(57)【要約】本発明は、ヒト二重微小染色体阻害剤（ＭＤＭ２ｉ）への患者の感受性を判定するためにバイオマーカーの差別的遺伝子発現を監視する方法、バイオマーカーを測定することによってＭＤＭ２ｉへの細胞の感受性を判定する方法、および候補ＭＤＭ２ｉについてスクリーニングする方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト二重微小染色体２阻害剤（ＭＤＭ２ｉ）による処置へのがん患者の感受性を予測する方法であって、
患者から得たがん試料中で、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現についてアッセイする工程を含み、少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現は、ＭＤＭ２ｉによる処置に患者が感受性であることを示す、方法。
【請求項２】
１つ超のバイオマーカーが表２から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮの遺伝子発現についてアッセイする工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのバイオマーカーのアッセイの前にｐ５３を変異についてアッセイし、ｐ５３の変異の存在はＭＤＭ２ｉへの感受性の低下を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
がん試料が、乳房、肺、すい臓、卵巣、中枢神経系（ＣＮＳ）、子宮内膜、胃、大腸、結腸、食道、骨、尿路、造血、リンパ系、肝臓、皮膚、黒色腫、腎臓、軟部組織肉腫および胸膜からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのバイオマーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質が測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＭＤＭ２ｉがイソキノリノンである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＭＤＭ２ｉが表１から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
がん患者を処置する方法であって、
患者から得たがん試料中で、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現についてアッセイする工程であって、少なくとも１つのバイオマーカーの存在はＭＤＭ２ｉへの患者の感受性を示す、工程、および
患者にＭＤＭ２ｉを投与する工程
を含む、方法。
【請求項１０】
１つ超のバイオマーカーが表２から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮについてアッセイする工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのバイオマーカーのアッセイの前にｐ５３を変異についてアッセイし、ｐ５３の変異の存在はＭＤＭ２ｉへの感受性の低下を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ＭＤＭ２ｉの投与の前に患者から生体試料を得る工程、および、ＭＤＭ２ｉ未処置のがん試料中での表２からの少なくとも１つのバイオマーカーの差別的遺伝子発現を、ＭＤＭ２ｉ処置がん試料と比較する工程をさらに含み、遺伝子発現の増加は継続した患者感受性を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
がん試料が、乳房、肺、すい臓、卵巣、中枢神経系（ＣＮＳ）、子宮内膜、胃、大腸、結腸、食道、骨、尿路、造血、リンパ系、肝臓、皮膚、黒色腫、腎臓、軟部組織肉腫および胸膜からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
ＭＤＭ２ｉがイソキノリノンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
ＭＤＭ２ｉが表１から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
ＭＤＭ２ｉが治療的有効量で投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
ヒト二重微小染色体２阻害剤（ＭＤＭ２ｉ）へのがん細胞の感受性を予測する方法であって、
患者試料から得たがん細胞中で、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現についてアッセイする工程を含み、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現は、ＭＤＭ２ｉによる処置にがん細胞が感受性であることを示す、方法。
【請求項１９】
１つ超のバイオマーカーが表２から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮについてアッセイする工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つのバイオマーカーのアッセイの前にｐ５３を変異についてアッセイし、ｐ５３の変異の存在はＭＤＭ２ｉへの感受性の低下を示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
がん試料が、乳房、肺、すい臓、卵巣、中枢神経系（ＣＮＳ）、子宮内膜、胃、大腸、結腸、食道、骨、尿路、造血、リンパ系、肝臓、皮膚、黒色腫、腎臓、軟部組織肉腫および胸膜からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つのバイオマーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質が測定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
ＭＤＭ２ｉがイソキノリノンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
ＭＤＭ２ｉが表１から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
ＭＤＭ２ｉが治療的有効量で投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
ヒト二重微小染色体２阻害剤（ＭＤＭ２ｉ）へのがん細胞の感受性を判定する方法であって、
ａ）がん細胞を少なくとも１つのＭＤＭ２ｉと接触させる工程；
ｂ）ＭＤＭ２ｉと接触させた細胞中で、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現を測定する工程であって、少なくとも１つのバイオマーカーの発現はＭＤＭ２ｉへの感受性を示す、工程；および
ｃ）少なくとも１つのＭＤＭ２ｉで処置したがん細胞の細胞増殖を、未処置またはプラセボ処置がん細胞と比較する工程であって、未処置またはプラセボ処置がん細胞と比較するとき、処置されたがん細胞の細胞増殖が低減されている、工程
を含む、方法。
【請求項２８】
少なくとも１つのＭＤＭ２ｉと接触させたがん細胞の低減された細胞増殖が、１μＭ未満のＩＣ５０を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＭＤＭ２ｉがイソキノリノンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ＭＤＭ２ｉが表１から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも２つの異なる時点で細胞をＭＤＭ２ｉと接触させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
ステップａ）で細胞を２つの異なるＭＤＭ２ｉと接触させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
細胞を２つの異なるＭＤＭ２ｉと同時に接触させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
細胞を２つの異なるＭＤＭ２ｉと異なる時点で接触させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
がん細胞が、乳房、肺、すい臓、卵巣、中枢神経系（ＣＮＳ）、子宮内膜、胃、大腸、結腸、食道、骨、尿路、造血、リンパ系、肝臓、皮膚、黒色腫、腎臓、軟部組織肉腫および胸膜からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１つのバイオマーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質が測定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮについてアッセイする工程を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
ステップｂ）およびｃ）が、ＭＤＭ２ｉの各用量の投与の後、４時間、８時間、１６時間、２４時間、４８時間、３日、１週、１カ月および数カ月後からなる群から選択される時点で繰り返される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
ＭＤＭ２ｉ候補についてスクリーニングする方法であって、
ａ）細胞をＭＤＭ２ｉ候補と接触させる工程；
ｂ）ＭＤＭ２ｉ候補と接触させた細胞中で、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現を測定する工程であって、少なくとも１つのバイオマーカーの発現はＭＤＭ２ｉへの感受性を示す、工程；および
ｃ）ＭＤＭ２ｉ候補と接触させた細胞からの細胞増殖の低減を、表１からとられたＭＤＭ２ｉと接触させた細胞の細胞増殖の低減、および未処置またはプラセボ処置した細胞の細胞増殖と比較する工程
を含む、方法。
【請求項４０】
バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮについてアッセイする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＭＤＭ２ｉ候補が、表２の少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現を増加させる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
細胞が、乳房、肺、すい臓、卵巣、中枢神経系（ＣＮＳ）、子宮内膜、胃、大腸、結腸、食道、骨、尿路、造血、リンパ系、肝臓、皮膚、黒色腫、腎臓、軟部組織肉腫および胸膜からなる群から選択されるがん細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
表２の少なくとも１つのバイオマーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が測定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮについてアッセイする工程を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
選択されたがん患者集団におけるがんの処置で使用するためのＭＤＭ２ｉを含む組成物であって、がん患者集団が、前記患者から得たがん細胞試料中での、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現の出現に基づいて選択される、組成物。
【請求項４６】
がん細胞試料が、乳房、肺、すい臓、卵巣、中枢神経系（ＣＮＳ）、子宮内膜、胃、大腸、結腸、食道、骨、尿路、造血、リンパ系、肝臓、皮膚、黒色腫、腎臓、軟部組織肉腫および胸膜からなる群から選択される、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮの遺伝子発現に基づいて患者が選択される、請求項４５または４６に記載の組成物。
【請求項４８】
ヒト二重微小染色体２阻害剤（ＭＤＭ２ｉ）による処置へのがん患者の感受性を予測するためのキットであって、
ｉ）バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮの発現を検出する手段；ならびに
ｉｉ）前記キットの使用説明書
を含む、キット。
【請求項４９】
請求項１〜３７に記載の方法のいずれかのための、請求項４８に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、薬理ゲノミクスの分野、ならびに処置の前に患者の感受性を判定すること、処置後の患者の応答、すなわちがん感受性を追跡すること、および化合物をスクリーニングすることにおいて有益な、バイオマーカーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
腫瘍タンパク質５３としても知られるｐ５３は、がんの予防に関与する、しばしばゲノムのゲートキーパーまたはガーディアンと呼ばれる腫瘍抑制遺伝子である（Levine、Cell 1997、88:323〜331）。ｐ５３遺伝子は、通例静止している転写因子をコードし、細胞がストレスまたは傷害を受けるとき、例えばＤＮＡ傷害が変異原から発生するときに活性化される。細胞がストレスまたは傷害を受けるとき、傷害を受けた細胞を除去し、生物体にとってもはや脅威でないように、ｐ５３は傷害を制限するかそれを除き、アポトーシス経路を始動させる作用をする（Vogelsteinら、Nature 2000、408:307〜310）。様々ながんの分析は、ｐ５３がヒトがんの約５０％で変異することを示した（Hollsteinら、Nucleic Acids Res. 1994、22:3551〜3555：Hollsteinら、Science 1991、253(5015):49〜53）。単一の機能性コピーのみを有するｐ５３がヘテロ接合であるヒトは、成人期の早期に、リー・フロイメニ症候群として知られる障害である腫瘍を発症する（Varleyら、Hum. Mutat. 2003、21(3):313〜320）。しかし、ｐ５３が細胞の消長を調節するのと同じくらい、ｐ５３はＭＤＭ２として知られる別のタンパク質によって調節される。
【０００３】
二重微小染色体２タンパク質（Double minute 2 protein）（ＭＤＭ２）は、ｐ５３の負の調節因子として発見された（Fakharzadehら、EMBO J. 1991、10(6):1565〜1565）。ＭＤＭ２は、ｐ５３結合ドメインおよび核外移行シグナル配列を含有するＥ３リガーゼをコードし、ｐ５３と複合体を形成すると、核からそれを除去してユビキチン化し、そのことはユビキチン−プロテオゾーム経路によるｐ５３タンパク質の分解を促進する（Hauptら、Nature 1997、387(6630):296〜299；Pietteら、Oncogene 1997、15(9):1001〜1010）。さらに、ＭＤＭ２はｐ５３トランス活性化ドメインへの結合によってｐ５３の活性を直接に阻害し、そのこともｐ５３媒介遺伝子発現を阻止する（Wuら、Genes Dev. 1993、7:1126〜1132）。したがって、ＭＤＭ２は複数の方法でｐ５３を調節する。
【０００４】
ＭＤＭ２は、いくつかのがん、例えば脂肪肉腫、グリア芽細胞腫および白血病で過剰発現される（Momandら、Nucleic Acids Res. 1998、26(15):3453〜3459）。ＭＤＭ２の過剰発現はｐ５３の活性に干渉し、腫瘍のアポトーシスおよび増殖停止を阻止することができる（de Rozieresら、Oncogene 2000、19(13):1691〜1697）。ＭＤＭ２の過剰発現は、神経膠腫および急性リンパ球性白血病での不良な予後と相関する（Onelら、Mol. Cancer Res. 2004、2(1):1〜8）。
【０００５】
ＭＤＭ２はｐ５３の阻害剤であるので、ｐ５３へのＭＤＭ２の結合を阻止する治療薬はｐ５３の分解を阻止し、遊離のｐ５３を結合させ、がん細胞での遺伝子発現を媒介し、細胞周期の停止およびアポトーシスをもたらす。ｐ５３−ＭＤＭ２相互作用の小分子阻害剤に関する以前の報告がある（Vassilevら、Science、2004、303(5659):844〜888；Zhangら、Anticancer drugs、2009、20(6):416〜424；Vuら、Curr. Topics Microbiol. Immuno.、2011、348:151〜172）。これらの化合物の結合様式およびヒトＭＤＭ２−Ｎｕｔｌｉｎ複合体の結晶構造、ならびにＭＤＭ２の上のｐ５３結合部位の足場およびポケットも公知である（Vassilev、上記）。Ｎｕｔｌｉｎとして知られるこれらのＭＤＭ２阻害剤の最初のものはＭＤＭ２に結合し、ｐ５３結合ポケットを占有し、ＭＤＭ２−ｐ５３複合体の形成を阻止する。これは、ｐ５３タンパク質のより少ない分解、およびｐ５３標的遺伝子の発現につながる。Ｎｕｔｌｉｎで処置されたがん細胞系は、増殖停止およびアポトーシスの増加を示した。例えば、ＳＪＳＡ−１骨肉腫系は、ＭＤＭ２遺伝子の増幅されたコピーを含有する。Ｎｕｔｌｉｎ−３によるこの系の処置は、増殖を低減し、アポトーシスを増加させた（Vassilevら、Science、2004、303(5659):844〜888）。ＳＪＳＡ−１細胞系は、マウスでの異種移植の作製で使用された。Ｎｕｔｌｉｎ−３の投与は、異種移植の増殖を９０％低減した。非がん性細胞に及ぼすＮｕｔｌｉｎ化合物の効果を調査するために、ヒトおよびマウスの正常な線維芽細胞をＮｕｔｌｉｎ−３で処置したところ、細胞の増殖が遅くなるものの、それらは生存力を保持した（Vassilev、上記）。
【０００６】
特にがんに関して、どの患者が治療薬を与えられるべきかについて指示するバイオマーカーを見出すことは有益である。これは、試行錯誤のアプローチと対照的に、よりタイムリーで攻撃的な処置を可能にする。さらに、投与後に細胞が療法に感受性であり続けることを示すバイオマーカーの発見も有益である。これらのバイオマーカーは、治療薬を与えられている患者の応答を監視するために使用することができる。患者が処置に非感受性になったことをバイオマーカーが示すならば、投与する薬量を増加するか、減少させるか、完全に中止するか、または追加の治療薬を投与することができる。このように、ＭＤＭ２阻害剤と関連するバイオマーカーを開発する必要性がある。このアプローチは正しい患者が適当な処置を受けることを確実にし、処置期間中に、継続するＭＤＭ２阻害剤感受性について患者を監視することができる。
【０００７】
ＭＤＭ２阻害剤の開発においては、特異的バイオマーカーが、投与による作用機構の理解を助ける。作用機構は、細胞周期および差別的遺伝子発現における調節機構の複合カスケードを含む可能性がある。この分析は、ＭＤＭ２阻害剤候補へのがん細胞の特定の感受性およびその候補の活性を判定するために、薬物開発の前臨床段階で行われる。薬力学的調査で特に興味があるものは、本明細書に開示されるものなどの、感度および活性のある特異的マーカーの同定である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明は、表２の同定されたいくつかの遺伝子が、ＭＤＭ２阻害剤（以降、「ＭＤＭ２ｉ」）への細胞の感受性の判定で特異的バイオマーカーとして働くという分析に関する。本発明は、表２のバイオマーカーの少なくとも１つが、どのがん細胞がＭＤＭ２ｉに感受性であるか予測することにおいて、精度および特異性が増加したＭＤＭ２ｉの「遺伝子サイン」を提供するという分析に関する。この方法は、ＭＤＭ２ｉへのがん試料の感受性を予測する、患者からとられたがん試料における表２のバイオマーカーの少なくとも１つの遺伝子発現またはタンパク質レベルを分析する。発現レベルの変化のパターンは、好ましい応答または好ましからぬ応答の指標となることができる。さらに、表２で提供される遺伝子サインは、ｐ５３経路が機能的であることも示すため、高い予測値を有する。多くの腫瘍が、変異したｐ５３、および腫瘍に増殖優位性を提供する非機能的経路を有するため、これは予想外の結果である。本発明は、その個体に特異的である機能的ゲノムサインに基づいて患者が処置される「カスタマイズされた薬」の例である。
【０００９】
表２の少なくとも１つのバイオマーカーの予測値は、患者が処置に感受性であり続けているかどうか判定するために、ＭＤＭ２ｉによる処置の後に使用することもできる。ＭＤＭ２ｉ治療薬が投与されたならば、ＭＤＭ２ｉ処置への患者の継続した感受性を監視するためにバイオマーカーが使用される。本開示は、ＭＤＭ２ｉ処置の後の、同定された遺伝子の発現の上方または下方制御にも関する。これは、患者が正しい処置クールを受けると判定することにおいて有益である。本発明は、ＭＤＭ２ｉ処置への患者の感受性を予測および監視する方法を含む。本方法は、患者へのＭＤＭ２ｉの投与のステップ、および患者から得た生体試料でのバイオマーカー遺伝子の発現の測定のステップを含む。患者の応答は、表２からの少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現の検出に基づいて評価される。少なくとも１つのバイオマーカーの発現レベルの検出および／または変化は、処置への患者の感受性の指標となる。発現レベルのパターンは、患者の好ましい応答または好ましからぬ応答の指標となることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａは、ｐ５３−ＭＤＭ２相互作用の破壊におけるＭＤＭ２ｉのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を示す図である。図１Ｂは、がん細胞の増殖に対するＭＤＭ２ｉのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を示す図である。
【図２】ｐ５３の状態（変異体または野生型）およびＭＤＭ２ｉ（２）へのがん細胞の感受性を示す図である。Ｘ軸は感受性の交差点であり、Ｙ軸はＡｍａｘ値である。図２は、ＭＤＭ２ｉ（２）への細胞の感受性、およびｐ５３の変異の状態、ｍｔ（変異体）または野生型（ｗｔ）を示す。ｍｔパネルはｐ５３変異ＣＣＬＥ細胞系のＭＤＭ２ｉ（２）感受性プロファイルを提示し、ｗｔパネルはｐ５３野生型ＣＣＬＥ細胞系のＭＤＭ２ｉ（２）感受性プロファイルを提示する。Ａｍａｘは、最大効果レベル（参照阻害剤に対して較正された、最も高いＭＤＭ２ｉ（２）試験濃度での阻害）と規定され、ＩＣ５０は、ＭＤＭ２ｉ（２）応答が参照阻害剤に対して−５０の絶対阻害に到達したμＭ濃度と規定される。細胞系計数は、ＭＤＭ２ｉ（２）化学的感受性およびｐ５３変異状態、および関連する統計値に細分化される。データは、関連する統計値の分割表としても提示される。
【図３】発現の変化倍率および過剰発現値の統計的有意性を示すバイオマーカーを示す図である。図３は、選択されたＭＤＭ２ｉ化学的感受性予測バイオマーカーおよびそれらの関連する統計値を示す。遺伝子識別情報は、公式のＨＵＧＯ記号である。「Ｅｘｐｒ」接頭辞は、これらのバイオマーカーが転写産物発現型であることを示す。
【図４】様々な濃度のＭＤＭ２ｉ（１）で４時間処置し、代表的な薬力学的バイオマーカーとして選択されたｐ５３標的遺伝子について精査した、感受性および非感受性の代表的細胞のウェスタンブロットを示す図である。
【図５】より大きなバイオマーカーセットに対して遺伝子サインの予測値の増加を実証するグラフである。図５は、ＭＤＭ２ｉ（２）化学的感受性予測モデルの交差検証性能を示す。３つの予測特性セットから誘導されるモデルの性能は、感受性（正しく予測された感受性細胞系の画分）、特異性（正しく予測された非感受性細胞系の画分）、ＰＰＶ（正の予測値、このように予測される感受性細胞系の画分）およびＮＰＶ（負の予測値、このように予測される非感受性細胞系の画分）を使用して評価される。エラーバーは、５倍の交差検証の５反復の平均値の１つの標準偏差である。表２に表す１３個の選択されたバイオマーカーを用いたモデルは、ＭＤＭ２ｉ（２）化学的感受性のより優れた予測性を達成し、これは性能測定と独立しているが、ＰＰＶを性能指示器とみなすときに最も著しい。
【図６】遺伝子サイン、および細胞系が感受性であるか非感受性であるかどうかの予測、およびＭＤＭ２ｉで処置したときのＩＣ５０について各々分析した細胞系のリストを示す図である。
【図７】図７Ａ〜Ｃは、ＭＤＭ２ｉ（１）による処置の後の、ＳＪＳＡ−１異種移植モデルにおける腫瘍増殖の用量依存的阻害（遺伝子サインにより感受性であると予測される）、代表的薬力学的バイオマーカーとしてのｐ２１（ＣＤＫＮ１Ａ）発現の同時誘導を示す図である。
【図８】有効用量でのＭＤＭ２ｉ（１）感受性細胞の処置の後の、タンパク質レベルでのｐ２１（ＣＤＫＮ１Ａ）の発現を示す図である。
【図９】ＯｎｃＥｘｐｒｅｓｓデータベースおよび原発腫瘍バンクの遺伝子サインを使用して感受性であると予測された腫瘍試料のモデルを示す図である。図９は、ヒト原発腫瘍コレクションおよびＣＣＬＥ細胞系データにおける、ＭＤＭ２ｉ化学的感受性予測の系統特異的相関を示す。左のパネルは、ヒト原発腫瘍試料コレクションからの予測された感受性試料の画分と細胞系データで観察された感受性比の間の相関を示す。右のパネルは、ヒト原発腫瘍試料コレクションからの予測された感受性試料の画分と原発腫瘍異種移植コレクションで予測された感受性比の間の相関を示す。試料／異種移植／細胞系は、系統によって組織される。破線は、同一性の線である。
【図１０】表２に記載されるバイオマーカーの複数の組合せから構築された、ＭＤＭ２ｉ（２）感受性予測モデルによって達成された正の予測値（ＰＰＶ）を表す図である。図１０は、バイオマーカーの複数の組合せから構築されたＭＤＭ２ｉ（２）感受性予測モデルによって達成された正の予測値（ＰＰＶ）を示す。組合せおよび単一遺伝子モデルのＰＰＶは、箱髭図で示され、２つのｐ５３変異状態および１３個のバイオマーカーモデルによって与えられるＰＰＶと比較される（髭は四分位間範囲の１．５倍伸長し、黒線は中央値であり、ノッチは中央値信頼区間の推定であり、箱幅はデータポイントの数に比例し、外れ値は示さない；「ｂｍ」：バイオマーカー；「ａｌｌＥｘＭｔ」：ｐ５３の全エクソン変異モデル；「ｅｘ５ｔｏ８ｍｔ」：ｐ５３のエクソン５〜８変異モデル）。
【図１１】表２に記載されるバイオマーカーの複数の組合せから構築された、ＭＤＭ２ｉ感受性予測モデルによって達成された特異性を表す図である。図１１は、バイオマーカーの複数の組合せから構築されたＭＤＭ２ｉ（２）感受性予測モデルによって達成された特異性を示す。組合せおよび単一遺伝子モデルの特異性は、箱髭図で示され、２つのｐ５３変異状態および１３個のバイオマーカーモデルによって与えられるＰＰＶと比較される（髭は四分位間範囲の１．５倍伸長し、黒線は中央値であり、ノッチは中央値信頼区間の推定であり、箱幅はデータポイントの数に比例し、外れ値は示さない；「ｂｍ」：バイオマーカー；「ａｌｌＥｘＭｔ」：ｐ５３の全エクソン変異モデル；「ｅｘ５ｔｏ８ｍｔ」：ｐ５３のエクソン５〜８変異モデル）。
【図１２】表２に記載されるバイオマーカーの複数の組合せから構築された、ＭＤＭ２ｉ感受性予測モデルによって達成された感受性を表す図である。図１２は、バイオマーカーの複数の組合せから構築されたＭＤＭ２ｉ（２）感受性予測モデルによって達成された感受性を示す。組合せおよび単一遺伝子モデルの感受性は、箱髭図で示され、２つのｐ５３変異状態および１３個のバイオマーカーモデルによって与えられるＰＰＶと比較される（髭は四分位間範囲の１．５倍伸長し、黒線は中央値であり、ノッチは中央値信頼区間の推定であり、箱幅はデータポイントの数に比例し、外れ値は示さない；「ｂｍ」：バイオマーカー；「ａｌｌＥｘＭｔ」：ｐ５３の全エクソン変異モデル；「ｅｘ５ｔｏ８ｍｔ」：ｐ５３のエクソン５〜８変異モデル）。
【図１３】ｐ５３変異状態と一緒に、表２に記載されるバイオマーカーの複数の組合せから構築された、ＭＤＭ２ｉ感受性予測モデルによって達成されたＰＰＶを表す図である。図１３は、バイオマーカーとｐ５３変異状態の組合せから構築されたＭＤＭ２ｉ（２）感受性予測モデルによって達成された正の予測値（ＰＰＶ）を示す。プロットの説明については、図１０、１１または１２を参照されたい；「ｂｍ」：バイオマーカー；「ｍｔ」：ｐ５３のエクソン５〜８変異；「ａｌｌＥｘＭｔ」：ｐ５３の全エクソン変異モデル；「ｅｘ５ｔｏ８ｍｔ」：ｐ５３のエクソン５〜８変異モデル。
【図１４】ｐ５３変異状態と一緒に、表２に記載されるバイオマーカーの複数の組合せから構築された、ＭＤＭ２ｉ感受性予測モデルによって達成された特異性を表す図である。図１４は、バイオマーカーとｐ５３変異状態の組合せから構築されたＭＤＭ２ｉ（２）感受性予測モデルによって達成された特異性を示す。プロットの説明については、図１０、１１または１２を参照されたい；「ｂｍ」：バイオマーカー；「ｍｔ」：ｐ５３のエクソン５〜８変異；「ａｌｌＥｘＭｔ」：ｐ５３の全エクソン変異モデル；「ｅｘ５ｔｏ８ｍｔ」：ｐ５３のエクソン５〜８変異モデル。
【図１５】ｐ５３変異状態と一緒に、表２に記載されるバイオマーカーの複数の組合せから構築された、ＭＤＭ２ｉ感受性予測モデルによって達成された感受性を表す図である。図１５は、バイオマーカーとｐ５３変異状態の組合せから構築されたＭＤＭ２ｉ（２）感受性予測モデルによって達成された感受性を示す。プロットの説明については、図１０、１１または１２を参照されたい；「ｂｍ」：バイオマーカー；「ｍｔ」：ｐ５３のエクソン５〜８変異；「ａｌｌＥｘＭｔ」：ｐ５３の全エクソン変異モデル；「ｅｘ５ｔｏ８ｍｔ」：ｐ５３のエクソン５〜８変異モデル。
【図１６】ＭＤＭ２ｉ（１）へのヒト原発異種移植モデルの応答およびそれらの予測された感受性／非感受性を示すグラフである。図１６は、表２に開示されるバイオマーカーを使用してＭＤＭ２ｉに感受性であると予測され、１００ｍｇ／ｋｇのＭＤＭ２ｉ（１）の連日投与に感受性であると確認されるヒト原発異種移植モデルを表し、がん患者集団での記載された予測モデルの使用を支持する（ＨＭＥＸ＝黒色腫；ＨＣＯＸ＝結腸直腸がん；ＨＳＡＸ＝脂肪肉腫；ＨＫＩＸ＝腎細胞癌；ＣＨＬＩまたはＨＬＩＸ＝肝がん；ＨＢＲＸ＝乳がん；ＨＰＡＸ＝膵がん；ＨＬＵＸ＝肺がん）。
【図１７】野生型ｐ５３のために予め選択され、感受性／非感受性であると次に予測されるヒト原発異種移植モデルのＭＤＭ２ｉ（１）への応答を示すグラフである。図１７は、表２に開示されるバイオマーカーを使用してＭＤＭ２ｉに感受性であると予測され、１００ｍｇ／ｋｇのＭＤＭ２ｉ（１）の連日投与に感受性であると確認される野生型ｐ５３ヒト原発異種移植モデルを示し、野生型ｐ５３の予め選択されたがん患者集団での記載された予測モデルの使用を支持する（ＨＭＥＸ＝黒色腫；ＨＣＯＸ＝結腸直腸がん；ＨＳＡＸ＝脂肪肉腫；ＨＫＩＸ＝腎細胞癌；ＣＨＬＩ＝肝がん；ＨＰＡＸ＝膵がん；ＨＬＵＸ＝肺がん）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の説明
本発明の態様、特色および実施形態は、以下の項目に要約され、それぞれ単独でまたは組み合わせて使用することができる：
【００１２】
１．ヒト二重微小染色体２（Human Double Minute 2）阻害剤（ＭＤＭ２ｉ）による処置へのがん患者の感受性を予測する方法であって、患者から得たがん試料中で、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現を測定する工程を含み、少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現は、ＭＤＭ２ｉによる処置に患者が感受性であることを示す方法。
【００１３】
２．患者から得たがん試料中で、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現を測定する工程；ＭＤＭ２ｉへの患者の感受性を判定する工程；および患者にＭＤＭ２ｉを投与する工程を含む、がん患者を処置する方法。
【００１４】
３．患者から得たがん試料中で、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現についてアッセイする工程であり、少なくとも１つのバイオマーカーの存在は、ＭＤＭ２ｉへの患者の感受性を示す、工程；および患者にＭＤＭ２ｉを投与する工程を含む、がん患者を処置する方法。
【００１５】
４．ヒト二重微小染色体２阻害剤（ＭＤＭ２ｉ）へのがん細胞の感受性を予測する方法であって、患者のがん試料から得たがん細胞中で、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現についてアッセイする工程を含み、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現は、ＭＤＭ２ｉによる処置にがん細胞が感受性であることを示す方法。
【００１６】
５．ヒト二重微小染色体２阻害剤（ＭＤＭ２ｉ）へのがん細胞の感受性を予測する方法であって、細胞中で、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現を測定する工程を含み、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現は、ＭＤＭ２ｉによる処置にがん細胞が感受性であることを示す方法。
【００１７】
６．ＭＤＭ２ｉ候補についてスクリーニングする方法であって、
ａ）細胞をＭＤＭ２ｉ候補と接触させる工程；
ｂ）ＭＤＭ２ｉ候補と接触させた細胞中で、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現を測定する工程であり、少なくとも１つのバイオマーカーの発現はＭＤＭ２ｉへの感受性を示す、工程；ならびに
ｃ）ＭＤＭ２ｉ候補と接触させた細胞からの細胞増殖の低減を、表１からとられたＭＤＭ２ｉと接触させた細胞の細胞増殖の低減、および未処置またはプラセボ処置した細胞の細胞増殖と比較する工程を含む方法。
【００１８】
７．ヒト二重微小染色体２阻害剤（ＭＤＭ２ｉ）へのがん細胞の感受性を判定する方法であって、ａ）がん細胞を少なくとも１つのＭＤＭ２ｉと接触させる工程；ｂ）ＭＤＭ２ｉと接触させた細胞中で、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現を測定する工程；ｃ）少なくとも１つのＭＤＭ２ｉで処置したがん細胞の細胞増殖を、未処置またはプラセボ処置がん細胞と比較する工程を含み、未処置またはプラセボ処置がん細胞（untreated to placebo treated cancer cell）と比較するとき、処置されたがん細胞の細胞増殖が低減されている、工程を含む方法。
【００１９】
８．表２から１つ超のバイオマーカーが選択される、項目１〜７のいずれか一項の方法。
【００２０】
９．表２から少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２個、または１３個全てのバイオマーカーが選択される、項目１または８の方法。
【００２１】
１０．表２から選択される任意のバイオマーカーに加えて、バイオマーカーとしてｐ５３が選択される、項目１〜９のいずれか一項の方法。
【００２２】
１１．バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂおよび／またはＡＥＮを含む、項目１〜１０のいずれか一項の方法。
【００２３】
１２．少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現を対照試料の遺伝子発現と比較することは、機能的ｐ５３遺伝子経路を示す、項目１〜１１のいずれか一項の方法。
【００２４】
１３．がん試料が、乳房、肺、すい臓、卵巣、中枢神経系（ＣＮＳ）、子宮内膜、胃、大腸、結腸、食道、骨、尿路、造血、リンパ系、肝臓、皮膚、黒色腫、腎臓、軟部組織肉腫および胸膜からなる群から選択される、項目１〜４または８〜１２のいずれか一項の方法。
【００２５】
１４．少なくとも１つのバイオマーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質が測定される、項目１〜１３のいずれか一項の方法。
【００２６】
１５．対照と比較するとき、少なくとも１つのバイオマーカーの発現ががん試料で増加する、項目１、２または５〜１１のいずれか一項の方法。
【００２７】
１６．ＭＤＭ２ｉが表１から選択される、項目１〜１５のいずれか一項の方法。
【００２８】
１７．ＭＤＭ２ｉがＭＤＭ２のｐ５３結合ポケットに結合する化合物である、項目１〜１６のいずれか一項の方法。
【００２９】
１８．ＭＤＭ２ｉが、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａまたは表１のＭＤＭ２ｉと実質的に同じであるＭＤＭ２のｐ５３結合ポケットに結合する化合物である、項目１〜１６のいずれか一項の方法。
【００３０】
１９．ＭＤＭ２ｉが、ｐ５３とＭＤＭ２の間のタンパク質間相互作用を阻止する化合物である、項目１〜１８のいずれか一項の方法。
【００３１】
２０．ＭＤＭ２ｉが、ｐ５３経路活性を誘導することによって細胞増殖を阻害する化合物である、項目１〜１９のいずれか一項の方法。
【００３２】
２１．ＭＤＭ２ｉの投与の前に患者から生体試料を得る工程をさらに含む、項目２〜２０のいずれか一項の方法。
【００３３】
２２．ＭＤＭ２ｉが治療的有効量で投与される、項目２〜２１のいずれか一項の方法。
【００３４】
２３．少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現ががん細胞で増加する、項目４〜１４、または１６〜２２のいずれか一項の方法。
【００３５】
２４．少なくとも１つのＭＤＭ２ｉと接触させたがん細胞のＩＣ５０が１μＭ未満である、項目３〜５または７〜２３のいずれか一項の方法。
【００３６】
２５．少なくとも２つの異なる時点で細胞をＭＤＭ２ｉと接触させる、項目３〜５または７〜２５のいずれか一項の方法。
【００３７】
２６．細胞を２つの異なるＭＤＭ２ｉと接触させる、項目３〜５または７〜２６のいずれか一項の方法。
【００３８】
２７．細胞を２つの異なるＭＤＭ２ｉと同時に接触させる、項目２６の方法。
【００３９】
２８．細胞を２つの異なるＭＤＭ２ｉと異なる時点で接触させる、項目２６の方法。
【００４０】
２９．ＭＤＭ２ｉがイソキノリノンである、項目１〜２８のいずれか一項の方法。
【００４１】
３０．ＭＤＭ２ｉ候補についてスクリーニングする方法であって、ａ）細胞をＭＤＭ２ｉ候補と接触させる工程；ｂ）ＭＤＭ２ｉ候補と接触させた細胞中で、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現を測定する工程であって；ｃ）少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現はＭＤＭ２ｉへの感受性を示すこと；およびｄ）ＭＤＭ２ｉ候補と接触させた細胞からの細胞増殖の低減を、表１からとられたＭＤＭ２ｉと接触させた細胞の細胞増殖の低減、および未処置またはプラセボ処置した細胞の細胞増殖と比較する工程を含む方法。
【００４２】
３１．ＭＤＭ２ｉ候補の遺伝子発現を表１から選択されるＭＤＭ２ｉの遺伝子発現と比較する、項目３０の方法。
【００４３】
３２．ＭＤＭ２ｉ候補が、表２からの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２個、または１３個全てのバイオマーカーの遺伝子発現を増加させる、項目３０または３１の方法。
【００４４】
３３．細胞が、乳房、肺、すい臓、卵巣、中枢神経系（ＣＮＳ）、子宮内膜、胃、大腸、結腸、食道、骨、尿路、造血、リンパ系、肝臓、皮膚、黒色腫、腎臓、軟部組織肉腫および胸膜からなる群から選択されるがん細胞である、項目３０〜３２のいずれか一項の方法。
【００４５】
３４．表２の少なくとも１つのバイオマーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が測定される、項目３０〜３３のいずれか一項の方法。
【００４６】
３５．バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮを含む、項目３０〜３４のいずれか一項の方法。
【００４７】
３６．選択されたがん患者集団におけるがんの処置で使用するためのＭＤＭ２ｉを含む組成物であって、がん患者集団が、前記患者から得たがん細胞試料中での、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現に基づいて選択される組成物。
【００４８】
３７．表２から少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２個、または１３個全てのバイオマーカーが選択される、項目３６の組成物。
【００４９】
３８．表２から選択される任意のバイオマーカーに加えて、バイオマーカーとしてｐ５３が選択される、項目３６または３７の組成物。
【００５０】
３９．バイオマーカーがＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂおよび／またはＡＥＮである、項目３６〜３８のいずれか一項の組成物。
【００５１】
４０．ＭＤＭ２ｉが表１から選択される、項目３６〜３９のいずれか一項の組成物。
【００５２】
４１．ＭＤＭ２ｉがＭＤＭ２のｐ５３結合ポケットに結合する化合物である、項目３６〜４０のいずれか一項の組成物。
【００５３】
４２．ＭＤＭ２ｉが、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａまたは表１のＭＤＭ２ｉと実質的に同じであるＭＤＭ２のｐ５３結合ポケットに結合する化合物である、項目３６〜４１のいずれか一項の組成物。
【００５４】
４３．ＭＤＭ２ｉが、ｐ５３とＭＤＭ２の間のタンパク質間相互作用を阻止する化合物である、項目３６〜４２のいずれか一項の組成物。
【００５５】
４４．ＭＤＭ２ｉが、ｐ５３経路活性を誘導することによって細胞増殖を阻害する化合物である、項目３６〜４３のいずれか一項の組成物。
【００５６】
４５．ＭＤＭ２ｉがイソキノリノンである、項目３６〜４４のいずれか一項の組成物。
【００５７】
４６．がん細胞試料が、乳房、肺、すい臓、卵巣、中枢神経系（ＣＮＳ）、子宮内膜、胃、大腸、結腸、食道、骨、尿路、造血、リンパ系、肝臓、皮膚、黒色腫、腎臓、軟部組織肉腫および胸膜からなる群から選択される、項目３６〜４５のいずれか一項の組成物。
【００５８】
４７．バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮの遺伝子発現に基づいて患者が選択される、項目３６〜４６のいずれか一項の組成物。
【００５９】
４８．野生型ｐ５３の予め選択されたがん患者集団から選択される、選択されたがん患者集団でのがんの処置で使用するための、項目３６、３７または３９〜４７のいずれか一項の組成物。
【００６０】
４９．ヒト二重微小染色体２阻害剤（ＭＤＭ２ｉ）による処置へのがん患者の感受性を予測するためのキットであって、ｉ）表２からのバイオマーカーのいずれか１つ、好ましくは表２から選択される１つ超の、特に少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２個、または１３個全てのバイオマーカーの発現を検出する手段；およびｉｉ）前記キットの使用説明書を含むキット。
【００６１】
５０．バイオマーカーがＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂおよび／またはＡＥＮである、項目４９のキット。
【００６２】
５１．ｐ５３の発現を検出するための手段をさらに含む、項目４９または５０のキット。
【００６３】
５２．項目１〜３２の方法のいずれかのための、項目４９〜５１によるキットの使用。
【００６４】
一態様では、本開示は、がん細胞を含有する試料において表２で特定されるバイオマーカーの少なくとも１つを分析する方法を提供し、この方法において、少なくとも１つのバイオマーカーの発現は、がん細胞がＭＤＭ２ｉ処置に感受性になるかどうかを示す。発現変化のパターンは、良好な患者応答、または好ましからぬ応答の指標となることができ、表２からの少なくとも１つのバイオマーカーの発現に基づいて患者を選択することもできるし、拒絶することもできる。あるいは、表２のバイオマーカーの全てを単一のセットとしてアッセイすることができる。
【００６５】
ＭＤＭ２ｉによる処置の後、本開示は、がん細胞を含有する試料中で、表２で特定されるバイオマーカーの少なくとも１つを分析する方法を提供し、この方法において、ＭＤＭ２ｉ処置の後のバイオマーカーの発現は、患者がなおＭＤＭ２ｉ処置に感受性であることを示す。少なくとも１つのバイオマーカーの発現レベルの検出および／または変化は、ＭＤＭ２ｉ感受性の指標であり、これは処置への患者の応答と相関する。あるいは、表２のバイオマーカーの全てを単一のセットとしてアッセイすることができる。発現のパターンは、好ましい患者応答または好ましからぬ応答の指標となることができる。
【００６６】
したがって、本開示は、ヒト二重微小染色体２阻害剤（ＭＤＭ２ｉ）による処置へのがん患者の感受性を予測する方法であって、患者から得たがん試料中で、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現をアッセイする工程を含み、少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現は、ＭＤＭ２ｉによる処置に患者が感受性であることを示す方法を提供する。
【００６７】
表２から１つ超のバイオマーカーが選択される方法。
【００６８】
バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮの遺伝子発現についてアッセイする工程を含む方法。
【００６９】
少なくとも１つのバイオマーカーのアッセイの前にｐ５３を変異についてアッセイし、ｐ５３の変異の存在はＭＤＭ２ｉへの感受性の低下を示す方法。
【００７０】
がん試料が、乳房、肺、すい臓、卵巣、中枢神経系（ＣＮＳ）、子宮内膜、胃、大腸、結腸、食道、骨、尿路、造血、リンパ系、肝臓、皮膚、黒色腫、腎臓、軟部組織肉腫および胸膜からなる群から選択される方法。
【００７１】
少なくとも１つのバイオマーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質が測定される方法。
【００７２】
ＭＤＭ２ｉがイソキノリノンである方法。
【００７３】
ＭＤＭ２ｉが表１から選択される方法。
【００７４】
患者から得たがん試料中で、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現についてアッセイする工程であり、少なくとも１つのバイオマーカーの存在は、ＭＤＭ２ｉへの患者の感受性を示す、工程；および患者にＭＤＭ２ｉを投与する工程を含む、がん患者を処置する方法。
【００７５】
表２から１つ超のバイオマーカーが選択される方法。
【００７６】
バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮについてアッセイする工程を含む方法。
【００７７】
少なくとも１つのバイオマーカーのアッセイの前にｐ５３を変異についてアッセイし、ｐ５３の変異の存在はＭＤＭ２ｉへの感受性の低下を示す方法。
【００７８】
ＭＤＭ２ｉの投与の前に患者から生体試料を得る工程、およびＭＤＭ２ｉ未処置のがん試料中での表２からの少なくとも１つのバイオマーカーの差別的遺伝子発現を、ＭＤＭ２ｉ処置がん試料と比較する工程をさらに含み、遺伝子発現の増加は継続した患者感受性を示す方法。
【００７９】
がん試料が、乳房、肺、すい臓、卵巣、中枢神経系（ＣＮＳ）、子宮内膜、胃、大腸、結腸、食道、骨、尿路、造血、リンパ系、肝臓、皮膚、黒色腫、腎臓、軟部組織肉腫および胸膜からなる群から選択される方法。
【００８０】
ＭＤＭ２ｉがイソキノリノンである方法。
【００８１】
ＭＤＭ２ｉが表１から選択される方法。
【００８２】
ＭＤＭ２ｉが治療的有効量で投与される方法。
【００８３】
ヒト二重微小染色体２阻害剤（ＭＤＭ２ｉ）へのがん細胞の感受性を予測する方法であって、患者試料から得たがん細胞中で、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現についてアッセイする工程を含み、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現は、ＭＤＭ２ｉによる処置にがん細胞が感受性であることを示す方法。
【００８４】
表２から１つ超のバイオマーカーが選択される方法。
【００８５】
バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮについてアッセイする工程を含む方法。
【００８６】
少なくとも１つのバイオマーカーのアッセイの前にｐ５３を変異についてアッセイし、ｐ５３の変異の存在はＭＤＭ２ｉへの感受性の低下を示す方法。
【００８７】
がん試料が、乳房、肺、すい臓、卵巣、中枢神経系（ＣＮＳ）、子宮内膜、胃、大腸、結腸、食道、骨、尿路、造血、リンパ系、肝臓、皮膚、黒色腫、腎臓、軟部組織肉腫および胸膜からなる群から選択される方法。
【００８８】
少なくとも１つのバイオマーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質が測定される方法。
【００８９】
ＭＤＭ２ｉがイソキノリノンである方法。
【００９０】
ＭＤＭ２ｉが表１から選択される方法。
【００９１】
ＭＤＭ２ｉが治療的有効量で投与される方法。
【００９２】
ヒト二重微小染色体２阻害剤（ＭＤＭ２ｉ）へのがん細胞の感受性を判定する方法であって、ａ）がん細胞を少なくとも１つのＭＤＭ２ｉと接触させる工程；ｂ）ＭＤＭ２ｉと接触させた細胞中で、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現を測定する工程であり、少なくとも１つのバイオマーカーの発現はＭＤＭ２ｉへの感受性を示す、工程；およびｃ）少なくとも１つのＭＤＭ２ｉで処置したがん細胞の細胞増殖を、未処置またはプラセボ処置がん細胞と比較する工程を含み、未処置またはプラセボ処置がん細胞と比較するとき、処置されたがん細胞の細胞増殖が低減されている方法。
【００９３】
少なくとも１つのＭＤＭ２ｉと接触させたがん細胞の低減された細胞増殖が１μＭ未満のＩＣ５０を有する方法。
【００９４】
ＭＤＭ２ｉがイソキノリノンである方法。
【００９５】
ＭＤＭ２ｉが表１から選択される方法。
【００９６】
少なくとも２つの異なる時点で細胞をＭＤＭ２ｉと接触させる方法。
【００９７】
ステップａ）において、細胞を２つの異なるＭＤＭ２ｉと接触させる方法。
【００９８】
細胞を２つの異なるＭＤＭ２ｉと同時に接触させる方法。
【００９９】
細胞を２つの異なるＭＤＭ２ｉと異なる時点で接触させる方法。
【０１００】
がん細胞が、乳房、肺、すい臓、卵巣、中枢神経系（ＣＮＳ）、子宮内膜、胃、大腸、結腸、食道、骨、尿路、造血、リンパ系、肝臓、皮膚、黒色腫、腎臓、軟部組織肉腫および胸膜からなる群から選択される方法。
【０１０１】
少なくとも１つのバイオマーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質が測定される方法。
【０１０２】
バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮについてアッセイする工程を含む方法。
【０１０３】
ステップｂ）およびｃ）が、ＭＤＭ２ｉの各用量（dose）の投与から４時間、８時間、１６時間、２４時間、４８時間、３日、１週、１カ月および数カ月後からなる群から選択される時点で繰り返される方法。
【０１０４】
ＭＤＭ２ｉ候補についてスクリーニングする方法であって、
ａ）細胞をＭＤＭ２ｉ候補と接触させる工程；
ｂ）ＭＤＭ２ｉ候補と接触させた細胞中で、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現を測定する工程であり、少なくとも１つのバイオマーカーの発現はＭＤＭ２ｉへの感受性を示す、工程；および
ｃ）ＭＤＭ２ｉ候補と接触させた細胞からの細胞増殖の低減を、表１からとられたＭＤＭ２ｉと接触させた細胞の細胞増殖の低減、および未処置またはプラセボ処置した細胞の細胞増殖と比較する工程を含む方法。
【０１０５】
バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮについてアッセイする方法。
【０１０６】
ＭＤＭ２ｉ候補が表２の少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現を増加させる方法。
【０１０７】
細胞が、乳房、肺、すい臓、卵巣、中枢神経系（ＣＮＳ）、子宮内膜、胃、大腸、結腸、食道、骨、尿路、造血、リンパ系、肝臓、皮膚、黒色腫、腎臓、軟部組織肉腫および胸膜からなる群から選択されるがん細胞である方法。
【０１０８】
表２の少なくとも１つのバイオマーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が測定される方法。
【０１０９】
バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮについてアッセイする工程を含む方法。
【０１１０】
選択されたがん患者集団におけるがんの処置で使用するためのＭＤＭ２ｉを含む組成物であって、がん患者集団が、前記患者から得たがん細胞試料中での、表２から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現の出現（showing）に基づいて選択される組成物。
【０１１１】
がん細胞試料が、乳房、肺、すい臓、卵巣、中枢神経系（ＣＮＳ）、子宮内膜、胃、大腸、結腸、食道、骨、尿路、造血、リンパ系、肝臓、皮膚、黒色腫、腎臓、軟部組織肉腫および胸膜からなる群から選択される組成物。
【０１１２】
バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮの遺伝子発現に基づいて患者が選択される組成物。
【０１１３】
ヒト二重微小染色体２阻害剤（ＭＤＭ２ｉ）による処置へのがん患者の感受性を予測するためのキットであって、
ｉ）バイオマーカーＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮの発現を検出する手段；ならびにｉｉ）前記キットの使用説明書を含むキット。
【０１１４】
上に記載する方法のいずれかのためのキットの使用。
【０１１５】
定義
本明細書および請求項で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈が明らかに別に指示しない限り、複数形が含まれる。例えば、用語「細胞」には、その混合物を含めて複数の細胞が含まれる。
【０１１６】
全ての数値呼称、例えば、範囲を含むｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、０．１の増分だけ（＋）または（−）に変化する近似値である。必ずしも明言されていないが、全ての数値呼称には用語「約」が先行することを理解するべきである。必ずしも明言されていないが、本明細書に記載される試薬は例示に過ぎないこと、およびそのようなものの均等物は当技術分野で公知であることも理解するべきである。
【０１１７】
用語「マーカー」または「バイオマーカー」は、本明細書において互換的に使用される。バイオマーカーは核酸またはポリペプチドであり、核酸またはポリペプチドの存在、不在または差別的発現は、任意のＭＤＭ２ｉへの感受性を判定するために使用される。例えば、ＣＤＫＮ１Ａはバイオマーカーである。
【０１１８】
「ＭＤＭ２」は、ｐ５３のユビキチン化を媒介し、ｐ５３の核外移行を許し、ｐ５３分解を誘発するＥ３ユビキチン−タンパク質リガーゼを指す。特に明記されていなければ、本明細書で用いられるＭＤＭ２はヒトＭＤＭ２の受託番号ＮＭ＿００２３９２／ＮＰ＿００２３８３（配列番号１／配列番号２）を指す。
【０１１９】
「ｐ５３」は、腫瘍サプレッサータンパク質を指し、ヒトｐ５３（ｐ５３受託番号：ＤＮＡ−ＮＭ＿０００５４６、タンパク質−ＮＰ＿０００５３７）を指す。
【０１２０】
細胞は、表２に開示されるバイオマーカーの少なくとも１つが差別的に発現されるときに、ＭＤＭ２ｉによる阻害に「感受性である」か「感受性」を提示する。あるいは、細胞は、表２に開示されるバイオマーカーの全てがセットとして差別的に発現されるときに、ＭＤＭ２ｉによる阻害に「感受性である」。一実施形態では、細胞増殖の低減に関してＭＤＭ２ｉのＩＣ５０が１０μＭ未満、好ましくは１μＭ未満であるとき、細胞は「感受性である」か、「感受性」を提示するか、「処置に感受性である」。
【０１２１】
「対照細胞」、「対照組織」および「対照試料」は、ＭＤＭ２ｉに非感受性である（すなわち、細胞増殖の低減に関してＭＤＭ２ｉのＩＣ５０が１０μＭを超える；または、細胞増殖の低減に関してＭＤＭ２ｉのＩＣ５０が１μＭ未満と「感受性」が規定されるならば、「非感受性」は細胞増殖の低減に関してＭＤＭ２ｉのＩＣ５０が１μＭを超えることを表す）、ベースライン対照、またはがんの細胞、組織もしくは試料をそれぞれ指す。
【０１２２】
「正常な試料」は、非がん性の組織または細胞を指す。
【０１２３】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドであれ、リボヌクレオチドであれ、またはその類似体であれ、任意の長さのヌクレオチドの重合体形を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有することができ、任意の機能を果たすことができる。以下のものは、ポリヌクレオチドの非限定例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含むことができる。存在するならば、ヌクレオチド構造の改変は重合体のアセンブリーの前後に付与することができる。ヌクレオチド配列には、非ヌクレオチド構成成分が割り込んでもよい。ポリヌクレオチドは、例えば標識構成成分とのコンジュゲーションによって、重合の後にさらに改変されてもよい。この用語は、二本鎖と一本鎖の両方の分子も指す。別に規定または要求されない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形と、二本鎖形を構成することが公知であるか予測される２本の相補的一本鎖形の各々の両方を包含する。
【０１２４】
「遺伝子」は、転写および翻訳された後に特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることが可能である少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチド配列は、それらが関連する遺伝子のより大きな断片または完全長コード配列を同定するために使用することができる。より大きな断片配列を単離する方法は、当業者に公知である。
【０１２５】
「遺伝子発現」あるいは「遺伝子生成物」は、遺伝子が転写および翻訳されるときに生成される、核酸またはアミノ酸（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）を指す。
【０１２６】
用語「ポリペプチド」は用語「タンパク質」と互換的に使用され、最も広義には、２個以上のサブユニットのアミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド様物質（peptidomimetics）の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結されてもよい。別の実施形態では、サブユニットは他の結合、例えばエステル、エーテルなどによって連結されてもよい。
【０１２７】
本明細書で用いる場合、用語「アミノ酸」は、天然および／または非天然もしくは合成のアミノ酸、ならびにＤおよびＬの両光学異性体、アミノ酸類似体およびペプチド様物質を指す。ペプチド鎖が短い場合は、３つ以上のアミノ酸のペプチドはオリゴペプチドと一般的に呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合は、ペプチドはポリペプチドまたはタンパク質と一般的に呼ばれる。
【０１２８】
用語「単離された」は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片が天然で通例関連している、細胞性その他の構成要素から分離されたことを意味する。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、その生来または天然の環境、例えば染色体の中でそれが通例関連する３’および５’の連続したヌクレオチドから分離される。当業者に明白であるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片は、それをその天然に存在する対応物から区別するために「単離」を必要としない。さらに、「濃縮」、「分離」または「希釈」されたポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片は、濃度または容積あたりの分子の数がその天然に存在する対応物のそれより「濃縮された」バージョンでは大きいか、「分離された」バージョンでは小さいという点で、その天然に存在する対応物から区別可能である。その一次配列で、または例えばそのグリコシル化パターンが天然に存在する対応物と異なる、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片は、その単離された形で存在する必要がないが、その理由は、一次配列、あるいはグリコシル化パターンなどの別の特徴によってそれがその天然に存在する対応物から識別可能だからである。したがって、天然に存在しないポリヌクレオチドは、単離された天然に存在するポリヌクレオチドとは別個の実施形態として提供される。細菌細胞で生成されるタンパク質は、それが天然に生成される真核細胞から単離された天然に存在するタンパク質とは別個の実施形態として提供される。
【０１２９】
ポリヌクレオチド操作との関連で使用されるとき、「プローブ」は、標的とハイブリダイズさせることによって、対象の試料に潜在的に存在する標的を検出する試薬として提供されるオリゴヌクレオチドを指す。通常、プローブは、標識、またはハイブリダイゼーション反応の前か後に標識を付着させることができる手段を含む。適する標識には、限定されるものではないが、放射性同位体、蛍光色素、化学発光化合物、色素、および酵素を含むタンパク質が含まれる。
【０１３０】
「プライマー」は、標的とハイブリダイズさせ、その後標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進することによって対象の試料中に潜在的に存在する標的または「鋳型」に結合する、遊離の３’−ＯＨ基を一般に有する短いポリヌクレオチドである。「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、複製されたコピーが、「プライマー対」または「上流」および「下流」のプライマーからなる「プライマーセット」、ならびにＤＮＡポリメラーゼ、一般的には熱に安定のポリメラーゼ酵素などの重合触媒を使用して、標的ポリヌクレオチドから作製される反応である。ＰＣＲの方法は当技術分野で周知であり、例えば、PCR: A Practical Approach、M. MacPhersonら、IRL Press at Oxford University Press（1991）に教示される。ポリヌクレオチドの複製されたコピーを生成する全ての工程、例えばＰＣＲまたは遺伝子クローニングは、本明細書において「複製」と総称される。プライマーは、ハイブリダイゼーション反応、例えばサザンまたはノーザンブロット分析でプローブとして使用することもできる（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、2版（1989））。
【０１３１】
本明細書で用いる場合、「発現」は、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される工程および／または転写されたｍＲＮＡがペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質にその後翻訳される工程を指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから誘導される場合は、発現は真核細胞でのｍＲＮＡのスプライシングを含むことができる。
【０１３２】
遺伝子に適用される、「差別的に発現される」は、遺伝子から転写および／もしくは翻訳されるｍＲＮＡ、または遺伝子によってコードされるタンパク質生成物の差別的生成を指す。差別的に発現される遺伝子は、対照細胞の発現レベルと比較して過剰発現または過小発現されてもよい。しかし、本明細書で用いる場合、過剰発現は遺伝子発現の増加であり、対照の対応物の細胞または組織で検出されるものに対して、一般に少なくとも１．２５倍、あるいは少なくとも１．５倍、あるいは少なくとも２倍、あるいは少なくとも３倍、あるいは少なくとも４倍高い発現である。本明細書で用いる場合、過小発現は遺伝子発現の低減であり、対照の対応物の細胞または組織で検出されるものに対して、一般に少なくとも１．２５倍、あるいは少なくとも１．５倍、あるいは少なくとも２倍、あるいは少なくとも３倍、あるいは少なくとも４倍低い発現である。用語「差別的に発現される」は、がん細胞またはがん性組織での発現が検出され、存在するが、対照細胞での発現が検出不能である場合も指す。
【０１３３】
遺伝子の高い発現レベルは、遺伝子の過剰発現または遺伝子コピー数の増加のために起こることができる。遺伝子は、負の調節因子の調節解除または不在のために、増加するタンパク質レベルに翻訳されることもある。
【０１３４】
「遺伝子発現プロファイル」は、複数の試料で繰り返され、それらの試料によって共有される特性、例えば組織型、特定の処置への応答、または細胞での特定の生物学的過程もしくは経路の活性化を反映する、少なくとも１つのバイオマーカーの発現パターンを指す。さらに、遺伝子発現プロファイルは、その共通特性を共有する試料と共有しない試料の間で、２つの群に試料を無作為に割り当てることによっておそらく達成されるより優れた精度で差異が生じる。遺伝子発現プロファイルは、未知の状態の試料がその共通特性を共有するかどうか予測するために使用することができる。少なくとも１つのバイオマーカーのレベルと一般的なプロファイルの間に多少の変動が予想されるはずであるが、一般的なプロファイルへの発現レベルの全体的な類似性は、発現プロファイルが反映する共通特性を共有していない試料で類似性が偶然に観察される可能性が統計学的に低いものである。
【０１３５】
用語「ｃＤＮＡ」は、相補的なＤＮＡ、すなわち逆転写酵素などの酵素でｃＤＮＡに仕立てられる、細胞または生物体に存在するｍＲＮＡ分子を指す。「ｃＤＮＡライブラリー」は、細胞または生物体に存在するｍＲＮＡ分子の全てのコレクションであり、全ては酵素逆転写酵素でｃＤＮＡ分子に変えられ、その後「ベクター」（外来ＤＮＡの添加の後に複製し続けることができる他のＤＮＡ分子）に挿入される。ライブラリーのための例示的なベクターには、バクテリオファージ（「ファージ」としても知られる）、細菌に感染するウイルス、例えばラムダファージが含まれる。ライブラリーは、対象の特異的ｃＤＮＡ（したがってｍＲＮＡ）について次に探ることができる。
【０１３６】
本明細書で用いる場合、互換的に使用される「固相支持体」または「固体支持体」は、特定のタイプの支持体に限定されない。むしろ、多数の支持体が利用可能であり、当業者に公知である。固相支持体には、シリカゲル、樹脂、誘導体化されたプラスチックフィルム、ガラスビーズ、プラスチックビーズ、アルミナゲル、マイクロアレイおよびチップが含まれる。本明細書で用いる場合、「固体支持体」には合成抗原提示マトリックス、細胞およびリポソームも含まれる。適する固相支持体は、所望の最終用途および様々なプロトコルへの適合性に基づいて選択することができる。例えば、ペプチド合成のためには、固相支持体は、樹脂、例えばポリスチレン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られるＰＡＭ−樹脂）、ｐｏｌｙＨＩＰＥ（Ｒ）（商標）樹脂（Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ、Ｃａｎａｄａから得られる）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られる）、ポリエチレングリコールを接いだポリスチレン樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌＲ（商標）、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、またはポリジメチルアクリルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから得られる）を指すことができる。
【０１３７】
ポリヌクレオチドは、ハイスループットスクリーニングアッセイで使用するために、固体支持体に付着させることもできる。ＰＣＴ  ＷＯ９７／１０３６５は、例えば、高密度オリゴヌクレオチドチップの構築を開示している。米国特許第５，４０５，７８３号；第５，４１２，０８７号および第５，４４５，９３４号も参照のこと。この方法を使用して、チップアレイを形成するために誘導体化されたガラス表面でプローブが合成される。光保護されたヌクレオシドホスホラミダイトをガラス表面に結合し、写真平板マスクを通して光分解によって選択的に脱保護し、第２の保護されたヌクレオシドホスホラミダイトと反応させる。所望のプローブが完成するまで、結合／脱保護工程を繰り返す。
【０１３８】
例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＨＧ−Ｕ１３３−Ｐｌｕｓ−２  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓなどの遺伝子チップを用いてメッセンジャーＲＮＡのレベルを測定することによって、転写活性を評価することができる。したがって、多数の対象遺伝子のＲＮＡのハイスループットのリアルタイム定量化が再現性のある系で可能になる。
【０１３９】
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、核酸プローブがその標的部分配列と特異的にハイブリダイズするが他のいかなる配列ともハイブリダイズしない条件を指す。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する条件には、以下のものが含まれる：温度、イオン強度およびホルムアミドなどの変性剤の濃度。これらの因子の１つを変更することは別の因子に影響を及ぼすことができ、当業者はストリンジェンシーの所望のレベルを維持するための条件の変更を理解する。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの例は、以下の通りである：６５〜６８℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または４２℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミド（上記、Sambrookを参照）。「中程度にストリンジェントな」ハイブリダイゼーションの例は、以下の条件である：５０〜６５℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または３７〜５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび２０％ホルムアミド。中程度にストリンジェントな条件は、中程度の量の核酸ミスマッチが所望されるときに使用される。洗浄がハイブリダイゼーション条件の一部であることを、当業者は理解する。例えば、洗浄条件には、０２．×〜０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳおよび４２〜６８℃の温度が含まれてもよく、そこにおいて、温度を高めることは洗浄条件のストリンジェンシーを増加させる。
【０１４０】
ハイブリダイゼーションが２つの一本鎖のポリヌクレオチドの間で、逆行性立体配置で起こる場合は、反応は「アニーリング」と呼ばれ、それらのポリヌクレオチドは「相補的である」と記載される。ハイブリダイゼーションが第１のポリヌクレオチドの１つと第２の鎖の間で起こることができるならば、二本鎖ポリヌクレオチドは別のポリヌクレオチドに「相補的」または「相同的」である可能性がある。「相補性」または「相同性」（１つのポリヌクレオチドがもう１つに相補的である程度）は、一般に認められる塩基対合則により互いと水素結合を形成すると予想される、対向鎖中の塩基の割合で定量化することが可能である。
【０１４１】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドまたはポリペプチド領域）が別の配列と特定の百分率（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性」を有するとは、整列させたときに、２つの配列の比較において塩基（またはアミノ酸）のその百分率が同じであることを意味する。このアラインメントおよび相同性パーセントまたは配列同一性は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、（1987）追補30、セクション7.7.18、表7.7.1に記載されるものを使用して判定することができる。好ましくは、アラインメントのためにデフォルトパラメータが使用される。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予想＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；並べ替え＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長。
【０１４２】
用語「細胞増殖性障害」は、異常な細胞増殖および／もしくは分裂、または機能喪失で特徴付けられる正常な生理機能の調節不全を含むものとする。「細胞増殖性障害」の例には、限定されるものではないが、過形成、新生物、化生および様々な自己免疫性障害、例えばＴ細胞アポトーシスの調節不全で特徴付けられるものが含まれる。
【０１４３】
本明細書で用いる場合、用語「新生物細胞」、「新生物疾患」、「新生物」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「がん」および「がん細胞」（互換的に使用される）は、比較的自律的な増殖を示す細胞を指し、そのため、それらは細胞増殖の制御のかなりの喪失（すなわち、脱調節された細胞分裂）で特徴付けられる異常な増殖表現型を示す。新生物細胞は、悪性であっても良性であってもよい。転移性の細胞または組織は、細胞が近隣の身体構造に侵入し、破壊することができることを意味する。
【０１４４】
用語「がん」は、例えば、乳房、肺、すい臓、卵巣、中枢神経系（ＣＮＳ）、子宮内膜、胃、大腸、結腸、食道、骨、尿路、造血、リンパ系、肝臓、皮膚、黒色腫、腎臓、軟部組織肉腫および胸膜を含むがん疾患を指す。
【０１４５】
用語「ＰＢＭＣ」は、末梢血単核細胞を指し、「ＰＢＬ」−末梢血リンパ球を含む。
【０１４６】
腫瘍増殖を「抑制する」ことは、ＭＤＭ２ｉ化合物との接触がない腫瘍の増殖と比較して、ＭＤＭ２ｉと接触させたときの腫瘍細胞の増殖の低減を示す。腫瘍細胞の増殖は、それらに限定されないが、腫瘍サイズを測定すること、３Ｈ−チミジン組込みアッセイを使用して腫瘍細胞が増殖しているか判定すること、ＦＤＧ−ＰＥＴ（フッ化デオキシグルコース陽電子放出断層撮影法）画像化でグルコース取り込みを測定すること、または腫瘍細胞を計数することを含む、当技術分野で公知の任意の手段によって評価することができる。腫瘍細胞の増殖を「抑制する」ことは、以下の状態のいずれかまたは全部を意味する：腫瘍増殖を遅くすること、遅延および停止させること、ならびに腫瘍収縮。
【０１４７】
「組成物」は、活性薬剤と、別の担体、例えば化合物または組成物であり不活性であるもの（例えば、検出可能な薬剤または標識）または活性であるもの、例えばアジュバント、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバント等との組合せである。担体には、医薬用の賦形剤および添加剤、例えば；タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質および炭水化物（例えば、単糖およびオリゴ糖を含む糖；誘導体化された糖、例えばアルジトール、アルドン酸、エステル型糖等；ならびに多糖または糖重合体）も含まれ、それらは単独または重量もしくは容量で１〜９９．９９％の組合せを含めて、単独でまたは組合せで存在することができる。炭水化物賦形剤には、例えば；単糖、例えばフルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボース等；二糖、例えばラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース等；多糖、例えばラフィノース、メレチトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン等；ならびにアルジトール、例えばマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）およびミオイノシトールが含まれる。
【０１４８】
例示的なタンパク質賦形剤には、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼイン等が含まれる。緩衝能力で機能することもできる代表的なアミノ酸／抗体構成成分には、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテーム等が含まれる。
【０１４９】
用語「担体」には、緩衝剤またはｐＨ調整剤がさらに含まれ；一般的に、緩衝剤は、有機の酸または塩基から調製される塩である。代表的な緩衝剤には、有機酸の塩、例えばクエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸またはフタル酸の塩；トリス、トロメタミン塩酸塩またはリン酸緩衝液が含まれる。追加の担体には、重合体の賦形剤／添加剤、例えばポリビニルピロリドン、フィコール（重合糖）、デキストレート（例えば、２−ヒドロキシプロピル−直角位相−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、着香料、抗微生物剤、甘味料、抗酸化物、静電防止剤、界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ２０（商標）およびＴＷＥＥＮ８０（商標）などのポリソルベート）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）およびキレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）が含まれる。
【０１５０】
本明細書で用いる場合、用語「薬学的に許容される担体」は、標準の薬用担体、例えばリン酸緩衝生理食塩溶液、水および乳濁液、例えば油／水または水／油乳濁液、および各種の湿潤剤のいずれかを包含する。組成物は、それらがｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に許容されるという追加の条件で、安定剤および保存料、および上記の担体のいずれかを含むこともできる。担体、安定剤およびアジュバントの例については、Remington's Pharmaceutical Science、15版（Mack Publ. Co.、Easton（1975）およびPhysician's Desk Reference、52版、Medical Economics、Montvale、N.J.（1998）を参照のこと。
【０１５１】
「有効量」は、有益であるか所望の結果を達成するのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与、適用または投薬量（dosage）で投与することができる。
【０１５２】
「対象」、「個体」または「患者」は本明細書において互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物には、マウス、サル、ヒト、飼育動物、スポーツ動物およびペットが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５３】
本明細書で用いられるＭＤＭ２の「阻害剤」は、ｐ５３とＭＤＭ２の会合を低減する。この阻害は、例えば、それらが結合する前にｐ５３とＭＤＭ２の会合を低減すること、またはそれらが結合した後にｐ５３とＭＤＭ２の会合を低減し、このように両方の分子を遊離させることを含むことができる。
【０１５４】
ＭＤＭ２ｉのバイオマーカーとして、今ではいくつかの遺伝子が同定されている。本明細書および表２において特定されるバイオマーカーの１つまたは複数の存在またはその遺伝子発現の減少もしくは増加は、任意のＭＤＭ２ｉへの患者の感受性を判定するために使用することができ、例えば、バイオマーカーの発現は、がん患者がＭＤＭ２ｉの投与に感受性であり、都合よく応答することを示す。別の例として、ＭＤＭ２ｉによる処置の後、患者試料を得て、患者がＭＤＭ２ｉ処置になお感受性であるかどうか発見するために、試料を感受性についてアッセイすることができる。あるいは、表２のバイオマーカーの全てを単一のセットとしてアッセイすることができる。
【０１５５】
ＭＤＭ２阻害剤（ＭＤＭ２ｉ）は、ｐ５３−ＭＤＭ２会合の阻害剤である化合物であり、本発明の方法または使用と併用して有益である。ＭＤＭ２ｉは、ｐ５３−ＭＤＭ２会合の阻害が指示される場合、例えば腫瘍および／またはがん性細胞増殖の処置において、ヒトまたは獣医学での使用のための医薬組成物において有益である。特に、そのような化合物はヒトがんの処置で有益であるが、その理由は、これらのがんの進行がｐ５３の「ゲートキーパー」機能を越えること、例えばＭＤＭ２の過剰発現に少なくとも部分的に依存する可能性があるからである。ＭＤＭ２ｉ化合物は、例えば、癌腫（例えば、乳房、肺、すい臓、卵巣、中枢神経系（ＣＮＳ）、子宮内膜、胃、大腸、結腸、食道、骨、尿路、造血、リンパ系、肝臓、皮膚、黒色腫、腎臓、軟部組織肉腫および胸膜）の処置で有益である。例示的なＭＤＭ２ｉ化合物のリストは、表１に見出される（ＷＯ２０１１０７６７８６を参照）。表１に見出されるＭＤＭ２ｉ化合物は、イソキノリノンクラスの分子である。ＭＤＭ２のｐ５３結合ポケット、特にＮｕｔｌｉｎ−３ａと実質的に同じであるか、表１からの例示的なＭＤＭ２ｉが結合する場合と実質的に同じＭＤＭ２のｐ５３結合ポケットに結合する他のＭＤＭ２ｉを、本発明の方法または使用に適用することもできる。本実施形態に従って使用されるＭＤＭ２ｉは、表１に記載されるもの（すなわち、ＭＤＭ２ｉ（１）およびＭＤＭ２ｉ（２））、またはＮｕｔｌｉｎ  ３ａ、例えば置換されたイソキノリノンもしくはキナゾリノンと構造的に関係していてもよい。本明細書に含まれる方法は、スピロ−オキシインドール、イミダゾリルインドールおよびシス−イミダゾリンなどの他の化合物と使用することもできる（Shangaryら、Mol. Cancer Ther. 2008 7(6): 1533〜1542：Furetら、BioOrg.Med.Chem. Let. 2012 22:3498〜3502およびCarolら、Pediatr. Blood Cancer 2012 1〜9頁を参照、雑誌に編入される前に２０１２年７月２日にオンラインで公開）。本明細書で用いられるＭＤＭ２ｉは、ｐ５３とＭＤＭ２の間のタンパク質間相互作用を阻止し、および／またはｐ５３経路活性を誘導することによって細胞増殖を阻害する。
【０１５６】
【表１】
2015526078.tif 000002
【０１５７】
遺伝子発現の測定
遺伝子発現の検出は、例えば遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量、または遺伝子から転写されるｍＲＮＡの逆転写から生成されるｃＤＮＡの量、または遺伝子によってコードされるポリペプチドもしくはタンパク質の量を検出することを含む、任意の適当な方法によることができる。これらの方法は試料ごとに実施することができるか、ハイスループット分析のために改変することができる。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）Ｕ１３３マイクロアレイチップを使用する。
【０１５８】
一態様では、遺伝子発現は、そのバイオマーカーのための適当なプローブと特異的にハイブリダイズするプローブとのハイブリダイゼーションによって検出され、定量化される。プローブは、当技術分野で公知である方法を使用するハイスループットスクリーニングアッセイで使用するための、固体支持体に付着させることもできる。例えば、ＷＯ９７／１０３６５および米国特許第５，４０５，７８３号、第５，４１２，０８７号および第５，４４５，９３４号は、本明細書に開示される配列の１つまたは複数を含有することができる高密度オリゴヌクレオチドチップの構築を開示している。米国特許第５，４０５，７８３号、第５，４１２，０８７号および第５，４４５，９３４号に開示されている方法を使用して、本発明のプローブは、誘導体化されたガラス表面で合成される。光保護されたヌクレオシドホスホラミダイトをガラス表面に結合し、写真平板マスクを通して光分解によって選択的に脱保護し、第２の保護されたヌクレオシドホスホラミダイトと反応させる。所望のプローブが完成するまで、結合／脱保護工程を繰り返す。
【０１５９】
一態様では、遺伝子の発現レベルは、プローブ改変チップへの核酸試料の曝露を通して判定される。抽出された核酸を、例えば、好ましくは増幅ステップの間、蛍光性タグで標識する。標識試料のハイブリダイゼーションは、適当なストリンジェンシーレベルで実施する。プローブ−核酸ハイブリダイゼーションの程度は、検出装置を用いて定量的に測定される。米国特許第５，５７８，８３２号および第５，６３１，７３４号を参照のこと。
【０１６０】
あるいは、公知の技術を用いて遺伝子コピー数、転写または翻訳のいずれか１つを判定することができる。例えば、ＰＣＲなどの増幅方法が有益である場合がある。ＰＣＲの一般手順は、MacPhersonら、PCR: A Practical Approach、（IRL Press at Oxford University Press（1991））に教示される。しかし、各適用反応に使用されるＰＣＲ条件は、経験的に決定される。いくつかのパラメータは、反応の成功に影響する。それらには、アニーリングの温度および時間、伸長時間、Ｍｇ２＋および／またはＡＴＰ濃度、ｐＨ、ならびにプライマー、鋳型およびデオキシリボヌクレオチドの相対的濃度がある。増幅の後、生じるＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動と、続く臭化エチジウム染色および紫外線照射による可視化によって検出することができる。
【０１６１】
一実施形態では、ハイブリダイズした核酸は、試料核酸に付着している１つまたは複数の標識を検出することによって検出される。標識は、当業者に周知であるいくつかの手段のいずれかによって組み込むことができる。しかし、一態様では、標識は試料核酸の調製の増幅ステップの間に、同時に組み込まれる。したがって、例えば、標識されたプライマーまたは標識されたヌクレオチドによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標識された増幅生成物を提供する。別個の実施形態では、標識されたヌクレオチド（例えばフルオレセイン標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を使用する上記の転写増幅は、標識を転写された核酸に組み込む。
【０１６２】
あるいは、標識は元の核酸試料（例えば、ｍＲＮＡ、ポリＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）に直接に、または増幅の完了後に増幅生成物に加えることができる。標識を核酸に付着させる手段は当業者に周知であり、例には、例えば、核酸のリン酸化と、それに続く、試料核酸を標識（例えば、蛍光団）に連結する核酸リンカーの付着（ライゲーション）とによる、ニックトランスレーションまたは末端標識（例えば標識されたＲＮＡによる）が含まれる。
【０１６３】
本発明での使用に適する検出可能な標識には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段によって検出することが可能な任意の組成物が含まれる。本発明で有益な標識には、標識されたストレプトアビジンコンジュゲートで染色するためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光性タンパク質等）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用される西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよびその他）、および比色標識、例えばコロイド金または着色されたガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズが含まれる。そのような標識の使用を教示している特許には、米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；および第４，３６６，２４１号が含まれる。
【０１６４】
標識の検出は、当業者に周知である。したがって、例えば、放射性標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは、放射された光を検出する光検出器を使用して検出することができる。酵素標識は、酵素に基質を提供し、基質への酵素の作用によって生じる反応生成物を検出することによって一般的に検出され、比色標識は着色標識を単に可視化することによって検出される。
【０１６５】
検出可能な標識は、例えばＷＯ９７／１０３６５に記載される通り、ハイブリダイゼーションの前か後に標的（試料）核酸に加えることができる。これらの検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションの前に標的（試料）核酸に直接に付着させるか、それに組み込まれる。対照的に、「間接標識」は、ハイブリダイゼーションの後にハイブリッド二重鎖に連結される。一般に、間接標識は、ハイブリダイゼーションの前に標的核酸に付着させた結合部分に付着させる。例えば、標的核酸は、ハイブリダイゼーションの前にビオチン化してもよい。ハイブリダイゼーションの後、アビジンコンジュゲート型蛍光団はビオチンを有するハイブリッド二重鎖に結合して、検出が容易な標識を提供する。核酸を標識する方法および標識されたハイブリダイズした核酸を検出する方法の詳細なレビューについては、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology、24巻: Hybridization with Nucleic Acid Probes、P. Tijssen編Elsevier、N.Y.（1993）を参照する。
【０１６６】
ポリペプチドの検出
バイオマーカーの発現レベルは、表２に掲載したバイオマーカーの少なくとも１つのタンパク質発現またはタンパク質生成物を検査することによって判定することもできる。タンパク質レベルを判定することは、患者から得た試料中のバイオマーカーのポリペプチドを選択的に認識して結合する抗体の間で起こる任意の免疫特異的結合の量を測定すること、およびこれを対照試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの免疫特異的結合の量と比較することを含む。対照の発現と比較するとき、バイオマーカーのタンパク質発現の量は増加することも、低減することもある。あるいは、表２のバイオマーカーの全てを単一のセットとしてアッセイすることができる。
【０１６７】
タンパク質分析のために、様々な技術を当技術分野で利用できる。それらには、限定されるものではないが、放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射線測定法、ｉｎ  ｓｉｔｕイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位体標識を使用する）、ウェスタンブロット分析、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光アッセイ、フローサイトメトリー、免疫組織化学、共焦点鏡検、酵素アッセイ、表面プラズモン共鳴およびＰＡＧＥ−ＳＤＳが含まれる。
【０１６８】
バイオマーカーおよびＭＤＭ２ｉ処置のアッセイ
患者がＭＤＭ２ｉに感受性であると予測されると、患者への任意のＭＤＭ２ｉの投与を１回の投与で、処置クール全体で連続的に、または断続的に実行することができる。最も有効な手段および投薬量を判定する方法は当業者に周知であり、療法のために使用される組成物、療法の目的、処置される標的細胞、および処置対象によって異なる。１回または複数回の投与を実施することができ、用量レベルおよびパターンは担当医によって選択される。適する投薬製剤および薬剤の投与方法は、経験的に調整することができる。
【０１６９】
患者がＭＤＭ２ｉ処置に感受性のままであるかどうか判定するために、表２に提供されるバイオマーカーの少なくとも１つをＭＤＭ２ｉ投与の後にアッセイすることができる。さらに、単一のＭＤＭ２ｉ投与の後に、少なくとも１つのバイオマーカーを複数の時点でアッセイすることができる。例えば、ＭＤＭ２ｉの初期ボーラスが投与され、表２からの少なくとも１つのバイオマーカーが、最初の処置から１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間、４８時間、３日、１週または１カ月または数カ月の後にアッセイされる。あるいは、表２のバイオマーカーの全てを単一のセットとしてアッセイすることができる。
【０１７０】
表２の少なくとも１つのバイオマーカーは、各ＭＤＭ２ｉ投与の後にアッセイすることができるので、複数回のＭＤＭ２ｉ投与があるならば、継続した患者感受性を判定するために少なくとも１つのバイオマーカーを各投与の後にアッセイすることができる。患者は複数回のＭＤＭ２ｉ投与を受けることができ、その後、バイオマーカーは異なる時点でアッセイすることができる。例えば、処置クールは、ＭＤＭ２ｉの初期用量、指定された時間の後に第２の用量、および第２の用量の数時間後にさらに第３の用量の投与を必要とすることがある。表２の少なくとも１つのバイオマーカーは、ＭＤＭ２ｉの各用量の投与から１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間、４８時間、３日、１週または１カ月または数カ月の後にアッセイすることができる。あるいは、表２のバイオマーカーの全てを単一のセットとしてアッセイすることができる。
【０１７１】
異なるバイオマーカーが異なる時点でアッセイされることも、本発明の範囲内である。いかなる１つの理論にも縛られないが、ＭＤＭ２ｉまたはバイオマーカーの作用機構のために、ＭＤＭ２ｉへの応答は遅れ、患者がＭＤＭ２ｉ投与に引き続き感受性であるかどうか判定するために、投与後の任意のときに表２からの少なくとも１つのバイオマーカーがアッセイされる。ＭＤＭ２ｉの各投与の後の表２の少なくとも１つのバイオマーカーのアッセイは、処置の手段、投薬量およびクールに関して指針を提供する。あるいは、表２のバイオマーカーの全てを単一のセットとしてアッセイすることができる。
【０１７２】
最後に、異なるＭＤＭ２ｉの投与と、続く表２の少なくとも１つのバイオマーカーのアッセイがある。この実施形態では、複数のＭＤＭ２ｉが選択され、患者に投与される。各々の異なるＭＤＭ２ｉの投与の後に、表２からの少なくとも１つのバイオマーカーを次にアッセイすることができる。このアッセイは、異なるＭＤＭ２ｉの投与の後の複数の時点で行うこともできる。例えば、第１のＭＤＭ２ｉを患者に投与し、投与から１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間、４８時間、３日、１週または１カ月または数カ月の後に、少なくとも１つのバイオマーカーをアッセイすることができる。次に第２のＭＤＭ２ｉを投与し、第２のＭＤＭ２ｉの投与から１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間、４８時間、３日、１週または１カ月または数カ月の後に、少なくとも１つのバイオマーカーを再びアッセイすることができる。各場合において、表２のバイオマーカーの全てを単一のセットとしてアッセイすることができる。
【０１７３】
本発明の別の態様は、ＭＤＭ２ｉの適する用量レベルについて評価する方法であって、ＭＤＭ２ｉの投与の後に、表２に特定される遺伝子の少なくとも１つの差別的発現を監視することを含む方法を提供する。例えば、ＭＤＭ２ｉの最初のボーラスの投与の後に、表２の少なくとも１つのバイオマーカーを分析し、この結果に基づいて、ＭＤＭ２ｉ投薬量の増加または減少が推奨される。ＭＤＭ２ｉの調整された投薬量の投与の後、少なくとも１つのバイオマーカーの分析は、調整された用量に患者がなお感受性であるかどうか、および調整された用量が予想される有益性、例えば腫瘍増殖の抑制を提供することを判定する。あるいは、ＭＤＭ２ｉの用量への感受性を評価するための単一のセットとして、表２のバイオマーカーの全てをアッセイすることができる。
【０１７４】
任意のＭＤＭ２ｉの活性を評価するためのキットを、作製することができる。例えば、ＭＤＭ２ｉ感受性を評価するために、表２に掲載されるバイオマーカーのためのＰＣＲまたはマイクロアレイハイブリダイゼーションのための核酸プライマーを含むキットを使用することができる。あるいは、表２に掲載されるバイオマーカーの少なくとも１つの抗体が供給されるキットは、ＭＤＭ２ｉ感受性についてアッセイするのに有益である。
【０１７５】
特にその処置が長期にわたるとき、がんは化学療法処置に抵抗性になることが可能であることは当技術分野で周知である。がんがＭＤＭ２ｉに感受性であるかどうか判定するために、任意の化学療法薬による長期にわたる処置の後に、表２のバイオマーカーの少なくとも１つの差別的発現についてのアッセイを行うことができる。例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）などのキナーゼ阻害剤は、特定のキナーゼを強く阻害するが、他のキナーゼを弱く阻害することもできる。他のＭＤＭ２ｉ、例えばＮｕｔｌｉｎファミリーの化合物もある。患者が別の化学療法薬または別のＭＤＭ２ｉで以前に処置された場合は、腫瘍がＭＤＭ２ｉに感受性であるかどうか判定するために、表２のバイオマーカーの少なくとも１つについてアッセイすることは患者にとって有益な情報である。がんが寛解し、その後再生するか異なる部位に転移した場合に、このアッセイは特に患者に有益である。
【０１７６】
ＭＤＭ２阻害剤のスクリーニング
他のＭＤＭ２ｉについてスクリーニングするために、表２に掲載される少なくとも１つのバイオマーカーについてアッセイすることが可能である。この方法は、細胞がＭＤＭ２ｉ候補阻害剤に感受性であるかどうか予測する、表２からの少なくとも１つのバイオマーカーを有する細胞をアッセイすることを含み、細胞を候補ＭＤＭ２ｉと次に接触させ、処置した細胞のＩＣ５０を既知のＭＤＭ２ｉ接触感受性細胞と比較する。例えば、表２の少なくとも１つのバイオマーカーの差別的発現で判定される通り、任意のＭＤＭ２ｉに感受性であると予測される細胞については、候補ＭＤＭ２ｉは３μＭ以下のＩＣ５０を有する。表２からの少なくとも１つのバイオマーカーの発現の測定は、前に記載される方法、例えばＰＣＲまたはマイクロアレイ分析によって行うことができる。あるいは、表２のバイオマーカーの全てを単一のセットとしてアッセイすることができる。
【０１７７】
【表２】
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【実施例】
【０１７８】
実施例１：  ＭＤＭ２ｉ（１）およびＭＤＭ２ｉ（２）の両方は、生化学アッセイおよび細胞アッセイで等しく強力なｐ５３−ＭＤＭ２阻害剤である。
ＩＣ５０判定のためのＴＲ−ＦＲＥＴアッセイ：標準アッセイ条件は、白い３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ：Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に、１２５ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のＮｏｖｅｘｉｎ、０．０１％のゼラチン、０．２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７、１ｍＭのＤＴＴおよび１．７％の最終ＤＭＳＯを含有するＰＢＳ緩衝剤中で、６０μＬの総容量からなった。ＭＤＭ２ｉ（１）およびＭＤＭ２ｉ（２）の両方を、０．１ｎＭのビオチン化ＭＤＭ２（ヒトＭＤＭ２アミノ酸２〜１８８、内部調製物）、０．１ｎＭのユウロピウム標識ストレプトアビジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ：Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）および１０ｎＭのＣｙ５−ｐ５３ペプチド（Ｃｙ５−ｐ５３  ａａ１８〜２６、内部調製物）に異なる濃度で加えた。室温で１５分間のインキュベーションの後、ＧｅｎｉｏｓＰｒｏ読取装置（Ｔｅｃａｎ：Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で試料を測定した。時間分解モードで測定された２つの異なる蛍光シグナルの生データから、ＦＲＥＴアッセイ読み出しを計算した（蛍光６６５ｎｍ／蛍光６２０ｎｍ×１０００）。ＸＬｆｉｔ（登録商標）（Ｆｉｔモデル＃２０５）を使用する曲線あてはめによってＩＣ５０値を計算する。このデータを、図１Ａに示す。
【０１７９】
結合速度定数（Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の判定：高速結合動態を研究するためにＧｅｎｉｏｓＰｒｏ読取装置（Ｔｅｃａｎ：Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の急速混合ツールを使用した（単一ウェルモード）。５０μｌのアッセイ緩衝液に阻害剤および２０ｎＭのＣｙ５標識ｐ５３ペプチドを含有するマイクロプレートを、読取装置内に置いた。２５℃で１０分間の平衡の後、０．２ｎＭのビオチン化ＭＤＭ２および０．２ｎＭのユウロピウム−ストレプトアビジンを含有する５０μｌの緩衝液を４７５μｌ／ｓで注射することによって、結合反応を開始した。蛍光を６６５ｎＭにより様々な時間間隔で測定し、最初のものは注射の０．６秒後であった。阻害剤の不在下で、Ｃｙ５蛍光は０．６秒後に既に最大であって、その後少なくとも１５分間、安定していた。ＭＤＭ２ｉ（１）およびＭＤＭ２ｉ（２）の存在下では蛍光は遅く減少し、定常状態に到達するまで測定を続けた。１％のＤＭＳＯを含有するウェルと対照として１０μＭのＮｕｔｌｉｎ−３を含有するウェル間の差として、対照蛍光をとった。各時点の阻害作用は、対応する対照のパーセントとして計算した。異なる濃度の阻害剤の存在下で得られた進行曲線を合わせて、全体としてあてはめた。以下のそれぞれの方程式：Ｆｉｔ＝［Ｉｍｉｎ＋（（Ｉｍａｘ−（（（Ｋｉ＾ｎＨ）＊Ｉｍａｘ）／（（ｙ＾ｎＨ）＋（Ｋｉ＾ｎＨ））））＊（１−ｅｘｐ（（（−１）＊（ｋｏｆｆ＋（（ｙ＊ｋｏｆｆ）／Ｋｉ）））＊ｘ）））］およびＦｉｔ＝［Ｉｍｉｎ＋（（Ｉｍａｘ−（（（Ｋｉ＾ｎＨ）＊Ｉｍａｘ）／（（ｙ＾ｎＨ）＋（Ｋｉ＾ｎＨ））））＊（１−ｅｘｐ（（（−１）＊（ｋｏｎ＊（Ｋｉ＋ｙ）））＊ｘ）））］、に基づいて正確なＫｏｎおよびＫｏｆｆ値を得るように設計された新規あてはめ方法論を使用して、ＸＬｆｉｔ（登録商標）で非線形回帰を実施し、式中、Ｋｉは阻害の定数を表し、Ｉｍｉｎは最小阻害（％）を表し、Ｉｍａｘは最大阻害（％）を表し、ｎＨはヒル係数を表し、ｘは時間を表し、ｙは阻害剤濃度を表す。このデータを、図１Ａに示す。
【０１８０】
細胞増殖阻害およびＧＲＩＰ  ｐ５３転位アッセイ：細胞性増殖および生存力の減少に及ぼすＭＤＭ２ｉ（１）およびＭＤＭ２ｉ（２）の作用を、ＤＮＡ相互作用蛍光色素ＹＯＰＲＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｌｕｃｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に基づく標準増殖アッセイを使用して、ｐ５３野生型（ＳＪＳＡ−１およびＨＣＴ１１６  ｐ５３ｗｔ／ｗｔ細胞）とｐ５３変異細胞系（ＳＡＯＳ２およびＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞）の両方で測定する。簡潔には、細胞を３７℃で一晩、９６ウェルプレートに平板培養し、ＭＤＭ２ｉ（１）またはＭＤＭ２ｉ（２）の漸増濃度で７２時間処置する。製造業者の指示に従ってＤＮＡ相互作用蛍光色素ＹＯＰＲＯを使用して各ウェルでの細胞濃度を次に判定し、Ｇｅｍｉｎｉ−ＥＭ標準プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ：Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して蛍光シグナルを測定する。ＸＬｆｉｔ（登録商標）（Ｆｉｔモデル＃２０１）を使用する曲線あてはめによってＩＣ５０値を計算し、このデータを図１Ａに示す。
【０１８１】
ｐ５３−ＭＤＭ２タンパク質間相互作用をモジュレートする化合物の能力を細胞で直接に監視するために、メカニズムのｐ５３−ＭＤＭ２再分配アッセイ（ＧＲＩＰアッセイ）を使用する。この完全に人工的なアッセイでは、ｐ５３タンパク質を蛍光性ＧＦＰ標識で標識して、細胞の細胞質に固着しているＭＤＭ２タンパク質に結合させる。特定の化合物による細胞の処置は、２つのタンパク質の間の相互作用の解離と、細胞質から核への放出されたｐ５３−ＧＦＰタンパク質の転位を引き起こす。この作用は、ＡｒｒａｙＳｃａｎ−ＶＴｉ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）を使用する高含有量画像化プラットホームと、続く経時的蛍光シグナルを使用して検出、数量化される（図１Ｂ、ＧＲＩＰ  ｐ５３転位アッセイを参照）。
【０１８２】
全体として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイと細胞アッセイの両方を使用して、図１Ａおよび１Ｂに提示される結果は、ＭＤＭ２ｉ（１）およびＭＤＭ２ｉ（２）の両方が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで同等の強力なｐ５３−ＭＤＭ２タンパク質間相互作用阻害剤であり、ｐ５３−ＭＤＭ２タンパク質間相互作用を阻害し、ｐ５３依存的に腫瘍細胞の増殖を妨げ、ｐ５３の蓄積および核への転位を誘導することを示す。このデータを、図１Ｂに示す。細胞系の間にＩＣ５０の大きな不一致があることに留意する。これは、２つの細胞系の間にＭＤＭ２ｉへの感受性の差があることの指標でもあり、したがって、感受性の判定は、どの患者が治療薬を受けるかについての決定で有益である。
【０１８３】
実施例２：  ｐ５３変異の状態は、細胞系でのＭＤＭ２ｉ化学的感受性に関連している
がん関連細胞系のパネルでのＭＤＭ２ｉ（２）化学的感受性とのｐ５３変異の関連は、フィッシャーの直接確率検定によって検定された。細胞系パネルは、Cancer Cell Line Encyclopedia（ＣＣＬＥ）イニシアティブ（Barretina J.、Caponigro G.、Stransky N.、Venkatesan K.ら。Cancer Cell Line Encyclopediaは、抗がん剤感受性の予測的モデリングを可能にする。Nature 483:603〜7、2012）によってカバーされるものである。詳細なゲノム、遺伝子および薬理学的特徴付けは、ＣＣＬＥ細胞系で行われた。
【０１８４】
ＣＣＬＥ細胞系でのｐ５３変異状態は、ＳａｎｇｅｒセンターＣＯＳＭＩＣデータおよびＥｘｏｍｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを含む内部ソースから編集された、遺伝子レベルの遺伝子の改変、例えば点変異、挿入、欠失および複合遺伝子改変のデータソースからとられる。これは、ＣＣＬＥ細胞系にわたる概ね１，６００個のがん関連遺伝子からのデータを含む。ＣＣＬＥパネルの分析は、変異体ｐ５３を含有する２４４個の細胞系、および野生型ｐ５３（ｐ５３受託番号：ＤＮＡ−ＮＭ＿０００５４６、タンパク質−ＮＰ＿０００５３７）を発現する１１２個の細胞系を明らかにした。
【０１８５】
ＭＤＭ２ｉ（２）化学的感受性は、ＣＣＬＥ細胞系の薬理学的特徴付けから判定された。ＭＤＭ２ｉ（２）感受性から、細胞系を２つの群に分けた。１つの群はＭＤＭ２ｉ（２）化合物に感受性の細胞系を含み、他の群はＭＤＭ２ｉ（２）化合物に化学的に非感受性のものを包含する。そのような層化は、それぞれ４７個の感受性および３０９個の非感受性の細胞系の２つの群をもたらした。そのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学的感受性データから、細胞がＭＤＭ２ｉ処置に感受性であるという予測は、１３％であると推定された。ｐ５３変異と感受性群との関連の統計検定は、ｐ５３変異（ｍｔ）とＭＤＭ２ｉ（２）への化学的感受性の間の関連を示す（図２）。図２のｍｔパネルはｐ５３変異ＣＣＬＥ細胞系のＭＤＭ２ｉ（２）感受性プロファイルを提示し、野生型（ｗｔ）パネルはｐ５３野生型ＣＣＬＥ細胞系のＭＤＭ２ｉ（２）感受性プロファイルを提示する。Ａｍａｘは、上で参照したＣＣＬＥ刊行物に記載の通り、ＭＧ１３２、参照として使用されたプロテアソーム阻害剤に対して較正された、最大作用レベル（最も高いＭＤＭ２ｉ（２）試験濃度での阻害）と規定され、ＩＣ５０は、ＭＤＭ２ｉ（２）応答が参照阻害剤に対して−５０の絶対阻害に到達したμＭ濃度と規定される。細胞系計数はＭＤＭ２ｉ（２）化学的感受性およびｐ５３変異状態、および関連する統計値に細分化される。データは、関連する統計値の分割表としても提示される。
【０１８６】
このデータは、そのｐ５３状態が野生型である場合は、細胞系がＭＤＭ２ｉ（２）への感受性を示す可能性がより高いことを示す。実際は、大多数のｐ５３変異細胞系は化合物に非感受性であることが見出されるが、ｐ５３野生型細胞系の２／３より多くのものは感受性である。
【０１８７】
このデータから、ｐ５３野生型遺伝子型はＭＤＭ２ｉ感受性の第１の指標であり、したがって、ＭＤＭ２ｉに応答するがん患者を選択するために考慮すべき第１の層化バイオマーカーであると結論づけることができる。
【０１８８】
実施例３：  ゲノムデータおよび臨床関連事象からのＭＤＭ２ｉへの細胞系の化学的感受性の予測。
任意のＭＤＭ２ｉ処置の前に、感受性細胞系を非感受性細胞系と識別するバイオマーカーを同定する目的で、ＭＤＭ２ｉ（２）処置によって与えられる２つの細胞系感受性群を比較する。そのようなバイオマーカーは、任意のＭＤＭ２ｉ処置の感受性を予測するために使用される。分析するバイオマーカーは、以下のタイプである：１）ＲＭＡ標準化法によって要約される、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）技術とＨＧ−Ｕ１３３プラス２アレイによって生成される遺伝子レベルの発現値；２）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰ６．０技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で得られ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ａｐｔソフトウェアを使用して処理され、ＨａｐＭａｐ参照正常試料のコレクションに対するｌｏｇ２変換比で表される、遺伝子レベルの染色体コピー数の値；３）実施例２で上に記載される、遺伝子レベルの遺伝子の改変または変異；４）ＧｅｎｅＧｏ  Ｍｅｔａｃｏｒｅ（登録商標）知識ベースで参照される、経路に寄与する遺伝子にわたる標準化された平均アプローチによって経路発現レベルを要約する、経路レベルの発現値；５）細胞系系統（起源の細胞系組織）；６）遺伝子改変、コピー数および発現情報を統合することによる、腫瘍抑制遺伝子のセレクションの活性化状態を要約する、遺伝子レベルの腫瘍サプレッサー状態。そのようなゲノムデータはＣＣＬＥ細胞系ゲノムおよび遺伝子の特徴付けとの関連で生成され、合計約４５，０００個のゲノム特性をカバーする。
【０１８９】
２つの細胞系群ゲノム特性を比較するために、特性タイプによってウィルコクソンの符号付順位検定またはフィッシャーの直接確率検定を使用する。連続的値（遺伝子発現およびコピー数、経路発現特性）を有する特性は、ウィルコクソンの符号付順位検定にかけ、別個の値（遺伝子の改変、腫瘍サプレッサー状態および系統特性）を有するものは、感受性と非感受性細胞系群の間の差別的プロファイル評価のために、フィッシャーの直接確率検定にかける。感受性の細胞系群を非感受性のものと区別する重要な特性は、間違った発見率によって制御されるｐ値カットオフにパスするものである。ｐ値制限にかかわりなく、特性タイプにつき最小または最大数の特性も必要とされる。特性選択ステップに及ぼす特性間の高い相関度の影響を最小にするために、前処理ステップとして統計検定の前に特性データをクラスター化する。このステップは、ＦｒｅｙおよびＤｕｅｃｋの親和性増殖法（Clustering by Passing Messages Between Data Points。Frey B.およびDueck D.、Science 315:972〜6、2007）を使用して特性タイプレベルで実施され、ほとんどの変動性を代表する特性セットを検索する。
【０１９０】
バイオマーカー同定を狙うこの２つのクラスの比較のために、細胞系感受性群またはクラスは以下の通りに規定される：４７個の感受性細胞系の感受性群および２０４個の非感受性細胞系の非感受性群。この非感受性群を構成する２０４個の細胞系は、実施例２で指摘する３０９個の非感受性細胞系セットからの最も非感受性のものである。この特性選択ステップは、非感受性のものから感受性の細胞系群を識別するための重要な差別的プロファイルを有し、したがって、ＭＤＭ２ｉへの試料の化学的感受性を予測するマーカーとして考慮すべき必要な特性を有する、合計約２００個の重要な特性を与えた。上で実施例２に記載の通り、関連するバイオマーカーはｐ５３変異状態それ自体である。特性選択ステップの統計値（ｐ値１．１７Ｅ−２１）は、ＭＤＭ２ｉへの感受性を予測するその役割を確認した。さらに、ｐ５３状態に関連するオッズ比（０．０２４）は、ｐ５３変異がＭＤＭ２ｉ非感受性細胞系でより多く現れることを示す。さらに注目すべきは、さらに特性選択ステップの統計値によると、大部分の予測的バイオマーカーは、ｐ５３転写標的遺伝子のサブセットであることが見出される。これらを、表２／図３に示す。図３に示す通り、それらの変化倍率は、これらのバイオマーカーの転写産物がＭＤＭ２ｉ感受性の細胞系集団でより多く発現されることを示す。このことは、ＭＤＭ２ｉに感受性である細胞系では、任意の処置の前にあるレベルのｐ５３機能活性が予め存在していることをおそらく示している。
【０１９１】
表２／図３のバイオマーカーがＭＤＭ２ｉ感受性細胞での機能的ｐ５３経路を反映することは、図４で検証される。図４で、細胞溶解の前に、細胞は、漸増濃度のＭＤＭ２ｉ（１）で４時間処置された。指示通り、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１２０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、６ｍＭのＥＧＴＡ  ｐＨ８．５、１％のＮＰ−４０、２０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＰＭＳＦおよび０．５ｍＭのＮａ−Ｖａｎａｄａｔを含有する細胞溶解緩衝剤を使用して、全細胞溶解物を調製し、タンパク質をＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃ＮＰ０３２２ＢＯＸ、Ｌｕｃｅｒｎｅ；Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で分離し、半湿式ブロットシステムを使用してニトロセルロースＰｒｏｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ８５膜（Ｗｈａｔｍａｎ＃１０４０１２６１：Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）の上に１ｃｍ２膜につき１．５ｍＡで２時間移し、抗ホスホ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５）（１／１０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＃９２８４：Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）ウサギポリクローナル抗体、または抗ｐ５３（Ａｂ−６）（汎親和性、クローンＤＯ−１）（１／１０００；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ＃ＯＰ４３  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗ＭＤＭ２（Ａｂ−１、クローンＩＦ２）（１／１０００；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ＃ＯＰ４６）、抗ｐ２１ＷＡＦ１（Ａｂ−１、クローンＥＡ１０）（１／５００；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ＃ＯＰ６４：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）または抗α−チューブリン（Ｓｉｇｍａ＃Ｔ５１６８：Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）マウスモノクローナル抗体でイムノブロットした。図４に示すように、ＭＤＭ２ｉ（１）の濃度を増加させることはｐ５３タンパク質レベルの安定化を誘導し、Ｃ３ＡとＣＯＬＯ７９２細胞の両方でホスホ−ｐ５３の有意な増加はない。興味深いことに、ＭＤＭ２ｉ（１）による処置は、Ｃ３Ａ感受性細胞でｐ５３標的遺伝子ｐ２１（ＣＤＫＮ１Ａ）とＭＤＭ２の両方の強力な新規発現も誘導するが、ＣＯＬＯ−７９２非感受性細胞系では誘導しない。全体として、このデータは、ＭＤＭ２ｉ阻害剤への感受性が内在性の機能的ｐ５３経路の存在に直接に関係があること、表２／図３のバイオマーカーがセットとして一緒に、または単独で、処置の前のｐ５３経路の機能性を直接に示すことを示し、および、これらのバイオマーカーがｐ５３の作用機構と相関する患者感受性を予測する強力な能力を有することを示す。
【０１９２】
重要なゲノム特性は、２つのＭＤＭ２ｉ化学的感受性群またはクラスのナイーブなベイズ確率論モデリングのための基礎特性として使用される。モデリングステップの目標は、未知試料の患者応答（感受性または非感受性）を一定の信頼度で予測する、分類体系または分類子を誘導することである。予測モデルは、前述の２つの感受性クラスに層化される化学的に特徴付けられたＣＣＬＥ細胞系集団の全体にわたってナイーブなベイズアルゴリズムを訓練することによって規定される。分類子の性能は、モデルを訓練するために使用されるデータの５倍の交差検証を５回反復することによって評価される。モデル性能は、以下のクラスレベルの尺度で要約される：感受性、特異性、正の予測値および負の予測値。感受性クラスは、感受性および正の予測値計算のための参照として使用される。ナイーブなベイズアルゴリズムのデフォルト出力は、１つのクラスまたは他方に割り当てるべき予測される各試料のためのスコアまたは確率である。確率閾値は、確率スコアを感受性または非感受性のクラスレベルの予測に変換すると規定される。確率閾値は、全ての予測される試料にわたって計算される感受性および特異性を最大にする確率と規定される。全体の、ほとんど同一の手順が、実施例２で参照されるＣＣＬＥ刊行物においてより詳細に記載されている。
【０１９３】
ｐ５３変異状態だけ、または約２００個の遺伝子の全体の予測特性セットからよりも、表２に見出される少なくとも１つのバイオマーカー、あるいはセットとしての表２のバイオマーカーから、より優れた予測力を達成することができることを実証するために、これらの特性セットの各々からのナイーブなベイズモデルを訓練し、それらの性能を上記の通りに交差検証によって評価し、比較した（図５）。図５は、表２に見出される選択されたバイオマーカーが、ｐ５３変異状態および約２００個の重要な特性のより大きな群より優れ、ＭＤＭ２ｉへの患者応答性の予測で実質的な向上を提供することを実証する。正の予測値（ＰＰＶ）によって性能を評価するとき、これは特に目ざましい。
【０１９４】
７６％の正の予測値（ＰＰＶ）は、予測された感受性細胞系の７６％がＭＤＭ２ｉ処置に感受性であることを示唆する。臨床場面への外挿法として、７６％のＰＰＶは、腫瘍生検からＭＤＭ２ｉ（２）に感受性であると予測されたがん患者の７６％がＭＤＭ２ｉ（２）処置に対して臨床応答を示すことも示唆する。表２のバイオマーカーを使用し、ナイーブなベイズ予測モデルに関連する患者層化による臨床応答のこの濃縮を、事前の患者層化のないベースライン臨床応答率と比較した。化学的感受性データから推定されるベースライン臨床応答率は、１９％である。したがって、臨床観点では；表２のバイオマーカーは、予測された感受性患者集団で臨床応答の明らかな増加を有する。予測でのこの増加は、ｐ５３状態単独、または初期に選択されたおよそ２００個のゲノム特性の全てについてアッセイするより大きく、より特異的である。これは図５で見ることができ、そこで、「全２００個のバイオマーカー」特性バーは、初期選択されたおよそ２００個のゲノム特性のＰＰＶである。「全２００個のバイオマーカー」特性について報告されたＰＰＶは、５９％である。ｐ５３だけを使用した場合のＰＰＶは、５６％である（図５）。表２に開示されるバイオマーカーセットのＰＰＶは、７６％である（「表２の選択されたバイオマーカー」）。一般に、２００個のゲノム特性のより大きなデータセットは、ＭＤＭ２ｉ感受性の予測に関するより多くのデータポイントおよびより多くの見通しを提供するので、これは意外な結果である。しかし、セットとしてとられるとき、表２のバイオマーカーは予測値の１７％の増加を提供するので、これは正しくない。今では１００人中の１７人のさらなる患者が正しい処置を受けると予測されるので、これはクリニックで重要である。
【０１９５】
表２のバイオマーカーの予測値を試験するために、ＣＣＬＥプロジェクトの一部として薬理学的特徴付けで以前に検討されなかった５２個の細胞系を、ＭＤＭ２ｉへのそれらの感受性について増殖アッセイでアッセイした。簡潔には、細胞を３７℃で一晩、９６ウェルプレートに平板培養し、ＭＤＭ２ｉの漸増濃度で７２時間処置する。製造業者の指示に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ＃Ｇ７５７１／２／３：Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）を使用して各ウェルでの細胞濃度を次に判定し、ＳＹＮＥＲＧＹ  ＨＴプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ：Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）を使用して発光シグナルを測定する。ＸＬｆｉｔ（登録商標）を使用して、曲線あてはめによってＩＣ５０値を計算する（図６）。ＭＤＭ２ｉへの細胞系の感受性は、実施例１に記載される細胞増殖阻害アッセイで試験した全ての細胞の観察されたＩＣ５０を比較することによって判定される。感受性のためのカットオフは、ＭＤＭ２ｉ（１）およびＭＤＭ２ｉ（２）の両方についてＩＣ５０≦３μＭに決定された。図５に開示される値を確認するために、上記の予測モデルを使用してあらゆる細胞系の感受性の予測を実施する。細胞系は、様々な腫瘍に由来する。例えば；黒色腫（ＣＯＬＯ−８２９、ＣＯＬＯ−８４９、ＩＧＲ−１、ＭＥＬ−ＪＵＳＯ、ＳＫ−ＭＥＬ−１、ＳＫ−ＭＥＬ−３１、ＵＡＣＣ−６２、ＵＡＣＣ−２５７）、白血病（ＢＶ１７３、ＥＯＬ−１、ＧＤＭ−１、ＨｕＮＳ１、Ｌ−５４０、ＭＶ−４−１１、ＯＣＩ−ＬＹ３、ＲＳ４：１１、ＳＵＰ−Ｂ１５、ＨＤＬＭ２、ＪＭ１）、乳がん（ＣＡＬ５１、ＥＦＭ−１９２、ＨＣＣ２０２）、膵がん（ＤＡＮ−Ｇ）、肝がん（ＪＨＨ−５）および肺がん（ＲＥＲＦ−ＬＣＫ−ＫＪ）。このアッセイは、表２に開示されるバイオマーカーの全てを単一のセットとして行った。全体として、３６／５２個の細胞系がＭＤＭ２ｉに感受性であると予測され、これらの３６個の細胞系のうち２４個は感受性で、６６％の正の予測値をもたらしたが、再び、ｐ５３単独についてアッセイしたものより予測値（ＰＰＶ）の有意な増加であった。非応答細胞をスクリーニングして除くことに関して、１６／５２個の細胞系はｐ５３−ＭＤＭ２阻害剤に非感受性であると予測され、１３／１６個は実際に非感受性であることが見出され、８１％の有意な負の予測値（ＮＰＶ）をもたらした。全体として、これらのデータは、図５に記載される予測モデルの性能に類似している。無関係な細胞系の実際のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、ＭＤＭ２ｉ化学的感受性予測モデルの試験を可能にし、したがって、表２に開示されるバイオマーカーの検証を可能にした。
【０１９６】
実施例４：  ＭＤＭ２ｉ処置は、腫瘍でのｐ２１（ＣＤＫＮ１Ａ）のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの用量依存的増加に相関する、腫瘍増殖阻害をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害する。
図３に開示される予測バイオマーカーをさらに検証するために、ヒト原発試料または細胞系からのｉｎ  ｖｉｖｏヒト異種移植モデルをマウスの腫瘍に皮下に直接に注射して増殖させ、ＭＤＭ２ｉ感受性について次に評価した。全ての動物を４日間順応させ、食物および水を無制限に与えて病原体制御環境に収容した（ＩＩＩ型ケージにつき５匹のマウス）。動物は、トランスポンダーで識別した。Ｋａｎｔｏｎａｌｅｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒａｍｔ  Ｂａｓｅｌ−Ｓｔａｄｔによって発行された認可番号１９７５に含まれた手順によって試験を実施し、Ｅｉｄｇｅｎｏｓｓｉｓｃｈｅｓ  ＴｉｅｒｓｃｈｕｔｚｇｅｓｅｔｚおよびＥｉｄｇｅｎｏｓｓｉｓｃｈｅ  Ｔｉｅｒｓｃｈｕｔｚｖｅｒｏｒｄｎｕｎｇを厳守した。３．０×１０６のＳＪＳＡ−１骨肉腫細胞を１００μｌのＰＢＳ（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋なし）に濃縮し、Ｈａｒｌａｎヌードマウスの右側腹部に注射することによって、皮下腫瘍を誘導した。ＭＤＭ２ｉの投与は、細胞注射から１２〜１４日後に開始した。各投与の直前にＭＤＭ２ｉを調製した。ＭＤＭ２ｉ化合物を０．５％ＨＰＭＣ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）に溶解し、２５、５０または１００ｍｇ／ｋｇで毎日注射した（ｑ２４ｈ）。ノギスによる測定（式ｌ×ｗ×ｈ×π／６を使用した）から判定される腫瘍体積（ＴＶｏｌ）を、１週当たり３回測定した。腫瘍応答は、Ｔ／Ｃのように、腫瘍体積の変化（エンドポイントから出発値を引く、ｍｍ３で表す）、すなわち、
【０１９７】
【数１】
2015526078.tif 000004
によって数量化した。腫瘍退行の場合、腫瘍応答は、出発ＴＶｏｌの退行の百分率、すなわち、
【０１９８】
【数２】
2015526078.tif 000005
によって数量化した。マウスの体重（ＢＷ）を１週当たり３回測定し、処置の開始日（０日目）に対する任意の特定の時点での、ＢＷの変化百分率（Δ％ＢＷ）の計算を可能にした。図７Ａに示すように、ＭＤＭ２ｉ（１）によるＳＪＳＡ−１異種移植腫瘍の１０日間の処置は用量依存的腫瘍増殖阻害をもたらし、２５ｍｇ／ｋｇ  ｑ２４ｈで５０％、５０ｍｇ／ｋｇ  ｑ２４ｈで３％（静止）の有意なＴ／Ｃであった。１０日間の１００ｍｇ／ｋｇ  ｑ２４ｈでは、ＭＤＭ２ｉ（１）処置は、６５％の有意な腫瘍退行を誘導した（図７Ｂ）。経時的平均体重曲線によって示される通り、全ての用量はｑ２４ｈスケジュールで良好な耐容性を示した。
【０１９９】
ＭＤＭ２ｉ（１）の抗腫瘍活性は、腫瘍でのｐ２１（ＣＤＫＮ１Ａ）ｍＲＮＡレベルの有意な用量依存的誘導と相関していた（図７Ｃ）。簡潔には、ＤＮＡ消化を実施しなかったこと以外は製造業者の指示に従ってＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（登録商標）（７９６５４、Ｑｉａｇｅｎ：Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（登録商標）（７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ：Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、細胞ペレットから全ＲＮＡを精製した。全ＲＮＡを５０μＬの無ＲＮアーゼ水で溶出した。全ＲＮＡは、分光計ＮＤ−１０００  Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、米国）を使用して定量化した。対照プライマーおよびヒトｐ２１（ＣＤＫＮ１Ａ）（Ｈｓ００３５５７８２＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）またはマウスｐ２１（ＣＤＫＮ１Ａ）（Ｍｍ００４３２４４８＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）のためのプライマーで、すなわちＴａｑＭａｎ遺伝子発現キットアッセイ（２０×プローブ色素ＦＡＭ（商標）（またはＶＩＣ）−ＴＡＭＲＡ（またはＭＧＢ）；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）により、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｐｌｕｓ（ＲＴ−ＱＰＲＴ−０３２Ｘ、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ：Ｓｅｒａｉｎｇ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して、試料につき３反復でｑＲＴ−ＰＣＲ（定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）を設定した。より具体的には、Ｈ２Ｏと組み合わせて８μＬ／ウェルの総容量で、マスター混合液を、１×Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ緩衝液、１×プライマー溶液および１×Ｅｕｒｏｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素の最終濃度で、氷の上で調製した。ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学３８４ウェル反応プレート（４３０９８４９、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をベンチの上に固定し、２μＬのｍＲＮＡ（濃度：１０または２０ｎｇ／μｌ）（または陰性対照のために水）を３反復でピペットにより移し、続いて８μＬ／ウェルのマスター混合液を添加した。ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学接着フィルムキット（４３１３６６３、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）でプレートを次にカバーし、４℃において１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）に置いた。４８℃で３０分間の１サイクル、９５℃で１０分間の１サイクル、および最後に９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を交互に用いる４０サイクルでプログラムを実行した。サイクル数（ＣＴ）を判定し、２−ＣＴ値を計算し、ＧＡＰＤＨ対照から得た２−ＣＴ値で割ることによって値を標準化した。対照（すなわちＤＭＳＯまたはビヒクルで処置された動物）に対する増加倍率を計算し、棒グラフで表示した。
【０２００】
さらに、免疫組織化学によって判断される通り、ＭＤＭ２ｉ（１）の抗腫瘍活性は、腫瘍でのｐ２１（ＣＤＫＮ１Ａ）タンパク質レベルの有意な用量依存的誘導と相関していた（図８）。ＳＪＳＡ−１異種移植腫瘍を収集し、腫瘍の中央から３〜４ｍｍ切片を取り出し、前標識した組織カセットに移し、４℃で前冷却した中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）１０（ｖ／ｖ）％（ｐＨ６．８〜７．２）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇａｒｄｅｎ、ＦＬ、ＵＳＡ）に液浸固定した。腫瘍を次に室温で２４時間固定し、続いてパラフィン化のためにＴＰＣ  １５Ｄｕｏ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｍｅｄｉｔｅ）で処理した。その後、腫瘍切片をパラフィンに包埋し、各パラフィンブロックからいくつかの３μｍ厚切片を回転式ミクロトーム（Ｍｉｋｒｏｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で切り出し、４８℃の水浴に広げ、ガラススライド（ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）に載せ、３７℃で一晩、または６０℃で３０分間、オーブンで乾燥させた。乾燥させた組織切片を、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のために処理した。ｐ２１（ＣＤＫＮ１Ａ）の免疫組織化学を、Ｄａｋｏからのマウスモノクローナル抗体クローンＳＸ１１８（カタログ番号Ｍ７２０２  Ｄａｋｏ：Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を１：５０の希釈で使用して実施した。ＳＡ−ＨＲＰ溶液（Ｖｅｎｔａｎａ／Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を省略して、Ｎ−Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ  Ｍｏｕｓｅｓｔａｉｎキット（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ、Ｊａｐａｎ）をＤＡＢＭａｐキット色素体システムと一緒に使用して、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ自動免疫染色装置で免疫組織化学を実施した。穏やかな（９５℃で８分間＋１００℃で２０分間）条件でＣｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ＵＬＴＲＡ（登録商標）（Ｖｅｎｔａｎａ／Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、抗原回収を行った。製造業者の指示に従って、一次抗体のインキュベーションの前後に、Ｎ−Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ  Ｍｏｕｓｅｓｔａｉｎキット（登録商標）（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ、Ｊａｐａｎ）からのブロック試薬ＡおよびＢを使用して、マウス交差反応性をブロックした。一次抗体はＤａｋｏ抗体希釈剤（ＡｂＤ）での所望の希釈により手動で適用し、続いて周囲温度で１時間インキュベートした。対応する陰性対照は、ＡｂＤだけでインキュベートした。その後Ｎ−Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ  Ｍｏｕｓｅｓｔａｉｎキット（登録商標）（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）からの標識ポリマーシステムＳｉｍｐｌｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  ＭＡＸ  ＰＯ（Ｍ）およびＤＡＢＭａｐキット（Ｖｅｎｔａｎａ／Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）からのＤＡＢ基質を使用して、切片を染色した。切片の対比染色は、ヘマトキシリン（Ｖｅｎｔａｎａ／Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して行った。自動染色を実行した後、スライドはエタノールの段階系列で脱水し、キシレ���でクリアにし、Ｐｅｒｔｅｘ（登録商標）マウント剤でマウントした。
【０２０１】
実施例５：  ヒト原発腫瘍マウス異種移植モデルおよびヒト原発腫瘍でのＭＤＭ２ｉ（２）感受性の予測。
バイオマーカー、およびそれらの関連する予測力がｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞系の外に存在するかどうか実証するために、ヒト原発腫瘍試料および異種移植モデルのコレクションでＭＤＭ２ｉ感受性を予測するために、表２のバイオマーカーをナイーブなベイズ予測モデルと共に使用した。
【０２０２】
ナイーブなベイズ確率論モデリングの特性の基礎として、表２の全てのバイオマーカーの遺伝子レベルの発現値を使用した。それらは実施例３に記載される通りに生成し、唯一の差は、標準化が正常試料と腫瘍試料の参照セットを標的にした、ＲＭＡ要約ステップであった。ナイーブなベイズモデリングは、実施例３に記載されている通りに実行する。
【０２０３】
感受性予測のために提出されたヒト原発腫瘍試料および異種移植モデルは、それぞれ約１８，０００個および５０３個の試料のコレクションであり、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ技術（ヒトゲノムＵ１３３プラス２．０アレイ）で生成されたその遺伝子発現プロファイルが利用可能である。コレクションの試料は、病理学、組織学および原発部位を含む試料オントロジーのために管理された用語集により、内部注釈がついていた。公開および内部のソースから関連する遺伝子チップデータを集め、一貫性のための同じ標準試料に対して上記の通り標準化した。
【０２０４】
コレクションからのＭＤＭ２ｉ予測感受性試料の比を、上の実施例３に記載されるＭＤＭ２ｉ（２）化学的感受性データによって与えられる感受性細胞系の割合と比較した。優れた相関は、ヒト原発腫瘍試料でＭＤＭ２ｉ感受性を予測する図３に開示されるバイオマーカーの能力を実証すると予想される。明暸性のために、感受性細胞系の割合が細胞系の化学的感受性データで過小評価されている系統を潜在的に同定することに加えて、感受性予測比と感受性細胞系比の比較は組織起源によって分割される。
【０２０５】
図９（左パネル）は、コレクションからの予測された感受性ヒト原発腫瘍試料とＭＤＭ２ｉ化学的感受性データからの感受性細胞系の間の相関を示す。それは、表２に開示されるバイオマーカーを示し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞系試料の外で感受性を予測するためのその使用は有効である。それは、ヒト原発腫瘍試料でＭＤＭ２ｉ化学的感受性を予測するために、表２に開示されるバイオマーカーを使用することができることも示す。それは、以前に調査されていない新しい腫瘍指標を明らかにし、現在の研究で見出される結果を確認する。新しい指標、例えば肝臓（肝細胞癌）および腎臓（腎細胞癌）は、ＭＤＭ２ｉによる処置のために表２に開示されるバイオマーカーで前臨床的および臨床的に評価するべき潜在的に新しい疾患指標を表す。図９Ａは、原発黒色腫腫瘍でＭＤＭ２ｉ化学的感受性を予測するために、表２に開示されるバイオマーカーを使用することができることも示し、現在の研究で見出される結果と一致する。
【０２０６】
図９（右パネル）は、予測された感受性ヒト原発腫瘍試料の画分と原発腫瘍異種移植コレクションでの予測された感受性比の間の相関を示す。腫瘍試料／異種移植／細胞系は、系統によって組織化される。両パネル中の破線は、同一系である。それは、例示されたサインおよび関連する予測分類子を研究し、検証することができる、ｉｎ  ｖｉｖｏマウス異種移植モデルから生成されたデータが、ｉｎ  ｖｉｖｏのコレクション試料の残りからのデータと一致することを示す。それは、マウス異種移植モデルが、ｉｎ  ｖｉｖｏ前臨床の場面では、がん患者および疾患指標の臨床転帰を予測するための、ｐ５３下流標的遺伝子ベースの分類子アプローチを検証するソース材料であることを確認する。
【０２０７】
実施例６：  同定された１３個のバイオマーカーの単一のバイオマーカーおよび任意の組合せは、ＭＤＭ２ｉへの化学的感受性を予測する。
ナイーブなベイズ予測モデリングフレームワークと共に使用するとき、表２に表される１３個のバイオマーカーは、実施例３および５に例示されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系とｉｎ  ｖｉｖｏの両方でＭＤＭ２ｉ感受性を予測する。これらの１３個のバイオマーカーのサブセットもＭＤＭ２ｉ感受性を予測するかどうか調査するために、単一のバイオマーカーおよびそれらの複数の組合せを予測的モデリングの特性基礎として用いる。次にそれらの予測性能を、ＭＤＭ２ｉ感受性予測のための予測特性として使用するときに、完全な１３個のバイオマーカーまたはｐ５３変異状態で達成されるものと比較する。
【０２０８】
ｐ５３変異状態の２つの例が、実施例６で考慮される。これらの２つの例は、実施例２で指摘したように、ＣＣＬＥ細胞系のＥｘｏｍｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇデータから規定され、患者の層化または臨床注釈のためにｐ５３遺伝子が配列決定をされる臨床場面の代用であることを意図する。
【０２０９】
ｐ５３変異状態の第１の例は、ｐ５３のエクソン５〜８にわたる変異から規定される。エクソン５〜８は、ｐ５３のＤＮＡ結合性ドメインを包含し、それは記載されたｐ５３変異の大多数を含有し、臨床場面で一般的に配列決定の対象にされるｐ５３エクソンである（例えば、新しい自動ＤＮＡシーケンサーによるｐ５３遺伝子の急速配列決定。Bharaj B.、Angelopoulou K.およびDiamandis E.、Clinical Chemistry 44:7 1397〜1403、1998）。第２の例は主なｐ５３転写産物の完全なオープンリーディングフレームを考慮し、したがって全てのコードエクソン変異から規定される。
【０２１０】
表２に開示される１３個のバイオマーカーのリストから、複数のバイオマーカー組合せを生成することができる。２〜１２個のバイオマーカーからの全ての組合せタイプが、ＭＤＭ２ｉ化学的感受性の予測的モデリングの特性基礎として評価される。５０個を超える異なる組合せが所与の組合せタイプに存在するとき、評価される組合せの数は５０に制限される。各組合せタイプの５０個全ての組合せは、ランダムに選び出した。
【０２１１】
上記の特性セット（単一のバイオマーカー、２〜１２個のバイオマーカー組合せ、ｐ５３変異状態の例）に関連する全ての予測的モデルを大部分は実施例３に記載の通りに訓練し、評価した。実施例３と異なることは、以下の通りである：トレーニングデータは実施例３で使用されたものよりわずかに大きく、２６４個の細胞系（感受性のクラスから４７個および非感受性クラスから２１７個）を包含する；５倍の交差検証スキームで細胞系を感受性または非感受性と呼ぶために、ナイーブなベイズ確率論モデリングで０．５のｐ値閾値を使用した。さらに、交差検証過程によって生成された全ての試料層をランダムに選択し、お互いに独立していた。組合せの予測モデルの性能ならびにｐ５３変異状態例および１３個のバイオマーカーモデルとのそれらの比較を、図１０〜１２に示す。
【０２１２】
図１０は、単一のバイオマーカー、組合せ、１３個のバイオマーカーおよびｐ５３変異モデルによって達成された正の予測値（ＰＰＶ）を表す。ＰＰＶは、考慮されたモデリング過程による患者選択の後に臨床試験で予想される臨床効力の推定値である。便宜上、特性セットにつきプロットに５つを超えるデータポイントがあるとき、データは箱髭図で表される。
【０２１３】
図１０は、わずか２個および３個のバイオマーカーからの組合せが、エクソン５〜８のｐ５３変異（「ｅｘ５ｔｏ８ｍｔ」）および全エクソンｐ５３変異特性（「ａｌｌＥｘＭｔ」）にそれぞれ優ることを示す。実際は、データの正規分布を仮定すると、髭の末端によって規定される上限および下限は、データポイントの約９９％を包含する。したがって、評価した２−および３−バイオマーカー組合せの大部分は、ｐ５３変異状態例によって達成されたものより高いＰＰＶを示す。さらに、全ての単一の遺伝子モデルが２つのｐ５３変異例に優るとは限らないとしても、それらの大半（およそ７５％、箱プラス上髭）はｐ５３全エクソン変異に優る。注目すべきことに、考慮された試料集団では全ての単一遺伝子モデルは感受性細胞系比（約１８％）より高いＰＰＶをもたらし、わずか１つのバイオマーカーから構築されたＭＤＭ２ｉ感受性予測モデルが、感受性試料で選択された試料を濃縮することが可能なことを示す。
【０２１４】
さらに、図１０にグラフ表示される通り、このモデリング演習の下で、ｐ５３エクソン５〜８変異状態モデルによって与えられるＰＰＶは、５回の交差検証反復の平均で４８％である。それは、実施例３に開示されるｐ５３変異ＰＰＶ（５６％）より有意に低い。これは、一般的な慣行である、ｐ５３エクソン５〜８の配列決定が患者選択のために用いられる臨床場面では、例示された１３個のバイオマーカーに基づく患者選択が、実施例３から予想されるよりさらに高い付加値を有することを示す。
【０２１５】
図１１は、評価された、いくつかのモデルによって達成された特異性を示す。図１０のＰＰＶに関しては、わずか２つのバイオマーカーから構成されるあらゆる組合せは、変異例だけから得られるものより高い特異性を達成するのに十分である。モデル性能を監視するために特異性が使用される場合は、全ての単一バイオマーカーモデルは変異に優る。
【０２１６】
図１２は、感受性を示す。感受性はリコールとも呼ばれ、患者選択の結果保持される真に感受性の患者集団の推定値である。ＭＤＭ２ｉ感受性予測モデルのための特性基礎としての９つのバイオマーカーの組合せは、完全な１３バイオマーカーリストで達成されるものと同等の感受性を得るのに十分である。しかし、わずか少数の９−バイオマーカー組合せだけが、２つのｐ５３変異状態予測モデルによって与えられるものより高い感受性を達成する。しかし、注目すべきことに、わずか２つのバイオマーカーからの評価された全ての組合せ、および単一バイオマーカーモデルの大半は、ランダム分類の結果偶然に予想されるものより高い感受性を提示する（約１８％）。
【０２１７】
図１０、１１および１２からの結論では、ＭＤＭ２ｉへの化学的感受性を予測するモデルで特性基礎として使用するとき、単一のバイオマーカーは、臨床場面で潜在的にＭＤＭ２ｉに応答する患者の有意な濃縮をもたらす試料感受性予測を達成するのに十分である。さらに、任意の２つ以上のバイオマーカーから構成された組合せは、ｐ５３変異に基づく患者選択で得られたものに対して、予想される臨床効力を増加させる。表２に掲載されるバイオマーカーのいずれかから８つのバイオマーカーを組み合わせることは、１３個のバイオマーカーモデルによって与えられるものと同等の患者リコールを達成するのに十分である。１３個の遺伝子サインおよび関連する組合せについて得られる予測モデル性能測定基準は、実施例３で行われたように、モデルのナイーブベイズ確率論ステップで使用されるクラス帰属ｐ値閾値を最適化することによって、さらに最適化することができる。
【０２１８】
さらなる実施形態では、表２に表すバイオマーカーがｐ５３変異状態と共同してＭＤＭ２ｉ化学的感受性を予測することができるかどうかについて調査される。単一のバイオマーカーおよび２つ以上のバイオマーカーの組合せは、特性リストでｐ５３変異状態と組み合わせられる。以前におよび上で記載される通り、特性リストは次に感受性予測モデリングの基礎として利用される。生じた複数のモデルの性能は、上記のように評価される。
【０２１９】
例として使用されるｐ５３変異状態例は、ｐ５３エクソン５〜８の変異である。図１３、１４および１５は、ｐ５３変異をバイオマーカーと組み合わせたそれらのモデルのＰＰＶ、特異性および感受性をそれぞれ表し、変異のみのモデルおよび完全な１３−バイオマーカーモデルによって与えられる結果と比較される。
【０２２０】
図１３は、１３のリストからの少なくとも単一のバイオマーカーが、ｐ５３変異状態と共同で、データの基礎感受性比率（１８％）より高いＰＰＶを達成するのに十分であることを示す。図１３は、予測モデルで特性として用いられるとき、単一のバイオマーカーが、最低限、なおｐ５３変異状態と一緒に、上記の２つのｐ５３変異状態例で得られるものより高いＰＰＶを達成することも示す。最後に、ｐ５３変異と一緒の任意の５つのバイオマーカーは、１３個のバイオマーカーのモデルによって達成されるＰＰＶを再現する。
【０２２１】
特異性および感受性がモデル性能測定基準として考慮されるとき、図１４および１５から同じ結論が引き出される。図１５から注目すべきことは、ｐ５３変異と共にモデル化される場合は、わずか１つのバイオマーカーから高い感受性を得ることができる。
【０２２２】
結論として、表２からの単一または複数のバイオマーカーをｐ５３変異状態と組み合わせることは、ＭＤＭ２ｉ感受性の予測を可能にし、治療または臨床場面での患者選択のために適用されるときは、潜在的なＭＤＭ２ｉ応答患者の損失を限定して有意な濃縮をもたらす。
【０２２３】
実施例７：  同定された１３個のバイオマーカーはｉｎ  ｖｉｖｏおよび前選択された野生型ｐ５３ヒト原発異種移植モデルで、ＭＤＭ２ｉへの化学的感受性を予測する。
図３に開示される予測的バイオマーカーをさらに検証するために、マウスの皮下にヒト原発腫瘍を直接に移植し、増殖させ、次にＭＤＭ２ｉ感受性について評価した。全ての動物を４日間順応させ、食物および水を無制限に与えて病原体制御環境に収容した（ＩＩＩ型ケージにつき５匹のマウス）。動物は、トランスポンダーで識別した。Ｋａｎｔｏｎａｌｅｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒａｍｔ  Ｂａｓｅｌ−Ｓｔａｄｔによって発行された認可番号１９７５に含まれた手順によって試験を実施し、Ｅｉｄｇｅｎｏｓｓｉｓｃｈｅｓ  ＴｉｅｒｓｃｈｕｔｚｇｅｓｅｔｚおよびＥｉｄｇｅｎｏｓｓｉｓｃｈｅ  Ｔｉｅｒｓｃｈｕｔｚｖｅｒｏｒｄｎｕｎｇを厳守した。皮下腫瘍は、ヒト患者腫瘍の腫瘍断片（３×３×３ｍｍ３）をＨａｒｌａｎヌードマウスの右腹部に移植することによって誘導した。腫瘍が１５０〜２００ｍｍ３のサイズになったときにＭＤＭ２ｉ（１）の投与が開始され、処置期間は４週までであった。ＭＤＭ２ｉ（１）は、各投与のために新たに作製した。ＭＤＭ２ｉ（１）を０．５％ＨＰＭＣ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）に溶解し、１００ｍｇ／ｋｇで毎日注射した（ｑ２４ｈ）。ノギスによる測定（式ｌ×ｗ×ｈ×π／６を使用した）から判定される腫瘍体積（ＴＶｏｌ）を、１週当たり３回測定した。腫瘍応答は、腫瘍体積の変化の百分率、すなわち、
【０２２４】
【数３】
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によって数量化した。マウスの体重（ＢＷ）を１週当たり３回測定し、処置の開始日（０日目）に対する任意の特定の時点でのＢＷの変化百分率（Δ％ＢＷ）の計算を可能にした。
【０２２５】
ＭＤＭ２ｉへの感受性のために使用したカットオフは、完全腫瘍体積測定（最長直径の合計の代わりに）に適合させたＲＥＣＩＳＴに基づき、すなわち、感受性であるか応答性であるとみなされたモデルは、完全な応答（完全退行）、または部分的な応答（腫瘍体積の＞５０％の減少）または安定した疾患（腫瘍体積の５０％の減少から３５％の増加の間）を提示した。進行性の疾患（腫瘍体積の＞３５％の増加）を示すｉｎ  ｖｉｖｏモデルは、ＭＤＭ２ｉ処置に非応答性であると考えられた。例えばＭＤＭ２ｉによる持続的処置期間の後の抵抗性機構の出現によるいかなる誤ったコールをも避けるために、処置期間中の最大作用時点で感受性コールを出した。研究のために使用したヒト原発異種移植腫瘍モデルは様々な腫瘍に由来し、系統組成は図９に従って選択された、例えば、黒色腫（１９）、結腸直腸がん（１７）、脂肪肉腫（３）、腎細胞癌（３）、肝がん（７）、乳がん（１）、膵がん（２）および肺がん（３）。あらゆるヒト原発異種移植腫瘍モデルの感受性の予測は、大部分は実施例３および５に例示される通りに、単一のセットとしての表２に開示される全てのバイオマーカーおよび予測モデルを使用して実施した。この特定の例では、７７個のＭＤＭ２ｉ（２）感受性細胞系を５５７個の非感受性細胞系と比較することによって、ナイーブなベイズ確率論規則を訓練し、それより上では異種移植腫瘍モデルはＭＤＭ２阻害に感受性であると予測されるナイーブなベイズ予測モデル確率閾値は０．２に設定した。さらに、感受性および非感受性クラスへのトレーニング細胞系の化学的感受性の帰属は、実施例２に例示される通りに行い、唯一の差は、所与の細胞系のために薬理学的特徴付けが繰り返されたときに、繰り返された感受性の要約のために細胞系感受性測定基準の中央値を使用したことである。
【０２２６】
図１６に示すように、２７／５５個のヒト原発異種移植腫瘍モデルはＭＤＭ２ｉに感受性であると予測され、これらの２７個のｉｎ  ｖｉｖｏモデルのうち、１９個は実験により感受性であると確認され、７０．５％の正の予測値になり、４９％の基礎応答率を向上させた。さらに、２８／５５個のｉｎ  ｖｉｖｏモデルはＭＤＭ２ｉに非感受性であると予測され、２０／２８個は実験により非感受性であると確認され、７１．５％の有意な負の予測値（ＮＰＶ）になった。全体として、これらのデータは、図５に記載される予測モデルの性能と同等である。ＭＤＭ２ｉ処置へのヒト原発異種移植腫瘍モデルの応答の評価は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＤＭ２ｉ化学的感受性予測モデルの検証を可能にし、したがって、マウスの患者由来の異種移植腫瘍を使用して、表２に開示されるバイオマーカーの妥当性を確認した（図１６）。
【０２２７】
この研究で使用した全５５個のヒト原発異種移植腫瘍モデルのために、ｐ５３変異コールが利用可能である。それらのうちの３４個は、野生型ｐ５３である。図１７に示すように、２２／３４個の野生型ｐ５３ヒト原発異種移植腫瘍モデルはＭＤＭ２ｉに感受性であると予測され、これらの２２個のｉｎ  ｖｉｖｏモデルのうち、１８個は実験により感受性であると確認され、８２％の正の予測値になり、６５％の基礎応答率を再び有意に向上させた。３４個のうちの１２個のモデルはＭＤＭ２ｉに非感受性であると予測され、８／１２個は実験により非感受性であると確認され、６６．５％の有意な負の予測値（ＮＰＶ）になった。全体として、これらのデータは、図５に記載される予測モデルの性能と同等であり、マウスの野生型ｐ５３の選択された患者由来の異種移植腫瘍を用いて、表２に開示されるバイオマーカーを再び立証した（図１７）。
【０２２８】
結論として、図５に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ予測モデルの性能が、ヒト原発異種移植腫瘍モデルを使用して確認され、表２に開示されるバイオマーカーをｉｎ  ｖｉｖｏでさらに立証した。重要なことに、ここに記載される知見は、選択されていないがん患者または野生型ｐ５３の前選択されたがん患者集団における、ＭＤＭ２ｉ化学的感受性予測モデルの使用を支持する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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