(57)【要約】本発明は、式(I)で示されるジアゼピン誘導体および式(II)で示されるテトラアザシクロドデカン誘導体：2015535811.tif 000091から選ばれる両親媒性の常磁性金属キレート部分を含む常磁性固体脂質ナノ粒子(pSLN)であって、該キレート部分が、Gd(III)、Mn(II)、Cr(III)、Cu(II)、Fe(III)、Pr(III)、Nd(III)、Sm(III)、Tb(III)、Yb(III)、Dy(III)、Ho(III)およびEr(III)から選ばれる、該ナノ粒子に関する。本発明はさらに、常磁性金属の両親媒性錯体を含む該固体脂質ナノ粒子(pSLN)の製造方法および診断分野におけるMRI造影剤としてのpSLNの使用に関する。
2015535811.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)で示されるジアゼピン誘導体および式(II)で示されるテトラアザシクロドデカン誘導体：
2015535811.tif 000067
[式中、
Yは、式：Y'-NH-または(Y')2-N-で示される基であって；ここで、Y'は、直線または分枝の飽和または不飽和C8〜C16アルキル基；ヒドロキシ -OH、カルボキシ -COOR1、オキシカルボニル-(C8〜C16)アルキルおよびオキシカルボニル-(C8〜C16)アルケニルから選ばれる1つ以上の基で任意に置換されたリン酸基 -O-(HO-P=O)-O-によって中断されたC1〜C10アルキル基(ここで、R1は、水素 HまたはC1〜C4直線または分枝アルキル基である)から選ばれる；またはY'は、置換もしくは部分置換グリセロールのモノリン酸エステルであり、飽和または不飽和炭素鎖を有する脂肪族脂肪酸とエステル化された該グリセロールの少なくとも1つの官能基を有し、リン酸官能基は、遊離であるかまたはアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属と塩化される；
Lは、カルボニル -C=O、チオカルボニル -C=S、アミノ -NR1-、カルボキシ -COO-、オキシ-カルボニル -OCO-、アミド -NR1CO-または-CONR1-、酸素 -O-およびイオウ -S-(ここで、R1は前記と同意義)から選ばれる原子または基で任意に置換または中断された直線または分枝基である脂肪族C3〜C10環式および複素環式およびC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニルまたはアルキニルから選ばれる二価のリンカーである；
RI-IVおよびRI-III はそれぞれ独立して、-(C1〜C3)アルキルカルボキシ基である]
から選ばれる両親媒性の常磁性金属キレート部分またはその塩を含む常磁性固体脂質ナノ粒子(pSLN)であって、該キレート部分が、Gd(III)、Mn(II)、Cr(III)、Cu(II)、Fe(III)、Pr(III)、Nd(III)、Sm(III)、Tb(III)、Yb(III)、Dy(III)、Ho(III)およびEr(III)またはその塩から選ばれる常磁性金属イオンと錯体を形成する、該ナノ粒子。
【請求項２】
C12〜C24飽和または不飽和の、直線または分枝アルキル鎖を有するモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリド、またはその混合物から選ばれるグリセリドを少なくとも含み、ジグリセリドおよびトリグリセリドの場合、アルキル鎖は同一または異なってよく、飽和または不飽和C12〜C22脂肪酸、脂肪酸エステルおよびその混合物を任意に含む固体脂質コアを特徴とする、請求項１に記載のpSLN。
【請求項３】
該グリセリドが、トリグリセリドであり、好ましくは、トリミリスチン、トリパルミチン、トリステアリンおよびトリアラキジンおよびそれらの混合物から選ばれる、請求項１〜２のいずれか1つに記載のpSLN。
【請求項４】
両親媒性成分が、C6〜C24直線または分枝の、飽和または不飽和鎖リン脂質、リゾ脂質またはスフィンゴ脂質から選ばれる両親媒性化合物ならびに請求項１において定義された式(I)および／または(II)の常磁性錯体またはその塩から選ばれる両親媒性化合物を少なくとも含む該固体脂質コアの周囲の両親媒性成分を特徴とする、請求項１〜３のいずれか1つに記載のpSLN。
【請求項５】
30〜50% 重量/重量の請求項２において定義された脂質；
27〜45% 重量/重量のC6〜C24直線または分枝の、飽和または不飽和鎖リン脂質、リゾ脂質またはスフィンゴ脂質から選ばれる化合物である両親媒性化合物；
5〜14% 重量/重量の請求項１において定義された式(I)および／または(II)の両親媒性常磁性錯体またはその塩；
を含む、請求項１〜４のいずれか1つに記載のpSLN。
【請求項６】
生理的条件下で測定された、0.47 Tにおいて、25 mM-1s-1より高い、好ましくは30 mM-1s-1より高い緩和能値r1pを特徴とする、請求項１〜５のいずれか1つに記載のpSLN。
【請求項７】
粒子分布10〜220 nm、平均流体力学直径100 nm未満および多分散指数(PdI)0.2未満を特徴とする、請求項１〜６のいずれか1つに記載のpSLN。
【請求項８】
該平均直径が50〜70 nmであり、PdIが0.12〜0.18である、請求項７に記載のpSLN。
【請求項９】
両親媒性成分が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールまたはそれらの混合物から選ばれるリン脂質であり、さらに、胆汁酸、胆汁酸誘導体またはその塩、糖脂質、脂肪酸、脂肪族アルコール、ジアルキルエーテルまたはトコフェロールを任意に含む、請求項４〜８のいずれか1つに記載のpSLN。
【請求項１０】
リン脂質が、天然由来であり、大豆または卵レシチンである、請求項９に記載のpSLN。
【請求項１１】
少なくとも1つのイオン性または非イオン性界面活性剤、適当な特異的リガンドおよび／またはアルキル鎖または両親媒性成分で任意に化学的に修飾されたステルス剤、任意に化学的に修飾された内因性生体分子(ここで、特異的リガンドまたは内因性生体分子は、さらに、ビタミン、ペプチドおよびポリペプチドから選ばれる)から選ばれる少なくとも1つの成分を含む、請求項１０に記載のpSLN。
【請求項１２】
両親媒性常磁性錯体が、以下の化合物：
2015535811.tif 000068
2015535811.tif 000069
2015535811.tif 000070
2015535811.tif 000071
2015535811.tif 000072
2015535811.tif 000073
2015535811.tif 000074
2015535811.tif 000075
2015535811.tif 000076
2015535811.tif 000077
2015535811.tif 000078
またはその塩から選ばれる、請求項１〜１１のいずれか1つに記載のpSLN。
【請求項１３】
ステルス剤が、リン脂質および／または葉酸で任意に化学的に修飾されたポリエチレングリコール(PEG)(DSPE-PEG 2000-葉酸)である、請求項９〜１２のいずれか1つに記載のpSLN。
【請求項１４】
常磁性金属の両親媒性錯体を含む固体脂質ナノ粒子(pSLN)の製造方法であって、以下のステップ：
a)水と混ざらない低沸点有機溶媒中で、以下を混合することによって有機相(O)を製造すること：
請求項１において定義された式(I)で示されるジアゼピン誘導体および式(II)で示されるテトラアザシクロドデカン誘導体から選ばれる、金属イオンとキレート化するのに適した両親媒性錯体であって、該キレート部分が、Gd(III)、Mn(II)、Cr(III)、Cu(II)、Fe(III)、Pr(III)、Nd(III)、Sm(III)、Tb(III)、Yb(III)、Dy(III)、Ho(III)およびEr(III)から選ばれる常磁性金属イオンと錯体を形成する錯体；
C12〜C24飽和または不飽和の、直線または分枝アルキル鎖を有するモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリド、またはその混合物から選ばれるグリセリドを少なくとも含み、ジグリセリドおよびトリグリセリドの場合、アルキル鎖は同一または異なってよく、飽和または不飽和C12〜C22脂肪酸、脂肪酸エステルおよびその混合物を任意に含む脂質；
C6〜C24直線または分枝の、飽和または不飽和鎖リン脂質、リゾ脂質、スフィンゴ脂質から選ばれ、さらに、胆汁酸、胆汁酸誘導体またはその塩、糖脂質、脂肪酸、脂肪族アルコール、ジアルキルエーテルおよびトコフェロールを任意に含む、両親媒性界面活性剤；
b)1種以上のイオン性または非イオン性界面活性剤、およびC3〜C8ポリ-アルキルアルコールおよびC5〜C12飽和脂肪酸から選ばれる共界面活性剤を任意に含む水溶液(W)を製造すること；
c)a)で製造した有機層(O)を、b)で製造した水溶液(W)と混合して、20℃〜40℃の温度で安定かつ透明なマイクロエマルション(W/O)を得ること；
d)ステップc)のマイクロエマルション(W/O)を、20℃〜40℃の温度で張力活性剤として少なくとも1種のイオン性または非イオン性界面活性剤を含む第二の水溶液(W1)に加えて、多重エマルション(W/O/W1)を得ること；
e)多重エマルションから有機溶媒を蒸発させ、脂質ナノ粒子の懸濁液を得ること；
f)ステップe)で得た懸濁液を、ステップa)で定義した脂質成分の結晶点より低い温度に冷却して、pSLNを得ること；
を含む方法。
【請求項１５】
ステップa)の脂質が、トリグリセリドであり、好ましくは、トリミリスチン、トリパルミチン、トリステアリンおよびトリアラキジンおよびそれらの混合物から選ばれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップa)における水と混ざらない有機溶媒が、塩化メチレン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ギ酸エチル、1,2-ジクロロエタンおよびそれらの混合物から選ばれる、請求項１４〜１５のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１７】
溶媒が、塩化メチレンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップa)における有機相(O)が、25℃〜40℃、より好ましくは30〜35℃の温度に暖められる、請求項１４〜１７のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１９】
ステップa)における脂質成分中の脂肪酸が、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸から選ばれる、請求項１４〜１８のいずれか1つに記載の方法。
【請求項２０】
ステップa)における脂質成分が、トリパルミチンおよびステアリン酸である、請求項１４〜１８または１９のいずれか1つに記載の方法。
【請求項２１】
ステップa)における両親媒性界面活性剤が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールおよびそれらの混合物、あるいは大豆または卵レシチンから選ばれるリン脂質を含むか、または、該リン脂質である、請求項１４〜２０のいずれか1つに記載の方法。
【請求項２２】
さらに、モノまたはオリゴグリコシドおよびそのグリセロールのエトキシル化モノ、ジおよびトリエステルまたはそれらの混合物の添加を含む、請求項１４〜２１のいずれか1つに記載の方法。
【請求項２３】
ステップb)において定義された水溶液(W)が、さらに、低分子量イオン性界面活性剤、好ましくはコール酸および誘導体、タウロコール酸およびその水和塩秒、コール酸ナトリウム、グリコール酸ナトリウムおよびタウロデオキシコール酸ナトリウムから選らばれるアニオン性界面活性剤を含み、任意に、糖脂質、脂肪酸、脂肪族アルコール、ジアルキルエーテルまたはトコフェロールから選ばれる界面活性剤を含む、請求項１４〜２２のいずれか1つに記載の方法。
【請求項２４】
ステップa)において定義された有機相(O)またはステップb)において定義された水溶液(W)が、さらに、適当な特異的リガンドおよび／またはアルキル鎖または両親媒性成分で任意に化学的に修飾されたステルス剤、任意に化学的に修飾された内因性生体分子(ここで、特異的リガンドまたは内因性生体分子は、さらに、ビタミン、ペプチドおよびポリペプチドから選ばれる)から選ばれる少なくとも1つの追加成分を含む、請求項１４〜２３のいずれか1つに記載の方法。
【請求項２５】
さらに、以下のステップ：
g)pSLN懸濁液の精製；
h)滅菌；
を含む、請求項１４〜２３のいずれか1つに記載の方法。
【請求項２６】
請求項１３〜２５のいずれか1つに記載の方法にしたがって得られる、請求項１〜１２のいずれか1つに記載のpSLN。
【請求項２７】
式(I')：
2015535811.tif 000079
で示されるジアゼピン誘導体、または式(II')：
2015535811.tif 000080
で示されるテトラアザシクロドデカン
[式中、
Yは、式：Y'-NH-または(Y')2-N-で示される基であって；ここで、Y'は、直線または分枝の飽和または不飽和C8〜C16アルキル基；ヒドロキシ -OH、カルボキシ -COOR1、オキシカルボニル-(C8〜C16)アルキルおよびオキシカルボニル-(C8〜C16)アルケニルから選ばれる1つ以上の基で任意に置換されたリン酸基 -O-(HO-P=O)-O-によって中断されたC1〜C10アルキル基(ここで、R1は、水素 HまたはC1〜C4直線または分枝アルキル基である)から選ばれる；
Lは、カルボニル -C=O、チオカルボニル -C=S、アミノ -NR1-、カルボキシ -COO-、オキシ-カルボニル -OCO-、アミド -NR1CO-または-CONR1-、酸素 -O-およびイオウ -S-(ここで、R1は前記と同意義)から選ばれる原子または基で任意に置換または中断された直線または分枝基であるC1〜C6アルキルから選ばれる二価のリンカーである]
（該式(I')で示されるジアゼピンまたは式(II')で示されるテトラアザシクロドデカンは、任意に生理的に許容しうる塩の形態で、Gd(III)、Mn(II)、Cr(III)、Cu(II)、Fe(III)、Pr(III)、Nd(III)、Sm(III)、Tb(III)、Yb(III)、Dy(III)、Ho(III)およびEr(III)から選ばれる常磁性金属イオンと任意に錯体を形成する）。
【請求項２８】
以下の化合物：
2015535811.tif 000081
2015535811.tif 000082
2015535811.tif 000083
2015535811.tif 000084
2015535811.tif 000085
2015535811.tif 000086
2015535811.tif 000087
2015535811.tif 000088
2015535811.tif 000089
2015535811.tif 000090
から選ばれる常磁性両親媒性Gd(III)錯体またはその塩。
【請求項２９】
請求項１３〜２４に記載の方法にしたがってpSLNを製造するための請求項２７〜２８に記載の錯体の使用。
【請求項３０】
請求項１〜１２または２６に記載のpSLNを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、MRI(磁気共鳴画像法)における造影剤として用いるための、テトラアザシクロドデカンおよびジアゼピン誘導体などの常磁性金属イオンキレート剤の誘導体を含む常磁性特性を有する固体脂質ナノ粒子(SLN)[pSLN]の新規な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床状況において通例用いられる造影剤は、静脈内投与後、健康な組織と比べて病理組織において示差的な血管透過性に応じて、細胞外空間で示差的に分配される低分子量の親水性ガドリニウム錯体である。溢出の程度に応じて組織に到達する濃度が異なることは、磁気共鳴シグナルの強度の相違をもたらし、画像中の陽性造影(白)を増加させる。磁気共鳴画像法によって測定可能なシグナルを生成する造影剤の固有の能力は、水プロトンの磁化ベクトルの緩和時間を変更する造影剤の能力を示す緩和能(r)と呼ばれるパラメーターによる。
【０００３】
「縦」および「横」と呼ばれ、それぞれ緩和能パラメーターr1およびr2である2つのタイプの緩和メカニズムがある。臨床設定において一般に造影剤の有効性を比較するために用いられる緩和能パラメーターは、通常、r1である。臨床設定において現在用いられる製品は、それらが0.47 Tの外部磁場により水中で25℃にて測定される場合、4〜6 mM-1s-1の範囲のr1値を有する。このクラスの製品の第二の重要な特徴は、いくつかの場合において血清アルブミンと弱い相互作用がある以外は、生体分子との特異的相互作用の完全不在である。結果として、血液クリアランス率は高く、排出は、主として糸球体ろ過によって、すなわち尿として行われる。このクラスの製品は、血流、組織および細胞もしくは分子成分に対する特異性の欠如を特徴とするということである。近年、代替のMRI造影剤の追及が次第に進行してきている。新たな造影剤の探索は、標的部位におけるナノ粒子の効率的な蓄積および保持(EPR効果)および血流中でのより長い半減期ゆえに、病理組織へのより高い特異性を提供するナノ粒子に基づく技術的プラットフォームの開発へと向かっている。通例用いられる構想は、ナノ粒子(リポソーム、混合ミセル、ナノエマルション、デンドリマーなど)中への数多くのガドリニウム錯体(1000〜100000)の取り込みを含む。
【０００４】
この点において、脂質ベース粒子システム(すなわち、エマルション、ミセル、リポソームなど)へのそれらの取り込みを有利にすることを目的としてキレート化ユニットに親油性特性を提供する＞10個の炭素原子アルキル鎖(中〜長アルキル鎖)で修飾されたキレート剤の使用は、当技術分野においてすでに記載されている。
【０００５】
特に、本出願人によるWO 00/09170は、優勢に血管のMRI錯体および優勢に血管外の錯体の両方を含むミセルデュアルMRI造影剤の製造を記載する。WO97/00087に記載の親油性部分をもつ常磁性キレート剤の製造は、1種以上の両親媒性有機化合物に関連してWO00/09170において用いられる。さらに、[10-[2-(オクタデシルアミノ)-2-オキソエチル]-1,4,7,10-テトラアザ-シクロドデカン-1,4,7-トリアセタト-(3-)]ガドリニウム]の製造が、記載されている。
【０００６】
Briley-Saebo、J Phys Chem、2009は、MR標識リポたんぱく質の製造のための、それぞれアルキルおよびリン脂質誘導体化AAZTAおよびDTPA Gdのキレート剤の高密度リポタンパク質(HDL)への共役を記載する。また、Yamakoshiら、Chem. Comm. 2011は、MRI強化動脈硬化性プラーク画像法のための、低密度リポタンパク質(LDL)粒子とのGd DO3A-アルケニル鎖の共役を記載する。
【０００７】
本願出願人による米国6,342,598は、ミセル組成物を形成することができる組成物の製造のための、中〜長アルキル鎖によるカルボキサミド結合を介して修飾された、ポリカルボン酸および大環状キレート剤の製造を記載する。
【０００８】
Kielarら、JACS 2010は、2つの疎水性鎖で官能化されたDOTA錯体を用いて製造されたリポソームの緩和能測定を提供する。リポソーム緩和能は、大きく増強され、超分子構造が、高緩和能システムの開発のための魅力的な戦略を表すことが確認される。
【０００９】
さらに、病理組織に過剰発現した受容体部位の認識のための特定の分子部分の添加によって生成された粒子、または網内系(RES)または免疫系によって認識および結果として生じる排出/不活化を制限することができるステルス剤の特性を改善し、調節することが可能になるので、巨大分子システムは、非常に柔軟性のある設計を提供する。多数の画像化プローブをもつ粒子をロードする可能性とともに、これらの特性は、様々な画像モダリティ、特に、磁気共鳴画像法などの、より低い感度を有するモダリティの感度を改善することを可能にする。常磁性ナノ粒子の使用は、磁気共鳴を、典型的には分子イメージング法において用いられる放射活性プローブを用いる診断技術のための価値ある代替手段にし、より良好な空間分解能というさらなる利点を提供する。理論的には、もし適切に修飾されれば、血流中での満足できる持続性を特徴とし、分子バイオマーカーを認識する能力がある高い緩和能値(r1)をもつナノ粒子を作成することが可能である。
【００１０】
さらに、ナノ粒子の使用は、異なる特性をもつ画像化プローブが、磁気共鳴画像法およびポジトロンエミッショントモグラフィー(PET/MRI)もしくはX線コンピューター断層撮影および単光子放出コンピューター断層撮影(SPECT/CT)などの組合せ手順のために利用可能な造影剤を生成するために共存可能なデュアルシステムの設計を可能にする。
【００１１】
しかしながら、ナノ粒子(すなわち、リポソーム、量子ドットまたは酸化鉄粒子)は、対象の部位のみならず、細網内皮系の食細胞(特にクッパー細胞および食細胞)に長時間蓄積するという不利点を有する。
【００１２】
細網内皮系による認識から粒子をマスキングするために用いる戦略にかかわらず、結果は、クリアランス時間は可変性であるが、通常、肝臓および脾臓などの臓器内でのガドリニウムを含むナノ粒子の高い蓄積である。これらの臓器からの排出は非常に遅く、実質的毒性イオンであるガドリニウムへのヒトの身体の曝露時間の増加がもたらされる(Longmireら、Nanomedicine、2008、3：703-717)。
【００１３】
したがって、ナノ粒子MRI剤にとって、インビボ用途に対する挑戦は、一方では最適臓器生体内分布の達成であり、他方で、Gd(III)蓄積による毒性の低減化である。これらの特性は、有意なMRIシグナル増幅を可能にし、場合により、投与された常磁性金属の用量を低下させる、画像化レポーターの高ペイロードを運ぶナノ粒子の能力と組合せなければならない。
【００１４】
ガドリニウムへの曝露の増加によって誘発される毒性は、近年研究されており、腎性線維症皮膚症としても知られる腎性全身性線維症(NSF)などの疾患の開始と、重篤な腎不全の患者におけるガドリニウム錯体の投与との間の相関関係が見い出された。線維症のこの形態は、拡散痛を伴う、進行性で消耗性の皮下および筋肉硬直をもたらし、患者を死亡させる可能性がある。ヒトの身体におけるガドリニウム錯体の持続による、それらに基づく造影剤の潜在的毒性の証拠は、キレート形態であっても、上述のイオンを含むナノ粒子を用いる適用を開発することの可能性に対して大きな制限引き起こす。さらに、ナノ粒子ならびにリポソームは、経時的に安定ではなく、臨床用途にとって安全ではないとみなされうる脂質成分で調製される(Mukherje S. ら、Indian J Pharm Sci. 2009 Jul-Aug、71(4)：349-358；doi：10.4103/0250-474X.57282 e)。造影剤のより安全でより適応性のある製剤を同定しようとして、Morel(Morel Sら、Eur J Pharm Biopharm. 1998 Mar；45(2)：157-63)は、たとえば、[GdDOTA]-および[GdDTPA]2-などのガドリニウムキレート錯体を含む固体脂質ナノ粒子の製造を記載して、このアプローチの実現可能性を探った。しかしながら、pSLNへの上述のガドリニウム錯体の取り込みは、比較的低い。
【００１５】
最初は、薬物のデリバリーまたはそれらの制御放出のため(WO 00/30 620)に開発されるか、または特定の投与経路(たとえば、WO 2004/039 351に記載の眼科症状の治療のための眼経路)を介するデリバリーを可能にするために開発されたGasco(EP526666)によって元々記載された方法を有効に使用しているMorelに記載のpSLNの製造は、Gd(III)の低いSLNアップロードをもたらす、脂質コアに対する親水性Gd(III)錯体の親和性が低いことに悩まされている。さらに、このようなナノ粒子の緩和特性は、溶液中のGd錯体について測定された値に非常に近いpSLNの緩和能値によって確認されるように、期待どおりには増加しない(Kielarら、J Am Chem Soc、2010、前述；Mulderら、NMR in Biomed、2006、19：142-164)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、MR画像化分野において、上述の問題を解決する、安定なMR応答性ナノ粒子剤の製造のための新たな戦略を開発する必要性が非常に高くなっている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
常磁性金属錯体を有するSLN、すなわち、特に開示するように選択され、設計された両親媒性キレート剤を製造するための本発明のアプローチは、MRI剤としての固体脂質ナノ粒子(pSLN)の製造に関連する上述の主な制限を解消する。
【００１８】
事実、本発明にしたがって製造されたナノ粒子は、高いナノ粒子緩和能をもたらす、固体脂質コアによって誘発された配向性により、高いGd(III)ペイロードおよび常磁性金属イオンのバルク水分子への良好な接近可能性を示す。したがって、臨床用途における同じ画像品質の達成のための常磁性金属のより低い用量を予見することができる。
【００１９】
さらに、肝臓、脾臓および腎臓などの臓器中のGd(III)の蓄積は制限され、Gd(III)は、本発明インビボ研究によって観察されたように、これらの臓器からの最適クリアランス時間を示す。
【００２０】
Gd(III)の毒性の問題がより関連性が高くなり、MRI剤としてのこれらのシステムの更なる発展を非常に制限する肝臓および脾臓に、ナノ粒子システムが蓄積する傾向があることが知られている(Longmireら、Nanomedicine、2008、3：703-717)。
【００２１】
本発明のpSLNは、上記で指摘した問題を解決している：インビボ研究は、中/長期の網膜内皮系におけるガドリニウムの制限された蓄積を、金属キレート部分の親油性鎖の特性を調節し、これらの系の緩和能増強を維持することによって得ることができることを明らかにしている。
【００２２】
このように、当技術分野で提案された様々なナノ粒子システムと比べて、より高い安全性を合理的に予測することができる。
発明の概要
本発明は、式(I)で示されるジアゼピン誘導体および式(II)で示されるテトラアザシクロドデカン誘導体：
2015535811.tif 000003
[式中、
Yは、式：Y'-NH-または(Y')2-N-で示される基であって；ここで、Y'は、直線または分枝の飽和または不飽和C8〜C16アルキル基；ヒドロキシ -OH、カルボキシ -COOR1、オキシカルボニル-(C8-C16)アルキルおよびオキシカルボニル-(C8〜C16)アルケニルから選ばれる1つ以上の基で任意に置換されたリン酸基 -O-(HO-P=O)-O-によって中断されたC1〜C10アルキル基(ここで、R1は、水素 HまたはC1〜C4直線または分枝アルキル基である)から選ばれる；またはY'は、置換もしくは部分置換グリセロールのモノリン酸エステルであり、飽和または不飽和炭素鎖を有する脂肪族脂肪酸とエステル化された該グリセロールの少なくとも1つの官能基を有し、リン酸官能基は、遊離であるかまたはアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属と塩化される；
Lは、カルボニル -C=O、チオカルボニル -C=S、アミノ -NR1-、カルボキシ -COO-、オキシ-カルボニル -OCO-、アミド -NR1CO-または-CONR1-、酸素 -O-およびイオウ -S-(ここで、R1は前記と同意義)から選ばれる原子または基で任意に置換または中断された直線または分枝基である脂肪族C3〜C10環式および複素環式およびC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニルまたはアルキニルから選ばれる二価のリンカーである；
RI-IVおよびRI-IIIはそれぞれ独立して、-(C1〜C3)アルキルカルボキシ基である]
から選ばれる両親媒性の常磁性金属キレート部分またはその塩を含む常磁性固体脂質ナノ粒子(pSLN)であって、該キレート部分が、Gd(III)、Mn(II)、Cr(III)、Cu(II)、Fe(III)、Pr(III)、Nd(III)、Sm(III)、Tb(III)、Yb(III)、Dy(III)、Ho(III)およびEr(III)から選ばれる常磁性金属イオンと錯体を形成する、該ナノ粒子に関する。
【００２３】
本発明はさらに、常磁性金属の両親媒性錯体を含む該固体脂質ナノ粒子(pSLN)の製造方法およびMRI造影剤としての得られるpSLNに関する。
【００２４】
方法は、以下のステップを含む：
a)水と混ざらない低沸点有機溶媒中で、以下を混合することによって得られる有機相(O)を製造すること：
式(I)で示されるジアゼピン誘導体および式(II)で示されるテトラアザシクロドデカン誘導体：
2015535811.tif 000004
[式中、
Yは、式：Y'-NH-または(Y')2-N-で示される基であって；ここで、Y'は、直線または分枝の飽和または不飽和C8〜C16アルキル基；ヒドロキシ -OH、カルボキシ -COOR1、オキシカルボニル-(C8〜C16)アルキルおよびオキシカルボニル-(C8〜C16)アルケニルから選ばれる1つ以上の原子または基で任意に置換されたリン酸基 -O-(HO-P=O)-O-によって中断されうるC1〜C10アルキル基(ここで、R1は、水素 HまたはC1〜C4直線および分枝アルキル基から選ばれる)から選ばれる；
Lは、カルボニル -C=O、チオカルボニル -C=S、アミノ -NR1-、カルボキシ -COO-、オキシ-カルボニル -OCO-、アミド -NR1CO-または-CONR1-、酸素 -O-およびイオウ -S-(ここで、R1は前記と同意義)から選ばれる原子または基で任意に置換または中断された直線または分枝基である脂肪族C3〜C10環式または複素環式、またはC1〜C6アルキル、アルケニルまたはアルキニルから選ばれる二価のリンカーである；
RI-IVおよびRI-III はそれぞれ独立して、-(C1〜C3)アルキルカルボキシ基である]
から選ばれる金属イオンの配位に適した化合物を含む両親媒性成分であって、該キレート部分が、Gd(III)、Mn(II)、Cr(III)、Cu(II)、Fe(III)、Pr(III)、Nd(III)、Sm(III)、Tb(III)、Yb(III)、Dy(III)、Ho(III)およびEr(III)から選ばれる常磁性金属イオンと錯体を形成する両親媒性成分；
C6〜C24直線または分枝の、飽和または不飽和鎖リン脂質、リゾ脂質、スフィンゴ脂質から選ばれる両親媒性成分(ここで、胆汁酸またはその誘導体、糖脂質、脂肪族脂肪アルコール、ジアルキルエーテル、トコフェロールまたはその混合物などの界面活性剤が存在することもできる)；および
12〜24個の炭素原子の長さである直線または分枝の、飽和または不飽和炭化水素鎖を有するモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリド、またはその混合物から選ばれるグリセリドを少なくとも含み、飽和C12〜C22脂肪酸またはそのエステルを任意に含む脂質成分；
b)1種以上のイオン性または非イオン性界面活性剤、およびC3〜C8ポリ-アルキルアルコールおよびC5〜C12飽和脂肪酸から選ばれる共界面活性剤を任意に含む水溶液(W)を製造すること；
c)a)で製造した有機層(O)を、b)で製造した水溶液(W)と混合して、20℃〜40℃の温度で安定かつ透明なマイクロエマルション(W/O)を得ること；
d)ステップc)のマイクロエマルション(W/O)を、20℃〜40℃の温度で張力活性のある少なくとも1種のイオン性または非イオン性界面活性剤を含む第二の水溶液(W1)に加えて、多重エマルション(W/O/W1)を得ること；
e)多重エマルションから有機溶媒を蒸発させ、脂質ナノ粒子の懸濁液を得ること；
f)ステップe)で得た懸濁液を、ステップa)で定義した脂質成分の結晶点より低い温度に冷却して、pSLNを得ること。
【００２５】
本発明のpSLNを含む注射用組成物も記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ステルス剤を任意に含む常磁性固体脂質粒子の図解である。
【図２】典型的なpSLNのDSC走査および吸熱ピーク。上：製造直後の曲線、中：1ヵ月後の曲線、下：製造終了後2ヶ月の曲線。
【図３】B22286ロードSLN、リポソームおよびプロハンス(登録商標)のU937取り込み。バーは、B22286ロードpSLNおよびリポソームおよびプロハンスとインキュベーションした後のU937溶解液中のGd(III)モル/タンパク質mgを表す。
【図４】0.05 mmol/kgの用量でpSLNを投与された後に獲得されたMR画像。
【図５】(A)および(B)：健康なC57BL/6マウスにおけるB22286錯体を含むpSLNの投与後のインビボ臓器生体内分布。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な記載
本発明は、式(I)で示されるジアゼピン誘導体および式(II)で示されるテトラアザシクロドデカン誘導体：
2015535811.tif 000005
[式中、
Yは、式：Y'-NH-または(Y')2-N-で示される基であって；ここで、Y'は、直線または分枝の飽和または不飽和C8〜C16アルキル基；ヒドロキシ -OH、カルボキシ -COOR1、オキシカルボニル-(C8〜C16)アルキルおよびオキシカルボニル-(C8〜C16)アルケニルから選ばれる1つ以上の基で任意に置換されたリン酸基 -O-(HO-P=O)-O-によって中断されたC1〜C10アルキル基(ここで、R1は、水素 HまたはC1〜C4直線または分枝アルキル基である)から選ばれる；またはY'は、置換もしくは部分置換グリセロールのモノリン酸エステルであり、飽和または不飽和炭素鎖を有する脂肪族脂肪酸とエステル化された該グリセロールの少なくとも1つの官能基を有し、リン酸官能基は、遊離であるかまたはアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属と塩化される；
Lは、カルボニル -C=O、チオカルボニル -C=S、アミノ -NR1-、カルボキシ -COO-、オキシ-カルボニル -OCO-、アミド -NR1CO-または-CONR1-、酸素 -O-およびイオウ -S-(ここで、R1は前記と同意義)から選ばれる原子または基で任意に置換または中断された直線または分枝基である脂肪族C3〜C10環式および複素環式およびC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニルまたはアルキニルから選ばれる二価のリンカーである；
RI-IVおよびRI-III はそれぞれ独立して、-(C1〜C3)アルキルカルボキシ基である]
から選ばれる両親媒性の常磁性金属キレート部分またはその塩を含む常磁性固体脂質ナノ粒子(pSLN)であって、該キレート部分が、Gd(III)、Mn(II)、Cr(III)、Cu(II)、Fe(III)、Pr(III)、Nd(III)、Sm(III)、Tb(III)、Yb(III)、Dy(III)、Ho(III)およびEr(III)から選ばれる常磁性金属イオンと錯体を形成する、該ナノ粒子に関する。
【００２８】
本発明のpSLNは、概ね、以下の組成を有する：
脂質成分(主として固体脂質コア)は、約30〜50%(重量/重量)、好ましくは35〜45%であり、融点が37℃を超える、12〜24個の炭素原子の長さである飽和または不飽和、直線または分枝の炭化水素鎖を有するモノグリセリド、ジグリセリドもしくはトリグリセリドまたはその混合物から選ばれる少なくとも1つのグリセリドを含み、および12〜24個の炭素原子を含む飽和または不飽和、直線または分枝の脂肪酸鎖またはそのエステルを任意に含む。脂肪酸が、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸またはその混合物から選ばれるのが好ましい。脂肪酸エステル成分は、たとえば、パルミチン酸セチルによって代表される。12〜24個の炭素原子を含む、ポリエチレングリコール脂肪酸と脂肪族アルコールのモノまたはジエステルが任意に存在してもよい。pSLNにおいて、脂質成分は、固体および結晶形態である；
両親媒性成分は、脂質コアの周囲に主として見い出され、6〜24個の炭素原子を含む直線または分枝の、飽和または不飽和鎖リン脂質、リゾ脂質またはスフィンゴ脂質であるのが好ましい。それは、方法のステップa)で定義したように、pSLNの27〜45%(重量/重量)である。リン脂質であるのが好ましく、pSLNの約33〜38%であるのがより好ましい。上述したように、それは、常磁性錯体の両親媒性成分とともに脂質コアの周囲に主として見い出される；および
常磁性錯体を含む両親媒性成分は、pSLNの5〜14%、より好ましくは8〜12%であり、式(I)および／または式(II)で示される錯体である。
【００２９】
本発明において、「固体脂質コア」は、少なくとも体温(37℃)(この値を含む)まで、好ましくは42℃まで、さらにより好ましくは55℃まで(すべての中間値を含む)固体である脂質コアを意図する。図解を図１に示す。
【００３０】
両親媒性成分中の界面活性剤がリン脂質またはその誘導体である、pSLNの好ましい実施態様において、システム内に存在するリンの含量に対する両親媒性錯体の含量を表すことが可能でえある。この場合、両親媒性錯体は、リン脂質に関し、約10〜30モル%および好ましくは17〜23モル%である。事実、錯体9bを含む代表的なpSLNにおいて、P/Gd(III)比は、6、好ましくは5未満であり、実験パートにより詳述するように、少なくとも10000、より好ましくは少なくとも11000、12000モル単位の錯体/粒子のGd(III)のロード(ペイロード)に対応する。
【００３１】
pSLNは、たとえば、それ自体が、好ましくは500〜10,000ダルトン、より好ましくは2,000〜5,000ダルトンの分子量を有し、あるいはリガンド機能をもつビタミンまたはペプチドなどの、アルキル官能基および／またはリン脂質、細胞受容体に対する特異的リガンドで誘導体化されるか、アルキル官能基で非誘導体化または誘導体化された、PEG(ポリエチレングリコール)などのステルス機能をもつポリマーコーティングを任意に含む。特定の好ましい実施態様において、pSLNは、DSPE-PEG 2000-葉酸を含む。
【００３２】
そのように製剤されたpSLNにおいて造影剤は、一般に、市販の低分子量大環状錯体より高い緩和能を有し(表I参照)、したがって、低用量の常磁性金属錯体で、診断的値の磁気共鳴画像を提供することができる。一般に、現在利用可能なMRI造影剤に関し、臨床設定における投与用量は、0.1 mmol Gd/kgであるが、pSLNを用いた前臨床データは、低用量で診断的画像を得ることが可能であることを示す。さらに、高い緩和率、すなわち、高い緩和能値は、従来のMRI造影剤と比較して低用量での診断情報の速い獲得および審査された領域における造影媒体の明確な同定を保証する。
【００３３】
一般に、本発明のpSLNは、実験セクションにおいてより詳述するように(表3および4)、水溶液中(データ示さず)および生理的条件下(25〜50 mM-1s-1)の両方における高い緩和能値r1pを特徴とする。事実、0.47 TにおけるpSLNの緩和能値は、生理的条件において測定される場合、典型的には25 mM-1s-1よりも高く、好ましくは30 mM-1s-1よりも高く、より好ましくは25〜50 mM-1s-1である。
【００３４】
本発明のpSLNは、図２に示すデータによって実証されるように、固体コアを特徴とする。
【００３５】
脂質コアに必須でトリパルミチンを含む好ましいpSLN製剤の吸熱融解ピークは、42℃〜55℃である。これは、約47℃(および45℃の開始値)であり、トリパルミチンの準安定多形型の1つの融解温度に対応する、トリパルミチンの融解ピークと一致する(Chapman D. 「The polymorphism of glycerides」1962およびWindbergsら、AAPS PharmSciTech、2009、10：1224-1233を参照)。図２に示すDSC走査は、SLNのコアにおける固体構造の存在を定性的に決定するのを可能にする。
【００３６】
固体脂質コアのより複雑な組成について、融解ピークは、37℃〜55℃である。単一の脂質成分の1つ以上の多形型または2つ以上の脂質体の混合物の異なる多形型が存在する場合、pSLNはまた、1つ以上の融解ピークを特徴としうる。
【００３７】
特定の理論に縛られることを望むものではないが、本発明のpSLNは、その内部構造における固体コアの存在により、ナノエマルションまたはリポソームよりも安定である。このことは、外部環境に向かうキレート化されたGd(III)イオンの最適配向ならびにその結果として縦および横の両方の水プロトンの緩和時間を減少させることにおいて高い有効性をもつ水プロトンのより良好な接近可能性が可能になる。
【００３８】
実験セクション、表10においてより詳しく示すように、本発明のpSLNは、中〜長期間(10日間)において最適生体内分布およびGd蓄積特性を示す。一般に、それらは、他の脂質ベース粒子システム(たとえば、混合ミセルなど、Anelliら、MAGMA 2001、12：114-120を参照)よりも、肝臓(特に肝細胞)に対してより高い指向性を示す。pSLNは、中〜長期間の蓄積を減少させる等しく高いクリアランス率を有するけれども、肝臓は、静脈内投与後6時間以内にpSLNが主に濃縮される臓器である(用いた時点において、両親媒性錯体、特に式(I)で示される錯体の配位ケージの著しく高い動態安定性により（したがって、該錯体が特に好ましい）、ガドリニウム測定値は臓器に存在する錯体の量の指標である)。注目に値するのは、脾臓(他のナノ粒子貯蔵臓器)におけるガドリニウムの蓄積は、非常に低く、一般に、たとえば混合ミセルなどの他の脂質ベースナノ粒子システムよりも低い(Anelliら、MAGMA 2001、12：114-120を参照)。これは、脾臓における食細胞の取り込みから逃れるそれらの能力を直接実証するpSLNの重要な挙動である。これは、他の脂質ベース粒子システム(リポソーム)と比較して、単球-マクロファージ細胞株U937による本発明のpSLNの取り込みが低いというインビトロ観察と一致する。これらの実験観察は、本発明のpSLNの、細網内皮系(RES)の食細胞の認識から逃れる改善された能力を実証し、その改善は本発明のpSLNの生体内分布に影響を及ぼし、特に肝臓内の肝細胞にデリバリーされたpSLNの量を増加させる。肝細胞を通過して、それらの化学構造の両親媒性に従属するクリアランスで、ガドリニウムキレートは身体から排出される。RESの食細胞(クッパー細胞、探求およびマクロファージ)は、インビボにおけるそれらの効果的な使用のための重要な因子である。食細胞からのGd(III)の排出過程は、長い時間を必要とするので、金属イオンによって生み出される毒性効果のリスクが増加する。
【００３９】
ナノ粒子、特にpSLNの生体内分布およびクリアランスのメカニズムは、未だ完全には解明されていないが、本発明のpSLNの改善された特性が、一次的にそれらの食細胞への取り込みを低下させる最適化された表面特性に依存し、そして二次的にpSLNによって肝臓に輸送された選択された常磁性金属錯体の特性に依存しうることが提案される。
【００４０】
インビボの結果が示唆するように、肝臓におけるGd(III)錯体のクリアランスは、pSLNに取り込まれた金属錯体の親油性によって調節されることが見い出された。
【００４１】
実際に、生体内分布研究は、異なるタイプの両親媒性錯体で製造されたpSLNが、鎖長にも従属する排出プロフィールを有することを示す。表8、9および10は、健康なC57BL/6マウスにおける50 μmol/kgのpSLNの投与後の生体内分布測定の例を示す。異なる臓器における金属の量は、投与量に対する%(ID(injected dose)%)として記録されている。本発明pSLNを製造するのに用いた異なる両親媒性錯体によって得られた結果は、アルキル鎖の構造およびそれらの性質(鎖をより生分解性にする、リン酸基などの加水分解可能な基の存在など)の差異が、上記の事と共に、pSLNの生体内分布を調節するため、および肝細胞における取り込み率およびそれに続く胆管への排出を調節するための重要な因子であることを示すように見える。
【００４２】
したがって、好ましい態様では、本発明は、それらの生体内分布に関する優先傾向の順番で(実験パートにおける表8および9を参照)、以下の両親媒性化合物：37a、12d、25a、9b、9cで製造されたpSLNに関する。化合物37aおよび12dが特に好ましい。
【００４３】
さらにより好ましい態様では、上記pSLNは、好ましくはDSPE-PEG 2000-葉酸などの受容体特異的リガンドなどの分子標的剤およびステルス剤を含む。細胞取り込み実験の結果は、葉酸誘導体を含むpSLNが、葉酸受容体を過剰発現している細胞系(たとえば、IGROV-1)に対する高い親和性を特徴とし、そのことによって、それらが予想通り効果的に内部移行され、葉酸塩無しと比べて、より強いMRIシグナルをもたらすとを示す。実際に、組織および臓器分布が、内因性生体構造への標的剤によって最適化されうることが一般に知られている。
【００４４】
しかしながら、標的化分子が不在であっても、本発明のpSLNは、検出可能なシグナルを与え、実験パート(図4)に示すように、インビボで用いることができるMRI診断剤を表す。
【００４５】
他のSLNベースシステムに対してすでに指摘したように、これらの非常に複雑なシステムの生体内分布および臓器クリアランスは、ナノ粒子径および表面電荷密度などの表面特性にも強く影響を受ける。この点に関して、本発明のpSLNは、粒子分布10〜220 nm、平均直径(ｚ平均)＜100 nmおよび多分散指数(PdI)＜0.2のを特徴とする。pSLNが、平均直径50〜70 nmおよびPdI0.12〜0.18を特徴とするのが好ましい(実験パートの表5および6を参照)。
【００４６】
これらの特性は、本発明方法にしたがって得られ、両親媒性錯体の最適分散および脂質コア周囲でのそれらの分布は、標準劇に達成されうる。該方法が、両親媒性金属錯体取り込みを最適化することも見い出されており、その最適化は、常に55%よりも高い取り込み効率をもたらす。
【００４７】
特に、より高い取り込み効率は、少なくとも8個の炭素原子、より好ましくは8〜16個の炭素原子、あるいはさらにより好ましくは10〜14個の炭素原子のアルキルおよび／またはカルボキシアルキル鎖長の錯体により得られる。
【００４８】
これは、金属錯体、したがって、常磁性金属それ自体をもつpSLNの高いペイロードをもたらす。式(I)および式(II)で示される錯体の代表例としていくつかの典型的化合物について測定されたこのパラメーターは、約10000、11000、12000分子単位のガドリニウム/粒子より大きいか、または同じになる。
【００４９】
本発明のpSLNはまた、固体コアは、表面物質および常磁性両親媒性錯体の層のための固定因子(anchorage factor)を提供するので、ミセルシステムと比較して改善された安定性という利点も提供する。事実、既知のミセルシステムとは異なって、pSLNは、希釈してもそれらの構造を変更しない。
【００５０】
より高い安定性によって、注入の準備ができている低濃度pSLN分散液の形態でも、より容易に、より長く保管することができるようになる。
【００５１】
上述したように、そしていくつかの代表的化合物について実験パートでより詳しく述べるように、pSLNは通常、生理的媒体中で、非誘導体化親水性ガドリニウム錯体、特にSLNに配合された場合に見い出される値よりも高い、非常に高い緩和能を示す。一例として、いくつかのGd(III)錯体の緩和能値を以下に示す。ここで、生理的条件下で測定された値は、NaCl 0.9%中、HSA 4%で得られた値を意味する。これらの化合物のうちのいくつかは、市販されているか、または親油性鎖を含まないか、またはSLNに配合されたものである(e参照)。
【００５２】
表I．いくつかの既知のMRI用化合物の緩和能値
2015535811.tif 000006
表3および4に示すように、そして実施例パートでより詳しく説明するように、pSLNは、溶液中、すなわち、pSLNに配合されていないキレート化両親媒性化合物と比較して、より高い緩和能値を示す。
【００５３】
この理由および上述した特徴のために、本発明のpSLNは、MRI用造影剤に適している。
【００５４】
したがって、本発明はまた、生理的に適合性のある診断用途のための賦形剤、希釈剤などとともに、適当な溶液に懸濁させた、記載したpSLNを含む医薬組成物を含む。
【００５５】
それらは、その生体内分布特性のために、「血液プール」剤として、脳微細循環の画像化研究のために、血管造影適用、ならびに組織透過性が変更された場合でも、腫瘍病理の結果としての炎症を起こした組織において、特に適している。
【００５６】
画像化法は、適当な用量の本発明のpSLNまたはその生理的に適合性のある滅菌組成物の投与後にMRI画像を導くことを含む。本発明のpSLNを用いることによってMRI画像を得るために適当な量は、たとえば、25〜100 μmol/kgである。
【００５７】
本発明はさらに、以下のステップを含む、上記の常磁性金属の両親媒性錯体を有する固体脂質ナノ粒子(pSLN 常磁性固体脂質ナノ粒子)の最適化された製造方法に関する：
a)水と混ざらない有機溶媒に以下の成分：常磁性金属の錯体、および6〜24個の炭素原子を含む直線または分枝の、飽和または不飽和鎖を特徴とするリン脂質、スフィンゴ脂質およびリゾ脂質(ここで、胆汁酸またはその誘導体、糖脂質、脂肪族脂肪アルコール、ジアルキルエーテル、トコフェロールまたはその混合物などの界面活性剤が、以下に詳述するように存在してもよい)から選ばれる界面活性剤によって現される両親媒性成分；脂質成分；ならびに任意の他の両親媒性および／または親水性成分(たとえば、任意にさらに適当な内因性生体分子および／または親油性または両親媒性成分の特異的認識用リガンドで修飾された、PEG、好ましくはPEG-2000などの表面コーティング用ポリマー)を溶解することによって、最初に有機相(O)を製造する。これらの成分の可溶化は、20℃〜40℃、より好ましくは25〜37℃、さらにより好ましくは30〜35℃の温度で有機相(O)を加熱することによって行われる。水と混ざらない、用いた有機溶媒は、低沸点であり、蒸発温度は、大気圧下または制御された真空条件下で20℃〜70℃である。好ましい実施態様によれば、溶媒は、塩化メチレン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ギ酸エチルまたはそれらの混合物から選ばれるのが好ましい。
【００５８】
脂質成分は、12〜24個の炭素原子を含む炭化水素鎖を有し、融点が37℃を超える、モノグリセリド、ジグリセリドもしくはトリグリセリドまたはそれらの混合物から選ばれる。モノグリセリドは、たとえば、グリセリル-1-モノパルミテートまたグリセリル-1-モノステアレートである；ジグリセリドは、たとえば、。グリセリル-1,3-ジラウレート、グリセリル-1,3-ジパルミテート、グリセリル-1,3-ジステアレートである。炭化水素鎖は、飽和または不飽和であってよく、分枝または非分枝であってよい。脂質成分が、トリミリスチン、トリパルミチン、トリステアリンおよびトリアラキジンまたはそれらの混合物などのトリグリセリドであるのが好ましい。
【００５９】
脂質成分は、たとえば、SOFTISAN(登録商標)およびWitepsol(登録商標)、好ましくはWitepsol(登録商標)W35、H42、E76、E85またはSOFTISAN(登録商標)138、142、154の名称で知られている市販の混合物などのモノ-、ジ-またはトリ-グリセリドの混合物から構成されてもよい。
【００６０】
脂質成分が、１種以上の飽和または不飽和の、直線または分枝の12〜24個の炭素原子を含む脂肪酸鎖を含むのが好ましい。脂肪酸が、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸であるのが好ましい。脂質成分が、たとえば、パルミチン酸セチルなどの脂肪酸のエステルを任意に含んでもよい。12〜24個の炭素原子を含む、脂肪酸と脂肪族アルコールのポリエチレングリコールモノまたはジエステルを任意に含んでもよい。
【００６１】
特に好ましい実施態様によれば、脂質成分は、トリパルミチンおよびステアリン酸を、さらにより好ましくはそれぞれ8〜9.9および2〜0.1の重量比で含む。トリパルミチンとステアリン酸の比が9：1であるのがより好ましい。特に好ましい実施態様によれば、 DSPE-PEG 2000などの両親媒性成分が、脂質成分に加えられる。さらに、葉酸受容体を過剰発現している腫瘍細胞を特異的に認識することができる成分の挿入が必要である場合、葉酸で誘導体化された両親媒性成分(DSPE-PEG 2000-葉酸など)をさらに加えることができる。
【００６２】
常磁性金属の両親媒性錯体は、親油性脂肪族部分と配位ケージを特徴とする、金属イオンの配位化合物である式(I)および式(II)で示される誘導体から選ばれる。
【００６３】
このような配位ケージは、主として、2つのクラスに属する：ジアゼピン誘導体(式(I))およびテトラアザシクロドデカン誘導体（式(II)）。
【００６４】
ジアゼピン型配位ケージから誘導される両親媒性構造は、式(I)：
2015535811.tif 000007
またはその塩を特徴とする。
テトラアザシクロドデカン型はいいケージをもつ両親媒性構造は、式(II)：
2015535811.tif 000008
またはその塩を特徴とする。
上記式(I)および式(II)において、
Yは、式：Y'-NH-または(Y')2-N-で示される基であって；ここで、Y'((Y')2-N-である場合、同一もしくは異なりうる)は、直線または分枝の飽和または不飽和C8〜C16アルキル基；基 -O-(HO-P=O)-O-、またはヒドロキシ -OH、カルボキシ -COOR1、オキシカルボニル-(C8〜C16)アルキルおよびオキシカルボニル-(C8〜C16)アルケニル基から選ばれる1つ以上の原子または基で任意に置換された該基によって任意に中断されたC1〜C10アルキル基(ここで、R1は、水素 Hおよび直線または分枝C1〜C4アルキル基から選ばれる)から選ばれる；またはY'は、置換もしくは部分置換グリセロールのモノリン酸エステルであり、飽和または不飽和炭素鎖を有する脂肪族脂肪酸とエステル化された該グリセロールの少なくとも1つの官能基を有し、リン酸の官能基は、遊離であるかまたはアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属と塩化される；
Lは、カルボニル -C=O、チオカルボニル -C=S、アミノ -NR1-、カルボキシ -COO-、オキシ-カルボニル -OCO-、アミド -NR1CO-または-CONR1-、酸素 -O-およびイオウ -S-(ここで、R1は前記と同意義)から選ばれる原子または基で任意に置換または中断された脂肪族C3〜C10環式または複素環式または直線または分枝C1〜C6アルキルまたはアルキニル基から選ばれる二価のリンカーである；
RI-IVおよびRI-III はそれぞれ独立して、-(C1-C3)アルキルカルボキシ基である。
Y基が、Y基の末端窒素原子と、Yと結合する末端に存在するカルボニル(-C=O)またはチオカルボニル(-C=S)との間のアミド結合によって、L基に連結されるのが好ましい。Y基が、(Y')2-N-(ここで、Y'残基は、同一もしくは異なって、長さがC8-C16、好ましくはC10-C14、より好ましくはC10H21およびC12H25のアルキル鎖である)であるのが好ましい。
【００６５】
したがって、好ましい実施態様によれば、Y基は、式：
2015535811.tif 000009
または
2015535811.tif 000010
[式中、#は、リンカーLへの結合点を示す]
で示される。
【００６６】
あるいは、Y基は、式：Y'-NH-(ここで、Y'は、１種以上の式：
2015535811.tif 000011
で示されるリン酸基によって中断されたC8〜C16アルキル基、より好ましくはC10〜C14アルキル基である)であってもよい。この実施態様によれば、Yは、式：Y'-NH-(ここで、Y'は、上述の１種以上のリン酸基で中断され、少なくとも1つ、好ましくは8〜16個の炭素原子、またはより好ましくは10〜14個の炭素原子を含む2または3個のカルボキシアルキル基でさらに置換されたC10〜C14アルキル基である)で示されるリン脂質である。
【００６７】
さらなる別の実施態様において、Yは、飽和または不飽和C-C鎖をもつ脂肪族脂肪酸でエステル化された該グリセロールの少なくとも1つの官能基、および遊離またはアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属で塩化されているリン酸の他の官能基を有する置換または部分置換グリセロールのモノリン酸エステルである。
【００６８】
さらに別の実施態様によれば、Yは、以下の基：
a)
2015535811.tif 000012
b)
2015535811.tif 000013
c)
2015535811.tif 000014
[式中、#は、リンカーLへの結合点を示す]
から選ばれる。
【００６９】
式(I)で示されるキレート剤を用いる錯体が特に好ましい。
【００７０】
リンカーLは、式(I)で示される誘導体において、ジアゼピン部分をY基に連結し、同様に、式(II)で示される誘導体において、テトラアザシクロドデカンをY基に連結する二価の基である。
【００７１】
Lは、式(I)中のY残基の末端窒素原子のための結合点として、1つの末端側にてチオカルボニル基(-C=S)、またはより好ましくはカルボニル基(-C=O)で任意に官能化された、直線または分枝のC1〜C6アルキル、アルケニルまたはアルキニル基から選ばれる基である。
【００７２】
好ましくは、リンカーLは、Y基に連結する末端側に、カルボニル官能基を有する、置換または非置換直線のC1〜C6アルキル誘導体およびC6〜C8シクロアルキル誘導体から選ばれるカルボニル-アルキル誘導体である。リンカーのいくつかの例は、メチルカルボニル、エチルカルボニル、プロピルカルボニル、ブチルカルボニル、ペンチルカルボニルおよび直線または環式ヘキシルカルボニルである。
【００７３】
式(I)で示される化合物には、リンカーLが、式d)で示されるブチル-カルボニルおよび式e)で示されるシクロヘキシル-カルボニル：
d)
2015535811.tif 000015
e)
2015535811.tif 000016
[式中、#は、式(I)で示されるジアゼピンへの結合点を示す]
から選ばれるのがより好ましい。
【００７４】
式(II)で示される化合物には、リンカーLが、式f)で示されるメチルカルボニルおよび式g)で示されるカルボキシプロピルカルボニル：
f)
2015535811.tif 000017
g)
2015535811.tif 000018
[式中、#は、式(I)で示されるテトラアザシクロドデカンへの結合点を示す]
から選ばれるのが好ましい。
【００７５】
上記のとおり、リンカーLは、Y基への一方の端に結合し、ジアゼピンまたはテトラアザシクロドデカンへの他方の端に結合する。式：Y'-NH-または(Y')2-N-で示されるY基は、リンカーLがアミド結合を介して結合される末端窒素原子を有する。
【００７６】
式(I)で示される化合物には、LY-系が、
h)
2015535811.tif 000019
i)
2015535811.tif 000020
l)
2015535811.tif 000021
m)
2015535811.tif 000022
[式中、Y'は、前記と同意義であり、#は、式(I)で示されるジアゼピンの誘導体への結合点を示す]
から選ばれるのが好ましい。
【００７７】
式(II)で示される化合物には、LY-系が、
n)
2015535811.tif 000023
o)
2015535811.tif 000024
p)
2015535811.tif 000025
q)
2015535811.tif 000026
[式中、Y'は、前記と同意義であり、#は、式(II)で示されるテトラアザシクロドデカンの誘導体への結合点を示す]
から選ばれるのが好ましい。
【００７８】
好ましい実施態様によれば、pSLNが、以下：
2015535811.tif 000027
[式中、RI-IVは前記と同意義である]
から選ばれる式(I)で示される化合物を含むのが好ましい。
【００７９】
好ましい実施態様によれば、RI-IV基は、同一であり、CH2-COOHである。キレート部分は、Gd(III)、Mn(II)、Cr(III)、Cu(II)、Fe(III)、Pr(III)、Nd(III)、Sm(III)、Tb(III)、Yb(III)、Dy(III)、Ho(III)およびEr(III)(Gd(III)が好ましい)から選ばれる常磁性金属イオンと錯体を形成する。
【００８０】
したがって、好ましい式(I)で示されるキレート剤は、一般式(I')：
2015535811.tif 000028
[式中、LおよびYならびにそれらの組合せL-Yは、前記の好ましい実施態様と同意義である]
で示される化合物またはその塩によって定義され、好ましくは常磁性金属イオン(Gd3+が好ましい)との錯体の形態によって定義される。
【００８１】
同様に、好ましい式(II)で示されるキレート剤は、一般式(II')：
2015535811.tif 000029
[式中、LおよびYならびにそれらの組合せL-Yは、前記の好ましい実施態様と同意義である]
を有する化合物であるか、またはその塩である。
【００８２】
したがって、YおよびLの構造に従って、Gd(III)、Mn(II)、Cr(III)、Cu(II)、Fe(III)、Pr(III)、Nd(III)、Sm(III)、Tb(III)、Yb(III)、Dy(III)、Ho(III)およびEr(III)(Gd3+が好ましい)から選ばれる常磁性金属イオンとの錯体の形態、および／またはそれらの生理的に適合性のある塩の形態において、pSLNの製造に好ましい式(I')は、以下：
2015535811.tif 000030
から選ばれる。
【００８３】
好ましい式(II')で示される錯体は、以下：
2015535811.tif 000031
2015535811.tif 000032
2015535811.tif 000033
2015535811.tif 000034
から選ばれる。錯体：37aおよび32aおよび32bが特に好ましい。
【００８４】
したがって、pSLNの製造に特に適している上記の好ましい式(I')および式(II')で示される錯体の使用ならびに上記Gd(III)キレート錯体の使用もまた、本発明において開示されれる。
【００８５】
両親媒性キレート化合物の合成は、以下に概略するか、または実験パートで詳述する方法によって実行される。
【００８６】
上述したように、方法のステップa)において、両親媒性成分の1つは、6〜24個の炭素原子を含む直線または分枝の、飽和または不飽和鎖を特徴とする、リン脂質、スフィンゴ脂質およびリゾ脂質から選ばれる界面活性剤によって代表される。この成分は、リン脂質であるのが好ましく、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールまたはそれらの混合物が好ましい。リン脂質が、大豆またはたとえば、卵レシチンなどの天然起源であるのがさらにより好ましく、それらの両方が市販されている(エピクロン(Epikuron)200(登録商標)、エピクロン170(登録商標)またはエピクロン100(登録商標)、リポイド(Lipoid)(登録商標)S 75、リポイド(登録商標)S 100または卵レシチンリポイド(登録商標)E80)。
【００８７】
ステップa)における界面活性剤特性を有する両親媒性成分は、胆汁酸またはその塩、糖脂質、脂肪酸、脂肪族アルコール、ジアルキルエーテルまたはトコフェロールを含んでもよい。
【００８８】
可溶化中に、低融点であり、室温にて融解するのが好ましいモノまたはポリ-グリコシドおよびそれらのエトキシル化類縁体、グリセロールのモノ、ジおよびトリエステルなどの他の界面活性剤を任意に含めることができる。
【００８９】
好ましい実施態様において、ステップa)で製造された有機相(O)中の試薬濃度を以下のとおりまとめることができる：
脂質：
グリセリド：0.115〜0.170 M、
リン脂質、存在する場合：0.115〜0.170 M、
脂肪酸、存在する場合：0.032〜062 M
ポリマーコーティング(すなわち、PEG)、存在する場合：0〜0.018 M 
常磁性錯体：0.014〜0.038 M；
b)平行して、または続いて、ステップa)で用いた溶媒の溶媒和特性を増加させるのに有用な１種以上の界面活性剤および任意に共界面活性物質、典型的にはポリアルキルアルコールを含む水相(W)を製造する。この相における好ましい界面活性物質は、低分子量イオン性物質、さらにより好ましくは、コール酸およびタウロコール酸またはその水和塩、コール酸ナトリウム、グリコール酸ナトリウムおよびタウロデオキシコール酸ナトリウムなどのその誘導体から選ばれるアニオン性界面活性物質から選ばれる。特に好ましい実施態様によれば、タウロコール酸ナトリウム(乳化剤として)を用い、さらに好ましくは共溶媒として1-ブタノールと組合わせ、溶解させて、水相(W)を形成する。アニオン性界面活性剤であるポリアルキル-ホスフェート、アルキル-スルフェートまたはスルホネートまたはジオクチル-ナトリウムスクシネートなどのアルキル-スルホ-スクシネートを用いることもできる。
【００９０】
共界面活性物質として、一価アルコールなどの3〜8個の炭素原子を含むポリアルキルアルコール(たとえば、1-プロパノール、1-ブタノール、1-ペンタノール、1-ヘキサノール、1-ヘプタノール、1-オクタノール、3-ヘプタノールおよび4-ペンタノール)またはエサジオール(esadiol)などのジオールまたは酪酸などの低分子量脂肪酸が用いられる。
【００９１】
任意に、この相に、さらなる親水性成分(たとえば、標的化剤またはPEGなどのポリマー系)を加えることができる；
【００９２】
c)次いで、a)で製造した有機相(O)を、b)で製造した水相(W)とともに緩やかに混合して、ステップa)において定義された温度にて安定で透明なマイクロエマルション(W/O)を得る。混合時間は一般に、約20〜30分間である。
【００９３】
d)次いで、好ましくはステップa)において定義された温度から選ばれる温度にて、ステップc)で得られたマイクロエマルション(W/O)を、少なくともイオン性または非イオン性界面活性剤またはその混合物を含む水溶液(W1)に加えて、多重エマルション(W/O/W1)を得る。
【００９４】
ステップd)において、張力活性剤としてW1に加えられた非イオン性界面活性剤のうち、好ましいのは、ソルビタンおよび類縁エトキシル化誘導体の6〜24個の炭素原子を含む飽和および不飽和脂肪酸のモノ、ジおよびトリエステルである。より好ましくは、製剤は、ポリソルベート80(Tween(登録商標)80)および／またはポリソルベート60(Tween(登録商標)60)、ポリソルベート40(Tween(登録商標)40)などの類似化合物として市販されているポリオキシメチレンソルビタンモノオレエートを含む。ソルビタンモノパルミテート(Span(登録商標)40)、ソルビタンモノステアレート(Span(登録商標)60)、ソルビタンモノオレエート(Span(登録商標)80)などのさらなるソルビタン誘導体を含んでもよい。非イオン性界面活性物質のうち、C6〜C24脂肪酸のモノ、ジまたはトリエステル誘導体、たとえば、エトキシレートが好ましい。非イオン性界面活性物質が、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート(Tween(登録商標)80)であるのがより好ましい。
【００９５】
e)有機溶媒は、大気圧または制御された真空下で、好ましくは蒸発によって、多重エマルションから除去される。蒸発は、用いた溶媒の蒸発温度より上の温度まで多重エマルションの温度を上昇させることによって行うこともできる；
【００９６】
f)約2時間かけて、脂質コアの結晶化点以下の温度に達するまで懸濁液をゆっくりと冷却する；0.1〜0.4℃/分、好ましくは0.2〜0.4℃/分、さらにより好ましくは0.22〜0.3℃/分、そして好ましくは0.25℃ /分の速度で、分散液を10℃まで冷却するのが好ましい。
【００９７】
適当に希釈した後、MR造影剤として、たとえば調査の目的で、使用できるpSLNの懸濁液が得られる。
【００９８】
注射用造影剤の製造のための好ましい実施態様によれば、次いで、SLN中の過剰の非取り込み成分から分散液を精製し(ステップg)、滅菌する(ステップh)。精製手順は、透析、限外ろ過または超遠心分離を包含してもよい。好ましくはグルコースの等張溶液を用いて、製剤が、30kDaの限外ろ過膜によって限外ろ過され、8〜12 mM、より好ましくは9〜11 mMの最終ガドリニウム濃度に濃縮されるのが好ましい。次いで、たとえば、0.22μmフィルターを通すろ過によって、製剤を滅菌する。
【００９９】
これらの化合物によれば、製造のステップa)において溶解された最初の量と比較した場合の、pSLNに含まれる金属錯体%として計算されたpSLNにおける造影剤の取り込み効率は、一般に、55%以上、好ましくは60%、70%を超え、さらにより好ましくは80%を超える。
【０１００】
特に、好ましくは生理的に適合性のある注射用液中での直接限外ろ過によって行われた精製ステップの終わりに、粒子相が、分散液の約5〜16%、より好ましくは6〜12%である注射用コロイド分散液が得られる。
【０１０１】
構造が図１において図解されるpSLNからなる粒子相は、飽和または不飽和の、直線または分枝のC12〜C24の鎖長を有するモノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリドあるいはそれらの好ましくはを含む製造工程の液体成分(ステップa)において特定されたもの)によって形成された固体結晶コアからなる。好ましくは、結晶コアは、好ましくは飽和トリグリセリドから選ばれた単一のトリグリセリド、より好ましくはトリパルミチンを含む。コアはまた、C12〜C24鎖の飽和または不飽和の、直線または分枝の脂肪酸または脂肪アルコール、またはそれらの混合物を含んでもよい。特に好ましい脂肪酸は、ステアリン酸またはその塩であるが、エチレンオキシドのモノまたはジエステルなどの脂肪酸もまた、存在してもよい。液体コアは、少なくとも体温(37℃)(この値を含む)まで、より好ましくは55℃(すべての中間値を含む)までは固体である。
【０１０２】
コアは、pSLN製造方法のステップa)-d)において定義された両親媒性特性をもつ成分および界面活性剤によって囲まれ、したがって、血液または医薬製剤などの一般的に水性である外の媒体との界面を表す。図１において概略するように、両親媒性成分は、ポリマーコーティング(ステルス剤)を任意に含むことができる。
【０１０３】
精製および／または洗浄手順の後、pSLNの分散液は、使用した親水性低分子量イオン性界面活性剤を含まないとみなされるべきである。
【０１０４】
したがって、本発明のさらなる態様は、記載したように製造され、一般式、式(I)および式(II)、またはより好ましくは一般式、式(I')および式(II')から選ばれる金属イオンキレート錯体を含む常磁性SLNを含む医薬組成物に関する。
【０１０５】
本発明の目的のために、詳細な記載中の式は、光学的純粋体での化合物およびそれらのラセミ混合物に適用する。さらに、一般に、用語「錯体」は、他に特記されない限り、当業者には明白な、常磁性金属で「錯形成された」場合に2つのタイプの配位ケージをもつ両親媒性化合物を定義する。該金属を用いる錯体の製造は、当技術分野で公知である(WO00/30688を参照)。
【０１０６】
本明細書に記載の式(I)および式(I')ならびに式(II)または式(II')は、生理的に許容しうる塩基、または有機もしくは無機酸のイオンとの塩の形態であってもよい。
【０１０７】
特に好ましい塩基は、第一、第二または第三級アミン、塩基性アミノ酸およびナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムの無機水酸化物、またはそれらの混合物から選ばれる。有機酸のアニオンは、酢酸、コハク酸、ギ酸、マレイン酸、シュウ酸のアニオンである；無機酸のアニオンは、硫酸、リン酸、ホスホン酸のアニオンである。アミノ酸のうち、リシン、アルギニン、オルニチン、アスパラギン酸またはグルタミン酸などが好ましい。
【０１０８】
本発明のさらなる実施態様は、式(II')：
2015535811.tif 000035
[式中、
Yは、式：Y'-NH-または(Y')2-N-で示される基であって；ここで、Y'は、直線または分枝の飽和または不飽和C8〜C16アルキル基；ヒドロキシ -OH、カルボキシ -COOR1、オキシカルボニル-(C8〜C16)アルキルおよびオキシカルボニル-(C8〜C16)アルケニルから選ばれる1つ以上の原子または基で任意に置換されたリン酸基 -O-(HO-P=O)-O-によって中断されうるC1〜C10アルキル基(ここで、R1は、水素 HまたはC1〜C4直線および分枝アルキル基から選ばれる)から選ばれる；
Lは、カルボニル -C=O、アミノ -NR1-、カルボキシ -COO-、アミド -NR1CO-または-CONR1-(ここで、R1は前記と同意義)から選ばれる原子または基で任意に置換または中断された直線または分枝基から選ばれる二価のリンカーである]
で示される両親媒性キレート剤またはその塩に関する。
【０１０９】
さらに好ましいのは、以下の化合物：
2015535811.tif 000036
2015535811.tif 000037
2015535811.tif 000038
である。
【０１１０】
さらに、本発明は、本発明の方法で用いる場合に、脂質層またはコアへの高い取り込み効率を特徴とする、好ましくは固体の脂質ナノ粒子の製造のための以下の化合物：
2015535811.tif 000039
2015535811.tif 000040
2015535811.tif 000041
の使用を含む。
【０１１１】
式(I)および式(II)で示される化合物の合成。一般的反応工程式
本発明の式(I)で示される化合物は、最初に、選ばれたリンカーLとジアゼピン部分の間のアダクトの形成、次いで、リンカーの末端側のカルボン酸官能基の活性化、選ばれたY基を用いる、続いてのアミド化を含む方法によって製造することができる。最後に、得られた生成物に存在する場合、保護基を除去し、選ばれた常磁性金属で、誘導体を任意に錯体化する。
【０１１２】
合成過程の「試薬」と呼ばれるリンカーLとジアゼピン部分との間のアダクトは、ジアゼピンの前駆体であるN,N'-ジベンジルエチレンジアミンと、選ばれたリンカーの前駆体である適当なニトロ誘導体の反応によって得られる。続いて、ニトロ基は、典型的には、水素添加および続いての塩基性条件下でのN-アルキル化によって、還元され、官能性にされる。リンカーLとジアゼピン部分との間の該アダクトは、選ばれるY部分を変えることによって、一連の式(I)で示される誘導体の製造用ビルディングブロックとして、有利に製造され、使用されうる。
【０１１３】
したがって、式(I)および式(II)：
2015535811.tif 000042
および
2015535811.tif 000043
で定義される化合物の製造のための合成は、以下のステップ：
a)式：
2015535811.tif 000044
または
2015535811.tif 000045
[式中、RI-IVは、前記と同意義であり、Lは、末端カルボン酸官能基を含むリンカーである]
で示されるアダクトの製造；
b)リンカーの該末端カルボン酸官能基の活性化；
c)ステップb)の生成物と、上記Y基との間のアミド化反応；
d)式(I)または(II)で示される誘導体を得るための任意の保護基の切断；
e)常磁性錯体の形態での式(I)または(II)で示される誘導体を得るための常磁性金属イオンとのキレート化；
を含む。
【０１１４】
説明のための例によれば、本発明方法は、以下に示すように、化合物5が、出発アダクトである誘導体12aの製造のための方法によって、一般的に表すことができる。
反応工程式１
2015535811.tif 000046
【０１１５】
さらに詳しくは、下記反応工程式に示すように、リンカーとジアゼピン部分との間のアダクト5は、パラホルムアミドの存在下でのN,N'-ジベンジルエチレンジアミンジアセテートと、6-ニトロヘキサン酸メチルエステル1のアルコール溶液との反応、次いで、ニトロ基2の還元、アミノ誘導体3の官能基化および末端カルボン酸基4の選択的切断によって製造される。
反応工程式２
2015535811.tif 000047
【０１１６】
一般に化合物5で表されるジアゼピン誘導体を、本発明方法のステップb)のように末端カルボン酸官能基の活性化に付す。活性化は、カルボン酸官能基の活性化のために有機化学において一般に知られている手順にしたがって、典型的には、CHCl3、CH2Cl2などから選ばれる非極性有機溶媒などの適当な有機溶媒中、出発物質に関して少なくとも1：1のモル比、またはたとえば、1：1.5までのモル比などのわずかに過剰のモル比において、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)または1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)などのカルボジイミドの存在下、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)などのカルボキシル活性化剤との反応によって、行われる。CH2Cl2の存在下、出発物質に関して1：1〜1：1.1のモル比で、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)およびEDCの存在下でステップb)が行われるのが好ましい。次いで、そのようにして得られた誘導体を、ステップc)にしたがって、一般にジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)の存在下、リンカーLの活性化カルボン酸末端基と、選ばれたY残基、たとえばジブチルアミンなどの窒素原子との間のアミド化反応に付す。
【０１１７】
ステップb)の後に得られた活性化化合物をCHCl3に溶解させ、たとえば、出発物質に関して1：1〜1：1.7のモル比で、ジブチルアミンおよびDIPEAをこの順序で加えることによって、アミド化反応を行う。次いで、一般に20〜24時間までの時間、選ばれた温度、典型的には室温(たとえば15〜30℃の温度)にて、溶液を適切な時間枠の間攪拌する。次いで、このようにして形成されたアミド生成物を、一般に真空下または蒸留操作により、水で洗浄し、分離された有機相を蒸発させることによって精製する。精製後、たとえば、クロマトグラフィーによって、式(I)で示される生成物は、保護された形態で、たとえば、好ましくはtert-ブチルエステル誘導体として、高収率(about 80%)および高純度(約95〜99%、HPLC)で得られる。
【０１１８】
ステップd)にしたがって、たとえばステップa)で実際に用いられた保護基の種類に応じて、当技術分野で耕地の条件下、カルボン酸保護体で得られた式(I)で示される誘導体を容易に脱保護することができる。可能な保護基の選択における一般的参考文献として、「Greene's protective groups in organic synthesis」、 Wiley 14th Edを参照されたい。
【０１１９】
好ましい実施態様において、カルボン酸官能基は、tert-ブチルエステルとして保護され、脱保護は、酸性条件下、典型的にはトリフルオロ酢酸(TFA)およびCH2Cl2などの有機非極性溶媒の存在下で、行われる。
【０１２０】
式(II)で示される化合物の合成は、市販の1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸 トリス(1,1-ジメチル)エチルエステル 26から、または文献[Stuart G. Levy、Vincent Jacques、Kevin Li Zhou、Shirley Kalogeropoulos、Kelly Schumacher、John C. Amedio、Jonathan E. Scherer、Steven R. Witowski、Richard Lombardy、およびKarsten Koppetsch Org. Process. Res. Dev. 2009、13(3)、535-542]にしたがって製造されたα-(2-カルボキシエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸 テトラ(1,1-ジメチル)エチルエステル 33から出発して行われた。
【０１２１】
実験パートにおいて定義される化合物26および33は、カルボン酸官能基の活性化、アミド化反応および保護されたカルボン酸官能基の脱保護に付された。
【０１２２】
脱保護した後、対応する金属錯体誘導体を得るために、そのようにして得られた式(I)および(II)で示される化合物を、金属イオン含有化合物と適当に反応させることができる。該変換は、たとえば、水またはCHCl3またはMeOHなどの有機溶媒またはそれらの混合物の存在下、選ばれた金属の無機もしくは有機塩または酸化物との反応によって典型的に行われる。金属の好ましい対イオンは、塩化物または酢酸塩であり、好ましい塩は、GdCl3、Gd(OAc)3であり、好ましい酸化物は、Gd2O3である。
【０１２３】
実験パート
式(I)で示される化合物の製造
【実施例１】
【０１２４】
反応工程式３にしたがう化合物9aの製造
反応工程式３
2015535811.tif 000048
【０１２５】
実施例1.1：化合物5の製造
下記反応工程式２に示すように、US2006018830に記載の手順にしたがって、5つのステップで化合物5を製造した。
反応工程式２
2015535811.tif 000049
【０１２６】
アンバーライトA21の存在下、2-ニトロシクロヘキサノンをMeOH中で還流して、6-ニトロヘキサン酸メチルエステル1を得た。1とN,N'-ジベンジルエチレンジアミンアセト酢酸およびパラホルムアルデヒドを反応させて、ジアゼピン2を得、まず水素添加式して3を得、次いで、ブロモ酢酸t-ブチルでアルキル化して、ペンタエステル4を得た。THF/H2O中の4のLiOHを用いる選択的加水分解により、5を得た。全収率13 %。
【０１２７】
実施例1.1a：化合物6の製造
6-[ビス[2-[(1,1-ジメチル)エトキシ]-2-オキソエチル]アミノ]-6-[(2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル)オキシ]-5-オキソペント-1-イル]テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸ビス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル
化合物5(14.6 g；0.022 mol)をCH2Cl2(350 mL)に溶解させ、次いで、NHS(3.75 g；0.033 mol)を加え、混合物を氷浴で0℃に冷却した。CH2Cl2(150 mL)中のEDC(6.25 g；0.033 mol)の溶液を滴下し、次いで、反応溶液を室温にて24時間攪拌した。混合物をH2O(3x150 mL)で洗浄した。有機相を乾燥(Na2SO4)し、ろ過し、蒸発させて、6を黄色油状物で得た(15.42 g；0.020 mol)。
収率92%。
分析データ：
Mr：768.94(C38H64N4O12)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１２８】
実施例1.2：化合物7a-cの製造：一般的手順
化合物6(1当量)をCHCl3(濃度1% w/v)に溶解させた。適当なホスホエタノールアミン(1当量)(1,2-ジデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン DLPEまたはジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン DPPE)およびジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(1.7当量)を、この順序で加えた。溶液を室温にて3時間〜24時間攪拌した。混合物をH2O(1x50 mL)、酸性化したH2O(pH4-5、HClにより；1x50 mL)およびH2O(1x50 mL)で連続的に洗浄した。有機相を乾燥(Na2SO4)し、ろ過し、蒸発させた。このようにして得られた粗物質を、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物7a-cを白色固体物質で得た。
【０１２９】
実施例1.2a：化合物7aの製造
6-[ビス[2-[(1,1-ジメチル)エトキシ]-2-オキソエチル]アミノ]-6-[(13R)-10-ヒドロキシ-10-オキシド-5,16-ジオキソ-13-(1-オキソドデシル)オキシ]-9,11,15-トリオキサ-6-アザ-10-ホスファペンタコス-1-イル]テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸ビス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル
試薬：化合物6(797 mg；1.04 mmol)；1,2-ジデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(543 mg；1.04 mmol)。
化合物7a(937 mg；0.796 mmol)。収率77%。
分析データ：
HPLC-ELSD：100%(領域%)；
Mr：1177.50(C59H109N4O17P)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１３０】
実施例1.2b：化合物7bの製造
6-[ビス[2-[(1,1ジメチル)エトキシ]-2-オキソエチル]アミノ]-6-[(13R)-10-ヒドロキシ-10-オキシド-5,16-ジオキソ-13-(1-オキソドデシル)オキシ]-9,11,15-トリオキサ-6-アザ-10-ホスファヘプタコス-1-イル]-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸ビス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル
試薬：化合物6(700 mg；0.91 mmol)；1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン DLPE(500 mg；0.86 mmol) 
化合物7b(927 mg、0.751 mmol)。収率87%。
分析データ：
HPLC-ELSD：100%(領域%)；Mr：1233.61(C63H117N4O17P)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１３１】
実施例1.2c：化合物7cの製造
6-[ビス[2-[(1,1ジメチル)エトキシ]-2-オキソエチル]アミノ]-6-[(13R)-10-ヒドロキシ-10-オキシド-5,16-ジオキソ-13-(1-オキソドデシル)オキシ]-9,11,15-トリオキサ-6-アザ-10-ホスファノナコス-1-イル]-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸ビス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル
試薬：化合物6(1.92 g；2.50 mmol)；1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン DPPE(1.73 g；2.50 mmol)。
化合物7c(2.79 g；2.07 mmol)。収率83%。
分析データ：
HPLC-ELSD：100%(領域%)；Mr：1345.82(C71H133N4O17P)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１３２】
実施例1.3：t-ブチルエステルの切断：一般的手順
化合物7a-c(1当量)をCH2Cl2(濃度2-4% w/v)に溶解させ、溶液を攪拌し、0℃にて冷却し、次いで、TFA(6当量)を滴下した。反応混合物を室温にて1時間攪拌した。溶液を蒸発させ、残渣を新鮮なTFA(30当量)に溶解させた。この溶液を室温にて80時間攪拌した；MS分析およびHPLC-ELSDによって反応をモニターした。混合物を蒸発させ、残渣をジイソプロピルエーテルで処理して、白色固体を得、遠心分離し、ジイソプロピルエーテル(2x30 mL)で洗浄した。その固体をH2Oに懸濁させ、5%水性NaHCO3の添加によってpH6-7にて溶解させ、1M HClの添加によってpH2にて沈殿させた。固体をろ過し、減圧乾燥(P2O5)して、下記にデータを示すリガンド8a-cを得た。
【０１３３】
実施例1.3a：化合物8aの製造
6-[ビス[2-[(1,1ジメチル)エトキシ]-2-オキソエチル]アミノ]-6-[(13R)-10-ヒドロキシ-10-オキシド-5,16-ジオキソ-13-(1-オキソドデシル)オキシ]-9,11,15-トリオキサ-6-アザ-10-ホスファペンタコス-1-イル]-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸
試薬：化合物7a(885 mg；0.752 mmol)。
化合物8a(669 mg；0.702 mmol)；収率93%。
分析データ：
HPLC-ELSD：92.3%(領域%)
Mr：953.07(C43H77N4O17P)
錯滴定(1.001 mM GdCl3)：95.7%
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１３４】
実施例1.3b：化合物8bの製造
6-[ビス[(カルボキシメチル)アミノ]-6-[(13R)-10-ヒドロキシ-10-オキシド-5,16-ジオキソ-13-(1-オキソドデシル)オキシ]-9,11,15-トリオキサ-6-アザ-10-ホスファヘプタコス-1-イル]-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸 
試薬：化合物7b(875 mg、0.709 mmol)。
化合物8b(750 mg；0.642 mmol)；収率91%。
分析データ：
HPLC-ELSD：75.5%(領域%)
Mr：1009.18(C47H85N4O17P)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１３５】
実施例1.3c：化合物8cの製造
6-[ビス[(カルボキシメチル)アミノ]-6-[(13R)-10-ヒドロキシ-10-オキシド-5,16-ジオキソ-13-(1-オキソドデシル)オキシ]-9,11,15-トリオキサ-6-アザ-10-ホスファノナコス-1-イル]-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸
試薬：化合物7c(2.79 g；2.07 mmol)
化合物8c(1.77 g；1.58 mmol)；収率76%。
分析データ：
HPLC-ELSD：95.3%(領域%)
Mr：1121.39(C55H101N4O17P)
錯滴定(1.001 mM GdCl3)：95.7%
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１３６】
実施例1.4：水性媒体中での錯形成：一般的手順
リガンド8(a-c)(1当量)をH2O(濃度5%；pH1-2)に再懸濁させ、5% NaHCO3水溶液の添加によってpH6.5-7にて溶解させた。 GdCl3(1当量)の滴定溶液を少しずつ加えた。溶液を室温にて攪拌し、5% NaHCO3溶液の添加によってpHを一定に維持した。HPLC-ELSDおよびキシレノールオレンジアッセイによって錯形成をモニターした。凍結乾燥によって錯体を単離し、サイズ排除クロマトグラフィーによって塩から精製して、化合物9a-cを得た。
【０１３７】
実施例1.4a：化合物9aの製造
[[6-[ビス[(カルボキシメチル)アミノ]-6-[(13R)-10-ヒドロキシ-10-オキシド-5,16-ジオキソ-13-(1-オキソドデシル)オキシ]-9,11,15-トリオキサ-6-アザ-10-ホスファペンタコス-1-イル]-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸(4-)]ガドリネート(1-)]ナトリウム
試薬：化合物8a(400 mg、0.438 mmol)
化合物9a (257 mg、0.228 mmol)；収率52%。
分析データ：
HPLC-ELSD：98.9%(領域%)
Mr：1129.28(C43H73GdN4NaO17P)
MSは、構造に対応した。
【０１３８】
実施例1.4b：化合物9bの製造
[6-[ビス[(カルボキシメチル)アミノ]-6-[(13R)-10-ヒドロキシ-10-オキシド-5,16-ジオキソ-13-(1-オキソドデシル)オキシ]-9,11,15-トリオキサ-6-アザ-10-ホスファヘプタコス-1-イル]-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸(4-)]ガドリネート(1-)]ナトリウム
試薬：化合物8b(690 mg、0.590 mmol)
化合物9b(614 mg；0.518 mmol)；収率88%。
分析データ：
HPLC-ELSD：95.6%(領域%)
Mr：1185.39(C47H81GdN4NaO17P)
MSは、構造に対応した。
【０１３９】
実施例1.4c：化合物9cの製造
[6-[ビス[(カルボキシメチル)アミノ]-6-[(13R)-10-ヒドロキシ-10-オキシド-5,16-ジオキソ-13-(1-オキソドデシル)オキシ]-9,11,15-トリオキサ-6-アザ-10-ホスファノナコス-1-イル]-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸(4-)]ガドリネート(1-)]ナトリウム 
試薬：化合物8c(500 mg、0.435 mmol)
化合物9c(517 mg、0398 mmol)；収率：92%
分析データ：
HPLC-ELSD：99.2%(領域%) [8]
Mr：1297.60(C55H97GdN4NaO17P)
MSは、構造に対応した。
【実施例２】
【０１４０】
化合物12d-eの製造
反応工程式４にしたがって、化合物12d-eを製造する：
反応工程式４
2015535811.tif 000050
【０１４１】
実施例2.1：化合物10d-eの製造：一般的手順
実施例1.1aにしたがって製造された化合物6(1当量)を、ジアルキルアミン(1当量)およびDIPEA(1.7当量)とともにCHCl3(濃度1-3% w/v)に溶解させた。反応溶液を室温にて24時間攪拌し、H2O(1x50 mL)、酸性化したH2O(pH4-5、HClにより；1x70 mL)およびH2O(1x50 mL)で連続的に洗浄した。有機相を乾燥(Na2SO4)し、ろ過し、蒸発させた。そのようにして得られた生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、下記に結果を示すように、化合物10(d-e)を油状物で得た。
【０１４２】
実施例2.1d：化合物10dの製造：6-[ビス[2-[(1,1-ジメチル)エトキシ]-2-オキソエチル]アミノ]-6-[5-(ジデシルアミノ)-5-オキソペント-1-イル]-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸ビス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル
試薬：化合物6(1.92 g；2.50 mmol)；ジデシルアミン(0.743 g；2.50 mmol)
化合物10d(2.26 g；2：38 mmol)。収率：95 %。
分析データ：
HPLC-ELSD：95.3 %(領域%)；Mr：951.42(C54H102N4O9)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１４３】
実施例2.1e：化合物10eの製造：6-[ビス[2-[(1,1-ジメチル)エトキシ]-2-オキソエチル]アミノ]-6-[5-(ドデシルアミノ)-5-オキソペント-1-イル]-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸-ビス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル
試薬：化合物6(3.13 g；4.07 mmol)；ジドデシルアミン(1.44 g；4.07 mmol)
化合物10e(4.30 g、4.27 mmol)。収率：105%(溶媒残差)。
分析データ：
HPLC-ELSD：89.7%(領域%)；Mr：1007.53(C58H110N4O9)。
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１４４】
実施例2.2：化合物11d-eの製造：一般手順
化合物10d-e(1当量)をCH2Cl2(20-50 mL)に溶解させ、そのようにして得られた溶液を攪拌し、0℃に冷却し、次いで、TFA(6当量)を滴下した。反応混合物を室温にて1時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、得られた残渣を新鮮なTFA(50当量)に溶解させた。この溶液を80時間攪拌した。混合物を蒸発させ、残渣をジイソプロピルエーテル(70 mL)で処理して、白色沈殿を得、ろ過または遠心分離し、ジイソプロピルエーテル(2x20 mL)で洗浄し、減圧乾燥(P2O5；NaOHペレット)して、リガンド11dおよび11eを白色固体で得た。粗生成物をH2Oに再懸濁させ、2N NaOHの添加によってpH6-7にて溶解させ、1M HClの添加によってpH2にて沈殿させた。
【０１４５】
実施例2.2d：化合物11dの製造：6-[ビス[(カルボキシメチル)]アミノ]-6-[5-(ジデシルアミノ)-5-オキソペント-1-イル]-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸
試薬：化合物10d(2.20 g、2.31 mmol)
化合物11d(1.08 g；1：48 mmol) 収率：64 %。
分析データ：
HPLC-ELSD：95.7 %(領域%)
Mr：726.99(C38H70N4O9)
錯滴定(1.001 mM GdCl3)：94 %。
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１４６】
実施例2.2e：化合物11eの製造：6-[ビス[(カルボキシメチル)アミノ]-6-[5-(ドデシルアミノ)-5-オキソペント-1-イル]-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸
試薬：化合物10e(4.30 g、4.27 mmol)；
化合物11e(2.83 g、3.61 mmol) 収率：85 %。
分析データ：
HPLC-ELSD：82.4%(領域%)。
Mr：783.10(C42H78N4O9)。
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１４７】
実施例2.3：化合物12d-eの製造：一般的手順
リガンド11d-e(1当量)をH2O(濃度5% w/v；pH1-2)に懸濁させ、2N NaOHの添加によってpH6.5-7にて溶解させる。GdCl3(1当量)の滴定溶液を少しずつ加えた。混合物を室温にて攪拌し、0.1N NaOHの添加によってpHを一定に維持した。反応溶液を濃縮して、沈殿を得た；錯体12d-eをろ過により同定した。
【０１４８】
実施例2.3d：化合物12dの製造：[(6-[ビス[(カルボキシメチル)アミノ]-6-[5-(ジデシルアミノ)-5-オキソペント-1-イル]-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸[4-)]ガドリネート(1-)]ナトリウム
試薬：化合物11d(1.1 g；1：48 mmol)；
化合物12d(1.12 g；1.24 mmol)；収率90%。
分析データ：
HPLC-ELSD：94.6 %(領域%)
Mr：903.20(C38H66GdN4NaO9)
MSは、構造に対応した。
【０１４９】
実施例2.3e：化合物12eの製造：[[6-[ビス[(カルボキシメチル)アミノ]-6-[5-(ドデシルアミノ)-5-オキソペント-1-イル]-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸(4-)]ガドリネート(1-)]ナトリウム
試薬：化合物11e(1.10 g、1.37 mmol)；
化合物12e(1.02 g；1.06 mmol)；収率：78 %。
分析データ：
HPLC-ELSD：94.3 %(領域%)
Mr：959.31(C42H74GdN4NaO9)。
MSは、構造に対応した。
【実施例３】
【０１５０】
化合物21の製造
6-[ビス[2-[(1,1-ジメチル)エトキシ]-2-オキソエチル]アミノ]-6-[(1R,4R)-4-カルボキシシクロヘキサン-1-イル]テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸ビス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル 
反応工程式５にしたがって、化合物21を製造した。
反応工程式５
2015535811.tif 000051
【０１５１】
実施例3a：化合物14の製造
(1R,4R)-4-(ヒドロキシメチル)シクロヘキサンカルボン酸メチルエステル
MeOH(300 mL)中のtrans-(1R,4R)-4-ヒドロキシメチルシクロヘキサンカルボン酸13(15 g；94.8 mmol)の溶液に、濃H2SO4(15 mL)を加え、次いで、反応混合物を4時間攪拌還流した。溶液を濃縮し、次いで、NH4OH水溶液添加によって塩基性化した；白色固体をろ去し、母液をEtOAc(3x70 mL)で抽出した。合せた有機層を、飽和NaCl水溶液で洗浄し、乾燥(Na2SO4)し、減圧蒸発して、14を黄色液体(17.26 g)で得、これ以上の精製をせずに次の反応に用いた。
定量的収率。
分析データ：
Mr：172.22(C9H16O3)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１５２】
実施例3b：化合物15の製造
(1R,4R)-4-[(メチルスルホニルオキシ)メチル]シクロヘキサンカルボン酸メチルエステル
0℃に冷却したTHF(450 mL)中の化合物14(17.26 g)の溶液に、triエチルアミン(39.4 mL；284.5 mmol)、次いで、塩化メタンスルホニル(14.9 mL；151.7 mmol)を加えた。混合物を0℃にてさらに10分間攪拌し、次いで、反応混合物を室温にて2時間攪拌した。反応混合物をセライト(0.01-0.04 mm)床でろ過し、次いで、新鮮なTHFで洗浄した。得られる溶液を減圧蒸発させて、化合物15を黄色油状物で得(30.95 g)、これ以上の精製をせずに次の反応に用いた。
定量的収率。
分析データ：
Mr：250.30(C10H18O5S)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１５３】
実施例3c：化合物16の製造
(1R,4R)-4-(ヨードメチル)シクロヘキサンカルボン酸メチルエステル
アセトン(450 mL)中の化合物15(30.95 g)およびヨウ化ナトリウム(42.64 g；284.5 mmol)の溶液を室温にて2時間攪拌し、次いで、3.5時間還流した。室温にて60時間後、追加のNaI(5 g；17.7 mmol)を加え、溶液を7時間還流した。溶媒を減圧蒸発させ、黄色残渣をジエチルエーテルで処理した；不溶性の塩をろ去し、新鮮なジエチルエーテルで洗浄した。エーテル溶液を蒸発させ、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物16を黄色液体で得た(22.43 g；79.5 mmol)。
収率：84 % 
分析データ：
Mr：282.12(C9H15IO2)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１５４】
実施例3d：化合物17の製造
(1R,4R)-4-(ニトロメチル)シクロヘキサンカルボン酸メチルエステル
DMSO(1 L)中の亜硝酸ナトリウム(10.72 g；155.4 mmol)およびフロログルシノール(10.78 g；85.4 mmol)の溶液に、化合物16(21.92 g；77.7 mmol)を加えた。窒素下、溶液を室温にて48時間攪拌した。反応混合物をH2O(3 L)で希釈し、Et2Oで抽出した。有機層を乾燥(Na2SO4)し、蒸発させて、粗生成物を得、フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。化合物17(10.35 g；51.4 mmol)を淡黄色液体で得た。
収率：66 %
分析データ：
HPLC：97.9%(HPLC 領域%)
Mr：201.22(C9H15NO4)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１５５】
実施例3e：化合物18の製造
6-[(1R,4R)-4-(メトキシカルボニル)シクロヘキサン-1-イル]-6-ニトロ-1,4-ビス(フェニルメチル)-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン
EtOH(400 mL)中のN,N'-ジベンジルエチレンジアミンアセト酢酸(18.29 g；50.7 mmol)の懸濁液を、透明な溶液が得られるまで60℃にて攪拌した；パラホルムアルデヒド(4.57 g；152.2 mmol)を加え、懸濁液を80℃にて1.5時間加熱して、暗橙色の透明溶液を得た。EtOH中の化合物17(10.21 g；50.7 mmol)の溶液を滴下し、最終溶液を80℃にて6時間攪拌した。室温にて15時間後、得られる沈殿をろ過し、EtOHで洗浄し、真空乾燥して、化合物18を白色固体物質(17.88 g；38.4 mmol)で得た。
収率：76%。
分析データ：
HPLC：99.61 %(領域%)
Mr：465.59(C27H35N3O4)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１５６】
実施例3f：化合物19の製造
6-アミノ-4-(メトキシカルボニル)シクロヘキサン-1-イル] テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン。
THF(200 mL)中の化合物18(17.88 g；38.4 mmol)の懸濁液を、透明な溶液が得られるまで40℃にて攪拌した；次いで、溶液をMeOH(150 mL)で希釈した。MeOH(50 mL)中の5% Pd/C(10.66 g)の懸濁液を加え、混合物を大気圧で40℃にて11時間水素添加した。触媒をろ去し、溶液を蒸発させて、化合物19を緑色がかった油状物で得た(9.57 g；37.4 mmol)。得られた生成物をさらに精製することなく用いた。
収率：98 %。
分析データ：
Mr：255.36(C13H25N3O2)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１５７】
実施例3g：化合物20の製造
6-[ビス[2-[(1,1-ジメチル)エトキシ]-2-オキソエチル]アミノ]-6-[(1R,4R)-4-(メトキシカルボニル)-シクロヘキサン-1-イル]テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸ビス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル
化合物19(9.52 g；37.3 mmol)をCH3CN(400 mL)に溶解させ、次いで、K2CO3(23.19 g；167.8 mmol)およびNa2SO4(15.88 g；111.8 mmol)を加えた。続いて、ブロモ酢酸t-ブチル(24.6 mL；167.8 mmol)を加え、混合物を80℃にて16時間攪拌した。塩をろ去し、ろ液を蒸発させ、残渣をEtOAc(200 mL)に溶解させ、溶液をH2O(3x70 mL)および飽和NaCl水溶液(70 mL)で洗浄した。有機相を乾燥(Na2SO4)し、ろ過し、蒸発させた。粗生成物(27.36 g)をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物20を淡黄色油状物で得た(5.34 g；7.5 mmol)。
収率：20 %
分析データ：
Mr：711.93(C37H65N3O10)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１５８】
実施例3h：化合物21の製造
6-[ビス[2-[(1,1-ジメチル)エトキシ]-2-オキソエチル]アミノ]-6-[(1R,4R)-4-カルボキシ-シクロヘキサン-1-イル]テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸ビス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル
室温にて攪拌しながらi-PrOH(100 mL)中の化合物20の溶液に、2N NaOH(7.12 mL；14.2 mmol)を加え、次いで、H2O(5.5 mL)を、均質な混合物が得られるまで加えた。反応が完了しなかったため、溶液を室温にて5.5時間攪拌し、溶液を-20℃にて15時間保管した。温度を室温まで上げて、反応混合物をさらに3時間攪拌した。2N HCl(7.12 mL)でpHを7に調節し、溶液を室温にて減圧蒸発させた。残渣をH2O(80 mL)に再懸濁させ、2N HCl(7.12 mL)で酸性化し、EtOAcで抽出した。有機層を乾燥(Na2SO4)し、蒸発させて、化合物21を白色固体(4.5 g；6.45 mmol)で得た。
収率：90 %。
分析データ：
Mr：697.91(C36H63N3O10)。
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【実施例４】
【０１５９】
化合物25a-cの製造
反応工程式６にしたがって、化合物25a-cを製造した。
反応工程式６
2015535811.tif 000052
【０１６０】
実施例4.1：化合物22の製造
6-[ビス[2-[(1,1-ジメチル)エトキシ]-2-オキソエチル]アミノ]-6-[(1R,4R)-4-[[(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ]カルボニル]シクロヘキサン-1-イル]テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸ビス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル
0℃にて攪拌しながらCH2Cl2(50 mL)中の化合物21(1.09g；1.6 mmol)の溶液に、NHS(0.27g；2.3 mmol)を加え、次いで、CH2Cl2(50 mL)中のEDC(0.45g；2.3 mmol)を滴下した。反応混合物を室温にて49時間攪拌した。最終溶液をH2O(3x40 mL)で洗浄し、有機層を乾燥乾燥(Na2SO4)し、蒸発させて、22を固体(1.35 g)で得、さらに精製することなく次のステップに用いた。
定量的収率。
【０１６１】
実施例4.2：化合物25a-cの製造：一般的手順
CHCl3(濃度2%)中の化合物22(1当量)の溶液に、選ばれたアミン(1-1.3当量)を加え、次いで、DIPEA(1.7当量)を添加した。混合物を室温にて64-72時間攪拌した。反応溶液が中性になったので、追加のDIPEA(1.7当量)を加え、反応混合物を室温にて2-21時間攪拌した。次いで、反応混合物をH2O(35 mL)で、洗液のpHが酸性になるまで希HCl(3x40 mL)で、そしてH2O(35 mL)で連続的に洗浄した。有機相を乾燥(Na2SO4)し、蒸発させて、粘稠で黄色がかった粗生成物を得、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、下記にデータを示す化合物23 a-cを黄色油状物で得た。
【０１６２】
実施例4.2a：化合物23aの製造
6-[ビス[2-[(1,1-ジメチル)エトキシ]-2-オキソエチル]アミノ]-6-[(1R,4R)-4-[(ジデシルアミノ)-カルボニル]シクロヘキサン-1-イル]テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸ビス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル
試薬：化合物22(1.18 g；1：48 mmol) ジデシルアミン(0.44 g；1.48 mmol)
化合物23a(075 g、0.77 mmol)。収率：52%。
Mr：977.46(C56H104N4O9)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１６３】
実施例4.2c：化合物23cの製造
6-[ビス[2-[(1,1-ジメチル)エトキシ]-2-オキソエチル]アミノ]-6-[(1R,4R)-4-[[[(7R)-4-ヒドロキシ-4-オキシド-10-オキシド-10-オキソ-7-[(1-オキソドデシル)オキシ]-3,5,9-トリオキサ-4-ホスファノナデク-1-イル]アミノ]カルボニル]シクロヘキサン-1-イル]テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸ビス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル
試薬：化合物22(1.35 g；1.56 mmol)；1,2-ジデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(0.81 g；1.56 mmol)
化合物23c(0.84 g；0.70 mmol)。収率：45%。
Mr：1203.54(C61H111N4O17P)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１６４】
実施例4.3：化合物24a-cの製造：一般的手順
0℃にて攪拌しながらCH2Cl2(50 mL)中の化合物23aまたは23c(1当量)の溶液に、TFA(6当量)を滴下した。反応混合物を室温にて1時間攪拌し、次いで、蒸発させて、残渣を新鮮なTFA(350当量)に溶解させた；次いで、溶液を室温にて24-28時間攪拌した。TFAを蒸発させ、残渣をiPr2O(40-60 mL)で処理して、白色固体を得、遠心分離によって単離し、乾燥(NaOHペレットの存在下、減圧および30℃)して、下記にデータを示す化合物24a-cを得た。
【０１６５】
実施例4.3a：化合物24aの製造
6-[[ビス(カルボキシメチル)]アミノ]-6-[(1R,4R)-4-[(ジデシルアミノ)カルボニル]シクロヘキサン-1-イル]テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸 
試薬：化合物23a(0.75 g、0.77 mmol)
化合物24a(0.41 g；0.54 mmol) 収率：70%。
分析データ：
HPLC-ELSD：94.1%(領域%)
Mr：753.03(C40H72N4O9)
錯滴定：(0.001 M GdCl3)：81.7%
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１６６】
実施例4.3c：化合物24cの製造
6-[[ビス(カルボキシメチル)]アミノ]-6-[[[(7R)-4-ヒドロキシ-4-オキシド-10-オキソ-7-[(1-オキソドデシル)オキシ]-3,5,9-トリオキサ-4-ホスホノナデク-1-イル]アミノ]カルボニル]シクロヘキサン-1-イル]テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸
試薬：化合物23c(0.84 g、0.70 mmol)
化合物24c(0.67 g；0.69 mmol)；収率：98%。
分析データ：
HPLC-ELSD：96.2% (領域%)
Mr：979.11(C45H79N4O17P)
錯滴定：(0.001 M GdCl3)：96.9%
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１６７】
実施例4.4：化合物25a-cの製造：一般的手順
実施例2.3に記載の手順にしたがって、滴定された化合物を製造した。
【０１６８】
実施例4.4a：化合物25aの製造
[[6-[[ビス(カルボキシメチル)]アミノ]-6-[(1R,4R)-4-(ジデシルアミノ)カルボニル]シクロヘキサン-1-イル]テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸(4-)]ガドリネート(1-)]ナトリウム
試薬：化合物24a(0.32 g、0：43 mmol)
化合物25a(0.33 g；0.35 mmol) 収率：83 %。
分析データ：
HPLC-ELSD：95.2%(領域 %)
Mr：929.24(C40H68GdN4NaO9)
TGA：5.7%
MSは、構造に対応した。
【０１６９】
実施例4.4c：化合物25cの製造
[[6-[[ビス(カルボキシメチル)]アミノ]-6-[(1R,4R)-4-[[(7R)-4-ヒドロキシ-4-オキシド-10-オキソ-7-[(1-オキソドデシル)オキシ]-3,5,9-トリオキサ-4-ホスファノノナデク-1-イル]アミノ]カルボニル]シクロヘキサン-1-イル]テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-アセト酢酸(4-)]ガドリネート(1-)]ナトリウム
試薬：化合物24c(0.35 g、mmol 0.36)
化合物25c(0.31 g；0.27 mmol) 収率：77 %
分析データ：
Mr：1155.32(C45H75GdN4 NaO17P)
MSは、構造に対応した。
【０１７０】
式(II)で示される化合物の製造
【実施例５】
【０１７１】
[10-[2-(ジデシルアミノ)-2-オキソエチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-トリアセテート(3-)]ガドリニウム(29)の製造
反応工程式７
2015535811.tif 000053
【０１７２】
実施例5.a：10-[2-(ジデシルアミノ)-2-オキソエチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-三酢酸トリス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル(27)の製造
CH3CN(500 mL)中の化合物26(5 g；7.8 mmol)の懸濁液に、HBTU(g；mmol)およびDIPEA(g；mmol)を加え、混合物を室温にて30分間攪拌した；ジデシルアミン(2.32 g；7.8 mmol)を加え、混合物を室温にて24時間攪拌した。
【０１７３】
反応混合物を蒸発させ、残渣をCHCl3に溶解させ、H2O(100 mL)、酸性化したH2O(pH4-5、HClにより；100 mL)およびH2O(100 mL)で連続的に洗浄した。有機層を乾燥(Na2SO4)し、ろ過し、蒸発させ、得られる粗物質をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、 化合物27を無色油状物(5.36 g；7.24 mmol)で得た。収率93%。
分析データ
HPLC-ELSD：96.9 %(領域%)
Mr：740.08(C40H77N5O7)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１７４】
実施例5.b：10-[2-(ジデシルアミノ)-2-オキソエチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-三酢酸(28)の製造
0℃に冷却したCH2Cl2(100 mL)中の化合物27(5.02 g；5.89 mmol)の溶液に、TFA(6当量)を滴下した；得られる溶液を室温にて1時間攪拌し、次いで、蒸発させた。残渣を新鮮なTFA(50当量)に溶解させ、そのようにして得られた溶液を室温にて96時間攪拌した。
【０１７５】
反応混合物を蒸発させ、残渣を iPr2O(150 mL)で処理して、白色固体物質を得、遠心分離し、iPr2O(2x40 mL)で洗浄した。このような固体をH2Oに再懸濁させ、1M NaOHの添加によってpH6-7にて溶解させ、そのようにして得られた溶液を、溶離液としてH2O/CH3CN勾配を用いるアンバーライト(登録商標)XAD1600樹脂でのパーコレーションによって精製した。所望の生成物を含む画分をあわせ、凍結乾燥して、リガンド28(2.04 g；2.99 mmol)を白色固体物質で得た。収率51%。
分析データ
HPLC-ELSD：99.5%(領域%)
Mr：683.97(C36H69N5O7)
錯滴定(0.01 M ZnSO4)：98.8%
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１７６】
実施例5.c：[10-[2-(ジデシルアミノ)-2-オキソエチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-三酢酸(3-)]ガドリニウム(29)の製造
H2O(50 mL)中のリガンド28(1.01 g；1.45 mmol)の溶液に、pH5-6にて、0.1 M GdCl3(14.5 mL；1.45 mmol)の溶液を少しずつ加え、溶液を室温にて攪拌し、0.1 M NaOHの添加によってpHを6.5および7.5の間に維持した。溶離駅としてH2O/CH3CN勾配を用いるアンバーライト(登録商標)XAD1600樹脂上での溶離によって溶液を脱塩した。所望生成物を含む画分をあわせ、凍結乾燥して、錯体29を白色固体物質(1.08 g；1.29 mmol)得た。収率89%。
分析データ
HPLC-ELSD：99.0%(領域%)
Mr：838.20(C36H66GdN5O7)
MSは、構造に対応した。
【実施例６】
【０１７７】
錯体32a-bの製造
反応工程式８
2015535811.tif 000054
【０１７８】
実施例6.1：化合物30a-bの製造：一般手順
CH2Cl2(濃度1% w/v)中の化合物26の懸濁液に、HBTU(1当量)およびDIPEA(1.7当量)を連続的に加え、混合物を室温にて30分間攪拌した；次いで、ホスホエタノールアミン(DLPE n＝10またはDMPE n＝12)(1当量)を加え、混合物を室温にれ24時間攪拌した。反応混合物をH2O(100 mL)、酸性化したH2O(pH4〜5、HClにより；100 mL)およびH2O(100 mL)で連続的に洗浄した。有機層を乾燥(Na2SO4)し、ろ過し、蒸発させ、そのようにして得られた粗物質をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物30a-bを得た。
【０１７９】
実施例6.1a：10-[(10R)-7-ヒドロキシ-7-オキシド-2,13-ジオキソ-10-[(1-オキソドデシル)オキシ]-6,8,12-トリオキサ-3-アザ-7-ホスファテトラコス-1-イル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-三酢酸トリス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル 30aの製造
試薬：化合物26(968 mg；1.69 mmol)；1,2-ジドデカニル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(980 mg；1.69 mmol)。
化合物30a(605 mg、0.53 mmol)；収率32%。
分析データ
HPLC-ELSD：40.6 %(領域%)
Mr：1134.48(C57H108N5O15P)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１８０】
実施例6.1b：10-[(10R)-7-ヒドロキシ-7-オキシド-2,13-ジオキソ-10-[(1-オキソテトラデシル)オキシ-6,8,12-トリオキサ-3-アザ-7-ホスファエサコス(phosphaesacos)-1-イル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-三酢酸トリス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル 30bの製造
試薬：化合物26(1.43 g；2.36 mmol)、1,2-ジテトラデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(1.50 g；2.36 mmol)。
化合物30b(2.18 g、1.97 mmol)。収率78 %。
分析データ
HPLC-ELSD：82.4 %(領域%)
Mr：1190.49(C61H116N5O15P)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１８１】
実施例6.2：化合物31a-bの製造：一般手順
0℃に冷却した CH2Cl2(濃度1% w/v)中の化合物30a-bの溶液に、TFA(6当量)を滴下し、溶液を室温にて1時間攪拌し、次いで、蒸発させた。残渣を新鮮なTFA(30当量)に溶解させ、新たな溶液を室温にて96時間攪拌する。
【０１８２】
反応混合物を蒸発させ、残渣をiPr2O(150 mL)で処理して、白色固体物質を得、遠心分離し、iPr2O(2x40 mL)で洗浄した。
【０１８３】
以下の方法にしたがって、粗生成物31aを精製した。 粗生成物をH2Oに懸濁させ、5%水性NaHCO3の添加によってpH6〜7にて溶解さ、続いて、1M HClの添加によってpH3にて再沈殿させた。そのようにして得られた固体を遠心分離し、乾燥して、リガンド31aを得た。
【０１８４】
以下の方法にしたがって、粗生成物31bを精製した。粗生成物をH2Oに懸濁させ、1M NaOHの添加によってpH6〜7にて溶解させ、そのようにして得られた溶液を
溶離液としてH2O/CH3CN勾配を用いるアンバーライト(登録商標)XAD1600樹脂上でのパーコレーションによって精製した。所望の生成物を含む画分をあわせ、凍結乾燥して、リガンド31bを得た。
【０１８５】
実施例6.2a：10-[(10R)-7-ヒドロキシ-7-オキシド-2,13-ジオキソ-10-[(1-オキソドデシル)オキシ]-6,8,12-トリオキサ-3-アザ-7-ホスファテトラコス-1-イル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-三酢酸(31a)の製造
試薬：化合物30a(600 mg、0.53 mmol)
化合物31a(501 mg、0.53 mmol)。収率98 %。
分析データ
HPLC-ELSD：61.3 %(領域 %)
Mr：966.16(C45H84N5O15P)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１８６】
実施例6.2b：
10-[(10R)-7-ヒドロキシ-7-オキシド-2,13-ジオキソ-10-[(1-オキソテトラデシル)オキシ]-6,8,12-トリオキサ-3-アザ-7-ホスファエサコス-1-イル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-三酢酸(31b)の製造
試薬：化合物30b(2.0 g、1.68 mmol)
化合物31b(1.1 g；1.07 mmol)。収率63 %。
分析データ
HPLC-ELSD：99.9 %(領域%)
Mr：1022.26(C49H92N5O15P)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１８７】
実施例6.3：化合物32a-bの製造：一般手順
室温にて攪拌しながら、CH3OH/H2O 10：1(1当量)中のピリジン(中和されるまで)およびGd(Ac)3の溶液を、CHCl3(濃度1% w/v)中のリガンド31a-bの懸濁液に少しずつ加えた。反応混合物を蒸発させ、残渣をCH3OH/トルエン(3x50 mL)およびCHCl3(3x50 mL)で処理し、それぞれ溶解した後に蒸発乾固した。最終残渣をH2Oに懸濁させ、凍結乾燥して、錯体32a-bを白色固体物質で得た。
【０１８８】
実施例6.3a：[10-[(10R)-7-ヒドロキシ-7-オキシド-2,13-ジオキソ-10-[(1-オキソドデシル)オキシ]-6,8,12-トリオキサ-3-アザ-7-ホスファテトラコス-1-イル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-三酢酸(3-)]ガドリニウム(32a)の製造
試薬：化合物31a(423 mg、0.44 mmol)
化合物32a(472 mg、0.42 mmol)。収率96 %
分析データ
HPLC-ELSD：69.5 %(領域%)
Mr：1120.38(C45H81GdN5O15P)
MSは、構造に対応した。
【０１８９】
実施例6.3b：[10-[(10R)-7-ヒドロキシ-7-オキシド-2,13-ジオキソ-10-[(1-オキソテトラデシル)オキシ]-6,8,12-トリオキサ-3-アザ-7-ホスファエサコス-1-イル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-三酢酸(3-)]ガドリニウム(32b)の製造
試薬：化合物31b(900 mg、0.85 mmol)
化合物32b(991 mg、0.84 mmol)。収率99 %。
分析データ
HPLC-ELSD：92.8 %(領域%)
Mr：1176.49(C49H89GdN5O15P)
MSは、構造に対応した。
【実施例７】
【０１９０】
錯体37a-bの製造
反応工程式９
2015535811.tif 000055
【０１９１】
金属錯体37a-bの合成のために出発反応物として用いた化合物33は、当技術分野で周知の手順にしたがって合成した(Org. Process. Res Dev. 2009、13 (3)、535-542)。
【０１９２】
実施例7.1：10-[(4R)-7-(2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル)オキシ-2,2-ジメチル-3,7-ジオキソ-2-オキシエプト-4-イル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-三酢酸トリス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル(34)の製造
0℃にて冷却しながら、CH2Cl2(30 mL)中のEDC溶液(0.757 g；3.95 mmol)の溶液を、CH2Cl2(50 mL)中の化合物33(2 g；2.63 mmol)およびNHS(0.455 g；3.95 mmol)の溶液に滴下し、反応混合物を室温にて20時間攪拌した。次いで、混合物をH2O(3x60 mL)(中和されるまで)で洗浄し、蒸発させて、化合物34(1.78 g；2.22 mmol)を得た。収率84%。
分析データ
Mr：797.98(C39H67N5O12)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１９３】
実施例7.2a：10-[(1S)-1-[[(1,1-ジメチル)エトキシ]カルボニル]-4-オキソ-4-(ジデシルアミノ)ブト-1-イル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-三酢酸トリス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル(35a)の製造
CHCl3(70 mL)中の化合物34(1.78 g；2.23 mmol)の溶液に、ジデシルアミン(0.665 g；2.23 mmol)およびDIPEA(646 microL；3.79 mmol)を連続的に加え、溶液を室温にて72時間攪拌した。反応混合物をH2O(1x50 mL)、酸性H2O(pH4-5、HClにより、1x50 mL)およびH2O(1x50 mL)で連続的に洗浄し、乾燥(Na2SO4)し、蒸発させて、化合物35a(2.27 g；2.23 mmol)を得た。定量的収率。
分析データ
Mr：980.46(C55H105N5O9)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１９４】
実施例7.2b：10-[(1S)(12R)-1-[[(1,1-ジメチル)エトキシ]カルボニル]-9-ヒドロキシ-9-オキシド-4,15-ジオキソ-12-(1-オキソドデシル)オキシ]-8,10,14-トリオキサ-5-アザ-9-ホスファテトラコス-1-イル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-三酢酸トリス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル(35b)の製造
CHCl3(25 mL)中の化合物34(0.762 g；0.995 mmol)の溶液に、1,2-ジデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(0.500 g；0.955 mmol)およびDIPEA [ ](276 μL；1.62 mmol)を連続的に加え、溶液を室温にて22時間攪拌した。反応混合物をH2O(1x50 mL)、酸性H2O(pH4-5、HClにより、1x50 mL)およびH2O(1x50 mL)で連続的に洗浄し、乾燥(Na2SO4)し、蒸発させ、そのようにして得られた粗残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物35b(0,725 g；6.01 mmol)を得た。収率63%。
分析データ
HPLC-ELSD：79.7%(領域%)
Mr：1205.53(C60H111N5O17P)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１９５】
実施例7.3：化合物36a-bの製造：一般手順
0℃にて冷却しながら、CH2Cl2(濃度1% w/v)中の化合物35a-bの溶液に、TFA(6当量)を滴下し、溶液を室温にて1時間攪拌し、次いで、蒸発させた。残渣を新鮮なTFA(30当量)に溶解させ、得られる溶液を室温にて80 -120時間攪拌した。反応混合物を蒸発させ、残渣をiPr2O(80-100 mL)で処理して、白色固体物質を得、遠心分離し、iPr2O(2x30 mL)で洗浄した。粗化合物36aをアンバークロム(登録商標)CG161樹脂上のクロマトグラフィーによって精製して、リガンド36aを得、粗化合物36bを乾燥し、さらに精製することなく用いた。
【０１９６】
実施例7.3a：10-[(1S)-1-カルボキシ-4-オキソ-4-(ジデシルアミノ)ブト-1-イル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-三酢酸(36a)の製造
試薬：化合物35a(1.87 g、1.91 mmol)
化合物36a(688 mg、0.91 mmol)。収率48%。
分析データ
HPLC-ELSD：99.8 %(領域%)
Mr：756.03(C39H73N5O9)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１９７】
実施例7.3b：10-[(1S)(12R)-1-カルボキシ-9-ヒドロキシ-9-オキシド-4,15-ジオキソ-12-(1-オキソドデシル)オキシ]-8,10,14-トリオキサ-5-アザ-9-ホスファテトラコス-1-イル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-三酢酸(36b)の製造
試薬：化合物35b(665 mg、0.55 mmol)
化合物36a(540 mg、0.55 mmol)。定量的収率
分析データ
HPLC-ELSD：99.8 %(領域%)
Mr：981.10(C44H79N5O17P)
1H-および13C-NMRおよびMSは、構造に対応した。
【０１９８】
実施例7.4：錯体37a-bの製造：一般手順
リガンド36a-bをH2Oに懸濁させ、2M NaOH(36a)または5% 水性NaHCO3(36b)の添加によってpH6-7にて溶解させ、次いで、0.1M NaOH(36a)または5% 水性NaHCO3(36b)の添加によってpH7に維持しながら、0.1 M(1当量) GdCl3の溶液を少しずつ加えた。凍結乾燥によって粗錯体を得、セファデックス(登録商標)G10樹脂上のサイズ排除クロマトグラフィーによって塩から精製して、錯体37a-bを得た。
【０１９９】
実施例7.4a：[[10-[(1S)-1-カルボキシ-4-オキソ-4-(ジデシルアミノ)ブト-1-イル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-三酢酸(4-)]ガドリネート(1-)]ナトリウム(37a)の製造
試薬：化合物36a(400 mg、0.529 mmol)
化合物37a(326 mg、035 mmol)。収率66%。
分析データ
HPLC-ELSD：98.6 %(領域%)
Mr：932.24(C39H69GdN5NaO9)
MSは、構造に対応した。
【０２００】
実施例7.4b：[[10-[(1S)(12R)-1- カルボキシ -9-ヒドロキシ-9-オキシド-4,15-ジオキソ-12-(1-オキソドデシル)オキシ]-8,10,14-トリオキサ-5-アザ-9-ホスファテトラコス-1-イル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-三酢酸(4-)]ガドリネート(1-)]ナトリウム 37bの製造
試薬：化合物36b(500 mg、0.510 mmol)
化合物37a(150 mg、0.130 mmol)。収率25%
分析データ
HPLC-ELSD：61.1%(領域%)
Mr：1158.32(C44H76GdN5NaO17P)
MSは、構造に対応した。
【実施例８】
【０２０１】
実施例8.1：式Iで示される化合物(9b)およびDSPE-PEG-2000を用いるpSLNの製造
CH2Cl2に200 mgのエピクロン200(登録商標)(Cargill Deutschland GmbH、クレーフェルト、ドイツ)、50 mgの[1,2-ジステロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)アンモニウム塩 DSPE-PEG-2000、65 mgの錯体9b(滴定濃度88%)、225 mgのトリパルミチン、25 mgのステアリン酸を溶解させることによって、有機相(O)を製造した。有機相を36℃に加熱し、様々な成分の溶解が完了するまで攪拌した。175 mgのタウロコール酸ナトリウム、0.2 mLの1-ブタノールおよび0.250 mLの水を含む水性相(W)を有機相に加えた。安定で透明なマイクロエマルション(W/O)が得られるまで、溶液を36℃にて30分間攪拌した(製造方法のステップc)。同時に、0.24%(重量/体積)Tween 80(登録商標)(Serva、ハイデルベルク、ドイツ)を含む水溶液W1を製造し、30℃に加熱した。30℃に維持しながら、水性相W1にマイクロエマルションW/Oを滴下して、多重エマルションW/O/W1を得た(製造方法のステップd)。次いで、45分間の攪拌下にて多重エマルションを維持しながら、大気圧にて有機溶媒を蒸発させた(ステップe)。次いで、分散液の温度を10℃まで下げ、pSLNの脂質コアを結晶化させる(ステップf)。次いで、そのようにして得られた分散液を、再生セルロース膜(Pellicon XL 30kDa)およびグルコース5.5% w/vの溶液を用いることによる限外ろ過プロセスによって、過剰の乳化剤成分から精製した。最後に、分散液を濃縮して、約8 mLにし、ろ過した(0.22 μmフィルター)。最終製剤中に存在する金属およびリンの量を、ICP-MS(ELAN 6100 パーキンエルマー)によって測定した。SLNにおけるGd(III)錯体の取り込み効率を、理論量と比較しての最終分散液中のGd(III)重量%として計算した。平均流体力学直径(z平均)および多分散指数(PdI)などの分散した粒子の特性は、DLS技術(Zetasizer Nano ZS、Malvern Instruments)によって、P=2mMの濃度にてPBS中で測定された。表面電荷・電位(ζ電位)は、ELS(ゼータサイザーナノZS、Malvern Instruments)によって、5.5%グルコース溶液中、P=2 mMの濃度で常に測定された。
【０２０２】
さらに、実施例8.3に記載の手順にしたがって、緩和時間測定法的特性について、製剤を特性決定した。アルブミンの存在下での緩和能データを表3に示す。
【０２０３】
表1：錯体9bを含むpSLNの特性決定
2015535811.tif 000056
P/Gd(III)比は、6.22であると計算された。
【０２０４】
実施例8.2：式(II)で示される化合物(B22286)、DSPE-PEG-2000およびリガンド1,2-ジステアリル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[葉酸(ポリエチレングリコール)-2000]アンモニウム塩(DSPE-PEG-2000-葉酸)を用いるpSLNの製造
化合物B22286の合成は、MAGMA 2001.12(2-3)、114-120)に記載された。その式は、以下のとおりである。
2015535811.tif 000057
錯体9bを等価モル数のB22286と置き換え、実施例8.1に記載の手順と同様にして、SLNに錯体を配合した。分散液の化学物理的特性決定を、先の実施例に記載のように行い、データを表2に記載する。
【０２０５】
表2：B22286、DSPE-PEG2000およびDSPE-PEG2000-葉酸を含む製剤の特性決定
2015535811.tif 000058
式(II)の誘導体(B22286)、DSPE-PEG-2000で製造されたpSLNにおけるGd(III)のロードは、約12000分子単位のGd 錯体/粒子であった。この値は、タービスキャン・ラブ・エキスパート(Turbiscan Lab Expert)装置を用いて、粒子によって占有された体積分率(Φ%)を測定することによって得られた。
【０２０６】
完全球体の体積に対する各粒子の体積を概算することによって、粒子の平均直径(50 nm)から単一粒子の体積(Vp)を計算した。次いで、cm3当りのnp粒子の数を、関係：np＝Vtot/Vp(ここで、Vtotは、1つの製剤cm3においてナノ粒子によって占有された総体積である)から算出したが、 pSLN/cm3の数は約1014/cm3であると推定される
【０２０７】
モル濃度からGd(III)錯体の分子の数を算出することによって、各個々の粒子に取り込まれた分子の数が、約12000分子単位(ペイロード)であることを推定することができた。
P/Gd(III) は、5.13であると計算された。
【０２０８】
実施例8.3：緩和能の測定
Minispec装置 mq20(Bruker Biospin、ドイツ)を用いて、緩和能測定を行なった。以下の式：
Ri1obs＝1/Ti,J1obs＝ri,j1p [Gd3+] + 1/Tj1
[式中、Ri1obsは、SLNに製剤された造影剤について観察された緩和時間であり、T1obsは、縦緩和時間である；ここで、指数iおよびjはそれぞれ、取り込まれた造影媒体および媒体に関連する]
を用いたT1の測定からSLNに組み込まれた各錯体のr1p値を決定した。詳しくは、緩和能測定は、20 MHzおよび25℃(pH7.4)にて、アルブミン(NaCl 0.9%中HSA4%)またはヒト血漿(HP)の存在下で行なわれている。
【０２０９】
表3：SLNに取り込まれた式(I)のGd(III)の両親媒性錯体の緩和能値r1p(mM-1s-1)
2015535811.tif 000059
表4：SLNに取り込まれた式(II)のGd(III)の両親媒性錯体の緩和能値r1p(mM-1s-1)
2015535811.tif 000060
【０２１０】
実施例8.4：式(I)の錯体および式(II)の錯体を含むpSLN製剤の物理化学的特性
表3および4は、実施例8.1および8.2に記載したように製造された製剤の物理化学的特性の例を示す。SLNにおけるの取り込みの効率は、理論的量と比較した、最終分散液中の重量%として計算された。平均流体力学直径(z平均)および多分散指数(PdI)などの分散した粒子の特性は、DLS技術(Zetasizer Nano ZS、Malvern Instruments)によって、P=2mMの濃度にてPBS中で測定された。表面電荷・電位(ζ電位)は、ELS(ゼータサイザーナノZS、Malvern Instruments)によって、5.5%グルコース溶液中、P=2 mMの濃度で常に測定された。
【０２１１】
表5：式(I)のGd(III)の両親媒性錯体誘導体を取り込んでいるpSLNの、取り込み効率および粒子分布の動的光散乱(DLS)特性決定
2015535811.tif 000061
【０２１２】
表6：式(I)のGd(III)の両親媒性錯体誘導体を取り込んでいるpSLNの、取り込み効率および粒子分布のDLS特性決定
2015535811.tif 000062
【０２１３】
実施例8.5：化合物9ｂを取り込んでいるpSLNの熱量測定値
DSC 25装置(Mettler Toledo)を用いて熱量測定研究を行った。一例として報告する実験において、錯体9bを含むpSLNの分散液30 mgを正確に秤量して、アルミニウムのるつぼに入れ、次いで、密閉した。5℃/分の走査速度で25℃から85℃にサンプルを加熱し、次いで、1℃/分の速度で25℃まで冷却した。対照として、水を入れたるつぼを用いて測定を行なった。製剤の製造後(4℃にて保管)2ヶ月間同じ実験を行い、結晶コアの多形において有意な変化は観察されなかった。
【実施例９】
【０２１４】
pSLNを用いるMR画像化
Balb/Cマウスの脇腹に移植された腫瘍モデルであるヒト卵巣がん(IGROV-1)を用いて、インビボ研究を行った。 7テスラMRIトモグラフ(Bruker Biospin、Germany)で画像を得た。
【０２１５】
図４は、50 μmol(Gd)/kgの用量にて、比較のために用いた錯体B22286で製造されたpSLN製剤の静脈内投与によって得られた結果を示す。投与後30分までに検出された腫瘍組織におけるpSLNの蓄積に留意することができる。
【実施例１０】
【０２１６】
B22286をロードしたSLN、B22286をロードしたリポソームおよびプロハンス(登録商標)のインビトロU937取り込み
Terrenoら(ChemistryおよびBiodiversity、vol. 5、2008：1901-1912)に記載の手順にしたがい、薄層堆積/押し出し技術を用いて、B22286を含むリポソームを製造した。リポソーム製剤は、以下の組成を有する：B22286(15 mol%)、POPC(59 mol%)、コレステロール(23 mol%)およびDSPE-Peg2000(3 mol%)。
【０２１７】
5%ウシ胎仔血清、2mMのグルタミン、100 IU/mLのペニシリンおよび100 マイクログラム/mLのストレプトマイシンを補足したRPMI-1640培地10 mLを入れた直径10 cmのペトリ皿にヒト白血病性単球リンパ腫細胞株(U937)を播種した(約2x106/皿)。マクロファージへの分化は、TPA(20 ng/mL)の添加後48時間のインキュベーションによって誘発される。さらなる使用の前に、5 mLのPBSで細胞を洗浄し、5%ウシ胎仔血清、2mMのグルタミン、100 IU/mLのペニシリンおよび100 マイクログラム/mLのストレプトマイシンを補足した3 mLの新鮮なRPMI-1640培地を供給する。
【０２１８】
本発明の記載のように製造されたpSLN(実施例8.1)およびリポソームを、0.15 mMのGd(III)濃度で6時間インキュベートした。1 mMのプロハンス(登録商標)を用いて同じ実験を行った。各実験において、培地を除去し、PBSで細胞を洗浄した。PC 120 Minispec装置(Bruker Biospin、Germany)での25℃、20 MHz(0.47 T)における溶液のプロトン緩和率(R1obs)の測定によるGd(III)量の決定ために、超音波処理によって細胞を溶解し、120℃にて一夜37%HCl中で石灰化した。ブラッドフォード法によって、細胞溶解液から、各サンプルのタンパク質濃度も決定した。
【０２１９】
この単球-マクロファージ細胞株によるpSLNの取り込みが、リポソームと比較して低いことが観察された結果を図３に示す。
【実施例１１】
【０２２０】
pSLNに取り込まれた式(I)および(II)の常磁性錯体の生体内分布研究
pSLNに取り込まれた式(I)および(II)の常磁性錯体のインビボ生体内分布を健康なC57BL/6マウスにおいて研究した。50 μmol(Gd)/kgの用量で、ｎ匹の動物にpSLNを投与した(ここで、nは、各研究について表7-8-9-10に定義される)。投与後の異なる時点で動物を犠牲にした(表7-8-9-10を参照)。犠牲にした後、血液に対して約1：100(v/v)の比率でナトリウムヘパリン(Clexane(登録商標) 4000 IU/0.4 mL)の溶液を含むチューブに血液を保管した。潅流後、肝臓、脾臓および右腎臓を切除し、マイクロ波石灰化(MDS-2000 CEM Corporation)を用いて硝酸(65% w/v)で石灰化した。次いで、ICP-OES(OPTIMA 2100 DV パーキンエルマー)によって、Gd(III)含量を測定し、下記のとおり計算されたID%として研究において報告した：
臓器中のID%＝(臓器におけるGdマイクログラム／投与された用量のGdμg)x100
血液中のID%＝[(Gdマイクログラム/血液mL)ｘ(動物の重量ｘ72)／Gd μgで投与された用量)ｘ100],
ここで、72は、マウスの血液体積(mL/kg)に対応する。
【０２２１】
実施例8.1の記載のように製造したpSLNを、サンプリング時間およびサンプル数も示す表7の実験スキームに記載した用量で投与した。
【０２２２】
表7：実験スキーム
2015535811.tif 000063
【０２２３】
50 μmol/kgの式(I)および式(II)のGd(III)錯体の投与後1分、6時間および10日における生体内分布の研究を、先の実施例の記載のように製造した様々な錯体について繰り返した。投与後の時点1'(または投与直後)、6 時間、10(または7)日後において異なる錯体で製造されたpSLNについて得られた生体内分布の値を下記表8-10に記録する。
【０２２４】
表8：式(I)および(II)の両親媒性錯体を含むpSLNの投与(1')後の生体内分布
2015535811.tif 000064
NQ(定量不可能)＜0.006%、ND(検出不可能)＜0.002%
【０２２５】
表9：式(I)および(II)の両親媒性錯体を含むpSLNの投与の6時間後における生体内分布
2015535811.tif 000065
NQ(定量不可能)＜0.006%、ND(検出不可能)＜0.002%
【０２２６】
表10：式(I)および(II)の両親媒性錯体を含む製剤の投与の10日後における生体内分布
2015535811.tif 000066
NQ(定量不可能)＜0.006%、ND(検出不可能)＜0.002%
【０２２７】
得られた結果、特に、10日の時点での結果は、肝臓および脾臓におけるナノ粒子およびガドリニウムの蓄積が、程度は可変であるが、両親媒性錯体の鎖長および性質に応じて様々であることを示す。
【０２２８】
特に、本発明で用いる錯体の例示的実施態様にすぎないが、好ましい錯体について、対応するpSLN製剤の肝臓における蓄積は、常に、肝細胞からのクリアランスの遅さゆえに高い肝臓蓄積をもつ両親媒性錯体のモデルとして用いられるGd錯体であるB22286のpSLNよりも低かった。対照的に、脾臓における食細胞の取り込みは、アップロードされたガドリニウム錯体の化学構造によって、ほんのわずかに修飾されうるナノ粒子の表面特性によって調節されるプロセスであるので、脾臓に蓄積したGd(III)イオンの量は、pSLNにアップロードされたガドリニウム錯体構造に関して変化しない。
【図１】
2015535811.tif 000092
【図２】
2015535811.tif 000093
【図３】
2015535811.tif 000094
【図４】
2015535811.tif 000095
【図５Ａ】
2015535811.tif 000096
【図５Ｂ】
2015535811.tif 000097
【国際調査報告】
2015535811.tif 000098
2015535811.tif 000099
2015535811.tif 000100
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