(57)【要約】  本明細書では、架橋剤で脱水された胎盤組織移植片と接触することによって生産される組織移植片を開示する。本明細書に記載の組織移植片は、バリアを提供し、創傷から生物活性剤の移動を防止する。したがって、組織移植片は、創傷から生物活性剤の好ましくない移動を防止する一方、創傷治癒を高める。架橋移植片を作製及び使用する方法も本明細書に記載されている。
2015503367.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱水された胎盤組織移植片を架橋剤と接触させることを含む方法によって生産される胎盤組織移植片。
【請求項２】
前記胎盤組織移植片が、１つまたは複数の胎盤の構成要素を含む、請求項１に記載の移植片。
【請求項３】
前記胎盤の構成要素が、羊膜、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）、絨毛膜、ウォートン・ジェリー、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項２に記載の移植片。
【請求項４】
前記胎盤組織移植片が、羊膜／絨毛膜の積層を含む、請求項１に記載の移植片。
【請求項５】
前記胎盤組織移植片が、少なくとも２つの絨毛膜の層、少なくとも２つの羊膜の層、または少なくとも１つの絨毛膜の層および羊膜を含む、請求項１に記載の移植片。
【請求項６】
前記胎盤組織移植片が、お互いに貼り付けられた複数の絨毛膜および／または羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を有する、請求項１に記載の移植片。
【請求項７】
前記脱水された胎盤組織移植片が、化学的に脱水されまたは熱的に脱水される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の移植片。
【請求項８】
前記架橋剤が糖、ジアルデヒド、エポキシド、ヒドラジド、またはカルボジイミドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の移植片。
【請求項９】
前記糖が、Ｄ−リボース、グリセロース、アルトロース、タロース、エルセオース、グルコース、リキソース、マンノース、キシロース、グロース、アラビノース、イドース、アロース、ガラクトース、マルトース、ラクトース、スクロース、セロビオース、ゲンチオビオース、メリビオース、ツラノース、トレハロース、イソマルトース、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項８に記載の移植片。
【請求項１０】
ステップ（ａ）の前に、前記胎盤組織移植片を架橋する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の移植片。
【請求項１１】
胎盤組織移植片を生産するための方法であって、前記方法は、脱水された胎盤組織移植片を架橋剤と接触させることを含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片を含む創傷被覆材。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片を創傷に適用することを含む、対象での創傷治癒を高めるための方法。
【請求項１４】
脳硬膜の修復、歯周形成外科的（ｐｅｒｉｏｐｌａｓｔｉｃ）処置、小帯牽引の除去、失われた膝蓋骨組織の再生、洞腔中のシュナイダー膜の修復、歯科インプラント周囲の軟組織、口腔前庭形成術、組織再生誘導法においての請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【請求項１５】
外科的処置後の脊椎の上または付近の瘢痕形成を予防する又は軽減させるための方法であって、前記方法は、対象に、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片を、対象の脊髄硬膜または脊椎付近の領域に直接適用することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項１６】
前記外科的処置が後処置を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記後処置が椎弓切除術または椎間板切除術を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記後処置が前方腰椎椎体間固定術（ＡＬＩＦ）および経椎間孔椎体間固定術（ＴＬＩＦ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記外科的処置が前処置を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
対象での硬膜裂傷を治療するための方法であって、前記方法は、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片を硬膜裂傷に直接適用することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
歯科の適用において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【請求項２２】
整形外科の適用において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【請求項２３】
耳鼻咽喉科の適用において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【請求項２４】
眼科の適用（例えば、眼表面修復のオン−レイ（ｏｎ−ｌａｙ）移植片）において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【請求項２５】
婦人科の適用において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【請求項２６】
泌尿器科の適用において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【請求項２７】
全身の手術において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【請求項２８】
心臓の適用において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【請求項２９】
形成手術後の瘢痕形成を軽減するまたは予防するための請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
創傷治癒適用において、薬物または生物活性剤は、一般的に創傷治癒を高めるために創傷に適用する。生物活性剤に応じて、創傷を残さないおよび被験者の他の身体部分へ移動しないような創傷に剤を局所的に保つことが望ましい。このことは特に生物活性剤が有毒物質であると、被験者の全身至る所に広がる場合と関連性がある。したがって、創傷に塗布した生物活性剤の移動を防ぐ創傷治療装置を有することが望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本明細書では、架橋剤で脱水胎盤組織移植片と接触することによって生産される組織移植片を開示する。本明細書に記載の組織移植片は、バリアを提供し、創傷から生物活性剤の移動を防止する。したがって、組織移植片は、創傷から生物活性剤の好ましくない移動を防止する一方、創傷治癒を高める。架橋移植片を作製および使用する方法も本明細書に記載されている。
【０００３】
本発明の利点は、以下の説明に一部記載され、一部は説明から明らかであり、または以下に記載の態様の実施によって知ることができる。以下に説明する利点は、特に添付の特許請求の範囲において指摘される要素および組み合わせによって実現および達成されるであろう。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、いずれも、例示的および注釈的なものにすぎず、限定的なものではないことが理解されるべきである。
【０００４】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付図面は、以下に説明するいくつかの態様を例示する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】本明細書に記載の組織移植片組成物を作製するための方法の概要フローチャートである。
【図２】脱水されたおよび水和した胎盤組織の架橋を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本願物品および方法を開示および記載する前に、下記の態様は、特定の化合物、合成方法、または使用に限定されず、したがってもちろん、変更され得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される専門用語は、単に特定の態様を説明する目的であり、限定されることを意図しないことが理解されるべきである。
【０００７】
本明細書および以下の請求項において、以下の意味を有すると定義されるべきいくつかの用語に対して、参照がなされる：
【０００８】
本明細書および添付の請求項において用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数形の指示対象を含むことを留意しなければならない。したがって、例えば、「生物活性剤」との言及は、２つまたはそれ以上のそのような剤の混合物などを含む。
【０００９】
「随意的（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「場合により（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、続けて記述される事象または状況が生じ得るまたは生じ得ないこと、および、その記載はその事象または状況が生じる事例および生じない事例を含むことを意味する。例えば、語句「場合により清浄化するステップ」は、清浄化するステップが行われ得るか行われ得ないことを意味する。
【００１０】
本明細書において用いられる用語「対象」は、任意の脊椎生物である。
【００１１】
本明細書において用いられる用語「羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）」は、中間組織層が取り除かれていない羊膜組織を含む。
【００１２】
本明細書において用いられる用語「羊膜」は、中間組織層が取り除かれた羊膜組織を含む。
【００１３】
タイトルまたはサブタイトルは、読者の便宜のために本明細書中において用いられてよく、本発明の範囲に影響を及ぼす意図ではない。さらに、本明細書中で用いられるいくつかの用語は、以下にさらに具体的に定義される。
【００１４】
Ｉ．架橋組織移植片およびそれを作製するための方法
本明細書では、架橋剤で脱水された胎盤組織移植片と接触することから生じる組織移植片を開示する。本明細書で記載される組織移植編は、１つまたは複数の胎盤構成要素で構成される。本明細書において用いられる用語「胎盤の構成要素」は、任意の材料または胎盤および臍帯に存在する組織を含む。一態様では、胎盤の構成要素は、限定されないが、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）、羊膜、絨毛膜、ウォートン・ジェリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ ｊｅｌｌｙ）、胎盤ディスク、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００１５】
図１は、本明細書に記載の組織移植片の調製に用いるための胎盤組織を摘出し、処理し、そして調製するためのステップの例示的な、限定されない概略（１００）と特定の態様を示す。それぞれの個々のステップに関するさらに詳細の説明および議論を続ける。はじめに、胎盤は採取される（ステップ１１０）。材料は保存されて、適切な処理場、または検査（ｃｈｅｃｋ−ｉｎ）と評価のための施設に、従来の組織保存方法で運ばれる（ステップ１２０）。それから、全体の処理、操作、および胎盤組織の分離が行われる（ステップ１３０）。それから、許容できる組織は、除染される（ステップ１４０）。除染後、胎盤組織は脱水されて（ステップ１４５）、および脱水された組織移植片は続けて架橋剤と接触させる（ステップ１５０）。それから、架橋組織移植片は、好ましいサイズに切断され、続けて今後の使用のために梱包される（ステップ１６０）。各ステップを以下に詳細に記載する。
【００１６】
最初の組織採取（ステップ１１０）
組織移植片を生産するために用いられる構成要素は、胎盤に由来する。胎盤の起源は変更することができる。一態様では、胎盤は、ヒトのような哺乳類に由来し、制限されないが、ウシ、ブタなどを含む他の動物をここで用いることができる。ヒトの場合、胎盤の回収は、帝王切開の出産中にそれが採取される病院で行われる。出産間近の母親を指すドナーは、移植が可能な最も安全な組織を提供するために設計された総合的なスクリーニングプロセスを自主的に受ける。スクリーニングプロセスは、好ましくは、ヒト免疫不全ウイルス１型および２型に対する抗体（抗−ＨＩＶ−１および抗−ＨＩＶ−２）、Ｂ型肝炎ウイルス Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する抗体（抗−ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体（抗−ＨＣＶ）、ヒトＴ−リンパ向性ウイルスＩ型およびＩＩ型に対する抗体（抗−ＨＴＬＶ−Ｉ、抗−ＨＴＬＶ−ＩＩ）、ＣＭＶ、および梅毒に対する抗体、および、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検査する核酸に関して、従来の血清検査を用いて検査する。上記の検査リストは単に例示的であり、当業者により理解されるように、より多くの、より少ない、または異なる検査が、経時的にまたは移植片の使用目的に基づいて、所望され、または、必要とされてよい。
【００１７】
ドナーの情報およびスクリーニング検査結果の検討に基づいて、ドナーは、許容できるとみなされるか、または許容できないとみなされるかの、いずれかである。加えて、細菌、例えば、クロストリジウムまたは連鎖球菌の存在を判定するために、分娩時に培養が行われる。ドナーの情報、スクリーニング検査、および分娩培養が全て満たしている場合（すなわち、いかなるリスクも示さず、または許容できるレベルのリスクを示す）、ドナーは医長に承認されて、組織標本は、さらなる処理および評価に当初ふさわしいと指定される。
【００１８】
上記の選定基準に見合うヒト胎盤は、好ましくは、滅菌輸送バッグ中の生理食塩水中に入れられ、そして処理場またはさらなる処理のための実験室への輸送のために、ウェットアイスの容器中に保存される。
【００１９】
スクリーニング検査と分娩培養からの結果の取得が完了する前に胎盤が採取される場合は、そのような組織はラベルされて検疫所に保管される。組織が操作および使用に安全であること示す必要なスクリーニング評価と分娩培養が満たされた後にのみ、胎盤は、さらなる処理に承認され、医長からの最終承認を得る。
【００２０】
材料の検査および評価（ステップ１２０）
処理センターまたは実験室への到着時に、輸送物は開封されて、滅菌輸送バッグ／容器が、なお密封されてかつ冷却されているか、適切なドナー書類が存在するか、そして書類上のドナー番号が、組織を含む滅菌輸送バッグ上の番号と一致するか、確認される。組織を含む滅菌輸送バッグはそれから、さらなる処理の準備が整うまで、冷蔵庫内で保管される。
【００２１】
全体組織の処理（ステップ１３０）
組織をさらに処理する準備が整ったら、胎盤組織をさらに処理するために必要な滅菌用品が制御環境中のステージングエリアに集められて、制御環境の中へ導入するために準備がされる。一態様では、胎盤は室温で処理される。制御環境が製造フードならば、滅菌用品は開封されて従来の滅菌技術を用いてフード内へ置かれる。制御環境がクリーンルームならば、滅菌用品は開封されて滅菌ドレープで覆われたカート上に置かれる。作業表面全体は、従来の滅菌技術を用いて、一枚の滅菌ドレープで覆われており、滅菌用品および処理装置は、同様に従来の滅菌技術を用いて、滅菌ドレープ上に置かれる。
【００２２】
処理装置は、従来かつ産業上認可された除染手順により除染されて、それから制御環境内に導入される。装置は、装置が組織標本に近接する可能性を最小限にするために戦略的に制御環境内に置かれ、さもなければ不注意に組織標本で汚染される。
【００２３】
つぎに、胎盤は滅菌輸送バッグから取り出されて、制御環境内の滅菌処理ボウルへと無菌的に移される。滅菌ボウルは、室温または室温付近の高張生理食塩水（例えば、１８％ＮａＣｌ）を含む。胎盤は、血塊を分離するのを助けるため、および、胎盤組織を室温に到達させるために、穏やかに揉まれて、それは、胎盤の構成要素がお互いから（例えば、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）および絨毛膜）、分離するのを促進する。周囲温度まで温められた後（例えば、約１０〜３０分後）、胎盤は滅菌処理ボウルから取り出されて、検査のために羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）の膜層を下向きにして、処理トレイ上に平らに置かれる。
【００２４】
胎盤は、変色、破片または他の汚染、臭気、および損傷の兆候について調べられる。組織サイズも書き留める。この時点で、組織がさらなる処理にふさわしいかどうかについて決定がなされる。
【００２５】
一態様では、胎盤がさらなる処理にふさわしいとみなされると、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）、ウォートン・ジェリー、及び絨毛膜は胎盤から切断される。本態様では、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）、ウォートン・ジェリー、及び絨毛膜は一から分離されず、この得られた胎盤組織はさらに下記のようにして処理される。
【００２６】
別の態様では、胎盤の羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）及び絨毛膜は注意深く分離されることができる。一態様では、この処置に用いられる材料および装置は、処理トレイ、１８％生理食塩水、滅菌４×４スポンジ、および２つの滅菌ナルジェンジャー（Ｎａｌｇｅｎｅ ｊａｒ）を含む。胎盤組織はそれから、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）が絨毛膜から分離されることができる領域（典型的には隅）を見つけるために精査される。羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）は、絨毛膜上の薄い不透明の層として見られる。
【００２７】
線維芽細胞層は、１枚の滅菌ガーゼまたは綿棒で羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）の両側にやさしく触れることで確認される。線維芽細胞層は、試験材料に張り付く。羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）は、処理トレイの中に、基底膜層を下にして置かれる。また、先の尖っていない道具、細胞スクレーパーまたは滅菌ガーゼを用いて、任意の残りの血液が取り除かれる。このステップは十分注意して行われるべきであり、また、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を引き裂かないようにしなければならない。羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）の清浄化は、いったん羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）が外見上滑らかで乳白色になると完了する。
【００２８】
特定の態様では、中間組織層は、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）から取り除かれる。これは、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）から中間組織層を剥がすことにより行うことができる。あるいは、中間組織層は、ガーゼまたは他の適切なワイプで中間組織層を拭き取ることで、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）から取り除くことができる。結果として生じる羊膜は、続いて、下記の方法を用いて除染することができる。中間組織層は任意の付加的な処理を必要とせずそのまま用いることができる。
【００２９】
特定の態様では、ウォートン・ジェリーは、場合により、次の方法を用いて単離することができる。メスまたはハサミを用いて、臍帯が絨毛ディスク（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｄｉｓｋ）から切り離される。いったん静脈および動脈が確認されたら、臍帯は、静脈または動脈の一つを縦に下へと切断される。いったん臍帯が切断されたら、ウォートン・ジェリーから静脈および動脈壁を切断するために外科用ハサミおよび鉗子を用いることができる。次に、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を切断することにより、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）の外層がウォートン・ジェリーから取り除かれる。羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）をウォートン・ジェリーから取り除いた後、ウォートン・ジェリーは小片に切断することができる。一態様では、小片は、およそ１〜４ｃｍ×１０〜３０ｃｍでおよその厚さが１．２５ｃｍである；しかしながら、適用に応じて、他の厚さが可能である。
【００３０】
化学的除染（ステップ１４０）
本明細書で述べた胎盤組織のいずれかは、以下に記載されている技術を用いて化学的に除染できる。一態様では、胎盤組織は室温で除染される。一態様では、ステップ１３０で生産される羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）は、次のステップのために滅菌ナルジェンジャー中に置くことができる。一態様では、次の方法は、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を清浄化するために用いることができる。各ナルジェンジャーは無菌的に１８％の高張生理食塩水で満たされて密封される（または蓋で封がされる）。ジャーはそれから、ロッカープラットフォーム上に置かれて、３０〜９０分間撹拌されて、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）から汚染物質をさらに取り除く。ロッカープラットフォームが臨界的環境（例えば、製造フード）内でなかった場合は、ナルジェンジャーは制御／滅菌環境へ戻されて開封される。滅菌鉗子を用いて、または無菌的に中身を静かに移して、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）は、１８％高張生理食塩水を含むナルジェンジャーからやさしく取り出されて、空のナルジェンジャー中に置かれる。羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を有する、この空のナルジェンジャーは、それから、無菌的に、予め混合された抗生物質溶液で満たされる。一態様では、予め混合された抗生物質溶液は、硫酸ストレプトマイシンおよび硫酸ゲンタマイシンのような抗生物質の混合物からなる。ポリミキシンＢ硫酸塩およびバシトラシンのような他の抗生物質、または、現在利用可能または将来利用可能である同様の抗生物質もまた、適切である。加えて、抗生物質溶液は、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）の温度を変化させないように、添加時に室温であることが好ましく、さもなければ羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を傷つける。羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）および抗生物質を含む、このジャーまたは容器はそれから、密封され、または密閉されて、ロッカープラットフォーム上に置かれて、好ましくは６０〜９０分間、撹拌される。抗生物質溶液内での羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）のそのような振動または撹拌は、組織から汚染物質および細菌をさらに取り除く。場合により、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）は、洗浄剤で洗浄することができる。一態様では、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）は、０．１〜１０％、０．１〜５％、０．１〜１％、または０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ洗浄液で洗浄することができる。
【００３１】
ロッカープラットフォームが臨界的環境（例えば、製造フード）内でなかった場合は、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）および抗生物質を含むジャーまたは容器はそれから、臨界的／滅菌環境へ戻されて開封される。滅菌鉗子を用いて、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）はジャーまたは容器からやさしく取り出されて、滅菌水または標準の生理食塩水（０．９％生理食塩水）を含む滅菌ボウル中に置かれる。羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）は、少なくとも１０〜１５分間、滅菌水／標準生理食塩水中に、適所に浸される。羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）は、組織からの抗生物質溶液および任意の他の汚染物質の除去を促進するために、わずかに撹拌されてよい。少なくとも１０〜１５分後に、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）は、脱水およびさらなる処理がされる状態になる。
【００３２】
絨毛膜の場合は、以下の例示的な方法を用いることができる。羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）から絨毛膜を分離して線維層から凝固血液を除去した後、絨毛膜は１８％生理食塩水中で１５分〜６０分間、すすぎがされる。第一のすすぎのサイクルの間、１８％生理食塩水は、溶液温度がおよそ４８℃であるように、実験用加熱板を用いて滅菌容器中で加熱される。溶液が静かに移され、絨毛膜組織は滅菌容器内に置かれて、静かに移された生理食塩水が容器に注がれる。容器は密封されて、ロッカープレート上に置かれて、１５分〜６０分間撹拌される。１時間の撹拌浴の後に、絨毛膜組織は取り出されて、さらに１５分〜６０分のすすぎのサイクルのために、第二の加熱撹拌浴中に置かれた。場合により、絨毛膜組織は、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）のために、上記のように洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ洗浄液）で洗浄することができる。容器は密封されて、１５分〜１２０分間、加熱せずに撹拌される。絨毛膜組織はつぎに、脱イオン水で（２５０ｍｌの脱イオン水×４回）、各すすぎで激しく動かして洗浄される。組織は取り出されて、１×ＰＢＳ ｗ／ＥＤＴＡ溶液の容器中に置かれる。容器は密封されて、８時間制御された温度下で、１時間撹拌される。絨毛膜組織は取り出されて、滅菌水を用いてすすぎがされる。目視検査は、任意の残っている変色した線維状血液材料を絨毛膜組織から除去するために行われた。絨毛膜組織は、褐色変色の兆候がない乳白色の外観を有するはずである。
【００３３】
ウォートン・ジェリーの除染の場合には、ウォートン・ジェリーは滅菌ナルジェンジャーに移される。次に、室温の１８％高張生理食塩水が、組織をすすぐために加えられて、ジャーが密封される。ジャーは３０〜６０分間撹拌される。インキュベーション後、ジャーは除染されて、滅菌領域へ戻される。組織は清潔な滅菌ナルジェンジャーに移されて、そして予熱（約４８℃）された１８％ＮａＣｌが加えられる。容器は密封されて、ロッカープレート上に置かれて、６０〜９０分間撹拌される。
【００３４】
一態様では、すすぎ後、ジャーは除染されて、滅菌領域へ戻される。組織が取り出されて、抗生物質溶液中に置かれる。容器は密封されて、ロッカープラットフォーム上で６０〜９０分間撹拌される。インキュベーションに続いて、ジャーは、１〜１０℃で２４時間まで冷蔵されてよい。ウォートン・ジェリーは次に、およそ２００ｍＬの滅菌水を含む滅菌ボウルへ移される。組織は１〜２分間すすがれて、およそ３００ｍｌの滅菌水を含む滅菌ナルジェンジャーへ移される。ジャーは密封されて、３０〜６０分間、ロッカー上に置かれる。インキュベーション後、ジャーは滅菌領域へ戻される。ウォートン・ジェリーは、褐色変色の兆候がない乳白色の外観を有するはずである。組織はさらなる処理の準備を整える。
【００３５】
別の態様では、胎盤組織が分離しない羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）、ウォートン・ジェリー、および絨毛膜である場合、胎盤組織は上述の技術および溶液（例えば、抗生物質溶液、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘなどの洗浄剤）のいずれかを用いて除染できる
【００３６】
特定の態様では、化学的除染後に羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）上に存在する上皮層を除去することが望ましい。一態様では、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）上に存在する上皮層は、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）の基底層を露出するために実質的に取り除かれる。取り除かれる上皮の量に関して、用語「実質的に取り除かれる」は、本明細書で、５０％より多い、６０％より多い、７０％より多い、８０％より多い、９０％より多い、９５％より多い、または９９％より多い上皮細胞を羊膜から取り除くことを定義する。羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）上に残っている上皮細胞の存在または不存在は、当技術分野で知られている技術を用いて評価することができる。例えば、上皮細胞層の除去後、処理ロットからの代表的な組織サンプルが、標準的な顕微鏡の検査スライド上に置かれる。組織サンプルはそれから、エオシンＹ染色を用いて染色され、評価される。サンプルはそれからカバーされてスタンドに置かれる。いったん、染色するのに十分な時間が過ぎたら、拡大下で目視観測される。
【００３７】
上皮層は、当技術分野で知られている技術により取り除くことができる。例えば、上皮層は、細胞スクレーパーを用いて、羊膜から削り取ることができる。他の技術は、限定されないが、膜の凍結、細胞スクレーパーを用いた物理的除去、または上皮細胞を非イオン洗剤、陰イオン洗剤、およびヌクレアーゼに曝すことを含む。上皮が除去された組織はそれから、基底膜が傷つけられておらず損傷されていないことを確認するために検査される。このステップは、処理ステップの完了後かつ次のセクションに記載のように組織が脱水されてから行われる。例えば、代表的なサンプル移植片が、顕微鏡を用いた分析のために取り出される。組織サンプルは標準的なスライド上に置かれて、１００μｌのエオシンＹ染料はサンプルに適用され、セットすることができる。組織サンプルはそれから、拡大下で調べられる。細胞物質は細胞の存在を示す黒に染めるであろう。染められた細胞が存在しなければ、上皮除去は達成された。
【００３８】
脱水（ステップ１４５）
上述の準備された１つまたは複数の胎盤組織は、脱水された胎盤組織移植片を生産するために脱水することができる。２つまたはそれ以上の胎盤組織が用いられる場合、組織移植片は積層である。例えば、羊膜、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）、絨毛膜、ウォートン・ジェリー、またはこれらの組み合わせからなる積層を生産することができる。一態様では、組織移植片は羊膜／絨毛膜の積層である。別の態様では、組織は少なくとも２つの絨毛膜の層、少なくとも２つの羊膜の層、または少なくとも１つの絨毛膜の層および羊膜を有する。さらなる態様では、胎盤組織は複数の絨毛膜および／または羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を有する。積層された組織移植片を生産するための技術は、当技術分野において既知である。
【００３９】
一態様では、組織移植片は、化学的脱水に続く凍結乾燥により脱水される。一態様では、化学的脱水ステップは、胎盤組織に存在する残りの水を、実質的に（すなわち、９０％より多く、９５％より多く、または９９％より多く）または完全に除去する（すなわち、組織を脱水する）ために、胎盤組織を極性有機溶媒と十分な時間および量で接触させることにより行われる。溶媒はプロトン性または非プロトン性であってよい。本明細書で有用な極性有機溶媒の例は、限定されないが、アルコール類、ケトン類、エーテル類、アルデヒド類、またはそれらの任意の組み合わせを含む。具体的な非限定の例は、ＤＭＳＯ、アセトン、テトラヒドロフラン、エタノール、イソプロパノール、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一態様では、胎盤組織は、室温で極性有機溶媒に接触させられる。さらなるステップは必要なく、胎盤組織は下記のようにして、直接に凍結乾燥することができる。
【００４０】
化学的脱水後、任意の残りの水および極性有機溶媒を除去するために、胎盤組織移植片は凍結乾燥される。一態様では、胎盤組織は凍結乾機に置かれ、胎盤組織は−５０℃〜−８０％で凍結乾燥される。別の態様では、胎盤組織は、凍結乾燥機に吊るすように凍結乾燥機に置かれる。他の様態では、胎盤組織は凍結乾燥を促進できる基板上に置かれる。そのような基板の例は、限定されないが、平鍋、ボウル、ふるい、またはフレームを含む。一態様では、１つまたは複数の胎盤組織は、凍結乾燥の前に、適切な乾燥用固定具上に任意に置くことができる。例えば、少なくとも２つの水和した絨毛膜の層、少なくとも２つの水和した羊膜の層、または少なくとも１つの水和した絨毛膜および水和した羊膜の層は、乾燥用固定具に適用することができる。他の様態では、分離されていない羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）、ウォートン・ジェリー、および絨毛膜からなる胎盤組織は、乾燥用固定具の上部に置くことができ、その場合、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）および／または絨毛膜などの１つまたは複数の追加の胎盤組織は、組織の上部に任意に適用することができる。
【００４１】
乾燥用固定具は、好ましくは、胎盤組織を平たい形状で広げて置いて完全に受け入れるのに十分大きいサイズである。一態様では、乾燥用固定具は、デュポンが発明して販売するアセタール樹脂工学プラスチックのブランド名であるテフロン（登録商標）またはデルリン製であり、そしてそれはまた、ジョージア州マリエッタのＷｅｒｎｅｒ Ｍａｃｈｉｎｅ， Ｉｎｃ．から市販されている。耐熱性および耐切断性であり、湿組織を受け入れるのに適切な形状に形成することが可能な任意の他の適切な材料もまた、乾燥用固定具に用いることができる。
【００４２】
一態様では、乾燥用固定具の受容面は、切断後の組織の所望の外輪郭であって、組織が用いられる適用可能な外科的処置に要求されるサイズと形である、製品スペースを規定する溝を有する。例えば、乾燥用固定具は、溝が格子配置であるようにして配列させることができる。一つの乾燥用固定具上の格子は、同一の均一なサイズであってよく、または異なる外科的適用のために設計された多様のサイズを含んでよい。それでもなお、当業者によって理解されるように、任意のサイズおよび形の配列を、乾燥用固定具に用いることができる。別の態様では、積空間を規定する溝を有する代わりに、乾燥用固定具は、隆起した突起部または刃を有する。
【００４３】
特定の態様では、乾燥用固定具は、テキスト、ロゴ、名前、または同様のデザインの形状にわずかに隆起した、または、ギザギザした、表面模様（ｔｅｘｔｕｒｅ）を含み得る。この表面模様付けされた（ｔｅｘｔｕｒｅｄ）テキスト、ロゴ、名前、またはデザインは、カスタマイズされ、移植片を販売しているまたはエンドユーザー（例えば、外科医）により要求された望ましい特性に応じているであろう会社により自社ブランド化され得る。乾燥されると、基本的に組織自身の中にラベルをもたらしながら、組織は隆起した表面模様の周りに、またはギザギザした表面模様の中に、それ自身を形作る。好ましくは、脱水後に、乾燥組織のエンドユーザー（典型的には外科医）が胎盤組織の上部および基底部を区別することができるように、表面模様／ラベルは、胎盤組織上に一方向にのみ読まれる、または見られることができる。他の様態では、移植片の側面を識別するために、凍結乾燥後にスタンプは胎盤組織上に刻み込まれ得る。
【００４４】
いったん胎盤組織が乾燥用固定具上に置かれると、乾燥用固定具は凍結乾燥機内に置かれる。胎盤組織移植片を脱水するための凍結乾燥機の使用は、加熱脱水のような他の技術に比べて、より効率的かつ完璧であり得る。一般に、胎盤組織移植片中の氷晶形成は、組織移植片中の細胞外マトリックスを傷つけ得るので避けることが望ましい。凍結乾燥前に胎盤組織を化学的に脱水することで、この問題は回避することができる。
【００４５】
別の態様では、脱水ステップは、胎盤組織を温めるステップを含む。一態様では、胎盤の構成要素は、適切な上述の乾燥用固定具上に置かれて、そして、乾燥用固定具は滅菌Ｔｙｖｅｘ（または同様の、通気性があり熱耐性で密封可能な材料）の脱水バッグ中に置かれて、密封される。通気性のある脱水バッグは、組織を、急速すぎる乾燥から保護する。複数の乾燥用固定具が同時に処理される場合は、それぞれの乾燥用固定具は、それ自身のＴｙｖｅｘバッグ中に置かれるか、または、複数の乾燥フレームをそれ上に保持するように設計された適切な取り付けフレーム中に置かれて、それからフレーム全体がより大きい一つの滅菌Ｔｙｖｅｘ脱水バッグ内に置かれて密封されるかの、いずれかである。
【００４６】
１つまたは複数の乾燥用固定具を含むＴｙｖｅｘ脱水バッグはそれから、およそ３５〜５０℃に予熱された非真空のオーブンまたはインキュベーター内に置かれる。組織を過乾燥または燃焼はさせないが組織を十分に乾燥させるために、およそ４５℃の温度で４５分で行うことができるが、Ｔｙｖｅｘバッグは、３０〜１２０分間、オーブン中にそのままにされる。任意の具体的なオーブンに関する具体的な温度および時間は、高度、オーブンの大きさ、オーブン温度の精度、乾燥用固定具に用いられる材料、同時に乾燥される乾燥用固定具の数、一つまたは複数の、乾燥用固定具のフレームが同時に乾燥されるのかどうか、などを含む他の因子に基づいて計算および調節される必要がある。
【００４７】
架橋（ステップ１５０）
胎盤組織移植片が脱水された後、移植片は架橋剤に接触される。理論に束縛されるものではないが、脱水された組織移植片を架橋することは、水和した組織移植片を架橋することと比べて高密度化および小さくなった孔径サイズを有する移植片を生産する。このことは図２に示されていて、胎盤組織２０は脱水された組織移植片２２を生産するために脱水される。脱水された組織移植片２２の架橋は、組織移植片２４を生産し、組織移植片２４は水和した組織移植片２８から架橋した組織移植片２６と比べてより小型で、高密度で、多孔質でない。多孔率を低減して高密度の組織移植片を生産することの重要性は、以下で論じられる。
【００４８】
脱水された組織移植片は、当技術分野で知られている技術を用いて架橋剤に接触させられ得る。一態様では、脱水された組織移植片は、架橋剤の溶液内に直接置かれる。理論に束縛されるものではないが、組織移植片の表面から移植片の中心に向かって内側へ架橋が進行する。組織の表面は、直ちに浸水して架橋され、溶液を取ると、組織の膨張を防ぐ。架橋剤が移植片に染み込むと、組織の膨張が起こる前に共有結合架橋は形成され、それによってさらに膨張を抑える。
【００４９】
一般に、架橋剤は非毒性および非免疫原性である。特定の態様では、胎盤組織は、２またはそれ以上の異なる架橋剤で処理することができる。胎盤組織を処理するための条件は、変更することができる。一態様では、架橋剤の水溶液が入った容器中に置くことができる。一態様では、架橋剤の濃度は、０．１Ｍ〜５Ｍ、０．１Ｍ〜４Ｍ、０．１Ｍ〜３Ｍ、０．１Ｍ〜２Ｍ、または０．１Ｍ〜１Ｍである。別の態様では、胎盤組織は、１〜２秒間、最大で６０分まで、架橋剤で処理することができる。さらなる態様では、胎盤組織は、最高で５０℃までの室温で、架橋剤で処理される。
【００５０】
架橋剤は通常、タンパク質と反応して共有結合を生じさせることが可能な、２またはそれ以上の官能基を有する。一態様では、架橋剤はタンパク質上に存在するアミノ基と反応することができる基を有する。そのような官能基の例は、限定されないが、ヒドロキシル基、置換または非置換アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ヒドラジド基、およびアルデヒド基を含む。一態様では、架橋剤は、例えば、グルタルアルデヒドのようなジアルデヒド類であってよい。別の態様では、架橋剤は、例えば、（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチル−カルボジイミド（ＥＤＣ）のようなカルボジイミドであってよい。別の態様では、架橋剤は、酸化デキストラン、ｐ−アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［α−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル、ｐ−アジドフェニルグリオキサル一水和物、ビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド、ビス−［スルホスクシンイミジル］スベレート、ジチオビス［スクシンイミジル］プロピオナート、ジスクシンイミジルスベレート、および１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドハイドロクロライド、二官能性オキシラン（ＯＸＲ）、またはエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）であってよい。
【００５１】
一態様では、糖が、羊膜および絨毛膜に存在するタンパク質と反応して共有結合を形成することができる場合、糖が架橋剤である。例えば、糖はメイラード反応によりタンパク質と反応することができ、それは糖類を還元することによりタンパク質上のアミノ基の非酵素的グリコシル化によって始まり、後に続く共有結合の形成をもたらす。架橋剤として有用な糖類の例は、限定されないが、Ｄ−リボース、グリセロース、アルトロース、タロース、エルセオース、グルコース、リキソース、マンノース、キシロース、グロース、アラビノース、イドース、アロース、ガラクトース、マルトース、ラクトース、スクロース、セロビオース、ゲンチオビオース（ｇｅｎｔｉｂｉｏｓｅ）、メリビオース、ツラノース、トレハロース、イソマルトース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。このように、一態様では、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）または絨毛膜は、膜に共有結合された少なくとも１つの架橋剤を含む。別の態様では、１つの組織移植片は、１つの羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）と１つの絨毛膜を含み、ここで、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）と絨毛膜は、１つの架橋剤を介してお互いに共有結合している。
【００５２】
以下の方法は、脱水された羊膜／絨毛膜組織を架橋剤で処理するための例示的な方法を提供する。組織移植片は、架橋剤、好ましくは０．０５〜１ＭのＤ−リボース、好ましくは０．２Ｍ（３．０１％）のＤ−リボースを含む、ナルジェンジャーに、１〜６０分間、好ましくは５分間、置かれる。インキュベーション後、組織移植片は溶液から取り除かれる。架橋された組織移植片はそれから、任意の過剰な架橋剤を除去するために水または他の適切な溶媒ですすがれ、続いて、上述の技術を用いて脱水され得る。
【００５３】
特定の態様では、脱水ステップ１４５の前に移植片を作るために用いられる胎盤組織を架橋することが望ましい。例えば、羊膜および絨毛膜は、積層、脱水、および後に続く架橋の前に独立して架橋剤に接触させられ得る。別の態様では、羊膜／絨毛膜移植片は、脱水ステップ１４５および後に続く架橋の前に生産され、架橋され得る。上述の架橋剤および技術のいずれかは、これらの実施態様に用いられ得る。
【００５４】
切断および梱包（ステップ１６０）
いったん架橋後に組織移植片が十分に脱水されたら、組織移植片はそれから、特定の商品サイズに切断される準備がされて、保管、最終的な滅菌および後の外科的使用のために、適切に梱包される。生産されるべき移植片の数は、乾燥用固定具（単数または複数）上の組織のサイズおよび形状に基づいて見積もられる。また、それぞれの組織移植片に対して一つの、適切な数のポーチが、滅菌／制御環境の中に導入される。
【００５５】
一態様では、乾燥用固定具が用いられ、溝を有する場合は、商品サイズに組織を切断するために以下の例示的な方法に従う。乾燥用固定具が格子状に構成される場合は、＃２０または同様のストレートまたはローリング刃を、それぞれの溝のラインに沿って平行に切断するために用いる。次に、垂直方向の全ラインが切断される。あるいは、乾燥用固定具が隆起した縁または刃を有する場合は、組織を商品サイズに切断するために以下の方法に従う。滅菌ローラーを、乾燥用固定具を横切って転がるために用いる。脱水された組織が、乾燥用固定具の全ての隆起した刃または縁に沿って切断されるように、十分な圧力が付与されるべきである。
【００５６】
切断後、それぞれの組織移植片は、それぞれの「インナー」ポーチに置かれる。好ましくは透明側と不透明側を有するインナーポーチは、透明側を上に向けるべきである。組織移植片は、「インナー」ポーチに、文字、ロゴ、名前または同様のデザインの形態の表面模様がインナーポーチの透明側に面し、インナーポーチの外側から見えるように、置かれる。この方法は、それぞれの別個の移植片に対して繰り返される。
【００５７】
それぞれの組織移植片はそれから、裂け目または穴がないか、商品サイズ（切断物として）が、規定のサイズのおよそ（＋または−）１ミリメーター以内で、組織の著しい染みまたは変色がないか、および表面模様付けされたロゴまたはワードが、「インナー」ポーチを介して読めて、そして見えるかどうかを、確認するための最終的な検査がされる。最終的な組織移植片は、長時間、室温で保管され得る。
【００５８】
ＩＩ．架橋された組織移植片の適用
本明細書に記載の移植片は、対象の創傷治癒を含む様々な医学的用途で使用し得る。上記のとおり、本明細書に記載の架橋された組織移植片は、架橋された水和した胎盤組織と比べてより小型で高密度である。加えて、本明細書に記載の組織移植片の多孔率は、架橋された、水和した組織移植片と比べるとより低い。本明細書に記載の組織移植片は、創傷をより早く治癒するように、創傷に生物活性剤を局所的に保つことが望ましい創傷治癒の適用に有用である。さらに、生物活性剤が有毒物質であるなら、対象の全身至る所に広がる場合、本明細書に記載の組織移植片は生物活性剤が創傷から移動するのを防ぐ効果的な、不透過性のバリアを提供することができる。
【００５９】
日常ベースで医師を訪れる創傷のタイプはさまざまである。急性の創傷は、外科的処置、外傷および火傷に起因する。慢性の創傷は、他の点では健康な人において、治癒に比べて閉じるのが遅い創傷である。患者を悩ませる慢性の創傷のタイプの例は、糖尿病性足部潰瘍、静脈性下腿潰瘍、圧迫潰瘍、動脈性潰瘍、および感染する手術創傷を含む。
【００６０】
外傷性創傷を治療する時の医師の目標は、最小限の瘢痕および感染で、創傷の領域における自然な機能を患者が保持するようにしながら創傷を治療することである。創傷が感染する場合、手足または生命の喪失を導き得る。ほとんどは、何事もなく医師はこれらの患者を治療する。しかしながら、慢性の創傷を扱う医師は、手足または生命の喪失を導き得る感染リスクを最小限化するために、できるだけ素早く創傷を閉じることを主に心掛ける。慢性の創傷は、治癒カスケードを悪化または遅らせる共存症を有する患者での創傷である。一態様では、本明細書に記載の移植片は、炎症を軽減して治癒を高めるのを助けるために、必須の創傷治癒因子、細胞外マトリックスタンパク質および炎症性メディエータを運搬して瘢痕組織形成を軽減する、組織再生テンプレートとして機能することができる。
【００６１】
別の態様では、本明細書に記載の組織移植片は、手術後に起こる脊椎および周辺領域への合併症を対処する、または軽減するのに有用である。急性および慢性の脊椎損傷および脊椎痛は、脊柱における外傷および／または退行性変化に起因し得る。退行性の患者に関しては、通常、患者の症状および病状に応じた可能な手術が施される。保存療法が失敗したときの第１の外科的選択肢は、椎弓切除術またはマイクロ椎間板切除術である。これらの低侵襲的処置は、痛みの発生または脊柱管狭窄を緩和することを目的とする。疾患が進行している場合には、他の手術、例えば、限定されないが、脊椎固定も必要となり得る。脊椎固定は、前方（腹部を通って前から）、後方（背中から）、または側部（脇を通って）で、様々な方法を通して達成されてよい。それぞれの方法は、利点と欠点がある。目標は典型的に、椎間板を取り除き、板の高さを元に戻して、動きおよびさらなる劣化を制限するために２つの脊椎骨を一緒に固定させる（ｆｕｓｅ）ことである。外科医および患者の外科的選択肢には、椎間板を人口板で置き換えることもある。脊椎外傷は典型的に、脊椎レベル（ｓｐｉｎｅ ｌｅｖｅｌｓ）を固定する（ｆｕｓｉｎｇ）ことにより治療され、または、椎骨が破砕している場合は、外科医は椎体切除術（ｃｏｒｐｅｃｔｏｍｙ）をして、影響を受けたレベルにわたって固定することを選択し得る。
【００６２】
一態様では、本明細書に記載の組織移植片は、脊椎上または脊椎付近の瘢痕形成を予防または軽減し、および硬膜裂傷をシーリングするのに有用である。手術後の脊椎上または脊椎付近の瘢痕形成は非常に衰弱性（ｄｅｂｉｌｉｔａｔｉｎｇ）であり得て、そして場合により、上記の症状を対処するための手術をその後に必要とする。また、用語「抗−癒着」は、当技術分野において、脊椎上または脊椎付近の瘢痕組織の予防を指すためにも用いられる。他の態様では、本明細書に記載の組織移植片は、移植片が周囲の手術部位由来の手術後の外傷から脊髄硬膜を保護する、保護バリアとして用いることができる。例えば、移植片は、椎骨などの、切れたばかりの骨による鋭いエッジによって引き起こされる、脊髄硬膜への損傷を防ぐことができる。他の態様では、組織移植片は、前方腰椎椎体間固定術（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｌｕｍｂａｒ ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ ｆｕｓｉｏｎ）、後方腰椎椎体間固定術（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｌｕｍｂａｒ ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ ｆｕｓｉｏｎ）、経椎間孔腰椎椎体間固定術（ｔｒａｎｓ−ｌｕｍｂａｒ ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ ｆｕｓｉｏｎ）、前方頸部椎間板切除術および固定術（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ ａｎｄ ｆｕｓｉｏｎ）、マイクロ椎間板切除術、脊髄硬膜修復のため、および脳脊髄液漏（ＣＳＦ ｌｅａｋａｇｅ）を防ぐための硬膜シーラントとして、用いることができる。
【００６３】
外科的処置に応じて、組織移植片は、脊髄硬膜、神経根を含む脊椎の周辺領域、またはそれらの組み合わせに、直接適用することができる。椎骨の独特な構造のために、組織移植片は、対象における適切な位置に配置して付けることができるようにして、任意の形状または寸法に切断することができる。例えば、組織移植片が、両側の被覆に用いられる場合、長方形型の膜は、組織移植片を、後方脊椎突起（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｓｐｉｎａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ）周辺に合わせさせて、横の動きを最小限にする。横の動きを最小限にすることに加えて、組織移植片はまた、影響を受けた領域への露出のために骨髄層が取り除かれている近位および遠位のバリアカバレッジを与えることができる。一態様では、適切な配置を確実にするために、移植片は、対象での移植片の適切な配置を確実にするために、移植片の露出した基底膜上をエンボス加工することができる。特に、適切な移植片の配置は、移植片の基底膜が脊髄硬膜または周辺領域に直接接触することを確実にする。例えば、適切な膜の配置および方向は、後方または前方アプローチが使用される脊椎の適用において材料を適用する場合に重要である。
【００６４】
移植片は、脊椎と関連する様々な外科的処置に起因し得る瘢痕形成を予防または軽減するのに有用である。組織片は首、背中、または腰における任意の処置後に用いることができる。適用に応じて、羊膜（ａｍｎｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）の上皮は実質的に取り除かれてよい。例えば、椎弓切除術または椎間板切除術などの後処置では、上皮層は実質的に取り除かれる。上皮細胞層の除去は、羊膜の基底膜層を露出させて、細胞シグナル特性を増大させる。この上方制御の応答は、細胞の遊走および抗−炎症性タンパク質の発現を高めて、線維症を阻害する。脊髄硬膜は、通常、後方処置の後、未保護のままにされる。このように、本明細書に記載の移植片は、これらの処置において、満たされていない要求をもたらす。
【００６５】
他の態様では、上皮細胞層は取り除かれない。例えば、前方腰椎椎体間固定術（ＡＬＩＦ）や経椎間孔椎体間固定術（Ｔｒａｎｓｆｏｒａｍｉｎａｌ Ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ Ｆｕｓｉｏｎ）（ＴＬＩＦ）のような前処置または改良された前処置では、羊膜の上皮層は取り除かれず、損傷されていない。これらの態様では、移植片は、腹膜、より大きな血管、および腹部の筋肉組織からの隔離を維持することにより脊椎の手術部位にさらなる保護を与える。膜は、癒着および瘢痕に対する、減少した摩擦解剖学的バリア（ｆｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｔｏｍｉｃａｌ ｂａｒｒｉｅｒ）としての役割を果たす。例えば、移植片は、瘢痕組織が大きな血管を脊椎に結合させるのを防ぐことができる。これは、脊椎の手術後での一般的な問題であり、これを対処するための第二の外科的処置が必要である。
【００６６】
別の態様では、組織移植片は、歯科の適用に有用である。例えば、移植片は、歯科インプラントの周辺に、または、進行性歯肉退縮欠損の治療に用いることができる。別の態様では、移植片は、組織再生誘導法において用いることができる。
【００６７】
他の態様では、本発明に記載の移植片は、整形外科の適用（すなわち、スポーツ医学）で用いることができる。スポーツ医学は、活発な人およびスポーツ選手において、外傷に起因する関節中または関節周辺の様々な軟組織損傷、または運動の繰り返しによりもたらされる慢性状態の修復および再建を含む。例えば、スポーツ医学は、制限されないが、肩、肘、足、足首、手および手首と関連する、様々な異なる損傷の治療を含む。
【００６８】
損傷の主なタイプは、腱および靭帯の捻挫および様々な関節におけるヘルニアを含み、最も一般的には、膝のＡＣＬおよび肩の回旋腱板である。腱と靭帯でない処置は、裂けた膝半月板の修復および治療されないままにしておくと関節の変形性関節症をもたらし得る膝軟骨の修復を含む。また、非外科的選択肢は、炎症を起こした腱（例えば「テニス肘」）への抗−炎症性薬剤の注入、関節への潤滑剤の注入（例えばヒアルロン酸を膝へ）、ならびに理学療法およびブレーシング（ｂｒａｃｉｎｇ）を含む。
【００６９】
一態様では、本明細書に記載の組織移植片は、治癒している腱上での瘢痕形成を防ぐために、腱修復を包むために用いることができる。また、それらは、修復がうまく進行するための、保護的な閉鎖環境を提供することができる。組織移植片は、同種移植片を購入する必要性に代替するため、または、腱または靭帯の移行をするために、既製の（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）腱および靭帯として用いることができる。
【００７０】
他の態様では、本明細書に記載の組織移植片は、回旋腱板の補強で用いることができる。いくつかの回旋腱板の裂傷は、生存可能な天然組織の欠如のため、修復を助ける補強マトリックスを必要とするほどに大きい。本明細書に記載の組織移植片は、修復を補強するためのマトリックスとして用いることができる。一態様では、本明細書に記載の組織移植片は、膝軟骨を修復するために用いることができる。例えば、組織移植片は、細胞培養された軟骨細胞または軟骨欠損の内側の他のプロ軟骨再生マトリックスを保持するためのバリアとして用いることができる。この態様では、組織移植片は、欠損を閉鎖してマトリックスを所定の位置に維持するためのフラップとして使用される。
【００７１】
一態様では、組織移植片は、末梢神経を修復するために用いることができる。組織移植片は、治癒している神経の上に瘢痕が形成するのを防ぐために、神経修復上を包むものとして用いることができる。また、組織移植片は、修復がうまく進行するための、保護的な閉鎖環境を提供することができる。他の態様では、組織移植片は、神経末端が再接近し得ない保護的環境中に神経が伸びるのを導くための神経再生チューブ中に製造することができる。ここで、末端が他の軟組織に妨害されることなく自由に接することができる場合、神経は一定の距離次第で再度結合することができる。別の態様では、組織移植片は、前立腺切除術の処置後に神経束を束ねるために用いることができる。これらの神経は、勃起機能および排泄抑制能力を司る。組織移植片は、瘢痕および場合により神経を損傷することからそれらを守るために、神経上に置くことができる。
【００７２】
他の態様では、本明細書に記載の組織移植片は、骨膜の修復での補助；破裂性／損傷性嚢の修復の補助；骨修復中の空隙充填材料の固定の補助；のような他の整形外科の適用において、または対象の四肢に関する適用（例えば、小骨の固定のための抗−癒着バリア、金属めっきまたは金属製品が用いられる場合の抗−癒着バリア、または、破裂性／損傷性嚢の修復の補助）において、用いることができる。
【００７３】
一態様では、本明細書に記載の組織移植片は、骨移植片が典型的に用いられる適用に用いることができる。そのような適用は、限定されないが、椎体間固定術、横突間突起固定（ｉｎｔｅｒｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｕｓｉｏｎ）、新鮮骨折、癒着不能骨折、関節再建、脛骨骨幹端、足および足関節の固定、第１のおよび第２の歯槽堤増成術、上顎洞挙上術（ｓｉｎｕｓ  ｅｌｅｖａｔｉｏｎｓ）、抜歯窩増強（ｓｏｃｋｅｔ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、抜歯窩保存術（ｓｉｔｅ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）、および歯周骨内欠損（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｉｎｔｒａｂｏｎｙ  ｄｅｆｅｃｔｓ）を含む。例えば、記載の組織移植片は、１つまたは複数の骨移植片が骨折に適用される骨折の治癒を促すのに有用である。ここで、本明細書に記載の組織移植片は、骨移植片が骨折から骨移植片の遊走を防ぐために適用された後で、骨折に直接適用することができ、最終的に骨折の治癒を高める。例えば、Ｍｅｄｔｏｎｉｃによって製造された骨移植片ＩＮＦＵＳＥ（登録商標）は、直接適用することができる。この態様では、組織移植片は創傷治癒を高め、ならびに対象の全身の至るところに広がるＩＮＦＵＳＥ（登録商標）に起因され得る望ましくない副作用の可能性を軽減するまたは防ぐ。
【００７４】
別の態様では、組織移植片は、女性の受胎能に関与し得る疾患の治療、生殖器系に起因する痛みまたは生殖器系におけるガンに関する産婦人科（ＯＢ／ＧＹＮ）の外科的処置に用いることができる。これらの処置は、子宮筋腫の除去（筋腫切除術）、卵巣嚢胞の除去、卵管結紮、子宮内膜症の治療、いくつかのガン性または非ガン性腫瘍の除去、および膣スリング（ｖａｇｉｎａｌ ｓｌｉｎｇｓ）を含む。これらの処置は、経膣の、腹部の、または腹腔鏡の手法により達成されてよい。
【００７５】
組織移植片は、外科的処置後の生殖器系における瘢痕組織の量を軽減するためのパッチとして用いることができる。瘢痕組織は、線維組織の別形態であり、そしてまた、受胎能の問題に寄与し得る。卵巣上または卵管中の瘢痕の量を最小限に抑える能力は、手術後の受胎能および痛みさえにも役立ち得る。別の態様では、組織移植片は、重症の子宮内膜症の治療後に子宮壁を補強するために、および、患者の妊娠する能力を高めるために、用いることができる。さらなる態様では、組織移植片は、卵巣嚢胞の除去後の抗−癒着バリア、または膣壁びらんの修復の補助として用いることができる。
【００７６】
他の態様では、組織移植片は心臓適用に用いることができる。狭心症は心筋の虚血（血液の不足、したがって、酸素供給の欠乏）による、一般に冠動脈（心臓の血管）の閉塞または攣縮による、重度の胸部痛である。狭心症の主な原因である冠動脈疾患は、心臓の動脈のアテローム性動脈硬化に起因する。アテローム硬化性の血塊を除去するための様々な開放性の心臓および血管の外科処置は、血管の修復、再建および閉鎖、および外科的欠損を閉鎖させてパッチするための再生組織パッチの補助を必要とする。また、心臓バイパス移植片および心臓欠陥の再建（心臓切開の外科的処置の一環として）は、パッチまたは移植片から、軟組織の弱さに対する支え（ｂｕｔｔｒｅｓｓ）、適切な組織の欠損がある場合は組織置換、および心臓それ自身への癒着を軽減する可能性も与えるという、恩恵を受けることができる。本明細書に記載の組織移植片は、頸動脈修復、冠動脈バイパス移植術、先天性心疾患、心臓弁修復、および血管修復（すなわち末梢血管）などの手術および合併症に起因する血管および心臓の欠陥の修復を助けるためのパッチとして、用いることができる。
【００７７】
本明細書に記載の組織移植片は、全身の外科処置で用いることができる。例えば、全身の外科的処置は、腹腔に関する処置を含む。これらは、腸、胃、大腸、肝臓、胆嚢、虫垂、胆管および甲状腺を含む。処置は、ヘルニア、ポリープ切除、ガン除去、結腸クローン病および潰瘍性大腸炎の外科的処置を含んでよい。これらの処置は、開腹または腹腔鏡下で行われてよい。他の態様では、組織移植片は、吻合の閉鎖、吻合のための抗−癒着バリア、またはヘルニア修復のための抗−癒着バリアを促進するために用いることができる。
【００７８】
他の態様では、組織移植片は耳鼻咽喉科（ＥＮＴ）処置で用いることができる。鼓室形成は、鼓膜（ｅａｒｄｒｕｍ）（鼓膜（ｔｙｍｐａｎｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ））および／または中耳の小骨の再建のために行われる。穿孔された鼓膜の治療のための、様々な選択肢が存在する。穿孔が最近の外傷による場合は、耳、鼻および喉の多くの専門家は、自然に治癒するかどうか観察して見ることを選択するだろう。これが生じないか、または、頻回の再度の穿孔が同一エリアに生じる場合は、手術が検討され得る。鼓室形成は、外耳道を通して、または耳の後ろの切開により行うことができる。ここで、外科医は、耳周辺の皮膚の下の組織から移植片を摘出して、そして、鼓膜を再建するためにそれを用いる。本明細書に記載の組織移植片は、患者自身の組織の摘出と関連するさらなる外傷を防ぐために用いることができ、そして手術時間を短縮する。他の態様では、組織移植片は、アデノイド切除後の創傷被覆、扁桃摘出後の創傷被覆、またはシュナイダー膜（Ｓｎｉｄｅｒｉａｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の促進修復として用いることができる。
【００７９】
他の態様では、本明細書に記載の組織移植片は、形成外科処置で用いることができる。瘢痕形成術（ｓｃａｒ ｒｅｖｉｓｉｏｎ）は、瘢痕の見た目を改善または軽減するための手術である。それはまた、機能を回復させ、損傷、創傷、または以前の手術に起因する皮膚変化（美観を損なうこと）をなおす。瘢痕組織は、損傷または手術後の皮膚治癒として形成する。瘢痕の量は、創傷の大きさ、深さ、および部位；人の年齢；遺伝；および皮膚の色（色素沈着）を含む皮膚特性により決定され得る。手術は、瘢痕の切除および欠損の注意深い閉鎖を含む。一態様では、本明細書に記載の組織移植片は、瘢痕の治癒および予防；および軟組織の縁の丁寧な近似（ｃａｒｅｆｕｌ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｆｔ−ｔｉｓｓｕｅ ｅｄｇｅｓ）が達成不可能であって瘢痕組織が生じ得るケロイドまたはガンの修復（ｒｅｖｉｓｉｏｎ）／除去に役立つパッチとして用いることができる。さらに、組織移植片の抗炎症性特性は、その上、治癒を高めることができる。
【００８０】
他の態様では、組織移植片は、眼科の適用（例えば、眼表面修復のオン−レイ（ｏｎ−ｌａｙ）移植片）または泌尿器科の適用（例えば、精管復元術の間の精管の閉鎖を促進する、または外傷により生じる精管の閉鎖を促進する）において用いることができる。
【００８１】
移植片の適用に応じて、移植片は、自家血液の採取と分離を用いた産物または期限切れの保存血由来の血小板濃縮物のいずれかの、血小板濃縮物由来の天然起源の増殖因子；骨髄穿刺液；濃縮ヒト胎盤臍帯血幹細胞、濃縮羊水幹細胞またはバイオリアクター中で増殖された幹細胞由来の幹細胞；または抗生物質からなる溶液のような生物活性剤に浸すことができる。ここで、組織移植片の１つまたは複数の膜層は、生物活性剤を吸収する。生物活性剤を有する湿組織移植片を創傷に対して適用する際、生物活性剤は時間をかけて創傷に届けられる。
【００８２】
移植片の適用に応じて、移植片は、自家血液の採取と分離を用いた産物または期限切れの保存血由来の血小板濃縮物のいずれかの、血小板濃縮物由来の天然起源の増殖因子；骨髄穿刺液；濃縮ヒト胎盤臍帯血幹細胞、濃縮羊水幹細胞またはバイオリアクター中で増殖された幹細胞由来の幹細胞；または抗生物質からなる溶液のような生物活性剤に浸すことができる。ここで、組織移植片の１つまたは複数の膜層は、生物活性剤を吸収する。生物活性剤を有する湿組織移植片を創傷に対して適用する際、生物活性剤は時間をかけて創傷に届けられる。
【００８３】
本明細書に記載の組織移植片は対象の組織に直接適用することができるが、それらはまた、続けて対象に適用することのできる創傷被覆材（ｗｏｕｎｄ ｄｒｅｓｓｉｎｇ）に適用することができる。例えば、創傷包帯は、ガーゼ、絆創膏またはラップ、または対象へ直接適用することのできる組織移植片を含むことができる、または付けることができる任意の他の適切な物であり得る。
【００８４】
様々な改良および変更を、本明細書に記載の化合物、組成物および方法に対して行うことができる。本明細書に記載の化合物、組成物および方法の他の態様は、明細書の検討、および、本明細書に開示された化合物、組成物および方法の実践から明らかであろう。明細書および実施例は例示的であると考えられることが意図される。
【図１】
2015503367.tif 000003
【図２】
2015503367.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成25年10月9日(2013.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前記胎盤組織移植片が羊膜および絨毛膜からなる群より選択された１つまたは複数の層、およびさらに少なくとも１つの前記羊膜層が無傷の線維芽細胞層を含むことを特徴とする、架橋され、脱水された胎盤組織移植片。
【請求項２】
前記胎盤組織移植片が、ウォートン・ジェリーをさらに含む、請求項１に記載の移植片。
【請求項３】
前記胎盤組織移植片が、単に羊膜、または単に絨毛膜を含む、請求項１に記載の移植片。
【請求項４】
前記胎盤組織移植片が、羊膜／絨毛膜の積層を含む、請求項１に記載の移植片。
【請求項５】
前記胎盤組織移植片が、少なくとも２つの絨毛膜の層、少なくとも２つの羊膜の層、または少なくとも１つの絨毛膜の層および羊膜を含む、請求項１に記載の移植片。
【請求項６】
前記胎盤組織移植片が、お互いに貼り付けられた複数の絨毛膜層および／または羊膜層を有する、請求項１に記載の移植片。
【請求項７】
前記脱水された胎盤組織移植片が、化学的に脱水されまたは熱的に脱水される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の移植片。
【請求項８】
胎盤組織移植片が糖、ジアルデヒド、エポキシド、ヒドラジド 、またはカルボジイミドから成る群から選択された架橋剤で架橋された、請求項１〜７のいずれか一項に記載の移植片。
【請求項９】
前記糖が、Ｄ−リボース、グリセロース、アルトロース、タロース、エルセオース、グルコース、リキソース、マンノース、キシロース、グロース、アラビノース、イドース、アロース、ガラクトース、マルトース、ラクトース、スクロース、セロビオース、ゲンチオビオース、メリビオース、ツラノース、トレハロース、イソマルトース、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項８に記載の移植片。
【請求項１０】
前記胎盤組織移植片が脱水後に架橋される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の移植片。
【請求項１１】
架橋され、脱水された胎盤組織移植片を生産する方法であって、その方法は、前記胎盤組織移植片が羊膜および絨毛膜から成る群から選択された１つまたは複数の層を含み、さらに少なくとも１つの前記羊膜層が無傷の線維芽細胞層を含むことを特徴とする、脱水された胎盤組織移植片を架橋剤と接触させることを含む方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片を含む創傷被覆材。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれかの組織移植片を創傷に適用することを含む、対象での創傷治癒を高めるための方法。
【請求項１４】
脳硬膜の修復、歯周形成外科の（ｐｅｒｉｏｐｌａｓｔｉｃ）処置、小帯牽引の除去、失われた膝蓋骨組織の再生、洞腔中のシュナイダー膜の修復、歯科インプラント周囲の軟組織、口腔前庭形成術、組織再生誘導法においての請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【請求項１５】
外科的処置後の脊椎の上または付近の瘢痕形成を予防する又は軽減させるための方法であって、前記方法は、対象に、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片を、対象の脊髄硬膜または脊椎付近の領域に直接適用することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項１６】
前記外科的処置が後処置を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記後処置が椎弓切除術または椎間板切除術を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記後処置が前方腰椎椎体間固定術（ＡＬＩＦ）および経椎間孔椎体間固定術（ＴＬＩＦ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記外科的処置が前処置を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
対象での硬膜裂傷を治療するための方法であって、前記方法は、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片を硬膜裂傷に直接適用することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
歯科の適用において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【請求項２２】
整形外科の適用において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【請求項２３】
耳鼻咽喉科の適用において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【請求項２４】
眼科の適用（例えば、眼表面修復のオン−レイ（ｏｎ−ｌａｙ）移植片）において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【請求項２５】
婦人科の適用において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【請求項２６】
泌尿器科の適用において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【請求項２７】
全身の手術において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【請求項２８】
心臓の適用において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【請求項２９】
形成手術後の瘢痕形成を軽減するまたは予防するための請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織移植片の使用。
【国際調査報告】
2015503367.tif 000005
2015503367.tif 000006