(57)【要約】  発明は、発現された核酸配列のライブラリから配列セットを選択するための方法に関し、細胞が与えられ、各々の細胞は標的タンパク質として発現される発現核酸配列を備える。細胞は、細胞をカチオン性多糖類で処理し、その後それらをアニオン性多糖類で処理し、封入細胞を生じさせ、封入細胞の膜に孔をあけ、可溶化区画を生じさせ、それらを、検出可能な標識を担持する当該標的タンパク質へのリガンドと接するようにし、検出可能な標識の関数として可溶化区画のサブセットを選択し、かつ選択される配列セットとして当該選択範囲から発現核酸配列を単離することによって、封入される。
2015503926.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現された核酸配列のライブラリから配列セットを選択するための方法であって、
−複数の細胞が与えられ、各々の細胞は前記細胞中の標的タンパク質として発現される発現核酸配列を備え、
−前記複数の細胞は封入ステップで封入され、封入ステップは、
・カチオン処理ステップで、カチオン性多糖類で前記複数の細胞を処理することと、
・アニオン処理ステップで、アニオン性多糖類で前記複数の細胞を処理することとを備え、
前記封入ステップは複数の封入細胞を生じさせ、
−可溶化ステップで、前記封入細胞の膜を可溶にし、複数の可溶化区画を生じさせ、
−標識ステップで、前記複数の可溶化区画を
・検出可能な標識を担持する、前記標的タンパク質へのリガンドと、または
・前記標的タンパク質の酵素活性の指示薬と接するようにし、前記酵素活性は前記指示薬を検出可能な標識に変換し、
−選択ステップで、前記可溶化区画中に存在する検出可能な標識の関数として、前記複数の可溶化区画のサブセットを選択して、選択範囲を生じさせ、
−単離ステップで、選択される配列セットとして選択範囲から前記発現核酸配列を単離する、方法。
【請求項２】
カチオン性多糖類はキトサンであり、および／またはアニオン性多糖類はアルギン酸塩もしくはヒアルロン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カチオン処理ステップはアニオン処理ステップに先行する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アニオン処理ステップを後に伴うカチオン処理ステップを備える一連のステップは２〜１０回繰り返される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
検出可能な標識は蛍光染料である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドは、オリゴペプチド、作用物質、拮抗物質、基質、または前記標的タンパク質の変異体に結合する遷移状態類似体である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
選択される配列セットは複数の細胞に移され、一連の封入ステップ、可溶化ステップ、標識ステップ、選択ステップ、および単離ステップを受ける、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記単離ステップの後、前記選択される配列セットは、
ａ．突然変異体を増幅された配列に導入するプロセスによる前記発現核酸配列の増幅、および／または、
ｂ．前記発現核酸配列への配列トラクトの削除もしくは挿入
によって多様化され、
その後、選択される配列セットは、別の一連の封入ステップ、可溶化ステップ、標識ステップ、選択ステップ、および単離ステップを受ける、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
発現核酸配列の前記ライブラリは、互いとの同一性が少なくとも６０％である相同配列のライブラリである、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記発現核酸配列は導入遺伝子発現構築体を備える、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記導入遺伝子発現構築体はプラスミドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的タンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質、イオンチャネル、酵素、核内受容体、転写因子、またはＤＮＡ／ＲＮＡ結合タンパク質である、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記可溶化ステップは前記封入細胞を界面活性剤に露出することによって達成される、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞は細菌細胞である、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記検出可能な標識は蛍光染料であり、前記選択ステップは蛍光細胞選別によって達成される、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
説明
進化分子工学は、タンパク質に改良された性質を与える。進化したタンパク質は、工業用酵素、結合分子、および重要な研究ツールとして活用されている。すべての進化分子工学方法におけるきわめて重要なステップは、所望の表現型のためのタンパク質ライブラリの選択またはスクリーニングである。選択技術は、タンパク質の表現型をその遺伝子型にリンクすることによって非常に大きなライブラリを調べられるようにし、対象の変異体の迅速な同定を可能にする。大きなライブラリから対象の生体分子を同定するのに、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、およびリボソームディスプレイなどの選択方法が十分に確立され、慣用されているが、これらの方法のうちいずれも、複雑な細胞内合成もしくは処理ステップまたはそれらの機能的完全性のための細胞内構造の存在に依存するタンパク質の選択に適していない。従来の手段で得ることができないタンパク質クラスの一例がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の群である。界面活性剤ミセル中で安定しているＧＰＣＲ突然変異体は、ＧＰＣＲ構造および生化学的特徴を理解するにあたり、それらの重要性のために魅力的な研究対象である。
【０００２】
細菌ディスプレイは、細菌細胞を用いて、所与のタンパク質とそれをエンコードするプラスミドとを物理的に含有する。細菌ディスプレイは、異なるＧＰＣＲに適用されて、大腸菌中で機能発現が大きく改良された突然変異体を得る。これらの高発現ＧＰＣＲの多くは界面活性剤中でより安定しているが、界面活性剤ミセル中での高い発現と高い安定性との間の相関はよくても弱い。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本明細書中で用いる省略形は、ＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役受容体）、ＮＴ（ニューロテンシンペプチド）、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）、ＤＤＭ（ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）、ＤＭ（ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）、ＯＧ（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）、ＬｂＬ（レイヤバイレイヤ）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート／Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−スルホ−Ｎ−［３−［［３α，５β，７α，１２α）−３，７，１２−トリヒドロキシ−２４−オキソコラン−２４−イル］アミノ］プロピル］−１−プロパナミウムヒドロキシド）、ＣＨＳ（コレステリルヘミスクシナートトリス塩）、ＣＨＥＳＳ（細胞ハイスループット封入、可溶化、およびスクリーニング）、ＨＬ−ＮＴ（HiLyte Fluor６４７標識ニューロテンシンペプチド（８−１３））、ＦＬ−ＮＴ（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ標識ニューロテンシンペプチド（８−１３））、ＦＬ−プラゾシン（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ標識プラゾシン）である。
【０００４】
本発明は、発現された核酸配列のライブラリから配列セットを選択するための方法を提供する。これは一般的に以下のステップによって進行する。
【０００５】
−複数の細胞が与えられ、細胞の各々は発現された核酸配列を備え、この核酸配列は細胞の中に発現され、標的タンパク質を生じさせ、
−当該複数の細胞は封入ステップで封入され、細胞は、カチオン性多糖類（「カチオン処理ステップ」）でおよびアニオン性多糖類（「アニオン処理ステップ」）で処理され、その後、細胞は「封入細胞」と称され、
−封入細胞は可溶にされ（「可溶化ステップ」）、これによりそれらの膜は破壊されて細胞中へのまたは細胞外への小分子（オリゴペプチドなどの低分子量化合物）の侵入および離脱を許す一方で、球状タンパク質などのより大きな構造は細胞中に保持され、今や封入されかつ可溶にされた細胞は「可溶化区画」と称され、
−可溶化区画は、
・検出可能な標識を担持する、当該標的タンパク質へのリガンドと、または
・当該標的タンパク質の酵素活性の指示薬と接するようにされ、酵素活性は指示薬を検出可能な標識に変換し（「標識ステップ」）、
−可溶化区画のサブセットは、各々の可溶化区画の中に存在する検出可能な標識の量の関数として選択され（「選択ステップ」）、選択される可溶化区画は「選択範囲」と称され、
−発現された核酸配列は、選択される配列セットとして当該選択範囲から単離される（「単離ステップ」）。
【０００６】
カチオン性多糖類の１つの非限定的例がキトサンである。キトサン（ＣＡＳ番号９０１２−７６−４）は、β−１−４−Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの（ランダム）線状重合体である。
【０００７】
アニオン性多糖類の１つの非限定的例はアルギン酸塩であり、別のものはヒアルロン酸である。アルギン酸塩（ＣＡＳ番号９００５−３２−７）は、（１−４）−β−Ｄ−マンヌロン酸およびアルファ−Ｌ−グルロン酸の線状共重合体である。ヒアルロン酸（ＣＡＳ番号９００４−６１−９）はグリコサミノグリカンである。発明を実践するための他のポリイオンは、ポリ−Ｌ−リジン、カルボキシメチルセルロース、ポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、硫酸ポリスチレンナトリウム、ポリ（スチレン）−コ−スチレンスルホン酸ナトリウム（ＮａＰＳＳ）、ＰＬＧＡ（ポリ乳酸−コ−グリコール酸）、ポリ乳酸、または化合物のポリクオタニウムリストの１つなどの化粧品業界で用いられることが知られている水溶性ポリカチオン性重合体（化粧品業界で用いられる異なるポリカチオン性重合体の名称；「ポリクオタニウム」のウィキペディアの記載を参照）を含むが、それらに制限されない。
【０００８】
１つの実施形態では、カチオン処理ステップはアニオン処理ステップの前に行なわれる。初期層は鋳型表面の性質に依存する。大腸菌については、細胞の表面は、外膜の外面を備えるリポ多糖類（ＬＢＳ）によって負に荷電している。これにより、細胞は、正に荷電する重合体による初期コーティングの影響を受けやすくなる。特定の細胞が正に荷電した表面を有する場合は、プロセスの順序を逆にすることができる（すなわち、負に荷電した層を先に塗布する）。
【０００９】
１つの実施形態では、封入ステップはいくつかのラウンドにわたって進行し、一連のアニオンおよびカチオンコーティングを繰返す。このように、アニオン処理ステップを後に伴うカチオン処理ステップは、たとえば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回繰返されて、より厚みのあるカプセルを生じさせてもよい。
【００１０】
可溶化ステップは、細胞壁または外膜（および、大腸菌などのグラム陰性細菌の場合は内膜）を破壊して細胞の内部を露出する一方で、封入ステップの間に細胞に塗布されるコーティングは、その後のステップでプローブで探られる細胞中のより大きな構造を保持する。大きさの限界は、用いられる多価電解質（分子量）および封入ステップで堆積される層の量を調節することによって調整可能である。これは、対象の特定のタンパク質を保持できるようにする発明の方法の「調整」を可能にする。同じように、これは、特定の大きさのプローブまたはリガンドが細胞の中に入れるようにする。
【００１１】
可溶化ステップは、封入ステップの間に細胞上にコーティングされる重合体層を破壊しない任意の方法を用いてもよい。例は、界面活性剤処理パーフォリン、リソチーム、弱い超音波処理、高浸透圧または低浸透圧ショック、電気穿孔、アルコール処理、凍結融解サイクル、カプセルの加熱および沸騰、ならびに圧力勾配を含む。
【００１２】
実施形態によっては、複数の可溶化区画を生じさせる可溶化ステップで当該封入細胞の膜を可溶にすることは、水溶液中の界面活性剤に当該複数の封入細胞を露出するステップを備える。
【００１３】
このように、実施形態によっては、発明の方法は、
−複数の細菌細胞を与えることを備え、各々の細胞は、各々の細胞の中で標的タンパク質として発現される発現核酸配列を備え、さらに
−封入ステップで、当該複数の細胞を封入することを備え、当該封入は、
・カチオン処理ステップで、カチオン性多糖類で当該複数の細菌細胞を処理することと、
・アニオン処理ステップで、アニオン性多糖類で当該複数の細菌細胞を処理することとを備え、
当該封入ステップは複数の封入細菌細胞を生じさせ、さらに
−可溶化ステップで、界面活性剤で当該封入細菌細胞の膜を可溶にして複数の可溶化区画を生じさせることと、
−標識ステップで、当該複数の可溶化区画を
・検出可能な標識を担持する、当該標的タンパク質へのリガンドと、または
・当該標的タンパク質の酵素活性の指示薬と、接するようにすることとを備え、当該酵素活性は当該指示薬を検出可能な標識に変換し、さらに
−選択ステップで、当該可溶化区画中に存在する検出可能な標識の関数として当該複数の可溶化区画のサブセットを選択して選択範囲を生じさせることと、
−単離ステップで、選択される配列セットとして、当該選択範囲から当該発現核酸配列を単離することとを備える。
【００１４】
１つの実施形態では、細胞内膜に局所化されるＧＰＣＲを発現する封入大腸菌細胞は、細胞膜を可溶にする界面活性剤である２％のｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシドの水溶液で数時間処理される。受容体分子はこうして細胞膜から除去され、可溶化区画内部のｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシドミセルに可溶にされる。ＤＤＭ、ＯＧ、ＣＨＡＰＳなどの他の界面活性剤、およびこれらのうち任意のものの混合物も用いられた（実施例を参照）。
【００１５】
標識ステップの１つの代替例に従うと、可溶化区画は標的タンパク質へのリガンドと接するようにされ、リガンドは検出可能な標識を担持する。可溶化区画と接するようにされるリガンドは、−残されていれば−細胞壁または外膜中の穿孔または孔を通っておよび封入ステップで細胞上にコーティングされた封入物を通って可溶化区画に入って、可溶化区画内部に保持される標的タンパク質をプローブで探ることができる。
【００１６】
発明を実践するリガンドの非限定的例は、オリゴペプチド、（アロステリック）酵素作用物質もしくは拮抗物質、またはイオンチャネル作用物質もしくは拮抗物質、受容体作用物質もしくは拮抗物質、インバースアゴニスト、リバースアゴニスト、およびアロステリック調節因子である。リガンドは、標的タンパク質の変異体に結合する酵素基質または遷移状態類似体でもあり得る。リガンドの他の非限定的例は、抗体、ＤＡＲＰｉｎ（本明細書中に引用により援用されるＵＳ２０１２０１４２６１１（Ａ１）を参照）、ＦＡＢ、ナノ抗体、または一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの特異的結合分子である。可溶化膜コーティングの細孔の大きさおよび加えられた重合体層の数に依存して、機能タンパク質（ポリペプチド）もリガンドとして用いてもよい。
【００１７】
標識ステップの別の代替例に従うと、可溶化区画は標的タンパク質の酵素活性の指示薬と接するようにされる。酵素活性は、指示薬を、検出可能な標識として働いて細胞または区画の検出およびさらなる選択を可能にする、（変換後は変換前の指示薬とは異なる吸収または蛍光スペクトルを有する）染料に変換する。このように、この代替例に従うと、標識ステップはリガンド独立である。たとえば、一般的な酸化還元指示薬を用いてペルオキシダーゼの活性を検出することができる。非限定的な例として、界面活性剤の存在下でフマル酸レダクターゼの活性を可溶化区画中に検出することができる。フマル酸レダクターゼまたは変異フマル酸レダクターゼを発現する細胞が封入されて、区画は界面活性剤で可溶にされる。次に、水溶性３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）が可溶化区画に加えられ、そこでこれは区画に入り、任意の活性フマル酸レダクターゼがＭＴＴを紫色の不溶性ホルマザンに還元する。ホルマザン沈殿物は可溶化区画内部に留まり、特定の区画中でのその存在は、フローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）を用いて検出および単離することができる。
【００１８】
１つの実施形態では、検出可能な標識は蛍光染料である。蛍光染料の非限定的例は、４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）、５−もしくは６−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭおよび６−ＦＡＭ）もしくはフルオレセインなどのキサンテン染料、５−もしくは６−カルボキシテトラメチルローダミン（５もしくは６−ＴＡＭＲＡ）などのローダミン染料、またはシアニン染料である。
【００１９】
選択ステップは、細胞または区画の、その中の標識の量または質による区別を可能にする任意の方法で進行してもよい。蛍光標識については、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）が選択の方法である。
【００２０】
１つの実施形態では、選択される配列セットは、発明の方法に従う選択をもう１ラウンド受ける。このように、選択される配列セットはサブクローニングされ、再び細胞の中に移入され、一連の封入ステップ、可溶化ステップ、標識ステップ、選択ステップ、および単離ステップを１回または数回受ける。繰返しは、選択される配列セットをさらに操作することなく、以前の繰返しの選択される配列セットに適用されてもよい。１つの実施形態では、選択される配列セットは、たとえば、変異性ＰＣＲ（Chen & Arnold, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1993, 90:5618-5622）によって突然変異される。この方法は点突然変異を導入し、これは、任意の個別の配列の長さを実質的に変更したり、選択される配列セットに「ノイズ」を加えたりすることなく、徐々に配列を変更して突然変異を導入し、その中から選択のその後のラウンドを選ぶことができる。代替例または補完例は、ＤＮＡシャッフリングまたは飽和突然変異誘発である（Stemmer, Nature 1994, 370: 389-391; Miyazaki & Arnold, J. Mol. Evol. 1999, 49: 716-720）。
【００２１】
代替的に、１つの実施形態では、選択される配列セットは、配列トラクトを削除し、選択される配列の間の配列トラクトを組換えるもしくはシャッフリングする、または新しい配列トラクトをランダムに導入する処理を受ける。そのような操作は、生理学的設定における組換えと均等であり、進化空間でのより大きな「飛躍」を可能にする。１つの実施形態では、点突然変異と組換えとの両者が組合される。このように、選択される配列セットは、増幅された配列内に突然変異を導入するプロセスによる当該発現核酸配列の増幅によって、および／または当該発現核酸配列への配列トラクトの削除もしくは挿入によって多様化され、その後、選択される配列セットは、別の一連の封入ステップ、可溶化ステップ、標識ステップ、選択ステップ、および単離ステップを受ける。配列変異体を導入するための方法は、Dalby（Curr. Opin. Struct. Biology 2011, 21, 473-480）およびその中に引用される文献によって検討される。
【００２２】
発現核酸配列のライブラリは、ランダムライブラリ、または相同配列もしくはある細胞、組織、病理状態、もしくは対象のパラメータに接続される任意の他のやり方で発現される配列からなるライブラリであってもよい。１つの実施形態では、発現された核酸配列のライブラリは、互いとの同一性が６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の相同配列からなる。
【００２３】
本発明の文脈での同一性とは、位置毎の配列比較の結果を表わす単一の定量的パラメータである。配列比較の方法は当該技術分野で公知である。公に入手可能なＢＬＡＳＴアルゴリズムが例である。
【００２４】
大部分の実施形態では、発現された核酸配列は、たとえば発現プラスミドなどの細胞中に存在する導入遺伝子発現構築体の一部である。１つの実施形態では、発現された核酸配列はゲノム的であり、複数の細胞は突然変異体の群である。１つの実施形態では、複数の細胞は、細胞種類または生物の非相同混合物である。これは、たとえば、生物の環境に由来した試料中の超安定酵素などの稀な表現型の探索を可能にする。
【００２５】
標的タンパク質は、細胞中に発現され、封入および可溶化の後に可溶化区画中に保持される任意のタンパク質であってもよい。１つの重要な非限定的例は、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質である。他の非限定的例は、イオンチャネル、酵素、核内受容体、転写因子、およびＤＮＡ／ＲＮＡ結合タンパク質を含む。標的タンパク質の他の例は、抗体、ＤＡＲＰｉｎ、ＦＡＢ、ナノ抗体、または一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの特異的結合分子である。小分子量標的タンパク質は、より大きな構造（たとえば、トリプルＧＦＰタグ）を形成するための他のオリゴペプチドもしくはタンパク質との融合により、または増大した数の重合体層分の可溶化区画の有効細孔径の減少により、可溶化区画中に保持される。
【００２６】
原則として、（単語の生物学的意味での）任意の種類の細胞を用いることができる。本明細書の文脈での細胞という用語は、このように、（グラム陽性およびグラム陰性）細菌細胞、植物細胞を含む真核生物細胞、哺乳類細胞培養適応細胞を含む哺乳類細胞、または封入および細胞の自然の閉じ込めのその後の破壊のステップの影響を受けやすい任意の他の細胞を含む。本明細書中に示される例は細菌細胞を利用するが、本発明の範囲は細菌細胞に限定されるものではない。
【００２７】
１つの実施形態では、細胞は細菌細胞である。１つの実施形態では、細胞は細胞培養中の単離された懸濁哺乳類細胞である。１つの実施形態では、細胞は、細胞培養中の単離された懸濁植物細胞である。
【００２８】
１つの実施形態では、検出可能な標識は蛍光染料であり、当該選択ステップは蛍光細胞選別によって達成される。
【００２９】
１つの実施形態では、細胞は大腸菌細胞であり、標的タンパク質はＧタンパク質共役受容体であり、検出可能な標識は蛍光染料である。
【００３０】
たとえば、細胞、標的タンパク質、カチオン性多糖類、アニオン性多糖類、検出可能な標識、または選択手順などの単一の分離可能な特徴の代替例が、本明細書中で「実施形態」としてどこで述べられたとしても、本明細書中に開示される発明の別々の実施形態を形成するようにそのような代替例を自由に組合せてもよいことを理解すべきである。
【００３１】
以下の図および実施例によって発明をさらに図示する。そこからさらなる実施形態および利点を導出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】発明の１つの実施形態の概略図であって、受容体突然変異体のライブラリは形質転換されかつ大腸菌中に発現され、細胞は封入され、細胞膜は界面活性剤で透過化され、封入層は半透過性障壁として働いてカプセル内に可溶化受容体およびそのエンコーディングプラスミドを保持するが、カプセルの中への蛍光標識されたリガンドを許し、そこでリガンドは機能的受容体分子に結合することができ、界面活性剤安定ＧＰＣＲ突然変異体を含有するカプセルはより蛍光性であり、かつＦＡＣＳで群から選別可能であり、遺伝子材料は選別されたカプセルから回収され、所望の受容体突然変異体を同定するためまたは突然変異もしくは選択のさらなるラウンドのための鋳型として用いられる、図である。
【図２】大腸菌細胞のＬｂＬ封入および現発明のためのこの方法の最適化の概略図であって、（ａ）正に荷電したキトサン重合体と負に帯電したアルギン酸塩との交互の層を置くことによって大腸菌細胞が封入され、（ｂ）「ヒルバーグ（Hillberg）」ＬｂＬプロセスの際に産生される凝集細胞の量が、アルギン酸塩およびキトサンの封入溶液へのＥＤＴＡ（＋ＥＤＴＡ）の添加によって大きく低減され、（ｃ）封入溶液のｐＨを７よりも下に下げる結果、界面活性剤処理に耐えることができるより強いカプセルを生じた、図である。
【図３】封入細胞の特徴付けを示す図であって、ＧＰＣＲ発現大腸菌細胞は、３組の、１層のキトサンおよび１層のアルギン酸塩で封入され、ＦＡＣＳで分析され、（ａ）裸細胞のレーザ散乱性が９１．４％の単細胞を封じ込める任意のゲートの定義を可能にし、（ｂ）封入細胞試料中に検出される粒子の６０．５％がこのゲート内に入り、残余の粒子の大部分はより大きな分子に特徴的な散乱性を呈し、（ｃ）裸細胞および封入細胞は界面活性剤（１％のＤＤＭ、０．６％のＣＨＡＰＳ、０．１２％のＣＨＳ）に露出され、経時的な細胞様粒子の損失がＦＡＣＳでアッセイされ、裸細胞の界面活性剤処理の結果、細胞様粒子の迅速な損失を生じた（黒線で囲った白丸）一方で、界面活性剤処理された封入細胞試料（灰色線で囲った白い四角）は、１５日の期間にわたって細胞様ナノ粒子の高い割合を維持し、未処理裸細胞（黒塗り潰し三角形）および未処理封入細胞（灰色塗り潰し四角）は両者とも、経時的に細胞様粒子の高い割合を維持し、（ｄ）Ｃ末端でｓｆＧＦＰタグ付けされたＤ０３−およびＣ７Ｅ０２−発現細胞が封入され、ＨＬ−ＮＴの存在下で弱い界面活性剤混合物（ＳＡＢ）または強い界面活性剤（ＤＭ）に露出され、カプセル内に含有されるｓｆＧＦＰ蛍光は、ＦＡＣＳを用いて１５日間測定され、試料の中にｓｆＧＦＰチャネル中の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の大きな低減は観察されず、このことは発現された受容体がナノカプセルから漏れ出ていなかったことを示し、（ｅ）反対に、カプセル当たりの結合リガンドの平均レベルは１５日の実験にわたってより大きく変化し、予期されたように、ＤＭ中のＤ０３の活性は経時的に低減され、Ｃ７Ｅ０２試料の蛍光は、最初の２日間にわたって増大し、その後、１５日後に初期レベルに戻る傾向があったが、これはこの突然変異体が依然としてリガンドに結合することができたことを示す、図である。
【図４】封入細胞の電子顕微鏡写真を示し、（ａ）裸大腸菌細胞、（ｂ）封入細胞、および（ｃ）１％のＤＤＭで２４時間処理された封入細胞が透過電子顕微鏡で視覚化された図である。
【図５】界面活性剤安定３０３ライブラリメンバーの選択を示す図であって、界面活性剤安定「３０３ライブラリ」メンバーはＦＡＣＳで選択され、（ａ）選別された群の蛍光ヒストグラムは界面活性剤安定受容体の強い濃縮を表わし、（ｂ）２２個の選択されたクローンが個別に発現され、可溶化され、ＯＧ中で２もしくは１００時間後にリガンド結合活性についてアッセイされ、上位３つの受容体が発現され、２０℃で３時間にわたって１．７％のＤＭ中で可溶化され、可溶化受容体は４℃で１時間ストレプトアビジン常磁性ビーズで上澄みから捕捉され、（ｃ）Ｃ７Ｅ０２（灰色の丸）、３０３ＯＧＢ５（灰色の四角）、３０３ＯＧＧ７（黒丸）、もしくは３０３ＯＧＧ８（黒三角）でコーティングされたビーズは、１．７％のＤＭ中で１時間、２０ｎＭのＨＬ−ＮＴ（８−１３）で処理され、その後上昇する温度で３０分間熱的に免疫性をテストされるか、もしくはリガンドの不在下で加熱後に２０ｎＭのＨＬ−ＮＴ（８−１３）で処理され、（ｅ）代替的に、１．７％のＤＭ中での可溶化の後、受容体でコーティングされたビーズは、リガンドなしで４℃で１５分間、２％のＯＧ中で洗浄され、その後、２％のＯＧ中で１時間、２０ｎＭのＨＬ−ＮＴ（８−１３）に露出されて、次に上昇する温度で３０分間熱的に免疫性をテストされるか、または（ｆ）リガンドの不在下で加熱後に２０ｎＭのＨＬ−ＮＴ（８−１３）で処理され、２％のＯＧ中のＣ７Ｅ０２でコーティングされたビーズからは特異的シグナルを測定することはできず、競合物として５μＭのＮＴ（８−１３）の存在下であらゆる温度点で平行測定値を取って特異的蛍光シグナルを計測し、繰返し測定の平均としてデータ点をプロットし、１００％は、２０℃での３０分加熱後に測定されたシグナルを表わし、エラーバーは標準誤差を示す、図である。
【図６】選択された３０３ライブラリメンバーを特徴付けるのに用いられる方法を示す図である。
【図７】高度に安定した、選択された３０３ライブラリメンバーのアミノ酸配列を示す図であって、選択された受容体のアミノ酸配列が親ラットＮＴＳ１、Ｄ０３、および高発現クローンＣ７Ｅ０２と並べられ、膜貫通ヘリックスの場所が円筒で示される一方で、Ｄ０３に対する突然変異体の数がΔの列に示される、図である。
【図８】ＣＨＥＳＳでの界面活性剤安定ＡＤＲＡ１Ａ突然変異体の選択を示す図であって、界面活性剤安定ＡＤＲＡ１Ａライブラリメンバーは、２００ｎＭのＢＯＤＩＰＹ  ＦＬプラゾシンを用いてＦＡＣＳで選択され、（ａ）２１個の選択されたクローンが個別に発現され、可溶化され、３時間後にＰＢＳ−Ｅ（ＤＣＣ）中でリガンド結合活性についてアッセイされ、（ｂ）上位４つの受容体がリガンドの不在下で２０℃で３時間、ＰＢＳ−Ｅ（ＤＣＣ）中で可溶化され、可溶化された受容体は４℃で１時間、ストレプトアビジン常磁性ビーズで上澄みから捕捉され、ＡＤＲＡ１ＡＤＣＣＡ３（黒丸）、ＡＤＲＡ１ＡＤＣＣＧ４（灰色線で囲んだ白い四角）、ＡＤＲＡ１ＡＤＣＣＤ７（黒×）、またはＡＤＲＡ１ＡＤＣＣＤ８（灰色線で囲った白丸）でコーティングされたビーズは、２０ｎＭの［3Ｈ］プラゾシンで１時間処理され、その後、上昇する温度で３０分間熱的に免疫性をテストされるか、または（ｃ）リガンドの不在下で加熱後に２０ｎＭの［3Ｈ］プラゾシンで処理され、受容体がリガンドの不在下で可溶化された際、ＡＤＲＡ１Ａ−またはＡ１Ａ−０５でコーティングされたビーズからは大きなシグナルを測定することができず、競合物としての１０μＭの未標識プラゾシンの存在下であらゆる受容体について平行測定値を取って特異的蛍光シグナルを計測し、繰返し測定の平均としてデータ点をプロットし、１００％は、２０℃での３０分加熱後に測定されたシグナルを表わし、エラーバーは標準誤差を示す、図である。
【図９】安定した選択されたＡＤＲＡ１Ａライブラリメンバーのアミノ酸配列を示す図であって、選択された受容体のアミノ酸配列は、親ＡＤＲＡ１Ａおよび以前に同定された高発現突然変異体Ａ１Ａ−０５と並べられ、膜貫通ヘリックスの場所が円柱で示される一方で、ＡＤＲＡ１Ａに対する突然変異体の数がΔの列に示される、図である。
【実施例】
【００３３】
界面活性剤安定Ｇタンパク質共役受容体の選択
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、療法上の大きな関心対象である内在性膜タンパク質である。ＧＰＣＲ遺伝子ファミリーはヒトゲノムの中で最大であり、多様な刺激を感知しかつそれに応答する約８５０の異なる受容体をエンコードする。大部分の生物物理学的および構造的研究のために、受容体をまず界面活性剤中で可溶化し、精製する必要がある。いくつかのＧＰＣＲの結晶構造はしばしば、Ｇタンパク質との結合を排除するであろうＴ４−リソチームとの融合として解明されているが、このファミリーの多くのメンバーはそのような研究にはあまりに不安定である。
【００３４】
このファミリーのより幅広い研究のための困難は、内在性膜タンパク質の界面活性剤安定性の直接的な改良を可能にするであろう合理的または進化的な方策が説明されていないことである。安定化突然変異体は、半合理的な試行錯誤またはアラニン走査およびスクリーニング方策を用いて以前に同定された。しかしながら、個別に調製された溶解物に対して分析を行なわなければならないため、自動化プラットフォームを用いてすら、少数の突然変異体しかスクリーニングすることができない。代替的に、細菌中のより高い機能発現について選択する進化分子工学方法が開発された（Sarkar et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(39): p. 14808-13; Dodevski and Pluckthun, J Mol Biol, 2011. 408(4): p. 599-615）。膜中のより高い機能発現は、弱い界面活性剤中での安定性との明確な相関を示したが、短鎖界面活性剤に対する耐性は直接に相関しないかもしれない。なぜなら、特定の残基が、嵩張る界面活性剤またはリン脂質分子によってアクセス不可能なタンパク質内部への短鎖界面活性剤のアクセスを制御するからである。
【００３５】
それにも拘わらず反復進化分子工学の巨大な力を活用するため、細菌細胞中で直接に受容体の可溶化を実行して、界面活性剤可溶でかつ機能的なＧＰＣＲ変異体について、各々が異なる受容体突然変異体を発現する＞１０8個の細胞の同時スクリーニングを可能にしようとした。細胞を一次区画として用いることにより、遺伝子型（エンコーディングプラスミド）へのＧＰＣＲ表現型の接続を維持して、こうしてこのスクリーンをダーウィン的プロセスの一部、すなわち選択および多様性の反復、として用いる。
【００３６】
解決すべき課題は、遺伝子型から表現型への極めて重要な結合が破壊されるであろうために、細胞が界面活性剤に露出されると即時に崩壊し、それにより受容体突然変異体およびプラスミドの混合物全体を均質化して、進化分子工学にとってプロセスを無用なものにしてしまうであろうことであった。
【００３７】
この課題を解決するため、我々の重要な構想は細胞を封入することであった。可溶化ＧＰＣＲ突然変異体タンパク質およびエンコーディングプラスミドを含有する界面活性剤耐性ナノカプセルにＧＰＣＲ発現（細菌）細胞を変換することにより、タンパク質結晶化に好適な界面活性剤耐性ＧＰＣＲの分子的進化のための多様なライブラリを使用できるようになるであろうと企図した。機能的選択は、ＧＰＣＲの選択から大腸菌中での高機能発現に適合された（Sarkar et al.の同じ箇所；Dodevski and Pluckthunの同じ箇所）。蛍光標識された受容体リガンドを、活性受容体分子に結合した細胞に適用した。次に、その外膜が徐々に透過化される、内膜中に大量の活性ＧＰＣＲを発現する細菌細胞を、複数ラウンドの発現および選択を通した蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて選択することができた。次に、選択された細胞中に含有されるプラスミドを配列することによって高発現突然変異体の遺伝的同一性を同定することができた。本研究では、可溶化される受容体を選別する必要があるが、封入細胞については、依然として同様のＦＡＣＳ戦略も用いることができた。工夫された戦略は、細胞高スループット封入、可溶化、およびスクリーニング（ＣＨＥＳＳ）（図１）と名付けられた。
【００３８】
細胞を封入するため、多価電解質の層毎の（ＬｂＬ）堆積に基づく技術（Hillberg and Tabrizian, Biomacromolecules, 2006. 7(10): p. 2742-50）を最適化した。この方法は、空のカプセルを産生せず、複数の細胞を含有するカプセルはわずかであり、バッチで大量の細胞（＞１０10）を封入するように容易に規模を拡大することができた。方法は、外膜上にディスプレイされるリポ多糖類が寄与する大腸菌細胞の負の表面電荷を利用し、これは、正に荷電した重合体であるキトサン（ポリ−Ｄ−グルコサミン）の細胞上への堆積を助けた。結合していないキトサンを洗浄した後、負に荷電したアルギン酸塩重合体を堆積し、その結果、交互に荷電した安定重合体の強いコーティングを得た（図２ａ）。封入の条件は、細胞の凝集を最小限にしつつ重合体の堆積を最大にするように、異なる緩衝液およびｐＨの値をスクリーニングすることによって最適化された（図２ｂおよび図２ｃ）。最適化された条件は、フローサイトメトリおよび電子顕微鏡で分析されると（図４）、大部分が細胞サイズの（図３ａおよび図３ｂ）、界面活性剤耐性（図３ｃ）カプセルからなる調製物を産生した。封入は、その細胞膜が崩壊した全細胞の界面活性剤処理を可能にした一方で、内膜に発現されたＧＰＣＲはインサイチューで可溶化され、界面活性剤に１５日間露出された後ですらカプセル内に保持された（図３ｄ）。
【００３９】
次に、機能的界面活性剤可溶化ＧＰＣＲ分子をカプセル内に検出可能であること、および安定したＧＰＣＲを不安定なＧＰＣＲ変異体から差別化可能であることを確実にした。これらの実験には、ラットニューロテンシン受容体（ｒＮＴＳ１）の２つの突然変異体を利用した。Ｄ０３は、細菌ディスプレイとともに進化分子工学を用いて同定された、弱い界面活性剤中で安定しているｒＮＴＳ１の高発現変異体である。Ｃ７Ｅ０２は、ＤＭミセル中で非常に安定したＤ０３に由来する変異体である。ＦＡＣＳによって機能性をテストした。蛍光標識ＮＴＲ１リガンドであるHiLyte Fluor６４７標識ＮＴ（ＨＬ−ＮＴ）は、カプセルの細孔を通って拡散することができ、可溶化受容体によって結合可能であった。弱い界面活性剤混合物（１％のＤＤＭ、０．５％のＣＨＡＰＳ、０．１％のＣＨＳ、および３０％のグリセロール）を用いて、両方の可溶化受容体の機能的リガンド結合を１５日の期間にわたってカプセルのＦＡＣＳによって測定することができた（図３ｅ）。１．７％のＤＭを含有するより強い界面活性剤緩衝液で処理されると、Ｄ０３を含有するカプセルは、１０時間以内にＨＬ−ＮＴ結合の損失を呈した一方で、安定した受容体Ｃ７Ｅ０２は、全１５日の期間にわたってリガンド結合活性を呈した（図３ｅ）。興味深いことに、安定した受容体を含有するカプセルから測定された特異的蛍光シグナルは、おそらくは界面活性剤によるカプセルの明確化によって時間とともに大きくなり、その結果、蛍光発光の散乱がより少なくなった。全体的に、これらの実験は、ナノカプセル内部で直接に界面活性剤に可溶にされた異なる受容体の安定性特性をプローブで探ることができることを実証した。
【００４０】
進化分子工学実験における選択ツールとしてのＣＨＥＳＳを検証するため、いくつかの界面活性剤安定受容体を含有することがわかっている、以前から確立されているライブラリに方法を適用した。「３０３ライブラリ」は、Ｄ０３に由来するｒＮＴＳ１突然変異体の集まりである。このライブラリ中の３０個の可変位置を飽和突然変異誘発および高機能発現選択戦略から同定した。ｒＮＴＳ１の安定性を増すと報告されているさらに３つのアミノ酸置換基がこのライブラリに含まれた。これらの３３個の可変位置は、野生型残基で組換えられて、８．６×１０9個の個別の突然変異体の理論的多様性を有するライブラリを産生した。このライブラリは、以前に細菌ディスプレイに適用されて、高発現突然変異体を同定した（Schlinkmann et al., J. Mol. Biol. 2012, 422(3), 414-28を参照）。Ｃ７Ｅ０２を含むこれらの突然変異体のうちいくつかは、短鎖界面活性剤中で相対的に安定していることがわかった。このように、このライブラリは、ライブラリの全多様性をスクリーニングすることによって、短鎖界面活性剤中で安定している受容体の直接単離の目的でのＣＨＥＳＳ選択のためのテストケースとなることができた。
【００４１】
ＧＰＣＲライブラリメンバーを含有する大腸菌ＤＨ５αの約１０8個の形質転換体が誘導され、ＧＰＣＲを発現できるようにされ、封入され、かつリガンドなしで２０℃で３時間、その後２０ｎＭのＦＬ−ＮＴの存在下で２０℃で２時間、２％のＤＭで処理された。各々のラウンドで、緑蛍光カプセルの上位０．５−１％がＦＡＣＳで選択され、その後、カプセルの超音波破壊、選択された突然変異体のＰＣＲ増幅、再クローニング、および形質転換が行なわれた。２ラウンド目および３ラウンド目では、可溶化のために短鎖界面活性剤オクチル−グルコシド（ＯＧ）を用いた。ラウンド１から３までの選別された群の蛍光強度は、選別された群中のＯＧ耐性ｒＮＴＳ１変異体の強い濃縮を示した（図５ａ）。
【００４２】
３ラウンド目の選別後に選択された突然変異体は、Ｃ末端ｓｆＧＦＰ融合およびインビボビオチン化のためのａｖｉタグを含有する発現ベクターの中にクローニングされた［２１］。それらの安定性をテストするため（図６）、発現受容体タンパク質が２０℃で３時間、２％のＤＭの中で可溶化され、ストレプトアビジンでコーティングされた常磁性ビーズ上に固定された。これにより、他のタンパク質の洗浄が可能になり、界面活性剤は２％のＯＧに交換された。ＨＬ−ＮＴが加えられて、機能的受容体分子に結合した。
【００４３】
アッセイされた２２個の選択されたライブラリメンバーのうち、２０個が、２％のＯＧ中で２時間可溶化されるとかなりのリガンド結合を呈した一方で、親遺伝子Ｄ０３は完全に不活性であった（図５ｂ）。１３個のクローンは、２％のＯＧ中で２時間後にＣ７Ｅ０２に対して機能的受容体の部分が大きく増大した。２％のＯＧ中で４日を超えた後、これらのクローンのうち８個は依然としてかなりのリガンド結合を示した一方で、Ｃ７Ｅ０２は完全に不活性であった。「３０３ライブラリ」へのＣＨＥＳＳの適用が、そのような高頻度のＯＧ耐性ＧＰＣＲを生成したことは有望であった。
【００４４】
１．７％のＤＭまたは２％のＯＧ中で可溶化された際に、上位３つの選択されたクローンの熱変性プロファイルをリガンドの存在または不在下で測定した。３０３ＯＧＢ５、３０３ＯＧＧ７、および３０３ＯＧＧ８は、ＤＭおよびＯＧの両方で、ＮＴの存在または不在下で（図５ｃ、図５ｄ、図５ｅ、および図５ｆ）加熱されると、Ｃ７Ｅ０２に勝る向上した熱安定性を呈した。特に留意すべきなのは、リガンドの不在下で加熱された際のこれらの重合体の高い安定性であり、これは高度の固有の受容体安定性を示す。反対に、同じ条件下で、Ｃ７Ｅ０２については活性を全く測定できなかった。これはおそらく、Ｃ７Ｅ０２がＮＴ結合なしではＯＧ中で安定していなかったためであり、これらのアッセイについては、界面活性剤はリガンドの不在下で交換された。
【００４５】
一方で、ＣＨＥＳＳ、３０３ＯＧＢ５、３０３ＯＧＧ７、および３０３ＯＧＧ８を通して選択されたクローンは、リガンドの存在または不在下で（図５ｅおよび図５ｆ）、ＯＧ中で約４０℃のＴ1/2値を呈した。受容体の配列（図７）は、主に膜貫通ヘリックス内に位置する、それぞれＤ０３を上回る２２個、２１個、および１４個のアミノ酸置換基を示す。
【００４６】
ＣＨＥＳＳが一般的にＧＰＣＲに適用可能であったか否かを調べるため、大腸菌中での高い機能発現について２ラウンドの変異性ＰＣＲおよび選択を以前受けたアルファ１Ａアドレナリン受容体（ＡＤＲＡ１Ａ）のライブラリに選択が適用された（Dodevski and Pluckthunの同じ箇所）。封入されたＡＤＲＡ１Ａライブラリは、ＦＡＣＳ選択前に、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識プラゾシン（ＦＬ−プラゾシン）の存在下で界面活性剤混合物（１％のＤＤＭ、０．５％のＣＨＡＰＳ、０．１％のＣＨＳ、３０％のグリセロール）によってインサイチューで可溶化された。同じ界面活性剤混合物を用いた順次の３ラウンドの選択の後、２１個の選択された単一クローンがこの界面活性剤混合物中での増大した安定性について個別にアッセイされた（図８ａ）。これらの受容体のうち１２個が、高機能発現について以前選択された最良の突然変異物（Ａ１Ａ−０５）よりも高い、また野生型ＡＤＲＡ１Ａよりも大幅に高い安定性を呈した。
【００４７】
上位４つの選択されたクローンの熱変性プロファイルが、リガンドの存在または不在下で（図８ｂおよび図８ｃ）測定された。上位４つの選択されたクローンであるＡ１ＡＤＣＣＡ３、Ａ１ＡＤＣＣＧ４、Ａ１ＡＤＣＣＤ７、およびＡ１ＡＤＣＣＤ８は、リガンドの存在下で約４０℃の、またはその不在下で約３５℃のＴ1/2値を呈した。これらの条件下で、野生型ＡＤＲＡ１Ａおよびより高い機能発現のために選択された突然変異体Ａ１Ａ−０５は、リガンドの不在下では２０℃ですらこの界面活性剤中で不安定のように思われた。というのも、大きな蛍光シグナルが得られなかったからである。界面活性剤中の安定性について直接に進化した受容体は、野生型受容体（図９）と比較して、１２個から１４個の間のアミノ酸置換基を含有することがわかった。突然変異体の大部分は、主にヘリックス２、３、４、および７において、受容体の７つの膜貫通コア内で局所化され、多数の保存された置換基も受容体のＣ末端尾部の中にあることがわかった。興味深いことに、選択されたクローンのすべてが、高機能発現について同じライブラリから選択されたＡＤＲＡ１Ａ突然変異体中に同定されなかった置換基を含有し（Dodevski and Pluckthunの同じ箇所）、このことは、ＣＨＥＳＳが界面活性剤中での受容体安定性を特異的に向上させる低頻度突然変異体の濃縮を可能にすることを示唆する。ＮＴＳ１系ライブラリの選択と同様に、ＣＨＥＳＳは、今日までに報告されている最も界面活性剤安定ＡＤＲＡ１Ａアイソフォームを送達することができた。
【００４８】
２つの関連のないＧＰＣＲに対するＣＨＥＳＳの成功裏の適用は、ＣＨＥＳＳが、生物物理学的分析および結晶学スクリーンに完璧に適した強い界面活性剤に対して安定したＧＰＣＲを直接に生成するための新規で迅速な方法であることを示す。Ｔ４リソチームの融合に依存しない受容体をループのうち１つに進化させることにより、Ｇタンパク質との複合体の研究が簡易化される。ＣＨＥＳＳは、ペプチドまたはＧタンパク質自身すらなどのＧタンパク質模倣物の結合を有利にする受容体突然変異体の直接の選択を可能にし得、このことは、活性立体配座中で安定化される受容体の直接の選択を強化することができる。
【００４９】
付加的な多価電解質層を加えることによってカプセルの透過性を調整することができるので、ＣＨＥＳＳは、非ＧＰＣＲ膜タンパク質または酵素などの可溶タンパク質に適用されてもよい。これは微視的区画を形成する方法であり、およびしたがってこの点において油中水乳剤と同様である一方で、これは、バルク溶液からのおよびバルク溶液へのアクセスを小分子に与え、各々の区画は細菌細胞から直接に作製される。界面活性剤が利用される記載のものなどの適用例を油中水乳剤を用いて実行することはできない。通常は膜タンパク質可溶化および安定性テストなどの細胞破壊を必要とするであろうすべてのアッセイ、または細胞不透過蛍光発生基質を用いた酵素アッセイを、生きている細菌細胞から作製されるこれらの区画中で直接に今回行なうことができた。
【００５０】
ＣＨＥＳＳは長期にわたる安定性の研究に適している。なぜなら、一旦適切に封入されると、ＣＨＥＳＳカプセルは何週にもわたって安定しているからである。細菌細胞を半透過性安定カプセルに直接に変換することにより、個別の細胞溶解物と比較して、同時にテスト可能な試料の数がおそらくは５または６桁増える。膜タンパク質の研究の分野では、ＣＨＥＳＳが、ここに記載されるＧＰＣＲなどの強い界面活性剤に対して安定したタンパク質の直接進化と関連付けられる困難に対する一般的な解決策の一部をなすことができ、そのことがこれらの療法的に関連のあるタンパク質のより完全な理解に繋がることが望まれる。
【００５１】
材料および方法
プラスミド、受容体ライブラリ、および細菌発現
この研究でのすべてのクローニングおよび発現のために大腸菌株ＤＨ５αを用いた。これは、ＧＰＣＲエンコーディングプラスミドまたはライブラリおよび前述のように発現されたタンパク質に形質転換された（Sarkar et al.の同じ箇所：Dodevski and Pluckthunの同じ箇所）。
【００５２】
細胞の封入
ＬｂＬ封入のため、以下の変形例については、Hillberg et al.（同じ箇所）が記載した手順に従った。水平遠心分離機中で３８００ｒｃｆで遠心分離することにより、タンパク質発現後に細胞を採取し、ｐＨ７．４のＰＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコル（ＰＢＳ−Ｅ）で３回洗浄した。細胞は、０．２５ｍｇ／ｍｌの低分子量キトサン（Sigma Aldrich）を含有するｐＨ６．０のＰＢＳ−Ｅ中で再懸濁され、勢いよく混合された。水平遠心分離機中で１７００ｒｃｆで遠心分離することによって細胞が集められ、ｐＨ６．０のＰＢＳ−Ｅで洗浄され、その後、０．２５ｍｇ／ｍｌの低粘度アルギン酸（Sigma Aldrich）を含有するｐＨ６．０のＰＢＳ−Ｅ中で再懸濁され、勢いよく振られた。カプセルは、ｐＨ６．０のＰＢＳ−Ｅ中で３回洗浄され、最終的にｐＨ７．４のＰＢＳ−Ｅ中に再懸濁された。封入された試料の粒子性および蛍光性は、容積測定粒子計数能力を有するPartec CyFlow Space血球計算機を用いて特徴付けられた。ＦＡＣＳで測定されるリガンド結合アッセイでは、（Anaspecによって合成された）２０ｎＭのHiLyte Fluor６４７標識ＮＴ（８−１３）（ＨＬ−ＮＴ）に細菌細胞が少なくとも２時間露出され、その後遠心分離され、１回洗浄され、その後ＦＡＣＳ分析された。
【００５３】
透過電子顕微鏡法
未処理大腸菌培養がエッペンドルフチューブ中で遠心分離され、上澄みが破棄された。ペレットからの細胞がセルロース毛細管の中に引かれ、乾燥を防止するためにすぐに１−ヘキサデセンに浸漬された。メスを用いて約４ｍｍ長さのチューブが切断され、６ｍｍのアルミニウム検体担体の１５０μｍのウェルの中に移された。処理された大腸菌培養は、封止された２００μｌのピペット先端の中で遠心分離された。ろ紙で上澄みが除去され、封止された先端が切断され、ペレットは、６ｍｍのアルミニウム検体担体の１００μｍの空洞の中にピペットで直接に移された。試料は、１−ヘキサデセン中に漬けられた平らな６ｍｍのアルミニウム検体担体で挟まれ、ＥＭ  ＨＰＭ１００高圧凍結装置（Leica Microsystems、オーストリア、ウィーン）で高圧凍結された。試料は、ＡＦＳ２凍結置換ユニット（Leica Microsystems）中で、２％のＯｓＯ4を含有する無水アセトンで凍結置換された。試料は、３０℃／時の周期的な温度遷移勾配で、−９０℃で８時間、−６０℃で８時間、−３０℃で８時間、および０℃で１時間置換された。次に、試料は、４℃で無水アセトンで２回洗浄され、エポン／アラルダイト（登録商標）中に埋込まれた。断面は、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で後染色され、GatanＣＣＤカメラ（１ｋ×１ｋ）およびデジタル顕微鏡写真取得ソフトウェア（Gatan GmbH、ドイツ、ミュンヘン）を用いて、Phillips ＣＭ１２透過電子顕微鏡（ＦＥＩ、オランダ、アイントフォーヘン）中で画像化された。
【００５４】
ライブラリからの界面活性剤安定ＧＰＣＲの選択
ＧＰＣＲライブラリで形質転換された大腸菌培養は、封入され、完全プロテアーゼ阻害剤（Roche）、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコル、および２％のＤＭ（ＰＢＳ−Ｅ（ＤＭ））を含有するｐＨ７．４のＰＢＳ−Ｅで処理された。「３０３ライブラリ」での選択について、初期選択ラウンドは、リガンドなしで勢いよく振ることによって、２％のＤＭで２０℃で３時間、その後２０ｎＭのＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ標識ＮＴ（８−１３）（ＦＬ−ＮＴ）（Sarkar et al.の同じ箇所）の存在下で２０℃で２時間、封入されたナイーブライブラリの免疫性をテストすることに係った。カプセルは、ＦＩＴＣチャネル中の上位０．５−１％のの蛍光カプセルのＦＡＣＳ選択の前に、ＰＢＳ−Ｅ（ＤＭ）溶液で２回洗浄された。遺伝子情報は、５分間の超音波水浴中でのカプセルの超音波破壊後に、特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅により、選別されたカプセルから回収された。２ラウンド目および３ラウンド目の選択では、カプセルは、１ラウンド目のように、ＰＢＳ−Ｅ（ＤＭ）中で３時間可溶化され、その後１時間の間２０ｎＭのＦＬ−ＮＴが加えられ、その後、カプセルは、遠心分離によって集められ、２％のＯＧ（ＰＢＳ−Ｅ（ＯＧ））および２０ｎＭのＦＬ−ＮＴを含有するＰＢＳ−Ｅ中に再懸濁された。カプセルは、ＰＢＳ−Ｅ（ＯＧ）中２０ｎＭのＦＬ−ＮＴ中で１回洗浄されて効率的な界面活性剤交換を促進し、その後、リガンドがある状態で２％のＯＧ中で２時間インキュベートされた。カプセルは、ＰＢＳ−Ｅ（ＯＧ）中で２回洗浄され、蛍光カプセルの上位０．５−１％がＦＡＣＳで選別された。
【００５５】
ＡＤＲＡ１Ａライブラリ選択については、ラウンド毎に同一条件で３ラウンドの選択が行なわれた。カプセルは、２００ｎＭのＢＯＤＩＰＹ−ＦＬプラゾシン（Invitrogen）（ＦＬ−プラゾシン）を含有する、１％のＤＤＭ、０．５％のＣＨＡＰＳ、ＰＢＳ中０．１％、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４の３０％のグリセロールで可溶化された。カプセルは、１％のＤＤＭ、０．５％のＣＨＡＰＳ、ＰＢＳ中０．１％のＣＨＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４の３０％のグリセロールで２回洗浄され、蛍光カプセルの上位０．５−１％がＦＡＣＳで選別された。
【００５６】
界面活性剤安定性について選択されたクローンをスクリーニング
選択の最終ラウンドから増幅されたＰＣＲフラグメントは、Ｃ末端ｓｆＧＦＰ−Ａｖｉタグ融合を含有するベクターにクローニングされた。Ｃ末端Ａｖｉタグを有するＧＰＣＲの発現は、インビボでビオチン化された受容体の高い百分率を発生すると以前示された（Dodevski and Pluckthunの同じ箇所）。受容体は、２４ディープウェルプレート中に発現され、細胞は、５０ｍｇ／ｍｌのニワトリリソチーム（Sigma Aldrich）を含有するＰＢＳ−Ｅ（ＤＭ）中で可溶化された。プレートは、超音波水浴中で５分間超音波分解され、その後勢いよく振りながら２０℃で３時間インキュベートされた。細胞の破片が遠心分離で除去され、可溶化された受容体を含有する上澄みが、ストレプトアビジンでコーティングされた常磁性ビーズ（Invitrogen）で、「３０３」ライブラリメンバーの場合は４℃で１時間２０ｎＭのＨＬ−ＮＴで、インキュベートされた。溶液が混合され、ビーズは、kingfisher FLEX磁性粒子プロセッサ（Thermo scientific）を用いて９６ディープウェルプレート中で操作された。「３０３ライブラリ」メンバーについては、受容体でコーティングされたビーズは、２０ｎＭのＨＬ−ＮＴを含有するＰＢＳ−Ｅ（ＯＧ）の２つの後続の界面活性剤交換溶液の中に移された。ＯＧへの２時間または１００時間の露出の後、ビーズは、ＰＢＳ−Ｅ（ＯＧ）の中で１回洗浄され、その後ウェル当たり１００μｌのＰＢＳ−Ｅ（ＯＧ）中の底が透明の黒い９６−ウェルマイクロプレート（Greiner）に移された。ＨＬ−ＮＴおよびｓｆＧＦＰ蛍光レベルは、ＨＬ−ＮＴについては６３０ｎｍおよびｓｆＧＦＰについては４８８ｎｍでの励起により、Ｍ１０００ダブルモノクロメータ方式蛍光プレートリーダ（Tecan）を用いて、各々のウェルの中で測定された。ＨＬ−ＮＴについては６６８ｎｍの、ｓｆＧＦＰについては５１２ｎｍの蛍光発光シグナルが測定された。
【００５７】
単一ＡＤＲＡ１Ａクローン分析については、赤蛍光標識リガンドの利用不可能性は、可溶化された受容体へのリガンド結合を定量化するのに3Ｈ−標識プラゾシン（Invitrogen）を用いる必要があることを意味した。発現および可溶化は、２０℃で、５０ｍｇ／ｍｌのニワトリリソチームおよび２０ｎＭの［3Ｈ］プラゾシンでさらに補完された１％のＤＤＭ、０．５％のＣＨＡＰＳ、０．１％のＣＨＳ、および３０％のグリセロール（ＰＢＳ−Ｅ（ＤＣＣ））を含有するｐＨ７．４のＰＢＳ−Ｅのより弱い界面活性剤混合物を用いて、上記のように行なわれた。磁性ビーズへの結合および洗浄の後、データ点当たりの最終ビーズ溶液の３／４（１５μｌ）が、２００μｌのOptiPhase Supermixカクテル（PerkinElmer）中に再懸濁され、液体シンチレーションカウンタ（1450 Microbeta plus；PerkinElmer）上で3Ｈカウントが測定された。ビーズ溶液の残余の１／４は、１００μｌのＰＢＳ−Ｅ（ＤＣＣ）中に再懸濁され、各試料のｓｆＧＦＰ蛍光が上記のように測定された。
【００５８】
熱安定性アッセイ
ＮＴＳ１関連受容体は、２０℃で、２０−２４時間の間、２００ｍｌの培養中で発現された。細胞は遠心分離によって採取され、ＰＢＳ−Ｅで１回洗浄され、細胞は超音波分解（Sonifier 250、Branson）によって破壊された。溶解された細胞は遠心分離で集められ、上澄みが破棄された。ペレットは、３時間勢いよく振りながら、２０℃で、５０ｍｇ／ｍｌのニワトリリソチームを含有するＰＢＳ−Ｅ（ＤＭ）中で可溶化された。不溶材料は遠心分離で除去され、ストレプトアビジンでコーティングされた常磁性ビーズに上澄みが露出された。可溶化された受容体は、４℃で１時間ビーズに結合され、その後リガンドなしでＰＢＳ−Ｅ（ＤＭ）またはＰＢＳ−Ｅ（ＯＧ）のいずれかを含有する新しい容器に移されて１５分間混合された。ビーズは、リガンド（または競合物）ありまたはなしで、ＰＢＳ−Ｅ（ＤＭ）またはＰＢＳ−Ｅ（ＯＧ）を含有する新しい容器中に再懸濁された。ビーズ含有溶液は、９６ウェルＰＣＲプレートの行に沿って分散され、勾配ＰＣＲサイクラ（Biometra）を用いて３０分間熱処理された。リガンドは、加熱の前または後に１．５時間、受容体でコーティングされたビーズでインキュベートされた。ビーズは、関連の界面活性剤溶液中で１回洗浄され、その後底が透明な黒い９６−ウェルマイクロプレート中で再懸濁され、各々のウェルの残余の蛍光強度が上記のように測定される。GraphPad Prismを用いたデータの非線形回帰フィッティングを用いて、見掛け上のＴ１／２の値が規定された。
【００５９】
ＡＤＲＡ１Ａ由来クローンについては、発現および超音波分離が上記のように行なわれたが、ペレットは、リガンドの不在下で３時間勢いよく振りながら、２０℃で５０ｍｇ／ｍｌのニワトリリソチームを含有するＰＢＳ−Ｅ（ＤＣＣ）中で可溶化された。熱処理およびリガンド処理が上記のように行なわれ、放射性リガンド結合アッセイおよび曲線当てはめが前述のように行なわれた（Dodevski and Pluckthunの同じ箇所）。
【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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