(57)【要約】  本開示は、エンテロウイルスを直接的に検出するためのポイントオブケア側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイに係る。特に、本開示は、エンテロウイルスに対して特異的な抗体を使用して、手、足および口腔疾患(HFMD)に係る病因的病原体を検出するための、ポイントオブケア側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイに関する。
2015529830.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロウイルスの存在を検出するための側方流動テストストリップであって、該テストストリップが、
複数の検出体分子を含むコンジュゲートパッド、および
複数の捕捉分子を含むテストライン
を含み、該テストストリップがエンテロウイルスを検出することを特徴とする、前記側方流動テストストリップ。
【請求項２】
前記テストストリップが、エンテロウイルスの検出に対して特異的である、請求項1記載の側方流動テストストリップ。
【請求項３】
前記テストストリップが、エンテロウイルスの検出に対して100％特異的である、請求項1または2記載の側方流動テストストリップ。
【請求項４】
前記検出体分子各々が、検出可能な粒子が結合された、第一の抗原特異的抗体を含む、請求項1〜3の何れか1項に記載の側方流動テストストリップ。
【請求項５】
前記検出可能な粒子が、金製ナノ粒子を含む、請求項4記載の側方流動テストストリップ。
【請求項６】
前記第一の抗原特異的抗体が、ウイルス表面タンパク質の第一の領域に対して特異的である、請求項4または5記載の側方流動テストストリップ。
【請求項７】
前記捕捉分子各々が、第二の抗原特異的抗体を含む、請求項1〜6の何れか1項に記載の側方流動テストストリップ。
【請求項８】
前記第二の抗原特異的抗体が、前記ウイルス表面タンパク質の第二の領域に対して特異的である、請求項7記載の側方流動テストストリップ。
【請求項９】
前記テストストリップが、約30分以内にテスト結果を与える、請求項1〜8の何れか1項に記載の側方流動テストストリップ。
【請求項１０】
前記テストストリップが、約20分以内にテスト結果を与える、請求項1〜9の何れか1項に記載の側方流動テストストリップ。
【請求項１１】
前記テストストリップが、約10分でテスト結果を与える、請求項1〜10の何れか1項に記載の側方流動テストストリップ。
【請求項１２】
前記テストストリップが、約90％以上の精度でテスト結果を与える、請求項1〜11の何れか1項に記載の側方流動テストストリップ。
【請求項１３】
前記テストストリップが、約95％以上の精度でテスト結果を与える、請求項1〜12の何れか1項に記載の側方流動テストストリップ。
【請求項１４】
前記テストストリップが、約99％以上の精度でテスト結果を与える、請求項1〜13の何れか1項に記載の側方流動テストストリップ。
【請求項１５】
前記テストストリップが、約100％なる精度でテスト結果を与える、請求項1〜14の何れか1項に記載の側方流動テストストリップ。
【請求項１６】
前記エンテロウイルスが、1種以上のエンテロウイルスを含む、請求項1〜15の何れか1項に記載の側方流動テストストリップ。
【請求項１７】
前記テストストリップが、ポイントオブケア側方流動テストストリップである、請求項1〜16の何れか1項に記載の側方流動テストストリップ。
【請求項１８】
請求項1〜17の何れか1項に記載の側方流動テストストリップの製造方法であって、該方法が：
コンジュゲートパッドを製造すること；
検出体分子を含む検出体分子溶液を調製すること；および
該コンジュゲートパッドを、該検出体分子溶液に浸すこと、
を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項１９】
1種以上のエンテロウイルスを検出するための診断用キットであって、該診断用キットが、請求項1〜17の何れか1項に記載の側方流動テストストリップを含むことを特徴とする、前記キット。
【請求項２０】
更に、生物学的流動性サンプルを採集するためのサンプル採集デバイスを含む、請求項19記載の診断用キット。
【請求項２１】
側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイを用いた、エンテロウイルスの存在を測定する方法であって：
サンプルを準備すること；
複数の検出体分子および複数の捕捉分子を含む、側方流動テストストリップを準備すること；
該サンプルを該側方流動テストストリップのサンプルパッドに添加すること；および
該サンプルを該複数の検出体分子に暴露すること、
を含むことを特徴とする、前記エンテロウイルスの存在を測定する方法。
【請求項２２】
前記検出体分子各々が、検出し得る粒子が結合された第一の抗原特異的抗体を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
前記検出し得る粒子が、金製ナノ粒子を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記第一の抗原特異的抗体が、ウイルス表面タンパク質を含むウイルス抗原に対して特異的であり、前記サンプルがエンテロウイルスを含む場合には、該第一の抗原特異的抗体が、該ウイルス表面タンパク質に結合して、1以上の第一の複合体を形成し、該サンプルがエンテロウイルスを含まない場合には、該第一の抗原特異的抗体が、該ウイルス表面タンパク質に結合しない、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
前記捕捉分子各々が、第二の抗原特異的抗体を含み、前記1以上の第一の複合体が、該第二の抗原特異的抗体に暴露され、該第二の抗原特異的抗体が、前記ウイルス表面タンパク質に対して特異的であり、該第二の抗原特異的抗体が、該ウイルス表面タンパク質に結合して、1以上の第二の複合体を形成する、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
前記1以上の第二の複合体の形成が、赤色ラインの形成をもたらし、該赤色ラインが、エンテロウイルスの存在を示す、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
前記サンプルが、生物学的流体を含む、請求項21〜26の何れか1項に記載の方法。
【請求項２８】
前記生物学的流体が唾液を含む、請求項21〜27の何れか1項に記載の方法。
【請求項２９】
前記エンテロウイルスが、1種以上のエンテロウイルスを含む、請求項21〜28の何れか1項に記載の方法。
【請求項３０】
前記側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイが、ポイントオブケア側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイである、請求項21〜29の何れか1項に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が、約30分以内にテスト結果を与える、請求項21〜30の何れか1項に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が、約20分以内にテスト結果を与える、請求項21〜31の何れか1項に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法が、約10分でテスト結果を与える、請求項21〜32の何れか1項に記載の方法。
【請求項３４】
前記方法が、約90％以上の精度でテスト結果を与える、請求項21〜33の何れか1項に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法が、約95％以上の精度でテスト結果を与える、請求項21〜34の何れか1項に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が、約99％以上の精度でテスト結果を与える、請求項21〜35の何れか1項に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が、約100％を超える精度でテスト結果を与える、請求項21〜36の何れか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互引照
本件特許出願は、2012年9月12日付で出願された、「側方流動免疫クロマトグラフィー技術を用いた、エンテロウイルス検出のためのポイントオブケアアッセイ」と題するシンガポール特許出願第201206800-3号に対して優先権を主張するものであり、また該特許出願の変更である。この特許出願全体を、参考としてここに組入れる。
【０００２】
本開示は、ウイルス検出のためのポイントオブケア(point-of-care)側方流動イムノグラフィー(immunographic)アッセイに係る。特に、本開示は、エンテロウイルス検出のためのポイントオブケア側方流動イムノグラフィーアッセイに係る。
【背景技術】
【０００３】
手、足および口腔の疾患(HFMD)は、アジア太平洋沿岸地域における最も一般的な感染症の一つであり、また最近の二、三十年間に渡り、多数の死者をもたらしている。この疾患は、主として体液、例えば唾液との接触を通して伝染、拡散される。殆どのエンテロウイルスは、HFMDの原因となる病原体である。HFMDに罹った患者の予後は、該HFMDを引起す該エンテロウイルスに依存して変動する可能性がある。例えば、コクサッキーウイルス(Coxsackievirus) A16(CA16)等のエンテロウイルス(Enteroviruses)は、典型的に自己限定性のHFMDを引起し、一方でエンテロウイルス(Enterovirus) 71(EV71)は、神経学的な合併症を引き起こし、また死をもたらす恐れがある。
HFMDは、主として子供達を冒し、また手、足および/または口腔粘膜に小胞性発疹をもたらす、穏やかな発疹性熱病の一形態である。60種を超える、HFMDを引起す恐れのあるエンテロウイルスがある。HFMDの主な病因となる病原体は、ピコルナビリダエ(Picornaviridae)科に属するエンテロウイルス、即ちEV71、CA16、コクサッキーウイルス(Coxsackievirus) B2(CB2)およびエコーウイルス(Echovirus) 7(エコー(Echo)7)である。一般に、殆どのエンテロウイルスによって引起される臨床的な症状は類似している可能性があり、従ってどのエンテロウイルスが該HFMDを引起したかを、単にこれらの臨床的な症状のみを観察しただけで決定することは、困難である可能性がある。しかし、EV71は、典型的にその例外的なビルレンスのために区別することができ、これは、神経学的な合併症および死をもたらす恐れがある。EV71によって引起される可能性のある該神経学的な合併症は、無菌性髄膜炎、脳幹脳炎、肺水腫および灰白髄炎様麻痺を包含する。
【０００４】
アジア太平洋沿岸地域におけるHFMDに係る最近の主な大発生は、1998年の台湾における78名の死亡、1997年のマレーシアにおける41名の死亡、2000年のシンガポールにおける5名の死亡、2006年のマレーシアにおける18名の死亡、および2008年のシンガポールにおける2名の死亡をもたらした。上記死者の全ては、EV71により引起され、またこれら死者の幾人かにおいて、これらの患者は、EV71およびCA16によって同時に感染されていたことが分かった。2010年の中国における、最近のHFMDの流行においては、EV71による250名を超える死者を含む、250,000名を超えるHFMD患者が報告された。
2010年にシンガポールにおいては、19,000名を超えるHFMD患者が報告され、そこで該患者の12％が、EV71に起因するものであった。この驚くほどのHFMD患者数は、保育センターおよび学校の閉鎖をもたらし、これは結果的として経済に影響を及ぼした。
【０００５】
今日までのところ、HFMDを治療するのに使用し得る有効な抗ウイルス薬はなく、またHFMDを予防するのに利用できるワクチンもない。目下のところ、HFMDに対する全ての公知の治療法は、その症状に基くものであり、またとりわけEV71に対しては、最小限度の有効性を持つに過ぎない。一般的に入手し得る有効な抗ウイルス薬またはワクチンが存在しないために、迅速かつ正確にHFMD患者を同定して、タイミングの良い治療を施し、また患者の管理を行い、かつ感染の広がりを減じる必要性がある。
更に、一般的には、一般開業医、医療従事者、および学校の教師は、典型的に、HFMDに罹ったまたはHFMDの初期段階にある子供達を、肉眼的に観測し得る症状、例えば発熱、口内潰瘍、および/または手および/または足等の末端部における発疹に基いて分類、同定および/または診断している。この診断法は、極めて主観的なものであり、また誤った分類または誤診を起しがちである。子供達におけるHFMDの蔓延は、特に混み合った場所、例えば学校において迅速なものとなる可能性があり、従って迅速かつ正確なHFMD患者の同定が、該疾患の更なる拡散を防止するために必要とされる。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、特異的な抗原-抗体相互作用を使用する、側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイに係る。1または複数のウイルスを含む被検体を、サンプルパッドに添加し、引続き毛管作用によりテストストリップに沿って流動させる。該テストストリップは、検出体分子を含み、ここで該検出体分子は、コロイド状金(即ち、コロイド状金製ナノ粒子)が結合された（conjugated to）第一の特異的抗体を含む。該ウイルスが該検出体分子と遭遇した場合に、該コロイド状金が結合された該第一の特異的抗体は、該ウイルスのウイルス抗原を認識する。ここで、該ウイルス抗原は、特異的ウイルス表面タンパク質(即ち、エンテロウイルスのVP1タンパク質)を含む。該第一の特異的抗体は、該ウイルスの該特異的ウイルス表面タンパク質(即ち、エンテロウイルスのVP1タンパク質)の第一の領域に結合して、抗体-抗原複合体を含む第一の複合体を形成する。該抗体-抗原複合体は、テストラインに塗布された第二の特異的抗体を含む該テストラインまで更に移動し、ここで該第二の特異的抗体は該特異的ウイルス表面タンパク質(即ち、エンテロウイルスのVP1タンパク質)を認識する。該第二の特異的抗体は、該特異的ウイルス表面タンパク質(即ち、エンテロウイルスのVP1タンパク質)の第二の領域に結合する。該ウイルスは、該テストラインに塗布された該第二の特異的抗体に結合する。該第二の特異的抗体の該ウイルスに対する結合は、抗体-抗原サンドイッチ複合体を含む第二の複合体を形成する。1以上の抗体-抗原サンドイッチ複合体の形成は、赤色ラインの形成を結果し、これは、上記コロイド状金製ナノ粒子が赤色を有していることから、上記検出体分子の該コロイド状金のために肉眼視可能であるか、あるいは肉眼で観察可能となる。
【０００７】
本開示に係る上記側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイおよびこれを用いたエンテロウイルスを検出するための方法は、90％以上の精度にて、30分以内に、HFMD患者の迅速なポイントオブケア同定を可能とする。本開示に係るこの側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイおよびこれを用いたエンテロウイルスを検出するための方法は、効果的かつ効率の良い患者の管理を行うことを可能とし、また誤診のあらゆる可能性を減じる。
本開示に係る第一の局面は、エンテロウイルスの存在を検出するための側方流動テストストリップ（lateral flow test strip）を提供するものであり、ここで該テストストリップは、複数の検出体分子を含むコンジュゲートパッド、および複数の捕捉分子を含むテストラインを含むことができ、該テストストリップがエンテロウイルスを検出する。
幾つかの態様において、上述の側方流動テストストリップは、エンテロウイルスの検出に対して特異的であり得る。幾つかの態様において、該側方流動テストストリップは、エンテロウイルスの検出に対して、100％特異的であり得る。
【０００８】
幾つかの態様において、上記検出体分子各々は、検出可能な粒子が結合された第一の抗原特異的抗体を含むことができる。幾つかの態様において、該検出可能な粒子は、金製ナノ粒子を含むことができる。幾つかの態様において、該第一の抗原特異的抗体は、ウイルス表面タンパク質を含むウイルス抗原に対して特異的であり得る。幾つかの態様において、該第一の抗原特異的抗体は、該ウイルス表面タンパク質の第一の領域に対して特異的であり得る。幾つかの態様において、該ウイルス表面タンパク質は、VP1タンパク質であり得る。幾つかの態様において、該検出体分子各々は、1以上の第一の抗原特異的抗体を含むことができ、ここで該1以上の第一の抗原特異的抗体各々を、検出可能な粒子と結合させることができる。
幾つかの態様において、上記捕捉分子各々は、第二の抗原特異的抗体を含む。幾つかの態様において、該第二の抗原特異的抗体は、上記ウイルス表面タンパク質に対して特異的であり得る。幾つかの態様において、該第二の抗原特異的抗体は、該ウイルス表面タンパク質の第二の領域に対して特異的であり得る。幾つかの態様において、該ウイルス表面タンパク質は、VP1タンパク質であり得る。
【０００９】
幾つかの態様において、上述の側方流動テストストリップは、約30分以内、約20分以内、または約10分以内にテスト結果を与えることができる。幾つかの態様において、該側方流動テストストリップは、約20分以内にテスト結果を与えることができる。幾つかの態様において、上述の側方流動テストストリップは、約10分でテスト結果を与えることができる。
幾つかの態様において、上述の側方流動テストストリップは、約90％以上の精度でテスト結果を与えることができる。幾つかの態様において、上述の側方流動テストストリップは、約95％以上の精度でテスト結果を与えることができる。幾つかの態様において、上述の側方流動テストストリップは、約99％以上の精度でテスト結果を与えることができる。幾つかの態様において、上述の側方流動テストストリップは、約100％なる精度でテスト結果を与えることができる。
幾つかの態様において、上記エンテロウイルスは1種以上のエンテロウイルスを含むことができる。
幾つかの態様において、上述の側方流動テストストリップは、ポイントオブケア側方流動テストストリップであり得る。
【００１０】
本開示に係る第二の局面は、上述の側方流動テストストリップの製造方法を提供するものであり、該方法は：コンジュゲートパッドを製造すること；検出体分子を含む検出体分子溶液を調製すること；および該コンジュゲートパッドを、該検出体分子溶液に浸すこと、を含むことができる。
本開示に係る第三の局面は、1種以上のエンテロウイルスを検出するための診断用キットを提供するものであり、ここで該診断用キットは、上述の側方流動テストストリップを含む。
幾つかの態様において、上述の診断用キットは、更に生物学的流動性サンプルを採集するためのサンプル採集デバイスをも含む。
本開示に係る第四の局面は、側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイを用いた、エンテロウイルスの存在を測定する方法を提供するものであり、該方法は：サンプルを準備すること；複数の検出体分子および複数の捕捉分子を含む、側方流動テストストリップを準備すること；該サンプルを該側方流動テストストリップのサンプルパッドに添加すること；および該サンプルを該複数の検出体分子に暴露すること、を含むことができる。
【００１１】
幾つかの態様において、上記検出体分子各々は、検出可能な粒子が結合された第一の抗原特異的抗体を含むことができる。幾つかの態様において、該検出可能な粒子は、金製ナノ粒子を含むことができる。幾つかの態様において、該検出体分子各々は、1以上の第一の抗原特異的抗体を含むことができ、ここで該1以上の第一の抗原特異的抗体各々は、検出可能な粒子と結合させることができる。
幾つかの態様において、上記第一の抗原特異的抗体は、ウイルス表面タンパク質を含むウイルス抗原に対して特異的であり得、ここで上記サンプルがエンテロウイルスを含む場合、該第一の抗原特異的抗体は該ウイルス表面タンパク質と結合して、1以上の第一の複合体を形成することができる。幾つかの態様において、該第一の抗原特異的抗体は、該ウイルス表面タンパク質の第一の領域に対して特異的であり得る。幾つかの態様において、該ウイルス表面タンパク質は、VP1タンパク質であり得る。
【００１２】
幾つかの態様において、上記捕捉分子各々は、第二の抗原特異的抗体を含むことができる。幾つかの態様においては、上記1以上の第一の複合体を、該第二の抗原特異的抗体に暴露することができ、ここで該第二の抗原特異的抗体は、上記ウイルス表面タンパク質に対して特異的であり得、該第二の抗原特異的抗体は、該ウイルス表面タンパク質と結合して、1以上の第二の複合体を形成し得る。幾つかの態様において、該第二の抗原特異的抗体は、該ウイルス表面タンパク質の第二の領域に対して特異的であり得る。幾つかの態様において、該ウイルス表面タンパク質は、VP1タンパク質であり得る。
幾つかの態様において、上記1以上の第二の複合体の形成は、赤色ラインの形成を結果し得、ここで該赤色ラインは、エンテロウイルスの存在を示す。
幾つかの態様において、上記サンプルは生物学的流体を含むことができる。幾つかの態様において、該生物学的流体は唾液を含むことができる。
幾つかの態様において、上記エンテロウイルスは1種以上のエンテロウイルスを含むことができる。
幾つかの態様において、上記側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイは、ポイントオブケア側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイであり得る。
【００１３】
幾つかの態様において、上述のエンテロウイルスの存在を測定する方法は、約30分以内にテスト結果を与えることができる。幾つかの態様において、上述のエンテロウイルスの存在を測定する方法は、約20分以内にテスト結果を与えることができる。幾つかの態様において、上述のエンテロウイルスの存在を測定する方法は、約10分でテスト結果を与えることができる。
幾つかの態様において、上述のエンテロウイルスの存在を測定する方法は、約90％以上の精度でテスト結果を与えることができる。幾つかの態様において、上述のエンテロウイルスの存在を測定する方法は、約95％以上の精度でテスト結果を与えることができる。幾つかの態様において、上述のエンテロウイルスの存在を測定する方法は、約99％以上の精度でテスト結果を与えることができる。幾つかの態様において、上述のエンテロウイルスの存在を測定する方法は、100％なる精度でテスト結果を与えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1は、本開示の一態様に従う、側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイに係る原理、概念および/または構成部品を示す図である。
【図２】図2は、本開示の一態様に従う、側方流動免疫クロマトグラフィーテストストリップの構成、組立てを示す図である。
【図３】図3は、種々の型のウイルスを検出するために、本開示に係る側方流動免疫クロマトグラフィー用テストストリップの一態様を用いたテストランの実験結果を示す図であり、ここでCはコントロールラインであり、またTはテストラインである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下の詳細な説明では、添付図を参照する。該添付図は、該詳細な説明の一部をなす。これらの図において、同様な記号は、文脈が別異のことを指示していない場合には、典型的に類似の構成部品が同一であることを明らかにしている。この詳細な説明において記載される例示的態様、添付図、および特許請求の範囲は、限定を意味するものではない。本明細書に提示された趣旨の精神および範囲を逸脱することなしに、その他の態様を利用することができ、またその他の変更を行うことができる。
他に特に指定されていない限り、本明細書において使用される上記用語「含んでいる(comprising)」および「含む(comprise)」並びにその文法上の変形体は、これ等が列挙された要素を含み、しかも同様に追加の、列挙されていない要素をも含み得るように、「開放されている」または「排他的でない」用語を表すものとする。
ここにおいて使用される、成分の濃度、条件、その他の測定値等に係る用語「約」は、その述べられた値の±5％、またはその述べられた値の±4％、またはその述べられた値の±3％、またはその述べられた値の±2％、またはその述べられた値の±1％、またはその述べられた値の±0.5％、またはその述べられた値の±0％を意味する。
【００１６】
本開示全体を通して、幾つかの態様は、ある範囲の形式で記載し得る。範囲の形式での記載は、単に便宜および簡潔性のためであると理解すべきであり、また該記載された領域の範囲に対する融通性のない確固とした限定として理解すべきではない。従って、ある範囲に係る記載は、あらゆる可能な下位-範囲並びに該当する範囲内の個々の数値を具体的に記載したものと考えるべきである。例えば、1〜6等の或る範囲に係る記載は、1〜3なる範囲、1〜4なる範囲、1〜5なる範囲、2〜4なる範囲、2〜6なる範囲、3〜6なる範囲等の下位-範囲、並びに当該範囲内の個々の数、例えば1、2、3、4、5、および6を具体的に記載したものと考えるべきである。このことは、該範囲の広さとは無関係に当てはまる。
本開示は、エンテロウイルスの存在を検出するための、側方流動テストストリップに係り、ここで該テストストリップは、コンジュゲートパッド、およびテストラインを含むことができ、該コンジュゲートパッドは検出体分子を含み、該テストストリップがエンテロウイルスを検出する。
幾つかの態様において、上記側方流動テストストリップは、エンテロウイルスの検出に対して特異的であり得る。幾つかの態様において、該側方流動テストストリップは、エンテロウイルスの検出に対して100％特異的であり得る。
【００１７】
幾つかの態様において、上記検出体分子各々は検出可能な粒子が結合した第一の抗原特異的抗体を含むことができる。幾つかの態様において、該検出可能な粒子は金製ナノ粒子を含むことができる。幾つかの態様において、該金製ナノ粒子は100nm以下、40nm以下、または20nm以下の大きさを持つことができる。その他の検出可能な粒子も、意図されている。幾つかの態様において、該検出体分子各々は、1種以上の第一の抗原特異的抗体を含むことができ、ここで該1種以上の第一の抗原特異的抗体各々は、検出可能な粒子と結合させることができる。
幾つかの態様において、上記第一の抗原特異的抗体は、ウイルス表面タンパク質を含むウイルス抗原に対して特異的であり得る。幾つかの態様において、該第一の抗原特異的抗体は汎-エンテロウイルス抗体であり得る。その他の抗体の使用も意図されている。
幾つかの態様において、検出体分子は、タンパクA-被覆コロイド状金(即ち、タンパクA-被覆コロイド状金製ナノ粒子)を、以下のプロトコールに従って、汎-エンテロウイルス抗体と結合させることにより調製し得る：
【００１８】
1. 金製ナノ粒子を含むコロイド状金溶液2mLを、エッペンドルフチューブに加え、4℃、25,000gにて1時間、遠心脱水処理する（spun）。
2. 得られる上澄は捨てることができる。得られる該ペレットを、1mLのプロテイン(Protein) A IgG結合バッファー(サーモサイエンティフィック(ThermoScientific))により再度懸濁させることができる。
3. 十分な体積の汎-エンテロウイルス抗体を、工程(2)において得られた混合物に添加して、0.1〜0.3mg/mLなる最終濃度を持つ溶液を調製することができる。
4. 工程(3)で得られた溶液を、25℃で450rpmにてサーモミキサ上で穏やかに振盪しつつ、1時間に渡りインキュベートすることができる。
5. インキュベーション後、上記溶液を4℃、25,000rpmにて1時間に渡り遠心脱水処理することができる。得られるペレットを、0.5〜1mLのプロテインA IgG結合バッファー(サーモサイエンティフィック)に再度懸濁させて、汎-エンテロウイルス抗体が結合されたタンパク質A被覆金製ナノ粒子を含む最終的な溶液を製造することができる。
6. 上記汎-エンテロウイルス抗体が結合されたタンパク質A被覆金製ナノ粒子を含む最終的な溶液は、更に使用するまで、4℃にて保存することができる。
【００１９】
幾つかの態様において、上記テストラインは、複数の捕捉分子を含むことができる。幾つかの態様において、各捕捉分子は、該テストラインに塗布されている第二の抗原特異的抗体を含むことができる。幾つかの態様において、該第二の抗原特異的抗体は、上記ウイルス表面タンパク質に対して特異的であり得る。幾つかの態様において、該第二の抗原特異的抗体は、抗-エンテロウイルス71抗体であり得る。その他の抗体の使用も意図されている。
幾つかの態様において、テストラインの捕捉分子は、以下のプロトコールに従って、ビオチンを抗-エンテロウイルス71抗体(米国、マサチューセッツ州(Massachusetts, USA)のミリポア(Millipore))と結合させることにより調製し得る：
【００２０】
1. 50mMのEZ-リンクアミン-PEG2-ビオチン(EZ-linkTM Amine-PEG2-Biotin)(米国、マサチューセッツ州(Massachusetts, USA)のサーモサイエンティフィック(ThermoScientific))を、0.1M MESバッファー中で調合して、ビオチン-MES(Biotin-MES)溶液を製造することができる。
2. 0.5〜1mLの0.1M MESバッファーを、50μL〜100μL(即ち、上記ビオチン-MES溶液)に添加し得る。
3. 次いで、十分な体積の抗-エンテロウイルス71抗体を上記溶液に添加して、1.0mg/mL〜2.0mg/mLなる範囲の濃度を持つMES-ビオチン-抗体溶液を調製することができる。
4. 1〜5μLの10mM EDC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)を、上記MES-ビオチン-抗体溶液に添加することができる。
5. この得られる溶液を、室温にて穏やかに振盪しつつ、2時間に渡りインキュベートすることができる。
6. インキュベーション後、この得られる溶液を、14,000gにて10分間遠心分離処理し、また得られるビオチン-抗体上澄を集めることができる。
7. 次に、上記ビオチン-抗体上澄を、以下のように脱塩処理工程に掛けることができる：
【００２１】
a. 脱塩カラムを開放し、15mLのファルコンチューブ内に挿入し、次にこれを、一回の、1,000gにて2分間に及ぶ遠心脱水処理に掛ける。
c. 上記ファルコンチューブは捨てることができる。上記脱塩カラムを新たな15mLのファルコンチューブに挿入し、段階(6)から得たビオチン-抗体上澄に重層し、また1,000gにて2分間の遠心脱水処理に付すことができる。
d. 上記ビオチン-抗体上澄を集めることができ、また上記脱塩カラムを捨てることができる。
e. 上記の集められたビオチン-抗体上澄は、更なる使用まで、-20℃にて保存することができる。
幾つかの態様において、コントロールラインの捕捉分子は、以下のプロトコールに従って、ビオチンを、ヤギ抗-マウスIgG抗体(サーモサイエンティフィック(ThermoScientific))および10ストレプトアビジンと結合させることによって調製することができる：
【００２２】
1. 50mMのEZ-リンクアミン-PEG2-ビオチン(EZ-linkTM Amine-PEG2-Biotin)(サーモサイエンティフィック(ThermoScientific))を、0.1M MESバッファー中で調合して、ビオチン-MES溶液を製造することができる。
2. 0.5〜1mLの0.1M MESバッファーを、50μL〜100μLの上記ビオチン-MES溶液)に添加し得る。
3. 次いで、十分な体積のヤギ抗-マウスIgG抗体(サーモサイエンティフィック(ThermoScientific))を上記溶液に添加して、2.0mg/mLなる濃度を持つMES-ビオチン-抗体溶液を調製することができる。
4. 1〜5μLの10mM EDCを、上記MES-ビオチン-抗体溶液に添加することができる。
5. この得られる溶液を、室温にて穏やかに振盪しつつ、2時間に渡りインキュベートすることができる。
6. インキュベーション後、この得られる溶液を、14,000gにて10分間遠心分離処理し、また得られるビオチン-抗体上澄を集めることができる。
7. 次いで、上記ビオチン-抗体上澄を、以下のように脱塩処理に付すことができる：
【００２３】
a. 脱塩カラムを開放し、15mLのファルコンチューブ内に挿入し、次いでこれを一回の、1,000gにて2分間に渡る遠心脱水処理に掛ける。
c. 上記ファルコンチューブは捨てることができる。上記脱塩カラムを新たな15mLのファルコンチューブに挿入し、段階(6)から得たビオチン-抗体上澄に重層し、また1,000gにて2分間に渡り遠心脱水処理することができる。
d. 上記ビオチン-抗体上澄を集めることができ、また上記脱塩カラムを捨てることができる。
e. 上記の集められたビオチン-抗体上澄は、更なる使用まで、-20℃にて保存することができる。
8. 100〜500μLの1mg/mLストレプトアビジン(米国、ミズーリ州セントルイス(St. Louis, Missouri, USA)のシグマ-アルドリッチ(Sigma-Aldrich))を、上記ビオチン-抗体上澄溶液に添加し、また十分に混合することができる。
9. この最終的なビオチン-抗体溶液は、更なる使用まで-20℃にて保存し得る。
【００２４】
幾つかの態様において、上記側方流動テストストリップは、約30分以内、約25分以内、約20分以内、約15分以内、あるいは約10分以内にテスト結果を与えることができる。臨床的サンプルに関連して、35分後には、エンテロウイルスが該臨床的サンプル内に存在するか否かとは無関係に、該側方流動テストストリップに係る全テスト結果は正である。
幾つかの態様において、上記側方流動テストストリップは約90％以上の、約95％以上の、約99％以上の、あるいは約100％なる精度にてテスト結果を与えることができる。
幾つかの態様において、上記側方流動テストストリップは、同時に2以上のエンテロウイルス存在の検出を可能とする。
幾つかの態様において、上記側方流動テストストリップは、1以上のエンテロウイルス存在の検出を可能とする。幾つかの態様において、本開示に係る該側方流動テストストリップは、エコーウイルス、コクサッキーAおよびBウイルス、ポリオ1、2、および3、およびエンテロウイルス70および71を含む全てのエンテロウイルスの存在を検出することを可能とする。
幾つかの態様において、上記側方流動テストストリップは、ポイントオブケア側方流動テストストリップであり得る。
【００２５】
本開示は、また本開示に係る上記側方流動テストストリップの製法にも係り、ここで該方法は、コンジュゲートパッドを製造すること；検出体分子を含む検出体分子溶液を調製すること；および該コンジュゲートパッドを、該検出体分子溶液に浸すこと、を含むことができる。
本開示は、また1種以上のエンテロウイルスを検出するための診断用キットにも関連し、ここで該診断用キットは、本開示に係る上記側方流動テストストリップを含む。
幾つかの態様において、上記診断用キットは、更に一種の生物学的流動性サンプルまたは複数種の生物学的流動性サンプルを採取するためのサンプル収集デバイスをも含む。幾つかの態様において、該生物学的流動性サンプルは、唾液または尿を含むことができる。その他の生物学的流動性サンプルも意図されている。
本開示は、また側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイを用いた、エンテロウイルスの存在を測定する方法にも係り、ここで該方法は：サンプルを準備すること；側方流動テストストリップを準備すること；該サンプルを該側方流動テストストリップのサンプルパッドに添加すること；および該サンプルを、該側方流動テストストリップの検出体分子に暴露すること、を含むことができる。
【００２６】
幾つかの態様において、上記検出体分子各々は、検出可能な粒子が結合された第一の抗原特異的抗体を含むことができる。幾つかの態様において、該検出可能な粒子は、金製ナノ粒子を含むことができる。幾つかの態様において、該金製ナノ粒子は、100nm以下、40nm以下、または20nm以下の大きさを持つことができる。その他の検出可能な粒子も意図されている。幾つかの態様において、該検出体分子の各々は、1種以上の第一の抗原特異的抗体を含むことができ、ここで該1種以上の第一の抗原特異的抗体の各々は、検出可能な粒子と結合させることができる。
幾つかの態様において、上記第一の抗原特異的抗体は、ウイルス表面タンパク質を含むウイルス抗原に対して特異的であり得、ここで上記サンプルがエンテロウイルスを含む場合、該抗原特異的抗体は、該ウイルス表面タンパク質に結合して、1種以上の第一の複合体を形成し得る。幾つかの態様において、該第一の抗原特異的抗体は、汎-エンテロウイルス抗体であり得る。他の抗体の使用も意図されている。
幾つかの態様において、上記捕捉分子各々は、第二の抗原特異的抗体を含む。幾つかの態様においては、上記1種以上の第一の複合体を、該第二の抗原特異的抗体に暴露することができ、ここにおいて該第二の抗原特異的抗体は、上記ウイルス表面タンパク質に対して特異的であり得、該第二の抗原特異的抗体は、該ウイルス表面タンパク質と結合して、1種以上の第二の複合体を生成し得る。幾つかの態様において、該第二の抗原特異的抗体は、抗-エンテロウイルス71抗体であり得る。その他の抗体の使用も意図されている。
【００２７】
幾つかの態様において、上記1種以上の第二の複合体の形成は、赤色ラインの形成をもたらし得る。ここで、該赤色ラインは、エンテロウイルスの存在を示す。
幾つかの態様において、上記サンプルは生物学的流体を含むことができる。幾つかの態様において、該生物学的流体は唾液または尿を含むことができる。その他の生物学的流体も意図されている。
幾つかの態様において、上記側方流動テストストリップは、同時に、2種以上のエンテロウイルスを検出することができる。
幾つかの態様において、上記側方流動テストストリップは、1種以上のエンテロウイルスの存在を検出することを可能とする。幾つかの態様において、本開示に係る該側方流動テストストリップはエコーウイルス、コクサッキーAおよびBウイルス、ポリオ1、2、および3、およびエンテロウイルス70および71を含む全てのエンテロウイルスの存在を検出することを可能とする。
【００２８】
幾つかの態様において、上記側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイは、ポイントオブケア側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイであり得る。
幾つかの態様において、上述のエンテロウイルスの存在を測定する方法は、約30分以内、約25分以内、約20分以内、または約10分以内にテスト結果を与えることができる。35分後には、上記側方流動テストストリップに係る全てのテスト結果は、エンテロウイルスが上記サンプル内に存在するか否かとは無関係に、正となる。
幾つかの態様において、上述のエンテロウイルスの存在を測定する方法は、約90％以上の、約95％以上の、約99％以上の精度、あるいは約100％なる精度にてテスト結果を与えることができる。
本開示は、側方流動免疫クロマトグラフィー技術を用いて、手、足および口腔疾患(Hand, Foot and Mouth Disease: HFMD)を引起すエンテロウイルスを検出するための、コロイド状金(即ち、コロイド状金製ナノ粒子)が結合された抗原特異的抗体の使用に係る。
【００２９】
本開示は、特異的抗原-抗体相互作用を利用する、側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイに係る。1種または複数のウイルスを含有する被検体が、サンプルパッドに添加され、その後該被検体は毛管作用によって、テストストリップに沿って流動する。該テストストリップは検出体分子を含み、ここで該検出体分子は、コロイド状金(即ち、コロイド状金製ナノ粒子)が結合された第一の特異的抗体を含む。該ウイルスが該検出体分子と遭遇した場合、該コロイド状金が結合されている該第一の特異的抗体は、該ウイルスのウイルス抗原を認識するが、ここで該ウイルス抗原は、特異的ウイルス表面タンパク質(即ち、エンテロウイルスのVP1タンパク質)を含む。該第一の特異的抗体は、該ウイルスの該特異的ウイルス表面タンパク質(即ち、エンテロウイルスのVP1タンパク質)の第一の領域に結合して、抗体-抗原複合体を含む第一の複合体を形成する。該抗体-抗原複合体は、更にテストライン上に塗布された第二の特異的抗体を含む該テストラインまで移動し、そこで該第二の特異的抗体は、該特異的ウイルス表面タンパク質(即ち、エンテロウイルスのVP1タンパク質)を認識する。該第二の特異的抗体は、該特異的ウイルス表面タンパク質(即ち、エンテロウイルスのVP1タンパク質)の第二の領域に結合する。該ウイルスは該テストライン上に塗布された該第二の特異的抗体に結合する。該第二の特異的抗体の該ウイルスとの結合は、抗体-抗原サンドイッチ複合体を含む第二の複合体を形成する。該1種以上の抗体-抗原サンドイッチ複合体の形成は、赤色ラインの形成をもたらし、この赤色ラインは、該コロイド状金製ナノ粒子が赤色を有しているので、上記検出体分子の該コロイド状金のために、肉眼視可能となるか、あるいは肉眼的に観察可能となる。
【００３０】
本開示に係る上記側方流動免疫クロマトグラフィー技術は、極めて特異的な抗原-抗体相互作用を利用している。本開示に係る該側方流動免疫クロマトグラフィー技術は、ユーザーにとって使い勝手の良いものである。故に、ヘルスケアトレーニングをしていないユーザーまたは個々人は、本開示に係る上記側方流動テストストリップおよび側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイを首尾良く使用することができる。例えば、該ユーザーにとっては、テストの開始のために、サンプル(即ち、サンプル流体)および一定量のランニングバッファー(running buffer)を該サンプルパッドに適用することのみが必要とされる。
本開示に係る上記側方流動テストストリップは、毛管作用を利用して、エンテロウイルスについてテストする。本開示に係る該側方流動テストストリップは、サンプル(即ち、サンプル流体)を上記サンプルパッドに適用した時点から、30分以内にテスト結果を与える。
本開示に係る上記側方流動テストストリップは、該テストストリップが小さく、かつ携帯可能となるように製造することができる。幾つかの態様において、側方流動テストストリップは、約6cmなる長さおよび約0.5cmなる幅を持つことができる。幾つかの態様において、該長さは、約6cmを超えまたはこれ未満であり得、またその幅は、約0.5cmを超え、またこれ未満であり得る。また、該側方流動テストストリップに関するその他の寸法も意図されている。該テスト結果は、色の生成に基いており、該色の生成は、ヒトの目による肉眼的観測が可能であり、従って本開示に係る上記側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイは、高価な光学的検出用計測器の使用を必要としない。
【００３１】
本開示に係る上記側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイおよびこれを用いるエンテロウイルスを検出するための上記方法は、30分以内に、90％以上の精度で、HFMD患者の迅速なポイントオブケア同定を可能とする。本開示に係る該側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイおよびこれを用いるエンテロウイルスを検出するための該方法は、有効かつ効率的な患者の管理の実施を可能とし、また誤診のあらゆる可能性を減じる。
図1は、本開示の一態様に従う、側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイの原理、概念および/または構成部品を示すものである。
図2は、本開示の一態様に従う、側方流動免疫クロマトグラフィーテストストリップの構成、組立てを示す図である。
【００３２】
図1および図2に示したように、サンプルのテストおよび分析は、被検体4を含む、十分な体積の生物学的流動性サンプル(例えば、唾液)を、側方テストストリップ2のサンプルパッド6に添加することにより実施することができる。ここにおいて、被検体4は、1種以上のエンテロウイルスを含むことができる。サンプルパッド6が被検体4を含有する該生物学的流動性サンプルで飽和された場合、被検体4を含有する該生物学的流動性サンプルは、検出体分子10を含むコンジュゲートパッド8まで移動し得る。ここで、検出体分子10の各々は、金製ナノ粒子が結合されている第一の抗原特異的抗体を含み、該第一の抗原特異的抗体は、エンテロウイルスに対して特異的である。被検体4を含有する該生物学的流動性サンプルおよび検出体分子10は、側方流動テストストリップ2の毛管床を介して混合流動し得る。このようにするに際して、被検体4が一種のエンテロウイルスを含む場合、該第一の抗原特異的抗体は、該エンテロウイルスのVP1タンパク質の第一領域と結合することができ、一方で更に該毛管床を介して移動し、それによって1種以上の抗体-抗原複合体を形成する。被検体4がエンテロウイルスを含まない場合、該第一の抗原特異的抗体は、ウイルス表面タンパク質と結合することはない。
側方流動テストストリップ2は、膜/反応膜12を含むことができる。この膜12は、これを横切るテストライン14を含む、ニトロセルロース膜または酢酸セルロース膜であり得る。テストライン14は、その上に固定化されている第二の抗原特異的抗体を含むことができる。
【００３３】
上記の1種以上の抗体-抗原複合体は、更に、上記第二の抗原特異的抗体で被覆されているテストライン14まで移動することができる。ここで、該第二の抗原特異的抗体もエンテロウイルスに対して特異的である。該第二の抗原特異的抗体は、該エンテロウイルスのVP1タンパク質の第二領域に結合することができる。該第二の抗原特異的抗体は該エンテロウイルスに結合し、それによって1種以上の抗体-抗原サンドイッチ複合体を形成することができる。所定期間に渡り、被検体4を含有する上記生物学的流動性サンプルの多くが、側方流動テストストリップ2を通過した場合には、より多くの抗体-抗原サンドイッチ複合体が蓄積する。該抗体-抗原サンドイッチ複合体が蓄積するにつれて、多数の金製ナノ粒子が蓄積されて、可視性のまたは肉眼による観察可能な赤色ラインをもたらす。赤色ラインの形成は、該被検体または生物学的流動性サンプル4が、エンテロウイルスを含むことを立証する、正のテストであることを示す。この赤色ラインは、ヒトの目により肉眼的に観察し得る。赤色ラインが存在しないことは、該生物学的流動性サンプルがエンテロウイルスを含まないことを立証する、負のテストであることを示す。
また、膜12はこれを横切るコントロールライン16を含むことができる。コントロールライン16は第三の抗体を含み、これは検出体分子10の上記第一の抗原特異的抗体に対して特異的である。
更に、側方流動テストストリップ2は、吸上パッド/吸上げパッド18をも含むこともできる。この吸上パッド18は、毛管作用により膜12を横切って、被検体4を含む上記生物学的流動性サンプルを取込み、また該生物学的流動性サンプルを集めるのに使用することができる。
【実施例】
【００３４】
実験準備
1. バッファーの調製
サンプルパッドバッファー
10mMのリン酸バッファー、1% v/vのイソプロパノールおよび0.04％のツイーン(Tween)を一緒に加えて、混合物を製造した。この混合物のpHを8.0に調製し、これによりサンプルパッドバッファーを製造した。このサンプルパッドバッファーを4℃にて保存した。
コンジュゲーションバッファー(Conjugation Buffer)
4.7〜5.5なる範囲に調節されたpHを持つ、0.1MのMES(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸)バッファーを用いてコンジュゲーションバッファーを調製した。このコンジュゲーションバッファーを4℃にて保存した。
ランニングバッファー
1mMのホウ酸ナトリウム、1％のイソプロパノールおよび0.04％のツイーンを一緒に加えて、混合物を製造した。この混合物のpHを8.0に調節し、これによりランニングバッファーを製造した。このランニングバッファーを4℃にて保存した。
【００３５】
2. 側方流動ストリップの構成
本開示に係る側方流動テストストリップの構成は図1に示されている。側方流動テストストリップの組立ては、バイオドットバッチラミネータシステム(BioDot Batch Laminator System)(米国カリフォルニア州(CA, USA)の、バイオドット(BioDot))を、この製造業者の取扱説明書に従って使用して実施した。テストラインの捕捉分子およびコントロールラインの捕捉分子は、1μL/cmなる割合で、バイオドットディスペンサリープラットフォーム(BioDot Dispensary Platform；バイドット(BioDot))を用いて、ニトロセルロース膜上に、1回塗布法を利用して噴霧した。該テストラインおよびコントロールラインで該側方流動テストストリップを塗布した後、該ニトロセルロース膜を、穏やかに振盪しつつ20分間、ブロッキングバッファー(米国カリフォルニア州(CA, USA)の、ライフテクノロジーズ(Life Technologies Corporation))によってブロックした。サンプルパッドを、上記サンプルパッドバッファーで浸し、37℃にて乾燥させた。金製コンジュゲートパッドを検出体分子溶液で浸し、37℃にて乾燥させた。次に、該サンプルパッドおよび金が結合されたパッドを、上記側方流動テストストリップに添加した。全ての組立てられたテストストリップを、使用するまで、デシケータ内に保存した。
【００３６】
3. テストライン用捕捉分子の製造
テストライン用捕捉分子は、以下のプロトコールに従ってビオチンを抗-エンテロウイルス71抗体(米国マサチューセッツ州(Massachusetts, USA)のミリポア(Millipore))と結合させることにより製造した：
1. 50mMのEZ-リンクアミン-PEG2-ビオチン(EZ-linkTM Amine-PEG2-Biotin)(米国マサチューセッツ州(Massachusetts, USA)のサーモサイエンティフィック(ThermoScientific))を、0.1M MESバッファー内で調製し、ビオチン-MES溶液を製造した。
2. 1mLの0.1M MESバッファーを60μLの該ビオチン-MES溶液に添加した。
3. 次に、十分な体積の抗-エンテロウイルス71抗体を該溶液に添加して、2.0mg/mLなる濃度を持つMES-ビオチン-抗体溶液を製造した。
4. 3μLの10mM EDC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)を、該MES-ビオチン-抗体溶液に添加した。
5. 得られたこの溶液を、室温にて穏やかに振盪しつつ、2時間に渡ってインキュベートした。
6. インキュベーションの後、該生成溶液を、14,000gにて10分間遠心分離処理し、またそのビオチン-抗体上澄を集めた。
7. 次いで、該ビオチン-抗体上澄を、以下の脱塩工程に掛けた：
a. 脱塩カラムを開放し、および15mLのファルコンチューブに挿入し、その後1回、1,000gにて2分間の遠心脱水処理に掛けた。
c. 該ファルコンチューブを捨てた。この脱塩カラムを、新たな15mLのファルコンチューブに挿入し、工程(6)から得たビオチン-抗体上澄と重層させ、かつ1,000gにて2分間の遠心脱水処理に掛けた。
d. 該ビオチン-抗体上澄を集め、また該脱塩カラムを捨てた。
e. 集められた該ビオチン-抗体上澄を、更に使用するまで-20℃にて保存した。
【００３７】
4. 検出体分子の製造
検出体分子は、以下のプロトコールに従って、プロテインA-被覆コロイド状金(即ち、プロテインA-被覆コロイド状金製ナノ粒子)を、汎-エンテロウイルス抗体と結合させることにより製造した：
1. 2mLの金製ナノ粒子を含むコロイド状金溶液を、エッペンドルフチューブに加え、4℃、25,000gにて1時間の遠心脱水処理に掛けた。
2. 該上澄を捨てた。得られるペレットを、1mLのプロテインA IgG結合バッファー(Protein A IgG Binding Buffer)(サーモサイエンティフィック(ThermoScientific))を用いて再懸濁させた。
3. 十分な体積の汎-エンテロウイルス抗体を、工程(2)で得られた混合物に添加して、0.3mg/mLなる最終濃度を持つ溶液を製造した。
4. 工程(3)で得られた該溶液を25℃、450rpmにて、サーモミキサ上で穏やかに振盪しつつ、1時間に渡りインキュベートした。
5. インキュベーションの後、該溶液を4℃、25,000gにて1時間に渡る遠心脱水処理に掛けた。得られたペレットを、1mLのプロテインA IgG結合バッファー(サーモサイエンティフィック)に再懸濁させて、汎-エンテロウイルス抗体が結合された、プロテインA-被覆金製ナノ粒子を含む最終溶液を製造した。
6. 該汎-エンテロウイルス抗体が結合された、プロテインA-被覆金製ナノ粒子を含む最終溶液を、更に使用するまで4℃にて保存した。
【００３８】
5. コントロールライン用捕捉分子の製造
コントロールライン用捕捉分子を、以下のプロトコールに従って、ビオチンを、ヤギ抗-マウスIgG抗体(サーモサイエンティフィック(ThermoScientific))および10ストレプトアビジンと結合させることにより製造した：
1. 50mMのEZ-リンクアミン-PEG2-ビオチン(EZ-linkTM Amine-PEG2-Biotin)(サーモサイエンティフィック)を、0.1M MESバッファー内で調製し、ビオチン-MES溶液を製造した。
2. 1mLの0.1M MESバッファーを60μLの該ビオチン-MES溶液に添加した。
3. 次に、十分な体積のヤギ抗-マウスIgG抗体(サーモサイエンティフィック)を該溶液に添加して、2.0mg/mLなる濃度を持つMES-ビオチン-抗体溶液を製造した。
4. 3μLの10mM EDCを、該MES-ビオチン-抗体溶液に添加した。
5. 得られたこの溶液を、室温にて穏やかに振盪しつつ、2時間に渡ってインキュベートした。
【００３９】
6. インキュベーションの後、該生成溶液を、14,000gにて10分間遠心分離処理し、またそのビオチン-抗体上澄を集めた。
7. 次いで、該ビオチン-抗体上澄を、以下の脱塩工程に掛けた：
a. 脱塩カラムを開放し、および15mLのファルコンチューブに挿入し、その後これを1回の、1,000ｇにて2分間に及ぶ遠心脱水処理に掛けた。
c. 該ファルコンチューブを捨てた。この脱塩カラムを、新たな15mLのファルコンチューブに挿入し、工程(6)から得たビオチン-抗体上澄と重層させ、また1,000ｇにて2分間の遠心脱水処理に付した。
d. 該ビオチン-抗体上澄を集め、また該脱塩カラムを捨てた。
e. 集められた該ビオチン-抗体上澄を、更なる使用まで-20℃にて保存した。
8. 250μLの1mg/mLストレプトアビジン(米国ミズーリ州セントルイス(St. Louis, Missouri, USA)の、シグマ-アルドリッチ(Sigma-Aldrich))を、上記ビオチン-抗体上澄溶液に添加し、また十分に混合した。
9. この最終的なビオチン-抗体溶液を、更なる使用まで-20℃にて保存した。
【００４０】
分析されたウイルス
本開示の側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイおよび側方流動テストストリップの一態様を使用して、研究室において培養された、以下のウイルスについてテストし、かつ分析した：
1. エンテロウイルス
・エンテロウイルス(Enterovirus) 71 (EV71)；
・コクサッキーウイルス(Coxsackievirus) A16 (CA16)；
・コクサッキーウイルス(Coxsackievirus) B2 (CB2)；
・エコーウイルス(Echovirus) 6 (エコー(Echo) 6)；
2. 非-エンテロウイルス
・サイトメガロウイルス(Cytomegalovirus) (CMV)；
・単純ヘルペスウイルス(Herpes Simplex Virus) (HSV)
上記ウイルスを、別々に6つ(6)の異なる唾液流体サンプルに導入した。即ち、これら6個(6)の唾液流体サンプル各々は、異なるウイルスを含んでいた。該6個(6)の唾液流体サンプル各々を、別箇であるが同一の、本開示に係る側方流動テストストリップを用いてテストし、かつ分析した。
【００４１】
上記テストおよび分析は、十分な体積の唾液流体サンプルを、上記側方テストストリップのサンプルパッドに添加することにより行った。ここにおいて、該唾液流体サンプルはウイルスを含む。該添加された唾液流体サンプルの体積は、約30μL〜約100μLなる範囲であり得る。該サンプルパッドが該唾液流体サンプルで飽和された場合、該唾液流体サンプルは、上記検出体分子を含む上記金コンジュゲートパッドまで移動している。ここで、該検出体分子各々は、金製ナノ粒子が結合された第一の抗原特異的抗体を含み、この第一の抗原特異的抗体は、エンテロウイルスに対して特異的である。該唾液流体サンプルおよび該検出体分子は、該側方流動テストストリップの毛管床を介して混合し、流動する。このようにするに際して、該唾液流体サンプルが1種のエンテロウイルスを含む場合に、該第一の抗原特異的抗体は、該エンテロウイルスの特異的ウイルス表面タンパク質(この場合には、VP1タンパク質)の第一領域に対して結合することができ、一方該毛管床を介して更に移動し、それによって1種以上の抗体-抗原複合体を形成する。該唾液流体サンプルがエンテロウイルスを含まない場合、該第一の抗原特異的抗体が、該ウイルス表面タンパク質と結合することはない。
【００４２】
上記1種以上の抗体-抗原複合体は、第二の抗原特異的抗体で被覆されている上記テストラインまで更に移動する。ここにおいて、該第二の抗原特異的抗体もエンテロウイルスに対して特異的である。該第二の抗原特異的抗体は、該エンテロウイルスの上記特異的ウイルス表面タンパク質(この場合には、VP1タンパク質)の第二領域に対して結合することができ、それによって1種以上の抗体-抗原サンドイッチ複合体を形成する。所定期間に渡り、上記唾液流体サンプルのより多くが上記側方流動テストストリップを通過した場合、より多くの抗体-抗原サンドイッチ複合体が蓄積される。該抗体-抗原サンドイッチ複合体が蓄積されるにつれて、多数の金製ナノ粒子が蓄積され、結果として肉眼視可能な、または肉眼的に観察し得る赤色ラインを与える。この赤色ラインの形成は、該唾液流体サンプルがエンテロウイルスを含むことを裏付ける、正のテストであることを示す。この赤色ラインは、ヒトの目により肉感的に観察することができる。赤色ラインが存在しないことは、該唾液流体サンプルがエンテロウイルスを含まないことを裏付ける、負のテストであることを示す。
【００４３】
結果
図3は、種々の型のウイルスを検出するために、本開示に係る側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイおよび側方流動テストストリップの一態様を用いたテストランの実験結果を示す図であり、ここでCはコントロールラインであり、またTはテストラインである。図3に示したように、該側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイおよび側方流動テストストリップは、エンテロウイルスに対して特異的である。例えば、上記エンテロウイルスE6、CA16、EV71およびCB2を含むテスト用唾液流体サンプルに対して使用された該テストストリップ各々は、赤色ラインの形成を示した。即ち、これは正のテストを与え、また該唾液流体サンプル各々がエンテロウイルスを含んでいたことを裏付けている。しかし、非-エンテロウイルスCMVおよびHSVを含むテスト用唾液流体サンプルに対して使用された該テストストリップ各々は、赤色ラインの形成を示さなかった。即ち、これは負のテストを与え、また該唾液流体サンプルがエンテロウイルスを含んでいなかったことを裏付けている。
提供されたテストストリップ各々は、該サンプル流体としての唾液を該サンプルパッドに添加した時点から10分以内に結果を与えた。
上記実験結果により立証されたように、本開示に係るポイントオブケア側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイおよび側方流動テストストリップは、エンテロウイルスの検出に際して、改善された効率を示す。
【００４４】
様々な局面および態様をここに記載してきたが、上記開示を読んだ後には、本発明の様々なその他の変更および適応が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、当業者には明らかであり、またこのような変更並びに適応全てが、添付した特許請求の範囲内に入ることを意図している。ここに記載されている様々な局面および態様は、例示のためのものであり、また限定する意図はなく、本発明の真の範囲および精神は、添付された特許請求の範囲によって示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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