(57)【要約】【課題】本発明は、ＩｇＧ２ヒンジドメインを含む融合タンパク質に関する。【解決手段】本発明は、多量体形態で活性またはより活性であるタンパク質、ペプチド、および小分子を多量体化することができる多量体化ドメインとしてＩｇＧ２ヒンジを含有する生物学的に活性な融合タンパク質、そのような融合タンパク質を含む組成物、ならびにそのような融合タンパク質を作製および使用する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のＩｇＧ２ヒンジモノマーと、
１つ以上のペプチド、タンパク質、炭水化物／糖、または小分子と、
を含み、
前記１つ以上のＩｇＧ２ヒンジドメインが、前記１つ以上のペプチド、タンパク質、または小分子を多量体化して、二量体またはより高次の多量体にする、
融合タンパク質。
【請求項２】
前記１つ以上のペプチド、タンパク質、または小分子が、その活性が多量体化により改善される任意のペプチド、タンパク質、小分子、または炭水化物／糖である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質またはペプチドが、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、モノクローナル抗体、および抗体様化合物、細胞表面受容体、細胞表面受容体リガンド、ならびにこれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質が、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１Ｌ、ＣＥＲＶＩＧペプチド、ＣＴＬＡ４、ＩＬ１２、ＩＬ１２ＲＡ、主要組織適合複合体、およびインスリンからなる群から選択される、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ペプチドが、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＩＬ１２のｐ４０サブユニット、およびヒト副甲状腺ホルモンの外部ドメインから選択される、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記小分子が、化学療法剤、細胞傷害性分子、色素、および蛍光物質からなる群から選択される、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記炭水化物／糖が、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、ネオ糖タンパク質、グリコクラスター、グリコポリマー、グリコデンドリマーと呼ばれる単分散ナノ構造体、糖アルコール、および糖ロッドからなる群から選択される、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、配列番号１と少なくとも８０％の相同性がある、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、配列番号１と少なくとも９０％の相同性がある、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、配列番号１と少なくとも９５％の相同性がある、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、配列番号１と１００％の相同性がある、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、少なくとも１つのＣ−Ｘ−Ｘ−Ｃモチーフを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、少なくとも２つのＣ−Ｘ−Ｘ−Ｃモチーフを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記Ｃ−Ｘ−Ｘ−ＣモチーフのＸ−Ｘが、Ｖ−ＥまたはＰ−Ｐを含む、請求項１２または１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
免疫グロブリンＦｃドメインを更に含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、Ｆｃガンマ受容体への不十分な結合のために選択される、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、Ｆｃガンマ受容体に不十分に結合するために突然変異される、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
前記Ｆｃドメインが、２３３、２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２６５、２６９、２７０、２９２、２９３、２９５、２９６、２９７、３０３、３２７、３２９、３３８、３７６、および／または４１４位の１つ以上で突然変異される、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記Ｆｃドメインが、Ｆｃガンマ受容体に不十分に結合するために修飾される、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記Ｆｃドメインが、超フコシル化、脱マンノシル化、または半グリコシル化により修飾される、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１に記載の融合タンパク質と薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的製剤。
【請求項２３】
請求項２２に記載の薬学的製剤により、それを必要とする患者を治療する方法。
【請求項２４】
前記患者が炎症性疾患を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記炎症性疾患が自己免疫性疾患である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記自己免疫性疾患が、関節炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、慢性炎症性多発ニューロパチー、多巣性運動ニューロパチー、強皮症、自己免疫性ぶどう膜炎、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、関節リウマチ、クローン病、およびアトピー性皮膚である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記自己免疫性疾患が、提供者から被移植者への臓器の移植に関連する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記炎症性疾患が感染性疾患である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記感染性疾患が、細菌または真菌感染である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記感染性疾患がウイルス感染である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記融合タンパク質が、静脈内、皮下、経口、腹腔内、舌下、頬側、経皮、真皮下埋め込み、または筋肉内で患者に投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記融合タンパク質が静脈内投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
追加の薬学的に活性な薬剤を投与することを更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記追加の薬学的に活性な薬剤が、ステロイド、モノクローナル抗体、抗生物質、抗ウイルス剤、サイトカイン、または別の方法で免疫修飾物質として作用することができる薬剤を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ステロイドが、プレドニゾロン、コルチゾン、モメテゾン、テストステロン、エストロゲン、オキサンドロロン、フルチカゾン、ブデソニド、ベクラメタゾン、アルブテロール、またはレブアルブテロールである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３６】
１つ以上のＩｇＧ２ヒンジモノマーと、
１つ以上のＦｃドメインであって、抗原結合部位を含むように操作されている前記１つ以上のＦｃドメインと、
を含み、
前記１つ以上のＩｇＧ２ヒンジドメインが、前記１つ以上のペプチド、タンパク質、または小分子を多量体化して、二量体またはより高次の多量体にする、
融合タンパク質。
【請求項３７】
前記融合タンパク質が、
ａ）ＦｃγＲ、補体、またはＦｃＲｎと、
ｂ）Ｆｃドメインが結合するように操作されている抗原と、
を結合させることができる、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
前記Ｆｃドメインが結合するように操作されている前記抗原が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕである、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、配列番号１と少なくとも８０％の相同性がある、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、配列番号１と少なくとも９０％の相同性がある、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、配列番号１と少なくとも９５％の相同性がある、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項４２】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、配列番号１と１００％の相同性がある、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項４３】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、少なくとも１つのＣ−Ｘ−Ｘ−Ｃモチーフを含む、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項４４】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、少なくとも２つのＣ−Ｘ−Ｘ−Ｃモチーフを含む、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項４５】
前記Ｃ−Ｘ−Ｘ−ＣモチーフのＸ−Ｘが、Ｖ−ＥまたはＰ−Ｐを含む、請求項４３または４４に記載の融合タンパク質。
【請求項４６】
請求項３６に記載の融合タンパク質と薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的製剤。
【請求項４７】
請求項２２に記載の薬学的製剤により、それを必要とする患者を治療する方法。
【請求項４８】
前記患者が炎症性疾患を有する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記炎症性疾患が自己免疫性疾患である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記自己免疫性疾患が、関節炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、慢性炎症性多発ニューロパチー、強皮症、自己免疫性ぶどう膜炎、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、およびアトピー性皮膚である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記自己免疫性疾患が、提供者から被移植者への臓器の移植に関連する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記炎症性疾患が感染性疾患である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記感染性疾患が、細菌感染またはウイルス感染である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記患者が癌を有する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記融合タンパク質が、静脈内、皮下、経口、腹腔内、舌下、頬側、経皮、真皮下埋め込み、または筋肉内で患者に投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
前記融合タンパク質が静脈内投与される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
追加の薬学的に活性な薬剤を投与することを更に含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
前記追加の薬学的に活性な薬剤が、ステロイド、モノクローナル抗体、抗生物質、抗ウイルス剤、サイトカイン、または別の方法で免疫修飾物質として作用することができる薬剤を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ステロイドが、プレドニゾロン、コルチゾン、モメテゾン、テストステロン、エストロゲン、オキサンドロロン、フルチカゾン、ブデソニド、ベクラメタゾン、アルブテロール、またはレブアルブテロールである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
１つ以上のＩｇＧ２ヒンジモノマーと、
１つ以上の抗原結合抗体可変ドメイン、そのフラグメント、または変種と、
を含み、
前記１つ以上のＩｇＧ２ヒンジドメインが、前記１つ以上の抗原結合抗体可変ドメイン、そのフラグメント、または変種を多量体化して、二量体またはより高次の多量体にする、
融合タンパク質。
【請求項６１】
可変軽鎖（ＶＬ）に結合している可変重鎖（ＶＨ）を含む、請求項６０に記載の融合タンパク質。
【請求項６２】
前記ＶＬへの前記ＶＨの融合が、エピトープ結合部位を形成する、請求項６１に記載の融合タンパク質。
【請求項６３】
前記ＶＨがリンカーにより前記ＶＬに結合している、請求項６１に記載の融合タンパク質。
【請求項６４】
ＶＨまたはＶＬのＣＨ１領域を更に含む、請求項６３に記載の融合タンパク質。
【請求項６５】
前記ＶＨおよびＶＬが、同じ細胞において同時発現している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６６】
１つ以上の抗原結合抗体可変ドメイン、そのフラグメント、または変種が、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ、二特異性抗体、三特異性抗体、ミニボディ、単一ドメイン抗体、ナノボディ、または単鎖抗体である、請求項６０に記載の融合タンパク質。
【請求項６７】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、配列番号１と少なくとも８０％の相同性がある、請求項６０に記載の融合タンパク質。
【請求項６８】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、配列番号１と少なくとも９０％の相同性がある、請求項６０に記載の融合タンパク質。
【請求項６９】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、配列番号１と少なくとも９５％の相同性がある、請求項６０に記載の融合タンパク質。
【請求項７０】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、配列番号１と１００％の相同性がある、請求項６０に記載の融合タンパク質。
【請求項７１】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、少なくとも１つのＣ−Ｘ−Ｘ−Ｃモチーフを含む、請求項６０に記載の融合タンパク質。
【請求項７２】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、少なくとも２つのＣ−Ｘ−Ｘ−Ｃモチーフを含む、請求項６０に記載の融合タンパク質。
【請求項７３】
前記Ｃ−Ｘ−Ｘ−ＣモチーフのＸ−Ｘが、Ｖ−ＥまたはＰ−Ｐを含む、請求項７１または７２に記載の融合タンパク質。
【請求項７４】
免疫グロブリンＦｃドメインを更に含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７５】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、Ｆｃガンマ受容体への不十分な結合のために選択される、請求項７４に記載の融合タンパク質。
【請求項７６】
前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである、請求項７５に記載の融合タンパク質。
【請求項７７】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、Ｆｃガンマ受容体に不十分に結合するために突然変異される、請求項７４に記載の融合タンパク質。
【請求項７８】
前記Ｆｃドメインが、２３３、２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２６５、２６９、２７０、２９２、２９３、２９５、２９６、２９７、３０３、３２７、３２９、３３８、３７６、および／または４１４位の１つ以上で突然変異される、請求項７７に記載の融合タンパク質。
【請求項７９】
前記Ｆｃドメインが、Ｆｃガンマ受容体に不十分に結合するために修飾される、請求項７４に記載の融合タンパク質。
【請求項８０】
前記Ｆｃドメインが、超フコシル化、脱マンノシル化、または半グリコシル化により修飾される、請求項７９に記載の融合タンパク質。
【請求項８１】
請求項６０に記載の融合タンパク質と薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的製剤。
【請求項８２】
請求項８１に記載の薬学的製剤により、それを必要とする患者を治療する方法。
【請求項８３】
前記患者が炎症性疾患を有する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記炎症性疾患が自己免疫性疾患である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記自己免疫性疾患が、関節炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、慢性炎症性多発ニューロパチー、強皮症、自己免疫性ぶどう膜炎、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、およびアトピー性皮膚である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記自己免疫性疾患が、提供者から被移植者への臓器の移植に関連する、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
前記炎症性疾患が感染性疾患である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
前記感染性疾患が細菌感染である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記感染性疾患がウイルス感染である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記融合タンパク質が、静脈内、皮下、経口、腹腔内、舌下、頬側、経皮、真皮下埋め込み、または筋肉内で患者に投与される、請求項８２に記載の方法。
【請求項９１】
前記融合タンパク質が静脈内投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項９２】
追加の薬学的に活性な薬剤を投与することを更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項９３】
前記追加の薬学的に活性な薬剤が、ステロイド、モノクローナル抗体、抗生物質、抗ウイルス剤、サイトカイン、または別の方法で免疫修飾物質として作用することができる薬剤を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項９４】
前記ステロイドが、プレドニゾロン、コルチゾン、モメテゾン、テストステロン、エストロゲン、オキサンドロロン、フルチカゾン、ブデソニド、ベクラメタゾン、アルブテロール、またはレブアルブテロールである、請求項３５に記載の方法。
【請求項９５】
前記１つ以上のペプチド、タンパク質、炭水化物／糖、または小分子が、前記ＩｇＧ２ヒンジのＮ末端に融合している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９６】
前記１つ以上のペプチド、タンパク質、炭水化物／糖、または小分子が、前記ＩｇＧ２ヒンジのＣ末端に融合している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９７】
前記１つ以上のペプチド、タンパク質、炭水化物／糖、または小分子が、ＣＴＬＡ−４またはその細胞外ドメインである、請求項９５に記載の融合タンパク質。
【請求項９８】
Ｂ７．１またはＢ７．２タンパク質を更に含む、請求項９７に記載の融合タンパク質。
【請求項９８】
前記１つ以上のペプチド、タンパク質、炭水化物／糖、または小分子が、ＰＤ−１である、請求項９５に記載の融合タンパク質。
【請求項９９】
前記ＰＤ−１が、ＰＤ−１の細胞外ドメインである、請求項９８に記載の融合タンパク質。
【請求項１００】
配列番号６を含む、請求項９９に記載の融合タンパク質。
【請求項１０１】
前記１つ以上のペプチド、タンパク質、炭水化物／糖、または小分子が、ＣＥＲＶＩＧペプチドである、請求項９５に記載の融合タンパク質。
【請求項１０２】
前記ＣＥＲＶＩＧが配列番号１１を含む、請求項１０１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０３】
配列番号１６を含む、請求項１０２に記載の融合タンパク質。
【請求項１０４】
前記１つ以上のペプチド、タンパク質、炭水化物／糖、または小分子が、ＣＴＬＡ−４またはその細胞外ドメインである、請求項９６に記載の融合タンパク質。
【請求項１０５】
Ｂ７．１またはＢ７．２タンパク質を更に含む、請求項１０４に記載の融合タンパク質。
【請求項１０６】
前記１つ以上のペプチド、タンパク質、炭水化物／糖、または小分子が、ＰＤ−１である、請求項９６に記載の融合タンパク質。
【請求項１０７】
前記ＰＤ−１が、ＰＤ−１の細胞外ドメインである、請求項１０６に記載の融合タンパク質。
【請求項１０８】
配列番号５を含む、請求項１０７に記載の融合タンパク質。
【請求項１０９】
前記１つ以上のペプチド、タンパク質、炭水化物／糖、または小分子が、ＣＥＲＶＩＧペプチドである、請求項９６に記載の融合タンパク質。
【請求項１１０】
前記ＣＥＲＶＩＧが配列番号１１を含む、請求項１０９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１１】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、抗原結合部位を含むように操作されている前記１つ以上のＦｃドメインの前記Ｃ末端に融合している、請求項３６に記載に融合タンパク質。
【請求項１１２】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、抗原結合部位を含むように操作されている前記１つ以上のＦｃドメインの前記Ｎ末端に融合している、請求項３６に記載に融合タンパク質。
【請求項１１３】
前記Ｆｃドメインが結合するように操作されている前記抗原が、配列番号１８のＨｅｒ２／ｎｅｕである、請求項１１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１４】
配列番号１９を含む、請求項１１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１１５】
前記Ｆｃドメインが結合するように操作されている前記抗原が、配列番号１８のＨｅｒ２／ｎｅｕである、請求項１１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１１６】
配列番号２０を含む、請求項１１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１１７】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、前記１つ以上の抗原結合抗体可変ドメイン、そのフラグメント、または変種の前記Ｃ末端に融合している、請求項６０に記載の融合タンパク質。
【請求項１１８】
前記ＩｇＧ２ヒンジが、前記１つ以上の抗原結合抗体可変ドメイン、そのフラグメント、または変種の前記Ｎ末端に融合している、請求項６０に記載の融合タンパク質。
【請求項１１９】
前記１つ以上のペプチド、タンパク質、炭水化物／糖、または小分子が、ＰＤ−１である、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１２０】
前記ＰＤ−１が、ＰＤ−１の細胞外ドメインである、請求項１１９に記載の融合タンパク質。
【請求項１２１】
配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０を含む、請求項１２０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２２】
前記１つ以上のペプチド、タンパク質、炭水化物／糖、または小分子が、ＣＥＲＶＩＧペプチドである、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１２３】
前記ＣＥＲＶＩＧペプチドが配列番号１１を含む、請求項１２２に記載の融合タンパク質。
【請求項１２４】
配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５を含む、請求項１２３に記載の融合タンパク質。
【請求項１２５】
１つ以上のペプチド、タンパク質、炭水化物／糖、または小分子と１つ以上のＩｇＧ２ヒンジモノマーとの間にリンカーを更に含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１２６】
前記１つ以上のペプチド、タンパク質、炭水化物／糖、または小分子が、ＣＥＲＶＩＧペプチドである、請求項１２５に記載の融合タンパク質。
【請求項１２７】
前記ＣＥＲＶＩＧペプチドが配列番号１１を含む、請求項１２６に記載の融合タンパク質。
【請求項１２８】
配列番号１７を含む、請求項１２７に記載の融合タンパク質。
【請求項１２９】
１つ以上の追加のＦｃドメインを更に含む、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項１３０】
抗原結合部位を含むように操作されている前記Ｆｃドメインが、Ｈｅｒ２／ｎｅｕに結合するように操作されている、請求項１２９に記載の融合タンパク質。
【請求項１３１】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕに結合するように操作されている前記Ｆｃドメインが、配列番号１８を含む、請求項１３０に記載の融合タンパク質。
【請求項１３２】
配列番号２１を含む、請求項１３１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３３】
前記タンパク質が、主要組織適合複合体である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１３４】
前記主要組織適合複合体が、クラスＩ主要組織適合複合体である、請求項１３３に記載の融合タンパク質。
【請求項１３５】
前記主要組織適合複合体が、クラスＩＩ主要組織適合複合体である、請求項１３３に記載の融合タンパク質。
【請求項１３６】
色素または蛍光物質を更に含む、請求項１３３に記載の融合タンパク質。
【請求項１３７】
抗原特異的Ｔ細胞を検出するための、フローサイトメトリーにおける請求項１３６に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項１３８】
前記タンパク質またはペプチドが細胞表面受容体である、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項１３９】
前記細胞表面受容体がＧタンパク質共役受容体である、請求項１３８に記載の融合タンパク質。
【請求項１４０】
前記Ｇタンパク質共役受容体がケモカイン受容体である、請求項１３９に記載の融合タンパク質。
【請求項１４１】
前記ケモカイン受容体が、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、またはＣＸＣＲ２である、請求項１４０に記載の融合タンパク質。
【請求項１４２】
前記細胞表面受容体がＢ細胞受容体である、請求項１３８に記載の融合タンパク質。
【請求項１４３】
前記細胞表面受容体がＴ細胞受容体である、請求項１３８に記載の融合タンパク質。
【請求項１４４】
前記細胞表面受容体がＴＮＦスーパーファミリー受容体である、請求項１３８に記載の融合タンパク質。
【請求項１４５】
前記ＴＮＦスーパーファミリー受容体が、ＣＤ１３７、ＢＡＦＦ  Ｒ、ＢＣＭＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤｃＲ３、ＤｃＴＲＡＩＬ、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、Ｆａｓ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、リホトキシンベータＲ、ＮＧＦ  Ｒ、オステオプロテゲリン、ＯＸ４０、ＲＡＮＫ、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫ  Ｒである、請求項１４４に記載の融合タンパク質。
【請求項１４６】
前記ＴＲＡＩＬ  Ｒが、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３、またはＴＲＡＩＬ  Ｒ４である、請求項１４５に記載の融合タンパク質。
【請求項１４７】
前記タンパク質またはペプチドが細胞表面受容体リガンドである、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項１４８】
前記細胞表面受容体がＴＮＦスーパーファミリー受容体のリガンドである、請求項１４７に記載の融合タンパク質。
【請求項１４９】
ＴＮＦスーパーファミリー受容体の前記リガンドが、ＴＮＦαまたはＢＬｙＳである、請求項１４８に記載の融合タンパク質。
【請求項１５０】
前記細胞表面受容体リガンドが細胞表面糖タンパク質のリガンドである、請求項１４７に記載の融合タンパク質。
【請求項１５１】
細胞表面糖タンパク質に結合している前記リガンドが、ＣＤ４、ＣＤ１２３、ＣＤ３０３、またはＡ  ＣＤ３０４リガンドである、請求項１５０に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１月２７日に出願された米国仮出願第６１／５９１，６１５号に対する優先権を主張し、この内容はその全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般に、免疫学、自己免疫、炎症、および腫瘍免疫学の分野に関する。より詳細には、本発明は、多量体形態で活性またはより活性であるタンパク質、ペプチド、および小分子を多量体化することができる多量体化ドメインとしてＩｇＧ２ヒンジを含有する生物学的に活性な融合タンパク質、そのような融合タンパク質を含む組成物、ならびにそのような融合タンパク質を作製および使用する方法に関する。
【発明の概要】
【０００３】
タンパク質、ペプチド、小分子、および炭水化物／糖の望ましいレベルの多量体化を達成し、同時に、患者の免疫系にとって外来である多量体化ドメインに対する有害反応を患者において引き起こさない問題を解決する免疫療法に使用するために、治療タンパク質および小分子を多量体化する現存する方法の代替案の必要性が存在する。本発明は、１つ以上の天然に生じる多量体化ドメインと、１つ以上のペプチド、タンパク質、小分子、核酸、脂肪酸、または炭水化物／糖とを含む生物学的に活性な融合タンパク質、それを含有する組成物、およびそれを使用する方法に関する。これらの融合タンパク質は、自己免疫性疾患が含まれるが、これに限定されない広範囲の免疫学的、内分泌学的、炎症性、感染性、および癌の障害を治療する広範囲の用途を有する。加えて、これらの融合タンパク質の特定のものは、現在ビオチン−ストレプトアビジンが多量体を作製するために画像化剤または臨床診断剤として使用されているアッセイにおいて使用されるもののような、実験用試薬としての有用性も有する。
【０００４】
一実施形態において、本発明は、１つ以上の配列番号１のＩｇＧ２ヒンジドメインと、１つ以上のペプチド、タンパク質、小分子、核酸、脂肪酸、または炭水化物／糖とを含む融合タンパク質に関する。更なる実施形態において、１つ以上のＩｇＧ２ヒンジドメインは、１つ以上のペプチド、タンパク質、小分子、核酸、脂肪酸、または炭水化物／糖を多量体化して、二量体またはより高次の多量体にする。なお更なる実施形態において、１つ以上のペプチド、タンパク質、または小分子は、その活性が多量体化により改善される任意のペプチド、タンパク質、小分子、核酸、脂肪酸、または炭水化物である。なお更なる実施形態において、活性において観察される改善は、タンパク質への多量体化化合物の結合の親和性または結合活性の増加を介したものである。一実施形態において、配列番号１のＩｇＧ２ドメインは、１つ以上のペプチドまたはタンパク質のＣ末端に融合している。別の実施形態において、配列番号１のＩｇＧ２ドメインは、１つ以上のペプチドまたはタンパク質のＮ末端に融合している。別の実施形態においてＩｇＧ２ドメインは、小分子、核酸、脂肪酸、または炭水化物／糖に融合している。なお別の実施形態において、ＩｇＧ２ドメインは、Ｆｃドメインのようなリンカータンパク質を介して、小分子、核酸、脂肪酸、または炭水化物／糖に融合している。
【０００５】
特定の実施形態において、融合タンパク質は、１つ以上の配列番号１のＩｇＧ２ヒンジドメインと、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、細胞表面受容体、細胞表面受容体リガンド、またはモノクローナル抗体から選択される１つ以上のタンパク質とを含む。別の実施形態において、ＩｇＧ２ヒンジは、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、細胞表面受容体、または細胞表面受容体リガンドから選択される１つ以上のタンパク質の細胞外ドメインに融合している。特定の実施形態において、ＩｇＧ２ヒンジは、細胞表面受容体の細胞外ドメインに融合して、可溶性受容体を形成する。一実施形態において、可溶性受容体は、ＴＮＦスーパーファミリーのＴＮＦ受容体結合メンバーのファミリーからのものである。特定の実施形態において、１つ以上のタンパク質は、ＰＤ−１、ＰＤ−１Ｌ、ＣＴＬＡ４、ＩＬ１２、ＩＬ１２ＲＡ、または主要組織適合複合体の１つ以上である。特定の実施形態において、ホルモンに融合しているＩｇＧ２ヒンジは、多量体化ホルモンをホルモン受容体に提示する。一実施形態において、多量体化ホルモンは、インスリン、ヒト成長ホルモン、グルカゴン様ペプチド−１、レプチン、オレキシン、グレリン、または性ホルモンである。別の実施形態において、融合タンパク質は、１つ以上の配列番号１のＩｇＧ２ヒンジドメインと、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＩＬ１２のｐ４０サブユニット、またはヒト副甲状腺ホルモンの１つ以上の外部ドメインとを含む。別の実施形態において、ＩｇＧ２ヒンジは、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、細胞表面受容体、細胞表面受容体リガンドから選択される１つ以上のタンパク質の細胞外ドメインに結合している合成ペプチドに融合している。
【０００６】
一実施形態において、融合タンパク質は、１つ以上の配列番号１のＩｇＧ２ヒンジドメインと、１つ以上のＰＤ−１タンパク質とを含む。一実施形態において、ＰＤ−１タンパク質は、ＰＤ−１の細胞外ドメインを含む。一実施形態においてＩｇＧ２ヒンジは、ＰＤ−１ペプチドのＣ末端に融合している。別の実施形態においてＩｇＧ２ヒンジは、ＰＤ−１ペプチドのＮ末端に融合している。なお更なる実施形態において、融合タンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジおよびＰＤ−１ペプチドに加えて、Ｆｃドメインも含む。なお別の実施形態において、融合タンパク質は、ＰＤ−１ペプチドとＩｇＧ２ヒンジの間にリンカーを含む。更なる実施形態において、融合タンパク質は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０である。
【０００７】
別の実施形態において、融合タンパク質は、１つ以上の配列番号１のＩｇＧ２ヒンジドメインと、ＳＩＲＰαに結合することができる１つ以上のペプチドとを含む。一実施形態において、ＳＩＲＰαに結合するペプチドは、ＣＤ４７分子である。なお別の実施形態において、ＳＩＰＲαに結合するペプチドは、ＣＥＲＶＩＧ合成ペプチドである。更なる実施形態において、ＳＩＲＰαに結合するＣＥＲＶＩＧペプチドは、配列番号１１を含む。一実施形態においてＩｇＧ２ヒンジは、ＣＥＲＶＩＧペプチドのＣ末端に融合している。別の実施形態においてＩｇＧ２ヒンジは、ＣＥＲＶＩＧペプチドのＮ末端に融合している。なお更なる実施形態において、融合タンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＥＲＶＩＧペプチドに加えて、Ｆｃドメインも含む。なお別の実施形態において、融合タンパク質は、ＣＥＲＶＩＧペプチドとＩｇＧ２ヒンジの間にリンカーを含む。更なる実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７を含む。
【０００８】
なお別の実施形態において、融合タンパク質は、１つ以上の配列番号１のＩｇＧ２ヒンジドメインと、１つ以上の主要組織適合複合体タンパク質とを含む。一実施形態において、１つ以上の主要組織適合複合体タンパク質は、クラスＩ主要組織適合複合体である。別の実施形態において、１つ以上の主要組織適合複合体は、クラスＩＩ主要組織適合複合体である。なお更なる実施形態において、１つ以上の主要組織適合複合体タンパク質を含む融合タンパク質は、標識を更に含む。一実施態様において、標識は色素である。別の実施態様において、標識は蛍光物質である。一実施形態において、１つ以上のＩｇＧ２ヒンジドメインと、１つ以上の主要組織適合複合体タンパク質とを含む融合タンパク質は、例えば、フローサイトメトリーにより抗原特異的Ｔ細胞の存在を検出する四量体アッセイに有用である。
【０００９】
一実施形態において、融合タンパク質は、１つ以上の配列番号１のＩｇＧ２ヒンジドメインと、１つ以上の細胞表面受容体とを含む。一実施形態において、細胞表面受容体は、Ｇタンパク質共役受容体である。特定の実施形態において、Ｇタンパク質共役受容体は、ケモカイン受容体である。更なる実施形態において、ケモカイン受容体は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、またはＣＸＣＲ２である。別の実施形態において、細胞表面受容体は、Ｔ細胞受容体である。なお別の実施形態において、細胞表面受容体は、Ｂ細胞受容体である。なお別の実施形態において、細胞表面受容体は、ＣＤ１３７、ＢＡＦＦ  Ｒ、ＢＣＭＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤｃＲ３、ＤｃＴＲＡＩＬ、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、Ｆａｓ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、リホトキシンベータＲ、ＮＧＦ  Ｒ、オステオプロテゲリン、ＯＸ４０、ＲＡＮＫ、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫ  ＲのようなＴＮＦスーパーファミリー受容体である。
【００１０】
別の実施形態において、融合タンパク質は、１つ以上の配列番号１のＩｇＧ２ヒンジドメインと、１つ以上の細胞表面受容体リガンドとを含む。一実施形態において、細胞表面受容体リガンドは、ＴＮＦスーパーファミリー受容体である。更なる実施形態において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドは、ＴＮＦαまたはＢＬｙＳである。更なる実施形態において、細胞表面受容体リガンドは、細胞表面糖タンパク質のリガンドである。更なる実施形態において、細胞表面糖タンパク質は、ＣＤ４、ＣＤ１２３、ＣＤ３０３、またはＣＤ３０４リガンドである。
【００１１】
なお更なる実施形態において、融合タンパク質は、１つ以上の配列番号１のＩｇＧ２ヒンジドメインと、化学療法剤、細胞傷害性分子、色素、および／または蛍光物質の１つ以上とを含む。なお更なる実施形態において、融合タンパク質は、１つ以上の配列番号１のＩｇＧ２ヒンジドメインと、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、ネオ糖タンパク質、グリコクラスター、グリコポリマー、グリコデンドリマーと呼ばれる単分散ナノ構造体、糖アルコール、および糖ロッドの１つ以上とを含む。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、１つ以上の配列番号１のＩｇＧ２ヒンジドメインと、１つ以上のペプチド、タンパク質、小分子、核酸、脂肪酸、または炭水化物／糖と、１つ以上の免疫グロブリンＦｃドメインモノマーとを含む融合タンパク質に関する。更なる実施形態において、融合タンパク質は、Ｆｃガンマ受容体への弱い親和結合のために選択される１つ以上の免疫グロブリンＦｃドメインを含有する。特定の実施形態において、Ｆｃガンンマ受容体への低い親和性結合のために選択される免疫グロブリンＦｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃドメインである。特定の実施形態において、免疫グロブリンＦｃドメインは、Ｆｃガンマ受容体に不十分に結合するために突然変異される。なお更なる実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｆｃガンマ受容体に不十分に結合するため、２３３、２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２６５、２６９、２７０、２９２、２９３、２９５、２９６、２９７、３０３、３２７、３２９、３３８、３７６、および／または４１４位で突然変異される。なお更なる実施形態において、免疫グロブリンＦｃドメインは、Ｆｃガンマ受容体に不十分に結合するため、未変性ヒト免疫グロブリンＦｃに対する１つ以上のグリコシル化変化のように修飾される。特定の実施形態において、免疫グロブリンＦｃドメインは、超フコシル化、脱マンノシル化、または半グリコシル化により修飾され、それによってＦｃ受容体の結合を減少させる。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、抗原結合部位を含むように操作されている１つ以上の免疫グロブリンＦｃドメインと、抗原結合部位を含むように操作されている１つ以上のＦｃドメインを多量体化するＩｇＧ２ヒンジとを含む融合タンパク質に関する。更なる実施形態において、ＩｇＧ２ヒンジは、抗原結合部位を含むように操作されている１つ以上のＦｃドメインのＮ末端に融合している。別の実施形態において、ＩｇＧ２ヒンジは、抗原結合部位を含むように操作されている１つ以上のＦｃドメインのＣ末端に融合している。更なる実施形態において、融合タンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジと、抗原結合部位を含むように操作されている１つ以上のＦｃドメインとを結合するリンカーを更に含む。なお更なる実施形態において、融合タンパク質は、抗原結合部位を含むように操作されていない追加のＦｃドメインを含む。一実施形態において、抗原結合部位を含むように操作されている１つ以上のＦｃドメインは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕと結合するように操作されており、配列番号１８を含む。更なる実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１を含む。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、１つ以上１つ以上の抗原結合抗体可変ドメイン、そのフラグメント、または変種と、１つ以上のＩｇＧ２ヒンジモノマーとを含む融合タンパク質に関し、ここでＩｇＧ２ヒンジドメインは、１つ以上の抗原結合抗体可変ドメイン、そのフラグメント、または変種を多量体化する。一実施形態において、１つ以上の抗原結合抗体可変ドメイン、そのフラグメント、または変種は、可変軽鎖に結合している可変重鎖である。更なる実施形態において、可変軽鎖に結合している可変重鎖は、エピトープ結合部位を形成する。更なる実施形態において、可変重鎖は、リンカーにより可変軽鎖に結合している。更なる実施形態において、１つ以上１つ以上の抗原結合抗体可変ドメイン、そのフラグメント、または変種は、一価抗体のＦａｂフラグメント、ｓｃＦｖ、二特異性抗体、三特異性抗体、ミニボディ、単一ドメイン抗体、ナノボディ、または単鎖抗体である。更なる実施形態において、ＩｇＧ２ヒンジは、１つ以上１つ以上の抗原結合抗体可変ドメイン、そのフラグメント、または変種のＣ末端に融合している。更なる実施形態において、ＩｇＧ２ヒンジは、１つ以上１つ以上の抗原結合抗体可変ドメイン、そのフラグメント、または変種のＮ末端に融合している。なお更なる実施形態において、融合タンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジおよび１つ以上１つ以上の抗原結合抗体可変ドメイン、そのフラグメント、または変種に加えて、Ｆｃドメインも含む。なお別の実施形態において、融合タンパク質は、１つ以上１つ以上の抗原結合抗体可変ドメイン、そのフラグメント、または変種、ペプチドとＩｇＧ２ヒンジの間にリンカーを含む。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、１つ以上のＩｇＧ２ヒンジドメインと、１つ以上のペプチド、タンパク質、核酸、脂肪酸、炭水化物、または小分子と、場合により１つ以上の免疫グロブリンＦｃドメインとを含有する融合タンパク質および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的製剤に関する。更なる実施形態において、融合タンパク質を含む薬学的製剤は、それを必要とする患者に静脈内、皮下、経口、腹腔内、舌下、眼科、頬側、鼻腔内、直腸内、経真皮、真皮下埋め込み、または筋肉内で投与される。更なる実施形態において、融合タンパク質は、追加の薬学的に活性な薬剤の投与の前、間、または後に投与される。更なる実施形態において、追加の薬学的に活性な薬剤は、ステロイド；モノクローナル抗体、融合タンパク質、もしくは抗サイトカインのような生物製剤の抗自己免疫薬；非生物製剤の抗炎症薬；免疫抑制薬；抗生物質；抗真菌薬；抗ウイルス剤；サイトカイン；または別の方法で免疫修飾物質として作用することができる薬剤を含む。なお更なる実施形態において、ステロイドは、プレドニゾン、プレドニゾロン、コルチゾン、デキサメタゾン、モメテゾン、テストステロン、エストロゲン、オキサンドロロン、フルチカゾン、ブデソニド、ベクラメタゾン、アルブテロール、またはレブアルブテロールである。なお更なる実施形態において、モノクローナル抗体は、インフリキシマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、ゴリムマブ、オファツムマブ、ＬＹ２１２７３９９、ベリムマブ、ベルツズマブ、またはセルトリズマブである。なお更なる実施形態において、融合タンパク質は、エタネルセプトまたはアバタセプトである。なお更なる実施形態において、抗サイトカイン生物製剤はアナキンラである。なお更なる実施形態において、抗リウマチ性非生物学的薬剤は、シクロホスファミド、メトトレキセート、アザチオプリン、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、ミノサイクリン、有機金化合物、ホスタマチニブ、トファシチニブ、エトリコキシブ、またはスルファサラジンである。なお更なる実施形態において、免疫抑制薬は、シクロスポリンＡ、タクロリムス、シロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、エベロリムス、ＯＫＴ３、抗胸腺細胞グロブリン、バシリキシマブ、ダクリズムマブ、またはアレムツズマブである。なお更なる実施形態において、融合タンパク質は、化学療法剤の投与の前、間、または後に投与される。なお更なる実施形態において、融合タンパク質および追加の治療剤は、一緒に投与されたときに治療上の相乗作用を示す。一実施形態において、融合タンパク質は、追加の治療剤の投与の前に投与される。別の実施形態において、融合タンパク質は、追加の治療剤の投与と同時に投与される。なお別の実施形態において、融合タンパク質は、追加の治療剤の投与の後に投与される。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、１つ以上のＩｇＧ２ヒンジドメインと、１つ以上のペプチド、タンパク質、または小分子と、場合により１つ以上の免疫グロブリンＦｃドメインとを含有する融合タンパク質の有効量により、それを必要とする患者を治療する方法に関する。更なる実施形態において、それを必要とする患者は、炎症性、感染性、新生物性、ホルモン性、または自己免疫性疾患を有する。なお更なる実施形態において、炎症性疾患は、冠動脈性心疾患、アルツハイマー病、過敏性腸管症候群、および非アルコール性脂肪性肝炎からなる群から選択される。なお更なる実施形態において、感染性疾患は、細菌、ウイルス、真菌、またはプリオン感染のうちから選択される。特定の実施形態において、患者は敗血症を有する。なお更なる実施形態において、自己免疫性疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、Ｉ型またはＩＩ型真性糖尿病、自己免疫性甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性貧血症、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、多巣性運動ニューロパチー、強皮症、全身性エリテマトーデス、乾癬、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、自己免疫性ぶどう膜炎、ＡＮＣＡ陽性血管炎、セリアック病、天疱、皮膚多発性筋炎、グッドパスチャー病、重症筋無力症、グレーブス病、川崎病、鎌状赤血球クリーゼ、特発性肺線維症、白斑症、およびアトピー性皮膚炎からなる群から選択される。なお更なる実施形態において、自己免疫性疾患は、提供者から被移植者への臓器の移植に関連する。なお更なる実施形態において、自己免疫性疾患は、自己免疫性疾患と伝統的に特徴決定されていないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、骨減少症、および骨粗鬆症のように免疫系の細胞が重要な役割を果たす疾患である。特定の実施形態において、ホルモン性疾患は、糖尿病、肥満、アジソン病、クッシング症候群、 先端巨大症、多嚢胞性卵巣症候群、副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、および骨粗鬆症から選択される。
【００１７】
別の実施形態において、融合タンパク質は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒ、およびチンパンジー）、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ウサギ、ヤギ、シカ、ヒツジ、フェレット、アレチネズミ、モルモット、ハムスター、コウモリ、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、およびアヒル）、魚類、ならびに爬虫類を種特異的タンパク質またはキメラ融合タンパク質により治療するために投与される。なお別の実施形態において、ヒトは、成人または小児である。なお別の実施形態において、融合タンパク質は、自己免疫性疾患を予防するために投与される。更なる実施形態において、融合タンパク質は、愛玩動物および家畜におけるワクチン関連自己免疫性状態を予防するために投与される。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
天然に生じるＩｇＧ２ヒンジドメインの使用により、二量体およびより高次の多量体として活性またはより活性なペプチド、タンパク質、小分子、核酸、および脂肪酸に多量体化する手法には、従来の多量体化技術の使用により多量体化された分子より多量体化が驚くほど効率的である免疫的に活性な融合タンパク質の組み換えおよび／または生化学的作製が含まれる。本明細書に記載されている融合タンパク質は、例えば、自己免疫性疾患、炎症性疾患、内分泌学的な疾患、癌、および敗血症を含む感染性疾患の治療に有用性を有する。それぞれの実施形態は、特定の例示的な実施形態を伴って、下記に詳細に記載されている。 
【００１９】
本明細書で使用されるとき、特許請求の範囲および／または明細書における用語「含む」と共に使用されたときの語「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」および「１つまたは１つを超える」の意味とも一致している。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、「融合タンパク質」は、複数のドメインを含有する隣接ポリペプチドまたは分子が融合または一緒に結合して、新規のタンパク質またはタンパク質小分子／炭水化物化合物を形成することを意味する。例えば、例示的な「融合タンパク質」は、配列番号１のＩｇＧ２ヒンジドメインを含有し、免疫グロブリンＦｃドメインまたは修飾された免疫グロブリンＦｃドメインに融合／結合し、ＣＴＬＡ４の外部ドメインに更に融合／結合して、融合タンパク質を形成する。用語「融合タンパク質」は、小分子または炭水化物のような非タンパク質またはペプチドへの配列番号１のＩｇＧ２ヒンジドメインの融合も包含する。
【００２１】
「直接結合している」とは、２つの配列が、介在性または外来性配列、例えば制限酵素認識部位またはクローニングフラグメントを有することなく、互いに連結していることを意味する。当業者は、「直接結合している」は、多量体化の能力が実質的に影響を受けない限り、アミノ酸の付加または除去を包含することを理解する。特定の実施形態において、ＩｇＧ２ヒンジは、ペプチド、タンパク質、核酸、脂肪酸、または小分子に直接結合している。他の実施形態において、ＩｇＧ２ヒンジは、免疫グロブリンＦｃドメインモノマーに直接結合しており、これは次にペプチド、タンパク質、核酸、脂肪酸、または小分子に直接結合している。他の実施形態において、ＩｇＧ２ヒンジに直接結合しているペプチド、タンパク質、核酸、脂肪酸、または小分子は、次に免疫グロブリンＦｃドメインモノマーに直接結合している。
【００２２】
「相同性」とは、所定の核酸またはアミノ酸配列の配列全体にわたる同一性を意味する。例えば、「８０％の相同性」は、所定の配列が、主張される配列と約８０％の同一性を供給し、挿入、欠失、置換、およびフレームシフトを含み得ることを意味する。当業者は、配列アラインメントを、挿入および欠失を考慮して実施して、配列の全長にわたる同一性を決定できることを理解する。
【００２３】
以下の段落は、本発明の融合タンパク質の構成単位を、構造的および機能的の両方において定義し、次に融合タンパク質それ自体を定義する。しかし、初めに、上記に示されているように、本発明のそれぞれの融合タンパク質は、少なくとも１つのＩｇＧ２ヒンジドメインを有することに最初に注目することが有益である。ＩｇＧ２ヒンジドメインは、別の融合タンパク質のＩｇＧ２ヒンジドメインと相互作用して、多量体を作り出す。したがって、融合タンパク質の、本明細書において考察されている大部分の機能性形態は、一般に、二量体（または多量体）形態で存在する。本明細書において考察されている融合タンパク質のモノマーは、少なくとも二次鎖と会合して、機能性ホモ二量体構造および多量体構造を形成しなければならない単鎖である。
ＩｇＧ２ヒンジ
【００２４】
当該技術において知られているように、ヒトＩｇＧ２は、ヒンジ領域を介して共有結合二量体を形成することができる（Ｙｏｏ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０，３１３４−３１３８（２００３）；Ｓａｌｆｅｌｄ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５，１３６９−１３７２（２００７））。ＩｇＧ２の二量体形成は、潜在的に、Ｃ−Ｃ結合によりＩｇＧ２ヒンジ構造を介して仲介され（Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ  ２００３）、ヒンジ構造が単独で二量体形成を仲介し得ることを示唆している。しかしヒト血清中に見出されるＩｇＧ２二量体の量は、限定されている。ホモ二量体の二量体として存在するＩｇＧ２の量はＩｇＧ２全体の１０％未満であることが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより推定され得る（Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。更に、ホモ二量体の二量体を超えたＩｇＧ２の多量体化ドメインの定量的な証拠が存在しない。（Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。すなわち、未変性ＩｇＧ２は、ヒト血清においてより高次の多量体を形成することが見出されていない。したがって、本明細書に提示されている結果は、未変性ＩｇＧ２と比べた多量体化の程度に関して驚くべきものであり、ＩｇＧ２ヒンジ含有融合タンパク質が高次多量体に存在し得る点において特に驚くべきものである。ヒトＩｇＧ２ヒンジモノマーのアミノ酸配列は、次のＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１）である。本発明者たちは、配列番号１の４つのシステインのうちの任意の１つの突然変異が、融合タンパク質の多量体化を大きく減少させることに関連し得ることを実証した。本明細書において「アミノ酸コア」と呼ばれる、ＩｇＧ２ヒンジモノマーの２つのＣ−Ｘ−Ｘ−Ｃ部分が存在する。したがって、本発明の融合タンパク質モノマーは、ＩｇＧ２ヒンジモノマーの全１２個のアミノ酸の配列、またはＦｃドメインモノマーを伴う４つのアミノ酸コアのいずれか、もしくは両方を含み得る。アミノ酸コア構造のＸ−Ｘは、任意のアミノ酸であり得るが、特に好ましい実施形態において、Ｘ−Ｘ配列は、Ｖ−ＥまたはＰ−Ｐである。当業者は、ＩｇＧ２ヒンジモノマーが、４つのコアアミノ酸構造に加えて、ＩｇＧ２ヒンジ配列の全てを含むヒンジ配列の任意の部分から構成され得ることを理解する。したがって、ＩｇＧ２ヒンジ配列は、配列番号１の１２個全てのアミノ酸を含み得る、またはＩｇＧ２ヒンジがタンパク質、ペプチド、核酸、脂肪酸、もしくは小分子を多量体化する能力を維持する限り、２つのＣ−Ｘ−Ｘ−Ｃモチーフを維持しながらアミノ酸の任意の組み合わせを含み得る。例えば、ＩｇＧ２ヒンジは、Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃを単独で、またはコア構造をフランキングするアミノ酸の任意の組み合わせと共に含み得る。理論に束縛されることなく、１つの融合タンパク質のＩｇＧ２ヒンジは、別の融合タンパク質のＩｇＧ２ヒンジと結合し、それによって、非多量体化タンパク質と比較して受容体への機能的結合のような増加した活性を保持しながら、ホモ二量体の二量体またはより高次の多量体を形成することができる。あるいは、ＩｇＧ２ヒンジのＣ−Ｘ−Ｘ−Ｃモチーフは、他のタンパク質ドメインのＣとＣ−Ｃ架橋を形成し、それによって、非多量体化タンパク質と比較して受容体への増加し���機能的結合を保持しながら、ホモ二量体の二量体またはより高次の多量体を形成することができる。理論に束縛されることなく、Ｃ−Ｃ架橋を介して形成された多量体は、安定しており、ジスルフィド結合分析によって共有結合を含んでいる。
ペプチド、タンパク質、核酸、脂肪酸、および小分子
本発明に有用なペプチド、タンパク質、核酸、脂肪酸、および小分子は、多量体化されたとき、改善または増加された活性を示すものである。活性が多量体化により改善されるタンパク質の例には、例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー（例えば、４−１ＢＢ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＴＲＡＩＬ、ＢＬｙＳ、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシン、リンホトキシンベータ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＷＥＡＫ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＥＤＡ、ＥＤＡ−Ａ１、ＥＤＡ−Ａ２、ＦＡＳリガンド、ＧＩＴＲリガンド、ＯＸ４０リガンド、およびＴＬ１Ａ）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮＡ１（インターフェロンα１）、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＧ（インターフェロンγ）、およびＩＦＮＫ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＴＸＬＮＡ、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ２５（ＩＬ１７Ｅ）、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、Ｌ３６ＲＮ、ＩＬ３６Ａ、ＩＬ３７、ＩＬ３６Ｂ、ＩＬ３６Ｇ、ＩＬ２、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２４、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９）、ケモカイン（例えば、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、エオタキシン、ＭＰＦ−１、ＣＸＣＬ−１７、ＣＸＣＬ−１０、ＣＸＣ３）、骨形態形成タンパク質、およびＴＧＦ−βファミリーメンバー（例えば、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８Ｂ、ＧＤＦ１０（ＢＭＰ３Ｂ）、ＧＤＦ１１（ＢＭＰ１１）、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＭＳＴＮ、ＧＤＦ９、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＮＯＤＡＬ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、およびＴＧＦＢ３）、任意のＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリー（例えば、ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）およびＰＤＧＦＡ）、他のサイトカイン（例えば、ＣＳＦ１、（ＭＣＳＦ）、ＦＡＭ３Ｂ、ＬＥＦＴＹ２）、可溶性受容体（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ａｒｒａｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ａｎａｌｙｔｅｓ  Ａｒｒａｙに列記されている１０９個の可溶性受容体のいずれか）、任意の表面抗原分類を含む細胞表面受容体、またはケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、およびＣＸＲ２）のようなＧタンパク質共有結合受容体、ＴＮＦスーパーファミリー受容体（例えば、ＣＤ１３７、ＢＡＦＦ  Ｒ、ＢＣＭＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤｃＲ３、ＤｃＴＲＡＩＬ、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、Ｆａｓ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、リホトキシンベータＲ、ＮＧＦ  Ｒ、オステオプロテゲリン、ＯＸ４０、ＲＡＮＫ、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫ  Ｒ）、任意の表面抗原分類を含む細胞表面受容体のリガンド（例えば、ＣＤ４、ＣＤ３０３、またはＣＤ３０４）、天然に生じるホルモン（例えば、α−ＭＳＨ、ＧＬＰ−１、インスリン、ヒト成長ホルモン、グルカゴン、インスリン様増殖因子−１、レプチン、エリスロポエチン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、バソプレシン、オキシトシン、副腎皮質刺激ホルモン、サイロトロピン放出ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、コルチコトロピン放出ホルモン、ソマトスタチン、メラトニンチロキシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ホスファトニン、オステオカルシン、コルチゾールのようなグルココルチコイド、アルドステロンのようなミネラルコルチコイド、テストステロンおよびＤＨＥＡのようなアンドロゲン、エストラジオールのようなエストロゲン、プロゲステロンのようなプロゲスチン、アミリン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、カルシトリオール、カルシフェロール、ガストリン、セクレチン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、コレシストキニン、インクレチン、線維芽細胞増殖因子１９、ニューロペプチドＹ、グレリン、ＰＹＹ３−３６、アンギオテンシノゲン、トロンボポエイチン、ヘプシジン、レチノール結合タンパク質４、およびアディポネクチン）、神経伝達物質（例えば、エピネフリン、ノルエピネフリン、セロトニン、アセチルコリン、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸、ＧＡＢＡ、一酸化窒素、ヒスタミン、ドーパミン、ＴＡＡＲ受容体に結合する微量アミン、ＧＡＢＡｂ受容体に結合するＧＨＢ、ヒポクレチン、ナイアシン、エンドカンナビノイド、例えばアナンダミン、２−ＡＧ、ノラジンエーテル、ＮＡＤＡ、およびＯＡＤ、ならびに内因性オピオイド、例えばエンケファリン、ベータ−エンドルフィン、ダイノルフィン、エンドモルフィン、ノシセプチン、オピオルフィン、およびモルヒネ）、増殖因子（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、および血小板由来増殖因子）、これらのいずれかのフラグメント、これらのいずれかの機能的類縁体、これらのいずれかのフラグメントの機能的類縁体、ならびにこれらの組み合わせが含まれる。活性が多量体化により改善されるペプチドの例には、例えば、ＣＴＬＡ４の外部ドメイン、ＩＬ１２／２３のｐ４０サブユニット、およびヒト副甲状腺ホルモンが含まれる。活性が多量体化により改善される小分子の例には、例えば、化学療法剤、細胞傷害性分子、色素、および蛍光物質が含まれる。化学療法剤の特定の例には、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン、パクリタキセル、ドシタキセル、エポチロン、エトピシド、テニポシド、タフルポシド、アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メルカプトプリン、メトトレキセート、チオグアニン、ブレオマイシン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、オールトランスレチノイン酸、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンが含まれる。細胞傷害性分子の特定の例には、メトトレキセート、シクロホスファミド、またはアザチオプリン、ミコフェノール酸、およびシクロスポリンＡが含まれる。
【００２５】
ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ１５２としても知られており、Ｔ細胞に発現し、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達する、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ２８と同様に、ＣＴＬＡ４は、Ｂ７．１およびＢ７．２（それぞれ、ＣＤ８０およびＣＤ８６）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に結合する。しかし、ＣＤ２８と異なり、ＣＴＬＡ−４は、同時刺激シグナルの代わりに阻害シグナルをＴ細胞に伝達し、ＣＤ２８よりも高い親和性で結合する。Ｂ７分子に対するＣＴＬＡ−４の増加した親和性は、ＣＴＬＡ−４が、ＣＤ２８からＢ７リガンドを隔離し、ＣＤ２８依存性同時刺激に拮抗することを可能にする。ＣＴＬＡ−４は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質側末端を含有する。本発明によると、ＣＴＬＡ−４分子の全体が融合タンパク質に含まれ得る、またはＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインだけが融合タンパク質に含まれ得る。
【００２６】
ＣＴＬＡ−４は、魅力的な薬学的標的である。ＣＴＬＡ−４がＣＤ２８よりも高い親和性でＢ７．１およびＢ７．２分子をＡＰＣに結合するので、自己免疫性疾患の潜在的な療法として徹底的に研究されてきた。ＣＴＬＡ−４と抗体の融合タンパク質（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、アバタセプト）は、関節リウマチの治療用に市販されている。加えて、第二世代のＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合剤であるベタセプトは、エプスタイン・バーウイルスへの感受性が増加した腎臓移植患者のために、近年ＦＤＡにより承認されている。
【００２７】
逆に、ＣＴＬＡ−４拮抗剤は、免疫系耐容の阻害剤として癌の治療に大きな望みも示す。ＣＴＬＡ−４に対して拮抗性のある抗体（イピルムマブ）が、この臨床適応症のために開発されている。
【００２８】
ＣＴＬＡ−４二量体化は、生物学的活性にとって必須であると思われる。ＣＴＬＡ−４は、Ｂ７．２結合の際に検出可能な立体構造変化を受けず（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）"Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−２  ｃｏｍｐｌｅｘ，"Ｎａｔｕｒｅ，４１０（６８２８）：６０４−８）、Ｂ７への連結の前に、非機能性共有結合ホモ二量体として存在する（Ｌｉｎｄｓｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）"Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−４（ＣＴＬＡ−４）"Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（２５）：１５４１７−１５４２４）。ＣＴＬＡ−４二量体化／多量体化は、分子間ジスルフィド結合、Ｎ結合グリコシル化、およびＢ７リガンド誘導性二量体化により階層的に調節されることが示されている。（Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ｅｔａｌ．（２００５）"Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＴＬＡ−４  ｄｉｍｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｌａｔｔｉｃｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，"Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７５：９９６−１００４）。したがって、本発明の多量体は、ＣＴＬＡ−４タンパク質およびペプチドの二量体およびより高次の多量体を作り出すことにより、ＣＴＬＡ−４の生物学的活性を増強するのに特に有用である。
【００２９】
プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーに属する免疫受容体である。ＰＤ−１は、２つのリガンドのＰＤＬ−１またはＰＤＬ−２のいずれかとの相互作用の際に、タンパク質チロシンホスファターゼのＳＨＰ−２を動員することにより、抗原受容体シグナル伝達を負に調節する。（Ｏｋａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｈｏｎｊｏ（２００７）"ＰＤ−１  ａｎｄ  ＰＤ−１  ｌｉｇａｎｄｓ：ｆｒｏｍ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，"Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９（７）：８１３−８２４）。
【００３０】
ＰＤ−１は、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、およびＩＣＯＳと相同性を共有するＩｇＶ型細胞外ドメインを含むＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＰＤ−１は、活性化されると末梢ＴおよびＢ細胞に発現する。ＰＤ−１リガンドのＰＤＬ−１およびＰＤＬ−２も、ＩｇＣおよびＩｇＶ型細胞外ドメインから構成されるＩ型膜貫通糖タンパク質であるが、ＰＤ−１と異なり、ＰＤＬ−１およびＰＤＬ−２は、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。（Ｏｋａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｈｏｎｊｏ）。
【００３１】
ＰＤ−１調節不全は、ループス、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、強直性脊椎炎、心筋梗塞、およびアレルギーのようなヒト自己免疫性疾患に関連し、一方、異常なＰＤＬ−１およびＰＤＬ−２は、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、Ｈ．ピロリ感染のような多くの感染性疾患に関連する。ＰＤ−１の拮抗剤は、癌および感染性疾患の治療に有用であり、一方、ＰＤ−１の作動薬は、自己免疫、アレルギー、および移植拒絶の治療に有用である。理論に束縛されることなく、ＰＤ−１の、本発明の多量体を含有する細胞外ドメインは、細胞内シグナルを送ることなくＰＤＬ−１リガンドを結合させることに有用であり、それによって、ＰＤＬ−１／ＰＤＬ−２シンクとして作用し、ＰＤ−１シグナル伝達を遮断する。したがって、本発明の多量体は、関連する細胞シグナル伝達を有することなくＰＤＬ−１／ＰＤＬ−２に結合する、ＰＤ−１タンパク質およびペプチドの二量体およびより高次の多量体を作り出すことによって、ＰＤ−１の生物学的活性を遮断するのに特に有用である。
【００３２】
ＩＬ−１２は、抗原刺激に応答して樹状細胞、マクロファージ、および特定のＢ細胞により産生されるサイトカインである。ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２の連続した存在下で最終的にＴｈ１細胞に発達するＴｈ０細胞へ非変性Ｔ細胞が分化することにおいて機能し、それは、ＩＬ−１２がインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の産生も刺激し、一方でＩＬ−４産生を減少させ、よってＴ細胞のＴｈ１細胞への分化をもたらすからである。
【００３３】
ＩＬ−２３は、細胞残骸を含む危険シグナルに応答して樹状細胞およびマクロファージにより産生されるサイトカインである。ＩＬ−２３は、メモリーＴ細胞をＴｈ１７表現型に向けることにおいて機能する。したがって、ＩＬ−１２は主に非変性Ｔ細胞に作用するが、ＩＬ−２３はほとんどがメモリーＴ細胞に作用する。
【００３４】
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、ＩＬ−１２ｐ３５（ＩＬ−１２α）と共通ｐ４０（ＩＬ−１２β）サブユニットのヘテロ二量体であり、一方、ＩＬ−２３は、ＩＬ−２３ｐ１９（ＩＬ−２３α）と共通ｐ４０（ＩＬ−１２β）サブユニットのヘテロ二量体である。両方のヘテロ二量体ＩＬ−１２およびＩＬ−２３は、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３受容体に対して作動的であり、次に、転写活性化因子ＳＴＡＴ４を活性化して、ＩＮＦαの産生を刺激する。その一方、共通ｐ４０サブユニットの天然に生じるホモ二量体は、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３受容体に対して拮抗的である。したがって、製薬会社がＩＬ−１２／２３受容体活性を減少させることを目的に抗体を開発してきたが、これらの抗体は、また、天然に拮抗的なｐ４０／ｐ４０ホモ二量体に結合し、循環から取り除き得る。本発明は、炎症促進性ＩＬ−１２／２３受容体シグナル伝達を減少させ、Ｔｈ１免疫応答を減衰させようという努力において、ｐ４０／ｐ４０ホモ二量体およびｐ４０／ｐ４０のより高次の多量体の存在を増加することを目的にし、このことは、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、および多発性硬化症のような特定の自己免疫性疾患を有する患者において特に有用である。
【００３５】
ＣＤ４７は、細胞表面膜貫通Ｉｇスーパーファミリーのメンバーであり、シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰα）の細胞外リガンドである。ＳＩＲＰαとＣＤ４７の相互作用は、炎症性刺激に応答した好中球遊出のような免疫細胞機能を調節する。（Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）"Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｃＤ４７  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  α，"Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７２：２２７８−２５８５）。
【００３６】
Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．は、ＣＤ４７においてエピトープを模倣し、ＳＩＲＰαに結合し、炎症部位への好中球遊走を阻害することができる、新規の機能性遮断ペプチドのＣＥＲＶＩＧＴＧＷＷＶＲＣ（配列番号１１）を同定した。これらのペプチドは、本明細書において「ＣＥＲＶＩＧペプチド」と呼ばれる。ＣＥＲＶＩＧペプチドとは、ＣＥＲＶＩＧ残基を含有し、ＳＩＲＰαに結合することができる任意のペプチドを意味する。配列番号１１は、ＣＥＲＶＩＧペプチドの一例である。したがって、ＣＥＲＶＩＧペプチドと、ＩｇＧ２ヒンジドメインと、場合によりＦｃドメインとを含む本発明の多量体は、ＣＥＲＶＩＧペプチドの二量体およびより高次の多量体を作り出すことによって、ＣＤ４７の生物学的活性を遮断するのに特に有用である。
【００３７】
モノクローナル抗体を含む抗体を、本発明により多量体化することもできる。モノクローナル抗体の例には、３Ｆ８、８Ｈ９、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ  ペゴール、ＡＬＤ５１８、アレムツズマブ、アルツモマブペンテタート、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトキス、アンルキンズマブ（ＩＭＡ−６３８）、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アチヌマブ、アトリズマブ（トシリズマブ）、アトロリムマブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ビシロマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カンツズマブラブタンシン、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カツマキソマブ、ＣＣ４９、セデリズマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、Ｃｈ．１４．１８、シタツズマブボガトキス、シキスツムマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、クレネズマブ、ＣＲ６２６１、ドアセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デノスマブ、デツモマブ、ドルリモマブアリトキス、ドロジツマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エナバツズマブ、エンリモマブペゴール、エノキズマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エキスビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、ＦＢＴＡ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、ホントリズマブ、ホラルマブ、ホラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレンバツムマブベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、ＧＳ６６２４、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、イムシロマブ、インダツキシマブラブタンシン、インフリキシマブ、インテツムマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ、リビビルマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マスリモマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマパスドトキス、ムロモナブ−ＣＤ３、ナコロマブタフェナトキス、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトキス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネレリモマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オクレリズマブ、オズリモ���ブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブモナトキス、オレゴボマブ、オテリキシズマブ、オキセルマブ、オゾラリズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ、パスコリズマブ、パテクリズマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピンツモマブ、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ１４０、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレズマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブペンデチド、セクキヌマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソラネズマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブパプトキス、テフィバズマブ、テリモマブアリトキス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（トレメリムマブ）、チガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トシリズマブ（＝アトリズマブ）、トラリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ、バテリズンバ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビシリズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ジラリムマブ、ゾリモマブアリトキスが含まれる。
【００３８】
多量体化される抗体は、例えばブリナツモマブのような二重特異性抗体であり得る。ブリナツモマブは、構造ｓｃＦｖ−ＳｃＦｖを有し、ここで、一方のＦｖは抗ＤＣ１９であり、他方のＦｖは抗ＣＤ３Ａである。ＩｇＧ２ヒンジの付加は、癌細胞における低発現腫瘍特異的抗原のような低発現抗原を標的にするのに有用な特徴である、両方のエピトープへの多価結合を有する抗体の多量体形態をもたらす。加えて、２つ以上のエピトープへの多価結合を有する多特異的抗体は、複数の抗体を発現するように設計されたタンパク質構築物に、ＩｇＧ２ヒンジを付加することよって作り出すことができる。
【００３９】
抗体の抗原結合ドメインは、軽鎖の可変部（ＶＬ）に結合した重鎖の可変部（ＶＨ）を使用し、抗原結合部位を形成することによって作製され得る。（Ｈｏｌｔ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）"Ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，"Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｌｏｇｙ，２１（１１）：４８４−４９０）。可変軽鎖は、多くの可能なリンカー領域の１つを使用して可変重鎖に結合され得、ＶＨまたはＶＬのＣＨ１領域も含有し得る。ＶＨもしくはＶＬ、または両方を同時に、多量体化するＩｇＧ２ヒンジドメインに結合することができ、場合によりＦｃに結合することができる。あるいは、ＶＨまたはＶＬは、同じ細胞において同時発現され得、キメラタンパク質として融合され得ない。あるいは、ＶＨまたはＶＬは、同じ細胞において同時発現され得、それぞれ個別に、多量体化するＩｇＧ２ヒンジドメインにキメラタンパク質として融合され得る。本明細書において「ドメイン抗体」と呼ばれるこれらの抗原結合ドメインの多量体化は、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−８、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７のようなサイトカイン、および他の炎症促進仲介物質への可溶性受容体として有用である。
【００４０】
多量体化ドメイン抗体は、ホルモン受容体が限定されることなく含まれる細胞表面受容体の強力な作動薬としても有用である。ドメイン抗体は、例えば低発現腫瘍受容体のような細胞表面受容体の強力な拮抗剤としても有用であり得る。ドメイン抗体は、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、または抗体の抗原結合ドメインが使用される他の任意のアッセイのような方法に有用な診断試薬としても有用である。ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体のＶＨドメインのＮ末端にＶＬドメインおよびリンカーを配置することにより生成された単鎖抗体（ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）（Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）"Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ−Ｆｃ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ，"Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４（１２）：１０２５−１０３３）を、多量体化するＩｇＧ２ヒンジに結合して、多量体化単鎖抗体を形成することもでき、例えば、下記である。
ａ．ＩｇＧ２ヒンジ−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＩｇＧ１  ＣＨ１−ＩｇＧ１ヒンジ−ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＩｇＧ１  ＣＨ３
ｂ．ＩｇＧ２ヒンジ−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＩｇＧ１  ＣＨ１−ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＩｇＧ１  ＣＨ３
ｃ．ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ１  ＣＨ１−ＩｇＧ１ヒンジ−ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＩｇＧ１  ＣＨ３
ｄ．ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ１  ＣＨ１−ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＩｇＧ１  ＣＨ３
ｅ．ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ１ヒンジ−ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＩｇＧ１  ＣＨ３
ｆ．ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＩｇＧ１  ＣＨ３
ｇ．ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＩｇＧ１  ＣＨ１−ＩｇＧ１ヒンジ−ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＩｇＧ１  ＣＨ３−ＩｇＧ２ヒンジ
ｈ．ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＩｇＧ１  ＣＨ１−ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＩｇＧ１  ＣＨ３−ＩｇＧ２ヒンジ
【００４１】
上記に考察されたドメイン抗体に加えて、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、二特異性抗体、三特異性抗体、ミニボディ、および単一ドメイン抗体のような一価抗体フラグメントを含む他の小型の組み換えモノクローナル抗体フラグメントおよび変種も、本発明のＩｇＧ２ヒンジを使用して多量体化され得る。ドメイン抗体と同様に、これらのフラグメントは、全てのモノクローナル抗体の標的特異性を保持するが、より経済的に産生され得、一連の診断および治療用途において独自の優れた特性を有することができる。これらのモノクローナル抗体フラグメントまたは変種は、Ｆｃドメインを有する、または有さないＩｇＧ２ヒンジに直接結合され得る。
【００４２】
加えて、Ｗｕｒｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，（２００８）"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ  ｔｏ  ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｓｔａｔｕｓ  ｏｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，"Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３（９）：１１２６−１１３６により概説されている抗体誘導性で非Ｉｇ結合の足場も、本発明の方法により多量体化され得る。
【００４３】
ナノボディと呼ばれ、軽鎖を欠き、ラクダおよびラマから作製されるもの似ている完全に機能的な抗体（Ｄｅｆｆｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ａｆｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８（１２）：２６４５−２６５２）も、本発明のＩｇＧ２ヒンジにより多量体化され得る。これらの重鎖抗体は、単一可変ドメイン（ＶＨＨ）と２つの定常ドメイン（ｃＣＨ２およびｃＣＨ３）を含有し、ここでクローン化および単離されたＶＨＨドメインは、元の重鎖抗体の全ての抗原結合能を有する安定したポリペプチドである。ｃＣＨ１または軽鎖はない。この重鎖抗体を、多量体化するＩｇＧ２ヒンジドメインに結合して、以下のような多量体化する単鎖抗体を形成することができる。
ａ．ｈＩｇＧ２ヒンジ−ＶＨＨ−ｃヒンジ−ｃＣＨ２−ｃＣＨ３
ｂ．ｈＩｇＧ２ヒンジ−ＶＨＨ−ｃＣＨ２−ｃＣＨ３
ｃ．ＶＨＨ−ｈＩｇＧ２ヒンジ−ｃヒンジ−ｃＣＨ２−ｃＣＨ３
ｄ．ＶＨＨ−ｈＩｇＧ２ヒンジ−ｃＣＨ２−ｃＣＨ３
ｅ．ＶＨＨ−ｃヒンジ−ｃＣＨ２−ｃＣＨ３−ｈＩｇＧ２ヒンジ
ｆ．ＶＨＨ−ｃＣＨ２−ｃＣＨ３−ｈＩｇＧ２ヒンジ
【００４４】
抗原提示細胞の表面に発現された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子は、抗原に結合し、抗原をＴ細胞に提示する。ＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ分子は、ＭＨＣクラスＩＩ分子も多量体化され得るが、四量体アッセイにおける使用のために多量体化される。特定の実施形態において、四量体アッセイは、抗原特異的Ｔ細胞の存在を検出するために使用される。Ｔ細胞は、それが特異的であるペプチドを検出するために、ペプチドとＭＨＣ複合体の両方を、Ｔ細胞が接触する細胞の表面において認識しなければならない。ペプチドと複合体形成したＭＨＣへのＴ細胞受容体の結合親和性が極めて低いので、このことは歴史的に困難な課題であった。初期の解決方法は、結合の結合活性を増加する同一のペプチド抗原をそれぞれ提示するＭＨＣ分子の四量体を作り出すことによって実現した。ＭＨＣ抗原複合体をＩｇＧ２ヒンジにより多量体化することは、結合親和性および結合活性を更に増加する。これらの化合物は、検出に使用するために、例えば色素または蛍光物質により標識され得る。ビオチン−ストレプトアビジンＭＨＣ四量体を含む類似の化合物を使用することもできる。
【００４５】
糖鎖生物学における多価炭水化物誘導体の重要な役割も十分に記載されている。（Ｒ．Ｒｏｙ，Ｔｏｐｉｃｓ  Ｃｕｒｒ  Ｃｈｅｍ  １９９７，１８７；２４１−２７４；Ｍ．Ｍａｍｍｅｎ，Ｓ．Ｋ．Ｃｈｏｉ，Ｇ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ  １９９８，１１０；２９０８−２９５３）。
【００４６】
直鎖または分岐鎖オリゴヌクレオチド多量体は、生化学アッセイにおいて増幅因子として有用である（米国特許第５，１２４，２４６号）。
【００４７】
より高級な脂肪酸は、カルボニル基の負に分極された酸素原子およびカルボキシル基の正に分極された水素原子が存在する結果として、水素結合により会合多量体を形成することができる（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｌａｙｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｔｅｒｅｓａ  Ｋｏｗａｌｓｋａ  ａｎｄ  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓｈｅｒｍａ）。特定の脂肪酸の多量体は、単独で、またはタンパク質との組み合わせにより治療上有用であり得る。高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）の危険性の減少に肯定的に関連する。ＨＤＬは、粒子１つあたり４つのアポリポタンパク質から構成される。ＨＤＬは、それ自体異種性である。ＨＤＬは、アポＡ−ＩおよびアポＡ−ＩＩから、またはアポＡ−Ｉ単独で構成される。ＨＤＬ２は、通常、アポＡ−Ｉのみから構成され、一方、ＨＤＬ３は、アポＡ−ＩとアポＡ−ＩＩの組み合わせを含有する。ＨＤＬ２より密度が低いＨＤＬ粒子は、アポＥが豊富である。ＩｇＧ２ヒンジと、脂肪酸もしくは脂肪酸の組み合わせ、または１つ以上のアポリポタンパク質のいずれかとの融合タンパク質は、脂肪酸またはアポリポタンパク質（複数可）の多量体を作り出す。これらの多量体は、例えば、コレステロール輸送の逆転、アテローム性動脈硬化症の改善、原発性もしくは続発性の心筋もしくは能卒中の危険性の減少、またはアルツハイマー病およびパーキンソン病を含む、脳のような脂質が豊富な臓器の疾患の治療に治療上有用であり得る。
【００４８】
改善された血液凝固は、例えば、外科的状況において時々必要である。フォン・ヴィルブランド因子は、血液凝固に重要なタンパク質である（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４，１３３０−１３３４）。内皮細胞はヴィルブランド因子を非常に大型の多量体として分泌し、次にこれらは、ＡＤＡＭＴＳ１３のような利用可能なメタロプロテアーゼにより小型の多量体に素早く切断される（Ｎａｔ．Ｍｅｄ  １５（７）；７３８）。フォン・ヴィルブランド因子の小型の多量体は、血餅の促進に関して大型の多量体よりも悪質である。ＩｇＧ２ヒンジとフォン・ヴィルブランド因子の融合タンパク質は、多量体のサイズを増加し、機能性を増加する。
Ｆｃドメイン
【００４９】
本明細書に使用されるとき、「Ｆｃドメイン」または「免疫グロブリンＦｃドメイン」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に結合し得る、または結合され得る最小領域（大型ポリペプチドの文脈において）または最小タンパク質折り畳み構造（単離タンパク質の文脈において）を記載する。ＦｃフラグメントとＦｃ部分フラグメントの両方において、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への分子の結合を可能にする最小結合領域である。Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に結合されている別個のポリペプチドに限定され得るが、ＦｃドメインがＦｃフラグメントの一部または全部、ならびにＦｃ部分フラグメントの一部または全部であり得ることも明らかである。用語「Ｆｃドメイン」が本発明に使用されるとき、１つを超えるＦｃドメインを意味することが当業者に認識される。Ｆｃドメインは、２つのＦｃドメインモノマーから構成される。本明細書において更に定義されるように、２つのそのようなＦｃドメインモノマーが会合してホモ二量体を形成するとき、得られるＦｃドメインはＦｃ受容体結合活性を有する。したがって、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に結合することができるホモ二量体構造である。
【００５０】
本発明の融合タンパク質の特定のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメイン、ならびにＦｃドメインを含むヒンジ領域は、これらが誘導される、免疫グロブリンサブクラス、ならびに生物体の両方に関して、独立して選択され得る。したがって、本明細書に開示されている融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ、マウスＩｇＧ２ａ、またはイヌＩｇＡもしくはＩｇＢのような多様な免疫グロブリン型から独立して生じる、Ｆｃドメインモノマーおよび部分Ｆｃドメインモノマーを含み得る。同様に、それぞれのＦｃドメインモノマーおよび部分Ｆｃドメインモノマーは、多様な種、好ましくは、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒ、およびチンパンジー）、ヒト、ネズミ、クマネズミ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ウサギ、ヤギ、シカ、ヒツジ、フェレット、アレチネズミ、モルモット、ハムスター、コウモリを含む哺乳類の種、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、およびアヒル）、魚類、ならびに爬虫類から誘導されて、種特異的またはキメラ融合タンパク質を産生し得る。
【００５１】
個別のＦｃドメインモノマーおよび部分Ｆｃドメインモノマーも、ヒト化され得る。当業者は、異なるＦｃドメインおよび部分Ｆｃドメインが異なる種類の機能性を提供することを理解する。例えば、ＦｃγＲは、ＩｇＧ免疫グロブリンに特異的に結合し、他の部類の免疫グロブリンには十分に結合しない。
【００５２】
「ＦｃγＲに特異的に結合することができる」とは、本明細書で使用されるとき、ＦｃγＲに結合することを意味する。特定的結合は、一般に、結合アッセイにおいて、後に続く過剰量の非標識リガンドにより置き換えられる標識リガンドの量と定義される。しかしこれは、当該技術において十分に確立されている、特異的結合を評価するための他の方法（例えば、Ｍｅｎｄｅｌ  ＣＭ，Ｍｅｎｄｅｌ  ＤＢ，'Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ'ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｔｈｅ  ｐｒｏｂｌｅｍ  ａｎｄ  ａ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９８５  Ｍａｙ  １５；２２８（ｌ）：２６９−７２）を除外しない。特異的結合は、融合タンパク質の会合と解離の両方の定数を特徴決定する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）により市販されている）またはバイオレイヤー干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）により市販されている）のような、当該技術において良く知られている多様な方法によって測定され得る（Ａｓｉａｎ  Ｋ，Ｌａｋｏｗｉｃｚ  ＪＲ，Ｇｅｄｄｅｓ  Ｃ．Ｐｌａｓｍｏｎ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ：ｎｅｗ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，  ｖｉｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００５，９：５３８−５４４）。本発明の融合タンパク質は、Ｆｃドメインモノマーを含むように設計されるが、融合タンパク質に含まれるＦｃドメインモノマーは、Ｆｃガンマ受容体への不十分な結合のために選択される。「Ｆｃガンマ受容体への不十分な結合」とは、Ｆｃドメインが、高い親和性で結合するＦｃガンマ受容体よりも相対的に弱い親和性で結合することを意味する。例えば、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、天然にはＦｃガンマ受容体に不十分に結合し、したがって、これらのアイソタイプは本発明において特に有用である。
【００５３】
あるいは、通常の状況下ではＦｃガンマ受容体に高い親和性で結合するＩｇＧ１のようなアイソタイプを、突然変異させるか、そうでなければ修飾して、Ｆｃ結合親和性を減少させることができる。これらの突然変異および修飾は、下記により詳細に記載される。理論に束縛されることなく、Ｆｃガンマ受容体に十分に結合しないＦｃドメインを含有する融合タンパク質は、Ｆｃドメインを含有しない融合タンパク質と比べて、血清半減期の増加およびより効率的な製造精製を含む有用な薬剤特徴を保持すると考えられる。したがって、一次配列がＩｇＧ２ヒンジから構成される融合タンパク質は、Ｆｃガンマ受容体への結合に関係なく、重要な臨床および非臨床有用性を有する多量体を作り出す。
【００５４】
本発明は、Ｆｃドメインと、Ｆｃドメインの天然に生じるアミノ酸配列と異なるアミノ酸を有するＦｃ部分ドメインとを含む融合タンパク質も包含する。本発明の融合タンパク質に含めるのに好ましいＦｃドメインは、ホロ−Ｆｃγ受容体またはＦｃγＲの可溶性細胞外ドメイン部分のいずれかに不十分な特異的結合親和性を有する。多数のＦｃドメインおよびＦｃドメインモノマーの第一級アミノ酸配列およびＸ線結晶学構造が、当該技術において利用可能である。例えば、Ｗｏｏｆ  ＪＭ，  Ｂｕｒｔｏｎ  ＤＲ．Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４  Ｆｅｂ；４（２）：８９−９９を参照すること。Ｆｃγ受容体結合能を有する代表的なＦｃドメインには、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインが含まれる。これらの非変性配列は、機能的配列の部位特異的突然変異誘発マッピングを含む広範囲な構造機能分析を受けてきた。これらの以前の構造機能研究および利用可能な結晶学データに基づいて、当業者は、ＦｃドメインのＦｃγＲ受容体結合能を減少しているが、より効率的に精製された融合タンパク質を作り出すこと、またはＦｃドメインもしくは部分ドメインを欠いている同じタンパク質より長い半減期を有する融合タンパク質を作り出すことのような、機能的な有用性を保持する機能的Ｆｃドメイン配列変種を設計することができる。
【００５５】
アミノ酸変化は、Ｆｃドメインの配列全体にわたって見出され得る、またはＦｃドメインを含む特定のＦｃ部分ドメインに隔離され得る。本発明の融合タンパク質に使用されるＦｃドメインの機能性変種は、非変性Ｆｃドメインと少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。同様に、本発明の融合タンパク質に使用されるＦｃ部分ドメインの機能性変種は、非変性Ｆｃ部分ドメインと少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【００５６】
当業者は、本発明がＦｃフラグメントモノマー、Ｆｃ部分フラグメントモノマー、および本発明の融合タンパク質の構築におけるＦｃドメインモノマーの機能性変種の使用を更に包含することを理解する。Ｆｃドメインモノマーの機能性変種は、非変性Ｆｃドメインモノマー配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【００５７】
アミノ酸変化は、Ｆｃγ受容体への融合タンパク質の結合親和性を減少する、または完全に防止する。好ましくは、そのようなアミノ酸変化は保存的アミノ酸置換であるが、そのような変化は、欠失、付加、および他の置換を含む。保存的アミノ酸置換は、典型的には、以下の群内における変化を含む：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン、およびトレオニン；リシン、ヒスチジン、およびアルギニン、ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。加えて、アミノ酸変化は、多量体化の頻度、程度、率、または強度を、例えばシステイン残基の付加により増強することができる。
【００５８】
アミノ酸変化は、Ｆｃドメイン多型をもたらす天然に生じるアミノ酸変化であり得る、またはアミノ酸変化は、例えば部位特異的突然変異誘発により導入され得る。アミノ酸変化は、Ｆｃドメインが所望の生物学的活性を保持する限り、Ｆｃドメイン内のあらゆる場所において生じ得る。好ましい実施形態において、多型または突然変異は、受容体結合の減少をもたらす。多型／突然変異は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＥＵ指標によると、好ましくはアミノ酸位置２３３、２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２６５、２６９、２７０、２９２、２９３、２９５、２９６、２９７、３０３、３２７、３２９、３３８、３７６、および／または４１４の１つ以上に生じる。これらのアミノ酸位置における特定の多型／突然変異は、当該技術において良く知られており、例えば、Ｓｈｅｉｌｄｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６６０４において見出され得る。
【００５９】
好ましい実施形態において、多型／突然変異は、ＩｇＧ１  Ｆｃの２３３、２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２６５、２６９、２７０、２９２、２９３、２９５、２９６、２９７、３０３、３２７、３２９、３３８、３７６、および／または４１４位に１つ以上のアミノ酸置換を含有する。更なる実施形態において、多型／突然変異は、ＩｇＧ１  Ｆｃの２３３、２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２６５、２６９、２７０、２９２、２９３、２９５、２９６、２９７、３０３、３２７、３２９、３３８、３７６、および／または４１４位に２つ以上のアミノ酸置換を含有する。更なる実施形態において、多型／突然変異は、ＩｇＧ１  Ｆｃの２３３、２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２６５、２６９、２７０、２９２、２９３、２９５、２９６、２９７、３０３、３２７、３２９、３３８、３７６、および／または４１４位に３つ以上のアミノ酸置換を含有する。更なる実施形態において、多型／突然変異は、ＩｇＧ１  Ｆｃの２３３、２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２６５、２６９、２７０、２９２、２９３、２９５、２９６、２９７、３０３、３２７、３２９、３３８、３７６、および／または４１４位に３つを超えるアミノ酸置換を含有する。
【００６０】
用語「機能性変種」は、本明細書で使用されるとき、基準配列（ポリペプチドである場合）と同じ生物学的効果を仲介することができる、または基準配列（ポリヌクレオチドである場合）によりコードされるポリペプチドと同じ生物学的効果を仲介することができるポリペプチドをコードする、基準配列への相同性により関連する配列を意味する。機能性配列変種には、ポリヌクレオチドとポリペプチドの両方が含まれる。配列同一性は、一般に、規定値パラメーターのＦｉｌｔｅｒ−Ｏｎ、Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ−ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ−３、Ｅ  ｖａｌｕｅ−１０、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ−１１，１、およびＡｌｉｇｎｍｅｎｔｓ−５０により動作するＢＬＡＳＴ２．０（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）の使用により評価される。
【００６１】
非変性Ｆｃドメインのアミノ酸配列組成に加えて、Ｆｃドメインの炭水化物含有量が、Ｆｃドメイン構造およびＦｃγＲとの結合相互作用において重要な役割を果たすことが知られている。例えば、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌ．Ｓｈｉｅｌｄｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｃｋ  ｏｆ  Ｆｕｃｏｓｅ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧｌ  Ｎ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  ＦｃγＲＩＩＩ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ＪｕＩ  ２００２；２７７：２６７３３−２６７４；Ａｎｎ  Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｉｅ  Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｃ２−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｎ  Ｉｇ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｍｏｕｓｅ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ａｐｒ１９９８；１６０：３３９３−３４０２を参照すること。炭水化物含有量は、例えば、特定の細胞株を含む特定のタンパク質発現系、またはインビトロ酵素修飾の使用により制御され得る。したがって、本発明は、ドメインが得られるホロ抗体の非変性炭水化物含有量を有するＦｃドメインを含む融合タンパク質、ならびに変更された炭水化物含有量を有する融合タンパク質を含む。別の実施形態において、融合タンパク質の多量体構成要素は、同じ融合タンパク質のホモ二量体構成要素と比較して異なるグリコシル化パターンにより特徴決定される。好ましい実施形態において、融合タンパク質には、Ｆｃ受容体結合を減少させるグルコシル化パターンを含むホモ二量体および多量体が豊富である。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、超フコシル化、脱マンノシル化、または半グリコシル化されており、したがって、Ｆｃ受容体への結合の減少をもたらす（Ｙａｍｍｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｔｏ  （２００９）"Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ，"ｍＡｂｓ，１：３，２３０−２３６）。
【００６２】
本発明は、Ｗｏｚｎｉａｋ−Ｋｎｏｐｐ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）"Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｌｏｏｐｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｄｏｍａｉｎｓ：Ｆｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓに記載されているように、Ｆｃドメインの構造ループに抗原結合部位を含むＦｃドメインを含む融合タンパク質も包含する。これらの構築物において、抗原結合部位は、ループ領域、特にループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦを含むＦｃ  ＣＨ３ドメインのＣ末端の先端部に位置するループ領域に導入される。これらの操作されたＦｃは操作された抗原結合部位を介して抗原に結合することができるだけでなく、Ｆｃγ受容体、補体、およびＦｃＲｎへの結合を介して作動体機能を発揮する能力を保持することもできる。これらの操作されたＦｃは、任意の抗原に結合する抗原結合ドメインを含むことができる。例えば、Ｆｃは、上記に考察されたモノクローナル抗体と同じ抗原に結合する抗原結合部位を含むように操作され得る。一実施形態において、Ｆｃは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ部位を発現するように操作される。更なる実施形態において、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ部位を発現するように操作されたＦｃ（配列番号１８）をＩｇＧ２ヒンジに融合して、操作されたＦｃの多量体化を仲介させる。ＩｇＧ２ヒンジを、操作されたＦｃ（配列番号１９）のＣ末端、または操作されたＦｃ（配列番号２０）のＮ末端に融合することができる。加えて、融合タンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジと操作されたＦＣ（ＩｇＧ２ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−操作Ｆｃ）（配列番号２１）との間にＦｃ  ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むことができる。これらの多量体化化合物は、抗原、例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕと、化合物の腫瘍死滅効力を増加させるＦｃγＲＩＩＩａの両方に高い結合活性を有する。
融合タンパク質
【００６３】
本明細書で使用されるとき、用語「融合タンパク質」は、少なくとも配列番号１のＩｇＧ２ヒンジと、活性が多量体化により増加するペプチド、タンパク質、核酸、脂肪酸、または小分子とを含有する任意の単一隣接ペプチド分子を意味する。本発明の融合タンパク質は、減少した親和性で、または親和性が全くなくＦｃ受容体に結合する免疫グロブリンＦｃドメインモノマーを含むこともできる。更に、本発明の融合タンパク質は、少なくとも第２融合タンパク質と会合すると、活性が多量体化により増加する少なくとも２つのペプチド、タンパク質、核酸、脂肪酸、または小分子を含む二量体または多量体構造を形成する。
【００６４】
融合タンパク質の領域、ＩｇＧ２ヒンジ、多量体化されるペプチド、タンパク質、核酸、脂肪酸、または小分子、および免疫グロブリンＦｃドメインモノマーは、融合タンパク質の連続した領域のアミノ末端からカルボキシ末端まで配列され得る。領域は、互いに直接結合され得る、またはアミノ酸リンカー残基の小領域を使用して結合され得る。本発明の融合タンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジのカルボキシ末端に結合したペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸末端、またはペプチド、タンパク質のカルボキシ末端に結合したＩｇＧ２ヒンジのアミノ末端を含む。小分子、核酸、および脂肪酸に関しては、融合タンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジのカルボキシ末端に結合した小分子、核酸、または脂肪酸を含み得る。逆に、融合タンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジのアミノ末端に結合した小分子、核酸、または脂肪酸を含み得る。例えば、本発明の融合タンパク質は、下記を含み得る。
タンパク質／ペプチド／小分子／核酸／脂肪酸−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２ヒンジ−タンパク質／ペプチド／小分子／核酸／脂肪
本発明の融合タンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジに結合した小分子または脂肪酸も含む。例えば、小分子、脂肪酸、または核酸は、下記であり得る。
小分子／核酸／脂肪酸−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２ヒンジ−小分子／核酸／脂肪酸
あるいは、小分子、核酸、または脂肪酸は、リンカーを介してＩｇＧ２ヒンジに結合し得る、または糖結合を介してＩｇＧ２ヒンジに結合し得る。
【００６５】
一実施形態において、ペプチド／タンパク質／小分子／核酸／脂肪酸は、ＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットである。別の実施形態において、ペプチド／タンパク質／小分子／核酸／脂肪酸は、ＣＴＬＡ４タンパク質またはＣＴＬＡ-４細胞外ドメインペプチドである。更なる実施形態において、ペプチド／タンパク質／小分子／核酸／脂肪酸は、ＰＤ−１タンパク質またはＰＤ−１細胞外ドメインペプチドである。更なる実施形態において、ペプチド／タンパク質／小分子／核酸／脂肪酸は、ＣＥＲＶＩＧペプチドである。更なる実施形態において、例示的な融合タンパク質は、ＣＴＬＡ４タンパク質またはＣＴＬＡ４細胞外ドメインペプチドを含有し、Ｂ７分子も含有する。そのような分子の例には、下記が含まれる。
ＣＴＬＡ４−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２ヒンジ−ＣＴＬＡ４
Ｂ７−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２ヒンジ−Ｂ７
ＩｇＧ２ヒンジ−ＣＴＬＡ４−Ｂ７
Ｂ７−ＣＴＬＡ４−ＩｇＧ２ヒンジ
ＣＴＬＡ４−Ｂ７−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２ヒンジ−Ｂ７−ＣＴＬＡ４
ＩｇＧ２ヒンジ−ＣＴＬＡ４−Ｂ７
【００６６】
一実施形態において、Ｂ７はＢ７．１である。別の実施形態において、Ｂ７はＢ７．２である。
【００６７】
本発明の追加の融合タンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジのカルボキシ末端に結合したペプチド、タンパク質、小分子、核酸、または脂肪酸のアミノ末端を含み、次にこれはＩｇＧ２ヒンジのアミノ末端を介して、免疫グロブリンＦｃドメインモノマーのカルボキシ末端に結合しており、例えば、Ｆｃ−ＩｇＧ２ヒンジ−ペプチド  タンパク質  小分子／核酸／脂肪酸である。
【００６８】
本発明の融合タンパク質は、下記も含み得る。
タンパク質／ペプチド／小分子／核酸／脂肪酸−ＩｇＧ２ヒンジ−Ｆｃ
Ｆｃ−タンパク質／ペプチド／小分子／核酸／脂肪酸−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２ヒンジ−Ｆｃ−ペプチド／タンパク質／小分子／核酸／脂肪酸
タンパク質／ペプチド／小分子／核酸／脂肪酸−Ｆｃ−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２ヒンジ−ペプチド／タンパク質／小分子／核酸／脂肪酸−Ｆｃ
【００６９】
一実施形態において、ペプチド／タンパク質／小分子／核酸／脂肪酸は、ＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットである。別の実施形態において、ペプチド／タンパク質／小分子／核酸／脂肪酸は、ＣＴＬＡ４タンパク質またはＣＴＬＡ４細胞外ドメインペプチドである。更なる実施形態において、ペプチド／タンパク質／小分子／核酸／脂肪酸は、ＰＤ−１タンパク質またはＰＤ−１細胞外ドメインペプチドである。更なる実施形態において、ペプチド／タンパク質／小分子／核酸／脂肪酸は、配列番号１１のＣＥＲＶＩＧペプチドである。更なる実施形態において、例示的な融合タンパク質は、ＣＴＬＡ４タンパク質またはペプチドを含有し、Ｂ７分子も含有する。Ｂ７分子を含有する融合タンパク質の例には、下記が含まれる。
ＣＴＬＡ４−ＩｇＧ２ヒンジ−Ｆｃ
ＣＴＬＡ４−Ｆｃ−ＩｇＧ２ヒンジ
Ｆｃ−ＣＴＬＡ４−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２ヒンジ−ＣＴＬＡ４−Ｆｃ
Ｆｃ−ＩｇＧ２ヒンジ−ＣＴＬＡ４
ＩｇＧ２ヒンジ−Ｆｃ−ＣＴＬＡ４
Ｂ７−ＩｇＧ２ヒンジ−Ｆｃ
Ｂ７−Ｆｃ−ＩｇＧ２ヒンジ
Ｆｃ−Ｂ７−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２ヒンジ−Ｂ７−Ｆｃ
Ｆｃ−ＩｇＧ２ヒンジ−Ｂ７
ＩｇＧ２ヒンジ−Ｆｃ−Ｂ７
Ｂ７−ＣＴＬＡ４−ＩｇＧ２ヒンジ−Ｆｃ
Ｆｃ−Ｂ７−ＣＴＬＡ４−ＩｇＧ２ヒンジ
Ｂ７−ＣＴＬＡ４−Ｆｃ−ＩｇＧ２ヒンジ
ＣＴＬＡ４−Ｂ７−ＩｇＧ２ヒンジ−Ｆｃ
Ｆｃ−ＣＴＬＡ４−Ｂ７−ＩｇＧ２ヒンジ
ＣＴＬＡ４−Ｂ７−Ｆｃ−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２ヒンジ−Ｂ７−ＣＴＬＡ４−Ｆｃ
Ｆｃ−ＩｇＧ２ヒンジ−Ｂ７−ＣＴＬＡ４
ＩｇＧ２ヒンジ−Ｆｃ−Ｂ７−ＣＴＬＡ４
ＩｇＧ２ヒンジ−ＣＴＬＡ４−Ｂ７−Ｆｃ
Ｆｃ−ＩｇＧ２ヒンジ−ＣＴＬＡ４−Ｂ７
ＩｇＧ２ヒンジ−Ｆｃ−ＣＴＬＡ４−Ｂ７
【００７０】
一実施形態において、Ｂ７はＢ７．１である。別の実施形態において、Ｂ７はＢ７．２である。
【００７１】
別の実施形態において、ペプチド／タンパク質／小分子／核酸／脂肪酸は、ＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットである。
ＩｇＧ２ヒンジ−ＩＬ−１２  ｐ４０
ＩＬ−１２  ｐ４０−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２ヒンジ−Ｆｃドメイン−ＩＬ−１２  ｐ４０
ＩｇＧ２ヒンジ−ＩＬ−１２  ｐ４０−Ｆｃドメイン
Ｆｃドメイン−ＩＬ−１２  ｐ４０−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩＬ−１２  ｐ４０−Ｆｃドメイン−ＩｇＧ２ヒンジ
Ｆｃドメイン−ＩｇＧ２ヒンジ−ＩＬ−１２  ｐ４０
ＩＬ−１２  ｐ４０−ＩｇＧ２ヒンジ−Ｆｃドメイン
【００７２】
更なる実施形態において、ペプチド／タンパク質／小分子／核酸／脂肪酸は、ＰＤ−１タンパク質またはＰＤ−１細胞外ドメインペプチドである。
ＩｇＧ２ヒンジ−ＰＤ−１
ＰＤ−１−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２ヒンジ−Ｆｃドメイン−ＰＤ−１
ＩｇＧ２ヒンジ−ＰＤ−１−Ｆｃドメイン
Ｆｃドメイン−ＰＤ−１−ＩｇＧ２ヒンジ
ＰＤ−１−Ｆｃドメイン−ＩｇＧ２ヒンジ
Ｆｃドメイン−ＩｇＧ２ヒンジ−ＰＤ−１
ＰＤ−１−ＩｇＧ２ヒンジ−Ｆｃドメイン
【００７３】
更なる実施形態において、ペプチド／タンパク質／小分子／核酸／脂肪酸は、ＣＥＲＶＩＧペプチドである。
ＩｇＧ２ヒンジ−ＣＥＲＶＩＧ
ＣＥＲＶＩＧ−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２ヒンジ−Ｆｃドメイン−ＣＥＲＶＩＧ
ＩｇＧ２ヒンジ−ＣＥＲＶＩＧ−Ｆｃドメイン
Ｆｃドメイン−ＣＥＲＶＩＧ−ＩｇＧ２ヒンジ
ＣＥＲＶＩＧ−Ｆｃドメインｎ−ＩｇＧ２ヒンジ
Ｆｃドメイン−ＩｇＧ２ヒンジ−ＣＥＲＶＩＧ
ＣＥＲＶＩＧ−ＩｇＧ２ヒンジ−Ｆｃドメイン
【００７４】
別の実施形態において、ペプチド／タンパク質／小分子／核酸／脂肪酸は、フォン・ヴィルブランド因子である。フォン・ヴィルブランド因子を含有する融合タンパク質の例には、下記が含まれる。
ＩｇＧ２ヒンジ−ＶＷＦ
ＶＷＦ−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２ヒンジ−Ｆｃドメイン−ＶＷＦ
ＩｇＧ２ヒンジ−ＶＷＦ−Ｆｃドメイン
Ｆｃドメイン−ＶＷＦ−ＩｇＧ２ヒンジ
ＶＷＦ−Ｆｃドメイン−ＩｇＧ２ヒンジ
Ｆｃドメイン−ＩｇＧ２ヒンジ−ＶＷＦ
ＶＷＦ−ＩｇＧ２ヒンジ−Ｆｃドメイン
【００７５】
別の実施形態において、ペプチド／タンパク質／小分子／核酸／脂肪酸は、ＭＨＣ分子である。この実施形態において、ＭＨＣ分子は多量体化されて、ＭＨＣ四量体のような多量体を形成する。ＭＨＣ分子を含有する融合タンパク質の例には、下記が含まれる。
蛍光タグ−ＭＨＣ−抗原−ＩｇＧ２ヒンジ
蛍光タグ−ＩｇＧ２ヒンジ−ＭＨＣ−抗原
ＭＨＣ−抗原−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２ヒンジ−ＭＨＣ−抗原
ＩｇＧ２ヒンジ−ＭＨＣ−抗原−ビオチン化四量体単位
【００７６】
別の実施形態において、小型ペプチドは、多価結合のために標的への小型ペプチドの結合親和性および結合活性を増加する多量体を形成するため、Ｆｃを有する、または有さないＩｇＧ２ヒンジに融合される。小型ペプチドは、多くの場合、非常に短い臨床半減期を有し、このことはＦｃの付加により改善され得る。この手法の一実施形態において、配列ＬＧＡＳＷＨＲＰＤＫＣＣＬＧＹＱＫＲＰＬＰ（配列番号２）を有する２１ｍｅｒペプチドは、ＣＸＣＲ４のペプチド拮抗剤である（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００  ３９（１３）ｐｐ３７８２）。ペプチドは、ＣＸＣＲ４シグナル伝達、およびＣＤ４細胞へのＨＩＶのＣＸＣＲ４仲介浸入を防止することが実証されている。ＩｇＧ２ヒンジを付加することによって、ペプチドは多量体され、より大きな親和性および結合活性を伴って結合する。Ｆｃを付加することによって、多量体化された化合物の半減期は増加される。治療上の使用には、ＨＩＶ疾患および免疫障害の治療が含まれる。ＬＧＡＳＷＨＲＰＤＫＣＣＬＧＹＱＫＲＰＬＰ（配列番号２）ペプチドを含有する融合タンパク質の例には、下記が含まれる。
ＬＧＡＳＷＨＲＰＤＫＣＣＬＧＹＱＫＲＰＬＰ（配列番号２）−ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ４  Ｆｃ
ＬＧＡＳＷＨＲＰＤＫＣＣＬＧＹＱＫＲＰＬＰ（配列番号２）−ＩｇＧ４  Ｆｃ−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ４  Ｆｃ−ＬＧＡＳＷＨＲＰＤＫＣＣＬＧＹＱＫＲＰＬＰ（配列番号２）−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ４  Ｆｃ−ＩｇＧ２ヒンジ−ＬＧＡＳＷＨＲＰＤＫＣＣＬＧＹＱＫＲＰＬＰ（配列番号２）
ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ４  Ｆｃ−ＬＧＡＳＷＨＲＰＤＫＣＣＬＧＹＱＫＲＰＬＰ（配列番号２）
ＩｇＧ２ヒンジ−ＬＧＡＳＷＨＲＰＤＫＣＣＬＧＹＱＫＲＰＬＰ（配列番号２）−ＩｇＧ４  Ｆｃ
ＬＧＡＳＷＨＲＰＤＫＣＣＬＧＹＱＫＲＰＬＰ（配列番号２）−ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ２  ＣＨ２−ＩｇＧ２  ＣＨ３
ＬＧＡＳＷＨＲＰＤＫＣＣＬＧＹＱＫＲＰＬＰ（配列番号２）−ＩｇＧ２  ＣＨ２−ＩｇＧ２  ＣＨ３−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２  ＣＨ２−ＩｇＧ２  ＣＨ３−ＬＧＡＳＷＨＲＰＤＫＣＣＬＧＹＱＫＲＰＬＰ（配列番号２）−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２  ＣＨ２−ＩｇＧ２  ＣＨ３−ＩｇＧ２ヒンジ−ＬＧＡＳＷＨＲＰＤＫＣＣＬＧＹＱＫＲＰＬＰ（配列番号２）
ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ２  ＣＨ２−ＩｇＧ２  ＣＨ３−ＬＧＡＳＷＨＲＰＤＫＣＣＬＧＹＱＫＲＰＬＰ（配列番号２）
ＩｇＧ２ヒンジ−ＬＧＡＳＷＨＲＰＤＫＣＣＬＧＹＱＫＲＰＬＰ（配列番号２）−ＩｇＧ２  ＣＨ２−ＩｇＧ２  ＣＨ３
【００７７】
別の類似の実施形態において、Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００５；１１６（３）；２１１−２１９）は、ＥＧＦＲへのＥＧＦ結合を模倣し、有糸分裂誘発およびＥＧＦＲシグナル伝達を阻害するペプチドを同定した。この小型ペプチドは、ＩｇＧ２ヒンジに結合することができ、場合により上記に記載されたＦｃに結合することができる。これは、抗癌剤として有用である。
【００７８】
別の実施形態において、Ｍａｒｕｔａ  ｅｔ  ａｌ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００２．９（６）；５４３−５２）は、ＦＧＦ受容体発現細胞に結合する小型ペプチドＭＱＬＰＬＡＴ（配列番号３）を同定した。ＭＱＬＰＬＡＴ（配列番号３）は、正常な細胞よりも癌細胞に結合し、蓄積する。これらは、拮抗剤または作動薬として特徴決定されていない。この小型ペプチドは、ＩｇＧ２ヒンジに結合することができ、場合により上記に記載されたＦｃに結合することができる。これは、抗癌剤として有用であり、化合物により標的細胞へ毒性化合物を特異的に送達することに使用できる。ＭＱＬＰＬＡＴ（配列番号３）ペプチドを含有する融合タンパク質の例には、下記が含まれる。
ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ４  Ｆｃ−ＦＧＦ結合ペプチド−ペプチド毒素
ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ４  Ｆｃ−ＦＧＦ結合ペプチド−小分子毒素
ＩｇＧ４  Ｆｃ−ＦＧＦ結合ペプチド−ペプチド毒素−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ４  Ｆｃ−ＦＧＦ結合ペプチド−小分子毒素−ＩｇＧ２ヒンジ
ＦＧＦ結合ペプチド−ペプチド毒素−ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ４  Ｆｃ
ＦＧＦ結合ペプチド−小分子毒素−ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ４  Ｆｃ
ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ２  ＣＨ２−ＩｇＧ２  ＣＨ３−ＦＧＦ結合ペプチド−ペプチド毒素
ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ２  ＣＨ２−ＩｇＧ２  ＣＨ３−ＦＧＦ結合ペプチド−小分子毒素
ＩｇＧ２  ＣＨ２−ＩｇＧ２  ＣＨ３−ＦＧＦ結合ペプチド−ペプチド毒素−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２  ＣＨ２−ＩｇＧ２  ＣＨ３−ＦＧＦ結合ペプチド−小分子毒素−ＩｇＧ２ヒンジ
ＦＧＦ結合ペプチド−ペプチド毒素−ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ２  ＣＨ２−ＩｇＧ２  ＣＨ３
ＦＧＦ結合ペプチド−小分子毒素−ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ２  ＣＨ２−ＩｇＧ２  ＣＨ３
【００７９】
別の実施形態において、Ｒｕｆｆ  ｅｔ  ａｌ（ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  １９８７：２１１（１）；１７−２２）は、ＨＩＶのＣＤ４受容体結合を遮断するｏｃｔａペプチドＡＳＴＴＴＮＹＴ（配列番号４）を同定した。この小型ペプチドは、ＩｇＧ２ヒンジに結合することができ、場合により上記に記載されたＦｃに結合することができる。これは、抗ウイルス剤として有用である。
【００８０】
別の実施形態において、Ｎｏｂｅｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ（ＰｌｏｓＯｎｅ．２０１１．６（１２）ｅ２８６１１）は、ＥｐｈＢ４受容体を標的にし、ＥｐｈＢ４−エフリン−Ｂ２相互作用を破壊することにより血管形成を阻害する、ＴＮＹＬ−ＲＡＷと呼ばれる１５ｍｅｒペプチドを同定した。この小型ペプチドは、ＩｇＧ２ヒンジに結合することができ、場合により上記に記載されたＦｃに結合することができる。これは、腫瘍崩壊剤として有用である。別の実施形態において、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２１（１１）（２００３）および他は、軽鎖の可変部（ＶＬ）に結合した重鎖の可変部（ＶＨ）の使用により結合ドメインを生成して、エピトープ結合部位を形成する能力について記載している。可変軽鎖は、多くの可能なリンカー領域の１つを使用して可変重鎖に結合され得、ＶＨまたはＶＬのＣＨ１領域を含有し得る。ＶＨもしくはＶＬ、または両方を同時に、多量体化するＩｇＧ２ヒンジドメインに結合することができ、場合により、上記に記載されたＦｃに結合することができる。あるいは、ＶＨまたはＶＬは、キメラタンパク質として直接融合され得ないが、代わりに同じ細胞において同時発現され得る。更なる実施形態において、同時発現されたＶＬは、ＩｇＧ２ヒンジ領域にも結合している。更なる実施形態において、ＶＨはＣＨ１に結合していないので、同時発現されたペプチドは、ＶＨ−ＩｇＧ２ヒンジおよびＶＬを含む。
【００８１】
Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５  Ｓｅｐ；２３（９）：１１２６−３６）は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖのような一価抗体のフラグメントおよび操作された変種を含むモノクローナル抗体の変種、二特異性抗体、三特異性抗体、ミニボディ、ならびに単一ドメイン抗体である、一連の小型組み換えフラグメントを概説する。これらのフラグメントは、全てのモノクローナル抗体の標的特異性を保持するが、より経済的に産生され得、一連の診断および治療用途において独自の優れた特性を有することができる。これらは、それぞれ、上記の開示されたＩｇＧ２ヒンジドメインを含めることにより同様に多量体化され得る。
【００８２】
Ｗｕｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，９，５０２−５０９）は、ＩｇＧスーパーファミリーの足場、ループをグラフトするのに適した剛性コア構造を提供するループ含有または高度構造化タンパク質足場、好ましい３Ｄ立体配置への可変ループの組み込みを可能にするオリゴマータンパク質足場、および単一結合面を示す担体タンパク質を含む、発見され、確認されている約５０個の異なる抗体誘発性の非Ｉｇ足場を概説する。これらは、それぞれ、上記の開示されたＩｇＧ２ヒンジドメインを含めることにより同様に多量体化され得る。
【００８３】
別の実施形態において、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ  ２００１  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌ  １４  ｎｏ  １２  ｐｐ１０２５−１０３３は、ＶＬドメインおよびリンカーを、ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体のＶＨドメインのＮ末端に配置して単鎖抗体（ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）を生成する能力を実証した。
【００８４】
別の実施形態において、Ｄｅｆｆａｒ  ｅｔ  ａｌ（Ａｆｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．８（１２），ｐｐ．２６４５−２６５２，１７  Ｊｕｎｅ，２００９）は、ラクダおよびラマが軽鎖を欠いた完全機能性抗体を有することを実証した。これらの重鎖抗体は、単一可変ドメイン（ＶＨＨ）と２つの定常ドメイン（ｃＣＨ２およびｃＣＨ３）を含有し、ここでクローン化および単離されたＶＨＨドメインは、元の重鎖抗体の全ての抗原結合能を有する安定したポリペプチドである。ｃＣＨ１または軽鎖はない。著者たちは、これらの重鎖抗体をナノボディと呼ぶ。この重鎖抗体を、多量体化するＩｇＧ２ヒンジドメインに結合して、以下のような多量体化する単鎖抗体を形成することができる。
ｈＩｇＧ２ヒンジ−ＶＨＨ−ｃヒンジ−ｃＣＨ２−ｃＣＨ３
ｈＩｇＧ２ヒンジ−ＶＨＨ−ｃＣＨ２−ｃＣＨ３
ＶＨＨ−ｈＩｇＧ２ヒンジ−ｃヒンジ−ｃＣＨ２−ｃＣＨ３
ＶＨＨ−ｈＩｇＧ２ヒンジ−ｃＣＨ２−ｃＣＨ３
ＶＨＨ−ｃヒンジ−ｃＣＨ２−ｃＣＨ３−ｈＩｇＧ２ヒンジ
ＶＨＨ−ｃＣＨ２−ｃＣＨ３−ｈＩｇＧ２ヒンジ
【００８５】
免疫グロブリンＦｃドメインは、未変性ＩｇＧ１より低い親和性でＦｃガンマ受容体に結合するが、プロテインＡもしくはプロテインＧアフィニティーカラムに結合する能力の保持、または新生児ＦｃＮ受容体への好ましい結合を含む他の有益な特徴も保持する任意のＦｃドメインまたはフラグメントである。Ｆｃドメインは、天然に生じ得る、天然に生じる構成要素から非天然の組み合わせにより構成され得る、または天然に生じる、および非天然に生じる構成要素から構成され得る。そのようなＦｃドメインの例には、下記が含まれる。
ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ２  ＣＨ２−ＩｇＧ２  ＣＨ３ 
ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ３  ＣＨ２−ＩｇＧ３  ＣＨ３
ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ３  ＣＨ２−ＩｇＧ２  ＣＨ３
ＩｇＧ２ヒンジ−ＩｇＧ２  ＣＨ２−ＩｇＧ３  ＣＨ３
ＩｇＧ４ヒンジ−ＩｇＧ４  ＣＨ２−ＩｇＧ４  ＣＨ３
ＩｇＧ２  ＣＨ２−ＩｇＧ２  ＣＨ３
ＩｇＧ４  ＣＨ２−ＩｇＧ４  ＣＨ３
ＩｇＧ４  ＣＨ２−ＩｇＧ２  ＣＨ３
ＩｇＧ２  ＣＨ２−ＩｇＧ４  ＣＨ３
半グルコシル化ＩｇＧ１ヒンジ−ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＩｇＧ１  ＣＨ３
半グルコシル化ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＩｇＧ１  ＣＨ３
半グルコシル化ＩｇＧ３ヒンジ−ＩｇＧ３  ＣＨ２−ＩｇＧ３  ＣＨ３
半グルコシル化ＩｇＧ３  ＣＨ２−ＩｇＧ３  ＣＨ３
ＩｇＧ１ヒンジ−ＩｇＧ２  ＣＨ２−ＩｇＧ３  ＣＨ３
ＩｇＧ１ヒンジ−ＩｇＧ１  ＣＨ２  Ｎ２９７Ａ−ＩｇＧ１  ＣＨ３
ＩｇＧ１ヒンジ−ＩｇＧ１  ＣＨ２  Ｄ２６５Ａ−ＩｇＧ１  ＣＨ３
【００８６】
あるいは、免疫グロブリンＦｃドメインは、抗原結合部位を含有するように操作されたＦｃドメインまたはフラグメントである。これらの融合タンパク質は、炎症性疾患、自己免疫性疾患、および癌の治療に有用である。例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原結合部位を発現するように操作されたＦｃは、乳癌の治療に有用である。そのようなＦｃドメインを含む融合タンパク質の例は、下記である。
操作されたＦｃ−ＩｇＧ２ヒンジ
ＩｇＧ２ヒンジ−操作されたＦｃ
ＩｇＧ２ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−操作されたＦｃ
薬学的組成物
【００８７】
本明細書に記載されている融合タンパク質組成物の投与は、任意の一般的な、もしくは一般的ではない経路、経口、非経口、または局所を介するものである。例示的な経路には、経口、経鼻、頬側、直腸内、膣内、眼内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、動脈内、腫瘍内、脊髄、鞘内、関節内、動脈内、くも膜下、舌下、口腔粘膜、気管支、リンパ管、子宮内、皮下、腫瘍内、縫合糸のような埋め込み式装置もしくは埋め込み可能ポリマーのような埋め込み式装置への組み込み、硬膜内、皮質内、または真皮が含まれるが、これらに限定されない。そのような組成物は、通常、本明細書に記載されている薬学的に許容される組成物として投与される。好ましい実施形態において、単離された融合タンパク質は、静脈内または皮下投与される。
【００８８】
用語「薬学的に許容される担体」は、本明細書で使用されるとき、任意および全ての溶媒、分散媒体、被覆、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、ヒドロゲルなどが含まれる。薬学的に活性な物質へのそのような媒体および薬剤の使用は、当該技術において良く知られている。任意の従来の媒体または薬剤が本発明のベクターまたは細胞と適合しない場合を除いて、治療組成物におけるその使用は考慮される。補助活性成分を組成物に組み込むこともできる。
【００８９】
本発明の融合タンパク質組成物は、中性または塩形態で処方され得る。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成される）、ならびに例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸により、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸により形成されるものが含まれる。遊離カルボキシル基により形成される塩は、また、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは第二鉄のような無機塩基から、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導され得る。
【００９０】
滅菌注射用液剤は、適切な溶媒中の必要量の融合タンパク質に、必要に応じて、上記に列挙された多様な他の成分を組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は、多様な滅菌活性成分を、塩基分散媒体および上記に列挙された必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用液剤を調製するための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これらは活性成分と、予め滅菌濾過された溶液からの任意の追加の望ましい成分との粉末を生じる。
【００９１】
更に、一実施形態は、経口投与に適した融合タンパク質組成物であり、不活性希釈剤を用いる、または用いないで薬学的に許容される担体により提供される。担体は、同化できる、または食用に適するべきであり、液体、半液体、すなわち、ペースト、または固体の担体が含まれる。任意の従来の媒体、薬剤、希釈剤、または担体が受容者に有害である、またはそれに含有された融合タンパク質調合剤の治療有効性に有害である場合を除いて、本発明の方法の実施に使用される経口投与用融合タンパク質組成物におけるその使用は、適切である。担体または希釈剤の例には、脂肪、油、水、生理食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、充填剤など、またはこれらの組み合わせが含まれる。用語「経口投与」は、本明細書で使用されるとき、経口、頬側、経腸、または胃内投与が含まれる。
【００９２】
一実施形態において、融合タンパク質組成物は、任意の好都合で実践的な方法により、すなわち、溶解、懸濁、乳化、混合、封入、マイクロカプセル化、吸着などにより担体と組み合わされる。そのような手順は、当業者にとって日常的なものである。
【００９３】
特定の実施形態において、粉末形態の融合タンパク質組成物は、半固体または固体担体と十分に組み合わされる、または混合される。混合は、粉砕のような任意の従来の方法により実施され得る。組成物が例えば胃の中で変性して治療活性を失うのを保護するために、安定剤を混合過程において加えることもできる。経口投与用の組成物に使用される安定剤の例には、緩衝剤、胃酸の分泌に対する拮抗剤、グリシンおよびリシンのようなアミノ酸、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなどのような炭水化物、タンパク質分解酵素阻害剤などが含まれる。より好ましくは、経口投与される組成物では、安定剤には胃酸の分泌に対する拮抗剤も含まれ得る。
【００９４】
更に、半固体または固体担体と組み合わされる経口投与用の融合タンパク質組成物は、硬質もしくは軟質ゼラチンカプセル剤、錠剤、または丸剤に更に処方され得る。より好ましくは、ゼラチンカプセル剤、錠剤、または丸剤は、腸溶性被覆されている。腸溶性被覆は、ｐＨが酸性である胃または腸上部における組成物の変性を防止する。すなわち、米国特許第５，６２９，００１号を参照すること。小腸に到達すると、そこの塩基性ｐＨは被覆を溶解し、組成物を放出させて、腸細胞、例えばパイエル板Ｍ細胞と相互作用することを可能にする。
【００９５】
別の実施形態において、粉末形態の融合タンパク質組成物は、融合タンパク質を封入する、または融合タンパク質が結合されるナノ粒子を作り出す材料と十分に組み合わされる、または混合される。それぞれのナノ粒子は、１００ミクロン以下のサイズを有する。ナノ粒子は、そうでなければ経口での生物学的利用能がなくなる、融合タンパク質の胃腸吸収を可能にする粘膜付着性を有し得る。
【００９６】
別の実施形態において、粉末化された組成物は、すなわち水もしくは生理食塩水のような液体担体と、安定剤を用いて、または用いることなく組み合わされる。
【００９７】
使用され得る特定の融合タンパク質製剤は、カリウムを含まない低張性のリン酸に基づいた緩衝剤中の融合タンパク質の液剤であり、ここで緩衝剤の組成は、以下である。６ｍＭのリン酸ナトリウム一塩基一水和物、９ｍＭのリン酸ナトリウム二塩基六水和物、５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０±０．１。低張緩衝剤中の融合タンパク質の濃度は、１０マイクログラム／ｍｌ〜１００ミリグラム／ｍｌの範囲であり得る。この製剤は、例えば静脈内投与であるが、これに限定されない任意の投与経路を介して投与され得る。
【００９８】
更に、半固体担体と組み合わされる局所投与用の融合タンパク質組成物は、クリーム剤またはゲル軟膏剤に更に処方され得る。ゲル軟膏剤の処方に好ましい担体は、ゲルポリマーである。本発明のゲル組成物の製造に使用される好ましいポリマーには、カルボポール、カルボキシメチルセルロース、およびプルロニックポリマーが含まれるが、これらに限定されない。特に、粉末化された融合タンパク質は、皮膚の上または下の疾患の治療のために皮膚に適用するため、０．５％〜５％ｗｔ／容積の強度のカルボポール９８０のような重合剤を含有する水性ゲルと組み合わされる。用語「局所投与」は、本明細書で使用されるとき、真皮、表皮、皮下、または粘膜表面への適用が含まれる。
【００９９】
更に、融合タンパク質組成物は、皮下または真皮下埋め込み用のポリマーに処方され得る。埋め込み式薬剤注入ポリマー用の好ましい製剤は、一般に安全と認められる薬剤であり、例えば、架橋デキストラン（Ｓａｍａｎｔｈａ  Ｈａｒｔ，Ｍａｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｈｅｓｉｓ，"Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｇｅｌ：Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ"Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｕｎｅ  ８，２００９）、デキストラン−チラミン（Ｊｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．Ｐａｒｔ  Ａ．１６（８）：２４２９−４０）、デキストラン−ポリエチレングリコール（Ｊｕｋｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．Ｐａｒｔ  Ａ．，１６（２）：５６５−７３）、またはデキストラン−グルテルアルデヒド（Ｂｒｏｎｄｓｔｅｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，５３：７−１３）が含まれ得る。当業者は、多くの類似のポリマーおよびヒドロゲルが、ポリマーまたはヒドロゲル内に融合タンパク質を固定して組み込み、孔サイズを所望の直径に制御することにより形成され得ることを知っている。
【０１００】
処方されると、液剤は、投与量処方に適合した方法により、症状の改善または治療をもたらすために治療上有効であるような量で投与される。製剤は、摂取用液剤、薬剤放出カプセル剤などのような多様な剤形により容易に投与される。投与量のいくらかの変動は、治療される対象の状態に応じて生じ得る。投与の責任者は、いずれの場合においても、個別の対象に適した用量を決定することができる。更に、ヒトへの投与では、調合剤は、ＦＤＡの生物製剤評価研究センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の基準により要求される滅菌性、一般的な安全性、および純度の基準を満たす。
【０１０１】
投与経路は、当然のことながら、治療される疾患の位置および性質によって変わり、例えば、皮内、経真皮、真皮下、非経口、経鼻、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮、気管内、腹腔内、腫瘍内、灌流、洗浄、直接注射、および経口投与が含まれ得る。
用語「非経口投与」には、本明細書で使用されるとき、化合物が腸を介した吸収を伴わないで対象に吸収される任意の形態の投与が含まれる。本発明に使用される例示的な非経口投与には、筋肉内、静脈内、腹腔内、腫瘍内、眼内、経鼻、または関節内投与が含まれるが、これらに限定されない。
融合タンパク質の治療用途
【０１０２】
合理的な設計に基づいて、本発明の融合タンパク質は、自己免疫性疾患を治療するため、ならびに癌および炎症性疾患のバイオ免疫療法のような多様な他の文脈において免疫機能を調節するための、重要な生物製剤として役立つ。本発明の主題である化合物により有効に治療され得る状態に含まれるものには、サイトカインネットワークにおける不平衡による炎症性疾患、病原性自己抗体もしくは自己侵襲的Ｔ細胞により仲介される自己免疫性障害、または慢性で再発性の自己免疫性、炎症性、もしくは感染性の疾患もしくは過程の急性もしくは慢性期が含まれる。
【０１０３】
本明細書に記載されている単離された融合タンパク質を使用する治療の一般的な手法は、疾患または病態を有する対象に、治療に効果をもたらす治療有効量の単離された免疫学的に活性な融合タンパク質を投与することである。幾つかの実施形態において、疾患または病態は、サイトカインネットワークにおける不均衡による炎症性疾患、病原性自己抗体もしくは    により仲介される自己免疫性障害、    と広く分類され得る。 
【０１０４】
用語「治療する」および「治療」は、本明細書で使用されるとき、対象が疾患もしくは病態、または疾患もしくは病態の症状に改善を有するように、治療有効量の本発明の融合タンパク質を対象に投与することを意味する。改善は、疾患もしくは病態、または疾患もしくは病態の症状における任意の改善または治療である。改善は、観察可能もしくは測定可能な改善である、または対象の一般的な満足感における改善であり得る。したがって、当業者は、治療が疾患状態を改善し得るが、疾患の完全な治癒ではないことがあり得ることを理解する。具体的には、対象における改善には、炎症の減少；Ｃ反応性タンパク質のような炎症性検査マーカーの減少；自己抗体、または血小板数、白血球数、もしくは赤血球数のような自己免疫マーカーにおける改善、発疹もしくは紫斑の減少、脱力感、麻痺、もしくは刺痛の減少、高血糖症の患者におけるグルコースレベルの増加、関節痛、炎症、腫脹、もしくは劣化の減少、痙攣、ならびに下痢の頻度および量の減少、狭心症の減少、組織の炎症の減少、または発作頻度の減少の１つ以上により明白に示される自己免疫の減少；癌腫瘍量の減少、腫瘍進行までの時間の延長、癌痛の減少、生存率の増加、または生活の質の改善；あるいは骨粗鬆症の進行の遅延または骨粗鬆症の改善の１つ以上が含まれ得る。
【０１０５】
用語「治療有効量」は、本明細書で使用されるとき、疾患または病態の症状の改善または治療をもたらす量を意味する。
【０１０６】
本明細書で使用されるとき、「予防」は、疾患の症状の完全な防止、疾患の症状の発生の遅延、またはその後に進展する疾患症状の重篤度の軽減を意味することができる。
【０１０７】
用語「対象」は、本明細書で使用されるとき、本発明の融合タンパク質が本明細書に記載されている方法に従って投与される任意の哺乳類対象を意味する。特定の実施形態において、本開示の方法は、ヒト対象を治療するために用いられる。本開示の方法は、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒ、およびチンパンジー）、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ウサギ、ヤギ、シカ、ヒツジ、フェレット、アレチネズミ、モルモット、ハムスター、コウモリ、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、およびアヒル）、魚類、ならびに爬虫類を、種特異的またはキメラ融合タンパク質分子を産生して治療するために用いることもできる。
【０１０８】
特に、本発明の融合タンパク質は、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、血管炎、酒さ、ざ瘡、湿疹、心筋、および他の心筋の状態、全身性エリテマトーデス、糖尿病、脊椎症、滑膜線維芽細胞、および骨髄間質；骨量減少；パジェット病、骨巨細胞腫；多発性骨髄腫；乳癌；廃用骨減少症；栄養不良、歯周疾患、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球症、脊髄損傷、急性敗血症性関節炎、骨軟化症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成症、多骨性線維性骨異形成症、歯周再構築、および骨折；サルコイドーシス；溶骨性骨癌、肺癌、腎癌、および直腸癌；骨転移、骨痛管理、ならびに体液性悪性高カルシウム血症、強直性脊椎炎、および他の脊椎関節症；移植拒絶反、ウイルス感染、血液学的新生物、および新生物様状態、例えばホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性白血病、菌状息肉症、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、毛様細胞リンパ腫、およびリンパ形質細胞性白血病）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含むリンパ球前駆体細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢性Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、および大顆粒リンパ球性白血病を含む成熟ＴおよびＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、成熟化を有するＡＭＬ、分化を有さないＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、および急性単球性白血病を含む急性骨髄性白血病のような骨髄性新生物、骨髄異形成症候群、慢性骨髄性白血病を含む慢性骨髄増殖性障害、中枢神経系の腫瘍、例えば、脳腫瘍（神経膠腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、髄芽腫、上衣細胞腫、および網膜芽細胞腫）、固形腫瘍（上咽頭癌、基底細胞癌、膵癌、胆管癌、カポジ肉腫、精巣癌、子宮、膣、もしくは子宮頸癌、卵巣癌、原発性肝癌、または子宮内膜癌、血管系の腫瘍（血管肉腫および血管周囲細胞腫））、または他の癌が含まれるが、これらに限定されない状態を治療するために使用することができる。
【０１０９】
「癌」は、本明細書において、未制御な細胞増殖により典型的に特徴付けられる、哺乳動物における生理学的な病態を意味する、または記載する。癌の例には、癌腫、 リンパ腫、芽細胞腫、肉腫（脂肪肉腫、骨原性肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、線維肉腫、粘液肉、軟骨肉腫）、神経内分泌腫瘍、中皮腫、脊索腫、滑膜腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、および白血病、またはリンパ性悪性腫瘍腫が含まれるが、これらに限定されない。そのような癌のより特定的な例には、扁平細胞癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌を含む肺癌、小細胞肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃および腹部の癌、膵癌、神経膠芽細胞、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓の癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓または腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆管の腫瘍、ユーイング腫瘍、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、肺の癌腫、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、骨髄異形成疾患、重鎖病、神経内分泌腫瘍、シュワン細胞腫、および他の癌腫、ならびに頭頸部癌が含まれる。
【０１１０】
本発明の融合タンパク質は、自己免疫性疾患の治療に使用され得る。用語「自己免疫性疾患」は、本明細書で使用されるとき、８０を超える疾患および病態の多様な群を意味する。これらの疾患および状態の全てにおいて、基礎となる問題は、身体の免疫系が身体自体を攻撃することである。自己免疫性疾患は、結合組織、神経、筋肉、内分泌経、皮膚、血液、ならびに呼吸器および胃腸器系を含む全ての主要な身体系に影響を与える。自己免疫性疾患には、例えば、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、および１型糖尿病が含まれる。
【０１１１】
本発明の組成物および方法に使用される治療可能な疾患または状態は、特発性血小板減少性紫斑病、同種免疫性／自己免疫性血小板減少症、後天性免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性溶血性貧血、パルボウイルスＢ１９関連赤血球無形成症、後天性抗因子ＶＩＩＩ自己免疫、後天性フォン・ヴィルブランド病、多発性骨髄腫、および意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、敗血症、再生不良性貧血、赤芽球ろう、ダイアモンド・ブラックファン貧血、新生児溶血性疾患、免疫仲介好中球減少症、血小板輸血不応状態、新生児、輸血後紫斑、溶血性尿毒症症候群、全身性血管炎、血栓性血小板減少性紫斑病、またはエヴァンス症候群が含まれるが、これらに限定されない血液免疫学的過程であり得る。
【０１１２】
疾患または病態は、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、異常タンパク性ＩｇＭ脱髄性多発ニューロパチー、ランバート・イートン筋無力症症候群、重症筋無力症、多巣性運動ニューロパチー、抗−／ＧＭ１、脱髄、多発性硬化症、および視神経炎に関連する下位運動ニューロン症候群、全身硬直症候群、抗Ｙｏ抗体による傍腫瘍性小脳変性症、傍腫瘍性脳脊髄症、抗Ｈｕ抗体による感覚性ニューロパチー、癲癇、脳炎、脊髄炎、特にヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス−１に関連する脊髄症、自己免疫性糖尿病性ニューロパチー、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、または急性突発性自律神経障害性ニューロパチーが含まれるが、これらに限定されない神経免疫学的過程でもあり得る。
【０１１３】
疾患または病態は、川崎病、関節リウマチ、フェルティ症候群、ＡＮＣＡ陽性血管炎、自発性多発性筋炎、皮膚筋炎、抗リン脂質症候群、反復自然流産、全身性エリテマトーデス、若年性特発性関節炎、レイノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、またはぶどう膜炎が含まれるが、これらに限定されないリウマチ性疾患過程でもあり得る。
【０１１４】
疾患または病態は、中毒性表皮壊死症、壊疽、肉芽腫、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、落葉状天疱瘡、白斑症を含む自己免疫性皮膚水疱形成疾患、連鎖球菌毒素ショック症候群、強皮症、びまん性および限定的皮膚全身性硬化症を含む全身性硬化症、またはアトピー性皮膚炎（特にステロイド依存性のもの）が含まれるが、これらに限定されない皮膚の免疫疾患過程でもあり得る。
【０１１５】
疾患または病態は、封入体筋炎、壊死性筋膜炎、炎症性ミオパチー、筋炎、抗デコリン（ＢＪ抗原）ミオパチー、傍腫瘍性壊死性ミオパチー、Ｘ連鎖空胞化ミオパチー、ペナシラミン誘発性多発筋炎、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、または心筋症が含まれるが、これらに限定されない筋骨格の免疫疾患過程でもあり得る。
【０１１６】
疾患または病態は、悪性貧血、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアック病、疱疹状皮膚炎、原因不明肝硬変、反応性関節炎、クローン病、ウィップル病、潰瘍性大腸炎、または硬化性胆管炎が含まれるが、これらに限定されない胃腸の免疫疾患過程でもあり得る。
【０１１７】
疾患または病態は、移植片対宿主病、抗体仲介性移植片拒絶反応、骨髄移植後拒絶反応、感染症後炎症、リンパ腫、白血病、新生物形成、喘息、抗ベータ細胞抗体による１型真性糖尿病、シェーグレン症候群、混合性結合組織病、アジソン病、フォークト・小柳・原田症候群、膜性増殖性糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、橋本甲状腺炎、ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発動脈炎、チャーグ・ストラウス症候群、結節性多発動脈炎、または多臓器不全でもあり得る。
【０１１８】
本明細書に開示されている融合タンパク質は、免疫応答プロフィールに特定の変化を及ぼす多様な文脈において免疫系応答を変更するために、容易に適用することもできる。対象において免疫応答を変更または調節することは、免疫応答の率または構成要素を増加する、減少する、または変化させることを意味する。例えば、サイトカイン産生または分泌レベルは、サイトカイン受容体の適切な組み合わせを、これらの受容体と相互作用するように設計された融合タンパク質により標的化することによって、望ましく増加または減少され得る。免疫応答は、本明細書に開示されている融合タンパク質により調節されていない免疫応答と比較して、増加または減少した、単球マクロファージ誘導性細胞の食作用の潜在性、増加または減少した破骨細胞機能、増加または減少した、抗原提示細胞（例えば、ＤＣ）による抗原提示、増加または減少したＮＫ細胞機能、増加または減少したＢ細胞機能を含む、多量体化されたタンパク質、ペプチド、または小分子の受容体を発現する免疫細胞の作動体機能でもあり得る。
本明細書に記載されている融合タンパク質は、樹状細胞、マクロファージ、破骨細胞、単球、もしくはＮＫ細胞を含む免疫細胞からの同時刺激分子の発現を調節するため、あるいはこれらの同じ免疫細胞の分化、成熟、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）もしくはインターロイキン−２３（ＩＬ−２３）を含むサイトカイン分泌の減少、またはインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）もしくはインターロイキン−６（ＩＬ−６）を含むサイトカイン分泌の増加を阻害するために使用され得る。当業者は、免疫細胞を融合タンパク質に曝露し、免疫細胞機能の調節を測定することによって、融合タンパク質の効能を確認することもでき、ここで免疫細胞は、樹状細胞、マクロファージ、破骨細胞、ＮＫ細胞、または単球である。一実施形態において、免疫細胞は、融合タンパク質にインビトロで曝露され、細胞表面受容体またはサイトカイン産生の量を決定するステップを更に含み、ここで細胞表面受容体またはサイトカイン産生の量における変化は、免疫細胞機能の調節を示す。別の実施形態において、免疫細胞は、自己免疫性疾患の動物モデルにおいて融合タンパク質にインビボで曝露され、自己免疫性疾患の改善の程度を評価するステップを更に含む。
【実施例】
【０１１９】
実施例１−免疫学的に活性なＩｇＧ２ヒンジ（２ヒンジ）−多量体の構築物設計
Ａ．ＣＴＬＡ−４
２−ヒンジＣＴＬＡ融合構築物は、ＰＣＲを使用して操作される。ＣＴＬＡ４細胞外ドメインを含有するｃＤＮＡクローンは、多くのもの（Ｏｒｉｇｅｎカタログ番号ＳＣ３０３６０５のホモ・サピエンス細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、転写変種１ＮＭ＿００５２１４．３をコードするもの）が商業的供給者か得られる、または商業的供給者からの多くｃＤＮＡ（ＤＮＡ２．０  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を合成することにより得られる。あるいは、ｃＤＮＡは、多くの商業的供給者からのｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０４２５−０１５  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリー）のＰＣＲによって得ることができる。ヒトＩｇＧ２ヒンジ配列に相補的であり、ＣＴＬＡ  ｃＤＮＡドメインに相補的なＤＮＡ配列を追加的に含有するプライマーをＰＣＲに使用して、ヒトＩｇＧ２ヒンジドメインをコードし、ＣＴＬＡ４細胞外ドメインをコードする配列をコードする融合ＰＣＲ産物を生成する。次にＰＣＲフラグメントを、多くの市販の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ（商標）３．３−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローンする。あるいは、制限酵素認識部位をＰＣＲプライマーに付加して、挿入物の更なる操作およびサブクローニングを促進することができる。終止コドンをＣ末端プライマーの制限部位の前に付加して、この構築物のフランキング配列のリードスルーを防止する。ＩｇＧ２ヒンジ融合をコードするＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより生成することは、２−ヒンジを、融合パートナーのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに配置すること可能にする、または重複プライマーを使用する２ステップＰＣＲ法を使用することにより、融合パートナーの内部もしくは２つの別個の融合パートナーの間に２−ヒンジを配置することを可能にする。５プライマーＰＣＲプライマーにおけるリーダーペプチドをコードするＤＮＡ配列を組み込むことにより、融合タンパク質の分泌を促進するリーダーペプチドの組み込みも可能にする。
【０１２０】
上記の例は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列を使用する。あるいは、本発明者たちは、完全ＣＴＬＡ４配列を使用する、または本発明者たちは、受容体結合およびまたは生物学的機能が多量体化により改善され得る、他のタンパク質をコードする配列を使用する。前の例に記述されたように、本発明者たちは、完全コード配列、細胞外ドメインをコードする配列、またはより小さな多価結合融合タンパク質の生成を可能にする、受容体結合ペプチドドメインをコードするより小さな配列を使用することができる。
【０１２１】
２−ヒンジＣＴＬＡ構築物は同様に作製され、上記に記載されたようにＩｇＧ２ヒンジおよびＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含有するが、構築物のＣ末端に付加された２つのエピトープタグも含有する。これらのエピトープタグは、タンパク質の同定または精製に使用される。この第２構築物において、２つのエピトープタグのＶ５およびＨｉｓタグは、終止コドンの前のフレームに存在するが、Ｎ末端にも存在し得る。精製タグは、ＧＳＴ、ｍｙｃ、Ｈｉｓ、およびＶ５タグを含む、精製および同定に使用される多くのタンパク質タグのうちの１つまたは幾つかであり得る。
Ｂ．ＰＤ−１
【０１２２】
２−ヒンジＰＤ−１融合構築物は、ＰＣＲを使用して操作される。ＰＤ−１細胞外ドメインを含有するｃＤＮＡクローンは、商業的供給者から得られる、または商業的供給者からの多くのｃＤＮＡ（ＤＮＡ２．０  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を合成することにより得られる。あるいは、ｃＤＮＡは、多くの商業的供給者のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲにより得ることができる。ヒトＩｇＧ２ヒンジ配列に相補的であり、ＰＤ−１  ｃＤＮＡドメインに相補的なＤＮＡ配列を追加的に含有するプライマーをＰＣＲに使用して、ヒトＩｇＧ２ヒンジドメインをコードする融合ＰＣＲ産物、およびＰＤ−１細胞外ドメインをコードする配列を生成する。次にＰＣＲフラグメントを、多くの市販の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ（商標）３．３−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローンする。あるいは、制限酵素認識部位をＰＣＲプライマーに付加して、挿入物の更なる操作およびサブクローニングを促進することができる。終止コドンをＣ末端プライマーの制限部位の前に付加して、この構築物のフランキング配列のリードスルーを防止する。ＩｇＧ２ヒンジ融合をコードするＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより生成することは、２−ヒンジを、融合パートナーのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに配置すること可能にする、または重複プライマーを使用する２ステップＰＣＲ法を使用することにより、融合パートナーの内部もしくは２つの別個の融合パートナーの間に２−ヒンジを配置することを可能にする。５プライマーＰＣＲプライマーにおけるリーダーペプチドをコードするＤＮＡ配列を組み込むことにより、融合タンパク質の分泌を促進するリーダーペプチドの組み込みも可能にする。
【０１２３】
上記の例は、ＰＤ−１の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列を使用する。あるいは、本発明者たちは、完全ＰＤ−１配列を使用する、または本発明者たちは、受容体結合およびまたは生物学的機能が多量体化により改善され得る、他のタンパク質をコードする配列を使用する。前の例に記述されたように、本発明者たちは、完全コード配列、細胞外ドメインをコードする配列、またはより小さな多価結合融合タンパク質の生成を可能にする、受容体結合ペプチドドメインをコードするより小さな配列を使用することができる。
【０１２４】
２−ヒンジＰＤ−１構築物は同様に作製され、上記に記載されたようにＩｇＧ２ヒンジおよびＰＤ−１の細胞外ドメインを含有するが、構築物のＣ末端に付加された２つのエピトープタグも含有する。これらのエピトープタグは、タンパク質の同定または精製に使用される。この第２構築物において、２つのエピトープタグのＶ５およびＨｉｓタグは、終止コドンの前のフレームに存在するが、Ｎ末端にも存在し得る。精製タグは、ＧＳＴ、ｍｙｃ、Ｈｉｓ、およびＶ５タグを含む、精製および同定に使用される多くのタンパク質タグのうちの１つまたは幾つかであり得る。
Ｃ．ＣＥＲＶＩＧペプチド
【０１２５】
２−ヒンジＣＥＲＶＩＧ融合構築物は、ＰＣＲを使用して操作される。ＣＥＲＶＩＧを含有するｃＤＮＡクローンは、商業的供給者からの多くｃＤＮＡ（ＤＮＡ２．０  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を合成することにより得られる。あるいは、ｃＤＮＡはＰＣＲにより得ることができる。ヒトＩｇＧ２ヒンジ配列に相補的であり、ＣＥＲＶＩＧ  ＤＮＡドメインに相補的なＤＮＡ配列を追加的に含有するプライマーをＰＣＲに使用して、ヒトＩｇＧ２ヒンジドメインをコードする融合ＰＣＲ産物を生成する。次にＰＣＲフラグメントを、多くの市販の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ（商標）３．３−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローンする。あるいは、制限酵素認識部位をＰＣＲプライマーに付加して、挿入物の更なる操作およびサブクローニングを促進することができる。終止コドンをＣ末端プライマーの制限部位の前に付加して、この構築物のフランキング配列のリードスルーを防止する。ＩｇＧ２ヒンジ融合をコードするＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより生成することは、２−ヒンジを、融合パートナーのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに配置すること可能にする、または重複プライマーを使用する２ステップＰＣＲ法を使用することにより、融合パートナーの内部もしくは２つの別個の融合パートナーの間に２−ヒンジを配置することを可能にする。５プライマーＰＣＲプライマーにおけるリーダーペプチドをコードするＤＮＡ配列を組み込むことにより、融合タンパク質の分泌を促進するリーダーペプチドの組み込みも可能にする。これらの融合タンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジ多量体を有さない構築物と比較して高分子量の多量体を産生する。これらの多量体を、非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化した。
Ｄ．抗原結合部位を有するように操作されたＦｃ
【０１２６】
２−ヒンジＦｃ／Ｈｅｒ２ｎｅｕ融合構築物は、ＰＣＲを使用して操作される。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ結合部位を有するように操作されたＦｃドメイン（配列番号１８）を含有するｃＤＮＡクローンは、商業的供給者からの多くｃＤＮＡ（ＤＮＡ２．０  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を合成することにより得られる。あるいは、ｃＤＮＡはＰＣＲにより得ることができる。ヒトＩｇＧ２ヒンジ配列に相補的であり、Ｆｃ／Ｈｅｒ２ｎｅｕドメインに相補的なＤＮＡ配列を追加的に含有するプライマーをＰＣＲに使用して、ヒトＩｇＧ２ヒンジドメインをコードする融合ＰＣＲ産物を生成する。次にＰＣＲフラグメントを、多くの市販の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ（商標）３．３−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローンする。あるいは、制限酵素認識部位をＰＣＲプライマーに付加して、挿入物の更なる操作およびサブクローニングを促進することができる。終止コドンをＣ末端プライマーの制限部位の前に付加して、この構築物のフランキング配列のリードスルーを防止する。ＩｇＧ２ヒンジ融合をコードするＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより生成することは、２−ヒンジを、融合パートナーのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに配置すること可能にする、または重複プライマーを使用する２ステップＰＣＲ法を使用することにより、融合パートナーの内部もしくは２つの別個の融合パートナーの間に２−ヒンジを配置することを可能にする。５プライマーＰＣＲプライマーにおけるリーダーペプチドをコードするＤＮＡ配列を組み込むことにより、融合タンパク質の分泌を促進するリーダーペプチドの組み込みも可能にする。これらの融合タンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジ多量体を有さない構築物と比較して高分子量の多量体を産生する。これらの多量体を、非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化した。
実施例２−組み換えタンパク質の発現
【０１２７】
上記に考察された組成物の産生における使用に適した多数の発現系が存在する。特に、真核生物に基づいた系を、核酸配列、またはこれらの同族ポリペプチド、タンパク質、およびペプチドを産生するために用いることができる。多くのそのような系が商業的に広く入手可能である。
【０１２８】
特定の実施形態において、本明細書に記載されている２−ヒンジ多量体は、標準的なプロトコールに従って、免疫グロブリンタンパク質の組み換え産生のために十分に確立されているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の使用により産生される。あるいは、例えば、トランスジェニック動物を利用して、一般的に、十分に確立されたトランスジェニック動物技術の使用による動物の乳汁に発現させることにより、本明細書に記載されているヒト２−ヒンジ多量体を産生することができる。Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５  Ｓｅｐ；２３（９）：１１１７−２５；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ＳＭ，Ｌｅ  Ｇａｌｌ  Ｆ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４  Ｊａｎ；２６（１）：３９−６０；また、Ｋｏ  Ｋ，Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ  Ｈ．Ｐｌａｎｔ  ｂｉｏｐｈａｒｍｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２００５  Ｊｕｌ；１１１（１）：９３−１００も参照すること。
【０１２９】
昆虫細胞／バキュロウイルス系は、両方ともその全体が参照として本明細書に組み込まれる米国特許第５，８７１，９８６号、同第４，８７９，２３６号に記載されているように、異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現を産生することができ、これらは、例えば名称がＭＡＸＢＡＣ（登録商標）２．０によりＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）から、およびＢＡＣＰＡＣＫ（商標）ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭによりＣＬＯＮＴＥＣＨ（登録商標）から購入することができる。
【０１３０】
発現系の他の例には、合成エクジソン誘発性受容体を利用するＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標）のＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＣＯＮＴＲＯＬ（商標）誘発性哺乳類発現系が含まれる。誘発性発現系の他の例は、完全長ＣＭＶプロモーターを使用する誘発性哺乳類発現系であるＴ−ＲＥＸ（商標）（テトラサイクリン調節発現）系を担持する、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）から入手可能である。ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）は、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ（ピキア メタノリカ）発現系と呼ばれる酵母発現系も提供し、これは、メチロトローフ酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａにおける組み換えタンパク質の高レベル発現のために設計されている。当業者は、本明細書に記載されている発現構築物のようなベクターを、そのコード化された核酸配列、またはその同族ポリペプチド、タンパク質、もしくはペプチドを産生するためにどのように発現させるかを知っている。一般に、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｂｙ  Ｒｏｃｋｙ  Ｓ．Ｔｕａｎ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７），ＩＳＢＮ０８９６０３３３３３；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｂｙ  Ｒｏｓｈｎｉ  Ｌ．Ｄｕｔｔｏｎ，Ｊｅｎｏ  Ｍ．Ｓｃｈａｒｅｒ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００７），ＩＳＢＮ０８１３８０５１７１；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  Ｂｙ  Ｏｔｔｏ−Ｗｉｌｈｅｌｍ  Ｍｅｒｔｅｎ，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｓｔａｆｆ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２００１），ＩＳＢＮ０７９２３７１３７２を参照すること。
実施例３−免疫学的に活性な２−ヒンジ融合タンパク質の発現および精製
【０１３１】
実施例１および２に記載された核酸構築物は、２ヒンジ組み換えキメラを天然に発現しない細胞株に形質移入される。コード化されたポリペプチドは、分泌性リーダー配列に起因して分泌型タンパク質として発現し、これは、一般に、細胞の外に輸送される際に内在性プロテアーゼにより除去される、または当該技術に周知の技術により後に切断および除去される。これらの分泌型の免疫学的に活性な生体模倣体は、これらがＦｃドメインを含有するように操作されている場合、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーカラムの使用により精製される。プロテインＡまたはプロテインＧ精製は、当該技術において良く知られており、複数の商業的供給者が存在する。ＩｇＧ２多量体融合タンパク質がＨｉｓ、ｍｙｃ、またはＶ５タグのような代替的なタンパク質タグを含有する場合、これらのタグは精製に利用され得る。あるいは、非タグ化ＩｇＧ２融合多量体タンパク質では、精製は、イオン交換、ゲル濾過、および疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーのような伝統的な精製方法により達成され得る。Ｈｉｇタグクロマトグラフィー手法および他のアフィニティークロマトグラフィー精製方法は、当該技術において良く知られている。精製された２−ヒンジ融合タンパク質のサイズおよび純度は、還元的および／または非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により確認される。
実施例４−大規模生産のための免疫学的に活性なＩｇＧ２ヒンジ多量体の発現および精製
【０１３２】
多様な系が、細菌、昆虫細胞、または酵母を含む大量の特定のタンパク質を産生するために使用され得るが、哺乳類細胞における発現は、タンパク質の変更されたグリコシル化に起因する問題を最小限にすることができる。ＣＨＯ細胞のような哺乳類細胞は、Ｉｇ主鎖に融合した多様なタンパク質を過剰発現するために使用されてきた。ＩｇＧ２ヒンジ融合タンパク質が構築物にＦｃドメインを含有する場合、Ｆｃドメインは、タンパク質アフィニティーカラム精製の使用による細胞上澄みからの後の精製を可能にするタグとなる（Ｈａｒｒｉｓ，ＣＬ，ＤＭ  Ｌｕｂｌｉｎ  ａｎｄ  ＢＰ  Ｍｏｒｇａｎ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｐｉｔｆａｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６８：２４５−２５８，２００２）。多くの融合タンパク質は、Ｉｇの定常領域、特にＣＨ２およびＣＨ３部分Ｆｃドメインモノマーのフレームに直接クローンされる。Ｉｇにより発現されたインターフェロンガンマ受容体細胞外ドメインの発現の特定の例を使用して、機能的活性を有する大量のタンパク質が産生されている（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓ，Ｍ，Ｃ．Ｍｅｓａ，Ｇ．Ｓｃｈｍｉｄ，Ｒ．Ｇｅｎｔｚ，Ｍ．Ｍａｎｎｅｂｅｒｇ，Ｍ．Ｚｕｌａｕｆ，Ｚ．Ｄｅｍｂｉｃ  ａｎｄ  Ｇ．Ｇａｒｏｔｔａ，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｓ  ＩｇＧ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．．２７０：３９５８−３９６４，１９９５）。
実施例５−関節炎のマウスモデルにおける治療有用性
【０１３３】
治療ネズミコラーゲン誘発性関節炎（「ＣＩＡ」）モデルは、関節リウマチにおける治療化合物の効能のために十分に確立された予測モデルである。このモデルは、治療薬として多量体化ＣＴＬＡ４−２ヒンジを含有する化合物（「実施例５試験物質」）を評価するのに十分に適している。このモデルでは、コラーゲンを注射し、それにより関節炎をマウスに誘発する。薬剤は、悪化する関節炎を改善または逆転する能力について評価され得る。０日目に、ＤＢＡ１／Ｊマウスには、１つの陰性対照群を除いて、ウシＩＩ型コラーゲン溶液を完全フロイントアジュバントとの１：１混合物により注射する。２０日目に、コラーゲン免疫化を、コラーゲンを受けず、関節炎を発症しないと予測される動物１０匹の１つの対照群を除いて繰り返した。２２〜２７日目に、コラーゲン注射を受けたマウスには、関節炎の発生について１日おきにスコアを付ける。それぞれの足には以下のスコアを付ける。０＝関節炎の目に見える作用なし、１＝指１本に浮腫および／または紅斑；２＝指２本に浮腫および／または紅斑；３＝２本を超える指に浮腫および／または紅斑；４＝全ての足および指に重篤な関節炎。計算された関節炎指数（ＡＩ）スコアは、個別の足スコアを加えることにより得て、最大ＡＩ＝１６によりそれぞれ測定して記録される。マウスは、ＡＩスコアの３を有する場合に処置群に選択され、処置のために群分けされる。ＡＩ＝３の群が形成された日に、化合物による試験がその群において始まる。第２対照群は、治療処置を受けない。この実験群において、群は、ａ）４日毎に静脈内投与される１０ｍｇ／Ｋｇの実施例５試験物質、ｂ）４日毎に静脈内投与される３０ｍｇ／Ｋｇの実施例５試験物質、ｃ）４日毎に静脈内投与される５０ｍｇ／Ｋｇの実施例５試験物質、ｄ）４日毎に静脈内投与される１００ｍｇ／Ｋｇの実施例５試験物質、およびｅ）２日毎に静脈内投与される１０ｍｇ／Ｋｇのエタネルセプトにより個別に処置される。各群は、処置の０、４、８、および１２日目に４用量で処置され、マウスは２１日間にわたって観察される。実施例５試験物質を受けたマウスは、処置なし群よりも有意に低いＡＩスコアを有し、エタネルセプト処置群と比較して匹敵するか、またはより良好なＡＩスコアを有し、用量応答関係を実証している。
実施例６−関節炎のマウスモデルにおける治療有用性
【０１３４】
実施例５のＣＩＡ実験は、治療薬として多量体化ｐ４０−ＩｇＧ２ヒンジを含有する化合物（「実施例６試験物質」）により繰り返される。この実験において、群は、ａ）４日毎に静脈内投与される１０ｍｇ／Ｋｇの実施例６試験物質、ｂ）４日毎に静脈内投与される３０ｍｇ／Ｋｇの実施例６試験物質、ｃ）４日毎に静脈内投与される５０ｍｇ／Ｋｇの実施例６試験物質、ｄ）４日毎に静脈内投与される１００ｍｇ／Ｋｇの実施例６試験物質、およびｅ）毎日経口投与される１０ｍｇのプレドニゾロンにより個別に処置される。各試験物質群は、処置の０、４、８、および１２日目に４用量で処置され、マウスは２１日間にわたって観察される。実施例６試験物質を受けたマウスは、処置なし群よりも有意に低いＡＩスコアを有し、ステロイド処置群と比較して匹敵するか、またはより良好なＡＩスコアを有し、用量応答関係を実証している。
実施例７−フローサイトメトリーにおける診断有用性
【０１３５】
フローサイトメトリーは、細胞のような微視的粒子を、流体の流れに浮遊させ、電子検出器を通過させることによって計数および検査する技術である。これは、１秒あたり最大数千の粒子の物理的および／または化学的特徴の同時多パラメーター分析を可能にする。フローサイトメトリーは、健康障害の診断に日常的に使用されているが、研究および臨床業務の両方において他の多くの用途を有する。慣用的な研究的使用は、目的の個体群を精製するため、細胞表面マーカーのような特性に基づいて粒子を物理的に分類することである。
【０１３６】
ＭＨＣ四量体は、ＭＨＣ単位のうちビオチン−ストレプトアビジンアフィニティーの使用により頻繁に作り出され、特にＴ細胞のフローサイトメトリーを実施する試薬として有用であるので、ＩｇＧ２ヒンジの融合した多量体化ＭＨＣは、更に大きな有用性がある。目的の抗原からのペプチドは、ＭＨＣ−ＩｇＧ２ヒンジ融合タンパク質に結合し、タンパク質は蛍光標識される。それぞれのＭＨＣ四量体が、検出されることが望ましいそれぞれの抗原特異的Ｔ細胞に対して特別仕様でなければならないのと同様に、それぞれのＩｇＧ２ヒンジ−ＭＨＣ多量体も同様に特別仕様でなければならない。蛍光ＭＨＣ−抗原−ＩｇＧ２ヒンジ多量体は、このペプチドに応答する特異的Ｔ細胞だけに結合する。多量体化ＩｇＧ２ヒンジ−ＭＨＣ−抗原は、同じＭＨＣから構成され、ビオチン−ストレプトアビジン結合により組み合わされた四量体と同じほど、またはより大きな感受性により蛍光標識を介してフローサイトメトリーにより検出され得る。
【配列表】
2015506372000001.app
【国際調査報告】
2015506372.tif 000002
2015506372.tif 000003