(57)【要約】  ２成分を有する水性殺菌組成物。第１の成分は、０．５−５ｗｔ％の、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの混合物である。第２の成分は、１−１０ｗｔ％の、Ｃ６−Ｃ１２アルキル基、平均３−７モル重合単位のプロピレンオキサイドおよび平均５−１２モル重合単位のエチレンオキサイドを含む非イオン性界面活性剤である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）０．５−５ｗｔ％の、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの混合物；ならびに（ｂ）１−１０ｗｔ％の、Ｃ６−Ｃ１２アルキル基、平均３−７モル重合単位のプロピレンオキサイドおよび平均５−１２モル重合単位のエチレンオキサイドを含む非イオン性界面活性剤を含む水性殺菌組成物。
【請求項２】
前記非イオン性界面活性剤が、構造：
ＲＯ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｘ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙＨ
（式中、ＲはＣ６−Ｃ１２アルキル基であり、ｘから３から７であり、ｙは５から１２である）
を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
３から８ｗｔ％の前記非イオン性界面活性剤を有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ＲがＣ７−Ｃ９アルキル基であり、ｘが４から６であり、ｙが５から７または８から１０である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
１−３ｗｔ％の前記混合物を有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
Ｒが２−エチルヘキシルであり、ｙが６または９であり、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン対２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの重量比が２．５：１から３．５：１であり、前記非イオン性界面活性剤対前記混合物の重量比が５：１から２：１である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
（ａ）５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの混合物；ならびに（ｂ）構造：
ＲＯ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｘ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙＨ
（式中、ＲはＣ８アルキル基であり、ｘは５であり、ｙは６または９である）
を有する非イオン性界面活性剤を含む、相乗的殺菌組成物。
【請求項８】
５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン対２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの重量比が２．５：１から３．５：１である、請求項７に記載の相乗的殺菌組成物。
【請求項９】
Ｒが２−エチルヘキシルであり、ｙが９であり、前記混合物対前記非イオン性界面活性剤の重量比が１：２から１：５０である、請求項８に記載の相乗的殺菌組成物。
【請求項１０】
Ｒが２−エチルヘキシルであり、ｙが６であり、前記混合物対前記非イオン性界面活性剤の重量比が１：０．５から１：１０である、請求項８に記載の相乗的殺菌組成物。
【請求項１１】
（ａ）５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの混合物；ならびに（ｂ）Ｃ６−Ｃ１２アルキル基、平均３−７モル重合単位のプロピレンオキサイドおよび平均５−１２モル重合単位のエチレンオキサイドを含む非イオン性界面活性剤を含み、前記非イオン性界面活性剤対前記混合物の重量比が１０：１から０．８：１である水性殺菌組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−クロロ−２−メチルイソチアゾリン−３−オン、２−メチルイソチアゾリン−３−オンおよび界面活性剤を含有する殺菌組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
５−クロロ−２−メチルイソチアゾリン−３−オン、２−メチルイソチアゾリン−３−オンおよび非イオン性分散剤を含有する組成物が、米国特許第４，２９５，９３２号明細書に開示されている。該組成物は、５−クロロ−２−メチルイソチアゾリン−３−オンおよび２−メチルイソチアゾリン−３−オンの３：１混合物およびＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ６１またはＴＥＲＧＩＴＯＬ  Ｌ６１分散剤と同じ組成を有すると思われるエチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとのコポリマーを含有する。しかし、５−クロロ−２−メチルイソチアゾリン−３−オンおよび２−メチルイソチアゾリン−３−オンを含有する代替の組成物の必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第４，２９５，９３２号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が対処する問題は、５−クロロ−２−メチルイソチアゾリン−３−オンおよび２−メチルイソチアゾリン−３−オンを含有する代替の組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、（ａ）０．５−５ｗｔ％の５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの混合物；ならびに（ｂ）１−１０ｗｔ％の、Ｃ６−Ｃ１２アルキル基、平均３−７モル重合単位のプロピレンオキサイドおよび平均５−１２モル重合単位のエチレンオキサイドを含む非イオン性界面活性剤を含む水性殺菌組成物を対象とする。
【０００６】
本発明は、（ａ）５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの混合物；ならびに（ｂ）構造：
ＲＯ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｘ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙＨ
（式中、ＲはＣ８アルキル基であり、ｘは５であり、ｙは６または９である）
を有する非イオン性界面活性剤を含む、相乗的殺菌組成物をさらに対象とする。
【０００７】
本発明は、（ａ）５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの混合物；ならびに（ｂ）Ｃ６−Ｃ１２アルキル基、平均３−７モル重合単位のプロピレンオキサイドおよび平均５−１２モル重合単位のエチレンオキサイドを含む非イオン性界面活性剤を含み、前記非イオン性界面活性剤対前記混合物の重量比が１０：１から０．８：１である水性殺菌組成物をさらに対象とする。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
「ＭＩＴ」は、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンであり、２−メチル−３−イソチアゾロンとも称される。「ＣＭＩＴ」は、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンであり、５−クロロ−２−メチル−３−イソチアゾロンとも称される。好ましくは、ＣＭＩＴ対ＭＩＴの重量比は、少なくとも２：１、好ましくは少なくとも２．５：１である。好ましくは、ＣＭＩＴ対ＭＩＴの重量比は、４：１以下、好ましくは３．５：１以下である。本発明の好ましい一実施形態において、ＣＭＩＴ：ＭＩＴの比は約３：１である。
【０００９】
本明細書において使用する場合、下記の用語は、文脈が特に他のことを明確に述べない限り、指定された定義を有する。「殺菌剤」という用語は、ある場所において微生物の成長を阻害、または成長を制御可能な化合物を指し、殺菌剤は、殺細菌剤、殺真菌剤および殺藻剤を含む。「微生物」という用語は、例えば、真菌（酵母およびカビなど）、細菌および藻を含む。本明細書において使用される用語の「固体」組成物は、２５℃において固体の組成物である。下記の略称は本明細書を通して使用される：ｐｐｍ＝重量百万分率（重量／重量）、ｍＬ＝ミリリットル。他のことが明記されない限り、温度は摂氏度（℃）であり、百分率に対する言及は重量百分率（ｗｔ％）であり量および比率は、有効成分ベース、すなわちイソチアゾロンおよび非イオン性界面活性剤である。固体組成物中の水の百分率は、任意の水和塩中に存在するすべての水および存在し得る任意の遊離水を含む。
【００１０】
好ましくは、水性組成物は、少なくとも０．８ｗｔ％のＣＭＩＴおよびＭＩＴ混合物（有効成分ベース）、好ましくは少なくとも１ｗｔ％、好ましくは少なくとも１．１ｗｔ％の前記組成物、好ましくは少なくとも１．２ｗｔ％、好ましくは少なくとも１．３ｗｔ％を含有し、；好ましくは、該組成物は４．５ｗｔ％以下の前記混合物を含有し、好ましくは４ｗｔ％以下、好ましくは３．５ｗｔ％以下、好ましくは３ｗｔ％以下、好ましくは２．５ｗｔ％以下、好ましくは２ｗｔ％以下、好ましくは１．８ｗｔ％以下の前記混合物を含有する。好ましくは、非イオン性界面活性剤対ＣＭＩＴ／ＭＩＴ混合物の重量比は、ＣＭＩＴ／ＭＩＴおよび界面活性剤の有効成分重量に基づき、１０：１以下、好ましくは８：１以下、好ましくは６：１以下、好ましくは５：１以下、好ましくは４：１以下、好ましくは３．５：１以下、好ましくは３：１以下であり、好ましくは少なくとも０．８：１、好ましくは少なくとも１：１、好ましくは少なくとも１．５：１、好ましくは少なくとも２：１、好ましくは少なくとも２．５：１、好ましくは少なくとも３：１である。
【００１１】
「金属硝酸塩」は、好ましくはアルカリ金属、アルカリ土類金属またはアンモニウムの硝酸塩である。好ましくは、金属はリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウムまたはこれらの組み合わせであり、より好ましくは、ナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはこれらの組み合わせである。マグネシウムが特に好ましい。
【００１２】
水性組成物は、好ましくは少なくとも７０ｗｔ％の水を含有し、好ましくは少なくとも８０ｗｔ％、好ましくは少なくとも８５ｗｔ％、好ましくは少なくとも８７ｗｔ％、好ましくは少なくとも８９ｗｔ％の水を含有する。好ましくは、水性組成物は、少なくとも０．５ｗｔ％の金属硝酸塩を含有し、好ましくは少なくとも１ｗｔ％、好ましくは少なくとも１．２ｗｔ％、好ましくは少なくとも１．４ｗｔ％、好ましくは少なくとも２ｗｔ％の金属硝酸塩を含有し、好ましくは８ｗｔ％以下、好ましくは６ｗｔ％以下、好ましくは５ｗｔ％以下、好ましくは４ｗｔ％以下、好ましくは３ｗｔ％以下の金属硝酸塩を含有する。好ましくは、水性組成物は、少なくとも０．００５ｗｔ％の、ヨウ素酸、臭素酸、過ヨウ素酸またはそれらの塩の少なくとも１つを含有し、好ましくは少なくとも０．０１ｗｔ％、好ましくは少なくとも０．０１５ｗｔ％、好ましくは少なくとも０．０２ｗｔ％の、ヨウ素酸、臭素酸、過ヨウ素酸またはそれらの塩の少なくとも１つを含有し、好ましくは０．２ｗｔ％以下、好ましくは０．１ｗｔ％以下、好ましくは０．０５ｗｔ％以下の、ヨウ素酸、臭素酸、過ヨウ素酸またはそれらの塩の少なくとも１つを含有する。好ましくは、硝酸銅、硫酸銅または他の塩を含む銅系安定剤を使用することができ、好ましくは少なくとも０．０５ｗｔ％、好ましくは少なくとも０．１０％、好ましくは少なくとも０．１５％、好ましくは少なくとも０．２０％；好ましくは２．０％以下、好ましくは１．０％以下、好ましくは５．０以下を含有する。さらに、過酸化物またはブロノポール系安定剤もまた使用できる。通常、水性組成物は、工業的使用のために１．０から１５ｐｐｍのＣＭＩＴ／ＭＩＴ（有効成分ベース）に希釈されるものである。
【００１３】
好ましくは、非イオン性界面活性剤は下記の構造：
ＲＯ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｘ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙＨ
（式中、ＲはＣ６−Ｃ１２アルキル基であり、ｘは３から７であり、ｙは５から１２である。）
を有する。ｘおよびｙの数は、化合物の混合物に由来する平均値である。好ましくは、ＲはＣ６−Ｃ１０アルキル基、好ましくはＣ７−Ｃ９アルキル基、好ましくはＣ８アルキル基、好ましくは２−エチルヘキシル基である。好ましくは、Ｒは分枝型アルキル基である。好ましくは、ｘは４−６であり、好ましくは約５である。好ましくは、ｙは５−１０であり、好ましくは６−１０、好ましくは６−９、好ましくは５−７または８−１０、好ましくは７−１０、好ましくは８−１０、好ましくは約９である。好ましくは、水性組成物は、少なくとも２ｗｔ％の前記非イオン性界面活性剤（有効成分ベース）を含有し、好ましくは少なくとも３ｗｔ％、好ましくは少なくとも３．５ｗｔ％、好ましくは少なくとも４ｗｔ％の前記非イオン性界面活性剤を含有し、好ましくは９ｗｔ％以下、好ましくは８ｗｔ％以下、好ましくは７ｗｔ％以下、好ましくは６．５ｗｔ％以下、好ましくは６ｗｔ％以下の前記非イオン性界面活性剤を含有する。
【００１４】
水性組成物は、イソチアゾロン殺生物剤の生成から持ち越される微量の有機溶媒を含有してもよい。好ましくは、水性組成物中の有機溶媒の合計レベルは、１％以下、好ましくは０．５％以下、好ましくは０．３％以下、好ましくは０．２％以下、好ましくは０．１％以下である。通常、存在し得る有機溶媒としては、例えば、エタノール、酢酸エチル、酢酸、酢酸ブチル、ブタノールおよび塩化メチレンが挙げられる。
【００１５】
好ましくは、水性組成物は、他の界面活性剤を実質的に含まず、すなわち、水性組成物は、１ｗｔ％未満の前記非イオン性界面活性剤以外の界面活性剤を含有し、好ましくは０．５ｗｔ％未満、好ましくは０．３ｗｔ％未満、好ましくは０．２ｗｔ％未満、好ましくは０．１ｗｔ％未満、好ましくは０．０５ｗｔ％未満の前記非イオン性界面活性剤以外の界面活性剤を含有する。
【００１６】
好ましくは、相乗的殺菌組成物は、（ａ）５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの混合物；ならびに（ｂ）Ｃ８アルキル基、平均５重合単位のプロピレンオキサイドおよび平均９重合単位のエチレンオキサイドを含む非イオン性界面活性剤を含有する。好ましくは、前記混合物対前記非イオン性界面活性剤の重量比は、１：２から１：５０である。好ましくは、相乗的殺菌組成物は、（ａ）５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの混合物；ならびに（ｂ）Ｃ８アルキル基、平均５重合単位のプロピレンオキサイドおよび平均６重合単位のエチレンオキサイドを含む非イオン性界面活性剤を含有する。好ましくは、前記混合物対前記非イオン性界面活性剤の重量比は、１：０．５から１：１０である。好ましくは、非イオン性界面活性剤は下記の構造：
ＲＯ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｘ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙＨ
（式中、ＲはＣ８アルキル基であり、ｘは５であり、ｙは６または９、好ましくは９である）を有する。好ましくは、Ｃ８アルキル基は２−エチルヘキシルである。ＣＭＩＴ／ＭＩＴ混合物（３：１重量比）は、Ｐ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｅ．クロアカ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）およびＫ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｍｏｎｉａｅ）に対して前述の式（式中、Ｒが２−エチルヘキシルであり、ｘが５であり、ｙが９である）の非イオン性界面活性剤と相乗的であり、この組み合わせはエンテロバクター・クロアカ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）の成長の阻害において特に有効である。ＣＭＩＴ／ＭＩＴ混合物混合物（３：１重量比）は、前述の式（式中、Ｒは２−エチルヘキシルであり、ｘは５であり、ｙは６である）の非イオン性界面活性剤と、エンテロバクター・クロアカ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｍｏｎｉａｅ）に対して相乗的であった。好ましくは、相乗的殺菌組成物は実質的に他のイソチアゾロンを含まない、すなわち、相乗的殺菌組成物は、有効成分の合計重量に基づき１ｗｔ％未満、好ましくは０．５ｗｔ％未満、好ましくは０．２ｗｔ％未満、好ましくは０．１ｗｔ％未満の、ＣＭＩＴ／ＭＩＴ以外のイソチアゾロンを有する。好ましくは、相乗的殺菌組成物は実質的に他の殺菌剤を含まず、すなわち、相乗的殺菌組成物は、有効成分の合計重量に基づき１ｗｔ％未満、好ましくは０．５ｗｔ％未満、好ましくは０．２ｗｔ％未満、好ましくは０．１ｗｔ％未満の、ＣＭＩＴ／ＭＩＴ以外の殺菌剤を有する。
【００１７】
本発明の組成物は、他の原料、例えば消泡剤および乳化剤を含んでもよい。本発明の殺菌組成物を使用して、微生物または水生高等生物（例えば、原生動物、無脊椎動物、コケムシ、渦鞭毛藻、甲殻類、軟体動物など）の成長を、微生物の攻撃を受ける場所の上、中またはその場所に殺菌有効量の組成物を導入することによって阻害することができる。適切な場所としては、例えば、工業用プロセス水；電着塗装（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏａｔ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）系；冷却塔；空気清浄装置；ガススクラバー；鉱物スラリー；廃水処理；観賞用噴水；逆浸透ろ過；限外ろ過；バラスト水；蒸発凝縮器；熱交換機；紙パルプ処理用流体および添加物；デンプン；プラスチック；エマルジョン；分散液；塗料；ラテックス；ニスなどの被膜剤；建設用製品、例えばマスチック、コーキング材およびシーラントなど；建設用接着剤、例えばセラミック接着剤、カーペット裏地接着剤および貼り合わせ用接着剤など；工業的もしくは消費者用接着剤；写真用化学薬品；印刷流体；家庭用品、例えば浴室および台所用洗浄剤；化粧品；トイレタリー製品；シャンプー；石鹸；洗剤；工業用洗浄剤；床磨き剤；洗濯すすぎ剤；金属加工油剤；コンベア潤滑剤；油圧油；革および革加工製品；織物；織物製品；木材および木材加工製品、例えば合板、チップボード、フレークボード、積層梁、配向性ストランドボード、ハードボードおよびパーティクルボード；液油加工流体；燃料；油田流体、例えば注入水、破砕流体および掘削泥水；農業用アジュバント保存；界面活性剤保存；医療機器；診断試薬保存；食品保存、例えばプラスチックまたは紙の食品ラップ；食品；飲料、および工業プロセス用低温殺菌器；便器；レクリエーション水域；プール；ならびにスパが挙げられる。
【００１８】
ある用途において微生物の成長を阻害または制御するために必要とされる本発明の殺菌組成物の特定量は変動する。通常、本発明の組成物の量は、組成物の有効成分が０．１から１，０００ｐｐｍ（百万分率）で提供された場合、微生物の成長を制御するために十分である。組成物の有効成分（すなわち非イオン性界面活性剤およびイソチアゾロン混合物）は、その場所において少なくとも１ｐｐｍ、好ましくは少なくとも５ｐｐｍ、好ましくは少なくとも１０ｐｐｍ、好ましくは少なくとも２０ｐｐｍの量で存在することが好ましい。組成物の有効成分は、その場所において７００ｐｐｍ以下、好ましくは４００ｐｐｍ以下、好ましくは２００ｐｐｍ以下、好ましくは１００ｐｐｍ以下、好ましくは５０ｐｐｍ以下、好ましくは３０ｐｐｍ以下、好ましくは２０ｐｐｍ以下で存在することが好ましい。
【００１９】
工業的および商業的冷却水系において、好ましくは有効成分の合計濃度は、少なくとも１ｐｐｍ、好ましくは少なくとも２ｐｐｍ、好ましくは少なくとも３ｐｐｍ；好ましくは２５ｐｐｍ以下、好ましくは２０ｐｐｍ以下、好ましくは１５ｐｐｍ以下、好ましくは１２ｐｐｍ以下、好ましくは１０ｐｐｍ以下、好ましくは８ｐｐｍ以下、好ましくは６ｐｐｍ以下である。本発明の方法において、工業的および商業的冷却水系は、非イオン性界面活性剤およびイソチアゾロン混合物を、一緒または別々に、上記の濃度を生み出す量で加えることによって処理される。
【実施例１】
【００２０】
ＰＬＵＲＯＮＩＣ界面活性剤とＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤との適合性スクリーニング
いくつかのＰＬＵＲＯＮＩＣ界面活性剤を含むさまざまな界面活性剤が、表面上の細菌生物汚染を制御するための、低レベルのＣＭＩＴ／ＭＩＴ（３：１重量比）殺生物剤の有効性を改善することが既に示されている。本出願のすべての試験において、ＣＭＩＴ／ＭＩＴは、銅またはヨウ素酸塩系の安定剤を含まなかった。殺生物剤と界面活性剤との１．５：５重量パーセント比の併用は、さまざまな時点および異なる母材においてさまざまな生物による生物汚染の制御に有効であった。ＰＬＵＲＯＮＩＣおよびＴＥＲＧＩＴＯＬ  Ｌ界面活性剤は、プロピレンオキサイド（ＰＯ）とエチレンオキサイド（ＥＯ）とのコポリマーであり、ポリプロピレングリコールをエチレンオキサイドでキャップすることにより作製される。ナンバリング系の１桁目の３００倍は重合ＰＯコアの分子量を示し、２桁目の１０倍は界面活性剤中の重合エチレンオキサイドの百分率を示す。例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ６１は、ＭＷ１８００のＰＯコアを有し、全体で１０％ＥＯである。
【００２１】
しかし、２部分（２つのドラム）の処理は、追加のポンプ、タイマー、配管系、電気、在庫、空所および維持管理を必要とするので、微生物制御のために２部分（２つのドラム）の処理を使用することは望ましくない。最も望ましい投与系は、単一製品（１ドラム）戦略である。しかし、併用製剤は、実行可能な選択であるために、優れた適合性および安定性を実証しなければならない。
【００２２】
殺生物剤および界面活性剤の併用を含有する安定な製剤は、特に昇温における保存下での良好な物理的および化学的適合性の最小基準を実証しなければならない。製品からの発泡も、最小から全くないことは併用製品の重要な特長である。
【００２３】
このスクリーニング研究において、いくつかのＰＬＵＲＯＮＩＣ界面活性剤（ＢＡＳＦ  Ｃｏ．）を、１％および５％でＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤と併用して評価した。殺生物剤と界面活性剤との物理的安定性を、４０℃において１週間の間評価した。この実施例において、殺生物剤を、最終濃度１．５％に製剤化し、０．１５％の硝酸銅により安定化させた。
【００２４】
この研究結果により、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ６２（１％または５％において）とＣＭＩＴ／ＭＩＴとの製剤が相分離を起こし、したがって使用に不適切であることが示された。ＣＭＩＴ／ＭＩＴ製剤とＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ４３との相分離は、１：１比においても見られたが、１：５重量比においては見られなかった。しかし、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ４４は、ＣＭＩＴ／ＭＩＴとの併用において相分離を示さなかった。これらのスクリーニング結果に基づき、ＣＭＩＴ／ＭＩＴとＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ４４界面活性剤との製剤は、さらなる適合性試験に適切であった。
[表]
2015534552.tif 000002
【実施例２】
【００２５】
ＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤とＰＬＵＲＯＮＩＣ界面活性剤との長期熱老化後の適合性。
この安定性／適合性研究において、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ４４およびＬ４４  ＩＮＨ界面活性剤（ＢＡＳＦ  Ｃｏ．）を５％レベルで、０．０１％ヨウ素酸カリウムにより事前安定化または事後安定化のいずれかを行った１．５％レベルのＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤と併用して評価した。殺生物剤と界面活性剤との物理的／化学的安定性を、２５°において４週間保存後および５５℃において４〜８週間保存後に評価した。適切な製剤は、＞９０％の各殺生物剤成分の残留を示し、５５℃において４週間保存後に濁りも沈殿物も示さない。わずかな色変化のみが望ましくないが、これは固体（沈殿物）を生み出すものでも、または投与される殺生物剤の濃度に影響を与えるものでもないので、許容可能である。許容できない試料は太字および下線で強調してある。
【００２６】
この研究結果により、ＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤は、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ４４またはＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ４４  ＩＮＨ界面活性剤のいずれとも昇温（５５℃）において適合性ではないことが示された。ＣＭＩＴ殺生物剤のより激しい分解が試料１および試料２（事前安定化）対試料２および試料３（事後安定化）において見られた。すべての熱老化試料は、殺生物剤の喪失（＜９５％の残留）、沈殿の形成および混濁の出現のため許容できないと見なされた。したがって、ＣＭＩＴ／ＭＩＴとＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ４４またはＬ４４  ＩＮＨ界面活性剤との併用は、さまざまな熱老化条件および調製方法において強固でも適合性でもない。
[表]
2015534552.tif 000003
【実施例３】
【００２７】
ＣＭＩＴ／ＭＩＴ製剤と界面活性剤との化学的安定性。
さらなる研究を実施し、ＣＭＩＴおよびＭＩＴ有効成分と、さまざまな界面活性剤との（１．５：５重量比）併用における化学的安定性を、長期熱老化条件下で比較した。
【００２８】
この研究において、いくつかの追加の界面活性剤を５％で、０．０１％ヨウ素酸カリウムにより事前安定化または事後安定化のいずれかを行った１．５％のＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤と併用して評価した。殺生物剤製剤と界面活性剤との化学的安定性を、当初２５°において評価し、４週後および８週後の老化を５５℃において評価した。適切な製剤は、＞９５％の各殺生物剤成分の残留を示し、５５℃において４週間保存後に濁りも沈殿も示さない。わずかな色変化のみが望ましくないが、これは固体（沈殿物）を生み出すものでも、または投入される殺生物剤の濃度に影響を与えるものでもないので、許容可能である。許容できない試料は太字および下線で強調してある。
【００２９】
ＣＭＩＴ／ＭＩＴとＴＥＲＧＩＴＯＬ  Ｌ−６４およびＳｕｒｆ．Ａ（平均９単位のＥＯによりキャップされた平均５単位のＰＯを含む２−エチルヘキシル）との併用により、良好な物理的安定性および化学的安定性が示され、両方のイソチアゾロン殺生物剤は５５℃において４〜８週間後も活性であった。１つの試料だけが８週後にＣＭＩＴの有意な喪失を示した。わずかな色変化がＣＭＩＴ／ＭＩＴ＋Ｓｕｒｆ．Ａに見られたが、濁りも沈殿も観察されなかった。したがって、これらの界面活性剤は両方ともＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤を含有する強固な製剤の候補である。
[表]
2015534552.tif 000004
【実施例４】
【００３０】
ＣＭＩＴ／ＭＩＴ製剤と、Ｓｕｒｆ．Ａ、ＢおよびＣならびにＴＥＲＧＩＴＯＬ界面活性剤との適合性スクリーニング。
適合性スクリーニング研究を実施して、ＣＭＩＴ／ＭＩＴ製剤と、さまざまな界面活性剤との適合性を評価し、これらの界面活性剤は、ＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤の微生物バイオフィルム制御に対する有効性を強化していた。物理的観察を、１．５％ＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤と５％界面活性剤とを含有する併用製剤に対して実施した。ＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤を、１４％ＣＭＩＴ／ＭＩＴ製品を希釈して、（非添加が明記されない限り）０．０１％ヨウ素酸カリウムにより事後安定化することにより調製した。
【００３１】
結果により、ＣＭＩＴ／ＭＩＴが物理的には無色透明であり、ヨウ素酸カリウムにより安定化させた場合沈殿物を含まないことが示された。１．５％ＣＭＩＴ／ＭＩＴ製剤中の安定剤の除去により、４０°および５５℃において変色および沈殿物が生じた。
【００３２】
Ｓｕｒｆ．Ｃ（平均３単位のＥＯによりキャップされた平均５単位のＰＯを含む２−エチルヘキシル）およびＴＥＲＧＩＴＯＬ  Ｌ−８１界面活性剤（ＣＭＩＴ／ＭＩＴ含有または非含有）は、ゼロ時において物理的に不適切（混濁またはゲル化）であり、さらなる試験を行わなかった。
【００３３】
Ｓｕｒｆ．Ｂ（平均６単位のＥＯによりキャップされた平均５単位のＰＯを含む２−エチルヘキシル）およびＴＥＲＧＩＴＯＬ  Ｌ−６２は、ＣＭＩＴ／ＭＩＴとの併用において変わりやすい結果を示し、濁り、色または高発泡のため適切とはみなされなかった。
【００３４】
Ｓｕｒｆ．ＡおよびＴＥＲＧＩＴＯＬ  Ｌ−６４界面活性剤は、５％で１．５％のＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤と一緒に製剤化した場合、優れた物理的特性および適合性を示した。これらの製剤は、通常、透明であり、濁りまたは色が無く、５５℃までの短期熱老化後に最小の発泡から発泡が無かった。
[表]
2015534552.tif 000005
【実施例５】
【００３５】
ＣＭＩＴ／ＭＩＴ製剤と、Ｓｕｒｆ．ＡおよびＴＥＲＧＩＴＯＬ  Ｌ−６４界面活性剤との長期熱老化後の適合性および安定性。
さらなる安定性試験を、Ｓｕｒｆ．Ｂ、Ｓｕｒｆ．ＡおよびＴＥＲＧＩＴＯＬ  Ｌ−６４界面活性剤を含有するＣＭＩＴ／ＭＩＴ製剤に対して実施し、それらの長期物理的適合性および化学的適合性を評価した。試験は２５℃、４０℃および５５℃において実施した。結果により、２ヶ月後５５℃において保存されたＴＥＲＧＩＴＯＬＬ−６４＋ＣＭＩＴ／ＭＩＴを除くすべての製剤が優れた化学的安定性（初期濃度の＞９５％が残留）および物理的外観（透明、沈殿および濁りなし）を示した。わずかな発泡および色が、Ｓｕｒｆ．ＢとＣＭＩＴ／ＭＩＴとを含有する製剤において観察された。
【００３６】
老化３ヶ月後、ＣＭＩＴ有効成分のわずかな喪失（９４％残留）が５５℃においてＳｕｒｆ．Ａに見られた。ＣＭＩＴの中程度の喪失（８９％残留）および黄変が、５５℃においてＳｕｒｆ．Ｂに見られた。すべての他の被験併用は、優れた物理的適合性および化学的適合性を示した。
【００３７】
６ヶ月後、室温において老化させたすべての試料は非常に安定であり、物理的に適合性であった。想定通りに、昇温における殺生物剤のさらなる喪失がいくつかの製剤に関して指摘されたが、４０℃および５５℃において６ヶ月の保存に関してこれは許容可能である。
[表]
2015534552.tif 000006
Ｓｕｒｆ．Ａ＋ＣＭＩＴ／ＭＩＴ初期濃度＝１．１３３％ＣＭＩＴ＋０．３７５％ＭＩＴ
Ｓｕｒｆ．Ａ＋ＣＭＩＴ／ＭＩＴ初期濃度＝１．１２７％ＣＭＩＴ＋０．３７１％ＭＩＴ
ＴＥＲＧＩＴＯＬ  Ｌ−６４＋ＣＭＩＴ／ＭＩＴ初期濃度＝１．１１６％ＣＭＩＴ＋０．３６５％ＭＩＴ
ＣＭＩＴ／ＭＩＴ初期濃度＝１．１６３％ＣＭＩＴ＋０．３８４％ＭＩＴ
[表]
2015534552.tif 000007
[表]
2015534552.tif 000008
【００３８】
プランクトン細菌による相乗作用試験
高分解能最小発育阻止濃度（ＨＲＭＩＣ）研究を実施して、ＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤および界面活性剤の両方単独または併用の阻害レベルを決定した。試験は標準的実験質培地において実施した。結果は、３０℃において２４時間のインキュベーション後に決定した。
【００３９】
材料および方法
本発明の併用の相乗性は、該化合物の広範囲の濃度および比率を試験することによって実証された。相乗性の１つの尺度は、Ｋｕｌｌ，Ｆ．Ｃ．；Ｅｉｓｍａｎ，Ｐ．Ｃ．；Ｓｙｌｗｅｓｔｒｏｗｉｃｚ，Ｈ．Ｄ．ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ，  Ｒ．Ｌ．，ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ９：５３８−５４１（１９６１）により記載された工業的に認められた方法であり、下記の式により決定される比を使用する：
Ｑａ／ＱＡ＋Ｑｂ／ＱＢ＝相乗指数（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｉｎｄｅｘ）（「ＳＩ」）、式中：
ＱＡ＝単独で作用する、エンドポイントを生み出す化合物Ａ（第１の成分）のｐｐｍ濃度（化合物ＡのＭＩＣまたはＭＢＣ）。
Ｑａ＝混合物中の、エンドポイントを生み出す化合物Ａのｐｐｍ濃度。
ＱＢ＝単独で作用する、エンドポイントを生み出す化合物Ｂ（第２の成分）のｐｐｍ濃度（化合物ＢのＭＩＣまたはＭＢＣ）。
Ｑｂ＝混合物中の、エンドポイントを生み出す化合物Ｂのｐｐｍ濃度。
【００４０】
Ｑａ／ＱＡおよびＱｂ／ＱＢの  合計が１より大きい場合、拮抗作用が示される。合計が１に等しい場合、相加性が示され、１未満である場合、相乗性が実証される。ＳＩが低いほど、その特定の混合物により示される相乗作用は大きい。殺菌剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、特定の設定条件下で加えられた微生物の成長を防ぐ最も低い被験濃度である。
【００４１】
試験は、９６ウェルマイクロタイタ―プレートにより、高分解能ＭＩＣ併用試験方法を用いるＢＩＯＭＥＫ  ２０００  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用して設定され、これは、２種の殺生物剤の複数の併用を１つの試験プレートに提供する。無機塩＋グルコース−酵母エキス（Ｍ９ＧＹ）培地において成長が観察されなかった（阻害）殺生物剤の最も低い濃度を、併用の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）として定義した。
【００４２】
シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＴＣＣ１５４４２）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）（ＡＴＣＣ１３０４７）またはクレブシラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＡＴＣＣ１００３１）の２４時間齢培養液の１：２０希釈液を試験に使用した。マイクロタイタープレートの各ウェルに、各生物の２０μｌの純粋培養懸濁液を１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌの最終密度で入れた。
【００４３】
ＭＩＣプレートを３０℃において２４時間インキュベートし、微生物の成長（濁度）の有無を視覚的に検査した。試験は、殺生物剤の異なる出発濃度で二連に設定して、抗菌活性を示す併用候補の数を増やした。成長を阻害した殺生物剤の最も低い濃度を、ＭＩＣとして記録した。すべての殺生物剤の結果を、有効成分ベースについてｐｐｍ（百万分率）で報告する。
【００４４】
結果により、ＣＭＩＴ／ＭＩＴがＳｕｒｆ．ＡおよびＳｕｒｆ．Ｂと相乗的であったことが示された。相乗指数値を下記の表に要約する。界面活性剤単独は、１０，０００ｐｐｍにおいて抗菌活性を示さなかった。
【００４５】
ＣＭＩＴ／ＭＩＴおよびＳｕｒｆ．Ａによる相乗作用が、３種すべての被験細菌株に対して観察された。Ｓｕｒｆ．Ｂのみが、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）および（クレブシラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）株に対してＣＭＩＴ／ＭＩＴとの相乗作用を示し、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対しては相乗作用を示さなかった。
[表]
2015534552.tif 000009
[表]
2015534552.tif 000010
[表]
2015534552.tif 000011
【００４６】
ＣＭＩＴ／ＭＩＴ  殺生物剤＋界面活性剤によるバイオフィルム制御研究
【００４７】
材料および方法
モデルバイオフィルム系を使用して、ＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤および界面活性剤処理（単独または併用）の、定着したバイオフィルムの根絶に関する有効性を評価した。この系は、１％のトリプチケースソイブロスを含むリン酸緩衝生理食塩水（１００ｍｌ）中でスライドガラス上においてバイオフィルムを成長させることを伴った。３種の細菌（シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＡＴＴＣＣ１５４４２、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）ＡＴＣＣ  １３０４７およびクレブシラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ１００３１）の混合物を、バイオフィルム試料のための接種材料として使用した。撹拌しながら（１５０−２００ｒｐｍ）３０℃において２４−４８時間インキュベーション後、事前成長バイオフィルムのスライドをリン酸緩衝生理食塩水ですすぎ、合成冷却水（５８４ｍｇ／ｌ  ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ）、２０３ｍｇ／ｌ  ＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ）、８４ｍｇ／ｌＮａＨＣＯ３、５ｍｇ／ｌ  アクリレートポリマーおよび０．１％  トリプチケースソイブロス）を含有する殺生物剤処理接触溶液に移した。所定の接触時間（４−２４時間）後、バイオフィルムをすすぎ、掻き取り、生存細菌の生菌数を、平板生菌数測定法またはＭＰＮによりトリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）培地を使用して決定した。
【００４８】
データを下記に提供して、細菌汚染を制御するための界面活性剤の存在下におけるＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤による相加的有効性を実証した。界面活性剤単独の添加により、高濃度であってもバイオフィルム制御は示されなかった。したがって、界面活性剤は、表面における細菌汚染の制御において、ＣＭＩＴ／ＭＩＴとの相乗効果を実証した。概して、制御または別の処理に対する少なくとも０．５ｌｏｇ単位のｌｏｇ減少の増加が、測定可能な改善の証拠である。
【００４９】
ＣＤＣ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｒｅａｃｔｏｒ研究に関して、ＣＤＣ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｒｅａｃｔｏｒを、下記を例外としてＡＳＴＭ  Ｅ２５６２−０７の手順に従って使用した：
１．Ｐ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）から変更した細菌種は、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）ＡＴＣＣＢＡＡ７４、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）宿主生物のアカントアメーバ・ポリファーガ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ  ｐｏｌｙｐｈａｇａ）ＡＴＣＣ３０４６１および未定義の環境細菌生物を含む。環境生物およびレジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）は、細胞懸濁液に由来する
２．バッチ相（流動のないインキュベーション）を、過去の２４時間から５日間に延長して、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）の遅い成長速度を支持した。
３．冷却塔環境に関連する条件を反映するために、培地を合成冷却水に変更し、培地の流速を遅くして、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）の遅い成長速度を反映させた。
４．処理プロトコルは、標的殺生物剤が、初期投薬後に加えられた現実的な維持投薬により、クーポンに付着した生存バイオフィルムにどのように影響を与えるかを検出するために、ＢＣＤＭＨ−ハロゲン化水（０．６ｐｐｍの利用可能な塩素）によりフラッシュする、２４時間の事後処理を加えることさらに含んだ。
５．サンプリングを変更して、プレサンプリングのすすぎステップを取り除き、ステップ１０．３．４−１０．４．２を取り除き、激しいボルテックス混合ステップに置き換えて、被験クーポンからバイオフィルムを取り外した。レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）生菌数は二連にプレーティングしなかった。
【実施例６】
【００５０】
ＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤（１．５ｐｐｍ有効成分；ａ．ｉ．）単独により、未処理対照と比較して細菌生物汚染の制御に関して、２．３ｌｏｇ減少が４時間において示され、０．７ｌｏｇ減少が２４時間において示された。１５ｐｐｍ有効成分で単独で試験されたＳｕｒｆ．Ａ、ＢおよびＣにより、未処理の対照と比較して、表面の細菌汚染の減少は示されなかった。ＣＭＩＴ／ＭＩＴと、Ｓｕｒｆ．Ａ、ＢまたはＣ（１：１０ｗｔ％比）との併用はすべて、ＣＭＩＴ／ＭＩＴ処理単独と比較して細菌バイオフィルム制御の改善を示した。したがって、これらの界面活性剤は、単独で試験した場合には制御を示さなかったが、ＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤による細菌バイオフィルム成長の制御を改善した。
[表]
2015534552.tif 000012
【実施例７】
【００５１】
ＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤（１．５ｐｐｍ有効成分；ａ．ｉ．）単独により、未処理対照と比較して細菌生物汚染の制御に関して、１．２ｌｏｇ減少が４時間において示され、２．２ｌｏｇ減少が２４時間において示された。
【００５２】
１．５ｐｐｍのＣＭＩＴ／ＭＩＴと、５ｐｐｍのＳｕｒｆ．ＢまたはＳｕｒｆ．Ａ（１：３．３ｗｔ％比）との併用はすべて、ＣＭＩＴ／ＭＩＴ処理単独と比較して細菌バイオフィルム制御の改善を示した。
【００５３】
この試験において、Ｓｕｒｆ．Ｃは、ＣＭＩＴ／ＭＩＴと一緒に細菌制御の改善を示さなかったが、Ｓｕｒｆ．Ａは、２４時間処理されたバイオフィルム試料において生存細菌を示さなかった。したがって、Ｓｕｒｆ．ＡおよびＳｕｒｆ．Ｂは、ＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤による細菌バイオフィルム成長の制御を改善した。
[表]
2015534552.tif 000013
*検出限界= 生存細胞は回収されなかった
【実施例８】
【００５４】
ＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤（１．５ｐｐｍ有効成分；ａ．ｉ．）単独により、未処理対照と比較して細菌生物汚染の制御に関して、２．３ｌｏｇ減少が４時間において示され、２．５ｌｏｇ減少が２４時間において示された。
【００５５】
Ｓｕｒｆ．Ａ（５ｐｐｍ有効成分）とＣＭＩＴ／ＭＩＴ（１．５ｐｐｍ）（殺生物剤：界面活性剤１：３．３ｗｔ％比）とは、ＣＭＩＴ／ＭＩＴ処理単独と比較して細菌バイオフィルム制御の改善を示した。
[表]
2015534552.tif 000014
*検出限界=生存細胞は回収されなかった
【実施例９】
【００５６】
１．５ｐｐｍおよび３ｐｐｍの有効成分のＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤単独により、未処理対照と比較して、４〜２４時間後の細菌バイオフィルム成長の１．４から２．３のｌｏｇ減少が示された。ＣＭＩＴ／ＭＩＴとＳｕｒｆ．Ａ（１：３．３ｗｔ％比）との併用により、２４時間の接触後のＣＭＩＴ／ＭＩＴ処理単独と比較して、細菌バイオフィルム制御の改善が示された。５０ｐｐｍの有効成分Ｓｕｒｆ．Ａだけでは細菌制御は見られなかった。したがって、この界面活性剤は、単独で試験した場合には制御を示さなかったが、ＣＭＩＴ／ＭＩＴ殺生物剤（この殺生物剤に関する正常な用量範囲内で）による細菌バイオフィルム成長の制御を改善した。
[表]
2015534552.tif 000015
【実施例１０】
【００５７】
処理を、ＣＤＣ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｒｅａｃｔｏｒにおいて、上記の材料および方法に記載のように、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）細菌を含む混合環境試料に対して評価した。
[表]
2015534552.tif 000016
【実施例１１】
【００５８】
界面活性剤：低ＣＭＩＴ／ＭＩＴ比の評価
一連の試料を、４種の異なる界面活性剤（ＴＥＲＧＩＴＯＬ  Ｌ−６１、ＴＥＲＧＩＴＯＬ  Ｌ−６４、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ＢおよびＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ａ）により、それぞれ製剤の３％または１．５％で調製した。各製剤は、およそ１１％のＫＡＴＨＯＮ（商標）ＣＦ１４００殺生物剤を、最終有効成分濃度１．５％のＣＭＩＴ／ＭＩＴに対して含有した。製剤の残りは脱イオン水であった。対照試料を、界面活性剤の代わりに水を加えることによって作製した。不安定化対照を、ＫＡＴＨＯＮ（商標）ＷＴから作製し、不安定化対照は他の製剤を安定化したヨウ素酸塩のいずれも含有しなかった。
【００５９】
各試料を、ＫＡＴＨＯＮ（商標）ＣＦ１４００（ＣＭＩＴおよびＭＩＴ）中の有効成分のレベルに関して、ゼロ時およびその後４週間の間毎週分析した。合計有効成分レベルは、ＣＭＩＴおよびＭＩＴの濃度の合計である。試料を、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。
【００６０】
試料を調製し、ゼロ時におけるＣＭＩＴおよびＭＩＴレベルに関して分析し、すべての試料が正確に投与されたことを確保した。分析後、試料を３つのバイアル、１つは２５℃における加熱老化用、１つは４０℃における加熱老化用および１つは５５℃における加熱老化用に分けた。
【表１】
2015534552.tif 000017
その後、試料を４週間の間毎週分析し、熱老化後の安定性を決定した。
【表２】
2015534552.tif 000018
ＴＥＲＧＩＴＯＬ  Ｌ−６１を含有する試料は、１週間の熱老化後に混濁した。５５℃において１週間熱老化されたＳｕｒｆ．Ｂを含有する試料もまた、混濁した。
【表３】
2015534552.tif 000019
２週間の時点のブロードなピークのため、Mg(NO3)2 のレベルは分析できなかった。
【表４】
2015534552.tif 000020
【表５】
2015534552.tif 000021
４週間の熱老化後、混濁しなかったすべての試料は、不安定化ＣＭＩＴ／ＭＩＴ試料を除き極めて安定なままであった。
【表６】
2015534552.tif 000022
残留パーセントの値のいくつかは、試料に関して記録された初期の値より高い。これは、熱老化中にいくらかの水が蒸発したためと思われる。試料の安定性のより正確な図を提供するために、合計有効成分の値を、ＣＭＩＴおよびＭＩＴの出発濃度に対して正規化する前に、Ｍｇ（ＮＯ３）２濃度に対して正規化した。表７はこれらの結果を記載している。
【表７】
2015534552.tif 000023
透明なままであった試料のすべてが、不安定化ＣＭＩＴ／ＭＩＴ試料を除いて、５５℃において１ヵ月間安定であった。Ｍｇ（ＮＯ３）２レベルがｔ＝２週で正確に計算されなかったので、残留パーセントをその時点に関しては計算しなかった。
【実施例１２】
【００６１】
１：１  ＣＭＩＴ／ＭＩＴ：界面活性剤の併用の有効性
【００６２】
培地
トリプチケースソイブロス寒天（ＴＳＢＡ）
３０ｇのトリプチケースソイブロス（Ｄｉｆｃｏ）および１５ｇの寒天（Ｄｉｆｃｏ）を２リットルのフラスコに量る。
１０００ｍｌの脱イオン水を加える。
１２１℃において２０分間オートクレーブ処理する。
２５ｍｌのＴＳＢＡを滅菌プレート（ＶＷＲ）に注ぐ。
【００６３】
ポテトデキストロースブロス（ＰＤＢ）
２４ｇのポテトデキストロースブロス（Ｄｉｆｃｏ）を２リットルのフラスコに量る。
１０００ｍｌの脱イオン水を加える。
完全に混合して、１分間沸騰させる。
１２１℃において２０分間オートクレーブ処理する。
【００６４】
サブローデキストロース寒天（ＳＤＡ）
１９５ｇのサブローデキストロース寒天（Ｄｉｆｃｏ）を２リットルのフラスコに量る。
１０００ｍｌの脱イオン水を加える。
完全に混合して、１分間沸騰させる。
１２１℃において２０分間オートクレーブ処理する。
ウォーターバスにおいて冷却し、１００μｌのゲンタマイシン（ｇｅｎｔｏｍｙｃｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）および１００μｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を培地に加える。
２５ｍｌのＳＤＡを滅菌プレート（ＶＷＲ）に注ぐ。
【００６５】
トリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）
３０ｇのトリプチケースソイブロス（Ｄｉｆｃｏ）を２リットルのフラスコに量る。
１０００ｍｌの脱イオン水を加える。
１２１℃において２０分間オートクレーブ処理する。
【００６６】
Ａｌｇａ−Ｇｒｏ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ
０．３ｇの寒天（Ｄｉｆｃｏ）を１００ｍｌのフラスコに量る。
６０ｍｌの脱イオン水を加える。
１２１℃において２０分間オートクレーブ処理する。
放冷する。
Ａｌｇａ−Ｇｒｏ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｐｐｌｙ）を加える。
【００６７】
方法
高分解能最小発育阻止濃度評価
【００６８】
微生物
下記の被験微生物は、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から入手した。
[表]
2015534552.tif 000024
【００６９】
培養管理
細菌を、ＴＳＢＡで３０℃において４８時間成長させた。真菌は、ＳＤＡで２５℃において４８時間成長させた。各プレートを、およそ５ｍＬのリン酸緩衝液、ｐＨ７．２で洗浄した。培養懸濁液を、等体積の滅菌５０％グリセロールと混合した。得られた懸濁液を１ｍＬずつ２ｍＬのクライオバイアルに分注し、−７０℃において保存した。微生物を、凍結したクライオバイアルから試験前に回収した。細菌を、ＴＳＢＡで３０℃において４８時間成長させた。真菌は、ＳＤＡで３０℃において４８時間成長させた。
【００７０】
藻類を成長させ、液体培養培地（Ｂｏｌｄ  ３Ｎ培地）において管理した。藻類を回収し、６００ｇにおいて６分間遠心分離し、培養培地に再懸濁した。藻類種を混合し、１００μＬを殺生物剤含有寒天プレートの上に置いた。プレートを、恒明下で３０℃においてインキュベートした。
【００７１】
藻類用培地の調製のために、２０ｇのＢａｃｔｏ  ａｇａｒを９８０ｍＬのｄＨ２Ｏに加え、１２１℃において３０分間オートクレーブ滅菌し、５０℃のウォーターバスに配置し、その後２０ｍＬのＢｏｌｄ  ３Ｎ（５０×ストック）を各リットルに加えた。寒天の一部を無菌的に（ａｓｐｅｃｔｉｃａｌｌｙ）に滅菌フラスコに移し、そこに所望の量の殺生物剤を加え、その後寒天をペトリ皿に注いだ。ペトリ皿を殺生物剤を含有する約２０ｍｌの最終藻類用培地で満たした。
[表]
2015534552.tif 000025
細菌および真菌を阻害するために必要な殺菌剤の最も低い濃度を、高分解能最小発育阻止濃度（ＨＲＭＩＣ）試験により決定した。さまざまな量の各殺菌剤を９６ウェルプレート中の培地に加えた。ＨＲＭＩＣ試験に使用した培地は、細菌にはトリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）および真菌にはポテトデキストロースブロス（ＰＤＢ）であった。定常期の細菌を、一晩３０℃において、回転振とうインキュベーター（１２５往復／分）においてＴＳＢ中で成長させた。真菌のリン酸緩衝懸濁液を調製し、ＰＤＢで希釈した。一晩培養液を、ＯＤ値０．４０に対して較正し、約１．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬの出発細菌懸濁液を確保した。適切な希釈を、適切な試験培地で実施し、試験に植え付け、細菌に関してはおよそ１０６ＣＦＵ／ｍＬを各ウェルに、または真菌に関しては１０５ＣＦＵ／ｍＬを各ウェルに提供した。三連の細胞懸濁液を、すべての生物に関して調製した。マイクロタイタ―プレートを、細菌に関しては３０℃において２４時間、および真菌に関しては２５℃において７日間インキュベートし、その後、各ウェルの濁度を観察することによって微生物の成長の有無をチェックした。藻類は、液体培養培地（Ｂｏｌｄ  ３Ｎ培地）において成長させ、管理した。藻類を回収し、６００ｇにおいて６分間遠心分離し、培養培地に再懸濁した。藻類種を混合し、１００ｕＬを殺生物剤含有寒天プレートに置いた。プレートを、恒明下で３０℃においてインキュベートした。インキュベート後、殺生物剤含有寒天プレート上の成長の存在を視覚的にチェックし、対照プレートに対して比較した。成長を示さなかった第１のマイクロタイタ―ウェル中の化合物濃度が、殺菌剤に関する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）であった。高分解能ＭＩＣ試験は、エンドポイントの間隔が狭く、被験化合物の間のより大きな差別化が可能なので、通常の２倍ＭＩＣ試験より正確である。各殺菌剤に関するＭＩＣ値を、細菌、真菌および藻類それぞれに関する３種の異なる接種材料試験の、各接種材料を３連に試験した平均から決定した。
[表]
2015534552.tif 000026
【００７２】
緑藻類系統のＭＩＣ試験を、Ｂｏｌｄ  ３Ｎ培地を含有する寒天ペトリ皿を使用して実施した。この培地は、藻類の成長を最もよく支援するので選択した。ＣＭＩＴ／ＭＩＴ  １．５％殺菌剤およびＣＭＩＴ／ＭＩＴのブレンド、１．５％＋Ｓｕｒｆ．Ａ（「１：１混合物」）を、寒天培地に加え、０．７５、１．５、３．０、６．０および１２．０ｐｐｍの有効成分を提供した。
【００７３】
藻類接種材料を、藻類を回収し、６００ｇにおいて６分間遠心分離し、培養培地に再懸濁することによって調製した。１００μＬ量の各週齢の藻類培養液を、さまざまな濃度の殺生物剤を含有する寒天プレートの表面に画線し、照明付きインキュベーターで３０℃においてインキュベートした。３０℃において７日間のインキュベーション後、寒天表面で藻類の成長（目で見て緑色の外観）を阻害した殺生物剤の最も低い濃度を、ＭＩＣと見なした。試料は、二連で試験した。
【００７４】
１．５％ＣＭＩＴ／ＭＩＴ＋１．５％Ｓｕｒｆ．Ａ（「１：１混合物」）の抗菌活性
１：１混合物および１．５％ＣＭＩＴ／ＭＩＴのＭＩＣ値を、細菌混合物（実験１、２および３）または真菌（４、５および６）に対して、前記のように高分解能ＭＩＣ法を使用してＴＳＢまたはＰＤＢ中で決定した。１：１混合物および１．５％ＣＭＩＴ／ＭＩＴのＭＩＣ値を、藻類に対して、前記のように寒天プレートＭＩＣ法を使用してＢａｃｔｏ  ａｇａｒにおいて決定した。結果は、１：１混合物および１．５％ＣＭＩＴ／ＭＩＴが、低レベルで微生物の成長を阻害する、高度に有効な殺菌剤であることを示している。さらに、１：１混合物のＭＩＣは、１．５％  ＣＭＩＴ／ＭＩＴのＭＩＣと同様である。ＭＩＣ研究において、ｐｐｍ  ａ．ｉは、試験条件で存在するＣＭＩＴ／ＭＩＴの量を指す。
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【国際調査報告】
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