(57)【要約】  本発明は、抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント、それをコードする核酸分子、及びこれらの用途に関するものである。本発明の抗体の変異体は、ＥｒｂＢ２に高い親和度で結合することができる。したがって、抗体の変異体は、少ない量でも癌を効果的に予防または治療することができる。【選択図】図８
2015517486.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）軽鎖可変ドメインと、
（ｂ）次のアミノ酸置換で構成された群から選択された２以上のアミノ酸置換を有する重鎖可変ドメインと、
を含む抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント：
配列番号１のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置４１のＰｒｏがＡｒｇに置換、位置９６のＧｌｙがＡｓｎに置換、位置９７のＧｌｙがＡｌａに置換、位置９８のＡｓｐがＴｒｐに置換、位置９８のＡｓｐがＬｙｓに置換、位置１００ｂのＡｌａがＳｅｒに置換、位置１００ｃのＭｅｔがＰｈｅに置換、位置１０１のＡｓｐがＡｌａに置換、位置１０１のＡｓｐがＶａｌに置換、位置１０２のＴｙｒがＨｉｓに置換、及び位置１０２のＴｙｒがＬｅｕに置換。
【請求項２】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置９８のＡｓｐがＴｒｐに置換、位置１００ｃのＭｅｔがＰｈｅに置換、位置１０１のＡｓｐがＡｌａに置換、及び位置１０２のＴｙｒがＬｅｕに置換を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置９６のＧｌｙがＡｓｎに置換、位置９７のＧｌｙがＡｌａに置換、位置９８のＡｓｐがＬｙｓに置換、位置１００ｂのＡｌａがＳｅｒに置換、位置１００ｃのＭｅｔがＰｈｅに置換、位置１０１のＡｓｐがＶａｌに置換、及び位置１０２のＴｙｒがＨｉｓに置換を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置４１のＰｒｏがＡｒｇに置換、位置９８のＡｓｐがＴｒｐに置換、位置１００ｃのＭｅｔがＰｈｅに置換、位置１０１のＡｓｐがＡｌａに置換、及び位置１０２のＴｙｒがＬｅｕに置換を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列または次のアミノ酸置換で構成された群から選択された２以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする請求項１に記載の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント：
配列番号２のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置５０のＳｅｒがＴｈｒに置換、位置５１のＡｌａがＴｈｒに置換、位置５２のＳｅｒがＴｈｒに置換、位置５３のＰｈｅがＴｒｐに置換、位置５４のＬｅｕがＰｒｏに置換、位置７２のＴｈｒがＳｅｒに置換、位置９１のＨｉｓがＴｙｒに置換、位置９３のＴｈｒがＧｌｎに置換、位置９３のＴｈｒがＡｓｎに置換、位置９６のＰｒｏがＡｌａに置換、位置９６のＰｒｏがＶａｌに置換、及び位置９７のＴｈｒがＳｅｒに置換。
【請求項６】
前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置９３のＴｈｒがＧｌｎに置換、位置９６のＰｒｏがＡｌａに置換、及び位置９７のＴｈｒがＳｅｒに置換を含むことを特徴とする請求項５に記載の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置５０のＳｅｒがＴｈｒに置換、位置５１のＡｌａがＴｈｒに置換、位置５２のＳｅｒがＴｈｒに置換、位置５３のＰｈｅがＴｒｐに置換、位置５４のＬｅｕがＰｒｏに置換、位置７２のＴｈｒがＳｅｒに置換、位置９１のＨｉｓがＴｙｒに置換、位置９３のＴｈｒがＡｓｎに置換、及び位置９６のＰｒｏがＶａｌに置換を含むことを特徴とする請求項５に記載の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
前記抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントは、次の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン及び配列番号３のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン及び配列番号４のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン及び配列番号３のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン；または
（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン及び配列番号６のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン。
【請求項９】
前記抗体は、ヒト化抗体であることを特徴とする請求項１に記載の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載のＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントの重鎖可変ドメインをコードする核酸分子。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれかに記載のＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントの軽鎖可変ドメインをコードする核酸分子。
【請求項１２】
（ａ）請求項１から９のいずれかに記載のＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントの薬剤学的有効量と、
（ｂ）薬剤学的に許容される担体と、
を含む癌の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項１３】
前記癌は、乳房癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、膵臓癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、大腸癌、及び甲状腺癌で構成された群から選択された癌であることを特徴とする請求項１２に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１４】
（ａ）請求項１から９のいずれかに記載のＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントと、
（ｂ）薬剤学的に許容される担体と、
を含む薬剤学的組成物を治療学的有効量で個体に投与する段階を含む癌の予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント、それをコードする核酸分子、及びこれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）は、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）のような受容体型チロシンキナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）の一種であって、細胞膜に存在し、細胞の成長、分化及び生存に重要な役割を行うものと知られている（非特許文献１）。ＨＥＲ２は、他のＨＥＲファミリータンパク質と異なって、リガンドに依存的に活性化されず、常に活性化された状態で作用し、通常、正常細胞では、細胞膜に約２０，０００個程度発現されるが、癌細胞では、その１００倍である約２０，０００，０００個程度が過発現されると知られている（非特許文献２）。このようなＨＥＲ２の過発現は、ＨＥＲ２−ＨＥＲ２ホモダイマー（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）だけではなく、他のＨＥＲファミリーであるＨＥＲ１またはＨＥＲ３とのヘテロダイマー（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を過度に誘導し、その結果、細胞の増殖及び成長を誘発することによって、癌細胞への変形を促進する（非特許文献３）。
【０００３】
今まで、乳房癌（２５〜３０％）、卵巣癌（１５〜３０％）、胃癌（２３％）、肺癌（１１〜３２％）、腎臓癌（３０〜４０％）、直腸癌（１７〜９０％）、膵臓癌（２６〜４５％）、膀胱癌（４４％）、前立腺癌（１２％）、及び頭頸部癌（２９〜３９％）など多様な癌細胞でＨＥＲ２の過発現が報告された（非特許文献４〜１３）。また、ＨＥＲ２の過発現は、子宮内膜癌、唾液腺癌、結腸癌、及び甲状腺癌で観察された（非特許文献１４〜２７）。
【０００４】
ＨＥＲ２を標的とする抗癌治療剤は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈで開発して１９９８年から販売されたハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、４Ｄ５）が唯一であり、その適応症は、ＨＥＲ２が過発現された転移性乳房癌または早期乳房癌に他の抗癌剤と共に併用投与するものである（非特許文献２８）。ハーセプチンは、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに作用して、ＨＥＲ２−ＨＥＲ２の間のホモダイマーの生成を抑制させることによって、癌細胞の生存と増殖とを抑制すると知られている（非特許文献２９）。
【０００５】
しかし、ＨＥＲ２標的抗癌治療剤としてハーセプチンの成功にも拘らず、単独投与時に１２〜３４％、併用投与時に３８〜５０％程度の反応効果を表わし、また、単独投与時に２〜７％、併用投与時に１１〜２８％まで非正常な心臓疾患が報告され、女性１０人のうち１人程度は、既に有している心疾患の危険の増加の恐れのために、ハーセプチン薬物治療を受けることができない（非特許文献３０）。したがって、ハーセプチンよりも副作用の少ない後続抗体の開発が要求されており、Ｇｅｎｅｔｅｃｈで開発したＯｍｎｉｔａｒｇが現在臨床３相にある（非特許文献３１）。しかし、Ｏｍｎｉｔａｒｇは、ハーセプチンに比べて、副作用面での長所はあるが、効能が落ちるという短所を有している。このような理由で、新規なＨＥＲ２抗体またはその改善された形態、例えば、親和性または効能などが増加した４Ｄ５抗体の変異体が切実に要求される。
【０００６】
一般的に、抗原に対する高親和度抗体を得ることは、露出される抗原の表面が制限されるので、容易ではない。特に、このような現象は、ｎａｉｖｅファージディスプレイライブラリーからインビトロ選別（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を行う時よりもさらに起こる。したがって、ｎａｉｖｅファージディスプレイライブラリーから一般的に得られる抗体の親和度は、１０〜１００ｎＭレベルに過ぎない（非特許文献３２）。
【０００７】
抗体の親和度を向上させるための戦略は、任意戦略（ｒａｎｄｏｍ  ａｐｐｒｏａｃｈ）と標的化戦略（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ）とに分けて見られる（非特許文献３３）。標的化突然変異誘発（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）は、特定ＣＤＲやＦＲ、すなわち、特定アミノ酸に突然変異を与える戦略で標的化ＰＣＲ（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＰＣＲ）、ＣＤＲワーキング（ＣＤＲ  ｗａｌｋｉｎｇ）、部位特異的突然変異誘導（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、及びＣＤＲターゲットホットスポット（ＣＤＲ  ｔａｒｇｅｔ  ｈｏｔｓｐｏｔ）などの方法を利用できる。任意突然変異誘発（Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）は、可変ドメインに変異を与える戦略でエラー誘発ＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ）、ＤＮＡシャフリング、及びチェーンシャフリングなどの方法を利用できる（非特許文献３４）。このような方法で作った多様な変異体をライブラリーで製作し、ファージ表面に多様な変異体ライブラリーをディスプレイして選別する過程を経る。それ以外にも、イーストディスプレイ及びリボゾームディスプレイを利用する（非特許文献３５〜３６）。
【０００８】
本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊａｃｌｙｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ．８：３８−４９（２００８）
【非特許文献２】Ｓｈｅｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１１７−１２７（１９９１）
【非特許文献３】Ｍａｙｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２：７２４２−７２５１（２００６）
【非特許文献４】Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５３：１６６−１７５（２００４）
【非特許文献５】Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２：４３７７ｓ−４３８３ｓ（２００６）
【非特許文献６】Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９１：１１９５−１１９９（２００４）
【非特許文献７】Ｃａｎｃｅｒ  ９４：２５８４−２５８９（２００２）
【非特許文献８】Ｃａｎｃｅｒ  ９８：６６−７３（２００３）
【非特許文献９】Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：６８１−６８５（２００５）
【非特許文献１０】Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌ  １７：１５−２１（１９９５）
【非特許文献１１】Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８７：３４９−３５９（２０００）
【非特許文献１２】Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  １２：Ｓ１５−Ｓ１９（２００１）
【非特許文献１３】Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０４：３１７−３２５（２００４）
【非特許文献１４】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：９７４（１９８５）
【非特許文献１５】Ｌａｎｃｅｔ：１：７６５−７６７（１９８６）
【非特許文献１６】Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：９５５−９５８（１９８６）
【非特許文献１７】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓ．３：２１−３１（１９８８）
【非特許文献１８】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：８１−８８（１９８９）
【非特許文献１９】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：１０３４（１９９１）
【非特許文献２０】Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ，３８：３６４（１９９０）
【非特許文献２１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：４２１−４２５（１９９０）
【非特許文献２２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：５１８４（１９９０）
【非特許文献２３】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：６６０５（１９８９）
【非特許文献２４】Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．３：２５４−２５７（１９９０）
【非特許文献２５】Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５７：３５８−３６３（１９８８）
【非特許文献２６】Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５９：４６−５２（１９９１）
【非特許文献２７】Ｃａｎｃｅｒ  ６５：８８−９２（１９９０）
【非特許文献２８】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：２６３９−２２６４（１９９９）
【非特許文献２９】Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  １８：９７７−９８４（２００７）
【非特許文献３０】Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５７：３９−５１（２００７）
【非特許文献３１】Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２：４４３６ｓ−４４４０ｓ（２００６）
【非特許文献３２】Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２３：１８５−１９３（２０１０）
【非特許文献３３】Ｓｈｅｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ．５（４）：３３３−５２（２００７）
【非特許文献３４】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．５８：６５７−６６７（２００６）
【非特許文献３５】Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５０３−５０８（１９９７）
【非特許文献３６】Ｚａｈｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７９（１８）：１８８７０−１８８７７（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、ＥｒｂＢ２に対するヒト化抗体である４Ｄ５よりも抗原親和度及び癌細胞増殖阻害活性が改善された抗体の変異体を開発するために努力した。その結果、親抗体に比べて、高い抗原親和度と癌細胞増殖抑制活性とを表わす抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体を製造した。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントを提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントの重鎖可変ドメインをコードする核酸分子を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前記抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントの軽鎖可変ドメインをコードする核酸分子を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、癌の予防または治療用薬剤学的組成物を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、癌の予防または治療方法を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の一様態によれば、本発明は、（ａ）軽鎖可変ドメインと、（ｂ）次のアミノ酸置換で構成された群から選択された２以上のアミノ酸置換を有する重鎖可変ドメインと、を含む抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントを提供する：
配列番号１のアミノ酸配列でカバット番号付けシステム（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）による位置４１のＰｒｏがＡｒｇに置換、位置９６のＧｌｙがＡｓｎに置換、位置９７のＧｌｙがＡｌａに置換、位置９８のＡｓｐがＴｒｐに置換、位置９８のＡｓｐがＬｙｓに置換、位置１００ｂのＡｌａがＳｅｒに置換、位置１００ｃのＭｅｔがＰｈｅに置換、位置１０１のＡｓｐがＡｌａに置換、位置１０１のＡｓｐがＶａｌに置換、位置１０２のＴｙｒがＨｉｓに置換、及び位置１０２のＴｙｒがＬｅｕに置換。
【００１８】
本発明者らは、ＥｒｂＢ２に対するヒト化抗体である４Ｄ５よりも抗原親和度及び癌細胞増殖阻害活性が改善された抗体の変異体を開発するために努力した。その結果、親抗体に比べて、高い抗原親和度と癌細胞増殖抑制活性とを表わす抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体を製造した。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明の抗体の変異体は、ＥｒｂＢ２に高い親和度で結合する。特に、本発明の抗体の変異体は、ＥｒｂＢ２に対する親和度が従来の市販抗体治療剤である４Ｄ５に比べて、最大８倍改善された。
（ｂ）本発明の抗体の変異体は、優れた癌細胞増殖阻害活性を表わす。特に、本発明の抗体の変異体の胃癌細胞株増殖阻害活性は、４Ｄ５よりも約３．５倍優れている。
（ｃ）したがって、本発明の抗体の変異体は、少ない量でも癌を効果的に予防または治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ｓｃＦｖのディスプレイのための別途の転写体を発現するベクターの一部を示す図面である。オープンリーディングフレームは、ＯｍｐＡ分泌信号配列、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、リンカー配列（Ｌ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ｃ−ｍｙｃタグ配列、及びウイルス外被タンパク質をコードする。
【図２】図２は、ＥｒｂＢ２に結合するｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ分子を生産するＥ．ｃｏｌｉクローンを選別するためのモノクローナルＥＬＩＳＡの結果を示したグラフである。
【図３】図３は、ヒト化抗体４Ｄ５の重鎖可変ドメイン（配列番号１）、ＡＨ０６とＡ０５８との重鎖可変ドメイン（配列番号３）、ＡＨ１６の重鎖可変ドメイン（配列番号４）、及びＡ０９１の重鎖可変ドメイン（配列番号６）のアミノ酸配列を比較して示す図面である。
【図４】図４は、ヒト化抗体４Ｄ５、ＡＨ０６、ＡＨ１６の軽鎖可変ドメイン（配列番号２）、Ａ０５８の軽鎖可変ドメイン（配列番号５）、及びＡ０９１の軽鎖可変ドメイン（配列番号７）のアミノ酸配列を比較して示す図面である。
【図５】動物細胞で生産及び精製された本発明による抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す図面である。
【図６】図６は、抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体（Ｄ９８Ｗ）の細胞増殖阻害活性に対する分析結果を示す図面である。精製されたＩｇＧを６日間ＮＣＩ−Ｎ８７細胞で評価した。
【図７】図７は、抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体（Ａ０５８とＡ０９１）の細胞増殖阻害活性に対する分析結果を示す図面である。精製されたＩｇＧを６日間ＮＣＩ−Ｎ８７細胞で評価した。
【図８】図８は、抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体（ＡＨ０６とＡＨ１６）の細胞増殖阻害活性に対する分析結果を示す図面である。精製されたＩｇＧを６日間ＮＣＩ−Ｎ８７細胞で評価した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、下記で詳しく説明する。
【００２２】
Ｉ．抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体及びその抗原結合性フラグメント
本発明の抗体の変異体は、ＥｒｂＢ２に対して特異的結合能を有する。
【００２３】
本明細書で使われる用語、“抗体の変異体（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｎｔ）”は、ＥｒｂＢ２に対するヒト化抗体４Ｄ５の重鎖可変ドメイン及び／または軽鎖可変ドメインでそれぞれ少なくとも２以上のアミノ酸が置換された可変ドメインを含むアミノ酸置換変異体を意味する。すなわち、本発明は、親抗体４Ｄ５の重鎖及び／または軽鎖可変ドメインのうち、特定位置のアミノ酸を置換することによって、抗原親和力及び癌細胞増殖阻害活性が改善された抗体の変異体を提供することである。
【００２４】
下記の実施例で確認したように、本発明の抗体の変異体は、親抗体である４Ｄ５に比べて、ＥｒｂＢ２に対する親和力が最大８倍向上し（表５）、また、４Ｄ５に比べて、約３．５倍優れた活性で胃癌細胞の増殖を抑制する（図８）。
【００２５】
前記４Ｄ５抗体の重鎖可変ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、４Ｄ５抗体の軽鎖可変ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００２６】
本発明の抗体の変異体は、完全な抗体の形態だけではなく、抗体分子の抗体フラグメントを含む。
【００２７】
完全な抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖不変領域は、γ、μ、α、δ及びεタイプを有し、サブクラスでγ１、γ２、γ３、γ４、α１及びα２を有する。軽鎖の不変領域は、κ及びλタイプを有する。
【００２８】
抗体分子の抗原結合性フラグメントまたは抗体フラグメントとは、抗原結合機能を保有しているフラグメントを意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体フラグメントのうち、Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）とを有する構造であって、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成しながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有している最小の抗体切片でＦｖフラグメントを生成する組換え技術は、ＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ  ８８／１０６４９、ＷＯ  ８８／１０６６３０、ＷＯ  ８８／０７０８５、ＷＯ  ８８／０７０８６、及びＷＯ８８／０９３４４に開示されている。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、一般的にペプチドリンカーを通じて重鎖の可変領域と単鎖の可変領域とが共有結合で連結されるか、またはＣ末端で直ちに連結されていて、二重鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造をなしうる。このような抗体フラグメントは、タンパク質加水分解酵素を用いて得られ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すれば、Ｆａｂが得られ、ペプシンで切断すれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが得られる）、望ましくは、遺伝子組換え技術を通じて製作することができる。
【００２９】
本発明で、抗体は、望ましくは、Ｆｖ形態であるか、完全な抗体の形態である。また、重鎖不変領域は、γ、μ、α、δまたはεのうちの何れか１つのアイソタイプから選択されうる。望ましくは、不変領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）またはガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖不変領域は、カッパまたはラムダ型であり得る。
【００３０】
本明細書で使われる用語、“重鎖”は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ、及び３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む全長の重鎖、及びそのフラグメントをいずれも意味する。また、本明細書で使われる用語、“軽鎖”は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ、及び不変領域ドメインＣＬを含む全長の軽鎖、及びそのフラグメントをいずれも意味する。
【００３１】
本発明の望ましい具現例によれば、前記重鎖可変ドメインは、次のアミノ酸置換を含む：
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置９８のＡｓｐがＴｒｐに置換、位置１００ｃのＭｅｔがＰｈｅに置換、位置１０１のＡｓｐがＡｌａに置換、及び位置１０２のＴｙｒがＬｅｕに置換（配列番号３）；
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置９６のＧｌｙがＡｓｎに置換、位置９７のＧｌｙがＡｌａに置換、位置９８のＡｓｐがＬｙｓに置換、位置１００ｂのＡｌａがＳｅｒに置換、位置１００ｃのＭｅｔがＰｈｅに置換、位置１０１のＡｓｐがＶａｌに置換、及び位置１０２のＴｙｒがＨｉｓに置換（配列番号４）；または
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置４１のＰｒｏがＡｒｇに置換、位置９８のＡｓｐがＴｒｐに置換、位置１００ｃのＭｅｔがＰｈｅに置換、位置１０１のＡｓｐがＡｌａに置換、及び位置１０２のＴｙｒがＬｅｕに置換（配列番号６）。
【００３２】
本明細書で、前記重鎖可変ドメインのアミノ酸置換を説明しながら言及した、カバット番号付けシステムによる位置４１は、配列番号１の４１番目のアミノ酸であるＰｒｏを意味し、位置９６は、配列番号１の１００番目のアミノ酸であるＧｌｙを意味し、位置９７は、配列番号１の１０１番目のアミノ酸であるＧｌｙを意味し、位置９８は、配列番号１の１０２番目のアミノ酸であるＡｓｐを意味し、位置１００ｂは、配列番号１の１０６番目のアミノ酸であるＡｌａを意味し、位置１００ｃは、配列番号１の１０７番目のアミノ酸であるＭｅｔを意味し、位置１０１は、配列番号１の１０８番目のアミノ酸であるＡｓｐを意味し、位置１０２は、配列番号１の１０９番目のアミノ酸であるＴｙｒを意味する。
【００３３】
本発明の望ましい具現例によれば、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、または次のアミノ酸置換を含む：
配列番号２のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置５０のＳｅｒがＴｈｒに置換、位置５１のＡｌａがＴｈｒに置換、位置５２のＳｅｒがＴｈｒに置換、位置５３のＰｈｅがＴｒｐに置換、位置５４のＬｅｕがＰｒｏに置換、位置７２のＴｈｒがＳｅｒに置換、位置９１のＨｉｓがＴｙｒに置換、位置９３のＴｈｒがＧｌｎに置換、位置９３のＴｈｒがＡｓｎに置換、位置９６のＰｒｏがＡｌａに置換、位置９６のＰｒｏがＶａｌに置換、及び位置９７のＴｈｒがＳｅｒに置換で構成された群から選択された２以上のアミノ酸置換。
【００３４】
本発明のより望ましい具現例によれば、前記軽鎖可変ドメインは、次のアミノ酸置換を含む：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置９３のＴｈｒがＧｌｎに置換、位置９６のＰｒｏがＡｌａに置換、及び位置９７のＴｈｒがＳｅｒに置換（配列番号５）；または
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置５０のＳｅｒがＴｈｒに置換、位置５１のＡｌａがＴｈｒに置換、位置５２のＳｅｒがＴｈｒに置換、位置５３のＰｈｅがＴｒｐに置換、位置５４のＬｅｕがＰｒｏに置換、位置７２のＴｈｒがＳｅｒに置換、位置９１のＨｉｓがＴｙｒに置換、位置９３のＴｈｒがＡｓｎに置換、及び位置９６のＰｒｏがＶａｌに置換（配列番号７）。
【００３５】
本明細書で、前記軽鎖可変ドメインのアミノ酸置換を説明しながら言及した、カバット番号付けシステムによる位置５０は、配列番号２の５０番目のアミノ酸であるＳｅｒを意味し、位置５１は、配列番号２の５１番目のアミノ酸であるＡｌａを意味し、位置５２は、配列番号２の５２番目のアミノ酸であるＳｅｒを意味し、位置５３は、配列番号２の５３番目のアミノ酸であるＰｈｅを意味し、位置５４は、配列番号２の５４番目のアミノ酸であるＬｅｕを意味し、位置７２は、配列番号２の７２番目のアミノ酸であるＴｈｒを意味し、位置９１は、配列番号２の９１番目のアミノ酸であるＨｉｓを意味し、位置９３は、配列番号２の９３番目のアミノ酸であるＴｈｒを意味し、位置９６は、配列番号２の９６番目のアミノ酸であるＰｒｏを意味し、位置９７は、配列番号２の９７番目のアミノ酸であるＴｈｒを意味する。
【００３６】
本発明の望ましい具現例によれば、本発明の抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントは、（ａ）配列番号３、配列番号４及び配列番号６で構成された群から選択された重鎖可変ドメインと、（ｂ）配列番号２、配列番号５及び配列番号７で構成された群から選択された軽鎖可変ドメインと、を含む。
【００３７】
本発明のより望ましい具現例によれば、本発明の抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントは、次の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含む：
（ｉ）配列番号２の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３の重鎖可変ドメイン；
（ｉｉ）配列番号２の軽鎖可変ドメイン及び配列番号４の重鎖可変ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号５の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３の重鎖可変ドメイン；または
（ｉｖ）配列番号７の軽鎖可変ドメイン及び配列番号６の重鎖可変ドメイン。
【００３８】
本発明の抗体は、単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、そして、前記抗体のエピトープ結合性フラグメントなどを含むが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
本発明の望ましい具現例によれば、本発明の抗体は、ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄａｎｔｉｂｏｄｙ）である。
【００４０】
本発明の抗体の変異体または抗体フラグメントは、ＨＥＲ２を特異的に認識することができる範囲内で、本明細書に記載の本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体配列だけではなく、その生物学的均等物も含みうる。例えば、抗体の結合親和度及び／またはその他の生物学的特性をさらに改善させるために、抗体のアミノ酸配列に追加的な変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／または置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいてなされる。アミノ酸側鎖置換体のサイズ、形状及び種類に対する分析によって、アルギニン、リシンとヒスチジンは、いずれも正電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシンとセリンは、類似したサイズを有し；フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは、類似した形状を有するということが分かる。したがって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リシンとヒスチジン；アラニン、グリシンとセリン；そして、フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは、生物学的に機能均等物であると言える。
【００４１】
変異を導入するに当たって、アミノ酸の疎水性インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｎｄｅｘ）が考慮されうる。それぞれのアミノ酸は、疎水性と電荷とによって疎水性インデックスが付与されている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスタイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。
【００４２】
タンパク質の相互的な生物学的機能（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ）を付与するに当たって、疎水性アミノ酸インデックスは非常に重要である。類似した疎水性インデックスを有するアミノ酸に置換して初めて、類似した生物学的活性を保有できるということは公知の事実である。疎水性インデックスを参照して変異を導入させる場合、望ましくは、±２以内、より望ましくは、±１以内、さらに望ましくは、±０．５以内の疎水性インデックス差を表わすアミノ酸の間に置換を行う。
【００４３】
一方、類似した新水性値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）を有するアミノ酸の間の置換が均等な生物学的活性を有するタンパク質を招くということもよく知られている。米国特許第４，５５４，１０１号に開示されたように、次の新水性値が、それぞれのアミノ酸残基に付与されている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００４４】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質でのアミノ酸交換は、当該分野に公知されている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も通常起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。
【００４５】
前述した生物学的均等活性を有する変異を考慮するならば、本発明の抗体またはそれをコードする核酸分子は、配列リストに記載の配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を表わす配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、前記本発明の配列と任意の他の配列とを最大限対応してアラインし、当業者に通常利用されるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも６１％の相同性、より望ましくは、７０％の相同性、さらに望ましくは、８０％の相同性、最も望ましくは、９０％の相同性を表わす配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は、当業者に公知されている。アラインメントに対する多様な方法及びアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４８：４４３（１９７０）；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＳｃｉ．８：１５５−６５（１９９２）、及びＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１（１９９４）に開示されている。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））は、ＮＢＣＩなどで接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して利用できる。ＢＬＳＡＴは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。このプログラムを利用した配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認することができる。
【００４６】
本発明によれば、本発明の抗体の変異体または抗体フラグメントは、機能性分子と結合された免疫結合体であり得る。ＨＥＲ２は、癌細胞の表面に発現される分子なので、本発明の免疫結合体、すなわち、抗体の変異体−機能性分子は、ＨＥＲ２を過発現する癌の予防、治療及び診断に利用できる。前記機能性分子は、化学物質、放射性核種、免疫治療剤、サイトカイン、ケモカイン、毒素、生物作用剤、及び酵素阻害物質などを含む。
【００４７】
本発明の抗体の変異体またはそのフラグメントとカップリングさせるのに望ましい機能性分子は、化学物質、サイトカインまたはケモカインであり、より望ましくは、化学物質である。前記化学物質は、抗癌剤であり、例えば、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロナイシン、アドゼレシン、アラノシン、アルデスロイキン、アロプリノールナトリウム、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アモナファイド、アンプリジェン、アムサクリン、アンドロゲン、アングイジン、アフィジコリングリシナート、アサレイ、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、バチルス・カルメット−ゲラン（ＢＣＧ）、ベーカーズアンチフォール、β−２−デオキシチオグアノシン、ビスアントレンＨＣｌ、ブレオマイシンサルフェート、ブスルファン、ブチオニンスルホキシイミン、ＢＷＡ７７３Ｕ８２、ＢＷ  ５０２Ｕ８３／ＨＣｌ、ＢＷ  ７Ｕ８５メシレート、セラセミド、カルベティマー、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、クロロキノキサリンスルホンアミド、クロロゾトシン、クロモマイシンＡ３、シスプラチン、クラドリビン、コルチコステロイド、コリネバクテリウムパルヴム、ＣＰＴ−１１、クリスナトール、シクロシチジン、シクロホスファミド、シタラビン、シテムベナ、ダビスマレアート、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、ジアザウリジン、デクスラゾキサン、ジアンヒドロガラクチトール、ジアジクオン、ジブロモズルシトール、ジデミンＢ、ジエチルジチオカルバメート、ジグリコアルデヒド、ジヒドロ−５−アザシチジン、ドキソルビシン、エチノマイシン、エダトレキセート、エデルフォシン、エフロニチン、エリオット溶液、エルサミトルシン、エピルビシン、エソルビシン、エストラムスチンフォスフェート、エストロゲン、エタニダゾール、エチオフォス、エトポシド、ファドラゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボン酢酸、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、５’−フルオロウラシル、ＦｌｕｏｓｏｌＴＭ、フルタミド、硝酸ガリウム、ゲムシタビン、酢酸ゴセレリン、ヘプスルファム、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ホモハリントニン、硫酸ヒドラジン、４−ヒドロキシアンドロステンジオン、ヒドロジウレア、イダルビシンＨＣｌ、イホスファミド、４−イポメアノール、イプロプラチン、イソトレチノイン、ロイコボリンカルシウム、酢酸リュープロリド、レバミゾール、リボソームダウノルビシン、リボソーム捕集ドキソルビシン、ロムスチン、ロニダミン、メイタンシン、メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、メノガリル、メルバロン、６−メルカプトプリン、メスナ、バチルス・カルメット−ゲランのメタノール抽出物、メトトレキサート、Ｎ−メチルホルムアミド、ミフェプリストン、ミトグアゾン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン塩酸塩、モノサイト／マクロファージコロニー刺激因子、ナビロン、ナフォキシジン、ネオカルチノスタチン、酢酸オクトレオチド、オルマプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パラ、ペントスタチン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ピラルビシン、ピリトレキシム、ピロキサントロン塩酸塩、ＰＩＸＹ−３２１、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プレドニムスチン、プロカルバジン、プロゲスチン、ピラゾフリン、ラゾキサン、サルグラモスチム、セムスチン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌール、スラミンナトリウム、タモキシフェン、タキソテール、テガフール、テニポシド、テレフタルアミジン、テロクシロン、チオグアニン、チオテパ、チミジンインジェクション、チアゾフリン、トポテカン、トレミフェン、トレチノイン、塩酸トリフルオペラジン、トリフルリジン、トリメトレキサート、ＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ）、ウラシルマスタード、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンゾリジン、Ｙｏｓｈｉ  ８６４、ゾルビシン、シトシンアラビノシド、エトポシド、メルファラン、タキソテール、タキソール、及びこれらの混合物であるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
ＩＩ．核酸分子及び組換えベクター
本発明の他の様態によれば、本発明は、本発明の抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントの重鎖可変ドメインをコードする核酸分子を提供する。
【００４９】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、本発明の抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントの軽鎖可変ドメインをコードする核酸分子を提供する。
【００５０】
本明細書で使われる用語、“核酸分子”は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）、そして、ＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子で基本構成単位であるヌクレオチドは、天然のヌクレオチドだけではなく、糖または塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０））。本発明の重鎖及び軽鎖可変ドメインをコードする核酸分子の配列は変形されうる。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、または非保存的置換または保存的置換を含む。
【００５１】
本発明の一具現例によれば、前記重鎖可変ドメインをコードする核酸分子は、配列番号３、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインをコードする核酸分子であり、前記軽鎖可変ドメインをコードする核酸分子は、配列番号２、配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインをコードする核酸分子である。
【００５２】
本発明の一具現例によれば、本発明の核酸分子は、全体重鎖領域をコードする核酸分子または全体軽鎖領域をコードする核酸分子内に含まれた形態であり得る。
【００５３】
本発明の核酸分子は、前記ヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を表わすヌクレオチド配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、前記本発明のヌクレオチド配列と任意の他の配列とを最大限対応してアラインし、当業者に通常利用されるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも８０％の相同性、より望ましくは、少なくとも９０％の相同性、最も望ましくは、少なくとも９５％の相同性を表わすヌクレオチド配列を意味する。
【００５４】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、（ａ）本発明の重鎖可変ドメインをコードする核酸分子と、（ｂ）本発明の軽鎖可変ドメインをコードする核酸分子と、を含む組換えベクターを提供する。
【００５５】
本明細書で使われる用語、“ベクター”は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であって、プラスミドベクター；コスミドベクター；そして、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどが含まれ、望ましくは、プラスミドベクターである。
【００５６】
本発明の望ましい具現例によれば、本発明のベクターで軽鎖可変ドメインをコードする核酸分子及び重鎖可変ドメインをコードする核酸分子は、プロモーターと作動的に結合（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）されている。
【００５７】
本明細書で使われる用語、“作動的に結合された”は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／または翻訳を調節する。
【００５８】
本発明の望ましい具現例によれば、本発明の組換えベクターは、（ａ）配列番号３、配列番号４及び配列番号６で構成された群から選択された重鎖可変ドメインをコードする核酸分子と、（ｂ）配列番号２、配列番号５及び配列番号７で構成された群から選択された軽鎖可変ドメインをコードする核酸分子と、を含む。
【００５９】
本発明のより望ましい具現例によれば、本発明の組換えベクターは、次の核酸分子を含む：
（ｉ）配列番号３の重鎖可変ドメインをコードする核酸分子及び配列番号２の軽鎖可変ドメインをコードする核酸分子；
（ｉｉ）配列番号４の重鎖可変ドメインをコードする核酸分子及び配列番号２の軽鎖可変ドメインをコードする核酸分子；
（ｉｉｉ）配列番号３の重鎖可変ドメインをコードする核酸分子及び配列番号５の軽鎖可変ドメインをコードする核酸分子；または
（ｉｖ）配列番号６の重鎖可変ドメインをコードする核酸分子及び配列番号７の軽鎖可変ドメインをコードする核酸分子。
【００６０】
本発明の組換えベクターシステムは、当業者に公知の多様な方法を通じて構築され、これについての具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）に開示されており、本文献は、本明細書に参照として挿入される。
【００６１】
本発明のベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築されうる。また、本発明のベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主として構築されうる。
【００６２】
例えば、本発明のベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター、及びＴ７プロモーターなど）、翻訳の開始のためのリボソーム結合位置及び転写／翻訳終結配列を含むことが一般的である。宿主細胞としてＥ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、ＤＨ５αなど）が利用される場合、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーター及びオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９８４）１５８：１０１８−１０２４）、そして、ファージλの左向きプロモーター（ｐＬλプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ．ａｎｄ  Ｈａｇｅｎ，Ｄ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，（１９８０）１４：３９９−４４５）が調節部位として利用されうる。宿主細胞としてバチルス菌が利用される場合、バチルス・チューリンゲンシスの毒素タンパク質遺伝子のプロモーター（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９８）６４：３９３２−３９３８；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９６）２５０：７３４−７４１）またはバチルス菌で発現可能な如何なるプロモーターでも、調節部位として利用されうる。
【００６３】
一方、本発明の組換えベクターは、当業者で度々使われるプラスミド（例：ｐＣＬ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、及びｐＵＣ１９など）、ファージ（例：λｇｔ４・λＢ、λ−Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１、及びＭ１３など）またはウイルス（例：ＳＶ４０など）を操作して製作することができる。
【００６４】
本発明の望ましい具現例によれば、本発明の組換えベクターは、ｐＣＬ発現ベクター、望ましくは、ｐＣＬＳ０５（大韓民国出願番号第１０−２０１１−００５６６８５号）発現ベクターを操作して製作することができる。
【００６５】
一方、本発明のベクターが発現ベクターであり、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター、及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が利用され、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。一具現例で、本発明の組換えベクターは、ＣＭＶプロモーターを含む。
【００６６】
本発明の組換えベクターは、それから発現される抗体の精製を容易にするために、他の配列と融合されることもある。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）、及び６×Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などがある。また、本発明のベクターによって発現されるタンパク質が抗体であるために、精製のための追加的な配列なしにも、発現された抗体は、タンパク質Ａカラムなどを通じて容易に精製することができる。
【００６７】
一方、本発明の組換えベクターは、選択標識として当業者に通常利用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン、及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
【００６８】
本発明の抗体の変異体を発現するベクターは、軽鎖と重鎖とが１つのベクターで同時に発現されるベクターシステムであるか、または軽鎖と重鎖とをそれぞれ別途のベクターで発現させるシステムいずれも可能である。後者の場合、２つのベクターは、同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ）及び標的形質転換（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて宿主細胞に導入される。同時形質転換は、軽鎖及び重鎖をコードするそれぞれのベクターＤＮＡを同時に宿主細胞に導入した後、軽鎖と重鎖とをいずれも発現する細胞を選別する方法である。標的形質転換は、軽鎖（または、重鎖）を含むベクターに形質転換された細胞を選別し、軽鎖を発現する選別された細胞を重鎖（または、軽鎖）を含むベクターに再び形質転換して、軽鎖及び重鎖いずれもを発現する細胞を最終的に選別する方法である。下記の実施例では、軽鎖と重鎖とが１つのベクターで同時に発現されるベクターシステムを用いて抗体を製造した。
【００６９】
ＩＩＩ．形質転換体
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、本発明の組換えベクターに形質転換された宿主細胞を提供する。
【００７０】
本発明のベクターを安定しながらも、連続してクローニング及び発現させる宿主細胞は、当業者に公知されて如何なる宿主細胞も利用でき、例えば、エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バシラスサブチリス及びバチルス・チューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ））、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）またはスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を含むが、これに制限されるものではない。
【００７１】
前記ベクターの適した真核細胞宿主細胞は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）のような真菌、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、及びネウロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）のような酵母、その他の下等真核細胞、昆虫−由来細胞のような高等真核生物の細胞、そして、植物または哺乳動物由来の細胞を利用できる。望ましくは、宿主細胞は、猿の腎臓細胞７（ＣＯＳ７：ｍｏｎｋｅｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、幼いハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞または２９３細胞であり、より望ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。
【００７２】
Ｅ．ｃｏｌｉなどの微生物を利用する場合、生産性は、動物細胞などに比べて高い方であるが、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）問題によって、インタクト（ｉｎｔａｃｔ）なＩｇ形態の抗体生産には望ましくないが、Ｆａｂ及びＦｖなどの生産には使われる。
【００７３】
本明細書で、宿主細胞への“形質転換”及び／または“形質感染”は、核酸を有機体、細胞、組織または器官に導入する如何なる方法も含まれ、当分野で公知されたように、宿主細胞によって適した標準技術を選択して行うことができる。このような方法には、電気衝撃遺伝子伝達法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈澱、シリコンカーバイド纎維を利用した撹拌、アグロバクテリア媒介された形質転換、ＰＥＧ、デキストランサルフェート、リポフェクタミン、及び乾燥／抑制媒介された形質転換方法などが含まれるが、これに制限されるものではない。
【００７４】
ＩＶ．抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントの製造方法
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、（ａ）本発明の組換えベクターに形質転換された宿主細胞を培養する段階と、（ｂ）前記宿主細胞で抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントを発現させる段階と、を含む抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントの製造方法を提供する。
【００７５】
前記抗体製造で形質転換された宿主細胞の培養は、当業者に知られた適当な培地と培養条件とによってなされうる。このような培養過程は、当業者ならば、選択される菌株によって容易に調整して使うことができる。このような多様な培養方法は、多様な文献（例えば、Ｊａｍｅｓ  Ｍ．Ｌｅｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，１３８−１７６）に開示されている。細胞培養は、細胞の成長方式によって、懸濁培養と付着培養、培養方法によって、回分式、流加式及び連続培養式の方法に区分される。培養に使われる培地は、特定の菌株の要求条件を適切に満足させなければならない。
【００７６】
動物細胞培養は、前記培地は、多様な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。使われる炭素源の例は、葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、マルトース、澱粉及びセルロースのような炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、蓖麻子油及びココナッツ油のような脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸のような脂肪酸、グリセロール及びエタノールのようなアルコール、そして、酢酸のような有機酸を含む。これら炭素源は、単独または組合わせられて使われる。使われる窒素源の例は、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液（ＣＳＬ）及び大豆麦のような有機窒素源及び要素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源を含む。これら窒素源は、単独または組合わせられて使われる。前記培地には、リン源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び対応するナトリウム−含有塩が含まれうる。また、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含みうる。それ以外に、アミノ酸、ビタミン、及び適切な前駆体などが含まれうる。
【００７７】
培養中に、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を培養物に適切な方式で添加して、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使って気泡の生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を保持するために、培養物内に酸素または酸素−含有ガス（例、空気）を注入する。培養物の温度は、通常、２０℃〜４５℃、望ましくは、２５℃〜４０℃である。
【００７８】
形質転換された宿主細胞を培養して収得した抗体は、精製していない状態で使われ、さらに多様な通常の方法、例えば、透析、塩沈澱及びクロマトグラフィーなどを用いて高純度に精製して使われる。そのうちから、クロマトグラフィーを利用する方法が最も多く使われ、カラムの種類と順序は、抗体の特性、培養方法などによって、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどで選択することができる。
【００７９】
Ｖ．癌の予防または治療用薬剤学的組成物
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、（ａ）本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントの薬剤学的有効量と、（ｂ）薬剤学的に許容される担体と、を含む癌の予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００８０】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、治療学的有効量の前記薬剤学的組成物を個体に投与する段階を含む癌の予防または治療方法を提供する。
【００８１】
本明細書で使われる用語、“予防”は、疾病の進行を完全に、あるいは部分的に抑制するか、延ばすことだけではなく、さらに深刻な疾病への転換を遅延させることを含む最も広い意味として使われ、用語“治療”は、癌細胞の部分的、あるいは全体的破壊だけではなく、癌成長の部分的または完全な抑制を含む。
【００８２】
本発明の一具現例によれば、前記癌は、ＨＥＲ２を過発現する癌である。一特定例で、前記癌は、乳房癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、膵臓癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、大腸癌、及び甲状腺癌で構成された群から選択される。他の具現例で、前記癌は、乳房癌または胃癌である。本明細書で使われる用語、“ＨＥＲ２を過発現する癌”は、同じ組織類型の非癌性細胞と比較して有意的にさらに高いレベルにＨＥＲ２を癌細胞表面に有している癌である。このような過多発現は、遺伝子増幅によっても、転写または翻訳の増加によって起こりうる。
【００８３】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微小結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含みうる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
【００８４】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口で投与し、非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、及び直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるために、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。また、薬剤学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与される。
【００８５】
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様であり、通常、熟練された医師は、所望する治療または予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の望ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。本明細書で、用語“薬剤学的有効量”は、癌を予防または治療するのに十分な量を意味する。
【００８６】
本発明の薬剤学的組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳液の形態であるか、エクストラクト剤、散剤、座剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、またはカプセル剤の形態でもあり、分散剤または安定化剤をさらに含みうる。
【００８７】
本発明の組成物は、個別治療剤として投与するか、他の治療剤と併用して投与され、従来の治療剤とは、順次または同時に投与される。
【００８８】
抗体の変異体は、抗体の変異体−治療剤（機能性分子）結合体の形態で生体内に投入して、癌の治療に利用でき、これについての説明は、前記で説明した通りである。薬剤を特異的標的部位に標的化するのに適当であり、望ましいさまざまな条件は、例えば、文献Ｔｒｏｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ，（１９８２）１９−３０に報告されている。
【００８９】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。
【実施例】
【００９０】
実施例１．多様なＣＤＲ残基を有するファージディスプレイされたｓｃＦｖライブラリーの製作
ｓｃＦｖとｐＩＩＩとが結合された形態でディスプレイを生成するファージミドベクターを使って、ファージディスプレイされたｓｃＦｖライブラリーを製作した。前記ベクターの概略的な構造を図１に図示した。前記ベクターは、ＩＰＴＧ−誘導性Ｐｌａｃプロモーターの制御下の抗体の可変ドメインを含み、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＳ（配列番号８）である。親抗体になる抗ＥｒｂＢ２抗体（４Ｄ５）の製造方法及び可変ドメイン配列は、米国特許第５，８２１，３３７号及び第６，０５４，２９７号に公知されている。
【００９１】
ｓｃＦｖディスプレイベクターの唯一の“停止鋳型”バージョンを使ってライブラリーを生成した。本実施例では、ＴＧＡ停止コドンが軽鎖のカバット残基４８に挿入された鋳型ｐＣＭＴＧファージミドベクターを使った（ＩＧ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｃｏ．，韓国）。重鎖ＣＤＲ３には、停止コドンが導入されていない。多様化させる位置にＮＮＫコドンを有する突然変異誘発オリゴヌクレオチドを使って、ＣＤＲ多様性を導入すると同時に、停止コドンを除去した。これにより、同種二量体化ｃ−ｍｙｃ及びｐＩＩＩに融合されたｓｃＦｖライブラリー構成源をコードするオープンリーディングフレームが生成された。
【００９２】
重鎖ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ３領域を優先的に変化させた。重鎖ＣＤＲ３領域を変化させるために、ＨＦ（配列番号１９）とＬＮ０１＿Ｒプライマー（配列番号９）、ＨＦ（配列番号１９）とＬＮ０２＿Ｒプライマー（配列番号１０）とを使ってＰＣＲを行った。Ｃ１０００  Ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，米国）を使って製造社の指針によって、Ｅｘ  ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ，日本）で次のように増幅過程を進行した：９５℃で２０秒間変性、５７℃で３０秒間プライマー結合及び７２℃で４５秒間伸長させる増幅過程を２７サイクル実施。そして、軽鎖ＣＤＲ３領域を変化させるために、ＬＮ０３＿Ｆ（配列番号１１）とＬＲプライマー（配列番号１７）、ＬＮ０４＿Ｆ（配列番号１２）とＬＲプライマー対を用いて次のようにＰＣＲを実施した：９５℃で２０秒間変性、５７℃で３０秒間プライマー結合及び７２℃で４５秒間伸長させる増幅過程を２７サイクル実施。
【００９３】
重鎖ＣＤＲ３と軽鎖ＣＤＲ３変異体のうちから選別された抗体を鋳型で軽鎖ＣＤＲ２をターゲットとしてＮＮＫコドンを使って、ランダムに突然変異を誘導するライブラリーを製作するために、２回のＰＣＲ過程を行った。ＰＣＲは、９５℃で２０秒間変性、５７℃で３０秒間プライマー結合及び７２℃で４５秒間伸長させる増幅過程を２７サイクル実施した。正方向プライマーとしてＬＦ（配列番号１８）を使い、逆方向プライマーとしてＬＮ０５＿Ｒ（配列番号１３）とＬＮ０６＿Ｒ（配列番号１４）とを１：１の比率で混合したプライマーを使って、Ａ切片を得て、ＬＮ０５０６＿Ｆ（配列番号１５）とＨＲプライマー（配列番号２０）を使って、Ｂ切片を得た。Ａ切片とＢ切片とを鋳型でＬＦ（配列番号１８）とＨＲプライマー（配列番号２０）対でＰＣＲを行った。それ以外にも、重鎖ＣＤＲ３と２個の軽鎖（ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）変異体のうちから選別された抗体を鋳型でＬＦ（配列番号１８）とＬＮ０７＿Ｒプライマー（配列番号１６）とを使って追加的にライブラリーを製作した。
【００９４】
前記ライブラリーから選別された重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ２変異抗体を鋳型でＣＤＲとフレームワーク部分いずれもをターゲットでランダムに突然変異を誘導するために、エラー誘発ＰＣＲを行って、抗体ライブラリーを製作するために、次のようにＰＣＲ過程を２回にわたって行った：最初のＰＣＲは、ＧｅｎｅＭｏｒｐＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）を使って、９５℃で２０秒間変性、５７℃で３０秒間プライマー結合及び７２℃で４５秒間伸長させる増幅過程を３２サイクル行い、二番目のＰＣＲは、Ｅｘ  ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ，日本）を使って、９５℃で２０秒間変性、５８℃で３０秒間プライマー結合及び７２℃で４５秒間伸長させる増幅過程を２０サイクル行い；まず、ＬＦ（配列番号１８）とＬＲ（配列番号１７）とを使って、軽鎖を含む切片とＨＦ（配列番号１９）とＨＲプライマー（配列番号２０）対を用いて重鎖を含む切片をＰＣＲを通じてそれぞれ増幅した。軽鎖と重鎖２つの切片をＬＦ（配列番号１８）とＨＲプライマー（配列番号２０）対でＰＣＲして、ｓｃＦｖ形態のフラグメントで得て、ライブラリーを製作した。ＰＣＲに使われたプライマーの配列は、表１に表わした。
【００９５】
【表１】
2015517486.tif 000003
【００９６】
親抗体は、ヒト化抗体４Ｄ５の可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号１の重鎖可変ドメイン；配列番号２の軽鎖可変ドメイン）を含む（表２）。
【００９７】
【表２】
2015517486.tif 000004
【００９８】
ライブラリーＬＮ０１及びＬＮ０２は、１個の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ３）でランダム化された残基で製作され、ライブラリーＬＮ０３及びＬＮ０４は、１個の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ３）でランダム化された残基で製作された。また、ライブラリーＬＮ０５、ＬＮ０６及びＬＮ０７は、２個の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）及び重鎖ＣＤＲ３でランダム化された残基で製作された。ランダム化された特定残基を表３に表わした。ＣＤＲ位置は、カバット命名法によってナンバリングした。エラー誘発ＰＣＲを通じて製作したＣＤＲは、もちろん、フレームワーク部分を含むライブラリーをＬＮ０８と名付けた。
【００９９】
【表３】
2015517486.tif 000005
【０１００】
前記ライブラリーは、大腸菌ＸＬ１−ブルー（２００１５８，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）に電気穿孔させ（Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２８：３３３−３６３）、形質転換された細胞をＥｘ１２ヘルパーファージ（ＩＧ  ｔｈｅｒａｐｙ，韓国）の存在下で一晩成長させて、ファージミドＤＮＡを被膜化し、その表面上ｓｃＦｖフラグメントをディスプレイするファージ粒子を生産した。各ライブラリーは、５×１０８個超過の構成源を含有した。
【０１０１】
実施例２．ライブラリーからＥｒｂＢ２特異的抗体の選択
実施例１の抗体ライブラリーからＥｒｂＢ２特異的抗体を選別した。ＮＵＮＣ  ９６ウェルマキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）免疫プレートを４℃で捕獲標的（２μｇ／ｍｌ）に一晩コーティングし、スーパーブロックＴＢＳ（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ，Ｐｉｅｒｃｅ）で２時間遮断した。３７℃で一晩成長させた後、ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈澱させて、ファージを濃縮し、スーパーブロックＴＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（シグマ）に再懸濁させた。以後、ファージ溶液（約１０ｌ２ファージ／ｍｌ）をコーティングされた免疫プレートに添加した。ファージ結合のために、２時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ、０．０５％トウイーン２０で１０回洗浄した。結合されたファージを０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．２）で１０分間溶離し、溶離液を１Ｍ  Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ９．０）で中和した。溶離されたファージを大腸菌ＸＬ１−ブルーで増幅させた。
【０１０２】
親抗体のＫＤ値がピコモルレベルに抗原との親和度が非常に高いレベルなので、親和度が向上した抗体の選別に難点がある。したがって、本発明者らは、親抗体よりも親和度が高い抗体を選別するために、大きく３種の方法を使った。最初の方法で、洗浄時間を最大４４時間まで処理して、ｏｆｆ−ｒａｔｅが向上した抗体を選別しようとした（Ｃｈｅｎｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８１（１９９９））。二番目の方法で、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．２）を使って、前−溶離（ｐｒｅ−ｅｌｕｔｉｏｎ）過程を行った後、最終的に溶離する方法を使い（Ｂｒｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（４）：３９７−９（１９９９））、三番目の方法で、溶離前にチオシアン酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を処理して弱く結合されている抗体を除去する方法を使った（Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０６：１９１−４（１９８８）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２４１（１−２）：１７１−８４（２０００）；Ｈｕｒｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．１３４（１）：５５−６１（２０１０））。
【０１０３】
前記実験を通じて選択された個別クローンをカルベニシリン及びアンピシリンが補充された２ＹＴブロス５００μＬで９６ウェルフォーマットで成長させ、培養上澄み液をファージＥＬＩＳＡに直接使って、標的タンパク質でコーティングされたプレートには結合するが、ＢＳＡでコーティングされたプレートには結合していないファージディスプレイされたｓｃＦｖを検出した（図２）。ＢＳＡコーティングされたプレートに比べて、標的タンパク質コーティングされたプレート上でＯＤ値０．５以上であり、１．０Ｍチオシアン酸アンモニウムを処理しても、結合力を保持するクローンをＥｒｂＢ２に対する特異的結合体（変異体）と定義した。４〜５回の繰り返し実験後、個別クローンをスクリーニングしてライブラリーから標的タンパク質ＥｒｂＢ２に対する結合体を選別した。
【０１０４】
前記特異的結合体のＤＮＡ配列を分析した。分析の結果、１つの特異的結合体（ＡＨ０６）は、カバットによる番号付けシステムによって親抗体４Ｄ５の重鎖可変ドメインの９８、１００ｃ、１０１及び１０２位置でアミノ酸が置換されたということを確認した。前記ＡＨ０６以外の結合体の配列を確認した結果、カバット残基９８、１００ｃ、１０１及び１０２以外に追加的に重鎖可変ドメインでカバット残基４１、９６、９７または１００ｂ、軽鎖可変ドメインでカバット残基５０、５１、５２、５３、５４、７２、９１、９３、９６または９７位置のアミノ酸が置換されたということを確認した。
【０１０５】
最適の特異的結合体を探すために、置換されたそれぞれの残基を組み合わせて、最終的に選別された特異的結合体をＡＨ０６、ＡＨ１６、Ａ０５８及びＡ０９１と名付けた。ヒト化抗体ＡＨ０６の重鎖は、ヒト化４Ｄ５抗体重鎖の変異体であり、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を含む。ヒト化抗体ＡＨ１６は、配列番号２及び配列番号４のアミノ酸配列を含む。ヒト化抗体Ａ０５８は、配列番号３及び配列番号５のアミノ酸配列を含む。ヒト化抗体Ａ０９１は、配列番号６及び配列番号７のアミノ酸配列を含む。前記抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を表４に表わした。また、親抗体４Ｄ５と前記抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列とを比較して、図３及び図４に示した。
【０１０６】
【表４】
2015517486.tif 000006
【０１０７】
実施例３．抗ＥｒｂＢ２抗体の軽鎖及び重鎖全体遺伝子発現ベクターの製造
実施例２から製造されたｓｃＦｖ形態のヒト化抗体の可変ドメイン遺伝子をヒト化抗体の全体遺伝子に製造するために、ｐＣＬＳ０５発現ベクター（大韓民国出願番号第２０１１−００５６６８５号）を使った。まず、前記抗体の重鎖可変ドメイン遺伝子を発現ベクターｐＣＬＳ０５に挿入するために、重鎖可変ドメイン遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ（ＮＥＢ，米国）と３７℃で２時間反応させて切断した後、１．５％アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウム染色とを通じて約１．４ｋｂの遺伝子切片を確認した。同様に、発現ベクターｐＣＬＳ０５も、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで切断して約７．５ｋｂの切断された発現ベクターを確認した。以後、それぞれの遺伝子切片をキアゲン抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，米国）を用いて回収した後、Ｔ４  ＤＮＡ連結酵素（ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ，Ｔａｋａｒａ  Ｈｏｌｄｉｎｇｓ，日本）を用いて１６℃で一晩反応させた後、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させて形質転換体を得た。該得られた形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが含有されたＬＢ培地で一晩培養した後、プラスミドを回収した後、配列分析を通じて重鎖全体遺伝子がベクター内に挿入されたということを確認した。
【０１０８】
ヒト化抗体の重鎖全体遺伝子が入っている前記ｐＣＬＳ０５発現ベクターに軽鎖全体遺伝子を挿入するために、軽鎖全体遺伝子を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ（ＮＥＢ，米国）と３７℃で２時間反応させて切断した後、１．５％アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウム染色とを通じて約０．７ｋｂの遺伝子切片を確認した。同様に、発現ベクターｐＣＬＳ０５も、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで切断して、約８．８ｋｂの切断された発現ベクターを確認した。以後、それぞれの遺伝子切片をキアゲン抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，米国）を用いて回収した後、Ｔ４  ＤＮＡ連結酵素（Ｔａｋａｒａ  Ｈｏｌｄｉｎｇｓ，日本）を用いて１６℃で一晩反応させた後、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させて形質転換体を得た。該得られた形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが含有されたＬＢ培地で一晩培養した後、プラスミドを回収した後、配列分析を通じて全体軽鎖遺伝子がベクター内に挿入されたということを確認した。
【０１０９】
実施例４．ヒト化抗体の発現のためのＣＨＯ細胞の形質転換
ヒト化抗体の動物細胞での活性を測定するために、前記実施例３からそれぞれ製造された発現ベクターを用いてＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ＣＨＯ−ｓ細胞（＃Ｒ８００−０７，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）を形質転換させた。まず、ＣＨＯ細胞を培養するために、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）に８ｍＭ  Ｌ−グルタミン（２５０３０−０８１，Ｇｉｂｃｏ，米国）を添加した培養培地を利用した。５％二酸化炭素が供給される３７℃培養器（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ  ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で２〜３日間前記細胞を培養した後、常温（２５℃）で１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を回収した。次いで、回収されたＣＨＯ−ｓ細胞を０．４％トリパンブルー（Ｆｌｕｋａ，米国）溶液で染色し、血球計算板（ｈｅｍａｔｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて細胞の数を測定した。
【０１１０】
細胞濃度を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生存度（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）＞９５％になるようにＣＨＯ−ｓ細胞を新たな培地で継代培養した。１３２μｇの発現ベクターと１３０μＬ  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ（＃１６４４７−１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）を１０分間反応させた後、準備された細胞と混ぜて５日間ＣＯ２培養器（３７℃、５％  ＣＯ２、１１０ｒｐｍ  Ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）で培養した。
【０１１１】
実施例５．ヒト化抗体の精製
前記実施例４から得た形質転換体を下記のように培養した後、抗体を精製してヒト化抗体を収得した。具体的に、５００ｍｌ三角フラスコに入れられた１００ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地で５×１０７個の細胞を５％  ＣＯ２、３７℃湿潤培養器で５日間培養した。前記細胞培養液を回収し、遠心分離した後、それを濾過して抗体が含まれた培養液のみを得た。また、培養液で抗体のみを精製するために、３０ｍｇ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ／ｍｌの結合能を有するレジン（ｒｅｓｉｎ）であるＭａｂｓｅｌｅｃｔ（１７−５１９９−０１，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，イギリス）１ｍｌをｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｌｕｍｎ（７３２−１０１０，ＢＩＯ−ＲＡＤ，米国）に充填して使った。抗体をタンパク質−Ａと結合させるために、抗体が発現された前記細胞培養液をＭａｂｓｅｌｅｃｔカラムに通過させた後、０．１Ｍクエン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ）緩衝液を通過させて、タンパク質−Ａと結合されたヒト化抗体を溶出させた。以後、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ９．０）緩衝液を前記抗体回収液の１／１０体積で添加して、抗体溶出液のｐＨを中和させた。
【０１１２】
精製された抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）でバッファ交換（ｂｕｆｆｅｒ  ｃｈａｎｇｅ）を進行した。ＭＷＣＯ  ３００００であるＶＩＶＡＳＰＩＮ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＶＳ２０２１）をＰＢＳでウェッティング（ｗｅｔｔｉｎｇ）させた後で、精製された抗体試料を入れて、３，０００ｒｐｍ、４℃、３０分間遠心分離した。０．５ｍｌで濃縮された試料に５ｍｌになるように、ＰＢＳを１０倍体積で添加して遠心分離を３回繰り返すことによって、１，０００倍以上バッファ交換させた。
【０１１３】
精製された抗体のタンパク質をＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｍｉｎｉ  Ｇｅｌｓ  ４〜１２％  ｇｒａｄｉｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＰ０３２１）を使って確認した。その結果、図５に表われたように、精製された抗体の重鎖タンパク質バンド（５万ダルトン分子量位置）及び軽鎖タンパク質バンド（２万５千ダルトン分子量位置）いずれもを確認することができた（図５）。
【０１１４】
実施例６．抗ＥｒｂＢ２抗体のＥｒｂＢ２に対する親和力の測定
本願発明による抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体のＥｒｂＢ２に対する親和度を測定した。まず、文献（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２９３（４）：８６５−８１（１９９９））によって、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）データを得た。ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００表面プラズモン共鳴システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を使って測定された結合及び解離速度定数からＥｒｂＢ２に対する前記抗体の変異体の結合親和度を計算した。Ｍ５センサーチップ表面にアミンカップリング法を使って抗原を固定させた（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９１）１９８：２６８−２７７）。Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を使ってバイオセンサーチップを活性化させて、ＥｒｂＢ２を共有カップリングさせた。ＥｒｂＢ２を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で緩衝液交換し、約３０μｇ／ｍｌで希釈した。ＥｒｂＢ２分取液を５μＬ／分の流速で注入して、カップリングされたタンパク質の約２５０〜３００反応ユニット（ＲＵ）を果たした。１Ｍエタノールアミン溶液を遮断剤として注入した。薬動学の測定のために、１００、５０、２５、１２．５、６．２５及び３．１２５ｎＭに希釈して使い、低濃度から順次に注入した。１０μＬ／分の流速で５分間注入して結合させ、３０分間ランニングバッファを注入して解離させた。表面プラズモン共鳴測定からの平衡解離定数、ＫＤ値をｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。ビアコアデータを表５に要約して表わした。
【０１１５】
【表５】
2015517486.tif 000007
【０１１６】
表５に表われたように、文献（Ｒｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）２１：８５１−８６２）に報告されているＤ９８Ｗ変異体の親和度は、ＫＤ値が２２４ｐＭで親抗体４Ｄ５のＫＤ値４２２ｐＭに比べて、約２倍向上したが、本願発明の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体ＡＨ０６は、ＫＤ値が５０．２ｐＭで親抗体４Ｄ５に比べて、８倍向上した親和度を表わした。また、本願発明のＡＨ１６は、ＫＤ値が２９７ｐＭで親抗体４Ｄ５に比べて、約２倍向上した親和度を表わした（表５）。
【０１１７】
このような結果は、本願発明の４Ｄ５変異体は、親抗体である４Ｄ５に比べて、抗原に対する親和度が著しく改善されたということを表わす。
【０１１８】
実施例７．抗ＥｒｂＢ２抗体の生体外細胞増殖阻害活性の試験
各抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体のＥｒｂＢ２媒介疾病阻害効果を確認するために、胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−５８２２）を使って、抗体の細胞増殖阻害能を試験した。細胞増殖阻害活性の評価のために、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを使って脱着させた後、０．７５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように培地に懸濁させて、９６ウェル細胞培養用プレートに０．１ｍｌずつ接種した。接種後、３７℃、５％  ＣＯ２条件で細胞が付着されるように培養し、細胞にヒト化抗体を処理した。抗体を１０、１、０．１、０．０１及び０．００１μｇ／ｍｌの濃度で処理し、抗体処理時には、ＲＰＭＩ１６４０／２％  ＦＢＳ培地を使った。約６日間反応させた後、ＷＳＴ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を処理して、３〜４時間発色反応させた後、４５０ｎｍ波長値を測定した。
【０１１９】
ＮＣＩ−Ｎ８７細胞に対する抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体及び４Ｄ５抗体の細胞増殖阻害活性を図６〜図８に示した。図７及び図８に表われたように、本願発明の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体は、親抗体４Ｄ５に比べて、約３．５倍まで細胞増殖阻害活性が増加した。一方、前記実施例６で親抗体４Ｄ５に比べて、親和度が２倍ほど向上したと測定されたＤ９８Ｗの細胞増殖阻害活性は、４Ｄ５に比べて、同等レベルの活性を表わすのに留まった（図６）。具体的に、本願発明のＡ０９１のＩＣ５０は、１０．３ｎＭ（４Ｄ５のＩＣ５０は、２５．４ｎＭ）で４Ｄ５に比べて、約２倍効能が向上し、Ａ０５８に対するＩＣ５０は、４．３ｎＭ（４Ｄ５に対するＩＣ５０は、１０．４ｎＭ）で４Ｄ５に比べて、約２．５倍効能が向上した（図７）。また、ＡＨ０６に対するＩＣ５０は、３．４ｎＭ（４Ｄ５に対するＩＣ５０は、１１．６ｎＭ）で４Ｄ５に比べて、約３．５倍効能が向上した（図８）。
【０１２０】
このような結果は、本願発明の４Ｄ５変異体が親抗体４Ｄ５及び文献に開示されたＤ９８Ｗに比べて、親和度だけではなく、細胞増殖阻害活性も、著しく向上したということを表わす。
【０１２１】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したので、当業者にとって、このような具体的な技術は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。
【図１】
2015517486.tif 000008
【図２】
2015517486.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年11月28日(2014.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）軽鎖可変ドメインと、
（ｂ）次のアミノ酸置換で構成された群から選択された２以上のアミノ酸置換を有する重鎖可変ドメインと、
を含む抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント：
配列番号１のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置４１のＰｒｏがＡｒｇに置換、位置９６のＧｌｙがＡｓｎに置換、位置９７のＧｌｙがＡｌａに置換、位置９８のＡｓｐがＴｒｐに置換、位置９８のＡｓｐがＬｙｓに置換、位置１００ｂのＡｌａがＳｅｒに置換、位置１００ｃのＭｅｔがＰｈｅに置換、位置１０１のＡｓｐがＡｌａに置換、位置１０１のＡｓｐがＶａｌに置換、位置１０２のＴｙｒがＨｉｓに置換、及び位置１０２のＴｙｒがＬｅｕに置換。
【請求項２】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置９８のＡｓｐがＴｒｐに置換、位置１００ｃのＭｅｔがＰｈｅに置換、位置１０１のＡｓｐがＡｌａに置換、及び位置１０２のＴｙｒがＬｅｕに置換を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置９６のＧｌｙがＡｓｎに置換、位置９７のＧｌｙがＡｌａに置換、位置９８のＡｓｐがＬｙｓに置換、位置１００ｂのＡｌａがＳｅｒに置換、位置１００ｃのＭｅｔがＰｈｅに置換、位置１０１のＡｓｐがＶａｌに置換、及び位置１０２のＴｙｒがＨｉｓに置換を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置４１のＰｒｏがＡｒｇに置換、位置９８のＡｓｐがＴｒｐに置換、位置１００ｃのＭｅｔがＰｈｅに置換、位置１０１のＡｓｐがＡｌａに置換、及び位置１０２のＴｙｒがＬｅｕに置換を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列または次のアミノ酸置換で構成された群から選択された２以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする請求項１に記載の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント：
配列番号２のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置５０のＳｅｒがＴｈｒに置換、位置５１のＡｌａがＴｈｒに置換、位置５２のＳｅｒがＴｈｒに置換、位置５３のＰｈｅがＴｒｐに置換、位置５４のＬｅｕがＰｒｏに置換、位置７２のＴｈｒがＳｅｒに置換、位置９１のＨｉｓがＴｙｒに置換、位置９３のＴｈｒがＧｌｎに置換、位置９３のＴｈｒがＡｓｎに置換、位置９６のＰｒｏがＡｌａに置換、位置９６のＰｒｏがＶａｌに置換、及び位置９７のＴｈｒがＳｅｒに置換。
【請求項６】
前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置９３のＴｈｒがＧｌｎに置換、位置９６のＰｒｏがＡｌａに置換、及び位置９７のＴｈｒがＳｅｒに置換を含むことを特徴とする請求項５に記載の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列でカバット番号付けシステムによる位置５０のＳｅｒがＴｈｒに置換、位置５１のＡｌａがＴｈｒに置換、位置５２のＳｅｒがＴｈｒに置換、位置５３のＰｈｅがＴｒｐに置換、位置５４のＬｅｕがＰｒｏに置換、位置７２のＴｈｒがＳｅｒに置換、位置９１のＨｉｓがＴｙｒに置換、位置９３のＴｈｒがＡｓｎに置換、及び位置９６のＰｒｏがＶａｌに置換を含むことを特徴とする請求項５に記載の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
前記抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントは、次の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン及び配列番号３のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン及び配列番号４のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン及び配列番号３のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン；または
（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン及び配列番号６のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン。
【請求項９】
前記抗体は、ヒト化抗体であることを特徴とする請求項１に記載の抗ＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載のＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントの重鎖可変ドメインをコードする核酸分子。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれかに記載のＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントの軽鎖可変ドメインをコードする核酸分子。
【請求項１２】
（ａ）請求項１から９のいずれかに記載のＥｒｂＢ２抗体の変異体またはその抗原結合性フラグメントの薬剤学的有効量と、
（ｂ）薬剤学的に許容される担体と、
を含む癌の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項１３】
前記癌は、乳房癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、膵臓癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、大腸癌、及び甲状腺癌で構成された群から選択された癌であることを特徴とする請求項１２に記載の薬剤学的組成物。
【国際調査報告】
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