(57)【要約】本発明は、特に分子生物学または細胞生物学の用途において化学的、生化学的または生物学的反応を達成するために必要な期間適切な温度に溶液を加熱および維持するための加温装置または自発的ヒートパックの使用に関する。加温装置を含有する生物学的キットも本発明の一部である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
30℃から40℃の間の温度でのインキュベーションを必要とする生物学的、生化学的または化学的反応を行うためのプロセスであって、発熱性の物理的または化学的プロセスに基づいて働く加温装置を作動させるステップと、前記加温装置を、前記反応に関わる試薬を含有する容器と接触させるステップとを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項２】
加温装置を容器と接触させるステップが、加温装置と容器の少なくとも下部とを、この目的のために提供される保持体のくぼみの中に入れることにより行われることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
容器が酵素溶液を含有し、加温装置と容器との接触が少なくとも10分間維持されることを特徴とする請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
加温装置が、酢酸ナトリウム飽和水溶液を含有する気密封止プラスチックパウチで構成されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
反応に関わる試薬を含有する溶液の容積が、３mlから10 mlの間であり、前記溶液を含有する容器が、７cmから11 cmの間の直径を有するペトリ皿または前記ペトリ皿の区画であり、加温装置が、厚さが３mmから７mmの間で直径が７cmから11 cmの間の円盤であることを特徴とする請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
加温装置を収容することを意図する保持体のくぼみが、直径が７cmから11.5 cmの間の円形であり、５mmから20 mmの間の深さを有することを特徴とする請求項２または５に記載のプロセス。
【請求項７】
(i)酢酸ナトリウム飽和水溶液を含有する気密封止プラスチックパウチで構成される加温装置中で結晶化を開始するステップと、
(ii)前記加温装置の上に、0.2%から１%の間の濃度のトリプシンの溶液を含有する容器を置くステップと、
(iii)前記溶液中に組織試料を入れ、少なくとも10分間インキュベートするステップと、
(iv)組織試料をすすぐステップと
を含む、組織試料に由来する細胞を解離するための請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
(i)患者への移植のために適当な細胞を含む皮膚組織試料を請求項７に記載のプロセスに供するステップと、
(ii)前記皮膚試料を起源とする適当な細胞を採集し、溶液に懸濁するステップと、
(iii)ステップ(ii)で得られた溶液を細胞篩でろ過するステップと
を含む、患者の皮膚に施用するために適当な細胞懸濁物を調製するための請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
ステップ(iii)で得られた細胞懸濁物にヒアルロン酸を加えるさらなるステップを含む、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
ステップ(ii)においてメラニン形成細胞が回収されることを特徴とする、白斑の処置のための請求項８または９に記載のプロセス。
【請求項１１】
発熱性の物理的または化学的プロセスに基づいて働く加温装置を含むことを特徴とする、生物学的用途のためのキット。
【請求項１２】
加温装置が、過冷却された酢酸ナトリウム飽和水溶液を含有する気密封止プラスチックパウチで構成される請求項11に記載のキット。
【請求項１３】
前記加温装置を収容することを意図するくぼみを有する保持体も含むことを特徴とする請求項11または12に記載のキット。
【請求項１４】
加温装置の寸法と同じ寸法を有する底部を有する容器も含むことを特徴とする請求項10〜13のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
酵素も含むことを特徴とする請求項10〜14のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学および細胞生物学のキットの分野、ならびに穏和な熱の供給を必要とする化学反応を行うためのキットの分野に関する。本発明の主題は、特に、生検を処理するための単純で安価な自発的加熱手段を含むキットである。
【背景技術】
【０００２】
ここ数年、細胞の移植、特に自己細胞の移植は、患部組織または損傷組織の再生を促進するための効果的で安全な手段として必須になっている。ある種の治療プロトコールは、再移植の前にエクスビボでの細胞の増殖および／または改変を必要とする。その他のプロトコールでは、本質的に、問題の組織の健常部分から細胞が採取され、処置される病変にて該細胞が本質的に直ちに再移植される。このことは、特に、ある種の熱傷(細胞増殖を必要としない程度)、外傷後および術後低色素、無色性皮膚症(dermatoses achromatiques)、瘢痕などのような皮膚疾患または病変の処置のためのプロトコールについて当てはまる。これらのプロトコールでは、試料の処置とは、本質的に、ほぼ完全に細胞を解離し、適当であれば、その後に、意図する用途のための適当な細胞(例えば無色性皮膚症のためにメラニン形成細胞)を選択するために様々な細胞型を分離し、凝集物を除くためにろ過することになる。細胞の解離は、通常、試料をトリプシン溶液中でインキュベートすることにより行われる。トリプシン活性のための最適温度は、37℃である。この温度にて、そして酵素の濃度および所望する解離の程度に応じて、文献に記載されるインキュベーション時間は、50分から３時間の間である(Guerraら, 2003; Mulekar, 2003; van Geelら, 2004)。より低い温度では酵素の活性はより低く、インキュベーション時間を数時間長くすることが必要であるので、プロトコールの全てのステップを同日に行うことができなくなる(GauthierおよびSurleve-Bazeille, 1992)。この理由のために、これらのプロトコールは、現在、インキュベータを含む技術的プラットフォームを有する構造物において少なくとも部分的に行われているが、インキュベータは、皮膚科学の業務ではしばしば存在しない。
【０００３】
インキュベータを備えていない医療従事者が白斑に罹患している患者を処置することができるようにするために、Clinical Cell Culture社は、サンプリングから細胞の再移植までの全てのステップを行うために必要な消耗品と、電池を備えた電子加熱ユニットとを含むキット(ReCell(登録商標))を提供している。このデバイスは、非常に高い価格と、環境に与える影響という２つの主要な問題点を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来技術の解決法、特にReCell(登録商標)キットに対する有利な代替を提供する。なぜなら、本発明は、酵素の作用のために必要な期間中、酵素溶液を適切な温度に加熱および維持するための加温装置の使用に基づくからである。用語「加温装置」は、本明細書において、発熱性の物理的または化学的プロセスに基づいて働く、熱を発することができる小さい物体のことをいい、「マジカルヒートパック(bouillottes magiques)」または「自発的ヒートパック」とも呼ばれる。これらは、寒さに曝された手または足を加熱するために通常は用いられる。以下の本文において、用語「加温装置」および「ヒートパック」は、区別せずに用いる。物理的プロセスに基づく加温装置としては、例えば、過冷却された酢酸ナトリウム飽和水溶液を含有するパウチで構成される再利用可能な加温装置が挙げられる。液体の内部にある金属片を折り曲げることにより、固化した酢酸塩の結晶が生じ、これが結晶化の引き金となり、溶液は固体になる。この相転移は融点(例えば20%溶液について54℃)にて起こるので、パウチが加熱され、固化が一旦完了すると室温まで冷却される。パウチが冷却されると、パウチを非常に熱い湯に入れることにより、(固体になった)酢酸ナトリウムを液体状態に戻すことができる。空気との接触の際の酸化により活性化される構成要素を有する化学的加温装置も存在する。これらはより長期間有効であるが(過冷却された酢酸ナトリウムに基づく加温装置についてのおよそ１時間と比較して、８〜60時間)、１回しか使用できない。
【０００５】
本発明者らは、加温装置の上におかれた容器、典型的にはペトリ皿に入った溶液が、数分以内に、トリプシンのような多くの酵素の活性のために最適な温度に到達し、前記温度に少なくとも15〜20分間とどまることを示した(以下の実施例１〜３)。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
よって、本発明は、まず、30℃から40℃の間の温度でのインキュベーションを必要とする生物学的、生化学的または化学的反応を行うためのプロセスであって、発熱性の物理的または化学的プロセスに基づいて働く加温装置を作動させるステップと、前記加温装置を、前記反応に関わる試薬を含有する容器と接触させるステップとを含むことを特徴とするプロセスに関する。このプロセスは、生物学、医学または診断の用途の関係において特に有利である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
このプロセスのある特定の実行では、加温装置を容器と接触させるステップは、加温装置と容器の少なくとも下部とを、この目的のために提供される保持体のくぼみの中に入れることにより行われる。このような保持体により、まず、容器を加温装置の上に正しく固定でき、よって、傾く危険性が制限される。さらに、熱伝導率が低い断熱保持体を用いることにより、加温装置からの熱の喪失を制限し、加温装置から加熱される溶液への熱の伝達を促進できる。ある好ましい実行では、くぼみの深さは、加温装置と容器の下部だけを収容できる。このようにすれば、容器は、加温装置の上に正しく固定され、滑動の危険がなく、しかもまだ操作者が容易につかむことができる。
【０００８】
上記のプロセスにおいて、加温装置と、適当であれば断熱保持体との使用により、生物学的、生化学的または化学的溶液の温度を30℃から40℃の間に必要な期間(数分から数十分まで、例えば５、10、15、18、20分以上)維持できる。アウトドアレジャー活動(スキー、登山など)を通常は意図する単純で安価な物体である加温装置の、洗練された実験室備品の代替としての生物学的(分子生物学または細胞生物学)または化学的プロセスを行うためのこの使用は、驚くべきことに有利である。なぜなら、この使用により、得られる結果の質を損なうことなく著しい節約が可能になるからである。
【０００９】
上記において、用語「生物学的反応」は、生体に由来する要素、例えば生存細胞(生検を起源とする動物細胞、植物細胞、酵母または細菌)、ウイルス、オルガネラ、酵素、代謝産物などが関わる任意の反応に対して用いられる。「生化学的反応」は、生体の化学反応に関わる物質(酵素、糖、脂質など)を用いる。
【００１０】
本発明のプロセスの特定の一実施形態によると、容器は酵素溶液を含有し、加温装置と容器との接触は少なくとも10分間維持される。特定の一実施形態によると、加温装置は細胞生物学プロセスの関係で用いられ、酵素溶液は、生検、例えば解離される組織試料を起源とする細胞を含有する。この場合、酵素溶液は、例えばトリプシンを含有する。
１時間未満のインキュベーションを必要とする反応のために、加温装置は、好ましくは、酢酸ナトリウム飽和水溶液を含有する気密封止プラスチックパウチで構成される。しかし、本発明は、より長いインキュベーションを可能にする化学的加温装置も用いることができる。
【００１１】
本発明のプロセスの特定の一実施形態によると、酢酸ナトリウムを含有するパウチ型の用いられる加温装置は、厚さが３mmから７mmの間、好ましくは４〜６mmで、直径が７cmから11 cmの間、好ましくは８〜10 cmの円盤であり、反応に関わる試薬を含有する溶液が、３mlから10 mlの間の容積であり、直径が７cmから11 cmの間、好ましくは８cmから10 cmの間のペトリ皿、または前記ペトリ皿の区画に含まれる。用語「ペトリ皿」は、本明細書において、蓋を有する、ガラスまたはプラスチックでできた浅い透明の円筒形の皿を意味することを意図する。本発明のある種の特定の実行では、ペトリ皿は、例えば１つの直径に沿った小さい壁により、仕切られている。この特定の実施形態の関係において保持体を用いる場合、加温装置を収容することを意図するくぼみも加温装置の直径よりわずかに大きい直径(７cmから11.5 cmの間)を有する円形であり、５mmから20 mmの間の深さを有する。
【００１２】
本発明は、新しく採取された組織試料に由来する細胞を解離するためのプロセスであって、
(ｉ)酢酸ナトリウム飽和水溶液を含有する気密封止プラスチックパウチで構成される加温装置中で結晶化を開始し、場合によって、前記加温装置を、保持体、好ましくは断熱保持体中のこの目的のために提供されるくぼみの中に入れるステップと、
(ii)前記加温装置の上に、0.2%から１%の間の濃度のトリプシンの溶液を含有する容器を置くステップと、
(iii)前記溶液中に組織試料を入れ、少なくとも10分間、好ましくは15〜20分間インキュベートするステップと、
(iv)組織試料をすすぐステップと
を含むプロセスにも関する。
【００１３】
もちろん、このプロセスの実行中に、加温装置、容器および適当であれば断熱保持体のくぼみの寸法は、加温装置と容器との間の交換の表面積が確実に大きくなるように注意する。特定の一実施形態によると、加温装置は円盤形状であり、容器は上記のようにペトリ皿である。この場合、これらの２つの要素の直径は、好ましくは、同一または本質的に同一である。保持体を用いるならば、少なくとも加温装置を収容することを意図する保持体のくぼみも、加温装置および容器の直径よりわずかに大きい直径を有する円形である。
【００１４】
上記のプロセスにおいて、適当であればステップ(iv)に先行してまたは該ステップの後に、阻害物質を加えることによりトリプシンを阻害するステップを行うことができる。しかし、本発明によるプロセスの好ましい一実施形態によると、トリプシン阻害物質を加えず、組織試料をすすぐことが、トリプシンの作用を停止するために充分である。このことにより、特に、細胞とともに患者に与えられる物質の数を制限できる。
【００１５】
本発明は、患者の皮膚に施用するために適切な細胞懸濁物を調製するためのプロセスであって、
(i)患者への移植のために適当な細胞を含む皮膚組織試料に対して上記の解離プロセスを行うステップと、
(ii)前記皮膚試料を起源とする適当な細胞を採集し、溶液に懸濁するステップと(適当であれば、このステップは、前記試料からある種の細胞を分離および／または選別する中間ステップを必要とする)、
(iii)ステップ(ii)で得られた溶液を細胞篩でろ過するステップと
を含むプロセスにも関する。
【００１６】
特定の一実施形態によると、上記のプロセスは、ステップ(iii)で得られた細胞懸濁物にヒアルロン酸を加えるさらなるステップを含む。このステップにより、創傷床に容易に施用される粘性混合物を得ることができる。さらに、ヒアルロン酸は、細胞生存率を増進する。
上記のプロセスのある特定の用途は、白斑の処置である。本出願では、ステップ(ii)で回収される細胞は、少なくともメラニン形成細胞を含む。
【００１７】
本発明は、発熱性の物理的または化学的プロセスに基づいて働く加温装置を含むことを特徴とする、生物学的用途のためのキット(細胞生物学キットおよび／または分子生物学キット)にも関する。
本発明によるキットの好ましい一実施形態によると、加温装置は、過冷却された酢酸ナトリウム飽和水溶液を含有する気密封止プラスチックパウチで構成される。
【００１８】
本発明のキットの好ましい一実施形態によると、キットは、加温装置を収容することを意図するくぼみを含む保持体も含有する。この保持体は、例えば、５mmから35 mmの間の厚さを有する断熱材料の板を含み、ここで、加温装置を収容することを意図するくぼみは、５mmから25 mmの間の深さを有する。保持体は、中空保持体を形成するように折り曲げまたは組み立てられるより薄い板(例えば１mmの厚さ)で構成されることもできる。好ましくは、保持体に用いられる材料は、20℃にて0.4 W.m-1.K-1以下の熱伝導率λを有する。より好ましくは、その熱伝導率は、0.15 W.m-1.K-1未満または0.08 W.m-1.K-1未満または0.04 W.m-1.K-1以下である。使用できる材料としては、限定されないが、例えば、木材(合板のλ=0.11 W.m-1.K-1)、ボール紙(λ=0.07 W.m-1.K-1)、コルク(λ=0.04 W.m-1.K-1)、PVC (λ=0.2 W.m-1.K-1)、ポリプロピレン(λ=0.1〜0.22 W.m-1.K-1)、硬質ポリウレタンフォーム(λ=0.025)および発泡ポリスチレン(λ=0.036)が挙げられる。キットについて構想される用途によると、保持体の断熱の性質は、多少、重要である。例えば、皮膚科学の業務において、上記のようなプロセスにより細胞懸濁物を調製することを意図するキットについて、保持体の断熱の性質は、２次的である。なぜなら、キットが用いられる前提は、一般的に少なくとも18℃であり、細胞試料をトリプシンとインキュベートする時間はそれほど長くないからである。他方、ある種の用途は、極度の熱条件を課し、かつ／または30℃から40℃の間の温度にてより長いインキュベーション時間を必要とすることがある。この場合、適当であれば、容器内に熱をより長い時間保つための蓋を補うことができる断熱保持体を用いることが重要である。30℃から40℃の間で１時間より長いインキュベーションを必要とするこのような用途としては、限定されないが、例えば、軟骨細胞を単離するための軟骨の酵素消化；生殖細胞を単離するための精巣生検の消化；膵臓生検からのランゲルハンス島の取得；線維芽細胞を単離するための真皮の消化；歯肉線維芽細胞を単離するための歯肉生検の消化が挙げられる。
【００１９】
本発明のキットは、効率的な熱交換を可能にするために、加温装置、および適当であれば保持体のくぼみの寸法と同じ寸法を有する底部を有する容器も含むことができる。例えば、加温装置は、厚さが３mmから７mmの間、好ましくは４〜６mmで、直径が７cmから11 cmの間、好ましくは８〜10 cmの円盤であり得、この場合、容器は、好ましくは、加温装置の直径とほぼ同じ直径を有するペトリ皿であり、保持体が存在するならば、加温装置を収容することを意図するくぼみも加温装置の直径よりわずかに大きい直径を有する円形である。
【００２０】
本発明によるキットは、酵素、例えばトリプシンも含有できる。このようなキットは、例えば、生検の処理のために設計され、特に、前記生検の細胞を解離するために必要な手段を含む。特定の一実施形態によると、このキットは、加温装置の直径と同一または非常に近い直径を有する、区画に分けられたペトリ皿と、細胞篩と、トリプシン(凍結乾燥された形または溶液で)とを含む。
【００２１】
以下の実施例および図は、本発明を説明するが、その範囲を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】20℃の部屋で40分間、ペトリ皿の直径とほぼ等しい直径の円盤形状の酢酸ナトリウム加温装置の上に置いた直径９cmのペトリ皿中の緩衝液の温度の変化。
【図２】保持体とヒートパック(加温装置)とを含むデバイスの写真。１:ヒートパック;２:保持体;３:ヒートパックの上に置いた仕切りのある皿。
【図３】保持体なしの場合の時間の関数としての温度の変化。
【図４】保持体V2を用いた場合の時間の関数としての温度の変化。
【図５】保持体V3を用いた場合の時間の関数としての温度の変化。
【図６】時間の関数としての温度の変化(保持体なしの手段と保持体V2またはV3を有する手段との比較)。
【実施例】
【００２３】
実施例１:加温装置の上に置いたペトリ皿中の媒体の温度
ペトリ皿の直径とほぼ等しい直径と４mmから６mmの間の厚さとを有する円盤形状の酢酸ナトリウム加温装置の上に置いた直径９cmのペトリ皿中の(緩衝剤)溶液の温度を測定した。
結果(図１)は、温度が30℃に数分で達するので、温度のかなり迅速な増加を示す。温度は、次いで、20分を少し超える間、30℃から40℃の間にとどまる。
これらの結果は、良好な再現性を示した。
【００２４】
実施例２:メラニン形成細胞の自己移植片による白斑の処置の関係における真皮-表皮分離への適用
薄い皮膚生検(0.2 mm〜0.3 mm)を用いて、創傷の床に自己細胞を播種する。
移植片の解離の後に得た細胞懸濁物は、主に基底ケラチノサイト細胞であるが、ランゲルハンス細胞、メラニン形成細胞および線維芽細胞も含む混合集団で構成される。
【００２５】
用いた材料
実施例１に記載する加温装置と、付属要素ならびに器具、すなわち酵素溶液および施用溶液、２つの区画に分けられたペトリ皿を含む滅菌器具で構成される使い捨てキット。
【００２６】
プロトコール
滅菌手術野を準備する。
受け取りの際に、キットは使用時まで+４℃にて貯蔵する。キットを使用前に10分間周囲温度に置く。
【００２７】
酵素溶液の調製および加熱
５mlの注射器および針を用いて、５mlのPBS溶液を取り、凍結乾燥されたトリプシンの瓶に注入する。完全に均質にした後に、再構成された溶液を取り、２つの区画に分けられたペトリ皿の一方の区画に入れる。
金属板を崩すことにより瞬時にヒートパックを作動させる;結晶は瞬時に固化する。
２つの区画に分けられたペトリ皿を作動させたヒートパックの上に置き、５分待つ。
【００２８】
皮膚試料の採取
試料を採取する領域を、外科用フェルトペンで規定し、アルコール溶液中の0.5%クロルヘキシジンで消毒し、２%キシロカインで麻酔をかける。最小表面積４cm2で厚さ0.2〜0.3 mmの皮膚の薄片を、皮膚採取器を用いて採取する。
【００２９】
真皮-表皮分離(DES)の実施
滅菌鉗子(提供されない)を用いて、生検を0.4%のトリプシン溶液を含むペトリ皿の区画に移す。
15分間インキュベートする。
生検をすすぐ:
同じ５mlの注射器および針を用いて、５mlのPBS溶液を取り、ペトリ皿の第２の区画に入れる。
インキュベーションの最後に、滅菌鉗子を用いて、生検を第２の区画に移してPBSで迅速にすすぐ。
滅菌鉗子を用いて、生検を、真皮表皮接合部が上を向く方向を保つように注意しながらペトリ皿の蓋の内部に入れる。
鉗子を用いて、２つの断片を分ける。
【００３０】
細胞懸濁物の調製
第２の５mlの注射器および針を用いて、1.5 mlのPBSをとり、生検断片に加え、メス(提供されない)を用いて接合部表面から細胞をこそげ落とし、表皮部分を粗く切断して、細胞混合物を得る。
傍らに取りのけておき、真皮部分を固定化する。
ペトリ皿を傾けて、５mlの注射器を用いて全容積を吸い込み、細胞を注射器に引き上げ、吸い込みを数回行って細胞懸濁物を創出する。
【００３１】
細胞ろ過
細胞懸濁物を、赤い蓋のついたポットの上に置いた篩に移す。
【００３２】
ヒアルロン酸中での細胞懸濁物の調製
篩を取り除く。
注射器に入っていた(すなわち1.5 ml)ヒアルロン酸を、ろ過済み細胞懸濁物を含む赤い蓋のついたポットに入れる。
注射器を用いて、ヒアルロン酸と細胞懸濁物とを混合して、粘性であるが均質な懸濁物を得る。
このようにして調製した懸濁物は、創傷床の上にシリンジにより置く準備ができている。
【００３３】
結果
上記のプロトコールを、２つのトリプシン濃度(0.4%および0.8%)を用いて、３つの異なる皮膚試料に対して数回行った。
得られた結果を、以下の表１にまとめる。
【００３４】
【表１】
2015519905.tif 000002
【００３５】
トリプシン濃度
活性物質を得るためのプロセスは、van Geelら(van Geelら, 2004)により記載された技術から適合させた。
トリプシン溶液の濃度は最適化した(0.25%トリプシン/0.08%EDTAの代わりに0.4%または0.8%トリプシン)。van Geelらにより記載される技術とは異なって、トリプシンの阻害は、胎児ウシ血清型の阻害物質を加えて行わず、PBSですすぐことにより行って、生成物の生成のために用いる生体起源の生成物の数を低減させた。この形態のトリプシン阻害の後の細胞生存率を確認した。
【００３６】
細胞生存率
細胞生存率は、従来の細胞培養技術であるトリパンブルー排除試験に従って決定した。トリパンブルーと細胞懸濁物との容積対容積の希釈を、溶血チューブ中で行った。１〜２分間接触させた後に、混合物を、マイクロピペットを用いて、計数セル上のスライドとカバーグラスの間に置いた。青く染色される死滅細胞と染色されない生存細胞とを、位相鎖光学顕微鏡を用いて計数した。
細胞生存率は、表皮細胞を単離した(90%を超える)後に非常に満足できるものであった。
培養に戻した後の細胞の挙動およびクローニング効率は、生検間で均一であり、細胞懸濁物が、トリプシン処理の後に増殖できる細胞を含有することを示した。
【００３７】
単離細胞数/cm2生検
計算は、上記の試験の結果に基づいて行った。
単離細胞数は、処理した生検のサイズに依存して個体ごとに変動したが、細胞収率/cm2 は比較的一定であった。よって、最終懸濁物の細胞密度は、処理した生検のサイズに大きく依存する。
【００３８】
クローニング効率試験(CFE)
クローニング効率のパーセンテージにより、接着およびコロニー形成可能な細胞の量を評価できる。既知の量の表皮細胞を３つのT25 cm2フラスコに接種した。培養14日目付近に、クローンが十分に大きいが接合されていないときに、フラスコを、クリスタルバイオレットの溶液(10%ホルムアルデヒド/0.5%クリスタルバイオレット、蒸留水適量)で染色した。クローニング効率は、T25 cm2あたりに接種した細胞数に対する、T25 cm2フラスコあたりの全コロニー数の平均×100の比率を得ることにより計算した。
培養に戻した後の細胞の挙動およびクローニング効率は、生検間で均一であり、細胞懸濁物が、トリプシン処理の後に増殖できる細胞を含有することを示した。
【００３９】
フローサイトメトリーによる細胞懸濁物中のメラニン形成細胞含量
細胞膜を、PBS-１% BSA (ウシ血清アルブミン)-0.5% tritonの溶液中で透過にした。正常メラニン形成細胞に特異的な１次抗体(NKI/beteb抗体)をインキュベートし、次いで、PBS-１% BSAですすいだ。２次抗体(Alexa Fluor 488ロバ抗マウス抗体)をインキュベートし、次いで、PBS-１% BSAですすいだ。標識された細胞をPBS中に取り、FACS-SCANを通過させた。
得られた表皮懸濁物中のメラニン形成細胞/ケラチノサイト比率は、Guerraらにより計算されたもの(１:30から１:200の間)と同等であった(Guerraら, 2003)。
ここで記載するプロセスでは、単離表皮細胞は培養せず、プロセス全体を１日で行った(生検、最終生成物の生成および非培養自己表皮細胞の移植)。
【００４０】
実施例３:加温装置を用いる媒体の温度の増加および維持を最適化するための断熱保持体の使用
3.1.材料および方法
材料および試薬
PVCヒートパック(加温装置)、EC表示。
折り畳むと直径90 mmの円形のくぼみを有する全厚さ15 mmの保持体が得られる、１〜２mmの厚さのポリプロピレン(PP)シートで構成された保持板(図２)。
仕切りのあるペトリ皿(参考Dutscher 020012)。
ThermoTrack V4および／またはA BT 529ソフトウェアで作動するようにプログラムされた温度プローブ(thermobouton)。
【００４１】
方法
+４℃にて貯蔵し、20分間周囲温度にて平衡化した６ミリリットルのPBSを、直径90 mmのペトリ皿の区画の１つに入れ、ここにthermoboutonプローブ(温度変動を記録するためのデバイス)を入れ、毎分温度を記録する。ペトリ皿を、次いで、蓋で覆う。
thermoboutonプローブは媒体と接触し、ヒートパックの作動後に溶液内で直接温度変動を測定できる。実験は、ヒートパックおよびペトリ皿を保持体の円形のくぼみの中に置くかまたは置かずに行う(図２)。３つの異なる保持体を試験した。これらは、加温装置およびペトリ皿を収容することを意図する円形のくぼみのほぼ中心の位置の点で異なる。
各条件を、異なる温度プローブを用いて５〜６回試験した。温度測定は、20分間行った。温度の平均は、この期間中に記録された全ての値から計算した。
保持体ありまたはなしで媒体中で測定した温度の統計解析は、スチューデントのｔ検定により行った。
【００４２】
3.2.結果
保持体なしでヒートパックを用いた場合の媒体の温度の変化
媒体に浸した温度プローブにより収集された温度データを図３に図示する。６回の試験からの平均温度は35.5℃であり、平均標準偏差は3.9℃であった。
これらの結果は、保持体なしで様々な加温装置を用いて得られた温度の再現性を証明する。
【００４３】
保持体中でヒートパックを用いた場合の媒体の温度の変化
２つの保持体(プロトタイプV2およびV3)を試験した。これらは、加温装置を収容することを意図する円形のくぼみの位置の点で異なる。実際に、保持体V3では、このくぼみは、保持体内の熱が均一になるように中央に寄っており、加温装置の上に置かれた仕切りのあるペトリ皿内の温度の増加および維持を最適にした。
媒体に浸した温度プローブにより20分間収集された温度データを、図４(保持体V2)、図５(保持体V3)及び図６(２つの保持体と保持体なしで得られた温度との比較)に示すグラフに図示し、以下の表にまとめる。
【００４４】
【表２】
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【００４５】
これらの結果は、以下のことを証明する。
加温装置間の再現性;
到達温度は、加温装置を保持体中に入れた場合により高い(V2を用いて1.1℃、V3を用いて0.8℃の差);
保持体ありまたはなしで、仕切りのあるペトリ皿に含まれる媒体は、少なくとも18分間、35℃より高い温度に維持される;
保持体なしで、39.5℃の最大温度に９分間で到達するが、保持体V2を用いると、40.5℃に６分間で到達する。
【００４６】
観察される差が統計的に有意であるかを決定するために、スチューデントのｔ検定による統計解析を、保持体V3を用いて得られた値を用いて行った。この検定は、0.03 < 0.05の確率を示し、このことは、保持体なしで得られた温度と保持体V3を用いて得られた温度との差が有意であることを証明する(表３)。保持体V3は、よって、保持体なしよりも平均でより高い温度を、より迅速にかつより高い再現性(s.d.±１℃)で得ることを可能にする。
【００４７】
【表３】
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【００４８】
よって、保持体は、温度の増加および／または維持を最適にすることを可能にする。
実施例２に記載する表皮懸濁物を生成するためのプロセスに従って、真皮-表皮分離を行うための薄い皮膚生検の酵素消化中にVitiCell(登録商標)キットの保持体を用いることにより、平均でより高い温度をより迅速に得ることができる。保持体は、よって、２重の利点、すなわち作業板およびヒートパックの温度増加の最適化を有する。
【００４９】
【表４】
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【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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