(57)【要約】トリブロックコポリマーマトリックスＡ−Ｂ−Ａ（ここで、Ａは、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）又はポリラクチド（ＰＬＡ）から選択され、Ｂは、ポロキサマー又はポロキサミンである）を有するミクロスフィアコアを含む細胞運搬ミクロスフィア組成物であって、該ミクロスフィアコアが細胞接着コーティングでコーティングされており、該細胞接着コーティングに結合した全細胞又は細胞フラグメントをさらに含む細胞運搬ミクロスフィア組成物、細胞運搬ミクロスフィア組成物の調製方法、並びにそれらの用途。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリブロックコポリマーマトリックスＡ−Ｂ−Ａ（ここで、Ａは、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）又はポリラクチド（ＰＬＡ）から選択され、Ｂは、ポロキサマー又はポロキサミンである）を有するミクロスフィアコアを含む細胞運搬ミクロスフィア組成物であって、該ミクロスフィアコアが細胞接着コーティングでコーティングされており、該細胞接着コーティングに結合した全細胞又は細胞フラグメントをさらに含む、細胞運搬ミクロスフィア組成物。
【請求項２】
Ａがポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）である、請求項１に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物。
【請求項３】
Ｂがポロキサマーである、請求項１又は２に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物。
【請求項４】
トリブロックコポリマー中のポロキサマー又はポロキサミンの割合が２〜４０重量％である、請求項１又は２に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物。
【請求項５】
全細胞を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物。
【請求項６】
ミクロスフィア内に埋め込まれた有効成分をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物。
【請求項７】
有効成分がタンパク質である、請求項６に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物。
【請求項８】
細胞接着コーティングがフィブロネクチン及びポリ−Ｄ−リシンを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物。
【請求項９】
請求項１〜５及び８のいずれか一項に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物を調製するための方法であって、
−  トリブロックコポリマーマトリックスＡ−Ｂ−Ａ（ここで、Ａは、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）又はポリラクチド（ＰＬＡ）から選択され、Ｂは、ポロキサマー又はポロキサミンである）を有するミクロスフィアコアを提供すること、
−  該ミクロスフィアを細胞接着化合物で完全に又は部分的にコーティングすること、及び
−  全細胞又は細胞フラグメントを含む細胞運搬ミクロスフィア組成物を得るために、全細胞又は細胞フラグメントを、細胞接着表面を提示するミクロスフィアと接触させること
からなる工程を含む、方法。
【請求項１０】
請求項６、７及び８のいずれか一項に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物を調製するための方法であって、
−  Ａ−Ｂ−Ａ（好ましくは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）−ポロキサマー−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド））トリブロックコポリマーのポリマー溶媒（好ましくは、有機溶媒）溶液を提供すること、
−  有効成分（好ましくは、タンパク質）を提供すること、
−  該有効成分を該Ａ−Ｂ−Ａトリブロックコポリマー溶液に追加し、乳化又は懸濁すること（好ましくは、タンパク質の場合には該有効成分を懸濁すること）、
−  界面活性剤を含有する水相中で、該Ａ−Ｂ−Ａトリブロックコポリマー溶液を乳化すること、
−  該ポリマー溶媒を除去し、それにより、該有効成分が埋め込まれたマトリックスを形成するミクロスフィアを得ること、
−  該ミクロスフィアを単離すること、
−  このようにして得られたミクロスフィアを細胞接着化合物で完全に又は部分的にコーティングすること、及び
−  全細胞又は細胞フラグメントを含む細胞運搬持続放出ミクロスフィア組成物を得るために、全細胞又は細胞フラグメントを、細胞接着表面を提示するミクロスフィアと接触させること
からなる工程を含む、方法。
【請求項１１】
ヒト又は動物の体の治療処置方法に使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物。
【請求項１２】
変性疾患の治療処置方法に使用するための、変性疾患を処置するのに有効な全細胞又は細胞フラグメントを含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物を、薬学的に許容しうる担体並びに場合により他の治療及び／又は予防成分と共に含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞運搬ミクロスフィア組成物、その調製方法及びそれらの用途に関する。
【０００２】
発明の背景
国際公開第03092657号は、生体適合性かつ生体分解性の材料に基づく微粒子に関する。その表面は関心対象の細胞又はそのフラグメントを含み、前記細胞又は微粒子の埋め込み時のそれらの環境に対して有効な少なくとも１つの活性物質の分子であって、コントロールされた持続的な方法で微粒子によって放出される分子をさらに含む。
【０００３】
自己又は非自己前駆体又は成熟細胞を移植することによる細胞療法は、罹患器官を修復するための有望な戦略である。また、幹細胞生物学の最近の発展は、さらなる刺激を細胞ベースの治療に提供している。いくつかのチームは、損傷組織を修復するために、胚性幹細胞、成体幹細胞、組織由来幹細胞又はより最近では誘導多能性幹細胞を使用している。この状況において、成体幹細胞、特に多能性間葉系間質細胞とも命名された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、それらの安全性、異なる組織からの相対的なアクセシビリティ及び自己移植を行う可能性により、組織工学にとって魅力的な細胞源と思われる。実際、これらの幹細胞は、それらの固有の分化能により、筋骨格組織工学及び再生用途に使用され成功している。それらはまた、特定の条件下で、ニューロン様細胞又は内皮様細胞などの他の細胞系統に分化することができる。また、間葉系幹細胞は損傷組織に移行できることが公知であり、それらの修復特性のいくつかは、それらの免疫調節作用を含むパラクリン機構によって媒介される。しかしながら、移植後に細胞の大部分は死亡するか、又は分化表現型に既に誘導された場合にはこの誘導表現型を維持していない。従って、わずかな細胞数及びその挙動の望ましくない改変により、組織修復過程は非効率的であり、細胞はホストの環境と正しく融合しない。治療における効率的な使用のためには、移植後における細胞の生着（すなわち、特に、細胞の短期のさらには長期の生存及び機能状態）を改善する必要がある。
【０００４】
成長因子及び分化因子は細胞の生存及び分化を改善し得、さらに、周囲環境に影響を与えることによってより良好な移植片の融合を可能にし得る。様々な成長因子、サイトカイン又はモルフォゲンが、ＭＳＣの分化を指令するのに広く使用されている。それにもかかわらず、これらの因子の投与には、それらの短い半減期、多面的作用及びそれらの生物学的障壁を通じた限定的な通過に起因する技術的な課題が依然としてある。従って、これらの因子のための送達担体、例えば、ナノデバイス又はマイクロデバイスの使用は、現在のところ、例えば、タンパク質を保護し、かつタンパク質のコントロールされた持続放出を可能にするための重要な選択肢である。
【０００５】
サイトカインに加えて、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の組成及び微小環境の三次元性を含むいくつかのパラメータは、ヒト間葉系幹細胞の生存及び分化に強く影響を与えることが示されている。これに関して、ＥＣＭ表面を提供する足場が、例えば、脳のニューロン修復のために開発されている（Delcroix et al Biomaterials 2011）。
【０００６】
この状況において、魅力的な戦略は、in vivoで細胞に適切な微小環境を提供することによって、幹細胞を運搬して移植幹細胞の生着を刺激する埋め込み可能な小型の薬理学的に活性な足場内でこれらの関連パラメータを提供することである。
【０００７】
本発明者らは、好ましくは活性分子を連続的に放出するように設計された生体適合性かつ生体分解性のミクロスフィアである薬理学的に活性なミクロキャリア（コーティングミクロスフィア）であって、輸送される細胞に三次元構造を供給する細胞外マトリックス分子又は細胞接着分子を備える細胞接着表面を提示する薬理学的に活性なミクロキャリアについて調査した。１つの小型ミクロキャリア内で組み合わさったこれらのパラメータは、輸送される細胞及び周囲組織に対して作用する。細胞及びタンパク質を送達するこの固有かつ簡単なデバイスの構想の証明は、異なる細胞接着表面（ラミニン、フィブロネクチン、ポリ−Ｄ−リシン）及び／又は成長因子（ＮＧＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ−３）を有するコーティングミクロスフィアに結合した神経細胞株、神経前駆細胞及び成体幹細胞を使用した、神経障害を処置するための神経保護及び組織修復について最初に立証されている（Tatard et al 2004, Tatard et al 2007, Delcroix et al 2011, Garbayo et al 2011）。さらに、軟骨修復のための効率的な支持体を提供することを目的として、ヒト間葉系幹細胞が結合した薬理学的に活性なトランスフォーミング成長因子３（ＴＧＦ−β３）放出ミクロキャリアは、in vitro及びin vivoでそれらの軟骨細胞分化を誘導することが示された［Bouffi C, et al. The role of pharmacologically active microcarriers releasing TGF-β3 in cartilage formation in vivo by mesenchymal stem cells. Biomaterials. 2010;31:6485-931］。そうとは言え、これらの薬理学的に活性なポリ（Ｄ，Ｌラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）ミクロキャリアは、放出時のタンパク質−ポリマーの相互作用のために、ＴＧＦ−β３をわずかな量で、かつ不完全に放出し（３０日間で生物活性タンパク質の２５％）、タンパク質の不安定性をもたらした。これらの高活性な治療用タンパク質を生理学的なレベルで正確に送達するために、低容量のカプセル化ローディングで機能させることを不可欠とすることによって相互作用が増強される。この問題を回避する試みでは、親水性セグメントのポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）がＰＬＧＡのような疎水性ポリエステルに導入されて、トリブロックコポリマーミクロスフィアが形成された。ＰＥＧセグメントの存在は水の取り込みを増加させるので、タンパク質放出がより高くなる（TRAN et al. European Journal of Pharmaceutical Sciences 45 (2012) 128-137）。
【０００８】
本発明の目的は、既存の製品及び方法の前記欠点を取り除くか、又はこれらを少なくとも実質的に軽減することである。
【０００９】
発明の概要
今回、本出願人は、特定のトリブロックコポリマーを基礎としたコーティングされたミクロスフィア組成物によって運搬される全細胞又は細胞フラグメントの数が大幅に増加したことを発見した。加えて、特定のトリブロックコポリマーの使用は、全細胞の数を増加させる。さらに、コーティングの性質は、コーティングされたミクロスフィア組成物によって運搬される全細胞又は細胞フラグメントの数を増加させ、細胞分化に影響を与え得る。加えて、特定のトリブロックコポリマーは、有効成分、好ましくはタンパク質を埋め込むことができ、顕著な有効成分高放出特性を有する持続放出マトリックス組成物を提供する。従って、前記マトリックス組成物に連結された関心対象の全細胞又はそのフラグメントは有効成分と相互作用し得るので、より優れた有効性の全細胞又はフラグメントが得られる。
【００１０】
好ましい実施態様の説明
従って、本出願の主題は、トリブロックコポリマーマトリックスＡ−Ｂ−Ａ（ここで、Ａは、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）又はポリラクチド（ＰＬＡ）から選択され、Ｂは、ポロキサマー又はポロキサミンである）を含むミクロスフィアコアを含む細胞運搬ミクロスフィア組成物であって、該ミクロスフィアコアが細胞接着コーティングでコーティングされており、該細胞接着コーティングに結合した全細胞又は細胞フラグメントをさらに含む細胞運搬ミクロスフィア組成物である。
【００１１】
好ましいトリブロックコポリマーマトリックスは、
ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）−ポロキサマー−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）、
ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）−ポロキサミン−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）
及びポリ（ラクチド）−ポロキサマー−ポリ（ラクチド）、特にポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）−ポロキサマー−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）
である。
【００１２】
ミクロスフィアは、マイクロメートル範囲、典型的には１μm〜１０００μm、好ましくは５μm〜５００μm、詳細には１０μm〜２５０μm、詳細には２５μm〜１５０μm、より詳細には５０μm〜８０μmの直径を有する小さなほぼ球状の粒子である。
【００１３】
Ａ−Ｂ−Ａコポリマー、より具体的にはポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）−ポロキサマー−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）は、トリブロックコポリマーである。
【００１４】
好ましい第１のブロックは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）である。
【００１５】
第２の好ましいブロックは、ポロキサマー又はポロキサミン、好ましくはポロキサマーである。ポロキサマーは、それ自体が非イオン性トリブロックコポリマーである。１，０００〜３，５００g/mol、好ましくは１，０００〜２０００g/molのポリオキシプロピレン質量及び４０〜９０％、好ましくは８０〜８５％のポリオキシエチレン含有量を有するポロキサマーが好ましく、より詳細にはポロキサマー１８８である。ポロキサマー１８８は、８，４００の平均分子量及び約８０重量％のオキシエチレンを有する。
【００１６】
トリブロックコポリマーの混合物が使用され得る。
【００１７】
ＰＬＧＡ−ポロキサミン−ＰＬＧＡトリブロックは、４個のＰＬＧＡ分子が単一のポロキサミン分子に結合したコポリマーブロック構造を有し得る。
【００１８】
トリブロックコポリマー中のポロキサマー又はポロキサミンの割合は、０．４〜４０重量％、好ましくは８〜２０重量％である。
【００１９】
２，０００〜２０，０００g/mol、好ましくは２，０００〜１５，０００g/mol、より好ましくは７，０００〜１０，０００g/molのポロキサマー分子量及び０．４〜５０％、好ましくは８〜２０％、より好ましくは９〜１２％のポロキサマー含有量を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）−ポロキサマー−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）トリブロックコポリマーが特に好ましい。
【００２０】
本発明の細胞運搬ミクロスフィア組成物は、関心対象の細胞を運搬するのに有用である。細胞、すなわち、細胞フラグメント又は好ましくは全細胞、より好ましくは機能的全細胞は、細胞接着表面コーティングを介してミクロスフィアと相互作用する。
【００２１】
本発明によれば、全細胞又は細胞フラグメントは、前記ミクロスフィア組成物に間接的に結合される。本出願では、「細胞接着表面コーティング」は、細胞接着を増強する細胞外マトリックス分子若しくは細胞接着分子又は前記分子のフラグメント若しくは分子のフラグメントを含むか、又はこれらからなる表面を意味する。この細胞接着表面コーティングはまた、細胞機能、特に増殖又は生存又はより具体的には分化を改変し得る。ミクロスフィア組成物は、この目的のために、ポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−リシン、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸トリペプチド（ＲＧＤ）、ポリオルニチン、ポリエチレンアミン、他の合成分子、例えば、フィブロネクチン様化合物、又は細胞外マトリックス分子（フィブロネクチン（ＦＮ）、ラミニン、コラーゲン）又は細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ、セレクチン）又は細胞外マトリックス分子若しくは細胞接着分子のフラグメントからなる群より選択されるものを含む細胞接着又は機能（例えば、生存又は分化）を増強する化合物で完全にコーティングされるか若しくは部分的にコーティングされるか、又は別の方法によって得られる細胞接着表面を提示する。単一化合物又はこのような化合物の混合物が使用され得る。フィブロネクチン様化合物は、例えば、ＳＩＧＭＡから市販されている。
【００２２】
細胞は、好ましくは６０−４０の比で好ましくはフィブロネクチン及びポリ−Ｄ−リシンを含むコーティングによって、細胞運搬ミクロスフィアの表面に結合される。
【００２３】
ミクロスフィアに対する全細胞又は細胞フラグメントの結合機構は、異なる性質のものでもよい。細胞付着は、分子間力によって、例えば、イオン力（例えば、カチオン性ポリ−Ｄ−リシン）、ファンデルワールス力又は水素結合によって得られ得る。細胞接着は、従来のリガンド−受容体結合に従って、細胞表面上に存在する受容体（例えば、細胞表面上のインテグリン及び細胞接着コーティング上に存在するＦＮ又はラミニンのような細胞外マトリックス分子、又は細胞表面上の細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）及び細胞接着コーティング上に存在するＮ−ＣＡＭ）を介して特に得られ得る。
【００２４】
細胞、好ましくはヒト細胞は、例えば、成体自己細胞、胎児細胞、トランスフォーメーション又は非トランスフォーメーション細胞株、幹細胞、多能性（multipotent）
又は多能性（pluripotent）細胞、再プログラム化細胞であり得る。これらの細胞は、再生医療における様々な疾患に使用され得る。
【００２５】
これは、例えば、糖尿病処置のための肝細胞及びランゲルハンス島の移植の場合である。
【００２６】
神経移植の場合、細胞は、ドーパミンを分泌することができるＰＣ１２細胞株であり得、ＮＧＦの作用下で交感神経ニューロン様に分化し得る。細胞の他の例としては、肝臓、心筋、中枢神経系の修復のための細胞移植、ランゲルハンス島の移植に使用される細胞、骨髄細胞、成体細胞、胎児細胞、再プログラム化細胞、トランスフォーメーション又は非トランスフォーメーション細胞株、幹細胞、遺伝子改変細胞、複製欠損性リコンビナントウイルスを産生する細胞、肝細胞、膵島細胞、神経細胞、筋細胞、造血細胞、骨細胞が挙げられる。
【００２７】
他の適切な細胞は、トランスジーンを含有する細胞、近隣のホスト細胞に感染する複製欠損性リコンビナントウイルスを産生する細胞のような、in vivo遺伝子導入のための細胞である。
【００２８】
「細胞フラグメント」は、全細胞の薬理学的に活性な部分を意味する。薬理学的に活性な細胞フラグメントは、例えば、細胞膜を破壊して細胞内容物を放出させる超音波処理によって、又は酵素ベースの破壊によって、全細胞から得られ得る。従来の試験により、所望の薬理学的効果が維持されるかを評価することが可能になる。同じミクロスフィアは、全細胞及び細胞フラグメントを含み得る。
【００２９】
当業者であれば、用語「ａ」が、本明細書で「少なくとも１つ」又は「１つ又はいくつか」を意味する場合を容易に理解することができる。例えば、ミクロスフィアコアが細胞接着コーティングでコーティングされることが文中で示されている場合には、「少なくとも１つの細胞接着コーティング」を意味し、又は本発明のミクロスフィア組成物がミクロスフィア内に有効成分を含むことが文中で示されている場合には、「少なくとも１つの有効成分」を意味する。
【００３０】
本発明の好ましい細胞運搬ミクロスフィア組成物は、ミクロスフィア内に埋め込まれた有効成分を含む。有効成分は、コポリマーマトリックス中に埋め込まれている。従って、溶解中の有効成分は、コポリマーを通る水で満たされた孔を通じた拡散によって、又はカプセル化コポリマーの溶解によって脱出する方法を見つけなければならない。コアは、顕著な有効成分高放出特性を有する持続放出マトリックス組成物を提供する。
【００３１】
有効成分はまた、ミクロスフィアの表面上に存在し得る。
【００３２】
有効成分（好ましくは、タンパク質）は、in vitro又はin vivoにおける細胞の増殖及び分化をコントロールするか、又はそれらの組織環境をモデュレーションする（免疫学的拒絶現象を回避する、血管新生を促進する）可能性を提供する。有効成分はまた、細胞フラグメントの効果をコントロールする可能性を提供する。
【００３３】
関心対象の細胞を運搬する持続放出ミクロスフィア組成物の場合、有効成分は、好ましくは、細胞又はそれらの作用をモデュレーションする活性剤である。前述のように、モデュレーションは、好ましくは、これらの細胞の増殖若しくは分化又は組織環境の改変である。
【００３４】
従って、有効成分、好ましくはタンパク質は、有利には、免疫調節剤、例えば、サイトカイン、好ましくはインターロイキン、又は前記細胞の生存に寄与してそれらの機能を経時的に拡張する因子、例えば、成長因子、好ましくはニューロトロフィン、トランスフォーミング成長因子を含む骨形成タンパク質拡大ファミリー、又はモルフォゲンのようなタンパク質性の若しくはレチノイン酸のような非タンパク質性の分化誘導因子を含む。
【００３５】
反対に、有効成分は、細胞に輸送されてその死亡及び廃棄をプログラミングする毒性分子、例えば、Ｆａｓリガンドであり得る。
【００３６】
従って、タンパク質有効成分は、有利には、酵素、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、抗体フラグメント、凝固因子、又は細胞に対して作用するか若しくはそれらの組織環境を変化させることが公知の他のタンパク質である。
【００３７】
タンパク質有効成分としては、より詳細には、ニューロトロフィン、例えば、ＮＧＦ、ＢＮＤＦ、ＮＴ−３など、ＴＧＦｆｉｓ  ＧＤＮＦファミリー、ＦＧＦ  ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、インターロイキン、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ケモカイン、レチノイン酸、エリスロポエチンなど、又はそれらの混合物からなる群より選択されるものを含む成長因子、サイトカイン又は細胞分化に影響を与える免疫調節因子が挙げられる。
【００３８】
用語「タンパク質」有効成分は、ポリペプチド及びオリゴペプチド有効成分を含む。
【００３９】
好ましい有効成分は、細胞の生存、機能を促進するか、又は決められた表現型への幹細胞の分化を指令する。
【００４０】
それらはまた、免疫反応及び移植片拒絶を軽減するか、又は血管新生の増加による統合を促進することによって、組織環境を変化させ得る。
【００４１】
本組成物に使用される有効成分はまた、成長因子などのこれらの成分に応答するプロモーターのコントロール下にある遺伝子改変細胞中に存在する遺伝子の発現をコントロールするのに使用され得る。
【００４２】
タンパク質有効成分は、好ましくは、ナノ粒子として使用される。それらは、特に、ナノ析出によって得られる。
【００４３】
より従来型の非タンパク質性有効成分としては、例えば、抗酸化分子（ビタミン、フラボノイド）、化学療法薬（５−ＦＵ、ＢＣＮＵ、ドセタキセル、パクリタキセル．．．）、放射線増感薬、例えば、（５−ヨード−２’−デオキシウリジン（Ｉｄｕｒｄ．．．）が挙げられる。
【００４４】
本発明の主題はまた、上に定義した細胞運搬ミクロスフィア組成物を調製するための方法であって、
−  トリブロックコポリマーマトリックスＡ−Ｂ−Ａ（ここで、Ａは、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）又はポリラクチド（ＰＬＡ）から選択され、Ｂは、ポロキサマー又はポロキサミンである）を含むミクロスフィアコアを提供すること
−  該ミクロスフィアを細胞接着化合物で完全に又は部分的にコーティングすること、及び
−  全細胞又は細胞フラグメントを含む細胞運搬ミクロスフィア組成物を得るために、全細胞又は細胞フラグメントを、細胞接着表面を提示するミクロスフィアと接触させること
からなる工程を含む方法である。
【００４５】
本発明を実施するのに好ましい条件下では、細胞接着表面は、例えば、合成接着ペプチド（例えば、ポリリシン）又はＲＧＤ様ペプチド（例えば、ＲＧＤ）又は細胞外マトリックス分子のペプチド（例えば、ＩＫＶＡＶ）又は細胞接着分子のペプチド（例えば、ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥ）をミクロスフィアの表面上に移植することによるポリマーマトリックスの化学的表面改変によって得られる。
【００４６】
本発明のさらなる主題はまた、トリブロックコポリマー中に埋め込まれた有効成分（好ましいは、タンパク質）をさらに含む上に定義した細胞運搬ミクロスフィア組成物を調製するための方法であって、
−  Ａ−Ｂ−Ａ（好ましくは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）−ポロキサマー−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド））トリブロックコポリマーのポリマー溶媒（好ましくは、有機溶媒）溶液を提供すること、
−  有効成分（好ましくは、タンパク質）を提供すること、
−  該有効成分を該Ａ−Ｂ−Ａトリブロックコポリマー溶液に追加し、乳化又は懸濁すること（好ましくは、タンパク質の場合には該有効成分を懸濁すること）、
−  界面活性剤を含有する水相中で、該Ａ−Ｂ−Ａトリブロックコポリマー溶液を乳化すること、
−  該ポリマー溶媒を除去し、それにより、該有効成分が埋め込まれたマトリックスを形成するミクロスフィアを得ること、
−  該ミクロスフィアを単離すること、
−  このようにして得られたミクロスフィアを細胞接着化合物で完全に又は部分的にコーティングすること、及び
−  全細胞又は細胞フラグメントを含む持続放出ミクロスフィア組成物を得るために、全細胞又は細胞フラグメントを、細胞接着表面を提示するミクロスフィアと接触させること
からなる工程を含む方法である。
【００４７】
上記本発明の方法を実施するのに好ましい他の条件下では、コーティング工程は、懸濁液中で、コーティングの細胞接着化合物をミクロスフィアと適切な割合で混合することによって実施され得る。コーティングは、好ましくは、接着化合物をミクロスフィア上に吸着させることによって得られる。
【００４８】
上記本発明の方法を実施するのに好ましいさらに他の条件下では、接着工程は、細胞懸濁液をコーティングミクロスフィア懸濁液と適切な割合で混合することによって実施され得る。
【００４９】
コーティングＡ−Ｂ−Ａ（好ましくは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）−ポロキサマー−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド））マトリックス内に埋め込まれた有効成分（好ましいは、タンパク質）を含む持続放出ミクロスフィア組成物であって、全細胞又は細胞フラグメントをさらに含む持続放出ミクロスフィア組成物がこのようにして得られる。
【００５０】
ミクロスフィアは、細胞接着若しくは細胞機能（例えば、生存）又はその両方を増強する化合物で完全にコーティングされ得るか若しくは部分的にコーティングされ得るか、又は別の方法によって得られる細胞接着表面を示し得る。
【００５１】
溶媒は、トリブロックコポリマーの任意の適切な溶媒、好ましくは有機溶媒、特に塩化メチレンとアセトン又はグリコフロールとの注射可能な混合溶媒であり得る。
【００５２】
タンパク質有効成分は、好ましくは、ナノ析出によって予め得られる。従って、コポリマーとタンパク質との間の相互作用は減少される。タンパク質は、アルブミンなどの添加剤によって安定化される必要はない。
【００５３】
有機溶媒の除去は、例えば、抽出培地、好ましくは水の追加によって行われる。
【００５４】
このようにして得られたミクロスフィアは、好ましくは、ろ過などの物理的分離によって単離される。
【００５５】
さらに、単離されたミクロスフィアは、好ましくは、凍結乾燥される。
【００５６】
使用される特定のトリブロックコポリマーにより、本発明の少なくとも１つの有効成分を含む細胞運搬ミクロスフィア組成物は、有利な特性を有する。
【００５７】
以下に示されているように、使用される特定のトリブロックコポリマーは、興味深い量の結合した全細胞又は細胞フラグメントを有する組成物を提供する。
【００５８】
特定のトリブロックコポリマーの使用はまた、全細胞の数を増加させる。
【００５９】
さらに、コーティングの性質は、コーティングされたミクロスフィア組成物によって運搬される全細胞又は細胞フラグメントの数を増加させ得、細胞分化に影響を与え得る。
【００６０】
加えて、特定のトリブロックコポリマーは、有効成分、好ましくはタンパク質を埋め込むことができ、コントロールされた放出プロファイル及びさらに有効成分高放出の顕著な特性を有する持続放出マトリックス組成物を提供する。従って、前記マトリックス組成物に連結された関心対象の全細胞又はそのフラグメントは、有効成分と相互作用し得るので、全細胞又はフラグメントの優れた有効性が得られる。
【００６１】
ミクロスフィアのトリブロックコポリマーは生体適合性であり、ヒトの体内に再吸収され得る。
【００６２】
上記細胞運搬ミクロスフィア組成物は、前記ミクロスフィアが関心対象の全細胞又はそのフラグメントをそれらの表面上に提供し、場合により、前記細胞若しくはそれらの環境に対して有効な少なくとも１つの成分、及び／又は持続的かつコントロールされた放出によって微粒子から放出される有効成分も含む組成物の調製に使用され得る。
【００６３】
これは、本発明のさらなる目的が、ヒト又は動物の体の治療処置方法に使用するための、関心対象の全細胞又はそのフラグメントを提供する、上に定義したコーティングされた細胞運搬ミクロスフィア組成物である理由である。
【００６４】
本発明のさらなる目的は、ヒト又は動物の体の治療処置方法に使用するためのコーティングされた細胞運搬ミクロスフィア組成物であって、前記ミクロスフィアが関心対象の全細胞又はそのフラグメントをそれらの表面上に提供し、前記細胞若しくはフラグメント又は上に定義したそれらの環境に対して有効な成分をさらに含むコーティングされた細胞運搬ミクロスフィア組成物である。
【００６５】
より具体的には、本発明のさらなる目的は、変性疾患、好ましくは神経変性疾患（パーキンソン、ハンチントン、アルツハイマー．．．）、脊髄損傷、変形性関節症疾患（変形性関節症、外傷後変形性関節症）、虚血性疾患（脳虚血、勃起機能不全、尿失禁、末梢四肢虚血）、腎機能不全の治療処置方法に使用するための細胞運搬ミクロスフィア組成物であって、前記ミクロスフィアが関心対象の全細胞又はそのフラグメントをそれらの表面上に提供し、前記全細胞若しくはフラグメント又は上に定義したそれらの環境に対して有効な成分も含む細胞運搬ミクロスフィア組成物である。
【００６６】
それらの治療的使用の観点から、上記組成物は、好ましくは、医薬組成物として製剤化される。
【００６７】
従って、本発明は、本発明の細胞運搬ミクロスフィア組成物を、薬学的に許容しうる担体並びに場合により他の治療及び／又は予防成分と共に含む医薬組成物を含む。
【００６８】
一般に、本発明の細胞運搬ミクロスフィア組成物は、類似用途に使用される薬剤について認められている投与様式のいずれかによって、治療有効量で投与される。適切な投与量範囲は、処置するべき疾患の重症度、被験体の年齢及び相対的健康、使用される有効成分又は細胞若しくはフラグメントの効力、投与経路及び投与形態、並びに投与が対象とする兆候などのいくつかの要因に依存する。このような疾患を処置する分野の当業者であれば、過度の実験を伴わずに、個人的な知識及び本出願の開示に依拠して、所定の疾患に対する本発明の化合物の治療有効量を確認することができるであろう。
【００６９】
本発明の細胞運搬ミクロスフィア組成物は、通常、非経口投与に適切なものを含む医薬製剤として投与される。
【００７０】
本発明の細胞運搬ミクロスフィア組成物は、１つ以上の従来のアジュバント、担体又は希釈剤と共に、医薬組成物及び単位投与量の形態になされ得る。医薬組成物及び単位剤形は、さらなる活性化合物又は有効成分の有無にかかわらず、従来の割合で従来の成分を含み得、単位剤形は、用いられるべき目的の１日投与量範囲に応じた任意の適切な有効量の有効成分を含有し得る。
【００７１】
細胞運搬ミクロスフィア組成物は、特に、非経口使用のための滅菌注射用調製物の形態で用いられ得る。
【００７２】
非経口投与又は局所投与の場合（例えば、注射、好ましくは、ボーラス注射又は定位注射による）、有無にかかわらず、本発明の細胞運搬ミクロスフィア組成物を製剤化して、処方剤又は添加剤の有り又は無しで、アンプル、ボトル、プレフィルドシリンジ、小容量の輸液中に単位剤形で、又は複数回投与容器で提供し得る。
【００７３】
組成物は、油性又は水性ビヒクル中で懸濁液のような形態をとり得る。非水性又は油性の希釈溶媒又はビヒクルの例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油、及び注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられ、処方剤、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤又は懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散剤を含有し得る。あるいは、細胞運搬ミクロスフィア組成物は、滅菌固体の無菌単離によって、又は適切なビヒクル、例えば、滅菌発熱性物質除去蒸留水を用いて使用前の構成用溶液から凍結乾燥することによって得られる粉末形態であり得る。
【００７４】
上記細胞運搬ミクロスフィア組成物を実施するのに好ましい条件はまた、想定される上記本発明の他の主題、特に、細胞と共に提供される細胞運搬ミクロスフィア組成物、上記方法及び医薬製剤に適用される。例えば、すべての場合において、使用される有効成分は、好ましくはタンパク質である。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、コーティングを有する非ローディングミクロスフィアを示す。
【図２】図２は、光学顕微鏡（Ａ）及び走査型電子顕微鏡（Ｂ）を使用して評価した非ローディングコーティングミクロスフィア（調製１０）の表面への細胞接着を示す。
【図３】図３は、トリブロックコポリマー（ポリマーフィルム）上のフィブロネクチン細胞接着表面の半定量的蛍光強度をＰＬＧＡと比較して示す。
【図４】図４は、インキュベーションの４時間後における、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡミクロスフィア、ＰＬＧＡ又はＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡコーティングミクロスフィア（フィブロネクチン／ＰＤＬ細胞接着表面を有するミクロスフィア）上に接着したｈＭＳＣの数を示すグラフである。
【図５】図５は、ＰＬＧＡ又はＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡと配合したコーティングミクロスフィア上のｈＭＳＣの数を時間の関数として示す。
【図６】図６は、ミクロスフィアからのリゾチームのin vitro放出（Ａ）及び放出培地緩衝液（５００μlのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．０５Ｍ）のｐＨ（Ｂ）を７日間隔で測定した結果を示す。
【図７】図７は、ＰＬＧＡ＋Ｐ１８８  １：１０、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ＋Ｐ１８８  １：１０、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ＋Ｐ１８８  １：２０ミクロスフィアからの生物活性リゾチームの時間対累計放出を示すグラフである。
【図８】図８は、ＰＬＧＡ＋Ｐ１８８  １：１０、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ＋Ｐ１８８  １：１０及びＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ＋Ｐ１８８  １：２０のいずれかから構成されるミクロスフィアからの全ＴＧＦ−β３及び生物活性ＴＧＦ−β３の累計放出を示すグラフである。
【図９】図９は、ＴＧＦｂ３放出性又はＴＧＦｂ３非放出性のＰＬＧＡコーティングミクロスフィア又はＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡコーティングミクロスフィアと共にin vitro培養したｈＭＳＣの軟骨細胞分化を示す。軟骨細胞マーカー（Ａ）、脂肪生成（adypogenic）マーカー（Ｂ）及び骨形成マーカー（Ｃ）の発現。
【図１０】図１０は、非ローディングコーティングミクロスフィア（Ａ、Ｄ）、ＴＧＦｂ３コーティングミクロスフィアＰＬＧＡ（Ｂ、Ｅ）及びＴＧＦｂ３コーティングミクロスフィアＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ（Ｃ、Ｆ）と共にｈＭＳＣを２８日間マイクロペレット培養した場合の、軟骨細胞外マトリックスの成分であるコラーゲンＩＩ（Ａ、Ｂ、Ｃ）及びアグリカン（Ｄ、Ｅ、Ｆ）の免疫染色を示す画像である。
【００７６】
本発明の利点を説明することを目的とする下記実施例を参照することによって、本発明の範囲をより良く理解することができる。
【００７７】
調製１：ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ、ＰＬＡ−Ｐ１８８−ＰＬＡ及びＰＬＧＡ−ポロキサミン−ＰＬＧＡコポリマーの調製
開始剤としてポロキサマー１８８及び触媒としてオクタン酸第一スズ［Ｓｎ（Ｏｃｔ）２］を使用して、ＤＬ−ラクチドとグリコリドとの開環重合によって、トリブロックコポリマーＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ（Ａ−Ｂ−Ａコポリマー）を調製した。
【００７８】
様々な正確な量のポロキサマー１８８（１、２、３）又はポロキサミン（４）及びポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）（１、２、４）又はＰＬＡ（３）を混合し、表１に従ってオクタン酸第一スズ［Ｓｎ（Ｏｃｔ）２］と共に１００mL丸底フラスコに入れた。
【００７９】
【表１】
2015511622.tif 000002
【００８０】
表１の混合物を１４０℃に加熱し、水分及び酸素を除去するために１５サイクルの真空−窒素パージによって脱気した。次いで、フラスコを０℃で凍結し、１０−３mbarの動的減圧下で密封した。一定の撹拌下、１４０℃で重合を進行させた。５日後、５００mLの塩化メチレンに溶解することによって生成物を回収し、次いで同容量のエタノールを追加することによって沈殿させた。
【００８１】
最後に、トリブロックコポリマーをろ過し、冷エタノールで洗浄し、減圧下、４５℃で一定重量まで一晩乾燥した。
【００８２】
分析
１Ｈ  ＮＭＲ及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ及び他のコポリマーを特性決定した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおけるＰＥＧ単位（３．６ppm）及びＰＬＧＡブロック（４．７６ppm）の共鳴の積分比を使用することによって、ＰＬＧＡブロックの分子量を決定した。固定相としてPlgel 5μm mixed-C (60cm)カラム及びWaters 410屈折率検出器を備えるWaters Inc.装置を使用し、１mL／分のＤＭＦで溶出するＳＥＣによって、コポリマーの分子量を決定した。典型的には、試料を１０mg/mLでＤＭＦに溶解し、Millipore Corporation製のPTFE filter Millex（登録商標）-FH（孔径０．４５μm）でろ過してから、２０μLのコポリマー溶液を注入した。ポリ（スチレン）標準に対するキャリブレーションに従って、Ｍｎ及びＭｗを表した。
【００８３】
結果
１Ｈ  ＮＭＲによる計算
【００８４】
【表２】
2015511622.tif 000003
【００８５】
サイズ排除クロマトグラフィーによる計算
【００８６】
【表３】
2015511622.tif 000004
【００８７】
参照として使用したポリマーは、Phusis (Saint-Ismier, France)によって提供されている非キャップ（末端の遊離カルボン酸基）ＰＬＧＡ３７．５／２５（Ｍｎ１４，０００Da）、及びInstitut des biomolecules Max Mousseron, CNRS UMR 5247, Montpellier, F-34093 Franceによって提供されているＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ（ＰＬＧＡセグメントはＭｎ４５，３００、ＰＥＧセグメントはＭｎ４，０００）である。
【００８８】
調製２：ポロキサマー１８８（１−１０比）とカップリングさせたナノ析出リゾチームの調製
タンパク質ナノ粒子の一般的な調製手順：
Bouffi C et al. http://www.sciencedirect.com/science/article/ pii/S0142961210013487 - bib55: The role of pharmacologically active microcarriers releasing TGF-β3 in cartilage formation in vivo by mesenchymal stem cells. Biomaterials. 2010;31:6485-93及びGiteau A et al. Reversible protein precipitation to ensure stability during encapsulation within PLGA microspheres. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2008;70:127-36によって以前に記載されている方法を使用して、タンパク質をナノ析出した：
【００８９】
９００μgのリゾチームと、９mgのポロキサマー１８８とを含有する４５μlのＮａＣｌ  ０．３Ｍ溶液をグリコフロール（１．０４ｇ）に追加して、１mLの懸濁液を室温で形成する。遠心分離（１０，０００ｇ、３０分間、４℃）及び上清の除去によって、複合粒子を回収する。１００mgのミクロスフィアバッチを調製するために、６００μgのリゾチーム及び６mgのポロキサマー１８８を使用した。
【００９０】
調製３：ポロキサマー１８８（３Ａ  １−１０比；３Ｂ  １−２０比）とカップリングさせたナノ析出リゾチームの調製
１５０μgのリゾチームと、リゾチーム添加比に応じた様々な量のポロキサマー１８８（それぞれ１−１０又は１−２０比について、１．５mg又は３mgのＰ１８８）とを含有する１０μLのＮａＣｌ  ０．３Ｍ溶液を１．１ｇのグリコフロールに追加した。遠心分離（１０，０００ｇ、３０分間、４℃）及び上清の除去によって、複合粒子を回収する。
【００９１】
調製４：ポロキサマー１８８（４Ａ：１−１０比；４Ｂ：１−２０比）とカップリングさせたナノ析出ＴＧＦ−β３の調製
一般的な手順を凍結乾燥ＴＧＦ−β３に合わせた。
【００９２】
５０μgのＴＧＦ−β３と、ＴＧＦ−β３−ポロキサマー１８８比に応じた様々な量のポロキサマー１８８（Ｐ１８８、Lutrol（登録商標）F68, BASF, Levallois-Perret, France）（それぞれ１−１０及び１−２０比について、０．５又は１mgのＰ１８８）とを含有する１０μLのＴＲＩＳ−ＨＣｌ  ０．７５Ｍ、ＮａＣｌ  ２Ｍ（ｐＨ＝７．４）溶液を１．０７７ｇの冷グリコフロール（４℃）（Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France）に追加した。遠心分離（１０，０００ｇ、３０分間、４℃）及び上清の除去によって、複合粒子を回収する。
【００９３】
調製５：ポロキサマー１８８（５Ａ：１−１０比；５Ｂ：１−２０比）とカップリングさせたナノ析出ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の調製
調製４と同様の方法で、及び以前に記載されているように（Delcroix et al. Biomaterials 2011）、１−１０又は１−２０のタンパク質−ポロキサマー１８８比いずれかのナノ析出ＨＳＡを生産した。７５０μgのＨＳＡと、ＨＳＡ添加比に応じた様々な量のポロキサマー１８８（それぞれ１−１０又は１−２０比について、７．５mg又は１５mgのＰ１８８）とを含有する１０μLのＮａＣｌ  ０．３Ｍを１．１ｇのグリコフロールに追加した。遠心分離（１０，０００ｇ、３０分間、４℃）及び上清の除去によって、複合粒子を回収する。
【００９４】
調製６：ポロキサマー１８８ナノ粒子（６Ａ：１−１０比；６Ｂ：１−２０比）とカップリングさせたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の調製
調製５と同様の方法で、及び以前に記載されているように（Delcroix et al. Biomaterials 2011）、１−１０又は１−２０のタンパク質−ポロキサマー１８８比いずれかのナノ析出ＨＳＡを生産した。２５０μgのＨＳＡと、ＨＳＡ添加比に応じた様々な量のポロキサマー１８８（それぞれ１−１０又は１−２０比について、２．５又は５mgのＰ１８８）とを含有する１０μLのＮａＣｌ  ０．３Ｍを１．１ｇのグリコフロールに追加した。遠心分離（１０，０００ｇ、３０分間、４℃）及び上清の除去によって、複合粒子を回収する。
【００９５】
調製７：ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の調製
以前に記載されているように［Bouffi et al Biomaterials 2010］、インフォームドコンセントの後、股関節置換手術を受けた患者由来の骨髄穿刺液から、ヒトＭＳＣ培養物を樹立した。簡潔に言えば、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Hyclone, ThermoFisherScientific）、２mMグルタミン、１００U/mlペニシリン、１００mg/mlストレプトマイシン（Lonza）及び１ng/mlヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（R&DSystems, Lille, France）を補充した完全α−最小必須培地（αＭＥＭ）（Lonza, Levallois-Perret, France）に、細胞懸濁液をプレートした。ＭＳＣは、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５について陽性であり、ＣＤ１４、ＣＤ３４及びＣＤ４５について陰性であることが示され、第３継代〜第４継代を使用した。
【００９６】
調製８：ポリマーフィルム
溶媒キャスティングによって、コポリマー１及びＰＬＧＡのポリマーフィルムを調製した；１０mgのコポリマー（コポリマー１又はＰＬＧＡ）をＤＭＳＯに溶解し、ガラス皿に注ぎ、続いて空気乾燥した。コポリマー１のフィルム及びＰＬＧＡのフィルムを得た。
【００９７】
調製９：参照ミクロスフィア
下記調製１２の方法に従って、リゾチームを含まない参照ミクロスフィアを生産し、非ローディングＭＳと命名した。この場合、有機溶液は、２mLの有機溶媒（３：１塩化メチレン／アセトン）及び１５０mgのコポリマーを含有していた。
【００９８】
調製１０：コーティングミクロスフィアの調製
非ローディングミクロスフィアを得るために、ポリマーミクロスフィア（調製９又は調製１３）を、フィブロネクチン（ＦＮ）（Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France）及びポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）（Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France）でコーティングした。
【００９９】
Dulbeccoリン酸緩衝生理食塩水ＤＰＢＳ（LONZA, Levallois-Perret, France）でコーティング溶液を調製した。コーティング分子の濃度（１５μg/mL）は、６μg/mLのＦＮ及び９μg/mLのＰＤＬであった（６０：４０のＦＮ：ＰＤＬ比に相当する）。
【０１００】
５mgのミクロスフィアをＤＰＢＳに再懸濁し、ミクロスフィアが完全に分散するまで超音波処理した。ＦＮ及びＰＤＬ細胞接着分子を含有する溶液をミクロスフィア懸濁液に混合し（最終容量：１０mL）、１５rpmの回転下に３７℃で１時間３０分置いた。コーティング後、コーティングミクロスフィアを滅菌蒸留水で３回洗浄し、凍結乾燥し、最後に長期保存のために−２０℃で保存した。チューブ壁上の生成物が失われるのを防ぐために、Sigmacote（登録商標）（Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France）ですべてのチューブを覆った。
【０１０１】
調製１１：コポリマー１、コポリマー３及びＰＬＧＡミクロスフィア（ミクロスフィアバッチ１５０mg）、コポリマー５、コポリマー６、コポリマー７、コポリマー８、コポリマー９（ミクロスフィアバッチ１００mg）中に埋め込まれたリゾチーム／ポロキサマー１８８粒子の調製
タンパク質有効成分をミクロスフィア中に埋め込むための一般的な手順：
TRAN et al. Protein-loaded PLGA-PEG-PLGA microspheres: A tool for cell therapy, European Journal of Pharmaceutical Sciences 45 (2012) 128-137によって記載されているように、タンパク質有効成分のカプセル化を実施した。
【０１０２】
１５０mgの調製１のコポリマー１若しくは３又はＰＬＧＡ（参照ポリマー）を含有する有機溶液（２mL；３：１塩化メチレン：アセトン）（バッチ１００mg：１００mgの調製１のコポリマー５、６、７、８又は９を含有する１．３４mLの３：１塩化メチレン：アセトン）に、調製２のポロキサマー１８８ナノ粒子（１−１０比）とカップリングさせたリゾチームを慎重に分散させた。この有機懸濁液をポリ（ビニルアルコール）水溶液（９０mL、４％w/v）又は（バッチ１００mg：６０mL、４％w/v）中で乳化し、室温で維持し、５５０rpmで１分間機械撹拌した。（Heidolph RZR 2041, Merck Eurolab, Paris, France）。１００mLの脱イオン水を追加して１０分間撹拌した後、５００mLの脱イオン水（バッチ１００mg：それぞれ６６mL及び３３４mLの脱イオン水）を、得られたｏ／ｗエマルジョンに追加し、３００rpmで２０分間撹拌して、有機溶媒を抽出した。懸濁液を１２５μmステンレスメッシュで篩別し、次いで３７μmポリプロピレンフィルタで篩別することによって回収した。５００mLの脱イオン水でミクロスフィアを洗浄し、次いで凍結乾燥してから−２０℃で保存した。
【０１０３】
タンパク質ローディングは、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡミクロスフィア、ＰＬＡ−Ｐ１８８−ＰＬＡミクロスフィア、ＰＬＧＡ−Ｔ１１０７−ＰＬＧＡミクロスフィア又はＰＬＧＡミクロスフィア１mg当たり６μgのリゾチーム（Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France）であった。
【０１０４】
分析
−  Multisizer（商標）コールターカウンター（Beckman Coulter, Roissy, France）を使用して、得られたミクロスフィアの平均体積径及びサイズ分布を評価した。
【０１０５】
−  Mettler Toledo Star System (Mettler-Toledo, Viroflay, France)を用いて、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を実施した。試料（１０mg）を密封アルミニウムるつぼに入れた；最初にそれらを２５〜８０℃に加熱し、次いで、５０〜１００℃の範囲をカバーするサーモグラムを１０℃／分の加熱速度で記録した。ＤＳＣ技術によって、ポリマーのＴｇを決定した。
【０１０６】
【表４】
2015511622.tif 000005
【０１０７】
調製１２：ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡミクロスフィア（コポリマー２）及びＰＬＧＡ（ミクロスフィアバッチ１５０mg）中に埋め込まれたリゾチーム／ポロキサマー１８８粒子の調製
調製３及び５のナノ析出タンパク質を遠心分離によって回収し、１５０mgのコポリマーを含有する有機溶液（２mL；３：１塩化メチレン／アセトン）に分散させた。有機溶液をポリ−（ビニルアルコール）水溶液（９０mL、４％w/v）中で乳化し、１℃で維持し、１分間機械撹拌した（５５０rpm）（Heidolph RZR 2041, Merck Eurolab, Paris, France）。１００mLの脱イオン水を追加して１０分間撹拌した後、得られたｏ／ｗエマルジョンを脱イオン水（５００mL）に追加し、５５０rpmでさらに２０分間撹拌して、有機溶媒を抽出した。最後に、形成された微粒子を５μmフィルタ（ＨＶＬＰ型、Millipore SA, Guyancourt, France）でろ過し、５００mLの脱イオン水で洗浄し、凍結乾燥してから＋４℃で保存した。
【０１０８】
調製１３：ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡミクロスフィア（コポリマー２及びＰＬＧＡ）（ミクロスフィアバッチ５０mg）中へのＴＧＦ−β３／ポロキサマー１８８及びＨＳＡ／ポロキサマー１８８粒子のマイクロカプセル化
ＴＧＦ−β３／ポロキサマー１８８粒子及びＨＳＡ／ポロキサマー１８８粒子をＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ及びＰＬＧＡミクロスフィア中に埋め込むための手順は調製１２と同じであったが、この場合のミクロスフィアバッチは５０mgである。
【０１０９】
それぞれ調製４及び６に記載されている方法を使用して、ＴＧＦ−β３及びＨＳＡを別個にナノ析出した。
【０１１０】
ナノ析出ＴＧＦ−β３及びＨＳＡを遠心分離によって回収し、有機相（５０mgのＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ（ポリマー２）又はＰＬＧＡを溶解した３：１塩化メチレン：アセトン溶液６７０μL）に分散させ、これをポリ（ビニルアルコール）（Mowiol（登録商標）4-88, Kuraray Specialities Europe, Frankfurt, Germany）水溶液（３０ml、１℃で４％w/v）中で乳化し、５５０rpmで１分間機械撹拌した（Heidolph, RZR 2041, Merck Eurolab, Paris, France）。３３mlの脱イオン水を追加して１０分間撹拌した後、このエマルジョンを１６７mLの脱イオン水に追加し、２０分間撹拌して、有機溶媒を抽出した。最後に、ミクロスフィアを０．４５μmフィルタ（ＨＶＬＰ型、Millipore SA, Guyancourt, France）でろ過し、洗浄し、凍結乾燥した。
【０１１１】
タンパク質ローディングは、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ及びＰＬＧＡミクロスフィア１mg当たり１μgのＴＧＦ−β３（Peprotech, Paris, France）と５μgのヒト血清アルブミン（（Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France）であった。
【０１１２】
実施例１：ヒト間葉系幹細胞が結合したＦＮ及びＰＤＬコーティング非ローディングＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡミクロスフィアの調製
工程１：ＦＮ及びＰＤＬコーティングミクロスフィアの調製
ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ（コポリマー２）ミクロスフィアを、フィブロネクチン（ＦＮ）（Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France）及びポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）（Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France）（調製１０）でコーティングした。
【０１１３】
Dulbeccoリン酸緩衝生理食塩水ＤＰＢＳ（LONZA, Levallois-Perret, France）でコーティング溶液を調製した。コーティング分子の濃度（１５μg/mL）は、６μg/mLのＦＮ及び９μg/mLのＰＤＬであった（６０：４０のＦＮ：ＰＤＬ比に相当する）。
【０１１４】
５mgのＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ（コポリマー２）ミクロスフィアをＤＰＢＳに再懸濁し、ミクロスフィアが完全に分散するまで超音波処理した。ＦＮ及びＰＤＬコーティング分子を含有する溶液をミクロスフィア懸濁液に混合し（最終容量：１０mL）、１５rpmの回転下に３７℃で１時間３０分置いた。コーティング後、ミクロスフィアを滅菌蒸留水で３回洗浄し、凍結乾燥し、最後に長期保存のために−２０℃で保存した。チューブ壁上の生成物が失われるのを防ぐために、Sigmacote（登録商標）（Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France）でそれぞれの及びすべてのチューブを覆った。
【０１１５】
抗フィブロネクチン抗体を使用した免疫蛍光染色は、ミクロスフィアのＦＮコーティングを示す。本実施例のＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡミクロスフィアのNomarsky干渉顕微鏡並びにNomarsky及び蛍光画像の重ね合わせ。このコーティングは十分なものであり、図１に示されているように、ＦＮは、コーティングミクロスフィアのすべての表面を覆っている。
【０１１６】
工程２：ヒト間葉系幹細胞が結合したＦＮ及びＰＤＬコーティングミクロスフィアの調製
調製７のヒト間葉系幹細胞をＰＢＳで洗浄し、０．１６％トリプシン（Sigma）、０．０２％ＥＤＴＡ（Lonza）溶液で剥がし、１４００rpmで１０分間ペレット化した。
【０１１７】
３％ＦＢＳを補充した培養培地に細胞ペレットを再懸濁した。α−ＭＥＭ培地、３％ＦＢＳを含有するコーティングされたエッペンドルフチューブ（Sigmacote（登録商標）, Sigma）に、０．７５mgの調製１０の凍結乾燥ＦＮ及びＰＤＬコーティングミクロスフィア組成物を１５分間再懸濁した。工程１のＦＮ及びＰＤＬコーティングミクロスフィア組成物の懸濁液を超音波処理し、簡単にボルテックスしてから、細胞懸濁液（細胞０．２５×１０６個／０．５mgミクロスフィア組成物）を追加した。次いで、混合物を穏やかに流し、1.9 cm2Costar ultra-low cluster plate (#3473, Corning, Avon, France)にプレートした。プレートを３７℃で４時間インキュベーションして、ＦＮ及びＰＤＬコーティングミクロスフィア表面上に細胞を接着させた。ミクロスフィア組成物／細胞凝集物又は複合体のこの懸濁培養液を回収し、α−ＭＥＭで洗浄し、２００ｇで２分間遠心分離することによってペレット化した。
【０１１８】
以前に記載されているように［Tatard et al 2007 Biomaterials）］、試料を走査型電子顕微鏡分析のために調製した。簡潔に言えば、非ローディングコーティングミクロスフィア（調製１０）をＰＢＳで洗浄し、グルタルアルデヒド１％及びオスミウム１％で固定し、次いでアルコールで脱水した。その後、それらをヘキサメチルジシラザンに浸漬し、厚い炭素層で覆って、最後に観察した。
【０１１９】
光学顕微鏡（Ａ）及び走査型電子顕微鏡（Ｂ）を使用して、非ローディングコーティングミクロスフィア（調製１０）の表面への細胞接着を評価した。得られた画像を図２に報告する。
【０１２０】
図２は、光学顕微鏡によるｈＭＳＣ／非ローディングコーティングミクロスフィア（ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ）／細胞複合体を示す。走査型電子顕微鏡によって観察したところ、これらの細胞は、コーティングミクロスフィアと３Ｄ複合体を形成した。
【０１２１】
実施例２：ヒト間葉系幹細胞が結合した、埋め込まれたＴＧＦ−β３／ＨＳＡを含有するＦＮ及びＰＤＬコーティングミクロスフィアの調製
工程１：ＦＮ及びＰＤＬコーティングミクロスフィアの調製
実施例１の工程１に記載されているのと同じ方法で、調製１３のミクロスフィアのコーティングを実施した。同じ結果が得られた。
【０１２２】
工程２：ヒト間葉系幹細胞が結合したＦＮ及びＰＤＬコーティングミクロスフィアの調製
実施例１の工程２に記載されているのと全く同じ方法で、細胞をこれらのミクロスフィアに結合させた。同じ結果が得られた。
【０１２３】
トリブロックコポリマー６〜９を使用して、ヒト間葉系幹細胞が結合したコーティング非ローディングトリブロックコポリマーミクロスフィア及びヒト間葉系幹細胞が結合した対応するミクロスフィアの類似調製物を製造した。
【０１２４】
方法及び分析結果
１−ポリマーフィルム上への細胞接着コーティング
１０μg/mLのＦＮ溶液中で、ポリマーフィルム（調製８）を３７℃で１．５時間インキュベーションした。コーティングポリマーフィルムをＰＢＳで３回洗浄した。
【０１２５】
免疫蛍光によって、ＦＮコーティングを決定した。簡潔に言えば、４％ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液による飽和工程を室温で６０分間実施した。ポリマーフィルムをＰＢＳで３回洗浄し、続いて、モノクローナルマウス抗ヒトフィブロネクチン抗体（１：１００）と共に４℃で一晩インキュベーションした。次いで、切片をＰＢＳで洗浄し、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ抗体（１：２００）と共に６０分間インキュベーションし、ＰＢＳで洗浄し、ストレプトアビジン−fluoprobe547（１：５００）と共に４０分間インキュベーションした。アイソタイプコントロールも実施した。
【０１２６】
図３は、トリブロックコポリマー（ポリマーフィルム）上のフィブロネクチン細胞接着表面の半定量的蛍光強度をＰＬＧＡと比較して示す。
【０１２７】
高い蛍光強度は、研究したポリマーフィルム上の高いフィブロネクチン吸着を示すので、良好なフィブロネクチンコーティングを示す。蛍光強度は、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡコポリマー上ではＰＬＧＡと比較して高く、このことは、フィブロネクチンによるコーティングがより良好であることを意味する。
【０１２８】
２．非ローディングミクロスフィアのコーティングの分析
Malvern Zetasizer（登録商標）（Nano Series DTS 1060, Malvern Instruments S.A., Worcestershire, UK）を使用して、ミクロスフィアのゼータ電位を決定した。Smoluchowskiの式を使用して電気泳動移動度の値をζ電位に変換することによって、ミクロスフィア懸濁液（ＮａＣｌ  １mM中、０．３mg/mL）で、ゼータ電位の測定を達成した。結果は、平均±標準偏差として示す。
【０１２９】
ＰＬＧＡ及びＰＬＧＡ−ポロキサマー−ＰＬＧＡミクロスフィアは、ＦＮ細胞接着表面では正のゼータ電位値を示し、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡミクロスフィアの場合にはこれが−８．１±２．３mVから＋７．９±０．８mVまで変動した。これらの結果は、ミクロスフィアが十分にコーティングされていることを示しており、正に帯電した細胞接着表面は細胞の接着を促進するので、このコーティングは細胞接着に十分である。
【０１３０】
３．細胞−非ローディングコーティングミクロスフィア複合体（実施例１、ポリマー２、ポリマー参照）及び細胞−ミクロスフィア複合体（調製９＋調製７、ポリマー２）の形成
ｈＭＳＣをＰＢＳで洗浄し、０．１６％トリプシン０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Lonza, Levallois-Perret, France）で剥がし、１４００rpmで１０分間ペレット化した。３％ＦＢＳを補充した培養培地に細胞ペレットを再懸濁した。α−ＭＥＭ培地、３％ＦＢＳを含有するコーティングされたエッペンドルフチューブ（Sigmacote, Sigma）に、０．７５mgの凍結乾燥ミクロスフィア（調製９又は１０）を１５分間再懸濁した。コーティングミクロスフィア懸濁液を超音波処理し、簡単にボルテックスしてから、細胞懸濁液（細胞０．２５×１０６個／０．５mgコーティングミクロスフィア）を追加した。次いで、混合物を穏やかに流し、1.9 cm2Costar ultra-low cluster plate (#3473, Corning, Avon, France)にプレートした。
【０１３１】
生存細胞数を明らかにするCyquantアッセイによって、４時間の時点における細胞接着を評価した。
【０１３２】
結果を図４に示す：ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡのミクロスフィア（調製９、ポリマー２）、ＰＬＧＡの非ローディングコーティングミクロスフィア（調製１０、ポリマー参照）及びＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡの非ローディングコーティングミクロスフィア（調製１０、ポリマー２）上への４時間の時点における細胞接着。
【０１３３】
コーティングは細胞接着を増加させ、細胞接着は、非ローディングコーティングミクロスフィアでは全細胞の１１８％であるのに対して、同じ非コーティングミクロスフィアでは８６％である。また、細胞接着は、コーティングＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡミクロスフィアでは参照ポリマーＰＬＧＡと比較して良好であり、それぞれ１２０％及び９７％である。
【０１３４】
４．非ローディングコーティングミクロスフィア（調製１０）上での細胞の増殖／生存
ｈＭＳＣをＰＢＳで洗浄し、０．１６％トリプシン０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Lonza, Levallois-Perret, France）で剥がし、１４００rpmで１０分間ペレット化した。３％ＦＢＳを補充した培養培地に細胞ペレットを再懸濁した。α−ＭＥＭ培地、３％ＦＢＳを有する、コーティングされたエッペンドルフチューブ（Sigmacote（登録商標）, Sigma）中で、０．７５mgの凍結乾燥コーティングミクロスフィアを１５分間再懸濁した。コーティングミクロスフィア懸濁液を超音波処理し、簡単にボルテックスしてから、細胞懸濁液（細胞０．２５×１０６個／０．５mgコーティングミクロスフィア）を追加した。次いで、混合物を穏やかに流し、1.9 cm2Costar ultra-low cluster plate (#3473, Corning, Avon, France)にプレートした。この懸濁培養液を経時的に維持し、様々な時間間隔（２４時間、４８時間及び７日間）で細胞生存率を評価し、製造業者のガイドラインに従ってCyquant細胞増殖アッセイ（登録商標）（Invitrogen, France）を使用して、コーティングミクロスフィアに接着した生細胞を定量した。結果を図５に示す。星印＊＊は、有意差（ｐ＜０．０１）、ｎ＝３を示す。
【０１３５】
細胞接着の２４時間、４８時間及びさらには７日後、細胞／コーティングミクロスフィア複合体を維持したところ、経過観察期間を通じて死細胞は観察されなかった。細胞培養の７日後、ｈＭＳＣは単独では増殖しなかったのに対して、２種類のコーティングミクロスフィアと複合体を形成しているものは増殖し、細胞数が有意に増加した。加えて、増殖アッセイにより、ｈＭＳＣを非ローディングＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡコーティングミクロスフィアと共に培養した場合、細胞数が特に増加したことが示された。
【０１３６】
従って、コーティングされたＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡミクロスフィア上の細胞数は７日目において有意に増加しており、このことは、これらのコーティングミクロスフィアが、細胞の増殖又は／及び生存を経時的に刺激したことを示唆している。
【０１３７】
５．カプセル化活性リゾチームの量及び活性リゾチーム放出のin vitro評価（調製１１）
カプセル化工程における生物学的活性の喪失を検出するために、実施例１のミクロスフィアから抽出した活性タンパク質の量を、ミクロスフィアをＤＭＳＯに溶解した後に決定した。
【０１３８】
リゾチームローディングミクロスフィア（１０mg、３バッチ）を、５mL  PTFEチューブ中の０．９mLのＤＭＳＯに溶解した。１時間後、３mLの０．０１Ｍ  ＨＣｌを追加した。この溶液をさらに１時間静置した。
【０１３９】
A Aubert-Pouessel et al. in vitro delivery system for assessing the biological integrity of protein upon release from PLGA microspheres. Pharm Res. 2002;19:1046-51によって以前に報告されているように、M. lysodeikticus細菌細胞懸濁液中の濁度変化を測定することによって、活性リゾチームの量を決定した。１００マイクロリットルのリゾチーム溶液を２．９mLの０．０１５％w/v M. lysodeikticus懸濁ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）緩衝溶液に追加した。インキュベーション（３７℃、４時間）後、吸光度を４５０nmで測定した。標準曲線を用いて、活性タンパク質の量を計算した。
【０１４０】
カプセル化率の結果を表４に報告する。カプセル化率は、ポリマーに応じて６０〜６６％であり、このことは、タンパク質がポリマーマトリックス中に適切に埋め込まれていることを意味する。
【０１４１】
タンパク質のin vitro放出
ａ）リゾチーム−調製１１
０．１％w/v  ＢＳＡ及び０．０９％w/v  ＮａＣｌを含有する５００μLの０．０５Ｍ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）を１０mgのミクロスフィアに追加して遠心分離チューブに入れることによって、ミクロスフィア（調製１１）からのリゾチームのin vitro放出プロファイルを決定した。チューブを密閉し、振盪水浴（３７℃、１２５rpm）中でインキュベーションした。決められた間隔で、チューブを２，８００ｇで５分間遠心分離して、上清を回収し、ｐＨ並びにリゾチーム及びポロキサマーの放出を分析した。次いで、上清を新たな緩衝液に交換した。
【０１４２】
図６は、（Ａ）ミクロスフィアからのリゾチームのin vitro放出（Ｂ）７日間隔除去の放出培地緩衝液（５００μlのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．０５Ｍ）のｐＨの結果を示す。
【０１４３】
ＰＬＡ−Ｐ１８８−ＰＬＡコポリマーのミクロスフィアからはカプセル化リゾチームの４５％が放出されるのに対して、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡコポリマー（参照ポリマー）では３８％である。しかしながら、ＰＬＡ−Ｐ１８８−ＰＬＡ（ポリマー３）のミクロスフィアからのリゾチームの大部分は、最初の１５日間に放出された。ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡでは、リゾチームの６０％が、連続放出プロファイルで最初の２２日間に放出された。
【０１４４】
放出培地のｐＨの変化を図６Ｂに示す。ＰＬＧＡ、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ及びＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡミクロスフィアの放出培地で観察された酸性ｐＨとは異なり、ＰＬＡ−Ｐ１８８−ＰＬＡミクロスフィアの放出培地のｐＨは、ＰＬＡの分解が遅いため常に安定している。加えて、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ及びＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡミクロスフィアのｐＨプロファイルは類似している。インドアミクロスフィアとアウトドアミクロスフィアとの間の交換及びポリマーの分解速度が、両種類のミクロスフィアで近い可能性がある。
【０１４５】
これらの結果は、タンパク質放出の割合を高めるための、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ及びＰＬＡ−Ｐ１８８−ＰＬＡの利益を明らかに示している。
【０１４６】
６．カプセル化活性リゾチームの量及び活性リゾチームの放出のin vitro評価（調製１２）
調製１２：
チューブを振盪水浴（３７℃、１２５rpm）中でインキュベーションした。決められた時間間隔で、チューブを２，８００ｇで５分間遠心分離した。２００μLの上清を分析用に回収し、新たな緩衝液（２５０μl）に交換した。セクション５に記載されている酵素アッセイによって、放出された生物学的活性リゾチームの割合を測定した。
【０１４７】
ミクロスフィアからの生物活性リゾチームの累計放出を示す図７に結果を報告する。ＴＲＩＳ−ＨＣＬ中で、ＰＬＧＡ＋Ｐ１８８  １：１０、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ＋Ｐ１８８  １：１０、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ＋Ｐ１８８  １：２０を３７℃で３０日間インキュベーションし、異なる時点で放出された培地中のリゾチームをバイオアッセイで測定した。各エラーバーは、各製剤について、平均％累計値の±標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【０１４８】
ポリマーマトリックス（ＰＬＧＡ又はＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ）と、リゾチームによるナノ析出工程に関連するＰ１８８添加剤の量とが生物活性リゾチームの放出プロファイルに与える影響を評価し、図７に報告した。
【０１４９】
ｉ）ナノ析出工程では、一定のタンパク質−Ｐ１８８比１：１０でポリマーマトリックスを改変した。これらの条件では、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡをマトリックスとして使用した場合、ＭＳからのリゾチームの放出が有意に増加した。３０日目において、カプセル化リゾチームの５１％が放出されたのに対して、ＰＬＧＡ系ＭＳでは１７％であった。実際、３日目において、リゾチームの１２％がＰＬＧＡ  ＭＳから放出され、続いて低放出がこの初期バースト後に観察された（３０日目において、１２％〜１７％）。対照的に、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡをマトリックスとして使用した場合、放出はあまり顕著ではなく、より持続的な放出が０日目〜１５日目に観察され、その結果、３０日目における放出されたタンパク質は５１％であった。
【０１５０】
従って、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡトリブロックコポリマーの使用は、リゾチームの放出を、ＰＬＧＡ組成物と比較して有意に増加させる。
【０１５１】
ｉｉ）次いで、ＰＬＧＡ−ポロキサマー−ＰＬＧＡをポリマーマトリックスとして選択して、異なる比率のポロキサマーを試験した。
【０１５２】
結果：タンパク質／ポロキサマー比を１：２０とした場合、放出された生物学的活性タンパク質が上昇した。図７で観察されるように、タンパク質／ポロキサマー比を１：２０とした場合、リゾチームの放出は、タンパク質／ポロキサマー比を１：１０とした場合の２０日目における５１％（前述のとおり）から７１％に増加した。
【０１５３】
従って、より低いタンパク質／ポロキサマー比の使用は、リゾチームの放出を、より高い比と比較して有意に増加させる。
【０１５４】
また、図７と図６との比較では、ポリマー１及び２（ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＡＧＡ）を用いて、いずれの場合にもローディングタンパク質の割合を０．６％又は０．１％とし、タンパク質／ポロキサマー比を１／１０としてミクロスフィアを調製すると、放出プロファイルは非常に類似することが示されている。第１の事例では、２２日目においてタンパク質の５５％近くが放出されており、第２の事例では５１％である。従って、カプセル化工程において、別個にナノ析出し、治療用タンパク質と同時に混合した担体タンパク質（例えば、アルブミン）を同時にカプセル化することによって、治療用タンパク質のローディングを大幅に減少させることが可能である。この結果は、高価な活性医薬成分、特に治療用タンパク質とって特に興味深いものである。
【０１５５】
７．ミクロスフィア及びコーティングミクロスフィア内の全ＴＧＦβ３の評価。非コーティング及びコーティングミクロスフィアからの全ＴＧＦβ３及び生物活性ＴＧＦβ３の放出プロファイル
【０１５６】
カプセル化工程中の生物学的活性の喪失を検出するために、実施例３のミクロスフィアから抽出した活性タンパク質の量を、ミクロスフィアをＤＭＳＯ（５mg／１mL  ＤＭＳＯ）（Bouffi 2010, § 212）に１時間（３バッチ）にわたって溶解した後に決定した。この時間の後、試料を遠心分離し、残ったＤＭＳＯを蒸発させた。特異的ＥＬＩＳＡキット（R&DSystems, Lille, France）を使用して、カプセル化タンパク質（例えば、ＴＧＦ−β３）を測定した。
【０１５７】
ＰＬＧＡミクロスフィア中へのＴＧＦ−β３のカプセル化率は１１６±２２％であり、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡミクロスフィア中へのＴＧＦ−β３のカプセル化率は８９±１２％であった。より親水特性のトリブロックコポリマーは、カプセル化率をわずかに減少させる。しかしながら、カプセル化率は十分なものであり、ＴＧＦ−β３ローディングミクロスフィアは、コーティングミクロスフィアを生産するのに使用することができる。
【０１５８】
ミクロスフィアからのＴＧＦ−β３のin vitro放出
ＰＬＧＡ＋Ｐ１８８  １：１０、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ＋Ｐ１８８  １：１０、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ＋Ｐ１８８  １：２０（調製１３）のいずれかから構成されるミクロスフィアをＰＢＳ  １％ＢＳＡ中でインキュベーションし、ＥＬＩＳＡ（Duoset ELISA human TGF-β3 (R&D Systems, Lille, France）又は下記バイオアッセイによって、異なる時点で放出された培地中のＴＧＦ−β３を試験した。
【０１５９】
ミクロスフィアから放出されたＴＧＦ−β３の生物学的活性を評価するために、Tesseur et al. (Highly sensitive and specific bioassay for measuring bioactive TGF-beta. BMC Cell Biol. 2006;7:15,)によって以前に開発されたバイオアッセイを実施した。
【０１６０】
このバイオアッセイは、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子にカップリングされたＴＧＦ−β応答性Ｓｍａｄ結合エレメントからなるレポータープラスミドで安定トランスフェクションされたＴＧＦβ１−／−マウス（ＭＦＢ−Ｆ１１）から単離されたマウス線維芽細胞を使用することに基づくものである。ＭＦＢ−Ｆ１１線維芽細胞を、９６ウェル平底培養プレート（Nunc（登録商標）, Dutscher, France）中に細胞３×１０４個／ウェルで播種した。一晩インキュベーションした後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１００U/mLペニシリン及び１００mg/mLストレプトマイシン（Lonza, Levallois-Perret, France）を補充した５０μLの無血清ＤＭＥＭ中でインキュベーションした。
【０１６１】
２時間後、５０μLのＴＧＦ−β３含有試料をさらに２４時間にわたって追加した。標準曲線を決定するために、系列希釈の定量の標準ＴＧＦ−β３を他のウェルに追加した。製造業者の説明書に従ってＳＥＡＰレポーター遺伝子アッセイ化学発光キット（Roche, Meylan, France）を使用して、５０μLの培養上清でＳＥＡＰ活性を測定した。micro plate luminometre (Ascent FL, Thermo Fisher Scientific, Cergy-Pontoise, France)を使用して化学発光を検出し、Ascent software for Fluoroscan (Thermo Fisher Scientific, Cergy-Pontoise, France)を用いて結果を分析した。
【０１６２】
図８は、ミクロスフィアからの全ＴＧＦ−β３及び生物活性ＴＧＦ−β３の累計放出を示す。Ａ．ＥＬＩＳＡ及びバイオアッセイによって評価した、ＰＬＧＡ＋Ｐ１８８  １：１０、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ＋Ｐ１８８  １：１０、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ＋Ｐ１８８  １：２０（調製１３）からのＴＧＦＢ３の放出プロファイル。Ｂ．ＴＧＦβ３をローディングしたＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ（Ｐ１８８  １：２０）ミクロスフィア（調製１３）対コーティングミクロスフィア（調製１３＋調製１０）からの放出の比較。各エラーバーは、各製剤について、平均％累計値の±標準偏差（ｎ＝３）を示す。
【０１６３】
いくつかのミクロスフィア製剤を試験した：
ＴＧＦ−β３でナノ析出したＰ１８８をカプセル化するＰＬＧＡミクロスフィア（１：１０のＴＧＦ−β３：Ｐ１８８比（w/w））、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡミクロスフィア＋Ｐ１８８  １：１０及びＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡミクロスフィア＋Ｐ１８８  １：２０（図８Ａ）。ＥＬＩＳＡアレイによって又はバイオアッセイによって測定した場合、ミクロスフィアから放出された同程度の量のＴＧＦ−β３が検出されたが、このことは、放出されたＴＧＦ−β３が生物活性であったことを示している。生物活性ＴＧＦ−β３の放出プロファイルは各製剤について類似しており、初期放出がより高く（０日目〜７日目）、その後は３０日目まで徐放期であった（図８Ａ）。
【０１６４】
これらの結果は、ＥＬＩＳＡによって測定した場合のＴＧＢ３の放出プロファイルがバイオアッセイで測定したものとマッチすることを示している。従って、すべての異なる調製物から放出されたＴＧＦＢ３が生物学的に活性であることが示されている。
【０１６５】
リゾチームについて観察されたように、ＰＬＧＡミクロスフィアからのＴＧＦ−β３の放出は低く、３０日目における放出されたＴＧＦ−β３は２５％であるが、このことは、タンパク質がマトリックスへの放出中に分解していることを示唆している。
【０１６６】
タンパク質／Ｐ１８８比が１：１０のＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡを使用すると、約４０％のＴＧＦ−β３が０日目〜３日目により顕著に放出され、その後の３日目〜３０日目の放出は微弱であった（１０％）。
【０１６７】
従って、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡトリブロックコポリマーの使用は、リゾチームの放出を、ＰＬＧＡ組成物と比較して有意に増加させる。
【０１６８】
タンパク質／Ｐ１８８比が１：２０の同じマトリックスポリマー（ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ）を用いると、生物活性ＴＧＦ−β３の７４％が放出されたが、６０％が６日目において放出されており、１４％が６日目〜３０日目に放出されていた。
【０１６９】
生物活性ＴＧＦ−β３対放出された全ＴＧＦ−β３の比の平均値は、ＰＬＧＡ製剤では約５６±８．９％であったのに対して、ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡ＋Ｐ１８８  １：２０製剤では９６±１２．５％であったが、このことは、この後者の製剤によるタンパク質の保護がより効率的であることを示唆している。
【０１７０】
従って、より低いタンパク質／Ｐ１８８比の使用は、ＴＧＦ−β３の放出を、より高い比と比較して有意に増加させる。
【０１７１】
タンパク質放出に対するコーティングの影響を評価することを目的として、非コーティングミクロスフィア及びＦＮ−ミクロスフィアからのＴＧＦ−β３放出の比較を実施した（図８Ｂ）。
【０１７２】
ＴＧＦＢ３コーティングミクロスフィア（調製１３＋調製１０）からの放出は、３０日間では、非コーティングミクロスフィア（調製１３）と比較してより持続的であることが示された（本発明のミクロスフィアでは３日目における放出が３２％であったのに対して、非コーティングミクロスフィアから放出されたのは５５％であった）が、このことは、ミクロスフィアからのタンパク質放出におけるコーティング工程及び細胞接着表面（フィブロネクチン＋ポリＤ＿リシン）の影響を示唆している（図８Ｂ）。
【０１７３】
８．軟骨細胞分化
ＰＬＧＡ又はＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡマトリックス（ポリマー２）を有する非ローディングコーティングミクロスフィア（調製１０）及びＴＧＦＢ３放出コーティングミクロスフィア（調製１３＋調製１０）のｈＭＳＣの軟骨細胞分化を、２８日間のマイクロペレット培養によって誘導した。ＰＬＧＡ又はＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡマトリックス（ポリマー２）を有する非ローディングコーティングミクロスフィア（調製１０）及びＴＧＦＢ放出コーティングミクロスフィア（調製１１）のｈＭＳＣの培養を、コニカルチューブ中、マイクロペレットで実施した。簡潔に言えば、ＭＳＣ（細胞２．５×１０５個）及び０．５mgのコーティングミクロスフィアを、１５mLコニカルチューブ中で遠心分離によってペレット化し、軟骨形成培地で培養した。この培地は、０．１mMデキサメタゾン、０．１７mMアスコルビン酸及び１％インスリントランスフェリンセレン酸（ＩＴＳ）サプリメント（Lonza）を補充したＤＭＥＭから構成されていた。１０ng/mL  ＴＧＦ−Ｂ３を補充した軟骨形成培地中でペレット培養によって、ＭＳＣの標準的な軟骨形成を誘導した。これは、マイクロペレット培養によるin vitro軟骨細胞分化のゴールドスタンダードであるので、比較としての役割を果たした。
【０１７４】
分析：定量的ｑＰＣＲ
マイクロペレット培養の２１日後に、ＰＬＧＡ又はＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡマトリックスを有する非ローディングコーティングミクロスフィア及びＴＧＦβ３放出コーティングミクロスフィアのｈＭＳＣをＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液で機械的に剥がした。次いで、製造業者の推奨に従って、細胞調製物からの全ＲＮＡを抽出した。１％β−メルカプトエタノールを含有する緩衝液に細胞を溶解し、ＤＮＡｓｅ処理して微量のゲノムＤＮＡを除去してからＲＮＡを抽出した（Total RNA isolation Nucleospin（登録商標）RNA II, Macherey Nagel, Hoerdt, France）。製造業者の説明書に従ってSuperScript（商標）II Reverse Transcriptase (Invitrogen)を用いて、第１鎖ｃＤＮＡ合成を実施した。第１鎖ｃＤＮＡ合成の後、ｃＤＮＡを精製し（Qiaquick PCR purification kit, Qiagen, Courtaboeuf, France）、５０μLのＲＮａｓｅフリー水（Gibco）中に溶出した。ｃＤＮＡ（３．１２５ng）を、iQ SYBR Green Supermix (Biorad)及びプライマーミックス（０．２mM）と最終容量１０μLで混合した。最初の変性工程を９５℃で３分間とし、９５℃で１０秒間、５５℃で１５秒間及び７２℃で１５秒間を４０サイクルとして、Chromo4 thermocycler (Biorad)で増幅を行った。増幅後、産物の融解曲線により、ターゲット遺伝子に対するプライマーの特異性を決定した。各ｃＤＮＡについて２回の測定から、平均サイクル閾値（Ｃｔ）を求めた。いくつかのハウスキーピング遺伝子、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｄｈ、ＮＭ＿００２０４６）、β２ミクログロブリン前駆体（Ｂ２Ｍ、ＮＭ＿００４０４８）、βアクチン（Ａｃｔｂ、ＮＭ＿００１１０１）、及び熱ショック９０ｋＤタンパク質１β（Ｈｓｐｃｂ、ＮＭ＿００７３５５）を標準化のために試験した。Ｇａｐｄｈ、Ｈｐｒｔ１及びＨｓｐｃｂが３つの最も安定なハウスキーピング遺伝子であったことを決定するために、GeNorm（登録商標）フリーウェア（http://medgen.ugent.be/ ejvdesomp/genorm/）を使用した。デルタｃＴ法［Ｑ＝Ｅ（全試験試料のＣｔ  ｍｉｎ−当該試料のＣｔ）］（ここで、Ｅはプライマー効率に関するものである（プライマー効率＝１００％の場合、Ｅ＝２））によって、相対転写量（Ｑ）を決定した。Vandesompele et al. [29]に記載されている多標準化法を使用して、相対量（Ｑ）を標準化した。
【０１７５】
図９は、ＴＧＦｂ３放出性又はＴＧＦｂ３非放出性のＰＬＧＡコーティングミクロスフィア又はＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡコーティングミクロスフィアと共にin vitro培養したｈＭＳＣの軟骨細胞分化を示す。軟骨細胞マーカー（Ａ）、脂質生成（adypogenic）マーカー（Ｂ）及び骨形成マーカー（Ｃ）の発現。
【０１７６】
ＴＧＦ−β３放出コーティングミクロスフィアと共に培養したＭＳＣでは、試験したすべての軟骨形成マーカー（コラーゲンＩＩ  Ｂ変異体、リンク、アグリカン、ＣＯＭＰ）の発現が軟骨細胞分化のゴールドスタンダードと比較して増加していることが、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によってin vitroで観察される（図９）。また、ＰＬＧＡ−Ｐ１２８８−ＰＬＧＡマトリックスから構成される新たな製剤にｈＭＳＣを結合させた場合、コラーゲン２及びＣＯＭＰの発現が有意にアップレギュレーションされるという違いを、２つのコーティングミクロスフィア製剤間で観察することができる（それぞれＴＧＦ−β３  ＰＬＧＡコーティングミクロスフィア対ＴＧＦ−β３  ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡコーティングミクロスフィアでは、コラーゲン２の発現が３５〜５９倍に増加している）。注目すべきことに、非ローディングＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡコーティングミクロスフィアと共に細胞を培養した場合、軟骨形成マーカーは検出されなかった。これらの結果は、ＦＮコーティングミクロスフィアによるＴＧＦ−β３の連続的な放出によって、軟骨細胞分化が誘導されたことを示唆している。本発明者らの研究では、いかなる条件下においても、骨形成マーカーＡＰ及びオステオカルシンは、０日目（Ｄ０）の非処置細胞と比較して低レベルで発現していたことに留意することが重要である（図９）。興味深いことに、非ローディングＦＮ  ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡコーティングミクロスフィアを除くすべての他の条件下において、脂肪細胞（adypocytic）マーカーは、非処置細胞（０日目（Ｄ０））と比較してダウンレギュレーションしていた（図９）。このことは、効率的かつ特異的な軟骨細胞分化のための放出された成長因子の重要性、及びマトリックス特性の影響を強く示唆している。
【０１７７】
分析：組織学及び免疫組織化学
マイクロペレット培養の２１日後、非ローディングコーティングミクロスフィア及びＴＧＦＢ放出コーティングミクロスフィアのｈＭＳＣを４％パラホルムアルデヒドで２４時間固定し、ＰＢＳで洗浄し、ルーチンな組織学のために処理した。パラフィン包埋試料切片（５mm）をエタノール及びキシレンの勾配によって再水和し、ヘマトキシリン−エオシンで染色した。
【０１７８】
製造業者の説明書に従ってUltravision detection system anti polyvalent HRP/DABkit (LabVision, Microm, Francheville, France)を使用して、試料切片に対して免疫組織化学を実施した。
【０１７９】
ＩＩ型コラーゲン及びアグリカンの免疫染色のために、最初に、非ローディングコーティングミクロスフィア及びＴＧＦβ３放出コーティングミクロスフィアのｈＭＳＣのマイクロペレットを、エピトープ賦活用のヒアルロニダーゼ０．１％（Sigma）と共に３７℃で１時間インキュベーションした。一次抗体の抗アグリカンポリクローナルウサギ抗体（１：５０；Millipore, Molsheim, France）又は抗ＩＩ型コラーゲンモノクローナルマウス抗体（１：５０；Interchim）を、非ローディングコーティングミクロスフィア及びＴＧＦβ放出コーティングミクロスフィアのｈＭＳＣのマイクロペレットと共に室温（ＲＴ）で１時間インキュベーションした。次いで、最後に、それらをマイヤーヘマトキシリン（LabVision）で３分間対比染色し、Eukitt (Sigma)と共にマウントした。免疫陽性細胞外マトリックスは、褐色の染色を示した。
【０１８０】
ｈＭＳＣを、ＴＧＦ−β３  ＰＬＧＡコーティングミクロスフィア（Ａ、Ｄ）、ＴＧＦ−β３  ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡコーティングミクロスフィア（Ｂ、Ｅ）、非ローディングＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡコーティングミクロスフィア（Ｃ、Ｆ）と共にマイクロペレット培養した。免疫染色を可能にするために、２８日目の後に、このようにして形成した複合体をパラフィン切片に包埋した。
【０１８１】
Ａ、Ｂ及びＣはコラーゲンＩＩの免疫染色を表すのに対して、Ｄ、Ｅ、Ｆはアグリカンの免疫染色である。
【０１８２】
軟骨ＥＣＭ分子の発現を示す図１０に結果を報告する。
【０１８３】
ＩＩ型コラーゲンの免疫組織化学特異的染色（図１０Ａ、Ｂ、Ｃ）は、特にＴＧＦＢ３放出ＦＮ−ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡコーティングミクロスフィアにｈＭＳＣを結合させた場合（図１０Ｃ）、均等に分布した強い染色を示した。染色強度は、ＦＮではより弱かった。
【０１８４】
非ローディングＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡコーティングミクロスフィアでは、ＰＬＧＡコーティングミクロスフィアが見られ、特異的なＩＩ型コラーゲンの発現は見られなかった。対照的に、非ローディングＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡコーティングミクロスフィアに細胞を結合させた場合、アグリカン染色を観察することができる（このタンパク質がｈＭＳＣでは基底レベルで発現していることに一致する）（図１０Ｄ）。それでもなお、ＴＧＦ−β３放出コーティングミクロスフィアと共に細胞を培養した場合、この染色はより強かった（図１０Ｅ、Ｆ）。
【０１８５】
これらの結果は、ＴＧＦＢ３放出コーティングミクロスフィアが、軟骨ＥＣＭ分子を分泌するｈＭＳＣの軟骨細胞分化を誘導することを立証している。また、ＴＧＦＢ３放出ＦＮ−ＰＬＧＡ−Ｐ１８８−ＰＬＧＡコーティングミクロスフィアは、おそらくはその放出促進プロファイルにより、前記細胞の軟骨細胞分化をより良く刺激する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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