(57)【要約】  本発明は、酸化還元反応用試薬の安定性向上のための安定剤組成物、およびこれを含む安定性の増進した酸化還元反応用試薬組成物に関するものであって、前記酸化還元反応用試薬組成物は電気化学的バイオセンサ用試薬として使用できる。【選択図】図１
2015517302.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化還元酵素、電子伝達媒体、および親水性包含化合物を含むことを特徴とする、酸化還元反応用試薬組成物。
【請求項２】
前記親水性包含化合物は、シクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）系化合物およびシクロデキストリン系化合物の誘導体からなる群より選択された１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の酸化還元反応用試薬組成物。
【請求項３】
前記親水性包含化合物は、アルファ−シクロデキストリン（α−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、ベータ−シクロデキストリン（β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、ガンマ−シクロデキストリン（γ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、ヒドロキシプロピル−アルファ−シクロデキストリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−α−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、ヒドロキシプロピル−ガンマ−シクロデキストリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−γ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、およびメチル−ベータ−シクロデキストリン（ｍｅｔｈｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）からなる群より選択された１種以上であることを特徴とする、請求項２に記載の酸化還元反応用試薬組成物。
【請求項４】
前記酸化還元酵素は、
脱水素酵素（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、酸化酵素（ｏｘｉｄａｓｅ）、およびエステル化酵素（ｅｓｔｅｒａｓｅ）からなる群より選択された１種以上の酸化還元酵素；または
脱水素酵素、酸化酵素、およびエステル化酵素からなる群より選択された１種以上の酸化還元酵素と、フラビンアデニンジヌクレオチド（ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＮＡＤ）、およびピロロキノリンキノン（Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ｑｕｉｎｏｎｅ、ＰＱＱ）からなる群より選択された１種以上の補助因子とを含むことを特徴とする、請求項１に記載の酸化還元反応用試薬組成物。
【請求項５】
前記脱水素酵素（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、酸化酵素（ｏｘｉｄａｓｅ）、およびエステル化酵素（ｅｓｔｅｒａｓｅ）からなる群より選択された１種以上の酸化還元酵素は、グルコース脱水素酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、グルタミン酸脱水素酵素（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、グルコース酸化酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）、コレステロール酸化酵素（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ）、コレステロールエステル化酵素（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｓｔｅｒａｓｅ）、ラクテート酸化酵素（ｌａｃｔａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）、アスコルビン酸酸化酵素（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ）、アルコール酸化酵素（ａｌｃｏｈｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ）、アルコール脱水素酵素（ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、およびビリルビン酸化酵素（ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｏｘｉｄａｓｅ）からなる群より選択された１種以上のものであることを特徴とする、請求項４に記載の酸化還元反応用試薬組成物。
【請求項６】
前記酸化還元酵素は、フラビンアデニンジヌクレオチド−グルコース脱水素酵素（ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＦＡＤ−ＧＤＨ）、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド−グルコース脱水素酵素（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）からなる群より選択された１種以上のものであることを特徴とする、請求項４に記載の酸化還元反応用試薬組成物。
【請求項７】
前記電子伝達媒体は、第１電子伝達媒体および第２電子伝達媒体の混合物からなり、
前記第１電子伝達媒体は、Ｒｕ、Ｆｅ、Ｏｓ、Ｒｈ、Ｍｏ、およびＩｒからなる群より選択された１種以上を含む金属含有錯体であり、
前記第２電子伝達媒体の混合物は、チオニン（ｔｈｉｏｎｉｎｅ）、１−メトキシＰＭＳ（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ）、３−アミノ−７−（２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシヘキサンアミド）−５−フェノチアジニウム（３−ａｍｉｎｏ−７−（２，３，４，５，６−ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ  ｈｅｘａｎａｍｉｄｏ）−５−ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｉｕｍ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウム（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）、アズールＣ（Ａｚｕｒｅ  Ｃ）、アズールＡ（Ａｚｕｒｅ  Ａ）、メチレンブルー（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｂｌｕｅ）、トルイジンブルー（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  Ｂｌｕｅ）、およびこれらの誘導体からなる群より選択された１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の酸化還元反応用試薬組成物。
【請求項８】
界面活性剤、水溶性高分子、４次アンモニウム塩、脂肪酸、および増粘剤からなる群より選択された１種以上の添加剤を追加的に含むことを特徴とする、請求項１に記載の酸化還元反応用試薬組成物。
【請求項９】
前記界面活性剤は、トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ソジウムドデシルスルフェート（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）、パーフルオロオクタンスルホネート（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｏｃｔａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、およびソジウムステアレート（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔｅａｒａｔｅ）からなる群より選択された１種以上のものであり；
前記水溶性高分子は、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ；ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ；ＰＶＡ）、パーフルオロスルホネート（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ヒドロキシエチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙ  ｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＣＭＣ）、セルロースアセテート（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｃｅｔａｔｅ）、およびポリアミド（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ）からなる群より選択された１種以上のものであり；
前記４次アンモニウム塩は、エシルトリメチルアンモニウム（ｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、ミリスチルトリメチルアンモニウム（ｍｙｒｉｓｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、セチルトリメチルアンモニウム（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、オクタデシルトリメチルアンモニウム（ｏｃｔａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、およびテトラヘキシルアンモニウム（ｔｅｔｒａｈｅｘｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）からなる群より選択された１種以上のものであり；
前記脂肪酸は、Ｃ４〜Ｃ２０の炭素鎖を有する脂肪酸およびその脂肪酸塩からなる群より選択された１種以上のものであり；
前記増粘剤は、ナトロゾールおよびジエチルアミノエチル−デキストランヒドロクロライド（ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）からなる群より選択された１種以上のものであることを特徴とする、請求項８に記載の酸化還元反応用試薬組成物。
【請求項１０】
前記酸化還元反応用試薬組成物は、電気化学的バイオセンサに使用するための電気化学的バイオセンサ用試薬組成物であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の酸化還元反応用試薬組成物。
【請求項１１】
作動電極と補助電極が１つの基板に構成され、
前記作動電極は、請求項１０に記載の酸化還元反応用試薬組成物を含むことを特徴とする、平面型電気化学的バイオセンサ。
【請求項１２】
作動電極と補助電極が別の基板に構成され、
前記作動電極は、請求項１０に記載の酸化還元反応用試薬組成物を含むことを特徴とする、対面型電気化学的バイオセンサ。
【請求項１３】
酸化還元酵素、電子伝達媒体、および親水性包含化合物を混合する段階を含むことを特徴とする、酸化還元反応用試薬組成物の製造方法。
【請求項１４】
前記親水性包含化合物は、シクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）系化合物およびシクロデキストリン系化合物の誘導体からなる群より選択された１種以上であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記親水性包含化合物は、アルファ−シクロデキストリン（α−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、ベータ−シクロデキストリン（β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、ガンマ−シクロデキストリン（γ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、ヒドロキシプロピル−アルファ−シクロデキストリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−α−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、ヒドロキシプロピル−ガンマ−シクロデキストリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−γ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、およびメチル−ベータ−シクロデキストリン（ｍｅｔｈｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）からなる群より選択された１種以上である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記酸化還元酵素は、
脱水素酵素（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、酸化酵素（ｏｘｉｄａｓｅ）、およびエステル化酵素（ｅｓｔｅｒａｓｅ）からなる群より選択された１種以上の酸化還元酵素；または
脱水素酵素、酸化酵素、およびエステル化酵素からなる群より選択された１種以上の酸化還元酵素と、フラビンアデニンジヌクレオチド（ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＮＡＤ）、およびピロロキノリンキノン（Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ｑｕｉｎｏｎｅ、ＰＱＱ）からなる群より選択された１種以上の補助因子とを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記電子伝達媒体は、第１電子伝達媒体および第２電子伝達媒体の混合物からなり、
前記第１電子伝達媒体は、Ｒｕ、Ｆｅ、Ｏｓ、Ｒｈ、Ｍｏ、およびＩｒからなる群より選択された１種以上を含む金属含有錯体であり、
前記第２電子伝達媒体の混合物は、チオニン（３，７−Ｄｉａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎ−５−ｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、１−メトキシＰＭＳ（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ）、３−アミノ−７−（２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシヘキサンアミド）−５−フェノチアジニウム（３−ａｍｉｎｏ−７−（２，３，４，５，６−ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ  ｈｅｘａｎａｍｉｄｏ）−５−ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｉｕｍ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウム（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）、アズールＣ（Ａｚｕｒｅ  Ｃ）、アズールＡ（Ａｚｕｒｅ  Ａ）、メチレンブルー（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｂｌｕｅ）、トルイジンブルー（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  Ｂｌｕｅ）、およびこれらの誘導体からなる群より選択された１種以上であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化還元反応用試薬の安定性向上のための安定剤組成物、およびこれを含む安定性の増進した酸化還元反応用試薬組成物に関するものであって、前記酸化還元反応用試薬組成物は電気化学的バイオセンサ用試薬として使用できる。
【背景技術】
【０００２】
糖尿管理において、血糖の周期的な測定は極めて重要であり、このため、正確性と精密性を備えた多様な種類の電気化学的バイオセンサが幅広く用いられている。血糖を測定する電気化学的バイオセンサは、作動電極に酵素、電子伝達体、および多様な安定剤と分散剤を混合して調製した試薬を乾燥させて製造するが、その特性を最も大きく左右するのは、使用する酵素の種類と電子伝達体の特性である。
【０００３】
例えば、大部分の商用化された電気化学的センサに使用されるグルコース酸化還元酵素のＦＡＤ−ＧＯｘ（ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）は、熱に安定しておりグルコースだけを酸化させる反応選択性には優れているが、血液に溶けている酸素と反応するため、ＦＡＤ−ＧＯｘ酵素を用いて作ったセンサは、試料血液の種類（静脈血、動脈血、または毛細血）に応じて測定値が大きく異なることがある。
【０００４】
一方、ＰＱＱ−ＧＤＨ酵素（ｐｙｒｒｏｌｅ  ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ｑｕｉｎｏｎｅ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を用いて作ったセンサは、血中酸素の影響をほとんど受けない特性を示すのに対し、グルコースに対する特異性のほか、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）、マルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）、またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）などのような様々な種の単糖類または二糖類にも選択性を示し、特に、腎臓腹膜透析をする患者の場合には、マルトースによる影響によって誤った治療をする場合が発生し得る事実が知られている。他のＧＤＨ酵素のＮＡＤ−ＧＤＨ（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を用いるセンサは、マンノース、マルトース、およびラクトースのような二糖類と反応しないことから、反応選択性はＰＱＱ−ＧＤＨより良いが、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のような助酵素を別途に試薬組成に添加しなければならず、保管安定性が低い問題がある。
【０００５】
ＦＡＤ−ＧＤＨ（ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を用いる電気化学的センサは、血中に溶けている酸素の量に影響を受けず、安定性が高く、ＰＱＱ−ＧＤＨ酵素を使用するセンサの欠点であるマルトースに対する特異性もなく、最近多く使用されている。反面、ＦＡＤ−ＧＤＨは、その酵素を生産する細菌や真菌（ｆｕｎｇｉ）の種類に応じて共に使用可能な電子伝達体（ｍｅｄｉａｔｏｒ）の種類が制限的である。
【０００６】
最も普遍的に使用される電子伝達体としては、ポタシウムフェリシアニド［Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６］があるが、安価で、反応性が良く、ＦＡＤ−ＧＯｘ、ＰＱＱ−ＧＤＨ、またはＦＡＤ−ＧＤＨを用いたセンサのすべてに有用である。しかし、この電子伝達体を用いたセンサは、血液に存在する尿酸（ｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）やゲンチシン酸（ｇｅｎｔｉｓｉｃ  ａｃｉｄ）のような妨害物質による測定誤差を発生し、温度と湿度によって変質しやすいため、製造と保管に格別に注意しなければならず、長時間保管後、バックグラウンド電流の変化によって、低濃度のグルコースを正確に検出するのに困難がある。
【０００７】
ヘキサアンミンルテニウムクロライド［Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３］は、フェリシアニドに比べて酸化還元安定性が高く、この電子伝達体を用いたバイオセンサは、製造と保管が容易であり、長時間保管でもバックグラウンド電流の変化が小さく、安定性が高い利点を有するが、ＦＡＤ−ＧＤＨと使用するには反応性が互いに合わず、商業的に有用なセンサとして製作しにくい欠点がある。
【０００８】
最近、酵素や電子伝達体を使用しないナノポアの電極表面を有する特殊形態のバイオセンサを用いて、グルコースを検出しようとする試みがある。例えば、ＵＳ８０８３９２６は、シクロデキストリンで形成したナノポア構造の電極を用いて、低濃度のグルコース測定に有用なセンサを提示した。しかし、このセンサは、非常に低い濃度から高い濃度まですべて測定するのには適しておらず、大量生産にも適しない欠点を有している。
【０００９】
したがって、酸素によって影響されず、温度と湿度による性能変化が少なく、長期間保管した後でも性能の変化が少なく、広い濃度範囲の測定が可能であり、大量生産に適した酸化還元反応用試薬、より具体的には、電気化学的バイオセンサ用試薬を製造するための技術の開発が要求されている。本発明は、このような要件を満足するバイオセンサ試薬組成物を提示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明者らは、電気化学的バイオセンサに使用可能な酸化還元反応用試薬に親水性包含化合物（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を添加して、酸化還元酵素と電子伝達体を安定化させることができることを確認して、本発明を完成した。
【００１１】
したがって、本発明の一例は、親水性包含化合物を有効成分として含む酸化還元反応用試薬安定剤組成物を提供する。
【００１２】
他の例は、酸化還元酵素、電子伝達媒体、および親水性包含化合物を含み、安定性の増進した酸化還元反応用試薬組成物を提供する。
【００１３】
さらに他の例は、酸化還元酵素、電子伝達媒体、および親水性包含化合物を混合する段階を含む、安定性の増進した酸化還元反応用試薬の製造方法を提供する。
【００１４】
さらに他の例は、前記安定性の増進した電気化学的バイオセンサ用試薬組成物を含む電気化学的バイオセンサを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、ＦＡＤ−ＧＤＨの電子伝達媒体として、チオニン（ｔｈｉｏｎｉｎｅ）または１−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳ（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ）とヘキサアンミンルテニウムクロライドを共に使用する場合、酵素と電子伝達体との間の反応速度が速くなってグルコース検出性能が顕著に向上することを見出して、これらを含むバイオセンサ用試薬組成物に関して特許出願した（大韓民国特許出願第２０１２−０００９６６８号）。
【００１６】
本発明者らは、前記のように、第１電子伝達媒体の金属含有錯体（例えば、ヘキサアンミンルテニウムクロライド）と反応性の低い酸化還元酵素の活性を高めるために、第２電子伝達媒体として、チオニン（図６参照）、およびこの化合物と類似の構造を有する化合物（図７参照）を共に使用する時に現れる不安定性を解決して、試薬組成物の安定性を増進させるための研究を繰り返した結果、前記試薬組成物に、試薬安定剤として、ヒドロキシプロピルアルファシクロデキストリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−α−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ、ＨＰ−α−ＣＤ）、ヒドロキシプロピルベータシクロデキストリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ、ＨＰ−β−ＣＤ）、またはヒドロキシプロピルガンマシクロデキストリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−γ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ、ＨＰ−γ−ＣＤ）のような親水性包含化合物（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を添加する場合、センサを長期間保管した後でも酸化還元反応効率およびグルコース検出性能に変化がほとんどないことを確認した。親水性包含化合物は、チオニンとの包含複合体の形成を誘導してチオニンの制限された溶解性を高め、酵素との直接的な反応を制限して試薬組成物の安定性を増加させることができる。例えば、ＨＰ−β−ＣＤは、単位体積あたりほぼ５０％（ｗ／ｖ）まで溶ける程度に水に非常に溶けやすい性質を有するが、このような性質によって水に溶けにくい物質と複合体を形成し、水に溶けている形態の安定した複合体を形成するようになる。
【００１７】
本発明者らは、親水性包含化合物が、ＦＡＤ−ＧＤＨ酵素とヘキサアンミンルテニウムおよびチオニン伝達媒体を含む電気化学的バイオセンサにおいて、酸素と反応せず、高い温度および湿度によって変質する程度が小さく、検出感度が妨害物質によってほとんど影響されず、長期間の保管性にも優れた酸化還元反応用試薬として使用可能であることを確認し、より具体的には、電気化学的バイオセンサ用試薬およびこれを含むバイオセンサを提供できることを確認して、本発明を完成した。
【００１８】
本発明に提供される酸化還元反応用試薬、より具体的には、電気化学的バイオセンサ用試薬は、酸素によって影響されず、温度と湿度による性能変化が少なく、長期間保管した後でも性能の変化が少なく、広い濃度範囲（例えば、５〜１０００ｍｇ／ｄＬ）の測定が可能であり、大量生産に適する利点を有する。
【００１９】
本発明の具体例においては、適用可能な例として、グルコースを測定するためのバイオセンサを例示しているが、本発明の試薬組成物に含まれる酵素の種類を異ならせることにより、コレステロール、ラクテート、クレアチニン、過酸化水素、アルコール、アミノ酸、グルタメートのような多様な物質の定量のためのバイオセンサに適用することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明にかかるバイオセンサ用試薬安定剤組成物およびこれを含む試薬組成物は、酸素と反応せず、高い温度および湿度によって変質する程度が小さく、妨害物質によってほとんど影響されないため、血液内の代謝物質、特にグルコース検出のための電気化学的バイオセンサの製造に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一実施形態にかかる平面型バイオセンサの分解斜視図である。
【図２】本発明の一実施形態にかかる対面型バイオセンサの分解斜視図である。
【図３】実施例２による平面型バイオセンサを用いて、グルコース濃度を異ならせた試料を適用した場合に現れる電流の変化を測定したグラフである。
【図４】実施例１による対面型バイオセンサを用いて、グルコース濃度を異ならせた試料を適用した場合に現れる電流の変化を測定したグラフである。
【図５】実施例３と比較例２による対面型バイオセンサを５０℃で熟成し、グルコース濃度を異ならせた試料を適用した場合、熟成期間に応じた傾きの変化を示したグラフである。
【図６】本発明の一実施形態で使用されたチオニンの構造である。
【図７】本発明の一実施形態で使用されたチオニン誘導体の構造である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
上記のように、本発明の一例は、親水性包含化合物を有効成分として含む酸化還元反応用試薬安定剤組成物を提供する。
【００２３】
一具体例において、前記酸化還元反応用試薬は、電気化学的バイオセンサ用試薬として使用可能なため、本発明の他の例は、親水性包含化合物を有効成分として含む電気化学的バイオセンサ用試薬安定剤組成物を提供する。
【００２４】
さらに他の例は、酸化還元酵素、電子伝達媒体、および親水性包含化合物を含み、安定性の増進した酸化還元反応用試薬組成物を提供する。
【００２５】
一具体例において、前記酸化還元反応用試薬組成物は、電気化学的バイオセンサに適用可能なため、本発明のさらに他の例は、酸化還元酵素、電子伝達媒体、および包含化合物を含み、安定性の増進した電気化学的バイオセンサ用試薬組成物を提供する。
【００２６】
さらに他の例は、酸化還元酵素、電子伝達媒体、および親水性包含化合物を混合する段階を含む、安定性の増進した酸化還元反応用試薬の製造方法を提供する。
【００２７】
一具体例において、前記酸化還元反応用試薬組成物は、電気化学的バイオセンサに適用可能なため、本発明のさらに他の例は、酸化還元酵素、電子伝達媒体、および親水性包含化合物を混合する段階を含む、安定性の増進した電気化学的バイオセンサ用試薬の製造方法を提供する。
【００２８】
さらに他の例は、前記安定性の増進した電気化学的バイオセンサ用試薬組成物を含む電気化学的バイオセンサを提供する。
【００２９】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００３０】
本明細書に使用されたものであって、「包含化合物（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、包接化合物または内包化合物ともいい、適当な条件下、２種の分子のうち、一方の分子がかご形の内包格子を作り、その間に他の分子が充填される形態を有する化合物を意味する。
【００３１】
本発明で使用される親水性包含化合物は、シクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）系化合物およびその誘導体からなる群より選択された１種以上であってよく、より具体的には、シクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）系化合物であってよい。前記シクロデキストリン系化合物のような親水性包含化合物は、センサを長期間保管してもグルコース検出性能への変化が少ないようにする役割を果たす。
【００３２】
前記シクロデキストリン系化合物は、構造的に環状に結合したグルコースの数が６個のアルファ−シクロデキストリン（α−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、７個のベータ−シクロデキストリン（β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、８個のガンマ−シクロデキストリン（γ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）などからなる群より選択されたものであってよく、具体的には、シクロデキストリンは、ベータ−シクロデキストリンであってよい。
【００３３】
前記シクロデキストリン系化合物の誘導体は、シクロデキストリン系化合物がヒドロキシプロピル基、メチル基などからなる群より選択された１種以上の置換基を含むものであってよい。例えば、代表的なシクロデキストリン系化合物の誘導体として、ヒドロキシプロピル−アルファ−シクロデキストリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−α−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、ヒドロキシプロピル−ガンマ−シクロデキストリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−γ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、メチル−ベータ−シクロデキストリン（ｍｅｔｈｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）などが挙げられる。本発明の具体例では、ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンを代表例として例示したが、アルファ−およびガンマ−シクロデキストリンの類似の特性を有する誘導体も類似の性質を示し得ることを確認した（図４参照）。
【００３４】
前記親水性包含化合物、つまり、シクロデキストリン系化合物、シクロデキストリン系化合物の誘導体、特にヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンは、水に非常に溶けやすいため、酸化還元反応用試薬組成物、特に電気化学的バイオセンサ用試薬組成物に含まれる場合、試薬内の不溶性物質と複合体を形成して水に溶ける安定した複合体を形成することにより、溶解性を高めて試薬を安定化する役割を果たす。
【００３５】
したがって、本発明は、親水性包含化合物の酸化還元反応用試薬、例えば、電気化学的バイオセンサ用試薬を安定化させるための用途を提供し、その一実施形態として、前記親水性包含化合物を有効成分として含む酸化還元反応用試薬安定剤組成物、またはバイオセンサ用試薬安定剤組成物を提供する。
【００３６】
前記安定化される酸化還元反応用試薬または電気化学的バイオセンサ用試薬は、酸化還元酵素および電子伝達媒体を含む通常の酸化還元反応用試薬または電気化学的バイオセンサ用試薬である。
【００３７】
他の側面において、酸化還元酵素、電子伝達媒体、および親水性包含化合物を含む、安定性の増進した酸化還元反応用試薬組成物が提供される。具体例において、前記酸化還元反応用試薬組成物は、電気化学的バイオセンサ用試薬組成物として適用可能なため、さらに他の例において、酸化還元酵素、電子伝達媒体、および親水性包含化合物を含む、安定性の増進した電気化学的バイオセンサ用試薬組成物が提供される。
【００３８】
さらに他の側面において、酸化還元酵素、電子伝達媒体、および親水性包含化合物を混合する段階を含む、安定性の増進した酸化還元反応用試薬の製造方法が提供される。具体例において、前記酸化還元反応用試薬組成物は、電気化学的バイオセンサに適用可能なため、さらに他の例において、酸化還元酵素、電子伝達媒体、および親水性包含化合物を混合する段階を含む、安定性の増進した電気化学的バイオセンサ用試薬の製造方法を提供する。より具体的には、前記製造方法において、前記酸化還元酵素、電子伝達媒体、および親水性包含化合物を混合する段階は、酸化還元酵素および電子伝達媒体を混合する段階と、前記得られた混合物に親水性包含化合物を添加する段階とを含んで行うことができる。
【００３９】
さらに他の例は、前記安定性の増進した電気化学的バイオセンサ用試薬組成物を含む電気化学的バイオセンサを提供する。
【００４０】
さらに他の例は、前記安定性の増進した電気化学的バイオセンサ用試薬組成物を含む電気化学的バイオセンサを提供する。
【００４１】
この時、親水性包含化合物は、先に説明したように、試薬を安定化させる試薬安定剤としての役割を果たす。
【００４２】
本明細書において、特別な言及がない限り、酸化還元酵素、電子伝達媒体、および試薬安定剤として親水性包含化合物を含む、安定性の増進した試薬は、「酸化還元反応用試薬組成物または電気化学的バイオセンサ用試薬組成物」と記載し、親水性包含化合物による安定化対象となる通常の酸化還元酵素および電子伝達媒体を含む従来の試薬は、「酸化還元反応用試薬または電気化学的バイオセンサ用試薬」と区分して記載する。また、酸化還元反応用試薬組成物または電気化学的バイオセンサ用試薬組成物を総称する場合、特別な言及がない限り、「試薬組成物」と称する。
【００４３】
前記親水性包含化合物は前述の通りである。
【００４４】
酸化還元酵素は、生体の酸化還元反応を触媒する酵素を総称するもので、本発明では、測定しようとする対象物質、例えば、バイオセンサの場合には、測定しようとする代謝物質と反応して還元される酵素を意味する。このように還元された酵素は、電子伝達媒体と反応し、この時発生した電流変化などの信号を測定して代謝物質を定量する。本発明に使用可能な酸化還元酵素は、各種脱水素酵素（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、酸化酵素（ｏｘｉｄａｓｅ）、エステル化酵素（ｅｓｔｅｒａｓｅ）などからなる群より選択された１種以上のものであってよく、酸化還元または検出対象物質に応じて、前記酵素群に属する酵素の中から、前記対象物質を基質とする酵素を選択して使用することができる。
【００４５】
より具体的には、前記酸化還元酵素は、グルコース脱水素酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、グルタミン酸脱水素酵素（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、グルコース酸化酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）、コレステロール酸化酵素（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ）、コレステロールエステル化酵素（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｓｔｅｒａｓｅ）、ラクテート酸化酵素（ｌａｃｔａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）、アスコルビン酸酸化酵素（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ）、アルコール酸化酵素（ａｌｃｏｈｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ）、アルコール脱水素酵素（ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ビリルビン酸化酵素（ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｏｘｉｄａｓｅ）などからなる群より選択された１種以上であってよい。
【００４６】
一方、前記酸化還元酵素は、測定しようとする対象物質（例えば、代謝物質）から酸化還元酵素が奪った水素を保管する役割を果たす補助因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）を共に含むことができるが、例えば、フラビンアデニンジヌクレオチド（ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＮＡＤ）、ピロロキノリンキノン（Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ｑｕｉｎｏｎｅ、ＰＱＱ）などからなる群より選択された１種以上であってよい。
【００４７】
例えば、血中グルコース濃度を測定しようとする場合、前記酸化還元酵素としてグルコース脱水素酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＧＤＨ）を使用することができ、前記グルコース脱水素酵素は、補助因子としてＦＡＤを含むフラビンアデニンジヌクレオチド−グルコース脱水素酵素（ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＦＡＤ−ＧＤＨ）、および／または補助因子としてＦＡＤ−ＧＤＨを含むニコチンアミドアデニンジヌクレオチド−グルコース脱水素酵素（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）であってよい。
【００４８】
具体例において、前記使用可能な酸化還元酵素は、ＦＡＤ−ＧＤＨ（例えば、ＥＣ１．１．９９．１０など）、ＮＡＤ−ＧＤＨ（例えば、ＥＣ１．１．１．４７など）、ＰＱＱ−ＧＤＨ（例えば、ＥＣ１．１．５．２など）、グルタミン酸脱水素酵素（例えば、ＥＣ１．４．１．２など）、グルコース酸化酵素（例えば、ＥＣ１．１．３．４など）、コレステロール酸化酵素（例えば、ＥＣ１．１．３．６など）、コレステロールエステル化酵素（例えば、ＥＣ３．１．１．１３など）、ラクテート酸化酵素（例えば、ＥＣ１．１．３．２など）、アスコルビン酸酸化酵素（例えば、ＥＣ１．１０．３．３など）、アルコール酸化酵素（例えば、ＥＣ１．１．３．１３など）、アルコール脱水素酵素（例えば、ＥＣ１．１．１．１など）、ビリルビン酸化酵素（例えば、ＥＣ１．３．３．５など）などからなる群より選択された１種以上であってよい。
【００４９】
前記電子伝達媒体は、代謝物質と反応して還元された酵素と酸化還元反応して還元され、こうして形成された還元状態の電子伝達媒体は、酸化電位が印加された電極表面で電流を発生させる役割を果たす。
【００５０】
前記電子伝達媒体は、第１電子伝達媒体および第２電子伝達媒体の混合物であってよい。
【００５１】
前記第１電子伝達媒体および第２電子伝達媒体の混合物において、前記第１電子伝達媒体は、金属含有錯体であってよく、第２電子伝達媒体は、チオニン（ｔｈｉｏｎｉｎｅ）、１−メトキシＰＭＳ（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ）、３−アミノ−７−（２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシヘキサンアミド）−５−フェノチアジニウム（３−ａｍｉｎｏ−７−（２，３，４，５，６−ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ  ｈｅｘａｎａｍｉｄｏ）−５−ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｉｕｍ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウム（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）、アズールＣ（Ａｚｕｒｅ  Ｃ）、アズールＡ（Ａｚｕｒｅ  Ａ）、メチレンブルー（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｂｌｕｅ）、トルイジンブルー（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  Ｂｌｕｅ）、およびこれらの誘導体からなる群より選択された１種以上であってよい（図６および図７参照）。前記金属含有錯体は、Ｒｕ、Ｆｅ、Ｏｓ、Ｒｈ、Ｍｏ、およびＩｒからなる群より選択された１種以上を含む錯体であってよい。
【００５２】
具体例において、前記金属含有錯体は、ルテニウム錯体、例えば、ヘキサアンミンルテニウムクロライド［Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３］、ルテニウムトリフェンジオン｛［Ｒｕ（ｐｈｅｎｄｉｏｎｅ）３］２＋、ｐｈｅｎｄｉｏｎｅ＝１，１０−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ−５，６−ｄｉｏｎｅ｝、ルテニウムティーピーワイビーピーワイ｛［Ｒｕ（ｔｐｙ）（ｂｐｙ）Ｈ２Ｏ］２＋、ｔｐｙ＝２，２’：６’，２’’−ｔｅｒｐｙｒｉｄｉｎｅ、ｂｐｙ＝２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ｝などからなる群より選択された１種以上のルテニウム錯体であってよい。
【００５３】
電子伝達媒体として、金属含有錯体とチオニンまたはその誘導体との混合物、および／または金属含有錯体と１−メトキシＰＭＳまたはその誘導体との混合物を使用する場合、チオニンまたは１−メトキシＰＭＳと金属含有錯体とのモル比が１：１〜２０（チオニンまたは１−メトキシＰＭＳのモル：金属含有錯体のモル）、より具体的には１：１〜１０であってよい。
【００５４】
本発明の好ましい具体例によれば、前記電子伝達媒体としてルテニウム錯体とチオニンまたはチオニン誘導体を共に使用することにより、グルコース検出性能を顕著に増加させ、グルコース検出における様々な妨害物質の影響がほとんどないようにすることができる。
【００５５】
この時、前記電子伝達媒体として金属含有錯体（例えば、ルテニウム錯体）とチオニンまたはチオニン誘導体とを含む試薬組成物は、酸化還元酵素１００重量部を基準として、金属含有錯体２０〜７００重量部、例えば６０〜７００重量部、または３０〜３４０重量部を含有することができる。前記金属含有錯体の含有量は、酸化還元酵素の活性度に応じて適切に調節することができ、試薬組成物内に含まれている酸化還元酵素の活性度が高ければ、金属含有錯体の含有量が低くても試薬組成物の目的とする効果を発揮できるため、一般に酸化還元酵素の活性度が高いほど、金属含有錯体の含有量は相対的に低く調節することができる。例えば、活性度が７００Ｕ／ｍｇの酸化還元酵素を使用する場合には、酸化還元酵素１００重量部を基準として、金属含有錯体６０〜７００重量部、例えば３０〜３４０重量部を含有することができ、酸化還元酵素の活性度がこれより高くなると、金属含有錯体の含有量をこれより低く調節することができる。金属含有錯体の含有量が前記範囲より低い場合、高い血糖濃度においてセンサの反応が鈍くなる問題があり、前記範囲を超える場合、血液によって試薬が速く溶けない問題があり得る。
【００５６】
また、前記電子伝達媒体として金属含有錯体（例えば、ルテニウム錯体）とチオニンまたはチオニン誘導体とを含む試薬組成物は、酸化還元酵素１００重量部を基準として、チオニンまたはその誘導体を２〜２５重量部、例えば６〜２５重量部、または６〜２０重量部を含有することができる。前記チオニンまたはその誘導体の含有量は、酸化還元酵素の活性度に応じて適切に調節することができ、試薬組成物内に含まれている酸化還元酵素の活性度が高ければ、金属含有錯体の含有量が低くても試薬組成物の目的とする効果を発揮できるため、一般に酸化還元酵素の活性度が高いほど、チオニンまたはその誘導体の含有量は相対的に低く調節することができる。例えば、活性度が７００Ｕ／ｍｇの酸化還元酵素を使用する場合には、酸化還元酵素１００重量部を基準として、チオニンまたはその誘導体６〜２５重量部、または６〜２０重量部を含有することができ、酸化還元酵素の活性度がこれより高くなると、チオニンまたはその誘導体の含有量をこれより低く調節することができる。チオニンまたはその誘導体の含有量が前記範囲未満の場合、高い血糖濃度においてセンサの反応が鈍くなる問題があり、前記範囲を超える場合、血液によって試薬が速く溶けない問題があり得る。
【００５７】
本発明にかかる試薬組成物は、前記試薬安定剤としての親水性包含化合物を、酸化還元酵素１００重量部に対して、５０〜６００重量部、例えば８０〜５００重量部、１００〜４５０重量部、２００〜６００重量部、３００〜５００重量部、または３５０〜４５０重量部の量で含むことができる。例えば、活性度が７００Ｕ／ｍｇの酸化還元酵素を使用する場合には、酸化還元酵素１００重量部を基準として、親水性包含化合物２００〜６００重量部、具体的には３００〜５００重量部、より具体的には３５０〜４５０重量部を含有することができ、酸化還元酵素の活性度がこれより高くなると、包含化合物の含有量をこれより低く調節することができる。前記試薬安定剤としての親水性包含化合物の含有量が前記範囲より少ない場合、チオニンまたはチオニン誘導体が完全に溶けない問題があり、前記範囲を超える場合、センサの敏感度が低くなる問題があるため、試薬安定剤としての親水性包含化合物の含有量は前記範囲とするのが良い。
【００５８】
一方、本発明にかかる試薬組成物は、界面活性剤、水溶性高分子、４次アンモニウム塩、脂肪酸、増粘剤などからなる群より選択された１種以上の添加剤を、試薬溶解時の分散剤、試薬製造時の粘着剤、長期保管の安定剤などの役割のために追加的に含むことができる。
【００５９】
前記界面活性剤は、試薬を分注する時、試薬が電極上で均等に拡散して、試薬が均一な厚さに分注されるようにする役割を果たすものであってよい。前記界面活性剤として、トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ソジウムドデシルスルフェート（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）、パーフルオロオクタンスルホネート（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｏｃｔａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ソジウムステアレート（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔｅａｒａｔｅ）などからなる群より選択された１種以上を使用することができる。本発明にかかる試薬組成物は、試薬を分注する時、試薬が電極上で均等に拡散して、試薬が均一な厚さに分注されるようにする役割を適切に果たすようにするために、前記界面活性剤を、酸化還元酵素１００重量部を基準として、３〜２５重量部、例えば１０〜２５重量部の量で含有することができる。例えば、活性度が７００Ｕ／ｍｇの酸化還元酵素を使用する場合、酸化還元酵素１００重量部を基準として、界面活性剤１０〜２５重量部を含有することができ、酸化還元酵素の活性度がこれより高くなると、界面活性剤の含有量をこれより低く調節することができる。
【００６０】
前記水溶性高分子は、試薬組成物の高分子支持体であって、酵素の安定化および分散（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ）を助ける役割を果たすものであってよい。前記水溶性高分子としては、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ；ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ；ＰＶＡ）、パーフルオロスルホネート（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ヒドロキシエチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙ  ｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＣＭＣ）、セルロースアセテート（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｃｅｔａｔｅ）、ポリアミド（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ）などからなる群より選択された１種以上を使用することができる。本発明にかかる試薬組成物は、酸化還元酵素の安定化および分散（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ）を助ける役割を十分かつ適切に発揮させるために、前記水溶性高分子を、酸化還元酵素１００重量部を基準として、１０〜７０重量部、例えば３０〜７０重量部の量で含有することができる。例えば、活性度が７００Ｕ／ｍｇの酸化還元酵素を使用する場合、酸化還元酵素１００重量部を基準として、水溶性高分子３０〜７０重量部を含有することができ、酸化還元酵素の活性度がこれより高くなると、水溶性高分子の含有量をこれより低く調節することができる。
【００６１】
前記水溶性高分子は、支持体および酵素の安定化および分散（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ）を助ける役割を効果的に果たすために、重量平均分子量が２，５００〜３，０００，０００程度、例えば５，０００〜１，０００，０００程度であってよい。
【００６２】
前記４次アンモニウム塩は、赤血球容積率（ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ）の量に応じた測定誤差を減少させる役割を果たすものであってよい。前記４次アンモニウム塩としては、エシルトリメチルアンモニウム（ｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、ミリスチルトリメチルアンモニウム（ｍｙｒｉｓｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、セチルトリメチルアンモニウム（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、オクタデシルトリメチルアンモニウム（ｏｃｔａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、テトラヘキシルアンモニウム（ｔｅｔｒａｈｅｘｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）などからなる群より選択された１種以上を使用することができる。本発明にかかる試薬組成物は、赤血球容積率に応じた測定誤差を効率的に減少させるために、前記４次アンモニウム塩を、酸化還元酵素１００重量部を基準として、２０〜１３０重量部、例えば７０〜１３０重量部の量で含有することができる。例えば、活性度が７００Ｕ／ｍｇの酸化還元酵素を使用する場合、酸化還元酵素１００重量部を基準として、４次アンモニウム塩７０〜１３０重量部を含有することができ、酸化還元酵素の活性度がこれより高くなると、４次アンモニウム塩の含有量をこれより低く調節することができる。
【００６３】
前記脂肪酸は、前述した４次アンモニウム塩と同様に、赤血球容積率（ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ）の量に応じた測定誤差を減少させる役割を果たし、また、高濃度領域においてバイオセンサの線形動的領域（ｌｉｎｅａｒ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｎｇｅ）を拡大させる役割を果たす。前記脂肪酸としては、Ｃ４〜Ｃ２０の炭素鎖を有する脂肪酸およびその脂肪酸塩からなる群より選択された１種以上を使用することができ、好ましくは、Ｃ６〜Ｃ１２からなるアルキル炭素鎖を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を使用することができる。前記脂肪酸としては、カプロン酸（ｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ヘプタン酸（ｈｅｐｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、カプリル酸（ｃａｐｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、オクタン酸（ｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ノナン酸（ｎｏｎａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、カプリン酸（ｃａｐｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ウンデカン酸（ｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ラウリン酸（ｌａｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）、トリデカン酸（ｔｒｉｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ミリスチン酸（ｍｙｒｉｓｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ペンタデカン酸（ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ヘプタデカン酸（ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ステアリン酸（ｓｔｅａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ノナデカン酸（ｎｏｎａｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、アラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、前記脂肪酸の塩などからなる群より選択された１種以上を使用することができる。本発明にかかる試薬組成物は、赤血球容積率に応じた測定誤差の減少および高濃度領域においてバイオセンサの線形動的領域の拡大効果を適切に得るために、前記脂肪酸を、酸化還元酵素１００重量部を基準として、１０〜７０重量部、例えば３０〜７０重量部の量で含有することができる。例えば、活性度が７００Ｕ／ｍｇの酸化還元酵素を使用する場合、酸化還元酵素１００重量部を基準として、脂肪酸３０〜７０重量部を含有することができ、酸化還元酵素の活性度がこれより高くなると、脂肪酸の含有量をこれより低く調節することができる。
【００６４】
前記増粘剤は、試薬を電極に強固に付着させる役割を果たす。前記増粘剤としては、ナトロゾール、ジエチルアミノエチル−デキストランヒドロクロライド（ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）などからなる群より選択された１種以上を使用することができる。本発明にかかる試薬組成物は、試薬を電極に強固に付着させるために、前記増粘剤を、酸化還元酵素１００重量部を基準として、１０〜９０重量部、例えば３０〜９０重量部の量で含有することができる。例えば、活性度が７００Ｕ／ｍｇの酸化還元酵素を使用する場合、酸化還元酵素１００重量部を基準として、増粘剤３０〜９０重量部を含有することができ、酸化還元酵素の活性度がこれより高くなると、増粘剤の含有量をこれより低く調節することができる。
【００６５】
また、本発明は、前記試薬組成物が含まれている電気化学的バイオセンサを提供する。
【００６６】
一実施形態において、電気化学的バイオセンサにおいて、作動電極および補助電極が一平面上に備えられ、前記作動電極上に本発明にかかる試薬組成物が含まれていることを特徴とする、平面型電気化学的バイオセンサが提供される（図１参照）。
【００６７】
他の実施形態において、電気化学的バイオセンサにおいて、作動電極および補助電極が互いに異なる平面上で対面するように備えられ、前記作動電極上に本発明にかかる試薬組成物が含まれていることを特徴とする、対面型電気化学的バイオセンサが提供される（図２参照）。
【００６８】
前記バイオセンサにおいて、本発明にかかる試薬組成物が含まれている形態は特別な制限がなく、具体的には、作動電極の表面にコーティングされた形態で含まれるとよいが、これに制限されるわけではない。
【００６９】
本発明にかかる前記平面型および対面型電気化学的バイオセンサは、例えば、大韓民国特許公開第１０−２００４−０１０５４２９号、大韓民国特許公開第１０−２００６−００８９４６４号、大韓民国特許登録第０８５４３８９号、大韓民国特許公開第１０−２００８−００８０８４１号、大韓民国特許公開第１０−２００８−００８４０３０号、大韓民国特許公開第１０−２００８−００８８０２８号などに公知の方法を通じて製造することができる。
【００７０】
以下、前記平面型および対面型電気化学的バイオセンサの構造を、図１および図２を参照して例示する。
【００７１】
まず、図１に示す平面型電気化学的バイオセンサは、作動電極と補助電極が一平面上に備えられるもので、上から、血液がセンサ内に染み込むようにするための通気部１０を備えた上板１１と、両面に接着剤がコーティングされていて、前記上板と下記の下板とを接着させる役割を果たし、血液が毛細作用で電極側に染み込むようにするための嵌合板９と、下記の作動電極および補助電極に含まれる（例えば、コーティングされる）本発明にかかる試薬組成物８と、下記の作動電極および補助電極の面積を規定するための通路部が備えられた絶縁板７と、下記の下板上にプリントされる作動電極２および補助電極３と、前記作動電極および補助電極が形成される下板１とが順次に積層された構造を有する。
【００７２】
図２に示す対面型電気化学的バイオセンサは、作動電極と補助電極が互いに異なる平面上に対面するように備えられるもので、上から、血液がセンサ内に染み込むようにするための通気部１０を備え、下記の補助電極がプリントされる上板１１と、前記上板にプリントされる補助電極３と、両面に接着剤がコーティングされていて、前記上板と下記の下板とを接着させる役割を果たし、血液が毛細作用で電極側に染み込むようにするための嵌合板９と、下記の作動電極に含まれる（例えば、コーティングされる）本発明にかかる試薬組成物８と、下記の作動電極と前記補助電極の面積を規定するための通路部が備えられた絶縁板７と、前記補助電極と下記の補助電極のリードとを連結する回路連結接地５と、下記の下板上にプリントされる作動電極２、補助電極のリード４、および血液の入る速度を測定するための流動感知電極６と、前記作動電極、補助電極のリード、および流動感知電極が形成される下板１とが順次に積層される構造を有する。
【００７３】
上述のように、本発明にかかる試薬組成物は、センサを長期間保管した後でもグルコースなどの検出対象の代謝産物に対する検出性能に変化が少なく、特に血糖測定のための電気化学的バイオセンサの製造に有用である。
【００７４】
以下、本発明を下記の実施例によりさらに詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００７５】
＜実施例１＞試薬安定剤を含む試薬組成物の製造
酸化還元酵素としてフラビンアデニンジヌクレオチド−グルコース脱水素酵素（ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＦＡＤ−ＧＤＨ、ＥＣ１．１．９９．１０）１００重量部に対して；
金属含有錯体としてヘキサアンミンルテニウムクロライド（Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３）８０重量部（５０ｍＭ）；
チオニン（ｔｈｉｏｎｉｎｅ）３６重量部（２０ｍＭ）；
ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）４０６重量部（５０ｍＭ）；
脂肪酸としてソジウムオクタノエート（ｓｏｄｉｕｍ  ｏｃｔａｎｏａｔｅ）５２重量部；
４次アンモニウム塩として臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム（ｍｙｒｉｓｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）１０４．３重量部；
増粘剤としてジエチルアミノエチル−デキストランヒドロクロライド（ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）５２重量部およびナトロゾール（Ｎａｔｒｏｓｏｌ）１１．７重量部；
水溶性高分子として８０％水和されたポリビニルアルコール（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ；重量平均分子量：９，０００〜１０，０００）５２重量部；および
界面活性剤（商品名：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）１７．４重量部；
をソジウムホスフェート緩衝液（ｐＨ６．４、０．１Ｍ濃度の１２４９ｍｌ）および脱イオン水（１６１４．６ｍｌ）に溶かし、溶液内に残っている微粒子はろ過して除去して、酸化還元反応用試薬組成物を製造した。
【００７６】
＜実施例２＞実施例１の試薬組成物を含む平面型バイオセンサの製造
平面型バイオセンサの一例として、図１に示しているように、平均値０．５μｌの試料導入部を有する平面型バイオセンサを製造した。
【００７７】
図１において、  
１は作動電極（面積：１．０５ｍｍ２）および補助電極が形成される、ポリエステルで作った下板プラスチックであり、
２と３は炭素グラファイトをスクリーンプリントして作った電極で、２は作動電極、３は補助電極であり、
７は絶縁体であって、作動電極と補助電極の面積を規定し、
８は作動電極にコーティングされる、実施例１で製造した試薬組成物であり、
９は血液が毛細作用で電極側に染み込むようにした、０．１０ｍｍ厚さの嵌合板で、その両面に接着剤がコーティングされていて、上板と下板とを接着させる役割を果たし、
１０は血液がセンサ内に染み込むようにするための空気排出口であり、
１１はポリエステルで作った上板プラスチックとして、バイオセンサを製作した。
【００７８】
＜実施例３＞実施例１の試薬組成物を含む対面型バイオセンサの製造
対面型バイオセンサの一例として、図２に示しているように、平均値０．５μｌの試料導入部を有する対面型バイオセンサを製造した。
【００７９】
図２において、
１は作動電極（面積：１．９５ｍｍ２）、補助電極のリード、および流動感知電極がスクリーンプリントされた、ポリエステルで作った下板プラスチックであり、
２、３、４および６は炭素グラファイトをスクリーンプリントして作った電極で、２は作動電極、３は補助電極、４は補助電極のリード、６は血液の入る速度を測定するための流動感知電極であり、
５は３と４とを連結するように、銀と塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）で作った回路連結接地であり、
７は絶縁体であって、作動電極の面積を規定し、
８は作動電極にコーティングされる、実施例１で製造した試薬組成物であり、
９は血液が毛細作用で電極側に染み込むようにした、０．０７ｍｍ厚さの嵌合板で、その両面に接着剤がコーティングされていて、上板と下板とを接着させる役割を果たし、
１０は空気排出口であり、
１１は補助電極がスクリーンプリントされた、ポリエステルで作った上板プラスチックとして、バイオセンサを製作した。
【００８０】
＜比較例１＞試薬安定剤を含まない試薬組成物の製造
実施例１と同様に実施して試薬組成物を製造するが、試薬安定剤のヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンを添加せずに試薬組成物を製造した。
【００８１】
＜比較例２＞比較例１の試薬組成物を含む対面型バイオセンサの製造
実施例１−２と同様に実施して対面型バイオセンサを製造するが、比較例１で製造した試薬組成物を作動電極にコーティングしてバイオセンサを製作した。
【００８２】
＜実験例１＞平面型バイオセンサのグルコース標準溶液に対する電流測定
実施例２で製作した平面型バイオセンサを用いて、グルコース標準溶液に対する電流測定を行った。ここで、前記グルコース標準溶液は、静脈から抽出した血液をヘマトクリッ（ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ）４２％に合わせ、グルコース分析器（製造会社：ＹＳＩ、モデル名：２３００Ｓｔａｔ  Ｐｌｕｓ）を用いて、様々なグルコース濃度を有するように製造した血液をいう。
【００８３】
具体的には、それぞれのグルコース濃度が１１、２２、５０、６７、１０１、２０２、３０１、３９６および５０９ｍｇ／ｄＬの標準溶液が作動電極と補助電極を同時に覆った瞬間、作動電極に０ｍＶをかけて、３秒間待機した後、作動電極に２００ｍＶをかけてから、１秒後に電流を測定した。すべての測定は各濃度あたり１０回ずつ測定し、その平均値を図３に示した。
【００８４】
図３に示されているように、実施例２で製造した平面型バイオセンサは、グルコース濃度に応じて測定される電流が漸進的に増加する良い直線性を示すことが分かった。この時、測定される電流の作動電極の単位面積あたりの傾きは２０．５ｎＡ／（ｍｇ／ｄＬ）／ｍｍ２である。
【００８５】
＜実験例２＞対面型バイオセンサのグルコース標準溶液に対する電流測定
実施例３で製作した対面型バイオセンサを用いて、実験例１と同様に、グルコース標準溶液に対する電流測定を行った。ただし、それぞれのグルコース標準溶液の濃度は１１、２１、５０、７２、１０４、２０４、３０３、３９７および５００ｍｇ／ｄＬとした。
【００８６】
本実験は、試薬安定化剤として、ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンの代わりに、ヒドロキシプロピル−アルファ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−ガンマ−シクロデキストリン、またはベータ−シクロデキストリンを含む試薬組成物を、実施例１の方法によってそれぞれ製造し、それぞれ製造された試薬組成物を用いて、実施例３の方法によってバイオセンサを製作して、前記同様の実験を行った。
【００８７】
すべての測定は各濃度あたり１０回ずつ測定し、その平均値を図４に示した。
【００８８】
図４に示されているように、試薬組成物中において、試薬安定剤として、ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンを含むバイオセンサは、作動電極の単位面積あたりの傾きが２６．９ｎＡ／（ｍｇ／ｄＬ）／ｍｍ２で最も良い直線性を示しており、他の試薬安定剤を含む場合でも良好な直線性を示すことが明らかになった。
【００８９】
＜実験例３＞対面型バイオセンサを５０℃で熟成した時のグルコース標準溶液に対する電流測定
センサを商用化するためには、センサの有効期間内にセンサの性能変化が少なくなければならない。実験例３は、センサを長期間保管する時にどれだけ安定しているかを調べる実験である。つまり、実施例３と比較例２で製作した対面型バイオセンサを、５０℃で４、１１、１７、２４、２９、３６および４３日間熟成した後、実験例２と同様に、グルコース標準溶液に対する電流測定を行い、その結果を図５に示した。この時、５０℃で４３日間熟成させた場合は、室温で１７ヶ月保管したことに相当する。
【００９０】
図５から明らかなように、試薬安定剤として、ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）を含む場合、少なくとも４３日間の熟成期間において傾きの変化は最大３．６％であったが、ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンを含まない場合、熟成期間に応じて傾きが次第に減少し、４３日間熟成した後の傾きは、熟成前と比較して２１％減少したことが明らかになった。したがって、ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンを試薬組成物に添加すれば、センサを長期間性能変化なく保管可能であることを確認することができる。
【００９１】
したがって、本発明にかかるヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンを含む酸化還元反応用試薬組成物は、長期保管に非常に安定していて、血液内のグルコース検出のためのバイオセンサの製造に有用である。本発明の実施例に提示した試薬組成物および比率は発明の一例に過ぎず、使用しようとする用途および要求する性能に応じて感応の程度を調節するために自由に変化させることができ、これは、本実施技術を扱う当業者には当然のことであるので、本発明の核心は提示した実施例に限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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