(57)【要約】  酵素電気化学系センサ内で使用されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）高分子補酵素は、懸垂基としてポリマー主鎖に共有結合されたＮＡＤ部分を含む。酵素電気化学系バイオセンサは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）高分子補酵素、高分子電子移動剤（例えば、高分子フェロセン）少なくとも１つの作用電極、及び少なくとも１つの参照電極を備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素電気化学系バイオセンサであって、
懸垂基としてポリマー主鎖に共有結合されたＮＡＤ部分を含むニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）高分子補酵素と、
高分子電子移動剤と、
少なくとも１つの作用電極と、
少なくとも１つの参照電極と、を備える、酵素電気化学系バイオセンサ。
【請求項２】
前記ＮＡＤ高分子補酵素及び前記高分子電子移動剤が、両方とも固定化構成にある、請求項１に記載の酵素電気化学系バイオセンサ。
【請求項３】
前記ポリマー主鎖が所定のモノマーを含む、請求項１又は２に記載の酵素電気化学系バイオセンサ。
【請求項４】
前記所定のモノマーがアクリルアミドモノマーである、請求項３に記載の酵素電気化学系バイオセンサ。
【請求項５】
前記所定のモノマーが、ヒドロキシエチルメタクリレート、ビニルピロリドン、（３−（メタクリロイルアミノ）プロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、（２−メタクリロイルオキシ）エチル）トリメチルアンモニウムクロリド、ナトリウム−４−スチレンスルホネート、アクリル酸、Ｎ，Ｎ’−ジエチルアクリルアミド、及びＮ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドからなるモノマー群から選択される、請求項３に記載の酵素電気化学系バイオセンサ。
【請求項６】
前記ＮＡＤ高分子補酵素が、以下の化学構造を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素電気化学系バイオセンサ：
【化１】
2015517114.tif 000005
式中、
ｎは１又は２であり、
Ｘ及びＹは、任意の好適な数であってもよく、
Ｒ（Ｒ−ｏｘ）の酸化形態は、以下の化学構造
【化２】
2015517114.tif 000006
を有し、
Ｒ（Ｒ−ｒｅｄ）の還元形態は、以下の化学構造
【化３】
2015517114.tif 000007
を有する。
【請求項７】
ｎが１と等しい、請求項６に記載の酵素電気化学系バイオセンサ。
【請求項８】
ｎが２と等しい、請求項６に記載の酵素電気化学系バイオセンサ。
【請求項９】
前記ＮＡＤ高分子補酵素が、１，０００ｋｇ／ｍｏｌ〜１，０００，０００ｋｇ／ｍｏｌの範囲内のＭＷを有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵素電気化学系バイオセンサ。
【請求項１０】
前記ＮＡＤ高分子補酵素が還元形態にある、請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵素電気化学系バイオセンサ。
【請求項１１】
前記ＮＡＤ高分子補酵素が酸化形態にある、請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵素電気化学系バイオセンサ。
【請求項１２】
前記ＮＡＤ高分子補酵素が、酸化還元補酵素として構成されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵素電気化学系バイオセンサ。
【請求項１３】
前記高分子電子移動剤が高分子フェロセンである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の酵素電気化学系バイオセンサ。
【請求項１４】
前記高分子電子移動剤が、
イオン性部分を含む親水性ポリマーと、
複数の取り付けられた酸化還元メディエーターと、を含む高分子量酸化還元ポリマーであり、
イオン性親水性高分子量ポリマーの分子量が１６ｋｇ／ｍｏｌを超える、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の酵素電気化学系バイオセンサ。
【請求項１５】
前記酸化還元メディエーターがフェロセンである、請求項１４に記載の酵素電気化学系バイオセンサ。
【請求項１６】
体液試料中の検体を判定するための方法であって、
体液試料が、ポリマー主鎖に懸垂基として共有結合されたＮＡＤ部分を含むニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）高分子補酵素と接触し、また高分子電子移動剤と接触するように、前記体液試料を酵素電気化学系バイオセンサに適用する工程と、
前記バイオセンサにより生成される電子信号に基づいて前記検体を判定する工程と、を含む、方法。
【請求項１７】
前記酵素電気化学系バイオセンサが、酵素電気化学系分析試験ストリップである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記検体がβ−ヒドロキシブチレートである、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリマー主鎖が所定のモノマーを含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記所定のモノマーがアクリルアミドモノマーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記所定のモノマーが、ヒドロキシエチルメタクリレート、ビニルピロリドン、（３−（メタクリロイルアミノ）プロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、（２−メタクリロイルオキシ）エチル）トリメチルアンモニウムクロリド、ナトリウム−４−スチレンスルホネート、アクリル酸、Ｎ，Ｎ’−ジエチルアクリルアミド、及びＮ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドからなるモノマー群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＮＡＤ高分子補酵素が、以下の化学構造を有する、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法：
【化４】
2015517114.tif 000008
式中、
ｎは、１又は２であり、
Ｘ及びＹは、任意の好適な数であってもよく、
Ｒ（Ｒ−ｏｘ）の酸化形態は、以下の化学構造
【化５】
2015517114.tif 000009
を有し、
Ｒ（Ｒ−ｒｅｄ）の還元形態は、以下の化学構造
【化６】
2015517114.tif 000010
を有する。
【請求項２３】
ｎが１と等しい、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ｎが２と等しい、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＮＡＤ高分子補酵素が、１，０００ｋｇ／ｍｏｌ〜１，０００，０００ｋｇ／ｍｏｌの範囲内のＭＷを有する、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＮＡＤ高分子補酵素が還元形態にある、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＮＡＤ高分子補酵素が酸化形態にある、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＮＡＤ高分子補酵素が、酸化還元補酵素として構成されている、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記高分子電子移動剤が、高分子フェロセンである、請求項１６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記高分子電子移動剤が、
イオン性部分を含む親水性ポリマーと、
複数の取り付けられた酸化還元メディエーターと、を含む高分子量酸化還元ポリマーであり、
イオン性親水性高分子量ポリマーの分子量が１６ｋｇ／ｍｏｌを超える、請求項１６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記酸化還元メディエーターがフェロセンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＮＡＤ高分子補酵素及び前記高分子電子移動剤が、両方とも固定化構成にある、請求項１６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に医療用装置、より詳細には、酵素電気化学系センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
液体試料中の検体の判定（例えば、検出及び／又は濃度測定）は医療分野において特に関心が寄せられている。例えば、尿、血液、血漿又は組織液などの体液の試料中のグルコース、ケトン体、ラクテート、コレステロール、リポタンパク質、トリグリセリド、アセトアミノフェン及び／又はＨｂＡ１ｃ濃度を判定することが望ましい場合がある。そのような判定は、例えば、視覚、測光又は電気化学的技術に基づくセンサを用いて達成することができる。従来の電気化学系分析試験ストリップは、例えば、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７０８，２４７号及び同第６，２８４，１２５号に記載されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示の第１の態様は、酵素電気化学系バイオセンサを提供し、前記センサは、
懸垂基としてポリマー主鎖に共有結合されたＮＡＤ部分を含む
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）高分子補酵素と、
高分子電子移動剤と、少なくとも１つの作用電極と、少なくとも１つの参照電極と、を備える。
【０００４】
本開示の第２の態様は、体液試料中の検体を判定するための方法を提供し、前記方法は、
体液試料が、懸垂基としてポリマー主鎖に共有結合されたＮＡＤ部分を含むニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）高分子補酵素と接触し、また高分子電子移動剤と接触するように、体液試料を酵素電気化学系バイオセンサに適用する工程と、
バイオセンサにより生成される電子信号に基づいて検体を判定する工程と、を含む。
【０００５】
酵素電気化学系バイオセンサは、酵素電気化学系分析試験ストリップであってもよい。検体は、β−ヒドロキシブチレートであってもよい。ＮＡＤ高分子補酵素及び高分子電子移動剤は、両方とも固定化構成にあってもよい。
【０００６】
ポリマー主鎖は、所定のモノマーを含んでもよい。所定のモノマーは、アクリルアミドモノマーであってもよい。所定のモノマーは、ヒドロキシエチルメタクリレート、ビニルピロリドン、（３−（メタクリロイルアミノ）プロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、（２−メタクリロイルオキシ）エチル）トリメチルアンモニウムクロリド、ナトリウム−４−スチレンスルホネート、アクリル酸、Ｎ，Ｎ’−ジエチルアクリルアミド、及びＮ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドからなるモノマー群から選択されてもよい。
【０００７】
ＮＡＤ高分子補酵素は、以下の化学構造を有してもよい。
【０００８】
【化１】
2015517114.tif 000002
式中、
ｎは、１又は２であり、
Ｘ及びＹは、任意の好適な数であってもよく、
Ｒ（Ｒ−ｏｘ）の酸化形態は、以下の化学構造を有してもよく、
【０００９】
【化２】
2015517114.tif 000003
Ｒ（Ｒ−ｒｅｄ）の還元形態は、以下の化学構造を有してもよい。
【００１０】
【化３】
2015517114.tif 000004
ｎは、１と等しくてもよい。代替的に、ｎは、２と等しくてもよい。
【００１１】
ＮＡＤ高分子補酵素は、１，０００ｋｇ／ｍｏｌ〜１，０００，０００ｋｇ／ｍｏｌの範囲内のＭＷを有してもよい。
【００１２】
ＮＡＤ高分子補酵素は、還元形態にあってもよい。代替的に、ＮＡＤ高分子補酵素は、酸化形態にあってもよい。ＮＡＤ高分子補酵素は、酸化還元補酵素として構成されていてもよい。
【００１３】
高分子電子移動剤は、高分子フェロセンであってもよい。
【００１４】
高分子電子移動剤は高分子量酸化還元ポリマーであってもよく、前記ポリマーは、
イオン性部分を含む親水性ポリマーと、複数の取り付けられた酸化還元メディエーターと、を含み、
イオン性親水性高分子量ポリマーの分子量は、１６ｋｇ／ｍｏｌを超える。酸化還元メディエーターは、フェロセンであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本明細書中に組み込まれ、本明細書の一部をなす添付図面は、本発明の好適な実施形態を示したものであって、上記に述べた一般的説明及び以下に述べる詳細な説明と共に、本発明の特徴を説明する役割を果たすものである。
【図１】官能化ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の合成の簡略化した化学的順序である。
【図２】ＮＡＤモノマーの合成の簡略化した化学的順序である。
【図３】本発明の実施形態で使用されるＮＡＤ高分子補酵素の合成の簡略化した化学的順序である。
【図４】本発明の実施形態で使用されるＮＡＤ高分子補酵素を含む酵素電気化学系バイオセンサのβ−ヒドロキシ酪酸に対する電流応答を示すグラフである。
【図５Ａ】本発明の一実施形態による酵素電気化学系センサ（即ち、電気化学系分析試験ストリップ）の簡略化した切断端面図、斜視図、及び分解斜視図である。
【図５Ｂ】本発明の一実施形態による酵素電気化学系センサ（即ち、電気化学系分析試験ストリップ）の簡略化した切断端面図、斜視図、及び分解斜視図である。
【図５Ｃ】本発明の一実施形態による酵素電気化学系センサ（即ち、電気化学系分析試験ストリップ）の簡略化した切断端面図、斜視図、及び分解斜視図である。
【図６】本発明の一実施形態による体液試料中の検体を判定するための方法における段階を示す流れ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下の詳細な説明は、図面を参照しつつ読まれるべきもので、異なる図面中、同様の要素は同様の符号にて示してある。図面は、必ずしも一定の比率ではないが、単に説明の目的で例示的な実施形態を表しており、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。詳細な説明は、本発明の原理を限定としてではなく、例として説明するものである。この説明は、当業者による本発明の作製及び使用を明確に可能とし、本発明を実施する最良のモードであると目下考えられるものを含む、本発明の数個の実施形態、適合物、変更物、代替物及び使用を説明する。
【００１７】
本明細書で任意の数値や数値の範囲について用いる「約」又は「およそ」という用語は、構成要素の部分又は構成要素の集合が、本明細書で述べるその所望の目的に沿って機能することを可能とするような適当な寸法の許容誤差を示すものである。
【００１８】
一般に、本発明の実施形態による酵素電気化学系センサ内で使用されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）高分子補酵素は、懸垂基としてポリマー主鎖（例えば、ポリアクリルアミド）に共有結合したＮＡＤ部分を含む。そのようなＮＡＤ高分子補酵素は、例えば高分子ＮＡＤ補酵素及び高分子電子移動剤を検体検出マトリックス内に固定化する技術を用いることにより、酸化還元補酵素として、本発明の実施形態による酵素電気化学系バイオセンサ（分析試験ストリップなどの）に容易に組み込まれ得る点で有益である。そのような酵素電気化学系バイオセンサは連続バイオセンサを含み、ＮＡＤ高分子補酵素を高分子電子移動剤と有益に組み合わせる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００６／００６９２１１号を参照されたい）。
【００１９】
図１は、官能化ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の合成の簡略化した化学的順序であり、式中、「ｎ」（図１に使用される）＝１又は２である。図２は、ＮＡＤモノマーの合成の簡略化した化学的順序であり、式中、「ｎ」（図１に使用される）＝１である。図３は、本発明の電気化学系バイオセンサ実施形態に使用され得るＮＡＤ高分子補酵素の合成の簡略化した化学的順序である。図３に使用されるように、「Ｘ」は、ＮＡＤ単量体反復単位の数を表す一方、「Ｙ」は、反復アクリルアミド単位の数を表す。ＮＡＤモノマー反復単位の数（即ち、「Ｘ」）は、任意の好適な数であってもよい。アクリルアミド反復単位の数（即ち、「Ｙ」）は、任意の好適な数であってもよい。
【００２０】
いったん本開示を知ると、当業者は、図１〜３は主鎖中にアクリルアミドコモノマーを含む特に有益なＮＡＤ高分子補酵素を示しているが、他の好適なモノマー（１つ又は複数）も使用できることを認識するであろう。そのような好適なモノマーとしては、例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート、ビニルピロリドン、（３−（メタクリロイルアミノ）プロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、（２−メタクリロイルオキシ）エチル）トリメチルアンモニウムクロリド、ナトリウム−４−スチレンスルホネート、アクリル酸、Ｎ，Ｎ’−ジエチルアクリルアミド、及びＮ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
これらの図面に示される合成を、図面を参照して以下に説明する。Ｎ６−カルボキシメチル−ＮＡＤ＋の合成は、以下の３工程プロセスを用いて達成された。
工程１：Ｎ１−カルボキシメチル−ＮＡＤ＋（ｎ＝１である、図１の２番目の構造）の合成。
５ｍｌのＢｉｏｔａｇｅマイクロ波反応管に、０．１Ｍ  ｐＨ  ７．０リン酸ナトリウム緩衝液（３．５ｍｌ）に予め溶解したＮＡＤ＋（１．０ｇ、１．５１ｍｍｏｌ）とヨード酢酸（１．５ｇ、８．０６ｍｍｏｌ、５．３４ｅｑ）とを加えた。５．０Ｍ  ＮａＯＨ水溶液を使用してｐＨを７．０に調整した。反応槽を密封し、マイクロ波照射を用いて混合物を１０分間で５０℃に加熱した。
【００２２】
得られた桃色溶液（約５ｍｌ）を、５Ｍ  ＨＣｌ水溶液を使用してｐＨ  ３．０に酸性化した後、アセトン／ＩＭＳ（１：１）（２５ｍｌ）の予備冷却（−５℃）混合物中に注いだ。得られた沈殿物を濾過し、最初にＩＭＳ（５ｍｌ）で、次いで乾燥ジエチルエーテル（１５ｍｌ）で洗浄し、その後、乾燥窒素下で１０分間風乾した。更に、デシケータ内にて溶融ＣａＣｌ２上で一晩乾燥して、Ｎ１−カルボキシメチル−ＮＡＤ＋を桃色の非晶質固体（１．６２ｇ）（粗）として得た。
【００２３】
工程２：Ｎ６−カルボキシメチル−ＮＡＤＨ（ｎ＝１である、図１の３番目の構造）の合成。
上記で調製した粗Ｎ１−カルボキシメチル−ＮＡＤ＋（９．１ｇ、約１０．５７ｍｍｏｌ）を水溶液（４５０ｍｌ）中１．３％  ｗ／ｖ  ＮａＨＣＯ３に溶解し、溶液に窒素を１０分間散布することにより脱酸素した。亜ジチオン酸ナトリウム（３．５ｇ、２０．１ｍｍｏｌ）を一部で加え、混合物を周囲温度で撹拌して、ニコチンアミド部分の還元をもたらした（即ち、酸化状態ＮＡＤ＋を還元状態ＮＡＤＨに変換）。１．０時間後、溶液の色が桃色から黄色に変化していた。次いで、溶液に空気を１０分間散布して、任意の過剰の亜ジチオン酸塩を破壊し、５Ｍ  ＮａＯＨ水溶液を使用することによりｐＨを１１．０とした。この混合物を７０℃で９０分間加熱して、Ｎ６−カルボキシメチル−ＮＡＤＨへのジムロート転位を促進した後、２５℃に冷却した。薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、イソ酪酸／水／３２％  ＮＨ４ＯＨ（ａｑ）、６６／３３／１．５、体積による）は、この段階で、Ｎ１−カルボキシメチル−ＮＡＤＨの存在の証拠を示さなかった。
【００２４】
工程３：Ｎ６−カルボキシメチル−ＮＡＤ＋（ｎ＝１である、図１の４番目の構造）へのＮ６−カルボキシメチル−ＮＡＤＨの酸化。
Ｎ６−カルボキシメチル−ＮＡＤＨを含む反応混合物を、３Ｍトリス緩衝液（ｐＨ  ７．０）（１７．５ｍｌ）で処理し、５Ｍ  ＨＣｌ水溶液（約４．９ｍｌ）を使用してｐＨを７．５に調整した。アセトアルデヒド（３．５ｍｌ、６２．６ｍｍｏｌ）を加えた直後、酵母アルコール脱水素酵素（サッカロマイセス・セレヴィシエ（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの）（〜３００Ｕ／ｍｇ）（１０．５ｍｇ、約３１５０Ｕの酵素）を加え、その後、周囲温度で撹拌してニコチンアミド部分を脱酸させた（即ち、ＮＡＤＨをＮＡＤ＋に変換）。１８時間後、反応混合物（約４８５ｍｌ）をおよそ１／３の体積まで真空濃縮（３０℃／１０〜１５バール）し、アセトン／ＩＭＳ（１：１）の予備冷却（−５℃）混合物（１８００ｍｌ）中に注いだ。微細スラリーを３℃で１８時間放置して熟成した。得られた沈殿物を遠心分離により収集し、焼結ガラス（ｇｌａｓｓ  ｓｉｎｔｅｒ）上にてＩＭＳ（４０ｍｌ）で、次いで乾燥ジエチルエーテル（１２０ｍｌ）で洗浄した後、乾燥窒素下で１０分間風乾した。更にデシケータ内にて溶融ＣａＣｌ２上で一晩乾燥して、Ｎ６−カルボキシメチル−ＮＡＤ＋を黄褐色の吸湿性固体（３．９９ｇ）（粗）として得た。
【００２５】
粗Ｎ６−カルボキシメチル−ＮＡＤ＋（１．０ｇ）を水（２０ｍｌ）中に取り上げ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０ゲル濾過カラム（２×１０ｃｍ、２０ｍｌ）に通した。ＵＶ活性物質を含む溶出した全画分を組み合わせ（６０ｍｌ全体積）、水で予め平衡化したＤｏｗｅｘ  １−Ｘ２イオン交換樹脂（Ｃｌ−；４×５０ｃｍ、２００ｍｌ）のカラムに加えた。「Ｐｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ」クロマトグラフィー機器を使用して、０〜５０ｍＭのＬｉＣｌ（ｐＨ  ３．０に緩衝化）の線形勾配を１０ｍｌ／分で６５分間にわたって適用した。２５〜３５ｍＭにて溶出した画分を組み合わせ（約１００ｍｌ）、５Ｍ  ＬｉＯＨでｐＨ  ７．０に中和し、およそ１／３の体積まで蒸発させ、アセトン／ＩＭＳ（１：１）の予備冷却（−５℃）混合物（３００ｍｌ）中に注いだ。微細スラリーを３℃で１８時間放置して熟成した。得られた沈殿物を遠心分離により収集し、焼結ガラス上にてＩＭＳ（３０ｍｌ）で、次いで乾燥ジエチルエーテル（５０ｍｌ）で洗浄した後、乾燥窒素下で１０分間風乾した。更にデシケータ内にて溶融ＣａＣｌ２上で一晩乾燥して、精製されたＮ６−カルボキシメチル−ＮＡＤ＋をクリーム色の吸湿性固体（０．３０７ｇ）として得た。外挿した総収率＝１．２２５ｇ、１４％。
【００２６】
ＮＡＤモノマーを以下のように、また図２に示すように調製した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）（０．２ｇ、１．２９ｍｍｏｌ、１．０ｍｏｌ  ｅｑ）の水（２０ｍｌ）溶液を、周囲温度で２．０Ｍ  ＨＣｌ水溶液を使用してｐＨ  ７．２に調整した。Ｎ６−カルボキシメチル−ＮＡＤ＋（０．４５ｇ、０．６２２ｍｍｏｌ、０．５ｍｏｌ  ｅｑ）及びヒドロキノン（０．０１７ｇ、０．１５４ｍｍｏｌ、０．１２５ｍｏｌ  ｅｑ）を一回量にて連続して加え、２．０Ｍ  ＨＣｌ水溶液を使用してｐＨ  ７．２に調整した。試薬Ｎ６−［Ｎ−（２−（Ｎ−（２−メタクリルアミドエチル）カルバモイルメチル）−ＮＡＤ＋を一回量にて、周囲温度で加え、２．０Ｍ  ＨＣｌ水溶液を使用してｐＨ  ７．２に調整した。混合物を暗所にて周囲温度で２４時間撹拌した。
【００２７】
ｐＨを監視し、ｐＨ７．０〜ｐＨ７．５に維持した。次いで、反応混合物を蒸留水（３０ｍｌ）で希釈し、予め調製したＳｅｐｈａｄｅｘゲル（１５ｇ、１５０ｍｌの蒸留水で平衡化）のベッドに通し、蒸留水（８０ｍｌ）で溶出した。溶出液（およそ１１０ｍｌ）を予め調製したカラム（Ｄｏｗｅｘ  １−Ｘ２（Ｃｌ−形態））上に負荷し、前記カラムは、自動化クロマトグラフィーシステム（Ｐｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ）を通して流れるように設定され、５カラム容積の水を用いて４０ｍｌ／分で平衡化された。粗化合物を（ポンプを介して）負荷する前に、流速を２０ｍｌ／分に低下させた。
【００２８】
０〜５０ｍＭの塩化リチウム水溶液（ｐＨ３で緩衝化）の線形勾配を６０分間にわたって適用した（即ち、バイナリポンプ構成；Ａ：水、Ｂ：５０ｍＭ  ＬｉＣｌ（ｐＨ  ３）、６０分間にわたる１００：０  Ａ：Ｂ〜０：１００  Ａ：Ｂ）。溶出した画分をＴＬＣで分析し、所望の画分（４０〜５０ｍＭにて溶出した、５０ｍｌ）を半分の体積（２５ｍｌ）に濃縮し、エタノール（３７５ｍｌ、１５容積）の撹拌溶液に２℃で滴加した。得られた沈殿物を遠心分離（Ｇｅｎｅｖａｃ  ＥＺ２＋、３６００ｒｐｍ、３分間）により集め、濾過により収集し、冷エタノール（５０ｍｌ）で洗浄した。沈殿物を、デシケータ内にて塩化カルシウム上で、真空下にて周囲温度で乾燥した後、冷凍庫内に保管した。
【００２９】
ＮＡＤモノマーとアクリルアミドとのコポリマー（即ち、本発明の一実施形態によるＮＡＤ高分子補酵素）の合成を、以下のように、また図３に示すように行った。０．２０９ｇの上記で調製したＮＡＤモノマー、０．８ｇのアクリルアミド及び９．２ｇの水を、メカニックスターラー（ｍｅｃｈａｎｉｃ  ｓｔｉｒｒｅｒ）、コンデンサー、窒素入口および出口を備えたフラスコに加えた。室温にて窒素で３０分間脱酸素した後、溶液を７０℃に加熱し、次いでフラスコに５０マイクロリットル２０ｖｏｌの過酸化水素溶液と９ｍｇの過硫酸アンモニウムとを加えた。重合を連続的な振盪下で６時間継続した。粗ポリマーを水に対する透析により２日間精製した後、凍結乾燥した。
【００３０】
図４は、ＮＡＤ高分子補酵素及びフェロセン高分子メディエーターの両方を含む、本発明の一実施形態による酵素電気化学系バイオセンサの電流応答を示すグラフである。図４のデータは、以下の試験設定を用いて生成した。（ｉ）表面堆積試薬層を有する炭素電極。炭素電極は、スクリーン印刷により製作され、絶縁層により画定された露出表面寸法２．５×２．５ｍｍを有する。２．０ｍｇ／ｍＬのＮＡＤ高分子補酵素と、２．０ｍｇ／ｍＬのフェロセン高分子メディエーターと、１．０ｍｇ／ｍＬのβ−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼと、１．０ｍｇ／ｍＬのジアフォラーゼとを含んでいた、０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．４）中の１０μＬ（マイクロリットル）の溶液を風乾することにより、試薬層を調製した。試薬被覆電極を０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．４）中に一晩浸し、試験前に新鮮なトリス緩衝液で濯いだ。（ｉｉ）Ａｇ／ＡｇＣｌ及び白金ワイヤを、それぞれ参照電極及び対電極として使用した。
【００３１】
図４の測定は、２５ｍｌビーカー内の１０．０ｍＬの０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ  ７．４）中の３つの電極を用いて開始した。次いで、０．３Ｖの電位を印加した。ビーカーに１．０ｍＭ  β−ヒドロキシ酪酸（ＨＢＡ、ケトン体）を加えた。ＨＢＡを加えた直後、磁気振盪を短時間適用した。ＨＢＡを加えた後、電流の増大が明らかに検出され（図４参照）、高分子ＮＡＤ補酵素及びフェロセン高分子メディエーターが関与するセンサ電流応答が示された。
【００３２】
図５Ａ  ５Ｂ及び５Ｃは、本発明の一実施形態による酵素電気化学系センサ１００（即ち、電気化学系分析試験ストリップ）の簡略化した切断端面図、斜視図、及び分解斜視図である。
【００３３】
図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃを参照すると、本発明の一実施形態による酵素電気化学系分析試験ストリップ１００は、電気絶縁基板層１０２、パターン絶縁層１０４、少なくとも１つの作用電極及び少なくとも１つの対／参照電極を画定するパターン導電体層１０６（明確さのために、図５Ｃでは単一の構成要素１０６’として示されていない）、並びに本明細書に記載した（例えば、図１〜３に関連して）ＮＡＤ高分子補酵素、高分子電子移動剤（高分子フェロセンなどの）及び酵素（例えば、β−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ）を含む酵素試薬層１０８を備える。
【００３４】
電気絶縁基板層１０２は、例えば、ナイロン基板、ポリカーボネート基板、ポリイミド基板、ポリ塩化ビニル基板、ポリエチレン基板、ポリプロピレン基板、グリコール変性ポリエステル（ＰＥＴＧ）基板、又はポリエステル基板などの、当業者に既知の任意の好適な電気絶縁基板であってもよい。電気絶縁基板は、例えば、約５ｍｍの幅、約２７ｍｍの長さ、約０．５ｍｍの厚みといったように、任意の好適な寸法を有し得る。
【００３５】
パターン絶縁層１０４は、例えばスクリーン印刷可能な絶縁インクから形成することが可能である。そのようなスクリーン印刷可能な絶縁インクは、Ｗａｒｅｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．のＥｒｃｏｎから「Ｉｎｓｕｌａｙｅｒ」の名で市販されている。
【００３６】
パターン導電体層１０６は、導電性カーボンインク材料を含むがこれに限定されない、任意の好適な導電性材料から形成することが可能である。
【００３７】
酵素試薬層１０８は、前述したＮＡＤ高分子補酵素及び高分子電子移動剤に加えて、任意の好適な酵素試薬を含んでもよく、酵素試薬の選択は、判定される検体に依存する。例えば、血液試料中のグルコースを判定する場合、酵素試薬層１０８は、機能的動作に必要な他の構成成分と共に、ＮＡＤ−依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含んでもよい。酵素試薬層及び電気化学的分析テストストリップ全般に関する更なる詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２４１，８６２号に開示されている。
【００３８】
高分子電子移動剤は、例えば、イオン性部分を有する親水性ポリマーと、複数の取り付けられた酸化還元メディエーター（例えば、フェロセン）とを含む高分子量酸化還元ポリマーを含む、任意の好適な高分子電子移動剤であってもよい。そのようなイオン性親水性高分子量ポリマーの分子量は、有益には例えば１６ｋｇ／ｍｏｌを超えてもよい。そのようなイオン性親水性高分子量ポリマーは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００６／００６９２１１号に記載されている。
【００３９】
本発明の実施形態による電気化学系バイオセンサは、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）高分子補酵素及び高分子電子移動剤の両方を含ませることが、例えばそれらの両方を固定化構成で使用することによって連続バイオセンサ内でのデヒドロゲナーゼ酵素の新規な使用を可能にする点で、特に有益である。
【００４０】
電気化学系分析試験ストリップ１００は、パターン絶縁導電体層１０６、パターン絶縁層１０４及び酵素試薬層１０８の順次整列の形成により製造されてもよい。例えば、スクリーン印刷、フォトリソグラフィ、グラビア印刷、化学蒸着及びテープ積層法を含む、当業者に既知の任意の好適な技術を使用して、このような順次整列の形成を達成することができる。
【００４１】
図６は、本発明の一実施形態による、体液試料（例えば、全血又は組織液試料）中の検体（グルコース又はケトンなどの）を判定するための方法２００における段階を示す流れ図である。工程２１０において、方法２００は、体液試料が、懸垂基としてポリマー主鎖に共有結合したＮＡＤ部分を含むＮＡＤ高分子補酵素と接触し、また高分子電子移動剤（例えば、高分子フェロセン）と接触するように、体液試料を酵素電気化学系バイオセンサ（例えば、酵素電気化学系分析試験ストリップ）に適用する工程を含む。
【００４２】
方法２００は更に、酵素電気化学系バイオセンサにより生成された電子信号に基づいて、体液試料中の検体を判定する工程を含む（図１１の工程２２０参照）。
【００４３】
いったん本開示を知ると、当業者は、本発明の実施形態による、及び本明細書に記載される、酵素電気化学系バイオセンサの任意の技法、利点、及び特性を組み込むように、方法６００を容易に修正できることを認識するであろう。
【００４４】
本明細書に、好ましい本発明の実施形態が示され、記載されてきたが、このような実施形態は、単なる例として提供されていることが、当業者に明らかであろう。当業者は、目下、本発明から逸脱することなく多数の変更、変化、及び置換を思いつくであろう。本明細書に記載した本発明の実施形態の様々な代替物は、本発明の実施にて使用できることを理解するべきである。以下の「特許請求の範囲」は、本発明の範囲を定義するとともに、特許請求の範囲に含まれる組成物、装置及び方法、並びにそれらの均等物をこれによって網羅することを目的としたものである。
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【国際調査報告】
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