(57)【要約】本明細書において、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  Ｆ１−Ｖ融合タンパク質の発現のためのプラスミド構築物の作製を記載する。開示されたプラスミドにおいて、Ｆ１−Ｖ融合タンパク質コード配列は大腸菌ｈｔｒＡプロモーターに作動可能に連結され、大腸菌ＨｌｙＡ分泌シグナル配列にインフレームで融合される。また、例えばペストに対する経口ワクチンとして使用するための、Ｆ１−Ｖ融合タンパク質発現プラスミドを含有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ株を記載する。
2015519061.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｈｔｒＡプロモーター配列に作動可能に連結されたＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓＦ１−Ｖ融合タンパク質コード配列を含む組換え核酸分子であって、前記核酸分子が配列番号１のヌクレオチド１−１５５８と少なくとも９５％同一の配列を含む、組換え核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子が配列番号１のヌクレオチド１−１５５８の配列を含む、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項３】
前記Ｆ１−Ｖ融合タンパク質コード配列にインフレームで融合された分泌シグナルペプチドコード配列をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の組換え核酸分子。
【請求項４】
前記分泌シグナルペプチドが大腸菌ＨｌｙＡ分泌シグナルペプチドである、請求項３に記載の組換え核酸分子。
【請求項５】
前記核酸分子の配列が、配列番号１と少なくとも９５％同一である、請求項３または請求項４に記載の組換え核酸分子。
【請求項６】
前記核酸分子の配列が配列番号１を含む、請求項５に記載の組換え核酸分子。
【請求項７】
大腸菌ｈｔｒＡプロモーター配列に作動可能に連結されたＹ．ｐｅｓｔｉｓ  Ｆ１−Ｖ融合タンパク質コード配列を含み、前記Ｆ１−Ｖ融合タンパク質コード配列にインフレームで融合された大腸菌ＨｌｙＡ分泌シグナルペプチド分泌シグナルペプチドコード配列をさらに含む組換え核酸分子であって、前記核酸分子の配列が配列番号１を含む、組換え核酸分子。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含むプラスミド。
【請求項９】
前記プラスミドが低コピー数プラスミドである、請求項８に記載のプラスミド。
【請求項１０】
選択可能なマーカーをさらに含む、請求項８または請求項９に記載のプラスミド。
【請求項１１】
前記選択可能なマーカーが抗生物質耐性遺伝子である、請求項１０に記載のプラスミド。
【請求項１２】
大腸菌ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤタンパク質コード配列をさらに含む、請求項８から１１のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項１３】
請求項７に記載の組換え核酸分子、複製起点、選択可能なマーカーおよび前記大腸菌ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤタンパク質コード配列を含むプラスミド。
【請求項１４】
請求項１から７のいずれか一項に記載の組換え核酸分子または請求項８から１３のいずれか一項に記載のプラスミドを含む、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ細菌。
【請求項１５】
請求項１４に記載のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ細菌および薬学的に許容され得るキャリアを含む免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記組成物が経口投与用に製剤化される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
請求項１４に記載のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ細菌を被験体に投与するか、または請求項１５もしくは請求項１６に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、前記被験体においてＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓに対する免疫応答を誘発する方法。
【請求項１８】
前記免疫応答が防御免疫応答である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１４に記載のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを被験体に投与するか、または請求項１５もしくは請求項１６に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、前記被験体においてペストを予防する、ペストの発症の危険性を低減する、またはペストを処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１２年５月２３日に出願された米国仮出願第６１／６５０，６７６号の利益を主張する。米国仮出願第６１／６５０，６７６号は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
分野
本開示は、ペストの病原体であるＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓに対する防御のための免疫原性組成物の開発に関する。この開示はさらに、Ｆ１−Ｖ融合タンパク質発現構築物を含有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ株およびこれらの使用法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓは、ペストの病原体である。歴史上、少なくとも３度のペストの世界的大流行が記録されており、これによりほぼ２億人が死亡した。ペストは、通常感染したノミにかまれることによって伝染する人獣共通感染症である。Ｙ．ｐｅｓｔｉｓの天然の保有宿主としては、げっ歯類、リスおよびプレーリードッグが挙げられる。Ｙ．ｐｅｓｔｉｓの大規模保有宿主は、現在オーストラリアを除く全主要居住大陸に存在する（Ｓｕｎら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｅｖ  Ｃｔｒｉｅｓ  ５（９）：６１４−６２７，２０１１）。ペストは、アフリカ、中国、インド、南米の一部および米国南西部を含む、世界の多くの地域に特有である（Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８：１０５９−１０６７，２００７；Ｌｅａｒｙら、Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐａｔｈｏｇ  ２３：１６７−１７９，１９９７）。最近の疫学的研究は、世界中で年間およそ４，０００人のペストの症例が存在することを示している（Ｓｕｎら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｅｖ  Ｃｔｒｉｅｓ  ５（９）：６１４−６２７，２０１１）。したがって、ペストは、依然として深刻な公衆衛生上の懸念である。
【０００４】
ペストは、最も一般的に腺ペストとして存在し、これは、熱および痛みを伴う、ノミの咬傷に近いリンパ節の腫脹（「横痃」）の突然の発症により特徴付けられる。抗生物質による迅速な処置が、一般的に有効である（Ｍｏｒｔｏｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２：２５２４−２５３２，２００４）。しかし、細菌は、ノミの咬傷の部位から広範囲に播種することができ、時として肺に感染する。肺が感染した場合、ペストは、咳またはくしゃみにより発生するエアロゾルにより伝染し得、原発性肺ペストの突発につながる（Ｌｅａｒｙら、Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐａｔｈｏｇ  ２３：１６７−１７９，１９９７）。肺ペストは高度に伝染性であり、一般的に致命的である（Ｍｏｒｔｏｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２：２５２４−２５３２，２００４）。ペストは高度に感染性であり、エアロゾル化により広がり得るので、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓは、潜在的生物兵器とみなされる（Ｓｕｎら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｅｖ  Ｃｔｒｉｅｓ  ５（９）：６１４−６２７，２０１１；Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８：１０５９−１０６７，２００７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｕｎら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｅｖ  Ｃｔｒｉｅｓ  ５（９）：６１４−６２７，２０１１
【非特許文献２】Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８：１０５９−１０６７，２００７
【非特許文献３】Ｌｅａｒｙら、Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐａｔｈｏｇ  ２３：１６７−１７９，１９９７
【非特許文献４】Ｍｏｒｔｏｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２：２５２４−２５３２，２００４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書において、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  Ｆ１−Ｖ融合タンパク質の発現のためのプラスミド構築物の作製を開示する。さらに、例えばペストに対するワクチンとして使用するための、開示のプラスミド構築物を含む、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ株（「Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ」または「Ｔｙ２１ａ」とも称される）細菌を開示する。
【０００７】
本明細書において、真核生物宿主細胞において活性である誘導性プロモーター、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｈｔｒＡプロモーターに配列に作動可能に連結されたＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  Ｆ１−Ｖ融合タンパク質コード配列を含む組換え核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド１−１５５８と少なくとも８５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、Ｆ１−Ｖ融合タンパク質コード配列にインフレームで融合された、分泌シグナルペプチドコード配列、例えば大腸菌ＨｌｙＡ分泌シグナル配列をさらに含む。特定の限定されない例において、核酸分子は配列番号１の配列を含む。
【０００８】
さらに、開示の核酸分子を含むプラスミドおよび開示の核酸分子またはプラスミドを含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ細菌を提供する。
【０００９】
限定されない一実施形態において、大腸菌ｈｔｒＡプロモーター配列に作動可能に連結されたＹ．ｐｅｓｔｉｓ  Ｆ１−Ｖ融合タンパク質コード配列およびＦ１−Ｖ融合タンパク質コード配列にインフレームで融合された大腸菌ＨｌｙＡ分泌シグナルペプチド分泌シグナルペプチドコード配列を含む組換え核酸分子を提供し、該核酸分子の配列は配列番号１を含む。また、核酸分子、複製起点、選択可能なマーカーおよび大腸菌ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤタンパク質コード配列を含むプラスミドを提供する。さらに、該プラスミドを含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを提供する。
【００１０】
また、Ｆ１−Ｖ発現プラスミドおよび薬学的に許容され得るキャリアを含有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを含む免疫原性組成物を提供する。
【００１１】
本開示により、Ｆ１−Ｖ発現プラスミドを含有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを被験体に投与するか、または本明細書に開示の免疫原性組成物を投与することにより、被験体においてＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓに対する免疫応答を誘発する方法をさらに提供する。また、本明細書に開示のプラスミドもしくは組換え核酸分子を含有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを被験体に投与するか、または本明細書に開示の免疫原性組成物を投与することにより、被験体においてペストを予防する、ペストの発症の危険性を低減させる、またはペストを処置する方法も提供される。
【００１２】
本発明の前述のおよび他の目的、特徴、および利点は、添付の図を参照して進める、以下の詳細な説明からより明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、プラスミドｐＨｔｒＦ１−Ｖ−Ｈｌｙ内にクローニングされた、合成Ｆ１−Ｖ融合ＤＮＡ挿入物の模式図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＨｔｒＦ１−Ｖ−Ｈｌｙ（９４０７ｂｐ）の略図であり、これは、低コピープラスミドｐＧＢ−２内にクローニングされたペストＦ１−Ｖ遺伝子融合構築物からなる。ｐＧＢ−２の複製起点（ＯＲＩ）は、選択可能なスペクチノマイシン耐性遺伝子（ｓｐｃＲ）に隣接して配置される。合成遺伝子融合挿入物は、Ｆ１−Ｖ遺伝子に連結されたｈｔｒＡプロモーターからなり、Ｆ１−Ｖ遺伝子は、改変されたリンカー配列によって互いに融合され、ＨｌｙＡ細胞外分泌シグナル（ＨｌｙＡｓ）に融合されている。プラスミドはまた、分泌機構タンパク質ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤのコード配列も含む。
【図３】図３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質抽出液の分析を示す。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを、ｐＨｔｒＦ１−Ｖ−ｈｌｙ（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ  Ｆ１−Ｖ融合タンパク質含有）またはｐＨｔｒＰＡｃｍ−ｈｌｙ（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ防御抗原（ＰＡ）を含有；Ｏｓｏｒｉｏら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ７７（４）：１４７５−１４８２，２００９により記載）のいずれかにより形質転換した。培養物を一晩増殖させ、培養上清（Ｓ）および細胞ペレット（Ｐ）の両方を回収した。タンパク質抽出液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、市販の抗Ｆ１または抗Ｖモノクローナル抗体によりプローブした。ｐＨｔｒＦ１−Ｖ−ｈｌｙにより形質転換されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａは、Ｆ１−Ｖ融合タンパク質（５８ｋＤａ）を産生および分泌する。
【図４】図４は、Ｆ１−ＶおよびＰＡ抗原に対する全血清ＩｇＧ力価を示す、一対のグラフである。１０匹の６から８週齢のマウスの群を、腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって、Ｆ１−Ｖまたはあらかじめ構築された炭疽病ＰＡを産生するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを含有する、３回の隔週用量により免疫した。マウスの第３の群は、Ｆ１−Ｖを産生するＴｙ２１ａおよびＰＡを産生するＴｙ２１ａの１：１混合物が与えられた。対照のマウスは、空のｐＧＢ−２ベクターにより形質転換されたＴｙ２１ａを、３用量与えた。免疫されたマウスは、２〜５×１０７コロニー形成単位（ＣＦＵ）／用量が与えられた。第３および最終免疫の１週間後に血清を回収した。全循環Ｆ１−ＶおよびＰＡに対する特異的なＩｇＧ力価を、ＥＬＩＳＡにより分析した。
【図５】図５は、Ｆ１−Ｖ抗原に対する全血清ＩｇＧ力価を示すグラフである。８週齢のマウス（ｎ＝５／群／時点）を、Ｆ１−Ｖプラスミドまたは空のｐＧＢ−２ベクターにより形質転換されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａでｉ．ｐ．経路により、２週ごとに３回免疫した。マウスは、２〜５×１０７ＣＦＵ／用量を、０、２および４週目に与えられた。５匹のマウス／処置由来の血清を、０、１、３および５週目に回収した。全循環Ｆ１−Ｖ特異的ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより分析した。
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、ｒＦ１−Ｖに対する脾細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏのリコール応答を示すグラフである。１０匹の６から８週齢のマウスの群が、免疫されないか、または腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって、Ｆ１−Ｖもしくは空のベクターｐＧＢ２を産生するＴｙ２１ａを含有する３回の隔週用量で免疫されるかのいずれかであった。免疫マウスは、２〜５×１０７ＣＦＵ／用量を与えられた。脾臓細胞は第３および最終免疫の１週間後に採取され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｒＦ１−Ｖにより７２時間刺激された。培養上清を採取し、サイトカインに関して分析した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
配列表
添付の配列表に列挙される核酸配列およびアミノ酸配列は、米国特許施行規則１．８２２に規定されているように、ヌクレオチド塩基に対する標準的な文字の省略形、およびアミノ酸に対する３文字コードを用いて示される。各核酸配列の片方の鎖だけが示されるが、相補鎖は、表示される鎖に対する任意の参照によって含められると理解される。配列表は、２０１３年５月９日に作成された１３．８ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出されており、それは、本明細書中に参考として援用される。添付の配列表において、以下のとおりである：
配列番号1は、プラスミドpHtrF1-V-HlyにクローニングされたF1-V融合DNA挿入物のヌクレオチド配列である。配列番号1は以下のエレメントを含む:
ヌクレオチド1〜112=htrAプロモーター配列
ヌクレオチド113〜562=F1抗原コード配列
ヌクレオチド563〜580=リンカー配列
ヌクレオチド581〜1558=V抗原コード配列
ヌクレオチド1559〜1747=HlyA分泌シグナル配列。
【００１５】
配列番号2は、F1抗原のアミノ酸配列である。
【００１６】
配列番号3は、リンカーペプチドのアミノ酸配列である。
【００１７】
配列番号4は、Ｖ抗原のアミノ酸配列である。
【００１８】
配列番号5は、HlyA分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
【００１９】
（詳細な説明）
Ｉ．省略形
ＣＦＵ            コロニー形成単位
ＥＬＩＳＡ        酵素結合免疫吸着測定法
Ｆ１              分画１抗原
ＩＦＮ            インターフェロン
ＩＬ              インターロイキン
ｉ．ｐ．          腹腔内
ＯＲＩ            複製起点
ＰＡ              防御抗原
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＴＮＦ            腫瘍壊死因子
Ｖ                毒性抗原
ＩＩ．用語および方法
別段述べられない限り、専門用語は、慣例的用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓによる出版，１９９４（ＩＳＢＮ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．による出版，１９９４（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．による出版，１９９５（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）に見られ得る。
【００２０】
本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、特定の用語の説明が以下に提供される：
アジュバント：抗原に対する免疫応答を非特異的に強化する物質またはビヒクル。アジュバントは、抗原が吸着される無機物の懸濁液、（ミョウバン、水酸化アルミニウムまたは燐酸アルミニウム）；または抗原溶液が鉱油中で乳化された油中水エマルジョン（例えば、不完全フロイントアジュバント）、時として、さらに抗原性を強化するために殺されたマイコバクテリアを含む場合（完全フロイントアジュバント）を含むことができる。免疫賦活性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含む免疫賦活性オリゴヌクレオチド）もまた、アジュバントとして使用可能である（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；第６，３３９，０６８号；第６，４０６，７０５号；および第６，４２９，１９９号を参照されたい）。アジュバントは、生体分子、例えば、補助刺激分子もまた含む。例示的生物学的アジュバントとしては、ＩＬ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＯＸ−４０Ｌおよび４１ＢＢＬが挙げられる。
【００２１】
投与：組成物を被験体に与える、適用するまたは接触させること。投与は、多数の経路のいずれか、例えば、局所、経口、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、髄腔内および筋肉内などにより達成可能である。本明細書に記載のいくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、経口経路により被験体に投与される。
【００２２】
コード配列:タンパク質またはペプチドをコードする(すなわち、オープンリーディングフレームを含有する)核酸配列。
【００２３】
Ｆ１抗原：Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ毒性タンパク質。Ｆ１抗原はＹ．ｐｅｓｔｉｓに特有の１００ｋｂプラスミドによりコードされ、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ桿菌を包含する莢膜の主要なタンパク質構成要素である。Ｆ１抗原は、宿主細胞による食作用を防止すると考えられる。Ｆ１抗原はまた、「Ｆ１莢膜抗原」とも称される。Ｆ１の配列は公知であり、公的に利用可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて）。例示的Ｆ１抗原のヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド１１３−５６２として本明細書では説明され、Ｆ１の例示的アミノ酸配列は、配列番号２として提供される。
【００２４】
インフレームで融合（した）：同じリーディングフレーム内にあるように接続された２つの核酸配列に対する言及。
【００２５】
融合タンパク質：２つの異なるタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列に由来する操作された核酸配列の発現により生じるタンパク質。融合タンパク質を作るために、核酸配列は同じリーディングフレーム内（「インフレーム」）になければならず、内部終止コドンは含有しない。
【００２６】
ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤ：原核生物溶血素分泌タンパク質。本明細書中のいくつかの実施形態において、開示のプラスミドは、大腸菌ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤタンパク質をコードする。大腸菌ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤをコードする低コピープラスミド（ｐＧＢ−２）は、米国特許第７，７５８，８５５号において既に記載されており、この特許は本明細書に参照により組み込まれる。
【００２７】
免疫応答：免疫系の細胞、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージまたは多形核細胞（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅｏｃｙｔｅ）の、抗原などの刺激因子に対する応答。免疫応答は、例えば、インターフェロンまたはサイトカインを分泌する上皮細胞を含む、宿主の防御反応に関係する身体の任意の細胞を含み得る。免疫応答は、限定するものではないが、先天性免疫応答または炎症を含む。本明細書において使用する場合、防御免疫応答は、被験体を感染症から防御する（感染症を予防する、または感染症に関連する疾患の発症を予防する）免疫応答を指す。
【００２８】
免疫:ワクチン接種などにより、被験体を疾患(例えば感染性疾患)から防御すること。
【００２９】
免疫原性組成物：特異的免疫応答（または免疫原性応答）を被験体において刺激または誘発するために有用な組成物を意味するために、本明細書において使用される用語。本明細書中のいくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、Ｆ１−Ｖ発現プラスミドを含有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを含む。いくつかの実施形態において、免疫原性応答は、被験体を、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓによる感染症、またはＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓからの疾患進行（例えば、腺ペストまたは肺ペスト）にさらに耐性にすることを可能にするという点で、防御的であるか、または防御免疫を提供する。免疫原性組成物のタイプの具体例の１つは、ワクチンである。
【００３０】
いくつかの実施形態において、免疫原性組成物の「有効量」または「免疫刺激量」は、被験体に投与した時に、検出可能な免疫応答を発生させるために十分な量である。このような応答は、例えば、免疫原性組成物中に提供された１またはそれより多くのエピトープに特異的な抗体の産生を含んでよい。または、応答は、免疫原性組成物中に提供された１またはそれより多くのエピトープに対する、ＴヘルパーまたはＣＴＬに基づく応答を含んでよい。これらの３種の応答すべてが、ナイーブ細胞またはメモリー細胞に由来すると思われる。他の実施形態において、免疫原性組成物の「防御有効量」は、動物に投与した時に、動物に防御免疫（例えば、ペストに対する防御）を付与するために十分な量である。
【００３１】
単離：「単離された」または「精製された」生物学的構成要素（例えば、核酸、ペプチドまたはタンパク質）は、その構成要素が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的構成要素、すなわち、他の染色体のおよび染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、およびタンパク質から実質的に分離されているか、離れて生成されているか、または精製されている。したがって、「単離された」または「精製された」核酸、ペプチドおよびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語は、宿主細胞内の組換え発現によって調製された核酸、ペプチドおよびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸またはタンパク質も包含する。「単離された」または「精製された」という用語は、絶対的純度を要求するものではなく、むしろ、相対的用語として意図される。したがって、例えば、単離された生物学的構成要素は、生物学的構成要素が、細胞内のその天然環境または他の生成容器中にある生物学的構成要素より濃縮されているものである。好ましくは、調製物は、該生物学的構成要素が、調製物の全生物学的構成要素含有量の少なくとも５０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれより上を表すように精製される。
【００３２】
核酸分子：ヌクレオチドの重合体形態であり、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方、ならびに上記の合成形態および混合型重合体を含み得る。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチドまたはヌクレオチドのいずれかのタイプの改変形態を指す。本明細書において使用される「核酸分子」という用語は、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。核酸分子は、別段説明されない限り、普通少なくとも１０塩基長である。この用語は、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖の形態を含む。ポリヌクレオチドは、天然に存在する、および／または天然に存在しない、ヌクレオチド連結により一緒に連結された、天然および改変されたヌクレオチドのいずれか、または両方を含んでもよい。
【００３３】
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：いかなる内部終止コドンもなくアミノ酸をコードするひと続きのヌクレオチドトリプレット（コドン）。これらの配列は、通常、ペプチド／ポリペプチド／タンパク質／ポリタンパク質に翻訳可能である。
【００３４】
作動可能に連結される：第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的関係性で配置されるとき、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合、そのコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されるＤＮＡ配列は、２つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合、同じリーディングフレームにおいて連続している。イントロンが存在する場合、その作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続していなくてもよい。
【００３５】
複製起点（ＯＲＩ）：ＤＮＡの複製が開始される、ゲノムまたはプラスミド中の特定の核酸配列。ＯＲＩの具体的構造は種により変動するが、概して、すべてがＡＴの高含有量により特徴付けられる。
【００３６】
薬学的に許容され得るキャリア：本開示において有用な、薬学的に許容され得るキャリアは、従来のキャリアである。Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７５）には、１またはそれより多くの治療用化合物または分子およびさらなる医薬品の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。
【００３７】
一般に、キャリアの性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口用の製剤は、通常、薬学的かつ生理的に許容され得る流体（例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなど）をビヒクルとして含む注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセルの形態）の場合、従来の無毒性固体キャリアとしては、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムが挙げられ得る。投与される薬学的組成物は、生物学的に中性のキャリアに加えて、少量の無毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート）を含み得る。
【００３８】
ペスト：Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ科の、非運動性の成長の遅い、通性細菌であるＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓにより引き起こされる感染性疾患。Ｙ．ｐｅｓｔｉｓは、げっ歯類、特にラットおよびそれらを食物とするノミにおいて運ばれる。他の動物およびヒトは、普通、げっ歯類またはノミの咬傷から直接細菌と接触する。Ｙ．ｐｅｓｔｉｓによる感染症は、腺ペスト、敗血症ペストまたは肺ペストをもたらし得る。
【００３９】
Ｙ．ｐｅｓｔｉｓにより誘導される疾患の最も一般的な形態である腺ペストにおいて、細菌はリンパ系に感染して、リンパ系は炎症を起こす。腺ペストは通常、感染したノミまたはげっ歯類の咬傷により罹患する。まれな症例において、ペストを有する人により使用された、汚染された衣類または他の材料の一片に由来するＹ．ｐｅｓｔｉｓ細菌が、皮膚の隙間を介して進入する。腺ペストはリンパ節を冒し、細菌への曝露の３から７日以内に、感冒様症状、例えば、発熱、頭痛、寒気、衰弱および腫脹した圧痛のあるリンパ腺（横痃）が発症する。腺ペストは、まれに人から人に広がる。
【００４０】
敗血症ペストは、普通、ノミまたはげっ歯類の咬傷を介して、腺ペストと同じ方法で罹患に至り、細菌は血液中で繁殖する。しかし、敗血症ペストは、リンパ系ではなく、血流中における細菌の繁殖の発生により特徴付けられる。敗血症ペストは、普通、未処置の横痃または肺のペストの合併症として起こり、その症状は、発熱、寒気、衰弱、腹痛、ショックおよび皮下または他の器官の出血を含む。しかし、横痃は敗血症ペストにおいては発症せず、敗血症ペストは、まれに人から人に広がる。
【００４１】
肺ペストは、ペストの最も深刻な形態であり、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ細菌が肺に感染した時に起こり、肺炎を引き起こす。肺ペストは、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ細菌が吸い込まれた時に罹患し得る。肺ペストの風媒性飛沫に曝露されて１から３日以内に、発熱、頭痛、衰弱、息切れ、胸部痛、咳および時として血を含んだ、または水気の多い唾液を伴う肺炎の急速な兆候が現れる。このタイプのペストもまた、横痃または敗血症ペストが、疾患が肺に広がった後に未処置であった時に人から人に広がり得る。この時点において、疾患は、感染した個体が咳またはくしゃみをした時に空気中に放出された、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓを保有する呼吸飛沫により、他の誰かに伝染する可能性がある。
【００４２】
プラスミド：宿主細胞において自律複製可能な環状核酸分子。本開示のいくつかの実施形態において、プラスミドは低コピー数プラスミドである。例えば、低コピー数プラスミドは、宿主細胞においておよそ１〜１０、例えば３〜９または５〜７コピーを産生するプラスミドであり得る。特定の実施例において、低コピー数プラスミドは、宿主細胞においておよそ５〜７コピーを産生する。具体的な例において、低コピー数プラスミドは、米国特許第７，７５８，８５５号に記載のｐＧＢ−２プラスミドに基づき、該特許は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
疾患を予防する、処置するまたは回復させる：疾患を「予防する」とは、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「処置する」とは、疾患または病理学的状態が発症し始めた後に、それらの徴候または症状を回復させる治療的介入のことを指す。「回復させる」とは、疾患の徴候または症状の数または重症度の減少のことを指す。
【００４４】
プロモーター：核酸の転写を指示する一連の核酸調節配列。プロモーターは、必要な核酸配列を転写開始部位付近に含む。プロモーターは、必要に応じて、転写開始部位から数千塩基対も離れて配置され得る遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含む。構成的プロモーターと誘導性プロモーターの両方が含まれる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５１６−５４４，１９８７を参照のこと）。本明細書中のいくつかの実施形態において、プロモーターは、大腸菌のｈｔｒＡ（高温要求性Ａ（ｈｉｇｈ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  Ａ））遺伝子のプロモーターである。ｈｔｒＡプロモーターは、真核生物細胞のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染症の間に活性な誘導性プロモーターである。具体的な限定されない例において、ｈｔｒＡプロモーター配列は、配列番号１のヌクレオチド１−１１２を含む。
【００４５】
組換え：組換え核酸または組換えタンパク質は、天然に存在しない配列を有するか、または２つの別途分離された配列のセグメントの人工的な組み合わせによって作製された配列を有する、核酸またはタンパク質である。この人工的な組み合わせは、化学的合成によって、または単離された核酸のセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子操作技法によって、達成されることが多い。
【００４６】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ：グラム陰性、桿状の鞭毛細菌。Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ種は、２５００を超える異なる血液型亜型を含み、このうちの１つがＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ血液型亜型である。
【００４７】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ：Ｔｙ２１ａは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉの菌株である。Ｔｙ２１ａは、腸チフスに対する経口ワクチンとして使用される、生きた弱毒化細菌株である（Ｏｓｏｒｉｏら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７７（４）：１４７５−１４８２，２００９；ＧｅｒｍａｎｉｅｒおよびＦｕｒｅｒ，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １３１：５５３−５５８，１９７５；Ｗａｈｄａｎら、Ｂｕｌｌ  ＷＨＯ  ５８：４６９−４７４，１９８０；米国特許第３，８５６，９３５号）。
【００４８】
選択可能なマーカー：マーカーを発現する生物（例えば細菌）に有利な陽性選択または陰性選択をもたらすタンパク質をコードするヌクレオチド配列。選択可能なマーカーは、例えばスペクチノマイシンなどの抗生物質耐性遺伝子を含む。
【００４９】
配列同一性：アミノ酸配列間または核酸配列間の類似性は、別途、配列同一性と称される、配列間の類似性に関して表現される。配列同一性は、パーセンテージ同一性（または類似性もしくは相同性）に関して測定されることが多い；そのパーセンテージが高いほど、その２つの配列はより似ている。所定の遺伝子またはタンパク質のホモログまたはバリアントは、標準的な方法を用いてアラインメントされたとき、比較的高い程度の配列同一性を有する。
【００５０】
比較するために配列をアラインメントする方法は、当該分野で周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが：Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：１０８８１−１０８９０，１９８８；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４，１９８８およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６：１１９−１２９，１９９４に記載されている。
【００５１】
ＮＣＢＩベーシックローカルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴＴＭ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するために、いくつかの供給源（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）およびインターネット上を含む）から入手可能である。
【００５２】
本明細書中のいくつかの実施形態において、配列番号１〜５のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を提供する。
【００５３】
血液型亜型：特徴的な抗原のセットにより識別される、種または亜種の細分化。血液型亜型は「血清型」とも称される。
【００５４】
シグナルペプチド：タンパク質の翻訳後輸送を指示する短い（通常３〜６０アミノ酸長）ペプチド鎖。分泌シグナルペプチドは、タンパク質が、そのタンパク質が産生される細胞から分泌されるように指示するシグナルペプチドである。本明細書中のいくつかの実施形態において、分泌シグナルペプチドは、大腸菌溶血素タンパク質ＨｌｙＡ由来のシグナルペプチドである。具体的な限定されない例において、ＨｌｙＡ分泌シグナルペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を有し、配列番号１のヌクレオチド１５５９−１７４７によりコードされる。
【００５５】
被験体：ヒト哺乳動物と非ヒト哺乳動物の両方を含むカテゴリーである、生存している多細胞脊椎動物。
【００５６】
治療有効量：特定の薬剤により処置される被験体において所望の効果を達成するために十分な、その薬剤の量。例えば、この量は、被験体において免疫応答を誘発するため、および／またはＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓによる感染症を予防するために有用な、Ｆ１−Ｖ発現プラスミドを含有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａの量であり得る。理想的には、本開示の文脈において、Ｆ１−Ｖ発現プラスミドを含有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａの治療有効量は、被験体において実質的な細胞傷害性効果を引き起こすことなく、被験体において、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  により引き起こされる感染症に対して耐性を上げる、感染症を予防する、回復させる、および／または処置するために十分な量である。被験体において、感染症に対して耐性を上げる、感染症を予防する、回復させる、および／または処置するために有用な、Ｆ１−Ｖ発現プラスミドを含有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａの有効量は、例えば、処置される被験体、治療用組成物の投与様式および他の要因に依存する。
【００５７】
単位用量：個別または一括して所望の効果、例えば免疫原性効果を生み出すように計算された、活性材料の所定の量を含有する物理的に分離した単位。単一の単位用量または複数の単位用量を使用して、所望の効果、例えば免疫原性効果を提供することができる。一例において、単位用量は、本明細書において開示のＦ１−Ｖ融合タンパク質を発現するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉの所望の量を含む。
【００５８】
Ｖ抗原：ｌｃｒＶ遺伝子によりコードされるＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ毒性タンパク質。Ｖ抗原は、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓの毒性において多機能な役割を果たす分泌タンパク質である。例えば、Ｖ抗原は、低カルシウム応答の毒性遺伝子の発現に関する陽性レギュレーターであり、タイプＩＩ分泌系によるエフェクタータンパク質の真核細胞内へのトランスロケーションに関与する。Ｖ抗原はまた、サイトカイン、例えばＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生を阻害することによって、免疫調節物質として機能すると考えられる。Ｖ抗原配列は公知であり、公に利用可能である。Ｖ抗原の例示的ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド５８１−１５５８として本明細書に提供され、Ｖ抗原の例示的アミノ酸配列は、配列番号４として本明細書において示される。
【００５９】
ワクチン：被験体（例えば、獣医学的被験体またはヒト被験体）に投与して、疾患または他の病態（例えばペスト）に対して免疫、例えば能動免疫を付与することができる免疫原性組成物。ワクチンは、治療的または予防的に使用することができる。したがって、ワクチンは、感染症の可能性を低減させる、または疾患もしくは病態の症状の重症度を低減させる、または疾患もしくは病態の進行を制限するために使用することができる。本明細書中の一例において、ワクチンは、本明細書に開示のＦ１−Ｖ融合タンパク質を発現するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉを含む。
【００６０】
Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ：グラム陰性、桿状細菌。Ｙ．ｐｅｓｔｉｓは、ヒトおよび他の動物を感染させることができる通性嫌気性菌である。Ｙ．ｐｅｓｔｉｓによる感染症は、横痃ペスト、敗血症ペストまたは肺ペストを引き起こすことができる。
【００６１】
別段説明されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示被験体を含む。同様に、単語「または」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、「および」を含むと意図される。それゆえ、「ＡまたはＢを含む」は、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに対して与えられたすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量の値が、近似値であり、説明のために提供されていることが、さらに理解されるべきである。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価の方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得るが、好適な方法および材料が、下記に記載される。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献の全体が、参考として援用される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が優先するものとする。さらに、その材料、方法および例は、単なる例示であって、限定すると意図されない。
【００６２】
ＩＩＩ．いくつかの実施形態の概要
本明細書において、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  Ｆ１−Ｖ融合タンパク質の発現のためのプラスミド構築物の開発を開示する。また、例えば、ペストに対する経口ワクチンとして使用するための、Ｆ１−Ｖ融合タンパク質発現プラスミドを含有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ株（本明細書において「Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ」または「Ｔｙ２１ａ」とも称される）も開示する。
【００６３】
本明細書において、大腸菌ｈｔｒＡプロモーター配列に作動可能に連結されるＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  Ｆ１−Ｖ融合タンパク質コード配列を含む組換え核酸分子を提供する。ｈｔｒＡプロモーターは、真核生物宿主細胞において活性な誘導性プロモーターである。時として、Ｆ１およびＶタンパク質のコード領域は、核酸リンカー、例えば配列番号１のヌクレオチド５６３−５８０を含むリンカーにより分離されている。
【００６４】
いくつかの実施形態において、Ｆ１−Ｖ融合タンパク質コード配列は、配列番号１のヌクレオチド１１３−１５５８と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。特定の例において、Ｆ１−Ｖ融合タンパク質コード配列は、配列番号１のヌクレオチド１１３−１５５８を含む、またはこれらからなる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ｈｔｒＡプロモーター配列は、配列番号１のヌクレオチド１−１１２と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。特定の例において、ｈｔｒＡプロモーター配列は、配列番号１のヌクレオチド１−１１２を含む、またはこれらからなる。
【００６６】
いくつかの実施形態において、大腸菌ｈｔｒＡプロモーター配列に作動可能に連結されたＹ．ｐｅｓｔｉｓ  Ｆ１−Ｖ融合タンパク質コード配列を含む核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド１−１５５８と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の配列を含む。特定の例において、前記核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド１−１５５８を含む、またはこれらからなる。
【００６７】
いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、Ｆ１−Ｖ融合タンパク質コード配列にインフレームで融合された分泌シグナルペプチドコード配列をさらに含む。いくつかの例において、分泌シグナルペプチドは、大腸菌ＨｌｙＡ分泌シグナルペプチドである。具体的な限定されない例において、大腸菌ＨｌｙＡ分泌シグナルペプチドコード配列は、配列番号１のヌクレオチド１５５９−１７４７と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるか、または配列番号１のヌクレオチド１５５９−１７４７を含むかもしくは配列番号１のヌクレオチド１５５９−１７４７からなる。
【００６８】
特定の実施形態において、組換え核酸分子の配列は、配列番号１と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。具体的な限定されない例において、核酸分子の配列は、配列番号１を含むかまたは配列番号１からなる。
【００６９】
本明細書に開示の組換え核酸分子を含むプラスミドをさらに提供する。したがって、いくつかの実施形態において、前記プラスミドは、配列番号１と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるか、または配列番号１を含む核酸分子を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態において、プラスミドは、低コピー数プラスミドである。例えば、低コピー数プラスミドは、宿主細胞においておよそ１〜１０または３〜９または５〜７コピーのプラスミドを産生するプラスミドであってよい。特定の例において、低コピー数プラスミドは、宿主細胞においておよそ５〜７コピーを産生する。具体的例において、低コピー数プラスミドは、米国特許第７，７５８，８５５号に記載のｐＧＢ−２プラスミドに基づき、該特許は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、前記プラスミドは、選択可能なマーカーをさらに含む。選択可能なマーカーは当該分野において周知であり、適切な選択可能なマーカーは、プラスミドの所望の選択基準および具体的使用に基づき、当業者により選択され得る。いくつかの例において、選択可能なマーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。限定されない一例において、選択可能なマーカーはスペクチノマイシン耐性遺伝子である。
【００７２】
いくつかの実施形態において、前記プラスミドは、大腸菌ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤタンパク質コード配列をさらに含む。ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤタンパク質は、該プラスミドによりコードされるＦ１−Ｖ融合タンパク質の細胞外分泌を可能にする、溶血素分泌タンパク質である。
【００７３】
本明細書に開示の組換え核酸分子またはプラスミドを含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ細菌をさらに提供する。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａは、腸チフスのための経口ワクチンとして承認されている、生きた弱毒化された細菌株である。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａの投与は安全であることが示されており、この株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ防御抗原（ＰＡ）を発現させるために、以前から有効に使用されている（例えば、Ｏｓｏｒｉｏら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７７（４）：１４７５−１４８２，２００９；および米国特許第７，７５８，８５５を参照されたく、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓのクローニングされたＦ１およびＶ抗原（融合タンパク質として）を送達するためのキャリアとしての、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ細菌の使用を本明細書において開示する。
【００７４】
また、本明細書に開示のプラスミドまたは換え核酸分子を含有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む免疫原性組成物も提供される。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、経口投与用に製剤化される。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は単位用量形態で製剤化される。
【００７５】
被験体に、本明細書に開示のプラスミドもしくは組換え核酸分子を含有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ細菌を投与することによって、または本明細書に開示の免疫原性組成物を投与することによって、被験体においてＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓに対する免疫応答を誘発する方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、免疫応答は防御免疫応答である。いくつかの実施形態において、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａまたは免疫原性組成物は、治療的に、例えば、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓによる感染後に投与される。他の実施形態において、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａまたは免疫原性組成物は、予防的に、例えば、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ．による感染症の危険性を予防または低減するために投与される。
【００７６】
また、本明細書に開示のプラスミドもしくは組換え核酸分子を含有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを被験体に投与するか、または本明細書に開示の免疫原性組成物を投与することによって、被験体においてペストを予防する、ペスト発症の危険性を低減する、またはペストを処置する方法を提供する。ペストは、腺ペスト、敗血症ペスまたは肺ペストであり得る。いくつかの実施形態において、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａまたは免疫原性組成物は、治療的に、例えば、ペストの臨床的兆候が被験体において発現した後で投与される。他の実施形態において、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａまたは免疫原性組成物は、予防的に、例えば、ペストの危険性を予防または低減するために投与される。
【００７７】
限定されない一例において、本明細書において、大腸菌ｈｔｒＡプロモーター配列に作動可能に連結されたＹ．ｐｅｓｔｉｓ  Ｆ１−Ｖ融合タンパク質コード配列およびＦ１−Ｖ融合タンパク質コード配列にインフレームで融合された大腸菌ＨｌｙＡ分泌シグナルペプチド分泌シグナルペプチドコード配列を含み、核酸分子の配列が配列番号１を含む、組換え核酸分子を提供する。
【００７８】
限定されない別の例において、（ｉ）大腸菌ｈｔｒＡプロモーター配列に作動可能に連結されたＹ．ｐｅｓｔｉｓ  Ｆ１−Ｖ融合タンパク質コード配列およびＦ１−Ｖ融合タンパク質コード配列にインフレームで融合された大腸菌ＨｌｙＡ分泌シグナルペプチド分泌シグナルペプチドコード配列を含み、核酸分子の配列が配列番号１を含む、組換え核酸分子；（ｉｉ）複製起点；（ｉｉｉ）選択可能なマーカー；ならびに（ｉｖ）大腸菌ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤタンパク質コード配列、を含むプラスミドを提供する。
【００７９】
限定されない別の例において、組換え核酸分子またはプラスミドを含み、前記組換え核酸分子またはプラスミドが大腸菌ｈｔｒＡプロモーター配列に作動可能に連結されたＹ．ｐｅｓｔｉｓ  Ｆ１−Ｖ融合タンパク質コード配列およびＦ１−Ｖ融合タンパク質コード配列にインフレームで融合された大腸菌ＨｌｙＡ分泌シグナルペプチド分泌シグナルペプチドコード配列を含み、核酸分子またはプラスミドの配列が配列番号１を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを提供する。さらに、該Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む免疫原性組成物を提供する。時として、免疫原性組成物は、経口投与用に製剤化される。また、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａまたは免疫原性組成物を被験体に投与することによって、被験体においてＹ．ｐｅｓｔｉｓに対する免疫応答を誘発する方法が提供される。
【００８０】
限定されないさらに別の例において、ペストに対する防御のための経口ワクチンを提供し、該ワクチンは、組換え核酸分子またはプラスミドを含み、該組換え核酸分子またはプラスミドは、大腸菌ｈｔｒＡプロモーター配列に作動可能に連結されたＹ．ｐｅｓｔｉｓ  Ｆ１−Ｖ融合タンパク質コード配列およびＦ１−Ｖ融合タンパク質コード配列にインフレームで融合された大腸菌ＨｌｙＡ分泌シグナルペプチド分泌シグナルペプチドコード配列を含み、該核酸分子またはプラスミドの配列は配列番号１を含む。
【００８１】
本明細書に開示の組換え核酸分子およびプラスミド、ならびに本明細書に開示の組換え核酸分子またはプラスミドを含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａは、以前に記載されたペスト用ワクチンを上回るいくつかの有利性を有する。例えば、大腸菌ｈｔｒＡプロモーターは、主としてｉｎ  ｖｉｖｏで活性であり、Ｆ１−Ｖ融合タンパク質の哺乳動物宿主細胞における効率的な発現を可能にし、一方で、ブロス培養液中の発現は制限され、ワクチン産生のための発現構築物の安定性を促進する。宿主において誘発された免疫応答を強化する、宿主細胞におけるＦ１−Ｖの効率的な発現はワクチンの有効性を増加させる。加えて、低コピープラスミド、例えばｐＧＢ−２プラスミドの使用は、Ｆ１−Ｖ発現構築物の安定性をさらに強化する。さらに、大腸菌ＨｌｙＡ分泌シグナルならびに大腸菌ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤタンパク質コード配列の使用は、宿主におけるＦ１−Ｖ融合タンパク質の細胞外分泌を強化し、ワクチンにより誘発された免疫応答をさらに改善する。最終的に、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａの使用は、ペストワクチンの経口投与のための安全で効率的な手段を可能にする。
【００８２】
ＩＶ．免疫原性組成物の製剤および投与
本明細書に開示の組換え核酸分子、プラスミドおよび免疫原性組成物は、単位剤形で便利に提示でき、従来の薬学的技術を使用して調製できる。このような技術は、活性成分と、薬学的キャリア(複数可)または賦形剤(複数可)とを組み合わせるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分と液体キャリアとを均一および密に組み合わせることにより調製される。製剤は、単位用量または複数用量の容器、例えば密閉されたアンプルおよびバイアルで提示でき、使用直前に滅菌液体キャリア、例えば注射用水の添加だけが必要とされる、フリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存できる。即時注射の溶液および懸濁液は、当業者により一般に使用される滅菌の散剤、顆粒および錠剤から調製可能である。
【００８３】
ある実施形態において、単位投薬量の製剤は、投与される成分の用量もしくは単位、またはこれらの適切な画分を含有する製剤である。上記で特に述べた成分に加えて、本明細書において包含される製剤が、当業者により一般に使用される他の薬剤を含み得ることは、理解されるべきである。
【００８４】
免疫原性組成物として使用するための組成物を含む、本明細書において提供される組成物は、さまざまな経路、例えば、バッカルおよび舌下を含む経口、直腸、非経口、エアロゾル、経鼻、筋肉内、皮下、皮内および局所経路を介して投与可能である。該組成物は、限定するものではないが、溶液、エマルジョンおよび懸濁液、ミクロスフェア、粒子、マイクロ粒子、ナノ粒子およびリポソームを含む、さまざまな形態で投与可能である。特定の実施形態において、免疫原性組成物は経口投与される。
【００８５】
投与体積は、投与経路に依存して変動する。当業者は、さまざまな投与経路に対する適切な体積を知っていると思われる。
【００８６】
投与は、単回または複数回の用量により達成可能である。本開示の文脈において被験体に投与される用量は、時間と共に有益な治療的応答を誘導するために、例えば、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ感染症またはペストの発症を予防するために十分であるべきである。必要とされる用量は、例えば被験体の年齢、体重および全体的健康に依存して変動し得る。
【００８７】
個々の用量中の免疫原性組成物の量は、免疫刺激性応答を、重要な、有害な副作用なく誘導する量として選択される。このような量は、どの特定組成物を用いるか、どのように投与されるかに依存して変動する。初回用量は約１μｇから約１ｍｇの範囲であってよく、いくつかの実施形態は約１０μｇから約８００μｇの範囲を有し、さらに他の実施形態は約２５μｇから約５００μｇの範囲を有する。免疫原性組成物の初回投与の後で、被験体は、適切な間隔をあけて、１または数回のブースター投与を与えられてよい。ブースター投与は、約１μｇから約１ｍｇの範囲であってよく、他の実施形態は約１０μｇから約７５０μｇの範囲を有し、さらに他は約５０μｇから約５００μｇの範囲を有する。１〜５年、例えば３年の間隔の定期的ブースターが、所望のレベルの防御免疫の維持には望ましいと思われる。
【００８８】
免疫原性組成物の構成要素として細菌を投与する場合、用量はまた、調製物中のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数により測定することもできる。したがって、いくつかの例において、Ｆ１−Ｖ発現構築物を保有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａの治療有効用量は、少なくとも１００ＣＦＵ、少なくとも１０３ＣＦＵ、少なくとも１０４ＣＦＵ、少なくとも１０５ＣＦＵ、少なくとも１０６ＣＦＵ、少なくとも１０７ＣＦＵ、少なくとも１０８ＣＦＵまたは少なくとも１０９ＣＦＵ、例えば、１００ＣＦＵから１０９ＣＦＵ、または１０３ＣＦＵから１０８ＣＦＵ、または１０４ＣＦＵから１０７ＣＦＵ、または１０５ＣＦＵから１０６ＣＦＵのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａである。
【００８９】
本明細書において、治療有効量の組換え核酸分子、プラスミドまたはＦ１−Ｖ発現構築物を保有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを、単独で、または薬学的に許容され得るキャリアと組み合わせて含む、薬学的組成物（免疫原性組成物または免疫刺激性組成物とも称される）を提供する。
【００９０】
薬学的に許容され得るキャリアは、限定するものではないが、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組み合わせを含む。キャリアおよび組成物は滅菌可能であり、製剤は、投与様式に適合する。組成物はまた、少量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含有してもよい。組成物は液状溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、持続放出製剤または散剤であってよい。組成物は、伝統的な結合剤およびキャリア、例えばトリグリセリドと共に、坐薬として製剤化することもできる。経口製剤は、標準的キャリア、例えば薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロースおよび炭酸マグネシウムを含むことができる。一般的薬学的キャリア、例えば、滅菌食塩水溶液またはゴマ油のいずれもが使用可能である。媒質はまた、従来の薬学的補助材料、例えば浸透圧を調製するための薬学的に許容され得る塩、バッファー、保存剤などを含有してもよい。本明細書に提供される組成物および方法に使用可能な他の媒質は、通常生理食塩水およびゴマ油である。
【００９１】
開示された免疫原性組成物は、他の生物学的に不活性または活性な薬剤（または両方）を含んでもよい。例えば、開示された免疫原性組成物は、アジュバント、キャリア、賦形剤および抗菌剤（例えば抗生物質）を含んでもよい。
【００９２】
場合により、１またはそれより多くのサイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αもしくはＩＦＮ−γ、１またはそれより多くの増殖因子、例えばＧＭ−ＣＳＦもしくはＧ−ＣＳＦ；１またはそれより多くの分子、例えばＯＸ−４０Ｌもしくは４１ＢＢＬまたはこれらの分子の組み合わせは、生物学的アジュバントとして使用可能である（例えば、Ｓａｌｇａｌｌｅｒら、１９９８，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６８（２）：１２２−３８；Ｌｏｔｚｅら、２０００，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．６（補遺１）：Ｓ６１−６；Ｃａｏら、１９９８，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １６（補遺１）：２５１−６０；Ｋｕｉｐｅｒら、２０００，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６５：３８１−９０を参照されたい）。これらの分子は、全身的（または局所的）に宿主に投与可能である。
【００９３】
以下の実施例は、ある特定の特徴および／または実施形態を例証するために提供される。これらの実施例は、本開示を、記載された特定の特徴または実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９４】
（実施例１）
プラスミドの構築ならびにＦ１−Ｖの発現および分泌の分析
この実施例は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａワクチン株中のＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ莢膜タンパク質画分１（Ｆ１）／毒性抗原融合タンパク質前駆体（ＬｃｒＶ）融合タンパク質（Ｆ１−Ｖ融合タンパク質と称される）の発現のための、遺伝学的に安定なプラスミド系の作製を記載する。
【００９５】
最適化されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ防御抗原（ＰＡ）発現のための、遺伝学的に安定なプラスミド発現系は、以前にも開発されていた（Ｏｓｏｒｉｏら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７７（４）：１４７５−１４８２，２００９；および米国特許第７，７５８，８５５号を参照されたく、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ  Ｆ１−Ｖ融合タンパク質の発現のためのプラスミド系の作製のために、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ  Ｆ１−Ｖ融合物の既に公開された合成構築物（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ９２４３８０．１）を改変した（図１）。Ｔｙ２１ａにおいて使用することに成功している低コピー数プラスミドｐＧＢ−２（Ｏｓｏｒｉｏら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７７（４）：１４７５−１４８２，２００９；Ｘｕら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７０（８）：４４１４−４４２３，２００２）を、プラスミド構築の骨格として使用した。合成Ｆ１−Ｖ融合物を、プラスミドｐＧＢ−２（図２）においてｈｔｒＡプロモーターから下流にクローニングした。
【００９６】
細胞外発現を誘導するために、合成Ｆ１−Ｖ融合遺伝子（終止コドンを欠いている）のインフレーム遺伝子融合物を、大腸菌アルファ溶血素タンパク質ＨｌｙＡの分泌シグナルペプチド（最終の６６アミノ酸）（図１および図２）により作製した。ＨｌｙＡ輸送装置に必要な構成要素であるＨｌｙＢおよびＨｌｙＤをコードする遺伝子もまた、プラスミドベクターに含まれた（図２）。
【００９７】
プラスミドｐＨｔｒＦ１−Ｖ−ＨｌｙにクローニングされたＦ１−Ｖ融合ＤＮＡ挿入物のＤＮＡ配列：
【００９８】
【化１】
2015519061.tif 000003
【００９９】
Ｓ．Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａにおけるＦ１−Ｖの発現および分泌の評価のために、ｐＨｔｒＦ１−Ｖ−ｈｌｙまたはＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ＰＡをコードする以前に構築されたプラスミド（Ｏｓｏｒｉｏら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７７（４）：１４７５−１４８２，２００９）のいずれかにより形質転換されたＴｙ２１ａを、スペクチノマイシン選択による培養培地において一晩増殖させ、その後、遠心分離により採取した。上清画分をおよそ１０倍に濃縮した。ペレット画分を、濃縮された上清と同等の体積中に同時に溶解した。等体積の上清画分およびペレット画分を、ウエスタンブロットによって、Ｆ１またはＬｃｒＶのいずれかに対する市販のモノクローナル抗体を使用して分析した。
【０１００】
図３に示すように、結果は、ｐＨｔｒＦ１−Ｖにより形質転換されたＴｙ２１ａがＦ１−Ｖ融合タンパク質を産生および分泌することを明らかに実証している。実際に、Ｆ１−Ｖは、ペレット分画中に検出できない。翻訳されたＤＮＡ配列に基づき、Ｆ１−Ｖ融合タンパク質の推定分子質量はおよそ５８ｋＤａである。Ｔｙ２１ａから分泌されたＦ１−Ｖの、観察されたわずかに高い分子質量は、６６アミノ酸の分泌シグナルＨｌｙＡの付加を反映していると思われる。抗ＬｃｒＶ抗体を使用するＦ１−Ｖの検出は、およそ５５から５８ｋＤａである第２の生成物を検出している。このバンドは、ＨｌｙＡが切断されたＦ１−Ｖを表している。
【０１０１】
（実施例２）
マウスにおけるワクチン構築物の免疫原性
この実施例は、血清ＩｇＧ力価および刺激された脾臓細胞のサイトカイン発現により測定した、Ｆ１−Ｖ融合発現構築物を保有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａの免疫原性を記載する。
【０１０２】
Ｆ１−Ｖを発現するＴｙ２１ａの、防御免疫応答を誘導する能力を、Ａ／Ｊマウスの免疫により検査した。１０匹の６から８週齢のマウスの群を、腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって、Ｆ１−Ｖまたは以前に構築された炭疽病ＰＡを産生するＴｙ２１ａを含有する、３回の隔週用量で免疫した。マウスの第３の群は、Ｆ１−Ｖを産生するＴｙ２１ａおよびＰＡを産生するＴｙ２１ａの１：１混合物を与えられた。対照マウスは、空のｐＧＢ−２ベクターにより形質転換された、３用量のＴｙ２１ａを与えられた。免疫マウスは、２〜５×１０７ＣＦＵ／用量を与えられた。血清および脾臓を、第３免疫および最終免疫の１週間後に回収した。全循環Ｆ１−ＶおよびＰＡに特異なＩｇＧ力価を、ＥＬＩＳＡにより分析した。
【０１０３】
Ｔｙ２１ａにおけるＦ１−Ｖ融合物の発現は、マウス中に高い抗Ｆ１−Ｖ血清ＩｇＧ力価をもたらし、平均して幾何平均力価はほぼ５００，０００であった（図４）。Ｆ１−Ｖを発現するＴｙ２１ａおよびＰＡを発現するＴｙ２１ａによる同時免疫は、マウスにおいて抗Ｆ１−Ｖおよび抗ＰＡの高ＩｇＧ力価をもたらした。空のベクターｐＧＢ２を発現するＴｙ２１ａ対照株は、循環する抗Ｆ１−Ｖ  ＩｇＧも抗ＰＡ  ＩｇＧももたらさなかった。
【０１０４】
続く実験において、全血清ＩｇＧ力価を、Ｆ１−Ｖプラスミドまたは空のｐＧＢ−２プラスミドにより形質転換されたＴｙ２１ａにより、２週間ごとに３回免疫された（ｉ．ｐ．）８週齢のマウスにおいて決定した。免疫マウスは、２〜５×１０７ＣＦＵ／用量を０、２および４週目に与えられ、血清を０、１、３および５週目に回収した。全循環Ｆ１−Ｖ特異的ＩｇＧ力価を、ＥＬＩＳＡにより分析した。結果は、３回の免疫により、マウスにおいて高い抗Ｆ１−Ｖ  ＩｇＧ力価が生じることを示した（図５）。
【０１０５】
いくつかの先行する研究により、次世代ペストワクチンは、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ特異的Ｉｇおよび細胞性免疫（ＣＭＩ）応答の両方を誘導することを目的とするべきであることが示唆されてきた。この点を考慮して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｒＦ１−Ｖにより７２時間刺激された、採取された脾臓細胞のサイトカイン応答を測定した。
【０１０６】
１０匹の６から８週齢のマウスの群を、免疫しない（対照）か、またはＦ１−Ｖもしくは空のベクターｐＧＢ２を産生するＴｙ２１ａを含有する３回の隔週用量によりｉ．ｐ．で免疫した。免疫マウスは、２〜５×１０７ＣＦＵ／用量を与えられた。脾臓細胞を、第３および最終の免疫の後１週間に採取し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｒＦ１−Ｖにより７２時間刺激した。培養上清を採取し、サイトカインの産生に関して分析した。
【０１０７】
図６Ａ〜６Ｄに示すように、ｒＦ１−Ｖに対するサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１７）リコール応答は、変わりやすかった。非免疫マウス由来の脾臓細胞は、ｒＦ１−Ｖにより刺激した場合、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１７のいずれも分泌しなかった。しかし、ｐＨｔｒＦ１−Ｖ−ｈｌｙにより形質転換されたＴｙ２１ａで免疫された数匹のマウス由来の脾臓細胞は、相当量のＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１７を発現した。ｐＧＢ２単独により形質転換されたＴｙ２１ａで免疫された１匹のマウスは、ｒＦ１−Ｖに対して有意なＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αリコール応答を有した。
（実施例３）
Ｙ．ｐｅｓｔｉｓによる感染症を予防または阻害する方法
この実施例は、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓによる感染症を予防または阻害し、それによって危険性のある被験体においてペストの発症を予防または阻害するために使用可能な例示的方法を記載する。
【０１０８】
Ｙ．ｐｅｓｔｉｓによる感染症の危険性のある被験体を、処置のために選択する。例えば、被験体は、ペストが風土病である地域に住んでいる個体であってもよく、または他のペスト犠牲者と接触したことがある被験体であってもよい。被験体は、Ｆ１−Ｖ融合タンパク質発現構築物を保有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ細菌を含む免疫原性組成物を投与される。Ｆ１−Ｖ発現プラスミドは、大腸菌ｈｔｒＡプロモーター配列に作動可能に連結されたＹ．ｐｅｓｔｉｓ  Ｆ１−Ｖ融合タンパク質コード配列およびＦ１−Ｖ融合タンパク質コード配列（配列番号１）にインフレームで融合された大腸菌ＨｌｙＡ分泌シグナルペプチド分泌シグナルペプチドコード配列を含む。免疫原性組成物の適切な治療有効用量は、熟練した開業医により選択可能である。いくつかの実施例において、用量は、約１０６から約１０８ＣＦＵである。被験体は、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ．に対して十分な免疫応答を誘発するために、必要に応じて単回用量または複数回用量を投与され得る。
【０１０９】
開示された本発明の原理が適用され得る多数の可能な実施形態を考えれば、例証された実施形態が、本発明の好ましい例だけにすぎず、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことは認識されるはずである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および精神内に入る全てを本発明者らの発明と主張する。
【図４】
2015519061.tif 000004
【図５】
2015519061.tif 000005
【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015519061.tif 000011
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