(57)【要約】  本発明は、患者における形質細胞関連疾患の特性決定をするための方法であって、（ｉ）患者から少なくとも１つのサンプルを提供し；（ｉｉ）サンプルにおいて、２又はそれ以上の（ａ）κ：λ遊離軽鎖（ＦＬＣ）比；（ｂ）重鎖クラスと結合するκ軽鎖：同じクラスの重鎖と結合するλ軽鎖の比（ＨＬＣκ：ＨＬＣλ比）；（ｃ）サンプル中のＦＬＣの総量、及び（ｄ）重鎖クラスと結合するκ軽鎖＋同じクラスの重鎖と結合するλ軽鎖の総量（総ＨＬＣ）；を決定し；（ｉｉｉ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び／若しくは（ｄ）からの各比又は量を規定値と比較し、そして各比又は量にスコアを割り当て、そして（ｉｖ）形質細胞関連疾患を特性決定するためにスコアを用いることを含む、方法を提供する。本発明の方法を実施するために構成された装置もまた、提供する。本発明はまた、任意で混合される、（ｉ）抗κＦＬＣ特異的及び抗λＦＬＣ特異的抗体、並びに（ｉｉ）抗κ重鎖クラス特異的及び抗λ重鎖クラス特異的抗体又はこれらの断片の組み合わせを含む、キットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における形質細胞関連疾患の特性決定をするための方法であって、
（ｉ）患者から少なくとも１つのサンプルを提供し；
（ｉｉ）サンプルにおいて、２又はそれ以上の
（ａ）κ：λ遊離軽鎖（ＦＬＣ）比；
（ｂ）重鎖クラスと結合するκ軽鎖：同じクラスの重鎖と結合するλ軽鎖の比（ＨＬＣκ：ＨＬＣλ比）；
（ｃ）サンプル中のＦＬＣの総量、及び
（ｄ）重鎖クラスと結合するκ軽鎖＋同じクラスの重鎖と結合するλ軽鎖の総量（総ＨＬＣ）；
を決定し；
（ｉｉｉ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び／又は（ｄ）からの各比又は量を規定値と比較し、そして各比又は量にスコアを割り当て；そして
（ｉｖ）形質細胞関連疾患を特性決定するためにスコアを用いること
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＦＬＣκ：λ比及びＨＬＣκ：λ比が、決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法を含む、コンピュータに実施される、方法。
【請求項４】
工程（ｉｉｉ）が、コンピュータにより実施される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記スコアが、形質細胞疾患の種類を示す、及び／又は形質細胞疾患の特性決定のための信頼水準を示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記κ：λ遊離軽鎖比が決定され、そしてＦＬＣκ：λについての正常範囲と比較される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＦＬＣκ：λ比が正常範囲を上回る、あるいは下回る場合、前記ＦＬＣκ：λにスコアが与えられる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＦＬＣκ：λ比が正常範囲内である場合、サンプル中のＦＬＣの総量が決定され、そして量についてスコアが与えられる、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＦＬＣκ：λ比が正常範囲内である場合、正常範囲を上回るＦＬＣκ又はＦＬＣλレベルが、更なる調査を要求することを示唆する、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＬＣκ：ＨＬＣλ比が決定され、そしてその重鎖クラスについてのＨＬＣκ：ＨＬＣλの正常範囲と比較される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＬＣκ：ＨＬＣλ比が正常範囲を上回る、あるいは下回る場合、前記ＨＬＣκ：ＨＬＣλにスコアが与えられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＬＣκ：ＨＬＣλ比が正常範囲内である場合、総ＨＬＣκ＋ＨＬＣλ量が決定され、そしてスコアが与えられる、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＬＣκ：ＨＬＣλ比が正常範囲内である場合、正常範囲を上回るＨＬＣκ又はＨＬＣλレベルが、更なる調査を要求することを示唆する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＨＬＣκ：ＨＬＣλ比及び／又は総ＨＬＣが、サブクラス特異的である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
サンプル中のλＦＬＣの量が、クローン性スコア又はＦＬＣの産生若しくは抑制の指標を産み出すために、κＦＬＣの量と比較される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
サンプル中のＨＬＣλの量が、クローン性スコア又はＦＬＣの産生若しくは抑制の指標を産み出すために、ＨＬＣκの量と比較される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
κ：λＦＬＣ比、ＨＬＣκ：ＨＬＣλ比、総ＦＬＣ及び／又は総ＨＬＣが、免疫吸着アッセイにより決定される、請求項１〜１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗κＦＬＣ特異的、抗λＦＬＣ特異的、抗κ重鎖クラス特異的、及び／若しくは抗λ重鎖クラス特異的抗体又はこれらの特異的な断片の使用を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アッセイが、サンドイッチアッセイ、例えばＥＬＩＳＡアッセイである、あるいは抗体とＦＬＣ又はＨＬＣとの結合が、比濁計、濁度計、フローサイトメーター及び／又はLuminex（商標）ビーズを用いて決定される、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９に記載の方法を実施するために構成された、コンピュータプロセッサ及びメモリを含む、装置
【請求項２１】
κ：λＦＬＣ比、ＨＬＣκ：ＨＬＣλ比及び任意で総ＦＬＣ及び／又は総ＨＬＣを測定するための検出器を含む、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
任意で混合される、（ｉ）抗κＦＬＣ特異的及び抗λＦＬＣ特異的抗体又はこれらの断片、並びに（ｉｉ）抗κ重鎖クラス特異的及び抗λ重鎖クラス特異的抗体又はこれらの断片の組み合わせを含む、キット。
【請求項２３】
サンプル中の総ＦＬＣを決定するための、更なる抗体又はこれの断片を追加で含む、請求項２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者において形質細胞疾患を特性決定するための方法、並びに前記方法を実施するための装置及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
出願人らは、患者におけるモノクローナル高ガンマグロブリン血症の広い範囲について評価する方法として、長年、遊離軽鎖を研究している。かかる遊離軽鎖の診断における使用は、著書「Serum FreeLight Chain Analysis, Sixth Edition (2008) A.R. Bradwell, ISBN 9780704427969」に詳細に記載される。患者におけるポリクローナル抗体の減少した又は増加した産生が存在するポリクローナル異常も知られている。
【０００３】
抗体は、重鎖及び軽鎖を含む。これらは、通常、二倍対称性（two-fold symmetry）を有し、２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖からなり、それぞれ可変領域ドメイン及び定常領域ドメインを含む。各軽鎖／重鎖対の可変ドメインは、結合して抗原結合部位を形成し、両者の鎖は抗体分子の抗原結合特異性に寄与する。軽鎖はκ及びλの二種類からなり、任意の所定の抗体分子は、いずれかの軽鎖を有し、両方を有さない。ヒトにおいて生産されるλ分子のおおよそ２倍のκ分子が存在するが、これはいくつかの哺乳動物において異なる。通常、軽鎖は、重鎖に結合する。しかしながら、いくつかの結合しない「遊離軽鎖」（ＦＬＣ）が個人の血清又は尿中において検出可能である。遊離軽鎖は、軽鎖の重鎖との結合により通常隠れている遊離軽鎖の表面に対する抗体の上昇により特異的に同定され得る。遊離軽鎖において、この表面は曝露され、これを免疫学的に検出することが可能である。κ又はλ遊離軽鎖の検出のための市販のキットとしては、例えば、The Binding Site Limited, Birmingham, United Kingdomにより製造される、「Freelite（商標）」が挙げられる。出願人らは、これまでに、遊離κ、遊離λの量、及び／又は遊離κ／遊離λ比の測定が、患者におけるモノクローナル高ガンマグロブリン血症の検出を可能にすることを明らかにしている。これは、例えば、無傷の免疫グロブリン多発性骨髄腫（ＭＭ）、軽鎖ＭＭ、非分泌性ＭＭ、ＡＬアミロイド症、軽鎖沈着症、くすぶり型（smouldering）ＭＭ、形質細胞腫及びＭＧＵＳ（意義不明のモノクローナル高ガンマグロブリン血症）の診断の助けとして用いられている。ＦＬＣの検出はまた、他のＢ細胞悪液質の診断、及び実際に代替として、一般的なモノクローナル高ガンマグロブリン血症の診断のための尿中のベンスジョーンズタンパク質分析を助けるために用いられている。
【０００４】
従来、λ又はκ軽鎖のうちの一方の増加は、探されている。例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）は、悪性形質細胞のモノクローナル増殖に起因し、単一種類の免疫グロブリンを産生する単一種類の細胞の増加をもたらす。これは、個人において観察される、λ又はκのいずれかの遊離軽鎖の量の増加をもたらす。この濃度の増加は、決定されてもよく、通常、遊離κ対遊離λの比は決定され、通常の範囲と比較される。これは、モノクローナル疾患の診断を助ける。さらに、遊離軽鎖アッセイはまた、患者の疾患の治療後のために用いられてもよい。例えば、ＡＬアミロイド症の治療後の患者の予後診断が行なわれてもよい。
【０００５】
Katzmann et al (Clin. Chem. (2002); 48(9): 1437-1944)は、モノクローナル高ガンマグロブリン血症の診断における、遊離κ及び遊離λ免疫グロブリンについての血清参照間隔及び診断範囲を議論する。２１〜９０歳の年齢の個人を免疫アッセイにより研究し、そして免疫固定により得られる結果と比較し、Ｂ細胞悪液質に罹患する個人におけるモノクローナル遊離軽鎖の検出のための免疫アッセイを最適化する。κ及びλＦＬＣの量及びκ／λ比は記録され、Ｂ細胞悪液質の検出のために決定される参照間隔を可能にする。
【０００６】
出願人らはまた、これまでに、個人が一見したところ健康な対象である場合でさえ、ＦＬＣについてのアッセイが個人の長期生存を予測するために用いることができることを明らかにした（国際公開第２０１１／０２１０４１号）。彼らは、総ＦＬＣ濃度が、統計学的に有意に、長期生存に関連していることを発見した。さらに、この関連は、存在する長期生存予後診断マーカー、例えばコレステロール、クレアチニン、システインＣ及びＣ反応性タンパク質についての関連と同様である、あるいはそれよりも優れているように見える。総ＦＬＣ測定のためのアッセイは、文献に開示される。総ＦＬＣを測定するアッセイは、商標「Combylite」の下で、The Binding Site, Birmingham, United Kingdomから入手することができる。
【０００７】
重鎖クラス−軽鎖タイプ結合特異的（HLC）免疫グロブリン、軽鎖クラス結合特異的（HLC）免疫グロブリン、例えばＩｇＡλ、ＩｇＡκ、ＩｇＧκ、ＩｇＧλ、ＩｇＭκ又はＩｇＭλの測定はまた、モノクローナル高ガンマグロブリン血症の特性決定に役立つことが発見されている。重鎖クラス−軽鎖タイプ特異的抗体及びこれの使用は、国際公開第２００６／０７９８１６号に開示されている。かかる抗体は、商標「Hevylite」の下で、The Binding Site, Birmingham, United Kingdomから入手することができる。
【０００８】
１超の特異的な抗体の産生が増加又は減少している、ポリクローナル異常に関連する疾患は、一般的に知られている。例えば、これは、抗体産生の一般的な増加、あるいは存在する２つの別々の腫瘍起源からの２又はそれ以上のモノクローナル抗体により特性決定され得る。慢性感染症、自己免疫疾患及び多くの腫瘍は、ポリクローナル免疫グロブリンの増加を引き起す。皮膚、肺、及び消化管疾患は、ＩｇＡ濃度の増加を引き起す傾向があるのに対し、全身感染症は、特にＩｇＧ以外の全ての免疫グロブリンを増加させる。
【０００９】
血清タンパク質電気泳動（ＳＰＥ）は、血清タンパク質が分離された後のアガロース電気泳動ゲルを走査すること（scanning）を含み、前記ゲルは、染色される。免疫固定電気泳動（ＩＦＥ）は、可視の沈殿バンドを生じさせるために、電気泳動用ゲル内のタンパク質と結合する抗体を用いて血清タンパク質の存在を検出する。係る方法に関連する多数の限定が存在する。２００１年から、血清ＦＬＣアッセイは、血清中の遊離λ又は遊離κ軽鎖（ＦＬＣ）を同定するために用いられている。ＦＬＣ、ＳＰＥ及び／又はＩＦＥアッセイの組み合わせた使用は、国際ガイドラインにおいて推奨されている。各試験の別々の結果は、別々に解釈され、一緒に組み合わされた結果は、互いにサポートしても、しなくてもよい（例えば、Dispenzieri A. et. al, Leukaemia 23-2 (2009), 215-24を参照のこと）。
【００１０】
最近になって、Hevylite（商標）抗体を用いたＨＬＣアッセイが、出願人により開発されている。かかるＨＬＣアッセイは、さもなければＳＰＥにより測定され得る腫瘍からの関連するモノクローナルタンパク質と、測定される反対の軽鎖に結合する同一の重鎖クラスの関連しないポリクローナルレベルとの比の定量を可能にする。この比は、血清中のモノクローナルタンパク質の種類及び濃度の決定のために、ＳＰＥ及びＩＦＥの代わりに用いることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
利用可能である様々なアッセイからの結果の解釈は、困難で有り、幾らかの技能及び専門知識を要求する。出願人らは、任意で、総ＦＬＣ及び／又は総ＨＬＣとともに、ＦＬＣ及びＨＬＣの結果は重み付けられ、モノクローナル高ガンマグロブリン血症の同定のためのスコアを生み出すことができることを明らかにしている。これは、異常の指標を示すためのみならず、指標の信頼度を示すために用いることができる。１又は複数の結果における分析エラーは、より容易に同定することができる。これは、モノクローナル高ガンマグロブリン血症における識別及び信頼度を可能にすることが予測され、そして前記識別は、
ａ）モノクローナルタンパク質産生（この無傷の免疫グロブリン、遊離軽鎖又は両者の実際の産生である）。非関連免疫グロブリンの関連するポリクローナル抑制を含む、又は含まない。
ｂ）非モノクローナル産生を含むポリクローナル産生の上昇−高ガンマグロブリン血症
ｃ）非モノクローナル産生を含むポリクローナル産生の抑制−低ガンマグロブリン血症
ｄ）非モノクローナル産生を含む正常のポリクローナル産生
ｅ）重鎖のクラスに結合するカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖の産生、及び／又はモノクローナルタンパク質産生を含まない軽鎖又はラムダ軽鎖の産生
である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、患者における形質細胞関連疾患の特性決定をするための方法であって、
（ｉ）患者から少なくとも１つのサンプルを提供し；
（ｉｉ）サンプルにおいて、２又はそれ以上の
（ａ）κ：λ遊離軽鎖（ＦＬＣ）比；
（ｂ）重鎖クラスと結合するκ軽鎖：同じクラスの重鎖と結合するλ軽鎖の比（ＨＬＣκ：ＨＬＣλ比）；
（ｃ）サンプル中のＦＬＣの総量、及び
（ｄ）重鎖クラスと結合するκ軽鎖＋同じクラスの重鎖と結合するλ軽鎖の総量（総ＨＬＣ）；
を決定し；
（ｉｉｉ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び／若しくは（ｄ）からの各比又は量を規定値と比較し、そして各比又は量にスコアを割り当て、そして
（ｉｖ）形質細胞関連疾患を特性決定するためのスコアを用いること
を含む、方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
異常なＦＬＣκ：λ比又はＨＬＣκ：ＨＬＣλ比、上昇したクローナル濃度、及び非関連の免疫グロブリンの抑制の指標は、例えば、モノクローナル形質細胞関連疾患の存在の確実性の高いレベルを与える。
【００１４】
典型的に、κ：λＦＬＣ比及びＨＬＣκ：ＨＬＣλ比が、決定される。
【００１５】
サンプル中の総ＦＬＣ及び総ＨＬＣの決定は、スコアを提供するために用いられてもよい。
【００１６】
正常範囲内のＦＬＣκ：λ比を有するカッパＦＬＣ又はラムダＦＬＣの上昇したレベルは、潜在的な異常性を強調し、更なる調査を必要とする。同様に、正常範囲内のＨＬＣκ：ＨＬＣλ比を有する上昇したＨＬＣκ又はＨＬＣλはまた、潜在的な異常性を強調し、更なる調査を必要とする。
【００１７】
前記サンプルは、尿サンプルでもよいが、血清、血液又は血漿が好ましい。
【００１８】
スコア付けシステムは、形質細胞関連疾患の特性決定を可能にし、特性決定の簡便化を助け、熟練していない従事者により実行されるアッセイを可能にし、そして決定される結果における信頼度を可能にする。
【００１９】
前記形質細胞関連疾患は、モノクローナル免疫グロブリン異常症でもよい。これは、Ｂ細胞関連疾患、例えば骨髄腫（例えば無傷の免疫グロブリン骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌性骨髄腫）、ＭＧＵＳ、ＡＬアミロイド症、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ホジキンリンパ腫、濾胞中心細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、プレＢ細胞性白血病、又は急性リンパ芽球性白血病でもよい。
【００２０】
前記形質細胞関連疾患は、ポリクローナル関連疾患、例えば高ガンマグロブリン血症又は低ガンマグロブリン血症でもよい。
【００２１】
前記方法は、コンピュータにより実施されてもよく、例えば工程（ｉｉｉ）は、実施されてもよい。前記スコアは、アウトプット、例えばコンピュータディスプレイ上に表示されてもよい。あるいは、前記スコアは、疾患の種類の適当な診断のアウトプットを生ずるために用いられてもよい。
【００２２】
１又はそれ以上のサンプルは、実質的に同時に患者から採取されてもよい。前記量は、単一のサンプル又は別々のサンプルに関して評価されてもよい。
【００２３】
前記スコアは、形質細胞疾患の種類を示すのに用いられてもよく、そして／あるいは形質細胞疾患の特性決定のための信頼水準を含んでもよい。
【００２４】
例えば、高い又は中程度のＦＬＣκ：λ比は、カッパモノクローナル免疫グロブリン異常症を示す。しかしながら、モノクローナル産生の低い信頼性は、低い異常なκ：λＦＬＣ比がそれ自身に関して同定されることを指し示す。重鎖クラスの１つ（例えば、ＩｇＡκ：ＩｇＡλ）についてのＨＬＣ比が異常な比を示す場合、前記比及び軽鎖タイプについて、これはモノクローナル産生の発見を裏付ける。
【００２５】
特定のクラスについての総ＦＬＣ及び／又は総ＨＬＣの合計は、免疫グロブリン産生の異常なレベル、又は、例えば、１又はそれ以上の免疫グロブリンのクラス、例えばＩｇＭ又はＩｇＡの抑制を示すために用いることができる。
【００２６】
典型的には、ＦＬＣκ：λ比は決定され、ＦＬＣκ：λ比についての正常範囲と比較される。正常範囲は、評価される集団に応じて、典型的に０．２６〜１．６５である、一見して健康な個人についてのκ：λの典型的な範囲でもよい。
【００２７】
ＦＬＣκ：λ比が、その正常範囲を上回る又は下回る場合、スコアが与えられてもよい。スコアは、クローン性の同定について、例えば、高い、中程度、若しくは低い；１、２、３若しくは４；又は＋、＋＋、＋＋＋若しくは＋＋＋＋でもよい。「正常な比」はまた、例えばゼロとしてスコア付けされてもよい。規定範囲を上回る比、例えば１．６５超は、カッパモノクローン性を示し、カッパ値は、例えば、高い、中程度、若しくは低い；又は大変高いについて４、やや高いについて３、低いについて２、正常範囲を単に上回るに１のスコアが与えられる。前記比が正常範囲（例えば０．２６未満）は、λモノクローン性を示し、同様の方法において再びスコア付けがされ得る。
【００２８】
例えば、以下の比は、結果をスコア付けするために用いられてもよい。
【００２９】
【表１】
2015511008.tif 000002
【００３０】
あるいは、スコア付けシステム、例えば１〜４又は＋〜＋＋＋＋が用いられてもよい。
【００３１】
ＦＬＣκ：λ比が正常である場合、その後、ＦＬＣ（κ＋λ）の総量が決定され、そして増加した又は減少したポリクローナルＦＬＣ産生を示すためにスコア付けされる。正常な総ＦＬＣは、典型的に血清中において２７ｍｇ／ｍｌである。再び、高い、中程度、低い；−４〜＋４（＋４が非常に高い総ＦＬＣを示し、−４が非常に低い産生を示す）、又は−−−−、−−−、−−、−、０（正常）、＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋のスコアが、用いられてもよい。例えば：
【００３２】
ＦＬＣ若しくはＨＬＣの産生若しくは抑制のクローン性スコア又は指標を生み出すために、サンプル中のλＦＬＣの量は、サンプル中のκＦＬＣの量と比較されてもよい（あるいはＨＬＣκの量がＨＬＣλの量と比較される）。典型的に、産生又は抑制レベルは、正常なＦＬＣ又はＨＬＣ比について示される。
【００３３】
【表２】
2015511008.tif 000003
【００３４】
正常な比（例えば、０．２６〜１．６５）を、分解することができる。
【００３５】
例えばＦＬＣκ＋ＦＬＣλ＞４５．７ｍｇ／Ｌ  −  ＦＬＣ産生
ＦＬＣκ＋ＦＬＣλ＜９．０１ｍｇ／Ｌ  −  ＦＬＣ抑制
【００３６】
【表３】
2015511008.tif 000004
【００３７】
あるいは、総ＦＬＣ産生は、３つのバンド、高い産生、正常、又は抑制産生に分けることができる。
【００３８】
特定の重鎖クラスに結合するκ軽鎖タイプ：同一の重鎖クラスに結合するλ軽鎖の比、（ＨＬＣκ：λ）比は、その重鎖クラスについて正常範囲と比較されてもよい。重鎖クラスは、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ又はＩｇＥでもよい。より典型的には、これらとしてＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭは、かかる疾患に関連している可能性がある。１又はそれ以上の前記クラスを、評価してもよい。したがって、前記比は、ＩｇＡ：ＩｇＡλ、ＩｇＧκ：ＩｇＧλ、ＩｇＭκ：ＩｇＭλ、ＩｇＤκ：ＩｇＤλ及び／又はＩｇＥκ：ＩｇＥλでもよい。
【００３９】
典型的な正常な比は、
ＩｇＧκ：ＩｇＧλ  ０．９８〜２．７５
ＩｇＡκ：ＩｇＡλ  ０．８０〜２．０４
ＩｇＭκ：ＩｇΜλ  ０．９６〜２．３０
である。
【００４０】
これらのＨＬＣ比は、ＦＬＣと同様の方法においてスコア付されてもよい。
【００４１】
ＨＬＣκ：ＨＬＣλ比が正常範囲内である場合、そのクラス（ＨＬＣκ＋ＨＬＣλ）についての総ＨＬＣが決定及びスコア付けされ、そして重鎖クラス産生の上昇又は抑制の指標を与える。即ち、例えばＩｇＧκ：ＩｇＧλ（同一のクラス）がその後決定される。
【００４２】
ＦＬＣκ：ＦＬＣλ及びＨＬＣκ：ＨＬＣλが正常範囲内である場合、ＦＬＣκ若しくはＦＬＣλ及び／又はＨＬＣκ若しくはＨＬＣλの上昇したレベルは、疾患を指し示し、そして更なる検査を要求することを強調する。上昇は、正常範囲を上回るレベルにより定義されてもよい。典型的な正常範囲は、
ＦＬＣκ  ３．３  〜１９．４
ＦＬＣλ  ５．７１〜２６．３
ＩｇＧκ  ４．０３〜９．７８
ｌｇＧλ  １．９７〜５．７１
ＩｇＡκ  ０．４８〜２．８２
ＩｇΑλ  ０．３６〜１．９８
ＩｇＭκ  ０．２９〜１．８２
ＩｇΜλ  ０．１７〜０．９４
である。
【００４３】
代わりに、あるいは加えて、ＨＬＣκ：ＨＬＣλ比は、サブクラス特異的でもよい。これは、より特異的なデータを与える。ＩｇＧは、例えば４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）を有する。ＩｇＡは、２つのサブクラス（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を有する。したがって、ＨＬＣ比は、例えばＩｇＧ２κ：ＩｇＧ２λ比でもよい。
【００４４】
典型的なスコア付けシステムの例は以下である。
【００４５】
【表４】
2015511008.tif 000005
【００４６】
ポリクローン性は、同様にスコア付されてもよい。
【００４７】
【表５】
2015511008.tif 000006
【００４８】
再び、「ゼロ」のスコアは、正常な比について与えられてもよい。抑制及び産生は、３つのバンド、高い産生、正常、及び抑制として表示されてもよい。
【００４９】
クローン性は、ＩｇＧについてＦＬＣ比と同様の方法においてスコア付けされてもよく、実際、他の重鎖について同様である。
【００５０】
【表６】
2015511008.tif 000007
【００５１】
例えば、いくつかのポリクローナルＭ抑制を有する中程度のＩｇΑλ、及びＩｇＧκに関する分析的エラー（低い重み付け及び不一致）は、
ＩｇＧκ低い、ＩｇΑλ中程度、ＩｇＭ合計として中程度の抑制
として表され得る。
【００５２】
ＦＬＣの結果（κ：λＦＬＣ及び／又は総ＦＬＣ）は、エラー又は一致の面積を同定するために、ＨＬＣの結果（ＨＬＣκ：ＨＬＣλ及び／又は総ＨＬＣ）と比較され得る。
【００５３】
高いλＦＬＣを有するＩｇＡラムダ、ポリクローナル的に抑制されたＩｇＭ、及びＩｇＧに関する分析エラーは、
κ：λＦＬＣλ高い、ＩｇＡλ高い、ＩｇＧλ低い、ＩｇＭ合計として低い抑制
として表され得る。
【００５４】
上述のスコア付の代替の方法は、以下のように用いることができる。
【００５５】
例えば、ＦＬＣ（β）結果の実行は、クローン性カッパ［Ａ］又はラムダ［Ｂ］又はポリクローナル異常［Ｃ］を示す。［Ａ］又は［Ｂ］は、１〜４（＋、＋＋、＋＋＋又は＋＋＋＋）のレベルに関してスコア付され得る。［Ｃ］は、抑制又は上昇であり得、−４〜＋４（−−−、−−、−、０、＋、＋＋、＋＋＋、又は＋＋＋＋）の測定に関してスコア付され得る。これは、ＦＬＣ結果が以下の１つであることを意味する。
【００５６】
【数１】
2015511008.tif 000008
【００５７】
例えば強力なＦＬＣラムダ結果、ＦＬＣ測定（β）は、
【００５８】
【数２】
2015511008.tif 000009
である。
【００５９】
Ｇ（γ）、Ａ（α）又はＭ（μ）についてのＨＬＣ結果は、同様の方法において表され得、これらは、クローン性（カッパ［Ａ］又はラムダ［Ｂ］又はポリクローナル異常［Ｃ］）を示す。再び、クローン性［Ａ］又は［Ｂ］は、１〜４（＋、＋＋、＋＋＋又は＋＋＋＋）のレベルに関してスコア付され得、そして［Ｃ］についての抑制又は上昇が生じ得、そして−４〜＋４（−−−−、−−−、−−、−、０、＋、＋＋、＋＋＋、又は＋＋＋＋）の測定に関してスコア付され得る。
【００６０】
【数３】
2015511008.tif 000010
【００６１】
例えば、いくつかのポリクローナルＭ抑制を有する中程度のＩｇΑラムダ、及びＩｇＧカッパに関する分析的エラー（低い重み付け及び不一致）は、下記のように表され得る。
【００６２】
【数４】
2015511008.tif 000011
【００６３】
ＦＬＣ結果（β）は、ＨＬＣ  Ｇ（γ）、Ａ（α）及びＭ（μ）結果と組み合わされ得る。高いラムダＦＬＣレベルを有するＩｇＡラムダ、ポリクローナル的に抑制されたＩｇＭ結果、及びＩｇＧに関する分析エラーの例は、下記のように表され得る。
【００６４】
【数５】
2015511008.tif 000012
【００６５】
クローン同一性は、ＦＬＣ（β）結果とＨＬＣ（γ、α又はμ）結果との一致により示され、この場合、β及びαである。β及びαは、これがラムダサンプルであることを示し、γの不一致は、γ結果がエラーであることを示し、そして前記μ結果は、ポリクローナル抑制が存在するというさらなる情報を提供する。
【００６６】
アルゴリズムからの第二の結果は、結果における信頼度であり、これは、一致の項目から計算することができる。
【００６７】
【数６】
2015511008.tif 000013
【００６８】
サンプル中のＦＬＣ及びＨＬＣの測定は、当該技術分野において一般的に知られている方法を用いて決定されてもよい。
【００６９】
κ又はλＦＬＣに特異的な抗体、又は抗体の断片は、一般的に知られており、商標名Freelite（商標）の下で市販されている。
【００７０】
重鎖クラス−軽鎖タイプ特異的抗体（例えば抗ＩｇＡκ抗体）はまた、一般的に、当該技術分野において知られており（ＷＯ２００６／０７９８１６を参照のこと）、The Binding Site, Birmingham, UKから商標名Hevylite（商標）の下で市販されている。あるいは、重鎖と結合する軽鎖は、例えば、ＷＯ２００６／０７９８１６に記載されるような、抗軽鎖タイプ抗体及び抗重鎖クラス抗体を用いたサンドイッチアッセイにより決定され得る。
【００７１】
典型的に、ＦＬＣ又はＨＬＣ、例えばκ：λＦＬＣ比、総ＦＬＣ、ＨＬＣκ：ＨＬＣλ及び／又は総ＨＬＣは、免疫アッセイ、例えばＥＬＩＳＡアッセイにより、あるいは蛍光標識されたビーズ、例えばLuminix（商標）ビーズを用いることにより決定される。
【００７２】
ＥＬＩＳＡは、例えば、特定の抗原を検出するために抗体を用いる。アッセイに用いられる１又はそれ以上の抗体は、基質を検出可能な検出物に変換することが可能な酵素により標識されてもよい。かかる酵素としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及び当該技術分野で知られている他の酵素が挙げられる。あるいは、他の検出可能なタグ又は標識は、酵素の代わりに、あるいは酵素と一緒に用いられてもよい。これらとしては、放射性同位体、当該技術分野において知られる幅広い範囲の着色及び蛍光標識、例えばフルオロセイン、アレクサフルオロ、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミンレッド、カスケードブルー、マリーナブルー、パシフィックブルー、カスケードイエロー、ゴールド；及びコンジュゲート、例えばビオチン（例えばInvitrogen Ltd, United Kingdomから入手可能）が挙げられる。染料ゾル、金属ゾル、化学発光標識、又は着色ラテックスが用いられてもよい。１又はそれ以上のこれらの標識は、本明細書に記載の様々な発明に従ってＥＬＩＳＡアッセイ、あるいは他のアッセイ、本明細書に記載される標識された抗体又はキットにおいて用いられてもよい。
【００７３】
ＥＬＩＳＡ型アッセイの構築は、それ自身、当該技術分野においてよく知られている。例えば、ＦＬＣに特異的な「結合抗体」は、基板上に固定化される。前記「結合抗体」は、当該技術分野においてよく知られている方法により、基板上に固定化されてもよい。サンプル中のＦＬＣは、ＦＬＣ又はＨＬＣと結合する「結合抗体」により、「結合抗体」を介して基板と結合する。
【００７４】
未結合の免疫グロブリンは、洗い流されてもよい。
【００７５】
ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、結合した免疫グロブリンの存在を、結合抗体よりも目的のＦＬＣの異なる部分に特異的な、標識された「検出抗体」を用いることにより決定してもよい。
【００７６】
フローサイトメトリーは、目的のＦＬＣ又はＨＬＣの結合を検出するために用いられてもよい。この技術は、当該技術分野、例えばセルソーティングの分野においてよく知られている。しかしながら、これは、標識された粒子、例えばビーズを検出するために、そしてこれらのサイズを測定するために用いることができる。多数の教科書が、フローサイトメトリーを記載する（例えばPractical Flow Cytometry, 3 Ed. (1994), H. Shapiro, Alan R. Liss, New York, and Flow Cytometry, First Principles (2nd Ed.) 2001, A.L. Given, Wiley Liss）。
【００７７】
１つの結合抗体、例えば、ＦＬＣに特異的な抗体は、ビーズ、例えばポリスチレン又はラテックスビーズと結合する。前記ビーズは、サンプル及び第二の検出抗体と混合される。検出抗体は、好ましくは、検出可能な標識で標識され、これは、ＦＬＣと結合し、サンプル中において検出される。これは、評価されるＦＬＣが存在する場合、標識されたビーズをもたらす。
【００７８】
本明細書に記載される他の検出物に特異的な他の抗体はまた、これらの検出物の検出を可能にするために用いられてもよい。
【００７９】
標識されたビーズは、従って、フローサイトメトリーを介して検出されてもよい。様々なビーズ、例えば様々な蛍光標識は、例えば抗遊離λ及び抗遊離κ抗体について用いられてもよい。本明細書に記載される他の検出物に特異的な他の抗体はまた、これらの検出物の検出を可能にするために、本明細書に記載されるこの又は他のアッセイを用いてもよい。これは、同時に決定されるそれぞれの種類のＦＬＣ結合の量、又は決定される他の検出物の存在を可能にする。
【００８０】
あるいは、又は追加で、様々なサイズのビーズは、様々な抗体、例えば様々なマーカー特異的抗体について用いられてもよい。フローサイトメトリーは、様々なサイズのビーズを識別することができ、従って、サンプル中のそれぞれのＦＬＣ及び他の検出物の量を迅速に決定することができる。
【００８１】
代替の方法は、例えば、蛍光標識ビーズ、例えば市販されているLuminex（商標）ビーズと結合する抗体を使用する。様々なビーズが様々抗体とともに用いられる。様々なビーズは、様々な蛍光混合物で標識され、従って、蛍光波長により決定される様々な検出物を可能にする。Luminexビーズは、Luminex Corporaion, Austin, Texas, United States of Americaから入手することができる。
【００８２】
好ましくは、用いられるアッセイは、比濁法又は濁度法である。
【００８３】
本発明の方法を実行するために構成された装置はまた、提供される。これらは、前記方法を実行するために構成されるコンピュータプロセッサ及びメモリを含んでもよい。これらは、前記スコア及び／又は結果を表示するためのアウトプット、例えばディスプレイスクリーンを含んでもよい。
【００８４】
前記装置は、κ：λＦＬＣ比、ＨＬＣκ：ＨＬＣλ比及び任意で総ＦＬＣ及び／又は総ＨＬＣを測定するための検出器を含んでも良い。
【００８５】
前記装置は、フローサイトメーター、比濁計又は濁度計でもよい。
【００８６】
キットは、
（ｉ）抗κＦＬＣ特異的及び抗λＦＬＣ特異的抗体、及び
（ｉｉ）抗κ重鎖クラス特異的及び抗λ重鎖クラス特異的抗体又はこれらの断片
を含む。
【００８７】
前記キットは、サンプル中の総ＦＬＣ及び／又はＨＬＣを測定するための抗体又は断片をさらに含んでも良い。
【００８８】
かかる検出抗体又は断片は、例えば、それぞれの異なる検出抗体について異なる染料又は標識を用いたマルチプレックスキットにおいて一緒に混合されてもよい。標識は、例えば異なるLuminex（商標）ビーズでもよい。
【００８９】
適用は、実施例のみによって記載されてもよい。
【００９０】
κ：λＦＬＣ比、総ＦＬＣ、ＨＬＣκ：ＨＬＣλ比及び／又は総ＨＬＣは、当該技術分野において一般的に知られている技術を用いて行なわれる。
【００９１】
典型的に、Freelite（商標）キット、Hevylite（商標）キット及びCombylite（商標）キット（The Binding Site Ltd, Birmingham, UKから入手可能）は、患者からの血清のサンプルを測定するために、製造者の使用説明書に従って、用いられる。
【００９２】
結果は、例えば、上記の表１〜６に示され、上記に記載されるようにスコア付けされる。
【００９３】
下記の表７は、出願人らにより予め見出された患者のタイプに基づいて、予測され得るいくつかの結果の解釈を示す。
【００９４】
【表７】
2015511008.tif 000014
【００９５】
非クローン性は、更なる調査が必要とされてもよいことを示す。
【００９６】
本発明のアルゴリズムの使用の実証
方法：ロイヤルウォルヴァーハンプトン病院（Royal Wolverhampton Hospital）に来院した１５１５人の患者を分析した。ＳＰＥ及びＩＦＥは、SEBIA Hydrasys 2を用いて行い、ＦＬＣ及びＨＬＣアッセイは、比濁分析により行ない、そして結果を、本明細書に記載されるアルゴリズムを用いて分析し、
（１）ＦＬＣ及びＨＬＣ比：
（２）アイソタイプマッチ抑制のレベル；
（３）全身性免疫グロブリン抑制のレベル；及び
（４）ＦＬＣ及びＨＬＣ産生
を組み込む。
前記アルゴリズムに由来する結果及び既往歴の（historic）ＳＰＥ及びＩＦＥゲルを、患者の臨床診断と比較した。
【００９７】
結果：診察時において、１５６／１５１５（１０％）のサンプルが異常なＳＰＥを有し；１０１／１５６はＩＦＥにより陽性であった。５２人／１０１のＩＦＥ陽性患者は、血液疾患が確認され、
１４人  多発性骨髄腫（ＭＭ）、
３人  ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）、
１人  ＩｇＭクリオグロブリン血症、
３人  慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、
３人  リンパ腫、
１人  形質細胞腫
１人  シェーグレン症候、及び
２６人  意義不明のモノクローナル免疫グロブリン異常症（ＭＧＵＳ）
を含んだ。
【００９８】
診察時において、１７５人／１５１５人（１１％）のサンプルを、ＦＬＣ／ＨＬＣアルゴリズムにより、ＦＬＣ及び／又はＨＬＣ異常を有するとして同定した。ＦＬＣ／ＨＬＣアルゴリズムは、ＳＰＥ／ＩＦＥにより同定される全ての５２人の患者、並びに
１人  アミロイド症、
１人  無症候性ＭＭ、
６人  ＣＬＬ、
１人  小リンパ球性白血病、
２人  リンパ腫、及び
１５人  軽鎖ＭＧＵＳ患者
を含む、ＳＰＥ／ＩＦＥにより検出されない更なる２６人の患者を含む、血液疾患をする７８人の患者を同定した。
【００９９】
結論：ＦＬＣ及びＨＬＣアッセイに基づくアルゴリズムは、血液疾患を検出するためのより感度の高い方法を提供し、ＳＰＥ及びｓＩＦＥのスクリーニングパネルにより見落とされる２６人の患者を同定した。
【国際調査報告】
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