲＡ３株として選択した。
【０２９４】
ｕｒａ３Δ部位からのＫａｎＭＸマーカー除去およびｈｉｓ３Δ部位からのＵＲＡ３マーカー除去
Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄｕｒａ３Δ：：ｋａｎＭＸｈｉｓ３Δ：：ＵＲＡ３をｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号１４７）で形質転換し、ヒスチジンおよびウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上に３０℃で播種して、ＫａｎＭＸマーカーを除去した。形質転換体をＹＰ添加１０ｇ／Ｌガラクトース中において３０℃で約６時間培養して、ＣＲＥリコンビナーゼおよびＫａｎＭＸマーカー切除を誘発し、回収のためにＹＰＤ（２０ｇ／Ｌグルコース）プレート上に３０℃で播種した。単離株をＹＰＤ中で一晩培養し、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ、１ｇ／Ｌ）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した単離株を選択した。ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号１４７）プラスミドの除去のために、５−ＦＯＡ耐性分離株をＹＰＤ中で培養し、その上に播種した。ＹＰＤ＋Ｇ−４１８プレート、ウラシル欠損合成完全培地プレート、およびヒスチジン欠損合成完全培地プレート上の増殖をアッセイすることで、ＫａｎＭＸマーカー、ＵＲＡ３マーカー、およびｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの喪失について、単離株をチェックした。Ｇー４１８感受性でウラシルおよびヒスチジン栄養要求性である、正しい単離株をＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰｈｉｓ３Δ株として選択し、ＰＮＹ１５００（ＢＰ８５７）と命名した。欠失およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、ｕｒａ３ΔではプライマーｏＢＰ４５０（配列番号１４８）およびｏＢＰ４５１（配列番号１４９）を用い、ｈｉｓ３ΔではプライマーｏＢＰ４６０（配列番号１４５）およびｏＢＰ４６１（配列番号１４６）を用いた、ＰＣＲおよび配列決定によって確認した。
【０２９５】
遺伝子欠失をＰＮＹ０１５００半数体株中で作成した。染色体の遺伝子欠失は、標的遺伝子の相同性上流および下流を含有する、カセットとの相同組換えによって作成した。形質転換体は、Ｇ−４１８耐性マーカーまたはウラシル欠損培地上の成長のいずれかを使用して選択した。遺伝子破壊カセットは、妨害される遺伝子の上流および下流の側面に位置する５０〜５５ｂｐの特異的プライマーを使用して、ＰＣＲによって作成された。Ｃｒｅ−ｌｏｘシステムを使用して、マーカーの再循環を達成した。
【０２９６】
内在性ＰＤＥ１コード領域を欠失させるために、ＵＲＡ３マーカー除去のための縮重ｌｏｘＰ７１およびｌｏｘＰ６６部位で挟まれたＵＲＡ３ｐ−ＵＲＡ３−ＵＲＡ３ｔカセットを含有するｐＬＡ５９（配列番号１５０）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と、プライマーＰＤＥ１  Ｆ  ＵＲＡ３（配列番号１５１）およびＰＤＥ１  Ｒ  ＵＲＡ３（配列番号１５２）とを使用して実施した。標準遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ０１５００に形質転換し、合成完全培地（１×アミノ酸非含有酵母窒素原礎培地、１×ウラシル欠損２０ｇ／Ｌのグルコース添加アミノ酸混合物）上において３０℃で選択した。プライマーＵＲＡＩＲおよびＰＤＥ１Ｆ（配列番号１５３および１５４）を用いたコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、組み込みカセットと、プライマーＵＲＡＩＦおよびＰＤＥ１Ｒ（配列番号１５５および１５６）との存在を確認した。カセットのＵＲＡ３マーカーを除去するために、細胞をｐＲＳ４２３：：ＧＡＬ１
ｐ−ｃｒｅ（配列番号１４７）で形質転換して、ヒスチジンドロップアウト合成完全培地（１×酵母窒素原礎培地、１×ヒスチジン除去アミノ酸混合物２０ｇ／Ｌのグルコース添加）上で、形質転換体を３０℃で選択した。５ｇ／Ｌのガラクトース添加酵母抽出物＋ペプトン（ＹＰ）寒天プレート上に形質転換体を播種して、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現を誘導した。ウラシル欠損２０ｇ／Ｌのグルコース添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。欠失およびマーカー除去はまた、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で調製されたゲノムＤＮＡを使用した、プライマーＰＤＥ１ＦおよびＰＤＥ１Ｒ（配列番号１５４および１５６）を用いた、ＰＣＲおよび配列決定によっても確認された。得られたＰＮＹ０１５００のＰＤＥ１欠失株は、ＰＮＹ０３００１（（ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｅ１Δ：：ｌｏｘｐ７１／６６）と命名された。
【０２９７】
実施例２
イソブタノール生産のための株の構築
ローラードラム内の２ｍＬの胞子形成前培地（０．８％酵母抽出物、０．３％ペプトン、１０％グルコース）中の３０℃での一晩成長と、それに続く新鮮な胞子形成前培地での１：１０希釈、そしてさらなる４時間の成長によって、酵母株ＰＮＹ８６０（ＡＴＣＣ特許寄託名ＰＴＡ−１２００７、２０１１年７月２１日に寄託）を胞子形成能力について試験した（Ｃｏｄｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：６３０−６３８，１９９５）。遠心分離によって細胞を回収して、２ｍＬの胞子形成培地（０．５％酢酸カリウム）に再懸濁して、ローラードラム内において３０℃で４日間培養した。顕微鏡検査は、胞子形成が起きたことを明らかにした。およそ３０％の細胞はａｓｃｉの形態であり、ａｓｃｉの約半数は４個の胞子を含有した。胞子形成培養物（１００μＬ）を遠心分離によって回収し、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ（登録商標）（１Ｍソルビトール中の５０μｇ／ｍＬ）に再懸濁して、室温で２０分間培養した。アリコート（５μＬ）をペトリ皿に移し、製造会社の使用説明書に従って、Ｓｉｎｇｅｒ  ＭＳＭ解剖顕微鏡（Ｓｉｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｓｏｍｅｒｓｅｔ  ＵＫ）を使用して、１８個の四分子を解体した。プレートを３０℃で３日間培養し、胞子生存度をスコアした。図１は、四分子切開プレートを示す。
【０２９８】
交雑型を同定するために、３つのオリゴヌクレオチドプライマー、ＡＫ０９−１＿ＭＡＴ（配列番号２７２）、ＡＫ０９−２＿ＨＭＬ（配列番号２７３）、およびＡＫ０９−０３＿ＨＭＲ（配列番号２７４）によって、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、２つの四分子からの４つの胞子コロニーを、コロニーＰＣＲ（例えばＨｕｘｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．６：２３６，１９９０を参照されたい）によって分析した。
【０２９９】
コロニーからの細胞は、０．０２ＭのＮａＯＨ中で懸濁し、９９℃で１０分間加熱して溶解した。次に製造会社が推奨する通りにＴａｑポリメラーゼを使用して（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）、この溶解産物の一部をＰＣＲ反応中でテンプレートとして使用した。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動によって分析した。交雑型α株は４０４ｂｐの産物を生じることが予測され、交雑型ａ株は５４４ｂｐの産物を生じることが予測され、二倍体は双方のバンドを生じるべきである。図２は、親株ＰＮＹ８６０が、２本のバンドを生じて、胞子子孫が約４００ｂｐまたは約５５０ｂｐの１本の顕著なバンドのみを生じることを示す（しかしいくつかは、その他のサイズの薄いバンドを生じる）。これらの結果は、ＰＮＹ８６０が二倍体であり、大部分異株性であることを示唆する（しかし低レベルの交雑型交換が起きたかもしれない）。
【０３００】
ＰＣＲ断片サイズに基づいて、交雑型は表４のように推測され得る。
【０３０１】
【表６】
2015503350.tif 000008
【０３０２】
これらの帰属を確認するために、四分子１（ＰＮＹ８６０−１）からの胞子を交雑し、顕微鏡検査で接合子形成を探すことで交雑をスコアして、結果は表５に示すようである。
【０３０３】
【表７】
2015503350.tif 000009
【０３０４】
酵母株は、次のように命名された：ＰＮＹ８６０−１ＡはＰＮＹ８９１と命名され、ＰＮＹ８６０−１ＢはＰＮＹ０８９２と命名され、ＰＮＹ８６０−１ＣはＰＮＹ８９３と命名され、およびＰＮＹ８６０−１ＤはＰＮＹ０８９４と命名された。
【０３０５】
半数体株（ＰＮＹ８９１  ＭＡＴａおよびＰＮＹ０８９４  ＭＡＴα）を、イソブタノール生産のための宿主として選択した。半数体株中で遺伝子欠失および組み込みを実施して、イソブタノール生産に適する株背景を作り出した。染色体の遺伝子欠失は、標的遺伝子の相同性上流および下流と、形質転換体選択のためのＧ−４１８耐性マーカーまたはＵＲＡ３遺伝子のいずれかとを含有する、ＰＣＲカセットによる相同組換えによって実施した。遺伝子組み込みのために、組み込まれる遺伝子をＰＣＲカセットに含めた。Ｃｒｅ−ｌｏｘシステムまたは無瘢痕欠失法のいずれかを使用して、選択マーカー再循環を達成した（Ａｋａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ２３：３９９，２００６）。
【０３０６】
第１に、ＰＮＹ８９１  ＭＡＴａ中で遺伝子欠失（ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＰＤＣ６、およびＰＤＣ１）および組み込み（ＰＤＣ１部位へのｉｌｖＤ）を実施して、ＰＮＹ１７０３（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ）を作成した。第２に、ＰＮＹ１７０３をＰＮＹ０８９４  ＭＡＴαと交雑させて、二倍体を作成した。得られた二倍体を胞子形成させ、次に四分子を解体して、グルコースおよびエタノール培地上での成長表現型と、ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤを保有する遺伝子型とについて、胞子分離個体をスクリーニングした。２つの交雑型半数体、ＰＮＹ１７１３（＝ＭＡＴα  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖ）、およびＰＮＹ１７１４（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ）が単離された。第３に、遺伝子欠失（ＰＤＣ５、ＦＲＡ２、ＧＰＤ２、ＢＤＨ１、およびＹＭＲ２２６ｃ）および組み込み（それぞれＰＤＣ５、ＦＲＡ２、ＧＰＤ２、およびＢＤＨ１部位への、ｋｉｖＤ、ｉｌｖＤ、ａｌｓＳ、およびｉｌｖＤ−ａｄｈ）をＰＮＹ１７１４株背景で実施して、ＰＮＹ１７５８（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ  ｐｄｃ５Δ：：ｋｉｖＤ（ｙ）ｆｒａ２Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６−ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ  ｂｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ  ｙｍｒ２２６ｃΔ）を構築した。第４に、Ｋ９Ｄ３．ＫＡＲＩ遺伝子を含有するｐＷＺ００９（配列番号１５８）と、ｉｌｖＤ遺伝子を含有するｐＷＺ００１（配列番号１５９）との２つのプラスミドで、ＰＮＹ１７５８を形質転換して、サトウキビイソブタノール産生菌ＰＮＹ１７７５（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ  ｐｄｃ５Δ：：ｋｉｖＤ（ｙ）ｆｒａ２Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６−ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ  ｂｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ  ｙｍｒ２２６ｃΔ／ｐＷＺ００９，ｐＷＺ００１）を構築した。
【０３０７】
ＵＲＡ３欠失
内在性ＵＲＡ３コード領域を欠失させるために、ｌｏｘＰ部位で挟まれたＴＥＦ１ｐ−ｋａｎＭＸ−ＴＥＦ１ｔカセットを含有するｐＬＡ５４（配列番号１３２）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅し、生体内で相同組換えして、引き続いてＫａｎＭＸマーカーを除去した。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびプライマーＢＫ５０５（配列番号１３３）およびＢＫ５０６（配列番号１３４）を使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＵＲＡ３部分は、ＫａｎＭＸカセットの組み込みがＵＲＡ３コード領域の置換をもたらすように、ＵＲＡ  ＡＴＧの１８０ｂｐ上流の５’領域およびコード領域の７８ｂｐ下流の３’領域から誘導された。標準遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を使用して、半数体株であるＰＮＹ８９１にＰＣＲ産物を形質転換し、２％グルコースおよびＧ−４１８（ジェネテシン（登録商標）、１００μｇ／ｍＬ）添加富栄養培地上において、３０℃で形質転換体を選択した。２％グルコース添加富栄養培地上に形質転換体をパッチに植えて、ウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上にレプリカ播種し、ウラシル栄養要求株を同定した。プライマーＬＡ４６８（配列番号１３５）およびＬＡ４９２（配列番号１３６）を用いたコロニーＰＣＲによって、これらのパッチをスクリーニングして、組み込みカセットの存在を確認した。ＵＲＡ３変異体が得られた；ＮＹＬＡ９６（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰ）。
【０３０８】
ＨＩＳ３欠失
内在性ＨＩＳ３コード領域を欠失させるために、ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３ｐ−ＵＲＡ３−ＵＲＡ３ｔカセットを含有するｐＬＡ３３（配列番号１６０）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅し、生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびプライマー３１５（配列番号１６１）および３１６（配列番号１６２）を使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＨＩＳ３部分は、ＵＲＡ３カセットの組み込みが、ＨＩＳ３コード領域の置換をもたらすように、ＨＩＳ３  ＡＴＧの５０ｂｐ上流の５’領域およびコード領域の５０ｂｐ下流の３’領域から誘導された。標準遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を使用してＰＣＲ産物をＮＹＬＡ９６に形質転換し、ウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上において、３０℃で選択した。プライマー９２（配列番号１６３）および３４６（配列番号１６４）を用いたコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、組み込みカセットの存在を確認した。ｐＲＳ４２３：：ＧＡＬ１ｐ−ｃｒｅ（配列番号１４７）で形質転換し、ヒスチジン欠損２％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。０．５％ガラクトース添加酵母抽出物＋ペプトン（ＹＰ）寒天プレート上に形質転換体を播種して、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現を誘導した。ウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。また、ＵＲＡ３を欠失させるために使用したＫａｎＭＸカセットのマーカー除去は、２％グルコースおよびＧ−４１８（ジェネテシン（登録商標）、１００μｇ／ｍＬ）が添加された富栄養培地に、３０℃でコロニーをパッチで植えて、成長の不在を立証することで確認した。得られたＵＲＡ３およびＨＩＳ３欠失株は、ＮＹＬＡ１０７（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ）と命名された。
【０３０９】
ＰＤＣ６欠失
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ピルビン酸デカルボキシラーゼの３つの異なるイソ酵素をコードする、３つのＰＤＣ遺伝子（ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６）を有する。ピルビン酸デカルボキシラーゼは、エタノール発酵の第１段階を触媒して、解糖中に生じたピルビン酸からアセトアルデヒドを生成する。
【０３１０】
無瘢痕欠失法（Ａｋａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ２３：３９９，２００６）に従って、ＰＤＣ６コード領域の相同性上流（断片Ａ）および下流（断片Ｂ）と、形質転換体の選択のためのプロモーター（ＵＲＡ３遺伝子の２５０ｂｐ上流）およびターミネーター（ＵＲＡ３遺伝子の１５０ｂｐ下流）（断片Ｕ）があるＵＲＡ３遺伝子と、ＰＤＣ６コード領域の３’領域（断片Ｃ）とを含有するＰＣＲカセット（Ａ−Ｂ−Ｕ−ｃ）を用いた相同組換えによって、ＰＤＣ６コード配列を欠失させた。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、テンプレートとしてのＰＮＹ８９１ゲノムＤＮＡから、無瘢痕ＰＤＣ６欠失のためのＰＣＲカセットのための４つの断片（Ａ、Ｂ、Ｕ、Ｃ）を増幅した。ＰＮＹ８９１ゲノムＤＮＡは、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって調製した。ＰＤＣ６断片Ａは、ＰＤＣ６断片Ｂの５’末端との相同性がある３’テールを含有する、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号１６５）とプライマーｏＢＰ４４１（配列番号１６６）によって増幅した。ＰＤＣ６断片Ｂは、ＰＤＣ６断片Ａの３’末端と相同性の５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４２（配列番号１６７）、およびＰＤＣ６断片Ｕの５’末端と相同性の５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４３（配列番号１６８）によって増幅した。ＰＤＣ６断片Ｕは、ＰＤＣ６断片Ｂの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４４（配列番号１６９）、およびＰＤＣ６断片Ｃの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４５（配列番号１７０）によって増幅した。ＰＤＣ６断片Ｃは、ＰＤＣ６断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４６（配列番号１７１）、およびプライマーｏＢＰ４４７（配列番号１７２）によって増幅した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって精製した。ＰＤＣ６断片ＡとＰＤＣ６断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号１６５）およびｏＢＰ４４３（配列番号１６８）で増幅することで、ＰＤＣ６断片Ａ−ＢをオーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＤＣ６断片ＵとＰＤＣ６断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ４４４（配列番号１６９）およびｏＢＰ４４７（配列番号１７２）で増幅することで、ＰＤＣ６断片Ｕ−ＣをオーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上でゲル精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）がそれに続いた。ＰＤＣ６断片Ａ−ＢとＰＤＣ６断片Ｕ−Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号１６５）およびｏＢＰ４４７（配列番号１７２）で増幅することで、ＰＤＣ６Ａ−Ｂ−Ｕ−ＣカセットをオーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって精製した。
【０３１１】
ＮＹＬＡ１０７のコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＤＣ６Ａ−Ｂ−Ｕ−ＣＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上に、３０℃で播種した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号１７３）およびｏＢＰ４４９（配列番号１７４）を用いたＰＣＲによって、ｐｄｃ６ノックアウトがある形質転換体をスクリーニングした。染色体からＵＲＡ３マーカーを除去するために、正しい形質転換体をＹＰＤ中で一晩培養し、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーが欠失した分離株を選択した。欠失およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号１７３）およびｏＢＰ４４９（配列番号１７４）を用いた、ＰＣＲおよび配列決定によって確認した。単離株中のＰＤＣ６遺伝子の不在は、ＰＤＣ６、ｏＢＰ５５４（配列番号１７５）、およびｏＢＰ５５５（配列番号１７６）のコード配列に対して特異的なプライマーを使用した、陰性ＰＣＲ結果によって実証された。正しい単離株をＰＮＹ１７０２株（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ）として選択した。
【０３１２】
ＰＤＣ１欠失およびｉｌｖＤ組み込み
ＰＤＣ１コード領域を欠失させて、ＰＤＣ１コード領域の相同性上流（断片Ａ）および下流（断片Ｂ）と、ｉｌｖＤコード領域（断片ｉｌｖＤ）と、形質転換体の選択のためのプロモーターおよびターミネーター（断片Ｕ）があるＵＲＡ３遺伝子と、ＰＤＣ１コード領域（断片Ｃ）の３’領域とを含有するＰＣＲカセット（Ａ−ｉｌｖＤ−Ｂ−Ｕ−ｃ）での相同組換えによって、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００６１０からのｉｌｖＤコード領域で置換した。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製されたＮＹＬＡ８３（参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４３号明細書に記載される）ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤ組み込みのためのＰＣＲカセットのためのストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）からのｉｌｖＤコード領域がそれに続くＡ断片を増幅した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤは、ＰＤＣ１断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号１７７）、およびプライマーｏＢＰ５１５（配列番号１７８）によって増幅した。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製されたＰＮＹ８９１ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤ組み込みのためのＰＣＲカセットのためのＢ、Ｕ、およびＣ断片を増幅した。ＰＤＣ１断片Ｂは、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５１６（配列番号１７９）と、ＰＤＣ１断片Ｕの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５１７（配列番号１８０）とによって増幅した。ＰＤＣ１断片Ｕは、ＰＤＣ１断片Ｂの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５１８（配列番号１８１）、およびＰＤＣ１断片Ｃの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５１９（配列番号１８２）によって増幅した。ＰＤＣ１断片Ｃは、ＰＤＣ１断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５２０（配列番号１８３）、およびプライマーｏＢＰ５２１（配列番号１８４）によって増幅した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって精製した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤおよびＰＤＣ１断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ５１３およびｏＢＰ５１７で増幅することで、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤ−ＢをオーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＤＣ１断片ＵとＰＤＣ１断片Ｃを混合し、プライ���ーｏＢＰ５１８（配列番号１８１）およびｏＢＰ５２１（配列番号１８４）で増幅することで、ＰＤＣ１断片Ｕ−ＣをオーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上でゲル精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）がそれに続いた。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤ−ＢとＰＤＣ１断片Ｕ−Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号１７７）およびｏＢＰ５２１（配列番号１８４）で増幅することで、ＰＤＣ１Ａ−ｉｌｖＤ−Ｂ−Ｕ−ＣカセットをオーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって精製した。
【０３１３】
ＰＮＹ１７０２のコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＤＣ１Ａ−ｉｌｖＤ−Ｂ−Ｕ−ＣＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上に３０Ｃで播種した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号１８５）およびｏＢＰ５１２（配列番号１８６）を用いたＰＣＲによって、ｐｄｃ１ノックアウトｉｌｖＤ組み込みがある形質転換体をスクリーニングした。単離株中のＰＤＣ１遺伝子の不在は、ＰＤＣ１、ｏＢＰ５５０（配列番号１８７）、およびｏＢＰ５５１（配列番号１８８）のコード配列に対して特異的なプライマーを使用した、陰性ＰＣＲ結果によって実証された。染色体からＵＲＡ３マーカーを除去するために、正しい形質転換体をＹＰＤ中で一晩培養し、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーが欠失した分離株を選択した。ＰＤＣ１欠失、ｉｌｖＤ組み込み、およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｉｌｖＤＳｍ（１３５４Ｆ）（配列番号１８９）およびｏＢＰ５１２（配列番号１８６）を用いたＰＣＲと、プライマーｉｌｖＤＳｍ（７８８Ｒ）（配列番号１９０）およびｉｌｖＤＳｍ（１３５４Ｆ）（配列番号１８９）を用いた配列決定とによって確認した。正しい単離株をＰＮＹ１７０３株（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ）として選択した。
【０３１４】
ＰＮＹ１７１３（＝ＭＡＴα  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ）およびＰＮＹ１７１４（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ）を単離するための、ＰＮＹ１７０３  ＭＡＴａ×ＰＮＹ０８９４  ＭＡＴα交雑、胞子形成、および四分子切開。
【０３１５】
ＹＰＤ上でＰＮＹ１７０３  ＭＡＴａおよびＰＮＹ０８９４  ＭＡＴαを３０℃で一晩交雑して、二倍体（ＭＡＴａ／α）細胞を作成した。可能な二倍体をＹＰＤプレート上に画線塗抹して、３０℃で４日間培養して、単一コロニーを単離した。二倍体を同定するために、ＭＡＴ遺伝子座の右側でその方向を向く配列に相当するＭＡＴ１（配列番号１９１）、ＭＡＴαおよびＨＭＬαに位置する特異的領域内の配列に相当するＭＡＴ２（配列番号１９２）、およびＭＡＴａおよびＨＭＲａに位置するα特異的領域内の配列に相当するＭＡＴ３（配列番号１９３）の３つのオリゴヌクレオチドプライマーによって、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、コロニーＰＣＲ（Ｈｕｘｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．６：２３６，１９９０）を実施した。二倍体コロニーは、ＭＡＴα特異的４０４ｂｐおよびＭＡＴａ特異的５４４ｂｐの２つのＰＣＲ産物を生じることから、判定された。得られた二倍体を胞子形成前培地中で培養し、次に胞子形成培地に接種した（Ｃｏｄｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：６３０，１９９５）。３日後、胞子形成効率を顕微鏡でチェックした。胞子を０．０５ｍｇ／ｍＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ（登録商標）で消化した（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹからの手順を使用した）。８枚のプレートの四分子をＹＰＤプレート上で解体し（プレートあたり１８個の四分子、合計１４４個の四分子、５７６個の胞子）、３０℃に４日間おいた。遺伝子型ｕｒａ３Δおよびｈｉｓ３Δ、およびエタノールおよびグルコース培地上の成長表現型について胞子子孫をスクリーニングするために、ＹＰＤプレート上の胞子を、酵母レプリカ平板法装置（Ｃｏｒａｓｔｙｌｅｓ，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＮＣ）を使用して、１）ウラシル（ｕｒａ）欠損２％グルコース添加合成完全（ＳＣ）培地、２）ヒスチジン（ｈｉｓ）欠損２％グルコース添加ＳＣ次に３）０．５％エタノール培地添加ＳＣに順次レプリカ播種した。ＳＣ−ｕｒａプレートおよびＳＣ−ｈｉｓプレート上で成長できなかったが、ＳＣ＋０．５％エタノールプレートおよびＹＰＤプレート上で成長した胞子を選択してＰＣＲ分析し、それらの交雑型を判定した（Ｈｕｘｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．６：２３６，１９９０）。胞子がｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤを含有するかどうかを判定するために、選択された胞子を、プライマーｏＢＰ５１２（配列番号１８６）およびｉｌｖＤＳｍ（１３５４Ｆ）（配列番号１８９）を使用したコロニーＰＣＲによってチェックした。ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤを含有する胞子は、予測された９６２ｂｐのＰＣＲ産物を生成したが、欠失がないものはＰＣＲ産物を生成しなかった。次にプライマーＢＰ４４８（配列番号１７３）およびＢＰ４４９（配列番号１７４）を使用���て、陽性の胞子をＰＤＣ６欠失についてＰＣＲチェックした。予測されたＰＣＲサイズの断片は、ｐｄｃ６Δを含有する細胞では１．３ｋｂｐであり、野生型ＰＤＣ６遺伝子を含有する細胞では２．９ｋｂｐであった。双方の交雑型について正しい単離株を選択し、ＰＮＹ１７１３（＝ＭＡＴα  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ）およびＰＮＹ１７１４（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ）と命名した。
【０３１６】
ＰＤＣ５欠失およびｋｉｖＤ（ｙ）組み込み
ＰＤＣ５コード領域を欠失させて、ＰＤＣ５コード領域の相同性上流（断片Ａ）および下流（断片Ｂ）と、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の発現のためにコドン最適化されたｋｉｖＤ（ｙ）コード領域（断片ｋｉｖＤ（ｙ））と、形質転換体の選択のためのプロモーターおよびターミネーター（断片Ｕ）があるＵＲＡ３遺伝子と、ＰＤＣ５コード領域の３’領域（断片Ｃ）とを含有するＰＣＲカセット（Ａ−ｋｉｖＤ（ｙ）−Ｂ−Ｕ−ｃ）での相同組換えによって、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのｋｉｖＤコード領域で置換した。
【０３１７】
ＰＤＣ５断片Ａは、ｋｉｖＤ（ｙ）の５’末端との相同性がある３’テールを含有する、プライマーＴ−Ａ（ＰＤＣ５）（配列番号１９４）とプライマーＢ−Ａ（ｋｉｖＤ）（配列番号１９５）を用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、テンプレートとしてのＰＮＹ８９１ゲノムＤＮＡから増幅した。コード配列ｋｉｖＤ（ｙ）は、ＰＤＣ５断片Ａの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーＴ−ｋｉｖＤ（ａ）（配列番号１９７）、およびＰＤＣ５断片Ｂの５’末端との相同性がある３’テールを含有するプライマーＢ−ｋｉｖＤ（ｂ）（配列番号１９８）によって、テンプレートとしての（配列番号１９６）から増幅した。ＰＤＣ５断片ＡおよびｋｉｖＤ（ｙ）を混合し、プライマーＴ−Ａ（ＰＤＣ５）およびＢ−Ａ（ｋｉｖＤ）で増幅することで、ＰＤＣ５断片Ａ−ｋｉｖＤ（ｙ）をオーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＤＣ５断片ＢをｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化して、ＰＤＣ５Ａ−ｋｉｖＤ（ｙ）−Ｂ−Ｕ−ＣＰＣＲカセットのＢ−Ｕ部分を作成した。得られたプラスミドは、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３−ｓａｄＢ−ＰＤＣ５断片Ｂ（配列番号１９９）と命名された。プラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３−ｓａｄＢ−ＰＤＣ５断片Ｂは、ｋｉｖＤ（ｙ）断片の３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーＴ−Ｂ（ｋｉｖＤ）（配列番号２００）、およびＰＤＣ５断片Ｃの５’末端との相同性がある３’テールを含有するｏＢＰ５４６（配列番号２０１）を使用した、ＰＤＣ５断片Ｂ−断片Ｕの増幅のためのテンプレートとして使用した。ＰＤＣ５断片Ｃは、ＰＤＣ５断片Ｂー断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５４７（配列番号２０２）、およびプライマーｏＢＰ５３９（配列番号２０３）によって増幅した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって精製した。ＰＤＣ５断片Ｂ−断片ＵおよびＰＤＣ５断片Ｃを混合し、プライマーＴ−Ｂ（ｋｉｖＤ）（配列番号２００）およびｏＢＰ５３９（配列番号２０３）で増幅することで、ＰＤＣ５断片Ｂ−断片Ｕ−断片ＣをオーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）がそれに続いた。ＰＤＣ５断片Ａ−ｋｉｖＤ（ｙ）断片とＰＤＣ５断片Ｂ−断片Ｕ−ＰＤＣ５断片Ｃを混合し、プライマーＴ−Ａ（ＰＤＣ５）（配列番号１９４）およびｏＢＰ５３９（配列番号２０３）で増幅することで、ＰＤＣ５Ａ−ｋｉｖＤ（ｙ）−Ｂ−Ｕ−ＣカセットをオーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって精製した。
【０３１８】
ＰＮＹ１７１４のコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＤＣ５Ａ−ｋｉｖＤ（ｙ）−Ｂ−Ｕ−ＣＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損０．５％エタノール添加（グルコース無添加）合成完全培地上に、３０℃で播種した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号２０４）およびｋｉｖＤ（６５２Ｒ）（配列番号２０５）を用いたＰＣＲによって、ｐｄｃ５ノックアウトｋｉｖＤ組み込みがある形質転換体をスクリーニングした。単離株中のＰＤＣ５遺伝子の不在は、ＰＤＣ５、ｏＢＰ５５２（配列番号２０６）、およびｏＢＰ５５３（配列番号２０７）のコード配列に対して特異的なプライマーを使用した、陰性ＰＣＲ結果によって実証された。染色体からＵＲＡ３マーカーを除去するために、双方のＭＡＴαおよびＭＡＴａ株の正しい各形質転換体をＹＰＥ（０．５％エタノール）中で一晩培養し、エタノール添加（グルコース無添加）５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーが欠失した分離株を選択した。ＰＤＣ５欠失、ｋｉｖＤ（ｙ）組み込み、およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ５４０およびｏＢＰ５４１を用いたＰＣＲによって確認した。ｋｉｖＤ（ｙ）コード領域の正しい組み込みは、プライマーｋｉｖＤ（６５２Ｒ）（配列番号２０５）、ｋｉｖＤ（６０２ｆ）（配列番２０８）、およびｋｉｖＤ（１２５０Ｆ）（配列番号２０９）を用いたＤＮＡ配列（ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）によって確認した。正しい単離株は、ＰＮＹ１７１６（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ  ｐｄｃ５Δ：：ｋｉｖＤ（ｙ））株と命名された。
【０３１９】
ＦＲＡ２欠失およびＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）−ＴＥＦ１ｔ組み込み
ＦＲＡ２コード領域を欠失させ、相同組換えによってカセットＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＡＢ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）−ＴＥＦ１ｔ−ＨｉｓＧ−ＵＲＡ３−ＨｉｓＧで置換した。カセットＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＡＢ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）−ＴＥＦ１ｔ−ＨｉｓＧ−ＵＲＡ３−ＨｉｓＧは、雑種プロモーターＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＡＢ１ｐと、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現のためにコドン最適化されたストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００６１０からのｉｌｖＤ（ｙ）コード領域と、ＴＥＦ１ｔターミネーターと、ＨｉｓＧ断片で挟まれたプロモーターとミネーターがあるＵＲＡ３遺伝子とを含有する。
【０３２０】
プラスミドｐＲＳ４２３−ＴＰＩ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）（配列番号２１０）を制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化して、アガロースゲル上で２，２７０ｂｐのＴＰＩ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）断片を精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）がそれに続いた。ＴＰＩ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）断片をｐＭＯＤ−ＵＲＡ３ｒ２（配列番号２１１）上のＮｏｔＩおよびＳａｌＩ部位にクローン化して、ｐＭＯＤ−ＵＲＡ３ｒ２−ＴＰＩ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）を構築した。ｐＭＯＤ−ＵＲＡ３ｒ２はｐＵＣ１９ベースであり、ＨｉｓＧ断片で挟まれたＵＲＡ３遺伝子の配列を含有する。プライマーＴ−ＴＥＦ１ｔ（ＮｏｔＩ）（配列番号２１２）およびプライマーＢ−ＴＥＦ１ｔ（ＮｏｔＩ）（配列番号２１３）によって、テンプレートとしてのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤＮＡから、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、ＰＣＲＴＥＦ１ｔ（２８５ｂｐ）を増幅した。ＰＣＲＴＥＦ１ｔ断片を制限酵素ＮｏｔＩで消化し、次にｐＭＯＤ−ＵＲＡ３ｒ２−ＴＰＩ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）上のＮｏｔＩ部位にクローン化した。ＴＥＦ１ｔの正しい配向は、２，００９ｂｐの予想サイズで、Ｔ−ＤＳｍｏ（ＲＰＳ５ｐ）（配列番号２１４）およびＢ−ＴＥＦ１ｔ（ＮｏｔＩ）（配列番号２１３）を用いたコロニーＰＣＲ解析によって確認された。得られたプラスミドは、ｐＭＯＤ−ＵＲＡ３ｒ２−ＴＰＩ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）−ＴＥＦ１ｔと命名された。次に、ｐＭＯＤ−ＵＲＡ３ｒ２−ＴＰＩ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）−ＴＥＦ１ｔ上のＴＰＩ１ｐプロモーターを雑種プロモーターＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ（配列番号２１５）で置換した。プライマーＴ−Ｕ／ＰＧＫ１（ＸｈｏＡｐａ）（配列番号２１７）およびプライマーＢ−ＦＢＡ１（ＳｐｅＩ）（配列番号２１８）によって、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、プラスミドｐＲＳ３１６−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ＧＵＳ（配列番号２１６）から、ＰＣＲＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐカセットを増幅した。ＰＣＲＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ産物を制限酵素ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩで消化し、ＰＣＲ断片をアガロースゲル上で精製してゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）がそれに続いた。ｐＭＯＤ−ＵＲＡ３ｒ２−ＴＰＩ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）−ＴＥＦ１ｔを制限酵素ＳａｌＩおよびＳｐｅＩで消化し、次にＴＰＩ１ｐを欠く６，８８７ｂｐのプラスミド断片をアガロースゲル上で精製して、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）．がそれに続いた。ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩで消化されたＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ産物に、６，８８７ｂｐのｐＭＯＤ−ＵＲＡ３ｒ２−ｉｌｖＤ（ｙ）−ＴＥＦ１ｔをライゲートして、ｐＭＯＤ−ＵＲＡ３ｒ２−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）−ＴＥＦ１ｔ（配列番号２１９）を作成した。ＦＲＡ２ＡＴＧの５０ｂｐ上流の５’領域を含有するプライマーＴ−ＦＲＡ（Ｄｓｍ）（配列番号２２０）、およびＦＲＡ２コード領域の５０ｂｐ下流の３’領域を含有するＢ−ＦＲＡ（Ｄｓｍ）（配列番号２２１）によって、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、プラスミドｐＭＯＤ−ＵＲＡ３ｒ２−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）−ＴＥＦ１ｔから、ＰＣＲカセットＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＡＢ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）−ＴＥＦ１ｔ−ＨｉｓＧ−ＵＲＡ３−ＨｉｓＧを増幅した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって精製した。
【０３２１】
ＰＮＹ１７１６のコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲカセットＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＡＢ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）−ＴＥＦ１ｔ−ＨｉｓＧ−ＵＲＡ３−ＨｉｓＧで形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損０．５％エタノール添加（グルコース無添加）合成完全培地上に、３０℃で播種した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ６０２（配列番号２２２）およびＢ−ＴＥＦ１ｔ（ＮｏｔＩ）を用いたＰＣＲによって、ｆｒａ２ノックアウトＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＡＢ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）−ＴＥＦ１ｔ−ＨｉｓＧ−ＵＲＡ３−ＨｉｓＧ組み込みがある形質転換体をスクリーニングした。染色体からＵＲＡ３マーカーを除去するために、正しい各形質転換体をＹＰＥ（０．５％エタノール）中で一晩培養し、エタノール添加（グルコース無添加）５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーが欠失した分離株を選択した。ＦＲＡ２欠失、ｏｆＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＡＢ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）−ＴＥＦ１ｔ組み込み、およびＵＲＡ３マーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーＤＳｍ（ｏ）５０Ｒ（配列番号２２３）、ＤＳｍ（ｏ）１Ｆ（配列番号２２４）、ＤＳｍ（ｏ）６８８Ｆ（配列番号２２５）、およびＤＳｍ（ｏ）１３５２Ｆ（配列番号２２６）を用いたＤＮＡ配列決定によって確認した。正しい単離株は、ＰＮＹ１７２０（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ  ｐｄｃ５Δ：：ｋｉｖＤ（ｙ）ｆｒａ２Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ））と命名された。
【０３２２】
ＧＰＤ２欠失およびＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ組み込み
ＧＰＤ２コード領域を欠失させ、変性ｌｏｘＰ７１／ｌｏｘＰ６６部位で挟まれたＵＲＡ３ｐ−ＵＲＡ３−ＵＲＡ３ｔカセットと、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＦＢＡ１プロモーターと、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）亜種サブティリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８株（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＮＣ＿０００９６４）からのａｌｓＳとを含有するＰＣＲカセット（ＵＲＡ３−ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ）を用いた、相同組換えによって、ＦＡＢ１プロモーターおよびａｌｓＳコード領域で置換した。
【０３２３】
ｌｏｘＰ７１／ｌｏｘＰ６６部位で挟まれたＰＣＲＵＲＡ３ｐ−ＵＲＡ３−ＵＲＡ３ｔ断片は、ＧＰＤ２ＡＴＧの５’領域６０ｂｐ上流を含有するプライマーＴ−ＵＲＡ（ｇｐｄ＿６０ｂｐ）（配列番号２２７）、およびＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ断片の５’末端との相同性がある３’テールを含有するＢ−ＵＲＡ（ａｌｓＳ）（配列番号２２８）によって、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、ｐＬＡ５９（配列番号１５０）から増幅した。ＰＣＲＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ断片は、ＵＲＡ３ｐ−ＵＲＡ３−ＵＲＡ３ｔ断片の３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーＴ−ａｌｓＳ（ＵＲＡ）（配列番号２３０）、およびＧＰＤ２遺伝子の６０ｂｐ下流の３’領域を含有するＢ−ａｌｓＳ（ｇｐｄ＿６０ｂｐ）（配列番号２３１）によって、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、ｐＵＣ１９−ｋａｎ：：ｐｄｃ１：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ：：ＴＲＸ１（配列番号２２９）から増幅した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）がそれに続いた。ＵＲＡ３ｐ−ＵＲＡ３−ＵＲＡ３ｔ断片とＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ断片を混合し、プライマーＴ−ＵＲＡ（ｇｐｄ＿６０ｂｐ）およびＢ−ａｌｓＳ（ｇｐｄ＿６０ｂｐ）で増幅することで、ＵＲＡ３−ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳカセットをオーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって精製した。
【０３２４】
ＰＮＹ１７２０のコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲカセットＵＲＡ３−ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳで形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損０．５％エタノール添加（グルコース無添加）合成完全培地上に、３０℃で播種した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーＦＢＡ−ａｌｓ１５５７（配列番号２３２）およびｇｐｄ２−ｄｏｗｎ１７８（配列番号２３３）を用いたＰＣＲによって、ｇｐｄ２ノックアウトＵＲＡ３−ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ組み込みがある形質転換体をスクリーニングした。ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号１４７）で形質転換し、ウラシル欠損０．５％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。０．５％エタノール添加５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に、形質転換体を画線塗抹して３０℃で培養し、ＵＲＡ３マーカーを喪失した単離株を選択した。ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの除去のために、５−ＦＯＡ耐性分離株をＹＰＥ（０．５％エタノール）中で培養したＧＰＤ２欠失、ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ組み込み、およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｇｐｄ２−ｕｐ２２９（配列番号２３４）およびＢ−ＦＢＡ１（ＳｐｅＩ）（配列番号２１８）を用いたＰＣＲによってチェックし、プライマーＴ−ａｌｓＳ（ＵＲＡ）、ＦＢＡ−ａｌｓ７５２（配列番号２３５）、ＦＢＡ−ａｌｓ１５５７（配列番号２３２）、およびｇｐｄ２−ｄｏｗｎ１７８を用いたＤＮＡ配列決定によって確認した。正しい単離株は、ＰＮＹ１７２５（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ  ｐｄｃ５Δ：：ｋｉｖＤ（ｙ）ｆｒａ２Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６−ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳと命名された。
【０３２５】
ＢＤＨ１欠失およびＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＴＥＦ１ｔ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ組み込み
ＢＤＨ１コード領域を欠失させ、相同組換えによって、カセットＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＴＥＦ１ｔ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈで置換した。ＢＤＨ１欠失およびＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＴＥＦ１ｔ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ組み込みカセット（Ａ−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＴＥＦ１ｔ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ−Ｂ−Ｕ−ｃ）は、ＢＤＨ１コード領域の相同性上流（断片Ａ）および下流（断片Ｂ）と、雑種プロモーターＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐと、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００６１０からのｉｌｖＤコード領域と、ＴＥＦ１ｔターミネーターと、ＩＬＶ５ｐプロモーターと、ベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ）からのターミネーターがあるａｄｈコード領域と、形質転換体の選択のためのプロモーターおよびターミネーター（断片Ｕ）ｍがあるＵＲＡ３遺伝子と、ＢＤＨ１コード領域（断片Ｃ）の３’領域とを含有する。断片Ａ、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ、ｉｌｖＤ、ＴＥＦ１ｔ、ＩＬＶ５ｐ、ａｄｈ、断片Ｂ、断片Ｕ、および断片ＣをｐＵＣ１９ベースのプラスミドにクローン化して、ｐＢＰ１３３９（＝ｐＡ−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＴＥＦ１ｔ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ−Ｂ−Ｕ−ｃ）（配列番号２３６）を作成した。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、プライマーｏＢＰ６８５（配列番号２３７）およびｏＢＰ６９０（配列番号２３８）によって、ＰＣＲカセットＡ−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＴＥＦ１ｔ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ−Ｂ−Ｕ−ＣをｐＢＰ１３３９から増幅した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって精製した。
【０３２６】
コンピテント細胞ｏｆＰＮＹ１７２５を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲカセットＡ−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＴＥＦ１ｔ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ−Ｂ−Ｕ−Ｃで形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損０．５％エタノール添加（グルコース無添加）合成完全培地上に、３０℃で播種した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ７２６（配列番号２３９）およびＤＳｍ１３５４Ｆ（配列番号２４０）を用いたＰＣＲによって、ｂｄｈ１ノックアウトＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＴＥＦ１ｔ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ−Ｂ−Ｕ組み込みがある形質転換体をスクリーニングした。染色体からＵＲＡ３マーカーを除去するために、正しい各形質転換体をＹＰＥ（０．５％エタノール）中で一晩培養し、エタノール添加（グルコース無添加）５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーが欠失した分離株を選択した。ＢＤＨ１欠失、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＴＥＦ１ｔ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ組み込み、およびＵＲＡ３マーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーＤＳｍ７８８Ｒ（配列番号２４１）、ＤＳｍ６９６Ｆ（配列番号２４２）、ＤＳｍ１３５４Ｆ（配列番号２４０）、ＡＤＨＢｉ６４３Ｒ（配列番号２４３）、およびＡＤＨＢｉ５５４Ｆ（配列番号２４４）を用いたＤＮＡ配列決定によって確認した。正しい単離株は、ＰＮＹ１７３０（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ  ｐｄｃ５Δ：：ｋｉｖＤ（ｙ）ｆｒａ２Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）−ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６−ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ  ｂｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ）と命名された。
【０３２７】
ＹＭＲ２２６ｃ欠失
ＰＮＹ１７３０株中の遺伝子ＹＭＲ２２６ｃを相同組換えによって欠失させ、２．０ｋｂの直鎖無瘢痕欠失カセットを使用してＰＣＲ増幅した。カセットは、選択可能なマーカーとしてのその固有のプロモーターおよびターミネーターがあるＵＲＡ３遺伝子と、欠失カセットの組み込みおよび天然介在配列の除去を促進するためのＹＭＲ２２６ｃ遺伝子染色体遺伝子座側面に位置する上流および下流相同配列と、ＵＲＡ３マーカーの組換えおよび除去を促進するための反復配列とを含んでなる、スプライスされたＰＣＲ増幅断片から、構築された。１，２０８ｂｐのＵＲＡ３発現カセットは、順方向および逆方向ＰＣＲプライマーＮ１２５１（配列番号２４５）およびＮ１２５２（配列番号２４６）によって、ｐＬＡ３３（配列番号１６０）からＰＣＲ増幅された。順方向および逆方向プライマーＮ１２５３（配列番号２４７）およびＮ１２５４（配列番号２４８）は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ２２１１株（ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ  ｆｒａ２Δ  ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ）のゲノムＤＮＡ調製品からの３’ＵＲＡ３重複配列タグがある、２５０ｂｐの下流相同配列を増幅した。順方向および逆方向ＰＣＲプライマーＮ１２５６（配列番号２４９）およびＮ１２５５（配列番号２５０）は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ２２１１株のゲノムＤＮＡ調製品からの５’ＵＲＡ３重複配列タグがある、２５０ｂｐの反復配列を増幅した。順方向および逆方向ＰＣＲプライマーＮ１２５７（配列番号２５１）およびＮ１２５８（配列番号２５２）は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ２２１１株のゲノムＤＮＡ調製品からの５’反復重複配列タグがある、２５０ｂｐの上流相同配列を増幅した。
【０３２８】
Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して、およそ１．５μｇのＰＣＲ増幅カセットをＰＮＹ１７３０株に形質転換して資化能力を持たせ、組み込まれたｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＵＲＡ３カセットがある細胞を選択するために、ウラシル欠損０．５％エタノール添加（グルコース無添加）合成完全培地上に、形質転換混合物を３０℃で播種した。７２〜９６時間後に出現した形質転換体は、引き続いて同一培地上に短く画線塗抹して、３０℃で２４〜４８時間培養した。ＰＣＲによって、短い画線培養をｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＵＲＡ３についてスクリーニングし、５’外向きＵＲＡ３欠失カセット特異的内部プライマーＮ１２４９（配列番号２５３）を、側面に位置する内向き染色体特異的プライマーＮ１２３９（配列番号２５４）と対合させ、３’外向きＵＲＡ３欠失カセット特異的プライマーＮ１２５０（配列番号２５５）を、側面に位置する内向き染色体特異的プライマーＮ１２４２（配列番号２５６）と対合させた。ＰＮＹ１７３０  ｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＵＲＡ３の陽性のＰＣＲスクリーニングは、それぞれ５９８および７２６ｂｐの５’および３’ＰＣＲ産物をもたらした。
【０３２９】
陽性ＰＮＹ１７３０  ｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＵＲＡ３クローンをＹＰＥ（０．５％エタノール）中で一晩培養し、次にエタノール添加（グルコース無添加）５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーが欠失した分離株を選択した。５’および３’染色体特異的プライマーＮ１２３９およびＮ１２４２を用いて、２４から４８時間後に出現したコロニーをマーカー喪失についてＰＣＲスクリーニングした。ＰＮＹ１７３０  ｙｍｒ２２６ｃΔマーカー喪失の陽性ＰＣＲスクリーニングは、８０１ｂｐのＰＣＲ産物をもたらした。ＰＮＹ１７３０  ｙｍｒ２２６ｃΔ株は、ＰＮＹ１７５８（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ  ｐｄｃ５Δ：：ｋｉｖＤ（ｙ）ｆｒａ２Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６−ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ−ｂｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ  ｙｍｒ２２６ｃΔ）と命名された。
【０３３０】
イソブタノール産生菌ＰＮＹ１７７５の構築
アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）ＤＳＭ１４６６２からのＫ９Ｄ３．ＫＡＲＩ遺伝子を保有するｐＷＺ００９（配列番号１５８）と、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００６１０からのｉｌｖＤ遺伝子を保有するｐＷＺ００１（配列番号１５９）との２つのプラスミドで、ＰＮＹ１７５８を形質転換した。ＰＮＹ１７７５のコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して、プラスミドｐＷＺ００９およびｐＷＺ００１で同時形質転換した。形質転換細胞をウラシルおよびヒスチジン欠損０．５％エタノール添加（グルコース無添加）合成完全培地上に、３０℃で播種した。得られた形質転換体は、イソブタノール生成株ＰＮＹ１７７５（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ  ｐｄｃ５Δ：：ｋｉｖＤ（ｙ）ｆｒａ２Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）−ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６−ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ  ｂｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ  ｙｍｒ２２６ｃΔ／ｐＷＺ００９，ｐＷＺ００１）と命名された。
【０３３１】
イソブタノール産生菌ＰＮＹ１７８９の構築
ＰＮＹ１７３０（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ  ｐｄｃ５Δ：：ｋｉｖＤ（ｙ）ｆｒａ２Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）−ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６−ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ  ｂｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ）株を使用して、イソブタノール産生菌ＰＮＹ１７８９を作成した。
【０３３２】
ｐｄｃ５Δ：：ｋｉｖＤ（ｙ）ｗｉｔｈｐｄｃ５Δ：：ｋｉｖＤ．Ｌｇ．ｙの置換
ＰＮＹ１７３０中のｐｄｃ５Δ欠失領域に組み込まれたラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｕｓｓｌａｃｔｉｓ）ｋｉｖＤ（ｙ）コード領域を、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（＝ｋｉｖＤ．Ｌｇ．ｙ）のためにコドン最適化されたリステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）ｋｉｖＤ遺伝子で、相同組換えによって置換した。
【０３３３】
ｋｉｖＤ．Ｌｇ．ｙ組み込みカセット（Ａ−ＫｉｖＤ．Ｌｇ．ｙ−Ｂ−Ｕ−ｃ）は、ＰＤＣ５コード領域の相同性上流（断片Ａ）および下流（断片Ｂ）と、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）からのｋｉｖＤ．Ｌｇ．ｙコード領域、形質転換体の選択のためのプロモーターおよびターミネーター（断片Ｕ）があるＵＲＡ３遺伝子と、ｋｉｖＤ．Ｌｉ．ｙコード領域（断片Ｃ）の３’領域とを含有する。断片Ａは、ｋｉｖＤ．Ｌｉ．ｙの５’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーＴ−Ａ（ＰＤＣ５）（配列番号１９４）とＢ−Ａ（ｋｉｖＤＬｇ）（配列番号２５７）によって、テンプレートとしてのＰＮＹ０８９１ゲノムＤＮＡから増幅した。ｋｉｖＤ．Ｌｉ．ｙコード領域は、断片Ａの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーＴ−ｋｉｖＤＬｇ（Ａ）（配列番号２５９）、および断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有するＢ−ｋｉｖＤＬｇ（Ｂ）（配列番号２６０）によって、ｐＢＰ１７１９（＝ｐＵＣ１９−ｕｒａ３ＭＣＳ−Ｕ（ＰＧＫ１）Ｐｆｂａｉ−ｋｉｖＤ  Ｌｇ（ｙ）−ＡＤＨ１  ＢＡＣ−ｋｉｖＤ。ＬＩ断片Ｃ（配列番号２５８）から増幅した。断片Ｂ−Ｕは、ｋｉｖＤ．Ｌｉ．ｙの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーＴ−Ｂ（ｋｉｖＤＬｇ）（配列番号２６２）、および断片Ｃの５’末端との相同性がある５’テールを含有するｏＢＰ５４６（ｎｅｗ）（配列番号２６３）によって、ｐＢＰ９０４（＝ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３−ｓａｄＢ−ＰＤＣ５断片Ｂ）（配列番号２６１）から増幅した。断片Ｃは、断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ５４７（ｎｅｗ）（配列番号２６４）、およびプライマーｏＢＰ５３９（ｎｅｗ）（配列番号２６５）によって増幅した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって精製した。断片Ａと断片ＫｉｖＤ．Ｌｇ．ｙを混合し、プライマーＴ−Ａ（ＰＤＣ５）およびＢ−ｋｉｖＤＬｇ（Ｂ）で増幅することで、断片Ａ−ＫｉｖＤ．Ｌｇ．ｙをオーバーラップＰＣＲによって作成した。断片Ｂ−Ｕおよび断片Ｃ混合し、プライマーＴ−Ｂ（ｋｉｖＤＬｇ）およびｏＢＰ５３９（ｎｅｗ）で増幅することで、断片Ｂ−Ｕ−ＣをオーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上でゲル精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）がそれに続いた。断片Ａ−ＫｉｖＤ．Ｌｇ．ｙと断片Ｂ−Ｕ−Ｃを混合し、プライマーＴ−Ａ（ＰＤＣ５）およびｏＢＰ５３９（ｎｅｗ）で増幅することで、Ａ−ＫｉｖＤ．Ｌｇ．ｙ−Ｂ−Ｕ−ＣカセットをオーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって精製した。
【０３３４】
コンピテント細胞ｏｆＰＮＹ１７３０を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲカセットＡ−ＫｉｖＤ．Ｌｇ．ｙ−Ｂ−Ｕ−Ｃで形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損０．５％エタノール添加（グルコース無添加）合成完全培地上に、３０℃で播種した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーセットｏＢＰ５４０／ｋｉｖＤＬｇ（５６９Ｒ）およびｋｉｖＤＬｇ（５３０Ｆ）／ｏＢＰ５４１を用いたＰＣＲによって、Ａ−ＫｉｖＤ．Ｌｇ．ｙ−Ｂ−Ｕ−Ｃ組み込みがある形質転換体をスクリーニングした。染色体からＵＲＡ３マーカーを除去するために、正しい各形質転換体をＹＰＥ（０．５％エタノール）中で一晩培養し、エタノール添加（グルコース無添加）５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーが欠失した分離株を選択した。ｋｉｖＤ．Ｌｇ．ｙによるｋｉｖＤ（ｙ）の置換、およびＵＲＡ３マーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｋｉｖＤＬｇ（５６９Ｒ）（配列番号２６６）、ｋｉｖＤＬｇ（５３０Ｆ）（配列番号２６７）、およびｋｉｖＤＬｇ（１１６２Ｆ）（配列番号２６８）を用いたＤＮＡ配列決定によって確認した。正しい単離株は、ＰＮＹ１７８７（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ  ｐｄｃ５Δ：：ｋｉｖＤ．Ｌｇ．ｙ  ｆｒａ２Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ｉｌｖＤ．ｙ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６−ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ  ｂｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ）と命名された。
【０３３５】
ＨＩＳ３＋復元
欠失させたＨＩＳ３コード配列を、ＨＩＳ３コード領域と上流および下流相同性とを含有するＰＣＲカセットを用いた相同組換えによって、ＰＮＹ１７８７株中で復元させた。
【０３３６】
プライマーＴ−ＨＩＳ３（ｕｐ３００）（配列番号２６９）およびプライマーＢ−ＨＩＳ３（ｄｏｗｎ２７３）（配列番号２７０）によって、テンプレートとしてのＰＮＹ８９１ゲノムＤＮＡから、ＨＩＳ３コード領域と側面に位置する上流および下流領域とを含有するＨＩＳ３コーディングＰＣＲカセットを増幅した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上でゲル精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）がそれに続いた。ＰＮＹ１７７３のコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して、ＨＩＳ３＋ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物をヒスチジン欠損０．５％エタノール添加（グルコース無添加）合成完全培地上に、３０℃で播種した。ヒスチジン欠損０．５％エタノール添加（グルコース無添加）合成完全培地上での成長について、ＨＩＳ３＋組み込みがある形質転換体をスクリーニングし、プライマーセットＴ−ＨＩＳ３（ｕｐ３００）およびプライマーＢ−ＨＩＳ３（ｄｏｗｎ２７３）を用いたコロニーＰＣＲによって確認した。正しい単離株は、ＰＮＹ１７８８（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ  ｐｄｃ５Δ：：ｋｉｖＤ．Ｌｇ．ｙ  ｆｒａ２Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ｉｌｖＤ．ｙ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６−ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ  ｂｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ）と命名された。
【０３３７】
ＰＮＹ１７８８は、アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）ＤＳＭ１４６６２からのＫ９Ｄ３．ＫＡＲＩ遺伝子と、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００６１０からのｉｌｖＤ遺伝子とを保有するプラスミドｐＮＺ００１（配列番号２７１）で形質転換した。ＰＮＹ１７８８のコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して、プラスミドｐＮＺ００１で同時形質転換した。形質転換細胞をウラシル欠損０．５％エタノール添加（グルコース無添加）合成完全培地上に、３０℃で播種した。得られた形質転換体は、イソブタノール生成株ＰＮＹ１７８９（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ  ｐｄｃ５Δ：：ｋｉｖＤ（ｙ）ｆｒａ２Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）−ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６−ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ  ｂｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ  ／  ｐＮＺ００１）と命名された。
【０３３８】
実施例３
ＰＤＥ１欠失があるイソブタノール産生菌の構築
ＰＮＹ０１７５８中の内在性ＰＤＥ１コード領域を欠失させるために、ＵＲＡ３マーカー除去のための縮重ｌｏｘＰ７１およびｌｏｘＰ６６部位で挟まれたＵＲＡ３ｐ−ＵＲＡ３−ＵＲＡ３ｔカセットを含有するｐＬＡ５９（配列番号１５０）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と、プライマーＰＤＥ１ＦＵ  Ｒ  Ａ３（配列番号１５１）およびＰＤＥ１  Ｒ  ＵＲＡ３（配列番号１５２）とを使用して実施した。標準遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ０１７５８に形質転換し、５ｇ／Ｌのエタノール添加合成完全培地（１×アミノ酸無添加酵母窒素原礎培地、１×ウラシル欠損アミノ酸混合物）上において３０℃で選択した。プライマーＵＲＡＩＲおよびＰＤＥ１Ｆ（配列番号１５３および１５４）を用いたコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、組み込みカセットと、プライマーＵＲＡＩＦおよびＰＤＥ１Ｒ（配列番号１５５および１５６）との存在を確認した。カセットのＵＲＡ３マーカーを除去するために、細胞をｐＲＳ４２３：：ＧＡＬ１ｐ−ｃｒｅ（配列番号１４７）で形質転換して、５ｇ／Ｌのエタノール添加合成完全培地（１×アミノ酸無添加酵母窒素原礎培地、１×ヒスチジン欠損アミノ酸混合物）上で、形質転換体を３０℃で選択した。０．５％ガラクトース添加酵母抽出物＋ペプトン（ＹＰ）寒天プレート上に形質転換体を播種して、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現を誘導した。ウラシル欠損５ｇ／Ｌのエタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。欠失およびマーカー除去はまた、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で調製されたゲノムＤＮＡを使用した、プライマーＰＤＥ１ＦおよびＰＤＥ１Ｒ（配列番号１５４および１５６）を用いた、ＰＣＲおよび配列決定によっても確認された。得られたＰＮＹ０１７５８のＰＤＥ１欠失株は、ＰＮＹ０３０４０（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ  ｐｄｃ５Δ：：ｋｉｖＤ（ｙ）ｆｒａ２Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６−ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ  ｂｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ  ｙｍｒ２２６ｃΔ  ＰＤＥ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６）と命名された。
【０３３９】
イソブタノール産生菌ＰＮＹ０１７５９およびＰＮＹ０３０４１の構築
アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）ＤＳＭ１４６６２からのＫ９Ｄ３．ＫＡＲＩ遺伝子を保有して、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００６１０からのｉｌｖＤ遺伝子を保有するプラスミドｐＫ９Ｄ３．ＯＬＥ１ｐ．ＩｌｖＤ（配列番号１５７）で、ＰＮＹ０１７５８およびＰＮＹ０３０４０を形質転換した。ＰＮＹ０１７５８およびＰＮＹ０３０４０のコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して、プラスミドｐＫ９Ｄ３．ＯＬＥ１ｐ．ＩｌｖＤ（配列番号１５７）で形質転換した。形質転換細胞をウラシル欠損０．５％エタノール添加（グルコース無添加）合成完全培地上に、３０℃で播種した。得られた形質転換体は、イソブタノール生成株ＰＮＹ０１７５９（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ  ｐｄｃ５Δ：：ｋｉｖＤ（ｙ）ｆｒａ２Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６−ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ  ｂｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈ  ｙｍｒ２２６ｃΔ／ｐＫ９Ｄ３．ＯＬＥ１ｐ．ＩｌｖＤ）ａｎｄ  ＰＮＹ０３０４１（＝ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ  ｐｄｃ５Δ：：ｋｉｖＤ（ｙ）ｆｒａ２Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ｉｌｖＤ（ｙ）ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６−ＦＢＡ１ｐ−ａｌｓＳ  ｂｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ−ｉｌｖＤ−ＩＬＶ５ｐ−ａｄｈｙｍｒ２２６ｃΔＰＤＥ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６／  ｐＫ９Ｄ３．ＯＬＥ１ｐ．ＩｌｖＤ）と命名された。
【０３４０】
１２５ｍＬ通気フラスコ内において、２ｇ／Ｌのスクロースおよび５ｇ／Ｌのエタノールが添加された、合成培地（１×アミノ酸非含有酵母窒素原礎培地およびウラシル非含有酵母合成ドロップアウト培地補給剤）中で、イソブタノール産生菌ＰＮＹ０１７５９およびＰＮＹ０３０４１を培養した。細胞を２５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で一晩培養した。ＰＮＹ０３０４１の２つの独立したコロニー、すなわち３０４１＃５および３０４１＃１８を、ウラシル欠損５ｇ／Ｌのエタノール添加（グルコース無添加）および２ｇ／Ｌのスクロース添加合成完全培地上において３０℃で純化して、引き続く実験で使用した。
【０３４１】
実施例４
スクロース加水分解に対するＰＤＥ１欠失の影響
細胞をＹＰＤプレート（１０ｇ／Ｌのペプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、および２０ｇ／Ｌのグルコース）上において３０℃で２４時間培養した。２０ｍＬの２０ｇ／Ｌのグルコース含有合成完全培地（ＳＣ）（１×アミノ酸なしの酵母窒素原礎培地、１×ウラシルおよびヒスチジン添加アミノ酸混合物）中に、（プレートからの）白金時１杯のＰＮＹ０１５００細胞またはＰＮＹ０３００１（ＰＤＥ１Δ）細胞を接種して、３０℃で２４時間培養した。細胞を遠心分離して、４３〜４４ｇ／Ｌのスクロースを含有するＳＣ培地に再懸濁した。細胞の光学濃度を１０（ＯＤ６００）に調節し、試験管を３０℃および２２０ｒｐｍでインキュベートした。サンプル（１０ｍＬ容積）を５０ｍＬねじ蓋管に入れた。接種の２、６、および８時間後に、各ねじ蓋管からおよそ０．５ｍＬのサンプルを取り出して遠心分離し、残留糖含有量の分析前に濾過滅菌した。ＹＳＩ  ２３００  ＳＴＡＴ添加（商標）Ｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  Ｌａｃｔａｔｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＹＳＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｏｈｉｏ）を使用して、培地の残留スクロースおよびグルコース含有量を推定した。
【０３４２】
スクロースを炭素源として含有する合成完全培地中で培養した、ＰＮＹ０１５００およびＰＮＹ０３００１（ＰＤＥ１Δ）の残留糖含有量は、表６に示される。ＰＮＹ０１５００細胞およびＰＮＹ０３００１細胞は、ＳＣ培地中で、同様のスクロース加水分解および糖消費パターンを示した。ＰＤＥ１の欠失は、スクロース加水分解および糖消費に悪影響を与えなかった。
【０３４３】
【表８】
2015503350.tif 000010
【０３４４】
実施例５
イソブタノール存在下におけるスクロース加水分解
２０ｇ／Ｌのグルコースを含む２０ｍＬのＳＣ培地（１×アミノ酸なしの酵母窒素原礎培地、１×ウラシルおよびヒスチジン添加アミノ酸混合物）中に、プレートからの白金時１杯のＰＮＹ０１５００細胞またはＰＮＹ０３００１（ＰＤＥ１Δ）細胞を接種して、３０℃で２４時間培養した。細胞を遠心分離して、４３〜４４ｇ／Ｌのスクロースと１５ｇ／Ｌのイソブタノールとを含有するＳＣ培地に再懸濁した。細胞の光学濃度を１０（ＯＤ６００）に調節して、試験管を３０℃および２２０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。サンプル（１０ｍＬ容積）を５０ｍＬねじ蓋管に入れた。接種０時間目および３および５時間後に、各ねじ蓋管からおよそ０．５ｍＬのサンプルを採取した。残留糖含有量分析前に、サンプルを遠心分離して濾過滅菌した。ＨＰＸ  ８７Ｎ  Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）カラム、３００×７．８ｍｍ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用したＨＰＬＣ（１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）によって、残留スクロース、グルコース、フルクトース、およびエタノール含量を推定した。
【０３４５】
スクロースおよびイソブタノールを炭素源として含有する合成完全培地中で培養したＰＮＹ０１５００およびＰＮＹ０３００１（ＰＤＥ１Δ）の残留糖含有量は、表７に示される。１５ｇ／Ｌのイソブタノールを含有する合成完全培地中のＰＮＹ０１５００と、ＰＮＹ０３００１のスクロース加水分解速度を比較した。ＰＮＹ０１５００細胞およびＰＮＹ０３００１細胞は、１５ｇ／Ｌのイソブタノールを含有する中ＳＣ培地で、スクロース加水分解および糖消費の異なるパターンを示した。ＰＮＹ０３００１細胞は、ＰＮＹ０１５００よりも迅速な速度でスクロースを加水分解した。５時間の培養後に、ＰＮＹ０３００１は、加水分解糖類もまた消費して、ＰＮＹ０１５００と比較して、５０％より多くのエタノールを生成した。ＰＤＥ１欠失は、イソブタノール存在下で、スクロース加水分解および糖代謝に良い影響を与えた。ＰＤＥ１欠失は、発酵能力を改善したようである。
【０３４６】
【表９】
2015503350.tif 000011
【０３４７】
実施例６
ＰＤＥ１ノックアウト株中のスクロース加水分解およびイソブタノール力価
ＰＮＹ０１７５９およびＰＮＹ０３０４１細胞（３０４１＃５および３０４１＃１８）を実施例５に記載されるように培養して、２５℃および３０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって細胞を沈殿させ、上清を廃棄した。
【０３４８】
生産期
５０ｍＬねじ蓋管内の生産培地（ＰＭ）（表８および９）を使用して、細胞を１０（ＯＤ６００）、約７〜８ｇ／Ｌの乾燥細胞重量に希釈した。０．２２μｍ濾紙を使用して、使用前に培地を濾過滅菌した。ねじ蓋管を３０℃および２００ｒｐｍで２０時間撹拌し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。生成した残留スクロースおよびイソブタノールのＨＰＬＣによる分析のために、サンプルを保存した。次に細胞ペレットを酸洗浄した。
【０３４９】
【表１０】
2015503350.tif 000012
【０３５０】
【表１１】
2015503350.tif 000013
【０３５１】
酸洗浄期
細胞ペレットを１０ｍＬの酸洗浄培地（ＡＷＭ）、ｐＨ２に再懸濁して（表１０）、２００ｒｐｍおよび３０℃で１２０分間撹拌した。
【０３５２】
【表１２】
2015503350.tif 000014
【０３５３】
細胞再循環
酸洗浄期後、３０００ｒｐｍで４分間の遠心分離によって細胞を収集し；上清を廃棄して、１０ｍＬの新鮮ＰＭを細胞に添加した。細胞を培養して、ＨＰＬＣのためにサンプルを収集して、残留スクロース含有量を測定した。各生産期後、細胞を酸洗浄し、次に細胞を再循環させた。
【０３５４】
ＰＭ中で２０時間の培養後の培養物中の残留スクロースの定量化は、細胞の酸洗浄後に、ＰＮＹ０１７５９内でスクロース分解が徐々に低下したことを示した（表１１）。ＰＮＹ０３０４１（ＰＤＥ１Δ）は、スクロースを効率的に加水分解し、細胞の３回の酸洗浄後に、スクロース蓄積はなかった。培養物の残留スクロース含有量は、２回目および３回目の酸洗浄後に増大した。ＰＮＹ０３４１細胞は、ＰＮＹ０１７５９と比較して、細胞の酸洗浄後により多くのイソブタノールを生成した（表１２）。これらの結果は、ＰＤＥ１欠失がスクロース加水分解を改善し、イソブタノール産生菌のイソブタノール力価を改善することを示す。
【０３５５】
【表１３】
2015503350.tif 000015
【０３５６】
【表１４】
2015503350.tif 000016
【０３５７】
実施例７
酸洗浄後のＰＤＥ１ノックアウトの細胞生存度
１２５ｍＬ通気フラスコ内において、２ｇ／Ｌのスクロースおよび５ｇ／Ｌのエタノールが添加された、合成培地（１×アミノ酸非含有酵母窒素原礎培地およびウラシル非含有酵母合成ドロップアウト培地）中で、イソブタノール産生菌株ＰＮＹ０１７５９およびＰＮＹ０３０４１（ＰＤＥ１Δ）を培養した。細胞を２５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で一晩培養した。３０００ｒｐｍおよび２５℃で５分間の遠心分離によって細胞を沈殿させて、上清を廃棄し、初期ＯＤ６００２０で細胞をＣＰＭに再懸濁した。実施例６に記載されるように、細胞を厳密な酸洗浄期および生産期の対象とした。生細胞数（ＣＦＵ／ｍＬ）アッセイのために、酸洗浄期の終わりにサンプルを１回取り出した。この目的で、０．１ｍＬの培養物を、１×酵母窒素原礎培地中で１０−７に希釈して、ウラシルが欠損し炭素源として５ｇ／Ｌのエタノールを添加した合成完全培地の寒天プレート上に、０．００５ｍＬの希釈培養物をスポットした。３０℃で４８〜７２時間のプレート培養後、コロニーを計数した後に、１ｍＬの培養物あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を計算した。
【０３５８】
３回の酸洗浄後に、ＰＮＹ０１７５９の生細胞数が４×１０２に低下したのに対し、３回の酸洗浄後のＰＮＹ０３０４１の生細胞数は、６．５×１０４であった（表１３）。イソブタノール産生菌中のＰＤＥ１遺伝子ノックアウトは、細胞の酸洗浄後細胞生存度を改善した。
【０３５９】
【表１５】
2015503350.tif 000017
【０３６０】
実施例８
合成培地中におけるＰＤＥ１ノックアウトの成長速度
１２５ｍＬ通気フラスコ内において、２ｇ／Ｌのスクロースおよび５ｇ／Ｌのエタノール添加合成完全培地（１×アミノ酸非含有酵母窒素原礎培地およびウラシル非含有酵母合成ドロップアウト培地）中に、０．５の初期ＯＤ６００で、ＰＮＹ０３０４１（ＰＤＥ１Δ）およびＰＮＹ０１７５９細胞を接種した。フラスコを２２０ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で２４時間培養した。サンプルを２時間間隔で採取して、光学濃度に基づいて成長速度を計算した。ＰＤＥ１ノックアウトＰＮＹ０３０４１の成長速度（μ）は、ＰＮＹ０１７５９と比較してより大きかった。ＰＮＹ０３０４１の成長速度は０．２であり、ＰＮＹ０１７５９の成長速度は０．１２であった。富栄養培地ＹＰＥ（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのペプトン、および５ｇ／Ｌのエタノール）中において、ＰＮＹ０３０４１およびＰＮＹ０１７５９は、同様の成長速度（０．２７〜０．２８）を有した。
【０３６１】
実施例９
ＰＤＥ１ノックアウトのイソブタノール耐性
１２５ｍＬ通気フラスコ内において、２ｇ／Ｌのスクロースおよび５ｇ／Ｌのエタノール添加合成完全培地（１×アミノ酸非含有酵母窒素原礎培地およびウラシル非含有酵母合成ドロップアウト培地）中に、０．５の初期ＯＤ６００で、ＰＮＹ０３０４１（ＰＤＥ１Δ）およびＰＮＹ０１７５９細胞を接種した。フラスコを２２０ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で２４時間培養した。遠心分離によって細胞を回収して、３０ｇ／Ｌのイソブタノールを添加した同一培地で、２０（ＯＤ６００）に懸濁した。細胞を２００ｒｐｍで撹拌しながら、１１時間培養した。炭素源としてエタノールを添加した合成完全培地中で、０時間および１１時間目に生菌数を数えた。この目的で、培養を１×酵母窒素原礎培地で１０−７に希釈し、０．００５ｍＬの希釈細胞懸濁液を寒天プレート上にスポットした。プレートを３０℃で４８〜７２時間培養し、プレート上のコロニー計数後、ＣＦＵ／ｍＬを計算した。
【０３６２】
結果は、表１４に示される。３０ｇ／Ｌのイソブタノールを含有する培地中では、ＰＮＹ０１７５９と比較して、ＰＮＹ０３０４１中で細胞死が低下した。ＰＤＥ１欠失が、イソブタノール耐性を改善したと結論付けてもよい。
【０３６３】
【表１６】
2015503350.tif 000018
【０３６４】
実施例１０
細胞再循環
５ｇ／Ｌのエタノールを炭素源として含有する、合成完全培地プレート（１×アミノ酸非含有酵母窒素原礎培地、１×ヒスチジンおよびウラシル非含有アミノ酸ドロップアウト、１％ｗ／ｖ寒天）上に、ＰＮＹ０１７７５細胞をグリセロール保存株から画線塗抹した。３０℃で４８時間の培養後、１２５ｍＬフラスコ内で、炭素源として２ｇ／Ｌのスクロースおよび５ｇ／Ｌのエタノールを含有する２０ｍＬの合成完全液体培地に、プレートからの細胞パッチを接種した。振盪機内において細胞を２００ｒｐｍで撹拌しながら、３０℃で２４時間培養した（Ｉｎｎｏｖａ  ４４Ｒ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＴ，ＵＳＡ）。この培養を使用して、５００ｍＬの成長培地ＣＩＧ＃２に接種した（表１５）。
【０３６５】
【表１７】
2015503350.tif 000019
【０３６６】
培養は、０．３〜０．５の初期ＯＤ６００で、５００ｍＬフラスコ中の１００ｍＬの培地中で培養し、３０℃および２００ｒｐｍで培養した。２４時間後、４０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって細胞を収集し、再循環および生産培地ＣＲＰ＃２培地（表１６）中で、１０の初期ＯＤ６００に再懸濁した。
【０３６７】
【表１８】
2015503350.tif 000020
【０３６８】
生産期は、１０ｍＬの生産培地、および５ｍＬの高圧蒸気滅菌抽出剤Ｉｓｏｆｏｌ（登録商標）１６（Ｓａｓｏｌ  Ｏｌｅｆｉｎｓ  ＆  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）または抽出剤混合物Ｉｓｏｆｏｌ（登録商標）１６＋トリオクチル酸化ホスフィン（ＴＯＰＯ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含有する、５０ｍＬねじ蓋管内で実施された。抽出剤混合物（Ｉｓｏｆｏｌ（登録商標）１６＋ＴＯＰＯ）は、５０ｇのＴＯＰＯを４０ｍＬの高圧蒸気滅Ｉｓｏｆｏｌ（登録商標）１６中に緩慢に溶解することで調製された。０時間目（Ｔ＝０ｈ）のためのサンプルは、生産培地と抽出剤を添加した直後に回収した。０時間試料採取中の細胞損失を回避するために、試料採取に先だって、ねじ蓋管を４０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。各期（水性ならびに有機抽出期）から、１ミリリットルのサンプルを採取した。ねじ蓋管をチューブホルダ内で４５°の角度に傾けて、１６０ｒｐｍで撹拌しながら３０℃でインキュベートした。７時間のインキュベーション後、サンプルを４０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、各期から１ｍＬのサンプルを採取した。全てのサンプルは、ＨＰＸ  ８７Ｎ  Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）カラム、３００×７．８ｍｍ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用したＨＰＬＣ（１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）と、ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ、および０．２５μｍのフィルム、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用したガスクロマトグラフィー（７８９０Ａ  ＧＣ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）とによって、糖類および代謝産物をさらに分析するまで、−８０℃で保存した。生産培地（ＣＲＰ＃２）中での７時間の培養を生産期と見なした。各生産期後、細胞を遠心分離によって収集し、酸洗浄した。
【０３６９】
酸洗浄では、細胞を４０００ｒｐｍでの遠心分離によって収集し、１ｍＬの酸洗浄培地（硫酸を使用してｐＨ２に調節されたＣＲＰ＃２培地）に再懸濁して、ボルテックスによって混合した。ねじ蓋管をで４５°の角度に傾けて、底への細胞沈降を妨げ、３０℃および２００ｒｐｍで１時間培養した。この時期を酸洗浄期と見なした。酸洗浄細胞は、イソブタノール生産のために使用された（細胞再循環、Ｒ）。
【０３７０】
細胞再循環のために、各酸洗浄期後に４０００ｒｐｍでの遠心分離によって、細胞を収集し、１０ｍＬの新鮮生産培地（ＣＲＰ＃２）および５ｍＬの高圧蒸気滅菌抽出剤に再懸濁した。
【０３７１】
ＰＮＹ１７７５は、抽出剤Ｉｓｏｆｏｌ（登録商標）１６（表１７）の存在下、またはＩｓｏｆｏｌ（登録商標）１６およびＴＯＰＯ（表１８）の混合物の存在下で、酸洗浄ありまたはなしで再循環された。Ｒ−０、Ｒ−１、などは細胞が受けた再循環回数を指す。酸洗浄不在下では、再循環７回後に、３つのパラメータ（イソブタノール力価、糖総消費量、および糖比取り込み速度）の漸進的低下が観察された。試験条件下では、酸洗浄存在下において、再循環３回後に、イソブタノール力価、糖総消費量、および糖比取り込み速度の低下が観察された。サイクル６の終了時、酸洗浄細胞は、対照の４０％の糖消費速度を有した。結果は、抽出剤Ｉｓｏｆｏｌ（登録商標）１６または抽出剤混合物Ｉｓｏｆｏｌ（登録商標）１６＋ＴＯＰＯが、酸洗浄なしのイソブタノール生成に悪影響を及ぼさないことを示した。
【０３７２】
【表１９】
2015503350.tif 000021
【０３７３】
【表２０】
2015503350.tif 000022
【０３７４】
実施例１１
再生
本実施例は、イソブタノール産生菌ＰＮＹ１７７５中における、糖消費速度およびイソブタノール生成の復元を実証する。再循環７回目の酸洗浄期の終わりに、Ｉｓｏｆｏｌ（登録商標）１６の存在下で、細胞を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペレットを除去せずに、培地を注意深く除去し、５ｍＬのＣＩＧ＃２培地を添加した。細胞を２００ｒｐｍおよび３０℃で４時間培養した。富栄養培地によるこの細胞処理は、再生期と称される。再生期後、細胞を上記のように再度遠心分離して、ペレットを新鮮生産培地（ＣＲＰ＃２）に再懸濁した。
【０３７５】
イソブタノール産生菌ＰＮＹ０１７７５に対する再生の効果は、表１９に示される。再生後、イソブタノール産生菌は、０．５２ｇ／ｇ／ｈの糖消費速度を有し、それは再生されなかった細胞と比較して５倍高かった。さらに、糖消費速度は、次の２サイクルにわたり、０．９２ｇ／ｇ／ｈの速度に回復した。
【０３７６】
【表２１】
2015503350.tif 000023
【０３７７】
実施例１２
細胞再循環および再生
本実施例は、イソブタノール産生菌ＰＮＹ１７８９中のイソブタノール力価、残留糖、および糖比取り込み速度に対する、再循環および再生の影響を記載する。５ｇ／Ｌのエタノールを炭素源として含有する、合成完全培地プレート（１×アミノ酸非含有酵母窒素原礎培地、１×ヒスチジンおよびウラシル非含有アミノ酸ドロップアウト、１％ｗ／ｖ寒天）上に、ＰＮＹ０１７８９細胞をグリセロール保存株から画線塗抹した。３０℃で４８時間の培養後、１２５ｍＬフラスコ内において、炭素源として２ｇ／Ｌのスクロースおよび５ｇ／Ｌのエタノールを含有する２０ｍＬの合成完全液体培地に、プレートからの細胞パッチを接種した。細胞を２００ｒｐｍで撹拌しながら、３０℃で２４時間培養したこの培養を使用して、５００ｍＬの成長培地ＣＩＧ＃２に接種した。この段階では、培養は、０．３〜０．５の初期ＯＤ６００で、５００ｍＬフラスコ中の１００ｍＬの培地中で培養し、３０℃および２００ｒｐｍで培養した。２４時間後、４０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって細胞を収集し、再循環および生産培地（ＣＲＰ＃２）中で、初期ＯＤ６００１０に再懸濁した。生産期は、１０ｍＬの生産培地および抽出剤としての５ｍＬの高圧蒸気滅菌Ｉｓｏｆｏｌ（登録商標）１６を含有する、５０ｍＬねじ蓋管内で実施された。０時間目（Ｔ＝０ｈ）のためのサンプルは、生産培地と抽出剤を添加した直後に回収した。０時間試料採取中の細胞損失を回避するために、試料採取に先だって、ねじ蓋管を４０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。各期（水性ならびに有機抽出期）から、１ミリリットル（１ｍＬ）のサンプルを採取した。ねじ蓋管をチューブホルダ内で４５°の角度に傾けて、１６０ｒｐｍで撹拌しながら３０℃でインキュベートした。１０時間のインキュベーション後、サンプルを４０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、各期から１ｍＬのサンプルを採取した。全てのサンプルは、ＨＰＸ  ８７Ｎ  Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）カラム、３００×７．８ｍｍ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用したＨＰＬＣ（１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）と、ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ、および０．２５μｍのフィルム、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用したガスクロマトグラフィー（７８９０Ａ  ＧＣ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）とによって、糖類および代謝産物をさらに分析するまで、−８０℃で保存した。生産培地（ＣＲＰ＃２）中での７時間の培養を生産期と見なした。各生産期後、細胞を遠心分離によって収集し、酸洗浄した。
【０３７８】
酸洗浄では、細胞を４０００ｒｐｍでの遠心分離によって収集し、１ｍＬの酸洗浄培地（硫酸を使用してｐＨ２に調節されたＣＲＰ＃２培地）に再懸濁して、ボルテックスによって混合した。ねじ蓋管を４５°の角度に傾けて、底への細胞沈降を妨げ、３０℃および２００ｒｐｍで１時間培養した。この時期を酸洗浄期と見なした。酸洗浄細胞は、イソブタノール生産のために使用された（細胞再循環、Ｒ）。
【０３７９】
細胞再循環のために、各酸洗浄期後に４０００ｒｐｍでの遠心分離によって、細胞を収集し、１０ｍＬ新鮮生産培地（ＣＲＰ＃２）および５ｍＬのＩｓｏｆｏｌ（登録商標）１６に再懸濁した。
【０３８０】
再生のために、酸洗浄期の再循環７回目の終了時に、細胞を４０００×ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペレットを除去せずに、培地を注意深く除去し、５ｍＬのＣＩＧ＃２培地を添加した。細胞を２００ｒｐｍおよび３０℃で４時間培養した。再生期後、細胞を上記のように再度遠心分離して、ペレットを新鮮生産培地（ＣＲＰ＃２）に再懸濁した。
【０３８１】
ＰＮＹ１７８９を酸洗浄ありで、Ｉｓｏｆｏｌ（登録商標）１６の存在で再循環した。結果は、表２０に示される。酸洗浄存在下において、再循環３回後に、イソブタノール力価、糖総消費量、および糖比取り込み速度の低下が観察された。酸洗浄のサイクル７の終了時に、細胞は、糖消費量速度に、サイクル１と比較して＞３０％の低下を有した。サイクル７後の再生は、後続のサイクルにおける糖消費速度を２倍以上改善した。
【０３８２】
【表２２】
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【０３８３】
実施例１３
酸洗浄
１２５ｍＬ通気フラスコ内において、７６ｍｇ／Ｌのトリプトファン、３８０ｍｇ／Ｌのロイシン、１００ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０、０．２％スクロース、および０．５％エタノールを添加した合成培地（アミノ酸非含有酵母窒素原礎培地およびウラシル、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンなしの酵母合成ドロップアウト培地補給剤）中で、イソブタノール産生菌株ＰＮＹ１７７５を培養した。細胞を２５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で一晩培養した。一晩培養物を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１ｍＬのＣＩＧ＃２培地に再懸濁して、１２５ｍＬ通気フラスコ内の５０ｍＬのＣＩＧ＃２培地に接種した。振盪機（Ｉｎｎｏｖａ  ４４Ｒ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＴ，ＵＳＡ）内で２５０ｒｐｍ振盪しながら、細胞を３０℃で一晩培養した。一晩培養物を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、１ｍＬＣＲＰ＃２培地に再懸濁し、１５ｍＬ円錐管内の９ｍＬのＣＲＰ＃２培地に接種して、栓をしてローラードラム内において３０℃で培養した。２４時間後、参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書に記載されるようにして、培養上清（Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルターユニット、Ｃｏｓｔａｒカタログ番号８１６９を使用して収集された）をＨＰＬＣによって分析した。イソブタノール力価（ｇ／Ｌ）は、６．７６＋０．２３（ｎ＝２）であった。
【０３８４】
ＰＮＹ１７７５株を新鮮ＳＥ−Ｈｉｓ−Ｕｒａ（１％エタノール）プレート上に画線塗抹して、３０℃でおよそ４８時間培養した。細胞をプレートから取り出し、無菌微量遠心管内の１ｍＬのＳＥ−Ｈｉｓ−Ｕｒａ（１％エタノール）培地に再懸濁して、ボルテックスして均一懸濁液とした。次に細胞を通気栓付き１２５ｍＬ無菌フラスコ（二重反復試験フラスコ）内の２５ｍＬＳＥ−Ｈｉｓ−Ｕｒａ培地中に接種して、１２０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で培養した。培養物の初期ＯＤ６００は、約０．５であった。２０時間の培養後、ＯＤ６００は３．３に達した。培養を２本の５０ｍＬ遠心管内において、４５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄して、細胞を５００ｍＬのＣＩＧ＃２培地に再懸濁し、それぞれ１２５ｍＬの培養物を含有する４本の５００ｍＬフラスコに、初期ＯＤ６００約０．５で分配した。２２時間の培養後、各培養物のＯＤ６００が測定されて、３．２３〜３．６２の範囲であった。２つの培養物が遠心分離されてプールされ、８０ｍＬのＣＲＰ＃２に再懸濁されて、培養物のＯＤは１０．０２（６ｇｄｃｗ／Ｌ）であった。
【０３８５】
この培養物の１０ミリリットル（１０ｍＬ）をそれぞれ６本の１５ｍＬ円錐ねじ蓋遠心管にピペットで移し、培養物を回転ドラム内で３０℃で培養した。これによって、対照および酸洗浄処理の双方のための三重反復試験サンプルを作成した。
【０３８６】
生産期のために、ねじ蓋管を７時間培養した。７時間の終わりに、ねじ蓋管を遠心分離して、上清を収集して、ＨＰＬＣ分析のために一部を濾過した。全ての上清は、４℃で保存した。次にねじ蓋管に栓をして、対照サンプルペレットを室温に１時間置いた。酸洗浄サンプルペレットをそれぞれ１ｍＬの酸洗浄培地に再懸濁した。細胞を再懸濁して、ピペット操作によって穏やかに混合した。次に１２０ｒｐｍで振盪しながら、サンプルを３０℃でおよそ５０分間培養した。酸洗浄培養の終わりに、酸洗浄培養物を４５００ｒｐｍで３分間遠心分離した（ｃｅｎｔｒｉｇｕｇｅｄ）。いかなる細胞も乱さないように、ピペットで酸洗浄上清を注意深く取り出して、上清を廃棄した。
【０３８７】
全ての細胞ペレットを１０ｍＬの新鮮ＣＲＰ＃２に再懸濁した。ねじ蓋管をしっかり閉じて、次に回転ドラム内において３０℃で培養して、生産期を開始した。
【０３８８】
全ての培養上清（Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルターユニット、Ｃｏｓｔａｒカタログ番号８１６９を使用して収集された）は、（米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書に記載されるようにして）ＨＰＬＣによって分析した。スクロース、グルコース、およびフルクトースは、Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）カラム、３００×７．８ｍｍ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、ＨＰＬＣによって分析した。その他の化合物は、Ｓｈｏｄｅｘ（商標）糖カラム、３００ｍｍ長さ×８ｍｍ内径を使用してＨＰＬＣによって分析した。結果は、表２１に示される。
【０３８９】
【表２３】
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【０３９０】
表２１のデータは、２回のサイクル後に、対象および酸洗浄処理培養物の双方で糖利用速度が改善されたことを示した。さらに対象および酸洗浄処理サンプルの双方において、イソブタノールの収率はサイクル１〜１０で同様であった。経路中間体（αＫＩＶ、ＤＨＩＶ、およびイソ酪酸）の濃度は、対象および酸洗浄処理の双方において、様々なサイクルで同様であり、イソブタノール生合成経路酵素が活性であり、低いｐＨへの曝露によって不活性化されなかったことを実証した。
【０３９１】
上の記述から、本発明の目的が達成されたことは、明らかである。特定の実施形態のみが記載されたが、上記の説明から、当業者には代案の実施形態および様々な修正形態が明らかであり、本発明の精神および範囲内である。当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識し、または見極めることができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【０３９２】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、本発明が関係する当業者の技能レベルを示すものであり、あたかも個々の出版物、特許、または特許出願が、あらゆる目的のために参照によって援用されると具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、参照によって本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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