(57)【要約】【課題】ＤＮＡ結合のためのプラズマ処理に関する。【解決手段】  本発明は、プラズマ処理表面に結合したＤＮＡを含む組成物を提供し、プラズマは、アルゴンプラズマ、圧縮空気プラズマ、火炎性プラズマまたは真空プラズマなど、任意の適当なプラズマであることができる。本発明の方法によって処理できる表面には、セラミック、金属、織物および有機ポリマー表面がある。ＤＮＡは、マーカーＤＮＡなど任意のＤＮＡであることができ、そのＤＮＡは、線状または環状、一本鎖または二本鎖、長さ約２５塩基〜約１０，０００塩基であることができる。プラズマ処理表面を生成するためにプラズマに表面を曝露する工程と、処理表面に表面結合ＤＮＡを生成するためにプラズマ処理表面にＤＮＡを適用する工程とを含む、表面にＤＮＡを結合させる方法も提供される。表面にＤＮＡを結合させるためのシステムも開示され、そのシステムは、プラズマ処理表面を生成するためにプラズマで表面を処理するのに適合されたプラズマ発生装置と；プラズマ処理表面に表面結合ＤＮＡを生成するためにプラズマ処理表面にＤＮＡを適用するのに適合されたＤＮＡを含有するアプリケーターを含む。【選択図】図１０Ａ
2015519882.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラズマ処理表面に結合したＤＮＡを含む組成物。
【請求項２】
プラズマ処理が、アルゴンプラズマ、圧縮空気プラズマ、火炎性プラズマおよび真空プラズマから選択されるプラズマでの処理を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
表面がセラミック、半導体、金属、織物または有機ポリマーの表面である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ＤＮＡが、約２０〜約１０，０００塩基から本質的になる、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ＤＮＡが、約５０〜約５，０００塩基から本質的になる、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ＤＮＡが、約７５〜約５００塩基から本質的になる、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
プラズマ処理表面に結合したＤＮＡが洗浄に強い、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
プラズマ処理表面を生成するために、プラズマに表面を曝露する工程と、
処理表面に表面結合ＤＮＡを生成するために、プラズマ処理表面にＤＮＡを適用する工程と、
を含む、表面にＤＮＡを結合させる方法。
【請求項９】
さらに、
プラズマ処理表面からＤＮＡサンプルを抽出する工程と、増幅したＤＮＡサンプルを生成するために、抽出したＤＮＡサンプルを増幅させる工程とを含み、
ここで、増幅したＤＮＡサンプルが、プラズマ処理表面に適用されたＤＮＡとして識別される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抽出したＤＮＡサンプルが、ＰＣＲを使用して増幅される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
増幅したＤＮＡサンプルが、キャピラリー電気泳動に供される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
プラズマ処理表面が、不純物および夾雑物を取り除かれている、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
プラズマ処理表面が、プラズマ処理によって表面に作られた反応性官能基を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
処理表面に適用されるＤＮＡの濃度が、１リットルにつき少なくとも約１フェムトグラム（約１０−１５ｇ／Ｌ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
プラズマ処理表面を生成するために、プラズマで表面を処理するのに適合されたプラズマ発生装置と、
プラズマ処理表面に表面結合ＤＮＡを生成するために、プラズマ処理表面にＤＮＡを適用するのに適合されたＤＮＡを含有するアプリケーターと、
を含む、表面にＤＮＡを結合させるためのシステム。
【請求項１６】
プラズマ処理が、アルゴンプラズマまたは圧縮空気プラズマでの処理を含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
表面が、セラミック、半導体、金属、織物または有機ポリマーの表面である、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
ＤＮＡが、約２５〜約１０，０００塩基から本質的になる、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１９】
ＤＮＡが、約５０〜約５，０００塩基から本質的になる、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
ＤＮＡが、約７５〜約５００塩基から本質的になる、請求項１９に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]関連出願
[0002]  本出願は、２０１２年４月９日に出願の米国特許仮出願第６１／６２１，７３９号および２０１３年３月１５日に出願の米国特許出願第１３／８３６，２３８号の利益を主張し、その全開示をその全体において参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
[0003]技術分野
[0004]  本発明は、プラズマ処理、プラズマ処理表面にＤＮＡを結合させる方法、処理表面に結合したＤＮＡによって形成されるＤＮＡ付加物および化合物、ならびに処理表面にＤＮＡを結合させるためのシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
[0005]関連技術の説明
[0006]  しばしば物質の第四状態と呼ばれるプラズマは、一部の粒子がイオン化しているガス様の状態である。特に、プラズマは、正電荷および負電荷の粒子の電気的に中性な媒体であり、プラズマ全体としての電荷はおよそ０である。プラズマ粒子は結合していないが、プラズマ粒子の並進運動が電流と磁場を発生するので、これらの粒子は完全に自由なわけではなく、互いに影響を及ぼし合う。この電気伝導性のため、プラズマは、固体、液体およびガスなど、物質の他の低エネルギー状態とは別である。プラズマは、明確なフォームまたは体積を持たないという点で気相と密接に関係するが、非マクスウェル速度分布をしばしば有することによって、および粒子相互作用の性質において異なる。質量と体積の両方に関して、プラズマは、宇宙において圧倒的に多い一般的な物質の相である。全ての星はプラズマでできており、惑星間空間でさえプラズマで満たされている。
【０００４】
[0007]  プラズマの一例は、太陽から連続的に流れ出るイオン流の、太陽風である。地球の磁場はこれらの粒子を閉じ込め、その多くは、地球の方向に加速される極に向かって進む。これらのイオンと大気原子および分子との衝突は、北極および南極上にそれぞれ発生する北極光および南極光のフォームでエネルギー放出を引き起こし、無線受信における不規則な干渉の発生源になる。
【０００５】
[0008]  プラズマの電離度は、電子を失ったまたは獲得した原子の割合であり、主に温度によって決まる。わずか１％の粒子がイオン化している、部分的にイオン化したガスでさえ、プラズマとしてふるまうことができる。プラズマ温度は、粒子当たりの平均熱動力学エネルギーの尺度である。プラズマの電離度は、イオン化エネルギーに比例する電子温度によって決定される。多くの場合、プラズマ内の電子は、マクスウェルエネルギー分布から著しく乖離しているときでさえ、電子温度が比較的明確に定義されている熱平衡と大体同じである。電子とイオンおよび中性原子の間の質量差が大きいため、電子は、イオンまたは中性原子と平衡になるよりかなり速くそれ自身の間で熱力学的平衡になる。この理由から、イオン温度は、電子温度と大きく異なることもあり、通常はより低い。
【０００６】
[0009]  電子、イオンおよび中性原子(neutrals)の相対温度に基づいて、プラズマは「熱的」か「非熱的」かに分類される。熱プラズマは熱平衡であり、そのため電子と重粒子は同じ温度を有する。一方、非熱的プラズマにおいて、イオンおよび粒子の温度は、電子よりかなり低い。非熱的で非平衡なプラズマは通常、熱プラズマほどイオン化されておらず、より低いエネルギー密度を有する、したがって、その温度は粒子の間で均一に分散されない。時には、プラズマは、ほぼ完全にイオン化されている場合は「ホット」であると、またほんのわずかのガス分子だけがイオン化されている場合は「コールド」であると称される。しかし、「コールド」プラズマでさえ、通常、電子温度は、なお数千ケルビンもある。
【０００７】
[0010]  プラズマは、例えば火炎中でガスを加熱してその分子もしくは原子をイオン化し、それによって火炎性プラズマを発生させることによって、または強力な電磁場を適用することによって、例えばレーザもしくはマイクロ波発生器を使用することによって生成することができる。しかし、プラズマを生成する全ての方法は、それを生成し、持続するためにエネルギーの投入を必要とする。例えば、放電管内の誘電ガスまたは液体の間に電流が印加されるとき、プラズマを発生させることができる。電位差および二次的な電界は、結合している、負電荷の、電子を陽極の方へ引っ張り、一方で陰極は原子核を引っ張る。電圧を増加させるにつれて、電流は、誘電限度を越えて絶縁破壊の段階にまで物質を電気的に分極させ、イオン化が増加するにつれてその物質は絶縁体から導体に変換する。電子と中性ガス原子との衝突によりイオンおよび電子がさらに作られ、短い平均自由行路のため、約２０回の連続的な衝突セットの後に荷電粒子の数は急速に増加する。
【０００８】
[0011]  プラズマは、産業的製造においてコンピュータチップおよび他の電子部品など傷つきやすい製品をクリーニングするのに有用である。プラズマクリーニングには、エネルギー性プラズマの適用による表面からの不純物および夾雑物(contaminant)の除去が含まれる。これらの処理システムは、電界を使用して表面に反応性ガスを導く。水、吸収ガスおよびポリマーフラグメントなどの低分子量物質が落とされ、清浄で、汚れていない表面が露出する。同時に、プラズマ中の一定の割合の反応性成分は、新たに露出した表面に結合して、表面の化学的性質を変化させ、望ましい官能性を付与する。アルゴンおよび酸素などのガス、ならびに空気と水素／窒素などの混合物を使用することができる。高周波電圧（通常はｋＨｚ〜ＭＨｚ）を使用して、低圧（例えば大気圧の１，０００分の１以下、すなわち真空）でガスをイオン化することによってプラズマを生成することができ、または別法として、大気圧でプラズマを生成することもできる。プラズマは、原子、分子、イオン、電子、フリーラジカル、および短波紫外線（略して真空UVまたはVUV）域の光子を含む。この混合物は、室温であることができ、その後プラズマ中に置かれた任意の表面と相互作用する。
【０００９】
[0012]  使用されるガスが酸素である場合、プラズマは、重要な(critical)クリーニングに有効で、経済的で、環境的に安全な方法である。ＶＵＶエネルギーは、表面夾雑物のほとんどの有機結合を切断して、高分子量夾雑物を破壊することができる。第２のクリーニング作用は、プラズマ中に生成した高反応性酸素種（Ｏ２＋、Ｏ２−、Ｏ３、Ｏ、Ｏ＋、Ｏ−、イオン化オゾン、準安定性励起酸素、および自由電子）を使用して実施することができる。これらの種は、有機夾雑物と反応して、Ｈ２Ｏ、ＣＯ、ＣＯ２、および比較的高い蒸気圧を有し、処理中に低圧力室から容易に排出される低分子量炭化水素を形成する。得られた表面は、超清浄である。
【００１０】
[0013]  処理しようとする表面が、銀または銅など酸化されやすい材料からなる場合、アルゴンまたはヘリウムなどの不活性ガスを代わりに使用して、処理された表面でのこれらの反応を防ぐことができる。処理した原子およびイオンが分子砂吹きのようにふるまい、有機夾雑物を取り除くことができる。これらの夾雑物は、再び気化され、低圧力室に排出できる。
【００１１】
[0014]  プラズマには、工業的および生産的冶金、マイクロエレクトロニクスにおける溶射およびエッチングなどの表面処理、金属切断および溶接、ならびに日常的な車両排出ガス浄化および蛍光／発光ランプを含むがこれに限定されない多くの工業用途があり、一方でさらに航空宇宙工学用の超音速燃焼エンジンにおける役割もある。本発明は、ＤＮＡ結合のための表面の調製に対するこれらプラズマ特性の使用に関する。
【００１２】
[0015]  ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）は、リン酸ジエステル結合によって鎖に連結したヌクレオチドで構成される、構造不定の(unstructured)一本鎖としてまたは二重らせんとして存在することができる。ＤＮＡを構成するヌクレオチドは、ペントース糖リン酸エステル鎖または主鎖にコンジュゲートした、窒素を含有する「塩基」で構成される。ＤＮＡには４つの天然に存在する塩基があり、２つはプリン：通常それぞれＡおよびＧと表されるアデニンおよびグアニンであり、２つはピリミジン：通常ＴおよびＣと表されるチミンおよびシトシンである。Ａ：Ｔ塩基対の間で形成される２つの水素結合により、ヌクレオチド鎖のアデニン塩基は、チミン塩基との対合に対する天然の親和性を有し、グアニン塩基は、その間で形成される３つの水素結合によって、シトシンとより強く対合する。ＤＮＡ鎖中の各ペントース糖は、ペントース環の５’および３’位でリン酸基によりＤＮＡ中で２つの隣接するヌクレオチドに結合し、糖−リン酸主鎖を形成する２’−デオキシリボースである。各デオキシリボース糖はまた、ポリヌクレオチド鎖の糖−リン酸主鎖のリボースの１’位で含窒素塩基に共有結合している。
【００１３】
[0016]  塩基の組合せは、個々の鎖において任意の順序または配列で配置できるが、二本鎖ＤＮＡの２本の鎖の塩基配列は同一ではなく、むしろ相補的である。鎖は逆平行であり、２本の鎖が５’から３’の方向に平行に続くが、２本の鎖は反対の方向であることを意味する。また、一方の鎖の各塩基は、他方の鎖の相補的塩基に水素結合し、アデニンはチミンと対合し、グアニンはシトシンと対合する。各オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド鎖は、遊離の５’末端リン酸基および遊離の３’末端ヒドロキシル基を有する。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのこれら遊離の５’および３’末端基は、基質または対象のプラズマ活性化表面の官能基など、化学的に反応性の高い官能基との反応に利用可能である。
【００１４】
[0017]  現存する生物のゲノムに見出されるＤＮＡは、その生物の生物学的情報をコードしており、特定の動物、植物、菌類または細菌の青写真と考えることができる。動植物の多様性は、膨大なコード能力およびＤＮＡ分子にコードされている情報の安定性の証拠である。
【００１５】
[0018]  ＤＮＡの巨大な情報コード能力および情報配列の保存により、これらの分子は、例えば結合できる対象に対する固有マーカーまたは「タガント」としてなど他の目的に有用になる。これは、例えば品質保証および品質管理（QAおよびQC）などの識別目的、または容易に複製できない重要な品目の認証または確認用にすることができ、したがって本物の品目より低品質であり、本物の市場を侵す可能性がある偽物を防ぐことができる。
【００１６】
[0019]  様々な物理的な方法により、増幅後に微量のＤＮＡを検出することができる。原理的には、当技術分野で周知の技術によるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で単一のＤＮＡ鎖を連続的に複製して、定量し、必要に応じて確認目的のＤＮＡ配列決定に供することができる、検出可能な量の二本鎖コピーを生成することができる。例えば、Ｄ’Ｈａｅｎｅ  Ｂ．、ら  Ａｃｃｕｒａｔｅ  ａｎｄ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１０、５０巻（4号）：２６２〜７０頁；Ｋｕｂｉｓｔａ  Ｍ、ら  Ｔｈｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  Ｍｅｄ．（2006）２７巻（2〜3号）：９５〜１２５頁；Ｒｉｇｈｅｔｔｉａ，Ｐ．Ｇ．およびＧｅｌｆｉｂ，Ｃ．  Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙ（Ｎ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅｓ）  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（1997）２４４巻（2号）：１９５〜２０７頁を参照のこと。
【発明の概要】
【００１７】
[0020]  発明の概要
[0021]  本発明は、ＤＮＡがプラズマ処理表面に結合した組成物を提供する。本発明は、表面にＤＮＡを結合させる方法をさらに提供し、本方法は、プラズマ処理表面を生成するためにプラズマに表面を曝露する工程と、プラズマ処理表面に表面結合ＤＮＡを生成するためにプラズマ処理表面にＤＮＡを適用する工程とを含む。
【００１８】
[0022]  本発明は、表面にＤＮＡを結合させるためのシステムも提供し、そのシステムは、プラズマ処理表面を生成するためにプラズマで表面を処理するのに適合されたプラズマ発生装置と；プラズマ処理表面に表面結合ＤＮＡを生成するためにプラズマ処理表面にＤＮＡを適用するのに適合されたＤＮＡを含有するアプリケーターを含む。
【００１９】
[0023]  加えて、本発明は、表面にアルカリ処理したＤＮＡを結合させる方法をさらに提供し、本方法は、プラズマ処理表面を生成するためにプラズマに表面を曝露する工程と；プラズマ処理表面に表面結合ＤＮＡを生成するためにプラズマ処理表面にアルカリ処理したＤＮＡを適用する工程とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】[0025]本発明の一実施形態による、対象の表面にＤＮＡを結合させる方法のフローチャートである。
【図２】[0026]図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、それぞれ、マーカーＤＮＡを適用する前にプラズマ処理した、羊毛糸、毛織物および綿織物由来サンプルで得られた、ＤＮＡの検出結果を示す図である。
【図３】[0027]図３Ａは、プラズマ処理した紡ぎ糸に結合したＤＮＡを洗浄した後の紡ぎ糸由来サンプルで得られた、ＤＮＡの検出結果を示す図である。図３Ｂおよび３Ｃは、プラズマ処理していない表面に結合したＤＮＡを洗浄する前および洗浄した後に、織物見本から抽出したＤＮＡで得られた、ＤＮＡの検出結果を示す図である。
【図４】[0028]図４Ａは、マイクロチップのプラズマ処理表面にＤＮＡを適用した後のマイクロチップからのＤＮＡ検出の典型的な結果を示す図である。図４Ｂおよび４Ｃは、洗浄前および洗浄後の金属マイクロチップから抽出したＤＮＡで得られた、ＤＮＡの検出結果を示す図である。ＤＮＡは、マイクロチップの表面をプラズマ処理した後に適用した。
【図５】[0029]図５Ａおよび５Ｂは、プラズマ処理表面に結合したＤＮＡを洗浄する前および洗浄した後のガラスマイクロチップから抽出したＤＮＡでのＤＮＡの検出結果を示す図である。
【図６Ａ−Ｅ】[0030]プラズマ処理したホイルでのキャピラリー電気泳動の結果を示す図である。図６Ａ：プラズマ処理したホイルにＤＮＡを結合させた後のアルミホイルクリッピング。図６Ｂ：流水で洗浄した後のクリッピング。図６Ｃ：１回目の連続洗浄の洗浄水５０ｍＬのうちのサンプル１μＬ。図６Ｄ：２回目の連続洗浄からのサンプル１μＬ。図６Ｅ：３回目の連続洗浄からのサンプル１μＬ。
【図６Ｆ−Ｉ】プラズマ処理したホイルでのキャピラリー電気泳動の結果を示す図である。図６Ｆ：４回目の連続洗浄からのサンプル１μＬ。図６Ｇ：５回目の連続洗浄からのサンプル１μＬ。図６Ｈ：６回目の連続洗浄からのサンプル１μＬ。図６Ｉ：６回目の連続洗浄後のクリッピング。
【図７Ａ−Ｅ】[0031]プラズマ処理していないアルミホイルで得られたキャピラリー電気泳動の結果を示す図である。図７Ａ：プラズマ処理無しのホイルにＤＮＡを結合させた後のアルミホイルクリッピング。図７Ｂ：流水で洗浄した後のクリッピング。図７Ｃ：１回目の連続洗浄からのサンプル１μＬ。図７Ｄ：２回目の連続洗浄からのサンプル１μＬ。図７Ｅ：３回目の連続洗浄からのサンプル１μＬ。
【図７Ｆ−Ｉ】プラズマ処理していないアルミホイルで得られたキャピラリー電気泳動の結果を示す図である。図７Ｆ：４回目の連続洗浄からのサンプル１μＬ。図７Ｇ：５回目の連続洗浄からのサンプル１μＬ。図７Ｈ：６回目の連続洗浄からのサンプル１μＬ。図７Ｉ：６回目の連続洗浄後のクリッピング。
【図８Ａ】[0032]上のスポットはマーカーＤＮＡと発蛍光団（F）で、または下のスポットは発蛍光団を持たないマーカーＤＮＡ（nf）で、標識したマイクロチップを示す画像である。点線でスポットに輪郭を描く。
【図８Ｂ−Ｃ】図８Ｂ：マイクロチップのプラスチック／セラミック部分のＤＮＡスポットのエタノール綿棒採取サンプルの増幅から得られるキャピラリー電気泳動の結果を示す図である。図８Ｃ：マイクロチップの金属部分のＤＮＡスポットのエタノール綿棒採取サンプルの増幅から得られるキャピラリー電気泳動の結果を示す図である。
【図９】[0033]図９Ａおよび９Ｂ：プラズマ処理したマイクロチップ表面に適用したマーカーＤＮＡスポットを拭った後のラテックス手袋の指先からのエタノール綿棒採取サンプルの増幅から得られるキャピラリー電気泳動の結果を示す図である。
【図１０Ａ】[0034]使い捨てベンチパッド（bench pad）上の、部分的に露出させた金属ワイヤとワイヤの一部から除去したテフロン（登録商標）外装を示す図である。
【図１０Ｂ−Ｄ】図１０Ｂ：プラズマ前処理した、アルカリ活性化したＤＮＡで処理された、露出されたワイヤのサンプルの増幅から得られたキャピラリー電気泳動の結果を示す図である。図１０Ｃ：プラズマ前処理無しで、アルカリ活性化したＤＮＡで処理された、露出されたワイヤのサンプルの増幅から得られたキャピラリー電気泳動の結果を示す図である。図１０Ｄ：プラズマ前処理無しで、マーカーＤＮＡで処理された、露出されたワイヤのサンプルの増幅から得られたキャピラリー電気泳動の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
[0035]詳細な説明
[0036]  定義：
[0037]  本明細書で使用される用語「基質に結合している」および「固定化している」は、ＤＮＡ結合および固定化に適用する場合、相互に交換可能である。
【００２２】
[0038]  本明細書で使用される用語「タガント(taggant)」とは、ＤＮＡマーカーのことを示し、任意選択によりＤＮＡマーカーは、第２のマーカー物質との組合せで存在することができる。マーカーＤＮＡ、および存在する場合には追加の１つ以上のマーカーは、対象に固定されて、例えば製造原料など対象の特性を示す。タガントで印をつけられる対象は、保管中か輸送中かにかかわらず、電子デバイス、衣類、紙、繊維もしくは織物の品目、またはその他の商業品目、または現金もしくは貴重品など、任意の固体の追跡可能な品目であることができる。別法として、タガントで印をつけられる商業品目は、例えばインク、色素、またはスプレーなど液体であることもできる。別の変形例において、商業品目は、紙、金属、木、プラスチックまたは粉末など必需品であることができる。タガントは、例えば、その会社もしくは品目の型に特有であることができ（例えば型番）、品目の特定のロットもしくはバッチに特有であることができ（ロット番号）、または例えば、品目に固有の製造番号としてなど実際の品目に特有であることができる。加えて、タガントは、１つ以上の任意の様々な他の有用な品目のデータを示すことができ；例えば、タガントは、タグ付けされた製品もしくは品目を製造した企業の名称および連絡先、製造日、製品もしくは品目の卸売業者および／または予定している小売業者を示すデータをコードすることができる。タガントは、例えば、それだけには限らないが、品目に組み込まれた成分の原料など、成分データまたは製品もしくは品目の製造に使用された生産設備もしくは機械の識別；製品もしくは品目を流通に出荷した日、卸売業者による受け入れ日および／または小売業者に配達された日およびその他の有用な商用データ、または例えば特別注文品目の所有者の個人情報など他のデータを示すこともできる。データまたは徴候の各要素は、タガントに暗号化または符号化することができ、対象から回収されたタガントから判読し、本明細書に記載される方法によって復号化または解読することができる。次いで復号化もしくは解読されたデータを使用して、対象の特性を確認する、または対象を認証する、または偽の品目を排除することができる。
【００２３】
[0039]  用語「ＰＣＲ」とは、ポリメラーゼ連鎖反応のことを指す。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは最初に好熱性細菌（サーマス・アクアチクス）から単離された耐熱性Ｔａｑポリメラーゼなど耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、鋳型核酸配列に接する特定の配列に相補的な一対の短いプライマーオリゴヌクレオチドを含む、融解、再アニーリングおよび重合サイクルによる温度サイクルによって鋳型核酸配列のコピー数を拡大するのに有用な増幅技術である。ＰＣＲには、ＤＮＡ鎖を複製して元のＤＮＡ鎖の１００万倍以上のコピーを得る標準的なＰＣＲ法（例えば、ランダムプライマーを使用するPCR:例えばPCR with Arbitrary Primers: Approach with Care. W.C. Black IV, Ins. Mol. Biol. 2: 1-6, Dec. 2007を参照のこと）；ＰＣＲ産物の量を各サイクルで観察できるリアルタイムＰＣＲ技術（リアルタイム定量的PCR:C.A. Heid, J. Stevens, K.J. Livak and P.M. Williams, 1996 Genome Research 6: 986-994）；最初にＲＮＡをＤＮＡ鎖に複製し、その後に標準的なＰＣＲ反応によってＤＮＡ鎖を増幅する逆転写ＰＣＲ（例えば:定量的RT-PCR:Pitfalls and Potential: W.F. Freeman, S.J. Walker and K.E. Vrana; BioTechniques 26:112-125, January 1999を参照のこと）があるが、これに限定されない。
【００２４】
[0040]  本明細書で使用される用語「モノマー」とは、１つ以上の他のそのような実体に共有連結して、オリゴマーまたはポリマーを形成することができる任意の化学的実体のことを指す。「モノマー」の例には、ヌクレオチド、アミノ酸、サッカリド、アミノ酸などがある。
【００２５】
[0041]  用語「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり得るヌクレオチドで構成されるポリマーを意味する。これらの化合物は、天然のまたは合成的に作製されるデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドであることができる。合成的に作製される核酸は、天然に存在する配列または非天然の固有の配列であることができる。
【００２６】
[0042]  用語「リボ核酸」および「ＲＮＡ」とは、リボヌクレオチドで構成されるポリマーのことを示す。用語「デオキシリボ核酸」および「ＤＮＡ」とは、デオキシリボヌクレオチドで構成されるポリマーのことを示す。
【００２７】
[0043]  用語「ヌクレオチド」とは、窒素含有塩基に共有結合した糖リン酸、通常はリボース−５’−リン酸または２’−デオキシリボース−５’−リン酸を含むモノマー単位を意味し、デオキシリボヌクレオチドの場合、通常はアデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）またはチミン（T）、リボヌクレオチドの場合、通常はアデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）またはウラシル（U）を意味する。
【００２８】
[0044]  この明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオチドモノマーから共有結合的に構成され(composed of covalently)、長さ２〜約２０ヌクレオチドの鎖を形成している一本鎖または二本鎖ポリマーのことを指す。
【００２９】
[0045]  この明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドモノマーから共有結合的に構成され、一般に長さ約２０ヌクレオチドを超える鎖を形成している一本鎖または二本鎖ポリマーのことを指す。
【００３０】
[0046]  天然に存在する配列を有する核酸は、配列特異的な様式で核酸とハイブリダイズすることができる。すなわち、それら核酸は、相補的塩基対Ａ：Ｔ（アデニン：チミン）およびＧ：Ｃ（グアニン：シトシン）が分子間（または分子内）水素結合およびπ電子を介して各鎖に平面隣接塩基の協力的スタッキング相互作用を形成するハイブリダイゼーション反応に関与することができ、共にワトソン−クリック塩基対合相互作用として公知である。核酸鎖の塩基は、Ｇ（グアニン）がＵ（ウラシル）と対になる、または別法として、Ｉ（イノシン）がＣ（シトシン）、Ｕ（ウラシル）もしくはＡ（アデニン）と対になるいわゆる「ゆらぎ」相互作用でハイブリダイズして、正常なワトソン−クリック塩基対合相互作用より低い結合エネルギーを持つ非ワトソン−クリック塩基対を形成することもできる。
【００３１】
[0047]  用語「識別可能な配列」または「検出可能な配列」とは、識別しようとする標的ヌクレオチド配列との特異的な相互作用のために設計されたプライマーもしくはプローブによるハイブリダイゼーションおよび／またはＰＣＲ技術によって検出できるヌクレオチド配列のことを意味する。標的ヌクレオチド配列と特異的プローブもしくはプライマーとの相互作用を光学的および／または目視の手段で検出して、標的ヌクレオチド配列の存在を決定することができる。
【００３２】
[0048]  一実施形態において、本発明は、プラズマ処理した様々な基質にＤＮＡおよび発蛍光団を結合できる方法を提供する。この方法によって、ＤＮＡは材料に結合され、洗浄およびクリーニングなど全ての種類の仕上げプロセスに耐え、さらに安全に取り出して製品を認証することができる。認証は、いくつかの方法によって見出すことができる。紫外線光が発蛍光団の存在を検出できる場合、１つの方法は、製品に発蛍光団を添加して、迅速に識別できるようにする工程を含む。別の認証方法は、化学的リンカーを介して基質にＤＮＡを結合させる工程を含む。リンカーは、末端に反応性官能基を持つ炭素原子の鎖をしばしば含む。この反応性官能基を活性化して、利用可能な基に、または印をつけようとする基質もしくは製品に共有結合させることができる。製品に付着しているこのＤＮＡは特定の製品に固有であり、そのため指紋の役目を果たして認証を可能にする。これら方法の組合せにより絶対確実な識別方法を作れるはずであり、製品の蛍光が第１のレベルの保護となり、ＤＮＡが複写できない第２の固有かつ明確な層になるはずである。
【００３３】
[0049]  別の実施形態において、本発明は、偽造者になろうとする者によって本質的に複製できず、様々な化学的および布地処理に耐性がある植物ＤＮＡマーカーである、ＳｉｇＮａｔｕｒｅ（商標）ＤＮＡ（Applied DNA Sciences, Stony Brook, NY）を提供する。確実に付着させるために、ＳｉｇＮａｔｕｒｅ（商標）ＤＮＡは、天然および合成繊維の両方、ならびに羊毛、綿、例えば、ナイロンおよびポリエチレンテレフタレート（PET）などのポリエステルなど、他の非晶質材料にしっかりと結合するように考案された。これらの織物は、製造プロセス中にＳｉｇＮａｔｕｒｅ（商標）ＤＮＡで印をつけて、布地製品に印をつける何らかの追加工程の必要性を回避することができる。概念の証明として、様々な紡毛糸および織物を標準的な手順で仕上げ、ＳｉｇＮａｔｕｒｅ（商標）ＤＮＡの残存性を、下の実施例に記載の通り販売時点で検査した。試験した全ての布地において、ＳｉｇＮａｔｕｒｅ（商標）ＤＮＡが回収され、製品を法医学的に認証した(forensically authenticated)。したがって、ＳｉｇＮａｔｕｒｅ（商標）ＤＮＡで布地製品に印をつけることにより、ＤＮＡレベルで布地製品に印をつけ、商標をつけ、法医学的に認証するための経済的で、信頼性が高く、安全な方法を提供することができる。
【００３４】
[0050]  本発明は、活性化デオキシリボ核酸（単数）または活性化デオキシリボ核酸（複数）をプラズマ処理した基質に結合させる方法も提供する。本方法は、アルカリ性条件にデオキシリボ核酸（DNA）を曝露させる工程と、アルカリ処理したＤＮＡをプラズマ処理した基質と接触させる工程とを含む。次いで、プラズマ処理した基質に結合したアルカリ処理ＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブによる結合に利用可能であり、ＰＣＲ技術によって増幅することができ、そのヌクレオチド配列は、鋳型として結合したＤＮＡを用いるプライマー伸長法によって決まるＤＮＡ配列決定法によって決定することができる。この方法のさらなる実施形態は、２０１３年３月７日に出願の米国特許出願第１３／７８９，０９３号に開示されており、その全開示をその全体において参照により本明細書に組み込む。
【００３５】
[0051]  一実施形態において、デオキシリボ核酸を高ｐＨのアルカリ性溶液と混合することによりアルカリ性条件を生成し、例えばアルカリ性溶液のｐＨは、約９．０以上のｐＨ；約１０．０以上のｐＨ；約１１．０以上のｐＨ、またはさらに約１２．０以上のｐＨであることができ、アルカリ性条件に曝露させたデオキシリボ核酸を基質と接触させる。一実施形態において、アルカリ性溶液は、アルカリ金属の水酸化物の溶液である。
【００３６】
[0052]  本発明の別の実施形態は、プラズマ処理した基質にデオキシリボ核酸を結合させる方法を提供し、その方法は、アルカリ性条件にデオキシリボ核酸を曝露させる工程であって、アルカリ性条件が、デオキシリボ核酸をアルカリ性溶液と混合することによって生成される工程と、アルカリ性条件に曝露させたデオキシリボ核酸を基質と接触させる工程とを含み；アルカリ性溶液は、アルカリ金属の水酸化物の溶液であり、アルカリ金属は、リチウム（Li）、ナトリウム（Na）、ルビジウム（Rb）およびセシウム（Cs）からなる群から選択される。
【００３７】
[0053]  別の実施形態において、本発明は、プラズマ処理した基質にデオキシリボ核酸を結合させる方法を提供し、その方法は、アルカリ性条件にデオキシリボ核酸を曝露させる工程であって、アルカリ性条件が、デオキシリボ核酸をアルカリ性溶液と混合することによって生成される工程と、アルカリ性条件に曝露させたデオキシリボ核酸を基質と接触させる工程とを含み；アルカリ性溶液は、アルカリ金属水酸化物の溶液であり、アルカリ金属水酸化物は、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）および水酸化セシウム（ＣｓＯＨ）からなる群から選択される。一実施形態において、アルカリ金属水酸化物は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）である。
【００３８】
[0054]  本発明の別の実施形態は、プラズマ処理した基質にデオキシリボ核酸を結合させる方法を提供し、その方法は、アルカリ性条件にデオキシリボ核酸を曝露させる工程と、アルカリ性条件に曝露させたデオキシリボ核酸をプラズマ処理した基質と接触させる工程とを含み；アルカリ性条件は、デオキシリボ核酸をアルカリ金属水酸化物の溶液と混合することによって生成され、アルカリ金属水酸化物溶液は、約１ｍＭ〜約１．０Ｍの濃度を有する。
【００３９】
[0055]  本発明の別の実施形態は、プラズマ処理した基質にデオキシリボ核酸を結合させる方法を提供し、その方法は、アルカリ性条件にデオキシリボ核酸を曝露させる工程と、アルカリ性条件に曝露させたデオキシリボ核酸をプラズマ処理した基質と接触させる工程とを含み；アルカリ性条件は、デオキシリボ核酸をアルカリ金属水酸化物の溶液と混合することによって生成され、アルカリ金属水酸化物溶液は、約１０ｍＭ〜約０．９Ｍの濃度を有する。
【００４０】
[0056]  本発明の別の実施形態は、プラズマ処理した基質にデオキシリボ核酸を結合させる方法を提供し、その方法は、アルカリ性条件にデオキシリボ核酸を曝露させる工程と、アルカリ性条件に曝露させたデオキシリボ核酸をプラズマ処理した基質と接触させる工程とを含み；アルカリ性条件は、デオキシリボ核酸をアルカリ金属水酸化物の溶液と混合することによって生成され、アルカリ金属水酸化物溶液は、約０．１ｍＭ〜約０．８Ｍの濃度を有する。
【００４１】
[0057]  本発明の別の実施形態は、プラズマ処理した基質にデオキシリボ核酸を結合させる方法を提供し、その方法は、アルカリ性条件にデオキシリボ核酸を曝露させる工程と、アルカリ性条件に曝露させたデオキシリボ核酸をプラズマ処理した基質と接触させる工程とを含み；アルカリ性条件は、デオキシリボ核酸をアルカリ金属水酸化物の溶液と混合することによって生成され、アルカリ金属水酸化物溶液は、約０．６Ｍの濃度を有する。
【００４２】
[0058]  本発明の別の実施形態は、プラズマ処理した基質にデオキシリボ核酸を結合させる方法を提供し、その方法は、アルカリ性条件にデオキシリボ核酸を曝露させる工程と、アルカリ性に曝露させたデオキシリボ核酸をプラズマ処理した基質と接触させる工程とを含み、ここで、デオキシリボ核酸は、約９．０〜約１４．０のｐＨを有するアルカリ性溶液と混合され、約０℃〜約６５℃の温度でインキュベートされて、アルカリ性条件を生成する。
【００４３】
[0059]  本発明の別の実施形態は、プラズマ処理した基質にデオキシリボ核酸を結合させる方法を提供し、その方法は、アルカリ性条件にデオキシリボ核酸を曝露させる工程と、アルカリ性に曝露させたデオキシリボ核酸をプラズマ処理した基質と接触させる工程とを含み、ここで、デオキシリボ核酸は、約９．０〜約１４．０のｐＨを有するアルカリ性溶液と混合され、約５℃〜約５５℃の温度でインキュベートされて、アルカリ性条件を生成する。
【００４４】
[0060]  本発明のさらに別の実施形態は、プラズマ処理した基質へのデオキシリボ核酸の結合を増強させる方法を提供し、その方法は、アルカリ性条件にデオキシリボ核酸を曝露させる工程と、アルカリ性に曝露させたデオキシリボ核酸をプラズマ処理した基質と接触させる工程とを含み、ここで、デオキシリボ核酸は、約９．０〜約１４．０のｐＨを有するアルカリ性溶液と混合され、約１０℃〜約４５℃の温度でインキュベートされて、アルカリ性条件を生成する。
【００４５】
[0061]  本発明の別の実施形態は、プラズマ処理した基質にデオキシリボ核酸を結合させる方法を提供し、その方法は、アルカリ性条件にデオキシリボ核酸を曝露させる工程と、アルカリ性に曝露させたデオキシリボ核酸をプラズマ処理した基質と接触させる工程とを含み、ここで、デオキシリボ核酸は、約９．０〜約１４．０のｐＨを有するアルカリ性溶液と混合され、約１５℃〜約３５℃の温度でインキュベートされて、アルカリ性条件を生成する。
【００４６】
[0062]  本発明の別の実施形態は、プラズマ処理した基質にデオキシリボ核酸を結合させる方法を提供し、その方法は、アルカリ性条件にデオキシリボ核酸を曝露させる工程と、アルカリ性条件に曝露させたデオキシリボ核酸をプラズマ処理した基質と接触させる工程とを含み；アルカリ性条件は、デオキシリボ核酸をアルカリ金属水酸化物の溶液と混合し、約０℃〜約６５℃の温度でその混合物をインキュベートすることによって生成される。
【００４７】
[0063]  本発明の別の実施形態は、プラズマ処理した基質にデオキシリボ核酸を結合させる方法を提供し、その方法は、アルカリ性条件にデオキシリボ核酸を曝露させる工程と、アルカリ性条件に曝露させたデオキシリボ核酸をプラズマ処理した基質と接触させる工程とを含み；アルカリ性条件は、デオキシリボ核酸をアルカリ金属水酸化物の溶液と混合し、約１５℃〜約２２℃の温度でその混合物をインキュベートすることによって生成される。
【００４８】
[0064]  別法として、別の実施形態において、本発明は、プラズマ処理した基質にデオキシリボ核酸を結合させる方法を提供し、デオキシリボ核酸を、任意の適切な高ｐＨ緩衝液の溶液と混合してアルカリ性条件を生成し、アルカリ性条件に曝露させたデオキシリボ核酸をプラズマ処理した基質と接触させることができる。高ｐＨ緩衝液は、ｐＫａ約９．０〜約１１．０以上の範囲の任意の適切な高ｐＨ緩衝液であることができる。一実施形態において、高ｐＨ緩衝液のｐＨは、例えば、約９．０以上のｐＨ；約１０．０以上のｐＨ；または、約１１．０以上のｐＨであることができる。例えば、別の実施形態において、有効ｐＨ範囲約１０．０〜１１．４（２５℃）、ｐＫａ約１０．７０（２５℃）のＣＡＢＳ（４−［シクロヘキシルアミノ］−１−ブタンスルホン酸）、製品番号Ｃ５５８０  Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ；有効ｐＨ範囲約９．７〜１１．１（２５℃）、ｐＫａ約１０．５６（２０℃）、ｐＫａ約１０．４０（２５℃）、ｐＫａ約１０．０２（３７℃）のＣＡＰＳ（Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ｃ６０７０およびＣ２６３２；有効ｐＨ範囲約９．０〜１０．５（２５℃）、ｐＫａ約９．７０（２５℃）のＡＭＰ（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ａ９１９９およびＡ９８７９；有効ｐＨ範囲約８．９〜１０．３（２５℃）、ｐＫａ約９．６０（２５℃）、ｐＫａ約９．４３（３７℃）のＣＡＰＳＯ（Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシル−３−アミノプロパンスルホン酸）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ｃ２２７８およびＣ８０８５；有効ｐＨ範囲約８．６０〜１０．０（２５℃）、ｐＫａ約９．５５（２０℃）、ｐＫａ約９．４９（２５℃）、ｐＫａ約９．３６（３７℃）のＣＨＥＳ（２−（Ｎシクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ｃ２８８５およびＣ８２１０；有効ｐＨ範囲約８．３〜９．７（２５℃）、ｐＫａ約９．００（２５℃）、ｐＫａ約９．１０（３７℃）のＡＭＰＳＯ（３−［（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ａ６６５９およびＡ７５８５など適切な高ｐＨ緩衝液とデオキシリボ核酸を混合して、アルカリ性条件を生成することができる。
【００４９】
[0065]  本発明の典型的な実施形態において、アルカリ性条件に曝露させたデオキシリボ核酸を、液体組成物の成分として添加する。液体組成物は、例えば、印刷用インクなど任意の適切な液体組成物であってもよい。例えば、一実施形態において、インクは、各々Ｍａｒｋｅｍ（登録商標）、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ製の、製品番号４４０８Ｒまたは９７０シリーズＴｏｕｃｈ  Ｄｒｙ（登録商標）ペレットなど熱硬化型エポキシアクリレートインクであってもよい。別法として、Ｄｕｐｏｎｔ（登録商標）製のＡｒｔｉｓｔｒｉ（登録商標）Ｐ５０００＋Ｓｅｒｉｅｓ−Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｉｎｋまたは製品番号００−９８８などＲａｈｎ  ＵＳＡ  Ｃｏｒｐ．製のＥｐｏｘｙ  Ａｃｒｙｌａｔｅ  Ｉｎｋを使用することができる。
【００５０】
[0066]  本発明の一実施形態において、タガントは核酸を含む。一実施形態において、タガントは、ＤＮＡから本質的になり、識別または認証に有用な他の重要な成分は無い。別法として、または追加で、例えば、紫外線（UV）タガント、アップコンバージョン蛍光体（UCP）赤外線（IR）タガント、紫外線マーカータガント、紫外線発蛍光団タガント、セラミック赤外線マーカータガント、タンパク質タガント、および／または微量要素タガントなどの他のタガントを、本発明の方法によるアルカリ処理によって活性化されたデオキシリボ核酸タガントと組合せて使用できる。典型的な実施形態において、使用されるタガントは、例えば、ＤＮＡタガントと赤外線アップコンバージョン蛍光体（UCP）タガントの組合せを含んでもよい。別の典型的な実施形態において、使用するタガントは、例えば、ＤＮＡタガントと赤外線アップコンバージョン蛍光体（UCP）タガントと紫外線タガントの組合せを含んでもよい。例えば、典型的な実施形態において、赤外線（UCP）タガントは、例えば、緑色、青色または赤色の（UCP）赤外線タガントであることができ、例えばＢｏｓｔｏｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ製の緑色赤外線マーカー、製品番号ＢＰＰ−１０６９；青色ＵＣＰ、製品番号ＢＰＰ−１０７０；または赤色ＵＣＰ、製品番号ＢＰＰ−１０７１などがある。
【００５１】
[0067]  本発明の方法によって可溶性タガントを溶解させる溶液としては、例えば、水、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス-ＨＣｌ、１ｍＭ  EDTA）、トリス−グリシン緩衝液、トリス−ＮａＣｌ緩衝液、ＴＢＥ緩衝液（トリス-ホウ酸-EDTA）、ＴＡＥ緩衝液（トリス-酢酸-EDTA）およびＴＢＳ緩衝液（トリス緩衝食塩水）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ緩衝液（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ緩衝液（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、ＭＥＳ緩衝液（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＰＢＰ緩衝液（リン酸ナトリウム+EDTA）、ＴＥＮ緩衝液（トリス/EDTA/ＮａＣｌ）、ＴＢＳＴ緩衝液（トリス−ＨＣｌ、ＮａＣｌおよびTween20）、ＰＢＳＴ緩衝液（Tween20を含むリン酸緩衝生理食塩水）ならびに生物学および化学において使用される公知の他の多くの緩衝液のいずれかが挙げられる。
【００５２】
[0068]  本発明の典型的な実施形態によるデオキシリボ核酸および任意の追加のタガントで印をつけられる対象物としては、例えば、セラミック表面、プラスチックフィルム、ビニールシート、骨董品、宝飾品、身分証明書、クレジットカード、磁気帯カード、絵画、美術品、記念品、スポーツ収集品および他の収集品が挙げられる。次いでこれらの対象の真偽は、例えば、以下にさらに詳述する方法で、上に結合しているまたは共有結合しているタガントを識別することによって確認できる。
【００５３】
[0069]  一実施形態において、アルカリ性条件に曝露させたデオキシリボ核酸が結合する表面は、全て商業的に容易に入手可能な、ポリカーボネート（PC）、ポリメチルメタクリレート（PMMA）、ポリウレタン（PU）、ポリスチレン（PS）、ナイロンまたはポリプロピレン（PP）からなる群から選択されるポリマーなど、ポリマー形状をなす対象または品目の表面であることができる。
【００５４】
[0070]  本発明の実施形態は、本発明を例示する非限定的な例として下に列挙されるが、本発明の範囲に対する限定と受け止められることを意図するものでないことは、当業者にとって直ちに明らかになろう。
【００５５】
[0071]  典型的な実施形態は、対象の外観を乱すことなく対象からのタガントの回収性(recoverability)を高める方法を提供する。本発明のいくつかの典型的な実施形態について、以下で詳細に説明する。
【００５６】
[0072]  本発明の典型的な実施形態は、対象上に組み込まれたタガントまたは活性化したＤＮＡタガントを結合させるために液体中に組み込まれたタガントを使用した、対象を認証する方法も提供する。
【００５７】
[0073]  例えば、本発明の典型的な実施形態は、対象からのタガントの回収性を高める方法を提供し；本方法は、対象の表面上にＤＮＡタガントを組み込む工程または対象または表面に活性化したＤＮＡタガントを結合させるためには液体中にＤＮＡタガントを組み込む工程を含む。
【００５８】
[0074]  本明細書に記載の通り、一般に本発明の典型的な実施形態は、処理表面にＤＮＡを結合させる方法、ＤＮＡ処理した表面に結合したＤＮＡによって形成される化合物および処理表面にＤＮＡを結合させるためのシステムを含む。したがって、これらの実施形態は、様々な変更および変形フォームがあり得るが、本明細書に開示される具体的な実施形態は、例のためであり、図面においては単に例示目的であり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００５９】
[0075]  前述の通り、ＤＮＡは、各一本鎖の３’末端に遊離のヒドロキシル基、５’末端に遊離のリン酸基を有するポリマーである。これらの基は、他の分子の外来性の反応基に結合することができる。理論に束縛されるものではないが、ＤＮＡで印をつけようとする対象表面のプラズマ処理により、処理表面に適用されたＤＮＡを結合する反応基が生成すると考えられる。そのような反応を使用して、識別のためにまたは法医学的認証のために対象の表面にＤＮＡで印をつけることができる。
【００６０】
[0076]  対象の表面にＤＮＡを結合させるための本発明の実施形態による方法のフローチャートを、図５に示す。次に図を参照すると、工程５１において、表面をプラズマ処理に曝露させて、プラズマ処理表面を生成している。無線周波数またはマイクロ波周波数電界を使用して、ガスを陽イオンおよび負に荷電した電子を含むプラズマ荷電粒子にイオン化することによってノズル内に大気プラズマを発生させることができる。そのようなプラズマを生成するための市販のユニットとしては、Ｔｈｉｅｒｒｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Detroit, MI）；Ｅｎｅｒｃｏｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Menomonee Falls, WI）；およびＨＢＺ  Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ  Ｚｅｎｔｒｕｍ  Ｂｅｒｌｉｎ（Berlin, Germany）を含むいくつかの生産業者から市販されている低圧プラズマシステムおよび大気プラズマシステムがある。これらの実験においては、Ｔｈｉｅｒｒｙ  Ｄｉｅｎｅｒ  Ｐｌａｓｍａ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｆｅｍｔｏ−Ｐｌａｓｍａ  Ｃｌｅａｎｅｒ、Ｅｎｅｒｃｏｎ  Ｐｌａｓｍａ３（商標）またはＥｎｅｒｃｏｎ  Ｄｙｎｅ−Ａ−Ｍｉｔｅ（商標）ＩＴ  Ｐｌａｓｍａ  Ｔｒｅａｔｅｒユニットを利用した。
【００６１】
[0077]  これらの機械は、６００ワット、１５０ＫＨｚ  ＲＦシグナルを使用して、室温、大気圧プラズマを発生することができる。圧縮ガスを使用して、約５０Ｌ／分の速度での運動量移動により荷電粒子を放出し、それによって対象の表面に衝突させる。プラズマ表面処理における表面のライン速度（line speed）は、５０フィート／分と同程度になり得る。
【００６２】
[0078]  荷電粒子の衝突は、酸化物層を除去し、金属表面をエッチングし、表面からラジカルを作ることができ、そのラジカルにより他の表面分子は分解され、副産物分子は蒸発し、それによって表面がクリーニングされる。圧力およびガスの型を制御することによって、プラズマラジカルは、対象表面上に官能基を発生させて、標的分子との分子間架橋など二次反応を誘導することもできる。例えば、いくつかの実施形態において、アルゴンプラズマを使用してクリーニングし、一方で他の実施形態において、圧縮空気プラズマを使用して官能基を作ることができる。特定の条件下で、これらの官能基は、ＤＮＡなど他の外来性の分子と安定な結合を直接形成することができる
【００６３】
[0079]  次に工程５２において、対象の処理表面にＤＮＡを適用して、ＤＮＡで印をつける。本発明によって処理できる典型的な表面としては、それだけには限らないが、糸、羊毛、綿、織物、通貨、銀および銅が挙げられる。本発明によって処理できる対象としては、それだけには限らないが、ウェーハなどの対象、ならびに露出したセラミック、プラスチックガラス、エポキシ、シリコンおよび金属、銅表面を含むマイクロチップが挙げられる。本発明によって処理できる対象の一覧には、ダイヤモンド、金、宝石、木およびガラスもある。
【００６４】
[0080]  典型的な織物は、超長繊維（ELS）とも呼ばれるピーマ綿およびギザ綿であり、極めて高い耐久性および吸収性がある優れた混紡綿の１つと考えられている。よくある新世界綿、ケブカワタ（Gossypium hirsutum）種とは異なり、ピーマ綿は、カイトウメン（Gossypium barbadense）種から得られる。
【００６５】
[0081]  本発明の実践において有用なＤＮＡは、任意の長さであることができる。一実施形態において、ＤＮＡ鎖は、長さ約２５塩基〜約１０，０００塩基である。別の実施形態において、ＤＮＡ鎖は、長さ約５０塩基〜約５，０００の塩基である。さらに別の実施形態において、ＤＮＡ鎖は、長さ約７５塩基〜約５００塩基である。別法として、他の実施形態において、ＤＮＡ鎖は、長さ約２５〜約５００ヌクレオチド、または長さ約３０〜約４００ヌクレオチド、または約４０〜約３００；またはさらに長さ約５０〜約２００ヌクレオチドであることができる。
【００６６】
[0082]  対偽造および認証に有用なＤＮＡは、Ｌｉａｎｇらの米国特許公開第２０１０／０２８５９８５号に開示されており、その開示をその全体において参照により本明細書に組み込む。Ｌｉａｎｇらは、単一のＤＮＡ鋳型を提供する工程と、鋳型に相補的な逆鋳型ＤＮＡ（rtDNA）オリゴヌクレオチドのプールを提供する工程と、コンビナトリアル変異技術を使用してｒｔＤＮＡオリゴヌクレオチドのプール中にあるプライマーを複数のより小さいサブセットへグループ化する工程と、ｒｔＤＮＡオリゴヌクレオチドのプール中の複数のより小さいサブセットのｒｔＤＮＡオリゴヌクレオチドから複数のセキュリティマーカーを生成する工程とを含み、より小さいサブセットの各々が別のセキュリティマーカーを定義している、複数のセキュリティマーカーを生成する方法を開示している。別のセキュリティマーカーの配列を有する一本鎖ＤＮＡをＤＮＡとして使用して、本発明による処理表面に適用することができる。
【００６７】
[0083]  本発明のさらなる実施形態によると、自動化できるもしくはロボット製造プロセスの一部である加圧キャニスタを使用して、または手作業による噴霧によって、処理表面にＤＮＡを適用することができる。本発明の他の実施形態において、ＤＮＡを含有する綿棒で表面を綿棒で塗る、ＤＮＡを含有する織物で拭く、ＤＮＡを含有する溶液中で洗浄する、ＤＮＡを含有する溶液に浸すことによって、または化学蒸着（CVD）プロセスなど蒸気中でＤＮＡを適用することによって、処理表面にＤＮＡを適用することができる。処理表面に対するＤＮＡの結合は、１リットルにつき１ピコグラム（１０−１２ｇ／Ｌ）またはさらに１リットルにつき１フェムトグラム（１０−１５ｇ／Ｌ）の低いＤＮＡ濃度で実現できる。処理表面に結合したＤＮＡは、洗浄に対して非常に強い(highly relieient to washing)。
【００６８】
[0084]  処理表面に結合したＤＮＡは、検出、抽出、分析および識別することができる。抽出したＤＮＡを検出する能力により、表面処理された対象は、その後の識別および認証のためにＤＮＡで印をつけることが可能になる。図１を再度参照すると、工程５３において、ＤＮＡは乾燥表面から抽出され、ＰＣＲを使用して増幅される。
【００６９】
[0085]  ＰＣＲ増幅の後に、工程５４において、ＤＮＡサンプルはキャピラリー電気泳動法を使用して分析された。１５ＫＶに設定した電圧、電流３０μＡ、温度６０℃、レーザ出力９．９ｍＷでＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを、本明細書に記載される実験に使用した。プラズマ処理表面にマーカーＤＮＡを適用するのに上記のどの方法を使用したかにかかわらず、使用したマーカーＤＮＡから増幅された期待されるサイズのアンプリコンが、試験した全てのサンプルにおいて検出された。
【００７０】
[0086]  プラズマ処理は、Ｔｈｉｅｒｒｙ  Ｐｌａｓｍａ  Ｃｈａｍｂｅｒ中で、真空設定最大７５％、周囲温度、出力１００％で、１０秒間であった。代表的な実験の結果を、図に示し、下に記載する。
【実施例】
【００７１】
[0087]  実施例１：布地に結合したマーカーＤＮＡ
[0088]  上記の方法によりプラズマ処理した羊毛糸、毛織物および綿の表面に結合したＤＮＡのＤＮＡ抽出物由来増幅産物のキャピラリー電気泳動後のＤＮＡ検出の結果をそれぞれ図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに示す。各パネルは、ＤＮＡ鎖の塩基数に対応するＤＮＡ鎖サイズに対する蛍光強度を示す。
【００７２】
[0089]  実施例２：布地に結合したマーカーＤＮＡの洗浄
[0090]  プラズマ処理後に、ＤＮＡが異なる表面にしっかりと結合しているかどうか確認するために、毛糸、毛織物、綿をプラズマで処理し、次いで様々な洗浄に供した。織物を、苛酷な(harsh)界面活性剤を用いて少なくとも１時間洗浄し、次いで７０℃の流水で少なくとも３時間すすいだ。この実施例において使用した典型的で非限定的な界面活性剤は、ＢＡＳＦ  ＳＥから入手可能なＫｉｅｒａｌｏｎ  Ｊｅｔ  Ｂであり、１２ｇ／Ｌの濃度で使用した。任意の適当な市販の界面活性剤、例えばＰｒｏｃｔｏｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅから入手可能なＴｉｄｅ（登録商標）２Ｘを使用することもできる。乾燥後に、ＤＮＡをＰＣＲ増幅し、前の通り分析した。全てのサンプルにおいて、洗浄の前後にＤＮＡが検出されたことから、プラズマ処理によりＤＮＡが様々な表面にしっかりと結合することが実証された。陰性対照として、ＤＮＡをプラズマ処理していない様々な表面に噴霧した。表面を洗浄し、ＤＮＡをＰＣＲ増幅し、分析した。水ですすいだ後には、洗浄によりＤＮＡが完全に除去されたことから、プラズマ処理が、様々な表面に対する強力なＤＮＡ結合を促進することが実証された。得られた結果を図３Ａ〜３Ｃのパネルに示す。
【００７３】
[0091]  ＤＮＡを結合させ、洗浄した後のプラズマ処理した毛糸の検出結果を図３Ａに示す。プラズマ前処理に供しなかった同様に処理した毛織物の洗浄前後のアンプリコンの検出結果をそれぞれ図３Ｂおよび３Ｃに示す。プラズマ処理した表面を単に洗浄した後に、ＤＮＡが検出される。マーカーＤＮＡを適用した表面がプラズマ処理されていない場合、洗浄はマーカーＤＮＡを除去するのに十分であり、その後のマーカーＤＮＡ検出の試みに失敗した。これらの結果は、プラズマ処理により、ＤＮＡの結合が洗浄に強くなることを実証している。
【００７４】
[0092]  実施例３：マイクロチップに結合したマーカーＤＮＡの洗浄
[0093]  プラズマ処理表面にＤＮＡを適用した後のマイクロチップ表面から抽出したＤＮＡについて得られた、ＤＮＡの検出結果を図４Ａに示す。マーカーＤＮＡを適用した、プラズマ処理および無処理両方の金属マイクロチップ表面の洗浄前後に抽出したＤＮＡのＤＮＡ検出の代表的な結果を図４Ｂおよび４Ｃに例示する。マイクロチップを、強力な流れの熱水で少なくとも１分間すすいだ。過剰な水をスポンジで拭いて乾燥させ、サンプルを６０℃のオーブン中で少なくとも１時間さらに乾燥させた。洗浄前の処理した金属マイクロチップについての検出結果を図４Ｂに示す。洗浄後の同じマイクロチップからの検出結果を図４Ｃに示す。
【００７５】
[0094]  実施例４：プラズマ処理したホイルに結合したマーカーＤＮＡの洗浄
[0095]  マーカーＤＮＡを適用したプラズマ処理したガラス表面の洗浄前後に得たサンプルにおけるＰＣＲ増幅によるマーカーＤＮＡ検出の代表的な結果を図５Ａおよび５Ｂに例示する。
【００７６】
[0096]  第１の実験におけるホイルクリッピングまたは洗浄のサンプルから得た、プラズマ処理したアルミホイルに結合したマーカーＤＮＡのＰＣＲ増幅のキャピラリー電気泳動分析の結果をパネル図６Ａ〜６Ｉに示す。
【００７７】
[0097]  脱イオンした蒸留水中の濃度２．５ｎｇ／ｍｌの二本鎖マーカーＤＮＡ  ２０マイクロリットルを、上記の通りプラズマ処理したおよそ５ｍｍｘ５ｍｍの四角形のアルミホイル表面全体に均一に塗り広げて、推定密度およそ０．５ｎｇ／ｍｍ２のマーカーＤＮＡを得た。溶液を、プラズマ処理したホイルの表面上で、真空下で２０分間乾燥させた。約０．５ｍｍ〜約１．０ｍｍの四角形の、ホイルの中央からのクリッピングを、ホイルから切り取り、マーカーＤＮＡのＰＣＲ検出に使用した。キャピラリー電気泳動の結果を図６Ａに示す。この実験において使用したマーカーＤＮＡから増幅された３３１塩基の期待されるアンプリコンが、検出された。残りのホイルを熱い流水で約１分間洗浄し、別のクリッピングサンプルを採取し、ＰＣＲに供した。図６Ｂに示すように、再び期待されるアンプリコンを検出した。１回目の洗浄からホイルクリッピングを取り出し、次いで以下の通り水での一連の洗浄に供した：各洗浄において、ホイルをプラスチックＦａｌｃｏｎチューブ中の脱イオンした蒸留水５０ｍｌに入れ、約３０秒〜約１分間ボルテックスした。次いで、洗浄水のサンプル１マイクロリットルをＰＣＲ分析に供して、マーカーＤＮＡを検出した。１回目の連続洗浄からホイルクリッピングを取り出し、乾燥させ、前のように脱イオンした蒸留水５０ｍｌの２回目の連続洗浄で洗浄した。３、４、５および６回目の連続洗浄を、１回目および２回目の洗浄の通り実行した。１回目〜６回目の洗浄に対して得られたキャピラリー電気泳動の結果を図６Ｃ〜６Ｈに示す。１回目および２回目の洗浄ではマーカーＤＮＡアンプリコンを検出したが、その後の洗浄では検出しなかった。次いで６回目の連続洗浄後のホイルクリッピングを、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲに供した。増幅産物のキャピラリー電気泳動結果を図６Ｉに示す。マーカーＤＮＡのＰＣＲ増幅由来アンプリコンが明瞭に見えることから、検出可能なマーカーＤＮＡが、熱水洗浄に続く６回の連続洗浄後にもなおホイルに結合していたことが実証される。
【００７８】
[0098]  実施例５：無処理のホイルに結合したマーカーＤＮＡの洗浄
[0099]  プラズマ処理に供していない同様の大きさの四角形のアルミホイルの表面全体に塗り広げた同じマーカーＤＮＡで、第２の実験を行った。得られた結果を図７Ａ〜７Ｉに示す。この時、増幅された３３１塩基のアンプリコンが、熱水洗浄後の６回の洗浄の各々で検出されたことから、連続洗浄において、無処理のホイルからＤＮＡが浸出し続けていることが実証された。理論に束縛されるものではないが、これらの結果は、ＤＮＡが、前の実験のプラズマ処理したホイルと比べて無処理のホイルにしっかりと結合していないことを示唆している。
【００７９】
[0100]  実施例６：マイクロチップのセラミック／プラスチック部分および金属部分に結合したマーカーＤＮＡの回収
[0101]  上のスポットでは発蛍光団と混合したマーカーＤＮＡ（F）で、または下のスポットでは発蛍光団を持たないマーカーＤＮＡ（nf）でスポットすることにより、金属部分でマイクロチップを標識した。図８Ａ。ＤＮＡスポットを、真空下で乾燥させた。
【００８０】
[0102]  マイクロチップのプラズマ処理したプラスチック／セラミック部分のＤＮＡスポットからのエタノール綿棒採取サンプルの増幅から得られたキャピラリー電気泳動の結果を図８Ｂに示す。マイクロチップの金属部分のＤＮＡスポットからのエタノール綿棒採取サンプルの増幅から得られたキャピラリー電気泳動の結果を図８Ｃに示す。
【００８１】
[0103]  ラテックス手袋の指先で乾燥ＤＮＡスポットを拭い、プラズマ処理したマイクロチップ表面のマーカーＤＮＡスポットを指先で拭った後のラテックス手袋の指先からエタノール綿棒でサンプル採取した。
【００８２】
[0104]  得られたキャピラリー電気泳動の結果を図９Ａおよび図９Ｂに示す。かろうじて検出可能なＤＮＡ増幅しか観察されなかった。マーカーＤＮＡが結合したマイクロチップのプラズマ処理表面全体にラテックス手袋を機械的に擦るまたはすり減らした後に検出されたマーカーＤＮＡに対応する３３１塩基のアンプリコンピークは、マーカーＤＮＡがマイクロチップ表面にしっかりと結合しており、そのためラテックス手袋で拭う、擦るおよびすり減らす(abrading)ことによって微量のＤＮＡしか遊離しないことを示唆している。
【００８３】
[0105]  実施例７：銅ワイヤに結合したマーカーＤＮＡの回収
[0106]  外装を除去し、マルチコア銅ワイヤの索のカバーを剥がしてワイヤの半分の長さを露出させた。Ｔｈｉｅｒｒｙ  Ｐｌａｓｍａ  Ｃｈａｍｂｅｒ中で、真空設定最大７５％で、周囲温度で、出力１００％で、１０秒間、ワイヤをプラズマ処理した。１０ｃｍｘ１０ｃｍの使い捨て計測用ベンチパッド上の、部分的に露出させた金属ワイヤとワイヤの一部から除去したテフロン（登録商標）外装を図１０Ａに示す。露出したワイヤ表面は、ベンチパッド領域のおよそ０．５％におよぶと推定された。
【００８４】
[0107]  マーカーＤＮＡを、０．６Ｍ  ＮａＯＨ溶液中で、周囲温度（約１８℃）で、３０分間アルカリ活性化し、中性ｐＨで緩衝液に希釈することにより中和した。第１の試験において、７．５ｐｇのアルカリ活性化したマーカーＤＮＡ溶液を含有する１．５ｍｌ体積を、ワイヤセグメントおよびベンチパッドに吹き付け、それによりＤＮＡ溶液を１０ｃｍｘ１０ｃｍ領域全体に実質的に均一に沈着させた。風乾後に、家庭用の界面活性剤を使用することもできるが、Ｋｉｅｒａｌｏｎ  Ｊｅｔ  Ｂ（BASF）でワイヤおよび絶縁体を洗浄した。次いで、標準的な研究室流し蛇口の最大水圧を使用して、ワイヤおよび絶縁体を熱い流水で３分間入念にすすいだ。プラズマ前処理に供し、アルカリ活性化したＤＮＡで処理された、露出されたワイヤのサンプルの増幅から得られたキャピラリー電気泳動の結果を図１０Ｂに示す。マーカーＤＮＡの増幅後に、ＰＣＲ産物に対応する３３１塩基のアンプリコンが明瞭に見える。類似の結果が、マーカーＤＮＡを吹き付けたワイヤ被覆物のサンプルの増幅でも得られた。
【００８５】
[0108]  並行実験において、ワイヤをプラズマ前処理に供しなかったことを除いて上記の通りで、アルカリ活性化したマーカーＤＮＡを銅ワイヤに吹き付けた。プラズマ前処理無しで、アルカリ活性化したＤＮＡで処理された、露出されたワイヤのサンプルの増幅から得られたキャピラリー電気泳動の結果を図１０Ｃに示す。前の通り、マーカーＤＮＡに対応するアンプリコンを検出した。
【００８６】
[0109]  第２の並行実験において、それ以外は上記の通りで、アルカリ活性化していないマーカーＤＮＡを、プラズマ前処理に供していない銅ワイヤに吹き付けた。プラズマ前処理無しで、マーカーＤＮＡで処理された、露出されたワイヤのサンプルの増幅から得られたキャピラリー電気泳動の結果を図１０Ｄに示す。この実験では、マーカーＤＮＡに対応するいかなるアンプリコンも、検出されなかった。
【００８７】
[0110]  各特許の開示および本明細書に開示される公開されている特許出願は、各々その全体を参照により本明細書に組み込む。
【００８８】
[0111]  本開示は、典型的な実施形態を参照して詳細に記載されているが、請求項に記載したような本発明の精神と範囲から逸脱することなくそれに対する様々な変更および置きかえを作製できることを当業者なら認識されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｅ】
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【図６Ｆ−Ｉ】
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【図７Ａ−Ｅ】
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【図７Ｆ−Ｉ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ−Ｃ】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ−Ｄ】
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【国際調査報告】
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