(57)【要約】  本発明は、がん疾患の進行を診断及び／又は監視及び／又は予測する方法であって、少なくとも１個のサンプルについて、Th17細胞、Th1細胞及び／又はTh2細胞のグループを含むT細胞のグループの少なくとも１種の、Treg細胞以外のT細胞に対するTreg細胞の比率を測定することを特徴とする生体外における方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん疾患の進行を診断及び／又は監視及び／又は予測する方法であって、少なくとも１個のサンプルについて、Th17細胞、Th1細胞及び／又はTh2細胞のグループを含むT細胞のグループの少なくとも１種の、Treg細胞以外のT細胞に対するTreg細胞の比率を測定することを特徴とする生体外における方法。
【請求項２】
Treg細胞以外のT細胞に対するTreg細胞の比率を測定するために、Th17細胞、Th1細胞及びTh2細胞は単一グループとしてみなすことを特徴とする、請求項１に記載の生体外における方法。
【請求項３】
診断が患者を特定のリスク群に層別化することに使用される、請求項１又は２に記載の生体外における方法。
【請求項４】
Th17細胞に対するTreg細胞の比率を測定することを特徴とする、請求項１に記載の生体外における方法。
【請求項５】
サンプルが腫瘍又は腫瘍由来細胞培養であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体外における方法。
【請求項６】
サンプルが腫瘍の生検試料であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体外における方法。
【請求項７】
サンプルが卵巣がんサンプルであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体外における方法。
【請求項８】
Treg細胞がフローサイトメトリー分析により測定される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体外における方法。
【請求項９】
Treg細胞のフローサイトメトリー分析が、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD25抗体、抗CD127抗体、抗CCR4抗体、抗FoxP3抗体及び抗Helios抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種の抗体を用いた表面染色により行われることを特徴とする、請求項８に記載の生体外における方法。
【請求項１０】
Treg細胞以外のT細胞と比較したTreg細胞の比率がELISAにより測定されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体外における方法。
【請求項１１】
Treg細胞の割合がリアルタイムPCRにより測定されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体外における方法。
【請求項１２】
被験者について、請求項１に記載のがん疾患の進行を診断及び／又は監視及び／又は予測する生体外における方法であって、該方法が下記のステップを含む方法：
（ａ）前記被験者から得られたサンプルについて、Treg細胞並びにTh17細胞、Th1細胞及び／又はTh2細胞からなる群より選ばれるT細胞のグループの少なくとも１種のポピュレーションの測定；
（ｂ）ステップ（ａ）において測定された前記T細胞のグループの少なくとも１種のポピュレーションに対する前記Treg細胞のポピュレーションの比率の測定；及び、
（ｃ）測定された差異ががんを示す、ステップ（ｂ）において測定された比率と予め測定されたベースライン閾値との比較。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）で測定された比率と、ステップ（ｃ）で示された予め測定されたベースライン閾値との間の関係に基づき、前記被験者を特定のがんステージ又はリスク群に分類するステップ（ｄ）をさらに含む、請求項１２に記載の生体外における方法。
【請求項１４】
前記T細胞のグループの少なくとも１種がTh17細胞を含む、請求項１２に記載の生体外における方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの増殖、特に卵巣がんの増殖における腫瘍浸潤性免疫細胞パターンの変化を明らかにし、上皮性卵巣がん（EOC）の初期段階においてTreg（制御性T細胞）より優勢なエフェクターT細胞の存在により表される抗腫瘍免疫反応から、疾患の進行期における顕著な免疫抑制までの動的シフトを明瞭に示す。
【０００２】
腫瘍内微小環境の中に存在する免疫細胞のタイプは、患者の生存に重要な役割を果たす。しかしながら疾患の進行中における腫瘍浸潤性免疫細胞の動態についてはほとんど知られていない。卵巣がん患者の腫瘍組織に浸潤する免疫細胞は、疾患の異なる段階で研究されてきた。卵巣がんの進行の初期段階は、強いTh17免疫反応が特徴的であったが、ステージIIの患者では多数のTh1細胞の動員が観察された。
【０００３】
播種性腫瘍（ステージIII〜IV）において、Helios＋活性化制御性T細胞（Treg）は多数のマクロファージや骨髄樹状細胞（mDC）と共に検出される。腫瘍浸潤性Tregは循環TregよりCCR4発現が著しく低く、また腫瘍浸潤性Treg数は、卵巣腫瘍細胞の培養上清中のCCL22レベルと有意に相関している。これらのことは、腫瘍浸潤性TregがCCR4／CCL22相互作用を介して動員されることを示唆する。CCL22は主として原発卵巣腫瘍中の腫瘍細胞、マクロファージ及びmDCにより産生され、その産生はIFNγに反応して著しく増加する。これらのことより、おそらく炎症性刺激により引き起こされるTregの特異的動員は、卵巣がんの進行期において著しい免疫抑制を誘導する。
【０００４】
前述の知見は、種々のがん、特に卵巣がんの診断と監視のための生体外における方法に用いられる。本方法は、望ましくは細胞表面上のマーカーを用いて、異なる細胞型の同定に利用される。T細胞介在性免疫は種々の異なるT細胞により構成される。例えば細胞障害性T細胞は、表面抗原CD8（MHCクラスI受容体）により特徴付けられる。ヘルパーT細胞はいくつかのサブグループに分けることができる。本発明に対して最も関係のあるT細胞は表面マーカーCD4+（MHCクラスII）を有し、特にCD4+ Th17細胞で構成される。CD4+ Th17細胞は好中球応答性を亢進し、特に細胞外細菌に対して有効であることが知られている。腫瘍内において、Th17細胞は腫瘍細胞を殺す効果を有すると推測されている。他の興味深い細胞群はTregと呼ばれ、これはCD4+ 制御性T細胞である。この型の細胞はT細胞を抑制する。通常この種の細胞は過剰な免疫反応を回避する効果を有する。しかしながら腫瘍細胞においては、Treg細胞の存在は腫瘍細胞に対する自身の生体免疫防御を下方制御するため、最終的には腫瘍増殖を促進する。
【０００５】
［先行技術］
Cannonらは、卵巣がんに対する樹状細胞ワクチン接種について記述している（非特許文献１）。がん免疫療法におけるTh17の可能な役割が議論されている。
【０００６】
Kryczekらは、制御性T細胞、すなわちFoxp3+CD4+ のサブポピュレーションについて記述している（非特許文献２）。これらの細胞は、潰瘍性大腸炎やがんのような病的微小環境においては炎症性Treg細胞であると推測されている。
【０００７】
Levequeらは、生体外で単離された上皮性卵巣がん関連Tregは、IL-2存在下で刺激するとTh17細胞に転換することを報告している（非特許文献３）。
【０００８】
Curielらは、ヒト卵巣がん腫瘍患者において、Treg細胞は腫瘍特異的T細胞免疫を抑制し、生体内でのヒト腫瘍の増殖に寄与すると記述している（非特許文献４）。
【０００９】
Zamarronらは、Th17細胞、制御性Tリンパ球及び免疫調節性サイトカインが、がんの増殖を促進又は抑制するという二重の役割を果たすことを報告している（非特許文献５）。がんの進行におけるこれらの最終的な役割は、腫瘍の微小環境に大きく依存している。
【００１０】
Tosoliniらは、結腸直腸がん患者において、異なる種類の浸潤性の細胞傷害性T細胞及びヘルパーT細胞（Th1、Th2、Treg、Th17）についての臨床的影響を記述している（非特許文献６）。
【００１１】
Kryczekらは、がん患者におけるTh17細胞の積極的役割について記述している（非特許文献７）。Th17細胞並びに卵巣がん患者における関連する機序及び臨床的意義が研究された。
【００１２】
Chiらは、炎症と自己免疫疾患の発症におけるヘルパーT細胞タイプ17（Th17）及び制御性T細胞（Treg）の重要な役割について記述している（非特許文献８）。腫瘍及び末梢血における当該細胞の分布が開示されている。
【００１３】
先行技術は、Treg細胞の他のT細胞群、特にTh17に対する比率の測定について、また予後や可能性のある治療戦略に対してかかる比率を使用することについて示唆を与えていない。
【背景技術】
【００１４】
卵巣がんは世界的に女性において最も頻度の高い１０の悪性腫瘍のひとつであり、婦人科がんにおいて最も高い死亡率を示すことが知られている。高感度で特異的なバイオマーカーがないため、また本疾患が急速に増殖し広がるという事実により、ほぼ70％の患者が予後不良な腫瘍播種のある進行期であると診断される。従来の治療法により卵巣がんの80％以上で悪性細胞数の顕著な減少に至るが、化学療法抵抗性の少数の腫瘍細胞が残存するため、患者の多くは２〜５年以内に最終的に致死的な本疾患の再発を経験する。卵巣がん患者の予後を改善するため、またがん治療にうまく適応するため、それぞれ高リスクの患者の識別し、再発の可能性を減らす優れた予後マーカーと新しい治療戦略が必要である。
【００１５】
免疫監視機構はがんの増殖と進行において重要な役割を果たすと説明されてきた。免疫不全マウスにおける実験で、免疫系は腫瘍を認識し根絶し得ることが示された。しかしながら、がん細胞は腫瘍特異的免疫反応を抗原刺激するが、腫瘍と宿主免疫系との相互作用は腫瘍の臨床的な退縮をもたらさず、むしろ腫瘍組織内の免疫抑制的微小環境の発達をもたらし、結果的に免疫回避を促進する。さらに、研究用マウスから実験的に得られた結果ががん患者においても妥当であるかどうかは不明である。
【００１６】
定着した腫瘍を根絶することができないにもかかわらず、一定の腫瘍浸潤性の免疫細胞の存在はがん患者における強力な予後マーカーとなる。大量の腫瘍浸潤性CD3+ T細胞は、進行した卵巣がん患者において有利な臨床転帰と関連することが報告されている。最近の研究では、生存の改善がCD8+ 細胞障害性T細胞数の増大と関連することが報告されている。一方、腫瘍組織中の大量のCD4+CD25+FoxP3+制御性T細胞（Treg）、形質細胞様樹状細胞及びB7-H4+マクロファージは不良な予後を示す。CD4+ ヘルパーT細胞の役割は十分に裏付けされていない；しかしながら、Th17細胞はがん免疫において実質的な役者であるという強力な証拠がある。
【００１７】
炎症促進性Th17細胞は主として自己免疫疾患と粘膜免疫に関連している。Th17細胞は卵巣がん、頭頸部がん、胃がん、乳がん、直腸結腸がん、及び前立腺がんを含む異なる型の腫瘍に存在することが示されている。広範囲に研究されたにもかかわらず、腫瘍免疫と患者の生存におけるTh17細胞の正確な役割については依然として議論が分かれている。一方では、IL-17産生細胞は抗腫瘍免疫を促進すると報告されているが、他方では、IL-17は腫瘍増殖を促進する血管新生因子として作用することが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Cannon et al. Expert Opin. Biol. Ther., 2011; 441-445.
【非特許文献２】Kryczek et al. J. Immunol., 2011, 4388-4395.
【非特許文献３】Leveque et al. J. Immunother., 2009, 101-108.
【非特許文献４】Curiel et al. Nature Medicine, 2004, 942-949.
【非特許文献５】Zamarron et al. Int. J. Biol. Sci., 2011, 651-658.
【非特許文献６】Tosolini et al. Cancer Res., 2011, 1263-1271.
【非特許文献７】Kryczek et al. Blood, 2009, 1141-1149.
【非特許文献８】Chi et al. Clinical and Experimental Immunology, 2010, 480-489.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
公表された研究の大部分は、種類の異なる腫瘍浸潤性免疫細胞のパターンと予後的意義に焦点を当てている；しかしながら疾患進行中の腫瘍組織内での免疫反応の動態についてはほとんど知られていない。上皮性卵巣がん（EOC）の異なるステージにおけるCD4+及びCD8+ Tリンパ球、樹状細胞並びにマクロファージの分布、表現型及び臨床病理学的意義を評価した。本発明の結果は、がんの増殖中における腫瘍浸潤性免疫細胞パターンの変化を実証し、EOCの初期段階においてTregより優勢であるエフェクターTh17細胞浸潤から、疾患の進行期における顕著なTregの集積までの動的シフトを明確に示す。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の開示においていくつかの用語が用いられるが、これらは免疫学の領域において通常に使用されるものである。したがって用語の意味については、具体的には下記のテキストブックを参照することができる：
Janeway's Immunobiology、第７版、Kenneth Murphy, Paul Travers, Mark Walport（2008）、
Fundamental Immunology、第６版、William E. Paul（2008）、ヴォルタース・クルーワー（Wolters Kluwer）、又は、
Pezzutto, Ulrichs, Burmester；Taschenatlas der Immunologie, Thieme, 第２版（2007）。
これらは広範なCDマーカーのリスト及びそれらの説明、サイトカイン及びそれらの通常使われる略号を含む。
【００２１】
本発明の過程において、下記の知見が得られた：
Ａ）Th17リンパ球は腫瘍組織中に集積し、その比率は疾患の進行と逆相関する。
Th17リンパ球は分析した卵巣がんサンプルの100％に検出された（範囲＝0.06〜22.8％）。CD4+ T細胞サブセットの中でのTh17細胞の比率は、疾患が汎発した患者（FIGOステージIII〜IV）から得られた腫瘍組織中より、疾患が限局された患者（FIGOステージI）から得られた腫瘍組織中において有意に高かった（図１Ａ、Ｂ参照）。全腫瘍から得られた単一細胞懸濁液中のTh17細胞の出現頻度は同じパターンを示し、Th17細胞の絶対数は進行した疾患では有意に減少することを示した。これらの発見と一致して、初期ステージの患者の腫瘍組織から得られた細胞培養上清中のIL-17及びIL-21の濃度は、未刺激並びにPMA及びイオノマイシン刺激培養の両方で顕著に高かった（図１Ｃ参照）。疾患の後期におけるTh17細胞の比率の有意な減少にもかかわらず、患者の末梢血で比較した場合、腫瘍浸潤性Th17細胞の割合は有意に高かった（図１Ｄ参照）。末梢血だけでのTh17細胞の出現頻度は、腫瘍組織中のTh17細胞数又は比率について予測的ではなかったが、対照目的に使用することができる。
【００２２】
Ｂ）腫瘍浸潤性Tregの比率は腫瘍組織で高まり、疾患の進行とともに増加する。
Th17細胞とは対照的に、CD4+CD25+CD127-FoxP3+ Tregの比率は、疾患ステージIの患者からのサンプルと比較した場合、疾患が汎発した患者（FIGOステージIII〜IV）から得られた腫瘍組織中において有意に高かった（図２Ａ、Ｂ参照）。腫瘍浸潤性Treg（Ti-Treg）の比率は、疾患のすべてのステージの患者の末梢血において見出されるものより有意に高かった（図２Ｃ参照）。Ti-Tregの状態をより良く特徴づけるため、Treg活性化のマーカーである転写因子Heliosも分析した。Helios+ Tregの比率は、EOC患者の末梢血（56.3±4.2％）より腫瘍組織（67.8±2.5％）において有意に高かった（図２Ｄ参照）。Helios+ Tregの比率は疾患の異なるステージにおいて差はなかった。疾患進行中に安定Ti-Tregの比率が増加することは、腫瘍組織から得られた単一細胞懸濁液においてFoxP3 TSDRで脱メチル化された安定Ti-Tregの比率を評価する定量的リアルタイムPCRに基づくメチル化アッセイを用いてさらに確認された（図２Ｅ参照）。Treg及びTh17リンパ球の比率は同一の腫瘍において逆相関し（r = −0.44、p < 0.01）（図２Ｆ参照）、Tregの比率はマクロファージ数と正に相関した（r = 0.47、 p < 0.01）（図２Ｇ参照）。
【００２３】
Ｃ）Th1とCD8+ Tリンパ球並びに樹状細胞（DC）とマクロファージの比率は、疾患進行中に有意な変化を示さない。Th17細胞及びTregに加え、Th1細胞、CD8+ T細胞、pDC、骨髄樹状細胞（mDC）及びマクロファージを含む他の免疫細胞サブセットを腫瘍組織中で分析した。進行腫瘍においてmDCとマクロファージの比率が増加する傾向があったが（図３参照）、これらの細胞型のいずれも、卵巣がんが進行する間に統計的に有意な動態を示さなかった。
【００２４】
Ｄ）腫瘍から得られた単一細胞懸濁液のサイトカイン及びケモカインプロファイルは、Thリンパ球の生体内原位置での初回抗原刺激や分極よりはむしろ腫瘍組織中への分極したThリンパ球の動員を裏付ける。
腫瘍微小環境をより良く特徴づけるため、またサイトカインプロファイルがTリンパ球の生体内原位置での初回抗原刺激や分極を裏付けるのかどうかを調べるため、腫瘍から得られた単一細胞懸濁液のサイトカイン及びケモカインプロファイルを評価した。非刺激培養上清では、３種類のサイトカイン、IL-6、IL-10及びTNFαのみが検出された（図４Ａ参照）。IL-2、IL-4、IL-12及びIL-23レベルは検査を行った患者サンプルの大部分でMILLIPLEX（商標）アッセイの検出限界以下であり、IL-17は疾患ステージIにある患者の細胞懸濁液で検出されたのみであった。重要なことには、腫瘍浸潤性Th17細胞の比率が最高であったステージI の患者からの培養上清では、Th17分極に極めて重要なIL-1βが最低限の濃度（4.2±2.5 pg/mL）でのみ検出された（図４Ｃ参照）。IL-17を除き、非刺激培養において疾患の進行に関するその他の有意な相関は観察されなかった。PMA及びイオノマイシン刺激に関して、IL-12及びIL-23を除き、分析したサイトカインの大部分が産生された（図４Ａ参照）。IL-21産生は、ステージIの患者からの培養上清と比較した場合、疾患の進行期にある患者からの培養上清で著しく減少した（図１Ｃ）。TGFβ mRNA発現はすべての患者サンプルで観察され、疾患ステージとは有意には相関しなかった（図４Ｄ）。
【００２５】
非刺激の腫瘍由来細胞はCCL20、CCL22並びに炎症性CXCL9及びCXCL10を多量に産生したが（図４Ｂ参照）、CCL2、CCL5、CCL17、CCL19及びCCL21の産生は少量であった。CCL22のレベル（図５Ａ参照）、CXCL9及びCXCL10のレベル（結果は示さず）は疾患の進行中に増加した；しかしながらこれらのデータは統計的に有意ではなかった。CXCL9レベルは、腫瘍浸潤性CD4+（r = 0.65、p < 0.01）及びCD8+（r = 0.64、p < 0.01）Tリンパ球数と有意に相関した。特定のThリンパ球サブセットとは相関しなかった（結果は示さず）。最も重要なものとして、CCL22レベルはTi-Treg数と有意に相関した（r = 0.66、p < 0.01）（図５Ｂ）。ケモカインと腫瘍浸潤性免疫細胞との間に他の相関性は観察されなかった。
【００２６】
Ｅ）TregはおそらくCCL22／CCR4相互作用を介して腫瘍組織に動員され、その位置で増殖する。
上記のように、Ti-Treg数は腫瘍細胞培養上清中のCCL22レベルと有意に相関した。これらの観察と一致して、Ti-TregのCCR4発現は末梢血からのTi-Tregより顕著に低かった（平均蛍光強度はそれぞれ3487±333及び6280±35；n = 6）（図５Ｃ参照）。Ti-Tregが生体内原位置で増殖したかどうかを評価するため、腫瘍組織から得られた細胞懸濁液及びPBMCについてKi67染色を行った。Ti-Tregは末梢血中のTregと比較して著しく高い割合でKi67を発現していた（それぞれ21.8±5.1％及び12.9±1.8％；n = 6）。Ki67は、通常のCD4+FoxP3- T細胞ではTregと比較して著しく低い割合で発現していた（腫瘍組織において7.6±2.7％、及び末梢血において2.3±0.4％）（図５Ｄ、Ｅ参照）。
【００２７】
Ｆ）卵巣がん細胞株はIFNγ刺激によりCCL22を含むケモカインを産生する。
卵巣がん細胞株はCCL22を産生することができるかどうかを評価するため、OV-90細胞及びSKOV3細胞を、IFNγが乳がん細胞株においてCCL22を誘導することが示されていることより、組換えヒトIFNγの刺激下又は非刺激下で培養した。
初代腫瘍由来細胞懸濁液とは対照的に、卵巣がん細胞株における自発性のCCL22分泌は検出されなかった。これは、本研究において測定した他のケモカインの大部分と同様な結果であった。SKOV3細胞株は自発性には少量のCXCL9しか産生しなかったが（図６Ａ参照）、非刺激OV-90細胞は大量のCXCL9、CXCL10及びCCL20を産生した（図６Ｂ参照）。IFNγの添加は、試験した両方の細胞株でCCL19、CCL21及びCCL22の強い分泌を誘導した。驚くべきことに、IFNγ刺激により、CXCL9、CXCL10及びCCL20産生はSKOV3細胞で増加したが、OV-90細胞では減少した（図６Ａ、Ｂ参照）。
【００２８】
Ｇ）初代卵巣腫瘍由来細胞はIFNγ刺激によりCCL22産生が顕著に増加した。
初代腫瘍由来単一細胞懸濁液についてIFNγの効果を評価するため、患者の腫瘍組織（n = 6）から単離された細胞をIFNγ存在下で培養した。図６Ｃに示される通り、腫瘍細胞培養懸濁液においてCCL21、CCL22及びCXCL10濃度のみがIFNγ刺激により増加し、最も顕著な増加はCCL22について観察された。CCL22の分泌源として、非刺激培養でも刺激培養でもpCAM+腫瘍細胞、マクロファージ及びmDCが同定された（図６Ｄ）。
【００２９】
本発明は、がん疾患の進行を診断及び／又は監視及び／又は予測する方法であって、少なくとも１個のサンプルについて、Th17細胞、Th1細胞及び／又はTh2細胞のグループを含むT細胞のグループの少なくとも１種の、Treg細胞以外のT細胞に対するTreg細胞の比率を測定する生体外における方法を提供する。
【００３０】
本明細書に記載された生体外における方法の利点は、特定の型のがんをより優れて診断できることである。本方法は、どの種類の治療薬を患者に投与すべきかについて非常に決定的である。がんの型をより良く特徴づけることにより、治療を患者の利益に適合させることができる。
【００３１】
本明細書に開示された生体外における方法は、好ましくは、卵巣がん患者を、差次的に強化された補助化学療法により治療することのできる特定のリスク群に層別化することに使用される。卵巣がんを患う患者の治療に対して、患者がどの型のがんを患っているのかを知ることはかなりの利点である。患者の一群において強力な化学療法を適用することが有利である一方で、同種の治療が他の患者群においては有害効果をもたらす可能性がある。静脈注射のカルボプラチンやパクリタキセルは、卵巣がんに対して一般的に標準レジメンであると考えられている。転移性卵巣がんの主に腹膜表面での併発を考慮して、活性化学療法剤が腹腔内経路によっても送達される。別の方法として白金を用いた化学療法が適用される。さらに、ドキソルビシン及びトポテカンのリポソーム製剤又はゲムシタビンのような化学療法剤が使用される。
【００３２】
用いられる代替的な治療案にはイホスファミド、シスプラチン及びパクリタキセルがあり、イホスファミドとシスプラチンとの組み合わせ又はイホスファミドとパクリタキセルとの組み合わせが好ましい。本明細書に開示された生体外における方法は、生体外における診断方法により決定される特定のリスク群に対する最も効果的な化学療法治療の選択を可能にする。
【００３３】
選択された治療の効果に頼る患者において、がんの進行を監視することも重要である。本明細書に開示された方法により、生体外における診断方法を実行すること、また特定の治療により得られる結果を観察することが可能である。本診断方法の結果を受領した後に、治療方法を継続するか、適合するか又は変更するかを決定することができる。さらに、がん疾患の進行をうまく予測することは望ましいことである。
【００３４】
生体外における本方法において、サンプルは、Th17細胞に対するTreg細胞の比率、又はTh1細胞及び／若しくはTh2細胞に対するTreg細胞の比率を測定する方法で処理される。本発明の特に好ましい実施態様において、Th17細胞に対するTreg細胞の比率が測定される。この測定は当業者に周知の方法により実行される。高い頻度で細胞は、細胞型ポピュレーションに特徴的な特定の表面マーカーに対する抗体により同定される。特定の表面マーカーに対する数種類の抗体を組み合わせて使用することも可能である。しかしながら重要なのは、特定の細胞型に対して特異的な表面マーカーに対する少なくとも１種の抗体が使用されることである。Treg細胞を同定するため、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD25抗体、抗CD127抗体及び抗CCR4抗体並びに特に好ましくは抗FoxP3抗体及び／又は抗Helios抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種の、好ましくは少なくとも２種の、より好ましくは少なくとも３種の抗体を使用することが望ましい。
【００３５】
細胞の特徴付けは通常、細胞ポピュレーションの測定を可能にするフローサイトメトリー分析（蛍光活性化細胞分類、FACS）により行われる。特に好ましい実施態様において、細胞がTreg細胞ポピュレーションに属するか又はTh17細胞ポピュレーションに属するかを決定する。
【００３６】
識別方法において使用されるサンプルは、がん組織又はがん組織の転移部から入手してよい。例えば、このようなサンプルは手術後に患者から取り除かれるが、原発腫瘍又はより大きな転移性腫瘍が取り除かれる際に一般的に行われる。サンプルは生検によっても得られる。
【００３７】
別法として、サンプルは腫瘍組織に由来する細胞培養から得てもよい。腫瘍組織を細かく切り、通常の条件下で増殖する腫瘍細胞を分離することもできる。しかしながら、細胞の分化に影響する可能性のあるサイトカインの増殖培地への添加により引き起こされる誤った結果を避けるための注意が払われる。
【００３８】
対照の目的として、血液から得られた細胞、具体的には末梢血単核細胞についても本明細書に記載された方法を実行することが必要である。
【００３９】
腫瘍組織内の型の異なる腫瘍浸潤性免疫細胞の存在及び予後値が広く研究された；しかしながら、疾患が進行する間の腫瘍組織内の免疫細胞パターンの変化についてはほとんど知られていない。がん組織内の免疫細胞分布の動態を研究するため、初期及び進行期の疾患の両方について患者の適切な選択が不可欠である。しかしながらEOC患者の15％未満しかステージIと診断されないので、前向き研究において初期卵巣がん病巣の微小環境を研究することは非常に困難である。疾患初期の患者から新鮮な腫瘍組織サンプルを入手できる可能性は非常に低いにもかかわらず、ステージIの患者からの6個の腫瘍サンプルを、より進行した疾患（ステージII〜IV）を伴う患者からの38個の腫瘍サンプルとともに分析することができた。
【００４０】
実験の主要部分は卵巣がんを患った患者を用いて実施した。しかしながら、測定したT細胞の比率の変化についての一般原則は、がんの進行に伴って類似的に変化すると推測される。したがって、本明細書において開示された方法は、すべての型のがん、特に前立腺がん、乳がん、結腸がんに適用することができる。しかしながら好ましくは、生体外における本診断方法の使用は、卵巣がんを患った患者に適合する。
【００４１】
CD4+ T細胞の異なるサブセットが、疾患が進行する間に存在し、著しく異なるパターンを示すことが見出された。これは他の免疫細胞の型では見られなかった。実際、EOCの初期ステージは強いTh17免疫反応により特徴付けられるが（図１Ａ参照）、疾患の進行期では、制御性T細胞が主要なポピュレーションとして検出された（図２Ａ参照）。驚くべきことに、CD8+ Tリンパ球及びpDCはいかなる実質的な変化も示さないが、mDC及びマクロファージの比率は疾患が進行する間に増加することが明らかとなった。Th1細胞の比率は、ステージII腫瘍でわずかに増加した後、疾患の進行期で再び減少した。しかしながらmDC及びマクロファージにおける変化も、Th1細胞における変化も、統計的に有意ではなかった。CD4+ エフェクターT細胞、すなわち大量のIFNγ産生細胞により置き換えられたTh17細胞の初期バーストについての同様の動態は、EAE及び感染のマウスモデルにおいて記述されている。
【００４２】
これらの観察と一致して、Lohrら（Microbiol. Infect. 2009, 11, 589-593）は、抗原特異的T細胞をT細胞によって認識される抗原を発現している遺伝子導入マウスに移入し、Th17の次にTh1エフェクター細胞が連続的に発生し、その後に疾患の後期におけるTregが発生するということを見出した。この動態はヒト腫瘍の微小環境においては説明されておらず、マウスモデルにおいて得られた試験結果をヒトに移すことができるかどうかは不明確である。
【００４３】
特に、腫瘍浸潤性Th17細胞の起源及び腫瘍免疫におけるTh17細胞の正確な役割は、議論の的になったままである。Kryczekら（Blood (2009), 114, 1141-1149）は、EOC組織から単離したマクロファージは、試験管内でTh17細胞を誘導することができると報告している。しかしながら、IL-1β、IL-6及びIL-23は、ヒトTh17細胞の分化に必須であると推定されているので、本発明において観察された腫瘍微小環境のサイトカインプロファイル、特にステージIにある患者における極めて低いレベルのIL-1βとIL-23の完全な欠如（図４Ｃ参照）というサイトカインプロファイルは、生体内原位置でTh17が分極するという仮説を支持しない。Th17輸送にはCCR6／CCL20系が介在していることが示されている。驚くべきことに、本研究においては、腫瘍組織中のTh17細胞数とCCL20レベルとの間には相関関係は観察されなかった。
【００４４】
Th17細胞と比較すると、より多くの研究は、腫瘍におけるTregの輸送特性と予後的意義に着目している。Curielら（Nat. Med. (2004) 10, 942-949）は、卵巣がん組織に浸潤しているTregがTAA特異的免疫を試験管内及び生体内で効果的に阻害し、腫瘍増殖に寄与することを示した。これらの著者は、Tregの腫瘍輸送がCCL22を介していることを示唆した。TregのCCL22／CCR4を介する腫瘍組織への動員は、近年乳がん患者において確認された。
【００４５】
本研究において、Ti-Tregは主としてHelios+ 活性化Tregであることを示した。これらTi-Tregのかなりの数は、FoxP3 TSDRにおいて脱メチル化されていた。試験管内でTGFβにより誘導されたものではなく自然発生のFoxp3+ Tregは、TSDRの選択的脱メチル化に関連する安定したFoxp3発現を示すことが明らかとなった。同様に、IkarosファミリーメンバーであるHeliosは、自然発生の胸腺由来Treg（nTreg）とナイーブCD4+ T細胞から末梢性に誘導されたTreg（iTreg）とを区別するのに有用なマーカーであることが報告されているが、これらの知見はつい最近になって疑問視されている。したがって、Helios は、nTregとiTregとを区別するよりもむしろ、起源にかかわらず活性化Tregを示すのに有用であることが明らかである。まとめると、本明細書において開示したように、EOC 組織中のTi-Tregにおいて見出されたHeliosの高発現とTSDRの脱メチル化は、Ti-Tregの安定性と高度に活性化された状態を示す。
【００４６】
Treg腫瘍輸送に関する研究と一致して、卵巣腫瘍細胞培養上清において、Ti-Treg数はCCL22濃度と有意に相関することが明らかになった。常にTi-Tregは、CCR4発現が循環Tregより顕著に低かった。低レベルのCCR4は、CCL22との活発な会合によるCCR4の内部移行を反映する。また、Ti-Tregの大部分（21.8±5.1％）は増殖マーカーであるKi67を発現しており、広範に局所展開することを示している。
【００４７】
Fagetら（Cancer Research (2011), 71, 6143-6152）は、IFNγが乳房腫瘍細胞によるCCL22産生のきっかけであることを明らかにした。実際に、腫瘍細胞と浸潤免疫細胞（特にマクロファージ及びNK細胞）との協調が、大量のCCL22を誘導するのに必須であることが明らかになった。同様に卵巣がん細胞株は、IFNγ刺激により、かなりの高濃度のCCL22を含むケモカインを産生するのが観察された。最も重要なことは、初代の卵巣がん組織由来細胞において、組換えIFNγは選択的にCCL22産生を増強し、分析した他のケモカインに対してはほとんど影響がなかったことである（図６Ｃ）。本研究において、腫瘍細胞、マクロファージ及びmDCは、がん組織サンプル中のCCL22の重要な出所として同定された。
【発明の効果】
【００４８】
要約すれば、卵巣がん患者における抗腫瘍免疫反応の発達は、非常に動的であることが実験データにより示唆された。疾患の初期ステージではTh17細胞の強力な動員が観察され、その後、Th1細胞、マクロファージ及びmDCが動員される。EOCの後期ステージでは、おそらく移住した細胞により産生された高濃度のIFNγが、高い比率のマクロファージ及びmDCとともにCCL22産生及びCCL22／CCR4を介するTregの動員に有利に働き、抑制的な微小環境の発達を促進する。このように、開示された知見は、活動的な抗腫瘍免疫反応から進行したEOCにおける顕著な免疫抑制までの動的シフトを明確に示すので、新たながん免疫療法手順の開発は、免疫促進戦略を含むだけではなく、進行した疾患における免疫抑制性の腫瘍微小環境をも標的とすべきである。
【００４９】
実験結果は図に要約されている。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
疾患ステージに応じた初代卵巣腫瘍組織中及び末梢血中のTh17細胞の比率を、すべてのCD4+ T細胞に関連しているTh17リンパ球のパーセンテージとして示している。
【図１Ａ】データはCD4+ T細胞の中のTh17リンパ球の比率として示され、各ステージにおける平均値を表す。
【図１Ｂ】ドットプロットはCD3+CD4+ 細胞についてゲートしており、２人の代表的な患者におけるIL-17及びIFNγを示す。
【図１Ｃ】カラムは、PMA＋イオノマイシンで刺激した腫瘍組織由来細胞より産生されるIL-17及びIL-21の平均レベル＋標準誤差を表す。
【図１Ｄ】カラムは、腫瘍組織及び末梢血単核細胞（PBMC）におけるTh17細胞の平均比率＋標準誤差を表す。* p < 0.05、** p < 0.01（Ａ、ANOVAの後にScheffe検定；Ｄ、対応のあるt検定）
【００５１】
疾患ステージに応じた初代卵巣腫瘍組織中及び末梢血中のTregの比率をしめす。
【図２Ａ】データはCD4+ T細胞の中のCD4+CD25+CD127-FoxP3+ Tregの比率として表され、各ステージにおける平均値を示す。
【図２Ｂ】ドットプロットはCD3+CD4+ 細胞についてゲートしており、２人の代表的な患者におけるCD25+FoxP3+ Tregを示す。
【図２Ｃ】カラムは、腫瘍組織及びPBMCにおけるTregの比率の平均＋標準誤差を示す。
【図２Ｄ】ドットプロットはCD3+CD4+ CD25+CD127- 細胞についてゲートしており、１人の代表的な患者の腫瘍組織におけるFoxP3+Helios+ Tregを示す。ボックスプロットは、CD4+CD25+CD127-FoxP3+ Tregの中のHelios+ Tregの比率を表す。ボックスの境界は、25パーセンタイル値及び75パーセンタイル値を示し、ボックス中のラインは中央値を表す。髭は90及び10パーセンタイル値を示す。
【図２Ｅ】カラムは、疾患の異なるステージにおける初代卵巣腫瘍組織から単離された細胞の中のFoxP3 TSDRで脱メチル化されたTregの比率を表し、エラーバーは標準誤差を示す。
【図２Ｆ】ラインは、腫瘍浸潤性TregとTh17細胞の百分率の間の負の相関を示す。
【図２Ｇ】ラインは、腫瘍浸潤性Tregの百分率と腫瘍浸潤性マクロファージ数の間の負の相関を示す。* p < 0.05、** p < 0.01（Ａ、ANOVAの後にScheffe検定；Ｃ、Ｄ、対応のあるt検定）
【００５２】
疾患ステージに応じた初代卵巣腫瘍組織中のTh1リンパ球、骨髄樹状細胞（mDC）及びマクロファージの比率をしめす。
【図３Ａ】データは、CD4+ T細胞の中のCD3+CD4+IFNγ+ Th1細胞の平均比率＋標準誤差として示される。
【図３Ｂ】カラムは、単離された腫瘍由来細胞の1 MにおけるCD45+Lineage-HLA-DR+CD14-CD11c+ mDCの平均数＋標準誤差を示す。
【図３Ｃ】カラムは、単離された腫瘍由来細胞の1 MにおけるCD45+Lineage-HLA-DR+CD14+ マクロファージの平均数＋標準誤差を示す。
【００５３】
腫瘍由来単一細胞懸濁液のサイトカイン及びケモカインプロファイルをしめす。
【図４Ａ】白抜きカラムは自発性サイトカイン産生の平均を表す；黒塗りカラムはPMA及びイオノマイシン刺激によるサイトカイン産生を表す。
【図４Ｂ】カラムは、自発性ケモカイン産生の平均を表す。すべてのエラーバーは標準誤差を示す。
【図４Ｃ】プロットは、疾患が進行する間のTh17分極サイトカインやIL-17の自発性産生の平均の動態を示す。
【図４Ｄ】プロットは、疾患が進行する間の、β−アクチンmRNA発現の平均割合として表されるTGFβ mRNA発現の動態を示す。
【００５４】
卵巣腫瘍組織へのTregの動員には、おそらくCCL22が介在する。
【図５Ａ】カラムは、腫瘍由来細胞培養上清中のCCL22（macrophage-derived chemokine）産生＋標準誤差を示す。
【図５Ｂ】この散布図は、CCL22産生とTi-Treg数との正の相関関係を示す。
【図５Ｃ】ヒストグラムは、１人の代表的な患者の腫瘍組織（黒線）及び末梢血（灰色線、薄い色付き）中のCD4+CD25+CD127-FoxP3+ TregにおけるCCR4発現を示す。カラムは、腫瘍組織及び末梢血中のCD4+CD25+CD127-FoxP3+ TregにおけるCCR4の平均蛍光強度＋標準誤差を示す（n = 6）。
【図５Ｄ】カラムは、腫瘍組織及び末梢血中の増殖しているKi67+CD4+CD25+CD127-FoxP3+ TregとCD4+FoxP3- コンベンショナルT細胞（Tconv）との平均比率＋標準誤差を示す（n = 6）。
【図５Ｅ】ドットプロットはCD3+CD4+ 細胞についてゲートしており、代表的なステージIIIの患者におけるKi67+ FoxP3+ TregとFoxP3- Tconvとの比率を示す。* p < 0.05（対応のあるt検定）
【００５５】
IFNγは、卵巣がん細胞株及び卵巣がん患者の両方でケモカイン産生を誘導する。
【図６Ａ】カラムは、IFNγ刺激下（黒カラム）又は無刺激下（白カラム）での卵巣がん細胞株におけるケモカイン産生の平均＋標準誤差を示す。
【図６Ｂ】カラムは、IFNγ刺激下（黒カラム）又は無刺激下（白カラム）での卵巣がん細胞株におけるケモカイン産生の平均＋標準誤差を示す。
【図６Ｃ】データは、非刺激培養と比較したIFNγ刺激初代腫瘍由来細胞培養におけるケモカインレベルの倍変化の平均＋標準誤差を表す。
【図６Ｄ】ヒストグラムは、初代腫瘍由来細胞における自発性のCCL22発現を示す。細胞は、CD45-EpCAM+ 腫瘍細胞；CD45+Lineage-HLA-DR+CD14+ マクロファージ及びCD45+Lineage-HLA-DR+CD14-CD11c+ mDCについてゲートしている。
【００５６】
【図７】卵巣がんの異なるステージにおけるTh17に対するTregの比率の相違。図７では、平均値が、FIGOステージIでは約0.7、FIGOステージIIでは約6.7、またFIGOステージIII／IVでは約47であることが明確に示される。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００５７】
ａ）患者及び組織サンプル
末梢血及び原発性上皮性卵巣がん検体は、2009年3月から2011年10月の間に、プラハのモトール（Motol）大学病院で最初の腫瘍縮小手術を受けた44人の患者から得た。試験に登録された患者で、手術前に腫瘍免疫賦活化学療法を受けた者はいなかった。すべての組織検体は、患者の同意にもとに採取され、試験は、モトール大学病院の施設内倫理委員会の承認を得た。
【００５８】
EOC患者の臨床病理学的特徴
【表１】
2015526709.tif 000002
【００５９】
腫瘍組織を剪刀で細かく刻み、1 mg/mLのコラゲナーゼD（ロシュ社、バーゼル、スイス）を含むPBS中で37℃、30分間消化し、gentleMACS（商標）ディソシエーター（ミルテニーバイオテク、オーバーン、カリフォルニア）を用いて機械的に分離させ、100 μmナイロン製細胞ろ過器（BDバイオサイエンス、フランクリン・レイクス、ニュージャージー）を通した。血液サンプルからの末梢血単核細胞（PBMC）は、Ficoll-Paque密度勾配溶液（GEヘルスケア、ウォキショー、ウィスコンシン）を用いて単離した。
【００６０】
ｂ）細胞株
卵巣がん細胞株OV-90及びSKOV3は、10％熱失活FCS、L-グルタミン及びペニシリン−ストレプトマイシン（すべてインビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア）を補完したRPMI1640を用い、37℃、5％CO2で培養した。
【実施例２】
【００６１】
用いた分析方法
（２．１）フローサイトメトリー分析
腫瘍浸潤性骨髄DC（mDC）、形質細胞様DC（pDC）及びマクロファージを検出するため、単一細胞懸濁液をCD3、CD11c、CD14、CD16、CD19、CD20、CD45、CD56（エクスバイオ、ベステック、チェコ共和国）、CD123（イーバイオサイエンス、サンディエゴ、カリフォルニア）及びHLA-DR（BDバイオサイエンス）に対する特異的抗体で染色した。制御性T細胞（Treg）は、抗CD3抗体（エクスバイオ）、抗CD4抗体（イーバイオサイエンス）、抗CD8抗体（エクスバイオ）、抗CD25抗体、抗CD127抗体及び抗CCR4抗体（バイオレジェンド）を用いた表面染色の後、Foxp3染色緩衝液セット（イーバイオサイエンス）を用いた固定及び透過化並びに抗FoxP3抗体（イーバイオサイエンス）及び抗Helios抗体（バイオレジェンド）を用いた細胞内染色により同定した。細胞内サイトカインを検出するため、細胞懸濁液を、ブレフェルジンA（バイオレジェンド）の存在下、50 ng/mLのPMA及び1 μg/mLのイオノマイシン（シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ）で4時間刺激した。4時間のインキュベーション後、細胞をCD3（エクスバイオ）、CD4（イーバイオサイエンス）及びCD8（エクスバイオ）に対する抗体で染色し、Foxp3染色緩衝液セット（イーバイオサイエンス）で固定及び透過化し、それから抗IL-17抗体（バイオレジェンド）及び抗IFNγ抗体（BDバイオサイエンス）で染色した。CCL22検出のために、細胞をブレフェルジン存在下で4時間培養し、それから上記の通りにDC／マクロファージ同定のために用いられる抗体、EpCAM（バイオレジェンド）及びCCL22（アールアンドデー、ミネアポリス、ミネソタ）により標識した。サンプルは、FlowJoソフトウェア（ツリースター、アシュランド、オレゴン）を用い、BD FACSAria（BDバイオサイエンス）で分析した。
【００６２】
（２．２）ELISA分析
上記と同様な方法で、ELISAフォーマットにおいて適切な抗体を用いて細胞を同定し、識別した。T細胞の表面マーカーに対する抗体を用いることにより、細胞を容易に識別することができる。
【００６３】
（２．３）リアルタイムPCR
他の実施例において、細胞の識別はリアルタイムPCRにより行うことができる。この方法においては、関連のある表面マーカーの発現を示す特徴的な遺伝子に対する特異的なプライマーを用いた。適切なプライマーの組み合わせを用いることにより、簡単なPCR試験において、Th17細胞に比較したTreg細胞の比率がサンプル中でどうなのかを測定することができる。
【００６４】
（２．４）サイトカイン及びケモカインの検出
腫瘍組織由来細胞懸濁液（1×106 細胞／mL）を、10％熱失活FCS、L-グルタミン及びペニシリン−ストレプトマイシン（インビトロジェン）を補完したRPMI1640中で、PMA＋イオノマイシン存在下又は非存在下で培養した。IFNγ介在性のケモカイン誘導のために、卵巣がん細胞株及び初代腫瘍組織由来細胞懸濁液（1×106 細胞／mL）を、10、50及び100 ng/mLのヒト組換えIFNγ（インビトロジェン）存在下で培養した。24時間のインキュベーション後、培養上清を採取し、使用するまで−80℃で保存した。培養上清中に遊離されたIL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17a、IL-21、IFNγ及びTNFα濃度はMILLIPLEX（商標）ヒト・サイトカイン／ケモカインキット（ミリポア、ビレリカ、マサチューセッツ）を用いて測定した。ケモカイン（CCL2、CCL5、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CXCL9及びCXCL10）はQuantibody（登録商標）アレイキット（レイバイオテク、ノークロス、ジョージア）を用いて分析した。
【００６５】
（２．５）ゲノムDNAの抽出と定量的リアルタイムPCRに基づくメチレーションアッセイ
ゲノムDNA（gDNA）を、PureLinkゲノムDNAミニキット（インビトロジェン、カールスバッド、米国）を用いて、2×106 個の腫瘍組織由来細胞を含む融解液より単離した。抽出したgDNAの濃度は、ナノドロップ2000c紫外−可視分光光度計（サーモサイエンティフィック、ウォルサム、米国）で測定した。4〜5 μgのgDNAを、メチルコード亜硫酸水素塩転換キット（インビトロジェン）を用いて、亜硫酸水素ナトリウムで処理した。メチル化及び脱メチル化FoxP3  Treg特異的脱メチル化領域（TSDR）の定量的リアルタイムPCR増幅は、亜硫酸水素塩処理gDNA、0.5UプラチナTaq DNAポリメラーゼ（インビトロジェン）、MgCl2不含PCR緩衝液、3 mM MgCl2、0.2 mM dNTP（それぞれ）、1 μM プライマー及び0,2 μM TaqManプローブを用いて行った。PCR反応は、CFX 96サイクラー（バイオ・ラッド、ハーキュリーズ、米国）を用いて行った。メチル化特異的及び脱メチル化特異的プライマー並びにTaqManプローブは商業的に合成した（TIB MOLBIOL、ベルリン、ドイツ）。メチル化及び脱メチル化FoxP3 TSDR DNAの量は、Rasmussenら（Meuer, Wittwer, Nagawara (2001), Rapid Cycle Real-time PCR, Springer, pp. 21-34）により説明されているSecond Derivative Maximum法を用いて、交差点直線回帰により検量線から推定した。脱メチル化FoxP3 TSDRを有する細胞の比率は、メチル化及び脱メチル化FoxP3 TSDR DNAの総量に対する脱メチル化FoxP3 TSDR DNAの割合として算出した。
【００６６】
（２．６）プラスミド構築
メチル化及び脱メチル化FoxP3 TSDR（86 bp）のDNA断片を、HindIII及びEcoRIの制限酵素認識部位を用いて、pUC18プラスミド（アマシャムバイオサイエンス、アマシャム、英国）にクローン化した。プラスミド構築の同定は、塩基配列決定後、Wizard Plus Midiprepsキット（プロメガ、マディソン、米国）を用いるプラスミドDNA精製、並びに7点の終濃度、すなわち100、10及び1 pg/μL並びに100、10、1及び0.1 fg/μLで、3.34×10-7 〜3.34×10-1の範囲のプラスミドコピーを表す7点の希釈により検証した。段階希釈によりアッセイの特異性が示され、メチル化及び脱メチル化FoxP3 TSDRの定量化の標準として使用した。
【００６７】
（２．７）RNA抽出と定量的リアルタイムPCR
トータルRNAは、RNA Easy Miniキット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用いて、2×106個の腫瘍組織由来細胞から抽出した。RNA濃度はナノドロップ2000c紫外−可視分光光度計（サーモサイエンティフィック）により測定し、RNAの完全性はExperion自動システム（バイオ・ラッド）を用いて評価した。相補的DNAは、M-MLV逆転写酵素（インビトロジェン）を用いてトータルRNAから合成し、プライマー並びにTGFβ及びハウスキーピング遺伝子であり内部標準として用いられるβ-アクチン特異的TaqManプローブ存在下、定量的リアルタイムPCRにより増幅した。すべてのプライマーとプローブは商業的に合成した（TIB MOLBIOL）。各アッセイにおけるqPCR産物の同一性は塩基配列決定により検証した。標的遺伝子の相対発現は、β-アクチンの発現に対して標準化した。
【００６８】
（２．８）統計分析
統計分析はStatistica（登録商標）10.0ソフトウェア（スタットソフト、タルサ、オクラホマ）を用いて行った。データのパラメトリック推定は、コルモゴロフ−スミルノフ検定を用いて標準化に対する検証を行った。等分散の検定はリーベン検定で行った。腫瘍浸潤性免疫細胞間の相関は、ピアソンのr係数を用いて評価した。腫瘍組織サンプルと末梢血サンプルとの間の相違は、対応のあるt−検定により分析した。残りのデータは、ANOVAの後、Scheffe検定により分析した。結果は、p < 0.05の場合に統計的に有意とみなした。
【実施例３】
【００６９】
さらなる試験において、前記の通り、患者の腫瘍（卵巣がん）からのサンプルを使用した。Th17細胞のパーセンタイル値に対するTregのパーセンタイル値の比率は、各患者の原発腫瘍について測定し、図７にプロットした。比率は、疾患のステージにより分類した。各ドットは、１例の患者について測定した比率を表す。平均比率及び平均値の標準誤差は、疾患の各ステージについて測定した。この実験で得られた値は、表２の関連統計値とともに与えられる。
【００７０】
実験３で得られた結果は、図７に要約する。原発卵巣がん組織内のTh17 T細胞に対するTregの比率は、疾患のステージに依存することが示された。Th17 T細胞のパーセンタイル値に対するTregのパーセンタイル値の比率は、各患者の腫瘍組織について測定した。グラフ上の各ドットは、１人の患者についての比率を表す。また、疾患の各ステージにおける平均＋標準誤差を表している（対応がないスチューデントのt−検定、*p < 0.05）。
【００７１】
【表２】
2015526709.tif 000003
【００７２】
値から、疾患FIGOステージによって比率に著しい違いのあることが明らかである。「FIGO」の略語は「Federation Internationale de Gynecologie et d'Obstetique」を表す。この団体はAmerican Joint Committee on Cancer（AJCC）と連携して、上皮性卵巣がんを定義するための指定された病期分類を有している；FIGO系は最も一般的に使用される。ステージIについての平均値は約0.75、ステージIIについての平均値は約6.7、そしてステージIII〜IVについての平均値は46.7である。
【００７３】
これらのデータより、特定の疾患ステージにおけるすべての患者から算出されたTh17細胞に対するTregの平均比率は、疾患の重症度と共に増加した。診断と監視は、各ステージの平均比率を各患者について測定された実際の比率と比較することに基づく。FIGOステージIと診断されたがん患者についての比率が、算出された平均比率の0.75より低い場合、または、FIGOステージIIと診断されたがん患者についての比率が、算出された平均比率の6.6より低い場合、予後が比較的良いと解釈することができる。同様に、FIGOステージIII〜IVの患者は、ステージI又はIIにおいて測定される平均比率に匹敵する比率を有する。各ステージについての平均比率より低い比率を有する患者は、同じ疾患ステージにある高い比率を有する患者より予後は良いと推定することができる。したがって、個々の比率を全体的な平均比率と比較することにより予後診断が可能となり、また、予後診断に基づく薬物療法が最適化される。
【図１Ａ】
2015526709.tif 000004
【図１Ｂ】
2015526709.tif 000005
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2015526709.tif 000009
【図２Ｃ】
2015526709.tif 000010
【図２Ｄ】
2015526709.tif 000011
【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2015526709.tif 000019
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2015526709.tif 000023
【図５Ｃ】
2015526709.tif 000024
【図５Ｄ】
2015526709.tif 000025
【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2015526709.tif 000028
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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