(57)【要約】基材内の複数の反応サイトの中に液体試料を充填するための試料ローダーが、提供される。試料ローダーは第１のブレードと、第１のブレードに結合された第２のブレードとを含む。試料ローダーは、複数の反応サイトを含む基材に液体試料を分注するように構成されている第１のブレードと第２のブレードとの間の流路をさらに含む。さらに、さまざまな実施形態において、液体試料は、第１のブレードおよび第２のブレードと８５＋／−１５度の前進接触角を有する。さらに、流路から複数の反応サイトに分注される液体試料の充填は、毛管作用に基づいていてもよい。
2015511016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材内の複数の反応サイトの中に液体試料を充填するための試料ローダーであって、前記試料ローダーは、
第１のブレードと、
第２のブレードであって、前記第１のブレードは、前記第２のブレードに結合されている、第２のブレードと、
前記第１のブレードと前記第２のブレードとの間の流路であって、前記流路は、液体試料を基材に分注するように構成され、前記基材は、複数の反応サイトを含む、流路と
を含む、試料ローダー。
【請求項２】
前記流路に流体的に接続されたリザーバーをさらに含み、前記リザーバーは、反応サイトのアレイの中に充填されるべき配置された液体試料を受け取るように構成されている、請求項１に記載の試料ローダー。
【請求項３】
前記第１のブレードおよび前記第２のブレードは、ポリオレフィン類、ポリウレタン類、およびシロキサン類からなる群のうちの１つから構成されている、請求項１に記載の試料ローダー。
【請求項４】
前記第１のブレードおよび前記第２のブレードは、一緒に先細りになることにより先端を形成し、前記先端における前記第１のブレードと前記第２のブレードとの間の距離は、１００μｍ未満である、請求項１に記載の試料ローダー。
【請求項５】
前記第１のブレードおよび前記第２のブレードは、前記液体試料を前記流路から分注するために前記基材と接触する、請求項１に記載の試料ローダー。
【請求項６】
前記液体試料は、前記第１のブレードおよび前記第２のブレードと８５＋／−１５度の前進接触角を有する、請求項１に記載の試料ローダー。
【請求項７】
前記流路から前記複数の反応サイトに分注される前記液体試料の充填は、毛管作用に基づいている、請求項１に記載の試料ローダー。
【請求項８】
前進接触角と後退接触角との間のヒステリシスは、０度から３０度までの間である、請求項１に記載の試料ローダー。
【請求項９】
基材における複数の反応サイトの中に液体試料を充填する方法であって、前記方法は、
液体試料を試料ローダーのリザーバーに配置することと、
前記試料ローダーを前記複数の反応サイトを含む前記基材に接触させることと、
前記液体試料が前記複数の反応サイトにわたって配置されるように、前記試料ローダーを前記基材に接触させながら、前記試料ローダーを前記複数の反応サイトにわたって横方向に移動させることと
を含む、方法。
【請求項１０】
液体試料の体積は、毛管作用によって各反応サイトの中に引き込まれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料ローダーは、第１のブレードおよび第２のブレードを含み、前記第１のブレードおよび前記第２のブレードは、前記第１のブレードと前記第２のブレードとの間の前記液体試料を前記複数の反応サイトに配置するように構成されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記液体試料は、試料ローダーと８５＋／−１５度の前進接触角を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前進接触角と後退接触角との間のヒステリシスは、０度から３０度までの間である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料ローダーは、ポリオレフィン類、ポリウレタン類、およびシロキサン類からなる群からの材料から構成されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記液体試料は、前記基材に配置される前に前記第１のブレードと前記第２のブレードとの間の流路を通って前記リザーバーから移動する、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記基材の表面および前記複数の反応サイトの表面は親水性である、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
基材の中に複数の液体試料を充填するための装置であって、前記装置は、
ケースと、
前記ケース内の静止容積であって、前記静止容積は、基材と複数の液体試料で充填されている複数の反応サイトとを含むチップを受け取るように構成されている、静止容積と、
前記ケースと隣接する関係にあるように構成されている漏斗状ガイドであって、前記漏斗状ガイドは、前記チップが前記漏斗状ガイドを通過している間に、前記チップに接触することによって、前記複数の反応サイトにおける前記複数の液体試料の充填を容易にするように構成されている、漏斗状ガイドと
を含む、装置。
【請求項１８】
前記静止容積は、カプセル化媒体を含む、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記カプセル化媒体は、前記複数の液体試料の蒸発を最小限にするように構成されている、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記カプセル化媒体は、前記静止容積内で前記チップを取り囲む気泡を最小限にするように構成されている、請求項１８に記載の装置。
【請求項２１】
前記カプセル化媒体は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）であり、前記ＰＤＭＳは、完全には架橋されていない、請求項１８に記載の装置。
【請求項２２】
前記ＰＤＭＳは、完全に硬化されている、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記ＰＤＭＳは、０．８重量％の架橋剤を含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項２４】
前記カプセル化媒体は、生物学的反応が行われた後に、前記複数の試料のうちの少なくとも１つが前記チップから引き出されることを可能にするように構成されている、請求項１８に記載の装置。
【請求項２５】
前記漏斗状ガイドは、疎水性である、請求項１７に記載の装置。
【請求項２６】
前記複数の液体試料は、前記基材に含まれている複数のスルーホールの中に充填される、請求項１７に記載の装置。
【請求項２７】
前記複数のスルーホールは、各々、約１ナノリットルの容積を有する、請求項１７に記載の装置。
【請求項２８】
基材の中に複数の液体試料を充填する方法であって、前記方法は、
漏斗状ガイドの中に液体試料を配置することと、
前記漏斗状ガイドにチップを挿入することであって、前記チップは、基材および複数の反応サイトを含み、前記漏斗状ガイドは、前記チップと接触し且つ前記チップが前記漏斗状ガイドを通過することを可能にするように構成されている、ことと、
前記チップを前記漏斗状ガイドに通過させることにより、前記漏斗状ガイドに配置された前記液体試料を前記複数の反応サイトに充填することであって、前記チップへの前記漏斗状ガイドの前記接触は、前記液体試料の前記充填を容易にする、ことと
を含む、方法。
【請求項２９】
静止容積の中に前記チップを通すことであって、前記基材の静止容積は、カプセル化媒体を含む、こと
をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の反応サイトのうちの少なくともいくつかは、約１ナノリットルである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記チップは、少なくとも３０，０００個の反応サイトを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数の反応サイトの少なくとも８０％は、前記液体試料で充填される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記カプセル化媒体は、前記静止容積に予め充填されている、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１２年３月１６日出願の米国仮特許出願第６１／６１２，００５号、２０１２年３月１６日出願の米国仮特許出願第６１／６１２，０８７号、２０１２年１１月７日出願の米国仮特許出願第６１／７２３，７５９号、２０１２年３月１６日出願の米国仮特許出願第６１／６１２，００８号、２０１２年１１月７日出願の米国仮特許出願第６１／７２３，６５８号、および２０１２年１１月７日出願の米国仮特許出願第６１／７２３，７３８号の優先権の利益を主張し、それらの全てはまた、本明細書でそれらの全体が参照によって援用される。
【０００２】
背景
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標的ＤＮＡ配列の増幅法である。これまでは、ＰＣＲは一般に９６ウェルマイクロプレートまたは３８４ウェルマイクロプレート内で行われてきた。より高いスループットが望まれる場合、マイクロプレートにおける従来のＰＣＲ法は、費用効果的ではなくまたは効率的ではない。一方、ＰＣＲの反応容積を減少させることが、試薬の消費量を低減させ、反応容積の熱質量の減少から、増幅回数を低下させる可能性がある。この方策は、アレイフォーマット（ｍ×ｎ）において実施されてもよく、結果として、多数のより小さい反応容積を生じさせる。さらに、アレイを使用することにより、定量化感度、ダイナミックレンジ、および特異性が高められたスケーラブルなハイスループット解析が可能になる。
【０００３】
アレイフォーマットは、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）を行うためにも使用されてきた。ｄＰＣＲの結果は、レア対立遺伝子の濃度を検出および定量化するために使用されて、核酸試料の絶対定量化を提供し、および核酸濃度の低い倍率変化（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅｓ）を測定することができる。一般に、複製の数を増やすことは、ｄＰＣＲの結果の精度および再現性を増大させる。
【０００４】
ほとんどの定量的なポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）プラットフォームにおけるアレイフォーマットは、アッセイ単位の試料の実験（ｓａｍｐｌｅ−ｂｙ−ａｓｓａｙ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）のために設計されており、ＰＣＲの結果は、ポストラン解析のためにアドレス可能である必要がある。しかしながら、ｄＰＣＲのために、各ＰＣＲの結果の特定の位置またはウェルは重要でない可能性があり、および試料あたりの陽性および陰性の複製の数のみが解析される可能性がある。
【０００５】
ｄＰＣＲにおいて、比較的に少数の標的ポリヌクレオチド配列または標的ヌクレオチド配列を含有する溶液は、各試料が大体、１分子の標的ヌクレオチド配列を含有しているか、または標的ヌクレオチド配列を全く含有していないように、多数の小さい試験試料に細分される可能性がある。試料が続いてＰＣＲのプロトコル、手順、または実験において熱サイクルにかけられると、標的ヌクレオチド配列を含有する試料は増幅されおよび陽性検出信号を生み出し、一方、標的ヌクレオチド配列を含有しない試料は増幅されず検出信号を生み出さない。
【０００６】
上述のような用途のために反応容積を減らし続けると、例えば、アレイに試料体積を充填することおよび試料体積の物理的分離を維持することへの信頼に関する課題に繋がる可能性がある。換言すると、できるだけ多くのウェルまたはスルーホールの中に試料体積を充填し、およびウェル間またはスルーホール間のクロストークを低減させることが重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書中に記載されるさまざまな実施形態に従って、基材内の複数の反応サイトの中に液体試料を充填するための試料ローダーが提供される。試料ローダーは、第１のブレード、および第１のブレードに結合された第２のブレードを含む。試料ローダーは、複数の反応サイトを含む基材に液体試料を分注するように構成された、第１のブレードと第２のブレードとの間の流路をさらに含む。さらに、さまざまな実施形態において、液体試料は、第１のブレードおよび第２のブレードと８５＋／−１５度の前進接触角を有する。さらに、流路から複数の反応サイトに分注される液体試料の充填は、毛管作用に基づいていてもよい。
【０００８】
本明細書中に記載される他の実施形態において、基材内の複数の反応サイトの中に液体試料を充填する方法が提供される。方法は、液体試料を試料ローダーのリザーバーに配置することを含む。次いで、複数の反応サイトを含む基材に、試料ローダーを接触させること。方法は、さらに、液体試料が複数の反応サイトにわたって配置されるように、試料ローダーを基材に接触させながら、試料ローダーを複数の反応サイトにわたって水平方向に移動させることを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、本明細書中に記載されるさまざまな実施形態による基材における例示的なアレイを示す図である。
【００１０】
【図１Ｂ】図１Ｂは、本明細書中に記載されるさまざまな実施形態による基材におけるアレイの断面図である。
【００１１】
【図２】図２は、本明細書中に記載されるさまざまな実施形態によるアレイ内の試料体積の充填を示す図である。
【００１２】
【図３Ａ】図３Ａは、本明細書中に記載されるさまざまな実施形態によるアレイ内に液体試料を充填するためのケースの図である。
【００１３】
【図３Ｂ】図３Ｂは、本明細書中に記載されるさまざまな実施形態によるアレイを含む、挿入された基材を用いて液体試料を充填するためのケースの例示的な図である。
【００１４】
【図３Ｃ】図３Ｃは、本明細書中に記載されるさまざまな実施形態によるアレイを含む、挿入された基材を用いて液体試料を充填するためのケースの別の例示的な図である。
【００１５】
【図４】図４は、本明細書中に記載されるさまざまな実施形態によるアレイ内に液体試料を充填する例示的な方法を示す図である。
【００１６】
【図５Ａ】図５Ａは、本明細書中に記載されるさまざまな実施形態による液体試料を充填するためのケースの例示的な構成要素を示す図である。
【００１７】
【図５Ｂ】図５Ｂは、本明細書中に記載される実施形態による液体試料を充填するためのケースのアレイホルダー部分を示す図である。
【００１８】
【図５Ｃ】図５Ｃは、本明細書中に記載されるさまざまな実施形態による充填のための組み立てられたケースを示す図である。
【００１９】
【図６】図６は、本教示のさまざまな実施形態によるアレイ内に液体試料を充填するための１つの例示的なケースを示す図である。
【００２０】
【図７】図７は、本教示のさまざまな実施形態によるアレイ内に液体試料を充填するための別の例示的なケースを示す図である。
【００２１】
【図８Ａ】図８Ａは、本教示のさまざまな実施形態によるアレイ内に液体試料を充填するためのさらに別の例示的なケースを示す図である。
【００２２】
【図８Ｂ】図８Ｂは、本教示のさまざまな実施形態による図８Ａに示されるアレイ内に液体試料を充填するための例示的なケースの別の図である。
【００２３】
【図９Ａ】図９Ａは、本教示のさまざまな実施形態による例示的な漏斗状ガイドの１つの図である。
【００２４】
【図９Ｂ】図９Ｂは、本教示のさまざまな実施形態による図８Ａに示される例示的な漏斗状ガイドの断面図である。
【００２５】
【図１０】図１０は、本教示のさまざまな実施形態による１つよりも多くの試料を充填するための例示的なチップの図である。
【００２６】
【図１１】図１１は、本教示のさまざまな実施形態による充填装置を示す図である。
【００２７】
【図１２】図１２は、本教示のさまざまな実施形態による別の充填装置を示す図である。
【００２８】
【図１３】図１３は、本教示のさまざまな実施形態による試料ローダーを示す図である。
【００２９】
【図１４Ａ】図１４Ａは、本教示のさまざまな実施形態による試料ローダーの側面図である。
【００３０】
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、本教示のさまざまな実施形態による試料ローダーの先端を示す図である。
【００３１】
【図１５】図１５は、本教示のさまざまな実施形態による別の試料ローダーを示す図である。
【００３２】
【図１６】図１６は、本教示のさまざまな実施形態による別の充填装置を示す図である。
【００３３】
【図１７】図１７は、本教示のさまざまな実施形態による別の充填装置を示す図である。
【００３４】
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｃは、本教示のさまざまな実施形態による充填方法を示す図である。
【００３５】
【図１９】図１９Ａ〜図１９Ｂは、本教示のさまざまな実施形態によるケース密封方法を示す図である。
【００３６】
【図２０】図２０は、本教示のさまざまな実施形態による後退接触角および前進接触角を示す図である。
【００３７】
【図２１】図２１は、本教示のさまざまな実施形態による試料ローダーによる反応サイトの充填を示す図である。
【００３８】
【図２２】図２２は、本教示の実施形態が実施されてもよいポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）機器を示すブロック図である。
【００３９】
【図２３】図２３は、本明細書中に記載されるさまざまな実施形態による充填された試料の熱サイクルの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明のより十分な理解を提供するために、以下の記載は、具体的構成、パラメーター、実施例などの多くの具体的詳細を示す。しかしながら、そのような記載は、本発明の範囲を制限するものとして意図されるものではなく、例示的な実施形態のよりよい説明を提供するように意図されるものであることを認識されたい。
【００４１】
本発明は、基材内のアレイ内に試料、試料体積、または反応容積を充填するための方法およびシステムに関し、より具体的には、基材内の個々の反応サイトのアレイ内に試料を充填することに関する。
【００４２】
さまざまな実施形態において、多数の小容積試料における標的を検出するために使用される物品内に試料を充填するためのデバイス、器具、システム、および方法が提供される。これらの標的は、ＤＮＡ配列（無細胞ＤＮＡを含む）、ＲＮＡ配列、遺伝子、オリゴヌクレオチド、分子、タンパク質、バイオマーカー、細胞（例えば、循環腫瘍（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ）細胞）、または任意の他の適当な標的生体分子を含むがそれらに限定されない任意の適当な生物学的標的であってもよい。さまざまな実施形態において、そのような生物学的要素は、胎児診断、マルチプレックスｄＰＣＲ、ウイルス検出および定量化の標準、遺伝子型判定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）、シークエンス確認（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）、変異検出、遺伝子組み換え生物の検出、レア対立遺伝子検出、およびコピー数変動のような用途において、さまざまなＰＣＲ、ｑＰＣＲ、および／またはｄＰＣＲ法およびシステムと共に使用されてもよい。
【００４３】
多数の試料が処理されている定量的なポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）に一般に適用可能であるが、任意の適当なＰＣＲ法は、本明細書中に記載されるさまざまな実施形態に従って使用されてもよいことを認識されたい。適当なＰＣＲ法は、それらに限定されるものではないが、例えば、デジタルＰＣＲ、対立遺伝子特異的なＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ライゲーション媒介ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ｃａｓｔＰＣＲ、ゲノムウォーキング、およびブリッジＰＣＲを含む。
【００４４】
以下に記載されるように、本明細書中に記載されるさまざまな実施形態に従って、反応サイトは、それらに限定されるものではないが、例えば、スルーホール、試料保持領域、ウェル、インデント（ｉｎｄｅｎｔａｔｉｏｎ）、スポット、空洞、および反応室を含んでいてもよい。
【００４５】
さらに、本明細書中で使用されるように、熱サイクルは、例えば、サーマルサイクラー、等温増幅、サーマルコンベンション（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）、赤外線介在熱サイクル、またはヘリカーゼ依存性増幅の使用を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、チップは、作り付けの加熱素子と一体化されていてもよい。さまざまな実施形態において、チップは、半導体と一体化されていてもよい。
【００４６】
さまざまな実施形態に従って、標的の検出は、それらに限定されるものではないが、蛍光検出、陽性イオンまたは陰性イオンの検出、ｐＨ検出、電圧検出、または電流検出のいずれか１つまたは組み合わせであってもよい。
【００４７】
本明細書中に記載されるさまざまな実施形態は、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）に特に適している。デジタルＰＣＲにおいて、比較的に少数の標的ポリヌクレオチド配列または標的ヌクレオチド配列を含有する溶液は、各試料が大体、１分子の標的ヌクレオチド配列を含有しているか、または標的ヌクレオチド配列を全く含有していないように、多数の小さい試験試料に細分される可能性がある。試料が続いてＰＣＲのプロトコル、手順、または実験において熱サイクルにかけられると、標的ヌクレオチド配列を含有する試料は増幅されおよび陽性検出信号を生み出し、一方、標的ヌクレオチド配列を含有しない試料は増幅されず検出信号を生み出さない。ポアソン統計を用いると、元の溶液中の標的ヌクレオチド配列の数は、陽性検出信号を生み出す試料の数と相関している可能性がある。
【００４８】
本明細書中に記載される実施形態によるチップの例示的なｄＰＣＲの結果は、図２３に示される。
【００４９】
典型的なｄＰＣＲのプロトコル、手順、または実験を行うために、初期試料溶液を、単純および費用効果的である方法で、数ナノリットル、１ナノリットルまたは約１ナノリットル、あるいは１ナノリットル未満の容積をそれぞれ有する何万ものまたは何十万もの試験試料に分けることができることは、有利である。標的ヌクレオチド配列の数は非常に少ない可能性があるので、初期溶液の全内容が複数の反応サイトを占めてそれらに含有されることは、そのような状況において重要である可能性もある。
【００５０】
本明細書中に記載される実施形態は、初期試料溶液を、試料溶液の全てまたは本質的に全てを占めるように複数の反応サイト内に分配することによって、これらのおよび他のｄＰＣＲの設計制約を解消する。
【００５１】
高スループットのＰＣＲアッセイおよびｄＰＣＲ法のために、アレイフォーマットを使用して一度に実施される反応の数を増やすと同時に液体試料の反応容積を低減させる方策が採用されてもよい。液体試料の反応容積のアレイは、複数の反応サイト内の基材内にあってもよい。本明細書中に記載されるさまざまな実施形態に従って、反応サイトは、それらに限定されるものではないが、スルーホール、ウェル、インデント、スポット、空洞、反応室、または試料を保持することができる任意の構造であってもよい。いくつかの実施形態において、スルーホールまたはウェルは、直径が先細りになっていてもよい。
【００５２】
液体試料の反応容積を減少させると、より高密度の反応容積が可能になり、その結果、所与の領域内でより多くの反応が行われ得る。例えば、基材内の３００μｍの直径のスルーホールからなる反応サイトのアレイは、約３０ｎＬの反応容積を含有することができる。例えば、アレイ内の各スルーホールの寸法を直径６０〜７０μｍに減少させることによって、各反応容積は、１００ｐＬの液体試料になり得る。本明細書中に記載されるさまざまな実施形態に従って、反応容積は、約１ｐＬ〜３０ｎＬの液体試料の範囲に及ぶことがある。いくつかの実施形態において、反応サイトのアレイは、ダイナミックレンジを増大させるために、多様な異なる容積の反応サイトから構成されていてもよい。さらに、ダイナミックレンジは、液体試料の１回よりも多くの回数の希釈を用いることによって増大されてもよい。
【００５３】
図１Ａは、本明細書中に記載されるさまざまな実施形態によるアレイを含むチップ１００を示す。チップ１００は、例えば、物品、デバイス、アレイ、スライド、またはプラテンと呼ばれてもよい。チップ１００は、基材１１０および反応サイトのアレイ１２０を含む。基材１１０は、それらに限定されるものではないが、例えば、金属、ガラス、セラミック、シリコンを含むさまざまな材料であってもよい。アレイ１２０は、複数の反応サイト１０４を含む。複数の反応サイト１０４は、例えば、スルーホール、ウェル、インデント、スポット、空洞、または反応室であってもよい。また、反応サイトは、例えば、円形、三角形、または六角形のような、多様な断面形状を有していてもよい。他の形状を有することにより、より密接に詰まった反応サイトを可能にして、所与の領域内の反応の数をさらに増大させることができる場合がある。
【００５４】
図１Ｂは、さまざまな実施形態による反応サイト１０４のアレイの断面図を示す。チップ１００は、第１の表面１１２および第２の表面１１４を有する。各反応サイト１０４は、第１の表面１１２内の開口部から第２の表面１１４内の開口部まで延びる。反応サイト１０４は、処理または検査されるべき生物学的試料を含有するそれぞれの液体試料を保持するために、毛管作用により十分な表面張力を提供するように構成されていてもよい。チップ１００は、参照によりその全体が完全に本明細書中に示されているものとして本明細書中に組み込まれるＵＳＰＮ６，３０６，５７８、ＵＳＰＮ７，３３２，２７１、ＵＳＰＮ７，６０４，９８３、ＵＳＰＮ７，６８２，５６５、ＵＳＰＮ６，３８７，３３１、またはＵＳＰＮ６，８９３，８７７のうちのいずれかに開示されているような全体的な形状または構造を有していてもよい。図１Ｂに示される例において、反応サイトはスルーホールである。
【００５５】
さまざまな実施形態において、第１の表面１１２および第２の表面１１４は親水性材料を含み、また反応サイト１０４の表面は親水性材料を含む。これらの実施形態において、毛管作用は、反応サイトへの液体試料の充填を容易にする。さらに、毛管作用は液体試料を反応サイト内に保持する。
【００５６】
さまざまな実施形態において、第１の表面１１２および第２の表面１１４は疎水性材料を含み、また反応サイト１０４の表面は疎水性材料を含む。これらの実施形態において、毛管作用は反応サイトへの液体試料の充填を容易にする。さらに、毛管作用は液体試料を反応サイト内に保持する。
【００５７】
いくつかの実施形態において、反応サイト１０４の表面は親水性材料を含み、一方、第１の表面１１２および第２の表面１１４は疎水性材料を含む。このようにすると、液体試料は親水性表面に向かう傾向があるので、反応サイト１０４内への液体試料の充填が容易にされる。さらに、反応サイト１０４内に充填された液体試料間の交差汚染またはクロストークは最小限にされる。そのような親水性領域のアレイは、疎水性表面上の親水性の島を含んでいてもよく、また、それに限定されるわけではないが、堆積、プラズマ、マスキング法、転写、スクリーン印刷、スポッティング、または同様のものを含む広範な微細加工技術を用いて基材１０２上に形成されていてもよい。
【００５８】
示される実施形態において、基材１１０は、各反応サイト１０４が約１．３ナノリットルの容積を有するように、第１の表面１１２と第２の表面１１４との間で３００マイクロメートルの厚さを有する。あるいはまた、例えば反応サイト１０４の直径および／または基材１０２の厚さを低減させることによって、各反応サイトの容積は１．３ナノリットル未満であってもよい。
【００５９】
その結果、各反応サイトは、１ナノリットル以下、１００ピコリットル以下、３０ピコリットル以下、または１０ピコリットル以下である容積を有していてもよい。他の実施形態において、いくつかのまたは全ての反応サイトの容積は、１〜２０ナノリットルの範囲内である。さまざまな実施形態に従って、複数の反応サイトは、ダイナミックレンジを増大させるために、ある範囲のいろいろな容積を含んでいてもよい。
【００６０】
ある実施形態において、反応サイト１０４の密度は、平方ミリメートルあたり少なくとも１００反応サイトであってもよい。他の実施形態において、反応サイトの密度がより高い場合がある。例えば、チップ１００内の反応サイト１０４の密度は、平方ミリメートルあたり１５０反応サイト以上、平方ミリメートルあたり２００反応サイト以上、平方ミリメートルあたり５００反応サイト以上、平方ミリメートルあたり１，０００反応サイト以上、または平方ミリメートルあたり１０，０００反応サイト以上であってもよい。
【００６１】
ある実施形態において、スルーホールの密度は、平方ミリメートルあたり少なくとも１００反応サイトであってもよい。他の実施形態において、スルーホールの密度がより高い場合がある。例えば、チップ１００内部のスルーホールの密度は、平方ミリメートルあたり１５０スルーホール以上、平方ミリメートルあたり２００スルーホール以上、平方ミリメートルあたり５００スルーホール以上、平方ミリメートルあたり１，０００スルーホール以上、または平方ミリメートルあたり１０，０００スルーホール以上であってもよい。
【００６２】
チップ１００の他の実施形態は、全ての目的のために本明細書中に組み込まれる２０１２年３月１６日に出願された仮出願第６１／６１２，０８７号（整理番号ＬＴ００６５５  ＰＲＯ）および２０１２年１１月７日に出願された仮出願第６１／７２３，７５９号（整理番号ＬＴ００６５５  ＰＲＯ  ２）にさらに説明されている。
【００６３】
上述のように、反応サイトの寸法を低減させると、各反応サイトの中に液体試料を充填することに関連する課題が生じる。
【００６４】
上述のように、残余液体試料が非常に少ないか全くないように液体試料を充填することが望ましい。チップを充填するための本明細書中に記載されるさまざまな実施形態に従って、充填のためにチップに旋用される液体試料の体積の少なくとも７５％が複数の反応サイトに充填される。いくつかの実施形態において、充填のためにチップに旋用される液体試料の体積の少なくとも９０％が複数の反応サイトに充填される。さまざまな実施形態において、充填されるべきチップに旋用される液体試料の体積は、チップ上の複数の反応サイトの容積の合計の容積と等しい。いくつかの実施形態において、チップに旋用される液体試料の体積は、チップ上の複数の反応サイトの容積の合計から１つの反応サイトの容積を引いた容積である。
【００６５】
図２を参照して、本明細書中に記載されるさまざまな実施形態に従って、反応サイトのアレイ１０４は、液体試料の体積をチップ１００上に配置させることによって充填されてもよい。可撓性材料からなる試料ローダー２０６は、アレイ１０４と接触してアレイ１０４の毛管充填を容易にするのに十分な圧力で反応サイトのアレイ１０４上に液体試料を広げるために使用されてもよい。充分な圧力は、横方向に一掃する様式で加えられた際に、表面の疎水性／親水性特性に打ち勝つのに充分な力であってもよい。いくつかの実施形態において、試料ローダー２０６は固定して保持されて、チップ１００がアレイ１０４上に液体試料を広げるように移動させられてもよい。他の実施形態において、反応サイト１０４のアレイを充填するために、チップ１００は固定して保持され、一方、試料ローダー２０６がアレイ１０４上を移動させられてもよい。さらに、このような方法で、チップ１００から過剰の液体試料を取り除いてもよい。
【００６６】
さらに、本明細書に記載されるさまざまな実施形態に従って、複数の反応サイトは、チップがケースまたはキャリア内に移動させられた際に充填されてもよい。ケースは、液体試料の蒸発を防止するのに役立つことができ、また、熱サイクルの間の各反応容積の安定性も増大させる。
【００６７】
図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃは、本明細書に開示されるさまざまな実施形態による反応サイトのアレイを充填するための例示的なケース３００のさまざまな図を示す。ケース３００は、第１の部分３０２および第２の部分３０４を含んでいてもよい。第１の部分３０２および第２の部分３０４は、閉じられた位置において第１の部分３０２および第２の部分３０４がチップ１００を囲繞するように、移動可能に接続されるように構成されている。
【００６８】
本教示のさまざまな実施形態に従って、チップ内の反応サイトを充填するための方法は図４中に示される。ステップ４０２において、液体試料は試料ローダーに配置される。さまざまな実施形態において、試料ローダーは、液体試料が試料ローダー内部のリザーバー内に保持されるように、液体試料を配置するためのアクセスポートを有していてもよい。他の実施形態において、液体試料は、反応サイトのアレイを含有するチップ上に直接的に配置されてもよい。ステップ４０４において、試料ローダーは、チップと接触させられる。ステップ４０６において、試料ローダーは、反応サイトを液体試料で充填するために、反応サイトの毛管作用が生じるのに充分な圧力で液体試料が反応サイトと接触させられるように、チップの表面を横断して横方向に移動させられる。ステップ４０８は、任意選択的に行われてもよい。ステップ４０８において、試料ローダーによってチップの表面に配置され且つ反応サイトに充填されていない何らかの過剰の液体試料の除去は、熱を加えることによって容易にされてもよい。チップは加熱表面によって加熱されてもよい。過剰の液体試料の除去は、例えば、液体試料内の生体分子の増幅の間に生じ得るエラーを低減するのに役立ち得る。
【００６９】
図５Ｂを参照して、第１の部分３０２は、チップ１００を保持していてもよい。いくつかの実施形態において、チップ１００は、ポート３１０に塗布された接着剤によって、ケース３００の第１の部分３０２内に保持されていてもよい。接着剤は、例えば、一種の糊またはＵＶ接着剤であってもよい。他の実施形態において、チップ１００は、例えば、締め具（ｆａｓｔｅｎｅｒ）または留め具（ｃｌｉｐ）によって第１の部分３０２内に保持されていてもよい。
【００７０】
さまざまな実施形態に従って、漏斗状ガイド３０８は、ケース３００の第２の部分３０４に対して隣接する関係にあり、チップ１００の反応サイト内への試料の導入を容易にする。漏斗状ガイド３０８は、反応サイトを充填するためにチップ１００に接触し圧力を加えるのに充分に可撓性の疎水性材料であってもよい。漏斗状ガイド３０８は、例えば、シリコーン、ＲＴＶ、ポリウレタン、天然ゴム、他のエラストマーまたはポリオレフィンから構成されていてもよい。漏斗状ガイド３０８は、チップ１００が漏斗状ガイド３０８を通過して移動させられる際に、液体試料をチップ１００上に広げて個々の反応サイトを充填するように構成されている。また、漏斗状ガイド３０８は、ガスケットであるように構成されていてもよい。
【００７１】
このように、本明細書を通じて特に図４で検討された方法で、試料材料の導入は容易になり、また必要とされる試料の最小容積は低減可能である。さまざまな実施形態において、漏斗状ガイド３０８はケース内に一体化されており、またはケースに対して結合されている。あるいはまた、漏斗状ガイド３０８は、別個のまたは取り外し可能なアイテムであってもよい。
【００７２】
漏斗状ガイド３０８は、さまざまな形状および寸法であってもよい。例えば、１つの実施形態において、漏斗状ガイド３０８は、図９Ａおよび図９Ｂに示されるように、狭いスリット９０４を備えるトラフの形をとってもよい。スリット９０４は、液体試料が漏斗状ガイド３０８内に置かれたときに、液体試料がそれを通過しないように、十分に狭い幅を有する。スリット９０４は、チップ１００が通過してケースの第２の部分３０４の内部に位置する静止容積（ｒｅｓｔｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ）３１２内に入るのを可能にする。いくつかの実施形態において、例えば、デブリまたは空気を締め出すために、薄膜がスリット９０４を覆って静止容積３１２を囲繞された状態に保っていてもよい。チップ１００が漏斗状ガイド３０８を通じて挿入される際に、チップ１００は、スリット９０４を覆う膜を破いてもよい。
【００７３】
第２の部分３０４には試料ポート３０６も結合されている。液体試料は、チップ１００を充填するために、試料ポート３０６内に配置されていてもよい。試料ポート３０６内に配置された液体試料は、漏斗状ガイド３０８内に保持されてもよい。さらに、漏斗状ガイド３０８は、試料の充填を容易にするように、その長さに沿ったいくつかの点として試料材料を受け取るように構成されていてもよい。漏斗状ガイドの長さに沿ったいくつかの試料充填ポートは、液体試料の効率的な充填を容易にし得る。漏斗状ガイドの長さに沿ったいくつかの充填ポートは、チップ１００と協働するように構成されていてもよい。
【００７４】
チップ１００は、複数の試料をチップの別個の部分に充填してスループットを増大させるために、別個の領域に細分されていてもよい。図１０は、少なくとも２つの試料を含むように構成されているチップ１０００を示す。仕切り１００４は、反応サイトの第２のアレイ１００８から反応サイトの第１のアレイ１００６を分離する。このような方法で、チップは、第１の液体試料が第１のアレイ１００６内に充填され且つ第２の液体試料が第２のアレイ１００８内に充填されるように充填されてもよい。いくつかの実施形態において、第１の液体試料は試料のある希釈液であってもよく、また第２の液体試料は試料の別の希釈液であってもよい。
【００７５】
他の実施形態において、第１および第２の液体試料は、例えば、図３Ａ〜図３Ｃまたは図８Ａ〜図８Ｂに示されるケースによってチップ１０００内に充填されてもよい。本明細書中に記載されるさまざまな実施形態によるケースを使用して、液体試料は、チップ上の所望のアレイの中に充填されるように、漏斗状ガイド内に充填されてもよい。それに対して、チップ１００２は、さまざまな実施形態による複数の試料領域の単一のアレイを含むチップを示す。
【００７６】
上述のように、液体試料が保持されてチップ１００と接触するように、漏斗状ガイド３０８はトラフ状のウェルを形成するような構成を有していてもよい。
【００７７】
上述のように、第２の部分３０４は静止容積３１２を含んでいてもよい。静止容積３１２は、ケース３００が閉じられた位置にあるときにチップが保持される場所である。さまざまな実施形態において、静止容積３１２は浸漬液で満たされていてもよい。浸漬液は、封入媒体（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）と称される場合もある。封入媒体は、反応サイト１０４内に含有される液体試料と混ざらない不混和流体（例えば、液体またはゲル）であってもよく、また反応サイト１０４内に含有される液体試料の蒸発を防止するまたは低減させるように構成されていてもよい。
【００７８】
さまざまな実施形態に従って、封入媒体は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）であってもよい。ＰＤＭＳは、反応サイトに充填される液体試料を汚染することなくチップ１００の反応サイトを十分に封入するように、低度に架橋（ｕｎｄｅｒ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ）されていてもよい。
【００７９】
ＰＤＭＳは、これをＰＣＲと共に使用するために適当とする、いくつかの特性を有する。例えば、ＰＤＭＳは、自己蛍光性が非常に低く、ＰＣＲの温度で熱的に安定であり、且つ重合プロセスに対して非抑制的である。さらに、ＰＤＭＳは、水性試料を含有していてもよいが、しかし水蒸気に対してガス透過性であってもよい。
【００８０】
ＰＤＭＳは、低度に架橋されていてもよいが、しかし完全に硬化されてもよい。１つの例において、封入媒体は、０．８重量％の架橋剤が添加されたＰＤＭＳである。典型的には、完全に架橋されたＰＤＭＳは、架橋剤が１０重量％添加されている。他の適当な封入媒体は、ＰＣＲに適合する他の粘弾性材料であってもよい。
【００８１】
ＰＤＭＳを低度に架橋することによって、ＰＤＭＳは、完全に架橋された材料に通常関連する全ての特質を維持しつつ、適当な封入材料（ｅｎｃａｐｓｕｌａｎｔ）として機能することができる。例えば、ＰＤＭＳは、１０パーセント未満である架橋剤の量を使用することによって低度に架橋されてもよい。例えば、１％以下の架橋レベルは、あるｄＰＣＲ用途のようなあるＰＣＲ用途のためのある設計要件を満たす。多重ｄＰＣＲ応答は、０．８％以下である架橋剤の量で封入された平板１００を使用して示されている。さらに、低度に架橋されたＰＤＭＳ材料のフロリナート（Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ）に比べて高い粘度に起因して、ＰＤＭＳカプセル化媒体（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）は、梱包要件および顧客のワークフローの解決策に役立つ可能性がある。
【００８２】
チップ１００が試料および漏斗状ガイド３０８のスリットを通過する際に、反応サイトは、試料で満たされ静止容積３１２内に入ることとなる。チップ１００の挿入の前に静止容積３１２がカプセル化媒体で満たされる場合、満たされた反応サイトが空気に曝される時間の長さおよび試料の蒸発量が最小限にされる。
【００８３】
ケースは、ＰＣＲ適合性を有するなど、生物学的反応と適合する一連の材料から作製されてもよい。例えば、ＰＣＲ適合性を有するように、ケースは、自己蛍光性が低く、ＰＣＲ反応に対して非抑制的であり、ＰＣＲのための励起および検出波長に対して光学的に透明であり、且つＰＣＲの温度で熱的に安定であってもよい。ケースのための材料の例は、それらに限定されるものではないが、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリ環状オレフィン、環状オレフィン、または他のそのような高分子材料（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌ）であってもよい。
【００８４】
いくつかの実施形態において、静止容積３１２は、ケース内のポケットの内部である。ポケットは、静止容積３１２の内部に封入媒体を含有するように構成されていてもよい。いくつかの実施形態において、封入媒体は、チップ１００が挿入される前にポケット内に予め充填されていてもよい。チップ１００は、予め充填された容積内に押し込まれてもよく、その間に、チップ１００は封入媒体によって封入される。ケースを閉鎖し、第１の部分３０２を第２の部分３０４と組み立て、静止容積３１２の内部の封入媒体内にチップ１００を封入する間、ガスケット３０８は、静止容積３１２の密封を形成するように、第１の部分３０２によってさらに圧縮される。
【００８５】
他の実施形態において、静止容積３１２内のポケットは、チップ１００が静止容積３１２内に押し込まれたときにポケットが開けられるように、密封されてもよく且つ空気の空間（ｖｏｉｄ  ｏｆ  ａｉｒ）であってもよい。このような方法で、チップのためにオイルレスの方法およびケースが使用される。
【００８６】
さまざまな実施形態において、漏斗状ガイド３０８は、ポリジメチルシリコーン、または同様の材料から構成されていてもよい。また、いくつかの実施形態において、シリコーン油が、漏斗状ガイド３０８に含まれていてもよい。例えば、シリコーン油は、ＰＤ５であってもよい。このポリマー材料（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍａｔｅｒｉａｌ）を用いて、シリコーン油はポリマーマトリクスから時間をかけてゆっくりと開放される。シリコーン油は、チップ１００がもっとたやすく漏斗状ガイド３０８を押し通されるように、漏斗状ガイド３０８に潤滑性を与えてもよい。これらの実施形態において、漏斗状ガイド３０８は、チップ１００が漏斗状ガイド３０８を通過して移動させられる際にチップ１００上に液体試料を広げて個々の反応サイトを充填するように構成される。さらに、シリコーン油は、ケース３００内に充填される際にチップ１００覆って、試料の蒸発を低減または防止してもよい。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、シリコーン油の被覆は試料の損失を防止するために十分であるので、封入媒体は必要でない場合がある。
【００８７】
さまざまな実施形態に従って、浸漬液は、それらに限定されるものではないが、エラストマー、ポリマー、または油であってもよい。浸漬液は、充填に役立ち、試料の蒸発を低減し、且つ気泡を防止し得る。ケースの内部の空気は、例えば、試料の生物学的反応を妨げ、またはイメージングの不正確さにつながる可能性がある。
【００８８】
いくつかの用途のための浸漬液の例は、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙによって市販されているフロリナートである。しかしながら、フロリナートは、後でＰＣＲサイクルの間に放出されて望まれていない気泡の形成の原因となり得る空気を簡単に取り込むその傾向に起因して、あるＰＣＲ用途のためには問題がある可能性がある。
【００８９】
図３Ｂは、チップ静止容積３１２の内部にチップ１００を備えるケースを示す。第１の部分および第２の部分は閉じられた位置にある。図３Ｃは、本明細書中に記載されるさまざまな実施形態による閉じられたケースの別の斜視図である。
【００９０】
図４は、本明細書に記載されるさまざまな実施形態による複数の反応サイトを充填する方法４００を描くフローチャートを示す。ステップ４０２において、液体試料は、漏斗状ガイドに配置される。図９Ａおよび図９Ｂに描かれるように、漏斗状ガイドは、液体試料を保持するためにトラフ状の形状であってもよい。さまざまな実施形態に従って、漏斗状ガイドは疎水性材料から構成されていてもよい。
【００９１】
ステップ４０４において、チップは漏斗状ガイド内に挿入され、ここで、チップは、上述のように、基材および複数の反応サイトを含む。漏斗状ガイドは、チップが漏斗状ガイドを通過する際に、チップと接触するように構成されている。
【００９２】
ステップ４０６において、チップは、複数の反応サイトの中に液体試料を充填するために、漏斗状ガイドを通過させられる。漏斗状ガイドの接触は、反応サイト内への液体試料の充填を容易にする。上述のように、漏斗状ガイドは、横方向に一掃する様式で加えられた際に表面の疎水性／親水性特性に打ち勝つのに充分な力で、チップと接触する。また、このような方法で、漏斗状ガイドは、過剰分を漏斗状ガイドの内部に保つことによって、基材上に残される可能性のある過剰の液体試料も低減させる。
【００９３】
チップを充填するための本明細書中に記載されるさまざまな実施形態に従って、充填のためにチップに施用される液体試料の体積の少なくとも７５％は、複数の反応サイトに充填される。いくつかの実施形態において、充填のためにチップに施用される液体試料の体積の少なくとも９０％は、複数の反応サイトに充填される。さまざまな実施形態において、充填されるべきチップに施用される液体試料の体積は、チップ上の複数の反応サイトの容積の合計の容積と等しい。いくつかの実施形態において、チップに施用される液体試料の体積は、チップ上の複数の反応サイトの容積の合計から１つの反応サイトの容積を引いた容積である。
【００９４】
さらに、さまざまな実施形態において、反応サイトおよび基材は、疎水性材料で被覆されまたは構成されていてもよい。このような方法では、反応サイトの毛管力は、反応サイトを液体試料で充填し且つ反応サイトの内部に液体試料を含有させることにおける実質的な因子である。
【００９５】
いくつかの実施形態において、反応サイトは、親水性材料で被覆されまたは構成されていてもよく、一方、基材は、疎水性材料で被覆されまたは構成されていてもよい。したがって、漏斗状ガイドによって提供される力と組み合わせて、液体試料の充填はさらにより効率的であり得る。チップは、堆積、プラズマ、マスキング法、転写、スクリーン印刷、スポッティング、または同様のもののようなさまざまな被覆の方法で被覆されてもよい。また、被覆の方法および特性は、全ての目的のために本明細書中に組み込まれる２０１２年１１月７日に出願された仮出願整理番号ＬＴ００６６８  ＰＲＯにも説明されている。
【００９６】
図８Ａおよび図８Ｂは、本明細書に記載されるさまざまな実施形態による反応サイトのアレイを備えるチップを充填するためのケースの別の例を示す。ケース８０２は、漏斗状ガイド８０６およびチップ静止容積８０８を含む。チップ１００は、チップ静止容積８０８内に挿入される。チップ１００の試料充填は、漏斗状ガイド８０６によって容易にされる。上述のように、チップ静止容積８０８は、試料の蒸発、試料間のクロストーク、および気泡を最小限にするのを助けるために、浸漬液すなわち封入媒体で満たされていてもよい。図８Ｂは、チップ１００が充填されチップ静止領域８０８内にある位置にあるケース８Ｂを示す。このケースの例において、ケース８０２の上部および底部移動可能部分は、ケースを閉じチップ１００を充填する間に上部および底部部分を一緒にスライドさせることに関連するエラーを低減させるために、予め組み立てられている。ケース８０２は、チップ１００の充填および封入のたやすさを増大させることが可能である。
【００９７】
本教示のさまざまな実施形態によるチップ１００内の複数の反応サイト１０４を充填するために、他の方法が使用されてもよい。例えば、複数の反応サイト１０４は、真空充填されてもよい。例えば、チップは、陰圧下にあるケースまたは材料の内部にあってもよい。複数の反応サイトは、液体試料が針から反応サイトの中に引き出されるように、陰圧で満たされたケースを試料で満たされた針で刺すことによって充填される。
【００９８】
さらに、いくつかの実施形態によれば、チップは遠心力によって充填されてもよい。例えば、チップは、回転板に搭載されてもよい。板の回転によって、チップ上に配置させた試料をチップのスルーホールに強制的に通すことができる。
【００９９】
別の例示的な充填装置は、図１１に示される。この装置を使用することにより、充填動作は数回のチップの充填にわたってより均一であり得る。充填装置を使用して、ユーザーはチップを手動で充填してもよい。あるいはまた、充填装置は自動化されてもよい。充填装置は、充填されるべきチップが置かれてもよいチップホルダー１１０２を含んでいてもよい。チップホルダーは、充填ベース１１０４内に含まれてもよい。試料ローダー１１０６は、試料ローダーホルダー１１０８内に置かれてもよい。このような方法で、試料ローダー１１０６は、チップを充填するために一貫して位置付けられる。上述のように、試料ローダーホルダー１１０８をチップ上で横方向に移動させることによって、試料ローダーは、チップ上で試料体積を押し、反応サイトを充填させる。
【０１００】
さまざまな実施形態において、ユーザーは、液体試料をチップ上に配置してもよい。次いで、ユーザーは、試料ローダーを保持し、および試料ローダーをチップ上で横方向に移動させて、反応サイトの中に液体試料を充填してもよい。手動のおよび自動化された充填方法の両方に関して、試料ローダーは、チップ上を横方向に移動しながらチップに対して０〜９０度の角度で位置付けられて、反応サイトを充填してもよい。
【０１０１】
試料ローダーは、本明細書中に記載されるさまざまな実施形態に従って、多様な材料から構成されていてもよいことを認識されたい。例えば、試料ローダーは、ポリオレフィン類、ポリウレタン類、シロキサン類、または同様のものから構成されていてもよい。いくつかの実施形態において、試料ローダーは、低密度ポリエチレンであるＤｏｗ  ７２２から構成されていてもよい。しかしながら、試料ローダーの材料と液体試料との間に５〜１７９度の水接触角を作り出すであろういずれの材料も、試料ローダーのための許容可能な材料であり得ることを認識されたい。
【０１０２】
反応サイトの物理的特性、ならびに反応サイトおよびチップの表面の疎水性／親水性特性と共に、液体試料の特性、試料ローダーの材料特性、および試料ローダーの物理的形状は、相互作用的であり、本教示のさまざまな実施形態による試料を充填するための装置のための完全なシステムとして全て考慮に入れられなければならない。
【０１０３】
試料ローダーから液体試料を広げることは、液体試料の水接触角に依存する。水接触角は、試料ローダーの材料特性と液体試料の特性との関係に由来する。水接触角が９０度未満である場合、液体試料と基材表面との間の関係は親水性であり、試料は、スルーホールの中に試料を引き込むための毛管作用のために必要である、基材表面との粘着性の相互作用を示す。例えば、５０度未満の水接触角を有する、親水性の高すぎる基材は、例えば、基材表面上の過剰の液体試料の滞留の増加や、反応サイトの非効率的な充填を引き起こし得る。さらに、小さい接触角は、液体試料がいくつかの反応サイト内に速く移動しすぎて、複数の反応サイト内の液体試料の不均一な分布を引き起こす原因となり得る。
【０１０４】
反対に、水接触角が９０度を超えている場合、基材表面と液体試料との関係は疎水性であり、また毛管力が陰性となるので、液体試料は反応サイト内に移動しないことになる。また、この状況は、基材表面上の液体試料の滞留を引き起こし、およびいくつかの反応サイトを液体試料で充填することを妨げる可能性がある。したがって、基材および反応サイトの表面は、液体試料に関して基材および反応サイトの表面の疎水性および親水性が釣り合うように設計されている。
【０１０５】
これらの特性を念頭に、さまざまな実施形態に従って、効率的な充填は、液体試料との前進接触角が液体試料との後退接触角と同様になるように試料ローダーを構成することによって達成されてもよい。図２０を参照して、前進接触角および後退接触角が示されている。水滴２００２は、基材２０００上に示されている。基材が傾けられた場合に、水滴２００２は、前進接触角２００６および後退接触角２００４を有することになる。
【０１０６】
さまざまな実施形態に従って、前進接触角は８５＋／−１５度であり、および後退接触角は８５＋／−１５度である。
【０１０７】
チップに対する試料ローダーの下向きの力は、材料の種類、試料ローダーの厚さ、ならびにチップの厚さおよび材料に依存し得る。しかしながら、下向きの力は、チップに接触するための力からチップを破損させるために必要とされる力までの範囲で変動し得る。（シリコンの厚さは、１つの因子として考慮に入れられるであろう）。さらに、さまざまな実施形態において、試料ローダーがチップを横断して一掃する速度は、２．０秒／ｍｍから最高０．２秒／ｍｍまでであってもよい。
【０１０８】
図１２に示される充填装置の別の例示的な実施形態において、チップを充填するためにダブル試料ローダー１２０８が使用されてもよい。この充填装置は、図１１に示されるように、チップホルダー１２０２、充填ベース１２０４および試料ローダーホルダー１２０８を含んでいてもよい。チップホルダー１４０２は充填されるべきチップを保持する。チップホルダー１２０２は充填ベース１２０４内に保持されていてもよい。試料ローダーホルダー１２０８はダブル試料ローダー１２０６を保持していてもよい。いくつかの実施形態において、ユーザーは、チップホルダー１２０２内のチップ上で試料ローダーホルダー１２０８を横方向に手動で押してもよい。他の実施形態において、試料ローダーホルダー１２０８による移動は、モーターを使用することにより自動化されていてもよい。
【０１０９】
ダブル試料ローダー１２０６は、複数の反応サイトに充填される試料体積を増大させ得る。さまざまな実施形態において、充填されるべき試料体積は、ダブル試料ローダー１２０６の２つの試料ローダー間に配置されてもよい。このような方法で、ダブル試料ローダー１２０６の各試料ローダーは、充填されるべき試料体積をチップを横断して案内して、複数の反応サイトを試料体積で充填するのに役立つ。
【０１１０】
上述のように、ダブル試料ローダーを用いて試料体積を充填することで、チップ上に配置された試料体積の少なくとも７５％を反応サイトの内部に充填してもよい。他の実施形態において、ダブル試料ローダーを用いて試料体積を充填することで、チップ上に配置された試料体積の少なくとも９０％を反応サイトの内部に充填してもよい。他の実施形態において、ダブル試料ローダーを用いて試料体積を充填することで、チップ上に配置された試料体積の１００％を反応サイトの内部に充填してもよい。
【０１１１】
図１３は、本明細書中に記載されるさまざまな実施形態による別の試料ローダー１３００を示す。試料ローダー１３００は、第１のブレード１３０２および第２  １３０４を含んでいてもよい。また、試料ローダー１３００は、チップのような基材内に含まれる反応サイトのアレイの中に充填されるべき液体試料が配置されていてもよいアクセスポート１３０６を含んでいてもよい。アクセスポート１３０６内に配置された液体試料は、反応サイト内に試料が充填されるまで、第１のブレード１３０２と第２のブレード１３０４との間のリザーバー１３０８の内部に置かれていてもよい。液体試料は、試料ローダー１３００の先端である流路の端部で分注されるように、流路１３１０の内部を流れていてもよい。
【０１１２】
上述のように、試料ローダー１３００は、いくつかの実施形態による反応サイトを手動で充填するために、ユーザーによって保持されてもよい。他の実施形態において、試料ローダー１３００は、充填装置に取り付けられ、反応サイトを充填するために使用されてもよい。
【０１１３】
第１のブレード１３０２および第２のブレード１３０４は、第１のブレード１３０２および第２のブレード１３０４の幅のエッジに沿って液体試料が湿るように、互いに向かって先細りになるように構成されている。このような方法で、試料ローダー１３００がチップを横切って一掃させられる際に反応サイトの中に液体試料が効率的に充填されるように、チップの表面を横切って液体試料の一様な分布ができ得る。
【０１１４】
図２１を参照して、試料ローダーによる反応サイトの充填は、本明細書中に記載されたさまざまな実施形態に従って示される。反応サイト１０４内に充填されるべき液体試料２１０４は、試料ローダー２１０２の内部にある。試料ローダー２１０２は、表面１０６を横切って横方向に移動させられる。試料ローダー２１０２が移動させられる際に、液体試料２１０４は、毛管作用によって反応サイト１０４内に充填される。
【０１１５】
図１４Ａは、試料ローダー１３００の側面図を示す。この図において、リザーバー１３０８が示される。液体試料が試料ローダー１３００内に配置されたとき、上述のように、液体は、反応サイトの中に液体試料が充填されるまでリザーバー１３０８内に置かれていてもよい。リザーバー１３０８に配置されてもよい液体試料の体積は、１０〜２０μＬであってもよい。他の実施形態において、反応サイトに充填される液体試料の体積は、０．５μＬから１００μＬまでであってもよい。さらに他の実施形態において、反応サイトに充填される液体試料の体積は、１００μＬを超えていてもよい。反応サイトに充填される液体試料の体積は、上述のように、例えば、試料ローダーの材料の特性、液体試料の特性、および試料ローダーと液体試料との間の関係に依存し得る。
【０１１６】
図１４Ｂは、試料ローダー１３００の第１のブレード１３０２および第２のブレード１３０４の拡大図を示す。第１のブレード１３０２と第２のブレード１３０４との間の先細りが示される。さまざまな実施形態において、先細り角度は、０．１度から１５度までであってもよい。いくつかの実施形態において、先細り角度は、１．５度から２度までであってもよい。さまざまな実施形態において、先細りは、先端における第１のブレード１３０２と第２のブレード１３０４との間の距離が０．５μｍから１００μｍまでであってもよいようなものであり得る。いくつかの実施形態において、第１のブレード１３０２と第２のブレード１３０４との間の距離は、１００μｍ〜２ｍｍであってもよい。
【０１１７】
さらに、さまざまな実施形態に従って、試料ローダー１３００の先端は、チップと６５＋／−３度の角度で接触してもよい。さまざまな実施形態に従って、試料ローダー１３００の先端は、チップと接触するとき０〜０．００４インチ屈曲されてもよい。さらに、チップを横断する試料ローダー１３００の一掃動作は、直線状であってもよい。換言すると、最小限の縦揺れ、横揺れ、偏揺れがある。スプレッダー１３００は、例えば、２〜３ｍｍ／秒の速度でチップを横断して移動してもよい。
【０１１８】
図１５は、本明細書に記載されるさまざまな実施形態による別の試料ローダー１５００を示す。試料ローダー１５００は、図１６に示されるように、充填装置に接続されていてもよい。図１３と同様に、試料ローダー１５００は、第１のブレード１５０２および第２のブレード１５０４も有していてよい。また、図１３と同様に、反応サイトに充填されるべき液体試料は、アクセスポート１５０８内に配置されてもよい。液体試料は、流路１５１２を通って試料ローダー１５００の先端に流れることができる。流路１５１２は、第１のブレード１５０２および第２のブレード１５０４によって形成される。
【０１１９】
例示的な充填装置１６００は図１６に示される。充填装置１６００は、試料ローダーホルダー１６０６に取り付けられた試料ローダー１６０４を含む。試料ローダーホルダー１６０６と試料ローダー１６０４との組立品は、反応サイトのアレイを含むチップ１６０２内に液体試料を充填するように構成されている。さまざまな実施形態において、試料ローダーホルダー１６０６は、試料ローダー１６０４がチップ１６０２を横断して横方向に移動させられてチップ１６０２上に液体試料を配置するように手動で移動させられてもよく、こうしてチップ１６０２内の反応サイトを充填してよい。他の実施形態において、試料ローダーホルダーは、チップ１６０２上で試料ローダー１６０４を移動させるために制御システムによって機械的に制御されてもよい。
【０１２０】
図４を参照して記載されるように、チップは、いくつかの実施形態において、過剰の液体試料の除去を容易にするために加熱されてもよい。過剰の液体試料の除去は、反応サイト間の交差汚染、または橋渡しを低減するのに役立ち得る。さまざまな実施形態において、相対湿度のような他の環境因子は、反応サイトに対する液体試料の充填を容易にするように調節されてもよい。
【０１２１】
図１７は、本教示のさまざまな実施形態による別の充填装置１７００を示す。充填装置１７００は、チップ１７０４上の反応サイトを充填するための組立品だけでなく、汚染を防止しおよびチップ１７０４の取り扱いを容易にするためにチップ１７０４が囲繞されるように、ケース内にチップを密封するための組立品を含む。充填装置１７００は、チップ１７０４がチップベース１７０２内に置かれ得るように構成されたチップベース１７０２を含む。こうして、チップ１７０４は、試料ローダー１７０８がチップ１７０４に含まれる反応サイトに液体試料を配置することができるような位置にある。試料ローダー１７０８は、試料ローダーコネクタ１７０６を介して取り付けられている。試料ローダーコネクタ１７０６は、チップ１７０４に接触するための位置に試料ローダー１７０８をクリップ留めするように構成されたクリップであってもよい。試料ローダー１７０８は、試料の汚染を防止するために、１回の使用または数回の使用の後に取り換えられる必要があり得る。
【０１２２】
試料ローダーコネクタ１７０６は、機構ハウジング１７１０に結合されている。機構ハウジング１７１０は、反応サイトに液体試料を充填するためにチップ１７０４を横切って試料ローダー１７０８を移動させるための機構を囲繞していてもよい。機構ハウジング１７１０内に囲繞された機構は、チップ１７０４と接触するように試料ローダー１７０８を位置付け且つチップ１０４を横切って横方向に試料ローダー１７０８を移動させるように構成された、ばねおよびギアを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、レバー１７１２の起動で、充填を開始するための初期位置に試料ローダー１７０８を位置付けてもよい。さまざまな実施形態に従って、液体試料の充填を開始するために、チップを横切って試料ローダー１７０８の移動を開始するようにレバー開放ボタン１７１４が起動される。レバー１７１２が開放される際に、機構は、チップ１７０４を横切って試料ローダー１７０８を移動させるように構成されている。反応サイトへの液体試料の充填の例は、図１８Ａ〜図１８Ｃに示される。
【０１２３】
また、充填装置１７００は、ネスト１７１６に結合されたアーム１７１８を含む組立品を含んでいてもよい。ネスト１７１６は、チップ１７０４を密封するためのカバー１７２０を保持するように構成されている。機構ハウジング１７１０の内部の機構は、充填後にカバー１７２０がチップ１７０４を覆うようにアーム１７１８を移動させる。チップ１７０４を覆う方法は、図１９Ａ〜図１９Ｂに示される。
【０１２４】
上述のように、図１８Ａ〜図１８Ｃは、チップ１７０４に含まれる反応サイトのアレイを充填するために試料ローダー１７０８がチップ１７０４を横切って移動させられるプロセスを示す。充填プロセスを開始するために、試料ローダー１７０８は、図１８Ａに示されるように、試料ローダー１７０８が一端部でチップ１７０４と接触するように位置付けられる。液体試料は、試料ローダー１７０８内に配置される。機構ハウジング１７１０内に含有される充填機構は作動させられ、試料ローダー１７０８は、図１８Ｂに示されるように、チップ１７０４上を移動させられる。試料ローダーがチップ１７０４を横断して移動させられ、液体試料が反応サイトに配置されると、試料ローダー１７０８は、図１８Ｃに示されるように、チップ１７０４から離昇される。さまざまな実施形態において、充填方法は、液体試料を充填するために１回達成されてもよい。他の実施形態において、図１８Ａ〜図１８Ｃの充填方法は、反応サイトに対する液体試料の実質的に完全な充填を保証するために、２回繰り返されてもよい。他の実施形態において、図１８Ａ〜図１８Ｃに示される充填方法は、複数回、達成されてもよい。
【０１２５】
さまざまな実施形態に従って、試料ローダー１７０８の先端は、チップと６５＋／−３度の角度で接触してもよい。さまざまな実施形態に従って、試料ローダー１７０８の先端は、チップと接触するとき０〜０．００４インチ屈曲されてもよい。さらに、チップを横断する試料ローダー１７０８の一掃動作は、直線状であってもよい。換言すると、最小限の縦揺れ、横揺れ、偏揺れがある。試料ローダー１７０８は、例えば、２〜３ｍｍ／秒の速度でチップを横断して移動してもよい。しかしながら、反応サイトを充填するために試料ローダー１７０８を移動させる他の速度も可能である。さらに、さまざまな実施形態において、試料ローダー１７０８は、さらなる反応サイトの充填を続けるために、１回よりも多くの回数、反応サイト上を移動させられてもよい。
【０１２６】
図１９Ａ〜図１９Ｂは、カバー１７２０の位置付けおよびカバー１７２０を用いたチップ１７０４の密封を示す。図１９Ａは、チップ１７０４に向かうアーム１７１８の移動を示す。図１９Ｂは、カバー１７２０を含み、チップ（図示せず）の下のベースと接触して、ベースおよびカバー１７２０を含むケース内にチップ１７０４を密封する、アーム１７１８およびネスト１７１６の組立品を示す。アーム１７１８は、チップ１７０４上にカバー１７２０を取り付けるのに充分な下向きの力を提供する。カバー１７２０は、例えば、テープまたはスナップでベースに結合されて、チップ１７０４を囲繞してもよい。スナップを使用する場合、いくつかの実施形態において、アーム１７１８は、カバー１７２０をベースにスナップ留めするために充分な力を届け得る。
【０１２７】
また、上述のように、充填装置１７００は、反応サイトに充填されなかった過剰の液体試料の除去を容易にするために、チップを加熱するための加熱素子を含んでいてもよい。さまざまな実施形態において、加熱素子は、チップベース内に含まれていてもよい。過剰の液体試料の除去は、反応サイト間の交差汚染および橋渡しを低減し得る。
【０１２８】
上述のように、さまざまな実施形態に従って利用されてもよい器具は、それに限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）器具である。図２０は、本教示の実施形態が実施されてもよいＰＣＲ器具２０００を示すブロック図である。ＰＣＲ器具２０００は、試料支持デバイス（図示せず）内に含有された複数の試料２０１２上に置かれる加熱されたカバー２０１０を含んでいてもよい。さまざまな実施形態において、試料支持デバイスは、複数の反応サイトを備えるチップ、物品、基材、またはガラスもしくはプラスチックのスライドであってもよく、反応サイトは、反応サイトと加熱されたカバー２０１０との間にカバーを有する。試料支持デバイスのいくつかの例は、それらに限定されるものではないが、標準的なマイクロタイターの９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートのようなマルチウェルプレート、またはマイクロカード、またはガラスもしくはプラスチックのスライドのような実質的に平面的な支持体を含んでいてもよい。さまざまな実施形態における反応サイトは、基材の表面に形成された規則的または不規則的なアレイにパターン付けられたくぼみ、インデント、畝、およびそれらの組み合わせを含んでいてもよい。
【０１２９】
液体試料体積が複数の反応サイトに充填されると、反応サイトの内部で生物学的反応を開始することができる。さまざまな実施形態において、生物学的反応は、ＰＣＲ反応であってもよい。したがって、チップは、ＰＣＲ器具上で熱サイクルにかけられてもよい。
【０１３０】
ＰＣＲ器具のさまざまな実施形態は、試料ブロック２０１４、加熱および冷却のための素子２０１６、熱交換器２０１８、制御システム２０２０、ならびにユーザーインターフェース２０２２を含む。本教示による熱ブロック組立品のさまざまな実施形態は、図２０のＰＣＲ器具２０００の構成要素２０１４〜２０１８を含む。
【０１３１】
ある試料支持体のために構成された器具において、ＰＣＲ器具２０００がさまざまな実施形態によるチップ１００を使用し得るように、アダプターが提供されてもよい。アダプターは、チップ１００の内部の試料に対する効率的な熱伝導を可能にするように構成されている。
【０１３２】
図２０におけるＰＣＲ器具２０００の実施形態に関し、制御システム２０２０は、検出システム、加熱されたカバー、および熱ブロック組立品の機能を制御するために使用されてもよい。制御システム２０２０は、図２０のＰＣＲ器具２０００のユーザーインターフェース２０２２を介してエンドユーザーとアクセス可能であってもよい。また、コンピューティングシステム（図示せず）は、図２０のＰＣＲ器具２０００の機能およびユーザーインターフェース機能の制御を提供する役割を果たしてもよい。さらに、コンピューティングシステムは、データ処理、表示、および報告準備の機能を提供してもよい。そのような器具制御機能の全ては、ＰＣＲ器具に専用の局所的なものであってもよく、またはコンピューティングシステムは、続いてより詳細に検討されるように、制御、分析、および報告の機能の一部または全ての遠隔制御を提供してもよい。
【０１３３】
本教示のさまざまな実施の以下の記載は、例示および説明の目的で示されている。それは網羅的ではなく、本教示を開示された正確な形態に限定するものではない。修正および変形は、上記教示に照らして可能であり、または本教示の実施から達成されてもよい。加えて、記載された実施はソフトウエアを含むが、しかし、本教示は、ハードウエアおよびソフトウエアの組み合わせとしてまたはハードウエア単独において実施されてもよい。本教示は、オブジェクト指向および非オブジェクト指向の両方のプログラミングシステムを用いて実施されてもよい。
【０１３４】
本明細書中に記載されるさまざまな実施形態に関する方法のための例示的なシステムは、以下の米国仮特許出願に記載されたものを含む：
・  米国仮出願第６１／６１２，０８７号、２０１２年３月１６日出願；および
・  米国仮出願第６１／７２３，７５９号、２０１２年１１月７日出願；および
・  米国仮出願第６１／６１２，００５号、２０１２年３月１６日出願；および
・  米国仮出願第６１／６１２，００８号、２０１２年３月１６日出願；および
・  米国仮出願第６１／７２３，６５８号、２０１２年１１月７日出願；および
・  米国仮出願第６１／７２３，７３８号、２０１２年１１月７日出願；および
・  米国仮出願第６１／６５９，０２９号、２０１２年６月１３日出願；および
・  米国仮出願第６１／７２３，７１０号、２０１２年１１月７日出願；および
・  米国仮出願第６１／７７４，４９９号、２０１３年３月７日出願；および
・  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ００６５５  ＰＣＴ、２０１３年３月１５日提出；および
・  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ００６５６  ＰＣＴ、２０１３年３月１５日提出；および
・  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ００６５７  ＰＣＴ、２０１３年３月１５日提出；および
・  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ００６６８  ＰＣＴ、２０１３年３月１５日提出；および
・  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ００６９９  ＰＣＴ、２０１３年３月１５日提出。
【０１３５】
また、これら出願の全ては参照によってその全体が本明細書中に組み込まれている。
【０１３６】
ある例示的な実施形態、例、および用途に関してさまざまな実施形態が記載されてきたが、本教示から逸脱することなくさまざまな修正および変更がなされてもよいことは当業者にとって明らかであろう。
【図１Ａ】
2015511016.tif 000003
【図１Ｂ】
2015511016.tif 000004
【図２】
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【図３Ａ】
2015511016.tif 000006
【図３Ｂ】
2015511016.tif 000007
【図３Ｃ】
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【図４】
2015511016.tif 000009
【図５Ａ】
2015511016.tif 000010
【図５Ｂ】
2015511016.tif 000011
【図５Ｃ】
2015511016.tif 000012
【図６】
2015511016.tif 000013
【図７】
2015511016.tif 000014
【図８Ａ】
2015511016.tif 000015
【図８Ｂ】
2015511016.tif 000016
【図９Ａ】
2015511016.tif 000017
【図９Ｂ】
2015511016.tif 000018
【図１０】
2015511016.tif 000019
【図１１】
2015511016.tif 000020
【図１２】
2015511016.tif 000021
【図１３】
2015511016.tif 000022
【図１４Ａ】
2015511016.tif 000023
【図１４Ｂ】
2015511016.tif 000024
【図１５】
2015511016.tif 000025
【図１６】
2015511016.tif 000026
【図１７】
2015511016.tif 000027
【図１８Ａ】
2015511016.tif 000028
【図１８Ｂ】
2015511016.tif 000029
【図１８Ｃ】
2015511016.tif 000030
【図１９Ａ】
2015511016.tif 000031
【図１９Ｂ】
2015511016.tif 000032
【図２０】
2015511016.tif 000033
【図２１】
2015511016.tif 000034
【図２２】
2015511016.tif 000035
【図２３】
2015511016.tif 000036
【国際調査報告】
2015511016.tif 000037
2015511016.tif 000038
2015511016.tif 000039
2015511016.tif 000040