(57)【要約】ＣＤ１１ｂ阻害剤を投与することを含む、対象における黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を処置および予防する方法に関する。さらに、ヒトＣＤ１１ｂを発現する非ヒトトランスジェニック動物、ならびに黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態の処置および予防のための新規治療法を特定する方法における前記非ヒトトランスジェニック動物の使用に関する。2015517463.tif 000032
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置する方法であって、
黄色ブドウ球菌感染を有するか、または有する危険性のある対象を選択することと、
前記対象における黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに有効な条件の下で、ＣＤ１１ｂ阻害剤を前記選択された対象に投与することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記黄色ブドウ球菌感染が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）感染である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＤ１１ｂ阻害剤が、タンパク質またはペプチド阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＤ１１ｂ阻害剤が、組換え好中球阻害因子（ｒＮＩＦ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＤ１１ｂ阻害剤が、ＬｕｋＡＢ受容体結合ドメインを含む組換え可溶性タンパク質またはペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記組換え可溶性タンパク質またはペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基１４７〜３３７に対応するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＤ１１ｂ阻害剤が、ＣＤ１１ｂ特異的抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＤ１１ｂ特異的抗体が、ＣＤ１１ｂのＩドメインに結合する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＤ１１ｂ阻害剤が、小分子阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＤ１１ｂ阻害剤が、２−［４−（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−キノリン−１−イル）−ブタ−１，３−ジエニル］−１−チルナフト［１，２−ｄ］チアゾール−１−イウム；クロリド、１−エチル−２−／３−／１−エチルベンゾチアゾリン−２−イリジエン／プロペニル／−チアゾリウム，ヨージド、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択された対象に、前記ＣＤ１１ｂ阻害剤と併せて、抗感染剤、抗生物質、および抗菌剤からなる群から選択される薬剤を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が、処置または予防され、前記状態が、皮膚創傷および感染、組織膿瘍、毛包炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、化膿性関節炎、心筋炎、心内膜炎、ならびに毒素性ショック症候群からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記投与が、経口的に、吸入によって、鼻腔内滴下によって、局所的に、経皮的に、非経口的に、皮下に、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、胸膜内に、腹腔内に、または粘膜への適用によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記投与を繰り返すことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が、乳幼児、若年者、または成人である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が、免疫無防備状態の乳幼児、若年者、または成人である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記黄色ブドウ球菌感染および／または前記黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が予防される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記黄色ブドウ球菌感染および／または前記黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が処置される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ゲノムが安定的に組み込まれた発現構築物を含む、トランスジェニック非ヒト動物であって、前記発現構築物が、ヒトＣＤ１１ｂをコードするポリヌクレオチド配列を含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２０】
前記発現構築物が、ヒトＣＤ１１ｂをコードする前記ポリヌクレオチド配列に機能的に連結された白血球特異的プロモーターをさらに含む、請求項１９に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２１】
前記動物が、齧歯類である、請求項１９に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２２】
前記動物が、マウスである、請求項１９に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２３】
黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに適した候補化合物を特定する方法であって、
候補化合物のコレクションを提供することと、
請求項１９に記載のトランスジェニック非ヒト動物を、ＬｕｋＡＢ媒介性白血球死を誘導することができる作用物質に曝露することと、
前記コレクションからの１つ以上の候補化合物を、前記トランスジェニック動物に投与することと、
前記１つ以上の候補化合物が投与された前記トランスジェニック動物におけるＬｕｋＡＢ媒介性白血球死のレベルを測定することと、
前記１つ以上の候補化合物が投与された前記トランスジェニック動物における前記ＬｕｋＡＢ媒介性白血球死のレベルを、前記１つ以上の候補化合物が投与されなかったトランスジェニック動物におけるＬｕｋＡＢ媒介性白血球死の対照レベルと比較することと、
前記比較に基づき、前記対照レベルと比較して前記トランスジェニック動物における前記ＬｕｋＡＢ媒介性白血球死のレベルを低減する前記コレクションの候補化合物を、黄色ブドウ球菌および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに適した化合物として特定することと、を含む、方法。
【請求項２４】
前記作用物質が、黄色ブドウ球菌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記作用物質が、単離された黄色ブドウ球菌ＬｕｋＡＢタンパク質を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記作用物質が、組換えにより生成されたＬｕｋＡＢタンパク質を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記投与が、前記曝露の前に行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記投与が、前記曝露の後に行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに適した候補化合物を特定する方法であって、
候補化合物のコレクションを提供することと、
請求項１９に記載のトランスジェニック非ヒト動物を黄色ブドウ球菌に曝露することと、
前記コレクションからの１つ以上の候補化合物を、前記トランスジェニック動物に投与することと、
前記１つ以上の候補化合物が投与された前記トランスジェニック動物における黄色ブドウ球菌感染レベルを測定することと、
前記１つ以上の候補化合物が投与された前記トランスジェニック動物における前記黄色ブドウ球菌感染レベルを、前記１つ以上の候補化合物が投与されていないトランスジェニック動物における対照黄色ブドウ球菌感染レベルと比較することと、
前記比較に基づき、前記対照黄色ブドウ球菌感染レベルと比較して前記トランスジェニック動物における黄色ブドウ球菌感染レベルを低減する候補化合物を、黄色ブドウ球菌および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに適した化合物として特定することと、を含む、方法。
【請求項３０】
前記投与が、前記曝露の前に行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記投与が、前記曝露の後に行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができる化合物を特定する方法であって、
候補化合物のコレクションを提供することと、
ヒトＣＤ１１ｂを発現する細胞の集団を提供することと、
前記細胞の集団をＬｕｋＡＢ媒介性細胞毒性を誘導することができる作用物質で処置することと、
前記処置された細胞の集団を、前記候補化合物のコレクションからの１つ以上の候補化合物と接触させることと、
前記１つ以上の候補化合物の存在下および非存在下で、前記処置された細胞の集団におけるＬｕｋＡＢ媒介性細胞毒性レベルを測定することと、
前記１つ以上の候補化合物の存在下と非存在下とで、前記測定されたＬｕｋＡＢ媒介性細胞毒性レベルを比較することと、
前記比較に基づき、候補化合物を特定することであって、前記１つ以上の候補化合物の非存在下と比較して、前記１つ以上の候補化合物の存在下での前記ＬｕｋＡＢ媒介性細胞毒性レベルの減少により、黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができる１つ以上の化合物が特定される、ことと、を含む、方法。
【請求項３３】
細胞毒性の標識マーカーを提供することと、
前記ヒトＣＤ１１ｂを発現する細胞の集団を、前記処置中に前記細胞毒性の標識マーカーに曝露することと、
前記細胞毒性の標識マーカーを検出することであって、前記細胞集団におけるＬｕｋＡＢ媒介性細胞毒性レベルの前記測定が、前記検出に基づいている、ことと、をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞毒性の標識マーカーが、細胞生死判別色素、細胞不透過性色素、および／または細胞溶解のマーカーを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ヒトＣＤ１１ｂを発現する細胞が、白血球である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記ヒトＣＤ１１ｂを発現する細胞が、ヒトＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を発現するように操作されたヒトまたは非ヒト有核細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができる候補化合物を特定する方法であって、
候補化合物のコレクションを提供することと、
ＬｕｋＡＢ結合ドメインを含む単離されたＣＤ１１ｂ受容体またはそのフラグメントを提供することと、
前記単離されたＣＤ１１ｂ受容体またはそのフラグメントを、標識ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／または標識ＬｕｋＡＢタンパク質を含む作用物質で処置することと、
前記処置された、単離されたＣＤ１１ｂ受容体またはそのフラグメントを、前記コレクションからの１つ以上の候補化合物と接触させることと、
１つ以上の候補化合物の存在下および非存在下での、前記単離されたＣＤ１１ｂ受容体またはそのフラグメントへの前記標識ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／または標識ＬｕｋＡＢの結合レベルを測定することと、
前記１つ以上の候補化合物の存在下と非存在下とで、前記単離されたＣＤ１１ｂ受容体またはそのフラグメントへの前記ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／またはＬｕｋＡＢの結合レベルを比較することと、
前記比較に基づいて、黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができる１つ以上の候補化合物を特定することと、を含む、方法。
【請求項３８】
前記１つ以上の候補化合物の非存在下と比較して、前記１つ以上の候補化合物の存在下での前記単離されたＣＤ１１ｂ受容体またはそのフラグメントへのＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／またはＬｕｋＡＢ結合の減少により、前記１つ以上の候補化合物が、黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができるとして特定される、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１２年５月２日出願の米国仮特許出願第６１／６４１，５４３号の恩典を主張するものである。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所より与えられた助成金番号１Ｒ５６ＡＩ０９１８５６−０１Ａ１のもと、政府の援助を受けて行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、黄色ブドウ球菌感染を処置および予防する方法、ならびに黄色ブドウ球菌感染の処置および予防のための新規治療法を特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ」））は、人口の２５％超に片利共生的に定着する細菌である。重要なことに、この生物は、その初期の定着部位を破壊することができ、細菌の播種および疾患をもたらす。黄色ブドウ球菌は、院内感染の主な原因であり、感染性心内膜炎ならびに皮膚および軟組織感染の最も一般的な病原体であり、食中毒の４大原因の１つである。総計で、黄色ブドウ球菌は、米国の病院内で年間１２０万人超の患者に感染している。ヒトの健康に対する黄色ブドウ球菌の脅威は、黄色ブドウ球菌感染に対する最後の砦と考えられる抗生物質、バンコマイシンに耐性である株を含む、抗生物質耐性株（すなわち、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）株）の出現によってさらに強調される。これらの事実は、この重要な病原体に対する新規の治療法を開発する重要性を強調する。
【０００５】
黄色ブドウ球菌は、この細菌が、異なる種類の免疫細胞、特に身体の主要な防御システムを構成する白血球の亜集団による攻撃を無効化し、かつそれに耐えることを可能にする多種多様な毒性因子および毒素を生成する。これらの毒性因子および毒素の生成は、黄色ブドウ球菌に感染状態を維持させる（Ｎｉｚｅｔ，″Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｈｏｗ  Ｌｅａｄｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  Ｓｕｂｖｅｒｔ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  Ｒｅｖｅａｌ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ，″Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０（１）：１３２２（２００７）（非特許文献１））。これらの毒性因子の中で、黄色ブドウ球菌は、２つの非関連タンパク質またはサブユニットの相乗作用によって宿主防御細胞および赤血球の膜を損傷させる、いくつかの二成分性ロイコトキシンを生成する（Ｍｅｎｅｓｔｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｍｏｄｅ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｔａ−Ｂａｒｒｅｌ  Ｐｏｒｅ−Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ａｌｐｈａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ，″Ｔｏｘｉｃｏｌ．３９（１１）：１６６１−１６７２（２００１）（非特許文献２）を参照されたい）。これらの二成分性ロイコトキシンの中で、γ−溶血素（ＨｌｇＡＢおよびＨｌｇＣＢ）およびパントン−バレンタインロイコシジン（ＰＶＬ）が最も良く特徴付けられている。
【０００６】
哺乳類細胞に対するロイコシジンの毒性は、２つの成分の作用を伴う。第１のサブユニットは、クラスＳサブユニット（すなわち、「緩徐溶出型」）と呼ばれ、第２のサブユニットは、クラスＦサブユニット（すなわち、「急速溶出型」）と呼ばれる。ＳおよびＦサブユニットは、相乗的に作用し、単球、マクロファージ、樹状細胞、および好中球（集合的に食細胞として知られる）を含む白血球上に孔を形成する（Ｍｅｎｅｓｔｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｍｏｄｅ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｔａ−Ｂａｒｒｅｌ  Ｐｏｒｅ−Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ａｌｐｈａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ，″Ｔｏｘｉｃｏｌ．３９（１１）：１６６１  １６７２（２００１）（非特許文献２））。二成分性毒素が標的細胞膜に孔を形成する機構は、完全に理解されているわけではない。これらの毒素の提案される作用機構は、多くの場合は受容体を通じてＳサブユニットが標的細胞膜に結合した後、ＦサブユニットがＳサブユニットに結合し、それによりオリゴマーを形成し、次いで該オリゴマーが標的細胞膜中に挿入する予備孔を形成することを含む（Ｊａｙａｓｉｎｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｔｈｅ  Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ  Ｐｏｒｅ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａｎ  Ｏｃｔａｍｅｒ  Ｗｉｔｈ  Ｆｏｕｒ  ＬｕｋＦ  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ａｎｄ  Ｆｏｕｒ  ＬｕｋＳ  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  Ａｒｏｕｎｄ  ａ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ａｘｉｓ，″Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉ．１４（１０）：２５５０  ２５６１（２００５）（非特許文献３））。二成分性ロイコトキシンによって形成された孔は、典型的に、カチオン選択性である。孔形成は、溶解を介して細胞死を引き起こし、それは標的白血球の場合、カチオンの流入に起因する浸透不均衡から生じることが報告されている（Ｍｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ  Ｂｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｔｏｘｉｎ  Ｆｏｒｍｓ  Ｌａｒｇｅ  Ｉｏｎｉｃ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ，″Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４０（２９）：８５１４  ８５２２（２００１）（非特許文献４））。
【０００７】
ＭＲＳＡ感染を処置するのに効果的な治療法の設計は、特に困難である。メチシリンおよび関連抗生物質への耐性に加えて、ＭＲＳＡは、マクロライド（例えば、エリスロマイシン）、β−ラクタマーゼ阻害剤の組み合わせ（例えば、ユナシン、オーグメンチン）、およびフルオロキノロン（例えば、シプロフロキサシン）、ならびにクリンダマイシン、トリメトプリム／スルファメトキシゾール（バクトリム）、およびリファンピンに対する著しいレベルの耐性を有することも見出されている。重篤な黄色ブドウ球菌感染の場合、臨床医は、静脈内バンコマイシンを用いてきた。しかしながら、上記のように、黄色ブドウ球菌のバンコマイシン耐性が報告されている。したがって、黄色ブドウ球菌感染に効果的に効く新たな抗生物質薬を開発する必要性がある。
【０００８】
本発明は、当該技術分野におけるこのような制限および他の制限を克服することに向けられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｎｉｚｅｔ，″Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｈｏｗ  Ｌｅａｄｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  Ｓｕｂｖｅｒｔ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  Ｒｅｖｅａｌ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ，″Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０（１）：１３２２（２００７）
【非特許文献２】Ｍｅｎｅｓｔｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｍｏｄｅ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｔａ−Ｂａｒｒｅｌ  Ｐｏｒｅ−Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ａｌｐｈａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ，″Ｔｏｘｉｃｏｌ．３９（１１）：１６６１−１６７２（２００１）
【非特許文献３】Ｊａｙａｓｉｎｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｔｈｅ  Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ  Ｐｏｒｅ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａｎ  Ｏｃｔａｍｅｒ  Ｗｉｔｈ  Ｆｏｕｒ  ＬｕｋＦ  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ａｎｄ  Ｆｏｕｒ  ＬｕｋＳ  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  Ａｒｏｕｎｄ  ａ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ａｘｉｓ，″Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉ．１４（１０）：２５５０  ２５６１（２００５）
【非特許文献４】Ｍｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ  Ｂｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｔｏｘｉｎ  Ｆｏｒｍｓ  Ｌａｒｇｅ  Ｉｏｎｉｃ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ，″Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４０（２９）：８５１４  ８５２２（２００１）
【発明の概要】
【００１０】
本発明の第１の態様は、対象における黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置する方法に関する。この方法は、黄色ブドウ球菌感染を有する危険性があるか、または有する対象を選択することと、対象における黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに有効な条件の下で、ＣＤ１１ｂ阻害剤を選択された対象に投与することと、を含む。
【００１１】
本発明の別の態様は、ゲノムが、ヒトＣＤ１１ｂをコードするポリヌクレオチド配列を含む安定的に組み込まれた発現構築物を含む、トランスジェニック非ヒト動物に関する。本発明の他の態様は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を使用し、黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに適した候補化合物を特定する方法に関する。
【００１２】
本発明の別の態様は、黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができる化合物を特定する方法に関する。この方法は、候補化合物のコレクションを提供することと、ヒトＣＤ１１ｂを発現する細胞の集団を提供することと、を含む。この方法は、前記細胞の集団を、ＬｕｋＡＢ媒介性細胞毒性を誘導することができる作用物質で処置することと、処置された細胞の集団を、コレクションからの１つ以上の候補化合物と接触させることと、をさらに含む。この方法は、前記１つ以上の候補化合物の存在下および非存在下で、処置された細胞の集団におけるＬｕｋＡＢ媒介性細胞毒性レベルを測定することと、前記１つ以上の候補化合物の存在下と非存在下とで、測定されたＬｕｋＡＢ媒介性細胞毒性レベルを比較することと、をさらに含む。前記１つ以上の候補化合物の非存在下と比較して、前記１つ以上の候補化合物の存在下でのＬｕｋＡＢ媒介性細胞毒性レベルの減少により、黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができる化合物が特定される。
【００１３】
本発明の別の態様は、黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができる候補化合物を特定する方法に関する。この方法は、候補化合物のコレクションを提供することと、ＬｕｋＡＢ結合ドメインを含む単離されたＣＤ１１ｂ受容体またはそのフラグメントを提供することと、を含む。この方法は、単離されたＣＤ１１ｂ受容体またはそのフラグメントを、標識ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／または標識ＬｕｋＡＢタンパク質を含む作用物質で処置することと、処置された、単離されたＣＤ１１ｂ受容体またはそのフラグメントを、コレクションからの１つ以上の候補化合物と接触させることと、をさらに含む。単離されたＣＤ１１ｂ受容体またはそのフラグメントへの標識ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／または標識ＬｕｋＡＢの結合レベルを、１つ以上の候補化合物の存在下および非存在下で測定し、単離されたＣＤ１１ｂ受容体またはそのフラグメントへの標識ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／またはＬｕｋＡＢの結合レベルを、前記１つ以上の候補化合物の存在下と非存在下とで比較する。この比較に基づいて、黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができる１つ以上の候補化合物を特定する。
【００１４】
黄色ブドウ球菌は、米国の病院内で年間１２０万超の患者に感染し、米国内で年間約４０，０００人の死亡を伴う。この細菌は、院内感染および市中感染の主な原因であり、感染性心内膜炎、皮膚、および軟組織感染の最も一般的な病原体であり、食中毒の４大原因の１つである。ヒトの健康に対する黄色ブドウ球菌の脅威は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含む、抗生物質耐性株の出現によってさらに強調される。これらの事実は、新規の治療法の開発のための新たな標的を特定する重要性を強調する。本発明は、ＣＤ１１ｂが、黄色ブドウ球菌毒性因子ロイコトキシンＡＢ（ＬｕｋＡＢ）に対するヒト細胞受容体であるという発見に関する。ＬｕｋＡＢは、メチシリン感受性およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の両方の、ヒト好中球に対する細胞毒性特性に関与し、ヒト細胞上のその細胞受容体の特定により、黄色ブドウ球菌感染から防御するための新たな治療的アプローチが可能になる。さらに、この毒性受容体の発見は、黄色ブドウ球菌感染について研究し、新規の治療法を特定するための改善された動物モデルの作製およびスクリーニングアッセイを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＬｕｋＡＢおよび黄色ブドウ球菌細胞毒性を示す。図１Ａは、同質遺伝子型の野生型（ＷＴ）およびΔｌｕｋＡＢ変異ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ株から単離された分泌タンパク質による中毒化時のヒト多形核白血球（ＰＭＮ）の生存率のグラフである。ΔｌｕｋＡＢ変異株からの分泌タンパク質で処置された細胞において観察された生存率の増加は、プラスミドによりｌｕｋＡＢをトランスで発現させることによって反転した（ΔｌｕｋＡＢ／ｐｌｕｋＡＢ）。宿主細胞の生存率は、細胞代謝活性を監視する試薬であるＣｅｌｌＴｉｔｅｒを用いて監視した。図１Ｂは、ヒト全血および一次ヒトＰＭＮ中の黄色ブドウ球菌生存を示すグラフである。コロニー形成単位は、インプットＣＦＵに対して正規化した。図１Ｃは、表示された株で感染させたマウスの感染後９６時間の腎臓における細菌負荷を示すグラフである。結果は、６超の異なるドナー（図１Ａおよび１Ｂ）および１群当たり２０匹のマウス（図１Ｃ）からのＰＭＮ／全血の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。＊は、ＷＴと比較して統計的に有意な差を示す（ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０．０５）。
【図２】異なるヒト細胞におけるＬｕｋＡＢ誘導細胞毒性の用量反応である。このグラフは、精製されたＬｕｋＡＢによる中毒化時の表示された細胞の生存率を示す。宿主細胞の生存率は、細胞代謝活性を監視する試薬であるＣｅｌｌＴｉｔｅｒを用いて監視した。結果は、三つ組の試料の平均＋Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図３】一次好中球に対するＬｕｋＡＢおよび黄色ブドウ球菌の細胞毒性を示す。このグラフは、同質遺伝子型の野生型（ＷＴ）およびΔｌｕｋＡＢ変異ＭＳＳＡ株から単離された分泌タンパク質による中毒化時のヒト（ｈＰＭＮ）および一次マウス（ｍＰＭＮ）好中球の生存率を示す。宿主細胞の生存率は、細胞代謝活性を監視する試薬であるＣｅｌｌＴｉｔｅｒを用いて監視した。結果は、少なくとも６つの独立した試料の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図４】ＬｕｋＡＢが、ヒトインテグリンＭａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）と直接相互作用することを示す。図４Ａは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズを使用する、ｈｉｓタグ付きＬｕｋＡＢによるビオチン化ＰＭＮ−ＨＬ６０溶解物のプルダウンであり、試料は、ニトロセルロース膜に転写され、ＤｙＬｉｇｈｔストレプトアビジンでプローブされた。図４Ｂは、抗ＣＤ１１ｂ抗体を使用する、上記のｈｉｓタグ付きロイコトキシンによるＰＭＮ−ＨＬ６０溶解物のプルダウンの免疫ブロットである。図４Ｃは、上記のｈｉｓタグ付きロイコトキシンによる精製されたＭａｃ−１のプルダウンのＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙタンパク質染色であり、図４Ｄは、抗ＣＤ１１ｂ抗体による対応する免疫ブロットを示す。
【図５】ＣＤ１１ｂが、宿主細胞のＬｕｋＡＢ媒介性殺滅に必要かつ十分であることを実証する。図５Ａは、１０μｇ／ｍｌのＬｕｋＡＢによる１時間のＨＬ６０またはＰＭＮ−ＨＬ６０細胞の中毒化後の細胞生存率を示す棒グラフである。細胞生存率は、代謝色素ＣｅｌｌＴｉｔｅｒで測定した。図５Ｂは、非標的化（ＮＴ）ｓｈＲＮＡウイルスと比較して、ＣＤ１８  ｓｈＲＮＡウイルスで形質導入されたＰＭＮ−ＨＬ６０細胞におけるＣＤ１８およびＣＤ１１ｂ表面レベルのフローサイトメトリープロットである。図５Ｃは、１０μｇ／ｍｌのＬｕｋＡＢまたはＰＶＬによる１時間のＮＴおよびＣＤ１８  ｓｈＲＮＡ  ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞の中毒化に伴う孔形成を定量化する棒グラフである。孔形成は、蛍光色素臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で測定した。図５Ｄは、図５Ｂについて記載の通り測定されたＣＤ１１ｂ  ｓｈＲＮＡウイルスまたは非標的化（ＮＴ）ｓｈＲＮＡウイルスで形質導入されたＨＬ６０細胞およびＰＭＮ−ＨＬ６０細胞におけるＣＤ１８およびＣＤ１１ｂ表面レベルを示す。図５Ｅは、１０μｇ／ｍｌのＬｕｋＡＢまたはＰＶＬによる１時間のＮＴおよびＣＤ１１ｂ  ｓｈＲＮＡ  ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞の中毒化に伴う孔形成を定量化する棒グラフである。孔形成は、ＥｔＢｒで測定した。図５Ｆは、４０μｇ／ｍｌのＬｕｋＡＢまたはＰＶＬによる２時間の、ＣＤ１１ｂをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の中毒化を示す。ＣＤ１１ｂ＋細胞の枯渇率は、中毒化後に細胞を抗ＣＤ１１ｂ抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を行うことによって決定した。図５Ｆの棒グラフは、２つの独立した実験の平均を示す。ＦＡＣＳプロットは、代表的な実験に基づく。全ての他のデータは、別段の指示がない限り、三つ組の試料の平均±標準偏差（ＳＤ）として表される。＊＊＊は、一元配置分散分析によるＰ＜０．０００１を示す。
【図６】ＣＤ１８のノックダウンが、ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞表面上の複数のβ２インテグリンの枯渇をもたらすことを示す。ＮＴにおける特定の抗体（中塗りの黒色）およびＰＭＮ−ＨＬ６０細胞におけるＣＤ１８  ｓｈＲＮＡ（灰色線）を用いるフローサイトメトリーによって決定されるＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、およびＣＤ１１ａ細胞表面レベルを、アイソタイプ対照抗体（黒色線）と比較した。
【図７】ＬｕｋＡＢが、ＣＤ１１ｂのＩドメインを標的として細胞を殺滅することを実証する。図７Ａは、３つの異なる抗ＣＤ１１ｂクローン（α−ＣＤ１１ｂ）を含む１０μｇ／ｍｌのインテグリン特異的抗体（α−ＣＤ１１ａ、α−ＣＤ１１ｃ、およびα−ＣＤ１８）、または抗体なし（Ｎｏ  Ａｂ）で処置された後、２．５μｇ／ｍｌのＬｕｋＡＢで１時間中毒化したＰＭＮの生存率を示す棒グラフである。膜損傷は、蛍光色素ＳＹＴＯＸグリーンで測定した。結果は、８つのドナーから単離されたＰＭＮの平均±ＳＥＭを表す。図７Ｂは、１０μｇ／ｍｌのＬＭ２／１またはアイソタイプ対照で処理された後、中毒化され、上記の通り評価されたＰＭＮの生存率を示す。結果は、４つのドナーから単離されたＰＭＮの平均±ＳＥＭを表す。図７Ｃは、抗ＣＤ１１ｂ抗体を用いるフローサイトメトリー分析により決定される、ＰＭＮ−ＨＬ６０と比較した、空ベクター（ＥＶ）、ＷＴ  ＣＤ１１ｂ、またはＩ欠失ＣＤ１１ｂウイルスで安定的に形質導入されたＨＬ６０細胞上のＣＤ１１ｂ表面レベルを示す。図７Ｃに記載される安定的に形質導入されたＨＬ６０細胞系の生存率を、１０μｇ／ｍｌのＬｕｋＡＢで１時間中毒化した後にＰＭＮ−ＨＬ６０と比較し、膜損傷（図７Ｄ）および細胞代謝（図７Ｅ）を、それぞれ図７Ａおよび図５Ａに記載の通り評価した。データは、三つ組の試料の平均±ＳＤとして表される。＊は、一元配置分散分析によるＰ＜０．０５を示し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を示し、＊＊＊は、Ｐ＜０．０００１を示す。
【図８】ＬｕｋＡＢが、マウスＣＤ１１ｂ  Ｉドメインと比較して、ヒトＣＤ１１ｂ  Ｉドメインに優先的に結合することを示す。図８Ａは、ＥｔＢｒを用いて測定された、２０μｇ／ｍｌのＬｕｋＡＢまたは１０μｇ／ｍｌのＬｕｋＥＤによる１時間の中毒化後の腹腔浸出細胞（ＰＥＣ）における孔形成を示す棒グラフである。データは、三つ組の試料の平均±ＳＤとして表される。図８Ｂは、抗Ｌｙ６Ｇおよび抗ＣＤ１１ｂ抗体を使用した、ＰＥＣ上のＬｙ６ＧおよびＣＤ１１ｂ表面レベルを示すフローサイトメトリー分析である。図８Ｃは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ法を使用した、ＤＮＡＳＴＡＲ  ＭｅｇＡｌｉｎｅソフトウェアを用いて構築されたヒト、ゴリラ、ウサギ、およびマウスＩドメインのアミノ酸配列アラインメントの系統樹である。図８Ｄは、競合ドットブロットアッセイの結果を示し、精製された組換えヒトＣＤ１１ｂ  Ｉドメインを、５μｇ／ｍｌの蛍光標識されたＬｕｋＡＢ（ＦＩＴＣ−ＬｕｋＡＢ）および１０倍過剰（５０μｇ／ｍｌ）の未標識ＬｕｋＡＢまたは未標識ＰＶＬとインキュベートした。ＦＩＴＣ−ＬｕｋＡＢ結合は、デンシトメトリーによって定量化した。図８Ｅは、５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−ＬｕｋＡＢとインキュベートした精製された組換えヒトまたはマウスＣＤ１１ｂ  Ｉドメインのドットブロットである。ＦＩＴＣ−ＬｕｋＡＢ結合は、デンシトメトリーによって定量化した。
【図９】ＣＤ１１ｂが、細胞をエクスビボ感染における細胞外黄色ブドウ球菌によるＬｕｋＡＢ媒介性殺滅に対して感受性にすることを実証する。図９Ａは、表示された感染多重度（ＭＯＩ）における、非オプソニン化された野生型（ＷＴ）ＣＡ−ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００または同質遺伝子型ｌｕｋＡＢ変異体（ΔｌｕｋＡＢ）による２時間の感染後の、図５Ｂに記載される非標的（ＮＴ）またはＣＤ１１ｂ  ｓｈＲＮＡ  ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞の生存率を示すグラフである。膜損傷は、ＳＹＴＯＸグリーンで測定した。データは、三つ組の試料の平均±ＳＤとして表される。図９Ｂは、１０μｇ／ｍｌのＣＤ１１ｂ特異的抗体（３つの異なるクローン）に続いて表示されたＭＯＩの非オプソニン化ＷＴ  ＵＳＡ３００による１時間の感染で処置されたＰＭＮの生存率を示すグラフである。膜損傷は、ＳＹＴＯＸグリーンで測定した。結果は、８つのドナーから単離されたＰＭＮの平均±ＳＥＭを表す。＊は、一元配置分散分析によるＰ＜０．０５を示し、＊＊＊は、Ｐ＜０．０００１を示す。
【図１０】ＣＤ１１ｂのノックダウンが、ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞による黄色ブドウ球菌のオプソニン化媒介性貪食に影響しないことを示す。オプソニン化を用いて（図１０Ｂ）または用いずに（図１０Ａ）様々なＭＯＩのＧＦＰ−ＵＳＡ３００に感染させたＮＴおよびＣＤ１１ｂ  ｓｈＲＮＡ  ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞における貪食された細菌の量は、フローサイトメトリーによって決定した。リソスタフィンの存在下で感染を行い、細胞外細菌からのＧＦＰシグナルを排除した。
【図１１】貪食された黄色ブドウ球菌のＬｕｋＡＢ媒介性細胞損傷および増殖の回復が、ＣＤ１１ｂに依存することを実証する。図１１Ａは、様々なＭＯＩのオプソニン化ＷＴまたはΔｌｕｋＡＢ  ＵＳＡ３００による９０分間の感染後の図５Ｄに記載される非標的（ＮＴ）またはＣＤ１１ｂ  ｓｈＲＮＡ  ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞の生存率を示すグラフである。膜損傷は、ＳＹＴＯＸグリーンで測定した。データは、三つ組の試料の平均±ＳＤとして表される。図１１Ｂは、ＭＯＩ１０でのＮＴまたはＣＤ１１ｂ  ｓｈＲＮＡ  ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞の感染時のオプソニン化ＷＴまたはΔｌｕｋＡＢ  ＵＳＡ３００の増殖を示すグラフである。細菌コロニー形成単位は、同期化の１、２、または３時間後にＰＭＮ−ＨＬ６０細胞を溶解した後に希釈平板法によって決定した。増殖％を決定するために、細菌数をゼロ時点でのインプットに対して正規化し、これを１００％に設定した。結果は、２つの独立した感染からの三つ組の試料の平均±ＳＤを表す。図１１Ｃの顕微鏡写真は、感染前に蛍光コンジュゲート抗ＣＤ１１ｂ抗体またはアイソタイプ対照で染色することによって決定される、ＭＯＩ１０のオプソニン化ＧＦＰ−ＵＳＡ３００による感染後のＰＭＮにおける、または感染していないＰＭＮにおけるＣＤ１１ｂの局在化を示す。同期化後に細胞を固定し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＰｅｒｓｏｎａｌＤＶ生細胞撮像システムを使用して画像を撮像した。各条件の代表的な画像を示す。図１１Ｄは、ＬＭ２／１抗ＣＤ１１ｂ抗体またはアイソタイプ対照で前処置されたＰＭＮの、ＭＯＩ１０のＧＦＰ−ＵＳＡ３００による感染を示す。赤色のＥｔＢｒ染色は、孔形成を示す。同期化後０分および３０分に蛍光顕微鏡を使用して画像を撮像し、３０分後の代表的な画像を示す。図１１Ｅは、図１１Ｄに示される画像から得られた視野当たりの臭化エチジウム陽性ＰＭＮの定量化を示すグラフである。結果は、感染後（Ｔ０）および３０（Ｔ３０）分での２つのドナーから単離されたＰＭＮの感染からの３つの独立した計数の平均を表す。＊＊は、一元配置分散分析によるＰ＜０．００１を示し、＊＊＊は、Ｐ＜０．０００１を示す。
【図１２】抗ＣＤ１１ｂ  ＬＭ２／１抗体によるＰＭＮの処置が、黄色ブドウ球菌の貪食を阻害しないことを示す。α−ＣＤ１１ｂ  ＬＭ２／１抗体またはアイソトープ対照抗体による前処置後にオプソニン化ＧＦＰ−ＵＳＡ３００に感染したＰＭＮにおける細菌局在化。同期化直後（Ｔ０）に蛍光画像を撮像した。赤色のバックグラウンドＥｔＢｒ染色もこの時点で示される。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明の第１の態様は、対象における黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置する方法に関する。この方法は、黄色ブドウ球菌感染を有する危険性があるか、または有する対象を選択することと、対象における黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに有効な条件の下で、ＣＤ１１ｂ阻害剤を選択された対象に投与することと、を含む。
【００１７】
現在、黄色ブドウ球菌感染の大部分は、ＭＲＳＡに起因する（Ｍｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ａｍｏｎｇ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，″Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５５：６６６−６７４（２００６）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。以前は、ＭＲＳＡ感染の大部分は、院内起源（ＨＡ−ＭＲＳＡ）であると考えられていたが、現在、感染は、医療施設に曝露していない他の健常な個人において発生している（すなわち、コミュニティ関連ＭＲＳＡ（ＣＡ−ＭＲＳＡ））（Ｋｌｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，″Ｊａｍａ  ２９８：１７６３−１７７１（２００７）およびＫｌｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｕｎｉｔｓ  ｉｎ  ＵＳ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ，１９９２−２００３，″Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４２：３８９−３９１（２００６）、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらのＣＡ−ＭＲＳＡ関連の感染はより重篤であり、ＨＡ−ＭＲＳＡ感染と比較して、より高い死亡率をもたらす（Ｄｅｌｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，″Ｌａｎｃｅｔ  ３７５：１５５７−１５６８（２０１０）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。近年の報告は、ＨＡ−ＭＲＳＡ感染と関連付けられるものと比較して、ＣＡ−ＭＲＳＡ感染と関連付けられる株の毒性の増加が、主に好中球（ＰＭＮ）媒介性殺滅を回避するＣＡ−ＭＲＳＡ関連株の強化された能力に起因することを示唆した（Ｖｏｙｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  Ｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｔｏ  Ａｖｏｉｄ  Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ，″Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：３９０７−３９１９（２００５）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｋｅｙ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＭＲＳＡ，″Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３：１５１０−１５１４（２００７）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｅｐｉｄｅｍｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，″Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６：５８８３−５８８８（２００９）、Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｃｈ��ｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  Ｔｈａｔ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，″Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９：８１４−８２５（２０１１）、およびＡｌｏｎｚｏ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｃｏｃｉｄｉｎ  ＥＤ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ，″Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８３：４２３−４３５（２０１２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。黄色ブドウ球菌は、細胞毒素および細胞溶解ペプチドのコレクションでＰＭＮを標的化および殺滅することによって、ＰＭＮ媒介性殺滅を回避する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｋｅｙ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＭＲＳＡ，″Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３：１５１０−１５１４（２００７）、Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  Ｔｈａｔ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，″Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９：８１４−８２５（２０１１）、Ａｌｏｎｚｏ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｃｏｃｉｄｉｎ  ＥＤ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ，″Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８３：４２３−４３５（２０１２）、Ｌｏｆｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐａｎｔｏｎ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ  Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ  ｉｓ  ａ  Ｖｅｒｙ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ，″ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．６：ｅ１０００７１５（２０１０）、およびＶｅｎｔｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｔｗｏ−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，″ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ５：ｅ１１６３４（２０１０）、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）。この点に関して、ヒト感染と関連付けられる黄色ブドウ球菌株は、最大４つの異なる二成分性ロイコトキシンを生成することができる。これらの二成分性ロイコトキシンは、宿主食細胞に対する顕著な選択性を呈する毒素のβ−バレル孔形成ファミリーのメンバーである。ブドウ球菌ロイコトキシンの細胞毒性特性は、インビトロでの標的細胞膜における八量体孔の形成に起因し、これは、細胞膨潤をもたらし、最終的に細胞死に至る（Ｆｅｒｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，��Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｂｉ−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｇａｍｍａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎｓ  ａｎｄ  Ｌｅｕｃｏｃｉｄｉｎｓ  Ｗｉｔｈ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，″Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４１４：１０８−１２６（１９９８）、Ｊａｙａｓｉｎｇｈｅ  ＆  Ｂａｙｌｅｙ，″Ｔｈｅ  Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ  Ｐｏｒｅ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａｎ  Ｏｃｔａｍｅｒ  Ｗｉｔｈ  Ｆｏｕｒ  ＬｕｋＦ  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ａｎｄ  Ｆｏｕｒ  ＬｕｋＳ  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  Ａｒｏｕｎｄ  ａ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ａｘｉｓ，″Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１４：２５５０−２５６１（２００５）、Ｓｕｇａｗａｒａ−Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｔｗｏ−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｇａｍｍａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｉｎｔｏ  Ｈｅｔｅｒｏｈｅｐｔａｍｅｒｉｃ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｏｒｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ａｌｔｅｒｎａｔｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｒａｔｉｏｓ  ｏｆ  ３：４  ａｎｄ  ４：３，″Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４７４７−４７５６（２００２）、Ｍｅｎｅｓｔｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｍｏｄｅ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｔａ−Ｂａｒｒｅｌ  Ｐｏｒｅ−Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ａｌｐｈａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ，″Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３９：１６６１−１６７２（２００１）、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）。４つの異なる二成分性ロイコトキシンの中で、ロイコトキシンＡＢ（ＬｕｋＡＢ）は、主に、ヒト好中球に対するＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ両方のそれぞれの細胞毒性特性に関与する（下記実施例、およびその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｏｒｒｅｓの米国特許公開第２０１１／０２７４６９３号参照）。
【００１８】
毎年ＭＲＳＡにかかる多数の個人を考えると、これらの感染の相当な割合が、伝統的な抗生物質処置の経過に対して不能となる可能性がある。そのような感染を処置する革新的な手法は、黄色ブドウ球菌感染に対する防御に関与する最も重要な生得的免疫細胞であるＰＭＮの殺滅に関与する、ＬｕｋＡＢ等の黄色ブドウ球菌毒性因子を阻害することである。本明細書に記載の通り、出願人は、ヒトＰＭＮ上のＬｕｋＡＢの細胞受容体としてＣＤ１１ｂを特定した。ＬｕｋＡＢのＣＤ１１ｂへの結合は、ＬｕｋＡＢ細胞毒性の第１のステップであり、ＬｕｋＡＢオリゴマー化および孔形成が続き、細胞死に至る。したがって、ＣＤ１１ｂ阻害剤等のＬｕｋＡＢ／ＣＤ１１ｂ相互作用を阻害する薬剤は、ＬｕｋＡＢ細胞毒性をブロックし、さらにはＰＭＮの枯渇を予防し、生得的免疫系による黄色ブドウ球菌の自然排除を促進するために臨床的に有効である。本発明の好適な実施形態において、ＣＤ１１ｂ阻害剤は、その生理的リガンドに対するＣＤ１１ｂの結合に干渉することなく、ＣＤ１１ｂ／ＬｕｋＡＢ相互作用を選択的に阻害する。
【００１９】
本発明のこの態様に従い、好適なＣＤ１１ｂ阻害剤としては、非限定的に、タンパク質またはペプチド阻害剤、抗体、および小分子が挙げられ、これらのうちの多くは、以下に記載の通り当該技術分野において知られている。
【００２０】
ＣＤ１１ｂの例示のペプチド阻害剤は、ＵＫ−２７９２７６としても知られる組換え好中球阻害因子（ｒＮＩＦ）を含む。ＮＩＦは、イヌ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｃａｎｉｎｕｍ）から単離およびクローニングされた４１−ｋＤａ糖タンパク質である（Ｍｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，″Ａ  Ｈｏｏｋｗｏｒｍ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈａｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ａ  Ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８，″Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０９（１３）：１０００８−１００１５（１９９４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＮＩＦは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体複合体（Ｍａｃ−１、Ｍｏ１、αＭβ２、およびＣＲ３としても知られる）に高い親和性で結合し、それにより内皮細胞上でその生理的リガンドへのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体の結合をブロックする。本発明に従い、ｒＮＩＦ（ＵＫ−２７９２７６）を含む治療組成物は、ＣＤ１１ｂとのＬｕｋＡＢの相互作用を容易に阻害し、その後誘導される細胞毒性を予防する。
【００２１】
本発明の方法における使用に適した別の例示のタンパク質またはペプチド阻害剤は、ＬｕｋＡＢ受容体結合ドメインを含む組換え可溶性タンパク質である。本発明の好適な実施形態において、可溶性タンパク質は、組換えヒトＣＤ１１ｂタンパク質またはＣＤ１１ｂ  ＬｕｋＡＢ結合ドメインを含む。ＬｕｋＡＢ結合ドメインを含む例示の可溶性タンパク質は、ＣＤ１１ｂのＩドメインを含む可溶性タンパク質またはそのフラグメントである。ＣＤ１１ｂのＩドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸残基１４７〜３３７（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００６３２）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の残基１４７〜３３７（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１１３９２８０）にまたがる。ＣＤ１１ｂタンパク質を含む別の例示の可溶性タンパク質は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｎａらの″Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  β２  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８，″Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：３１０６−３１１０（１９９１）により記載される可溶性ヒトＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体である。本発明のこの態様に従い、可溶性ＬｕｋＡＢ受容体結合タンパク質を含む本発明の治療組成物は、黄色ブドウ球菌ＬｕｋＡＢ毒性因子に結合し、そのＣＤ１１ｂ発現標的細胞（例えば、食細胞）との相互作用およびその後誘導される細胞毒性を予防する。
【００２２】
本発明のこの態様の別の実施形態において、ＣＤ１１ｂ阻害剤は、ＣＤ１１ｂまたはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８特異的抗体である。本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、天然供給源または組換え供給源に由来する無傷の免疫グロブリン、ならびに無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分（すなわち、抗原結合部分）を含むことを意味する。本発明の抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）、ペンタボディ（ｐｅｎｔａｂｏｄｙ）、ナノボディ、遺伝子操作された形態の抗体、およびそれらの組合せが挙げられる。好適な抗体としては、全長（すなわち、天然に存在するか、または正常な免疫グロブリン遺伝子フラグメント組換えプロセスによって形成される）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）およびその免疫活性フラグメント（すなわち、全長免疫グロブリン分子の特定結合部分を含む）が挙げられ、これらも天然に存在し得るか、または自然界で合成され得る。したがって、用語「抗体フラグメント」は、例えばＦ（ａｂ′）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖ，ｓｃＦｖ等の抗体の一部分を含む。構造に関係なく、抗体フラグメントは、全長抗体によって認識される同じ抗原と結合し、本発明の文脈では、ＣＤ１１ｂまたはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に特異的に結合し、ＬｕｋＡＢ結合を妨げる。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ＣＤ１１ｂのＬｕｋＡＢ結合ドメイン、すなわちＣＤ１１ｂのＩドメインに結合するが、ＣＤ１１ｂの他のドメインに結合しないため、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体の他の生理的リガンドが受容体に結合するのを可能にする一方で、黄色ブドウ球菌ＬｕｋＡＢ結合を特異的にブロックする。抗体および抗体フラグメントを作製およびスクリーニングする方法は、当該技術分野において周知である。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体は、任意の哺乳類動物、例えば、非限定的に、齧歯類、ウサギ、イヌ、ヤギ、ウマ、ラクダ、ラマ、ニワトリ、ヒトに由来し得る。
【００２４】
モノクローナル抗体の生成方法は、当該技術分野において周知の技術を使用して行われ得る（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ−ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ（Ｍａｒｙ  Ａ．Ｒｉｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈｅａｔｈｅｒ  Ｍ．Ｌａｄｙｍａｎ  ｅｄｓ．，１９９５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一般に、このプロセスは、関心対象の抗原（すなわち、Ｃｄ１１ｂまたはそのフラグメント）でインビボまたはインビトロであらかじめ免疫化された哺乳類の脾臓から免疫細胞（リンパ球）を得ることを含む。
【００２５】
次いで、抗体分泌リンパ球を、骨髄腫細胞、または細胞培養物中で無限に複製することができる形質転換細胞と融合させ、それにより不死化免疫グロブリン分泌細胞株を生成する。哺乳類骨髄種細胞、または細胞培養物中で無限に複製することができる他の融合パートナーとの融合は、標準の周知技術によって、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他の融合剤を使用することによって達成される（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｏｈｌｅｒ，″Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｓｉｏｎ，″Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：５１１（１９７６）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。不死化細胞株は、好ましくはマウスであるが、他の哺乳類種の細胞に由来してもよく、ある栄養素の利用に必須の酵素を欠損し、急速な増殖が可能であり、良好な融合能力を有するように選択される。得られる融合細胞、すなわちハイブリドーマを培養し、得られるコロニーを、所望のモノクローナル抗体の生成についてスクリーニングする。そのような抗体を生成するコロニーをクローニングし、インビボまたはインビトロのいずれかで増殖させて、大量の抗体を生成する。
【００２６】
本発明の別の実施形態において、モノクローナルＣＤ１１ｂ抗体または抗体フラグメントは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの″Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ，″Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載の技術を使用して作製された抗体ファージライブラリーから単離することができる。それら全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｍａｋｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，″Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）、およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｂｙ−Ｐａｓｓｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｖ−Ｇｅｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  Ｐｈａｇｅ，″Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）は、ファージライブラリーを使用した、マウスおよびヒト抗体の単離についてそれぞれ説明する。次の刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の生成（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアルな感染およびインビボ組換えについて説明している（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替物である。
【００２７】
あるいは、モノクローナル抗体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号に記載のような組換えＤＮＡ法を使用して作製することができる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅させるオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲによって、成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞から単離される。次いで、重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドは、好適な発現ベクターにクローニングされ、該ベクターは、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を生成しない大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞等の宿主細胞にトランスフェクトされたときに、モノクローナル抗体を生成する。
【００２８】
ＣＤ１１ｂ抗体は、ヒト化抗体またはキメラ抗体でもあり得る。非ヒト（例えば、齧歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの高頻度可変領域からの残基が、所望の抗体特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変領域からの残基により置き換えられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見出されない残基を含んでよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練させる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および典型的に２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、高頻度可変ループの全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のそれである。ヒト化抗体は、任意で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にヒト免疫グロブリンのそれも含む。さらなる詳細については、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００２９】
キメラ抗体は、好ましくは、ヒト抗体定常領域に実質的または排他的に由来する定常領域、およびヒト以外の哺乳類からの可変領域の配列に実質的または排他的に由来する可変領域を有する。キメラ化プロセスは、マウス（または他の非ヒト哺乳類）抗体の高頻度可変領域またはＣＤＲ以外の可変領域を、対応するヒト配列で置き換えることによってもより効果的にすることができる。ＣＤＲ以外の可変領域は、可変フレームワーク領域（ＦＲ）としても知られている。本発明のさらに他のモノクローナル抗体は、それらがＬｕｋＡおよび／またはＬｕｋＢならびにＣＤ１１ｂの両方に対し特異性を有することにおいて二重特異性である。二重特異性抗体は、好ましくは、ヒトであるか、またはヒト化される。
【００３０】
本明細書の実施例に記載の通り、ＣＤ１１ｂ特異的抗体は、当該技術分野において知られている（それら全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｔｗｏ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏ１  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，″Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３２５９−３２６３（１９８６）、およびＪａｅｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｉｓｃｈｅｍｉａ−Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｌｉｖｅｒ，″Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １７（５）９１５−９２３（１９９３）も参照）。特に好適な抗体は、ＣＤ１１ｂのヒトＩドメインに結合するマウスＬＭ２／１  ＣＤ１１ｂ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）である。ＬＭ２／１  ＣＤ１１ｂ抗体と同じ抗原結合ドメインを有する同様の抗体、すなわち、ヒト抗体またはヒト化抗体も本発明の方法での使用に好適である。多数の他のヒトＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８抗体も市販されており、例えば、ＤＡＫＯ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）からの抗ＣＲ３（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）抗体および２ＬＰＭ１９ｃ（抗ＣＤ１１ｂ抗体）、ならびにＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）からのαＭ−４４抗体（ＣＤ１１ｂ）を参照されたい。
【００３１】
本発明のこの態様の別の実施形態において、好適なＣＤ１１ｂ阻害剤は、小分子阻害剤である。好適な小分子ＣＤ１１ｂ阻害剤は、当該技術分野において知られており、２−［４−（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−キノリン−１−イル）−ブタ−１，３−ジエニル］−１−チルナフト［１，２−ｄ］チアゾール−１−イウム；クロリド（化合物１）およびその誘導体、ならびに１−エチル−２−／３−／１−エチルベンゾチアゾリン−２−イリジエン／プロペニル／−チアゾリウム；ヨージド（化合物２）およびその誘導体が挙げられる（Ｂａｎｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  ３  Ｂｌｏｃｋ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｂｕｒｓｔ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ，″Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．３０４（３）：１０１６−１０２４（２００３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらの小分子阻害剤（すなわち、化合物１および２）の好適な誘導体は、インビトロリガンド結合アッセイまたは細胞接着アッセイを使用して測定される、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体複合体へのリガンド結合をブロックする能力を維持する任意の誘導体化合物を含む。本発明の方法での使用にも好適な例示の誘導体小分子阻害剤は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｎｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  ３  Ｂｌｏｃｋ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｂｕｒｓｔ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ，″Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．３０４（３）：１０１６−１０２４（２００３）により説明される。
【００３２】
本発明の方法での使用に好適なＣＤ１１ｂの別の小分子阻害剤は、Ｎ−［９Ｈ−（２，７−ジメチルフルオレニル−９−メトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシン（ＮＰＣ  １５６６９）を含む（Ｂａｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｎ−［９Ｈ−（２，７−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｌｕｏｒｅｎｙｌ−９−ｍｅｔｈｏｘｙ）ｃａｒｂｏｎｙｌ］−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ，ＮＰＣ  １５６６９，Ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８  Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，″Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２３（２）：１３９−４９（１９９２）参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００３３】
本発明の方法に従う処置に好適な対象としては、非限定的に、任意の動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトが挙げられる。好適な対象としては、免疫無防備状態および非免疫無防備状態の乳幼児、若年者、および成人が挙げられる。本発明の一実施形態において、対象は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染を有するか、または有する危険性がある。本発明の別の実施形態において、対象は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）感染を有するか、または有する危険性がある。他の好適な対象としては、黄色ブドウ球菌感染から生じる状態、すなわち黄色ブドウ球菌関連状態、例えば、皮膚創傷および感染、組織膿瘍、毛包炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、化膿性関節炎、心筋炎、心内膜炎、ならびに毒素性ショック症候群等を有し得るか、または発症する危険性がある対象が挙げられる。
【００３４】
本発明の一実施形態において、ＣＤ１１ｂ阻害剤は、黄色ブドウ球菌感染または関連状態にかかる危険性のある対象における黄色ブドウ球菌感染の発症を予防、遅延、または阻害するように予防的に投与される。本発明のいくつかの実施形態において、ＣＤ１１ｂ阻害剤の予防的投与は、個体における黄色ブドウ球菌感染を完全に予防するのに有効である。他の実施形態において、予防的投与は、さもなければそのような投与が無い状態では発症する感染を、完全に予防する、すなわち、個体における黄色ブドウ球菌感染を実質的に予防または阻害するのに有効である。
【００３５】
本発明の別の実施形態において、ＣＤ１１ｂ阻害剤は、黄色ブドウ球菌感染を有する個体に治療的に投与され、感染のさらなる進展を阻害する、すなわち、個体における他の細胞への感染の広がりを阻害する。
【００３６】
本発明の治療組成物は、処置される黄色ブドウ球菌感染の性質に応じて、併用療法の一部として別の活性剤と併せて投与することができる。そのような追加の活性剤としては、抗感染剤、抗生物質、および抗菌剤が挙げられる。
【００３７】
本発明において有効であり得る代表的な抗感染剤としては、バンコマイシンおよびリソスタフィンが挙げられる。他の抗感染剤としては、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＴｏｒｒｅｓらの米国特許出願公開第２０１１／０２７４６９３号に記載のＬｕｋＡＢ阻害剤、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＴｏｒｒｅｓらの米国特許出願公開第２０１３／００１７２０３号に記載のＬｕｋＥＤ阻害剤または抗体、およびその全体が参照により本明細書に組み込まれるＴｏｒｒｅｓらの同第２０１３／００３９８８５号に記載のＣＣＲ５阻害剤が挙げられる。
【００３８】
本発明において有効であり得る代表的な抗生物質および抗菌剤としては、ペニシリナーゼ耐性ペニシリン、セファロスポリン、およびカルバペネムが挙げられ、バンコマイシン、リソスタフィン、ペニシリンＧ、アンピシリン、オキサシリン、ナフシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、セファロチン、セファゾリン、セファレキシン、セフラジン、セファマンドール、セフォキシチン、イミペネム、メロペネム、ゲンタマイシン、テイコプラニン、リンコマイシン、およびクリンダマイシンを含む。これらの抗生物質の投与量は、当該技術分野において周知である（例えば、ＭＥＲＣＫ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＤＩＡＧＮＯＳＩＳ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＹ（Ｂｅｅｒｓ  ＆  Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｄｓ．，２００４）参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。抗感染剤、抗生物質、および／または抗菌剤は、投与前に組み合わされ得るか、または同時に（同じ組成物の一部として、または異なる組成物によって）投与されるか、または本発明のＣＤ１１ｂ阻害剤組成物に連続して投与されてよい。ある実施形態において、投与は繰り返される。
【００３９】
本発明の治療組成物は、単回投与で、または複数回投与プロトコルに従い投与されてよい。例えば、本発明の一実施形態において、１回または２回投与といった比較的少ない用量の治療組成物が投与される。本発明の別の実施形態において、治療組成物は、より頻繁に、例えば、感染レベルが減少するか、または消滅するまで毎日投与される。一般に、数日または数週間の期間にわたる反復投与を含む従来の抗生物質療法を含む実施形態において、抗生物質は、例えば、少なくとも５日間、１０日間、またはさらに１４日間以上の期間に１日１回、２回、または３回以上摂取され得るが、ＣＤ１１ｂ阻害剤組成物は、１回または２回のみ投与される。しかしながら、異なる投与量、投与のタイミング、および治療組成物および抗生物質の相対量が、処置される対象および感染に基づいて当業者により選択および調節されることができ、そうされるべきである。
【００４０】
黄色ブドウ球菌感染を予防するために本発明のＣＤ１１ｂ阻害性組成物を使用する文脈において、阻害性ＣＤ１１ｂ組成物の濃度は、黄色ブドウ球菌感染の予防または実質的な予防、特に、影響を受け易い集団（すなわち、乳幼児、若年者、成人、または免疫無防備状態の乳幼児、若年者、もしくは成人）における黄色ブドウ球菌の予防を達成するのに十分でなければならない。黄色ブドウ球菌感染を処置するために治療組成物を使用する文脈において、ＣＤ１１ｂ阻害性組成物の投与量は、ＬｕｋＡＢ媒介性細胞毒性を阻害するのに十分であり、かつ、症状の数の低減、少なくとも１つの症状の重篤度の減少、または少なくとも１つの症状のさらなる進行の遅延、またはさらには感染の全体的な軽減を達成することができる投与量である。
【００４１】
ＬｕｋＡＢ媒介性細胞毒性を阻害するためのＣＤ１１ｂ阻害剤の治療上有効な量は、標準手順に従い決定することができ、例えば、組成物中のこれらの活性剤の濃度、投与の形態および頻度、処置（または予防）される黄色ブドウ球菌感染の重篤度、ならびに年齢、体重、および健康および免疫状態全般等の対象の詳細を含む多数の要素を考慮する。一般的なガイダンスは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ′Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）に見出すことができる。所望されるか、または必要とされる予防的または治療的効果を提供する投与量に到達するまで、医師は、ＣＤ１１ｂ阻害性組成物を投与してよい。この治療の進行は、従来のアッセイにより容易に監視され得る。
【００４２】
本発明の薬剤は、予防的および／または治療的処置のために非経口、局所的、静脈内、経口、皮下、腹腔内、鼻腔内、または筋肉内手段によって投与され得る。
【００４３】
本発明の薬剤は、非経口投与のために製剤化されてよい。薬剤の溶液または懸濁液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と好適に混合された水中に調製することができる。分散液はまた、グリセロール中、液体ポリエチレングリコール中、およびそれらの油中混合物中に調製することができる。例示的な油は、石油、動物、植物、または合成起源の油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、または鉱物油である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のグリコールは、特に注射液に好ましい液体担体である。通常の保管および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含有する。
【００４４】
注射用途に好適な薬学的製剤としては、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は、滅菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流体でなければならない。これは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌等の微生物の混入作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する、溶媒または分散媒体であり得る。
【００４５】
本発明の薬剤を全身に送達することが望ましい場合、それらは注射による、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために製剤化されてよい。注射のための製剤は、単位剤形の状態で、例えば、アンプルまたは複数回投与容器中に、追加の保存剤とともに提示されてよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルション等の形態をとることができ、また、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤等の調合剤を含有してよい。
【００４６】
本発明の薬剤の腹腔内または髄腔内投与は、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ，ＣＡにより記載されるもの等の注入ポンプを使用して達成することもできる。そのようなデバイスは、所望の化合物の連続注入を可能にし、反復注入および反復操作を回避する。
【００４７】
前述の製剤に加えて、薬剤はデポー調製物として製剤化されてもよい。そのような長期作用性製剤は、好適なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂と製剤化され得るか、あるいはわずかに可溶性の誘導体として、例えば、わずかに可溶性の塩として製剤化され得る。
【００４８】
本発明の別の態様は、ゲノムが、ヒトＣＤ１１ｂをコードするポリヌクレオチド配列を含む安定的に組み込まれた発現構築物を含む、トランスジェニック非ヒト動物に関する。
【００４９】
ヒトＣＤ１１ｂをコードする好適なヌクレオチド配列は、当該技術分野において知られており、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００６３２）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１１４５８０８）として以下に示される。対応するＣＤ１１ｂアミノ酸配列も、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００６３２）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ＮＭ＿００００１１３９２８０）として以下に示される。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１
2015517463.tif 000003
2015517463.tif 000004
2015517463.tif 000005
2015517463.tif 000006
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２
2015517463.tif 000007
2015517463.tif 000008
2015517463.tif 000009
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ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３
2015517463.tif 000011
2015517463.tif 000012
2015517463.tif 000013
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４
2015517463.tif 000014
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2015517463.tif 000017
2015517463.tif 000018
【００５０】
ヒトＣＤ１１ｂタンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、当業者に周知の任意の標準方法によってトランスジェニックマウスのゲノムに組み込まれ得る。当該技術分野において知られている多様な技術のいずれかを使用し、導入遺伝子を動物に導入して、トランスジェニック動物の初代系統を生成することができる（例えば、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８６）、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９９４）、およびＬａｚｚａｒｉｎｉの米国特許第５，６０２，２９９号、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔの同第５，１７５，３８４号、Ｇｉｎｓｂｕｒｇの同第６，０６６，７７８号、Ｓａｔｏらの同第６，０３７，５２１号参照、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）。そのような技術としては、限定されないが、前核微量注入（Ｗａｇｎｅｒらの米国特許第４，８７３，１９１号、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、生殖細胞系へのレトロウイルス媒介性遺伝子移入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６１４８−６１５２（１９８５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、胚幹細胞中の遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５６：３１３−３２１（１９８９）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、胚の電気穿孔（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、および精子媒介性遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５７：７１７−７２３（１９８９）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
【００５１】
例えば、様々な発生段階での胚細胞を使用して、トランスジェニック動物の生成のための導入遺伝子を導入することができる。胚細胞の発生段階に応じて異なる方法が使用される。接合体は、微量注入のための良好な標的であり、接合体を微量注入する方法は周知である（Ｗａｇｎｅｒらの米国特許第４，８７３，１９１号参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。マウスにおいて、雄前核は、直径約２０マイクロメートルのサイズに到達し、１〜２ピコリットル（ｐｌ）のＤＮＡ溶液の再現性のある注入を可能にする。遺伝子移入のための標的としての接合体の使用は、大部分において、注入されたＤＮＡが第１の分割前に宿主ゲノムに組み込まれるという主な利益を有する（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４４３８−４４４２（１９８５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。結果として、トランスジェニック非ヒト動物の全ての細胞は、組み込まれた導入遺伝子を担持する。生殖細胞の５０％が導入遺伝子を内包するため、これは、一般に初代の子孫への導入遺伝子の効率的伝達にも反映される。
【００５２】
本発明のトランスジェニック動物は、胚幹（ＥＳ）細胞への標的ベクターの導入によって作製することもできる。ＥＳ細胞は、適切な条件下で着床前の胚をインビトロで培養することによって得られる（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６（１９８１）、Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：２５５−２５８（１９８４）、Ｇｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：９０６５−９０６９（１９８６）、およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：４４５−４４８（１９８６）、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）。導入遺伝子は、電気穿孔、リン酸カルシウム共沈殿、プロトプラストまたはスフェロプラスト融合、リポフェクションおよびＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクションを含む、当該技術分野において知られている多様な方法を使用して、ＤＮＡトランスフェクションによってＥＳ細胞に効率的に導入することができる。導入遺伝子は、レトロウイルス媒介性形質導入または微量注入によってＥＳ細胞に導入することもできる。その後、そのようなトランスフェクトされたＥＳ細胞は、胚盤胞期の胚の胞胚腔へのそれらの導入の後、胚に定着することができ、得られるキメラ動物の生殖細胞系に寄与することができる（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１４６８−１４７４（１９８８）において概説される）。トランスフェクトされたＥＳ細胞の胞胚腔への導入前に、トランスフェクトされたＥＳ細胞は、導入遺伝子が選択の手段を提供する場合、導入遺伝子を組み込んだＥＳ細胞を濃縮するための様々なそのような選択プロトコルに供され得る。あるいは、ＰＣＲを使用して、導入遺伝子を組み込んだＥＳ細胞についてスクリーニングすることができる。この技術は、胞胚腔への移入前の適切な選択条件下での、トランスフェクトされたＥＳ細胞の増殖の必要性をなくす。
【００５３】
さらに、レトロウイルス感染を使用して、導入遺伝子を非ヒト動物に導入することもできる。発生中の非ヒト胚をインビトロで胚盤胞期まで培養することができる。この時期の間、割球はレトロウイルス感染の標的であり得る（Ｊａｎｅｎｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７３：１２６０−１２６４（１９７６）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。導入遺伝子を導入するために使用されるウイルスベクター系は、典型的に、導入遺伝子を担持する複製欠損レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：６９２７−６９３１（１９８５）、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：６１４８−６１５２（１９８５））。トランスフェクションは、ウイルス生成細胞の単層上で割球を培養することによって容易かつ効率的に得られる。あるいは、感染をより遅い段階で行うことができる。当該技術分野において知られているレトロウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用してトランスジェニック動物を作製する追加の手段は、レトロウイルス粒子またはレトロウイルスを生成するマイトマイシンＣ処置された細胞を、受精卵または早期胚の囲卵腔中に微量注入することを含む（Ｏｎｉｏｎｓの第ＷＯ９０／０８８３２号、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５４】
本発明は、全ての細胞に導入遺伝子を担持するトランスジェニック非ヒト動物、ならびに全てではないが一部の細胞に導入遺伝子を担持する動物を提供し、すなわち、導入遺伝子の発現は、導入遺伝子の上流に置かれた細胞特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントによって制御される。本発明の一実施形態において、ヒトＣＤ１１ｂを発現するトランスジェニック動物は、白血球のみにおいてＣＤ１１ｂ導入遺伝子を発現する。本発明のこの実施形態に従い、白血球特異的プロモーター配列は、ヒトＣＤ１１ｂをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結される。好適な白血球特異的プロモーターとしては、非限定的に、ＬＳＰ１プロモーター（Ｍａｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ，″Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｐ５２（ＬＳＰ１）Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｐｐ５２  Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，″Ｇｅｎｅ  ２６８：９−１６（２００１）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、マクロシアリンプロモーター（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｔｈｅ  Ｍａｃｒｏｓｉａｌｉｎ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄｉｒｅｃｔｓ  Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｐｕ．１  ａｎｄ  ｃ−Ｊｕｎ，″Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：５３８９−５３９９（１９９８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、リゾチームプロモーター（Ｂｏｎｉｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｅ  Ｄｏｍａｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ，″ＥＭＢＯ  Ｊ．９：２８４３−４８（１９９０）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、および通常ＣＤ１１ｂを発現する細胞（例えば、顆粒球、単球、マクロファージ、およびナチュラルキラー細胞）中でのみヒトＣＤ１１ｂの発現を促進する骨髄特異的ＣＤ１１ｂプロモーター（Ｐａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ１１ｂ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ，″Ｂｌｏｏｄ  ７９：８６５−８７０（１９９２）およびＨｉｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ＣＤ１１ｂ，″Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２１０５−０９（１９９２）、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。トランスジェニック動物における導入遺伝子発現を駆動するのに好適な発現構築物またはクローニング構築物は、当該技術分野において周知である。発現構築物の他の構成要素は、強力なポリアデニル化部位、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位、および転写物がスプライ���ングされることを保証するイントロンを含む。
【００５５】
ヒトＣＤ１１ｂをコードするポリヌクレオチドは、任意の非ヒト動物に挿入され得る。一実施形態において、動物は、齧歯類、例えば、マウスである。トランスジェニックモデルの作製に一般に使用されるマウスの好適な系統としては、非限定的に、ＣＤ−１（登録商標）ヌードマウス、ＮＵ／ＮＵマウス、ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウス、ＢＡＬＢ／Ｃマウス、ＮＩＨ−ＩＩＩマウス、ＳＣＩＤ（登録商標）マウス、非近交系ＳＣＩＤ（登録商標）マウス、ＳＣＩＤベージュマウス、Ｃ３Ｈマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＤＢＡ／２マウス、ＦＶＢマウス、ＣＢ１７マウス、１２９マウス、ＳＪＬマウス、Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウス、ＢＤＦ１マウス、ＣＤＦ１マウス、ＣＢ６Ｆ１マウス、ＣＦ−１マウス、Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウス、ＳＫＨ１マウス、ＰＧＰマウス、およびＢ６ＳＪＬマウスが挙げられる。
【００５６】
トランスジェニック動物をスクリーニングおよび評価し、ヒトＣＤ１１ｂが全ての細胞上で発現または白血球上で特異的に発現される表現型を有する動物を選択する。初期スクリーニングは、例えば、サザンブロット分析またはＰＣＲ技術を使用して行い、動物細胞を分析して導入遺伝子の組み込みが起こったことを検証することができる。トランスジェニック動物の細胞中の導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、限定されないが、動物から得られた組織試料のノーザンブロット分析、インサイチューハイブリダイゼーション分析、および逆転写ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含む技術を使用して、評価することもできる。さらに、ヒトＣＤ１１ｂの表面発現は、蛍光分子とコンジュゲートされたヒト特異的抗ＣＤ１１ｂ抗体を使用して、フローサイトメトリーによって評価することができる。トランスジェニック非ヒト哺乳類は、本発明の方法において有効な表現型を有する動物を特定するようにさらに特徴付けることができる。特に、トランスジェニック非ヒト動物を黄色ブドウ球菌に曝露することができ、白血球細胞死を調べることができる。
【００５７】
本発明の別の態様は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を使用して、黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに適した候補化合物を特定する方法に関する。本発明のこの態様の一実施形態において、候補化合物を特定する方法は、候補化合物のコレクションを提供することを含む。この方法は、ヒトＣＤ１１ｂを発現するトランスジェニック動物を、ＬｕｋＡＢ媒介性白血球死を誘導することができる作用物質に曝露することと、１つ以上の候補化合物をトランスジェニック動物に投与することと、をさらに含む。この方法は、１つ以上の候補化合物が投与されたトランスジェニック動物におけるＬｕｋＡＢ媒介性白血球死のレベルを測定することと、１つ以上の候補化合物が投与されたトランスジェニック動物におけるＬｕｋＡＢ媒介性白血球死のレベルを１つ以上の候補化合物が投与されなかったトランスジェニック動物におけるＬｕｋＡＢ媒介性白血球死の対照レベルと比較することと、をさらに含む。ＬｕｋＡＢ媒介性細胞死の対照レベルは、ＬｕｋＡＢ作用物質を投与して、候補化合物を投与しなかったトランスジェニック動物におけるＬｕｋＡＢ媒介性細胞死のレベルである。対照レベルと比較して、トランスジェニック動物におけるＬｕｋＡＢ媒介性白血球死のレベルを低減する候補化合物は、黄色ブドウ球菌および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに適した化合物として特定される。
【００５８】
本発明のこの方法に従い、ＬｕｋＡＢ媒介性白血球死、またはヒトＣＤ１１ｂタンパク質を発現する任意の細胞の細胞死を誘導することができる作用物質としては、非限定的に、黄色ブドウ球菌、特にＭＲＳＡもしくはＭＳＳＡ株、単離されたＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、もしくはＬｕｋＡＢタンパク質複合体を含む組成物、組換えにより生成されたＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、もしくはＬｕｋＡＢタンパク質複合体を含む組成物、またはＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、もしくはＬｕｋＡＢタンパク質複合体を生成するよう操作された原核細胞および／もしくは真核細胞が挙げられる。
【００５９】
本発明のこの態様の一実施形態において、候補化合物は、好適な予防剤を特定するための手段として、トランスジェニック動物を、ＬｕｋＡＢ細胞毒性を誘導することができる作用物質に曝露する前に投与される。あるいは、候補化合物は、好適な治療剤を特定するための手段として、トランスジェニック動物をＬｕｋＡＢ作用物質に曝露した後に投与される。
【００６０】
トランスジェニック齧歯類を使用して、黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに適した候補化合物を特定するための本発明の別の方法は、候補化合物のコレクションを提供するステップと、ヒトＣＤ１１ｂを発現するトランスジェニック動物を黄色ブドウ球菌に曝露するステップと、コレクションからの１つ以上の候補化合物をトランスジェニック動物に投与するステップと、を含む。この方法は、１つ以上の候補化合物が投与されたトランスジェニック動物における黄色ブドウ球菌感染レベルを測定することと、１つ以上の候補化合物が投与されたトランスジェニック動物における黄色ブドウ球菌感染レベルを、黄色ブドウ球菌に曝露されたが１つ以上の候補化合物が投与されていないトランスジェニック動物における対照黄色ブドウ球菌感染レベルと比較することと、対照黄色ブドウ球菌感染レベルと比較して、トランスジェニック動物における黄色ブドウ球菌感染レベルを低減する候補化合物を、黄色ブドウ球菌および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに適した化合物として特定することと、をさらに含む。
【００６１】
黄色ブドウ球菌感染レベルを測定することは、非限定的に、動物の生存、細胞生存率、炎症反応、細菌負荷、および感染関連病理を含む、黄色ブドウ球菌感染の任意の１つ以上の指標の評価または測定を包含する。動物の生存および／または細胞生存率を増加させ、動物における炎症反応または細菌負荷を低減し、感染の病理を改善する候補化合物は、黄色ブドウ球菌および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに適した化合物である。
【００６２】
本発明のこの態様の一実施形態において、候補化合物は、好適な予防剤を特定するための手段として、トランスジェニック動物を黄色ブドウ球菌に曝露する前に投与される。あるいは、候補化合物は、好適な治療剤を特定するための手段として、トランスジェニック動物を黄色ブドウ球菌に曝露した後に投与される。
【００６３】
本発明の別の態様は、黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができる化合物を特定する方法に関する。この方法は、典型的に、インビトロ、すなわち、細胞培養物中で行われる。この方法は、候補化合物のコレクションを提供することと、ヒトＣＤ１１ｂを発現する細胞の集団を提供することと、を含む。この方法は、細胞の集団をＬｕｋＡＢ媒介性細胞毒性を誘導することができる作用物質で処置することと、処置された細胞の集団を、コレクションからの１つ以上の候補化合物と接触させることと、をさらに含む。この方法は、１つ以上の候補化合物の存在下および非存在下で、処置された細胞の集団におけるＬｕｋＡＢ媒介性細胞毒性レベルを測定することと、１つ以上の候補化合物の存在下と非存在下とで、測定されたＬｕｋＡＢ媒介性細胞毒性レベルを比較することと、をさらに含む。１つ以上の候補化合物の非存在下と比較して、１つ以上の候補化合物の存在下でのＬｕｋＡＢ媒介性細胞毒性レベルの減少により、黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができる化合物が特定される。
【００６４】
本発明のこの態様に従い、使用するのに適したヒトＣＤ１１ｂを発現する細胞は、ヒト白血球、例えば、単球、顆粒球、マクロファージ、およびナチュラルキラー細胞が挙げられる。他の好適な細胞としては、ＣＤ１１ｂを発現するように操作された任意の有核細胞、例えば、ヒトＣＤ１１ｂポリヌクレオチド配列を含有する発現構築物（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または３のヌクレオチド配列を含む発現構築物）を安定的または一過的にトランスフェクトされた細胞が挙げられる。
【００６５】
本明細書に記載の通り、本発明のこの方法は、ＬｕｋＡＢ媒介性細胞毒性およびヒト食細胞の溶解をもたらす事象のカスケードのいくつかの局面を阻害する薬剤を特定するように設計される。カスケードの一部である標的事象としては、例えば、食細胞上のＣＤ１１ｂ受容体へのＬｕｋＡおよび／またはＬｕｋＢの結合、ＬｕｋＡへのＬｕｋＢの結合（ＬｕｋＡＢオリゴマー化）、およびＬｕｋＡＢオリゴマーにより形成された膜孔の閉塞が挙げられる。このアッセイは、ＬｕｋＡＢ結合ドメインを含むヒトＣＤ１１ｂタンパク質またはそのフラグメントを発現する任意の哺乳類または非哺乳類細胞、好適な培養培地、および単離された、または組換えＬｕｋＡおよび／またはＬｕｋＢ、または黄色ブドウ球菌を利用する。このアッセイは、ヒトＣＤ１１ｂを発現する細胞が、ＬｕｋＡＢ細胞毒性を誘導することができる作用物質と接触される前、接触中、または接触された後に細胞に曝露される細胞毒性の標識マーカーをさらに含む。この細胞毒性の標識マーカーは、細胞生死判別色素、細胞不透過性色素、および／または細胞溶解の指標を含んでよい。
【００６６】
当業者であれば、次のプロトコルが単なる例証であり、反応条件、検出可能な標識の選択、および装置（例えば、検出および定量化のための器具）等の様々な操作パラメータが、適切と判断されるように変えてよいことを理解するであろう。次の方法は、概して、影響されるカスケードにおける正確な事象を必ずしも明らかにすることなく、ＬｕｋＡＢ細胞毒性を阻害する薬剤を特定することに向けられる。
【００６７】
ＣＤ１１ｂ−ＬｕｋＡＢ細胞毒性の阻害剤を特定するために、ヒトＣＤ１１ｂを発現する細胞（例えば、ヒト食細胞またはヒトＣＤ１１ｂをトランスフェクトされたマウス食細胞）を、３８４ウェル透明底部ブラック組織培養処理済プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に５×１０３細胞／ウェルで、１０％の熱非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した最終容量５０μｌのＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中に置く。次いで、細胞を試験化合物／分子（約５μｌ／異なる濃度）と接触／混合／反応／処置してよく、次いで、ＬｕｋＡおよびＬｕｋＢで中毒化されてよく、好ましい実施形態において、これらは実質的に精製され（５μｌの約０．００１〜２μＭ溶液）、好ましくはＬｕｋＡおよびＬｕｋＢによる食細胞の中毒化を可能にする培養条件下で、例えば、１時間、３７℃、５％ＣＯ２で、一緒に添加される。対照として、細胞は、培養培地（１００％生存）および０．１％  ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（１００％死滅）で処理されてよい。
【００６８】
これらの実施形態において、次いで、上記の通り処置された細胞を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）等の細胞生存率を監視するための色素（細胞の代謝活性の定量化により培養物中の生存細胞の数を測定することによって吸光度を介した細胞生存率の決定を可能にする）とインキュベートし、追加の期間の間インキュベートしてもよい（例えば、約２時間、３７℃、５％ＣＯ２）。次いで、プレートリーダー、例えば、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２１０３マルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して４９２ｎｍで比色反応を測定すること等によって細胞生存率が決定されてよい。生存細胞のパーセントは、例えば、次の式を使用することによって計算されてよい：％生存率＝１００×［（Ａｂ４９２試料−Ａｂ４９２Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ）／（Ａｂ４９２組織培養培地）］。生存率パーセントの増加は、ＬｕｋＡＢ細胞毒性の阻害を示唆する。
【００６９】
このアッセイの変形形態は、膜損傷アッセイと呼ばれる。これらの実施形態において、上記の通り処置された細胞（例えば、試験化合物／分子で細胞を処置すること、次いで精製されたＬｕｋＡまたはＬｕｋＡＢで細胞を中毒化することを含む）は、次いで、ＳＹＴＯＸグリーン等の細胞不透過性蛍光色素（０．１μＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と（製造者の指示に従って）インキュベートし、例えば、さらに１５分間、室温暗所でインキュベートしてよい。膜損傷の指標としての蛍光は、次いで、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２１０３マルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）等のプレートリーダーを使用して、励起４８５ｎｍ、放出５３５ｎｍで測定されてよい。蛍光の減少は、ＬｕｋＡＢ細胞毒性の阻害を示唆する。
【００７０】
これらのアッセイは共に、ヒトＣＤ１１ｂを発現する細胞に対するＬｕｋＡＢ細胞毒性作用を阻害または低減する化合物の特定を容易にする。特に上記の方法が阻害活性を明らかにする場合、追加の方法が、独立してまたは上記の方法と併せて使用されてよく、これは当業者が、生化学カスケードのどの事象が、薬剤により影響されるか、または標的化されるかをより正確に決定するのを可能にする。これらの事象としては、ＣＤ１１ｂ受容体へのＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、またはＬｕｋＡＢの結合、ＬｕｋＡへのＬｕｋＢの結合（ＬｕｋＡＢオリゴマー化）、およびＬｕｋＡＢオリゴマーによって形成された膜孔の閉塞が挙げられる。
【００７１】
中毒化プロセスの第１のステップであると考えられる、標的細胞へのＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、またはＬｕｋＡＢの結合をブロックまたは低減する阻害剤をスクリーニングするために、ヒトＣＤ１１ｂを発現する細胞（例えば、ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞）を、３８４ウェル平底組織培養処理済プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２．５×１０３細胞／ウェルで、１０％の熱非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した最終容量５０μｌのＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中に置いてよい。次いで、細胞を試験化合物／分子（約５μｌ／異なる濃度）で処置し、約０．０１〜２μＭ溶液の精製された蛍光標識されたＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、またはＬｕｋＡＢ（例えば、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＡＰＣ、ＰＥ）５ｕｌで１時間、３７℃、５％ＣＯ２で中毒化してよい。試験化合物／分子の有効性を評価するために、例えば、ハイコンテンツスクリーニングおよびハイコンテンツ分析のために設計された自動蛍光顕微鏡撮像システム（例えば、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＥＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（励起４８５ｎｍ、放出５３５ｎｍ））を使用して、ＣＤ１１ｂへのＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、またはＬｕｋＡＢの結合の指標として、細胞関連蛍光が測定されてよい。
【００７２】
中毒化プロセスの第２のステップであると考えられる、ＬｕｋＡ／ＬｕｋＢ相互作用をブロックまたは低減する阻害剤をスクリーニングするために、ヒトＣＤ１１ｂを発現する細胞（例えば、ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞）を、３８４ウェル平底組織培養処理済プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２．５×１０３細胞／ウェルで、１０％の熱非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した最終容量５０μｌのＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中に置いてよい。次いで、細胞を試験化合物／分子で処置し、精製されたＬｕｋＡおよび精製されたＬｕｋＢの混合物で中毒化してよく、ＬｕｋＢは、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＡＰＣ、ＰＥ等の蛍光分子で蛍光標識され、中毒化プロセスが完了するように置かれる（例えば、１時間、３７℃、５％ＣＯ２）。試験化合物／分子の有効性を評価するために、例えば、ハイコンテンツスクリーニングおよびハイコンテンツ分析のために設計された自動蛍光顕微鏡撮像システム（例えば、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＥＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（励起４８５ｎｍ、放出５３５ｎｍ））を使用して、ＬｕｋＡ／ＬｕｋＢ−ＦＩＴＣ相互作用の指標として、細胞関連ＬｕｋＢ−ＦＩＴＣ蛍光が測定されてよい。
【００７３】
ＬｕｋＡＢ孔の形成をブロックまたは阻害する阻害剤、細胞溶解をもたらすエフェクター分子をスクリーニングするために、ヒトＣＤ１１ｂを発現する細胞（例えば、ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞）を、３８４ウェル透明底ブラック組織培養処理済プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２．５×１０３細胞／ウェルで、１０％の熱非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および５０μＭの臭化エチジウムカチオン色素を補充した最終容量５０μｌのＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中に置いてよい。ＬｕｋＡＢ孔は、この色素の取り込みを促進する。次いで、細胞を試験化合物／分子（約５μｌ／異なる濃度）で処置し、次いで、精製されたＬｕｋＡＢ（約０．００１〜２μＭ）で１０〜２０分間、３７℃、５％ＣＯ２で中毒化してよい。膜損傷の指標としての蛍光は、次いで、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２１０３マルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）等のプレートリーダーを使用して測定されてよい。蛍光の減少は、ＬｕｋＡＢ孔の阻害を示唆する。対照として、ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞は、培養培地（陰性対照）および０．０１％  ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（陽性対照）で処理されてよい。
【００７４】
本発明の別の態様は、黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができる候補化合物を特定する方法に関する。この方法は、候補化合物のコレクションを提供することと、ＬｕｋＡＢ結合ドメインを含む単離されたＣＤ１１ｂ受容体またはそのフラグメントを提供することと、を含む。この方法は、単離されたＣＤ１１ｂ受容体またはそのフラグメントを、標識ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／または標識ＬｕｋＡＢタンパク質を含む作用物質で処置することと、処置された、単離されたＣＤ１１ｂ受容体またはそのフラグメントを、コレクションからの１つ以上の候補化合物と接触させることと、をさらに含む。単離されたＣＤ１１ｂ受容体またはそのフラグメントへの標識ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／または標識ＬｕｋＡＢの結合レベルを、１つ以上の候補化合物の存在下および非存在下で測定し、単離されたＣＤ１１ｂ受容体またはそのフラグメントへの標識ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／またはＬｕｋＡＢの結合レベルを、１つ以上の候補化合物の存在下と非存在下とで比較する。この比較に基づいて、黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができる１つ以上の候補化合物を特定する。
【００７５】
本発明のこの態様に従い、候補化合物の非存在下と比較して、候補化合物の存在下での単離されたＣＤ１１ｂ受容体またはそのフラグメントへのＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／またはＬｕｋＡＢ結合の減少により、黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができる化合物が特定される。
【００７６】
本発明のこの態様に従い、候補ＣＤ１１ｂ阻害剤の存在下および非存在下でインビトロリガンド結合アッセイを行う方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｂａｎｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  ３  Ｂｌｏｃｋ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｂｕｒｓｔ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ，″Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．３０４（３）：１０１６−１０２４（２００３）参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらの方法は、典型的に、Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，″Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４３５８−６５（１９９５）に記載され、Ｂａｎｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  ３  Ｂｌｏｃｋ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｂｕｒｓｔ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ，″Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．３０４（３）：１０１６−２４（２００３）（いずれもそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる）により修正される方法を使用し、適切な細胞、例えば、ヒトＰＭＮからのＣＤ１１ｂまたはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体複合体の単離および精製を含む。あるいは、ＣＤ１１ｂ、そのフラグメント、またはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は、組換えにより生成され得る。ＬｕｋＡＢ結合ドメインを含むＣＤ１１ｂのペプチドまたはポリペプチドが、本発明の方法に利用されるとき、所望のペプチドまたはポリペプチドは合成で生成され得る。本発明のこの態様は、単離された、または組換えＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、およびＬｕｋＡＢタンパク質の精製および標識化をさらに含む。ＬｕｋＡおよびＬｕｋＢをコードするポリヌクレオチド配列、ならびにＬｕｋＡおよびＬｕｋＢを合成または単離する方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＴｏｒｒｅｓらの米国特許公開第２０１１／０２７４６９３号において詳述される。最後に、候補ＣＤ１１ｂ阻害剤の存在下および非存在下で、単離されたＣＤ１１ｂ受容体、そのフラグメント、またはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体複合体への標識ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／またはＬｕｋＡＢ結合を測定する方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｎｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  ３  Ｂｌｏｃｋ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｂｕｒｓｔ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ，″Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．３０４（３）：１０１６−２４（２００３）において十分に説明される。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例は、本発明の実施形態を説明するために提供されるが、本発明の範囲を限定することは決して意図しない。
【００７８】
実施例１〜７の材料および方法
細胞培養物
ＨＬ６０およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で、別段の記載がない限り、いずれも１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を補充したＲＰＭＩおよびＤＭＥＭ中にそれぞれ維持した。ＨＬ６０細胞は、１．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で７２時間、約２．５×１０５でＰＭＮ−ＨＬ６０細胞へと分化させた。形質導入されたＨＬ６０細胞は２μｇ／ｍｌピューロマイシン中に維持した。
【００７９】
一次ヒトＰＭＮの単離
血液試料を、匿名の健常なドナーからバフィーコートとして得た（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ）。Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒは、この研究に関与した全ての参加者から文書によるインフォームドコンセントを得た。ＰＭＮは、デキストラン勾配によって単離した。
【００８０】
黄色ブドウ球菌からのＨｉｓ−ＬｕｋＡＢ精製
組換えＬｕｋＡＢを黄色ブドウ球菌から共精製するために、ＬｕｋＡをＮ末端６ｘ−ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグと融合させた構築物を作製した。この構築物は、最初にｌｕｋＡＢプロモーター領域およびｌｕｋＡシグナル配列を黄色ブドウ球菌ニューマンゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅することによって、複数のクローニングステップを通じて作製し、６Ｘ−Ｈｉｓタグをコードするヌクレオチドは、ｌｕｋＡシグナル配列（ｓｓ）の後に、次のプライマー：
2015517463.tif 000019
を使用して付加した。増幅された配列を、ＸｍａＩおよびＢａｍＨＩを使用して、ｐＯＳ１プラスミド（Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ，″Ｃｅｌｌ７０（２）：２６７−２８１（１９９２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）にクローニングした。次いで、ｌｕｋＡＢ遺伝子間領域を有するｌｕｋＢを、黄色ブドウ球菌ニューマンゲノムＤＮＡから次のプライマー：
2015517463.tif 000020
を用いてＰＣＲ増幅した。この配列を、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩを用いてｐＯＳ１  ＰｌｕｋＡＢ−ｓｓｌｕｋＡ−６Ｈｉｓベクターにクローニングした。最後に、成熟ｌｕｋＡを、次のプライマー：
2015517463.tif 000021
を用いてＰＣＲ増幅した。この配列を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いてｐＯＳ１  ＰｌｕｋＡＢ−ｓｓｌｕｋＡ−６Ｈｉｓ−ｌｕｋＢベクターにクローニングし、ＰｌｕｋＡＢ−ｓｓｌｕｋＡ−６Ｈｉｓ−ｌｕｋＡ−ｌｕｋＢを得た。組換えプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、形質転換体をアンピシリン耐性によって選択した。陽性クローンを、黄色ブドウ球菌ニューマンΔｌｕｋＡＢに形質転換した（Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  Ｔｈａｔ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，″Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９（３）：８１４−８２５（２０１１）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８１】
１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）中で５時間、３７℃、１８０ｒｐｍで約１．５のＯＤ６００まで株を増殖させることにより、タンパク質を黄色ブドウ球菌から精製した。次いで、細菌を４０００ｒｐｍ、４℃で１５分間ペレット状にし、上清を回収して、０．２μｍフィルターを通して濾過した。培養上清を、１０ｍＭイミダゾールの存在下、３０分間４℃で攪拌しながらニッケル−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）とインキュベートした。試料をカラムに適用し、２５ｍＭイミダゾールを補充したトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ：５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄し、５００ｍＭイミダゾールで溶出した。タンパク質を１Ｘ  ＴＢＳ＋１０％グリセロール中、４℃で終夜透析した。
【００８２】
ＬｕｋＡＢとＭａｃ−１との相互作用を検出するための生化学研究
ストレプトアビジンによるプルダウン生成物の検出の場合、ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞を、ＥＺ−ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と冷ＰＢＳ中、３０分間、４℃で回転させながらインキュベートした。急冷するために、次いで、反応細胞を冷ＰＢＳ中１００ｍＭの冷グリシンで洗浄した。細胞を、ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）含有冷ＴＢＳ中に再懸濁し、１％  Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ）を用いて３０分間、４℃で回転させながら可溶化した。試料を１５０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、可溶化部分を含有する上清を回収した。可溶化部分（約２×１０６細胞から）を、３０分間、４℃で回転させながら、１０μｇ（５μｇ／１００万個の細胞）のＨｉｓ−ＬｕｋＡＢとインキュベートするか、またはＴＢＳとモックインキュベートした。試料を、１０ｍＭイミダゾールの存在下、５０μｌのニッケル樹脂と１時間、４℃で回転させながらインキュベートした。樹脂を１ＸＰＢＳ＋５０ｍＭイミダゾールで洗浄し、タンパク質を１ＸＰＢＳ＋５００ｍＭイミダゾールで溶出した。試料を４ＸＳＤＳ沸騰緩衝液中で沸騰させ、４〜１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配（ＢｉｏＲａｄ）で８０Ｖで流した後、ニトロセルロース膜に３０Ｖで１時間転写した。膜をＰＢＳ中０．０１％  ｔｗｅｅｎで１時間ブロッキングし、次いで、１：１０００のストレプトアビジン−Ｄｙｌｉｇｈｔ  ６８０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と１時間インキュベートした。膜を乾燥させ、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線撮像システム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して走査した。
【００８３】
ＰＭＮ−ＨＬ６０溶解物を用いるプルダウンも、Ｈｉｓタグ付きＬｕｋＡＢ、Ｈｉｓタグ付きＬｕｋＥＤ（Ａｌｏｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｃｏｃｉｄｉｎ  ＥＤ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ，″Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８３（２）：４２３−４３５（２０１２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、またはＨｉｓタグ付きＰＶＬ（Ａｌｏｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，″ＣＣＲ５  ｉｓ  ａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＥＤ，″Ｎａｔｕｒｅ  ４９３（７４３０）：５１−５５（２０１３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を用いて、ビオチン化なしで上記の通りに行い、試料は、１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで流し、ニトロセルロース膜に１ａｍｐで１時間転写した。膜を、抗ＣＤ１１ｂ抗体（クローン２３８４３、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でプローブし、これを１：２５，０００で希釈されたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−６８０コンジュゲート抗ウサギ二次（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体およびＯｄｙｓｓｅｙ撮像システムを使用して検出した。
【００８４】
精製されたＬｕｋＡＢおよび精製されたＭａｃ−１を用いるプルダウンの場合、４μｇの組換えＭａｃ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、０．１％  Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの存在下、４μｇの精製された組換えＨｉｓ−ＬｕｋＡＢ、Ｈｉｓ−ＬｕｋＥＤ、Ｈｉｓ−ＰＶＬ、またはＰＢＳと、３０分間、４℃で回転させながらインキュベートした。試料を１００μｌニッケル樹脂とインキュベートし、洗浄して上記の通り溶出した。４ＸＳＤＳ緩衝液中の沸騰させた試料を、４〜１５％勾配ゲル上に流した。試料の１セットを、抗ＣＤ１１ｂ抗体を用いる免疫ブロットによって上記の通り処理した。他の試料セットの場合、ゲルを総タンパク質染料Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造者の指示に従い染色した。
【００８５】
ＰＭＮ（２×１０７個）を１％  Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドで可溶化し、可溶性部分を２０μｇのＨｉｓ−ＬｕｋＡＢとインキュベートし、複合体を上記の通りニッケル樹脂で精製した。試料を４〜１５％勾配ゲル上に流し、Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙで染色した。レーン全体をゲルから切除し、質量分析に供した。
【００８６】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析
細胞を、蛍光コンジュゲート抗体を用いて３０分間氷上で染色した後、１ＸＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋０．０５％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）で洗浄した。非コンジュゲート抗体の場合は、細胞を、一次抗体抗体を用いて３０分間氷上で染色した後、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、蛍光コンジュゲート二次抗体を用いて３０分間氷上で染色した後、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。全てのＦＡＣＳデータは、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得した。データは、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を使用して分析した。
【００８７】
ＦＡＣＳ分析のための抗体
一次ヒト細胞およびヒト細胞系の表面染色に使用される抗体としては、次が挙げられる：抗ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ（クローンＩＣＲＦ４４）、抗ＣＤ１８−ＰＥ／Ｃｙ５（クローンＴＳ１／１８）、抗ＣＤ１１ａ−ＦＩＴＣ（クローンＨＩ１１１）、および抗ＣＤ１１ｃ−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（クローンＢｕ１５）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。ＬｕｋＡＢとＣＤ１１ｂとの相互作用をマッピングするための抗体としては、上に列挙されるヒト特異的抗体の非コンジュゲート型ならびにＬＭ２／１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）およびＣＢＲＭ１／５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）抗ＣＤ１１ｂクローンが挙げられる。Ｉ欠失ＣＤ１１ｂを検出するために、ヤギ抗ＣＤ１１ｂ（ポリクローナル）を抗ヤギＩｇＧ−ＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに使用した。
【００８８】
マウスＭａｃ−１を発現する一次マウス細胞２９３Ｔ細胞の表面染色に使用される抗体としては、次が挙げられる：抗ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ（クローンＭ１／７０）および抗Ｌｙ−６Ｇ−ＦＩＴＣ（クローン１Ａ８）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。
【００８９】
ＣＤ１１ｂ  ｃＤＮＡでのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、製造者の指示に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、全長ヒトＣＤ１１ｂ  ｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ）を含有するｐＣＭＶ６−ＸＬ５プラスミドまたは空ベクターとインキュベートした。トランスフェクション効率は、ＧＦＰ生成対照ベクターで決定されるように７０〜８０％の間であり、ＣＤ１１ｂ表面レベルは、フローサイトメトリーにより４８時間後に決定された。この時点で、ＬｕｋＡＢまたはＰＶＬに対する感受性が、４０μｇ／ｍｌの各毒素またはＰＢＳを２時間、３７℃、５％  ＣＯ２で細胞に添加することによって決定された。次いで、細胞を洗浄し、α−ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ（クローンＩＣＲＦ４４）で染色した。ＣＤ１１ｂ＋細胞の枯渇は、フローサイトメトリーによって測定し、ＰＢＳ処置されたＣＤ１１ｂ＋細胞のパーセントを１００％に正規化した。
【００９０】
オーバーラップＰＣＲによるｈＣＤ１１ｂ  Ｉ欠失変異体の作製
ヒトＣＤ１１ｂからのＩドメインの欠失は、オーバーラップＰＣＲによって達成され、Ｉドメインの５′セグメント上流およびＩドメインの３′セグメント下流が、ヒトＣＤ１１ｂ  ｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ）を含有するｐＣＭＶ６−ＸＬ５ベクターから増幅された。５′ＵＴＲを含まないがＫｏｚａｋ配列を含むＣＤ１１ｂの５′セグメントの増幅の場合、次のプライマー：
2015517463.tif 000022
を使用した。ＣＤ１１ｂの３′セグメントの増幅の場合、次のプライマー：
2015517463.tif 000023
を使用した。２つのセグメントを、次のプライマー：
2015517463.tif 000024
を使用して、オーバーラップＰＣＲによって連結した。野生型（ＷＴ）ヒトＣＤ１１ｂも、この最後のプライマーセットでＯｒｉＧｅｎｅプラスミドから増幅させた。増幅された配列を、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩを使用してｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＧＦＰ−Ｐｕｒｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｈＣＤ１１ｂ−ｐｕｒｏおよびｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−Ｉ欠失ｈＣＤ１１ｂ−ｐｕｒｏ構築物を得た。組換えプラスミドを大腸菌ＲｅｃＡ−５α（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）に形質転換し、形質転換体を、アンピシリン耐性によって選択した。
【００９１】
ヒトＣＤ１１ｂおよびＣＤ１８のレンチウイルスに基づくノックダウンおよびＣＤ１１ｂの過剰発現
レンチウイルスのｓｈＲＮＡ発現ベクターのストックを、前述の通り（Ｕｎｕｔｍａｚ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ａｒｅ  Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ＨＩＶ−１  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｔｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，″Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９（１１）：１７３５−１７４６（１９９９）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に次のプラスミド：ｐＭＤＧ  ｇａｇ−ｐｏｌ、ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、ｐＶＳＶ−Ｇ  Ｅｎｖ、およびＳＩＧＭＡ  ＭＩＳＳＩＯＮ  ＴＲＣ  １．５ライブラリーから購入したｐＬＫＯ．１ＣＤ１１ｂまたはＣＤ１８  ｓｈＲＮＡ構築物をリン酸カルシウムコトランスフェクションすることによって、生成した。次のｓｈＲＮＡ配列：
2015517463.tif 000025
をＣＤ１１ｂに対して使用し、
2015517463.tif 000026
をＣＤ１８に対して使用した。上清を４８時間後に回収し、遠心分離して濾過し、細胞残渣を除去し、前述の通りＪｕｒｋａｔ細胞上で力価を測定した（Ｕｎｕｔｍａｚ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ａｒｅ  Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ＨＩＶ−１  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｔｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，″Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９（１１）：１７３５−１７４６（１９９９）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＨＬ６０細胞を、それぞれのウイルスまたは空ベクター対照ウイルスで７２時間形質導入した後、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンで選択し、これは約９５〜９９％の形質導入されていない細胞を殺滅させることが決定された。生存細胞を増殖させ、ノックダウンをフローサイトメトリーによって確認した。
【００９２】
レンチウイルス発現ベクターのストックを、前述の通り（Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｔｈｅ  Ｖｐｘ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ＳＡＭＨＤ１  ｆｏｒ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｕｓ，″Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６（２３）：１２５５２−１２５６０（２０１２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に次のプラスミド：ｐＭＤＧ  ｇａｇ−ｐｏｌ、ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、ｐＶＳＶ−Ｇ  Ｅｎｖ、およびｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｈＣＤ１１ｂ−ｐｕｒｏまたはｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−Ｉ欠失ｈＣＤ１１ｂ−ｐｕｒｏをコトランスフェクションすることによって、作製した。ウイルスを回収し、ＨＬ６０細胞に上記の通り形質導入した。生存細胞を増殖させ、野生型およびＩ欠失ＣＤ１１ｂ表面レベルをフローサイトメトリーによって確認した。細胞をＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞選別器を使用して選別し、α−ＣＤ１１ｂ抗体で染色される細胞の上位２５％を回収した。
【００９３】
腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）の誘発
マウスＰＥＣを、加熱殺菌された黄色ブドウ球菌を用いて前述の通り誘発した（Ａｌｏｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，″ＣＣＲ５  ｉｓ  ａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＥＤ，″Ｎａｔｕｒｅ  ４９３（７４３０）：５１−５５（２０１３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９４】
ＦＩＴＣ−ＬｕｋＡＢの作製
組換えＮ末端フルオレセイン標識ＬｕｋＡＢを作製するために、黄色ブドウ球菌ニューマンゲノムＤＮＡからのＬｕｋＡの成熟タンパク質コード配列をＰＣＲ増幅し、次のプライマー：
2015517463.tif 000027
を使用して、システインをシグナル配列の後のＮ末端に付加した。増幅された配列を、ＢａｍＨ１およびＸｂａｌを使用して、上記の通りＰｌｕｋＡＢ−ｓｓｌｕｋＡ−６Ｈｉｓ−ｌｕｋＢにクローニングした。組換えプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、形質転換体を、アンピシリン耐性によって選択した。陽性クローンを、黄色ブドウ球菌ニューマンΔｌｕｋＡＢに形質転換した（Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  Ｔｈａｔ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，″Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９（３）：８１４−８２５（２０１１）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。タンパク質を上記の通り黄色ブドウ球菌から精製し、２０倍モル過剰のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８  Ｃ５マレイミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で終夜、４℃で攪拌しながら標識化した。１０％グリセロール含有ＴＢＳ中で１０ｋＤａ分子量カットオフ透析カセットを用いた透析によって過剰な色素を除去した。標識タンパク質の活性をサイトメトリーアッセイによって確認した。
【００９５】
Ｆｌａｇタグ付きＣＤ１１ｂ  Ｉドメインの大腸菌からの精製
Ｃ末端３ＸＦｌａｇタグおよびＮ末端６Ｘ−Ｈｉｓタグを有する組換えヒトおよびマウスＣＤ１１ｂ  Ｉドメインを作製するために、ヒトおよびマウスＩドメインをｐＣＭＶ６−ＸＬ５およびｐＣＭＶ−ＥｎｔｒｙヒトおよびマウスＣＤ１１ｂ  ｃＤＮＡ構築物（ＯｒｉＧｅｎｅ）からそれぞれ増幅させた。Ｃ末端６Ｘ−グリシンリンカーに続いて３Ｘ−Ｆｌａｇタグを有するヒトＩドメインの増幅の場合、次のプライマーを使用した：
2015517463.tif 000028
。Ｃ末端６Ｘ−グリシンリンカーに続いて３Ｘ−Ｆｌａｇタグを有するマウスＩドメインの増幅の場合、次のプライマーを使用した：
2015517463.tif 000029
。ベクターがコードする６Ｘ−Ｈｉｓタグが、ＩドメインのＮ末端に存在するように、増幅された配列を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いてｐＥＴ１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。組換えプラスミドを大腸菌Ｔ７  ＬｙｓＹ  ｌａｃＱに形質転換し、形質転換体を、アンピシリン耐性によって選択した。
【００９６】
大腸菌からタンパク質を精製するために、株を３７℃、１８０ｒｐｍで、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス中で０．５のＯＤ６００まで増殖させ、次いで、１ｍＭ  ＩＰＴＧで３時間、３７℃、１８０ｒｐｍで誘導した。細菌を溶解し、溶解物をニッケル樹脂とインキュベートした。Ｈｉｓタグ付きＩドメインを５００ｍＭイミダゾールで溶出した。
【００９７】
ＬｕｋＡＢ−ＣＤ１１ｂ  Ｉドメイン相互作用を決定するためのドットブロット分析
５〜０．１５６μｇの精製された組換えヒトおよびマウスＣＤ１１ｂ  Ｉドメインを、ドットブロット真空（ＢｉｏＲａｄ）を使用してＰＶＤＦ膜に吸収させた。膜を１Ｘ  ＴＢＳ中２％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、次いで、ＴＢＳ＋２％  ＢＳＡ中５μｇ／ｍｌの精製されたＦＩＴＣ−ＬｕｋＡＢと１時間インキュベートした。競合アッセイの場合、１０倍過剰（５０μｇ／ｍｌ）の非標識精製ＬｕｋＡＢまたはＰＶＬも膜とインキュベートした。ＦＩＴＣ−ＬｕｋＡＢの結合は、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線撮像システムを使用して検出し、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒソフトウェアを使用して、デンシトメトリーによって定量化した。
【００９８】
Ｍａｃ−１およびＣＤ１１ｂ  ＩドメインへのＬｕｋＡＢ結合の表面プラズモン共鳴分析
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、前述の通りＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００システム（ＧＥ）を使用して実行した（Ｈｕｅｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｔｈｅ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  Ｊｅｊｕｎｉ  Ｄｐｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｎｄｓ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｉｒｏｎ  ｏｒ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ，″Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２０１３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。簡単に言うと、組換えＭＡＣ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）または組換えＩドメイン（マウスおよびヒト）を、ＮＨＳ捕捉キットを使用して、シリーズＳセンサーチップＣＭ５（ＧＥ）のフローセル２〜４の上に固定化し、フローセル１をブランク固定化として実行した。ＬｕｋＡＢおよびその変異体を、マルチサイクルカイネティクスを使用して、０．６２５〜２５ｕｇ／ｍＬの範囲の濃度で流し、各相互作用に対し少なくとも３回の実験を行った。シングルサイクルカイネティクスを利用し、マルチサイクルカイネティクスの完了前に濃度を最適化した。全てのＳＰＲ実験の流動緩衝液は、ｐＨ６．８の１ｘＰＢＳであった。
【００９９】
細胞毒性アッセイ
細胞を前述の通り中毒化した（Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  Ｔｈａｔ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，″Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９（３）：８１４−８２５（２０１１）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。簡単に言うと、１ウェル当たり１×１０５個の細胞を、１〜２時間、３７℃、５％  ＣＯ２で、表示された濃度の精製組換えＬｕｋＡＢで中毒化した。細胞膜損傷、毒素孔形成、または細胞代謝を、ＳＹＴＯＸグリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、臭化エチジウム（ＭＰ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、またはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でそれぞれ評価した。抗インテグリン抗体を用いた実験の場合、抗体を中毒化の３０分前に室温で添加し、抗体は中毒化の間存在した。
【０１００】
黄色ブドウ球菌によるインビトロおよびエクスビボ感染
これらの感染は、ΔｌｕｋＡＢ、ｌｕｋＡＢで染色体的に補完されたΔｌｕｋＡＢ（ΔｌｕｋＡＢ：：ｌｕｋＡＢ）、または野生型（ＷＴ）ＵＳＡ３００クローン型ＬＡＣ株を用いて前述の通り行った。簡単に言うと、細胞外黄色ブドウ球菌によるＰＭＮまたはＰＭＮ−ＨＬ６０の殺滅を決定するために、正規化されたＵＳＡ３００を、１ウェル当たり１×１０５個の細胞と、感染多重度（ＭＯＩ）１００、５０、１０、または１で、３７℃、５％  ＣＯ２で１〜２時間インキュベートした。抗インテグリン抗体を用いた実験の場合、抗体を感染の３０分前に室温で添加し、抗体は感染の間存在した。膜損傷は、ＳＹＴＯＸグリーンを使用して評価した。
【０１０１】
ＰＭＮ−ＨＬ６０に感染したときに貪食された黄色ブドウ球菌の増殖回復を決定するために、オプソニン化ＵＳＡ３００を、１ウェル当たり１×１０５個のＰＭＮ−ＨＬ６０と、ＭＯＩ１０で遠心分離によって同期させた。同期化後３０分、６０分、１２０分、および１８０分に、ＰＭＮ−Ｈｌ６０をサポニンで溶解し、連続的に希釈した。回復した細菌は、コロニー形成単位ＣＦＵを数えることによって決定した。
【０１０２】
オプソニン化黄色ブドウ球菌に感染した後のＰＭＮまたはＰＭＮ−ＨＬ６０の膜損傷も、上記の通りＰＭＮおよび細菌を調製することによって決定され、ＳＹＴＯＸグリーンは同期化後１〜２時間で添加した。
【０１０３】
蛍光顕微鏡法
ＰＭＮを、構成的にＧＦＰを発現するようにｐＯＳ１−ＰｓａｒＡ−ｓｏｄ  ＲＢＳ−ｓｇｆｐで形質転換されたオプソニン化ＬＡＣ  ＷＴ、ΔｌｕｋＡＢ、およびΔｌｕｋＡＢ：：ｌｕｋＡＢ株に感染させた。
【０１０４】
黄色ブドウ球菌を貪食するＰＭＮにおけるＣＤ１１ｂの位置を決定するために、ＰＭＮを抗ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ（ＩＣＲＦ４４）抗体またはそれぞれのアイソタイプ対照（マウスＩｇＧ１κ−ＡＰＣ、クローンＭＯＰＣ−２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて３０分間氷上で前染色した。次いで、ＰＭＮを３５ｍｍガラス底マイクロウェル皿（２０ｍｍマイクロウェル、１．５厚、非コーティング、ＭａｔＴｅｋ）に３×１０６個の細胞を置き、ＭＯＩ１０で、ＧＦＰ−ＵＳＡ３００と同期させた。ＰＭＮのプレートを、感染の非存在下でＣＤ１１ｂ染色を検出するためにモック感染させた。ウサギ血清からアフィニティー精製されたポリクローナル抗ＬｕｋＡ抗体およびリソスタフィン（Ａｍｂｉ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＬＬＣ）を添加し、細胞外細菌の効果を排除した。リソスタフィンとの３７℃、５％  ＣＯ２での１０分間のインキュベーション後、細胞を１ＸＰＢＳ中２％のパラホルムアルデヒドおよび０．１Ｍのリジンを用いて３０分間氷上で固定した。プレートを１ＸＰＢＳで洗浄し、撮像するまで１ＸＰＢＳ中に４℃で保管した。画像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７１倒立顕微鏡、ＣｏｏｌＳｎａｐ  ＨＱ２  ＣＣＤカメラ、およびｚスタック能力を持つＳｏｆｔＷｏｒｘ  ｓｕｉｔｅを備える、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＰｅｒｓｏｎａｌＤＶ生細胞撮像システムで６０Ｘ油浸対物レンズを使用して撮像した。画像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して処理した。
【０１０５】
中和抗体の存在下でのＧＦＰ−ＵＳＡ３００および臭化エチジウムの取り込みを撮像するために、ＰＭＮを抗ＣＤ１１ｂ（ＬＭ２／１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）抗体またはそれぞれのアイソタイプ対照（マウスＩｇＧ１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて３０分間室温で前処置した。次いで、ＰＭＮを上記の通り感染させ、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ４０  ＣＦＬ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）の４０Ｘ対物レンズ、Ａｘｉｏｃａｍ  ＩＣｃ  １（Ｚｅｉｓｓ）、およびＺｅｉｓｓによるＺｅｎソフトウェアを使用し、同期化後０分および３０分に画像を撮像した。
【０１０６】
統計
データは、別段の指示がない限り、一元配置分散分析およびターキーの多重比較事後試験（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  第５．０版、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して分析した。本明細書に提示されるデータは、別段の指示がない限り、同様の結果をもたらした少なくとも３つの独立した実験のうちの１つに由来する。
【０１０７】
実施例１−ＬｕｋＡＢはヒト好中球における黄色ブドウ球菌の細胞毒性特性を媒介する
ヒト多形核細胞を、同質遺伝子型の野生型およびｌｕｋＡＢ変異体（ΔｌｕｋＡＢ）メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）株から単離された分泌タンパク質に曝露した。野生型黄色ブドウ球菌株からの分泌タンパク質へのＰＭＮの曝露は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒアッセイによって調べられる強力な細胞死をもたらした（図１Ａ、黒色バー）。対照的に、ｌｕｋＡＢ変異体株からの分泌タンパク質へのＰＭＮの曝露は、細胞死を著しく低減させた（図１Ａ、灰色バー）。ΔｌｕｋＡＢ株によりもたらされた細胞毒性活性の欠失は、図１Ａに示されるように（白色バー）、ｌｕｋＡＢを発現するプラスミドで株を形質転換することによって回復した（ΔｌｕｋＡＢ／ｐＬｕｋＡＢ）。これらのデータは、ＬｕｋＡＢが、ヒト好中球に対するＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ株両方の細胞毒性特性に関与することを示す。
【０１０８】
ＬｕｋＡＢの重要性は、ＬｕｋＡＢが、ヒト全血および一次ヒトＰＭＮのエクスビボ感染中の黄色ブドウ球菌生存に重要であるという所見によりさらに支持される（図１Ｂ、黒色（ＷＴ）および白色（ΔｌｕｋＡＢ／ｐＬｕｋＡＢ）バーを灰色バー（ΔｌｕｋＡＢ）と比較する）。さらに、腎膿瘍のマウスモデルを使用し、インビボでの黄色ブドウ球菌病原性に対するＬｕｋＡＢの寄与を決定した。このモデルにおいて、マウスに黄色ブドウ球菌を含有する眼窩後注射でチャレンジを行い、次いで、感染後９６時間に安楽死させた。腎臓ホモジネート中の細菌負荷を、黄色ブドウ球菌病原性の尺度として使用する。このモデルを使用し、ｌｕｋＡＢを欠失する同質遺伝子型変異体は、ＷＴ  ＣＡ−ＭＲＳＡと比較して、腎組織における細胞負荷の約１００倍の減少を呈する（図１Ｃ、灰色バー）。ｌｕｋＡＢ変異体の表現型は、プラスミドによりｌｕｋＡＢをトランスで発現させることによって部分的に補完された（図１Ｃ、白色バー）。集合的に、これらのデータは、ＬｕｋＡＢが、黄色ブドウ球菌病原性に重要な毒性因子であることを示す。
【０１０９】
精製された組換え毒素を用いる実験は、ＬｕｋＡＢが、ヒトＰＭＮ、単球（一次およびＴＨＰ１細胞の両方）、マクロファージ、および樹状細胞を含む、多様なヒト細胞を標的化および殺滅するために必要かつ十分であることを明らかにした（図２、Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  ｔｈａｔ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，″Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９（３）：８１４−２５も参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。対照的に、マスト細胞（ＲＢＬ３Ｈ３）、リンパ球（Ｊｕｒｋａｔ）、上皮細胞（ＨｅｐＧ２および２９３Ｔ）、および赤血球は、ＬｕｋＡＢに対し高度に不応性である（図２）。さらに、ヒト骨髄細胞系ＨＬ６０のＰＭＮ様細胞（「ＰＭＮ−ＨＬ６０」）への分化は、これらの細胞をＬｕｋＡＢ細胞毒性に対して高度に感受性にする（図２）。
【０１１０】
上に提示されるデータは、ＬｕｋＡＢがヒト食細胞を標的化および殺滅することを示す（図２）。重要なことに、一次マウス好中球を用いる実験は、同質遺伝子型の野生型黄色ブドウ球菌から単離された分泌タンパク質が、マウス細胞とインキュベートされるとき、細胞毒性が全くまたはほとんど観察されないため、ＬｕｋＡＢがヒト特異的であると思われることを明らかにした（図３）。これらのデータは、ヒト細胞系を用いた研究に基づいて、黄色ブドウ球菌により生成される最も重要なロイコトキシンであるＬｕｋＡＢの寄与が、感染のマウスモデルにより十分に測定されないことを示唆するため、これらは極めて大きな意味を有する。したがって、ヒト食細胞をＬｕｋＡＢに対して感受性にする細胞決定因子の特定は、ヒトにおける黄色ブドウ球菌感染の病理生物学をより良く表すトランスジェニック動物の作製を可能にする。
【０１１１】
実施例２−ＬｕｋＡＢはインテグリンαＭ／β２（Ｍａｃ−１またはＣＲ３）と直接相互作用する
ＬｕｋＡＢと相互作用する宿主タンパク質を特定するために、ＬｕｋＡＢに対し極めて敏感であるＨＬ６０骨髄細胞系から分化された短命の好中球様細胞であるＰＭＮ−ＨＬ６０細胞を用いて、プルダウンアッセイを行った（Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  Ｔｈａｔ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，″Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９（３）：８１４−８２５（２０１１）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。溶解物をＨｉｓタグ付きＬｕｋＡＢとインキュベートし、ニッケルカラムを使用して毒素−宿主タンパク質複合体を単離した。ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞上の表面タンパク質を、ＬｕｋＡＢとのインキュベーション前にビオチン化し、宿主タンパク質が、蛍光コンジュゲートストレプトアビジンを使用して可視化され得るようにする（図４Ａ）。この技術を用いることによって、多数の宿主タンパク質がＬｕｋＡＢと会合することが観察された（図４Ａ）。ビオチン化なしでヒト血液から単離された一次ヒトＰＭＮを用いてプルダウンを繰り返し、ＬｕｋＡＢによるプルダウン中に富む細胞因子の識別および量を、質量分析によって決定した。最も豊富なＬｕｋＡＢ相互作用細胞表面タンパク質は、ＣＤ１８およびＣＤ１１ｂであり（表１）、これらはそれぞれ、インテグリンαＭ／β２、ＣＲ３、またはＭａｃ−１として知られ本明細書ではＭａｃ−１と呼ばれるインテグリン複合体のαおよびβ成分である。ＬｕｋＥＤまたはＰＶＬではなく、ＬｕｋＡＢとＣＤ１１ｂとの会合は、ＣＤ１１ｂ特異的抗体を用いた免疫ブロットによって確認した（図４Ｂ）。ＬｕｋＡＢとＭａｃ−１との特異的および直接相互作用は、プルダウンが精製された組換え毒素および精製された受容体を用いて行われたときに確認された。総タンパク質染色は、ＬｕｋＥＤまたはＰＶＬではなくＬｕｋＡＢが、それぞれ約１５０ｋＤａおよび９５ｋＤａである、精製されたＭａｃ−１複合体のＣＤ１１ｂおよびＣＤ１８サブユニットの両方をプルダウンすることができることを明らかにした（図４Ｃ）。免疫ブロットは、他の毒素ではなく、ＬｕｋＡＢによるプルダウンにおけるＣＤ１１ｂの存在をさらに検証した（図４Ｄ）。
【０１１２】
（表１）ＬｕｋＡＢ相互作用細胞因子の質量分析
2015517463.tif 000030
【０１１３】
ＬｕｋＡＢのＭａｃ−１との直接相互作用をより良く特徴付けるために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を行ったところ、ＬｕｋＡＢが、用量依存的および飽和可能にＭａｃ−１に結合し、約３８．４ｎＭの解離定数（Ｋｄ）をもたらすことを示した（表２）。
【０１１４】
（表２）ＬｕｋＡＢ／Ｍａｃ−１相互作用のＳＰＲ分析
2015517463.tif 000031
【０１１５】
実施例３−Ｍａｃ−１のＣＤ１１ｂサブユニットは、細胞をＬｕｋＡＢに対して感受性にするのに必要かつ十分である。
ＬｕｋＡＢに対する細胞の感受性とＭａｃ−１との関連を提供するために、ＨＬ６０細胞を、非標的化ｓｈＲＮＡ（ＮＴ  ｓｈＲＮＡ）またはＣＤ１８  ｓｈＲＮＡを含有するウイルスで形質導入した。これらの細胞のＬｕｋＡＢへの感受性を強化するために、安定的に形質導入されたＨＬ６０細胞系をＰＭＮ−ＨＬ６０に分化させ（図５Ａ）、ＣＤ１８およびＣＤ１１ｂの細胞表面レベルに対するｓｈＲＮＡの効果をフローサイトメトリーによって確認した（図５Ｂ）。ＮＴ  ｓｈＲＮＡ細胞と比較して、ＣＤ１８  ｓｈＲＮＡ細胞は、ＣＤ１８を顕著に枯渇した（図５Ｂ）。ＣＤ１８は、全てのインテグリンαサブユニットの安定性および表面局在化に必要であるため（Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ  １（ＬＦＡ−１）−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ：Ｔｈｅ  ＡｌｐｈａＬ  ａｎｄ  Ｂｅｔａ２  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ａｒｅ  Ｉｎｔｅｒｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，″Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８（１）：２７３−２７９（１９９７）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｃ−１，ＬＦＡ−１，ｐ１５０，９５  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ，″Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０（６）：１９０１−１９１８（１９８４）、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ＣＤ１１ｂもＣＤ１８  ｓｈＲＮＡ細胞において枯渇した（図５Ｂ）。したがって、ＣＤ１８を標的化することによって、Ｍａｃ−１枯渇細胞系を作製した。精製されたＬｕｋＡＢを用いたＣＤ１８  ｓｈＲＮＡ細胞の中毒化は、Ｍａｃ−１がＬｕｋＡＢ孔の形成に必要であることを明らかにした（図５Ｃ）。対照的に、ＰＶＬは、Ｍａｃ−１非依存的に孔を形成した。これは、ＬｕｋＡＢおよびＰＶＬが異なる細胞決定因子を利用してそれらの細胞毒性を作用させることを示す（図５Ｃ）。
【０１１６】
Ｍａｃ−１に加えて、ＰＭＮ−ＨＬ６０は、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ）およびＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８（ｐ１５０／９５）で装飾され、ＣＤ１８の枯渇は、これらのβ２インテグリンの表面レベルの低減も同様にもたらした（図６）。Ｍａｃ−１複合体のノックダウンが、ＬｕｋＡＢへの耐性の増加に関与し、β２インテグリンの全体的なノックダウンではないことを保証するために、ＨＬ６０細胞をＣＤ１１ｂ標的化ｓｈＲＮＡで安定的に形質導入した。この戦略は、ＣＤ１８レベルに対する著しい効果なしに、ＣＤ１１ｂの顕著な枯渇をもたらした（図５Ｄ）。実際に、ＣＤ１１ｂ標的化ｓｈＲＮＡで形質導入された細胞上で観察されたＭａｃ−１レベルは、親ＨＬ６０細胞のそれに類似した（図５Ｄ）。ＣＤ１１ｂの枯渇は、細胞をＬｕｋＡＢ孔に対して耐性にするが、ＰＶＬ孔に対しては耐性にしない（図５Ｅ）。これらの所見は、ＣＤ１１ｂが細胞をＬｕｋＡＢに対して感受性にするために重要であることを実証する。
【０１１７】
ＣＤ１１ｂが細胞をＬｕｋＡＢに対して感受性にするのに十分であるかどうかを決定するために、機能獲得実験を行った。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＣＤ１８の非存在下でＣＤ１１ｂ表面局在化を支持することができることが示されている（Ｓｏｌｏｖｊｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｐｈａ  ａｎｄ  Ｂｅｔａ  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ＡｌｐｈａＭｂｅｔａ２，″Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（２）：１３３６−１３４５（２００５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、これらの細胞に、ＣＤ１１ｂをコードするプラスミドまたは空プラスミドのいずれかを一過的にトランスフェクトし、ＣＤ１１ｂ表面レベルをフローサイトメトリーによって決定した（図５Ｆ）。ＰＶＬではなく、ＬｕｋＡＢによるこれらの細胞の中毒化は、ＣＤ１１ｂ＋ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の大部分（８０〜９０％）の枯渇をもたらし、ＣＤ１１ｂが、細胞をＬｕｋＡＢに対して感受性にするのに必要かつ十分であることを確認した（図５Ｆ）。
【０１１８】
実施例４−ＣＤ１１ｂのＩドメインは、標的細胞に対するＬｕｋＡＢ媒介性毒性に必要である
ＬｕｋＡＢ細胞毒性が、ＣＤ１１ｂ特異的抗体でブロックされ得るかどうかを調べた。ＬｕｋＡＢで中毒化する前に、一次ＰＭＮを、ＣＤ１１ｂを標的化する３つの異なる抗体、ならびにＣＤ１８、ＣＤ１１ａ、およびＣＤ１１ｃに対する抗体で前処置した。全ての３つのＣＤ１１ｂ抗体およびＣＤ１８抗体は、ある程度のＬｕｋＡＢ毒性のブロッキングを示すが、ＬＭ２／１  ＣＤ１１ｂ抗体のみが、未処置の細胞またはアイソタイプ対照と比較したときに、ＬｕｋＡＢ活性を著しく阻害した（図７Ａ〜７Ｂ）。
【０１１９】
ＬＭ２／１抗体は、ＣＤ１１ｂ  Ｉドメイン（またはＡドメイン）を認識し、該ドメインは、大部分の内因性Ｍａｃ−１リガンドが、金属イオン依存性接着部位（ＭＩＤＡＳ）を介して結合する場所である（Ａｒｎａｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ａｌｌｏｓｔｅｒｙ，ａｎｄ  Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，″Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１：３８１−４１０（２００５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＬＭ２／１のブロッキングのデータに基づいて、ＣＤ１１ｂのＩドメインが、標的細胞のＬｕｋＡＢ媒介性殺滅に必要であると仮定した。この可能性に対処するために、前述の通りオーバーラップＰＣＲを使用してＩドメインを欠失させた変異型ＣＤ１１ｂを構築した（Ｙａｌａｍａｎｃｈｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉ  Ｄｏｍａｉｎ−Ｄｅｌｅｔｅｄ  Ｍａｃ−１  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ−１，″Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２９）：２１８７７−２１８８２（２０００）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｉドメインの欠失が、ＣＤ１１ｂとＣＤ１８との相互作用またはＭａｃ−１とＩドメインを必要としない内因性リガンドとの相互作用に影響しないことが確認されている（Ｙａｌａｍａｎｃｈｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉ  Ｄｏｍａｉｎ−Ｄｅｌｅｔｅｄ  Ｍａｃ−１  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ−１，″Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２９）：２１８７７−２１８８２（２０００）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＨＬ６０細胞に、野生型（ＷＴ）ＣＤ１１ｂ、Ｉ欠失ＣＤ１１ｂ、または空ベクター対照を含有する構築物から作製されたウイルスで形質導入した。これらの細胞は、ＬｕｋＡＢに対して高度に耐性であり、低レベルのＣＤ１１ｂを有するため選択した（図５Ａおよび５Ｄ）。Ｉドメインが細胞毒性に必須である場合、外因性ＷＴ  ＣＤ１１ｂは、これらの細胞をＰＭＮ−ＨＬ６０細胞と同様に感受性にし、一方、Ｉ欠失型のＣＤ１１ｂはそうではないであろう。形質導入および安定的組み込みに続いて、ＨＬ６０細胞系の表面上のＣＤ１１ｂのレベルを、ＷＴおよびＩ欠失型のＣＤ１１ｂの両方を認識するα−ＣＤ１１ｂ抗体を用いて、フローサイトメトリーにより評価した（図７Ｃ）。ＷＴおよびＩ欠失ＣＤ１１ｂの両方は、ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞のそれに相当するか、またはそれより高いレベルで表面に露出していた（図７Ｃ）。外因性ＷＴ  ＣＤ１１ｂは、空ベクター対照ＨＬ６０細胞と比較した、膜損傷および細胞死の増加によって証明されるように、ＨＬ６０細胞をＬｕｋＡＢに対して感受性にした（図７Ｄ〜７Ｅ）。外因性ＷＴ  ＣＤ１１ｂを有するＨＬ６０細胞によって呈される感受性のレベルは、分化させたＰＭＮ−ＨＬ６０細胞に相当した。対照的に、外因性Ｉ欠失ＣＤ１１ｂを有するＨＬ６０細胞は、ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞に対して同等レベルの表面ＣＤ１１ｂを有するにもかかわらず、ＬｕｋＡＢ媒介性��胞毒性に対して高度に耐性であった（図７Ｃ〜７Ｅ）。
【０１２０】
実施例５−ＬｕｋＡＢは、マウスＣＤ１１ｂ  Ｉドメインと比較して、ヒトＣＤ１１ｂ  Ｉドメインに対してより高い親和性を示す。
精製されたＬｕｋＡＢは、ヒトおよびサルＰＭＮに対して高度に細胞毒性であり、ウサギＰＭＮに対して中度に毒性であり、マウスＰＭＮに対して低度に毒性であることが示された（図３）（Ｍａｌａｃｈｏｗａ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＧＨ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，″Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０６（８）：１１８５−１１９３（２０１２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらの所見は、ＬｕｋＡＢが、血液精製されたＰＭＮを種特異的に標的化することを示唆する。ＬｕｋＥＤに対して高度に感受性であるマウス腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）は、ＬｕｋＡＢに対し耐性である（図８Ａ）。ＰＥＣは、主に動員されたＰＭＮ（Ｌｙ６Ｇ＋／ＣＤ１１ｂ＋）、ならびに単球およびマクロファージ（Ｌｙ６Ｇ−／ＣＤ１１ｂ＋）からなり、それら全てが高レベルの表面ＣＤ１１ｂを有する（図８Ｂ）。
【０１２１】
毒性活性（図７Ｃ〜７Ｄ）に関するＣＤ１１ｂ  Ｉドメインの必要性と共に、ＬｕｋＡＢの種特異性を考慮して、異なる種からのこのドメインの保存を調べた。ヒト、ゴリラ、ウサギ、およびマウスＣＤ１１ｂ  Ｉドメインのアミノ酸配列のアラインメントは、予想通り、グリラが最もヒトに類似し（９８．６％同一性）、続いてウサギ（７９．１％同一性）、次いでマウス（７８．１％同一性）に類似することを明らかにした（図８Ｃ）。これらのデータは、これらの種からのＰＭＮに対するＬｕｋＡＢの指向性と相関する（Ｍａｌａｃｈｏｗａ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＧＨ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，″Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０６（８）：１１８５−１１９３（２０１２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらの差が、ＣＤ１１ｂ  Ｉドメインに対するＬｕｋＡＢの結合に影響し得るかどうかを調査するために、ＬｕｋＡＢ−ＣＤ１１ｂ  Ｉドメイン相互作用を検出するドットブロットアッセイを開発した。蛍光標識ＬｕｋＡＢとヒトＣＤ１１ｂ  Ｉドメインとの間の用量依存的相互作用が観察され、これは非標識ＰＶＬとではなく過剰な非標識ＬｕｋＡＢと競合した（図８Ｄ）。このアッセイを使用するヒト対マウスＣＤ１１ｂ  ＩドメインとのＬｕｋＡＢ結合の比較は、ＬｕｋＡＢがヒトＣＤ１１ｂ  Ｉドメインに優先的に結合することを明らかにした（図８Ｅ）。ＳＰＲ分析は、ＬｕｋＡＢが１．９２ｎＭのおおよそのＫｄでヒトＣＤ１１ｂ  Ｉドメインに結合し、１．０６ＭのＬｕｋＡＢ−マウスＣＤ１１ｂ  Ｉドメイン相互作用のそれよりも約８〜９ｌｏｇ低いことを明らかにした（表１）。
【０１２２】
実施例６−細胞外黄色ブドウ球菌は、ＣＤ１１ｂを利用して感染中にＬｕｋＡＢ媒介性細胞損傷を引き起こす
黄色ブドウ球菌感染におけるＣＤ１１ｂの役割を確認するために、ＮＴまたはＣＤ１１ｂ  ｓｈＲＮＡ  ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞を、ＣＡ−ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００株ＬＡＣまたはＬｕｋＡＢを欠失する同質遺伝子型変異体（ΔｌｕｋＡＢ）に感染させた。ＷＴ  ＵＳＡ３００は、ＬｕｋＡＢ依存的にＮＴ  ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞を殺滅した（図９Ａ）。対照的に、ＣＤ１１ｂ表面レベルが、ｓｈＲＮＡ（ＣＤ１１ｂ）によってこれらの細胞で低減されるとき、ＷＴ  ＵＳＡ３００は、もはや細胞損傷を引き起こさず、代わりにｌｕｋＡＢ変異体株に類似する（図９Ａ）。
【０１２３】
精製されたヒトＰＭＮのＵＳＡ３００株によるエクスビボ感染を行い、ＬｕｋＡＢ媒介性細胞損傷が、感染前の抗ＣＤ１１ｂ抗体での前処置によりブロックされ得るかどうかを試験した。これらの実験は、抗ＩドメインＬＭ２／１抗体が、ＵＳＡ３００媒介性細胞損傷を中和することに成功したことを明らかにし（図９Ｂ）、したがって黄色ブドウ球菌−ＰＭＮ相互作用中のＣＤ１１ｂ  Ｉドメインの、ＬｕｋＡＢ媒介性標的化に関する役割を確認した。
【０１２４】
実施例７−貪食された黄色ブドウ球菌は、ＣＤ１１ｂのＬｕｋＡＢ媒介性標的化を利用して細胞損傷を引き起こし、内部からの脱出を促進する
貪食後のＬｕｋＡＢ媒介性細胞損傷が、ＰＭＮ内からのＵＳＡ３００の早期脱出および続くＵＳＡ３００の増殖を促進することが近年確認された。ＣＤ１１ｂがＬｕｋＡＢの細胞内細胞毒性活性に寄与するかどうかを決定するために、ＮＴおよびＣＤ１１ｂ  ｓｈＲＮＡ  ＰＭＮ−ＨＬ６０細胞をオプソニン化ＵＳＡ３００に感染させ、同期させて貪食を促進した。重要なことに、ＣＤ１１ｂの枯渇は、ＵＳＡ３００の貪食に影響しなかった（図１０Ａ〜１０Ｂ）。これらの条件下で、ＣＤ１１ｂのノックダウンにより、ＷＴ  ＵＳＡ３００によって引き起こされる細胞損傷が消失した（図１１Ａ）。
【０１２５】
これらの実験は、貪食されたＵＳＡ３００が、ＬｕｋＡＢを用いてＰＭＮ−ＨＬ６０媒介性増殖制限を妨げることを明らかにした（図１１Ｂ）。しかしながら、ＣＤ１１ｂのノックダウンは、ΔｌｕｋＡＢ変異体株と比較した、ＷＴ  ＵＳＡ３００の増殖の利点を排除した（図１１Ｂ）。
【０１２６】
ＣＤ１１ｂが、貪食された黄色ブドウ球菌によってＰＭＮ内から脱出するために利用されるために、ＣＤ１１ｂは、黄色ブドウ球菌を取り囲む食胞膜中に存在しなければならない。黄色ブドウ球菌の貪食中のＣＤ１１ｂの位置を決定するために、ヒトＰＭＮを蛍光標識されたα−ＣＤ１１ｂ抗体または蛍光標識されたアイソタイプ対照で事前染色し、続いてＧＦＰ−ＵＳＡ３００に感染させた。同期化後に感染した細胞を固定し、ｚスタック能力を持つＡｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＰｅｒｓｏｎａｌＤＶ生細胞撮像システムを使用して撮像した。感染していないヒトＰＭＮにおいて、ＣＤ１１ｂ染色は、細胞の細胞膜全体に分散される（図１１Ｃ）。しかしながら、ＵＳＡ３００による感染時に、ＣＤ１１ｂは、貪食されたＧＦＰ−ＵＳＡ３００と付随することがわかった（図１１Ｃ）。
【０１２７】
ＬＭ２／１抗ＣＤ１１ｂ中和抗体を、貪食されたＵＳＡ３００により引き起こされるＬｕｋＡＢ媒介性ＰＭＮ損傷をブロックする試みに使用した。これらの実験の場合、ＧＦＰ−ＵＳＡ３００  ＷＴ、同質遺伝子型ΔｌｕｋＡＢ、またはｌｕｋＡＢで染色体的に補完した同質遺伝子型ΔｌｕｋＡＢに感染させる前に、ＰＭＮをＬＭ２／１抗体またはアイソタイプ対照で前処置した。これらの実験は、細胞外細菌および細胞外ＬｕｋＡＢの潜在的寄与を排除するためのリソスタフィンおよび抗ＬｕｋＡ、ならびに孔形成を測定するための蛍光色素臭化エチジウムの存在下で行った。特に、ＰＭＮ内で観察されたＧＦＰ−ＵＳＡ３００の量がＬＭ２／１処置に関わらず同様であったため、感染前のＬＭ２／１での前処置は、黄色ブドウ球菌の貪食をブロックしない（図１２）。貪食されたＵＳＡ３００は、ＰＭＮがアイソタイプ対照抗体で前処置されるとき、同期化後３０分でＬｕｋＡＢ媒介性孔形成を引き起こした（図１１Ｄ）。対照的に、ＬＭ２／１前処置は、ＬｕｋＡＢ媒介性孔形成の減少をもたらし（図１１Ｄ〜１１Ｅ）、ｌｕｋＡＢ変異体株で観察された表現型を模倣した。
【０１２８】
実施例１〜７に関する論考
この研究は、細胞を特異的に標的化および殺滅するためにブドウ球菌ロイコトキシンＬｕｋＡＢによって利用される細胞分子としての、Ｍａｃ−１インテグリンのＣＤ１１ｂの特定について説明する。この結論は、ＬｕｋＡＢが、Ｍａｃ−１複合体（特にＣＤ１１ｂのＩドメイン）と直接相互作用し、ノックダウンおよび機能獲得分析によって証明されるように、ＣＤ１１ｂが、細胞をＬｕｋＡＢに対して感受性にするのに必要かつ十分であるという所見によって支持される。
【０１２９】
ＬｕｋＥＤおよびＰＶＬ等の他の二成分性毒素ではなく、ＬｕｋＡＢによって特異的に利用される細胞標的の特定は、ブドウ球菌ロイコトキシンが特定の細胞型を標的化するための非重複機構を有することを強調する。ＣＣＲ５は、近年、リンパ球、マクロファージ、および樹状細胞を標的化および殺滅するためにＬｕｋＥＤによって利用される細胞受容体として特定された（Ａｌｏｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，″ＣＣＲ５  ｉｓ  ａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＥＤ，″Ｎａｔｕｒｅ  ４９３（７４３０）：５１−５５（２０１３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。しかしながら、単球およびＰＭＮは、ＣＣＲ５非依存的にＬｕｋＥＤによって殺滅され、追加の細胞受容体が、これらの細胞を標的化するためにＬｕｋＥＤによって利用され得ることを示唆する（Ａｌｏｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，″ＣＣＲ５  ｉｓ  ａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＥＤ，″Ｎａｔｕｒｅ  ４９３（７４３０）：５１−５５（２０１３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。単一のブドウ球菌毒素が、複数の受容体を標的化し得るという事実、および各毒素が別個の非重複受容体を利用し得るという事実は、黄色ブドウ球菌が、既に広範なレパートリーの毒素で排除することができる細胞型の数を大幅に増加させる。
【０１３０】
ＰＭＮ等の生得的免疫細胞の標的化された殺滅は、黄色ブドウ球菌ならびに多数の他のヒト病原体の病原性に重要である。Ｍａｃ−１は、ＰＭＮ、マクロファージ、単球、および樹状細胞を含む（Ｈｏ  ＆  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，″Ｍａｃ−１  Ａｎｔｉｇｅｎ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｐｌｅｅｎ，″Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８（５）：２２８１−２２８６（１９８２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ＬｕｋＡＢによって標的化される細胞の全てで発現され（Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  Ｔｈａｔ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，″Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９（３）：８１４−８２５（２０１１）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、貪食、細胞活性化、細胞媒介性殺滅、および化学走性等の複数の細胞機能に関与する（Ｓｏｌｏｖｊｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｐｈａ  ａｎｄ  Ｂｅｔａ  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ＡｌｐｈａＭｂｅｔａ２，″Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（２）：１３３６−１３４５（２００５）、Ｈｙｎｅｓ  Ｒ．Ｏ．，″Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ：Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ，  Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ，″Ｃｅｌｌ  １１０（６）：６７３−６８７（２００２）、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）。本研究は、細胞外黄色ブドウ球菌および貪食された黄色ブドウ球菌の両方が、ＬｕｋＡＢを用いて、ＣＤ１１ｂを標的化することにより、感染中にＰＭＮ損傷を引き起こすことを実証する。ＣＤ１１ｂが貪食された黄色ブドウ球菌を取り囲むという所見は、食胞からの黄色ブドウ球菌のＬｕｋＡＢ媒介性脱出とＣＤ１１ｂを関連付ける。
【０１３１】
ヒトＣＤ１１ｂ  ＩドメインのＬｕｋＡＢの細胞標的としての特定は、この毒素によって呈される観察された種特異性についての説明を提供する。マウスＣＤ１１ｂ  Ｉドメインに対するＬｕｋＡＢの親和性は、ヒトＣＤ１１ｂ  Ｉドメインに対して観察されたものよりも約８〜９ｌｏｇ低く、以前に報告されたマウスＰＭＮの感受性と相関する（Ｍａｌａｃｈｏｗａ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＧＨ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，″Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０６（８）：１１８５−１１９３（２０１２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。結合親和性の差は、アミノ酸配列アラインメントに基づくこれら２つの種からのＩドメイン間の発散配列相同性によって説明される可能性が最も高く、これにより、２つのＩドメイン間の７８．１％の同一性が得られた。特に、ＵＳＡ３００がｌｕｋＡＢをインビボでマウス膿瘍において発現すること、および該毒素が、マウス腎膿瘍モデルにおける感染プロセスおよび細菌負荷の両方に寄与することが観察された（Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  Ｔｈａｔ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，″Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９（３）：８１４−８２５（２０１１）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＬｕｋＡＢは、この腎膿瘍形成マウスモデルにおいて役割を果たすが、ヒトＰＭＮと比較して、マウスＰＭＮのこの毒素への顕著な耐性は、マウスモデルが、ヒトにおける黄色ブドウ球菌病理生物学に対するＬｕｋＡＢの真の寄与を過小評価することを示唆する。黄色ブドウ球菌によって生成される漸増する数の毒性因子（例えば、超抗原、ＣＨＩＰＳ、ＰＶＬ、ＬｕｋＡＢ）の種特異的活性は（Ｖａｎｄｅｎｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎｓ，Ｂｉ−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎｓ，ａｎｄ  Ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  Ａｒｓｅｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ｄａｍａｇｉｎｇ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  Ｆａｃｔｏｒｓ？″Ｆｒｏｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２：１２  （２０１２）、Ｒｏｏｉｊａｋｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｖａｓｉｏｎ，″Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３（１２）：５９６−６０１（２００５）、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）、黄色ブドウ球菌の病原性を研究するために現在用いられている動物モデルの制限を強調する。したがって、改善された動物モデルは、黄色ブドウ球菌の完全な毒性能力を理解するために重要であり、これは、この重要なヒト病原体に効くことができる有効な薬物の開発に不可欠である。
【０１３２】
本発明は、例示の目的で詳述されたが、そのような詳細は単にその目的のためであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者はそこに変更を行うことができることが理解される。
【図１】
2015517463.tif 000033
【図２】
2015517463.tif 000034
【図３】
2015517463.tif 000035
【図４】
2015517463.tif 000036
【図５】
2015517463.tif 000037
【図６】
2015517463.tif 000038
【図７】
2015517463.tif 000039
【図８】
2015517463.tif 000040
【図９】
2015517463.tif 000041
【図１０】
2015517463.tif 000042
【図１１】
2015517463.tif 000043
【図１２】
2015517463.tif 000044
【手続補正書】
【提出日】平成27年1月7日(2015.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2015517463000001.app
【国際調査報告】
2015517463.tif 000045
2015517463.tif 000046
2015517463.tif 000047