(57)【要約】  本願明細書に記載されているのは、バクテリオファージＴ４の小外部キャプシド（Ｓｏｃ）タンパク質およびバクテリオファージＴ４フィブリチンのフォルドンドメイン（Ｆｄ）に融合される、部分的な外部ドメインおよび細胞質ドメインを含む可溶性ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１トリマー（Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄ）である。プレヘアピン構造を有するｇｐ４１トリマーは、ウイルス侵入の機構の理解のため、およびＨＩＶ−１ワクチン、診断薬および治療薬の開発のための候補として、用いられ得る。異なる改変物を含むｇｐ４１タンパク質の他の二次的実施形態もまた開示されている。１つの実施形態によれば、ｇｐ４１トリマーは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）にさらに付着される。ｇｐ４１トリマーの製造方法もまた開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質が融合タンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質が組換えタンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質が変異タンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質が以下の領域：
バクテリオファージＴ４の小外部キャプシドタンパク質（Ｓｏｃ）、
変異体ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１、および
バクテリオファージＴ４フィブリチン由来のフォルドンドメイン
を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記変異体ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１領域のアミノ酸配列（配列番号４）が、野生型ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１のアミノ酸配列（配列番号２）に対して少なくとも９０％同一である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記変異体ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１が、前記野生型ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１と、前記アミノ酸配列に対する以下の変異：
Ａｒｇ５５７のグルタミン酸との置換
Ｌｅｕ５６５のアルギニンとの置換
Ｌｅｕ５６８のグルタミン酸との置換
Ｌｅｕ６３５のグルタミン酸との置換
Ｌｅｕ６４５のグルタミン酸との置換
Ｌｅｕ６８４からＶａｌ７０５までの２２アミノ酸残基の欠失；および
Ｇｌｎ５７７からＴｈｒ６０５までの２９アミノ酸残基の欠失
を含有することにより異なり、
ここで、数がＨＩＶ−１株ＨＸＢ２由来の該ｇｐ４１配列を用いる各領域についての最初のアミノ酸に対応する、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
トリマーである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記タンパク質が、そのＮ末端で細胞透過性ペプチド（配列番号８）にさらに結合している、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項１に記載のタンパク質をコードする、単離ＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項９に記載のＤＮＡを含む、組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の組換えベクターを含む、形質転換体。
【請求項１３】
以下の工程：
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを含有する発現ベクターから、融合タンパク質を発現する工程、
（ｂ）工程（ａ）由来の該融合タンパク質を精製し、それにより配列番号６のアミノ酸配列を含む精製型の融合タンパク質を形成する工程、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記方法がさらに以下の工程：
（ｃ）ＨＩＶ−１レトロウイルスｇｐ４１遺伝子に対するヌクレオチド置換および欠失を導入し、それにより変異体ｇｐ４１遺伝子を形成する工程、
（ｄ）バクテリオファージＴ４由来ｓｏｃ遺伝子、該変異体ｇｐ４１遺伝子、および前記バクテリオファージＴ４フィブリチン由来フォルドンドメインを含む人工ＤＮＡフラグメントの複数のコピーを産生する工程、
（ｅ）該ＤＮＡフラグメントを制限酵素で処理し、それにより該ＤＮＡフラグメントにクローニング適合性末端を形成する工程、ならびに
（ｆ）クローニング適合性末端を有する該ＤＮＡフラグメントを前記発現ベクターに連結する工程、
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法がさらに以下の工程：
（ｇ）前記精製された融合タンパク質をリフォールディングし、それによりフォールディングした融合タンパク質を形成する工程
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項１７】
前記タンパク質が融合タンパク質である、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記タンパク質が組換えタンパク質である、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記タンパク質が変異タンパク質である、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記タンパク質が以下の領域：
バクテリオファージＴ４の小外部キャプシドタンパク質（Ｓｏｃ）、および
変異体ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１
を含む、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項２１】
前記変異体ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１領域のアミノ酸配列（配列番号４）が、野生型ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１のアミノ酸配列（配列番号２）に対して少なくとも９０％同一である、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項２２】
前記変異体ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１が、前記野生型ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１と、前記アミノ酸配列に対する以下の変異：
Ａｒｇ５５７のグルタミン酸との置換
Ｌｅｕ５６５のアルギニンとの置換
Ｌｅｕ５６８のグルタミン酸との置換
Ｌｅｕ６３５のグルタミン酸との置換
Ｌｅｕ６４５のグルタミン酸との置換
Ｌｅｕ６８４からＶａｌ７０５までの２２アミノ酸残基の欠失；および
Ｇｌｎ５７７からＴｈｒ６０５までの２９アミノ酸残基の欠失
を含有することにより異なり、
ここで、数がＨＩＶ−１株ＨＸＢ２由来の該ｇｐ４１配列を用いる各領域についての最初のアミノ酸に対応する、請求項２１に記載のタンパク質。
【請求項２３】
トリマーである、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項２４】
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項２５】
前記タンパク質が融合タンパク質である、請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項２６】
前記タンパク質が組換えタンパク質である、請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項２７】
前記タンパク質が変異タンパク質である、請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項２８】
前記タンパク質が以下の領域：
バクテリオファージＴ４の小外部キャプシドタンパク質（Ｓｏｃ）、および
変異体ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１
を含む、請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項２９】
前記変異体ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１領域のアミノ酸配列（配列番号４）が、野生型ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１のアミノ酸配列（配列番号２）に対して少なくとも９０％同一である、請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項３０】
前記変異体ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１が、前記野生型ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１と、前記アミノ酸配列に対する以下の変異：
Ａｒｇ５５７のグルタミン酸との置換
Ｌｅｕ５６５のアルギニンとの置換
Ｌｅｕ５６８のグルタミン酸との置換
Ｌｅｕ６３５のグルタミン酸との置換
Ｌｅｕ６４５のグルタミン酸との置換
Ｌｅｕ６８４からＶａｌ７０５までの２２アミノ酸残基の欠失；および
Ｇｌｎ５７７からＴｈｒ６０５までの２９アミノ酸残基の欠失
を含有することにより異なり、
ここで、数がＨＩＶ−１株ＨＸＢ２由来の該ｇｐ４１配列を用いる各領域についての最初のアミノ酸に対応する、請求項２９に記載のタンパク質。
【請求項３１】
配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項３２】
前記タンパク質が融合タンパク質である、請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項３３】
前記タンパク質が組換えタンパク質である、請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項３４】
前記タンパク質が以下の領域：
バクテリオファージＴ４の小外部キャプシドタンパク質（Ｓｏｃ）、および
ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１
を含む、請求項２４に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１２年１１月２９日に出願された、「可溶性完全長ＨＩＶ−１  ＧＰ４１トリマーの設計」の名称の米国仮特許出願第６１／７３１，１４７号の優先権の利益を主張し、その全体が本明細書において参照として援用されている。
【０００２】
本願は、２０１０年４月９日に出願された「タンパク質および核酸送達ビヒクル、その構成成分および機構」の名称の米国仮特許出願第６１／３２２，３３４号、および２０１１年４月８日に出願された、「タンパク質および核酸送達ビヒクル、その構成成分および機構」の名称の米国特許出願第１３／０８２，４６６号に対する参照を構成し、その全体が本明細書において参照として援用されている。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、宿主細胞へのウイルスの詳細な侵入機構の理解、およびＨＩＶ−１ワクチン、診断薬、および治療薬の開発のための候補としての理解を助ける可溶性ヒトレトロウイルスＨＩＶ−１糖タンパク質ｇｐ４１トリマーに関する。
【背景技術】
【０００４】
（関連技術）
ＨＩＶ−１侵入の基本的な経路は確立されているが、ウイルスと宿主細胞レセプターとの間の一連の初期相互作用、細胞外糖タンパク質ｇｐｌ２０および膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１、ならびにそれらの中間体を含む詳細な機構は充分に分かっていない。そのため、鍵となる中間体を模したｇｐ４１組換え体の設計は、その機構の解明、ならびに強力な治療薬およびワクチンの開発にとって必須である。このような組換え体を産生するための標準的なアプローチは、ｇｐ４１の極端な疎水性のために成功していない。本願は、本明細書に記載されるような従来技術の欠点を解消する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の広範な局面によると、本発明は、バクテリオファージＴ４の小外部キャプシド（Ｓｏｃ）タンパク質およびバクテリオファージＴ４フィブリチンのフォルドンドメイン（Ｆｄ）に融合される、部分的な外部ドメインおよび細胞質ドメインを含む可溶性ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１トリマー（Soc-gp41M-Fd）を提供する。
【０００６】
第２の広範な局面によると、本発明は、バクテリオファージＴ４の小外部キャプシド（Ｓｏｃ）タンパク質およびバクテリオファージＴ４フィブリチンのフォルドンドメイン（Ｆｄ）に融合され、さらに膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）に付着される、部分的な外部ドメインおよび細胞質ドメインを含む可溶性ＨＩＶ−１レトロウイルス膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１トリマー（Soc-gp41M-Fd）を提供する。ｇｐ４１トリマーの製造方法がまた開示される。
【０００７】
第３の広範な局面によると、本発明は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。
【０００８】
第４の広範な局面によると、本発明は、以下の工程：（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを含む発現ベクターから融合タンパク質を発現する工程；（ｂ）工程（ａ）からの融合タンパク質を精製し、それにより配列番号６のアミノ酸配列を含む精製型(purified form)の融合タンパク質を形成する工程；を含む方法を提供する。
【０００９】
第３の広範な局面によると、本発明は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。
【００１０】
第３の広範な局面によると、本発明は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。
【００１１】
第３の広範な局面によると、本発明は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】ｇｐ４１の種々の領域の略図である。
【図１Ｂ】ｇｐ４１機能に重点を置いたＨＩＶ−１侵入のスキーム図である。
【図１Ｃ】プレヘアピン構造のｇｐ４１組換えトリマーを生成する戦略を図示するスキーム図である。
【図２Ａ】Ｓｏｃ−ｇｐ４１およびＳｏｃ−ｇｐ４１ΔＩＤ組換え体の種々の領域の略図である。
【図２Ｂ】ＩＰＴＧ誘導なし（０時間）またはＩＰＴＧ誘導３時間後（３時間）のＳｏｃ−ｇｐ４１のタンパク質パターンを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。
【図２Ｃ】ＩＰＴＧ誘導なし（０時間）またはＩＰＴＧ誘導３時間後（３時間）のＳｏｃ−ｇｐ４１ΔＩＤのタンパク質パターンを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。
【図２Ｄ】Ｓｏｃ−ｇｐ４１（上のパネル）とＳｏｃ−ｇｐ４１＿ＩＤ（下のパネル）との可溶性を比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。
【図２Ｅ】ＨｉｓＴｒａｐカラム上のＳｏｃｇｐ４１ΔＩＤの溶出プロフィールである。
【図３Ａ】ｇｐ４１  ６ＨＢ構造（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＡＩＫ）を示すリボン図である。
【図３Ｂ】ＨＲ１の残基Ａｒｇ５５７のＧｌｕ５５７への変更を図示するリボン図である。
【図３Ｃ】ＨＲ１の残基Ｌｅｕ５６８のＧｌｕ５６８への変更を図示するリボン図である。
【図３Ｄ】ＩＰＴＧ誘導なし（０時間）およびＩＰＴＧ誘導３時間後（３時間）、種々のｇｐ４１変異体のタンパク質発現および可溶性を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％）の画像である。
【図３Ｅ】精製Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍタンパク質を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％）の画像である。
【図３Ｆ】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過によるＳｏｃ−ｇｐ４１Ｍの溶出プロフィールである。
【図３Ｇ】迅速透析（レーン１）または緩徐リフォールディング（レーン２）により復元された精製Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍの未変性ＰＡＧＥ（４〜２０％勾配）の画像である。
【図４Ａ】Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄ組換え体およびＳｏｃ−ｇｐ４１ｅｃｔｏＭ−Ｆｄ組換え体の略図である。
【図４Ｂ】精製Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％）の画像である。
【図４Ｃ】精製されたＳｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−ＦｄおよびＳｏｃ−ｇｐ４１ｅｃｔｏＭ−Ｆｄのタンパク質の未変性ＰＡＧＥゲル（４〜２０％勾配）の画像である。
【図４Ｄ】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過後のＳｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄ画分のオリゴマー状態を示す未変性ゲル（４〜２０％勾配）の画像である。
【図４Ｅ】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過後のＳｏｃ−ｇｐ４１ｅｃｔｏＭ−Ｆｄ画分のオリゴマー状態を示す未変性ゲル（４〜２０％勾配）の画像である。
【図５Ａ】Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄに結合されたＨＲ２ペプチドＣ３４を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％）の画像である。
【図５Ｂ】Ｃ３４ペプチドの添加あり（Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−ＦｄとＣ３４とが１：２０モル比）または添加なしのＳｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄのオリゴマー状態を示す未変性ＰＡＧＥゲル（４〜２０％勾配）の画像である。
【図６Ａ】ＴＺＭ／ｂｌアッセイにより決定されるような精製２Ｆ５  ＩｇＧの連続希釈物を用いたウイルス中和を示す棒グラフである。
【図６Ｂ】ＴＺＭ／ｂｌアッセイにより決定されるような精製４Ｅ１０  ＩｇＧの連続希釈物を用いたウイルス中和を示す棒グラフである。
【図７Ａ】ファージＴ４キャプシドのＣｒｙo−ＥＭ構造を示す図である。
【図７Ｂ】ファージＴ４上のＳｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄの結合を図示するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。
【図７Ｃ】Ｓｏｃ−融合タンパク質とキャプシド結合部位比が２０：１のファージＴ４上のＳｏｃ−ｇｐ４１ｅｃｔｏＭ−Ｆｄの結合を図示するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。
【図７Ｄ】Ｓｏｃ−融合タンパク質とキャプシド結合部位比が２０：１のファージＴ４上のＣＰＰ−Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄの結合を図示するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。
【図７Ｅ】Ｓｏｃ−ｇｐ４１−Ｆｄの飽和結合曲線である。
【図７Ｆ】Ｓｏｃ組換え体およびＳｏｃ−ｇｐ４１融合物組換え体の結合パラメーターを示す表である。
【図８】可溶性トリマーならびにｇｐ４１トリマーを整列させたファージＴ４ナノ粒子を生成するための一連のアプローチを示すフローチャートであり、可溶性トリマーおよび呈示されたトリマーの模式図を下部に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（定義）
添付の図面は、本願に組み込まれ、かつ本明細書の一部を構成するが、これは発明の例示の実施形態を図示し、そして上に示した一般的記載および以下に示した詳細な説明と一緒になって、発明の特徴を説明する役割を果たす。
【００１４】
用語の意味が当該用語の一般的に使用される意味から逸脱する場合、特に表示のない限り、出願人は、以下に提供された定義を使用することを意図する。
【００１５】
本発明の目的のために、単数形「ａ」、「an」、および「the」は、本明細書に提示された文脈が特に明確に表示しない限り、複数への言及も包含する。
【００１６】
本発明の目的のために、用語「アミノ酸」は、生物の遺伝暗号によりコードされ、そしてタンパク質への前駆体である生物学的有機化合物をいう。
【００１７】
本発明の目的のために、用語「クローニング適合性末端」は、特定のヌクレオチド配列を含む特定の認識部位でＤＮＡを切断する制限酵素（または制限エンドヌクレアーゼ）により切断されるＤＮＡフラグメントの平滑末端または粘着末端をいう。ＤＮＡインサートをクローニングベクターまたは発現ベクターにクローニングすることができるように、ＤＮＡインサートの両末端は、当該ＤＮＡインサートが正しい方向に組み込まれることを確実にする適合性末端を作出する制限酵素で処理されなければならない。
【００１８】
本発明の目的のために、用語「欠失」は、変異体タンパク質のポリペプチド配列からのアミノ酸残基の欠如をいう。
【００１９】
本発明の目的のために、用語「融合タンパク質」は、別のタンパク質を本来コードする２つまたはそれ以上の遺伝子の接合を介して作出されるタンパク質をいう。この融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドを生じる。
【００２０】
本発明の目的のために、用語「同一の」または「同一性」は、対応する位置に同じアミノ酸を有する２つまたはそれ以上のポリペプチド配列のアミノ酸残基の割合百分率をいう。例えば、ポリペプチド配列に対して少なくとも９０％同一であるタンパク質は、その残基の少なくとも９０％が、対応する位置で、そのアミノ酸配列中のものと同じである。
【００２１】
本発明の目的のために、用語「変異体タンパク質」は、変異を有する遺伝子によりコードされたタンパク質産物をいう。
【００２２】
本発明の目的のために、用語「変異」は、タンパク質のポリペプチド配列における変更をいう。
【００２３】
本発明の目的のために、用語「オーバーラップ伸長ＰＣＲ」または「オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応」は、長いＤＮＡフラグメントをより短いものから作出するために用いられる、伝統的なＰＣＲ技術のバリエーションである分子生物学技術をいう。
【００２４】
本発明の目的のために、用語「ＰＡＧＥ」は、ポリアクリルアミド電気泳動をいい、高分子（通常は、タンパク質または核酸）をそれらの電気泳動の移動度に従って分離する技術である。
【００２５】
本発明の目的のために、用語「組換え」は、遺伝子組換えプロセスを介して生成される任意の核酸、タンパク質、または生物学的分子をいう。
【００２６】
本発明の目的のために、用語「置換」は、変異体タンパク質のポリペプチド配列の特定位置のアミノ酸残基の置換をいう。
【００２７】
本発明の目的のために、用語「形質転換体」は、外来ＤＮＡの取り込みを介して遺伝的に改変された原核生物細胞をいう。
【００２８】
本発明の目的のために、用語「トリマー」は、３つの通常非共有結合タンパク質巨大分子によって形成されたタンパク質複合体をいう。
【００２９】
本発明の目的のために、用語「ベクター」は、外来遺伝子材料を別の細胞（それが複製または発現され得る）に人工的に運ぶビヒクル（媒体）として用いられるＤＮＡ分子をいう。
【００３０】
（説明）
ＨＩＶ−１エンベロープスパイクは、外部糖タンパク質ｇｐ１２０および膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１で構成されるヘテロダイマーのトリマーである。ｇｐ１２０は、宿主レセプターへの結合によりウイルス侵入を開始し、一方、ｇｐ４１は、ウイルス膜と宿主膜との間の融合を仲介する。ＨＩＶ−１浸入の基本経路は確立されているが、詳細な機構の理解は不十分である。キーとなる中間体を擬態するｇｐ４１組換え体の設計は、この機構の解明ならびに有力な治療薬およびワクチンの開発に必須である。このような組換え体を生成するための標準的なアプローチは、ｇｐ４１の極度の疎水性のために未だ成功していない。ここで、分子遺伝学および生化学的アプローチを用いて、可溶性完全長ｇｐ４１トリマーを設計するために、一連の仮説を試験した。膜貫通型近位外部領域の前方のｇｐ４１外部ドメインの２つの長い７アミノ酸（heptad）反復らせんＨＲ１およびＨＲ２を変異させ、分子内のＨＲ１−ＨＲ２相互作用を破壊したが、分子間のＨＲ１−ＨＲ１相互作用は破壊しなかった。これにより、凝集の減少および可溶性の向上が生じた。Ｃ末端の２７アミノ酸のフォルドン（foldon）の付着および緩徐リフォールディングがｇｐ４１をトリマーに導いた。トリマーは、露出されたＨＲ１溝へのＨＲ２ペプチドの結合および広範中和性抗体２Ｆ５および４Ｅ１０によるウイルス中和の阻害から明らかな、プレヘアピン構造で安定化されている。ファージＴ４の小外部キャプシドタンパク質への付着が、ｇｐ４１トリマーをナノ粒子アレイに転換した。これらのアプローチは、初めて、融合タンパク質および細胞質ドメインの両方を含む可溶性ｇｐ４１トリマーの設計に至った。これは、当該機構およびｇｐ４１ベースのＨＩＶ−１ワクチンの開発への新規な洞察を提供する。
【００３１】
ヒト免疫不全１型ウイルス（ＨＩＶ−１）により引き起こされた後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、主要な世界的な疫病である。有効な化学療法剤が発見されているが、これらは、感染が既に生じた後のウイルス複製を阻害する（１、２）。おそらく、感染部位のＨＩＶ−１浸入を阻止し得る予防ワクチンが、当該疫病を制御するための最良の戦略である（３〜５）。ヒトにおいてこれまでに行われた４つの大きなワクチン効力試験のうち、ＲＶ１４４試験のみが、ＨＩＶ−１感染から穏当であるが有意な防御（３１．２％）を示した（６）。主としてＨＩＶ−１の極度の遺伝的多様性のために、有効なＨＩＶ−１ワクチンの開発がいまだ最大の課題の１つとして残っている（７）。この多様性に加えて、グリコシル化による必須エピトープのマスキングおよびウイルスエンベロープの並外れた進化により、宿主免疫応答を逃れ得る（８）。したがって、ＨＩＶ−１ワクチン開発の主要な目標は、浸入の機構を詳細に理解し、そして免疫原ならびにウイルス侵入を阻止し得る治療薬および抗体（Ａｂｓ）の標的として働き得る保存された中間体を同定することである（４、９）。
【００３２】
ＨＩＶ−１、「球状の」エンベロープを持ったレトロウイルスは、宿主細胞の原形質膜と融合し、ヌクレオキャプシドコアを細胞質ゾルに送達する。浸入のキーとなる成分は、ウイルスエンベロープの脂質二層に包埋されたトリマースパイクである。それはヘテロダイマーのトリマーであり、各ダイマーは、、外部糖タンパク質ｇｐ１２０および膜貫通型糖タンパク質ｇｐ４１からなり、これらは、前駆タンパク質ｇｐ１６０のタンパク質分解切断から誘導される。ＨＩＶ−１浸入は、ウイルスと宿主細胞レセプターとの間の一連の初期の相互作用を包含する。ウイルスは、まず、ｇｐ１２０と表面分子（例えば、α４β７インテグリンおよびＤＣ−ＳＩＧＮ）との間の比較的弱い相互作用により捕捉され（１１〜１３）、次いで、ＣＤ４（ＣＤ４＋  Ｔ細胞上の一次レセプターである）との高親和性相互作用に至る（１４）。ｇｐ１２０における構造変化は、ケモカインコレセプターＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４のための結合部位を露出させる（１５）。さらなる構造変化は、ｇｐ４１の２つの長いらせん（７アミノ酸反復（ＨＲ）配列を含有する：ＨＲ１およびＨＲ２）の開放、およびＮ末端融合ペプチドの宿主細胞膜への挿入に至る（１６、１７）。プレヘアピン中間体、ＨＲ１らせん間の分子間相互作用により安定化された三本鎖コイルドコイルが形成される（図１Ａおよび１Ｂ）。図１Ａでは、ＦＰは、融合ペプチドであり；ＰＲは、融合ペプチド近位領域であり；ＨＲ１は７アミノ酸反復１であり；ループ（１１８）は、先端ループであり；ＨＲ２は７アミノ酸反復２であり；ＭＰＥＲは膜近位外部領域であり；ＴＭは膜貫通型らせんであり；Ｃｙｔｏは細胞質ドメインである。ＥｃｔｏおよびＣｙｔｏは、外部ドメインおよび細胞質ドメインにそれぞれ対応する。数は、ＨＩＶ−１のＨＸＢ２株からのｇｐ４１配列を用いた各領域についての最初のアミノ酸に対応する。４つのシステイン（−ＳＨ）の位置を示す。
【００３３】
図１Ｂに示すような宿主レセプターとのＨＩＶ−１エンベロープの相互作用後、ｇｐ１２０およびｇｐ４１はＨＲ１およびＨＲ２らせんの露出ならびにプレヘアピン中間体の形成を生じる構造変化を受ける。ＨＲ２らせんは折り返し、そして６重らせん束（hexa-helical bundle）（６ＨＢ）を形成するＨＲ１らせん間の溝と相互作用し、ウイルス膜および細胞膜を融合のために極めて接近させる。
【００３４】
ｇｐ１２０サブユニットが解離し、スパイクの基部でＨＲ２らせんを折り返し、ＨＲ１らせんと相互作用させる。このように形成された６重らせん束が、宿主およびウイルス膜をより接近した位置に置き、膜融合およびヌクレオキャプシドの原形質ゾルへの放出を促進する（１８〜２０）。
【００３５】
中間体の構造および機能の理解は、遺伝的に多様なＨＩＶ−１ウイルスに対する広範中和性抗体（ｂｎＡｂｓ）を惹起させる免疫原擬態体を設計するために不可欠である（４、２１、２２）。実際、保存された膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）（これは、ＨＲ２らせんと膜貫通型ドメインとの間にスパイクの基部に存在する（図１Ｂ））は、それらの間で最も充分に特徴づけられている一連のｂｎＡｂｓである２Ｆ５および４Ｅ１０により認識されるエピトープからなる（２３〜２６）。これらのｂｎＡｂｓでの受動免疫は、ＨＩＶ−１感染個体および非ヒト霊長類においてウイルス血を減少した（２７〜２９）。ＭＰＥＲエピトープは、プレヘアピン中間体において十分に露出され（図１Ｂ）、この中間体は、ｇｐ４１外部ドメインの最も拡張された構造であり、免疫原設計の第一の標的としている（３０〜３２）。
【００３６】
６重らせん束中間体（図１Ｂおよび３Ａ参照）（融合活性ｇｐ４１のコア）の結晶構造が決定されているが（３３）、プレヘアピン中間体の構造および機能についてはほとんど知られていない（３１、３４、３５）。図３Ａにおいて、３１２、３１４、３１６はＨＲ１らせんであるが３２２、３２４、３２６はＨＲ２らせんである。側鎖をスティックで示す。可溶性のトリマー状態で完全長ｇｐ４１の任意の形態を生成する試みは、ｇｐ４１の非常に高い疎水性およびその極度の沈降する傾向のためにいまだ成功していない（３６）。特定の切断型または構造制約型のｇｐ４１外部ドメイン（ＨＲ１、ＨＲ２およびＭＰＥＲモチーフを含む）のみが生成されているが、これらは、弱いｂｎＡｂｓを惹起するか、または全く惹起しないかのいずれかである（３１、３６〜３９）。ｇｐ４１分子の他の成分（例えば融合ペプチドおよび細胞質ドメイン）が、ＭＰＥＲおよび他の機能モチーフを正確な構造で呈示する、天然のプレヘアピン中間体を模倣する構造を生成するのに必要であり得る（４０、４１）。しかし、融合ペプチドおよび／または細胞質ドメインを含む可溶性の構造上定義されたｇｐ４１オリゴマーの報告は未だない。
【００３７】
本発明の開示された実施形態は、融合ペプチド、外部ドメイン、および細胞質ドメインを含む完全長の可溶性ｇｐ４１組換え体の設計を報告する。開示された実施形態の設計は、ＨＲ１らせん間の分子間相互作用を保持しつつＨＲ１らせんとＨＲ２らせんとの間の分子内相互作用を弱める変異の導入を含み得る。このような変異は、非特異的相互作用を最小化し、そしてｇｐ４１の可溶性を改善した。緩徐リフォールディングと共にフォルドン（ファージＴ４トリマー化タグ）を付着させることにより、ｇｐ４１タンパク質のトリマーおよび規定のオリゴマーへのフォールディングに至った。これらのｇｐ４１トリマーは、小外部キャプシドタンパク質（Ｓｏｃ）への付着により、バクテリオファージＴ４キャプシドナノ粒子（これもまた、ウイルスキャプシドの擬３倍軸への結合によりトリマーを形成する）上に呈示された（４２）。これらのｇｐ４１組換え体は、２Ｆ５および４Ｅ１０ｍＡｂｓによるＨＩＶ−１ウイルス中和を強く阻害した。これは、おそらく、ウイルス侵入の間に形成されたプレヘアピン構造と競合することによる。これらのアプローチは、プレヘアピン様構造の可溶性の完全長ｇｐ４１トリマーの設計に至った。これは、初めて、ウイルス侵入の機構の解明のため、およびＨＩＶ−１ワクチン、診断薬および治療薬の開発の候補として、用いられ得た。
【実施例】
【００３８】
（実施例１）
（発現ベクターの構築）
全てのｇｐ４１構築物を、野生型ＨＸＢ２  ｇｐ４１  ＤＮＡを鋳型として用いたオーバーラップ伸長ＰＣＲによるスプライシング（splicing-by- overlap extension PCR）（４３）によって生成した。ヌクレオチド配列中に所望の変異を含むプライマーを用いて変異を導入した。ｇｐ４１融合組換え体の構築のために、ｇｐ４１、Ｓｏｃおよびフォルドンに対応するＤＮＡフラグメントを、それぞれのＤＮＡ鋳型、ならびに各フラグメント間にリンカーとして追加のアミノ酸ＳＡＳＡを含むオーバーラッピングプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。次いで、フラグメントを一緒に結合させ（stitched）、そしてこの結合したＤＮＡを独自の制限部位ＸｈｏＩまたはＮｃｏＩを含む末端プライマーを用いて増幅した。最終ＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＮｃｏＩで消化し、そして線状化し脱リン酸化したｐＴｒｉＥｘ−４  Ｎｅｏプラスミドベクターとライゲートした。この組換えＤＮＡを、大腸菌ＸＬ−１０  Ｇｏｌｄコンピテント細胞に形質転換し、そしてミニプレッププラスミドＤＮＡを個々のコロニーから調製した。ＤＮＡインサートの存在を制限消化および／またはインサート特異的プライマーを用いた増幅によって同定した。クローニングしたＤＮＡの正確性をＤＮＡ配列決定により確認した。次いで、タンパク質発現のために、プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＰＬコンピテント細胞に形質転換した。
【００３９】
（実施例２）
（ｇｐ４１組換えタンパク質の発現および可溶性試験）
ｇｐ４１クローンを含むＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＰＬ細胞を、３０℃にて３時間、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。細菌タンパク質抽出試薬Ｂ−ＰＥＲを用いて細胞を溶解し、そして１２，０００ｇにて１０分間、遠心分離した。可溶性の上清画分および不溶性のペレット画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。不溶性の封入体を含むペレットを、異なる変性試薬、ＳＤＳ、尿素、または塩酸グアニジン（ＧｎＨＣｌ）で処理した。１２，０００ｇで１０分間遠心分離後、上清およびペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。
【００４０】
（実施例３）
（組換えタンパク質の精製）
ＩＰＴＧ誘導後の細胞を８，２００ｇで４℃にて１５分間の遠心分離によって採集し、そしてAminco French pressを用いて溶解した。３４，０００ｇで２０分間の遠心分離によって、ｇｐ４１組換えタンパク質を含む封入体を可溶性画分から分離した。１Ｌ培養物からの封入体ペレットを５０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、および２０ｍＭイミダゾール緩衝液（８Ｍ尿素を含有する）中に溶解した。30分後、試料を３４，０００ｇで２０分間、遠心分離して細胞破片を除去した。上清を、同じ緩衝液で予備平衡したHisTrap HPカラムにロードした。結合したタンパク質を同じ緩衝液中の２０〜５００ｍＭの線形イミダゾール勾配を用いて溶出した。緩徐リフォールディング手順を実施し、精製タンパク質のリフォールディングを行った。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液中Superdex 200ゲル濾過クロマトグラフィー（Hiload prep grade）により、タンパク質をさらに精製した。可溶性タンパク質として発現されたgp41組換え体のために、細胞溶解物の上清をHistrapおよびSuperdex 200ゲル濾過カラムによって精製した。精製したタンパク質を−８０℃にて凍結保存した。
【００４１】
（実施例４）
（ｇｐ４１組換え体のリフォールディング）
HisTrapクロマトグラフィー（８Ｍ尿素中）による精製後、徐々に尿素濃度を減少（６Ｍ、４Ｍ、２Ｍ、１Ｍ、０．５Ｍ、または尿素なし）した緩徐透析により、タンパク質をリフォールディングした。透析緩衝液は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｌ−Ａｒｇ、および５ｍＭ  ＤＴＴをさらに含んだ。タンパク質を少なくとも８時間、透析した後、尿素濃度を減少させながら別の緩衝液に変更した。最後の段階で、タンパク質を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液、またはＰＢＳ（ｐＨ７．４）のいずれかに対して、６時間、透析し、緩衝液を２時間ごとに変更した。
【００４２】
（実施例５）
（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）および未変性ＰＡＧＥ）
１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて、ｇｐ４１組換えタンパク質の発現、可溶性、および精製の質を決定した。タンパク質をCoomassie Blue R-250で染色し、未変性PAGE（４〜２０％勾配ゲル）を用いて組換えタンパク質のフォールディングおよびオリゴマー状態を決定した。タンパク質をBio-safe Coomassie Stainで染色した。
【００４３】
（実施例６）
（偽型ウイルス中和競合アッセイ）
ＴＺＭ／ｂｌ細胞を用いて、２Ｆ５ｍＡｂおよび４Ｅ１０ｍＡｂによるＨＩＶ−１中和を決定した。ｍＡｂを、３倍連続希釈（増殖培地（１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１５％ウシ胎児血清を有するＤＭＥＭ）中５０μｇ／ｍｌから開始する）で力価測定した。９６ウェル平底黒プレート上に、種々の希釈度の１２．５μｌのｍＡｂを２Ｆ５中和のために１２０ｎＭおよび４Ｅ１０中和のために２００ｎＭの濃度で１２．５μｌのｇｐ４１組換えタンパク質または他のコントロール競合体と混合した。試料を３７℃にて３０分間インキュベートし、そして、２５μｌの偽型ウイルスＳＦ１６２（約１５０，０００相対蛍光単位（ＲＬＵ）を生ずるのに最適化した希釈度）を添加した。試料をさらに３０分間インキュベートした。ＴＺＭ／ｂｌ細胞（５０μｌ；６０μｇ／ｍｌ  ＤＥＡＥ−デキストランを含有する増殖培地中２×１０５細胞／ｍｌ）を各ウェルに添加した。各プレートは、細胞および偽型ウイルスを有するウェル（ウイルスコントロール）または細胞単独（バックグラウンドコントロール）を有するウェルを含んだ。また、ｇｐ４１と２Ｆ５または４Ｅ１０との最初のインキュベーションを省くことにより、アッセイを実施した。プレートを４８時間インキュベートし、次いで１００μｌ／ウェルの再構成したBrite Lite Plusを添加した。Victor 2ルミノメーターを用いてＲＬＵを測定した。ｍＡｂを含有するウェルからウイルスコントロールを有するウェルまでのＲＬＵ値を比較することにより、ｍＡｂの存在による阻害％を算出した。各ｍＡｂ単独およびｇｐ４１組換えタンパク質または他のコントロール競合体と予め混合したｍＡｂについて、ＩＣ５０を算出した。２つの独立したアッセイを実施し、そして結果を平均した（４４、４５）。
【００４４】
（実施例７）
（ファージＴ４キャプシド上のＳｏｃ−ｇｐ４１トリマーのインビトロディスプレイ）
速度ショ糖勾配遠心分離によってｈｏｃ−ｓｏｃ−ファージを精製した。約２×１０１０ＰＦＵの精製ｈｏｃ−ｓｏｃ−ファージを１．５ｍＬ  ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブ中で１８，０００ｇで４℃にて４５分間遠心分離した。ペレットを１０μ１のＰＢＳ緩衝液中に再懸濁した。精製Ｓｏｃ−ｇｐ４１融合タンパク質を所望の濃度で添加し、そしてこの反応混合物（１００μｌ）を４℃にて４５分間インキュベートした。上述のような遠心分離によりファージを沈降させ、そしてペレットを１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、１０〜２０μ１の同じ緩衝液中に再懸濁した。試料を新たなエッペンドルフチューブに移し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。結合タンパク質および非結合タンパク質の密度体積をレーザーデンシトメトリーにより決定した。呈示されたｇｐ４１のコピー数を、それぞれのレーンにおいて主要キャプシドタンパク質ｇｐ２３＊（９３０コピー／ファージ）（「＊」は、主要キャプシドタンパク質ｇｐ２３の切断型を表す）または尾部鞘タンパク質ｇｐ１８（１３８コピー／ファージ）の既知コピー数に準拠して算出した。データを一部位飽和リガンド結合曲線としてプロットし、そしてSigmaPlot10.0ソフトウエアを用いて非線形回帰によりフィットした。
【００４５】
（結果）
（ｇｐ４１組換え体設計）
ｇｐ４１組換えタンパク質の設計はいくつかの理由から困難であることが証明されてきた。まず、ｇｐ４１（配列番号１）の構造は、天然のエンベロープのトリマー中でｇｐ１２０との相互作用により安定化される（４６）。ｇｐ１２０からの分離は、融合タンパク質であるＨＲ１およびＨＲ２らせんならびにＭＰＥＲのような疎水性の高い領域の曝露につながる（図１Ａ）。ヘテロなタンパク質の発現中のこれらの領域間の非特異的な高い親和性相互作用は、新生ポリペプチド鎖の凝集につながる。第二に、ＨＲ１およびＨＲ２らせん（図３Ａ参照）の一連の相互作用残基（疎水性および荷電性の）は、単独よりもむしろ、ポリペプチド鎖間の組合せの相互作用を好む（３３）。第三に、ｇｐ４１は、４つのシステイン（図１Ａ）を含み、これらは特に凝集状態において非特異的な架橋を形成し得る。凝集状態では密に凝集したポリペプチド鎖は、水を排除する。これらの問題は、本発明に記載されるように、ｉ）変異の導入、ｉｉ）タグの結合、およびｉｉｉ）フォールディング動力学（図１Ｃ）によるｇｐ４１配列と構造の合理的な修飾により対処し得る。
【００４６】
変異−分子内部のＨＲ１−ＨＲ２の相互作用を破壊する変異の導入は、６重らせん束の形成に不利であり、ｇｐ４１をプレヘアピン中間構造に安定化する。そこでは、鎖は分子内ＨＲ１−ＨＲ１相互作用により保持され、ＭＰＥＲエピトープはよりよく曝露され得る（３０、３１）。
【００４７】
タグ−折りたたまれたＴ４ファージのようなトリマー化タグの付着は、核であるｇｐ４１のトリマーへのフォールディングを促進し得る（４７）。Ｔ４キャプシド上にトリマーを形成するＳｏｃ（配列番号２）への融合は、ファージナノ粒子上にｇｐ４１のトリマーを呈示し得る（４２、４８）。
【００４８】
免疫優性（ＩＤ）領域の欠失−本発明の開示された実施形態は、ＨＲ１およびＨＲ２らせんの間の先端ループ部分（図２Ａ、アミノ酸Ｑ５７７−Ｔ６０５）の欠失が、ｇｐ４１組換え体設計にとって重大な影響を及ぼすであろうことを示す：ｉ）この配列は、ＩＤエピトープからなることが報告されている（４９〜５１）。アミノ酸Ｑ５７７〜Ｔ６０５はＳｏｃ−ｇｐ１ΔＩＤ変異体中で欠失され、アミノ酸Ｌ６８４〜Ｖ７０５は両方の組換え体で欠失された。
【００４９】
強いＡｂ応答がこの領域に向けられるが、これらのＡｂはウイルスを中和しない。他方で、相補体媒介機構を通して、それらはＨＩＶ−１感染を促進するかも知れない（５２、５３）。この領域の欠失は、それゆえ、Ａｂ応答を相対的に免疫原性の低いＭＰＥＲエピトープに迂回させることにより、ｇｐ４１の免疫原性を改善し得る（３２）。ｉｉ）この配列は、２つのシステイン残基（Ｃ５９８およびＣ６０４）からなるため、それらの欠失はジスルフィド架橋と不溶化を最少にし得る。ｉｉｉ）ループの４６アミノ酸中２４の欠失は、介在ループのねじれを必要とする６重らせん束よりも３重らせんプレヘアピン構造を好み得る（図１Ｂ）。
【００５０】
開示されたある実施形態によると、２つの全長組換えｇｐ４１タンパク質が構築された。１つはＩＤ配列（Ｓｏｃ−ｇｐ４１、配列番号３）を有し、もう１つはそれを有しない（Ｓｏｃ−ｇｐ４１ΔＩＤ、配列番号４）、ともに融合ペプチド、細胞外ドメインおよび細胞質ドメインを有するが、２２アミノ酸は有さない（膜貫通ドメインは毒性があることがわかった。データ示さず）。構築物は結局Ｔ４ファージ上に呈示されるから（下記参照）、Ｓｏｃとｇｐ４１の間に４アミノ酸の柔軟なリンカー（ＳＡＳＡ）を有するＳｏｃ融合が、これらの実験で使用された。Ｓｏｃ−ｇｐ４１およびＳｏｃ−ｇｐ４１ΔＩＤ組換えタンパク質の両方が、大腸菌中で過剰発現され（全細胞タンパク質中約２０％）（図２Ｂおよび２Ｃ、レーン３）、予想されたように不溶性の封入体に区画された（図２Ｂおよび２Ｃ、レーン４の水溶性画分とレーン５の不溶性画分とを比較のこと）。可能性の上清（Ｓ）と不溶性ペレット（Ｐ）画分が分析された。Ｓｔｄ．は分子量標準である。しかしながら、それらは異なる可溶化挙動を示した（図２Ｄ）。図２Ｄにおいて、不溶性の封入体（ＩＢ）は、様々な変性剤で処理され１２０００ｇで１０分間遠心分離された。上清（Ｓ）とペレット（Ｐ）がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。Ｓｏｃ−ｇｐ４１は８Ｍ尿素または６Ｍ  ＧｎＨＣｌのいずれによっても可溶化できなかった（図２Ｄ、上側のパネル、レーン４および６）のに対し、Ｓｏｃ−ｇｐ４１ΔＩＤは、同じ条件下でほぼ完全に可溶化し（図２Ｄ、下のパネル、レーン４および６）、ＨｉｓＴｒａｐアフィニティクロマトグラフィーでほぼ均一まで精製できた（図２Ｅ）。曲線２１２は、吸光度単位を示し、曲線２１４はイミダゾール勾配を示す。挿入図は、精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）の画像を示す。
【００５１】
さらに、尿素濃度は２Ｍまで減少され得、タンパク質は溶液中に残った。しかしながら、尿素濃度がさらに減少されると沈殿が生じた。他方で、Ｓｏｃ−ｇｐ４１タンパク質は可溶化のために強イオン性界面活性剤であるＳＤＳを必要とした。ＳＤＳとともにでも、部分的な可溶化のみが達成され（図２Ｄ、上側パネル、レーン２）、ＳＤＳは溶解性を維持するために精製を通じて必要であった。
【００５２】
ＨＲ１およびＨＲ２らせん中の変異−ＨＲ１およびＨＲ２らせんの間の一連の相互作用は、トリマーのエンベロープ構造の集合の中心となり、これらの相互作用は、膜融合とウイルスエントリの間動的に変化する（１８、３３、５４）（図１Ｂおよび３Ａ）。これらは、トリマー化につながるＨＲ１らせんの間の分子間相互作用と、ＨＲ２らせんが２つのＨＲ１らせんの間の疎水性の溝の中にループバックすることによる分子内相互作用を含む（図１Ｂおよび３Ａ）（３３）。我々は、分子内相互作用の不安定化は非特異的な凝集を減少させると仮定したが、重要なことは、それは６重らせん束ではなく、３重らせんのプレヘアピン構造を好み得ることである。なぜなら、短くされた先端ループと変異の組合せにより、エネルギー的に好ましくないものとなるからである。
【００５３】
ｇｐ４１の６重らせん束の結晶構造（図３Ａ）（３３）から、変異が起こればＨＲ１−ＨＲ２相互作用は弱まるが、ＨＲ１−ＨＲ１相互作用は弱まらない相互作用が同定された。例えば、Ａｒｇ５５７（３３２）のＧｌｕへの変異は、Ａｒｇ５５７（３３２）とＧｌｕ６４８（３３４）の間の静電引力を静電反発へと変化させ得る（図３Ｂ）。そして、Ｌｅｕ５６８（３４２）へのＧｌｕ導入は、Ｌｅｕ５６８（３４２）とＩｌｅ６３５（３４４）の間の疎水性相互作用を壊し、同時にＧｌｕ６３４（３４６）についての静電反発を作り出し得る（図３Ｃ）。これらの原理を用いて、Ｓｏｃ−ｇｐ４１  ＭＤのバックグラウンドにおいて６つの変異クローンが構築され、それらの溶解性が比較された（図３Ｄ）。図３Ｄにおいて、レーン３および４は、細胞をＢ−ＰＥＲ試薬で溶解し、１２０００ｇで遠心分離した後の可溶性の上清（ｓ）と不溶性ペレット（Ｐ）画分を示す。全ての変異体はｇｐ４１を過剰発現したが、変異５（配列番号５）−Ｒ５５７Ｅ、Ｌ５６５Ｒ、Ｌ５６８Ｅ、Ｉ６３５Ｅ、Ｌ６４５Ｅ−は最良の結果が得られ、タンパク質を可溶性の形で発現した（約４０％が可溶性、レーン３、赤い矢印３５２で印をつけられた）。それゆえ、いくつかの実施形態によれば、この構築物、すなわちＳｏｃ−ｇｐ４１変異体（Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍ、配列番号５）は、さらなる設計のために選ばれた。
【００５４】
Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍタンパク質を細胞溶解物から精製する試みは、しかしながら成功しなかった。なぜならそれはＨｉｓＴｒａｐカラムに結合しなかったからである。これはおそらくタンパク質が誤フォールディングし、ヒスチジンタグが構造中に埋没したためである。他方で、８Ｍ尿素で可溶化したタンパク質は、カラムに効率的に結合し、＞９５％の純度で精製できた（図３Ｅ）。ある実施形態によると、Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍタンパク質は、封入体から８Ｍ尿素変性後ＨｉｓＴｒａｐカラムクロマトグラフィーで精製された。精製されたタンパク質３５２ｎ８Ｍ尿素は、その後、ＰＢＳ緩衝液に対して透析された（「迅速」透析）。Ｓｔｄは分子量標準である。このタンパク質は、ＰＢＳに対する「迅速」透析（８Ｍ尿素からＰＢＳへの１段階遷移）で可溶性のままであったが、得られたタンパク質は、サイズ排除ゲルろ過クロマトグラフィーにより非常に高分子量種としての挙動を示した（図３Ｆ、曲線３６２）。曲線３６２は、迅速透析により復元されたＳｏｃ−ｇｐ４１Ｍタンパク質を示し、曲線３６４は、緩徐リフォールディングにより復元されたタンパク質を示す。また、未変性ＰＡＧＥ（図３Ｇ、レーン１）によりスメアとして泳動し、変異タンパク質は、可溶性であっても、ヘテロの多様な凝集体を形成した（矢印３７２、３７４、３７６、３７８で示す）が明確なオリゴマーではないことを示唆している。精製されたＳｏｃ−ｇｐ４１Ｍタンパク質の未変性ＰＡＧＥ（４〜２０％勾配）は、迅速透析（レーン１）または緩徐リフォールディング（レーン２）により復元した。
【００５５】
緩徐リフォールディング−極端に疎水性のｇｐ４１のフォールディング動力学が、そのプロセスを正しいフォールディングおよびオリゴマー化経路に向けるためにコントロールされなければならないと仮定されてきた。タンパク質濃度、ｐＨ、還元剤、Ｌ−アルギニン、および「緩徐」透析を含む多数の変数が、アッセイとして未変性ＰＡＧＥを用いて、フォールディング動力学をコントロールするために最適化された［Ｌ−アルギニンが、タンパク質の凝集を抑制し、リフォールディングを促進する（５５）］。誤フォールディングされ凝集したタンパク質は、未変性ゲルに入らず、またはスメアとして泳動するだろうのに対し、フォールディングされた種は、はっきりと区別できるバンドを示し得る。
【００５６】
大量の一連の実験からのデータは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０〜９．０、０．２５〜１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度、５ｍＭ  ＤＴＴ、および２００ｍＭ  Ｌ−アルギニンに対する緩徐透析により最良の結果が得られたことを示した。これらの条件下でのリフォールディングしたｇｐ４１のゲルろ過溶出プロファイルは、巨大な凝集物（空隙容積；図３Ｆ、曲線３６２）からオリゴマー（図３Ｆ、曲線３６４）へのシフトを示した。未変性ゲル電気泳動は、ラダー状のバンドの出現により明らかに、ｇｐ４１の一部は明確なオリゴマーに折りたたまれたことが示された（図３Ｇ、レーン２，矢印３７２、３７４、３７６、３７８により示す）。しかしながら、ほとんどのＳｏｃ−ｇｐ４１Ｍは、まだ可溶性の凝集物として残り、ウェルの近くに留まった（図３Ｇ、レーン２参照）。
【００５７】
フォルドンタグを用いたトリマー化−Ｔ４フィブリチンの２７アミノ酸のトリマー化ドメインであるフォルドンは、異種ドメインおよびタンパク質のトリマー化に広く使用されてきた（３１、４７）。我々は、このフォルドン配列をｇｐ４１に付着させることで、フォールディング経路の初期ステップでｇｐ４１のトリマー化の核になるだろうと仮定した。いくつかの実施形態によると、我々は、細胞質ドメインを欠失したＳｏｃ−ｇｐ４１ｅｃｔｏＭ−Ｆｄ（配列番号７）とともにＳｏｃ−ｇｐ４１Ｍ―Ｆｄ（配列番号６）を構築した（図４Ａ）。両方のタンパク質が過剰発現され、精製された。結果は、フォルドンは、予想どおり、劇的にｇｐ４１のフォールディングおよびオリゴマー状態を変化させ、トリマーおよびより高次のオリゴマーを作り、溶解性もまたさらに改良された。可溶性画分（約５００μｇ／Ｌ培養、図４Ｂ、レーン２）、または不溶性画分（約２０ｍｇ／Ｌ培養、図４Ｂ、レーン３）のいずれから精製したＳｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄタンパク質も同様に挙動し、トリマーおよび明確なオリゴマーを生成した（図４Ｃ、レーン１および２）。図４Ｂにおいて、レーン１は、分子量標準；レーン２、細胞溶解物の上清から精製したタンパク質；レーン３、尿素変性および緩徐リフォールディングにより封入体から精製したタンパク質。図４Ｃにおいて、レーン１、上清から精製したＳｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄ；レーン２、封入体から精製したＳｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄ；レーン３、封入体から精製したＳｏｃ−ｇｐ４１ｅｃｔｏＭ−Ｆｄ。トリマーバンドには、矢印４１２、４１４および４１６が付されている。ヘキサマーのバンドには矢印４１８、４２０が付されている。
【００５８】
この種の溶出容量（図４Ｄ）を、ゲルろ過カラムをキャリブレートするために用いた一連の既知の標準タンパク質の溶出容量と比較することにより、ラダーの最も下のバンドはトリマーであることが決定された。ラダーのうち次に高いオリゴマーバンドは、ヘキサマーであると決定された。実際に、ほとんど凝集体を生成したＳｏｃ−ｇｐ４１Ｍと異なり、フォルドンを接着させたＳｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−ＦｄおよびＳｏｃ−ｇｐ４１ｅｃｔｏＭ−Ｆｄタンパク質は本質的に全て、トリマーおよびオリゴマーとして回収された（図４Ｃ、レーン１〜３）。ｇｐ４１のトリマーおよびオリゴマーはサイズ排除カラム上で分離できた（図４Ｄおよび４Ｅ）。図４Ｄおよび４Ｅにおいて、画分の溶出容積と推定分子量はレーンの上部にラベルされている。トリマーおよびヘキサマーの位置は、矢印で示されている。
【００５９】
実際、ほとんどトリマーを含む画分は、この方法で精製できた。オリゴマーの分布は、しかしながら、トリマー画分の第二ラウンドのゲルろ過により変化しなかった。このことは、ｇｐ４１サブユニットの相互作用が高親和性であり、動的平衡にないことを示唆する。開示された実施形態から、基本的なｇｐ４１オリゴマー単位はトリマーであることが推定される。ヘキサマー（およびより高次のオリゴマー）はほとんど、ｇｐ４１のトリマー間の（非特異的）相互作用により形成されたトリマーの２量体（または多量体）であると思われる。Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−ＦｄおよびＳｏｃ−ｇｐ４１ｅｃｔｏＭ−Ｆｄは、類似のオリゴマー化パターンを示した（図４Ｄおよび４Ｅ）が、外部ドメイン構築物のそれよりも、全長のｇｐ４１のより大きな画分がトリマーにオリゴマー化することを見出した（図４Ｃ、レーン２（Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄ）および３（Ｓｏｃ−ｇｐ４１ｅｃｔｏＭ−Ｆｄ）を比較のこと；図４Ｄ（Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄ）および４Ｅ（Ｓｏｃ−ｇｐ４１ｅｃｔｏＭ−Ｆｄ）を比較のこと）。これは、おそらくトリマー−トリマー相互作用を制限することにより、巨大な細胞質ドメインがトリマーを安定化したことを示唆している。
【００６０】
ｇｐ４１トリマーはプレヘアピン構造を持つ−上に記載された理由により、ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄ変異体は、プレヘアピン構造において安定化されると予想される。もしそうなら、外的に付加されたＨＲ２ペプチドは、分子間相互作用を通して、ＨＲ１らせんの間の曝露された溝に結合しているはずである（１６、３３）。この仮説をテストするために、３４アミノ酸のＨＲ２ペプチド（Ｃ３４、４ｋＤａ）が、Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄに付加され、未結合のペプチドは、１０ｋＤａ除外膜を用いて大規模透析することにより除去された。ｇｐ４１のトリマーは、プレヘアピン状態にあれば、Ｃ３４ペプチドを捕獲し、ｇｐ４１−Ｃ３４複合体を形成するだろう。結果はＣ３４ペプチドがｇｐ４１に保持されたことを証明した（図５Ａ、レーン１）。Ｃ３４ペプチドは、Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄに、ｇｐ４１分子に対し２または２０倍のＣ３４モル比で添加され、リフォールディングされた。未結合のペプチドは、１０ｋＤａ除外膜を用いて大規模透析することにより除去された。レーン３、サイズ標準として用いた０．４μｇのＣ３４ペプチド。
【００６１】
実際、複合体内のＣ３４に対するｇｐ４１の割合は、用いたＣ３４のモル量がｇｐ４１の２倍（図５Ａ、レーン１）であろうと、またはｇｐ４１の２０倍（図５Ａ、レーン２）であろうと、同じに留まった。他方、３６アミノ酸のＨＲ１（Ｎ３６）ペプチドの付加は、おそらくコントロールできないＨＲ１−ＨＲ１相互作用のためにｇｐ４１の沈殿を起こした。第二に、ｇｐ４１のフォールディングパターンは、Ｃ３４により影響を受けなかった（図５Ｂ、Ｃ３４の無いレーン１とＣ３４を有するレーン２を比較のこと）。このことは、Ｃ３４結合がある場合も無い場合もｇｐ４１の構造が同じであったことを意味する。プレヘアピン構造中でのみＣ３４がＨＲ１に結合することが期待されるから、Ｃ３４が無い場合でも同じ構造にフォールディングされた推論され得る。試料は、過剰なｇｐ４１は、Ｃ３４を透析により除去するに先立って電気泳動された。レーン３、サイズ標準として用いた３μｇのＣ３４ペプチド。
【００６２】
中和ＭＰＥＲエピトープは、ｇｐ４１のトリマーによく曝露されている−ｂｎＡｂｓ  ２Ｆ５および４Ｅ１０は、ｇｐ４１の保存されたＭＰＥＲエピトープに結合し、ＨＩＶ−１の進入を阻止し、これが、おそらく、このエピトープがよく曝露されているプレヘアピン段階で、融合を阻止することによる（３１、３４、３５）（図１Ｂ参照）。この仮説と一致して、これらのｍＡｂｓは、６重らせんのヘアピン束に対してではなく、プレヘアピンのｇｐ４１中間体にもっとも高い親和性を持つ（３０、５６）。もし、トリマーのＳｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−ＦｄとＳｏｃ−ｇｐ４１ｅｃｔｏＭ−Ｆｄがプレヘアピン構造を持てば、それらは２Ｆ５と４Ｅ１０ｍＡｂに高い親和性で結合し、ＨＩＶ−１感染を中和するそれらの能力を阻害するはずである。この仮説を試験するために、Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−ＦｄおよびＳｏｃ−ｇｐ４１ｅｃｔｏＭ−Ｆｄが、ＴＺＭ／ｂｌ偽型ウイルス中和反応混合物に、ｇｐ４１対ｍＡｂの様々なモル比で添加され、５０％のウイルスの中和が阻害されるＡｂｓの量（ＩＣ５０）が決定された。データは、両方の構築物が協力にウイルス中和を阻害したことを証明した（図６Ａおよび６Ｂ）。１２０ｎＭ程度の低いｇｐ４１の濃度が、２Ｆ５と４Ｅ１０の結合のためにウイルスと競合するために十分であった。それは、７〜１０倍ＩＣ５０値を上昇させる（図６Ａおよび６Ｂ）。ｍＡｂに対するｇｐ４１のモル比１：１において、４５〜７６％ウイルス中和の阻害が観察された。全長のｇｐ４１は、外部ドメイン構築物よりも少し高い阻害を示した。ｇｐ４１がｍＡｂとプレインキュベーションされようが、中和混合物に直接添加されようが顕著な違いは観察されなかった。これらの結果を実証すると、スクランブルしたＭＰＥＲペプチドでなく、２３アミノ酸のＭＰＥＲ直鎖状ペプチドが２Ｆ５中和を阻害した（図６Ａおよび６Ｂ）。また、ＭＰＥＲペプチドは、４Ｅ１０中和に影響を与えなかった。これは、４Ｅ１０ｍＡｂは構造エピトープを認識する事実と一致する。ｇｐ４１細胞質ドメイン（Ｓｏｃ−ｃｙｔｏ）もＳｏｃコントロールも顕著な阻害を示さず、ｇｐ４１−２Ｆ５／４Ｅ１０相互作用の特異性が証明された。これらの結果は、さらに、トリマーのｇｐ４１Ｍ−Ｆｄ構築物が、機能的に関連する構造でＭＰＥＲ中和エピトープを曝露するプレヘアピン構造で安定化されることを支持する。
【００６３】
図６Ａおよび６Ｂにおいて、精製された２Ｆ５（図６Ａ）または４Ｅ１０（図６Ｂ）ＩｇＧの段階希釈物が９６ウェルプレートに添加された。ｇｐ４１のトリマーまたは他のコントロール競合物がｍＡｂに添加され、３７℃で３０分間インキュベートされた。ＳＦ１６２ウイルスがこのプレートに添加され、３７℃で３０分間インキュベートされ、続いてＴＺＭ／ｂｌ細胞が添加された。３７℃で４８時間インキュベートした後、細胞は溶解され、最大阻害の半分の阻害濃度（ＩＣ５０）が、発光測定により決定されたルシフェラーゼ活性から算出された。ＭＰＥＲペプチドの配列は、ＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＮＩＴＮＷＬＷＹＩＫ（アミド）およびＭＰＥＲスクランブルペプチドの配列は、ＬＳＩＮＥＡＦＫＷＬＤＷＷＴＬＮＤＬＷＹＩＷＫ（アミド）である。Ｓｏｃ−ｃｙｔｏは、ｇｐ４１の細胞質ドメインのＳｏｃのＣ末端への融合である。このタンパク質は過剰発現され、大腸菌から８Ｍ尿素変性に続くリフォールディングにより精製された。
【００６４】
バクテリオファージＴ４ナノ粒子上でのｇｐ４１のトリマーの呈示−８７０コピーの小さな外部キャプシドタンパク質、Ｓｏｃ（９ｋＤ）がＴ４キャプシドの表面に散りばめられる。Ｓｏｃは溶液中でモノマーであるが、疑似３倍軸でキャプシドに結合するとトリマー化する（図７Ａ）（４２）。各々のＳｏｃ分子が２つのｇｐ２３＊主要キャプシドタンパク質サブユニットに結合し、隣接するカプソメアを固定し、キャプシド構造を強化する。ＣおよびＮ末端の両方がキャプシド表面に露出され、Ｃ末端が疑似３倍軸にＮ末端が疑似２倍軸にある（図７Ａ）。開示された実施態様では、ｇｐ４１をＳｏｃのＣ末端に融合させ、Ｔ４上にそれを呈示させることにより、トリマーのｇｐ４１は、ファージキャプシドの３倍軸で安定に呈示されるだろうと仮定した。ｇｐ４１のトリマーの整列を持つそのような粒子は、免疫原性を高めるとともに、構造−活性研究を可能にする（６４）。ｇｐ４１のトリマーは、未変性のＳｏｃとほぼ同程度の効率でｈｏｃ−ｓｏｃ−キャプシド上で集合した（図７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｅおよび７Ｆ）。Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄ結合は、Ｓｏｃ−ｇｐ４１分子のキャプシド結合部位への増加する比率とともに増加し、約２０：１の割合で飽和に達した（図７Ｂ）。図７Ｂにおいて、約２×１０１０ｈｏｃ−ｓｏｃ−ファージ粒子が、Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄ分子のキャプシド結合部位への増加する割合（１：１〜４０：１、上部にラベルされた）でインキュベートされ、集合が行われた。レーン１は、コントロールのｈｏｃ−ｓｏｃ−ファージ；２、４、６、８、１０および１２は、結合した融合タンパクＳｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄ（Ｂ）を呈示するファージ；３、５、７、９、１１および１３は、上清中の非結合タンパク質（Ｕ）である。主要なキャプシドタンパク質ｇｐ２３＊の位置は矢印７１２でマークされている。
【００６５】
図７Ｃにおいて、結合したＳｏｃ−ｇｐ４１ｅｃｔｏＭ−Ｆｄタンパク質は、赤い矢印７１４で示された（レーン２）。図７Ｄにおいて、４９ｋＤａのＣＰＰ−Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍ―Ｆｄタンパク質は、４８．７ｋＤａのｇｐ２３＊と同じ位置に移動する（赤い矢印７１６で示された）。
【００６６】
飽和結合曲線（図７Ｅ）から算出されたみかけの結合定数（Ｋｄ）は、１２１ｎＭで、結合したｇｐ４１の最大コピー数（Ｂｍａｘ）はキャプシドあたり約８５９であった。これは、全てのＳｏｃ結合部位が塞がった時のコピー数８７０に近い。同様の結合挙動ならびにＫｄとＢｍａｘの値が、Ｓｏｃ−ｇｐ４１ｅｃｔｏＭ−Ｆｄについても観察された（図７Ｃおよび７Ｆ）。図７Ｅにおいて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）からレーザ密度測定により、結合および非結合タンパク質の密度容積が決定され、それぞれのレーンに存在するｇｐ２３＊の密度容積に対して正規化された。ｇｐ２３＊（キャプシド当たり９３０コピー）を参照してコピー数が決定された。このデータは、１部位の飽和リガンド結合曲線としてプロットされ、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ１０．０ソフトウエアを使用し、非線形回帰により適合された。算出した結合パラメーターを示す。Ｋｄ、みかけの結合定数；Ｂｍａｘ、ファージ粒子当たりの最大コピー数。ＳｏｃおよびＳｏｃ−ｇｐ４１融合組換え体の結合パラメーターを、図７Ｆに示す。ＣＰＰ−Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄのバンドは、ｇｐ２３＊バンドと重なるため、ｇｐ２３＊の濃度は差し引かれ、コピー数は尾の鞘タンパク質、ｇｐ１８を参照して決定された（ファージ当たり１３８コピー；図７Ｄ、レーン２の矢印７１６で示す）。
【００６７】
ある開示された実施形態によると、ｇｐ４１ナノ粒子設計をさらに改良するためには、１３アミノ酸の細胞浸透ペプチド（ＣＰＰ（配列番号８）、ＣＰＰ−Ｔａｔ（ＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＰＰＱ）がＳｏｃ−ｇｐ４１のＮ末端に付着された。ＣＰＰは、付着した積み荷分子が細胞膜を超えて通過するのを容易にする塩基アミノ酸が豊富な１０〜３０アミノ酸のペプチドである（５７）。ＨＩＶ−１のトランス活性化因子タンパク質、ＴＡＴ由来のＣＰＰ−Ｔａｔは最も効率的なＣＰＰの１つである（５７）。ＣＰＰ−Ｓｏｃ−ｇｐ４１Ｍ−Ｆｄ（配列番号９）は、過剰発現され、精製され、Ｔ４キャプシドに効率的に結合され得、結合パラメーターもまた同様である（図７Ｄおよび７Ｆ）。それゆえ、ＣＰＰまたはＣＤ４０リガンド（５８）のような別の分子は、疑似２倍軸で、樹状細胞のような抗原提示細胞にナノ粒子をターゲティングするために指向され得る。１つの最近の実験は、Ｓｏｃに付着した標的分子を表示するＴ４粒子が高い効率で細胞に取り込まれることを示している（未発表結果）。
【００６８】
ＨＩＶ−１と宿主細胞間の鍵となる相互作用は十分に確立したが、ウイルスエンベロープの異常な遺伝的多様性および糖化により必須のエピトープをマスクすることが、防御的免疫反応を誘導できる組換え体を設計することを困難にした（５９、６０）。しかしながら、ＨＩＶ−１ウイルスは、多くのタイプ−１融合ウイルスのように、侵入の間、動的遷移を受け、いくつかの脆弱部位を細胞表面に曝露し、それらを治療薬および中和Ａｂｓにアクセス可能にする。プレヘアピン中間体は、数分のオーダーで半減期が比較的安定（１９）であるから、１つのそのような標的であり、その外部ドメインは最も広げられ、保存された中和エピトープは最も露出されている（図１Ｂ）（３０、３１、５９、６０）。実際、エンフビルチド、臨床用に承認された強力な２０アミノ酸の侵入阻害剤（６１）であるが、と２Ｆ５と４Ｅ１０のような一連のｂｎＡｂｓは、この中間体に結合することでウイルスの侵入を止める。プレヘアピン構造で安定化されたｇｐ４１組換え体の設計は、それゆえ、効果的な治療薬およびワクチンの開発とともに、メカニズムを理解するために重要な意味を持つだろう。
【００６９】
極端に疎水性のｇｐ４１は、悪名高く凝集しやすく、可溶性のｇｐ４１を生産する試みは成功していない（３６）。以前の研究は、ほとんどがＨＲ１らせんおよびＨＲ２らせんのみを含む、ｇｐ４１の外部ドメインの短い不完全な部分を生産できたのみであった（３１、３８、３９、６２）。これらおよびその他の合成ペプチド模倣体は強力なｂｎＡｂｓを導き出せず、他のｇｐ４１の構造および機能的モチーフが真のプレヘアピン構造を模倣するために必須であろうという仮説が導かれた（図１Ｂ参照）（４０、４１）。これらは、ＨＲ１／ＨＲ２らせんおよびＭＰＥＲに加えて、Ｎ末端での融合タンパクとＣ末端での細胞質ドメインを含むかも知れないが、これまで生産されたｇｐ４１の組換え体はいずれも、これらの高い疎水性領域を含まない。
【００７０】
開示された実施態様では、３つの鍵となる問題が、プレヘアピン構造で安定化された可溶性のトリマーｇｐ４１を生成するために取り組まれるべきであることを仮説とした（図１Ｃ）。第一に、非特異的な凝集とともに６重らせん束の形成につながるＨＲ１およびＨＲ２らせん間の分子間相互作用を、３重鎖コイルで分子を安定化するために壊すべきである。我々は、ＭＰＥＲエピトープ残基を完全に残しながら、相補的な電荷−電荷および疎水的相互作用のいくらかを静電反発に変換させるとともに、先端ループの一部とＨＲ１らせんの５つのＣ末端アミノ酸を欠失させることによりこれを達成した。これらの修飾は、ｇｐ４１の可溶性を非常に向上させたが、タンパク質の小さな画分のみがトリマーにオリゴマー化した（図８）。トリマー化する強い傾向があるフォルドンタグの付着は、ｇｐ４１をトリマー化するために必要だった。おそらく、フォルドンは、ｇｐ４１フォールディングの核となり、トリマーに集合するのを助けた。タグはＣ末端に存在するため、トリマー化はおそらくこの末端から始まり、分子の残りを通して伝搬し、強いＨＲ１−ＨＲ１相互作用を通じてタンパク質の３本鎖コイルドコイルへのフォールディングにつながった。比較的低タンパク質濃度では、この過程は反応速度論的に遅くなることもまた必要である。でなければ、非特異的な鎖間の相互作用が、おそらくタンパク質をフォールディング経路の途中で止め、急速で制御不能な凝集につながる。
【００７１】
開示された実施態様は、予想される結果を生じた（図８）。各々のアプローチはそれ自体ｇｐ４１のトリマーを生成するには不十分だった。例えば、変異の導入は、水溶性を大きく改善したが、フォールディングはトリマーに誘導するものではないので、タンパク質鎖は、なお、凝集体に合体した。トリマー化タグの付着と緩徐リフォールディングの両方がこの問題を正すのに必要であった。ヘキサマーおよびより高次のオリゴマーが、トリマーに加えて生産されたが、全てのオリゴマーの核構造はトリマーに見える。より高次のオリゴマーは、おそらくトリマー間の非特異的相互作用により生じたトリマーのマルチマーである。いくつかの疎水性パッチがｇｐ４１外部ドメイン中に曝露されているので、このことは予想しなかった。ｇｐ４１外部ドメインは、そうでなければ天然のスパイク中でｇｐ１２０ドメインとの相互作用により安定化されただろう。これらは、トリマーの多量体化につながるだろう。これは、異種発現系により生産されたｇｐ１４０のトリマーについてさえ共通に観察される現象で、そこでは、ｇｐ４１外部ドメインの短い領域のみが曝露される。
【００７２】
証拠は、ｇｐ４１のトリマーがプレヘアピン中間体を模倣する構造を有することを示す。そこでは３本鎖のＨＲ１らせんの外部の溝はＨＲ２らせんによって塞がれてはいない。この予測と一致して、３４アミノ酸のＨＲ２ペプチドは、効率的にｇｐ４１のトリマーと結合し、多量体化パターンはペプチドとともに、あるいは、ペプチドがなくても一致した。もしトリマーが６重らせん束構造にあると、そのＨＲ２ペプチドはｇｐ４１に結合せず、オリゴマー化パターンは異なっていただろう（１６、３３）。ｇｐ４１のトリマーのプレヘアピン中間体構造は、ウイルス中和アッセイによりさらに支持された。ｇｐ４１のトリマーは、ｇｐ４１対ｍＡｂの同じモル比においてさえ、強力に２Ｆ５または４Ｅ１０ウイルスの中和を阻害し、過剰のウイルスの存在下では、プレヘアピン中間体に曝露されたＭＰＥＲエピトープが２Ｆ５および４Ｅ１０に最も高い親和性で結合する以前の証拠と一致した（３０、３１）。
【００７３】
免疫原としてのｇｐ４１のトリマーの潜在的な使用は、強い免疫応答を引き起こし得る堅牢なプラットフォームに組換え体を結びつけることによりさらに増進され得る。バクテリオファージＴ４呈示は、Ｓｏｃを抗原の一端に付着させることにより、可溶性の抗原をナノ粒子の抗原に変換する簡単だが強力な戦略を提供する（６３、６４）。我々は以前、ＨＩＶ−１Ｇａｇ  ｐ２４および他の抗原を呈示するそのようなナノ粒子が、細胞応答とともに強いＡｂを誘導することを示した（６４、６５）。ＳｏｃとＮ末端に付着させることは、ｇｐ４１のフォールディングまたはトリマー化を妨害せず、Ｔ４キャプシドへの結合にも影響を与えなかった。実際、Ｓｏｃ−結合部位は、基本的に飽和しており、Ｔ４ファージを約２９０のｇｐ４１のトリマーで装飾する結果となった。ＳｏｃのＣ末端は疑似３倍軸に外側に突き出るため（図７Ａ）（４２）、Ｃ末端に付着したｇｐ４１のトリマーはキャプシド表面から離れて延びるだろう（図８）。それにより、ＭＰＥＲエピトープは抗原提示細胞により捕獲されるために曝露される。さらに、ＣＰＰのような追加の標的とするリガンドが取り込まれ得、強力にこれらのｇｐ４１が整列された高密度ナノ粒子の広い応用を促進し得る。
【００７４】
結論として、分子遺伝学と生化学的なアプローチを用いて、一連の仮説がテストされ（図８）、ファージナノ粒子上に整列された同じもののみならず、融合ペプチド、外部ドメインおよび細胞質ドメインを含む可溶性の全長ｇｐ４１のトリマーの生成につながった。トリマーは、プレヘアピン構造で安定化され、そこではＨＲ１らせんの溝およびＭＰＥＲエピトープがよく曝露されるだろう。
【００７５】
これらは、初めて、この重要な中間体の構造決定、新規な治療薬のスクリーニング、新診断薬の開発、およびｇｐ４１を基礎とするＨＩＶ−１ワクチンの設計を可能にする。最近のＲＶ１４４の試みは、ＨＩＶ−１感染に対する防御とｇｐ１２０可変ループＶ２に対するＡｂｓ生成の間の関係を示した（６、６６）。我々の研究により生成された全長ｇｐ４１抗原は、細胞応答のみならず結合し中和するＡｂｓを誘導するように、ワクチンの免疫原性をさらに改良するために、ｇｐ１２０と併用して使われ得る。以上を踏まえ、我々は、効果的なＨＩＶ−１ワクチンとしてのこれらの潜在性をテストするためにｇｐ１４０のトリマーとＶ１／Ｖ２ループのような他のＨＩＶ−１エンベロープ免疫原を調製する同様のアプローチを使用している。
【００７６】
本発明をある特定の実施形態を参照して記載したが、添付の請求項において定められる本発明の領域および範囲から逸脱することなく、記載された実施形態に対して多くの改変、修正および変更をなすことができる。したがって、本発明は、記載された実施形態に限定されるものではなく、以下の請求項の文言によって定められる全範囲およびその等価物を含むものである。
【００７７】
（参考文献）
以下の参考文献は、上記で参照され、および／または本発明とともに用いられ得る技術を記載し、そして以下の参考文献の内容および開示は、参照により本明細書に援用される。
【００７８】
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【図１Ａ】
2015535534.tif 000002
【図１Ｂ】
2015535534.tif 000003
【図１Ｃ】
2015535534.tif 000004
【図２Ａ】
2015535534.tif 000005
【図２Ｂ】
2015535534.tif 000006
【図２Ｃ】
2015535534.tif 000007
【図２Ｄ】
2015535534.tif 000008
【図２Ｅ】
2015535534.tif 000009
【図３Ａ】
2015535534.tif 000010
【図３Ｂ】
2015535534.tif 000011
【図３Ｃ】
2015535534.tif 000012
【図３Ｄ】
2015535534.tif 000013
【図３Ｅ】
2015535534.tif 000014
【図３Ｆ】
2015535534.tif 000015
【図３Ｇ】
2015535534.tif 000016
【図４Ａ】
2015535534.tif 000017
【図４Ｂ】
2015535534.tif 000018
【図４Ｃ】
2015535534.tif 000019
【図４Ｄ】
2015535534.tif 000020
【図４Ｅ】
2015535534.tif 000021
【図５Ａ】
2015535534.tif 000022
【図５Ｂ】
2015535534.tif 000023
【図６Ａ】
2015535534.tif 000024
【図６Ｂ】
2015535534.tif 000025
【図７Ａ】
2015535534.tif 000026
【図７Ｂ】
2015535534.tif 000027
【図７Ｃ】
2015535534.tif 000028
【図７Ｄ】
2015535534.tif 000029
【図７Ｅ】
2015535534.tif 000030
【図７Ｆ】
2015535534.tif 000031
【図８】
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