(57)【要約】  方法は、核酸を含む試料溶液を試料受容部と接触させることによって、試料溶液を石英ファイバーフィルターの試料受容部に収着させる段階と、、試料受容部から離れる方向に向かうウィッキング力の下で洗浄溶液を試料受容部に流すことによって、核酸の大半を試料受容部の近傍に維持しながら、試料受容部を洗浄すること、を含む。関連する装置も提供される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む試料溶液を試料受容部と接触させることによって、試料溶液を石英ファイバーフィルターの試料受容部に収着させる段階と、
試料受容部から離れる方向に向かうウィッキング力の下で洗浄溶液を試料受容部に流すことによって、核酸の大半を試料受容部の近傍に維持しながら、試料受容部を洗浄段階と
を含む方法。
【請求項２】
試料溶液がカオトロピック塩を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
洗浄溶液がエタノール及びイソプロパノールの１種以上を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
石英ファイバーフィルターが、粒径２．２μｍ以上、基本重量８５ｇ／ｍ2、厚さ約３００μｍ〜約６００μｍの範囲の粒子に対して、約９８％のの粒子保持効率を有する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
石英ファイバーフィルターが、試料受容部から離れた洗浄部を含み、洗浄溶液が洗浄部に添加される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
石英ファイバーフィルターが、第１の端部、洗浄部、試料受容部、及び第２の端部を含む長尺ストリップであり、洗浄部が、第２の端部より第１の端部の近くに位置し、試料受容部が、洗浄部より第２の端部の近くに位置する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
セルロース、シリカマイクロファイバーフィルター、グラスファイバー、及び石英フィルターの１種以上で作製され、洗浄部及び第２の端部の少なくとも一方と隣接しかつ垂直方向に整列した吸収性パッドを用意することをさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
洗浄部が、第１の端部であり、洗浄段階において、試料受容部を洗浄溶液の表面の外部に位置させながら、洗浄部を洗浄溶液中に浸漬する、請求項６記載の方法。
【請求項９】
セルロース、シリカマイクロファイバーフィルター、グラスファイバー、及び石英フィルターの１種以上で作製され、石英ファイバーフィルターと隣接及び垂直方向に整列した吸収性パッドを用意することをさらに含み、洗浄溶液を試料受容部に添加する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
洗浄後、石英ファイバーフィルターを乾燥させることをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
石英ファイバーフィルターを備える装置であって、石英ファイバーフィルターが、
試料溶液と接触させることによって核酸を含む試料溶液を収着させ、試料受容部から離れる方向に向かうウィッキング力の下で洗浄溶液を試料受容部に流した後に、核酸の大半を試料受容部の近傍に維持するための試料受容部
を含んでいる、装置。
【請求項１２】
石英ファイバーフィルターが、粒径２．２μｍ以上、基本重量８５ｇ／ｍ2、厚さ約３００μｍ〜約６００μｍの範囲の粒子に対して、約９８％のの粒子保持効率を有する、請求項１１記載の装置。
【請求項１３】
石英ファイバーフィルターが、試料受容部から空間的に離隔した洗浄部を含む、請求項１１記載の装置。
【請求項１４】
石英ファイバーフィルターが、第１の端部、洗浄部、試料受容部、及び第２の端部を含む長尺ストリップであり、洗浄部が、第２の端部より第１の端部の近くに位置し、試料受容部が、洗浄部より第２の端部の近くに位置する、請求項１３記載の装置。
【請求項１５】
セルロース、シリカマイクロファイバーフィルター、グラスファイバー、及び石英フィルターの１種以上で作製され、洗浄部及び第２の端部の少なくとも一方と隣接しかつ垂直方向に整列して位置する吸収性パッドをさらに備える、請求項１４記載の装置。
【請求項１６】
洗浄部が第１の端部である、請求項１４記載の装置。
【請求項１７】
セルロース、シリカマイクロファイバーフィルター、グラスファイバー、及び石英フィルターの１種以上で作製され、石英ファイバーフィルターと隣接及び垂直方向に整列した吸収性パッドをさらに備える、請求項１１記載の装置。
【請求項１８】
石英ファイバーフィルターをその中に封入する筐体をさらに備える、請求項１１記載の装置。
【請求項１９】
筐体が、試料受容部を露出させる試料用開口部を含む、請求項１８記載の装置。
【請求項２０】
試料溶液が、カオトロピック塩を含み、洗浄溶液が、エタノール及びイソプロパノールの１種以上を含む、請求項１１記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、核酸の単離方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸は、検出又は診断領域など、異なる領域で様々に用いられている。核酸レベルにおける検出又は診断は、例えば、タンパク質レベルにおけるよりも感度又は特異度が高い。植物若しくは動物組織のような組織に由来する粗抽出物、細胞溶解物、又は血液若しくは尿試料などの分析物は、核酸の他に、他の分子種（又は不純物）を含み、これらの少なくとも一部は、核酸の検出を阻害する場合もあり、検出結果をマスクする場合もあるので、通常は核酸を不純物から単離することが必要である。核酸を含む分析物は、通常、利用可能なのは少量であるので、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などの増幅法が開発されている。時により、核酸を単離するための要件の１つは、分析物から、その後の増幅手順において使用するのに十分な量の核酸を得ることであろう。
【０００３】
核酸を単離／分離／精製するための種々の技法が開発されている。例えば、米国特許出願公開第２００５／０１１２６５８号は、核酸を遠心力下で単離及び精製する方法について開示し、米国特許出願公開第２００７／０２２１５６３号は、核酸を圧力下で分離及び精製するための方法について開示しており、国際特許出願公開第２００７／１０４９６２号は、核酸が膜の全長に沿って分配されるように液体試料を吸収性膜に沿って流すことによって、核酸を液体試料から分離するための方法を教示している。
【０００４】
例えば、米国特許第７０６７２８７号では、石英ろ紙を、遠心力又は圧力下で核酸を回収するための方法において、粒子を含む、核酸に結合可能な固相として用いうることを開示している。しかし、石英ファイバーフィルターは、核酸の単離／分離／精製に実際に用いられていることはいまだ確認されておらず、おそらくは粒子形態で用いるのに適さず、核酸の単離／分離／精製とは全く異なる空気サンプリングにおいて用いられることは十分に周知である。石英ファイバーフィルターが核酸の単離／分離／精製において実際には用いられていない別の理由は、核酸を収着するには高密度過ぎであると考えられているためでありうる。
【０００５】
遠心力及び圧力は、遠心力及び圧力を発生させるための機器、並びに特殊な操作技能を必要とし、したがって、例えば、高価な機器及び熟練した人員が都合できない場合には望ましくない。加えて、遠心力及び圧力は、核酸鎖を破壊して短か過ぎるストリングにする可能性があり、比較的小さなサイズの核酸だけが得られる結果となる。膜に沿った分配による分離は、核酸及び不純物の両方が併せて膜上に広がるために、時により、品質が問題となり得る。
【０００６】
したがって、核酸の新たな単離方法及び装置を開発することが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第２００５／００７９５３５Ａ１号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様では、核酸を含む試料溶液を試料受容部と接触させることによって、試料溶液を石英ファイバーフィルターの試料受容部に収着させる段階と、試料受容部から離れる方向に向かうウィッキング力の下で洗浄溶液を試料受容部に流すことによって、核酸の大半を試料受容部の近傍に維持しながら、試料受容部を洗浄すること、を含む方法が提供される。
【０００９】
別の態様では、装置が提供される。装置は、試料溶液と接触させることによって核酸を含む試料溶液を収着させ、試料受容部から離れる方向に向かうウィッキング力の下で洗浄溶液を試料受容部に流した後に、核酸の大半を試料受容部の近傍に維持するための試料受容部を含む、石英ファイバーフィルターを備える。
【００１０】
これら及び他の利点と特色は、付属の図面との関連で提示される本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明からよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の第１の実施形態に従う装置についての概略図である。
【図２】本発明の第２の実施形態に従う装置についての概略図である。
【図３】本発明の第３の実施形態に従う装置についての概略図である。
【図４】実施例１で得られた電気泳動画像を示す図である。
【図５】実施例２の電気泳動について、どのようにして小片を採取したのかを示す概略図である。
【図６】実施例２及び比較例１で得られた電気泳動画像を示す図である。
【図７】実施例５の洗浄段階を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本出願の本明細書及び特許請求の範囲の全体で用いられる近似的表現は、それが関係する基本的な機能に変化を生じずに、許容可能な範囲で変化させうる任意の量的表示を修飾するために適用することができる。したがって、「約」など、用語（複数可）により修飾される値は、指定される正確な値に限定されるものではない。場合によって、近似的表現は、値を測定するための機器の精度に対応しうる。
【００１３】
以下の明細書及び特許請求の範囲では、文脈が明らかに別のことを指示しない限りにおいて、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を包含する。さらに、本明細書で用いられる接尾辞の「（ｓ）」は、通常、それが修飾する用語の単数及び複数の両方を包含し、これにより、その用語の１つ以上を包含することを意図する。
【００１４】
本明細書で用いられる「〜しうる（ｍａｙ）」及び「〜でありうる（ｍａｙ  ｂｅ）」という用語は、一連の状況において生じる可能性、指定される特性、特徴、若しくは機能の保有を示し、及び／又は制限される動詞と関連する可能性、能力又は可能性の１つ以上を表すことによって、別の動詞を限定する。したがって、「〜しうる」及び「〜でありうる」の使用は、一部の状況では、修飾される語が、場合によって、適切でないか、可能でないか、又は適さないこともあることを考慮に入れながら、修飾される語が指示される能力、機能、又は使用に明らかに適切であるか、可能であるか、又は適することを指し示す。例えば、ある状況では、事象又は能力を予期しうる一方、他の状況では、事象又は能力は生じないかも知れない。この区別が、「〜しうる」及び「〜でありうる」という用語によりとらえられる。
【００１５】
本明細書の下記では、付属の図面を参照しながら、本開示の好ましい実施形態について記載する。以下の説明では、本開示を不要な細部において曖昧にすることを回避するために、周知の機能又は構造について詳細に記載することはしない。
【００１６】
本発明の第１の実施形態に従う装置１が、試料溶液と接触させることによって核酸（図示せず）を含む試料溶液（図示せず）を収着させ、試料受容部から離れる方向に向かうウィッキング力（図示せず）下で試料受容部を通して洗浄溶液（図示せず）を流した後に、核酸の大半を試料受容部の近傍に維持するための試料受容部１２を含む、石英ファイバーフィルター１０を含む、図１を参照されたい。
【００１７】
石英ファイバーフィルター１０は、そこに試料溶液を収着させ、石英ファイバーフィルターに適用された核酸の貯蔵又はその後の分析を阻害しない、任意の多孔性材料及び吸収性材料を包含する。ある実施形態では、石英ファイバーフィルター１０を、結合剤なしで、純粋な石英ファイバーで作製する。ある実施形態では、石英ファイバーフィルターは、粒径２．２μｍ以上、基本重量８５ｇ／ｍ2、厚さ約３００μｍ〜約６００μｍの範囲の粒子に対して、約９８％の粒子保持効率を有する。この目的に適する石英ファイバーフィルターの例には、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡから市販されているＷｈａｔｍａｎ（登録商標）グレードＱＭ−Ａ石英マイクロファイバーフィルター、及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡから市販されているＡＱＦＡ石英ファイバーフィルターが含まれるがこれらに限定されない。
【００１８】
石英ファイバーフィルター１０は、それに沿って、その上に適用された洗浄溶液が移動させることできる長尺ストリップの形態でありうる。石英ファイバーフィルター１０は、ポリエステル（Ｍｙｌａｒ（登録商標））又はＰＥＴのようなプラスチック材料などの裏当て材で支えることができる。
【００１９】
装置は、単純な核酸精製デバイスの場合もあり、代替的に核酸分析デバイス／機器全体の部分又は構成部分の場合もある。
【００２０】
試料受容部１２は、そこに試料溶液を収着させうる任意の形状又は立体構成でありうる。試料受容部１２は、石英ファイバーフィルター１０自体の区画又は吸収パッドのいずれの場合もあり、液体中で石英ファイバーフィルター１０と接触する。
【００２１】
ある実施形態では、石英ファイバーフィルター１０が、試料受容部１２、そこに洗浄溶液（図示せず）を添加する、試料受容部１２から離れた洗浄部１４、第１の端部１６、及び第２の端部１８を含む長尺ストリップでありうる。洗浄部１４は、第２の端部１８より第１の端部１６の近くに位置し、試料受容部１２は、洗浄部１４より第２の端部１８の近くに位置している。このような配置では、洗浄溶液を、洗浄部１４に適用すると、洗浄溶液の大半は、試料受容部１２から離れる方向に向かうウィッキング力の下で、洗浄部１４から、試料受容部１２を通って、第２の端部１８に流れるであろう。
【００２２】
ある実施形態では、洗浄部１４が、第１の端部１６であり、試料受容部を洗浄溶液の表面の外部に位置させながら、洗浄部１４／１６を洗浄溶液中に浸漬することによって、洗浄溶液を、石英ファイバーフィルターに適用する。
【００２３】
本明細書で用いられる「収着」という用語は、意図的に又は意図せずに実現される、収着された組成物を試料受容部から除去するための条件下に置かれない限りは試料受容部から容易に除去されないような形で、試料溶液を吸収させるか、吸着させるか、又はそれ以外の形で試料受容部内若しくは試料受容部上に組み入れることを意味する。
【００２４】
本明細書で用いられる「核酸の大半」という用語は、試料受容部の近傍に維持される核酸の量であって、試料受容部に収着させた試料溶液中の核酸の総量の約１５％以上、試料受容部に収着させた試料溶液中の核酸の総量の５０％以上、又は試料受容部に収着させた試料溶液中の核酸の総量の９０％以上でありうる量を指す。
【００２５】
本明細書で用いられる「単離する、単離すること、又は単離」という用語は、核酸を試料溶液から、増幅分析など、核酸のその後の分析／使用を容易にする形で分離又は精製する行為又は動作を指し示す。
【００２６】
本明細書で用いられる、「核酸」という語句は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）の一方又は両方を意味する。単離核酸は、単一の種類の核酸を含む場合もあり、２つ以上の異なる種類の核酸を含む場合もある。単離核酸は、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、直鎖状の場合もあり環状の場合もある。また、単離核酸の長さも限定されない。単離核酸の長さは、数ｂｐ乃至数Ｍｂｐの範囲において任意でありうる。しかし、単離核酸の長さは、一般に、取扱いが容易であるように、数ｂｐ乃至数百ｋｂｐの範囲である。本発明の核酸の単離／精製法は、従来の方法がなしうるよりも、より広範囲にわたる長さの核酸を迅速に回収しうる。本発明により単離される核酸の長さは、約１ｂｐ〜約１５００ｋｂｐ、好ましくは約１ｋｂｐ〜約５００ｋｂｐ、より好ましくは約２０ｋｂｐ〜約２００ｋｂｐの範囲でありうる。
【００２７】
本発明の分析物には制限がない。分析物の例には、ヒト及び動物の生理学的／病理学的体液（例えば、分泌物、排出物、滲出物、及び浸出液）又は細胞懸濁液（例えば、血液、リンパ液、滑液、精液、口腔細胞を含む唾液、皮膚剥離物、毛根細胞など）；植物の生理学的／病理学的液体又は細胞懸濁液；細菌、真菌、プラスミド、ウイルスなどの液体生成物、抽出物、又は懸濁液；蠕虫、原虫、スピロヘータなどを含めた寄生虫の液体生成物、抽出物、又は懸濁液；ヒト又は動物の身体組織（例えば、骨、肝臓、腎臓など）の液体抽出物又はホモジネート；ＤＮＡ合成又はＲＮＡ合成に由来する培地；化学的又は生化学的に合成されるＤＮＡ又はＲＮＡの混合物；並びにＤＮＡ及び／又はＲＮＡがその中に存在するか又は存在しうる他の任意の供給源が含まれる。特に、分析物には、血液、血液細胞、及び抗凝血剤を伴う血液などの生理学的試料又は臨床試料が含まれる。供給源から分析物を取り出すための例示的な方法は、静脈穿刺により、ヒト又は動物の供給源から血中の核酸試料を取り出すことである。
【００２８】
試料溶液は、ＤＮＡ及びＲＮＡの一方若しくは両方、又は、ＤＮＡ及びＲＮＡの一方若しくは両方を含む細胞、細胞構成要素、又は細胞抽出物を、その中に溶存させるか、懸濁させるか、混合するか、又はそれ以外の形で含有して含む溶液でありうる。試料溶液は、分析物から調製される溶液でありうる。
【００２９】
核酸を含む試料溶液を分析物から調製するための例示的な方法は、分析物試料を容器に注入する段階、核酸可溶化試薬を容器に添加し、試料を核酸可溶化試薬と混合する段階、結果として得られる混合溶液をインキュベートする段階、及び水溶性の有機溶媒をインキュベートされた混合溶液に添加する段階を包含するが、ここで、最後の２つの段階は任意のものとする。核酸可溶化試薬は、細胞膜及び核膜が溶存するように溶解させ、核酸を可溶化／分散させる。核酸可溶化試薬の例には、カオトロピック塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの１つ以上を含む溶液が含まれる。核酸可溶化試薬は、乾燥状態で投入することもできる。
【００３０】
核酸を含む試料溶液を調製するための方法は、例えば、超音波処理、鋭利な突起物を用いる処理、又は高速撹拌若しくはボルテックス処理を用いて実施することができる。
【００３１】
本発明の好ましいプロテアーゼは、例えば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、及び金属プロテアーゼの１つ以上である。セリンプロテアーゼを特に限定するわけではないが、例えば、プロテアーゼＫが好ましく用いられうる。システインプロテアーゼを特に限定するわけではないが、例えば、パパイン及びカテプシンが好ましく用いられうる。金属プロテアーゼを特に限定するわけではないが、例えば、カルボキシペプチダーゼが好ましく用いられうる。ヌクレアーゼを含まないプロテアーゼも用いることができる。金属イオンなどの安定化剤を含むプロテアーゼも用いることができる。より具体的には、塩化マグネシウムなどの形態のマグネシウムイオンが好ましい。安定化剤は、全反応系の総容量に対して約１〜約１０００ミリモル／ｍＬ、好ましくは、約１０〜約１００ミリモル／ｍＬの濃度で組み入れることができる。
【００３２】
プロテアーゼは、添加時において、全反応系１ｍｌ当たり、好ましくは約０．００１ＩＵ〜約１０ＩＵ、より好ましくは約０．０１ＩＵ〜約１ＩＵの量で用いることができる。
【００３３】
プロテアーゼは、カオトロピック塩、界面活性剤、又は別の試薬と併せて用いることができる。代替的に、プロテアーゼは、カオトロピック塩及び界面活性剤などの他の試薬とは別個の試薬として用いることもできる。後者の場合には、分析物試料を、プロテアーゼを含む試薬とまず混合し、次いで、混合物を、カオトロピック塩及び／又は界面活性剤を含む試薬と混合する。又は、プロテアーゼは、分析物試料をカオトロピック酸及び／又は界面活性剤を含む試薬とまず混合した後で混合することもできる。
【００３４】
分析物試料を核酸可溶化試薬と混合するための手順は、限定されない。
【００３５】
分離及び精製された核酸の収量は、分析物試料と核酸可溶化試薬との混合物を、プロテアーゼに好ましい温度で、好ましい反応時間にわたりインキュベートすることによって増大させることができる。インキュベーション温度は、通常、約２０℃〜約７０℃であり、インキュベーション時間は、通常、約１分間〜約９０分間である。インキュベーション法は、特に限定されず、温熱浴又は加熱チャンバーに浸漬することによって実施することができる。
【００３６】
核酸可溶化試薬溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約１０、より好ましくは約６〜約９、さらにより好ましくは約６．５〜約８の範囲である。
【００３７】
核酸可溶化試薬溶液中のカオトロピック塩の濃度は、好ましくは約０．５Ｍ以上、より好ましくは約０．５Ｍ〜約１０Ｍの範囲で、さらにより好ましくは約５Ｍ〜約８Ｍの範囲である。塩酸グアニジンが好ましいカオトロピック塩であるが、他のカオトロピック塩（例えば、トリフルオロ酢酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、及びチオシアン酸グアニジン）も用いることができる。カオトロピック塩の代わりに、尿素をカオトロピック物質として用いることも可能である。これらのカオトロピック物質は、個別に用いることもでき、それらの２つの以上を組み合わせて用いることもできる。
【００３８】
核酸可溶化試薬溶液は、水溶性の有機溶媒を含みうる。水溶性の有機溶媒としては、アルコールが好ましい。アルコールは、一級アルコール、二級アルコール、及び三級アルコールの任意のものでありうる。アルコールとしては、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール及びその異性体、並びにブチルアルコール及びその異性体が好ましく用いられうる。これらの水溶性の有機溶媒は、独立に用いることもでき、それらの２つの以上の組合せとして用いることもできる。核酸可溶化試薬溶液中の水溶性の有機溶媒の濃度は、好ましくは約１重量％〜約２０重量％の範囲である。
【００３９】
核酸可溶化試薬溶液中の界面活性剤の濃度は、好ましくは約０．１重量％〜約２０重量％の範囲である。核酸可溶化試薬溶液中の界面活性剤の例には、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、及び両親媒性界面活性剤が含まれる。
【００４０】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系の界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系の界面活性剤、及び脂肪酸アルキルアミドは、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００など）と共に用いることができ、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系の界面活性剤を用いうることが好ましい。ポリオキシエチレンアルキルエーテル系の界面活性剤は、ＰＯＥデシルエーテル、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥトリデシルエーテル、ＰＯＥアルキレンデシルエーテル、ＰＯＥソルビタンモノラウレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、ＰＯＥアルキルアミン、及びＰＯＥアセチレングリコールの中から選択することができる。
【００４１】
カチオン性界面活性剤の例には、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチル塩化アンモニウム、テトラデシルトリメチル塩化アンモニウム、及び塩化セチルピリジニウムが含まれる。これらの界面活性剤は、独立に用いることもでき、それらの２つ以上の組合せとして用いることもできる。
【００４２】
ＤＮＡなど、ＲＮＡ以外の核酸を回収する場合には、ＲＮＡ分解酵素を核酸可溶化試薬溶液に添加して、そうしなければ回収される核酸中に共存するＲＮＡによる干渉を低減することが好ましい。また、ＤＮＡ分解酵素阻害剤を添加することも好ましい。ＲＮＡ分解酵素は、特に限定されず、とりわけ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）など、ＲＮＡを分解できる酵素が好ましく用いられうる。
【００４３】
他方、ＲＮＡなど、ＤＮＡ以外の核酸を回収する場合には、ＤＮＡ分解酵素を、核酸可溶化試薬溶液に添加することが好ましい。これにより、そうでなければ回収される核酸中に共存するＤＮＡによる干渉を低減することができる。また、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を添加することも好ましい。ＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、ＲＮＡ分解酵素を特異的に阻害するＲＮＡ分解酵素阻害剤が好ましい。ＤＮＡ分解酵素は、特に限定されず、ＤＮアーゼＩなど、ＤＮＡを特異的に分解できる酵素が好ましく用いられうる。
【００４４】
ある実施形態では、石英ファイバーフィルターを洗浄溶液で洗浄した後で、ＤＮＡ又はＲＮＡを特異的に分解できる酵素を試料受容部に添加することができる。
【００４５】
核酸を含む試料溶液は、好ましくは消泡剤を含んでもよい。消泡剤の例には、ケイ素を含む消泡剤（例えば、シリコーン油、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、修飾ポリシロキサン、及びシリコーン化合物）、アルコール系の消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルヘキサノール、高級アルコール、及びポリオキシアルキレングリコール）、エーテル系の消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ及びノニルセロソルブ−３−ヘプチルソルビトール）、油脂系の消泡剤（例えば、動物油及び植物油）、脂肪酸系の消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、及びパルミチン酸）、金属石鹸系の消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミニウム及びステアリン酸カルシウム）、脂肪酸エステル系の消泡剤（例えば、天然蝋及びリン酸トリブチル）、リン酸系の消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウム）、アミン系の消泡剤（例えば、ジアミルアミン）、アミド系の消泡剤（例えば、ステアリン酸アミド）及び他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄及びボーキサイト）が含まれる。特に好ましくは、ケイ素を含む消泡剤とアルコール系の消泡剤との組合せを、消泡剤として用いることができる。
【００４６】
インキュベートされた混合溶液に添加される水溶性の有機溶媒としては、アルコールが好ましく用いられうる。一級アルコール、二級アルコール、及び三級アルコールの任意のものを用いることができる。メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール、及びそれらの異性体が好ましく用いられうる。核酸を含む試料溶液中のこのような水溶性の有機溶媒の濃度は、約５重量％〜約９０重量％の範囲であることが好ましい。
【００４７】
核酸を含む試料溶液及び洗浄溶液の両方とも、チューブ、ピペット、若しくは自動式注入器により、又は他の任意の適用可能な方途／ツールで、石英ファイバーフィルターに適用しうる。洗浄溶液は、ウィッキング力の下で、外部の力を伴わずに、石英ファイバーフィルターに沿って、又はこれを通って流れ、石英ファイバーフィルターに対するアフィニティーが核酸より小さい不純物を運び去り、これにより、核酸の大半を試料受容部の近傍に維持しながら、試料受容部を洗浄する。
【００４８】
洗浄溶液は、核酸を含む試料溶液を添加する場所と同じ場所、すなわち、試料受容部において、石英ファイバーフィルターに供給することができる。洗浄溶液は、試料受容部とは異なる場所において、石英ファイバーフィルターに適用することもできる。前者の場合において、試料受容部と洗浄部とは、石英ファイバーフィルター上の同じ場所である。
【００４９】
洗浄溶液は、汚染物質、例えば、タンパク質を分解できる酵素を含みうる。さらに、洗浄溶液は、状況に応じて、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼなどを含みうる。デオキシリボヌクレアーゼを含む洗浄溶液の使用は、ＲＮＡの選択的な回収を可能とするであろう。同様に、リボヌクレアーゼを含む洗浄溶液の使用は、ＤＮＡの選択的な回収を可能とするであろう。
【００５０】
洗浄溶液は、水溶性の有機溶媒及び／又は水溶性の塩を含むことが好ましい。洗浄溶液は、石英ファイバーフィルター上に吸着された試料溶液中の不純物を、核酸と併せて洗い落とす。したがって、洗浄溶液は、吸着された核酸を保ちながら、石英ファイバーフィルターから不純物を脱着させる組成物を有しうる。水溶性の有機溶媒、例えば、核酸がその中で難溶性であるアルコールは、核酸以外の成分を石英ファイバーフィルターから脱着させるのに適する。同時に、水溶性の塩を組み入れることによって、核酸を吸着する効果が増強され、不要な成分の選択的な脱着が改善される。
【００５１】
洗浄溶液中に含有される例示的な水溶性の有機溶媒には、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、ブタノール、及びアセトンが含まれ、このうちでは、エタノールがより好ましい。水溶性の有機溶媒は、好ましくは約２０重量％〜約１００重量％で、より好ましくは約４０重量％〜約１００重量％で、洗浄溶液中に組み入れる。
【００５２】
他方、洗浄溶液中に含有される例示的な水溶性の塩は、好ましくはハロゲン化塩又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである。
【００５３】
図２を参照すると、本発明の第２の実施形態に従う装置２は、石英ファイバーフィルター２０、上半分２４及び下半分２６を含むプラスチック筐体２２、並びに吸収性パッド２８を含む。
【００５４】
石英ファイバーフィルター２０は、第１の実施形態の石英ファイバーフィルター１０と同様であり、試料受容部２０２及び洗浄部２０４、第１の端部２０６、並びに第２の端部２０８を含む。洗浄部２０４は、第２の端部２０８より第１の端部２０６の近くに位置し、試料受容部２０２は、洗浄部２０４より第２の端部２０８の近くに位置している。このような配置では、洗浄溶液を、洗浄部２０４に適用すると、洗浄溶液の多くは、試料受容部２０２から離れる方向に向かうウィッキング力の下で、洗浄部２０４から、試料受容部２０２を通って、第２の端部２０８に流れるであろう。
【００５５】
プラスチック筐体２２は、石英ファイバーフィルター２０及び吸収性パッド２８をその中に封入する。上半分２４と下半分２６とは、一体に成形することもでき、別個に成形することもできる。上半分２４は、位置において、それぞれ、試料受容部２０２及び洗浄部２０４に対応する試料用開口部２４０及び洗浄用開口部２４２を含む。核酸を含む試料溶液を添加する間、試料用開口部２４０は、核酸を含む試料溶液が完全に収着される前、試料受容部２０２と併せて核酸を含む試料溶液を収容しうる。
【００５６】
吸収性パッド２８は、洗浄部２０４及び第２の端部２０８のそれぞれと隣接及び垂直方向に整列し、洗浄溶液を試料受容部２０２から引き離すウィッキング力を増強するのを助ける。
【００５７】
本発明の第３の実施形態に従う装置３が、石英ファイバーフィルター３０、上半分３４及び下半分３６を含むプラスチック筐体３２、並びに吸収性パッド３８を備える、図３を参照されたい。
【００５８】
石英ファイバーフィルター３０は、第１の実施形態の石英ファイバーフィルター１０と同様であり、試料受容部３０２、第１の端部３０６、並びに第２の端部３０８を含む。試料受容部３０２は、第２の端部３０８より第１の端部３０６の近くに位置する。
【００５９】
プラスチック筐体３２は、石英ファイバーフィルター３０及び吸収性パッド３８をその中に封入する。上半分３４と下半分３６とは、一体に成形することもでき、別個に成形することもできる。上半分３４は、位置において、試料受容部３０２に対応する試料用開口部３４０を含む。核酸を含む試料溶液を添加する間、試料用開口部３４０は、核酸を含む試料溶液が完全に収着される前は、試料受容部３０２と併せて核酸を含む試料溶液を収容しうる。
【００６０】
吸収性パッド３８は、石英ファイバーフィルター３０と隣接及び垂直方向に整列し、洗浄溶液を試料受容部３０２から引き離すのを助ける。
【００６１】
このような配置では、核酸を含む試料溶液及び洗浄溶液の両方を試料受容部３０２に適用するが、洗浄溶液を試料受容部３０２に適用すると、洗浄溶液は、試料受容部３０２から離れる方向に向かうウィッキング力の下で、試料受容部３０２を通って、第２の端部３０８及び／又は吸収性パッド３８に流れるであろう。
【００６２】
吸収性パッド２８、３８は、セルロース、シリカマイクロファイバーフィルター、グラスファイバー、及び石英ファイバーフィルターなどの吸収性材料で作製する。
【００６３】
ある実施形態では、試料受容部を、筐体の外に位置させることができる。
【００６４】
本発明の方法は、核酸を含む試料溶液を試料受容部と接触させることによって、試料溶液を石英ファイバーフィルターの試料受容部に収着させる段階と、試料受容部から離れる方向に向かうウィッキング力の下で、洗浄溶液を、試料受容部を通して流すことによって、核酸の大半を試料受容部の近傍に維持しながら、試料受容部を洗浄段階とを含みうる。
【００６５】
本発明では、吸収性の石英ファイバーフィルター自体の多孔性に固有のウィッキング力が、洗浄溶液を流し、不純物と核酸との多孔性の石英ファイバーフィルターに対する異なるアフィニティーのために、試料溶液から、核酸の他に不純物を取り去ることを可能とし、これにより、外部の駆動力（例えば、遠心力及び圧力）を発生させる機器及び特殊な技能を有する人員に対する必要を排除し、現場及び遠隔地域における単離を可能とする駆動力として作用する。洗浄溶液を、試料受容部を通して流し、核酸を試料受容部の近傍に維持しながら、不純物を取り去ることによって、核酸を、試料溶液中の他の成分から十分に分離して、ＰＣＲなど、従来の核酸検出方法を用いてそれらを検出することが可能となると考えられる。実際、これは、精製効果を有する。
【００６６】
この方法は、任意の分析において単純な精製段階を実施するための、特に、重大な阻害を伴わずに石英ファイバーフィルターの存在下で実施しうるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅を伴う分析のための、費用効果が高く、効率性の高い方法でありうる。核酸を含む試料溶液をフィルターに適用した後、及び、洗浄溶液をフィルターを通して流して不純物を取り去った後に、石英ファイバーフィルターが核酸を捕捉していることは予期せぬことである。ひとたび石英ファイバーフィルター上で分離されれば、核酸をさらなるｉｎ  ｓｉｔｕの分析にかけることもでき、必要な場合は、適切な緩衝液を用いて、核酸を、石英ファイバーフィルターから溶出させるか、又はそれ以外の形で石英ファイバーフィルターから除去し、溶出物又は抽出物に対して分析を実行することもできる。
【００６７】
洗浄溶液により洗浄した後、通常、核酸を含む試料溶液を添加する前と比べて、試料受容部の色が元に戻るか、又はほぼ元に戻る。ある実施形態では、石英ファイバーフィルターを、洗浄した後９０℃を下回る温度で、好ましくは３７℃若しくは４０℃で、又は室温で乾燥させる。石英ファイバーフィルター、より適切には、石英ファイバーフィルターの試料受容部、例えば、試料受容部の近傍で抽出された小片又はパンチを、例えば、実験室環境において採取し、さらなる分析に使用する。
【００６８】
例えば、石英ファイバーフィルター上の特定の核酸の存在を検出するために、小片又はパンチをＰＣＲ混合物に浸す。ＰＣＲ混合物は、特定の生物に特徴的でありうる特異的な核酸配列を増幅するようにデザインされたヌクレオチド、ポリメラーゼ、及びＰＣＲプライマーのセットなどの試薬を含みうる。ＰＣＲ混合物は、緩衝液、マグネシウム塩などをさらに含みうる。
【００６９】
石英ファイバーフィルター上の核酸のＰＣＲ分析から得られるＣｔ値は、従来の複雑な精製法及び／又は保存法を用いる分析によるＣｔ値と同等であった。これは、本発明の方法及び装置が、核酸を精製し、汚染物質／阻害剤を除去するように有効に働くことを示唆する。
【００７０】
本明細書で用いられるヌクレオチドには、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー、逆転写酵素誘発ＰＣＲ用のプライマー）、ＬＣＲのためのオリゴヌクレオチド基質のセット、ＤＮＡプローブ若しくはＲＮＡプローブ、遺伝子配列決定において用いられるオリゴヌクレオチド、又は標的配列安定化剤が含まれる。
【００７１】
本明細書で用いられる「プライマー」とは、石英ファイバーフィルター上の相補的な核酸配列にアニールすることが可能であり、他のオリゴヌクレオチドと相補的な配列を含むＤＮＡ鎖（又は、ことによると、ＲＮＡ鎖）の合成をプライミングするように配向されたオリゴヌクレオチドの断片を意味する。ある用途では、このオリゴヌクレオチドの配列及びその相補的な配列が所定の配列であることが望ましい。他の用途では、配列が未知でありうる。複数の縮重プライマー又は相補的な配列に結合することが予測される配列を有するプライマーを用いることができる。プライマー対を用いて、相補的な配列対及びサイズが公知であるか又は未知である２つの相補的な配列の間の配列を増幅することができる。加えて、プライマーを用いて、当初は二本鎖であるＤＮＡ又はＲＮＡの他、一本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡである鋳型も増幅することができる。一本鎖鋳型については、オリゴヌクレオチドの１つと相補的な配列が、その相補的な配列にアニールするときに、第１のプライマーが伸長することによって合成されることが理解される。
【００７２】
ＰＣＲ又は逆転写酵素誘発ＰＣＲのためのプライマーは、通常と同様、プライマー対として存在させることもでき、ゲノム配列決定又は逆転写酵素誘発ＰＣＲのための一部のプロトコールについての場合にそうでありうる通り、１つだけのプライマーを存在させることもできる。
実施例
以下の実施例は、主張される本発明を実施するにあたり、当業者にさらなる指針を与えるために組み入れる。したがって、これらの実施例は、付属の特許請求の範囲で規定される本発明を限定するものではない。
【００７３】
実施例１：単離後における位置分析
抗凝血剤（ヘパリンナトリウム）、０．２５μｌのプロテアーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）及び２．５μｌの溶液（６６．８７％の塩酸グアニジニウム及び４％のＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００）を含むヒト全血（２．５μｌ）試料を、１．５ｍｌの微小遠心管に添加した。
【００７４】
微小遠心管を約１５秒間振とうし、次いで、間欠的にボルテックスしながら、室温で約１０分間インキュベートして、試料溶液を調製した。インキュベーションの終了時には、微小遠心管内の混合物の色が赤色から暗褐色に変化した。
【００７５】
調製後に、得られた試料溶液を、微小遠心管からプラスチック筐体の試料用開口部を介して移し、図２に示される通りに構成された装置の筐体内に封入される石英ファイバーフィルターの試料受容部と接触させた。石英ファイバーフィルターは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡから得られるＷｈａｔｍａｎ（登録商標）グレードＱＭ−Ａ石英マイクロファイバーフィルターの幅４ｍｍ×長さ６ｃｍのストリップであった。プラスチック筐体は、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｊｉｅｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａから得られるＡ−９プラスチック筐体であった。洗浄部及び第２の端部の下方の吸収性パッドは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡから得られるＷｈａｔｍａｎ（登録商標）グレード４７０特殊目的用ろ紙であった。
【００７６】
移動〜約５秒後に、試料溶液が、石英ファイバーフィルターの試料受容部に吸収され、試料受容部の色が、褐色に変わったことが観察された。次いで、洗浄溶液（１５０μｌ、８０％のエタノール溶液）を、筐体の洗浄用開口部を介して添加して、洗浄溶液を、試料受容部を介して洗浄用開口部と連絡した洗浄部から流すことによって、試料受容部を洗浄した。
【００７７】
試料受容部の近傍に目視可能な不純物が観察されず、試料受容部の色が試料溶液を添加する前の色に戻ったら、装置を、乾燥させるために、３７℃で３０分間にわたりオーブンに入れた。試料溶液が添加されてから、試料受容部の色が戻るまで、約５分間しかかからなかった。乾燥後、石英ファイバーフィルターを、筐体から取り出し、その長手方向に沿って、各々の幅を４ｍｍとし、長さを５ｍｍとする１２の小片に切り刻んだ。各小片を、０．８％のアガロースゲルを有する別個の試料ウェルに入れ、パルスフィールドゲル電気泳動を実施した。
【００７８】
パルスフィールドゲル電気泳動は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．製のＣＨＥＦ  Ｍａｐｐｅｒ（登録商標）ＸＡシステム上、１２０Ｖの電圧で４５分間にわたり実行した。電気泳動後、アガロースゲルを、１倍濃度のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ溶液により、１．５時間にわたり染色し、次いで、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ製のＴｙｐｈｏｏｎ（商標）Ｔｒｉｏ（商標）可変モード造影機を用いて走査して、電気泳動画像を得た。
【００７９】
電気泳動画像を、図４に示す。図４のレーンＡ〜Ｌは、ストリップの第１の端部から第２の端部への小片の画像を順に表す、例えば、レーンＡ〜Ｂは、第１の端部及び洗浄部に対応する小片の画像を表し、レーンＣ〜Ｄは、試料受容部に対応する小片の画像を表し、レーンＭは、ＤＮＡマーカー（ＤＬ  １５０００、Ｔａｋａｒａ）の画像を表す。画像は、洗浄後、核酸の大半が試料受容部の近傍に維持されたことを示す。
【００８０】
実施例２：単離後におけるサイズ分析
実施例１で用いたストリップと同様な石英ファイバーフィルターのストリップを、実施例１の場合と同じ形で調製された同じ量の試料溶液と接触させ、実施例１の洗浄溶液と同じ洗浄溶液により実施例１の場合と同じ形で洗浄した。
【００８１】
石英ファイバーフィルターのストリップを、実施例１の場合と同じ形で乾燥させたら、石英ファイバーフィルターを、プラスチック筐体から取り出し、破線２１１の間の試料受容部２０２の近傍の小片２１０（全長１ｃｍ）を、図５に示す通りに、石英ファイバーフィルターストリップ２０から切り出した。次いで、長さ１ｃｍの小片２１０を半分に切断し、２つの半小片を１％のアガロースゲルを有する試料ウェルに入れて、パルスフィールドゲル電気泳動を実施した。
【００８２】
パルスフィールドゲル電気泳動は、ＣＨＥＦ  Ｍａｐｐｅｒ（登録商標）ＸＡシステム上、６ｖ／ｃｍの電圧、１０℃の温度で２４時間にわたり実行した。電気泳動後、アガロースゲルを、１倍濃度のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ溶液により５時間にわたり染色し、次いで、Ｔｙｐｈｏｏｎ（商標）Ｔｒｉｏ（商標）可変モード造影機を用いて走査して、電気泳動画像を得た。パルスフィールドゲル電気泳動画像を、図６に示す。
【００８３】
比較例１
製品添付文書で推奨される操作プロトコールに従い、ＱＩＡａｍｐ  ｂｌｏｏｄ  ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ヘパリンナトリウム（抗凝血剤）を含む２．５μｌのヒト全血から抽出されたＤＮＡ溶液（２．５μｌ）を、２．５μｌの水と混合し、１％のアガロースゲルを有する試料ウェルに入れて、実施例２の場合と同じ形で電気泳動を実施した。
【００８４】
製品添付文書で推奨される操作プロトコールに従い、ＱＩＡａｍｐ  ｂｌｏｏｄ  ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ヘパリンナトリウム（抗凝血剤）を含む２．５μｌのヒト全血から抽出された、別のＤＮＡ溶液２．５μｌを、２．５μｌの水と混合し、実施例１で用いたストリップと同じストリップ上に滴下した。乾燥後、石英ファイバーフィルターの長さ１ｃｍの小片を、試料受容部の近傍で切断し、１％のアガロースゲルを有する別個の試料ウェルに入れて、実施例２の場合と同じ形で電気泳動を実施した。
【００８５】
図６にも、パルスフィールドゲル電気泳動画像を示す。図６では、レーンＮが、ＭｉｄＲａｎｇｅ  ＩＩ  ＰＦＧマーカーを表し、レーンＯが、比較例１の２．５μｌのＤＮＡと２．５μｌの水との混合物の画像であり、レーンＰは、比較例１の小片の画像であり、レーンＱは、実施例２の小片の画像である。
【００８６】
図６からわかる通り、比較例１で単離／精製されたＤＮＡのサイズ範囲は、ＱＩＡＧＥＮ  ｂｌｏｏｄ  ｍｉｎｉキットにより抽出されるＤＮＡのサイズが２００ｂｐから５０ｋｂｐであると述べる製品紹介と合致し、実施例２で単離／精製されたＤＮＡのサイズ範囲よりはるかに狭い。
【００８７】
実施例３：単離後における量分析
実施例１で用いたストリップと同様な、石英ファイバーフィルターの３つのストリップを、実施例１の場合と同じ形でそれぞれ調製された同じ量の３つの試料溶液にそれぞれ接触させ、実施例１の洗浄溶液と同じ３つの洗浄溶液により実施例１の場合と同じ形でそれぞれ洗浄した。
【００８８】
前出の例の場合と同じ形での乾燥後、直径１．２ｍｍの小片を、試料受容部の近傍で、Ｈａｒｒｉｓ  Ｕｎｉ−ｃｏｒｅ  １．２ｍｍパンチャーにより、各ストリップからパンチした。小片の各々を、ベータ−アクチンに対するＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲ用の２５μｌのマスターミックス（Ｅｘ  Ｔａｑ  ＨＳを含有する１倍濃度のＰＣＲ緩衝液、３００ｎＭの各ベータ−アクチンプライマー及び１００ｎＭのベータ−アクチンプローブ）を含有する２５μｌのＰＣＲチューブに入れた。
比較例２
製品添付文書で推奨される操作プロトコールに従い、ＱＩＡａｍｐ  ｂｌｏｏｄ  ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、各々が、抗凝血剤（ヘパリンナトリウム）を含む２．５μｌのヒト全血から抽出された、２．５μｌのＤＮＡ溶液の３つの試料の各々を、２．５μｌの水と混合し、各々を、実施例１で用いたストリップと同じ石英ファイバーフィルターストリップ上に滴下させた。乾燥後、試料受容部において、Ｈａｒｒｉｓ  Ｕｎｉ−ｃｏｒｅ  １．２ｍｍパンチャーにより、各ストリップから直径１．２ｍｍの小片をパンチした。各小片を、ベータ−アクチンに対するＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲ用の２５μｌのマスターミックス（Ｅｘ  Ｔａｑ  ＨＳ、３００ｎＭの各ベータ−アクチンプライマー及び１００ｎＭのベータ−アクチンプローブを含有する１倍濃度のＰＣＲ緩衝液）を含有する２５μｌのＰＣＲチューブに入れた。
【００８９】
リアルタイムＰＣＲは、Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）  ＩＩサーモサイクラー（Ｃｅｐｈｅｉｄ）上、９５℃で３０秒間の後で、９５℃で５秒間及び６０℃で２０秒間の２段階サイクルを４０回行うサイクリング条件で実行した。
【００９０】
実施例３及び比較例２の小片を用いて、ベータ−アクチンを増幅することに成功した。Ｃｔ値を、表１に示す。結果は、実施例３で精製されたＤＮＡが、比較例２に照らして同等量／良好量であることを示す。
【００９１】
【表１】
2015503324.tif 000003
実施例４：プラスチック筐体なしの単離
実施例１の場合と同じ形で調製された同じ量の試料溶液を、実施例１で用いたストリップと同じストリップの試料受容部と接触させた。約５秒後に、試料溶液が、ストリップに吸収され、試料受容部の色が、褐色に変わったことが観察された。
【００９２】
その直後、図７に示す通り、ストリップ８０の第１の端部８２を、９６ウェルプレートのウェル８６内の、実施例１の洗浄溶液と同じ１５０μｌの洗浄溶液８４中に浸漬したが、試料受容部８８及び試料受容部８８と洗浄溶液の表面８３との間の部分８１は、洗浄溶液８４中に浸漬しなかった。約５分後に、試料受容部の色が戻ったら、小片を、ウェル８６から取り出し、３７℃のオーブン内で２０分間にわたり乾燥させた。
【００９３】
直径１．２ｍｍの小片をパンチし、実施例３の場合と同じ系で増幅した。
【００９４】
実験は、１回繰り返した。２つの小片の各々を用いて、ベータ−アクチン遺伝子を増幅することに成功した。Ｃｔ値は２７．９９及び２８．０８であった。
比較例３：乾燥なしの単離
実施例１で用いたストリップと同じ石英ファイバーフィルターのストリップを、実施例１の場合と同じ形で調製された同じ量の試料溶液と接触させ、実施例１の洗浄溶液と同じ洗浄溶液により実施例１の場合と同じ形で洗浄した。
【００９５】
乾燥段階なしで、直径１．２ｍｍの小片を洗浄の直後にパンチし、実施例４の場合と同じ系で増幅した。この小片を用いてベータ−アクチン遺伝子を増幅するのには成功することができなかった。
【００９６】
実施例５：単一のインポートを用いる単離
図３に示される通りに構成された装置を用いた。実施例１の試料溶液と同様の、調製された試料溶液を、プラスチック筐体の試料用開口部を介して滴下させて、実施例１で用いたストリップと同じ石英ファイバーフィルターストリップの試料受容部と接触させた。
【００９７】
約５秒後に、試料溶液が、石英ファイバーフィルターストリップの試料受容部に吸収され、試料受容部の色が、褐色に変わったことが観察された。次いで、洗浄溶液（１５０μｌ、８０％のエタノール溶液）を、筐体の試料用開口部を介して添加して、試料受容部を洗浄した。
【００９８】
前出の例の場合と同じ形での乾燥後、直径１．２ｍｍの小片を、試料受容部において、Ｈａｒｒｉｓ  Ｕｎｉ−ｃｏｒｅ  １．２ｍｍパンチャーにより、固体のストリップからパンチし、実施例４の場合と同じ系で増幅した。
【００９９】
実験は、１回繰り返した。小片の両方を用いて、ベータ−アクチン遺伝子を増幅するのに成功することができ、増幅のＣｔ値は２７．７６及び２８．７３であった。
【０１００】
実施例６：非洗浄ストリップとの対比分析
実施例１の場合と同じ形で調製された同じ量の試料溶液を、実施例１のストリップと同じストリップに添加した。乾燥後、直径１．２ｍｍの小片をパンチし、実施例４の場合と同じ形で増幅した。
【０１０１】
ストリップを、実施例１の場合と同じ形で洗浄し、乾燥させる前に、実施例１の場合と同じ形で調製された同じ量の試料溶液を、実施例１のストリップと同じストリップに添加した。比較のために、直径１．２ｍｍの小片もパンチし、実施例４の場合の通りに増幅した。
【０１０２】
両方の小片を用いて、ベータ−アクチン遺伝子を増幅することができた。Ｃｔ値を、以下の表２に示す。非洗浄小片のＣｔ値は、洗浄された小片よりはるかに大きかった。すなわち、洗浄後により高度なＤＮＡ増幅効率が得られた。
【０１０３】
【表２】
2015503324.tif 000004
実施例７：ヒト全血試料との対比分析
ヘパリンナトリウム（抗凝血剤）を含むヒト全血（２．５μｌ）を、２．５μｌの水と混合し、実施例１のストリップと同じストリップの試料受容部に滴下した。乾燥後、試料受容部を中心とする直径１．２ｍｍの小片をパンチし、実施例４の場合と同じ形で増幅した。
【０１０４】
比較のために、直径１．２ｍｍの小片も、実施例１の場合と同じ形で同じ量の試料溶液を添加された、実施例１で用いたストリップと同じストリップから、実施例４と同じ形でパンチし、同じ量の洗浄溶液により、実施例１の場合と同じ形で洗浄し、実施例１の場合と同じ形で乾燥させ、実施例４と同じ形で増幅した。
【０１０５】
各実験は、１回繰り返した。ベータ−アクチン遺伝子は、４つの小片を用いて増幅した。Ｃｔ値を、表３に示す。洗浄なしの小片のＣｔ値は、洗浄ありの小片よりはるかに大きかった。すなわち、試料溶液の調製において核酸可溶化試薬などがなくても、増幅はやはり機能したが、洗浄後に、より高度なＤＮＡ増幅効率が得られた。
【０１０６】
【表３】
2015503324.tif 000005
実施例８：市販のプロトタイプとの対比分析
試料溶液は、ヘパリンナトリウム（抗凝血剤）を含む２．５μｌのヒト全血、０．２５μｌのプロテアーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）、及び５μｌの溶液（６６．８７％の塩化グアニジニウム及び４％のＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００）を用いて、実施例１の場合と同じ形で調製した。試料溶液を、実施例１で用いたストリップと同じストリップに添加した。試料溶液が収着されたのを観察した後で、実施例１で用いた洗浄溶液と同じ洗浄溶液４００μｌを洗浄部に添加して、試料受容部を５分間にわたり洗浄した。
【０１０７】
試料溶液は、ヘパリンナトリウム（抗凝血剤）を含む２．５μｌのヒト全血を用いて、実施例１の場合と同じ形で調製し、Ｎａｎｏｈｅｌｉｘ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａから得られるｐｕｎｃｈ−ｉｔ（商標）ＮＡ−ｓａｍｐｌｅキットによる５μｌの溶解用溶液を、ｐｕｎｃｈ−ｉｔ（商標）ＮＡ−ｓａｍｐｌｅキットの試料受容部に添加した。試料溶液が収着されたのを観察した後で、ｐｕｎｃｈ−ｉｔ（商標）ＮＡ−ｓａｍｐｌｅキットの４００μｌの洗浄溶液を洗浄部に添加して、試料受容部を５分間にわたり洗浄した。
【０１０８】
前出の例の場合と同じ形での乾燥後、ｐｕｎｃｈ−ｉｔ（商標）ＮＡ−ｓａｍｐｌｅキットの試料受容部の色は、依然として試料溶液を添加する前の色と異なるが、ストリップの試料受容部は元に戻ることが観察された。
【０１０９】
実験は繰り返し行った。２つの小片のそれぞれを、ｐｕｎｃｈ−ｉｔ（商標）ＮＡ−ｓａｍｐｌｅキット及びストリップからパンチし、前出の例の場合と同じ形で増幅した。ｐｕｎｃｈ−ｉｔ（商標）ＮＡ−ｓａｍｐｌｅキットによる２つの小片のＣｔ値は、３１．３５及び３２．１３であり、ストリップのＣｔ値である２８．２０及び２７．７８より大きかった。
【０１１０】
本開示を典型的な実施形態において例示及び記載してきたが、いかなる形であれ本開示の精神から逸脱しない限り、多様な変更及び置き換えを行いうるので、示された詳細に限定されることを意図するものではない。したがって、本明細書で開示された開示のさらなる変更及び同等物は、単なる日常的な実験を用いて、当業者が見いだしうるものであり、全てのこのような変更及び同等物は、以下の特許請求の範囲により規定される本開示の精神及び範囲内にあると考えられる。
【図１】
2015503324.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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