(57)【要約】  本発明は、特異的酵素の基質として機能する電気活性部分（ＥＡＭ）を利用することによって標的分析物を検出する方法を記載する。標的分析物が存在する場合、官能基が遷移金属錯体から酵素的に除去され、２つの固有電位Ｅ０１及びＥ０２で定量可能な電気化学的シグナルが生じ、これを電極上の自己組織化単分子層（ＳＡＭ）によって検出する。【選択図】図３
2015529809.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）試験サンプルと、遷移金属錯体及び酵素反応部分（ＥＲＭ）を含み、第１のＥ０を有する電気活性部分（ＥＡＭ）とを、前記試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物の存在下で前記ＥＲＭが前記ＥＡＭの少なくとも一部から除去され、第２のＥ０を有するＥＡＭを生じる条件下で接触させることと、
（ｂ）前記ＥＡＭの第１のＥ０と第２のＥ０との間の変化を検出することと、
を含み、前記変化が前記少なくとも１つの標的分析物の存在の指標である、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの標的分析物が、前記ＥＡＭから前記ＥＲＭを除去する酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの標的分析物が、（ｉ）第１の固体支持体に結合する捕捉結合リガンドと、（ｉｉ）前記ＥＡＭから前記ＥＲＭを除去する酵素である代理酵素を含む可溶性結合リガンドとの間で結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記捕捉結合リガンド及び前記可溶性結合リガンドが、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体のフラグメント、タンパク質及びペプチドからなる群から独立して選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
溶液相中のアッセイ混合物が工程（ａ）中及び工程（ｂ）前に形成され、該アッセイ混合物と、電極又は電極アレイを備える第２の固体支持体とを、前記第１のＥ０を有するＥＡＭ及び前記第２のＥ０を有するＥＡＭを含む自己組織化単分子層（ＳＡＭ）が前記電極上に形成される条件下で接触させる工程（ａ１）を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＡＭが、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）として第２の固体支持体上の電極又は電極アレイに共有結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＡＭが前記ＥＲＭと前記遷移金属錯体とを結び付ける自己犠牲部分（ＳＩＭ）を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素反応部分（ＥＲＭ）が、アミノ酸、ペプチド、アセテート、脂質、炭水化物、ホスフェート又は他の官能基からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの標的分析物が、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記代理酵素が、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼからなる群から選択される、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的分析物が前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記遷移金属錯体が、鉄、ルテニウム及びオスミウムからなる群から選択される遷移金属を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記遷移金属錯体がフェロセン及び置換フェロセンを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＥＡＭが、前記遷移金属錯体を前記電極に繋留する柔軟性オリゴマーアンカーを含み、該柔軟性アンカーが、例えばポリアクリル酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリビニルピロリジノン、アクリルアミド、無水マレイン酸、及びポリビニルピリジン、アリルアミン、エチレンイミン、オキサゾリン、並びに分子間の疎水性相互作用を制限し、組織化及び剛性を防ぐ側鎖を有する他の疎水性オリゴマーを含む主鎖又は側鎖に極性又は帯電官能基を有するオリゴマーである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記試験サンプル中で２つ以上の異なる標的分析物が検出され得るように、前記電極アレイの各々の電極が固有のＥＡＭを含むＳＡＭで修飾されており、各々のＥＡＭが特異的標的分析物又は前記代理酵素に固有のＥＲＭを含む、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
固体支持体を含む組成物であって、該固体支持体が、
（ｉ）自己組織化単分子層（ＳＡＭ）と、
（ｉｉ）遷移金属錯体及び酵素反応部分（ＥＲＭ）を含む共有結合した電気活性部分（ＥＡＭ）と、
を含む電極を備え、前記ＥＡＭが、前記ＥＲＭが存在する場合に第１のＥ０を有し、前記ＥＲＭが存在しない場合に第２のＥ０を有する、組成物。
【請求項１７】
前記ＥＡＭが前記ＥＲＭと前記遷移金属錯体とを結び付ける自己犠牲部分（ＳＩＭ）を更に含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記遷移金属が、鉄、ルテニウム及びオスミウムからなる群から選択される、請求項１６又は１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記遷移金属錯体がフェロセン又は置換フェロセンである、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＥＡＭが、前記遷移金属錯体を前記電極に繋留する柔軟性オリゴマーアンカーを含み、該柔軟性アンカーが、例えばポリアクリル酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリビニルピロリジノン、アクリルアミド、無水マレイン酸、及びポリビニルピリジン、アリルアミン、エチレンイミン、オキサゾリン、並びに分子間の疎水性相互作用を制限し、組織化及び剛性を防ぐ側鎖を有する他の疎水性オリゴマーを含む主鎖又は側鎖に極性又は帯電官能基を有するオリゴマーである、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記固体支持体が電極アレイを備える、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記試験サンプル中で２つ以上の異なる標的分析物が検出され得るように、前記電極アレイの各々の電極が固有のＥＡＭを含むＳＡＭで修飾されており、各々のＥＡＭが特異的標的分析物又は前記代理酵素に固有のＥＲＭを含む、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物を検出するキットであって、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。
【請求項２４】
試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）試験サンプルと、第１のＥ０を有し、遷移金属錯体及び酵素反応部分（ＥＲＭ）を含む電気活性部分（ＥＡＭ）とを、前記試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物の存在下で前記ＥＲＭが前記ＥＡＭの少なくとも一部から除去され、第２のＥ０を有するＥＡＭを生じる条件下で接触させることであって、溶液相中のアッセイ混合物を形成することと、
（ｂ）前記アッセイ混合物と電極又は電極アレイを備える固体支持体とを、前記第１のＥ０を有するＥＡＭ及び前記第２のＥ０を有するＥＡＭを含む自己組織化単分子層（ＳＡＭ）が前記電極上に形成される条件下で接触させることと、
（ｃ）前記ＥＡＭの第１のＥ０と第２のＥ０との間の変化を検出することと、
を含み、前記変化が前記少なくとも１つの標的分析物の存在の指標である、方法。
【請求項２５】
試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）試験サンプルと電極又は電極アレイを備える固体支持体とを、該試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物の存在下で前記ＥＲＭが前記ＥＡＭの少なくとも一部から除去され、第２のＥ０を有するＥＡＭを生じる条件下で接触させることであって、前記電極が、
（ｉ）自己組織化単分子層と、
（ｉｉ）第１のＥ０を有し、遷移金属錯体及び酵素反応部分（ＥＲＭ）を含む共有結合した電気活性部分（ＥＡＭ）と、
を含むことと、
（ｂ）前記ＥＡＭの第１のＥ０と第２のＥ０との間の変化を検出することと、
を含み、前記変化が前記少なくとも１つの標的分析物の存在の指標である、方法。
【請求項２６】
試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）試験サンプルと第１の固体支持体に結合した捕捉結合リガンドとを、少なくとも１つの標的分析物の存在下で第１の錯体が形成される条件下で接触させることと、
（ｂ）前記第１の錯体と代理酵素を含む可溶性結合リガンドとを、前記第１の固体支持体上に第２の錯体が形成される条件下で接触させることと、
（ｃ）前記第２の錯体と、遷移金属錯体及び酵素反応部分（ＥＲＭ）を含み、第１のＥ０を有する電気活性部分（ＥＡＭ）とを、前記試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物の存在下で前記ＥＲＭが前記ＥＡＭの少なくとも一部から除去され、第２のＥ０を有するＥＡＭを生じる条件下で接触させることと、
（ｄ）前記ＥＡＭの第１のＥ０と第２のＥ０との間の変化を検出することと、
を含み、前記変化が前記少なくとも１つの標的分析物の存在の指標であり、前記代理酵素が前記ＥＲＭを前記ＥＡＭから除去する酵素である、方法。
【請求項２７】
工程（ａ）と工程（ｂ）との間に洗浄工程を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に洗浄工程を含む、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
溶液相中のアッセイ混合物が工程（ｃ）中で形成され、該アッセイ混合物と、電極又は電極アレイを備える第２の固体支持体とを、前記第１のＥ０を有するＥＡＭ及び前記第２のＥ０を有するＥＡＭを含む自己組織化単分子層（ＳＡＭ）が前記電極上に形成される条件下で接触させる工程（ｃ１）を更に含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＥＡＭが、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）として第２の固体支持体上の電極又は電極アレイに共有結合する、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異的酵素の基質として機能する電気活性部分（ＥＡＭ）を利用することによって標的分析物を検出する方法を記載する。標的分析物（すなわち酵素）が存在する場合、官能基が遷移金属錯体から酵素的に除去され、２つの固有電位Ｅ０１及びＥ０２で定量可能な電気化学的シグナルが生じ、これを電極上の自己組織化単分子層（ＳＡＭ）によって検出する。
【背景技術】
【０００２】
起電力（ＥＭＦ）は、ガルバーニ電池又はボルタ電池の２つの電極間の最大電位差であり、この場合、標準水素電極が以下の電池の左側にある：
【０００３】
【表１】
2015529809.tif 000003
【０００４】
ＥＭＦは、溶液間の液界を無視若しくは算出することができるか、又はそれが全く存在しない場合にのみ、上記電池の図式スキームの右側に位置する電極の電極電位とみなされる。
【０００５】
右側の電極の電極電位（酸化還元電位と呼ばれることが多い）は、ネルンストの式で与えられる。
【数１】
2015529809.tif 000004
【０００６】
この関係は、
【数２】
2015529809.tif 000005
が
【数３】
2015529809.tif 000006
に等しく設定され、ｐＨ及び
【数４】
2015529809.tif 000007
がゼロに等しい場合に式（２．２１）から得られる。電極電位の符号の下付き文字に、酸化還元系の酸化及び還元構成要素の符号が示される。より複雑な反応では、符号Ｅの後に電池の右半分で起こる全反応（「半電池」反応）を書くことが特に推奨される。したがって、今回の場合は、
【数５】
2015529809.tif 000008
である。
【０００７】
量
【数６】
2015529809.tif 000009
は、標準電極電位と称される。これは、酸化還元系の構成要素の酸化能力又は還元能力を表す。標準電極電位がより正になると、系の酸化型がより強い酸化剤となり、還元型がより弱い還元剤となる。同様に、標準電位がより負になると、酸化還元系の還元構成要素がより強い還元剤となり、酸化型がより弱い酸化剤となる。
【０００８】
ネルンストの式、式（１−２）における標準電極Ｅ０は、その標準的用法で下記のように表される：
【数７】
2015529809.tif 000010
（式中、Ｅ０はレドックス反応の標準電位であり、Ｒは一般気体定数（８．３１４ＪＫ−１ｍｏｌ−１）であり、Ｔはケルビン温度であり、ｎは反応中に移動した電子の数であり、Ｆはファラデー定数（９６４８７クーロン）である）。このため、Ｅ０の負極側では、酸化型が還元する傾向があり、正反応（すなわち還元）がより有利である。電気活性種の酸化状態の変化によって生じる電流はファラデー電流と称される。
【０００９】
以前の研究は、２つの固有電位Ｅ０１及びＥ０２で定量可能な電気化学的シグナルを生じる遷移金属錯体に結合した官能基の変換を用いて記載されている。例えば、特許文献１及び特許文献２（いずれもその全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。この方法は概して、分析物を電極以外の固体支持体上の機能的タグを有し得る結合リガンドのサンドイッチ内に結合させることを含む。標的結合の後、過酸化物生成部分又は中間酵素及び過酸化水素を生成する基質を添加する。レドックス活性錯体が電極に結合し、過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む。酵素系により生成した過酸化物はＰＳＭと反応し、自己犠牲部分（ＳＩＭ）が除去され、遷移金属錯体に結合した官能基が変換され、２つの固有電位Ｅ０１及びＥ０２で定量可能な電気化学的シグナルを生じる。本願は同様の検出スキームを記載するが、酵素標的は遷移金属錯体に結合した官能基と直接相互作用するか、又は遷移金属錯体に結合した官能基と自己犠牲基を介して相互作用し、該基が除去され、遷移金属錯体の官能性置換基が変化して２つの固有電位Ｅ０１及びＥ０２で定量可能な電気化学的シグナルが生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１００３３８６９号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１２−０１８１１８６号
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、酵素の基質であるＥＡＭを導入することによって標的分析物を検出する改善された組成物及び方法を提供する。予期せぬことに、ＥＡＭをホモジニアス反応のために溶液に導入し、続いてＳＡＭ形成のために電極に供給するか、又は電極上に予め形成されたＳＡＭに固定化することができる。特に、このシステムの驚くべき利点は、シグナル伝達分子であるＥＡＭが酵素標的の基質としても働くため、代理標的の必要性が排除されることである。一般的な代理標的の排除は同じ試験サンプル中の複数の酵素標的の検出（例えば多重検出）を可能にする（図６）。さらに、本開示の組成物及び方法は、適切な酵素でタグ付けられた抗体によるタンパク質標的の検出にも有用である。重大なことに、これらの方法は試験サンプル中の複数のタンパク質標的の検出を可能にするが、これは各々の標的特異的抗体は異なる酵素で標識され、酵素タグの１つのみの基質として設計されたＥＡＭで特異的に修飾された電極アレイの１つと反応するためである（図７）。
【００１２】
本発明によって検出され得る標的分析物は、前駆体分子、例えば基質からの官能基の除去を触媒する限りにおいて多くの異なる酵素クラスを包含する。潜在的酵素標的としては、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼが挙げられる。
【００１３】
重大なことに、本発明は全く試薬を用いない標的酵素の検出を可能にする方法も記載する。
【００１４】
一態様では、本発明は、試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物を検出する組成物及び方法であって、
（ａ）試験サンプルと、遷移金属錯体及び酵素反応部分（ＥＲＭ）を含み、第１のＥ０を有する電気活性部分（ＥＡＭ）とを、上記試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物の存在下で上記ＥＲＭが上記ＥＡＭの少なくとも一部から除去され、第２のＥ０を有するＥＡＭを生じる条件下で接触させることと、
（ｂ）上記ＥＡＭの第１のＥ０と第２のＥ０との間の変化を検出することと、
を含み、上記変化が上記少なくとも１つの標的分析物の存在の指標である、組成物及び方法を提供する。
【００１５】
本態様の一実施の形態では、上記少なくとも１つの標的分析物が、上記ＥＡＭから上記ＥＲＭを除去する酵素である、方法が提供される。
【００１６】
本態様の別の実施の形態では、上記少なくとも１つの標的分析物が、（ｉ）第１の固体支持体に結合する捕捉結合リガンドと、（ｉｉ）上記ＥＡＭから上記ＥＲＭを除去する酵素である代理酵素を含む可溶性結合リガンドとの間で結合する、方法が提供される。
【００１７】
本開示の一実施の形態では、任意の実施の形態は、上記捕捉結合リガンド及び上記可溶性結合リガンドが、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体のフラグメント、タンパク質及びペプチドからなる群から独立して選択されるものである。
【００１８】
一態様では、本開示は、溶液相中のアッセイ混合物が工程（ａ）中及び工程（ｂ）前に形成され、該アッセイ混合物と、電極又は電極アレイを備える第２の固体支持体とを、上記第１のＥ０を有するＥＡＭ及び上記第２のＥ０を有するＥＡＭを含む自己組織化単分子層（ＳＡＭ）が上記電極上に形成される条件下で接触させる工程（ａ１）を更に含む、方法を提供する。このように、本態様の一実施の形態では、試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）試験サンプルと、第１のＥ０を有し、遷移金属錯体及び酵素反応部分（ＥＲＭ）を含む電気活性部分（ＥＡＭ）とを、上記試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物の存在下で上記ＥＲＭが上記ＥＡＭの少なくとも一部から除去され、第２のＥ０を有するＥＡＭを生じる条件下で接触させることであって、溶液相中のアッセイ混合物を形成することと、
（ｂ）上記アッセイ混合物と電極又は電極アレイを備える第２の固体支持体とを、上記第１のＥ０を有するＥＡＭ及び上記第２のＥ０を有するＥＡＭを含む自己組織化単分子層（ＳＡＭ）が上記電極上に形成される条件下で接触させることと、
（ｃ）上記ＥＡＭの第１のＥ０と第２のＥ０との間の変化を検出することと、
を含み、上記変化が上記少なくとも１つの標的分析物の存在の指標である、方法が提供される。
【００１９】
別の態様では、本開示は、上記ＥＡＭが、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）として第２の固体支持体上の電極又は電極アレイに共有結合する、方法を提供する。本態様の一実施の形態では、試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）試験サンプルと電極又は電極アレイを備える第２の固体支持体とを、該試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物の存在下で上記ＥＲＭが上記ＥＡＭの少なくとも一部から除去され、第２のＥ０を有するＥＡＭを生じる条件下で接触させることであって、上記電極が、
（ｉ）自己組織化単分子層と、
（ｉｉ）第１のＥ０を有し、遷移金属錯体及び酵素反応部分（ＥＲＭ）を含む共有結合した電気活性部分（ＥＡＭ）と、
を含むことと、
（ｂ）上記ＥＡＭの第１のＥ０と第２のＥ０との間の変化を検出することと、
を含み、上記変化が上記少なくとも１つの標的分析物の存在の指標である、方法が提供される。
【００２０】
本開示の一実施の形態では、任意の上述の実施の形態は、試験サンプルを少なくとも１つのプロ酵素と、該少なくとも１つのプロ酵素が上記少なくとも（least）１つの標的分析物によって切断されて少なくとも１つの代理酵素が形成され、該少なくとも１つの代理酵素が上記ＥＲＭを除去する条件下で更に接触させるものである。
【００２１】
本開示の一実施の形態では、試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）試験サンプルと少なくとも１つのプロ酵素とを、該少なくとも１つのプロ酵素が少なくとも１つの標的分析物によって切断される条件下で接触させることであって、少なくとも１つの代理酵素を形成することと、
（ｂ）代理酵素と、第１のＥ０を有し、遷移金属錯体及び酵素反応部分（ＥＲＭ）を含む電気活性部分（ＥＡＭ）とを、試験サンプル中の少なくとも１つの代理酵素の存在下で上記ＥＲＭが上記ＥＡＭの少なくとも一部から除去され、第２のＥ０を有するＥＡＭを生じる条件下で接触させることであって、溶液相中のアッセイ混合物を形成することと、
（ｃ）上記アッセイ混合物と電極又は電極アレイを備える固体支持体とを、上記第１のＥ０を有するＥＡＭ及び上記第２のＥ０を有するＥＡＭを含む自己組織化単分子層（ＳＡＭ）が上記電極上に形成される条件下で接触させることと、
（ｄ）上記ＥＡＭの第１のＥ０と第２のＥ０との間の変化を検出することと、
を含み、上記変化が上記少なくとも１つの標的分析物の存在の指標である、方法を提供する。
【００２２】
本開示の別の実施の形態では、試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）試験サンプルと少なくとも１つのプロ酵素とを、該少なくとも１つのプロ酵素が少なくとも１つの標的分析物によって切断される条件下で接触させることであって、少なくとも１つの代理酵素を形成することと、
（ｂ）代理酵素と電極又は電極アレイを備える固体支持体とを、試験サンプル中の少なくとも１つの代理酵素の存在下で上記ＥＲＭが上記ＥＡＭの少なくとも一部から除去され、第２のＥ０を有するＥＡＭを生じる条件下で接触させることであって、上記電極が、
（ｉ）自己組織化単分子層と、
（ｉｉ）第１のＥ０を有し、遷移金属錯体及び酵素反応部分（ＥＲＭ）を含む共有結合した電気活性部分（ＥＡＭ）と、
を含むことと、
（ｃ）上記ＥＡＭの第１のＥ０と第２のＥ０との間の変化を検出することと、
を含み、上記変化が上記少なくとも１つの標的分析物の存在の指標である、方法を提供する。
【００２３】
本開示の一実施の形態は、試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）試験サンプルと第１の固体支持体に結合した捕捉結合リガンドとを、少なくとも１つの標的分析物の存在下で第１の錯体が形成される条件下で接触させることと、
（ｂ）上記第１の錯体と代理酵素を含む可溶性結合リガンドとを、上記第１の固体支持体上に第２の錯体が形成される条件下で接触させることと、
（ｃ）上記第２の錯体と、遷移金属錯体及び酵素反応部分（ＥＲＭ）を含み、第１のＥ０を有する電気活性部分（ＥＡＭ）とを、上記試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物の存在下で上記ＥＲＭが上記ＥＡＭの少なくとも一部から除去され、第２のＥ０を有するＥＡＭを生じる条件下で接触させることと、
（ｄ）上記ＥＡＭの第１のＥ０と第２のＥ０との間の変化を検出することと、
を含み、上記変化が上記少なくとも１つの標的分析物の存在の指標であり、上記代理酵素が上記ＥＲＭを上記ＥＡＭから除去する酵素である、方法を提供する。
【００２４】
一実施の形態では、工程（ａ）と工程（ｂ）との間に洗浄工程を含む。
【００２５】
任意の上述の実施の形態による別の実施の形態では、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に洗浄工程を含む。
【００２６】
任意の上述の実施の形態による別の実施の形態では、溶液相中のアッセイ混合物が工程（ｃ）中に形成され、該アッセイ混合物と、電極又は電極アレイを備える第２の固体支持体とを、上記第１のＥ０を有するＥＡＭ及び上記第２のＥ０を有するＥＡＭを含む自己組織化単分子層（ＳＡＭ）が上記電極上に形成される条件下で接触させる工程（ｃ１）を更に含む。
【００２７】
任意の上述の実施の形態の更に別の実施の形態では、上記ＥＡＭが、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）として第２の固体支持体上の電極又は電極アレイに共有結合する。
【００２８】
本開示の一実施の形態では、任意の上述の実施の形態は、上記ＥＡＭが上記ＥＲＭと上記遷移金属錯体とを結び付ける自己犠牲部分（ＳＩＭ）を更に含むものである。
【００２９】
本開示の一実施の形態では、任意の上述の実施の形態は、上記酵素反応部分（ＥＲＭ）が、アミノ酸、ペプチド、アセテート、脂質、炭水化物、ホスフェート、又は他の官能基からなる群から選択されるものである。
【００３０】
本開示の一実施の形態では、任意の上述の実施の形態は、上記少なくとも１つの標的分析物が、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、及びリガーゼ、又は基質若しくは補基質から官能基を除去する他の酵素からなる群から選択されるものである。
【００３１】
本開示の一実施の形態では、任意の上述の実施の形態は、上記代理酵素が、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、及び基質若しくは補基質から官能基を除去する他の酵素からなる群から選択されるものである。
【００３２】
本開示の一実施の形態では、任意の上述の実施の形態は、上記標的分析物が前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）であるものである。
【００３３】
本開示の一実施の形態では、任意の上述の実施の形態は、上記遷移金属錯体が鉄、ルテニウム及びオスミウムからなる群から選択される遷移金属を含むものである。
【００３４】
本開示の一実施の形態では、任意の上述の実施の形態は、上記遷移金属錯体がフェロセン及び置換フェロセンを含むものである。
【００３５】
本開示の一実施の形態では、任意の上述の実施の形態は、上記ＥＡＭが、上記遷移金属錯体を上記電極に繋留する柔軟性オリゴマーアンカーを含み、該柔軟性アンカーが、例えばポリアクリル酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリビニルピロリジノン、アクリルアミド、無水マレイン酸、及びポリビニルピリジン、アリルアミン、エチレンイミン、オキサゾリン、並びに分子間の疎水性相互作用を制限し、組織化及び剛性を防ぐ側鎖を有する他の疎水性オリゴマーを含む主鎖又は側鎖に極性又は帯電官能基を有するオリゴマーであるものである。
【００３６】
本開示の一実施の形態では、任意の上述の実施の形態は、上記試験サンプル中で２つ以上の異なる標的分析物が検出され得るように、上記電極アレイの各々の電極が固有のＥＡＭを含むＳＡＭで修飾されており、各々のＥＡＭが特異的標的分析物又は上記代理酵素に固有のＥＲＭを含むものである。
【００３７】
本開示の別の態様は、固体支持体を含む組成物であって、該固体支持体が、
（ｉ）自己組織化単分子層（ＳＡＭ）と、
（ｉｉ）遷移金属錯体及び酵素反応部分（ＥＲＭ）を含む共有結合した電気活性部分（ＥＡＭ）と、
を含む電極を備え、上記ＥＡＭが、上記ＥＲＭが存在する場合に第１のＥ０を有し、上記ＥＲＭが存在しない場合に第２のＥ０を有する、組成物を提供する。
【００３８】
本開示の組成物の一実施の形態では、上記ＥＡＭが上記ＥＲＭと上記遷移金属錯体とを結び付ける自己犠牲部分（ＳＩＭ）を更に含む。別の実施の形態では、本開示の組成物は、鉄、ルテニウム及びオスミウムからなる群から選択される上記遷移金属を含む。別の実施の形態では、本開示の組成物はフェロセン又は置換フェロセンである上記遷移金属錯体を含む。
【００３９】
本開示の組成物の更なる実施の形態では、上記ＥＡＭが、上記遷移金属錯体を上記電極に繋留する柔軟性オリゴマーアンカーを含み、該柔軟性アンカーが、例えばポリアクリル酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリビニルピロリジノン、アクリルアミド、無水マレイン酸、及びポリビニルピリジン、アリルアミン、エチレンイミン、オキサゾリン、並びに分子間の疎水性相互作用を制限し、組織化及び剛性を防ぐ側鎖を有する他の疎水性オリゴマーを含む主鎖又は側鎖に極性又は帯電官能基を有するオリゴマーである。
【００４０】
本開示の組成物の更なる実施の形態では、上記固体支持体が電極アレイを備える。本開示の組成物の一層更なる実施の形態は、上記試験サンプル中で２つ以上の異なる標的分析物が検出され得るように、上記電極アレイの各々の電極が固有のＥＡＭを含むＳＡＭで修飾されており、各々のＥＡＭが特異的標的分析物又は上記代理酵素に固有のＥＲＭを含む。
【００４１】
本開示の別の態様は、試験サンプル中の少なくとも１つの標的分析物を検出するキットであって、本開示の任意の組成物を含む、キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】基質が単一アミノ酸チロシンであるＥＡＭ−基質分子の構造例を示す図である。このＥＡＭはチロシン残基（Ｃ末端）の後を切断するキモトリプシンの基質として働く。切断点は強調したペプチド結合を通る破線で示される。得られる生成物を右側に示す。
【図２】リン酸化ＥＡＭの構造例を示す図である。このＥＡＭはホスファターゼの非特異的基質として働く。ホスフェートが破線で示されるように除去されると、化学的脱離が誘発され、得られる第一級アミン官能基化フェロセンを右側に示す。
【図３】ＥＡＭ−アミノ酸又はＥＡＭ−ペプチドを含有するＳＡＭで修飾された金電極を示す図である。このＥＡＭ−ペプチド分子上のペプチドは唯一のプロテアーゼの特異的基質として働く。溶液中の活性標的プロテアーゼの濃度は、カルボキシ末端残基とＥＡＭのアミン頭部基との間の被切断（scissile）ペプチド結合の切断によって検出される。ＥＡＭからのこのアミノ酸配列の切断によって、Ｈ２Ｏ２ベースのＥ−ＴＲＡＣＥシステムと類似した第２のレドックスピークが現れる。
【図４】リン酸化ＥＡＭを含有するＳＡＭで修飾された金電極を示す図である。ホスホ−ＥＡＭ分子は溶液中のホスファターゼの基質として働く。溶液中の活性ホスファターゼの濃度はＥＡＭの脱リン酸化によって検出される。この脱リン酸化事象は化学的脱離を誘発し、露出した第一級アミン官能基化フェロセンが生じる。
【図５】本発明のタンパク質検出適用例を示す図である。イムノアッセイフォーマットでは、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を二次抗体にタグ付けする。この抗体を電極に供給すると、ＡＰがＥＡＭを脱リン酸化し、自己犠牲リンカーの放出が誘発され、遷移金属錯体の官能性置換基が変化して、ＡＰ濃度に応じて２つの固有電位Ｅ０１及びＥ０２で定量可能な電気化学的シグナルが生じる。
【図６】種々のＥＡＭ−基質分子で特異的に修飾された電極を利用する多重酵素（例えばプロテアーゼ）検出を示す図である。
【図７ａ】ＰｒｏＣｌｅａｖｅアッセイによるタンパク質検出が、典型的なＥＬＩＳＡアッセイのように各々の標的のイムノサンドイッチ錯体を形成することから始まることを示す図である。固体支持体（例えば、各々異なる標的に対する捕捉Ａｂを含むビーズミックス）を使用して、各々の標的のサンドイッチ錯体を形成する。各々の二次抗体は固有の酵素タグを有する。
【図７ｂ】低ｐＨ洗浄又は他の方法を用いて残留サンプルを洗い流した後に標的／二次抗体を溶液に放出するサンドイッチ錯体の解離を示す図である。
【図７ｃ】電極に供給される溶液を示す図である。各々の電極を、特異的プロテアーゼ酵素の基質として働く固有のＥＡＭ−アミノ酸／ペプチドのＳＡＭで修飾する。代理標的となる二次抗体プロテアーゼタグは、指定の１つの電極のＥＡＭから特異的ペプチドを切断する。
【図８】ＰＢＳ、４８０ｎＭ及び２．４μＭのキモトリプシン（実線、破線、三角）とともに１５分間インキュベートした電極のサイクリックボルタモグラムを示す図である。−０．２５Ｖに存在するレドックス波及び０．０６Ｖの還元電流によって、明らかな正のシグナルを２．４μＭのキモトリプシンで観察することができる。ベースラインを超える小さなシグナルが４８０ｎＭのキモトリプシンからも観察される。
【図９】溶液相中のＥＡＭ−基質分子とともにインキュベートしたキモトリプシンの用量応答を示す図である。ＥＡＭを検出用の電極に供給する前に反応が生じる。
【図１０】置換キノンメチドをベースとするサンプル自己犠牲スペーサー基を示す図である。
【図１１】過剰に供給されるプロ酵素代理標的を特異的に活性化する標的プロテアーゼを示す図である。活性化された代理酵素は代理酵素に特異的なＥＲＭと反応し、ＥＡＭからＥＲＭを除去して定量可能なシグナルを生じる。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
概要
本発明は、酵素的に除去されて定量可能な電気化学的シグナルを生じるアミノ酸、アミノ酸鎖（ペプチド）、ホスフェート、炭水化物、脂質、アセテート又は他の官能性頭部基を有するＥＡＭ（電気活性部分）を利用して標的酵素を検出することができる方法を記載する。
【００４４】
本発明は酵素、すなわちプロテアーゼ、ペプチダーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ又はトランスフェラーゼの存在及び活性の検出を記載する。本開示の方法では、シグナルを酵素反応部分（ＥＲＭ）の特性の変化に基づいて検出する。
【００４５】
このアプローチを用いたプロテアーゼ活性の測定では試薬は使用されず、溶液中の酵素の存在及び活性が直接検出される。このアプローチは固有に修飾された電極を用いて複数の酵素標的分析物に適用することができる。
【００４６】
ＥＲＭは、プロテアーゼ等の標的分析物によって直接認識され得る官能基、又はプロテアーゼ等の代理酵素であり得る。
【００４７】
プロテアーゼ
プロテアーゼの濃度及び活性の検出は、薬物開発及び細胞状態のモニタリングから対象のサンプルマトリックス及び標的との臨床的関連まで多数の用途に用いることができる。ＭＭＰ、ＡＤＡＭ、カリクレイン及びＰＳＡを含む多くのがんバイオマーカーがプロテアーゼ分類に該当する。タンパク分解事象と関連する酵素は、細胞毒性及び細胞生存性の評価にも一般に利用されている。プロテアーゼの検出に用いられる多くの現在のシステムは、多くの工程を含むイムノアッセイフォーマットに依存するものであり、酵素活性の評価は得られないことが多い。ＰｒｏＣｌｅａｖｅアッセイはサンプルマトリックス中のプロテアーゼ濃度を活性によって測定する手段である。このシステムには他のプロテアーゼ検出方法に優る利点がある。利点の１つは例えば、単一の反応チャンバに供給され、同時に複数の測定を行う複数の標的を含有する単一サンプルの使用である。別の利点は、付加的な試薬を使用することなくＰｒｏＣｌｅａｖｅによるプロテアーゼの検出をもたらすことであり、電極へのサンプル供給、反応及びシグナル測定に試薬は含まれない。
【００４８】
ＰｒｏＣｌｅａｖｅシステムの基本要素は、酵素基質及び電気化学的シグナル出力の両方としての二重機能を有するＥＡＭ−ペプチド（電気活性部分）分子である。分子の基質部分は、対象のプロテアーゼのみについて基質として働くように選ばれる単一又は複数のアミノ酸配列であり得る。非限定的な例としては、ＥＡＭ−ＨＳＳＫＬＱ基質の切断によるＰＳＡ活性の検出が挙げられるが、これに限定されない。各々のペプチド基質の被切断結合はペプチドのＣ末端で起こり、切断が起こるとＥＡＭの末端アミンの露出が起こる（図１）。したがって、基質特異性はＰ１−Ｐ２−Ｐ３位のアミノ酸によって決まる。Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’位等の被切断結合のカルボキシル側に隣接するアミノ酸は存在しない。基質は、最初の無傷（intact）ＥＡＭ−ペプチドが単一の見掛け電位Ｖ１を示すようにペプチド結合によってＥＡＭに結合する。標的プロテアーゼの存在下で、基質はカルボキシル末端で切断され、Ｖ１とは異なる負にシフトした明らかな見掛け電位Ｖ２を有する第一級アミン官能基化フェロセンＥＡＭが生じる。したがって、標的プロテアーゼの存在は２つのレドックス波を有する電気化学的プロファイルをもたらし、プロテアーゼ濃度の増大に伴いＶ１でのシグナルの低下及びＶ２でのシグナルの増大が観察される。このシグナル出力はＥ−ＴＲＡＣＥ  Ｈ２Ｏ２検出システムと類似している。本開示のアッセイでは、化学反応ではなく酵素的に触媒される事象によってシグナルが生成する。これにより、実質的に検出不可能なバックグラウンドシグナルレベルしか生じないはるかに安定した初期レドックス種（ＥＡＭ）が可能になる。
【００４９】
ホスファターゼタグを用いた直接検出
多くの検出システムが、基質を検出可能なシグナルへと変換する代理標的又は酵素として酵素タグに依存している。非限定的な例は、ｐ−ニトロフェニルホスフェートを光学的吸収測定によって検出可能な着色反応生成物へと変換するアルカリホスファターゼ標識二次抗体である。本開示の方法は、ホスファターゼの基質として働く特異的に設計されたＥＡＭによる非特異的なホスファターゼの直接検出を提供する（図４）。代理標的として使用されるホスファターゼの検出に加えて、このシステムをサンプルの全ホスファターゼ活性の評価に用いることができる。かかる方法は細胞状態のモニタリング、薬物開発及びシグナル伝達経路の調査を含む多くの用途に有用であり得る。当該技術分野で開示される多くの現在のシステムでは、克服すべき課題が極めて複雑であるため、このタイプの測定は可能ではない。例えば、イムノアッセイフォーマットを利用する現在の検出技法では複数の標的を検出する必要があり、複雑なサンプルマトリックスの正確な光学的読み取りは困難であり、現在の小分子ベースの検出は天然基質、阻害剤及びスカベンジャーからの汚染に直面している。
【００５０】
本願の不可欠な要素は、酵素基質及び電気化学的シグナル伝達物質の両方としての二重機能を有するＥＡＭ分子である。この場合、基質部分はペプチドの代わりにリン酸基である（図２）。ＥＡＭのフェニルホスフェート頭部基は、最初の無傷リン酸化ＥＡＭが単一の見掛け電位Ｖ１を示すようにフェロセンとの連結性を示す。ホスファターゼの存在下で、リン酸基が除去されてフェノールが生じ、これが不可逆的１，６−脱離及び脱炭酸反応を受け、負にシフトした明らかな見掛け電位Ｖ２を有する第一級アミン官能基化フェロセンＥＡＭが生じる。したがって、標的ホスファターゼの存在は２つのレドックス波を有する電気化学的プロファイルをもたらし、ホスファターゼ濃度の増大に伴いＶ１でのシグナルの低下及びＶ２でのシグナルの増大が観察される。
【００５１】
表面検出フォーマットでは、基質がプロテアーゼの活性部位に接近可能である必要があるため、ＥＡＭ−基質分子の構造がアッセイの成功の中心となる。秩序だった半結晶性の剛性ＳＡＭは、基質の小さなサイズ及びその密集した疎水性ＳＡＭ環境への近接性を考えると、必ずしもこのアッセイに理想的であるとは限らない。これらの条件下では基質は溶液／ＳＡＭ界面に露出するが、依然として酵素活性部位に接近可能でない可能性がある。ＰｒｏＣｌｅａｖｅアッセイ機構はＥＡＭの化学的性質の直接的な変化であり、周囲環境の変化に依存しないため、このアッセイにおける「単分子層」の機能は電極の汚損を防ぎ、ＥＡＭ−基質をアドレス可能な電極に繋留することである。これらの点を考慮すると、一実施形態では、ＥＡＭ−基質分子はより長い柔軟性の親水性アンカー（例えば図１及び図２ｂに見られるポリエチレングリコール）を含む。かかるＥＡＭ−基質分子は、酵素が容易に拡散することのできる環境を築くのに適している。さらに、柔軟性の増大は酵素活性部位への基質（ＥＡＭ）の接近性を増大する可能性がある。表面検出フォーマットでのこの特定のアッセイの別の利点は、１つのサンプル中の多くの標的プロテアーゼを同時に検出することができることである。
【００５２】
酵素によってタグ付けされた抗体を用いたタンパク質の検出
本発明の別の態様は、OhmxのＥ−ＴＲＡＣＥアッセイに利用される小分子代理標的（Ｈ２Ｏ２）ではなく酵素によってタグ付けされた二次抗体が代理標的となる「電気化学的ＥＬＩＳＡ」を行う代替手段を記載する。酵素代理標的の利点は、同じサンプル中の複数の標的の検出を可能にする特異性をもたらすことである。一般的な小分子代理標的では或る標的からのシグナルを別の標的と区別することができないため、この複数の標的の検出は達成することができない。加えて、複数の標的の検出は酵素及びタンパク質の検出において有益なツールであり、この能力をもたらすことが現在のアッセイシステムの重大な課題である。本開示のアッセイは、図６及び図７に示されるように単一のウェルにおいて単一のサンプルから複数のタンパク質、酵素又はタンパク質及び酵素の組合せを検出する能力をもたらす。
【００５３】
標的分析物
本明細書で「標的分析物」若しくは「分析物」若しくは「標的」又は文法的な同等物は、検出対象の任意の分子、化合物又は粒子を意味する。下でより十分に説明されるように標的分析物は結合リガンド（捕捉結合リガンド及び可溶性結合リガンドの両方）に結合するか、又はＥＡＭ自体に酵素的に作用する。
【００５４】
標的酵素
一態様では、本発明は標的酵素の検出に有用な方法及び組成物を提供する。本明細書で「分析物」、「標的分析物」又は「標的酵素」はオキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ（特にプロテアーゼ）、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ及びリガーゼを含むが、これらに限定されない検出対象の酵素を意味する。酵素命名法１９９２（Academic Press，San Diego，California）、付録１（１９９３）、付録２（１９９４）、付録３（１９９５）、付録４（１９９７）及び付録５（それぞれEur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5、Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6、Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5、Eur. J. Biochem. 1997, 250; 1-6及びEur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650、全てその全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。別の態様では、代理酵素を検出してもよい。本明細書で「代理酵素」又は「代理標的」は、標的分析物自体の代わりにＥＲＭをＥＡＭから除去するその検出スキームのシグナル生成部として機能する酵素を意味する。この代理酵素は典型的には捕捉結合リガンドにタグ付けられるが、標的分析物によって活性化され、活性化するとＥＡＭと反応してＥＲＭを除去し、シグナルを生成する試薬として添加される不活性酵素であってもよい。
【００５５】
ヒドロラーゼ
幾つかの実施形態では、標的酵素はヒドロラーゼである。本明細書で「ヒドロラーゼ」は様々な化学結合の加水分解を触媒する酵素を意味する。ヒドロラーゼはＥＣ番号分類のＥＣ  ３に分類される。ヒドロラーゼとしては、エステル結合（ヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、リパーゼ及びホスファターゼ等のエステラーゼ）、糖（グリコシラーゼ／ＤＮＡグリコシラーゼ、グルコシドヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ等を含むカルボヒドラーゼ）、エーテル結合、ペプチド結合（プロテアーゼ／ペプチダーゼ）、炭素−窒素結合（ペプチド結合以外）、酸無水物（ヘリカーゼ及びＧＴＰアーゼを含む酸無水物ヒドロラーゼ）、炭素−炭素結合、ハロゲン化物結合、リン−窒素結合、硫黄−窒素結合、炭素−リン結合、硫黄−硫黄結合及び炭素−硫黄結合の加水分解を触媒する酵素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
幾つかの実施形態では、ヒドロラーゼはプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４）である。本明細書で「プロテアーゼ」又は「プロテイナーゼ」は、アミノ酸を連結するペプチド（アミド）結合の加水分解によってタンパク質を加水分解することができる酵素を意味する。具体的には、特にペプチドを加水分解する酵素を指すペプチダーゼがプロテアーゼの定義に含まれる。
【００５７】
本明細書で「タンパク質」又は文法的な同等物は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチド、非天然アミノ酸及びアミノ酸類似体、並びにペプチド模倣構造を含有するタンパク質を含む誘導体及び類似体を意味する。側鎖は（Ｒ）配置又は（Ｓ）配置であり得る。好ましい実施形態では、アミノ酸は（Ｓ）配置又はＬ配置である。下記で論考するように、タンパク質を捕捉基質として使用する場合、サンプル汚染物質による分解を遅らせるためにタンパク質類似体を利用することが望ましい場合もある。しかしながら概して、タンパク質類似体を酵素基質として使用する場合、基質は依然として標的酵素によってプロセシングされることが可能である。
【００５８】
プロテアーゼはセリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ及びグルタミン酸プロテアーゼの６つの群に分類される。概して、プロテアーゼはタンパク質のアミノ酸配列に応じて特異的なペプチド結合を切断するか（例えば制限タンパク分解の特異的なセグメント）、又は完全タンパク質をアミノ酸に分解することができる（非制限タンパク分解）。活性はタンパク質の機能を消失させるか、若しくはタンパク質をその主成分まで消化する破壊的変化であっても、機能の活性化であっても、又はシグナル伝達経路のシグナルであってもよい。
【００５９】
幾つかの実施形態では、標的酵素はエンドペプチダーゼである。本明細書で「エンドペプチダーゼ」は、タンパク質基質の一方又は両方の末端からペプチド結合を切断するエキソペプチダーゼに対して、タンパク質基質内のペプチド結合を切断するペプチダーゼを意味する。エンドペプチダーゼは、触媒機構に基づいてセリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ及び他のエンドペプチダーゼというサブクラスに分けられる。
【００６０】
対象の特定のプロテアーゼはＰＳＡ（前立腺特異的抗原）である。幾つかの実施形態では、がんと良性疾患（例えば良性前立腺肥大）とを区別する手段としてＰＳＡ活性を検出することができる。サンプル、例えば尿、精液、前立腺液又は前立腺マッサージ後尿におけるタンパク分解ＰＳＡ活性の決定は、前立腺がんの存在と関連付けることができる。これは国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１１／００９１９号（国際公開第２０１１／１４６１４３号として公開されており、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に更に記載されている。ＰＳＡはそれに記載の手法を用い、試験サンプルをＰＳＡの特異的ペプチド基質を有するＥＡＭ（例えば第１のＥ０を有するＨＳＳＫＬＱ−ＥＡＭ）に導入することによって検出することができ、活性ＰＳＡが存在する場合、Ｑ−ＥＡＭ結合が切断され、ペプチドが放出されて第２のＥ０を有するＥＡＭが生じ、活性ＰＳＡの存在が示される。
【００６１】
（１）セリンエンドペプチダーゼ
このクラスは以下の２つの異なるファミリーを含む：キモトリプシン、トリプシン又はエラスターゼ又はカリクレイン等の哺乳動物酵素を含むキモトリプシンファミリー、及びサブチリシン等の細菌酵素を含むサブチリシンファミリー。全体三次元（３Ｄ）構造は２つのファミリーで異なるが、これらは同じ活性部位形状を有し、触媒反応は同じ機構で進行する。セリンエンドペプチダーゼは、基質残基と相互作用する様々な酵素サブサイトでのアミノ酸置換に関連した異なる基質特異性を示す。広範な基質との相互作用部位を有する酵素もあるが、Ｐ１基質残基に制限された特異性を有する酵素もある。
【００６２】
（２）システインエンドペプチダーゼ
このファミリーはパパイン、アクチニジン又はブロメライン等の植物プロテアーゼ、リソソームカテプシン並びにカテプシンＢ、Ｌ、Ｓ、Ｈ、Ｊ、Ｎ及びＯを含む幾つかの哺乳動物カテプシン、細胞質カルパイン（カルシウム活性化）、並びに幾つかの寄生動物プロテアーゼ（例えばトリパノソーマ属、住血吸虫属）並びにインターロイキン変換酵素（ＩＣＥ）を含むカスパーゼを含む。
【００６３】
（３）アスパラギン酸エンドペプチダーゼ
アスパラギン酸エンドペプチダーゼの大半はペプシンファミリーに属する。ペプシンファミリーには、ペプシン及びキモシン並びにリソソームカテプシンＤ等の消化酵素、並びにレニン及び或る特定の真菌プロテアーゼ（ペニシロペプシン、リゾプスペプシン、エンドチアペプシン）等のプロセシング酵素が含まれる。第２のファミリーとして、レトロペプシンとも呼ばれるＡＩＤＳウイルス（ＨＩＶ）由来のプロテアーゼ等のウイルスエンドペプチダーゼが挙げられる。
【００６４】
セリン及びシステインプロテアーゼとは対照的に、アスパラギン酸エンドペプチダーゼによる触媒反応には、４面体型中間体が存在するにも関わらず共有結合中間体は関与しない。求核攻撃は、１つ目は水分子から２つのカルボキシル基の二連子へ、２つ目は二連子から基質のカルボニル酸素へという２つの同時のプロトン移動によって達成され、ＣＯ−ＮＨ結合切断が同時に起こる。
【００６５】
（４）メタロエンドペプチダーゼ
メタロエンドペプチダーゼは細菌、真菌及び高等生物に見られる。メタロエンドペプチダーゼは配列及び構造が大幅に異なるが、この酵素の大部分が触媒活性を有する亜鉛原子を含有する。場合によっては、亜鉛は活性を喪失することなくコバルト又はニッケル等の別の金属に置き換えられ得る。細菌サーモリシンが十分に特徴付けられており、その結晶構造から亜鉛に２つのヒスチジン及び１つのグルタミン酸が結合することが示される。多くの酵素は亜鉛に対して２つのヒスチジンリガンドを与える配列ＨＥＸＸＨを含有し、第３のリガンドはグルタミン酸（サーモリシン、ネプリライシン、アラニルアミノペプチダーゼ）又はヒスチジン（アスタシン）である。他のファミリーは異なるＺｎ原子の結合様式を示す。触媒機構は、被切断結合のカルボニル基に対する亜鉛結合水分子の攻撃後に非共有４面体型中間体の形成をもたらす。この中間体は、グルタミン酸プロトンの脱離基への移動によって更に分解される。
【００６６】
アデノシンデアミナーゼ、アンジオテンシン変換酵素、カルシニューリン、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ５、腎ジペプチダーゼ及びウレアーゼを含む金属酵素に特に関心が持たれている。
【００６７】
一実施形態では、メタロエンドペプチダーゼはＭＭＰ−１〜ＭＭＰ−１０、特にＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７及びＭＭＰ−９を含むマトリックスメタロプロテイナーゼである。
【００６８】
トランスフェラーゼ
幾つかの実施形態では、標的酵素はトランスフェラーゼである。本明細書で「トランスフェラーゼ」は、或る分子（ドナー）から別の分子（アクセプタ）への官能基（例えばメチル又はリン酸基）の移動を触媒する酵素を意味する。
【００６９】
トランスフェラーゼはＥＣ番号分類のＥＣ  ２に分類される。トランスフェラーゼは、９つのサブクラスに更に分類することができる：一炭素基を移動させる酵素（メチルトランスフェラーゼ）、アルデヒド基又はケトン基を移動させる酵素、アシルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、メチル基以外のアルキル基又はアリール基を移動させる酵素、含窒素基を移動させる酵素（トランスアミナーゼ）、含リン基を移動させる酵素（ポリメラーゼ及びキナーゼを含むホスホトランスフェラーゼ）、含硫黄基を移動させる酵素（硫黄トランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼ）、及び含セレン基を移動させる酵素。
【００７０】
真核生物は、多くの細胞プロセスの調節に特定のタンパク質のリン酸化及び脱リン酸化を用いる（T. Hunter, Cell 80:225-236 (1995)、Karin, M., Curr. Opin. Cell Biol. 3:467-473 (1991)）。これらのプロセスとしてはシグナル伝達、細胞分裂及び遺伝子転写の開始が挙げられる。このため、生物の維持、適応及び疾患に対する感受性はタンパク質のリン酸化及び脱リン酸化によって制御される。これらの現象は広範であり、ヒトがおよそ２０００個のタンパク質キナーゼ遺伝子及び１０００個のタンパク質ホスファターゼ遺伝子を有することが推定され（T. Hunter, Cell 80:225-236 (1995)）、これらの一部が疾患感受性をコードする可能性がある。これらの理由で、タンパク質キナーゼ及びホスファターゼは薬物療法の開発の良好な標的となる。
【００７１】
オキシドレダクターゼ
幾つかの実施形態では、標的酵素はオキシドレダクターゼである。オキシドレダクターゼは或る分子（酸化剤、水素ドナー又は電子ドナーとも呼ばれる）から別の分子（還元剤、水素アクセプタ又は電子アクセプタとも呼ばれる）への電子の移動を触媒する酵素である。オキシドレダクターゼは酵素のＥＣ番号分類のＥＣ  １に分類される。オキシドレダクターゼは２２個のサブクラスに更に分類することができる。多くのオキシドレダクターゼ酵素は、１つ又は複数の金属イオンを含有する金属酵素である。この群におけるいくつかの例示的な酵素は、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、５−リポキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アロマターゼ、シクロオキシゲナーゼ、シトクロムＰ４５０、フマル酸レダクターゼ、ヘムオキシゲナーゼ、ラノステロールデメチラーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、リボヌクレオシド二リン酸レダクターゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ及びキサンチンオキシダーゼである。
【００７２】
リアーゼ
幾つかの実施形態では、標的酵素はリアーゼである。本明細書で「リアーゼ」は、加水分解及び酸化以外の手段による様々な化学結合の切断を触媒し、多くの場合新たな二重結合又は新たな環構造を形成する酵素を意味する。
【００７３】
リアーゼは酵素のＥＣ番号分類のＥＣ  ４に分類される。リアーゼは７つのサブクラスに更に分類することができる：（１）炭素−炭素結合を切断するリアーゼ、例えばデカルボキシラーゼ、アルデヒドリアーゼ及びオキソ酸リアーゼ、（２）炭素−酸素結合を切断するリアーゼ、例えばデヒドラターゼ、（３）炭素−窒素結合を切断するリアーゼ、（４）炭素−硫黄結合を切断するリアーゼ、（５）炭素−ハロゲン化物結合を切断するリアーゼ、（６）リン−酸素結合を切断するリアーゼ、例えばアデニル酸シクラーゼ及びグアニル酸シクラーゼ、並びに（７）他のリアーゼ、例えばフェロケラターゼ。
【００７４】
イソメラーゼ
幾つかの実施形態では、標的酵素はイソメラーゼである。本明細書で「イソメラーゼ」は、異性体の構造再配置を触媒する酵素を意味する。
【００７５】
イソメラーゼ自体が酵素のＥＣ分類：ＥＣ  ５に含まれている。イソメラーゼは６つのサブクラスに更に分類することができる：（１）ラセミ化を触媒する酵素（ラセマーゼ）及びエピマー化を触媒する酵素（エピメラーゼ）、（２）幾何異性体の異性化を触媒する酵素（シス−トランスイソメラーゼ）、（３）分子内オキシドレダクターゼ、（４）分子内トランスフェラーゼ（ムターゼ）、（５）分子内リアーゼ、及び（６）他のイソメラーゼ（トポイソメラーゼを含む）。
【００７６】
リガーゼ
リガーゼは酵素のＥＣ番号分類のＥＣ  ６に分類される。リガーゼを６つのサブクラスに更に分類することができる：（１）炭素−酸素結合を形成する酵素（例えばトランスファーＲＮＡを対応するアミノ酸でアシル化する酵素（アミノ酸−ｔＲＮＡリガーゼ））、（２）炭素−硫黄結合を形成する酵素（例えばアシル−ＣｏＡ誘導体を合成する酵素）、（３）炭素−窒素結合を形成する酵素（例えばアミドシンターゼ、ペプチドシンターゼ、複素環を形成する酵素、アミド−Ｎ−供与体としてグルタミンを使用する酵素）等、（４）炭素−炭素結合を形成する酵素（カルボキシル化酵素、大部分はビオチニル−タンパク質）、（５）リン酸エステル結合を形成する酵素（例えば核酸において破壊されたホスホジエステル結合を復元する酵素（修復酵素と呼ばれることが多い））、及び（６）窒素−金属結合（例えばテトラピロール環系の金属キレート化）を形成する酵素。
【００７７】
プロ酵素増幅
チモーゲンとしても知られるプロ酵素は、プロペプチドセグメントが除去された場合に活性となる酵素の不活性形態である。プロセグメントの除去は立体配座変化を誘導するか、又はそれまで接近不可能であった酵素活性部位への接近を可能にする。これらのプロ酵素は不活性であるが、代理標的として使用することができ、プロ酵素をその活性形態に「変える」対象の標的によって活性化され、これがその後ＥＡＭのＥＲＭと反応する。プロ酵素濃度は標的分析物よりも数倍高いため、このプロ酵素代理標的を用いてシグナルを増幅することができる。各々の標的酵素について多くのプロ酵素を活性化し、はるかに多くのＥＡＭを反応させる（図１１）。この場合、ＥＲＭはプロ酵素の活性形態の基質として働く。
【００７８】
ホスファターゼ
生体系におけるリン酸化は、酵素及び受容体の活性化／不活性化、解糖における基質レベルのリン酸化及び酸化的リン酸化におけるエネルギー貯蔵を含む多くの細胞プロセスの調節に関与する。翻訳後修飾、とりわけリン酸化事象は成長、分化及び代謝を含む多くの細胞機能に不可欠であり、多くの場合、リン酸化はがんにおける変形（transmogrification）をもたらすシグナル伝達経路脱制御手段を与える。リン酸化は、リン酸化を行うキナーゼ及び脱リン酸化を行うホスファターゼによって媒介される。本発明は、リン酸化調節因子であるホスファターゼの活性を定量化する方法を提供する。これは、細胞状態のモニタリング、薬物開発及びシグナル伝達経路の調査を含む多くの用途において有用なツールをもたらし得る。
【００７９】
結合及び酵素反応条件は概して生理学的条件である。概して、複数のアッセイ混合物を並行して異なる濃度で用い、様々な濃度に対する差次的応答を得る。典型的には、これらの濃度の１つを陰性対照、すなわちゼロ濃度又は検出レベル未満とする。加えて、任意の様々な他の試薬がスクリーニングアッセイに含まれていてもよい。これらとしては、最適結合を促進し、及び／又は非特異的な若しくはバックグラウンド相互作用を低減するのに使用することができる塩等の試薬、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤等が挙げられる。また、別の形でアッセイの効率を改善する試薬、例えば標的化阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤等を使用することができる。構成要素の混合物は、必要な結合をもたらす任意の順序で添加してもよい。
【００８０】
酵素とＥＡＭとの反応はＥＡＭのＥＲＭ及び／又はＥＲＭ−ＳＩＭ構成要素の喪失をもたらし、ＥＡＭのＥ０の変化を生じる。幾つかの実施形態では、ＥＡＭのＥ０は約２０ｍＶ、３０ｍＶ、４０ｍＶ、５０ｍＶ、７５ｍＶ、８０ｍＶ、９０ｍＶ〜１００ｍＶ変化し、２００ｍＶ、３００ｍＶ又は５００ｍＶの変化を生じる幾つかの実施形態が達成される。幾つかの実施形態では、ＥＡＭのＥ０の変化は減少である。幾つかの実施形態では、ＥＡＭのＥ０の変化は増大である。
【００８１】
電子移動は概して電子的に開始し、電圧が好ましい。印加電位の正確な制御及び変動は、ポテンシオスタット及び三電極系（１つの参照電極、１つの試料電極及び１つの対電極）又は二電極系（１つの試料電極及び１つの対電極）によって行うことができる。これにより、一部はレドックス活性分子の選択、一部は使用する導電性オリゴマーに依存する系のピーク電子移動電位に印加電位を整合させることができる。
【００８２】
好適な酵素標的分析物としては、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ及びトランスフェラーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼを含み、具体的にはトリプシン、キモトリプシン、ＰＳＡ、ＭＭＰ、ＡＤＡＭを含む、官能基を除去するか、又は或る分子から別の分子へと官能基を移動させる酵素が挙げられる。ＭＭＰ、ＡＤＡＭ、カリクレイン及びＰＳＡを含む多くのがんバイオマーカーが、プロテアーゼ分類に入る。これらのクラスの１つに属する酵素のプロ酵素形態を、シグナルを増幅する代理標的として利用することができる。細胞毒性及び細胞生存性の評価に一般に利用されるタンパク分解事象と関連する酵素を、このシステムを用いて測定することもできる。
【００８３】
他の好適な標的分析物としては、抗体に、又は他の捕捉フォーマットで固定化し得る、治療用分子（治療薬物及び乱用薬物、抗生物質等を含む）；生体分子（ホルモン、サイトカイン、タンパク質、脂質、炭水化物、細胞膜抗原及び受容体（神経受容体、ホルモン受容体、栄養素受容体及び細胞表面受容体）又はそれらのリガンド等を含む）；全細胞（原核細胞（病原性細菌等）及び哺乳動物腫瘍細胞を含む真核細胞を含む）；ウイルス（レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス等を含む）；並びに胞子等が挙げられる。
【００８４】
幾つかの実施形態では、標的分析物はタンパク質である。当業者に認められているように、本発明を用いて検出することができる多数の可能なタンパク性標的分析物が存在する。本明細書で「タンパク質」又は文法的な同等物は、タンパク質、オリゴペプチド及びペプチド、非天然アミノ酸及びアミノ酸類似体、並びにペプチド模倣構造を含有するタンパク質を含む誘導体及び類似体を意味する。側鎖は（Ｒ）配置又は（Ｓ）配置であり得る。好ましい実施形態では、アミノ酸は（Ｓ）配置又はＬ配置である。下記で論考するように、タンパク質を結合リガンドとして使用する場合、サンプル汚染物質による分解を遅らせるためにタンパク質類似体を利用することが望ましい場合もある。
【００８５】
好適なタンパク質標的分析物としては、（１）免疫グロブリン、特にＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、特に例えばヒトアルブミン、アポリポタンパク質（アポリポタンパク質Ｅを含む）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、コルチゾール、α−フェトプロテイン、チロキシン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、抗トロンビンに対する抗体、医薬品（抗癲癇薬（フェニトイン、プリミドン、カルバマゼピン、エトスクシミド、バルプロ酸及びフェノバルビタール）、心臓作用薬（ジゴキシン、リドカイン、プロカインアミド及びジソピラミド）、気管支拡張剤（テオフィリン）、抗生物質（クロラムフェニコール、スルホンアミド）、抗鬱剤、免疫抑制剤、乱用薬物（アンフェタミン、メタンフェタミン、カンナビノイド、コカイン及びアヘン剤）を含む）に対する抗体、並びに様々なウイルス（オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例えば呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス）、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、レオウイルス、トガウイルス（例えば風疹ウイルス）、パルボウイルス、ポックスウイルス（例えば天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス）、エンテロウイルス（例えばポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型及びＣ型を含む）、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス）、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、ハンタウイルス、アレナウイルス、ラブドウイルス（例えば狂犬病ウイルス）、レトロウイルス（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ  Ｉ及びＩＩを含む）、パポーバウイルス（例えばパピローマウイルス）、ポリオーマウイルス及びピコルナウイルス等を含む）及び細菌（バシラス属；ビブリオ属、例えばコレラ菌（V. cholerae）；エシェリキア属、例えば腸管毒素原性大腸菌（E. coli）、シゲラ属、例えば志賀赤痢菌（S. dysenteriae）；サルモネラ属、例えばチフス菌（S. typhi）；マイコバクテリウム属、例えば結核菌（M. tuberculosis）、癩菌（M. leprae）；クロストリジウム属、例えばボツリヌス菌（C. botulinum）、破傷風菌（C. tetani）、クロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）、ウェルシュ菌（C. perfringens）；コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、例えばジフテリア菌（C. diphtheriae）；ストレプトコッカス属、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）、肺炎レンサ球菌（S. pneumoniae）；スタフィロコッカス属、例えば黄色ブドウ球菌（S. aureus）；ヘモフィラス属、例えばインフルエンザ菌（H. influenzae）；ナイセリア属、例えば髄膜炎菌（N. meningitidis）、淋菌（N. gonorrhoeae）；エルシニア属、例えばランブル鞭毛虫（G. lamblia）、ペスト菌（Y. pestis）、シュードモナス属、例えば緑膿菌（P. aeruginosa）、シュードモナス・プチダ（P. putida）；クラミジア属、例えばクラミジア・トラコマチス（C. trachomatis）；ボルデテラ属、例えば百日咳菌（B. pertussis）；トレポネーマ属、例えば梅毒トレポネーマ（T. palladium）等を含む対象の広範な病原性及び非病原性原核生物を含む）に対する抗体を含むが、これに限定されない治療又は診断関連抗体；（２）クレアチンキナーゼ、乳酸脱水素酵素、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、トロポニンＴ、ミオグ��ビン、フィブリノゲン、コレステロール、トリグリセリド、トロンビン、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）を含む心臓病の指標として又はその治療に使用される酵素；アミラーゼ、リパーゼ、キモトリプシン及びトリプシンを含む膵疾患の指標；コリンエステラーゼ、ビリルビン及びアルカリホスファターゼ（正：phosphatase）を含む肝機能酵素及びタンパク質；アルドラーゼ、前立腺酸性ホスファターゼ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、並びにＨＩＶプロテアーゼ等の細菌酵素及びウイルス酵素を含むが、これらに限定されない酵素（及び他のタンパク質）；（３）エリトロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ−１〜ＩＬ−１７を含む）、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２を含む）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βを含む）、ヒト成長ホルモン、トランスフェリン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質、レプチン、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、毛様体神経栄養因子、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、カルシトニン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、コルチゾール、エストラジオール、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、プロゲステロン、テストステロン等のホルモン及びサイトカイン（大半が細胞受容体のリガンドとして働く）；並びに（４）他のタンパク質（α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原ＣＥＡを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
加えて、抗体を検出し得る任意の生体分子を検出することもできる。すなわち、ウイルス又は細菌細胞、治療薬物及び乱用薬物等の検出を直接行うことができる。
【００８７】
好適な標的分析物としては、乳がん（ＣＡ１５−３、ＣＡ５４９、ＣＡ２７．２９）、ムチン様癌関連抗原（ＭＣＡ）、卵巣がん（ＣＡ１２５）、膵臓がん（ＤＥ−ＰＡＮ−２）並びに結腸直腸がん及び膵臓がん（ＣＡ１９、ＣＡ５０、ＣＡ２４２）のマーカーを含むが、これらに限定されない炭水化物が挙げられる。
【００８８】
捕捉結合リガンド及び可溶性結合リガンド
ＳＡＭ及びＥＡＭに加えて、幾つかの実施形態では、固体支持体は捕捉結合リガンドを含む。本明細書で「結合リガンド」又は「結合種」は、標的分析物の存在を調査するために使用され、標的分析物に結合する化合物を意味する。概して、本明細書に記載の大半の実施形態については、標的分析物分子１つ当たり少なくとも２つの結合リガンド（固体支持体に結合する「捕捉」又は「アンカー」結合リガンド、及び標的分析物に独立して結合し、直接的又は間接的にプロテアーゼ又はホスファターゼ酵素等の少なくとも１つの標識を含む可溶性結合リガンド）が使用される。本明細書で「捕捉結合リガンド」は、標的分析物に結合する固体支持体に結合している標的分析物に結合する結合リガンドを意味する。本明細書で「可溶性結合リガンド」は、捕捉結合リガンドとは異なる部位で標的分析物に結合する溶液中に存在する結合リガンドを意味する。
【００８９】
当業者に認められているように、結合リガンドの組成は標的分析物の組成によって決まる。広範な分析物に対する結合リガンドは既知であるか、又は既知の技法を用いて容易に発見することができる。例えば、分析物がタンパク質である場合、結合リガンドはタンパク質（特に抗体又はそのフラグメント（ＦＡｂ等）を含む）又は小分子を含む。
【００９０】
概して、抗体は捕捉結合リガンド及び可溶性結合リガンドの両方として有用である。
【００９１】
可溶性結合リガンドは、供給されるＥＡＭを基質として利用することが意図される特異的酵素も含む。「代理酵素」とも称されるこの酵素タグは、官能基を基質又は補基質から除去又は移動させる任意の酵素であり得る。この場合、それぞれの酵素反応部分（ＥＲＭ）が供給されるＥＡＭから特異的に除去される。
【００９２】
概して、捕捉結合リガンドは検出目的での固体支持体表面への標的分析物の結合を可能にする。一実施形態では、結合は特異的であり、結合リガンドは結合対の一部である。本明細書で「特異的に結合する」とは、分析物と試験サンプルの他の構成要素又は汚染物質とを区別するのに十分な特異性でリガンドが分析物に結合することを意味する。本明細書で「特異的な結合対」とは、抗体／抗原及び受容体／リガンド等の結合リガンドの相補対を意味する。結合は、非特異的な結合を除去する洗浄工程を含むアッセイ条件下で分析物が結合したままであるのに十分であるものとする。幾つかの実施形態では、例えば或る特定の生体分子の検出において、結合リガンドへの分析物の結合定数は少なくとも約１０−４Ｍ−１〜１０−９Ｍ−１であり、少なくとも約１０−５〜１０−９が好ましく、少なくとも約１０−７Ｍ−１〜１０−９Ｍ−１が特に好ましい。
【００９３】
広範な分析物に対する結合リガンドは既知であるか、又は既知の技法を用いて容易に発見することができる。例えば、分析物が一本鎖核酸である場合、結合リガンドは概して実質的に相補的な核酸である。代替的には、米国特許第５，２７０，１６３号、同第５，４７５，０９６号、同第５，５６７，５８８号、同第５，５９５，８７７号、同第５，６３７，４５９号、同第５，６８３，８６７号、同第５，７０５，３３７号及び関連特許（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に概略的に記載されるように、実質的に任意の標的分析物に結合する核酸「アプタマー」を開発することができる。同様に、分析物は核酸結合タンパク質であってもよく、捕捉結合リガンドは一本鎖又は二本鎖核酸である。代替的には、分析物が一本鎖又は二本鎖核酸である場合、結合リガンドは核酸結合タンパク質であり得る。分析物がタンパク質である場合、結合リガンドは上記のタンパク質（特に抗体又はそのフラグメント（ＦＡｂ等）を含む）、小分子又はアプタマーを含む。好ましい結合リガンドタンパク質は抗体及びペプチドを含む。当業者に認められているように、好ましくは特異的に結合する任意の２つの分子を分析物又は結合リガンドとして使用することができる。好適な分析物／結合リガンド対としては、抗体／抗原、受容体／リガンド、タンパク質／核酸；核酸／核酸、酵素／基質及び／又は阻害剤、炭水化物（糖タンパク質及び糖脂質を含む）／レクチン、炭水化物及び他の結合パートナー、タンパク質／タンパク質；及びタンパク質／小分子が挙げられるが、これらに限定されない。これらは野生型又は誘導体配列であり得る。
【００９４】
サンプル
標的分析物は概してサンプル中に存在する。当業者に認められているように、サンプル溶液は、体液（実質的に任意の生物の血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門分泌物及び膣分泌物、汗並びに精液を含むが、これらに限定されず、哺乳動物のサンプルが好ましく、ヒトのサンプルが特に好ましい）；環境サンプル（大気、農産物、水及び土壌のサンプルを含むが、これらに限定されない）；植物材料；生物兵器サンプル；研究サンプル、精製サンプル、未加工サンプル等を含むが、これらに限定されない様々なものを含み得る。当業者に認められているように、実質的に任意の実験操作をサンプルに行うことができる。幾つかの実施形態では、貯蔵（例えば凍結及び／又は保管）した又は新鮮な組織を利用する。パラフィン包埋サンプルは、これらのサンプルが診断及び予後診断等のサンプルと関連する付加的なデータの存在のために非常に有用であり得ることから、多くの実施形態で特に有用である。本明細書に記載の固定及びパラフィン包埋した組織サンプルは、貯蔵可能な又は保管可能な組織サンプルを指す。大半の患者由来の病理サンプルは、組織学的分析及び後続の保管貯蔵を可能にするために日常的に固定及びパラフィン包埋される。
【００９５】
固体支持体
標的分析物は、電極を備える固体支持体を用いて検出される。本明細書で「基板」又は「固体支持体」又は他の文法的な同等物は、捕捉リガンド又はＥＡＭの付着又は結合に適切な個別の部位を含有するように修飾され得る任意の材料を意味する。好適な基板としては、金等の金属表面、下記で規定する電極、ガラス及び改質ガラス又は官能化ガラス、ガラス繊維、テフロン、セラミック、マイカ、プラスチック（アクリル樹脂、ポリスチレン、及びスチレンと他の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリウレタン、テフロン（商標）、並びにそれらの誘導体等を含む）、ＧＥＴＥＫ（ポリプロピレンオキシドとガラス繊維とのブレンド）等、多糖、ナイロン又はニトロセルロース、樹脂、シリカ又はシリコン及び変性シリコンを含むシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、並びに他の様々なポリマーが挙げられ、ポリマー裏面上の蒸着金回路が特に好ましい。一実施形態では、固体支持体は微小粒子、磁性微小粒子、ビーズ及びマイクロチャネルから選択される。
【００９６】
本発明の系は、アドレス可能な検出電極（本明細書では概して「パッド」、「アドレス」又は「微小位置（micro-locations）」と称される）のマトリックスが存在するアレイフォーマットで特に有用である。本明細書で「アレイ」とは、アレイフォーマットの複数の捕捉リガンドを意味する。アレイのサイズはアレイの組成及び最終用途に依存する。約２個〜数千個の異なる捕捉基板を含有するアレイを作製することができる。
【００９７】
好ましい実施形態では、検出電極が基板上に形成される。加えて、本明細書の論考は概して金電極の使用を対象とするが、当業者に認められているように、他の電極を使用してもよい。基板は本明細書及び引用参照文献で概説されるような広範な材料を含み得る。
【００９８】
概して、材料としてはプリント配線板材料が挙げられる。配線板材料は、導電層でコーティングされ、リソグラフィー法、特にフォトリソグラフィー法を用いて処理され、電極及びインターコネクト（当該技術分野で相互接続部又はリードと称される場合もある）のパターンを形成した絶縁基板を含むものである。絶縁基板は常にという訳ではないが、概してポリマーである。当該技術分野で既知のように、１つ又は複数の層を使用して、「二次元」（例えば全ての電極及び相互接続部が平面内にある）又は「三次元」（電極が一方の表面上にあり、インターコネクトがボードの反対側まで貫通し得るか、又は電極が複数の表面上にある）のボードを作製してもよい。三次元系は、「ボード貫通」相互接続部が作製されるように、ドリリング又はエッチングに続く銅等の金属による電気めっきの使用に依存することが多い。配線板材料は、基板に既に結合した銅ホイル等のホイルを備えることが多く、付加的な銅が必要に応じて（例えば相互接続部に）例えば電気めっきによって添加される。次いで、銅表面を接着層の結合のために例えばエッチングによって粗面化する必要がある場合もある。したがって、好ましい実施形態では、本発明は複数の電極、好ましくは金電極を備える基板を含むチップを提供する。電極の数はアレイについて概説される通りである。各々の電極が本明細書で概説されるようにアッセイの最終工程中にｉｎ  ｓｉｔｕで自己組織化単分子層により修飾される。加えて、各電極が相互接続部を有する、すなわち電極が最終的に電極を制御することができるデバイスに結合する。すなわち、各電極が独立してアドレス可能である。
【００９９】
最後に、本発明の組成物は、マイクロ流体構成要素及びロボット構成要素（例えば、米国特許第６，９４２，７７１号及び同第７，３１２，０８７号並びに関連案件（どちらもその全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい）、並びにシグナル処理法を用いるコンピュータを含む検出システム（例えば米国特許第６，７４０，５１８号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい）を含む広範な付加的構成要素を含み得る。
【０１００】
自己組織化単分子層
電極は、予め形成された自己組織化単分子層（ＳＡＭ）又はホモジニアスアッセイの一環としてｉｎ  ｓｉｔｕで形成されたＳＡＭを備える。本明細書で「単分子層」又は「自己組織化単分子層」又は「ＳＡＭ」とは、自発的に表面に化学吸着した比較的秩序だった分子の集合体を意味し、分子は互いにほぼ並行し、表面にほぼ垂直に配向する。分子の各々が表面に付着する官能基と、単分子層内の隣接分子と相互作用して比較的秩序だったアレイを形成する部分とを含む。「混合」単分子層は、少なくとも２つの異なる分子が単分子層を構成する不均一単分子層を含む。本明細書で概説されるように、単分子層の使用は表面への生体分子の非特異的結合の量を低減し、核酸の場合、オリゴヌクレオチドと電極との距離の結果としてオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの効率を増大させる。加えて、単分子層は電荷担体を電極の表面から離しておく働きをする。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、単分子層はオリゴマーを含み、特にオリゴマーは概して下記のようにＥＡＭを電極表面に結合するために使用される。好ましい実施形態では、オリゴマーは柔軟であり、剛性又は組織化があったとしても僅かであるように隣接分子との相互作用が限られている。さらに、これらのオリゴマーは酵素相互作用に対してより接近可能な界面を与えるために親水性であってもよい。遷移金属錯体は電極表面及び溶液を介した電極との直接の電子的連絡のための支持対イオン電解質への満足な接近に十分に近いため、これらのオリゴマーは無秩序及び柔軟性により導電性である必要はない。好ましい柔軟性の親水性オリゴマーとしては、これらの特徴を有するその主鎖又は側鎖に極性又は荷電官能基を有するオリゴマーが挙げられる。親水性オリゴマーも、水性サンプルへのＥＡＭの溶解度を増大するため好ましい。水性サンプルは最高酵素活性に理想的であるため、より水溶性のＥＡＭは標的ＥＡＭ反応を行うのに有機溶媒を殆ど必要とせず、酵素活性の増大のためにより高いシグナルを生じる。例としては、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリビニルピロリジノン、アクリルアミド、無水マレイン酸及びポリビニルピリジンが挙げられる。アリルアミン、エチレンイミン及びオキサゾリンを含むアミン官能性オリゴマーを使用することもできる。他の疎水性のオリゴマー、特に分子間疎水性相互作用を制限し、したがって組織化及び剛性を抑制する側鎖を有するオリゴマーを同様に使用してもよい。疎水性オリゴマーリンカーは、酵素活性部位近くの疎水性領域とのより有利な相互作用を有する場合があるため、特定の酵素に適している可能性がある。理想的なオリゴマーの長さは標的酵素及びモノマー構造に応じて異なる場合があり、より長いオリゴマーが酵素の接近に最適であるが、長さの上限が電気化学的性能によって課せられる。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、単分子層は導電性オリゴマーを含み、特に導電性オリゴマーは概して下記のようにＥＡＭを電極表面に結合するために使用される。本明細書で「導電性オリゴマー」とは、好ましくは線状の実質的に導電性のオリゴマーを意味し、その幾つかの実施形態が文献内で「分子ワイヤー」と称される。本明細書で「実質的に導電性の」とは、オリゴマーが１００Ｈｚで電子を移動させることが可能であることを意味する。概して、導電性オリゴマーは、導電性オリゴマーのモノマー単位間に実質的に重なりあったπ軌道、すなわち結合π軌道を有するが、導電性オリゴマーは１つ又は複数のシグマ（σ）結合を含有していてもよい。加えて、導電性オリゴマーは、結合したＥＡＭへ又はそれから電子を注入又は受容するその能力によって機能的に規定され得る。さらに、導電性オリゴマーは本明細書で規定されるように絶縁体よりも導電性である。加えて、本発明の導電性オリゴマーは、それ自体が電子を供与又は求引し得る電気活性ポリマーとは区別される。
【０１０３】
導電性オリゴマーのより詳細な説明は、国際公開第１９９９／５７３１７号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に見られる。特に、国際公開第１９９９／５７３１７号の１４頁〜２１頁の構造１〜９に示される導電性オリゴマーが本発明に使用される。幾つかの実施形態では、導電性オリゴマーは以下の構造を有する：
【化１】
2015529809.tif 000011
【０１０４】
加えて、単分子層中の少なくとも一部の導電性オリゴマーの末端は電子的に露出している。本明細書で「電子的に露出する」とは、末端に極めて接近したＥＡＭの配置の際及び適切なシグナルによる開始後に、ＥＡＭの存在に依存するシグナルが検出され得ることを意味する。導電性オリゴマーは末端基を有していても又は有していなくてもよい。このため、付加的な末端基は存在せず、導電性オリゴマーは例えばアセチレン結合等の末端基で終了する。代替的には、幾つかの実施形態では、本明細書で「Ｑ」と表されることもある末端基が付加される。末端基は幾つかの理由、例えばＥＡＭの検出に対する導電性オリゴマーの電子的有用性に寄与するため、又は他の理由、例えば非特異的結合の防止からＳＡＭの表面を変更するために使用され得る。例えば、標的分析物がＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸である場合に、核酸が反発される又は表面への付着が防止され、ハイブリダイゼーションが促進されるように負に帯電した表面を形成する負に帯電した基が末端上に存在し得る。好ましい末端基としては、−ＮＨ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ及び−ＣＨ３等のアルキル基、並びに（ポリ）エチレングリコール等の（ポリ）アルキル酸化物が挙げられ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２Ｈ、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｈ及び−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４Ｈが好ましい。
【０１０５】
一実施形態では、異なるタイプの末端基を有する導電性オリゴマーの混合物を使用することが可能である。このため、例えば一部の末端基は検出を促進することができ、一部は非特異的結合を防止することができる。
【０１０６】
このため、不動態化剤は電極への溶媒の接近性を遮断する物理的障壁として働く。そのように、不動態化剤自体は実際には（１）導電性又は（２）非導電性、すなわち絶縁性の分子であり得る。このため、一実施形態では、不動態化剤は本明細書に記載されるように、電極への電荷移動を遮断又は減少させる末端基を有する又は有しない導電性オリゴマーである。導電性であってもよい他の不動態化剤としては、−（ＣＦ２）ｎ−、−（ＣＨＦ）ｎ−及び−（ＣＦＲ）ｎ−のオリゴマーが挙げられる。好ましい実施形態では、不動態化剤は絶縁体部分である。
【０１０７】
幾つかの実施形態では、単分子層は絶縁体を含む。「絶縁体」は好ましくは線状の実質的に非導電性のオリゴマーである。本明細書で「実質的に非導電性」とは、絶縁体を介した電子移動速度が導電性オリゴマーを介した電子移動速度よりも遅いことを意味する。言い方を変えれば、絶縁体の電気的抵抗は導電性オリゴマーの電気的抵抗よりも高い。しかしながら、−（ＣＨ２）１６分子等の概して絶縁体とみなされるオリゴマーであっても、遅い速度ではあるが電子を移動させ得ることにも留意されたい。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、絶縁体は約１０−７Ω−１ｃｍ−１以下の伝導性Ｓを有し、約１０−８Ω−１ｃｍ−１未満が好ましい（Gardner et al., Sensors and Actuators A 51 (1995) 57-66（引用することにより本明細書の一部をなすものとする））。
【０１０９】
概して、絶縁体はシグマ結合を有するアルキル又はヘテロアルキルオリゴマー又は部分であるが、任意の特定の絶縁体分子は芳香族基又は１つ若しくは複数の共役結合を含有し得る。本明細書で「ヘテロアルキル」とは、少なくとも１つのヘテロ原子、すなわち窒素、酸素、硫黄、リン、ケイ素又はホウ素が鎖に含まれるアルキル基を意味する。代替的には、絶縁体は、好ましくは実質的に電子移動を阻害又は遅延させる働きをする１つ又は複数のヘテロ原子又は結合を付加した導電性オリゴマーによく似たものであり得る。幾つかの実施形態では、絶縁体はＣ６〜Ｃ１６アルキルである。
【０１１０】
絶縁体を含む不動態化剤は、電極への部分又は導電性オリゴマーの密集、絶縁体の親水性又は疎水性、及び絶縁体の柔軟性、すなわち回転柔軟性、ねじれ柔軟性又は縦方向柔軟性を変更する本明細書で規定のＲ基で置換されていてもよい。例えば、分岐アルキル基を使用することができる。加えて、絶縁体を含む不動態化剤の末端は、単分子層の露出表面に影響を与える付加的な基（本明細書で末端基（「ＴＧ」）と称される場合もある）を含有し得る。例えば、サンプルによる非特異的結合を阻害するため、又は分析物の結合動態に影響を与えるために帯電した中性又は疎水性基の付加が行われ得る。例えば、或る特定の標的分析物の結合を促す若しくは妨げる、又は反発する若しくは表面ヘの付着を防止するために、帯電表面を形成する帯電基が末端上に存在し得る。
【０１１１】
不動態化剤の長さは必要に応じて異なる。概して、不動態化剤の長さは、上記で概説したような導電性オリゴマーの長さと同様である。加えて、導電性オリゴマーは不動態化剤と基本的に同じ長さを有するか又はそれより長い。
【０１１２】
ｉｎ  ｓｉｔｕ単分子層は、絶縁体を含む単一タイプ又は異なるタイプの不動態化剤を含み得る。
【０１１３】
好適な絶縁体は当該技術分野で既知であり、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＲＨ）ｎ−及び−（ＣＲ２）ｎ−、エチレングリコール又は酸素の代わりに他のヘテロ原子、すなわち窒素又は硫黄を用いた誘導体（電極が金である場合、硫黄誘導体は好ましくない）が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、絶縁体はＣ６〜Ｃ１６アルキルを含む。
【０１１４】
幾つかの実施形態では、電極は金属表面であり、必ずしも相互接続又は電気化学を行う能力を有する必要はない。
【０１１５】
電気活性部分
ＳＡＭに加えて、ｉｎ  ｓｉｔｕ修飾電極はＥＡＭを含む。本明細書で「電気活性部分（ＥＡＭ）」又は「遷移金属錯体」又は「レドックス活性分子」又は「電子移動部分（ＥＴＭ）」は、可逆的に又は半可逆的に１つ又は複数の電子を移動させることが可能な金属含有化合物を意味する。電子供与能及び電子受容能が相対的なものである、すなわち或る特定の実験条件下で電子を失うことができる分子は、異なる実験条件下で電子を受容することが可能であることが理解されよう。
【０１１６】
可能な遷移金属錯体の数が非常に多く、電子移動化合物の当業者が本発明において多数の化合物を利用することが可能であることを理解されたい。本明細書で「遷移金属」とは、原子が部分的又は完全な電子殻を有する金属を意味する。本発明での使用に好適な遷移金属としては、カドミウム（Ｃｄ）、銅（Ｃｕ）、コバルト（Ｃｏ）、パラジウム（Ｐｄ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、オスミウム（Ｏｓ）、レニウム（Ｒｅ）、白金（Ｐｔ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、タングステン（Ｗ）及びイリジウム（Ｉｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、Ｆｅ、Ｒｅ、Ｗ、Ｍｏ及びＴｃに加えて第一遷移金属系列、白金金属（Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ及びＰｔ）が本発明で特に使用される。本発明で使用される金属は、ルテニウム、オスミウム、鉄、白金及びパラジウムを含む酸化状態の変化の際に配位部位の数が変化しない金属でもあり、オスミウム、ルテニウム及び鉄がとりわけ有用である。概して、遷移金属は本明細書（又は引用参照文献）でＴＭ又はＭと表される。
【０１１７】
遷移金属及び配位リガンドは金属錯体を形成する。本明細書で「リガンド」又は「配位リガンド」（本明細書又は引用参照文献の図で「Ｌ」と表される）は、概して配位共有結合を介して１つ若しくは複数のその電子を１つ若しくは複数の中心原子若しくはイオンに供与するか、又は共有結合を介してその電子をそれらと共有する原子、イオン、分子又は官能基を意味する。
【０１１８】
幾つかの実施形態では、小極性リガンドが使用される。概して本明細書で「Ｌ」と表される好適な小極性リガンドは、本明細書でより十分に説明されるように大きく２つのカテゴリーに分けられる。一実施形態では、小極性リガンドは、概して不十分な脱離基又は良好なシグマドナーとしてのその特徴、及び金属の固有性のために効果的に金属イオンに不可逆的に結合する。これらのリガンドは「置換的に不活性」と称される場合もある。代替的には、下記でより十分に説明されるように、小極性リガンドは金属イオンに可逆的に結合することができ、そのため標的分析物の結合の際に、分析物は、その良好な脱離基特性又は不十分なシグマドナー特性のために効果的に小極性リガンドを置き換える１つ又は複数の金属の配位原子を生じ得る。これらのリガンドは「置換的に不安定」と称される場合もある。リガンドは、高い溶媒再構成エネルギーに寄与することから双極子を形成するのが好ましい。
【０１１９】
遷移金属錯体の構造の一部を下に示す：
【化２】
2015529809.tif 000012
【０１２０】
Ｌは金属イオンに結合する配位原子を生じる共リガンドである。当業者に認められているように、共リガンドの数及び性質は金属イオンの配位数に依存する。単座、二座又は多座共リガンドを任意の位置で使用することができる。このため、例えば金属の配位数が６である場合、導電性オリゴマーの末端のＬ、核酸に由来するＬ、及びｒが合計６となる。このため、金属の配位数が６である場合、ｒは０（全ての配位原子が他の２つのリガンドから与えられる場合）から全ての共リガンドが単座である場合の４という範囲とすることができる。このため、概して、ｒは金属イオンの配位数及び他のリガンドの選択に応じて０〜８である。
【０１２１】
一実施形態では、金属イオンの配位数は６であり、導電性オリゴマーに結合するリガンド及び核酸に結合するリガンドの両方が少なくとも二座である、すなわちｒが好ましくは０、１（すなわち、残りの共リガンドが二座である）又は２（２つの単座共リガンドが使用される）である。
【０１２２】
当該技術分野で認められているように、共リガンドは同じであっても又は異なっていてもよい。好適なリガンドは、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、炭素原子又はリン原子（金属イオンに応じる）を配位原子として用いるリガンド（概して文献内でシグマ（σ）ドナーと称される）、及びメタロセンリガンド等の有機金属リガンド（概して文献内でパイ（π）ドナーと称され、本明細書でＬｍと表される）という２つのカテゴリーに分けられる。好適な窒素供与リガンドは当該技術分野で既知であり、シアノ（Ｃ≡Ｎ）、ＮＨ２；ＮＨＲ；ＮＲＲ’；ピリジン；ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジン及びビピリジンの置換誘導体；テルピリジン及び置換誘導体；フェナントロリン、特に１，１０−フェナントロリン（略称ｐｈｅｎ）、並びに４，７−ジメチルフェナントロリン及びジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン（略称ｄｐｐｚ）等のフェナントロリンの置換誘導体；ジピリドフェナジン；１，４，５，８，９，１２−ヘキサアザトリフェニレン（略称ｈａｔ）；９，１０−フェナントレンキノンジイミン（略称ｐｈｉ）；１，４，５，８−テトラアザフェナントレン（略称ｔａｐ）；１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン（略称ｃｙｃｌａｍ）及びイソシアニドが挙げられるが、これらに限定されない。縮合誘導体を含む置換誘導体を使用してもよい。幾つかの実施形態では、ポルフィリン及びポルフィリンファミリーの置換誘導体を使用することができる。例えば、Comprehensive Coordination Chemistry, Ed. Wilkinson et al., Pergammon Press, 1987, Chapters 13.2 (pp 73-98), 21.1 (pp. 813-898) and 21.3 (pp 915-957)（全て引用することにより明示的に本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。
【０１２３】
当該技術分野で認められているように、ドナー（１）が金属に結合し、ドナー（２）が周囲の媒体（溶媒、タンパク質等）との相互作用に利用可能である任意のリガンドドナー（１）−架橋−ドナー（２）を、とりわけシアノ（Ｃがドナー（１）であり、Ｎがドナー（２）であり、パイ系がＣＮ三重結合である）のように、ドナー（１）及びドナー（２）がパイ系を介して結合する場合に本発明で使用することができる。一例は、ビピリジンによく似ているが、「背面」に媒体との相互作用のためにＮドナーを有するビピリミジンである。その他の共リガンドとしては、シアネート、イソシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）、チオシアネート、イソニトリル、Ｎ２、Ｏ２、カルボニル、ハロゲン化物、アルコキシド、チオレート、アミド、リン化物、並びにスルフィノ、スルホニル、スルホアミノ及びスルファモイル等の硫黄含有化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
幾つかの実施形態では、複数のシアノを種々の金属との錯体形成のための共リガンドとして使用する。例えば、７つのシアノでＲｅ（ＩＩＩ）に結合し、８つでＭｏ（ＩＶ）及びＷ（ＩＶ）に結合する。このため、本発明では、Ｒｅ（ＩＩＩ）で６つ以下のシアノ及び１つ若しくは複数のＬ、又はＭｏ（ＩＶ）若しくはＷ（ＩＶ）で７つ以下のシアノ及び１つ若しくは複数のＬを使用することができる。Ｗ（ＩＶ）系を有するＥＡＭは、より不活性であり、より調製が容易であり、より有利な還元電位を有することから他のものに勝る特定の利点を有する。概して、より大きなＣＮ／Ｌ比はより大きなシフトをもたらす。
【０１２５】
炭素、酸素、硫黄及びリンを用いる好適なシグマ供与リガンドが当該技術分野で既知である。例えば、好適なシグマ炭素ドナーは、Cotton and Wilkenson, Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, 1988（引用することにより本明細書の一部をなすものとする；例えば３８頁を参照されたい）に見られる。同様に、好適な酸素リガンドとしては、クラウンエーテル、水及び当該技術分野で既知の他のリガンドが挙げられる。ホスフィン及び置換ホスフィンも好適である。Cotton and Wilkensonの３８頁を参照されたい。
【０１２６】
酸素、硫黄、リン及び窒素供与リガンドは、ヘテロ原子が配位原子として働くように結合する。
【０１２７】
幾つかの実施形態では、有機金属リガンドを使用する。レドックス部分として使用される純粋に有機の化合物、及び複素環又は環外置換基としてドナー原子とのδ結合有機リガンドを有する様々な遷移金属配位錯体に加えて、パイ結合有機リガンドを有する広範な遷移金属有機金属化合物が利用可能である（Advanced Inorganic Chemistry, 5th Ed., Cotton & Wilkinson, John Wiley & Sons, 1988, chapter 26、Organometallics, A Concise Introduction, Elschenbroich et al., 2nd Ed., 1992, VCH、及びComprehensive Organometallic Chemistry II, A Review of the Literature 1982-1994, Abel et al. Ed., Vol. 7, chapters 7, 8, 10 & 11, Pergamon Press（引用することにより明示的に本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい）。かかる有機金属リガンドとしては、シクロペンタジエニドイオン［Ｃ５Ｈ５（−１）］等の環式芳香族化合物、並びにビス（シクロペンタジエニル）金属化合物類（すなわちメタロセン）を生じるインデニリデン（−１）イオン等の様々な環置換誘導体及び環縮合誘導体が挙げられる。例えば、Robins et al., J. Am. Chem. Soc. 104:1882-1893 (1982)及びGassman et al., J. Am. Chem. Soc. 108:4228-4229 (1986)（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。これらの中でも、フェロセン［（Ｃ５Ｈ５）２Ｆｅ］及びその誘導体が、広範な化学的（Connelly et al., Chem. Rev. 96:877-910 (1996)（引用することにより本明細書の一部をなすものとする））及び電気化学的（Geiger et al., Advances in Organometallic Chemistry 23:1-93及びGeiger et al., Advances in Organometallic Chemistry 24:87（引用することにより本明細書の一部をなすものとする））電子移動又は「レドックス」反応に使用される典型例である。様々な第一列、第二列及び第三列遷移金属のメタロセン誘導体が、リボース環又は核酸のヌクレオシド塩基に共有結合するレドックス部分の有力な候補である。他の潜在的に好適な有機金属リガンドとしては、ビス（アレーン）金属化合物を生じるベンゼン等の環状アレーン並びにその環置換誘導体及び環縮合誘導体が挙げられ、ビス（ベンゼン）クロムが典型例である。アリル（−１）イオン又はブタジエン等の他の環状π結合リガンドが潜在的に好適な有機金属化合物をもたらし、他のパイ結合及びデルタ結合リガンドと伝導する全てのかかるリガンドが、金属と炭素との結合が存在する一般的な有機金属化合物類を構成する。架橋有機リガンド及び付加的な非架橋リガンドを有し、金属−金属結合を有する及び有しないかかる化合物の様々な二量体及びオリゴマーの電気化学的研究は、核酸分析において有力な候補レドックス部分である。
【０１２８】
共リガンドの１つ又は複数が有機金属リガンドである場合、リガンドは概して有機金属リガンドの炭素原子の１つを介して結合するが、結合は複素環リガンドの他の原子を介するものであってもよい。好ましい有機金属リガンドとしては、置換誘導体を含むメタロセンリガンド及びメタロセネオファン（metalloceneophanes）が挙げられる（Cotton and Wilkenson（上掲）の１１７４頁を参照されたい）。例えば、メチルシクロペンタジエニル等のメタロセンリガンドの誘導体（ペンタメチルシクロペンタジエニルのように複数のメチル基を有するのが好ましい）を用いて、メタロセンの安定性を増大することができる。好ましい実施形態では、メタロセンの２つのメタロセンリガンドの一方のみが誘導体化される。
【０１２９】
本明細書に記載されるように、リガンドの任意の組合せを用いることができる。好ましい組合せとしては、以下のものが挙げられる：ａ）全てのリガンドが窒素供与リガンドである；ｂ）全てのリガンドが有機金属リガンドである；及びｃ）導電性オリゴマーの末端のリガンドがメタロセンリガンドであり、核酸によって与えられるリガンドが窒素供与リガンドであり、必要に応じて他のリガンドが窒素供与リガンド若しくはメタロセンリガンド、又はその混合物である。
【０１３０】
概して、金属の存在により複数のプロリガンド（proligands）が互いに結合して複数の酸化状態をもたらすことから、非大環状キレート剤を含むＥＡＭは金属イオンに結合し、非大環状キレート化合物を形成する。
【０１３１】
幾つかの実施形態では、窒素供与プロリガンドが使用される。好適な窒素供与プロリガンドは当該技術分野で既知であり、ＮＨ２；ＮＨＲ；ＮＲＲ’；ピリジン；ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジン及びビピリジンの置換誘導体；テルピリジン及び置換誘導体；フェナントロリン、特に１，１０−フェナントロリン（略称ｐｈｅｎ）、並びに４，７−ジメチルフェナントロリン及びジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン（略称ｄｐｐｚ）等のフェナントロリンの置換誘導体；ジピリドフェナジン；１，４，５，８，９，１２−ヘキサアザトリフェニレン（略称ｈａｔ）；９，１０−フェナントレンキノンジイミン（略称ｐｈｉ）；１，４，５，８−テトラアザフェナントレン（略称ｔａｐ）；１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン（略称ｃｙｃｌａｍ）及びイソシアニドが挙げられるが、これらに限定されない。縮合誘導体を含む置換誘導体を使用してもよい。金属イオンを配位的に飽和させず、別のプロリガンドの付加を必要とする大環状リガンドがこの目的で非大環状とみなされることに留意されたい。当業者に認められているように、多数の「非大環状」リガンドを共有結合して、配位的に飽和しているが、環状骨格を欠く化合物を形成することが可能である。
【０１３２】
幾つかの実施形態では、単座（例えば、少なくとも１つのシアノリガンド）、二座、三座及び多座リガンドの混合物をＥＡＭの構造に使用することができる。
【０１３３】
少なくとも第１の自己犠牲部分が結合したメタロセン、特にフェロセンであるＥＡＭが本発明で特に有用であるが、幾つかの実施形態では、下記のように２つ以上の自己犠牲部分が結合している（本明細書に広く記載される自己犠牲部分を有する他のＥＡＭを使用してもよいことにも留意されたい）。幾つかの実施形態では、２つ以上の自己犠牲部分がフェロセンに結合する場合、全てシクロペンタジエニル環の１つに結合する。幾つかの実施形態では、自己犠牲部分は異なる環に結合する。幾つかの実施形態では、１つの部位が電極への結合に使用される限り、シクロペンタジエニル環の一方又は両方が自己犠牲部分で飽和することが可能である。
【０１３４】
幾つかの実施形態では、ＥＡＭは置換１，１’−フェロセンを含む。フェロセンは空気中で安定している。フェロセンは捕捉リガンド及びアンカー基の両方で容易に置換され得る。フェロセンの周囲の環境を変化させるだけでなく、シクロペンタジエニル環の回転を防ぐフェロセン上の捕捉リガンドへの標的タンパク質の結合により、エネルギーがおよそ４ｋＪ／ｍｏｌ変化する（国際公開第１９９８／５７１５９号、Heinze and Schlenker, Eur. J. Inorg. Chem. 2974-2988 (2004)、Heinze and Schlenker, Eur. J. Inorg. Chem. 66-71 (2005)、及びHolleman-Wiberg, Inorganic Chemistry, Academic Press 34th Ed, at 1620、全て引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。
【化３】
2015529809.tif 000013
【０１３５】
他の幾つかの実施形態では、ＥＡＭは１，３−二置換フェロセンを含む。１，３−二置換フェロセンは既知であるが（Bickert et al., Organometallics 1984, 3, 654-657、Farrington et al.,Chem. Commun. 2002, 308-309、Pichon et al., Chem. Commun. 2004, 598-599、及びSteurer et al., Organometallics 2007, 26, 3850-3859を参照されたい）、ＳＡＭにおけるこの種の分子の電気化学的研究は文献内で報告されていない。シクロペンタジエニル（Ｃｐ）環の回転がエクリプス配座の両方のＣｐ置換基で起こり得る１，１’−二置換フェロセンとは対照的に、１，３−二置換フェロセンの位置異性体はこれらのＣｐ基間の堅固な形状を強化する分子構造をもたらす。化合物１〜化合物５等の１，３−二置換フェロセンの代表例が下記に示される。アンカー及び捕捉リガンドの両方に結合する１，３−二置換フェロセンの例を下に示す。
【化４】
2015529809.tif 000014
【０１３６】
加えて、ＥＡＭは概して、ＥＡＭの電極への結合に用いられる、ＥＡＭの導電性オリゴマーへの結合のための結合部分を有する。概して、必須というわけではないが、フェロセン等のメタロセンの場合、図２に概略的に示されるように自己犠牲部分（複数の場合もあり）はシクロペンタジエニル環の１つに結合し、結合部分は他の環に結合するが、同じ環への結合も起こり得る。当業者に認められているように、いずれの環についても自己犠牲部分と少なくとも１つの結合リンカーとの任意の組合せを使用することができる。
【０１３７】
自己犠牲部分（複数の場合もあり）及び結合部分（複数の場合もあり）に加えて、フェロセンは、少なくとも自己犠牲基の存在下又は非存在下におけるＥ０を変化させることを含む様々な理由で付加することができる付加的な置換基も含み得る。関連の引用される参照文献において「Ｒ」基として示されることが多い好適な置換基は、２００８年１０月１７日付けで出願された米国特許出願公開第１２／２５３，８２８号、２００８年１０月１７日付けで出願された米国特許出願公開第１２／２５３，８７５号、２０１０年５月７日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３３２，５６５号、２０１０年５月２１日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３４７，１２１号、及び２０１０年７月２０日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３６６，０１３号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に列挙されている。
【０１３８】
下記のような幾つかの実施形態では、酵素反応部分（ＥＲＭ）がＥＡＭに直接結合し、ＥＲＭが標的酵素に曝露されるとＥ０の変化をもたらす場合、ＥＡＭは自己犠牲部分を含まない。図１に示されるように、一実施形態では、チロシンが結合する場合に第１のＥ０を有し、例えばキモトリプシンの存在下で除去されると第２のＥ０を有するように、過酸化物感受性部分がＥＡＭ（この場合、フェロセン）に直接結合する。
【０１３９】
酵素反応部分
本発明に使用される基質は標的酵素に応じて異なる。酵素／基質の関係は概して関連標的酵素の特徴としてよく知られている。
【０１４０】
酵素反応部分（ＥＲＭ）は、以下の２つの要件を満たすように置換遷移金属錯体に結合する結合基である：（１）可能な限り限られた他の酵素との交差反応性なしに酵素の特異的基質として機能すること、及び（２）標的又は代理標的酵素によって除去された場合に、ＥＡＭの直接化学変化又はその後の誘導化学変化（すなわち、誘発自己犠牲プロセス）が未反応出発ＥＡＭとは異なる新たなＥ０を有する遷移金属をもたらすこと。
【０１４１】
多くの好適なＥＲＭ基が存在し、幾つかを下記に挙げる。したがって、ＥＲＭ及び遷移金属錯体へのＥＲＭ結合の選択及び設計について慎重に検討する必要がある。ＥＲＭの隣接基は、親水性力、疎水性力、立体力、水素結合力若しくはファンデルワールス力、又は反応速度の増大若しくは低下をもたらす他の相互作用のために酵素活性部位におけるＥＲＭの結合に影響を及ぼす可能性がある。かかる結合の検討としては、例えば所望の標的、ペプチド長又はＳＩＭスペーサーの含有及び選択に応じたアミン対カルボキシ末端結合が挙げられる。幾つかの実施形態では、例えばホスファターゼの広範な活性を検出するのに一般的な基質（例えばリン酸基）が好ましい。
【０１４２】
好適な標的酵素／基質対としては、プロテアーゼ／タンパク質（プロテアーゼ／ペプチドを含む）、リガーゼ／核酸、リガーゼ／タンパク質、リパーゼ／脂質、カルボヒドラーゼ／炭水化物、キナーゼ／リン酸基等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
例えば、標的酵素がプロテアーゼである場合、基質は概して標的酵素によって切断されるペプチドを含むタンパク質である。幾つかの実施形態では、ペプチド等のより小さな捕捉基質が好ましいが、より大きなタンパク質を使用することもできる。この場合も、電気化学ポテンシャルを変化させる酵素の作用の結果として遷移金属錯体に結合する置換官能基の連結性を変化させることが重要である。基質は好ましくは、各々の基質が１つ又は複数の特異的標的酵素によってのみ切断され得るように切断に対する特異性を与えることができる配列も含む。
【０１４４】
自己犠牲部分
本発明のＥＡＭは、ＥＡＭが、自己犠牲部分が存在する場合に第１のＥ０を有し、下記のように自己犠牲部分が除去される場合にと第２のＥ０を有するようにＥＡＭに共有結合する少なくとも１つの自己犠牲部分を含む。
【０１４５】
「自己犠牲スペーサー」又は「自己犠牲リンカー」という用語は、２つの化学的部分を正常に安定した三部分分子へと共有結合することが可能な二官能性化学的部分を指す。自己犠牲スペーサーは、第１の部分への結合が切断されると第２の部分から自発的に分離することが可能である。本発明では、自己犠牲スペーサーは酵素反応部分、例えばリン酸基をＥＡＭに連結する。図２に概略的に示されるように、ホスファターゼ酵素へと曝露されると、リン酸基が除去され、スペーサーが離れる。概して、不可逆的な反復結合転位反応が電子供与性アルコール官能基（すなわちキノンメチドモチーフ）によって開始する任意のスペーサーを、酸化条件下でアルコールを生成する誘発部分として働くホウ素基を用いて設計することができる。代替的には、ホウ素部分は遷移金属のプロキレート剤（pro-chelator）であるリガンド中の潜在フェノール酸素を遮蔽することができる。酸化の際に、リガンドが変形し、ＳＡＭにおいてＥＡＭ形成を開始する。例えば、サンプルキレートリガンドは、鉄に結合するサリチルアルデヒドイソニコチノイルヒドラゾンである。
【０１４６】
当業者に認められているように、広範な自己犠牲部分を広範なＥＡＭ及び過酸化物感受性部分とともに使用することができる。自己犠牲リンカーは、米国特許出願公開第２００９００４１７９１号、同第２０１００１４５０３６号、並びに米国特許第７，７０５，０４５号及び同第７，２２３，８３７号（特に自己犠牲スペーサーの開示について、全てその全体が引用することにより明示的に本明細書の一部をなすものとする）を含む多数の参照文献に記載されている。
【０１４７】
本発明で特に有用な幾つかの自己犠牲リンカーを図１０に示す。自己犠牲スペーサーは単一のモノマー単位、又は同じモノマーのポリマー（ホモポリマー）若しくは異なるモノマーのポリマー（ヘテロポリマー）を含み得る。代替的には、自己犠牲スペーサーは、先願の「酵素を検出する電気化学的アッセイ（Electrochemical Assay for the Detection of Enzymes）」、米国特許出願公開第１２／２５３，８２８号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０３６３号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されるような化学的構造に類似した切断後のＥＡＭの環境を変化させるＳＡＭ中のＥＡＭの隣接基であり得る。
【０１４８】
アンカー基
本発明は、ＥＡＭ（任意に導電性オリゴマーによって電極表面に結合する）と、電極表面にｉｎ  ｓｉｔｕで結合するＳＡＭとを含む化合物を提供する。概して、幾つかの実施形態では、これらの部分はアンカー基を用いて電極に結合している。本明細書で「アンカー」又は「アンカー基」は、本発明の化合物を電極に結合する化学基を意味する。
【０１４９】
当業者に認められているように、アンカー基の組成はｉｎ  ｓｉｔｕで結合する表面の組成に応じて異なる。金電極の場合、ピリジニルアンカー基及びチオールベースアンカー基の両方が特に有用である。
【０１５０】
導電性オリゴマーの共有結合は、使用する電極及び導電性オリゴマーに応じて様々な方法で達成することができる。概して、下記構造１において「Ａ」で示される或るタイプのリンカーを使用する場合、Ｘは導電性オリゴマーであり、網掛けした表面は電極である。
【化５】
2015529809.tif 000015
【０１５１】
この実施形態では、Ａはリンカー又は原子である。「Ａ」の選択は電極の特徴に一部依存する。このため、例えば金電極を使用する場合、Ａは硫黄部分であり得る。代替的には、金属酸化物電極を使用する場合、Ａは酸化物の酸素に結合したケイ素（シラン）部分であり得る（例えば、Chen et al., Langmuir 10:3332-3337 (1994)、Lenhard et al., J. Electroanal. Chem. 78:195-201 (1977)（どちらも引用することにより明示的に本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい）。炭素ベース電極を使用する場合、Ａはアミノ部分であり得る（好ましくは第１級アミン；例えばDeinhammer et al., Langmuir 10:1306-1313 (1994)を参照されたい）。このため、好ましいＡ部分としては、シラン部分、硫黄部分（アルキル硫黄部分を含む）及びアミノ部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
幾つかの実施形態では、電極は炭素電極、すなわちガラス状炭素電極であり、結合はアミン基の窒素を介したものである。代表的な構造は米国特許出願公開第２００８０２４８５９２号（特にそれに記載の構造並びに種々のアンカー基の説明及び付随の文章について、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）の構造１５に示される。この場合も付加的な原子、すなわちリンカー及び／又は末端基が存在していてもよい。
【０１５３】
上記の米国特許出願公開第２００８０２４８５９２号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）の構造１６では、酸素原子は金属酸化物電極の酸化物に由来する。Ｓｉ原子は他の原子を含有する、すなわち置換基を含有するケイ素部分であってもよい。他の電極へのＳＡＭの他の結合が当該技術分野で既知である。例えばインジウムスズ酸化物電極への結合、更にはインジウムスズ酸化物電極へのリン酸塩の化学吸着についてのNapier et al., Langmuir, 1997を参照されたい（H. Holden Thorpe, CHI conferenceにて口頭発表, May 4-5, 1998）。
【０１５４】
好ましい一実施形態では、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）を電極として使用し、アンカー基はホスホン酸含有種である。
【０１５５】
硫黄アンカー基
構造１では単一部分として示されているが、導電性オリゴマーは２つ以上の「Ａ」部分によって電極に結合していてもよい。この「Ａ」部分は同じであっても又は異なっていてもよい。このため、例えば電極が金電極であり、「Ａ」が硫黄原子又は部分である場合、下記構造２、３及び４に概略的に示されるように、複数の硫黄原子を電極への導電性オリゴマーの結合に用いることができる。当業者に認められているように、他のかかる構造を作製することができる。構造２、３及び４では、Ａ部分は単なる硫黄原子であるが、置換硫黄部分を使用してもよい。
【化６】
2015529809.tif 000016
【化７】
2015529809.tif 000017
【化８】
2015529809.tif 000018
【０１５６】
構造４と同様に、電極に結合した３つの硫黄部分を有する単一の炭素原子で終わる導電性オリゴマーを得ることが可能であり得ることにも留意されたい。
【０１５７】
別の態様では、本発明は結合チオールを含むアンカーを提供する。幾つかの実施形態では、アンカーはアルキルチオール基を含む。
【０１５８】
別の態様では、本発明は、金電極等の電極での分析物検出用の電気活性部分の構築においてアンカー基として働く結合多点結合型（multipodal）硫黄含有化合物を提供する。すなわち、スペーサー基（ＥＡＭ、ＲｅＡＭＣ又は「空」単分子層形成種に結合することができる）は２つ以上の硫黄原子を用いて結合している。これらの多点結合型アンカー基は、本明細書に記載されるように線状又は環状であり得る。
【０１５９】
幾つかの実施形態では、アンカー基は金表面に結合する２つの硫黄原子を含有する「二点結合型（bipodal）」であり、線状であるが、場合によっては他の多点結合型（例えば「三点結合型（tripodal）」）の系を含むことが可能であり得る。かかる多点結合型アンカー基は安定性の増大を示し、及び／又は立体的に困難な頭基を有するチオール含有アンカーからのＳＡＭの調製のフットプリントの増大を可能にする。
【０１６０】
幾つかの実施形態では、アンカーは環状ジスルフィドを含む（「二点結合型（bipod）」）。場合によっては他の多点結合型（例えば「三点結合型」）の環系アンカー基を含むことが可能であり得る。環の原子の数は例えば５〜１０で変化することができ、下記で論考する多環式アンカー基も含まれる。
【０１６１】
幾つかの実施形態では、アンカー基は下に示すように先端窒素原子及び分子内ジスルフィド結合を有する７員環である［１，２，５］−ジチアゼパン単位を含む：
【化９】
2015529809.tif 000019
【０１６２】
構造（５）において、環の炭素原子が付加的に置換され得ることにも留意されたい。当業者に認められているように、他の員数の環も含まれる。加えて、他の環状アルカン（環状ヘテロアルカンを含む）又は芳香環構造で置換された上に示す［１，２，５］−ジチアゼパン等の環状ヘテロアルカンを含み得る多環式環構造を使用することができる。
【０１６３】
幾つかの実施形態では、アンカー基及びスペーサーの一部は下に示す構造を有する：
【化１０】
2015529809.tif 000020
【０１６４】
ここでの「Ｒ」基は、ＥＡＭの遷移金属構成要素の末端配位リガンドを有する結合オリゴフェニルエチニレン単位を含む任意の置換基であり得る。
【０１６５】
アンカーは、Li et al., Org. Lett. 4:3631-3634 (2002)（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載の二点結合型中間体（Ｉ）（Ｒ＝Ｉである式ＩＩＩの化合物）から合成される。Wei et al, J. Org, Chem. 69:1461-1469 (2004)（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）も参照されたい。
【０１６６】
硫黄原子の数は本明細書に概説するように変更することができ、特定の実施形態ではスペーサー１つ当たり１つ、２つ及び３つが用いられる。
【０１６７】
当業者に認められているように、本発明の組成物は、下記及び２００８年１０月１７日付けで出願された米国特許出願公開第１２／２５３，８２８号、２００８年１０月１７日付けで出願された米国特許出願公開第１２／２５３，８７５号、２０１０年５月７日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３３２，５６５号、２０１０年５月２１日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３４７，１２１号、２０１０年７月２０日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３６６，０１３号に概説されるものを含む様々な方法で作製することができる。幾つかの実施形態では、組成物は米国特許第６，０１３，４５９号、同第６，２４８，２２９号、同第７，０１８，５２３号、同第７，２６７，９３９号、米国特許出願公開第０９／０９６５９３号及び同第６０／９８０，７３３号、並びに２００８年８月７日付けで出願された米国仮出願第６１／０８７，１０２号（いずれもその全体が全ての目的で引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示される方法に従って作製される。
【０１６８】
用途
本発明の系は、本明細書で概説される様々な標的分析物の検出に使用される。幾つかの実施形態では、例えばプロテアーゼ、例えばキモトリプシン、トリプシン、ＰＳＡ、ＭＭＰ、ホスファターゼ、リアーゼ、ヒドロラーゼ及びトランスフェラーゼ等の特定の酵素の検出に用いられる。他の実施形態では、図５に概略的に示されるように「サンドイッチ」タイプのアッセイが用いられる。
【０１６９】
幾つかの実施形態では、例えば「サンドイッチ」タイプのフォーマットにおいて、試験サンプル中に含有される標的分析物を、捕捉結合リガンドを含む固体支持体に添加する。この添加に続いて、任意の洗浄工程及び酵素でタグ付けされた可溶性結合リガンドの添加を行うが、当業者に認められているように、これらの添加は同時に行っても、又は溶液結合リガンドを固体支持体への添加の前に標的分析物を含有するサンプルに添加してもよい。表面はこの場合も任意に洗浄され、続いて固体支持体に結合した標的サンドイッチがＥＡＭに供給される。幾つかの実施形態では、このＥＡＭは溶液相中に存在し、他の実施形態では、このＥＡＭは電極上の予め形成されたＳＡＭに固定化されている。可溶性結合リガンドの酵素タグは、ＥＡＭのＥＲＭと酵素的に反応し、Ｅ０２で電気化学的シグナルを示す反応ＥＡＭを生じる。次いで、反応及び未反応ＥＡＭの量を、それぞれＥ０２及びＥ０１での電気化学的シグナルを定量化することによって測定することができる。ＥＡＭが溶液相中に存在する場合、反応及び未反応ＥＡＭ並びにサンドイッチ錯体を含有するアッセイ混合物をＳＡＭの形成及び検出用の電極に供給する。
【０１７０】
幾つかの実施形態では、サンドイッチ錯体を単離した後、酵素によってタグ付けされた可溶性結合リガンドが固体支持体から溶液相に放出されるように解離させる。次いで、溶液相の可溶性結合リガンドを反応用のＥＡＭに供給するが、幾つかの実施形態では、このＥＡＭは溶液相中に存在し、他の実施形態では、このＥＡＭは電極上の予め形成されたＳＡＭに固定化されている。
【０１７１】
検出
レドックス活性分子と電極との間の電子移動は様々な方法で検出することができ、好ましくは、アンペロメトリー、ボルタンメトリー、キャパシタンス及びインピーダンスを含む電子検出が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法には、ＡＣ又はＤＣ電流に基づく時間又は周波数に依存する方法、パルス法、ロックイン法及びフィルタリング（ハイパス、ローパス、バンドパス）が含まれる。幾つかの実施形態では、電子移動検出のみが必要とされ、他の実施形態では、電子移動速度が決定され得る。
【０１７２】
幾つかの実施形態では、アンペロメトリー、ボルタンメトリー、キャパシタンス及びインピーダンスを含む電子検出を用いる。好適な技法としては、電解重量法；クーロメトリー（制御電位クーロメトリー及び一定電流クーロメトリーを含む）；ボルタンメトリー（サイクリックボルタンメトリー、パルスボルタンメトリー（正規パルスボルタンメトリー、矩形波ボルタンメトリー、差分パルスボルタンメトリー、Ｏｓｔｅｒｙｏｕｎｇ矩形波ボルタンメトリー及び定電量（coulostatic）パルス法））；ストリッピング分析（陽極ストリッピング分析、陰極ストリッピング分析、矩形波ストリッピングボルタンメトリー）；コンダクタンス測定（電解コンダクタンス、直接分析）；時間依存性電気化学的分析（クロノアンペロメトリー、クロノポテンショメトリー、サイクリッククロノポテンショメトリー及びアンペロメトリー、ＡＣポログラフィー（polography）、クロノガルバメトリー（chronogalvametry）及びクロノクーロメトリー）；ＡＣインピーダンス測定；キャパシタンス測定；ＡＣボルタンメトリー及び光電気化学が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
幾つかの実施形態では、電子移動のモニタリングはアンペロメトリー検出によって行われる。この検出方法は、本発明の組成物を含有する電極と、試験サンプル中の補助（対）電極との間に電位（分離参照電極と比較する）を印加することを伴う。標的分析物の存在下又は非存在下のサンプル中で効率の異なる電子移動を誘導する。
【０１７４】
アンペロメトリーにより電子移動を測定するデバイスは高感度電流検出を伴い、電圧電位を制御する手段、通常はポテンシオスタットを含む。この電圧をレドックス活性分子の電位に対して最適化する。
【０１７５】
幾つかの実施形態では、代替的な電子検出モードを利用する。例えば、ポテンショメトリー（又はボルタンメトリー）測定は非ファラデー（正味電流フローなし）プロセスを伴い、ｐＨ検出器及び他のイオン検出器で従来用いられている。同様のセンサーを使用して、レドックス活性分子と電極との間の電子移動をモニタリングする。加えて、絶縁体の他の特性（抵抗等）及び導体の他の特性（伝導性、インピーダンス及びキャパシタンス等）を用いて、レドックス活性分子と電極との間の電子移動をモニタリングすることができる。最後に、電流（電子移動等）を生成する任意の系では小磁場も生成し、幾つかの実施形態ではこれをモニタリングしてもよい。
【０１７６】
本発明の組成物で観察される高速の電子移動の利点の１つが、時間分解能によって電子電流に基づくモニターのシグナル対ノイズ結果を大幅に増強し得ることであることを理解されたい。本発明の高速の電子移動は、高いシグナル及び電子移動の開始と終了との間の常同的遅延の両方をもたらす。例えば電子移動のパルス開始及び検出の「ロックイン」増幅器を用いて特定の遅延のシグナルを増幅することによって、シグナル対ノイズの大きさの改善を達成することができる。
【０１７７】
幾つかの実施形態では、直流電流（ＤＣ）法を用いて電子移動を開始し、検出する。上述のように、先のレドックス活性分子の第１のＥ０及び後の反応レドックス活性分子の第２のＥ０によって分析物の検出が可能になる。当業者に認められているように、多数の好適な方法を用いて電子移動を検出することができる。
【０１７８】
幾つかの実施形態では、交流電流（ＡＣ）法を用いて電子移動を開始する。第１の入力電気的シグナルを、好ましくは少なくとも試料電極（本発明の錯体を含有する）及び対電極を介して系に適用し、電極と第２の電子移動部分との間の電子移動を開始する。電圧を参照電極及び作用電極に印加する三電極系を用いてもよい。この実施形態では、第１の入力シグナルは少なくともＡＣ成分を含む。ＡＣ成分は変動振幅及び周波数であってもよい。概して、本方法での使用については、ＡＣ振幅は約１ｍＶ〜約１．１Ｖの範囲であり、約１０ｍＶ〜約８００ｍＶが好ましく、約１０ｍＶ〜約５００ｍＶがとりわけ好ましい。ＡＣ周波数は約０．０１Ｈｚ〜約１０ＭＨｚの範囲であり、約１Ｈｚ〜約１ＭＨｚが好ましく、約１Ｈｚ〜約１００ｋＨｚがとりわけ好ましい。
【０１７９】
幾つかの実施形態では、第１の入力シグナルはＤＣ成分及びＡＣ成分を含む。すなわち、試料電極と対電極との間のＤＣオフセット電圧を第２の電子移動部分の電気化学的電位によって掃引する。掃引を用いて系の最大応答が見られるＤＣ電圧を同定する。これは概して、レドックス活性分子の電気化学的電位又はその前後である。この電圧を決定した後、掃引又は１つ若しくは複数の均一ＤＣオフセット電圧を用いることができる。約１Ｖ〜約＋１．１ＶのＤＣオフセット電圧が好ましく、約５００ｍＶ〜約＋８００ｍＶがとりわけ好ましく、約３００ｍＶ〜約５００ｍＶが特に好ましい。ＤＣオフセット電圧に加えて、変動振幅及び周波数のＡＣシグナル成分を適用する。レドックス活性分子がＡＣ摂動に応答するのに十分に低い溶媒再構成エネルギーを有する場合、電極とレドックス活性分子との間の電子移動によってＡＣ電流が生じる。
【０１８０】
幾つかの実施形態では、ＡＣ振幅を変化させる。理論に束縛されるものではないが、振幅の増大によって駆動力が増大するようである。このため、より高い過電圧を生じるより高い振幅が、より速い電子移動速度をもたらす。このため、概して、その周波数でより高い過電圧を用いることにより、任意の単一周波数での応答の改善（すなわち、より高い出力シグナル）が同じ系で得られる。このため、振幅を高周波数で増大させて、系を介した電子移動速度を増大させ、感度の増大をもたらすことができる。加えて、上述のように、レドックス活性分子の第１及び第２のＥ０を電子移動速度に基づいて測定し、これを用いて周波数又は過電圧に基づき２つを区別することが可能である。
【０１８１】
幾つかの実施形態では、系の測定は少なくとも２つの別個の振幅又は過電圧で行われ、複数の振幅での測定が好ましい。上述のように、振幅の変化の結果としての応答の変化が系の同定、較正及び定量化の基礎となり得る。
【０１８２】
幾つかの実施形態では、ＡＣ周波数を変化させる。異なる周波数で、異なる分子は異なる形で応答する。当業者に認められているように、周波数の増大により概して出力電流が増大する。しかしながら、電子が電極とレドックス活性分子との間を移動することができる速度よりも周波数が大きい場合、より高い周波数によって出力シグナルの喪失又は減少が引き起こされる。或る時点で、周波数はレドックス活性分子を阻害する均一溶媒を通る電子移動速度よりも大きくなり、出力シグナルも低下する。
【０１８３】
加えて、ＡＣ法を用いることにより、共有結合核酸以外の実体による任意の単一周波数でのバックグラウンドシグナルの大幅な低減、すなわち不要なシグナルの「ロックアウト」又は「フィルタリング」が可能になる。すなわち、溶液中の電荷担体又はレドックス活性分子の周波数応答がその拡散係数により制限される。したがって、高周波数では、電荷担体は、その電荷を電極に移動させるのに十分に急速には拡散せず、及び／又は電荷移動動態は十分な速度ではない可能性がある。これは、不動態化層の単分子層を利用しないか、又は単分子層が部分的若しくは不十分な、すなわち溶媒が電極に接近可能である実施形態において特に重要である。しかしながら、本ＡＣ法を用いると、単分子層の有無を問わずに、溶液中の１つ又は複数の電荷担体の周波数応答を防止する１つ又は複数の周波数を選ぶことができる。これは、血液等の多くの体液がアンペロメトリー検出法を妨げ得る相当量のレドックス活性分子を含有することから特に重要である。
【０１８４】
幾つかの実施形態では、系の測定は少なくとも２個の別個の周波数で行われ、複数の周波数での測定が好ましい。複数の周波数はスキャンを含む。好ましい実施形態では、周波数応答を少なくとも２個、好ましくは少なくとも約５個、より好ましくは少なくとも約１０個の周波数で求める。
【０１８５】
シグナル処理
入力シグナルを伝達して電子移動を開始した後、出力シグナルを受信又は検出する。出力シグナルの存在及び大きさは、入力シグナルの過電圧／振幅；入力ＡＣシグナルの周波数；電子移動部分間の介在媒体の組成、すなわちインピーダンス；ＤＣオフセット；系の環境；及び溶媒に依存する。所与の入力シグナルでは、出力シグナルの存在及び大きさは、概して金属イオンの酸化状態の変化をもたらすのに必要とされる溶媒再構成エネルギーに依存する。このため、ＡＣ成分及びＤＣオフセットを含む入力シグナルを伝達すると、電子が電極とレドックス活性分子との間で移動し、溶媒再構成エネルギーが十分に低い場合、周波数は範囲内であり、振幅は十分なものとなり、出力シグナルを生じる。
【０１８６】
幾つかの実施形態では、出力シグナルはＡＣ電流を含む。上記で概説したように、出力電流の大きさは多数のパラメーターに依存する。これらのパラメーターを変化させることによって、系を様々に最適化することができる。
【０１８７】
概して、本発明で生成するＡＣ電流は約１フェムトアンペア〜約１ミリアンペアの範囲であり、約５０フェムトアンペア〜約１００マイクロアンペアの電流が好ましく、約１ピコアンペア〜約１マイクロアンペアがとりわけ好ましい。
【０１８８】
装置
本発明は、ＡＣ検出方法を用いて分析物を検出する装置を更に提供する。装置は、少なくとも第１の測定電極又は試料電極と、第２の測定電極又は対電極とを有する試験チャンバを備える。三電極系も有用である。第１及び第２の測定電極を、液体試験サンプルの存在下で２つの電極が電気的に接触することができるように試験サンプル受容領域と接触させる。
【０１８９】
更に別の実施形態では、第１の測定電極はスペーサーを介して、好ましくは本明細書に記載されるような導電性オリゴマーを介して共有結合したレドックス活性錯体を含む。代替的には、第１の測定電極は共有結合したレドックス活性分子及び結合リガンドを含む。
【０１９０】
装置は試験チャンバ、すなわち測定電極に電気的に接続された電源を更に備える。電源は必要に応じてＡＣ電圧及びＤＣ電圧を供給することが可能であるのが好ましい。
【０１９１】
一実施形態では、装置は入力シグナル及び出力シグナルを比較することが可能なプロセッサを更に備える。プロセッサは電極と連結し、出力シグナルを受信することにより、標的分析物の存在を検出するように作られている。
【実施例】
【０１９２】
実施例１：表面ベースの反応によるキモトリプシンの検出
図１に示されるＥＡＭのニート（neat）ＳＡＭをエタノール中１００μＭの濃度で５時間成長させた。次いで、電極をエタノールに続いて水で洗浄した。凍結乾燥キモトリプシンをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁した。４０μＬの標的溶液（ＰＢＳ、２．４μＭキモトリプシン、４８０ｎＭキモトリプシン）を分離電極に供給し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、標的溶液を除去し、電極を水でリンスし、試験溶液を適用した。キモトリプシンに対する用量応答を実証する数値を下記表１に示す。
【０１９３】
【表２】
2015529809.tif 000021
【０１９４】
実施例２：溶液ベースの均一反応によるキモトリプシンの検出
拡散及び酵素接近性の両方の制限のために表面反応よりも速い溶液反応速度を説明するため、ＥＡＭ−基質分子を溶液プローブとして用いるＰｒｏＣｌｅａｖｅアッセイを実行した。ＥＡＭ−基質をサンプルに供給し、反応させた。酵素切断が溶液中で起こった後、サンプルを検出用の金電極に供給した。溶液の反応／未反応ＥＡＭが電極に繋留し、測定を行った。システムのシグナル出力の固有の自己較正が、規則的な十分充填されたＳＡＭを形成することなく確実な測定をもたらすことから、この検出方法を利用した。
【０１９５】
ヒトαキモトリプシンの滴定をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で行った。９０μＬのこの溶液を新たなチューブに移した。ＥＡＭ２（下記）の１ｍＭストック（エタノール中）１０μＬを、９０μＬのキモトリプシン滴定液（titration）に入れ、１００μＭ  ＥＡＭ（１０％エタノール）溶液の最終濃度を得た。反応を１時間行った。次いで、４５分間のＳＡＭ形成のために溶液を電極に適用した。次いで、標的溶液を除去し、電極を水でリンスし、試験溶液を適用した。このアッセイの用量応答を実証する数値を下記表２に示す。
【化１１】
2015529809.tif 000022
【０１９６】
【表３】
2015529809.tif 000023
【０１９７】
本明細書に記載の実施例及び実施形態が例示のみを目的とすることが理解されよう。文脈上明らかに除外される場合を除き、本発明の一態様について開示される全ての実施形態を、任意の好適な組合せで本発明の他の態様について開示される実施形態と組み合わせることができる。本発明の範囲を逸脱することなく様々な修正及び変更を本発明に加えることができることが当業者には明らかであろう。このため、本発明の修正及び変更が添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内にある限り、本発明がそれらを包含することが意図される。本明細書に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、全ての目的で引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【図１】
2015529809.tif 000024
【図２】
2015529809.tif 000025
【図３】
2015529809.tif 000026
【図４】
2015529809.tif 000027
【図５】
2015529809.tif 000028
【図６】
2015529809.tif 000029
【図７Ａ】
2015529809.tif 000030
【図７Ｂ】
2015529809.tif 000031
【図７Ｃ】
2015529809.tif 000032
【図８】
2015529809.tif 000033
【図９】
2015529809.tif 000034
【図１０】
2015529809.tif 000035
【図１１】
2015529809.tif 000036
【国際調査報告】
2015529809.tif 000037
2015529809.tif 000038
2015529809.tif 000039
2015529809.tif 000040