(57)【要約】  本発明は、臨床および前臨床マトリクス中の、Copolymer 1、Copolymer-1、Cop 1またはCopとしても知られる酢酸グラチラマー（ＧＡ）を包含するペプチド、ペプチドオリゴマーおよびポリマーの薬物動態評価のための特異的免疫アッセイを開発する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酢酸グラチラマー（ＧＡ）に対する抗体を産生および取得する方法であって、下記を含んで成る方法：
ａ．哺乳動物を酢酸グラチラマーで免疫化して、ＧＡに対する抗体を産生するように免疫反応を起こすこと；
ｂ．免疫化から所定の時間後に、免疫化された哺乳動物から、産生された抗体を含む血清を採取し、産生された抗体を精製するために、抗体を含む血清をプロテインＡカラムに通して、抗ＧＡ抗体の第１プール、および場合によりＧＡを含むフロースルーを得ること；
ｃ．前記抗ＧＡ抗体を用いて、抗ＧＡ抗体カラムを調製し、
ｉ．抗体を含む血清を抗ＧＡ抗体カラムに通して、抗ＧＡ抗体の第２プールを得るか、または
ii．ステップ（ｂ）のプロテインＡ精製カラムからのフロースルーを通して、抗体の第２プール、および場合によりＧＡを含むフロースルーを得ること；
ｄ．場合により各段階のフロースルーで哺乳動物を再免疫化し、場合により抗体の第１および第２プールを混合して、酢酸グラチラマーに対する抗体を取得すること。
【請求項２】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項３】
生物学的サンプル中の酢酸グラチラマー（ＧＡ）を薬物動態評価するためのアッセイであって、下記を含んで成るアッセイ：
ａ．酢酸グラチラマーに対する抗体を産生および取得し、該抗体を用いて、上記のサンプルの薬物動態評価のための抗ＧＡ抗体カラムを調製する方法；
ｂ．酢酸グラチラマー−ウシ血清アルブミン（ＧＡ−ＢＳＡ）コンジュゲートアフィニティカラムを得、該カラムを用いて、
ｉ．前記薬物動態評価のために、サンプル中の抗ＧＡ抗体をポジティブアフィニティ精製するか、または
ii．前記薬物動態評価のために、ＧＡ血清結合タンパク質をポジティブアフィニティ精製する
方法；
ｃ．前記薬物動態評価のために、ＧＡ血清結合タンパク質をネガティブ精製するために、ＢＳＡまたはＨＳＡアフィニティカラムを用いる方法；または
ｄ．前記薬物動態評価のために、ＧＡ、精製ＧＡ血清結合タンパク質または抗ＧＡ抗体を用いてＥＬＩＳＡを行う方法；または
ｅ．上記方法の組み合わせ。
【請求項４】
生物学的サンプルが、前臨床もしくは臨床マトリクスまたはそれらの組み合わせである、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項５】
酢酸グラチラマーに対する抗体を産生および取得する方法が、請求項１に記載の方法である、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項６】
酢酸グラチラマー−ウシ血清アルブミン（ＧＡ−ＢＳＡ）コンジュゲートアフィニティカラムを得る方法が、
ａ．ＢＳＡおよびＧＡのＮ末端アミン基をグルタルアルデヒドに共有結合させて、前記ＧＡ−ＢＳＡコンジュゲートを得ること；および
ｂ．ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩液中でＧＡ−ＢＳＡコンジュゲートをアフィゲルにカップリングして、前記ＧＡ−ＢＳＡコンジュゲートアフィニティカラムを得ること
を含む、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項７】
ＥＬＩＳＡがサンドイッチＥＬＩＳＡである、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項８】
薬物動態評価が、酵素免疫アッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降および免疫蛍光から成る群から選択される方法またはその組み合わせによって行われる、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項９】
薬物動態評価が、サンプル中のＧＡのＴ1/2、ＴmaxおよびＣmaxの情報を与える、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項１０】
生物学的サンプル中のＧＡペプチドの分子サイズ範囲を調べるために、ＧＡおよび参照対照のコパキソンをＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで分離する、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項１１】
サンプル中の抗ＧＡ抗体のポジティブアフィニティ精製を、抗ＧＡ抗体のポジティブ結合のためにサンプルをＧＡ−ＢＳＡコンジュゲートアフィニティカラムに通し、精製抗体を得るために前記結合抗体を溶離させることによって行う、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項１２】
サンプル中のＧＡ血清結合タンパク質のポジティブアフィニティ精製を、ＧＡ血清結合タンパク質のポジティブ結合のためにサンプルをＧＡ−ＢＳＡコンジュゲートアフィニティカラムに通し、精製タンパク質を得るために前記結合タンパク質を溶離させることによって行う、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項１３】
サンプル中のＧＡ血清結合タンパク質のネガティブ精製を、ＧＡ血清結合タンパク質以外の不純物のネガティブ結合のために、ポジティブアフィニティ精製において得られた溶出液もしくはフロースルーまたはそれらの組み合わせを、ＢＳＡまたはＨＳＡアフィニティカラムに通し、精製ＧＡ血清結合タンパク質を得ることによって行う、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項１４】
アッセイにおける各方法が、生物学的サンプル中のＧＡの特異性、交差反応性および濃度に関する情報を与える、請求項３に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床および前臨床マトリクスにおける、Copolymer 1、Copolymer-1、Cop 1またはCopとしても知られる酢酸グラチラマー（ＧＡ）を包含するペプチド、ペプチドオリゴマーおよびポリマーの薬物動態を評価するための、特異的な免疫アッセイを開発する方法を提供する。本発明はまた、哺乳動物において酢酸グラチラマー（ＧＡ）に対するｐＡｂ（ポリクローナル抗体）を作製する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症の処置に現在用いられている酢酸グラチラマーは、ミエリン塩基性タンパク質中に存在する４つのアミノ酸、すなわちグルタミン酸、リジン、アラニンおよびチロシンのランダムコポリマーである。１日１回２０ｍｇの酢酸グラチラマーを注射により皮下投与すると、Ｔ細胞集団が、炎症性Ｔｈ１細胞から、炎症反応を抑制する制御性Ｔｈ２細胞側にシフトする。作用機序は、グラチラマーがミエリン塩基性タンパク質に似ていることによっており、グラチラマーはin vivoでデコイとして働き、ミエリンに対する自己免疫反応を回避させる。ＧＡは皮下注射されると、投与量の一部がリンパ循環に、一部が全身循環に入り得ると考えられるが、血液脳関門のような免疫学的寛容部位を通過するようではないと考えられる。ＧＡのランダムポリマーは、注射部位で局所的に、小オリゴペプチドおよび遊離アミノ酸に加水分解されることが知られており、したがってエピトープが絶えず変化するので、ヒトでは注射後１時間を超えて、イヌでは注射後６時間を超えては、薬物動態プロファイルの決定のために免疫アッセイを用いることができなかった（CDER Aplication: NDA 20-622/S015参照）。
【発明の概要】
【０００３】
ＧＡの可能なすべてのエピトープに対応する恐らくは高親和性のｐＡｂの作製、抗体のアフィニティ精製、およびＧＡ結合血清結合タンパク質の分離の本発明の新規アプローチにより、前臨床および臨床マトリクス中の血清タンパク質結合ＧＡの検出における実際的困難を克服する、非常に特異的で高感度のアッセイの開発が可能となった。
【０００４】
本発明は、前臨床および臨床マトリクスにおける酢酸グラチラマー薬物動態評価のための特異的免疫アッセイを開発する方法に関する。この方法は、下記ステップを含む：
ａ）ウサギにおいて酢酸グラチラマーに対するｐＡｂを作製する方法。
ｂ）ＧＡとＢＳＡとをコンジュゲート化し、抗ＧＡ ｐＡｂをアフィニティ精製する方法。
ｃ）前臨床および臨床マトリクスからＧＡ結合タンパク質を精製する方法。
ｄ）免疫アッセイにおいてＧＡの検出または定量のためにＧＡ結合血清タンパク質またはＢＳＡもしくはＨＳＡをキャプチャー試薬として使用すること。
ｅ）前臨床および臨床マトリクス中のＧＡを定量するための、多重フォーマットの特異的で高感度の免疫アッセイを開発すること。
ｆ）ＧＡのin vivo半減期を延長する新規ＧＡ製剤を開発するためのタンパク質担体を同定すること。
【０００５】
本発明の一態様においては、ＧＡ原薬中に存在するランダムポリマーに対する抗体を産生するために、抗原混合物に対する抗体の産生に一般に用いられるカスケード免疫化スキームを応用した。
【０００６】
本発明は他の一態様において、ネガティブおよびポジティブアフィニティ精製カラムを調製するための、ＢＳＡおよびＢＳＡ−ＧＡコンジュゲートのようなアフィニティリガンドの調製に関する。
【０００７】
本発明の他の一態様においては、アフィニティ精製抗ＧＡ抗体の特異性を、ＥＬＩＳＡにおいて、ポジティブ結合のためにはＧＡ、ＢＳＡ−ＧＡコンジュゲートを用いて、ネガティブ結合のためにはＢＳＡ、ＨＳＡ、前臨床および臨床マトリクスからのＧＡ結合血清タンパク質を用いて評価した。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、銀染色によって染色したＳＤＳ ＰＡＧＥにおいて分子量に基づいて分離されたBioconのＧＡおよび市販のＧＡの比較を示す（ＧＡ−グラチラマー）。Ｌ１−タンパク質ラダー；Ｌ２−市販ＧＡ ５μｇ／レーン；Ｌ３−Biocon ＧＡ ５μｇ／レーン。
【図２】図２は、プロテインＡ精製抗Biocon ＧＡウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングによるBiocon ＧＡのアイデンティティーを示す。ＳＤＳ ＰＡＧＥで分離したBiocon ＧＡおよび市販ＧＡ（５μｇ）をＰＶＤＦ膜にブロットし、プロテインＡ精製抗Biocon ＧＡウサギポリクローナル抗体（５５μｇ／ｍｌ）で探り、二次抗ウサギポリクローナルＩｇＧ ＡＬＰコンジュゲート（希釈−１／２５０００）で検出した。Ｌ１−タンパク質ラダー；Ｌ２−市販ＧＡ ５μｇ／レーン；Ｌ３−Biocon ＧＡ ５μｇ／レーン。
【図３】図３は、抗原アフィニティ精製抗Biocon ＧＡウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングによるBiocon ＧＡのアイデンティティーを示す。ＳＤＳ ＰＡＧＥで分離したBiocon ＧＡおよび市販ＧＡ（５μｇ）をＰＶＤＦ膜にブロットし、抗原アフィニティ精製抗Biocon ＧＡウサギポリクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ）で探り、抗ウサギＩｇＧ ＡＬＰコンジュゲート（希釈−１／２５０００）で検出した。Ｌ１−タンパク質ラダー；Ｌ２−市販ＧＡ ５μｇ／レーン；Ｌ３−Biocon ＧＡ ５μｇ／レーン。
【図４】図４は、カスケード免疫化スキームを示す。
【図５】図５は、ウサギにおいて抗グラチラマー抗体を産生させるカスケード免疫化においてデプリーションされたグラチラマー（ＧＡ）のＳＤＳ ＰＡＧＥプロファイリングを示す。レーンＳＭ：タンパク質分子量マーカー；レーンＢ：ブランク；レーンＧＡ：グラチラマー；レーンｄＧＡ１〜４：イムノデプリーションされたグラチラマー抗原。
【図６】図６は、プレ採血（Ｂ１）、試験採血（Ｂ２）、試験採血（Ｂ３）、産物採血（Ｂ４）および最終採血（Ｂ５）から精製された抗グラチラマー抗体による酢酸グラチラマーのウエスタンブロット分析を示す。
【図７】図７は、ＧＡ−ＢＳＡアフィニティカラムの調製を示す。
【図８】図８は、グルタルアルデヒドを架橋剤として用いる酢酸グラチラマーとウシ血清アルブミンとの架橋を示す。レーン１−タンパク質サイズマーカー；レーン２−ＢＳＡ；レーン３−グラチラマー；レーン４−コンジュゲート化されたＢＳＡ−グラチラマー（１）。
【図９】図９は、活性化セファロースマトリクス（アフィゲル（affigel）１５）への酢酸グラチラマー−ＢＳＡコンジュゲートのカップリングの有効性を示す。レーン１−タンパク質サイズマーカー；レーン２−カップリング後（１μｇ／レーン）；レーン３−カップリング前（１μｇ／レーン）（２）。
【図１０】図１０は、ＢＳＡ−ＧＡアフィニティカラムを用いた、マトリクスからのＧＡ結合タンパク質の精製、およびヒト血清からのＧＡ結合タンパク質のＳＤＳ ＰＡＧＥ銀染色プロファイルを示す。
【図１１】図１１は、ＧＡ結合血清タンパク質の特異性／交差反応性を示す。
【図１２】図１２は、ＧＡキャプチャー試薬として前臨床および臨床マトリクスから得たＧＡ結合血清タンパク質を用いる免疫アッセイフォーマットを示す。
【図１３】図１３は、ヒトマトリクス中のＧＡを検出するための、さまざまなＧＡキャプチャー試薬を用いて開発された薬物動態アッセイフォーマットを示す。
【図１４】図１４は、ラットマトリクス中のＧＡを検出するための、さまざまなＧＡキャプチャー試薬を用いて開発された薬物動態アッセイフォーマットを示す。
【図１５】図１５は、イヌマトリクス中のＧＡを検出するための、さまざまなＧＡキャプチャー試薬を用いて開発された薬物動態アッセイフォーマットを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、前臨床および臨床マトリクスにおける酢酸グラチラマー薬物動態評価のための特異的免疫アッセイを開発する方法に関する。この方法は、下記ステップを含む：
ａ）ウサギにおいて酢酸グラチラマーに対するｐＡｂを作製する方法。
ｂ）ＧＡとＢＳＡとをコンジュゲート化し、抗ＧＡ ｐＡｂをアフィニティ精製する方法。
ｃ）前臨床および臨床マトリクスからＧＡ結合タンパク質を精製する方法。
ｄ）免疫アッセイにおいてＧＡの検出または定量のために抗ＧＡ抗体、ＧＡ結合血清タンパク質またはＢＳＡもしくはＨＳＡをキャプチャー試薬として使用すること。
ｅ）前臨床および臨床マトリクス中のＧＡを定量するための、多重フォーマットの特異的で高感度の免疫アッセイを開発すること。
ｆ）ＧＡのin vivo半減期を延長する新規ＧＡ製剤を開発するためのタンパク質担体を同定すること。
【００１０】
本発明の一態様においては、ＤＰ（酢酸グラチラマー製剤）中のペプチドの分子サイズ範囲を調べるために、ＧＡのランダムポリマーおよび参照対照コパキソンをＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで分離した。ＤＰの抗原／ペプチドの免疫反応性が、ウエスタンブロット法により証明された。分離されたＧＡおよびコパキソンの抗原／ペプチドのほぼ全てが、「プロテインＡ」精製ｐＡｂおよびＧＡアフィニティ精製抗ＧＡ ｐＡｂに対し反応性であった。ＧＡおよびコパキソンのＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットプロファイルから得られたデータの比較により、分子量ならびにプロテインＡ ｐＡｂおよび抗ＧＡ ｐＡｂに対する免疫反応性から、それらが同様／同一であることが示唆される。
【００１１】
他の一態様においては、ＧＡ原薬中に存在するランダムポリマーに対する抗体を産生するために、抗原混合物に対する抗体の産生に一般に用いられるカスケード免疫化スキームを応用した。この方法において、ウサギをＧＡのプライマリーおよびブースター投与により免疫化した後、各試験採血の高度免疫血清中の抗ＧＡ抗体を、プロテインＡカラムを用いて精製した。プロテインＡ精製ウサギ抗ＧＡ抗体を用いて、アフィニティ抗体カラムを調製して、同種タンパク質抗原を選択的にデプリーションし、それによってアフィニティカラムのフロースルーにおいて抗原プールに濃縮した。濃縮された抗原は、先のサイクルでは免疫反応を起こさなかったので、それをその後のブースター注射において免疫原として用いた。デプリーションされた免疫反応性の抗原およびフロースルー中に存在する濃縮された免疫反応性の低い抗原は、免疫細胞をプライミングして一次抗体（免疫反応性の低いタンパク質用）および二次抗体（免疫反応性に親和性の成熟したＡｂ）を産生させるのに役立ちうる。抗ＧＡ抗体の精製、免疫反応性抗原のデプリーション、免疫反応性の低い抗原の濃縮、およびブースター注射、のサイクルを繰り返すことにより、ＧＡ原薬中の全ての可能な免疫原性／抗原性タンパク質集団に対応する抗体を作製した。
【００１２】
本発明のさらに別の一態様においては、アフィニティカラム（ＢＳＡおよびＢＳＡ−ＧＡコンジュゲートカラム）の調製は下記ステップを含む：
ａ）アフィゲル１５を用いてＢＳＡアフィニティカラムを調製する。ｐＨ７．４のＰＢＳ中でＢＳＡのアフィゲルへのカップリングを行う。
ｂ）ＢＳＡとＧＡとを、各タンパク質のＮ末端アミノ基に共有結合するグルタルアルデヒド化学を用いてコンジュゲート化した。
ｃ）抗ＧＡ高度免疫血清からのウサギ抗体を、プロテインＡカラムを用いて精製し、透析により得た溶出液をＢＳＡ−ＧＡアフィニティカラムに通し、０．２５Ｍグリシン（ｐＨ２．５）を用いて抗体をアフィニティ溶離させ、溶出液を１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）で中和し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対し透析した。精製段階の１つにおいて、ＢＳＡカラムを用いてネガティブ精製を行った。
【００１３】
酢酸グラチラマーおよびＢＳＡをグルタルアルデヒドで架橋反応が完了するまで処理し、ＧＡ−ＢＳＡコンジュゲートの有効性を確かめるために、反応混合物を透析して過剰の未反応グルタルアルデヒドを除去し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ、次いで銀染色に付した。
【００１４】
本発明のさらに別の一態様においては、アフィニティ精製抗ＧＡ Ａｂの特異性を、ＥＬＩＳＡにおいて、ポジティブ結合のためにはＧＡ、ＢＳＡ−ＧＡコンジュゲートを用いて、ネガティブ結合のためにはＢＳＡ、ＨＳＡ、前臨床および臨床マトリクスからのＧＡ結合血清タンパク質を用いて評価した。同様に、ビオチニル化アフィニティ精製抗ＧＡ Ａｂも、同様の特異性結果を示した。
【００１５】
以下の実施例および添付の図面によって本発明をさらに詳しく説明する。ただし、実施例は本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【実施例１】
【００１６】
前臨床および臨床血清マトリクスからのＧＡ血清結合タンパク質の精製
異なる血清（ヒト、サル、ラット、イヌ、ウサギ）を個別に、ＧＡ−ＢＳＡコンジュゲートアフィニティカラムに通し、未結合タンパク質をカラムから洗い流した後、０．２５Ｍグリシン（ｐＨ２．５）を用いてＧＡ結合血清タンパク質を溶離し、溶出液を１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）で中和し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対し透析した。ＧＡ結合タンパク質のマトリクスからの精製に用いた方法、およびそのＳＤＳ ＰＡＧＥプロファイルをゲルに示す。
【実施例２】
【００１７】
ａ）ＧＡ結合血清タンパク質の特異性／交差反応性
精製したＧＡ結合タンパク質でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、ＧＡ直接コーティングを対照として、ビオチニル化ＧＡアフィニティｐＡｂとの交差反応性を調べた（実験２）。精製抗原プールは、アフィニティ精製抗ＧＡ ｐＡｂに対し交差反応性を示さないという結果が示された。
【００１８】
ｂ）キャプチャー試薬としての直接コーティングされたＧＡおよび精製ＧＡ結合タンパク質、およびビオチニル化ＧＡアフィニティｐＡｂによるＧＡの検出は、明らかなシグナル対ノイズ比を示した（実験３）。ＧＡ検量線に見られるグラデーションを図に表すことにより、血清マトリクス中のＧＡの検出および定量のための薬物動態評価方法の開発が可能となった。
【実施例３】
【００１９】
前臨床および臨床マトリクス中のＧＡを検出するための、精製した特異ＧＡ結合血清抗原を用いるＰＫ ＥＬＩＳＡ法の開発
ヒト、サル、ラット、ウサギおよびイヌ血清からのＧＡ特異的抗体プールの精製を前記のように行い、各マトリクスにおけるＰＫ法開発のためのコーティング試薬として使用した。各マトリクスについて３００００〜７ｎｇ／ｍｌの検量線を作成し、５倍ＭＲＤで各コーティング抗体に加え、室温で１時間インキュベートした。抗原により捕捉された薬物を、ビオチニル化アフィニティ精製抗ＧＡ ｐＡｂ、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートにより検出した。結果（グラフ）は、各マトリクスにおいてマトリクス毎に異なる感度で（２００〜７ｎｇ／ｍｌ）明らかなシグナル対ノイズ比を示した。ニートのヒトのマトリクスでは、約７ｎｇ／ｍｌの感度が達成された。
【実施例４】
【００２０】
ＰＫアッセイフォーマットの使用可能性の評価
血清タンパク質に結合したＧＡを捕捉する異なる固定化試薬を用いる、全部で７つの異なるＥＬＩＳＡ法を、ヒト、イヌおよびラットのマトリクスを用いて試験した。予備的な結果に基づけば、アフィニティ精製抗ＧＡ抗体およびアフィニティ精製ＧＡ結合タンパク質を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡが、感度がより一層高いロバストなアッセイの開発に理想的である。本発明者らは、ＧＡ特異抗原、およびＥＬＩＳＡアッセイにおけるキャプチャー試薬としての、ＧＡにより親和性の抗体が、サンプル（液相）中の血清タンパク質に結合したＧＡの分離（固相抽出）を促進にし、前臨床および臨床血清マトリクス中の低濃度のＧＡの測定を可能にすると考える。
【実施例５】
【００２１】
ウサギポリクローナル抗コパキソン抗体を用いる、Sprague Dawleyラット血清中のコパキソンの検出
特定の種の血清サンプル中のコパキソンを定量するための検量線を作成するために、それぞれ既知の濃度でスパイクされたコパキソンを含有する、一組の校正標準を形成する、一連の血清サンプルを、ニート血清中１００００００ｎｇ／ｍｌ、３０００００ｎｇ／ｍｌ、４０００ｎｇ／ｍｌ、２０００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、６２．５ｎｇ／ｍｌ、３１．３ｎｇ／ｍｌ、７．８ｎｇ／ｍｌおよび３．９ｎｇ／ｍｌのレベルのコパキソンを用いて血清中に調製した。
【００２２】
ＥＬＩＳＡプレートをポリクローナルウサギ抗コパキソン抗体で予めコーティングし、適切に希釈された、校正標準を構成する血清サンプル、および分析用サンプルを、コーティングされた抗コパキソン抗体に結合するようインキュベートし、未結合の、および結合の弱い血清成分を、ＰＢＳＴ（０．１％tween 20を含有するリン酸緩衝食塩液）による洗浄によって分離した。ビオチン標識ポリクローナルウサギ抗コパキソン抗体およびストレプトアビジンアルカリ性ホスファターゼコンジュゲートを用いて、結合コパキソンを検出した。基質をウェルに入れ、試験サンプルについて６４０ｎｍで得られた青色シグナルを、校正標準の濃度−反応相関から作成した検量線と比較して、血清サンプル中の未知コパキソン濃度を決定する。
【実施例６】
【００２３】
ウサギポリクローナル抗コパキソン抗体の特異的結合の証明
血清中にスパイクされたコパキソンを特異的に検出し、コパキソン血清タンパク質複合体の検出を回避するように、ポリクローナルウサギ抗コパキソン抗体を、固定化ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）およびＢＳＡ−コパキソンを含む活性化アガロースカラムを用いて特異的に精製した。
【００２４】
ステップ１：アフィゲル１５（Biorad）を用いてＢＳＡアフィニティカラムを調製した。アフィゲルへのＢＳＡの結合を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で行った。
ステップ２：グルタルアルデヒド化学を用いて、ＢＳＡとＧＡとを、各タンパク質のＮ末端アミノ基への共有結合により化学的にコンジュゲート化した。
【実施例７】
【００２５】
Sprague DawleyラットにおけるパイロットＰＫ試験
３匹の雄Sprague Dawleyラットに、コパキソンを２０ｍｇ／ｋｇ体重で、投与体積１ｍｌおよび投与濃度２０ｍｇ／ｋｇ／日で投与した。与えられた強度２０ｍｇ／ｋｇに対し、可能な最小用量（１ｍｌ／ｋｇの投与体積に基づく）に基づいて投与量を選択した。各動物の体重を測定し、２０ｍｇ／ｋｇ体重でコパキソンを投与した。５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、１０時間および２４時間の時点で、各動物からの血液サンプルを、１０μｌのプロテアーゼ阻害剤中に採集した。血清分離のために、血液サンプルを氷上に保存した。血清を分離し、搬出まで−８０℃で保存した。２４時間までのサンプルの輸送はドライアイス中で行った（−４４℃）。
【００２６】
ラットパイロット試験におけるＰＫプロファイルの概要
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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