(57)【要約】本発明は、髄膜炎菌ワクチンを分析するためにＥＬＩＳＡもしくは類似のアッセイを使用する。上記アッセイは、上記ワクチン内の髄膜炎菌タンパク質に結合する抗体、および特に、髄膜炎菌に対して殺菌性であり、そして／または上記髄膜炎菌タンパク質内のコンフォメーション性エピトープを認識するモノクローナル抗体を使用する。試験ワクチンの一連の希釈物に対して上記アッセイを行うことによって、およびその結果と、既知の有効性の参照ワクチンを使用して得られるものとを比較することによって、上記試験ワクチンの相対的有効性を決定することが可能である。この値は、ワクチンの製造されたバッチが公に発売されるのに適しているのか、または製造失敗を経たので、使用される得べきではないのかを決定するためのパラメーターとして使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
髄膜炎菌ワクチンサンプルのインビトロ分析のための結合アッセイであって、該アッセイは、（ｉ）該サンプル内の髄膜炎菌タンパク質免疫原を、（ａ）髄膜炎菌に対して殺菌性であるか、または（ｂ）髄膜炎菌抗原中のコンフォメーション性エピトープを認識するモノクローナル抗体と相互作用させる工程；次いで、（ｉｉ）工程（ｉ）からの該免疫原と抗体との間の相互作用を測定する工程、を包含する、アッセイ。
【請求項２】
前記工程（ｉｉ）における測定は、前記ワクチンサンプル内の前記モノクローナル抗体の標的エピトープの濃度を定量的に示す、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記結合アッセイは、競合ＥＬＩＳＡである、上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項４】
工程（ｉ）は、前記モノクローナル抗体と前記サンプル中の免疫原との間で複合体が形成し得るように、該抗体とともに該サンプルをインキュベートする工程であって：これら複合体は、競合抗原が固定化される容器に添加され、ここで該競合抗原は、該モノクローナル抗体に結合し得る、工程；そして次いで、工程（ｉｉ）において、該競合抗原に結合する該モノクローナル抗体の量を決定する工程を包含する、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項５】
工程（ｉｉ）は、酵素で標識された二次抗体を使用する、上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項６】
マイクロウェルプレートの中で起こる、上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記ワクチンは、髄膜炎菌のＮＨＢＡ、ｆＨｂｐおよび／もしくはＮａｄＡ抗原を含み、工程（ｉ）において使用される前記モノクローナル抗体は、髄膜炎菌のＮＨＢＡ、ｆＨｂｐもしくはＮａｄＡ抗原を認識する、上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記ワクチンは、１より多くの髄膜炎菌免疫原を含む、上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項９】
前記ワクチンは、髄膜炎菌小胞を含む、上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記ワクチンは、吸着された髄膜炎菌免疫原を含む、上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１１】
工程（ｉ）において単一のモノクローナル抗体を使用する、上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１２】
工程（ｉ）においてマウスモノクローナルＩｇＧ抗体を使用する、上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１３】
髄膜炎菌試験ワクチンサンプルのインビトロ分析のための方法であって、該方法は、（ｉ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアッセイを、該試験サンプルに対して、および必要に応じて、該試験サンプルの少なくとも１つの希釈物に対して行う工程；（ｉｉ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアッセイを、既知のインビボ有効性の標準ワクチンサンプルに対して、および必要に応じて、該標準ワクチンサンプルの少なくとも１つの希釈物に対して行う工程；ならびに（ｉｉｉ）工程（ｉ）からの結果と工程（ｉｉ）からの結果とを比較して、該標準ワクチン中の免疫原の有効性に対して、該試験ワクチン中の免疫原の有効性を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項１４】
ワクチンのバッチを分析するためのプロセスであって、該プロセスは、（ｉ）請求項１３に記載の方法によって該バッチから少なくとも１つのワクチン中の免疫原の相対的有効性をアッセイする工程；および工程（ｉ）の結果が受容可能な相対的有効性を示す場合、（ｉｉ）インビボでの使用のために該バッチからさらなるワクチンを配布する工程を包含する、プロセス。
【請求項１５】
髄膜炎菌ワクチンサンプルのインビトロ分析のための競合ＥＬＩＳＡアッセイであって、ここで該アッセイは、（ｉ）溶液相の抗ワクチンモノクローナル抗体、（ｉｉ）該抗ワクチン抗体によって認識される固定化された抗原、および（ｉｉｉ）該抗ワクチン抗体に結合する標識された抗体、を使用し、ここで該抗体は、（ａ）髄膜炎菌に対して殺菌性であるか、または（ｂ）該髄膜炎菌抗原中のコンフォメーション性エピトープを認識する、競合ＥＬＩＳＡアッセイ。
【請求項１６】
髄膜炎菌ワクチンサンプルのインビトロ分析のための結合アッセイであって、ここで該アッセイは、ワクチン中の免疫原を使用して、コントロール抗原へのモノクローナル抗体の結合を阻害し、ここで該モノクローナル抗体は、該ワクチン中の免疫原および該コントロール抗原の両方に結合する、結合アッセイ。
【請求項１７】
上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイの使用に続いて配布されたワクチン。
【請求項１８】
（ａ）可変領域が配列番号２１および配列番号２２を含むモノクローナル抗体；（ｂ）可変領域が配列番号２３および配列番号２４を含むモノクローナル抗体；（ｃ）可変領域が配列番号２５および配列番号２６を含むモノクローナル抗体；（ｄ）可変領域が配列番号２７および配列番号２８を含むモノクローナル抗体から選択される、髄膜炎菌ｆＨｂｐを認識するモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国仮出願第６１／６０８，２９３号（２０１２年３月８日に出願）の利益を主張する。上記仮出願の完全な内容は、全ての目的のために参考として本明細書に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）から防御するためのタンパク質含有ワクチンの有効性を評価するためのインビトロアッセイの分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
インビトロ力価測定によって定量される生ワクチンとは異なり、不活化ワクチンもしくはサブユニットワクチンの有効性は、通常、公の使用のためのその配布（ｒｅｌｅａｓｅ）前に各バッチに対するインビボ試験を要する［１］が、多くの例外が存在する（例えば、インフルエンザワクチンについてはＳＲＩＤ（一元放射免疫拡散法）有効性試験およびＢ型肝炎ワクチンについてはＥＬＩＳＡの使用）。
【０００４】
代表的なインビボ試験は、実験モデルとして小型齧歯類（マウスもしくはラット）を使用する免疫化−チャレンジ試験を含む。ワクチンのタイプに依存して、種々のエンドポイントが使用される（例えば、死亡／生存率（全細胞百日咳、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイド、狂犬病ワクチン）、臨床徴候（ジフテリア、破傷風）、もしくはコロニー形成（全細胞および無細胞百日咳））。既知の有効性を有する標準調製物と並行して用量応答曲線を確立することによって、上記ワクチンの有効性は、その調製物と比較して（例えば、標準的な単位で）表され得る。
【０００５】
チャレンジモデルは、常に利用可能であるわけではない。それらの場合、有効性試験は、通常、血清学的応答に制限され、抗体応答は、試験動物の免疫化後に測定される。これら抗体の機能性のうちの少なくとも一部は、病原体をインビトロで中和するそれらの能力によって、または補体の存在下で細菌を死滅させるそれらの能力（例えば、髄膜炎菌に関しては血清殺菌性抗体アッセイ、もしくはＳＢＡ）に対して決定され得る。
【０００６】
上記ＳＢＡアッセイは有用であるが煩わしく、多くのマウスの犠牲を要する。参考文献１で説明されるように、従って、ワクチン有効性を評価するためのインビトロでの代替手段を提供することは望ましい。
【０００７】
ＭｅｎＢワクチンを分析するための１つのインビトロアッセイは、参考文献２および３で開示される「ＭＡＴＳ」  ＥＬＩＳＡ試験である。ＭＡＴＳによって測定される相対的有効性は、ＭｅｎＢ株がＳＢＡにおいて死滅させられ得ることと相関することが示された。
【０００８】
上記ＭＡＴＳ試験は、上記ワクチンの免疫原性を分析するというよりもむしろ、ＭｅｎＢワクチンの株適用範囲を評価するために使用され得る。髄膜炎菌ワクチンの免疫原性を評価するためのさらなるかつ改善されたインビトロアッセイが未だ必要である。このようなインビトロアッセイは、特定のワクチンが、ヒトレシピエントでの予測されるインビボ活性を有することを確認するために使用され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／００３５２３４号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｅｔｚら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００２）２０：２４１１〜３０
【非特許文献２】Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（２０１０）１０７：１９４９０〜５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の開示）
本発明は、髄膜炎菌ワクチンを分析するために結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用する。上記アッセイは、上記ワクチン内の髄膜炎菌タンパク質に結合する抗体、および特に、髄膜炎菌に対して殺菌性であり、そして／または上記髄膜炎菌タンパク質内のコンフォメーション性エピトープを認識するモノクローナル抗体を使用する。試験ワクチンの一連の希釈物に対して上記アッセイを行うことによって、およびその結果と、既知の有効性の標準ワクチンもしくは参照ワクチンを使用して得られるものとを比較することによって、上記試験ワクチンの相対的有効性を決定することは可能である。この値は、ワクチンの製造されたバッチが、公への配布に適しているか、またはそれが生産失敗を経たので使用されるべきではないかを決定するためのパラメーターとして使用され得る。本発明のアッセイは、複数の種々の抗原を含み、そして／または吸着した抗原を含むワクチンを分析するために特に有用である。
【００１２】
従って、本発明は、髄膜炎菌ワクチンサンプルのインビトロ分析のための結合アッセイを提供し、上記結合アッセイは、（ｉ）上記サンプル内の髄膜炎菌タンパク質免疫原を、（ａ）髄膜炎菌に対して殺菌性であるか、または（ｂ）上記髄膜炎菌抗原中のコンフォメーション性エピトープを認識するモノクローナル抗体と相互作用させる工程；次いで、（ｉｉ）工程（ｉ）からの上記免疫原と抗体との間の相互作用を測定する工程を包含する。
【００１３】
本発明はまた、髄膜炎菌試験ワクチンサンプルのインビトロ分析のためのアッセイを提供し、上記アッセイは、（ｉ）上記結合アッセイを、上記サンプルに対して、および必要に応じて、上記試験サンプルの少なくとも１つの希釈物に対して行う工程；（ｉｉ）上記結合アッセイを標準ワクチンサンプルに対して、および必要に応じて、上記標準ワクチンサンプルの少なくとも１つの希釈物に対して行う工程；ならびに（ｉｉｉ）工程（ｉ）からの結果と工程（ｉｉ）からの結果とを比較して、上記標準ワクチン中の免疫原の有効性に対して、上記試験ワクチン中の免疫原の有効性を決定する工程を包含する。
【００１４】
本発明はまた、バルクワクチンを分析するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ｉ）上記で記載されるとおりのバルク中の免疫原の相対的有効性をアッセイする工程；および工程（ｉ）の結果が受容可能な相対的有効性を示す場合、（ｉｉ）上記バルクからワクチンの単位用量を調製する工程を包含する。
【００１５】
本発明はまた、ワクチンのバッチを分析するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ｉ）上記に記載されるとおりのバッチに由来する少なくとも１つのワクチン中の免疫原の相対的有効性をアッセイする工程；および工程（ｉ）の結果が受容可能な相対的有効性を示す場合、（ｉｉ）インビボでの使用のために上記バッチからさらなるワクチンを配布する工程を包含する。
【００１６】
本発明はまた、髄膜炎菌ワクチンサンプルのインビトロ分析のための競合ＥＬＩＳＡアッセイを提供し、ここで上記アッセイは、（ｉ）溶液相の抗ワクチンモノクローナル抗体、（ｉｉ）上記抗ワクチン抗体によって認識される固定化抗原、および（ｉｉｉ）上記抗ワクチン抗体に結合する標識された抗体を使用し、ここで上記抗体は、髄膜炎菌に対して殺菌性であるか、または（ｂ）上記髄膜炎菌抗原中のコンフォメーション性エピトープを認識するかのいずれかである。
【００１７】
本発明はまた、髄膜炎菌ワクチンサンプルのインビトロ分析のための結合アッセイを提供し、上記アッセイは、ワクチン中の免疫原を使用して、コントロール抗原へのモノクローナル抗体の結合を阻害する。ここで上記モノクローナル抗体は、上記ワクチン中の免疫原および上記コントロール抗原の両方に結合する。
【００１８】
本発明はまた、本明細書で記載されるとおりのアッセイの使用後に配布されたワクチンを提供する。
【００１９】
本発明はまた、本発明のアッセイを行うためのキットを提供する。このキットは、例えば、マイクロウェルプレート、ウェルに固定化された抗原を含むマイクロウェルプレート、希釈緩衝液、および／もしくは抗免疫原抗体を含み得る。
【００２０】
（結合アッセイおよびＥＬＩＳＡフォーマット）
本発明は、結合イムノアッセイを使用する。代表的には、これは、当該分野で周知であるとおりの酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。本発明は、任意のＥＬＩＳＡフォーマット（直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、および競合ＥＬＩＳＡとして従来から公知のものを含む）を使用し得る。
【００２１】
本発明のＥＬＩＳＡアッセイの工程（ｉ）は、上記サンプル内の髄膜炎菌タンパク質免疫原を、モノクローナル抗体と相互作用させる工程を包含する。この相互作用の特徴（例えば、均質もしくは不均質）は、選択されたＥＬＩＳＡフォーマットによって変化する。次いで、上記モノクローナル抗体と上記免疫原との間の相互作用は、工程（ｉｉ）で検出される。ＥＬＩＳＡに関して代表的であるように、上記相互作用は、定量的に測定され得る。その結果工程（ｉｉ）は、上記ワクチンサンプル内の、上記モノクローナル抗体の標的エピトープの濃度を示す結果を提供する。殺菌性もしくはコンフォメーション性エピトープに結合するモノクローナル抗体を使用することによって、工程（ｉｉ）の結果は、上記ワクチンサンプル中の対応する機能的エピトープの濃度を示し、関連エピトープ（および機能）を保持している免疫原と、上記エピトープを失ったもの（例えば、貯蔵の間のもしくは誤った取り扱いによる、変性、凝集もしくは分解に起因する）とを区別し得る。既知の有効性の標準ワクチンで得られた値と比較することによって、工程（ｉｉ）の結果は、試験ワクチンの相対的有効性を計算するために使用され得る。
【００２２】
本発明での使用に好ましいＥＬＩＳＡフォーマットは、競合ＥＬＩＳＡ（図５）である。このフォーマットにおいて、上記ワクチンサンプルは、上記モノクローナル抗体（一次抗体）と上記サンプル中の免疫原との間で複合体が形成し得るように、上記抗体とともにインキュベートされる。次いで、これら複合体は、競合抗原が固定化される容器に添加される。上記ワクチンサンプル由来の免疫原と複合体形成されない抗体は、これら固定化された競合抗原に結合し得る；上記サンプルが上記抗体に対する多くの標的を含む場合、上記固定化された競合抗原に結合する複合体化していない抗体は少ないのに対して、上記サンプル中の標的が少ない（免疫原が少量（例えば、希釈後に）なのか、または上記抗体のエピトープが喪失された（例えば、免疫原の変性後に）のかに拘わらず）と、より多くの複合体化されない抗体がもたらされる。上記固定化された競合抗原に結合される抗体（通常の洗浄工程の後など）は、次いで、上記モノクローナル抗ワクチン（すなわち、一次）抗体に結合する標識二次抗体を添加することによって検出され得る。上記標識は、通常の方法で固定化された一次抗体の量を定量するために使用される。競合ＥＬＩＳＡの使用は、同じ免疫原上の異なるエピトープを認識する２種の異なる抗免疫源抗体を有する必要性を回避し、そしてまた、複数の異なる免疫原成分を含むワクチンにおいてより良好な結果を与え得る。それはまた、試験する前にいかなる操作をも要することなく、上記試験ワクチンを直接分析することを可能にする（しかし、このような操作は、所望であれば行われ得る）。
【００２３】
固定化に適した競合抗原としては、上記ワクチンに存在する髄膜炎菌タンパク質、またはこれらワクチンタンパク質を含むタンパク質（例えば、融合タンパク質）、または上記ワクチンタンパク質のフラグメントを含むタンパク質（例えば、短縮型形態）が挙げられる。上記固定化された競合抗原は、上記抗体への結合に関して上記ワクチンの免疫原と競合し得るように、上記関連モノクローナル抗体によって認識されるエピトープを保持しなければならない。代表的には、これは、バルクワクチンの新鮮なバッチから、または好ましくは、バルクワクチンの調製前のバルク精製免疫原の新鮮なバッチからの抗原を固定化することによって達成され得る。
【００２４】
ＥＬＩＳＡにおける抗体の標識は、種々の形態をとり得る。好ましい競合フォーマットにおいて、上記二次抗体は標識されている。ＥＬＩＳＡにおいて、上記抗体は、酵素で標識され、次いで、これは、その生成物が容易に検出可能である反応を触媒するために使用される。上記結合した酵素は、酵素基質に検出可能な変化を引き起こし得、それは、例えば、色の変化を引き起こす様式で基質を改変するために固定化されるようになった後、上記標識された抗体に添加される。例えば、上記酵素は、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＨＲＰ）、もしくはホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ、ＡＰ）であり得る。他の酵素もまた使用され得る（例えば、ラッカーゼ、β−ガラクトシダーゼなど）。
【００２５】
基質の選択は、結合される酵素の選択に依存する。さらに、基質は、コスト、使用しやすさ、感度（すなわち、検出下限）および入手可能な画像化装置との適合性の点で異なる。これらパラメーターは、ＥＬＩＳＡに熟練した者が精通している。好ましい基質は、結合した酵素と接触した場合に、比色上の変化、化学発光の変化、もしくは化学蛍光の変化を受ける。比色基質（およびそれらの酵素パートナー）としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＰＮＰＰもしくはｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＡＰ）；ＡＢＴＳもしくは２，２’−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸］（ＨＲＰ）；ＯＰＤもしくはｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＨＲＰ）；およびＴＭＢもしくは３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＨＲＰ）。化学発光基質としては、ルミノールもしくは５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン（ＨＲＰ）（特に、改変フェノール（例えば、ｐ−ヨードフェノール）の存在下で）が挙げられる。化学蛍光基質としては、ｐ−ヒドロキシヒドロケイ皮酸（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｈｙｄｒｏｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）が挙げられる。種々の特許権を持った基質もまた、利用可能であり、これらは、所望であれば、本発明で使用され得る（例えば、ＱｕａｎｔａＢｌｕ、ＱｕａｎｔａＲｅｄ、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ、Ｔｕｒｂｏ  ＴＭＢなど）。
【００２６】
ＥＬＩＳＡ試薬が固体表面に固定化される場合、この表面は、種々の形態をとる。通常、上記試薬は、プラスチック表面（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、もしくはシクロオレフィンから作製される表面）上に固定化される。上記プラスチックは、特に、色素生成性の酵素基質を使用する場合、通常、透明かつ無色である。白色もしくは黒色のプラスチックは、当該分野で公知であるように、発光基質もしくは蛍光基質を使用する場合に好ましいと思われる。上記プラスチックは、一般に、ＥＬＩＳＡに関して当該分野で公知であるとおりのマイクロウェルプレート（マイクロタイタープレート）（複数の個々の反応ウェルを有する平らなプレート）の形態で使用される。このようなプレートとしては、通常は、２：３の矩形行列で配置された、６個、２４個、９６個、もしくは３８４個のサンプルウェルを有するものが挙げられる。マイクロウェルプレートは、希釈系列の調製、および空間的関係を維持しながら、例えば、抗体およびワクチンの混合物を、上記抗体とワクチンとの間の相互作用を測定するために異なるマイクロウェルプレートへと移す工程において、物質をあるプレートから別のプレートへと移すこともまた容易にする。
【００２７】
ＥＬＩＳＡの間に、ブロッキング試薬および／もしくは洗剤を、例えば、上記アッセイの結果をゆがめ得る非特異的結合相互作用を低下させるために添加することは、望ましいことであり得る。ブロッキング手順は、ＥＬＩＳＡ分野で研究している者が精通している。
【００２８】
上記で考察されるＥＬＩＳＡフォーマットに加えて、本発明は、ＥＬＩＳＡの任意の適切な改変版（例えば、Ｍ＆Ｐ  ＥＬＩＳＡもしくはＥＬＩＳＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ［４］、参考文献５の迅速ＥＬＩＳＡなど）を使用し得、そしてまた、ＥＬＩＳＡの代替手段（例えば、フローインジェクションイムノアフィニティー分析（ＦＩＩＡＡ）、ＡｌｐｈａＬＩＳＡもしくはＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ［６］、解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＤＥＬＦＩＡ））、ＥＬＡＳＴ、ＢＩＯ−ＰＬＥＸ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＭＳＤなど）を使用するために拡げられ得る。これら結合アッセイのいずれも使用され得る。
【００２９】
標識として結合体化酵素を使用する代替手段として、他の標識化が可能である。例えば、他の間接標識（すなわち、酵素の代替手段）が使用され得るが、上記抗体を、直接標識（例えば、着色粒子、電気化学的に活性な試薬、レドックス試薬、放射活性同位体、蛍光標識もしくは発光標識）への結合体化によって標識することもまた、可能である。
【００３０】
さらなる代替手段として、上記一次抗体は、高親和性タグ（例えば、ビオチン、アビジンもしくはストレプトアビジン）に結合体化され得る。上記タグ（例えば、アビジン、ストレプトアビジンもしくはビオチン）のリガンドに結合体化された酵素は、次いで、固定化された一次抗体を検出するために使用され得る。
【００３１】
これらバリエーションのうちのいずれかは、発明全体の範囲および趣旨内で使用され得る。
【００３２】
いくつかのＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、二次抗体を標識する以外に、上記抗ワクチンモノクローナル抗体（殺菌性抗体であるか、またはコンフォメーション性エピトープを認識するものであるかに関わらず）は、標識される。従って、本発明は、髄膜炎菌タンパク質（例えば、本明細書で開示されるように、ＮＨＢＡなど）に免疫特異的に結合しかつ酵素（例えば、ＡＰもしくはＨＲＰ）に結合体化されるモノクローナル抗体を提供する。免疫特異的結合は、非特異的結合とは対照的であり得、このように、本発明の抗体は、無関係のコントロールタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）に対してより髄膜炎菌標的タンパク質に対して高い親和性（例えば、少なくとも１００倍高い親和性）を有する。
【００３３】
（ワクチンサンプル）
本発明のアッセイは、ワクチンを分析するために使用される。上記アッセイは、上記ワクチンのうちの少なくとも１つのサンプルに対して行われ、この分析は、上記サンプル採取したワクチンについての情報を明らかにする。上記アッセイは、バルクワクチンから採取されたサンプルに対して行われ、ここで上記アッセイの結果は、そのバルクの最終結果、例えば、さらなる製造用途に（例えば、ワクチンのパッケージされた用量を調製することに）適切であるか、またはそれが代わりに改変もしくは廃棄されるべきかを決定するために使用され得る。上記アッセイはまた、ワクチンのバッチから採取されたサンプルに対して行われ得、その場合、上記アッセイの結果は、そのバッチの最終結果（例えば、上記バッチが、ヘルスケア専門家による使用のために配布するために適しているか）を決定するために使用され得る。通常、十分なサンプルが、ワクチン配布アッセイに関して通常である統計実施でのコンプライアンスを確実にするために、バルク／バッチから採取される。公に配布される形態にある（処方され、パッケージされた）最終ワクチンのバッチの試験は、最も有用である。
【００３４】
上記ワクチンサンプルは、完全な強度で、すなわち、それが上記バルクもしくはバッチから採取される形態において分析され得る。しかし、いくらかの場合、完全な強度の何分の１かで（例えば、希釈後に）上記ワクチンを分析することは有用である。最も有用なアッセイは、一連の強度を分析し、そのうちの最も強いものは、完全な強度のサンプルであってもよいし、何分の１かの強度であってもよい。希釈は、代表的には、淡水よりむしろ緩衝液を使用して達成される。このような緩衝液は、ときおり、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０）を含み得る。
【００３５】
上記ワクチンの一連の希釈物を分析することは有用である。例えば、連続の１：２、１：５もしくは１：１０（容積で）の希釈が使用され得る。上記希釈系列は、少なくとも２つのメンバーを含むが、通常は、より多くのメンバー、例えば、５、１０、もしくはより多くのメンバーを含む。例えば、１：２での９連続希釈は、最も強度の高いサンプルに対して、１：２０、１：２１、１：２２、…、１：２９、および１：２１０倍強度の１０サンプルを与える。上記希釈系列は、希釈物に対してプロットされ得る（文字通りもしくは概念的に）一連の測定値を提供するために、本発明のアッセイを使用して試験され得る。この一連の測定値は、以下に記載されるように、上記ワクチンの相対的有効性を評価するために使用され得る。上記ワクチンは、少なくとも１種の髄膜炎菌タンパク質免疫原、すなわち、ヒトに投与される場合、殺菌性の免疫応答を誘発するタンパク質を含む。種々のこのようなタンパク質は、当該分野で公知であり、ＢＥＸＳＥＲＯＴＭ製品［７，８］において見いだされるようなＮＨＢＡ、ｆＨｂｐおよびＮａｄＡが挙げられるが、これらに限定されない。分析され得るさらなるタンパク質免疫原は、ＨｍｂＲ、ＮｓｐＡ、ＮｈｈＡ、Ａｐｐ、Ｏｍｐ８５、ＴｂｐＡ、ＴｂｐＢ、およびＣｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼである。ワクチンは、これら種々の抗原のうちの１種以上を含み得る。例えば、上記ワクチンは、ＮＨＢＡ、ｆＨｂｐおよびＮａｄＡの各々を含み得る。それはまた、単一の抗原の改変形態を含み得る。例えば、それは、各異なる改変体を別個に認識するために異なるモノクローナル抗ａｎｔｉ−ｆＨｂｐ抗体を使用する、髄膜炎菌ｆＨｂｐの１種より多くの改変体（すなわち、異なる配列を有する２種のｆＨｂｐタンパク質［９］）を含み得る。
【００３６】
上記ワクチンは、髄膜炎菌小胞、すなわち、髄膜炎菌外膜由来の抗原を保持する髄膜炎菌外膜から小胞を形成するために、上記外膜の破壊もしくはブレブ形成によって得られる任意のプロテオリポソーム小胞を含み得る。従って、この用語は、例えば、ＯＭＶ（ときおり、「ブレブ」といわれる）、微小胞（ＭＶ）および「ネイティブＯＭＶ」（「ＮＯＭＶ」）を含む。種々のこのような小胞は、当該分野で公知であり（例えば、参考文献１０〜２４を参照のこと）、これらのうちのいずれかは、本発明によって分析される予定のワクチン内に含まれ得る。しかし、いくつかの実施形態において、上記ワクチンは、小胞を含まない。ワクチンが小胞を含まない場合、競合ＥＬＩＳＡフォーマットを使用することは好ましい。なぜならこれは、複数の成分を含むサンプルにおいてよりよい結果を与える傾向にあるからである。
【００３７】
分析されたワクチンは、好ましくは、血清群Ｂの髄膜炎菌に対して防御する、ヒトにおける免疫応答を誘発し得る。例えば、上記ワクチンは、広く入手可能であり（例えば、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−３３５）、参考文献２５において配列決定された株であったプロトタイプ血清群Ｂ株（例えば、ＭＣ５８）に対して少なくとも防御性である免疫応答を誘発し得る。他の株はまた、ワクチン効力に関して試験され得る［２］が、ＭＣ５８に対する応答は、容易に試験される。
【００３８】
本発明に従って分析され得る好ましいワクチンは、ＢＥＸＳＥＲＯＴＭ［７］である。このワクチンは、アミノ酸配列、配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなる３種の異なる組換えタンパク質を含む。それはまた、ＮＺ９８／２５４外膜小胞を含む。
【００３９】
髄膜炎菌タンパク質免疫原に加えて、ワクチンは、他の免疫原を含み得る。これらは、髄膜炎菌由来の非タンパク質免疫原および／または他の細菌由来の免疫原および／または非細菌性病原体（例えば、ウイルス）由来の免疫原であり得る。従って、例えば、分析されるワクチンは、以下を含み得る：（ａ）ＭＥＮＶＥＯ、ＭＥＮＡＣＴＲＡ、およびＮＩＭＥＮＲＩＸ製品（すべて結合体化莢膜サッカリドを含む）にあるような、髄膜炎菌に由来する（例えば、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／もしくはＹに由来する）１種以上の莢膜サッカリド；（ｂ）ＰＲＥＶＮＡＲおよびＳＹＮＦＬＯＲＩＸ製品にあるような、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する抗原（例えば、サッカリド（代表的には、結合体化される）；（ｃ）Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、表面抗原ＨＢｓＡｇ）；（ｄ）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（例えば、百日咳ホロ毒素（ＰＴ）およびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）（必要に応じて、パータクチンならびに／もしくは凝集原２および３と組み合わせても））；（ｅ）ジフテリア抗原（例えば、ジフテリアトキソイド）；（ｆ）破傷風抗原（例えば、破傷風トキソイド）；（ｇ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ（Ｈｉｂ）由来のサッカリド抗原（代表的には、結合体化されている）；ならびに／あるいは（ｈ）不活化ポリオウイルス抗原。
【００４０】
上記ワクチンは、薬学的組成物であるので、その免疫原に加えて、代表的には、薬学的に受容可能なキャリアを含み、このようなキャリアの完全な考察は、参考文献２６で入手可能である。
【００４１】
分析されるワクチンのｐＨは、通常、６〜８の間であり、より好ましくは、６．５〜７．５の間（例えば、約７）である。分析されるワクチンの安定的なｐＨは、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、もしくはヒスチジン緩衝液）の使用によって維持され得る。従って、分析されるワクチンは、一般に、緩衝液を含む。
【００４２】
分析されるワクチンは、無菌であり得、かつ／もしくは発熱物質を含まなくてもよい。本発明の組成物は、ヒトに対して等張性であり得る。
【００４３】
分析されるワクチンは、免疫学的に有効な量の抗原、ならびに必要であれば、任意の他の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、個体へのその量の単一用量もしくはシリーズの一部としてのいずれかでの投与が、処置もしくは予防のために有効であることを意味する。この量は、処置される予定の個体の健康状態および身体状態、年齢、処置される予定の個体の分類グループ（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望される防御の程度、上記ワクチンの処方、処置している医師の医学的状況の評価、および他の関連因子に依存して変化する。上記量は、慣用的な治験を介して決定され得る比較的広い範囲に入ると予測される。本発明の組成物の抗原含有量は、一般に、１用量あたりのタンパク質の量に関して表される。免疫原１つあたり１０〜５００μｇ（例えば、５０μｇ）の用量が有用であり得る。
【００４４】
分析されるワクチンは、免疫学的アジュバントを含み得る。従って、例えば、それらは、アルミニウム塩のアジュバントもしくは水中油型エマルジョン（例えば、水中スクアレンエマルジョン）を含み得る。適切なアルミニウム塩としては、ヒドロキシド（例えば、オキシヒドロキシド）、ホスフェート（例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトホスフェート）（例えば、参考文献２７の第８章＆第９章を参照のこと）、またはこれらの混合物が挙げられる。上記塩は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質など）をとり得、上記塩への抗原の吸着は、好ましい。患者に投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは、５ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなど）である。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの間である。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。水酸化アルミニウムアジュバントは、髄膜炎菌ワクチンでの使用に特に適している。本発明は、上記ワクチン内のタンパク質免疫原の吸着にも拘わらず、有用な結果を与えることが示されており、脱着工程を必要とせずに、分析が可能である（すなわち、上記ワクチンの脱着予備処理なしに分析が行われ得る）。上記ワクチンが吸着した免疫原を含む場合、競合ＥＬＩＳＡフォーマットを使用することは、これがよりよい結果を与える傾向にあるので好ましい。
【００４５】
分析されるワクチンは、抗菌物質を、特に、複数用量フォーマットでパッケージされる場合に、含み得る。抗菌物質（例えば、チメロサールおよび２−フェノキシエタノール）は、ワクチン中に一般に見いだされるが、水銀を含まない保存剤もしくは保存剤を全く含まないかのいずれかを使用することは好ましい。
【００４６】
分析されるワクチンは、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（ポリソルベート）（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０））を含み得る。洗剤は、一般に、低レベル（例えば、＜０．０１％）で存在する。分析されるワクチンは、ＯＭＶ調製に由来する残留洗剤（例えば、デオキシコール酸塩）を含み得る。残留洗剤の量は、好ましくは、ＭｅｎＢタンパク質の１μｇごとに０．４μｇ未満（より好ましくは、０．２μｇ未満）である。
【００４７】
分析されるワクチンがＬＯＳを含む場合、ＬＯＳの量は、好ましくは、タンパク質１μｇごとに、０．１２μｇ未満（より好ましくは、０．０５μｇ未満）である。
【００４８】
分析されるワクチンは、張度を与えるために、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含み得る。１０±２ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣｌの濃度が代表的である（例えば、約９ｍｇ／ｍｌ）。
【００４９】
（標準ワクチン）
本発明のアッセイは、ワクチン中の機能的エピトープの量についての定量的情報を提供し得る。この量が既知の有効性のワクチン中の量と比較される場合、試験ワクチンの相対的有効性を計算することは可能である。従って、いくつかの実施形態において、上記分析されるワクチンは、インビボアッセイにおいて既知の有効性を有する標準ワクチンである（例えば、それは、既知のＳＢＡ力価を有する）。他の実施形態において、上記分析されるワクチンは、インビボアッセイにおいて既知の有効性を有しない試験ワクチンである。さらなる実施形態において、上記アッセイは、標準ワクチンおよび試験ワクチンの両方を分析するために使用され、上記試験ワクチンの分析結果は、上記標準ワクチンの分析と比較され、この比較は、上記標準ワクチンの既知の有効性に対して上記試験ワクチンの有効性を表すために使用される。
【００５０】
例えば、ＢＥＸＳＥＲＯＴＭの新たなバルク調製物の製造後、または製造したワクチンのバッチもしくはバルクの貯蔵後、上記バッチ／バルクの試験サンプルは、本発明のアッセイを使用して試験され得、その結果は、既知のインビボ有効性を有するＢＥＸＳＥＲＯＴＭで得られたものと比較され得る。この比較は、上記新たな／貯蔵された、バッチ／バルク（上記試験サンプル）が、なるべき程度に強力であるか否かを明らかにする。そうであれば、上記バッチ／バルクは、さらなる使用のために配布され得；そうでないならば、調査および／もしくは廃棄され得る。例えば、単位用量は、上記バルクから調製され得るか、または上記バッチは、公的分配および使用のために配布され得る。
【００５１】
相対的有効性を評価するために、種々の強度において上記試験ワクチンおよび上記標準ワクチンを分析することは有用である。上記で考察されるように、上記ワクチンの一連の希釈物が分析され得る。上記希釈系列は、希釈に対する結合アッセイ結果の曲線を（文字通りもしくは概念的に）提供するために、本発明のアッセイを使用して試験され得る。この曲線は、相対的有効性を決定するために、標準曲線（すなわち、同じ曲線であるが、上記標準ワクチンで得られている）と比較され得る。例えば、上記試験ワクチンおよび参照ワクチンの希釈の対数に対して結合力価の対数をプロットすることによって、２つの平行な回帰直線の間の水平距離は、相対的有効性を示す（水平分離なしは、１００％もしくは１．０という相対的有効性を示す）。
【００５２】
比較を単純化するために、上記試験ワクチンのために使用される希釈は、上記参照ワクチンのために使用されるもの（例えば、両方のワクチンについて一連の１：２、１：５、もしくは１：１０希釈）と同じであるべきである。
【００５３】
相対的有効性の試験は、上記アッセイの変動を決定するために複数回、例えば、単一のサンプルに対して複数回（二連、三連など）行われ得、そして／または同じバルク／バッチに由来する複数のサンプルに対して行われ得る。本発明は、有用なパラメーターとして、このような複数回のアッセイにおける変動（例えば、変動係数）を決定することを含み得る。そしていくつかの実施形態において、上記アッセイの結果は、受容可能な限界以内に（例えば、＜１５％）変動が入る場合のみ有用とみなされる。ときおり、試験が実験セッション内で行われるか（アッセイ内）もしくは異なる実験セッションで行われるか（アッセイ間）に依存して、より広い変動が許容される（例えば、＜２０％）。
【００５４】
ワクチンが複数の種々の免疫原を含む場合、これらのうちの各々の有効性は、理想的には、別個に試験される。次いで、これら結果は、全体として上記ワクチンサンプルの分析のために合わされ得るが、全体的な有効性の何らかの損失の具体的原因を同定することは、有用である。
【００５５】
（抗体）
本発明のアッセイは、上記分析されるワクチン内に存在するタンパク質免疫原を認識するモノクローナル抗体を使用する。本発明は、髄膜炎菌に対して殺菌性であり、そして／または上記タンパク質免疫原中のコンフォメーション性エピトープを認識する抗体を使用し得る。両方の場合に、上記抗体は、従って、機能的免疫原と変性もしくは非機能的免疫原とを区別し得る。殺菌性抗体の使用が好ましい。
【００５６】
抗体が髄膜炎菌に対して殺菌性であるか否かを決定することは、当該分野で慣用的であり、ＳＢＡによって評価され得る［２８〜３１］。参考文献３２は、一致した手順（ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を使用する場合に、このアッセイの良好な実験室間再現性を報告している。ＳＢＡは、株Ｈ４４／７６（ＰｕｂＭＬＳＴデータベースの参照株２３７；株名Ｂ：Ｐ１．７，１６：Ｆ３−３：ＳＴ−３２（ｃｃ３２）；４４／７６−３もしくはＺ３８４２としても公知）に対して実施され得る。しかし、現在の目的に関しては、抗体は、それがヒト補体を使用して株ＭＣ５８を死滅させれば、殺菌性であるとみなされ得る。
【００５７】
抗体がコンフォメーション性エピトープを認識しているか否かを決定することはまた、簡単である。例えば、上記抗体は、上記標的抗原に由来する直鎖状ペプチドフラグメントの一団に対して試験され得（例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ技術を使用して）、上記結合は、上記完全な抗原に対する抗体の結合と比較され得る。代替手段として、結合は、上記標的抗原の変性の前後で比較され得る。
【００５８】
本発明のアッセイは、単一のモノクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体の混合物を使用し得る。代表的には、ワクチンは、複数の種々の免疫原を含み、これらの各々は、その分析のために種々のモノクローナル抗体を要する。従って、アッセイは、単一の免疫原を認識する単一のモノクローナル抗体；単一の免疫原（代表的には、上記免疫原上の種々のエピトープ）を認識する複数の種々のモノクローナル抗体；複数の種々の免疫原を認識する複数の種々のモノクローナル抗体（ここで免疫原１種あたり１種以上の抗体がある（代表的には、それらが同じ免疫原を標的とするのであれば、異なるエピトープを認識する）を使用し得る。複数の免疫原を同時に認識するために単一のアッセイを行うよりむしろ、１回のアッセイあたり単一のモノクローナル抗体で複数回のアッセイを行うことは好ましい。これら結果は、上記ワクチンサンプルの分析全体のために組み合わされ得る。複数のアッセイを使用することによって、複数免疫原ワクチン内の各免疫原は、例えば、標準ワクチンに対する有効性のあらゆる喪失の原因を区別するために、別個にアッセイされ得る。
【００５９】
抗体は、それがワクチン中に存在し得る他の抗原と交差反応しないことを担保するために試験され得る。この試験は簡単であり、このような交差反応抗体は、いずれも用心してかつ適切に制御して使用されてもよいし、交差反応活性を有しない抗体を支持して却下されてもよい。
【００６０】
相対的有効性の決定を容易にするために、上記モノクローナル抗体は、標的抗原が希釈された場合に、線形的な結合応答を示すべきである。すなわち、上記標的抗原の希釈は、上記抗体による結合の際に、それに応じた低下をもたらすべきである。線形性は、例えば、Ｒ２≧０．９５を有する線形回帰によって評価され得る。
【００６１】
上記モノクローナル抗体は、任意の適切な種から得られ得る（例えば、マウス、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、もしくはヒトモノクローナル抗体）。有利なことには、上記選択される種は、二次抗体が容易に利用可能であるように選択され得る。例えば、標識されたヤギ抗マウス二次抗体は、容易に得られるので、マウスモノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡにおいて容易に使用可能である。
【００６２】
上記モノクローナル抗体は、任意の重鎖タイプを有し得る（例えば、それは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＭクラスの抗体をそれぞれ生じる、α、δ、ε、γもしくはμ重鎖を有し得る）。クラスは、サブクラスもしくはアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ２などへとさらに分けられ得る。抗体はまた、アロタイプによって分類され得る。例えば、γ重鎖は、Ｇ１ｍアロタイプａ、ｆ、ｘもしくはｚを有し得、Ｇ２ｍアロタイプｎ、またはＧ３ｍアロタイプｂ０、ｂ１、ｂ３、ｂ４、ｂ５、ｃ３、ｃ５、ｇ１、ｇ５、ｓ、ｔ、ｕ、もしくはｖを有し得；κ軽鎖は、Ｋｍ（１）、Ｋｍ（２）もしくはＫｍ（３）アロタイプを有し得る。ＩｇＧモノクローナル抗体が好ましい。天然のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド架橋によって一緒に保持された、２本の同一軽鎖（１つの定常ドメインＣＬおよび１つの可変ドメインＶＬ）、および２本の同一重鎖（３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、ならびに１つの可変ドメインＶＨ）を有する。
【００６３】
上記モノクローナル抗体は、任意の軽鎖タイプを有し得る。例えば、それは、カッパ（κ）軽鎖もしくはラムダ（λ）軽鎖のいずれかを有し得る。
【００６４】
用語「抗体」は、哺乳動物において天然に見いだされるように、天然の抗体に限定されない。上記用語は、ＥＬＩＳＡのようなイムノアッセイにおいて同じ役割を果たし得る任意の類似分子を含む。従って、上記抗体は、例えば、抗原結合活性を保持する天然の抗体のフラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント）、単一のポリペプチド鎖としてＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む「単鎖Ｆｖ」、「ダイアボディー」、「トリアボディー」、単一可変ドメインもしくはＶＨＨ抗体、「ドメイン抗体」（ｄＡｂ）、ある生物に由来する定常ドメインを有するが、可変ドメインは別の生物に由来するキメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体などであり得る。上記抗体は、単一の抗原結合部位（例えば、ＦａｂフラグメントもしくはｓｃＦｖにおけるように）もしくは複数の抗原結合部位（例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントもしくはダイアボディーもしくは天然抗体におけるように）を含み得る。しかし、抗体が１つより多くの抗原結合部位を有する場合、それは、好ましくは、単一特異的抗体である。すなわち、全ての抗原結合部位が、同じ抗原を認識する。上記抗体は、定常ドメイン（例えば、ＣＨドメインもしくはＣＬドメインを含む）を有し得るが、これは、常に必要とされるわけではない。従って、用語「抗体」とは、本明細書で使用される場合、多様な構造特徴を有するある範囲のタンパク質（通常は、２つのβ−シートに配置されたアンチパラレルβ鎖の２層サンドイッチを有する、全てβタンパク質の折り畳みを有する少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む）を包含するが、上記タンパク質の全てが、上記標的タンパク質である免疫原に結合する能力を有する。
【００６５】
抗体に関連して本来は使用される用語「モノクローナル」は、免疫細胞の単一のクローン系統によって生成される抗体に言及し、同じ標的タンパク質を全て認識すると同時に、異なるＢ細胞によって生成され、そのタンパク質上の異なるエピトープに対して指向される「ポリクローナル」抗体とは対照的である。本明細書で使用される場合、語「モノクローナル」は、いかなる特定の細胞起源をも意味しないが、全てが同じアミノ酸配列を有し、同じ標的タンパク質中の同じエピトープを認識する抗体の任意の集団をいう。従って、モノクローナル抗体は、任意の適切なタンパク質合成システム（免疫細胞、非免疫細胞、無細胞系などを含む）を使用して生成され得る。この使用は、上記分野においては通常のことである。例えば、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞株において発現されるＣＤＲグラフト化ヒト化抗体ＳｙｎａｇｉｓＴＭ、ＣＨＯ細胞株において発現されるヒト化抗体ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ、およびＣＨＯ細胞株において発現されるファージディスプレイされた抗体ＨｕｍｉｒａＴＭに関しての製品データシートは全て、モノクローナル抗体として上記製品を参照する。用語「モノクローナル抗体」とは、従って、上記抗体の種もしくは供給源に関しても、上記抗体が作製される様式によっても限定されない。
【００６６】
既知のモノクローナル抗体は、本発明とともに使用され得るか、または新たなモノクローナル抗体が公知の技術（例えば、フロイント完全アジュバントとともに参照ワクチンの免疫原をマウスに注射すること）し、その後、例えば、殺菌活性などの適切な特性を有するものをスクリーニングすることを使用して生成され得る。本発明は、特定の既知の抗体の使用を要しないが、ＢＥＸＳＥＲＯＴＭ中の免疫原の分析に有用な多くの抗体が以下に記載される：
・ＢＥＸＳＥＲＯＴＭ製品中で見いだされるとおりのＮＨＢＡをアッセイするために適したモノクローナル抗体は、コンフォメーション性エピトープをおそらく認識する４２Ａ４Ａ２抗体（マウスＩｇＧ１）である。
・ＢＥＸＳＥＲＯＴＭ製品中で見いだされるとおりのｆＨｂｐをアッセイするために適したモノクローナル抗体としては、ＭＡｂ５０２抗体［３３，３４］、１２Ｃ１／Ｄ７抗体（以下を参照のこと）および１１Ｆ１０／Ｇ６抗体（以下を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。これら３種の抗体は、全て殺菌性である。ＭＡｂ５０２（マウスＩｇＧ２ａ）は、希釈された場合に良好な線形性を与えないので、他の２種の抗体（ともにＩｇＧ２ｂ）が好ましい。２種の他の有用な抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体は、３０Ｇ１１／Ｈ３および１４Ｂ３／Ｄ４である（以下を参照のこと）。ＪＡＲ３およびＪＡＲ５抗体（参考文献３５；ＧｅｎＢａｎｋ  ＶＬおよびＶＨ遺伝子は、ＪＦ７１５９２７、Ｆ７１５９２６、ＪＦ７１５９２９およびＪＦ７１５９２８である）もまた使用され得る。同様に、他の先行技術であるＪＡＲ抗体が使用され得る（例えば、ＪＡＲ３５まで［３６］）。上記抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体は、ｆＨｂｐの単一の改変体に結合し得るか、または１種より多くの改変体（例えば、参考文献３７で報告されるように、ＪＡＲ３およびＪＡＲ５抗体）に結合し得る。
・ＢＥＸＳＥＲＯＴＭ製品中で見いだされるとおりのＮａｄＡをアッセイするために適したモノクローナル抗体は、殺菌性９Ｆ１１／１９抗体（マウスＩｇＧ２ｂ）である。
【００６７】
ワクチン中の小胞成分をアッセイすることは、上記小胞中の任意の抗原を使用し得るが、抗ＰｏｒＡ抗体を使用することは簡便である。なぜなら、これらは、血清サブタイプ分析に容易に利用可能であるからである（例えば、ＮＩＢＳＣから）。従って、ＢＥＸＳＥＲＯＴＭ製品中で見いだされるとおりのＯＭＶ成分をアッセイするために、適切なモノクローナル抗体は、血清サブタイプＰ１．４を認識する。
【００６８】
本発明で使用される二次抗体（例えば、上記アッセイの競合フォーマットで）は、一次抗体が固定化された場合に、上記一次抗体を認識し得る。上記二次抗体は、代表的には、ポリクローナルである。例えば、上記一次抗体がマウスであれば、上記二次抗体は、抗マウス抗体（例えば、ヤギ抗マウスＩｇＧ）であり得る。二次抗体を選択するための適切な基準は、ＥＬＩＳＡ分野において周知である。
【００６９】
（一般）
本発明の実施は、別段示されなければ、当該分野の技術範囲内の化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来法を使用する。このような技術は、文献中で十分に説明されている。例えば、参考文献３８〜４４などを参照のこと。
【００７０】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなってもよいし、さらなるなにかを含んでもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【００７１】
数値ｘに関して用語「約」とは、任意選択であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【００７２】
本発明が「エピトープ」に関係する場合、このエピトープは、Ｂ細胞エピトープおよび／もしくはＴ細胞エピトープであり得るが、通常は、Ｂ細胞エピトープである。このようなエピトープは、経験的に（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ［４５，４６］もしくは類似の方法を使用して）同定され得るか、またはそれらは、（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数［４７］、マトリクスベースのアプローチ［４８］、ＭＡＰＩＴＯＰＥ［４９］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［５０，５１］、ニューラルネットワーク［５２］、ＯｐｔｉＭｅｒ  ＆  ＥｐｉＭｅｒ［５３，５４］、ＡＤＥＰＴ［５５］、Ｔｓｉｔｅｓ［５６］、親水性［５７］、抗原性指数［５８］または参考文献５９〜６３で開示される方法などを使用して）推測され得る。エピトープは、抗体の抗原結合部位もしくはＴ細胞レセプターによって認識され、これらに結合する抗原の一部であり、それらは「抗原決定基」といわれ得る。
【００７３】
２つのアミノ酸配列の間のパーセンテージ配列同一性への言及は、アラインメントされる場合、アミノ酸のそのパーセンテージが、上記２つの配列を比較したときに同じであることを意味する。このアラインメントおよび％相同性もしくは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献６４の第７．７．１８節に記載されるもの）を使用して決定され得る。好ましいアラインメントは、ギャップオープンペナルティー  １２およびギャップ伸長ペナルティー  ２、６２のＢＬＯＳＵＭマトリクスでのアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。上記Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献６５に開示されている。
【００７４】
語「実質的に」は、「完全に」を排除しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まなくてもよい。必要であれば、語句「実質的に」は、本発明の定義から省かれ得る。
【００７５】
（髄膜炎菌タンパク質免疫原）
（ＮＨＢＡ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａのヘパリン結合抗原））
ＮＨＢＡ［６８］は、遺伝子ＮＭＢ２１３２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＧＩ：７２２７３８８；  本明細書では配列番号９）として、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８［２５］の公開されたゲノム配列中に含まれた。多くの株のＮＨＢＡの配列は、それ以来公開されてきた。例えば、ＮＨＢＡの対立遺伝子形態（タンパク質「２８７」といわれる）は、参考文献６６の図５および図１５において、および参考文献６７の実施例１３および図２１で認められ得る（そこでは配列番号３１７９〜３１８４）。ＮＨＢＡの種々の免疫原性フラグメントもまた、報告されている。
【００７６】
本発明での使用に好ましいＮＨＢＡ抗原は、（ａ）配列番号９と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有する；および／または（ｂ）配列番号９の少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメント（ここで「ｎ」は、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号９に由来するエピトープを含む。
【００７７】
最も有用なＮＨＢＡ抗原は、被験体への投与後、アミノ酸配列、配列番号９からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合し得る抗体を誘発し得る。本発明での使用に有利なＮＨＢＡ抗原は、被験体への投与後に、殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。
【００７８】
ＮＨＢＡの過剰発現は、種々の方法（例えば、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下でのＮＨＢＡ遺伝子の導入［６８］で以前に達成された。
【００７９】
（ＮａｄＡ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  アドヘシンＡ））
上記ＮａｄＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開されたゲノム配列［２５］に、遺伝子ＮＭＢ１９９４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２７２５６；本明細書では配列番号１０）として含まれた。多くの株に由来するＮａｄＡ抗原の配列が、それ以来公開されてきており、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａアドヘシンとしてのタンパク質活性は、十分に記録されている。ＮａｄＡの種々の免疫原性フラグメントもまた報告されている。
【００８０】
本発明での使用に好ましいＮａｄＡ抗原は、（ａ）配列番号１０と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有する；および／または（ｂ）配列番号１０の少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメント（ここで「ｎ」は、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１０のエピトープを含む。
【００８１】
最も有用なＮａｄＡ抗原は、被験体への投与後、アミノ酸配列、配列番号１０からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合し得る抗体を誘発し得る。本発明での使用に有利なＮａｄＡ抗原は、被験体への投与後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。配列番号６は、１つのこのようなフラグメントである。
【００８２】
（ＨｍｂＲ）
全長ＨｍｂＲ配列は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開されたゲノム配列［２５］に遺伝子ＮＭＢ１６６８（本明細書では配列番号７）として含まれた。参考文献６９は、異なる株に由来するＨｍｂＲ配列（本明細書では配列番号８）を報告し、参考文献７０は、さらなる配列（本明細書で配列番号１９）を報告する。配列番号７および８は、１個のアミノ酸だけ長さが異なり、９４．２％同一性を有する。配列番号１９は、配列番号７より１アミノ酸短く、それらは、ＣＬＵＳＴＡＬＷによって９９％同一性（１個の挿入、７個の差異）を有する。本発明は、任意のこのようなＨｍｂＲポリペプチドを使用し得る。
【００８３】
本発明は、全長ＨｍｂＲ配列を含むポリペプチドを使用し得るが、部分ＨｍｂＲ配列を含むポリペプチドをしばしば使用する。従って、いくつかの実施形態において、本発明に従って使用されるＨｍｂＲ配列は、配列番号７と少なくともｉ％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ここで上記値ｉは、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９以上である。他の実施形態において、本発明に従って使用されるＨｍｂＲ配列は、配列番号７からの少なくともｊ個連続したアミノ酸のフラグメントを含み得、ここで上記値ｊは、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上である。他の実施形態において、本発明に従って使用されるＨｍｂＲ配列は、（ｉ）配列番号７と少なくともｉ％配列同一性を有する、および／または（ｉｉ）配列番号７からの少なくともｊ個連続したアミノ酸のフラグメントを含む、アミノ酸配列を含み得る。
【００８４】
ｊ個のアミノ酸の好ましいフラグメントは、配列番号７に由来するエピトープを含む。このようなエピトープは、通常、ＨｍｂＲの表面に位置するアミノ酸を含む。有用なエピトープとしては、ヘモグロビンへのＨｍｂＲの結合に関わるアミノ酸を有するものが挙げられる。なぜなら、これらエピトープに結合する抗体は、細菌が宿主ヘモグロビンに結合する能力をブロックし得るからである。ＨｍｂＲのトポロジー、およびその重大な機能的残基は、参考文献７１で調査された。膜貫通配列を保持するフラグメントは、これらが細菌表面に、例えば、小胞において提示され得るので有用である。ＨｍｂＲの長いフラグメントの例は、配列番号１５および１６に対応する。しかし、可溶性ＨｍｂＲが使用される場合、上記膜貫通配列が省かれているが、代表的には細胞外部分に由来するエピトープを保持する配列が、使用され得る。
【００８５】
最も有用なＨｍｂＲ抗原は、被験体への投与後に、アミノ酸配列、配列番号７からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合し得る抗体を誘発し得る。本発明での使用に有利なＨｍｂＲ抗原は、被験体への投与後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。
【００８６】
（ｆＨｂｐ（Ｈ因子結合タンパク質））
上記ｆＨｂｐ抗原は、詳細に特徴付けられてきた。それは、タンパク質「７４１」［参考文献６７の配列番号２５３５および２５３６］、「ＮＭＢ１８７０」、「ＧＮＡ１８７０」［７２〜７４］、「Ｐ２０８６」、「ＬＰ２０８６」もしくは「ＯＲＦ２０８６」［７５−７７］としても知られていた。それは、天然ではリポタンパク質であり、全ての髄膜炎菌血清群にわたって発現される。ｆＨｂｐのＣ末端免疫優性ドメイン（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｄｏｍａｉｎ）（「ｆＨｂｐＣ」）の構造は、ＮＭＲによって決定された［７８］。上記タンパク質のこの部分は、８本鎖のβ−バレルを形成し、その鎖は、種々の長さのループで接続されている。上記バレルの前には、短いαヘリックスおよび可撓性Ｎ末端テールがある。
【００８７】
上記ｆＨｂｐ抗原は、３つの異なる改変体に分類され［７９］、それは、所定のファミリーに対して惹起された血清が、同じファミリー内で殺菌性であるが、他の２つのファミリーのうちの１つを発現する株に対しては活性でない、すなわち、ファミリー内で交差防御性があるが、ファミリー間で交差防御性はないことが見いだされた。本発明は、単一のｆＨｂｐ改変体を使用し得るが、ワクチンは、上記改変体のうちの２つもしくは３つに由来するｆＨｂｐを通常含む。従って、本発明は、以下から選択される２つもしくは３つの異なるｆＨｂｐの組み合わせを使用し得る：（ａ）配列番号１と少なくともａ％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むおよび／もしくは配列番号１からの少なくともｘ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第１のタンパク質；（ｂ）配列番号２と少なくともｂ％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むおよび／もしくは配列番号２からの少なくともｙ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第２のタンパク質；ならびに／または（ｃ）配列番号３と少なくともｃ％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むおよび／もしくは配列番号３からの少なくともｚ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第３のタンパク質。
【００８８】
上記値ａは、少なくとも８５（例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５以上）である。上記値ｂは、少なくとも８５（例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５以上）である。上記値ｃは、少なくとも８５（例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５以上）である。上記値ａ、ｂおよびｃは、本質的に互いに関連しない。
【００８９】
上記値ｘは、少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。上記値ｙは、少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。上記値ｚは、少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。上記値ｘ、ｙおよびｚは、本質的に互いに関連しない。
【００９０】
本発明が単一のｆＨｂｐ改変体を使用する場合、組成物は、（ａ）配列番号１と少なくともａ％配列同一性を有するおよび／もしくは配列番号１からの少なくともｘ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列；または（ｂ）配列番号２と少なくともｂ％配列同一性を有するおよび／もしくは配列番号２からの少なくともｙ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列；または（ｃ）配列番号３と少なくともｃ％配列同一性を有するおよび／もしくは配列番号３からの少なくともｚ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列、を含むポリペプチドを含み得る。
【００９１】
本発明が、上記改変体のうちの２つもしくは３つに由来するｆＨｂｐを使用する場合、組成物は、以下から選択される２つもしくは３つの異なるｆＨｂｐの組み合わせを含み得る：（ａ）配列番号１と少なくともａ％配列同一性を有するアミノ酸を含むおよび／もしくは配列番号１からの少なくともｘ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド；ならびに（ｂ）配列番号２と少なくともｂ％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むおよび／もしくは配列番号２からの少なくともｙ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチド；ならびに／または（ｃ）配列番号３と少なくともｃ％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むおよび／もしくは配列番号３からの少なくともｚ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第３のポリペプチド。上記第１、第２および第３のポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有する。
【００９２】
本発明が上記改変体のうちの２つに由来するｆＨｂｐを使用する場合、組成物は、（ａ）配列番号１と少なくともａ％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むおよび／もしくは配列番号１からの少なくともｘ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド；ならびに（ｂ）配列番号２と少なくともｂ％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むおよび／もしくは配列番号２からの少なくともｙ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチド、の両方を含み得る。上記第１および第２のポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有する。
【００９３】
本発明が上記改変体のうちの２つに由来するｆＨｂｐを使用する場合、組成物は、（ａ）配列番号１と少なくともａ％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むおよび／もしくは配列番号１からの少なくともｘ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド；（ｂ）配列番号３と少なくともｃ％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むおよび／もしくは配列番号３からの少なくともｚ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチド、の両方を含み得る。上記第１および第２のポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有する。
【００９４】
本発明に従って使用され得る別の有用なｆＨｂｐは、例えば、参考文献８０において開示される改変形態（例えば、そこからの配列番号２０もしくは２３を含む）のうちの１つである。これら改変形態は、髄膜炎菌に対して広く殺菌性である抗体応答を誘発し得る。参考文献８０中の配列番号７７は、使用され得る別の有用なｆＨｂｐ配列である。
【００９５】
ＯＭＶ中のｆＨｂｐタンパク質は、通常、例えば、Ｎ末端システインで脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅ）されている。他の実施形態において、それらは脂質化されていない。
【００９６】
本発明の方法によって分析され得る１つのワクチンは、ｆＨｂｐの２つの異なる改変体を含む。その第１の改変体は、アミノ酸配列、配列番号２９を有し得、その第２の改変体は、アミノ酸配列、配列番号３０を有し得る。これらは、好ましくは、それらのＮ末端システインで脂質化されている。このワクチンは、リン酸アルミニウムアジュバントを含み得、同様に、ヒスチジン緩衝液およびポリソルベート８０を含み得る。理想的には、上記ワクチンは、等量の上記２つの異なるｆＨｂｐポリペプチドを含む。
【００９７】
（ＮｓｐＡ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ表面タンパク質Ａ））
上記ＮｓｐＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開されたゲノム配列［２５］中に、遺伝子ＮＭＢ０６６３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２５８８８；本明細書では配列番号１１）として含まれた。上記抗原は、参考文献８１＆８２から、以前から公知であった。多くの株に由来するＮｓｐＡ抗原の配列は、それ以来公開されてきた。ＮｓｐＡの種々の免疫原性フラグメントもまた、報告されている。
【００９８】
本発明での使用に好ましいＮｓｐＡ抗原は、（ａ）配列番号１１と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有する；および／もしくは（ｂ）配列番号１１の少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメント（ここで「ｎ」は、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１１に由来するエピトープを含む。
【００９９】
最も有用なＮｓｐＡ抗原は、被験体への投与後に、アミノ酸配列、配列番号１１からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合し得る抗体を誘発し得る。本発明での使用に有利なＮｓｐＡ抗原は、被験体への投与後に、殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。
【０１００】
（ＮｈｈＡ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｈｉａホモログ））
上記ＮｈｈＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開されたゲノム配列［２５］中に、遺伝子ＮＭＢ０９９２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２６２３２；本明細書では配列番号１２）として含まれた。多くの株に由来するＮｈｈＡ抗原の配列は、それ以来公開されきており（例えば、参考文献６６＆８３）、ＮｈｈＡの種々の免疫原性フラグメントが報告されている。それは、Ｈｓｆとしても公知である。
【０１０１】
本発明での使用に好ましいＮｈｈＡ抗原は、（ａ）配列番号１２と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有する；および／もしくは（ｂ）配列番号１２の少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメント（ここで「ｎ」は、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１２に由来するエピトープを含む。
【０１０２】
最も有用なＮｈｈＡ抗原は、被験体への投与後に、アミノ酸配列、配列番号１２からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合し得る抗体を誘発し得る。本発明での使用に有利なＮｈｈＡ抗原は、被験体への投与後に、殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。
【０１０３】
（Ａｐｐ（接着および透過タンパク質））
上記Ａｐｐ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開されたゲノム配列［２５］中に、遺伝子ＮＭＢ１９８５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２７２４６；本明細書では配列番号１３）として含まれた。多くの株に由来するＡｐｐ抗原の配列は、それ以来公開されてきた。それはまた、「ＯＲＦ１」および「Ｈａｐ」としても知られていた。Ａｐｐの種々の免疫原性フラグメントもまた、報告されている。
【０１０４】
本発明での使用に好ましいＡｐｐ抗原は、（ａ）配列番号１３と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有する；および／もしくは（ｂ）配列番号１３の少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメント（ここで「ｎ」は、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１３に由来するエピトープを含む。
【０１０５】
最も有用なＡｐｐ抗原は、被験体への投与後に、アミノ酸配列、配列番号１３からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合し得る抗体を誘発し得る。本発明での使用に有利なＡｐｐ抗原は、被験体への投与後に、殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。
【０１０６】
（Ｏｍｐ８５（８５ｋＤａ外膜タンパク質））
上記Ｏｍｐ８５抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開されたゲノム配列［２５］中に、遺伝子ＮＭＢ０１８２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２５４０１；本明細書では配列番号１４）として含まれた。多くの株に由来するＯｍｐ８５抗原の配列は、それ以来公開されてきた。Ｏｍｐ８５に関するさらなる情報は、参考文献８４および８５に見いだされ得る。Ｏｍｐ８５の種々の免疫原性フラグメントもまた、報告されている。
【０１０７】
本発明での使用に好ましいＯｍｐ８５抗原は、（ａ）配列番号１４と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有する；および／もしくは（ｂ）配列番号１４の少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメント（ここで「ｎ」は、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１４に由来するエピトープを含む。
【０１０８】
最も有用なＯｍｐ８５抗原は、被験体への投与後に、アミノ酸配列、配列番号１４からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合し得る抗体を誘発し得る。本発明での使用に有利なＯｍｐ８５抗原は、被験体への投与後に、殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。
【０１０９】
（ＴｂｐＡ）
上記ＴｂｐＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開されたゲノム配列［２５］中に、遺伝子ＮＭＢ０４６１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２５６８７；本明細書で配列番号１７）として含まれた。多くの株に由来するＴｂｐＡの配列は、それ以来公開されてきた。ＴｂｐＡの種々の免疫原性フラグメントもまた報告されている。
【０１１０】
本発明での使用に好ましいＴｂｐＡ抗原は、（ａ）配列番号１７と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有する；および／もしくは（ｂ）配列番号１７の少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメント（ここで「ｎ」は、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１７に由来するエピトープを含む。
【０１１１】
最も有用なＴｂｐＡ抗原は、被験体への投与後に、アミノ酸配列、配列番号１７からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合し得る抗体を誘発し得る。本発明での使用に有利なＴｂｐＡ抗原は、被験体への投与後に、殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。
【０１１２】
（ＴｂｐＢ）
上記ＴｂｐＢ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開されたゲノム配列［２５］中に、遺伝子ＮＭＢ１３９８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２５６８６；本明細書では配列番号１８）として含まれた。多くの株に由来するＴｂｐＢの配列は、それ以来公開されてきた。ＴｂｐＢの種々の免疫原性フラグメントもまた、報告されている。
【０１１３】
本発明での使用に好ましいＴｂｐＢ抗原は、（ａ）配列番号１８と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有する；および／もしくは（ｂ）配列番号１８の少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメント（ここで「ｎ」は、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１８に由来するエピトープを含む。
【０１１４】
最も有用なＴｂｐＢ抗原は、被験体への投与後に、アミノ酸配列、配列番号１８からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合し得る抗体を誘発し得る。本発明での使用に有利なＴｂｐＢ抗原は、被験体への投与後に、殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。
【０１１５】
（Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ）
上記Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開されたゲノム配列［２５］中に、遺伝子ＮＭＢ１３９８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２６６３７；本明細書では配列番号２０）として含まれた。多くの株に由来するＣｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼの配列は、それ以来公開されてきた。Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼの種々の免疫原性フラグメントもまた報告されている。
【０１１６】
本発明での使用に好ましいＣｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ抗原は、（ａ）配列番号２０と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有する；および／もしくは（ｂ）配列番号２０の少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメント（ここで「ｎ」は、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号２０に由来するエピトープを含む。
【０１１７】
最も有用なＣｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ抗原は、被験体への投与後に、アミノ酸配列、配列番号２０からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合し得る抗体を誘発し得る。本発明での使用に有利なＣｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ抗原は、被験体への投与後に、殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。
【０１１８】
（モノクローナル抗体）
本発明はまた、髄膜炎菌抗原を認識するモノクローナル抗体を提供する。これらは、本発明のアッセイとともに使用され得るか、またはより一般的に使用され得る。
【０１１９】
本発明の１つの抗体は、「１２Ｃ１／Ｄ７」である。そのＶＬ領域は、アミノ酸配列、配列番号２１を有し、そのＶＨ領域は、アミノ酸配列、配列番号２２を有する。
【０１２０】
本発明の別の抗体は、「１１Ｆ１０／Ｇ６」である。そのＶＬ領域は、アミノ酸配列、配列番号２３を有し、そのＶＨ領域は、アミノ酸配列、配列番号２４を有する。
【０１２１】
本発明の別の抗体は、「３０Ｇ１１／Ｈ３」である。そのＶＬ領域は、アミノ酸配列、配列番号２５を有し、そのＶＨ領域は、アミノ酸配列、配列番号２６を有する。
【０１２２】
本発明の別の抗体は、「１４Ｂ３／Ｄ４」である。そのＶＬ領域は、アミノ酸配列、配列番号２７を有し、そのＶＨ領域は、アミノ酸配列、配列番号２８を有する。
【０１２３】
本発明はまた、髄膜炎菌抗原に結合し、１２Ｃ１／Ｄ７、１１Ｆ１０／Ｇ６、３０Ｇ１１／Ｈ３、もしくは１４Ｂ３／Ｄ４のＶＬ領域およびＶＨ領域に由来するＣＤＲを含む、モノクローナル抗体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１−１】図１は、モノクローナル抗体（Ａ）４２Ａ４Ａ２、（Ｂ）ＭＡｂ５０２、（Ｃ）１２Ｃ１／Ｄ７、（Ｄ）１１Ｆ１０／Ｇ６、（Ｅ）９Ｆ１１／１９、（Ｆ）抗ＰｏｒＡを使用して、ＢＥＸＳＥＲＯＴＭ中のＮＨＢＡ、ｆＨｂｐ、ＮａｄＡおよびＯＭＶ免疫原に対する相対的有効性プロットを示す。各プロットは、ｌｏｇ（希釈率）に対するｌｏｇ（ＯＤ４０５−６２０ｎｍ）を示す。丸は、上記標準ワクチンのデータを示し；三角は、上記試験ワクチンのデータを示す。
【図１−２】図１は、モノクローナル抗体（Ａ）４２Ａ４Ａ２、（Ｂ）ＭＡｂ５０２、（Ｃ）１２Ｃ１／Ｄ７、（Ｄ）１１Ｆ１０／Ｇ６、（Ｅ）９Ｆ１１／１９、（Ｆ）抗ＰｏｒＡを使用して、ＢＥＸＳＥＲＯＴＭ中のＮＨＢＡ、ｆＨｂｐ、ＮａｄＡおよびＯＭＶ免疫原に対する相対的有効性プロットを示す。各プロットは、ｌｏｇ（希釈率）に対するｌｏｇ（ＯＤ４０５−６２０ｎｍ）を示す。丸は、上記標準ワクチンのデータを示し；三角は、上記試験ワクチンのデータを示す。
【図１−３】図１は、モノクローナル抗体（Ａ）４２Ａ４Ａ２、（Ｂ）ＭＡｂ５０２、（Ｃ）１２Ｃ１／Ｄ７、（Ｄ）１１Ｆ１０／Ｇ６、（Ｅ）９Ｆ１１／１９、（Ｆ）抗ＰｏｒＡを使用して、ＢＥＸＳＥＲＯＴＭ中のＮＨＢＡ、ｆＨｂｐ、ＮａｄＡおよびＯＭＶ免疫原に対する相対的有効性プロットを示す。各プロットは、ｌｏｇ（希釈率）に対するｌｏｇ（ＯＤ４０５−６２０ｎｍ）を示す。丸は、上記標準ワクチンのデータを示し；三角は、上記試験ワクチンのデータを示す。
【図２】図２は、ＢＥＸＳＥＲＯＴＭ中のＯＭＶの２つのさらなるバッチについての相対的有効性プロットを示す。
【図３】図３は、一晩加熱したワクチンのＲＰ値を示す。４つのバーの４つの群は、左から右に、以下である：ｆＨｂｐ；ＮＨＢＡ；ＮａｄＡ；およびＯＭＶ。各群内で、４つのバーは、以下である：３７℃；５０℃；６０℃；および８０℃。
【図４−１】図４は、モノクローナル抗体（Ａ）ＭＡｂ５０２、（Ｂ）４２Ａ４Ａ２、（Ｃ）９Ｆ１１／１９、および（Ｄ）抗ＰｏｒＡを使用する、標準ワクチン（丸）およびアジュバント（三角）のＲＰプロットを示す。
【図４−２】図４は、モノクローナル抗体（Ａ）ＭＡｂ５０２、（Ｂ）４２Ａ４Ａ２、（Ｃ）９Ｆ１１／１９、および（Ｄ）抗ＰｏｒＡを使用する、標準ワクチン（丸）およびアジュバント（三角）のＲＰプロットを示す。
【図５】図５は、競合フォーマットでの本発明のＥＬＩＳＡを図示する。上では、上記ワクチン免疫原のうちの１つに対するモノクローナル抗体（Ａ）が、各ウェルにおいて漸増して希釈されたワクチンを有する１０個のウェル中で、上記ワクチンサンプル（Ｂ）と混合される。（Ｃ）において、この混合物は、第２のプレートのウェルへと移され、第２のプレートのウェルは、固定化されたワクチン免疫原で被覆されている。インキュベーション後、上記プレートを洗浄し（Ｄ）、次いで酵素結合体化抗ｍＡｂ血清が、工程（Ｅ）で添加される。その後、上記酵素は、ＥＬＩＳＡ出力のための検出可能な反応を触媒するために使用される。
【発明を実施するための形態】
【０１２５】
上記ＢＥＸＳＥＲＯＴＭ製品は、参考文献７に記載され、１．５ｍｇ  水酸化アルミニウムに吸着され、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株ＮＺ９８／２５４に由来する２５μｇ  ＯＭＶを含む、ＮａｄＡ（亜改変体（ｓｕｂｖａｒｉａｎｔ）３．１；配列番号６）、ｆＨｂｐ亜改変体１．１（ＧＮＡ２０９１−ｆＨｂｐ融合タンパク質として；配列番号５）、およびＮＨＢＡ亜改変体１．２（ＮＨＢＡ−ＧＮＡ１０３０融合タンパク質として；配列番号４）の各々の５０μｇを含む。
【０１２６】
以下のモノクローナル抗体が利用可能である：
（Ａ）４２Ａ４Ａ２（ＮＨＢＡに対するマウスＩｇＧ１）
（Ｂ）ＭＡｂ５０２（ｆＨｂｐに対するマウスＩｇＧ２ａ）
（Ｃ）１２Ｃ１／Ｄ７（ｆＨｂｐに対するマウスＩｇＧ２ｂ）
（Ｄ）１１Ｆ１０／Ｇ６（ｆＨｂｐに対するマウスＩｇＧ２ｂ）
（Ｅ）９Ｆ１１／１９抗体（ＮａｄＡに対するマウスＩｇＧ２ｂ）
（Ｆ）抗ＰｏｒＡ（Ｐ１．４）（ＮＩＢＳＣから入手可能）。
【０１２７】
これら抗体は、４２Ａ４Ａ２（これは、非殺菌性であるが、コンフォメーション性エピトープを認識するようである）を除いて、殺菌性である。
【０１２８】
上記ＢＥＸＳＥＲＯＴＭ製品を、各回１：２もしくは１：５のいずれかで９回連続希釈する。これら希釈系列のうちの６つは、第１のマイクロタイタープレート（プレート１）の行（Ａ）〜（Ｆ）、列１（最も濃い）〜１０（最も薄い）に存在する。各行は、上記で記載される６種のモノクローナル抗体（Ａ）〜（Ｆ）のうちの１つを受容し、各々は、各列で同じ濃さで使用される。インキュベーション後、これら６０ウェルの内容物を、第２のプレート（プレート２）の６０ウェルに移す。プレート２の行（Ａ）〜（Ｆ）のウェルを、個々の組換えタンパク質（Ａ）ＮＨＢＡ、（Ｂ−Ｄ）ｆＨｂｐ、（Ｅ）ＮａｄＡおよび（Ｆ）ＰｏｒＡで被覆する。他の実施形態では、１枚のＥＬＩＳＡプレートの全てのウェルを、同じ抗原を使用して被覆し、各抗原を、異なるＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを使用することによって別個に試験する。
【０１２９】
上記混合物を、２時間にわたって、３７℃で（ｆＨｂｐに関して）または室温で（ＮＨＢＡ、ＮａｄＡおよびＰｏｒＡに関して）インキュベートし、次いで、洗浄する。上記ワクチン抗原に結合しなかったモノクローナル抗体は上記プレート上に保持される。抗マウスＩｇＧ（アルカリホスファターゼに結合体化されている）を、次いで、全ての６０ウェルにｐＮＰＰとともに添加し、保持されたモノクローナル抗体の量をＯＤ４０５−６２０ｎｍによって評価する。従って、上記ワクチン免疫原（連続希釈される）は、プレート２の中の固定化された抗原への上記モノクローナル抗体の結合を阻害する。上記ワクチンサンプル中のより高いレベルのエピトープは、この結合がより阻害されることをもたらし、従って、上記ｐＮＰＰの添加後に、より低い検出可能なシグナルがもたらされる。
【０１３０】
図１Ａ〜１Ｆは、６つの行からの結果を示す。グラフはまた、参照ワクチンで測定されたデータを含み、２つの平行な線の比較から、以下の相対的有効性が明らかになる：
【０１３１】
【表１】
2015517089.tif 000002
図１Ｂ中の（すなわち、ＭＡｂ５０２を使用する）異常値は、その曲線が線形でなく、互いに平行でなかったことから生じた。全ての他の場合では、その曲線は線形であり、良好なＲ２値を有した。従って、上記アッセイは、相対的有効性を評価するために適している。
【０１３２】
アッセイ間の一貫性をチェックするために、上記抗ＰｏｒＡ測定値を、２つのさらなるＢＥＸＳＥＲＯＴＭバッチについてチェックした（図２Ａおよび図２Ｂ）。図１Ｆ、図２Ａおよび図２Ｂ中の結果は大きな差異を示さず、ＲＰは、その３つの異なるワクチンバッチで１．０３３、０．９１７および０．８９３であった。
【０１３３】
このアッセイが損傷したワクチンを同定する能力を、ＢＥＸＳＥＲＯＴＭ製品を熱ストレスに人工的に曝すことによって試験した。８０℃で２時間後の４種の免疫原成分の各々の相対的有効性値は、以下のとおりであった：
【０１３４】
【表２】
2015517089.tif 000003
図３は、３７℃、５０℃、６０℃および８０℃で一晩のインキュベーションした後の、上記４種の免疫原成分の各々についての相対的有効性値を示す。従って、上記アッセイは、誤った熱処理によって引き起こされる有効性の喪失を検出し得る。
【０１３５】
上記水酸化アルミニウムアジュバントが上記アッセイに干渉しないことを確認するために、抗体（Ａ）、（Ｂ）、（Ｅ）および（Ｆ）を、標準ワクチンもしくはアジュバントで試験した。図４に示されるように、上記アジュバントは常に、これが上記それぞれの免疫原への各モノクローナル抗体の結合と競合および／もしくは干渉できないことを示した。
【０１３６】
（抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体）
４種の殺菌性マウス抗ｆＨｂｐ  ＩｇＧ２ｂサブクラスモノクローナル抗体を得た：１２Ｃ１／Ｄ７；１１Ｆ１０／Ｇ６；３０Ｇ１１／Ｈ３；および１４Ｂ３／Ｄ４。ＲＮＡを、マウスハイブリドーマ細胞から、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｍＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して、製造業者の説明書に従って単離した。ｃＤＮＡを、約２００ｎｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡテンプレート、オリゴ−（ｄＴ）プライマー、およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴを使用して、逆転写を介して生成した。ＰＣＲによって、参考文献８６に記載されるとおりの免疫グロブリン重鎖（Ｈ）縮重プライマーおよび軽鎖（Ｌ）縮重プライマーを使用して、ｃＤＮＡを増幅した。その精製産物を、配列決定のためにｐＳＴＢｌｕｅ−１  Ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  Ｂｌｕｎｔベクターに挿入した。
【０１３７】
【化１】
2015517089.tif 000004
ＦＡＣＳアッセイにおいて、上記１１Ｆ１０／Ｇ６および３０Ｇ１１／Ｈ３は、上記３種の異なるｆＨｂｐ改変体：ＭＣ５８（改変体１）；９６１−５９４５（改変体２）；およびＭ１２３９（改変体３）の各々を有する髄膜炎菌株に結合できた。さらに、これら２種のＦＡＣＳ陽性抗体はまた、上記３種の改変体の各々を有する株に対して殺菌活性を示した。
【０１３８】
１４Ｂ３／Ｄ４は、ＦＡＣＳ陽性であり、ＭＣ５８および９６１−５９４５に対して殺菌性であったが、Ｍ１２３９に対してはそうではなかった。１２Ｃ１／Ｄ７は、ＦＡＣＳ陽性であり、ＭＣ５８に対して殺菌性であったが、９６１−５９４５に対してもＭ１２３９に対してもそうではなかった。
【０１３９】
１２Ｃ１／Ｄ７および１１Ｆ１０／Ｇ６は、ｆＨｂｐへの結合に関してｆＨと競合し；他の２種の抗体は、競合しなかった。
【０１４０】
１１Ｆ１０／Ｇ６に対するエピトープは、ｆＨｂｐ（ｖａｒ  １．１）中の残基Ｌｙｓ−２６８を含むようである。
【０１４１】
１２Ｃ１／Ｄ７に対するエピトープは、ｆＨｂｐ（ｖａｒ  １．１）中の残基Ｖａｌ−２７０を含むようである。
【０１４２】
１４Ｂ３／Ｄ４に対するエピトープは、ｆＨｂｐ中の残基６０〜９０を含むようである。
【０１４３】
３０Ｈ１１／Ｈ３に対するエピトープは、ｆＨｂｐ（ｖａｒ  １．１）中の残基Ｌｙｓ−２５７を含むようである。
【０１４４】
本発明が単なる例示によって上記に記載され、改変が本発明の範囲および趣旨内にありつつ行われ得ることは、理解される。
【０１４５】
【化２】
2015517089.tif 000005
【０１４６】
【化３】
2015517089.tif 000006
【０１４７】
【化４】
2015517089.tif 000007
【図１Ａ】
2015517089.tif 000008
【図１Ｂ】
2015517089.tif 000009
【図１Ｃ】
2015517089.tif 000010
【図１Ｄ】
2015517089.tif 000011
【図１Ｅ】
2015517089.tif 000012
【図１Ｆ】
2015517089.tif 000013
【図２Ａ】
2015517089.tif 000014
【図２Ｂ】
2015517089.tif 000015
【図３】
2015517089.tif 000016
【図４Ａ】
2015517089.tif 000017
【図４Ｂ】
2015517089.tif 000018
【図４Ｃ】
2015517089.tif 000019
【図４Ｄ】
2015517089.tif 000020
【図５】
2015517089.tif 000021
【配列表】
2015517089000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年10月22日(2014.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
髄膜炎菌ワクチンサンプルのインビトロ分析のための結合アッセイであって、該アッセイは、（ｉ）該サンプル内の髄膜炎菌タンパク質免疫原を、（ａ）髄膜炎菌に対して殺菌性であるか、または（ｂ）髄膜炎菌抗原中のコンフォメーション性エピトープを認識するモノクローナル抗体と相互作用させる工程；次いで、（ｉｉ）工程（ｉ）からの該免疫原と抗体との間の相互作用を測定する工程、を包含する、アッセイ。
【請求項２】
前記工程（ｉｉ）における測定は、前記ワクチンサンプル内の前記モノクローナル抗体の標的エピトープの濃度を定量的に示す、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記結合アッセイは、競合ＥＬＩＳＡである、請求項１〜２のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項４】
工程（ｉ）は、前記モノクローナル抗体と前記サンプル中の免疫原との間で複合体が形成し得るように、該抗体とともに該サンプルをインキュベートする工程であって：これら複合体は、競合抗原が固定化される容器に添加され、ここで該競合抗原は、該モノクローナル抗体に結合し得る、工程；そして次いで、工程（ｉｉ）において、該競合抗原に結合する該モノクローナル抗体の量を決定する工程を包含する、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項５】
工程（ｉｉ）は、酵素で標識された二次抗体を使用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記ワクチンは、髄膜炎菌のＮＨＢＡ、ｆＨｂｐおよび／もしくはＮａｄＡ抗原を含み、工程（ｉ）において使用される前記モノクローナル抗体は、髄膜炎菌のＮＨＢＡ、ｆＨｂｐもしくはＮａｄＡ抗原を認識する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記ワクチンは、１より多くの髄膜炎菌免疫原を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記ワクチンは、髄膜炎菌小胞を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項９】
前記ワクチンは、吸着された髄膜炎菌免疫原を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１０】
工程（ｉ）において単一のモノクローナル抗体を使用する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１１】
工程（ｉ）においてマウスモノクローナルＩｇＧ抗体を使用する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１２】
髄膜炎菌試験ワクチンサンプルのインビトロ分析のための方法であって、該方法は、（ｉ）請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアッセイを、該試験サンプルに対して、および必要に応じて、該試験サンプルの少なくとも１つの希釈物に対して行う工程；（ｉｉ）請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアッセイを、既知のインビボ有効性の標準ワクチンサンプルに対して、および必要に応じて、該標準ワクチンサンプルの少なくとも１つの希釈物に対して行う工程；ならびに（ｉｉｉ）工程（ｉ）からの結果と工程（ｉｉ）からの結果とを比較して、該標準ワクチン中の免疫原の有効性に対して、該試験ワクチン中の免疫原の有効性を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項１３】
ワクチンのバッチを分析するためのプロセスであって、該プロセスは、（ｉ）請求項１２に記載の方法によって該バッチから少なくとも１つのワクチン中の免疫原の相対的有効性をアッセイする工程；および工程（ｉ）の結果が受容可能な相対的有効性を示す場合、（ｉｉ）インビボでの使用のために該バッチからさらなるワクチンを配布する工程を包含する、プロセス。
【請求項１４】
髄膜炎菌ワクチンサンプルのインビトロ分析のための競合ＥＬＩＳＡアッセイであって、ここで該アッセイは、（ｉ）溶液相の抗ワクチンモノクローナル抗体、（ｉｉ）該抗ワクチン抗体によって認識される固定化された抗原、および（ｉｉｉ）該抗ワクチン抗体に結合する標識された抗体、を使用し、ここで該抗体は、（ａ）髄膜炎菌に対して殺菌性であるか、または（ｂ）該髄膜炎菌抗原中のコンフォメーション性エピトープを認識する、競合ＥＬＩＳＡアッセイ。
【請求項１５】
髄膜炎菌ワクチンサンプルのインビトロ分析のための結合アッセイであって、ここで該アッセイは、ワクチン中の免疫原を使用して、コントロール抗原へのモノクローナル抗体の結合を阻害し、ここで該モノクローナル抗体は、該ワクチン中の免疫原および該コントロール抗原の両方に結合する、結合アッセイ。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアッセイの使用に続いて配布されたワクチン。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
本発明はまた、髄膜炎菌抗原に結合し、１２Ｃ１／Ｄ７、１１Ｆ１０／Ｇ６、３０Ｇ１１／Ｈ３、もしくは１４Ｂ３／Ｄ４のＶＬ領域およびＶＨ領域に由来するＣＤＲを含む、モノクローナル抗体を提供する。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
髄膜炎菌ワクチンサンプルのインビトロ分析のための結合アッセイであって、該アッセイは、（ｉ）該サンプル内の髄膜炎菌タンパク質免疫原を、（ａ）髄膜炎菌に対して殺菌性であるか、または（ｂ）髄膜炎菌抗原中のコンフォメーション性エピトープを認識するモノクローナル抗体と相互作用させる工程；次いで、（ｉｉ）工程（ｉ）からの該免疫原と抗体との間の相互作用を測定する工程、を包含する、アッセイ。
（項目２）
上記工程（ｉｉ）における測定は、上記ワクチンサンプル内の上記モノクローナル抗体の標的エピトープの濃度を定量的に示す、項目１に記載のアッセイ。
（項目３）
上記結合アッセイは、競合ＥＬＩＳＡである、上記項目のいずれか一項に記載のアッセイ。
（項目４）
工程（ｉ）は、上記モノクローナル抗体と上記サンプル中の免疫原との間で複合体が形成し得るように、該抗体とともに該サンプルをインキュベートする工程であって：これら複合体は、競合抗原が固定化される容器に添加され、ここで該競合抗原は、該モノクローナル抗体に結合し得る、工程；そして次いで、工程（ｉｉ）において、該競合抗原に結合する該モノクローナル抗体の量を決定する工程を包含する、項目３に記載のアッセイ。
（項目５）
工程（ｉｉ）は、酵素で標識された二次抗体を使用する、上記項目のいずれか一項に記載のアッセイ。
（項目６）
マイクロウェルプレートの中で起こる、上記項目のいずれか一項に記載のアッセイ。
（項目７）
上記ワクチンは、髄膜炎菌のＮＨＢＡ、ｆＨｂｐおよび／もしくはＮａｄＡ抗原を含み、工程（ｉ）において使用される上記モノクローナル抗体は、髄膜炎菌のＮＨＢＡ、ｆＨｂｐもしくはＮａｄＡ抗原を認識する、上記項目のいずれか一項に記載のアッセイ。
（項目８）
上記ワクチンは、１より多くの髄膜炎菌免疫原を含む、上記項目のいずれか一項に記載のアッセイ。
（項目９）
上記ワクチンは、髄膜炎菌小胞を含む、上記項目のいずれか一項に記載のアッセイ。
（項目１０）
上記ワクチンは、吸着された髄膜炎菌免疫原を含む、上記項目のいずれか一項に記載のアッセイ。
（項目１１）
工程（ｉ）において単一のモノクローナル抗体を使用する、上記項目のいずれか一項に記載のアッセイ。
（項目１２）
工程（ｉ）においてマウスモノクローナルＩｇＧ抗体を使用する、上記項目のいずれか一項に記載のアッセイ。
（項目１３）
髄膜炎菌試験ワクチンサンプルのインビトロ分析のための方法であって、該方法は、（ｉ）項目１〜１２のいずれか１項に記載のアッセイを、該試験サンプルに対して、および必要に応じて、該試験サンプルの少なくとも１つの希釈物に対して行う工程；（ｉｉ）項目１〜１２のいずれか１項に記載のアッセイを、既知のインビボ有効性の標準ワクチンサンプルに対して、および必要に応じて、該標準ワクチンサンプルの少なくとも１つの希釈物に対して行う工程；ならびに（ｉｉｉ）工程（ｉ）からの結果と工程（ｉｉ）からの結果とを比較して、該標準ワクチン中の免疫原の有効性に対して、該試験ワクチン中の免疫原の有効性を決定する工程、を包含する、方法。
（項目１４）
ワクチンのバッチを分析するためのプロセスであって、該プロセスは、（ｉ）項目１３に記載の方法によって該バッチから少なくとも１つのワクチン中の免疫原の相対的有効性をアッセイする工程；および工程（ｉ）の結果が受容可能な相対的有効性を示す場合、（ｉｉ）インビボでの使用のために該バッチからさらなるワクチンを配布する工程を包含する、プロセス。
（項目１５）
髄膜炎菌ワクチンサンプルのインビトロ分析のための競合ＥＬＩＳＡアッセイであって、ここで該アッセイは、（ｉ）溶液相の抗ワクチンモノクローナル抗体、（ｉｉ）該抗ワクチン抗体によって認識される固定化された抗原、および（ｉｉｉ）該抗ワクチン抗体に結合する標識された抗体、を使用し、ここで該抗体は、（ａ）髄膜炎菌に対して殺菌性であるか、または（ｂ）該髄膜炎菌抗原中のコンフォメーション性エピトープを認識する、競合ＥＬＩＳＡアッセイ。
（項目１６）
髄膜炎菌ワクチンサンプルのインビトロ分析のための結合アッセイであって、ここで該アッセイは、ワクチン中の免疫原を使用して、コントロール抗原へのモノクローナル抗体の結合を阻害し、ここで該モノクローナル抗体は、該ワクチン中の免疫原および該コントロール抗原の両方に結合する、結合アッセイ。
（項目１７）
上記項目のいずれか一項に記載のアッセイの使用に続いて配布されたワクチン。
（項目１８）
（ａ）可変領域が配列番号２１および配列番号２２を含むモノクローナル抗体；（ｂ）可変領域が配列番号２３および配列番号２４を含むモノクローナル抗体；（ｃ）可変領域が配列番号２５および配列番号２６を含むモノクローナル抗体；（ｄ）可変領域が配列番号２７および配列番号２８を含むモノクローナル抗体から選択される、髄膜炎菌ｆＨｂｐを認識するモノクローナル抗体。
【国際調査報告】
2015517089.tif 000022
2015517089.tif 000023
2015517089.tif 000024
2015517089.tif 000025
2015517089.tif 000026