(57)【要約】  本発明は、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を発現するように操作された組換え宿主細胞において、脂肪酸生成物などの脂質を製造する方法に関する。組換え微生物は、非天然脱水素酵素遺伝子を発現しない微生物と比較して高い速度で増殖でき、脂質製造のために操作され、非天然脱水素酵素を発現する微生物の培養物は、非天然脱水素酵素遺伝子を含まない対照微生物の培養物よりも多くの脂質を製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質を製造する微生物を培養する方法であって、
脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質の製造のための少なくとも１種の遺伝子が発現される条件下、適した培養培地中に、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質の製造のためのポリペプチドをコードする少なくとも１種の非天然遺伝子を含む組換え微生物の培養物を提供することを含み、
ここで、培養物は、非天然脱水素酵素をコードする遺伝子を含まない点を除いてすべての点で同一である対照微生物を含む培養物が製造するものよりも、多い量の脂質を製造し、
さらに、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む組換え微生物は、非天然脱水素酵素をコードする遺伝子を欠く対照微生物よりも、高い成長および／または増殖速度を有する、方法。
【請求項２】
脱水素酵素が、ＮＡＤＰ依存性脱水素酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素、非リン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素またはリンゴ酸酵素である、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号４またはその活性断片に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
脱水素酵素が、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、配列番号１８、配列番号１９またはその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
脱水素酵素が、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、配列番号１６およびその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
脱水素酵素が、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素が、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３およびその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素が、組換え微生物に対して内因性である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
組換え微生物が、組換え光合成微生物、好ましくは、微細藻類、より好ましくは、アクナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォラ属（Amphora）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Asteromonas）、ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオコッカス属（Botryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス属（Chaetoceros）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロロコッカム属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（Chlorella）、クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、クリコスファエラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、クリプトモナス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモスファエラ属（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（Euglena）、フランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサムニオン属（Gloeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属（Halocafeteria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、レポシンクリス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィジウム属（Monoraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（Nannochloropsis）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロクロリス属（Nephrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzschia）、オクロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイスティス属（Oocystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova）、パラクロレラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラム属（Phaeodactylum）、ファガス属（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラチモナス属（Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス属（Pleurococcus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、シュードネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）、ピロボトリス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、スケレトネマ属（Skeletonema）、スピロギラ属（Spyrogyra）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラセルミス属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viridiella）およびボルボックス属（Volvox）からなる群から選択される微細藻類の種である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
組換え微生物が、ラン藻、好ましくは、アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロカプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カマエシフォン属（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロコッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナリウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（Cyanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シアノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シリンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsis）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミエラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオセイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iyengariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノストック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillatoria）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プレウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieria）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、トリコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）またはゼノコッカス属（Xenococcus）からなる群から選択されるラン藻の種である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
組換え光合成微生物が、光独立栄養的に培養される、請求項１３または請求項１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
脱水素酵素をコードする第１の非天然遺伝子を含む組換え微生物であって、脂質の製造に関与している酵素をコードする少なくとも第２の非天然遺伝子をさらに含み、酵素が、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、ヒドロキシベンゾイルチオエステラーゼ、脂質分解活性を有するポリペプチド、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、アシル−ＣｏＡレダクターゼ、アシル−ＡＣＰレダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、ワックスシンターゼ、デカルボキシラーゼ、デカルボニラーゼ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＰＡＰおよびＤＧＡＴからなる群から選択され、
脂質を製造し、
さらに、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を欠く、そうでなければ同一である微生物よりも高い成長および／または増殖速度を有する、組換え微生物。
【請求項１７】
脂質が、脂肪酸、脂肪酸誘導体またはトリグリセリドである、請求項１６に記載の組換え微生物。
【請求項１８】
脱水素酵素が、ＮＡＤＰ依存性脱水素酵素である、請求項１６または請求項１７のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項１９】
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素、非リン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素またはリンゴ酸酵素である、請求項１８に記載の組換え微生物。
【請求項２０】
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素である、請求項１９に記載の組換え微生物。
【請求項２１】
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号４またはその活性断片に対して少なくとも５０％の同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の組換え微生物。
【請求項２２】
脱水素酵素が、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、請求項１９に記載の組換え微生物。
【請求項２３】
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号１８、配列番号１９およびその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の組換え微生物。
【請求項２４】
脱水素酵素が、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素である、請求項１９に記載の組換え微生物。
【請求項２５】
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、配列番号１６およびその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の同一性、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の組換え微生物。
【請求項２６】
組換え微生物が、組換え光合成微生物、好ましくは、微細藻類、より好ましくは、アクナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォラ属（Amphora）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Asteromonas）、ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオコッカス属（Botryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス属（Chaetoceros）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロロコッカム属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（Chlorella）、クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、クリコスファエラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、クリプトモナス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモスファエラ属（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（Euglena）、フランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサムニオン属（Gloeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属（Halocafeteria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、レポシンクリス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィジウム属（Monoraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（Nannochloropsis）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロクロリス属（Nephrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzschia）、オクロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイスティス属（Oocystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova）、パラクロレラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラム属（Phaeodactylum）、ファガス属（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラチモナス属（Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス属（Pleurococcus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、シュードネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）、ピロボトリス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、スケレトネマ属（Skeletonema）、スピロギラ属（Spyrogyra）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラセルミス属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viridiella）およびボルボックス属（Volvox）からなる群から選択される微細藻類の種である、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２７】
組換え微生物が、ラン藻、好ましくは、アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロカプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カマエシフォン属（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロコッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナリウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（Cyanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シアノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シリンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsis）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミエラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオセイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iyengariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノストック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillatoria）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プレウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieria）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、トリコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）またはゼノコッカス属（Xenococcus）からなる群から選択される微細藻類の種である、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２８】
配列番号２９に対して、少なくとも６５％の同一性、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本願は、２０１２年１２月４日に作製された、配列表テキストファイル「６１０３７５２７＿ｌ．ｔｘｔ」、ファイルサイズ８４キロバイト（ＫＢ）として本明細書と同時に提出されたアミノ酸配列および／または核酸配列の参照を含有する。前記の配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（ｉｉ）に準拠した、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、いくつかの実施形態では、光合成微生物における代謝経路の操作に関する。具体的には、本発明は、脂肪酸、脂肪酸誘導体および／または脂質の合成のための経路の操作に関する。本発明はまた、バイオ燃料を含めた種々の生成物のために使用され得る光合成微生物において脂肪酸生成物などの脂質を製造するための、方法、微生物および核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００３】
化石燃料は、腐敗した動植物から形成された有機物質の埋蔵されている可燃性の地質堆積物が、何億年もかけて地殻中で熱および圧力に対する曝露によって原油、石炭、天然ガスまたは重油に変換されたものの総称である。化石燃料は、有限の再生不能な資源である。
【０００４】
グローバル経済によってエネルギー需要が高まったことにより、炭化水素の費用にかかる圧力がさらに強くなっている。エネルギーの他にも、プラスチックおよび化学メーカーを含めた多数の産業が、その製造プロセスの原料として炭化水素の利用可能性に大きく依存している。既存の供給源に取って代わる費用効率の高いものがあれば、エネルギーおよびこれらの原料費にかかる上昇圧力を軽減するのに寄与することができよう。この目的を果たすために、費用効率の高い強化されたバイオプロセスによる高エネルギー燃料の微生物生産に主な努力が集中している。しかし、可燃性生成物を作製するための発酵ベースのアプローチなどの化石燃料製造のいくつかの代替法は、サトウキビ、イネ、トウモロコシなどの炭水化物が豊富な原料を大量に使用することに頼っている。可燃性燃料を製造するためのこのような資源の使用は、原料に対する市場圧力を高め、世界の食糧供給の価格を釣り上げるという望ましくない結果となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
脂肪酸は、長いアルキル鎖からなり、自然界の石油に相当し、化学的機能およびエネルギー貯蔵機能の両方のために細胞によって使用される一次代謝産物である。これらのエネルギーが豊富な分子は、今日、燃料から油脂化学物質にわたる多様な製品のために植物油および動物油から単離される。この重要なクラスの化学物質を得るためのよりスケーラブルで制御可能な経済的方法があれば、再生可能なエネルギー源の開発にとって有益となろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本発明は、脂質を製造する方法であって、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む組換え微生物の培養物を提供すること、および非天然遺伝子が発現される条件下で微生物が増殖するのを可能にすることを含み、培養物が少なくとも１種の脂質を製造する、方法を提供する。好ましくは、培養物は、対照微生物が、非天然脱水素酵素をコードする遺伝子を発現しない点を除いて、非天然脱水素酵素遺伝子を発現する組換え微生物とすべての点で同一である対照微生物の対照培養物によって製造される脂質の量よりも多い量の脂質を製造する。脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を発現し、脂質を製造する組換え微生物は、非天然脱水素酵素遺伝子を発現しない対照微生物よりも高い増殖速度を有し得る。組換え微生物によって製造される脂質は、任意の脂質であり得、好ましくは、脂肪酸生成物、例えば、脂肪酸、脂肪酸誘導体またはトリグリセリドであり得る。さらに、組換え微生物は、脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードするさらなる非天然遺伝子を含み得る。非天然脱水素酵素遺伝子を発現する組換え微生物は、適した培養培地、例えば、組換え微生物の成長および／または増殖を支援する培養培地で培養され得る。この方法は、培養物から少なくとも１種の脂質を単離することをさらに含み得る。
【０００７】
また、特定の態様では、脂質を製造する微生物の繁殖および／または増殖速度を改善する方法が本明細書において提供され、この方法は、脂質を製造する微生物において脱水素酵素をコードする組換え核酸分子を発現させること、および微生物の繁殖を支援する条件下で微生物を培養することを含み、微生物の繁殖および／または増殖速度は、同一条件下で培養され、対照微生物が脱水素酵素をコードする組換え核酸分子を発現しない点を除いて、組換え微生物とすべての点で同一である対照微生物のものよりも高い。さらに、微生物は、脂質の合成に関与する１種または複数のポリペプチドをコードする少なくとも１種のさらなる非天然遺伝子を含み得る。
【０００８】
非天然遺伝子または組換え核酸分子によってコードされる脱水素酵素は、酸化反応においてＮＡＤＰを使用し得る脱水素酵素であり得る。さらに、またはあるいは、非天然遺伝子は、宿主微生物に対して異種（異なる種から誘導される）または同種（同じ種から誘導される）である脱水素酵素をコードし得、特定の態様では、非天然遺伝子は、宿主微生物における過剰発現のために操作された内因性遺伝子であり得る。種々の例では、脱水素酵素は、アルデヒド脱水素酵素（例えば、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素または非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．９）を含む）、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素またはリンゴ酸酵素であり得る。例えば、組換え微生物は、いくつかの例では、配列番号４、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るアルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。あるいは、またはさらに、組換え微生物は、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得、いくつかの例では、配列番号１８または配列番号１９のアミノ酸配列またはその活性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素であり得る。あるいは、またはさらに、脱水素酵素は、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素であり得、いくつかの例では、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列またはその活性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素であり得る。あるいは、またはさらに、組換え微生物は、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。６−ホスホグルコン酸脱水素酵素は、いくつかの例では、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３のアミノ酸配列またはその活性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０００９】
非天然脱水素酵素遺伝子を含む微生物は、真菌、細菌または不等毛藻であり得、例えば、微細藻類またはラン藻などの光合成微生物であり得る。例えば、微生物は、アクナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォラ属（Amphora）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Asteromonas）、ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオコッカス属（Botryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス属（Chaetoceros）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロロコッカム属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（Chlorella）、クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、クリコスファエラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、クリプトモナス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモスファエラ属（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（Euglena）、フランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサムニオン属（Gloeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属（Halocafeteria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、レポシンクリス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィジウム属（Monoraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（Nannochloropsis）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロクロリス属（Nephrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzschia）、オクロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイスティス属（Oocystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova）、パラクロレラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラム属（Phaeodactylum）、ファガス（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラチモナス属（Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス属（Pleurococcus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、シュードネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）、ピロボトリス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、シゾクラミデラ属（Schizochlamydella）、スケレトネマ属（Skeletonema）、スピロギラ属（Spyrogyra）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラクロレラ属（Tetrachlorella）、テトラセルミス属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viridiella）またはボルボックス属（Volvox）の種である微細藻類であり得る。あるいは、微生物は、ラン藻であり得、アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロカプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カマエシフォン属（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロコッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナリウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（Cyanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シアノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シリンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsis）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミエラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオセイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iyengariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノストック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillatoria）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プレウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieria）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、トリコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）またはゼノコッカス属（Xenococcus）の種であり得る。
【００１０】
本発明の光合成宿主微生物は、例えば、培養培地において炭素の実質的に唯一の供給源として無機炭素を用いて、脂質の製造のために光独立栄養的に培養され得る。微生物は、培養培地中に無機炭素、例えば、ＣＯ２とともに提供されてもよく、および／または炭酸塩が、培養期間の間、培養物に供給されてもよい。
【００１１】
光合成微生物であり得る、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む組換え微生物は、脂肪酸生成物またはトリグリセリドなどの脂質の製造に関与するポリペプチドをコードする第２の非天然遺伝子をさらに含み得る。限定されない例として、脂質の製造に関与するポリペプチドは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニルＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、ヒドロキシルベンゾイルチオエステラーゼ、脂質分解活性を有するポリペプチド、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、アシル−ＣｏＡレダクターゼ、アシル−ＡＣＰレダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、ワックスシンターゼ、デカルボキシラーゼ、デカルボニラーゼ、グリセロールリン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）またはジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）であり得る。組換え微生物は、例えば、脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、ワックスエステル、アルカンまたはアルケンなどの脂肪酸誘導体を製造し得るか、またはトリグリセリドを製造し得、そのいずれも、特定の例では、脂質の製造に関与する遺伝子で形質転換されていない場合には、微生物によって天然に製造されない脂質であり得る。例えば、組換え微生物は、チオエステラーゼをコードする第２の非天然遺伝子を含み得、脂肪酸生成物、例えば、遊離脂肪酸または脂肪酸誘導体を製造し得る。脂肪酸生成物は、Ｃ８〜Ｃ１４の、例えば、Ｃ１２〜Ｃ１８などのＣ１２〜Ｃ２４の少なくとも１種のアシル鎖を含み得る。
【００１２】
脱水素酵素をコードする第１の非天然遺伝子および脂質の製造に関与する脂質ポリペプチドをコードする第２の非天然遺伝子を含む組換え微生物は、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含まない点を除いて、組換え微生物とすべての点で同一である対照微生物よりも高い増殖速度を有し得る。例えば、非天然脱水素酵素遺伝子および脂質生合成のためのポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含む組換え微生物は、脱水素酵素遺伝子が発現され、組換え微生物が脂質を製造する培養期間の間、高い増殖速度を有し得る。組換え微生物は、光合成微生物であり得、特定の例では、組換え微生物が、少なくとも１種の脂質、例えば、特定の例では、光合成微生物によって天然に製造されない脂肪酸生成物であり得る脂肪酸生成物などを製造する光独立栄養条件下で培養された場合に非天然脱水素酵素遺伝子を含まないか、または発現しない対照微生物よりも高い増殖速度を有し得る。
【００１３】
また、組換え光合成微生物が、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質の製造に関与するポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含み、培養物が、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を欠く点を除いてすべての点で同一である微生物の同一培養物によって製造されるものよりも多量の脂質を製造する、適した培養培地中に組換え光合成微生物を含む培養物が本明細書において提供される。さらに、またはあるいは、非天然脱水素酵素遺伝子を含む微生物の培養物は、３、４、５または６日培養した後に、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を欠く点を除いて、すべての点で同一である微生物の同一培養物によって到達される培養密度よりも高い光学濃度に到達し得る。培養物は、例えば、培養培地が、実質的に唯一の炭素源として無機炭素を含有する光独立栄養培養物であり得る。培養物は、第１の非天然遺伝子を欠く組換え微生物を含む点を除いて、すべての点で同一である培養物と比較して、少なくとも１０％多く、少なくとも２５％多く、少なくとも５０％多く、少なくとも７５％多く、少なくとも１００％、少なくとも２００％多く、少なくとも３００％多く、少なくとも４００％多く、少なくとも５００％多く、少なくとも７００％多くまたは少なくとも８００％多くの脂肪酸、脂肪酸誘導体またはトリグリセリドを製造し得る。
【００１４】
本明細書における方法のいずれかにおいて使用される組換え微生物は、本明細書において開示されるような任意の脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得、例えば、脱水素酵素は、アルデヒド脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素またはリンゴ酸酵素であり得る。例えば、脱水素酵素は、アルデヒド脱水素酵素であり得、いくつかの例では、配列番号４、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。あるいは、またはさらに、微生物は、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得、いくつかの例では、配列番号１８または配列番号１９のアミノ酸配列またはその活性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素であり得る。あるいは、またはさらに、微生物は、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得、いくつかの例では、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素であり得る。あるいは、またはさらに、微生物は、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。６−ホスホグルコン酸は、いくつかの例では、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３のアミノ酸配列またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００１５】
方法は、培養物から少なくとも１種の（on）脂質を単離することをさらに含み得る。脂質は、細胞、培地または全培養物から単離され得る。また、本明細書において提供される方法または組換え微生物のいずれかによって製造される脂質も本明細書において提供される。脂質は、脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、ワックスエステル、アルカン、アルケン、リン脂質、ガラクト脂質もしくはトリグリセリドのいずれかまたはいずれかの組合せであり得る。脂質は、１２から２４個の間の炭素原子、例えば、１２から１８個の炭素原子などの８から２４個の炭素原子を含有する少なくとも１種のアシル鎖を含み得る。
【００１６】
いくつかの態様では、本発明は、配列番号３、配列番号９、配列番号１、配列番号１２、配列番号１４または配列番号１７に対して少なくとも５０％同一である第１のヌクレオチド配列を含む第１の組換え核酸分子を含む組換え光合成微生物に関し、核酸分子は、脱水素酵素をコードする。組換え光合成微生物は、少なくとも、脂肪酸生成物の製造のために操作され得、脂質の合成に関与するポリペプチドをコードする第２の組換え核酸分子またはヌクレオチド配列を含み得る。例えば、光合成微生物は、例えば、ラン藻であり得る光合成微生物によって天然に製造されない、遊離脂肪酸、脂肪酸誘導体またはトリグリセリドの合成に関与するポリペプチドをコードする組換えヌクレオチド配列を含み得る。例えば、光合成微生物は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする組換えヌクレオチド配列を含み得、遊離脂肪酸または脂肪酸誘導体を製造し得る。例示的な例では、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、高等植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼまたはその変異体、例えば、配列番号２１のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼなどであり得る。
【００１７】
本発明は、さらなる例では、アルデヒド脱水素酵素またはＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列を含む非天然の第１の核酸分子を含む組換え微生物を提供し、光合成微生物は、外因性の第１の核酸分子を欠く、そうでなければ同一である微生物によって製造されるものよりも多くの脂肪酸、脂肪酸誘導体または脂質を製造する。いくつかの実施形態では、生物は、非天然アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、ヒドロキシベンゾイルチオエステラーゼ、アシル−ＡＣＰレダクターゼ、アシル−ＡＣＰレダクターゼ、ワックスシンターゼ、デカルボニラーゼ、デカルボキシラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニルＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、グリセロールリン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）またはジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）からなる群から選択される酵素をコードする少なくとも１種の第２の非天然核酸分子をさらに発現する。さらに、微生物は、第２の非天然核酸分子の不在下では微生物によって製造されない脂肪酸、脂肪酸誘導体またはグリセロ脂質を製造し得る。組換え微生物は、光合成微生物であり得、光独立栄養条件で第１の核酸を欠く、そうでなければ同一である微生物によって製造されるものよりも多くの脂肪酸、脂肪酸誘導体またはグリセロ脂質を製造し得る。いくつかの態様では、本発明は、脂肪酸生成物を製造するのに十分な時間量の間、アルデヒド脱水素酵素またはＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードする第１の非天然遺伝子を含み、脂肪酸、脂肪酸誘導体または脂質生合成に関与するポリペプチドをコードする第２の非天然遺伝子を含む本発明の組換え光合成微生物を培養することを含む、脂肪酸生成物を製造する方法に関する。脂肪酸生成物は、光合成微生物によって天然には製造されない生成物であり得る。
【００１８】
また、異種プロモーター、すなわち、ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子を普通は調節しないプロモーターの制御下にある同種ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子を含む組換え光合成微生物も提供される。例えば、ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子は、異種の、好ましくは、調節可能なプロモーターと作動可能に連結され得、組換え微生物のゲノム内の非天然遺伝子座に組み込まれ得る。あるいは、異種プロモーターは、宿主ゲノム中に挿入され、内因性ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子と作動可能に連結されるようになり得、その結果、内因性ホスホグルコン酸（phosphhogluconate）脱水素酵素が宿主微生物において過剰発現され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、脂質（例えば、脂肪酸生成物）の製造に関与するポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む第２の核酸をさらに発現し、ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子の発現が、微生物の繁殖および／または増殖速度を、組換えホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子を含まない、そうでなければ同一である微生物に対して高める。
【００１９】
いくつかの実施形態では、光合成微生物は、ラン藻である。いくつかの実施形態では、ラン藻が、アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロカプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カマエシフォン属（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロコッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナリウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（Cyanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シアノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シリンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsis）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミエラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオセイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iyengariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノストック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillatoria）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プレウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieria）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、トリコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）およびゼノコッカス属（Xenococcus）からなる群から選択される。
【００２０】
本発明はまた、光合成微生物によって、遊離脂肪酸、脂肪酸誘導体または脂質を製造する方法を提供する。方法は、第１の非天然核酸分子および第２の核酸分子が発現されて、少なくとも１種の脂肪酸または脂肪酸誘導体を製造する条件下で本明細書に記載される光合成微生物を培養することを含み得る。所望により、光合成微生物は、光栄養的に培養される。
【００２１】
組換え微生物における脱水素酵素をコードする非天然遺伝子の発現および脂質生合成のポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、同一に培養される対照微生物の培養物によって製造される脂肪酸の製造に対して、脱水素酵素を過剰発現する微生物の培養物による脂肪酸生成物の製造の増大をもたらし得、対照微生物は、対照微生物が非天然脱水素酵素遺伝子を欠く点を除いて、非天然脱水素酵素遺伝子を発現する微生物と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、非天然脱水素酵素遺伝子および非天然脂質生合成遺伝子を発現する微生物の培養物によって製造された遊離脂肪酸、脂肪酸誘導体またはグリセロ脂質の量は、非天然脱水素酵素遺伝子を欠く対照微生物の培養物によって製造される遊離脂肪酸、脂肪酸誘導体またはグリセロ脂質よりも、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％または少なくとも２００％多い。微生物は、光合成微生物であり得る。
【００２２】
さらに、またはあるいは、組換え微生物における脱水素酵素をコードする非天然遺伝子の発現および脂質生合成のためのポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、非天然脱水素酵素遺伝子を欠く、そうでなければ同一である微生物におけるＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ＋の比に対して、ＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ＋の細胞内比を増大し得る。例えば、非天然脱水素酵素遺伝子および非天然脂質生合成遺伝子を発現する細胞におけるＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ＋比は、脂質が製造されている培養期間の間、非天然脱水素酵素遺伝子を欠く、そうでなければ同一である対照微生物のＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ＋比よりも、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％または少なくとも２００％高いものであり得る。微生物は、光合成微生物であり得る。
【００２３】
なおさらに、またはあるいは、組換え微生物における、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子の発現および脂質生合成のためのポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、非天然脱水素酵素遺伝子を欠く、そうでなければ同一である微生物の繁殖および／または増殖速度に対して、操作された微生物の繁殖速度および／または増殖速度を高め得る。例えば、繁殖速度または増殖速度は、非天然脂質生合成遺伝子を発現するが、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含まない対照微生物の繁殖速度および／または増殖速度よりも、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％または少なくとも２００％高いものであり得る。例えば、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質生合成のためのポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含む操作された微生物の培養物は、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含まない、そうでなければ同一である微生物の培養物によって達成され得る培養物において、３、４、５、６日またはそれ以上後に高い細胞密度を達成し得、培養物は、脂質を製造する。微生物は、光合成微生物であり得る。
【００２４】
本発明に従う光合成微生物によって製造される遊離脂肪酸、脂肪酸誘導体または脂質の量は、培養物１リットルあたり、少なくとも２９０ｍｇ、少なくとも３３０ｍｇ、少なくとも３７０ｍｇ、少なくとも４００ｍｇ、少なくとも５００ｍｇ、少なくとも６００ｍｇであり得る。さらに、脂肪酸生成物を製造する方法は、光合成微生物から、または成長培地から少なくとも１種の脂肪生成物を単離することをさらに含み得る。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、配列番号２または配列番号２９またはその活性断片に対して少なくとも６５％同一である、少なくとも７５％同一である、少なくとも８５％同一である、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド配列をコードする核酸配列を含む単離核酸分子を提供する。コードされるポリペプチドは、脱水素酵素活性、例えば、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素活性を有し得る。核酸分子は、脱水素酵素をコードする配列とは異種であり得、調節可能、例えば、誘導性であり得るプロモーターをさらに含み得る。核酸分子は、ベクター中に提供され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】操作されたシネコシスティス属（Synechocystis）株によって製造される総遊離脂肪酸を表す図である。ＣｃｌＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子（配列番号２０）とともに、Ｂ１０  ＯＲＦ（「ｄｅｈｙｄｒｄ」；配列番号１）、ＮＢ８部分ＯＲＦ断片（配列番号５）、ＮＢ１０４  ＯＲＦ（「６−Ｐ−ｄｅ」；配列番号９）およびＮＢ１０４  ＯＲＦ全コンティグ断片（配列番号８）を発現するシネコシスティス属（Synechocystis）株は、ＣｃｌＦａｔＢ１遺伝子単独を含有していた対照株と比較して高レベルの遊離脂肪酸を製造した。
【図２】６日成長させた最後の、操作されたシネコシスティス属（Synechocystis）ＰＣＣ６８０３株の光学密度を表す図である。すべての株を１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導して、ＣｃｌＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子および脱水素酵素遺伝子を発現させた。黒色バーは、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ単独を発現する株に相当する。模様の入ったバーは、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子とともに、脱水素酵素として同定された単離遺伝子を含有していた株に相当する。
【図３】野生型（ＷＴ）および操作されたシネコシスティス属（Synechocystis）株の酸化還元状態を表す図である。ＷＴシネコシスティス属（Synechocystis）株（「６８０３」）、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ発現株（ＣｃｌＦａｔＢ１）およびＣｃｌＦａｔＢ１チオエステラーゼ遺伝子および脱水素酵素遺伝子を同時発現する株（ＣｃｌＦａｔＢ１＋Ｂ１０；ＣｃｌＦａｔＢ１＋ＮＢ１０４）のＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比が示されている。Ｄは、培養における日数を示す。
【図４】６−ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子を示す、ＮＡＤＰＨを生成するペントースリン酸経路の一部を表す図である。
【図５】導入遺伝子の発現を誘導した６日後の、ＣｃＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を発現する（黒色バー）またはＣｃｌＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子およびシネコシスティス属（Synechocystis）６−ホスホグルコン酸脱水素酵素ｓｌｌ０３２９遺伝子（配列番号１２）を同時発現する（模様の入ったバー）シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）株による遊離脂肪酸（ＦＦＡ）製造を表す図である。株は、ＯＤ７３０＝５．０で誘導した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
光合成生物は、ＣＯ２に由来する固定炭素並びに同様に光合成から生成するＡＴＰおよびＮＡＤＰＨを使用して膜および貯蔵脂質の製造のために脂肪酸を合成する。ＮＡＤＰＨはまた、脱水素酵素の活性によって生成し得る。用語「脱水素酵素」は、本明細書において、１つまたは複数の水素化物（Ｈ−）をＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋などのアクセプターに移すことによる、基質の酸化を触媒する酵素を指すよう使用される。本発明は、脱水素酵素をコードする少なくとも１種の非天然遺伝子を発現し、例えば、１種または複数の脂肪酸、１種または複数の脂肪酸誘導体および／または１種または複数のグリセロ脂質（例えば、１種または複数のトリグリセリド）などの１種または複数の脂質を製造する組換え微生物を提供する。組換え微生物は、いくつかの態様では、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を発現しない匹敵する微生物よりも、脂質を製造しながら良好な増殖速度を実証し、さらに、非天然脱水素酵素遺伝子を発現する組換え微生物の培養物は、対照微生物が、非天然脱水素酵素遺伝子を発現しない点を除いて、脱水素酵素遺伝子を発現する微生物とすべての点において同一である微生物の対照培養物によって製造されるものよりも多くの脂質を製造し得る。組換え微生物は、組換え光合成微生物であり得る。また、脱水素酵素をコードする少なくとも１種の非天然遺伝子を含む微生物の培養物を提供することによって脂質を製造する方法も提供され、培養物は、微生物が脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含まないという点を除いて、すべての点において同一である培養物よりも多くの脂質を製造する。微生物は、光合成微生物であり得、いくつかの例では、光独立栄養的に培養され得る。微生物は、脂質の合成に関与するポリペプチドをコードする１種または複数の非天然遺伝子をさらに含み得る。
【００２８】
定義
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本願が支配する。文脈によって別に必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。本明細書において記載されるすべての刊行物、特許およびその他の参考文献は、個々の刊行物または特許出願の各々が、具体的に、個別に、参照によって組み込まれるよう示されるかのように、すべての目的のために参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【００２９】
本発明の実施または試験において、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料が使用され得るが、適した方法および材料は、以下に記載される。材料、方法および例は、単に例示されており、制限であるよう意図されない。本発明のその他の特徴および利点は、詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかとなる。
【００３０】
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語および語句は、以下に定義される。
【００３１】
別に明確に示されない限り、本開示内容および特許請求の範囲において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、複数形を含む。
【００３２】
実施形態が、言葉「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用いて本明細書に記載される場合はいつでも、そうではなく、「からなる」および／または「から本質的になる」という用語で記載される類似の実施形態も提供される。
【００３３】
本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用されるような用語「および／または」とは、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」および「Ｂ」を含むものとする。
【００３４】
用語「遺伝子」は、ポリペプチドまたは発現されるＲＮＡをコードする核酸分子（通常、ＤＮＡであるが、所望により、ＲＮＡ）の任意のセグメントを指すよう広く使用される。したがって、遺伝子は、発現されるＲＮＡ（ポリペプチドコード配列または例えば、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、リボザイムなどといった機能的ＲＮＡを含み得る）をコードする配列を含む。遺伝子は、その発現に必要な、または影響を及ぼす調節配列ならびに例えば、イントロン配列、５’または３’非翻訳配列などといったその天然状態でタンパク質またはＲＮＡをコードする配列と関連している配列をさらに含み得る。遺伝子は、対象の供給源からクローニングすることおよび既知または予測される配列情報から合成することを含め、種々の供給源から得ることができる。
【００３５】
用語「核酸」または「核酸分子」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のセグメントを指し、また、修飾された骨格を有する核酸（例えば、ペプチド核酸、ロックド核酸）または修飾されたもしくは天然に存在しない核酸塩基も含む。核酸分子は、二本鎖であっても、一本鎖であってもよく、遺伝子またはその一部を含む一本鎖核酸は、コーディング（センス）鎖であっても、非コーディング（アンチセンス）鎖であってもよい。
【００３６】
核酸分子は、示された供給源「から誘導する」ことができ、これは、示された供給源からの核酸セグメントの単離（全体でまたは一部で）を含む。核酸分子はまた、例えば、直接クローニング、ＰＣＲ増幅、または示されたポリヌクレオチド供給源からのもしくは示されたポリヌクレオチド供給源と関連している配列に基づいた人工合成によって、示された供給源から誘導することができる。特定の供給源または種から誘導される遺伝子または核酸分子はまた、供給源核酸分子に対して配列修飾を有する遺伝子または核酸分子を含む。例えば、供給源（例えば、特定の参照遺伝子）から誘導される遺伝子または核酸分子は、意図されないか、または計画的に導入されている、供給源遺伝子または核酸分子に対する１つまたは複数の突然変異を含み得、置換、欠失もしくは挿入を含む１つまたは複数の突然変異が計画的に導入されている場合には、配列変更は、細胞もしくは核酸のランダム突然変異もしくは標的突然変異によって、増幅もしくはその他の分子生物学技術によって、または化学合成またはその任意の組合せによって導入され得る。機能的ＲＮＡまたはポリペプチドをコードする参照遺伝子または核酸分子から誘導される遺伝子または核酸分子は、参照または供給源機能的ＲＮＡまたはポリペプチドと、またはその機能的断片に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する機能的ＲＮＡまたはポリペプチドをコードし得る。例えば、機能的ＲＮＡまたはポリペプチドをコードする参照遺伝子または核酸分子から誘導される遺伝子または核酸分子は、参照または供給源機能的ＲＮＡまたはポリペプチドと、またはその機能的断片と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する機能的ＲＮＡまたはポリペプチドをコードし得る。
【００３７】
本明細書において、「単離された」核酸またはタンパク質は、その天然環境または核酸もしくはタンパク質が天然に存在する状況から取り出されている。例えば、単離タンパク質または核酸分子は、天然のまたは自然の環境において関連している細胞または生物から取り出されている。単離された核酸またはタンパク質は、いくつかの例では、部分的または実質的に精製されている場合もあるが、単離に特定のレベルの精製が必要というわけではない。したがって、例えば、単離核酸分子は、天然に組み込まれている染色体、ゲノムまたはエピソームから切り出された核酸配列であり得る。
【００３８】
「精製された」核酸分子もしくはヌクレオチド配列またはタンパク質もしくはポリペプチド配列は、細胞性物質および細胞成分を実質的に含まない。精製された核酸分子またはタンパク質は、例えば、バッファーまたは溶媒の域を超える化学物質を含まないものであり得る。「実質的に含まない」は、新規核酸分子の域を超える成分が検出可能ではないということを意味するものではない。
【００３９】
用語「天然に存在する」および「野生型」とは、天然に見られる形態を指す。例えば、天然に存在する、または野生型核酸分子、ヌクレオチド配列またはタンパク質は、天然供給源中に存在し得、またはそれから単離され得、ヒトの操作によって意図的に修飾されていない。
【００４０】
本明細書において、「弱毒化された」とは、量、程度、強度または力において低減されたことを意味する。弱毒化された遺伝子発現とは、問題の遺伝子の転写の、またはコードされたタンパク質の翻訳、フォールディングもしくはアセンブリーの大幅に低減された量および／または速度を指し得る。限定されない例として、弱毒化された遺伝子は、突然変異された、もしくは破壊された遺伝子（例えば、部分もしくは完全欠失または挿入突然変異によって破壊された遺伝子）または遺伝子調節配列の変更によって発現が減少した遺伝子であり得る。
【００４１】
「外因性核酸分子」または「外因性遺伝子」とは、細胞に導入された（「形質転換された」）核酸分子または遺伝子を指す。形質転換された細胞は、組換え細胞と呼ばれることもあり、これに、さらなる外因性遺伝子（複数可）が導入され得る。核酸分子で形質転換された細胞の子孫も、外因性核酸分子を受け継いでいる場合には「形質転換された」と呼ばれる。外因性遺伝子は、形質転換されている細胞に対して、異なる種に由来するもの（そのため「異種」）ものであっても、同一種に由来するもの（そのため「同種」）であってもよい。「内因性」核酸分子、遺伝子またはタンパク質は、宿主中に生じるか、または宿主によって天然に産生される天然核酸分子、遺伝子またはタンパク質である。
【００４２】
用語「天然に」とは、本明細書において、宿主中に天然に生じるときに核酸配列またはアミノ酸配列を指すよう使用される。用語「非天然」は、本明細書において、宿主において天然に生じない核酸配列またはアミノ酸配列を指すよう使用される。細胞から取り出され、実験室操作に付され、宿主細胞に導入または再導入された核酸配列またはアミノ酸配列は、「非天然」と考えられる。宿主細胞に導入された合成または部分合成遺伝子は、「非天然」である。非天然遺伝子は、宿主ゲノムにおいて組換えられている、１種または複数の異種調節配列に作動可能に連結された、宿主微生物にとって内因性である遺伝子をさらに含む。
【００４３】
「組換え」または「操作された」核酸分子は、ヒト操作によって変更された核酸分子である。限定されない例として、組換え核酸分子は、１）例えば、化学的または酵素的技術を使用して（例えば、化学的核酸合成の使用によって、または核酸分子の複製、重合、消化（エキソヌクレアーゼの、またはエンドヌクレアーゼの）、連結、逆転写、転写、塩基修飾（例えば、メチル化を含む）、組込みまたは組換え（相同および部位特異的組換えを含む）のための酵素の使用による）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで部分的もしくは全体的に合成された、または修飾された、２）天然には結合していない、結合されたヌクレオチド配列を含み、３）天然に存在する核酸分子配列に対して１つまたは複数のヌクレオチドを欠くよう分子クローニング技術を使用して操作されている、および／または４）天然に存在する核酸配列に対して１つまたは複数の配列変更または再編成を有するよう分子クローニング技術を使用して操作されている任意の核酸分子を含む。限定されない例として、ｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏポリメラーゼ反応によって作製され、リンカーが結合されているか、またはクローニングベクターもしくは発現ベクターなどのベクター中に組み込まれている任意の核酸分子のように、組換えＤＮＡ分子である。
【００４４】
用語「組換えタンパク質」とは、本明細書において、遺伝子工学によって製造されたタンパク質を指す。
【００４５】
用語組換え、操作された、または遺伝子操作されたとは、生物に適用される場合には、異種または外因性組換え核酸配列の生物への導入によって操作されている生物を指し、遺伝子ノックアウト、標的突然変異および遺伝子置換、プロモーター置換、欠失または挿入並びに導入遺伝子または合成遺伝子の生物への導入を含む。組換えまたは遺伝子操作された生物はまた、遺伝子「ノックダウン」のための構築物が導入されている生物であり得る。このような構築物として、それだけには限らないが、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスおよびリボザイム構築物が挙げられる。また、ゲノムがメガヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼの活性によって変更された生物も含まれる。外因性または組換え核酸分子は、組換え／遺伝子操作された生物のゲノム中に組み込まれ得るか、その他の場合には、組換え／遺伝子操作された生物のゲノム中に組み込まれない。本明細書において、「組換え微生物」または「組換え宿主細胞」は、本発明の組換え微生物の後代または誘導体を含む。特定の修飾は、突然変異または環境の影響のいずれかのために後世において起こり得るので、このような後代または誘導体は、実際には親細胞と同一でない場合もあるが、本明細書において使用されるような用語の範囲内に依然として含まれる。
【００４６】
用語「プロモーター」とは、細胞においてＲＮＡポリメラーゼと結合でき、下流（３’方向）コード配列の転写を開始できる核酸配列を指す。プロモーターは、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーターは、転写開始部位ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）を含み得る。真核生物プロモーターは、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有することが多い。原核生物プロモーターは、−１０および−３５原核生物プロモーターコンセンサス配列を含有し得る。種々の異なる供給源に由来する、構成性、誘導性および抑制性プロモーターを含めた多数のプロモーターが、当技術分野で周知である。代表的な供給源として、例えば、ウイルス、哺乳類、昆虫、植物、酵母および細菌細胞種が挙げられ、これらの供給源に由来する適したプロモーターは、容易に入手可能であるか、またはオンラインで、もしくは、例えば、ＡＴＣＣなどの保管所ならびにその他の市販のもしくは個々の供給源から公的に入手可能な配列に基づいて合成によって製造できる。プロモーターは、１方向性（１方向で転写を開始する）である場合も、２方向性（いずれかの方向で転写を開始する）である場合もあり得る。プロモーターは、構成性プロモーター、抑制性プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。プロモーターの限定されない例として、例えば、Ｔ７プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーターおよびＲＳＶプロモーターが挙げられる。誘導プロモーターの例として、ｌａｃプロモーター、ｐＢＡＤ（ａｒａＡ）プロモーター、Ｔｅｔプロモーター（米国特許第５，４６４，７５８号および同５，８１４，６１８号）およびエクジソンプロモーター（Noら、Proc. Natl. Acad. Sci.(1996年)93(8):3346〜3351頁）が挙げられる。
【００４７】
用語「異種」とは、ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵素への言及において使用される場合には、宿主生物種以外の供給源に由来する、または宿主生物種以外の供給源から誘導される、ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵素を指す。対照的に「同種」ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵素は、本明細書において、宿主生物種から誘導されるポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵素を意味するよう使用される。遺伝子調節配列に、または遺伝子配列を維持または操作するために使用される補助的核酸配列（例えば、プロモーター、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ポリＡ付加配列、イントロン配列、スプライシング部位、リボソーム結合部位、内部リボソーム侵入配列、ゲノム相同性領域、組換え部位など）に言及する場合には、「異種」とは、調節配列または補助的配列が、構築物、ゲノム、染色体またはエピソーム中で調節または補助的核酸配列が隣接している遺伝子と天然には会合していないことを意味する。したがって、その天然状態では（すなわち、遺伝子操作されていない生物のゲノムでは）、作動可能に連結されていない遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、本明細書において、プロモーターが、連結される遺伝子と同一種から（またはいくつかの場合には、同一生物から）誘導され得る場合であっても、「異種プロモーター」と呼ばれる。
【００４８】
本明細書において、用語「タンパク質」または「ポリペプチド」とは、単数形の「ポリペプチド」ならびに複数形の「ポリペプチド」を包含するものとし、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結された単量体（アミノ酸）から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸の任意の鎖（単数または複数）を指し、特定の長さの生成物を指すわけではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２個以上のアミノ酸の鎖（単数または複数）を指すために使用される任意のその他の用語が、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはこれらの用語のいずれかと同義的に使用され得る。
【００４９】
本願は、米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）によって維持される、長く確立された、広範囲に参照されるデータベースにおいて使用される識別子によって核酸およびポリペプチドを開示し、指す。遺伝子または種名の後ろの括弧内に本明細書において一般的に提供される受託番号は、米国国立衛生研究所（United States National Institutes of Health）によって維持される米国国立生物工学情報センターウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で公的に入手可能な配列記録の独特の識別子である。「Ｇｅｎｌｎｆｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ」（ＧＩ）配列同定番号は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に特異的である。配列が多少なりとも変化する場合には、新規ＧＩ番号が割り当てられる。特定のＧｅｎＢａｎｋ記録に現れる配列の種々のＧＩ番号、バージョン番号および更新日を追跡するために、シークエンスリビジョンヒストリー（Sequence Revision History）ツールが入手可能である。受託番号およびＧＩ番号に基づいて核酸もしくは遺伝子配列またはタンパク質配列を検索することおよび得ることは、例えば、細胞生物学、生化学、分子生物学および分子遺伝学の技術分野で周知である。
【００５０】
本明細書において、核酸またはポリペプチド配列に関して、用語「同一性パーセント」または「相同性」は、最大同一性パーセントを求めて配列をアラインし、最大相同性パーセントを達成するために、必要に応じてギャップを導入した後の、既知ポリペプチドと同一である候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。Ｎ末端またはＣ末端挿入または欠失は、相同性に影響を及ぼすと解釈されてはならず、約３０個未満、約２０個未満または約１０個未満のアミノ酸残基のポリペプチド配列への内部欠失および／または挿入は、相同性に影響を及ぼすと解釈されてはならない。
【００５１】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列レベルでの相同性または同一性は、配列類似性検索に適合しているプログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘ（Altschul(1997年)、Nucleic Acids Res. 25、3389〜3402頁およびKarlin(1990年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87、2264〜2268頁）によって使用されるアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）解析によって決定できる。ＢＬＡＳＴプログラムによって使用されるアプローチは、まず、クエリー配列およびデータベース配列間でギャップを用いて、または用いずに、同様のセグメントを考慮し、次いで、同定されるすべてのマッチの統計的有意性を評価し、最後に、有意性の予め選択された閾値を満たすマッチのみをまとめることである。配列データベースの類似性検索における基本的な問題の考察については、Altschul(1994年)、Nature Genetics 6、119〜129頁を参照のこと。ヒストグラム、説明、アラインメント、予測（すなわち、データベース配列に対するマッチを報告するための統計的有意性閾値）、カットオフ、マトリックスおよびフィルター（低複雑度）の検索パラメータは、デフォルト設定であり得る。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘによって使用されるデフォルトスコアリングマトリックスは、８５を超える長さのクエリー配列（ヌクレオチド塩基またはアミノ酸）に推奨されるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Henikoff(1992年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89、10915〜10919頁）である。
【００５２】
ヌクレオチド配列を比較するために設計されたｂｌａｓｔｎには、スコアリングマトリックスは、Ｍ（すなわち、マッチする残基の対に対するリワードスコア）対Ｎ（すなわち、ミスマッチする残基に対するペナルティースコア）の比によって設定され、ＭおよびＮのデフォルト値は、それぞれ＋５および−４であり得る。４種のｂｌａｓｔｎパラメータは、以下のように調整され得る：Ｑ＝１０（ギャップ生成ペナルティー）；Ｒ＝１０（ギャップ伸長ペナルティー）；ｗｉｎｋ＝１（クエリーに沿ってどのｗｉｎｋｔｈ位置でもワードヒットを生成する）およびｇａｐｗ＝１６（ギャップを含むアラインメントが作製されるウィンドウ幅を設定する）。アミノ酸配列の比較のための同等なＢｌａｓｔｐパラメータ設定は、Ｑ＝９、Ｒ＝２、ｗｉｎｋ＝ｌおよびｇａｐｗ＝３２であり得る。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０において利用可能な配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較は、ＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップ生成ペナルティー）およびＬＥＮ＝３（ギャップ伸長ペナルティー）を使用でき、タンパク質比較における同等設定は、ＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２であり得る。
【００５３】
したがって、本発明のポリペプチドまたは核酸配列に言及する場合には、全長ポリペプチドまたは核酸配列または少なくとも５０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個、少なくとも１２５個、少なくとも１５０個もしくはそれ以上の全タンパク質のアミノ酸残基の連続配列を含むその断片、例えば、少なくとも１個のアミノ酸残基が、挿入および置換を含有する開示された配列のＮ末端および／またはＣ末端に、および／または開示された配列内のＮ末端および／またはＣ末端に挿入されているこのような配列の変異体に関して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％または８５％、例えば、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性または約１００％の配列同一性が含まれる。考慮される変異体は、さらにまたはあるいは、例えば、相同組換えもしくは部位指定もしくはＰＣＲ突然変異誘発による所定の突然変異を含有するものならびにそれだけには限らないが、本明細書に記載されたものを含むその他の種の対応するポリペプチドもしくは核酸、挿入および置換を含有するポリペプチドもしくは核酸のファミリーの対立変異体もしくはその他の天然に存在する変異体ならびに／またはポリペプチドが、挿入および置換を含有する天然に存在するアミノ酸以外の部分（例えば、酵素などの検出可能な部分）を用いて、置換、化学的、酵素的もしくはその他の適当な手段によって共有結合によって修飾されている誘導体を含み得る。
【００５４】
本明細書において、語句「保存的アミノ酸置換」または「保存的突然変異」とは、共通の特性を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を指す。個々のアミノ酸間の共通の特性を定義するために機能的方法は、同種生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の正規化された頻度を解析することである（Schulz(1979)Principles of Protein Structure, Springer-Verlag）。このような解析に従って、群内のアミノ酸が互いに優先的に交換し、従って、全体的なタンパク質構造に対する影響において互いに最も似ているアミノ酸の群が、定義され得る（Schulz(1979)Principles of Protein Structure, Springer-Verlag）。この方法で定義されたアミノ酸群の例として、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓを含む「荷電／極性群」；Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐを含む「芳香族または環状群」ならびにＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＣｙｓを含む「脂肪族群」を挙げることができる。各群内に、亜群も同定され得る。例えば、荷電／極性アミノ酸の群は、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓを含む「正電荷を有する亜群」；ＧｌｕおよびＡｓｐを含む「負電荷を有する亜群」およびＡｓｎおよびＧｌｎを含む「極性亜群」を含む亜群に細分され得る。別の例では、芳香族または環状群は、Ｐｒｏ、ＨｉｓおよびＴｒｐを含む「窒素環亜群」ならびにＰｈｅおよびＴｙｒを含む「フェニル亜群」を含む亜群に細分され得る。別のさらなる例では、脂肪族群は、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅを含む「大きな脂肪族の非極性亜群」；Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＣｙｓを含む「脂肪族のわずかに極性の亜群」ならびにＧｌｙおよびＡｌａを含む「小さい残基の亜群」を含む亜群に細分され得る。保存的な突然変異の例として、それだけには限らないが：正電荷が維持され得るようなＬｙｓのＡｒｇとの、または逆も同様；負電荷が維持され得るようなＧｌｕのＡｓｐとの、または逆も同様；遊離−ＯＨが維持され得るようなＳｅｒのＴｈｒとの、または逆も同様；および遊離−ＮＨ２が維持され得るようなＧｌｎのＡｓｎとの、または逆も同様といった上記の亜群内のアミノ酸のアミノ酸置換が挙げられる。「保存的変異体」とは、参照ポリペプチド（例えば、配列が刊行物または配列データベースにおいて開示されているか、または配列が核酸シークエンシングによって決定されているポリペプチド）の１個または複数のアミノ酸を、共通の特性を有する、例えば、上記で描写されたような同一アミノ酸群または亜群に属するアミノ酸と置き換えるよう置換されている１個または複数のアミノ酸を含むポリペプチドである。
【００５５】
本明細書において、「発現」は、少なくともＲＮＡ産生のレベルでの遺伝子の発現を含み、「発現生成物」は、得られた生成物、例えば、ポリペプチドまたは発現された遺伝子の機能的ＲＮＡ（例えば、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイムなど）を含む。用語「増大された発現」は、ｍＲＮＡ産生の増大および／またはポリペプチド発現の増大を促進するための遺伝子発現における変更を含む。「増大された産生」は、天然産生またはポリペプチドの酵素活性と比較される、ポリペプチド発現の量における増大、ポリペプチドの酵素活性のレベルにおける増大、または両方の組合せを含む。
【００５６】
用語「分泌された」とは、本発明の組換え微生物または方法によって製造されたポリペプチドまたは脂肪酸生成物の、細胞膜周辺腔または細胞外環境への移動を含む。「増大された分泌」は、例えば、天然に存在する分泌のレベルと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％または少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれ以上である、天然に存在する分泌量を超える分泌を含む。
【００５７】
微生物における遺伝子の発現に影響を及ぼすために、微生物または宿主細胞内へ特定の核酸分子または特定のポリヌクレオチド配列が、「挿入」例えば、付加、組込み、取り込みまたは導入される、微生物を操作する態様が、本明細書において含まれる。例えば、対象の微生物は、プロモーターなどの発現制御配列とともに、またはともなわずに対象の特定の遺伝子を特定のゲノム遺伝子座に挿入するか、またはプロモーターを宿主微生物の遺伝子座中に挿入して、遺伝子座での特定の遺伝子または遺伝子のセットの発現に影響を及ぼすための部位指定相同組換えによって操作され得る。
【００５８】
本発明のさらなる態様は、特定のポリヌクレオチド配列の発現の部分的な、実質的なまたは完全な欠失、サイレンシング、不活化または下方調節を含む。遺伝子は、部分的に、実質的に、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化され得るか、またはその発現は、コードするポリペプチドによって実施される活性、例えば、酵素の活性に影響を及ぼすよう下方調節され得る。遺伝子は、遺伝子の機能および／または発現を破壊する核酸配列の挿入（例えば、ウイルス挿入、トランスポゾン突然変異誘発、メガヌクレアーゼ操作、相同組換えまたは当技術分野で公知のその他の方法）によって、部分的に、実質的にまたは完全に欠失、サイレンシング、不活化または下方調節され得る。用語「排除する」、「排除」および「ノックアウト」は、用語「「欠失」、「部分欠失」、「実質的な欠失」または「完全な欠失」と同義的に使用され得る。特定の実施形態では、対象の微生物は、対象の特定の遺伝子をノックアウトするための部位指定相同組換えによって操作され得る。さらにその他の実施形態では、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＤＮＡ（ａｓＤＮＡ）構築物は、対象の特定の遺伝子を部分的に、実質的にまたは完全にサイレンシングする、不活化するまたは下方調節するために使用され得る。
【００５９】
特定の核酸分子または特定のポリヌクレオチド配列のこれらの挿入、欠失またはその他の修飾は、「遺伝子修飾（複数可）」または「形質転換（複数可）」を包含すると理解され得、その結果、微生物または宿主細胞の得られた株が「遺伝的に修飾される」または「形質転換される」と理解され得る。
【００６０】
本明細書において、「上方調節された」または「上方調節」は、対象の遺伝子または核酸分子の発現または酵素の活性の増大、例えば、上方調節されていない、そうでなければ同一である遺伝子または酵素における発現または活性と比較した、遺伝子発現または酵素活性の増大を含む。
【００６１】
本明細書において、「下方調節された」または「下方調節」は、対象の遺伝子または核酸分子の発現または酵素の活性の低減、例えば、下方調節されていない、そうでなければ同一である遺伝子または酵素における発現または活性と比較した、遺伝子発現または酵素活性の低減を含む。
【００６２】
用語「Ｐｆａｍ」とは、Ｐｆａｍ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって維持され、ｐｆａｍ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／（Ｗｅｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ、Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ｐｆａｍ．ｓｂｃ．ｓｕ．ｓｅ／（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）；ｐｆａｍ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇ／（Ｊａｎｅｌｉａ  Ｆａｒｍ、Ｈｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ｐｆａｍ．ｊｏｕｙ．ｉｎｒａ．ｆｒ／（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ａｇｒｏｎｏｍｉｑｕｅ）；およびｐｆａｍ．ｃｃｂｂ．ｒｅ．ｋｒを含めた、いくつかの資金提供を受けたワールドワイドウェブサイトで利用可能な、タンパク質ドメインおよびタンパク質ファミリーの多くの収集物を指す。Ｐｆａｍの最新リリースは、ＵｎｉＰｒｏｔタンパク質データベースリリース１５．６、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔリリース５７．６およびＴｒＥＭＢＬリリース４０．６の混合物をベースとするＰｆａｍ  ２６．０（２０１１年１１月）である。Ｐｆａｍドメインおよびファミリーは、多重配列アラインメントおよび隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を使用して同定される。Ｐｆａｍ−Ａファミリーまたはドメイン割り当ては、タンパク質ファミリーの代表的なメンバーを使用する精選されたシードアラインメントによって作製される高品質割り当てであり、シードアラインメントに基づいて隠れマルコフモデルをプロファイルする（特に断りのない限り、Ｐｆａｍドメインまたはファミリーに対するクエリーされたタンパク質のマッチは、Ｐｆａｍ−Ａマッチである）。次いで、ファミリーに属するすべての同定された配列を使用して、ファミリーの全アラインメントを自動的に作製する（Sonnhammer(1998年)Nucleic Acids Research 26、320〜322頁；Bateman(2000年) Nucleic Acids Research 26、263〜266頁；Bateman(2004年) Nucleic Acids Research 32、Database Issue、D138〜D141頁；Finn(2006年) Nucleic Acid Research Database Issue 34、D247〜251頁；Finn(2010年) Nucleic Acids Research Database Issue 38、D211〜222頁）。例えば、上記の参考ウェブサイトのいずれかを使用してＰｆａｍデータベースにアクセスすることによって、ＨＭＭＥＲ相同性検索ソフトウェア（例えば、ＨＭＭＥＲ２、ＨＭＭＥＲ３またはより高いバージョン、ｈｍｍｅｒ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇ／）を使用して、タンパク質配列をＨＭＭに対してクエリーできる。クエリーされたタンパク質を、ｐｆａｍファミリーにあると（または特定のＰｆａｍドメインを有すると）同定する有意なマッチは、ビットスコアがＰｆａｍドメインの収集閾値以上であるものである。期待値（ｅ値）も、クエリーされたタンパク質をＰｆａｍ中に含めるための、またはクエリーされたタンパク質が特定のＰｆａｍドメインを有するかどうかを決定するための基準として使用され得、低いｅ値（１．０よりもかなり低い、例えば、０．１未満または０．０１以下）は、マッチが機会によるものであるという低い可能性を表す。
【００６３】
本明細書において、「長い鎖長の」脂肪酸またはアシル−ＡＣＰとは、１４個超の炭素の鎖長を有する脂肪酸またはアシル−ＡＣＰであり、「中程度の鎖長」の脂肪酸またはアシル−ＡＣＰは、８〜１４個の炭素の鎖長を有する脂肪酸またはアシル−ＡＣＰである。
【００６４】
「基質選択性」とは、酵素が最も活性である基質（単数または複数）を指す。例えば、異なるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、異なる程度の鎖長特異性を有し得、ＡＣＰから特定の長さの脂肪酸を切断するための酵素の「選択性」と呼ばれることもあり、チオエステラーゼは、通常、１種または複数のその他の鎖長の脂肪酸の切断においてはより少ない活性を有しながら、特定の鎖長の脂肪酸の切断において最も活性である。
【００６５】
本明細書において、用語「脂肪酸生成物」は、遊離脂肪酸、モノ−、ジ−またはトリグリセリド、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸エステル（それだけには限らないが、ワックスエステルを含む）および炭水化物（それだけには限らないが、アルカンおよびアルケンを含む）を含む。
【００６６】
本明細書において同義的に使用されるような「繁殖速度」または「複製速度」は、所与の培養物の倍加時間を測定することによって微生物において一般に測定される。微生物の繁殖速度を測定する方法は当技術分野で周知である。例えば、繁殖（細胞数の増大）または増殖（細胞数の増大ならびに細胞の大きさおよび／または細胞内容物の増大）の速度を測定するために、光学濃度（ＯＤ）測定値が期間にわたってとられ得る。あるいは、懸濁液中の微生物の濃度は、血球算定器または同様の装置を使用して、所与の容量の培養物中の細胞の濃度が決定され得る。種々の時間で複数のデータ点を取ることによって、培養物中の細胞の繁殖または複製速度を評価できる。一定時間にわたる培養密度の増大（例えば、ＯＤによって測定される）は、繁殖および／または増殖を示す。
【００６７】
脂肪酸生成物を産生するための代謝経路
本明細書において開示される組換え微生物によって産生される脂質は、遊離脂肪酸を含めた脂肪酸生成物ならびに限定するものではないが、モノ、ジまたはトリグリセリド；脂肪アルデヒド；脂肪アルコール；脂肪酸エステル（それだけには限らないが、ワックスエステルを含む）および炭水化物（それだけには限らないが、アルカンおよびアルケンを含む）を含めた、脂肪酸から誘導され、および／または細胞によって産生される脂肪酸のアシル鎖を組み込む生成物であり得る。脂肪酸生合成経路は、原核生物において、また真核生物の藻類および高等植物の葉緑体において高度に保存されており、中心代謝生成物アセチル−ＣｏＡから出発する。脂肪酸生合成は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）によって触媒されるアセチル−ＣｏＡのマロニル−ＣｏＡへの変換によって開始される。次いで、マロニル−ＣｏＡは、マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼ（大腸菌（E. coli）におけるＦａｂＤ）によって触媒されて、マロニル−ＡＣＰに変換される。次いで、マロニル−ＡＣＰが、酵素複合体脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）によって触媒されて、アシル−ＡＣＰに変換される。脂肪酸シンターゼ複合体は、まず、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩＩ（例えば、大腸菌（E. coli）のＦａｂＨ）によって触媒されて、マロニル−ＡＣＰをアセチル−ＡＣＰとともに縮合することによる伸長サイクルを開始する。ＦａｂＨ反応によって形成されるβ−ケトアシル−ＡＣＰ（３−ケトアシル−ＡＣＰ）は、３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ（例えば、ＦａｂＧ）によってβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ（３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ）に還元される。次いで、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰが、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素（例えば、ＦａｂＡ、ＦａｂＺ）によって作用されて、トランス−２−エノイル−ＡＣＰを形成し、これが、順に、エノイル−ＡＣＰレダクターゼ（例えば、ＦａｂＩ、ＦａｂＫ、ＦａｂＬ）によって還元されて、２炭素伸長されたアシル−ＡＣＰ生成物を形成する。その後のサイクルは、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩまたはＩＩ（例えば、ＦａｂＢまたはＦａｂＦ）によって触媒されるマロニル−ＡＣＰのアシル−ＡＣＰとの縮合によって開始される。縮合、還元、脱水および還元のサイクルが反復され、各サイクルは、アシル鎖が、トランスアシラーゼによって別の分子（例えば、グリセロール３−リン酸）に移されるか、葉緑体におけるＦａｔＡまたはＦａｔＢなどのチオエステラーゼによってＡＣＰから切断されて、遊離脂肪酸を形成するまで、マロニル−ＡＣＰから２個の炭素を付加する。
【００６８】
植物葉緑体とは異なり、ラン藻類は、遊離脂肪酸を産生せず、大腸菌（E. coli）およびその他の従属栄養細菌とは異なり、ラン藻類は、アシル−ＣｏＡを産生しない（Kaczmarzyk and Fulda(2010年) Plant Physiol. 152:1598〜1610頁）。アシル鎖がアシルキャリアタンパク質に共有結合によって結合される脂肪酸伸長後に、ラン藻類のアシルトランスフェラーゼは、アシル鎖をグリセロール骨格に移し、膜脂質を製造する。
【００６９】
それだけには限らないが、ラン藻などの微生物において遊離脂肪酸を製造するために、それだけには限らないが、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼをコードする遺伝子またはヒドロキシベンゾイルチオエステラーゼをコードする遺伝子などの外因性または組換えチオエステラーゼ遺伝子を発現させてもよい。微生物において脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、ワックスエステル、アルカンまたはアルケンなどの脂肪酸誘導体を製造するために、アシル−チオエステル中間体（例えば、アシル−ＣｏＡまたはアシル−ＡＣＰ）を所望の最終生成物（例えば、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケンまたはワックスエステル）に変換するための１種または複数の酵素を、所望により、チオエステラーゼをコードする外因性または組換え遺伝子、所望により、アシル−ＣｏＡシンセターゼをコードする外因性遺伝子と組み合わせて宿主細胞中に導入してもよい。例えば、脂肪アルデヒドおよび／またはアルカンが、所望の最終生成物である場合は、アルデヒド形成性脂肪アルデヒドレダクターゼ（例えば、アルデヒド形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼ、１．２．１．４２または１．２．１．５０；米国特許第６，１４３，５３８号も参照のこと）をコードする遺伝子を導入して、アシル−ＣｏＡを脂肪アルデヒドに還元してもよく；さらに、またはあるいは、アルデヒド形成性アシル−ＡＣＰレダクターゼ（例えば、ＷＯ２００９／１４０６９６またはＷＯ２０１１／０６６１３７に開示されるような）またはカルボン酸レダクターゼ遺伝子（例えば、ＷＯ２０１０／１３５６２４およびＷＯ２０１０／０４２６６４を参照のこと）を導入して、遊離脂肪酸を脂肪アルデヒドに還元してもよい。あるいは、またはさらに、脂肪アルコールオキシダーゼ（例えば、１．１．３．２０）または脂肪アルコール脱水素酵素（例えば、１．１．１．１６４）をコードする遺伝子を導入して、脂肪アルコールを脂肪アルデヒドに変換してもよい。脂肪アルデヒドは、所望により、脂肪アルデヒドデカルボニラーゼをコードする遺伝子（例えば、４．１．９９．５）の導入によって、アルカンにさらに処理してもよい。脂肪アルコール、アルケンおよび／またはワックスエステルが、所望の最終生成物である場合には、アルコール形成性脂肪酸アシルレダクターゼをコードする遺伝子（例えば、アルコール形成アシル−ＣｏＡレダクターゼ、１．２．１．５０）を宿主細胞に導入してもよい。さらに、脂肪アルデヒドレダクターゼ遺伝子を導入して、脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに還元してもよい。脂肪アルコールを、脂肪アルコール脱水酵素をコードする１種または複数の遺伝子の導入によって、アルケンにさらに処理してもよい。ワックスエステルを含めた脂肪酸エステルは、アルコールの脂肪酸アシルチオエステルとの縮合を触媒するポリペプチド、例えば、アシルトランスフェラーゼおよびワックスシンターゼをコードする遺伝子を導入することによって形成され得る。
【００７０】
いくつかの例では、アシル−ＡＣＰの脂肪アルコールへの変換は、脂肪アルデヒドの合成によって起こり得、宿主細胞において発現されたアシルレダクターゼ（例えば、アルデヒド形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼまたはアルデヒド形成性アシル−ＡＣＰレダクターゼ）は、まず、アシル−ＡＣＰを脂肪アルデヒドに還元する。例えば、特定の実施形態では、宿主細胞は、内因性脂肪アルデヒド形成性レダクターゼを過剰発現するように操作され得る（例えば、脂肪アルデヒド形成性レダクターゼ遺伝子の付近にプロモーターおよび／またはエンハンサー転写制御エレメントを挿入することによって）。その他の実施形態では、宿主細胞は、外因性脂肪アルデヒド形成性レダクターゼを発現するように操作され得る。宿主細胞は、脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに還元する脂肪アルデヒドレダクターゼまたはアルコール脱水素酵素をコードする外因性遺伝子をさらに含み得る。
【００７１】
ワックスエステルは、ワックスエステルシンターゼをコードする遺伝子を導入して、脂肪アルコールの脂肪酸アシルチオエステルとの縮合を触媒することによって形成され得る。ワックスエステルシンターゼは、例えば、クラスＥＣ２．３．１．２６（長鎖アルコールＯ−脂肪アシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．３．１．２０（ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．３．１．５１（アシルトランスフェラーゼ）または２．３．１．７５（ワックスエステルシンターゼ／アシル−ＣｏＡジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ）の酵素であり得る。
【００７２】
例えば、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリドおよびトリアシルグリセリド（「ＴＡＧ」）などのグリセロ脂質の製造には、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む本明細書に開示されるような組換え微生物は、それだけには限らないが、グリセロールリン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）またはジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）を含めたグリセロ脂質の製造に関与する酵素をコードする非天然遺伝子をさらに含み得る。
【００７３】
脱水素酵素
本発明は、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み、少なくとも１種の脂肪酸生成物を産生する組換え微生物を提供する。例えば、本明細書に開示される組換え微生物は、脱水素酵素をコードする核酸配列を含む単離核酸分子を用いて形質転換されてもよい。あるいは、またはさらに、組換え微生物は、脱水素酵素をコードする内因性核酸配列を含み得、内因性脱水素酵素遺伝子の発現を調節するために少なくとも１種の調節配列が微生物のゲノム中に挿入されている。さらに、微生物は、１種または複数の外因性遺伝子を用いて形質転換され得、および／または脂肪酸生成物などの脂質の製造に関与する１種または複数の内因性遺伝子を過剰発現するように操作され得る。
【００７４】
本明細書において開示される組換え微生物において発現され得る脱水素酵素として、制限するものではないが、アルデヒド脱水素酵素（アルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．３）、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．１６）、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．２７）、ラクトアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．２２）、ベンズアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．２８）、非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．９）、ＮＡＤＰ依存性（リン酸化）グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．１３）、δ−１−ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素（ＥＣ１．５．１．１２）、アセトアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ：１．５．１．１０）およびグルタミン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ：１．５．１．４１）を含む）、２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（例えば、イソクエン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、コハク酸脱水素酵素、αケトグルタル酸脱水素酵素）、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、例えば、Ｄ−２−ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、Ｄ−グリセリン酸脱水素酵素、バンコマイシン耐性タンパク質Ｈ、Ｄ−２−ホスホグリセリン酸脱水素酵素およびＤ−乳酸脱水素酵素（１．１．１．２８））、リンゴ酸酵素（１．１．１．４０）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（１．１．１．４９）、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（１．１．１．４３、１．１．１．４４）、グルタミン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素およびソルビトール脱水素酵素が挙げられる。種々の例では、本発明の微生物中に導入される、または過剰発現される非天然遺伝子によってコードされる脱水素酵素は、アルコール脱水素酵素ではない。さらなる例では、本発明の微生物中に導入される、または過剰発現される非天然遺伝子によってコードされる脱水素酵素は、ピルビン酸脱水素酵素またはリン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．１２）ではない場合がある。脱水素酵素の活性のアッセイは、当技術分野で周知である（例えば、Wynnら(1997年) Lipids 32:605〜610頁；Graupnerら(2000年)J. Bacteriol. 182:3688〜3692頁；Berrios-Riveraら(2002年) Metabolic Engineering 4:217〜229頁；Shinodaら(2005年)J. Biol. Chem. 280:17068〜17075頁；DomenechおよびFerrer(2006年) Biochim. Biophys. Acta 1760:1667〜1674頁；LoおよびChen(2010年)Mol. Biotechnol 46:157〜167頁）。
【００７５】
ＮＡＤＨを生じる脱水素酵素も、本発明の方法および微生物において使用するために考慮されるが、ＮＡＤＰＨを生成する脱水素酵素が特に興味深い。例えば、ＮＡＤＨは、宿主細胞にとって天然であり得るＮＡＤＰＨ−ＮＡＤ＋トランスヒドロゲナーゼと呼ばれることもあるＮＡＤＰＨ：ＮＡＤ＋酸化還元酵素（Ｂ特異的）の活性によって、細胞においてＮＡＤＰＨに変換され得るか（例えば、ＵＳ２００５／０１９６８６６を参照のこと）またはＮＡＤＰＨ−ＮＡＤ＋トランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、宿主微生物中に導入されてもよい。
【００７６】
ＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨに還元しながらリンゴ酸のピルビン酸への不可逆的脱炭酸を触媒する、リンゴ酸脱水素酵素（オキサロ酢酸脱炭酸化）（ＮＡＤＰ（＋））またはＮＡＤＰ−リンゴ酸酵素としても知られるリンゴ酸酵素（ＥＣ１．１．１．４０）が、非天然遺伝子の発現によって組換え宿主細胞において産生され得る脱水素酵素の一例である。リンゴ酸酵素をコードする非天然遺伝子は、任意の生物から誘導されるものであり得、宿主微生物に関して異種であっても、同種であってもよい。本明細書に開示されるような微生物において非天然遺伝子によってコードされ得るリンゴ酸酵素の限定されない例として、１９．２のギャザリングカットオフよりも大きなビットスコアを有する、Ｐｆａｍ  ＰＦ００３９０（リンゴ酸酵素、Ｎ末端ドメイン）に入る、および／または２３．５のギャザリングカットオフよりも高いビットスコアを有する、Ｐｆａｍ  ＰＦ０３９４９（リンゴ酸酵素ＮＡＤ結合ドメイン）に入るポリペプチドが挙げられる。リンゴ酸酵素の結晶構造は、Yangら（Protein Sci. 11: 332〜341頁(2002年)）によって報告されている。リンゴ酸酵素の限定されない例として、ムコール・サーシネロイデス（Mucor circinelloides）（ＡＢＭ４５９３３、ＡＡＯ２６０５３．１）、タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）（ＸＰ＿００２２９０５５０）、ファエオダクチルム・トリコルヌツム（Phaeodactylum tricornutum）（ＸＰ＿００２１７７８９０）、オストレオコッカス・ルシマリヌス（Ostreococcus lucimarinus）（ＸＰ＿００１４２０８４９）、リシナス・コムニス（Ricinus communis）（ＸＰ＿００２５２６５０７）、オリザ・サティバ（Oryza sativa）（ＮＰ＿００１０６４９９８）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（ＡＥＥ３６２９４）、クロレラ・バリアビリス（Chlorella variabilis）（ＥＦＮ５３６６２）、ヒト（Homo sapiens）（ＮＰ＿００２３８６）、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）（ＸＰ＿００１６９６２４０）、シネコシスティス属（Synechocystis）種ＰＣＣ６８０３（ＢＡＡ１６６６３）、ミクロシスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）（ＹＰ＿００１６５５８００）および「ノストック・アゾラエ（Nostoc azollae）」（ＹＰ＿００３７２０９４４）に由来するものが挙げられる。制限するものではないが、本明細書において提供される微生物において非天然遺伝子によってコードされるリンゴ酸酵素は、これらのリンゴ酸酵素または配列データベースに列挙されるようなその他のもの、その保存的変異体ならびにそのＮ末端および／またはＣ末端切断型または修飾された変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドであり得る。例えば、本明細書に提供される組換え微生物は、リンゴ酸酵素として同定されるポリペプチドに対して、またはその活性断片に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含み得る。
【００７７】
グルコース−６リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．４９）は、本明細書において提供されるような微生物における非天然遺伝子の発現によって製造され得るペントースリン酸経路のＮＡＤＰＨ生成性酵素である。グルコース−６リン酸をコードする遺伝子は、植物、動物または真菌、不等毛藻、藻類、細菌もしくはラン藻を含めた微生物から誘導されるものであり得る。例えば、脱水素酵素は、２１．７のギャザリングカットオフよりも大きなビットスコアを有する、Ｐｆａｍ  ＰＦ００４７９「グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＮＡＤ結合ドメイン」に入る、および／または１９．５のギャザリングカットオフよりも大きなビットスコアを有する、Ｐｆａｍ、ＰＦ０２７８１「グルコース−６−リン酸脱水素酵素、Ｃ末端ドメイン」に入るポリペプチドであり得る。本明細書において提供されるような微生物によって発現され得るグルコース−６−リン酸脱水素酵素の限定されない例として、シネコシスティス属（Synechocystis）種ＰＣＣ６８０３（ＢＡＡ１７４５１）、シネココッカス属（Synechococcus）種ＢＬ１０７（ＺＰ＿０１４６８２９７）、プロクロロコッカス・マリナス（Prochlorococcus marinus）株ＡＳ９６０１（ＹＰ＿００１００９５７１）、リングビア属（Lyngbya）種ＰＣＣ８１０６（ＺＰ＿０１６２０４１４）、タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）ＣＣＭＰ１３３５（ＥＥＤ９２５５０）、ミクロモナス属（Micromonas）種ＲＣＣ２９９（ＸＰ＿００２５０８５０５）；オストレオコッカス・タウリ（Ostreococcus tauri）（ＸＰ＿００３０７９５７３）、グリシン・マックス（Glycine max）（ＸＰ＿００３５３３０３２）、ブドウ（Vitis vinifera）（ＸＰ＿００２２６６９３０）、イネ（Oryza sativa Japonica Group）（ＡＡＱ０２６７１）、ハツカネズミ（Mus musculus）（ＮＰ＿０００３９３；ＮＰ＿０３２０８８）およびヒト（Homo sapiens）（ＮＰ＿０００３９３）のグルコース−６−リン酸脱水素酵素が挙げられる。制限するものではないが、本明細書において提供される操作された微生物において非天然遺伝子から発現され得るグルコース−６−リン酸脱水素酵素は、その保存的変異体を含めた、これらのグルコース−６−リン酸脱水素酵素または配列データベースに列挙されるようなその他のものに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するグルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであり得、そのＮ末端および／またはＣ末端切断型または修飾された変異体であり得る。例えば、本明細書において提供されたような組換え微生物は、グルコース−６−リン酸脱水素酵素として同定されるポリペプチドに対して、またはその活性断片に対して少なくとも９５％の同一性を有するグルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。
【００７８】
ペントースリン酸経路の別のＮＡＤＰＨ生成酵素として、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素がある。本明細書において「ホスホグルコン酸脱水素酵素」または「６−ホスホグルコン酸脱水素酵素」（ＥＣ１．１．１．４３またはＥＣ１．１．１．４４）は、ＮＡＤＰ＋の存在下でのリブロース−５−リン酸への６−ホスホグルコン酸の脱炭酸還元を触媒する酵素を指す。触媒作用の結果として、ＮＡＤＰ＋は、ＮＡＤＰＨに還元される。本発明は、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および好ましくは、脂質の製造のためのタンパク質をコードする少なくとも１種のさらなる遺伝子を含む組換え微生物を含む。本発明の組換え微生物によって発現される６−ホスホグルコン酸脱水素酵素は、植物、動物または真菌、不等毛藻、藻類、細菌またはラン藻を含めた微生物に由来するものであり得る。本明細書において開示されるように、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子の発現は、宿主微生物による脂肪酸生合成を増強し得る。本明細書において開示される微生物および方法において有用であり得るホスホグルコン酸脱水素酵素として、Ｐｆａｍ  ＰＦ０３４４６「６−ホスホグルコン酸脱水素酵素のＮＡＤ結合ドメイン」（ギャザリングカットオフ２１．０）に入る、好ましくは、Ｐｆａｍ  ＰＦ００３９３「６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、Ｃ末端ドメイン」（ギャザリングカットオフ２０．４）に入る６−ホスホグルコン酸脱水素酵素が挙げられる。６−ホスホグルコン酸脱水素酵素の結晶構造は公開されている（例えば、Adamsら(1994年)Structure 2:651〜658頁）。本明細書において提供されるような操作された微生物において非天然遺伝子によってコードされ得るホスホグルコン酸脱水素酵素の例として、それだけには限らないが、シネコシスティス属（Synechocystis）種ＰＣＣ６８０３（ＢＡＡ１０１０５）、シアノセイス属（Cyanothece）種ＰＣＣ７８２２（ＡＤＮ１４９７２）、ノストック・アゾラエ（Nostoc azollae）０７０８（ＡＤＩ６３５６６）、シネココッカス属（Synechococcus）種ＰＣＣ７００２（ＹＰ＿００１７３３４９０）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（ＡＥＤ９４７０５）、グリシン・マックス（Glycine max）（ＢＡＡ２２８１２）、ヨーロッパアカマツ（Pinus sylvestris）（ＡＤＰ０３０６０）、カイコ（Bombyx mori）（ｇｂ  ＤＡＡ２１２８３）、ウシ（Bos taurus）（ＤＡＡ２１２８３）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（ＡＡＡ５３６３７）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）ＮＩＨ２６２４（ＥＡＵ３３６１２）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）ＳＰ−ＢＳ２９３（ＥＦＬ６９８４１）、大腸菌（Escherichia coli）（ＡＡＧ３５２３７）の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素およびその変異体が挙げられる。さらに、またはあるいは、本明細書において開示されるような微生物は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３またはその活性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む６−ホスホグルコン酸脱水素酵素をコ���ドする非天然遺伝子を含み得る。配列番号１０のポリペプチドに対して相同性を有するアミノ酸配列を有する６−ホスホグルコン酸脱水素酵素の限定されない例として、カルノバクテリウム属（Carnobacterium）種ＡＴ７（ＺＰ＿０２１８５８９４）の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、アナエロコッカス・バギナリス（Anaerococcus vaginalis）ＡＴＣＣ５１１７０の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（ＺＰ＿０５４７３３９８）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（ＺＰ＿０５６４６９１２）およびクロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素様タンパク質ＮＣＩＭＢ８０５２（ＹＰ＿００１３０９３１５）が挙げられる。配列番号１３のポリペプチドに対して相同性を有するアミノ酸配列を有する６−ホスホグルコン酸脱水素酵素の限定されない例として、シアノセイス属（Cyanothece）種ＰＣＣ８８０１（ＹＰ＿００２３７２４３５）、ミクロシスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）ＮＩＥＳ−８４３（ＹＰ＿００１６５６５３６）、シネココッカス属（Synechococcus）種ＰＣＣ７００２（ＹＰ＿００１７３３４９０）、アルスロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）株パラカ（Paraca）（ＺＰ＿０６３８３６３２）、ノストック属（Nostoc）種ＰＣＣ７１２０（ＮＰ＿４８９３１５）、オシラトリア属（Oscillatoria）種ＰＣＣ６５０６（ＺＰ＿０７１１０１６８）およびサーモシネココッカス・エロンガツス（ThermoSynechococcus elongatus）ＢＰ−１（ＮＰ＿６８１３６６）の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素が挙げられる。制限するものではないが、本明細書において提供される操作された微生物において非天然遺伝子から発現され得る６−ホスホグルコン酸脱水素酵素は、同定されるホスホグルコン酸脱水素酵素のその保存的変異体を含めて、またＮ末端および／またはＣ末端切断型または修飾された変異体を含めて、上記で言及されたホスホグルコン酸脱水素酵素または刊行物もしくは配列データベースにおいて列挙されるようなその他のものに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有するホスホグルコン酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであり得る。いくつかの例では、本発明において有用な核酸分子は、本明細書において提供されるような、または配列データベースにおいて同定される６−ホスホグルコン酸脱水素酵素またはそのＮ末端および／もしくはＣ末端切断型変異体（例えば、参照酵素の葉緑体輸送ペプチドを欠く、あるいは、参照酵素には存在しない付加された葉緑体輸送ペプチドを有する６−ホスホグルコン酸脱水素酵素）、その保存的変異体またはその修飾された変異体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する６−ホスホグルコン酸脱水素酵素をコードし得る。
【００７９】
実施例において実証されるように、組換え微生物による脂質産生を改善するために、アルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子もまた、本発明の組換え微生物において発現され得る。「アルデヒド脱水素酵素」とは、本明細書において、アルデヒドのカルボン酸への酸化を触媒する酵素を指す。本明細書において開示される微生物および方法において有用なアルデヒド脱水素酵素として、Ｐｆａｍ  ＰＦ００１７１「アルデヒド脱水素酵素ファミリー」（ギャザリングカットオフ２３．０）に入るアルデヒド脱水素酵素が挙げられ、ＥＣ１．２．１．３のアルデヒド脱水素酵素、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．１６）、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．２７）、ラクトアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．２２）、ベンズアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．２８）、非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．９）、ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．１３）、δ−１−ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素（ＥＣ１．５．１．１２）、アセトアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ：１．５．１．１０）およびグルタミン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ：１．５．１．４１）が挙げられる。アルデヒド基質は、例えば、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、イソバレルアルデヒド、ベンズアルデヒド、グリセルアルデヒド−３−リン酸または別のアルデヒドであり得る。アルデヒド脱水素酵素の結晶構造の一例は、Di Costanzoら(2007年) J. Mol. Biol. 366:481〜493頁に提供される。本発明の微生物および方法において有用なアルデヒド脱水素酵素は、ＮＡＤＰ＋を補因子として使用できるアルデヒド脱水素酵素であり得る（例えば、LoおよびChen(2010年) Mol Biotechnol 46:157〜167頁）。アルデヒド脱水素酵素の限定されない例として、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）（ＹＰ＿０８９９３７）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）ＳＩＣ１（ＹＰ＿６８８８２３）、大腸菌（E. coli）（ＮＰ＿２８７８８８）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（ＮＰ＿０１５２６４）、ヒト（Homo sapiens）（ＮＰ＿０００６８０）、ハツカネズミ（Mus musculus）（ＡＡＢ３２７５４）のアルデヒド脱水素酵素ならびにストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）（Ｑ５９９３１）、トウモロコシ（Zea mays）（ＮＰ＿００１１０５５８９）およびエンドウマメ（Pisum sativum）（Ｐ８１４０６）のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（deydrogenase）が挙げられる。さらに、またはあるいは、アルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む本明細書において開示されるような微生物は、配列番号４、配列番号６または配列番号７に対して、またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし得る。配列番号４、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列に対して相同性を有するアルデヒド脱水素酵素の例として、制限するものではないが、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）ベルリナー（berliner）血清型（ＺＰ＿０４１１０１１０８）；バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）ＩＢＬ２００（ＺＰ＿０４０７０８７９）；バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）ＩＢＬ４２２２（ＺＰ＿０４０６４２０１）；バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）クルスタキ（kurstaki）血清型（ＺＰ＿０４１１３８６３）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０８７６（ＺＰ＿０４３１６４８２）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）ヒュアゾンゲンシス（huazhongensis）血清型（ＺＰ＿０４０８３４４５）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）（ＺＰ＿０３２２８８０８）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）１７２５６０Ｗ（ＺＰ＿０４３０５１６４）、バチルス・サイトトキシカス（Bacillus cytotoxicus）ＮＶＨ３９１−９８（ＹＰ＿００１３７４３２７）；バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＷＳＨ−００２（ＡＥＮ８９９９０）；バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）Ｒｏｃｋ３−１７（ＺＰ＿０４１５６１２７）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）ＡＨ６２１（ＺＰ＿０４２９３９７７）およびバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）株アル・ハカム（Al Hakam）（ＹＰ＿８９４００９）のアルデヒド脱水素酵素を含めた、バチルス属（Bacillus）種に由来するアルデヒド脱水素酵素が挙げられる。制限するものではないが、本明細書において提供される操作された微生物において非天然遺伝子から発現され得るアルデヒド脱水素酵素は、同定されたアルデヒド脱水素酵素の保存的変異体を含めて、またＮ末端および／またはＣ末端切断型または修飾された変異体を含めて、上記で言及されたアルデヒド脱水素酵素のいずれかまたは刊行物もしくは配列データベースにおいて列挙されたその他のものまたはその活性断片に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、アルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドであり得る。いくつかの例では、本発明において有用な核酸分子は、本明細書において提供されるような、または配列データベースにおいて同定されるアルデヒド脱水素酵素またはそのＮ末端および／またはＣ末端切断型変異体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアルデヒド脱水素酵素をコードし得る。
【００８０】
いくつかの例では、宿主微生物中に導入されたか、または過剰発現される遺伝子によってコードされるアルデヒド脱水素酵素は、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．２７）であり得る。メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素の結晶構造は、Dubourgら(2004年) Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr. 60:1435〜1437頁において見られる。メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素の限定されない例として、ラット（Rattus norvegicus）（ＡＡＡ４１６３８）；シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）（ＡＡＡ２５８９１）；ヒト（Homo sapiens）（ＣＡＢ７６４６８）；ゲオバチルス・サーモグルコシダシウス（Geobacillus thermoglucosidasius）Ｃ５６−ＹＳ９３（ＹＰ＿００４５８８３３３）；ハンセニエラ属（Hanseniella）種「Ｈａｎ２」（ＡＣＹ４５２９８）；タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）（ＸＰ＿００３６０８３７２）；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（ＡＥＣ０６２８６）；アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）６０１４０５９（ＺＰ＿０８４４２９６０）；およびロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）ＰＲ４（ＢＡＨ３４６６３）のメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素が挙げられる。あるいは、またはさらに、アルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む、本明細書に開示されるような微生物は、配列番号１８または配列番号１９に対して、またはその活性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードし得る。配列番号１８または配列番号１９に対して相同性を有するメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素の限定されない例として、バチルス・アトロファエウス（Bacillus atrophaeus）１９４２（ＹＰ＿００３９７５４２６；ＡＤＰ３４４９５）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＡＴＣＣ１４５８０（ＹＰ＿０８１３２３；ＡＡＵ２５６８５）、パエニバチルス・デンドリティフォルミス（Paenibacillus dendritiformis）Ｃ４５４（ＺＰ＿０９６７６６３６）、パエニバチルス・テラエ（Paenibacillus terrae）ＨＰＬ−００３（ＹＰ＿００５０７５５４６；ＡＥＴ５９３２３）、バチルス・クラウシー（bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６（ＹＰ＿１７３９２５；ＢＡＤ６２９６４）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）ＦＳＬ  Ｆ２−２０８（ＥＦＲ８５８２７）、リステリア・マーシー（Listeria marthii）ＦＳＬ  Ｓ４−１２０（ＺＰ＿０７８６９６５７；ＥＦＲ８８８４７）およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）ＬＡＡ１（ＺＰ＿０３４９５１８１；ＥＥＤ０６１２５）のメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素が挙げられる。制限するものではないが、本明細書において提供されるような操作された微生物において非天然遺伝子によってコードされるアルデヒド脱水素酵素は、これらのメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素のいずれかまたは配列データベースにおいて列挙されたその他のもの、その保存的変異体ならびにそのＮ末端および／ま��はＣ末端切断型または修飾された変異体に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドであり得る。例えば、本発明において有用な核酸分子は、本明細書において列挙されるようなポリペプチドに対して、または刊行物もしくは配列データベースにおいて同定される別のアルデヒド脱水素酵素に対して、またはその活性断片に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有するメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードし得る。
【００８１】
本明細書において開示されるような微生物は、あるいは、またはさらに、非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．２．１．９）である、ＮＡＤＰ＋を必要とするグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（非リン酸化）と呼ばれることもあるアルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の結晶構造は、Lorentzenら(2004年)J. Mol. Biol. 341:815〜828頁に提供されている。本明細書において提供されるような微生物において組換え核酸分子によってコードされ得る非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の限定されない例として、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（ＮＰ＿１８０００４）、クロレラ・バリアビリス（Chlorella variabilis）（ＥＦＮ５０６３７）、グリシン・マックス（Glycine max）（ＸＰ＿００３５４９５５０）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）（ＸＰ＿００３５７４５４０）、モロコシ（Sorghum bicolor）（ＸＰ＿００２４４４４１６）、トウモロコシ（Zea mays）（ＡＣＦ８４５７５）、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）（ＸＰ＿００１７５３７８４）、オストレオコッカス・ルシマリヌス（Ostreococcus lucimarinus）（ＸＰ＿００１４１８４４５）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）（ＺＰ＿０４１９６０２２．１）およびイヌカタヒバ（Selaginella moellendorffii）（ＸＰ＿００２９８１５８７．１）から誘導されるものが挙げられる。制限するものではないが、本明細書において提供されるような操作された微生物において非天然遺伝子によってコードされる非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素は、その保存的変異体を含めた、またそのＮ末端および／またはＣ末端切断型または修飾された変異体を含めた、これらの非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素のいずれかまたは配列データベースにおいて列挙されるようなその他のものに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであり得る。例えば、本発明において有用な核酸分子は、本明細書において提供されるようなポリペプチドまたはそのＮ末端および／またはＣ末端切断型または修飾された変異体に対して、または配列表もしくはデータベースにおいて同定される別の非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素に対して、またはその活性断片に対して、少なくとも８５％または少なくとも９０％の配列同一性を有する非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素をコードし得る。いくつかの場合には、本発明において有用な核酸分子は、本明細書において提供され、配列表もしくはデータベースにおいて同定されるようなポリペプチドに対して、少なくとも９５％の配列同一性を有するアルデヒド脱水素酵素をコードする。
【００８２】
本明細書において提供されるような組換え微生物における非天然遺伝子の発現によって製造され得るさらに別の種類の脱水素酵素として、例えば、Ｄ−２−ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、Ｄ−グリセリン酸脱水素酵素、バンコマイシン耐性タンパク質Ｈ、Ｄ−２−ホスホグリセリン酸脱水素酵素またはＤ−乳酸脱水素酵素などのＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素）がある。「Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素」とは、本明細書において、α−ヒドロキシカルボン酸のα−ケトカルボン酸への、例えば、乳酸化合物のピルビン酸化合物への酸化を触媒する酵素を指す。このプロセスでは、ＮＡＤ（Ｐ）＋が、還元されて、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生じる。多数のＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が、ＮＡＤ＋を補因子として好むが、その他のものがＮＡＤＰ＋を補因子として使用することがわかっている（DomenechおよびFerrer(2006年)Biochim Biophys Acta1760:1667〜1674頁）。Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素の結晶構造の一例を、Denglerら(1997年)J. Mol. Biol 267:640〜660頁に見出すことができる。本明細書において開示される微生物および方法において有用なＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素として、Ｐｆａｍ  ＰＦ０２８２６「Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素ファミリー」（ギャザリングカットオフ２５．１）に入るＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が挙げられる。Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素の限定されない例として、ハロフェラックス・メディテラネイ（Haloferax mediterranei）（ＡＢＢ３０００４）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）（ＡＡＢ０５６２６）、ハロアーキュラ・マリスモルツイ（Haloarcula marismortui）ＡＴＣＣ４３０４９（ＡＡＶ４７４６７）、バチルス属（Bacillus）種２  Ａ  ５７  ＣＴ２（ＺＰ＿０８００８４１２）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）ＭＧＡＳ２０９６（ＡＢＦ３６０１５．１）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）亜種プランタルム（plantarum）ＮＣ８（ＥＨＳ８１９８７．１）、スタフィロコッカス・アウレウス（staphylococcus aureus）亜種アウレウス（aureus）Ｓ０３８５（ＣＡＱ５０９９０．１）、リゾビウム・レグミノサルム（Rhizobium leguminosarum）次亜種トリフォリ（trifolii）ＷＳＭ２３０４（ＡＣＩ５７７６６．１）、ノストック・パンクチフォルメ（Nostoc punctiforme）ＡＴＣＣ２９１３３（ＹＰ＿００１８６９１２５）、ミクロモナス属（Micromonas）種ＲＣＣ２９９（ＡＣＯ７０３６５）、ファエオダクチルム・トリコルヌツム（Phaeodactylum tricornutum）ＣＣＡＰ１０５５／１（ＸＰ＿００２１８３６７５）、オストレオコッカス・タウリ（Ostreococcus tauri）（ＸＰ＿００３０８１９９２）およびネッタイシマカ（Aedes aegypti）（ＥＡＴ４３１２１）のＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素ならびにアカパンカビ（Neurospora crassa）（ＣＡＣ１８２５）のギ酸脱水素酵素が挙げられる。あるいは、またはさらに、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む本明細書において開示されるような微生物は、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５または配列番号１６に対して、またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含み得る。例えば、配列番号２または配列番号２９に対して、少なくとも少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、配列番号２または配列番号２９に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列などを含む、脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が本明細書において提供される。あるいは、本明細書において提供されるような核酸分子は、配列番号１５または配列番号１６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【００８３】
配列番号２または配列番号２９に対して相同性を有するＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素の限定されない例として、ポリモーフム・ギルバム（Polymorphum gilvum）ＳＬ００３Ｂ−２６Ａ１（ＹＰ＿００４３０２７０２）、スタッピア・アグレガタ（Stappia aggregata）ＩＡＭ  １２６１４（ＺＰ＿０１５４５６６６；ＥＡＶ４５５９５）、マリノモナス属（Marinomonas）種ＭＷＹＬ１（ＹＰ＿００１３４２１３３、ＡＢＲ７２１９８）、ラブレンジア・アレクサンドリー（Labrenzia alexandrii）ＤＦＬ−１１（ＺＰ＿０５１１５５８４、ＥＥＥ４６１８３）；デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）ＳＰＨ−１（ＹＰ＿００１５６６６４９、ＡＢＸ３８２６４）、バークホルデリア属（Burkholderia）種ＣＣＧＥ１００１（ＹＰ＿００４２３０８６１；ＡＤＸ５７８０１）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）ＡＴＣＣ１７０２９（ＹＰ＿００１０４４９５９；ＡＢＮ７８１８７）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）ＡＴＣＣ１７０２５（ＹＰ＿００１１６８２５１；ＡＢＰ７０９４６）；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）ＷＳ８Ｎ（ＺＰ＿０８４１５４１９；ＥＧＪ２０２１５）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）ＫＤ１３１（ＹＰ＿００２５２０５４１；ＡＣＭ０３４６８）およびバークホルデリア属（Burkholderia）種Ｃｈｌ−１（ＺＰ＿０６８３９７４３；ＥＦＧ７２５７３）のＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が挙げられる。制限するものではないが、本明細書において提供されるような操作された微生物において非天然遺伝子によってコードされるＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素は、その保存的変異体ならびにそのＮ末端および／またはＣ末端切断型または修飾された変異体を含めた、これらの非リン酸化Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素のいずれかまたは配列データベースにおいて列挙されるその他のものに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであり得る。例えば、本発明において有用な核酸分子は、配列番号２、配列番号２９に対して、または本明細書において列挙されたポリペプチドに対して、少なくとも８５％または少なくとも９０％の配列同一性を有するか、または刊行物もしくは配列データベースにおいて同定される別のＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素に対して、もしくはその活性断片に対して、少なくとも８５％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードし得る。いくつかの例では、本発明において有用な核酸分子は、本明細書において提供されるような、または配列データベースにおいて同定されるポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードし得る。いくつかの例では、本発明において有用な核酸分子は、配列番号２または配列番号２９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードし得る。
【００８４】
本明細書における組換え微生物および方法において有用なさらなるＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素として、配列番号１５または配列番号１６に対して相同性を有するもの、例えば、それだけには限らないが、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）ＮＣＩＭＢ  ８０５２（ＹＰ＿００１３０９３１６）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２（ＺＰ＿０５６４８１９９）；エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ＡＴＣＣ１２７５５（ＺＰ＿０８１４５０１１）、カルノバクテリウム属（Carnobacterium）種ＡＴ７（ＺＰ＿０２１８５８９３）およびエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）Ｅ１６３６（ＺＰ＿０６６９５３４５）のＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が挙げられる。制限するものではないが、本明細書において提供されるような操作された微生物において非天然遺伝子によってコードされるＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素は、その保存的変異体ならびにそのＮ末端および／またはＣ末端切断型または修飾された変異体を含めた、これらの非リン酸化Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素のいずれかまたは刊行物もしくは配列データベースにおいて列挙されるようなその他のものに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであり得る。例えば、本発明において有用な核酸分子は、配列番号１５、配列番号１６に対して、または配列表またはデータベースにおいて同定される別のＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素に対して、またはその活性断片に対して少なくとも８５％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードし得る。いくつかの例では、本発明において有用な核酸分子は、本明細書において提供されるような、または配列データベースにおいて同定されるポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードし得る。いくつかの例では、本発明において有用な核酸分子は、配列番号１５または配列番号１６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードし得る。
【００８５】
あるいは、またはさらに、イソクエン酸脱水素酵素遺伝子は、本明細書において提供されるような組換え微生物において発現され得る。本発明の微生物によって発現され得るイソクエン酸脱水素酵素の例として、制限するものではないが、カンジダツス・レジエラ・インセクチコラ（Candidatus Regiella insecticola）ＬＳＲ１（ＥＦＬ９２７９４）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）ＣＤＣ１５５１（ＡＡＫ４７７８６）；ブラッタバクテリウム属（Blattabacterium）種（クリプトセルクス・プンクトゥラトゥス（Cryptocercus punctulatus））株Ｃｐｕ（ＡＥＵ０９３１７）、トレポネーマ・アゾトニュートリシウム（Treponema azotonutricium）ＺＡＳ−９（ＡＥＦ８０１４２）、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス（Staphylococcus pseudintermedius）ＥＤ９９（ＡＤＸ７６３７９）、パエニバチルス・ポリミクサ（Paenibacillus polymyxa）Ｅ６８１（ＡＤＭ６９４２６）、大腸菌（Escherichia coli）ＩＨＥ３０３４（ＡＤＥ９１７９４）、アシジチオバチルス・フェロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）ＡＴＣＣ２３２７０（ＡＣＫ８０９５６）、コクシエラ・ブルネッティ（Coxiella burnetii）ＲＳＡ３３１（ＡＢＸ７８６６９）、バークホルデリア・シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei）１１０６ａ（ＡＢＯ０５９６６）、バークホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）ＮＣＴＣ１０２４７（ＡＢＯ０５９６６）、バークホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）ＮＣＴＣ１０２２９（ＡＢＮ０２９３５）、バークホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）ＳＡＶＰ１（ＡＢＭ５２８０３）、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）１０４（ＡＢＫ６６７７１）およびエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）亜種ハイドフィラ（hydrophila）ＡＴＣＣ７９６６（ＡＢＫ３８３６８）のイソクエン酸脱水素酵素が挙げられる。いくつかの例では、本発明において有用な核酸分子は、その保存的変異体ならびにそのＮ末端および／またはＣ末端切断型または修飾された変異体を含めた、本明細書において提供されるような、配列データベースにおいて同定されるポリペプチドに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するイソクエン酸脱水素酵素をコードし得る。
【００８６】
非天然核酸分子によってコードされ得るグルタミン酸脱水素酵素として、限定されない例として、カエノセファルス・アセラツス（Chaenocephalus aceratus）（Ｐ８２２６４）、ウシ（Bos taurus）（ＮＰ８７２５９３）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（ＮＰ＿１９７３１８）、タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）（ＸＰ＿００３６１８９７２）、クロレラ・バリアビリス（Chlorella variabilis）（ＥＦＮ５７９４３）、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）（ＸＰ＿００１７０２２７０）、ロドピレルラ・バルティカ（Rhodopirellula baltica）ＳＨ  １（ＮＰ＿８６７５３８）クテドノバクター・ラセミファー（Ktedonobacter racemifer）ＤＳＭ  ４４９６３（ＺＰ＿０６９６７７３８）またはロゼイフレクサス属（Roseiflexus）種ＲＳ−１（ＹＰ＿００１２７６０６２）のグルタミン酸脱水素酵素、あるいは、その保存的変異体および／またはそのＮ末端および／またはＣ末端切断型または修飾された変異体を含めた、本明細書において提供される、もしくは配列データベースにおいて同定されるポリペプチドに対して、少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有するグルタミン酸脱水素酵素を挙げることができる。
【００８７】
微生物および宿主細胞
本発明は、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を発現する組換え微生物を提供し、組換え微生物は、脂質を産生し、脱水素酵素を発現する組換え微生物の培養物は、対照培養物の微生物が脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含まない点を除いて、脱水素酵素を発現する微生物の培養物と同一である対照培養物が製造するよりも多量の脂質を製造する。組換え微生物は、例えば、脂肪酸、脂肪酸誘導体および／またはグリセロ脂質の製造のための酵素をコードする非天然遺伝子などの、脂質の製造のための少なくとも１種のさらなる非天然遺伝子をさらに含み得る。いくつかの例では、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質の合成に関与するポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含む微生物は、対照微生物が脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含まない点を除いて、非天然脱水素酵素遺伝子および脂質の製造に関与するポリペプチドをコードする非天然遺伝子を発現する微生物に対してすべての点で同一である対照微生物が有するよりも高い繁殖および／または増殖速度を有する。例えば、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質（例えば、脂肪酸生成物）合成物の製造のためのポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含む本明細書において開示されるような組換え微生物の培養物は、３、４、５、６日または７日以上の培養後に、対照微生物が脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含まない点を除いて、非天然脱水素酵素遺伝子および脂質の製造に関与するポリペプチドをコードする非天然遺伝子を発現する微生物とすべての点において同一である対照微生物によって達せられる細胞密度よりも高い細胞密度に達し得る。例えば、非天然脱水素酵素遺伝子および脂質の製造に関与するポリペプチドをコードする非天然遺伝子を発現する組換え微生物の培養は、脂質、例えば、脂肪酸生成物が製造される培養条件下で、非天然脱水素酵素遺伝子を欠く微生物の対照培養物よりも高い細胞密度に達し得る。脂肪酸生成物は、宿主微生物によって天然に製造されない（すなわち、脂質の製造に関与する非天然遺伝子を欠く宿主微生物によって製造されない）脂質であり得る。
【００８８】
本発明の組換え微生物または宿主細胞は、制限するものではないが、真菌、不等毛藻、藻類、真正細菌、古細菌、緑色非硫黄細菌、紅色非硫黄細菌またはラン藻類を含めた原核生物または真核生物起源のものであり得る。組換え宿主細胞は、それだけには限らないが、光合成生物であり得る。光合成生物として、高等植物（すなわち、維管束植物）、コケ植物、藻類および光合成細菌が挙げられる。用語「藻類」は、ラン藻類（ラン藻綱（Cyanophyceae））、緑色藻類（緑藻綱（Chlorophyceae））、黄緑色藻類（黄緑藻綱（Xanthophyceae））、黄金色藻類（黄金藻綱（Chrysophyceae））、褐色藻類（褐藻綱（Phaeophyceae））、赤色藻類（紅藻綱（Rhodophyceae））、珪藻類（珪藻綱（Bacillariophyceae））および「ピコプランクトン」（プラシノ藻綱（Prasinophyceae）および真正眼点藻綱（Eustigmatophyceae））を含む。また、用語藻類には、分類学的綱、渦鞭毛藻綱（Dinophyceae）、クリプト藻綱（Cryptophyceae）、ユーグレナ藻綱（Euglenophyceae）、灰色藻綱（Glaucophyceae）およびプリムネシウム藻綱（Prymnesiophyceae）のメンバーも含まれる。微細藻類は、顕微鏡を用いてのみ、単一生物として見られ得る単細胞藻類またはコロニー藻類である。微細藻類は、真核生物および原核生物藻類（例えば、ラン藻類）の両方を含む。
【００８９】
本明細書において使用するための藻類は、制限するものではないが、微細藻類、例えばそれだけには限らないが、アクナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォラ属（Amphora）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Asteromonas）、ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオコッカス属（Botryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス属（Chaetoceros）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロロコッカム属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（Chlorella）、クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、クリコスファエラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、クリプトモナス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモスファエラ属（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（Euglena）、フランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサムニオン属（Gloeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属（Halocafeteria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、レポシンクリス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィジウム属（Monoraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（Nannochloropsis）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロクロリス属（Nephrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzschia）、オクロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイスティス属（Oocystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova）、パラクロレラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラム属（Phaeodactylum）、ファガス（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラチモナス属（Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス属（Pleurococcus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、シュードネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）、ピロボトリス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、シゾクラミデラ属（Schizochlamydella）、スケレトネマ属（Skeletonema）、スピロギラ属（Spyrogyra）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラクロレラ属（Tetrachlorella）、テトラセルミス属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viridiella）またはボルボックス属（Volvox）の種などを含む。例えば、宿主微生物は、珪藻類であり得、アンフォラ属（Amphora）、カエトセロス属（Chaetoceros）、シクロテラ属（Cyclotella）、フラギラリア属（Fragilaria）、ナビクラ属（Navicula）、ファエオダクチラム属（Phaeodactylum）またはタラシオシーラ属（Thalassiosira）からなる群から選択される属であり得る。あるいは、いくつかの例では、宿主株は、ナノクロロプシス属（Nannochloropsis）もしくはエリプソイドン属（Ellipsoidon）の種などのユースティグマトファイト属（eustigmatophyte）またはそれだけには限らないが、クロレラ属（Chlorella）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、��セネデスムス属（Scenedesmus）またはテトラセルミス属（Tetraselmis）の種などの緑色藻類であり得る。
【００９０】
あるいは、組換え微生物は、ラン藻類の種であり得る。今日までに、例えば、種々のアカリオクロリス属（Acaryochloris）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、ラン藻、シアノセイス属（Cyanothece）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ノストック属（Nostoc）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）およびサーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）の種のゲノムを含めた３０種を超えるラン藻ゲノムが完全に配列決定されており、例えば、ラン藻類レプトリンビア属（Leptolyngbya）種の株ＢＬ０９０２、アナバエナ属（Anabaena）（ノストック属(Nostoc)）種ＰＣＣ７１２０、アナバエナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）ＡＴＣＣ２９４１３、ノストック・パンクチフォルメ（Nostoc punctiforme）ＡＴＣＣ２９１３３、ノストック属（Nostoc）種ＰＣＣ７４２２、シネコシスティス属（Synechocystis）種ＰＣＣ６８０３、シネココッカス・エロンガツス（Synechococcus elongatus）ＰＣＣ７９４２、シネココッカス・エロンガツス（Synechococcus elongatus）ＰＣＣ７００２などを含めた、多数のラン藻の種が分子生物学の技術を使用して操作されている（Tatonら(2012年)PLoS One Vol.7、Iss. 1 e30910；Ruffing(2011年) Bioengineered Bugs 2:136〜149頁）。本明細書において提供される組換え微生物は、限定されない例として、以下の属のラン藻類:アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロカプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カマエシフォン属（Chamaesiphon）、クロコッカス属（Chroococcus）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロコッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナリウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（Cyanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シアノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シリンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsis）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミエラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオセイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iyengariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノストック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillatoria）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プレウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieria）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、トリコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）またはゼノコッカス属（Xenococcus）のいずれかのものであり得る。例えば、組換え光合成微生物は、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）またはサーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）種であり得る。あるいは、組換え光合成微生物は、シアノビウム属（Cyanobium）、シアノセイス属（Cyanothece）またはシアノバクテリウム属（Cyanobacterium）の種であり得るか、さらにあるいは、組換え光合成微生物は、グロエオバクター属（Gloeobacter）、リンビア属（Lyngbya）またはレプトリンビア属（Leptolyngbya）の種であり得る。
【００９１】
組換え微生物は、本明細書において開示される任意の脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。いくつかの例では、微生物は、ＮＡＤＰＨ生成性脱水素酵素、例えば、ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（非リン酸化）（ＥＣ１．２．１．９）、リンゴ酸酵素、イソクエン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素または６−ホスホグルコン酸脱水素酵素などをコードする非天然遺伝子を発現する。あるいは、またはさらに、組換え微生物は、アルデヒド脱水素酵素、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素またはＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードする遺伝子を発現し得る。特定の例では、本明細書において提供されるような組換え微生物は、異種プロモーターに作動可能に連結された、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２または配列番号２９のアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む非天然核酸分子を含み得る。
【００９２】
例えば、組換え微生物は、グルコース−６−リン酸脱水素酵素または６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、例えば、本明細書において開示される任意のものなどといったペントースリン酸経路の脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。６−ホスホグルコン酸脱水素酵素は、原核生物または真核生物の任意の生物から誘導されるものであり得、例えば、宿主微生物と同一種に由来し得、非天然遺伝子は、内因性６−ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを遺伝子操作することによって過剰発現される、導入された遺伝子または内因性遺伝子であり得る。あるいは、またはさらに、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素は、配列番号１０、配列番号１１に対して、またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。例えば、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素は、配列番号１０または配列番号１１に対して、またはその活性断片に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。あるいは、またはさらに、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素は、配列番号１３に対して、またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。例えば、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素は、配列番号１３に対して、またはその活性断片に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。宿主微生物は、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子に加えて、脂質生合成、例えば、脂肪酸生成物の合成に関与するポリペプチドをコードする少なくとも１種のさらなる非天然遺伝子をさらに含み得る。非天然６−ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子および非天然脂質生合成遺伝子を含む組換え宿主微生物の培養物は、対照微生物が、非天然６−ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子を含まない点を除いて、組換え宿主微生物とすべての点で同一である対照微生物の培養物によって製造されるものよりも多量の脂肪酸生成物を製造し得る。さらに、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂肪酸生成物の合成に関与するポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含む組換え宿主微生物は、高い繁殖および／または増殖速度を有し得、および／または脂肪酸生成物が製造されている培養条件下で対照微生物によって達せられ得るものよりも高い細胞密度に達し得る。特定の例では、組換え微生物の培養物によって多量に製造された脂質は、脂質製造のための非天然遺伝子の発現の不在下では微生物によって製造されない脂肪酸生成物である。
【００９３】
さらなる例では、組換え微生物は、それだけには限らないが、本明細書において開示される任意のものを含めた、アルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。アルデヒド脱水素酵素は、原核生物または真核生物の任意の生物から誘導されるものであり得、例えば、宿主微生物と同一種に由来し得、非天然遺伝子は、内因性アルデヒド脱水素酵素遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを遺伝子操作することによって過剰発現される導入された遺伝子または内因性遺伝子であり得る。種々の例示的な例では、アルデヒド脱水素酵素は、配列番号４、配列番号６または配列番号７に対して、またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。例えば、アルデヒド脱水素酵素は、配列番号４、配列番号６または配列番号７に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。アルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む宿主微生物は、脂質生合成、例えば、脂肪酸生成物の合成に関与するポリペプチドをコードするさらなる非天然遺伝子をさらに含み得る。非天然アルデヒド脱水素酵素遺伝子および非天然脂質生合成遺伝子を含む組換え宿主微生物の培養物は、対照微生物が、非天然アルデヒド脱水素酵素遺伝子を含まない点を除いて、組換え宿主微生物とすべての点において同一である対照微生物の培養物によって製造されるものよりも多量の脂肪酸生成物を製造し得る。さらに、アルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂肪酸生成物の合成に関与しているポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含む組換え宿主微生物は、高い繁殖および／または増殖速度を有し得、および／または脂肪酸生成物が製造されている培養条件下で対照微生物によって達せられるものよりも高い細胞密度に達し得る。特定の例では、組換え微生物によって多量に製造された脂質は、脂質製造のためのポリペプチドをコードする非天然遺伝子の発現の不在下では、微生物によって製造されない脂肪酸生成物である。
【００９４】
例えば、アルデヒド脱水素酵素は、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素であり得、宿主微生物は、それだけには限らないが、本明細書において開示される任意のものなどのメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。例えば、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素は、配列番号１８または配列番号１９に対して、またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの例では、宿主微生物は、配列番号１８または配列番号１９に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。
【００９５】
さらなる例では、組換え微生物は、それだけには限らないが、本明細書において開示される任意のものなどの、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素は、原核生物または真核生物の任意の生物から誘導されるものであり得、宿主微生物と同一種に由来し得、非天然遺伝子は、内因性Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを遺伝子操作することによって過剰発現される導入された遺伝子または内因性遺伝子であり得る。種々の例では、微生物は、配列番号２または配列番号２９に対して、またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む。例えば、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素は、配列番号２または配列番号２９に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。さらなる例では、微生物は、配列番号１５または配列番号１６に対して、またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む。例えば、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素は、配列番号１５または配列番号１６に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む宿主微生物は、脂質生合成、例えば、脂肪酸生成物の合成に関与しているポリペプチドをコードするさらなる非天然遺伝子をさらに含み得る。非天然Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素遺伝子および非天然脂質生合成遺伝子を含む組換え宿主微生物の培養物は、対照微生物が、非天然Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素遺伝子を含まない点を除いて、組換え宿主微生物とすべての点において同一である対照微生物の培養物によって製造されるものよりも多量の脂肪酸生成物を製造し得る。さらに、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂肪酸生成物の合成に関与しているポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含む組換え宿主微生物は、脂肪酸生成物が製造されている培養条件下で対照微生物によって達せられるものよりも高い繁殖および／または増殖速度を有し得、および／またはより高い細胞密度に達し得る。組換え微生物によって多量に製造された脂質は、いくつかの例では、脂質製造のためのポリペプチドをコードする非天然遺伝子の発現の不在下では、微生物によって製造されない脂肪酸生成物であり得る。
【００９６】
特定の限定されない例では、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および微生物によって普通は製造されない（例えば、脂肪酸生成物の製造に関与しているポリペプチドをコードする非天然遺伝子を用いて形質転換されていない場合には、宿主微生物として使用される微生物の種または株によって製造されない）脂肪酸生成物の製造に関与しているポリペプチドをコードするさらなる非天然遺伝子を含む組換え微生物は、組換え光合成微生物であり得、組換え光合成微生物の培養物は、対照培養物の組換え光合成微生物が、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含まないか、または発現しない点を除いて、すべての点で同一である対照培養物によって製造されるものよりも多量の脂肪酸生成物を製造する。例えば、宿主微生物は、例えば、遊離脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸アルキルエステル）またはワックスエステルを天然に製造しない真核生物微細藻類の一種であり得、脱水素酵素遺伝子および脂肪酸生成物の製造のための遺伝子を用いて形質転換された組換え宿主微生物は、遊離脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、アルケン、脂肪酸エステルまたはワックスステルのうち１種または複数を製造できる。あるいは、宿主微生物は、例えば、遊離脂肪酸、脂肪アルコール、アルカン、アルケン、脂肪酸エステル、ワックスエステルまたはトリグリセリドを天然には製造しないラン藻類の一種であり得、脱水素酵素遺伝子および脂肪酸生成物の製造のための遺伝子を用いて形質転換された組換え宿主微生物は、遊離脂肪酸、脂肪アルコール、アルカン、アルケン、脂肪酸エステル、ワックスエステルまたはトリグリセリドのうち１種または複数を製造できる。
【００９７】
好ましくは、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質の製造に関与しているポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含む光合成微生物の培養物は、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を欠く、そうでなければ同一である光合成微生物の培養物によって製造されるものよりも多量の脂肪酸生成物を製造する。例えば、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質の製造に関与しているポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含む光合成微生物の光独立栄養培養物は、好ましくは、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を欠く、そうでなければ同一である光合成微生物の光独立栄養培養物によって製造されるものよりも多量の脂肪酸生成物を製造できる。さらに、またはあるいは、組換え光合成微生物の培養物は、例えば、無機（非還元）炭素を、脂肪酸生成物の製造のための炭素供給源として使用して、光独立栄養条件下で脂質を製造しながら、高い細胞密度に達し得る。
【００９８】
脂肪酸生成物の製造のための遺伝子修飾
本明細書において提供されるような組換え微生物は、例えば、脂肪酸、脂肪酸誘導体（例えば、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、ワックスエステル、アルカンまたはアルケン）またはグリセロ脂質（例えば、トリグリセリド）などの脂質を製造するように操作され得る。例えば、組換え微生物は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、ヒドロキシベンゾイルチオエステラーゼ、脂質分解活性を有するポリペプチド、アシル−ＡＣＰレダクターゼ、アシル−ＣｏＡレダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、ワックスシンターゼ、デカルボニラーゼ、デカルボキシラーゼ、グリセロールリン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）またはジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）のうち１種または複数をコードする少なくとも１種の非天然遺伝子を含み得る。
【００９９】
種々の限定されない例示的な例では、非天然脱水素酵素遺伝子を含む組換え微生物は、例えば、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、ヒドロキシベンゾイルチオエステラーゼおよび遊離脂肪酸の製造のための、または脂肪酸から生成した脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、ワックスエステル、アルカンもしくはアルケンの製造のための脂質分解活性を有するポリペプチドのうち１種または複数を含み得る。組換え微生物は、例えば、本明細書において開示される任意のものなどアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、例えば、高等植物ＦａｔＢチオエステラーゼなどをコードする非天然遺伝子を含み得る。例示的実施例では、微生物は、タバコソウ属（Cuphea）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼまたはその変異体をコードする非天然遺伝子、例えば、配列番号２１に記載のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを含み得る。組換え微生物は、微細藻類、例えば、ラン藻であり得る。
【０１００】
あるいは、またはさらに、非天然脱水素酵素遺伝子を含む組換え微生物は、脂肪アルデヒドの製造のために非天然アシルレダクターゼ遺伝子を、所望により、脂肪アルデヒドをアルカンに変換するデカルボニラーゼを含み得る。アルデヒド形成性アシルレダクターゼは、アシル−ＡＣＰレダクターゼまたはアシル−ＣｏＡレダクターゼであり得る。なおあるいは、またはさらに、非天然脱水素酵素遺伝子を含む組換え微生物は、脂肪アルコールの製造のためのアシルレダクターゼ遺伝子を、所望により、脂肪アルコールをワックスエステルに変換するワックスシンターゼを含み得る。アルコール形成性アシルレダクターゼは、アシル−ＡＣＰレダクターゼまたはアシル−ＣｏＡレダクターゼであり得る。ワックスシンターゼは、所望により、アシル−ＡＣＰを基質として使用できるワックスシンターゼであり得る。組換え微生物は、アシル−ＣｏＡシンセターゼをさらに含み得るか、またはアシルレダクターゼおよび／またはワックスシンターゼまたはアシルトランスフェラーゼなどの酵素が、アシル−ＡＣＰを基質として使用できる例では、アシル−ＣｏＡシンセターゼをコードする非天然遺伝子を含まない場合もある。特定の例では、脂肪酸誘導体の製造のために使用される組換え微生物は、アシル−ＣｏＡシンセターゼまたはアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのいずれかをコードする遺伝子を天然には含まず、アシル−ＣｏＡシンセターゼまたはアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのいずれかまたは両方をコードする外因性（すなわち、導入された）遺伝子をさらに含まない、ラン藻の一種である。
【０１０１】
あるいは、またはさらに、非天然脱水素酵素遺伝子を含む組換え微生物は、それだけには限らないが、ＤＧＡＴ、ＬＰＡＡＴまたはＧＰＡＴなどのアシルトランスフェラーゼをコードする非天然遺伝子を含み得、所望により、さらに、またはあるいは、ＰＡＰをコードする非天然遺伝子を含み得る。
【０１０２】
具体的には、それだけには限らないが、以下の例を含めた、コードされるポリペプチドが、酵素のクラスの活性を有する所与のクラスの既知または疑われる酵素に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列が、本明細書において開示される構築物および微生物において使用するために含まれる。例えば、チオエステラーゼ、リパーゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、アルデヒド形成性レダクターゼ、アルコール形成性レダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、デカルボニラーゼ、デカルボキシラーゼ、ワックスシンターゼ、アシルトランスフェラーゼまたは本明細書において提供される微生物および方法において有用な輸送体をコードする核酸配列は、同定されたチオエステラーゼ、リパーゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、アルデヒド形成性レダクターゼ、アルコール形成性レダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、デカルボニラーゼ、デカルボキシラーゼ、ワックスシンターゼまたはアシルトランスフェラーゼ、例えば、それだけには限らないが、本明細書において開示されたものを含めた、データベースにおいて注釈がつけられた配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有し得る。
【０１０３】
チオエステラーゼ
例えば、脱水素酵素をコードする１種または複数の組換え遺伝子の発現系に加えて、宿主微生物は、チオエステラーゼをコードする非天然遺伝子を含み得る。本明細書において、用語「チオエステラーゼ」は、チオエステル結合に作用して、脂肪酸放出できる加水分解酵素を含むものとする。宿主微生物は、遊離脂肪酸を製造できるか、またはチオエステラーゼによって放出された脂肪酸を、脂肪アルコールまたはワックスエステルなどのその他の生成物に変換できる。チオエステラーゼは、例えば、酵素番号３．１．２．２、３．１．２．１４、３．１．２．１８、３．１．２．１９、３．２．１．２０、３．１．２．２２、３．１．２．２３または３．１．２．２７に対応し得る。宿主微生物において発現される外因性チオエステラーゼは、例えば、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼまたはヒドロキシルベンゾイルチオエステラーゼであり得る。例えば、遊離脂肪酸の製造のための微生物は、いくつかの実施形態では、外因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子、例えば、Ｐｆａｍデータベースに対してクエリーされた場合に、２０．３（ＰＦ０１６４３のギャザリングカットオフ）以下のビットスコアを有するＰｆａｍ  ＰＦ０１６４３とのマッチを提供するポリペプチドをコードする遺伝子を用いて形質転換され得る。外因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子は、高等植物種に由来するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードし得る。高等植物から誘導されるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子として、制限するものではないが、タバコソウ属（Cuphea）の種（例えば、クフェア・カルタゲンシス（Cuphea carthagenensis）、クフェア・ライティー（Cuphea wrightii）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＣ４９７８４）、クフェア・ランケオラータ（Cuphea lanceolata）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＣＡＡ５４０６０）、クフェア・パルストリス（Cuphea palustris）、（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＣ４９７８３、ＡＡＣ４９１７９）、クフェア・フッケリアナ（Cuphea hookeriana）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＣ７２８８２、ＡＡＣ４９２６９、ＡＡＣ７２８８１、ＡＡＣ７２８８３）、クフェア・カロフィラ（Cuphea calophylla）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＢＢ７１５８０）に由来するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子または参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開ＵＳ２０１１／００２０８８３に開示される種々のタバコソウ属（Cuphea）の種の遺伝子）またはその他の高等植物種に由来する遺伝子を挙げることができる。さらなる例では、本明細書において開示される方法および培養物において使用される微生物は、それだけには限らないが、アラビドプシス（Arabidopsis）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＸＰ＿００２８８５６８１、ＮＰ＿１７２３２７）、ピーナッツ（Arachis hypogaea）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＢＯ３８５５６）、ブラシカ属（Brassica）種（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＣＡＡ５２０６９．１）、カメリア・オレイフェラ（Camellia oleifera）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＣＱ５７１８９）、シンナモナム・カンフォラム（Cinnamonum camphorum）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＣ４９１５１）、ココヤシ（Cocos nucifera）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＥＭ７２５１９、ＡＥＭ７２５２０、ＡＥＭ７２５２１）、グリシン・マックス（Glycine max）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＢＤ９１７２６）、ガルシニア・マンゴスターナ（Garcinia mangostana）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＢ５１５２５）、ワタ（Gossypium hirsutum）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＤ０１９８２）、ヘリアンサス・アヌス（Helianthus annuus）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＱ０８２２６）、ナンヨウアブラギリ（Jatropha curcas）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＢＵ９６７４４）、マカダミア・テトラフィラ（Macadamia tetraphylla）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＤＡ７９５２４）、アメリカアブラヤシ（Elaeis oleifera）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＭ０９５２４）、ギニアアブラヤシ（Elaeis guineensis）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＤ４２２２０）、イネ（Oryza sativa）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＢＡＡ８３５８２）、ポプラ（Populus tomentosa）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＢＣ４７３１１）、カリホルニアベイ（Umbellularia californica）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＣ４９００１）、アメリカニレ（Ulmus Americana）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＢ７１７３１）およびトウモロコシ（Zea mays）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＣＧ４１２９１）などの種に由来するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子またはすべて、その全文が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４５５，１６７号、同５，６５４，４９５号および同５，４５５，１６７号に、また米国特許出願公開第２００９／０２９８１４３号および同２０１１／００２０８８３号に開示される任意のものを含み得る。コケ類（コケ植物門（Bryophyta））、例えば、ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＸＰ００１７７０１０８）などに由来するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼもさらに含まれる。前記の例は、使用され得るアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の種類または特定の例に関して制限ではない。
【０１０４】
原核生物由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子がさらに含まれる。本明細書において提供される方法および培養物において有用な微生物によって発現され得る原核生物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの例示的な例として、それだけには限らないが、デスルホビブリオ・デスルフリカンス（Desulfovibrio desulfuricans）（例えば、Ｑ３１２Ｌ１）、エルシミクロビウム・ミヌトゥム（Elusimicrobium minutum）（例えば、ＡＣＣ９８７０５）、カルボキシドテルムス・ヒドロゲノフォルマンス（Carboxydothermus hydrogenoformans）（例えば、ＹＰ＿３５９６７０）、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）（例えば、ＹＰ＿００１０３９４６１）、ムーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）（例えば、ＹＰ＿４３１０３６）、ゲオバクター・メタリレデューセンス（Geobacter metallireducens）（例えば、ＹＰ＿３８４６８８）、サリニバクター・ルバー（Salinibacter ruber）（例えば、ＹＰ＿４４４２１０）、マイクロシーラ・マリナ（Microscilla marina）（例えば、ＥＡＹ２８４６４）、パラバクテロイデス・ディスタソニス（Parabacteroides distasonis）（例えば、ＹＰ＿００１３０３４２３）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）（例えば、ＺＰ＿０３９４９３９１）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）（例えば、ＹＰ＿００３０６２１７０）、ロイコノストック・メセントロイデス（Leuconostoc mesenteroides）（例えば、ＹＰ＿８１７７８３）、オエノコッカス・オエニ（Oenococcus oeni）（例えば、ＺＰ＿０１５４４０６９）、マイコバクテリア・スメグマティス（Mycobacterium smegmatis）（例えば、ABK74560）、マイコバクテリア・バンバーレニー（Mycobacterium vanbaalenii）（例えば、ＡＢＭ１１６３８）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）（例えば、ＺＰ＿０４３８５５０７）、ロドコッカス・オパクス（Rhodococcus opacus）（例えば、ＹＰ＿００２７７８８２５）に由来するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼまたは参照によりその全文が本明細書に組み込まれる２０１１年１２月３日に出願された、「Prokaryotic Acyl-ACP Thioesterases for Producing Fatty Acids in Genetically Engineered Microorganisms」と題された同時係属中の本発明の譲受人に譲渡された特許出願番号第１３／３２４，６２３号中に開示されるもののいずれかが挙げられる。
【０１０５】
さらなる例では、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼをコードする遺伝子は、脱水素酵素をコードする外因性核酸分子を含む宿主微生物中に導入され得る。遊離脂肪酸または脂肪酸誘導体の製造のために微生物中に形質転換されるアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ遺伝子は、植物、動物または微生物供給源に由来するものであり得る。例えば、大腸菌（E. coli）のＴｅｓＡまたはＴｅｓＢチオエステラーゼまたはその変異体、例えば、その全文が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／０７５４８３中に開示されるような変異体に制限されないものなどのアシル−ＣｏＡチオエステラーゼをコードする遺伝子が、微生物中に導入され得る。また、タンパク質ファミリーのＰｆａｍデータベースに対してクエリーされると、ビットスコアがギャザリングカットオフ（２０．７）以上である場合にＰｆａｍ  ＰＦ０２５５１（アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ）のメンバーとして同定されるタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。
【０１０６】
あるいは、またはさらに微生物は、外因性ヒドロキシベンゾイルチオエステラーゼ、例えば、外因性４−ヒドロキシベンゾイルチオエステラーゼまたは４−クロロベンゾエートチオエステラーゼをコードする１種または複数の遺伝子を含み得る。遊離脂肪酸を製造するために微生物において有用であり得るヒドロキシベンゾイルチオエステラーゼをコードする遺伝子として、例えば、２０１１年１２月１３日に出願され、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、「Genetically Engineered Microorganisms Comprising 4-Hydroxybenzoyl-CoA Tioesterases and Methods of Using Same for Producing Free Fatty Acids and Fatty Acid Derivatives」と題された同時係属中の、本発明の譲受人に譲渡された特許出願第１３／３２４，６０７号中に開示されるもの、バチルス属（Bacillus）種およびゲオバチルス属（Geobacillus）種に由来する４−ヒドロキシベンゾイルチオエステラーゼならびにアシディフィラム属（Acidiphilium）、バルトネラ属（Bartonella）、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）、マグネトスピリルム属（Magnetospirillum）、バークホルデリア属（Burkholderia）、グラヌリバクター属（Granulibacter）、リゾビウム属（Rhizobium）およびラブレンジア属（Labrenzia）の種などの４−ヒドロキシベンゾイルチオエステラーゼまたはその組合せを挙げることができる。
【０１０７】
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、通常、複数の異なるアシル鎖長を有するアシル−ＡＣＰ基質に対してある程度活性であり得る（例えば、基質選択を有する）が、特定のアシル鎖長を有する１種または複数のアシル−ＡＣＰ基質に対して、その他の鎖長の基質よりも高い活性を有し得る。例えば、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および／または２４個の炭素のアシル鎖長を有する１種または複数のアシル−ＡＣＰ基質に対して基質選択を有し得る。さらに、またはあるいは、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、１種または複数の、８から１８個の炭素、例えば、１２から１６個の炭素のアシル鎖長を有するアシル−ＡＣＰ基質を加水分解し得る。
【０１０８】
脂質分解活性を有するポリペプチド
本発明の組換え微生物または宿主細胞は、あるいは、またはチオエステラーゼをコードする非天然遺伝子に加えて、脂質分解活性を有する１種または複数のポリペプチドをコードする１種または複数の非天然遺伝子を含み得、脂質分解活性を有するポリペプチドは、膜脂質または貯蔵脂質、例えば、リン脂質、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロールなどまたはその組合せから遊離脂肪酸を製造できる。脂質分解活性を有するポリペプチドは、例えば、リパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼまたはアミダーゼであり得る。リパーゼは、それだけには限らないが、モノ、ジおよびトリアシルグリセロールならびにその組合せを含めたグリセロ脂質中のエステル結合の加水分解を触媒して、遊離脂肪酸およびアルコール放出する酵素である。
【０１０９】
遊離脂肪酸の製造のために微生物において脂質分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の使用は、２０１１年１２月１３日に出願され、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、「Production of Free Fatty Acids and Fatty Acid Derivatives by Recombinant Microorganisms Expressing Polypeptides Having Lipolytic Activity」と題された、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１３／３２４，６５３号に開示されている。脂質分解活性を有するポリペプチドは、例えば、グリセロ脂質（モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、ガラクト脂質などを含む）から脂肪酸を遊離するリパーゼであり得るか、またはアミダーゼであり得る。例えば、組換え微生物は、リパーゼ、それだけには限らないが、ＡＢ加水分解酵素Ｐｆａｍ一家（ＣＬ００２８）に属するＰｆａｍのメンバーであるリパーゼなどをコードする非天然遺伝子を含み得る。例えば、脂質分解活性を有するポリペプチドをコードする非天然遺伝子は、保存されたタンパク質ドメインＣＯＧ１０７５として同定されるＬｉｐＡドメインを含むか、またはタンパク質ファミリーＰｆａｍ  ＰＦ０１６７４（リパーゼ２）中に含まれるリパーゼ；保存されたタンパク質ドメインＣＯＧ３６７５として同定されるリパーゼ３ドメインを含むか、またはタンパク質ファミリーＰｆａｍ  ＰＦ０１７６４（リパーゼ３）中に含まれるリパーゼをコードする非天然核酸分子；タンパク質ファミリーＰｆａｍ  ＰＦ０７８１９（ＰＧＡＰ１）中に含まれるリパーゼをコードする非天然核酸分子；またはタンパク質ファミリーＰｆａｍ  ＰＦ０３５８３、Ｐｆａｍ  ＰＦ００１５１（リパーゼ）、Ｐｆａｍ  ＰＦ００５６１（Ａｂ加水分解酵素１）、Ｐｆａｍ  ＰＦ０２２３０（Ａｂ加水分解酵素２）、Ｐｆａｍ  ＰＦ０７８５９（Ａｂ加水分解酵素３）、Ｐｆａｍ  ＰＦ０８３８６（Ａｂ加水分解酵素４）、Ｐｆａｍ  ＰＦ１２６９５（Ａｂ加水分解酵素５）、Ｐｆａｍ  ＰＦ１２６９７（Ａｂ加水分解酵素６）、Ｐｆａｍ  ＰＦ１２７１５（Ａｂ加水分解酵素７）、Ｐｆａｍ  ＰＦ０４０８３（Ａｂヒドロリパーゼ）のいずれか中に含まれるポリペプチドをコードする非天然核酸分子をコードし得る。さらに、組換え微生物は、脂質分解活性を有するアミダーゼ、例えば、それだけには限らないが、２０．１のギャザリングカットオフよりも高いビットスコアを有するＰｆａｍ  ＰＦ０１４２５（アミダーゼ）に入り、脂肪酸の脂質からの放出を触媒できるアミダーゼなどをコードする非天然遺伝子を含み得る。
【０１１０】
さらに、またはあるいは、内因性リパーゼ遺伝子の発現を誘導または増大する遺伝子調節配列を含むように操作されている組換え微生物が考慮される。例えば、微生物は、異種プロモーターが内因性リパーゼ遺伝子のコーディング領域の上流に挿入されるように操作され得る。異種プロモーターは、例えば、相同組換えまたは部位指定組換えを使用して、内因性プロモーターを置換することもあり、および／または内因性リパーゼ遺伝子の発現を調節する内因性プロモーターの上流もしくは下流に挿入されてもよい。異種プロモーターは、内因性リパーゼ遺伝子の発現を増大する構成性プロモーターまたは誘導プロモーターであり得る。
【０１１１】
しかし、所望により、さらに、脂肪酸または脂肪酸誘導体の製造のためにチオエステラーゼをコードする外因性遺伝子を含むように操作された組換え微生物は、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする外因性遺伝子をさらに含み得、ＬＰＡＡＴは、チオエステラーゼのアシル−ＡＣＰ基質選択とは異なるチオエステラーゼアシル−ＡＣＰ基質選択を有する。あるいは、遺伝子操作されたラン藻であり得る遺伝子操作された微生物は、外因性チオエステラーゼ遺伝子の基質選択とは異なる基質選択を有する内因性ＬＰＡＡＴ遺伝子を過剰発現し得る。ＬＰＡＡＴ遺伝子の発現によって脂肪酸製造を増大するようラン藻類などの微生物を操作することは、２０１２年２月２４日に出願され、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、「Enhanced Production of Fatty Acids and Fatty Acid Derivatives by Recombinant Microorganism」と題された、同時係属中の、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１３／４０４，７１７１号に開示されている。
【０１１２】
アシル−ＣｏＡシンセターゼ
本発明の微生物および方法において使用される組換え核酸分子または単離核酸分子は、所望により、アシル−ＣｏＡシンセターゼをコードする核酸配列を含む場合があり、アシル−ＣｏＡシンセターゼは、チオエステラーゼまたはリパーゼによって生成した遊離脂肪酸を補酵素Ａとカップリングして、アシル−ＣｏＡを提供し得、これは、多数のレダクターゼ、ワックスシンターゼおよびアシルトランスフェラーゼの基質であり、アシルトランスフェラーゼは、アシル−ＣｏＡ基質を使用して、アルデヒド、アルコール、ワックスエステルおよびグリセロ脂質を生成し得る。アシル−ＣｏＡシンセターゼは、例えば、大腸菌（E. coli）（ＮＰ＿４１６２１６）のＦａｄＤ（ＮＰ＿４１６３１９）もしくはＦａｄＫまたは限定されない例として、ビブリオ・スプレンディダス（Vibrio splendidus）（ＥＧＵ４４２３０）もしくはマリノバクター・アドヘレンス（Marinobacter adhaerens）ＨＰ１５（ＡＤＰ９６８０３）のアシル−ＣｏＡシンセターゼを含めたその他の細菌種における相同体などの原核生物アシル−ＣｏＡシンセターゼであり得る。アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性を有するとわかっているか、有すると疑われる原核生物タンパク質のさらなる限定されない例として、それだけには限らないが、アシネトバクター属（Acinetobacter）種ＡＤＰ１  ｆａｄＤ（ＹＰ＿０４５０２４）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Haemophilus influenza）ＲｄＫＷ２０  ｆａｄＤ（ＮＰ＿４３８５５１）、バチルス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）Ｃ−１２５  ＢＨ３１０３  （ＮＰ＿２４３９６９）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）ｙｈＦｌ（ＮＰ＿３８８９０８）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）Ｐｆｏ−１  Ｐｆｌ−４３５４（ＹＰ＿３５００８２）、コマモナス・テストステローニ（Comamonas testosteroni）ＫＦ−１  ＥＡＶ１５０２３（ＺＰ＿０１５２００７２）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）ｆａｄＤ１（ＮＰ＿２５１９８９）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１  ｆａｄＤ２  （ＮＰ＿２５１９９０）、リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）ＣＦＮ４２  ｆａｄＤ（ＹＰ＿４６８０２６）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomo nas palustris）Ｂｉｓ  Ｂ１８  ＲＰＣ＿４０７４（ＹＰ＿５３３９１９）、ラルストニア・ソラナセラム（Rasltonia Solanacearum）ＧＭ１  １０００  ｆａｄＤ１（ＮＰ＿５２０９７８）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖ  ｆａｄＤＤ３５（ＮＰ＿２１７０２１）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖ  ｆａｄＤＤ２２（ＮＰ＿２１７４６４）およびステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomon as Maltophilia）Ｒ５５１−３  ＰＲＫ００５９（ＺＰ＿０１６４４８５７）が挙げられる。
【０１１３】
さらなる例では、アシル−ＣｏＡシンセターゼをコードする核酸配列は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アシル−ＣｏＡシンセターゼ（例えば、中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡシンセターゼＦａａ２ｐ（ＮＰ＿０１０９３１）またはＳＣＲＧ＿０４４８３アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＥＤＶ０８８４３）またはヤロウイア属（Yarrowia）脂質分解アシル−ＣｏＡシンセターゼ（例えば、ＣＡＧ７７８９２）などの真菌種から誘導されたアシル−ＣｏＡシンセターゼをコードし得る。本明細書において開示される構築物および微生物において使用され得るさらなるアシル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子として、植物のアシル−ＣｏＡシンセターゼ、例えば、セイヨウアブラナ（Brassica napus）（ＣＡＣ１９８７７）の長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼまたはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（ＡＥＥ７４３２４）の長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼまたはグリシン・マックス（Glycine max）（ＸＰ＿００３５２４９２０）のＹｎｇ−Ｉ様アシル−ＣｏＡシンセターゼおよび藻類種のアシル−ＣｏＡシンセターゼ、例えば、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）（ＸＰ＿００１６９３６９２）の長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼまたはナノクロロプシス・オクラータ（Nannochloropsis oculata）（例えば、ＡＤＰ０９３９１）またはクロレラ・バリアビリス（Chlorella variabilis）（例えば、ＥＦＮ５６５８８）のアシル−ＣｏＡシンセターゼなどが挙げられる。昆虫（例えば、ミツバチ（Apis mellifera）例えば、アシル−ＣｏＡシンセターゼファミリーメンバー２、ミトコンドリア前駆体、ＮＰ＿００１１９３９０２）およびハツカネズミ（Mus musculus）などの哺乳動物（例えば、「ＭＡＣＳ」アシル−ＣｏＡシンセターゼ、ＥＤＬ１７１７４）を含めた動物種のアシル−ＣｏＡシンセターゼがさらに考慮される。
【０１１４】
あるいは、本明細書において提供されるような組換え微生物は、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、チオエステラーゼおよび／またはリパーゼをコードする外因性または過剰発現される遺伝子を含まない場合もある。例えば、本明細書において提供されるような組換え微生物は、アシル−ＣｏＡ基質を利用することなく、または生成することなく１種または複数の脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、アルケンまたはワックスエステルを製造し得る。例えば、非アシル−ＣｏＡ基質を使用して脂肪アルコールおよびワックスエステルを製造する方法は、２０１２年９月２７日に出願され、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、「Production and Secretion of Fatty Acids and Fattty Acid Derivatives」と題された同時係属中の、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１３／８６０，４１７号に、また２０１２年３月６日に出願され、同様に参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、「Acyl-ACP Wax Ester Synthases」と題された、同時係属中の、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１３／４１３，４２６号に提供されている。
【０１１５】
アルデヒド生成性レダクターゼ
所望により、脂肪アルコール、ワックスエステルまたはアルカンなどの生成物にさらに変換され得る脂肪アルデヒドの製造のために、本明細書において提供されるようなトランスジェニック微生物は、例えば、アルデヒド形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼ、アルデヒド形成性アシル−ＡＣＰレダクターゼまたはカルボン酸レダクターゼなどのアルデヒド形成性レダクターゼをコードする外因性遺伝子を含み得る。脂肪アルデヒドを生成する既知アシル−ＣｏＡレダクターゼと相同であるタンパク質をコードすると予測されるＧｅｎＢａｎｋおよびその他の遺伝子データベースに列挙される遺伝子または遺伝子の一部は、本明細書において「アルデヒド生成性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ」と呼ばれ、それから製造される特定の脂肪アルデヒドまたは脂肪アルコールの製造について調べるために種々の微生物中に導入され得る。脂肪アルデヒド生成性アシル−ＣｏＡレダクターゼの限定されない例として、アシネトバクター・ベイリー（Acinetobacter baylyi）（ＡＡＣ４５２１７．１）のＡｃｒ１遺伝子、アシネトバクター属（Acinetobacter）種Ｍ−１のＡｃｒＭ−１遺伝子（ＹＰ００１０８６２１７）ならびに種々のフォトルミネッセンス細菌、例えば、アルテルモナス属（Altermonas）、フォトバクテリウム属（Photobacterium）、シュワネラ属（Shewanella）、ビブリオ属（Vibrio）またはゼノラブダス属（Xenorhabdus）の種のｌｕｘＣおよびｌｕｘＥ遺伝子が挙げられる。例えば、配列相同性またはタンパク質ドメインによって同定されるこれらのおよびその他の遺伝子によってコードされる酵素は、当技術分野で公知のアッセイを使用してその基質および生成物を調べるために試験され得る。
【０１１６】
いくつかの例では、宿主細胞は、それだけには限らないが、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１０／０２２１７９８（ＷＯ２００９／１４０６９６）に開示されるもののいずれかなどのアルデヒド形成性アシル−ＡＣＰレダクターゼをコードする非天然遺伝子を含み得る。例えば、組換え宿主細胞は、例えば、ＷＯ２００９／１４０６９６またはＷＯ２０１１／０６６１３７に開示されるようなアルデヒド形成性レダクターゼ、例えば、受託番号ＡＡＭ８２６４７；ＡＡＭ８２６４７；ＢＡＤ７８２４１；ＡＢＡ２２１４９；ＢＡＢ７６９８３；ＺＰ＿０３７６３６７４；ＡＣＬ４２７９１；ＺＰ＿０１６２８０９５；ＺＰ＿０１６１９５７４；ＹＰ＿００１８６５３２４；ＹＰ＿７２１９７８；ＮＰ＿６８２１０２；ＹＰ＿００１５１８３４１；ＹＰ＿００２３７１１０６；ＺＰ＿０５０２７１３６；ＺＰ＿０３２７３５５４；ＮＰ＿４４２１４６；ＺＰ＿０１７２８６２０；ＺＰ＿０５０３９１３５；ＹＰ＿００１８０２８４６；ＮＰ＿９２６０９１；ＹＰ＿００１６６０３２２；ＺＰ＿００５１６９２０；ＣＡＯ９０７８１；ＺＰ＿０１０８５３３７；ＹＰ＿００１２２７８４１；ＡＢＤ９６３２７；ＮＰ＿８９７８２８；ＹＰ＿００１２２４３７８；ＡＢＤ９６４８０；ＺＰ＿０１１２３２１５；ＡＢＢ９２２４９；ＺＰ＿０１０７９７７３；ＹＰ＿３７７６３６；ＮＰ＿８７４９２６；ＮＰ＿８９５０５８；ＡＢＤ９６２７４；ＡＢＤ９６４４２；ＺＰ＿０１４６９４６９；ＺＰ＿０５０４５０５２；ＹＰ＿００１０１４４１６；ＹＰ＿００１０１０９１３；ＹＰ＿３８１０５６；ＹＰ＿００１５５０４２１；ＮＰ＿８９２６５１；ＹＰ＿００１０９０７８３；ＺＰ＿０１４７２５９５；ＹＰ＿２９３０５５；ＺＰ＿０５１３８２４３；ＹＰ＿７３１１９２；ＹＰ＿００１４８３８１５；ＹＰ＿００１００８９８２；ＹＰ＿４７３８９６；ＹＰ＿４７８６３８；またはＹＰ＿３９７０３０を有するレダクターゼのいずれかなどに対して、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアルデヒド形成性アシル−ＡＣＰレダクターゼを含み得る。いくつかの例では、組換え宿主細胞は、アルデヒド形成性アシル−ＡＣＰレダクターゼをコードする外因性遺伝子を含み、ここで、アルデヒド形成性アシル−ＡＣＰレダクターゼは、ラン藻の種に由来するものであり得、宿主微生物と同一種に由来しても、異なる種に由来してもよい。あるいは、ラン藻宿主は、内因性アシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子を過剰発現するように操作され得る。
【０１１７】
本発明において使用され得るカルボン酸レダクターゼをコードする遺伝子の限定されない例として、ノカルジア（Nocardia）属ＣＡＲ遺伝子（ＡＹ４９５６９７）およびその相同体が挙げられ、その一部は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１０／０１０５９６３に開示されている。
【０１１８】
アルコール形成性脂肪酸アシルレダクターゼ
脂肪アルコール（所望により、ワックスエステルシンターゼによって基質として使用され得る）の製造のために、本明細書において提供されるような核酸分子は、脂肪アルコール形成性アシルレダクターゼまたはアシル−ＣｏＡを脂肪アルコールに還元し得る「ＦＡＲ」をコードする配列をさらに有し得る（can further）。ＦＡＲは、例えば、ユーグレナ属（Euglena）（例えば、Teerawanichpanら、Lipids 45:263〜273頁(2010年)を参照のこと）、アラビドプシス属（Arabidopsis）（例えば、Rowlandら、Plant Physiol. 142:866〜877頁(2006年)、Doanら、J. Plant Physiol. 166:787〜796頁(2009年)およびDomergueら、Plant Physiol. 153:1539〜1554頁(2010年)を参照のこと）、ヨモギ属（Artemisia）（例えば、Maesら、New Phytol. 189:176〜189頁(2011年)を参照のこと）、ホホバ（例えば、Metzら、Plant Physiol. 122:635〜644頁(2000年)を参照のこと）、ガ（例えば、Lienardら、Proc. Natl. Acad. Sci. 107:10955〜10960頁(2010年)を参照のこと）、ミツバチ（例えば、Teerawanichpanら、Insect Biochemistry and Molecular Biology 40:641〜649頁(2010年)を参照のこと）および哺乳動物（例えば、Honshoら、J. Biol. Chem. 285:8537〜8542頁(2010年)を参照のこと）において同定されている。本発明の微生物および方法において有用なアルコール形成性脂肪酸アシルレダクターゼは、宿主微生物において活性を有する任意のアルコール形成性レダクターゼであり得る。
【０１１９】
使用され得るその他のアルコール形成性脂肪酸アシルレダクターゼの限定されない例として、それだけには限らないが、カイコ（Bombyx mori）由来のｂｆａｒ（ＢＡＣ７９４２６）、ホホバ（Simmondsia chinensis）由来のｊｊｆａｒ（ＡＡＤ３８０３９）、コムギ（Triticum aestivum）由来のアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣＡＤ３０６９４またはＣＡＤ３０６９２）、ハツカネズミ（Mus musculus）由来のｍｆａｒｌ（ＮＰ＿０８１６５５）、ハツカネズミ（Mus musculus）由来のｍｆａｒ２（ＮＰ＿８４８９１２）、ヒト（H. sapiens）由来のｈｆａｒ（ＮＰ＿１１５６０４）、アズキノメイガ（Ostrinia scapulalis）由来のＦＡＲＸＩＩＩ（ＡＣＪ０６５２０）、トウモロコシ（Z. mays）由来のＭＳ２（ＮＰ＿００１１５１３８８またはＥＵ９７０８６５）またはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のＭＳ２（ＮＰ＿１８７８０５）、ＦＡＲ４（ＮＰ＿００１０３０８０９またはＮＰ＿１９００４０）、ＦＡＲ６（６７６３３７０３）、ＣＥＲ４（ＮＰ＿５６７９３６）またはＡｔｈ（ＮＰ５６７９３６）、サクラスガ（Yponomeuta evonymellus）由来のＹｅｖ−ｐｇＦＡＲ（ＧＱ９０７２３１−ＧＱ９０７２３３）、イポノメウタ・ロレルス（Yponomeuta rorellus）由来のＹｒｏ−ｐｇＦＡＲ（ＧＱ９０７２３４）、イポノメウタ・パデルス（Yponomeuta padellus）由来のＹｐａ−ｐｇＦＡＲ（ＧＱ９０７２３５）、アワノメイガ（Ostrinia nubilalis）由来のＯｎｕＥ（ＦＪ８０７７３５）、ヒト（Homo sapiens）由来のＨａｓ（ＡＡＴ４２１２９）などが挙げられる。
【０１２０】
本発明の微生物および方法において有用なアルコール形成性脂肪酸アシルレダクターゼはまた、またはあるいは、マリノバクター・アクアエオレイ（Marinobacter aquaeolei）ＶＴ８  Ｍａｑｕ＿２２２０（ＹＰ＿９５９４８６）、マリノバクター・アルジコラ（Marinobacter algicola）ＤＧ８９３（ΖΡ＿０１８９２４５７）；ハヘラ・ケジュエンシス（Hahella chejuensis）ＫＣＴＣ  ２３９６  ＨＣＨ＿０５０７５（ＹＰ＿４３６１８３）；オセアノバクター属（Oceanobacter）種ＲＥＤ６５（ＺＰ＿０１３０５６２９）またはマリノバクター・アクアエオリ（Marinobacter aquaeoli）ＶＴ８  ２２２０  Ｍａｑｕ＿２５０７遺伝子（ＡＢＭ１９５８２）などの原核生物アルコール形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼであり得る。
【０１２１】
基質としてアシル−ＡＣＰを使用できるアルコール形成性レダクターゼ（外因性および／または内因性アシル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子を欠く組換え微生物における脂肪アルコールおよびワックスエステルの製造のために使用され得る）は、２０１２年９月２７日に出願され、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、「Production and Secretion of Fatty Acids and Fatty Acid Derivatives」と題された、本発明の譲受人に譲渡された同時係属中の米国特許出願第１３／８６０，４１７号に、また２０１２年３月６日に出願され、同様に参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、「Acyl-ACP Wax Ester Synthases」と題された、同時係属中の、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１３／４１３，４２６号に開示される。
【０１２２】
ワックスエステルシンターゼ
ワックスエステルは、ワックスエステルシンターゼによって触媒される、脂肪酸アシル−チオエステル基質および脂肪アルコール間の縮合反応の生成物である。ワックスエステルシンターゼ活性を有するポリペプチドは、ワックスシンターゼ、膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＭＢＯＡＴ）、ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（例えば、ＥＣ２．３．１．２０）、アルコールアシルトランスフェラーゼ（ＡＡＴ、ＥＣ  ２．３．１．８４）、長鎖アルコールＯ−脂肪アシルトランスフェラーゼ（例えば、２．３．１．７５）またはアルコールシンターゼ／アシル−ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを含めたＯ−アシルトランスフェラーゼとして同定されるポリペプチドであり得る。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）として同定されるいくつかのポリペプチドは、ワックスエステルシンターゼ活性を有するとわかり得る。ワックスエステルシンターゼは、例えば、アシネトバクター属（Acinetobacter）（Ishigeら、Appl. Environ. Microbiol. 68:1192〜1195頁(2002年)；KalscheuerおよびSteinbuchel、J. Biol. Chem. 278:8075〜8082頁(2003年)；Kalscheuerら、Appl. Environ. Microbiol. 72:1373〜1379頁(2006年)）、マリノバクター属（Marinobacter）（HoltzappleおよびSchmidt-Dannert、J. Bacteriol. 189:3804〜3812頁(2007年)）、アラビドプシス属（Arabidopsis）（Liら、Plant Physiol. 148:97-107(2008年)）、ペチュニア（Kingら、Planta 226:381〜394頁(2007年)）、ホホバ（Lardizabalら、Plant Physiol.122:645〜655頁(2000年)）および哺乳動物種（ChengおよびRussell、J. Biol. Chem. 279:37798〜37807頁(2004年)；Yenら、J. Lipid Res. 46:2388〜2397頁(2005年)）において同定されている。
【０１２３】
ワックスエステルシンターゼは、構造ドメインまたは既知ワックスエステルシンターゼ／ＤＧＡＴ配列に対する配列類似性に基づいて、当技術分野で公知の方法を使用して同定され得る。限定されない例として、２０．６のギャザリングカットオフよりも高いビットスコアおよび０．０１以下のＥ値を有するＰｆａｍ  ＰＦ０３００７（ワックスエステルシンターゼ様アシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼドメイン）に入る、または２５．０のギャザリングカットオフより高いビットスコアおよび０．０１以下のＥ値を有するＰｆａｍ  ＰＦ１３８１３（「ＭＢＯＡＴ＿２」）に入るポリペプチドをコードする遺伝子が、本明細書において提供される核酸分子および微生物において使用するために選択され得る。
【０１２４】
本明細書において提供される核酸分子によってコードされるワックスエステル合成タンパク質として、それだけには限らないが、ホホバ（Simmondsia chinensis）、アシネトバクター属（Acinetobacter）種の株ＡＤＰ１（以前は、アシネトバクター・カルコアセチクス（Acinetobacter calcoaceticus）ＡＤＰ１）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ファンジバクター（アルカニボラックス）・ジャデンシス（Fundibacter （Alcanivorax） jadensis）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）またはアルカリゲネス・ユートロフス（Alkaligenes eutrophus）由来の多酵素複合体から選択されるアシルトランスフェラーゼまたはワックスシンターゼ、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、アシル−ｃｏＡワックスアルコールアシルトランスフェラーゼおよび二機能性ワックスエステルシンターゼ／アシル１−ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを挙げることができる。ワックスシンターゼはまた、アルカリゲネス・ユートロフス（Alkaligenes eutrophus）ならびにワックスおよび脂肪酸エステルを製造すると文献においてわかっているその他の生物に由来する多酵素複合体に由来し得る。
【０１２５】
本明細書において提供される核酸分子およびトランスジェニック微生物において使用するために考慮されるワックスエステルシンターゼ活性を有するとわかっているか、有すると疑われるタンパク質として、それだけには限らないが、マリノバクター・ヒドロカルボノクラスチクス（Marinobacter hydrocarbonoclasticus）ＷＳ  １（ＡＢＯ２１０２０）、マリノバクター・ヒドロカルボノクラスチクス（Marinobacter hydrocarbonoclasticus）ＤＳＭ  ８７９８  ＷＳ２（ＡＢＯ２１０２１）、Ｍ．種ＥＬＢ  １７（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＥＢＡ００３８８）、Ｍ．アクアエオレイ（aquaeolei）Ｍａｑｕ＿０１６８  ＷＳ（ＹＰ＿９５７４６２）、Ｍ．アドヘレンス（adhaerens）ＨＰ１５  ＷＳ（ＡＤＰ９９６３９）、ハヘラ・ケジュエンシス（Hahella chejuensis）ＫＣＴＣ  ２３９６（ＹＰ＿４３２５１２）、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）ワックスエステルシンターゼ（ＥＧＪ６３４０８）、Ａ．カルコアセチクス（calcoaceticus）ＷＳ／ＤＧＡＴ（ＺＰ＿０６０５８９８５）アシネトバクター・ベイリー（Acinetobacter baylyi）ＡＤＰ１ワックスエステルシンターゼ（ＡＡＯ１７３９１またはＱ８ＧＧＧ１）、ブラジリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）ＵＳＤＡ  １１０（ＮＰ＿７６９５２０）、エリスロバクター・リトラリス（Erythrobacter litoralis）ＨＴＣＣ  ２５９４（ＹＰ＿４５７３８９）、ロドコッカス・オパクス（Rhodococcus opacus）ワックスエステルシンターゼ（ＢＡＨ５３７０２）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）ワックスエステルシンターゼ（ＮＰ＿３３４６３８）、スメグマ菌（M. smegmatis）ワックスエステルシンターゼ（ＡＢＫ７４２７３）、アルカニボラックス属（Alcanivorax）の種の「ＷＳ／ＤＧＡＴ／ＭＧＡＴ」サブファミリータンパク質（ＣＡＬ１７２５２、ＥＤＸ９０９６０、ＥＤＸ８９０５２、ＺＰ＿０５０４３５３９、ＺＰ＿０５０４１６３１）、ノカルジア・ファルシニカ（Nocardia farcinica）ＩＦＭ  １０１５２由来のｗｓａｄｐｌ（ＹＰ＿１１７３７５）、フォトバクテリウム・プロフンダム（Photobacterium profundum）ＳＳ９（ＹＰ＿１３０４１３）、ロドフェラックス・フェリレデュセンス（Rhodoferax ferrireducens）ＤＳＭ１５２３６（ＺＰ＿００６９１７０４）およびサリニバクター・ルバー（Salinibacter ruber）ＤＳＭ１３８５５（ＹＰ＿４４６６０３）などの原核生物種に由来するワックスシンターゼが挙げられる。
【０１２６】
ワックスシンターゼとして有用であり得る真核生物ポリペプチドの例として、制限するものではないが、ホホバワックスエステルシンターゼＪｊＷＳ（ＡＦ１４９９１９）、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）ワックスエステルシンターゼ（ＡＤＩ６００５８）、シロイヌナズナ（Arabidiopsis thaliana）ＷＳＤ１  Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＮＰ＿５６８５４７）、シロイヌナズナ（Arabidiopsis thaliana）ＧＰＡＴアシルトランスフェラーゼ（ＮＰ＿１７４４９９）、シロイヌナズナ（Arabidiopsis thaliana）の推定長鎖アルコールＯ−脂肪アシルトランスフェラーゼ４（ＮＰ＿２００３４６）ナンヨウザンショウ（Murraya koenigii）ワックスエステルシンターゼ、ヒト（H. sapiens）由来のアシル−ＣｏＡワックスアルコールアシルトランスフェラーゼ２（ＮＰ＿００１００２２５４）、ハツカネズミ（Mus musculus）由来のｍＷＳ（Ｑ６Ｅ１Ｍ８）、フラガリア・キサナナス（Fragaria xananas）由来のＳＡＡＴ（ＡＡＧ１３１３０）、トウモロコシ（Zea mays）の膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＭＢＯＡＴ）（ＮＰ＿００１１３１１７９）、リンゴ（Malus x domestica）由来のｍｄＡＡＴ２（ＡＡＳ７９７９７）ならびに昆虫ワックスエステルシンターゼなどが挙げられる。
【０１２７】
基質としてアシル−ＡＣＰを使用でき、例えば、アシル−ＣｏＡシンセターゼまたはチオエステラーゼをコードする外因性または内因性遺伝子のいずれかまたは両方を欠く組換え微生物におけるワックスエステルの製造のために使用され得るワックスエステルシンターゼとして、２０１２年３月６日に出願され、同様に参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、「Acyl-ACP Wax Ester Synthases」と題された、本発明の譲受人に譲渡された、同時係属中の米国特許第１３／４１３，４２６号に開示されるものが挙げられる。基質としてアシル−ＡＣＰを使用できるワックスエステルシンターゼはまた、ＤＧＡＴ活性を有し得、それだけには限らないが、アシル−ＣｏＡを欠くラン藻類および／またはアシル−ＣｏＡシンセターゼもしくはチオエステラーゼをコードする外因性もしくは内因性遺伝子のいずれかもしくは両方を欠く微生物などの組換え微生物におけるトリグリセリドの製造において有用であり得る。
【０１２８】
あるいは、または上記の非天然遺伝子のいずれかに加えて、本発明の組換え微生物は、外因性脂肪酸デカルボキシラーゼまたは外因性脂肪アルデヒドデカルボニラーゼをコードする少なくとも１種の核酸分子、さらに、所望により、外因性アシル−ＣｏＡレダクターゼ、カルボン酸レダクターゼまたはアシル−ＡＣＰレダクターゼをコードする少なくとも１種の外因性核酸分子を含み得、アルカンおよび／またはアルケンを製造し得る。例えば、本明細書において提供されるような組換え微生物は、例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のＣＥＲ１（ＮＰ＿１７１７２３）もしくは別の種のオーソログもしくはその誘導体などのデカルボニラーゼまたは全文が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１０１２４０７１（ＷＯ２０１１／０６２９８７）に開示されるデカルボニラーゼのいずれかをコードする外因性核酸分子を含み得、これは、本明細書において上記に開示されるいずれかなどのアルデヒド形成性アシルレダクターゼをコードする非天然遺伝子とともに発現され得る。あるいは、本明細書において提供されるような組換え微生物は、それだけには限らないが、両方とも参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１００２３５９３４またはＵＳ８，１１０，０９３に開示されるいずれかなどのオレフィン（アルケン）の製造のための遺伝子をコードする非天然遺伝子を含み得る。本発明の組換え微生物または宿主細胞によって製造されるアルカンおよびアルケンは、例えば、例えば、７、９、１１、１３、１５および／または１７個の炭素の鎖長または７、９、１１、１３および／または１５個の炭素の鎖長または１１、１３および／または１５個の炭素の鎖長を含めた７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および／または２３個の炭素の鎖長を有し得る。
【０１２９】
トリグリセリド（ＴＡＧ）の製造のために微生物を操作するために、１種または複数のグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（本明細書において以下、「ＧＰＡＴ」とも呼ばれる；ＥＣ  ２．３．１．１５）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼまたは「ＬＰＡＡＴ」、ＥＣ  ２．３．１．５１、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ、３−ｓｎ−ホスファチジン酸ホスホ加水分解酵素）またはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ、Ｅ．Ｃ．２．３．１．２０）をコードする非天然遺伝子を、微生物中に導入してもよい。遺伝子は、原核生物または真核生物の任意供給源に由来し得る。これらのクラスの酵素のすべてに属する遺伝子は、当技術分野で公知であり、これらの活性を有する遺伝子への言及は、例えば、米国特許出願公開２００７／０１８４５３８、ＵＳ２０１０／０１５９１１０および２０１００２５５５５１に、また、２０１２年２月２４日に出願され、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、「Enhanced Production of Fatty Acids and Fatty Acid Derivatives by Recombinant Microorganism」と題された、本発明の譲受人に譲渡された、同時係属中の米国特許出願第１３／４０４，７１７１号に見出すことができる。
【０１３０】
あるいは、または上記の修飾のいずれかに加えて、本発明の組換え微生物は、所望により、脂肪酸製造に影響を及ぼす酵素をコードする外因性または組換え核酸分子を含み得る。例えば、本明細書において提供されるような組換え微生物は、それだけには限らないが、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニルＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼまたはβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼを含めた脂肪酸の合成に関与しているポリペプチドをコードする１種または複数の外因性核酸分子を含み得るか、または脂肪酸または脂質製造のためのポリペプチドをコードする内因性遺伝子を過剰発現するように操作され得る。
【０１３１】
なおさらに、組換え宿主細胞は、所望により、１種または複数の脂肪酸生成物の分泌を促進するために、外因性膜貫通輸送体を発現するように操作され得る。例えば、組換え宿主細胞は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体またはＲＮＤポンプをコードする非天然遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、輸送体は、アラビドプシス（Arabidopsis）遺伝子ＣＥＲ５、ＷＢＣ１１、ＡｔＭＲＰＳ、ＡｍｉＳ２およびＡｔＰＧＰ１またはサッカロミセス属（Saccharomyces）、ドロソフィラ属（Drosophila）、マイコバクテリアの種もしくは哺乳動物の種に由来する脂肪酸輸送体（ＦＡＴＰ）遺伝子によってコードされる輸送体タンパク質と、配列で、少なくとも８０％同一である。
【０１３２】
上記の組換え宿主細胞は、本明細書において記載されるような脂肪酸生成物を製造する方法のいずれかにおいて使用され得る。
【０１３３】
ＦＦＡ製造のためのさらなる修飾
組換え微生物は、例えば、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、アシル−ＡＣＰシンセターゼ、アシルＣｏＡ脱水素酵素、グリセロール−３−リン酸脱水素酵素、アセトアルデヒドＣｏＡ脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、酢酸キナーゼなど、およびその組合せをコードする内因性核酸分子の修飾をさらに含み得る。特定の実施形態では、修飾は、内因性核酸を下方調節し、核酸もしくはその調節エレメントの部分的な、実質的なまたは完全な欠失、サイレンシングまたは不活化を含む。
【０１３４】
いくつかの例では、例えば、ラン藻であり得る宿主微生物は、脂肪酸の脂質への再利用に関与しているアシル−ＡＣＰシンセターゼをコードする内因性遺伝子の弱毒化された発現を有し得る。内因性アシル−ＡＣＰシンセターゼ遺伝子は、例えば、プロモーターの欠失もしくは突然変異によって下方調節され得るか、または遺伝子のタンパク質コーディングは、例えば、挿入突然変異誘発によって内部が欠失されるか、もしくは破壊され得る。あるいは、全アシル−ＡＣＰシンセターゼ遺伝子は、例えば、相同組換えまたはその他のゲノム修飾技術によって欠失され得る。なおさらなる代替法では、それだけには限らないが、リボザイム、アンチセンスまたはＲＮＡｉ構築物などの遺伝子ノックダウン構築物が宿主細胞中に導入されて、内因性アシル−ＡＣＰシンセターゼ遺伝子の発現が弱毒化され得る。
【０１３５】
あるいは、またはさらに、本発明の組換え微生物（例えば、組換えラン藻（cuanobacterium））は、貯蔵炭水化物および／またはポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）生合成経路酵素をコードする１種または複数の遺伝子が不活化または下方調節されるよう、および／またはこのような経路で作動する酵素自体が阻害されるよう修飾され得る。例として、それだけには限らないが、グルカンシンターゼおよび／または分岐酵素を含めた、グリコーゲン、デンプンまたはクリソラミナリン合成に関与している酵素が挙げられる。その他の例として、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼおよびＰＨＡシンターゼなどのＰＨＡ生合成に関与している酵素が挙げられる。
【０１３６】
遺伝子は、破壊、欠失、アンチセンス配列の作製、リボザイムの作製、ＲＮＡｉ、メガヌクレアーゼゲノム修飾および／またはその他の組換えアプローチによって特異的に標的化され得る。遺伝子の不活化は、ＵＶおよび／または化学変異誘発物質に対する曝露などのランダム突然変異技術によって、さらに、またはあるいは達成され得、得られた遺伝子および／または酵素は、所望の活性を有する突然変異体についてスクリーニングされ得る。タンパク質自体が適当な抗体の細胞内生成、ペプチド阻害物質の細胞内生成など、またはそのいくつかの組合せによって阻害され得る。
【０１３７】
核酸分子
本明細書に記載される核酸分子およびコードされるポリペプチドは、本発明の方法のいずれかにおいて使用され得、本発明の構築物、ベクターまたは組換え微生物のいずれかに含まれ得る。脱水素酵素をコードする配列を含む核酸分子は、遊離脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、ワックスエステル、アルカン、アルケンおよび／またはトリグリセリドなどのグリセロ脂質を含めた脂肪酸生成物を製造するための宿主微生物および方法において使用するために提供される。本明細書において開示されるような核酸分子は、単離および／または精製され得る。
【０１３８】
本発明は、脱水素酵素をコードする核酸配列、例えば、本明細書に開示される任意のものまたはその任意の活性断片を含む単離核酸分子を提供する。例えば、本明細書において提供されるような核酸分子は、アルデヒド脱水素酵素、２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、グリセリド−３−リン酸脱水素酵素（非リン酸化）、リンゴ酸酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素またはソルビトール脱水素酵素をコードする核酸配列を含み得る。
【０１３９】
本明細書に記載されるような脱水素酵素をコードする組換え核酸分子の配列の宿主微生物（脂質の合成に関与しているポリペプチドをコードする非天然遺伝子を発現する組換え微生物など）における発現は、宿主微生物の培養物によって製造される脂肪酸生成物の、対照微生物の培養物の製造レベルよりも高い製造レベルをもたらし得、対照微生物は、同一条件下で培養され、対照微生物が、脱水素酵素をコードする非天然核酸配列を発現しない点を除いて、脱水素酵素をコードする核酸配列を発現する微生物とすべての点で実質的に同一である。さらに、脱水素酵素をコードする、本明細書において提供されるような組換え核酸分子または配列を含む組換え宿主微生物は、対照微生物が、脱水素酵素をコードする非天然核酸分子または配列を含まないという点を除いて、すべての点において脱水素酵素をコードする非天然核酸分子を含む宿主微生物と同一である対照微生物よりも、高い繁殖および／または増殖速度を有し得る。脱水素酵素をコードする配列を含む、本明細書において提供される組換え核酸分子を含む組換え宿主微生物は、組換え微生物が脂質を製造している培養期間の間に、脱水素酵素をコードする非天然核酸分子を欠く対照微生物よりも、高い繁殖および／または増殖速度を有し得る。組換え微生物は、例えば、光合成微生物であり得る。
【０１４０】
特定の例では、本明細書において提供されるような組換え核酸分子は、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１８または配列番号１９、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３のアミノ酸配列またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脱水素酵素をコードし得る。
【０１４１】
例えば、本発明は、配列番号２９のアミノ酸配列またはその一部に対して、例えば、配列番号２９のポリペプチドの機能的断片に対して、少なくとも少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子または組換え核酸分子を提供する。例えば、本明細書において提供されるような核酸分子は、配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、または配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、または、例えば、配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし得、配列番号２９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０１４２】
本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸配列に対して、またはその一部に対して、例えば、ポリペプチドの機能的断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含み得る、脱水素酵素をコードする単離核酸分子または組換え核酸分子を提供する。例えば、脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列またはその機能的断片に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか、または配列番号２のアミノ酸配列またはその機能的断片に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか、または、例えば、配列番号２のアミノ酸配列またはその機能的断片に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、また、配列番号２のアミノ酸配列のすべてもしくは活性断片に対して同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０１４３】
本発明は、本明細書に記載されるようなポリペプチドの機能的断片または変異体をコードするものなどの本発明のヌクレオチド配列の変動を包含する。種々の変異誘発物質および変異誘発プロセスによって誘導されるものなどのこのような変異体は、天然に存在する場合も、天然に存在しない場合もある。変動は、それだけには限らないが、保存的または非保存的アミノ酸変更またはアミノ酸付加および欠失をもたらし得る、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失および置換を含む。所与の核酸配列は、例えば、核酸分子もしくはその一部の化学合成、ランダムもしくは定方向突然変異を導入するＤＮＡ増幅方法、標準化学的もしくは照射突然変異誘発および／または人工進化（選択）またはドメインスワッピング方法によって修飾され、修飾された配列を生成し得る。さらに、脱水素酵素ＯＲＦは、ｃＤＮＡライブラリーなどの転写物の収集物から誘導することができ、転写物の配列は未知であり得る。加速された進化方法は、例えば、Stemmer(1994年) Nature 370、389〜391頁およびStemmer(1994年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91、10747〜10751頁に記載されている。突然変異は、それだけには限らないが、藻類またはラン藻類などのトランスジェニック種における野生型配列の発現を増強するためのコドン最適化（例えば、Burgess-Brown(2008年)Protein Expr. Purif. 59、94〜102頁）および本発明の脱水素酵素のアミノ酸配列を変更する部位指定突然変異誘発に起因する突然変異を含む。アミノ酸配列におけるこのような変更は、本発明の脱水素酵素の生物活性を高め得る。例えば、本発明の脱水素酵素タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、その生物活性を高めて、脂肪酸、脂肪酸誘導体または脂質製造を高めるよう突然変異誘発され得る。
【０１４４】
例えば、本発明は、参照ポリペプチドと比較して増大した活性を有する脱水素酵素の断片および変異体を提供し、特定の実施形態では、脱水素酵素断片または変異体は、変異体が誘導される脱水素酵素の活性と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％または１０００％増大される活性を有し得る。特定の実施形態では、断片または変異体を発現する宿主細胞の培養物によって製造される脂肪酸生成物の量は、断片または変異体が由来する脱水素酵素を発現する宿主細胞の培養物によって製造される脂肪酸生成物の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％または１０００％の量である。
【０１４５】
さらに、またはあるいは、本発明は、天然に存在する脱水素酵素アミノ酸配列の変異体、例えば、それだけには限らないが、参照配列のＮおよび／またはＣ末端で、および／または参照配列内で少なくとも１つのアミノ酸残基が付加または欠失されている、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３またはその断片の脱水素酵素配列の変異体をコードする核酸分子を提供する。例えば、タンパク質を葉緑体などの位置に向かわせるために、細胞標的化シグナルがタンパク質に付加され得る。
【０１４６】
本発明はまた、１個または複数のアミノ酸がタンパク質から欠失している脱水素酵素の欠失突然変異体をコードする核酸分子も包含する。例えば、コードされるポリペプチドは、Ｎおよび／またはＣ末端から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０または８０個のアミノ酸を欠くことがあり、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１８または配列番号１９、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３の対応するアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有し得る。いくつかの例では、欠失された配列は、標的化配列、例えば、葉緑体輸送ペプチドの少なくとも一部、ミトコンドリア標的化配列の少なくとも一部、小胞体標的化配列の少なくとも一部などを含み得る。
【０１４７】
置換、挿入または欠失は、変更された配列が、タンパク質と関連している生物学的機能を実質的に阻害する場合に、タンパク質に悪影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、脱水素酵素の変異体は、変異体が誘導される脱水素酵素（例えば、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１８または配列番号１９、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３のいずれかまたはその他の脱水素酵素）の活性と比較して約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％または５０％以下だけ低減された活性を有し得る。いくつかの実施形態では、脱水素酵素変異体を発現する宿主細胞の培養物によって製造される脂肪酸生成物の量は、変異体が誘導される脱水素酵素（例えば、例えば、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１８または配列番号１９、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３のいずれかまたはその他の脱水素酵素）を発現する宿主細胞の培養物によって製造された脂肪酸生成物の量の約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％または７５％以上である。
【０１４８】
したがって、本発明はまた、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１８または配列番号１９、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３のペプチド配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％または８５％、例えば、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または約１００％の配列同一性のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子；全タンパク質の少なくとも５０個、例えば、少なくとも７５個、少なくとも１００個、少なくとも１２５個、少なくとも１５０個またはそれ以上のアミノ酸残基の連続配列を含むその断片；このような配列のアミノ酸配列変異体を含み、ここでは、挿入および置換を含有する開示された配列（複数可）、開示された配列のアミノ酸配列変異体ならびに／または上記で定義されるその断片のＮおよび／もしくはＣ末端に、および／もしくはその内部に少なくとも１個のアミノ酸残基が挿入されている。考慮される変異体は、さらに、またはあるいは、例えば、相同組換えまたは部位指定もしくはＰＣＲ突然変異誘発によって所定の突然変異を含有するものならびにそれだけには限らないが、本明細書において記載されるものを含めたその他の種の対応するタンパク質、挿入および置換を含有するタンパク質のファミリーの対立遺伝子もしくはその他の天然に存在する変異体ならびに／またはタンパク質が、挿入および置換を含有する天然に存在するアミノ酸以外の部分（例えば、酵素などの検出可能な部分）を用いて、置換、化学的、酵素的もしくはその他の適当な手段によって共有結合によって修飾されている誘導体を含み得る。
【０１４９】
本発明の「核酸」または「核酸分子」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡであり得る。核酸分子は、二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡは、コーディングまたはセンス鎖であっても、非コーディングまたはアンチセンス鎖であってもよい。さらに、発現される核酸およびポリペプチドの化学的または酵素的変化は、標準的な方法によって実施され得る。例えば、配列は、リン酸基、メチル基、脂質、糖、ペプチド、有機もしくは無機化合物の付加によって、修飾されたヌクレオチドもしくはアミノ酸を含むことなどによって修飾され得る。
【０１５０】
さらに、核酸は、本明細書において開示される任意の脱水素酵素またはその活性断片を、本明細書において開示されるようなポリペプチドまたはその活性断片を含む融合タンパク質としてコードし得る。例えば、本発明の核酸は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン（例えば、Ｈｉｓ６）、ポリＨＮ、ポリリシン、血球凝集素、ＨＳＶタグまたはＨＩＶ−Ｔａｔの少なくとも一部と融合している、本発明の脱水素酵素またはその活性断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１５１】
本明細書において記載される本発明はまた、少なくとも２０の連続するヌクレオチドから少なくとも５０の連続するヌクレオチドまたはより長い長さのものである本明細書において記載されるヌクレオチド配列の一部を包含する本明細書において記載される単離核酸分子の断片に関する。このような断片は、プローブおよびプライマーとして有用であり得る。特に、プライマーおよびプローブは、本明細書において記載されるポリペプチドをコードする核酸分子と選択的にハイブリダイズし得る。例えば、以下に記載されるように、活性を保持するポリペプチドをコードする断片は、特に有用である。
【０１５２】
本発明はまた、選択的ハイブリダイゼーションなどのために、本明細書において記載されるヌクレオチド配列（例えば、本明細書において記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズし、脱水素酵素をコードする核酸分子）と高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子も提供する。ハイブリダイゼーションプローブは、塩基特異的方法で核酸の相補鎖と結合する合成オリゴヌクレオチドを含む。適したプローブは、Nielsen(1991年)Science、254、1497〜1500頁に記載されるようなポリペプチド核酸を含む。
【０１５３】
このような核酸分子は、例えば、高ストリンジェンシー条件下での特異的ハイブリダイゼーションによって検出および／または単離され得る。ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェンシー条件」は、インキュベーションおよび洗浄条件、例えば、特定の核酸の第２の核酸とのハイブリダイゼーションを可能にする温度およびバッファー濃度の条件を指す技術分野の用語であり、第１の核酸は、第２に対して完全に相補的、すなわち、１００％であり得るか、または第１および第２は、完全未満、例えば、６０％、７５％、８５％、９５％またはそれ以上である、ある程度の相補性を共有し得る。例えば、完全に相補的な核酸を、少ない相補性のものと区別する、特定の高ストリンジェンシー条件が使用され得る。
【０１５４】
核酸ハイブリダイゼーションのための「高ストリンジェンシー条件」、「中ストリンジェンシー条件」および「低ストリンジェンシー条件」は、Current Protocols in Molecular Biology(2011年) John Wiley & Sons）において説明されている。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する正確な条件は、洗浄バッファーのイオン強度、例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、温度、例えば、２３℃、４２℃、６８℃などおよびホルムアミドなどの不安定化剤またはＳＤＳなどの変性剤の濃度だけでなく、核酸配列の長さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間のミスマッチパーセントおよびその他の同一ではない配列内のその配列のサブセットの出現の頻度などの因子によっても変わる。したがって、高、中または低ストリンジェンシー条件は、経験的に決定され得る。
【０１５５】
ハイブリダイゼーションが起こらないストリンジェンシーのレベルからハイブリダイゼーションが最初に観察されるレベルへハイブリダイゼーション条件を変更することによって、所与の配列が、サンプル中の最も類似の配列とハイブリダイズすることを可能にする条件が決定され得る。
【０１５６】
例示的条件は、Krause(1991年) Methods in Enzymology、200、546〜556頁に記載されている。洗浄は、条件が普通、ハイブリッドの最少レベルの相補性を決定するよう設定されるステップである。一般的に、相同ハイブリダイゼーションのみが起こる最低温度から出発して、ＳＳＣ濃度を一定に保ちながらの最終洗浄温度が低下される１℃が、ハイブリダイズする配列間のミスマッチの最大程度の１％の増大を可能にする。一般的に、ＳＳＣの濃度を２倍にすることは、Ｔｍの増大をもたらす。これらの指針を使用して、洗浄温度を、考えられるミスマッチのレベルに応じて、高、中または低ストリンジェンシーについて経験的に決定できる。例示的な高ストリンジェンシー条件として、それだけには限らないが、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、３７℃で１％  ＳＤＳでのハイブリダイゼーションおよび６０℃で０．１×ＳＳＣでの洗浄が挙げられる。進行性に、より高ストリンジェンシーの条件の例として、ハイブリダイゼーション後の、およそ室温での０．２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳを用いる洗浄（低ストリンジェンシー条件）；約４２℃での０．２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳを用いる洗浄（中ストリンジェンシー条件；および約６８℃での０．１×ＳＳＣを用いる洗浄（高ストリンジェンシー条件）が挙げられる。洗浄は、これらの条件のうち１つのみ、例えば、高ストリンジェンシー条件を使用して実施され得るが、洗浄が増大するストリンジェンシーの順で２以上のストリンジェンシー条件を包含してもよい。最適条件は、関与する個々のハイブリダイゼーション反応に応じて変わり、経験的に決定され得る。
【０１５７】
標的核酸分子と使用されるプライマーまたはプローブ間の同様の程度の同一性または類似性を維持しながら、当技術分野で公知であるように、例として与えられたパラメータのうち１以上を変更することによって、同等条件が決定され得る。ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列は、例えば、本発明の核酸を含む生物を同定するための、および／または本発明の核酸を単離するためのプローブおよびプライマーとして有用である。
【０１５８】
本発明の核酸分子は、所望により、脱水素酵素遺伝子に対して同種であっても、異種であってもよい、非コーディング３’および５’配列などのさらなる非コード配列（例えば、調節配列を含む）を含み得る。あるいは、またはさらに、提供される核酸分子のいずれも、所望により、光合成生物に由来する少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、７００、８００、９００、１０００または１５００ヌクレオチドのさらなる核酸配列をさらに含み得る。本明細書において記載される核酸分子およびポリペプチドは、本発明の方法のいずれにおいても使用され得、本発明のベクターまたは組換え微生物のいずれにも含まれ得る。脱水素酵素をコードする配列を含む核酸分子は、遊離脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、ワックスエステル、アルカン、アルケン、モノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドを含めた脂肪酸生成物を製造するための宿主微生物および方法において使用するために提供される。
【０１５９】
核酸構築物
本発明はまた、ヌクレオチド配列の転写、翻訳または宿主ゲノムへの組込みを調節または媒介する１種または複数の配列をさらに含み得る脂質の製造に関与している脱水素酵素またはポリペプチドをコードする核酸配列を含む構築物を提供する。例えば、本発明は、１種または複数の「発現制御エレメント」または作動可能に連結している遺伝子の発現転写または転写されたＲＮＡの翻訳を調節する配列を含む発現構築物を提供する。例えば、発現制御エレメントは、発現構築物または「発現カセット」中で対象の遺伝子（例えば、脱水素酵素遺伝子）に作動可能に連結され得るプロモーターであり得る。プロモーターは、調節可能、例えば、誘導可能であり得る。
【０１６０】
核酸構築物が、対象の遺伝子（例えば、脱水素酵素遺伝子）をコードする核酸配列との作動可能な連結でプロモーターを含有しない態様では、核酸配列は、例えば、相同組換え、部位指定組込みおよび／またはベクター組込みによって内因性プロモーターと作動可能に連結されるようになるように細胞に形質転換され得る。いくつかの例では、相同組換えを宿主ゲノム中に媒介するために核酸構築物中に含まれるゲノム宿主配列は、遺伝子調節配列、例えば、核酸構築物の脱水素酵素遺伝子の発現を調節し得るプロモーター配列を含み得る。このような例では、構築物の導入遺伝子（複数可）は、宿主微生物に対して内因性であるプロモーターと作動可能に連結されるようになり得る。内因性プロモーター（複数可）は、調節可能、例えば、誘導可能であり得る。
【０１６１】
脱水素酵素をコードする核酸配列と作動可能に連結されたプロモーターは、脱水素酵素遺伝子に対して異種であるプロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導プロモーター、すなわち、特定の刺激に応じて作動可能に連結された遺伝子の転写を媒介するプロモーターであり得る。このようなプロモーターは、例えば、宿主細胞の成長に対する任意の有害な効果を最小化するのに、および／または脂肪酸生成物の製造を最大化するのに有利であり得る。誘導プロモーターは、例えば、明暗または高温もしくは低温に対して反応性であり得る、および／または特定の化合物に対して反応性であり得る。誘導プロモーターは、ａｒａプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｅｔプロモーター（例えば、米国特許第５，８５１，７９６号）、ｔｒｐ、ｌａｃまたはｔｅｔプロモーターの一部を含むハイブリッドプロモーター、ホルモン反応性プロモーター（例えば、米国特許第６，３７９，９４５号に記載されるものなどのエクジソン反応性プロモーター）、メタロチオニエンプロモーター（例えば、米国特許第６，４１０，８２８号）、例えば、サリチル酸、エチレン、チアミン、および／またはＢＴＨ（米国特許第５，６８９，０４４）などといった化学物質に対して反応性であり得る病因関連（ＰＲ）プロモーターまたはそのいくつかの組合せであり得る。誘導プロモーターは、明暗（米国特許第５，７５０，３８５号、同５，６３９，９５２号）、金属（Eukaryotic Cell 2:995〜1002頁(2003年)）または温度（米国特許第５，４４７，８５８号；AbeらPlant Cell Physiol. 49: 625〜632頁(2008年)；ShrodaらPlant J. 21:121〜131頁(2000年)）に対して反応性であり得る。前記のリストは、例示的なものであって、制限ではない。プロモーター配列は、宿主生物において機能性である限り、任意の生物に由来し得る。特定の実施形態では、誘導プロモーターは、例えば、宿主種において作動するプロモーターに誘導性を付与するために、既知誘導プロモーターに由来する１種または複数の部分またはドメインを、宿主細胞において作動し得る異なるプロモーターの少なくとも一部と融合することによって形成される。
【０１６２】
ラン藻類の形質転換には、それだけには限らないが、ａｒａ、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｃプロモーターならびにｔｒｃＹまたはｔｒｃＥプロモーターなどのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の付加によって誘導性である誘導体を含めた、ラン藻類において機能する種々のプロモーターが利用され得る。本発明において使用され得るその他のプロモーターとして、トランスポゾンによる、または細菌染色体による抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、スペクチノマイシンアデニルトランスフェラーゼなど、またはそれらの組合せ）と天然に関連しているプロモーター、種々の異種細菌および天然ラン藻遺伝子と関連しているプロモーター、ウイルスおよびファージ由来のプロモーター、合成プロモーターなど、またはそれらの組合せが挙げられる。例えば、プロモーター（複数可）は、真正細菌およびラン藻の種を含めたさまざまな種に由来する原核生物のプロモーター、例えば、ａｒａＣまたはｐＢＡＤプロモーター、ｒｈａプロモーター、Ｐｍプロモーター、ｘｙｌＳプロモーター、ｎｉｒプロモーター、ｎａｒプロモーターｐｈｏプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｃｙｓプロモーター、メタロチオニエンプロモーター、ｆｔｆプロモーター、ｇｌｎプロモーター、熱ショックプロモーター、低温誘導プロモーターまたはウイルス性プロモーターなどから選択され得る。前記のプロモーターは、例示的なものであって、制限ではない。使用され得るラン藻類から単離されるプロモーターとして、それだけには限らないが、以下：ｎｒｓ（ニッケル誘導性）、ｓｅｃＡ（分泌；細胞の酸化還元状態によって制御される）、ｒｂｃ（Ｒｕｂｉｓｃｏオペロン）、ｐｓａＡＢ（ＰＳ  Ｉ反応中心タンパク質；光調節される）、ｐｓｂＡ（ＰＳＩＩのＤｌタンパク質；光誘導性）など、およびそれらの組合せを挙げることができる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、窒素化合物によって調節される、例えば、ｎａｒ、ｎｔｃ、ｎｉｒまたはｎｒｔプロモーターなど。いくつかの実施形態では、プロモーターは、リン酸（例えば、ｐｈｏまたはｐｓｔプロモーター）または金属、例えば、ｎｒｓプロモーター（LiuおよびCurtis(2009年) Proc Natl Acad Sciences USA 106: 21550〜21554頁）またはｐｅｔＥプロモーター（BuikemaおよびHaselkorn(2001年) Proc Natl Acad Sciences USA 98:2729〜2734頁)）によって調節される。本発明の構築物において使用されるような誘導プロモーターは、上記のプロモーターおよび／または例えば、宿主種において作動するプロモーターに誘導性を付与するために、宿主生物において作動し得る異なるプロモーターの少なくとも一部に融合されたその他の誘導プロモーターの１つまたは複数の部分またはドメインを使用し得る。
【０１６３】
同様に、発現ベクター構築のためにさまざまな転写ターミネーターが使用され得る。可能性があるターミネーターの例として、それだけには限らないが、ｐｓｂＡ、ｐｓａＡＢ、ｒｂｃ、ｓｅｃＡ、Ｔ７コートタンパク質などおよびそれらの組合せを挙げることができる。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本発明の単離核酸分子または組換え核酸分子は、脱水素酵素をコードする核酸配列および脂質の合成に関与しているポリペプチド、例えば、チオエステラーゼまたはその他の脂質製造ポリペプチドをコードする核酸配列の両方を含み得る。脱水素酵素および脂質製造ポリペプチドをコードする核酸配列は、例えば、本明細書に記載される核酸配列のいずれかであり得る。特定の実施形態では、脱水素酵素をコードする核酸配列および脂質の製造に関与している脂質ポリペプチドをコードする核酸配列は、同一プロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結され得る。例えば、特定の実施形態では、２種の遺伝子（脱水素酵素および、例えば、チオエステラーゼをコードする）は、オペロンとして組織されてもよく、例えば、プロモーター配列に、５’から３’方向に、チオエステラーゼをコードする配列（またはその他のポリペプチドをコードする配列）、次いで、脱水素酵素をコードする配列が続く、逆もまた同様。脱水素酵素遺伝子および脂質合成のためのポリペプチドをコードする遺伝子を含むオペロンの上記の実施形態のいずれにおいても、１種または複数のさらなる調節配列が単離核酸分子中に含まれ得、例えば、翻訳を増強するための配列が、遺伝子をコードする配列のいずれかの上流に含まれ得、および／または転写ターミネーターが、所望により、合成オペロンの３’末端にまたはその付近に含まれ得る。
【０１６５】
脱水素酵素遺伝子および脂質の製造に関与しているポリペプチドをコードする遺伝子に加えて、１種または複数のさらなる遺伝子が、本明細書において提供されるような合成オペロン中に所望により含まれ得、１種または複数のさらなる遺伝子は、例えば、脂肪酸合成または脂肪酸合成もしくは脂質合成経路の酵素またはタンパク質をコードする１種もしくは複数のさらなる遺伝子および／または脂肪酸生成物合成を増強し得る酵素もしくはタンパク質をコードする１種もしくは複数の遺伝子、光合成または炭素固定を増強し得る１種もしくは複数の遺伝子および／または１種もしくは複数のリポーター遺伝子もしくは選択マーカーを含み得る。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、脱水素酵素をコードする核酸配列および脂質の製造に関与しているポリペプチドをコードする核酸配列が、同一核酸構築物で提供され得、それらは異なるプロモーターおよび／または転写エンハンサーと作動可能に連結される。プロモーターおよびエンハンサーは、例えば、本明細書に記載されるプロモーターおよび転写エンハンサーのいずれかであり得る。
【０１６７】
特定の実施形態では、脱水素酵素をコードする核酸配列を含むベクターは、ラン藻類への形質転換のために設計される。特定の実施形態では、ベクターは、脱水素酵素をコードする配列の、ラン藻ゲノムとの相同組換えを可能にする。
【０１６８】
本発明の単離核酸分子は、脱水素酵素またはその他のポリペプチドをコードする本明細書において開示される配列を、それだけには限らないが、発現ベクターなどのベクター中に含み得る。ベクターは、組換え手段および／または直接化学合成を含めたヒトの介入によって作製された核酸であり得、例えば、１種または複数の１）１種または複数の宿主における核酸配列の繁殖のための複製起点（製造宿主を含む場合も含まない場合もある）；２）１種または複数の選択マーカー；３）１種または複数のリポーター遺伝子；４）それだけには限らないが、プロモーター配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、翻訳を増強する配列などといった１種または複数の発現制御配列；および／または５）核酸配列の宿主ゲノムへの組込みを促進する１種または複数の配列、例えば、宿主微生物の１種または複数のヌクレオチド配列と相同性を有する１種または複数の配列を含み得る。ベクターは、宿主細胞における特定の核酸の転写および／または翻訳を可能にする１種または複数の指定の核酸「発現制御エレメント」を含む発現ベクターであり得る。ベクターは、プラスミド、プラスミドの一部、ウイルス構築物、核酸断片などまたはそれらの組合せであり得る。
【０１６９】
ベクターは、高コピー数ベクター、２種以上の細胞において複製し得るシャトルベクター、発現ベクター、組込みベクターまたはそれらの組合せであり得る。通常、発現ベクターは、「発現カセット」において、プロモーターと作動可能に連結された対象の遺伝子を含む核酸を含み得、これは、それだけには限らないが、転写ターミネーター、リボソーム結合部位、スプライシング部位またはスプライシング認識配列、イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入部位および同様のエレメントも含み得る。いくつかの実施形態によれば、本発明は、異種プロモーターの制御下に対象の遺伝子を含む単離核酸で形質転換された組換え微生物を含み得る。あるいは、ベクターが、対象の遺伝子を含む単離核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含有しない場合には、単離核酸は、相同組換え、部位指定組込みおよび／またはベクター組込みによって、内因性プロモーターと作動可能に連結されるようになるように、微生物または宿主細胞に形質転換され得る。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本発明は、１種または複数の発現制御エレメントと作動可能に連結している対象の遺伝子を含む単離核酸で形質転換された組換え微生物または宿主細胞をさらに提供する。いくつかの例では、組換え微生物の繁殖の間の特定の時点でタンパク質を発現すること、例えば、組換え微生物の成長または増殖に対する任意の有害な効果を最小にすることおよび／またはトリグリセリドまたは対象の脂肪酸生成物の製造を最大にすることが有利であり得る。このような例では、組換え微生物または宿主細胞中に導入された１種または複数の外因性遺伝子は、特定の刺激に応じて作動可能に連結された遺伝子の転写を媒介する誘導プロモーターと作動可能に連結され得る。
【０１７１】
形質転換ベクターは、さらに、またはあるいは、それだけには限らないが、薬物耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、代謝酵素および／または宿主の生存にとって必要な因子（例えば、栄養要求性マーカー）などまたはそれらの組合せなどの選択マーカーを含み得る。形質転換された細胞は、耐性カセットまたは栄養要求性マーカーを欠く細胞が成長できない条件下で抗生物質および／またはその他の選択マーカーの存在下で成長する能力に基づいて選択され得る。さらに、非選択マーカーが、蛍光タンパク質または検出可能な反応生成物を生成する酵素をコードする遺伝子などのベクター上に存在し得る。
【０１７２】
微生物および宿主細胞の形質転換
対象の遺伝子を含む単離核酸を含むベクターは、従来の形質転換および／またはトランスフェクション技術によってラン藻類中に導入され得る。本関連において使用されるような、用語「形質転換」、「トランスフェクション」、「コンジュゲーション」および「形質導入」は、リン酸カルシウムおよび／または塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、ナチュラルコンピテンス、化学的に媒介される転移、エレクトロポレーション、微粒子銃など、またはそれらの組合せを含めた、外来核酸（例えば、外因性ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための当業者に公知の多様な方法を含むものとする。宿主細胞の形質転換および／またはトランスフェクションのための適した方法の例は、例えば、Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2010)、Cold Spring Harbor Laboratory Pressに見出すことができる。
【０１７３】
本発明において使用するための植物などの宿主細胞は、制限するものではないが、アグロバクテリウム（Agrobacterium）の使用、パーティクルガン媒介性形質転換、レーザー媒介性形質転換またはエレクトロポレーションを含めた任意の実現可能な手段によって形質転換され得る。藻類および光合成細菌は、限定されない例として、ナチュラルＤＮＡ取り込み（Chungら(1998年) FEMS Microbiot Lett. 164:353〜361頁；Frigaardら(2004年) Methods Mol. Biol. 274: 325〜40頁；Zangら(2007年) J. Microbiol. 45:241〜245頁)、コンジュゲーション(Wolkら(1984年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81、1561〜1565頁)、形質導入、ガラスビーズ形質転換(Kindleら(1989年) J. Cell Biol. 109:2589〜601頁；Fengら(2009年) Mol. Biol. Rep. 36:1433〜9頁；米国特許第５，６６１，０１７号）、シリコンカーバイドウィスカー形質転換（Dunahayら(1997年) Methods Mol. Biol.(1997年) 62: 503〜9頁）、遺伝子銃（Dawsonら(1997年) Curr. Microbiol. 35: 356〜62頁；Hallmannら(1997年) Proc. Natl. Acad. USA 94:7469〜7474頁；Jakobiakら(2004年) Protist 155:381〜93頁；Tanら(2005年) J. Microbiol. 43: 361〜365頁；Steinbrennerら(2006年) Appl Environ. Microbiol. 72:7477〜7484頁；Kroth(2007年) Methods Mol. Biol. 390:257〜267頁；米国特許第５，６６１，０１７号）エレクトロポレーション（Kjaerulffら(1994年) Photosynth. Res. 41:277〜283頁；Iwaiら(2004年) Plant Cell Physiol. 45:171〜5頁；Ravindranら(2006年) J. Microbiol. Methods 66:174〜6頁；Sunら(2006年) Gene 377:140〜149頁；Wangら(2007年) Appl. Microbiol. Biotechnol. 76:651〜657頁；Chaurasiaら(2008年) J. Microbiol. Methods 73:133〜141頁；Ludwigら(2008年) Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:729〜35頁）、レーザー媒介性形質転換または任意のポリ（アミドアミン）デンドリマーの存在下、またはそれで前処理した後のＤＮＡととものインキュベーション（Pasupathyら(2008年) Biotechnol. J. 3: 1078〜82頁）、ポリエチレングリコール（Ohnumaら(2008年) Plant Cell Physiol. 49:117〜120頁）、陽イオン性脂質（Muradawaら(2008年) J. Biosci. Bioeng. 105:77〜80頁）、デキストラン、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム（Mendez-Alvarezら(1994年) J. Bacteriol. 176:7395〜7397頁）、所望により、細胞壁分解酵素で細胞を処理した後（Perrone ら(1998年) Mol. Biol. Cell 9: 3351〜3365頁）を含めた、任意の適した方法によって形質転換され得る。アグロバクテリウム媒介性形質転換はまた、例えば、藻類細胞壁を除去または傷づけた後に、藻類細胞で実施され得る（例えば、ＷＯ２０００／６２６０１；Kumarら(2004年) Plant Sci. 166: 731〜738頁）。遺伝子銃法は、植物および真核生物の藻類種の葉緑体の形質転換にとって特に上首尾である（例えば、Rameshら(2004年) Methods Mol. Biol. 274: 355〜307頁；Doestchら(2001年) Curr. Genet. 39:49〜60頁；米国特許第７，２９４，５０６号；ＷＯ２００３／０９１４１３；ＷＯ２００５／００５６４３；およびＷＯ２００７／１３３５５８を参照のこと、すべて参照によりその全文が本明細書に組み込まれる）。
【０１７４】
脂肪酸生成物を製造する方法
本発明は、脱水素酵素が発現され、少なくとも１種の脂肪酸生成物が製造される条件下で脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む本明細書において記載されるような組換え微生物を培養することによって脂肪酸生成物を製造する方法を包含する。方法は、少なくとも１種の脂肪酸生成物を単離することをさらに含み得る。脱水素酵素をコードする非天然遺伝子の発現は、培養期間の間、所望により、誘導され得る。所望により、組換え微生物によって製造される脂肪酸および／または脂肪酸誘導体の少なくとも一部は、微生物によって成長培地中に放出または分泌され得る。
【０１７５】
脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質の製造に関与しているポリペプチドをコードする少なくとも１種の非天然遺伝子を含む組換え微生物を、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質の製造のためのポリペプチドをコードする少なくとも１種の遺伝子が発現される条件下で培養して脂質を製造することを含む、脂質を製造する方法も、本明細書において提供される。方法は、少なくとも１種の脂質を単離することをさらに含み得る。脂質は、例えば、脂肪酸生成物であり得る。
【０１７６】
本明細書において提供される方法のいずれにおいても、非天然脱水素酵素遺伝子を含む組換え微生物の培養物は、対照微生物が、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含まない点を除いて、非天然脱水素酵素遺伝子を含む組換え微生物の培養物とすべての点において同一である対照微生物の対照培養物によって製造されるものよりも多くの脂質（例えば、脂肪酸生成物）を製造し得る。本明細書において提供される方法のいずれにおいても、非天然脱水素酵素遺伝子を含む組換え微生物は、対照微生物が、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含まない点を除いて、非天然脱水素酵素遺伝子を含む組換え微生物に対してすべての点で同一である対照微生物よりも高い繁殖および／または増殖速度を有する。例えば、非天然脱水素酵素遺伝子を含む組換え微生物の培養物は、１、２、３、４、５、６日または７日以上培養した後に、対照培養物によって達成されるものよりも高い細胞密度を達し得る。本方法において使用される組換え微生物は、光合成微生物であり得、培養は、無機炭素が、培養物の増殖および脂質の製造のための炭素の実質的に唯一の供給源である光独立栄養条件下であり得る。
【０１７７】
いくつかの例では、非天然脱水素酵素遺伝子および少なくとも１種の非天然脂質製造遺伝子を含む組換え微生物によって多量に製造される脂質（例えば、脂肪酸生成物）は、微生物によって天然には製造されない脂質、例えば、脂肪酸生成物などの脂質の製造に関与しているポリペプチドをコードする少なくとも１種の非天然遺伝子を欠く同一種の微生物によって製造されない脂質であり得る。
【０１７８】
放出および分泌は、本発明の生成物に関連して本明細書において、能動および／または受動輸送機構が、本発明の生成物が細胞膜を越えて細胞の外に出ることを可能にするプロセスを指すよう同義的に使用される。このような輸送機構の例として、それだけには限らないが、勾配拡散、促進拡散、能動輸送およびそれらの組合せを挙げることができる。
【０１７９】
培養は、選択されたおよび／または制御された条件の使用による、１種または複数の細胞の成長（例えば、細胞の大きさ、細胞内容物および／または細胞活性の増大）および／または繁殖（例えば、有糸分裂による細胞数の増加）の意図的な育成を指す。成長および繁殖の両方の組合せは、増殖と呼ばれ得る。本明細書において実施例において実証されるように、脂質製造細胞による脱水素酵素遺伝子の発現は、非天然脱水素酵素遺伝子を含まない脂質製造細胞の培養物に対して、培養物の細胞密度の増大をもたらす。
【０１８０】
組換え微生物を培養するために使用され得る選択されたおよび／または制御された条件の限定されない例は、定義された培地（ｐＨ、イオン強度および／または炭素供給源などの既知の特徴を有する）、指定の温度、酸素圧、二酸化炭素レベル、バイオリアクターにおける成長など、またはそれらの組合せの使用を含む。いくつかの実施形態では、微生物または宿主細胞は、還元炭素供給源を使用して従属栄養的に、または光および還元炭素供給源の両方を使用して混合栄養的に成長させられ得る。さらに、またはあるいは、微生物または宿主細胞は、光栄養的に培養され得る。光栄養的に成長する場合には、微生物は、エネルギー供給源として光を有利に使用し得る。ＣＯ２または重炭酸などの無機炭素供給源は、微生物によって生体分子の合成のために使用され得る。「無機炭素」は、本明細書において、生物によって持続可能なエネルギー供給源として使用され得ない炭素含有化合物または分子を含む。通常、「無機炭素」は、ＣＯ２（二酸化炭素）、炭酸、重炭酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩など、またはそれらの組合せの形態であり得、これらは、持続可能なエネルギーのためにさらに酸化され得ず、生物による還元力の供給源として使用され得ない。光独立栄養的に成長する微生物は、無機炭素が実質的に唯一の炭素の供給源である培養培地で成長させられ得る。例えば、無機炭素が実質的に唯一の炭素の供給源である培養物では、培養培地中に提供され得る任意の有機炭素分子または化合物は、細胞によって、エネルギーのために吸収および／または代謝され得ない、および／または細胞培養物の成長および増殖のための持続可能なエネルギーを提供するのに十分な量で存在しないのいずれかである。
【０１８１】
本発明の方法に従って有用であり得る微生物および宿主細胞は、世界中の種々の場所および環境において見出され得る。最適繁殖ならびに脂質および／またはその他の炭化水素成分の生成のための特定の成長培地は、変わり得、成長、繁殖または脂質などの生成物の製造を促進するよう最適化され得る。いくつかの場合には、微生物の特定の株は、微生物または宿主細胞の特定の株の、いくつかの阻害成分の存在またはいくつかの必須栄養必要量の不在のために、特定の成長培地では成長できない場合がある。
【０１８２】
微生物のさまざまな株に適した特定の培地の調製のための使用説明書にあるように、固体および液体成長培地は、一般に、さまざまな供給源から入手可能である。例えば、種々の新鮮な水および塩水培地として、Barsanti(2005年)Algae:Anatomy、Biochemistry & Biotechnology、CRC Press for media and Methods for culturing algaeに記載されるものを挙げることができる。藻類培地処方はまた、限定されない例として、ＵＴＥＸ培養物収集物（ｗｗｗ．ｓｂｓ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕ／ｕｔｅｘ／ｍｅｄｉａ．ａｓｐｘ）（２０１１年９月２０日に訪問した）、藻類および原生動物（Protozoa）の培養物収集物（ｗｗｗ．ｃｃａｐ．ａｃ．ｕｋ）（２０１１年９月２０日に訪問した）；およびカテドラ・ボタニキー（Katedra Botaniky）（ｂｏｔａｎｙ．ｎａｔｕｒ．ｃｕｎｉ．ｃｚ／ａｌｇｏ／ｃａｕｐ−ｍｅｄｉａ．ｈｔｍｌ）（２０１１年９月２０日に訪問した）を含めた種々の藻類培養収集物のウェブサイトで見出され得る。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、脂肪酸を製造する生物を培養するために使用される培地は、例えば、標準ＢＧ−１１培地（ＡＴＣＣ培地６１６、表５）、またはＡＴＣＣ培地８５４（ビタミンＢ１２を含有するよう修飾されたＢＧ−１１）もしくはＡＴＣＣ培地６１７（さらなるＮａＣｌおよびビタミンＢ１２を含有する、海洋ラン藻類のために修飾されたＢＧ−１１）などの修飾された培地などの標準培地処方と比較して、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、ベリリウム、鉛、鉄、ニッケル、コバルト、スズ、クロム、アルミニウム、亜鉛、銅など、またはそれらの組合せ（マグネシウム、カルシウム、および／または鉄などの特に多価の金属）などの金属（通常、塩として、および／またはイオン形態で提供される）の濃度の増大を含み得る。
【０１８４】
例えば、遊離脂肪酸を製造する成長する微生物に使用される培地は、標準培地と比較して、少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、２倍から１０倍の間および／または１０倍から１００倍の間の量の金属（例えば、カルシウム）を含み得る。遊離脂肪酸を製造し得る成長する微生物に使用される培地は、処方中に、例えば、少なくとも０．５ｍＭ、約０．５ｍＭから約１ｍＭの間、約１ｍＭから約２ｍＭの間、約２ｍＭから約５ｍＭの間、約５ｍＭから約１０ｍＭの間、約１０ｍＭから約２５ｍＭの間および２５ｍＭ超の金属（例えば、カルシウム）を含み得る。例えば、培地中に過剰量の金属（例えば、カルシウム）を使用することによって、脂肪酸（複数可）の少なくとも一部が石鹸沈殿物として捕捉され得、これは遊離脂肪酸（複数可）の毒性効果の低減をもたらし得る。培地中への金属（例えば、カルシウム）の添加は、さらに、またはあるいは、比較的高い濃度の遊離脂肪酸を有する培地中の微生物の耐性を増大し得る。さらに、またはあるいは、脂肪酸製造株は有利なことに、過剰の金属（例えば、カルシウム）含量を用いた場合に、より強固であり得る。過剰の成分は、金属として本発明において記載されているが、成分は、より一般には、カルボン酸塩対イオン供給源、例えば、石鹸形成性対イオン供給源、金属イオン供給源（本明細書において「金属」と記載される）、多価（すなわち、＋２以上の原子価を有する）対イオン供給源、二価対イオン供給源またはそれらのいくつかの組合せとして記載され得るということは考慮される。この金属／カルボン酸塩対イオン供給源に関するその他の詳細は、２０１１年１２月１３日に出願された「Culturing a Microorganism in a Medium with an Elevated Level of a Carbocylate Counterion Source」と題された、同時係属中の、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１３／３２４，６３６号に記載されている。
【０１８５】
培養方法は、記載されるような脱水素酵素遺伝子および脂肪酸生成物およびトリグリセリドの製造および／または微生物における代謝経路の調節に関与しているタンパク質をコードする遺伝子の一方または両方の発現を誘導することを含み得る。発現を誘導することは、栄養分または化合物を培養物に添加すること、培養培地から１種または複数の成分を除去すること、光および／または温度を増大または低減することおよび／または対象の遺伝子の発現を促進するその他の操作を含み得る。このような操作は、対象の遺伝子と作動可能に連結された（異種）プロモーターの性質に大きく依存し得る。
【０１８６】
本発明のいくつかの実施形態では、組換え微生物または宿主細胞は、バイオリアクターにおいて培養され得る。「バイオリアクター」とは、所望により、懸濁液中で、懸濁される場合には、好ましくは、水性液中で細胞が培養されるエンクロージャまたは部分的エンクロージャを指す。バイオリアクターは、微細藻類細胞を、その生理学的周期の種々の相にわたって培養するために使用され得る。バイオリアクターは、従属栄養成長および繁殖方法において使用するのに多数の利点を提供し得る。食物として使用するためのバイオマスを製造するには、微生物または宿主細胞は、好ましくは、例として、懸濁培養物中などの液体中で多量に発酵される。スチール発酵装置などのバイオリアクターは、極めて多量の培養容積を収容し得る（４０，０００リットル以上の能力のバイオリアクターが、本発明の種々の実施形態において使用され得る）。バイオリアクターはまた、通常、温度、ｐＨ、酸素圧、二酸化炭素レベルなど、ならびにそれらの組合せなどの１種または複数の培養条件の制御を可能にし得る。バイオリアクターは、通常、例えば、管類と結合しているポートを使用して設定可能であり、ＣＯ２、ＣＯ２が豊富な空気、酸素および／または窒素などのガス状成分が、液体培地と接触される（例えば、バブリングされる）のを可能にし得る。培養培地のｐＨ、微量元素および／または栄養分の同一性および／または濃度、その他の培地成分の同一性および／または濃度など、またはそれらの組合せなどのその他の培養パラメータは、通常、バイオリアクターを使用してより容易に操作され得る。
【０１８７】
微生物および宿主細胞は、さらに、またはあるいは、人工光源を備えたバイオリアクター、「フォトバイオリアクター」中で培養され得、および／または日光を含めた光が、許容される微生物成長および増殖を可能にする、促進する、および／または維持するのに十分なほど透明である１種もしくは複数の壁を有し得る。脂肪酸生成物またはトリグリセリドの製造のために、光合成微生物または宿主細胞は、さらに、またはあるいは、振盪フラスコ、試験管、バイアル、マイクロタイターディッシュ、ペトリディッシュなど、またはそれらの組合せ中で培養され得る。
【０１８８】
さらに、またはあるいは、組換え光合成微生物または宿主細胞は、池、運河、海上成長容器、溝、水路、流れなど、またはそれらの組合せ中で成長させられ得る。標準バイオリアクターと同様、それだけには限らないが、空気、ＣＯ２が豊富な空気、燃焼排ガスなど、またはそれらの組合せを含めた無機炭素（例えば、それだけには限らないが、ＣＯ２、重炭酸、炭酸塩など）の供給源が、培養物に供給され得る。ＣＯ２に加えてＣＯを含有し得る無機の燃焼排ガスおよび／またはその他の供給源を供給する場合には、（フォト）バイオリアクター中に導入されるＣＯレベルが、微生物の成長、増殖および／または生存に対して危険なおよび／または致死的用量を構成しないよう、このような供給源を前処理することが必要であり得る。
【０１８９】
本方法は、光合成微生物などの組換え微生物、例えば、本明細書において記載されるような脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む微細藻類またはラン藻などを培養して、少なくとも１種の脂肪酸生成物を製造することを含み、方法は、同一条件下で培養された、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含まない、そうでなければ同一である微生物の培養によって製造される脂肪酸生成物の量よりも、少なくともまたは約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％または１０００％多い、培養による製造をもたらす。さらに、またはあるいは、方法は、本明細書において記載された組換え微生物を培養することによって、１リットルの脂肪酸生成物の培養物あたり、少なくとも１００ｍｇ、少なくとも１１０ｍｇ、少なくとも１２０ｍｇ、少なくとも１３０ｍｇ、少なくとも１４０ｍｇ、少なくとも１５０ｍｇ、少なくとも１６０ｍｇ、少なくとも１７０ｍｇ、少なくとも１８０ｍｇ、少なくとも１９０ｍｇ、少なくとも２００ｍｇ、少なくとも２１０ｍｇ、少なくとも２２０ｍｇ、少なくとも２３０ｍｇ、少なくとも２４０ｍｇ、少なくとも２５０ｍｇ、少なくとも２６０ｍｇ、少なくとも２７０ｍｇ、少なくとも２８０ｍｇ、少なくとも２９０ｍｇ、少なくとも３００ｍｇ、少なくとも３１０ｍｇ、少なくとも３２０ｍｇ、少なくとも３３０ｍｇ、少なくとも３４０ｍｇ、少なくとも３５０ｍｇ、少なくとも３６０ｍｇ、少なくとも３７０ｍｇ、少なくとも３８０ｍｇ、少なくとも３９０ｍｇ、少なくとも４００ｍｇ、少なくとも４５０ｍｇ、少なくとも５００ｍｇ、少なくとも５５０ｍｇ、少なくとも６００ｍｇ、少なくとも６５０ｍｇ、少なくとも７００ｍｇ、少なくとも７５０ｍｇ、少なくとも８００ｍｇ、少なくとも８５０ｍｇ、少なくとも９００ｍｇ、少なくとも９５０ｍｇの脂肪酸生成物を製造することを含む。何度も、目的は、できるだけ多くの脂肪酸生成物を製造および／または回収することであり得るが、いくつかの場合には、本明細書において記載される方法によって製造および／または回収される脂肪酸生成物の量は、１リットルの培養物あたり約２ｇ以下、例えば、１リットルの培養物あたり１．５ｇ以下、１リットルの培養物あたり１ｇ以下、１リットルの培養物あたり８００ｍｇ以下、１リットルの培養物あたり６００ｍｇ以下、例えば、１リットルの培養物あたり約５５０ｍｇ以下または１リットルの培養物あたり約５００ｍｇ以下に制限され得る。
【０１９０】
脂肪酸生成物は、当業者に公知の回収手段によって、例えば、有機溶媒を使用する全培養物抽出などによって、培養物から回収され得る。いくつかの場合には、脂肪酸生成物の回収は、細胞の均質化によって増強され得る。例えば、脂肪酸、脂肪酸誘導体および／またはトリグリセリドなどの脂質は、２０１２年２月２９日に出願され、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、「Solvent Extraction of Products from Algae」と題された、同時係属中の、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１３／４０７，８１７号に記載されるように、高温および／または高圧で溶媒を用いる藻類の抽出によって藻類から単離され得る。
【０１９１】
脂肪酸生成物が、微生物から培養培地中に十分に放出または分泌される場合には、放出された脂肪酸生成物のみ、微生物内で製造され、貯蔵された脂肪酸生成物のみ、または製造され、放出された脂肪酸生成物の両方を効率的に回収するよう、回収方法が適応され得る。上記の組換え微生物によって培養培地中に分泌／放出された脂肪酸生成物は、種々の方法で回収され得る。例えば、不混和溶媒を使用する分配による直接的な単離方法が、使用され得る。さらに、またはあるいは、粒状吸着剤が使用され得る。これらは、回収方法の設計に応じて親油性粒子および／またはイオン交換樹脂を含み得る。それらは、別個の培地中を循環し、次いで、収集され得、および／または培地は、これらの粒子を含有する固定層カラム、例えば、クロマトグラフィーカラム上を通され得る。次いで、脂肪酸生成物は、例えば、適当な溶媒の使用によって粒状吸着剤から溶出され得る。このような状況において、１つの単離方法は、溶媒の蒸発を実施することと、続いて、単離された脂肪酸生成物をさらに処理して、種々の商業的目的のために使用され得る化学物質および／または燃料を得ることを含み得る。
【０１９２】
いくつかの例では、脂肪酸生成物、例えば、Ｃ８−Ｃ２４脂肪酸、Ｃ１０−Ｃ２２脂肪酸またはＣ１２−Ｃ１８脂肪酸、例えば、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６および／またはＣ１８脂肪酸のうち少なくとも１種などのレベルは、そうでなければ同一であるが、非天然脱水素酵素遺伝子を欠く微生物または宿主細胞の培養物に対して、培養物中で増大され得る。本発明は、本発明の方法によって製造される遊離脂肪酸、脂肪酸誘導体またはグリセロ脂質を含む組成物をさらに含む。
【０１９３】
さらに、またはあるいは、本発明は、以下の実施形態のうち１つまたは複数を含み得る。
【０１９４】
実施形態１。組換え微生物の培養物が、対照微生物が脱水素酵素をコードする第１の非天然ヌクレオチド配列を含まない点を除いて、第１および第２の非天然ヌクレオチド配列を含む組換え微生物に対してすべての点で同一である微生物の対照培養物によって製造されるものよりも、多量の脂質を製造し、組換え微生物が、脂質が製造される条件下で対照微生物よりも高い繁殖および／または増殖速度を有する、脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列を含む第１の非天然核酸分子および脂質生合成に関与しているポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも１つの第２の非天然核酸分子を含む組換え微生物。
【０１９５】
実施形態２。脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素、アセトアルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素、コハク酸塩脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、αケトグルタル酸脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、Ｄ−グリセリン酸脱水素酵素、バンコマイシン耐性タンパク質Ｈ、Ｄ−２−ホスホグリセリン酸脱水素酵素、Ｄ−乳酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素およびソルビトール脱水素酵素からなる群から選択され、および／または
脱水素酵素が、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１８または配列番号１９、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に従う組換え微生物。
【０１９６】
実施形態３。脂質生合成に関与しているポリペプチドが、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、４−ヒドロキシベンゾイル−チオエステラーゼ、脂質分解活性を有するポリペプチド、アルデヒド形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼ、アルデヒド形成性アシル−ＡＣＰレダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、アルコール形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼ、アルコール形成性アシル−ＡＣＰレダクターゼ、ワックスシンターゼ、デカルボニラーゼ、デカルボキシラーゼ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＰＡＰおよびＤＧＡＴからなる群から選択され、さらに所望により、脂質が、遊離脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、アルケン、脂肪酸エステル、ワックスエステル、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリドおよびトリアシルグリセリドからなる群から選択される脂肪酸生成物である、実施形態１または２に従う組換え微生物。
【０１９７】
実施形態４。第１の非天然核酸分子が、配列番号４、配列番号６または配列番号７に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％から１００％の間の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルデヒド脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列と、
配列番号１８または配列番号１９に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％から１００％の間の同一性を有するアミノ酸配列を含むメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列と、
配列番号２または配列番号２９に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％から１００％の間の同一性を有するアミノ酸配列を含むＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列と、
配列番号１５または配列番号１６に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％から１００％の間の同一性を有するアミノ酸配列を含むＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列と、
配列番号１０または配列番号１１に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％から１００％の間の同一性を有するアミノ酸配列を含むホスホグルコン酸脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列と、
配列番号１３に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％から１００％の間の同一性を有するアミノ酸配列を含むホスホグルコン酸脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列と
を含む、これまでの実施形態のいずれかに従う組換え微生物。
【０１９８】
実施形態５。脱水素酵素をコードする第１の非天然核酸分子および脂質の製造に関与しているポリペプチドをコードする第２の非天然核酸分子を含む組換え微生物の培養物が、対照微生物が、脱水素酵素をコードする第１の非天然ヌクレオチド配列を含まない点を除いて、第１の非天然ヌクレオチドおよび第２の非天然ヌクレオチド配列を含む組換え微生物に対してすべての点で同一である微生物の対照培養物によって製造されるものよりも多い量の脂質を製造し、脂質が、第２の非天然核酸分子を含まない組換え微生物と同一種または株の微生物によって製造されない脂肪酸生成物である、これまでの実施形態のいずれかに従う組換え微生物。
【０１９９】
実施形態６。組換え微生物が、光合成微生物である、これまでの実施形態のいずれかに従う組換え微生物。
【０２００】
実施形態７。光合成微生物が、所望により、アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロカプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カマエシフォン属（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロコッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナリウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（Cyanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シアノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シリンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsis）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミエラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオセイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iyengariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノストック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillatoria）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プレウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieria）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、トリコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）またはゼノコッカス属（Xenococcus）からなる群から選択されるラン藻であるか、または光合成微生物が、所望により、アクナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォラ属（Amphora）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Asteromonas）、ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオコッカス属（Botryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス属（Chaetoceros）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロロコッカム属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（Chlorella）、クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、クリコスファエラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、クリプトモナス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモスファエラ属（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（Euglena）、フランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサムニオン属（Gloeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属（Halocafeteria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、レポシンクリス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィジウム属（Monoraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（Nannochloropsis）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロクロリス属（Nephrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzschia）、オクロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイスティス属（Oocystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova）、パラクロレラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラム属（Phaeodactylum）、ファガス属（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラチモナス属（Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス属（Pleurococcus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、シュードネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）、ピロボトリス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、シゾクラミデラ属（Schizochlamydella）、スケレトネマ属（Skeletonema）、スピロギラ属（Spyrogyra）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラクロレラ属（Tetrachlorella）、テトラセルミス属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viridiella）およびボルボックス属（Volvox）からなる群から選択される微細藻類である、これまでの実施形態のいずれかに従う組換え微生物。
【０２０１】
実施形態８。脱水素酵素をコードする第１の核酸分子の発現が、第１の核酸を欠く、そうでなければ同一である微生物におけるＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ＋の比に対して、ＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ＋の細胞内比を増大し、例えば、ここで、細胞内ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比は、第１の核酸を欠く、そうでなければ同一である微生物よりも約５％高い、約１０％高い、約２０％高い、約３０％高い、約４０％高い、約６０％高い、約８０％高い、約１００％高い、約１５０％高い、約２００％高い、約３００％高い、約５００％高い、約７００％高い、約９００％高い、約１０００％高い、または約２０００％高い、実施形態６または７に従う組換え光合成微生物。
【０２０２】
実施形態９。組換え微生物の培養物が、前記の第１の核酸を欠く、そうでなければ同一である微生物の培養物と比較して、約１％多い、約５％多い、約１０％多い、約２０％多い、約３０％多い、約４０％多い、約５０％多い、約６０％多い、約７０％多い、約８０％多い、約９０％多い、約１００％多い、約２００％多い、約５００％多い、約７００％多い、約１０００％多い、または約２０００％多い脂肪酸生成物を製造する、実施形態６〜８のいずれか１つに従う組換え光合成微生物。
【０２０３】
実施形態１０。組換え光合成微生物が、前記の第１の非天然核酸分子を欠く、そうでなければ同一である光合成微生物よりも約５％高い、約１０％高い、約２０％高い、約３０％高い、約４０％高い、約６０％高い、約８０％高い、約１００％高い、約１５０％高い、約２００％高い、４００％高い、約６００％高い、約８００％高い、約１０００％高い、または少なくとも２０００％高い複製速度を有する、実施形態６〜９のいずれか１つの組換え光合成微生物。
【０２０４】
実施形態１１。所望により、脂質が、遊離脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、アルケン、脂肪酸エステル、ワックスエステル、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリドおよびトリアシルグリセリドからなる群から選択される脂肪酸生成物である、脂質を製造するのに十分な時間量の間、適した培養培地において、これまでの実施形態のいずれか１つに従う組換え微生物を培養することを含む、脂質を製造する方法。
【０２０５】
実施形態１２。組換え微生物が、光合成微生物であり、組換え光合成微生物が、光独立栄養的に培養される、実施形態１１に従う方法。
【０２０６】
実施形態１３。脱水素酵素をコードする核酸および脂質の製造に関与しているポリペプチドをコードする核酸配列の一方または両方の発現を誘導することを含む、実施形態１１または１２に従う方法。
【０２０７】
実施形態１４。方法が、培養物から脂質を回収することをさらに含む、実施形態１１〜１３のいずれかに従う方法。
【０２０８】
実施形態１５。脂質を製造する微生物において脱水素酵素をコードする組換え核酸分子を発現させることと、微生物の成長および／または増殖を支援する条件下で微生物を培養することを含み、微生物の成長および／または増殖速度が、同一条件下で培養され、対照微生物が脱水素酵素をコードする組換え核酸分子を発現しない点を除いて、組換え微生物に対してすべての点において同一である対照微生物のものよりも大きい、脂質を製造する微生物の成長および／または増殖速度を増大する方法。
【０２０９】
実施形態１６。培養物が、３、４、５または６日の培養後に、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を欠く点を除いて、すべての点において同一である微生物の同一培養物によって達せられる培養密度よりも高い光学濃度に達する、実施形態１１〜１５のいずれかに従う方法。
【０２１０】
実施形態１７。所望により、組換え微生物が、光合成組換え微生物であり、培養物が、実質的な量の還元炭素供給源を含まない、実施形態１〜１０のいずれか１つの組換え微生物を含む細胞培養物。
【０２１１】
実施形態１８。配列番号２または配列番号２９に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子。
実施例
【実施例１】
【０２１２】
微生物による脂肪酸製造を増強できるタンパク質をコードする遺伝子の同定のためにスクリーニングを設計した。ナイルブルースクリーニングは、テキサス州ラグーナマドレ（Laguna Madre、Texas）において水路から採取した環境サンプルから得られたＤＮＡ断片を含有するメタゲノムライブラリーの形質転換のためのバックグラウンドとして、クフェア・カルタゲンシス（Cuphea carthagenensis）由来のＣｃ１ＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのＮ末端切断型を保持していた大腸菌（E. coli）Ｔｏｐ１０株を使用した（シネコシスティス属（Synechocystis）のためにコドン最適化されたヌクレオチド配列、配列番号２０、アミノ酸配列配列番号２１；参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／００２０８８３を参照のこと）。プレートベースのアッセイを使用して、１０μｇ／ｍＬのナイルブルーＡ（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ、ＭＡ番号Ａ１７１７４）を含有する固体培地で遊離脂肪酸を製造する組換え大腸菌（E. coli）コロニーを同定した。ナイルブルーは脂肪酸を青色に染める。プレートを標準光ボックス上に置くことによって、コロニーを目視検査によって染色について調べた。ＣｃｌＦａｔＢ１チオエステラーゼを発現したが、ライブラリー断片を含まないバックグラウンド対照を上回る高レベルのナイルブルーＡ染色を示すコロニーを選択し、成長させ、さらにスクリーニングして、遊離脂肪酸検出キット（番号ＳＦＡ−１、Ｚｅｎｂｉｏ、Ｉｎｃ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ＮＣ）を使用して総非エステル化遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の量を決定した。
【０２１３】
ナイルブループレートアッセイにおいてバックグラウンド対照を上回る上昇した遊離脂肪酸レベルを示す大腸菌（E. coli）クローンの遊離脂肪酸含量を、続いて、遊離脂肪酸検出キットを用いるアッセイによって、フレームイオン化検出を用いるガスクロマトグラフィー（ＧＣ）（ＧＣ−ＦＩＤ）によってさらに解析した。ＧＣ−ＦＩＤ解析においてバックグラウンド対照を上回る上昇した遊離脂肪酸レベルを示す２００種の分離菌を選択し、クローンのヌクレオチド配列を決定した。これらの分離菌では、クローニングされた断片は、それらの配列の生物情報学解析に基づいて、各々、１つから少なくとも５つのオープンリーディングフレーム（有望な遺伝子）を含有していた。ＤＮＡ塩基配列決定し、重複性クローンを除去した後、配列を再度解析して、反復するタンパク質ドメインを同定した。「ＮＢ」と示されたクローンは、ナイルブルーアッセイから単離された。南カリフォルニアのソルトン湖の北に位置するパシフィックアクアファーム（Pacific Aquafarms）の池から採取した水サンプルからのＤＮＡの単離から作製されたメタゲノムライブラリーを使用する、脂肪酸の増強された生合成を検出するための別個の遺伝子アッセイも実施し、その結果、クローンＢ１０が単離された（表１）。
【０２１４】
いくつかのクローンを、脱水素酵素ドメインを含有するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有すると同定した（表１）。クローンＢ１０およびＮＢ１０６は、Ｄ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードする配列を含むと同定し；ＮＢ８およびＮＢ１１２は、アルデヒド脱水素酵素をコードすると同定し；ＮＢ１０４は、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素をコードすると同定した。したがって、機能的スクリーニングにおいて単離された、クローニングされた断片において、３種の別個の種類の脱水素酵素をコードする遺伝子を同定した。
【０２１５】
【表１】
2015517811.tif 000002
【０２１６】
Ｂ１０挿入部分は、１５９．３のビットスコアおよび４．２  ｅ−４７のｅ値を有する、Ｐｆａｍ  ０２８２６（「Ｄ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、ＮＡＤ結合ドメイン」、ギャザリングカットオフ、２５．１）に属すると同定されたポリペプチド（配列番号２）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号１）を含んでいた。Ｂ１０  ＯＲＦは、ポリモーフム・ギルバム（Polymorphum gilvum）ＳＬ００３Ｂ−２６Ａ１のＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、ＮＡＤ結合タンパク質（遺伝子ＩＤ：３２８５４２５９３；受託ＹＰ＿００４３０２７０２）と６４％同一である；ラブレンジア・アレクサンドリー（Labrenzia alexandrii）ＤＦＬ−１１のＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（遺伝子ＩＤ：２５４５０３４３３；受託ＺＰ＿０５１１５５８４）と５７％同一である；スタッピア・アグレガタ（Stappia aggregata）ＩＡＭ１２６１１４の２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（遺伝子ＩＤ：１１８４３８９６３；受託ＺＰ＿０１５４５６６６）と５６％同一である；マリノモナス属（Marinomonas）種ＭＷＹＬ１のＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＮＡＤ結合）（遺伝子ＩＤ：５３６７８４６；受託ＹＰ＿００１３４２１３３）と５５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。Ｂ１０  ＯＲＦの最初の１２個のアミノ酸（配列番号２）は、ポリモーフム・ギルバム（Polymorphum gilvum）Ｄ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、ＮＡＤ結合タンパク質の最初のアミノ酸であるメチオニンの上流であり、したがって、これらのアミノ酸は、Ｂ１０  ＯＲＦによってコードされる天然タンパク質の一部ではない可能性があり、コードされるポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１３〜３２６を含む可能性が高い。配列番号２９は、配列番号２のアミノ酸１３〜３２６に相当する。
【０２１７】
ＮＢ１０６挿入部分は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）のＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＺＰ＿０５５９７４０３；配列番号１６）のアミノ酸１〜１３７と同一であるポリペプチド（配列番号１５）をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号１４）を含んでいた。このポリペプチド配列は、５７．６のビットスコアおよび７．８  ｅ−１６のｅ値を有する、Ｐｆａｍ  ＰＦ００３８９（「Ｄ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、触媒ドメイン」、ギャザリングカットオフ、２４．６）に入った。ＮＢ１０６  ＯＲＦ（配列番号１４）によってコードされるポリペプチドに対して相同性を有するさらなるＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素として、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２のＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＺＰ＿０５６４８１９９；ＥＥＶ３１５３２）（７９％の同一性）；エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ＡＴＣＣ  １２７５５のＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＺＰ＿０８１４５０１１；ＥＧＣ６９９１２）（７８％の同一性）；カルノバクテリウム属（Carnobacterium）種ＡＴ７のＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＺＰ＿０２１８５８９３；ＥＤＰ６７３４８）（７２％の同一性）；エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）Ｅ１６３６のＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＺＰ＿０６６９５３４５；ＥＦＦ２３３２１）（７８％の同一性）；ペディオコッカス・アシディラクチシ（Pediococcus acidilactici）７＿４の２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＺＰ＿０６１９６１８１；ＥＦＡ２７３２４）（６３％の同一性）；ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）ＡＴＣＣ３６７の２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＹＰ＿７９４３４３；ＡＢＪ６３３１２）（６３％の同一性）；ラクトバチルス・コレオホミニス（Lactobacillus coleohominis）１０１−４−ＣＨＮの２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＺＰ＿０５５５３０１３；ＥＥＵ３０２３３）（６４％の同一性）；およびクロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）ＮＣＩＭＢ８０５２のＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＹＰ＿００１３０９３１６．１  ＧＩ１５００１７０６２）（７５％の同一性）が挙げられる。
【０２１８】
ＮＢ８挿入部分は、２８０．５のビットスコアおよび１．４  ｅ−８３のｅ値を有する、Ｐｆａｍ  ００１７１（「アルデヒド脱水素酵素」、ギャザリングカットオフ、２３．０）に属すると同定されたポリペプチド（配列番号４）をコードするＯＲＦ（配列番号３）を含んでいた。挿入部分の最も５’の末端で始まるＯＲＦは、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）チューリンゲンシス（thuringiensis）血清型アルデヒドレダクターゼ（遺伝子ＩＤ：１１８４３８９６３；受託ＺＰ＿０１４３２００４；配列番号７）のアミノ酸９５〜４５５に対して少なくとも９９％の同一性を有する。ＯＲＦが、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）アルデヒドレダクターゼ（配列番号７）の最もＮ末端の９０〜１００のアミノ酸に対して相同なアミノ酸を失っているので、ＮＢ８は、末端切断型バチルス（Bacillus）アルデヒドレダクターゼをコードすると思われる。さらに、発現実験が実施された場合に実現されなかったクローニングエラーのために、このＯＲＦの一部のみを、シネコシスティス属（Synechocystis）における発現のために組込みベクター中にクローニングした。したがって、バチルス（Bacillus）アルデヒド脱水素酵素のＮ末端の９４個のアミノ酸およびＣ末端の１０８個のアミノ酸を欠くポリペプチド（配列番号６）をコードするＮＢ８部分ＯＲＦ（配列番号５）の発現が、増殖および脂肪酸製造性に対して効果を実証したので（実施例２を参照のこと）、配列番号７（バチルス（Bacillus）アルデヒド脱水素酵素）のアミノ酸Ｎ末端からアミノ酸９５およびアミノ酸３４７のＣ末端は、活性にとって必要でないと思われる。配列番号４に対して配列相同性を有するアミノ酸配列を含むその他のバチルス（Bacillus）アルデヒド脱水素酵素として、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）ベルリナー（berliner）血清型のｙｗｄＨアルデヒド脱水素酵素（遺伝子ＩＤ：２２８９３８４９９；受託ＺＰ＿０４１５０１１０８）（９９％の同一性）；バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）ＩＢＬ２００のｙｗｄＨアルデヒド脱水素酵素（遺伝子ＩＤ：２２８９０７０１３；受託ＺＰ＿０４０７０８７９）（９８％の同一性）；バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）ＩＢＬ４２２２のアルデヒド脱水素酵素（ＮＡＤ）ファミリータンパク質（遺伝子ＩＤ：２２８８９９９６２；受託ＺＰ＿０４０６４２０１）（９８％の同一性）；バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）クルスタキ（kurstaki）血清型のアルデヒド脱水素酵素ｙｗｄＨ（遺伝子ＩＤ：２２８９５１７６４；ＺＰ＿０４１１３８６３）（９８％の同一性）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０８７６のアルデヒド脱水素酵素ｙｗｄＨ（遺伝子ＩＤ：２２９１８９４６５；ＺＰ＿０４３１６４８２）（９８％の同一性）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）ヒュアゾンゲンシス（huazhongensis）血清型のアルデヒド脱水素酵素ｙｗｄＨ（遺伝子ＩＤ：２２８９２００９６；ＺＰ＿０４０８３４４５）（９８％の同一性）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）のアルデヒド脱水素酵素（ＮＡＤ）ファミリータンパク質（遺伝子ＩＤ：２０６９６７８５２；ＺＰ＿０３２２８８０８）（９８���の同一性）およびバチルス・セレウス（Bacillus cereus）１７２５６０Ｗのアルデヒド脱水素酵素ｙｗｄＨ（遺伝子ＩＤ：２２９１７７７９１；ＺＰ＿０４３０５１６４）（９７％の同一性）が挙げられる。配列番号４に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルデヒド脱水素酵素として、バチルス・サイトトキシカス（Bacillus cytotoxicus）ＮＶＨ３９１−９８のアルデヒド脱水素酵素（遺伝子ＩＤ：５３４４０５６；ＹＰ＿００１３７４３２７）（８２％の同一性）；バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＷＳＨ−００２のアルデヒド脱水素酵素（遺伝子ＩＤ：３４５４４４９７３；ｇｂ  ＡＥＮ８９９９０）（６２％の同一性）；バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）Ｒｏｃｋ３−１７のアルデヒド脱水素酵素ｙｗｄＨ（遺伝子ＩＤ：２２８９９６４８８  ＺＰ＿０４１５６１２７）（８１％の同一性）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）ＡＨ６２１のアルデヒド脱水素酵素ｙｗｄＨ（ｇｉ  ２２９１６６２１７；  ＺＰ＿０４２９３９７７）（８９％の同一性）およびバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）株アル・ハカム（Al Hakam）のアルデヒド脱水素酵素（ＮＡＤ（Ｐ）＋）（ｇｉ  １１８４７６８５８；ＹＰ＿８９４００９）（９０％の同一性）が挙げられる。
【０２１９】
ＮＢ１１２挿入部分は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）のメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＹＰ＿００１４２３２３８；配列番号１９）に対して９８％の同一性を有するポリペプチド（配列番号１８）の一部をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号１７）を含んでいた。このポリペプチド配列は、２０３．７のビットスコアおよび３  ｅ−６０のｅ値を有する、Ｐｆａｍ  ＰＦ００１７１（「アルデヒド脱水素酵素」、ギャザリングカットオフ、２３．０）に入った。ＮＢ１１２  ＯＲＦ（配列番号１８）によってコードされるポリペプチドに対して相同性を有するさらなるメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素として、バチルス・アトロファエウス（Bacillus atrophaeus）１９４２のメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＹＰ＿００３９７５４２６；ＡＤＰ３４４９５）（９２％の同一性）；バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＡＴＣＣ１４５８０のメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＹＰ＿０８１３２３；ｇｉ  ５２０８２５３２）（８９％の同一性）；パエニバチルス・デンドリティフォルミス（Paenibacillus dendritiformis）Ｃ４５４のメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＺＰ＿０９６７６６３６）（８４％の同一性）；パエニバチルス・テラエ（Paenibacillus terrae）ＨＰＬ−００３のメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＹＰ＿００５０７５５４６；ＡＥＴ５９３２３）（８３％の同一性）；バチルス・クラウシー（bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６のメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＹＰ＿１７３９２５；ＢＡＤ６２９６４）（８０％の同一性）；リステリア菌（Listeria monocytogenes）ＦＳＬ  Ｆ２−２０８のメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＥＦＲ８５８２７）（７９％の同一性）；リステリア・マーシー（Listeria marthii）ＦＳＬ  Ｓ４−１２０のメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＺＰ＿０７８６９６５７；ＥＦＲ８８８４７）（７９％の同一性）；およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）ＬＡＡ１のメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＺＰ  ０３４９５１８１；ＥＥＤ０６１２５）（７０％の同一性）が挙げられる。
【０２２０】
ＮＢ１０４挿入部分（配列番号８）は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（例えば、ＺＰ＿０５２１２５３；配列番号１１）の一部として同定されたポリペプチド（配列番号１０）をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号９）を含んでいた。このポリペプチド配列は、５５．４のビットスコアおよび４．４  ｅ−１５のｅ値を有する、Ｐｆａｍ  ００３９３（「ホスホグルコン酸脱水素酵素」、ギャザリングカットオフ、２０．４）に入った。ＮＢ１０４オープンリーディングフレームは、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（配列番号１１）のアミノ酸１３〜３１１に対して１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする。ＮＢ１０４  ＯＲＦ（配列番号１０）によってコードされるポリペプチドに対して相同性を有するさらなる６−ホスホグルコン酸脱水素酵素として、カルノバクテリウム属（Carnobacterium）種ＡＴ７の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（遺伝子ＩＤ：１６３７９１４８７；ＺＰ＿０２１８５８９４；５６％の同一性）、アナエロコッカス・バギナリス（Anaerococcus vaginalis）ＡＴＣＣ５１１７０の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（遺伝子ＩＤ：２５６５４６０４４；ＺＰ＿０５４７３３９８；５１％の同一性）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（遺伝子ＩＤ：２５７８６７２５９；ＺＰ＿０５６４６９１２；５１％の同一性）およびクロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）ＮＣＩＭＢ  ８０５２の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素様タンパク質（遺伝子ＩＤ：１５００１７０６１；ＹＰ＿００１３０９３１５；４９％の同一性）が挙げられる。
【実施例２】
【０２２１】
ＮＢ８、ＮＢ１０４およびＢ１０株を含めた、配列決定されたクローンのいくつかのクローニングしたＤＮＡ断片（ＩＰＴＧ誘導性ｔｒｃＹプロモーター（配列番号２２）の制御下）を、続いて、異なる遺伝子座に組み込まれたＣｃ１ＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を含んでいたシネコシスティス属（Synechocystis）ＰＣＣ  ６８０３に形質転換した。
【０２２２】
Ｎ末端切断型Ｃｃ１ＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子（配列番号２０）を、大腸菌（E. coli）のＰ１５Ａ複製起点、シネコシスティス属（Synechocystis）６８０３への相同組換えのための「ＲＳ１アップ」（配列番号２４）および「ＲＳ１ダウン」（配列番号２５）断片、ＩＰＴＧ誘導性ｔｒｃＥによって駆動されるＣｕｐｈｅａ  Ｃｃ１ＦａｔＢ１チオエステラーゼ遺伝子のｌａｃＩＱレプレッサーおよび選択のためのカナマイシン耐性マーカーを含んでいた、シネコシスティス属（Synechocystis）組込みベクターＹＣ２８（配列番号２３）にクローニングした。ベクターのセグメントのＰＣＲ増幅のためのＤＮＡ供給源材料は、シネコシスティス属（Synechocystis）ゲノムＤＮＡ、ｐＵＣ−１９ベクター、ｐＡＣＹＣ−１８４ベクターおよび合成されたクフェア属（Cuphea）Ｃｃ１ＦａｔＢ１遺伝子（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ）を含有するベクターに由来する。
【０２２３】
実施例１に記載された機能的スクリーニングによって、脱水素酵素をコードする配列（またはその一部）を有すると同定された断片を過剰発現するために、発現ベクターも構築した。Ｂ１０  ＯＲＦ（配列番号１）、ＮＢ１０４コンティグ断片（配列番号８）およびＮＢ１０４  ＯＲＦ（配列番号９）を、ラン藻組込みベクターｐＳＧＩ−ＹＣ６３（配列番号２８）と相同な、約１５ｂｐの配列を含有するプライマーを使用するライブラリースクリーニングにおいて同定された「コンティグ」クローンから独立に増幅した。ＮＢ８部分ＯＲＦ断片（配列番号５）も、ｐＳＧＩ−ＹＣ６３組込みベクターにクローニングした。ｐＳＧＩ−ＹＣ６３は、選択のためのスペクチノマイシンマーカー、シネコシスティス属（Synechocystis）のＲＳ２部位における組込みのための相同な「ＲＳ２アップ」（配列番号２６）および「ＲＳ２ダウン」（配列番号２７）アーム、ｔｒｃＹプロモーターを調節するためのｌａｃＩＱレプレッサー（配列番号２２）および大腸菌（E.coli）繁殖のためのｐＵＣ複製起点を含有していた。
【０２２４】
Ｃｃ１ＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子構築物および脱水素酵素ＯＲＦ構築物を、ラン藻類に導入するために、シネコシスティス属（Synechocystis）種ＰＣＣ６８０３細胞を、実質的な量の還元炭素供給源を含まないＢＧ−１１培地において、約０．７〜０．９のＯＤ（７３０ｎｍ）に培養した。培養物の約１０ｍＬを、およそ２０００ｇで１５分間遠沈させ、細胞ペレットを１ｍＬの新鮮ＢＧ−１１培地に再懸濁した。細胞の３００μｌのアリコートを約１００ｎｇの組込みベクターを用いて形質転換した。細胞を明所（８０μＥ）で約６時間インキュベートし、次いで、Ｍｉｎｉｐｏｒｅフィルター上に広げ、抗生物質を含有しないＢＧ−１１寒天プレートの頂部に置いた。プレートを約８０μΕの光の下、約３０℃で約２４時間インキュベートした。次いで、フィルターを、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを有する新鮮ＢＧ−１１  １．５％寒天プレート上に移し、７日間培養した。シネコシスティス属（Synechocystis）種ＰＣＣ６８０３のコロニーを選びとり、新規寒天プレート上にパッチした。シネコシスティス属（Synechocystis）ゲノムへの組込みのために推定脱水素酵素をコードする構築物を、抗生物質選択が、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンに加えて２０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含んでいた点を除いて同一の手順を使用してＣｃ１ＦａｔＢ１で形質転換された株に形質転換した。
【０２２５】
Ｃｃ１ＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子および脱水素酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む培養物を、約６０ｕＥの光を用い、一定に振盪および１％  ＣＯ２を用いて成長させた。誘導時のＯＤは、０．６であった。培養物を１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導した。株を、１．５ｍＬの初期容量を有する４ｍＬのガラスバイアル中で成長させた。６日の最後に、バイアル中に約１ｍＬの培養物が残る全バイアル（蒸発損失のために）をガスクロマトグラフィーに付した。６８０３のＲＳ２部位に組み込まれたＣｃＦａｔＢ１チオエステラーゼ遺伝子を有する（ＴｒｃＹプロモーターの制御下に）が、外因性脱水素酵素遺伝子を保持しない株は、対照として働いた。
【０２２６】
遊離脂肪酸を、フレームイオン化検出を用いるガスクロマトグラフィー（ＧＣ）（ＧＣ−ＦＩＤ）によって解析した。ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）で内張りされたキャップ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてキャップされた４ｍＬバイアル中の１ｍＬの培養物を、分析のためにＡｎａｌｙｔｉｃａｌに付した。遊離脂肪酸Ｃ９：０、Ｃ１３：０およびＣ１７：０を各々、ヘキサン中６００μｇ／ｍｌの濃度で含む８４マイクロリットルの内部標準（Ｉ．Ｓ．）セットを培養サンプルに添加し、続いて、８３マイクロリットルの５０％  Ｈ２Ｓ０４、１６７マイクロリットルの５Ｍ  ＮａＣｌおよび１．４ミリリットルのヘキサンを添加した。各Ｉ．Ｓの最終濃度は、サンプル容量に対して５０μｇ／ｍｌとした。Ｉ．Ｓ．セットを作製するための脂肪酸は、ＦｌｕｋａまたはＮｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ、Ｉｎｃから購入した。遊離脂肪酸の変動する反応を考えて、３種のＩ．Ｓ．を使用した。Ｃ８：０およびＣ１０：０は較正されｗ／Ｃ９：０  Ｉ．Ｓ．；Ｃ１２：０およびＣ１４：０は、Ｃ１３：０  Ｉ．Ｓ．を使用し；残りのＣ１６：０から１８：２  ｃｉｓ９，１２は、Ｃ１７：０  Ｉ．Ｓ．を使用した。試薬およびＩ．Ｓ．添加後に、培養物を、マルチチューブボルテクサーで、２，５００ｒｐｍで３０分間ボルテックス処理した。バイアルを最終的に、２５００ｒｐｍで３分間遠心分離して、有機相および水相間の良好な分離を提供した。ヘキサン層をＧｅｒｓｔｅｌ  ＭＰＳ２Ｌオートサンプラーによってサンプリングした。脂肪酸サンプルを、Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＤＢ−ＦＦＡＰキャピラリーカラム（１０ｍの長さ、０．１０ｍｍの内径、０．１０μｍのフィルム厚）を含むＦＩＤ（フレームイオン化検出器）を備えたＡｇｉｌｅｎｔモデル７８９０Ａガスクロマトグラフで解析した。ＧＣオーブンを、以下の通りにプログラムした：１２０℃で０．１分、次いで、４０℃／分で２４０℃に加熱した（３分間維持）。インジェクター温度は、２５０℃で維持し、４０：１スプリット１．０μｌインジェクションを使用した。キャリヤーガスとして水素を０．５９９９ｍｌ／分の流速で使用した。ＦＩＤは３２０Ｃに設定した。分析物は、個々にインジェクトされた標準に対する保持時間の比較によって同定した。分析物の較正範囲は、Ｃ８：０−Ｃ１６：１脂肪酸について２．５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、Ｃ１８：０−Ｃ１８：２脂肪酸について０．６２５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌとした。各分析物の定量化限界は、Ｃ１８：０、Ｃ１８：ｌ  ｃｉｓ９（１．２５ｕｇ／ｍＬ）およびＣ１８：２  ｃｉｓ９，１２（２．５μｇ／ｍＬ）を除く、較正範囲に列挙される最低濃度とした。全細胞培養物への添加および回収実験は、抽出方法によって、Ｃ１６：１  ｃｉｓ９（７４％）、Ｃ１８：１  ｃｉｓ９（６３％）およびＣ１８：２  ｃｉｓ９，１２（６４％）を除いて、このサンプルバッチ実施中の各分析物について８５％〜１１５％内で一貫して回収されたことを示した。
【０２２７】
これらの操作されたシネコシスティス属（Synechocystis）株によって製造された遊離脂肪酸の総量が、図１に提供されている。Ｃｃ１ＦａｔＢ１チオエステラーゼをコードする配列（配列番号２０）とともに、Ｂ１０  ＯＲＦ（「ｄｅｈｙｄｒｄ」；配列番号１）、ＮＢ８部分ＯＲＦ断片（配列番号５）、ＮＢ１０４  ＯＲＦ（「６−Ｐ−ｄｅ」；配列番号９）およびＮＢ１０４  ＯＲＦ全コンティグ断片（配列番号８）を発現するシネコシスティス属（Synechocystis）株は、ＣｃｌＦａｔＢ１チオエステラーゼ遺伝子単独を含有していた対照株と比較して、高レベルの遊離脂肪酸を製造したということがわかる。図２は、スクリーニングから得られた、ＣｃｌＦａｔＢ１チオエステラーゼおよび脱水素酵素遺伝子を含むこの実験株において、スクリーニングが、ＣｃｌＦａｔＢ１チオエステラーゼを発現したが、脱水素酵素遺伝子を欠いた株の細胞密度よりも４〜５倍高い培養物を達成できたことを実証する。
【実施例３】
【０２２８】
脂肪酸製造を増強した遺伝子を発現させる効果をさらに調べるために、Ｂ１０（２−ヒドロキシ酸脱水素酵素ＮＡＤ結合ドメインタンパク質）遺伝子およびＮＢ１０４（６−ホスホグルコン酸脱水素酵素）遺伝子を、ＣｃｌＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子と一緒に発現するよう操作されたシネコシスティス属（Synechocystis）株を、細胞の酸化還元状態を変更するその能力について評価した。対照として、ＲＳ２部位にＣｃ１ＦａｔＢ１遺伝子が組み込まれた組込みベクターｐＳＧＩ−ＹＣ６３（１Ａ／ＹＣ６３）を、さらなる脱水素酵素遺伝子を有さない独立したシネコシスティス属（Synechocystis）６８０３株において発現させた。導入遺伝子（「６８０３」）を有さないシネコシスティス属（Synechocystis）６８０３を、さらなる対照として含めた。細胞を、６０μＥの一定光条件下で、振盪しながら成長させ、０．５のＯＤ７３０で１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することによって誘導し、チオエステラーゼを、存在する場合には、推定脱水素酵素を発現させた。サンプルを２４時間毎に３日間収集した。
【０２２９】
脱水素酵素遺伝子を用いて操作されたシネコシスティス属（Synechocystis）株および対照株の酸化還元状態を決定するために、酵素アッセイを実施して、誘導後１、２および３日で採取したサンプルでＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比を決定した。この目的には、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ定量化キット（Ｂｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用した。アッセイキット中の酵素は、酵素サイクリング反応においてＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを特異的に認識する。アッセイのために、各時点について、およそ１．５×１０７個の細胞を、アッセイキットとともに提供される１ｍｌのＮＡＤＰＨ抽出バッファー中に溶解した。細胞を、液体窒素中の２回の凍結／解凍サイクルおよび４ラウンドのビードビーティング（bead beating）に付した。次いで、溶解物を遠心分離し、上清を１０Ｋカットオフカラムで濾過した。すべての光合成色素およびＮＡＤＰＨを消費し得る酵素は、フィルター膜上に保持される。濾液は、小さな代謝産物のみからなり、ＮＡＤＰＨアッセイにおいて使用した。アッセイキットは、総ＮＡＤＰ（ＮＡＤＰ＋およびＮＡＤＰＨ）ならびにＮＡＤＰＨの測定を可能にした。ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比は、総ＮＡＤＰからＮＡＤＰＨの量を差し引いて、ＮＡＤＰ＋の量を提供すること、次いで、ＮＡＤＰＨの量を、ＮＡＤＰ＋の算出された量によって除することによって決定した。
【０２３０】
アッセイ結果は、図３に要約されている。図３は、連続する実験日でのＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ＋の比を示す。対照株野生型シネコシスティス属（Synechocystis）ＰＣＣ６８０３では、ＮＡＤＰＨは、培養における各さらなる日数につれて、ＮＡＤＰ＋に対して減少する。外因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｃｃ１ＦａｔＢ１を発現する株は、野生型細胞と比較した場合に、ＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ＋の比の著しい低下を示す。これは、脂肪酸生合成プロセスが広範な還元力を必要とすると知られているので予測された。しかし、この実験では、外来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現する株への脱水素酵素遺伝子の付加は、ＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ＋の比を増大し、ＮＢ１０４（６−ホスホグルコン酸脱水素酵素）遺伝子は、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比に対して、Ｂ１０（２−ヒドロキシ酸脱水素酵素ＮＡＤ結合ドメインタンパク質）遺伝子よりも大きな効果を有する。ＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ＋の比は、野生型レベルには入らないが、アシルＡＣＰチオエステラーゼ単独を発現する株よりも少なくとも２倍高い。
【０２３１】
したがって、ＣｃｌＦａｔＢ１チオエステラーゼととものシネコシスティス属（Synechocystis）６８０３におけるＢ１０  ＯＲＦまたはＮＢ１０４  ＯＲＦの発現は、細胞のＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比を高め（図３）、６日での培養密度によって測定されるような株の高い増殖速度を可能にし（図２）、すべての鎖長の遊離脂肪酸の高い製造にもつながった（図１）。ＮＢ１０４  ＯＲＦは、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、ペントースリン酸経路の酵素の一部（図４）をコードする。この経路は、６Ｃ糖からヌクレオチドおよび核酸生合成において使用される５Ｃ糖を製造する。ペントースリン酸経路は、脂肪酸生合成などの細胞内の還元性整合性反応のために使用される、ＮＡＤＰＨの形態の還元性等価物の生成において役立つ。
【実施例４】
【０２３２】
メタゲノムライブラリーから得られたＮＢ１０４  ＯＲＦは、エンテロコッカス（Enterococcus）６−ホスホグルコン酸脱水素酵素の一部をコードしていた。シネコシスティス属（Synechocystis）種ＰＣＣ６８０３から得られた６−ホスホグルコン酸脱水素酵素酵素遺伝子（配列番号１２）の過剰発現も試験して、エンテロコッカス属（Enterococcus）由来の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子と同一効果を発揮するかどうかを調べた。したがって、シネコシスティス（Synechocystis）６−ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子ｓｌｌ０２３９（受託ＢＡＡ１０１０５；ＧＩ：１００１４７９；配列番号１２）をＹＣ６３構築物中にクローニングし、これでは、ｔｒｃＹプロモーターの制御下に置かれ、ｔｒｃＥプロモーター（配列番号３０）によって調節され、ＲＳ１部位で組み込まれているＣｃｌＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を発現するシネコシスティス属（Synechocystis）株のＲＳ２部位に組み込まれる。得られた株を、ｔｒｃＹプロモーターからアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子（ＲＳ２部位で組み込まれた）のみを発現した対照シネコシスティス属（Synechocystis）種ＰＣＣ６８０３株とともに、脂肪酸製造について試験した。この実験では、高いレベルの遊離脂肪酸製造を得るよう高い密度に達した後に株を誘導した。手短には、５．０  ＯＤ等価細胞を遠沈させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび適当な抗生物質を含有する新鮮なＢＧ１１培地に再懸濁した。最終培養容量は１．５ｍｌとした。これらの株を、４ｍＬガラスバイアル中で、一定に振盪しながら、６０ｕＥの光強度および１％  ＣＯ２を用いて成長させた。細胞が比較的高密度で誘導され、誘導下で６日間培養されるこの実施例では、相同なシネコシスティス（Synechocystis）脱水素酵素遺伝子の発現はまた、遊離脂肪酸の量を増大した（図５）。サンプルの脂肪酸解析を、実施例２におけるように実施した。
【０２３３】
天然シネコシスティス（Synechocystis）６−ホスホグルコン酸脱水素酵素酵素は、ＣｃｌＦａｔＢ１チオエステラーゼ単独を発現する株と比較して、ＦＦＡを少なくとも２倍増大した（図５）。模様の入ったバーは、シネコシスティス属（Synechocystis）において、ＣｃｌＦａｔＢ１とともにクローニングされた天然シネコシスティス（Synechocystis）６８０３  ６−ホスホグルコン酸脱水素酵素酵素に相当する。したがって、本発明者らは、光独立栄養的に（培養物の成長または増殖を支援する還元炭素供給源を伴わずに）培養された光合成微生物を含めた生物における、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素などのＮＡＤＰＨ生成性脱水素酵素の過剰発現は、増殖速度を改善し、培養物による遊離脂肪酸の全体的な収率を増強すると結論付ける。
【０２３４】
概要および要約の節は、発明者によって考慮される１つまたは複数ではあるが、すべてではない本発明の例示的実施形態を示し得、したがって、決して、本発明および添付の特許請求の範囲を制限するよう意図するものではない。
【０２３５】
特定の実施形態の前記の説明は、他者が、当技術分野の技術の範囲内の知識を適用することによって、過度の実験を行うことなく、本発明の一般概念から逸脱することなく、このような特定の実施形態を容易に修飾および／または種々の適用のために適応させることができる本発明の一般的な性質を示す。したがって、このような適応および修飾は、本明細書において示された教示および指針に基づいて、開示された実施形態の等価物の意味および範囲内にあるものとし、本発明の広がりおよび範囲は、上記の例示的実施形態のいずれかによって制限されてはならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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