(57)【要約】  本明細書に記載のシステム及び方法は、試料で回折した光と試料で回折されない光との間の相対位相ずれを各種に設定した複数の位相差画像を用いて定量位相画像を生成する。生成された定量位相画像は、細胞体及び核のラベルを使用しない自動セグメンテーションに充分なコントラストを備えることができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
位相差イメージングのシステムであって、
試料を主光線で照明するための光源と、
主光線の経路内に試料の後にある少なくとも１つの主光線光学素子であって、試料で回折した光を集光し、試料で回折されない光を集光するように構成された主光線光学素子と、
少なくとも１つの主光線光学素子で集光された光を、第１の回折光線及び第１の非回折光線を含む第１の光線と、第２の回折光線及び第２の非回折光線を含む第２の光線とに分割するように構成されたビームスプリッタと、
第１の光線の経路内にある第１の光学素子であって、第１の非回折光線を焦点面で合焦させるように構成された第１の光学素子と、
第１の回折光線の少なくとも一部を遮断し、合焦した第１の非回折光線の少なくとも一部を透過させるように構成された、焦点面又はその近傍にあるマスクと、
第１の光線の経路内でマスクの後にある第２の光学素子と、
第１の光線の経路内で第２の光学素子の後にある可動ミラーであって、選択された複数の相対位相ずれ各々を第１の光線に生じさせる位置に配置されるように構成された可動ミラーと、
第１の光線の経路及び第２の光線の経路にある第２のビームスプリッタであって、可動ミラーから来る第１の光線と、第２の光線とを２次元撮像システムによる撮像のために合波するように構成された第２のビームスプリッタと
を備えるシステム。
【請求項２】
選択された複数の相対位相ずれが、ゼロ、π／２、及びπを含む、請求項１記載のシステム。
【請求項３】
選択された複数の相対位相ずれがさらに３π／２を含む、請求項２記載のシステム。
【請求項４】
システムは、１種以上の細胞を含む試料の高コントラストの撮像をラベルを使用せずに行うように構成される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のシステム。
【請求項５】
光源は低コヒーレンスの光線を生成する、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のシステム。
【請求項６】
光源は１０μｍ未満のコヒーレンス長の光線を生成する、請求項５記載のシステム。
【請求項７】
マスクは、合焦した第１の非回折光線の少なくとも一部を透過させるように構成された開口部を画定する、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のシステム。
【請求項８】
マスクは、第１の回折光線の大部分を遮断し、合焦した第１の非回折光線の大部分を透過させるように構成される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載のシステム。
【請求項９】
第２の光学素子は第１の光線を平行光にするように構成される、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のシステム
【請求項１０】
第２の光学素子は、第１の光学素子の焦点距離と同じ焦点距離を有する、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載のシステム。
【請求項１１】
第２の光線の経路内に第３の光学素子、及び第２の光線の経路内に第４の光学素子をさらに備え、第３の光学素子は、第４の光学素子の焦点距離とおよそ等しい焦点距離を有する、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載のシステム。
【請求項１２】
第４の光学素子は、第２の回折光線を撮像システムで合焦させるように構成される、請求項１１記載のシステム。
【請求項１３】
第１のビームスプリッタから２Ｄ撮像装置までの第１の非回折光線の光学経路長は、第１のビームスプリッタから２Ｄ撮像装置までの第２の回折光線の光学経路長とおよそ等しい、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載のシステム。
【請求項１４】
可動ミラーを配置する圧電素子をさらに備える、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載のシステム。
【請求項１５】
第２のビームスプリッタは、可動ミラーからの第１の非回折光線の透過した部分と、第２の回折光線とを合波するように構成される、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載のシステム。
【請求項１６】
少なくとも１つの主光線光学素子が顕微鏡の対物レンズを含む、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載のシステム。
【請求項１７】
少なくとも１つの主光線光学素子がチューブレンズを含む、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載のシステム。
【請求項１８】
可動ミラーを、相対位相ずれがゼロになるように配置し、相対位相ずれがπ／２になるように配置し、相対位相ずれがπになるように配置して得られた測定２次元位相差画像に少なくとも部分的に基づいて定量位相画像を求めるようにプログラムされたコンピューティングデバイスをさらに備える、請求項１乃至請求項１７のいずれか１項記載のシステム。
【請求項１９】
定量位相画像はさらに、相対位相ずれが３π／２になるように可動ミラーを配置して得られた測定２次元位相差画像に少なくとも部分的に基づく、請求項１８記載のシステム。
【請求項２０】
定量位相画像は、定量位相画像内の各位置の相対位相遅延に関する定量的な情報を含む、請求項１８又は請求項１９記載のシステム。
【請求項２１】
コンピューティングデバイスはさらに、定量位相画像に基づいて、細胞及び／又は核を含む試料のセグメンテーションをラベルを使用せずに行うようにプログラムされる、請求項１８乃至請求項２０のいずれか１項記載のシステム。
【請求項２２】
コンピューティングデバイスはさらに、定量位相画像の少なくとも一部に基づいて、細胞の単分子層試料について定量的な厚みの情報を生成するようにプログラムされる、請求項１８乃至請求項２１のいずれか１項記載のシステム。
【請求項２３】
定量位相イメージングの方法であって、
試料を通るように主光線を誘導し、
試料で回折した光及び試料で回折されない光を集光し、
集光された回折光及び非回折光を、第１の回折光線及び第１の非回折光線を含む第１の光線と、第２の回折光線及び第２の非回折光線を含む第２の光線とに分割し、
第１の非回折光線を焦点面で合焦させ、
焦点面又はその近傍で、第１の回折光線の少なくとも一部を遮断し、合焦した第１の非回折光線の少なくとも一部を透過させ、
透過した第１の非回折光線部分を相対位相シフト素子に誘導し、
相対位相シフト素子からの第１の光線と第２の光線を合波して合波光線を得、
合波光線を２次元撮像装置に誘導して位相差画像を生成し、
相対位相シフト素子を調節して、第１の光線と第２の光線との間の約ゼロの相対位相ずれに対応する位相差画像を取得し、
相対位相シフト素子を調節して、位相をずらした第１の光線と第２の光線との間の約π／２の相対位相ずれに対応する位相差画像を取得し、
相対位相シフト素子を調節して、位相をずらした第１の光線と第２の光線との間の約πの相対位相ずれに対応する位相差画像を取得し、
約ゼロの相対ずれに対応する少なくとも１つの位相差画像、約π／２の相対ずれに対応する少なくとも１つの位相差画像、及び約πの相対ずれに対応する少なくとも１つの位相差画像に少なくとも部分的に基づいて、コンピューティングデバイスを使用して定量位相画像を生成する
ことを含む方法。
【請求項２４】
相対位相シフト素子を調節して、位相をずらした第１の光線と第２の光線との間の約３π／２の相対位相ずれに対応する位相差画像を取得することをさらに含み、定量位相差画像は、約３π／２の相対ずれに対応する少なくとも１つの位相差画像にも基づく、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
定量位相画像は、定量位相画像内の各位置の相対位相遅延に関する定量的な情報を含む、請求項２３又は請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
試料は１種以上の細胞を含み、定量位相画像は、ラベルを使用しない、試料の高コントラスト画像である、請求項２３乃至請求項２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
定量位相画像に基づいて、細胞及び／又は核の自動化されたセグメンテーションをラベルを使用せずに行うことをさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
試料は細胞の単分子層を含み、方法は、試料の定量位相画像の少なくとも一部に基づいて、試料について定量的な厚みの情報を生成することをさらに含む、請求項２６又は請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
定量位相画像の少なくとも一部に基づいて、定量位相画像の少なくとも一部における各位置について定量的な厚みの情報を生成することをさらに含む、請求項２３乃至請求項２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
相対位相シフト素子は可動ミラーである、請求項２３乃至請求項２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
相対位相は、可動ミラーに結合された圧電素子を使用して調節される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
第１の回折光線の少なくとも一部を遮断し、合焦した第１の非回折光線の少なくとも一部を透過させることは、第１の回折光線の大部分を遮断することを含む、請求項２３乃至請求項３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
定量位相画像を表示することをさらに含む、請求項２３乃至請求項３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
焦点面又はその近傍に配置された空間フィルタが、合焦した第１の非回折光線の少なくとも一部を透過させ、第１の回折光線の少なくとも一部を遮断する、請求項２３乃至請求項３３のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
実施形態は、一般には位相差顕微鏡法に関する。より詳細には、いくつかの実施形態は、高コントラストの細胞イメージングを行うための定量位相顕微鏡法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料の顕微鏡画像内で細胞体や細胞核の境界を識別することを画像内での細胞体や細胞核のセグメンテーションと呼ぶことがある。試料の細胞の構造を（例えばセグメンテーションのために）画像化するために、染色技術やラベリング技術を使用して異なる種類の細胞構造間のコントラストを強調することがしばしば行われる。例えば、ＤＮＡやＲＮＡに反応する色素（例えばエチジウムブロマイド）や、細胞の核と細胞質とで異なる反応をする色素（例えばヘマトキシリンエオジン）で検体を染色する場合がある。別の例として、１種以上の着色した薬剤（発色団）及び／又は１種以上の蛍光剤（蛍光体）等のラベルが、特定タグの存在に基づいて細胞構造中の所期の物質を識別する際に有用である。そのような染色技術やラベリング技術は細胞構造の識別を助けるが、外部のコントラスト剤を使用する染色やラベリングはイメージング対象の試料の構造や対象となる他の性質に影響を及ぼす可能性がある。さらに、一般に、そのような染色やラベリングは生細胞には行うことができない。
【０００３】
従来の位相差イメージング技術（例えばゼルニケや微分干渉コントラスト（ＤＩＣ））は、明視野イメージングと比べると向上したコントラストで細胞の単分子層を画像化することができる。そのような位相差技術は、染色やラベリングを必要とせず、一般に充分な画像コントラストが得られるが、そのために追加的な光学素子、光源、及び位置合わせ手順が必要となる。
【０００４】
従来の位相イメージングは、大まかに言うと、一連の従来の透過光画像を処理する（例えば焦点画像と焦点外画像を減じる）ものと説明することができる。エッジの特徴が強化された画像が得られるものの、コントラストは細胞及び／又は核の自動化されたセグメンテーションの信頼度を保証するのには充分でないことが多い。
【０００５】
さらに、ラベルや染色を用いる従来の光学イメージングと従来の位相差イメージングでは、どちらでも細胞の単分子層に関する定量的な厚みの情報は得ることができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第３６５８４０５号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
例示的実施形態は、試料の定量位相画像を生成する方法及びシステムに関する。一部の実施形態は、生物試料の高コントラストの定量位相画像を生成するために用いることができる。生成された生物試料の高コントラストの定量位相画像は、画像内でラベルを使用せずに細胞体及び／又は核の自動セグメンテーションを行うのに充分なコントラストを備えることができる。定量位相画像は、様々な位置における試料の厚みに関する情報も提供することができる。空間的に分解された厚みの情報は、細胞の状態に関する充分な情報をもたらすことができ、それにより画像のセグメンテーションを不要にする。
【０００８】
例示的実施形態の１つは、調整可能な位相差イメージングのシステムである。このシステムは、試料を主光線で照明するための光源を含む。一部の実施形態では、光源は低コヒーレンスの光線を生成する。光は、１０μｍ未満のコヒーレンス長を有することができる。
【０００９】
システムはさらに、主光線の経路内の試料の後に少なくとも１つの主光線光学素子を含み、この主光線光学素子は、試料で回折した光を集光し、試料で回折されない光を集光するように構成される。一部の実施形態では、少なくとも１つの主光線光学素子は、顕微鏡の対物レンズ及び／又はチューブレンズを含む。
【００１０】
システムは、少なくとも１つの主光線光学素子で集光された光を第１の光線と第２の光線とに分割するように構成されたビームスプリッタも含む。第１の光線は第１の回折光線及び第１の非回折光線を含み、第２の光線は第２の回折光線及び第２の非回折光線を含む。
【００１１】
第１の光線の経路に沿って、システムは、第１の非回折光線を焦点面で合焦させるように構成された第１の光学素子（例えばレンズ）を含む。システムは、第１の回折光線の少なくとも一部を遮断し、合焦した第１の非回折光線の少なくとも一部を透過させるように構成された、焦点面又はその近傍にあるマスクも含む。一部の実施形態では、マスクは、合焦した第１の非回折光線の少なくとも一部を透過させるように構成された開口部を画定する。マスクは、第１の回折光線の大部分を遮断し、合焦した第１の非回折光線の大部分を透過させるように構成することができる。一般に、マスクは、非回折光線から変調成分を除去し、それにより明瞭な位相基準が得られる。
【００１２】
第２の光学素子（例えばレンズ）も、第１の光線の経路内のマスクの後に設けられる。一部の実施形態では、第２の光学素子は、第１の非回折光線を平行光にするように構成される。第２の光学素子は、第１の光学素子の焦点距離と同じ焦点距離を有することができる。システムは、第１のレンズ、マスク、及び第２のレンズを含む空間フィルタを含んでよい。
【００１３】
システムは、第１の光線の経路内の第２の光学素子の後に可動ミラーを含む。一部の実施形態では、システムは、可動ミラーを配置する圧電素子も含む。可動ミラーは、第２の光線に対する、選択された複数の相対位相ずれ各々を第１の光線に生じさせる位置に配置されるように構成される。一部の実施形態では、選択された複数の相対位相ずれは、ゼロ、π／２、及びπを含む。選択された複数の相対位相ずれは、さらに３π／２を含むことができる。
【００１４】
システムは、第１の光線の経路及び第２の光線の経路に第２のビームスプリッタも含む。第２のビームスプリッタは、可動ミラーから来る第１の光線と、第２の光線とを２次元（２Ｄ）撮像システムによる撮像のために合波するように構成される。一部の実施形態では、第２のビームスプリッタは、可動ミラーからの第１の非回折光線の透過した部分と、第２の回折光線とを合波するように構成される。
【００１５】
一部の実施形態では、第１のビームスプリッタから２Ｄ撮像システムまでの第１の非回折光線の光学経路長は、第１のビームスプリッタから２Ｄ撮像システムまでの第２の回折光線の光学経路長とおよそ等しい。
【００１６】
一部の実施形態では、システムは、第２の光線の経路内に第３の光学素子（例えばレンズ）及び第４の光学素子（例えばレンズ）を含む。第３の光学素子は、第４の光学素子の焦点距離とおよそ等しい焦点距離を有することができる。第４の光学素子は、第２の回折光線を２Ｄ撮像システムで合焦させるように構成することができる。
【００１７】
一部の実施形態では、システムはさらに、定量位相画像を求めるようにプログラムされたコンピューティングデバイスを含む。定量位相画像は、可動ミラーを、相対位相ずれがゼロになるように配置し、相対位相ずれがπ／２になるように配置し、相対位相ずれがπになるように配置して得られた測定２Ｄ位相差画像に少なくとも部分的に基づいて求めることができる。一部の実施形態では、定量位相画像はさらに、相対位相ずれが３π／２になるように可動ミラーを配置して得られた測定２Ｄ位相差画像に少なくとも部分的に基づく。定量位相画像は、定量位相画像内の各位置の相対位相遅延に関する定量的な情報を含むことができる。
【００１８】
一部の実施形態では、システムは、１種以上の細胞を含む試料を、ラベルを使用せずに高コントラストに撮像するために構成される。コンピューティングデバイスはさらに、定量位相画像に基づいて、細胞及び／又は核を含む試料のセグメンテーションをラベルを使用せずに行うようにプログラムすることができる。コンピューティングデバイスはさらに、定量位相画像の少なくとも一部に基づいて、細胞の単分子層試料について定量的な厚みの情報を生成するようにプログラムすることができる。
【００１９】
別の実施形態は定量位相イメージングの方法である。この方法は、試料を通るように主光線を誘導し、試料で回折した光及び試料で回折されない光を集光することを含む。
【００２０】
方法は、集光された回折光及び非回折光を、第１の回折光線及び第１の非回折光線を含む第１の光線と、第２の回折光線及び第２の非回折光線を含む第２の光線とに分割することも含む。一部の実施形態では、ビームスプリッタを使用して、集光された回折光及び非回折光を分割することができる。
【００２１】
方法は、第１の非回折光線を焦点面で合焦させることも含む。焦点面又はその近傍で第１の回折光線の少なくとも一部が遮断され、焦点面又はその近傍で、合焦した第１の非回折光線の少なくとも一部が通過する。一部の実施形態では、第１の回折光線の少なくとも一部を遮断し、合焦した第１の非回折光線の少なくとも一部を透過させることは、第１の回折光線の大部分を遮断することを含む。一部の実施形態では、焦点面又はその近傍に配置された空間フィルタが、合焦した第１の非回折光線の少なくとも一部を透過させ、第１の回折光線の少なくとも一部を遮断する。
【００２２】
方法はさらに、透過した第１の非回折光線部分を相対位相シフト素子に誘導することを含む。一部の実施形態では、相対位相シフト素子は可動ミラーである。相対位相は、可動ミラーに結合された圧電素子を使用して調節することができる。
【００２３】
方法は、相対位相シフト素子からの第１の光線と第２の光線を合波して合波光線を得、合波光線を２次元撮像装置に誘導して位相差画像を生成することも含む。
【００２４】
方法はさらに、相対位相シフト素子を調節して、第１の光線と第２の光線との間の約ゼロの相対位相ずれに対応する位相差画像を取得することを含む。方法は、相対位相シフト素子を調節して、位相をずらした第１の光線と第２の光線との間の約π／２の相対位相ずれに対応する位相差画像を取得することも含む。方法は、相対位相シフト素子を調節して、位相をずらした第１の光線と第２の光線との間の約πの相対位相ずれに対応する位相差画像を取得することを含む。
【００２５】
方法は、約ゼロの相対ずれに対応する少なくとも１つの位相差画像、約π／２の相対ずれに対応する少なくとも１つの位相差画像、及び約πの相対ずれに対応する少なくとも１つの位相差画像に少なくとも部分的に基づいて、コンピューティングデバイスを使用して定量位相画像を生成することを含む。定量位相画像は、定量位相画像内の各位置の相対位相遅延に関する定量的な情報を含むことができる。一部の実施形態では、方法はさらに定量位相画像を表示することを含む。
【００２６】
一部の実施形態では、方法はさらに、相対位相シフト素子を調節して、位相をずらした第１の光線と第２の光線との間の約３π／２の相対位相ずれに対応する位相差画像を取得することを含む。定量位相差画像は、約３π／２の相対ずれに対応する少なくとも１つの位相差画像にも少なくとも部分的に基づくことができる。
【００２７】
一部の実施形態では、方法はさらに、定量位相画像を表示することを含む。方法は、定量位相画像の少なくとも一部に基づいて、定量位相画像の少なくとも一部における各位置についての定量的な厚みの情報を生成することも含むことができる。
【００２８】
一部の実施形態では、試料は１種以上の細胞を含み、定量位相画像は、ラベルを使用しない、試料の高コントラスト画像である。一部の実施形態では、試料は細胞の単分子層を含み、方法は、試料の定量位相画像の少なくとも一部に基づいて、細胞の単分子層に関する定量的な厚みの情報を生成することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、定量位相画像に基づいて細胞及び／又は核の自動化されたセグメンテーションをラベルを使用せずに行うことも含む。
【００２９】
以下、添付図面を参照して各実施形態の特徴及び態様を説明する。図面では各要素は必ずしも一定の縮尺で図示していない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】いくつかの実施形態による位相差イメージングの例示的システムの概略図である。
【図２】いくつかの実施形態によるゼロ、π／２、及びπの相対位相ずれについての位相差画像を得ることを含む、定量位相イメージングの例示的方法を示すフローチャートである。
【図３】図２に示す方法の「位相差画像を得る」の部分を示すフローチャートである。
【図４】いくつかの実施形態による、ゼロ、π／２、及び３π／２の相対位相ずれについての位相差画像を得ることを含む、定量イメージングの別の例示的方法を示すフローチャートである。
【図５】本明細書に教示される例示的実施形態を実施するのに適した例示的コンピューティング環境の図である。
【図６】例示的システム及び方法を使用して得られた段差が刻まれたガラスの定量位相顕微鏡法データの２次元画像の図である。
【図７】図５の破線内に該当するデータの平均位相特性のグラフである。
【図８】例示的なシステム及び方法を使用して得られたヒトの口腔上皮細胞の定量位相顕微鏡法データの第１のセットの２次元画像である。
【図９】相対位相をｚ方向に表示した、ヒトの口腔上皮細胞の定量位相顕微鏡法データの第１のセットの３次元画像の透視図である。
【図１０】例示的システム及び方法を使用して得られたヒトの口腔上皮細胞の定量位相顕微鏡法データの第２のセットの２次元画像である。
【図１１】相対位相をｚ方向に表示した、ヒトの口腔上皮細胞の定量位相顕微鏡法データの第２のセットの３次元画像の透視図である。
【図１２】例示的システム及び方法を使用して得られた撮像チャンバ内のＢ３５生細胞の定量位相顕微鏡法データの第１のセットの２次元画像である。
【図１３】相対位相をｚ方向に表示した、撮像チャンバ内のＢ３５生細胞の定量位相顕微鏡法データの第１のセットの３次元画像の透視図である。
【図１４】例示的システム及び方法を使用して得られた撮像チャンバ内のＢ３５生細胞の定量位相顕微鏡法データの第２のセットの２次元画像である。
【図１５】相対位相をｚ方向に表示した、撮像チャンバ内のＢ３５生細胞の定量位相顕微鏡法データの第２のセットの３次元画像の透視図である。
【図１６】薄い消化管組織切片試料の２次元光学強度画像である。
【図１７】例示的システム及び方法を使用して得られた位相差画像から生成された薄い消化管組織切片試料の定量位相顕微鏡法データの第１のセットの２次元画像である。
【図１８】４ｘの倍率に設定した顕微鏡と共に例示的システム及び方法を使用して得られた薄い消化管組織切片試料の定量位相顕微鏡法データの第２のセットの２次元画像である。
【図１９】２０ｘの倍率に設定した顕微鏡で得られた位相差画像から生成された薄い消化管組織切片試料の定量位相顕微鏡法データの第３のセットの２次元画像である。
【図２０】顕微鏡の対物レンズを４０ｘの倍率に設定して得られた薄い消化管組織切片試料の定量位相顕微鏡法データの第４のセットの２次元画像である。
【図２１】４ｘの倍率に設定した顕微鏡と共に例示的システム及び方法を使用して得られたラットの間葉幹細胞試料の定量位相顕微鏡法データの第１のセットの２次元画像である。
【図２２】２０ｘの倍率に設定した顕微鏡で得られたラットの間葉幹細胞試料の定量位相顕微鏡法データの第２のセットの２次元画像である。
【図２３】４０ｘの倍率に設定した顕微鏡で得られたラットの間葉幹細胞試料の定量位相顕微鏡法データの第３のセットのグレースケールの２次元画像である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
定量位相イメージングのシステム及び方法に関連していくつかの実施形態を本明細書に記載する。例示的な実施形態では、試料で回折された光と試料で回折されない光との間の各種の相対的な位相ずれを含む複数の位相差画像を生成して、比較的アーチファクトの少ない定量位相画像を得る。一部の実施形態は、薄い生物試料（例えば細胞の単分子層）に関する定量的な光学的な厚みの情報を提供する位相差顕微鏡法システム及び方法を提供する。一部の実施形態は、ラベルを使用せずに自動化された細胞体及び／又は核のセグメンテーションを行うのに十分な画像コントラストを提供することができる。
【００３２】
図１は、一部の実施形態による、定量位相差（ＰＣ）イメージングを行う例示的システム１０の概略図である。システム１０は、試料１４を主光線１６で照明するための光源１２を含む。一部の実施形態では、レンズやフィルタなどの各種の光学素子を光源１２に含める、又は光源１２と試料１４の間に配置することができる。光源１２は、低時間コヒーレンス光源とすることができる。例えば、一部の実施形態では、光源は約２．５μｍ未満のコヒーレンス長の主光線を生成することができる。
【００３３】
試料１４は半透明又は透明の試料である。一部の実施形態では、試料は、乾燥した試料（例えばカバーガラスに置かれる）である場合も、湿った試料（例えばチャンバ内の生細胞）である場合もある。一部の実施形態では、試料は、マイクロタイタープレート又はｔ２２５フラスコに入れることができる。一部の実施形態では、試料は、使用する光の波長に応じて２μｍ〜１０μｍの厚みにすることができる。
【００３４】
主光線１６は試料１４と相互作用し、その結果、試料で回折された光（回折光）１８と試料で回折されない光（非回折光）１７が生じる。回折光１８及び非回折光１７は、試料１４の後に続いて主光線１６の経路内にある少なくとも１つの主光線光学素子２０によって集光される。凡例１１で示すように、同図では、試料で回折される光は実線で示し、試料で回折されない光は破線で示す。一部の実施形態では、少なくとも１つの主光線光学素子２０は、図示するように、対物レンズ２２、チューブレンズ２４、又はその両方を含むことができる。図示するように、１つ以上の透明又は半透明の光学素子１５（例えばスライドガラス、カバーガラス、チャンバの窓等）が、少なくとも１つの主光線光学素子２０と試料１４とを隔てることができる。
【００３５】
一部の実施形態では、光を集光する少なくとも１つの主光線光学素子２０は、顕微鏡２８の一部とすることができる（例えば顕微鏡の対物レンズ２２やチューブレンズ２４）。一部の実施形態では、光源１２は顕微鏡２８の一部としても、顕微鏡２８から独立していても、又は部分的に顕微鏡２８の中に組み込んでもよい。顕微鏡２８はさらに、回折光１８及び非回折光１７を誘導するための１つ以上のミラー（例えばミラー２６）を含むことができる。顕微鏡は、コンピューティングデバイス１００に接続する、かつ／又はコンピューティングデバイス１００と通信状態とすることができる。コンピューティングデバイス１００については下記で図５を参照してさらに詳細に説明する。
【００３６】
システム１０では、集光された光（回折光１８及び非回折光１７）が、第１の経路に沿った方向に沿って誘導される第１の光線３２と、第２の経路に沿って誘導される第２の光線３８の２つの別個の経路に分割される。光線３２、３８は経路の１つ又は両方に沿って光学的に操作された後に合波されて撮像装置６２に誘導され、合波光線３９の第１の光線部分と合波光線３９の第２の光線部分との干渉により位相差画像が生成される。
【００３７】
回折光１８と非回折光１７を含む集光された光２５は、第１のビームスプリッタ３０で、第１の回折光線３４及び第１の非回折光線３６を含む第１の光線３２と、第２の回折光線４０及び第２の非回折光線４２を含む第２の光線３８とに分割される。図示するように、集光された光２５はキューブビームスプリッタ３０で分割することができる。他の実施形態では、光の分割には他の光学素子を使用することができる（例えば平板ビームスプリッタ）。
【００３８】
第１の経路では、第１の回折光線３４の少なくとも一部分が遮断され、第１の非回折光線３６の少なくとも一部が透過される。システム１０は、第１の光線３２を焦点面４６に合焦させる第１の光学素子（例えばレンズ４４）を第１の光線３２の経路内に含む。システム１０は、焦点面４６又はその近傍に位置するマスク４８も含む。マスク４８は、第１の回折光線３４の少なくとも一部を遮断し、第１の非回折光線３６の少なくとも一部を通過させるように構成される。例えば、マスク４８は光を遮断する材料を含むことができ、マスク４８は、第１の非回折光線３６が合焦する位置又はその近傍に位置する開口部４９を画定することができる。第１の回折光線３４は焦点面４６で合焦しないため、第１の非回折光線３４の大部分は開口部４９を通らず、マスクで遮断されることになる。第１の非回折光線３６は焦点面４６で合焦するので、第１の回折光線の大部分又はすべては開口部４９を通る。一部の実施形態では、マスク４８は空間フィルタと記述することができる。
【００３９】
マスク４８の後、第１の非回折光線３７の透過部分は可動ミラー５４に到達し、第２の光線３８に対してシフトされ得る。システムは、マスク４８から可動ミラー５４の間に第２の光学素子（例えばレンズ５０）を含むことができる。一部の実施形態では、第２の光学素子（例えばレンズ５０）は、透過した非回折光線部分３７を平行光にするように構成することができる。一部の実施形態では、第２の光学素子（例えばレンズ５０）の焦点距離は、第１の光学素子（例えばレンズ４４）の焦点距離と概ね等しくすることができる。
【００４０】
上記のように、システム１０はさらに、透過した非回折光線部分３７を含む第１の光線３２の経路内の第２の光学素子（例えばレンズ５０）の後に可動ミラー５４を含むことができる。可動ミラー５４は、第２の光線３８に対して第１の光線３２に複数の選択された位相ずれ各々を生じさせる位置に配置されるように構成される。選択された相対位相ずれは、ゼロ、π／２、π、及び３π／２のいずれかを含むことができる。必要とされる位相ずれを生じさせるために可動ミラー５４を移動させる量は、試料を照明する光の主要波長に応じて決まる。例えば、可動ミラー５４が初期位置にある状態で相対位相ずれがなく、照明光主光線１６の主要波長がλの場合、初期位置からのミラーの変位（ΔＰ）と相対位相ずれ（Δθ）との関係は次の式で得られる。
【００４１】
【数１】
2015503128.tif 000003
【００４２】
波長８４０ｎｍの光の場合、π／２の相対位相ずれは、可動ミラー５４を１０５ｎｍだけ変位させることに相当する。可動ミラー５４は、可動ミラー５４を高精度に変位させるための追加的な部分又は部品を含む可動ミラーユニット５２の一部とすることができる。例えば、システム１０では、可動ミラーユニット５２は、矢印５８で示すように光線経路に沿ってミラーを並進させる圧電変換器５６も含む。圧電変換器５６への入力電圧で可動ミラー５４が変位される距離が決まり、この距離は相対位相ずれに比例する。一部の実施形態では、圧電変換器５６は、コンピューティングデバイス１００を使用して制御され得る（下記の図５の説明を参照されたい）。
【００４３】
他の実施形態では、他の装置、システム、又は機構を使用して可動ミラー５４を変位させてもよい。例えば、可動ミラーは、圧電アクチュエータ、線形可変差動変換器（ＬＶＤＴ）駆動ステージ、精密ねじ駆動ステージ、音声コイルアクチュエータ等の１つ又は任意の組み合わせによって並進させることができる。
【００４４】
第１の非回折光線３７の位相がずれた可能性のある透過部分を含む第１の光線３２は、可動ミラーで反射された後、第２のビームスプリッタ６０で誘導されて２次元撮像装置（例えばカメラ６２）に入る。
【００４５】
第２の光線３８の経路に移ると、第２の光線３８は第２の回折光線４０及び第２の非回折光線４２を含む。第１のビームスプリッタ３０からカメラ６２までで測定した第１の非回折光線３６の経路長は、第１のビームスプリッタ３０からカメラ６２までで測定した第２の回折光線４０の経路長とほぼ等しい。第２の光線３８は第３の光学素子（例えばレンズ６４）に到達することができ、第３の光学素子は第２の非回折光線４２を合焦させる。一部の実施形態では、第３の光学素子（例えばレンズ６４）の焦点距離は、第１の光学素子（例えばレンズ４４）の焦点距離とほぼ等しくすることができる。第２の光線３８は、その経路に沿って１つ以上のミラー（例えばミラー６６、６８）で誘導することができる。第２の光線３８は、第４の光学素子（例えばレンズ７０）にも到達することができ、その後第２のビームスプリッタ６０で第１の光線３２と合波される。一部の実施形態では、第４の光学素子（例えばレンズ７０）の焦点距離は第３の光学素子（例えばレンズ５０）の焦点距離とほぼ等しくすることができる。一部の実施形態では、第４の光学素子（例えばレンズ７０）は、第２の回折光線を２Ｄ撮像装置（例えばカメラ６２）で合焦させることができる。
【００４６】
一部の実施形態では、第２の光線の経路が第２のマスク（図示せず）を含むことができ、このマスクは、第２の非回折光線４２の少なくとも一部を遮断し、第２の回折光線４０の少なくとも一部を通過させるように構成される。そのような実施形態では、第２のマスクは、入射光の大部分は通過させるが、第２の非回折光線４２の焦点にあたる領域内にある光の大部分は遮断する素子の形態をとることができる。第２の非回折光線４２の少なくとも一部を遮断すると位相差画像のコントラストが向上するが、第２の非回折光線４２の焦点で第２のマスクに入射する回折光線４０の部分が遮断されるために位相画像の中心部の画質が低下する可能性がある。
【００４７】
第２のビームスプリッタ６０は、位相ずれした可能性のある透過した第１の非回折光線部分３７を含む第１の光線３２と、第２の回折光線４０を含み第２の非回折光線４２を含んでいる可能性のある第２の光線３８とを合波する。透過した第１の非回折光線部分３７と第２の回折光線４０との干渉により、２Ｄ撮像装置（例えばカメラ６２）で位相差（ＰＣ）画像が生成される。
【００４８】
２Ｄ撮像装置としては、適切な解像度を持つ任意の２Ｄ撮像装置を使用することができる（例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、光電子倍増管（ＰＭＴ）カメラ、高解像度ビデオカメラ、又は適切な解像度の他の撮像装置）。一部の実施形態では、２Ｄ撮像装置（例えばカメラ６２）は、分析のために画像又は画像データをコンピューティングデバイス１００に供給するように構成することができる。本明細書で使用する場合、用語「画像」は、表示される画像及び画像に対応するデータ又は情報の一方又は両方を意味することができる。したがって、画像を取得するとは、アナログ画像を得ること、又はデジタル画像に対応するデータを得ることを意味することができる。さらに、画像に対応するデータは、未処理の画像データ、処理された画像データ（例えばフィルタリング、平滑化、クロッピングがかけられた（ｃｒｏｐｐｅｄ）データ）、圧縮画像データ等である。さらに、当業者には理解されるように、画像データは各種形式で記憶又は伝送することができる（例えばＪＰＧ、ビットマップ、ポストスクリプト等）。
【００４９】
図２〜図４は、試料の定量位相画像を生成する例示的方法を概説するフローチャートである。説明のために、方法７０、８０、及び９０については、図１に示すシステム１０に関して説明する。ただし、当業者には理解されるように、他の構成を備える他のシステムを使用して方法７０、８０、及び９０を行うことも可能である。
【００５０】
図２は、第１の光線と第２の光線間の３つの異なる相対位相ずれに基づいて定量位相画像を生成する例示的方法７０を説明する図である。一部の実施形態では、定量位相イメージングの方法は、図２のフローチャートに概略的に示すように、位相シフト素子をゼロ、π／２、及びπの位相ずれに配置して位相差画像を得ることを含むことができる。方法７０の最初のステップであるステップ７２では、第１の光線３２と第２の光線３４間の相対位相ずれがゼロとなる位置に位相シフト素子を調節する。一般に、ステップ７２は、試料の位相差像を得る方法８０を行い、像が第１の光線３２と第２の光線３４間の相対位相ずれがゼロになる位置に達したことを示すまで位相シフト素子を調節しながら、得られた試料像を観察することによって達成することができる。
【００５１】
図３は、試料の位相差像を得る方法８０を流れ図で説明する図である。主光線１６が試料１４を通るように誘導される（ステップ８１）。主光線１６は光源１２から発することができる。主光線は低時間コヒーレンスを有することができる。例えば、一部の実施形態では、主光線は約１０μｍ未満のコヒーレンス長を有することができる。
【００５２】
試料で回折する光１８及び非回折光１７が集光される（ステップ８２）。図１に示すように、回折光１８及び非回折光１７は、１つ以上の主光線光学素子（例えば対物レンズ２２及びチューブレンズ２４）を使用して集光することができ、その主光線光学素子は顕微鏡２８の構成要素としてもよい。
【００５３】
集光された光２５は、第１の回折光線３４及び第１の非回折光線３６を含む第１の光線３２と、第２の回折光線４０及び第２の非回折光線４２を含む第２の光線とに分割される（ステップ８４）。図示するように、集光された光２５をキューブビームスプリッタ３０で分割することができる。
【００５４】
第１の非回折光線３６を焦点面４６で合焦させる（ステップ８４）。図のように、第１の非回折光線３６は第１の光学素子（例えば第１のレンズ４４）で合焦させることができる。他の実施形態では、複数のレンズ又は１つ若しくは複数の他の種類の光学素子（例えば曲面ミラー）を使用して第１の非回折光線３６を合焦させてもよい。
【００５５】
焦点面４６又はその近傍で、第１の回折光線３４の少なくとも一部が遮断され、第１の非回折光線３６の少なくとも一部が通過する（ステップ８５）。焦点面４６又はその近傍にあるマスク４８又は空間フィルタを使用して第１の回折光線３４の少なくとも一部を遮断し、第１の非回折光線３６の少なくとも一部を通過させることができる。例えば、マスクは、焦点の合った第１の非回折光線３６の少なくとも一部、大部分、又はほぼすべてがマスクを通るように配置された透過部分又は開口部４９を含むことができる。透過部分又は開口部４９から離れた箇所では、マスク４８は、焦点面４６で合焦しない第１の回折光線３４の少なくとも一部、大部分、又はほぼすべてを遮断するように構成することができる。
【００５６】
一部の実施形態では、透過した第１の非回折光線部分３７は第２の光学素子（例えばレンズ５０）を通過することができる。第２の光学素子は、透過した第１の非回折光線部分３７を平行光にするように構成することができる。透過した第１の非回折光線部分３７は相対位相シフト素子に誘導される（ステップ８６）。相対位相シフト素子は、第２の光線３８に対して第１の光線３２の経路を長くする素子とすることができる。図のように、相対位相シフト素子は例えば可動ミラー５４であり、可動ミラーは、可動ミラーを並進させる機構（例えば圧電変換器５６）を含む可動ミラーユニット５２の一部とすることができる。他の実施形態では、相対位相シフト素子は、物理的な経路長を変えずに第２の光線に対する第１の光線の光学経路長を変えることができる。例えば、一部の実施形態では、空気と異なる屈折率及び様々な長さを持つ各種光学素子を第１の光線の経路に挿入して位相ずれを得ることができる。別の例として、一部の実施形態では、同じ長さで屈折率が異なる各種光学素子を第１の光線の経路に挿入して位相ずれを得ることができる。第１の光線３２が相対位相シフト素子に到達すると、透過した第１の非回折部分３７を含んでいる第１の光線３２は、第２の回折光線部分４０を含んでいる第２の光線３８と合波される（ステップ８７）。図１に示すように、第１の光線３２と第２の光線３８は第２のビームスプリッタ６０で合波することができる。一部の実施形態では、第２の光線３８は、第１の光線３２と合波される前に１つ以上のさらに他の光学素子（例えばレンズ６４及びレンズ６９）に到達してもよい。
【００５７】
合波光線３９は２Ｄ撮像装置（例えばカメラ６２）に誘導される（ステップ８８）。例えば、システム１００では、第２のビームスプリッタ６０を使用して合波光線６２の第１の光線部分をカメラ６２に誘導し、ミラー６８を使用して合波光線３９の第２の光線部分をカメラ６２に誘導する。図１に示すように、レンズ６９などの光学素子を使用して、合波光線３９の第２の回折光線部分をカメラ６２に合焦させることができる。
【００５８】
図２のステップ７２で、相対位相ずれがゼロになる位置に位相シフト素子を調節するには、位相シフト素子（例えば可動ミラー５４）の位置を調節しながらカメラ６２から得られる現在の位相差像を積極的に観察することが伴うことがある。第１の光線３２と第２の光線３８間の相対位相ずれがゼロになる位置に位相シフト素子が来ると、位相差像は、位相シフト素子が相対位相ずれがゼロになる位置から離れている時と比べて、比較的高コントラスト（例えば最大コントラスト）となる。
【００５９】
相対位相ずれがゼロになるように位相シフト素子が配置されると（ステップ７２）、位相ずれゼロの位相差画像が得られる（ステップ７３）。位相差画像は、図３のステップ８９で像を観察する際に使用されるものと同じ２Ｄ撮像装置を使用して撮影することができる。カメラ３２は、位相差画像を撮影し、その画像をカメラ３２の内部メモリ又は記憶域に保存する、かつ／又は画像を分析及び／又は記憶のためにコンピューティングデバイス１００に送信することができる。したがって、位相ずれゼロの位相差画像を撮像装置又は撮像装置から画像を受け取った装置のメモリから取得することができる。
【００６０】
ステップ７３で第１の画像を得ると、π／２の位相ずれに対応する位置に位相シフト素子を調節する（ステップ７４）。上記で説明したように、主要波長がλの光線を仮定すると、上記の式１を使用して、所望の相対位相ずれ（Δθ）を得るためにゼロの相対位相ずれ位置から可動ミラーを変位させる距離（ΔＰ）を求めることができる。例えば、上記のように、波長８４０ｎｍの光の場合、π／２の相対位相ずれは、可動ミラー５４を１０５ｎｍ変位させる（ΔＰ）ことに相当する。したがって、可動ミラー５４を１０５ｎｍ変位させて、位相ずれがπ／２になる位置に配置することができる。相対位相ずれがπ／２になるように位相シフト素子を配置して位相差画像を得る（ステップ７５）。位相差画像は、図２に示す方法８０を使用して得ることができる（ステップ７５）。
【００６１】
次いで、第１の光線３２と第２の光線３８間の位相ずれがπ／２となる位置に位相シフト素子を調節する（ステップ７６）。例えば、波長が８４０ｎｍの光の場合、πの相対位相ずれは、可動ミラー５４を相対位相ずれゼロの位置から２１０ｎｍ変位させることに相当する。相対位相ずれがπになるように位相シフト素子を配置して位相差画像を得る（ステップ７７）。上記のように、位相差像は、図２に説明する方法８０を使用して取得し、撮影することができる（ステップ７７）。相対位相ずれがゼロ、π／２、及びπとなるように位相シフト素子を配置した時の位相差画像を得ると、その位相差画像から定量位相画像を生成する（ステップ７８）。方法８０については、ゼロの相対位相ずれ、π／２の相対位相ずれ、πの相対位相ずれの順で位相差像を得るものとして説明するが、実際には、ゼロの相対位相ずれに対応する場所が特定された後、位相差画像はどの順序で得てもよい。さらに、方法７０は、ゼロ、π／２、及びπの相対位相ずれそれぞれで位相差画像を得るものとして説明したが、位相シフト素子を任意の位置に置いて複数の位相差画像を得、その複数の画像を合成（例えば平均化）してから定量位相画像の生成に使用してもよい。
【００６２】
位相差画像は、以下の式により、試料からの回折光と非回折光との干渉として表すことができる。
【００６３】
【数２】
2015503128.tif 000004
【００６４】
ここで、Ｉ0（ｘ，ｙ）は各位置における位相差画像の強度であり、ＩUは非回折光からの画像強度であり、ＩDは回折光からの画像強度であり、Δψ（ｘ，ｙ）は２次元の位相ずれである。ＩU（ｘ，ｙ）及びＩD（ｘ，ｙ）はともに位置（ｘ，ｙ）の関数であるが、数式中では簡潔さのために単にＩU及びＩDで表している。
【００６５】
システム内の第１の光線と第２の光線間の相対位相ずれを制御された形で変化させ、ゼロ、π／２、π、及び３π／２の相対位相ずれで位相差画像を得る場合は、以下の式が適用される。
【００６６】
【数３】
2015503128.tif 000005
【００６７】
ゼロの相対位相ずれの位相差に対応する式Ｉ0（２）、π／２の相対位相ずれの位相差に対応する式Ｉ1（３）、及びπの相対位相ずれの位相差に対応する式Ｉ2（４）を組み合わせると、以下のようにＩ0、Ｉ1、及びＩ2に依存する画像全体の定量位相の式が得られる。
【００６８】
【数４】
2015503128.tif 000006
【００６９】
式６を使用して、各位置（ｘ，ｙ）における相対位相Δψ（ｘ，ｙ）を求めて、それぞれゼロ、π／２、及びπの相対位相ずれを持つ位相差画像Ｉ0、Ｉ1、及びＩ2から定量位相画像を作成することができ、定量位相画像は各位置における定量位相情報を含む。これにより得られる定量位相画像を３ステップ画像と呼ぶ。
【００７０】
図４は、４つの位相ずれに基づく定量位相画像を生成する例示的方法９０を説明する図である。一部の実施形態では、定量位相イメージングの方法は、図４のフローチャートに概略的に示すように位相ずれがゼロ、π／２、π、及び３π／２となるように位相シフト素子を配置して位相差画像を得ることを含むことができる。方法９０は、ゼロ、π／２、及びπの相対位相ずれになるように位相シフト素子を調節し、各相対位相ずれにおける位相差像を得るステップ９１〜９６を含み、これは方法７０の対応するステップ７２〜７７に対応する。方法９０では、位相シフト素子は、相対位相ずれが３π／２となる位置にも調節され（ステップ９７）、その位相ずれで位相差画像を得る（ステップ９８）。上記のように、図３の方法８０を使用して所望の位相差像を得ることができ、像は画像として取得することができる。ゼロ、π／２、π、及び３π／２の相対位相ずれにおける位相差画像から定量位相画像を生成する。
【００７１】
Ｉ0（ｘ，ｙ）がゼロの相対位相ずれにおける位相差画像強度であり、Ｉ1（ｘ，ｙ）がπ／２の相対位相ずれにおける位相差画像強度であり、Ｉ2（ｘ，ｙ）がπの相対位相ずれにおける位相差画像強度であり、Ｉ3（ｘ，ｙ）が３π／２の相対位相ずれにおける位相差画像強度である場合、画像中の各位置（ｘ，ｙ）における定量位相Δψ（ｘ，ｙ）は、下記の式７を使用して得ることができ、この式７は上記の式２〜５から導出される。
【００７２】
【数５】
2015503128.tif 000007
【００７３】
これにより得られる定量位相画像を４ステップ画像と呼ぶ。４ステップ定量位相画像の例を図６、８〜１５、１７、及び１８〜２３に示す。
【００７４】
方法７０の場合の定量位相画像値Δψ（ｘ，ｙ）は、コンピューティングデバイス（以下の図５に関する説明を参照）を使用して式６又はそれに相当する数式若しくは近似式を評価することにより、位相差画像Ｉ0、Ｉ1、及びＩ2から計算することができる。Ｉ2がＩ1と等しくなる位置では、差（Ｉ2−Ｉ1）は非ゼロの小さい値と定義して、式６でゼロ分母に関する問題を回避することができる。同様に、方法９０の場合の定量位相データ値Δψ（ｘ，ｙ）は、コンピューティングデバイスを使用して式７又はそれに相当する数式若しくは近似式を評価することにより、位相差画像Ｉ0、Ｉ1、Ｉ2、及びＩ3から計算することができる。Ｉ2がＩ0と等しくなる位置では、差（Ｉ2−Ｉ0）は非ゼロの小さい値と定義して、式７でゼロ分母に関する問題を回避することができる。
【００７５】
一部の実施形態では、定量位相値の計算は、位置ごとに行われる（例えば画素ごと、又はデータ点（ｘ0，ｙ0）ごと）。他の実施形態では、定量位相データを計算する前に、位相差画像データを処理してもよい（例えばいくつかの画素にわたって平均してノイズの影響を低減する）。当業者は、種々のコンピュータプログラムやアルゴリズムを使用して位相差画像データから定量位相データを生成できることを認識されよう。
【００７６】
一部の実施形態では、方法（例えば方法７０、方法９０）はさらに、定量位相画像を視覚表示装置１２２に表示することを含むことができる（下記の図５の説明を参照）。４ステップ定量位相画像の例を図６、８〜１５、１７、及び１８〜２３に示す。
【００７７】
一部の実施形態では、方法（例えば方法７０、方法９０）はさらに、定量位相画像データの少なくとも一部に基づいて試料の少なくとも一部分の厚みを計算することを含むことができる。この計算は、定量位相画像中の各位置における厚み、定量位相画像中の位置の少なくとも一部の各位置における厚み、又は定量位相画像に沿った断面の計算とすることができる。断面は、複数の画素線を平均して断面を得ることができる。下記の図７に関する説明を参照されたい。
【００７８】
図５は、本明細書で教示される例示的方法及びシステムを含む各実施形態を実施するのに適した例示的コンピューティング環境を示す。この環境は、関連する周辺装置を伴うコンピューティングデバイス１００を含む。コンピューティングデバイス１００は、本明細書で教示される各種方法又は方法の一部を行うための実行可能コード１５０を実装するようにプログラムすることができる。コンピューティングデバイス１００は、ハードドライブ、ＣＤ−ＲＯＭ、又は他の非一時的コンピュータ可読媒体などの記憶装置１１６を含む。記憶装置１１６はオペレーティングシステム１１８及び他の関連ソフトウェアを記憶することができる。コンピューティングデバイス１００はさらにメモリ１０６を含むことができる。メモリ１０６は、コンピュータシステムメモリ、又はＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＥＤＯ  ＲＡＭ等のランダムアクセスメモリを含む。メモリ１０６は他の種類のメモリ又はそれらの組み合わせも含むことができる。コンピューティングデバイス１００は、記憶装置１１６及び／又はメモリ１０６に、実行可能コード１５０の各部分を実装し、処理する命令を記憶することができる。
【００７９】
実行可能コード１５０は、位相差画像を分析して３ステップ及び／又は４ステップの定量位相画像を生成するコードを含むことができる。一部の実施形態では、実行可能コード１５０は、位相差画像及び／又は定量位相画像を処理するための画像処理機能（例えばクロッピング、平滑化、フィルタ、対象領域の定義等）を含むことができる。実行可能コード１５０は、位相差画像及び／又は定量位相画像を表示するコードも含むことができる。一部の実施形態では、実行可能コード１５０は、定量位相画像中の１つ以上の場所に対応する厚み情報を求めるコードも含むことができる。
【００８０】
一部の実施形態では、実行可能コード１５０はさらに、定量位相画像に基づいて細胞体及び／又は細胞核の自動化されたセグメンテーションを行うコードを含むことができる。当業者には、多くの知られる自動化されたセグメンテーション方法及び技術を自動的なセグメンテーションに用いることが可能であり、そのような技術には、ｗａｔｅｒｓｈｅｄ特徴検出、統計駆動型の閾値設定（例えばＯｔｓｕ、平均、ＭｉｎＥｒｒｏｒ、Ｈｕａｎｇ、トライアングル、ＭｉｎＭａｘ閾値設定）及び／又はエッジ強調フィルタ（例えばアンシャープマスク、Ｓｏｂｅｌフィルタリング、ガウスフィルタ、カルマンフィルタ）等があることが理解されよう。一部の実施形態では、実行可能コード１５０は、細胞及び／又は核をユーザ支援方式でセグメンテーションする機能を含むことができる（例えば、ユーザが定量位相画像中の細胞の境界や核の境界を指示できるようにするツール）。他の実施形態では、セグメンテーションはユーザにより完全に手動で行うこともできる。
【００８１】
コンピューティングデバイス１００はプロセッサ１０２も含み、メモリ１０６に記憶されたソフトウェアや、システムハードウェア、周辺装置及び／又は周辺ハードウェアを制御するための他のプログラムを実行するための１つ以上の追加的なプロセッサ１０２’も含むことができる。プロセッサ１０２及び（１つ以上の）プロセッサ１０２’は各々、シングルコアプロセッサであってもマルチコア（１０４及び１０４’）プロセッサであってもよい。コンピューティングデバイス１００内で仮想化を利用して、コンピューティングデバイスのインフラストラクチャと資源を動的に共有することができる。記憶装置１１６の実行可能コード１５０及び他のソフトウェアに仮想化プロセッサを使用することも可能である。仮想機械１１４を提供して、複数のプロセッサで実行されるプロセスを処理して、プロセスが複数のコンピューティング資源ではなく１つのみのコンピューティング資源を使用しているように見せることができる。１つのプロセッサと共に複数の仮想機械を使用することもできる。
【００８２】
ユーザは、ユーザインターフェース１２４又は他の任意のインターフェースを表示することのできる、コンピュータモニタ等の視覚表示装置１２２を通じてコンピューティングデバイス１００と対話することができる。表示装置１２２のユーザインターフェース１２４を使用して、位相差画像、定量位相画像、及び／又は各種周辺装置を制御するためのユーザコントロールを表示することができる。視覚表示装置１２２は、例示的実施形態の他の態様や要素（例えば記憶装置１１６に対応するアイコン）を表示することもできる。コンピューティングデバイス１００は、ユーザからの入力を受け取るためのキーボードやマルチポイントタッチインターフェース（例えばタッチスクリーン）１０８及びポインティングデバイス１１０（例えばマウス、トラックボール及び／又はトラックパッド）等の他の入出力装置を含むことができる。キーボード１０８及びポインティングデバイス１１０は、有線及び／又はワイヤレス接続を介して視覚表示装置１２２及び／又はコンピューティングデバイス１００に接続することができる。コンピューティングデバイス１００は、他の適切な従来の入出力周辺装置を含んでよい。
【００８３】
一部の実施形態では、コンピューティングデバイス１００は、有線接続、ワイヤレス接続、及び／又は記憶装置（例えばフラッシュドライブ）の物理的な移動を介して、撮像装置１７０（例えば図１のカメラ６２）との間で情報（例えばデータや画像）を送受信する。一部の実施形態では、コンピューティングデバイス１００は、撮像装置１７０の１つ以上の態様（例えば取得速度、画像の解像度等）を制御する実行可能コードを含む。一部の実施形態では、撮像装置１７０自体が、撮像パラメータ（例えば取得速度、画像の解像度等）を制御するためのユーザインターフェースを含むことができる。
【００８４】
一部の実施形態では、コンピューティングデバイス１００は、ミラー位置コントローラ１８０との間で情報を送受信することができる。例えば、コンピューティングデバイス１００は、可動ミラー５４の位置に関する情報を受け取り、かつ／又はミラー位置コントローラ１８０に可動ミラー５４の位置を変更するように指示することができる。一部の実施形態では、ミラー位置コントローラ１８０は、コンピューティングデバイス１００内に組み込んでもよい。
【００８５】
一部の実施形態では、コンピューティングデバイス１００は、顕微鏡／光源１６０との間で情報を送受信することができる。例えば、コンピューティングデバイス１００を使用して輝度等の光源のパラメータを観測及び／又は制御することができる。別の例として、デジタル制御される顕微鏡の場合は、顕微鏡のパラメータ（例えば焦点やフィルタリング）をコンピューティングデバイス１００を使用して観測し、制御することができる。
【００８６】
コンピューティングデバイス１００は、これらに限定されないが、標準的な電話回線、ＬＡＮ又はＷＡＮリンク（例えば８０２．１１、Ｔ１、Ｔ３、５６ｋｂ、Ｘ．２５）、ブロードバンド接続（例えばＩＳＤＮ、フレームリレー、ＡＴＭ）、ワイヤレス接続、コントローラエリアネットワーク（ＣＡＮ）、又はそれらの任意又はすべての組み合わせを含む各種の接続を通じて、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、又はインターネットを介してネットワークデバイス１２６とインターフェースをとるネットワークインターフェース１１２を含むことができる。ネットワークインターフェース１１２は、内蔵ネットワークアダプタ、ネットワークインターフェースカード、ＰＣＭＣＩＡネットワークカード、カードバスネットワークアダプタ、ワイヤレスネットワークアダプタ、ＵＳＢネットワークアダプタ、モデム、又はコンピューティングデバイス１００が、通信と本明細書に記載される動作を行うことが可能な任意種のネットワークとインターフェースをとることを可能にするのに適した他の任意の装置を含むことができる。
【００８７】
さらに、コンピューティングデバイス１００としては、ワークステーション、デスクトップコンピュータ、サーバ、ラップトップ、手持ち型コンピュータ等の任意のコンピュータシステム、又は、通信が可能で、本明細書に記載される動作を行うのに十分なプロセッサパワーとメモリ容量を有する他の形態のコンピューティング装置又は遠隔通信装置を用いることができる。
【００８８】
コンピューティングデバイス１００は、ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ  ＷＩＮＤＯＷＳ(登録商標）オペレーティングシステムの各種バージョン、Ｕｎｉｘ(登録商標）及びＬｉｎｕｘ(登録商標）オペレーティングシステムの各種リリース、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータ向けのＭＡＣＯＳの任意のバージョン、埋め込みオペレーティングシステム、リアルタイムオペレーティングシステム、オープンソースオペレーティングシステム、独自開発のオペレーティングシステム、モバイルコンピューティング機器向けのオペレーティングシステム、又はコンピューティングデバイスで実行することが可能で、本明細書に記載される動作を行うことが可能な他のオペレーティングシステム等のオペレーティングシステム１１８を実行することができる。オペレーティングシステムはネイティブモードで実行しても、エミュレートモードで実行してもよい。
例示的システム及び方法
本発明者らは、図１に示すシステム１０と同様の例示的なシステムを設計し、構築した。この例示的システムは、コヒーレンス長が６μｍの波長８４０ｎｍのスーパールミネセンスレーザーダイオードを使用して試料を照明する。対物レンズ及びチューブレンズを含む透過型顕微鏡を使用して、試料で回折した光と試料で回折されない光を集光した。このシステムでは２つのキューブビームスプリッタを使用した。第１の経路に沿って、システムは、焦点距離が６０ｍｍの第１のレンズと、焦点距離が６０ｍｍの第２のレンズを設けた。第１のレンズの焦点面に、システムは、直径が１５μｍの開口部を有するマスクを含み、このマスクは、合焦した第１の非回折光線の大部分を透過させ、第１の回折光線の大部分を遮断する。第２の経路に沿って、システムは、焦点距離が１５０μｍの第３のレンズと、焦点距離が１５０μｍの第４のレンズを設けた。０．６４ラジアンに相当する位置解像度及び０〜２πに相当する合計範囲を持つ圧電変換器上に可動ミラーを配置した。システムは、２Ｄ画像を得るための高解像度ＣＣＤカメラを備えた。顕微鏡を使用して回折光と非回折光を集光しており、また撮像する領域の規模のために、以下の説明では定量位相画像を定量位相顕微鏡法（ＱＰＭ）画像と呼ぶ。以下の説明とそれに対応する図６、８〜１５、１７、及び１８〜２３では、すべてのＱＰＭ画像は、ゼロ、π／２、π、及び３π／２の相対位相ずれにおける位相差画像の測定を伴う４ステップ技術を使用して生成されている。
ガラス試料に刻んだ段差についての結果例
段差を刻んだガラス試料を例示的なシステムで測定した。Ｄｅｋｔａｋの表面粗さ計を使用して単独で測定したところ、段差の高さは約２１８ｎｍであった。そのガラス試料の４つの測定位相差画像から図６のＱＰＭ画像２００を生成した。矩形２０２で示す領域では、行ごとに強度値を平均して、ｘ（単位：μｍ）の関数として平均位相（単位：ラジアン）を得、これをグラフ２０４の線２０６として表示する。段差Δψstepの位相の差は約０．７６ラジアンに等しい。以下の式を使用して位相の差を高さの差に関係づけることができ、式中、Δｈ（ｘ，ｙ）は任意の位置における相対高さであり、λ0は光源の中心波長であり、ｎ（ｘ，ｙ）はその位置における試料材料の屈折率である。
【００８９】
【数６】
2015503128.tif 000008
【００９０】
ガラス試料について、ｎは０．５２の一定値であり、段差について２０３ｎｍの厚み値が得られ、この値は、Ｄｅｋｔａｋの表面粗さ計で測定した値の７％以内にある。この一致は、本発明の例示的システム及び方法を使用して、ナノメートルのスケールで試料に関する定量的な厚み情報を得られることを実証している。
【００９１】
生物試料の場合、屈折率は異なる場所でほぼ一定であるか、又は各位置における細胞又は細胞構造の種類（例えば核、細胞小器官、細胞壁）ごとに変動する場合もある。例えば、種々の生物試料の屈折率は１．３３〜１．４７以上の範囲で異なる可能性がある。屈折率の変動が大きい試料では、厚みの判定には、位置（ｘ，ｙ）ごとに変化する屈折率を使用することが必要となる場合がある。当業者は、各種細胞及び細胞構造についての屈折率の既知の値を使用して、定量位相値から厚み値を計算できることを理解されよう。
ヒトの口腔上皮細胞についての結果例
図８〜図１１に、上記の例示的システムを使用して得られたヒトの口腔上皮細胞のＱＰＭ画像を示す。ヒトの口腔上皮細胞はカバーガラス上で撮像した。図８では定量位相情報を各位置における画像強度で表しているが、ＱＰＭ画像は、セグメンテーションのために口腔上皮細胞２１０、２１２、２１４、及び２１６を区別するのに十分なコントラストを備えている。さらに、これらのＱＰＭ画像は、核２１１、２１３、２１５、及び２１７等の細胞下位構造を識別するのに十分なコントラストを提供する。図９は、図８に示す定量位相情報の３次元表現の透視図を含み、ここでは位相は強度とｚ方向の高さの両方で識別している。図１０は、ヒトの口腔上皮細胞の別の２次元ＱＰＭ画像を含む。図１１は、図１０に示すＱＰＭ情報の３次元表現の透視図である。図８〜図１１はグレースケールであるが、実施形態によっては異なる色を使用して異なる位相値を示すことができる。
Ｂ３５細胞の結果例
図１２〜図１５は、上記の例示的システムを使用して得られたＢ３５生細胞のＱＰＭ画像を示す。Ｂ３５細胞株は、新生児ラットの中枢神経系の腫瘍から取られたニューロン細胞株である。Ｂ３５生細胞は撮像チャンバに入れた状態で撮像した。定量位相情報を各位置における画像強度で示す図１２の２次元画像で示すように、ＱＰＭ画像は、セグメンテーションのためにＢ３５細胞２３０〜２３９を区別するのに十分なコントラストを備えている。図１３は、図１２に示す定量位相情報の３次元表現の透視図を含み、ここでは位相は強度とｚ方向の高さの両方で識別される。図１４はＢ３５生細胞の別の２次元ＱＰＭ画像を含み、図１５はそれに対応するＱＰＭ画像の３次元表現の透視図である。
消化管組織切片の結果例
図１６〜図２０は、薄い消化管組織切片試料の画像である。図１７は、組織切片試料の２次元ＱＰＭ画像である。図１６は、比較用の組織切片試料の同じ場所の光学強度画像である。図１６及び図１７で示すように、図１７の消化管組織切片のＱＰＭ画像は、図１６の光学画像と比べて優れた画像の解像度と優れた画像コントラストをもたらす。さらに、ＱＰＭ画像は定量位相情報も提供する。
【００９２】
図１８〜図２０は、例示的システムを様々な倍率に設定して撮影した位相差画像から生成された消化管組織切片試料のＱＰＭ画像を含む。図１８は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＹＰｌａｎＦＬ  ４ｘ／０．１３対物レンズ（プラン、蛍石、倍率４ｘ、開口数０．１３）を備えた顕微鏡を使用して得られた位相差画像から生成された薄い消化管組織切片のＱＰＭ画像を含む。図１９は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＹＰｌａｎＦＬ  ２０ｘ／０．５対物レンズ（プラン、蛍石、倍率２０ｘ、開口数０．５）を備えた顕微鏡を使用して得られた位相差画像から生成された薄い消化管組織切片のＱＰＭ画像を含む。図２０は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＵＰｌａｎＳＡｐｏ  ４０ｘ／０．９５対物レンズ（プラン、アクロマート、倍率４０ｘ、開口数０．９５）を備えた顕微鏡を使用して得られた位相差画像から生成された薄い消化管組織切片のＱＰＭ画像を含む。図１９及び図２０に示すように、それぞれ２０ｘ及び４０ｘと比較的高い倍率でも、ＱＰＭ画像は良好な解像度と良好な画像コントラストを示している。
ラットの間葉幹細胞の結果例
図２１〜図２３は、例示的システムを様々な倍率に設定して撮影した位相差画像から生成されたラットの間葉幹細胞（ＭＳＣ）の試料のＱＰＭ画像を含む。ラットのＭＳＣはカバーガラスに載せて撮像した。ＭＳＣは、ラットの骨髄から得られる多能性幹細胞であり、分化して様々な細胞種類となることができる。図２１は、顕微鏡にＯｌｙｍｐｕｓ  ＹＰｌａｎＦＬ  ４ｘ／０．１３対物レンズ（プラン、蛍石、倍率４ｘ、開口数０．１３）を備えた例示的システムを使用して得られた位相差画像から生成されたＭＳＣのＱＰＭ画像を含む。図２１は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＹＰｌａｎＦＬ  ２０ｘ／０．５対物レンズ（プラン、蛍石、倍率２０ｘ、開口数０．５）を使用して得られた位相差画像から生成されたＭＳＣのＱＰＭ画像を含む。図２２は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＵＰｌａｎＳＡｐｏ  ４０ｘ／０．９５対物レンズ（プラン、アクロマート、倍率４０ｘ、開口数０．９５）を使用して得られた位相差画像から生成されたＭＳＣのＱＰＭ画像を含む。図２２及び図２３に示すように、それぞれ２０ｘ及び４０ｘと比較的高い倍率でも、ＭＳＣのＱＰＭ画像は良好な解像度と良好な画像コントラストを示している。
【００９３】
本発明の実施形態の一部の特徴を本明細書に例示し、記載したが、本出願に基づく多くの改変及び変更が当業者には明らかになろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の範囲に該当するすべてのそのような改変及び変更を包含するものであることを理解されたい。
【００９４】
特許請求の範囲では限定事項の特定の組み合わせを挙げるが、本発明は、各独立請求項を単独で明示的に包含し、また、明らかに整合性のないものを除き、関連する従属請求項に明確に述べられる限定事項の可能な組み合わせとの関連で各独立請求項を包含する。
【符号の説明】
【００９５】
１０  システム
１２  光源
１４  試料
１５  光学素子
１６  主光線
１７  非回折光
１８  回折光
２０  主光線光学素子
２２  対物レンズ
２４  チューブレンズ
２５  光
２８  顕微鏡
３０  ビームスプリッタ
３２  第１の光線
３４  第１の回折光線
３６  第１の非回折光線
３７  第１の非回折光線
３８  第２の光線
３９  合波光線
４０  第２の回折光線
４２  第２の非回折光線
４４  レンズ
４６  焦点面
４８  マスク
４９  開口部
５０  レンズ
５２  可動ミラーユニット
５４  可動ミラー
５６  圧電変換器
６０  ビームスプリッタ
６２  撮像装置（カメラ）
６４  レンズ
６６  ミラー
６８  ミラー
６９  レンズ
７０  レンズ
１００  コンピューティングデバイス
１０２  プロセッサ
１０２’  プロセッサ
１０４  プロセッサ
１０４’  プロセッサ
１０６  メモリ
１１０  ポインティングデバイス
１１４  仮想機械
１１６  記憶装置
１１８  オペレーティングシステム
１２２  表示装置
１２４  ユーザインターフェース
１５０  実行可能コード
１６０  顕微鏡／光源
１７０  撮像装置
１８０  ミラー位置コントローラ
【図１】
2015503128.tif 000009
【図２】
2015503128.tif 000010
【図３】
2015503128.tif 000011
【図４】
2015503128.tif 000012
【図５】
2015503128.tif 000013
【図６】
2015503128.tif 000014
【図７】
2015503128.tif 000015
【図８】
2015503128.tif 000016
【図９】
2015503128.tif 000017
【図１０】
2015503128.tif 000018
【図１１】
2015503128.tif 000019
【図１２】
2015503128.tif 000020
【図１３】
2015503128.tif 000021
【図１４】
2015503128.tif 000022
【図１５】
2015503128.tif 000023
【図１６】
2015503128.tif 000024
【図１７】
2015503128.tif 000025
【図１８】
2015503128.tif 000026
【図１９】
2015503128.tif 000027
【図２０】
2015503128.tif 000028
【図２１】
2015503128.tif 000029
【図２２】
2015503128.tif 000030
【図２３】
2015503128.tif 000031
【国際調査報告】
2015503128.tif 000032
2015503128.tif 000033
2015503128.tif 000034