(57)【要約】  本発明は、向上した可溶性を備えるイソプレン合成酵素活性を有する変異体ポリペプチドに関する方法及び組成物を提供する。特に、本発明は、組換え宿主細胞においてイソプレン産生を増加させる、イソプレン合成酵素変異体を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレン合成酵素活性を有する単離ポリペプチドであって、該ポリペプチド変異体が、配列番号１の対応する残基Ｘ２８８に置換を含み、かつ前記ポリペプチドが、残基Ｘ２８８に置換を含まない親ポリペプチドと比較してタンパク質溶解度が増加している、単離ポリペプチド。
【請求項２】
前記置換が残基Ｓ２８８のものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記置換が残基Ｓ２８８Ｃのものである、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、前記親ポリペプチドと比較してタンパク質の溶解度が少なくとも約５％〜少なくとも約７５％増加している、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、植物から単離された親ポリペプチドに由来するものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記親ポリペプチドが、ポプラ（poplar）（ハコヤナギ（Populus sp.））、クズ（kudzu）（プエラリア（Pueraria sp.））、ヨーロッパナラ（English oak）（カシ（Quercus sp.））又はヤナギ（willow）（サリクス（Salix sp.））から選択される植物種から単離される、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記親種が、ハコヤナギ（Populus sp）である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記親ペプチドがウラジロハコヤナギ（P. alba）、ヤマナラシ（P. tremuloides）、コットンウッド（P. trichocharpa）、セイヨウハコヤナギ（P. nigra）のものである、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記親種が、プエラリア（Pueraria sp.）である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記親種が、タイワンクズ（Pueraria montana）である、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記親種が、カシ（Quercus sp.）である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記親種が、ヨーロッパナラ（Quercus rubur）である、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記親種が、サリックス（Salix sp.）である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記親種がサリックス・アルバ（S. alba）又はサリックス・バビロニア（S. baylonica）である、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組み換え宿主細胞。
【請求項１６】
前記宿主細胞が、細菌細胞、藻類細胞、真菌細胞、酵母細胞、ラン藻細胞、又はクロストリジウムからなる群から選択される、請求項１５の宿主細胞。
【請求項１７】
前記宿主細胞が、細菌細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記細菌細胞が、グラム陽性細菌細胞、又はグラム陰性細菌細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記細菌細胞が、大腸菌（E. coli）、ラクトバチルス・アシドフィルス（L. acidophilus）、シュードアルテロモナス・シトレア（P. citrea）、バチルス・サブチリス（B. subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシィ（B. clausii）、バチルス・ハロドュランス（B. halodurans）、バチルス・メガテリウム（B. megaterium）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サーキュランス（B. circulans）、バチルス・ロータス（B. lautus）、バチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、ストレプトマイシス・アルブス（S. albus）、ストレプトマイシス・リビダンス（S. lividans）、ストレプトマイシス・セリカラー（S. coelicolor）、ストレプトマイシス・グリセウス（S. griseus）、シュードモナス（Pseudomonas sp.）、シュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes）、コリネバクテリウム・グルタミクム（C. glutamicum）細胞からなる群から選択される、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記宿主細胞が藻類細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記藻類細胞が、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ミドリムシ類、クロミスタ類、又は渦鞭毛藻類からなる群から選択される、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記宿主細胞が真菌細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記真菌細胞が糸状菌である、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記酵母細胞が、サッカロミセス（Saccharomyces sp）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア属（Pichia sp.）、又はカンジダ属（Candida sp.）からなる群から選択される、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞である、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
配列番号２（ＤＷ６１４）のアミノ酸残基を含むポリペプチドの結晶形態。
【請求項２８】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項２８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３０】
請求項２９に記載のベクターを含む、組み換え宿主細胞。
【請求項３１】
イソプレン産生法であって、（ａ）イソプレン産生に好適な条件下で請求項１５に記載の組み換え細胞を培養すること、並びに（ｂ）イソプレンを産生させること、を含む、方法。
【請求項３２】
イソプレン産生法であって、（ａ）イソプレン産生に好適な条件下で請求項３０に記載の組み換え細胞を培養すること、並びに（ｂ）イソプレンを産生させること、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１１年１０月２７日出願の、米国特許仮出願番号第６１／５５２，４５３号の優先権を主張する。この特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、イソプレン合成酵素変異体を含む方法及び組成物を提供する。特に、本発明は、宿主細胞におけるイソプレン産生を増加させる、植物のイソプレン合成酵素変異体を提供する。
【背景技術】
【０００３】
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、水不溶性でかつアルコール可溶性の揮発性炭化水素である。採算の合う量のイソプレンは、石油分解生成物中のＣ５留分から直接得ることができ、あるいはＣ５イソアルカン又はイソアルケンを脱水することにより得ることができる（Ｗｅｉｓｓｅｒｍｅｌ  ａｎｄ  Ａｒｐｅ，「工業有機化学（Industrial Organic Chemistry）」，第４版，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ｐｐ．１１７〜１２２，２００３）。Ｃ５骨格は、より小さなサブユニットから合成することもできる。しかしながら、再生不能資源に依存せずとも採算の合うイソプレン産生方法が所望されている。
【０００４】
ポリイソプレン及び多様なコポリマー（イソブチレン、ブタジエン、スチレン、又は他のモノマー）の製造にはイソプレンモノマーが使用される。採算の合うレベルのイソプレンを産生し得る株（原核生物又は真核生物の株）を樹立するには、ＤＸＰ又はＭＶＡ経路の一部又は全体、あるいはＭＶＡ及びＤＸＰ経路の両方を最適化する必要がある。この経路において鍵となる酵素はイソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）であり、この酵素は前駆体であるＤＭＡＰＰをイソプレンに変換する。これまでに同定されているイソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）としては、ポプラ（poplar）、ヨーロッパナラ（English oak）及びクズ（kudzu vine）などの植物由来のものが挙げられる。同定されている植物ＩｓｐＳ酵素の一部は、これまでに、大腸菌（E. coli）で発現させることで、ある程度特性評価されており、これらの酵素の動態パラメーターは、精製タンパク質をもとにｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定されている。しかしながら、天然のＩｓｐＳ酵素並びに更には一部の組換え酵素の可溶性は、宿主生物においてイソプレンを商業産生するには不十分である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、解決すべき課題のうち１つとしては、より多量のイソプレンを生物学的に製造することができるよう可溶性が改良されたイソプレン合成酵素変異体（例えば、特定の残基が置換されている変異体）の供給が挙げられる。本明細書に記載されるような課題を解決するにあたり、可溶性が改良されたイソプレン合成酵素を宿主で発現させることができる（例えば、宿主微生物）。
【０００６】
本明細書で引用されるすべての特許、特許出願、論文及び刊行物は、参照により明示的に本案件に援用される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、改良された可溶性を備え、イソプレン活性を有する変異体ポリペプチド組成物、並びにイソプレン産生のためのこのような変異体の製造及び使用方法を提供する。
【０００８】
適宜に、一態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性を有する単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチド変異体は、配列番号１に対応する残基Ｘ２８８に置換を含み、かつポリペプチドは、残基Ｘ２８８に置換を含まない親ポリペプチドと比較してタンパク質可溶性が増加している。一実施形態では、置換は、Ｓ２８８のものである。別の実施形態では、置換はＳ２８８Ｃである。別の実施形態では、ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較してタンパク質の溶解度が少なくとも約５％〜少なくとも約７５％増加している。別の実施形態では、ポリペプチドは、植物から単離された親ポリペプチドに由来する。別の実施形態では、親ポリペプチドは、ポプラ（poplar）（ハコヤナギ（Populus sp.））、クズ（kudzu）（プエラリア（Pueraria sp.））、ヨーロッパナラ（English oak）（カシ（Quercus sp.））又はヤナギ（willow）（サリクス（Salix sp.））から選択される植物種から単離される。別の実施形態では、親種はハコヤナギ（Populus sp.）である。別の実施形態では、親はウラジロハコヤナギ（P. alba）、アメリカヤマナラシ（P. tremuloides）、コットンウッド（P. trichocharpa）、セイヨウハコヤナギ（P. nigra）である。別の実施形態では、親種はプエラリア（Pueraria sp.）である。別の実施形態では、親種はタイワンクズ（Pueraria montana）である。別の実施形態では、親種はカシ（Quercus sp.）である。別の実施形態では、親種はヨーロッパナラ（Quercus rubur）である。別の実施形態では、親種はサリクス（Salix sp.）である。別の実施形態では、親種は、サリックス・アルバ（S. alba）又はサリックス・ベイロニカ（S. baylonica）である。
【０００９】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドのうちいずれかを含む組み換え宿主細胞を提供する。一実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞、藻類細胞、真菌細胞、酵母細胞、シアノ細菌細胞、又はクロストリジウムからなる群から選択される。別の実施形態では、宿主細胞は細菌細胞である。別の実施形態では、細菌細胞は、グラム陽性菌細胞又はグラム陰性菌細胞である。別の実施形態では、細菌細胞は、大腸菌（E. coli）、ラクトバチルス・アシドフィルス（L. acidophilus）、シュードアルテロモナス・シトレア（P. citrea）、バチルス・スブチリス（B. subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシィ（B. clausii）、バチルス・ハロドュランス（B. halodurans）、バチルス・メガテリウム（B. megaterium）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サーキュランス（B. circulans）、バチルス・ロータス（B. lautus）、バチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、ストレプトミセス・アルバス（S. albus）、ストレプトミセス・リビダンス（S. lividans）、ストレプトミセス・セリカラー（S. coelicolor）、ストレプトミセス・グリセウス（S. griseus）、シュードモナス（Pseudomonas sp.）、シュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes）、クロストリジウム（Clostridium sp.）、コリネバクテリウム（Corynebacterium sp.）、及びコリネバクテリウム・グルタミクム（C. glutamicum）からなる群から選択される。別の実施形態では、宿主細胞は藻類細胞である。別の実施形態では、藻類細胞は緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ミドリムシ類、クロミスタ類、又は渦鞭毛藻類からなる群から選択される。別の実施形態では、宿主細胞は真菌細胞である。別の実施形態では、真菌細胞は糸状菌である。別の実施形態では、宿主細胞は酵母細胞である。別の実施形態では、酵母細胞は、酵母菌属（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア属（Pichia sp.）、又はカンジダ属（Candida sp.）からなる群から選択される。別の実施形態では、酵母細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞である。
【００１０】
別の態様では、本発明は、配列番号２のアミノ酸残基を含むポリペプチドの結晶形態を提供する（ＤＷ６１４）。別の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性を有する単離ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを提供し、ポリペプチド変異体は配列番号１の対応する残基Ｘ２８８の置換を含み、ポリペプチドは、残基Ｘ２８８に置換を含まない親ポリペプチドと比較してタンパク質溶解度が増加している。別の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性を有する単離ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むベクターを提供し、ポリペプチド変異体は配列番号１の対応する残基Ｘ２８８の置換を含み、ポリペプチドは、残基Ｘ２８８に置換を含まない親ポリペプチドと比較してタンパク質溶解度が増加している。別の態様では、本発明は、上記のベクターを含む組み換え宿主細胞を提供する。別の態様では、本発明は、イソプレンの産生方法を提供し、方法は、（ａ）イソプレンの産生に好適な条件下で上記組換え細胞を培養すること、並びに（ｂ）イソプレンを産生させること、を含む。別の態様では、本発明は、イソプレンの産生方法を提供し、方法は、（ａ）イソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドを含む組み換え細胞を培養すること、ここで、ポリペプチド変異体は配列番号１の対応する残基Ｘ２８８に置換を含み、かつポリペプチドは残基Ｘ２８８に置換を含まない親ポリペプチドと比較してイソプレンの産生に好適な条件下でのタンパク質溶解度が増加している、並びに（ｂ）イソプレンを産生させること、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（Ａ）活性部位から約８Åに位置する部位の配置を示し、野生型ＩｓｐＳの単量体を示す図。ＰＤＢ  ３Ｎ０Ｇとの構造アラインメントをもとに、ジメチルアリルｓ−チオロジホスファート及びＭｇ２＋（球）を配置した。（Ｂ）Ａに記載の部位の拡大図。
【図２】ＤＷ２１８−ＭＥＡ  Ｐ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ  Ｓ２８８Ｃのプラスミドマップ。
【図３】Ｇ４９１Ｓ変異をもつウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素を収容するｐＣＨＬ２４３のプラスミドマップ。
【図４】Ｂ．ｐＤＷ１６１  ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ（Ｓ２８８Ｃ  Ｇ４９１Ｓ）−ｍＭＶＫのプラスミドマップ。
【図５】Ｓ２８８Ｃ変異を収容しているＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳが可溶性であることを示す図。
【図６】ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ  Ｓ２８８Ｃ  Ｇ４９１Ｓが、親酵素Ｇ４９１Ｓと比較して著しく可溶性が高いことを示すグラフ。
【図７】ウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ及びサリックス・アルバ（S. alba）ＩｓｐＳ間のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント。
【図８】ｐＥＷＬ７９２のプラスミドマップ。
【図９】ｐＥＷＬ７９５のプラスミドマップ。
【図１０】ウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ及びシダレヤナギ（S. babylonica）ＩｓｐＳ間のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント。
【図１１】ｐＥＷＬ８３４のプラスミドマップ。
【図１２】ｐＥＷＬ８５１のプラスミドマップ。
【図１３】上清及び沈殿画分中のＩｓｐＳのウェスタンブロット解析。
【図１４】上清及び沈殿画分中のＩｓｐＳを比較することによるＩｓｐＳのタンパク質可溶性解析を示すグラフ。
【図１５】ｐＥＷＬ９０６のプラスミドマップ。
【図１６】ｐＥＷＬ９０７のプラスミドマップ。
【図１７】クマシー染色したＮｕＰａｇｅゲル。このゲルからは、Ｓ２８８Ｃ変異により、サリックス（Salix）ＩｓｐＳの可溶性が向上していることが見て取れる。
【図１８】Ｓ２８８Ｃの変異により、サリックス（Salix）ＩｓｐＳの可溶性が向上していることを示すウェスタンブロット。
【図１９】硫黄原子の配置を示し、５σで輪郭をとった異なるマップにより、野生型ＩｓｐＳを示す図。
【図２０】ＩｓｐＳ変異体Ａ３Ｔ／Ｓ２８８Ｃの二量体を示す図。鎖Ａは明るい灰色で示し、鎖Ｂは暗い灰色で示す。
【図２１】野生型ＩｓｐＳ（暗い灰色）及び変異体Ａ３Ｔ／Ｓ２８８Ｃ（明るい灰色）の構造アラインメントを示す。
【図２２】第２８８番目の残基の周囲環境を示す野生型ＩｓｐＳ（明るい灰色）及び変異体Ａ３Ｔ／Ｓ２８８Ｃ（暗い灰色）の構造アラインメント。
【図２３】ｐＤＷ１９６のプラスミドマップ。
【図２４】ｐＤＷ２０４のプラスミドマップ。
【図２５】サリックス・アルバ（S. alba）の配列のうちウラジロハコヤナギ（P. alba）の配列と異なっている部位を強調して示す図。ＰＤＢ  １Ｎ２４との構造アラインメントをもとにＭｇ２＋（球）を配置した。
【図２６】シダレヤナギ（S. babylonica）の配列のうち、ウラジロハコヤナギ（P. alba）の配列と異なっている部位を強調して示す図。ＰＤＢ  １Ｎ２４との構造アラインメントをもとにＭｇ２＋（球）を配置した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、改良された溶解度を備えイソプレン活性を有する変異体ポリペプチド組成物、並びにイソプレン産生のためのこのような変異体の製造及び使用方法を提供する。一実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照配列の配列番号１に対応するＸ２８８残基に置換を有する。ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素の配列は次のとおりである（配列番号１）。
【００１３】
2015503904.tif 000003
【００１４】
本発明の実施には、別途記載のない限り、当該技術分野の範囲内のものである、タンパク質化学、分子生物学（組み換え法など）、微生物学、細胞生物学、生物化学、核酸化学、及び酵素学に関係する従来法が、採用され得る。このような技術は、分子クローニング法：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual），第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９年）並びに分子クローニング法：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual），第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ，２００１年）（本明細書では、合わせて、並びに個々に「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と参照する）、オリゴヌクレオチド合成法（Oligonucleotide Synthesis）（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４年）；動物細胞培養法（Animal Cell Culture）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７年）；実験免疫学ハンドブック（Handbook of Experimental Immunology）（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；哺乳類細胞用遺伝子導入ベクター（Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells）（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７年）；分子生物学標準プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７年；２００１年までの補足を含む）；ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応法（The Polymerase Chain Reaction），（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４年）；核酸化学における標準プロトコル（Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry）（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００年）；並びにＡｇｒａｗａｌ，ｅｄ．，オリゴヌクレオチド及び類似体の合成及び特性に関係するプロトコル（Protocols for Oligonucleotides and Analogs,Synthesis and Properties Humana）（Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９３年）などの文献中に十分に説明されている。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく説明される。
【００１５】
更に、本開示で提供される表題は本発明の様々な態様又は実施形態を制限するものではなく、総じて本明細書において参照として用いられ得るものである。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく定義される。それでもなお、本発明に対する理解を容易にさせる目的で、数多くの用語を以下に定義する。
【００１６】
用語の定義
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。本明細書において述べられるものと同様又は同等のあらゆる方法及び材料を本発明の実施において使用することができるが、好ましい方法及び材料については本明細書に述べる。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく説明される。
【００１７】
「Ｘ」は、任意のアミノ酸残基を指す。しかしながら、アミノ酸置換（例えば、「Ｘ００３Ｃ」）の文脈において、「Ｘ」は、置換により生じるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を意味する（例えば、Ｘは、Ｃ以外のアミノ酸残基である）と理解される。一部の実施形態では、残基の位置の前の付加的な「０」は記載されず、したがって、例えば、残基位置３を参照する際、「Ｘ００３」は、「Ｘ３」として記載される場合もある。
【００１８】
「イソプレン」は、２−メチル−１，３−ブタジエン（ＣＡＳ＃  ７８−７９−５）を指す。３，３−ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）からピロリン酸を除去することで得られる、直接的にかつ最終的に揮発性のＣ５炭化水素生成物であり得る。１つ以上のイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）分子の１つ以上のＤＭＡＰＰ分子への結合又は重合は包含されない。イソプレンは、製造方法により限定されない。
【００１９】
本明細書で使用するとき、用語「イソプレン合成酵素」、「イソプレン合成酵素変異体」及び「ＩｓｐＳ」は、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からピロリン酸を除去してイソプレンを生成する反応を触媒する酵素を指す。「イソプレン合成酵素」は、野生型配列であっても、あるいはイソプレン合成酵素変異体配列であってもよい。
【００２０】
「イソプレン合成酵素変異体」としては、イソプレン合成酵素活性を有する非野生型ポリペプチドが挙げられる。当業者は、既知の手法によりイソプレン合成酵素活性を測定することができる。例えば、ＧＣ−ＭＳ（例えば、国際公開第２００９／１３２２２０号，実施例３を参照されたい）又はＳｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３０１０〜１３０１６，１９９５を参照されたい。変異体は、野生型イソプレン合成酵素の配列に、置換、付加、欠失、及び／又はトランケーションが生じたものであってよい。変異体は、非野生型イソプレン合成酵素の配列に、置換、付加、欠失、及び／又はトランケーションが生じたものであってよい。本開示に記載の変異体は、親イソプレン合成酵素ポリペプチドと異なるアミノ酸残基置換を少なくとも１つ含有し得る。一部の実施形態では、親イソプレン合成酵素ポリペプチドは野生型配列である。一部の実施形態では、親イソプレン合成酵素ポリペプチドは非野生型配列である。各種実施形態では、変異体は、野生型イソプレン合成酵素の活性と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％の活性を有し得る。各種実施形態では、変異体は、野生型イソプレン合成酵素の配列に対し、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％配列相同性であり得る。各種実施形態では、変異体及び野生体間では１つ以上のアミノ酸残基が異なっていてよく、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０又は５０以上のアミノ酸残基が異なっていてよい。野生型イソプレン合成酵素としては、植物由来の任意のイソプレン合成酵素を挙げることができ、例えば、クズ（kudzu）イソプレン合成酵素、ポプラ（poplar）イソプレン合成酵素、ヨーロッパナラ（English oak）イソプレン合成酵素、及びヤナギ（willow）イソプレン合成酵素が挙げられる。
【００２１】
対象とするアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基が、参照アミノ酸配列のアミノ酸残基と「対応する」又は「対応している」又は「対応した」とは、対象とする配列に含まれるアミノ酸残基が、参照アミノ酸配列中のアミノ酸残基の位置と相同である位置又は等しい位置に配置されていることを示す。当業者は、ポリペプチド中の特定のアミノ酸残基の位置が、相同な参照配列の位置に対応するかどうかを判定することができる。例えば、イソプレン合成酵素ポリペプチドの配列を、既知の手法（例えば、塩基の位置を整列し検索するツールであるＢＬＡＳＴ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、又は構造に基づき配列を整列するプログラムであるＳＴＲＡＰなど）により参照配列（例えば、配列番号１）と整列させることもできる。加えて、相同なポリペプチド残基の三次元構造を決定する際の補助として、参照配列の結晶構造座標を使用することもできる（例えば、ＰＣＴ出願／米国特許出願公開第２０１０／０３２１３４号（国際公開第２０１０／１２４１４６号）を参照されたい）。他の態様では、立体構造レベルでの相同性を決定することで等価な残基を同定することもできる。このような手法を用いる場合、イソプレン合成酵素ポリペプチド又はイソプレン合成酵素変異体のアミノ酸残基は、対応する参照配列のアミノ酸残基の位置番号に従い、番号付けすることもできる。例えば、対象とするイソプレン合成酵素変異体の、各アミノ酸残基の位置番号を決定するために、配列番号１のアミノ酸配列を使用することもできる。
【００２２】
２つの核酸又はポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」は、以下の配列比較又は解析アルゴリズムのうちの１つを用いて評価する際に、最も一致するようにアライメントしたときに、２つの配列中の残基が同じのものであることを指す。
【００２３】
本明細書で使用するとき、「相同性」は、配列類似性又は同一性を指し、同一性が好ましい。相同性は、当該技術分野で既知の標準法により決定することもできる（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２［１９８１］；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３［１９７０＼；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４［１９８８］；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓのソフトウェアパッケージに含まれるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡなどのソフトウェアプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５［１９８４］を参照されたい）。有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、ペアワイズアラインメントのプログレッシブ法を用いて、一群の関連する配列から複数の配列のアラインメントを行う。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントを行うのに使用されるクラスタリング関係を示す系統樹をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅのプログレッシブアラインメントを単純化させて用いる（Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６０［１９８７］を参照されたい）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐにより説明されるものと同様である（Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３［１９８９］を参照されたい）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターとしては、３．００のデフォルトギャップ重みづけ（default gap weight）、０．１０のデフォルトギャップ伸長重みづけ（default gap length weight）及び重みつき末端ギャップ（weighted end gaps）が挙げられる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．により報告されているＢＬＡＳＴアルゴリズムもその他の有用なアルゴリズムの例である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０［１９９０］；並びにＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７［１９９３］を参照されたい）。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０〜４８０［１９９６］を参照されたい）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、複数の検索パラメーターを使用し、これらのうちのほとんどはデフォルト値に設定される。調節可能なパラメーターは以下の値に設定される：ｏｖｅｒｌａｐ  ｓｐａｎ＝１、ｏｖｅｒｌａｐ  ｆｒａｃｔｉｏｎ＝０．１２５、ｗｏｒｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ  Ｓ及びＨＳＰ  Ｓ２パラメーターは動的な値であり、特定の配列の構成及び所望の配列を検索する特定のデータベースの構成に依存してプログラム自体により確立される。しかしながら、これらの値は、感度を上昇させるように調整することができる。
【００２４】
参照配列と対象とする試験配列との配列同一率は、当業者により容易に判定することができる。ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列により共有される同一率は、配列をアライメントし、当該技術分野において既知の方法により同一性を判定することによって分子間での配列情報を直接比較することにより、判定される。配列類似性を判定するのに好適なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０［１９９０］を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）より公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントを行ったときに一致するか又はある程度ポジティブであると評価された（positive-valued）閾値スコアＴを満たすかのいずれかである問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を同定する。これらの最初にヒットした隣接ワードは、これらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための開始点として働く。ワードのヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り比較されている２つの配列の各々に沿って両方向に拡張される。ワードのヒットの拡張は、次の場合に止まる：累積アラインメントスコアが最大達成値から量Ｘだけ減少する、累積スコアがゼロ以下になる、又は、いずれかの配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、感度及びアラインメントの速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、ワード長（Ｗ）：１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５［１９９２］を参照されたい）アラインメント（Ｂ）：５０、期待値（Ｅ）：１０、Ｍ’５、Ｎ’−４、並びに両鎖の比較をデフォルトとする。
【００２５】
次に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、上記Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌを参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の一つの尺度は、最小和確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然により生じ得る確率の指標を提供する。例えば、試験核酸をイソプレン合成酵素の核酸と比較した際の最小和確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は本発明のイソプレン合成酵素の核酸と類似していると考えられる。イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている試験核酸は、最小和確率の比較結果が約０．５未満、及びより好ましくは約０．２未満である場合に、イソプレン合成酵素に関係している特定の核酸と類似していると考えられる。
【００２６】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列についての文脈において、「同一率（percent identical or percent identity）」は、２つ以上の配列を最も一致するように比較及びアライメントし、配列比較アルゴリズムを用いて又は目視検査を用いて判定したときに、２つ以上の配列が、同一であるか、あるいは核酸残基又はアミノ酸残基と、表記される割合で同一であることを指すものである。参照アミノ酸配列に対する、対象とするアミノ酸配列の、「配列相同性」又は「相同（％）」又は「配列相同性（％）」又は「アミノ酸配列相同性（％）」は、対象とするアミノ酸配列が、配列を最適にアライメントした際の比較長さにわたって参照アミノ酸配列に対して表記される割合（すなわち、アミノ酸とアミノ酸を並べたときの一致度）だけ相同であることを意味する。したがって、２つのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一率８０％又は同一率８０％は、最適にアライメントした２つのアミノ酸配列中のアミノ酸残基のうち８０％が同一であることを意味する。
【００２７】
参照核酸配列に対する、対象とする核酸配列の、「配列相同性」又は「相同性（％）」又は「配列相同性（％）」は、対象とする核酸配列が、配列を最適にアライメントした際の比較長さにわたって参照配列に対して表記される割合（すなわち、ヌクレオチドとヌクレオチドを並べたときの一致度）だけ相同であることを意味する。したがって、２つの核酸配列に対するヌクレオチド配列同一率８０％又は同一率８０％は、最適にアライメントした２つの核酸配列中のヌクレオチド残基のうち８０％が同一であることを意味する。
【００２８】
一態様では、参照配列に対する対象とする配列の「配列相同性」又は「配列相同性（％）」、又は「相同性（％）」は、２つの配列を最適にアライメントし、比較長さにわたって、２つの最適にアライメントした配列を比較することで、算出することができる。最適なアライメントにおいて両方の配列の残基が一致している位置の数は、一致する位置の数を求めて一致する位置の数を比較長さ（別途記載のない限り、参照配列の長さである）のうちの位置の合計数で除することで決定される。得られる数に１００を乗じることで、参照配列に対する対象とする配列の配列同一性を算出する。
【００２９】
「最適アラインメント」又は「最適アラインメントを行った」は、最高の同一性（％）スコアを与える２つ（以上）の配列のアラインメントを指す。例えば、２つのポリペプチド配列の最適アラインメントは、各配列中の同一のアミノ酸残基の最大数が共にアラインメントされているように手動で配列のアラインメントを行うことにより、あるいは、本明細書に記載の又は当該技術分野において既知の、ソフトウェアプログラム又は手順を用いることにより、達成することができる。２つの核酸配列の最適アラインメントは、各配列中の同一のヌクレオチド残基の最大数が共にアラインメントされているように手動で配列のアラインメントを行うことにより、あるいは、本明細書に記載の又は当該技術分野において既知の、ソフトウェアプログラム又は手順を用いることにより、達成することができる。
【００３０】
既定のアミノ酸置換マトリックス、ギャップ存在ペナルティ（ギャップオープンペナルティとも呼ばれる）及びギャップ伸張ペナルティなどの既定パラメーターを用い、２つの配列（例えば、ポリペプチド配列）がこのペアの配列について類似性スコアが最も高くなるようアラインメントされた場合、「最適アラインメントが行われた」とみなされ得る。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（上記Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆを参照されたい）は、多くの場合、ポリペプチド配列アラインメントアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ）においてデフォルトのスコアリング置換マトリックスとして使用される。ギャップ存在ペナルティはアラインメントされた配列の１つにアミノ酸ギャップが１つ導入された際に課せられ、ギャップ伸張ペナルティはギャップ中の各残基位置に対して課される。用いられる代表的なアラインメントは以下のものである：ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス、ギャップ存在ペナルティ＝１１、及びギャップ伸張ペナルティ＝１。アラインメントスコアは、アラインメントが開始及び終了する各配列のアミノ酸位置により（例えば、アラインメントウィンドウ）、並びに、場合によっては可能な限り最高の類似性スコアを達成するように一方若しくは両方の配列の中に１つ若しくは複数のギャップを挿入することにより、決定される。
【００３１】
２つ以上の配列間の最適アラインメントは、目視点検により手動で、あるいは、コンピュータ（例えば、アミノ酸配列に対するＢＬＡＳＴＰプログラム及び核酸に対するＢＬＡＳＴＮプログラム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２（１９９７）を参照されたい。米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトも参照されたい。）又はＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムが挙げられるがこれらに限定されない）を使用することにより、判定することができる。
【００３２】
対象とするポリペプチドは、対象とするポリペプチドが、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％配列相同性であるアミノ酸配列を含む場合、参照ポリペプチドと「実質的に同一」である。２つのこのようなポリペプチド間の同一性（％）は、最適にアラインメントされた２つのポリペプチド配列を目視確認することにより、又は標準的なパラメーターを用いるソフトウェアプログラム又はアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ，ＡＬＩＧＮ，ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することで、手入力で判定することができる。２つのポリペプチドが実質的に同一であることは、１つとしては、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと免疫学的に交差反応することにより示される。典型的には、保存アミノ酸置換によって異なるポリペプチドは免疫学的に交差反応する。したがって、ポリペプチドは、例えば、２つのペプチドが１つの保存的アミノ酸置換又は１つ以上の保存的アミノ酸置換のみで異なる場合、第２のポリペプチドに対して実質的に同一である。
【００３３】
対象とする核酸は、対象とする核酸が、参照核酸のヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％配列相同性であるヌクレオチド配列を含む場合、参照核酸と「実質的に同一」である。２つのこのような核酸間の同一性（％）は、最適にアラインメントされた２つの核酸配列を目視確認することにより、又は標準的なパラメーターを用いるソフトウェアプログラム又はアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することで、手入力で判定することができる。厳密な条件下（例えば、中程度に厳密〜非常に厳密という範囲）で、２つの核酸分子が互いにハイブリッド形成することは、核酸配列が実質的に同一であることの１つの指標になる。
【００３４】
「核酸」は、単鎖又は二本鎖のいずれかの形態をとっている２以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを指す。本明細書で定義される通りの核酸には、単一ヌクレオチド変異などの変異が生じ得ることは理解されるであろう。
【００３５】
「組み換え核酸」は、対象とする核酸が、１つ以上の核酸、すなわち、対象とする核酸の由来する生物において天然に生じるゲノムに含まれ、対象とする核酸に隣接する、１つ以上の核酸（例えば、遺伝子）、を含まないことを意味する。したがって、この用語には、例えば、ベクターに組み込まれた、プラスミド又はウィルスに自己複製的に組み込まれた、嫌気性微生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた、又は他の配列とは独立して別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、又はＰＣＲにより産生された若しくは制限エンドヌクレアーゼによる消化により産生されたｃＤＮＡ断片）として存在する、組み換えＤＮＡが包含される。組み換え核酸は、当該技術分野において既知である分子生物学的手法により得ることができ、あるいは、組み換え核酸の一部又は全長を化学合成することもできる。
【００３６】
「異種核酸」は、宿主細胞以外の他の種、又は宿主細胞と同種の他の株に由来している核酸配列であり得る。一部の実施形態では、配列は、同様の宿主細胞において天然に見られる他の核酸と同一ではない。一部の実施形態では、異種核酸は、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型核酸と同一ではない。
【００３７】
「内在性の核酸」は、宿主細胞においてその核酸配列が天然に見られる核酸である。一部の実施形態では、内在性の核酸は、宿主細胞において天然に見られる野生型核酸と同一である。一部の実施形態では、内在性の核酸の１つ以上のコピーを宿主細胞に組み込む。
【００３８】
本発明の核酸又はタンパク質は、単離又は精製形態であってよい。本明細書で使用するとき、核酸又はタンパク質に対して「単離」とは、これらが、限定するものではないが、細胞又は細胞培養物などの他の成分から分離されていることを意味する。均一な状態が好ましいものの、乾燥形態又は水溶液形態のいずれかであってもよい。純度及び均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて判定される。調製液中に存在する主要なタンパク質又は核酸は実質的に精製される。用語「精製」は、核酸又はタンパク質が、電気泳動ゲル中で基本的に１本のバンドとして検出されることを意味する。具体的には、「精製された」は、単離した際に、単離物が、単離物の少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９８重量％、又はより好ましくは少なくとも９９重量％の核酸又はタンパク質を含有することを意味する。
【００３９】
精製ポリペプチドは、例えば、研究室での合成、クロマトグラフィー、分取用電気泳動、ゲル電気泳動、遠心分離、沈殿、親和的精製などの数多くの手法により得ることができる（一般的に、Ｒ  Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２），Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい）。
【００４０】
「ポリペプチド」には、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド断片、及び融合ポリペプチドが内含される。遺伝子暗号の縮重に起因し、ポリペプチドは１種以上のヌクレオチド配列によりコードされる場合があることも理解されたい。
【００４１】
「異種ポリペプチド」は、異種核酸によりコードされているポリペプチドである。一部の実施形態では、配列は、同様の宿主細胞において天然に見られる核酸によりコードされる他のポリペプチドと同一ではない。異種タンパク質の例としては、イソプレン合成酵素などの酵素が挙げられる。一部の実施形態では、タンパク質をコードしている遺伝子が天然に生じる遺伝子であるのに対し、他の実施形態では、変異の生じている及び／又は合成遺伝子が使用される。
【００４２】
「内在性ポリペプチド」は、宿主細胞においてそのアミノ酸配列が天然に見られるポリペプチドである。一部の実施形態では、内在性ポリペプチドは、宿主細胞において天然に見られる野生型ポリペプチドと同一である。
【００４３】
本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈に明示されない限り、対象物が複数ある場合をも包含する。
【００４４】
別途記載のない限り、それぞれ、核酸は左から右に５’→３’の向きで記述され、アミノ酸は左から右にアミノ末端→カルボキシ末端の向きで記述される。
【００４５】
本明細書を通じて与えられるあらゆる最大数の限定は、あらゆるより小さい数値の限定を、あたかもそのようなより小さい数値の限定が明確に書かれているかのように包含するものと理解されることが意図される。本明細書の全体を通じて与えられるすべての最小の数値的限定には、これよりも大きいすべての数値的限定が、あたかもこうしたより大きい数値的限定が本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。本明細書の全体を通じて与えられるすべての数値的範囲には、これよりも狭い数値的範囲が、あたかもこうしたより狭い数値的範囲がすべて本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。
【００４６】
本開示において、実施形態に包含される（及び説明する）「約（about）」を付した値又はパラメーターについては、「約」を付したその値又はパラメーター自体を目的とする。
【００４７】
本開示に記載される本発明のすべての態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含む（comprising）」、態様及び実施形態「からなる（consisting）」、及び態様及び実施形態「から本質的になる（consisting essentially of）」を含むことが理解される。記載の要素から「本質的になる」方法又は組成物には、特定の工程又は材料のみが含まれ、かつこれらの工程又は材料は、方法及び組成物の基本特性及び新規特性に実質的に影響しないことは理解されるであろう。本発明は記載される特定の方法論、プロトコール、及び試薬に制限されるものではなく、これらは当業者により使用される文脈に応じて変動し得ることが理解されるであろう。
【００４８】
改良された溶解度を備えるイソプレン合成酵素変異体
本発明は、イソプレン合成酵素活性を有しかつ改良された溶解度を有する変異体ポリペプチド組成物、並びにこのようなポリペプチドの製造方法及び増加した量でイソプレンを産生する方法、を特徴とする。一部の実施形態では、ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、少なくとも約５％〜少なくとも約７５％増加しているタンパク質溶解度を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％増加しているタンパク質溶解度を有する。特に、これらの組成物及び方法は、イソプレンの生成速度を増加させ、かつ生成されるイソプレンの総量を増加させる。天然ゴムを用いる代わりに、本開示に記載のイソプレン産生に関する生合成工程を用いることは望ましい。以降に詳細に記載する通り、細胞のイソプレン産生量は、イソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）変異体をコードしている異種核酸を細胞に導入することで、非常に増加させることができる。
【００４９】
加えて、異種イソプレン合成酵素核酸を含有している細胞によるイソプレン産生は、細胞による１種以上のＤＸＰ経路に関係するポリペプチド（例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）ポリペプチド）及び／又はイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドの発現量を増加させることで増大させることができる。例えば、ＤＸＳ核酸及び／又はＩＤＩ核酸を細胞に導入できる。ＤＸＳ核酸は、異種核酸であっても、内在性の核酸の相補的な複製であってもよい。同様にして、ＩＤＩ核酸は、異種核酸であっても、内在性の核酸の相補的な複製であってもよい。一部の実施形態では、ＤＸＳ及び／又はＩＤＩポリペプチドの量は、内在性ＤＸＳ及び／又はＩＤＩプロモーターあるいは制御配列を、ＤＸＳ及び／又はＩＤＩ核酸の転写を増加させるその他のプロモーター及び／又は制御配列と置き換えることで、増大する。一部の実施形態では、細胞は、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸（例えば、植物イソプレン合成酵素核酸）、並びにイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性の核酸の相補的コピー、のいずれをも含有する。
【００５０】
コードされているＤＸＳ及びＩＤＩポリペプチドは、イソプレンの生合成に関するＤＸＰ経路の一部をなす。ＤＸＳポリペプチドは、ピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸へと変換する。任意の特定の理論に制限されることを意図するものではないが、ＤＸＳポリペプチド量を増加させることで、ＤＸＰ経路に取り込まれる炭素量が増加し、その結果イソプレン産生が増加することになるものと考えられる。ＩＤＩポリペプチドは、イソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリルジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）の相互変換を触媒する。任意の特定の理論に制限されることを意図するものではないが、細胞中のＩＤＩポリペプチド量を増加させることで、ＤＭＡＰＰに変換され、ひいてはイソプレンへと変換されるＩＰＰ量が増加するものと考えられる。
【００５１】
以降に詳細に記載する通り、一部の実施形態では、異種イソプレン合成酵素核酸を含有している細胞によるイソプレン産生は、細胞による１種以上のＭＶＡポリペプチドの発現を増大させることで増強できる。ＭＶＡ経路に関係する代表的なポリペプチドには、次のポリペプチド、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＭＶＡ経路に関係するポリペプチドの活性を２つ以上有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）のいずれかが含まれる。例えば、ＭＶＡ経路に関係する１種以上の核酸を細胞に導入できる。一部の実施形態では、細胞はＭＶＡ経路上流を含有し、このＭＶＡ経路上流には、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の核酸が包含される。一部の実施形態では、細胞はＭＶＡ経路下流を含有し、このＭＶＡ経路下流には、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、及びＩＤＩの核酸が包含される。一部の実施形態では、細胞はＭＶＡ経路全体を含有し、このＭＶＡ経路全体には、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、及びＩＤＩの核酸が包含される。ＭＶＡ経路に関係する核酸は、異種核酸又は内在性核酸の相補的複製であってよい。一部の実施形態では、１種以上のＭＶＡ経路に関係するポリペプチドの量は、内在性プロモーター又はＭＶＡ経路に関係する核酸の制御配列を、ＭＶＡ経路に関係する核酸の転写を増加させるその他のプロモーター及び／又は制御配列と置き換えることで増大する。一部の実施形態では、細胞は、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸（例えば、植物イソプレン合成酵素核酸）、並びにイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性の核酸の相補的コピー、のいずれをも含有する。
【００５２】
一部の実施形態では、少なくとも一部の細胞は、連続培養法（希釈を行わない連続培養など）で、少なくとも約５、１０、２０、５０、７５、１００、２００又は３００回以上分裂させた後も、異種イソプレン合成酵素の核酸、ＤＸＳ核酸、ＩＤＩ核酸、その他のＤＸＰ経路及び／又はＭＶＡ経路に関係する核酸を維持する。本発明の任意の態様に関する一部の実施例では、内在性イソプレン合成酵素、ＤＸＳ、ＩＤＩ、その他のＤＸＰ経路及び／又はＭＶＡ経路の、異種核酸又はこれらの核酸の相補的複製は、抗菌剤のカナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、又はクロラムフェニコールなどの選択マーカーも含む。
【００５３】
イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ジメチルアリルジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する。代表的なイソプレン合成酵素ポリペプチドとしては、イソプレン合成酵素ポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、並びに融合ポリペプチドが挙げられる。インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボで、ポリペプチドがＤＭＡＰＰをイソプレンへと変換する能力を測定して、ポリペプチドがイソプレン合成酵素ポリペプチド活性を有するか否かを判定する際には、標準法を使用できる。細胞抽出物中でのイソプレン合成酵素のポリペプチド活性は、例えば、Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３０１０〜１３０１６，１９９５、及びこの文献の参照文献に記載の通りに測定できる。
【００５４】
一実施形態では、ＤＭＡＰＰ（Ｓｉｇｍａ）は窒素流下で濃縮させ、乾燥させ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ８．２）を用い１００ｍＭに再水和し、−２０℃で保存する。アッセイを実施するために、金属製スクリューキャップと、テフロンコーティングのなされたシリコン製隔壁（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とを取り付けた２０ｍＬヘッドスペースバイアル瓶内で、５μＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ（２５０μｇ／ｍＬ）ＤＭＡＰＰ、６５μＬの植物抽出緩衝液（ＰＥＢ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、及び２ｍＭ  ＤＴＴ）を、２５μＬ細胞抽出物に加え、振盪させながら３７℃で１５分間培養した。２５０ｍＭ  ＥＤＴＡ２００μＬを加え、あるいは熱不活化によりこの反応をクエンチさせ、イソプレンをＧＣ／ＭＳによって定量化する。
【００５５】
イソプレン合成酵素親配列
親イソプレン合成酵素から、イソプレン合成酵素変異体を生成する。親イソプレン合成酵素は、野生型及び非野生型のイソプレン合成酵素などの、本明細書に記載される通りのイソプレン合成酵素である。代表的な親イソプレン合成酵素の核酸としては、イソプレン合成酵素ポリペプチドの活性を少なくとも１種有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。代表的な親イソプレン合成酵素ポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載されるような任意の生物資源から誘導されるポリペプチド及び核酸の変異体が挙げられる。
【００５６】
一部の実施形態では、親イソプレン合成酵素は、マメ科（Fabaceae）、ヤナギ（Salicaceae）科、又はブナ（Fagaceae）科のものである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、タイワンクズ（Pueraria montana）（クズ（kudzu））（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３７：７００〜７１２，２００５）、ポプラ（poplar）（ウラジロハコヤナギ（Populus alba）×トレムラ（tremula）ＣＡＣ３５６９６，Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  ２１３：４８３〜４８７，２００１）又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）、アスペン（aspen）（アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides）） Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ  ２７０（２２）：１３０１０〜１３１６，１９９５）、又はヨーロッパナラ（English Oak）（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｒｏｂｕｒ）（Ｚｉｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、国際公開第９８／０２５５０号）から天然に生じるポリペプチド又は核酸である。好適な親イソプレン合成酵素としては、限定するものではないが、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ３４１４３１、ＡＹ３１６６９１、ＡＢ１９８１８０、ＡＪ２９４８１９．１、ＥＵ６９３０２７．１、ＥＦ６３８２２４．１、ＡＭ４１０９８８．１、ＥＦ１４７５５５．１、ＡＹ２７９３７９、ＡＪ４５７０７０、及びＡＹ１８２２４１として定義されるものが挙げられる。その他の親配列は、ＰＣＴ出願／米国特許出願公開第２００９／０４１５８１号（国際公開第２００９／１３２２２０号）及びＰＣＴ出願／米国特許出願公開第２０１０／０３２１３４号（国際公開第２０１０／１２４１４６号）に記載される。
【００５７】
各種実施形態では、親イソプレン合成酵素は、ＭＥＡウラジロハコヤナギ（ウラジロハコヤナギ（P. alba））の配列に対して、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％配列相同性である。他の実施形態では、親イソプレン合成酵素は、完全長ウラジロハコヤナギ（P. alba）又は完全なウラジロハコヤナギ（P. alba）に対して、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％配列同一性である。
【００５８】
本発明の酵素変異体を生成するのに好適な様々な方法が、当該技術分野において既知であり、限定するものではないが、例えば、部位飽和変異導入、系統的変異導入法、変異挿入、ランダム変異、部位特異的変異導入、及び定向進化、並びに様々な他の組み換え手法が挙げられる。
【００５９】
溶解度の改良された変異体は、配列番号１に対応するＸ２８８に変異を含有させることにより作製することができる。一態様では、Ｘ２８８はＳ２８８である。別の態様では、変異はＳ２８８Ｃである。代表的な溶解度測定法は、以降の実施例において記載される。
【００６０】
代表的な核酸
本発明のイソプレン合成酵素変異体をコードしている核酸は、本発明の範囲内で提供され、企図される。各種実施形態では、核酸は組み換え核酸である。例えば、一部の実施形態では、イソプレン合成酵素変異体の核酸は、組み換え核酸が、イソプレン合成酵素変異体と、別のポリペプチド（例えば、融合ポリペプチドの精製又は検出を容易にする、Ｈｉｓ−タグなどといった、ペプチド）の全て又は一部とを含む融合ポリペプチドをコードするよう、他のポリペプチドの全て又は一部をコードしている他の核酸に操作可能に連結させる。一部の実施形態では、組み換え核酸の一部又は全ては化学的に合成される。一部の態様では、核酸は異種核酸である。「異種核酸」とは、その核酸配列が同じホスト細胞内に自然に見出される別の核酸の配列と同一ではない核酸のことを意味する。
【００６１】
一部の実施形態では、核酸は、天然に生じるイソプレン合成酵素核酸に由来する少なくとも約５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、又は８００以上連続する核酸を含む。一部の態様では、核酸は、野生型（すなわち、天然に生じる配列）イソプレン合成酵素核酸の配列と比較して１つ以上の変異を有する。一部の実施形態では、核酸は、イソプレン合成酵素の核酸の転写又は翻訳を増加させる変異（例えば、サイレント変異）を１箇所以上に有する。一部の実施形態では、核酸は、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている任意の核酸を縮重させた変異体である。
【００６２】
イソプレン合成酵素の核酸は、当業者に既知の標準法により、発現ベクターなどのベクターに組み込むことができる。イソプレン合成酵素、プロモーター、ターミネーター、並びに他の配列などの対象とする核酸を含むＤＮＡコンストラクトを連結し、これらを好適なベクターに挿入するのに使用される手法は、当該技術分野において周知である。加えて、ベクターは、既知の組み換え法（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＧａｔｅｗａｙ法）により構築することができる。
【００６３】
一部の実施形態では、現在、天然に生じる細胞において観察されるよりもはるかに高濃度でイソプレン合成酵素の核酸を過剰発現させることが望ましい場合がある。核酸の過剰発現は、ポリペプチドをコードしている核酸を、マルチコピープラスミドに選択的にクローニングすることで、あるいはこれらの核酸を強誘導型の又は常時発現型のプロモーターの制御下に配置することで、誘導することができる。所望のポリペプチドを過剰発現させる手法は、分子生物学領域で一般的で、かつ周知のものであり、その例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００１に見出すことができる。
【００６４】
経路に関係するポリペプチド例
上記の通り、ＤＸＰ経路及び／又はＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチドを、本開示に記載のイソプレン合成酵素変異体と組み合わせて使用して、イソプレン産生を増加させることができる。したがって、特定の態様では、ＭＶＡ経路に関係する１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は異種核酸である。他の態様では、ＭＶＡ経路に関係する１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は、内在性の核酸の複製である。本開示における任意の態様では、１つ以上のＭＶＡ経路に関係するポリペプチドは、（ａ）２分子のアセチル−ＣｏＡを縮合させてアセトアセチル−ＣｏＡを生成する酵素、（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）、（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素、（ｄ）メバロン酸をしてリン酸化してメバロン酸５−リン酸を生成する酵素、（ｅ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素、（ｆ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、並びに（ｇ）イソペンテニルピロリン酸をジメチルアリルジホスフェートへと変換する酵素、から選択できる。本開示における任意の態様では、１つ以上のＭＶＡ経路に関係するポリペプチドは、（ａ）アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸へと変換する酵素、（ｃ）メバロン酸リン酸をメバロン酸５−リン酸に変換する酵素、（ｄ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素、並びに（ｅ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、から選択される。
【００６５】
本開示における任意の態様では、メバロン酸をリン酸化してメバロン酸５−リン酸を生成する酵素は、メタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼ、ラクトバチルス（Lactobacillus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトミセス（Streptomyces）メバロン酸キナーゼポリペプチド、メタノコッカシド・バートニイ（M. Burtonii）メバロン酸キナーゼ、又はストレプトミセス（Streptomyces）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択できる。本開示における任意の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸へとリン酸化する酵素はメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼである。
【００６６】
ＭＶＡ経路上流に関係するポリペプチド
ＭＶＡ経路の上流は、細胞内代謝により産生されるアセチルＣｏ−Ａを、（ａ）（ｉ）チオラーゼ活性又は（ｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素活性、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、及び（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素活性のいずれかの活性をもつポリペプチドの作用によりメバロン酸に変換する際の開始基質として利用する。まず始めに、チオラーゼ又はアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素（アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡを利用する）の作用によりアセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する。次に、アセトアセチル−ＣｏＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素の酵素作用により、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）へと変換される。このＣｏ−Ａ誘導体をＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素により還元してメバロン酸を生成する。この反応は、メバロン酸経路によるイソプレノイド産生の律速段階となる。
【００６７】
ＭＶＡ経路上流に関係するポリペプチドの非限定例としては、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）ポリペプチドが挙げられる。ＭＶＡ経路上流のポリペプチドには、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが含まれる。ＭＶＡ経路上流に関係する代表的な核酸としては、ＭＶＡ経路上流に関係するポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＭＶＡ経路に含まれる代表的なポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。したがって、本開示では、ＭＶＡ経路上流関連性ポリペプチドをコードしている任意の遺伝子は、本発明において使用できることを企図する。
【００６８】
特定の実施形態では、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来の様々なｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を、単独で、あるいは上流ＭＶＡ経路関連性タンパク質をコードしている１つ以上の他のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子と組み合わせて選択することが、本発明の範囲内のものとして企図される。他の実施形態では、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素の遺伝子は、（ｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ合成酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素）ポリペプチド及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）ポリペプチドをコードしている１つ以上の他の遺伝子との組み合わせで本発明の範囲内のものとして企図される。したがって、特定の態様では、企図される遺伝子の任意の組み合わせを、本開示に記載される任意の手法により、組み換え細胞で発現させることができる。
【００６９】
国際公開出願第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、及び同第２０１０／１４８１５０号に記載の、ＭＶＡ経路上流に関係するポリペプチドのその他の非限定例を、本開示に使用できる。
【００７０】
ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている遺伝子
特定の実施形態では、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来の様々なｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を、単独で、あるいはＭＶＡ経路上流関連性タンパク質をコードしている１つ以上の他のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子と組み合わせて選択することが、本発明の範囲内のものとして企図される。リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）、及びエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）では、ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性のいずれをも保有しているポリペプチドをコードする。実際に、ｍｖａＥ遺伝子産物は、真正細菌で見られる、ＩＰＰ生合成に関係する最初の二機能性酵素となるものであり、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の第一例は、天然において他のタンパク質と融合していた（Ｈｅｄｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２  Ａｐｒｉｌ；１８４（８）：２１１６〜２１２２）。それに対しｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする。
【００７１】
したがって、組み換え細胞（例えば、大腸菌）は、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を１つ以上発現してメバロン酸を生成するよう設計することができる。１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子をマルチコピープラスミドで発現させることもできる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を宿主細胞の染色体に組み込むことができる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれた、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子のいずれもの異種発現に際し、遺伝子発現は、誘導型プロモーター又は常時発現型プロモーターのいずれかにより駆動できる。プロモーターは、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
【００７２】
本開示における任意の態様では、組み換え宿主細胞は、１種以上の１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路に関係するポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含み得る。一態様では、ＤＸＰ経路に関係するポリペプチドを１つ以上コードしている１つ以上の核酸は、異種核酸である。他の態様では、ＤＸＰ経路に関係する１種以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は、内在性の核酸の複製である。特定の態様では、ＤＸＰ経路に関係するポリペプチドは、（ａ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）、（ｂ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）、（ｃ）４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＭＣＴ）、（ｄ）４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＣＭＫ）、（ｅ）２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＭＣＳ）、（ｆ）１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸シンターゼ（ＨＤＳ）、及び（ｇ）１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸レダクターゼ（ＨＤＲ）からなる群から選択される。他の態様では、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチドはＤＸＳである。
【００７３】
他の態様では、当業者は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素を利用しない経路により、１分子のグルコースから３分子のアセチル−ＣｏＡを生成し得る、代替的な代謝過程を使用できる。その代わりに、特定の生物、特にビフィドバクテリウム（Bifidobacteria）において見出されるホスホケトラーぜを使用する［例えば、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ（ｅｄ．Ｌｅｎｇｅｌｅｒ，Ｄｒｅｗｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９，ｐ．２９９〜３０１；Ｍｅｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２００１，１８３：９，２９２９〜３６；Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００７，１７：５，８２２〜８２９を参照されたい］。ホスホケトラーゼ酵素は、典型的な代謝で用いられるピルビン酸の酸化以外の経路により、キシルロース５−リン酸又はフルクトース６−リン酸からのアセチル−ＣｏＡ（リン酸アセチルを介する）の生成を行うことができる。ホスホケトラーゼポリペプチドを用いアセチルＣｏＡの生合成を増加させることで、メバロン酸経路上流に依存する生合成経路の産生性が向上し、メバロン酸の生合成が大幅に増加し、結果として、ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰなどの下流のイソプレノイド前駆体分子の生合成を増加させることができる。標準法を使用し、ペプチドがＤ−フルクトース６−リン酸又はＤ−キシルロース５−リン酸をアセチル−Ｐへと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがホスホケトラーゼペプチド活性を有するかを判断できる。次に、アセチル−Ｐはフェリルアセチルヒドロキサム酸（ferryl acetyl hydroxamate）へと変換され得る。この変換は、分光測定により検出可能である（Ｍｅｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８３：２９２９〜２９３６，２００１）。ペプチド活性を有するものとして同定されたポリペプチドであれば、本発明に使用するのに好適である。代表的なホスホケトラーゼ核酸としては、限定するものではないが、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonville）から単離したホスホケトラーゼが挙げられる。
【００７４】
ＭＶＡ経路下流のポリペプチド
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の組成物又は方法の任意のものに記載の細胞は、メバロン酸（ＭＶＡ）経路下流のポリペプチドをコードしている核酸を１つ以上更に含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結される。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ＭＶＡ経路下流のポリペプチドが過剰発現するよう設計する。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結される。
【００７５】
メバロン酸生合成経路の下流は、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）及びジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）を含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路の下流は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）を更に含む。本明細書に提供される細胞は、イソプレンシンターゼ、ＭＶＡ経路上流の１種以上のポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路下流の１種以上のポリペプチドをコードしている核酸を含み得る。ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素、（ｂ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸へと変換する酵素、（ｃ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸へと変換する酵素、のうちの任意の酵素であり得る。より具体的には、メバロン酸を５−ホスホメバロン酸にリン酸化する酵素は、メタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼ、ラクトバチルス（Lactobacillus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス（Streptomyces）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス（Streptomyces）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びメタノコッカシド・バートニイ（M. Burtonii）メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群であってもよい。他の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸へとリン酸化する酵素はメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼである。
【００７６】
一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは異種ポリペプチドである。一部の態様では、細胞は、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸のコピーを１つ以上含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結される。一部の態様では、異種ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のポリペプチドである。
【００７７】
ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている核酸は、細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている核酸は更に、ベクター上に存在させてもよい。
【００７８】
ＭＶＡ経路下流のポリペプチドの例としては、次の（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；及び（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）も挙げられる。詳細には、下流のＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ（Methanosarcina）属由来のものであってよく、更に詳細には、下流のＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のものであってよい。一部の実施形態では、下流ＭＶＫのポリペプチドは、メタノサルシナ・バートニィ（M. burtonii）由来のものであってよい。ＭＶＡ経路下流のポリぺプチドのその他の例は、米国特許出願公開第２０１０／００８６９７８号に見出すことができ、この内容は、ＭＶＫ経路下流のポリペプチド及びＭＶＫ経路下流のポリペプチド変異体に関し参照によりその全文が明示的に本明細書に組み込まれる。
【００７９】
特に、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドとしては、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。ＭＶＡ経路下流の核酸の例としては、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＭＶＡ経路下流のポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。更に、イソプレンの産生量を増加させるような、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド変異体も、良好に使用することができる。
【００８０】
一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のポリペプチドである。一部の態様では、前記ＭＶＫは、ラクトバチルス（Lactobacillus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス（Streptomyces mevalonate）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス（Streptomyces）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチド、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びメタノコッカシド・バートニイ（M. Burtonii）メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される。本開示のプロモータのうちのいずれか（例えば、本開示に記載され、本開示の実施例において識別される、誘導型プロモータ及び常時発現型プロモータなどのプロモータ）を使用して、本開示のいずれかのＭＶＡポリペプチドの発現を駆動させることができる。
【００８１】
本明細書に記載の細胞のうち任意のものは、ＩＤＩ核酸（例えば、ＩＤＩをコードしている内在性又は異種核酸）を含み得る。イソペンテニルジホスフェートイソメラーゼポリペプチド（イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ又はＩＤＩ）は、イソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の相互変換を触媒する（例えば、ＩＰＰをＤＭＡＰＰへと変換し及び／又はＤＭＡＰＰをＩＰＰヘと変換する）。例示的なＩＤＩポリペプチドとしては、ＩＤＩポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを相互変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＩＤＩポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。ＩＤＩ核酸の例としては、ＩＤＩポリペプチド活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ＩＤＩポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【００８２】
アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子
他の態様では、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素の遺伝子（ａｋａ  ｎｐｈＴ７）を使用できる。アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、マロニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを合成する活性を有し、かつ２分子のアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを合成する活性は最小限である（例えば、非活性である）酵素をコードしている遺伝子である。例えば、Ｏｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｖｏｌ  １０７，Ｎｏ．２５，ｐｐ．１１２６５〜１１２７０（２０１０）を参照されたい。この文献中のｎｐｈＴ７に関する教示は、本開示に明確に組み込まれる。日本国特許公開第２００８〜６１５０６（Ａ）号及び米国特許出願公開第２０１０／０２８５５４９号には、放線菌のストレプトミセス（Streptomyces）属ＣＬ１９０株のアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子が記載されている。アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素も、アセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシル基転移酵素として参照され得る。使用することのできる代表的なアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素（又はアセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシル基転移酵素）としては、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢ５４０１３１．１が挙げられる。
【００８３】
本開示に記載の任意の態様又は実施例では、マロニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを合成する能力を有する酵素を使用できる。本開示に記載の特定の実施形態では、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する能力を有する放線菌のストレプトミセス（Streptomyces）属から誘導されるアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子を使用できる。
【００８４】
例示的な宿主細胞
本開示において請求される手法により、各種宿主細胞を用い、イソプレン合成酵素変異体を発現することのできる組み換え宿主細胞を生成し、イソプレンを産生することができる。宿主細胞は、天然にイソプレンを産生する細胞であっても、あるいは天然には産生しない細胞であってもよい。一部の実施形態では、宿主細胞はＤＸＰ経路を使用して天然にイソプレンを生成する細胞であり、この経路を使用したイソプレンの生成を促進するために、イソプレン合成酵素、ＤＸＰ経路ポリペプチド（例えば、ＤＸＳ）、及び／又はＩＤＩ核酸が加えられる。一部の実施形態では、宿主細胞はＭＶＡ経路を使用して天然にイソプレンを生成する細胞であり、この経路を使用したイソプレンの生成を促進するために、イソプレン合成酵素及び／又はＭＶＡ経路に関係する核酸が１つ以上加えられる。一部の実施形態では、宿主細胞はＤＸＰ経路を使用して天然にイソプレンを生成する細胞であり、ＭＶＡ経路及びＤＸＰ経路の一部又は全体を使用してイソプレンを生成するために、ＭＶＡ経路に関係した核酸が１つ以上加えられる。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＤＸＰ及びＭＶＡ経路の両方を使用して天然にイソプレンを生成する細胞であり、これらの経路の一方又は両方によるイソプレンの生成を促進するために、イソプレンシンターゼ核酸、ＤＸＳ核酸、ＩＤＩ核酸、又はＭＶＡ経路に関係する核酸が１つ以上加えられる。
【００８５】
一部の実施形態では、宿主細胞は、サッカロミセス（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア（Pichia sp.）、カンジダ（Candida sp.）又はヤロウイア・リポリィティカ（Y. lipolytica）などの酵母である。
【００８６】
一部の実施形態では、宿主細胞は、バチルス・リケノフォルミス（B.lichenoformis）又はバチルス・スブチリス（B. subtilis）などのバチルス（Bacillus）株、パントエア・シトレア（P. citrea）などのパントエア（Pantoea）株、シュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes）などのシュードモナス（Pseudomonas）株、ストレプトミセス・リビダンス（S. lividans）又はストレプト・ルビギノーサス（S. rubiginosus）などのストレプトミセス（Streptomyces）株、大腸菌などのエシェリキア（Escherichia）株、エンテロバクター（Enterobacter）株、ストレプトコッカス（Streptococcus）株、メタノサルシナ・マゼイ（Streptococcus）などの古細菌株、又はコリネバクテリウム・グルタニカム（C. glutamicum）などのコリネバクテリウム株である。
【００８７】
本明細書で使用するとき、「バチルス（Bacillus）」属としては、当業者に既知の「バチルス（Bacillus）属」のすべての種を包含し、限定するものではないが、例えば、バチルス・スブチリス（B. subtilis）（B. subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシィ（B. clausii）、バチルス・ハロドュランス（B. halodurans）、バチルス・メガテリウム（B. megaterium）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サーキュランス（B. circulans）、バチルス・ロータス（B. lautus）、及びバチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）が挙げられる。バチルス（Bacillus）属は分類上の再編成を受け続けるものと認識される。したがって、この属は、再分類された種を包含することを意図し、例えば、限定するものではないが、現在は「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）」と命名されたバチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）のような生物を包含する。酸素存在下での耐性内生胞子の生成はバチルス属の決定的特徴と考えられるが、この特徴は最近命名されたアリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、アンフィバチルス（Amphibacillus）、アネウリニバチルス（Aneurinibacillus）、アノキシバチルス（Anoxybacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、フィロバチルス（Filobacillus）、グラシリバチルス（Gracilibacillus）、ハロバチルス（Halobacillus）、パエニバチルス（Paenibacillus）、サリバチルス（Salibacillus）、サーモバチルス（Thermobacillus）、ウレイバチルス（Ureibacillus）、及びビルジバチルス（Virgibacillus）にも当てはまる。
【００８８】
一部の実施形態では、宿主細胞は、グラム陽性細菌である。非限定的な例としては、ストレプトミセス（Streptomyces）株（例えば、ストレプトミセス・リビダンス（S. lividans）、ストレプトミセス・セリカラー（S. coelicolor）、又はストレプトミセス・グリセウス（S. griseus））及びバチルス（Bacillus）株が挙げられる。一部の実施形態では、生物資源は、大腸菌（E. coli）又はシュードモナス（Pseudomonas sp.）などのグラム陰性細菌である。
【００８９】
一部の態様では、宿主細胞は植物であり、例えば、マメ科、例えばマメ亜科（Faboideae）などの植物である。一部の態様では、生物資源はクズ（kudzu）、ポプラ（poplar）（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）×トレムラ（tremula）ＣＡＣ３５６９６など）、ヤマナラシ（aspen）（例えば、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides））、又はヨーロッパナラ（Quercus robur）である。
【００９０】
一部の態様では、宿主細胞は、藻類、例えば緑藻、紅藻、灰色藻、クロララクニオン藻、ミドリムシ目、クロミスタ、又は渦鞭毛藻類である。
【００９１】
一部の実施形態では、宿主細胞はラン藻であり、例えば、形態学的に次の群：クロオコッカス、プレウロカプサ、オスシラトリアルス（Oscillatoriales）、ネンジュモ、又はスティゴネマのいずれかに分類されるラン藻などが挙げられる。
【００９２】
一部の実施形態では、宿主細胞は嫌気性細菌である。「嫌気性細菌」は増殖の際に酸素を必要としない微生物である。嫌気性細菌は、偏性嫌気性細菌、通性嫌気性細菌、又は耐気性細菌であり得る。これらの微生物は、上掲のバクテリア、及び酵母などの任意の微生物であり得る。「偏性嫌気性細菌」は、大気中酸素濃度で死に至る、嫌気性細菌である。「偏性嫌気性細菌」の例としては、限定するものではないが、クロストリジウム（Clostridium）、ユーロバクテリウム（Eurobacterium）、バクテロイデス（Bacteroides）、ペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus）、ブチリバクテリウム（Butyribacterium）、ベイロネラ（Veillonella）、及びアクチノマイセス（Actinomyces）が挙げられる。一実施形態では、「偏性嫌気性細菌」はクロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・オートエタノジナム（Clostridium autoethanogenum）、ユウバクテリウム・リモサム（Eurobacterium limosum）、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Clostridium carboxydivorans）、ペプトストレプトコッカス・プロダクツス（Peptostreptococcus productus）、及びブチルバクテリウム・メチロトロフィカム（Butyribacterium methylotrophicum）からなる群から選択されるいずれか１種、あるいはこれらの組み合わせであってよい。「通性嫌気性細菌」は、酸素の存在下で好気性呼吸を行うことができ、かつ酸素の制限下又は酸素非存在下では嫌気性の発酵を行うことのできる嫌気性細菌である。通性嫌気性細菌の例としては、限定するものではないが、大腸菌（Escherichia）、パントエア（Pantoea）、酵母、並びにヤロウイア（Yarrowia）が挙げられる。
【００９３】
一部の実施形態では、宿主細胞は光合成細菌である。他の実施形態では、宿主細胞は非光合成細菌である。
【００９４】
使用することのできる他の代表的な宿主細胞は、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０３１０７７号、及び同第２０１０／０３１０７９号に記載されている。
【００９５】
例示的な形質転換方法
イソプレン合成酵素、ＤＸＳ、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路の核酸又はこれらの核酸を収容しているベクターは、これらの核酸にコードされているイソプレン合成酵素、ＤＸＳ、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路関連性ポリペプチドを発現させる際、標準的な発現法を用い、宿主細胞（例えば、細菌細胞）に挿入することができる。宿主細胞へのＤＮＡコンストラクト又はベクターの導入は、形質転換、電気穿孔法、核酸のマイクロインジェクション、形質導入、形質移入（例えば、リポフェクションを利用した又はＤＥＡＥ−デキストリンを利用した形質移入、あるいは組み換えファージウイルスを用いた形質移入）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿法を用いるインキュベーション、ＤＮＡコートした微粒子銃による高速導入、及びプロトプラストの融合などの手法により実施できる。一般的な形質転換法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００１；並びにＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ，１６：５３〜５６，１９８９を参照されたい。これらの開示は、それぞれ参照によりその全体が組み込まれ、特に形質転換法に関して組み込まれる）。導入された核酸は、染色体ＤＮＡに組み込むことができ、又は染色体外の複製配列として維持することができる。
【００９６】
使用することのできる他の代表的な形質転換法は、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０３１０７７号、及び同第２０１０／０３１０７９号に記載されている。
【００９７】
例示的な細胞培養培地
宿主細胞を培養するにあたり任意の炭素源を使用することができる。用語「炭素源」は、宿主細胞又は生物により代謝することのできる、１つ以上の炭素を含有している化合物を指す。例えば、宿主細胞を培養するにあたり使用される細胞培地には、宿主細胞の生存能を維持させる又は宿主細胞を増殖させるのに好適な任意の炭素源を包含させることができる。
【００９８】
一部の実施形態では、炭素源は炭水化物（単糖、二糖、オリゴ糖、又は多糖など）、転化糖（例えば、酵素により処理したスクロースシロップ）、グリセロール、グリセリン（例えば、バイオディーゼル又は石鹸の製造工程で生成される副産物のグリセリン）、ジヒドロキシアセトン、Ｃ１化合物からなる炭素源、脂肪酸（例えば、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、又は多価不飽和脂肪酸）、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ポリペプチド（例えば、微生物又は植物タンパク質又はペプチド）、再生可能な炭素源（例えば、加水分解したバイオマス由来の炭素源、甜菜糖又はサトウキビ廃糖蜜などのバイオマスに由来する炭素源）、酵母エキス、酵母エキス由来の成分、ポリマー、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、コハク酸エステル、乳酸塩、酢酸塩、エタノール、又はこれらのうちの任意の２つ以上の組み合わせである。一部の実施形態では、炭素源は、限定するものではないが、グルコースなどの光合成生成物である。
【００９９】
単糖の例としては、グルコース及びフルクトースが挙げられ、オリゴ糖の一例としては、ラクトース及びスクロースが挙げられ、並びに多糖の例としては、デンプン及びセルロースが挙げられる。例示的な炭水化物としては、Ｃ６糖（例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、又はグルコース）及びＣ５糖（例えば、キシロース又はアラビノース）が挙げられる。一部の実施形態では、細胞培地は、糖、並びに糖以外の炭素源（例えば、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、Ｃ１化合物、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、又は酵母エキス由来の成分）を含有する。一部の実施形態では、細胞培地は、糖、並びにポリペプチド（例えば、微生物由来又は植物由来タンパク質又はペプチド）を含有する。一部の実施形態では、微生物由来ポリペプチドは、酵母又はバクテリア由来のポリペプチドである。一部の実施形態では、植物ポリペプチドは、大豆、トウモロコシ、セイヨウアブラナ、タイワンアブラギリ、パーム、落花生、ヒワマリ、ココナツ、カラシナ、ナタネ、綿実、パーム核、オリーブ、ベニバナ、胡麻、又は亜麻仁由来のポリペプチドである。
【０１００】
一部の実施形態では、糖濃度は、ブロス１Ｌ当たり、少なくとも約５グラム以上であり（５ｇ／Ｌ、ここで、ブロスの体積には、細胞培地の体積及び細胞体積を包含する）、例えば、少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、３００、又は４００ｇ／Ｌ以上である。一部の実施形態では、糖濃度は、約５０〜約４００ｇ／Ｌであり、例えば、約１００〜約３６０ｇ／Ｌ、約１２０〜約３６０ｇ／Ｌ、又は約２００〜約３００ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、この糖濃度には、宿主細胞の培養前及び／又は培養中に添加された糖の総量が含まれる。
【０１０１】
代表的な脂質は、Ｃ４の脂肪酸を１つ以上含有している任意の物質であり、なかでも飽和、不飽和、又は分岐型脂肪酸である。
【０１０２】
代表的な脂肪酸としては、式Ｒ−ＣＯＯＨの化合物が挙げられ、ここで、「Ｒ」は炭化水素である。代表的な不飽和脂肪酸としては、「Ｒ」が炭素−炭素二重結合を少なくとも１つ含有する化合物が挙げられる。代表的な不飽和脂肪酸としては、限定するものではないが、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミトエライジン酸、及びアラキドン酸が挙げられる。代表的なポリ不飽和脂肪酸としては、「Ｒ」が炭素−炭素二重結合を複数含有する化合物が挙げられる。代表的な飽和脂肪酸としては、「Ｒ」が飽和脂肪族基である化合物が挙げられる。一部の実施形態では、炭素源には、Ｃ１２飽和脂肪酸、Ｃ１４飽和脂肪酸、Ｃ１６飽和脂肪酸、Ｃ１８飽和脂肪酸、Ｃ２０飽和脂肪酸、又はＣ２２飽和脂肪酸などのＣ１２〜Ｃ２２脂肪酸が１種以上含有される。代表的な実施形態では、脂肪酸はパルミチン酸である。一部の実施形態では、炭素源は脂肪酸塩（例えば、不飽和脂肪酸）、脂肪酸誘導体（例えば、不飽和脂肪酸）、又は脂肪酸誘導体の塩（例えば、不飽和脂肪酸）である。好適な塩としては、限定するものではないが、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、及びこれに類するものなどが挙げられる。ジ−及びトリグリセロールはグリセロールの脂肪酸エステルである。
【０１０３】
一部の実施形態では、脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリド濃度は、ブロス１Ｌ当たり、少なくとも約１グラム以上であり（１ｇ／Ｌ、ここで、ブロスの体積には、細胞培地の体積及び細胞体積を包含する）、例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、３００、又は４００ｇ／Ｌ以上である。一部の実施形態では、脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドの濃度は、約１０〜約４００ｇ／Ｌであり、例えば、約２５〜約３００ｇ／Ｌ、約６０〜約１８０ｇ／Ｌ、又は約７５〜約１５０ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、濃度には、宿主細胞の培養前及び／又は培養中に添加した脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドの総量が含まれる。一部の実施形態では、炭素源は、（ｉ）脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリド、及び（ｉｉ）グルコースなどの糖を両方含有する。一部の実施形態では、脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドの、糖に対する比率は、炭素基準で約１：１（すなわち、脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドは糖炭素毎に１つずつ）である。特定の実施形態では、脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドの量は、約６０〜１８０ｇ／Ｌ、糖質の量は約１２０〜３６０ｇ／Ｌである。
【０１０４】
代表的な微生物ポリペプチド炭素源としては、酵母又はバクテリア由来の１種以上のポリペプチドが挙げられる。代表的な植物ポリペプチドの炭素源としては、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、タイワンアブラギリ、パーム、落花生、ヒワマリ、ココナツ、カラシナ、ナタネ、綿実、パーム核、オリーブ、ベニバナ、胡麻又は亜麻仁由来の一種以上のポリペプチドが挙げられる。
【０１０５】
代表的な再生可能な炭素源としては、乳清浸透液、コーンスティープリカー、甜菜廃糖蜜、大麦モルト、及び前述のいずれか由来の成分が挙げられる。また、代表的な再生可能な炭素源としては、トウモロコシ、スイッチグラス、サトウキビ、発酵工程に関係する細胞廃棄物、及び大豆、トウモロコシ、若しくは小麦の粉砕に由来するタンパク質副生成物などのバイオマス中に存在する、グルコース、ヘキソース、ペントース及びキシロースも挙げられる。いくつかの実施形態では、バイオマス炭素源はリグノセルロース、ヘミセルロース、又はセルロース材料であり、例えば、草、小麦、小麦わら、バガス、サトウキビバガス、軟質木材パルプ、トウモロコシ、トウモロコシの芯又は皮、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穀粒の繊維、トウモロコシ茎葉、スイッチグラス、籾殻製品、又は穀粒（トウモロコシ、ソルガム、ライ麦、ライ小麦、大麦、小麦、及び／又は醸造かす）の湿式若しくは乾式粉砕による副生成物が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なセルロース材料には、木、紙及びパルプ廃棄物、草質植物、及び果実パルプが挙げられる。いくつかの実施形態では、炭素源には、茎、穀粒、根、又は塊茎などの任意の植物部分が挙げられる。一部の実施形態では、次のいずれかの植物：トウモロコシ、小麦、ライ麦、ソルガム、ライ小麦、米、キビ、大麦、キャッサバ、マメ科植物、例えば、豆及び豌豆、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビ、及び／又はタピオカの、一部又は全体を炭素源として使用する。いくつかの実施形態では、炭素源は、キシロースとグルコースの両方を含むか、スクロースとグルコースの両方を含むバイオマス加水分解産物などの、バイオマス加水分解産物である。
【０１０６】
一部の実施形態では、細胞培養培地に加える前に、再生可能な炭素源（バイオマスなど）を前処理する。一部の実施形態では、前処理としては、酵素処理、化学処理、あるいは酵素及び化学処理の両方の組み合わせが挙げられる（例えば、Ｆａｒｚａｎｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９６（１８）：２０１４〜２０１８，２００５；米国特許第６，１７６，１７６号；同第６，１０６，８８８号を参照されたい）。一部の実施形態では、再生可能な炭素源は、細胞培養培地に加える前に一部又は完全に加水分解する。
【０１０７】
一部の実施形態では、再生可能な炭素源（トウモロコシ茎葉など）は、細胞培養培地に加える前に、アンモニア爆砕（ＡＦＥＸ）による前処理を行う（例えば、Ｆａｒｚａｎｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９６（１８）：２０１４〜２０１８，２００５を参照されたい）。ＡＦＥＸ前処理時には、再生可能な炭素源を、温和な温度（約６０〜約１００℃）、及び高圧（約１７２４〜約２０６８ｋＰａ（２５０〜約３００ｐｓｉ））で液体無水アンモニアにより約５分処理する。次に、圧を急速に開放する。この手法では、リグニン可溶化、ヘミセルロース加水分解、セルロースの脱結晶化などの化学作用及び物理作用を組み合わせ、表面積を増大させることで、酵素によるセルロース及びヘミセルロースの発酵糖へのほぼ完全な変換を可能にする。ＡＦＥＸ前処理は、ほとんどすべてのアンモニアを回収し、再利用することができ、なおかつ残余は下流工程において微生物用の窒素源として役立つという利点を有する。同様に、洗浄流にはＡＦＥＸ前処理は必要とされない。したがって、ＡＦＥＸ処理後の乾燥物質の回収率は実質的に１００％である。ＡＦＥＸは、乾燥対乾燥プロセスを基本とする。処理後の再生可能な炭素源は、長期にわたって安定であり、酵素加水分解又は発酵工程時に固体充填量を非常に多くして供給できる。セルロース及びヘミセルロースは、ＡＦＥＸ工程でほとんど又は全く分解されずに良好に保存される。ＡＦＥＸ前処理後の再生可能な炭素源は、酵素加水分解する前に中和する必要はない。ＡＦＥＸ処理後に炭素源を酵素加水分解し、混じりけのない糖ストリームを生成し、続いてこれを発酵に使用する。
【０１０８】
一部の実施形態では、炭素源（例えば、再生可能な炭素源）濃度は、少なくとも又は約０．１、０．５、１、１．５  ２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、又は５０％グルコース（ｗ／ｖ）に相当する。グルコース等量は、参照としてグルコースを用い、炭素源から生成されたグルコース量を測定する、標準的ＨＰＬＣ法によって割り出すことができる。一部の実施形態では、炭素源（例えば、再生可能な炭素源）濃度は、約０．１〜約２０％グルコース、例えば、約０．１〜約１０％グルコース、０．５〜約１０％グルコース、約１〜約１０％グルコース、約１〜約５％グルコース、又は約１〜約２％グルコースに相当する。
【０１０９】
一部の実施形態では、炭素源には、酵母エキス又は酵母エキスに含まれる１種以上の成分が含まれる。一部の実施形態では、糖濃度は、ブロス１Ｌ当たり、少なくとも約１グラム以上であり（１ｇ／Ｌ、ここで、ブロスの体積には、細胞培地の体積及び細胞体積を包含する）、例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、又は３００／Ｌ以上である。一部の実施形態では、酵母エキスの濃度は約１〜約３００ｇ／Ｌであり、例えば、約１〜約２００ｇ／Ｌ、約５〜約２００ｇ／Ｌ、約５〜約１００ｇ／Ｌ、又は約５〜約６０ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、この酵母エキス濃度には、宿主細胞の培養前及び／又は培養中に添加された酵母エキスの総量が含まれる。一部の実施形態では、炭素源には、酵母エキス（又は酵母エキスに含まれる１種以上の成分）及び他の炭素源、例えばグルコースの両方を含む。一部の実施形態では、酵母エキス対他の炭素源の比は、約１：５、約１：１０、又は約１：２０（ｗ／ｗ）である。
【０１１０】
これに加え、炭素源には、炭酸ガス、又はメタノールなどのＣ１化合物からなる基質も含まれる。メチロトローフ酵母（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（２）５４１〜５４３，１９８９）及びバクテリア（Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４，４１４８〜４１５５，１９８５）により、Ｃ１化合物基質（例えば、メタノール、ホルムアルデヒド、又はギ酸）からグリセロールが生成されることも報告されている。これらの生物は、メタンをギ酸に酸化して、Ｃ１化合物を同化し、グリセロールを生成できる。炭素の同化経路は、リブロースモノリン酸、セリン、又はキシルロース−モノリン酸を介するものであり得る（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６，参照により全体を、特に炭素源に関する記載を本開示に組み込む）。リブロースモノリン酸経路は、ギ酸をリブロース−５−リン酸と縮合させて、六炭糖のフルクトースを生成し、最終的には、三炭糖生成物であるグリセルアルデヒド−３−リン酸を生成する。同様に、セリン経路では、Ｃ１化合物をメチレンテトラヒドロ葉酸により同化し、解糖系に送り込む。
【０１１１】
メチロトローフは、Ｃ１及びＣ２基質に加え、数多くのその他の炭素含有化合物を、例えば、メチルアミン、グルコサミン、及び代謝活性に関係する数多くのアミノ酸を利用することも知られている。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンに含まれる炭素を利用し、トレハロース又はグリセロールを生成することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃｌ  Ｃｏｍｐｄ．，Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．，７ｔｈ  ｅｄ．，４１５〜３２．Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｍｕｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ，１９９３）。同様にして、数多くの種類のカンジダが、アラニン又はオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３（５），４８５〜９，１９９０）。
【０１１２】
一部の実施形態では、細胞は、生理的塩類及び栄養分を含有している標準培地で培養する（例えば、Ｐｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ａｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．７１〜８６，１９８８；ａｎｄ  Ｉｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８〜１３０６，１９９７を参照されたい）。代表的な増殖培地は、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）ブロス、サブローデキストロース（ＳＤ）ブロス、又は酵素培地（ＹＭ）ブロスなどの一般的な商業的に調製された培地である。微生物学又は発酵科学に関係する当業者には、使用することのできるその他の制限培地又は合成増殖培地、並びに特定の宿主細胞の増殖に好適な培地は知られているであろう。
【０１１３】
細胞培地は、適当な炭素源以外に、適当なミネラル、塩類、補因子、緩衝剤、及び培養の増殖又はイソプレン生成の促進に適した当業者には周知の他の成分を含むことが望ましい（例えば、国際公開第２００４／０３３６４６号及び当該明細書の引用文献、並びに国際公開第９６／３５７９６号及び当該明細書の引用文献を参照）。イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路の核酸が誘導性プロモータの制御下にあるような一部の実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドの発現を誘導するうえで有効な濃度で、誘導剤（例えば、糖、金属塩又は抗微生物剤など）を培地に加えることが望ましい。一部の実施形態では、細胞培地には、ＤＸＳ、ＩＤＩ、又はＭＶＡ経路に関係する１つ以上の核酸を有するベクター上の抗生物質耐性核酸（カナマイシン耐性核酸など）に対応した抗生物質（カナマイシンなど）を含有させる。
【０１１４】
使用することのできる他の代表的な細胞培養培地は、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０３１０７７号、同第２０１０／０３１０７９号に記載されている。
【０１１５】
代表的なイソプレン産生法
一部の実施形態では、イソプレン産生条件下で細胞を培養培地で培養する。一部の実施形態では、培養時に細胞が産生するイソプレン量は、１時間につき、細胞の湿潤重量１ｇ当たり、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、又は５，０００ナノモル（ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時）以上である。一部の実施形態では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時、例えば、約２〜約１００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時、約１００〜約５００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時、約１５０〜約５００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時、約５００〜約１，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時、約１，０００〜約２，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時、又は約２，０００〜約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時である。ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時単位のイソプレンの量は、米国特許第５，８４９，９７０号に開示の通りに測定できる。例えば、ヘッドスペース２ｍＬに含まれるイソプレン（例えば、密閉したバイアル瓶で、３２℃、２００ｒｐｍで振盪させながら約３時間培養した２ｍＬ培養物などの培養物から、ヘッドスペースに放出されたイソプレン）は、ｎ−オクタン／ｐｏｒａｓｉｌ  Ｃカラム（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ））を取り付け、ＲＧＤ２酸化水銀還元ガス検出器（Ｔｒａｃｅ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ））に連結させた等温操作系（８５℃）などの、一般的なガスクロマトグラフィー系を用い測定する（例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ａｔｍｏｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．２７Ａ：２６８９〜２６９２，１９９３；Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７：１５８８〜１５９１，１９９１を参照されたい）。標準イソプレン濃度をもとにした検量線により、ガスクロマトグラフィーの面積単位をイソプレン量（ｎｍｏｌ）に変換する。一部の実施形態では、細胞の湿潤重量（ｇ）当たりの値は、細胞培養物サンプルのＡ６００値を得、次に、Ａ６００値が既知である細胞培養物の湿潤重量に関する検量線をもとにＡ６００値を細胞重量（ｇ）に変換することで算出する。一部の実施形態では、細胞重量（ｇ）は、ブロス１Ｌ（細胞培地及び細胞を含む）のＡ６００値が１である場合、湿潤細胞が１ｇ含まれているものと仮定し、概算する。この値を、培養物をインキュベートした時間数（例えば３時間）で除算する。
【０１１６】
一部の実施形態では、培養時に細胞が産生するイソプレン量は、１時間につき、細胞の湿潤重量１ｇ当たり、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、又は１００，０００ｎｇ（ｎｇ／ｇｗｃｍ／時）以上である。一部の実施形態では、イソプレン量は、約２〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／時、例えば、約２〜約１００ｎｇ／ｇｗｃｍ／時、約１００〜約５００ｎｇ／ｇｗｃｍ／時、約５００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／時、約１，０００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／時、又は約２，０００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／時である。イソプレン量（ｉｎｎｇ／ｇｗｃｍ／時）は、上記のイソプレン産生量（ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時）に６８．１を乗じることで算出できる（以下の式５に記載の通り）。
【０１１７】
一部の実施形態では、細胞は、培養時に累積力価（総量）約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００ｍｇ／Ｌ（ブロス１Ｌ当たりの産生量（ｍｇ）。ここで、ブロス体積には、細胞体積及び細胞培地の体積を含む）以上のイソプレンを産生する。一部の実施形態では、イソプレン量は約２〜約５，０００ｍｇ／Ｌ、例えば、約２〜約１００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌ、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ、約１，０００〜約２，０００ｍｇ／Ｌ、又は約２，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌである。振盪フラスコ又は同様の培養装置におけるイソプレンの比産生量（ｍｇ／Ｌ）は、ＯＤ６００が約１．０の細胞培養物から試料を１ｍＬ採取し、２０ｍＬバイアル瓶に移し入れ、３０分インキュベートした後に、ヘッドスペース中のイソプレン量を測定することで、測定できる。ＯＤ６００が１．０でない場合、測定値は、ＯＤ６００により除算して、ＯＤ６００が１．０になるよう標準化できる。ヘッドスペースに含まれるイソプレン量（ｍｇ／Ｌ）に係数３８を乗じ、培養培地のＯＤ６００値をもとにした、１時間当たりのイソプレン産生量（ｍｇ／Ｌ（ブロス）／時／ＯＤ）に変換することもできる。単位「ｍｇ／Ｌ（ブロス）／時／ＯＤ６００」の値に、時間数とＯＤ６００値を乗じ、イソプレンｍｇ／Ｌ（ブロス）単位での累積力価を得ることもできる。
【０１１８】
発酵槽の瞬間イソプレン産生速度（ｍｇ／Ｌ（ブロス）／時）は、発酵槽で放出された気体試料を採取し、イソプレン量（気体１Ｌ当たりのイソプレン重量（ｍｇ）などの単位）を解析し、この値に、ブロス１Ｌにつき放出される気体速度（例えば、１時間当たりに６０Ｌの気体が放出されることを意味する１ｖｖｍ（気体体積／ブロス体積／分））を乗じることで測定することができる。したがって、気体の放出濃度が１ｍｇ／Ｌである場合、空気流１ｖｖｍ下での瞬間産生速度は６０ｍｇ／Ｌ（ブロス）／時に相当する。必要に応じて、単位ｍｇ／Ｌ（ブロス）／時の値をＯＤ６００により除算することで、ｍｇ／Ｌ（ブロス）／時／ＯＤ単位で比速度を得ることもできる。イソプレンの平均放出濃度に、発酵時の発酵ブロス１Ｌ当たりの放出気体総量（off-gas sparged）を乗じることで、イソプレン／Ｌ（気体）の平均値を総産生物の産生性（発酵ブロス１Ｌ当たりのイソプレン重量，ｍｇ／（ブロス）Ｌ）に変換することもできる。したがって、イソプレンの平均放出濃度が０．５ｍｇ／（ブロス）Ｌ／時である場合、１ｖｖｍ下１０時間経過時の総生成物濃度は３００ｍｇ／（ブロス）Ｌに相当する。
【０１１９】
一部の実施形態では、細胞は、培養時に、細胞培養培地に含まれる炭素の約０．００１５、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、又は１．６％以上をイソプレンに変換する。一部の実施形態では、炭素のイソプレンへの変換率は約０．００２〜約１．６％であり、例えば、約０．００２〜約０．００５％、約０．００５〜約０．０１％、約０．０１〜約０．０５％、約０．０５〜約０．１５％、０．１５〜約０．２％、約０．２〜約０．３％、約０．３〜約０．５％、約０．５〜約０．８％、約０．８〜約１．０％、又は約１．０〜約１．６％である。炭素のイソプレンへの変換率（「炭素収率（％）」とも呼ばれる）は、産生されたイソプレンに含まれる炭素原子のｍｏｌ数を、炭素源（バッチ中の並びに供給したグルコース及び酵母エキスに含まれる炭素ｍｏｌ濃度）に含まれる炭素原子のｍｏｌ数により除算することで測定できる。この数に１００％を乗じ、百分率を生成する（式１に示す通り）。
【０１２０】
式１
炭素収率（％）＝（産生されたイソプレンに含まれる炭素のｍｏｌ数）／（炭素源に含まれる炭素のｍｏｌ数）＊１００
この計算式では、酵母エキスには５０重量％の炭素が含有されるものと仮定することができる。
【０１２１】
式２
炭素収率（％）＝（３９．１ｇイソプレン＊１／６８．１ｍｏｌ／ｇ＊５Ｃ／ｍｏｌ）／［（１８１２２１ｇグルコース＊１／１８０ｍｏｌ／ｇ＊６Ｃ／ｍｏｌ）＋（１７７８０ｇ酵母エキス＊０．５＊１／１２ｍｏｌ／ｇ）］＊１００＝０．０４２％
【０１２２】
当業者であれば、イソプレン産生速度又は産生されたイソプレン量は、容易に任意の単位に変換できる。単位を相互変換するための、代表的な等式を以下に掲載する。
【０１２３】
イソプレン産生速度単位（総産生量及び比産生量）
式３
１ｇイソプレン／Ｌブロス／時＝１４．７ｍｍｏｌイソプレン／Ｌブロス／時（合計容積流量）
【０１２４】
式４
１ｎｍｏｌイソプレン／ｇｗｃｍ／時＝１ｎｍｏｌイソプレン／Ｌブロス／時／ＯＤ６００（この変換式では、ＯＤ６００の値が１のブロス１Ｌには、１ｇの湿潤細胞が含まれているものと仮定する）。
【０１２５】
式５
１ｎｍｏｌイソプレン／ｇｗｃｍ／時＝６８．１ｎｇイソプレン／ｇｗｃｍ／時（イソプレンの分子量）
【０１２６】
式６
１ｎｍｏｌイソプレン／ガス中Ｏ２（Ｌ）／時＝９０ｎｍｏｌイソプレン／Ｌブロス／時（培養ブロス１Ｌ当たりのＯ２流速９０Ｌ／時）
【０１２７】
式７
１μｇイソプレン／放出ガス中イソプレン（Ｌ）＝６０μｇイソプレン／Ｌブロス／時（流速６０Ｌガス／Ｌブロス）（１ｖｖｍ）
【０１２８】
力価単位（合計単位及び比単位）
式８
１ｎｍｏｌイソプレン／１ｍｇ細胞タンパク質＝１５０ｎｍｏｌイソプレン／Ｌブロス／ＯＤ６００（この変換式では、ＯＤ６００値が１のブロス１Ｌに含まれる合計タンパク質量は約１５０ｍｇであると仮定する）（比産生性）
【０１２９】
式９
１ｇイソプレン／Ｌブロス＝１４．７ｍｍｏｌイソプレン／Ｌブロス（合計力価）
【０１３０】
必要に応じて、細胞の湿潤重量単位を細胞の乾燥重量単位へと変換する際に、式１０を使用することができる。
【０１３１】
式１０
細胞乾燥重量＝（細胞湿潤重量）／３．３
【０１３２】
本発明に包含される一部の実施例では、イソプレン合成酵素変異体のポリペプチドをコードしている異種核酸を含む細胞は、本質的に同様の条件下で、イソプレン合成酵素変異体ポリペプチドをコードしている核酸を含まない細胞を増殖させた場合の産生量の、少なくとも約２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、又は４００倍以上の量に相当するイソプレンを産生する。
【０１３３】
本発明に包含される一部の実施例では、イソプレン合成酵素変異体のポリペプチドと、ＤＸＳ、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路関連性ポリペプチドのうちの１つ以上とをコードしている異種核酸を含む細胞は、本質的に同様の条件下で、異種核酸を含まない細胞を増殖させた場合の産生量の、少なくとも約２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、又は４００倍以上の量に相当するイソプレンを産生する。
【０１３４】
代表的なイソプレン精製法
一部の実施形態では、本開示の任意の方法は、イソプレンを回収する工程を更に包含する。例えば、本発明の組成物及び方法を用い産生させたイソプレンを、ガス・ストリッピング、分画、吸着／脱着、浸透気化法、固相からのイソプレンの熱又は減圧脱着、又は固相に不動化又は吸収させたイソプレンの溶媒による抽出などの標準法を用い回収することができる（例えば、米国特許第４，７０３，００７号及び同第４，５７０，０２９号を参照されたい）。一部の実施形態では、イソプレンの回収には、液体イソプレン（イソプレンの未希釈溶液又はイソプレンの溶媒希釈液など）の単離を包含する。ガス・ストリッピングには、連続的な様式で、発酵による放出気流からイソプレン蒸気を除去することを包含する。このような除去は、いくつかの異なる方法で達成することができ、これには、固相への吸着、液相への分割、又は直接凝縮が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、蒸気の露点を上回る温度での希釈イソプレン蒸気ストリームの膜濃縮により、液体イソプレンの凝縮がもたらされる。一部の実施形態では、回収は、米国仮出願特許第６１／２８８，１４２号（２００９年１２月１８日出願）に記載の通りに実施する。
【０１３５】
イソプレンの回収には、一工程又は複数工程を包含し得る。一部の実施形態では、発酵により生じた気体からのイソプレン蒸気の回収、及びイソプレンの液相への転換は同時に行う。例えば、放出される気体流から、イソプレンを直接液体へと凝縮させることができる。一部の実施形態では、発酵により生じた気体からのイソプレン蒸気の回収、及びイソプレンの液相への転換は連続的に行う。例えば、イソプレンを、固相に吸着させ、次に溶媒を用い固相から抽出することができる。
【０１３６】
一部の実施形態では、本開示の任意の方法は、イソプレンの精製を更に包含する。例えば、本発明の組成物及び方法を用い生成したイソプレンを、標準法により精製することができる。精製とは、イソプレンを生成した際に存在している１種以上の成分から、イソプレンを分離する手法を指す。一部の実施形態では、イソプレンは実質的に純粋な液体として得られる。精製法の例としては（ｉ）抽出溶媒からの蒸留、及び（ｉｉ）クロマトグラフィーが挙げられる。本明細書で使用するとき、「精製イソプレン」は、イソプレンを生成した際に存在している１種以上の成分から分離したイソプレンを意味する。例えば、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号、ＰＣＴ出願国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／４９６，５７３号を参照されたい。一部の実施形態では、イソプレンはイソプレンの産生時に存在する他の成分を少なくとも約２０重量％含んでいない。各種実施形態では、イソプレンの純度は、少なくとも又は約２５重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、重量％又は９９重量％である。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ分析、又はＧＣ−ＭＳ分析等の任意の適切な方法で分析することができる。
【０１３７】
本明細書の上記のすべての刊行物及び特許は、参照により本開示に組み込まれる。本発明の範囲及び精神から逸脱せずとも、本発明に記載の方法及び系の様々な修正及び改変が、当業者には明白であろう。これまでに、本発明を、特定の実施形態に関連付けて記載したが、本発明は、特定の実施形態に不当に制限されるよう請求されるものではないことは理解されるべきである。本明細書に記載の各種実施形態に関する１つの、幾つかの、又は全ての特性は、本発明の他の実施形態と組み合わせることができることも理解されるであろう。本発明のこれらの態様及び他の態様は、当業者にとっては自明のものであろう。
【実施例】
【０１３８】
ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）の活性部位付近に局在する変異をプールし、ＤＭＡＰＰをイソプレンに変換することができかつ宿主発現株に向上した生育を付与するものを選別した。濃縮工程を複数回行った後、Ｓ２８８Ｃ変異は、変異プールにおいて主要な変異であった。Ｓ２８８Ｃは、宿主細胞において発現させた場合に、ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）に対し、著しく増加した溶解度を付与した。Ｓ２８８Ｃは、大規模発酵中に、ＩｓｐＳに増加した溶解度を付与し、かつサリックス・アルバ（Salix alba）及びシダレヤナギ（Salix babylonica）ヤナギ（willow）種由来のＩｓｐＳ酵素の溶解度も著しく増加させた。
【０１３９】
実施例１．Ｓ２８８Ｃ変異として特定された酵素の活性部位付近のＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体のプールの濃縮
ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）の活性部位付近に局在する変異をプールし、ＤＭＡＰＰをイソプレンに変換することができかつ宿主発現株に向上した生育を付与するものを選別した。
【０１４０】
方法
ＮＮＫ／ＭＮＮオリゴヌクレオチドプライマー対を使用し、完全なＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ酵素（５４４残基）の各位置に、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＰＣＲにより変異を導入した。ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）のコード配列の各位置（可能性のある３２コドン）にＮＮＫにより置換を行うことで、変異プールにおいて全２０の可能性のあるアミノ酸を表現することができる。変異させるコドンの上流１０塩基及び下流２０塩基を有するようＮＮＫプライマーを体系的に作成した。プライマー対間で２３塩基がオーバーラップするよう、正確に同じ方法で相補的なＭＮＮプライマーを体系的に作製した。製造元の推奨するプロトコルに従って、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ産物の形質転換後、組換え変異体を精製した。
【０１４１】
プールする際に、宿主の活性を増加させるＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳの各変異体を同定するため、おおよその半径が、活性部位から８オングストローム（ＰＤＢ  ３Ｎ０Ｇ）以内となるよう、５１の部位を選択した（表１及び図１を参照されたい）。これらの各位置由来の、ＮＮＫのＰＣＲ産物をプールし、エレクトロコンピテントなＭＤ０９−１７０細胞を形質転換させた。独立した約７，５００の形質転換体を単離し、次にプールした後に濃縮工程を実施した。７，５００の形質転換体では、各位置にて可能性のある変異が重複して約５倍にサンプリングされていることが表された（ＮＮＫの各位置に関しては３２コドン。５１の位置のプールに関しては１，６３２のコドンに可能性があった）。次にこのプールを、米国特許公告第２０１０／０００３７１６号に記載の通りＭＶＡ添加下で生育させて数回濃縮し、ＩＰＴＧによりＩｓｐＳの発現誘導を行った。濃縮を３回繰り返した後、８又は１６のそれぞれの単離体におけるＩｓｐＳ翻訳配列を完全に配列決定した後に次の濃縮工程を行った。６回繰り返した後、濃縮を終了した。
【０１４２】
結果
５回選別を繰り返し、ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ（表１を参照されたい）の活性部位付近の５１の位置におけるそれぞれの変異のプールを濃縮した後、優性な変異としてＳ２８８Ｃを同定した。表２は、５回の濃縮の後、ランダムに単離し、配列決定した１６の変異体のうち１３が、Ｓ２８８Ｃ変異を保有していたことを示す。初期の３又は４回の濃縮後には、単離された８の変異体のいずれにもＳ２８８Ｃは存在せず、６回濃縮した後には単離されたもののうち（１６のうち）２つの変異体にのみ存在していた。表２は、６回の濃縮後、主要な変異はＲ４３５Ｒ（ＣＧＴからＣＧＧへの変異）のサイレント変異であったことも示し、このサイレント変異により、宿主株において単純なＩｓｐＳ発現の増加が生じた可能性がある。この濃縮手順では、単純に発現の向上した変異体を増産させるより前に、ＩｓｐＳに対し有効な特性を示す変異を特定するために限られた候補が示されることを意味する。
【０１４３】
表１．基質類似体により特定されかつＰＤＢ３Ｎ０Ｇにおいて金属の配位した
活性部位からおおよその８オングストローム（ＰＤＢ  ３Ｎ０Ｇ）以内の、
酵素活性部位付近の位置
2015503904.tif 000004
【０１４４】
（表１の続き）
2015503904.tif 000005
【０１４５】
表２．活性部位のプールの各濃縮工程において単離された変異体明瞭な配列決定が
得られなかった単離体については「ＮＤ」と表記する。
2015503904.tif 000006
【０１４６】
実施例２．Ｓ２８８Ｃ変異はＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素に可溶性を付与する
ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）の活性部位付近に局在する変異をプールし、ＤＭＡＰＰをイソプレンに変換することができかつ宿主発現株に向上した生育を付与するものを選別した。複数回濃縮工程を行った後、Ｓ２８８Ｃが主要変異であり（実施例１に記載）、かつ細胞内ＩｓｐＳ活性に明らかな有効性をもたらしたことから、さらなる解析のため、変異を保有している各株を単離した。
【０１４７】
方法
野生型と比較してＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ  Ｓ２８８Ｃ変異体の可溶性を評価するため、野生型ＩｓｐＳをコードしているプラスミドｐＣＬ２０１を含有しているＤＷ４２５株と、Ｓ２８８Ｃ変異体をコードしているプラスミドｐＤＷ２１８を含有しているＤＷ５２６株と（図２）をＬＢ培地に接種し、増殖させ、標準的な分子生物学的手法に従いＩＰＴＧにより発現誘導した（表５及び表６を参照されたい）。上記のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅの手順を用い、表４に示すプライマーを使用し、イソプレン合成酵素のＧ４９１Ｓ変異体を含むｐＣＨＬ２４３（図３）にＳ２８８Ｃ変異を導入した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）による変異導入を行い（ＰＣＲのサイクルパラメーターについては下記を参照されたい）、野生型イソプレン合成酵素をコードしているｐＤＷ３４（ｐＤＷ３４作製については下記を参照されたい）にＧ４９１Ｓ変異を導入し、ｐＣＨＬ２４３を作製した。
【０１４８】
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【０１４９】
表３  プライマー
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【０１５０】
Ｓ２８８ＣのｐＣＨＬ２４３への導入により得られたプラスミドをｐＤＷ１６１と命名し、配列決定を行い、ＩｓｐＳのＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）Ｓ２８８Ｃ  Ｇ４９１Ｓ変異体を保有していることを確認した（図４及び表４を参照されたい）。標準的な分子生物学的手法を用い、プラスミドｐＭＣＭ８２及びｐＤＷ１６１を使用し、ＣＭＰ４５１株を同時形質転換することにより、ＤＷ５３２株を作製した（表６）。１４Ｌ規模での発酵に備え、カルベニシリン及びスペクチノマイシンに耐性を示す陽性株を選別した。いずれかの実験又は発酵振盪フラスコ由来の試料を遠心分離し、分析前に−８０℃に凍結させた。
【０１５１】
凍結試料を解凍し、かつ溶解緩衝液に再懸濁させ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．６）緩衝液、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ／ＡＥＢＳＦ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、前述のとおりにフレンチ・プレス・セルを通過させた。次に、溶解させた培養液を４℃にて１０分間、卓上微量遠心機の最高速度でスピン・ダウンさせた。上清を回収し、沈殿を１ｘ溶解緩衝液により洗浄した後、微量遠心機により２回めの遠心工程を行った。遠心分離した試料を回収し、沈殿を溶解緩衝液に再懸濁して、初回の遠心工程由来の上清と正確に当量になるようにした。次に、当量の試料をローディングバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により処理し、製造元の推奨するプロトコルに従って、ゲル電気泳動し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮｕＰａｇｅ）クマシー染色した。上清由来のサンプルを泳動したレーンには可溶性タンパク質が存在し、かつ再懸濁した沈殿油彩のサンプルを泳動したレーンには不溶性タンパク質が存在していた。大規模でのＳ２８８Ｃ変異体の効果を観察する目的で、上記手順にしたがって、発酵株ＣＭＰ５６３（表６を参照されたい）及びＤＷ５３２由来の試料も画分した。前述のとおり、及び製造元の推奨するプロトコルに従って、発酵試料由来の可溶性及び不溶性ＩｓｐＳ画分をウェスタンブロット分析により検出し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ）、Ｓｔｏｒｍ  ８６０  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（ＧＭＩ，Ｉｎｃ．）を用い定量した。プラスミドｐＤＷ３４及びｐＭＣＭ８２並びに株ＣＭＰ５６３、ＤＷ５３２及びＣＭＰ４５１の作製は、これまでに国際公開第２００９／０７６６７６号号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０３１０７７号、同第２０１０／０３１０７９号、同第２０１０／１４８１５０号、同第２０１０／００５５２５号、同第２０１０／０７８４５７号、同第２０１０／１２４１４６号、同第２０１１／０７５５３４号、同第２０１０／１４８１４４号、同第２０１１／０７９３１４号、同第２０１１／０７５７４８号、及び同第２００２／０１０３９８号に記載されており、これらの特許文献のすべてが参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５２】
表４．ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ変異導入に使用したプライマー
2015503904.tif 000009
【０１５３】
表５．本試験で使用したプラスミド
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【０１５４】
表６．本試験で使用した株
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【０１５５】
結果
濃縮プールからＤＷ５２６株を直接単離し、発現誘導を行い、画分を行い、Ｓ２８８Ｃが可溶性に対し示す効果を野生型と比較して決定した。図５は、対照分子と比較して、ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ  Ｓ２８８Ｃ変異体が、不溶性画分に存在していないことを示す（クマシー染色ゲルのレーン２をレーン４と比較）。図５は、対照ＩｓｐＳ酵素は可溶性及び不溶性画分に約１：１比で存在するのに対し、Ｓ２８８Ｃが可溶性画分のみに検出されたことも示す。図６は、大規模発酵試験における、ＩｓｐＳの可溶性に対するＳ２８８Ｃ変異の効果を示す。この試験では、親ＩｓｐＳ酵素は、それまでに、細胞活性に対して正の効果を有するものの可溶性に対しては効果を有さないことが示されていた、Ｇ４９１Ｓ変異を保有していた。親酵素と比較して、ＩｓｐＳ  Ｇ４９１Ｓ  Ｓ２８８Ｃ酵素は、発酵株において著しく向上した可溶性を示した。図６は、Ｇ４９１Ｓ分子単独の場合ではＩｓｐＳの総量の７８％だけが可溶性であったのに対し、Ｓ２８８Ｃ  Ｇ４９１Ｓ分子では可溶性が９０％に向上していたことを示す。
【０１５６】
ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ  Ｓ２８８Ｃのアミノ酸配列
【０１５７】
2015503904.tif 000012
【０１５８】
ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ  Ｓ２８８Ｃを保有しているｐＤＷ２１８のＤＮＡ配列
【０１５９】
2015503904.tif 000013
【０１６０】
2015503904.tif 000014
【０１６１】
2015503904.tif 000015
【０１６２】
ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ  Ｇ４９１Ｓを保有しているｐＣＨＬ２４３のＤＮＡ配列
【０１６３】
2015503904.tif 000016
【０１６４】
2015503904.tif 000017
【０１６５】
2015503904.tif 000018
【０１６６】
ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ  Ｓ２８８Ｃ  Ｇ４９１Ｓのアミノ酸配列
【０１６７】
2015503904.tif 000019
【０１６８】
ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ  Ｓ２８８Ｃ  Ｇ４９１Ｓを保有しているｐＤＷ１６１のＤＮＡ配列
【０１６９】
2015503904.tif 000020
【０１７０】
2015503904.tif 000021
【０１７１】
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【０１７２】
実施例３．Ｓ２８８Ｃ変異は、サリックス・アルバ（Salix alba）及びシダレヤナギ（Salix babylonica）由来のＩｓｐＳ酵素の溶解性を向上させた。
サリックス・アルバ（Salix alba）及びシダレヤナギ（Salix babylonica）由来のＩｓｐＳの可溶性に対するＳ２８８Ｃ変異の効果を調査した。
【０１７３】
方法及び結果
プラスミドｐＥＷＬ７９２（ｐＴｒｃ  Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ）の構築
大腸菌（E. coli）の発現に特異的なコドン最適化法を利用し、Ｇｅｎｅ  Ｏｒａｃｌｅ  Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により、サリックス・アルバ（Salix alba）イソプレン合成酵素（S. alba IspS）をコードしている合成遺伝子の作製を行った。ＮｃｏＩ制限部位を５’末端に及びＰｓｔＩ制限部位を３’末端にもつよう遺伝子操作し、プラスミドｐＧＯｖ４に合成遺伝子をクローニングした。ウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ及びサリックス・アルバ（S. alba）ＩｓｐＳ間のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ配列アラインメントにより、同一性は９１．７３％であるとして示された（図７）。
【０１７４】
製造元のプロトコルをもとに、３７℃にて、制限酵素ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩ（Ｒｏｃｈｅ）により１μｇのｐＧＯｖ４  Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳプラスミドを消化した。次に、消化したＳ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ断片を、１％  ＥＸゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。製造元のプロトコルをもとに、３７℃にて、制限酵素ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩにより０．５μｇのｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を消化した。次に、１％  ＥＸゲルを使用してｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂプラスミドを精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用して抽出した。製造元のプロトコルをもとに、室温にて、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用し、Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ遺伝子をｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂプラスミドに連結した。ペトリ皿のｄｄＨ２Ｏに０．０２５μｍのニトロセルロース膜フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を浮かべ、ニトロセルロース膜フィルタ上にライゲーション混合物を静かに載せ室温で３０分間置き、ライゲーション混合物を脱塩した。ＭＣＭ４４６株の細胞をＬＢ中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で３回洗った。５０μＬの細胞懸濁液を５μＬの脱塩したｐＴｒｃ  Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳライゲーション混合物と混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用い、２ｍｍキュベット中で細胞懸濁液混合物を２．５ボルト及び２５μＦｄで電気穿孔した。１ｍＬのＬＢに細胞を回収し、振盪しながら３０℃で２時間インキュベートした。ＬＡ＋５０μｇ／μＬのカルベニシリン＋１０ｍＭのメバロン酸を添加したプレート上で形質転換体を選別し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、複数の形質転換体を回収し、５ｍＬ  ＬＢ＋５０μｇ／μＬカルベニシリンを入れたチューブにおいて３０℃にて一晩生育させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、一晩培養することでプラスミド調製を実施した。３７℃にて、プラスミドを制限酵素ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩにより消化し、１．２％  Ｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分析し、適切な大きさの断片が得られたことを確認した。複数の形質転換体から得られたプラスミドをＳｅｑｕｅｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）に用い、プライマーＥＬ１００５、ＥＬ１００６、ＥＬ１２７０、及びＥＬ１２７１により配列決定を行った（表７）。ＤＮＡの配列決定により、プラスミドが正しいものであることが示された。１つのプラスミドを選択し、ｐＥＷＬ７９２と命名した（図８、表８）。
【０１７５】
プラスミドｐＥＷＬ７９５（ｐＴｒｃ  Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ−ｍＭＶＫ）の構築
製造元のプロトコルに従って、テンプレートとしてプラスミドＭＣＭ３７６、プライマーＭＣＭ１６５及びＭＣＭ１７７、並びにＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  ＦｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてＰＣＲ反応を実施し、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）ＭＶＫ遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ条件は次のとおりにした：９５℃で２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃で２５秒間、５５℃で２５秒間、７２℃で１８秒間を２９サイクル、最後の伸長を７２℃で２分間。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）ＭＶＫのＰＣＲ産物を精製した。
【０１７６】
製造元のプロトコルをもとに、３７℃にて、制限酵素ＰｍｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によりメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）ＭＶＫのＰＣＲ産物を消化した。次に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用し、この消化したＰＣＲ断片を精製した。製造元のプロトコルをもとに、３７℃にて、制限酵素ＮｓｉＩ（Ｒｏｃｈｅ）により連続的に制限酵素による消化を実施した。次に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用し、この消化したメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）ＭＶＫ断片を精製した。製造元のプロトコルをもとに、３７℃にてプラスミドｐＥＷＬ７９２を制限酵素ＰｍｅＩにより消化した。次に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用し、消化したｐＥＷＬ７９２断片を精製した。製造元のプロトコルをもとに、３７℃にて、制限酵素ＮｓｉＩにより連続的に制限酵素による消化を実施した。この消化したｐＥＷＬ７９２断片を１％ＥＸゲルを使用して精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用し抽出した。製造元のプロトコルをもとに、１６℃にて、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用し、メタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）ＭＶＫ遺伝子をｐＥＷＬ７９２プラスミドに連結した。翌日、ペトリ皿のｄｄＨ２Ｏに、０．０２５μｍニトロセルロース膜フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を浮かべ、ニトロセルロース膜フィルタ上にライゲーション混合物を静かに載せ、室温で３０分間置き、ライゲーション混合物を脱塩した。ＭＣＭ４４６細胞を対数増殖期中期までＬＢで増殖させ、次に氷冷した滅菌水で３度洗浄した。５０μＬの細胞懸濁液を５μＬの脱塩したｐＴｒｃ  Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ−ｍＭＶＫライゲーション混合物と混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用い、２ｍｍキュベット中で細胞懸濁液混合物を２．５ボルト及び２５μＦｄで電気穿孔した。１ｍＬのＬＢに細胞を回収し、振盪しながら３０℃で２時間インキュベートした。ＬＡ＋５０μｇ／μＬのカルベニシリン＋１０ｍＭのメバロン酸を添加したプレート上で形質転換体を選別し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、複数の形質転換体を回収し、５ｍＬ  ＬＢ＋５０μｇ／μＬカルベニシリンを入れたチューブにおいて３０℃にて一晩生育させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、一晩培養することでプラスミド調製を実施した。制限酵素ＮｃｏＩ（Ｒｏｃｈｅ）及びＰｍｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、並びに緩衝液４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用し、３７℃にてプラスミドを消化し、１．２％  Ｅゲルで分析し、適切な大きさの断片が得られたことを確認した。複数の形質転換体から得られたプラスミドをＳｅｑｕｅｔｅｃｈに用い、プライマーＥＬ１００３、ＥＬ１００５、ＥＬ１００６、ＥＬ１２７０、ＥＬ１２７１、及びＥＬ１２７２により配列決定を行った（表７）。ＤＮＡの配列決定により、プラスミドが正しいものであることが示された。１つのプラスミドを選択し、ｐＥＷＬ７９５と命名した（図９、表８）。
【０１７７】
ＥＷＬ８０４株の構築（ＢＬ２１，ｐｇｌ＋ＰＬ．２−ｍＫＫＤｙＩ，ＧＩ１．２−ｇｌｔＡ，ｐＴｒｃ  Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ−ｍＭＶＫ）
ＣＭＰ４５１株の細胞をＬＢ中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で３回洗った。５０μＬの懸濁液を１μＬのｐＥＷＬ７９５プラスミドと混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用い、２ｍｍキュベット中で細胞懸濁液混合物を２．５ボルト及び２５μＦｄで電気穿孔した。１ｍＬのＬＢに細胞を回収し、振盪しながら３０℃で２時間インキュベートした。ＬＡ＋５０μｇ／μＬのカルベニシリン＋５ｍＭのメバロン酸を添加したプレート上で形質転換体を選別し、３７℃で一晩インキュベートした。１つのコロニーを採取し、ＥＷＬ８０４株と命名した（表９）。
【０１７８】
ＥＷＬ８１０株の構築（ＢＬ２１，ｐｇｌ＋ＰＬ．２−ｍＫＫＤｙＩ，ＧＩ１．２−ｇｌｔＡ，ｐＴｒｃ  Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ−ｍＭＶＫ，ｐＣＬ  Ｐｔｒｃ−Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ）
ＥＷＬ８０４株の細胞をＬＢ中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で３回洗った。５０μＬの細胞懸濁液を１μＬのプラスミドＭＣＭ８２（ｐＣＬ  Ｐｔｒｃ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ）と混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用い、２ｍｍキュベット中で細胞懸濁液混合物を２．５ボルト及び２５μＦｄで電気穿孔した。１ｍＬのＬＢに細胞を回収し、振盪しながら３０℃で２時間インキュベートした。ＬＡ＋５０μｇ／μＬのカルベニシリン＋５０μｇ／μＬのスペクチノマイシンを添加したプレート上で形質転換体を選別し、３７℃で一晩インキュベートした。１つのコロニーを採取し、ＥＷＬ８１０株と命名した（表９）。
【０１７９】
プラスミドｐＥＷＬ８３４（ｐＴｒｃ  Ｓ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳ）の構築
大腸菌（E. coli）の発現に特異的なコドン最適化法を利用し、Ｇｅｎｅ  Ｏｒａｃｌｅ  Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により、シダレヤナギ（Salix babylonica）イソプレン合成酵素（S.babylonica IspS）をコードしている合成遺伝子の作製を行った。ＮｃｏＩ制限部位を５’末端に及びＰｓｔＩ制限部位を３’末端にもつよう遺伝子操作し、プラスミドｐＧＯｖ４に合成遺伝子をクローニングした。ウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ及びシダレヤナギ（S. babylonica）ＩｓｐＳ間のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ配列アラインメントにより、同一性は９２．２８％であるとして示された（図１０）。
【０１８０】
製造元のプロトコルをもとに、３７℃にて、制限酵素ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩにより１μｇのｐＧＯｖ４  Ｓ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳプラスミドを消化した。次に、消化したＳ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳ断片を１％  ＥＸゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用して抽出した。製造元のプロトコルをもとに、３７℃にて、制限酵素ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩ（Ｒｏｃｈｅ）により０．５μｇのｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂプラスミドを消化した。次に、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂプラスミドを１％  ＥＸゲルを使用して精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ゲル抽出キットを使用して抽出した。製造元のプロトコルをもとに、室温にて、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用し、Ｓ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳ遺伝子をｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂプラスミドに連結した。ペトリ皿のｄｄＨ２Ｏに０．０２５μｍのニトロセルロース膜フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を浮かべ、ニトロセルロース膜フィルタ上にライゲーション混合物を静かに載せ室温で３０分間置き、ライゲーション混合物を脱塩した。ＭＣＭ４４６株の細胞をＬＢ中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で３回洗った。５０μＬの細胞懸濁液を５μＬの脱塩したｐＴｒｃ  Ｓ．ｂａｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳライゲーション混合物と混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用い、２ｍｍキュベット中で細胞懸濁液混合物を２．５ボルト及び２５μＦｄで電気穿孔した。１ｍＬのＬＢに細胞を回収し、振盪しながら３０℃で２時間インキュベートした。ＬＡ＋５０μｇ／μＬのカルベニシリン＋１０ｍＭのメバロン酸を添加したプレート上で形質転換体を選別し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、複数の形質転換体を回収し、５ｍＬ  ＬＢ＋５０μｇ／μＬカルベニシリンを入れたチューブにおいて３０℃にて一晩生育させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、一晩培養することでプラスミド調製を実施した。３７℃にて、プラスミドを制限酵素ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩにより消化し、１．２％  Ｅゲルで分析し、適切な大きさの断片が得られたことを確認した。複数の形質転換体から得られたプラスミドをＳｅｑｕｅｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）に用い、プライマーＥＬ１００４、ＥＬ１００６、ＥＬ１２８５、ＥＬ１２８６、ＥＬ１２８７により配列決定を行った（表７）。ＤＮＡの配列決定により、プラスミドが正しいものであることが示された。１つのプラスミドを選択し、ｐＥＷＬ８３４と命名した（図１１、表８）。
【０１８１】
プラスミドｐＥＷＬ８５１の構築（ｐＴｒｃ  Ｓ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳ−ｍＭＶＫ）
製造元のプロトコルに従って、テンプレートとしてプラスミドＭＣＭ３７６、プライマーＭＣＭ１６５及びＭＣＭ１７７、並びにＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  ＦｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＰＣＲ反応を実施し、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）ＭＶＫ遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ条件は次のとおりにした：９５℃で２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃で２５秒間、５５℃で２５秒間、７２℃で１８秒間を２９サイクル、最後の伸長を７２℃で２分間。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）ＭＶＫのＰＣＲ産物を精製した。
【０１８２】
製造元のプロトコルをもとに、３７℃にて、制限酵素ＰｍｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によりメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）ＭＶＫのＰＣＲ産物を消化した。次に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用し、この消化したＰＣＲ断片を精製した。製造元のプロトコルをもとに、３７℃にて、制限酵素ＮｓｉＩにより連続的に制限酵素による消化を実施した。次に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用し、この消化したメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）ＭＶＫ断片を精製した。製造元のプロトコルをもとに、３７℃にてプラスミドｐＥＷＬ８３４を制限酵素ＰｍｅＩにより消化した。次に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用し、消化したｐＥＷＬ８３４断片を精製した。製造元のプロトコルをもとに、３７℃にて、制限酵素ＮｓｉＩにより連続的に制限酵素による消化を実施した。１％  ＥＸゲルを使用し、この消化したｐＥＷＬ８３４断片を精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用し抽出した。製造元のプロトコルをもとに、１６℃にて一晩、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用し、Ｍ．マゼイ（M. mazei）ＭＶＫ遺伝子をｐＥＷＬ８３４プラスミドに連結した。翌日、ペトリ皿のｄｄＨ２Ｏに、０．０２５μｍニトロセルロース膜フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を浮かべ、ニトロセルロース膜フィルタ上にライゲーション混合物を静かに載せ、室温で３０分間置き、ライゲーション混合物を脱塩した。ＭＣＭ４４６細胞を対数増殖期中期までＬＢで増殖させ、次に氷冷した滅菌水で３度洗浄した。５０μＬの細胞懸濁液を５μＬの脱塩したｐＴｒｃ  Ｓ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳ−ｍＭＶＫライゲーション混合物と混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用い、２ｍｍキュベット中で細胞懸濁液混合物を２．５ボルト及び２５μＦｄで電気穿孔した。１ｍＬのＬＢに細胞を回収し、振盪しながら３０℃で２時間インキュベートした。ＬＡ＋５０μｇ／μＬのカルベニシリン＋１０ｍＭのメバロン酸を添加したプレート上で形質転換体を選別し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、複数の形質転換体を回収し、５ｍＬ  ＬＢ＋５０μｇ／μＬカルベニシリンを入れたチューブにおいて３０℃にて一晩生育させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、一晩培養することでプラスミド調製を実施した制限酵素ＮｃｏＩ及びＰｍｅＩ、並びに緩衝液４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用し、３７℃にてプラスミドを消化し、１．２％  Ｅゲルで分析し、適切な大きさの断片が得られたことを確認した。複数の形質転換体から得られたプラスミドをＳｅｑｕｅｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）に用い、プライマーＥＬ１００４、ＥＬ１００５、ＥＬ１００６、ＥＬ１２８５、ＥＬ１２８６、及びＥＬ１２８７により配列決定を行った（表６）。ＤＮＡの配列決定により、プラスミド配列を確認した。１つのプラスミドを選択し、ｐＥＷＬ８５１と命名した（図１２、表８）。
【０１８３】
ＥＷＬ８８７株の構築（ＢＬ２１，ｐｇｌ＋ＰＬ．２−ｍＫＫＤｙＩ，ＧＩ１．２−ｇｌｔＡ，ｐＴｒｃ  Ｓ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳ−ｍＭＶＫ）
ＣＭＰ４５１株の細胞をＬＢ中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で３回洗った。５０μＬの懸濁液を１μＬのｐＥＷＬ８５１プラスミドと混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用い、２ｍｍキュベット中で細胞懸濁液混合物を２．５ボルト及び２５μＦｄで電気穿孔した。１ｍＬのＬＢに細胞を回収し、振盪しながら３０℃で２時間インキュベートした。ＬＡ＋５０μｇ／μＬのカルベニシリン＋５ｍＭのメバロン酸を添加したプレート上で形質転換体を選別し、３７℃で一晩インキュベートした。１つのコロニーを採取し、ＥＷＬ８８７株と命名した（表９）。
【０１８４】
ＥＷＬ８９３株の構築（ＢＬ２１，ｐｇｌ＋ＰＬ．２−ｍＫＫＤｙＩ，ＧＩ１．２−ｇｌｔＡ，ｐＴｒｃ  Ｓ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳ−ｍＭＶＫ，ＭＣＭ８２）
ＥＷＬ８８７株の細胞をＬＢ中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で３回洗った。５０μＬの懸濁液を１μＬのＭＣＭ８２プラスミドと混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用い、２ｍｍキュベット中で細胞懸濁液混合物を２．５ボルト及び２５μＦｄで電気穿孔した。１ｍＬのＬＢに細胞を回収し、振盪しながら３０℃で２時間インキュベートした。ＬＡ＋５０μｇ／μＬのカルベニシリン＋５０μｇ／μＬのスペクチノマイシンを添加したプレート上で形質転換体を選別し、３７℃で一晩インキュベートした。１つのコロニーを採取し、ＥＷＬ８９３株と命名した（表９）。
【０１８５】
ＥＷＬ９００株の構築（ＢＬ２１，ＰＬ．２−ｍＫＫＤｙＩ，ｐＴｒｃ  Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ）及びＥＷＬ９０３株（ＢＬ２１，ＰＬ．２−ｍＫＫＤｙＩ，ｐＴｒｃ  Ｓ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳ）
ＭＣＭ５３１株の細胞をＬＢ中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で３回洗った。５０μＬの細胞懸濁液を１μＬのプラスミドｐＥＷＬ７９２（ｐＴｒｃ  Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ）又はｐＥＷＬ８３４（ｐＴｒｃ  Ｓ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳ）と混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用い、２ｍｍキュベット中で細胞懸濁液混合物を２．５ボルト及び２５μＦｄで電気穿孔した。１ｍＬのＬＢに細胞を回収し、振盪しながら３０℃で２時間インキュベートした。ＬＡ＋５０μｇ／μＬのカルベニシリン＋５ｍＭのメバロン酸を添加したプレート上で形質転換体を選別し、３７℃で一晩インキュベートした。プラスミドｐＥＷＬ７９２を保有している形質転換体に関しては１つのコロニーを選択し、ＥＷＬ９００株と命名した（表９）。プラスミドｐＥＷＬ８３４を保有している形質転換体に関しては１つのコロニーを選択し、ＥＷＬ９０３株と命名した（表９）。
【０１８６】
Ｐ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ、Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ、及びＳ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳの可溶性の比較
ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ（ＤＷ１９４）、ｐＴｒｃ  Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ（ＥＷＬ９００）及びｐＴｒｃ  Ｓ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳ（ＥＷＬ９０３）を発現している株をＬＢ培地で生育させ、ＯＤ６００が約０．５の時点で２００μＭのＩＰＴＧにより発現誘導を開始し、４時間にわたって発現誘導を行った。遠心分離により細胞沈殿を回収し、−８０℃にて保存した。フレンチ・プレスにより細胞を溶解させ、ウェスタンブロットによりタンパク質の可溶性について解析した。結果として、Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ及びＳ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳはＰ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳよりも可溶性が高いことが示された（図１３及び図１４）。
【０１８７】
ｐＥＷＬ９０６（ｐＴｒｃ  Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ  Ｓ２８８Ｃ）及びｐＥＷＬ９０７（ｐＴｒｃ  Ｓ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳ  Ｓ２８８Ｃ）の構築
プライマーを消化し、Ｓ２８８Ｃ変異をサリックス・アルバ（S. alba）ＩｓｐＳ（プライマーＥＬ１２８８及びＥＬ１２８９，表７を参照されたい）及びサリックス・バビロニア（S. babylonica）ＩｓｐＳ（プライマーＥＬ１２９０及びＥＬ１２９１，表７を参照されたい）。Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲの開始テンプレートとしてプラスミドｐＥＷＬ７９２（ｐＴｒｃ  Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ）及びｐＥＷＬ８３４（ｐＴｒｃ  Ｓ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳ）を使用した。ＰＣＲ条件は次のとおりにした：９５℃で２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、６８℃で６分間を１６サイクル繰り返した。各ＰＣＲ反応に際し、２μＬのＤｐｎＩ制限酵素（Ｒｏｃｈｅ）を添加し、３７℃にて２時間インキュベートし、親テンプレートを消化した。ＭＣＭ５３１株の細胞をＬＢ中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で３回洗った。５０μＬの細胞懸濁液を２μＬの各ＰＣＲ反応物と混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用い、２ｍｍキュベット中で細胞懸濁液混合物を２．５ボルト及び２５μＦｄで電気穿孔した。１ｍＬのＬＢに細胞を回収し、振盪しながら３０℃で２時間インキュベートした。ＬＡ＋５０μｇ／μＬのカルベニシリン＋５ｍＭのメバロン酸を添加したプレート上で形質転換体を選別し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、それぞれから複数の形質転換体を回収し、５ｍＬ  ＬＢ＋５０μｇ／μＬカルベニシリンを入れたチューブにおいて３０℃にて一晩生育させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、一晩培養することでプラスミド調製を実施した複数の形質転換体から得られたプラスミドをＳｅｑｕｅｔｅｃｈに用い、配列決定を行った。ｐＴｒｃ  Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ  Ｓ２８８Ｃの配列決定には、プライマーＥＬ１００５、ＥＬ１００６、ＥＬ１２７０、ＥＬ１２７１、及びＥＬ１２７２を使用した（表７を参照されたい）。ｐＴｒｃ  Ｓ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳ  Ｓ２８８Ｃの配列決定には、プライマーＥＬ１００５、ＥＬ１００６、ＥＬ１２８５、ＥＬ１２８６、及びＥＬ１２８７を使用した（表７を参照されたい）。
【０１８８】
ＤＮＡの配列決定の結果により、プラスミドが正しいものであり、かつＳ２８８Ｃ変異を含有していることが示された。プラスミドｐＴｒｃ  Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ  Ｓ２８８ＣをｐＥＷＬ９０６と命名した（図１５、表８）。プラスミドｐＴｒｃ  Ｓ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳ  Ｓ２８８ＣをｐＥＷＬ９０７と命名した（図１６、表８）。プラスミドｐＥＷＬ９０６によりＭＣＭ５３１細胞を形質転換させ、発現株ＥＷＬ９１３を作製した（表９）。プラスミドｐＥＷＬ９０７によりＭＣＭ５３１細胞を形質転換させ、発現株ＥＷＬ９１６を作製した（表９）。
【０１８９】
Ｐ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ、Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ、Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ  Ｓ２８８Ｃ、Ｓ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳ、及びＳ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳ  Ｓ２８８Ｃの可溶性の比較
Ｐ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ（ＤＷ１９４）、Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ（ＥＷＬ９００）、Ｓ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ  Ｓ２８８Ｃ（ＥＷＬ９１３）、Ｓ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳ（ＥＷＬ９０３）、又はＳ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳ  Ｓ２８８Ｃ（ＥＷＬ９１６）を発現している株をＬＢ＋５０μｇ／μＬカルベニシリンにて生育させた。ＯＤ６００が約０．５に達した時点で２００μＭ  ＩＰＴＧにより細胞に発現誘導を行い、３４℃にて４時間生育させた。遠心分離により細胞沈殿を回収し、−８０℃にて保存した。細胞をフレンチ・プレスにより溶解させ、１０％  ＮｕＰａｇｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のクマシー染色（図１７）並びにウェスタンブロット（図１８）によりタンパク質の可溶性について分析した。結果として、Ｓ２８８Ｃ変異によりＳ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ及びＳ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳのいずれもの可溶性が向上していたことが示された。
【０１９０】
表７．プライマー配列
2015503904.tif 000023
【０１９１】
表８．本試験で使用したプラスミド
2015503904.tif 000024
【０１９２】
表９．本試験で使用した株
2015503904.tif 000025
【０１９３】
５’末端にＮｃｏＩ制限部位をもち、かつＰｓｔＩ制限部位をもつよう遺伝子操作されたコドン最適化したＳ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳの配列
【０１９４】
2015503904.tif 000026
【０１９５】
ｐＥＷＬ７９２のＤＮＡ配列
【０１９６】
2015503904.tif 000027
【０１９７】
2015503904.tif 000028
【０１９８】
2015503904.tif 000029
【０１９９】
ｐＥＷＬ７９５のＤＮＡ配列
【０２００】
2015503904.tif 000030
【０２０１】
2015503904.tif 000031
【０２０２】
2015503904.tif 000032
【０２０３】
５’末端にＮｃｏＩ制限部位をもち、かつＰｓｔＩ制限部位をもつよう遺伝子操作されたコドン最適化したＳ．ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ  ＩｓｐＳの配列
【０２０４】
2015503904.tif 000033
【０２０５】
ｐＥＷＬ８３４のＤＮＡ配列
【０２０６】
2015503904.tif 000034
【０２０７】
2015503904.tif 000035
【０２０８】
2015503904.tif 000036
【０２０９】
ｐＥＷＬ８５１のＤＮＡ配列
【０２１０】
2015503904.tif 000037
【０２１１】
2015503904.tif 000038
【０２１２】
2015503904.tif 000039
【０２１３】
ｐＥＷＬ９０６のＤＮＡ配列
【０２１４】
2015503904.tif 000040
【０２１５】
2015503904.tif 000041
【０２１６】
2015503904.tif 000042
【０２１７】
2015503904.tif 000043
【０２１８】
ｐＥＷＬ９０７のＤＮＡ配列
【０２１９】
2015503904.tif 000044
【０２２０】
2015503904.tif 000045
【０２２１】
2015503904.tif 000046
【０２２２】
実施例４．ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）Ａ３Ｔ  Ｓ２８８Ｃの結晶構造
表１０に掲載するプライマーを使用し、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）変異導入により、Ｓ２８８Ｃ変異をＭＤ０９−１６３ベクター（これまでに記載）に導入した。製造元の推奨するプロトコルに従って、変異導入を実施した。ＰＣＲ産物により、ケミカルコンピテントなＴｏｐ１０大腸菌（E. coli）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞を形質転換させ、プラスミドを単離するため陽性の形質転換体を選択し、完全に配列決定した。単一のプラスミド、ｐＤＷ１９６（表１１、図２３）を検証し、更なる変異導入に使用した。上記の同様の手順によりＡ３Ｔ変異をｐＤＷ１９６ベクターに導入した。製造元の推奨するプロトコルに従って、完全に検証したプラスミド、ｐＤＷ２０４（表１１、図２４）によりケミカルコンピテントなＢＬ２１  ＤＥ３  ｐＬｙｓＳ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させた。構造解析のため、このＤＷ６１４株を、ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ  Ａ３Ｔ  Ｓ２８８Ｃ変異体の精製及びそれに続く結晶化に使用した。
【０２２３】
表１０．本試験に使用したプライマー
2015503904.tif 000047
【０２２４】
表１１．本試験に使用したプラスミド／株
2015503904.tif 000048
【０２２５】
ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ  Ｓ２８８Ｃ  ＴＥＶ  ６×Ｈｉｓのアミノ酸配列
【０２２６】
2015503904.tif 000049
【０２２７】
ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ  Ｓ２８８Ｃ  ＴＥＶ  ６×Ｈｉｓを保有しているｐＤＷ１９６のＤＮＡ配列
【０２２８】
2015503904.tif 000050
【０２２９】
2015503904.tif 000051
【０２３０】
ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ  Ａ３Ｔ  Ｓ２８８Ｃ  ＴＥＶ  ６×Ｈｉｓのアミノ酸配列
【０２３１】
2015503904.tif 000052
【０２３２】
配列番号２の配列は
【０２３３】
2015503904.tif 000053
【０２３４】
ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ  Ａ３Ｔ  Ｓ２８８Ｃ  ＴＥＶ  ６×Ｈｉｓを保有しているｐＤＷ２０４のＤＮＡ配列
【０２３５】
2015503904.tif 000054
【０２３６】
2015503904.tif 000055
【０２３７】
ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）Ａ３Ｔ  Ｓ２８８Ｃの発現及び精製
６×Ｈｉｓタグ付加ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）Ａ３Ｔ  Ｓ２８８Ｃの発現
Ｎ末端６×Ｈｉｓタグ付加ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）Ａ３Ｔ  Ｓ２８８Ｃを発現させ、株ＤＷ６１４から精製した。増殖法は、ＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞で発現させたヒスチジンタグ付加酵素に好適なものである。予定していた各１Ｌの増殖用に、１０ｍＬの一晩培養物を調製した。２５ｍＬフラスコを用い、１０ｍＬ  ＬＢ培地に適切な抗生物質（５０ｍｇ／ｍＬカナマイシン、５０ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコール）を加え、新しい細胞プレートから１コロニーを接種し、あるいは凍結させたグリセロールストックを直接接種した。約２２０ｒｐｍで振盪させながら、培養物を３０℃で一晩増殖させた。一日培養物は、各培養時に適切な抗生物質を添加した１Ｌ  ＬＢ培地で調製した。各１Ｌの一日培養物に１０ｍＬの一晩培養物を接種し、ＯＤ６００が約０．４〜０．６に到達するまで、約２２０ｒｐｍで振盪しながら３０〜３７℃で増殖させた。次に、４００μＭのＩＰＴＧにより１日培養物に発現誘導を行い、２２０ｒｐｍで振盪しながら３０℃にて５〜６時間増殖させた。次に、４℃にて１０，０００×ｇで１０分間遠心沈降し、細胞を回収した。回収後、細胞は次工程に直接用いるか、あるいは使用までの間−８０℃で保存した。
【０２３８】
６×Ｈｉｓタグ付加ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）Ａ３Ｔ  Ｓ２８８Ｃの精製
ヒスチジンタグ付加した酵素をＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞から精製するにあたって、細胞を新鮮な溶解緩衝液（溶解緩衝液（ｐＨ  ８．０）：Ｎｉ洗浄緩衝液＋０．５ｍＭ  ＰＭＳＴ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、０．２ｍｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅＩ、Ｎｉ洗浄緩衝液：５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）に穏やかに再懸濁した。細胞沈殿に対し、培養培地１Ｌにつき約４０〜５０ｍＬ溶解緩衝液を使用した。次に細胞を氷上で約３０分インキュベートした。次に、可溶化液が透明になり始めるまで、フレンチプレスセルを２〜３回通過させて（８２７４ｋＰａ／Ｈｉｇｈ  ｓｅｔｔｉｎｇ（１２００ｐｓｉ／Ｈｉｇｈ  ｓｅｔｔｉｎｇ）に設定して大型フレンチプレスセルを使用）、細胞懸濁液を完全に可溶化させた。活性解析及びゲル解析（約１００μＬ）のため可溶化液を保存した。次に、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ９０ＳＥ超遠心機により、４℃にて３０，０００ｘｇで３０分遠心分離し、可溶化液を清澄化させた。上清を回収し、維持した。「清澄化させた可溶化液」試料を、活性解析及びゲル解析のため保存した（約１００μＬ）。
【０２３９】
清澄化させた可溶化液を、０〜１００％  Ｎｉ緩衝液Ｂを用い、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。カラムに可溶化液を充填した後、このカラムをＮｉ洗浄緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ、３００ｍｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾール（ｐＨ  ８．０））により洗浄した。次に、０〜１００％  Ｎｉ溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール（ｐＨ  ８．０））を用い、カラムからＨｉｓタグ付加ＩｓｐＳを溶出させ、Ｈｉｓタグ付加ＩｓｐＳを含有している画分を回収した。次にカラムをＮｉ脱着緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ７．４））で洗浄した。次に、製造元の指示に従い、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜１２％ゲルＮＵＰＡＧＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により解析した。所望の画分をスピンフィルタ（Ｖｉｖａｓｐｉｎ−２０、Ｓａｒｔｏｒｉｓ）で濃縮し、次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５樹脂を装填したＨｉ  Ｐｒｅｐ  ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ  ｈｅａｔｈｃａｒｅ）で脱塩した。Ｇ−２５緩衝液は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  ＤＴＴからなり、ｐＨ  ７．４であった。次に画分を解析し、濃縮した。次に試料を−８０℃で保存した。
【０２４０】
ＤＷ６１４株由来のＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）Ａ３Ｔ  Ｓ２８８ＣのＴＥＶ切断
ＤＷ６１４株については上記のとおりである。Ｅｔｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．のＴｕｒｂｏＴＥＶプロテアーゼにより消化を実施した。１０μｇの精製タンパク質当たり１ユニットのＴｕｒｂｏＴＥＶを使用した。消化は４℃で一晩行った。試料をＮｉ緩衝液で平衡化させた他のＮｉカラムに素通りさせ、未切断の酵素、タグ、ＴｕｒｂｏＴＥＶプロテアーゼ（同様にタグ付加されている）、及び不純物を除去した。Ｎｉカラムを素通りさせ、洗浄液をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮＵＰＡＧＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い解析し、及びＤＭＡＰＰ活性を解析した。高純度の酵素を含油している試料をプールし、１ｍＭ  ＤＴＴを含有している５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．４）緩衝液で脱塩し、−８０℃で保存した。
【０２４１】
結晶構造の決定
コンストラクトＤＷ６１４を記載の通りに生成し、次に、可能性のある結晶化条件を検討するためにタンパク質濃縮液を調製した。コンストラクトを精製し、以下に記載の通りに別個に結晶化条件を検討した。最小限に、市販のスクリーニングキット：Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（Ａｌｉｓｏ  Ｖｉｅｊｏ、ＣＡ）のＣｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ及びＱｉａｇｅｎ社（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）のＪＣＳＧ＋Ｓｕｉｔｅを用い、コンストラクトを調査した。
【０２４２】
Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のＣｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ及びＱｉａｇｅｎ社のＪＣＳＧ＋Ｓｕｉｔｅを用い、最初の結晶化スクリーニングを設定した。数多くの条件でこのコンストラクトから結晶の生成が観察された；条件の最適化には、ｐＨ、沈殿剤、及び濃度の５０通りもの調節が包含された。最適化実験により、回折用に５種の異なるＤＷ６１４結晶を選別した。ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）Ａ３Ｔ  Ｓ２８８Ｃからなる結晶により、２．５Åの回折が得られた。この大型の棒状結晶は正方晶系空間群Ｐ４３２１２に属し、単位胞の寸法はａ＝ｂ＝１５６．８４，ｃ＝１４３．４１を有した。２μＬのタンパク質（９ｍｇ／ｍＬタンパク質）を２μＬ沈殿溶液［０．２Ｍマロン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．０）μＬ、８％（重量／体積）ポリエチレングリコール８０００］と混合し、５００μＬ沈殿剤に対し平衡化させ、結晶を成長させた。液体窒素による結晶の急速凍結前に、結晶は０．２Ｍマロン酸（ｐＨ  ７．０）、８％（重量／体積）ポリエチレングリコール８０００、及び２５％（重量／体積）エチレングリコールに通し、凍結保護した。
【０２４３】
短波長異常分散データ（Single-wavelength anomalous dispersion data：（ＳＡＤ））を回収し、セリンからシステインへの置換が存在することを検証した。Ｍｏｓｆｌｍ（Ｌｅｓｌｉｅ，Ａ．（１９９８）Ｊ．ｏｆ  Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ３０，１０３６〜１０４０）によりデータを統合し、ＳＣＡＬＡ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎ．（１９９４）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ  ５０，７６０〜７６３）によりスケーリングした。開始モデルとしてウラジロハコヤナギ（P. alba）由来のイソプレン合成酵素の構造を予め決定して使用し、このデータをＭＯＬＲＥＰ（Ｖａｇｉｎ，Ａ．，ａｎｄ  Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ，Ａ．（１９９７）Ｊ．ｏｆ  Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ３０，１０２２〜１０２５）に用いた（米国特許第２００９／００７６７４３号）。結晶は、溶媒含量６３％で、単位が非対称の二量体を１つ含有していた。Ｐｈａｓｅｒ  ＥＰ（Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．，ａｎｄ  ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．（２０１１）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ  ６７，３３８〜３４４）を使用し、ＳＡＤデータを使用した。得られる異常分散マップは、明らかに、第２８８番目の残基としてシステインが存在していることを示す（図１９）。
【０２４４】
結晶をスタンフォード・シンクロトロン放射光研究所に送付し、ビームライン１１〜１でデータを回収し、解像度１．９８Åの回折像をÅ得た。データを上記の通りに加工し、モデルの微調整に使用した。可視化プログラムのＣｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ  ６６，４８６〜５０１）を用い、マニュアルで再構築を繰り返す工程では、Ｒｅｆｍａｃ５（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎ．（１９９４）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ  ５０，７６０〜７６３）により微調整を行った。微調整時に、Ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙを使用し、タンパク質の幾何学を確認した（Ｄａｖｉｓ，Ｉ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３５：Ｗ３７５〜Ｗ３８３）。現行モデルではＲＷｏｒｋ値は１７．８％であり、ＲＦｒｅｅ値は２０．９％である。
【０２４５】
構造は、非対称性ユニットのホモ２量体から構成される（図２０）。各モノマーは２つのらせん状のドメイン、活性部位を含むＣ末端ドメイン、及び機能未知のＮ端末ドメインから構成される。野生型ＩｓｐＳ及びＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）Ａ３Ｔ  Ｓ２８８Ｃの構造アラインメントにより、最終的な折りたたみは変わらないものの、変異体は野生型の構造に干渉するいくつかの残基を含有していることが示される（図２１）。セリンのシステインにより置き換えでは、局所構造への障害は何ら生じない（図２２）、座標を付属書Ａに掲載する。
【０２４６】
実施例５．ウラジロハコヤナギ（P. alba）及びヤナギ（Salix spp.）ＩｓｐＳ酵素間の差異
アミノ酸は、ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）及びヤナギ（Salix spp.）間で異なる。ＩｓｐＳ酵素は表１２に掲載する。各アミノ酸置換に関する電荷変化、並びにＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）の結晶構造における各残基の表面接近性（％）を表１２に示す。表面接近性は、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．により作成及び支援されるプログラムＭＯＥを使用し算出した。特定の半径を有するプローブを使用し、各残基に関し、水が接近可能な表面積を推定した。次に、推定データをペプチドライブラリと比較し、これらのデータ間の比を表面接近性（％）として記録した。ウラジロハコヤナギ（P. alba）の配列と異なっているサリックス・アルバ（S. alba）の配列部位を図２５に示す。ウラジロハコヤナギ（P. alba）の配列と異なっているサリックス・ベイロニカ（S. baylonica）の配列部位を図２６に示す。
【０２４７】
表１２．ウラジロハコヤナギ（P. alba）及びヤナギ（Salix spp.）イソプレン
合成酵素酵素ウラジロハコヤナギ（P. alba）ＭＥＡ結晶構造における各位置の
電荷変化及び表面接近性を示す。
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【０２４８】
（表１２の続き）
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【０２４９】
本発明の範囲及び精神から逸脱せずとも、本発明に記載の方法及び系の様々な修正及び改変が、当業者には明白であろう。本発明は、特定の実施形態に関連付けて記載したが、本発明は、特定の好ましい実施形態に不当に制限されるよう請求されるものではないことは明白である。実際に、本発明の実施に関し記載される態様に関し、関連技術分野に属する当業者に明白である様々な修正が、以降の特許請求の範囲内にあるものとして意図される。
【０２５０】
付属書類Ａ
ウラジロハコヤナギ（P. alba）３Ｔ２８８Ｃ座標
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【０２５１】
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【０２５２】
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【０２５３】
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【０２５４】
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【０２５５】
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【０２５６】
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【０２５７】
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【０２５８】
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【０２５９】
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【０２６０】
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【０２６１】
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【０２６２】
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【０２６３】
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【０２６４】
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【０２６５】
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【０２６６】
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【０２６７】
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【０２６８】
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【０２６９】
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【０２７０】
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【０２７１】
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【０２７２】
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【０２７３】
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【０２７４】
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【０２７５】
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【０２７６】
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【０２７７】
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【０２７８】
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【０２７９】
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【０２８０】
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【０２８１】
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【０２８２】
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【０２８３】
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【０２８４】
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【０２８５】
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【０２８６】
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【０２８７】
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【０２８８】
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【０２８９】
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【０２９０】
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【０２９１】
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【０２９２】
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【０２９３】
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【０２９４】
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【０２９５】
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【０２９６】
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【０２９７】
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【０２９８】
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【０２９９】
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【０３００】
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【０３０１】
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【０３０２】
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【０３０３】
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【０３０４】
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【０３０５】
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【０３０６】
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【０３０７】
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【０３０８】
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【０３０９】
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【０３１０】
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【０３１１】
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【０３１２】
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【０３１３】
2015503904.tif 000122
【０３１４】
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【０３１５】
2015503904.tif 000124
【０３１６】
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【０３１７】
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【０３１８】
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【０３１９】
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【０３２０】
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【０３２１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2015503904.tif 000152
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
2015503904000001.app
【国際調査報告】
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2015503904.tif 000158
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