(57)【要約】  方法は、宿主細胞から少なくとも第１の酵素を産生し、第１の酵素は、第１の前処理リグノセルロース系バイオマスを加水分解し得る。本方法は、宿主細胞を培養して少なくとも第１の酵素を培養時間にわたり産生する工程を含み、宿主細胞の培養を、宿主細胞と、水と、固体組成物の複合糖および固体組成物のリグニンを含む固体組成物とを含む糖飢餓培養環境中で行う。このような方法において、固体組成物を、第２の前処理リグノセルロース系バイオマスの複合糖および第２の前処理リグノセルロース系バイオマスのリグニンを含む第２の前処理リグノセルロース系バイオマスから得；固体組成物の複合糖の総量と、固体組成物のリグニンの総量との比は、０を超え、第２の前処理リグノセルロース系バイオマスの複合糖の総量と、第２の前処理リグノセルロース系バイオマスのリグニンの総量との比未満である。
2015519916.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞から少なくとも第１の酵素を産生する方法であって、前記第１の酵素は、第１の前処理リグノセルロース系バイオマスを加水分解し得、前記宿主細胞を培養して少なくとも前記第１の酵素を培養時間にわたり産生する工程を含み、
前記宿主細胞の前記培養を、宿主細胞、水および固体組成物を含む糖飢餓培養環境中で行い、前記固体組成物は、前記固体組成物の複合糖および前記固体組成物のリグニンを含み、
ａ）前記固体組成物を、第２の前処理リグノセルロース系バイオマスの複合糖および前記第２の前処理リグノセルロース系バイオマスのリグニンを含む前記第２の前処理リグノセルロース系バイオマスから得；
ｂ）前記固体組成物中の前記複合糖の総量と前記リグニンの総量との比は、前記第２の前処理リグノセルロース系バイオマス中の前記複合糖の総量と前記リグニンの総量との比未満である方法。
【請求項２】
前記培養を、前記培養時間の少なくとも５０％である培養時間の一部にわたり、乾燥重量基準で前記糖飢餓培養環境の０〜１０重量％の範囲の１つまたは複数の添加単糖の量を有する単糖飢餓条件下で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固体組成物を、前記第２の前処理リグノセルロース系バイオマスから、
ａ）前記第２の前処理リグノセルロース系バイオマスの少なくとも一画分を、加水分解触媒の存在下で加水分解して前記固体組成物と、水および可溶性糖の溶液とを含む加水分解組成物を産生する工程ならびに；
ｂ）前記加水分解組成物から水および可溶性糖の前記溶液の少なくとも５０％を取り出す工程
を含む方法により得る、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
水および可溶性糖の前記溶液の前記取出を、デカンテーション、沈降、遠心分離、ろ過、加圧ろ過および洗浄からなる群を含む少なくとも１つの方法により行う、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記固体組成物を、前記第２の前処理リグノセルロース系バイオマスから、
ａ）前記第２の前処理リグノセルロース系バイオマスの少なくとも一画分を、加水分解触媒の存在下で加水分解して複合糖およびリグニンと、水および可溶性糖の溶液とを含む加水分解組成物を産生する工程；
ｂ）前記加水分解組成物中の前記可溶性糖の少なくとも一画分を変換して少なくとも１つの糖由来産物および前記固体組成物を含む変換組成物を産生する工程；
ｃ）前記少なくとも１つの糖由来産物の一画分を取り出す工程
を含む方法により得る、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの糖由来産物の前記一画分の前記取出を、デカンテーション、沈降、遠心分離、ろ過、加圧ろ過、洗浄、蒸発および蒸留からなる群から選択される少なくとも１つの方法により行う、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記加水分解触媒が、第２の酵素または酵素混合物を含む。請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記加水分解触媒が、水素イオン、有機酸および無機酸からなる群から選択される、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記加水分解組成物の前記変換が、発酵を含む、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの糖由来産物が、エタノールを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
単糖飢餓条件下の前記培養時間の前記一部が、前記培養時間の少なくとも７５％、前記培養時間の少なくとも８５％、前記培養時間の少なくとも９０％、前記培養時間の少なくとも９５％および前記培養時間の少なくとも９８％からなる群から選択される、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
糖飢餓条件下の前記培養時間の前記一部が、前記培養時間と同一である、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
１つまたは複数の添加単糖の前記量が、乾燥重量基準で前記糖飢餓培養環境の０〜５重量％、０〜２．５重量％、０〜２．０重量％、０〜１．０重量％の範囲である、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
添加単糖が前記糖飢餓培養環境中に存在しない、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記糖飢餓培養環境を少なくとも、前記第１の酵素の量の少なくとも一画分を含む収集組成物と、前記固体組成物の固体残留物の量の少なくとも一画分を含む排出組成物とに分離することにより、少なくとも前記第１の酵素を収集する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記排出組成物中の複合糖の総量が、乾燥重量基準で０〜３０重量％、０〜２０重量％、０〜１５重量％、０〜１０重量％、０〜７．５重量％、０〜５重量％、０〜２．５重量％からなる群から選択される範囲で存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の酵素をさらに使用して前記第１のリグノセルロース系バイオマスを加水分解し、前記第１のリグノセルロース系バイオマスおよび前記第２の前処理リグノセルロース系バイオマスは両方とも、同一の禾本属および同一の禾本種からなる群に由来するリグノセルロース系バイオマスを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法により得られる酵素または酵素混合物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の酵素混合物により加水分解された加水分解リグノセルロース系バイオマス。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
酵素は、生化学反応を触媒するタンパク質である。酵素は、ほぼ全ての生存宿主細胞により産生される。真菌綱の微生物により産生される一部の酵素は、リグノセルロース系原料の化学物質への変換プロセスにおいて有用である。これらの変換プロセスにおいて、酵素は、複合糖、例えばセルロースおよびヘミセルロースの、より低分子量の糖への加水分解反応における触媒として使用される。
【０００２】
リグノセルロース系原料からのセルロースおよびヘミセルロースの加水分解に、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼならびにキシランおよびマンナンの側鎖に対して作用する種々の酵素からなる十分に均衡のとれた酵素の混合物が要求されることは公知である。酵素産生は、バイオマス−エタノールプロセスにおける重要な工程であり、それというのも、酵素または酵素混合物産生および適用は、現在、リグノセルロース系バイオマス利用への生物学的ベース経路のためのよりコストを要する加工工程のものであるからである。
【０００３】
植物分解真菌トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の酵素系は、最も広範に調査されており、市販の酵素混合物を得るために最も広く使用される生物であると考えられる。Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）は、細胞外β−グルコシダーゼ分泌が低い場合であっても、多数のセルロースおよびヘミセルロース分解酵素を産生する。高セルロース変換を得るためにβ−グルコシダーゼ活性含有量が重要であることが周知なので、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）酵素溶液に、一般にβ−グルコシダーゼを補給して十分に均衡のとれた酵素溶液を得て、セルロースの加水分解をさらに進行させる。他の場合において、他の良好なβ−グルコシダーゼ産生真菌により産生される酵素を使用して市販の酵素または酵素混合物溶液を得ることもできる。
【０００４】
リグノセルロース系原料の変換プロセスのための酵素は、純セルロースおよび／またはさらにより高価な炭素源を含む複合培地上で宿主細胞を培養することにより産生させる。
【０００５】
酵素産生の最終コストを低減させるため、純セルロースよりも安価な基質を使用する多くの試みがなされてきた。前処理リグノセルロース系原料が、基質として使用されてきた。多くの研究グループは、最終酵素混合物コストを低減させるために何らかの様式でバイオエタノール産生に使用されるものと同一の原料を使用して酵素または酵素混合物を産生することを試みた。
【０００６】
しかしながら、培養に使用される基質と、特定の基質に対する得られる酵素の加水分解性能との間の明確な関係は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｒｕｔ  Ｃ３０またはペニシリウム・ブラシリアヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉａｎｕｍ）に関する従来の研究において報告されていない。様々な炭素源上での酵素の培養において得られる結果の概要は、（非特許文献１）および（非特許文献２）に見出すことができる。１つのこのような方法は、（特許文献１）に記載されている。この方法は、記載の前処理リグノセルロース系基質を酵素増殖の誘導物質として添加する一方、生物増殖のためのフィードとしてのグルコースの一定の添加を使用する。記述されるこの技術の目的は、宿主細胞中での酵素または酵素混合物産生に今日使用されているグルコースフィードおよび純セルロースを、主炭素源としておよび酵素産生のための誘導物質として使用することができる材料により置き換えることである。この利点は、容易に入手可能であり、したがって純セルロースよりも安価な誘導物質（リグノセルロース系バイオマス）の使用に起因して産生コストが低減されることである。誘導物質として、（特許文献１）は、少量のバイオマスを使用し、グルコースを継続的に添加して生物にフィードする。
【０００７】
（特許文献２）は、セルロースまたはリグノセルロース系バイオマスの酵素的加水分解物のエタノール発酵からの残留物を使用する、セルロース分解および／またはヘミセルロース分解酵素を産生する方法を開示している。この方法は、セルロースまたはリグノセルロース系バイオマスからエタノールを産生する方法に統合することができ、残留物が前処理基質の酵素的加水分解において使用される酵素の産生に役立つ。加水分解からのエタノール産生のために得られた糖溶液を本質的にリグニンにより構成される非加水分解固体画分から分離し、それをエタノール発酵に使用する。グルコースは、この工程において取り出される主要な糖である。エタノール発酵からの残留物は、エタノールの分離後、誘導炭素源としてまたは酵素の産生のための主炭素源として使用する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００７００５９１８号パンフレット
【特許文献２】米国特許第７，４９４，７９２号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊｕｈａｓｚ，Ｔ．，Ｓｚｅｎｇｙｅｌ，Ｚ．，Ｒｅｃｚｅｙ，Ｋ．，Ｓｉｉｋａ−Ａｈｏ，Ｍ．，Ｖｉｉｋａｒｉ，Ｌ．“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｏｒ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｈｅｍｉｅｎｚｙｍｅ  ｏｒ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ｏｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｃａｒｂｏｎ  ｓｏｕｒｃｅｓ”，（Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，４０，３５１９−３５２５）
【非特許文献２】Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｈ．，Ｏｌｓｓｏｎ，Ｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｏｒ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｂｙ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉａｎｕｍ  ＩＢＴ  ２０８８８：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｏｎ  ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ”（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌ，３８，３８１−３９０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
一般論として、前処理リグノセルロース系原料の全てまたはほとんどの関連画分の、有価産物への変換への関心が存在する。酵素産生のための基質としての前処理リグノセルロース系原料の一画分の使用は、リグノセルロース系原料の有用産物への変換プロセスについてのプラントの収率を低減させ得る。
【００１１】
したがって、酵素産生のためにリグノセルロース系前処理原料をより良好に使用する方法の開発が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本明細書において、第１の前処理リグノセルロース系バイオマスの加水分解のために宿主細胞から少なくとも１つの酵素を産生する方法であって、少なくとも１つの酵素を産生し得る宿主細胞を、宿主細胞、水および固体組成物を含む糖飢餓培養環境中で培養する工程を含み、前記固体組成物は、固体組成物の複合糖および固体組成物のリグニンをさらに含む方法が開示される。固体組成物は、第２の前処理リグノセルロース系バイオマスの複合糖および第２の前処理リグノセルロース系バイオマスのリグニンを含む第２の前処理リグノセルロース系バイオマスから得、固体組成物中の複合糖の総量とリグニンの総量との比は、第２の前処理リグノセルロース系バイオマス中の複合糖の総量とリグニンの総量との比未満である。培養後、固体組成物を固体残留物に変換する。
【００１３】
培養は、培養時間の少なくとも５０％である培養時間の一部にわたり、乾燥重量基準で糖飢餓培養環境の０〜１０重量％の範囲の１つまたは複数の添加単糖の量を有する単糖飢餓条件下で行うことができることも開示される。
【００１４】
固体組成物は、第２の前処理リグノセルロース系バイオマスから、第２の前処理リグノセルロース系バイオマスの少なくとも一画分を、加水分解触媒の存在下で加水分解して固体組成物と水および水溶性糖の溶液とを含む加水分解組成物を産生する工程；ならびに加水分解組成物から水および水溶性糖の溶液の少なくとも５０％を取り出す工程を含む方法により得ることができることがさらに開示される。
【００１５】
加水分解組成物の一画分の取出は、デカンテーション、沈降、遠心分離、ろ過、加圧ろ過および洗浄の群に含まれる少なくとも１つの方法により行うことができることも開示される。
【００１６】
固体組成物は、第２の前処理リグノセルロース系バイオマスから、第２の前処理リグノセルロース系バイオマスの少なくとも一画分を、加水分解触媒の存在下で加水分解して水溶性糖複合糖およびリグニンを含む加水分解組成物を産生する工程；加水分解組成物中の水溶性糖の少なくとも一画分を変換して少なくとも１つの糖由来産物および固体組成物を含む変換組成物を産生する工程；ならびに変換組成物の一画分を取り出す工程を含み、前記画分は、少なくとも１つの糖由来産物の少なくとも一画分を含む方法により得ることができることがさらに開示される。
【００１７】
変換組成物の一画分の取出は、デカンテーション、沈降、遠心分離、ろ過、加圧ろ過、洗浄、蒸発および蒸留の群に含まれる少なくとも１つの方法により行うことができることも開示される。
【００１８】
加水分解触媒は、第２の酵素または酵素混合物を含み得ることおよびそれは水素イオン、有機酸および無機酸からなる群から選択することができることがさらに開示される。
【００１９】
加水分解組成物の変換は、発酵を含み得ることも開示される。
【００２０】
少なくとも１つの糖由来産物は、エタノールを含み得ることがさらに開示される。
【００２１】
単糖飢餓条件下の培養時間の一部は、培養時間の少なくとも７５％、培養時間の少なくとも８５％、培養時間の少なくとも９０％、培養時間の少なくとも９５％および培養時間の少なくとも９８％からなる群から選択することができることがさらに開示される。
【００２２】
単糖飢餓条件下の培養時間の一部は、培養時間と同一であり得ることも開示される。
【００２３】
１つまたは複数の添加単糖の量は、乾燥重量基準で培養環境の０〜５重量％、０〜２．５重量％、０〜２．０重量％、０〜１．０重量％の範囲であることがさらに開示される。添加単糖が糖飢餓培養環境中に存在し得ないことも開示される。
【００２４】
糖飢餓培養環境を少なくとも、第１の酵素の少なくとも一画分を含む収集組成物(harvested composition)と、固体組成物の固体残留物の少なくとも一画分を含む排出組成物(exhaustedcomposition)とに分離することにより、少なくとも第１の酵素を収集することがさらに開示される。
【００２５】
酵素または酵素混合物をさらに使用して第１のリグノセルロース系バイオマスを加水分解することができ、第１のリグノセルロース系バイオマスおよび第２の前処理リグノセルロース系バイオマスは両方とも、同一の禾本属またはより好ましくは同一の禾本種からなる群に由来するリグノセルロース系バイオマスを含むことも開示される。
【００２６】
本開示の方法により産生される酵素または酵素混合物と、酵素混合物により加水分解された加水分解リグノセルロース系バイオマスも開示される。
【００２７】
排出組成物中の複合糖の総量は、乾燥重量基準で０〜３０重量％、０〜２０重量％、０〜１５重量％、０〜１０重量％、０〜７．５重量％、０〜５重量％、０〜２．５重量％からなる群から選択される範囲で存在し得ることがさらに開示される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１ａ】比較例および実施例によるグルコース加水分解収率のグラフである。
【図１ｂ】比較例および実施例によるキシロース加水分解収率のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
酵素を産生する宿主細胞を糖飢餓培養環境中で培養する事実により特徴づけられる、酵素を産生する方法が発見された。糖飢餓培養環境は、宿主細胞、水および前処理リグノセルロース系バイオマスから得られた固体組成物を含み；固体組成物は、複合糖およびリグニンを含み、それは複合糖およびリグニンが由来する前処理リグノセルロース系バイオマス中の複合糖の総量とリグニンの総量との比未満の複合糖の総量とリグニンの総量との比により特徴づけられる。換言すると、糖飢餓培養環境中の固体組成物は、前処理リグノセルロース系バイオマスから、前処理リグノセルロース系バイオマス中に含有される複合糖の全てではなく一画分を取り出すことにより得る。糖飢餓培養環境中の固体組成物は、前処理リグノセルロース系バイオマスに対して乾燥重量基準でより少量の複合糖を有するが、複合糖を依然として含む。
【００３０】
前処理リグノセルロース系バイオマスから取り出された糖は、有用化学物質、例えばエタノールに変換することができる。
【００３１】
次いで、宿主細胞により産生される酵素を、リグノセルロース系バイオマスおよび前処理リグノセルロース系バイオマスの加水分解において使用することができる。セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンは、リグノセルロース系バイオマスを構成する３つの主要なポリマーである。セルロースおよびヘミセルロースは、ポリマー糖である。
【００３２】
本開示に関して、単糖はモノマー糖であり、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトースおよびフルクトースからなる群から選択することができる。上記リストに存在しない他の単糖が存在し得ることに留意すべきである。単糖は、水溶性糖の群に属する。可溶性糖は、規定の溶媒、例えば水の存在下で溶媒中の均質溶液を形成する糖である。
【００３３】
単糖は、宿主細胞に直接フィード(feed)することができ、すなわち、宿主細胞は酵素を使用して単糖を代謝する必要がない。
【００３４】
オリゴマー糖は、水溶性のポリマー糖である。オリゴマー糖は、２つ以上のモノマー糖により構成される。オリゴマー糖は、宿主細胞により、通常、宿主細胞により産生される１つ以上の酵素の存在下でのみ代謝させることができる。
【００３５】
複合糖は、水溶性でないポリマー糖、例えば不水溶性グルカンおよびキシランである。グルカンは、様々な重合度を有するグルコースのポリマー分子を含む複合糖のクラス(class)である。キシランは、様々な重合度を有するキシロースのポリマー分子を含む複合糖のクラスである。
【００３６】
リグノセルロース系バイオマスの化学産物への多くの変換プロセスは、複合糖の一画分のみを変換し、主としてリグニンおよび副生物として未変換複合糖の残留画分を含有する組成物を産生する。一部の場合において、前処理リグノセルロース系バイオマス中の複合糖をさらに変換することが可能である場合であっても、変換プロセスを停止させる。それというのも、それは経済的に簡便でないためである。複合糖の残留画分を依然として含有する組成物は、熱生成のために燃焼させることが多く、このことはリグノセルロース系バイオマス中に含有される糖の低価値用途である。
【００３７】
驚くべきことに、本発明者らは、宿主細胞を、前処理リグノセルロース系バイオマスから複合糖の少なくとも一画分を取り出すことにより得られた固体組成物を含む糖飢餓培養環境中で培養することができることおよび宿主細胞が複合糖の残留画分を炭素源として使用し得ることを見出した。本発明者らは、宿主細胞からの酵素の産生がより高価な基質を炭素源として使用することにより得られる酵素の産生と同様またはそれより増加され得ることも見出した。
【００３８】
宿主細胞に慣習的にフィードするために使用される単糖、例えばグルコースおよびキシロースを、より安価な固体組成物により部分的または全体的に置き換えることができる。
【００３９】
好ましくは、糖飢餓培養環境は、単糖を含有せず、またはほとんど含有しない。
【００４０】
当技術分野において公知のおよび今後発明され得る任意の方法または方法の組合せを、第２の前処理リグノセルロース系バイオマスから固体組成物を得るために使用することができる。本方法は、化学的、物理的、生物学的プロセスまたはプロセスの組合せの使用を含み得る。
【００４１】
好ましくは、複合糖を前処理リグノセルロース系バイオマスから取り出し、有価化学産物である糖由来産物に変換する。変換プロセスは、単一工程でまたは複数工程で実現することができ、すなわち、糖由来産物は、取り出された複合糖を中間産物に変換することにより得ることができる。
【００４２】
好ましい実施形態において、固体組成物は、前処理リグノセルロース系バイオマス中の複合糖の少なくとも一画分を加水分解することにより得ることができる。
【００４３】
加水分解は、複合糖を水溶性糖に、およびオリゴマー糖をより低分子量の糖に変換するプロセスである。
【００４４】
前処理バイオマスの加水分解は、加水分解触媒およびさらには加水分解を効率的に行うために有用または必要であり得る他の添加剤の存在下で実施する。本発明に関して、加水分解触媒および添加剤は、「加水分解触媒組成物」と称することができる。
【００４５】
好ましい実施形態において、加水分解触媒組成物は酵素または酵素混合物を含み、加水分解は酵素的加水分解である。
【００４６】
別の好ましい実施形態において、酵素的加水分解は、国際公開第２０１０１１３１３０号パンフレットに開示のプロセスに従って実施され、この教示が全体として本明細書に組み込まれる。
【００４７】
別の実施形態において、加水分解触媒は酸を含み得、加水分解は酸加水分解である。第２の前処理リグノセルロース系バイオマスの加水分解を実施し得る全ての有機および無機酸を使用することができる。酸は、希釈溶液中に存在してもよい。水素イオンを加水分解プロセスにおいて使用することもできる。
【００４８】
前処理リグノセルロース系バイオマスの加水分解は、液体環境中で行うことができる。液体環境は、いくらかの液体、好ましくは水または水を含む液体を、前処理リグノセルロース系バイオマスに添加することにより得ることができる。液体は、リグノセルロース系バイオマスの前処理において添加することもできる。例えば、好ましい実施形態において、リグノセルロース系バイオマスは、水を含む液体中でリグノセルロース系バイオマスを浸漬することにより前処理し、次いで浸漬リグノセルロース系バイオマスを水蒸気爆砕させる。液体は、加水分解工程においてまたは加水分解触媒組成物に添加することもできる。酵素的加水分解の場合において、液体は、酵素混合物中に存在し得る。酸加水分解の場合において、液体は、希釈酸溶液中に存在し得る。
【００４９】
前処理リグノセルロース系バイオマスの加水分解は、好ましくは水を含む液体環境中で行うため、リグノセルロース系バイオマスから得られた加水分解組成物は、水および水溶性糖の溶液と、水溶性糖に加水分解されなかった複合糖を含む固体組成物とを含む。加水分解組成物の固体組成物は、前処理リグノセルロース系バイオマス中に含有されるリグニンも含む。リグニンは、前処理および加水分解プロセスの効果として改変および／または部分的に他の成分に変換されていてもよい。
【００５０】
加水分解組成物が他の成分を含み得る場合であっても、本発明の範囲について、加水分解組成物は少なくとも、水および水溶性糖の溶液と、固体組成物の複合糖およびリグニンをさらに含む固体組成物とを含む。
【００５１】
固体組成物は、加水分解組成物から水および水溶性糖の溶液の少なくとも５０％を取り出すことにより得ることができる。可能な限り最大量の水および水溶性糖の溶液を取り出すことが好ましい実施形態である一方、一部の水溶性糖は固体組成物中に依然として存在し得ることが留意される。別の実施形態において、固体組成物は水溶性糖を含まない。
【００５２】
水および水溶性糖を含む加水分解組成物から取り出された画分は、加水分解組成物の他の成分、例えば加水分解触媒および添加剤の少なくとも一画分または前処理もしくは加水分解の間に形成された化合物をさらに含み得る。取り出された画分は、リグニンおよび複合糖を含む固体組成物の一画分をさらに含み得る。好ましい実施形態において、糖飢餓環境は加水分解組成物中の実質的に全ての固体組成物を含み、実質的に全ての水および水溶性糖の溶液を取り出す。
【００５３】
別の実施形態において、糖飢餓環境は加水分解組成物中の全ての固体組成物を含み、全ての水および単糖の溶液を取り出す。
【００５４】
当技術分野において公知のおよびさらに今後発明され得る任意の方法および方法の組合せを、加水分解組成物から水および水溶性糖の溶液の少なくとも５０％を取り出すために使用することができる。これらの方法は、加水分解組成物の化学的および物理的処理を含む。化学および物理的処理は、連続的または同時に実施することができる。
【００５５】
加水分解組成物の少なくとも一画分を取り出すために好ましい方法は、デカンテーション、沈降、遠心分離、ろ過、例として膜ろ過および加圧ろ過ならびに洗浄を含む。
【００５６】
前処理リグノセルロース系バイオマスの少なくとも一画分の加水分解と、水および水溶性糖の溶液の少なくとも５０％の取出とは、連続的にまたは少なくとも部分的に同時に行うことができる。一実施形態において、単糖の少なくとも一画分は、加水分解を進行させながら例えば膜ろ過により取り出すことができる。
【００５７】
固体組成物は、酵素の産生のための宿主細胞の糖飢餓培養環境中に挿入する前にさらに加工することができる。固体組成物は、水溶性糖または酵素の産生に影響を及ぼすかもしくは酵素の産生を低減させ得る他の成分をさらに取り出すために好ましくは水により洗浄することもできる。宿主細胞の培養に必要とされる他の成分を固体組成物または糖飢餓培養環境に添加することができる。
【００５８】
加水分解組成物から取り出された水および水溶性糖の溶液の一画分は、有用な化学産物に変換することができる。
【００５９】
別の好ましい実施形態において、固体組成物は、前処理リグノセルロース系バイオマス中の複合糖の少なくとも一画分を加水分解触媒の存在下で加水分解して複合糖およびリグニンと水および水溶性糖の溶液とを含む加水分解組成物を産生し；次いで、加水分解組成物中の水溶性糖の少なくとも一画分を、少なくとも１つの糖由来産物と、複合糖およびリグニンを含む固体組成物とを含む変換組成物に変換し；変換組成物から糖由来産物の少なくとも一画分を取り出すことにより得ることができる。
【００６０】
本明細書に上記の加水分解に対する全ての考慮事項は、この実施形態にも当てはまる。加水分解組成物は、本発明の範囲内でさらに加工に供することができる。例えば、本プロセスは、水溶性糖の産物への変換を改善し得、物理的および化学的処理、例えば分離、精製、ｐＨ補正、希釈および濃縮を含み得る。加水分解組成物中の水溶性糖は、少なくとも１つの糖由来産物を含む変換組成物に部分的または全体的に変換する。加水分解組成物の任意の他の成分の変換または改変も、単糖の変換の間に生じ得る。特に、加水分解組成物中の複合糖およびリグニンは、複合糖およびリグニンを含む固体組成物を生成する変換プロセスにより影響され得；言い換えると、固体組成物は、加水分解組成物中の複合糖およびリグニンまたは加水分解組成物中の複合糖およびリグニンの改変物であり得る。変換組成物は、２つ以上の水溶性糖に由来する産物をさらに含み得る。
【００６１】
水溶性糖の変換は、触媒の存在下で行うことができる。触媒は、さらには変換を効率的に行うために有用または必要であり得る他の添加剤を含み得る。本発明に関して、触媒および添加剤は、「触媒組成物」と称することができる。
【００６２】
触媒は、水溶性糖の少なくとも１つの糖由来産物への変換を促進する任意の薬剤であり得る。触媒は、無機、有機または生物学的薬剤であり得る。
【００６３】
加水分解組成物の少なくとも一画分を変換するために任意のプロセスを使用することができる場合であっても、発酵は好ましいプロセスであり、糖由来産物は発酵産物である。発酵は、微生物または微生物混合物の存在下で単糖を発酵産物に変換する任意のプロセスである。
【００６４】
加水分解組成物の少なくとも一画分の変換に好ましい微生物は、酵母である。
【００６５】
酵母は、一般に、典型的には、娘細胞が付着したままであることが多い出芽により無性生殖し、炭水化物をアルコールおよび二酸化炭素に発酵し得る、菌糸体をほとんど有さないかまたは全く有さない単細胞の主として子嚢菌類の真菌を示す。好ましくは、酵母はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種は、Ｋｕｒｔｚｍａｎ（２００３）ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：４１７−４３２により系統発生的に定義されるとおりであり、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．パラドクス（Ｓ．ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、Ｓ．イカタエ（Ｓ．ｉｋａｔａｅ）、Ｓ．カリオカヌス（Ｓ．ｃａｒｉｏｃａｎｕｓ）、Ｓ．クドリアブゼビイ（Ｓ．ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、Ｓ．パストリアヌス（Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）およびＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）が含まれる。
【００６６】
触媒または微生物に応じて、様々な糖由来産物を産生することができる。任意の他の糖由来産物を生成することができる場合であっても、好ましい実施形態において、糖由来産物はエタノールである。
【００６７】
複合糖の加水分解組成物への加水分解および加水分解組成物中の水溶性糖の少なくとも一画分の、少なくとも１つの糖由来産物への変換は、連続的または同時に行うことができる。好ましい実施形態において、酵素的加水分解およびエタノールへの発酵を同時に行い、このプロセスは当技術分野において並行複発酵として公知である。
【００６８】
加水分解組成物中の水溶性糖の少なくとも一画分の変換は、液体環境中で行うことができる。液体環境は、いくらかの液体、好ましくは水または水を含む液体を、加水分解組成物に添加することにより得ることができる。液体は、加水分解組成物中または触媒組成物中に存在してもよい。
【００６９】
水溶性糖の少なくとも一画分の変換は、好ましくは水を含む液体環境中で行うため、変換組成物は、通常、少なくとも１つの糖由来産物と、水と、複合糖およびリグニンを含む固体組成物とを含む。加水分解組成物中のリグニンおよび複合糖は、加水分解および変換プロセスの効果として改変および／または部分的に他の成分に変換されてもよい。産物に変換されなかった水溶性糖は、変換組成物中に含まれてもよい。
【００７０】
本発明の範囲について、変換組成物は、少なくとも１つの糖由来産物と、複合糖およびリグニンを含む固体組成物とを含む。少なくとも１つの糖由来産物は、変換組成物中で可溶性または不溶性であり得る。好ましい実施形態において、糖由来産物は、変換組成物中で可溶性である。例えば、エタノールは発酵組成物中で可溶性である。固体組成物は、糖由来産物の少なくとも一画分を含む変換組成物の一画分を取り出すことにより得る。可能な限り最大量の糖由来産物を取り出すことが好ましい実施形態である一方、一部の糖由来産物は固体組成物中に依然として存在し得ることが留意される。別の実施形態において、固体組成物は糖由来産物を含まない。
【００７１】
変換組成物から取り出された画分は、変換組成物の他の成分、例えば変換されなかった水溶性糖、水、触媒および添加剤の少なくとも一画分をさらに含み得る。それは、変換組成物のリグニンおよび複合糖を含む固体組成物の一画分をさらに含み得る。好ましい実施形態において、糖飢餓環境は、変換組成物中の実質的に全ての固体組成物を含み、変換組成物から取り出された画分は、変換組成物中の実質的に全ての液体を含む。
【００７２】
別の実施形態において、糖飢餓環境は、変換組成物中の全ての固体組成物を含み、変換組成物から取り出された画分は、変換組成物中の全ての液体を含む。
【００７３】
当技術分野において公知のおよびさらに今後発明され得る任意の方法および方法の組合せを、少なくとも１つの糖由来産物を含む変換組成物の一画分の取出に使用することができる。これらの方法は、変換組成物の化学的および物理的処理を含む。化学的および物理的処理は、連続的または同時に実施することができる。
【００７４】
変換組成物の少なくとも一画分を取り出す好ましい方法は、デカンテーション、沈降、遠心分離、ろ過、例として膜ろ過および加圧ろ過、洗浄、蒸発ならびに蒸留を含む。
【００７５】
好ましい実施形態において、変換産物はエタノールであり、固体組成物は、変換組成物から、エタノールを蒸発させるかまたは蒸留し、デカンテーション、沈降、遠心分離、ろ過、例として膜ろ過および加圧ろ過ならびに洗浄の群における少なくとも１つの方法により変換組成物中の液体のほとんどの画分を除去することにより得る。
【００７６】
加水分解組成物中の水溶性糖の、少なくとも１つの糖由来産物への変換および変換産物の少なくとも一画分を含む変換組成物の一画分の取出は、少なくとも部分的に同時に行うことができる。一実施形態において、変換産物はエタノールであり、それは、例えば蒸発または蒸留により取り出すことができる一方、加水分解組成物中の単糖はエタノールに発酵する。
【００７７】
別の実施形態において、前処理リグノセルロース系バイオマスの加水分解、水溶性糖の少なくとも一画分の変換および変換組成物の一画分の取出は、少なくとも部分的に同時に行う。好ましい実施形態において、変換産物はエタノールであり、それは、並行複発酵の間に例えば蒸発および蒸留により取り出すことができる。
【００７８】
固体組成物は、酵素の産生のための宿主細胞の糖飢餓培養環境中に挿入する前にさらに加工することができる。固体組成物は、さらなる水溶性糖または酵素の産生に影響を及ぼすかもしくは酵素の産生を低減させ得る他の成分をさらに取り出すために好ましくは水により洗浄することもできる。
【００７９】
酵素を産生する方法
真菌起源、例えば糸状菌または細菌起源の宿主細胞中で酵素または酵素混合物を産生する手法は、当技術分野において周知である。本発明の増殖方法は、周知の方法であり得るが、但し、フィードは前処理リグノセルロース系バイオマスから得、前処理リグノセルロース系バイオマス中の複合糖の総量よりも少ない複合糖の総量を有する固体組成物を含むことを除く。好ましい実施形態において、単糖のフィードは培養中に限定する。
【００８０】
酵素産生手順は、当技術分野において周知である。本発明に関して、酵素または酵素混合物は、好ましくは宿主細胞により培養環境中に分泌される細胞外酵素または酵素混合物である。あるいは、酵素または酵素混合物は細胞内に存在する。
【００８１】
酵素または酵素混合物を産生し得る宿主細胞は、正確な培養条件下で特定の増殖速度において増殖させる。宿主細胞培養物を培養環境中に導入する場合、接種培養物はいくつかの段階を通過する。初期には、増殖は生じない。この期間は遅滞期と称され、適応の期間とみなすことができる。次の「対数期」と称される次の相の間に、宿主細胞培養物の増殖速度は徐々に増加する。最大増殖期間後にこの速度は停止し、培養物は定常期に入る。さらなる時間経過後に培養物は死滅期に入り、生存細胞数は低下する。増殖期において、関心対象の酵素および宿主細胞に応じて関心対象の酵素または酵素混合物が発現される。一実施形態において、酵素または酵素混合物は、対数期に発現されてよい。別の実施形態では、酵素または酵素混合物は、対数期と定常期との間の移行相において産生されてよい。別の実施形態において、酵素または酵素混合物は、定常期に発現されおよび／または胞子形成直前に発現されてもよい。本発明によれば、酵素または酵素混合物は、上記期の２つ以上で産生されてもよい。
【００８２】
換言すれば、本発明によれば、宿主細胞は好適な培地中で少なくとも１つの酵素または酵素混合物の発現、好ましくは分泌、任意選択的に回収を可能とする条件下で培養する。一方で上記のとおり、宿主細胞増殖は、本明細書の目的で、多くの技術的な相を有し、それらの相は培養という用語で一緒にグループ化される。宿主細胞培養は、前処理リグノセルロース系バイオマスから複合糖の少なくとも一画分を取り出すことにより得られた固体組成物を含む糖飢餓培養環境中で行う。糖飢餓培養環境は、微生物代謝に要求される追加の炭素源、窒素源および追加の塩をさらに含み得る。
【００８３】
好ましい実施形態によれば、前処理リグノセルロース系バイオマスは、国際公開第２０１０／１１３１２９号（この教示が参照により組み込まれる）に記載のとおり、浸漬／洗浄し、次いで水蒸気爆砕させることにより前処理されている。
【００８４】
培養後、酵素または酵素混合物は、当技術分野において周知の方法を使用して任意選択的に回収することができる。例えば、糖飢餓培養環境からの細胞外酵素または酵素混合物の回収は、慣用の手順、例として、限定されるものではないが、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を使用して行うことができる。細胞内酵素または酵素混合物の回収手順も当技術分野において周知である。
【００８５】
少なくとも本発明に関して、用語「培養」は、１つ以上の宿主細胞からなる大量培養物を使用して酵素または酵素混合物を産生する任意のプロセスを意味する。本発明は、例えば少なくとも５０リットル、好ましくは少なくとも５リットル、より好ましくは少なくとも１リットルの培養環境を有する工業規模産生に特に有用である。
【００８６】
酵素または酵素混合物には、限定されるものではないが、エンドグルカナーゼ（エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ）、セロビオヒドロラーゼまたはエキソグルカナーゼ（エキソ−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ）、β−グルコシダーゼ（１，４−β−Ｄ−グルコシダーゼ）、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、エンド−１，４−β−マンナナーゼ、１，４−β−キシロシダーゼおよび１，４−β−マンノシダーゼを含む酵素または酵素混合物の群に属するもののいずれかが含まれ得る。
【００８７】
本発明の方法は、回分(batch)、流加(fed-batch)、反復流加(repeated fed-batch)または連続プロセスとして実施することができる。
【００８８】
本発明の方法は、好気的または嫌気的に実施することができる。一部の酵素は液内培養により、一部の酵素は表面培養により産生する。本発明によれば、液内培養が好ましい。
【００８９】
したがって、一態様によれば、本発明は、宿主細胞中で酵素または酵素混合物を産生する方法であって、酵素または酵素混合物を産生し得る前記宿主細胞を、酵素または酵素混合物、例えば酵素または酵素混合物の産生に導く条件下で培養することを含み、前処理リグノセルロース系バイオマスから得られた固体組成物を使用して宿主細胞を、培養時間の少なくとも５０％である培養時間の一部にわたり乾燥重量基準で糖飢餓培養環境の０〜１０重量％の範囲の１つまたは複数の添加単糖の量を有する単糖飢餓条件下で増殖させる方法に関する。
【００９０】
培養時間は、宿主細胞前培養容量(pre-culture volume)を糖飢餓培養環境に添加してから、糖飢餓培養環境から酵素または酵素混合物を収集、取出または分離するまでの計測時間量である。複数回取出の場合において、培養時間は、最初の酵素または酵素混合物の最後の取出が終了した時点において終了する。
【００９１】
糖飢餓培養環境中に存在する前処理リグノセルロース系バイオマスから得られた固体組成物の量は、酵素または酵素混合物を産生するために宿主細胞の増殖に十分であるべきである。
【００９２】
単糖飢餓条件という語句は、一般に宿主細胞フィードの５０重量％超が、第２の前処理リグノセルロース系バイオマスから得られた固体組成物からのものであり、添加単糖からのものでないことを意味する。例示的な単糖飢餓条件は、プロセスに添加される任意選択の単糖の量が、たとえ添加されるとしても、乾燥重量基準で糖飢餓培養環境の０〜１０重量％の範囲の場合である。より好ましくは、任意選択の添加単糖は、乾燥重量基準で糖飢餓培養環境の０〜５重量％の範囲であるべきであり、０〜２．５重量％がさらにより好ましく、０〜２．０％が最も好ましい（たとえ単糖が添加されるとしても）。最良の場合において、添加単糖は存在せず、それは完璧な単糖飢餓条件である。さらに、添加単糖という語句は、１つ以上の添加単糖が存在し得ることを意味する。一実施形態において、任意選択の単糖が存在するが、示される割合未満において存在する。
【００９３】
単糖飢餓条件は、培養時間の少なくとも一部にわたり維持すべきである。定量的に表現すると、単糖飢餓条件は、培養時間の少なくとも５０％にわたり維持すべきであり、７５％がより好ましく、８５％がさらにより好ましく、９５％がなおもさらにより好ましく、培養時間の９９および１００％が最も好ましい。培養時間の１００％は、培養時間の少なくとも一部が培養時間に等しい場合である。
【００９４】
基質
酵素または酵素混合物産生のためのフィードとして一般に使用される炭素源基質にはグルコースまたは類似糖が含まれ、但し、複合糖の消費に対するそれらの消費が、規定の限度内であることを条件とする。窒素源基質、増殖刺激物質などを添加して培養および酵素または酵素混合物産生を改善することができる。窒素源には、尿素、アンモニア塩（例えばＮＨ４Ｃ１またはＮＨ４ＳＯ４）およびペプチドが含まれる。プロテアーゼを使用して例えばタンパク質を消化して遊離アミノ窒素（ＦＡＮ）を産生することができる。このような遊離アミノ酸は、宿主細胞のための栄養素として機能し得、それにより、増殖および酵素または酵素混合物産生を向上させる。増殖のための好ましい培養刺激物質には、ビタミンおよびミネラルが含まれる。ビタミンの例には、マルチビタミン、ビオチン、パントテン酸塩、ニコチン酸、メソイノシトール、チアミン、ピリドキシン、パラアミノ安息香酸、葉酸、リボフラビンならびにビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥが含まれる。ミネラルの例には、Ｐ、Ｋ、Ｍｇ、Ｓ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｚｎ、ＭｎおよびＣｕを含む栄養素を供給し得るミネラルおよび無機塩が含まれる。
【００９５】
酵素または酵素混合物産生プロセスにおいて、誘導物質（および炭素源）として通常使用される純セルロースは、前処理リグノセルロース系バイオマスから得られた固体組成物により置き換え；組成物は、好ましくは、酸前処理されている場合、例えば洗浄により中和する。
【００９６】
固体組成物は炭素源であり、炭素源と一緒に糖飢餓培養環境に添加することができるが、炭素源とは別個に添加することもできる。本発明によれば、宿主細胞培養物の接種前、接種と同時または接種後のいずれかに、少なくとも宿主細胞を増殖させるために必要とされる利用可能な複合糖の量に対応する量で、固体組成物を糖飢餓培養環境に添加することができる。固体組成物を培養時間の間に添加する場合、任意選択の添加単糖の量または任意選択の単糖とリグノセルロース系バイオマスとの比の新たな計算を行う。単糖の量は、培養時間の初期部分の間では十分低くなくてもよい一方、固体組成物を糖飢餓培養環境に添加することにより、任意選択の添加単糖の量は、少なくとも培養時間の残り時間にわたり規定範囲内になる。
【００９７】
当業者は、本発明による固体組成物の添加時期および添加量を容易に決定することができる。培養期間の間、固体組成物は、細胞宿主により常態で消費され、事前に規定された限度内で保持される。
【００９８】
上記のとおり、固体組成物は、周知の酵素または酵素混合物産生プロセスにおいてグルコースを通常で使用するのと同一の手法で使用する。
【００９９】
酵素収集
本開示の方法において、固体組成物を、酵素産生プロセスにおいて宿主細胞へのフィードに使用する。固体組成物を前処理リグノセルロース系バイオマスから得、前記固体組成物は複合糖およびリグニンを含む。宿主細胞に固体組成物中の複合糖をフィードするにつれ、固体組成物の固体残留物が糖飢餓培養環境中で固体組成物の少なくとも一画分から形成される。固体残留物は、固体組成物のリグニンの少なくとも一画分を含み、固体組成物の複合糖の一画分を含み得る。リグニンは、宿主細胞培養工程において改変されていてよい。
【０１００】
宿主細胞を糖飢餓培養環境中で培養することにより産生された酵素は、糖飢餓培養環境を少なくとも２つの画分、酵素の少なくとも一画分を含む収集組成物と、固体組成物の固体残留物の少なくとも一画分を含む排出組成物とに分離することにより収集することができる。固体残留物は、宿主細胞のほとんどを含み得る。
【０１０１】
「少なくとも２つの画分」は、糖飢餓培養環境を３つ以上の画分に分離することができることを意味し、この実施形態は本発明の範囲内である。
【０１０２】
収集組成物は、糖飢餓培養環境の他の成分、例えば固体組成物および／もしくは糖飢餓培養環境中に含有され、ならびに／または宿主細胞培養において添加された水および添加剤などをさらに含み得る。これは、固体組成物の一部および固体残留物の一部をさらに含み得る。好ましい実施形態において、収集組成物は、固体化合物を含有しないかまたは極めて少量で含有する。別の好ましい実施形態において、収集組成物は、全てのまたはほぼ全ての産生された酵素を含有する。
【０１０３】
排出組成物は、固体組成物の固体残留物の少なくとも一画分を含み、糖飢餓培養環境の他の成分、例えば糖飢餓環境中に含まれ、および／または宿主細胞培養工程において添加された水および添加剤などをさらに含み得る。これは、酵素の一部をさらに含み得る。好ましい実施形態において、排出組成物は、酵素を含有しないかまたは極めて少量で含有する。別の好ましい実施形態において、排出組成物は、全てのまたはほぼ全ての固体組成物の固体残留物を含有する。
【０１０４】
当技術分野において公知のおよびさらに今後発明され得る任意の方法および方法の組合せを、糖飢餓培養環境の少なくとも収集組成物および排出組成物への分離に使用することができる。これらの方法は、加水分解組成物の化学的および物理的処理を含む。化学的および物理的処理は、連続的または同時に実施することができる。
【０１０５】
糖飢餓培養環境を少なくとも収集組成物および排出組成物に分離する好ましい方法は、遠心分離、ろ過、透析、洗浄および加圧ろ過の群における少なくとも１つの方法を含む。
【０１０６】
収集組成物および排出組成物は、本発明の範囲内で任意のさらなるプロセスに供することができる。例えば、分離、精製、ｐＨ補正、希釈、濃縮などである。
【０１０７】
リグノセルロース系バイオマス
一般に、天然または天然発生リグノセルロース系バイオマスは、以下のとおり記載することができる。
【０１０８】
デンプンとは別に、植物バイオマス中の３つの主要構成成分は、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンであり、それらは一般にリグノセルロースという総称により称される。総称としての多糖含有バイオマスには、デンプンおよびリグノセルロース系バイオマスの両方が含まれる。したがって、原料の一部のタイプは、植物バイオマス、多糖含有バイオマスおよびリグノセルロース系バイオマスであり得る。
【０１０９】
本発明による多糖含有バイオマスは、例えばデンプンならびに精製デンプン、セルロースおよびヘミセルロースの形態のポリマー糖を含有する任意の材料を含む。
【０１１０】
特許請求される発明を得るための天然発生バイオマスの関連タイプには、デンプン含有穀粒、精製デンプン；コーン茎葉、バガス、藁、例えば、イネ、コムギ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、セイヨウアブラナ、ソルガムからの藁；軟木、例えば、ヨーロッパアカマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ラジアータパイン（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔｅ）；硬木、例えば、ヤナギ属種（Ｓａｌｉｘ  ｓｐｐ．）、ユーカリ属種（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐｐ．）；塊茎、例えば、ビート、ジャガイモ；例えば、イネ、コムギ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、セイヨウアブラナ、ソルガムおよびコーンからの穀草からなる群から選択される農作物；古紙、バイオガス処理からの繊維区分、堆肥、アブラヤシ処理からの残渣、都市固形廃棄物に由来するバイオマスなどが含まれ得る。実験は上記に列挙されるリストの数例に限定されるが、本発明は、全てに適用可能と考えられる。それというのも、特性決定は主としてリグニンの固有の特徴および表面積に限定されるためである。
【０１１１】
組成物を得るために使用されるリグノセルロース系バイオマス原料は、好ましくは、通常、禾本(grasses)と呼ばれる科からのものである。適切な名称は、顕花植物の単子葉植物綱（Ｌｉｌｉｏｐｓｉｄａ）（単子葉植物）におけるイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）または禾本科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）として公知の科である。この科の植物は、通常、禾本と呼ばれるかまたはそれらを他のイネ科植物と区別するため、真正禾本と呼ばれる。タケも含まれる。約６００の属および約９，０００〜１０，０００以上の種の禾本が存在する（Ｗｏｒｌｄ  Ｇｒａｓｓ  ＳｐｅｃｉｅｓのＫｅｗ  Ｉｎｄｅｘ）。
【０１１２】
イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）には、世界中で生育される主食穀粒および穀草作物、芝生および飼料草ならびにタケが含まれる。イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）は、一般に、稈と呼ばれる中空の茎を有し、それは、葉が生じる稈に沿った節と呼ばれる箇所で間隔を置いて塞がれている（中実）。禾本の葉は、通常、互生、対生（１つの平面で）またはまれに螺生で平行脈である。それぞれの葉は、ある距離で茎を抱える下位葉鞘と、通常全縁の葉身とに区別される。多くの禾本の葉身は、シリカの植物ケイ酸体により硬化され、それは草食動物を遠ざける助けとなる。一部の禾本（例えば、ソードグラス）において、これにより禾本葉身の縁がヒトの皮膚を切断するほど十分に鋭利になる。葉舌と呼ばれる膜質付属物または毛のふさは、葉鞘と葉身との間の接合部に存在し、水または昆虫が葉鞘中に侵入するのを防止する。
【０１１３】
禾本の葉身は、葉身の基部において生長し、伸長した茎頂からは生長しない。この低い生長点は草食動物に応答して進化し、それにより植物に甚大な損傷なしで禾本の採食または規則的な刈り取りが可能となる。
【０１１４】
イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）の花は、特徴的には小穂中で配置され、それぞれの小穂は、１つ以上の小花を有する（小穂は、円錐花序または穂状花序にさらに大別される）。小穂は、包頴と呼ばれる基部における２つ（またはより少ない場合もある）の苞葉と、それに続く１つ以上の小花とからなる。小花は、外頴（外側のもの）および内頴（内側）と呼ばれる２つの苞葉により包囲された花からなる。花は、通常、雌雄同花（雌雄同株であるトウモロコシは例外）であり、受粉は、ほとんど常に風媒である。花被は、鱗被と呼ばれる２つの芽鱗にまとめられ、それらが伸縮して外頴および内頴を広げ；これらは一般に、変形萼片と解釈される。
【０１１５】
イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）の果実は、種皮が果皮に融合しており、したがって、それから分離不可能である（トウモロコシ穀粒におけるように）頴果である。
【０１１６】
禾本には、生長習性の３つの一般分類；束型（群生とも呼ばれる）、匍匐枝型および根茎が存在する。
【０１１７】
禾本の成果は、部分的には、それらの形態および生長プロセスに存在し、部分的には、それらの生理学的多様性に存在する。禾本のほとんどは、炭素固定のためにＣ３およびＣ４光合成経路を使用する２つの生理学的な群に分類される。Ｃ４禾本は、特殊化された葉のクランツ構造と連結された光合成経路を有し、その構造は、特に高温気候および二酸化炭素が少ない雰囲気にそれらを適合させる。
【０１１８】
Ｃ３禾本は、「寒冷期禾本」と称される一方、Ｃ４植物は、「温暖期禾本」とみなされる。禾本は、一年生または多年生のいずれかであり得る。一年生寒冷期の例は、コムギ、ライムギ、一年生ブルーグラス（一年生メドウグラス、スズメノカタビラ（Ｐｏａ  ａｎｎｕａ）およびオートムギ）である。多年生寒冷期の例は、オーチャードグラス（カモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ））、ウシノケグサ（ウシノケグサ属種（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｓｐｐ））、ケンタッキーブルーグラスおよびホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）である。一年生温暖期の例は、コーン、スーダングラスおよびパールミレットである。多年生温暖期の例は、ビッグブルーステム、インディアングラス、バミューダグラスおよびスイッチグラスである。
【０１１９】
禾本科の１つの分類は、１２の亜科を認定する：これらは、１）２つの属（アノモクロア（Ａｎｏｍｏｃｈｌｏａ）、ストレプトケタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｈａｅｔａ））が含まれる広葉禾本の小系統であるアノモクロア亜科（ａｎｏｍｏｃｈｌｏｏｉｄｅａｅ）；２）３つの属、例として、ファルス（Ｐｈａｒｕｓ）およびレプタスピス（Ｌｅｐｔａｓｐｉｓ）が含まれる禾本の小系統であるファロア亜科（Ｐｈａｒｏｉｄｅａｅ）；３）アフリカ属プエリア（Ｐｕｅｌｉａ）が含まれる小系統であるプエリア亜科（Ｐｕｅｌｉｏｉｄｅａｅ）；４）コムギ、オオムギ、オートムギ、ブロムグラス（ブロヌス属（Ｂｒｏｎｎｕｓ））およびリードグラス（ノガリヤス属（Ｃａｌａｍａｇｒｏｓｔｉｓ））が含まれるイチゴツナギ亜科（Ｐｏｏｉｄｅａｅ）；５）タケが含まれるタケ亜科（Ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅａｅ）；６）イネおよび野生イネが含まれるエールハルタ亜科（Ｅｈｒｈａｒｔｏｉｄｅａｅ）；７）オオヨシおよびヨシが含まれるダンチク亜科（Ａｒｕｎｄｉｎｏｉｄｅａｅ）；８）キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）に含まれることもある１１の属の小亜科であるラッパグサ亜科（Ｃｅｎｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅａｅ）；９）ヒゲシバ亜科（Ｃｈｌｏｒｉｄｏｉｄｅａｅ）、例としてラブグラス（スズメガヤ属（Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ）、約３５０種、例としてテフ）、ドロップシード（ネズミノオ属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ）、約１６０種）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ（Ｌ．）Ｇａｅｒｔｎ．）およびムーリーグラス（ネズミガヤ属（Ｍｕｈｌｅｎｂｅｒｇｉａ）、約１７５種）；１０）キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）、例としてパニックグラス、トウモロコシ、ソルガム、サトウキビ、ほとんどのキビ、フォニオおよびブルーステムグラス；１１）ミクライロア亜科（Ｍｉｃｒａｉｒｏｉｄｅａｅ）ならびに１２）ダンソニオダ亜科（Ｄａｎｔｈｏｎｉｏｄｉｅａｅ）、例としてパンパスグラス；約５００種の禾本の属であるイチゴツナギ属（Ｐｏａ）については、両半球の温帯地域原産である。
【０１２０】
可食種子のために生長させる農産禾本は、穀草と呼ばれる。３つの一般的な穀草は、イネ、コムギおよびトウモロコシ（コーン）である。全ての作物のうち、７０％が禾本である。
【０１２１】
サトウキビは、製糖の主要源である。禾本は、建築に使用される。タケから作製された足場は、鋼製足場を破壊する台風の力の風に耐え得る。より大きいタケおよびダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ）は、材木と同様に使用することができる頑丈な稈を有し、禾本の根は、芝土家屋の芝土を安定化させる。ダンチク属（Ａｒｕｎｄｏ）は、木管楽器のためのリードを作製するために使用され、タケは、多数の道具に使用される。
【０１２２】
別の天然発生リグノセルロース系バイオマス原料は、木本植物または木材であり得る。木本植物は、木材をその構造組織として使用する植物である。これらは、典型的には、茎およびより大きい根が維管束組織に隣接して産生された木材により補強される多年生植物である。これらの植物の主要な茎、より大きい枝および根は、通常、肥厚した樹皮の層により覆われる。木本植物は、通常、木、低木または蔓性植物のいずれかである。木材は、木本植物が地上茎から年々生長するのを可能とし、こうして一部の木本植物を最大および最長植物とする構造的細胞順応物である。
【０１２３】
これらの植物は、水および栄養素を根から葉に移動させるため（木部）ならびに糖を葉から植物の残部に移動させるため（師部）の維管束系を必要とする。２種類の木部：前形成層からの一次生長の間に形成される一次木部および維管束形成層からの二次生長の間に形成される二次木部が存在する。
【０１２４】
通常、「木材」と呼ばれるものは、そのような植物の二次木部である。
【０１２５】
二次木部を見出すことができる２つの主要な群は、以下のものである：
１）球果植物（マツ目（Ｃｏｎｉｆｅｒａｅ））：約６００種の球果植物が存在する。全ての種は、この群にわたり構造が比較的均一な二次木部を有する。多くの球果植物は、高木になり：そのような木の二次木部は、軟木として市販される。
２）被子植物（被子植物門（Ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍａｅ））：約２５万から４０万種の被子植物が存在する。この群の中で、二次木部は単子葉植物（例えば、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ））においては見出されていない。多くの非単子葉被子植物は、木になり、それらの二次木部は、硬木として市販される。
【０１２６】
軟木という用語は、裸子植物に属する木からの木材を説明するために使用される。裸子植物は、子房中で包まれていないむき出しの種子を有する植物である。これらの種子「果実」は、硬木よりも原始的であるとみなされる。軟木の木は、通常、常緑性であり、球果を担持し、針葉または葉のような芽鱗を有する。これらには、球果植物種、例えばマツ、トウヒ、モミおよびシダーが含まれる。木材硬度は、球果植物種により変動する。
【０１２７】
硬木という用語は、被子植物科に属する木からの木材を説明するために使用される。被子植物は、子房中で保護のために包まれている胚珠を有する植物である。受精時、これらの胚珠は、種子に発達する。硬木の木は、通常、広葉性であり；温帯および寒帯緯度において、それらはほとんど落葉性であるが、熱帯および亜熱帯においてはほとんど常緑性である。これらの葉は、単葉（単一の葉身）であり得るかまたはそれらは葉柄に付いている小葉を有する複葉であり得る。形状が変動し得るが、全ての硬木の葉は、細い葉脈の明確な網目を有する。硬木植物には、例えば、アスペン、カバノキ、サクラ、カエデ、オークおよびチークが含まれる。
【０１２８】
したがって、好ましい天然発生リグノセルロース系バイオマスは、禾本および木材からなる群から選択することができる。別の好ましい天然発生リグノセルロース系バイオマスは、球果植物、被子植物、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）に属する植物からなる群から選択することができる。別の好ましい天然発生リグノセルロース系バイオマスは、その乾物の少なくとも１０重量％をセルロースとして、またはより好ましくは、その乾物の少なくとも５重量％をセルロースとして有するバイオマスであり得る。
【０１２９】
前処理
本発明によれば、リグノセルロース系バイオマスを前処理する。「前処理」という用語は、「処理」という用語により置き換えることができる。しかしながら、企図される好ましい技術は、さらに下記のとおり、リグノセルロース系バイオマスの「前処理」について周知のものである。
【０１３０】
上記のとおり、処理または前処理は、セルロースの分離および／または放出を促進してリグノセルロース系バイオマスからのセルロースの利用可能性を増加させる、当技術分野において公知の慣用の方法を使用して実施することができる。前処理技術は当技術分野において周知であり、それには物理的、化学的および生物学的前処理またはそれらの任意の組合せが含まれる。好ましい実施形態において、リグノセルロース系バイオマスの前処理は、回分または連続プロセスとして実施する。
【０１３１】
物理的前処理技術には、前処理リグノセルロース系バイオマスを作出するための種々のタイプのミル処理／粉砕（粒子サイズの低減）、照射、蒸気処理／水蒸気爆砕およびハイドロサーモリシス、好ましい実施形態において、浸漬、液体からの固体除去、固体の水蒸気爆砕が含まれる。
【０１３２】
粉砕には、乾燥、湿潤および振動ボールミル処理が含まれる。好ましくは、物理的前処理は、高圧および／または高温（水蒸気爆砕）の使用を含む。本発明に関して、高圧には、３〜６ＭＰａ、好ましくは３．１ＭＰａの範囲の圧力が含まれる。本発明に関して、高温には、約１００〜３００℃、好ましくは約１６０〜２３５℃の範囲の温度が含まれる。具体的な実施形態において、含浸は、約３．１ＭＰａの圧力および約２３５℃の温度において実施する。好ましい実施形態において、物理的前処理は、国際公開第２０１０／１１３１２９号パンフレット（ここの教示全体が参照により組み込まれる）に記載の方法に従って行う。
【０１３３】
必要でも好ましくもないが、化学的前処理技術には、酸、希酸、塩基、有機溶媒、石灰、アンモニア、二酸化硫黄、二酸化炭素、ｐＨ制御ハイドロサーモリシス、湿式酸化および溶媒処理が含まれる。
【０１３４】
化学的処理プロセスが酸処理プロセスである場合、それはより好ましくは、連続的な希酸または弱酸処理、例えば硫酸または別の有機酸、例えば酢酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸またはそれらの任意の混合物による処理である。他の酸を使用することもできる。弱酸処理は、少なくとも本発明に関して、処理ｐＨが１〜５、好ましくは１〜３の範囲にあることを意味する。
【０１３５】
具体的な実施形態において、酸濃度は０．１〜２．０重量％の範囲の酸、好ましくは硫酸である。酸は、リグノセルロース系バイオマスと混合しまたは接触させ、混合物は、約１６０〜２２０℃の範囲の温度において、数分から数秒の範囲の時間にわたり保持する。具体的には、前処理条件は以下のとおりであり得る：１６５〜１８３℃、３〜１２分間、０．５〜１．４％（ｗ／ｗ）の酸濃度、１５〜２５、好ましくは約２０％（ｗ／ｗ）の全固形分濃度。他の企図される方法は、米国特許第４，８８０，４７３号明細書、米国特許第５，３６６，５５８号明細書、米国特許第５，１８８，６７３号明細書、米国特許第５，７０５，３６９号明細書および米国特許第６，２２８，１７７号明細書に記載されている。
【０１３６】
湿式酸化技術は、酸化剤、例えば亜硫酸塩系酸化剤などの使用を含む。溶媒処理の例には、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などによる処理が含まれる。化学的処理プロセスは、一般に約５〜約１０分間実施するが、より短時間またはより長時間実施することができる。
【０１３７】
生物学的前処理技術には、リグニン可溶化微生物の適用（例えばＨｓｕ，Ｔ．−Ａ．，１９９６，Ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｏｍａｓｓ，ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｗｙｍａｎ，Ｃ．Ｅ．，ｅｄ．，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１７９−２１２；Ｇｈｏｓｈ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ，Ａ．，１９９３，Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ／ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇｎｏ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｂｉｏｍａｓｓ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：２９５−３３３；ＭｃＭｉｌｌａｎ，Ｊ．Ｄ．，１９９４，Ｐｒｅｔｒｅａｔｉｎｇ  ｌｉｇｎｏ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｂｉｏｍａｓｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ，ｉｎ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｅｌｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｈｉｍｍｅｌ，Ｍ．Ｅ．，Ｂａｋｅｒ，Ｊ．Ｏ．，ａｎｄ  Ｏｖｅｒｅｎｄ，Ｒ．Ｐ．，ｅｄｓ．，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５６６，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｃｈａｐｔｅｒ  １５；Ｇｏｎｇ，Ｃ．Ｓ．，Ｃａｏ，Ｎ．Ｊ．，Ｄｕ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｔｓａｏ，Ｇ．Ｔ．，１９９９，Ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｅｐｅｒ，Ｔ．，ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，６５：２０７−２４１；Ｏｌｓｓｏｎ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｈａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌ，Ｂ．，１９９６，Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇｎｏ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈ．１８：３１２−３３１；およびＶａｌｌａｎｄｅｒ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｋ．−Ｅ．Ｌ．，１９９０，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  ｌｉｇｎｏ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ：Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔ，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２：６３−９５参照）が含まれる。
【０１３８】
一実施形態において、化学的前処理および物理的前処理の両方、例として例えば弱酸処理および高温高圧処理を実施する。化学的および物理的処理は、連続的または同時に実施することができる。
【０１３９】
好ましい実施形態において、前処理は、１℃を超える水を用いて水からリグノセルロース系バイオマスを取り出す浸漬工程と、それに続く水蒸気爆砕工程として実施する。
【０１４０】
好ましい実施形態において、前処理リグノセルロース系バイオマスは、グルカンおよびキシラン（セルロースおよびヘミセルロース）としても公知の複合糖およびリグニンを含む。
【０１４１】
酵素または酵素混合物
酵素または酵素混合物は、リグノセルロース系バイオマスを分解し得るセルロース分解酵素または酵素の混合物を意味する。記載の方法に従って産生される酵素または酵素混合物は、任意の起源、例として細菌または真菌起源であり得る。化学修飾またはタンパク質遺伝子操作バリアントが含まれる。好適な酵素または酵素混合物には、一般のセルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、サーモビフィダ属（Ｔｈｅｍｏｂｉｆｉｄａ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からの酵素または酵素混合物、例えばフミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）、セルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、クリソスポリウム・ラクノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、ペニシリウム・デカンベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）により産生される真菌酵素または酵素混合物が含まれる。
【０１４２】
一実施形態において、産生される酵素または酵素混合物は、宿主細胞と同種の酵素または酵素混合物複合体である。一実施形態において、産生される酵素または酵素混合物は、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、好ましくはペニシリウム・デカンベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）の株の宿主細胞と同種の酵素または酵素混合物複合体である。
【０１４３】
産生される酵素または酵素混合物は、単一成分酵素または酵素混合物であってもよいものと理解すべきであり、例えば好適な宿主細胞中で組換えにより産生されるエンドグルカナーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、グルコヒドロラーゼ、またはベータ−グルコシダーゼを含む。酵素または酵素混合物には、当技術分野において公知の調節および／またはプロモーター領域を含む上記列記の酵素のコード領域の少なくとも一部を利用する組換え細胞中で産生される他の酵素または酵素クラスも含まれ得る。好適な宿主細胞を以下にさらに記載する。
【０１４４】
産生される酵素または酵素混合物は、酵素または酵素混合物を天然で産生する宿主細胞からの１つ以上の同種の酵素または酵素混合物成分が、欠失または不活化されている酵素または酵素混合物調製物であってもよい。
【０１４５】
酵素または酵素混合物を産生し得る宿主細胞
宿主細胞は任意の起源であり得る。上記のとおり、酵素または酵素混合物は、酵素または酵素混合物を産生し得る宿主細胞と同種または異種であり得る。
【０１４６】
本明細書において使用される「組換え宿主細胞」という用語は、酵素または酵素混合物をコードする遺伝子を保有し、前記遺伝子を発現して酵素または酵素混合物を産生し得る宿主細胞を意味し、酵素または酵素混合物をコードする遺伝子が、宿主細胞中に形質転換、形質移入、形質導入などされている。使用される形質転換、形質移入、形質導入などの技術は、当技術分野において周知であり得る。好ましい実施形態において、遺伝子は、１つ以上のコピーで組換え宿主細胞のゲノム中に組み込まれる。
【０１４７】
酵素または酵素混合物が異種である場合、酵素または酵素混合物を産生し得る組換え宿主細胞は、好ましくは真菌または細菌起源である。組換え宿主細胞の選択は、大体において、酵素または酵素混合物をコードする遺伝子および酵素または酵素混合物の起源に依存する。
【０１４８】
本明細書において使用される「野生型宿主細胞」という用語は、酵素または酵素混合物をコードする遺伝子を天然で保有し、前記遺伝子を発現し得る宿主細胞を指す。酵素または酵素混合物が、同種の調製物または酵素または酵素混合物複合体である場合、酵素または酵素混合物を産生し得る野生型宿主細胞またはその突然変異株は、好ましくは真菌または細菌起源である。
【０１４９】
「その突然変異株」は、例えば酵素または酵素混合物調製物をある成分において濃縮するために、１つ以上の遺伝子が欠失または不活化されている野生型宿主細胞であり得る。突然変異宿主細胞は、野生型宿主細胞により天然で産生される、酵素または酵素混合物複合体または調製物に１つ以上の追加の酵素活性または他の活性を導入するために追加の酵素またはタンパク質をコードする１つ以上の追加の遺伝子により形質転換された野生型宿主細胞であってもよい。追加の酵素は、同一活性（例えば酵素または酵素混合物活性）を有し得、または単に例えば異なる特性を有する別の酵素分子であり得る。突然変異野生型宿主細胞は、遺伝子の発現を増加させてより多くの酵素を産生するために、形質転換、形質移入、形質導入などされて、好ましくはゲノム中に組み込まれた追加の同種酵素コード遺伝子を有してもよい。
【０１５０】
好ましい実施形態において、組換えまたは野生型宿主細胞は、糸状菌起源である。宿主細胞の例には、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブジェルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、カワラタケ属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィロバシジウム属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、シワタケ属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ヒラタケ属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、スエヒロタケ属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ホウロクタケ属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞を含む群から選択されるものが含まれる。
【０１５１】
より好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の株を含む群から選択される。なおもより好ましい実施形態において、株はペニシリウム・デカンベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）である。
【０１５２】
別の好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞は、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・カルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レティキュラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコセキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）またはフザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）の株の細胞である。別の好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞は、ブジェルカンデラ・アダスタ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｒｕｆａ）またはセリポリオプシス・サブバーミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・ラクノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、コプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・パルロゼラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・デカンベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コガネシワウロコタケ（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａ）、エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビローサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）の株を含む群から選択される。
【０１５３】
別の好ましい実施形態において、組換えまたは野生型宿主細胞は、細菌起源である。宿主細胞の例には、グラム陽性細菌、例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の株、例えばバチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）もしくはバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）；またはストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株、例えばストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）もしくはストレプトミセス・ムリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ）を含む群から；またはグラム陰性細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくはシュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）から選択されるものが含まれる。
【０１５４】
加水分解
バイオマスは、バイオマスの加水分解から得られる水溶性種に加水分解可能ないくらかの化合物を含有する。セルロースの水溶性加水分解種の場合において、セルロースは、グルコース、セロビオースおよび高級グルコースポリマーに加水分解することができ、ダイマーおよびオリゴマーを含む。したがって、セルロースの水溶性加水分解種のいくらかは、グルコース、セロビオースおよび高級グルコースポリマーであり、それらのそれぞれのダイマーおよびオリゴマーを含む。セルロースは、炭水化物分解セルラーゼによりグルコースに加水分解される。したがって、炭水化物分解セルラーゼは、セルロースの加水分解のための触媒の例である。
【０１５５】
セルロース分解系の一般的理解によれば、セルラーゼは、３つのクラス；セルロース鎖の末端からセロビオース単位を開裂させるエキソ−１，４−［ベータ］−Ｄ−グルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）（ＥＣ３．２．１．９１）；セルロース鎖中の内部［ベータ］−１，４−グルコシド結合をランダムに加水分解するエンド−１，４−［ベータ］−Ｄ−グルカナーゼ（ＥＧ）（ＥＣ３．２．１．４）；セロビオースをグルコースに加水分解し、さらにセロオリゴ糖からグルコース単位を開裂させる１，４−［ベータ］−Ｄ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）に分類される。したがって、バイオマスがセルロースを含有する場合、グルコースはバイオマスの加水分解から得られる水溶性加水分解種であり、上記セルラーゼおよび実験の項に挙げられるものはセルロースの加水分解のための触媒の具体例である。
【０１５６】
同様の分析により、ヘミセルロースの加水分解産物はバイオマスの加水分解から得られる水溶性種であり、無論、バイオマスがヘミセルロースを含有することが想定される。ヘミセルロースには、キシラン、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、グルコマンナンおよびキシログルカンが含まれる。ヘミセルロース中の様々な糖がヘミセルラーゼにより遊離される。ヘミセルロース分解系は、ヘミセルロースの異種性質に起因してセルロース分解系よりも複雑である。この系は、とりわけ、キシラン鎖中の内部結合を加水分解するエンド−１，４−［ベータ］−Ｄ−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）；非還元末端からキシロオリゴ糖を攻撃し、キシロースを遊離させる１，４−［ベータ］−Ｄ−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）；内部結合を開裂させるエンド−１，４−［ベータ］−Ｄ−マンナナーゼ（ＥＣ３．２．１．７８）；マンノオリゴ糖をマンノースに開裂させる１，４−［ベータ］−Ｄ−マンノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２５）を含み得る。側鎖基は、多数の酵素；例えば［アルファ］−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２２）、［アルファ］−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）、［アルファ］−Ｄ−グルクロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．１３９）、シンナモイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．−）、アセチルキシランエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．６）およびフェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）により除去される。したがって、バイオマスがヘミセルロースを含有する場合、キシロースおよびマンノースは、ヘミセルロース含有バイオマスの加水分解から得られる水溶性加水分解種の例であり、上記ヘミセルラーゼおよび実験の項に挙げられるものは、ヘミセルロースの加水分解のための触媒の具体例である。
【０１５７】
本プロセスにおいて、加水分解触媒を含める。加水分解触媒組成物は、触媒、触媒をプロセスに導入するために使用される担体および他の添加剤／成分からなる。上記のとおり、触媒は、バイオマス中の化合物の少なくとも１つを、より低分子量の１つまたは複数の化合物に、バイオマス中の化合物を作製するために使用される基本糖または炭水化物に至るまでおよびそれを含めて変換する少なくとも１つの酵素または微生物を含み得る。種々の多糖、例えばセルロース、ヘミセルロースおよびデンプンについてこれを行い得る酵素は当技術分野において周知であり、それには依然として発明されていないものも含まれる。
【０１５８】
加水分解触媒組成物は、好ましくは、硫酸、塩酸、リン酸などまたはそれらの混合物からなる群から選択される無機酸も含み得る。無機酸は、１００℃を超える温度における加工に有用と考えられる。本プロセスは、特に無機酸の添加なしで実行することもできる。
【０１５９】
加水分解触媒をプロセスに担体、例えば水または有機系バイオマスとともに添加することが典型的である。したがって、物質収支目的のため、触媒組成物という用語は、触媒と、触媒をプロセスに添加するために使用される担体を含む。ｐＨ緩衝剤を触媒とともに添加する場合、それも触媒組成物の一部である。リグノセルロース系バイオマスは、デンプンを含有することが多い。デンプン加水分解において使用されるより重要な酵素は、アルファ−アミラーゼ（１，４−［アルファ］−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．１））である。これらは、１，４−［アルファ］−Ｄ−グルコシド結合を開裂させ、１，６−［アルファ］−Ｄ−グルコシド分枝点を迂回し得るが、加水分解し得ないエンド作用ヒドロラーゼである。しかしながら、エキソ作用グリコアミラーゼ、例えばベータ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）およびプルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）もデンプン加水分解に使用することができる。デンプン加水分解の結果は、主としてグルコース、マルトース、マルトトリオース、［アルファ］−デキストリンおよび様々な量のオリゴ糖である。デンプン系加水分解物を発酵に使用する場合、タンパク質分解酵素を添加することが有利であり得る。このような酵素は、微生物の凝集を妨害し得、微生物が利用可能なアミノ酸を生成し得る。したがって、バイオマスがデンプンを含有する場合、グルコース、マルトース、マルトトリオース、［アルファ］−デキストリンおよびオリゴ糖は、デンプン含有バイオマスの加水分解から得られる水溶性加水分解種の例であり、上記アルファ−アミラーゼおよび実験の項に挙げられるものは、デンプンの加水分解のための触媒の具体例である。
【０１６０】
使用
別の態様において、本方法は、宿主細胞中で酵素または酵素混合物を産生するための炭素源フィードとしての、前処理リグノセルロース系バイオマスから得られた固体組成物の使用に関する。
【０１６１】
本明細書に記載され、特許請求される本方法の範囲は、本明細書に開示の具体的な実施形態により限定されるものではない。それというのも、それらの実施形態は、本発明のいくつかの態様の説明であることが意図されるためである。任意の均等の実施形態が、本発明の範囲内であることが意図される。実際、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の種々の改変が上記記載から当業者に明白になる。このような改変も、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。矛盾がある場合、定義を含めて本開示が優先する。
【０１６２】
本方法は、プロセスから収集された酵素をさらに使用して第１のリグノセルロース系バイオマスを加水分解する追加の工程を有してもよい。好ましくは、第１のリグノセルロース系バイオマスおよび第２のリグノセルロース系バイオマスは、同一の禾本種に由来し、より好ましくは同一の禾本種に由来すべきである。酵素的加水分解を実施すべき第１のリグノセルロース系バイオマスを、酵素的加水分解前に前処理することも好ましい。
【０１６３】
記載の方法により作製された酵素または酵素混合物および記載される方法により産生された酵素または酵素混合物により加水分解されたリグノセルロース系バイオマスも発見される。
【０１６４】
実験手順
固体組成物の調製
様々な固体組成物を、ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ）および麦稈から調製した。培養実験において使用される様々な固体組成物を調製するため、バイオマスを前処理、酵素的加水分解、発酵および加圧ろ過に供した。
【０１６５】
前処理
リグノセルロース系バイオマスを連続リアクタ中に導入し、浸漬処理に供した。浸漬混合物を、浸漬液体と、固体浸漬原料を含有する画分とにプレスにより分離した。固体浸漬原料を含有する画分を、水蒸気爆砕に供した。２つのバイオマスについての前処理パラメータを表１に報告する。
【０１６６】
【表１】
2015519916.tif 000003
【０１６７】
水蒸気爆砕産物を、水蒸気爆砕液体と水蒸気爆砕固体とに分離した。
【０１６８】
水蒸気爆砕固体は、培養実験において使用されるダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ）前処理バイオマス（ＡＲ）および麦稈前処理バイオマス（ＷＳ）である。
【０１６９】
酵素的加水分解
前処理バイオマスを水と混合して７．５％の乾物含有率を有する混合物を得、混合物を酵素リアクタ中に挿入した。前処理バイオマス中に含有されるグルカン１グラム当たりのタンパク質の規定濃度に対応する酵素カクテルを添加した。酵素的加水分解を、撹拌しながら７２時間実施した。
【０１７０】
麦稈前処理バイオマスから出発して２つの異なる加水分解物を調製し；それぞれの加水分解物を、遠心分離（２０分間、８０００ｒｐｍ、４℃）により、水溶性糖を含有する液体画分と、固体組成物とに分離した。固体組成物（ＨＷ１およびＨＷ２と示す）を、培養実験において使用した。ＨＷ１およびＨＷ２の調製において使用される加水分解パラメータを表２に報告し、２つの異なる複合糖飢餓レベルを得るように選択し；特に、より高い酵素濃度を用い、それにより、より大きい飢餓の組成に対応するＨＷ２を調製した。
【０１７１】
【表２】
2015519916.tif 000004
【０１７２】
発酵および加圧ろ過
組成物ＨＷ２の条件に従って調製された麦稈加水分解物を、３ｇ／ｌの尿素および０．５ｇ／ｌの発酵酵母を有するバイオリアクタ中に挿入した。ｐＨを５に、および温度を３０℃に設定し、発酵を４８時間実施した。酵素的加水分解が発酵の間に継続するように、酵素カクテルを加水分解物から除去しなかった。固体濃縮画分からエタノールおよび液体成分を分離するため、固体、エタノールおよび他の液体画分を含む発酵ブロスを、８０℃の温度において１５ｂａｒにおいて加圧ろ過によりプレスした。プレスから抽出されたリグニンを含む固体濃縮画分（ＨＦＷと示す）を培養実験において使用した。
【０１７３】
ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  Ｄｏｎａｘ）加水分解物を、ＨＷ２に対応するパラメータに従って調製し、麦稈に使用された手順に従って発酵させた。プレスから抽出された固体濃縮画分（ＨＦＡと示す）を培養実験において使用した。
【０１７４】
組成
水溶性糖、複合糖、リグニンおよび他の化合物に関する前処理バイオマスおよび固体組成物の組成は、実験の項の最後に列記される標準的な分析法に従って決定した。
【０１７５】
表３は、前処理バイオマスＡＲおよびＷＳ、ＷＳ加水分解物に由来する固体組成物ＨＷ１およびＨＷ２ならびにＡＲおよびＷＳ加水分解物の発酵に由来する固体組成物（ＨＦＷおよびＨＦＡ）の組成を報告する。表は、以下の実験において使用され、以下の実験の項において記載されるＬＳ１およびＬＳ２の組成も含む。
【０１７６】
組成を、複合Ｃ６糖、複合Ｃ５糖、総水溶性糖（Ｃ５およびＣ６）および他の成分（リグニンおよび水を含む）に関して表現する。複合Ｃ６糖はグルコースベースであり、複合Ｃ５糖は主としてキシロースベースである。
【０１７７】
【表３】
2015519916.tif 000005
【０１７８】
本開示の範囲に関し、組成物は、複合糖とリグニンとの比により簡便に特徴づけられる。複合糖は、複合Ｃ６糖および複合Ｃ５糖の合計に対応する。ＷＳから得られた組成物、すなわち、ＨＷ１、ＨＷ２およびＨＦＷを考慮すると、以下のことが留意される：
−  ＨＷ１およびＨＷ２中の複合糖とリグニンとの比は、ＷＳ中の複合糖とリグニンとの比よりも低く、このことは、複合糖飢餓が加水分解において生じたことを反映する；
−  ＨＷ２中の複合糖とリグニンとの比は、ＨＷ１中の複合糖とリグニンとの比よりも低く、このことは、より高い酵素濃度において実施されたＨＷ２中のより効率的な加水分解を反映する；
−  ＨＦＷ中の複合糖とリグニンとの比は、ＨＷ２中の複合糖とリグニンとの比よりも低く、このことは、酵素が不活化および除去されず、加水分解が発酵の間に継続した事実に起因する。
【０１７９】
培養実験
酵素の産生のための宿主細胞の培養は、以下の実施例におけるとおり進行させた。それぞれの宿主細胞培養は、報告される実施例においてトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）およびペニシリウム・デカンベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）を宿主細胞として使用し、回収７日前に新たな胞子が播種されたＰＤＡプレートから回収された胞子溶液から出発した。
【０１８０】
実験を２つの工程に分割する：
１）特許請求される培養法の一部でない前培養および
２）宿主細胞を増殖させ、酵素を産生する宿主細胞培養。
【０１８１】
前培養
ＰＤＡプレートへの播種：
１．当技術分野において公知のとおり調製されたＰＤＡプレート（３．９％ジャガイモデキストロース寒天培地）中に、事前に回収した５００μＬの胞子溶液を分注した。
２．Ｐ．デカンベンス（Ｐ．ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）については５００μＬの無菌０．９％ＮａＣｌ溶液、またはＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）については１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を胞子上に分注し、表面が液体により全て被覆されるまでフラスコを穏やかに回転させた。
３．フラスコを綿栓により密閉し、アルミニウム箔により被覆し、Ｐ．デカンベンス（Ｐ．ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）については３０℃、またはＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）については２８℃において７日間インキュベートした。
【０１８２】
胞子溶液回収：
４．７日後、Ｐ．デカンベンス（Ｐ．ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）およびＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）について１０ｍＬの適切な無菌溶液（それぞれ０．９％ＮａＣｌおよび１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）をフラスコ中に分注した。
５．液体が混濁するまでフラスコを穏やかに回転させた。
６．可能な限り多くの容量の分注溶液を抜き取り、胞子懸濁液を無菌チューブ中に取り出した。
７．胞子溶液を４℃において貯蔵した。
【０１８３】
前培養設定工程
宿主細胞培養の開始前、前培養を設定することが必要であった。
【０１８４】
前培養培地は、宿主細胞培養相の容量に関して適切な容量（Ｐ．デカンベンス（Ｐ．ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）およびＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）についてそれぞれ１０分の１および１２分の１）を選択して表４に報告されるとおり調製した。
【０１８５】
【表４】
2015519916.tif 000006
【０１８６】
１．グルコースおよび胞子溶液は、滅菌後に添加した。胞子溶液容量は、Ｐ．デカンベンス（Ｐ．ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）については５０００ＣＦＵ／ｍｌおよびＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）については５００００ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度を得るように選択した。
【０１８７】
２．Ｐ．デカンベンス（Ｐ．ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）前培養物は３０℃において１７０ｒｐｍにおいて３０時間インキュベートした一方、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）前培養物は２８℃、１７０ｒｐｍにおいて６４時間インキュベートした。
【０１８８】
宿主細胞培養および酵素産生
宿主細胞培養環境を、表５に報告されるとおり調製する。
【０１８９】
【表５】
2015519916.tif 000007
【０１９０】
バイオマスは、本発明を実証するために調製された組成物（ＷＳ、ＡＲ、ＨＷ１、ＨＷ２、ＨＦＷ、ＨＦＡと示す）の群から選択する。
【０１９１】
１．滅菌後、ｐＨをＰ．デカンベンス（Ｐ．ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）については５．３に、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）については６．０に補正し、前培養容量を添加した。ｐＨは、様々なタイプの緩衝溶液（例えば０．１Ｍリン酸緩衝液）を使用してフラスコ中で制御する。
【０１９２】
２．宿主細胞培養および酵素産生は、それぞれの微生物について適切な温度および撹拌（Ｐ．デカンベンス（Ｐ．ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）については３０℃、１７０ｒｐｍ、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）については２８℃、１７０ｒｐｍ）において実施した。
【０１９３】
実験１
【０１９４】
【表６】
2015519916.tif 000008
【０１９５】
表６は、宿主細胞トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）にフィードするために使用された様々なリグノセルロース系バイオマスに対する活性を比較する。表において、「使用組成物」は、培養培地中で炭素原子源として使用されたバイオマスを示す。培地含有量は、ほぼ同一量のリグニンをそれぞれの培養環境中で提供するように計算した。それぞれの使用バイオマスは、複合糖とリグニンとの比の減少により特徴づけられるため、それぞれの培養培地中で使用される複合糖の量は、ＣＥ１からＷＥ３にかけて減少する。このことは、種々のタイプの宿主細胞のための方法を確立する。ＣＥ１活性は、表の第２欄において相対スケールで実験結果を表現するための参照として選択した。ＷＥ１、ＷＥ２およびＷＥ３実験は、唯一の炭素源が加水分解（ＨＷ１およびＨＷ２）および発酵（ＨＦＷ）前処理バイオマスから得られた組成物である培養培地を使用した。培養時間は全ての実験において同一であった（１６９時間）。
【０１９６】
実験結果は、前処理リグノセルロース系バイオマスを、前処理リグノセルロース系バイオマスから、複合糖の一画分を取り出すことにより得られた固体組成物により置換することができたことを明確に示す。さらに、糖飢餓リグノセルロース系バイオマスから得られた変換収率（産生される総活性と複合糖との比と定義）は、驚くべきことに、前処理リグノセルロース系バイオマスから得られたものよりも高く、この変換収率の増加は、表７に報告される結果により実証される。
【０１９７】
【表７】
2015519916.tif 000009
【０１９８】
実験２
さらなる実験において、複合糖含有率を有さず、または極めて低い複合糖含有率を有する様々な組成物を培養培地中で炭素源として使用した。
【０１９９】
ＣＥ２およびＣＥ３は、２つの異なる市販のリグニン試料を使用して生成した。ＣＥ２は、８％のＬｉｇｎｉｎ  ａｌｋａｌｉ  ｌｏｗ  ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ、コード４７１００３）を含有し、ＣＥ３は、８％のＬｉｇｎｉｎ  ａｌｋａｌｉ（Ｓｉｇｍａ、コード３７０９５９）を含有した。使用された市販のリグニンは、５％未満の複合糖含有率を有する。
【０２００】
酵素産生プロセス後、２つの異なるＷＥ３実験において使用された培養培地の残留物を、８０００ｒｐｍにおいて４℃において２０分間遠心分離し、２つの固体濃縮画分（それぞれＬＳ１およびＬＳ２と示す）を回収した。実験１からのＣＥ１を対照実験として報告する。
【０２０１】
ＬＳ１およびＬＳ２の組成を表３に含める。ＷＥ４およびＷＥ５培養培地は、リグニン含有率に関してＣＥ１よりも５倍多い材料を、ＬＳ１およびＬＳ２よりも２．５〜２．８倍多い材料をそれぞれ含有した。表３において証明されるとおり、ＬＳ１およびＬＳ２中の複合糖含有率は８％未満であり、培地に添加された複合糖の対応量を表に報告する。
【０２０２】
培養時間は１６９時間であった。
【０２０３】
【表８】
2015519916.tif 000010
【０２０４】
報告されたデータから明確なとおり、ＷＥ４およびＷＥ５の場合において、ＣＥ１の場合における複合糖の２０％に対応する複合糖量は、酵素産生を促進するために十分でない一方、ＣＥ１中で使用された複合糖の４５％の存在は、酵素の産生を増加させることが報告された（ＷＥ３実験）。
【０２０５】
実験３
ペニシリウム・デカンベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）を宿主細胞として使用して酵素を産生するためにさらなる実験を継続した。ＡＲ前処理バイオマスを炭素源として使用して比較例（ＣＥ４）を実施した一方、十分量のＨＦＡ組成物を添加してＣＥ４中で使用されたほぼ同一量のリグニンを提供してＷＥ６を実施した。培養時間は全ての実験について同一であった（１３８時間）。
【０２０６】
表９は、酵素産生の１３８時間後に得られた活性を報告する。実験は、ペニシリウム・デカンベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）を前処理または糖飢餓リグノセルロース系バイオマスのいずれの存在下で培養する場合も、少なくとも同一量の総酵素を産生することができたことを示す。
【０２０７】
【表９】
2015519916.tif 000011
【０２０８】
表９から明らかなことに、リグノセルロース系バイオマスの加水分解発酵から得られた糖飢餓固体組成物をフィードされた宿主細胞に由来する酵素は、前処理材料を使用して得られた比較例に由来するものと極めて近似する。
【０２０９】
実験４
麦稈固体組成物ＨＦＷに基づくＷＥ３において産生された酵素をさらに使用して麦稈前処理バイオマスＷＳを加水分解した。
【０２１０】
前処理バイオマスを水と混合して７．５％の乾物含有率を有する混合物を得、混合物を１００ｍｌのフラスコ中に挿入した。ＷＥ３中で増殖させた酵素混合物を、ＷＥ７およびＷＥ８実験における前処理バイオマスのグルカン１ｇ当たり６０および９０ｍｇのタンパク質においてそれぞれ投入し、加水分解をｐＨ５．０および５０℃において７２時間実施した。市販の酵素溶液を生産業者の仕様書に従って使用してＣＥ５実験を実施した。
【０２１１】
グルコースおよびキシロース濃度を６、２４、４８および７２時間において計測し、表１０に報告する。放出されたグルコースおよびキシロースをＷＳ前処理バイオマス中のグルカンおよびキシランの初期量に対して報告してグルカン加水分解収率およびキシラン加水分解収率を定量した。図１は、グルカン加水分解収率（図１ａ）およびキシラン加水分解収率（図１ｂ）のグラフを報告する。これらの実験により、本開示により産生された酵素は、前処理リグノセルロース系バイオマスの効率的な加水分解に使用することができることが明らかになる。
【０２１２】
【表１０】
2015519916.tif 000012
【０２１３】
分析法
活性測定
酵素活性を測定する産業公知方法を使用してＦＰＵ（ろ紙分解活性）、ベータ−グルコシダーゼおよびキシラナーゼ活性を測定した。違いは、ろ紙がＦＰＵのための基質であり、下記のサリシンおよびキシラン混合物をベータ−グルコシダーゼおよびキシラナーゼ活性アッセイとして使用したことである。
【０２１４】
【表１１】
2015519916.tif 000013
【０２１５】
組成測定
組成を、以下のＮＲＥＬ規格に従って実施した。
【０２１６】
ＮＲＥＬ分析法
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｌｉｇｎｉｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｍａｓｓ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＬＡＰ）Ｉｓｓｕｅ  Ｄａｔｅ：４／２５／２００８
Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６１８  Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ａｐｒｉｌ  ２００８
【０２１７】
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍａｓｓ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＬＡＰ）Ｉｓｓｕｅ  Ｄａｔｅ：７／１７／２００５
Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６１９  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００８
【０２１８】
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｍｐｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＬＡＰ）Ｉｓｓｕｅ  Ｄａｔｅ：９／２８／２００５
Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６２０  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００８
【０２１９】
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｏｌｉｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｔｏｔａｌ  Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  Ｓｏｌｉｄｓ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓａｍｐｌｅｓ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＬＡＰ）Ｉｓｓｕｅ  Ｄａｔｅ：３／３１／２００８
Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６２１  Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｍａｒｃｈ  ２００８
【０２２０】
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｓｈ  ｉｎ  Ｂｉｏｍａｓｓ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＬＡＰ）Ｉｓｓｕｅ  Ｄａｔｅ：７／１７／２００５
Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６２２  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００８
【０２２１】
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｇａｒｓ，Ｂｙｐｒｏｄｕｃｔｓ，ａｎｄ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓａｍｐｌｅｓ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＬＡＰ）Ｉｓｓｕｅ  Ｄａｔｅ：１２／０８／２００６
Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６２３  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００８
【０２２２】
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  Ｓｏｌｉｄｓ  ｉｎ  Ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ  Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＬＡＰ）Ｉｓｓｕｅ  Ｄａｔｅ：０３／２１／２００８
ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６２７  Ｍａｒｃｈ  ２００８
【図１ａ】
2015519916.tif 000014
【図１ｂ】
2015519916.tif 000015
【国際調査報告】
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