(57)【要約】  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計装置を用いて、生物試料、例えば血清または血液性試料を解析する方法が記載される。該方法は試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ試料プレート上の試料スポットに適用し、２０，０００回より多くのレーザーショットをその試料スポットにある試料にし、その装置から質量スペクトルデータを収集する工程を含む。ある実施態様においては、少なくとも１００，０００回のレーザーショットを、さらには５００，０００回のショットさえも試料にする。この方法（「ディープ−ＭＡＬＤＩ」と称される）は質量スペクトルにおけるノイズレベルの減少をもたらし、さらなるスペクトル情報を有意な量でその試料より得ることができる。その上、より少ない数のショットで可視できるピークがより鮮明となり、試料間でさらに信頼できる比較が可能である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ試料プレート上の試料スポットに適用される複合的生物試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計装置を用いて解析する方法であって、以下の工程：
２０，０００回より多くのレーザーショットを試料スポットにある試料にする工程；および
該装置より質量スペクトルデータを収集する工程
を含む、解析方法。
【請求項２】
少なくとも１００，０００回のレーザーショットを試料スポットにするところの請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも５００，０００回のレーザーショットを試料スポットにするところの請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生物試料が血液性試料を含むところの、請求項１、２または３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
試料プレートの画像解析を用い、スポット内で試料の含有量が相対的に高いまたは相対的に低い領域を特定する工程、および
２０，０００回より多くの試料へのレーザーショットを、試料の含有量が相対的に高いスポットの領域に自動的に操作する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
スポットを複数のサブスポットに分割する工程；
各サブスポットのラスタファイル（複数のショットを用いて試料から質量スペクトルを取得するためにサブスポット内の複数の別個のＸ／Ｙロケーションを特定するファイル）を作成する工程；
グリッド内にある各ロケーションでの複数のスペクトルを収集し、スペクトルをまとめ、各サブスポットについて一つにまとめたスペクトルを作成する工程；および
各サブスポットからまとめたスペクトルを一にまとめ、試料の一の全質量スペクトルを作成する工程
をさらに含むところの、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦプレート上の複数のスポットに適用し、複数のスポットの各々に少なくとも２０，０００回のショットを適用して質量スペクトルを取得し、複数のスポットの各々からの質量スペクトルをまとめる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該取得工程が複数の各々のスポットに適用される少なくとも１００，０００回のショットからの質量スペクトルの取得を含むところの、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
複数のスポットの各々からまとめられた質量スペクトルが、試料への百万回〜千万回のショットを適用して得られる質量スペクトルからなるところの、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
複合的生物試料が血液性試料を含むところの、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
対照スペクトルと、１または複数のスポット上の血液性試料に適用される記録したショット数とを活用して、血液性試料中の総タンパク質の存在量を測定することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
複合的生物試料を含有するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ試料プレート上のスポットを自動的にラスタ走査に付す工程；および
２０，０００回より多くのショットをそのスポットから取得する工程
を含む、質量スペクトルの取得方法。
【請求項１３】
スポットを複数のサブスポットに細分割する工程；
サブスポットを自動的にラスタ走査に付し、サブスポットに付き少なくとも２０，０００個の過渡スペクトルを得る工程；および
各サブスポットからの過渡スペクトルをまとめ、そのスポットについて一の全スペクトルを作成する工程
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
スポットを別個のＸ／Ｙロケーションにて少なくとも１０回ラスタ走査に付し、スポットの各ラスタ走査に付き少なくとも１０，０００回のショットからスペクトルを得るところの、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
スポットを別個のＸ／Ｙロケーションにて少なくとも１０回ラスタ走査に付し、１００，０００〜１，０００，０００回のショットから該スポットについてのスペクトルを得るところの、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
各ラスタ走査のＸ／Ｙロケーションが重複しないところの、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
画像解析を用いてスポット内で試料の濃度が相対的に高い領域を特定し、かかる領域中のスポットを自動的に走査するところの、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
試料をＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ試料プレート上に試料スポット内で均一に、かつ空間的に規則的に分配する方法で置く工程をさらに含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ試料プレートが研磨した金属プレートを含むところの、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
複合的生物試料が、血液性試料、リンパ液、導管流体、脳脊髄流体および前立腺圧出液からなる試料の群より選択されるところの、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
複合的生物試料がヒトより得られるところの、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
複合的生物試料が疾患を患っているヒトより得られるところの、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
疾患が癌であるところの、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ試料プレートの１または複数の試料スポットを照射するためのレーザー、および
試料にレーザーを照射しながら試料プレートをラスタ走査に付すための自動式ラスタ走査システム
を含む、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計システムであって、
質量分析計が試料に適用した２０，０００回より多くのショットから質量スペクトルを得るように構成されているところの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計システム。
【請求項２５】
質量分析計がスポットをレーザーで少なくとも１００，０００回自動的に照射し、得られた過渡スペクトルを一の質量スペクトルにまとめるように構成されているところの、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
質量分析計がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ試料プレートの複数のスポットをレーザーで各スポットについて少なくとも２０，０００回自動的に照射し、得られた過渡スペクトルを一の質量スペクトルにまとめるように構成されているところの、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２７】
質量分析計がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ試料プレートの複数のスポットをレーザーで各スポットについて少なくとも１００，０００回自動的に照射し、得られた過渡スペクトルを一の質量スペクトルにまとめるように構成されているところの、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２８】
試料中に存在する目的とする分子の存在量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により解析するための対照スペクトルの作成方法であって、
ａ）目的とする分子の標的とする存在量のレベル（モル濃度またはｐｐｍ）にまで試料をドープする工程；
ｂ）標的とする存在量のレベルにドープされた試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ試料プレートの１または複数のスポットに適用する工程；
ｃ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦプレート上の１または複数のスポットに２０，０００回より多くの多数のショットを行って質量分析を実施し、目的とする分子が対照となるスペクトルに確かに存在する対照スペクトルを作成する工程；および
ｄ）ショットの回数を記録する工程
を含む、方法。
【請求項２９】
目的とする分子の濃度が不明である試料を記録されているショット数でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法に供することで該試料の質量分析を行い、結果として生じる質量スペクトルを作成する工程；および
得られた質量スペクトルまたはその特徴を対照となるスペクトルまたはその特徴と比較する工程
をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
目的とする２種またはそれ以上の分子について、工程ａ）、ｂ）およびｃ）を実施する工程をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
濃度が不明な試料をヒトより得るところの、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
濃度が不明な試料が食品または環境試料であるところの、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
対照スペクトルを少なくとも１００，０００回のショットより得るところの、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
対照スペクトルを少なくとも５００，０００回のショットより得るところの、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
対照スペクトルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ試料プレート上の２またはそれ以上のスポットより取得し、各スポットを２０，０００回より多くのショットに供するところの、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
目的とする分子が約１ＫＤａ〜５０ＫＤａの質量範囲にあるタンパク質を含むところの、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
目的とする分子が代謝物を含むところの、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
目的とする分子が、癌抗原１２５、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびＣ−反応性タンパク質からなる分子の群より選択されるところの、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１２年５月２９日付け出願の米国仮特許出願番号６１／６５２３９４に対して３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９の下で優先権の利益を主張するものであり、その内容をそのまま本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の開示は、質量分析法、バイオマーカー・ディスカバリー、アッセイ・ディベロップメント、および臨床試験の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
（最新技術）
ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）ＴＯＦ（飛行時間型）質量分析法においては、試料／マトリックスの混合物を金属プレート（ＭＡＬＤＩプレートとして知られる）上の所定のロケーション（本明細書では「スポット」または「試料スポット」という）に配置する。レーザー光をスポット上のロケーションに一瞬当て（「ショット」として知られる）、試料の分子または他の成分を脱離してイオン化させる。試料の成分がイオン検出器まで「飛行」する。該装置は試料中の成分（分子）の質量対電荷比（ｍ／ｚ）および相対強度を質量スペクトルの形態にて測定する。
【０００４】
典型的には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定において、ＭＡＬＤＩプレート上の各スポットに数百回のショットが適用され、得られるスペクトル（一ショットに付き一のスペクトル）をまとめるか、または平均化し、各スポットについて一の全質量スペクトルを作成する。米国特許第７，１０９，４９１号は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法に使用される典型的なＭＡＬＤＩプレートを開示する。プレートは多数の個々のロケーションまたはスポットを含み、その場所で、試料は、典型的には、おそらくは数百のかかるスポットが一の配列にて配置されているプレートに適用される。
【０００５】
少なくとも、血清および血漿などの複合的生物試料の質量分析の領域における社会通念は、およそ１０００回より多くのショットを試料に供する必要はなく、そうでなければタンパク質の含有量が枯渇し、その装置のレーザーおよび検出器が過度に損耗し、しかもさらにショットしても、該試料についてさらなる情報を有意な量で得ることができないというものである。よって、例えばバイオマーカー・ディスカバリーを研究する間で、質量分析法によるデータを複合的生物試料から取得する場合には、試料スポットに付き５００−１０００回のショットを用いるのが一般的である。
【０００６】
血清または血漿の標準的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおいて検出可能なタンパク質の数は、循環中のタンパク質の存在量の広いダイナミック・レンジにより制限されると考えられる(Hortin G.L.、The MALDI-TOF mass spectrometric view of the plasma proteome and peptidome. Clin. Chem. 2006; 52:1223-37)。かくして、血清のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳは、１リットルに付き数マイクロモルの範囲の高い存在量のタンパク質で可能であるにすぎないと、一般的には考えられる。このことは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法が極めて高感度の技法であり、精製された試料中にたとえ微量であっても検出し得るとの観察に反するものである。（Albrethsen J.、The first decade of MALDI Protein profiling: A lesson in translational biomarker research. J. Proteomics 2011 74: 765-73）。本特許出願はこの不一致を説明するものであり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの高感度を単純試料から複合的生物試料にまで拡張する方法を提供する。
【０００７】
本発明の譲受人に付与された米国特許第７７３６９０５号は、とりわけ、生物試料（例えば、血清）のピーク同定方法、スペクトル配列方法、正規化方法および質量スペクトルを予め処理する他の技法、および抗癌薬の投与に対する患者の応答を予測する際のその使用を記載する。その’９０５特許はその中身がそのまま本明細書に組み込まれるものとする。
【発明の概要】
【０００８】
最近の試験的研究において、本発明者らは、同じＭＡＬＤＩスポットからの多数の（２０，０００回より多く、典型的には１００，０００回〜５００，０００回の）ショットを集めて平均化すること、あるいは同じ試料の複数のスポットから由来の蓄積したスペクトルの組み合わせを集めて平均化することで、ノイズのシグナルに対する相対レベルの減少が得られ、複合的生物試料の質量分析法から有意な量のさらなるスペクトル情報が明らかとなることを見出した。その上、種々の基準となるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いるパラダイムは明らかに間違っていると思われる。第一に、スポット上のタンパク質の含有量が完全に枯渇する前に、単一のスポットに数十万回のショットを行うことが可能である。第二に、多数のショットを平均化することで得られるノイズの減少はこれまでに可視化できなかったピーク（すなわち、１０００回のショットでは明らかでないピーク）の出現をもたらす。第三に、これまでに可視化できたピークであっても、より明確に特徴付けられ、試料を極めて多数の（１０００回よりもずっと多い）ショットに供する場合に、さらに信頼できるピーク強度の測定、および試料間での比較が可能となる。
【０００９】
一例として、本発明者らは、意外にも、血清または他の血液性試料が、複数のＭＡＬＤＩスポットを用いて、スポット当たり２０，０００回よりも多いショット、典型的にはスポット当たり２５０，０００回以上のショット、まさに２，８００，０００回のショットに供された場合に、各実験で、該スポットのタンパク質含有量が使用できなくならなかったことを示す、発見をした。さらには、試料を典型的な５００または１，０００回のショットに付した時には明らかでない、極めて有意な量のスペクトル情報（ピーク）がこれらの数のショットで取得されるスペクトルに含まれていることが分かった。例えば、２００，０００回のショットで明らかとなるピークは、血清試料中に存在する微量な無傷の（未消化の）タンパク質に相当するものと考えられる。本明細書に記載の技法、および本明細書にて「ディープ−ＭＡＬＤＩ」方法（すなわち、同じスポットから、または複数のスポットの組み合わせから、スポット当たり２０，０００回より多くのショット、好ましくはおおよそ２５０，０００ないし７５０，０００回以上のショットに付される方法）と称される技法を用いる場合、極めて多くのタンパク質が、場合によっては、血清試料中に存在するタンパク質全体の少なくとも半分が、半定量的および再現可能な様式で検出され得る。半定量的様式での検出は、強度（ピーク高、ピーク下面積）の測定値が、試料中のタンパク質の絶対的存在量または濃度と関連付けられることを意味する。再現可能な様式での検出は、同じ試料を何度も測定し、許容可能な変動係数の範囲内で同じ結果を得ることができることを意味する。
【００１０】
単一のＭＡＬＤＩスポットから２０，０００回より多くのショットを得ることは、最新のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置の限界を上回り得る；しかしながら、本発明者らはこの明細書にてこの限界付近で操作する数種の方法を記載する。理想的には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置は本明細書にて記載される「ディープ−ＭＡＬＤＩ」法に適合するように設計され、かかる装置について、自動ラスタ走査特性および単一スポット上に非常に多くのショットの実施能を含む、数種の具体的な提案が次の記載にて提示される。
【００１１】
ＭＡＬＤＩ試料スポットで数十万回のショットを用いる際に最も急を要する問題は、一般的なスポット調製においては、スポット内のあるいくつかのショットロケーションだけが、結合スペクトル中のシグナルに実質的に寄与するのに十分なイオン電流を発生させることである。初期の結果は、労働集約的な手動による操作を用い、レーザーショットに対してＭＡＬＤＩプレート上の一の所定のスポット内でイオン高収率のロケーションを視覚的に選択して取得され、この方法を続けることが可能であるが、レーザーショットのロケーションを選択する工程を自動化することが可能であり、それが本発明のハイスループットでの履行に好ましい（そうでなければ、簡単な理由として、多くのレーザーショットを無駄にすることなく、実質的にレーザーの寿命を下げることもない）。別の方法は、無作為に選択される最大多数のロケーションが高イオン電流を発生するようにＭＡＬＤＩスポットの質を向上することである。両方の方法共に、ディープ−ＭＡＬＤＩスペクトルの作成において有用である。
【００１２】
スペクトル取得を自動化するいくつかの方法が本願明視書に記載されている。その取得の自動化は、ラスタ方式にてスポットのレーザー走査の最適運動パターンを限定し、そして１個またはそれ以上のスポットから約７５０，０００または３，０００，０００回のショットを得るのに一のスポット内での別個のＸ／Ｙ座標のロケーションで複数のラスタ走査に付すための特定のシーケンスを作成することを含む。例えば、４個の試料スポットの各々について２５０，０００回のショットより取得されるスペクトルを合わせて１，０００，０００回のショットの一のスペクトルとすることができる。上記されるように、同じ試料を含有する複数のスポットで集められた数十万回から数百万回のショットを平均化して一のスペクトルを作成し得る。自動化の一の方法が、一の試料スポットを連続していないＸ／Ｙラスタ走査に供するラスタファイルを作成することを含む。別法は、スポットをサブグリッド（例えば、３ｘ３または５ｘ５グリッド）に分割し、サブスポットの別個のＸ／Ｙ座標のロケーションでラスタ走査に付するためのラスタファイルを作成することを含む。第三の方法として、スペクトル取得（複数のショット）のために相対的に高濃度の試料材料を含有する目的とする領域、および／またはタンパク質濃度が相対的に低いそれらの領域を同定するのに画像解析法を用いて、タンパク質濃度が相対的に高い領域でのスペクトル取得を行う方法が開示される
【００１３】
この開示のさらなる態様は、試料をＭＡＬＤＩプレートに適用する（「スポッティング」）方法を最適化し、単一のスポット内の試料／マトリックスのむらなく均一な結晶を生成することに関する。この方法は、自動化された方法を用いて、ＭＡＬＤＩプレート上の単一のスポットから数十万回のショットを得ることを容易にする。
【００１４】
本明細書のこの知見および方法には、バイオマーカーディスカバリー、試験開発、材料試験、現在の試験法の妥当性確認、および例えば、バイオマーカーディスカバリーの試みにおける仮説生成を含む、多くの用途がある。該方法はさらに、現在の方法と比べて、ハイスループット方式での、複合的試料中のさらに多量のタンパク質を再現して定量するその能力により、質量分析検査における「ダイリュートとショット」の可能性を強化する。例えば、該方法は、スポーツ選手のドーピング試験、例えばＴＨＣ分析物を検出するための薬物試験、代謝物試験、癌抗原１２５（ＣＡ−１２５）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）またはＣ−反応性タンパク質の存在および量を測定する試験、および環境および食品試験に用いることができる。他の応用例として、相対的研究を介して患者の既往試料からの臨床試料のタンパク質の含有量に基づき臨床試験を開発し、臨床の妥当性確認をフォローアップすることが挙げられる。
【００１５】
本明細書にて使用される用語：
１．  「過渡スペクトル」なる語は、ＭＡＬＤＩスポットにおける単一のロケーションまたはＸ／Ｙ位置を対象とする単一パケットのレーザーショット（各パケットは所定数のショット、例えば１００回、５００回、８００回等のショットからなる）より取得されるスペクトルをいう。
【００１６】
２．  「ロケーションスペクトル」なる語は、ＭＡＬＤＩスポットの同じロケーションにレーザー照射をｘ回行った１個またはそれ以上の過渡スペクトルの集積したまとまったスペクトルをいう。
【００１７】
３．  「スポットスペクトル」なる語は、単一のＭＡＬＤＩスポットを全体にわたって照射する間に取得されるすべてのロケーションスペクトルのまとまったものをいう。スポットスペクトルは、集計操作を行い、ロケーションスペクトルをまとめるだけで、あるいはロケーションスペクトルで配置操作および／または正規化操作（例えば、全イオン電流の正規化）を行った後で集計操作を行うことで取得することができる。スポットスペクトルは、典型的には、ＭＡＬＤＩスポット上の１０００００〜５０００００回のショットで取得され得る。スポットスペクトルを取得するのに、ａ）ロケーションスペクトルでのバックグラウンド除去および正規化を行い、まとめること；ｂ）ロケーションスペクトルでのバックグラウンド除去および配置操作を行い、まとめること；ｃ）ロケーションスペクトルのバックグラウンド除去、配置および正規化操作を行い、まとめることを含む、他の選択肢も可能である。本発明者らは、最良のダイナミックレンジが、ロケーションスペクトルを全イオン電流正規化に付し（詳細については、米国特許第７７３６９０５号を参照のこと）、次にまとめることにより達成され；いずれのバックグラウンド除去もスポットスペクトルにてなされうることを見出した。
【００１８】
４．  「ショットロケーション」なる語は、レーザー光が照射用のＭＡＬＤＩスポットをインターセプトする所定のロケーションをいう。ＭＡＬＤＩスポットに付き２０００００回または５０００００回のショットを得るために、レーザー光を、例えば、手動で、またはより好ましくは、ラスタ光がスポットを越えてラスタ走査する自動方式にて、ＭＡＬＤＩスポットを越えて多数（例えば、数百）の個々のショットロケーションに向ける。下記に説明されるように、すぐ隣のスポットロケーションを連続して照射することは一般に望ましくないため、ラスタパターンの設計が重要である。かくして、ラスタパターンの設計は空間としていくらか離れているショットロケーションを連続して選択し、ＭＡＬＤＩスポット全体にわたって空間的にシフトする方式にて走査を繰り返し、スポット内のすぐ隣のロケーションを連続して照射することを回避する。
【００１９】
５．  「過渡スペクトルの選別」なる語は、過渡スペクトルを受け入れるか、または拒むのかに用いる選別または選択工程をいう。一例として、過渡スペクトルの選別にて、過渡スペクトルが受け入れられるためには、所定のｍ／ｚの範囲内にある最低数（例えば、５個）のピークがその過渡スペクトルになければならず、過渡スペクトルにおけるシグナルのノイズに対する割合は特定の閾値より上になければならない。スペクトルの全イオン電流がある所定の閾値を越える必要があるなどの他の選別基準を用いることもでき、または下記に説明されるような除外リストまたは包含リストを用いることによって選別基準を設けてもよい。スペクトルの選別は全体において過渡スペクトルを許容するか、拒絶するかのいずれかである。
【００２０】
６．  本明細書にて使用される場合、「複合的生物試料」なる語は、その大多数が大きなダイナミックレンジにわたって、典型的には数桁にわたって広がっている、数十万個の分析物、例えば無傷のタンパク質を含有する試料として定義される。かかる複合的生物試料の例として、血液またはその成分（血清または血漿）、リンパ液、導管流体、脳脊髄液および前立腺圧出液が挙げられる。かかる複合的生物試料はまた、環境または食品試料からなり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａ−１Ｃは、選択される質量／電荷の範囲（ｍ／ｚ）の割合（ｍ／ｚ比  ７０００〜８０００）にある同じ試料の３種のＭＡＬＤＩ質量スペクトルの一例であって、ショット数の増加に伴い検出可能なピーク体積が増加することを示す。図１Ａのスペクトルは２０００回のショットより得られ、図１Ｂのスペクトルは１０００００回のショットより得られ、図１Ｃのスペクトルは５０００００回のショットより得られた。本発明の方法より得られる図１Ｂおよび１Ｃのスペクトルが、どのようにして、図１Ａのスペクトルに存在せず、本質的にノイズとして認められる、その試料の豊富なスペクトル情報を示すのかに注意する。
【００２２】
図１Ｄおよび１Ｅは、質量スペクトルのさらなる例であり、本発明のディープ−ＭＡＬＤＩ法にて取得される膨大なダイナミックレンジのスペクトルを示す。図１Ｄにて、７１４０〜７８９０Ｄａのｍ／ｚ範囲にあるスペクトルの一部を、約５０００００回のショットで取得される豊富なスペクトル情報を示す図１Ｄの差し込み図にて拡大して図示する。図１Ｅにて、さらなるスペクトル情報を示すためにＹ軸を増幅し、ｍ／ｚが約９５２０の領域でのピーク（ディープ−ＭＡＬＤＩ法で暴露されるが、典型的な約１０００回のショットのスペクトルでは可視できない）のスペクトルを差し込み図にて図示する。
【００２３】
【図２】図２Ａは長方形のアレイにて３８４個の試料スポットまたは「スポット」を配置して含有するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的プレートの平面図である。スポットは列番号１．．．２４と、行記号Ａ．．．Ｐにより同定され、例えば左上部のスポットはＡ１として同定される。図２Ｂは、Ｘ／Ｙロケーション座標と、スポットの中心に起源（０，０）とを有する、５ｘ５の長方形のグリッドに分割して示される、個々の試料スポットＰ１の拡大図である。長方形のグリッドとロケーション座標を自動化ラスタ走査方法にて用い、本明細書に詳細に記載されるようにスポットから１０００００回以上のショットでスペクトルを取得する。
【００２４】
【図３】図２ＡのＭＡＬＤＩプレートの単一スポットに正確に置かれた生物試料／マトリックスの混合物の写真である。理想的には、該スポットは、図３に示されるように、そのスポット内にむらなく均一な結晶化試料を含有する。
【００２５】
【図４】図３のスポットから１０００００回以上のショットを得るのに使用する可能性のあるラスタ走査パターンの一例である。スポットを何度も（例えば、２５回）ラスタ走査する。図４に示される一連の各符号（トライアングル、スクエア、Ｘ等）は、個々に別個のＸ／Ｙロケーションを示し、スポットは一回のラスタ走査で走査（ショット）される。各ロケーションでは、スポットを何度もショットに、例えば７００または８００回のショットに供することができる。
【００２６】
【図５】図３の試料スポットでの図４のラスタ走査パターンの重ね合わせを図示する。
【００２７】
【図６】例えば、図２Ｂまたは図５のラスタ走査において、ロケーション／ラスタに付き８００回のレーザーショットで蓄積されたスペクトルを集計するためのコマンドを示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置のユーザーインターフェースから由来のスクリーンショットである。
【００２８】
【図７】試料／マトリックスの混合物が空間的に均一な様式で結晶化しない領域を示す試料スポットの一部の画像である。
【００２９】
【図８】装置内のカメラで捕らえられた一部のスポットの画像を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置のユーザーインターフェースから由来のスクリーンショット、およびスポットの自動ラスタ走査のための一群のスポットの選択を示す。
【００３０】
【図９】スペクトル評価手段、スペクトル集積手段および異なるパターンでのファイアリングのためにスポットを横切るレーザーの移動手段を示す、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置のユーザーインターフェースから由来の別のスクリーンショットである。
【００３１】
【図１０】データ取得の間の過渡スペクトルを許容または拒絶するための評価頁のスクリーンショットである。
【００３２】
【図１１】バックグランドピークを削除するための除外リストを示すスクリーンショットである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
１．概説
例えば、血液的試料などの複合的生物試料を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析にて、単一のスポット上で多数のショット（＞２０，０００回のショット、さらには１００，０００回または５００，０００回のショット）に供することで、ノイズレベルが減少し、これまで可視できなかったピーク（すなわち、２，０００回のショットで明らかでなかったピーク）が明らかとなることが判明した。その上、この操作は、試料中のタンパク質の含有量を枯渇させることなく、行うことができる。さらに、これまで可視できたピークはさらに鮮明となり、試料間でより信頼される比較が可能となる。血液性試料の標準的なスペクトル（約１，０００回のショット）では、典型的には６０−８０種のピークが可視でき、それに対して２００，０００回のショットで、典型的には約２００−２２０種のピークが可視でき、５００，０００回のショットで、典型的には約４５０−４８０種のピークが可視でき、２，８００，０００回のショットで、典型的には約７６０種のピークが可視できる。本明細書で報告されるピークの数はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置のセッティングに関するものであり、これらの数はおおよその目安に過ぎず；装置のセッティングに応じて、また個々のピーク検出アルゴリズム（および、もちろん、実際の試料）に応じて、より多くの、または少ないピークが可視できることを認識すべきである。さらに、ピークの質およびその強度（量と関連付けられる）も、下記の図１Ａ−１Ｄにて説明されるように、少なくともある測定の下で改善されていることに留意すべきである。
【００３４】
図１Ａ−１Ｃは、同じ試料（血清）の３種のスペクトルを示しており、選択された範囲の質量／電荷（ｍ／ｚ比  ７，０００〜８，０００）のプロットであって、ショット数の増加に伴い、検出可能なピークの体積が増加することを示す。図１Ａのスペクトルは２，０００回のショットより得られ、図１Ｂのスペクトルは１００，０００回のショットより得られ、図１Ｃのスペクトルは５００，０００回のショットより得られた。図１Ａのスペクトルが本質的にノイズとしてどのように示され、関心のある認識できるスペクトル情報をほとんどまたは全く有しないことが明らかであることに特に留意する。図１Ａと図１Ｂを対比して、図１Ｂのスペクトル（１００，０００回のショットより取得されるスペクトル）は、図１Ａのスペクトル中には存在しない、個々のピーク（例えば、１０で特定されるピーク）を多く含有する。図１Ｃのスペクトルにて、そのスペクトルに示されるが、他のスペクトルでは示されないか、またはスペクトルの基部にてノイズと見なされる可能性のある、多くのピークがある。図１Ｃおよび１Ｂを図１Ａと比較した場合、図１Ａ（２，０００回のショット）のスペクトルでは存在しない、豊富なスペクトル情報が１００，０００回のショットおよび５００，０００回のショットで明らかにされ、図１Ｂおよび１Ｃで示されるように、ディープ−ＭＡＬＤＩ法によりノイズレベルが減少する。
【００３５】
図１Ｂおよび１Ｃのスペクトルでは、該スペクトルのダイナミックレンジに対する感度が上がっており、ピーク強度を存在量に相関させることができる。ピーク強度を用いて複合的生物試料を所定の濃度で存在する分子の存在について解析することが可能である。例えば、この方法では、試料中の目的とする（質量が既知の）分子を定め、標体を標的とする存在量のレベル（モル濃度、またはｐｐｍ）にまでドープし、ＭＡＬＤＩプレートに適用し；分子が標体中に特定の存在量（強度）でスペクトル中に確実に存在するまで（既知のｍ／ｚ位置でピークが存在するまで）、多数（例えば、１００，０００回より多く）のショットをプレートに対して行い、そのショット数（「ｘ」）を記録する。「対照スペクトル」と称されるスペクトルを作成するこの操作を慣用的定量および標準化方法に供し、当業者に明らかであるように、信頼性を保証する。このように、試験の目的とする試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびｘ回のショットに供する。得られたスペクトルで、目的とする分子に対応する既知の位置でのピークの強度が、対照スペクトル中のピークの強度よりも小さいとなれば、その場合には、試料中の目的とする分子の濃度が対照スペクトルの作成に用いられる試料中の分子の濃度よりも低い。この方法は複数の分析物に同時に用いることができる。さらには、目的とする分子について、ｘ回のショットで既知の一連の濃度にわたって複数の対照スペクトルを得ることができ、試験スペクトルを対照スペクトルと対比し、試験試料中にある目的とする分子の濃度の概算を決定し得る。この方法は、例えばアスリートの薬物試験、代謝物濃度の試験、環境試料試験等などの多くの目的に使用され得る。目的とする分子は、ほぼ１Ｋダルトンないし５０Ｋダルトンの質量範囲にある、タンパク質、例えば代謝物、癌抗原（ＣＡ）１２５、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｃ−反応性タンパク質等であり得る。
【００３６】
図１Ｄは、ディープ−ＭＡＬＤＩ法にて明らかにされる、スペクトルにおける膨大なダイナミックレンジの一の実例である。図１Ｄ中の差し込み図は、ｍ／ｚが７１４０ｋＤａと７８９０ｋＤａの間の範囲にあるスペクトルの一部であり、約５００，０００回のショットで得られるスペクトルおよび多数のピーク１０を示す。バックグランドの推定値（点線）を該スペクトルに重ね合わせ、それを差し引き、バックグラウンド除去したスペクトルを作成することができる。差し込み図のスペクトル情報、特にピーク１０の多くが図１Ｄの主たる部分では可視できない。図１Ｅにて、さらなるスペクトル情報、特に強度情報を示すためにＹ軸を増幅し、ｍ／ｚが約９５２０の領域でのピーク（ディープ−ＭＡＬＤＩ法で明らかにされるが、典型的な約１０００回のショットのスペクトルでは可視できない）のスペクトルを差し込み図にて示す。
【００３７】
図２Ａは長方形のアレイにて３８４個の試料スポットまたは「スポット」１４を配置して含有するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの標的プレート１２の平面図である。スポットは列番号１．．．２４と、行記号Ａ．．．Ｐにより同定され、例えば左上部のスポットはＡ１と同定される。図２Ｂは、その上に起源（０，０）を有するＸ／Ｙ座標システム（１６）を重ね合わせた、個々の試料スポットＰ１（１４）の拡大図である。該試料スポット（１４）は５ｘ５の長方形のグリッド（２５）に分割され、個々のサブスポット（１８）で示される。長方形のグリッド（１８）とロケーション座標システム（１６）を自動化ラスタ走査方法にて用い、下記に詳細に記載されるようにスポットから１００，０００回以上のショットを取得する。
【００３８】
大多数のショット（＞２０，０００回）の自動生成が絶対に必要であるわけではなく、現在利用可能なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置に現存する特徴が使用され得ることにまず留意した。一般に、現在のディープ−ＭＡＬＤＩ法では、レーザーショットに暴露された場合に、高いタンパク質収率をもたらすＭＡＬＤＩスポット上のロケーションを選択することが重要である。現存する質量分析装置の標準的ソフトウェアは、規則正しい予め定められたパス、すなわち（スポットの中心から）スクエアパターン、ヘキサゴンパターン、スパイラルパターンを用いてスポットを移動することを可能とする。ＭＡＬＤＩプレートのショットロケーションは、Bruker Corporationの既存のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置に入れられているFlexControl（登録商標）（Bruker）質量分析制御ソフトウェアの一部である、「ティーチング」と称されるプロセスにて決定される。（本明細書にて、折に触れて、Bruker Corporation装置の機能に言及するが、本発明の方法は、もちろん、特定の製造業者の特定の装置に限定されるものではない。）
【００３９】
被検査物／マトリックスの混合物をスポットに均等に分布して含有するＭＡＬＤＩスポットの一例を図３に示す。Bruker Corporationからの質量分析装置には、ＭＡＬＤＩスポットの領域を表示するカメラが内蔵されており；光り輝くロケーション３０を手動で選別し、レーザーを狙い定める。暗いロケーション３２は回避すべきである。光り輝くロケーションで高収率が得られないことが時にあるが、それは塩の結晶の存在と関連付けられるかもしれない。照射の間に、スポット中の領域は枯渇し始めうる；そのため、暗い領域（枯渇した収率の低い領域）は回避する必要がある。手動でのアプローチを続け、照射の間のスポットの画像を取得し、表示する。
【００４０】
予備実験の間に、本発明者らは、ショットを用いれば用いるほど、優れたロケーションを見つけることがますます困難になることを見出した。この効果は同じスポットを繰り返し用いた場合、例えば前の５０万回のショットの後に、２回目の５０万回のショットを付加する場合にも見られた。２回目のショットで、期待されるような質量スペクトルにおけるノイズレベルの大きな減少は得られなかった。実際に、得られる平均化されたスペクトルは全体の質が悪く、それはおそらくは空のロケーションが過多で、そのショットを平均化しているためである。これは、ショットロケーションを選択し、スペクトルを許容または拒絶するのに肉眼だけを用い、過渡スペクトルの選別を用いない場合に、初期のロケーションに対するバイアスの取得をもたらす可能性があり、かかるバイアスは制御する必要がある。仮に自動化ラスタ走査およびロケーションスペクトルの選別を用いるならば、このバイアスは排除される。
【００４１】
しかしながら、スループットを向上させるには、ロケーション選択の工程を自動化し、所定のスポットから多数のショットを取得することが望ましい。次のセクションには、数種の方法が記載される。以下に記載の方法は、血清（３μＬ）の試料要件で、ＭＡＬＤＩプレートにおける３つのスポットに置かれた一の試料から１３−１５分に７５０，０００回のショット（スポット当たり２５０，０００回のショット）を取得する能力を有する。
【００４２】
２．スペクトル収集の自動化
ＭＡＬＤＩプレート上の所定のスポット内で複数のショットのためのロケーションを肉眼で選択し、スポット当たり１００，０００回または５００，０００回のショットを得るのに労働集約的な手動工程を用いて結果を得、この方法を推し進めることも可能であるが、レーザーショットのロケーションを選択する工程の自動化が可能であり、数種の方法が本明細書に記載される。その取得の自動化は、ラスタ方式におけるスポットのラスタ走査の最適移動パターンを限定すること、および一のスポット内にある別個のＸ／Ｙロケーションで複数のラスタ走査を行うためのシーケンス発生に付し、例えば試料スポットから１００，０００回、２５０，０００回または５００，０００回のショットを得ることを含む。自動化の一の方法として、一の試料スポットの連続していないＸ／Ｙラスタ走査についてラスタファイルを作成することが挙げられる。すぐ隣にあるスポットのロケーションを連続してショットすることは一般に望ましくないため、ラスタパターンの設計は重要である。かくして、ラスタパターンの設計は、空間的にある程度離れているショットロケーションを連続して選択し、空間的にシフトする方式にてＭＡＬＤＩスポット全体の走査を繰り返し、該スポットにおけるすぐ隣のロケーションを連続して照射することを回避し、新たなショットロケーションを選択する。
【００４３】
他の方法は、スポットをサブスポットのグリッド（例えば、３ｘ３または５ｘ５のグリッド）に分割し（図２Ｂを参照のこと）、そのサブスポットの別個のＸ／Ｙロケーションでラスタ走査のためのラスタ走査ファイルを作成することを含む。
【００４４】
第三の方法は、画像分析法を用い、スペクトル取得（多数のショット）のために相対的に高濃度の試料材料を含有する目的とする領域を同定するように、および／または試料（例えば、タンパク質）濃度が相対的に低いそれらの領域を同定し、相対的に低濃度の試料（例えば、タンパク質）の領域でのスペクトル取得を回避するように開示される。
【００４５】
Ａ．  連続していないＸ／Ｙ座標のラスタ走査
一のスポットから多数のショットを取得する工程の一の自動化方法は、一の試料スポットの連続していないなＸ／Ｙラスタ走査のためのラスタファイルを作成することを含む。この方法を図４および５と関連して記載する。
【００４６】
図４は図３のスポット１４から１００，０００回以上のショットを取得するのに用いるためのラスタ走査パターン４００の図面である。スポット１４は連続的に複数回、例えば２５回ラスタ走査される。図４に示される一連の符号は、スポットが単一のラスタ走査にてスキャン（ショット）される、個々に別個のＸ／Ｙロケーションを示す。Ｘ／Ｙロケーションは中心（位置０，０）を起源とする図示される座標系に従って規定される。走査する間で、ラスタが各ロケーションに向けられる時に、そのロケーションにある試料は極めて多くのショット、例えばポジション／ロケーションに付き７００回または８００回のショットに供され得る。図４に示されるパターンから、各ラスタ走査がそのスポット内で個々に別個のロケーションを照射することからなることが分かる。個々のラスタ走査は連続してなされ、それによりスポット内のすぐ隣のロケーションを照射することを回避する。図５は図４のラスタパターンの図３のスポットへの重ね合わせを示す。
【００４７】
図４に示されるラスタ走査のための連続していないＸ／Ｙ座標での２５のラスタファイルを作成する操作はアペンディクス１に記載されており、それも本明細書の開示の一部である。
【００４８】
Ｂ．  スポットをサブスポットに分離するためのグリッドの使用およびサブスポットのラスタ走査
この方法の目的は、データ取得の間に「許容される」スペクトルをもたらす、試料スポット（すなわち、スポットＡ１、スポットＡ２等）上のロケーション／ラスタを手動で選択する工程を自動化し、数十万のスペクトルがサム・バッファー（sum buffer）に加えられるまでこれを行うことである。数十万のスペクトルをまとめ上げ／平均化することは、シグナル／ノイズの割合を増大させ、したがって上記されるように有意により多くのピークの検出を可能とする。
【００４９】
上記される連続していないラスタ走査を用いる場合のように、このセクションに記載されるようなグリッドの使用は、試料／マトリックス混合物が、図３に示されるように、スポット全体にわたって実質的にむらなく均一に分配されている場合に最もよく機能する。本発明にてこれを行うのに好ましい方法は、本明細書中、血清およびシナピン酸（マトリックス）の希釈および照射について後記される。したがって、本発明者らは、このむらのない分配のために、試料スポット上の実質的にすべてのロケーション／ラスタからスペクトルを取得し、そのことはすべてのロケーション／ラスタを「許容される」スペクトルについて前駆的に評価する必要性を排除する。
【００５０】
一の試料スポット上の数十万のスペクトルの収集は、スポット１４をサブスポットまたはグリッド因子１８（試料スポットを覆う）にさらに細かく分割するグリッド（図２Ｂ）を規定し、所望の数のスペクトルがサム・バッファーに加えられるまで、各サブスポット１８内の各ロケーション／グリッド点／ラスタから所定の数のスペクトルを集めることにより達成され得る。従来バージョンのBrukerソフトウェアは、自動方式で試料スポットに付き合計で最大２０，０００種のスペクトルの総和を可能とするに過ぎない（図６）。
【００５１】
この限定を回避するために、本発明者らは最初に５ｘ５のグリッド領域（図２Ｂ、１６）を規定し、それで各試料スポットを２５個（８ｘ８）のグリッドまたはサブスポット１８に分割する（図２Ｂ）。各グリッドまたはサブスポット１８について別個のラスタファイルを作成する。装置は、２０，０００個のスペクトルが（スペクトル）サム・バッファーに加えられるまで、グリッド１８内の各ロケーション／ラスタで８００個のスペクトル（ショット）を取得するようにする。その時点で、自動化方法１は、該装置が次のグリッドまたはサブスポット１８に動き、次にラスタファイルを使用し、別の２０，０００個のスペクトルを作成するようにする。実際には、各サブスポット１８について１つの、２５個のラスタファイルを設計し、その各々を、別個のオートキセキュート（AutoXecute）ＴＭ法（Bruker）に適用し、その方法にセットアップした評価に従ってデータを取得する。
【００５２】
この操作で、各２０，０００回のショットのバッチにおいて、フレックスイメージング（flexImaging）ＴＭ（Bruker）などの画像アプリケーションを用いる必要がなく、Brukerのフレックスコントロール（flexcontrol）ＴＭソフトウェアのツールを用いて、５００，０００回のショットのスペクトル（グリッド当たり２０，０００回のショットのスペクトルｘ２５個のグリッド）の取得が可能である。この操作の結果は１の試料スポットに対して２５個のスペクトルファイルであり、各々が、合計で２０，０００個のショットスペクトルからなる１つのまとまったスペクトルを含有する。次にこれらの２５個のスペクトルファイルをまとめ、例えば図１Ｃ、１Ｄおよび１Ｅに示されるような、５００，０００回のショットより取得される、ＭＡＬＤＩプレート上の単一スポットに関する全スペクトルを作成することができる。
【００５３】
最新のバージョンのフレックスコントロールＴＭ（Bruker）は、５００，０００回までのショットから統合されたスペクトルを集積することを可能とする。例えば、図６でのオートエクセキュート（autoExecute）ＴＭ（Bruker）法のエディターは、８００個のショット工程（ロケーション／ラスタ当たり８００回のショット）にて合計で２０，０００回のショットを可能とする。
【００５４】
しかしながら、試料スポットに付き１つのまとまったスペクトル（ｘ個の過渡スペクトルの合計）を収集することができるに過ぎない。本発明者らはＭＳ装置において現存するソフトウェアの特性に調整する必要があった。これらの調整に伴って、本発明者らは、上記されるようなグリッドを形成する、１または複数のラスタよりスペクトルを取得し、個々に過渡またはロケーションスペクトルを記録し得る。例えば、該装置は、図２Ｂのグリッドまたはサブスポット１８における各ラスタ（ｘ、ｙ位置）で取得される各８００回のショットロケーションスペクトルを、サム・バッファーに加えることを必要とせず、収集して記録するようにされ得る。同じ工程を試料スポットＡ１、Ａ２、Ａ３等内のすべてのサブスポットについて繰り返す（例えば、８００個のショットスペクトルが試料スポットに付き２５０個のラスタより取得され得る、すなわち試料スポットに付き２００，０００回のショットが取得され得る）。ロケーションスペクトルは、オートエクセキュートＴＭ（Bruker）にてスペクトルの選別を適用して、または適用することなく取得され得る。
【００５５】
Ｃ．  画像解析
スペクトル取得を自動化するための一の選択肢は、特に、試料がスポット全体にわたって空間的にむらなく分散しておらず、代わりに別の領域で濃縮して存在する状況下にある、スポット上にある高タンパク質収率／高試料濃度の空間的ロケーションを同定するための画像処理方法である。一の可能性のある実施態様において、その装置に内蔵されているカメラを用いてトレーニングスポットの光画像を取得する。次に、質量スペクトルを該トレーニングスポット上のロケーションのラスタより取得する。得られた質量スペクトルを、該スポットの光画像と組み合わせて用いて分類機構を作製し、光画像から、所定の試料調製物より調製されるさらなるスポットの高収率ロケーションを検出する。この分類を次に実際の試料スポットに適用する。これはエレガントなソリューションであるが、カメラフィードをキャプチャーし、カメラ画像からレーザーショットのロケーションにロケーションを再現可能にキャリブレートする問題と遭遇した。
【００５６】
別の方法は、質量分析計を用い、一のスポットを質量スペクトル画像化方法にて直接研究するものである。この方法の意図は、まず、予備走査を行い、一のスポット上のファインスケール（スクエア）パターンの各ロケーションに少数のショット（数十回のショット）を照射することである。これらの各ラスタロケーションのスペクトルを収集し、ｍ／ｚの所定の範囲内にある全イオン電流、またはイオン電流を各ロケーションについて記録する。予備走査を実施して得られるＮ最高強度のロケーションに基づき新たなラスタファイルを作成し、最終の質量スペクトルの取得に使用する。この方法は、最適なソリューションとしてBrukerのフレックスイメージングＴＭソフトウェアを用い、質量スペクトルの画像化操作にて複数のスペクトルを作成する。ソフトウェアでこれらのスペクトルを解析し、最終のラスタ走査パターンを作成する。この方法はマトリックスとしてシナピン酸を用いる標準的な希釈および照射工程では有用である可能性があるが、他のマトリックスおよび予め分別された試料セットでは（例えば、ＣＬＣＣＡであって、Leszyk,J.D.、Evaluation of the new MALDI Matrix 4-Chloro-a-Cyanocinnamic Acid, J. Biomolecular Techniques, 21:81-91 (2010)を参照のこと）準最適であるかもしれず、他の方法ではＮＯＧ沈降法が適合する（Zhang N.ら、Effects of common surfactants on protein digestion and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of the digested peptides using two-layer sample preparation. Rapid Commun. Mass Spectrom. 18:889-896 (2004)）。この別法での重要な態様は、生成されるファイルが大きすぎないように、ＭＳ画像化部における取得のセッティング値を見つけることである。標準的な取得ファイルは、１メガバイトの次数であり、４００ｘ４００のラスタ走査（４００個のロケーション、ロケーションに付き４００回のショット)で、本発明者らは１６，０００個のスペクトルを作成する。これらのスペクトルの要件は全く面倒ではなく、本発明者らは全イオン電流を評価する必要があるにすぎないため、解像度を低くセッティングして操作することができる。自動スペクトル取得セッティングより使用可能なロケーションのリストを直接取得することが、すなわち取得に成功した、または失敗したリストを得ることが可能である。本発明者らの研究から、ＭＳ画像化パッケージの一部として質量の情報選別を用い、（ファイルリストを介して認識される）ロケーションのリストを作成することが可能であると思われる。このことはプロトタイプのワークフローを作成するのに大いに役立つであろうが、半手動工程を回避するには特化したソフトウェアを用いて最適化する必要があろう。
【００５７】
図７は、マトリックスとしてＣＬＣＣＡを用いるＭＡＬＤＩスポットの部位を示し、高収率の領域は線形構造物からなり、低収率の領域は暗領域として示される。これらのケースでは、マトリックス試料は図７に示されるように極めて不均一に結晶化し、画像解析法が最も理にかなっているようである。画像解析で相対的に高収率の領域（１２０、１２２）を確認する。左下部にある領域１２４などの相対的に低収率の領域およびマトリックス領域１２６は画像解析用ソフトウェアで確認され、照射の間では無視される。
【００５８】
スポット上の高収率および低収率の領域を確認するための画像解析用ソフトウェアは種々の形態を取ることができ、当業者により開発され得る。例えば、スポットの黒白の画像（図７）はピクセルの配列からなり、各々が８ビットの量子化された値を有し、０が黒色（シグナルなし）であり、２２５が白色（飽和状態）である。「高収率」と同定される約１００よりも大きなピクセル値を有するピクセル、および相対的に「低収率」と同定される４０よりも小さいピクセル値を有するピクセルを特定することによるなどの選別操作を用いて相対的に高収率の領域を確認する。次に対応するピクセルが１００以上の値を有する試料スポットの領域でピクセル走査を始める。ピクセル値が２４０−２５５であるスポットのロケーションの領域は、塩結晶または低収率をもたらす他の特性を有すると決定することができるため、かかるロケーションを選別して取り除くことも可能である。図７に再び関連して、結晶構造１２０、１２２のピクセルは１００−２４０の範囲内にあるピクセル値を有し、それで走査されるであろうが、黒色領域１２４および１２６は走査されない。形態学的処理技法を用いて図７の結晶１２０などの構造を確認することもできる。画像解析用ソフトウェアは、走査する領域を決定するのに、形態学的処理および選別することの両方を含みうる。さらに、走査工程の間に（試料が枯渇するために）スポットを変更し、画像処理を走査の間に行い、一のスポットから１００，０００回以上のショットを生じさせる工程にわたってその照射を最適化し、低濃度の試料のそれらのロケーションを照射の間に回避することが可能である。
【００５９】
図８は、プレートのスポット１４、この場合にはスポットＦ１７の画像１３２を含む、装置のワークステーション１３０のディスプレイを示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置からのスクリーンショットである。該プレートのレイアウトを１２’で示し、スポットＦ１７は１４’で示される．一群のスポット１３４（Ｄ９〜Ｆ２０）を、上記の画像解析方法を用いて、自動モードで作動させるために選択する。
【００６０】
図９は該装置から由来の別のスクリーンショットである。最新の装置は、使用者に過渡スペクトルを許容するか、拒絶するかの評価領域を設定し（評価タブを用いる）、スポットに付きどれくらいの数のスペクトルを蓄積させるかを設定し（蓄積タブを用いる）、レーザーが特定のパターンで発射しうるようにスポットを横切って「移動する」こと（図示されるように、「移動」タブを用いる）を可能とする。選択肢は、例えば、ヘキサゴンまたはスパイラルの形態の無作為なウォークまたは移動を包含する。ソフトウェアはまた、７５０回のショットのスペクトルを一のショットロケーションから収集し、ついで次のショットロケーションに移動するまで、使用者がレーザーを発射し、かかるパラメータに従ってすべてのスペクトルを取得し、添加し続けることを可能とする。ショットロケーションが失敗したスポットであると考えられるまでに、トライアルの回数を設定することができる。同様に、低収率の領域を確認し、その領域での照射を回避する画像解析方法は、これら判断の失敗を著しく減少または排除する助けとなる。
【００６１】
図１０は、１５０で示されるように、過渡スペクトルを許容または拒絶する質量範囲を選択する、評価の頁を示す。取得の間に、過渡スペクトルが、設定閾値（解像度、シグナル強度または他の因子に基づく）をパスする所定の範囲内に、この場合には５，０００〜１８，０００Ｄａの範囲内にピークを有しないならば、その時には該スペクトルは拒絶されるであろう。すなわち、過渡スペクトルはサム・バッファーに加えられず、ロケーションスペクトル（すべてのショットからのスペクトルのまとめ）を形成するであろう。
【００６２】
図１１は、評価に含めたくない特別なピークがある場合に、これらのピークを「バックグラウンド・ピーク」とする排除リストおよびタグを作成しうる、評価の頁を示す。ソフトウェアは、バックグラウンド・ピークを規定するマトリックス用の所定の「コントロールリスト」を有するか、またはピークリストを取り込むことができる。
【００６３】
３．  複数のスポットからのスペクトルの収集
一般に、ディープ−ＭＡＬＤＩ法を拡張し、複数のスポットからのスペクトルを合わせることができる。例えば、標準的ＭＡＬＤＩプレート上の各スポットＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４およびＡ５（図２Ａを参照のこと）から試料の５００，０００回のショットを取得し、その得られたスペクトルを合計で２，５００，０００個のスペクトル（ショット）からなる一の全体のスペクトルに合わせる（まとめる）ことができる。推測するに、複数のショットからのスペクトルを合わせて極端に大きな数字のショットに達することができない、すなわち１００個のスポットにて各スポットで１００万回のショットを行い、１億回のショットの結果を付与しうることができないと考える理由はない。この操作に実践上の制限、例えばレーザーはあまりにも頻繁に失敗するという制限があるかもしれない。
【００６４】
実施例
本発明の方法の一の実施例にて、上記される方法を用い、複数のスポットを走査するために手動でまたは自動的に生成されるラスタを用いて、ＭＡＬＤＩプレート上で同じ血清の複数のスポットから５百万回のショットから由来のスペクトルを収集することが可能である。この方法において、ＭＡＬＤＩプレート上で単一試料の均一のスポットを再現可能な方法で取得することが好ましい。これは上記した方法を用いて達成され得る。
【００６５】
１．希釈した血清のＭＡＬＤＩ標的プレート上へのスポット処理
操作：
血清をＨＰＬＣ等級の水で１：１０に希釈し、かき混ぜる。試料をマトリックス（５０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ中シナピン酸（２０ｍｇ／ｍＬ）と１：１（ｖ／ｖ）で０．５ｍＬのマイクロ管中で混合し、かき混ぜる。マトリックス／試料の混合物（４μＬ）でＭＡＬＤＩ標的上の１または複数のスポットにスポット処理する。
【００６６】
ＭＡＬＤＩプレートにある３６個のスポット（ロケーション）をこの実施例にて使用した：
管１：ＭＡＬＤＩプレートのロケーションＥ１３、Ｅ１４およびＥ１５上にスポット処理する
管２：ロケーションＥ１６、Ｅ１７およびＥ１８上にスポット処理する
管３：ロケーションＥ１９、Ｅ２０およびＥ２１上にスポット処理する
管４：ロケーションＥ２２、Ｅ２３およびＥ２４上にスポット処理する
管５：ロケーションＦ１、Ｆ２およびＦ３上にスポット処理する
管６：ロケーションＦ４、Ｆ５およびＦ６上にスポット処理する
管７：ロケーションＦ７、Ｆ８およびＦ９上にスポット処理する
管８：ロケーションＦ１０、Ｆ１１およびＦ１２上にスポット処理する
管９：ロケーションＦ１３、Ｆ１４およびＦ１５上にスポット処理する
管１０：ロケーションＦ１６、Ｆ１７およびＦ１８上にスポット処理する
管１１：ロケーションＦ１９、Ｆ２０およびＦ２１上にスポット処理する
管１２：ロケーションＦ２２、Ｆ２３およびＦ２４上にスポット処理する
【００６７】
試料のスポットＥ１３〜Ｆ１８（管１−１０）は、かき混ぜた後で、同じピペットチップで３回直接適用し（各管中の１５μＬのうち、３ｘ４μＬ）；その一方で最後の６個の試料のスポットＦ１９−Ｆ２４（管１１および１２）もスポットＥ１３−Ｆ１８のように適用するが、プレート上にはピペットでアップダウンさせて適用した。標的プレートを卓上に置くことでＭＡＬＤＩプレート上のスポットを外界温度で乾燥させた。
【００６８】
結果：
スポットＥ１３〜Ｆ１７（プレート上でさらに混合することなく、プレートに直に適用されているスポット）の場合、各管で３番目のスポットは最初の２つのスポットよりも明らかに均一であった。均一性は視覚的に評価し；３番目のスポットが最も均一で、２番目のスポットが２番目に均一で、最初のスポットが均一性が最も低かった；ただし、管４からの３個のスポットの２番目であるＥ２３はその例外であり、２番目のスポット処理よりも各管での３番目のスポット処理のように見えた。
【００６９】
管中でかき混ぜることで混合し、プレートにピペットでアップダウンして適用した試料のスポットＦ１８、Ｆ１９、Ｆ２０、Ｆ２１、Ｆ２３およびＦ２４は等しく同様であり、Ｅ１３〜Ｆ１７のセットの３番目のスポットと同じ均一な外観を有した。Ｆ２２はＥ２３とほとんど同じように見えた。
【００７０】
２．  ５百万回のショットからのスペクトルの取得
上記した操作を行った後に、スポットに付き約３１２，５００回のショットに付した質量スペクトルデータを１６個のＭＡＬＤＩスポット：
Ｅ１５、Ｅ１８、Ｅ２１、Ｅ２３、Ｅ２４、Ｆ３、Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１２、Ｆ１５、Ｆ１８、Ｆ１９、Ｆ２０、Ｆ２１、Ｆ２３、およびＦ２４
より取得した。
【００７１】
上記に、およびアペンディクスに記載のラスタ走査ファイルを用いて、各スポットからのスペクトルを総合し、約５，０００，０００回のショットより取得される試料の全体のスペクトルを作成した。
【００７２】
４．  ＭＡＬＤＩプレートへの試料適用（スポット処理）の最適化
ＭＡＬＤＩプレートへの試料適用を最適化し、結晶化試料をＭＡＬＤＩプレート上の各試料スポットに均一でむらなく分配した。その一例を図３に示す。下記されるように、いくつかの実験を行い、試料混合物のＭＡＬＤＩプレート上のスポットに供給する（「スポット処理する」）ための最適操作を見つけた。これらの実験をこのセクションで記載する。
【００７３】
最初に、血清との数種の異なる調製物を調製した。特記されない限り、マトリックス（２μＬ）を加えた。特記されない限り、希釈した試料と、マトリックス媒体とを試料調製管中で混合した。試料調製管から複数のアリコートを取ることは結晶化に影響を及ぼすため、特記されない限り、本発明者らは単一の調製管から１個より多くのスポットにスポット処理を付与しなかった。
【００７４】
研磨した金属プレート実験を行い、均一なスポットを生成した。操作は次のとおりであった：
【００７５】
１．  試料を１／１０に希釈し（２μＬの試料＋１８μＬの水）、次に５０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ中のマトリックス（シナピン酸、２５ｍｇ／ｍＬ）と１：１（ｖ／ｖ）で混合し、マトリックス（２μＬ）をスポット処理に付す。この操作で良好で均一な結晶は得られなかった。
【００７６】
２．  マトリックス・チップを準備する。マトリックス（２μＬ）をスポット・チップにピペットで付与し、それを３０秒間放置する。試料を１／１０に希釈し（２μＬの試料＋１８μＬの水）、次に５０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ中のマトリックス（シナピン酸、２５ｍｇ／ｍＬ）と１：１（ｖ／ｖ）で混合する。過剰量のマトリックスをピペット・チップからイジェクトする。ピペット・チップを試料・マトリックスの混合物に入れ、ピペットで３回アップダウンする。そのチップを変えることなく、試料・マトリックスの混合物（２μＬ）をスポット処理に付す。この操作により、均一で良好な結晶が形成された。試料・マトリックスの混合物が光沢のある金属プレートと同じくらいに広がらないのは、これが研磨した金属プレートだからである。ピペット・チップに残る乾燥した結晶は、それがさらなる結晶を形成するための種として機能することで結晶化を改善するかもしれない。
【００７７】
３．  温度の結晶化に対する効果を実験した。試料を１／１０に希釈し（２μＬの試料＋１８μＬの水）、次に５０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ中のマトリックス（シナピン酸、２５ｍｇ／ｍＬ）と１：１（ｖ／ｖ）で混合する。試料を３７℃の水浴中に５分間入れる。試料を水浴から取りだし、直ちにスポット処理に付す。この操作により、良好で均一な結晶は生成されなかった。
【００７８】
４．  上記の実験２を繰り返すが、試料の混合物を２μＬではなく４μＬでスポット処理に付す。この操作により、均一である良好な結晶が形成された。４μＬをスポット処理に付すことで、スポットの直径をすべて覆い、良好な結晶およびデータが生成される。これが現在のところ最適であると考えられる操作である。
【００７９】
コメント：本発明でスポット処理に付す操作は例示として提案されているものであり、限定するものではなく、この開示されている方法に変形を加えることももちろん可能である。例えば、管中でマトリックスと試料との混合物を混合し、スポット処理に付すまでにそれを数分間放置してもよい。より均一な結晶を得ることは、同じピペット・チップを用いて同じ管からより多くのスポットを生成することが分かる。例えば、同じチップを用いて同じ管から１０個のスポットをスポット処理に付し、最後から５個かそこらのスポットのデータを収集することができるに過ぎず；あるいはまた、ＭＡＬＤＩプレート上へのスポット処理を開始する前に、該管の最初の５個のアリコート（４μＬ）を廃棄し得る。
【００８０】
本発明者らは、同じピペット・チップを用い、同じ試料管から光沢のある金属の標的プレート上に１０回スポット処理（スポットに付き２．５μＬ）に付すが、１の操作に従って、同様の結果（スペクトルの質）が得られることも見出した。
【００８１】
５．  解析性能評価
技術再現性
技術再現性の実験は、例えば１００個のバッチで１，０００回の技術的再現を毎日行って実施され得る。（プレート上にある、またはプレート上にない）試料（スポット）調製物への依存性、特により均一なイオン電流の生成をもたらす調製方法があるかどうかを確かめるために、例えば試料の希釈度を変更して実験することができる。高収率のロケーションの数がスポットからスポットへどのように変化しているか、この変動をどのようにして最小限に抑えるかをモニター観察することもできる。取得および調製を高レベルの精度でモニターし、記録を付けることが実施において優れている。
【００８２】
試料間の再現性
試料間の変動と同様に試料間の再現性も実験され得る。新たな現象が起こるかもしれない：ある試料はタンパク質に富み、より高収率のロケーションを含むスポットが得られるかもしれない。ある種の試料の属性（光学密度および色相）から基準を得ることも、あるいは（例えば、血清用の）試料取得装置を画一化し、より再現可能な操作をすることも可能である。最大の変数をカバーしようとするのに、できるだけ不均一な供給源と組み合わせた試料のセットを用いてもよい。かかるセットは、研究中で、既知の試料の収集および条件に従って適合する、現存するセットから得るべきであり、そのことは現存する試料のデータベースの使用を強固なものとする。
【００８３】
感度
スペクトル中でより多くのピークを観察することは、この方法でどの存在量の範囲を見つけることができ、実際にタンパク質のどの型を可視できるのかといった問題を提起する。このことは、複合的試料のＭＡＬＤＩ  ＭＳにおいて、存在量がより多いタンパク質からのイオンが存在量の少ないタンパク質からのイオンシグナルを抑制する概念としての「イオン抑制」のために、存在量の少ないイオンを観察することができず、したがって存在量の少ないタンパク質は検出できなくなるという、「社会通念」を解決する。実際、ピーク体積の増加が観察されることは（例えば、図１Ｃを参考のこと）この解釈について疑問を投げかける。さらには、ＭＡＬＤＩ  ＭＳの（半）定量的特性を真摯に受け止めなければならないようである。仮にタンパク質の存在量が数桁にわたって広範囲に広がっているとするならば、その対応する質量スペクトルはピーク高（もっと厳密に言えば、ピーク下面積）において大きな違いを示すことによってこの挙動を模倣すると考える。存在量の少ないタンパク質がイオン化しないためではなく、むしろ該タンパク質に対応するピークの振幅は極めて小さいために、ＭＡＬＤＩスペクトルにおいて存在量の少ないタンパク質を観察しようとは考えない。質量分析法にて大きなピークに焦点を当てることが一般的な方法であり、存在量の少ないピークは桁違いに小さいため、これらのピークがこれまでに観察されていないことは意外でもなんでもない。イオン抑制のような現象が起きないとか、イオン化の可能性が一の役割を果たさないと言っているわけではなく、これらの現象が存在量の少ないタンパク質が起源であるピークを完全に抑制するものではなく、スペクトルの強度の低い領域にて存在量の少ないタンパク質のピークを探すならば、該タンパク質は実際に観察できるようになると言うものである。かなりの割合の血清プロテオームに及ぶ探求は、このように、質量スペクトルのダイナミックレンジを広げるための探求とみなすことができる。他の計数に基づくいかなる技法とも同様に、この問題に対する簡単な解決方法は検出されるイオンの数（飛行時間容器当たりのイオンの数）を増やすことで統計値を上げることである。
【００８４】
社会通念に反するこの簡単な解釈にてより信頼を得るために、質量スペクトルのダイナミックレンジを確立し、それをタンパク質の存在量と結び付けることが望ましい。これは共に分析化学の観点から、感度曲線（ｍ／ｚの関数として）を確立し、ならびにあるピークに対応するタンパク質の同定、およびＥＬＩＳＡのような直交技法を介してこれらのタンパク質の存在量の比較測定を介して行われる。
【００８５】
スパイキング実験を介する解析感度
考え方は、特徴付けられたタンパク質の濃度を変えて血清試料にスパイクし、対応するピークを観察することができるかどうか、そのスパイクピークが消えるまでその濃度が減少するかどうかを検討することである。５ｋＤａないし３０ｋＤａの質量範囲を、理想的には１ｋＤａの間隔で走査してタンパク質の標体を選択する。関心のある質量範囲と適切に密接する範囲を目標とすべきであるが、妥協することも必要である。より高い質量ではあまり厳密でないようにすることができる。対照実験は、タンパク質の標体を水中で復元し、血清の存在がいかなる効果を有するかを評価するように行うことができる。ショット数の関数としての存在量に対してピーク強度をグラフにすることができる。このことは該方法のダイナミックレンジの考え方を本発明者らに付与する。異なる数のショットについてスパイクが観察され得る（Ｓ／Ｎカットオフでパラメーター化される）最低濃度を示す感度曲線をｍ／ｚの関数として作成することもできる。
【００８６】
予め分別された試料の使用
この開示の方法は、試料を分画するための沈殿方法、例えばＮＯＧ沈殿法、脱脂方法等と組み合わせて使用され得る。該方法はＣＬＣＣＡ等の他のマトリックスと一緒に使用され得る。これらの方法はまた、ディープ−ＭＡＬＤＩ法から大きく利益を受け得る可能性がある。試料の前分別に用いる予備データは、異なるピークを実際に見つけるが、そのピーク体積は少しも最適でなかったことを示す。一の目的として、このことは存在量が極めて多いタンパク質を取り除くと考えられる。
【００８７】
過去には、本発明者らは、枯渇および／または質量選別を用いてアルブミンおよびヘモグロビンなどの望ましくないタンパク質の含量を減らそうとしてきたが、これらの方法はいずれも完全な除去に至らず、これらのピークは可視できるままであった。本明細書に記載の、枯渇した、または質量選別した試料でのディープ−ＭＡＬＤＩ法の使用は、大きなピークの減少はまた、存在量があまり多くないタンパク質を見つけるのに不可欠なダイナミックレンジを減らすため、より優れた結果をもたらすはずである。
【００８８】
６．  さらなる考察
ａ．スペクトル取得のセッティングの道理にかなった選択肢の獲得
オートエクセキュート（autoExecute）ＴＭ（Bruker）法において、特定の基準を通る過渡スペクトルを収集するだけのために、フィルターリングのセッティングを規定することが可能である；本発明者らの場合には、外部定義閾値よりも大きな全イオン電流を有するそれらの過渡スペクトル（＜ｘｘ＞回のショットより発生する）を加えたいだけである。これは単純な操作では可能であると思えないが、同様の目的に用いることのできる処理方法のタブには選別基準がある。あるいはまた、ピーク評価方法にてこの目的に適合しうるパラメータがある。これはショットの数を減らさないが、初期のショットに向かうショットバイアスの問題、すなわちノイズだけからなる過渡シグナルを取得しないという問題を克服する可能性がある。過渡スペクトルを統合し、ロケーションスペクトルを作成するにおいて、自動選別操作の使用はバイアスの問題を回避する。
【００８９】
ｂ．スペクトルを評価するのに標準的方法、例えば、予備処理方法、バックグラウンド減算、アラインメント等を使用する。そのまま本明細書に組み込まれる米国特許第７，７３６，９０５号を参照のこと。
【００９０】
ｃ．スペクトル選別を越えるスペクトル取得パラメータの最適化：
・  ロケーション当たりのレーザーショットの最適数
・  最適なレーザー出力（および標体を介するこの定義）
・  確実にプローブされ得る一のスポット上のロケーションの最適数
・  最適とされる質量範囲
これらすべてのパラメータは最適化され得る。
【００９１】
ｄ．複数のスポットから組み合わせたスペクトルの制限の決定（上記の検討を参照のこと）
【００９２】
ｅ．解像度の改良
さらに多くのピークがノイズの海から出ている場合（図１Ｃと図１Ａを比較した場合）に、ピークが多く重なっており、そのことが個々の種類を信頼できる様式で解像することを困難としている。本発明者らが所定のダルトンにある複数のピークを見つけることができるかは疑わしいが、本発明者らは目的とするｍ／ｚの範囲にわたって約１−５Ｄａの解像度を有することを意図とした。これは、電圧の変更および抽出セッティングの遅れ、ならびにデータ取得電子機器の最適化を要求する。もちろん、飛行時間の容器の幅が小さすぎるようにした場合には、これは飛行時間の容器当たりの検出事象の低下をもたらし、そのために各容器中のノイズのレベルは高くなる。解像度と容器数の増加（複数のショットを介する）の間で合理的な妥協を見出すことが必要である。
【００９３】
ｆ．ショットの数の関数としてのピーク体積の評価
１．Ｓ／Ｎ割合（振幅）の達成可能な範囲
ディープ−ＭＡＬＤＩ法の原理は、飛行時間の容器の絶対強度がノイズスケールとショット数の平方根とのみからなるのに対して、シグナルを含有するＴＯＦの容器の絶対強度がショット数と直線的に増加するとの簡単な観察（ある程度のキャビアートはある）に基づいている。かくして、ショット数が増えれば、ＴＯＦの容器当たりの事象も多くなり、結局はたとえ小さなピークであってもノイズと区別され得るようになる。検出されるイオンの数は、ピーク下面積と比例の関係にあり；所定のｍ／ｚの範囲では、ピークは類似する幅を有するとの仮定の下に、およびピークはガウス近似で分布しているとの仮定の下に、ピーク下面積は、ピーク高に形成因子（最大値の半分でのピークの幅（半値全幅、ＦＷＨＭ）に依存する）を掛けたものに比例する。所定の感度を達成しうるため、すなわちショット数を相関させ、所定の強度レベルにある既知のピークを表すために、ピーク振幅を豊富さと関連付ける標準曲線（ｍ／ｚの関数として）を有することは有益である。
【００９４】
２．Ｓ／Ｎカット−オフの関数としてのピーク数；ピークのさらなる定義
ピーク体積を測定する最も簡単な考えは、Ｓ／Ｎカット−オフの関数として検出可能なピークの数を測定することである；この方法での予備実験は予測される挙動を示さず、すなわちスモールＳ／Ｎカット−オフである。これはローＳ／Ｎカット−オフでのピーク検出装置の過敏性により引き起こされるのかもしれない（あるいはノイズ評価に由来する）。この挙動に対するさらなる証拠が、少ないショットで検出されるピークのいくらかがより多くのショットでは消失する観察で得られる。関連するＴＯＦ容器中での事象の数が少な過ぎてノイズを評価する者がその少ないショットについて十分に評価できないと思われる。スペクトル（図１を参照のこと）を見て、より多くのショット（１００，０００回または５００，０００回のショット、図１Ｂおよび１Ｃ）がより少ないショット（２，０００回のショット、図１Ａ）よりもピークが視覚的により明確であるのは明らかであり；この評価をさらに定量的とするためにピークの定義についてさらなる基準を加えることが望ましい。
【００９５】
ｇ．方法の再現性の測定
ディープ−ＭＡＬＤＩ法の技術再現性を測定し、すなわち、ショット数の関数として、技術複製物（同じ試料の複数のスポット）からのディープ−ＭＡＬＤＩスペクトルを比較しうる。これは、変動係数（ＣＶ）対振幅特性曲線を、理想的には同じピークについて重ね合わせることにより測定されるべきである。初回パスにおいて、技術再現性を予備決定するのに１００個の技術複製物で十分であった。個々のピークのｍ／ｚを測定するのにＣＶを測定し、達成可能な質量精度の評価基準を得ることもできる。このことはスペクトル配列と共にまたはなしでなされるべきである。
【００９６】
１００個の技術複製物から由来のディープ−ＭＡＬＤＩスペクトルがある場合に、さらなる解析を行うこともできる。本発明者らは一群１０個の複製物を組み合わせ、再度、ピーク体積および再現性を測定しうる。あらゆる技術複製物を合わせ、原則として、スポットに付き個々の回数のショットを１００倍して得られるスペクトルと同様のスペクトルを得る。
【００９７】
ｈ．試料にわたって共通するピークの発見
確立された技術再現性がある場合に、異なる血清（または他の血清）試料より生じるピーク体積の変動を研究することができる。試料間（ＳＴＳ）の再現性を評価し、対象にわたって共通するピークを発見することができる。「健康な」対象を含有する先入観のない試料のセットで研究を行い、共通のピークを発見することが都合がよいと考えられる。２つの選択肢：初期の診断セット、例えば、標準的な希釈および照射のセッティングにて多くを示さない前立腺のセットの一つと、「健康な」対照と種々の癌の場合の混合物のセットが明らかである。解析は約１００個の試料の大きさで最適なセットを定める必要がある。
【００９８】
ｉ．配列、正規化およびピークの定義
本発明の方法の一の用途は、ディープ−ＭＡＬＤＩスペクトルを用いて共通するピークを発見し、列挙することである。ピーク体積は、ＣＶ対振幅特性曲線を用いて、理想的にはショット数（または他の適切な評価基準、例えばＴＯＦ容器当たりの事象の数、．．．）の関数として評価される。この操作はまた、一連の配列ピークにも至りうる。同じ方式で、種々の正規化操作を評価することを切望してもよい。本発明者らは、今日では、観察可能なｍ／ｚの範囲全体にわたって広がるより多くのピークを有しているため、領域に基づく正規化を促進するのに十分に大きな情報を与えない領域があるとは考えにくい。むしろ、ピークに基づく部分イオン電流（ＰＩＣ）の正規化を開発しうる。これには血清中に存在する安定した（位置および振幅の両面で安定した）ピークを同定する必要がある。このための方法は、そのアルゴリズムにおける停止基準を欠くために、いくらか恣意的であるから、スペクトル配列に使用される一連の所定のピークに類似する、そのような一連のピークを予め規定しておくことが都合がよい。
【００９９】
本発明の方法のさらなる用途はバイオマーカーの発見に用いるものであるが、本発明者らが現在使用するよりもさらにずっと大きな特徴集合を有する。その特徴集合はかなり大きいため、これはアルゴリズムのある部分に、例えば誤発見率の概算により優れた性能をもたらすに至るかもしれない。ディープ−ＭＡＬＤＩスペクトルより取得され得るより優れたピークの鮮明度は、情報とノイズの特徴の間でより明確な区別をもたらしうる。しかしながら、さらなる特徴を有することは、その特徴である選択の問題をより面倒とし、特徴を予め選別する必要性を際立たせる。
【０１００】
ｊ．ＭＡＬＤＩスポットの大きさの増加
レーザー照射の大きさ、ならびにグリッドの大きさを予めラスタ処理する工程のための最小とすることより生じる限界を考慮すると、標準的なスポットで十分なイオン生成のあるショットロケーションでは十分ではない可能性がある。これを処理する簡単な方法がスポットの大きさを増やすことである。フレックスイメージングＴＭ（Bruker）ソフトウェアはこの工程を極めて容易に支持する。この目的に適するかもしれないＭＳ画像用アプリケーションに使用される矩形スポッティング領域の選択肢もある。大きなスポットを用いることでさらに有利な点は、類似する数の適切なショットロケーションを位置付けることができるかどうか、スポット間で同じような質のスペクトルが得られるかどうかを心配する必要がないことである。試料の体積は問題を提起しないようである。スポットをより大きくすることが可能であるならば、ロジスティックを減らし、同じ取得のために複数のスポットで取り組むことができ、それは大多数のショットに不可欠かもしれない。
【０１０１】
アペンディクス
このアペンディクスは、連続していないｘ、ｙ座標の２５個のラスタファイルを作成する方法を記載する。該工程はBruker質量分析計装置で提供される手段に言及するが、これは十分に汎用されている方法であり、他の製造業者の装置にも適用可能である。
【０１０２】
次の工程を用いてヘキサゴンパターンに基づき２５個のセルグリッドを作り出した：
１）Brukerのラスタファイル「hexagon.raster」をノートパッドで開く。このパターンはＭＡＬＤＩ標的試料スポット上に分配されている８８９個の座標点を有する。
【０１０３】
２）端付近の座標点を除き、hexagon.rasterで座標点の数を８８９から７５０個に減らし、「hexagon750.raster」としてセーブする。図２を参照のこと。
【０１０４】
３）７５０個のｘ，ｙ点を、１バッチが３０個のｘ，ｙ点からなる２５のバッチに分け、それを２５個の別個のラスタファイル：「５ｘ５ １．ラスタ」、「５ｘ５ ２．ラスタ」、・・・「５ｘ５ ２５．ラスタ」としてセーブする。ファイルを、その名称が２５個のセルグリッドについて作成される名称であって、シーケンス発生装置を用いて作成された名称と同じであるように命名する（後記する事項６）を参照のこと）。結果は上記のように図４と同様である。
【０１０５】
４）２５個のラスタファイル（「５ｘ５ １．ラスタ」、「５ｘ５ ２．ラスタ」、・・・「５ｘ５ ２５．ラスタ」をMethods/AutoXRasterFileにコピーする。
【０１０６】
５）オートキセキュートメソッド「120411_375shots.axe」をオートキセキュート・メソッドエディターにて作成する。新たなメソッド「120411_375shots.axe」は、全スペクトルの蓄積数およびロケーション当たりのショット数を除いて、「120315_100kshot.axes」と類似している（表１）。
【表１】
2015518167.tif 000003
【０１０７】
６）シーケンス発生装置を原型に「強制」するために、上記されるように作成した２５個のラスタ（「５ｘ５ １．ラスタ」、「５ｘ５ ２．ラスタ」、・・・「５ｘ５ ２５．ラスタ」を用いてAutoXメソッドを作成する：
１．「作成方法」については「スクエア」を選択し、列ならびに行についてはセルおよびグリッドの次元数＝５を選択する（図４）。
２．ラスタを上書きしたいかどうかの指示があるときには、「いいえ」を選択する。シーケンス発生装置により作成されるファイル名と同じファイル名（「５ｘ５ １．ラスタ」、「５ｘ５ ２．ラスタ」、・・・「５ｘ５ ２５．ラスタ」）の予め限定されたラスタがあり、標的ホルダー（Methods/AutoXRasterFile）に既にセーブされているからであり、ポップアップ画面がでるように指示する。
【０１０８】
７）シーケンス発生装置の原型バージョン：２０１２０４０６．１を用いてオートシーケンス（AutoSequence）ファイルを作成する。
【０１０９】
（工程１−７の説明は優先権を主張する仮出願に記載されており、かかる説明はそれに関心のある者を対象とする。）
【０１１０】
新たなラスタの試験結果
本発明者らは２つの異なるスポットで連続していない新たなラスタをトライアウトし、第１のスポット、および第２のスポットで、各々、２５個のうち２３個で、２５個のうち２４個で拒絶スペクトルのほとんどないデータを取得することができた。両方の試料スポットでの操作を１０分足らずで行った。対照的に、本発明者らの初期のスクエアグリッドを用いて最終セットの約２４８Ｋのショットを収集するには数時間を要した。
【０１１１】
ラスタ点を試料スポットの中心に限定する菱形グリッドを用いる場合、一般にはより良好なシグナルが認められる。しかしながら、菱形を用いて２５個のセルグリッドを作成する場合には、単一の試料スポットで２５個のセルのうち８個でしかデータを収集できなかった。新たなラスタでカバーされる試料スポットの全面積はわずかに増え、スクエア発生装置の菱形発生方法を用いてグリッドを作成する場合に重なるラスタはほとんどないが、上記される新たなラスタを用いて得られる良い結果を説明する鍵となる因子は、ラスタがヒットする連続するロケーション間の距離にあると考えられる。
【０１１２】
本発明者らが今までのところ分かっている結果は、最良の選択肢が、試料スポットに付き２５０，０００回のショットを収集し、仮に２５０Ｋ回より多くのショットを必要とするならば複数のレプリケートでのスペクトルを収集することを示している。
【０１１３】
本発明者らは「手動で」作成した２５個のラスタファイルのうち２０個のファイルを用い、試料スポットに付き２５０，０００（２０ｘ１２，５００）ないし３００，０００（２０ｘ１５，０００）回のショットを収集しうる。
【図１Ａ】
2015518167.tif 000004
【図１Ｂ】
2015518167.tif 000005
【図１Ｃ】
2015518167.tif 000006
【図１Ｄ】
2015518167.tif 000007
【図１Ｅ】
2015518167.tif 000008
【図２Ａ】
2015518167.tif 000009
【図２Ｂ】
2015518167.tif 000010
【図３】
2015518167.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【図６】
2015518167.tif 000014
【図７】
2015518167.tif 000015
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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