(57)【要約】  いくつかの生物学的状態を表す遺伝子発現シグネチャを構築するための方法及びシステム、皮膚活性剤と対象となる皮膚状態との間の機能的関係を決定するためのシステム及び方法、並びに幅広いスペクトルの活性を有する皮膚活性剤を特定するための方法及びシステムが提供される。
2015526089.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化粧品使用のための皮膚ホメオスタシス上での撹乱因子の効果を評価する方法であって、前記方法が、
（ａ）コンピュータープロセッサに、格納された皮膚インスタンスのデータアーキテクチャに病的皮膚遺伝子発現シグネチャを用いて問い合わせをさせることであって、それぞれの皮膚インスタンスが撹乱因子に関連付けられ、かつ前記問い合わせが前記病的皮膚遺伝子発現シグネチャをそれぞれの格納された皮膚インスタンスと比較することを含んだ、問い合わせさせること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記病的皮膚発現シグネチャが、
（ａ）複数の皮膚状態に対する遺伝子発現測定値を得ることと、
（ｂ）（ａ）の前記遺伝子発現測定値を、対照サンプルに対する遺伝子発現測定値と比較することによって、前記皮膚状態で差次的に発現した遺伝子を特定することと、
（ｃ）コンピュータープロセッサに遺伝子発現一貫性値を
ｉ）前記差次的に発現した遺伝子に対するログオッズ比を算定することと、
ｉｉ）シグモイド関数を使用して前記ログオッズ比を変換することと、
ｉｉｉ）ゼロに対して片側ｔ検定を実施することと、
ｉｖ）前記片側ｔ検定から遺伝子発現一貫性値を達成するようにログオッズ比を算定すること、
とによって計算させることと、
（ｄ）前記遺伝子発現一貫性値によって順序付けされている、前記一貫して差次的に発現した遺伝子を表す識別子を含む、順序付けされたリストを作成することと、
（ｅ）遺伝子発現シグネチャリストを少なくとも１つのコンピューター可読媒体上に格納すること、
とを含む方法によって構築される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記病的皮膚遺伝子発現シグネチャが、約５個〜約４００個の上方調節された遺伝子、及び約５個〜約４００個の下方調節された遺伝子を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記病的皮膚遺伝子発現シグネチャが、ＴＳＴＡ３、ＡＲＰＣ５Ｌ、ＳＹＮＣＲＩＰ、ＰＰＰ４Ｒ１、ＰＯＬ３Ｓ、ＴＵＢＢ６、ＣＣＴ５、ＧＡＬＮＴ６、Ｃ１２ｏｒｆ５、Ｓ１００Ａ１１Ｐ、ＴＮＩＰ２、ＤＩＭＴ１Ｌ、ＯＴＵＢ１、ＭＰＺＬ２、ＤＤＸ３９、ＥＩＦ６、ＰＬＳＣＲ３、ＬＡＰＴＭ５、ＭＰＺＬ２、ＳＡＭＳＮ１、ＳＬＣ４３Ａ３、ＺＷＩＮＴ、ＥＨＢＰ１Ｌ１、ＴＲＩＭ１４、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＴＮＩＰ２、ＥＢＮＡ１ＢＰ２、ＳＥＣＴＭ１、ＦＡＩＭ３、Ｎ４ＢＰ１、Ｎ４ＢＰ１、ＳＮＲＰＤ３、ＬＡＰＴＭ５、ＬＯＣ３９１０２０、ＴＲＡＢＤ、Ｃ２０ｏｒｆ１１、及び２１６９５２＿ｓ＿ａｔからなる群から、好ましくは、ＴＳＴＡ３、ＡＲＰＣ５Ｌ、ＳＹＮＣＲＩＰ、ＰＰＰ４Ｒ１、ＰＯＬ３Ｓ、ＴＵＢＢ６、ＣＣＴ５、ＧＡＬＮＴ６、Ｃ１２ｏｒｆ５、Ｓ１００Ａ１１Ｐ、及びＴＮ１Ｐ２からなる群から選択される、少なくとも１つの上方調節された遺伝子を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記病的皮膚遺伝子発現シグネチャが、ＬＭＯＤ１、Ｃ１４ｏｒｆ１３２、ＧＰＤ１Ｌ、ＴＲＩＭ２、ＲＮＦ３８、ＬＯＮＰ２、２２２３６２＿ａｔ、ＰＨＹＨＩＰ、ＦＡＭ１１７Ａ、ＲＨＯＢＴＢ３、ＮＵＡＫ１、ＣＨＰ２、ＣＲＥＢＬ２、ＲＡＩ２、ＦＸＹＤ６、ＭＩＤ２、ＣＣＮＩ、ＰＥＬＩ２、ＦＯＸＪ３、ＡＮＫＲＤ２５、ＩＡＡ０２６５、ＦＬＪ１０３５７、ＯＳＢＰＬ１Ａ、ＤＤＸ４２、Ｃ１ｏｒｆ１１５、Ｃ２１ｏｒｆ２５、ＴＴＣ３、ＲＰＳ１４、２１２４９８＿ａｔ、ＰＦＡＡＰ５、ＴＳＰＹＬ５２１２９７０＿ａｔ、Ｃ６ｏｒｆ４８、ＩＨＰＫ２、及びＲＰ４−６９１Ｎ２４．１からなる群から選択される、好ましくは、ＰＨＹＨＩＰ、ＦＡＭ１１７Ａ、ＰＨＯＢＴＢ３、ＣＨＰ２、Ｃ１４ｏｒｆ１３２、ＬＯＮＰ２、２２２３６２−ａｔ、ＣＣＮＩ、ＰＥＬＩ２、ＬＭＯＤ１、ＧＰＤ１Ｌ、ＴＲＩＭ２、ＣＲＥＢＬ２、ＲＡＩ２、ＦＸＹＤ６、ＭＩＤ２、ＦＯＸＪ３、及びＡＮＫＲＤ２５からなる群から選択される、少なくとも１つの下方調節された遺伝子を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記病的皮膚遺伝子発現シグネチャが、表Ａに記載する前記上方調節された遺伝子を約８０％〜約１００％、及び表Ｂに記載する前記下方調節された遺伝子を約８０％〜約１００％含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記病的遺伝子発現シグネチャが、表Ｃに記載する遺伝子を約８０％〜約１００％含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記病的皮膚遺伝子発現シグネチャを、それぞれの格納された皮膚インスタンスと比較することが、複数のインスタンスのそれぞれに関連性スコアを割り当てることを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記関連性スコアが、＋２〜−２の値を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記格納された皮膚インスタンスが、細胞シグナリング、システム開発、表皮開発、免疫システムプロセス、及び炎症に影響する撹乱因子に関連付けられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
炎症のエクスビボ皮膚モデルで、前記撹乱因子の活性を特徴付けることを更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
皮膚炎症の前記エクスビボモデルが、哺乳類の皮膚サンプルを含み、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＬ−１ｂ、及びこれらの組合せからからなる群から選択される有効量の化合物を前記乳類の皮膚サンプルに送達することによって、哺乳類の皮膚サンプルで炎症が誘発される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
炎症の三次元器官モデルで、前記撹乱因子の活性を特徴付けることを更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞に基づくアッセイ、エクスビボ組織アッセイ、及びインビボアッセイからなる群から選択される少なくとも１つのアッセイで、前記撹乱因子の活性を特徴付けることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
炎症アッセイ、表皮分化アッセイ、上皮細胞増殖アッセイ、及び脂質代謝アッセイからなる群から選択される１つ以上のアッセイで、皮膚インスタンスに関連付けられる撹乱因子の活性を特徴付けることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の皮膚条件を表す遺伝子発現シグネチャの生成及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚状態は、発展途上世界で治療されているいくつかの最も一般的な疾患を含み、かつ著しい経済的な負担を示し、２００４年には米国のみでも約３９３億ドルもの推定コストを被っている。（「Ｔｈｅ  Ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  Ｓｋｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ２００４」、研究皮膚科学会及び米国皮膚科学会のために、Ｔｈｅ  Ｌｅｗｉｎ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．によって２００６年に用意された。）常時、米国の人工の３分の１は、少なくとも１つの皮膚状態に活動的に苦しめられていると推定される。（Ｊｏｈｎｓｏｎ，「Ｓｋｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｃａｒｅ  ａｍｏｕｎｔ  ｐｅｒｓｏｎｓ  １〜７４  ｙｅａｒｓ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，１９７１〜１９７４．」Ｖｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｓｅｒｉｅｓ  １１，Ｎｏ．２１２，ＤＨＥＷ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．（ＰＨＳ）７９−１６６０，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｆａｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １９７８：１〜７２．）異なる皮膚状態が、幅広く様々なきっかけ、生物学的機構、環境的因子、及び臨床症状に関連付けられ、皮膚ホメオスタシスへの研究、及び広範な適用範囲を有するスキンケア剤の開発を複雑にする。
【０００３】
座瘡は、皮疹（面皰、丘疹、膿疱、及び嚢胞を含む）によって特徴付けられる疾患であり、これは一般的に、顔、頚、胸、背中、及び肩を含む高い密度で脂腺を有する区域に生じる。皮疹は、例えば、毛嚢が皮脂及び死んだ皮膚細胞で閉塞したときに生じる。損傷は、炎症をともなう場合があり、プロピオニバクテリウム・アクネスなどの細菌が、詰まった孔の中で成長し炎症反応を引き起こす。いくつかの因子が、座瘡の発症及び重症度に寄与していると考えられている。座瘡発疹につながる皮膚内の物理的な変化が特徴付けられているが、どの毛嚢が冒されることになるか指示する根底にある原因を特定するのは困難であることが示されている。ストレス、思春期、薬物治療、及び妊娠によって生じたホルモンの変化は、座瘡の発生を増加する可能性がある。遺伝因子も、座瘡の羅患率に影響する。熱、湿度、及び油っぽい又は閉塞性皮膚用製品の使用を含む環境的因子も、結果的に座瘡の再発をもたらす可能性がある。炭水化物が多い食事も、座瘡の悪化につながる可能性がある（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍｅｒ  Ａｃａｄ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，５７（２）：２４７〜５６（２００７）を参照のこと）。座瘡治療の開発は、１つには、疾患の根本原因が十分に理解されていないため、無数の因子が皮膚状態に影響を及ぼす場合がある（又は及ぼさない場合がある）ため、遅れている。最新の療法は、皮疹が生じた後、発生が再発するのを防止するために座瘡を治療することを目的としている。
【０００４】
皮膚炎としても知られる湿疹は、皮膚の赤み及び掻痒、水泡、並びに亀裂につながる炎症によって特徴付けられる皮膚疾患の大きな区分である。湿疹は、世界中で約１０人に１人に影響を与えていると推定される。湿疹の型としては、神経皮膚炎、接触湿疹、脂漏性湿疹、楕円形湿疹、及び汗疱性湿疹が挙げられる。湿疹の正確な原因は知られていないが、この疾患は、アレルギー又は他の過敏症の疾病素質などの遺伝因子によって影響されていると考えられている。湿疹は、乾燥空気、寒さ、及び皮膚刺激物を含む環境的因子ともリンクしている。ストレス及び病気は、状態を悪化させると考えられている。
【０００５】
アトピー性皮膚炎は、湿疹の形態と考えられ、これは落屑性及び掻痒性発疹によって特徴付けられる慢性の皮膚疾患である。疾患は、皮膚損傷、変色、及び目の疾患として明白にすることができる。疾患のいくつかの原因が提案されているが、確かなことは何も特定されていない。食品、塵埃、花粉、及びフケを含む環境的なアレルゲンは、この疾病にリンクしている。家族研究（Ｋｌｕｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｙ，５８（１）：５〜１２（２００３））に基づき、遺伝因子は、疾病の発症に影響を及ぼすと考えられる。アトピー性皮膚炎も、表皮の障壁での欠陥につながる遺伝子の変化にリンクしている（Ｃｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１２９（８）：１８９２〜９０８（２００９））。環境的因子は、疾患の開発にも影響し、アトピー性皮膚炎は、マイクロ波及び携帯電話からの曝露と関連付けられる（例えば、Ｋｉｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２９（４）：３４８〜３５０（２００２）、及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８（５）：４４１〜７（２００７）を参照のこと）。
【０００６】
フケ（代替として文献中では単純性、粃糠性、又は頭部粃糠疹（ptyriasis）とも称される）は、剥離、掻痒、及び微小炎症によって特徴付けられる皮膚疾患である。フケは、身体の他の位置に見られることがある脂漏性皮膚炎の一形態と考えられている。一般に、フケは、炎症がわずかであり、通常は無症状であるので、臨床的見地から最も軽度の脂漏性皮膚炎の形態であると考えられている。実際に、わずか１０年前まで、フケ状態は非炎症性と考えられていた。一般に脂漏性皮膚炎は、より高度の炎症に関連付けられる。
【０００７】
フケの病因は複雑であり、頭皮と皮膚細菌叢と皮膚免疫系との間の相互作用の結果であるように見える。フケの重要な臨床的特徴としては剥離及び掻痒が挙げられ、これらの症状を引き起こす正確な根底にある事象は完全にはわかっていない。フケは、多数の病原経路及び複雑な機序を有する、複数のしばしば重複する原因を有すると考えられている。例えば、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｓｐｐを含む微生物相は、最も一般的なフケの形態と関係付けられる。しかしながら、症状の重症度と菌数との間には関係が見出されていない。太陽光への過度の曝露、頭皮の経度の長期にわたる刺激、過度のブラッシング、過度の洗髪、ある特定の化粧用毛髪用製品、及び空気によって運ばれた物質からの刺激、並びに心理的なストレスに続いて、フケと類似の鱗屑状態が生じる場合がある。
【０００８】
乾癬は、皮膚細胞の過度の蓄積によって特徴付けられる慢性の疾病である。疾患の臨床症状は多種多様であり、銀白色の皮膚の退廃物、掻痒、膨化、損傷、及び膿疱をしばしば含む。発赤は、無作為に身体の異なる部分の上に生じる可能性がある。この疾病は、一般に５つのサブタイプ、すなわち尋常性、滴状、逆性、膿疱性、及び紅皮症に分類され、そのそれぞれが独特の特性と関連付けられる。乾癬が重症の場合、結果的に外観を損ない、かつ身体障害となる場合がある。例えば、膿疱性乾癬は、発熱、さむけ、体重減少、悪心、頭痛、関節痛、及び疲労を含む全身性の症状につながる可能性がある。
【０００９】
乾癬の原因及びその特徴的な皮膚細胞の過形成は、十分に理解されていない。１つの仮説は、この疾病が免疫系の欠陥によって媒介されると提案しており、この疾病は、強い遺伝的構成要素を有すると考えられる。乾癬に対する感受性に関連付けられる染色体の遺伝子座が特定されている。外傷、喫煙、薬物治療、及び寒冷な気象を含む環境的なきっかけは、状態を悪化させ、かつ再発を引き起こす可能性があると考えられる。現在の治療は、既存の再燃の重症度を最小限にし、かつ再発を最小限にしようとしている。Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、及びＨｕｍｉｒａ（登録商標）を含む多くの既存の治療は、免疫系を標的としている。
【００１０】
皮膚状態の羅患率、及びこれらの原因を特定するための研究の努力にもかかわらず、多くの皮膚状態に対応する、根底にある機構は、明らかになっていないままである。それぞれの、個々の状態の病因は、多因子であり、かつ皮膚状態に関連付けられる複雑な疫学は、それぞれの状態に独特の遺伝と環境的因子との組み合わせによって影響される。実際、個人の疾病素質と組合せられた、異なる皮膚状態に関連付けられる多種多様な外部及び内部の刺激、及び病因学的複雑さは、広域スペクトル治療を困難にする。当該技術分野において、特定の状態の作用又は病因学の機構に頼ることなく潜在的な皮膚活性剤を特定し、薬剤の皮膚ホメオスタシス上での影響を決定する、複数の皮膚状態の根底にあるバイオロジーを研究するための材料及び方法における、継続的な必要性がある。
【００１１】
本研究者らは、外見上多種多様な皮膚状態のトランスクリプトーム調査に着手し、広域スペクトルの有効性を用いた新しい皮膚活性剤に対する探索のための「関連性マッピング」（Ｃ−マップ）の適用を探究した。機能性を、以前は特徴付けられていなかった遺伝子に対して正確に決定することが可能な一般的な観念、及び薬剤の潜在的な標的を、薬剤治療された細胞のための遺伝子発現プロファイルのデータベース内の関連性をマッピングすることによって特定することが可能な一般的な観念は、２０００年に、影響力の強い論文、Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．による［「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｖｉａ  ａ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ」Ｃｅｌｌ  １０２，１０９〜１２６（２０００）］の出版で巻頭を飾り、そのすぐ後に、「関連性マップ」の立ち上げ（−Ｊｕｓｔｉｎ  Ｌａｍｂ及びＭＩＴの研究者らによるマッププロジェクト）が続いた（「Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍａｐ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，」Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  ３１３，２００６）。２００６年、Ｌａｍｂのグループは、Ｃマップ構築の方法の詳細な概要及び第一世代Ｃマップの作成に使用した遺伝子発現プロファイルの参照コレクションの連載、並びに現在進行中の大規模コミュニティＣマッププロジェクト（ハイパーリンクｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／３１３／５７９５／１９２９／ｓｕｐｐｌ／ＤＣ１の「ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ」で閲覧可能）の始動の発表を開始した。
【００１２】
関連性マッピングは、癌を含む様々な疾病の治療のための新しい薬剤の特定を有して、確認された医療的な成功を収めた。それにもかかわらず、ある特定の制限的仮定が、種々の、かつしばしば明らかに無関係の、細胞表現型の顕在（皮膚状態などの）によって特徴付けられる、多遺伝子起源の疾病又は症候性状態に関して、Ｃマップの適用に異議を唱える。Ｌａｍｂによると、有用なＣマップを構築することの課題は、問い合わせ時に臨床的に顕著かつ有用な出力の生成を可能にする入力参照データを選択にあった。Ｌａｍｂの薬物に関連するＣマップでは、強い関連付けは参照関連付けを含み、強い関連付けは、「ヒット」として特定される所望の出力である。
【００１３】
しかしながら、薬学的な薬剤として好適な薬剤及び化粧剤として好適な薬剤は、分類上は別個である。薬学的な薬剤が、特異性のために選択され、体の構造及び機能への測定可能な効果を有することを意図する一方で、化粧剤は、外見への効果のために選択され、測定可能な程度まで、体の構造及び機能に効果をもたらさない場合がある。化粧剤は、細胞表現型への効果に関して実質的に非特異的である傾向もあり、体への投与は概して、身体面上又は身体面付近への塗布に限られる。
【００１４】
医薬品に関するＣマップを構築する際、Ｌａｍｂは、参照関連性が極度に高感度であり、同時に検出が困難（弱い）な場合、特定の困難に遭遇することを強調し、Ｌａｍｂは、数多くの冗長な関連付けを最小限に抑えるために妥協案を採用した。製剤の規制政策は意図される薬剤と病態との間の高度な特異性を要求し、また、医薬活性剤の開発において、脱線した関連付けを最小限に抑えた、単一のタンパク質に影響を与えることによる疾患の調節が望まれることから、ＬａｍｂのＣマップは、上記の妥協にもかかわらず、潜在的医薬品のスクリーニングに極めて適している。
【００１５】
Ｌａｍｂの関連性マッピングプロトコルは、したがって、特に上記される妥協案を仮定した、化粧品及びスキンケアの分野での仮説試験／生成に対するユーティリティを有することは予測されていなかった。スキンケア考案者は、複数の標的を調節することができ、複雑な表現型及び状態にわたって効果を有する、薬剤又は薬剤の組成物を模索している。更に、薬剤が医薬活性剤の規制政策の対象となることを回避するため、表現型に対するスキンケア剤の影響は本質的に比較的低くなくてはならない。それにもかかわらず、影響は消費者にとって知覚可能でなければならず、好ましくは、科学的方法によって実験的に確認可能でなければならない。美容上の状態の遺伝子転写／発現プロファイルは、低い倍率から中程度の倍率の差を有する多くの遺伝子を含み、一般に冗長である。したがって、化粧剤は、細胞表現型により多様であまり急性ではない効果を与え、確信のある仮説検証に有用な関連性マップの生成に適さない、Ｌａｍｂにより明示的に教示された種類の関連を生成する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】（Ｊｏｈｎｓｏｎ，「Ｓｋｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｃａｒｅ  ａｍｏｕｎｔ  ｐｅｒｓｏｎｓ  １〜７４  ｙｅａｒｓ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，１９７１〜１９７４．」Ｖｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｓｅｒｉｅｓ  １１，Ｎｏ．２１２，ＤＨＥＷ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．（ＰＨＳ）７９−１６６０，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｆａｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １９７８：１〜７２．）
【非特許文献２】（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍｅｒ  Ａｃａｄ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，５７（２）：２４７〜５６（２００７）を参照のこと）
【非特許文献３】（Ｋｌｕｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｙ，５８（１）：５〜１２（２００３））
【非特許文献４】（Ｃｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１２９（８）：１８９２〜９０８（２００９））
【非特許文献５】Ｋｉｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２９（４）：３４８〜３５０（２００２）
【非特許文献６】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８（５）：４４１〜７（２００７）
【非特許文献７】［「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｖｉａ  ａ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ」Ｃｅｌｌ  １０２，１０９〜１２６（２０００）］
【非特許文献８】（「Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍａｐ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，」Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  ３１３，２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
それにもかかわらず、Ｌａｍｂの教示及び先行技術全般に反して、本研究者らは、驚くべきことに、特にスキンケア活性剤及び化粧剤を評価するために、この種の活性剤が一般に生じる、高度に冗長で体系的な低レベルの効果にもかかわらず、有用な関連性マップを開発できることを発見した。更に、病的皮膚表現型によって共有される機能的関連性を発見し、皮膚ホメオスタシス上の薬剤の効果を研究するための関連性マップ手法の値は、薬物に基づくＣ−マップの原型によってカウンターに指示され、関連する表現型は非常に複雑であり、皮膚状態病因学は十分理解されておらず、遺伝撹乱は多数でかつ弱く、化粧剤作用は、同様に拡散し、かつ定義により、比較的弱い。そのそれぞれが多因子でかつよく示されていない、複数の生物学的状態を標的にする関連性マッピングの順調な適用は、スキンケア研究におけるブレークスルーであった。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記の問題に対する解決法を提供するために、少なくとも１つの実施形態は、皮膚ホメオスタシス上の撹乱因子の効果を評価する方法を目的とする。方法は、コンピュータープロセッサに、格納された病的皮膚遺伝子発現シグネチャを有する皮膚インスタンスのデータアーキテクチャを問い合わせさせることを含む。データアーキテクチャ内のそれぞれの皮膚インスタンスは、撹乱因子に関連付けられ、問い合わせは、病的皮膚遺伝子発現シグネチャをそれぞれの格納された皮膚インスタンスと比較する。これを構築するための、本方法で使用するために好適なシステム、データアーキテクチャ、遺伝子発現シグネチャ、及び方法も開示される。加えて、本方法により評価された撹乱因子を含む化粧品組成物を配合する方法が開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】複数の皮膚状態（座瘡、アトピー性皮膚炎、湿疹、フケ、及び乾癬）を表す病的皮膚遺伝子発現シグネチャを構成する、上方調節及び下方調節された遺伝子をリストする表である。
【図２】本発明での使用に好適なコンピューターシステムの概略図である。
【図３】図２のコンピューターシステムのコンピューター可読媒体と関連付けられたインスタンスの概略図である。
【図４】本発明での使用に好適なプログラム可能なコンピューターの概略図である。
【図５】具体的にはインスタンスの生成の状況での遺伝子発現を測定するための例示的なシステムの概略図である。
【図６】遺伝子発現シグネチャとインスタンスとの間の比較の概略図であり、これらのリスト間には正相関が存在する。
【図７】遺伝子発現シグネチャとインスタンスとの間の比較の概略図であり、これらのリスト間には負相関が存在する。
【図８】遺伝子発現シグネチャとインスタンスとの間の比較の概略図であり、これらのリスト間には中立的相関が存在する。
【図９】病的皮膚遺伝子発現シグネチャのフケ被験者と無症候性被験者とを区別する能力を図示するヒートマップ、及び多くのフケ防止シャンプーの有効成分であるジンクピリチオンで治療されたフケ罹患者の病的皮膚遺伝子発現シグネチャの逆転を図示するヒートマップである（グレースケールで示す）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、本発明の特定の実施形態を時折参照して本明細書で記載される。しかしながら、本発明は、異なる形態で実施されてもよく、本明細書において記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、本開示が徹底され、完全なものであり、当業者に本発明の範囲を十分に伝えるように、これらの実施形態が提供される。
【００２１】
特に定義しないかぎり、本明細書で用いるすべての技術的及び科学的用語は、本発明の属する分野における当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において本発明の説明に使用される用語は、特定の実施形態を記載するために過ぎず、本発明を制限するものではない。本発明の説明及び添付の「特許請求の範囲」において使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに示さないかぎり、同様に複数形を含むものとする。
【００２２】
本明細書で互換的に使用される場合、「関連性マップ」及び「Ｃマップ」という用語は、装置、システム、製品、及び細胞表現型又は美容上の状態と、遺伝子発現と、化粧活性剤などの撹乱因子との間の関係を特定するための方法を広く指す。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「化粧剤」という用語は、洗浄、美化、魅力の増進、外観の変更、又はそれらの組み合わせの目的で、哺乳動物の身体又はその任意の部分に、すり込む、注ぐ、振り掛ける、噴霧する、導入する、ないしは別の方法で塗布するためのあらゆる物質、並びにそのあらゆる構成成分を意味する。化粧剤としては、米国食品医薬品局によって一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）物質、食品添加物、及び市販薬を含む非化粧用消費者製品で使用される物質が挙げられるが、これに限定されない。一部の実施形態では、化粧剤は、皮膚への局所塗布に好適な皮膚科学的に許容可能な担体を含む化粧品組成物に組み込んでもよい。化粧剤としては、（ｉ）皮膚組織に少なくとも１つの効果（プラス効果又はマイナス効果）を誘発する又は引き起こすことが知られている、化学物質、化合物、小分子若しくは大分子、抽出物、製剤、又はそれらの組み合わせ、（ｉｉ）皮膚組織に少なくとも１つの今までは知られてない効果（プラス効果又はマイナス効果）を誘発する又は引き起こすことが知られており、提供される方法及びシステムを用いて、皮膚組織に少なくとも１つのこれまで知られていない効果（プラス効果又はマイナス効果）を誘発する又は引き起こすことが発見される、化学物質、化合物、小分子、抽出物、製剤、又はそれらの組み合わせ、並びに（ｉｉｉ）皮膚組織に対する影響を有することが知られておらず、提供される方法及びシステムを用いて、皮膚組織に対する影響を誘発する又は引き起こすことが発見される、化学物質、化合物、小分子、抽出物、製剤、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
化粧剤又は美容作用可能な材料のいくつかの例は、米国国立衛生研究所に関連するＰｕｂＣｈｅｍデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、米国化粧品工業会の成分データベース（ｈｔｔｐ：／／ｏｎｌｉｎｅ．ｐｅｒｓｏｎａｌｃａｒｅｃｏｕｎｃｉｌ．ｏｒｇ／ｊｓｐ／Ｈｏｍｅ．ｊｓｐ）、及び米国化粧品工業会発行の２０１０  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１３th  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＥＵ化粧品成分及び物質リスト、日本化粧品成分リスト、米国化粧品工業会のＳｋｉｎＤｅｅｐデータベース（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｓｍｅｔｉｃｓｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ）、ＦＤＡ認可賦形剤リスト、ＦＤＡ  ＯＴＣリスト、日本医薬部外品リスト、米国ＦＤＡ全食品添加物データベース、ＥＵ全食品添加物リスト、日本既存食品添加物、香味料ＧＲＡＳリスト、米国ＦＤＡ  ＧＲＡＳ物質評価委員会、米国家庭製品データベース、世界新製品データベース（ＧＮＰＤ）パーソナルケア、保健医療、食品／飲料／ペット、及び家庭用品データベース（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｎｐｄ．ｃｏｍ）において、並びに化粧品成分及び植物成分供給業者から見出すことができる。
【００２５】
他の化粧剤の非限定的な例としては、植物成分（植物の根、幹皮、葉、種子、又は果実のうちの１つ以上に由来してもよい）が挙げられる。一部の植物成分は、もう１つの溶剤を用いて植物バイオマス（例えば、根、茎、樹皮、葉等）から抽出してもよい。植物成分は、化合物の複合混合物を含んで、明白な活性成分を含まなくてもよい。別のカテゴリの化粧剤は、ビタミン化合物並びにそれらの誘導体及び組み合わせ、例えばビタミンＢ３化合物、ビタミンＢ５化合物、ビタミンＢ６化合物、ビタミンＢ９化合物、ビタミンＡ化合物、ビタミンＣ化合物、ビタミンＥ化合物、並びにそれらの誘導体及び組み合わせ（例えば、レチノール、レチニルエステル、ナイアシンアミド、葉酸、パンテノール、アスコルビン酸、トコフェロール、及び酢酸トコフェロール）である。他の化粧剤の非限定的な例としては、糖アミン、植物ステロール、ヘキサミジン、ヒドロキシ酸、セラミド、アミン酸、及びポリオールが挙げられる。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「皮膚活性剤」という用語は、本明細書で定義する化粧剤のサブセットであり、望ましくない皮膚状態（又はその症状）、例えば、フケ、脂漏性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、発疹、座瘡、湿疹、乾癬、又は実質的な美容上の懸案事項となる場合がある他の状態の治療を達成する目的で皮膚への塗布が意図されるあらゆる物質、並びにあらゆるその構成成分を概して含む。皮膚活性剤のカテゴリの例としては、フケ防止活性剤、ステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤、殺シラミ薬、感覚剤、酵素、ビタミン、育毛活性剤、日焼け止め剤、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。本発明による化粧品組成物は、皮膚活性剤を含有してもよい。
【００２７】
「皮膚科学的に許容可能な担体」は、ケラチン性組織への局所塗布に対して好適な担体を意味する。皮膚科学的に許容可能な担体は、例えば、単純な溶液（水系又は油系）固体形態（例えば、ジェル又はスティック）及びエマルション等の幅広く様々な形態であってもよい。
【００２８】
「遺伝子発現シグネチャ」という用語は、撹乱因子に対する皮膚状態又は生物学的応答を表す発現パターンを有する、合理的に由来する遺伝子のリスト又は複数のリストを指す。遺伝子発現シグネチャは、一般に遺伝子の組み合わせを含み、その発現は、正常又は対照状態に相関して、増加（上方調節された）及び／又は減少（下方調節された）し、これは、対象となる表現型に対するプロキシとして機能する場合がある。一般に、修飾された細胞表現型に対する遺伝子発現シグネチャ（例えば、撹乱因子への曝露に応答して観察される表現型、又は生物学的課題、又は皮膚状態に関連付けられる表現型）は、対照にわたって修飾される細胞表現型で差次的に発現された１セットの遺伝子として記載される場合がある（すなわち、野生型又は冒されていない細胞表現型）。遺伝子発現シグネチャは、インビトロ試験、インビボ試験、データベース情報、及びこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない、種々のデータソースに由来する可能性がある。様々な実施形態では、遺伝子発現シグネチャに関連付けられるデータは、差次的発現遺伝子を表す「識別子」の順序付けされたリストを含む。例示的な識別子としては、遺伝子名、遺伝子記号、マイクロアレイプローブセットＩＤ値、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。所望により、遺伝子発現シグネチャは、対象となる状態の複数の上方調節された遺伝子を表す識別子の第１のリストと、対象となる状態の複数の下方調節された遺伝子を表す識別子の第２のリストと、を含む。
【００２９】
「病的皮膚遺伝子発現シグネチャ」という用語は、本明細書で更に記載されるように、座瘡、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、及びフケ状態に関連付けられる遺伝子発現シグネチャを指す。
【００３０】
「撹乱因子」は、例えば、皮膚組織に生物学的応答を引き起こす、例えば、化学的又は物理的刺激であり、正常又は野生型遺伝子発現からの遺伝子発現のシフトにつながる。撹乱因子としては、任意の物質、薬品、化合物、小分子若しくは大分子、活性物質、天然物（例えば、ケモカイン）、抽出、製剤、薬物（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＬＯＰＡＣ（Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）コレクション）、及びこれらの組合せを採用することができる。「撹乱因子」は、差次的遺伝子発現データを生成する任意の他の刺激も含む。例えば、撹乱因子は、紫外線、熱、浸透圧ストレス、ｐＨ、微生物、ウイルス、組換えサイトカイン若しくは成長因子、又は低分子干渉ＲＮＡであってもよい。撹乱因子は、化粧剤であってもよいが、必ずしもそうである必要はない。いくつかの実施形態では、撹乱因子が皮膚細胞に塗布され、遺伝子発現が測定される。結果として得られる遺伝子発現データは、例えば、インスタンスとしてデータアーキテクチャ内に格納される。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「ベンチマーク」剤又は撹乱因子という用語は、例えば、皮膚組織上に既知の効果（正又は負の）を誘発又は生じさせる任意の薬品、化合物、小分子若しくは大分子、抽出、製剤、又はこれらの組合せを指す。様々な実施形態では、ベンチマーク剤の効果は、堅牢な、対象となる細胞型又は組織上の所望の効果である。フケの分野で周知のベンチマーク剤の非限定的な例としては、ジンクピリチオン（ＺＰＴ）、硫化セレン、ケトコナゾール、シクロピロックスオラミン、及びコールタールが挙げられる。
【００３２】
本明細書において使用する場合、「問い合わせ」という用語は、関連性マップへの入力として使用されるデータを指し、これに対して複数のインスタンスが比較される。問い合わせは、皮膚状態又はインスタンスに関連付けられる遺伝子発現シグネチャを含んでもよい。Ｃマップは、撹乱因子、遺伝子発現シグネチャ、皮膚疾患、主題シグネチャ、あるいはデータアーキテクチャを含む任意のデータ特性若しくはデータ特性の組み合わせ、又は関連性を用いて問い合わせることができる。
【００３３】
本明細書で使用する「インスタンス」という用語は、皮膚細胞に撹乱因子を投与する遺伝子発現プロファイリング実験からのデータを指す。いくつかの実施形態では、このデータは遺伝子を表す「識別子」のリストを含み、その発現は、遺伝子発現シグネチャに含まれる。識別子は、例えば、遺伝子名、遺伝子記号、マイクロアレイプローブセットＩＤ、これらの組合せ、又は任意の他の識別子を含む。いくつかの実施形態では、インスタンスは、マイクロアレイ実験からのデータを含み、対照と比較した差次的発現の程度によって順序付けされたマイクロアレイのプローブセットＩＤのリストを含む。このデータはメタデータも含んでよく、これには、撹乱因子、遺伝子発現プロファイリング試験条件、皮膚細胞、及びマイクロアレイのうちの１つ以上に関するデータが含まれるが、これらに限定されない。多数のインスタンスは、現在進行中の大規模コミュニティＣ−マッププロジェクト（ハイパーリンクｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／３１３／５７９５／１９２９／ｓｕｐｐｌ／ＤＣ１の「ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ」で閲覧可能）を介して一般的に利用可能である。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「皮膚科学的に許容可能な」は、記載される組成物又は構成成分に、過度の毒性、不適応性、不安定性、アレルギー反応等がなく、ヒトの皮膚組織と接触させて使用するのに好適であることを意味する。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「コンピューター可読媒体」という用語は、コンピューター可読命令、データ及びデータ構造、デジタルファイル、ソフトウェアプログラム及びアプリケーション、又は他のデジタル情報等の情報の格納のために任意の方法若しくは技術で実装されたあらゆる電子記憶媒体を指し、これにはあらゆる揮発性、不揮発性、着脱式、及び非着脱式媒体が含まれるが、これらに限定されない。コンピューター可読媒体としては、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、同期ＲＡＭ（ＳＲＡＭ）、ダイナミックＲＡＭ（ＤＲＡＭ）、同期ＤＲＡＭ（ＳＤＲＡＭ）、ダブルデータレートＳＤＲＡＭ（ＤＤＲ  ＳＤＲＡＭ）、ダイレクトＲＡＭバスＲＡＭ（ＤＲＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、プログラム可能読み出し専用メモリ（ＰＲＯＭ）、電気的消去可能プログラム可能読み出し専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）、ディスク、搬送波、及びメモリスティックが挙げられるが、これらに限定されない。揮発性メモリの例としては、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、同期ＲＡＭ（ＳＲＡＭ）、ダイナミックＲＡＭ（ＤＲＡＭ）、同期ＤＲＡＭ（ＳＤＲＡＭ）、ダブルデータレートＳＤＲＡＭ（ＤＤＲ  ＳＤＲＡＭ）、及びダイレクトＲＡＭバスＲＡＭ（ＤＲＲＡＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。不揮発性メモリの例としては、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、プログラム可能読み取り専用メモリ（ＰＲＯＭ）、消去可能プログラム可能読み取り専用メモリ（ＥＰＲＯＭ）、及び電気的消去可能プログラム可能読み取り専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。メモリは、プロセス及び／又はデータを格納することができる。また他のコンピューター可読媒体としては、磁気ディスクドライブ、フロッピーディスクドライブ、テープドライブ、ジップドライブ、フラッシュメモリカード、メモリスティック、コンパクトディスクＲＯＭ（ＣＤ−ＲＯＭ）、ＣＤ書き込み可能ドライブ（ＣＤ−Ｒドライブ）、ＣＤ書き換え可能ドライブ（ＣＤ−ＲＷドライブ）、及びデジタル多用途ＲＯＭドライブ（ＤＶＤ  ＲＯＭ）が含まれるが、これらに限定されない、あらゆる好適なディスク媒体が挙げられる。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「ソフトウェア」及び「ソフトウェアアプリケーション」という用語は、算定装置又は他の電子装置に機能、作業を行わせる、及び／又は所望の様式で挙動させる、１つ以上のコンピューター可読及び／又は実行可能な命令を指す。命令は、ルーチン、アルゴリズム、モジュール、ライブラリー、方法、及び／又はプログラム等、１つ以上の様々な形態で実施されてもよい。ソフトウェアは、様々な実行可能な及び／又は読み込み可能な形態で実装されてもよく、１つのコンピューター構成要素に位置することができ、並びに／又は２つ以上の通信、協働、及び／若しくは並列処理するコンピューター構成要素の間に分散することができ、それにより直列、並列、及び他の様式で読み込み及び／又は実行することができる。ソフトウェアは、１つ以上のコンピューター可読媒体上に格納することができ、本発明の方法及び機能を全体的又は部分的に実装してもよい。
【００３７】
「皮膚ホメオスタシス」は、正常な皮膚増殖（例えば、細胞新生及び分化）、構造、及び機能を維持する生理学的プロセスを指す。皮膚保護剤機能は、例えば、障壁完全性及び表皮のホメオスタシス（バイオマーカーを含む）の指標、経皮水分損失、加湿（コルネオメトリー）、及び外観（光学特性）を使用して評価される。皮膚ホメオスタシスの破壊は、結果として、座瘡、アトピー性皮膚炎、発汗障害、湿疹、扁平苔癬、乾癬、白斑、フケ、癌、及び同様のものなどの皮膚状態の開発をもたらすが、これに限定されない。皮膚ホメオスタシスの破壊も、例えば、ちりめんじわ、小じわ及び深じわ、弾力の損失又はたるみ、染み、まだらな色素沈着及び変色、老化による染み（はっきりと色素沈着した区域）、毛穴の拡大、乾燥、肌理の粗さ、皮膚の透光性又は薄さ、上皮のもろさ、組織修復不良、及び皮膚のボリュームの損失をもたらす。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「関連性スコア」という用語は、インスタンスが遺伝子発現シグネチャと相関する程度を表す、由来する値を指す。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「データアーキテクチャ」という用語は、概して、編成されたデータコレクションを含む１つ以上のデジタルデータ構造を指す。いくつかの実施形態では、デジタルデータ構造は、デジタルファイル（例えば、スプレッドシートファイル、テキストファイル、文書処理ファイル、データベースファイル等）として、コンピューター可読媒体上に格納することができる。いくつかの実施形態では、データベースに格納されたデータ（例えば、インスタンス及び遺伝子発現シグネチャ）にアクセスし、これを編成し、選択するために使用されるデータベース管理システム（ＤＢＭＳ）によって管理される場合があるデータベースの形態で、データアーキテクチャが提供される。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「遺伝子発現プロファイリング」及び「遺伝子発現プロファイリング実験」という用語は、遺伝子発現を検出し定量するために好適な任意の技術を用いる、生体サンプル中の複数の遺伝子の発現の測定を指す。例えば、多数の遺伝子のｍＲＮＡ発現は、マイクロアレイ法を用いて決定される場合がある。使用されてもよい他の新たな技術としては、ＮｅｘｔＧｅｎ配列技術を用いるＲＮＡ−Ｓｅｑ又は全トランスクリプトームの配列が挙げられる。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「マイクロアレイ」という用語は、生体サンプルの遺伝子発現プロファイリングを可能にする基板上の核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、小分子、大分子、及び／又はそれらの組み合わせのあらゆる順序付けされた配列を広く指す。オリゴヌクレオチド配列は、典型的には、異なる既知の場所で基質（例えば、プラスチック、複合糖質、又はアクリル樹脂）の表面に連結される複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。配列を生成する方法は、当業者の施術者に既知である。（例えば、Ｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０９：４３３〜５３（２００８）；Ｈｏｈｅｉｓｅｌ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，７：２００〜１０（２００６）；Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４１０：５７〜７３（２００６）；Ｒａｑｏｕｓｓｉｓ  ＆  Ｅｌｖｉｄｇｅ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，６：１４５〜５２（２００６）；Ｍｏｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，８５：１〜１５（２００５）、及びその中に引用された参考文献を参照のこと、それぞれの教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。特定の遺伝子転写物に特異的なプローブの場所はカタログ化され、固定されたプローブへのハイブリダイゼーションは検出され、ポリヌクレオチドは配列上のハイブリダイゼーションの場所によって特定される。マイクロアレイの非限定的な例は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、及びＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．から入手可能である。
【００４２】
別途記載のない限り、明細書及び特許請求の範囲中で使用される、成分の量、分子量などの特性、反応条件、その他を表すすべての数字は、あらゆる文脈において、「約」という用語によって修飾されるものと理解されるべきである。更に、本明細書及び特許請求の範囲中の任意の範囲の開示は、その範囲自体及びその中に包含される任意のもの、並びに終点も含むと理解されるべきである。全ての数範囲は、より狭い範囲を包含し、表現された上方及び下方範囲の限界値は互換可能であって、明示されていない範囲を更に作成する。別途記載のない限り、本明細書及び「特許請求の範囲」に記載の数値的性質は、本発明の実施形態において得ることが求められる所望の性質に応じて変化する場合がある近似値である。本発明の広い範囲を示している数値範囲及びパラメーターは近似値であるけれども、具体的な実施例に示される数値は、できるかぎり正確に報告されている。しかしながら、あらゆる数値は、それらのそれぞれの測定値に認められる誤差から必然的に生じる特定の誤差を本質的に包含する。
【００４３】
複数の生物学的状態を表す遺伝子発現シグネチャを構築するために、装置、システム、及び方法が提供される。様々な態様では、遺伝子発現シグネチャは、病因学又は臨床的な提示にかかわらず、複数の皮膚状態を表す病的皮膚発現シグネチャである。本明細書に記載されるように、病的皮膚遺伝子発現シグネチャは、例えば、異なる皮膚状態の根底にある幅広く変動する臨床症状とわかりにくいバイオロジーを仮定すると、そうでなければ困難である、多重の皮膚状態に対して有効な皮膚活性剤を特定するために価値のあるツールである。病的皮膚遺伝子発現シグネチャは、シグネチャが精密なきっかけ又は様々な皮膚状態の臨床的な提示にかかわらずその発現が撹乱される１セットの遺伝を含むとき、皮膚、又は他の上皮でのホメオスタシスの確立及び維持に基本的に重要なバイオマーカーを特定するために同様に価値のあるツールである。
【００４４】
皮膚ホメオスタシス上の撹乱因子の効果を評価するための装置、システム、及び方法も提供され、それによって撹乱因子と皮膚の健康との間の関連性（すなわち、関係）を特定できる可能性がある。方法は、コンピューターが、格納された皮膚インスタンスのデータアーキテクチャに問い合わせするようにすることを含み、それぞれの皮膚インスタンスは、病的皮膚遺伝子発現シグネチャを有する撹乱因子と関連付けられる。問い合わせすることは、病的皮膚遺伝子発現シグネチャをそれぞれの格納された皮膚インスタンスと比較することを含む。コンピューターによる方法は、対象となる複数の皮膚状態（例えば、座瘡、アトピー性皮膚炎、湿疹、フケ、及び乾癬）に関連付けられる、統計的に有意な数の遺伝子の発現に統計的に有意な変化を誘発する撹乱因子の特定を容易にし、皮膚状態を治療するための新しい化粧剤の特定又は既知の化粧剤の新しい使用につながる。例えば、本発明の一態様では、スキンケア組成物を製剤する方法が提供される。本方法は、コンピューターで少なくとも１つのコンピューター可読媒体上に格納された複数のインスタンスにアクセスすることと、コンピューターで少なくとも１つのコンピューター可読媒体上に格納された少なくとも１つの病的皮膚遺伝子発現シグネチャにアクセスすることと、コンピューターで病的皮膚遺伝子発現シグネチャを複数のインスタンスと比較することと、コンピューターで関連性スコアを複数のインスタンスのそれぞれに割り当てることと、皮膚科学的に許容可能な担体及び負の相関（すなわち、負の関連性スコア）を有するインスタンスに関連付けられる少なくとも１つの撹乱因子を含むスキンケア組成物を製剤することと、を含む。
【００４５】
本発明の特徴は、以下に更に記載される。項見出しは、読み取りの便宜のためであって、それ自体は限定を意図しない。本文書全体は統一された開示として関連することを意図しており、たとえ本文書の同一の文、又は段落、又は項の中に特徴の組み合わせが一緒に見出されないとしても、本明細書に記載される特徴のすべての組合せが企図されていることを理解するべきである。
【００４６】
遺伝子発現シグネチャを構築する方法
本発明は、少なくとも部分的に、それぞれに複数の測定された特徴を有する２つ以上のデータセットの間の関係を特定する方法の開発に基づく。一態様では、本発明は、複数の生物学的状態を表す遺伝子発現シグネチャを特定するための方法を提供する。皮膚の健康状況では、座瘡、アトピー性皮膚炎、湿疹、フケ、及び乾癬を含む多くの皮膚状態の正確な原因は、十分に理解されていない。追加的に、皮膚状態の病因は、典型的には、多数の既知の及び未知の外因性及び内因性因子が関与する複雑なプロセスが関与する。それぞれの皮膚状態には、異なる臨床的な特徴もともなう。実際、症状は、同一の状態から苦しめられる異なる個人間で幅広く異なる可能性がある。本明細書に記載される方法は、多種多様な生物学的（例えば、皮膚）状態を表す遺伝子発現シグネチャを際立って産する。
【００４７】
本発明は、遺伝子発現シグネチャを構築する方法を提供する。この方法は、（ａ）複数の生物学的状態に対する遺伝子発現測定値を得ることと、（ｂ）（ａ）の遺伝子発現測定値を、対照サンプルに対する遺伝子発現測定値と比較することによって、生物学的状態で差次的に発現した遺伝子を特定することと、（ｃ）コンピューターに遺伝子発現一貫性値を計算させることと、を含む。一貫性値は、複数の状態の間の発現の差の有意性を表す。方法は、（ｄ）遺伝子発現一貫性値によって順序付けされている、一貫して差次的に発現した遺伝子（すなわち、対照サンプルと比較して、試験された生物学的状態で差次的に発現される遺伝子）を表す識別子（識別子が（ｃ）で算定された遺伝子発現一貫性値により順序付けされるを含む）含む、順序付けされたリストを作成することと、（ｅ）順序付けされたリストを、遺伝子発現シグネチャとして少なくとも１つのコンピューター可読媒体上に格納することと、を更に含む。この方法は、所望により工程（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）のうちの１つ以上を実施するために、プログラム可能なコンピューターを使用することを含む。
【００４８】
遺伝子発現一貫性値を計算するために、差次的発現遺伝子に対するログオッズ比が算定され、このログオッズ比は、シグモイド関数を使用して変換される。この方法は、ゼロに対して片側ｔ検定を実施すること、及び片側ｔ検定からログオッズ比を算定することを更に含む。結果として得られる遺伝子発現一貫性値は、対象となる生物学的状態で差次的に発現した遺伝子を表す識別子の順序付けされたリストを生成するために使用される。識別子の順序付けされたリストは、所望により、順序付けされたリストのその序列に対応する識別子に対する数値的序列付けに関連付けられる。
【００４９】
「生物学的状態」は、疾病、生物学的疾患、栄養障害、年齢、及び感染に関連付けられる異常な表現型を含む、対象となる任意の表現型である。本発明の様々な態様では、生物学的状態は、皮膚状態であるが、この方法は、他の皮膚以外に関連する状態にも適用可能である。「対照サンプル」は、符号標本（例えば、複数の生物学的状態に対する遺伝子発現測定値を生成するために使用される同一の細胞型）であり、生物学的状態で苦しめられていない。例えば、対照サンプルからの遺伝子発現測定値は、生物学的状態から苦しめられる以前の時間的に早い時期に取られた生物学的サンプル、遺伝子発現測定値が既知の対照被験者若しくは母集団、又はインデックス値若しくはベースライン値から生成される。対照遺伝子発現プロファイルは、予知アルゴリズム又は集団調査から算定されたインデックスからも由来する可能性がある。様々な実施形態では、対照サンプルは、人種、性別、年齢、地理的場所、及び／又は複数の生物学的疾患の遺伝子発現測定値の起原に関する種族的出身に対して一致する。
【００５０】
遺伝子発現の測定
様々な態様では、本発明は、複数の生物学的状態を表す複数の生物学的サンプル（すなわち、異なる生物学的状態を表す少なくとも２つの生物学的サンプル）の遺伝子発現測定値などの、１つ以上の遺伝子発現測定値を得ることを含む。遺伝子発現測定値は、いくつかの遺伝子に対する定量的又は定性的発現データを含む。任意の好適な生物学的サンプル、例えば、ヒトの生物学的サンプルで、遺伝子発現プロファイルを、調べ、又は測定する。皮膚疾患の状況では、遺伝子発現測定値は、皮膚状態で苦しめられている皮膚からの全厚皮膚生検から得られる場合がある。フケ遺伝子発現プロファイルの生成については、例えば、生検は、フケに冒された頭皮から取られる。遺伝子発現測定値は、冒されていない被験者の解剖学的に匹敵する部位からサンプリングされたフケに冒されていない頭皮（すなわち、対照サンプル）と比較される。代替的又は追加的に、遺伝子発現測定値は、インビトロで対象となる生物学的疾患を模倣するのが困難である、ケラチノサイト細胞から得られる場合がある。
【００５１】
遺伝子発現は、様々なやり方で検出されかつ／又は測定される。遺伝子発現を表す例示的な生体分子（すなわち、「バイオマーカー」）はタンパク質、核酸（例えば、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はｃＤＮＡ）、タンパク質断片若しくは代謝産物、及び／又は遺伝子転写物によりコード化されるタンパク質によりコード化される酵素活性の生成物を含み、本明細書中に記載されるバイオマーカーのいずれかの検出及び／又は測定は、本発明の文脈において好適である。一実施形態では、この方法は、遺伝子のうちの１つ以上によりコード化されるｍＲＮＡを測定することを含む。所望の場合、この方法は遺伝子のうちの１つ以上によりコード化されるｍＲＮＡを逆転写すること、及び対応するｃＤＮＡを測定することを含む。任意の定量的核酸アッセイを使用してもよい。例えば、多くの定量的ハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、及びポリメラーゼ連鎖反応手順は、生体サンプル中のｍＲＮＡ転写物又はｃＤＮＡの量を定量的に測定するために存在する。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（２００７）及びその全ての補遺を参照のこと。所望により、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーション前にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅される。ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡサンプルはその後、例えば、所望により基板（例えば、アレイ又はマイクロアレイ）上に固定された、パネルの遺伝子のうちの１つ以上によりコード化されるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより調べられる。ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに特異的な１つ以上の好適なプローブの選択、及びハイブリダイゼーション又はＰＣＲ条件の選択は、核酸を取り扱う科学者の技術の範囲内である。バイオマーカー核酸のバイオマーカーに対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブへの結合は、バイオマーカーの特定及び定量を可能にする。
【００５２】
本発明は、コード化されたタンパク質を１つ以上の遺伝子によって測定することも意図する。本発明の状況でタンパク質を定量化するために、タンパク質を定量化するための任意の技法が使用されてもよい。例えば、定量的質量分析法は、小さいサンプル中の少量のタンパク質の測定を含む、サンプル中のタンパク質の測定のために好適である。Ｗｅｓｔｅｒｎブロット分析及びＥＬＩＳＡアッセイを含む、サンプル中のタンパク質を定量化するための多数の抗体に基づく方法が存在する。生物学的活性（例えば、酵素活性）を有するバイオマーカーに対しては、１つ以上のバイオマーカーの活性の測定値が、遺伝子発現測定のための代用品として使用されてもよい。典型的な酵素活性アッセイでは、例えば、生物学的サンプル又はこれらの一部は、酵素活性のために好適な状態下で酵素に対する基質と接触され、酵素的反応の生成物が経時的に測定される。
【００５３】
いくつかの変形では、対象となるタンパク質に優先的に結合し、かつ好ましくは、高い特異性で結合する１つ以上の抗体を使用して、タンパク質がイムノアッセイで特定及び／又は定量化される。例示的なイムノアッセイとしては、免疫蛍光イムノアッセイ、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、及びＷｅｓｔｅｒｎブロットが挙げられる。タンパク質を認識し、かつ定量化するために使用されるエピトープは、直鎖ペプチドエピトープ、立体構造的エピトープ、１つ以上の側鎖修飾を含む（例えば、グリコシル化）エピトープ、等々であってもよい。概して、Ｅ．Ｍａｇｇｉｏ，Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，（１９８０）（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．）を参照のこと。米国特許第４，７２７，０２２号、同第４，６５９，６７８号、同第４，３７６，１１０号、同第４，２７５，１４９号、同第４，２３３，４０２号、及び同第４，２３０，７６７号も参照のこと。
【００５４】
遺伝子発現を測定し、かつ遺伝子発現測定値を参照遺伝子発現測定値（対照サンプルから取った）と比較する例示的な方法が、図５を参照して以下に記載される。ｍＲＮＡは、生物学的サンプルから抽出され、ｃＤＮＡに転写され、これは２色マイクロアレイ解析が実施される場合、異なる蛍光染料（例えば、赤及び緑）でマーキングされる。代替的には、単色マイクロアレイ解析用にサンプルを準備して、所望する場合、更に複数の複製が処理される。所望により手順は参照（対照）サンプルでも実行される。ｃＤＮＡサンプルを、複数（例えば、数十、数百、数千）のプローブ８２を含むマイクロアレイ８０に共ハイブリダイズする。一態様では、マイクロアレイ上のそれぞれのプローブは、独特のプローブセット識別子を有する。マイクロアレイを、スキャナ８４によってスキャンし、これが色素を励起し、蛍光量を測定する。算定装置８６は原画像を解析して、遺伝子の発現レベルを表すｃＤＮＡの量を決定する。スキャナは、算定装置８６の機能を組み込んでもよい。遺伝子発現データは、ｉ）遺伝子発現の上方調節（例えば、試験材料（例えば、ｃＤＮＡ  ７４、７６）からプローブへの結合が参照材料（例えば、ｃＤＮＡ  ７８）と比較してより大きい）、ｉｉ）遺伝子発現の下方調節（例えば、試験材料（例えば、ｃＤＮＡ  ７４、７６）からプローブへの結合が試験材料（例えば、ｃＤＮＡ  ７８）よりも減少した）、ｉｉｉ）変動しない遺伝子発現（例えば、試験材料（例えば、ｃＤＮＡ  ７４、７６）からプローブへの結合が参照材料（例えば、ｃＤＮＡ  ７８）と比較して同様の）、及びｉｖ）検出可能なシグナル又はノイズを含まない、を含むシステムによって収集される。上方調節及び下方調節された遺伝子は、「示差的に発現した」と称される。
【００５５】
マイクロアレイ及びマイクロアレイ解析技法は当該技術分野において周知であり、他のマイクロアレイ技法を本発明の方法、装置、及びシステムと共に使用してもよいことが意図される。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）技術及びＩｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（商標）技術などの、しかしこれに限定されない、任意の好適な商用又は非商用マイクロアレイ技術及び関連技法を使用してもよい。当業者は、本発明が上に記載した方法に限定されないこと、並びに他の方法及び技法もまた、本発明の範囲内であると考えられることを理解するであろう。
【００５６】
病的皮膚遺伝子発現シグネチャ
一実施形態では、遺伝子発現シグネチャは、病的皮膚遺伝子発現シグネチャであり、複数の生物学的状態は、複数の皮膚状態（例えば、座瘡、アトピー性皮膚炎、湿疹、フケ、及び乾癬の任意の組合せ）である。本明細書で使用する場合、「病的皮膚遺伝子発現シグネチャ」は、座瘡、アトピー性皮膚炎、湿疹、フケ、及び乾癬の強化された（上方調節された）及び／又は低下した（下方調節された）発現を有する、複数の遺伝子を表す識別子の１つ以上の遺伝子発現シグネチャリストを含む。発現のパターンは、皮膚状態を表す。実施例により詳細に記載されるように、いくつかの遺伝子転写物は、座瘡、アトピー性皮膚炎、湿疹、フケ、及び乾癬から苦しめられる個人において、増加又は減少するレベルを呈して特定される。遺伝子転写物のリストを図１に示す。図１の遺伝子転写物のサブセットを以下の表Ａ及び表Ｂに説明し、これは、特定される遺伝子転写物、遺伝子発現一貫性値、並びにＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ＿３ＰＲＩＭＥ＿ＩＶＴ＿ＩＤ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３（ＨＧ−Ｕ１３３）Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ  ９５０５１  ＵＳＡ）による）からの遺伝子転写物を結合するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブ識別子に対応するタンパク質のアクロニム及び説明を提供する。
【００５７】
【表１−１】
2015526089.tif 000003
【００５８】
【表１−２】
2015526089.tif 000004
【００５９】
【表２−１】
2015526089.tif 000005
【００６０】
【表２−２】
2015526089.tif 000006
【００６１】
遺伝子発現シグネチャが、対象となる皮膚の生物学的（例えば、皮膚）状態と関連する、全ての有意に調節された遺伝子を表す場合がある一方で、典型的には、それは、かかる遺伝子のサブセットを表す。本発明の「病的皮膚遺伝子発現シグネチャ」では、複数の遺伝子は、ＴＳＴＡ３、ＡＲＰＣ５Ｌ、ＳＹＮＣＲＩＰ、ＰＰＰ４Ｒ１、ＰＯＬ３Ｓ、ＴＵＢＢ６、ＣＣＴ５、ＧＡＬＮＴ６、Ｃ１２ｏｒｆ５、Ｓ１００Ａ１１Ｐ、ＴＮＩＰ２、ＤＩＭＴ１Ｌ、ＯＴＵＢ１、ＭＰＺＬ２、ＤＤＸ３９、ＥＩＦ６、ＰＬＳＣＲ３、ＬＡＰＴＭ５、ＭＰＺＬ２、ＳＡＭＳＮ１、ＳＬＣ４３Ａ３、ＺＷＩＮＴ、ＥＨＢＰ１Ｌ１、ＴＲＩＭ１４、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＴＮＩＰ２、ＥＢＮＡ１ＢＰ２、ＳＥＣＴＭ１、ＦＡＩＭ３、Ｎ４ＢＰ１、Ｎ４ＢＰ１、ＳＮＲＰＤ３、ＬＡＰＴＭ５、ＬＯＣ３９１０２０、ＴＲＡＢＤ、Ｃ２０ｏｒｆ１１、２１６９５２＿ｓ＿ａｔ、ＬＭＯＤ１、Ｃ１４ｏｒｆ１３２、ＧＰＤ１Ｌ、ＴＲＩＭ２、ＲＮＦ３８、ＬＯＮＰ２、２２２３６２＿ａｔ、ＰＨＹＨＩＰ、ＦＡＭ１１７Ａ、ＲＨＯＢＴＢ３、ＮＵＡＫ１、ＣＨＰ２、ＣＲＥＢＬ２、ＲＡＩ２、ＦＸＹＤ６、ＭＩＤ２、ＣＣＮＩ、ＰＥＬＩ２、ＦＯＸＪ３、ＡＮＫＲＤ２５、ＩＡＡ０２６５、ＦＬＪ１０３５７、ＯＳＢＰＬ１Ａ、ＤＤＸ４２、Ｃ１ｏｒｆ１１５、Ｃ２１ｏｒｆ２５、ＴＴＣ３、ＲＰＳ１４、２１２４９８＿ａｔ、ＰＦＡＡＰ５、ＴＳＰＹＬ５２１２９７０＿ａｔ、Ｃ６ｏｒｆ４８、ＩＨＰＫ２、及びＲＰ４−６９１Ｎ２４．１からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子（例えば、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、又は少なくとも１０個の遺伝子）を含む。例えば、複数の遺伝子は、ＴＳＴＡ３、ＡＲＰＣ５Ｌ、ＳＹＮＣＲＩＰ、ＰＰＰ４Ｒ１、ＰＯＬ３Ｓ、ＴＵＢＢ６、ＣＣＴ５、ＧＡＬＮＴ６、Ｃ１２ｏｒｆ５、Ｓ１００Ａ１１Ｐ、及びＴＮ１Ｐ２からなる群から選択される少なくとも１つの上方調節された遺伝子などの、ＴＳＴＡ３、ＡＲＰＣ５Ｌ、ＳＹＮＣＲＩＰ、ＰＰＰ４Ｒ１、ＰＯＬ３Ｓ、ＴＵＢＢ６、ＣＣＴ５、ＧＡＬＮＴ６、Ｃ１２ｏｒｆ５、Ｓ１００Ａ１１Ｐ、ＴＮＩＰ２、ＤＩＭＴ１Ｌ、ＯＴＵＢ１、ＭＰＺＬ２、ＤＤＸ３９、ＥＩＦ６、ＰＬＳＣＲ３、ＬＡＰＴＭ５、ＭＰＺＬ２、ＳＡＭＳＮ１、ＳＬＣ４３Ａ３、ＺＷＩＮＴ、ＥＨＢＰ１Ｌ１、ＴＲＩＭ１４、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＴＮＩＰ２、ＥＢＮＡ１ＢＰ２、ＳＥＣＴＭ１、ＦＡＩＭ３、Ｎ４ＢＰ１、Ｎ４ＢＰ１、ＳＮＲＰＤ３、ＬＡＰＴＭ５、ＬＯＣ３９１０２０、ＴＲＡＢＤ、Ｃ２０ｏｒｆ１１、及び２１６９５２＿ｓ＿ａｔからなる群から選択される少なくとも１つの上方調節された遺伝子を含む。代替的に、又は加えて、病的皮膚遺伝子発現シグネチャに含まれる複数の遺伝子は、ＰＨＹＨＩＰ、ＦＡＭ１１７Ａ、ＰＨＯＢＴＢ３、ＣＨＰ２、Ｃ１４ｏｒｆ１３２、ＬＯＮＰ２、２２２３６２−ａｔ、ＣＣＮＩ、ＰＥＬＩ２、ＬＭＯＤ１、ＧＰＤ１Ｌ、ＴＲＩＭ２、ＣＲＥＢＬ２、ＲＡＩ２、ＦＸＹＤ６、ＭＩＤ２、ＦＯＸＪ３、及びＡＮＫＲＤ２５からなる群から選択される少なくとも１つの下方調節された遺伝子などの、ＬＭＯＤ１、Ｃ１４ｏｒｆ１３２、ＧＰＤ１Ｌ、ＴＲＩＭ２、ＲＮＦ３８、ＬＯＮＰ２、２２２３６２＿ａｔ、ＰＨＹＨＩＰ、ＦＡＭ１１７Ａ、ＲＨＯＢＴＢ３、ＮＵＡＫ１、ＣＨＰ２、ＣＲＥＢＬ２、ＲＡＩ２、ＦＸＹＤ６、ＭＩＤ２、ＣＣＮＩ、ＰＥＬＩ２、ＦＯＸＪ３、ＡＮＫＲＤ２５、ＩＡＡ０２６５、ＦＬＪ１０３５７、ＯＳＢＰＬ１Ａ、ＤＤＸ４２、Ｃ１ｏｒｆ１１５、Ｃ２１ｏｒｆ２５、ＴＴＣ３、ＲＰＳ１４、２１２４９８＿ａｔ、ＰＦＡＡＰ５、ＴＳＰＹＬ５２１２９７０＿ａｔ、Ｃ６ｏｒｆ４８、ＩＨＰＫ２、及びＲＰ４−６９１Ｎ２４．１からなる群から選択される少なくとも１つの下方調節された遺伝子を含む。
【００６２】
病的皮膚遺伝子発現シグネチャは、所望により、約８０％〜約１００％の表Ａに説明される上方調節された遺伝子、及び／又は約８０％〜約％１００の表Ｂに説明される下方調節された遺伝子を含み、これは、座瘡、乾癬、フケ、アトピー性皮膚炎、及び湿疹に共通な７０個の最も上方調節及び下方調節された遺伝子を表す。病的皮膚遺伝子発現シグネチャは、様々な実施形態において、図１に説明される約８０％〜約１００％の遺伝子を含む。いくつかの態様では、病的皮膚遺伝子発現シグネチャは、表Ａ若しくは表Ｂ又は図１に説明される遺伝子に限定されるが、追加的な遺伝子の発現は、本発明の他の実施形態で、遺伝子発現シグネチャの部分として含まれる場合がある。
【００６３】
様々な態様では、遺伝子発現シグネチャは、少なくとも２個の、少なくとも４個の、少なくとも５個の、少なくとも１０個の、少なくとも２０個の、少なくとも２５個の、少なくとも３０個の、又は少なくとも５０個の遺伝子（例えば、７５個以上の遺伝子）を参照する。代替的に、又は加えて、遺伝子発現シグネチャは、１０，０００個以下の、７，５００個以下の、５，０００個以下の、１，０００個以下の、８００個以下の、７５０個以下の、７００個以下の、５００個以下の、４５０個以下の、４００個以下の、３５０個以下の、３００個以下の、２５０個以下の、２００個以下の、１５０個以下の、１００個以下の、７０個以下の、５０個以下の、又は２０個以下の遺伝子を参照する。例えば、遺伝子発現シグネチャは、所望により、約５〜約８００個の遺伝子（例えば、約５個〜約４００個の遺伝子、約１０個〜約４００個の遺伝子、約１０個〜約２００個の遺伝子、又は約１０個〜約１４０個の遺伝子）に対応する識別子を含む。例示的な病的皮膚遺伝子発現シグネチャは、上方調節及び／又は下方調節された遺伝子とおおよそ等しい数の、約１００個〜約４００個の遺伝子を含む。例えば、好適な遺伝子発現シグネチャは、所望により約１００個〜約１５０個の遺伝子、約２５０個〜約３００個の遺伝子、約３００個〜約３５０個の遺伝子、又は約３５０個〜約４００個の遺伝子を含む。
【００６４】
遺伝子の数は、生物学的状態ごとに異なるであろう。典型的には化粧品の状態の表現型が有する場合のように、バイオロジーがより弱いとき、「ノイズ」に寄与する遺伝子の追加を避けるために、先行技術に含まれるものに対する統計的な要件に適合する場合があるものより少ない遺伝子が使用される場合がある。例えば、皮膚状態の遺伝子発現プロファイリング解析を、０．０５未満の統計的ｐ−値を有する約２，０００個〜４，０００個の遺伝子から、及び０．００１未満のｐ−値を有するおおよそ１０００個の遺伝子から産する場合、非常に強い生物学的応答が示される。中程度に強い生物学的応答は、０．００１未満のｐ値を有するおよそ４００〜６００個の遺伝子と組み合わせられた、０．０５未満の統計的ｐ値を有するおよそ８００〜２０００個の遺伝子を産する場合がある。これらの場合、遺伝子発現シグネチャは、所望により、約１００〜約６００の遺伝子を含む。より弱いバイオロジーは、所望により、約２０〜１００個の遺伝子などのより少ない遺伝子を含む遺伝子発現シグネチャによって表される。本発明は、約１０個〜約４００個の遺伝子の転写物へとハイブリダイズする、固定されたオリゴヌクレオチドの配列を更に提供し、遺伝子は図１から選択される（例えば、遺伝子は表Ａ及び表Ｂから選択される）。
【００６５】
病的皮膚遺伝子発現シグネチャが、座瘡、アトピー性皮膚炎、乾癬、湿疹、及びフケの遺伝子発現プロファイルを使用して生成される一方で、シグネチャも、関連性マッピング（本明細書で更に記載される）上で、黒色腫、母斑、炎症性腸疾患、炎症性結腸粘膜、異型乳管過形成（胸部）、前癌性アデノーマ、歯肉上皮、及びニッケル暴露皮膚炎（既知のＩＶ型アレルゲン）と非常に強いリンクを際立って表示される。したがって、本発明は、これらの状態での撹乱因子の効果を評価する方法において、病的皮膚遺伝子発現シグネチャの使用を更に意図する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、遺伝子現シグネチャを生物学的プロセスグリッド又は遺伝子オントロジー上にマッピングして、生理学的主題パターンを産する。最も広範なパターンは、遺伝子が統計的にクラスター化されたすべての主題を含むことになる。より限局性のパターンとしては、例えば、最も強く調節された遺伝子を投入された主題のサブセット、又は関連疾患に関する独特のサブセットが挙げられる。遺伝子オントロジー由来の遺伝子発現シグネチャ及び主題パターン解析は、一般により少ない遺伝子を含み、差次的診断及び非常に精密なかつ標的効果を有する活性剤に対するスクリーニングのための有用なツールである。
【００６７】
本発明のシステム、装置、及びコンピューター関連態様
図２、図４及び図５を参照して、例えば、遺伝子発現シグネチャを構築する、皮膚状態間の関連性を特定する、撹乱因子と皮膚ホメオスタシスとの間の関係を特定する、皮膚活性剤を特定する、及びスキンケア組成物を製剤するための本発明によるシステム及び装置のいくつかの実施例がここで記載される。システム１０は、算定装置１２、１４、算定装置１２と関連付けられたコンピューター可読媒体１６、及び通信網１８のうちの１つ以上を備える。
【００６８】
ハードディスクドライブとして設けられてもよいコンピューター可読媒体１６は、デジタルファイル２０と関連付けられたデータ構造に格納された複数のインスタンス２２、２４、及び２６を含むデジタルファイル２０、例えば、データベースファイルを含む。複数のインスタンスを、リレーショナルテーブル及びインデックス、又は他の種類のコンピューター可読媒体に格納してもよい。また、インスタンス２２、２４、及び２６を、複数のデジタルファイルにわたって分散してもよいが、本明細書では簡単にするために単一のデジタルファイル２０について記載する。
【００６９】
デジタルファイル２０は、文書処理ファイル形式（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄ）、スプレッドシートファイル形式（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ）、及びデータベースファイル形式を含むが、これらに限定されない多様な形式で提供することができる。いくつかの好適なファイル形式の一般的な例としては、*．ｘｌｓ、*．ｘｌｄ、*．ｘｌｋ、*．ｘｌｌ、*．ｘｌｔ、*．ｘｌｘｓ、*．ｄｉｆ、*．ｄｂ、*．ｄｂｆ、*．ａｃｃｄｂ、*．ｍｄｂ、*．ｍｄｆ、*．ｃｄｂ、*．ｆｄｂ、*．ｃｓｖ、*ｓｑｌ、*．ｘｍｌ、*．ｄｏｃ、*．ｔｘｔ、*．ｒｔｆ、*．ｌｏｇ、*．ｄｏｃｘ、*．ａｎｓ、*．ｐａｇｅｓ、*．ｗｐｓ等のファイル拡張子に関連付けられるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
図３を参照すると、いくつかの実施形態では、インスタンス２２は、マイクロアレイプローブセットＩＤの順序付けされたリストを含んでもよく、Ｎの値は、解析に使用するマイクロアレイ上のプローブの総数と等しい。一般的なマイクロアレイとしては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ及びＩｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＣｈｉｐｓが挙げられる。遺伝子発現プロファイルを生成するためには、マイクロアレイは、ヒトゲノムをプロファイリングするために設計されたものであるのが好ましい。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｃｈｉｐｓの一実施例としては、ＨＧ−Ｕ１３３Ａ２．０などのモデルＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ（ＨＧ）−Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０が挙げられるが、これに限定されない。しかしながら、専用の発生源にかかわらず、任意のマイクロアレイが、本発明の状況での使用に好適である。
【００７１】
マイクロアレイ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ）を利用したマイクロアレイ解析に由来するインスタンスは、遺伝子プローブセットＩＤの順序付けされたリストを含んでもよい。順序付けされたリストは、２〜２２，０００個以上のＩＤを含む、任意の数の遺伝子プローブセットＩＤを含む。順序付けされたリストを、デジタルファイル２０のデータ構造に格納してもよく、データは、デジタルファイルがソフトウェアアプリケーション２８によって読み取られたときに、プローブセットＩＤの順序付けされたリストを表す複数の文字列が再生されるように配列してもよい。それぞれのインスタンスがプローブセットＩＤの完全なリストを含むことが好ましい一方で、インスタンスのうちの１つ以上が、マイクロアレイのプローブセットＩＤのうちの全部を含まない場合があることが考えられる。インスタンスが、所望により、プローブセットＩＤの順序付けされたリストに加えて、又はその代わりに、他のデータを含むことも考えられる。例えば、同等の遺伝子名及び／又は遺伝子記号の順序付けされたリストでプローブセットＩＤの順序付けされたリストを代用してもよい。インスタンス及び／又はデジタルファイル２０と共に、追加データを格納してもよい。いくつかの実施形態では、この追加データはメタデータと称され、これは細胞株ＩＤ、バッチ番号、暴露期間、及び他の実験によって得られるデータ、並びにインスタンスＩＤと関連付けられた、他の任意の記述的材料のうちの１つ以上を含んでもよい。また、順序付けされたリストは、順序付けされたリスト中の識別子の序列付けされた位置を表す、そのそれぞれの識別子と関連付けられた数値も含んでよい。様々な実施形態では、それぞれのインスタンスは、差次的に発現した遺伝子（すなわち、撹乱因子暴露に対応する上方調節又は下方調節された遺伝子）の序列の順序付けされた識別子のインスタンスリストを含む。
【００７２】
再び図２、図３、及び図４を参照すると、コンピューター可読媒体１６は、その媒体上に格納された第２のデジタルファイル３０も有してもよい。第２のデジタルファイル３０は、１つ以上の遺伝子発現シグネチャ（例えば、１つ以上の皮膚状態遺伝子発現シグネチャ）に関連付けられるマイクロアレイプローブセットＩＤ（例示的な識別子）の１つ以上のリスト３２を含む。マイクロアレイプローブセットＩＤのリスト３２は、通常は、第１のデジタルファイル２０のインスタンスよりもはるかに小さいプローブセットＩＤのリストを含む。一部の実施形態では、このリストは、２〜１０００個のプローブセットＩＤを含む。他の実施形態では、リストは、約１０個、約５０個、約１００個、約２００個、又は約３００個より多い、及び／又は約５０００個、約２５００個、約１０００個、約８００個、約６００個、又は約４００個より少ないプローブセットＩＤを含む。第２のデジタルファイル３０のプローブセットＩＤのリスト３２は、対象となる１つ以上の皮膚状態（又は対象となる特定の撹乱因子に対する細胞の応答）を表すように選択された上方調節及び／又は下方調節された遺伝子を表すプローブセットＩＤのリストを含む。一部の実施形態では、第１のリストは、上方調節された遺伝子を表してもよく、第２のリストは、遺伝子発現シグネチャの下方調節された遺伝子を表してもよい。リストを、デジタルファイル３０のデータ構造に格納してもよく、データを、デジタルファイルがソフトウェアアプリケーション２８によって読み取られたときに、プローブセットＩＤのリストを表す複数の文字列が再現されるように配列してもよい。プローブセットＩＤの代わりに、同等の遺伝子名及び／又は遺伝子記号（又は別の命名）でプローブセットＩＤのリストを代用してもよい。遺伝子発現シグネチャ及び／又はデジタルファイル３０と共に追加データを格納してもよく、これは一般にメタデータと称され、これは、例えば、細胞株又はサンプル源、及びマイクロアレイＩＤ等の任意の関連情報を含んでもよい。病的皮膚遺伝子発現シグネチャに対するプローブセットＩＤのリストが、表Ａ及び表Ｂで説明される。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子発現シグネチャを、複数のデジタルファイルに格納してもよく、かつ／又は複数のコンピューター可読媒体上に格納してもよい。他の実施形態では、複数の遺伝子発現シグネチャ（例えば、３２、３４）を、同じデジタルファイル（例えば、３０）に格納してもよく、又はインスタンス２２、２４、及び２６を含む同じデジタルファイル若しくはデータベースに格納してもよい。
【００７３】
第１及び第２のデジタルファイルに格納したデータは、幅広く様々なデータ構造及び／又は形式で格納してもよい。いくつかの実施形態では、データを、無料データベース、商用データベース、又は社内の独自のデータベースなどの１つ以上の検索可能なデータベースに格納する。データベースは、例えば、フラットモデル、階層モデル、ネットワークモデル、関係モデル、次元モデル、又はオブジェクト指向モデルなどの、しかしこれに限定されない、当該分野において既知の任意のモデルによって提供又は構造化されてもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの検索可能なデータベースは、社内の独自のデータベースである。システム１０のユーザーは、データベース管理システムと関連付けられるグラフィカルユーザーインターフェースを用いて、そのシステムが操作可能に接続される１つ以上のデータベース又は他のデータ源にアクセスし、そこからデータを取り出すことができる。いくつかの実施形態では、第１のデジタルファイル２０は、第１のデータベースの形態で提供され、第２のデジタルファイル３０は、第２のデータベースの形態で提供される。他の実施形態では、第１及び第２のデジタルファイルを組み合わせて、単一ファイルの形態で提供してもよい。
【００７４】
いくつかの実施形態では、第１のデジタルファイル２０は、コンピューター可読媒体３８上に格納されたデジタルファイル３６から通信網１８を通して送信されるデータを含んでもよい。一実施形態では、第１のデジタルファイル２０は、細胞株（例えば、線維芽細胞株及び／又はケラチノサイト細胞系）から得られる遺伝子発現データ、またデジタルファイル３６からのデータ、例えば、他の細胞株又は細胞型からの遺伝子発現データ、遺伝子発現シグネチャ、撹乱因子情報、臨床治験データ、科学文献、化学データベース、薬学データベース、並びに他のそのようなデータ及びメタデータを含んでもよい。デジタルファイル３６は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＬＯＰＡＣコレクション、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃ−ＭＡＰコレクション、ＧＥＯコレクション、及びＣｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＡＳ）データベースを含むが、これらに限定されないデータベースの形態で提供されてもよい。
【００７５】
また、コンピューター可読媒体１６（又は別のコンピューター可読媒体、例えば１６）上には、読み取り、書き込み、ないしは別の方法でデジタルファイル２０、３０の管理、及び／若しくはデジタルファイル２０、３０へのアクセスのためのコンピューター可読命令又はソフトウェアを含む１つ以上のデジタルファイル２８が格納されていてもよい。また、コンピューター可読媒体１６は、算定装置１２に本発明の方法の１つ以上の工程を実施させるソフトウェア又はコンピューター可読及び／若しくは実行可能な命令も含んでもよく、この工程には、例えば、限定するものではないが、デジタルファイル３０に格納された遺伝子発現シグネチャをデジタルファイル２０に格納されたインスタンス２２、２４、及び２６と比較することに関連する工程（複数可）が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のデジタルファイル２８は、デジタルファイル２０、２８を管理するためのデータベース管理システムの一部を形成してもよい。データベース管理システムの非限定的な例は、米国特許第４，９６７，３４１号及び同第５，２９７，２７９号に記載される。
【００７６】
コンピューター可読媒体１６は、計算装置１２の一部を形成してもよく、又は別の方法で算定装置１２に接続されていてもよい。算定装置１２は、任意の汎用又は特殊用途のサーバー、デスクトップコンピューター、ラップトップコンピューター、タワー型コンピューター、マイクロコンピューター、ミニコンピューター、及びメインフレームコンピューターなどのコンピューターを含むが、これらに限定されない、幅広く様々な形態で提供することができる。様々な算定装置が本発明での使用に好適であり得るが、汎用算定装置１２を図４に例示する。算定装置１２は、プロセッサ４０、システムメモリ４２、及びシステムバス４４から選択される１つ以上の構成要素を備えてもよい。システムバス４４は、システムメモリ４２及びプロセッサ４０を含むがこれらに限定されない、システム構成要素のインターフェースを提供する。システムバス３６は、何種類かのバス構造のいずれであってもよく、これは種々の市販のバスアーキテクチャのうちのいずれかを使用して、メモリバス（場合によりメモリコントローラを備える）、周辺バス、及びローカルバスと更に相互接続してもよい。ローカルバスの例としては、業界標準アーキテクチャ（ＩＳＡ）バス、マイクロチャネルアーキテクチャ（ＭＳＡ）バス、拡張ＩＳＡ（ＥＩＳＡ）バス、周辺構成要素相互接続（ＰＣＩ）バス、ユニバーサルシリアル（ＵＳＢ）バス、及び小型コンピューターシステムインターフェース（ＳＣＳＩ）バスが挙げられる。プロセッサ４０は、あらゆる好適なプロセッサから選択されてもよく、これにはデュアルマイクロプロセッサ及び他のマルチプロセッサアーキテクチャを含むが、これらに限定されない。プロセッサは、１つ以上のプログラムアプリケーション又はソフトウェアと関連付けられた１セットの格納された命令を実行する。
【００７７】
システムメモリ４２は、不揮発性メモリ４６（例えば、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、消去可能プログラム可能読み取り専用メモリ（ＥＰＲＯＭ）、電気的消去可能プログラム可能読み取り専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）等）、及び／又は揮発性メモリ４８（例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ））を含んでもよい。基本入力／出力システム（ＢＩＯＳ）を、不揮発性メモリ３８に格納することができ、これは算定装置１２内の要素間で情報を伝達するのに役立つ基本ルーチンを含むことができる。また、揮発性メモリ４８は、データキャッシングのためのスタティックＲＡＭなどの高速ＲＡＭを含むことができる。
【００７８】
算定装置１２は更に、格納のために、例えば、内蔵ハードディスクドライブ（ＨＤＤ、例えば、エンハンスト集積ドライブエレクトロニクス（ＥＩＤＥ）又はシリアルアドバンストテクノロジーアタッチメント（ＳＡＴＡ））を含んでもよい、記憶装置４４を含んでもよい。算定装置１２は、（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ又はＤＶＤ−ＲＯＭ４８を読み取るための）光ディスクドライブ４６を更に含んでもよい。ドライブ及び関連するコンピューター可読媒体は、データの不揮発性ストレージ、本発明のデータ構造及びデータアーキテクチャ、コンピューター実行可能な命令等を提供する。算定装置１２について、ドライブ及び媒体は、好適なデジタル形式で任意のデータの格納装置を収容する。コンピューター可読媒体についての上記の説明は、ＣＤ−ＲＯＭ又はＤＶＤ−ＲＯＭなどのＨＤＤ及び光学式媒体に関するが、当業者は、ジップディスク、磁気カセット、フラッシュメモリカード、カートリッジ等などの、コンピューターにより読み取り可能な他の種類の媒体を使用してもよく、また更に、任意のかかる媒体は、本発明の方法を実施するためのコンピューター実行可能な命令を含んでもよいことを理解すべきである。
【００７９】
本明細書に記載される機能及び／又は方法を全体的若しくは部分的に実施するオペレーティングシステム及び１つ以上のソフトウェアアプリケーションを含む、いくつかのソフトウェアアプリケーションを、ドライブ４４及び揮発性メモリ４８上に格納することができる。実施形態が、様々な市販のオペレーティングシステム又はオペレーティングシステムの組み合わせを用いて実施することができることを理解するべきである。中央演算処理装置４０は、揮発性メモリ４８内のソフトウェアアプリケーションと共に、本明細書に記載される機能を実装するように構成又は適合された算定装置１２の制御システムとしての機能を果たしてもよい。
【００８０】
ユーザーは、例えば、キーボード、ポインティングデバイス（例えば、マウス（図示せず））、又はタッチスクリーンなどの、１つ以上の有線又は無線入力デバイス５０を介して、算定装置１２にコマンド及び情報を入力する。これら及び他の入力装置は、多くの場合、システムバス４４に連結される入力装置インターフェース５２を通して、中央演算処理装置４０に接続されるが、パラレルポート、ＩＥＥＥ  １３９４シリアルポート、ゲームポート、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）ポート、ＩＲインターフェース等の他のインターフェースによって接続することができる。算定装置１２は、別個又は統合型の表示装置５４を駆動してもよく、それもまた、ビデオポート５６等のインターフェースを介してシステムバス４４に接続されてもよい。
【００８１】
算定装置１２、１４は、有線及び／又は無線ネットワーク通信インターフェース５８を用いて、ネットワーク化された環境でネットワーク１８に亘って動作してもよい。ネットワークインターフェースポート５８は、有線及び／又は無線通信を容易にすることができる。ネットワークインターフェースポートは、ネットワークインターフェースカード、ネットワークインターフェースコントローラ（ＮＩＣ）、ネットワークアダプタ、又はＬＡＮアダプタの部分とすることができる。通信網１８は、インターネット等の広域ネットワーク（ＷＡＮ）、又はローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）とすることができる。通信網１８は、光ファイバーネットワーク、ツイストペアネットワーク、Ｔｌ／Ｅｌラインベースネットワーク若しくはＴ−キャリア／Ｅキャリアプロトコルの他のリンク、又は無線ローカルエリア若しくは広域ネットワーク（ウルトラモバイルバンド（ＵＭＢ）、ロングタームエボリューション（ＬＴＥ）等の多数のプロトコルを通して作動する）を含むことができる。加えて、通信網１８は、トランシーバ、変調／復調のための関連電子装置、並びにパケット交換通信の場合等のバックホール通信用のバックボーンネットワークに接続するためのスイッチ及びポートを含む、無線通信用の基地局を含むことができる。
【００８２】
一態様では、本発明は、撹乱因子の皮膚ホメオスタシス上での効果を評価するためのシステムを提供し、それによって１つ以上の撹乱因子が１つ以上の生物学的プロセスと関連する（例えば、撹乱因子と表現型との間の正又は負の関係を明瞭にする）可能性がある。システムは、上述されるように、その上に複数のインスタンス及び病的皮膚遺伝子発現シグネチャを格納させる、少なくとも１つのコンピューター可読媒体を含む。それぞれのインスタンスは、差次的に発現した遺伝子の序列の順序付けされた識別子のインスタンスリスト、及び病的皮膚に関連付けられる差次的に発現した遺伝子を表す識別子の１つ以上の遺伝子発現シグネチャリストを含む病的皮膚遺伝子発現シグネチャを含む。システムは、プログラム可能なコンピューターに以下の、すなわち（ｉ）コンピューター可読媒体上に格納された複数のインスタンス、及び病的皮膚遺伝子発現シグネチャにアクセスすることと、（ｉｉ）病的皮膚遺伝子発現シグネチャを複数のインスタンスと比較することであって、比較が遺伝子発現シグネチャリスト内のそれぞれの識別子を、複数のインスタンスのそれぞれに対するインスタンスリスト内の同一の識別子の位置と比較することを含んで比較することと、（ｉｉｉ）複数のインスタンスのそれぞれに関連性スコアを割り当てること、のうちの１つ以上を実行させるコンピューター可読命令を含むプログラム可能なコンピューターを更に含む。
【００８３】
所望により、システムは、生物学的サンプルを受容するためのマイクロアレイスキャナと、遺伝子発現データをスキャナから第１のプログラム可能なコンピューターへ送信するための第２のプログラム可能なコンピューターと、を更に含む。生物学的サンプルは、本明細書に更に記載されるように、遺伝子発現生成物を含む。代替的に又は加えて、システムは、ヒトの皮膚細胞への適用のための撹乱因子の配列を更に含む。
【００８４】
撹乱因子の皮膚ホメオスタシス上への影響及び生物学的状態間の共有性の評価
本明細書に記載される遺伝子発現シグネチャは、撹乱因子と皮膚ホメオスタシスとの間の関連性を特定する、すなわち、撹乱因子が皮膚の健康の１つ以上の態様を調節するかどうかを決定するために有用である。別の言い方をすれば、本発明は、１つ以上の撹乱因子の、例えば、皮膚の調節、皮膚保護剤構造及び機能、経皮水分損失、加湿、並びに皮膚の外観への効果を評価するための方法を提供する。例えば、病的皮膚遺伝子発現シグネチャは、皮膚の健康を改善及び／又は維持する薬剤を特定するためだけでなく、１つ以上の対象となる皮膚状態（例えば、座瘡、アトピー性皮膚炎、フケ、乾癬、及び湿疹のうちの１つ以上）に対する活性について皮膚活性剤の候補を評価するのに有用である。実際、本発明の材料及び方法は、材料及び方法の数十、数百、数千という数の活性剤の候補をコンピューターによりスクリーニングして、例えば、本明細書に記載されるインビトロ及びエクスビボ法を使用して更に評価するための候補を特定するのに役立つ。この点について、本発明は、座瘡、アトピー性皮膚炎、フケ、乾癬、湿疹、及び前述のものの任意の組合せを含む、幅広く様々な皮膚疾患に関連付けられる症状を低減又は軽減するための、可能性のある皮膚活性剤の有効性を予測するための関連性マッピングを利用するシステム及び方法を含む。関連性マッピング（Ｃ−マップ）は、表現型に関連付けられる遺伝子発現と撹乱因子に対する細胞応答との間に機能的関連性を発見する。関連性マッピングは、本明細書に詳細に記載され、かつ、例えば、Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０２，１０９〜１２６（２０００）、及びＬａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３，１９２９〜３５（２００６）に更に記載される。
【００８５】
本発明は、撹乱因子の皮膚ホメオスタシスへの効果を評価するための方法を提供する。方法は、格納された皮膚インスタンスのデータアーキテクチャを、病的皮膚遺伝子発現シグネチャに問い合わせることを含み、それぞれの皮膚インスタンスは、撹乱因子と関連付けられる。問い合わせは、病的皮膚遺伝子発現シグネチャをそれぞれの格納された皮膚インスタンスと比較することを含む（すなわち、病的遺伝子シグネチャの遺伝子発現シグネチャリスト内のそれぞれの識別子をそれぞれのインスタンスリスト内の同一の識別子の位置と比較する）。所望により、方法は、細胞シグナリング、システム開発、表皮開発、免疫システムプロセス、及び炎症に影響する撹乱因子に関連付けられる格納された皮膚インスタンスのデータアーキテクチャを問い合わせることを含む。所望により、病的皮膚遺伝子発現シグネチャの、それぞれの格納された皮膚インスタンスへの比較は、関連性スコアを複数のインスタンスのそれぞれに、割り当てることも含む。様々な態様では、方法は、負の関連性スコア（病的皮膚遺伝子発現シグネチャとインスタンスとの間の負の相関を表す）を有する皮膚インスタンスを特定すること、及び／又は正の関連性スコア（病的皮膚遺伝子発現シグネチャとインスタンスとの間の正の相関を表す）を有する皮膚インスタンスを特定することを更に含む。この方法は、いくつかの実施形態では、皮膚科学的に許容可能な担体及び特定される皮膚インスタンスと関連付けられる撹乱因子を含む、スキンケア組成物を製剤することも含む。
【００８６】
スキンケア組成物を製剤するための方法も本発明に含まれる。この方法は、少なくとも１つのコンピューター可読媒体上に格納された複数のインスタンスにアクセスすることを含む。それぞれのインスタンスは、撹乱因子（及び所望により細胞型）に関連付けられ、かつ上方調節された遺伝子及び下方調節された遺伝子を表す複数の識別子の順序付けされたリストを含む。該方法は、コンピューター可読媒体上に格納された少なくとも１つの病的皮膚遺伝子発現シグネチャにアクセスすることを更に含む。病的皮膚遺伝子発現シグネチャは、座瘡、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、及びフケに関連付けられる、複数の上方調節された遺伝子及び複数の下方調節された遺伝子を表す複数の識別子を含む１つ以上の遺伝子発現シグネチャリストを含む。病的皮膚遺伝子発現シグネチャは、複数のインスタンスと比較され、比較は、遺伝子発現シグネチャリスト内のそれぞれの識別子を、複数のインスタンスのそれぞれに対する順序付けされたリスト内の同一の識別子の位置と比較することとを含み、関連性スコアは、複数のインスタンスのそれぞれに割り当てられる。該方法は、皮膚科学的に許容可能な担体と、少なくとも１つの撹乱因子とを含むスキンケア組成物を製剤することを更に含み、少なくとも１つの撹乱因子に関連付けられるインスタンスの関連性スコアは、負である（すなわち、インスタンスと問い合わせ遺伝子発現シグネチャとの間に負の相関がある）。
【００８７】
追加的に、本発明は、対象となる１つ以上の生物学的状態と病的皮膚との間の共有性を特定する方法を提供する。この点において、上記される方法のインスタンスは、１つ以上の生物学的状態（座瘡、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、及びフケ以外）の１つ以上の遺伝子発現プロファイルと置き換えられる。生物学的状態は、様々な実施形態では、皮膚状態（すなわち、主として皮膚に明白な疾患）ではない。該方法は、外見的には異種の生物学的状態の共通な特徴の検出及び解析を可能にし、これにより、価値のある潜在的な治療的標的内への洞察を提供する。
【００８８】
したがって、一態様では、方法は、１つ以上の生物学的状態の格納された遺伝子発現プロファイルのデータアーキテクチャに、病的皮膚遺伝子発現シグネチャを問い合わせすることを含む。問い合わせすることは、病的皮膚遺伝子発現シグネチャを、それぞれの格納された遺伝子発現プロファイルと比較する（すなわち、病的遺伝子シグネチャの遺伝子発現シグネチャリスト内のそれぞれの識別子を、同一の識別子の生物学的状態のそれぞれの遺伝子発現プロファイル内の位置と比較する）ことを含む。所望により、病的皮膚遺伝子発現シグネチャの、それぞれの格納された遺伝子発現プロファイルに対する比較は、関連性スコアを生物学的状態の１つ以上に割り当てることを含む。
【００８９】
インスタンスの生成、データの順序付け
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、複数の遺伝子発現プロファイリング実験から得られたデータを含む複数のインスタンス（例えば、２２、２４、２６）を少なくとも第１のデジタルファイル２０に投入することを含んでもよく、これらの実験のうちの１つ以上は、例えば、ケラチノサイト細胞（又はヒト皮膚等価物若しくはエクスビボ培養したヒト皮膚などの他の皮膚細胞）を少なくとも１つの撹乱因子に暴露することを含む。説明を簡単にするために、下記で説明する遺伝子発現プロファイリングは、マイクロアレイ実験の状況とする。例示的なインスタンスの生成方法を、図５に図示する。１つの実施形態では、インスタンスは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ２．０  ＧｅｎｅＣｈｉｐ上のすべてのプローブセットに対して序列順序付けされたデータからなり、チップ上のそれぞれのプローブは、固有のプローブセット識別子を有する。プローブセットは、同一のＣ−マップバッチ内で対照に関して検出された遺伝子発現の倍率変化レベルによって序列順序付けされる（単一のインスタンス／対照の平均値）。プローブセット識別子は、最も上方調節されたものから最も下方調節されたものまでを反映するように序列順序付けされる。
【００９０】
特に、非差次的に調節された遺伝子についてさえも、特定のプローブセットに対する信号値は、遺伝子発現プロファイル（例えば、インスタンスに関連付けられる、又は対象となる生物学的状態に関連付けられる）及び対照プロファイルに対して同一にはなりそうにない。１とは異なる倍率変化は、計算されて、総括的な序列順序付けのために使用することができる。Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）によって開示される方法に従って、データは、非常に低いノイズ信号値を有し得る、遺伝子の効果を最小限に抑えるために、２つの閾値を使用して調整される。閾値化は、好ましくは、序列順序付けの前に実施される。説明のための例としては、第１の閾値が２０に設定される過程が挙げられる。プローブセットのシグナルが２０未満の場合、これは２０に補正される。序列付けの同位は第２の閾値を用いて分割されるが、このとき倍率変化が再び計算され、２未満のあらゆる値は２に設定される。いずれかの同位が残っている場合に対して、順序は、使用されるソーティングアルゴリズムによって決まるが、本質的にはランダムである。リストの中央のプローブセットは、実際の関連性スコアに有意義には寄与していない。
【００９１】
序列順序付けされたデータは、インスタンス又は遺伝子発現プロファイルとして格納される。プローブは、検出される遺伝子発現調節レベルに従ってリストにソートされてもよく、リストは、上方調節されたものから、辺縁部又は調節なしに下方調節されたものへと進行し、プローブＩＤのこの序列順序付けされたリストは、第１のデジタルファイル２０中にインスタンス（例えば、図５の２２）として格納される。図３を参照すると、インスタンス（又は対象となる生物学的疾患に関連付けられる遺伝子発現プロファイル）に関連付けられるデータは、リスト内でのその序列（例えば、１、２、３、４．．．Ｎであり、ここでＮは、マイクロアレイ上のプローブの総数を表す）を表すプローブＩＤ  ８０及び値８２を含む。順序付けされたリスト８４は、一般に、プローブＩＤのおよそ３つのグループ、すなわち、上方調節された遺伝子に関連付けられるプローブＩＤの第１のグループ８６、わずかな調節を含むか、又は検出可能なシグナル若しくはノイズを含まない遺伝子に関連付けられるプローブＩＤの第２のグループ８８、及び下方調節された遺伝子に関連付けられるプローブＩＤの第３のグループ９０を含んでもよい。最も上方調節された遺伝子は、リスト８４の最上部又はその付近にあり、最も下方調節された遺伝子は、リスト８４の最下部又はその付近にある。これらのグループは説明のために示すが、それぞれのインスタンスのリストは連続的であってもよく、調節された遺伝子の数は、例えば、そのインスタンスに関連付けられる撹乱因子の影響の強さに依存することになる。リスト８４内の他の配列が提供されてもよい。例えば、下方調節された遺伝子に関連付けられるプローブＩＤをリスト８４の最上部に配列してもよい。また、このインスタンスデータは、メタデータ、例えば、撹乱因子ＩＤ、撹乱因子濃度、細胞株又はサンプル源、及びマイクロアレイＩＤも更に含んでもよい。
【００９２】
いくつかの実施形態では、１つ以上のインスタンス（又は遺伝子発現プロファイル）は、少なくとも約１，０００個、２，５００個、５，０００個、１０，０００個、若しくは２０，０００個の識別子、及び／又は約３０，０００個、２５，０００個、若しくは２０，０００個未満の識別子を含む。いくつかの実施形態では、データベースは、少なくとも約５０、１００、２５０、５００、若しくは１，０００のインスタンス、及び／又は約５０，０００、２０，０００、１５，０００、１０，０００、７，５００、５，０００、若しくは２，５００未満のインスタンスを含む。インスタンスの複製が、作製されてもよく、同一の撹乱因子が、特定の細胞型（例えば、ケラチノサイト細胞）から第１のインスタンスを、及び別の標的細胞型又は生物学的サンプル（例えば、線維芽細胞、メラノサイト、又はエクスビボのヒトの皮膚などの複雑な組織）から第２のインスタンスを、誘導するために使用されてもよい。
【００９３】
遺伝子発現シグネチャのインスタンスに対する比較
図６及び図７を参照すると、ここで１つ以上の遺伝子発現シグネチャを有するインスタンスを問い合わせるための例示的な方法が記載されているであろう。大まかに言えば、方法は、１つ以上の遺伝子シグネチャ（例えば、病的皮膚遺伝子発現シグネチャ）で、格納されたインスタンス（例えば、皮膚インスタンス）のデータアーキテクチャを問い合わせすることと、インスタンス内で遺伝子発現シグネチャ遺伝子が、調節された遺伝子とどれぐらい強く一致するかを決定するために統計的な方法を適用することと、を含む。正の関連性は、インスタンス中の上方調節された遺伝子の中で、上方調節された遺伝子発現シグネチャリスト中の遺伝子が濃縮されている場合、及びインスタンス中の下方調節された遺伝子の中で、下方調節された遺伝子発現シグネチャリスト中の遺伝子が濃縮されている場合に生じる。一方、インスタンスの下方調節された遺伝子の中に遺伝子発現シグネチャの上方調節された遺伝子が主に認められる場合、及びその逆の場合には、これは負の関連性としてスコアされる。図６は、シグネチャ９０と、プローブＩＤ  １０２を含むインスタンス１０４との間の正の関連性の極端な例を概略的に図示し、インスタンスのプローブＩＤは、最も上方制御されたものから最も下方制御されたものへと順序付けられる。この例では、上方リスト９７及び下方リスト９９を含む遺伝子シグネチャ９０のプローブＩＤ  １００（例えば、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8）は、インスタンス１０４の最も上方制御及び下方制御されたプローブＩＤ  １０２とそれぞれ一対一の正の対応を有する。同様に、図７は、シグネチャ９４と、プローブＩＤ  ９０を含むインスタンス８８との負の関連の極端な例を概略的に図示しており、このときインスタンスのプローブＩＤは、最も上方制御されたものから最も下方制御されたものへと順序付けられる。この例では、上方リスト９３（例えば、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4）のプローブＩＤは、インスタンス８８の最も下方制御された遺伝子と正確に一致し、下方リスト９５（例えば、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8）のプローブＩＤは、インスタンス８８の最も上方制御されたプローブＩＤに正確に一致する。図８は、中立的関連性の極端な例を概略的に図示し、インスタンスの上方及び下方制御された遺伝子の間に、シグネチャの上方及び下方制御された遺伝子の一貫した強化が、正又は負のいずれにおいても存在しない。したがって、遺伝子シグネチャ１０８（上方リスト１０７及び下方リスト１０９を含む）のプローブＩＤ  １０６（例えば、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8）は、インスタンス１１２のプローブＩＤ  １１０を有するランクに対して分散され、インスタンスのプローブＩＤは、最も上方制御されたものから下方制御されたものへと順序付けられる。上記の実施形態は、遺伝子シグネチャが皮膚状態の最も顕著に上方調節及び下方調節された遺伝子を表す「上方リスト」及び「下方リスト」の両方を含む場合のプロセスを例示しているが、対象状態に関連付けられる主要なバイオロジーが、主に１つの方向への遺伝子調節を示すときに、遺伝子シグネチャが上方リストのみ又は下方リストのみを含んでもよいことが意図される。
【００９４】
いくつかの実施形態では、関連性スコアは、上方スコアと下方スコアとの組み合わせであり、上方スコアは、遺伝子発現シグネチャの上方調節された遺伝子とインスタンスの上方調節された遺伝子との間の相関を表し、下方スコアは、遺伝子発現シグネチャの下方調節された遺伝子とインスタンスの下方調節された遺伝子との間の相関を表す。上方スコア及び下方スコアは、例えば、＋１〜−１の値を有する。上方スコア（及び下方スコア）については、高い正値は、インスタンスの対応する撹乱因子が、遺伝子発現シグネチャの上方調節された（又は下方調節された）遺伝子に対して特異的なマイクロアレイプローブに対応する遺伝子の発現を誘発することを示す。高い負値は、インスタンスに関連付けられた対応する撹乱因子が、遺伝子シグネチャの上方調節された（下方調節された）遺伝子に対して特異的なマイクロアレイプローブに関連付けられた遺伝子の発現を抑制された（下方調節された）ことを示す。上方スコアは、上方調節された遺伝子を含む遺伝子発現シグネチャの上方リストのそれぞれの識別子（例えば、表Ａ、並びに図６〜図８のリスト９３、９７、及び１０７）を、順序付けられたインスタンスリストと比較することによって計算することができ、一方で、下方スコアは、下方調節された遺伝子を含む遺伝子シグネチャの下方リストのそれぞれの識別子（例えば、表Ｂ、並びに図６〜図８の下方リスト９５、９９、及び１０９を参照）を、順序付けられたインスタンスリストと比較することによって計算することができる。これらの実施形態では、遺伝子発現シグネチャは、上方リスト及び下方リストの組み合わせを含む。
【００９５】
一部の実施形態では、関連性スコアの値は、＋２（最大の正の関連性）〜−２（最大の負の関連性）の範囲であってもよく、関連性スコア（例えば、１０１、１０３、及び１０５）は、遺伝子シグネチャのそれぞれの識別子を順序付けされたインスタンスリストの識別子と比較することによって得られる、上方スコア（例えば、１１１、１１３、１１５）と下方スコア（例えば、１１７、１１９、１２１）との組み合わせである。他の実施形態では、関連性の範囲は、＋１〜−１であってもよい。スコアの例は、図６〜図８に、参照番号１０１、１０３、１０５、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、及び１２１として図示される。上方スコア及び下方スコア、並びに／又は関連性スコアによって表される遺伝子発現シグネチャとインスタンスとの間の一致の強さは、当該技術分野において既知の１つ以上の手法によって得ることができ、これにはパラメトリック手法及び非パラメトリック手法が含まれるが、これらに限定されない。パラメトリック手法の例としては、ピアソンの相関（又はピアソンｒ）及びコサイン相関が挙げられる。非パラメトリック手法の例としては、スピアマンの序列（又は序列の順序）相関、ケンドールのタウ相関、及びガンマ統計が挙げられる。所望により、必要条件を除去するために、すべてのプロファイルが同一のマイクロアレイプラットフォーム上で生成され、非パラメトリックで、コルモゴロフ・スミルノフ統計に基づく序列に基づいたパターン一致戦略（Ｍ．Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．「Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」；Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｅｄ．２，１９９９を参照のこと）（例えば、１７８ページ〜１８５ページを参照のこと）が使用される。しかしながら、すべての発現プロファイルが単一の技術プラットフォームに由来する場合、従来の相関手段、例えばピアソンの相関係数を用いて、類似の結果が得られる場合があることに留意されたい。
【００９６】
特定の実施形態では、本発明の方法及びシステムは、遺伝子セット強化解析（ＧＳＥＡ）（例えば、Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、及びＳｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ，１０２，１５５４５〜１５５５０を参照）として当該技術分野において既知の遺伝子プロファイリングデータに対して精緻化されている、コルモゴロフ・スミルノフ統計に基づく、ノンパラメトリック、ランクベースパターン一致戦略を採用する。それぞれのインスタンスについて、下方スコアは、問い合わせとインスタンスとの下方制御された遺伝子間の一致を反映するように算出され、上方スコアは、問い合わせとインスタンスとの上方制御された遺伝子間の相関を反映するように算出される。特定の実施形態では、下方スコア及び上方スコアはそれぞれ、−１〜＋１の範囲であってもよい。この組み合わせは、問い合わせシグネチャとインスタンスとの間の全体的一致の強さを表す。
【００９７】
上方スコア及び下方スコアの組み合わせは、それぞれのインスタンスに対する全体的な関連性スコアを計算するために使用され、上方及び下方スコアの範囲が−１〜＋１に設定される実施形態において、関連性スコアは、−２〜＋２の範囲になり、クエリ遺伝子発現シグネチャとインスタンスとの間の一致の強度を表す。スコア全体の符号は、インスタンスがシグネチャに対して正にリンクするか、負にリンクするかによって決定される。正の関連性は、インスタンスに関連付けられる撹乱因子が、シグネチャの上方リスト中の遺伝子を上方調節し、下方リスト中の遺伝子を下方調節する傾向にあるときに生じる。反対に、負の関連性は、撹乱因子が、上方及び下方シグネチャ遺伝子発現変化を逆転させる傾向にあるときに生じる。関連性スコアの大きさは、上方及び下方スコアが異なる符号を有するとき、上方及び下方スコアの絶対値の和である。高い正の関連性スコアは、撹乱因子が問い合わせ遺伝子発現シグネチャに関連付けられる状態を誘発する傾向を有することになると予測し、高い負の関連性スコアは、撹乱因子が問い合わせ遺伝子発現シグネチャに関連付けられる状態を逆転させるであろうことを予測する。ゼロのスコアは、上方及び下方スコアが同一のサインを有する場合に割り当てられ、撹乱因子が、状態遺伝子発現シグネチャに対して一貫した影響を有さなかったことを示す（例えば、上方及び下方リストの両方の上方調節）。
【００９８】
Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）によると、観察される関連性の統計的有意性を評価するための基準は存在しない。関連を検出する能力は、多くの複製を有する化合物の場合により高くなる場合がある。これに関して、複製することは、同じ撹乱因子を複数回プロファイルすることを意味する。それぞれのバッチで撹乱因子を多数回プロファイリングすると、バッチとバッチとの変動が減少する。マイクロアレイ実験は、強いバッチ効果を有する傾向があるため、関連性スコアが有意義かつ再現可能であるという信頼性を増加するために、異なるバッチ（すなわち、実験）においてインスタンスは、所望により複製される。
【００９９】
それぞれのインスタンスは、クエリ遺伝子発現シグネチャへのその関連性スコアによって序列順序付けされてもよく、結果として得られる序列順序付けされたリストは、データの視覚化を可能にする任意の好適なソフトウェア及びコンピューターハードウェアを使用して、ユーザーに表示される。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本方法は、表示されたインスタンスの序列順序付けされたリストから、（ｉ）対象インスタンスに関連付けられる１つ以上の撹乱因子（それによって、問い合わせシグネチャに記載される複数の遺伝子の活性化又は抑制を１つ以上の撹乱因子と相関させる）；（ｉｉ）任意の対象インスタンスに関連付けられる差次的に発現された遺伝子（それによって、そのような遺伝子を、１つ以上の撹乱因子、対象皮膚組織状態、又はそれら双方と相関させる）；（ｉｉｉ）任意の対象インスタンスに関連付けられる細胞（それによって、そのような細胞を差次的に発現された遺伝子、１つ以上の撹乱因子、及び対象皮膚組織状態のうちの１つ以上と相関させる）；又は（ｉｖ）それらの組み合わせ、を特定することを含んでもよい。インスタンスに関連付けられる撹乱因子を、そのインスタンスのデータベースに格納されたメタデータから特定してもよい。しかしながら、当業者は、インスタンスの撹乱因子データが、他の手段に、又は他の手段で、検索可能なように格納してもよいことを理解するであろう。特定された撹乱因子が、問い合わせ遺伝子発現シグネチャ中にリストされる遺伝子の活性化又は阻害に統計的に相関するため、及び問い合わせ遺伝子発現シグネチャが、生物学的状態（例えば、複数の対象となる皮膚の状態）に対するプロキシであるため、特定された撹乱因子は、新しい化粧剤のため、既知の化粧剤の新しい使用のため、又は既知の使用に対する既知の薬剤を立証するための候補となる場合がある。
【０１０１】
皮膚状態のモデル内での撹乱因子活性の特徴付け
いくつかの実施形態では、発明の方法は、薬剤の活性及びスキンケア剤としての有用性を立証するために、１つ以上のアッセイで、インスタンス（すなわち、皮膚活性剤の候補）に関連付けられる撹乱因子の活性を特徴付けることを含む。新しいスキンケア活性を特定する際の１つの大きな課題は、臨床有効性を予測するインビトロモデルの開発である。皮膚状態に対して予測をインビトロ及びエクスビボモデルで開発する課題は、多くの皮膚状態のきっかけ及び根底にあるバイオロジーが十分理解されていないという事実によって複雑化される。本明細書に記載される複数の皮膚状態のトランスクリプトームのプロファイリングは、多重の皮膚状態の共通する重要な特徴をインビボで概括する、インビトロ及びエクスビボアッセイへと多くの新しい洞察を提供する。この点について、様々な実施形態で、本発明は、撹乱因子の活性を、炎症シミュレーションアッセイ、表皮分化アッセイ、上皮細胞増殖アッセイ、及び脂質代謝アッセイから成る群から選択される１つ以上のアッセイで、特徴付けることを更に含む。所望により、該方法は、炎症シミュレーションアッセイ、表皮分化アッセイ、上皮細胞増殖アッセイ、及び脂質代謝アッセイ内の撹乱因子の活性を特徴付けることを含む。様々な態様では、該方法は、撹乱因子の活性を炎症のエクスビボ皮膚モデル及び／又は炎症の三次元器官モデルで特徴付けることを追加的に含む。
【０１０２】
本発明は、皮膚ホメオスタシス上の皮膚活性剤の候補の影響を特徴付けるために、アッセイの理路整然とした段階的なシステムを提供する。例えば、一実施形態では、該方法は、細胞に基づくアッセイで撹乱因子の活性を特徴付けることと、エクスビボ組織アッセイで撹乱因子の活性を特徴付けることと、インビボで撹乱因子の活性を特徴付けること、とを含む。細胞に基づくアッセイは、所望により、炎症アッセイ、表皮分化アッセイ、上皮細胞増殖アッセイ、及び脂質代謝アッセイ、並びに上述のものの任意の組合せから成る群から選択される。エクスビボ組織アッセイは、所望により、炎症の皮膚モデル及び／又は炎症の三次元器官モデルである。
【０１０３】
例示的な炎症シミュレーション、表皮分化、上皮細胞増殖、及び脂質代謝アッセイが、本明細書に記載される。炎症、分化、増殖、及び脂質代謝を研究するために好適な細胞培養物又は皮膚モデルとしては、器官の培養、ＮＨＥＫ又は第３ケラチノサイト培養（ビタミンＣ／血清ＮＨＥＫシステムを含む）、及びブタ又はヒト外植片が挙げられるが、これに限定されない。ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐ．ＮＨＥＫ−ｂａｓｅｄ  ＥｐｉＤｅｒｍ（商標）システムを含む多くの組織モデルが商業的に入手可能である。エクスビボ皮膚モデルは、被験者から外科的に除去し、インビボ状態（例えば、循環）を模倣する様式で培養した皮膚（例えば、ヒトの皮膚）をしばしば含む。ヒトの皮膚を使用するエクスビボ皮膚モデルは、モデルが、機能的な、完全に形成された角質層障壁、適当な組織構造、及びヒトの皮膚内に存在する細胞型の完全な補体のほとんど（すべてではない場合）を含むので、有利である。エクスビボヒト皮膚モデルは、大部分はある特定の課題にインビボ皮膚と類似の様式で応答する。三次元器官モデルは、ケラチノサイトが不活性媒質（例えば、コラーゲンゲル）上で培養され、組織培養皿内で空気液体境界面に上昇したときに開発する、ケラチノサイトに誘導された三次元の上皮を含む。三次元器官モデルは、炎症課題に応答し、インビボ皮膚と非常に類似した様式で分化する。好適なエクスビボモデル及びアッセイ状態は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年８月１５日出願の、米国特許出願第６１／６８３，４５２号に記載される。
【０１０４】
様々な態様では、細胞／外植片は、皮膚状態に対する生理学的主題パターンを誘発する撹乱因子の１つ又は組合せで治療される。ＩＬ−２２／１７の組合せは、フケ、座瘡、皮膚炎、湿疹、及び乾癬を含むいくつかの皮膚状態に関連付けられる病理とよく似た炎症環境をシミュレーションするための非常に良好な手段である。実際、ＩＬ−２２とＩＬ−１７との組合せは、例えば、フケで観察されるものと同一の様式で多くの生物学的プロセスに影響する。例えば、フケ罹患者は、ケラチノサイト分化の増加、アポトーシス調節の減少を呈し、炎症、生物的刺激、ホルモン刺激、及び創傷に対する応答の増加を呈し、並びにケトン代謝、脂質生合成、及びステロイド生合成の減少を呈する。皮膚細胞をＩＬ−２２及びＩＬ−１７に曝露すると、類似の生物学的応答を誘発する。追加的に、ＩＬ−２２及びＩＬ−１７を用いたフケのインビトロシミュレーションは、本明細書に記載される病的皮膚遺伝子発現パターンと大変よく似た遺伝子発現のカスケードを生成する。したがって、一態様では、本発明は、表皮層及び真皮層を含む哺乳類の皮膚サンプルを含む、皮膚炎症のエクスビボモデル内に特徴付ける撹乱因子活性を含み、炎症は、有効な量の、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＬ−１ｂ、及びこれらの組合せから成る群から選択される有効量の刺激物質を哺乳類の皮膚サンプルに送達することによって誘発される。
【０１０５】
例えば、炎症、表皮分化、上皮細胞増殖、及び／又は脂質代謝上での撹乱因子の効果は、脂質含有量（例えば、主要な皮下脂質クラスのＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ／ＴＬＣ評価によって決定される）、関連する脂質生合成酵素の生成、角化膜形成（例えば、比色測定を介して共有結合的に架橋したエンベロープタンパク質）、扁平分化マーカーの生成、レチノイン酸代謝阻害剤（ＲＡＭＢＡ）の存在（例えば、ヒトＣＹＰ３Ａ４阻害の検出を介した）、基底細胞増殖（例えば、使用して検出されるＰＣＮＡ、Ｋｉ６７若しくはＢｒｄＵ染色、又は生存可能な表皮の厚さを観察することによる）、炎症誘発性サイトカイン生成（例えば、ＩＬ−８放出又はＮＦ−ｋＢ活性の測定を介した）、及び／又は抗炎症性サイトカイン生成（例えば、ＩＬ−１０生成の測定を介した）を含むが、これに限定されない多数の終点のうちのいずれかを調べることによってによって決定される。代替的に又は加えて、障壁ホメオスタシスバイオマーカー（例えば、フィラグリン、インボルクリン、セリンパルミトイル転移酵素Ｉ及びＩＩ、トランスグルタミナーゼＩ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、βグルコセレブロシダーゼ、グルコシルセラミドシンターゼ、セラミドキナーゼ）遺伝子発現は、検出及び／又は定量化される。
【０１０６】
様々な実施形態では、撹乱因子の活性は、ベンチマークと比較される。例えば、脂質代謝アッセイでは、コレステロール、遊離脂肪酸、及び／又は撹乱因子に曝露された皮膚細胞（例えば、ケラチノサイト）内で生成されたセラミドが、定量化される。カルシウムを用いて処理された一致した細胞（すなわち、同一の細胞型、類似状態下で培養した）で観察される生成のレベルと等しいか又はより高い、コレステロール、遊離脂肪酸、セラミド、又はこれらの任意の組合せの生成レベルを媒介する撹乱因子は、脂質代謝モジュレーターであり、かつ皮膚活性剤の候補である。例示的な表皮分化アッセイは、角化膜形成を撹乱因子に曝露されたケラチノサイト又は既知の皮膚細胞分化因子によって比較する。例えば、細胞は、撹乱因子に曝露されて、細胞によって生成された架橋したエンベロープタンパク質の量は、定量化され、アントラリンで処理された細胞によって生成された架橋したエンベロープタンパク質の量と比較される。アントラリンによって媒介される架橋したエンベロープタンパク質の生成レベルと等しいかそれより高い架橋したタンパク質の生成レベルを媒介する撹乱因子は、分化モジュレーターであり、皮膚活性剤の候補である。
【０１０７】
細胞増殖アッセイ及び炎症アッセイに対する例示的なベンチマークは、例えば、湿疹及び乾癬の治療に使用されるクロベタゾール、副腎皮質ホルモンである。しかしながら、撹乱因子活性は、ベンチマーク活性と比較される必要はない。この点については、陰性対照（例えば、増殖阻害物質を有さない細胞増殖、外因性の増殖開始剤及び外因性の増殖のきっかけ（ＩＬ−１７及びＩＬ−２２などの）に応答して達成される細胞増殖なしに観察された細胞増殖を含む）と比較される、統計的に有意なレベル（例えば、ｔ−検定からｐ＜０．０５）の細胞増殖の抑制を媒介する撹乱因子は、皮膚活性剤の候補と考えられる。本発明の状況では、クロベタゾールによって媒介される細胞増殖のレベルは、細胞増殖アッセイに対して有用な参照である。クロベタゾールによって媒介される抑制レベルに匹敵する、またはそれより高い程度まで細胞増殖を抑制する撹乱因子も、皮膚活性剤の候補である。炎症アッセイでは、例えば、ＩＬ−２２／ＩＬ−１７によって検証される細胞は、撹乱因子に曝露され、かつ炎症に対する代用品としてＩＬ−８が測定される。陰性対照（例えば、撹乱因子を有さないで観察される炎症）と比較される、撹乱因子によって媒介されるＩＬ−８の統計的に有意な減少又は抑制は、撹乱因子が抗炎症剤であることを示し、これは皮膚活性剤の候補である。所望する場合、撹乱因子の活性は、クロベタゾールのものと比較され、クロベタゾールと等しい又はより高いＩＬ−８の抑制のレベルを媒介する撹乱因子も、皮膚活性剤の候補と考えられる。
【０１０８】
本明細書に記載される方法は、オートメーションに従うことができ、このように、撹乱因子の活性を特徴付けるための処理能力の高い方法として形式化されてもよい。オートメーション設備の使用は、本明細書に意図される、皮膚活性剤の候補の特定と、複数の候補（例えば、数百、数千の候補）の活性の迅速な特徴付けと、を並列的に可能にする。実際、本発明の方法は、潜在的な活性剤のライブラリーの大規模なスクリーニングに適当である。
【０１０９】
組成物及びパーソナルケア製品
一般に、皮膚活性剤は、当該技術分野において周知の化粧組成物及び製剤パラメーターを用いることによって塗布される。治療、塗布、調節、又は改善の様々な方法は、本発明の方法によって特定される皮膚用活性剤を含むスキンケア組成物を利用してもよい。皮膚活性剤の「有効量」は、所望の生物学的な効果を達成するために十分な量である。有効量は、治療される特定の皮膚の状態、使用される特定の薬剤、被験者の年齢及び身体的状態、並びに治療期間の長さによって異なることになる。所望の効果を達成するために、ある期間にわたって皮膚活性剤を複数回塗布して投与するのは有利である場合がある。例えば、複数回塗布は、例えば約１ヶ月〜約２４ヶ月（例えば約３ヵ月、約６ヶ月、約９ヶ月、約１２ヶ月、約１５ヶ月、約１８ヶ月、又は約２１ヶ月）の治療期間にかけて投与することができるが、より長い治療期間もまた企図される。場合によっては、治療期間中に皮膚活性剤を週に複数回及び／又は１日に複数回投与する。例えば、一実施形態では、望まれる結果を達成し、かつ／又は維持するために十分な期間の間、皮膚活性剤を、所望により週の１日又はそれ以上（例えば、週に２日、３日、４日、５日、６日、又は７日）に、１日１回又は２回塗布する。
【０１１０】
皮膚、毛髪、及び頭皮に関する定期的な衛生行為の一部として、組成物を塗布してもよい。一態様では、本明細書に記載されるものとして特定される薬剤は、例えば、シャンプー、コンディショナー、トニック、シャワージェル、液体ハンドクレンザー、顔用クレンザー、保湿剤、ローション（例えば洗浄用ローション）、スキンローション又はクリーム（アイクリーム及び／又はリップクリームなど）、顔面肌用化粧品（頬紅及びハイライターなど）、目用化粧品（アイシャドー、眉墨及びアイライナーなど）、唇用化粧品（口紅など）、ファンデーション、コンシーラー、しわ伸ばしセラム、マスカラ、スキンフェイシャルマスク、日焼け予防剤、頭髪スタイリング剤、顔毛スタイリング剤、乳液、オイル、ムース、軟膏、ミルク、ポマード、溶液、スプレー、エアロゾル、粉末、発泡体、ゲル（肌用、目用、及び／又は唇用のゲルなど）、セラム、スティック、ペースト、又は他の皮膚及び毛髪用製品又はトリートメントとして配合される。一実施形態では、何らかの審美的、予防的、治療的、又はその他の利益のために、組成物は皮膚上及び／又は毛髪上に残されるように（すなわち、「リーブオン」組成物として）意図される。
【０１１１】
パーソナルケア組成物に含むことができる構成成分の非限定的な例としては、状態調節剤、セルロース又はグアーカチオン性付着ポリマー、天然カチオン性付着ポリマー、合成カチオン性付着ポリマー、抗フケ剤、ゲル網（例えば脂肪族アルコール／界面活性剤網）、粒子、懸濁化剤（例えば米国特許第４，７４１，８５５号及びＲＥ３４，５８４号に記載されているような懸濁化剤）、パラフィン系炭化水素、噴射剤、粘性改質剤、染料、不揮発性の溶剤、水溶性希釈剤、非水溶性希釈剤、白濁剤、真珠光沢助剤、起泡増進剤、追加的な界面活性剤又は非イオン性共活性剤、シラミ駆除剤、ｐＨ調整剤、香水、保存料、キレート剤、タンパク質、皮膚活性薬剤、日焼け防止剤、紫外線吸収剤、ビタミン、アミノ酸、一価又は二価の塩、芳香剤、皮膚状態調節剤、剥離剤、及びこれらの混合物が挙げられる。代表的な状態調節剤としては、非限定的に、有機状態調節油、炭化水素油、ポリオレフィン、脂肪酸エステル、フッ素化状態調節化合物、脂肪族アルコール、アルキルグルコシド及びアルキルグルコシド誘導体、四級アンモニウム化合物、ポリエチレングリコール、並びにシリコーン状態調節剤（例えば、米国再発行特許第３４，５８４号、米国特許第２，８２６，５５１号、同第３，９６４，５００号、同第４，３６４，８３７号、同第５，１０４，６４６号、同第５，１０６，６０９号、及び英国特許第８４９，４３３号並びに「Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」（Ｐｅｔｒａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（１９８４））に記載されるシリコーン状態調節剤）が挙げられる。好適な合成カチオン性付着ポリマーの非限定的な例は、米国特許出願公報第２００３／０２２３９５１号に記載されている。代表的なフケ防止添加剤は、例えば、米国特許第２，６９４，６６８号、同第２，８０９，９７１号、同第３，１５２，０４６号、同第３，２３６，７３３号、同第３，７５３，１９６号、同第３，７６１，４１８号、同第４，３４５，０８０号、同第４，３２３，６８３号、同第４，３７９，７５３号、同第４，４７０，９８２号、及び同第４，８８５，１０７号に記載されている。パーソナルケア組成物は、特定の実施形態においては、微生物の成長を抑制し、製品の完全性を維持するために保存料系もまた含む。パーソナルケア組成物の代表的な構成成分は、米国特許第７，７７２，２１４号、同第７，７２７，５１６号、同第７，７０９，０１５号、同第７，７０４，９３２号、同第７，５８５，８２７号、及び同第７，５３１，４９７号にも記載されている。米国特許第７，１０１，８８９号、同第５，６２４，６６６号、同第６，４５１，３００号、同第６，９７４，５６９号、及び同第７，００１，５９４号は、組成物、製剤、ビヒクル、投与、及びフケの治療のために配合されるフケ防止剤を含むパーソナルケア製品に関する他の態様に関するガイダンスを含む、米国特許の非限定的な例である。本明細書に列挙した特許の全開示は、特にパーソナルケア組成物の製剤に関する教示に関して、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１１２】
本発明は、例示を目的として提示され、限定するものではない以下の実施例を参照することにより、よりよく理解できるであろう。
【０１１３】
（実施例１）
この実施例は、例示的な、インスタンスを生成するための方法を記載する。
【０１１４】
個々の実験（バッチと称する）は、概して、ビヒクルコントロール（例えば、ＤＭＳＯ）の６個の複製、使用する細胞型に強い再現可能効果を与える陽性コントロールの２個の複製サンプル、及び試験材料／撹乱因子のサンプルを含む、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）技術プラットフォームを用いて解析される３０〜９６個のサンプルを含む。試験材料の複製は、バッチ効果のため、別のバッチで実施された。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）解析に十分なＲＮＡ（２〜４μｇの全ＲＮＡ収量／ウェル）を提供するために、インビトロ試験を６ウェルプレートで実施した。
【０１１５】
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）からヒトテロメル化ケラチノサイト（ｔＫＣ）を得た。コラーゲンＩコーティング細胞培養フラスコ及びプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）上で、１Ｘヒトケラチノサイト成長サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を有する、ＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）培地で、ｔＫＣ細胞を増殖させた。化学物質暴露の２４時間前に、ケラチノサイトを２０，０００細胞／ｃｍ2で６ウェルプレート中に播種した。通常の細胞培養フラスコ及びプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）内で、ヒト皮膚線維芽細胞（ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）からのＢＪ細胞株）を、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を補充したイーグル最小必須培地（ＡＴＣＣ）で成長させた。化学曝露の２４時間前、ＢＪ線維芽細胞を１２，０００細胞／ｃｍ2で６ウェルプレートに播種した。
【０１１６】
すべての細胞を調湿したインキュベーター中、５％  ＣＯ2、３７℃でインキュベートした。ｔ＝−２４時間において、Ｔ−７５フラスコ及びプレートから細胞をトリプシン処理し、６ウェルプレート中の基本成長培地に蒔いた。実験計画に従って、ｔ＝０において培地を除去し、撹乱因子の適当な投与溶液で置き換えた。投与溶液は、前日に滅菌４ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎスナップキャップチューブ中で調製した。純粋試験材料は、濃度１〜２００μＭで調製してもよく、植物抽出物は、投与溶液の０．００１〜１重量％の濃度で調製してもよい。化学物質暴露の６〜２４時間後、細胞を観察し、画像化した。毒性の形態学的証拠を評価するために、細胞溶解及びＲＮＡ単離前に、ウェルを顕微鏡で観察した。形態学的変化が細胞毒性を示唆するのに十分であった場合に、低濃度の撹乱因子を試験した。次いで、細胞をβ−メルカプトエタノール（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）入りの３５０μＬ／ウェルのＲＬＴ緩衝液で溶解し、９６ウェルプレートに移し、−２０℃で保存した。
【０１１７】
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＲＮＡｄｖａｎｃｅ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｂｉｎｄ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、製造業者の使用説明に従って、細胞培養バッチからのＲＮＡをＲＬＴ緩衝液から単離した。Ａｍｂｉｏｎ  Ｍｅｓｓａｇｅ  Ａｍｐ（商標）ＩＩ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｄキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を使用して、製造業者の使用説明に従って、サンプル当たり１マイクログラムの全ＲＮＡを標識した。結果として得られるビオチン標識及び断片化されたＲＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ２．０ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）にハイブリッド形成し、次いで、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって提供されるプロトコルを使用して、それを洗浄、染色、及びスキャンした。
【０１１８】
（実施例２）
この実施例は、複数の生物学的条件を代表する遺伝子発現シグネチャを生成する方法を記載する。該方法は、多重の皮膚状態と関連付けられた遺伝子発現プロファイルを採用した。しかしながら、該方法が任意の生物学的状態の組み合わせに適用可能であることが理解されるであろう。
【０１１９】
５つの皮膚疾患（フケ、座瘡、アトピー性皮膚炎、湿疹、及び乾癬）に対する遺伝子発現データセットが収集された。それぞれの病変生検は、ｔ−検定を使用して「健康な」生検と比較された。片側ｔ−検定ｐt値は、プローブセットのそれぞれに対して算定され、ログオッズ比を計算するために使用された。ログオッズ比は、変化の有意性の測定値であり、上方／下方調節されたプローブに対して対称である。ログオッズ比は、次いで、ソフト閾値関数を使用して変換され、５つの皮膚疾患すべてにわたって結果として得られる値は、ｔ−統計量と類似の式を使用して一貫性値を算定するために使用された。次いで、プローブは、算定された一貫性値に基づいて序列付けされた。該方法は、以下の段落で更に記載される。
【０１２０】
座瘡、アトピー性皮膚炎、湿疹、及び乾癬遺伝子発現データセットが、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（出版されている文献からの遺伝子発現データセットに対するレポジトリ）から得られる一方で、フケデータセットは、内部で生成された。Ｏｍｎｉｂｕｓデータは、座瘡（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＳＥ６４７５、Ｔｒｉｖｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｅ  ａｒｒａｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ａｃｎｅ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｍａｒｋｅｄ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ，」Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ；１２６（５）：１０７１〜９（２００６）；ＰＭＩＤ：１６５２８３６２を引用）、アトピー性皮膚炎（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＳＥ５６６７、Ｐｌａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｅａｒｌｙ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，」Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ；１６（１）：２８〜３６（２００７）；ＰＭＩＤ：１７１８１６３４、及びＰｌａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａｔｉｃ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｈｉｎｏｓｉｎｕｓｉｔｉｓ  ｗｉｔｈ  ｎａｓａｌ  ｐｏｌｙｐｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏ  ｔｈｏｓｅ  ｉｎ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ；５（７）：ｅ１１４５０（２０１０）；ＰＭＩＤ：２０６２５５１１を引用）、湿疹（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＳＥ６０１２、Ｏｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｑｕａｐｏｒｉｎ  ３  ｉｎ  ａｔｏｐｉｃ  ｅｃｚｅｍａ，」Ａｌｌｅｒｇｙ；６１（９）：１１３２〜７  ９２００６）；ＰＭＩＤ：１６９１８５１８、及びＭｏｂｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  ｍｏｄｕｌｅ−ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｎｏｖｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｓｈｏｗｓ  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ７  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，」ＢＭＣ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ；３：１９（２００９）；ＰＭＩＤ：１９２１６７４０を引用）、及び乾癬（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＳＥ１３３５５、Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｓｃａｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ＩＬ−２３  ａｎｄ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ｐａｔｈｗａｙｓ，」Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ；４１（２）：１９９〜２０４（２０��９）；ＰＭＩＤ：１９１６９２５４、及びＳｗｉｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ，」ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ；６（４）：ｅ１８２６６  ９２０１１），ＰＭＩＤ：２１４８３７５０を引用）から収集された。
【０１２１】
それぞれの皮膚疾患データセット（遺伝子発現プロファイル）は、標準的なマイクロアレイ正規化方法を使用して正規化された。病変生検サンプルは、プローブセットのそれぞれに対する片側ｐ−値ｐtを誘導するために、片側ｔ検定を使用して「健康な」生検サンプルと比較された。遺伝子発現プロファイルは、同一のマイクロアレイチップを使用して生成されなかったので、５つの遺伝子発現プロファイルすべてに共通なプローブセットのみが考慮された。ログオッズ比は、それぞれのサンプルについて、式：ｌｏｄ＝ｌｏｇ（（１−ｐt）／ｐt）を使用して、それぞれのプローブセットに対して算定された。それぞれのログオッズ比は、それぞれのプローブセットに対して値ｃを誘導するために、ソフト閾値関数：ｃ＝（１／（１＋ｅ-α*lod））−０．５を使用して変換された。パラメーターαは、閾値のしゅん度を制御するために使用された。本研究ではα＝１．５が使用された。
【０１２２】
上で説明される誘導された５つの皮膚状態にわたるそれぞれのプローブセットに対するｃ−値は、１つの−サンプルｔ−検定統計値を計算するために使用された。ゼロで割り算するエラーを避けるために、小さい値である０．０１がｔ−検定式内の平方の合計に追加された。片側ｐ−値ｐt2が、計算され、それぞれのプローブセットについて、式ｌｏｄ１＝ｌｏｇ（（１−ｐt2）／ｐt2）を使用してログオッズ比が算定された。算定されたログオッズ値は、多い順にソートされた。最上位に序列付けされたプローブセットは、最も一貫して上方調節されたプローブセットを表し、最下位に序列付けされたプローブセットは、皮膚状態にわたって最も一貫して下方調節されたプローブセットを表す。
【０１２３】
例示的な病的皮膚遺伝子発現シグネチャは、図１に説明する遺伝子を含むように、表Ａ及び表Ｂに説明される、遺伝子発現シグネチャなどの７０個の最も著しく上方調節された遺伝子と７０個の最も著しく下方調節された遺伝子とを含む。
【０１２４】
本明細書に記載される方法を、遺伝子のリストを生成するために使用することができ、その発現は、上記される状態に限定されない１セットの生物学的状態の間で一貫して変更される。病的皮膚遺伝子発現シグネチャを生成するために使用される手法は、プロテオミクス、メタボロミクス、及びリピドミクス実験から生成されたデータセットを含むが、これに限定されない任意のデータセットに適用することができる。
【０１２５】
（実施例３）
この実施例は、皮膚活性剤の候補を信頼できるやり方でスクリーニングする目的で、病的皮膚遺伝子発現シグネチャを使用するための方法を例示する。
【０１２６】
病的遺伝子発現シグネチャは、上述されるように生成される。シグネチャは、多数の異なる薬剤（すなわち、「皮膚インスタンス」）に暴露された線維芽細胞及びケラチノサイト細胞系からの遺伝子発現プロファイルを含むＣ−マップデータベースに問い合わせるために使用される。表される薬剤の多くは、皮膚及び他の疾病を治療するために使用され、又は化粧品製品中で使用される。表される多くの薬剤は、薬物又は化粧品製品中での使用の履歴を有しない。それぞれの薬剤を数種の濃度で試験した。表Ｃに示すように、最も高く序列付けされた結果（最も強い負のリンクスコアを表すインスタンス）としては、エストラジオール、ナイアシンアミド、オールトランスレチノイン酸、及びＯｌｉｖｅｍ  ４６０のいくつかのインスタンスが挙げられ、そのすべては老化又は損傷した皮膚をインビボで正常化するうえで劇的な効果を有することが知られている。この結果は、この過程の有効性を立証している。
【０１２７】
【表３】
2015526089.tif 000007
【０１２８】
表Ｃに示される結果は、ケラチノサイト細胞系（表皮に対するプロキシ）からの遺伝子発現プロファイルが、皮膚の幅広く様々な疾患の治療のための化粧品及び／又は治療用薬剤に対する薬剤の候補のスクリーニングに有用であることも確実にする。
【０１２９】
この実施例は、本明細書に記載されるように、関連性マッピング、インスタンス、及び遺伝子発現シグネチャを、皮膚状態を改善するための皮膚活性剤の候補を信頼できるやり方でスクリーニングするために使用することができることを例示する。スクリーニングは、対象となる特定の皮膚状態に関与する作用の機構を理解せずに行うことができる。
【０１３０】
（実施例４）
この実施例は、フケ罹患者を非フケ罹患者から区別するための病的皮膚遺伝子発現シグネチャの使用を実証する。フケ症状を回復させるように治療されたとき、被験者は、健康な皮膚に酷似するものへの、病的皮膚遺伝子発現シグネチャの逆転を呈する。
【０１３１】
フケ対非フケの階層的クラスター分析（研究１）：フケ状態の頭皮及び健康な頭皮のゲノム全域にわたる転写プロファイルが、全厚頭皮生検から抽出されたＲＮＡを使用して評価された。標的ｃＤＮＡ（抽出されたｍＲＮＡからの）は、５４，６１３個のプローブを含有するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２マイクロアレイにハイブリダイズされ、統計解析は、３，７５７個の別個の遺伝子（機会のみを基準にして予想した数をはるかに超える）に対応する７，０００個を超える差次的に調節されたプローブセットを明らかにした。上述される病的皮膚遺伝子発現シグネチャからの上位４００個の著しく調節されたプローブセットを使用して、サンプルにわたる発現の類似性に基づいてこれらの遺伝子をグループ分けするために、階層的クラスタリング解析を使用した。これらのプローブセットの正規化された発現値（ｚ−スコアに基づく）のヒートマップが、図９にグレースケールで提示される。図９のそれぞれの列は、単一のプローブセットを表し、それぞれの縦列は、（単一のマイクロアレイ実験ではなく）すべての被験者のグループ平均値を表す。これらの遺伝子の発現パターンは、フケが関与した（損傷した）頭皮と非フケ頭皮との間の完全な統計的分離に影響するために十分であり、病的遺伝子発現シグネチャが診断的状態であることを示している。
【０１３２】
フケ罹患者の病的皮膚遺伝子発現シグネチャ上でのジンクピリチオン（ＺＰＴ）の効果（研究２）：フケ罹患者のトランスクリプトームプロファイル上でのＺＰＴの効果を、状態の主要な症状（剥離及び掻痒）を回復させるための既知の治療経過の間調べ、実質的に頭皮組織学及び細胞表面バイオマーカープロファイルを健康な状態に回復した。この研究では、我々の研究１からの主要なトランスクリプトームの所見を、第２の研究集団で再現することができた。すべてがｐ＜０．０５の判定基準を満足する、病的遺伝子発現シグネチャの同一の４００個のプローブセットの発現レベルを使用して、階層的クラスター分析が、フケを非フケから再度明確に分離したことは注目に値する（すべてのフケベースライン対非フケベースラインを参照のこと）。図９は、ＺＰＴ含有シャンプーを用いた３週間の治療を受けたフケ被験者が、ビヒクル治療を受けた正常な被験者とベースラインで統計的にクラスターとなる遺伝子発現プロファイルを表示したことを実証する。治療されたフケ被験者の病的皮膚遺伝子発現シグネチャ内の遺伝子の発現パターンのシフトは、状態の主要な症状の逆転及び組織構造の回復をともなった。これは、この皮膚ホメオスタシスへのシグネチャに関連付けられる遺伝子製品の根本的な重要性を強調する。ビヒクル治療は、いずれの研究グループでも、３週間の制御された週３回のビヒクルの適用（合計９回の曝露）後、遺伝子発現プロファイル上に有意な効果を生成しなかった。
【０１３３】
この実施例は、本明細書に記載される病的皮膚遺伝子発現シグネチャが、被験者内の生物学的状態の存在と不在とを区別し、特に罹患者を無症候性被験者（非フケ）から区別することを実証する。疾患の症状を緩和するための治療が、発現プロファイルの実質的な正常化を生じる一方で、ビヒクル治療は、プロファイルの有意なシフトを生じない。したがって、本発明は、これによって潜在的な治療をインビボで病的皮膚シグネチャに関連付けられる遺伝子発現上でのその効果に関して評価できる可能性がある方法を提供する。この点については、このシグネチャ内に常駐する遺伝子の発現パターンの逆転によって、少なくとも部分的に積極的な生物学的効果を定義することができる。
【０１３４】
（実施例５）
この実施例は、皮膚状態のモデルで撹乱因子活性を特徴付けるための方法を例示する。特に、この実施例は、例示的な炎症、細胞増殖、細胞分化、及び脂質代謝アッセイを記載する。
【０１３５】
脂質代謝アッセイ
すべてのアッセイは、ＨＥＫｎ細胞を使用して実施される場合がある。ＨＥＫｎ細胞は、ヒトケラチノサイト成長サプリメント（ＨＫＧＳ）（Ｃａｓｃａｄｅ、カタログ番号Ｓ−００１−５）を補充した、ケラチノサイト培養基（Ｅｐｉ−Ｌｉｆｅ培地（Ｃａｓｃａｄｅ、カタログ番号Ｍ−ＥＰＩ−５００−ＣＡ））内で培養される。細胞を、６０ｍｍディッシュ上に播種し、結果としてプレート当たり７０，０００細胞となる。プレートが９０％〜１００％コンフルエントであるとき、ケラチノサイト培養基を、ＤＭＥＭ：Ｈａｍｓ  Ｆ−１２（２：１）（ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１０６８）、Ｈａｍｓ  Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１７６５）（２：１）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０４３７−０７７）、１０μｇ／ｍＬインスリン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２５８５−０１４）、０．４μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ０１３５）、及び１％  ＣＤ脂質濃縮物（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９０５）で置き換える。
【０１３６】
９０〜１００％の培養密度が観察されるとき、培地を４８時間ごとに変えながら、ＨＥＫｎ細胞を、撹乱因子又はカルシウムに１０日間曝露する。細胞を、毎日顕微鏡下で観察する。１０日目に、プレートをリン酸緩衝生理食塩水で３回濯ぎ、（１Ｘ  ＰＢＳ（Ｍｅｄｉａ  Ｔｅｃｈ、Ｃｅｌｌｇｒｏ  ＃２１−０４０−ＣＶ））、２００μＬの２％  ＳＤＳ／３００ｍＭ尿素を、それぞれのプレートに追加する。プレートをこすり、同一の処理のうちの２つのプレートは貯蔵し、残りのライセートを、−８０℃で保管する。
【０１３７】
脂質を細胞から抽出するために、ライセートを解かし、おおよそ１６０ｍＬのライセートを１ｍＬのナノ純水と混合する。１：２のクロロホルム：メタノールを３ミリリットル添加し、混合する。追加的に１ミリリットルのクロロホルムを添加し、混合物、を１分間攪拌して、相分離を達成する。混合物を、２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。クロロホルム（下）層を、除去し、清浄な試験管に移す。クロロホルム層に、１０：１０：９のクロロホルム：メタノール：水を４ｍＬ添加し、混合物を３０秒間攪拌し、２５００ｒｐｍで１０分間再度遠心分離する。クロロホルム層を除去し、反応バイアルに移し、窒素下で乾くまで蒸発する。すべてのサンプルを、−８０℃で保管する。
【０１３８】
脂質を分離するために、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を採用する。乾燥したサンプルを、２：１のクロロホルム：メタノール１００μＬ中で再構成し、ＴＬＣバイアルに迅速に移す。サンプルを、ＴＬＣプレート上にスポットする。以下の溶剤、すなわち、クロロホルム（Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＆  Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号＃０４８−４）、アセトン（Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＆  Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号＃ＡＸ００１５−１）、メタノール（Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＆  Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号＃ＡＸ２３０−４）、エチルエーテル（Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＆  Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号＃ＡＨ１０６−４）、及び酢酸エチル（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号＃３１９９０２）＋５％酢酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号＃２４２８５３）を使用して、ｗｉｎＣＡＴＳ付きのＡＭＤ  ２システムを、採用してもよい。分離後、プレートを乾燥し、硫酸を噴霧し、ホットプレート上で約４５分間焦がし、冷却し、次いで、スキャンする。サンプルからの遊離脂肪酸、セラミド、及びコレステロールを定量化し、撹乱因子処理した細胞の脂質レベルをカルシウム処理した細胞内の脂質レベルと比較する。
【０１３９】
細胞分化アッセイ
細胞分化は、角化膜形成を検出することによって評価される場合がある。脂質代謝アッセイに関して上述されるように、細胞を培養する。９０〜１００％の培養密度が観察されるとき、培地を４８時間ごとに変えながら、ＨＥＫｎ細胞を撹乱因子又はアントラリンに６日間曝露する。細胞を、毎日顕微鏡下で観察する。６日目に、プレートをリン酸緩衝生理食塩水で３回濯ぎ、（１Ｘ  ＰＢＳ（Ｍｅｄｉａ  Ｔｅｃｈ、Ｃｅｌｌｇｒｏ  ＃２１−０４０−ＣＶ））、２００μＬの２％  ＳＤＳ／３００ｍＭ尿素を、それぞれのプレートに追加する。プレートをこすり、同一の処理のうちの２つのプレートは貯蔵し、残りのライセートを、−８０℃で保管する。
【０１４０】
総タンパク質濃度を決定するために、細胞を氷上で解かし、超音波処理する。ライセートを１０分間沸かし、４０μＬをタンパク質測定のために除去する（「タンパク質サンプル」）。タンパク質サンプルを、２％  ＳＤＳ／３００ｍＭ尿素緩衝液中で１：２に希釈し、−８０℃に戻した。タンパク質サンプルを解凍し、２％  ＳＤＳ／３００ｍＭ尿素緩衝液中で１：２（４０μＬ）に希釈する。総タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ番号２３２２５）を使用して製造業者の使用説明に従って測定する。
【０１４１】
架橋したエンベロープタンパク質を測定するために、ライセートを１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、可溶性タンパク質を除去する。上澄みを除去し、５００μＬの新鮮な２％  ＳＤＳを添加し、混合物を攪拌し、次いで、１３，０００ｒｐｍで更に１５分間遠心分離する。上澄みを除去し、５００μＬの新鮮な２％  ＳＤＳを添加し、混合物を攪拌し、次いで、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。上澄みを除去する。結果として得られるペレットを３００μＬの２％  ＳＤＳ中に再懸濁し、攪拌する。サンプルの１００μＬの部分標本を澄明な９６−ウェルプレート内に移し、吸光度を測定して（３４０ｎＭにおいてＯＤ）、架橋したエンベロープタンパク質を定量化する。ＢＣＡ総タンパク質サンプルを読みとるために、吸光度の測定値を正規化した。撹乱因子処理した細胞の架橋したエンベロープタンパク質のレベルを、アントラリン処理した細胞での架橋したエンベロープタンパク質レベルと比較した。
【０１４２】
炎症アッセイ
ヒトの第３細胞は、ＨＫＧＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ−００１−５）及びＡＢ／ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｒ−０１５−１０）で補充した、完全培地（Ｅｐｐｉｌｉｆｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｍ−ＥＰＩ−５００−ＣＡ））内で培養される。培地は、４８時間ごとに交換される。細胞は、２４ウェルプレート上に播種され（２５，０００細胞／プレート）、付着することができるように、３７℃で一晩インキュベートされる。翌日、完全培地は除去され、ＢＰＥ、ｈＥＧＦ及び抗生物質−Ｅｐｐｉｌｉｆｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｍ−ＥＰＩ−５００−ＣＡ）を含まない、ＨＫＧＳキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ−００１−ｋ）のインスリン、ヒドロコルチゾン、及びトランスフェリンで補充した、修飾された培地で置き換えられる。細胞は、一晩インキュベートすることができる。
【０１４３】
所望する場合、多重の濃度の撹乱因子が、同時に分析される（例えば、０．５μＭ及び１μＭ）。以下の処理パラメーターは、単に例示的であり、培養プレートサイズ、同時に試験される撹乱因子の数、撹乱因子の活性、及び同様のものについて調節するように修飾されてもよい。培地は、真空によって除去され、それぞれのウェルに、１ｍＬの以下のうちの１つが適用される：（ａ）ＤＭＳＯを含みかつサイトカインを有さない修飾された培地、（ｂ）ＤＭＳＯ及びサイトカイン（ヒトＩＬ−２２（２０ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号７８２−ＩＬ）及びヒトＩＬ−１７ａ（２００ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号３１４−ＩＬＢ））を含む修飾された培地、（ｃ）サイトカイン、ＤＭＳＯ、及びクロベタゾールを含む修飾された培地、（ｃ）サイトカイン、ＤＭＳＯ、及び５０μＭ撹乱因子を含む修飾された培地、並びに（ｄ）サイトカイン、ＤＭＳＯ、及び１００μＭ撹乱因子を含む修飾された培地。クロベタゾールは、ＩＬ−８生成を阻害し、したがって、炎症アッセイの状況で有用なベンチマークである、副腎皮質ホルモンである。クロベタゾールは、一般的に湿疹、乾癬、及び接触皮膚炎を治療するために処方される。
【０１４４】
培地のサンプル（１００μＬ）は、炎症カスケードの代用品である、ＩＬ−８レベルを調べるために処理後４８時間目に収集される。ＡＴＰレベルは、ＣｅｌｌＴｉｔｌｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定され、これは存在するＡＴＰの定量化に基づいて培養物中の生存細胞の数を決定する。培地サンプル中のＩＬ−８は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手可能なＬｕｍｉｎｅｘ技術を使用して解析される。ＩＬ−８の量（ｐｇ／ｍＬ）が、ＡＴＰ信号へと正規化される。撹乱因子で処理された細胞中のＩＬ−８生成レベルは、クロベタゾールで処理された細胞中のＩＬ−８生成レベルと比較される。方法は、単層培養中で成長するケラチノサイトに関して記載されているが、アッセイフレームワークは、三次元器官の培養物及びエクスビボのヒトの皮膚の培養物の両方に適用することができる。
【０１４５】
細胞増殖アッセイ
三次元器官の培養物に関して以下の方法論が記載されるが、この方法は、単層培養物又はエクスビボ皮膚外植片にも適用されてもよい。ヒトの三次元器官の培養物は、撹乱因子又はクロベタゾールに約９６時間の間曝露された。培養物は、１０μＭの最終的な濃度において、ＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）の６時間パルスで標識された。８μＭの厚さで薄片に切り分けられた、パラフィンを埋め込まれた組織上で、モノクローナル抗体を使用して、ＢｒｄＵ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）及びＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ（ペルオキシダーゼ）キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）に対して免疫組織化学的な染色が実施された。ＢｒｄＵの数が正の細胞は、決定され、かつ基底層内での全細胞のパーセントで表現される（標識インデックス（「ＬＩ」））。撹乱因子は、明白な細胞毒性を有することなく、ＬＩ上でのそれらの効果に基づいて評価される。撹乱因子で処理された培養物中の細胞増殖は、クロベタゾールで処理された培養物中の細胞増殖と比較される。
【０１４６】
本明細書に記載するアッセイは、数多くの皮膚疾患に共通の生理学的主題の代表であり、本明細書に記載される病的皮膚遺伝子発現シグネチャに関係付けられる。皮膚ホメオスタシス及び皮膚疾患上での撹乱因子の効果は、任意の１つ以上のアッセイを使用して更に特徴付けることができる。
【０１４７】
本明細書に開示した寸法及び値は、記載された正確な数値に厳密に限定されるものと理解されるべきではない。むしろ、特に断らないかぎり、そのような寸法のそれぞれは、記載された値及びその値の周辺の機能的に同等の範囲の両方を意味するものとする。例えば、「４０ｍｍ」として開示される寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することを意図する。
【０１４８】
任意の相互参照又は関連特許若しくは関連出願を包含する本明細書に引用される全ての文献は、明確に除外ないしは別の方法で限定されない限り、その全てを参照により本明細書中に組み込まれる。特に、本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許仮出願第６１／６８３，６６７号の利益を請求する。いずれの文献の引用も、こうした文献が本願で開示又は特許請求される全ての発明に対する先行技術であることを容認するものではなく、また、こうした文献が、単独で、あるいは他の全ての参照文献とのあらゆる組み合わせにおいて、こうした発明のいずれかを教示、示唆又は開示していることを容認するものでもない。更に、本文書において、用語の任意の意味又は定義の範囲が、参考として組み込まれた文書中の同様の用語の任意の意味又は定義と矛盾する場合には、本文書中で用語に割り当てられる意味又は定義に準拠するものとする。
【０１４９】
本発明の特定の実施形態が例示され記載されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の様々な変更及び修正を実施できることが、当業者には自明であろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのようなすべての変更及び修正を添付の特許請求の範囲で扱うものとする。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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