(57)【要約】  本発明は、全自動無細胞タンパク質製造装備及びこれを利用したタンパク質の製造方法に関し、より詳しくは上部が開放された構造で透析膜を備えた多数の透析チューブからなることを特徴とする反応容器を含むタンパク質発現反応部と、前記反応容器を加熱または冷却する反応温度調節部と、複数のピペットを含み、前記ピペットを利用して溶液を吸入または吐出することができるピペットアレイと、前記ピペットアレイを上下前後または左右に移動させて、溶液を移動させることができるピペットアレイ移動部と、磁場印加装置を備えたタンパク質精製部と、タンパク質製造に用いられる溶液を供給するマルチウェルプレートキットを装着できるマルチウェルプレート装着部と、を含むことを特徴とする全自動無細胞タンパク質製造装備及びこれを利用したタンパク質の製造方法に関する。さらに本発明は、親和性タグが結合した目標タンパク質以外にも親和性タグ（Ｔａｇ）が除去された純粋目標タンパク質の合成機能を有していて、最終精製されたタンパク質が溶けている溶出溶液を所望のタンパク質保管用緩衝溶液で多工程透析を介して早く所望の緩衝溶液に自動で交換する機能も持っていて、多数のタンパク質を全自動で簡単に大量製造できる全自動タンパク質製造装備及びこれを利用したタンパク質の製造方法に関する。さらに本発明は、タンパク質製造に必要な溶液が保存されるマルチウェルプレートキット及び透析膜を備えた透析チューブを含む全自動無細胞タンパク質製造用反応キットに関する。本発明に係る全自動無細胞タンパク質製造装備は、全自動で目標タンパク質を発現して精製するだけでなく、タンパク質保管用緩衝溶液に透析できるので、最終製造されたタンパク質をすぐに使用できる長所がある。また、本発明に係るタンパク質製造方法は、多工程で低分子発現溶液を交換して無細胞タンパク質発現に必要なエネルギー源などを持続的に供給することができて、従来の配置形態の無細胞タンパク質製作法を用いて目標タンパク質を得る場合に比べて最大５倍量を取得できて、磁性粒子を利用した目標タンパク質精製時タンパク質分解酵素を利用して不要な親和性タグを除去して純粋な目標タンパク質を製造できるので、産業、医療及び研究目的のタンパク質生産において、タンパク質活性及び構造に否定的影響を及ぼしかねない人工配列が除去された原形のタンパク質を生産できる点で非常に有用である。
2015529094.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上部が開放された構造で透析膜を備えた多数の透析チューブからなることを特徴とする反応容器を含むタンパク質発現反応部と、
前記反応容器を加熱または冷却する反応温度調節部と、
複数のピペットを含み、前記ピペットを利用して溶液を吸入または吐出することができるピペットアレイと、
前記ピペットアレイを上下前後または左右に移動させて、溶液を移動させることができるピペットアレイ移動部と、
磁場印加装置を備えたタンパク質精製部と、
タンパク質製造に用いられる溶液を供給するマルチウェルプレートキットを装着できるマルチウェルプレート装着部と、
を含むことを特徴とする全自動無細胞タンパク質製造装備。
【請求項２】
前記透析チューブは、一定の長さで切断された円筒形態で製作される透析膜からなることを特徴とする請求項１に記載の全自動無細胞タンパク質製造装備。
【請求項３】
前記反応容器は、蒸発を防ぐために、上部開放部にピペットが挿入されるように切開された反応容器カバーをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の全自動無細胞タンパク質製造装備。
【請求項４】
前記タンパク質発現反応部は、反応容器の上部に透析チューブが設置される複数の透析チューブ孔が形成されて、前記透析チューブ孔と連通される低分子発現溶液孔が前記透析チューブ孔の隣接した部位に形成されることを特徴とする請求項１に記載の全自動無細胞タンパク質製造装備。
【請求項５】
前記タンパク質発現反応部は、前記透析チューブ孔と連通されるようにタンパク質保管用緩衝溶液を収容できる透析溶液孔が前記透析チューブ孔の隣接した部位に形成されるタンパク質透析部をさらに含むことを特徴とする請求項４に記載の全自動無細胞タンパク質製造装備。
【請求項６】
前記タンパク質発現反応部は、
反応容器溶液を除去する開閉可能な排出口と、
前記排出口と連通されるように連結される廃液筒と、
反応容器に溶液を投入する注入口と、
前記注入口に溶液を定量的に注入する定量ポンプと、
前記定量ポンプに連結される少なくとも一つ以上の溶液筒と、
を含むことを特徴とする請求項１に記載の全自動無細胞タンパク質製造装備。
【請求項７】
前記タンパク質発現反応部は、前記定量ポンプと一側が連結されて、他側は前記溶液筒のうち選択される一つの溶液筒と連通されるようにする多チャンネル弁をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載の全自動無細胞タンパク質製造装備。
【請求項８】
前記タンパク質発現反応部は、
反応容器の溶液を注入または排出する溶液通路と、
前記溶液通路と連結されて溶液を定量的に注入または排出する正逆転定量ポンプと、
前記正逆転定量ポンプに連結される少なくとも一つ以上の溶液筒と、
前記正逆転定量ポンプに連結される少なくとも一つ以上の廃液筒と、
及び一側が前記正逆転定量ポンプと連結されて、他側が前記溶液筒及び廃液筒と連結されて、選択される一つの溶液筒または廃液筒を前記正逆転定量ポンプと連通されるようにする多チャンネル弁と、
を含むことを特徴とすることを特徴とする請求項１に記載の全自動無細胞タンパク質製造装備。
【請求項９】
前記ピペットアレイは、設置可能な反応容器の数だけ１個〜９６個のピペットを自動で脱付着させることができて、所望の溶液量を定量的に吸入して吐出することを特徴とする請求項１に記載の全自動無細胞タンパク質製造装備。
【請求項１０】
無細胞タンパク質製造装備に装着されるマルチウェルプレートキットは、無細胞タンパク質製造に必要な溶液を保存するために個別的に分離して単位ウェルで構成されることを特徴とする請求項１に記載の全自動無細胞タンパク質製造装備。
【請求項１１】
前記マルチウェルプレートキットは、タンパク質保管用緩衝溶液、滅菌蒸溜水、磁性粒子懸濁液、磁性粒子洗浄溶液、タンパク質溶出溶液、低分子発現溶液、タンパク質分解酵素反応溶液、及び膜タンパク質合成溶液等の前記無細胞タンパク質製造に必要な溶液中から１種以上が選択分株されて提供されることを特徴とする請求項１０に記載の全自動無細胞タンパク質製造装備。
【請求項１２】
前記反応温度調節部と前記磁場印加装置は、同じ位置で同時に調節が可能なように製作されて使用できることを特徴とする請求項１に記載の全自動無細胞タンパク質製造装備。
【請求項１３】
無細胞タンパク質を全自動で製造する方法において、
（ａ）無細胞タンパク質発現混合物製作工程（Ｓ１）と、
（ｂ）低分子発現溶液を利用したタンパク質発現工程（Ｓ２）と、
（ｃ）磁性粒子を利用したタンパク質精製工程（Ｓ３）と、
（ｄ）タンパク質保管用緩衝溶液を利用した透析工程（Ｓ４）と、
を含むことを特徴とする全自動無細胞タンパク質製造方法。
【請求項１４】
前記（ｂ）タンパク質発現工程は、（ｉ）低分子発現溶液注入工程、（ｉｉ）タンパク質発現促進工程、及び（ｉｉｉ）低分子発現溶液除去工程の工程からなることを特徴とする請求項１３に記載の全自動無細胞タンパク質製造方法。
【請求項１５】
前記（ｃ）タンパク質精製工程は、（ｉ）磁性粒子に結合された不純物を分離洗浄するために磁性粒子洗浄溶液を注入する工程、及び（ｉｉ）磁場を印加／解除する工程を順次１回以上繰り返して実施することを含むことを特徴とする請求項１３に記載の全自動無細胞タンパク質製造方法。
【請求項１６】
前記（ｃ）タンパク質精製工程は、前記（ｃ）タンパク質精製工程は、タンパク質溶出溶液を注入して磁性粒子から目標タンパク質を分離する工程を含むことを特徴とする請求項１３に記載の全自動無細胞タンパク質製造方法。
【請求項１７】
前記磁性粒子は、２価金属イオンが結合された磁性粒子であることを特徴とする請求項１３に記載の全自動無細胞タンパク質製造方法。。
【請求項１８】
前記（ｄ）透析工程は、（ｉ）透析溶液孔にタンパク質保管用緩衝溶液注入工程、及び（ｉｉ）透析チューブ内タンパク質溶出溶液除去工程を順次１回以上繰り返して実施することを含むことを特徴とする請求項１３に記載の全自動無細胞タンパク質製造方法。
【請求項１９】
前記（ｃ）磁性粒子を利用したタンパク質精製工程（Ｓ３）は、（ｃ’）親和性タグが除去された純粋目標タンパク質の精製工程（Ｓ３'）であることを特徴とする請求項１３に記載の全自動無細胞タンパク質製造方法。
【請求項２０】
前記（ｃ’）の親和性タグが除去された純粋目標タンパク質（の）精製工程（Ｓ３'）は、酵素切断部位を認知する酵素と酵素反応溶液を処理して親和性タグを目標タンパク質から分離する親和性タグ除去工程、及びタンパク質分解酵素を除去する工程を順次行って純粋目標タンパク質を精製することを特徴とする請求項１９に記載の全自動無細胞タンパク質製造方法。
【請求項２１】
前記親和性タグは、ヒスチジンまたはシステインであることを特徴とする請求項１９に記載の全自動無細胞タンパク質製造方法。
【請求項２２】
前記酵素は、タバコエチ病ウイルス由来タンパク質分解酵素、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ、トロンビン、エンテロキナーゼ、及びライノウイルスタンパク質分解酵素で構成された群から選択されることを特徴とする請求項２０に記載の全自動無細胞タンパク質製造方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の全自動無細胞タンパク質製造装備を利用して行うことを特徴とする請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の全自動無細胞タンパク質製造方法。
【請求項２４】
無細胞タンパク質製造に必要な溶液を保存するために個別的に分離して単位ウェルで構成されるマルチウェルプレートキットであることを特徴とする全自動無細胞タンパク質製造用反応キット。
【請求項２５】
前記無細胞タンパク質製造に必要な溶液は、タンパク質保管用緩衝溶液、滅菌蒸溜水、磁性粒子懸濁液、磁性粒子洗浄溶液、タンパク質溶出溶液、低分子発現溶液、タンパク質分解酵素反応溶液、及び膜タンパク質合成溶液で構成された群から選択された１種以上の溶液であることを特徴とする請求項２４に記載の全自動無細胞タンパク質製造用反応キット。
【請求項２６】
透析膜を備えた透析チューブをさらに含むことを特徴とする請求項２４に記載の全自動無細胞タンパク質製造用反応キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全自動無細胞タンパク質製造装備及びこれを利用したタンパク質の製造方法に関し、より詳しくは上部が開放された構造で透析膜を備えた多数の透析チューブからなることを特徴とする反応容器を含むタンパク質発現反応部と、前記反応容器を加熱または冷却する反応温度調節部と、複数のピペットを含み、前記ピペットを利用して溶液を吸入または吐出することができるピペットアレイと、前記ピペットアレイを上下前後または左右に移動させて、溶液を移動させることができるピペットアレイ移動部と、磁場印加装置を備えたタンパク質精製部と、タンパク質製造に用いられる溶液を供給するマルチウェルプレートキットを装着できるマルチウェルプレート装着部と、を含むことを特徴とする全自動無細胞タンパク質製造装備及びこれを利用したタンパク質の製造方法に関する。
【０００２】
さらに本発明は、親和性タグが結合した目標タンパク質以外にも親和性タグ（Ｔａｇ）が除去された純粋目標タンパク質の合成機能を有していて、最終精製されたタンパク質が溶けている溶出溶液を所望のタンパク質保管用緩衝溶液で多工程透析を介して早く所望の緩衝溶液に自動で交換する機能も持っていて、多数のタンパク質を全自動で簡単に大量製造できる全自動タンパク質製造装備及びこれを利用したタンパク質の製造方法に関する。
【０００３】
さらに本発明は、タンパク質製造に必要な溶液が保存されるマルチウェルプレートキット及び透析膜を備えた透析チューブを含む全自動無細胞タンパク質製造用反応キットに関する。
【背景技術】
【０００４】
一般に、組換えタンパク質を製造する方法は、大腸菌、酵母、動物細胞など種々の細胞株を利用して、細胞内に組換えタンパク質発現ベクターを形質転換させて細胞株を培養して目標タンパク質を発現させた後、この細胞を破砕して目標タンパク質を精製する方法が用いられている。
【０００５】
この方法は、組換えタンパク質を安定的に発現させる菌株選別過程を必要とし、以後細胞培養、細胞破砕、そしてタンパク質精製の一連の過程を経なければならないため、多くの時間と手間がかかる。
【０００６】
それだけでなく、細胞株に毒性を示すタンパク質または膜タンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の場合には、タンパク質を発現させることが難しいので、様々な発現条件を試みるなどの多くの手間がかかるため、一つの純粋なタンパク質を製造するまで少なくとも数日から長くて数ヶ月の時間を要する問題点がある。
【０００７】
このような問題点を克服しようと細胞を利用しないで試験管チューブのような反応容器内で短時間でタンパク質を発現する無細胞タンパク質発現方法とこれと関連する様々な製品が開発されてきた。この方法は、細胞培養をしないで所望のタンパク質を発現することを目的とし、目標遺伝子を含むベクター、細胞培養後分離／精製を介して得られた細胞抽出物、そしてアミノ酸、トリホスフェートＲＮＡ、エネルギー源、緩衝溶液を含むタンパク質発現溶液などで構成され、所望のタンパク質をコードする遺伝子は、細胞抽出物に含まれているＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）によってｍＲＮＡに転写（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）されて、細胞抽出物の内部に含まれたリボソーム、ｔＲＮＡなどを用いてタンパク質に翻訳（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）される過程を経てタンパク質を発現することになる。
【０００８】
無細胞タンパク質発現方法は、Ｒｏｃｈｅ、Ｐｒｏｍｅｇａなどによって製品化されており、試験管チューブにタンパク質を発現できる鋳型ＤＮＡ（例、発現ベクター、ＰＣＲ産物）、細胞破砕液、アミノ酸とトリホスフェートＲＮＡそしてエネルギー物質が入っている発現溶液を添加した後、適正温度（３０〜４０℃）で適正時間（１〜３時間）の間反応をさせて、目標タンパク質を発現させる方法である。この方法は細胞を用いてタンパク質を発現させる方法に比べて必要時間を画期的に減らすことができるだけでなく、細胞内で毒性を持つタンパク質や膜タンパク質も発現できるとの長所がある。
【０００９】
また、このような無細胞タンパク質発現を自動で行うことができ、簡単にタンパク質を製造できるシステムが開発された。
【００１０】
このような装備としては、ロシュ社で開発して発売しているＲＴＳ（Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）があって、この装備は、無細胞タンパク質発現を高効率で行うことができ、無細胞タンパク質発現が進行されながらエネルギー源の枯渇、リン酸などタンパク質合成阻害物の蓄積などにより反応が停止するのを克服するために反応容器の底に透析膜を設けて、この反応容器を少なくとも１０倍体積の低分子発現溶液が入っている容器の中に位置させて透析することによって反応が最大限進行されるようにした。このような基本原理はキム・ドンミョンなどが発表した論文（Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｍ．ａｎｄ  Ｃｈｏｉ，Ｃ．−Ｙ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１２５：６４５，１９９６）に記述されているように透析膜を介して持続的にトリホスフェートＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源が入っている低分子発現溶液を交換することで、タンパク質発現量を最大１０倍まで増加させることができる原理を用いた。
【００１１】
しかし、このような方式は、発現溶液の１０倍以上の低分子発現溶液を同時に用いなければならず、全体反応容器が大きくなって多くの種類のタンパク質を並列に同時に合成するためには装備が大掛かりになる問題点がある。また、自動化になっていないので、装備では一定温度で反応させながら撹はんさせる機能だけ行うことができ、反応後に合成されたタンパク質を精製するなどの過程を別に行わなければならない煩わしさがある。
【００１２】
日本のＲＩＫＥＮ研究所では、詳しい構造を明らかにしなかったが、このような大型装備を構築してタンパク質発現を自動化して（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｓｐｉｒｉｎ  ＆  Ｊａｍｅｓ  Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ，Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐ１０３，Ｆｉｇ  ６．３Ｂ）、Ｙａｅｔａ  Ｅｎｄｏ等は、Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ抽出物を利用した無細胞タンパク質発現方法を開発してＲＴＳ装備と異なる方式で自動化装備を開発した。
【００１３】
前記Ｙａｅｔａ  Ｅｎｄｏ等は、無細胞タンパク質発現溶液を低分子発現溶液で薄めて再び濃縮する方法を介してタンパク質発現収率を増やすことができた（ＵＳ２００６／０２５７９９７Ａ１）。
【００１４】
しかし、前記自動化装備も構造が複雑で装備価格が高価な問題点があって、ＲＴＳ装備のようなタンパク質精製機能がなく、多くのタンパク質を同時に製造するのに限界がある。
【００１５】
一方、細胞培養または無細胞タンパク質発現方法を介して組換えタンパク質が発現された試料には目標タンパク質以外にも多数のタンパク質が混在されているので、この試料から目標タンパク質を容易に精製するために、親和性タグ（ヒスチジンタグ）を付着する技術が利用されている。この技術は、鋳型遺伝子にヒスチジンタグを暗号化する配列を導入すると、この鋳型遺伝子から生成されるタンパク質のＣまたはＮ末端にヒスチジンタグがつくことになって、このヒスチジンタグと金属イオン（ニッケルイオン、コバルトイオンなど）の親和力を利用して、タンパク質を分離／精製すれば目標タンパク質だけ高純度で簡単に得ることができる。
【００１６】
しかし、タンパク質機能研究及び医療目的の目標タンパク質生産のためには、精製のために用いられる親和性タグが目標タンパク質の活性及び構造に否定的に作用できるので、これを除去する過程が必要である。
【００１７】
本発明者等（Ｂｉｏｎｅｅｒ）は、全自動タンパク質製造装備であるＥｘｉＰｒｏｇｅｎＴＭ（韓国公開特許１０−２０１１−０１２１５８８、１０−２０１３−００２３０９１）及び関連キットを開発した。この装備は、無細胞タンパク質発現反応を自動で行って、発現したタンパク質を自動で精製する装備であり、タンパク質発現反応を自動で行うために、鋳型ＤＮＡと反応に必要な溶液を自動で混ぜて、反応時間の間適正温度を維持できて、反応器内でＤＮＡからＲＮＡが合成されて、このＲＮＡからタンパク質が発現するまでのすべての過程を最適温度に維持することができる。また、発現したタンパク質が含まれている混合物試料から目標タンパク質を容易に精製するために、オリゴヒスチジンのような親和性タグを結合させた状態で目標タンパク質を発現させて、ここに二価金属イオン（ニッケルイオン、コバルトイオンなど）が付着した磁性粒子を利用して合成されたタンパク質を自動で精製する機能を有している。しかし、前記ＥｘｉＰｒｏｇｅｎＴＭ及びキットは、多数のタンパク質を同時に発現及び精製できるが、バッチ式でタンパク質発現をするので、時間が過ぎるにつれエネルギー源が枯渇して、タンパク質発現阻害物質の蓄積によってタンパク質発現が終了することで、最終的に発現するタンパク質量が少ない問題点を有している。
【００１８】
タンパク質の発現量を高めるためには、持続的にトリホスフェートＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源が入っている低分子発現溶液を供給して、蓄積されるタンパク質発現阻害物質を除去しなければならなく、これを全自動で行うためには新しい形態の反応器とシステムが必要である。
【００１９】
本発明者等は、既存の全自動タンパク質合成器ＥｘｉＰｒｏｇｅｎＴＭのタンパク質発現効率が低い短所を解決すると共に、低分子発現溶液を１０倍以上用いることで装備の大型化になる方法を避けて、目標タンパク質の発現率を高めることができる装備及びキットを開発するために鋭意努力した結果、無細胞タンパク質発現反応時透析膜を利用して、低分子発現溶液の持続的供給及びタンパク質発現阻害物質を除去して、目標タンパク質の発現率を高めることができる装備を開発した。
【００２０】
前記装備は、少量の低分子発現溶液を全自動でいくつかの工程に分けて供給して、タンパク質発現効率を上げることができる効果があり、既存のＥｘｉＰｒｏｇｅｎＴＭのように発現したタンパク質を全自動で精製することができ、精製後高濃度の溶出物質を含んでいる目標タンパク質溶液を所望のタンパク質保管用緩衝溶液に自動で交換できることを確認した。
【００２１】
また、精製に用いられる親和性タグが除去されなければならないタンパク質を製造する場合、目標タンパク質精製時タンパク質の特定アミノ酸配列を認識して切断するタンパク質分解酵素を処理して、全自動で親和性タグを除去して純粋な目標タンパク質を製造できることを確認して、本発明を完成することになった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】ＫＲ１０−０３８５２９８Ｂ１，２００３年５月１３日
【特許文献２】ＫＲ１０−０５３４５５８Ｂ１，２００５年１２月０１日
【特許文献３】ＫＲ１０−０７３３７１２Ｂ１，２００７年０６月２３日
【特許文献４】ＵＳ２００６／０２５７９９７Ａ１，２００６年１１月１６日
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】イ・チョルジュ等、タンパク質高速及び大量生産技術開発、科学技術部、２００５、１７〜３０ページ
【非特許文献２】Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｓｐｉｒｉｎ  ＆  Ｊａｍｅｓ  Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ．Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐ１０３  Ｆｉｇ  ６．３Ｂ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の目的は、無細胞タンパク質発現反応時透析膜を利用して少量の低分子発現溶液を全自動でいくつかの工程に分けて持続的に供給して、タンパク質発現阻害物質を除去して、目標タンパク質の発現率を高めることができる全自動無細胞タンパク質製造装備及び前記装備を利用した無細胞タンパク質製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
前記目的を達成するために、本発明は、上部が開放された構造で透析膜を備えた多数の透析チューブからなることを特徴とする反応容器を含むタンパク質発現反応部と、前記反応容器を加熱または冷却する反応温度調節部と、複数のピペットを含み、前記ピペットを利用して溶液を吸入または吐出することができるピペットアレイと、前記ピペットアレイを上下前後または左右に移動させて、溶液を移動させることができるピペットアレイ移動部と、磁場印加装置を備えたタンパク質精製部と、タンパク質製造に用いられる溶液を供給するマルチウェルプレートキットを装着できるマルチウェルプレート装着部と、を含むことを特徴とする全自動無細胞タンパク質製造装備を提供する。
【００２６】
本発明はまた、（ａ）無細胞タンパク質発現混合物製作工程（Ｓ１）と、（ｂ）低分子発現溶液を利用したタンパク質発現工程（Ｓ２）と、（ｃ）磁性粒子を利用したタンパク質精製工程（Ｓ３）と、（ｄ）タンパク質保管用緩衝溶液を利用した透析工程（Ｓ４）と、を含むことを特徴とする全自動無細胞タンパク質製造方法を提供する。
【００２７】
本発明はまた、（ａ）無細胞タンパク質発現混合物製作工程（Ｓ１）と、（ｂ）低分子発現溶液を利用したタンパク質発現工程（Ｓ２）と、（ｃ’）親和性タグが除去された純粋目標タンパク質の精製工程（Ｓ３'）と、（ｄ）タンパク質保管用緩衝溶液を利用した透析工程（Ｓ４）と、を含むことを特徴とする全自動無細胞タンパク質製造方法を提供する。
【００２８】
本発明はまた、無細胞タンパク質製造に必要な溶液を保存するために個別的に分離して単位ウェルで構成されるマルチウェルプレートキットと透析膜を備えた反応容器で構成されることを特徴とする全自動無細胞タンパク質製造用反応キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明に係る全自動無細胞タンパク質製造装備の簡略図である。
【図２】本発明に係る透析チューブを示したもので、（ａ）は断面図、（ｂ）は斜視図、（ｃ）は組立図である。
【図３】本発明に係る第１反応容器の斜視図と分解図である。
【図４】本発明に係る第２反応容器の斜視図と分解図である。
【図５】本発明に係る第３反応容器の斜視図と分解図である。
【図６】本発明に係る第４反応容器の斜視図と分解図である。
【図７】本発明に係るピペットアレイ正面図である。
【図８】本発明に係る全自動無細胞タンパク質製造方法の工程図（Ａ）及びマルチウェルプレートキットの斜視図（Ｂ）である。
【図９】本発明に係る全自動無細胞タンパク質製造装備を利用したタンパク質製造方法の工程である。
【図１０】本発明により製造された目標タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル確認結果である。（（Ａ）：Ｍ：バイオニアのＡｃｃｕＬａｄｄｅｒＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｚｅ  Ｍａｒｋｅｒ（Ｌｏｗ）、Ｅ：発現したＡｃＧＦＰ試料、Ｐ：精製されたＡｃＧＦＰ試料）、（Ｂ）Ｍ：バイオニアのＡｃｃｕＬａｄｄｅｒＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｚｅ  Ｍａｒｋｅｒ（Ｌｏｗ）、ＡｃＧＦＰ：精製されたＡｃＧＦＰ試料、ＲＦＰ：精製されたＲＦＰ試料、ＣＡＴ：精製されたＣＡＴ試料、ＡｃＧＦＰ（ＰＣＲプロダクト）：精製されたＡｃＧＦＰ−ＰＣＲプロダクト試料）
【図１１】本発明により製造された親和性タグが除去された純粋目標タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング（ＷＥＳＴＥＲＮ  ＢＬＯＴＴＩＮＧ）確認結果である。（（Ａ）：ＴＥＶ−ＡｃＧＦＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果、Ｍ：バイオニアのＡｃｃｕＬａｄｄｅｒＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｚｅ  Ｍａｒｋｅｒ（Ｌｏｗ）、Ｅ：発現されたＡｃＧＦＰ試料、Ｐ：精製されたＡｃＧＦＰ試料、（Ｂ）ヒスチジンタグ有無による試料比較、Ｃｏｎｔｒｏｌ：親和性タグが含まれた目標タンパク質精製方法で精製されたＴＥＶ−ＡｃＧＦＰ試料、Ｔａｇ−ｆｒｅｅ：親和性タグが除去された目標タンパク質精製方法で精製されたＴＥＶ−ＡｃＧＦＰ試料）
【発明を実施するための形態】
【００３０】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００３１】
本発明は、一観点で、上部が開放された構造で透析膜を備えた多数の透析チューブからなることを特徴とする反応容器を含むタンパク質発現反応部と、前記反応容器を加熱または冷却する反応温度調節部と、複数のピペットを含み、前記ピペットを利用して溶液を吸入または吐出することができるピペットアレイと、前記ピペットアレイを上下前後または左右に移動させて、溶液を移動させることができるピペットアレイ移動部と、磁場印加装置を備えたタンパク質精製部と、タンパク質製造に用いられる溶液を供給するマルチウェルプレートキットを装着できるマルチウェルプレート装着部と、を含むことを特徴とする全自動無細胞タンパク質製造装備に関する。
【００３２】
また、前記透析チューブは、一定の長さで切断された円筒形態の透析膜、前記透析膜の下部に挿入されて円盤型で形成される下部構成物及び前記透析膜の上部に挿入されて、Ｔ字形リング構造で製作される上部構成物を含むことを特徴とする。
【００３３】
また、前記透析チューブは、前記上部構成物と前記下部構成物に結合する前記透析膜の外周面に各々位置する弾性チューブをさらに含むことを特徴とする。
【００３４】
また、前記反応容器は、蒸発を防ぐために、上部開放部にピペットが挿入されるように切開された反応容器カバーをさらに含むことを特徴とする。
【００３５】
また、前記タンパク質発現反応部は、反応容器の上部に透析チューブが設置される複数の透析チューブ孔が形成されて、前記透析チューブ孔と連通される低分子発現溶液孔が前記透析チューブ孔の隣接した部位に形成されることを特徴とする。
【００３６】
また、前記タンパク質発現反応部は、反応容器の上部に透析チューブが設置される複数の透析チューブ孔が形成されて、前記透析チューブ孔と連通されるようにタンパク質保管用緩衝溶液を収容できる透析溶液孔が前記透析チューブ孔の隣接した部位に形成されるタンパク質透析部をさらに含むことを特徴とする。
【００３７】
また、前記タンパク質発現反応部は、反応容器溶液を除去する開閉可能な排出口と、前記排出口と連通されるように連結される廃液筒と、反応容器に溶液を投入する注入口と、前記注入口に溶液を定量的に注入する定量ポンプと、前記定量ポンプに連結される少なくとも一つ以上の溶液筒と、を含む。
【００３８】
また、前記タンパク質発現反応部は、前記定量ポンプと一側が連結されて、他側は前記溶液筒のうち選択される一つの溶液筒と連通されるようにする多チャンネル弁をさらに含むことを特徴とする。
【００３９】
また、前記タンパク質発現反応部は、反応容器の溶液を注入または排出する溶液通路と、前記溶液通路と連結されて溶液を定量的に注入または排出する正逆転定量ポンプと、前記正逆転定量ポンプに連結される少なくとも一つ以上の溶液筒と、前記正逆転定量ポンプに連結される少なくとも一つ以上の廃液筒と、及び一側が前記正逆転定量ポンプと連結されて、他側が前記溶液筒及び廃液筒と連結されて、選択される一つの溶液筒または廃液筒を前記正逆転定量ポンプと連通されるようにする多チャンネル弁と、を含むことを特徴とする。
【００４０】
また、前記ピペットアレイは、反応容器とピペットの数だけ１個〜９６個のピペットが１列から最大１２列まで設置可能で、前記ピペットを自動で脱付着させることができて、所望の溶液量を定量的に吸入して吐出することを特徴とする。
【００４１】
以下、本発明を詳細に説明する。
図１を参照して、本発明の全自動無細胞タンパク質製造装備１０の全体的な形態と構成について説明する。
【００４２】
本発明の全自動無細胞タンパク質製造装備は、タンパク質発現反応部１００、反応温度調節部１８０、ピペットアレイ３００、ピペットアレイ移動部３２０、タンパク質精製部４００、及びマルチウェルプレートキット２００、２００’を装着できるマルチウェルプレート装着部を含む。
【００４３】
前記タンパク質発現反応部１００は、円筒形態で製作される透析膜１１２が備えられて、上部が開放された透析チューブ１１０が縦横に一定間隔で配列されるように、透析チューブ１１０の上部が据え置きできる多数のホームを備えて、低分子発現溶液等をいれることができる容器であり、前記透析膜１１２の外部と接触させられるように低分子発現溶液を自動で加えて除去できる構造を特徴とする反応容器１２０、１４０、１６０、１７０を含むことを特徴とする。
【００４４】
前記反応温度調節部１８０は、前記反応容器１２０、１４０、１６０、１７０の下部に位置して、前記反応容器１２０、１４０、１６０、１７０を加熱または冷却する役割を果たす。
【００４５】
前記ピペットアレイ３００は、前記タンパク質発現反応部１００に挿入される多数の透析チューブ１１０のような配列を持つ複数のピペット３１０を含み、前記ピペット３１０を利用して溶液を吸入または吐出することができる。
【００４６】
前記ピペットアレイ移動部３２０は、前記ピペットアレイ３００を上下前後または左右に移動させて、タンパク質発現反応部１００、マルチウェルプレートキットなどにある溶液を移動させる役割を果たす。
【００４７】
前記タンパク質精製部４００は、発現された目標タンパク質を磁性粒子に付着させた後、磁性粒子を壁側に付着させることができる磁場印加装置１９０を含む。
【００４８】
前記磁場印加装置１９０は、磁石１９１が装着された磁石装着部１９２と磁石装着部１９２を上下に移動させて磁場を印加／解除できることを特徴とする。
【００４９】
またさらに、前記反応温度調節部１８０と前記磁場印加装置１９０を別に分離して製作することに限定するのではなく、同じ位置で同時に調節が可能なように製作されて使用できることを特徴とする。即ち、図面に図示された通り、タンパク質精製部４００を別に構成されるのではなく、単一個の反応容器１２０、１４０、１６０、１７０に前記タンパク質発現反応部１００と前記タンパク質精製部４００を共に含み、下部に前記反応温度調節部１８０と前記磁場印加装置１９０が移動して位置してもよい。
【００５０】
図２を参照して、本発明の透析チューブ１１０の形態に対して詳細に説明する。
本発明の透析チューブ１１０は、透析膜１１２、下部構成物１１３、上部構成物１１１、及び弾性バンド１１４を含む。
【００５１】
前記透析膜１１２は、一定の長さで切断された円筒形態で製作されて、前記下部構成物１１３は、円盤型で形成されて、前記透析膜１１２の下部に挿入されて、前記上部構成物１１１は、Ｔ字形リング構造で製作されて前記透析膜１１２の上部に挿入されて、溶液が投入できる孔が開けられている。
【００５２】
この時、前記透析チューブ１１０は、前記上部構成物１１１と前記下部構成物１１３に結合する前記透析膜１１２の外周面に各々弾性チューブ１１４が挿入されて密着して結束力をより高めることが好ましい。
【００５３】
また、前記上部構成物１１１は、反応容器１２０、１４０、１６０、１７０の透析チューブ孔１２１ａ、１４１ａに透析チューブ１１０が挿入されて据え置きできるように透析チューブ１１０の下部より径が大きいことを特徴とする。
【００５４】
より詳細には、前記透析チューブ１１０は、９６ｗｅｌｌ標準型式に合うように装着するために、前記上部構成物１１１の最大径が９ｍｍ以内であることが好ましく、前記透析膜１１２は、径が６．３７ｍｍまたは７．６２ｍｍの透析膜１１２を用いることが好ましい。
【００５５】
本発明の透析膜１１２は、従来の反応容器の下部に形成されるのに対して、円筒形態で形成されて、低分子発現溶液と当たる面積が広くて反応が効率的に進行される。
【００５６】
図３〜図６を参照して、本発明の反応容器１２０、１４０、１６０、１７０の形態に対して詳細に説明する。
図３〜図６は、本発明の反応容器１２０、１４０、１６０、１７０の種々の実現例を示し、図３は、１６個の透析チューブを収容することができる第１反応容器１２０を示して、図４は、４８個の透析チューブを収容することができる第２反応容器１４０を示して、図５は、９６個の透析チューブを収容することができる第３反応容器１６０を示して、図６は、９６個の透析チューブを収容することができる第４反応容器１７０を示す。
【００５７】
前記第１反応容器１２０と前記第２反応容器１４０は、低分子発現溶液を収容することができる低分子発現溶液孔１２１ｂ、１４１ｂが前記透析チューブ１１０と連通されるように形成される実現例であり、前記第３反応容器１６０と前記第４反応容器１７０は、低分子発現溶液を収容することができる空間が形成されて、ポンプ１６５、１７４を利用して低分子発現溶液、タンパク質保管用緩衝溶液などを供給または回収することができる実現例である。
【００５８】
図３を参照して、本発明の第１反応容器１２０に対して詳細に説明する。
前記第１反応容器１２０は、前記透析チューブ１１０が挿入される複数の透析チューブ孔１２１ａが形成されて、前記透析チューブ孔１２１ａの隣接した部位に形成されて、前記透析チューブ孔１２１ａと連通される低分子発現溶液孔１２１ｂが形成される。好ましくは、前記透析チューブ孔１２１ａは、１６個の孔が形成されて、１６個の前記透析チューブ１１０を収容することができることを特徴とする。
【００５９】
また、前記第１反応容器１２０は、各８個の透析チューブ１１０を収容して、タンパク質発現をさせるタンパク質発現反応部１００と、目標タンパク質精製後タンパク質保管用緩衝溶液を利用して透析させるタンパク質透析部１２２に分かれて用いられるように形成される。
【００６０】
前記タンパク質透析部１２２は、前記透析チューブ１１０が挿入される複数の透析チューブ孔１２２ａと前記透析チューブ孔１２２ａの隣接した部位に形成されて、前記透析チューブ孔１２２ａと連通されてタンパク質保管用緩衝溶液を収容することができる透析溶液孔１２２ｂが形成される。
【００６１】
また、前記第１反応容器１２０は、前記透析チューブ１１０の溶液が蒸発することを防ぐために、第１反応容器カバー１３０をさらに含む。
【００６２】
前記第１反応容器カバー１３０は、前記反応容器１２０に形成される低分子発現溶液孔１２１ｂ及び透析チューブ孔１２１ａと対応するように孔１３１が開けられて、孔１３１の上部には前記透析チューブ１１０の溶液が蒸発することを防ぐために前記蒸発防止膜１３２が形成されている。また、前記蒸発防止膜１３２は、ピペット３１０が円滑に挿入されるように前記低分子発現溶液孔１２１ｂと前記透析チューブ孔１２１ａと対応部分を切開させて用いられ、十字形態で切開して用いることが好ましいが、切開形態がこれに限定されるのではない。
【００６３】
図４を参照して、本発明の第２反応容器１４０に対して詳細に説明する。
前記第２反応容器１４０は、前記透析チューブが挿入される透析チューブ孔１４１ａが形成されて、前記透析チューブ孔１４１ａの隣接した部位に形成されて、前記透析チューブ孔１４１ａと連通される低分子発現溶液孔１４１ｂが形成される。好ましくは、前記透析チューブ孔１４１ａは、４８個の孔が形成されて、４８個の前記透析チューブ１１０を収容することができることを特徴とする。この時、低分子発現溶液孔の一部は、分けられてタンパク質透析部として用いられてもよい。
【００６４】
また、前記第２反応容器１４０は、前記透析チューブ１１０の溶液が蒸発することを防ぐために、第２反応容器カバー１５０をさらに含む。
【００６５】
前記第２反応容器カバー１５０は、前記第２反応容器１４０に形成される前記低分子発現溶液孔１４１ｂ及び前記透析チューブ孔１４１ａと対応するように孔１５１が開けられて、孔１５１の上部には、前記透析チューブ１１０の溶液が蒸発することを防ぐために蒸発防止膜１５２が形成されている。また、前記蒸発防止膜１５２は、ピペット３１０が円滑に挿入されるように前記低分子発現溶液孔１４１ｂ及び前記透析チューブ孔１４１ａと対応部分を切開させて用いられ、十字形態で切開して用いることが好ましいが、切開形態がこれに限定されるのではない。
【００６６】
図５を参照して、本発明の第３反応容器１６０に対して詳細に説明する。
前記第３反応容器１６０は、低分子発現溶液またはタンパク質保管用緩衝溶液を収容することができる所定の空間が形成される低分子発現溶液容器１６１と前記低分子発現溶液容器１６１を覆って、前記透析チューブ１１０が挿入されるための透析チューブ孔が開けられる溶液容器カバー１６２を含む。好ましくは、前記透析チューブ孔は、９６個の孔が形成されて、９６個の前記透析チューブ１１０を収容することができることを特徴とする。
【００６７】
また、前記第３反応容器１６０は、低分子発現溶液またはタンパク質保管用緩衝溶液が投入されるための注入口１６３、反応が終わった低分子発現溶液またはタンパク質保管用緩衝溶液を排出するための排出口１６４を含む。
【００６８】
また、前記注入口１６３は、定量ポンプ１６５、多チャンネル弁１６６、少なくとも一つ以上の溶液筒１６７が連結されている。より詳細には、前記注入口１６３に低分子発現溶液またはタンパク質保管用緩衝溶液が投入されるために、前記多チャンネル弁１６６が、前記溶液筒１６７中選択される一つの溶液筒１６７と連通されるようにして、前記定量ポンプ１６５を利用して前記溶液筒１６７にある低分子発現溶液またはタンパク質保管用緩衝溶液を前記第３反応容器１６０に注入することになる。
【００６９】
前記排出口１６４は、断続弁１６８と廃液筒１６９が連結されている。前記第３反応容器１６０に低分子発現溶液またはタンパク質保管用緩衝溶液が注入される場合、前記断続弁１６８は、閉められ、前記反応容器１６０に低分子発現溶液またはタンパク質保管用緩衝溶液が反応が起きて、一定時間が過ぎて反応が終わった低分子発現溶液またはタンパク質保管用緩衝溶液を前記断続弁１６８を開けて前記廃液筒１６９に回収することになる。
【００７０】
前記排出口１６４の形成位置は限定されるのではないか、好ましくは前記反応容器１６０の下部に形成されて、別途のポンプなしに重力によって前記排出口１６４に低分子発現溶液が吐出することが好ましい。また、前記反応容器１６０の内部の下部面が、前記排出口１６４側に傾斜するように形成されて、低分子発現溶液が円滑に抜け出ることが好ましい。また、前記排出口を反応容器の側面に配置させる場合、ポンプを共に配置させて溶液を吐出させることができる。
【００７１】
図６を参照して、本発明の第４反応容器１７０に対して詳細に説明する。
前記第４反応容器１７０は、前記第３反応容器１６０と同じ形状で製作されるものの、前記排出口１６４と前記注入口１６３を介して各々溶液が排出または注入されるのではなく、前記第４反応容器１７０の溶液通路１７３が位置して、一つの孔で溶液が注入または排出されることを特徴とする。図６では、下部に溶液通路が配置されることを記載したが、これに限定されるのではなく、溶液の注入または排出のためのいずれの位置や形態で配置されることが可能である。
【００７２】
前記溶液通路１７３は、正逆転定量ポンプ１７４、多チャンネル弁１７５、廃液筒１７７、及び溶液筒１７６と連結されている。前記多チャンネル弁１７５は、前記廃液筒１７７と少なくとも一つ以上の溶液筒１７６と連結されて選択される一つの筒と連通されるようにする役割を果たす。また、前記正逆転定量ポンプ１７４は、両方向に溶液を投入することができるポンプである。
【００７３】
より詳細には、前記第４反応容器１７０に低分子発現溶液またはタンパク質保管用緩衝溶液が投入される場合、前記多チャンネル弁１７５は、前記溶液筒１７６中選択される一つの溶液筒１７６を開放して、前記正逆転定量ポンプ１７４は、前記溶液筒１７６から前記第４反応容器１７０に低分子発現溶液またはタンパク質保管用緩衝溶液を投入することになる。それに対して、前記第４反応容器１７０の低分子発現溶液またはタンパク質保管用緩衝溶液を排出する場合、前記多チャンネル弁１７５は、前記廃液筒１７７を開放して、前記正逆転定量ポンプ１７４は、前記第４反応容器１７０から前記廃液筒１７７に反応を終えた低分子発現溶液またはタンパク質保管用緩衝溶液を排出することになる。
【００７４】
前記反応容器１２０、１４０、１６０、１７０が、前記のいずれの形態（図３〜図６に示した実現例）を持っても、精製されたタンパク質安定化のための追加的な透析過程を自動で行うことができる。親和性タグと結合する磁性粒子を利用して、タンパク質を付着させて洗浄して目標タンパク質以外の物質を除去した後、付着した目標タンパク質を磁性粒子から溶出させるために、高濃度の溶出物質が入っている溶出溶液を加えなければならない。このような溶出溶液をできるだけはやく除去して精製されたタンパク質が安定した緩衝溶液に変える過程が必要になるが、前記過程をピペットアレイ３００または前記のポンプ１６５、１７４と多チャンネル弁１６６、１７５を利用して自動で行うことができる。
【００７５】
以下、本発明の反応容器１２０、１４０、１６０、１７０の効果について詳細に説明する。
Ｗｅｌｌ形式の反応容器１２０、１４０、１６０、１７０とここに所望の数だけ装着できる透析膜が含まれた透析チューブを考案して、まず最小限の低分子発現溶液を用いて目標タンパク質を最大で発現できるタンパク質発現反応部を完成しようして、無細胞タンパク質低分子発現溶液を多工程的に加える方法を用いて最小限の低分子発現溶液でタンパク質発現を最大で増やす方法を試みた。
【００７６】
タンパク質発現反応が進行されながら生成された発現反応を阻害する反応物の濃度を透析膜を介して低くすれば、再び反応が持続的に進行されることを報告した。この時、反応を最大限増やすためには、少なくとも反応液に１０倍に該当する低分子発現溶液を用いなければならないと報告された。即ち、０．５ｍＬ体積のタンパク質発現反応をさせるためには、５ｍＬ以上の容量を持つ低分子発現溶液とこれを反応させることができる大きさの反応容器が必要になるが、このような容量では多数のタンパク質を発現するための反応器は大きい反応器を用いるようになって自動化装備の大きさも非常に大きくなる問題がある。
【００７７】
本発明では、このような問題を解決するために、低分子発現溶液を少なくいれて多工程で交換する方式で解決しようと試みた。
これに対して理論的に考察すると、発現反応が進行されると、生成される発現反応を阻害する物質の濃度をｃとして、反応溶液の体積をｖｍＬとして、低分子発現溶液の体積をＶｍＬとすると、透析膜を介して完全に平衡になると、反応溶液に残っている最終濃度は
【数１】
2015529094.tif 000003
になる。もしこの時に９倍の低分子発現溶液を用いると、Ｖ＝９ｖであるため、０.１ｃになりｃに到達する時まで即ち１０ｃぐらい反応が進行し続けることになる。例えば、Ｖ＝ｖにして、工程的に透析をさせると、１工程で０.５ｃになってｃに到達する時まで、２ｃぐらい反応が進行されることになる。ｃ濃度に到達した低分子発現溶液を除去して再び新しい低分子発現溶液を加えろと、２工程でも同様に０.５ｃになって反応溶液のｃだけ反応が進行されて、これを繰り返して８工程を進行すると、最終的に１０ｃだけ反応が進行されて、１０倍のタンパク質を得ることができる。従って、この方法を用いると、反応容器は大きさが１／９に減ることになって非常にコンパクトに製作され、全体装備の大きさを減らした装備を作ることができる。
【００７８】
また、多工程で溶液を交換するこの方法は、タンパク質製作の最終工程である透析工程ではより効率的である。最初の溶出物質の濃度をｃとして、反応溶液の体積をｖｍＬとして、緩衝溶液の体積をＶｍＬとすると、透析膜を介して完全に平衡がなると、反応溶液に残っている最終溶出物質の濃度は
【数２】
2015529094.tif 000004
になる。もしこの時、９倍の緩衝溶液を用いると、Ｖ＝９ｖであるため、０.１ｃまで到達することができる。例えば、Ｖ＝ｖにして、工程的に透析をさせると、１工程で透析されて平衡をなすことになると、０．５ｃになる。０．５ｃ濃度に到達した緩衝溶液を除去して再び新しい緩衝溶液を加えれば２工程で同様に０．２５ｃになり、３工程では０．１２５になるため、１／３の緩衝溶液だけでも似た濃度で透析することができる。
【００７９】
本発明は、工程的に低分子発現溶液を交換することができる反応容器１２０、１４０、１６０、１７０を考案して、最小限の低分子発現溶液で発現反応をさせて、目標タンパク質を最大で発現できるタンパク質発現反応部１００を完成して以後合成されたタンパク質の精製を行うことができる従来よりコンパクトながらもより効率的で多量のタンパク質製造が可能な全自動無細胞タンパク質製造装備を提供する。
【００８０】
図７を参照して、本発明のピペットアレイ３００に対して説明する。
前記ピペットアレイ３００は、１個〜９６個のピペット３１０を自動で脱付着させることができて、所望の容量の溶液を定量的に吸い込んで吐出できることを特徴とする自動化されたピペットアレイ３００であることを特徴とする。ピペットアレイ３００は、８個のピペットを１列にして１列から最大１２列まで配列されることを特徴とする。図７は、８個のピペットを装着できるピペットアレイを図示している。ピペットアレイ３００は、ピペットアレイ移動部３２０によって左右上下または前後に移動させるものであり、前記ピペットアレイ３００及びピペットレイ移動部３２０は、韓国登録特許１０−１０２５１３５及び韓国公開特許１０−２０１１−０１２１５８８に詳細に記載されている。
【００８１】
図８を参照して、本発明の全自動無細胞タンパク質製造方法とマルチウェルプレートキット２００、２００’に対して説明する。
本発明は、（ａ）無細胞タンパク質発現混合物製作工程（Ｓ１）と、（ｂ）低分子発現溶液を利用したタンパク質発現工程（Ｓ２）と、（ｃ）磁性粒子を利用したタンパク質精製工程（Ｓ３）と、（ｄ）タンパク質保管用緩衝溶液を利用した透析工程（Ｓ４）と、を含むことを特徴とする。
また、前記（ｃ）磁性粒子を利用したタンパク質精製工程（Ｓ３）は、一般に親和性タグが結合した目標タンパク質精製工程を意味して、（ｃ’）親和性タグが除去された純粋目標タンパク質の精製工程（Ｓ３'）に変更されることができることを特徴とする。
【００８２】
本発明の全自動無細胞タンパク質の製造方法は、好ましくは前記全自動無細胞タンパク質製造装備で製造されることを特徴とするか、これに限定されない。
本発明において、前記（ｂ）タンパク質発現工程は、（ｉ）低分子発現溶液注入工程、（ｉｉ）タンパク質発現促進工程、及び（ｉｉｉ）低分子発現溶液除去工程の工程からなることを特徴とする。
【００８３】
この時、低分子発現溶液は、マルチウェルプレートキットまたは溶液筒から供給されることを特徴とし、（ｉ）低分子発現溶液注入工程〜（ｉｉｉ）低分子発現溶液除去工程を順次１回以上繰り返して実施して多量のタンパク質発現が可能にすることを特徴とする。
【００８４】
本発明において、前記（ｃ）の磁性粒子を利用したタンパク質精製工程は、（ｉ）タンパク質発現物と磁性粒子を結合させる工程、（ｉｉ）磁性粒子洗浄溶液を注入して磁場を印加／解除して磁性粒子に結合された不純物を除去する洗浄工程、及び（ｉｉｉ）磁性粒子から目標タンパク質を分離する工程からなることを特徴とする。
【００８５】
前記（ｃ）磁性粒子を利用したタンパク質精製工程が、（ｃ’）親和性タグが除去された純粋目標タンパク質の精製工程（Ｓ３'）に変更される場合には、（ｉ）タンパク質発現物と磁性粒子を結合させる工程、（ｉｉ）磁性粒子洗浄溶液を注入して磁場を印加／解除して磁性粒子に結合された不純物を除去する洗浄工程、（ｉｉｉ）タンパク質分解酵素とタンパク質分解酵素反応溶液注入工程、（ｉｖ）磁性粒子と結合した親和性タグを目標タンパク質から分離する分離工程、及び（ｖ）磁性粒子とタンパク質分解酵素を結合させて目標タンパク質と分離する回収工程からなることを特徴とする。
【００８６】
この時、磁性粒子懸濁液、磁性粒子洗浄溶液、タンパク質溶出溶液またはタンパク質分解酵素反応溶液は、マルチウェルプレートキットから供給されることを特徴とし、（ｉｉ）磁性粒子洗浄溶液を注入して磁性粒子に結合された不純物を除去する洗浄工程は順次１回以上繰り返して実施することを特徴とする。
【００８７】
本発明において、前記（ｄ）タンパク質保管用緩衝溶液を利用した透析工程は、（ｉ）透析溶液孔にタンパク質保管用緩衝溶液注入工程、及び（ｉｉ）透析チューブ内タンパク質溶出溶液またはタンパク質分解酵素が除去されたタンパク質分解酵素反応溶液除去工程からなることを特徴とする。
【００８８】
この時、タンパク質保管用緩衝溶液は、マルチウェルプレートキットまたは溶液筒から供給されることを特徴として、（ｉ）透析溶液孔にタンパク質保管用緩衝溶液注入工程〜（ｉｉ）透析チューブ内タンパク質溶出溶液またはタンパク質分解酵素が除去されたタンパク質分解酵素反応溶液除去工程は、順次１回以上繰り返して実施することを特徴とする。
【００８９】
他の観点において、本発明は、全自動無細胞タンパク質製造用反応キットに関する。全自動無細胞タンパク質製造用反応キットは、無細胞タンパク質製造に必要な溶液を保存するために個別的に分離して単位ウェルで構成されるマルチウェルプレートキットであることを特徴とする。
【００９０】
また、前記マルチウェルプレートキットは、無細胞タンパク質製造に必要な溶液を含むことを特徴として、この時必要な溶液は、タンパク質保管用緩衝溶液、滅菌蒸溜水、磁性粒子懸濁液、磁性粒子洗浄溶液、タンパク質溶出溶液、低分子発現溶液、タンパク質分解酵素反応溶液、膜タンパク質合成のためのリボソーム、ミセルなどが含まれている溶液などで１種以上選択されることを特徴とするが、これに限定されのではなく、通常の知識を有する者が、無細胞タンパク質合成及び精製に必要な溶液が共に含まれて製造することができる。前記マルチウェルプレートキットは、無細胞タンパク質合成及び精製目的に応じてその溶液の種類と分株される単位ウェルが異なるように提供されることを特徴とする。
【００９１】
また、前記全自動無細胞タンパク質製造用反応キットは、透析膜を備えた透析チューブをさらに含むことを特徴とする。
【００９２】
また、前記低分子発現溶液、タンパク質保管用緩衝溶液は、溶液筒１６７、１７６に提供されてもよく、この場合、ポンプを利用して繰り返し溶液を添加することができ、反応完了以後廃液筒１６９、１７７を介して排出できる。
【００９３】
また、タンパク質精製に用いられる磁性粒子は、ニッケルイオン、コバルトイオン等のような２価金属イオンが結合された磁性粒子であることを特徴とする。
【００９４】
また本発明は、前記全自動無細胞タンパク質製造装備１０のタンパク質発現反応部１００に透析チューブ１１０を設置して透析チューブ１１０内にタンパク質発現混合物を注入した後、周期的に低分子発現溶液を透析チューブ１１０の外部に加えて無細胞タンパク質発現が持続的に起きるようにした後、親和性タグと結合する磁性粒子を利用するタンパク質精製方法を利用して磁場印加装置１９０を備えたタンパク質自動精製部４００で自動で発現したタンパク質を精製して、タンパク質透析部１２２を利用して精製されたタンパク質溶液をタンパク質保管用緩衝溶液に透析する過程を経て最終的に目標タンパク質を提供することを目的とする。
【００９５】
また、本発明で用いられるマルチウェルプレートキット２００、２００’は、第１マルチウェルプレートキット２００と第２マルチウェルプレートキット２００’を含む。
【００９６】
前記第１マルチウェルプレートキット２００には、隣接して２列をなす多数の単位ウェル（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）と、前記多数の単位ウェル（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）の上段部を密封するフィルム（図示せず）を含み、前記第２マルチウェルプレートキット２００’は、隣接して２列をなす多数のウェルからなる多数の単位ウェル（Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）と、前記多数の単位ウェル（Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）の上段部を密封するフィルム（図面図示せず）を含む。
【００９７】
上述したマルチウェルプレートキット２００、２００’は、各々列が２列であることを記載したが、設置可能な反応容器とピペットアレイのピペット数だけ各々の溶液を保存する空間に個別的に分離することを特徴とする。
【００９８】
また、前記マルチウェルプレートキット２００、２００’は、タンパク質発現に必要な低分子発現溶液、タンパク質精製に必要な、磁性粒子懸濁液、磁性粒子洗浄溶液、そしてタンパク質保管用緩衝溶液などを含む。
【００９９】
より詳細には、タンパク質精製に必要な溶液には、目標タンパク質を付着させるための磁性粒子懸濁液、前記磁性粒子から目標タンパク質以外のものを除去するための洗浄溶液、前記目標タンパク質を磁性粒子から脱着させる溶出溶液、目標タンパク質から親和性タグを除去する時必要なタンパク質分解酵素反応溶液、タンパク質保管用緩衝溶液、滅菌蒸溜水、低分子発現溶液、膜タンパク質合成溶液などを含んでもよい。
【０１００】
各々のマルチウェルプレートキット２００、２００’単位ウェルに注入される溶液は、使用目的により異なるように提供されてもよい。
【０１０１】
本発明での用語「鋳型ＤＮＡ」とは、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによってＤＮＡまたはＲＮＡ重合反応で新規ＤＮＡと新規ＲＮＡが生成される時、複製しようとする核酸鎖で、円形形態（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｆｏｒｍ）または線形形態（ｌｉｎｅａｒ  ｆｏｒｍ）のＤＮＡを用いることができる。好ましくは、前記円形形態のＤＮＡとしてはプラスミドＤＮＡが使用できて、線形形態のＤＮＡはＰＣＲ断片（ｐｒｏｄｕｃｔ）が使用できるが、これに限定されない。
【０１０２】
本発明の方法で鋳型ＤＮＡは、タンパク質発現が可能なベクター内に目標タンパク質の遺伝子配列と酵素切断部位配列を含むＤＮＡ配列を通常の遺伝子組換え方法によって容易に収得できて、このような方法は当業者には自明である。
【０１０３】
本発明の方法で前記鋳型を用いて発現したタンパク質は、目標タンパク質−酵素切断部位−親和性タグまたは親和性タグ−酵素切断部位−目標タンパク質の順で発現できて、前記酵素切断部位は、タンパク質分解酵素によって切断されて、これによって親和性タグが目標タンパク質と分離して、最終的に目標タンパク質だけを収得することができる。
【０１０４】
本発明での用語「親和性タグ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔａｇ）」とは、特定リガンド（ｌｉｇａｎｄ）に結合力を持つ物質を保有した融合パートナーと定義できて、通常的にタンパク質精製時盛んに利用されている。
【０１０５】
本発明の方法で、前記親和性タグは、（ｉ）基質との選択的親和性を利用したβ−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、（ｉｉ）ＩｇＧとの親和性を利用したプロテインＡ、または（ｉｉｉ）Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋などを含む金属親和性を利用したポリヒスチジンなどが使用でき、好ましくはヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）またはシステイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）であり、これに限定されない。
【０１０６】
本発明の方法では、磁性粒子（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄ）を用いてもよい。
本発明で、前記親和性タグは、遺伝子発現ベクターに親和性タグが挿入されたものを選択して、これに目標タンパク質をクローニングすることで、容易に挿入することができる。本発明で、前記親和性ベクターを含むベクターは、例えば、ｐＢＩＶＴ（バイオニア、韓国）、ｐＩＶＥＸ（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ）、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ドイツ）、ｐＫ７、ｐＱＥなどが用いられ、これらに限定されない。
【０１０７】
本発明ではまた、親和性タグがない発現ベクターを選択する場合、「鋳型」に親和性タグを発現する塩基配列を含ませて、遺伝子組換え方法を用いて製造することができる。
【０１０８】
また、本発明での用語「細胞破砕物」には、細胞培養後高圧破砕によって製造されたもので、ｍＲＮＡ転写及びタンパク質発現に必要なＲＮＡポリメラーゼ、リボソームなどの細胞構成物が含まれ、前記細胞は、動物細胞、微生物、または、植物細胞であってもよく、好ましくは微生物であり、より好ましくはＥ．ｃｏｌｉであるが、これに限定されない。
【０１０９】
本発明の方法で「発現溶液」とは、転写及び翻訳に必要なアミノ酸、エネルギー源、緩衝溶液などを含むサプリメント（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）である。本発明では「タンパク質発現溶液」と混用して用いられて、鋳型、細胞破砕物と混合してタンパク質合成に用いられる。
【０１１０】
本発明での用語「低分子発現溶液」とは、無細胞タンパク質発現、即ち転写、翻訳に必要なトリホスフェートＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源が入っている溶液を意味して、「タンパク質発現混合物」とは、細胞破砕液、発現溶液、緩衝溶液などが含まれてタンパク質の発現が起きる溶液を意味して、「鋳型ＤＮＡ」とは、発現しようとするプロモーター、ターミネーター、そしてタンパク質を暗号化する核酸配列を含んでいる発現ベクターまたはＰＣＲ産物を意味する。
【０１１１】
本発明での用語「タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）」とは、タンパク質上の特定アミノ酸配列を認知して、結合を切断して、アミノ酸またはペプチドへの分解能を持つ酵素として、タンパク質切断酵素（ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）と混用できる。
【０１１２】
本発明の方法で、前記タンパク質分解酵素は目標タンパク質に挿入された酵素切断部位を認識して、親和性タグを除去するのに用いられて、本発明では、特に目標タンパク質は切断しないで、酵素切断部位だけを認知して切断するライノウイルスタンパク質分解酵素（ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）、タバコエチ病ウイルス由来タンパク質分解酵素（（ＴＥＶ、Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ）ｐｒｏｔｅａｓｅ）、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ、トロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、エンテロキナーゼ（ｂｏｖｉｎｅ  Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ）等を用いることができ、好ましくはＴＥＶタンパク質分解酵素であるが、これに限定されたのではない。
【０１１３】
本発明での用語「酵素切断部位」とは、タンパク質切断酵素によって認知されて、切断されるポリペプチド内の特定アミノ酸配列である。
本発明の方法で前記「酵素切断部位」は、選択する酵素によって酵素切断部位の配列が変わることがあり、例えばライノウイルスタンパク質分解酵素は、「Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ↓Ｇｌｙ−Ｐｒｏ」；ＴＥＶタンパク質分解酵素は、「Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ↓Ｇｌｙ」；Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａは、「Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ↓」；トロンビンは、「Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓Ｇｌｙ−Ｓｅｒ」；及びエンテロキナーゼは、「Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ↓」であってもよく、これらに限定されない（前記表示「↓」は酵素切断部位である）。
【０１１４】
本発明において、親和性タグが結合した目標タンパク質合成方法では、透析チューブに入った鋳型、細胞破砕液及びタンパク質発現溶液の混合物に低分子発現溶液を加える低分子発現溶液注入工程（Ｓ１０）；前記反応容器で定温を維持してタンパク質合成反応が起きるようにするタンパク質発現促進工程（Ｓ２０）；低分子発現溶液除去工程（Ｓ３０）；マルチウェルプレートで磁性粒子懸濁液と磁性粒子洗浄液を混合して準備する磁性粒子平衡化工程（Ｓ４０）；前記収得されたタンパク質発現物をマルチウェルプレートに移動させた後、前記準備した磁性粒子を注入する混合工程（Ｓ５０）；前記混合工程（Ｓ５０）の単位ウェルに磁場を印加させて、前記磁性粒子と結合した目標タンパク質を除いた混合物を除去する除去工程（Ｓ６０）；前記除去工程（Ｓ６０）の単位ウェルに洗浄溶液を注入して、磁場を印加／解除させて磁性粒子と結合した目標タンパク質を除いた不純物を除去する洗浄工程（Ｓ７０）；タンパク質溶出溶液を利用して磁場を印加させて磁性粒子と目標タンパク質が分離された溶液を取得する工程（Ｓ８０）；及び前記目標タンパク質含有溶液を透析チューブに注入して、タンパク質保管用緩衝溶液をタンパク質透析部に注入（Ｓ９０）してタンパク質溶出溶液を除去（Ｓ１００）する過程からなる透析工程を含む親和性タグが結合された全自動無細胞タンパク質合成方法であることを特徴とする。
【０１１５】
本発明において、親和性タグが除去された純粋目標タンパク質合成方法では、透析チューブに入った鋳型、細胞破砕液、及びタンパク質発現溶液の混合物に低分子発現溶液を加える低分子発現溶液注入工程（Ｓ１０）；前記反応容器で定温を維持してタンパク質合成反応が起きるようにするタンパク質発現促進工程（Ｓ２０）；低分子発現溶液除去工程（Ｓ３０）；マルチウェルプレートで磁性粒子懸濁液と磁性粒子洗浄液を混合して準備する磁性粒子平衡化工程（Ｓ４０）；前記収得されたタンパク質発現物をマルチウェルプレートに移動させた後、前記準備した磁性粒子を注入する混合工程（Ｓ５０）；前記混合工程（Ｓ５０）の単位ウェルに磁場を印加させて、前記磁性粒子と結合された目標タンパク質を除いた混合物を除去する除去工程（Ｓ６０）；前記除去工程（Ｓ６０）の単位ウェルに洗浄溶液を注入して前記磁性粒子と結合した目標タンパク質を除いた不純物を除去する単位ウェルに磁場を印加させて、前記磁性粒子と結合された目標タンパク質を除いた不純物を除去する洗浄工程（Ｓ７０）；タンパク質分解酵素反応溶液を前記磁性粒子と結合された目標タンパク質が含まれた単位ウェルに加えて磁場を印加させて磁性粒子と結合された親和性タグを目標タンパク質から分離する工程、磁性粒子とタンパク質分解酵素を結合させて目標タンパク質と分離する工程（Ｓ８０’）；及び前記目標タンパク質含有溶液を透析チューブに注入して、タンパク質保管用緩衝溶液をタンパク質透析部に注入（Ｓ９０）してタンパク質溶出溶液除去の過程として（Ｓ１００）透析工程を含む親和性タグが除去された全自動無細胞タンパク質合成方法であることを特徴とする（図９）。
【０１１６】
本発明の実施例で、タンパク質を製造するために必要な試料である、鋳型ＤＮＡ、細胞破砕液、発現溶液、低分子発現溶液、親和性タグ除去用ＴＥＶ酵素及び反応溶液、磁性粒子懸濁液、磁性粒子洗浄溶液、タンパク質溶出溶液及びタンパク質保管用緩衝溶液を製造しており、本発明の全自動無細胞タンパク質製造装備と前記製造された試料を利用してタンパク質を製造した。
【０１１７】
本発明のタンパク質製造方法のうち無細胞タンパク質発現混合物製作工程を除いたいずれの反応は、全自動無細胞タンパク質製造装備によって自動化作業で行った。
【０１１８】
本発明の全自動無細胞タンパク質製造装備を利用して６個の反応ウェルで低分子発現溶液を多工程で交換しながらＡｃＧＦＰを製造して、図１０Ａに示したように１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで確認した結果、低分子発現溶液を順次置換するにつれてタンパク質の発現量が増加する結果を確認することができた。また、各々異なる形態で製作された鋳型を用いて各々異なるタンパク質を製造できるかを確認した（図１０Ｂ）。
【０１１９】
それに対して、ＴＥＶによって切断される配列が含まれたＡｃＧＦＰ遺伝子を鋳型にして、親和性タグを除去する方法で製造した結果、図１１に示したようにヒスチジンタグが除去されて精製された試料は、発現試料に比べて大きさが小さく、ヒスチジンタグの抗体（Ａｂｃａｍ社抗体利用）により検出されない結果が得られることを確認した。
【実施例】
【０１２０】
以下、実施例を通して、本発明をより一層詳細に説明する。この実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこの実施例によって制限されると解釈されないことは当業界の通常の知識を有する者には自明である。
【０１２１】
≪実施例１：鋳型ＤＮＡ製造≫
１−１：プラスミドＤＮＡ製造
本発明では、無細胞タンパク質製造のために、ＡｃＧＦＰ、ＣＡＴ、ＲＦＰ及びＴＥＶ−ＡｃＧＦＰ遺伝子を用いた。これは、本発明の無細胞タンパク質製造装備を利用したタンパク質製造を確認するために当業界に公示された一般的なタンパク質を対象に実験したもので、これに制限されないで当業者が無細胞タンパク質製造方法で生産しようとするタンパク質ならば、種類と関係なく適用可能であることは当業界に通常の知識を有する者には自明な事項である。各々の遺伝子は、遺伝子合成方法（ＮＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８，２４８，２００−２０３）によって合成した。以後、遺伝子合成物質に制限酵素処理をした後、ヒスチジンタグを有している無細胞発現ベクターｐＢＩＶＴ（バイオニア、韓国）にクローニングした。それに対して、ＴＥＶ−ＡｃＧＦＰの場合にはヒスチジンタグと目標タンパク質との間にＴＥＶで切断される配列（Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ↓Ｇｌｙ）を含んで製作した。
【０１２２】
発現ベクターとしては、ｐＢＩＶＴ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）、ｐＩＶＥＸ（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ）、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ドイツ）、ｐＫ７、ｐＱＥなどが用いられ、これらに限定されない。
【０１２３】
具体的に、制限酵素処理及びクローニングは次の通り実施した。
遺伝子合成物質に対する制限酵素処理はＮｄｅＩ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）１μＬ、ＳａｌＩ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）１μＬ、１０Ｘ  ＡｃｃｕＣｕｔＴＭ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）２μＬ、遺伝子合成物質１０μＬ、滅菌蒸溜水６μＬを各々のチューブに入れて混合した後３７℃で３時間定温配置した。発現ベクターに対する制限酵素処理は、ＮｄｅＩ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）１μＬ、ＳａｌＩ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）１μＬ、１０Ｘ  ＡｃｃｕＣｕｔＴＭ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）２μＬ、発現ベクター１０μＬ、滅菌蒸溜水６μＬをチューブに入れて混合した後３７℃で３時間定温配置した。各制限酵素処理反応物からＡｃｃｕｐｒｅｐ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）を用いてＤＮＡを精製した。
【０１２４】
以後、２×ｒａｐｉｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、米国）５μＬ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１μＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、米国）、制限酵素処理遺伝子合成物質３μＬ、制限酵素処理ベクター１μＬをチューブに入れて混合した後、１６℃で１時間定温配置した。その後、Ｅ．ｃｏｌｉコンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）１００μＬに前記定温配置した反応液１０μＬを入れて、氷上に３０分間置いた後４２℃で９０秒培養して、再び氷上に５分置いた。カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）が含まれたＬＢプレートに前記反応液を接種した後３７℃で１６時間培養した。
【０１２５】
白色コロニーを取ってＬＢ液体培地１０ｍＬで１６時間程度培養した後、遠心分離して上澄み液は捨てて、ＡｃｃｕＰｒｅｐ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）を用いてペレットからプラスミドＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡは、塩基配列分析を行って、各遺伝子合成方法によって合成された遺伝子であるか確認して、タンパク質合成に用いるＤＮＡは、該当コロニーを培養して同様の方法でプラスミドＤＮＡを確保した。プラスミドＤＮＡは、ＵＶ分光計（Ｓｈｉｍａｚｕ社製、日本）で濃度と純度を測定して、純度（Ａ２６０／２８０）が１．８〜２．０の間であることを確認した。
【０１２６】
１−２：ＰＣＲプロダクト製造
ＰＣＲプロダクト製作のためにＥｘｉＰｒｏｇｅｎＴＭ  ＰｒｏＸｐｒｅｓｓ  ＰＣＲ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）を用いた。
具体的に、先に目標遺伝子を増幅することができ、５‘と３’末端にオーバーラップ配列を有しているプライマーセットを製作して準備し、目標遺伝子を有している試料（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ、Ｔ  ｖｅｃｔｏｒなど）を鋳型にして１次ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応時キットで提供するＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＰｒｏＦｉ  Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｍｉｘを用いて、反応条件は、９４℃で５分間変成させた後、反応は９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で１分を一周期として３０サイクル（ｃｙｃｌｅ）で増幅して、最終的に７２℃、５分間重合させる条件で進めた。以後、１次ＰＣＲ反応物をＡｃｃｕＰｒｅｐ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）を利用して精製して準備した。
【０１２７】
前記１次ＰＣＲ反応物を鋳型にして、２次オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを進めて最終的にタンパク質合成のためのＰＣＲ断片を合成した。ＰＣＲ反応は、キットで提供するカセットセットとプライマーセット及び１次ＰＣＲ反応物を添加して行って、反応条件は９４℃で５分間変成させた後、反応は９４℃で１分、４８℃で１分、７２℃で１分を一周期で３０サイクル（ｃｙｃｌｅ）で増幅して、最終的に７２℃、５分間重合させる条件で進めた。２次ＰＣＲ反応物をＡｃｃｕＰｒｅｐ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）を利用して精製して準備した。
【０１２８】
≪実施例２：細胞破砕液製造≫
先に大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）；Ｎｏｖａｇｅｎ社製、米国）を３５０Ｌ発効槽（２×ＹＴ培地）で３７℃の温度で培養した。そして吸光度（ＯＤ６００）０．６で１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現させて、吸光度（ＯＤ６００）３．０〜３．５で培養を中断して遠心分離を介して細胞を回収して、−５０℃で保管した。
【０１２９】
回収された大腸菌１００ｇを５００ｍＬの洗浄溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ＯＡｃ）  ｐＨ８．２、１４ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、６０ｍＭ  Ｋ（ＯＡｃ）、１ｍＭ  ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、０．０５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ））を入れて、洗浄した後遠心分離（３，０００ＲＰＭ、３０分）する手順を４回繰り返した。
【０１３０】
洗浄が終わった後、大腸菌の重さを測定した後、重さの１．１倍の体積に該当する緩衝溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ＯＡｃ）ｐＨ８．２、１４ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、６０ｍＭ  Ｋ（ＯＡｃ）、１ｍＭ  ＤＴＴ）を入れて大腸菌を均一によく解いた後、細胞破砕機（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｓｅｒ、Ｓｔａｎｓｔｅｄ  Ｆｌｕｉｄ  Ｐｏｗｅｒ）を利用して一定圧力（２８０ｐｓｉ）下に細胞を破砕した。
【０１３１】
前記細胞破砕液を高速遠心分離（１６，０００ＲＰＭ、３０分、４℃）で分離して、上澄み液を回収して、これに対し前記緩衝溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ＯＡｃ）  ｐＨ８．２、１４ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、６０ｍＭ  Ｋ（ＯＡｃ）、１ｍＭ  ＤＴＴ）を細胞破砕液１０ｍＬ当たり３ｍＬの割合で混ぜた後、それに２６．７ｇ／ｍＬクレアチンキナーゼを添加した後、３７℃、８０分培養を介して前培養された溶液を作った。以後、前記前培養された溶液を遠心分離（１１，０００ＲＰＭ、２０分、４℃）を経て、最終的に細胞破砕液を製造した。この細胞破砕液は、使用前まで−７０℃に保管した。
【０１３２】
≪実施例３：発現溶液及び低分子発現溶液製造≫
無細胞タンパク質発現のために添加される発現溶液は、１１４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、２．４ｍＭ  ＡＴＰ、各１．７ｍＭ  ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰ、２ｍＭ  ＤＴＴ、９０ｍＭ  Ｋ（Ｇｌｕ）、８０ｍＭ  ＮＨ４（ＯＡｃ）、１２ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）、６８ｇ／ｍＬフォリン酸（ｆｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｌ−５−ｆｏｒｍｙｌ−５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、２．５ｍＭ混合アミノ酸（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｍｉｘｔｕｒｅ）、２％ＰＥＧ８０００、６７ｍＭクレアチンリン酸を混合して製造した。また、低分子発現溶液は、発現溶液：ＤＥＰＣ  ＤＷ：５％ＮａＮ３の比を４６．７：５２．３：１で混合して製造した。前記発現溶液と低分子発現溶液は使用前まで−２０℃に保管した。
【０１３３】
≪実施例４：親和性タグ除去用ＴＥＶ酵素及び反応溶液製造≫
４−１：発現ベクター製造及び菌株確保
ＴＥＶ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉコドンに最適化された遺伝子を合成して準備した。遺伝子合成方法（Ｌｏ−Ｃｈｕｎ  Ａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ.Ｃｏｍｍｕｎ．，２４８１：２００，１９９８）で合成された遺伝子は、ＴＥＶ酵素の前にヒスチジンタグを暗号化する配列を含んでいる。合成された遺伝子は、Ｎｄｅ  Ｉ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）１μＬ、ＸｈｏＩ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）１μＬ、１０Ｘ  ＡｃｃｕＣｕｔＴＭ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）２μＬ、遺伝子合成物質１０μＬ、滅菌蒸溜水６μＬを各々のチューブに入れて混合した後、３７℃で３時間反応させて遺伝子断片を収得した。また、同じ制限酵素と条件でｐＣｏｌｄ（ＴａＫａＲａ、日本）を処理して各々のＤＮＡをＡｃｃｕｐｒｅｐ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて精製した。
【０１３４】
前記精製されたＴＥＶ遺伝子断片３μＬ及びベクター１μＬを各々取って、これに２×ｒａｐｉｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）５μＬ及びＴ４  ＤＮＡリガーゼ１μＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、米国）を混合した後、１６℃で１時間ライゲーションした。
その次に、ＤＨ−５ａコンピテント細胞１００μＬにライゲーション反応物１０μＬを混合して、氷上で３０分、４２℃で９０秒、再び氷上で５分の順で処理してライゲーションされたベクターが、菌体内部に挿入されるようにして、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢプレートに接種して、３７℃で１６時間静置培養した。
【０１３５】
培養された白色コロニーを取ってアンピシリンが含まれたＬＢ液体培地１０ｍＬで１６時間程度振とう培養した後、遠心分離して上澄み液は捨てて、ＡｃｃｕＰｒｅｐ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）を用いてペレットからＴＥＶ遺伝子が挿入された発現ベクターｐＣｏｌｄ−ＴＥＶを収得した。
【０１３６】
前記準備したｐＣｏｌｄ−ＴＥＶ発現ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞１００μＬに１μＬを混合して、氷上で３０分、４２℃で９０秒、再び氷上で５分の順で処理して発現ベクターが菌体内部に挿入されるようにして、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンが含まれたＬＢプレートに接種して３７℃で１６時間静置培養して発現菌株を確保した。
【０１３７】
４−２：細胞培養
前記で確保されたＴＥＶ発現菌株は、ＬＢ培地を利用して１次（３ｍＬ）、２次（１００ｍＬ）、３次（２Ｌ）の順で３７℃の温度で培養して種菌を確保した。準備した種菌は、７０ＬのＬＢ培地に添加した後、３７℃の温度で培養して、吸光度（ＯＤ６００）０．４で０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して１８℃の温度で１６時間培養して、遠心分離を介して細胞を回収した。
【０１３８】
４−３：ＴＥＶ酵素精製
菌体１００ｇに１０００ｍＬの細胞緩衝溶液２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌｍｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｎｙｌ  Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を混合して菌体を均一に解いた後、細胞破砕機（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｓｅｒ、Ｓｔａｎｓｔｅｄ  Ｆｌｕｉｄ  Ｐｏｗｅｒ）を利用して一定圧力（２８０ｐｓｉ）下に細胞を破砕した。
【０１３９】
前記細胞破砕液を遠心分離（１１，０００ＲＰＭ、３０分、４℃）した後、上澄み液に４０％５％のストレプトマイシン硫酸塩（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）を添加した後、遠心分離（１１，０００ＲＰＭ、１５分、４℃）して核酸を除去した。
【０１４０】
回収した細胞破砕液体積の０．３１４倍に該当する硫酸アンモニウムを添加して遠心分離（１１，０００ＲＰＭ、１５分、４℃）してペレットを回収した。このペレットを２００ｍＬ  Ｎｉ  ｃｏｌｕｍｎ緩衝溶液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）で解いた後、透析チューブ（１０ｋＤａ、Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｕｂｉｎｇ、Ｓｉｇｍａ社製、米国）に入れて５０倍の体積に該当するＮｉカラム緩衝溶液で透析（１２時間、４℃）して異物を除去した。透析チューブ内の溶液を遠心分離（１１，０００ＲＰＭ、２０分、４℃）して上澄み液を回収した後、Ｎｉ−アガロース樹脂（ａｇａｒｏｓｅ  ｒｅｓｉｎ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が充填されたカラムに結合させた。以後、Ｎｉカラム溶出溶液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）を用いて、タンパク質が含まれた溶出液を収得した。
【０１４１】
前記タンパク質溶出液を前記と同じ透析チューブに入れて１００倍の体積に該当するＤＥＡＥカラム緩衝溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ））で透析（１２時間、４℃）した後、遠心分離（１１，０００ＲＰＭ、２０分、４℃）して上澄み液を回収して、ＤＥＡＥ樹脂（ｒｅｓｉｎ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が充填されたカラムに流した。ＴＥＶタンパク質は、ＤＥＡＥ樹脂と結合しないので、樹脂に結合されない溶液だけを回収して、透析チューブ（１０ｋＤ、Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｕｂｉｎｇ、Ｓｉｇｍａ社製、米国）に入れて、５０倍の体積に該当するＴＥＶ保管用緩衝溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  Ｔｒｉｎｔｏｎ  Ｘ−１００、５０％グリセロール）に透析及び濃縮した。最終回収されたＴＥＶ酵素は、使用前まで−２０℃に保管した。
【０１４２】
４−４：ＴＥＶ酵素反応溶液製造
ＴＥＶ酵素が反応できる溶液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭイミダゾール，５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ），０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，及び１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）を製造した。この溶液は、今後目標タンパク質から親和性タグを除去する時用いられて、使用前まで−２０℃に保管した。
【０１４３】
≪実施例５：磁性粒子懸濁液及び洗浄溶液製造≫
５−１：磁性粒子懸濁液製造
タンパク質精製に用いられる磁性粒子は、磁性を帯びる鉄（Ｆｅ）粒子をシリカ（Ｓｉｌｉｃａ）でコーティングして末端をニッケル（Ｎｉ）でコンプレックス（ｃｏｍｐｌｅｘ）化した磁性粒子で、バイオニア（Ｂｉｏｎｅｅｒ）社のＮｉ−ＮＴＡシリカ磁性粒子（ｓｉｌｉｃａ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ）を利用した。磁性粒子懸濁液は、２０％エタノールを利用して１０％スラリーに製造して用いた。
【０１４４】
５−２：磁性粒子洗浄溶液製造
タンパク質精製に必要な洗浄溶液を製造した。具体的に、磁性粒子洗浄溶液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭイミダゾール，５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ），及び１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）Ｉを製造して用いた。
【０１４５】
それに対して、親和性タグ除去時には磁性粒子洗浄溶液ＩＩ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、及び１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）を製造して用いた。
前記磁性粒子洗浄溶液は、使用前まで４℃に保管した。
【０１４６】
≪実施例６：タンパク質溶出溶液及びタンパク質保管用緩衝溶液製造≫
６−１：タンパク質溶出溶液製造
目標タンパク質精製に必要なタンパク質溶出溶液を製造した。具体的に、タンパク質溶出溶液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，１Ｍイミダゾール，５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ），及び１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）を製造した。この溶液は、使用前まで４℃に保管した。
６−２：タンパク質保管用緩衝溶液製造
目標タンパク質精製後、タンパク質を長期保管できるタンパク質保管用緩衝溶液を製造した。具体的に、タンパク質保管用緩衝溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．６），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０５％（ｖ／ｖ）ＮａＮ３，及び５０％（ｖ／ｖ）グリセロール）を製造した。この溶液は使用前まで４℃に保管した。
【０１４７】
≪実施例７：全自動無細胞タンパク質製造装備を利用したタンパク質製造≫
（１）無細胞タンパク質発現混合物製作工程
無細胞タンパク質発現のための混合物を製作する過程は次のとおりである。
内部と外部を滅菌蒸溜水で洗った透析チューブを、用いるべきタンパク質発現反応部とタンパク質透析部の反応容器の透析チューブ孔に入れた後、タンパク質透析部の各透析チューブには滅菌蒸溜水０．５ｍＬを満たす。
以後、前記実施例で準備した鋳型ＤＮＡ、細胞破砕液、発現溶液を常温で溶解した後、タンパク質発現反応部の透析チューブ内に注入して混合する。
【０１４８】
（２）低分子発現溶液を利用したタンパク質発現工程
低分子発現溶液は、マルチウェルプレートキットまたは溶液筒で提供されてもよく、試料の数量によって発現方法は下記の実施例のように変わり得る。
【０１４９】
イ．２４種以下の試料
図３〜図４にある第１または第２反応容器を用いてタンパク質発現を進めて、低分子発現溶液はマルチウェルプレートキットで提供される。
ピペットは、マルチウェルプレートキットの低分子発現溶液をタンパク質発現反応部に位置した反応容器の低分子発現溶液孔に注入する。この時、低分子発現溶液の体積は、各タンパク質発現混合物の約２.５〜３倍の体積に該当する。タンパク質発現反応部の下部に位置した反応温度調節部が加熱（２６〜３８℃）されて、ピペットは低分子発現溶液孔内に挿入されて溶液を周期的に混合する。この過程でタンパク質発現混合物が入っている透析チューブの透析膜を介して低分子発現溶液内のエネルギー源などが混合物内に注入されて、混合物内のタンパク質発現阻害物質は、透析膜外へ排出されながらタンパク質発現が促進される。３時間後、ピペットは、低分子発現溶液孔の低分子発現溶液を取って廃液筒に捨てた後、マルチウェルプレートキットで供給する新しい低分子発現溶液を反応容器の低分子発現溶液孔に注入する。このような低分子発現溶液を工程的に交換する過程は、５〜６回繰り返されてもよい。
【０１５０】
ロ．２４種以上の試料
図５〜図６にある第３または第４反応容器を用いてタンパク質発現を進めて、低分子発現溶液は溶液筒で提供される。
低分子発現溶液は、溶液筒から反応容器に連結される注入口を介して低分子発現溶液容器に注入される。この時、低分子発現溶液の体積は、全体タンパク質発現混合物体積の１０〜２０倍に該当する。タンパク質発現反応部の下部に位置した反応温度調節部が加熱（２６〜３８℃）されて、１６〜２０時間程度持続する。タンパク質発現混合物が入っている透析チューブの透析膜を介して低分子発現溶液内のエネルギー源などが混合物内に注入されて、混合物内のタンパク質発現阻害物質は、透析膜外へ排出されながらタンパク質発現が促進される。
タンパク質発現が終わった後、低分子発現溶液は、排出口を介して廃液筒に捨てられる。このような低分子発現溶液注入と除去工程は１回以上繰り返されてもよい。
【０１５１】
（３）磁性粒子を利用したタンパク質精製工程
タンパク質精製に必要な磁性粒子懸濁液、磁性粒子洗浄液及びタンパク質溶出溶液は、マルチウェルプレートキットで提供される。
【０１５２】
イ．親和性タグが結合された目標タンパク質精製
ピペットは、マルチウェルプレートキットの磁性粒子懸濁液をタンパク質精製部のマルチウェルプレートキットに移した後、磁性粒子洗浄溶液と混合する。タンパク質精製部の磁場印加装置によって磁性粒子をマルチウェルプレートキット壁面に付けた後、磁性粒子洗浄溶液を除去する。
【０１５３】
ピペットを利用して透析チューブ内のタンパク質発現混合物を磁性粒子があるマルチウェルプレートキットに移動させた後、磁性粒子と混合する。この過程で、ヒスチジンタグを有する目標タンパク質は磁性粒子表面の２価イオンと結合することになる。前記磁場印加装置によって目標タンパク質が結合された磁性粒子をマルチウェルプレートキット壁面に付けた後、不純物を除去する。
【０１５４】
目標タンパク質が結合した磁性粒子があるウェルに磁性粒子洗浄溶液を注入した後、ピペットを利用して混合して磁性粒子を懸濁させる。この過程で、磁性粒子に結合されているヒスチジンタグがないタンパク質が磁性粒子から離れて出てくる。以後、前記磁場印加装置によって磁性粒子はマルチウェルプレートキット壁面に付けた後、不純物が含まれた洗浄溶液を除去する。この過程は６〜８回繰り返されてもよい。
【０１５５】
洗浄が完了した目標タンパク質が結合された磁性粒子があるウェルにタンパク質溶出溶液を注入した後、ピペットを利用して混合する。この過程で目標タンパク質は磁性粒子から分離されて、溶液内に存在することになる。前記磁場印加装置によって磁性粒子をマルチウェルプレートキット壁面に付けた後、溶出された目標タンパク質溶液を回収する。回収した溶液は、タンパク質透析部に位置した透析チューブ内に移す。
【０１５６】
ロ．親和性タグが除去された純粋目標タンパク質の精製
ピペットは、マルチウェルプレートキットの磁性粒子懸濁液をタンパク質精製部のマルチウェルプレートキットに移した後、磁性粒子洗浄溶液と混合する。タンパク質精製部の磁場印加装置によって磁性粒子をマルチウェルプレートキット壁面に付けた後、磁性粒子洗浄溶液を除去する。
【０１５７】
ピペットを利用して透析チューブ内のタンパク質発現混合物を磁性粒子があるマルチウェルプレートキットに移動させた後、磁性粒子と混合する。この過程で、ヒスチジンタグを有する目標タンパク質は磁性粒子表面の２価イオンと結合することになる。前記磁場印加装置によって目標タンパク質が結合された磁性粒子をマルチウェルプレートキット壁面に付けた後、不純物を除去する。
【０１５８】
目標タンパク質が結合された磁性粒子があるウェルに磁性粒子洗浄溶液を注入した後、ピペットを利用して混合して磁性粒子を懸濁させる。この過程で、磁性粒子に結合されているヒスチジンタグがないタンパク質が磁性粒子から離れて出てくる。以後、前記磁場印加装置によって磁性粒子はマルチウェルプレートキット壁面に付けた後、不純物が含まれた洗浄溶液を除去する。この過程は６〜８回繰り返されてもよい。
【０１５９】
洗浄が完了した目標タンパク質が結合された磁性粒子があるウェルにＴＥＶ酵素と反応溶液混合物を注入した後、ピペットを利用して混合して、該当ウェルをタンパク質精製部の下段に位置した反応温度調節部を用いて３０℃で１時間加熱する。この過程で、目標タンパク質が親和性タグと分離され、最終的に目標タンパク質は磁性粒子から分離されて溶液内に存在することになる。また、この溶液内には親和性タグが除去された目標タンパク質以外に、ＴＥＶ酵素が共に含まれている。前記磁場印加装置によって磁性粒子をマルチウェルプレートキット壁面に付けた後、目標タンパク質が含まれた溶液を新しい磁性粒子に結合させる。この過程で、ヒスチジンタグを有しているＴＥＶ酵素は磁性粒子に結合して、目標タンパク質は結合しないまま上澄み液に存在する。
【０１６０】
以後、前記磁場印加装置によってＴＥＶ酵素が結合された磁性粒子をマルチウェルプレートキットの壁面に付けた後、最終目標タンパク質溶液を回収してタンパク質透析部に位置した透析チューブ内に移す。
【０１６１】
（４）タンパク質保管用緩衝溶液を利用した透析工程
タンパク質保管用緩衝溶液は、マルチウェルプレートキットまたは溶液筒で提供されてもよく、試料の数量により発現方法は下記の実施例の通り変わり得る。
【０１６２】
イ．２４種以下の試料
図３〜図４にある第１または第２反応容器を用いて透析を進めて、タンパク質保管用緩衝溶液は、マルチウェルプレートキットでに提供される。
【０１６３】
ピペットは、マルチウェルプレートキットのタンパク質保管用緩衝溶液をタンパク質透析部に位置した反応容器の透析溶液孔に注入する。この時、前記緩衝溶液の体積は、各目標タンパク質溶液の約２倍の体積に該当する。タンパク質透析部の下部に位置した反応温度調節部が、冷却（４〜８℃）されて、ピペットは、透析溶液孔内に挿入されて、溶液を周期的に混合する。この過程で、目標タンパク質溶液に含まれているタンパク質溶出溶液は、透析チューブの透析膜を介してタンパク質保管用緩衝溶液と交換される。３時間後、ピペットは、透析溶液孔のタンパク質保管用緩衝溶液を取って廃液筒に捨てた後、マルチウェルプレートキットで供給する新しいタンパク質保管用緩衝溶液を反応容器の透析溶液孔に注入する。このようなタンパク質保管用緩衝溶液を工程的に交換する過程は５〜６回繰り返されてもよい。
【０１６４】
ロ．２４種以上の試料
図５〜図６にある第３または第４反応容器を用いて透析を進めて、タンパク質保管用緩衝溶液は溶液筒で提供される。
【０１６５】
タンパク質保管用緩衝溶液は、溶液筒から反応容器に連結される注入口を介して透析容器に注入される。この時、タンパク質保管用緩衝溶液の体積は、全体目標タンパク質溶液体積の１０〜２０倍に該当する。タンパク質透析部の下部に位置した反応温度調節部は、冷却（４〜８℃）されて、１６〜２０時間程度持続する。この過程で、目標タンパク質溶液に含まれているタンパク質溶出溶液は、透析チューブの透析膜を介してタンパク質保管用緩衝溶液と交換される。このようなタンパク質溶出溶液とタンパク質保管用緩衝溶液を工程的に交換する過程は、１回以上繰り返されてもよい。
【０１６６】
≪実施例８：全自動無細胞タンパク質製造装備を利用して製造されたタンパク質発現程度確認≫
実施例７の方法で全自動無細胞タンパク質製造装備を利用して製造したタンパク質の発現程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で確認した。
本全自動無細胞タンパク質製造装備を利用して６個の反応ウェルで低分子発現溶液を多工程で交換しながらＡｃＧＦＰを製造した結果、図１０Ａに示した通り１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで確認した結果、低分子発現溶液を順次置換することによってタンパク質の発現量が増加する結果を確認することができた。
【０１６７】
また、ＡｃＧＦＰ以外にもＣＡＴ、ＲＦＰ及びＡｃＧＦＰ（ＰＣＲプロダクト）等他のタンパク質を製造できることを確認した（図１０Ｂ）。
【０１６８】
それに対して、ＴＥＶによって切断される配列が含まれたＡｃＧＦＰ遺伝子を鋳型にして、親和性タグを除去する方法で製造した結果、図１１Ａに示した通りヒスチジンタグが除去されて精製された試料（Ｐ）は、発現試料（Ｅ）に比べて大きさが小さいことを確認しており、ヒスチジンタグの抗体（Ａｂｃａｍ社抗体利用）を利用してウエスタンブロットを行った結果、ヒスチジンタグが除去されて精製された試料は検出されないことを確認した（図１１Ｂ）。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
本発明に係る全自動無細胞タンパク質製造装備は、全自動で目標タンパク質を発現して精製するだけでなく、タンパク質保管用緩衝溶液に透析できるので、最終製造されたタンパク質をすぐに使用できる長所がある。
【０１７０】
また、本発明に係るタンパク質製造方法は、多工程で低分子発現溶液を交換して無細胞タンパク質発現に必要なエネルギー源などを持続的に供給することができて、従来の配置形態の無細胞タンパク質製作法を用いて目標タンパク質を得る場合に比べて最大５倍量を取得できて、磁性粒子を利用した目標タンパク質精製時タンパク質分解酵素を利用して不要な親和性タグを除去して純粋な目標タンパク質を製造できるので、産業、医療及び研究目的のタンパク質生産において、タンパク質活性及び構造に否定的影響を及ぼしかねない人工配列が除去された原形のタンパク質を生産できる点で非常に有用である。
【０１７１】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記術は単に望ましい実施様態であるだけであり、これによって本発明の範囲が制限されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求範囲及びその等価物によって定義される。
【符号の説明】
【０１７２】
１０        全自動無細胞タンパク質製造装備、
１００      タンパク質発現反応部、
１１０      反応容器、
１１１      上部構成物、
１１２      透析膜、
１１３      下部構成物、
１１４      弾性バンド、
１２０      第１反応容器、
１２１ａ    透析チューブ孔、
１２１ｂ    低分子発現溶液孔、
１２２ａ    透析チューブ孔、
１２２ｂ    透析溶液孔、
１３０      第１反応容器カバー、
１３１      孔、
１３２      蒸発防止膜、
１４０      第２反応容器、
１４１ａ    透析チューブ孔、
１４１ｂ    分子発現溶液孔、
１５０      第２反応容器カバー、
１５１      孔、
１５２      蒸発防止膜、
１６０      第３反応容器、
１６１      低分子発現溶液容器、
１６２      反応容器カバー、
１６３      注入口、
１６４      排出口、
１６５      定量ポンプ、
１６６      多チャンネル弁、
１６７      溶液筒、
１６８      断続弁、
１６９      廃液筒、
１７０      第４反応容器、
１７１      低分子発現溶液容器、
１７２      反応容器カバー、
１７３      前記溶液通路、
１７４      正逆転定量ポンプ、
１７５      多チャンネル弁、
１７６      溶液筒、
１７７      廃液筒、
１８０      反応温度調節部、
１９０      磁場印加装置、
１９１      磁石、
１９２      磁石装着部、
２００、２００’    マルチウェルプレートキット、
３００      ピペットアレイ、
３１０      ピペット、
３２０      ピペットアレイ移動部、
４００      タンパク質精製部、
Ｓ１〜Ｓ４    全自動無細胞タンパク質製造方法
【図２】
2015529094.tif 000005
【図９】
2015529094.tif 000006
【図１】
2015529094.tif 000007
【図３】
2015529094.tif 000008
【図４】
2015529094.tif 000009
【図５】
2015529094.tif 000010
【図６】
2015529094.tif 000011
【図７】
2015529094.tif 000012
【図８】
2015529094.tif 000013
【図１０】
2015529094.tif 000014
【図１１】
2015529094.tif 000015
【国際調査報告】
2015529094.tif 000016
2015529094.tif 000017
2015529094.tif 000018
2015529094.tif 000019