(57)【要約】  本発明の主題は、医薬として使用するための、特に多発性骨髄腫を治療するための、デルフィニジンおよびスルホアルキルエーテルβシクロデキストリンの複合体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として使用するための、デルフィニジンおよびスルホアルキルエーテル β−シクロデキストリンの複合体。
【請求項２】
多発性骨髄腫の治療において使用するための、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
スルホアルキルエーテル β−シクロデキストリンが、スルホブチルエーテル β−シクロデキストリンであることを特徴とする、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項４】
スルホアルキルエーテル基によるシクロデキストリンの置換度が、３〜８、好ましくは４〜８、より好ましくは５〜８、より好ましくは６〜７であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５】
多発性骨髄腫が、病期Ｉの多発性骨髄腫、病期ＩＩの多発性骨髄腫、病期ＩＩＩの多発性骨髄腫、無症候性多発性骨髄腫、症候性骨髄腫、最近診断された多発性骨髄腫、応答性多発性骨髄腫、安定性多発性骨髄腫、進行性多発性骨髄腫、再発性多発性骨髄腫および難治性多発性骨髄腫からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
ボルテゾミブ、メルファラン、プレドニゾン、ビンクリスチン、カルムスチン、シクロホスファミド、デキサメタゾン、サリドマイド、ドキソルビシン、シスプラチン、エトポシドおよびシタラビンからなる群から選択される少なくとも１つの治療剤を有効量にてさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７】
放射線療法および／または幹細胞移植を受けているか、あるいは放射線療法および／または幹細胞移植の準備をしている対象における多発性骨髄腫の治療において使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８】
医薬的に許容し得る担体をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９】
経口、非経口（例えば、皮下、筋肉内および静脈内）、経眼、経肺および経鼻からなる群から選択される形式で投与するための製剤形態にある、請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１０】
経口投与形態が錠剤またはカプセルであることを特徴とする、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
非経口投与形態が、液剤、懸濁剤または分散剤であることを特徴とする、請求項９に記載の複合体。
【請求項１２】
経眼、経肺および経鼻投与形態が、エアゾール剤、液剤、懸濁剤または分散剤であることを特徴とする、請求項９に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療のための医薬としてのアントシアニジンおよびスルホアルキルエーテルβ-シクロデキストリンの複合体、ならびにアントシアニジンまたはその塩を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アントシアニジン類は、殆どの陸上高等植物に存在する抗酸化特性を有するジモクロミック色素（zymochromic pigments）である。アントシアニジン類は、非糖部分（アグリコン）であり、そして糖部分を有するアントシアン類（グリコシド）と密接に関連しており、これら双方はアントシアン類という総称の下に分類される。
【０００３】
多発性骨髄腫とは、形質細胞の変性である。形質細胞は、疾患および感染に対抗するために抗体を産生する免疫系の細胞である。これらの細胞は、血流により、特に骨髄に移送され、移送された箇所で蓄積して、永続的な損傷を正常組織に引き起こす。この重大な症候は、骨折、カルシウムレベルの増加（カルシウム過剰症）、または腎不全である。骨の損傷の原因は、骨髄腫細胞の急激な増殖および骨質の再吸収に関与し得る破骨細胞を活性化する破骨細胞アクチベーターＩＬ-６の遊離にあり、この結果として、骨質損傷が生じ、ひいては骨折へと至る。骨髄内の骨髄腫細胞が、正常な細胞と入れ替わるので、正常な血液細胞（特に、白血球細胞、加えて赤血球細胞）の生成にも影響が及び、一次的には感染リスクを増加させ、二次的には貧血に至る可能性がある。血小板数が低下することにより、血液凝固もまた低下する。高用量の化学療法および自家幹細胞移植により、平均余命が数年間引き延ばされ得るとしても、疾患診断後の６ヶ月時の罹患患者の平均余命は不十分である。それ故に、代替的かつ効果的な治療策および治療方法について緊急の必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、多発性骨髄腫の治療のために有効な医薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この目的は、請求項１〜２に記載のアントシアニジンおよびスルホアルキルエーテル β-シクロデキストリンの複合体により達成される。本発明の有利な実施態様は、サブクレームに開示される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
原文に対応する記載なし。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本明細書に使用される幾つかの用語を先に説明する。
【０００８】
本発明の複合体または本発明の組成物は、多発性骨髄腫に罹患している対象または個体を治療するために使用される。用語「対象」には、生存している動物およびヒトが含まれる。用語「少なくとも１つのアントシアニジンを含む組成物」には、別の成分を含まないアントシアニジン自体が含まれる。この治療の目的は、少なくとも部分的に骨髄腫細胞を殺傷または中和することである。「中和」または「殺傷」とは、本発明の内容においては、骨髄腫細胞増殖を、少なくとも部分的に破壊、分解、不活性化または防止することを意味する。「多発性骨髄腫」とは、形質細胞の癌である。多発性骨髄腫の病期は、国際病期分類システム（ＩＳＳ）により規定され得る。このＩＳＳは、β2-ミクログロブリン（β2−Ｍ）およびアルブミンに関する血液の試験結果の評価に基づいている（この各々２つの組合せにより、その他の試験因子と比較して、多発性骨髄腫について最も信頼できる予後診断が可能となる）。骨髄腫のためのＩＳＳに対応する診断基準の様々な病期は、次のとおりである；病期Ｉ：β２−Ｍ ３.５ ｍｇ／ｄＬかつアルブミン＞３.５ ｇ／ｄＬ、病期ＩＩ：β２−Ｍ＜３.５ ｍｇ／ｄＬまたはβ２−Ｍ ３.５〜５.５ ｍｇ／ｄＬ、かつアルブミン＜３.５ ｇ／ｄＬ、ならびに病期ＩＩＩ：β２−Ｍ＞５.５ ｍｇ／ｄＬ。多発性骨髄腫の病期は、通常、様々な骨髄腫カテゴリーのうちの一つに分類される。多発性骨髄腫は、無症候性または症候性であり得る。無症候性骨髄腫患者においては、臓器および組織の障害や症候は見られない。骨髄腫を原因とする臓器または組織の障害には、カルシウム過剰症、腎臓機能不全、貧血および骨の損傷が挙げられる。無症候性骨髄腫には、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）および病期Ｉの多発性骨髄腫が挙げられる。ＳＭＭは、モノクローナルタンパク質および骨髄中の形質細胞の若干の増加を特徴とする。無痛性多発性骨髄腫（ＩＭＭ）は、少量のモノクローナルタンパク質および骨髄中の形質細胞数の増加を特徴とする。多発性骨髄腫罹患患者は、その病状によっても特徴付けられる。この病状とは、患者が既に治療を受けているかどうか、またもし受けていれば、どのような結果であったかを基準にして決定される。再度または繰り返して疾患の診断を受けた患者は、本発明の内容において、骨髄腫に罹患しており、かつ既に治療を受けた個体である。既に治療を受けた患者は、下記に説明される様々な分類に入る。応答性疾患：治療に対して、Ｍ-タンパク質レベルが少なくとも５０％まで低下するような応答をする骨髄腫をいう；安定性疾患：治療に対して、応答しない（即ち、Ｍ−タンパク質レベルが５０％まで低下しない）が、さらに進行はしない（即ち、分解が起こらない）骨髄腫をいう；進行性疾患：分解がおこる活動性の骨髄腫をいう（即ち、Ｍ-タンパク質レベルの増加、かつより重大な臓器および組織の障害をいう）。主要な症例において、下記に言及される再発性疾患および／または難治性疾患は、進行性疾患として分類されてもよい。再発性疾患：最初は治療に対して応答するが、その後に進行性病期に戻る骨髄腫をいう。難治性疾患：ファーストラインの治療に対して応答しない骨髄腫、ならびにその後の治療にもはや応答しない再発性の骨髄腫の両方をい���。後者は、再発性疾患ということもできる。
【０００９】
本発明は、多発性骨髄腫に罹患している対象の治療方法であって、治療上有効量の本発明の複合体または本発明の組成物を該対象に投与する方法に関する。多発性骨髄腫は、あらゆる病期、上記したカテゴリーまたは病状にて治療され得る。本発明の複合体または組成物は、多発性骨髄腫の１以上の症候を低減させるために、単独にて、または少なくとも１つの別の治療剤と組み合わせて投与することができる。本発明の複合体または組成物は、別の治療剤と同時に投与されてもよく、これは同一組成物の構成成分であっても、または別の組成物中にて提供されてもよい。別法としては、本発明の複合体または組成物は、別の治療剤の投与前後に投与されてもよい。本発明の複合体または組成物は、別の治療剤と同一のまたは別の投与経路により投与されてもよい。この治療剤とは、化学療法剤、補助的治療剤またはその組合せであってもよい。「化学療法剤」とは、癌細胞に毒性である剤であり得る。本発明の内容において使用され得る化学療法剤の例示には、ボルテゾミブ（Velcade（登録商標）、Millennium社）、メルファラン、プレドニゾン、ビンクリスチン、カルムスチン、シクロホスファミド、デキサメタゾン、サリドマイド、ドキソルビシン、シスプラチン、エトポシドおよびシタラビンが挙げられる。本発明の特に好ましい実施態様において、本発明の複合体または組成物は、ボルテゾミブ（Velcade（登録商標））と組み合わせて使用される。本発明のさらに好ましい実施態様において、本発明の複合体または組成物は、メルファランと組み合わせて使用される。「補助的治療剤」とは、多発性骨髄腫の症候および合併症を低下させるために使用される剤である。補助的治療剤の例示には、ビスホスホネート類、成長因子類、抗生物質類、利尿薬および鎮痛剤が挙げられる。抗生物質の例示には、硫黄含有薬剤類、ペニシリン類（例えば、ベンジルペニシリン、ｐ−ヒドロキシベンジルペニシリン、２−ペンテニルペニシリン、N−ヘプチルペニシリン、フェノキシメチルペニシリン、フェネチシリン、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、ナフシリン、アンピシリン、アモキシシリン、シクラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、アゾロシリン、メズロシリン、メシリナム、アムジノシリン）、セファロスポリンおよびその誘導体（例えば、セファロシン、セファピリン、セファセトリル、セファゾリン、セファレキシン、セファンジン、セファドロキシル、セファマンドール、セフロキシム、セフォラニド、セホキシチン、セフォテタン、セファクロル、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、モキサラクタム、セホペラゾン、セフィキシム、セフチブテンおよびセフプロジル）、オキソリン酸、アミフロキサシン、テマフロキサシン、ナリジクス酸、ピロミド酸、シプロフロキサシン、シノキサシン、ノルフロキサシン、パーフロキサシン、ロサキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ピペミジン酸、スルバクタム、クラブリン酸、β-ブロモペニシラン酸、β−クロロペニシラン酸、６−アセチルメチレンペニシラン酸、セファオキサゾール、スルタミシリン、アムジノシリンおよびスルバクタムのホルムアルデヒドハイドレートエステル、タゾバクタム、アズトレオナム、スルファゼチン、イソスルファゼチン、ノルカルジシン類、ｍ−カルボキシフェニル、フェニルアセトアミドメチルホスホネート、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、デオキシサイクリン、メタサイクリンおよびミノサイクリンが挙げられる。ビスホスホネート類の例示には、エチドロネート（Didronel）、パミドロン酸（Aredia）、アレンドロネート（Fosamax）、リセドロネート（Actonel）、ゾレドロネート（Zometa）、イバンドロネート（Boniva）が挙げられる。利尿薬の例示には、チアジド誘導体、例えば、アミロライド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、メチルクロロチアジドおよびクロルタリドンが挙げられる。成長因子類の例示には、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、マクロファージコロニー-刺激因子（M-CSF）、マルチコロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、オンコスタチンMおよびインターロイキン類が挙げられる。鎮痛剤の例示には、オピエート類（例えば、モルフィン）、ＣＯＸ-２阻害剤類（例えば、ロフェコキシブ、バルデコキシブおよびセレコキシブ）、サリチレート類（例えば、アスピリン、コリンマグネシウムトリサリチレート、サルサレート、ジルニサルおよびサリチル酸ナトリウム）、プロピオン酸誘導体（例えば、フェノプロフェンカルシウム、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセンおよびナプロキセンナトリウム）、インドール酢酸誘導体（例えば、インドメタシン、スルフィンダック、エトドラクおよびトルメチン）、フェナメート（例えば、メフェナム酸およびメクロフェナメート）、ベンゾチアジン誘導体またはオキシカム類（例えば、モービックまたはピロキシカム）またはピロロ乳酸（例えば、ケトロラク）が挙げられる。
【００１０】
用語「治療」とは、本発明の内容において、下記に特定した結果を完全または部分的に達成することを意味する：臨床像を完全または部分的に低下させること；該疾患と関連のある少なくとも１つの臨床的症候または指標を改善すること；該疾患の進行を遅延、抑制または防止すること；または、該疾患の開始または発症を、完全または部分的に遅延、抑制または防止すること。処置される対象は、ヒトまたは動物、好ましくは哺乳類である。獣医学的医療処置、さらに家畜または野生動物の治療（例えば、ヒツジ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ）には、実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、サル）もまたふくまれる。
【００１１】
本発明の一実施態様において、本発明の複合体または組成物を、所望により別の治療剤と共に治療される対象は、放射線療法が施与される、および／または幹細胞療法のために準備される。本発明の複合体または組成物を、導入療法の経過中に用いて、好ましくは所望により別の治療剤と組み合わせて用いて、幹細胞の移植前に予め腫瘍量を低減させることができる（しかし、移植前だけでなく、幹細胞の移植期間中および／または幹細胞の移植期間後であってもよい）。
【００１２】
本発明の複合体または組成物は、好ましくは医薬組成物として提供かつ投与される。用語「医薬組成物」には、１以上の有効成分、および１つの有効成分または複数の有効成分のための担体として機能する１以上の不活性物質を含む。医薬組成物は、本発明の複合体または組成物の経口、非経口（皮下、筋肉内および静脈内）、経眼、経肺または経鼻投与を可能とする。非経口投与形態は、例えば、液剤、懸濁剤または分散剤であってもよい。経眼、経肺または経鼻投与形態は、例えば、エアロゾル、溶液剤、懸濁剤または分散剤であってもよい。製剤および投与のための適切な技術は、従来技術により公知である；例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」（Mack Publishing Co., Easton Pa.を参照されたい）。例えば、本発明の組成物および複合体は、医薬的に許容し得る担体 （例えば、生理食塩水）を用いて対象に静脈内投与される。水溶液中、好ましくは生理学的に許容できる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液または生理学的緩衝生理食塩水）中の製剤は、注射に適切である。非経口投与（静脈内、皮下、筋肉内および腹腔内投与を含む）のために、水性または油性溶液または固体製剤もまた有用である。該医薬組成物中の有効成分の割合は、変更することができ、通常単位用量あたり２〜６０重量％である。有効成分の割合は、有効用量が達成されるように適宜選択される。
【００１３】
「塩」または「医薬的に許容される塩」は、投与後に医薬的に有効な有効成分またはその有効な代謝物を遊離できる医薬的観点から許容され得る本発明の化合物のあらゆる塩である。本発明の組成物および複合体の塩は、無機または有機の酸および塩基から得られうる。
【００１４】
アントシアニジンは、「純粋形態」または「精製形態」で使用され得て、これは望ましくない成分が除去されることを意味する。
【００１５】
「アントシアニジン類」は、下記の基本構造を有する：
【化１】
2015534970.tif 000002
上記式中の置換基は、水素、水酸基およびメトキシ基からなる群から選択される。
【００１６】
本発明のアントシアニジンと複合体形成され得るシクロデキストリン類は、α−１，４−グリコシド結合により結合されたグルコース分子の環状オリゴ糖である。β−シクロデキストリンは、７つのグルコース単位を有する。スルホアルキルエーテルβ−シクロデキストリンの場合には、スルホアルキルアルコール中のグルコース単位の水酸基がエーテル化される。本発明によれば、一般的には、β−シクロデキストリンの２１のヒドロキシル基の内の幾つかのヒドロキシル基のみがエーテル化される。スルホアルキルエーテルシクロデキストリンの製造は、当業者には十分知られており、例えばＵＳ ５,１３４,１２７またはＷＯ ２００９／１３４３４７ Ａ２に記述されている。
【００１７】
スルホアルキルエーテル基は、シクロデキストリン類の親水性または水溶性を高めるために、先行技術においてシクロデキストリンに用いられる。スルホアルキルエーテル基は、アントシアニジン類および対応する置換β-シクロデキストリンの複合体の安定性を増強するためにある程度寄与しており、このため酸化に対して特に感受性であるアントシアニジンの貯蔵安定性および製剤化能を実質的に改善する。本発明の複合体を、下記のより詳細な説明に示すとおり、貯蔵時に安定な水溶液または固体として製剤することができる。
【００１８】
本発明によれば、特に好ましいものは、スルホブチルエーテル β−シクロデキストリン（ＳＥＢ−β−ＣＤ）を用いる複合体形成である。本発明の保護範囲を限定するものではないが、これについての考えられる説明としては、陰性電荷を帯びたスルホブチルユニットが、陽性電荷を帯びたアントシアニジンと電気的に相互作用し、そしてアルキル基に関しては、ブチル基が、適切な立体相互作用が可能となる最適な長さを有することである。
【００１９】
シクロデキストリンのスルホアルキルエーテル基による置換度は、好ましくは３〜８、より好ましくは４〜８、より好ましくは５〜８、より好ましくは６〜７である。６〜７の平均置換度を有する適切なスルホブチルエーテル β−シクロデキストリンは、例えば、文献ＷＯ２００９/１３４３４７ Ａ２に記述されており、商品名Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）として市販されている。４〜５の置換度、例えば４.２の置換度を有する対応するシクロデキストリンも同じように使用され得る。
【００２０】
本発明の純粋形態、塩形態または複合体形態にて使用されるアントシアニジン類は、好ましくはオーランチニジン、シアニジン、デルフィニジン、ユーロピニジン、ルテオリニジン、ペラルゴニジン、マルビジン、ペオニジン、ペチュニジンおよびロシニジンからなる群から選択される。化学構造は、上記式Ｉに対応しており、以下の置換パターンを有する。
【表１】
2015534970.tif 000003
【００２１】
特に好ましいものは、本明細書においてデルフィニジンである。
本発明は、医薬として使用するための、特に多発性骨髄腫の治療のための本発明の組成物または本発明の複合体の水溶液にも関する。
【００２２】
本発明の複合体および対応する水溶液の製造は、以下の工程を含む：
ａ）スルホアルキルエーテル β−シクロデキストリンの水溶液を調製する工程、
ｂ）アントシアニジンを加えて混合し、該複合体を製造する工程。
【００２３】
工程ａ）において、使用したシクロデキストリンの５〜１０重量％を含む水溶液を調製することが好ましい。本発明の内容において、水溶液のｐＨは、アントシアニジン、好ましくはデルフィニジンの添加中または添加後、好ましくは添加前に、ｐＨ７未満、好ましくは６未満、より好ましくは５未満、さらに好ましくは４〜５に調整されるのが特に好ましい。このｐＨで、水溶液中でのより高い複合体濃度を確立することができることが示された。
【００２４】
塩化物として計算されるアントシアニジンの濃度は、好ましくは、少なくとも０.５ ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１.０ ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１.５ ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは２.０ ｍｇ／ｍｌである。好ましい実施態様において、特に好ましい濃度範囲である少なくとも２.０ ｍｇ／ｍｌは、特にｐＨ４〜５の水溶液中で確立される。
【００２５】
製造に関して、水溶液の構成要素を混合することは、攪拌することにより達成され、混合に要する好ましい時間は２〜２０時間である。この混合は、光誘導性の酸化を避けるために暗所で実施されるのが好ましい。
【００２６】
本発明は、医薬として使用するための、特に多発性骨髄腫の治療として使用するための固体に関するものであって、この固体は、本発明に従って、上記した本発明の水溶液から溶媒を除去することにより得ることができる。該除去は、好ましくはフリーズドライ（凍結乾燥）により実施できる。本発明の医薬用水溶液および医薬用固体の双方は、良好な貯蔵安定性を有する。
【００２７】
本発明は、添付の図面を参照して実施例においてさらに説明されるが、これは本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００２８】
Ｉ．アントシアニジンデルフィニジンおよびシクロデキストリン類の複合体の製造
１.使用材料：
【表２】
2015534970.tif 000004
塩化デルフィニジンは、Ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ社から購入した。
【００２９】
２．デルフィニジン含量の決定
逆相ＨＰＬＣ法を使用して、デルフィニジン含有組成物中の塩化デルフィニジン含量を決定した。下記試薬を、この目的のために使用した：
【表３】
2015534970.tif 000005
【００３０】
使用したカラムは、Ｗａｔｅｒｓ Ｘ ＢｒｉｄｇｅＴＭＣ１８、３５μｌ、１５０ｍｍ×４.６ｍｍであった。
【００３１】
移動相は以下の通りであった：
フェーズＡ：水９５０ｍｌ、メタノール５０ｍｌ、ギ酸１０ｍｌ
フェーズＢ：水５０ｍｌ、メタノール９５０ｍｌ、ギ酸１０ｍｌ
【００３２】
以下のグラジエントプログラムを使用した：
【表４】
2015534970.tif 000006
【００３３】
停止時間：３５分
分析後の時間（ポストタイム）：８分
流速：１ｍｌ／分
注入量：２０μｌ
カラム温度：３０℃＋／−２℃
ＵＶ-Ｖｉｓ検出器：アッセイ用には５３０μｍ、不純物検出用には２７５μｍ
インテグレーター：面積
【００３４】
溶液およびサンプル調製：
希釈溶液１：１００ｍｌのメタノールおよび２.６ｍｌの１Ｍ ＨＣｌの混合液
希釈溶液２：１００ｍｌの４０％メタノールおよび２.６ｍｌの１Ｍ ＨＣｌの混合液
【００３５】
キャリブレーション溶液：デルフィニジンの標準液を、１０ｍｌのフラスコ内で１０ｍｇの塩化デルフィニジンを秤量して、希釈溶液１にそれを溶解することにより調製した。溶解後に、該溶液を、約０.１ｍｇ／ｍｌの濃度とするために希釈溶液２を用いて約１０倍希釈した。
【００３６】
コントロールのキャリブレーション溶液を、同じ方法で調製した。塩化デルフィニジンは、溶液中では不安定であるため、キャリブレーション溶液を直ちにＨＰＬＣにより分析した。
【００３７】
試験溶液の調製：
本発明に従って調製した（調製については、下記を参照されたい）固体のデルフィニジン含量を決定するために、１０ｍｌのフラスコ内でおおよそ５０ ｍｇの組成物を秤量した。その後、該組成物を、希釈溶液２に希釈して、おおよそ０.１ ｍｇ／ｍｌのデルフィニジン濃度が確立されるまで、同希釈溶液２を用いてさらに希釈した。
【００３８】
サンプル中のデルフィニジン含量の決定を、記載した外部標準によるキャリブレーションを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを利用して計算した。
【００３９】
実施例１：デルフィニジンおよびＳＢＥ−β−ＣＤの複合体形成
この実施例において、種々のシクロデキストリンによるデルフィニジンとの複合体形成および水溶液中の該複合体の溶解度を試験した。
【００４０】
１０重量％の各シクロデキストリンを含む中性の水溶液を調製した。β-ＣＤが難水溶性であるため、２重量％濃度のみを選択した。
【００４１】
５ｍｌのシクロデキストリン水溶液および５ｍｌの純水を各々、ガラスフラスコに入れた。その後、過剰量の塩化デルフィニジンを添加した。所要過剰量は、α-、β-およびγ-シクロデキストリン溶液について１０ｍｇであり、ＨＰＢＣＤ（２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）およびＳＢＥ−β−ＣＤ溶液については１５ｍｇであった。
【００４２】
該懸濁液を、暗所において３０℃で２０時間攪拌した。その後、その懸濁液を、孔径０.２２μｍのメンブレンフィルターを通して濾過した。
【００４３】
達成可能な溶解度を、下記表１に示す。
【表５】
2015534970.tif 000007
【００４４】
複合体および複合体形成により達成される溶解度の増加は、その他のシクロデキストリン類よりもＳＢＥ-β-ＣＤが非常に良好であることが判った。
【００４５】
実施例２：ｐＨの影響
この実施例において、水溶液中のデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤの溶解度に対するｐＨの影響を試験した。ＳＥＢ−β−ＣＤの水溶液を、実施例１の方法に従って調製したが、これらの溶液のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌを用いて表２に記載した酸性ｐＨ値に調整した。その後、塩化デルフィニジンを、実施例１の方法に従って加えて、さらなる処理を行った；唯一の例外は、攪拌時間を２.５時間に制限したことである。結果を、下記表２に示す。
【表６】
2015534970.tif 000008
【００４６】
複合体形成した塩化デルフィニジンのｐＨ値４〜５での溶解度は、中性ｐＨと比較して、およそ３倍増加するということが判る。
【００４７】
実施例３：本発明の固体の調製
この実施例において、本発明の複合体を、固体として製剤する。比較目的のために、デルフィニジン／ＨＰＢＣＤ複合体およびデルフィニジン／デンプン製剤を、固体形態で製造する。
【００４８】
実施例３.１：デルフィニジン／ＳＢＥ−β−ＣＤ
５ｇのＳＥＢ−β−ＣＤを、４０ｍｌの蒸留水に溶解して、透明な溶液を得た。溶液のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ４.８に調整した。その後、０.１１ｇの塩化デルフィニジンを加えて、該混合液を、暗所にて２７℃で２時間攪拌した。この均質溶液を、０.４５μｍの孔径を有するニトロセルロースメンブレンフィルターを通して真空濾過した。該溶液を凍結させて、その後−４８℃、約１０.３ Ｐａ（７７ｍＴｏｒｒ）圧力下で凍結乾燥させた。該凍結乾燥物を、粉砕して、０.３ｍｍのメッシュサイズの篩を通して篩過した。
【００４９】
実施例３.２：デルフィニジン／ＨＰＢＣＤ
これを実施例３.１と同じ方法で処理したが、かなりの量のサンプルが濾過の間に濾去された。この事実は、実施例３.１のＳＢＥ-β-ＣＤを使用する場合よりも、可溶化効果が顕著に低いことを示している。
【００５０】
実施例３.３：デルフィニジン／デンプン製剤
５ｇのデンプンを、４０ｍｌの蒸留水に懸濁した。白色懸濁液を得た。該溶液のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌを用いて４.６に調整した。その後、０.１１ｇの塩化デルフィニジンを加えて、暗所にて２７℃で２時間攪拌した。得られた均質液体を、凍結乾燥させて、この固形物を粉砕して、実施例３.１のとおりに篩過した。
実施例３.１は本願のものであるが、実施例３.２および３.３は比較例である。
【００５１】
実施例４：安定性試験
実施例３.１〜３.３の固体を、下記条件下で貯蔵した：
−スクリューキャップ付き褐色ガラス容器内で、８日間、室温にて貯蔵、
−その後、ガラス容器内で、２２日間、室温、暗所、酸素雰囲気下にて貯蔵。
【００５２】
上記した貯蔵後期の２２日間、２０ｍｌ容量のガラスバイアル内で行なった。事前に既に８日間貯蔵された各サンプル（２５０ｍｌ）を、その中に入れ、該バイアルをラバーストッパーにより閉じて、密封した。２本の注射針により、バイアルのヘッドスペースを純酸素に置換した。その後、該サンプルを暗所にて貯蔵した。
【００５３】
固体のデルフィニジン含量（塩化デルフィニジンとして計算し、重量％で示した）を、上記ＨＰＬＣ法により決定した。結果を下記の表３に示す。
【表７】
2015534970.tif 000009
【００５４】
この結果は、純酸素雰囲気下であっても、良好な安定性、即ち良好な貯蔵適合性を有するデルフィニジン複合体を、本発明に従って調製できることを示している。この複合体は、水中、特に弱酸性溶液中で良好な溶解度も有しており、このためデルフィニジンを、本発明に従って様々な方法にて製剤することができる。本発明の固体安定性は、デンプンを含む製剤（実施例３.３）とほぼ同程度良好であったが、しかしこの比較例を水溶液として製剤することはできない。
【００５５】
実施例５：水溶液中の安定性試験
既に上記した方法と同様に、逆相ＨＰＬＣ法を使用して、デルフィニジン含有溶液中の塩化デルフィニジン含量を決定した。以下の試薬を、この場合に使用した：
【表８】
2015534970.tif 000010
【００５６】
使用したカラムは、Ｗａｔｅｒｓ Ｘ ＢｒｉｄｇｅＴＭＣ１８、３５μｌ、１５０ｍｍ×４.６ｍｍであった。
【００５７】
移動相は以下の通りであった：
フェーズＡ：水 ７７０ ｍｌ、メタノール ２３０ ｍｌ、ギ酸 １０ ｍｌ
フェーズＢ：水 ５０ ｍｌ、メタノール ９５０ ｍｌ、ギ酸 １０ ｍｌ
【００５８】
以下のグラジエントプログラムを使用した：
【表９】
2015534970.tif 000011
停止時間：2５分
分析後の時間（ポストタイム）：８分
流速：１ｍｌ／分
注入量：２０μｌ
カラム温度：３０℃＋／−２℃
ＵＶ-Ｖｉｓ検出器：アッセイ用には５３０μｍ、不純物検出用には２７５μｍ
インテグレーター：面積
【００５９】
溶液およびサンプル調製：
希釈溶液１：１００ｍｌのメタノールおよび２.６ｍｌの１Ｍ ＨＣｌの混合液
希釈溶液２：１００ｍｌの５０％メタノールおよび２.６ｍｌの１Ｍ ＨＣｌの混合液
キャリブレーション溶液：
デルフィニジン標準液を、１０ｍｌのフラスコ内で１０ｍｇ塩化デルフィニジンを秤量して、希釈溶液１にそれを溶解させることにより調製した。溶解後に、この溶液を、およそ０.１ｍｇ／ｍｌの濃度とするために、希釈溶液２を用いて約１０倍に希釈した。
【００６０】
コントロールのキャリブレーション溶液を同じ方法で調製した。塩化デルフィニジンは、溶液中では不安定であるため、該キャリブレーション溶液を直ちにＨＰＬＣにより分析した。
【００６１】
試験溶液の調製：
本発明の水溶液中のデルフィニジン含量を決定するために、実施例３.１のデルフィニジン／ＳＢＥ−β−ＣＤ（本願）およびデルフィニジン（比較例）を、１.５８４ ｍｇ／ｍｌ（本発明の実施例）または０.０２１６ ｍｇ／ｍｌ（比較例）の開始濃度（デルフィニジンを基準に）が確立されるまで、０.９％ ＮａＣｌ溶液に溶解させた。該溶液を、室温で調製して、その後暗所において３７℃で密閉バイアル内にて貯蔵した。
【００６２】
デルフィニジン含量を、１、２、３および４時間後に決定した。下記の表は、前述開始濃度の％として決定した含量を示すものである。
【表１０】
2015534970.tif 000012
【００６３】
サンプル中のデルフィニジン含量の決定を、記述した外部標準によるキャリブレーションを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを利用して計算した。
【００６４】
ＩＩ．イン・ビトロでの骨髄腫細胞に対するアントシアニジンのデルフィニジンおよびデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ複合体の効果
１．試験株および実験手順
イン・ビトロ実験において、マウス骨髄腫細胞株 ＭＯＰＣ−３１５（ＡＴＴＣカタログ番号ＴＩＢ−２３）に対する、デルフィニジン＋スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリン複合体：sulfobutyl ether β-cyclodextrin complex（下記のデルフィニジン＋ＳＢＥＢＣＤ）およびデルフィニジンの効果を、下記に記述したＢＬＩ（＝生物発光画像, bioluminescence imageing）測定およびＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング, fluorescence activated cell sorting）分析により試験した。使用した方法（ＢＬＩ測定およびＦＡＣＳ分析）は、特許文献および技術文献（例えば、ＦＡＣＳを基にした特許ＤＥ １８１５３５２ Ｃ１）から当業者には十分知られている。
【００６５】
２．ＢＬＩ測定
ＢＬＩ測定の結果を、図１〜１１に示し、治療生存細胞数についての情報を提供する。
【００６６】
初期実験において、デルフィニジン＋ＳＢＥＢＣＤおよびＳＢＥＢＣＤの効果を調べた。第一に、ＲＰＭＩ−１６４０細胞培地（１００ μｌ）中の対数増殖期の細胞を、２４ウェルのポリスチレン細胞培養プレート（４０００細胞／ウェル）に置いた。滅菌ＲＰＭＩ−１６４０を、コントロールとして用いた。１００ μｌのＲＰＭＩ−１６４０に溶解したデルフィニジン＋ＳＢＥＢＣＤまたはＳＢＥＢＣＤを、次いで図３（全て３連で測定した）に示したように事前に作成した連続希釈物に加えて、該細胞培養プレートを、３７℃で４８時間インキュベートした後、この培地を、純粋なＲＰＭＩ−１６４０（即ち、ＳＢＥＢＣＤまたはデルフィニジン＋ＳＢＥＢＣＤを含まない新規培地）に交換して、該プレートを、３７℃で４８時間、再度インキュベートした。この目視結果を、図１（デルフィニジン＋ＳＢＥＢＣＤ）、図２（ＳＢＥＢＣＤ）および図５（コントロール）に示した。
【００６７】
ウェル中の生存細胞数は、ＢＬＩ測定におけるウェル当たりに測定した放出光子数と相関しており、色彩を対応させることにより（赤＝多数のシグナル/殆ど放出光子がない；青色＝多数のシグナル/多数の放出光子）、ＢＬＩの図１、２および５に表される。図１は、デルフィニジン＋ＳＢＥＢＣＤの含量が増加するにつれて、その毒性は全細胞が完全に死滅するまで高くなるが、一方でＳＢＥＢＣＤは、高用量でさえ殆ど毒性がないことを示した。このことは図２から明らかである（図２中の「Ｘ」と示した最下列のウェルは、同濃度を入れた隣接するウェルの試験から明らかな失敗として除外した）。図６は、図１（デルフィニジン＋ＳＢＥＢＣＤ）および２（ＳＢＥＢＣＤ）にて視覚的に示した実験結果を、対照としてのコントロール（図５：培地のみ）を基準にした％としてまとめ直したものである。
【００６８】
デルフィニジン自体の効果を、同じ実験手順を用いて試験した。この目的のために、ＲＰＭＩ−１６４０細胞培地（１００ μｌ）中の対数増殖期の細胞を、２４ウェルのポリスチレン細胞培養プレート（４０００細胞／ウェル）に同様にして置いた。その後、溶解した塩化デルフィニジン（１０％ＤＭＳＯおよび９０％Ｈ２Ｏ中に溶解）（１００ μｌ）を、図９に記載した濃度にて加えて（全て３連で測定）、この細胞培養プレートを、３７℃で４８時間インキュベーションした後に、培地を、純粋なＲＰＭＩ−１６４０（即ち、デルフィニジンを含まない新規培地）に交換して、プレートを３７℃で４８時間再度インキュベートした。このプレートについての視覚的結果を、図８（塩化デルフィニジン）および１０（コントロール：滅菌ＲＰＭＩ−１６４０）に示した。細胞に対するＤＭＳＯの効果を確認できるように、更に２つのコントールを追加して、並行して分析した［図８および９、「ＤＭＳＯ高濃度」（１００μｇ／ｍｌ ＤＭＳＯ）（１００ μｌ）および「ＤＭＳＯ低濃度」（５０ μｇ／ｍｌ ＤＭＳＯ）（１００ μｌ）を添加した後の各場合のウェルの最下列］。図１１は、図８（塩化デルフィニジン）にて視覚的に示した実験結果を、対照としてのコントロール（図１０：培地のみ）を基準にした％として、まとめ直したものである。
【００６９】
３．ＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳ分析の結果は、図１２（デルフィニジン＋ＳＢＥＢＣＤ）、１３（ＳＢＥＢＣＤ）、１４（塩化デルフィニジン）、１５（対照としてコントロールに基づいた、デルフィニジン＋ＳＢＥＢＣＤおよびＳＢＥＢＣＤ）および１６（対照としてコントロールに各場合に基づいた、塩化デルフィニジン、「ＤＭＳＯ高濃度」および「ＤＭＳＯ低濃度」）に示され、またＦＡＣＳ分析のためにヨウ化プロピジウムで予め染色された死亡細胞数についての情報を示す。
【００７０】
ＢＬＩ測定およびＦＡＣＳ分析の実験結果を、下記のとおりに要約できる：
−デルフィニジン＋ＳＢＥＢＣＤおよびデルフィニジン（塩化デルフィニジン）は、イン・ビトロでヒト骨髄腫細胞を死滅させる。
−この効果は、用量依存様式にて増大する（高用量にて全細胞が実質的に死滅する）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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