(57)【要約】  本文書は、体の失われた機能を置きかえ且つ/又は復元するための移植に使用する医療用補綴デバイスを目的とする。本文書は、アルギネートをコートした二酸化チタン骨格を作製する方法を開示し、そのアルギネートコーティングは、生物学的に活性な物質を任意に含む。
2015535695.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギネートコーティングを含む二酸化チタン骨格を作製する方法であって、
a)二酸化チタン骨格を用意する工程と、
b)少なくとも1つのアルギネート約1〜3%w/vを含むアルギネート溶液を前記二酸化チタン骨格の少なくとも一部に加え、次いで二酸化チタン骨格を遠心分離する工程と、
c)工程b)において得られる二酸化チタン骨格に、二価陽イオンがCa2+、Mg2+、Ba2+又はSr2+からなる群から選択される、二価陽イオン塩溶液を加え、次いで任意に二酸化チタン骨格をすすぐ工程と、
d)二酸化チタン骨格を乾燥させる工程と
を含み、任意に工程b)及びc)が少なくとも一回繰り返される、方法。
【請求項２】
工程b)のアルギネート溶液中のアルギネートの濃度が約2%w/vである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
工程c)における二価陽イオン塩溶液の濃度が、約50mMなど、約15〜150mMである、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
工程b)及びc)が、2〜10回など、2〜100回繰り返される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程b)のアルギネート溶液が、少なくとも1つの生物学的に活性な物質を更に含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的に活性な物質が、合成若しくは天然の生物活性分子、天然若しくは合成の薬物及び/又は生細胞からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
アルギネートが、10 000〜100 000g/molの分子量(Mw)を有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記アルギネートコーティングが、1〜20μmなど、少なくとも1μmの湿潤厚を有する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも1つのアルギネートが、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸カルシウム及びアルギン酸ストロンチウムからなる群から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項1から9のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる二酸化チタン骨格。
【請求項１１】
請求項1から9のいずれか一項に記載の方法によって得られる二酸化チタン骨格。
【請求項１２】
請求項10又は11に記載の二酸化チタン骨格を含む医療用インプラント。
【請求項１３】
医療用インプラントとして使用する、請求項10又は11に記載の二酸化チタン骨格。
【請求項１４】
骨などの組織の再生、修復、置換及び/若しくは復元に使用する、請求項10若しくは11に記載の二酸化チタン骨格又は請求項11若しくは12に記載の医療用インプラント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本文書は、医療用インプラント並びにその生体適合性及び体内での機能を改善する方法を目的とする。具体的には、本文書は、アルギネートコーティングを含む二酸化チタン骨格を作製する方法を開示し、そのアルギネートコーティングは、生物学的に活性な物質を任意に含んでもよい。
【背景技術】
【０００２】
外傷、腫瘍、癌、歯周炎及び骨粗鬆症などの症状は、骨欠損、骨成長及び体積の減少を引き起こす場合がある。これらの及び他の理由により、骨成長を改善し、骨の解剖学的構造を回復する方法を見いだすことは非常に重要なことである。
【０００３】
3次元骨格を活用する骨形成原細胞からの天然の骨組織形成は、失われた骨を修復及び再生するための自家移植片及び同種移植片の代替物を提供する。適切に構築された骨格は、多孔性であり十分に相互接続しているネットワークを含み、細胞が付着及び接着するのに適した表面を提供し、新たな骨の発達を誘導し、骨形成細胞の移動、増殖及び分化並びに内方増殖組織の血管新生を支持する。いくつかのポリマー及びバイオセラミックスが骨組織工学用に開発されたが、その低い機械的特性により、耐荷重用途に対する使用は制限されていた。
【０００４】
二酸化チタン(TiO2)は生体適合材料であり、生物活性特性及びある程度の静菌効果を有することも報告されている。従って、セラミックTiO2は、骨組織工学目的の材料として研究されてきた。空隙率90%及び圧縮強度1.63〜2.67MPaの値を実現する高い機械的強度を持つ高多孔性であり十分に相互接続しているTiO2骨格が最近開発され(Tiainenら2010)、その生体適合性及び骨伝導特性(osteoconductive property)がin vitro及びin vivoで実証された。
【０００５】
インプラント構造を異なる種類の生物学的に活性な分子でコーティングすることによって、例えば骨格の生体適合性を改善して骨結合を改善し、感染及び炎症を阻害する試みが行われた。しかし、移植後にインプラントにおいて目的とする機能を実行できるように、生物学的に活性な分子は、それを放出することができ、その生物活性を損なわず、負の体内反応を引き起こさないなどの方法でインプラントにコートされる必要がある。
【０００６】
ヒドロゲルは、空間充填剤、生物活性分子の送達媒体、及び細胞を組織し、刺激を与えて望ましい組織の形成を導く3次元構造など、組織工学において異なる用途に使用されてきた。アルギネートは、組織工学用のヒドロゲルを形成するために選ばれるポリマーの一例であり、細胞及び/又は増殖因子の封入並びに薬物の安定性及び送達を含めた様々な医療用途に使用されてきた。アルギネートは、β-D-マンヌロン酸(M)とα-L-グルクロン酸(G)モノマーとの親水性直鎖状多糖コポリマーである。Ca2+、Ba2+又はSr2+などの二価陽イオンが、Gモノマーのブロックと協調して相互作用し、それにより異なるポリマー鎖間にイオンブリッジが作られる場合に、アルギネートゲルが形成される。正常な生理的条件下で非毒性であり、生分解性であり、望ましい形状への加工が容易であるなど、生体材料の好ましい特性により、アルギネートは、皮膚、軟骨、骨、肝臓及び心臓組織の再生を含めた組織工学において詳細に研究されてきた。
【０００７】
しかし、医療用インプラント並びに組織工学の分野において、例えば、生体適合性であり且つ/又は体内でインプラントの結合を改善する支持構造を備えるインプラント構造の必要性が依然としてある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO 2008/078167
【特許文献２】WO08078164
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本文書の一目的は、生体適合性があり且つ/又は結合特性が改善された医療用インプラントなど、支持構造として適切な二酸化チタン骨格を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、一態様においてアルギネートコーティングを含む二酸化チタン骨格を作製する方法を目的とする本開示によって達成され、前記方法は、
a)二酸化チタン骨格を用意する工程と、
b)少なくとも1つのアルギネート約1〜3%w/vを含むアルギネート溶液を前記二酸化チタン骨格の少なくとも一部に加え、次いで二酸化チタン骨格を遠心分離する工程と、
c)工程b)において得られる二酸化チタン骨格に、二価陽イオンがCa2+、Mg2+、Ba2+又はSr2+からなる群から選択される、二価陽イオン塩溶液を加え、次いで任意に二酸化チタン骨格をすすぐ工程と、
d)二酸化チタン骨格を乾燥させる工程と
を含み、任意に工程b)及びc)が少なくとも一回繰り返される。
【００１１】
工程b)の後に工程c)が実行される場合、工程b)における遠心分離並びに/又は工程b)及びc)における低密度のアルギネート及び/若しくは二価陽イオン溶液のそれぞれにより、二酸化チタン骨格に、骨格の外表面だけでなく骨格内部の細孔の壁にも存在するアルギネート溶液の薄層を形成することが可能になる。工程c)において二価陽イオン塩溶液が添加されるとき、アルギネートのゲル化が起こり、それによってアルギネートゲル層が形成される。方法の工程b)及びc)を繰り返すことにより、2層以上のアルギネートゲル層からからなるアルギネートコーティングが生成されてもよい。本方法により、アルギネートの薄いコーティングを形成し、アルギネートゲルの1つ又は複数の層を生成することができるので、チタン骨格の細孔はアルギネートコーティングによって塞がれることは無く、細胞及び組織は容易に接近して骨格構造へと増殖できる。本方法を使用して二酸化チタン骨格上にアルギネートコーティングを調製する際の別の効果は、アルギネートコーティングが細孔の少なくとも一部の内部に形成されるので、アルギネートコーティングが骨格の他の表面にしかできない場合と比較して、極めて大きな表面対体積比になることである。これは、アルギネートコーティングに含まれる生物学的に活性な物質など、任意の物質の放出プロファイルに影響を及ぼす。また、アルギネートコーティングが二酸化チタン骨格の外表面から剥がれ落ちたとしても、アルギネートコーティングは骨格内部の細孔の表面上になおも存在することになる。
【００１２】
また、本文書はアルギネートコーティングを含む二酸化チタン骨格を作製する上記方法によって得られる二酸化チタン骨格を目的とする。
【００１３】
本明細書に開示する方法によって作製されたアルギネートコーティングを備えた二酸化チタン骨格を含む医療用インプラントを更に開示する。医療用インプラント用のアルギネートをコートした二酸化チタン骨格も開示する。
【００１４】
本文書は、骨などの組織の再生、修復、置換及び/若しくは復元のための並びに/又は骨などの組織の再生、修復、置換及び/若しくは復元に使用するための、アルギネートをコートした二酸化チタン骨格又はそれを含む医療用インプラントも目的とする。
【００１５】
更に、組織並びに/又は骨の再生、修復、置換及び/若しくは復元のための医療用インプラントを調製するためのアルギネートをコートした二酸化チタン骨格又はそれを含む医療用インプラントの使用法を開示する。
【００１６】
それを必要とする対象へのアルギネートをコートした二酸化チタン骨格又はそれを含む医療用インプラントの移植を含めた、組織を再生、修復、置換及び/又は復元する方法も開示する。
【００１７】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な記述、図面、実施例から、並びに特許請求の範囲から明らかになる。
【００１８】
定義
本文脈において「骨格（Scaffold）」とは、開放多孔性構造に関する。本文脈において骨格は「SC」と略記することができる。「二酸化チタン骨格」とは、骨格構造の構築材料として二酸化チタンを支配的に含む骨格であることを意味し、すなわち二酸化チタンが、骨格構造の形成に関与する主要物質である。従って、二酸化チタン骨格は、約51wt%、60wt%、70wt%、80wt%、90wt%、95wt%、96wt%、97wt%、98wt%、99wt%又は100wt%二酸化チタンなど、約51〜100wt%、60〜100wt%、60〜90wt%、70〜100wt%、70〜90wt%、80〜90wt%又は80〜95wt%の二酸化チタンなど、50wt%以上の二酸化チタンを有する。従って、二酸化チタン骨格は、骨格の構築材料として二酸化チタンを含んでも又はそれからからなっていてもよい。
【００１９】
本文書の文脈において「細孔直径」とは、囲壁の無い細孔の水力直径とする。水力直径は、当業者に周知であり、4*細孔の面積を細孔の円周長で割ると定義される。
【００２０】
「フラクタル次元支柱」とは、より細かくより細かな規模へと縮小するにつれて、あるフラクタルがどの程度完全に空間を満たしているように見えるかの指標を与える統計量である。フラクタル次元には多くの特異的な定義があるが、そのいずれも普遍のものとして扱われるべきでない。1の値は、直線に関係する。より高い数は、より複雑な表面構造である。本文書において、フラクタル次元は、コルモゴロフ又は「ボックスカウント」法(Liebovitch L.S.ら1989年)を使用して算出される。それは、Skyscan CTAn、Kontich、Belgiumにおいて2dと3dの両方で算出される。表面又は体積を正方形若しくは立方体のアレイに分け、対象表面の部分を含有する四角形の数を数える。3〜100ピクセルなど様々なボックスサイズに亘ってこれを繰り返す。表面を含有するボックスの数をlog-log図表においてボックス長に対してプロットし、log-log回帰の傾きからフラクタル次元を得る。本文脈において「総空隙率」とは、材料ではない本体内部の全ての区画、例えばどんな材料にも占有されていない空間と定義される。総空隙率は、閉鎖孔と開孔の両方を含む。
【００２１】
「内部支柱体積」とは、支柱の内腔の体積を意味する。
【００２２】
「焼結」、「焼結する」などとは、材料の粒子が互いに接着するまで(融点以下で)加熱することにより、粉末から対象を作る方法のことを意味する。焼結は昔から、セラミック対象を製造するために使用され、また粉末冶金学としてそのような分野での使用法が見いだされた。
【００２３】
本文脈において「医療用補綴デバイス」、「医療用インプラント」、「インプラント」などは、哺乳動物、例えばヒト哺乳動物など、脊椎動物の体内へ移植されることを目的とするデバイスに関する。本文脈においてインプラントは、解剖学的構造を置きかえ且つ/又は任意の身体機能を復元するために使用されてもよい。そのようなデバイスの例には、それだけには限らないが、歯科インプラント及び整形外科インプラントがある。本文脈において、整形外科インプラントは、筋骨格システム、特に関節及び骨における痛みの緩和を含めた機能の保存及び復元のために、脊椎動物、具体的にはヒトなどの哺乳動物の体内へ移植されることを目的とする任意のデバイスをその範囲に含む。本文脈において、歯科インプラントとは、歯科復元手順において脊椎動物、具体的にはヒトなどの哺乳動物の口腔に移植されることを目的とする任意のデバイスをその範囲に含む。一般に、歯科インプラントは、1つ又はいくつかのインプラント部品から構成される。例えば、歯科インプラントは通常、橋脚歯などの二次インプラント部品に結合している歯科固定具及び/又は歯冠、ブリッジ若しくは床義歯などの歯科復元を含む。しかし、他の部品が接続されても、歯科固定具など移植を目的とするデバイスはどれも、単独でインプラントと呼ぶことができる。上記から明らかなように、整形外科及び歯科インプラントは、整形外科及び歯科補綴デバイスと表してもよい。
【００２４】
本文脈において、「対象」とは、鳥類、爬虫類、哺乳動物、霊長類及びヒトなど、任意の脊椎動物に関する。
【００２５】
本文脈において、「セラミック」とは、熱処理して凝固構造を形成する無機粉末材料の対象を意味する。
【００２６】
「生物学的に活性な物質」とは、生物学的過程に影響し得る物質のことを意味し、すなわち、生物活性を有する。生物学的に活性な物質は、無機イオンなどの小分子又はタンパク質などのより大きな分子、更に細胞などの複合体でもよい。本文書の文脈における使用に適切な生物学的に活性な物質の例を下に開示する。生物学的に活性な物質はまた、本文脈において「生体分子」と表してもよい。
【００２７】
本文書の文脈において、「軟組織」とは体の他の構造及び器官を、接続する、支持する又は取り巻く骨ではない組織のことを意味する。軟組織には、靭帯、腱、筋膜、皮膚、線維組織、脂肪、滑膜、上皮、筋肉、神経及び血管がある。
【００２８】
本文書の文脈において、「硬組織」とは、骨及び歯並びに軟骨など石化組織のことを意味する。石化組織は、無機塩類を柔基質に取り込む生物組織である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】300mM CaCl2によってゲル化した2%アルギネート(A及びB)及び合成ペプチドを含有する2%アルギネート(C及びD)の微細構造を示す図である。倍率×25(A及びC)及び×100(B及びD)でのSEMによる観察。このゲルは二酸化チタン骨格上に存在せず、本明細書に開示されるアルギネートコーティングを含む二酸化チタン骨格を作製する方法によって調製されていない。従って、このゲルは、多孔性構造をとる。
【図２】37℃でのインキュベーションの21日後の、FITCで標識したペプチド2の放出プロファイルを示す図である。バーグラフは、各時点後に放出されたペプチドの量を示す。線グラフは、21日目までに放出されたペプチドの累積量を表す。値は、平均±SEMを表す。
【図３Ａ】上:異なる量の細胞(30×103、60×103、100×103及び200×103個細胞/ウェル)を播種したときの、培養の1及び5日後の接着細胞の数を示す図である。値は、平均±SEMを表す。下:倍率×200でSEMにより得た、100×103個細胞/ウェルを播種したときの、2%アルギネートヒドロゲルに接着している骨芽細胞の代表的な写真である。
【図３Ｂ】2%アルギネートコーティング上の骨芽細胞の付着を示す写真である。代表的な写真は、30×103 (A及びB)、60×103 (C及びD)、100×103 (E及びF)及び200×103 (G及びH)個細胞/ウェルを播種したとき、培養の1(A、C、E、G)及び5(B、D、F、H)日後に、接着細胞の共焦点顕微鏡により得られた。細胞核を白(DAPI染色)(左列)で表し、アクチンフィラメントを白(ファロイジン-FITC)(右列)で表す。棒目盛は、150μmを表す。
【図４】ペプチドを含まないアルギネートゲル(-)又は50μg/mLのエムドゲイン(EMD)若しくは合成ペプチド(P2、P5及びP6)のいずれかを含有するアルギネートゲルにMC3T3-E1細胞を播種して24時間後に採取した培地から測定したLDH活性を示す図である。高対照(100%)は、組織培養プラスチックに播種し、1% Triton X-100とインキュベートした細胞の細胞培養液にした。低対照(0%)は、組織培養プラスチックに播種し、0.1%酢酸-PBSとインキュベートした細胞の細胞培養液にした。LDH活性のパーセンテージは、以下の方程式を使用して算出した:細胞毒性(%)=(実験値-低対照)/(高対照-低対照)*100。値は、平均±SEMを表す。群間の差異は、マンホイットニー検定によって評価した、対照アルギネートゲル(-)に対して*p < 0.05、EMD含有アルギネートゲルに対して#p < 0.05。
【図５Ａ】ペプチドを含まない(-、対照群)、合成ペプチド又はEMD(50μg/mL)を含有する2%アルギネートゲルにおいて、14及び21日間MC3T3-E1細胞を培養した後の細胞接着関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子で標準化し、培養14日目の対照アルギネートゲルを100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の相対的なmRNAレベルを表す。値は、平均±SEMを表す。群間の差異は、スチューデントのt検定によって評価した;対照アルギネートゲル(-)に対して(*)p≦0.05、EMDに対して(#)p≦0.05。
【図５Ｂ】ペプチドを含まない(-、対照群)、合成ペプチド又はEMD(50μg/mL)を含有する2%アルギネートゲルにおいて、14及び21日間MC3T3-E1細胞を培養した後の細胞接着関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子で標準化し、培養14日目の対照アルギネートゲルを100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の相対的なmRNAレベルを表す。値は、平均±SEMを表す。群間の差異は、スチューデントのt検定によって評価した;対照アルギネートゲル(-)に対して(*)p≦0.05、EMDに対して(#)p≦0.05。
【図５Ｃ】ペプチドを含まない(-、対照群)、合成ペプチド又はEMD(50μg/mL)を含有する2%アルギネートゲルにおいて、14及び21日間MC3T3-E1細胞を培養した後の細胞接着関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子で標準化し、培養14日目の対照アルギネートゲルを100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の相対的なmRNAレベルを表す。値は、平均±SEMを表す。群間の差異は、スチューデントのt検定によって評価した;対照アルギネートゲル(-)に対して(*)p≦0.05、EMDに対して(#)p≦0.05。
【図５Ｄ】ペプチドを含まない(-、対照群)、合成ペプチド又はEMD(50μg/mL)を含有する2%アルギネートゲルにおいて14及び21日間MC3T3-E1細胞を培養した後の細胞接着関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子で標準化し、培養14日目の対照アルギネートゲルを100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の相対的なmRNAレベルを表す。値は、平均±SEMを表す。群間の差異は、スチューデントのt検定によって評価した;対照アルギネートゲル(-)に対して(*)p≦0.05、EMDに対して(#)p≦0.05。
【図６Ａ】ペプチドを含まない(-、対照群)、合成ペプチド又はEMD(50μg/mL)を含有する2%アルギネートゲルにおいて、14及び21日間MC3T3-E1細胞を培養した後の骨芽細胞分化関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子で標準化し、培養14日目の対照アルギネートゲルを100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の相対的なmRNAレベルを表す。値は、平均±SEMを表す。群間の差異は、スチューデントのt検定によって評価した;対照アルギネートゲル(-)に対して(*)p≦0.05、EMDに対して(#)p≦0.05。
【図６Ｂ】ペプチドを含まない(-、対照群)、合成ペプチド又はEMD(50μg/mL)を含有する2%アルギネートゲルにおいて、14及び21日間MC3T3-E1細胞を培養した後の骨芽細胞分化関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子で標準化し、培養14日目の対照アルギネートゲルを100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の相対的なmRNAレベルを表す。値は、平均±SEMを表す。群間の差異は、スチューデントのt検定によって評価した;対照アルギネートゲル(-)に対して(*)p≦0.05、EMDに対して(#)p≦0.05。
【図６Ｃ】ペプチドを含まない(-、対照群)、合成ペプチド又はEMD(50μg/mL)を含有する2%アルギネートゲルにおいて、14及び21日間MC3T3-E1細胞を培養した後の骨芽細胞分化関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子で標準化し、培養14日目の対照アルギネートゲルを100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の相対的なmRNAレベルを表す。値は、平均±SEMを表す。群間の差異は、スチューデントのt検定によって評価した;対照アルギネートゲル(-)に対して(*)p≦0.05、EMDに対して(#)p≦0.05。
【図６Ｄ】ペプチドを含まない(-、対照群)、合成ペプチド又はEMD(50μg/mL)を含有する2%アルギネートゲルにおいて、14及び21日間MC3T3-E1細胞を培養した後の骨芽細胞分化関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子で標準化し、培養14日目の対照アルギネートゲルを100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の相対的なmRNAレベルを表す。値は、平均±SEMを表す。群間の差異は、スチューデントのt検定によって評価した;対照アルギネートゲル(-)に対して(*)p≦0.05、EMDに対して(#)p≦0.05。
【図６Ｅ】ペプチドを含まない(-、対照群)、合成ペプチド又はEMD(50μg/mL)を含有する2%アルギネートゲルにおいて、14及び21日間MC3T3-E1細胞を培養した後の骨芽細胞分化関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子で標準化し、培養14日目の対照アルギネートゲルを100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の相対的なmRNAレベルを表す。値は、平均±SEMを表す。群間の差異は、スチューデントのt検定によって評価した;対照アルギネートゲル(-)に対して(*)p≦0.05、EMDに対して(#)p≦0.05。
【図６Ｆ】ペプチドを含まない(-、対照群)、合成ペプチド又はEMD(50μg/mL)を含有する2%アルギネートゲルにおいて、14及び21日間MC3T3-E1細胞を培養した後の骨芽細胞分化関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子で標準化し、培養14日目の対照アルギネートゲルを100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の相対的なmRNAレベルを表す。値は、平均±SEMを表す。群間の差異は、スチューデントのt検定によって評価した;対照アルギネートゲル(-)に対して(*)p≦0.05、EMDに対して(#)p≦0.05。
【図７】37℃でのインキュベーションの21日後の、P2-アルギネートコート骨格からのペプチド2(配列番号1)の放出プロファイルを示す図である。バーグラフは、各時点後に放出されたペプチドの量を示す。線グラフは、21日目までに放出されたペプチドの累積量を表す。値は、平均±SDを表す。
【図８】培養の48時間後に採取した培地から測定したLDH活性を示す図である。値は、平均±SEMを表す。マン-ホイットニー検定(p≦0.05):(a)標準的骨格(SC)に対して、(b)対照アルギネート骨格(-)に対して。
【図９】2%アルギネートコートTiO2骨格(対照アルギネート骨格)の10kV及び40PaでのSEM可視化を示す図である。図A及び図Bは、1層の2%アルギネートゲルを含むコーティング工程直後のTiO2骨格の微細構造を倍率50x(A)及び300x(B)で示す。図C及び図Dは、培養の7日後の対照アルギネート骨格上で培養した細胞を倍率50x(C)及び300x(D)で示す。
【図１０】標準的な骨格(A及びB)、対照アルギネート骨格(C及びD)及びP2-アルギネートコート骨格(E及びF)上で増殖しているMC3T3- E1細胞の培養の7日(A、C及びE)並びに21日(B、D及びF)後のSEM可視化の図である。骨格は、10kV、40Pa、倍率x50でSEMによって観察された。
【図１１】培養の7日後に骨格上で増殖している細胞数を示す図である。DNA含有量をHoechst蛍光染色によって分析し、直線標準曲線と相関させた。値は、平均±SEMを表す。マン-ホイットニー検定:(a)標準的な骨格(SC)及び(b)対照アルギネート骨格(-)に対してp≦0.05。
【図１２Ａ】TiO2骨格上で7(□)及び21日間(■)培養したMC3T3- E1細胞におけるItgb1の相対的なmRNA発現レベルを示す図である。標準的な骨格(SC)を参照群として使用した。データは、参照遺伝子(Gapdh及び18S)で標準化し、7日目の標準的な骨格(SC)上で培養した細胞を100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の倍率変化を表す。値は、平均±SEMを表す。スチューデントのt検定: (a)標準的な骨格(SC)及び(b)対照アルギネート骨格(-)に対してp≦0.05。
【図１２Ｂ】TiO2骨格上で7(□)及び21日間(■)培養したMC3T3- E1細胞におけるItgb3の相対的なmRNA発現レベルを示す図である。標準的な骨格(SC)を、参照群として使用した。データは、参照遺伝子(Gapdh及び18S)で標準化し、7日目の標準的な骨格(SC)上で培養した細胞を100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の倍率変化を表す。値は、平均±SEMを表す。スチューデントのt検定: (a)標準的な骨格(SC)及び(b)対照アルギネート骨格(-)に対してp≦0.05。
【図１２Ｃ】TiO2骨格上で7(□)及び21日間(■)培養したMC3T3- E1細胞におけるFn1の相対的なmRNA発現レベルを示す図である。標準的な骨格(SC)を、参照群として使用した。データは、参照遺伝子(Gapdh及び18S)で標準化し、7日目の標準的な骨格(SC)上で培養した細胞を100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の倍率変化を表す。値は、平均±SEMを表す。スチューデントのt検定: (a)標準的な骨格(SC)及び(b)対照アルギネート骨格(-)に対してp≦0.05。
【図１２Ｄ】TiO2骨格上で7(□)及び21日間(■)培養したMC3T3- E1細胞におけるItga8の相対的なmRNA発現レベルを示す図である。標準的な骨格(SC)を、参照群として使用した。データは、参照遺伝子(Gapdh及び18S)で標準化し、7日目の標準的な骨格(SC)上で培養した細胞を100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の倍率変化を表す。値は、平均±SEMを表す。スチューデントのt検定: (a)標準的な骨格(SC)及び(b)対照アルギネート骨格(-)に対してp≦0.05。
【図１３Ａ】TiO2骨格上で7(□)及び21日間(■)培養したMC3T3-E1細胞における、オステリクス(Osx)の相対的なmRNA発現レベルを示す図である。標準的な骨格(SC)を、参照群として使用した。データは、参照遺伝子(Gapdh及び18S)で標準化し、7日目の標準的な骨格(SC)上で培養した細胞を100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の倍率変化を表す。値は、平均±SEMを表す。スチューデントのt検定: (a)標準的な骨格(SC)及び(b)対照アルギネート骨格(-)に対してp≦0.05。
【図１３Ｂ】TiO2骨格上で7(□)及び21日間(■)培養したMC3T3-E1細胞における、骨形成タンパク質2(Bmp2)の相対的なmRNA発現レベルを示す図である。標準的な骨格(SC)を、参照群として使用した。データは、参照遺伝子(Gapdh及び18S)で標準化し、7日目の標準的な骨格(SC)上で培養した細胞を100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の倍率変化を表す。値は、平均±SEMを表す。スチューデントのt検定: (a)標準的な骨格(SC)及び(b)対照アルギネート骨格(-)に対してp≦0.05。
【図１３Ｃ】TiO2骨格上で7(□)及び21日間(■)培養したMC3T3-E1細胞における、I型コラーゲン(Coll-I)の相対的なmRNA発現レベルを示す図である。標準的な骨格(SC)を、参照群として使用した。データは、参照遺伝子(Gapdh及び18S)で標準化し、7日目の標準的な骨格(SC)上で培養した細胞を100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の倍率変化を表す。値は、平均±SEMを表す。スチューデントのt検定: (a)標準的な骨格(SC)及び(b)対照アルギネート骨格(-)に対してp≦0.05。
【図１３Ｄ】TiO2骨格上で7(□)及び21日間(■)培養したMC3T3-E1細胞における、インターロイキン6(Il-6)の相対的なmRNA発現レベルを示す図である。標準的な骨格(SC)を、参照群として使用した。データは、参照遺伝子(Gapdh及び18S)で標準化し、7日目の標準的な骨格(SC)上で培養した細胞を100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の倍率変化を表す。値は、平均±SEMを表す。スチューデントのt検定: (a)標準的な骨格(SC)及び(b)対照アルギネート骨格(-)に対してp≦0.05。
【図１３Ｅ】TiO2骨格上で7(□)及び21日間(■)培養したMC3T3-E1細胞における、オステオポンチン(Opn)の相対的なmRNA発現レベルを示す図である。標準的な骨格(SC)を、参照群として使用した。データは、参照遺伝子(Gapdh及び18S)で標準化し、7日目の標準的な骨格(SC)上で培養した細胞を100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の倍率変化を表す。値は、平均±SEMを表す。スチューデントのt検定: (a)標準的な骨格(SC)及び(b)対照アルギネート骨格(-)に対してp≦0.05。
【図１３Ｆ】TiO2骨格上で7(□)及び21日間(■)培養したMC3T3-E1細胞における、骨シアロタンパク質(Bsp)の相対的なmRNA発現レベルを示す図である。標準的な骨格(SC)を、参照群として使用した。データは、参照遺伝子(Gapdh及び18S)で標準化し、7日目の標準的な骨格(SC)上で培養した細胞を100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の倍率変化を表す。値は、平均±SEMを表す。スチューデントのt検定: (a)標準的な骨格(SC)及び(b)対照アルギネート骨格(-)に対してp≦0.05。
【図１３Ｇ】TiO2骨格上で7(□)及び21日間(■)培養したMC3T3-E1細胞における、アルカリホスファターゼ(Alp)の相対的なmRNA発現レベルを示す図である。標準的な骨格(SC)を、参照群として使用した。データは、参照遺伝子(Gapdh及び18S)で標準化し、7日目の標準的な骨格(SC)上で培養した細胞を100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の倍率変化を表す。値は、平均±SEMを表す。スチューデントのt検定: (a)標準的な骨格(SC)及び(b)対照アルギネート骨格(-)に対してp≦0.05。
【図１３Ｈ】TiO2骨格上で7(□)及び21日間(■)培養したMC3T3-E1細胞における、オステオカルシン(Oc)の相対的なmRNA発現レベルを示す図である。標準的な骨格(SC)を、参照群として使用した。データは、参照遺伝子(Gapdh及び18S)で標準化し、7日目の標準的な骨格(SC)上で培養した細胞を100%に設定し、そのパーセンテージで表示した標的遺伝子の倍率変化を表す。値は、平均±SEMを表す。スチューデントのt検定: (a)標準的な骨格(SC)及び(b)対照アルギネート骨格(-)に対してp≦0.05。
【図１４】アルギネートコートTiO2骨格の走査型電子顕微鏡特性評価を示す図である。TiO2骨格の支柱表面をコーティングしているアルギネート層(矢印)の倍率250x(A)及び1500x(B、C)での走査型電子顕微鏡による可視化。
【図１５】アルギネートをコートした及びコートしていないTiO2骨格の過ヨウ素酸シッフによる可視化を示す図である。アルギネートをコートした(A、B)及びコートしていない(C、D) TiO2骨格の過ヨウ素酸シッフ染色。上(A)から中央(B)に見られるように、アルギネート(赤色)は、骨格の全体に分布している。
【図１６】シンバスタチン放出を示す図である。37℃でのインキュベーション19日後の、2.4mM及び0.6mM SIMを含有するアルギネートコートTiO2骨格からのSIMの放出プロファイルを示す図である。バーグラフは、各時点後に放出されたSIMの量を示す。線グラフは、19日目までに放出されたSIMの累積量を表す。値は、平均±SDを表す。
【図１７Ａ】乳酸デヒドロゲナーゼ活性アッセイを示す図である。ドナー1について、1日おきに14日目まで測定した、10nM及び10μM SIMを含む骨格の培地中のLDH活性が、SIMを含まない骨格と比較して示される。SIMを含まないアルギネートコート骨格の効果と比較して、どのSIM濃度もLDH活性の有意な増加を引き起こさなかった。値は、平均±SDを表す。
【図１７Ｂ】乳酸デヒドロゲナーゼ活性アッセイを示す図である。ドナー2について、1日おきに14日目まで測定した、10nM及び10μM SIMを含む骨格の培地中のLDH活性が、SIMを含まない骨格と比較して示される。SIMを含まないアルギネートコート骨格の効果と比較して、どのSIM濃度もLDH活性の有意な増加を引き起こさなかった。値は、平均±SDを表す。
【図１７Ｃ】乳酸デヒドロゲナーゼ活性アッセイを示す図である。ドナー3について、1日おきに14日目まで測定した、10nM及び10μM SIMを含む骨格の培地中のLDH活性が、SIMを含まない骨格と比較して示される。SIMを含まないアルギネートコート骨格の効果と比較して、どのSIM濃度もLDH活性の有意な増加を引き起こさなかった。値は、平均±SDを表す。
【図１８Ａ】アルカリホスファターゼ活性アッセイを示す図である。ドナー1について、2、8、14及び21日目に10nM及び10μM SIMを含む骨格の培地中のALP活性(y軸)が、対照となるSIMを含まない骨格のパーセンテージで示される。SIMを含まない骨格と比較した場合、どの時点の培地においても、10nM又は10μM SIMのいずれの骨格についても測定したALP活性に著しい変化はなかった。値は、平均±SDを表す。
【図１８Ｂ】アルカリホスファターゼ活性アッセイを示す図である。ドナー2について、2、8、14及び21日目に10nM及び10μM SIMを含む骨格の培地中のALP活性(y軸)が、対照となるSIMを含まない骨格のパーセンテージで示される。SIMを含まない骨格と比較した場合、どの時点の培地においても、10nM又は10μM SIMのいずれの骨格についても測定したALP活性に著しい変化はなかった。値は、平均±SDを表す。
【図１８Ｃ】アルカリホスファターゼ活性アッセイを示す図である。ドナー3について、2、8、14及び21日目に10nM及び10μM SIMを含む骨格の培地中のALP活性(y軸)が、対照となるSIMを含まない骨格のパーセンテージで示される。SIMを含まない骨格と比較した場合、どの時点の培地においても、10nM又は10μM SIMのいずれかの骨格についても測定したALP活性に著しい変化はなかった。値は、平均±SDを表す。
【図１９Ａ】免疫測定法:分泌されたタンパク質の定量化を示す図である。2、8、14及び21日目に、10nM及び10μM SIMを含む骨格から細胞培養液へのTNFRSF11Bの分泌を、対照となるSIMを含まない骨格のパーセンテージで示す。値は、平均±SDを表す。
【図１９Ｂ】免疫測定法:分泌されたタンパク質の定量化を示す図である。2、8、14及び21日目に、10nM及び10μM SIMを含む骨格から細胞培地へのVEGFAの分泌を、対照となるSIMを含まない骨格のパーセンテージで示す。値は、平均±SDを表す。
【図１９Ｃ】免疫測定法:分泌されたタンパク質の定量化を示す図である。2、8、14及び21日目に、10nM及び10μM SIMを含む骨格から細胞培地へのBGLAPの分泌を、対照となるSIMを含まない骨格のパーセンテージで示す。値は、平均±SDを表す。
【図２０】リアルタイムRT-PCR分析を示す図である。7、14及び21日目に、10nM及び10μM SIMを含む骨格上で培養した細胞におけるBGLAPの相対的mRNA発現レベルを、SIMを含まない骨格と比較して、参照遺伝子GAPDHに対して標準化して示す。値は、平均±SDを表す。
【図２１Ａ】シンバスタチンを含む又は含まないアルギネートコートTiO2骨格におけるI型コラーゲンの沈着の共焦点レーザー走査型顕微鏡法による可視化を示す図である。アルギネートコートTiO2骨格上で培養したヒト初代骨芽細胞におけるI型コラーゲンの蛍光免疫細胞化学的分析。10nM SIMを含む骨格で培養した細胞の大多数にI型コラーゲンが検出される。
【図２１Ｂ】シンバスタチンを含む又は含まないアルギネートコートTiO2骨格におけるI型コラーゲンの沈着の共焦点レーザー走査型顕微鏡法による可視化を示す図である。アルギネートコートTiO2骨格上で培養したヒト初代骨芽細胞におけるI型コラーゲンの蛍光免疫細胞化学的分析。10μM SIMを含む骨格で培養した細胞の大多数にI型コラーゲンが検出される。
【図２１Ｃ】シンバスタチンを含む又は含まないアルギネートコートTiO2骨格におけるI型コラーゲンの沈着の共焦点レーザー走査型顕微鏡法による可視化を示す図である。アルギネートコートTiO2骨格上で培養したヒト初代骨芽細胞におけるI型コラーゲンの蛍光免疫細胞化学的分析。SIMを含まない骨格で培養した細胞の大多数にI型コラーゲンが検出される。細胞外コラーゲン原線維は、SIMを含まない骨格にしか見られない。Type I型コラーゲン、DNA、TiO2骨格表面。
【図２２】アルギネートをコートした及びコートしていない骨格の過ヨウ素酸シッフ/全カドヘリンの可視化を示す図である。アルギネートをコートした(B)及びコートしていない(A)骨格の過ヨウ素酸シッフ染色。断面(B)に見られるように、アルギネート(赤色)は、骨格の全体に分布している。2日目の、細胞播種したアルギネートをコートした(D)及びコートしていない(C)骨格の過ヨウ素酸シッフ/全カドヘリン二重染色。細胞を含有するアルギネート層が骨格を覆っている(D)。
【図２３】細胞を播種したアルギネートコート骨格のアクリジンオレンジ/エチジウムブロマイドによる可視化。2日目のアルギネートコート骨格に播種したヒト脂肪由来間葉系幹細胞のアクリジンオレンジ/エチジウムブロマイド染色を示す図である。細胞の大多数はアルギネートコーティング手順を生き残った。生細胞は緑色に染色し、死細胞は赤色に染色する。
【図２４Ａ】乳酸デヒドロゲナーゼ活性を示す図である。ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(hAD-MSC)について、1日おきに14日目まで測定した、エムドゲインを含む(EMDアルギネート)又は含まない(アルギネート)、細胞を播種したアルギネートコート骨格からの培地中の乳酸デヒドロゲナーゼ活性を、対照となる細胞を播種したコートしていない骨格のパーセンテージで示す。値は、平均+ SDを表す。統計分析:(a)エムドゲインを含まないアルギネートコート骨格に対してp≦0.05、(b)細胞を播種したコートしていない骨格に対してp≦0.05。
【図２４Ｂ】乳酸デヒドロゲナーゼ活性を示す図である。ヒト初代骨芽細胞(hOST)について、1日おきに14日目まで測定した、エムドゲインを含む(EMDアルギネート)又は含まない(アルギネート)、細胞を播種したアルギネートコート骨格からの培地中の乳酸デヒドロゲナーゼ活性を、対照となる細胞を播種したコートしていない骨格のパーセンテージで示す。値は、平均+ SDを表す。統計分析:(a)エムドゲインを含まないアルギネートコート骨格に対してp≦0.05、(b)細胞を播種したコートしていない骨格に対してp≦0.05。
【図２４Ｃ】総タンパク質含有量アッセイを示す図である。ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(hAD-MSC)について、1日おきに14日目まで測定した、エムドゲインを含む(EMDアルギネート)又は含まない(アルギネート)、細胞を播種したアルギネートコート骨格からの培地中の総タンパク質量を、対照となる細胞を播種したコートしていない骨格のパーセンテージで示す。値は、平均+ SDを表す。統計分析:(a)エムドゲインを含まないアルギネートコート骨格に対してp≦0.05、(b)細胞を播種したコートしていない骨格に対してp≦0.05。
【図２４Ｄ】総タンパク質含有量アッセイを示す図である。ヒト初代骨芽細胞(hOST)について、1日おきに14日目まで測定した、エムドゲインを含む(EMDアルギネート)又は含まない(アルギネート)、細胞を播種したアルギネートコート骨格からの培地中の総タンパク質量を、対照となる細胞を播種したコートしていない骨格のパーセンテージで示す。値は、平均+ SDを表す。統計分析:(a)エムドゲインを含まないアルギネートコート骨格に対してp≦0.05、(b)細胞を播種したコートしていない骨格に対してp≦0.05。
【図２５】RUNX2及びSOX9の共焦点レーザー走査型顕微鏡による可視化。エムドゲインを含む、アルギネートコート骨格(A)及びコートしていない骨格(B)上で培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞におけるRUNX2及びSOX9の蛍光免疫細胞化学的分析を示す図である。RUNX2は、エムドゲインを含む骨格上で培養した細胞の大多数で検出される(A)。しかし、RUNX2及びSOX9は、コートしていない骨格上で培養した細胞においては等しく検出される(B)。RUNX2(緑色)、SOX9(赤色)、TiO2骨格表面(白)。
【図２６】開放多孔性構造を示す、本文書の方法によって作製したアルギネート層でコートされているTiO2骨格の断面図である。断面の直径は、3mmである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
アルギネートをコートした二酸化チタン骨格を作製する方法
本文書は、一態様においてアルギネートコーティングを含む二酸化チタン骨格を作製する方法を目的とする。第1の態様において、本文書は従って、アルギネートコーティングを含む二酸化チタン骨格を作製する方法を目的とし、その方法は、
a)二酸化チタン骨格を用意する工程と、
b)少なくとも1つのアルギネート約1〜3%w/vを含むアルギネート溶液を前記二酸化チタン骨格の少なくとも一部に加え、次いで二酸化チタン骨格を遠心分離する工程と、
c)工程b)において得られる二酸化チタン骨格に、二価陽イオンがCa2+、Mg2+、Ba2+又はSr2+からなる群から選択される、二価陽イオン塩溶液を加え、次いで任意に二酸化チタン骨格をすすぐ工程と、
d)前記二酸化チタン骨格を乾燥させる工程と
を含み、任意に工程b)及びc)が少なくとも一回繰り返される。
【００３１】
また、本方法は上記の工程a)〜d)からなってもよく、任意に工程b)及びc)が少なくとも一回繰り返される。工程b)及びc)が繰り返されるとき、2層以上のアルギネートゲル層を含むアルギネートコーティングが生成される。従って、アルギネートコーティングは、1つ又は複数のアルギネートゲル層を含んでもよく又はそれからからなってもよい。この文書の他の場所に開示するように、アルギネート及び/又は二価陽イオン塩溶液は、1つ又は複数の生物学的に活性な物質を更に含んでもよい。工程c)において、二酸化チタン骨格は、二価陽イオン塩溶液が骨格に加えられた後に任意に遠心分離されてもよいが、好ましくは任意のすすぎの前である。
【００３２】
上記の方法はまた、二酸化チタン骨格の少なくとも一部をアルギネートコーティングでコーティングする方法と表してもよい。本文書の文脈において、アルギネートコーティングは、アルギネートのコーティングと表してもよい。アルギネートコーティングにおいて、湿潤した際に、アルギネートがゲル様の状態をとることは理解されよう。しかし、このゲル様の状態をとるにはアルギネートコーティングに一定量の水分が必要なこともよく理解されよう。従って、アルギネートをコートした二酸化チタン骨格を乾燥させ、乾燥した場所などに貯蔵した場合、アルギネートコーティングは、むしろ薄く、乾燥した、フイルム層(別名「キセロゲル」)の形状になる。しかし、アルギネートをコートした二酸化チタン骨格を体内に移植する場合又は水溶液に浸漬する場合など、より湿った環境に一旦供すると、アルギネートコーティングは再びゲル様の形態をとる。文脈から明白でない限り、本文書においてアルギネートコーティングを指す場合、これは、湿った及び乾燥した両方の形状のアルギネートコーティングを包含すると理解されよう。
【００３３】
本方法によって作製される二酸化チタン骨格は、「アルギネートコーティングを含む二酸化チタン骨格」、「アルギネートをコートした二酸化チタン骨格」などと表してもよい。
【００３４】
二酸化チタン骨格は、アルギネートコーティングによって少なくとも部分的に覆われている外表面を有する。別法として、二酸化チタン骨格の外表面の全体がアルギネートコーティングによって覆われていてもよい。しかし、二酸化チタン骨格は多孔性構造をとるので、本方法によって、アルギネート溶液及び二価陽イオン溶液は、骨格の細孔に浸透することになり、結果的にアルギネートコーティングは、骨格内部の細孔の少なくとも一部の表面にも形成される。アルギネートコーティングが、骨格細孔の中にどれ程深く形成されるかは、当然ながら、例えば骨格空隙率(より大きな空隙率はアルギネートの浸透を容易にし、骨格内部のより深くにコーティングを形成することが可能になる)、アルギネート及び/又は二価陽イオン溶液の濃度、遠心分離速度などの因子によって決まる。しかし、本方法は、二酸化チタン骨格の少なくとも外側の少なくとも一部の細孔の表面(壁)をアルギネートコーティングでコートすることを可能にする。通常は、アルギネートをコートした二酸化チタン骨格が走査型電子顕微鏡(SEM)によって分析されるとき、アルギネートコーティングは、骨格構造の全体に存在する(すなわち、骨格の細孔の大部分又は全ての壁の内側を覆う)。従って、本方法により、アルギネートコーティングは二酸化チタン骨格の外表面だけでなく、骨格内部の細孔の表面にも様々な程度で形成される。通常、アルギネートコーティングが形成される細孔表面の大部分は、アルギネートコーティングでコートされることになる。
【００３５】
当然ながら、骨格の内部及び外部表面の10〜100%、20〜98%、30〜98%、40〜98%、50〜98%、60〜98%、70〜98%、80〜98%又は90〜98%など、二酸化チタン骨格の全体若しくはそのほんの一部にアルギネート及び/又は二価陽イオン溶液を与えてもよい。内部及び外部骨格表面(すなわち外表面と内部細孔の壁の両方)の全てにアルギネートコーティングが形成される場合でも、アルギネート層を調製する間に、細孔の壁の一つ一つ全ての部分にアルギネート及び二価陽イオン溶液を行き届かせることはできないので、表面の少しの部分がコーティングされずに残ることは理解されよう。しかし、遠心分離を使用することにより、薄いアルギネートコーティングの形成が可能になり、且つアルギネート及び二価陽イオン溶液が骨格の内側部分に圧入され、それにより細孔の内側部分にもアルギネートコーティングの形成が可能になる。更に重要なことは、アルギネートコーティングを形成するには、そのようなアルギネートコーティング形成を望む骨格部分は、アルギネートと二価陽イオン溶液の両方に供されなければならず、さもなければアルギネートのゲル化が起こらない。
【００３６】
本方法によって、工程b)における遠心分離により、二酸化チタン骨格の外表面及び細孔内部にもアルギネート溶液の極めて薄い層を沈着させることができるので、二酸化チタン骨格上に薄いアルギネートコーティングを形成することが可能になる。また、理論に束縛されるものではないが、薄いアルギネートコーティングは、低密度のアルギネート及び二価陽イオン溶液を使用した結果である可能性があり、それが骨格の細孔への浸透を可能にする。本方法により、コートする表面において、通常アルギネートコーティングの各アルギネートゲル層が約3μmなど少なくとも1μmの湿潤厚（wet thickness）を有することが可能になる。しかし、方法の工程b)及びc)を繰り返すことにより、2層以上のアルギネート層からなるアルギネートコーティングを生成することができる。従って、望ましい厚さのアルギネートコーティングが得られるまで、本方法を使用して、2〜100、2〜10、2〜6、2〜4、3又は4回など、工程b)及びc)を繰り返すことにより、アルギネートコーティングの厚さを制御することができる。従って、アルギネートコーティングは、1つ又は複数のアルギネートゲル層を含むことができる。アルギネートコーティングは通常、1〜10μm又は3〜8μmなど約1〜20μmの厚さを有する。通常、アルギネートコーティングは、2〜6、2〜4、3又は4層など1〜10層のアルギネートゲル層からなる。生体分子(生物活性物質)がアルギネートコーティングに組み込まれる場合(この文書の他の場所を参照のこと)、生体分子のサイズは、層の数の選択に影響を及ぼす可能性がある。より小さい生体分子(すなわち、ドキシサイクリンなど低Mwを有する)は、より大きな生体分子より速くアルギネートコーティングから拡散する。従って、より小さい生体分子の遅延放出が望まれる場合、より多層のアルギネートゲル層を含むアルギネートコーティングが必要となる。一方、より大きな生体分子の場合、アルギネートコーティングからの放出速度は、アルギネートゲルの分解に大きく依存し、生体分子は、小さい生体分子ほど速くアルギネートコーティングから拡散しない。従って、アルギネートコーティングにおいて、より大きな生体分子にはより少ないアルギネートゲル層を使用してもよい。従って、生体分子のサイズ及び望ましい放出速度を知る
ことにより、アルギネートコーティングにおけるアルギネートゲル層の数を調節して、望ましい放出速度を実現することができる。
【００３７】
アルギネートコーティングにより細孔直径が当然ながらいくらか減少したとしても、薄いアルギネートコーティングは二酸化チタン骨格の細孔開口部を実質的に塞がないので、そのような薄い厚さのアルギネートコーティングが有利である。どちらかといえば、アルギネートコーティングは、二酸化チタン骨格細孔の壁の内側を覆う。薄いアルギネートコーティングが調製される場合でも、骨格細孔に多少の初期閉塞が起こり得るが、生物学的環境では、コーティング工程の直後に塞がれたままになっていたこれらの細孔において、閉塞アルギネートコーティングのある程度の分解が見られた(実施例2を参照のこと)。細孔閉塞が実質的に無いことによりアルギネートコーティングがあるにもかかわらず細胞及び組織が細孔に容易に浸透できるので、それにより二酸化チタン骨格への細胞の増殖を改善できるので有利になる。本方法は、更に均一な厚さを有するアルギネートコーティングの形成も可能にする。更に、本文書の方法によって形成されるアルギネートコーティングは、実質的に孔が無い。いくらかの空隙率を有する、アルギネートと二価陽イオン塩溶液を混合するだけで調製したアルギネートゲルを参照のこと(例えば、実施例1において調製され、図1に描かれるゲルを参照のこと)。本明細書に開示する方法によって二酸化チタン骨格上に調製した場合にアルギネートコーティングの空隙率が実質的に低下しない理由は、おそらく工程b)における遠心分離の後に二酸化チタン骨格上に形成されるアルギネート溶液のコーティングが薄いためである。
【００３８】
本方法に伴う別の利点は、アルギネートコーティングが細孔の少なくとも一部の内部に薄層で形成されるので、アルギネートコーティングが骨格の外表面にしか形成されない場合と比較して、極めて大きな表面対体積比になることである。これは、アルギネートコーティングに含まれる生物学的に活性な物質(本明細書の他の場所を参照のこと)など、任意の物質の放出プロファイルに影響を及ぼす。また、アルギネートコーティングが二酸化チタン骨格の外表面から剥がれ落ちたとしても、アルギネートコーティングは骨格内部の細孔の表面上になおも存在することになる。
【００３９】
また、本方法は、工程b)及びc)を繰り返すことによって、1つ又は複数のアルギネートゲル層を含むアルギネートコーティングの形成を可能にする。好ましい場合には、これは、異なる層に異なる生物学的に活性な物質及び/又はアルギネート若しくは二価陽イオンの型を含む異なるアルギネートゲル層の形成も可能にする。
【００４０】
工程b)の前に工程c)を実行することも可能である。しかし、その場合、アルギネートの薄いコーティングは形成されない。むしろ、アルギネートコーティングは、二酸化チタン骨格内部の細孔の大多数を満たす。幹細胞などの細胞を二酸化チタン骨格に組み込む場合、多数の細胞を骨格細孔の内部に沈着させ得るので、これは特に有利になる可能性がある。工程c)が工程b)の前に実行される場合、工程c)及びb)を一旦実行した後には二酸化チタン骨格のほとんどの細孔はアルギネートコーティングで既に満たされることになるので、工程c)及びb)を繰り返すことは不必要である可能性がある。従って本文書は、工程b)の前に工程c)を実行することによって作製されるアルギネート層を含む二酸化チタン骨格も目的とする。
【００４１】
アルギネート溶液は、アルギネートを含む水溶液である。それは、アルギネートが溶解するまで、好ましくは室温で例えば1時間〜終夜(例えば1〜24時間)撹拌することにより蒸留水又はリン酸緩衝生理的食塩水などの適切な緩衝液にアルギネートを溶解させることによって調製できる。
【００４２】
例えばアルギネートは、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸カルシウム及びアルギン酸ストロンチウムからなる群から選ばれてもよい。2種類以上のアルギネートの混合物が、使用されてもよい。アルギネートは通常、約10 000〜100 000g/mol、100 000〜300 000g/mol、250 000〜600 000g/mol、50 000〜150 000g/mol、50 000〜200 000g/mol又は50 000〜100 000g/molなど、約10 000〜600 000g/molの分子量(Mw)を有する高分子量アルギネートである。アルギネートはまた、約1000〜200 000g/molの高分子量を有してもよい。アルギネート溶液中のアルギネートの濃度は通常、1.5〜2.5%w/vなど約1〜3%w/v又は少なくとも1%など約2%w/v及び多くとも3%など多くとも3,5%である。アルギネートは、グルロン(グルロン酸)モノマーを最低約60%含んでもよい。生体分子(すなわち生物学的に活性な物質、本明細書の他の場所に開示されている)が、アルギネート溶液に添加されてもよい。
【００４３】
生物学的に活性な物質の濃度は、アルギネート溶液に添加される場合、当然ながら特定の生物学的に活性な物質及び/又は体内での目的とする機能によって決まる。通常、アルギネート溶液中の濃度はマイクログラムの範囲にあるが、500ng/mL〜500μg/mL、1〜500μg/mL、1〜100μg/mL、1〜80μg/mL、20〜70μg/mL、40〜60μg/mL又は50μg/mLなど、1ng〜1mg/mLの範囲でもよい。
【００４４】
二酸化チタン骨格にアルギネート溶液を与えるために、骨格をアルギネート溶液に浸漬してもよい。これは、撹拌下で、例えば回転振とう機によって約100rpm/分で行われてもよい。撹拌は、骨格の多孔性ネットワークにアルギネート溶液を拡散させるのに役立つ。通常は、二酸化チタン骨格は、1〜2時間、例えば1時間など約10分間〜2時間浸漬される。通常、液浸は室温で行われる。アルギネート溶液への液浸後に、通常は、約200〜300x gなどで0.5〜2分間、例えば1分間など短時間、二酸化チタン骨格を注意深く遠心分離することにより過剰な溶液を除去する。
【００４５】
工程c)において、二酸化チタン骨格に二価陽イオン塩溶液が加えられる。二価陽イオン塩溶液(本明細書において「二価陽イオン溶液」とも表される)は、Ca2+、Mg2+、Ba2+又はSr2+など、二価陽イオンの少なくとも1つの塩を含む水溶液である。適切な二価陽イオン塩の例には、それだけには限らないが、CaCl2、SrCl2、SrCO3、SrPO4、CaCO3、CaPO4、MgCl2、MgCO3及びMgPO4がある。この溶液中の二価陽イオン塩の濃度は通常、約15〜150、20〜500mM、20〜100mM、20〜400mM、200〜400mM、250〜350mM、30〜80mM、40〜60mM、45〜55mM又は約50mMなど約15〜500mMである。好ましくは、濃度は、約20〜100mMである。好ましくは、二価陽イオン塩は、CaCl2である。二酸化チタン骨格に二価陽イオン溶液を加えるために、二酸化チタン骨格は、しばらくの間、1〜2時間、例えば1時間など、例えば10分間〜2時間二価陽イオン溶液に浸漬されてもよい。これは、撹拌下で、例えば回転振とう機によって約100rpm/分で行われてもよい。撹拌は、骨格の多孔性ネットワークに二価陽イオン溶液を拡散させるのに役立つ。別法として、例えば二酸化チタン骨格に溶液を吹き付けるなど、二価陽イオン溶液を加える他の手段が使用されてもよい。二酸化チタン骨格に二価陽イオン溶液を加えた後に、任意に骨格を例えば蒸留水ですすいで、過剰な二価陽イオン溶液を除去する。別法として又は併せて、約200〜300x gなどで0.5〜2分間、例えば1分間などの短時間、二酸化チタン骨格を注意深く遠心分離することにより過剰な二価陽イオン塩溶液を除去してもよい。遠心分離工程が適用される場合、任意のすすぎは、好ましくは遠心分離後に行われる。更に、生物学的に活性な物質がアルギネートコーティングに含まれる場合、これらは、好ましくはアルギネート溶液に添加されるが、生物学的に活性な物質は、二価陽イオン溶液に(例えばアルギネート溶液に添加される場合と同じ濃度で)添加されてもよい。
【００４６】
工程d)は任意でもよく、約0.5時間〜数日間実行されてもよい。例えば終夜、例えば0.5〜24時間、5〜10時間又は1時間だけ実行されてもよい。通常は、この工程は、室温で実行される。
【００４７】
本明細書に開示するアルギネートをコートした二酸化チタン骨格を作製する方法は、任意に生物学的に活性な物質も含むアルギネートコーティング施した二酸化チタン骨格を提供する。従って、この文書は、本明細書に開示する方法によって得ることができる又は得られる、生物学的に活性な物質を任意に含むアルギネートコーティングを含む二酸化チタン骨格も目的とする。そのような二酸化チタン骨格は、例えばアルギネートをコートした二酸化チタン骨格又はアルギネートコーティングを含む二酸化チタン骨格と表してもよい。
【００４８】
アルギネートコーティングを含む二酸化チタン骨格は通常、単独で又はインプラントの一部として含まれて医療用インプラントとして使用される。この文書の他の部分から明らかであるように、使用される二酸化チタン骨格構造により、インプラントの移植部位及び目的とする機能に特に適合されたインプラント構造のオーダーメードが可能になる。従って、この文書は、医療用インプラントとして使用するアルギネートコーティングを含む二酸化チタン骨格も目的とする。アルギネートをコートした二酸化チタン骨格は多孔性構造を含み、その構造は優れた生体適合性を有し、細胞の増殖及び骨格又は骨格を含むインプラントの付着を刺激できる。多孔性構造により骨格内への細胞の内方増殖が可能になり、それにより、組織の再生が可能になる。大きな表面積により、構造内への細胞の増殖、それによる骨格の付着及び組織の再生も促進される。二酸化チタン骨格は、それ自体が優れた生体適合性を有する材料でできているので、対象に移植されるときの骨格に対する副作用が減少する。
【００４９】
アルギネートをコートした二酸化チタン骨格の使用法
組織工学において、アルギネートゲルは、空間充填剤、生物活性分子の送達媒体及び望ましい組織の形成を導くために細胞を組織し、刺激を提示する3次元構造体など、異なる用途に使用されており、本文書において開示されるアルギネートコーティングは、そのような目的のいずれに使用するにも都合がよい。本文書の二酸化チタン骨格は、本明細書に開示する方法によりアルギネート層でコートされる前後に、細胞播種に都合よく使用することもできる。
【００５０】
アルギネートコーティングを含む二酸化チタン骨格は対象に移植することができ、細胞は骨格構造内へと増殖していく。移植の前にアルギネートをコートした二酸化チタン骨格上に細胞を播種し増殖させることも可能になる。二酸化チタン骨格の相互接続したマクロ多孔性構造は、組織工学、とりわけ骨組織工学に特に適しており、現在利用可能な骨修復療法の興味深い代替法になる。この点において、二酸化チタン骨格の骨髄由来細胞の播種は、従来法を使用して実行され、その方法は当業者に周知である(例えば、Maniatopoulosら、1988年を参照のこと)。細胞は、アルギネートをコートした二酸化チタン骨格に播種され、適切な増殖条件下で培養される。培養には、その増殖を確立するのに適切な培地を供給する。骨格にアルギネートコーティングを施す前に、間葉系幹細胞など幹細胞などの細胞を二酸化チタン骨格に播種することも可能になる(そのような細胞播種及びアルギネートコーティングを実行する典型的な方法については実施例4を参照のこと)。
【００５１】
様々な型の細胞が、アルギネートをコートした二酸化チタン骨格の全体に増殖し得る。より正確には、細胞型は、造血又は間葉系幹細胞を含み、心臓血管、筋肉若しくは任意の結合組織を生ずる細胞も含む。細胞は、ヒト又は他の動物起原のものでもよい。しかし、アルギネートをコートした二酸化チタン骨格は、骨形成原細胞、とりわけ骨基質を合成する細胞の増殖に特に適している。組織工学の場合、細胞はどんな起原でもよい。細胞は、ヒト起原のものが有利である。アルギネートをコートした二酸化チタン骨格中で細胞を増殖させる方法により、例えばin vitro段階において、播種した骨形成原細胞が二酸化チタン骨格に浸透して、二酸化チタン骨格の構造中に広く分布しながら骨基質を合成することが可能になる。骨形成性原細胞の浸透及び、その結果としての骨基質合成は、機械的、超音波、電界又は電子的手段によって増強できる。
【００５２】
組織再生のためなど、細胞増殖のためにフレームワーク機能を果たす構造を必要とする場合はいつでも、アルギネートをコートした二酸化チタン骨格が有用である。二酸化チタン骨格のアルギネート層が存在することにより、骨格結合、生体適合性などを改善できる生物学的に活性な物質の送達が可能になる。アルギネートをコートした二酸化チタン骨格は、骨及び軟骨構造の再生に特に有用である。そのような構造の再生が必要になり得る状況の例には、外傷、骨若しくは歯の外科的除去又は癌治療に関連するものがある。
【００５３】
完全に又は部分的に置きかえることができる対象の構造の例には、それだけには限らないが、頬骨弓、内耳骨(具体的にはツチ骨、アブミ骨及びキヌタ骨)、上顎及び下顎の歯槽突起、眼窩の壁及び床、副鼻洞の壁及び床、頭蓋骨及び頭蓋骨異常を含む頭蓋顔面骨、例えば股関節形成異常の場合の股関節窩(寛骨臼窩)、 (限定されないが)上腕骨、橈骨、尺骨、大腿、脛骨及び腓骨を含めた長骨、椎骨、手及び足の骨、手の指及び足の指の複雑骨折、抜歯窩(抜歯による)の充填、骨縁下欠損の修復並びにインプラント周囲欠損の修復がある。加えて、腫瘍(の除去)、癌、感染、外傷、外科手術、先天異常、遺伝性疾患、代謝性疾患(例えば骨粗鬆症及び糖尿病)に起因する全ての型の骨欠損を充填するのにアルギネートをコートした二酸化チタン骨格が有用である。
【００５４】
開示する方法によって調製されるアルギネートをコートした二酸化チタン骨格又はそのような骨格を含む医療用インプラントは、骨などの組織の再生、修復、置換及び/又は復元に使用できる。従って、この文書は、アルギネートをコートした二酸化チタン骨格、又は骨などの組織の、再生、修復、置換及び/若しくは復元に使用するためのそれを含む医療用インプラントも目的とする。
【００５５】
本文書の方法によって得ることができる又は得られるアルギネートをコートした二酸化チタン骨格も、組織の再生、修復、置換及び/又は復元のための医療用インプラントの調製に使用できる。また、アルギネートをコートした二酸化チタン骨格も、骨などの組織の再生、修復、置換及び/又は復元のための医療用インプラントの調製に使用できる。
【００５６】
本文書の方法によって得ることができる又は得られるアルギネートをコートした二酸化チタン骨格若しくはそれを含む医療用インプラントも、それを必要とする対象へのその骨格又はそのようなアルギネートをコートした二酸化チタン骨格を含む医療用インプラントの移植を含めた、骨などの組織を再生、修復、置換及び/若しくは復元する方法に使用できる。
【００５７】
生物学的に活性な物質(生体分子)
上述の通り、アルギネート溶液及び/又は二価陽イオン溶液は、1つ又は複数の異なる種類の生物学的に活性な物質を含むことができる。従って、生物学的に活性な物質は、アルギネートコーティングに組み込むことができる。従って、アルギネートコーティングは、生物学的に活性な物質に対する担体としての機能を果たすことができ、結果的に生物学的に活性な物質は、アルギネートコーティングを介してアルギネートをコートした二酸化チタン骨格によって送達される。アルギネートコーティングは、1種類の生物学的に活性な物質又は2種類以上の生物学的に活性な物質の混合物を含むことができる。上述の通り、本明細書の他の場所に開示されているように本方法の工程b)及びc)を繰り返すことによってアルギネートコーティングが調製される場合、異なる層は異なる生物学的に活性な物質を含むことができる。
【００５８】
生物学的に活性な物質は、合成の若しくは天然の生物活性分子、天然の若しくは合成の薬物及び/又は生細胞など、体内で生物活性を有する任意の物質でもよい。カルシウム、クロミウム、フッ化物、金、ヨウ素、カリウム、マグネシウム、マンガン、セレン、硫黄、スズ、ナトリウム、亜鉛、ストロンチウム、硝酸塩、亜硝酸塩、リン酸、塩化物、硫酸塩、炭酸塩、カルボキシル又は酸化物など、無機の生物学的に活性なイオンも組み込むことができる。
【００５９】
生物学的に活性な物質は、細胞でもよい。アルギネートコーティングに組み込む生細胞の例には、それだけには限らないが間葉系幹細胞、骨細胞、多能性細胞、骨前駆細胞、脈管細胞、前駆体脈管細胞及び/又は間質細胞がある。
【００６０】
生物学的に活性な物質の例には、それだけには限らないが、天然の又は組換えの生物接着剤;天然の又は組換えの細胞接着因子;天然の、組換えの又は合成の生体高分子;天然の又は組換えの血液タンパク質;天然の又は組換えの酵素;天然の又は組換えの細胞外マトリックスタンパク質;天然の又は合成の細胞外マトリックス生体分子;天然の又は組換えのシグナル分子、増殖因子及びホルモン;天然の、組換え及び合成のペプチド、合成ペプチドホルモン;天然の、組換え又は合成のデオキシリボ核酸;天然の、組換え又は合成のリボ核酸;天然の又は組換えの受容体;酵素阻害剤;薬物;生物学的に活性な陰イオン及び陽イオン;ビタミンDなどのビタミン;アデノシン一リン酸(AMP)、アデノシン二リン酸(ADP)又はアデノシン三リン酸(ATP);マーカー生体分子;アミノ酸;脂肪酸;ヌクレオチド(RNA及びDNA塩基)、糖、テトラサイクリンなどの抗菌物質、免疫活性成分、抗体、抗炎症性分子、基質成分、内部変性タンパク質並びにスタチン及び/又はビスホスホネートなど小さい生物学的有機分子もある。
【００６１】
アルギネートコーティングへの組み込みに適したペプチド及びタンパク質には、特に細胞増殖並びに/又はインプラントの骨結合に影響を及ぼすことが公知のペプチド及びタンパク質がある。いくつかの天然のペプチドは、無機塩の析出を誘導することが示されており、従って、アルギネートコーティングに適切に組み込まれ得る。例としては、コラーゲン1及び2、アメロジェニン、アメロブラスチン、骨シアロタンパク質、エナメリン及びアンソカルシン(ansocalcin)がある。内骨格石化組織へのアパタイトの沈着及び増大は、高ポリプロリンタンパク質によって導かれる過程である。ポリプロリン反復は、硬組織細胞外マトリックスタンパク質に共通の特徴であり、タンパク質基質の緻密化、立体構造変化、アパタイト結晶長さ及びシグナル伝達事象にしばしば関与するタンパク質ドメインに対する結合に役割を果たす。例えば、エナメル基質誘導体(EMD)は、柔らかい及び硬い増殖を生体模倣的に刺激するために使用されるブタ胎仔歯牙材料の抽出物である。EMDは、炎症及び感染の阻害など、他の生物活性の多様性を有することも証明されている。EMDを含む商品は、Straumann(登録商標)エムドゲイン(Straumann AG社、Peter Merian-Weg 12、CH 4052 Basel、Switzerland)である。EMDは、上述の通り、アルギネート基質に適切に組み込まれ得るタンパク質であるアメロジェニンを大量に含有する。
【００６２】
アルギネートコーティングへの組み込みに適したペプチドの別の例には、WO 2008/078167に開示されている共通ペプチドに基づくペプチドがあり、このペプチドは生体内石灰化を誘導する。
【００６３】
実施例で使用されるペプチドP2(配列番号1)、P5(配列番号2)及びP6(配列番号3)は、WO 2008/078167の共通配列基づいたペプチドの例であり、アルギネートコーティングに適切に組み込まれ得る。そのような配列の他の例は、P1(配列番号4:PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP)、P3(配列番号5:PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP)及びP4(配列番号6:PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP)である。
【００６４】
通常、生物学的に活性な物質は、対象における二酸化チタン骨格の一体化を促進する物質であってもよい。
【００６５】
任意でアルギネートコーティングに組み込まれている生物学的に活性な物質の拡散速度は、分子量及びアルギネートコーティングの細孔と比較した生物学的に活性な物質のサイズ(ストークス半径によって定義される)による影響を受け、生物学的に活性な物質の化学的性質(相互作用分子-アルギネート、分極、すなわち親水性物質は極めて速やかに拡散できるが疎水性物質はアルギネートゲルを通ってゆっくりと拡散する)によって決まる。対象にアルギネートをコートした二酸化チタン骨格を移植して1日目の間又は数日後に、この文書の実験の項に使用されるペプチドなど、より小さい生物学的に活性な物質について生物学的に活性な物質のバースト放出プロファイルを見ることができる。アルギネートコーティングの孔径を調節する(上記参照)ことによって及び生物学的に活性な物質の特性(分子量、形状、極性など)を考慮することによって、組み込まれる生物学的に活性な物質の放出速度を調節することができる。
【００６６】
二酸化チタン骨格
本文書の二酸化チタン骨格は、細胞の付着及び内方増殖のための3次元空間を作ることによって組織形成を可能にする構造支持体として機能できる網状の骨格である。骨格の二酸化チタンは、生体適合性であり、異なる形状に加工して細胞の増殖のための機械的支持体及びフレームワークを形成できる骨格を提供する。従って、二酸化チタン骨格は、骨再生用など組織工学において使用するのに適した構造を提供する。
【００６７】
本文書の文脈における使用に適切な二酸化チタン骨格は、基本的に二酸化チタンの形状を成す骨格であり、すなわち二酸化チタンが二酸化チタン骨格の主要な構造成分である。二酸化チタン骨格は、開放多孔性構造をとるべきである。
【００６８】
通常、二酸化チタン骨格は、マクロ細孔であり相互接続を含むマクロ多孔性の骨格である。二酸化チタン骨格のマクロ細孔は、20〜2000μm、約30〜1500μm又は約30〜700μmなど、およそ10〜3000μmの範囲の細孔直径を有する。二酸化チタン骨格は、血管及び骨小柱などより大きな構造の内方増殖を可能にし、すなわち約100μm以上の直径を持つ細孔を含むことも重要である。細孔の少なくともいくつかが相互接続し且つ/又は部分的に相互接続していることが重要である。
【００６９】
細孔直径は、二酸化チタン骨格内への細胞増殖の速度及び程度、従って得られる組織の構造に影響を及ぼす可能性がある。通常、マクロ多孔性系は、二酸化チタン骨格の少なくとも50%の体積を占有する。二酸化チタン骨格中のマクロ及びミクロ細孔の体積は、二酸化チタン骨格の機能に応じて変化し得る。治療の目的が、多くの骨構造を置きかえることであり、治癒にかかる時間の間に二酸化チタン骨格を外しておくことができる場合、二酸化チタン骨格は、総骨格体積の最高90%を占めるマクロ多孔性系で作製されてもよい。
【００７０】
通常、二酸化チタン骨格は、70〜90%など、約40〜99%の総空隙率を有する。
【００７１】
通常、二酸化チタン骨格のフラクタル次元支柱は、約2.2〜2.3など約2.0〜3.0である。支柱太さは、二酸化チタン骨格の強度に影響を及ぼし、二酸化チタン骨格の支柱がより太いほど、二酸化チタン骨格はより強くなる。
【００７２】
通常、二酸化チタン骨格は、約0.8〜1.2μm3など約0.001〜3.0μm3の内部支柱体積を有する。低体積及び高フラクタル数により、より強い骨格を得られる。
【００７３】
二酸化チタン骨格の表面が、ミクロレベル及びナノレベルの構造を有することは、当業者には理解されよう。このミクロ及びナノ構造は、製造条件により修飾することができる。通常、ミクロレベルの細孔直径は、1〜10μmの範囲にある。通常、ナノレベルの細孔直径は、1μm未満である。
【００７４】
通常、本文脈における二酸化チタン骨格構造は、20〜2000μm、30〜1500μm、又は30〜700μmなどおよそ10〜3000μmのマイクロ及びマクロ細孔直径が混在している。細孔直径はまた、少なくとも20μmの相互接続細孔と共に40μmを上回ってもよい。
【００７５】
二酸化チタン骨格のサイズ及び形状は、その使用目的に応じて決定される。二酸化チタン骨格サイズ及び形状は、生産段階又は準備のできた骨格の後修飾のいずれでも調節することができる。従って、二酸化チタン骨格は、特定の対象における特定の使用のために容易に修正することができる。通常、二酸化チタン骨格のサイズ、形状などは、アルギネートコーティングでコートする前に調節される。
【００７６】
通常、二酸化チタン骨格は、二酸化チタンスラリーにポリマースポンジ構造を浸し(例えば、WO08078164に開示される方法を参照のこと)、スラリーをスポンジ上で凝固させ、1つ又は複数の焼結工程を実行してスポンジを除去し、強い骨格構造を作る方法により作製できる。従って、二酸化チタン骨格は、例えばWO08078164に開示される二酸化チタン骨格でもよい。そのような方法は、
a)二酸化チタンのスラリーを準備する工程と、
b)スポンジ構造など、多孔性ポリマー構造などの可燃性多孔性構造に工程a)のスラリーを加える工程と、
c)可燃性多孔性構造上でスラリーを凝固させる工程と、
d)凝固した二酸化チタンスラリーから可燃性多孔性構造を除去する工程と
を含んでもよく、工程d)は、
i)凝固した金属酸化物スラリーを含む可燃性多孔性構造を約500℃までゆっくりと焼結し、この温度を少なくとも30分間保持する工程と、
ii)最低で約1500℃まで又は約1750℃まで約3ケルビン/分で素早く焼結し、この温度を少なくとも10時間保持する工程と、
iii)少なくとも3ケルビン/分で室温まで素早く冷却する工程と
によって実行されてもよい。
【００７７】
本発明について以下の実施例に更に記載するが、特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００７８】
(実施例1)
生物学的に活性な物質を含む及び含まないアルギネートヒドロゲルの調製
【００７９】
【表１】
2015535695.tif 000003
【００８０】
1.材料及び方法
1.1.ペプチド及びエナメル基質誘導体の調製
エナメル基質誘導体(EMD)は、Straumann GmbH社、Basel、Switzerland)により好意で提供された。EMDを、リン酸緩衝食塩水(PBS)(PAA Laboratories GmbH社、Pasching、Austria)0.1%酢酸に10mg/mLになるよう溶解した。3つの合成ペプチドTable1(表1)を、過去の研究(Rubert Mら、2011年)に詳細に記載されている通り設計した。
【００８１】
ペプチドを、Eurogentec社(Seraing、Belgium)から購入した。合成ペプチドを、PBS 0.1%酢酸に5又は(FITC標識したペプチド2の場合) 10mg/mLになるよう溶解した。凍結融解サイクルの繰り返しを避けるためにアリコートを調製し、使用するまで-20℃で貯蔵した。
【００８２】
1.2.アルギネートヒドロゲルの調製
アルギン酸ナトリウム[Pronova UP LVG(登録商標)](最低60%のモノマーがグルロン酸である低粘度アルギネートである)をNovaMatrix(FMC BioPolymer AS社、Norway)から購入した。アルギン酸ナトリウムは、それ以上精製することなく使用した。2パーセント(w/v)アルギン酸ナトリウムをPBSに調製し、180rpmで、室温で終夜撹拌して均質なアルギネートヒドロゲルを得た。アルギネート溶液を終濃度50μg/mLで、合成ペプチド又はEMDと混合した。次いで、合成ペプチド/EMDを含有するアルギネートの溶液を24ウェル培養プレートに分配し、エーログラフ塗料噴霧器[Precisso社(登録商標) Madrid、Spain]を用いて300mM CaCl2を吹き付けた。室温で1〜2時間インキュベーションした後に、アルギネートヒドロゲルは完全にゲル化した。
【００８３】
1.3.走査型電子顕微鏡によるアルギネートヒドロゲル形態の特性評価
対照2%アルギネートヒドロゲル及び合成ペプチド2(50μg/mL)を含有する2%アルギネートヒドロゲルの形態を、走査型電子顕微鏡(SEM、Hitachi S-3400N、Hitachi High-Technologies Europe GmbH社、Krefeld、Germany)を使用して観察した。アルギネートヒドロゲル(凍結乾燥していない及び凍結乾燥した)の微細構造を観察した。アルギネートヒドロゲル凍結乾燥の場合、サンプルを-80℃で凍結し、続けて-35℃で凍結乾燥した。次いで、サンプルをN2中で凍結することにより、鋭いメスを使用して横断面に正確に切断可能にした。アルギネートヒドロゲルの構造を、10kV及び40Paを使用して倍率×25及び×100で観察した。環境制御型二次電子検出器(ESED)を倍率×25の画像に使用し、後方散乱電子検出器(BSED)を倍率×100の画像に使用した。各細孔の直径を、SEM、Hitachi S-3400Nのソフトウェアを使用して測定した。
【００８４】
1.4.ペプチド放出プロファイル
ペプチド放出プロファイルを研究するために、P2をFITCで標識した。2%アルギネートヒドロゲル(50μg/mL)に含有されるペプチドの放出を、蛍光分光法によって定量化した。最初に、アルギネートヒドロゲルを培地で洗浄して、過剰のCaCl2を除去した。次いで、750μLの細胞培養液を、ペプチドを投入したアルギネートヒドロゲルに添加した。サンプルを、37℃及び5% CO2で21日間インキュベートし、細胞培養液を週2回交換した。予め定めた時点(24時間、4日、7日、11日、14日、18日及び21日目)に上清を採取し、蛍光分光法(λ  ex 490nm及びλ  em 525nm)によって分析して、培地に放出されたペプチドの量を決定した。洗浄工程の間に放出されたペプチドの量も測定した。実験を3回実行し、各サンプルは三つ組で分析した。
【００８５】
各時点について線形標準曲線を使用して、相対的な蛍光ユニットを放出されたペプチドの量と相関させた。
【００８６】
1.5. MC3T3-E1の細胞培養
マウス骨芽細胞系MC3T3-E1(DSMZ社、Braunschweig、Germany)を前述のとおり維持した(Tiainen Hら、2011年)。播種の前に、クロスリンクされたアルギネートヒドロゲルを含有する24ウェル培養プレートを、750μLの培地で洗浄して、過剰のCaCl2を除去した。異なる細胞密度を使用して2%アルギネートゲルに対する細胞接着の効率を評価した後に、最後の実験の場合、100 000個細胞/ウェルの密度で細胞を播種した。培地は、週2回新しくした。播種の24時間後に培地を採取して、細胞生存率を研究した。14及び21日目に細胞を回収して、リアルタイムRT-PCRを用いて接着及び骨形成性関連マーカーの遺伝子発現を分析した。培養を、光学顕微鏡(Leica DMIRB、Leica Microsystems Wetzlar GmbH社、Germany)を使用して常法通り観察した。
【００８７】
1.6. 2%アルギネートゲルに対する細胞接着
播種の1及び5日後に、アルギネートヒドロゲルへの細胞の接着を評価して、実験に最適な播種密度を決定した。30×104〜200×104個細胞/ウェルの密度を試験した。アルギネートヒドロゲルに接着した細胞を、凍結融解方法によって脱イオン蒸留水に溶解した。細胞溶解物を使用して、Hoechst 33 258蛍光アッセイを用いてDNAの量を決定した。サンプルを、TNE緩衝液中で20μg/mL Hoechst 33 258蛍光染色剤(Sigma社、St. Quentin Fallavier、France)と混合し、蛍光強度を多機能マイクロプレートリーダー(Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer、Agilent Technologies社、Santa Clara、USA)を使用して356/465nmの励起及び放射波長で測定した。線形標準曲線を使用して、相対的な蛍光ユニットを細胞数と相関させた。
【００８８】
培養の1及び5日後に、アルギネートヒドロゲルに接着したMC3T3-E1細胞を、共焦点顕微鏡(Leica TCS SPE Microsystems Wetzlar GmbH社、Wetlzar、Germany)によって視覚化した。簡潔には、アルギネートヒドロゲルに播種した細胞を、PBS中の4%ホルムアルデヒドを用いて4℃で10分間固定した。染色のために、細胞を0.2%トライトン中で透過化処理し、材料の自発蛍光をPBS 3%BSAでブロッキングした。細胞の細胞骨格を、5μg/mL FITCファロイジン(Sigma社、St. Quentin Fallavier、France)を使用して、核をDAPI(Sigma社、Schnelldorf、Germany)を用いて染色した。更に、PBS 4%ホルムアルデヒドを用いて4℃で10分間細胞を固定した後に、2%アルギネートヒドロゲルに最初に播種した100×103個の細胞の細胞接着及び付着を観察し、その後に10kV、×200及び40PaでSEM並びにESEDを使用する可視化を続けた。
【００８９】
1.7.細胞生存率
24時間後に培地中で決定したLDH活性を、膜漏出又は細胞溶解の指標とみなした。細胞質性酵素の活性を前述のとおり(Rupert Mら、2011年)推定した。
【００９０】
【表２】
2015535695.tif 000004
【００９１】
1.8.トータルRNA単離及びリアルタイムRT-PCRによる骨芽細胞マーカーの遺伝子発現
処理の14及び21日後に前駆骨芽細胞MC3T3-E1細胞において、遺伝子発現に対するアルギネートヒドロゲルに投入した合成ペプチド及びEMDの効果を研究した。
【００９２】
製造業者の手順に従ってTripure(登録商標)(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)を使用して、トータルRNAを単離した。トータルRNAを、Nanodrop分光光度計(NanoDrop Technologies社、Wilmington、DE、USA)を使用して260nmで定量化した。
【００９３】
供給元の手順に従ってhigh capacity RNA-to-cDNA kit(Applied Biosystems社、Foster City、CA)を使用して、同量のRNA(350ng)をcDNAに逆転写した。PCR反応を実施するまで、各cDNAのアリコートを凍結した(-20℃)。
【００９４】
Lightcycler 480(登録商標)(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)でSYBRグリーン検出を使用して、リアルタイムPCRを実行した。2つの参照遺伝子[18SrRNA及びグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)]並びに10個の標的遺伝子[インテグリンα8(Itga8)、インテグリンβ1(Itgb1)、インテグリンβ3(Itgb3)、フィブロネクチン1(Fn1)、骨形成タンパク質2(Bmp2)、I型コラーゲン(Coll-I)、骨シアロタンパク質(Bsp)、アルカリホスファターゼ(Alp)、オステオカルシン(Oc)及びオステオポンチン(Opn)]に対してリアルタイムPCRを行った。
【００９５】
プライマー配列をTable2(表2)に詳述する。反応条件及び相対的な定量化を、前述のとおり行った(Tiainen Hら、2011年)。
【００９６】
1.9.統計分析
全てのデータは、平均値±SEMで表す。正規分布に基づいて、マン-ホイットニー検定又はスチューデントのt検定によって群間の差異を評価した。異なる変数間の相関を測定するために、ピアソン相関分析を使用した。Windows(登録商標)用SPSS(登録商標)プログラム(Chicago、IL)17.0版を使用した。結果は、p値≦0.05で統計的に有意と見なした。
【００９７】
結果
アルギネート微細構造
図1は、凍結乾燥した2%アルギネートヒドロゲル(図1A及び図1B)及び合成ペプチドを含有する2%アルギネートヒドロゲル(図1C及び図1D)の横断面の微細構造を示す。SEM画像に見られるように、合成ペプチドを含有するアルギネートヒドロゲルは、2%アルギネートヒドロゲルより不規則な構造を示すが、多孔性で相互接続した構造が、分析したゲルの全てで観察された。合成ペプチドを含まない又は含む2%アルギネートヒドロゲルのそれぞれについて、両方の架橋したヒドロゲルが、細孔直径42.9±3.5μm及び44.7±4.1μmの多孔性で相互接続した構造を表した。
【００９８】
2%アルギネートヒドロゲルからのペプチド送達
2%アルギネートヒドロゲルからのペプチド放出プロファイルを図2に記載する。インキュベーションの最初の24時間の間にペプチドのバースト放出が観察された(54.67%)。更に、累積放出プロファイルに見られるように、ペプチドの25.8%は、11日目までゆっくりと放出され、その後21日目まで経時的に徐放され続けた。実験終了時(21日後)に、アルギネートヒドロゲル中に理論的に含有される全ペプチドの5.6%が、放出されなかった。アルギネートヒドロゲルを培地で洗浄して、過剰のCaCl2を除去する工程の間に、投入したペプチドの12.7%が放出されたことに留意されたい。
【００９９】
細胞接着及び増殖
培養1日後には、播種した細胞の半分以上がゲルに接着しなかったので、アルギネートヒドロゲルへの低い細胞接着速度が観察された。にもかかわらず、細胞はアルギネートヒドロゲルに付着し、細胞培養の間中増殖した(図3)。更に、共焦点顕微鏡観察によって細胞を視覚化して、骨芽細胞がアルギネートヒドロゲル表面に付着し、展開する能力を確認した。共焦点画像は、同数の細胞が播種され、1日目から5日目まで増加したアクチン染色の増加と同時に起こる核の数の増加を示している(図3A〜図3H)。更に、アルギネートヒドロゲル上で培養した骨芽細胞の細胞糸状仮足を、SEMによって認めた。
【０１００】
細胞生存率に対する合成ペプチドを投入したアルギネートヒドロゲルの効果
24時間後(図4)又は長期間後(データ不掲載)のいずれにおいても、合成ペプチドを含有するアルギネートヒドロゲル上で培養した細胞に毒性効果は全く見られなかった。24時間後に、P2はEMDと比較して細胞生存率を著しく増加させ、一方でP5はEMD及び無処理のアルギネートゲルと比較して著しく低い毒性効果を示した。
【０１０１】
細胞接着マーカーの遺伝子発現に対する合成ペプチドを投入したアルギネートヒドロゲルの効果
培養の21日後に対照と比較した場合、P5で処理した細胞においてItga8の発現は増加した(図5A)。P2及びP6処理の14日後に対照と比較して、Itgb1 mRNAレベルは著しく減少した。21日後にEMDと比較して、P6で処理した細胞は、Itgb1 mRNAレベルを著しく減少させた(図5B)。P2及びP6での処理の14日後に対照と比較して、Itgb3及びFn1は、著しく減少し(図5C及び図5)、21日後に差異は全く観察されなかった。
【０１０２】
骨芽細胞マーカーの遺伝子発現に対する合成ペプチドを投入したアルギネートヒドロゲルの効果
EMDと比較して、Bmp2の相対的mRNAレベルは、P6での処理の14日後に著しく増加したが、P2での処理の21日後には減少した。細胞培養の14日後に対照と比較して、EMD処理は、Bmp2 mRNAレベルの有意な減少を誘導したが、21日後にはBmp2 mRNAレベルの増加が見られた、しかし差異は統計的有意性に達しなかった(図6A)。
【０１０３】
合成ペプチドのいずれかを含む処理の14日後に、対照と比較してColl-I遺伝子発現は著しく減少した(図6B)。異なる処理に共通して、Bsp mRNAレベルに差異は全く見られなかった(図6C)。P6での処理の14日及び21日後並びにP2での処理の21日後に、対照と比較してALP mRNAレベルは著しく減少した(図6D)。細胞培養の14日後に、EMDで処理した細胞と比較して合成ペプチドを含有する2%アルギネートゲル上で培養した細胞において、Oc mRNAレベルの増加が検出された。21日後に対照と比較した場合、P5又はP6で処理した細胞は、Oc mRNAレベルが増加した(図6E)。P2及びP6を含む培養14日後に、対照と比較してOpnの発現は著しく減少した。21日後に、対照と比較して合成ペプチド及びEMDのいずれかにより、Opn mRNAレベルは著しく増加した。EMD処理は、P2及びP6処理と比較してOpnのmRNA発現レベルを著しく増加させた(図6F)。
【０１０４】
考察
高ポリプロリン合成ペプチドが、in vitroで骨形成及び石灰化を誘導し、in vivoで骨吸収を減少させることは以前に示されている。この研究の目的は、これらの合成ペプチドを用いる局所的治療に適したヒドロゲルを含む処方を開発して、単独で又は骨格インプラント用の生分解性コーティングとしてのいずれかで、骨形成及び石灰化を促進することであった。
【０１０５】
本研究において、細胞を異なる合成ペプチドを含有するアルギネートゲルに曝露し、長期間培養して、骨芽細胞の生体応答に対するそれらペプチドの効果を評価した。ヒドロゲルの最適な処方は、制御され、局所的で、特定の生物活性分子送達のための緻密な構造の形成を考慮しなければならない。そのような特徴は、各特定の用途の、物理的な特性(例えば力学、分解、ゲル形成)、物質移行特性(例えば拡散)及び生物相互作用要件(例えば細胞接着及びシグナル伝達)によって支配されている。
【０１０６】
異なるポリマー濃度(1%、2%、3%、6%及び10%)でアルギネートゲル(Protanal LF200M、FMC polymers社、Oslo、Norway)を使用して実施された過去の研究は、ポリマー濃度の増加につれて孔径が減少すること示しており、その結果ペプチド媒体として作用する最も有望な処方として2%の濃度が得られた。これを念頭に置いて、2%アルギネートヒドロゲルを、300mM CaCl2を用いてイオン的に架橋し、最良の材料として選択した。
【０１０７】
凍結乾燥工程の後の、合成ペプチドを含む及び含まない両方のアルギネートゲルの微細構造のSEM分析から、42〜44μmの細孔直径を持つ多孔性で相互接続した構造が明らかになった;にもかかわらず、直径およそ1μmの孔径を持つ緻密な構造が、凍結乾燥していないゲルのSEM分析後に観察された(データ不掲載)。タンパク質の拡散速度は、分子量及びこれらの細孔と比較した拡散種のサイズ(ストークス半径によって定義される)による影響を受け、タンパク質の化学的性質(相互作用分子-アルギネート、分極、すなわち親水性薬物は極めて速やかに拡散できが疎水性薬物はゲル細孔を通ってゆっくりと拡散する)によって決まる。本研究に使用される合成ペプチドは長さ25アミノ酸の小ペプチドである(分子量2509.17〜2782.34Da)という事実により、ゲルを通る容易な拡散速度が期待されるべきである。従って、本研究において、2%アルギネートヒドロゲルに投入したペプチドは、インキュベーションの最初の24時間の間にバースト放出を呈し、その後21日間、進行性で持続的な放出が続いた。
【０１０８】
アルギネートは、細胞の付着に十分なタンパク質相互作用を持たない不活性基質と記載されているので、細胞接着及び増殖に対するアルギネートゲルの効率も検査し、哺乳動物細胞が無修飾のアルギネートヒドロゲルと相互作用できないことが示唆された。実際のところ、非常に特異的な接着表面を得るために、アルギネートヒドロゲルを用いるほとんどの研究は、細胞受容体に結合できるECMタンパク質の全長又はペプチド配列をポリマーに共有結合させている。実際に、いくつかの研究は、無修飾のアルギネートヒドロゲルではわずかな細胞接着しか観察されなかったが、RGD含有ペプチドによるアルギネートの修飾が細胞接着及び展開を促進することを報告している。しかし、本研究は、無修飾のアルギネートヒドロゲル[Pronova UP LVG(登録商標)]が、細胞の付着及び展開を可能にすることを示している。報告されている研究の中の差異は、使用されたアルギネートゲルの組成及び純度とその表面において細胞が増殖する能力の間の記載されている関係によると思われる。本研究において、使用したアルギネートは、最低でも60%のG画分を含有し、従って細胞の付着及び展開が可能になった。in vitro研究に最適な播種密度を、DNA定量化によって評価した。結果は、100×103個細胞/ウェルが、細胞接着と細胞増殖の両方において高い効率を持つ密度であることを示しており、従って、次の研究に選ばれた。アルギネートヒドロゲルは、MC3T3-E1細胞に対して非毒性であることを示し、組織培養プラスチック上で培養された細胞と比較して、細胞生存率に対してある種の防御効果を示した。更に、過去の研究において短期及び長期の細胞処理後に得られた結果と一致して、ヒドロゲル処方として与えられた合成ペプチドには細胞毒性が無いことが確認された。
【０１０９】
安定な骨芽細胞の接着は、特定の組合せで二量体化し、細胞外マトリックスタンパク質と相互作用するα及びβサブユニットから構成されるヘテロ二量体受容体であるインテグリンによって主に媒介される。骨芽細胞は、増殖する材料に応じて異なるインテグリン受容体を発現することが示されている。細胞接着におけるその役割に加えて、インテグリンは細胞骨格の組織化を調節し、情報伝達を媒介し、従って増殖、分化及び基質再形成を制御している遺伝子の発現を調節する。
【０１１０】
合成ペプチドが、インテグリン発現及びアルギネートヒドロゲルに対する細胞接着に影響を及ぼし得るかどうか調査するために、Itga8、Itgb1、Itgb3及び細胞外マトリックスタンパク質Fn1のmRNA発現レベルが研究された。合成ペプチド、特にP2及びP6での処理の14日後に、Itgb1、Itgb3及びFn1の発現は著しく減少した。β1インテグリンサブユニットは、コラーゲン、フィブロネクチン及びラミニンに対する骨受容体中に見いだされ、ECMへの骨芽細胞の接着を媒介し、一方でανβ3インテグリンは、Opn及びビトロネクチンへの接着を媒介する。興味深いのは、骨芽細胞において、ανβ3インテグリンの発現は細胞増殖を刺激し、基質石灰化を阻害し;β1及びβ3インテグリンサブユニットを含めた多数のインテグリンに結合する大量に存在するECMタンパク質であるFNは、同様に骨形成の初期段階に高発現しているが、細胞成熟の間は、基質中での蓄積が減少するという発見である。更に、合成ペプチドによる処理は、処理の21日後にItga8発現を著しく増加させ、細胞をP5で処理した場合顕著であった。Itga8は、骨芽細胞によって分泌され細胞接着及び増殖に関与するタンパク質であり、石灰化が開始された後に発現が増加するオステオポンチン(Opn)と相互作用することが示されている。ここで、Itga8とOpnのmRNA発現レベルの両側相関分析は、0.678のピアソン相関(p < 0.01)を示した。これらの結果は、合成ペプチドで処理した細胞が対照群と比較して細胞成熟の後期であり、分析した骨芽細胞マーカーの発現結果と一致していることを示す可能性がある。ペプチドのC末端領域にあるPPXPPの短い配列が、転写因子及び/又は活性化補助因子のトランス活性化活性に関与することが記載されている。合成ペプチドの作用機序は、細胞内シグナル伝達カスケードに影響を与え得る受容体との相互作用を含む可能性があり、保存されている高プロリン領域(PPLPP)を含有するそれらC末端の露出は、合成ペプチドのシグナル伝達活性において重要なものである可能性がある。合成ペプチドは、プロリンの高含有量に起因して期待された通り、二次構造要素を欠いている緻密で、十分に詰まったシグネチャーの構造を示し、相互作用に適した方法でPPLPP範囲を露出している。ペプチ
ド2及びペプチド6には、2つの固有のループが存在したが、ペプチド5は、C末端とN末端とが接触可能になる異なる位相のループを有する。従って、C末端の接近可能性におけるこれらの構造的な差異及び異なるペプチド間のこの短い共通配列(PPXPP)の構造的な硬さが、受容体との相互作用に影響を及ぼし得るという事実により、接着遺伝子の差異的発現を説明できる。
【０１１１】
一方で、最も特異的であり、最後に発現する、石灰化に役割がある骨芽細胞マーカーであるオステオカルシンが、処方された合成ペプチドを用いた処理の14及び21日後に、無処理の及びEMDアルギネートゲルと比較して著しく誘導され、すなわち培地に与えたときに得られた結果と一致したことが判明した。従って、EMDと合成ペプチドの両方を含む処理の21日後に、対照と比較して分化の様々な段階において高レベルで産生され、石灰化が開始された後に発現されるシアロタンパク質であるOpnは、著しく上方制御された。一方で、研究した時点において、骨芽細胞の分化、主に増殖及び基質成熟段階で骨形成に関連する遺伝子(Coll-I、Bmp-2、Bsp及びAlp)は、オステオカルシンより初期の段階で調節されるので、これら遺伝子の発現にどんな差異も観察されなかった。これまでに合成ペプチドを用いて実行されてきた研究の全てが、in vitroとin vivoの両方でオステオカルシンmRNAレベルの増加を繰り返し示したことは興味深い。このマーカーの関連性は、最近のin vivo研究において実証されており(Monjo Mら、2012年)、全ての中でTiインプラントの骨結合に最良の予測マーカーはオステオカルシンであった。合成ペプチドが、細胞の付着に対するアルギネートヒドロゲル特性を改善すること、並びに合成ペプチドを配合したヒドロゲル上で培養した細胞が、分化過程のより成熟した段階において対照ヒドロゲル及びEMDを配合したヒドロゲル上で培養した細胞に勝ることが示唆される。
【０１１２】
合成ペプチドの作用機序は、細胞分化の初期状態に細胞内シグナル伝達カスケードに影響を与え得る受容体との相互作用を含み、それによって最終的に骨芽細胞の分化を刺激する恐れがあり、この短い共通配列(PPXPP)の接近可能性及び構造的な硬さが、合成ペプチドのシグナル伝達活性において重要なものである可能性があると仮定できる。更に、本結果から、ペプチドは、細胞表面に発現しているインテグリンに結合する可能性があり、ペプチドは、第一にアルギネートヒドロゲル表面における骨芽細胞の付着を増加させ、第二に成熟した骨芽細胞の表現型と関連する遺伝子の発現を変調させる可能性があると仮定される。
【０１１３】
結論
結論として、結果は、2%アルギネートヒドロゲルが、合成高ポリプロリンペプチドの局所的送達に適切な処方であり、MC3T3-E1細胞におけるインテグリンα8、オステオポンチン及びオステオカルシンの発現を誘導することを実証している。これらのペプチド修飾されたアルギネートヒドロゲルは、骨組織工学用途の生物学的に活性な物質を含む新世代の注射可能な担体を表すことができ、二酸化チタン骨格など、骨格インプラント用の生分解性コーティングに使用することが期待できる。
【０１１４】
(実施例2)
アルギネートをコートした二酸化チタン骨格の調製
材料及び方法
2.1.合成ペプチド2(P2)の調製。
合成の高プロリンペプチド2(P2)(2HN- PLVPSQPLVPSQPLVPSQPQPPLPP-COOH)(配列番号1)は、Eurogentec社(Seraing、Belgium)から購入した。選択した合成ペプチド7.2mgを含有する1つのバイアルが凍結乾燥ペレット形態で送られ、それをリン酸緩衝食塩水(PBS)0.1%酢酸(PAA Laboratories GmbH社、Pasching、Austria)に10mg/mLになるように溶解した。
【０１１５】
凍結融解サイクルの繰り返しを避けるためにアリコートを調製し、使用するまで-20℃で貯蔵した。
【０１１６】
2.2.ペプチド2を含有する2%アルギネートの調製。
アルギン酸ナトリウム[Pronova UP LVG(登録商標)](最低60%のモノマーがグルロン酸である低粘度アルギネートである)をNovaMatrix(FMC BioPolymer AS社、Norway)から購入した。
【０１１７】
アルギン酸ナトリウムは、それ以上精製することなく使用した。多量のアルギン酸ナトリウム(2%w/v)を室温で3時間攪拌することによって蒸留水に溶解して、均質なアルギネート溶液を得る。固定濃度(50μg/mL)のP2を、溶液に添加し、1時間撹拌した。
【０１１８】
2.3. P2を含有する2%アルギネートでコーティングしたTiO2骨格の製造
(Tiainen Hら、2010年)によって以前に記載されているとおり、ポリマースポンジ複製(polymer sponge replication)によって、多孔性TiO2骨格を直径9mm及び高さ8mmのサイズで作製した。次いで、TiO2骨格を、P2を含む又は含まない1層の2%アルギネートゲルでコートした。簡潔には、TiO2骨格を、回転振とう機(IKA社  Vibrax VXR basic、Staufen、Germany)で100rpmでの撹拌下に室温で1時間、P2を含む又は含まない2%アルギネート溶液に沈めた。次いで、骨格を、252xgで1分間遠心分離した。サンプルを50mM CaCl2に1時間浸漬してゲル化させた。次いで、骨格をdH2Oですすいで、過剰のCaCl2を除去した。最終的に、サンプルを室温で終夜乾燥させた。1層の2%アルギネートゲルでコートした骨格(対照アルギネート骨格)を対照群として使用し、一方でコートしていないTiO2骨格(アルギネートを含まない、SC)も対照群として使用した。
【０１１９】
2.4. 2%アルギネートゲルでコートしたTiO2骨格からのペプチド2の放出プロファイル。
ペプチド2を含有する2%アルギネートでコートしたTiO2骨格(P2-アルギネートコート骨格)を、1mL蒸留水(pH 7.4)を含有する48ウェルプレートに入れた(Nunc GmBh社、Kg、Langenselbold、Germany)。細胞培養条件を模倣するために、サンプルを、回転振とう機[IKA社(登録商標)Schuettler MTS2(Germany)]で200rpmで、37℃で6時間、湿潤条件(蒸留水容器を使用して)で撹拌した。次いで、サンプルを、21日目まで加湿雰囲気中で、37℃で維持した。予め定めた時点(2日、5日、7日、9日、12日、14日、16日、19日及び21日)に蒸留水を採取し、新たな蒸留水を各ウェルに添加した。サンプル吸光度を、紫外-可視分光光度計[PerkinElmer社(登録商標)Lambda 25 UV/Vi Systems、USA]によって206nmの波長で分析して放出されたペプチドの量を決定した。並行して、1層の2%アルギネートゲルでコートしたTiO2骨格を対照として使用して、アルギネートの分解産物から得られた吸光度値を差し引いた。
【０１２０】
各時点について線形標準曲線を使用して、相対的な吸光度ユニットを、放出されたペプチドの量と相関させ、次いで放出されたP2の累積を算出した。実験は、三つ組で実行した。
【０１２１】
2.5.コートした及びコートしていないTiO2骨格におけるMC3T3-E1の細胞培養。
コートしていない及びペプチドを含む又は含まない2%アルギネートでコートした[P2及び対照(-)]TiO2骨格(SC)を、無菌条件下で48ウェルプレート(Nunc GmBh社、KG、Langenselbold、Germany)に入れた。200,000個細胞/骨格の密度で細胞を播種し、10%FBS(PAA Laboratories社、Pasching、Austria)並びにペニシリン100U/mL及びストレプトマイシン100μg/mL抗生物質(PAA Laboratory社、Pasching、Austria)を補充したα-MEM(PAA Laboratories社、Pasching、Austria)中で維持した。骨格内部での均一な細胞分布を保証するために、撹拌播種法を使用した(Takahashi Yら、2003年)。簡潔には、骨格に細胞懸濁液1mLを添加した後に、プレートを回転振とう機(Unitron、Infors HT社、Basel、Switzerland)で180rpmで、37℃で6時間、湿度条件で撹拌した。次いで、細胞を5% CO2の加湿雰囲気中で、37℃で21日目まで維持した。培地(1mL)は、一日おきに新しくした。
【０１２２】
処理の48時間後に培地を採取して、細胞毒性(LDH活性)を試験した。
【０１２３】
この3次元系の中への細胞増殖の能力を評価するために、7日後に、Hoechst染色を使用するDNA定量化によって細胞数も研究した。並行して、培養の7及び21日後に、骨格へのMC3T3-E1の細胞の付着もSEMによって視覚化された。
【０１２４】
細胞培養の7及び21日後に、骨芽細胞の成熟及び分化と関連するマーカーの発現を、リアルタイムRT-PCRによって評価した。
【０１２５】
2.6. 2%アルギネートコートTiO2骨格のSEM可視化。
アルギネートコートTiO2骨格の形態を、走査型電子顕微鏡を使用して観察した(SEM、Hitachi S-3400N、Hitachi High-Technologies Europe GmbH社、Krefeld、Germany)。培養の7及び21日後にSEMを更に使用して、TiO2骨格構造への細胞接着を視覚化した。簡潔には、細胞をPBSで2回洗浄し、PBS中の4%グルタルアルデヒドで2時間固定した。次いで、固定液を除去し、細胞を蒸留水で2回洗浄した。30分間隔で、50%、70%、90%及び100%エタノール溶液を添加して細胞を脱水した。エタノールを除去し、細胞を室温に放置して、残りのエタノールを蒸発させた。骨格を、後方散乱及び二次電子検出器を使用して10kV及び40Paで観察した。示した画像は、典型的な領域のものである。
【０１２６】
2.7.細胞生存率
48時間後に培地中で決定した乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性を、細胞生存の指標とみなした。細胞質性酵素の活性を、製造業者のキット説明書(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)に従って決定した。
【０１２７】
結果は、コートしていない骨格で培養した細胞の培地中のLDH活性を100%に設定して、相対的に示した。
【０１２８】
2.8.細胞数の決定。
3次元骨格上で増殖している細胞を、凍結融解法によって脱イオン蒸留水に溶解した。細胞溶解物を使用して、Hoechst 33258蛍光アッセイを用いてDNAの量を決定した。サンプルを、TNE緩衝液中で20μg/mL Hoechst 33258蛍光染色剤(Sigma社、St. Quentin Fallavier、France)と混合し、蛍光強度を多機能マイクロプレートリーダー(Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer、Agilent Technologies社、Santa Clara、United States of Amerrica)を使用して356/465nmの励起及び放射波長で測定した。線形標準曲線を使用して、相対的な蛍光ユニットを細胞数と相関させた。
【０１２９】
2.9.RNA単離及びリアルタイムRT-PCR分析
製造業者の手順に従ってTripure(登録商標)(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)を使用して、トータルRNAを単離した。トータルRNAを、Nanodrop分光光度計(NanoDrop Technologies社、Wilmington、DE、USA)を使用して260nmで定量化した。供給元の手順に従ってhigh capacity RNA-to-cDNA kit(Applied Biosystems社、Foster City、CA)を使用して、同量のトータルRNA(850ng)を42℃で60分間cDNAに逆転写した。PCR反応を実施するまで、各cDNAのアリコートを凍結した(-20℃)。
【０１３０】
Lightcycler 480(登録商標)(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)でSYBRグリーン検出を使用して、リアルタイムPCRを実行した。2つの参照遺伝子[18SrRNA及びグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Gapdh)]及び12個の標的遺伝子[インテグリンα8(Itga8)、インテグリンβ1(Itgb1)、インテグリンβ3(Itgb3)、フィブロネクチン1(Fn1)、オステリクス(Osx)、骨形成タンパク質2(Bmp2)、I型コラーゲン(Coll-I)、インターロイキン6(Il-6)、骨シアロタンパク質(Bsp)、アルカリホスファターゼ(Alp)、オステオカルシン(Oc)及びオステオポンチン(Opn)]に対してリアルタイムPCRを行った。
【０１３１】
プライマー配列をTable3(表3)に詳述する。
【０１３２】
【表３】
2015535695.tif 000005
【０１３３】
各反応は、Lightcycler-FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I(Fast Start Taqポリメラーゼ、反応緩衝液、dNTP混合物、SYBRGreen I色素及びMgCl2を含有する)7μL、0.5μM各センス及びアンチセンス特異的プライマー並びに希釈cDNA 3μLを最終体積10μLに含有した。増幅プログラムは、鋳型cDNAを変性するためのプレインキュベーション工程(95℃10分間)、その後に続く変性工程(95℃10秒間)、アニーリング工程(Osxの68℃5秒間及びAlpの65℃8秒間を除いて、60℃8〜10秒間)及び伸長工程(72℃10秒間)からなる45サイクルからからなった。
【０１３４】
各サイクル後に、蛍光を72℃で測定した(λex 470nm、λem530nm)。cDNA鋳型を含まない陰性対照を、各アッセイにおいて実行した。
【０１３５】
段階希釈を使用してLightCycler 480のソフトウェア内の所与の傾きからリアルタイム効率を算出し、異なる濃度を使用した場合、調査した全ての転写産物は高いリアルタイムPCR効率及び高い直線性を示した。PCR産物をLightCyclerによる融解曲線分析及びその後2%アガロース/TAEゲル電気泳動に供して、増幅特異性、Tm及びアンプリコンサイズをそれぞれ確認した。
【０１３６】
PCR後の相対定量は、LightCycler 480分析ソフトウェア1.5版(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)によって提供されたAdvanced relative quantification法を使用して、各サンプル中の標的遺伝子の濃度を同一サンプル中にある2つの参照遺伝子の濃度の平均で割ることによって算出した。
【０１３７】
2.10.統計
全てのデータは、平均値±SEMで表す。コルモゴルフスミルノフ検定を行って、正規性検定ためのパラメトリック又はノンパラメトリック分布を仮定し、正規分布に基づいてマン-ホイットニー検定又はスチューデントのt検定によって群間の差異を評価した。Windows(登録商標)用SPSS(登録商標)プログラム(Chicago、IL、USA)17.0版を使用した。結果は、p値≦0.05で統計的に有意と見なした。
【０１３８】
結果
ペプチド放出。
P2-アルギネートコート骨格のペプチド放出プロファイルを、図7に記載する。インキュベーションの最初の2日間にペプチドのバースト放出が観察された(21日後に放出されたP2の累積量の42.8%)。5日後に放出されたペプチドの量は、(21日目までに放出された累積量の)9.4%まで減少し、その後インキュベーションの21日目まで遅いが持続的なペプチド放出が経時的に続いた。更に、累積放出は、インキュベーションの21日後に2%アルギネートゲル内に捕捉されているP2がまだ存在することを示唆している。
【０１３９】
LDH活性
図8で示すように、研究したどの実験群においても毒性効果は観察されなかった。試験した全ての群において同程度の細胞生存率のパーセンテージが決定されたことは、対照アルギネート骨格(-)及びP2-アルギネートコート骨格(P2)のいずれも、細胞培養の48時間後に細胞に対してどんな毒性効果も示さなかったことを示している。
【０１４０】
2%アルギネートゲルをコートしたTiO2骨格のSEMによる可視化。
アルギネートコートTiO2骨格を、SEMによって観察した。図9A及び図9Bに示すように、TiO2骨格のいくつかの細孔は、アルギネートによるコーティング工程後に塞がれたが、細胞を播種し標準的な細胞培養条件(加湿雰囲気中で37℃)でインキュベーションした7日後には、ほとんど全ての細孔は塞がれていなかった(図9C及び図9D)。従って、閉塞アルギネートゲルのある程度の分解が、コーティング工程の直後に塞がれたままになっていたこれらの細孔に見られた。
【０１４１】
コートしていないTiO2骨格(SC)上で増殖している細胞の量(図10A及び図10B)は、アルギネートコートTiO2骨格(図10C〜図10F)より多かったが、細胞は、P2を含む又は含まないいずれかの2%アルギネートゲルでコートした骨格にも浸透し、接着することができた。
【０１４２】
7日目〜21日目までに骨格上で増殖している細胞数の増加が全ての実験群に見られた。
【０１４３】
細胞数
培養の7日後に、DNA定量化を使用して、TiO2骨格上で増殖している細胞数を決定した(図11)。SEM画像と一致して、培養の7日後に、TiO2骨格(SC)と比較して、どのアルギネートコートTiO2骨格においても細胞数は著しく低かった。従って、SCと比較して、61%及び49%の細胞数の減少が、P2を含まない及び含むアルギネートコート骨格それぞれに見いだされた。データは統計的有意性に達しなかったが、P2でコートした骨格は、アルギネート対照骨格(-)より32%多い細胞を示した。
【０１４４】
細胞接着関連マーカーの遺伝子発現。
図12に示すように、培養の7日後に、Itb1の相対的なmRNAレベルは、TiO2骨格(SC)と比較して、アルギネートコート骨格(P2を含む又は含まないどちらも)で増殖している細胞で著しく減少した。にもかかわらず、細胞培養の21日後に、群の中で差異は全く観察されなかった。21日後に、Itgb3 mRNAレベルは、TiO2骨格(SC)と比較して、アルギネートコート骨格(P2を含む又は含まないどちらも)で増殖している細胞で増加した。21日後に、コートしていない骨格と比較して高いFn1のmRNAレベルが、2%アルギネートコート骨格で増殖している細胞及びP2-アルギネートコート骨格で増殖している細胞で見られた。但し、最後の群では、データは統計的有意性に達しなかった。培養の21日後に、Itga8 mRNAは、対照アルギネート骨格と比較して、P2-アルギネートコート骨格で増殖している細胞で著しく増加した。
【０１４５】
いくつかの骨芽細胞分化マーカーの遺伝子発現。
図13は、いくつかの骨芽細胞分化マーカー遺伝子について相対的なmRNAレベルを示す。培養の21日後に、コートしていない骨格と比較して、オステリクスmRNAレベルはアルギネートコート骨格(P2を含む又は含まないどちらも)で増殖している細胞で増加した。細胞培養の21日後に、コートしていない骨格とアルギネートコート骨格の両方と比較して、Bmp-2及びIl-6 mRNAレベルは、P2-アルギネートコート骨格上で培養した細胞において著しく増加した。細胞培養の7日後に、アルギネートコート骨格と比較して、細胞増殖に関連するマーカーであるColl-IのmRNAレベルは、P2-アルギネートコート骨格で培養した細胞において著しく増加した。培養の21日後に、コートしていない骨格と比較して、Coll-Iは、アルギネートコート骨格とP2-アルギネートコート骨格の両方で著しく増加した。研究したどの時点でも、実験群の中でOpn、Bsp、Alp及びOc mRNAの発現レベルに有意差は全く観察されなかった。
【０１４６】
考察
本実験において、生物学的に活性な物質を含む及び含まない、アルギネートコーティングでコートして、耐荷重骨組織用途に使用するために骨形成及び石灰化を促進した二酸化チタン骨格の適合性が実証された。TiO2骨格は、圧縮強度2.6MPaまでの強度を有することが報告されており(Tiainen Hら2010年)、ブタin vivo研究において優れた機械的抵抗性を示した。
【０１４７】
骨組織工学において、骨格の構造は、骨形成に最適な微環境を提供しなければならない。骨格空隙率、細孔ネットワーク相互接続性、表面積対体積比及び表面の物理化学特性は、細胞移動及び分化、骨内方増殖、血管新生、並びに細胞と環境の間の物質移動を決定する。撹拌細胞播種法を使用する高多孔性TiO2骨格の使用は、マウス前骨芽細胞の優れた付着及び分布をもたらすと判明した。本研究において、1層の2%アルギネートでコートしたTiO2骨格は、3次元細胞増殖のための骨格としての使用に適した微細構造を示した。
【０１４８】
一部の細孔は、コーティング工程の直後に塞がれたままになっていたが、アルギネートの生分解特性により、37℃でのインキュベーションの7日後にはほとんど全ての細孔は塞がれておらず、従って、開口部窓が形成されて細胞が構造内へ浸透し、移動した。コートした及びコートしていないTiO2骨格の間で、細胞生存率に差異は全く観察されなかった。インキュベーションの最初の数時間にP2のバースト放出が見られ、アルギネートヒドロゲル単独と同じパターンに従い、その後21日間、進行性で持続的な放出が続いた。
【０１４９】
TiO2骨格は、骨芽細胞が接着し、移動し、増殖するのに適切な表面を提供した。アルギネートコートTiO2骨格中の細胞の量は、コートしていないTiO2骨格より少なかったが、アルギネートでコートした骨格は、細胞の発達及び分化を支持した。これらの結果は、アルギネートが細胞の付着に対して不活性な基質であり、プロリン配列に豊む合成ペプチドがアルギネートヒドロゲルの細胞付着に対する特性を高めると報告している過去の研究と一致している。従って、著しくはないが、7日後に、合成ペプチド2を含有する2%アルギネートでコーティングしたTiO2骨格は、アルギネートコートTiO2骨格と比較して細胞付着を改善する(+32%)傾向を示した。
【０１５０】
生体材料組成物は、骨芽細胞の成熟並びに石灰化に対する長期的な効果による細胞付着及び細胞骨格の組織化を調節することが報告されている。異なる群におけるSEM及びDNA定量化によって観察した細胞の付着の効率と一致して、Itgb1 mRNAのレベルは、コートしていない骨格で増殖している細胞と比較して、アルギネートコートTiO2骨格で増殖している細胞で減少した。更に、培養の21日後に、Itgb3及びFn1 mRNAのレベル(骨形成の初期段階で高発現し、細胞の成熟過程を通して減少する)は、コートしていない骨格と比較して、アルギネートコートTiO2骨格へと増殖している細胞において著しく増加した。更に、オステオポンチンに結合することにより石灰化段階に役割を果たすインテグリンであるItga8の発現は、アルギネートコート骨格と比較して、P2-アルギネートコート骨格によって誘導され、これはP2が石灰化過程に影響する可能性があることを示唆している。インテグリンは、材料表面への細胞の付着に関与するだけでなく、骨形成及び石灰化を誘導する情報伝達経路を媒介する。興味深いことに、通常は短期間上方制御され、その後下方制御される、骨芽細胞分化の初期段階と関連するItgb3、Fn1、Coll-I及びOsxのような遺伝子の発現は、コートしていない骨格において増殖している細胞と比較して、アルギネートコートTiO2骨格内へ増殖している細胞で、研究した遅い時点(21日目)で増加した。MC3T3-E1細胞が、コートしていない骨格上又はアルギネートコート骨格上で増殖している場合、骨芽細胞分化と関連する初期マーカーの時系列が変化することもあり得、そのため、おそらくアルギネート上への細胞接着の最初の問題により、コートしていないTiO2骨格と比較して、アルギネートコート表面で増殖している細胞は増殖全体にわたって細胞分化の改善を示した。アルギネートコーティングは、骨格上での細胞接着及び増殖を損なうように思われるが、石灰化能がある成熟して組織化された基質(ECM)の獲得は、どの群に対しても7日目〜21日目のAlp及びBsp mRNAレベルの著しい増加によって確認された。一旦、ECMの合成、組織化及び成熟が終了すると、Oc発現が上方制御されて石灰化が導かれる。結果は、培養の21日後にOc mRNAレベルのわずかな増加を示し、
従って、細胞は石灰化過程の直前であったと結論することができる。そのうえ、Opn及びBspの遺伝子発現レベルについての結果と一致して、コートしていないTiO2骨格に播種したMC3T3-E1細胞で以前に報告されているように、骨芽細胞細胞におけるBsp/Opn mRNAの関連性の増大は、ECM石灰化の刺激の指標となり得る。
【０１５１】
DNA含有量によって測定される細胞の量及びBmp2、Coll-I及びIl-6のより高い発現レベルによって認識できるように、アルギネートへのP2の添加は、アルギネートコート骨格と比較して細胞の増殖及び分化の特性を改善した。これまで、チタンインプラントはペプチドでコートされており、更に局所的送達の担体として使用するためにアルギネートヒドロゲル中に投入された場合、in vitroとin vivo両方の研究においてポリプロリン配列に富む合成ペプチドは、オステオカルシンmRNAレベルの増加を繰り返し示した。従って、総合すれば、これは、P2-アルギネートコート骨格が、in vivo環境において一層高い細胞の分化及び石灰化を促進し得ることを示唆する。
【０１５２】
結論
結論として、その結果は、アルギネートコートTiO2骨格が骨芽細胞分化を誘導するプロリン配列に富む合成ペプチドなど、生物学的に活性な物質の送達するための基質として作用できることを実証している。骨形成並びに石灰化におけるTiO2骨格の物理的及び骨伝導特性と合成高プロリンペプチドなどの生物学的に活性な物質の骨形成作用との組合せは、耐荷重用途における骨組織再生に対して新たな戦略を示し得る。
【０１５３】
(実施例3)
シンバスタチンの局所送達用のアルギネートをコートした二酸化チタン骨格の調製
1.要約
高多孔性二酸化チタン(TiO2)骨格を、アルギネート溶液を含有するシンバスタチン(SIM)(すなわち生物学的に活性な物質)に沈めた。走査型電子顕微鏡及び過ヨウ素酸シッフ染色によって視覚化した骨格の微細構造により、TiO2骨格支柱の表面を覆っている均一に分布したアルギネート層が明らかになった。進行性で持続的なSIM放出を、最高19日間観察した。骨芽細胞に対する細胞毒性は、SIMを含まない骨格と比較した場合、SIMを含む骨格によって全く観察されなかった。骨芽細胞マーカー(I型コラーゲンα1、アルカリホスファターゼ、オステオプロテゲリン、オステオカルシン及び血管内皮増殖因子A)の発現を、リアルタイムRT-PCRを使用して定量化した。オステオプロテゲリン、血管内皮増殖因子A及びオステオカルシンの分泌を、多重化免疫測定法(Luminex)によって分析した。21日後にSIMを含まない骨格と比較した場合、オステオカルシンの相対的な発現及び分泌は、10μM SIMを含む骨格で培養した細胞において著しく増加した。加えて、21日目にSIMを含まない骨格と比較した場合、血管内皮増殖因子Aの分泌は、10nMと10μM両方のSIMを含む骨格で培養した細胞において著しく増強された。結論として、結果は、SIMコートしたTiO2骨格が、SIMの持続的放出を支持し、骨芽細胞の分化を誘導できることを示している。TiO2骨格の物理的な特性とSIMの骨形成性作用との組合せは、即時負荷が求められる又は利用できない異常における骨再生に対して新たな戦略を示し得る。従って、この実施例は、本文書のアルギネートをコートした二酸化チタン骨格を使用して、骨芽細胞増殖に対して正の効果を提供するなど、生物学的に活性な物質を送達できることを実証している典型的な実施形態である。
【０１５４】
2.材料及び方法
2.1.SIMを含有するアルギネートヒドロゲルでコートしたTiO2骨格の製造
(Tiainen Hら、2010年)によって以前に記載されているとおり、直径9mm及び高さ8mmのサイズを有する多孔性TiO2骨格を、ポリマースポンジ複製によって作製した。つまり、ポリマー発泡体を、TiO2スラリーに含浸し、乾燥し、その後1500℃で40時間焼結した。TiO2スラリーの2層目を骨格に添加し、同一温度で前述のように再焼結した。マイクロコンピュータ断層撮影(1172 micro-CT imaging system、Skyscan社、Kontich、Belgium)によって決定した骨格の総表面積は、20.295cm2であった。作製した骨格を、121℃で20分間加圧滅菌することによって滅菌した。SIM(Krebs Biochemicals & Industries社、Andhra Pradesh、India)を100%エタノールに溶解した後に、milliQ水中の2%(w/v)Pronova UP LVGアルギン酸ナトリウム(FMC BioPolymer社、Sandvika、Norway)に望ましい濃度で添加して、SIM含有アルギネートコートTiO2骨格を作った。SIMを含む又は含まないアルギネート溶液を、0.22μm孔径の注射器フィルタ(TPP Techno Plastic Products AG社、Trasadingen、Switzerland)で使用前に滅菌した。
【０１５５】
TiO2骨格を、回転振とう機で100rpmでの撹拌下に室温で1時間SIMを含む又は含まないアルギネート溶液に沈め、続けて300xgで1分間遠心分離して、過剰なアルギネート溶液を除去した。その後、骨格を、回転振とう機で100rpmでの撹拌下に1時間SIMを含む又は含まない50mM CaCl2に浸漬した。アルギネートコート骨格をmilliQ水で最終的にすすいで、過剰なCaCl2を除去し、終夜風乾した。SIMを含まない2%アルギネートヒドロゲルでコートした骨格を、対照群として使用した。
【０１５６】
2.2. SIMを含有するアルギネートヒドロゲルでコートしたTiO2骨格の特性評価
アルギネートコート骨格を、金スパッタリング(Cressington sputter coater 108 auto、Cressington Scientific Instruments社、Watford、England)し、その微細構造を走査型電子顕微鏡(SEM)(TM-1000、Hitachi High-Technologies社、Tokyo、Japan)によって後方散乱二次イオンを用いて加速電圧15kVで視覚化した。アルギネートコーティングを、過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色によって更に評価した。要約すると、骨格をmilliQ水で洗浄し、1%過ヨウ素酸溶液(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO、USA)中で5分間で酸化させた。次いで、骨格をmilliQ水ですすぎ、シッフ試薬(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO、USA)中に15分間入れた。最終的に、骨格を微温の水道水に5分間浸漬し、その後撮影した(Nikon digital camera D700、Sendai Nikon Corporation社、Miyagi、Japan)。
【０１５７】
2.3.アルギネートコートTiO2骨格からのSIM放出の定量化
アルギネートコート骨格及びSIM(2.4mM、0.6mM)を含有するアルギネートコート骨格を、19日目までmilliQ水1mL中で、加湿雰囲気中で37℃に保ち、SIMの放出プロファイルを決定した。予め定めた時点(0.25日、2日、4日、6日、8日、10日、13日、15日、17日、19日)にmilliQ水を入れ換え、放出されたSIMの量を、紫外-可視分光光度計を使用して定量化した(PerkinElmer Lambda 25 UV/Vis System、PerkinElmer社、Waltham、MA、USA)。波長238nmでのサンプル吸光度を分析し、各時点について線形標準曲線を使用して、相対的な吸光度ユニットを放出されたSIMの量と相関させた。SIMを含まないアルギネートでコートした骨格の吸光度値を対照として使用して、アルギネートの分解産物から得られたバックグラウンド値を差し引いた。実験を、三つ組で実行した。
【０１５８】
2.4.初代ヒト骨芽細胞の細胞培養及び播種
3人のドナー、2人は大腿骨(16歳及び10歳の男性)由来及び1人は脛骨(41歳男性)由来の初代ヒト骨芽細胞(Cambrex Bio Science社、Walkersville、MD、USA)を、75cm2の培養フラスコ中の10%ウシ胎仔血清、0.1%硫酸ゲンタマイシン及びアンホテリシンB抗生物質並びに0.1%アスコルビン酸(Lonza社、Walkersville、MD、USA)を補充した骨芽細胞培地中で5% CO2の加湿雰囲気中で、37℃で培養した。7〜9継代目の細胞を、400.000個細胞/mLの密度で骨格に播種した。骨格の全体に及ぶ均一な細胞分布を確実にするために、撹拌播種法を使用した(Takahshiら2003年)。培地に浸漬した骨格を、48ウェル培養プレートに入れた。骨格に細胞懸濁液1mLを添加した後に、プレートを回転振とう機で、200rpmで、37℃で6時間撹拌した。細胞を播種した骨格を、培地1mLが入っている新たな培養プレートに移し、21日目まで5% CO2の加湿雰囲気中で、37℃で維持した。培地は、一日おきに交換した。採取した培地を、細胞毒性、アルカリホスファターゼ(ALP)活性及びタンパク質発現アッセイ用に保存した。培養の7、14及び21日後に、リアルタイムRT-PCR及び免疫細胞化学用として骨格を回収した。
【０１５９】
2.5.細胞毒性アッセイ
SIM含有骨格の細胞毒性を、培地中の細胞質性酵素乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の活性に基づいて推定した。製造業者(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)の細胞毒性検出キットの説明書に従って、14日目まで一日おきに採取した培地においてLDH活性を決定した。サンプル50μLを、キット反応混合物と暗所で、室温で30分間インキュベートした。サンプルの吸光度を、プレートリーダーで、492nmで測定した(Biochrom Asys Expert 96 Microplate Reader、Biochrom社、Holliston、MA、USA)。
【０１６０】
2.6. ALP活性アッセイ
培養の2、8、14及び21日後に、P-ニトロフェニルリン酸(pNPP)基質(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO、USA)を黄色の最終産物であるp-ニトロフェノールに加水分解するALPの能力を使用して、培地中のALP活性を定量化した。培地25μLを各サンプルから採取し、96ウェルプレート中でpNPP溶液100μLと暗所で、室温で30分間インキュベートし、その後各ウェルに3M NaOH 50μLを添加して、反応を停止させた。吸光度をプレートリーダー(Biochrom Asys Expert 96 Microplate Reader、Biochrom社、Holliston、MA、USA)で、405nmで測定し、ALP活性を仔ウシ腸アルカリホスファターゼ(Promega社、Madison、WI、USA)に基づく標準曲線を使用して定量化した。
【０１６１】
2.7.免疫測定法:分泌されたタンパク質の定量化
採取した培地のアリコートを、製造業者の説明書に従って改変PES 3K遠心濾過機(VWR社、Radnor、PA、USA)を使用して8倍濃縮した。濃縮細胞培養液中のタンパク質レベルの複数分析物プロファイリングを、xMAP技術を使用するLuminex 100/200 system(Luminex社、Austin、TX、USA)で実行した。取得した蛍光データを、xPONENT 3.1ソフトウェア(Luminex社、Austin、TX、USA)によって分析した。培養の2、8、14及び21日後にヒト骨パネル及びヒトサイトカイン/ケモカインキット(Millipore社、Billerica、MA、USA)を使用して、培地中のオステオプロテゲリン(TNFRSF11B)、オステオカルシン(BGLAP)及び血管内皮増殖因子A(VEGFA)の量を測定した。全ての分析は、製造業者の手順に従って実行した。
【０１６２】
2.8. RNA単離及びリアルタイムRT-PCR分析
製造業者の手順に少しの修正を加えてQiagen RNAミニキット(Qiagen社、Hilden、Germany)を使用して、細胞を播種した骨格からトータルRNAを単離した。簡潔には、骨格を溶解緩衝液に4℃で1時間浸漬し、その後回転振とう機で、300rpmで、室温で10分間撹拌を続けた。その後、骨格を破棄し、溶解物緩衝液を2Wで30秒間超音波処理した(Sonics社  Vibracell VC130PB、CT、USA)。残りの手順は、製造業者によって提供された手順に従った。
【０１６３】
オリゴdTプライマーを使用してRevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas社、St. Leon- Rot、Germany)を用いてcDNAを合成した。SsoAdvanced SYBR(登録商標)Green Supermixを使用してCFX 384リアルタイムシステム(Bio-Rad社、Hercules、California、USA)で、リアルタイムPCRを実行した。3工程増幅(40サイクル:95℃5秒、60℃60秒、72℃30秒)を実行した。増幅無し対照及び鋳型無しの対照を使用した。グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、I型コラーゲンα1(COL1A1)、アルカリホスファターゼ(ALPL)、オステオプロテゲリン(TNFRSF11B)、オステオカルシン(BGLAP)及び血管内皮増殖因子A(VEGFA)についてリアルタイムRT-PCRを行った。プライマー配列を、Table4(表4)に挙げる。リアルタイムRT-PCRデータを、ΔΔCT法で補正した効率を使用して分析した(Pfafflら2001年)。
【０１６４】
【表４】
2015535695.tif 000006
【０１６５】
2.9.免疫細胞化学及び共焦点レーザー走査型顕微鏡法
培養の21日後に、メスを使用して骨格を半分に切り、4%パラホルムアルデヒド(PFA)/4.6%D-マンニトール中で15分間固定し、その後更なる処理まで1%PFA/4.6%D-マンニトール中に貯蔵した。固定した骨格を、milliQ水中の0.05%無水シトラコン酸(pH 7.4)中で95℃で15分間加熱することによって熱誘導エピトーブ賦活に付し、0.2%Triton Xを含むリン酸緩衝生理的食塩水(PBS)中の1.25%ウシ血清アルブミン(BSA)中で1μg/mLに希釈したマウス抗ヒトI型コラーゲンモノクローナル抗体(I-8H5、MP Biomedicals社、Santa Ana、CA、USA)と室温で1時間インキュベートし、その後、2.5% BSA/0.05%Tween-20/PBSに2mg/mLの濃度で希釈したCy3コンジュゲートロバ抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch社、West Grove、PA、USA)中で、室温で30分間インキュベーションを続けた。細胞播種した全組織標本の染色骨格を、DAPIを使用して対比染色し、カバーガラス上に置き、Dako蛍光封入剤(Dako社、Glostrup、Denmark)で覆った。共焦点レーザー走査型顕微鏡法を、FluoView 1000共焦点レーザー走査型顕微(CLSM)(Olympus社、Center Valley、PA、USA)で実行した。骨格表面を、反射モードでCLSMを使用して視覚化した。ImageJ(NIH、Bethesda、MD、USA)を使用して画像を分析した。
【０１６６】
2.10.統計
細胞毒性、ALP活性、遺伝子発現及びタンパク質分泌分析によって得たデータを、正規性検定(Shapiro-Wilk)に通し、Holm-Sidak試験、次にパラメトリック一元配置ANOVA(SigmaPlot 12.3、Systat Software社、San Jose、CA、USA)を使用して群間で比較した。≦0.05の確率を、有意と見なした。
【０１６７】
3.結果
3.1. 2%アルギネートヒドロゲルをコートしたTiO2骨格の特性評価
アルギネートコート骨格のSEM分析は、液浸-遠心分離技術により、TiO2骨格支柱の表面をコーティングしているアルギネートの均一な分布が得られることを明らかにした(図14A〜図14C)。TiO2骨格の上(図15A)及び中(図15B)のPAS染色によって視覚化した通り、アルギネートの分布には小さな変動しか見られなかった。
【０１６８】
3.2.シンバスタチン放出
2.4mM及び0.6mMのSIMを含む骨格についてSIMの放出を調査した。SIMのゆっくりとした持続的放出が、両方の濃度で検出された。しかし、2.4mM SIMを含む骨格は、0.6mM SIMを含む骨格の場合に見られた15日間の放出と比較して、より長い17日間の放出期間になった(図16)。累積放出は、SIMが、インキュベーションの19日後でもアルギネート中に捕捉されたままであることを示唆した。この点以後の濃度は検出限界以下であったので、継続した放出は検出できなかった。
【０１６９】
3.3. LDH活性
アルギネートコート骨格からのSIMの細胞傷害効果を、広範な濃度(2.4mM、0.6mM、24μM、10μM、1μM、0.1μM及び10nM)で試験した。細胞を骨格に播種した場合、SIMは高濃度(10μM以上)で骨芽細胞に対する高い細胞毒性を見せた(データ不掲載)。14日間の細胞毒性研究を低濃度のSIM(10μM及び10nM)に対して実行して、持続的な時間SIMに曝露した場合の骨芽細胞生存率に対する効果を調査した。一般に14日間の全体にわたって、10nM SIMを含む骨格と比較してより高いLDH活性が、10μM SIMを含む骨格の培地中に検出された。SIMを含まないアルギネートコート骨格の効果と比較して、どのSIM濃度も、LDH活性の有意な増加を引き起こさなかった。LDH活性プロファイルに若干の変動が見られ、SIMに対する細胞応答にドナー依存的な差異を示した(図17A〜図17C)。
【０１７０】
3.4.骨芽細胞分化に対するSIM含有アルギネートコートTiO2骨格の効果
SIMを含まない骨格と比較した場合、どの時点の培地においても、SIM含有骨格上の培養骨芽細胞は、10nM又は10μM SIMいずれの骨格について測定したALP活性も著しく変化させなかった(図18A〜図18C)。
【０１７１】
SIMを含まない骨格と比較した場合、どの時点においても、10nM又は10μM SIMを含むいずれの骨格の培地のTNFRSF11B含有量にも有意差は見られなかった(図19A)。しかし、21日目にSIMを含まない骨格と比較した場合、培地中のVEGFAの含有量は、10nM及び10μM両方のSIMを含む骨格で培養した細胞において著しく増加した(図19B)。培養の21日後に、SIMを含まない骨格と比較して10nM SIMを含む骨格上で培養した細胞に有意差は全く見られなかったが、BGLAPの分泌は、SIMを含まない骨格と比較した場合、10μM SIMを含む骨格の細胞で著しく増強された(図19C)。
【０１７２】
培養の21日後に、SIMを含まない骨格と比較し、GAPDHに対して標準化した場合、BGLAPの相対的な発現は、10μM SIMを含む骨格で培養した細胞において著しく増加した。研究したどの時点でも実験群の中でALPL、COL1A1、TNFRSF11B又はVEGFA mRNAレベルの発現に有意差は全く観察されなかった(図20)。I型コラーゲンの沈着に対するSIMの効果を評価するために、染色した骨格に対してCLSM可視化を実行した。全ての骨格の大多数の細胞の細胞内にI型コラーゲンを検出した。しかし、細胞外コラーゲン原線維は、濃度に関わらずSIMを含む骨格にほとんど存在しなかった(図21A〜図21B)、一方でI型コラーゲン原線維の豊富なネットワークが、SIMを含まない骨格に見られた(図21C)。
【０１７３】
5.結論
結論として、本研究は、アルギネートコートTiO2骨格が、骨芽細胞の分化を誘導するSIM送達のための基質の機能を果たし得ることを示している。10μm SIMを含有するアルギネートでコートした骨格は、細胞毒性が低く、骨格上で培養された骨芽細胞のVEGFA及びBGLAPの分泌を著しく増加させた。SIMの局所的骨形成作用とTiO2骨格の物理的な特性との組合せは、耐荷重骨における骨組織再生に対して新たな戦略を示し得る。
【０１７４】
(実施例4)
エムドゲイン(EMD)の局所的送達用の及びヒト脂肪由来間葉系幹細胞の支持用のアルギネートをコートした二酸化チタン骨格の調製。
1.材料及び方法
1.1.二酸化チタン骨格の製造
(Tiainen Hら、2010年)によって以前に記載されているとおり、直径9mm及び高さ4mmのサイズを有する多孔性TiO2骨格を、ポリマースポンジ複製によって作製した。つまり、ポリマー発泡体を、TiO2スラリーに含浸し、乾燥し、その後1500℃で40時間焼結した。作製した骨格を、121℃で20分間加圧滅菌することによって滅菌した。
【０１７５】
1.2.ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の単離、特性評価及び細胞培養
hAD-MSCを、皮下脂肪組織から単離した。間葉性を確認するために、表面抗原の発現について、並びに環境刺激に応答した骨形成性、軟骨形成性及び脂肪生成性系統へと選択的に分化する能力について細胞を特徴づけた。以下のマーカータンパク質を評価した:
CD14(-)、CD19(-)、CD34(+)、CD45(-)、CD44(+)、CD73(+)、CD90(+)、CD105(+)、HLA-DR(-)及びIgG(-)。細胞の骨形成性分化表現型を、runt関連転写因子2(RUNX2)、I型コラーゲンα1(COL1A1)、アルカリホスファターゼ(ALPL)活性/mRNA発現及びアリザリンレッド染色による組織学的評価によって評価した。軟骨形成分化を、SRY(性決定領域Y)-ボックス9(SOX9)、II型コラーゲンα1(COL2A1)及びアグレカン(ACAN)mRNA発現を評価することによって分析した。脂肪生成性分化を、ペルオキシゾーム増殖因子活性化型受容体γ(PPARG)mRNA発現及びオイルレッド染色による組織学的可視化によって決定した。
【０１７６】
1.3.初代ヒト骨芽細胞の細胞培養
3人の男性ドナー、1人は脛骨由来及び2人は大腿骨由来のhOST(Cambrex Bio Science社、Walkersville、MD、USA)をそれぞれ、75cm2の培養フラスコ中の10%ウシ胎仔血清、0.1%硫酸ゲンタマイシン及びアンホテリシンB抗生物質並びに0.1%アスコルビン酸(Lonza社、Walkersville、MD、USA)を補充した骨芽細胞培地中で、5% CO2の加湿雰囲気中で、37℃で培養した。細胞播種時に、脛骨由来hOSTは、9継代目に達し、2人の大腿骨ドナー由来hOSTはそれぞれ6及び8継代目に達した。
【０１７７】
1.4.ヒト脂肪由来間葉系幹細胞及び初代ヒト骨芽細胞の播種
培地に予め浸漬した骨格を、24ウェル培養プレートに入れ、細胞懸濁液を、培地1mLに2×105個細胞/骨格の密度で骨格の上に滴下で添加した。骨格の全体に及ぶ均一な細胞分布を確実にするために、撹拌播種法を使用した(Takahashiら2003年)。播種後に、プレートを回転振とう機で200rpmで、湿度条件で、37℃で6時間撹拌した。細胞を播種した骨格を、培地1mLが入っている新たな培養プレートに移し、5% CO2の加湿雰囲気中で、37℃で維持した。翌日、細胞を播種した骨格の全てを、4.6%D-マンニトール溶液に2回浸漬し、次に300xgで1分間遠心分離を続けた。次いで、細胞が埋め込まれた骨格を、それぞれの群によって異なるように処理した。対照群のコートしていない骨格を、培地1mLが入っている新たな培養プレートに直ちに移し、21日目まで5% CO2の加湿雰囲気中で、37℃で維持した。EMDを含まないアルギネート群の骨格を、2%(w/v)Pronova UP LVGアルギン酸ナトリウム(FMC BioPolymer社、Sandvika、Norway)300μL、2%(w/v)Pronova UP LVGアルギン酸カルシウム(FMC BioPolymer社、Sandvika、Norway)600μL、0.003%(w/v)クエン酸/4.6%D-マンニトール600μL及び4.6% D-マンニトール300μLからなる新たに作製した溶液に10分間浸漬することによってアルギネートヒドロゲルでコーティングし、次に300xgで1分間遠心分離を続けて、過剰なアルギネート溶液を除去した。アルギネートコート骨格を、50mM CaCl2溶液で安定化し、培地1mLが入っている新たな培養プレートに移し、21日目まで5% CO2の加湿雰囲気中で、37℃で維持した。EMDを含むアルギネート群の骨格を、0.003%(w/v)クエン酸/4.6%D-マンニトール600μLが追加の150μg/mL EMD(Lot number: EMD 9121、Institut Straumann社、Basel、Switzerland)を含有することを除いてEMDを含まないアルギネート群の骨格と同じ方法で処理し、アルギネート溶液全体に対して50μg/mLの最終EMD濃度を得た。各ドナー、各処理及び2つの採取時点の3つ組は、全54個の骨格に含まれた。一日おきに培地を交換し、細胞毒性、アルカリホスファターゼ(ALP)活性、総タンパク質含有量及び発現アッセイに使用するために保存した。骨格を、リアルタイムRT-PCR及び免疫細胞化学用に培養14及び21日後に回収した。
【０１７８】
1.5.アルギネートヒドロゲルでコートした細胞を播種した骨格の可視化
アルギネートコーティングを、過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色によって視覚化した。要約すると、骨格をmilliQ水で洗浄し、1%過ヨウ素酸溶液(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO、USA)中で5分間で酸化させた。次いで、骨格をmilliQ水ですすぎ、シッフ試薬中に15分間入れた(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO、USA)。最終的に、骨格を微温の水道水に5分間浸漬し、その後撮影した。更に、培養の2日後に、アルギネートコーティングにおけるhAD-MSCの接着をPAS/全カドヘリン二重染色によって評価した。メスにより骨格を半分に切り、4%パラホルムアルデヒド(PFA)/4.6%D-マンニトール中で15分間固定し、その後更なる工程まで1%PFA/4.6%D-マンニトール中で貯蔵した。固定した骨格を、最初にPAS法に従って染色し、次に全カドヘリン染色を続けた。つまり、PASで染色した骨格を、0.2%Triton Xを含むリン酸緩衝生理的食塩水(PBS)中の1.25%ウシ血清アルブミン(BSA)中で4μg/mLに希釈したマウス抗ヒト全カドヘリンモノクローナル抗体(I-8H5、MP Biomedicals社、Santa Ana、CA、USA)と室温で1時間インキュベートし、その後、2.5% BSA/0.05%Tween-20/PBSに2μg/mLの濃度で希釈したCy3コンジュゲートロバ抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch社、West Grove、PA、USA)中で、室温で30分間インキュベーションを続けた。細胞播種した全組織標本の染色骨格を、DAPIを使用して対比染色し、カバーガラス上に置き、Dako蛍光封入剤(Dako社、Glostrup、Denmark)で覆った。共焦点レーザー走査顕微鏡法を、FluoView 1000共焦点レーザー走査型顕微(CLSM)(Olympus社、Center Valley、PA、USA)で実行した。骨格表面を、反射モードでCLSMを使用して視覚化した。ImageJ(NIH、Bethesda、MD、USA)を使用して画像を分析した。
【０１７９】
1.6.細胞毒性アッセイ
細胞播種した骨格の細胞毒性を、培地中の細胞質性酵素乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の活性に基づいて推定した。製造業者(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)の細胞毒性検出キットの説明書に従って、培養の14日目まで一日おきに採取した培地において、LDH活性を決定した。サンプル50μLを、キット反応混合物50μLと暗所で、室温で30分間インキュベートした。サンプルの吸光度を、プレートリーダーで、492nmで測定した(Biochrom Asys Expert 96 Microplate Reader、Biochrom社、Holliston、MA、USA)。
【０１８０】
加えて、培養の2日目にhAD-MSCの生存率をアクリジンオレンジ/エチジウムブロマイド染色によって視覚化した。メスにより骨格を半分に切り、4%パラホルムアルデヒド(PFA)/4.6%D-マンニトール中で15分間固定し、その後更なる工程まで1%PFA/4.6%D-マンニトール中で貯蔵した。共焦点レーザー走査型顕微鏡法を、FluoView 1000CLSM(Olympus社、Center Valley、PA、USA)で実行した。骨格表面を、反射モードでCLSMを使用して視覚化した。ImageJ(NIH、Bethesda、MD、USA)により、画像を分析した。
【０１８１】
1.7.総タンパク質含有量アッセイ
培養の2、8、14及び21日後に、細胞播種した骨格の総タンパク質含有量を、ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキット(Thermo Scientific Pierce Biotechnology社、Rockford、IL、USA)を用いて製造業者の説明書に従って培地中で決定した。サンプル25μLを、キット作業試薬200μLと暗所で、37℃で30分間インキュベートした。サンプルの吸光度を、プレートリーダー(Biochrom Asys Expert 96 Microplate Reader、Biochrom社、Holliston、MA、USA)で、562nmで測定し、総タンパク質量をBSA(Thermo Scientific Pierce Biotechnology社、Rockford、IL、USA)に基づく標準曲線によって算出した。
【０１８２】
1.8.アルカリホスファターゼ活性アッセイ
hAD-MSCに対しては培養の2、4、6、10、16及び20日並びにhOSTに対しては培養の4、8、12、16及び21日後に、P-ニトロフェニルリン酸(pNPP)基質(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO、USA)を黄色の最終産物であるp-ニトロフェノールに加水分解するALPの能力を使用して、培地中のALP活性を定量化した。サンプル25μLを、pNPP 100μLと暗所で、室温で30分間インキュベートし、その後3M NaOH 50μLを添加して、反応を停止させた。吸光度を、プレートリーダー(Biochrom Asys Expert 96 Microplate Reader、Biochrom社、Holliston、MA、USA)で、405nmで測定し、ALP活性を、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ(Promega社、Madison、WI、USA)に基づく標準曲線によって定量化した。
【０１８３】
1.9.RNA単離及びリアルタイムRT-PCR分析
製造業者によって提供された手順に従って、Qiagen RNAミニキット(Qiagen社、Hilden、Germany)により、細胞を播種した骨格からトータルRNAを単離した。ランダムプライマーを使用してRevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas社、St. Leon- Rot、Germany)を用いてcDNAを合成した。リアルタイムPCRは、Applied Biosystems 7300リアルタイムシステム(Life Technologies社、Paisley、UK)で、TaqMan(登録商標)Universal Master Mixを用いて実行した。増幅プログラムは、鋳型cDNA変性のためのプレインキュベーション工程(95℃10分間)、その後に続く変性工程(95℃15秒間)及びアニーリング工程(60℃60秒間)を含む40サイクルからからなった。cDNA鋳型を含まない陰性対照を、各アッセイにおいて実行した。hAD-MSCの場合、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、RUNX2、SOX9、PPARG、COL1A1、オステオプロテゲリン(TNFRSF11B)、分泌されたリンタンパク1(SPP1)、ALPL及びオステオカルシン(BGLAP)についてリアルタイムRT-PCRを行った。hOSTの場合、GAPDH、COL1A1、TNFRSF11B、SPP1、ALPL及びBGLAPについてリアルタイムRT-PCRを行った。リアルタイムRT-PCRデータは、ΔΔCT法(Pfafflら2001年)を使用して分析した。
【０１８４】
1.10.免疫測定法:分泌されたタンパク質の定量化
培地中のタンパク質レベルの複数分析物プロファイリングを、xMAP技術を利用するLuminex 100/200 system (Luminex社、Austin、TX、USA)で実行した。取得した蛍光データを、xPONENT 3.1ソフトウェア(Luminex社、Austin、TX、USA)によって分析した。培養の2、8、14及び21日後に、ヒト骨パネルキット(Millipore社、Billerica、MA、USA)によって、培地中のオステオプロテゲリン(TNFRSF11B)、分泌リンタンパク質1(SPP1)及びオステオカルシン(BGLAP)の量を測定した。全ての分析は、製造業者の手順に従って実行した。
【０１８５】
1.11.免疫細胞化学及び共焦点レーザー走査型顕微鏡法
培養の14及び21日後に、メスにより骨格を半分に切り、4%パラホルムアルデヒド(PFA)/4.6%D-マンニトール中で15分間固定し、その後更なる工程まで1%PFA/4.6%D-マンニトール中で貯蔵した。固定した骨格を、milliQ水中の0.05%無水シトラコン酸(pH 7.4)中で95℃で15分間加熱することによって熱誘導エピトーブ賦活に付し、0.2%Triton Xを含むリン酸緩衝生理的食塩水(PBS)中の1.25%ウシ血清アルブミン(BSA)中で1μg/mLに希釈したマウス抗ヒトモノクローナル抗体(I-8H5、MP Biomedicals社、Santa Ana、CA、USA)と室温で1時間インキュベートし、その後、2.5% BSA/0.05% Tween-20/PBSに2mg/mLの濃度で希釈したCy3コンジュゲートロバ抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch社、West Grove、PA、USA)中で、室温で30分間インキュベーションを続けた。細胞播種した全組織標本の染色骨格を、DAPIを使用して対比染色し、Dako蛍光封入剤(Dako社、Glostrup、Denmark)と一緒にカバーガラス上に搭載した。共焦点レーザー走査型顕微鏡法を、FluoView 1000CLSM(Olympus社、Center Valley、PA、USA)で実行した。骨格表面を、反射モードでCLSMを使用して視覚化した。ImageJ(NIH、Bethesda、MD、USA)により画像を分析した。
【０１８６】
1.12.統計
細胞毒性、ALP活性、遺伝子発現、総タンパク質含有量及び分泌分析によって得たデータを、Holm-Sidak試験、次にパラメトリック一元配置ANOVAを使用して群間で比較した。等分散及び/又は正規性検定に失敗した場合、順位付けクラスカルワリス一元配置ANOVAを実行した(SigmaPlot 12.3、Systat Software社、San Jose、CA、USA)。≦0.05の確率を、有意と見なした。
【０１８７】
2.結果
2.1.アルギネートコート細胞を播種した骨格の特性評価
アルギネートコート骨格のPAS染色は、TiO2骨格支柱の全ての表面をコーティングしているアルギネートヒドロゲルの均一な分布を明らかにした(図23A)。更に、アルギネートコートTiO2骨格へのhAD-MSC接着を、PAS/全カドヘリン二重染色によって実証した(図22D)。更に、培養の2日目に、播種したhAD-MSCの大多数はアクリジンオレンジ/エチジウムブロマイド染色により生存可能だった(図23)。
【０１８８】
2.2.ヒト脂肪由来幹細胞の特徴
細胞表面抗原CD14(-)、CD19(-)、CD34(+)、CD45(-)、CD44(+)、CD73(+)、CD90(+)、CD105(+)、HLA-DR(-)及びIgG(-)の発現パターンは、造血又は内皮起原細胞が存在しないことを示唆した。骨及び脂肪細胞分化を、アリザリンレッド及びオイルレッドをそれぞれ用いる組織学的可視化によって実証した。加えて、培養中に細胞は骨、軟骨及び脂肪沈着細胞へと選択的に分化した。その抗原表面発現パターン、組織学的評価並びにその骨形成性、軟骨形成性及び脂肪生成性系統へと分化する潜在性により、細胞をhAD-MSCと呼んだ。
【０１８９】
2.3.細胞適合性/乳酸デヒドロゲナーゼ活性
14日間の細胞毒性研究を、EMDを含む又は含まないアルギネートコート骨格に対して実行して、アルギネート及びEMDのhAD-MSC並びにhOST生存率に対する効果を調査した。一般に14日間の全体にわたって、EMDを含まないアルギネートコート骨格と比較してより高いLDH活性が、EMDを含むアルギネートコート骨格からの培地中に検出された。12日目にEMDを含まないアルギネートコート骨格とコートしていない骨格とを比較した場合、EMDを含むアルギネートコート骨格からのhAD-MSCがLDH活性の有意な増加を示した以外は、コートしていない骨格の効果と比較して、どの骨格も、LDH活性の有意な増加を引き起こさなかった(図24A)。更に、2、4及び14日目にコートしていない骨格と比較した場合、LDH活性の有意な減少が、EMDを含む及び含まないアルギネートコート骨格のhOST培地において観察された(図24B)。hAD-MSC及びhOSTのLDH活性プロファイルに若干の変動が見られ、アルギネート及びEMDに対する細胞応答に細胞型依存的な差異を示した(図24A〜図24B)。
【０１９０】
2.4.総タンパク質含有量
コートしていない骨格と比較した場合、どの時点においても、EMDを含む又は含まないいずれの骨格の場合にも、一般にhAD-MSC培地の総タンパク質含有量に有意差は全く見られなかった、但し8日目にコートしていない骨格と比較した場合に、総タンパク質量の有意な増加が、EMDを含む及び含まないアルギネートコート骨格の培地中に検出され、並びに12日目にEMDを含まないアルギネートコート骨格及びコートしていない骨格と比較した場合に、総タンパク質量の有意な増加がEMDを含むアルギネートコート骨格の培地中に見られたことを除く(図24C)。コートしていない骨格と比較した場合、どの時点においても、EMDを含む又は含まないいずれの骨格の場合にも、一般にhOST培地の総タンパク質含有量に有意差は全く見られなかった、但し2及び4日目にコートしていない骨格と比較した場合に、総タンパク質量の有意な低下が、EMDを含む及び含まないアルギネートコート骨格の培地中に検出されたことを除く(図24D)。
【０１９１】
2.5.アルカリホスファターゼ活性
コートしていない骨格と比較した場合、どの時点の培地において、EMDを含む又は含まないアルギネートコート骨格上の培養hAD-MSCは、EMDを含む又は含まないいずれの骨格について測定したALP活性も著しく変化させなかった、但しドナー1に関して20日目にEMDを含まないアルギネートコート骨格及びコートしていない骨格と比較した場合に、EMDを含むアルギネートコート骨格で培養した細胞の培地中のALP活性が著しく増加し、ドナー3に関して10日目にEMDを含まないアルギネートコート骨格及びコートしていない骨格と比較した場合に、EMDを含む骨格で培養した細胞の培地中のALP活性が著しく減少したことを除く。
【０１９２】
コートしていない骨格と比較した場合、どの時点の培地においても、EMDを含む又は含まないアルギネートコート骨格上の培養hOSTは、EMDを含む又は含まないいずれの骨格について測定したALP活性も著しく変化させなかった、但しドナー1に関して4日目にコートしていない骨格と比較した場合に、EMDを含まないアルギネートコート骨格で培養した細胞の培地中のALP活性が著しく減少し、ドナー2に関して12日目にコートしていない骨格と比較した場合に、EMDを含まないアルギネートコート骨格で培養した細胞の培地中のALP活性が著しく減少し、ドナー3に関して4及び16日目にコートしていない骨格と比較した場合に、EMDを含む及び含まないアルギネートコート骨格で培養した細胞の培地中のALP活性が著しく減少したことを除く。ALP活性プロファイルに若干の変動が見られ、EMDを含む又は含まないアルギネートコート骨格に対する細胞応答にドナー依存的な差異を示した。
【０１９３】
2.6.リアルタイムRT-PCR分析
研究したどの時点でも、実験群の中でhAD-MSCにおけるCOL1A1、TNFRSF11B、SPP1、ALPL及びBGLAP mRNAレベルの発現に有意差は全く観察されなかった。加えて、研究したどの時点でも、実験群の中でRUNX2、SOX9及びPPARG mRNAレベルの発現に有意差は全く観察されなかった。
【０１９４】
研究したどの時点でも、実験群の中でhOSTにおけるSPP1、ALPL及びBGLAP mRNAレベルの発現に有意差は全く観察されなかったにもかかわらず、培養の14日後に、EMDを含まない骨格、コートしていない骨格と比較し、GAPDHに対して標準化した場合、COL1A1の相対的な発現は、EMDを含む骨格で培養したhOSTにおいて著しく増加した。培養の14日後に、コートしていない骨格と比較し、GAPDHに対して標準化した場合、TNFRSF11Bの相対的な発現は、EMDを含む骨格で培養した細胞において著しく増加した。
【０１９５】
2.7.共焦点レーザー走査型顕微鏡法によるRUNX2及びSOX9の可視化
RUNX2及びSOX9の沈着に対するEMDの効果を評価するために、染色した骨格に対してCLSM可視化を実行した(図25)。
【０１９６】
2.8.免疫測定法:分泌されたタンパク質の定量化
コートしていない骨格と比較した場合、どの時点においても、EMDを含む又は含まないいずれの骨格のhAD-MSC若しくはhOSTいずれの培地のTNFRSF11B、SPP1及びBGLAP含有量においても有意差は見られなかった。どの時点においても、EMDを含む又は含まないいずれの骨格の培地の第2ドナーのTNFRSF11B含有量においても実質的な差異は全く見られず、第1ドナーの場合、8、14及び21日目に、EMDを含む又は含まない骨格のいずれの培地のTNFRSF11B含有量においても実質的な差異は全く検出されなかった。しかし、EMDを含む骨格と比較した場合、全ての時点で培地中の第3ドナーのTNFRSF11Bの含有量は、EMDを含まない骨格で培養した細胞においてより増加した。どの時点においても、EMDを含む又は含まないいずれの骨格の培地の第1及び第3ドナーのSPP1含有量においても実質的な差異は観察されなかった、但し21日目にEMDを含まない骨格と比較した場合に、培地中の第3ドナーのSPP1含有量がEMDを含む骨格で培養した細胞においてより多く発現したことを除く。更に、8及び21日目にEMDを含まない骨格と比較した場合、培地中の第2ドナーのSPP1含有量は、EMDを含む骨格で培養した細胞において更に増強された。どの時点においても、EMDを含む又は含まないいずれの骨格の培地の第1及び第3ドナーのBGLAP含有量においても実質的な差異は観察されなかった。しかし、2及び8日目にEMDを含まない骨格と比較した場合、培地中の第2ドナーのBGLAP含有量は、EMDを含む骨格で培養した細胞において更に増強された。
【０１９７】
全ての時点で、EMDを含まない骨格と比較した場合、培地中の第1及び第2ドナーのTNFRSF11Bの含有量は、EMDを含む骨格で培養した細胞においてより多く発現し、2及び8日目に、EMDを含む骨格と比較した場合、培地中の第3ドナーのTNFRSF11Bの含有量は、EMDを含まない骨格で培養した細胞においてより多く発現した。しかし、14及び21日目に、EMDを含む又は含まない骨格のいずれの培地の第3ドナーのTNFRSF11B含有量においても実質的な差異は全く観察されなかった。全ての時点で、EMDを含まない骨格と比較した場合、培地中の第1ドナーのSPP1の含有量は、EMDを含む骨格で培養した細胞において更に増加した。2、8及び14日目に、EMDを含まない骨格と比較した場合、培地中の第2ドナーのSPP1の含有量は、EMDを含む骨格で培養した細胞において更に増加した。2及び8日目に、EMDを含む又は含まないいずれの骨格の培地の第3ドナーのSPP1含有量においても実質的な差異は観察されなかった。2日目に、EMDを含む骨格と比較した場合、培地中の第1ドナーのBGLAPの含有量は、EMDを含まない骨格で培養した細胞において更に増加した。しかし、8日目に、EMDを含まない骨格と比較した場合、培地中の第1ドナーのBGLAPの含有量は、EMDを含む骨格で培養した細胞において更に増加した。2及び21日目に、EMDを含む骨格と比較した場合、培地中の第2ドナーのBGLAPの含有量は、EMDを含まない骨格で培養した細胞において更に増加した。しかし、14日目に、EMDを含まない骨格と比較した場合、培地中の第2ドナーのBGLAPの含有量は、EMDを含む骨格で培養した細胞において更に増加した。8、14及び21日目に、EMDを含まない骨格と比較した場合、培地中の第3ドナーのBGLAPの含有量は、EMDを含む骨格で培養した細胞において更に増加した。しかし、2日目に、EMDを含む骨格と比較した場合、培地中の第3ドナーのBGLAPの含有量は、EMDを含まない骨格で培養した細胞において更に増加した。
【０１９８】
5.結論
要約すれば、結果から、hAD-MSC及びhOSTは、EMC誘導体送達のためのコーティング手順を生存する能力を有すると結論できる。そのうえ、hOSTは、EMDを含むアルギネートコート骨格内で骨形成性系統に分化することができ、それはin vivoで有効性を評価する前に重要である。
【０１９９】
(実施例5)
開放多孔性構造を証明する、X線造影アルギネート層でコートしたTiO2骨格の製造
(Tiainen Hら、2010年)によって以前に記載されているとおり、ポリマースポンジ複製によって、多孔性TiO2骨格を直径9mm及び高さ8mmのサイズで作製した。次いで、TiO2骨格を、X線造影液[オムニパーク(イオヘキソール)、GE Healtcare社]を含む1層の2%アルギネートゲルでコートした。簡潔には、TiO2骨格を、回転振とう機(IKA社Vibrax VXR basic、Staufen、Germany)で100rpmでの撹拌下に室温で1時間、P2(配列番号1)を含む又は含まない2%アルギネート溶液に沈めた。次いで、骨格を、252xgで1分間遠心分離した。サンプルを50mM CaCl2に1時間浸漬してゲル化させた。次いで、骨格をdH2Oですすいで、過剰のCaCl2を除去した。最終的に、サンプルを室温で終夜乾燥させた。1層の2%アルギネートゲルでコートした骨格(対照アルギネート骨格)を対照群として使用し、一方でコートしていないTiO2骨格(アルギネートを含まない、SC)も対照群として使用した。骨格を、マイクロCTスキャナ(Skyscan 1172、Kontich、Belgium)でスキャンし、CTvoxで視覚化し、CTanで分析した。骨格の細孔直径は、5%しか減少せず、空隙率変化は3%未満であった。アルギネート層を塗布することにより相互接続性が変化しなかったことは、骨格が開放多孔性構造をなおも有し、極めて少ない細孔しか塞がれ(暗色)なかったことを証明している(図26)。全ての支柱がアルギネートの薄層(<10μm)で覆われたことも、見えた。
【０２００】
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、前述の説明は例示であり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限しないことは理解されるべきである。他の態様、利点及び変更は、以下の特許請求の範囲である。明白にそれとは反対に記載されていない限り、本明細書に記載されている好ましい各特徴は、本明細書に記載されている他のあらゆる好ましい特徴と併用して使用することができる。
【０２０１】
【表５】
2015535695.tif 000007
【図１】
2015535695.tif 000008
【図２】
2015535695.tif 000009
【図３Ａ】
2015535695.tif 000010
【図３Ｂ】
2015535695.tif 000011
【図４】
2015535695.tif 000012
【図５Ａ】
2015535695.tif 000013
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年3月19日(2015.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギネートコーティングを含む二酸化チタン骨格を作製する方法であって、
a)二酸化チタン骨格を用意する工程と、
b)少なくとも1つのアルギネート1〜3%w/vを含むアルギネート溶液を前記二酸化チタン骨格の少なくとも一部に加え、次いで二酸化チタン骨格を遠心分離する工程と、
c)工程b)において得られる二酸化チタン骨格に二価陽イオン塩溶液を加える工程であって、前記二価陽イオンがCa2+、Mg2+、Ba2+又はSr2+からなる群から選択される、二価陽イオン塩溶液を加える工程と、
d)二酸化チタン骨格を乾燥させる工程と
を含む、方法。
【請求項２】
工程b)のアルギネート溶液中のアルギネートの濃度が2%w/vである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
工程c)における二価陽イオン塩溶液の濃度が、15〜150mMである、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
工程c)における二価陽イオン塩溶液の濃度が、50mMである、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
工程b)及びc)が、2〜100回繰り返される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程b)及びc)が、2〜10回繰り返される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
工程b)のアルギネート溶液が、少なくとも1つの生物学的に活性な物質を更に含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的に活性な物質が、合成若しくは天然の生物活性分子、天然若しくは合成の薬物及び/又は生細胞からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
アルギネートが、10 000〜100 000g/molの分子量(Mw)を有する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記アルギネートコーティングが、少なくとも1μmの湿潤厚を有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも1つのアルギネートが、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸カルシウム及びアルギン酸ストロンチウムからなる群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項1から11のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる二酸化チタン骨格。
【請求項１３】
請求項1から11のいずれか一項に記載の方法によって得られる二酸化チタン骨格。
【請求項１４】
請求項12又は13に記載の二酸化チタン骨格を含む医療用インプラント。
【請求項１５】
医療用インプラントとして使用するための、請求項12又は13に記載の二酸化チタン骨格を含む組成物。
【請求項１６】
組織の再生、修復、置換及び/若しくは復元に使用するための、請求項12又は13に記載の二酸化チタン骨格を含む組成物。
【国際調査報告】
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