(57)【要約】  バージニアマイシンの添加によって、発酵生産に対する悪影響なしに、生体触媒としてザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）を使用する発酵中で、汚染が制御された。バージニアマイシンの有効濃度は、使用される発酵培地のタイプに左右されることが分かった。
2015519078.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）発酵培地；
ｂ）バージニアマイシン；および
ｄ）増殖するザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞集団
を含んでなる発酵ブロス組成物。
【請求項２】
乳酸の濃度が約５ｇ／Ｌ未満である、請求項１に記載の発酵ブロス。
【請求項３】
前記発酵培地がセルロース系バイオマス加水分解物を欠く、請求項１に記載の発酵ブロス。
【請求項４】
バージニアマイシンの濃度が少なくとも約０．２５ｐｐｍである、請求項３に記載の発酵ブロス。
【請求項５】
前記発酵培地がセルロース系バイオマス加水分解物を含んでなる、請求項１に記載の発酵ブロス。
【請求項６】
バージニアマイシンの濃度が少なくとも約１０ｐｐｍである、請求項５に記載の発酵ブロス。
【請求項７】
バージニアマイシンの濃度が少なくとも約２０ｐｐｍである、請求項６に記載の発酵ブロス。
【請求項８】
ａ）発酵培地を提供するステップと；
ｂ）バージニアマイシンを前記発酵培地に添加するステップと；
ｃ）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の種菌を前記発酵培地に添加して、それによって発酵ブロスを生産するステップと；
ｄ）前記発酵ブロスを前記ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖に適した条件に維持するステップと
を含んでなり、手順ｂ）およびｃ）が、順番に実施されても、または同時に実施されてもよく、細菌汚染が制御される、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞生体触媒を使用する発酵中で、細菌汚染を制御する方法。
【請求項９】
前記ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が、前記発酵ブロス中でエタノールを産生する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記発酵培地がセルロース系バイオマス加水分解物を欠く、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
バージニアマイシンが少なくとも約０．２５ｐｐｍの濃度で添加される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記発酵培地がセルロース系バイオマス加水分解物を含んでなる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１３】
バージニアマイシンが少なくとも約１０ｐｐｍの濃度で添加される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）発酵培地を提供するステップと；
ｂ）バージニアマイシンの存在下で増殖させたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の種菌を前記発酵培地に添加して、発酵ブロスを産生するステップと；
ｃ）前記発酵ブロスを前記ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖および前記ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞によるエタノール生産に適した条件に維持するステップと
を含んでなり、バージニアマイシンが（ｂ）の種菌と別に前記発酵培地に添加されず、エタノールが生産される、エタノールを生産する方法。
【請求項１５】
前記発酵培地が、セルロース系バイオマス加水分解物を含んでなり、またはセルロース系バイオマス加水分解物を欠く、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ｂ）のザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の種菌が、セルロース系バイオマス加水分解物を欠く培地中で培養され、バージニアマイシンの濃度が少なくとも約０．２５ｐｐｍである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
バージニアマイシンの濃度が約１ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
バージニアマイシンを含んでなる発酵培地中で、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を培養するステップを含んでなる、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖を改善する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学および発酵の分野に関する。より具体的には、方法は、生体触媒としてザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が使用される場合に、発酵の汚染を制御するために開発された。
【背景技術】
【０００２】
再生可能資源から生成される燃料エタノールは、世界的な化石燃料不足、エネルギーコスト上昇、および大気二酸化炭素増大に関連している地球温暖化効果の長期解決策の１つである。再生可能資源由来の燃料エタノールは、生体触媒を使用する糖類発酵によって生産される。目下、酵母が、エタノール生産のために最も広く使用されている生体触媒である。発酵性糖類は、最も典型的には、トウモロコシ穀粒、甜菜、およびサトウキビをはじめとする、加工生体材料から得られる。代案の豊富な生体材料糖原料は、セルロース系またはリグノセルロース系バイオマスである。物理的、化学的、および／または酵素的処理を使用して、セルロース系およびリグノセルロース系バイオマスを加工し、発酵性糖類を生産する方法が開発されている。
【０００３】
大規模発酵過程において、特に炭水化物源として生体材料を使用する場合、無菌性を維持することは困難である。大規模発酵工程は、典型的に、加工生体材料、装置、プロセス水またはその他の起源に由来し得る、細菌によって汚染される。典型的に、汚染細菌は、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の種などの乳酸菌（ＬＡＢ）である。汚染細菌は、糖類を使用して、一次産物生体触媒の有効性を低下させることで、発酵産物の収率を低下させる。汚染細菌は、酢酸および乳酸などの望まれない産物を産生し、それは培養中のストレス状態を増大させて、生体触媒増殖の劣化および／または生体触媒産物生産の低下につながる。
【０００４】
主に乳酸菌である汚染細菌は、典型的に、燃料用または醸造用のエタノールを生産するために、炭水化物源としてマッシュまたは糖蜜を使用する、生体触媒として酵母を利用する発酵で問題となっている。酵母および汚染細菌は、抗菌剤によっては感受性に差があるので、酵母発酵中の細菌を制御するために、いくつかの抗菌剤を使用し得る。酵母発酵でＬＡＢ汚染を制御するのに成功裏に使用されている抗菌剤としては、ペニシリン（非特許文献１）、バージニアマイシン（非特許文献２；非特許文献３；特許文献１）、ホップ酸（特許文献２）、ＦｅｒｍａＳｕｒｅ（商標）、ならびにエリスロマイシン、タイロシン、およびテトラサイクリンが挙げられる。
【０００５】
グルコース利用に加えたキシロースおよびアラビノース利用、そして競合代謝経路の不活性化をはじめとする株の改善を設計することで、エタノールを生産する効果的な生体触媒として、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が開発されている。さらにザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）は、セルロース系バイオマス加水分解物中に存在する阻害物質に対する耐性を増大させることにより、加水分解物発酵培地中における使用のために適応されている。しかしこの生体触媒は細菌であり、優勢な汚染物質もまた細菌であることから、エタノール発酵のための生体触媒としてザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を使用することには、汚染制御における追加的な難題がある。
【０００６】
テトラサイクリン、カナマイシン、ポリミキシン、およびストレプトマイシンをはじめとする、酵母と共に安全に利用できる多数の抗生物質の濃度は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４株の増殖を阻害する（非特許文献４）。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）と共に利用するのに、ペニシリンＧのみが安全であることが示された。ベンジルペニシリンが、エタノール生産のためのバッチ式ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）発酵において、細菌汚染を制御するのに成功裏に使用された（非特許文献５）。別のレビューでは、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）は、シードルおよびビールの汚染物質であることが報告されており、カナマイシン、ポリミキシン、およびスレプトマイシン（ｓｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）をはじめとするいくつかの抗生物質の典型的に、使用されるレベルに対して耐性があるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株が、発見されている（非特許文献６）。株間の違いは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＣＰ４株中で、ストレプトマイシン、カナマイシン、およびゲンタマイシンについて発見されたように、プラスミド耐性のコード化に関連していることもある（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００７１４５８５７号明細書
【特許文献２】米国特許第２００９００４２２７６号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９５４）Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２：２５２−２５８
【非特許文献２】Ｈｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：２８４−２９１
【非特許文献３】Ｂｉｓｃｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０３：１１７−１２２
【非特許文献４】Ａｇｒａｗａｎ  ａｎｄ  Ｂａｓａｐｐａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９６）１８：６７３−６７８
【非特許文献５】Ｇｒｏｔｅ  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８５）６３：２８７−２９０
【非特許文献６】Ｓｗｉｎｇｓ  ａｎｄ  Ｄｅ  Ｌｅｙ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９７７）４１：１−４６
【非特許文献７】Ｗａｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４７：１９８−２００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
エタノール生産のために開発されている細菌ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）生体触媒を利用する発酵において、細菌汚染物質を制御する方法に対する必要性が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が生体触媒である、発酵ブロス組成物と、培地の細菌汚染を制御する方法とを提供する。
【００１１】
したがって本発明は、
ａ）発酵培地；
ｂ）バージニアマイシン；および
ｄ）増殖するザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞集団
を含んでなる発酵ブロス組成物を提供する。
【００１２】
別の態様では本発明は、
ａ）発酵培地を提供するステップと；
ｂ）バージニアマイシンを発酵培地に添加するステップと；
ｃ）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の種菌を発酵培地に添加して、それによって発酵ブロスを生産するステップと；
ｄ）発酵ブロスをザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖に適した条件に維持するステップと
を含んでなり、手順ｂ）およびｃ）が、順番に実施されても、または同時に実施されてもよく、細菌汚染が制御される、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）生体触媒を使用する発酵中で細菌汚染を制御する方法を提供する。
【００１３】
一実施形態では、この方法の発酵ブロス中でエタノールが生産される。
【００１４】
さらに別の態様では本発明は、
ａ）発酵培地を提供するステップと；
ｂ）バージニアマイシンの存在下で増殖させたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の種菌を発酵培地に添加して、発酵ブロスを生産するステップと；
ｃ）発酵ブロスをザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖およびザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞によるエタノール生産に適した条件に維持するステップと
を含んでなり、エタノールが生産される、エタノールを生産する方法を提供する。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明は、バージニアマイシンを含んでなる発酵培地中で、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を培養するステップを含んでなる、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖を改善する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】キシロース利用のために遺伝子改変された、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中のエタノール発酵経路の略図を示す。
【図２】２ｇ／Ｌの酵母エキス抽出物と、異なる濃度のＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）、Ｌａｃｔｏｓｉｄｅ  Ｖ（商標）、またはＬａｃｔｏｓｉｄｅ  ２４７（商標）、および対照を添加した、清澄化ＭＤ０７＃３加水分解物中のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株の増殖を示すグラフである。
【図３Ａ】２ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）あり（Ｆ１０６８）またはなし（Ｆ１０６７）の規定培地中における、最初に１：１００の比率のラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）：Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株を接種した、培養物中の乳酸（Ａ）濃度のグラフを示す。
【図３Ｂ】２ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）あり（Ｆ１０６８）またはなし（Ｆ１０６７）の規定培地中における、最初に１：１００の比率のラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）：Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株を接種した、エタノール（Ｂ）濃度のグラフを示す。
【図４】２ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）あり（Ｆ１０６８）またはなし（Ｆ１０６７）の規定培地中における、最初に１：１００の比率のラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）：Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株を接種した、培養物中のグルコース利用のグラフを示す。
【図５Ａ】最初に１：１００の比率のＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）：Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株で汚染させた種培養を接種して、バージニアマイシンを欠く培地（Ｆ１０６９）中で培養した、または２ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）を含有する培地（Ｆ１０７０）中で培養した、加水分解物培地中の乳酸（Ａ）濃度のグラフを示す。
【図５Ｂ】最初に１：１００の比率のＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）：Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株で汚染させた種培養を接種して、バージニアマイシンを欠く培地（Ｆ１０６９）中で培養した、または２ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）を含有する培地（Ｆ１０７０）中で培養した、加水分解物培地中のエタノール（Ｂ）濃度のグラフを示す。
【図６Ａ】最初に１：１００の比率のＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）：Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株で汚染させた種培養を接種して、バージニアマイシンを欠く培地（Ｆ１０６９）中で培養した、または２ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）を含有する培地（Ｆ１０７０）中で培養した、加水分解物培地中のグルコース（Ａ）利用のグラフを示す。
【図６Ｂ】最初に１：１００の比率のＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）：Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株で汚染させた種培養を接種して、バージニアマイシンを欠く培地（Ｆ１０６９）中で培養した、または２ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）を含有する培地（Ｆ１０７０）中で培養した、加水分解物培地中のキシロース（Ｂ）利用のグラフを示す。
【図７Ａ】最初に１：１００の比率のＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）：Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株で汚染させ、バージニアマイシンなしで増殖させた種培養を接種して、異なる濃度のＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）を含有する加水分解物培地中で培養した、培養物の乳酸（Ａ）濃度のグラフを示す。
【図７Ｂ】最初に１：１００の比率のＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）：Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株で汚染させ、バージニアマイシンなしで増殖させた種培養を接種して、異なる濃度のＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）を含有する加水分解物培地中で培養した、培養物のエタノール（Ｂ）濃度のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、エタノール生産などのための生体触媒として、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を利用する発酵中で、汚染細菌を制御するための抗菌剤の使用に関する。バージニアマイシンが、汚染細菌を効果的に制御する一方で、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞にとって安全であるという発見は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が生体触媒である発酵中で、それを利用できるようにする。特に、セルロース系バイオマス加水分解物を含有する発酵培地中の汚染細菌の効果的な制御には、典型的に、酵母によるエタノール生産発酵で使用されるレベルよりも高い、高レベルのバージニアマイシンが必要であることが分かった。エタノール生産を低下させることなく、高レベルをザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）発酵中で使用し得る。燃料添加剤として使用するための、セルロース系バイオマス加水分解物などの再生可能資源からのエタノールの効率的な生産は、化石燃料不足に対処して、エネルギーコストと地球温暖化への影響を低下させる。
【００１８】
以下の定義と略語を特許請求の範囲と明細書の説明で使用する。
【００１９】
本明細書の用法では、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含んでなる）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含んでなる）」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｈａｓ（有する）」、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、「ｃｏｎｔａｉｎｓ（含有する）」、または「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」という用語、またはそれらのあらゆるその他のバリエーションは、非排他的包含をカバーすることが意図される。例えば要素の一覧を構成する組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもこれらの要素のみに限定されず、明示的に列挙されない、またはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有のその他の要素を含んでもよい。さらに特に断りのない限り、「ｏｒ」は排他的ｏｒでなく包括的ｏｒを指す。例えば条件ＡまたはＢは、以下のいずれかによって満たされる：Ａが真で（または存在し）Ｂが偽であり（または存在せず）、Ａが偽で（または存在せず）Ｂが真であり（または存在する）、ＡおよびＢの双方が真である（または存在する）。
【００２０】
さらに本発明の構成要件または構成要素に先立つ不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、構成要件または構成要素の事例数（すなわち発生率）に関して、非制限的であることが意図される。したがって「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈すべきであり、構成要件または構成要素の単数語形は、数が単数であることを明らかに意味する場合を除いて、複数もまた含む。
【００２１】
「発明」または「本発明」という用語は、本明細書の用法では非限定的用語であり、特定の発明の任意の単一実施形態を指すことは意図されず、本明細書および特許請求の範囲に記載される全ての可能な実施形態を包含する。
【００２２】
本明細書の用法では、使用される本発明の成分または反応物質の量を修飾する「約」という用語は、例えば濃縮物または溶液を実際に作成するのに使用される、典型的な測定および液体取り扱い手順を通じて；これらの手順における不注意による誤りを通じて；組成物を作成しまたは方法を実施するのに用いられる成分の製造、起源または純度の違いを通じて、生じ得る数量の変動を指す。「約」という用語はまた、特定の最初の混合物から生じる組成物の異なる平衡条件のために、異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されるか否かを問わず、特許請求の範囲には量の同等物が含まれる。一実施形態では、「約」という用語は、報告された数値の１０％以内、好ましくは報告された数値の５％以内を意味する。
【００２３】
「エタノール産生菌」という用語は、炭水化物源の代謝を通じて、エタノールを産生する生物を指す。
【００２４】
「発酵性糖」という用語は、発酵過程において、微生物が炭素源として使用し得るオリゴ糖類および単糖類を指す。
【００２５】
「同時糖化発酵（ＳＳＦ）」という用語は、バイオマスが糖化され、糖化から生じる発酵性糖類が生体触媒によって使用され、全て同時に、典型的に、同一反応容器内で、生成物が生じる過程を指す。
【００２６】
「セルロース系」という用語は、セルロースと、ヘミセルロースおよびリグニンをはじめとする追加的な成分とを含んでなる、組成物を指す。
【００２７】
「リグノセルロース系」という用語は、リグニンとセルロースの双方を含んでなる組成物を指す。リグノセルロース系物質はまた、ヘミセルロースを含んでなってもよい。
【００２８】
「糖化」という用語は、多糖類からの発酵性糖類の生成を指す。
【００２９】
「生体材料」という用語は、生体触媒による発酵で使用されてもよい炭水化物源である、あらゆる生物由来材料を指す。生体材料としては、セルロース系バイオマス、ならびに穀物、マッシュ、糖蜜、および（甜菜やサトウキビなどからの）粗汁などの炭水化物源として使用される、その他の植物材料と植物由来材料が挙げられる。
【００３０】
「前処理バイオマス」という用語は、糖化に先だって処理を受けたバイオマスを意味する。
【００３１】
「セルロース系バイオマス」という用語は、セルロースを含んでなり、任意選択的に、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および／または単糖類をさらに含んでなる材料をはじめとする、あらゆるセルロース系またはリグノセルロース系材料を指す。セルロース系バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質などの追加的な成分を含んでなってもよい。セルロース系バイオマスは、単一起源に由来してもよく、または２つ以上の起源に由来する混合物を含んでなり得る；例えば、セルロース系バイオマスは、トウモロコシ穂軸とトウモロコシ茎葉の混合物、または草と葉の混合物を含んでなることもあり得る。セルロース系バイオマスとしては、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙業汚泥、庭ごみ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これに限定されるものではない。セルロース系バイオマスの例としては、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉などの作物残渣、トウモロコシ茎葉、草本、小麦、麦藁、大麦藁、乾草、稲藁、スイッチグラス、パームの葉、空のパーム果房、古紙、サトウキビバガス、ソルガムまたは大豆セルロース系植物材料、穀物製粉から得られるセルロース成分、樹木、枝、根、葉、木片、おがくず、灌木および低木、野菜、果物、花卉、および家畜糞尿が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３２】
「セルロース系バイオマス加水分解物」という用語は、セルロース系またはリグノセルロース系バイオマスの糖化から生じる生成物を指す。バイオマスはまた、糖化に先だって前処理されてもよい。セルロース系バイオマス加水分解物は、バイオマス固形物を含有する生成物である。
【００３３】
「清澄化セルロース系バイオマス加水分解物」または「清澄セルロース系バイオマス加水分解物」という用語は、処理されて固形分が除去されたセルロース系バイオマス加水分解物を指し、それはセルロース系バイオマス加水分解物とは見なされない。さらに、セルロース系バイオマスに由来する糖類を含有する、あらゆる調製物。
【００３４】
「糖化酵素」という用語は、バイオマス成分の発酵性糖類への変換を触媒し得る酵素を指す。典型的に、酵素は、バイオマスが前処理された場合に、より効果的である。
【００３５】
「実質的汚染」という用語は、抗菌剤なしで発酵ブロスを約４０時間培養すると、乳酸の凡その規定培地よりも多く生成する、発酵ブロス中の乳酸菌汚染のレベルを指す。
【００３６】
「乳酸菌」という用語は、炭水化物発酵の主な代謝最終産物として乳酸を産生する細菌を指す。乳酸菌（ＬＡＢ）はグラム陽性細菌乳酸桿菌目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）に属し、例えば、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、および腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）が挙げられる。
【００３７】
「発酵培地」という用語は、生体触媒として使用される微生物の増殖を支持する、栄養素などの成分を含んでなる組成物を指す。発酵培地は、小規模培養および大規模生産発酵をはじめとする、任意の規模で使用してもよい。
【００３８】
「発酵ブロス」という用語は、その中で発酵が起きているまたは起きた、発酵培地および生体触媒細胞を含んでなる組成物を指す。発酵ブロス中における生体触媒の培養期間次第で、このブロスはまた、エタノールなどの生体触媒によって生成される生成物も含んでもよい。
【００３９】
「種培養」という用語は、発酵ブロスを生成するより多量の発酵培地に接種するのに使用される、生体触媒細胞の培養である。典型的に、種培養は、発酵ブロスの最終容積の約０．０１％〜２０％ｖ／ｖである。
【００４０】
「汚染」という用語は、意図的に添加されたのではない微生物の存在を指す。典型的に、所望の生体触媒が、発酵ブロスを生成する増殖培地に導入される。発酵ブロス中に存在する、導入された生体触媒以外の微生物は、汚染と見なされる。
【００４１】
本方法は、エタノール生産のための発酵などのザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細菌が生体触媒である、培養中の望まれない細菌の制御を提供する。望まれない汚染細菌は、典型的に、大規模工程中に、特に加工生体材料を含有する培地中に、存在する。培地で使用される加工生体材料としては、トウモロコシまたは小麦マッシュ、甜菜またはサトウキビ糖蜜、およびセルロース系またはリグノセルロース系バイオマス加水分解物などの炭水化物源が挙げられる。汚染細菌は、生体材料、加工装置、接種培養物、プロセス水、空気、またはその他の起源から、発酵過程に取り込まれることもある。生産発酵における汚染の制御は、典型的に、生体触媒が増殖して、汚染細菌存在下で得られるよりも高いレベルで生成物を産生できるようにして、より効率的で経済的な発酵過程を提供する。
【００４２】
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）発酵のための抗菌剤
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）それ自体は細菌であるので、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）発酵で使用される抗菌剤は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細菌に影響を及ぼすことなく、汚染細菌を選択的に標的にしなくてはならない。生体材料由来炭水化物源を使用する大規模発酵中の優勢な汚染細菌は、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株などの乳酸菌（ＬＡＢ）である。ＬＡＢはグラム陽性である一方で、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）はグラム陰性である。したがって難題は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖およびエタノール産生に対する悪影響なしに、発酵培地中でＬＡＢを制御する抗菌剤を同定することである。ＬＡＢに加えて、その他の汚染細菌が、この種の抗菌剤によって制御されてもよい。
【００４３】
本方法は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）発酵中における選択的抗菌剤として、バージニアマイシンを使用する。本明細書において、バージニアマイシンは、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）培養物の汚染制御における利用で、安全であることが分かった。バージニアマイシンは、ストレプトミセス・バージニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｅ）によって産生され、Ｌａｃｔｒｏｌ（登録商標）（Ｐｈｉｂｒｏ；Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）およびＬａｃｔｏｓｉｄｅ  Ｖ（商標）（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）などの異なる製剤として市販される。Ｌａｃｔｒｏｌ（登録商標）は、酵母が生体触媒であるエタノール発酵において、０．２５百万分率（ｐｐｍ）〜２．０ｐｐｍでの使用が推奨され、０．５ｐｐｍが最も一般的に使用される。製造会社の使用説明書は、用量が、発酵中に６．０ｐｐｍを超えるべきではないとしている。Ｌａｃｔｒｏｌ（登録商標）の仕様書は、製剤が１００％活性であるとして、２ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）が２ｐｐｍのバージニアマイシンに相当するとしている。Ｌａｃｔｏｓｉｄｅ  Ｖ（商標）は、酵母が生体触媒であるエタノール発酵中において、０．１ｐｐｍ〜３．０ｐｐｍでの使用が推奨される。さらにＬａｃｔｏｓｉｄｅ  ２４７（商標）（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）は、ペニシリンＧと組み合わされたバージニアマイシンを含有する。製造会社の使用説明書は、酵母が生体触媒であるエタノール発酵中における、１〜２ｐｐｍでの使用を推奨し、重度の感染では潜在的により高い比率が必要である。
【００４４】
一態様では、本方法では、バージニアマイシンとザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の種菌とが、発酵ブロスを生成する発酵培地に添加され、それはザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖に適した条件に維持される。バージニアマイシンおよび種菌は、培地に、順番に添加しても、または同時に添加してもよい。本発酵ブロス組成物は、下述するように、発酵培地、バージニアマイシン、およびザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖集団を含んでなる。ひとたび発酵培地に、冷凍庫原液からの細胞、冷凍庫原液から復活させた細胞、または種培養中の細胞などのザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が接種されると、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が増殖して、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖集団を形成する。
【００４５】
発酵培地は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖および生産を支持する、任意のタイプであってもよい。当業者は、以下の情報を考慮して、記載されるタイプの培地のいずれでも調製する方法を理解するであろう。一実施形態では、発酵培地は規定培地である。この培地は、グルコースなどの炭水化物源と、アミノ酸源と、酵母エキスなどのその他の栄養素と、微量成分、窒素、ＫＨ２ＰＯ４などのリン、およびＭｇＳＯ４を含んでもよいその他の成分とをはじめとする、典型的な購入された成分を含有する。規定培地は、実験室規模培養ならびに大規模発酵種菌として使用される種培養を培養するのに使用されることが多い。
【００４６】
別の実施形態では、発酵培地は、マッシュ、粗汁、または糖蜜などの非セルロース系材料から得られる糖類を含有する。これらの糖類は、穀類（トウモロコシ、小麦、大麦、およびライ麦など）、および甜菜およびサトウキビなどの糖料作物などの生体材料から調製される。発酵のために使用される加水分解マッシュは、糊化温度を超える温度に加熱して、アルファアミラーゼで処理して液化し、グルコアミラーゼなどの酵素を使用して糖化することで、典型的に、穀類から製造される。発酵培地中では、甜菜およびサトウキビからの糖蜜または粗汁を糖原料として使用してもよい。糖原料は主にデンプンまたは糖汁であるので、この種の糖原料は、非セルロース系生体材料糖原料（リグノセルロース系をはじめとするセルロース系）である。この種の糖原料は、典型的に、種培養で、および生体触媒として酵母を使用するエタノール生産で、およびその他の非セルロース系大規模発酵中で使用される。
【００４７】
非セルロース系起源からの糖を有する合成培地および培地には、（リグノセルロース系をはじめとする）セルロース系バイオマス加水分解物が欠如している。さらに、セルロース系バイオマスから得られて、高度に精製され固形物などのその他のセルロース成分が除去された、糖原料を含有する培地は、セルロース系バイオマス加水分解物が欠如した培地と見なされる。この種の培地は、清澄化セルロース系バイオマス加水分解物を含有する。
【００４８】
さらに別の実施形態では、発酵培地は、（リグノセルロース系をはじめとする）セルロース系生体材料から調製された、セルロース系バイオマス加水分解物を含有する。セルロース系バイオマス加水分解物は、バイオマス固形物を含有する。セルロース系バイオマス加水分解物は、（リグノセルロース系をはじめとする）セルロース系バイオマスの糖化によって生成される。典型的に、バイオマスは、糖化に先だって前処理される。バイオマスは、当業者に知られているあらゆる方法によって処理され、加水分解物中に発酵性糖類を生じてもよい。典型的に、バイオマスは、物理的および／または化学的処理を使用して前処理され、酵素的に糖化される。物理的および化学的処理としては、粉砕、製粉、切断、アンモニアまたはＮａＯＨなどの塩基処理、および／または酸処理が挙げられる。特に有用なのは、アンモニアを含んでなる水溶液に、バイオマスを接触させて、バイオマス−水性アンモニア混合物を生成する低アンモニア前処理であり、参照によって本明細書に援用する同一譲受人米国特許第７，９３２，０６３号明細書で開示されるように、アンモニア濃度は、バイオマス−水性アンモニア混合物のアルカリｐＨを維持するのに十分であるが、バイオマス乾燥重量に対して約１２重量％未満であり、バイオマスの乾燥重量は、バイオマス−水性アンモニア混合物重量に対して少なくとも約１５重量％固形分である。
【００４９】
酵素的糖化は、典型的に、酵素組成物または配合物を利用して、セルロースおよび／またはヘミセルロースを分解し、例えば、グルコース、キシロース、およびアラビノースなどの糖類を含有する加水分解物を生成する。糖化酵素は、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６：５０６−５７７，２００２）で概説される。少なくとも１つの酵素が使用され、典型的に、１つまたは複数のグリコシダーゼを含む糖化酵素配合物が使用される。グリコシダーゼは、二糖類、オリゴ糖類、および多糖類のエーテル結合を加水分解し、一般群「ヒドロラーゼ」（ＥＣ３．）の酵素分類ＥＣ  ３．２．１．ｘ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡと、付録１（１９９３）、付録２（１９９４）、付録３（１９９５）、付録４（１９９７）、および付録５［それぞれＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１−５，１９９４；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３２：１−６，１９９５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３７：１−５，１９９６；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０：１−６，１９９７；およびＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４：６１０−６５０  １９９９］）にある。本方法で有用なグリコシダーゼは、それらが加水分解するバイオマス構成要素によって分類し得る。本方法で有用なグリコシダーゼとしては、セルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ）、ヘミセルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノキシラナーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ）、およびデンプン加水分解グリコシダーゼ（例えば、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ）が挙げられる。さらに、ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．ｘ．ｙ）、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．ｘおよび３．１．４．ｘ）、リグニナーゼ（ＥＣ１．１１．１．ｘ）、またはフェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）などのその他の活性を糖化酵素共同体に添加して、バイオマスのその他の成分からの多糖類の放出を促進することが有用なこともある。多糖類加水分解酵素を産生する微生物が、異なる基質特異性を有するいくつかの酵素または一群の酵素によって触媒される、セルロース分解能力などの活性を往々にして示すことは、当該技術分野で公知である。したがって微生物からの「セルラーゼ」は、一群の酵素を含んでなってもよく、その１つまたは複数またはその全てが、セルロース分解活性に貢献してもよい。セルラーゼなどの商業的または非商業的酵素製剤は、酵素を得るのに利用される精製スキーム次第で、多数の酵素を含んでなってもよい。糖化で有用な多数のグリコシルヒドロラーゼ酵素およびその組成物が、国際公開第２０１１／０３８０１９号パンフレットで開示される。
【００５０】
糖化酵素は、商業的に入手されてもよい。このような酵素としては、例えばＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃ（登録商標）キシラナーゼ、Ａｃｃｅｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００、およびＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴ（Ｄａｎｉｓｃｏ  Ｕ．Ｓ．Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、およびＮｏｖｏｓｙｍｅ−１８８（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，２８８０  Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）が挙げられる。さらに糖化酵素は、未精製であってもよく、細胞抽出物またはホールセル調製物として提供されてもよい。酵素は、１つまたは複数の糖化酵素を発現するように改変された組換え微生物を使用して生成されてもよい。例えば、前処理セルロース系バイオマス糖化のために本明細書で使用されるＨ３Ａタンパク質調製物は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）遺伝子改変株によって産生される酵素の未精製調製物であり、セルラーゼおよびヘミセルラーゼの組み合わせを含み、参照によって本明細書に援用する、国際公開第２０１１／０３８０１９号パンフレットに記載される。
【００５１】
さらに糖化のための酵素としては、例えば、ＧＨ３、ＧＨ３９、ＧＨ４３、ＧＨ５５、ＧＨ１０、およびＧＨ１１ファミリーメンバーなどのグリコシルヒドロラーゼが挙げられる。ＧＨは、２つ以上の炭水化物間の、または炭水化物と非炭水化物部分間のグリコシド結合を加水分解する、一群の酵素である。ＧＨファミリーは、配列類似性に基づいて分類されており、分類は、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅ（ＣＡＺｙ）ｄａｔａｂａｓｅ（Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）Ｄ２３３−２３８）中で利用できる。これらの酵素のいくつかは、様々な基質に作用でき、糖化酵素としての効力を実証した。グリコシドヒドロラーゼファミリー３（「ＧＨ３」酵素は、例えば、β−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２１）；β−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）；Ｎ−アセチルβ−グルコサミニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５２）；グルカン−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５８）；セロデキストリナーゼ（ＥＣ：３．２．１．７４）；エキソ−１，３−１，４−グルカナーゼ（ＥＣ：３．２．１）；および／またはβ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）活性をはじめとする、いくつかの既知の活性を有する。グリコシドヒドロラーゼファミリー３９（「ＧＨ３９」）酵素はまた、例えば、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．７６）および／またはβ−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）活性をはじめとする、いくつかの既知の活性を有する。グリコシドヒドロラーゼファミリー４３（「ＧＨ４３」）酵素は、例えば、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５５）；β−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）；エンドアラビナナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９９）；および／またはガラクタン１，３−β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１４５）活性をはじめとする、いくつかの既知の活性を有する。グリコシドヒドロラーゼファミリー５１（「ＧＨ５１」）酵素は、例えば、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５５）および／またはエンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）活性を有することが知られている。グリコシドヒドロラーゼファミリー１０（「ＧＨ１０」）は、Ｓｃｈｍｉｄｔ
ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：２４０３−２４１２、およびＬｏ  Ｌｅｇｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５０９  ３０３−３０８）で詳細に記載され、グリコシドヒドロラーゼファミリー１１（「Ｈ１１」）は、Ｈａｋｏｕｖａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：９６１７−２４に記載されている。
【００５２】
下述するように、バイオマス加水分解物を含有する発酵培地は、１つまたは複数の追加的な糖類および／またはその他の添加成分がある、特定百分率の加水分解物を含有してもよく、または培地は、ソルビトールなどの微量添加がある、９０％以上の加水分解物を含有してもよい。様々な実施形態では、セルロース系バイオマス加水分解物は、発酵ブロスの最終容積の少なくとも約５０％、６０％、７９％、８０％、９０％または９５％である。典型的に、発酵ブロスの最終容積の約１０％は、種菌である。
【００５３】
バイオマス加水分解物の固形分含量は、用いられる前処理および糖化方法次第で、典型的に、約１０％〜４０％である。より典型的に、は、固形分は約２５％であり、９０％のセルロース系バイオマス加水分解物を含有する培地は、約２３％の固形分を有する。
【００５４】
発酵ブロスで使用されるバージニアマイシンの濃度
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）発酵ブロス中の汚染を制御するのに必要なバージニアマイシンの濃度は、発酵培地がセルロース系バイオマス加水分解物を含有するかどうかに応じて、変動することが本明細書で分かった。（上述の）セルロース系バイオマス加水分解物を欠く培地を含有する発酵ブロスでは、約２ｐｐｍの濃度のバージニアマイシンが、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞のグルコース利用およびエタノールの産生に影響を及ぼすことなく、汚染細菌を制御することが、本明細書で分かった。セルロース系バイオマス加水分解物を欠く本発酵ブロス中のバージニアマイシンの濃度は、それらの間のあらゆる整数または分数を含めて、少なくとも約０．２５ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ、０．７５ｐｐｍ、１ｐｐｍ、２ｐｐｍ、３ｐｐｍ、４ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、または２０ｐｐｍであってもよい。典型的な実施形態は、約０．２５ｐｐｍ〜２０ｐｐｍの濃度でバージニアマイシンを使用する。より典型的な実施形態は、約１．０ｐｐｍ〜１０ｐｐｍの濃度でバージニアマイシンを使用する。汚染を制御するのに必要なバージニアマイシンの量は、汚染の量、培地のタイプ、接種に続くザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の濃度、および発酵条件などの要因に左右され、当業者によって特定状況のために判定され得る。
【００５５】
汚染細菌の制御は、発酵ブロス中の乳酸レベルを測定することで評価してもよく、約４０時間の発酵後の約５ｇ／Ｌ未満の乳酸の存在は、汚染が制御されていることを意味する。汚染は、発酵ブロス中で約５ｇ／Ｌ未満の乳酸、または４ｇ／Ｌまたは３ｇ／Ｌまたは２ｇ／Ｌまたは１ｇ／Ｌ未満の乳酸に制御されてもよい。発酵ブロス中の乳酸の量は、典型的に、当業者に知られているように、ＨＰＬＣによってアッセイされる。
【００５６】
セルロース系バイオマス加水分解物を欠いて、２．５ｐｐｍまたは５ｐｐｍのバージニアマイシンを含有する培地中では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖は、ＯＤ６００による測定で、バージニアマイシン不在下の細胞増殖よりもさらに良いことが本明細書で分かった。一実施形態では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖は、バージニアマイシンを含んでなる培地中で、細胞を培養することで改善される。増殖の改善は、競合を通じた汚染レベルの低下、および／またはエタノール産生の増大に貢献してもよい。増殖を改善するために使用されるバージニアマイシンの濃度は、使用される培地タイプ、接種に続くザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の濃度、および発酵条件などの要因に左右される。当業者は、特定培地および発酵条件を使用した場合に、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖を刺激する、バージニアマイシンの濃度を容易に評価し得る。例えば、本明細書の実施例１に記載される条件下にある、清澄化セルロース系バイオマス加水分解物培地中では、２．５ｐｐｍ〜５ｐｐｍのバージニアマイシン濃度が、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖を改善する。その他の発酵では、約１ｐｐｍ〜約５０ｐｐｍ以上の濃度範囲のバージニアマイシンの存在が、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖を改善してもよい。
【００５７】
種培養中に存在する汚染が（上述したように）バージニアマイシンを使用して制御され、種培養がより大規模の発酵に接種するのに使用された場合、種菌とは別にバージニアマイシンまたはその他の抗微生物剤を発酵培地に添加することなく、汚染は大規模発酵中で制御されたままであることが、本明細書で分かった。したがって一実施形態では、発酵培地に接種するのに使用される種培養へのバージニアマイシンの包含によって、発酵中で汚染が制御される。発酵培地は、セルロース系バイオマス加水分解物を含有してもよく、またはセルロース系バイオマス加水分解物を欠いてもよい。セルロース系バイオマス加水分解物を欠く培地中で培養された種培養中では、バージニアマイシンの濃度は、上述のように、それらの間のあらゆる整数または分数を含めて、少なくとも約０．２５ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ、０．７５ｐｐｍ、１ｐｐｍ、２ｐｐｍ、３ｐｐｍ、４ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、または２０ｐｐｍであってもよい。典型的な実施形態は、約０．２５ｐｐｍ〜２０ｐｐｍの濃度でバージニアマイシンを使用する。より典型的な実施形態は、約１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍの濃度でバージニアマイシンを使用する。
【００５８】
しかし種培養中で汚染が制御されない場合、汚染は、汚染された種培養を接種された大規模発酵の要因である。一実施形態では、汚染された種培養を接種された発酵中の汚染は、セルロース系バイオマス加水分解物を欠く培地を使用する場合に、上述したように制御される。
【００５９】
セルロース系バイオマス加水分解物を含有する培地を含有する発酵ブロス中では、少なくとも約１０ｐｐｍの濃度のバージニアマイシンを使用して、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞による典型的なエタノール生産を保ちながら、汚染細菌を制御し得ることが本明細書で分かった（本明細書で使用されるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株では約７０〜８０ｇ／Ｌ）。セルロース系バイオマス加水分解物を含有する本発酵ブロスの様々な実施形態では、発酵ブロス中のバージニアマイシン濃度は、それらの間のあらゆる整数または分数を含めて、少なくとも約１０ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、３０ｐｍ、４０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、１５０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、または２５０ｐｐｍである。セルロース系バイオマス加水分解物と１０ｐｐｍ〜２５０ｐｐｍの濃度のバージニアマイシンとを含有する培地を含んでなる、汚染された種培養を接種された発酵ブロス中で、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞によって良好なエタノール生産が達成されることが、本明細書で分かった。セルロース系バイオマス加水分解物含有培地中の比較的高い固形分の存在が、セルロース系バイオマス加水分解物を欠く培地中で効果的なレベルと比較して、汚染を制御するのに必要なより高レベルのバージニアマイシンに対する要求に寄与することもある。加水分解物中の様々なバイオマス分解産物の存在もまた、寄与することもある。バージニアマイシンの高いレベルは、バージニアマイシン製品の製造会社によって、酵母エタノール生産での使用のために推奨されるレベルを上回る。
【００６０】
発酵で使用されるあらゆるタイプの培地において、特定の汚染制御の結果は、使用されるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の増殖および産生特性、存在する汚染微生物、最初の汚染レベル、存在する場合は（汚染する加水分解物副産物の固形分百分率および毒性およびザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞をはじめとする）培地中のセルロース系バイオマス加水分解物のタイプと量、および混合を含めた培養条件をはじめとする要因に左右される。当業者は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の生産性を保ちながら、特定の発酵条件を使用して、特定のザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）発酵ブロスの汚染を制御するのに効果的である、本明細書で開示される量に対するバージニアマイシンの濃度を容易に判定し得る。
【００６１】
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞種菌
本方法では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の種菌は、増殖培養を開始するのに効果的なあらゆるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞源であってもよい。典型的に、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は冷凍保存株として貯蔵され、細胞は、規定培地中の小規模培養で培養して復活させる。小規模培養は、発酵ブロスまたは培養物を生成するための発酵培地に添加される種菌として使用される。小規模培養はまた、種培養に接種するのに使用してもよい。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、種培養中で培養され、それは次に種菌として、より大規模な発酵に添加される。種菌として使用される種培養は、汚染を制御するのに必要なバージニアマイシンを含まない無菌規定培地を含有してもよい。代案としては、種菌として使用される種培養は、規定培地を含有してもよく、または加工装置などによって汚染されることもあるマッシュまたは糖蜜から調製された培地などのセルロース系バイオマス加水分解物を欠くその他の培地を含有してもよく、上述したようにバージニアマイシンが添加されて、汚染が制御される。さらに種菌として使用される種培養は、セルロース系バイオマス加水分解物と、上述したように汚染を制御するバージニアマイシンとを含有してもよい。
【００６２】
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞
あらゆるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞株が、本組成物および方法で使用されてもよく、使用される培地タイプや所望の発酵過程の結果をはじめとする要因に基づいて、選択される。所望の生産工程の効果的生体触媒である、あらゆるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を使用してもよい。例えばザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、グルコース、フルクトースおよび／またはスクロースを発酵基質として利用して、エタノールを自然に産生するが、キシロースは代謝しない。一実施形態では、本方法および組成物で使用されるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、キシロース利用のために改変されており、それはキシロースを含有するセルロース系バイオマス加水分解物を使用する場合に、特に所望される。
【００６３】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）などのエタノール産生ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株が、キシロースを発酵してエタノールにするために改変されている。米国特許第５，５１４，５８３号明細書、米国特許第５，７１２，１３３号明細書、米国特許第６，５６６，１０７号明細書、国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、Ｆｅｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９２）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３８  ３５４−３６１）、およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２４０−２４３）に記載されるようにして、キシロース代謝に関与する酵素発現のために、典型的に、４つの遺伝子をＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入して、キシロース利用代謝経路（図１）を作成する。これらとしては、キシロースのキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼをコードする遺伝子、およびキシルロースをリン酸化してキシルロース−５−リン酸を形成するキシルロキナーゼとをコードする遺伝子が挙げられる。ペントースリン酸経路の２つの酵素であるトランスケトラーゼとトランスアルドラーゼもさらに発現され、これらはキシルロース−５−リン酸を中間体に変換し、それはペントース代謝を解糖エントナー・ドウドロフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ）経路に連結して、キシロースのエタノールへの代謝を可能にする（図１を参照されたい）。これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、腸内細菌、およびある種の酵母や真菌などのキシロースを代謝できる多数の微生物のいずれかから得られてもよい。コード領域の起源としては、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）、およびザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコード領域が、典型的に、使用される。
【００６４】
コードＤＮＡ配列は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰプロモーター）、およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）エノラーゼ（ＥＮＯプロモーター）プロモーターなどの、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中で発現されるプロモーターと、作動可能に連結する。参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，９８９，２０６号明細書で開示される、発現が増大した変異ＧＡＰプロモーターもまた、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中での発現に有用である。コード領域は、プロモーターから個別に発現されてもよく、または２つ以上のコード領域がオペロン中で連結して、同一プロモーターから発現されてもよい。結果として生じるキメラ遺伝子は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞に導入してプラスミド上に保ってもよく、または例えば、相同的組換え、部位特異的組み込み、またはランダム組み込みを使用して、ゲノムに組み込んでもよい。キシロース利用代謝経路を発現するように改変された株の例としては、ＣＰ４（ｐＺＢ５）（米国特許第５５１４５８３号明細書）、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５（米国特許第６５６６１０７号明細書）、８ｂ（米国特許２００３０１６２２７１第号明細書；Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５；３２１−３２５）、およびＺＷ６５８（ＡＴＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８）が挙げられる。キシロース利用代謝経路の発現のために改変されたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、唯一の糖としてキシロースを含有する培地中で増殖できるようになる前に、一般に、キシロー含有培地中における適応期間を要する。
【００６５】
追加的な実施形態では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、成長速度および／または細胞量を増大させ、キシロース利用を増大させ、および／またはアラビノースなどのその他の糖類の使用を可能にし、酢酸などの化合物に対する阻害耐性を増大させ、またはエタノール生産を増大させる修飾などの、株を改善する１つまたは複数の追加的な遺伝子修飾を有する。
【００６６】
一実施形態では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，８４３，７６０号明細書に記載されるアラビノース利用のために、さらに改変されてもよい。アラビノース利用を可能にするために、キシロース利用経路の遺伝子に加えて発現される遺伝子としては、１）Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースに変換するＬ−アラビノースイソメラーゼ、２）Ｌ−リブロースをＬ−リブロース−５−リン酸に変換するＬ−リブロキナーゼ、および３）−リブロース−５−リン酸をＤ−キシルロースに変換するＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ（米国特許第５，８４３，７６０号明細書）が挙げられる。参照によって本明細書に援用する、米国特許第２０１１／０１４３４０８号明細書で開示されるように、アラビノース利用の改善は、ａｒａＥ遺伝子からのコード領域の発現などによって、アラビノースプロトン共輸送体をさらに発現することで達成されてもよい。
【００６７】
別の実施形態では、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，８９７，３９６号明細書に記載されるように、組み込み宿主因子のサブユニットをコードする内在性ｈｉｍＡ遺伝子を遺伝子改変してその発現を低下させ、それは酢酸含有培地中の増殖を改善する。酢酸はバイオマス加水分解物中に存在し、したがってバイオマス加水分解物を含有する培地を使用する場合、この成分に対する耐性を増大させることが所望される。
【００６８】
別の実施形態では、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載されるように、グルコースフルクトース酸化還元酵素（ＧＦＯＲ）活性を低下させる遺伝子修飾を施す。ＧＦＯＲならびにｈｉｍＡ遺伝子の発現低下は、アルドース還元酵素活性の低下について上で記載されるものなどのあらゆる方法によってもよい。
【００６９】
別の実施形態では、参照によって本明細書に援用する、同一譲受人同時係属米国特許出願公開第１３／１６１７３４号明細書で開示されるように、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）活性を増大させる遺伝子修飾が施される。ＲＰＩの発現増大は、天然プロモーターよりも高活性のプロモーターなどによって、内在性ＲＰＩをコードする遺伝子の発現を増大させることで、またはザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中のリボース−５−リン酸イソメラーゼ活性によって、任意選択のタンパク質またはポリペプチドをコードする異種遺伝子を発現させることで、達成されてもよい。米国特許出願第１３／１６１７３４号明細書に記載されるように、ＲＰＩ−ＡおよびＲＰＩ−Ｂと称される２つのリボース−５−リン酸イソメラーゼ酵素群があり、そのどちらが発現されてもよい。
【００７０】
別の実施形態では、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，９８９，２０６号明細書および米国特許第７，９９８，７２２号明細書で開示される、高活性の変異プロモーターを使用して、キシロース利用代謝経路の一部として発現されるキシロースイソメラーゼが発現される。その中で開示される変異プロモーターは、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターである。
【００７１】
別の実施形態では、キシロース利用代謝経路の一部として発現されるキシロースイソメラーゼは、同一譲受人同時係属米国特許公開第２０１１−０３１８８０１号明細書で開示されるように、ＥＣ  ５．３．１．５によって同定される酵素クラスに含まれる、Ｉ群キシロースイソメラーゼである。その中では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中において、２群キシロースイソメラーゼよりも活性が高い、アクチノプラネス・ミズリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）から単離されたコード領域から発現されるものなどのＩ群キシロースイソメラーゼが開示されている。その中で、Ｉ群キシロースイソメラーゼは、（ＰＨＹＬＩＰ（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  パッケージ  バージョン  ３．５ｃ；Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ（１９８９）Ｃｌａｄｉｓｔｉｃｓ  ５：１６４−１６６）中で実装されるＰＨＹＬＩＰ近隣結合アルゴリズム、ＧｒｏｕｐＳｉｍ解析（Ｃａｐｒａ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ（２００８）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２４  １４７３−１４８０）、およびプロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージのｈｍｍｓｅａｒｃｈアルゴリズム；Ｊａｎｅｌｉａ  Ｆａｒｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｍｐｕｓ，Ａｓｈｂｕｒｎ，ＶＡを使用する）を使用して、分子系統バイオインフォマティクス解析によって、定義される。
【００７２】
別の実施形態では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１１−００１４６７０−Ａ１号明細書で開示されるように、エタノールおよび酢酸アンモニウムを含有するストレス培養中での増殖に適応されている。酢酸耐性が改善されたこれらのザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、酢酸を含有するセルロース系バイオマス加水分解物を含有する発酵培地を使用する場合に、特に有用である。
【００７３】
上記参考文献で開示される株は、本方法で使用されてもよい株の例を提供し、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５、ＺＷ６５８（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８）、ＺＷ８００、ＺＷ８０１−４、ＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡ、ＡｃＲ＃３、およびＺＷ７０５が挙げられる。
【００７４】
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）発酵
本方法では、接種された培地、または発酵ブロスは、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖に適した条件下で培養される。一実施形態では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、発酵で使用される条件下において、エタノール生産の効果的生体触媒であるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株細胞であり、発酵ブロス中にエタノールが生成される。増殖が阻害される程度に発酵培地中の糖類濃度が高い場合、培地は、参照によって本明細書に援用する、同一譲受人の米国特許第７，６２９，１５６号明細書で開示されるように、ソルビトール、マンニトール、またはその混合物を含む。典型的に、ソルビトールまたはマンニトールが、約５ｍＭの最終濃度で培地中に存在する。
【００７５】
典型的に、約３０℃〜約３７℃の温度と、約４．５〜約７．５のｐＨの条件が使用される。典型的に、（嫌気的、微好気的、または微好気性発酵などの条件を含んでもよい）培養物は、空気、酸素、またはその他の気体の補給なしで、少なくとも約２０時間培養され、そして約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０時間以上培養されてもよい。典型的に、種培養が約２０時間培養されるのに対し、発酵生産培養物は、約４０時間以上培養される。起泡を最小化するために、消泡剤（シリコーンベース、有機ベースなどの任意の種類）を必要に応じて培地に添加してもよい。
【００７６】
商業的生産発酵培養物では、多様な培養手順を応用してもよい。例えば大規模生産は、バッチおよび連続培養手順の双方を使用してもよい。古典的バッチ培養法は、培地組成が培養開始時に設定されて、培養工程において人為的変更を受けない閉鎖系である。したがって所望の生物を培養工程開始時に培地に接種し、系に何も添加せずに、増殖または代謝活性を生じさせる。しかし典型的に、「バッチ」培養は、炭素源添加に関してバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの要素を制御する試みが頻繁になされる。バッチ系では、系の代謝産物組成とバイオマス組成は、培養を停止させる時点まで常に変化する。バッチ培養内では、細胞は、静的な遅滞期から高い対数増殖期へ、そして最後に、増殖速度が減退または停止する静止期へと減速する。処置を施さない場合、静止期にある細胞はやがて死滅する。対数期にある細胞は、往々にしてエタノール生産の大半に関与する。
【００７７】
標準バッチ系の変法が、流加系である。流加培養工程もまた、本方法および組成物に適し、培養の進行と共に基質が徐々に添加されることを除いては、典型的なバッチ系を構成する。流加バッチ系の実際の基質濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、およびＣＯ２のような排ガスの分圧などの測定可能要素の変化に基づいて推定する。バッチおよび流加培養法は、一般的で当該技術分野で周知であり、例は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，ａｎｄ  Ｂｒｏｃｋ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７，（１９９２）にある。
【００７８】
本方法および組成物はまた、連続培養工程で使用してもよい。連続培養は、バイオリアクターに培養液が継続的に添加される開放系であり、同時に等量の馴化培地が、加工のために取り出される。連続培養は、概して、細胞が主に対数増殖期にある、一定の高い液相密度に細胞を維持する。代案としては、固定化細胞を用いて連続培養を実施してもよく、その中では炭素および栄養素が継続的に添加されて、有価生成物、副産物または老廃物が、細胞集団から継続的に取り出される。細胞固定化は、当業者に知られているように、天然および／または合成材料から構成される幅広い固体支持体を使用して、実施してもよい。
【００７９】
生産工程では、生産発酵培養は、典型的に、システムの掃除が必要になるまで相次いで実施される。
【００８０】
本方法および組成物はまた、同時糖化発酵（ＳＳＦ）工程で使用してもよい。例えば参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１１−０３１８８０３号明細書で開示される方法を使用してもよい。このＳＳＦ工程では、高濃度のエタノール生産のための同時糖化発酵反応において、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が、低いインペラ撹拌、および糖化発酵混合物中の高濃度の不溶性固形分の条件下で、培養される。さらに、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の追加前に部分的糖化が実施され、次にさらなる糖化および発酵が同時に起きる、ハイブリッド糖化および発酵（ＨＳＦ）工程を使用してもよい。
【実施例】
【００８１】
以下の実施例で、本発明をさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しながら、例証としてのみ提供されるものと理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を見極めることができ、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明に様々な変更と修正を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。
【００８２】
略語の意味は、次の通りである。「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｇ／Ｌ」は１リットルあたりグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍで評価された光学濃度を意味し、「ＥＦＴ」は経過発酵時間を意味し、「ｐｐｍ」は百万分率を意味する。
【００８３】
一般方法
ＺＷ７０５株の説明
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株は、ＺＷ８０４−１株から作成した。ＺＷ８０１−４は、参照によって本明細書に援用する、同一譲受人の米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載される、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の組換えキシロース利用株である。ＺＷ８０１−４株はＺＷ８００株に由来して、それはＺＷ６５８株に由来し、これらは全て米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載される。ＺＷ６５８は、逐次遺伝子転位事象によって、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼ、およびトランスケトラーゼをコードする、４つのキシロース利用遺伝子を含有する２つのオペロン、ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔをＺＷ１（ＡＴＣＣ３１８２１）をゲノムに組み込み、続いてキシロース含有選択培地上で適応させて構築した（米国特許第７，６２９，１５６号明細書）。ＺＷ６５８は、ＡＴＣＣＰＴＡ−７８５８として寄託した。ＺＷ６５８中で、宿主媒介二重交差相同的組換えを使用して、グルコースフルクトース酸化還元酵素をコードする遺伝子を挿入的に不活性化し、スペクチノマイシン耐性を選択可能なマーカーとして、ＺＷ８００を作り出した（米国特許第７，７４１，１１９号明細書）。Ｃｒｅリコンビナーゼを使用した部位特異的組換えによって、ｌｏｘＰ部位と境を接するスペクチノマイシン耐性マーカーを除去し、ＺＷ８０１−４を作成した。
【００８４】
参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１１−００１４６７０号明細書に記載されるようにして、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ８０１−４株の培養物を酢酸アンモニウムを含有する培地のストレス条件下での増殖に適応させ、ＺＷ７０５を作成した。２５０ｍｌの撹拌されるｐＨおよび温度制御発酵槽（Ｓｉｘｆｏｒｓ；Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内で、ＺＷ８０１−４の連続培養を実施した。発酵のための基礎培地は、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１５ｍＭのリン酸アンモニウム、１ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、１０ｍＭのソルビトール、５０ｇ／Ｌのキシロース、および５０ｇ／Ｌのグルコースであった。高濃度の酢酸およびアンモニアの存在下における増殖への適応は、９７日間にわたり、比希釈率によって測定される確立成長速度を維持しながら、上記連続培養培地に添加する酢酸アンモニウムの濃度を少しずつ増大させてもたらされた。酢酸アンモニウムは、１６０ｍＭの濃度に増大された。アンモニウムイオン濃度のさらなる増大は、１３９日間の連続培養の終わりまでに、リン酸アンモニウムを２１０ｍＭの最終総アンモニウムイオン濃度に添加することで達成される。ＺＷ７０５株は、単一コロニーへの播種と１個の選択コロニーの増幅によって、適応集団から単離された。
【００８５】
穂軸組成物
国立再生可能エネルギー研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｇｏｒａｔｏｒｙ）（Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６１８（２００８年４月改訂）で詳述されるように、ＡＳＴＭ  Ｅ１７５８−０１「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ｂｙ  ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣによる炭水化物測定標準法）」を使用して、出発トウモロコシ穂軸中のセルロースおよびキシランの量を測定した。組成物は、乾燥重量を基準にして、３４．８％セルロース、２９．２％キシラン、１２．８％リグニンと判定された。
【００８６】
糖化酵素
Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼおよびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）−ＣＸ１２Ｌは、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ｕ．Ｓ．Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹから得られた。Ｎｏｖｏｚｙｍｅ−１８８は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（２８８０  Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から得られた。
【００８７】
Ｈ３Ａタンパク質
Ｈ３Ａタンパク質は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の遺伝子改変Ｈ３Ａ株から作成された。株Ｈ３Ａは、米国特許第７，６６６，６４８号明細書に記載されるようにして調製した。簡単に述べると、ＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９８４，２０：４６−５３）に由来して、高いセルラーゼ産生について選択されたトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）変異株を、電気穿孔を使用して、β−グルコシダーゼ発現カセットおよびエンドキシラナーゼ発現カセットで同時形質転換した。１つの形質転換体は、＃２２９株と称される。電気穿孔を使用して、β−キシロシダーゼＦｖ３Ａ発現カセット、β−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄ発現カセット、およびＦｖ５１Ａα−アラビノフラノシダーゼ発現カセットにより、＃２２９株を同時形質転換した。Ｈ３Ａ株は、この変換段階から単離された。
【００８８】
Ｈ３Ａ株の発酵中に生成される細胞外タンパク質を遠心分離によって細胞集団から分離し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ分子量カットオフ１０ｋＤのメンブレンを通過させて膜限外濾過によって濃縮し、ｐＨを４．８に調節した。総タンパク質は、較正物質としてウシ血清アルブミンを使用して、ＷｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍおよびＧｏｒｎａｌｌによる修正ビウレット法を使用して測定した（Ｗｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍ，１９６０，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．１６４０；Ｇｏｒｎａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９４９  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １７７：７５２）。本明細書でＨ３Ａタンパク質とも称されるこのＨ３Ａ細胞外タンパク質調製物は、セルラーゼおよびヘミセルラーゼ組み合わせ調製物として使用され、ＳＳＦ中に複合糖質加水分解をもたらした。
【００８９】
穂軸加水分解物ＦＲＦ１３
前処理
トウモロコシ穂軸加水分解物は、最初に、米国特許第７，９３２，０６３号明細書に記載される低アンモニア法を使用して、粉砕トウモロコシ穂軸の希釈アンモニア前処理によって調製した。容器本体周囲に蒸気を通過させるためのジャケットを含む、水平Ｌｉｔｔｌｅｆｏｒｄ  Ｄａｙ  １３０Ｌ反応器（Ｌｉｔｔｌｅｆｏｒｄ  Ｄａｙ，Ｉｎｃ．，Ｆｌｏｒｅｎｃｅ，ＫＹ）を前処理のために使用して、ＳＳＬ３４と命名される前処理穂軸を生成した。容器に、種トウモロコシ処理からの穂軸を、湿潤穂軸ベースで４６容量％の反応器充填に達するまで装填した（５１ポンド）。穂軸は、１．０ｍｍの篩付き大型微粉砕機（型番号１ＳＨ，シリアル番号１００１９；Ｐｕｌｖｅｒｉｚｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  Ｃｏ．，Ｓｕｍｍｉｔ，ＮＪ）を使用して、１ｍｍ未満のサイズにした。必要に応じて、粉砕前に、穂軸にドライアイスを添加して、機器が加熱するのを防止した。微粉砕機の主要駆動部分は、最大ローター速度９，６００ＲＰＭの５ｈ．ｐ．のモーターである。それは、６個の回転ハンマー、およびシェルを有し、対向する衝撃縁で被覆される。
【００９０】
穂軸は、０．３８５ｇ／ｃｍ３の湿潤蒿密度と、７．４重量％の水分を有した。容器上部近くへの２８．９重量％の水酸化アンモニウム溶液（９．８ポンド）および水（１７．９ポンド）の装入に先だって、０．１気圧に達するまで容器を真空にして、乾燥重量バイオマスに対して６重量％のＮＨ３と、容器内部の６０重量％固形分を得た。ＳＳＬ３５およびＳＳＬ３６と命名される第２および第３の前処理バッチを同一様式で実施して、引き続く糖化のために十分な材料を生成した。全てのバッチ中で、反応器撹拌器を７０ｒｐｍに設定し、容器のジャケットに蒸気を通過させた。容器が８０℃の内部温度に達したら、容器の上部近くに蒸気を装入して、容器内部温度を１４５℃に上昇させた。この温度を２０分間保った。この保持時間で１５分目に、ジャケットを通過する蒸気を停止させた。前処理の終了時、ベントコンデンサを通じて、大気圧に達するまで反応器を減圧させた。引き続いて、１５分間真空（およそ１気圧未満）にして温度を６０℃未満に低下させ、容器の底弁開放に先だって、前処理穂軸から追加的なアンモニアおよび水を除去し、前処理バイオマスを回収した。前処理穂軸バッチＳＳＬ３４、ＳＳＬ３５、およびＳＳＬ３６の最終固形分重量％は、それぞれ６７．４％、６６．２％、および６８．０％であった。
【００９１】
糖化
上述のＨ３Ａタンパク質での糖化によって、ＳＳＬ３４、ＳＳＬ３５、およびＳＳＬ３６調製品からの前処理トウモロコシ穂軸の混合物を使用して、２００Ｌ発酵槽内で、加水分解物（ＦＲＦ１３）を生成した。水の残留分（１２０．０ｋｇ）を発酵槽に添加し、ジャケットを１２１℃に加熱して２０分間滅菌した。水を４７℃に冷却し、タンク上部のポートを通じて前処理穂軸混合物を添加し；この時点で２０．０ｋｇを添加した。１ＮのＨ２ＳＯ４でｐＨを５．３に調節し、酵素製剤を添加した。酵素の投入量は４．５３ｋｇであり、それは反応器に添加された全穂軸中の１ｇのグルカン＋キシランあたり１４ｍｇのタンパク質に相当した。続く１２時間にわたり、３時間毎に４回、１５．０ｋｇの穂軸を反応器に添加して、各添加後に、１ＮのＨ２ＳＯ４でｐＨを５．３に調節した。この操作の標的固形物装填量は、２５重量％であった。発酵槽は、およそ７２時間にわたり４７℃およびｐＨ５．３に制御した。この期間の終了時に、２０リットルを抜き取ってこれらの実験で使用し、容器の残留内容物を発酵させた。加水分解物サンプルを分析し、残りは使用時まで冷蔵した。サンプル分析の結果は、表１に示される。
【００９２】
【表１】
2015519078.tif 000003
【００９３】
穂軸加水分解物ＭＤ０７＃３
前処理
トウモロコシ穂軸のバッチをハンマーミル（Ｇｌｅｎ  ＭｉｌｌｓＩｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＨ）で処理し、３／８インチ（０．９５ｃｍ）または３／１６インチ（０．４８ｃｍ）の篩を通過させて、１４５℃に維持される１７０ＬのＪａｙｇｏ反応器（Ｊａｙｇｏ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｍａｈｗａｈ，ＮＪ）内で、乾燥重量バイオマスに対して６％、８％、または１０％のアンモニアで２０分間処理した。水性アンモニア注入前に反応器を約０．１バールに排気し、２０分後、反応器を二段階で約０．１バールにフラッシュした。前処理穂軸混合物の最終固形分濃度は、約６０％であった。
【００９４】
糖化
ＭＤ０７＃３加水分解物は、再循環ループを装着した１０００Ｌ発酵槽内で生成された。水残留分（５４２．３ｋｇ）を発酵槽に添加して、１２１℃で２０分間滅菌した。水を４７℃に冷却し、タンク上部に位置する供給装置を通じて前処理穂軸混合物を添加し；この時点で１１２．１ｋｇを添加した。９．８重量％のＨ２ＳＯ４でｐＨを５．３に調節し、第１の酵素投入量を添加した。使用される酵素質量および対応する投入量については、表２を参照されたい。次の９時間にわたり、追加的な３１７．６ｋｇの前処理トウモロコシ穂軸を添加し、添加全体を通じて、９．８重量％のＨ２ＳＯ４でｐＨを５．３に調節した。この操作の標的固形物装填量は、２５重量％であった。最初の酵素添加の１２時間後に、第２の投入量を添加した（表２を参照されたい）。およそ９６時間にわたり発酵槽を４７℃およびｐＨ５．３に調節し、再循環ループを通じてスラリーを循環させた。最初の酵素添加の３時間後に開始して、再循環ループ内のロータステータ粉砕機を断続的に使用して、スラリー中の前処理穂軸の粒度を低下させた。粉砕機は、毎回３０〜１１０分間程度で、９回使用した。９６時間の操作終了時、いくつかの加水分解物を抜き取り、これらの実験で使用した。加水分解物サンプルを分析して、残りは使用時まで冷蔵した。サンプル分析の結果は、表３にある。
【００９５】
【表２】
2015519078.tif 000004
【００９６】
【表３】
2015519078.tif 000005
【００９７】
遠心分離と濾過によって、ＭＤ０７＃３加水分解物を清澄化ＭＤ０７＃３から生成し、最終段階は、０．２μｍフィルターを通じた濾過であった。
【００９８】
バージニアマイシン供給元
Ｌａｃｔｒｏｌ（登録商標）は、Ｐｈｉｂｒｏ（Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）から購入され、１００％バージニアマイシンである。
【００９９】
Ｌａｃｔｏｓｉｄｅ  Ｖ（商標）およびＬａｃｔｏｓｉｄｅ  ２４７（商標）は、Ｌａｌｌｅｍａｎｄ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入された。
【０１００】
培地
ＭＲＳ＝１０ｇ／Ｌのペプトン、８ｇ／Ｌの肉エキス、４ｇ／Ｌの酵母エキス、２０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム三水和物、１ｇ／Ｌのツイーン８０、２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、２ｇ／Ｌのクエン酸三アンモニウム、０．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／ＬのＭｎＳＯ４＊４Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．２。
【０１０１】
ＨＰＬＣ分析
発酵サンプルを設定間隔で収集し、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｌｌｉａｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）、またはＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＬＣのいずれかを使用して、条件＝０．６ｍＬ／分の０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４、注入容積＝５μＬ、オートサンプラー温度＝１０℃、カラム温度＝５５℃、稼働時間＝２５分間、屈折率による検出（４０℃保持）で、ＥｔＯＨと、残留糖類と、酢酸、乳酸、およびグリセロールなどのその他の代謝産物とについて分析した。ＨＰＬＣカラムは、ＢｉｏＲａｄ（Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ，ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から購入された。分析物を屈折率検出によって定量化し、既知の標準物質と比較した。
【０１０２】
実施例１
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のバージニアマイシン耐性
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株（一般方法に記載される）種菌は、３３℃で８時間にわたり、ＭＲＭ３Ｇ６培地（１０ｇ／ＬのＢＢＬ酵母エキス、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、６０ｇ／Ｌのグルコース、ｐＨ５．５）中で、２ｍＬのＯＤ約１０の冷凍保存株を復活させて調製した。この培養を使用して、２ｇ／Ｌの酵母エキスおよび様々なバージニアマイシン製剤が添加された、清澄化ＭＤ０７＃３加水分解物（一般方法を参照されたい）を含有する試験管に、２０％（最終容積）の接種率で接種して、約０．５の初期ＯＤを得た。バージニアマイシン含有剤Ｌａｃｔｒｏｌ（登録商標）、Ｌａｃｔｏｓｉｄｅ  Ｖ（商標）またはＬａｃｔｏｓｉｄｅ  ２４７（商標）の原液は、エタノール中１０００ｐｐｍで調製した。これらの薬剤を２．５ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、または２０ｐｐｍで培地に添加した。Ｌａｃｔｒｏｌ（登録商標）の仕様書は、製剤が１００％活性であるとして、２．５ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）が、２．５ｐｐｍのバージニアマイシンに相当するとしている。バージニアマイシン含有原液および純粋エタノールの添加を通じて、各試験管内の初期エタノール濃度は、１．９４容積％（１０．３ｍＬ中の２００μＬ）になる。試験管を３３℃に保って３２時間振盪し、ＯＤ６００で測定して増殖をモニターした。図２に示されるように、ＺＷ７０５は、１０ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）培地以外では、バージニアマイシンを欠く対照培養よりも、バージニアマイシン含有剤の存在下でより良い増殖を示した。
【０１０３】
実施例２
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）種培地中の汚染制御に対するバージニアマイシンの効果
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株（一般方法に記載される）種菌は、３３℃で約８時間にわたり、ＭＲＭ３Ｇ６培地（１０ｇ／ＬのＢＢＬ酵母エキス、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、６０ｇ／Ｌのグルコース、ｐＨ５．５）中で、２ｍＬのＯＤ約１０の冷凍保存株を復活させて調製し、その時点でＯＤは約２であった。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＴＣＣ８０１４株の種菌は、個々のコロニーをＭＲＳ培地に接種して３３℃で８時間増殖させて調製し、その時点でＯＤは約０．４であった。
【０１０４】
種培地（１０ｇ／ＬのＡｍｂｅｒｅｘ６９５酵母エキス、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１０ｍＭのソルビトール、１５０ｇ／Ｌのグルコース、ｐＨ５．５）を調製して、高圧蒸気滅菌（１２１℃、３０分間）によって滅菌した。５００ｍＬの培地サンプルに、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５（０．０５のＯＤ）およびＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＴＣＣ８０１４（０．０００５のＯＤ）の混合物を接種して、１：１００の汚染レベルを生成し、３３℃およびｐＨ５．５で発酵させた（ｐＨ調節が必要であれば、４ＮのＮＨ４ＯＨを添加した）。第２のサンプルでは、２ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）を添加した。Ｌａｃｔｒｏｌ（登録商標）は１００％活性成分であるので、これは２ｐｐｍのバージニアマイシンに相当する。ＨＰＬＣ（Ａｍｉｎｅｘ  ８７Ｈカラム、０．０１ＮのＨ２ＳＯ４、０．６ｍＬ／分）によって、培地に生成した乳酸およびエタノールの量を異なる時点でアッセイし、結果は図３Ａ（乳酸）および３Ｂ（エタノール）に示される。
【０１０５】
あらゆる抗菌剤（サンプルＦ１０６７）不在下では、１９．３時間の発酵後に、２．４ｇ／Ｌの乳酸および６０．３ｇ／Ｌのエタノールが形成した。２ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）添加培地（サンプルＦ１０６８）の平行培養では、１９．３時間の発酵後に０．３ｇ／Ｌの乳酸が生成し、乳酸濃度の低下によって証明されるように、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の増殖低下に対する、２ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）投入の有効性が例証された。Ｌａｃｔｒｏｌ（登録商標）存在下のエタノール生成量は、対照培養中の生成量と同等のままであった。
【０１０６】
グルコースはまた、上述したようにＨＰＬＣによっても測定され、結果は、グルコース消費量が、Ｌａｃｔｒｏｌ（登録商標）ありまたはなしの培養物で、同様であったことを示した（図４）。
【０１０７】
実施例３
バージニアマイシン処理Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）種培養を加水分解物培地種菌として使用する効果
実施例１のＥＦＴ＝１９．３時間におけるＦ１０６７培養物（Ｌａｃｔｒｏｌ（登録商標）なし）のサンプルを種培養として使用して、４５０ｍＬの穂軸加水分解物培地（ＦＲＦ１３；一般方法を参照されたい）（ｐＨ５．８に調節、＋１０ｍＭソルビトール）に、１０容積％（最終容積）で接種し、それを３３℃（ＥＦＴ＝２１時間で３０℃に低下させた）およびｐＨ５．８（４ＮのＮａＯＨで調節）で発酵させた。４８時間の発酵後（サンプルＦ１０６９）、２７．６ｇ／Ｌの乳酸（図５Ａ）および３２．６ｇ／Ｌのエタノール（図５Ｂ）が形成した。平行実験では、（実施例１からの）１９．３時間目のＦ１０６８培養物（２ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）添加）のサンプルを種培養として使用し、同じ１０容積％で同一培地に接種した。４８時間の発酵後（サンプルＦ１０７０）、７３．５ｇ／Ｌのエタノールが形成し（図５Ｂ）、検出可能な乳酸生成はなかった（図５Ａ）。結果は、汚染種培養で使用された低用量のＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）が、加水分解物発酵の汚染防止に十分であったことを示した。
【０１０８】
双方の加水分解物発酵中で、上述したようにＨＰＬＣによって、キシロースおよびグルコースもまたアッセイし、結果は図６に示される。どちらの発酵も、完全なグルコース消費を示したが、Ｌａｃｔｒｏｌ（登録商標）を含有する種培養が接種された発酵は、グルコースをより迅速に消費した。Ｌａｃｔｒｏｌ（登録商標）含有種培養を接種された発酵では、ほぼ完全なキシロース消費があった一方で、Ｌａｃｔｒｏｌ（登録商標）を欠く種培養が接種された発酵では、５０％を上回るキシロースが消費されなかった（図６）。
【０１０９】
実施例４
汚染Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）加水分解物の発酵に対するバージニアマイシンの効果
加水分解物発酵中の乳酸形成防止に必要なＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）投入量を判定するために、（実施例１からの）ＥＦＴ＝１９．３時間における意図的に汚染した種培養Ｆ１０６７の一部を種培養として使用して、０ｐｐｍ（サンプルＦ１０６９）または２ｐｐｍ（サンプルＦ１０７１）のＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）のいずれかを含有する穂軸加水分解物培地（ＦＲＦ１３；一般方法を参照されたい）（ｐＨ５．８に調節、＋１０ｍＭソルビトール）に、１０容積％（最終容積）で接種し、次にそれを３３℃（ＥＦＴ＝２１時間で３０℃に低下させた）およびｐＨ５．８（４ＮのＮａＯＨで調節）で発酵させた。
【０１１０】
より高濃度のＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）について調査するために、Ｆ１０６７と同様の種培養を生成し、１０、５０、または２５０ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）（それぞれサンプルＦ１０８１〜１０８３）の存在下で、上述したのと同様にして、穂軸加水分解物発酵のための種菌として使用した。図７Ａの結果は、４５時間後、０および２ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）を含有する培地中に大量（＞２０ｇ／Ｌ）の乳酸が生じたことを示す。１０ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）の含有は、乳酸形成を４５時間で約５ｇ／Ｌに低下させた。５０および２５０ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）の含有は、乳酸濃度を＜１ｇ／Ｌに保ち、加水分解物発酵中に汚染微生物を制御するための、より高濃度のバージニアマイシンに対する必要性が例証された。
【０１１１】
図７Ｂに示されるように、エタノール生産は、０ｐｐｍまたは２ｐｐｍを含有する発酵よりも、１０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、または２５０ｐｐｍのＬａｃｔｒｏｌ（登録商標）を含有する発酵中でより高かった。
【図１】
2015519078.tif 000006
【図２】
2015519078.tif 000007
【図３Ａ】
2015519078.tif 000008
【図３Ｂ】
2015519078.tif 000009
【図４】
2015519078.tif 000010
【図５Ａ】
2015519078.tif 000011
【図５Ｂ】
2015519078.tif 000012
【図６Ａ】
2015519078.tif 000013
【図６Ｂ】
2015519078.tif 000014
【図７Ａ】
2015519078.tif 000015
【図７Ｂ】
2015519078.tif 000016
【国際調査報告】
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2015519078.tif 000018
2015519078.tif 000019