(57)【要約】生物学的反応のための装置が、提供される。この装置は、基材と、この基材内の複数の反応サイトとを含む。基材の表面は第１の親水性を有するように構成され、複数の反応サイトの各表面は、第２の親水性を有することにより、実質的に多くの数の反応サイトに試料体積を充填するように構成される。各充填されている反応サイトの試料体積は、そのそれぞれの反応サイトに実質的に制限される。試料体積は、反応サイト内で生物学的反応を経るように構成される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的反応のための装置であって、前記装置は、
基材と、
前記基材内の複数の反応サイトと
を備え、
前記基材の表面は、第１の親水性を有するように構成され、前記複数の反応サイトの各表面は、第２の親水性を有することにより、実質的に多くの数の反応サイトに試料体積を充填するように構成され、
各充填されている反応サイトの前記試料体積は、そのそれぞれの反応サイトに実質的に制限され、
前記試料体積は、前記反応サイト内で生物学的反応を経るように構成される、
装置。
【請求項２】
前記第１の親水性は、６０〜１００度の水の前進接触角をもたらす、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記第１の親水性は、７５〜９０度の前進接触角をもたらす、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記第１の親水性は、前記第２の親水性と同じである、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
水の後退接触角が、６０〜１００度である、請求項２に記載の装置。
【請求項６】
前記水の前進接触角と前記後退接触角との間の差は、０度である、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記水の前進接触角と前記後退接触角との間の差は、０〜３０度である、請求項５に記載の装置。
【請求項８】
前記水の前進接触角と前記後退接触角との間の差は、１０〜１５度である、請求項５に記載の装置。
【請求項９】
前記基材の前記表面は、第１の親水性を有するように構成され、前記複数の反応サイトの各表面は、前記基材の前記表面および前記複数の反応サイトの各表面を同じ材料で被覆することによって第２の親水性を有するように構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記材料は、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）である、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記基材の前記表面および前記複数の反応サイトの各表面は、蒸着プロセスによって被覆される、請求項９に記載の装置。
【請求項１２】
前記実質的に多くの数の反応サイトは、前記複数の反応サイトの９０〜１００％である、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記複数の反応サイトの中に充填される前記液体試料体積は、高々１ナノリットルである、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
前記基材は、シリコン、酸化シリコン、ガラス、およびプラスチックのうち１つの材料から構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
前記複数の反応サイトは、スルーホールである、請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
前記生物学的反応は、増幅反応である、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
前記第１の親水性および前記第２の親水性は、前記試料体積を各充填された反応サイト内に実質的に制限するために十分な表面張力を生成する、請求項１に記載の装置。
【請求項１８】
毛管作用が、各反応サイトの中に充填される液体試料の体積を決定し、毛管作用の量は、各反応サイトの寸法に基づく、請求項１に記載の装置。
【請求項１９】
複数の反応サイトを有する基材を設計するための方法であって、前記方法は、
第１の材料との液体試料の水の前進接触角を決定することと、
前記第１の材料との液体試料の水の後退接触角を決定することと、
前記水の後退接触角が前記水の前進接触角から１５度以内である場合、基材の第１の表面および前記複数の反応サイトの各反応サイトの表面を前記第１の材料で被覆することと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１２年３月１６日出願の米国仮特許出願第６１／６１２，００５号、２０１２年３月１６日出願の米国仮特許出願第６１／６１２，０８７号、２０１２年１１月７日出願の米国仮特許出願第６１／７２３，７５９号、２０１２年３月１６日出願の米国仮特許出願第６１／６１２，００８号、２０１２年１１月７日出願の米国仮特許出願第６１／７２３，６５８号、および２０１２年１１月７日出願の米国仮特許出願第６１／７２３，７３８号の優先権の利益を主張し、それらの全てはまた、本明細書でそれらの全体が参照によって援用される。
【０００２】
本開示は、生物学的反応系で使用される基材の表面を処理する方法に関し、より詳細には、生体分子が表面に付着することを防止するために生物学的反応系で使用される基材の表面を化学的に処理する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標的ＤＮＡ配列を増幅する方法である。これまで、ＰＣＲは、一般に、９６ウェルまたは３８４ウェルのマイクロプレートで実行されている。より高いスループットが必要とされる場合、マイクロプレートにおける従来のＰＣＲ方法は、費用対効果が大きくなく、効率的でもない。さらに、スループットを増加させるに際して、ＰＣＲ反応体積を減少させると、試薬の消費量が減少し、反応体積の熱質量が減少することから増幅回数の減少をもたらすことがある。この方策は、アレイフォーマット（ｍ×ｎ）で実施され、より小さな反応体積を多数生じることがある。そのうえ、アレイを使用することによって、定量化感度、ダイナミックレンジ、および特異性が高められたスケーラブルなハイスループット解析が可能になる。
【０００４】
アレイはまた、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）を実行するために使用されている。ｄＰＣＲの結果は、レア対立遺伝子の濃度を検出および定量化し、核酸試料の絶対定量化を提供し、核酸濃度の低い倍率変化（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ）を測定するために使用することができる。一般に、複製の数を増加させると、ｄＰＣＲ結果の精度および再現性が増加する。
【０００５】
ほとんどの定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）プラットフォームにおけるアレイフォーマットは、アッセイ単位の試料の実験（ｓａｍｐｌｅ−ｂｙ−ａｓｓａｙ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）用に設計され、ＰＣＲの結果は、ポストラン解析のためにアドレス可能である必要がある。しかし、ｄＰＣＲでは、各ＰＣＲ結果の特定の位置またはウェルは重要でないことがあり、試料あたりの陽性複製および陰性複製の数のみが解析される場合がある。
【０００６】
ｄＰＣＲの読み取り値すなわち陽性反応の数および陰性反応の数はテンプレート濃度に線形的に比例するが、ｑＰＣＲの読み取り値（信号対サイクル）はテンプレート濃度の対数に比例する。したがって、ｄＰＣＲでは、試料体積を最小にすることが望ましい。
【０００７】
しかし、反応体積を引き続き減少させることが、例えば、試料体積をアレイに充填し、試料体積の物理的分離を維持することに対する信頼に関連する問題につながることがある。言い換えれば、できる限り多くのウェルすなわちスルーホールに試料体積を充填し、ウェルすなわちスルーホール間のクロストークを減少させることが重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
例示的な一実施形態では、生物学的反応のための装置が提供される。この装置は、基材と、この基材内の複数の反応サイトとを含む。基材の表面は第１の親水性を有するように構成され、複数の反応サイトの各表面は、第２の親水性を有することにより、実質的に多くの数の反応サイトに試料体積を充填するように構成される。各充填されている反応サイトの試料体積は、そのそれぞれの反応サイトに実質的に制限される。試料体積は、反応サイト内で生物学的反応を経るように構成される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本教示のさまざまな実施形態による例示的な被覆された基材を示す図である。
【００１０】
【図２】図２は、本教示のさまざまな実施形態による後退接触角および前進接触角を示す図である。
【００１１】
【図３】図３は、本教示のさまざまな実施形態による試料ローダーによる反応サイトの充填を示す図である。
【００１２】
【図４】図４は、本教示のさまざまな実施形態による例示的な方法を示すフローチャートである。
【００１３】
【図５】図５は、本教示のさまざまな実施形態により基材の基材表面を被覆する際のステップを示す図である。
【００１４】
【図６】図６は、本教示のさまざまな実施形態により基材の垂直表面を被覆する際のステップを示す図である。
【００１５】
【図７】図７は、本教示のさまざまな実施形態により基材の基材表面を被覆する際の別のステップを示す図である。
【００１６】
【図８】図８は、本教示のさまざまな実施形態により基材の垂直表面を被覆する際の別のステップを示す図である。
【００１７】
【図９】図９は、本教示のさまざまな実施形態により被覆された基材を使用し得る例示的なポリメラーゼ連鎖反応器具のブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のより完全な理解を提供するために、次の説明には、特定の構成、パラメーター、例などの多数の特定の詳細が記載されている。しかし、そのような説明は、本発明の範囲に対する制限として意図されるものではなく、例示的な実施形態のより良い説明を提供することが意図されることを認識されたい。
【００１９】
いくつかの生物学的反応を同時に実行するには、それぞれ充填された試料を有する複数の反応サイトを有する基材が必要とされることがある。反応サイトは、限定するものではないが、例えばスルーホール、インデント、またはウェルとすることができることを認識されたい。さらに、実験あたりの反応の数を増加させるために、試料エリアの大きさを減少させつつも、基材上の反応サイトの密度を増加させることができる。例えば、１５ｍｍ×１５ｍｍの基材上には、１０，０００個の反応サイトが含まれ得る。しかし、３０，０００個の反応サイトが１５ｍｍ×１５ｍｍの基材に含まれる場合、試料エリアはより小さくし、且つ基材上の反応サイトの密度を増加させることができる。
【００２０】
本明細書で説明するさまざまな実施形態によれば、試料体積で十分に充填され得る装置が提供される。基材の特定のエリアの疎水性および／または親水性などの表面特性は、反応サイトへの液体試料の充填を容易にすることができる。上記で説明したように、疎水性／親水性のレベルは、基材内の複数の反応サイトを充填することの簡単さおよび効率に影響を与えるさまざまな要因に基づくことができる。
【００２１】
例えば、反応サイトの充填に影響を与える１つの要因は反応サイトの物理的外形であり、且つ／または基材は試料の充填を容易にすることができる。例えば、反応サイトの深さ（チップの厚さ）および反応サイトの直径に基づく、反応サイト間のアスペクト比は、反応サイトの十分な充填に必要とされる特性の決定における要因であってよい。反応サイトの深さ（チップの厚さ）対直径の比は、アスペクト比と呼ばれる。例えば、反応サイトの深さが反応サイトの直径に等しい場合、アスペクト比は１である。別の例では、反応サイトの深さが反応サイトの直径よりも１０倍大きいとき、アスペクト比は１０である。反応サイトの直径は、反応サイトが液体反応媒体を充填することを可能／容易にする毛管力に影響を与える。いくつかの実施形態では、直径が小さいほど、毛管力が大きく且つ反応サイトの充填が良好／簡単になる。
【００２２】
さまざまな実施形態により反応サイトに試料体積を充填するのに影響を与える別の要因は、所望の充填効率および／または一貫性である。所望の効率は、充填されている反応サイトの９０％以上である。他の実施形態では、所望の効率は、充填されている反応サイトの９０％であってよく、反応サイト間のばらつきは高々１０％であってよい。
【００２３】
さまざまな実施形態により反応サイトに試料体積を充填するのに影響を与える別の要因は、反応サイト内の所望の反応を有する材料の適合性である。いくつかの実施形態では、所望の反応は増幅反応であることがある。より具体的には、増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であることがある。さまざまな実施形態による、装置の、例えば反応に関与する、試料体積、酵素、または試薬と接触する部分は、試料体積、酵素、または試薬と化学的に相互作用すべきではない。例えば、反応と接触する材料は、反応を妨害し得るイオンを反応サイト内に浸出させるべきではない。
【００２４】
試料体積が反応サイトへと充填された後では、さまざまな実施形態による反応サイトの充填に影響を与えるさらに別の要因は、試料体積の所望の制限である。言い換えれば、各反応サイトからの試料体積の漏洩を防止し、ある反応サイトから別の反応サイトへの溢流を防止し、反応サイトの外側での試料体積の滞留を防止するために十分な力が望ましい。
【００２５】
上述の要因を考慮に入れると、これらの目的を満たすことができる装置は、小体積を含む複数の反応サイトにおいて反応を実行するように設計および使用され得る。
【００２６】
表面の十分な疎水性／親水性特性を作るために、表面は別の材料で被覆され得る。本教示のさまざまな実施形態によれば、親水性特性を有する基材表面の一部分の被覆および親水性特性を有する反応サイトの表面の一部分の被覆。両方の表面とも親水性特性を有するが、反応サイトは、例えば、毛管作用によって充填され得る。さまざまな実施形態によれば、親水性被覆は同じ被覆であってよい。さまざまな実施形態によれば、被覆は蒸着によって施されてよい。
【００２７】
一方、本教示のさまざまな実施形態によれば、疎水性特性を有する基材表面の一部分の被覆および疎水性特性を有する反応サイトの表面の一部分の被覆。両方の表面とも疎水性特性を有するが、反応サイトは、例えば、毛管作用によって充填され得る。さまざまな実施形態によれば、疎水性被覆は同じ被覆であってよい。さまざまな実施形態によれば、被覆は蒸着によって施されてよい。
【００２８】
さらに、本明細書で説明する他の実施形態によれば、疎水性特性を有するように基材表面の一部分を被覆することおよび親水性特性を有するように基材の表面の一部分を被覆することを含む基材の被覆方法が容易になることができる。さらに、いくつかの実施形態によれば、試料エリアの表面は親水性であるように被覆され、基材の他の表面は疎水性であるように被覆される。このようにして、疎水性／親水性は、反応サイト内への液体試料の充填を容易にする。反応サイトは、例えば、毛管作用によって充填され得る。
【００２９】
そのうえ、さまざまな実施形態によれば、疎水性／親水性表面を有することによって、反応サイト間の液体試料の交差汚染を減少することができる。疎水性エリアは、各液体試料を反応サイト内のそのそれぞれの試料エリア内に保つ助けとなることができる。さまざまな実施形態によれば、継続的または完全な被覆はまた、基材からの反応を妨害し得るイオンの浸出を防止または減少させることができる。
【００３０】
被覆は、さまざまな実施形態によれば、他の被覆よりも物理的および化学的安定性を増加させてあり、生体適合性である。これは、活性生化学物質および生物学的反応で使用される材料の吸着およびその後の阻害を防止または減少させることができる。これらには、例えば、酵素、プローブ、およびＤＮＡが含まれ得る。特にデジタルＰＣＲ適用例では、望ましくない表面への反応化学物質および反応成分の吸着を最小にすることが重要である。
【００３１】
基材
本明細書で説明するさまざまな実施形態によれば、基材材料は、例えば、シリコン、酸化シリコン、ガラス、金属、セラミック、またはプラスチックであってよい。ガラスは感光性ガラスであってよい。しかし、本教示のさまざまな実施形態によれば、生体適合性であり蛍光検出を妨害しない任意の材料が被覆されてよいことは、当業者には認識されよう。
【００３２】
上述のように、反応体積の減少によって、より高い密度の反応体積を可能にすることができ、したがって、所与のエリア内でより多くの反応が実行可能である。例えば、基材における３００μｍの直径のスルーホールからなるアレイは、約３０ｎＬの反応体積を含むことができる。アレイ内の各スルーホールの大きさを直径６０〜７０μｍに減少させることによって、例えば、各反応体積は１００ｐＬとすることができる。本明細書で説明するさまざまな実施形態によれば、反応体積は、約１ｐＬから３０ｎＬの範囲に及ぶことがある。いくつかの実施形態では、反応サイトのアレイは、ダイナミックレンジが増加するように、さまざまな異なる体積の反応エリアからなることができる。
【００３３】
図１は、本明細書で説明するさまざまな実施形態による反応サイト１０４のアレイを有する基材１００を含むチップ１００を示す。チップ１００は、例えば、物品、デバイス、消耗品、アレイ、スライド、またはプラテンと呼ばれることがある。
【００３４】
チップ１００は基材１００を備える。基材１０２は、限定するものではないが、例えば、金属、ガラス、セラミック、シリコン、および酸化シリコンを含むさまざまな材料であってよい。
【００３５】
チップ１００は、複数の反応サイト１０４をさらに含む。複数の反応サイト１０４は、例えば、ウェル、空洞、またはスルーホールであってよい。各試料エリアは、例えば、円形、三角形、または六角形などのさまざまな断面外形も有してよい。他の外形を有することによって、より近接して密集した反応サイトを可能にし、所与のエリアにおける反応の数をさらに増加させることができる。さらに、反応サイトの外形は、反応サイトへの液体試料の充填を容易にすることもできる。
【００３６】
図１のチップ１００の断面図は、複数のスルーホール１０４を示す。各スルーホール１０４は、基材１０２の第１の表面内の開口から基材１０２の第２の表面内の開口まで延在し、各スルーホール１０４は、処理または検査される生体試料を含むそれぞれの液体試料を保持するために十分な表面張力を毛管作用により提供するように構成される。チップ１００は、それらの全体が本明細書にすべて記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳＰＮ６，３０６，５７８、ＵＳＰＮ７，３３２，２７１、ＵＳＰＮ７，６０４，９８３、ＵＳＰＮ７，６８２５，６５、ＵＳＰＮ６，３８７，３３１、またはＵＳＰＮ６，８９３，８７７のいずれかに開示されている全体的な形状または構造を有することができる。
【００３７】
さまざまな実施形態によれば、スルーホール１０４は、約１．３ナノリットルの体積を有することができる。あるいは、例えば、スルーホール１０４の直径および／または基材１０２の厚さを減少させることによって、各スルーホールの体積は１．３ナノリットル未満であってもよい。例えば、各スルーホール１０４は、１ナノリットル以下、１００ピコリットル以下、３０ピコリットル以下、または１０ピコリットル以下である体積を有することができる。他の実施形態では、スルーホール１０４のうちいくつかまたはすべての体積は１〜２０ナノリットルの範囲にある。
【００３８】
いくつかの実施形態では、スルーホール１０４の密度は、平方ミリメートルあたり少なくとも５０個のスルーホールとすることができる。他の実施形態では、スルーホールの密度がこれよりも高くてもよい。例えば、チップ１００内のスルーホール１０４の密度は、平方ミリメートルあたり１５０スルーホール以上、平方ミリメートルあたり２００スルーホール以上、平方ミリメートルあたり５００スルーホール以上、平方ミリメートルあたり１，０００スルーホール以上、平方ミリメートルあたり１０，０００スルーホール以上であってもよい。
【００３９】
チップ１００の他の実施形態は、すべての目的のために本明細書中に組み込まれる２０１２年３月１６日に出願された仮出願第６１／６１２，０８７号（整理番号ＬＴ００６５５  ＰＲＯ）および２０１２年１１月７日に出願された仮出願第６１／７２３，７５９号（整理番号ＬＴ００６５５  ＰＲＯ ２）にさらに説明されている。
【００４０】
上述のように、試料エリアの大きさを減少させると、各試料エリア内への液体試料の充填に関連する課題が発生することがある。本明細書で説明するさまざまな実施形態により基材表面に施された被覆は、反応サイトへの液体試料の充填を容易にし、且つ反応サイト間のクロストークを最小にすることができる。
【００４１】
被覆の前に、本明細書で説明する実施形態によれば、基材は清掃および水和されて、その後の化学反応の準備をしてもよい。清掃することによって、輸送および保管中に発生したかもしれない何らかのあり得る汚染が除去され、例えば、被覆プロセスにおける一貫性が保証される。
【００４２】
本明細書で説明する方法およびプロトコルは本明細書で説明するさまざまな実施形態による例であることを認識されたい。プロトコルは、高アスペクト比チップおよび／または低アスペクト比チップに対して機能するように修正されてもよい。いくつかの実施形態では、水接触角が６０〜１００度の間であるとき、十分な充填が発生することがある。他の実施形態では、水接触角が７５〜９０度であるとき、十分な充填が発生することがある。
【００４３】
さらに、バイコートとおよびモノコートの両方は、さまざまな実施形態によって説明される被覆を達成することができる。さらに、さまざまな実施形態による被覆方法は、例えば、液体被覆プロセスならびに蒸着プロセスを含むことができる。
【００４４】
親水性の方法
上述のように、本教示のさまざまな実施形態によれば、基材表面の、ならびに反応サイトの表面上での、親水性被覆は、生物学的反応に対する反応サイトのアレイの準備を容易にするために使用され得る。また、上述のように、基材はチップと呼ばれることがあり、反応サイトは、限定するものではないが、例えば、スルーホール、インデント、またはウェルとすることができる。さまざまな実施形態によれば、基材表面および反応サイトの被覆は、同じ材料であってよい。他の実施形態では、基材表面および反応サイトの被覆は、異なる材料であってよい。基材表面および反応サイトの表面は、蒸着プロセスによって被覆されてよい。
【００４５】
基材表面と反応サイト表面の両方は、さまざまな実施形態によれば、親水性特性を有することができるにもかかわらず、液体試料の充填は毛管作用に基づいてよい。言い換えれば、液体試料と反応サイトの壁との間の接着力によって、液体試料が反応サイト内に引き入れられる。以下の式から、各反応サイト内に引き入れられ得る液体試料の量は、反応サイトの半径によって決まる。
【００４６】
液体カラムの高さｈは次の式によって与えられる。
【数１】
2015512508.tif 000003
【００４７】
ここで、γは液体−空気表面張力（力／単位長さ）、θは水接触角、ρは液体の密度（質量／体積）、ｇは局所的な重力場の強度（力／単位質量）、ｒは反応サイトの半径（長さ）である。
【００４８】
さまざまな実施形態によれば、基材表面および反応サイトの疎水性／親水性特性は、基材および反応サイトを構成する材料および／またはそれらの表面の被覆の材料によって決まる場合がある。反応サイトの充填の効率は、基材表面および反応サイト表面との液体試料の水接触角によって決まる。
【００４９】
試料ローダーから液体試料を広げることは、液体試料の水接触角に依存する。水接触角は、試料ローダーの材料の性質と液体試料の性質との関係に由来する。水接触角が９０度未満である場合、液体試料と基材表面の関係は親水性であり、試料は、スルーホールへと試料を引き込む毛管作用に必要である、基材表面との粘着性の相互作用を示す。例えば、５０度未満の水接触角を有する、親水性の高すぎる基材は、例えば、基材表面上での過剰な液体試料の滞留の増加または反応サイトの非効率的な充填を引き起こし得る。さらに、小さい接触角は、液体試料がいくつかの反応サイト内に速く移動しすぎて、複数の反応サイト内の液体試料の不均一な分布を引き起こす原因となり得る。
【００５０】
反対に、水接触角が９０度を超えている場合、基材表面と液体試料の関係は疎水性であり、毛管力が陰性になるので、液体試料は反応サイト内に移動しないことになる。また、この状況は、基材表面上での液体試料の滞留を引き起こし、いくつかの反応サイトを液体試料で充填することを防止する可能性がある。したがって、基材および反応サイトの表面は、液体試料に関して基材および反応サイトの表面の疎水性および親水性が釣り合うように設計されている。
【００５１】
これらの特性を念頭に、さまざまな実施形態によれば、効率的な充填は、液体試料との前進接触角が液体試料との後退接触角と同程度であるように試料ローダーを構成することによって達成され得る。図２を参照すると、前進接触角および後退接触角が示されている。水滴２０２が基材２００上に示されている。基材が傾けられた場合に、水滴２０２は、前進接触角２０６および後退接触角２０４を有することになる。
【００５２】
本明細書で説明するさまざまな実施形態によれば、７０〜８５度の前進接触角は、反応サイトへの液体試料の十分な充填を提供することができる。
【００５３】
前進接触角と後退接触角との間の差は、ヒステリシスとして公知である。さまざまな実施形態では、表面特性は、ゼロ度のヒステリシスがあるように設計されてよい。他の実施形態では、表面特性は、３０度以下のヒステリシスがあるように設計されてよい。他の実施形態では、表面特性は、２０度以下のヒステリシスがあるように設計されてよい。他の実施形態では、表面特性は、０〜１５度のヒステリシスがあるように設計されてよい。高いヒステリシスを有するチップは、スルーホール内に充填される体積のばらつきを示し、外表面上で試料が滞留する傾向があり得る。
【００５４】
図３を参照すると、本明細書で説明するさまざまな実施形態による、試料ローダーによる反応サイトの充填が示されている。反応サイト１０４内に充填される液体試料３０４は、試料ローダー３０２の内部にある。試料ローダー３０２は、表面１０６を横切って側方に移動される。試料ローダー３０２が移動するとき、液体試料３０４が毛管作用によって反応サイト１０４内に充填される。
【００５５】
上述のように、さまざまな実施形態による被覆が蒸着プロセスによって堆積されてよい。そのようなプロセスの一例は次のとおりである。
１．チップを２−プロパノールに３０秒間浸漬させ、超音波処理を行う
２．５：１：１  水：水酸化アンモニウム：過酸化水素  ｖ：ｖ（過酸化水素および水酸化アンモニウムの３０％原液から）中で６０℃にて１０分間超音波処理する。
３．４：１  水：硝酸  ｖ：ｖ（硝酸の７０％原液から）中で６０℃にて１０分間超音波処理する。
４．乾燥させる
５．ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）の気相成長
【００５６】
本明細書で説明するさまざまな実施形態による他の適切な被覆は、アルキル−トリメトキシシラン、アルキル−トリエトキシシラン、アルキル−ジメトキシモノメチルシラン、アルキル−ジエトキシモノメチルシラン、アルキル−モノメトキシジメチルシラン、またはアルキル−モノエトキシジメチルシラン、または真空下の高温で揮発性である他の任意のシラン、シロキサン、シラザン、もしくはホスホネートであることを認識されたい。
【００５７】
本明細書で説明するさまざまな実施形態によれば、僅かに疎水性の基材表面および反応サイトの表面を作製する被覆材料も反応サイトを充填するために使用され得ることも認識されたい。９０〜１００度の水の前進接触角および水の後退接触角も、さまざまな実施形態により反応サイトを充填するために十分であり得る。
【００５８】
親水性／疎水性の方法
本明細書で説明するさまざまな実施形態によれば、以下は、十分な充填に望ましい特性を達成するための被覆プロセスの一例である。例示的な方法は図４に示されている。
【００５９】
チップの基材表面という第１のステップ：疎水性シラン（Ｃｌ）
方法は、基材表面１０６（図１）上に疎水性層を作製するステップ４０２を含む。図５を参照すると、水和した基材表面を反応性トリ−アルコキシシランと反応させることによって炭化水素層が基材表面１０６に付加されるステップ４０２が示されている。適切な炭化水素鎖を反応するトリ−アルコキシシランの第４の官能基として選択することによって、表面１０６の性質を微調整することができる。
【００６０】
基材表面１０６の表面の性質は、一貫した試料の反応サイト１０４内への充填にとって重大であり、また、反応サイト１０４内の充填後での基材表面１０６上での試料の滞留／残留を防止するのに重大である。試料の滞留が、生物反応サイクル中に隣接する反応サイト間のクロストークをもたらすことがあり、また、その後の偽陽性結果につながることもある。さまざまな実施形態によれば、表面の性質は、例えば、表面の性質を変更するように炭化水素鎖の長さ、シランの第４の官能基によって微調整され得る。
【００６１】
図５に示される一実施形態では、基材の基材表面１０６を露出させ、ヘプタンなどの非極性溶媒に溶解させたトリ−アルコキシシラン（炭化水素鎖はＣ４からＣ２０とすることができる）と反応させる。次いで、基材をシラン溶液中に浸漬する前に、反応サイトを希酸水溶液で満たし、これによって、それぞれの表面を、水と混和しないヘプタンに溶解させたシランと反応することから保護する。アルコキシ−シランと水和させた表面との反応は、所与の時間期間にわたって引き続き発生する。これらの反応は、酸性溶液および空気中での加水分解によって完了する。さまざまな実施形態によれば、反応が完了した後、アセトニトリル、イソプロピルアルコール、およびヘプタンなどのさまざまな溶媒で洗浄することによって水を除去し、方法の次のステップに備えて表面を準備する。
【００６２】
反応サイト表面の第１のステップ：官能基化シラン（Ｃ２）
図５（図４のステップ４０２）に示されるように基材表面を疎水性にした後、ステップ４０４は、反応サイトの垂直表面を実質的に連続した膜で親水性になるように被覆するプロセスを含む。このようにして、生化学物質を含む試料体積は、各所望の反応サイト内により容易に充填され得る。
【００６３】
この例では、Ｓ１は溶媒１（疎水性）を表し、Ｓ２は溶媒２（親水性）を表す。ここで、Ｓ１とＳ２は混和しない溶媒であり、Ｓ１は、Ｓ２によって濡らされたエリアに近づくことができない。Ｃ１は、Ｓ１中に溶解されたアルコキシシランを表す。Ｃ１は、基材表面１０６上に存在する−ＯＨ基と反応することができる。図５に示される反応によって、基材表面１０６は疎水性になる。Ｓ２が存在することによって、Ｓ１およびアルコキシシランが反応サイト１０４の垂直表面に近づくことが防止され、親水性が維持される。
【００６４】
反応中における試料の反応サイト内での充填および保留は、アスペクト比およびチップ表面に施される被覆の種類によって制御および強化される。そのうえ、いくつかのチップ基材は、イオンを浸出させたり、試料（生）化学物質との物理的相互作用を有したりすることがあり、実質的に連続した被覆が必要とされる場合がある。実質的に連続した被覆とは、イオンを試薬媒体に浸出させない被覆である。
【００６５】
一例では、実質的に連続した被覆は、エポキシ基によってその後の親水性ポリマーとの反応を可能とすることができながら、二重官能基化シラン（アルコキシ基およびエポキシ基）によって、水和した基材に結合するアルコキシ基によって達成されてよい。
【００６６】
このステップの一実施形態が図６に示されている。図５で完了したように、基材の基材表面は、Ｃ４〜Ｃ２０官能基化シランで覆われている。（アルコキシ）３−Ｓｉ−グリシジルまたはアミノ官能基化シランはまた、基材表面１０６上の未反応の−ＯＨ基と反応することができる。
【００６７】
より具体的には、図６に示されている例では、Ｃ２はアミノ官能基化シランの（アルコキシ）３グリシジルを表し、これは、Ｓ１中に溶解され、反応サイト１０４の表面上に存在する−ＯＨ基と反応することができる。言い換えれば、反応サイトの水和した壁は、ヘプタン中に溶解させたグリシジル基で官能基化したトリ−アルコキシシランの溶液と反応することができる。
【００６８】
反応サイト１０４の表面の反応によって、反応サイト１０４の表面に何らかの親水性が与えられ、水平壁を連続した保護層で覆う、プロセスの次のステップに、官能基が提供される。言い換えれば、グリシジル基は、水和した表面に結合されたシランを介して反応サイトの壁に付着することができ、さらなる化学作用により、例えば、ｄＰＣＲなどの適用を可能にするように反応サイトの被覆を微調整することができる。
【００６９】
反応サイト表面の第２のステップ：官能基化ポリマーの付着（Ｃ３）
ステップ４０４の後、ステップ４０６が実行されて、図７に示されている親水性ポリマーの付着によって反応サイト表面の親水性被覆を作製する。
【００７０】
１に近いアスペクト比を有するチップが使用されるとき、被覆ステップ４０６は重要であり、基材は、イオンを浸出させたり、試料の阻害、被毒および誤ったもしくは不正確な結果をもたらし得る生物試料／反応との他の相互作用を有したりすることがある。上述のように、さまざまな実施形態によれば、チップを被覆する目的は、基材表面１０６を覆う実質的に連続した疎水性膜を達成することであり、これによって、反応中のより良い試料充填および保留ならびに反応における不干渉が可能になる。いくつかの実施形態では、反応は、熱サイクル中であってよい。いくつかの実施形態では、次に、反応後の架橋の有無にかかわらず、前のステップで利用可能になったグリシジル基をさまざまな分子量のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、またはポリプロピレングリコールと反応させることができる。
【００７１】
一実施形態が図７に示されている。図６における反応サイト表面へのグリシジル基の後、グリシジル基はさらに修飾される。さまざまな実施形態によれば、２つの可能な経路があり得る。
【００７２】
第１の可能な経路では、グリシジル基は、触媒としての塩基の存在下でさまざまな分子量のポリエチレングリコールと反応する。Ｃ３として表される、さまざまな分子量のジ−グリシジル官能基化ポリエチレンオキシドおよび／またはポリプロピレンオキシド（ＰＥＯまたはＰＰＯ）を溶媒Ｓ３中に溶解させる。したがって、グリシジル環が開裂して、ポリエチレングリコール−ＯＨと反応する。次に、ジ−グリシジル官能基化ポリエチレンおよび／またはポリプロピレングリコールの追加および反応ならびにその後のポリアミンの存在下での架橋によって、調整可能な親水性を有する連続した膜が生成される。
【００７３】
第２の可能な経路では、グリシジル基を加水分解する。次いで、−ＯＨをジ−グリシジル官能基化ポリエチレンおよび／またはポリプロピレングリコールと反応させる。これに続いて、その後で、ポリアミンの存在下で架橋を行う。一実施形態では、反応は、所与の長さの時間および温度（室温〜１２０Ｃ）にわたる空気中および乾燥器中での硬化によって完了する。
【００７４】
基材表面の第２のステップ：疎水性シラン（Ｃｌ）
上述のように、図４のステップ４０２では、基材表面１０６を疎水性層で覆う。しかし、表面の未被覆／未反応の部分がある可能性があり、これらの部分は、次いで、図４のその後の被覆ステップ４０４および４０６中に反応する可能性がある。これは、基材表面１０６の被覆の疎水性のばらつきをもたらし、これによって、充填の間の基材表面１０６上での試料の滞留につながり得る。これは、反応サイト間での試料体積の橋渡しおよび誤った結果をもたらすことがある。いくつかの実施形態では、これを修復するために、基材表面１０６の疎水性被覆を微調整および均質化するためにＣ４〜Ｃ２０炭化水素で官能基化したトリ−アルコキシシランを使用する、基材表面の疎水性被覆を繰り返すことができる（ステップ４０２）。
【００７５】
次に、ステップ４０８では、基材の基材表面疎水性特徴を微調整することができる。反応サイト１０４の壁を被覆する前のステップ中に、基材表面上の被覆との何らかの望ましくない反応があった可能性がある。したがって、このステップでは、基材表面上の疎水性被覆を調整することができる。
【００７６】
図８を参照すると、Ｓ１は溶媒１（疎水性）を表し、Ｓ２は溶媒２（親水性）を表す。Ｓ１とＳ２は混和しない溶媒であり、Ｓ１は、Ｓ２によって濡らされたエリアを近づくことはできない。ステップ４０４中に、図６を参照すると、いくつかのＣ２が基材表面１０６に付着して、必要とされる／必要な疎水性を低下させた可能性がある。いくつかの実施形態では、ステップ４０２のような追加のステップを再度実施して、基材表面１０６の疎水性を微調整することができる。これは、正確なｄＰＣＲを達成するために必要とされることがある。Ｓ２が反応サイト１０４の内部に存在することによって、Ｓ１およびアルコキシシランが反応サイト１０４の表面に近づくことが防止され、親水性が維持される。
【００７７】
ステップ４０８は、基材表面の疎水性と垂直表面の親水性との適切なバランスを達成し、また、反応サイトのピッチおよび基材の厚さなどの基材の物理的外形の考慮事項と釣り合う助けとなることができる。これは、評価／調査されるべき生物試料による反応器の均等で一貫性のある充填を可能にするのに際して重要であることがある。
【００７８】
以下は、本開示の実施形態を実施するために使用され得る化学物質のリストである。
・タイプ１：「水和した」ＳｉＯ２を有する任意の基材への、そしてその後でタイプ２化学物質への化学結合を可能にするシリコン誘導体
・タイプ２：タイプ１化学物質の／との架橋を可能にするさまざまな（分子量および組成）エポキシポリマー
・ブチル、ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル、ヘキサデシルトリメトキシシラン；同じＣ４〜Ｃ１６炭化水素トリエトキシシラン；同じＣｘの全フッ素化誘導体（ｐｅｒ−ｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）
・アミノプロピルトリメトキシおよび／またはトリエトキシシラン；他のアミノＣｘトリメトキシおよび／またはトリエトキシシラン
・グリシジルプロピルジメトキシメチルシラン；グリシジルプロピルトリメトキシおよび／またはトリエトキシシラン；他のグリシジルＣｘトリメトキシおよび／またはトリエトキシシラン
・水酸化ナトリウム溶液、塩酸溶液、次亜塩素酸ナトリウム溶液
・疎水性溶媒および親水性溶媒（ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、アセトニトリル、イソプロピルアルコール、エタノール、メタノール、水、ケトンなど）
・ジグリシジルモノマーおよび／またはポリマー（ポリエチレンオキシド（任意の分子量）官能基化ジグリシジル、ポリプロピレンオキシド（任意の分子量）官能基化ジグリシジル、ポリビニルアルコール官能基化ジグリシジル、低分子量Ｃｘ炭化水素官能基化ジグリシジル、ジイソシアネート化合物
・触媒および架橋剤として使用されるアミン、ポリ−アミン、アルコール、ポリ−アルコール
【００７９】
上記で説明したように、チップは、本明細書で説明するさまざまな実施形態によりチップを被覆する前に清掃されてよい。さまざまな清掃プロトコルが実施されてよい。例えば、例示的な清掃プロトコルは以下のとおりである。
１．ＩＰＡ中で１×２分すすぐ；１×２２０ｋＨｚ；１×１７０ｋＨｚ
２．ＡＣＮ中で１×２分すすぐ；１×２２０ｋＨｚ；１×１７０ｋＨｚ
３．ＤＩＷで４×１分すすぐ；２×２２０ｋＨｚ；２×１７０ｋＨｚ
４．１５％ＨＮＯ３中に３０分、１５分間２２０ｋＨｚの音波、１５分間１７０ｋＨｚの音波
５．０．１４％硝酸中に１×２分、１×１７０ｋＨｚの音波、１×２２０ｋＨｚの音波
【００８０】
被覆ステップ４０２はさまざまなプロトコルによって実施され得ることを認識されたい。
【００８１】
一例として、本開示の実施形態によれば、以下の清掃プロトコルが得られる。
１．ヘプタン中のｎデシルトリメトキシシラン（Ｃ１０−シラン）１．５％中に４５分（基材表面；垂直表面はブロックされる）
２．０．１４％硝酸中に１５分
３．空気中にて室温で３０分
４．ＩＰＡ中に２×２分、２２０ｋＨｚの音波、パワー１００％
５．ヘプタン中に２×２分、２２０ｋＨｚの音波、パワー１００％
６．ヘプタン中の２％  ３グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン中に３０分（すべての表面）；開始時２２０ｋＨｚの音波５分
７．ＡＣＮ中に２×１分、２２０ｋＨｚの音波
【００８２】
被覆ステップ４０４および４０６はさまざまなプロトコルによって実施され得ることを認識されたい。しかし、一例として、本開示の実施形態によれば、以下のプロトコルが得られる。
１．ＡＣＮ中の２％ＰＥＧ  ８ｋおよび０．１％ＴＰＡ中に９０分、２２０ｋＨｚの音波、パワー１００％５分
２．空気中にて室温で３０分
３．９２Ｃの乾燥器に９０分
４．ＤＩＷ中に１×２分、１７０ｋＨｚの音波、パワー１００％
５．ＩＰＡ中に１×２分、１７０ｋＨｚの音波、パワー１００％
６．ヘプタン中に１×２分、１７０の音波
７．ＩＰＡ中に１×２分、１７０ｋＨｚの音波、パワー１００％
８．アセトニトリル（ＡＣＮ）中に１×２分；１７０ｋＨｚの音波、パワー１００％、
９．ＤＩＷ中に２×１分、２２０ｋＨｚの音波
１０．ＤＩＷ中に２×１分、１７０ｋＨｚの音波
１１．空気中に１５分
１２．空気で乾かす
１３．９２Ｃの乾燥器に３０分
１４．ヘプタン中の２％３グリシジルオキシプロピルトリメトキシルシラン中で３０分反応させる；開始時２２０ｋＨｚの音波５分
１５．ＡＣＮ中に２×１分、２２０ｋＨｚおよび１７０ｋＨｚの音波１×
１６．ＡＣＮ中の２％Ｊｅｆｆ  Ａｍｉｎｅ  ５ｋおよび０．１％ＴＰＡ中で９０分反応させる、２２０ｋＨｚの音波、パワー１００％５分
１７．空気中にて室温で１５分乾燥
１８．９２Ｃの乾燥器で９０分反応／乾燥
１９．ＩＰＡ中に１×２分、１７０ｋＨｚの音波
２０．ヘプタン中に１×２分、１７０ｋＨｚの音波
２１．ＩＰＡ中に１×２分、１７０ｋＨｚの音波
２２．アセトニトリル（ＡＣＮ）中に１×２分、１７０ｋＨｚの音波、パワー１００％
２３．ＤＩＷで２×１分すすぐ、１７０ｋＨｚの音波
２４．０．５％漂白剤（５ｍｌ  Ｃｌｏｒｏｘ＋９５ｍｌ  ＤＩＷ）中に１×２分；１７０ｋＨｚの音波
２５．４×１分ＤＩＷ、２×１７０ｋＨｚの音波、２×２２０ｋＨｚの音波
２６．空気中に１５分
２７．空気で乾かす
２８．９２Ｃの乾燥器で３０分乾燥
２９．真空パック
【００８３】
本明細書で説明する実施形態により被覆を実施するプロトコルの別の例を以下で説明する。以下の方法は、高アスペクト比チップならびに低アスペクト比チップに対して機能することができる。高アスペクト比チップでは、毛管力は、充填プロセスにおいてより主要な要因である。
１．清掃；Ｍｉｋｒｏｇｌａｓアレイ；
２．ＩＰＡ中で２×２分すすぐ；１×２２０ｋＨｚ；１×１７０ｋＨｚ
３．ＡＣＮ中で２×２分すすぐ；１×２２０ｋＨｚ；１×１７０ｋＨｚ
４．ＤＩＷ中で４×２分すすぐ；２×２２０ｋＨｚ；２×１７０ｋＨｚ
５．１５％ＨＮＯ３中に３０分、２２０ｋＨｚの音波１５分、１７０ｋＨｚの音波１５分
６．０．１４％硝酸中に１×２分、１×１７０ｋＨｚの音波、１×２２０ｋＨｚの音波
７．ＤＩＷ中で４×１分、２×１７０ｋＨｚおよび２×２２０ｋＨｚの音波
８．ＩＰＡ中に２×２分、２２０ｋＨｚの音波、パワー１００％
９．ヘプタン中に２×２分、１×２２０ｋＨｚおよび１×１７０ｋＨｚの音波
【００８４】
本明細書で説明するさまざまな実施形態による被覆方法はまた、処理要件の要求を満たすことができる。例えば、生物学的反応に使用される基材が、多数の顧客によって使用される基材である場合、さまざまな実施形態による被覆方法は再現可能であり、コスト要件を満たすことができ、基材の使用を求める要望を満たすように拡張可能である。
【００８５】
上述のように、さまざまな実施形態により利用され得る器具は、限定するものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）器具である。図９は、本発明の教示の実施形態が実施され得るＰＣＲ器具９００を示すブロック図である。ＰＣＲ器具９００は、試料支持デバイス（図示せず）内に含有された複数の試料９１２上に置かれる加熱されたカバー９１０を含んでいてもよい。さまざまな実施形態では、試料支持デバイスは、複数の試料領域を備えるガラスまたはプラスチックのスライドであってもよく、この試料領域は、試料領域と加熱されたカバー９１０との間にカバーを有する。試料支持デバイスのいくつかの例としては、限定するものではないが、標準的なマイクロタイターの９６ウェル、３８４ウェルプレートなどのマルチウェルプレート、図１に示されているチップ、またはマイクロカード、またはガラスもしくはプラスチックのスライドなどの略平坦な支持体があり得る。試料支持デバイスのさまざまな実施形態における試料領域は、基材の表面上に形成された規則的または不規則なアレイでパターン化された、くぼみ、インデント、畝、およびこれらの組み合わせを含むことができる。ＰＣＲ器具のさまざまな実施形態は、試料ブロック９１４と、加熱および冷却のための素子９１６と、熱交換器９１８と、制御システム９２０と、ユーザーインターフェース９２２とを含む。本教示による熱ブロック組立品のさまざまな実施形態は、図９のＰＣＲ器具９００の構成要素９１４〜９１８を備える。
【００８６】
図９のＰＣＲ器具９００の実施形態では、制御システム９２０は、検出システム、加熱されたカバー、および熱ブロック組立品の機能を制御するために使用されてもよい。制御システム９２０は、図９のＰＣＲ器具９００のユーザーインターフェース９２２を介してエンドユーザーが利用可能であることができる。また、図１に示されるコンピュータシステム１００は、図９のＰＣＲ器具９００の機能ならびにユーザーインターフェース機能の制御を提供するように働くことができる。さらに、コンピュータシステムは、データ処理機能、表示機能、およびレポート作成機能を提供することができる。そのような器具制御機能のすべては、局所的にＰＣＲ器具専用であってもよいし、またはコンピュータシステムが制御機能、分析機能、およびレポート生成機能の一部またはすべての遠隔制御を提供してもよい。
【００８７】
本教示のさまざまな実装形態の以下の説明は、例示および説明の目的で示されている。この説明は網羅的ではなく、本教示を開示の正確な形態に限定するものでもない。修正および変形は、上記の教示に照らして可能であり、または本教示の実施から得られてもよい。さらに、説明した実装形態はソフトウエアを含むが、本教示は、ハードウエアとソフトウエアの組み合わせとして、またはハードウエア単独において、実施されてもよい。本教示は、オブジェクト指向プログラミングシステムおよび非オブジェクト指向プログラミングシステムの両方を用いて実施されてもよい。
【００８８】
本明細書で説明したさまざまな実施形態に関する方法のための例示的なシステムは、以下の米国仮特許出願に記載されたものを含む。
・２０１２年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／６１２，０８７号；および
・２０１２年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６１／７２３，７５９号；および
・２０１２年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／６１２，００５号；および
・２０１２年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／６１２，００８号；および
・２０１２年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６１／７２３，６５８号；および
・２０１２年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６１／７２３，７３８号；および
・２０１２年６月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／６５９，０２９号；および
・２０１２年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６１／７２３，７１０号；および
・２０１３年３月７日に出願された米国仮特許出願第６１／７７４，４９９号；および
・２０１３年３月１５日に出願されたＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ００６５５  ＰＣＴ；および
・２０１３年３月１５日に出願されたＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ００６５６  ＰＣＴ；および
・２０１３年３月１５日に出願されたＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ００６５７  ＰＣＴ；および
・２０１３年３月１５日に出願されたＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ００６６８  ＰＣＴ；および
・２０１３年３月１５日に出願されたＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ００６９９  ＰＣＴ。
【００８９】
また、これら出願のすべてが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９０】
いくつかの例示的な実施形態、例、および適用例に関してさまざまな実施形態について説明してきたが、本教示から逸脱することなくさまざまな修正および変更を加えることができることは当業者には明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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2015512508.tif 000014
2015512508.tif 000015