(57)【要約】本発明は、アルツハイマー病を含むβ-アミロイドーシスを予防および/または治療するための方法に用いるためのα-シヌクレインのエピトープの少なくとも１のミモトープを含む組成物であって、該少なくとも１のミモトープが非毒性ジフテリア毒素突然変異体、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ジフテリア毒素(DT)、破傷風トキソイド(TT)、およびHaemophilus influenzaeプロテインD(プロテインD)からなる群から選ばれる医薬的に許容される担体タンパク質と結合または融合している、組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病を含むβ-アミロイドーシスを予防および/または治療するための方法に用いるためのα-シヌクレインのエピトープの少なくとも１のミモトープを含む組成物であって、該少なくとも１のミモトープが、非毒性ジフテリア毒素突然変異体、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ジフテリア毒素(DT)、破傷風トキソイド(TT)、およびHaemophilus influenzaeプロテインD(プロテインD)からなる群から選ばれる医薬的に許容される担体タンパク質と結合または融合している、組成物。
【請求項２】
該非毒性ジフテリア毒素突然変異体が、CRM 197、CRM 176、CRM 228、CRM 45、CRM 9、CRM 102、CRM 103、およびCRM 107、特にCRM 197からなる群から選ばれる、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
該少なくとも１のミモトープが少なくとも１のアジュバントとともに製剤化される請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
該少なくとも１のアジュバントが先天性免疫系を刺激することができる請求項３記載の組成物。
【請求項５】
該先天性免疫系を刺激することができる少なくとも１のアジュバントが、Toll様レセプター(TLR)アゴニスト、好ましくは、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8またはTLR9アゴニスト、特に好ましくはTLR4アゴニストを含むかまたはからなる、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
該TLRアゴニストが、モノホスホリルリピドA(MPL)、3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)、ポリI:C、GLA、フラゲリン、R848、イミキモド、およびCpGからなる群から選ばれる請求項５記載の組成物。
【請求項７】
該少なくとも１のアジュバントが、サポニン、好ましくはQS21、油中水エマルジョンおよびリポソームを含むまたはからなる請求項３〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
該少なくとも１のアジュバントが、MF59、AS01、AS02、AS03、AS04、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムからなる群から選ばれる、請求項３記載の組成物。
【請求項９】
該エピトープがアミノ酸配列KNEEGAPまたはDMPVDPDNを含む請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
該少なくとも１のミモトープがアミノ酸配列：
(X1)nX2X3X4X5GX6P(X7)m        (式I)、
［式中、
X1はあらゆるアミノ酸残基である、
X2は、リジン(K)、アルギニン(R)、アラニン(A)、およびヒスチジン(H)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X3は、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、グリシン(G)、およびアラニン(A)、好ましくはアスパラギン(N)、セリン(S)、グリシン(G)、およびアラニン(A)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X4は、グルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)、およびアラニン(A)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X5は、グルタミン酸(E)およびアスパラギン酸(D)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X6は、アラニン(A)およびチロシン(Y)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X7はあらゆるアミノ酸残基である、
nおよびmは、独立して0または0以上の整数である。］
を含み、
該式Iのアミノ酸配列がアミノ酸配列KNEEGAPを有するα-シヌクレインの7マーのポリペプチド断片と同一ではないかまたは該断片を含まず、
該式Iのアミノ酸配列を含む該少なくとも１のミモトープがアミノ酸配列KNEEGAPを含むα-シヌクレインのエピトープに特異的な抗体との結合能を有する、
請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
該ミモトープが以下からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む請求項１０記載の組成物：
(X1)nKNDEGAP(X7)m、(X1)nANEEGAP(X7)m、(X1)nKAEEGAP(X7)m、(X1)nKNAEGAP(X7)m、(X1)nRNEEGAP(X7)m、(X1)nHNEEGAP(X7)m、(X1)nKNEDGAP(X7)m、(X1)nKQEEGAP(X7)m、(X1)nKSEEGAP(X7)m、(X1)nKNDDGAP(X7)m、(X1)nRNDEGAP(X7)m、(X1)nRNEDGAP(X7)m、(X1)nRQEEGAP(X7)m、(X1)nRSEEGAP(X7)m、(X1)nANDEGAP(X7)m、(X1)nANEDGAP(X7)m、(X1)nHSEEGAP(X7)m、(X1)nASEEGAP(X7)m、(X1)nHNEDGAP(X7)m、(X1)nHNDEGAP(X7)m、(X1)nRNAEGAP(X7)m、(X1)nHNAEGAP(X7)m、(X1)nKSAEGAP(X7)m、(X1)nKSDEGAP(X7)m、(X1)nKSEDGAP(X7)m、(X1)nRQDEGAP(X7)m、(X1)nRQEDGAP(X7)m、(X1)nHSAEGAP(X7)m、(X1)nRSAEGAP(X7)m、(X1)nRSDEGAP(X7)m、(X1)nRSEDGAP(X7)m、(X1)nHSDEGAP(X7)m、(X1)nHSEDGAP(X7)m、(X1)nRQDDGAP(X7)m、好ましくは(X1)nKNDEGAP(X2)m、(X1)nRNEEGAP(X2)m、(X1)nRNDEGAP(X2)m、(X1)nKNAEGAP(X2)m、(X1)nKSDEGAP(X2)m、(X1)nRNAEGAP(X2)mまたは(X1)nRSEEGAP(X2)m。
【請求項１２】
以下からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む少なくとも１のミモトープを含む請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物：
(X1)nQASFAME(X7)m、(X1)nTASWKGE(X7)m、(X1)nQASSKLD(X7)m、(X1)nTPAWKGE(X7)m、(X1)nTPSWAGE(X7)m、(X1)nTPSWKGE(X7)m
［式中、
X1はあらゆるアミノ酸残基である、
X7はあらゆるアミノ酸残基である、
nおよびmは、独立して0または0以上の整数である。］
ここで、該少なくとも１のミモトープは、アミノ酸配列KNEEGAPを含むα-シヌクレインのエピトープに特異的な抗体との結合能を有する。
【請求項１３】
該少なくとも１のミモトープが、アミノ酸配列：
(X1’)n’X2’X3’PVX4’X5’X6’(X7’)m’      (式II)
［式中、
X1’はあらゆるアミノ酸残基である、
X2’は、アスパラギン酸(D)およびグルタミン酸(E)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X3’はあらゆるアミノ酸残基である、
X4’はあらゆるアミノ酸残基である、
X5’は、プロリン(P)およびアラニン(A)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X6’は、アスパラギン酸(D)およびグルタミン酸(E)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X7’はあらゆるアミノ酸残基である、
n’およびm’は、独立して0または0以上の整数である。］
を含み、
該式IIのアミノ酸配列が、アミノ酸配列DMPVDPDNを有するα-シヌクレインの8マーのポリペプチド断片と同じでないかまたは該断片を含まない、
式IIのアミノ酸配列を含む該少なくとも１のミモトープが、アミノ酸配列DMPVDPDNを含むα-シヌクレインのエピトープに特異的な抗体との結合能を有する、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
該ミモトープが以下からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する請求項３記載の組成物：
(C)DQPVLPD、(C)DMPVLPD、(C)DSPVLPD、(C)DSPVWAE、(C)DTPVLAE、(C)DQPVLPDN、(C)DMPVLPDN、(C)DSPVLPDN、(C)DQPVTAEN、(C)DSPVWAEN、(C)DTPVLAEN、(C)HDRPVTPD、(C)DRPVTPD、(C)DVPVLPD、(C)DTPVYPD、(C)DTPVIPD、(C)HDRPVTPDN、(C)DRPVTPDN、(C)DNPVHPEN、(C)DVPVLPDN、(C)DTPVYPDN、(C)DTPVIPDN、(C)DQPVLPDG、(C)DMPVLPDG、(C)DSPVLPDG、(C)DSPVWAEG、(C)DRPVAPEG、(C)DHPVHPDS、(C)DMPVSPDR、(C)DSPVPPDD、(C)DQPVYPDI、(C)DRPVYPDI、(C)DHPVTPDR、(C)EYPVYPES、(C)DTPVLPDS、(C)DMPVTPDT、(C)DAPVTPDT、(C)DSPVVPDN、(C)DLPVTPDR、(C)DSPVHPDT、(C)DAPVRPDS、(C)DMPVWPDG、(C)DAPVYPDG、(C)DRPVQPDR、(C)YDRPVQPDR、(C)DMPVDPEN、(C)DMPVDADN、DQPVLPD(C)、DMPVLPD(C)、(C)EMPVDPDNおよび(C)DNPVHPE。
【請求項１５】
n’および/またはm’が1であり、X1’および/またはX7’がシステイン(C)であることを特徴とする請求項１０〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
該少なくとも１のミモトープが、DQPVLPD、DSPVLPD、DVPVLPD、DSPVLPDG、YDRPVQPDR、DHPVHPDS、DAPVRPDS、KNDEGAP、KQEEGAP、およびKSEEGAP、特にDQPVLPDおよびYDRPVQPDRの群から選ばれる請求項１〜１５のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β-アミロイド形成および/または凝集(β-アミロイドーシス)に関連する疾患の予防および治療に関連する。
【０００２】
種々の変性疾患は、ミスフォールドした特異的タンパク質の蓄積および重合によって特徴付けられる。これらいわゆるプロテオパシーは、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、およびハンチントン病(HD)または封入体筋炎(IBM)、および種々のアミロイドーシスを含む全身的実体（エンティティ）などの疾患を含む。
【０００３】
本発明は、ミスフォールドしたタンパク質α-シヌクレイン(a-syn)の蓄積および凝集に関連するADの予防、治療、および診断に関する。本発明が標的とする疾患の他の例には、限定されるものではないが、前頭側頭型認知症(FTD)、進行性核上麻痺(PSP)、およびダウン症候群(DS)の認知症、およびIBMが含まれる。
【背景技術】
【０００４】
a-syn(最初にPARK1およびPARK4として同定された)は、新皮質、海馬、歯状回、線条体、視床、および小脳などの脳領域を含むヒトの神経系に広く発現する140アミノ酸のタンパク質である。該神経系において、a-synは、主にシナプス前終末にみられ、その役割は完全には理解されていないが、正常なシナプス機能と関連がある。a-synは、B-、T-、およびNK細胞、および単球、および血小板を含む造血系のメンバーにも高度に発現する。これらの細胞すべてにおけるその正確な役割は現在解っていないが、巨核球（血小板前駆体）の分化に関与することが証明されている。
【０００５】
先に示されたように、a-synは、それぞれPDおよび多系統萎縮症(MSA)の患者の脳に存在するニューロンおよびグリアにみられるアミロイド形成性封入体の重要な成分である。これら封入体はこれら著名なシヌクレイン病の典型的病的変化を示す。これおよび他の証拠は、最終的にこれら疾患を生じる物質である凝集したミスフォールドしたa-synを示唆する。
【０００６】
重要なことは、このミスフォールドしたタンパク質の封入体は、AD、FTD、PSP、DS、およびIBMを含む種々の他の変性疾患でも同定されている。
【０００７】
レビー小体(DLB)を有する認知症のトランスジェニックマウスモデルにおいて、ヒトa-synおよびヒトAPPの同時発現が、コリン作動性ニューロンの損失、シナプス小胞の減少、広範なアミロイド斑およびa-syn-免疫反応性ニューロン内繊維状封入体の形成に関連する認知変化および運動変化の発現をもたらすことが最近わかってきた。二重トランスジェニックマウスの表現型は、該２分子の同時発現の相乗効果を示す単一トランスジェニックマウスに比べてはるかに重度であった。
【０００８】
a-synの蓄積が機能的に損ない、最終的にニューロンの崩壊をもたらす正確なメカニズムは完全に解っていないが、最近の試験は、異常にフォールドされたa-synの蓄積は上記プロテオパシーの原因となる変性プロセスに関与することを示唆する。
【０００９】
Iwatsubo T.(Neuropathology 27(5)(2007)：474-478)は、α-シヌクレイン沈着およびそのリン酸化とα−シヌクレオパシーの病因との関連について試験している。この論文の著者は、シヌクレオパシー病変に沈着したα-シヌクレインのセリン129が広くリン酸化されることをみいだした。US 2007/213253は、野生型ヒトα-シヌクレインの凝集を阻害するのに用いることができる突然変異体ヒトα-シヌクレインおよびそれから誘導したペプチドに関する。WO 2004/041067において、α-シヌクレイン凝集に関連した疾患を予防または治療するための手段および方法はα-シヌクレイン断片の使用を含むことを開示する。US 2003/166558は、タンパク質沈着に対する免疫反応を誘導するのに用いることができるペプチドを開示する。US 2005/198694は、1〜23アミノ酸のC末端欠失を有する少なくとも100アミノ酸を含むα-シヌクレイン断片に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、アルツハイマー病を治療および/または予防するのに用いることができる化合物および医薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、アルツハイマー病を含むβ-アミロイドーシスを予防および/または治療するための方法に用いるためのα-シヌクレインのエピトープの少なくとも１のミモトープを含む組成物であって、該少なくとも１のミモトープが、非毒性ジフテリア毒素突然変異体、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ジフテリア毒素(DT)、破傷風トキソイド(TT)、およびHaemophilus influenzaeプロテインD(プロテインD)からなる群から選ばれる医薬的に許容される担体タンパク質と結合または融合（好ましくは結合）している、組成物に関する。
【００１２】
驚くべきことに、α-シヌクレインのエピトープのミモトープは、脳のβ−アミロイド沈着に関連する疾患を治療するのに用いることができることがわかった。
【００１３】
ADは、一般的に、アミロイドβ(Aβ)および過リン酸化Tauの広範な沈着によりもたらされるプロテオパシーと考えられるが、シナプスタンパク質a-synの異常凝集および蓄積は、ADにおける斑形成と関連があるかもしれない。興味深いことに、a-synは、最初にAD患者脳由来のアミロイド豊富化分画の成分として同定され、これはADにおけるa-synの潜在的重要性を明確に示す(Ueda K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(23) 1993：11282-6；A. Iwai、T. Saitoh et al. Neuron、14(1995)、pp. 467-475)。さらに、Matsubara et al.(Dement Geriatr Cogn Disord 2001;12:106-109 )もADとヒトのa-syn遺伝子のある種の変異体との関連を確認した。
【００１４】
前記疾患においてa-synと例えばAβが病態生理学的に相互作用するメカニズムに関して、それらは相乗的神経変性経路に関与することにより直接相互作用するかもしれないと仮定された。病的にホールドされたAβおよびa-syn分子は、ヒト疾患の前臨床モデル系において毒性作用を互いに悪化させうることが最近示された(Masliah et al. PNAS 2001 vol. 98、no. 21 p.12245-12250)。明らかに、これらの知見は、分子的根拠を与え、Aβ、a-syn、および特に種々の神経変性病状におけるそれらの連携の重要な役割を示す。
【００１５】
したがって、a-syn蓄積およびオリゴマー化の減少は、ミスフォールドしたa-synに関連する疾患、特にAD、FTD、PSP、DS、およびIBMの治療において有益であることを示し、現在の治療戦略によってもたらされる症状の単なる軽減を超えるこれら変性疾患の原因治療の新規戦略を示す。
【００１６】
該ミモトープの免疫原性は、驚くべきことに、該ミモトープを非毒性ジフテリア毒素突然変異体、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ジフテリア毒素(DT)、破傷風トキソイド(TT)、およびHaemophilus influenzaeプロテインD(プロテインD)からなる群から選ばれる担体タンパク質（非毒性ジフテリア毒素突然変異体、例えばCRM197が特に好ましい。）と融合または結合させることにより増加させることができる。
【００１７】
本明細書で用いている用語「エピトープ」は、特定の抗体分子により認識される抗原の免疫原性領域を表す。抗原は、それぞれ特定のエピトープを認識する抗体と結合することができる１またはそれ以上のエピトープを有しうる。
【００１８】
本発明では用語「ミモトープ」は、似ているエピトープと等価なトポロジーを有するコンフォメーションを有する分子を表す。ミモトープは、望む抗原と免疫特異的に結合する抗体の同じ抗原結合領域と結合する。ミモトープは、似ている抗原と反応する宿主における免疫反応を生じさせる。ミモトープは、エピトープおよび該エピトープに結合する抗体を含むin vitro阻害アッセイ（例えばELISA阻害アッセイ）において類似物であるエピトープの競合物としても作用しうる。しかしながら、本発明のミモトープは、哺乳動物に投与すると特異的免疫反応を誘導することができるが、in vitro阻害アッセイでは類似物であるエピトープの結合を必ずしも抑制または競合しないかもしれない。そのようなミモトープを含む本発明の化合物（上記のものも含む）は、該化合物のペプチドは天然のアミロイドβペプチドと異なるアミノ酸配列を有するため、自己反応性T細胞の形成を避ける利点を有する。
【００１９】
本発明のミモトープは、当該分野でよく知られた化学合成法により、単離されたペプチドまたは別のペプチドまたはポリペプチドの部分として合成的に製造することができる。あるいはまた、該ペプチドミモトープは、該ペプチドミモトープを産生する微生物中で産生することができ、次いでこれを単離し、所望によりさらに精製する。該ペプチドミモトープは、微生物（例えば細菌、酵母、または真菌）、真核細胞（例えば哺乳類細胞または昆虫細胞）、または組換えウイルスベクター（例えばアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、Simliki forest（シムリキ・フォーレスト）ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルス、またはセンダイウイルスを用いて製造することができる。該ペプチドミモトープを製造するのに適した細菌には、E.coli、B.subtilis、または該ペプチドミモトープなどのペプチドを発現することができる他のあらゆる細菌が含まれる。該ペプチドミモトープを発現するのに適した酵母の種類には、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Candida、Pichia pastoris、またはペプチドを発現することができる他のあらゆる酵母が含まれる。対応する方法は当該分野でよく知られている。組換え生成したペプチドの単離および精製方法も当該分野でよく知られており、例えば、ゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィなどが含まれる。
【００２０】
該ペプチドミモトープの単離を促進するために、該ペプチドミモトープがアフィニティクロマトグラフィにより単離することができるヘテロローガスなポリペプチドと翻訳的に融合（共有結合）した融合ポリペプチドを製造することができる。典型的なヘテロローガスなポリペプチドは、His-Tag(例えば、His6；6ヒスチジン残基)、GST-Tag(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)などである。該融合ポリペプチドは、ミモトープの精製を促進するだけでなく、該ミモトープポリペプチドが精製中に分解するのを抑制することもできる。精製後に該ヘテロローガスなポリペプチドを除去するのが望ましい場合は、該融合ポリペプチドは、該ペプチドミモトープと該ヘテロローガスなポリペプチドの間の接点に開裂部位を含みうる。該開裂部位は、該部位のアミノ酸配列に特異的な酵素（例えばプロテアーゼ）で開裂するアミノ酸配列からなる。
【００２１】
本発明のミモトープは、Nおよび/またはC末端またはその隣接部で修飾され、その部位にシステイン残基が結合していることもある。
【００２２】
本発明のミモトープは、好ましくはそのアミノ酸配列がαシヌクレインのアミノ酸配列と異なる抗原性ポリペプチドである。この点で、本発明のミモトープは、１またはそれ以上の天然アミノ酸残基ならびに１またはそれ以上の非天然アミノ酸(すなわち、20の「古典的」アミノ酸ではない)のアミノ酸置換を含むか、またはまたはそのような非天然アミノ酸で完全に組み立てられうる。適切な抗体誘導抗原は、市販のペプチドライブラリーから得ることができる。好ましくは、該ペプチドは少なくとも7アミノ酸であり、好ましい長さは、16アミノ酸以下、好ましくは14または20アミノ酸以下(例えば、5〜16アミノ酸残基)である。しかしながら、本発明ではより長いペプチドを抗体誘導抗原として非常に良く用いることができる。本発明のミモトープは、Nおよび/またはC末端に少なくとも１のさらなるアミノ酸残基を含む、ポリペプチドの部分でもありうる。
【００２３】
本発明のミモトープ（すなわち、本明細書に記載の抗体誘導抗原）を製造するには、もちろんファージライブラリー、ペプチドライブラリーも、最も変化する構造を、例えば組み合わせ化学により生成するかまたはハイスループットスクリーニング技術により得るのに適している(Display：A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas(編)et al.；Willats WG Phage display：practicalities、and prospects. Plant Mol. Biol. 2002 Dec.；50(6):837-54)。
【００２４】
本明細書で用いている用語「エピトープ」は、特定の抗体分子が特異的に結合することができる抗原の免疫原性領域を表す。抗原は、それぞれ特定のエピトープを認識する抗体と結合することができる１またはそれ以上のエピトープを有しうる。
【００２５】
本発明の組成物は、本明細書に記載の少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、または少なくとも10のミモトープを含みうる。
【００２６】
本発明の好ましい態様では、非毒性ジフテリア毒素突然変異体は、CRM 197、CRM 176、CRM 228、CRM 45、CRM 9、CRM 102、CRM 103、およびCRM 107からなる群から選ばれ、CRM 197が特に好ましい。
【００２７】
本発明のミモトープは、特に好ましくは、非毒性ジフテリア毒素突然変異体、例えばCRM 197(ジフテリア毒素の、無毒性であるが抗原的に同一の変異体)、CRM 176、CRM 228、CRM 45(Uchida et al J. Biol. Chem. 218；3838-3844、1973)、CRM 9、CRM 45、CRM 102、CRM 103、およびCRM 107、およびNichollsおよびYoule、Genetically Engineered Toxins、Frankel編、Marcel Dekker Inc、1992に記載の他の突然変異と融合または結合する。ミモトープなどのペプチドと他のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を融合する方法は当該分野でよく知られている。
【００２８】
本発明の別の局面は、アルツハイマー病を含むβ-アミロイドーシスを予防および/または治療するための方法に用いるためのα-シヌクレインのエピトープの少なくとも１のミモトープを含む組成物に関する。
【００２９】
そのような組成物において、該少なくとも１のミモトープは、医薬的に許容される担体、好ましくはKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)、破傷風トキソイド、アルブミン結合タンパク質、ウシ血清アルブミン、デンドリマー(MAP；Biol. Chem. 358：581)、ペプチドリンカー(または隣接領域)、およびSingh et al.、Nat. Biotech. 17(1999)、1075-1081(特にその表1に記載のもの)およびO'Hagan et al.、Nature Reviews、Drug Discovery 2(9)(2003)、727-735(特に、その中に記載の内因性免疫増強化合物および送達系)に記載の物質またはそれらの混合物と融合または結合することができる。この文脈において結合化学（例えば、ヘテロ二機能性化合物、例えばGMBSおよび「Bioconjugate Techniques」、Greg T. Hermansonに記載のものを用いる)は、当業者に知られた反応から選択することができる。もちろん、該少なくとも１のミモトープは、上記の非毒性ジフテリア毒素突然変異体、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ジフテリア毒素(DT)、破傷風トキソイド(TT)、およびHaemophilus influenzaeプロテインD(プロテインD)からなる群から選ばれる医薬的に許容される担体タンパク質と融合または結合することもできる。
【００３０】
本発明の組成物は、あらゆる適切な適用方法、例えば、i.d.、i.v.、i.p.、i.m.、鼻内、経口、皮下、経皮、皮内、およびあらゆる適切な送達装置(O'Hagan et al.、Nature Reviews、Drug Discovery 2(9)、(2003)、727-735)により投与することができる。したがって、本発明の少なくとも１のミモトープは、好ましくは、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内投与用に製剤化される(例えば、「Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations」、Sarfaraz Niazi、CRC Press Inc、2004参照)。
【００３１】
本発明の組成物は、本発明のミモトープを、0.1ng〜10mg、好ましくは10ng〜1mg、特に100ng〜100μg、あるいはまた、例えば100fmol〜10μmol、好ましくは10 pmol〜1μmol、特に100 pmol〜100 nmolの量で含む。典型的には、ワクチンは補助物質、例えば緩衝剤、安定化剤なども含みうる。
【００３２】
典型的には、本発明の組成物は、補助物質、例えば緩衝剤、安定化剤なども含みうる。好ましくは、そのような補助物質、例えば医薬的に許容される賦形剤、例えば水、緩衝剤、および/または安定化剤は、0.1〜99％(重量)、より好ましくは5〜80％（重量）、特に10〜70％（重量）の量で含まれる。可能な投与計画には、１週間毎、4週間毎（１月毎）、2月毎に約1〜12カ月間処置することを含むが、2〜5回、特に3〜4回初期ワクチン投与し(1または2月間)、次いでその6〜12カ月後、またはその数年後にブースターワクチン接種することも含む。
【００３３】
本発明の好ましい態様では、該少なくとも１のミモトープは、個体に、0.1ng〜10mg、好ましくは0.5〜500μg、より好ましくは1〜100μg/免疫の量で投与される。好ましい態様において、これらの量は、本発明の組成物中に存在するすべてのミモトープを表す。別の好ましい態様において、これらの量は、組成物中に存在する各単一ミモトープを表す。もちろん、種々のミモトープが異なる量または同量で存在するワクチンを提供することができる。しかしながら、あるいはまた本発明のミモトープは、0.1ng〜10mg、好ましくは10ng〜1mg、特に100ng〜300μg/kg体重の量で個体に投与することができる。
【００３４】
単回剤形を製造するために担体物質と混合することができるミモトープの量は、治療する宿主および特定の治療方法により変化する。該組成物の用量は、患者の病状、年齢、性別、および体重、並びに個体に望ましい反応を引き起こす抗体の能力に応じて変化しうる。投与計画は、最適な治療反応を得るために調整することができる。例えば、数分割用量を1日1回投与するか、または該用量を治療的状況の要求に応じて比例的に減少させることができる。ワクチンの用量は、状況に応じて最適な予防用量反応を得るために変化させることもできる。例えば、本発明のミモトープおよび組成物を、常に本発明の組成物を投与することにより誘導される抗体のレベルに応じて数日間、1または2週間、または数ヶ月間または数年間の間隔で個体に投与することができる。
【００３５】
本発明の好ましい態様において、該組成物は、2〜10回、好ましくは2〜7回、より好ましくは5回以下、最も好ましくは4回以下適用される。この免疫回数は基本的免疫付与をもたらしうる。特に好ましい態様において、連続ワクチン接種間の時間間隔は、2週間〜5年間、好ましくは1月間〜3年間以下、より好ましくは2カ月間〜1.5年間で選ばれる。ワクチン接種スケジュールの例には、6〜8週間および6カ月間以下の期間にわたる3〜4回の初期ワクチン接種が含まれうる。次いで、ワクチン接種を2〜10年間毎に反復することができる。本発明のミモトープの反復投与は、治療的ワクチン接種の最終効果を最大化することができる。
【００３６】
本発明の好ましい態様では、少なくとも１のミモトープは少なくとも１のアジュバントとともに製剤化される。
【００３７】
「アジュバント」は、抗原(すなわちミモトープ)に対する免疫反応を増強する化合物または混合物である。抗原は、主として送達系として、主として免疫モジュレーターとして作用するか、または両方の強い特徴を有しうる。適切なアジュバントには、ヒトを含む哺乳動物に用いるのに適したものが含まれる。
【００３８】
本発明の特に好ましい態様において、本明細書に記載の組成物に用いる少なくとも１のアジュバントは先天性免疫系を刺激することができる。
【００３９】
先天性免疫応答は、細胞表面のToll様レセプター(TLR's)および細胞内Nod-LRRタンパク質(NLR)により仲介され、それぞれD1およびD0領域により仲介される。該先天性免疫応答には、TLR活性化およびカスパーゼ-1の活性化に応じたサイトカイン産生、およびある種のNLR（Ipafを含む）に応じたIL-1β分泌が含まれる。この反応は、特異抗原に無関係であるが、抗原特異的な獲得免疫反応のアジュバントとして作用することができる。該抗原は、ワクチンまたは感染の形で外部から供給されるか、または例えば腫瘍関連抗原の場合のように固有でありうる。
【００４０】
多くの種々のTLRが特徴付けられている。これらTLRは種々のリガンドにより結合し活性化され、種々の生物および構造に局在する。特異的TLRにおける反応を誘発することができる免疫増強物質化合物の発現は当該分野で興味が持たれている。例えば、US 4,666,886は、TLR2アゴニストであるある種のリポペプチド分子を開示している。WO 2009/118296、WO 2008/005555、WO 2009/111337、およびWO 2009/067081は、それぞれTLR7の小分子アゴニストのクラスについて記載している。WO 2007/040840およびWO 2010/014913は、疾患を治療するためのTLR7およびTLR8アゴニストについて記載している。これら種々の化合物には、小分子免疫増強物質(SMIP)が含まれる。
【００４１】
先天性免疫系を刺激することができる該少なくとも１のアジュバントは、Toll様レセプター(TLR)アゴニスト、好ましくはTLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8またはTLR9アゴニスト、特に好ましくはTLR4アゴニストを含むかまたはからなる。
【００４２】
Toll様レセプターのアゴニストは当該分野でよく知られている。例えば、TLR2アゴニストはPam3CysSerLys4、ペプチドグリカン(Ppg)、PamCysであり、TLR3アゴニストはIPH 31XXであり、TLR4アゴニストは、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート、E6020、CRX-527、CRX-601、CRX-675、5D24.D4、RC-527であり、TLR7アゴニストはイミキモド、3M-003、Aldara、852A、R850、R848、CL097であり、TLR8アゴニストは3M-002であり、TLR9アゴニストは、フラゲリン、Vaxlmmune、CpG ODN(AVE0675、HYB2093)、CYT005-15 AllQbG10、dSLIMである。
【００４３】
本発明の好ましい態様では、TLRアゴニストは、モノホスホリルリピドA(MPL)、3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)、ポリI:C、GLA、フラゲリン、R848、イミキモド、およびCpGからなる群から選ばれる。
【００４４】
本発明の組成物はMPLを含みうる。MPLは、合成的に製造されるMPLまたは天然供給源から得ることができるMPLでありうる。もちろん、本発明の組成物に化学修飾MPLを加えることもできる。そのようなMPLの例は当該分野で知られている。
【００４５】
本発明のさらに好ましい態様では、該少なくとも１のアジュバントは、サポニン、好ましくはQS21、油中水エマルジョンおよびリポソームを含むかまたはからなる。
【００４６】
該少なくとも１のアジュバントは、好ましくはMF59、AS01、AS02、AS03、AS04、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムからなる群から選ばれる。
【００４７】
ヒトに用いることができる既知の適切な送達系形アジュバントの例には、限定されるものではないが以下のものが含まれる：アラム(例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、または水酸化アルミニウム)、リン酸カルシウム、リポソーム、水中油エマルジョン、例えばMF59(4.3％w/v スクアレン、0.5％w/v ポリソルベート80(Tween 80)、0.5％w/v ソルビタントリオレエート(Span 85))、油中水エマルジョン、例えばMontanide、およびポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)(PLG)微粒子またはナノ粒子。
【００４８】
ヒトに用いることができる既知の適切な免疫調節形アジュバントの例には、限定されるものではないが以下のものが含まれる：アクイラ木の樹皮由来のサポニン抽出物(QS21、Quil A)、TLR4アゴニスト、例えばMPL(モノホスホリルリピドA)、3DMPL(3-O-脱アシル化MPL)またはGLA-AQ、LT/CT突然変異体、サイトカイン、例えば種々のインターロイキン(例えば、IL-2、IL-12)またはGM-CSFなど。
【００４９】
ヒトに用いることができる送達特性および免疫調節特性の両方を有する既知の適切な免疫調節形アジュバントの例には、限定されるものではないが以下のものが含まれる：ISCOMS(例えば、Sjoelander et al.(1998) J. Leukocyte Biol. 64:713；WO90/03184、WO96/11711、WO 00/48630、WO98/36772、WO00/41720、WO06/134423、およびWO07/026,190参照)またはGLA-EM（Toll様レセプターアゴニスト（例えばTLR4アゴニスト）と水中油エマルジョンの混合物）。
【００５０】
本発明のミモトープ組成物の有効性を増強するためのアジュバントのさらなる例には、限定されるものではないが以下のものが含まれる：(1) 水中油エマルジョン製剤(他の特異的免疫刺激剤（例えばムラミルペプチド）（下記参照）または細菌細胞壁成分を含むか含まない)、例えば(a)10％スクアラン、0.4％Tween 80、5％プルロニックブロックドポリマーL121、およびthr-MDP含有SAF（微粒子化してミクロン以下のエマルジョンとするか、またはボルテックスして大粒子サイズのエマルジョンを生じる）、および(b)2％スクアレン、0.2％Tween 80、および１またはそれ以上の細菌細胞壁成分、例えばモノホスホリルリピドA(MPL)、トレハロースジミコラート(TDM)、および細胞壁骨格(CWS)、好ましくはMPL＋CWS(DETOX（登録商標）)を含むRIBI（登録商標）アジュバント系(RAS)、(Ribi Immunochem、Hamilton、Mont.)；(2) サポニンアジュバント、例えばQS21、STIMULON（登録商標）(Cambridge Bioscience、Worcester、Mass.)、Abisco（登録商標）(Isconova、Sweden)、またはIscomatrix（登録商標）(Commonwealth Serum Laboratories、Australia)、またはそれらから生じた粒子、例えばISCOMs(免疫刺激複合体)（ISCOMSはさらなる界面活性剤を含まないことがある）、例えばWO00/07621；(3)完全フロインドアジュバント(CFA)、および不完全フロインドアジュバント(IFA)；(4)サイトカイン、例えばインターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO99/44636)など)、インターフェロン(例えばγインターフェロン)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)など；(5) モノホスホリルリピドA(MPL)または3-O-脱アシル化MPL(3dMPL)(例えば、GB-2220221、EP-A-0689454参照)（肺炎球菌サッカライドを用いる場合は実質的にアラムを含まないことがある、例えばWO00/56358参照)；(6)3dMPLと例えばQS21および/または水中油エマルジョンとの組み合わせ(例えば、EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231参照)；(7)ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル(例えばWO99/52549参照)；(8)ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤とオクトキシノール(WO01/21207)との組み合わせ、またはポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤と少なくとも１のさらなる非イオン性界面活性剤、例えばオクトキシノール(WO01/21152)；(9)サポニンおよび免疫刺激オリゴヌクレオチド(例えばCpGオリゴヌクレオチド)(WO00/62800)；(10)免疫刺激剤および金属塩の粒子(例えばWO00/23105参照)；(11)サポニンおよび水中油エマルジョン、例えばWO99/11241；(12) サポニン(例えばQS21)＋3dMPL＋IM2(所望により＋ステロール)、例えばWO98/57659；(13)該組成物の効果を増強する免疫増強剤として作用する他の物質。ムラミルペプチドには以下のものが含まれる：N-アセチル-ムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン(thr-MDP)、N-25 アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン(ノル-MDP)、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1’-2’-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミンMTP-PE)など。
【００５１】
本発明の特に好ましい組成物は、アジュバントとして水中油エマルジョン（Toll様レセプターアゴニストを含むかまたは含まない）、およびリポソームおよび/またはサポニン含有アジュバント（Toll様レセプターアゴニストを含むかまたは含まない）を含む。本発明の組成物は、アジュバントとしてToll様レセプターアゴニストを含むかまたは含まない水酸化アルミニウムも含みうる。
【００５２】
本発明の好ましい態様では、エピトープは、アミノ酸配列KNEEGAPまたはDMPVDPDNを含むかまたはからなる。
【００５３】
下記エピトープのミモトープは当業者に知られている(例えば、WO 2009/103105、WO 2011/020133参照)。
【００５４】
本発明の組成物は、好ましくは下記アミノ酸配列を含むかまたはからなる少なくとも１のミモトープを含む：
(X1)nX2X3X4X5GX6P(X7)m        (式I)
［式中、
X1はあらゆるアミノ酸残基である、
X2は、リジン(K)、アルギニン(R)、アラニン(A)、およびヒスチジン(H)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X3は、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、グリシン(G)、およびアラニン(A)、好ましくはアスパラギン(N)、セリン(S)、グリシン(G)、およびアラニン(A)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X4は、グルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)、およびアラニン(A)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X5は、グルタミン酸(E)およびアスパラギン酸(D)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X6は、アラニン(A)およびチロシン(Y)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X7はあらゆるアミノ酸残基である、
nおよびmは、独立して0または0以上の整数である。］。
該式Iのアミノ酸配列は、アミノ酸配列KNEEGAPを有するα-シヌクレインの7マーのポリペプチド断片と同一でないかまたは含まず、式Iのアミノ酸配列を含む少なくとも１のミモトープは、アミノ酸配列KNEEGAPを含むα-シヌクレインのエピトープに特異的な抗体に対する結合能を有する。
【００５５】
用語「α-シヌクレインのエピトープに特異的な抗体との結合能を有するペプチド」は、該ペプチドがα-シヌクレインまたはまたはその断片を哺乳動物に投与することにより生成することができるα-シヌクレイン特異抗体と結合することができることを意味する。該結合能を有する該ペプチドは、哺乳動物におけるα-シヌクレイン特異抗体の形成を誘導することができる。その結果、後者の抗体は、本発明の化合物およびα-シヌクレインと結合する。
【００５６】
本発明の特に好ましい態様では、X2は、リジン(K)およびアルギニン(R)からなる群から選ばれるアミノ酸残基であり、および/またはX6はアラニン(A)である。
【００５７】
本発明の好ましい態様では、該ミモトープは、以下からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むかまたはからなる：(X1)nKNDEGAP(X7)m、(X1)nANEEGAP(X7)m、(X1)nKAEEGAP(X7)m、(X1)nKNAEGAP(X7)m、(X1)nRNEEGAP(X7)m、(X1)nHNEEGAP(X7)m、(X1)nKNEDGAP(X7)m、(X1)nKQEEGAP(X7)m、(X1)nKSEEGAP(X7)m、(X1)nKNDDGAP(X7)m、(X1)nRNDEGAP(X7)m、(X1)nRNEDGAP(X7)m、(X1)nRQEEGAP(X7)m、(X1)nRSEEGAP(X7)m、(X1)nANDEGAP(X7)m、(X1)nANEDGAP(X7)m、(X1)nHSEEGAP(X7)m、(X1)nASEEGAP(X7)m、(X1)nHNEDGAP(X7)m、(X1)nHNDEGAP(X7)m、(X1)nRNAEGAP(X7)m、(X1)nHNAEGAP(X7)m、(X1)nKSAEGAP(X7)m、(X1)nKSDEGAP(X7)m、(X1)nKSEDGAP(X7)m、(X1)nRQDEGAP(X7)m、(X1)nRQEDGAP(X7)m、(X1)nHSAEGAP(X7)m、(X1)nRSAEGAP(X7)m、(X1)nRSDEGAP(X7)m、(X1)nRSEDGAP(X7)m、(X1)nHSDEGAP(X7)m、(X1)nHSEDGAP(X7)m、(X1)nRQDDGAP(X7)m、好ましくは(X1)nKNDEGAP(X2)m、(X1)nRNEEGAP(X2)m、(X1)nRNDEGAP(X2)m、(X1)nKNAEGAP(X2)m、(X1)nKSDEGAP(X2)m、(X1)nRNAEGAP(X2)m、または(X1)nRSEEGAP(X2)m。
【００５８】
本発明の組成物は、好ましくは、シヌクレイン病を予防および/または治療するのに用いるための、アミノ酸配列：(X1)nQASFAME(X7)m、(X1)nTASWKGE(X7)m、(X1)nQASSKLD(X7)m、(X1)nTPAWKGE(X7)m、(X1)nTPSWAGE(X7)m、(X1)nTPSWKGE(X7)m、
［式中、X1はあらゆるアミノ酸残基である、
X7はあらゆるアミノ酸残基である、
nおよびmは、独立して0または0以上の整数である。］
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むかまたはからなる、アミノ酸配列KNEEGAPを含むα-シヌクレインのエピトープに特異的な抗体との結合能を有する少なくとも１のミモトープを含む。
【００５９】
本発明の好ましい態様では、該少なくとも１のミモトープは、アミノ酸配列：
(X1’)n’X2’X3’PVX4’X5’X6’(X7’)m’      (式II)
［式中、
X1’はあらゆるアミノ酸残基である、
X2’は、アスパラギン酸(D)およびグルタミン酸(E)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X3’はあらゆるアミノ酸残基である、
X4’はあらゆるアミノ酸残基である、
X5’は、プロリン(P)およびアラニン(A)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X6’は、アスパラギン酸(D)およびグルタミン酸(E)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X7’はあらゆるアミノ酸残基である、
n’およびm’は、独立して0または0以上の整数である。］
を含む。
【００６０】
該式IIのアミノ酸配列は、アミノ酸配列DMPVDPDNを有するα-シヌクレインの8マーのポリペプチド断片と同一でないかまたは含まず、
【００６１】
式IIのアミノ酸配列を含む該少なくとも１のミモトープは、アミノ酸配列DMPVDPDNを含むα-シヌクレインのエピトープに特異的な抗体との結合能を有する。
【００６２】
本発明の好ましい態様では、X3’は、グルタミン(Q)、セリン(S)、トレオニン(T)、アルギニン(R)、アスパラギン(N)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、メチオニン(M)、チロシン(Y)、アラニン(A)、およびロイシン(L)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である。
【００６３】
本発明の特に好ましい態様では、X4’は、グルタミン(Q)、トリプトファン(W)、トレオニン(T)、アルギニン(R)、アスパラギン酸(D)、イソロイシン(I)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、プロリン(P)、チロシン(Y)、アラニン(A)、セリン(S)、およびロイシン(L)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である。
【００６４】
本発明の組成物の部分である本発明のミモトープは、好ましくは以下からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する：(C)DQPVLPD、(C)DMPVLPD、(C)DSPVLPD、(C)DSPVWAE、(C)DTPVLAE、(C)DQPVLPDN、(C)DMPVLPDN、(C)DSPVLPDN、(C)DQPVTAEN、(C)DSPVWAEN、(C)DTPVLAEN、(C)HDRPVTPD、(C)DRPVTPD、(C)DVPVLPD、(C)DTPVYPD、(C)DTPVIPD、(C)HDRPVTPDN、(C)DRPVTPDN、(C)DNPVHPEN、(C)DVPVLPDN、(C)DTPVYPDN、(C)DTPVIPDN、(C)DQPVLPDG、(C)DMPVLPDG、(C)DSPVLPDG、(C)DSPVWAEG、(C)DRPVAPEG、(C)DHPVHPDS、(C)DMPVSPDR、(C)DSPVPPDD、(C)DQPVYPDI、(C)DRPVYPDI、(C)DHPVTPDR、(C)EYPVYPES、(C)DTPVLPDS、(C)DMPVTPDT、(C)DAPVTPDT、(C)DSPVVPDN、(C)DLPVTPDR、(C)DSPVHPDT、(C)DAPVRPDS、(C)DMPVWPDG、(C)DAPVYPDG、(C)DRPVQPDR、(C)YDRPVQPDR、(C)DMPVDPEN、(C)DMPVDADN、DQPVLPD(C)、DMPVLPD(C)、(C)EMPVDPDN、および(C)DNPVHPE。
【００６５】
本発明の特に好ましい態様では、n’および/またはm’は1であり、X1’および/またはX7’はシステイン(C)である。
【００６６】
本発明の好ましい態様では、該ミモトープは、7〜30、好ましくは7〜20、より好ましくは7〜16個、最も好ましくは8または9個のアミノ酸残基を含む。
【００６７】
本発明の好ましい態様では、該ミモトープは、以下からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むかまたはからなる：DQPVLPD、DSPVLPD、DVPVLPD、DSPVLPDG、YDRPVQPDR、DHPVHPDS、DAPVRPDS、KNDEGAP、KQEEGAP、およびKSEEGAP、特にDQPVLPD、およびYDRPVQPDR。もちろん、これらミモトープと本明細書に記載の担体タンパク質との結合を促進するために、該ミモトープはCおよび/またはN末端にシステイン残基を含むことができる。
【００６８】
本発明の特に好ましい態様では、本発明の組成物は、以下のミモトープおよび担体および/またはアジュバントの組み合わせを含む(表A参照)。
表Ａ：
【００６９】
ミモトープ配列(SEQ)：A＝DQPVLPD、B＝DSPVLPD、C＝DVPVLPD、D＝DSPVLPDG、E＝YDRPVQPDR、F＝DHPVHPDS、G＝DAPVRPDS、H＝KNDEGAP、I＝KQEEGAP、J＝KSEEGAP(該ミモトープは、それらと担体分子を結合するためのC-またはN-末端システイン残基を含む。)
担体(CAR)：C1＝CRM197、C2＝KLH
アジュバント(ADJ)：A1＝アラム、A2＝サポニンベースの製剤、A3＝QS21(純粋)、A4＝スクアレンベースの製剤、A5＝Addavax(クエン酸ナトリウム緩衝液(10 mM、pH 6.5)中スクアレン油(5％v/v)-Tween 80(0.5％w/v)中のソルビタントリオレエート(0.5％w/v))、A6＝MF59(0.5％ポリソルベート80、0.5％ソルビタントリオレート、4.3％スクアレン、注射用水、10mM Na-クエン酸緩衝液)、A7＝AS03、A8＝AF03、A9＝モノホスホリル-リピドA(MPL)、A10＝MPLA(Salmonella minnesotaリポ多糖由来リピドAの誘導体)、A11＝合成MPL、(＋）、A12＝A1＋A3、A13＝A1＋A5、A14＝A1＋A9、A15＝A3＋A9、A16＝A3＋A4、A17＝A4＋A9、A18＝A3＋A4＋A9、A19＝A1＋A3＋A4、A20＝A1＋A4＋A9、A21＝A1＋A3＋A9、A22＝Ribi アジュバントsystem、A23＝QS21(カプセル化)、A24＝CpG、A25＝A1＋A23、A26＝A1＋A24、A27＝A1＋A2、A28＝A1＋A9＋A24、A29＝A1＋A3＋A24、A30＝A1＋A23＋A24、A31＝A4＋A3、A32＝A4＋A9、A33＝A4＋A23、A34＝A4＋A24、A35＝A4＋A9＋A24、A36＝A4＋A3＋A24、A37＝A4＋A23＋A24、A38＝A4＋A3＋A9、A39＝A4＋A23＋A9、A40＝A4＋A3＋A9＋A24、A41＝A4＋A23＋A9＋A24、A42＝A9＋A23、A43＝A1＋A3＋A9＋A24、A44＝A1＋A9＋A23＋A24。
【００７０】
2015517457.tif 000002
【００７１】
2015517457.tif 000003
【００７２】
2015517457.tif 000004
【００７３】
2015517457.tif 000005
【００７４】
2015517457.tif 000006
【００７５】
2015517457.tif 000007
【００７６】
2015517457.tif 000008
【００７７】
2015517457.tif 000009
【００７８】
特に好ましいアジュバント組成物は、A1、A4、A12＝A1＋A3、A14＝A1＋A9、A18＝A3＋A4＋A9、A21＝A1＋A3＋A9、A26＝A1＋A24、A28＝A1＋A9＋A24、A29＝A1＋A3＋A24、A34＝A4＋A24、A38＝A4＋A3＋A9、およびA42＝A9＋A23を含む。これらの好ましいアジュバント組成物を本発明のミモトープと組み合わせて本発明の組成物を得ることができる。
【００７９】
表Aに記載のアジュバントは当該分野でよく知られている(例えば、Reed SG、Trend Immunol 30(2008)：23-32参照)。
【００８０】
本発明の特に好ましい態様では、本発明の組成物は、以下からなる群から選ばれるミモトープ、担体、およびアジュバントの組み合わせを含むかまたはからなる：A-C1-A1、A-C1-A3、A-C1-A4/A5/A6、A-C1-A9、A-C1-A12、A-C1-A14、A-C1-A16、A-C1-A17、A-C1-A18、A-C1-A21、A-C1-A26、E-C1-A1、E-C1-A3、E-C1-A4/A5/A6、E-C1-A9、E-C1-A12、E-C1-A14、E-C1-A16、E-C1-A17、E-C1-A18、E-C1-A21、E-C1-A26、A-C2-A1、A-C2-A3、A-C2-A4/A5/A6、A-C2-A9、A-C2-A12、A-C2-A14、A-C2-A16、A-C2-A17、A-C2-A18、A-C2-A21、A-C2-A26、E-C2-A1、E-C2-A3、E-C2-A4/A5/A6、E-C2-A9、E-C2-A12、E-C2-A14、E-C2-A16、E-C2-A17、E-C2-A18、E-C2-A21、およびE-C2-A26、好ましくはA-C1-A1、A-C1-A14、A-C1-A18,A-C1-A26、E-C1-A1、E-C1-A14、E-C1-A18、E-C1-A26、A-C2-A1、A-C2-A14、A-C2-A18,A-C2-A26、E-C2-A1、E-C2-A14、E-C2-A18、およびE-C2-A26（変数は表Aに記載の通りである（上記参照））。
【００８１】
本発明のさらなる局面は、特許請求の範囲に記載の適切な量の組成物をそれを必要とする対象に投与することにより本明細書に記載のシヌクレイン病を予防および/または治療する方法に関する。
【００８２】
本明細書で用いている用語「予防する（preventing）」は、疾患の発生を予防（リスクファクターの減少など）するだけでなく、いったん確立されたらその進行を止めその結果を減少させる手段に及ぶ。
【００８３】
本明細書で用いている用語「治療（処置）」または文法的等価物は、疾患（例えば神経変性疾患）の症状を改善しおよび/または逆転させることを含む。疾患と関連するあらゆるパラメーターの改善をもたらす化合物は、本発明のスクリーニング方法に用いるときは、治療的化合物として同定されうる。用語「治療（処置）」は、治療的処置および予防的（prophylacticまたはpreventative）手段の両方を表す。例えば、本発明の組成物および方法による処置の利益がありうるものには、すでに疾患および/または障害（例えば認知機能が欠損または低下している神経変性性疾患）を有するもの、および疾患および/または障害を予防すべきもの（例えば本発明の予防的処置を用いて）が含まれる。
【００８４】
本発明は、さらに以下の態様において定義される。
【００８５】
1. アルツハイマー病を含むβ-アミロイドーシスを予防および/または治療するための方法に用いるためのα-シヌクレインのエピトープの少なくとも１のミモトープを含む組成物であって、該少なくとも１のミモトープが、非毒性ジフテリア毒素突然変異体、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ジフテリア毒素(DT)、破傷風トキソイド(TT)、およびHaemophilus influenzaeプロテインD(プロテインD)からなる群から選ばれる医薬的に許容される担体タンパク質と結合または融合している組成物。
【００８６】
2. 態様１の組成物であって、該非毒性ジフテリア毒素突然変異体が、CRM 197、CRM 176、CRM 228、CRM 45、CRM 9、CRM 102、CRM 103、およびCRM 107、特にCRM 197からなる群から選ばれる組成物。
【００８７】
3. 態様1または2の組成物であって、該少なくとも１のミモトープが皮下、皮内、経皮、または筋肉内投与用に製剤化される組成物。
【００８８】
4. 態様1〜3のいずれかの組成物であって、該少なくとも１のミモトープが少なくとも１のアジュバントとともに製剤化されている組成物。
【００８９】
5. 態様4の組成物であって、該少なくとも１のアジュバントが先天性免疫系を刺激することができる組成物。
【００９０】
6. 態様5の組成物であって、先天性免疫系を刺激することができる該少なくとも１のアジュバントが、Toll様レセプター(TLR)アゴニスト、好ましくは、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8またはTLR9アゴニスト、特に好ましくはTLR4アゴニストを含むかまたはからなる先天性免疫系を刺激することができる組成物。
【００９１】
7. 態様6の組成物であって、該TLRアゴニストが、モノホスホリルリピドA(MPL)、3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)、ポリI:C、GLA、フラゲリン、R848、イミキモド、およびCpGからなる群から選ばれる組成物。
【００９２】
8. 態様4〜7のいずれかの組成物であって、該少なくとも１のアジュバントが、サポニン、好ましくはQS21、油中水エマルジョンおよびリポソームを含むかまたはからなる組成物。
【００９３】
9. 態様4の組成物であって、該少なくとも１のアジュバントが、MF59、AS01、AS02、AS03、AS04、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムからなる群から選ばれる組成物。
【００９４】
10. 態様1〜9のいずれかの組成物であって、該エピトープがアミノ酸配列KNEEGAPまたはDMPVDPDNを含む組成物。
【００９５】
11. 態様1〜10のいずれかの組成物であって、該少なくとも１のミモトープが下記アミノ酸配列を含む組成物：
(X1)nX2X3X4X5GX6P(X7)m        (式I)、
［式中、
X1はあらゆるアミノ酸残基である、
X2は、リジン(K)、アルギニン(R)、アラニン(A)、およびヒスチジン(H)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X3は、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、グリシン(G)、およびアラニン(A)、好ましくはアスパラギン(N)、セリン(S)、グリシン(G)、およびアラニン(A)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X4は、グルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)、およびアラニン(A)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X5は、グルタミン酸(E)およびアスパラギン酸(D)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X6は、アラニン(A)およびチロシン(Y)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X7はあらゆるアミノ酸残基である、
nおよびmは、独立して0または0以上の整数である］
ここで、該式Iのアミノ酸配列は、アミノ酸配列KNEEGAPを有するα-シヌクレインの7マーのポリペプチド断片と同じではないかまたは該断片を含まず、
該式Iのアミノ酸配列を含む少なくとも１のミモトープは、アミノ酸配列KNEEGAPを含むα-シヌクレインのエピトープに特異的な抗体との結合能を有する。
【００９６】
12. 態様11の組成物であって、X2がリジン(K)およびアルギニン(R)からなる群から選ばれるアミノ酸残基であり、および/またはX6がアラニン(A)である組成物。
【００９７】
13. 態様11または12の組成物であって、該ミモトープが以下からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む組成物：(X1)nKNDEGAP(X7)m、(X1)nANEEGAP(X7)m、(X1)nKAEEGAP(X7)m、(X1)nKNAEGAP(X7)m、(X1)nRNEEGAP(X7)m、(X1)nHNEEGAP(X7)m、(X1)nKNEDGAP(X7)m、(X1)nKQEEGAP(X7)m、(X1)nKSEEGAP(X7)m、(X1)nKNDDGAP(X7)m、(X1)nRNDEGAP(X7)m、(X1)nRNEDGAP(X7)m、(X1)nRQEEGAP(X7)m、(X1)nRSEEGAP(X7)m、(X1)nANDEGAP(X7)m、(X1)nANEDGAP(X7)m、(X1)nHSEEGAP(X7)m、(X1)nASEEGAP(X7)m、(X1)nHNEDGAP(X7)m、(X1)nHNDEGAP(X7)m、(X1)nRNAEGAP(X7)m、(X1)nHNAEGAP(X7)m、(X1)nKSAEGAP(X7)m、(X1)nKSDEGAP(X7)m、(X1)nKSEDGAP(X7)m、(X1)nRQDEGAP(X7)m、(X1)nRQEDGAP(X7)m、(X1)nHSAEGAP(X7)m、(X1)nRSAEGAP(X7)m、(X1)nRSDEGAP(X7)m、(X1)nRSEDGAP(X7)m、(X1)nHSDEGAP(X7)m、(X1)nHSEDGAP(X7)m、(X1)nRQDDGAP(X7)m、好ましくは(X1)nKNDEGAP(X2)m、(X1)nRNEEGAP(X2)m、(X1)nRNDEGAP(X2)m、(X1)nKNAEGAP(X2)m、(X1)nKSDEGAP(X2)m、(X1)nRNAEGAP(X2)mまたは(X1)nRSEEGAP(X2)m。
【００９８】
14. 態様1〜13のいずれかに記載の組成物であって、(X1)nQASFAME(X7)m、(X1)nTASWKGE(X7)m、(X1)nQASSKLD(X7)m、(X1)nTPAWKGE(X7)m、(X1)nTPSWAGE(X7)m、(X1)nTPSWKGE(X7)m
［式中、
X1はあらゆるアミノ酸残基である、
X7はあらゆるアミノ酸残基である、
nおよびmは、独立して0または0以上の整数である。］
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む少なくとも１のミモトープを含み、
該少なくとも１のミモトープがアミノ酸配列KNEEGAPを含むα-シヌクレインのエピトープに特異的な抗体との結合能を有する、
シヌクレイン病を予防および/または治療するのに用いるための組成物。
【００９９】
15. 態様1〜14のいずれかに記載の組成物であって、該少なくとも１のミモトープが以下のアミノ酸配列：
(X1’)n’X2’X3’PVX4’X5’X6’(X7’)m’      (式II)
［式中、
X1’はあらゆるアミノ酸残基である、
X2’は、アスパラギン酸(D)、およびグルタミン酸(E)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X3’はあらゆるアミノ酸残基である、
X4’はあらゆるアミノ酸残基である、
X5’は、プロリン(P)およびアラニン(A)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X6’は、アスパラギン酸(D)およびグルタミン酸(E)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、
X7’はあらゆるアミノ酸残基である、
n’およびm’は、独立して0または0以上の整数である。］
を含み、
該式IIのアミノ酸配列がアミノ酸配列DMPVDPDNを有するα-シヌクレインの8マーのポリペプチド断片と同じではないかまたは該断片を含まず、
該式IIのアミノ酸配列を含む少なくとも１のミモトープがアミノ酸配列DMPVDPDNを含むα-シヌクレインのエピトープに特異的な抗体との結合能を有する、組成物。
【０１００】
16. 態様15の組成物であって、X3’が、グルタミン(Q)、セリン(S)、トレオニン(T)、アルギニン(R)、アスパラギン(N)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、メチオニン(M)、チロシン(Y)、アラニン(A)、およびロイシン(L)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、組成物。
【０１０１】
17. 態様15または16に記載の組成物であって、X4’が、グルタミン(Q)、トリプトファン(W)、トレオニン(T)、アルギニン(R)、アスパラギン酸(D)、イソロイシン(I)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、プロリン(P)、チロシン(Y)、アラニン(A)、セリン(S)、およびロイシン(L)からなる群から選ばれるアミノ酸残基である、組成物。
【０１０２】
18. 態様15〜17のいずれかの組成物であって、該ミモトープが以下からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する組成物：(C)DQPVLPD、(C)DMPVLPD、(C)DSPVLPD、(C)DSPVWAE、(C)DTPVLAE、(C)DQPVLPDN、(C)DMPVLPDN、(C)DSPVLPDN、(C)DQPVTAEN、(C)DSPVWAEN、(C)DTPVLAEN、(C)HDRPVTPD、(C)DRPVTPD、(C)DVPVLPD、(C)DTPVYPD、(C)DTPVIPD、(C)HDRPVTPDN、(C)DRPVTPDN、(C)DNPVHPEN、(C)DVPVLPDN、(C)DTPVYPDN、(C)DTPVIPDN、(C)DQPVLPDG、(C)DMPVLPDG、(C)DSPVLPDG、(C)DSPVWAEG、(C)DRPVAPEG、(C)DHPVHPDS、(C)DMPVSPDR、(C)DSPVPPDD、(C)DQPVYPDI、(C)DRPVYPDI、(C)DHPVTPDR、(C)EYPVYPES、(C)DTPVLPDS、(C)DMPVTPDT、(C)DAPVTPDT、(C)DSPVVPDN、(C)DLPVTPDR、(C)DSPVHPDT、(C)DAPVRPDS、(C)DMPVWPDG、(C)DAPVYPDG、(C)DRPVQPDR、(C)YDRPVQPDR、(C)DMPVDPEN、(C)DMPVDADN、DQPVLPD(C)、DMPVLPD(C)、(C)EMPVDPDN、および(C)DNPVHPE。
【０１０３】
19. 態様11〜17のいずれかの組成物であって、n’および/またはm’が1であり、X1’および/またはX7’がシステイン(C)であることを特徴とする組成物。
【０１０４】
20. 態様11〜19のいずれかの組成物であって、該ミモトープが、7〜30、好ましくは7〜20、より好ましくは7〜16個、最も好ましくは8または9個のアミノ酸残基を含む組成物。
【０１０５】
21. 態様1〜20のいずれかの組成物であって、該少なくとも１のミモトープが、DQPVLPD、DSPVLPD、DVPVLPD、DSPVLPDG、YDRPVQPDR、DHPVHPDS、DAPVRPDS、KNDEGAP、KQEEGAP、およびKSEEGAP、特にDQPVLPDおよびYDRPVQPDRからなる群から選ばれる組成物。
【０１０６】
22. 態様1〜21のいずれかの組成物であって、表Aに記載の少なくとも１のミモトープおよび担体および/またはアジュバントの組み合わせ、好ましくはA-C1-A1、A-C1-A14、A-C1-A18,A-C1-A26、E-C1-A1、E-C1-A14、E-C1-A18、E-C1-A26、A-C2-A1、A-C2-A14、A-C2-A18,A-C2-A26、E-C2-A1、E-C2-A14、E-C2-A18、およびE-C2-A26を含む組成物。
【０１０７】
本発明を、限定されるものではないが、下記図および実施例によりさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１Ａ】TLR4、サポニンまたは水中油エマルジョンを含む別のアジュバントにおいて、アジュバントとDQPVLPD-CRM197コンジュゲートを組み合わせるとアジュバント単独または水酸化アルミニウムとDQPVLPD-CRM197コンジュゲートの組み合わせに比べて、より高い注射ペプチド特異的免疫原性が促進されることを示す。
【図１Ｂ】TLR4およびより低量のサポニンまたは水中油エマルジョンを含む別のアジュバントにおいて、アジュバントをYDRPVQPDR-CRM197コンジュゲートと組み合わせるとアジュバント単独または水酸化アルミニウムとYDRPVQPDR-CRM197コンジュゲートとの組み合わせに比べて、より高い注射ペプチド特異的免疫原性が促進されることを示す。
【図１Ｃ】水中油エマルジョンまたはサポニンではなく、TLR4を含む別のアジュバントにおいて、アジュバントとKNDEGAP-CRM197コンジュゲートを組み合わせるとアジュバント単独または水酸化アルミニウムとKNDEGAP-CRM197コンジュゲートの組み合わせに比べて、より高い注射ペプチド特異的免疫原性が促進されることを示す。
【図２Ａ】水中油エマルジョンおよびTLR4またはサポニンを含む別のアジュバントにおいて、アジュバントとDQPVLPD-KLHコンジュゲートを組み合わせるとアジュバント単独または水酸化アルミニウムとDQPVLPD-KLHコンジュゲートの組み合わせに比べて、より高い注射ペプチド特異的免疫原性が促進されることを示す。
【図２Ｂ】サポニンではなく、TLR4または水中油エマルジョンを含む別のアジュバントにおいて、アジュバントをYDRPVQPDR-KLHコンジュゲートと組み合わせるとアジュバント単独または水酸化アルミニウムとYDRPVQPDR-KLHコンジュゲートとの組み合わせに比べて、より高い注射ペプチド特異的免疫原性が促進されることを示す。
【図２Ｃ】TLR4（水中油エマルジョンまたはサポニンでは程度が低い）を含む別のアジュバントにおいて、アジュバントをKNDEGAP-KLHコンジュゲートと組み合わせるとアジュバント単独または水酸化アルミニウムとKNDEGAP-KLHコンジュゲートとの組み合わせに比べて、より高い注射ペプチド特異的免疫原性が促進されることを示す。
【図２Ｄ】サポニンではなく、TLR4または水中油エマルジョンを含む別のアジュバントにおいて、アジュバントをDHPVHPDS-KLHコンジュゲートと組み合わせるとアジュバント単独または水酸化アルミニウムとDHPVHPDS-KLHコンジュゲートとの組み合わせに比べて、より高い注射ペプチド特異的免疫原性が促進されることを示す。
【図３Ａ】サポニン（TLR4または水中油エマルジョンでは程度が低い）を含む別のアジュバントにおいて、アジュバントをDQPVLPD-CRM197コンジュゲートと組み合わせるとアジュバント単独または水酸化アルミニウムとDQPVLPD-CRM197コンジュゲートとの組み合わせに比べて、MCP-1サイトカインレベルに基づくより高い単球/マクロファージ活性化を示す。しかしながら、Quil-A単独では、すでに、かなり低レベルではあるが、単球/マクロファージ刺激を促進するようであることに注意すべきである。
【図３Ｂ】サポニン、水中油エマルジョンまたはTLR4を含む別のアジュバントにおいて、アジュバントをYDRPVQPDR-CRM197コンジュゲートと組み合わせるとアジュバント単独または水酸化アルミニウムとYDRPVQPDR-CRM197コンジュゲートとの組み合わせに比べて、MCP-1サイトカインレベルに基づくより高い単球/マクロファージ活性化を示す。しかしながら、Quil-A単独では、すでに、かなり低レベルではあるが、単球/マクロファージ刺激を促進するようであることに注意すべきである。
【図３Ｃ】サポニンまたは水中油エマルジョンまたはTLR4を含む別のアジュバントにおいて、アジュバントをKNDEGAP-CRM197コンジュゲートと組み合わせるとアジュバント単独または水酸化アルミニウムとKNDEGAP-CRM197コンジュゲートとの組み合わせに比べて、MCP-1サイトカインレベルに基づくより高い単球/マクロファージ活性化を示す。Quil-A単独では、すでに、かなり低レベルではあるが、単球/マクロファージ刺激を促進するようである。
【図３Ｄ】サポニン、TLR4または水中油エマルジョンを含む別のアジュバントにおいて、アジュバントをDHPVHPDS-CRM197コンジュゲートと組み合わせるとアジュバント単独または水酸化アルミニウムとDHPVHPDS-CRM197コンジュゲートとの組み合わせに比べて、MCP-1サイトカインレベルに基づくより高い単球/マクロファージ活性化を示す。Quil-A単独では、すでに、かなり低レベルではあるが、単球/マクロファージ刺激を促進するようである。
【図４Ａ】TLR4、サポニンまたは水中油エマルジョンを含む別のアジュバントにおいて、アジュバントをDQPVLPD-KLHコンジュゲートと組み合わせるとアジュバント単独または水酸化アルミニウムとDQPVLPD-KLHコンジュゲートとの組み合わせに比べて、MCP-1サイトカインレベルに基づくより高い単球/マクロファージ活性化を示す。
【図４Ｂ】TLR4、水中油エマルジョンまたはサポニンを含む別のアジュバントにおいて、アジュバントをYDRPVQPDR-KLHコンジュゲートと組み合わせるとアジュバント単独または水酸化アルミニウムとYDRPVQPDR-KLHコンジュゲートとの組み合わせに比べて、MCP-1サイトカインレベルに基づくより高い単球/マクロファージ活性化を示す。Quil-A単独では、すでに、単球/マクロファージ刺激を促進するようである。
【図４Ｃ】TLR4ではなく、水中油エマルジョンまたはサポニンを含む別のアジュバントにおいて、アジュバントをKNDEGAP-KLHコンジュゲートと組み合わせるとアジュバント単独または水酸化アルミニウムとKNDEGAP-KLHコンジュゲートとの組み合わせに比べて、MCP-1サイトカインレベルに基づくより高い単球/マクロファージ活性化を示す。Quil-A単独では、すでに、単球/マクロファージ刺激を促進するようである。
【図４Ｄ】TLR4、水中油エマルジョンまたはサポニンを含む別のアジュバントにおいて、アジュバントをDHPVHPDS-KLHコンジュゲートと組み合わせるとアジュバント単独または水酸化アルミニウムとDHPVHPDS-KLHコンジュゲートとの組み合わせに比べて、MCP-1サイトカインレベルに基づくより高い単球/マクロファージ活性化を示す。
【図５Ａ】末梢血中の単球分画のサイズに対するCRM197-コンジュゲートと種々のアジュバントの組み合わせの影響の比較。QuilAは、単独、および試験したすべてのミモトープ-コンジュゲートとの組み合わせにおいて単球数の減少傾向を示すが、すべての試料において単球パーセンテージは生理学的範囲内である。絶対分散はアッセイの変動性を反映する。
【図５Ｂ】末梢血中の単球分画のサイズに対するKLH-コンジュゲートと種々のアジュバントの組み合わせの影響の比較。QuilAは、単独、および試験したすべてのミモトープ-コンジュゲートとの組み合わせにおいて単球数の減少傾向を示すが、すべての試料において単球パーセンテージは生理学的範囲内である。絶対分散はアッセイの変動性を反映する。
【図６Ａ】水酸化アルミニウムとKNDEGAP-CRM197コンジュゲートとの組み合わせと比較したKNDEGAP-CRM197と組み合わせた別のアジュバントの末梢血単球におけるin vivo Aβ取り込みに対する相乗効果を示す。
【図６Ｂ】水酸化アルミニウムとDHPVHPDS-CRM197コンジュゲートとの組み合わせと比較したTLR4または水中油エマルジョンアジュバントとDHPVHPDS-CRM197との組み合わせの末梢血単球におけるin vivo Aβ取り込みの相乗効果（サポニンとDHPVHPDS-CRM197との組み合わせにはない）を示す。
【図６Ｃ】水酸化アルミニウムとKNDEGAP-KLHコンジュゲートとの組み合わせと比較したTLR4とKNDEGAP-KLHとの組み合わせの末梢血単球におけるin vivo Aβ取り込みの相乗効果（水中油エマルジョンまたはサポニンとKNDEGAP-KLHとの組み合わせにはない）を示す。
【図６Ｄ】水酸化アルミニウムとDHPVHPDS-KLHコンジュゲートとの組み合わせと比較したDHPVHPDS-KLHと組み合わせた別のアジュバントの末梢血単球におけるin vivo Aβ取り込みに対する相乗効果を示す。                                          （実施例）
【０１０９】
材料および方法：
ミモトープワクチン候補のin vivo特徴づけ：
コンジュゲート製造：
ミモトープペプチドを、ヘテロ二機能性架橋剤GMBSを用いて担体CRM-197またはKLHと結合させた。簡単には、CRM-197/KLHを室温で過剰のGMBSと混合して活性化させ、次いで透析して過剰のGMBSを除去した。次に、過剰のミモトープペプチドを活性化担体に加えた。該ミモトープCRM-197/KLHコンジュゲートをワクチン製剤に用いた。
ワクチンを種々のアジュバントと共に製剤化し、動物に適用した。CRM-197/KLHワクチンを他のワクチンと比較する場合や、種々のアジュバントを比較する場合は、同量のコンジュゲート化ミモトープペプチドをマウスに注射した。
【０１１０】
動物実験：
雌BALB/cマウス（6匹/群）を、種々のアジュバントを用いたミモトープ-CRM-197/KLHコンジュゲートで免疫した。コントロール群を、CRM-197/KLH＋各アジュバントおよび/またはPBSおよび/またはアジュバント単独で免疫した。
動物を一定間隔（2週間間隔）で3回ワクチン接種し、血漿試料を同様に定期的に（ワクチン接種前１日）採取した。
【実施例１】
【０１１１】
種々のアジュバント系を用いるミモトープ-CRM197コンジュゲートの効果：免疫原性(図1)
種々の並列実験において、雌BALB/cマウスを、同量の、CRM-197と結合したCまたはN-末端システイン残基を含むAFFITOPEペプチド(本明細書に記載のミモトープ)（10μg/免疫）で反復免疫した。同じAFFITOPEコンジュゲートを用いる種々の製剤を、適切なコントロール群（例えば、PBS単独またはアジュバント単独またはCRM197＋アジュバント）と比較する。
【０１１２】
下記ペプチド-コンジュゲートまたはコンジュゲートの組み合わせを用いる：
・CRM197結合DQPVLPD
・CRM197結合YDRPVQPDR
・CRM197結合DHPVHPDS
・CRM197結合NDEGAP
【０１１３】
この実験に用いたアジュバントは、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムおよびTLRアゴニストMPLA、スクアレンベースの水中油エマルジョン(＝Addavax)、サポニン含有アジュバント(＝QuilA)である。免疫後の抗体価を決定するためのin vitro ELISAアッセイを単一マウスの血漿を用いて行う（下記方法参照）。
【０１１４】
ペプチドELISA：
ワクチン接種した動物の免疫応答を検出するためのELISAを実施するために、末梢血液をヘパリンを抗凝固剤に用いてマウスから採取し、試料から血漿を調製した。次に、希釈した血漿をELISA分析に用いた。この目的で、ELISAプレート(Nunc Maxisorb)のウェルをペプチド-BSAコンジュゲートでコートした。次に、希釈血漿を加え、ペプチド特異抗体の検出を、ビオチン化抗マウスIgG(Southern Biotech)を用い、次いでStreptavidin-POD(Roche)およびABTSを用いる発色反応により行った。
【実施例２】
【０１１５】
種々のアジュバント系を用いるミモトープ-KLHコンジュゲートの効果：免疫原性(図2)
種々の並列実験において、雌BALB/cマウスを、同量のKLH結合ミモトープペプチド(例えば10μgペプチド/免疫)で反復免疫する。同じミモトープコンジュゲートを用いる種々の製剤を適切なコントロール群（例えば、PBS単独またはアジュバント単独またはKLH＋アジュバント）と比較する。
【０１１６】
下記ペプチド-コンジュゲートまたはコンジュゲートの組み合わせを用いる：
・KLH結合DQPVLPD
・KLH結合YDRPVQPDR
・KLH結合DHPVHPDS
・KLH結合NDEGAP
【０１１７】
この実験に用いたアジュバントは、（実施例１と同様に）水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムおよびMPLA、AddavaxおよびQuilAである。
免疫後のワクチン力価を決定するためのin vitro ELISAアッセイを単一マウスの血漿を用いて行う（実施例１に記載の方法参照）。
【実施例３】
【０１１８】
種々のアジュバント系を用いるミモトープ-CRM197コンジュゲートの効果：
末梢単球/マクロファージに対する効果(図3)
前記種々のアジュバントでアジュバント化したミモトープ-CRM197がサイトカイン環境を変化させ、末梢単球/マクロファージ活性化に影響を及ぼすか否かを分析するため、単球/マクロファージを活性化することが知られているかまたは単球/マクロファージの活性化を示すサイトカイン/ケモカイン（例えばCCL2/MCP1など）レベルを測定した。種々のワクチン注射後2時間の処置マウスから得た血漿中のサイトカイン/ケモカインレベルを測定する。
【０１１９】
サイトカインの測定：
ワクチン接種動物の循環中のサイトカインの濃度を決定するため、ワクチン注射後2時間で動物から血液を採取した。次に、血液試料から血漿を調製し、個々の試料のサイトカイン濃度を、FlowCytomixビーズアレイ系(eBioscience)およびフローサイトメトリー分析を用いて測定した。
【実施例４】
【０１２０】
種々のアジュバント系を用いるミモトープ-KLHコンジュゲートの効果：
末梢単球/マクロファージに対する効果(図4)
前記種々のアジュバントでアジュバント化したミモトープ-CRM197がサイトカイン環境を変化させ、末梢単球/マクロファージ活性化に影響を及ぼすか否かを分析するため、単球/マクロファージを活性化することが知られているかまたは単球/マクロファージの活性化を示すサイトカイン/ケモカイン（例えばCCL2/MCP1など）レベルを測定した。種々のワクチン注射後2時間の処置マウスから得た血漿中のサイトカイン/ケモカインレベルを測定する（詳細は実施例3を参照）。
【実施例５】
【０１２１】
単球および単球αシヌクレイン取り込みに対する免疫療法の効果(図5)
新規ワクチン製剤の、末梢CD11b＋単球数を変化させ、in vivo単球αシヌクレイン取り込みを変化させる能力も評価する。
【０１２２】
前記のごとく単球を脳ミクログリアの末梢血前駆細胞とみなす(Rezaie、P. et al 1999. Dev. Brain Res. 115:71-81；Mildner et al Nat Neurosci. 2007 Dec;10(12):1544-53)。CD11bおよびLy6Cなどのマーカーは、該末梢血単球上に存在し、該細胞が脳に浸潤するときに持続する免疫学的マーカーである(Mildner et al.、2007、Lebson L、et al. J Neurosci. 2010 Jul 21;30(29):9651-8)。
【０１２３】
TLRアゴニスト含有アジュバントまたはその成分が末梢血中の単球数の変化に寄与するか否かを検討するため、前記コンジュゲート−製剤の比較分析を行う。
この結果も、ミモトープ−ワクチン誘導免疫反応（抗体）とアジュバントに用いたTLRアゴニストとの相乗作用を証明する。
【０１２４】
フローサイトメトリー分析：
それぞれワクチンおよび抗体の最終注射後24時間で、末梢血をK2-EDTAを抗凝固剤に用いてマウスから採取した。BD Pharm Lyse（登録商標）(BD Pharmingen)を用いて個々の動物試料について赤血球溶解を行った。残りの末梢血細胞をラット抗マウスCD16/CD32(BD Fc Block（登録商標）（BD Biosciences）)とインキュベーションし、さらに細胞を、Mildner et al.、2007に記載の直接コンジュゲート化抗体または同様の抗体の組み合わせ：PEコンジュゲート化ハムスター抗マウスCD3、ラット抗マウスCD45R/B220、ラット抗マウスLy-6G、マウス抗マウスNK1.1；APCコンジュゲート化ラット抗マウスCD11b；PE-Cy7コンジュゲート化ハムスター抗マウスCD11c、FITC-ラット抗マウスLy-6C、および適切なラット抗マウスCD62L.(BD Biosciences)とインキュベーションした。
【０１２５】
試料をフローサイトメーター(BD FACSCanto II)に適用し、データを、用いた蛍光チャンネルに対する自動補正プロトコールを含むFACSDivaソフトウエア(BD Biosciences)にて分析した。
単球を、その前方/側方スキャッター特性で同定し、CD3-/CD45R/B220-/Ly-6G-/NK1.1-(系統-)/CD11b＋細胞としてゲートした。CD11b＋単球頻度を、総細胞（デブリを除く）のパーセンテージで示した。
【０１２６】
αシヌクレイン取り込みアッセイ(図6)：
末梢血中の単球の機能を試験するため、該単球の組換えヒトαシヌクレイン取り込み能を試験した。食作用活性を測定するため、蛍光組換えヒトα-シヌクレイン(1-140；HiLyte Fluor（登録商標）488標識、Anaspec Inc.)を用いた。
【０１２７】
該分析用に、マウスにHiLyte Fluor（登録商標）488標識α-シヌクレインを注射し、注射後2時間に血液を採取した。αシヌクレイン取り込み測定用の試料をフローサイトメーター(BD FACSCanto II)に適用し、データをFACSDivaソフトウエア(BD Biosciences)にて分析した。
【０１２８】
単球を、その前方/側方スキャッター特性で同定し（デブリを除く）、CD3-/CD45R/B220-/Ly-6G-/NK1.1-(系統-)/CD11b＋細胞としてゲートした。αシヌクレイン取り込みを、ゲートした単球のうちのHiLyte fluor（登録商標）488αシヌクレイン陽性細胞のパーセンテージで示すことにより評価した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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