(57)【要約】  本開示は、新形成性異常を有する対象動物への投与に有用な試薬（細胞を含む）及び関連する方法を提供する。該試薬及び方法は純度が高められた癌幹細胞を包含する。新形成性異常は、メラノーマ、卵巣癌、結腸直腸癌、乳癌及び肺癌を包含する。
2015526087.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトメラノーマ腫瘍を起源とする細胞の単離された集団であって、（i）該集団の細胞の少なくとも30％がCD146を発現し、かつ該集団の細胞の少なくとも30％がCD271を発現するか、又は（ii）該細胞の少なくとも30％がCD146及びCD271を共発現し、ここで該パーセント値（％）が該集団における平均値と定義される、前記単離細胞集団。
【請求項２】
該発現が少なくとも35％であり、さらに共発現が少なくとも35％である、請求項1に記載の単離細胞集団。
【請求項３】
該発現が少なくとも40％であり、さらに共発現が少なくとも40％である、請求項1に記載の単離細胞集団。
【請求項４】
該発現が少なくとも45％であり、さらに共発現が少なくとも45％である、請求項1に記載の単離細胞集団。
【請求項５】
該発現が少なくとも50％であり、さらに共発現が少なくとも50％である、請求項1に記載の単離細胞集団。
【請求項６】
該細胞の5％未満が夾雑細胞である、請求項1に記載の単離細胞集団。
【請求項７】
該細胞の2％未満が夾雑細胞である、請求項1に記載の単離細胞集団。
【請求項８】
自己由来樹状細胞を含むワクチンであって、該樹状細胞に請求項1に記載の単離細胞集団がロードされ、該樹状細胞及び該ヒト腫瘍が同一のヒト対象動物に由来する、前記ワクチン。
【請求項９】
自己由来樹状細胞を含むワクチンであって、該樹状細胞に請求項5に記載の単離細胞集団の少なくとも1つがロードされ、該樹状細胞及び該ヒト腫瘍が同一のヒト対象動物に由来する、前記ワクチン。
【請求項１０】
該細胞集団が、該樹状細胞へのロード前に細胞分裂を妨げる照射損傷を含むか、又は細胞分裂を妨げる核酸架橋剤を含む、請求項8に記載のワクチン。
【請求項１１】
ヒトメラノーマ腫瘍を起源とする細胞の単離された集団であって、該集団の細胞の少なくとも30％がCD146を発現し、かつ該細胞の少なくとも30％がCD271を発現するか、又は該細胞の少なくとも30％がCD146及びCD271を共発現し、ここで該細胞が、
工程i．メラノーマ腫瘍サンプルの細胞を分散させる工程、
工程ii．低接着性表面又は超低接着性表面上での培養、
工程iii．微小球体収集のための沈降工程、及び
工程iv．微小球体から細胞を解離させる工程
を含む方法によって調製される、前記単離細胞集団。
【請求項１２】
該方法がさらに、細胞を増加させて増加細胞集団を作製するために接着性表面上で培養培地で培養する工程（工程v．）を含む、請求項11に記載の細胞。
【請求項１３】
該単離細胞集団が、工程iの細胞で検出され得る発現と比較して、（i）ダウンレギュレートされた免疫抑制分子、（ii）アップレギュレートされたMHC-II、又は（iii）ダウンレギュレートされた免疫抑制分子及びアップレギュレートされたMHC-IIの少なくとも1つを有する、請求項11に記載の細胞。
【請求項１４】
該単離細胞集団が、工程iの細胞で検出され得る発現と比較して、（i）ダウンレギュレートされた免疫抑制分子、（ii）アップレギュレートされたMHC-II、又は（iii）ダウンレギュレートされた免疫抑制分子及びアップレギュレートされたMHC-IIの少なくとも1つを有する、請求項12に記載の細胞。
【請求項１５】
該免疫抑制分子が、インドールアミン-ピロール-2,3-ジオキシゲナーゼ、腫瘍増殖因子-ベータ及びインターロイキン-10（IL-10）の少なくとも1つであり、該ダウンレギュレーションが、工程iで検出され得る発現（100％と定義する）と比較して80％以下のレベルである、請求項12に記載の細胞。
【請求項１６】
メラノーマ腫瘍サンプル及び微小球体の一方又は両方から細胞を分散させる工程が添加プロテアーゼによる処理を含む、請求項11に記載の細胞。
【請求項１７】
低接着性表面又は超低接着性表面上での培養が塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）の存在下で実施される、請求項11に記載の細胞。
【請求項１８】
細胞を増加させるための接着性表面上での培養工程がbFGFを含む培養培地で実施される、請求項12に記載の細胞。
【請求項１９】
低接着性表面又は超低接着性表面上で培養する工程が形成されてある一切の腫瘍幹細胞球体を収集する工程を含み、該収集工程が2−3日毎に実施され、該収集球体の培養工程が低接着性表面上で新鮮な培地で再開される、請求項11に記載の細胞。
【請求項２０】
該接着性表面上での培養工程の合計時間が12−30日、14−28日、又は18−24日の時間枠から選択される、請求項12に記載の細胞。
【請求項２１】
請求項11に記載の単離細胞集団をロードされた自己由来樹状細胞を含むワクチンであって、該樹状細胞及び該ヒト腫瘍が同一のヒト対象動物に由来する、前記ワクチン。
【請求項２２】
請求項12に記載の単離細胞集団をロードされた自己由来樹状細胞を含むワクチンであって、該樹状細胞及び該ヒト腫瘍が同一のヒト対象動物に由来する、前記ワクチン。
【請求項２３】
該腫瘍細胞の分裂が、該樹状細胞へのロード前に、腫瘍細胞を照射することによって又は核酸架橋剤を該腫瘍細胞に添加することによって妨げられる、請求項21に記載のワクチン。
【請求項２４】
1つ以上のメラノーマ特異抗原に対して抗原特異的免疫応答を刺激する方法であって、該方法が、請求項11に記載の単離細胞集団をロードされる自己由来樹状細胞を含むワクチンを、生存メラノーマ細胞を含むヒト対象動物に投与する工程を含み、該樹状細胞及び該ヒト腫瘍が同一のヒト対象動物に由来する、前記方法。
【請求項２５】
該メラノーマ特異抗原がMAGE抗原である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
以下の工程を含む精製癌幹細胞を作製する方法：
（a）腫瘍サンプルの細胞を解離させることによって以前に入手してあった細胞浮遊物をニューロン幹細胞培地に浸漬し、さらに低接着性又は超低接着性容器で培養する工程、（b）癌幹細胞球体を形成させる工程、（c）沈降によって癌幹細胞球体を回収して回収球体を生じる工程、（d）該回収球体を再培養する工程、（e）前記再培養工程中に該回収球体を互いに結合させる工程、（f）該結合球体をバラバラにして単一細胞の浮遊物を得る工程。
【請求項２７】
細胞浮遊物を作製するために腫瘍サンプルを解離させる工程の前に腫瘍サンプルを入手する工程をさらに含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
増殖する接着性細胞培養を樹立し該細胞を増殖させる工程をさらに含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
工程（ii）の培養が低接着性表面上で実施されない、請求項11に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ii）の培養が超低接着性表面上で実施される、請求項11に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、米国仮特許出願61/718,643（2012年10月25日出願：発明の名称「高純度癌幹細胞及び高純度癌幹細胞集団の迅速な作製」（“Rapid Production of High Purity Cancer Stem Cells and Population of High Purity Cancer Stem Cells”、前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）及び米国仮特許出願61/683,477（2012年8月15日出願：発明の名称「高純度癌幹細胞及び高純度癌幹細胞集団作製の迅速な方法」（“Rapid Method to Produce High Purity Cancer Stem Cells and Population of High Purity Cancer Stem Cells”、前記文献もまた参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）の優先権を主張する。
本開示は、癌幹細胞、細胞精製の方法及び試薬、免疫応答の刺激方法、及び対象動物への投与方法に関する。本組成物及び関連の方法は、新形成性異常に特徴的な抗原に対する又は該抗原を発現する細胞に対する免疫応答を刺激することができる。本開示の新形成性異常にはメラノーマ、肝癌、胃癌及び卵巣癌が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
固形腫瘍では、小さなパーセンテージの細胞が、親腫瘍と同じ組織学的不均質性をもつ腫瘍を開始する能力を有する。これらの細胞は“癌幹細胞”と称される。これらはまた、腫瘍開始細胞又は癌開始細胞としても知られている。癌幹細胞は一群の特性によって定義できる。第一に、それらは自分自身を再生する能力を有する。第二に、それらは移植されたとき新規な腫瘍を樹立できる。第三に、それらは休眠状態又は緩徐な周期（細胞周期）の腫瘍細胞と特徴付けることができる。第四に、それらは化学療法又は放射線療法に対する腫瘍の耐性に必要であり得る。第五に、それらは、再生し、より分化した子孫細胞を生じるそれらの能力を維持するミクロ環境に依存する（該環境は癌幹細胞の未分化状態を維持する）。このミクロ環境は、間葉系幹細胞、組織結合線維芽細胞及び内皮細胞を含むことができる。結腸癌幹細胞の事例では、例えばこのミクロ環境は腫瘍結合筋線維芽細胞の存在を含む（Schmidt et al (2011) Oncotarget. 2:313-320；Borovski et al (2011) Cancer Res. 71:634-639；Korkaya et al (2011) J. Clin. Inv. 121:3804-3809）。in vitro培養により球体を形成する能力は、個々の細胞を癌幹細胞と同定するために役立ち得るさらに別の特徴である（Perego et al (2011) J. Inv. Dermatol. 11:546-547）。癌幹細胞の非制限的な一定義は、親腫瘍の完全な不均質性を再現し、かつ何度も継代した後でさえ持続的に増殖できる細胞である（Civenni et al (2011) Cancer Res. 71:3098-3109）。
【０００３】
癌幹細胞は免疫応答を阻害することが示された（該阻害メカニズムは、T調節性細胞（Treg）の誘発、T細胞活性化及び増殖の障害を含んでいた（Wei et al (2010) Clin. Cancer Res. 16:461-473））。
癌幹細胞は、持続的に自己を再生するそれらの能力によって腫瘍塊を樹立及び維持する。その他に、腫瘍幹細胞はまた上皮間葉移行状態と称されるものに遊走する。これらの自己再生の特色及び遊走性又は侵襲的な特徴は、癌の病毒性の主要な理由であると考えられる（Greaves et al (2012) Clonal evolution in cancer. Nature. 481(7381):p.306-13）。その他に、癌幹細胞は免疫抑制的特性を有する（Wu et al (2010) Glioma cancer stem cells induce immunosuppressive macrophages/microglia. Neuro. Oncol. 12:1113-1125）。したがって、癌幹細胞は、例えば癌幹細胞を破壊する試薬及び方法による抗癌療法の標的として研究されてきた。
【０００４】
仮説的腫瘍幹細胞は、マーカー及びマウスで実施される連続移植ゼノグラフアッセイを基にして多数の固形腫瘍で認定された。いくつかの表面マーカーがメラノーマで腫瘍幹細胞を同定できるが、これらのマーカーの発現は、外科切除後にアッセイしたときには腫瘍毎に変動し得る。バイオマーカーCD271は、神経冠起源の細胞に付随する増殖因子受容体である。CD271を用いて仮説的メラノーマ幹細胞を同定できる（連続希釈されたこれらのメラノーマ幹細胞はマウスモデルで増殖できる（Civenni et al (2011) Human CD271-positive melanoma stem cells associated with metastasis established tumor heterogeneity and long-term growth. Cancer Res. 71:3098-3109）。
胚発生時における神経冠細胞の特徴はそれらの遊走能力（間葉系細胞の特徴）である。間葉の特徴を維持するメラノーマ細胞はメラノーマ細胞のアグレッシブな種である。CD146（メラノーマ細胞接着分子（MCAM）及びMUC18としてもまた知られている）は、メラノーマ進行のマーカーである（Schlagbauer-Wadl  et  al  (1999)  Influence  of  MUC18/MCAM/CD146  expression  on  human  melanoma  growth  and  metastasis  in SCID mice. Int J Cancer. 81:951-955）。CD146（MCAM）はまた正常な間葉幹細胞によって発現される（Rusell et al (2010) Stem Cells. 28:788-798）。これら2つのマーカーの同一細胞上での共発現は癌幹細胞の非常にアグレッシブな形態の表示である。
【０００５】
癌幹細胞に特異的でない培地を用いる従来のアプローチは労働集約的で冗長であり、平均的な作製期間は3.8ヶ月（0.6から22.3カ月、中央値は3.1）である。これは処置時期の遅れを生じ、サンプルを提出した患者の29％しか治療を受けられない。しばしば、正常線維芽細胞の過剰増殖は熟練技術者の広範囲の操作を必要とし、このことは当該プロセスを高価なものにする。粗調製物は大半のアグレッシブ表現型（すなわち腫瘍開始細胞又は癌幹細胞）に由来する多量の抗原を欠く。
患者の腫瘍サンプルに由来する仮説的癌幹細胞を単離し、樹状細胞にロードするために必要な量に増殖させることによって、本開示は従来のアプローチを超える利点を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、新形成性異常をもつ対象動物への投与に有用な試薬（細胞を含む）及び関連する方法を提供する。本試薬及び方法は純度が高められた癌幹細胞を包含する。新形成性異常はメラノーマ、卵巣癌、結腸直腸癌、乳癌及び肺癌を包含する。
本開示は、ヒトメラノーマ腫瘍を起源とする単離された細胞集団を提供し、ここで、（i）該集団の細胞の少なくとも30％はCD146を発現し、かつ該集団の細胞の少なくとも30％はCD271を発現するか、又は（ii）該細胞の少なくとも30％はCD146及びCD271を共発現し、ここで該パーセント値（％）は該集団における平均値と定義される。提供されるものはまた上記単離された細胞集団であり、ここで該発現は少なくとも35％であり、さらに共発現は少なくとも35％である。提供されるものはまた上記細胞集団であり、ここで該発現は少なくとも40％であり、さらに共発現は少なくとも40％である。提供されるものはまた上記細胞集団であり、ここで該発現は少なくとも45％であり、さらに共発現は少なくとも45％である。別の特徴では、提供されるものは上記細胞集団であり、ここで該発現は少なくとも50％であり、さらに共発現は少なくとも50％である。
意図されるものはまた上記単離された細胞の集団であり、ここで該細胞の5％未満は夾雑細胞であるか、又は該細胞の2％未満が夾雑細胞である。
【０００７】
ワクチンの実施態様では、提供されるものは自己由来樹状細胞を含むワクチンであり、ここで該樹状細胞は上記単離された細胞集団をロードされ、さらに該樹状細胞及び該ヒト腫瘍は同一のヒト対象動物に由来する。
提供されるものは上記ワクチンであり、ここで、該細胞集団は該樹状細胞へのロード前に細胞分裂を妨げる照射損傷を含むか、又は細胞分裂を妨げる核酸架橋剤を含む。
別のワクチン実施態様では、提供されるものは自己由来樹状細胞を含むワクチンであり、ここで該樹状細胞はヒトメラノーマ腫瘍を起源とする細胞の少なくとも1つの単離集団をロードされ、ここで（i）該集団の細胞の少なくとも50％はCD146を発現し、かつ該集団の細胞の少なくとも50％はCD271を発現するか、又は（ii）該細胞の少なくとも50％はCD146及びCD271を共発現し、ここで該パーセント値（％）は該集団における平均値と定義され、さらに該樹状細胞及び該ヒト腫瘍は同一のヒト対象動物に由来する。
提供されるものは上記ワクチンであり、ここで、該細胞集団は該樹状細胞へのロード前に細胞分裂を妨げる照射損傷を含むか、又は細胞分裂を妨げる核酸架橋剤を含む。
【０００８】
提供されるものはヒトメラノーマ腫瘍を起源とする細胞の単離集団であり、ここで該集団の細胞の少なくとも30％はCD146を発現し、かつ該細胞の少なくとも30％はCD271を発現するか、又は該細胞の少なくとも30％はCD146及びCD271を共発現し、ここで該細胞は以下の工程を含む方法によって調製される：工程i．メラノーマ腫瘍サンプルの細胞を分散させる工程、工程ii．低接着性表面又は超低接着性表面上での培養、工程iii．微小球体収集のための沈降工程、及び工程iv．微小球体から細胞を解離させる工程。
さらに提供されるものは上記方法であり、当該方法はさらに、細胞を増加させて増加細胞集団を作製するために接着性表面上で培養培地にて培養する工程（工程v．）を含む。
提供されるものは上記方法であり、ここで工程（ii）は低接着性表面上での培養を含むか、又は工程（ii）は低接着性表面上での培養を含まないか、又は工程（ii）は超低接着性表面上での培養を含むか、又は工程（ii）は超低接着性表面上での培養を含み、かつ低接着性表面上での培養を含まない。
【０００９】
提供されるものはヒトメラノーマ腫瘍を起源とする細胞の単離集団であり、ここで該集団の細胞の少なくとも30％はCD146を発現し、かつ該細胞の少なくとも30％はCD271を発現するか、又は該細胞の少なくとも30％はCD146及びCD271を共発現し、ここで該細胞は以下の工程を含む方法によって調製される：工程i．メラノーマ腫瘍サンプルの細胞を分散させる工程、工程ii．低接着性表面又は超低接着性表面上での培養、工程iii．微小球体収集のための沈降工程、及び工程iv．微小球体から細胞を解離させる工程。
提供されるものは上記細胞集団であり、ここで該単離細胞集団は、工程iの細胞で検出され得る発現と比較して、（i）ダウンレギュレートされた免疫抑制分子、（ii）アップレギュレートされたMHC-II、又は（iii）ダウンレギュレートされた免疫抑制分子及びアップレギュレートされたMHC-IIの少なくとも1つを有する。
【００１０】
提供されるものは上記細胞であり、ここで該免疫抑制分子は、インドールアミン-ピロール-2,3-ジオキシゲナーゼ、腫瘍増殖因子-ベータ及びインターロイキン-10（IL-10）の少なくとも1つであり、該ダウンレギュレーションは、工程iで検出され得る発現（100％と定義する）と比較して80％以下のレベルである。
提供されるものは上記細胞であり、ここでメラノーマ腫瘍サンプル及び微小球体の一方又は両方から細胞を分散させる工程は添加プロテアーゼによる処理を含む。
提供されるものは上記細胞であり、ここで低接着性表面上での培養は塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）の存在下で実施される。
提供されるものは上記細胞であり、ここで低接着性表面又は超低接着性表面上で培養する工程は形成されてある一切の腫瘍幹細胞球体の収集を含み、該収集は2−3日毎に実施され、該収集球体の培養は低接着性表面上で新鮮な培地にて再開される。
ワクチンの実施態様では、提供されるものは、上記開示の単離細胞集団をロードされた自己由来樹状細胞を含むワクチンであり、ここで該樹状細胞及びヒト腫瘍は同一のヒト対象動物に由来する。
他のワクチン実施態様では、提供されるものは上記ワクチンであり、ここで、該樹状細胞へのロード前に、腫瘍細胞の分裂は腫瘍細胞を照射することによって又は核酸架橋剤を腫瘍細胞に添加することによって妨げられる。
【００１１】
提供されるものはヒトメラノーマ腫瘍を起源とする細胞の単離集団であり、ここで該集団の細胞の少なくとも30％はCD146を発現し、かつ該細胞の少なくとも30％はCD271を発現するか、又は該細胞の少なくとも30％はCD146及びCD271を共発現し、ここで該細胞は以下の工程を含む方法によって調製される：工程i．メラノーマ腫瘍サンプルの細胞を分散させる工程、工程ii．低接着性表面又は超低接着性表面上での培養、工程iii．微小球体収集のための沈降工程、及び工程iv．微小球体から細胞を解離させる工程、及び工程v．細胞を増加させて増加細胞集団を作製するために接着性表面上で培養培地にて培養する工程。
提供されるものは上記方法であり、ここで工程（ii）は低接着性表面上での培養を含むか、又は工程（ii）は低接着性表面上での培養を含まないか、又は工程（ii）は超低接着性表面上での培養を含むか、又は工程（ii）は超低接着性表面上での培養を含み、かつ低接着性表面上での培養を含まない。
【００１２】
提供されるものは上記細胞集団であり、ここで該単離細胞集団は、工程iの細胞で検出され得る発現と比較して、（i）ダウンレギュレートされた免疫抑制分子、（ii）アップレギュレートされたMHC-II、又は（iii）ダウンレギュレートされた免疫抑制分子及びアップレギュレートされたMHC-IIの少なくとも1つを有する。
提供されるものは上記細胞であり、ここで該免疫抑制分子は、インドールアミン-ピロール-2,3-ジオキシゲナーゼ、腫瘍増殖因子-ベータ及びインターロイキン-10（IL-10）の少なくとも1つであり、該ダウンレギュレーションは、工程iで検出され得る発現（100％と定義する）と比較して80％以下のレベルである。
提供されるものは上記細胞であり、ここでメラノーマ腫瘍サンプル及び微小球体の一方又は両方から細胞を分散させる工程は添加プロテアーゼによる処理を含む。
提供されるものは上記細胞であり、ここで低接着性表面上での培養は塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）の存在下で実施される。
【００１３】
提供されるものは上記細胞であり、ここで細胞を増加させるために接着性表面上で培養する工程はbFGFを含む培養培地で実施される。
提供されるものは上記細胞であり、ここで、低接着性表面上で培養する工程は形成されてある一切の腫瘍幹細胞球体の収集を含み、該収集は2−3日毎に実施され、該収集球体の培養は低接着性表面上で新鮮な培地にて再開される。
提供されるものは上記細胞であり、ここで、接着性表面上で培養する工程の総時間は12−30日、14−28日、又は18−24日の時間枠から選択される。
ワクチン実施態様では、提供されるものは、上記開示の単離細胞集団をロードされた自己由来樹状細胞を含むワクチンであり、ここで該樹状細胞及びヒト腫瘍は同一のヒト対象動物に由来する。
他のワクチン実施態様では、提供されるものは上記ワクチンであり、ここで、該腫瘍細胞の分裂は該樹状細胞へのロード前に、腫瘍細胞を照射することによって又は核酸架橋剤を腫瘍細胞に添加することによって妨げられる。
【００１４】
方法の実施態様では、提供されるものは、1つ以上のメラノーマ特異抗原に対して抗原特異的免疫応答を刺激する方法であり、該方法は、上記単離細胞集団をロードされた自己由来樹状細胞を含むワクチンを、生存メラノーマ細胞を含むヒト対象動物に投与する工程を含み、ここで該樹状細胞及びヒト腫瘍は同一のヒト対象動物に由来する。提供されるものはまた上記方法であり、ここで該メラノーマ特異抗原はMAGE抗原である。
別の方法実施態様では、提供されるものは精製癌幹細胞の作製方法であり、前記方法は以下の工程を含む：（a）腫瘍サンプルの細胞を解離させることによって以前に入手してあった細胞浮遊物をニューロン幹細胞培地に浸漬して超低接着性容器又は低接着性容器で培養する工程、（b）癌幹細胞球体を形成させる工程、（c）沈降によって癌幹細胞球体を回収して回収球体を生じる工程、（d）該回収球体を再培養する工程、（e）前記再培養工程中に該回収球体を互いに結合させる工程、（f）該結合球体をバラバラにして単一細胞の浮遊物を得る工程。
提供されるものは上記方法であり、ここで工程（a）は低接着性容器での培養を含むか、又は工程（a）は低接着性容器での培養を含まないか、又は工程（a）は超低接着性容器での培養を含むか、又は工程（a）は超低接着性容器での培養を含み、かつ低接着性容器での培養を含まない。
提供されるものはまた上記方法であり、前記はさらに、腫瘍サンプルをバラバラにして細胞浮遊物を作製する工程の前に腫瘍サンプルを入手する工程を含む。提供されるものはまた上記方法であり、前記はさらに、増殖する接着性細胞培養を樹立して該細胞を増加させる工程を含む。
【００１５】
本発明はヒトメラノーマ腫瘍を起源とする単離された細胞集団を提供し、ここで、該集団の細胞の少なくとも30％はCD146を発現し、かつ該集団の細胞の少なくとも30％はCD146を発現するか、又は該細胞の少なくとも30％はCD146及びCD271を共発現し、ここで該パーセント値は該集団における平均値である。
提供されるものはまた上記細胞集団であり、ここで、該集団の細胞の少なくとも40％はCD146を発現し、かつ該細胞の少なくとも40％はCD271を発現するか、又は該細胞の少なくとも40％はCD146及びCD271を共発現し、ここで該パーセント値は該集団における平均値と定義される。
提供されるものはまた上記細胞集団であり、ここで、該集団の細胞の少なくとも50％はCD146を発現し、かつ該細胞の少なくとも50％はCD271を発現するか、又は該細胞の少なくとも50％はCD146及びCD271を共発現し、ここで該パーセント値は該集団における平均値である。
提供されるものはまた上記細胞であり、ここで接着性表面上での培養は、前記増加細胞の集団で免疫抑制分子のダウンレギュレーションをもたらす。提供されるものはまた上記細胞であり、ここで接着性表面上での培養は免疫抑制分子のダウンレギュレーションをもたらし、さらにここで（i）免疫抑制分子は、インドールアミン-ピロール-2,3-ジオキシゲナーゼ、腫瘍増殖因子-ベータ及びインターロイキン-10（IL-10）の少なくとも1つであり、かつ（ii）接着性表面上での培養前の該少なくとも1つの免疫抑制分子の発現は100％であって、接着性表面上での培養後のダウンレギュレーションは、80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、又は約80％未満、約70％未満、約60％未満、約50％未満、約40％未満、約30％未満、約20％未満、約10％未満などのレベルの発現を生じる。
【００１６】
bFGF又は別の増殖因子、又は１つ以上の増殖因子と併用されるbFGFは、それぞれ約0.5ng/mL、約1.0ng/mL、約2.0ng/mL、約5.0ng/mL、約10ng/mL、約12ng/mL、約15ng/mL、約20ng/mL、約25ng/mL、約30ng/mL、約40ng/mL、約50ng/mLの濃度で、又は0.5-1.0ng/mL、1-2ng/mL、2-4ng/mL、1-5ng/mL、5-10ng/mL、10-12ng/mL、10-15ng/mL、15-20ng/mL、20-25ng/mL、25-30ng/mL、30-40ng/mLなどの範囲で用いられ得る。提供されるものはまた除外実施態様である。例えば、本開示は、bFGFが0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、12ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mLで、又は0.5-1.0ng/mL、1-2ng/mL、2-4ng/mL、1-5ng/mL、5-10ng/mL、10-12ng/mL、10-15ng/mL、15-20ng/mL、20-25ng/mL、25-30ng/mL、30-40ng/mLなどの範囲で存在する方法及び培地を除外することができる。上記代替実施態様は、上記除外実施態様と同様に、非接着性表面（又は非常に低接着性の表面又は超低接着性表面）とともに用いられる培地に適用することができる。上記代替実施態様はまた、上記除外実施態様と同様に、接着性表面とともに用いられる培地に適用できる。
【００１７】
さらにまた、提供されるものは上記細胞であり、ここで細胞の培養に用いられる培地のいずれも動物の生成物を含まない。提供されるものはまた上記細胞であり、ここでメラノーマ腫瘍サンプル及び微小球体の一方又は両方から分散される細胞は添加プロテアーゼによる処理を含む。提供されるものはまた上記細胞であり、ここでメラノーマ腫瘍サンプルから分散される細胞は添加コラゲナーゼを含む。提供されるものはまた上記細胞であり、ここで微小球体から分散される細胞は添加トリプシンによる処理を含む。
本開示は単離された細胞集団を提供し、ここで該細胞の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％若しくは少なくとも95％がCD146を発現するか、又は該細胞の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％若しくは少なくとも95％がCD271を共発現するか、又は該細胞集団の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％若しくは少なくとも95％が、少なくとも同じパーセンテージでCD146及びCD271の各々を発現するか、又は該細胞の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％若しくは少なくとも95％がCD146及びCD271の両方を共発現する。
【００１８】
本開示は上記単離された細胞の集団を包含し、ここで、該細胞は細胞球体によって構成されるか（ここで該細胞は細胞球体の形状で存在する）、該細胞は細胞球体によって構成されないか（ここで該細胞は細胞球体の部分ではない）、該細胞は浮遊物状態で存在するか、又は該細胞は単層状態で存在する。
別の特徴では、本開示は上記単離細胞集団を包含し、ここで該単離細胞集団の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％又は少なくとも98％が癌幹細胞である。さらにまた、本開示は、少なくとも1つの癌幹細胞、少なくとも10癌幹細胞、少なくとも100癌幹細胞、少なくとも1,000癌幹細胞、少なくとも2,000癌幹細胞、少なくとも5,000癌幹細胞、少なくとも10,000癌幹細胞、少なくとも20,000癌幹細胞、少なくとも50,000癌幹細胞、少なくとも100,000癌幹細胞、少なくとも1ｘ106癌幹細胞、少なくとも10ｘ106癌幹細胞、少なくとも100ｘ106癌幹細胞、少なくとも1ｘ109癌幹細胞、少なくとも10ｘ109癌幹細胞、少なくとも100ｘ109癌幹細胞又は少なくとも1ｘ1012癌幹細胞を含む単離された集団を提供する。
【００１９】
本開示が意図するものは、MAGE抗原を発現する細胞に対する有効な免疫応答を刺激することができる上記細胞集団であり、ここで、前記単離集団は少なくとも1つの樹状細胞と接触されるか、前記単離集団は少なくとも1つの樹状細胞によってin vivoでプロセスされるか、或いは有効な免疫応答は少なくとも1つの樹状細胞の対象動物への投与に応答して該対象動物で生じる。
本開示がさらに包含するものは、メラノーマ癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、又は肝細胞癌細胞の細胞に対する有効な免疫応答を刺激することができる上記単離細胞集団であり、ここで、前記単離集団は少なくとも1つの樹状細胞と接触されるか、前記単離集団は少なくとも1つの樹状細胞によってin vivoでプロセスされるか、或いは有効な免疫応答は少なくとも1つの樹状細胞の投与の結果として該対象動物で生じ、該樹状細胞は、メラノーマ、肺癌、乳癌、結腸直腸癌又は肝細胞癌を有する対象動物にそれぞれ投与される。
別の特徴では、本開示は上記単離細胞集団を提供し、ここで該有効な免疫応答は以下の1つ以上を含む：（a）対応する腫瘍の細胞に対する細胞傷害性T細胞応答、（b）細胞内サイトカイン染色アッセイ、ELISPOTアッセイ又はテトラマーアッセイによって測定される応答の増加、（c）抗原特異的CD8+T細胞の集団数の増加、（d）抗原特異的CD4+T細胞の集団数の増加、（e）RECIST基準による腫瘍量の減少、及び（f）対象動物の生存延長。
【００２０】
さらにまた本開示は上記単離細胞集団を提供し、ここで、該集団の実質的に全てがMAGE抗原を発現するか、該集団の約95％がMAGE抗原を発現するか、該集団の約90％がMAGE抗原を発現するか、該集団の約80％がMAGE抗原を発現するか、該集団の約70％がMAGE抗原を発現するか、該集団の約60％がMAGE抗原を発現するか、該集団の約50％がMAGE抗原を発現するか、該集団の約45％がMAGE抗原を発現するか、或いは該集団の約25％を超えるものがMAGE抗原を発現する。
別の例示的実施態様では、本開示は単離細胞集団を包含し、ここで、該細胞の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％若しくは少なくとも95％がMAGEを発現するか、該細胞の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％若しくは少なくとも95％がCD146を発現するか、又は該細胞の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％若しくは少なくとも95％がCD271を共発現するか、又は該細胞集団の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％若しくは少なくとも95％が、少なくとも同じパーセンテージでCD146及びCD271の各々を発現するか、又は該細胞の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％若しくは少なくとも95％がCD146及びCD271を共発現する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】精製過程の種々の段階におけるメラノーマ幹細胞のフローサイトメトリーの特徴。
【図２】自系メラノーマ細胞株のCD146及びCD271の発現パーセンテージを示す表。
【図３】種々のメラノーマ細胞株の表現型（CD146；CD271）。
【図４】酵素消化物中のメラノーマ幹細胞、標準的方法で調製されたメラノーマ幹細胞、及び球体生成方法によって調製されたメラノーマ細胞のフローサイトメトリーの結果（CD146；CD271）。
【図５】種々の処理に付したメラノーマ細胞のフローサイトメトリーの結果（CD146；CD271）（MHCクラスII；MHCクラスI）。
【図６】方法１を用いる精製手順図。
【図７】方法２を用いる精製手順図。
【図８】精製過程中の癌幹細胞の濃縮。図8Aはヒストグラムを示す。図8Bはフローサイトメトリーの結果を示す。
【図９】（1）腫瘍塊の細胞、（2）本開示の“癌幹細胞”、及び（3）標準方法によって作製された“精製細胞株”におけるCD146及びCD271の発現を比較したヒストグラム。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
“投与”は、前記用語がヒト、哺乳動物、哺乳動物系対象動物、動物、獣医の対象動物、プラセボの対象動物、研究対象動物、実験対象動物、細胞、組織、器官又は生物学的液体に対して適用されるとき、外因性リガンド、試薬、プラセボ、小分子、医薬物質、治療薬、診断薬、又は組成物の該対象動物、細胞、組織、器官若しくは生物学的液体などとの接触を意味する（ただし前記に限定されない）。“投与”は、例えば治療、薬理動態、診断、研究、プラセボ及び実験における方法を意味することができる。細胞の処理は、該細胞と試薬の接触を、ある液体と試薬の接触（ここで該液体は該細胞と接触状態にある）と同様に包含する。“投与”はまた細胞の例えばin vitro及びex vivo処理（試薬、診断組成物、結合組成物によるか又は別の細胞による処理）を包含する。
【００２３】
“アゴニスト”は、前記用語がリガンドと受容体に関係するとき、該受容体を刺激する分子、分子の組み合わせ、複合体、又は試薬の組み合わせを含む。例えば、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）のアゴニストは、GM-CSF、GM-CSFのムテイン若しくは誘導体、GM-CSFのペプチド模倣体、GM-CSFの生物学的機能を模倣する小分子、又はGM-CSF受容体を刺激する抗体を包含できる。アンタゴニストは、前記用語がリガンドと受容体に関係するとき、該受容体を阻害し、反対に作用し、ダウンレギュレートし及び／又は脱感作する分子、分子の組み合わせ又は複合体を含む。“アンタゴニスト”は、該受容体の構成的活性を阻害する任意の試薬を包含する。構成的活性はリガンド/受容体相互作用の非存在下で顕在するものである。“アンタゴニスト”はまた受容体の活性の刺激（又は調節）を阻害又は妨害する任意の試薬を包含する。例示すれば、GM-CSF受容体のアンタゴニストには該リガンド（GM-CSF）と結合して該リガンドと受容体との結合を妨害する抗体、又は受容体と結合して該リガンドと受容体との結合を妨害する（又は該受容体を不活性構造に固定する）抗体が含まれる（ただしこれらに全く限定されない）。
【００２４】
別に特段の規定がないか又は文脈から別に示されないかぎり、“発現”という用語は以下を包含する。発現は、mRNAの生合成、ポリペプチド生合成、ポリペプチド活性化（例えば翻訳後修飾による）、又は細胞内の位置の変化若しくはクロマチンへの補充による発現の活性化を包含する。換言すれば、“発現の増加”は、生合成の増加、又はリン酸化により引き起こされる活性の増加、又はサイトゾルから核への移動により引き起こされる活性の増加を包含する。
抗原提示細胞（APC）は抗原をT細胞に提示するために用いられる免疫系の細胞である。APCには樹状細胞、単球、マクロファージ、辺縁帯クッパー細胞、ミクログリア、ランゲルハンス細胞、T細胞及びB細胞が含まれる（例えば以下を参照されたい：Rodriguez-Pinto and Moreno (2005) Eur J Immunol. 35:1097-1105）。樹状細胞は少なくとも2つの系列で生じる。第一の系列は、プレ-DC1、骨髄細胞様DC1及び成熟DC1を包含する。第二の系列は、CD34++CD45RA-初期先駆多能性細胞、CD34++CD45RA+細胞、CD34++CD45RA++CD4+IL-3Rアルファ++プロ-DC2細胞、CD4+CD11c-プラズマ細胞様プレ-DC2細胞、リンパ球様ヒトDC2類プラズマ細胞由来DC2及び成熟DC2を包含する（例えば以下を参照されたい：Gilliet and Liu (2002) J Exp Med. 195:695-704；Bauer et al.(2001) J Immunol. 166:5000-5007；Arpinati et al. (2000) Blood 95:2484-2490；Kadowaki et al. (2001) j Exp Med. 194:863-869；Liu (2002) Human Immunolgy 63:1067-1071；McKenna et al. (2005) J Virol. 79:17-27；Rossi and Young (2005) J Immunol. 175:1373-1381；Banchereau and Palucka (2005) Nat Rev Immunol. 5:296-306）。
【００２５】
“有効量”は、内科的症状若しくは異常の症候又は徴候を緩和、逆転、軽減、予防又は診断することができる量（ただし前記に限定されない）を包含する。特段に又は文脈により別に示されないかぎり、“有効量”は症状を緩和するために十分な最小量に限定されない。疾患又は異常の重篤度は、ある処置が該疾患又は異常を予防、治療又は軽減する能力と同様に、バイオマーカーによって又は臨床パラメーターによって（ただし前記に全く限定されない）測定できる。バイオマーカーには、血液計測、血清、尿、脳脊髄液中の代謝物レベル、腫瘍細胞計測、癌幹細胞計測、腫瘍レベルが含まれる。腫瘍のサイズ及び数はRECIST基準によって決定できる（Eisenhauer et al. (2009) Eur J Cancer. 45:228-247）。発現マーカーは、mRNAの遺伝的発現又は遺伝子の増幅、抗原の発現及びポリペプチドの発現を包含する。臨床パラメーターには、進行を伴わない生存（PFS）、6カ月PFS、病状を伴わない生存（DFS）、進行を生じるまでの期間（TTP）、遠位転移を生じるまでの期間（TDM）、及び全生存期間含まれるが、ただし前記に全く限定されない。
“標識された”組成物は、直接的に又は間接的に、分光分析的、光化学的、生化学的、免疫化学的、同位元素的又は化学的方法によって検出できる。例えば、有用な標識には32P、33P、35S、14C、3H、125I、安定な同位元素、エピトープタグ、蛍光染料、高電子密度試薬、又は酵素が含まれ、前記は例えば酵素結合免疫アッセイ又はフルオレットで用いられる（例えば以下を参照されたい：Rozinov and Nolan (1998) Chem Biol. 5:713-728）。
【００２６】
“ヒトメラノーマ腫瘍を起源とする”細胞の集団の場合のように、“起源とする”という用語は、腫瘍に由来するただ1つの細胞を起源とした細胞の集団（ただし前記に全く限定されない）を包含し、さらにここで、該細胞集団は、当該単一細胞を培養し細胞分裂を介して細胞集団を作製する工程によって作製された。包含されるものはまた1つの腫瘍に由来する多数（2つ以上の数）の細胞を起源とする細胞の集団であり、さらにここで、当該数の細胞は培養され細胞分裂を介してより大きな数の細胞を生じた。包含されるものはまた、ある患者の別個の1つの腫瘍から入手された1つ以上の細胞、さらにまた同一患者の種々の腫瘍から入手された1つ以上の細胞を起源とした細胞の集団であり、ここで、最終的に作製された細胞集団は該採集腫瘍の全てに由来する混合腫瘍細胞である。採集腫瘍数は1つ、2つ、3つ、4つ又は5つ以上であり得る。“ヒトメラノーマ腫瘍を起源とする”細胞の集団という用語は、腫瘍内にたまたま存在しているのではないメラノーマ腫瘍細胞を出発細胞として用いること、すなわち孤立性細胞として存在するミエローマ細胞、例えばリンパ系又は循環系に存在する細胞を用いて出発することを包含する。“起源とする”という用語は、夾雑細胞除去による精製に付された採集腫瘍細胞、培地中での培養に付された採集腫瘍細胞、冷蔵庫での貯蔵に付された採集腫瘍細胞、培地中での増加に付された採集腫瘍細胞、1つ以上の球体のin vitro形成に付された採集腫瘍細胞、等を包含する（ただし前記に限定されない）。
【００２７】
癌の免疫学
癌は、当該癌に対する有効な免疫応答の欠如によって識別される。免疫応答の欠如は、例えば、多くの腫瘍抗原が“自家抗原”であるという事実、腫瘍細胞によるMHCの発現の欠如及び結果として腫瘍細胞による腫瘍抗原の提示の欠如、マクロファージと腫瘍の結びつき（ここで該マクロファージは免疫応答を低下させるサイトカインを発現する）、及びT調節性細胞（Treg）の免疫抑制活性から生じ得る。腫瘍に対する免疫応答の欠如はまた、腫瘍細胞が、生来の免疫応答を刺激する分子、すなわちToll様受容体（TLR）又はヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（NOD様受容体）を刺激する分子を発現しない傾向を有するという事実から生じる。癌は血液学的な癌（例えば白血病及び脊髄形成異常症候群）と同様に固形腫瘍を包含する。
癌は免疫系の障害と分類できる。この分類は、罹患ヒト集団の少なくとも一定の部分で免疫系が癌に対して最適に応答できないという事実に基づいている。癌は以下の理由により免疫系による攻撃を回避する。第一に、感染性生物に関する状況とは極めて対照的に、癌細胞は主として自家抗原から成る。癌抗原として分類されるいくつかの抗原は、実際に過剰発現される正常な抗原、又は当該ポリペプチド鎖のわずかに1つ又は2つのアミノ酸に変異を有する正常な抗原である。第二に、癌細胞は主要組織適合複合体（MHC）をダウンレギュレートし、したがって、MHCを介しては腫瘍細胞由来ペプチドをほとんど提示しない。第三に、腫瘍細胞及び付随する腫瘍関連マクロファージは、免疫応答を鈍化させるサイトカインを発現する（例えば以下を参照されたい：Yu et al (2007) Mature Rev Immunol. 7:41-51）。この鈍化は、例えば当該癌細胞又は関連マクロファージによるインターロイキン-10（IL-10）の分泌によって引き起こされる。第四に、感染に関する状況と異なり、癌細胞は如何なる免疫アジュバントも提供しない。病原体は多様な天然に存在する免疫アジュバントを発現する（前記はToll様受容体（TLR）アゴニスト及びNODアゴニストの形態をとる）（例えば以下を参照されたい：Kleinnijenhuis et al (2011) Clin Dev Immunol. 405310（12ページ））。一般的には、樹状細胞の最適な活性化には免疫アジュバントと1つ以上のToll様受容体（TLR）との接触が要求される。このことは樹状細胞によって発現されるTLRに当てはまる。したがって、いずれの癌細胞又は癌細胞抗原も、それ以上のことがなければ全ての樹状細胞を最適に活性化しるということはありえないであろう。さらに樹状細胞の活性化がなければ、樹状細胞とT細胞間の接触（免疫シナプス）は該T細胞を最適に活性化することができない。
【００２８】
例示的な実施では、本開示は、1つ以上の免疫アジュバントで樹状細胞を活性化する試薬及び方法を開示し、前記アジュバントは、例えばToll様受容体（TLR）アゴニスト、例えばCpG-オリゴヌクレオチド（TLR9）、イミキモド（TLR7）、ポリ(I:C)（TLR3）、グルコピラノシル脂質A（TLR4）、ムレイン（TLR2）、フラゲリン（TLR5）、或いは前記以外のアジュバント、例えばCD40アゴニスト（例えばCD40-リガンド）、又はサイトカイン、インターフェロン-ガンマ、プロスタグランジンE2などである。例えば以下を参照されたい：米国特許7,993,659号（Noelle et al）；米国特許7,993,648号（Kedl et al）；米国特許7,935,804号（Dubensky et al）（前記文献はそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。本開示は、上記アジュバント試薬の1つ以上によるDCのin vitro処理、又は前記に加えて或いは代替として該アジュバントのヒト対照動物、動物対象動物又は獣医対象動物への投与を包含する。
【００２９】
免疫系は、細胞性免疫、液性免疫及び補体応答を包含する。細胞性免疫は、樹状細胞、CD8+T細胞（細胞傷害性T細胞；細胞傷害性リンパ球）、及びCD4+T細胞（ヘルパーT細胞）を必要とする細胞ネットワーク及び事象を含む。樹状細胞（DC）はポリペプチド抗原を獲得し、これらの抗原はDCの外部から入手されるか、又はDCの内部で感染生物によって合成され得る。DCは該ポリペプチドを処理し（長さが約10アミノ酸のペプチドを生じる）、当該ペプチドをMHCクラスI又はMHCクラスIIのどちらかに移行させて複合体を形成し、当該複合体を該DCの表面へ輸送する。MHCクラスI/ペプチド複合体を保持するDCがCD8+T細胞と接触するとき、その結果はCD8+T細胞の活性化及び増殖である。MHCクラスIIの役割に関しては、MHCクラスII/ペプチド複合体を保持するDCがCD4+T細胞と接触するとき、その成果はCD4+T細胞の活性化及び増殖である（Munz et al (2010) Curr Opin Immunol. 22:89-93；Monaco (1995) J Leukocyte Biol. 57:543-547；Robinson et al (2002) Immunology 10:252-262）。抗原をT細胞に提示する樹状細胞は当該T細胞を“活性化”できるが、当該活性化されたT細胞は有効な免疫応答を高めることはできないかもしれない。CD8+T細胞による有効な免疫応答は、しばしば多数の相互作用の1つ以上によるDCの先行刺激を必要とする。これらの相互作用には、CD4+T細胞とDCとの直接接触（CD4+T細胞のCD40リガンドとDCのCD40受容体との接触を介する）又はTLRアゴニストと樹状細胞のToll様受容体（TLR）の1つとの直接接触が含まれる。
【００３０】
液性免疫はB細胞及び抗体が該当する。B細胞は形質転換して形質細胞になり、該形質細胞は抗体を発現しこれを分泌する。ナイーブB細胞は、それらはマーカーCD27を発現しないという点で識別され、一方、抗原特異的B細胞はCD27を確かに発現する（Perez-Andres et al (2010) Cytometry Part B 78B (Suppl.1) S47-S60）。該分泌抗体はその後腫瘍細胞表面に存在する腫瘍抗原と結合することができる。その結果は、感染細胞又は腫瘍細胞に抗体の付箋が付けられるということである。感染細胞又は腫瘍細胞と抗体の結合により、該結合抗体は感染細胞又は腫瘍細胞の殺滅を仲介し、ここで殺滅はNK細胞による。NK細胞は標的抗原を認識する立体構造をもたないが、T細胞が標的抗原を認識する立体構造を有するということにより、NK細胞の抗体定常領域と結合する能力は、抗体の付箋が付けられた細胞をNK細胞が特異的に殺滅することを可能にする。NK細胞の抗体認識は、抗体のFc部分と結合する（NK細胞の）Fc受容体によって媒介される。このタイプの殺滅は、抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）と称される。NK細胞はまたADCCのメカニズムとは無関係に細胞を殺滅することができ、この殺滅はMHCの発現が標的細胞で失われているか又は不完全であることを必要とする（例えば以下を参照されたい：Caligiuri (2008) Blood 112:461-469）。
【００３１】
いくつかの例示的な実施では、本開示は、癌幹細胞のNK細胞媒介殺滅を強化する試薬及び方法を提供する。NK細胞は癌幹細胞に対する細胞傷害作用を媒介することができる（例えば以下を参照されたい：Jewett and Tseng (2011) J Cancer. 2:443-457）。いずれの特定のメカニズムにも拘束されないが、本開示は、癌幹細胞抗原の投与又は癌幹細胞抗原をロードされた樹状細胞の投与を包含し、ここで該抗原は1つ以上の該癌幹細胞抗原を特異的に認識する抗体の産生を刺激し、該抗体はADCCを媒介する。抗原をロードされたという語句は、該樹状細胞が生細胞を捕捉する、壊死細胞を捕捉する、死細胞を捕捉する、ポリペプチドを捕捉する、又はペプチドを捕捉するなどの能力を意味する。交差提示による捕捉は本開示に包含される。包含されるものはまた、樹状細胞ではない抗原提示細胞（例えばマクロファージ又はB細胞）の使用である（例えば以下を参照されたい：O’Neill et al (2004) Blood. 104:2235-2246；Sabado and Bhardwaj (2010) Immunotherapy. 2:37-56）。
“遅延型過敏応答”の技術を用いて、主として細胞性免疫を必要とする免疫応答又は主として液性免疫を必要とする免疫応答を識別することができる。遅延型過敏応答の陽性シグナルは細胞性応答の指標である（例えば以下を参照されたい：Roychowdhury et al (2005) AAPS J. E834-E846）。
【００３２】
本開示は、弁別的トリプシン処理、例えば0.25％トリプシンを10分間用いる処理を包含する。包含されるものはまた、完全なトリプシン処理、例えば0.25％トリプシン又は120分のインキュベーションである（Liu et al (2012) PLos ONE. 7:e35720 (14ページ)）。別の特徴では、本開示は、添加トリプシンを用いるか、弁別的トリプシン処理を用いるか、又は完全なトリプシン処理を用いる試薬又は方法を除外する。本開示は、US2012/0122215（Edinger et al）；US2012/0020936（Harira）；US2011/0250182（Abbot et al）（前記の各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）に記載の試薬又は方法を包含し、さらにまたこれら試薬又は方法の1つ以上を除外する。Selvanら（Selvan et al (2010) Melanoma Res. 20:280-292）は接着性細胞をはがす試薬及び方法を開示する。
【００３３】
本開示は医薬、試薬、診断用キットを含むキットを提供し、当該医薬、試薬及びキットは樹状細胞、抗体又は抗原を含む。提供されるものはまた、少なくとも1つの樹状細胞及び少なくとも1つの抗原を含む組成物を投与する方法、抗体形成を刺激する方法、ADCCを刺激する方法、補体依存細胞傷害作用を刺激する方法、並びに患者の適切性を決定する方法及びキット、臨床試験又は通常の内科治療の状況における患者の組み入れ/除外基準を決定する方法及びキット、及び該医薬又は試薬に対する応答を予想する方法及びキットを提供する。補体依存細胞傷害作用は記載されている（例えば以下を参照されたい：Goodman et al (1990) J Clin Oncol. 8:1083-1092；Cheson (2010) J Clin Oncol. 28:3525-3530）。本開示の医薬組成物、試薬及び関連する方法はCD83陽性樹状細胞を包含し、CD83はIFN-ガンマ処理癌細胞をロードすることによって誘発される。本開示のCD83のある特徴では、該CD83は少なくとも2％、少なくとも3％、少なくとも4％、6％、7％、8％、9％、10％など誘発される。別の特徴では、除外されるものはDC試薬又はDC関連方法であり、ここで樹状細胞CD83は、IFN-ガンマ処理癌細胞をロードしても検出できるほどには誘発されない。培地、標識抗体、細胞培養必需品及び他の試薬は例えば以下から入手できる：Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）、Life Technologies（Carlsbad, CA）及びGIBCO（Grand Island, NY）。KO DMEM培地は“ノックアウトダルベッコー改変イーグル培地”である。B28培地は例えば以下に記載されている：Stevens et al (2009) Proc Natl Acad Sci. 106:16568-16573；及びBrewer et al (1993) J Neurosci Res. 35:567-576。Glutamax(商標)はL-アラニル-L-グルタミンである。
【００３４】
樹状細胞のローディング
樹状細胞にメラノーマ腫瘍細胞抗原をロードすることができ、DCワクチンを調製することができ、さらにDCワクチンを1つ以上の投与ルートによってヒト対象動物に投与することができる。例えば以下を参照されたい：Selvan et al (2008) Int J Cancer. 122:1374-1383；Sabado and Bhardwaj (2010) Immunotherapy. 2:37-56；Hirshowitz et al (2004) J Clin Oncol. 22:2808-2815；O’Neill et al (2004) Blood. 104:2235-2246；Schwaab et al (2009) Clin Cancer Res. 15:4986-4992；Zhong et al (2007) Clin Cancer Res. 13:5455-5462。
本開示は組成物及び方法を提供し、ここでは腫瘍細胞は、例えば照射、核酸架橋剤、ポリペプチドリンカー又はこれらの組み合わせによって不活化される。ある具体的な核酸アルキル化剤は、ベータ-アラニン,N-(アクリジン-9-イル),2-[ビス(2-クロロエチル)アミノエチルエステルである。紫外線（UVA）照射と併用される例示的架橋剤、例えばソラレンは、DNAを架橋するがタンパク質は改変しない能力を有する。核酸を標的とする化合物は4’-(4-アミノ-2-オキサ)-4,5’,8-トリメチルソラレン（“S-59”）であり得る。細胞は、150マイクロモル濃度のソラレンS-59及び3J/cm2UVA光（FX1019照射装置、Baxter Fenwal, Round Lake, IL）で不活化することができる。米国特許7,833,775号（Dubensky）及び7,691,393号（Dubensky）を参照されたい（前記は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
【００３５】
腫瘍抗原
本開示は、腫瘍抗原に対して免疫応答を刺激する、腫瘍抗原を発現する細胞に対して免疫応答を刺激する、ヒト又は獣医対象動物に投与する、及びヒト又は獣医対象動物の診断に使用するなどの試薬並びに方法を提供する。本開示は、例えばp53、MUC1、NY-ESO-1、c-myc、サーバイビング、p62、サイクリンB1及びHer2/neuの1つ以上を発現する細胞に対して免疫応答を刺激する試薬及び関連する方法を提供する（例えば以下を参照されたい：Reuschenbach et al (2009) Cancer Immunol Immunother. 58:1535-1554）。いくつかの例示的な実施では、免疫応答は前記の1つの抗原又は複数の抗原を発現する細胞に対抗するが必ずしも当該細胞に特異的ではない（該免疫応答は他の細胞にも同様に対抗する）。他の例示的な実施では、免疫応答は前記の1つの抗原又は複数の抗原を発現する細胞に対抗し、ここで該免疫応答は前記抗原の認識を必要とする。さらに他の例示的実施では、免疫応答は前記の1つの抗原又は複数の抗原を発現する細胞に対抗し、ここで該免疫応答は前記抗原の認識を必要としない。
【００３６】
本開示は、熱ショックタンパク質（HSP）を発現する細胞に対して免疫応答を刺激する試薬及び方法を提供する。HSPに対する免疫療法は、結腸直腸癌、メラノーマ及び腎細胞癌に対して有効である（例えば以下を参照されたい：Buonagro et al (2011) Clinical Vaccine Immunol. 18:23-34）。包含されるものは、癌-精巣抗原、又は弁別化抗原（differentiation antigen）、又は過剰発現抗原、又は腫瘍関連炭水化物抗原に対して免疫応答を刺激する試薬及び方法である。他の例示的な実施では、試薬及び方法は、MUC1（乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌及び卵巣癌に付随する抗原）を発現する新形成性異常に対して免疫応答を刺激する（Reuschenbach et al (2009) Cancer Immunol Immunother. 58:1535-1554）。提供されるものはまた、p53（肺癌、結腸直腸癌、食道癌及び卵巣癌に付随する抗原）を発現する新形成性異常に対して免疫応答を刺激する試薬及び方法である（Reuschenbach et al（上掲書））。さらにまた、提供されるものは、Her2/neu（乳癌、結腸直腸癌及び卵巣癌に付随する抗原）を発現する新形成性異常に対して免疫応答を刺激する試薬及び方法である。例示的な実施では、本開示は、以下の抗原に対して又は前記抗原を発現する細胞に対して免疫応答を刺激する試薬及び方法を提供し、ここで該抗原はMAGEファミリー抗原である。MAGEは“メラノーマ関連抗原”を意味する。MAGEファミリー抗原は、メラノーマ（Selvan et al (2008) Int J Cancer. 122:1374-1383）の他に、肝細胞癌（例えば以下を参照されたい：Mou et al (2002) Brit J Cancer. 86:110-116）、卵巣癌（Zhang et al (2010) BMC Cancer. 10：163(6-ページ)）、非小細胞肺癌（NSCLC）（Gridelli et al (2009) The Oncologist. 14:909-920；Sienel et al (2007) Clin Cancer Res. 13:3840-3847)、及び結腸直腸癌（Toh et al (2009) Clin Cancer Res. 15:7726-7736）に付随する。
【００３７】
CD133は以下を含む多様な癌によって発現される抗原である：メラノーマ、結腸直腸癌、ユーイング肉腫、肝細胞癌、非小細胞肺癌（NSCLC）及び卵巣癌（Perego et al (2011) J Inv Dermatol. 11:546-547；Cao et al (2011) BMC Gastroenterol. 11:71(11ページ)；Lorico and Rappa (2011) 135039(6ページ)；Ferrandina et al (2009) BMC Cancer. 9:221(9ページ)。本開示は、CD133を発現する癌幹細胞の集団、CD133を発現する癌幹細胞をロードされた少なくとも1つの樹状細胞、CD133を発現する癌幹細胞をロードされた樹状細胞を調製する方法、及びCD133を発現する癌幹細胞をロードした少なくとも1つの樹状細胞をCD133バイオマーカーを発現する癌を有する対象動物に投与する方法を提供する。
【００３８】
ABCB5抗原に関して本開示は試薬及び方法を提供し、ここでABCB5を発現する癌幹細胞は樹状細胞と接触されるか又は樹状細胞にロードされ、該ロードされた樹状細胞が、ABCB5発現癌を有するヒト対象動物又は動物に投与される。ABCB5発現は、例えばメラノーマ癌幹細胞（Schatton et al (2010) Cancer Res. 70:697-708）の他に結腸直腸癌（Wilson et al (2011) Cancer Res. 71:5307-5316）に付随する。関連方法は、ABCB5を発現する細胞（好ましくはABCB5を発現する癌幹細胞）に対する免疫応答の誘発を含む。
本開示はまた以下の抗原に関連する試薬及び方法を包含する：アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）、例えばALDH1A3；ABCB1（P-糖タンパク質/MDR1）；BCL2A1；SNAI2（slug）；ATM、CHEK1及びCHEK2。包含されるものはまた以下に関する試薬及び方法である：CD44、CD133、CD24、CD49f、ESA；CD166；及び系列パネル。系列パネルは、CD45、CD31、CD3、CD64、CD10、CD16、CD18及びGPA；CD45、CD31、CD140a及びTER119；CD45、CD31及びCD140aを含む。典型的には系列パネルは、CD45、CD31、CD3、CD64、CD10、CD16、CD18、GPA、CD140a及びTer119の1つ以上を含む（US2011/0124032（Diehn et al（前記は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））。
【００３９】
包含されるものはまた試薬及び関連方法であり、前記は、以下の抗原の1つ以上又は以下の抗原の1つ以上を発現する細胞に対する免疫応答の刺激に特異的である：MAGE-Aサブタイプ、例えばMAGE-A1、MAGE-A、MAGE-A2、MAGE-A3/6、MAGE-A4及びMAGE-A12（例えば上掲書（Sienel et al）を参照されたい）。また別の例示的な実施では、本開示は、以下に対して刺激する試薬及び関連方法を提供する：細胞間接着分子-1（ICAM-1）、又はICAM-1発現細胞、又は新形成細胞、又は対象動物の癌（前記はICAM-1の1つ以上と関係を有する）。ICAM-1付随癌にはメラノーマ、結腸癌、膀胱癌、肺癌、膵臓癌、及び肝細胞癌が含まれる（Shih et al (2004) Korean J Intern Med. 19:48-52）。さらにまた、本開示は試薬及び方法を提供し、前記は、以下の抗原、又は以下の抗原を発現する細胞、又は新形成細胞、又は対象動物の癌（sHLA-Eと関係を有する）に対して免疫応答を刺激する。sHLA-Eは非古典的MHCクラスI分子であり、メラノーマ、結腸直腸癌、及び腎癌に付随する（Allard et al (2011) PLos One. 6:e21118(9-ページ)）。提供されるものはまた試薬及び方法であり、前記は、以下の抗原、又は以下の抗原を発現する細胞、又は以下の抗原を発現する新形成細胞、又は以下の抗原を発現する対象動物の癌に対して免疫応答を刺激する。該抗原はHERV-K gag関連NGO-Pr-54である。この抗原は卵巣癌、前立腺癌及び白血病に付随する（Ishida et al (2008) Cancer Immunol. 8:15(10-ページ)）。
【００４０】
本開示は、以下の新形成細胞又は以下の対象動物の癌に対して免疫応答を刺激する試薬及び関連方法を提供する。例示的な実施は以下を包含する（ただしこれらに限定されない）：（1）メラノーマ及び結腸直腸癌；（2）メラノーマ及び卵巣癌；（3）メラノーマ及び肺癌；（4）メラノーマ及び肝癌；（5）メラノーマ、結腸直腸癌及び卵巣癌；（6）メラノーマ、結腸直腸癌及び肺癌；（7）メラノーマ、結腸直腸癌及び肝癌；（8）メラノーマ、肺癌及び肝癌；（9）メラノーマ、卵巣癌及び肺癌；（10）メラノーマ、卵巣癌及び肝癌；（11）メラノーマ、卵巣癌、肺癌及び肝癌；（12）メラノーマ、結腸直腸癌、肺癌及び肝癌；（13）メラノーマ、結腸直腸癌、卵巣癌及び肝癌；（14）メラノーマ、結腸直腸癌、卵巣癌及び肺癌；並びに（15）メラノーマ、結腸直腸癌、卵巣癌、肺癌及び肝癌。
【００４１】
除外される例示的な実施は、予め定められた免疫応答レベルを誘発しない、又は誘発できないことが示されてある試薬及び方法である。この予め定められた免疫応答レベルは、例えば1つ以上の癌細胞（メラノーマ細胞、結腸直腸癌細胞、卵巣癌細胞、肺癌細胞又は肝癌細胞）について評価することができる。非限定的に定義すれば、予め定められた刺激レベルは、例えば最大レベルの20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、2％未満、1％未満の刺激である。該最大レベルは、RECIST基準で最大応答を示すヒト対象動物のパーセントを基にするか、ヒト対象動物又は実験動物における癌幹細胞の殺滅を基にするか、全生存期間を基にするか、進行を伴わない生存（PFS）を基にするか、進行までの期間（TTP）を基にするか、最大の細胞傷害性リンパ球（CTL）応答シグナルを基にするか、最大のELISPOTアッセイシグナルを基にするか、抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）の最大の結果を基にするか、T細胞活性化を基にするか、T細胞増加を基にするか、細胞内サイトカイン染色（ICS）アッセイを基にするか、テトラマーアッセイなどを基にすることができる（例えば以下を参照されたい：Nomura et al (2008) Cytometry A. 73:984-991）。例えば、ある例示的な実施では、除外されるものは、予め定められた最大レベルの20％未満の刺激を生じる試薬及び方法である。臨床エンドポイント、例えばPFS、TTP、遠位転移までの期間、全生存期間、及びこれらエンドポイントを解釈する技術は詳述され（Brody (2012) Clinical Trials:Study Design, Endpoints and Biomarkers. Elsevier, San Diego, CA）、本開示の部分である。
【００４２】
本開示に包含される試薬、方法及び技術にはUS2011/0313229（Sugaya et al）（癌幹細胞に関係する）、WO2011/041453（Weismann and Boiko）（メラノーマ癌幹細胞の単離に関係する）、及びUS2011/0286963（Blot-Chabaud et al）（CD146に関係する）が含まれる（前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
非接着性状態、非接着性プレート、非接着性コーティングなどは、疎水性素材によって及び生物的汚れが付着しない素材、例えばポリスチレン、薄層寒天コーティング、シロキサン、フルオルポリマー、ポリエチレンなどによって提供され得る。例えば以下を参照されたい：Tsai et al (2009) J Biomater. Sci. Polym. Ed. 20:1611-1628；US7,790,217（Toreki et al）；US6,342,591（Zamora et al）；US2011/02822005（Jiang et al）（前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。非接着のためのポリエチレングリコール（PEG）はKimらによって記載されている（Kim et al (2006) Lab Chip. 6:1432-1437）。超低付着表面はコーニング超低付着表面（Corning, Inc.）及びテルモサイエンティフィック社のヌンクヒドロセル表面（Nunc HydroCell Surface）を含む。
【００４３】
例示的な実施では、本開示は非接着性状態を促進できる添加物を提供する。添加物は、例えば膜膨張剤、張力活性物質、プルロニックF-68、Tween-80又はポリビニルアルコール（PVA）（Sigma Aldrich catalogue, St. Louis, MO）である。
例示的な実施では、インドールアミン-ピロール2,3-ジオキシゲナーゼのダウンレギュレーションは、酪酸ナトリウム、COX-2阻害剤、アンチセンス核酸、si-RNA、又はミクロRNAによって実行される。IL-10又はTGF-ベータのダウンレギュレーションはアンチセンス核酸、si-RNA又はミクロRNAによって影響を受け得る。Liuらは、ミクロRNAを用いてIL-10の発現をダウンレギュレートさせることを開示している（Liu et al (2011) FEBS Lett. 585:1963-1968）。Yuらは、ミクロRNAを用いてTGF-ベータ受容体をダウンレギュレートすることにより形質転換増殖因子ベータ（TGF-ベータ）の有効性を低下させることを開示している（Yu et al (2012) Carcinogenesis. 33:68-76）。Langらは、小干渉RNA（siRNA）を用いてTGF-ベータ発現を阻害することを報告している（Lang et al (2011) Biochim Biophys Res Commun. 409:448-453）。
例示的な実施では、増加工程は単一細胞から出発して実施される。他の例示的な実施では、増加工程は、約10細胞、約20細胞、約50細胞、約100細胞、約200細胞、約500細胞、約1000細胞、約2000細胞、約5000細胞、約10000細胞、約20000細胞、約50000細胞などで開始される。
【００４４】
除外される例示的実施が提供される。本開示の試薬及び方法は、CD146の発現が50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、又は2％未満である細胞集団、組織、器官又は対象動物など（ただしこれらに全く限定されない）を除外することができる。除外することができるものはまた、CD271の発現が50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、又は2％未満である細胞集団、組織、器官又は対象動物などである。さらにまた別の除外される例示的実施では、除外することができるものは、CD146及びCD271の両方の共発現（測定された各細胞について正確に同一細胞における共発現）が50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、又は2％未満である細胞集団、組織、器官又は対象動物などである。除外することができるものはまた、CD146及びCD271の両方の発現（正確に同一細胞で共発現されるか又は細胞集団全体で単に両方が発現される）が50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、又は2％未満である細胞集団、組織、器官又は対象動物などである。
【００４５】
“共発現”という用語は、指定のマーカー（例えば遺伝子、ポリペプチド、抗原など）が正確に同一細胞で発現され、かつまた同時発生的に発現される状況を意味する。同時発生的共発現に関しては、共発現の時間枠は、約5分、約30分、約1時間、約6時間、約12時間、約1日、約2日、約4日、約8日などであり得る。共発現の時間枠は、少なくとも1分、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも20分、少なくとも60分、少なくとも2時間、少なくとも4時間、少なくとも6時間、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも8日、少なくとも1週間、少なくとも2週間などであり得る。
本開示はヒトミエローマ腫瘍を起源とする単離細胞集団を提供し、ここで該集団の細胞の少なくとも20％はCD146を発現しかつ該細胞の少なくとも20％はCD271を発現するか、又は該細胞の少なくとも20％がCD146及びCD271を共発現する。提供されるものはまた、ヒトメラノーマ腫瘍を起源とする単離細胞集団であり、ここで該集団の細胞の少なくとも30％はCD146を発現しかつ該細胞の少なくとも30％はCD271を発現するか、又は該細胞の少なくとも40％がCD146及びCD271を共発現する。提供されるものはまた、ヒトメラノーマ腫瘍を起源とする単離細胞集団であり、ここで該集団の細胞の少なくとも40％はCD146を発現しかつ該細胞の少なくとも30％はCD271を発現するか、又は該細胞の少なくとも40％がCD146及びCD271を共発現する。本開示は、単層又はそれ以外の層として存在する細胞集団、浮遊物として存在する細胞集団、1つ以上の球体として存在する細胞集団など（ただしこれらに限定されない）を包含する。
【００４６】
CD146又はCD271の一方のみの発現を検出し得る細胞集団
本開示は、CD146を発現するがCD271は発現しない細胞集団を包含する。本開示はまた、CD271を発現するがCD146は発現しない細胞集団を包含する。複数の実施態様で、包含されるものは、少なくとも20％の細胞がCD146を発現する、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％の細胞がCD146を発現するがCD271は発現しない細胞集団である。包含されるものはまた、少なくとも20％の細胞がCD146を発現する、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％の細胞がCD271を発現するがCD146は発現しない細胞集団である。包含されるものは、上記細胞を培養する方法、該細胞を単離する方法、該細胞を樹状細胞にロードする方法、上記細胞を含むワクチン、上記細胞をロードされた樹状細胞を含むワクチン、対象動物に該ワクチンを投与する方法などである。
【００４７】
CD146+/CD271-のメラノーマ細胞は間葉系癌細胞と鑑定され、CD146+/CD271+のメラノーマ細胞は、間葉系の特徴を有する癌幹細胞の細胞と鑑定される。本開示は細胞集団及び関連する方法を提供し、ここで該集団の細胞の少なくとも20％がCD146+/CD271-であり、該細胞の少なくとも22％、少なくとも24％、少なくとも26％、少なくとも28％、少なくとも30％、少なくとも34％、少なくとも38％、少なくとも42％、少なくとも46％、少なくとも50％、少なくとも54％、少なくとも58％、少なくとも62％、少なくとも66％、少なくとも70％、少なくとも74％、少なくとも78％又は少なくとも82％がCD146+/CD271-である。本開示は細胞集団及び関連する方法を提供し、ここで該集団の細胞の少なくとも20％がCD146-/CD271+であり、該細胞の少なくとも22％、少なくとも24％、少なくとも26％、少なくとも28％、少なくとも30％、少なくとも34％、少なくとも38％、少なくとも42％、少なくとも46％、少なくとも50％、少なくとも54％、少なくとも58％、少なくとも62％、少なくとも66％、少なくとも70％、少なくとも74％、少なくとも78％又は少なくとも82％がCD146-/CD271+である。除外される実施態様では、本開示は、上記開示のパーセンテージの1つに合致しないいずれの細胞集団も除外することができる。
【００４８】
除外される実施態様
除外できるものは、単一細胞、細胞集団、単層又はそれ以外の層として存在する細胞集団、浮遊物として存在する細胞集団、1つ以上の球体として存在する細胞集団などであって、CD146の発現が該細胞の10％未満で生じ、該細胞の20％未満、30％未満、40％未満、50％未満、60％未満、70％未満、80％未満で生じるものである。除外できるものは、単一細胞、細胞集団、単層又はそれ以外の層として存在する細胞集団、浮遊物として存在する細胞集団、1つ以上の球体として存在する細胞集団などであって、CD271の発現が該細胞の10％未満で生じ、該細胞の20％未満、30％未満、40％未満、50％未満、60％未満、70％未満、80％未満で生じるものである。除外できるものは、単一細胞、細胞集団、単層又はそれ以外の層として存在する細胞集団、浮遊物として存在する細胞集団、1つ以上の球体として存在する細胞集団などであって、CD146及びCD271の各々の発現は該細胞の10％未満で生じ、該細胞の20％未満、30％未満、40％未満、50％未満、60％未満、70％未満、80％未満で生じるものである。除外できるものは、単一細胞、細胞集団、単層又はそれ以外の層として存在する細胞集団、浮遊物として存在する細胞集団、1つ以上の球体として存在する細胞集団などであって、CD146及びCD271の各々の共発現が該細胞の10％未満で生じ、該細胞の20％未満、30％未満、40％未満、50％未満、60％未満、70％未満、80％未満で生じるものである。この文脈では、共発現は、与えられた個々の細胞の分析に関して、当該個々の細胞によるCD146及びCD271の両方の発現が検出できることを意味する。除外することができるものは任意のメラノーマ細胞集団であって、該メラノーマ細胞の1％を超える、2％を超える、4％を超える、5％を超える、10％を超える、15％を超える、20％を超える、30％を超える、40％を超える、50％を超える、60％を超える、70％を超える、80％を超える、90％を超える細胞がメラノーマ癌幹細胞ではない集団である。
本明細書（添付の特許請求の範囲を含む）で用いられるように、単語の単数形、例えば“a”、“an”及び“the”は、文脈が明らかにそうでないことを示していないかぎり、対応する語の複数形を含む。本明細書に引用する全ての参考文献は、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願及び配列表が、前記刊行物及び特許書類中の数値及び図面と同様に具体的にかつ個々に指示されているように、参照により同程度に本明細書に組み入れられる。
【００４９】
更なる説明
皮膚メラノーマの病期判定
本開示の医薬及び試薬はメラノーマ患者に投与することができ、ここでメラノーマはI期、II期、III期又はIV期と診断される（Mohr et al (2009) Ann. Oncology (Suppl.6) vi14-vi21）。I期は、例えば局所転移又は遠位転移の証拠が認められない原発性メラノーマの患者に該当する。II期は、リンパ系症状又は遠位転移の証拠が認められない患者を含み、これら患者はさらに、その上を覆う上皮が潰瘍を有する１mmより大きく2mm以下の厚さの病巣、又は上皮潰瘍を示す2mmより大きく4mm以下の厚さの病巣を特徴とする。III期メラノーマは、病理学的に立証される局所リンパ節の主要な関与又はイントランシット転移或いは衛星転移を示す病巣を含み、患者は、例えば1つ、2つ、3つ、4つ又は5つ以上の罹患リンパ節を有し得る。IV期メラノーマは遠位転移によって規定され、この転移は遠位の皮膚、皮下組織又はリンパ節にのみ分布し、転移は肺転移が主要であるか、又は他の全ての内蔵部位が巻き込まれる。
本開示は、予防的（すなわち未だ又は全くメラノーマと診断されていない患者に用いられる）投与のための方法を包含する。包含されるものは、患者が以前にメラノーマと診断されていたか、或いは以前に処置されメラノーマの根絶に成功していた（又は偶発的な完全緩解に至っていた）場合の投与方法、及び根絶の後で予防的に投与が用いられる投与方法である。
【００５０】
本開示は、医薬組成物若しくは医薬性試薬、関連する投与方法及び治療方法を提供し、それらは、ハザード比（HR）が1.0未満、HR が0.9未満、HRが 0.8未満、HR が0.7未満、HRが 0.6未満、HR が0.5未満、HR が0.4未満、HR が0.3未満などである生存データの結果を提供する。本開示は、全生存期間データ、進行を伴わない生存期間データ、進行までの期間のデータなどの結果を提供する。提供されるものはまた、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％などの6カ月PFSである。さらにまた提供されるものは、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％などの6カ月生存期間である。さらにまた提供されるものは、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％などの1年（又は2年）PFSである。さらにまた提供されるものは、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％などの1年（又は2年）全生存期間である（例えば、アメリカ合衆国保健福祉省食品医薬局の産業界向け指針、制癌剤及び生物薬剤の承認のための臨床試験エンドポイント（2005年4月）を参照されたい）
【００５１】
バイオマーカー及びフローサイトメトリー
メラノーマ癌幹細胞の研究は、マーカー、例えばCD271（Civenni et al (2001) Cancer Res. 71:3098-3109）、CD146、CD146（Perego et al (2010) J Inv Dermatol. 130:1877-1886）、及びABCB5（Schatton et al (2011) Cancer Res. 70:697-708）を検出する試薬及び方法を明らかにした。関心を持たれている他のバイオマーカーには、CD20、CD133、CD44、CD90、CD24、EpCAM、ALDH1及びABCB5が含まれる（例えば以下を参照されたい：Wang and Jacob (2011) Genome Medicine 3:11(6ページ)；Schlaak et al (2012) Oncotarget. 3:22-30）。
細胞集団の表現型の特徴付けは、表面マーカーに対するモノクローナル抗体（BD Pharmingen San Diego, CA:BD）を用いて実施される。ファーミンゲンCaliBRITEフローサイトメトリーカリブレーション（BD Pharmingen）を各実施前に用い、同一の装置設定をフローサイトメトリーデータの収集を通して用いた。フローサイトメトリーは、ベクトン-デッケンソン（Beckton-Dickenson）FACSCalibur(商標)フロサイトメーターを用いて実施する。細胞によって発現されるポリペプチドの数は、例えば蛍光抗体を用いてフローサイトメトリーで定量して測定できる(例えば以下を参照されたい：Macey  (2010)  Flow  Cytometry:Principles  and  Applications,  Humana  Press；Hawley  (2010)  Flow  Cytometry  Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press；Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, Wiley-Liss)。
【００５２】
フローサイトメトリーによる本開示の細胞株の特徴付けは、メラノーマ幹細胞マーカーとしてこれまでに記載された間葉系及び神経冠起源の細胞（それぞれCD146及びCD271）が濃縮されていることを示した。これらの細胞株ともとの粗酵素消化サンプルとの比較は、それら細胞株が精製及び増加後にCD146及び／又はCD271について濃縮されたことを示した（78.5+/-8.3％に対して26.9+/-5.8％）。任意抽出フェースII臨床試験で用いられた35/42細胞株の試験は、精製腫瘍細胞株におけるこれらマーカーの一貫した発現を示した（32.5+/-3.9％のCD146+/CD271-；41.5+/-4.3％のCD146+/CD271+；16.9+/-4.0％のCD146-/CD271-；6.4+/-1.9％のCD146-/CD271+）。自己樹状細胞療法で抗原供給源としてこれらの細胞を用いることによって、IV期メラノーマ患者の50％で5年生存が得られた（n＝54）。我々の方法による余分な凍結保存サンプルを用いて、我々は作製期間を2カ月に短縮し、成功率を80％に高めることができた。このプロセスはまた、癌幹細胞の純度をこれら公知の癌幹細胞マーカーを基準にして〜70％から＞90％に高めた。さらにまた、夾雑線維芽細胞は最低限の習熟操作により排除された。本アプローチは、自動化及びスケーラビリティーを促進する閉鎖式で一定形式の系の構築が可能な自動化及び／又は最適化に適切である。スケーラビリティー及び最適化はしばしばデリバリー及び調製コストの削減を伴い、自動化はまた労働コストの削減をもたらし得る。
【００５３】
球体
細胞が球体を形成する能力は、部分的には“インテグリン”と称される細胞表面タンパク質によってもたらされる。細胞表面で発現される同種親和性インテグリンは、細胞が“一緒に留まる”ことを担保する。球体は、酵素消化物（ED）（培養の極初期には単一細胞の浮遊物である）から直に形成されるか、又は凍結サンプル若しくは任意の時期における既存の付着培養から形成され得る。該酵素消化物の播種は、この固有の表面特性をもつ細胞を取り込む前記球体形成をもたらす。例えば線維芽細胞は取り込まれることはなく、最終的には重力作用による栄養補給時に培養から消失する。用いられる培地は接着を促進する分子を欠き、同種親和性特性をもたない細胞の非特異的な凝集を妨げ、かつ培養容器表面への接着を妨げる。そのような接着分子（CAM）は動物及びヒトの血清に通常的に見出され、したがって血清を含まない培地組成物が適切である。
無血清培地培養で、培地への補充によって供給されるものには任意のホルモン、栄養物、鉱物、及びビタミンが含まれ、それらは、増殖及び維持の促進又は細胞の生理及び機能に必要である。いくつかの事例では、有糸分裂誘導活性を有する増殖因子（例えばFGFファミリー及びEGF）の添加又は量の調整により幹細胞増殖を刺激及び維持することができる。
細胞球体（癌幹細胞球体を含む）は、固定し標識抗体で染色し、続いて共焦点顕微鏡術で観察することによりバイオマーカー発現を基にして特徴付けることができる（Weiswald et al (2010) Cancer. 10:106(11ページ)）。球体は、例えば新鮮な腫瘍から入手した浮遊物から、又はメラノーマ細胞の事例について報告されたように付着細胞としての増殖に順化させた細胞から調製できる（Perego et al (2011) J Inv Dermatol. 11:546-547）。球体は単一細胞から発生させることができ、前記は球体の蛍光顕微鏡法画像によって示される（例えば以下を参照されたい：Cao et al (2011) BMC Gastroenterol. 11:71(11ページ)）。球体の形態（例えば大きくて不規則に対して小さくてコンパクトな形態）は、培地の選択に影響され得る（Mancini et al (2011) PLoS ONE. 6:e21320(12ページ)）。本開示は上記の参考文献で開示された方法及び技術を包含する（ただし前記に全く限定されない）。
【００５４】
培養期間
本開示はメラノーマ癌幹細胞を調製する方法を提供し、ここで操作（例えば培地交換、再プレート、遠心分離及び沈降を含む）に要する時間を含む合計培養期間は5ヶ月未満、4ヶ月未満、3ヶ月未満、2ヶ月未満、1ヶ月未満、150日未満、120日未満、90日未満、60日未満、30日未満、又は150日未満（+/-20日）、120日未満（+/-20日）、90日未満（+/-20日）、60日未満（+/-20日）、30日未満（+/-20日）である。除外される実施態様では、本開示は、操作に要する時間が上記開示の時間枠の1つよりも長い、いずれの方法及び当該方法によって調製されるいずれの癌幹細胞集団も除外することができる。提供されるものは接着性培養における期間であり、前記は上記時間枠の1つによって示される。提供されるものはまた非接着性培養における期間であり、前記は上記時間枠の1つである。さらにまた、提供されるものはまた接着性培養及び非接着性培養の合計期間であり、前記は上記時間枠の1つによって認定される。
【００５５】
本開示の培地
ある処方バリエーションではHSA（ヒト血清アルブミン）含有B27サプリメント用いることができ、一方、別の変型ではBSA（ウシ血清アルブミン）含有B27サプリメントを用いることができる。表1は、ヒトアルブミンを含む実施態様の無血清サプリメント組成物を開示する（表1の最後の成分を参照されたい）。いくつかの例示的な実施では、BSAをヒト血清アルブミン（HSA）の代わりに用いることができる。表11は培地（RPMI1640）の成分を開示する。“PSF”はペニシリン（Pen）、ストレプトマイシン（Strep）及びファンギゾンを意味する。PSFは抗生物質及び抗カビ剤として用いられる。“ニューロブラスト幹細胞培地”は表8（培地中にはウシの成分）及び表9（ヒト血清アルブミン（HSA）を用いて作製される）に記載されている。“ニューロブラスト培地”及び“ニューロブラスト幹細胞培地”は1つのものであり同一物である。
本開示は、ニューロン幹細胞培地、ニューロン幹細胞培地を用いる方法、ニューロン幹細胞培地を使用して調製される細胞、前記細胞を対象動物に投与する方法、及びニューロン幹細胞培地を含むキットを包含する。ニューロン幹細胞培地のそれぞれ個々の成分について、本開示は、合計体積を一定に保持しつつ+/-5％以下、+/-10％以下、+/-15％以下、+/-％20以下、+/-25％以下、+/-30％以下などの濃度範囲を包含する。本開示は、該成分の1つ以上を省略したニューロン幹細胞培地を包含する。本開示はまた、1つ以上の代用を含むニューロン幹細胞培地を包含する。細胞培地の一般的な代用例には、例えばリン酸カリウムの代用にリン酸ナトリウムを、グリセロールの代用にシュクロースを、システインの代用にシスチンを用いることなどが含まれる。
【００５６】
塩基性線維芽細胞増殖因子の代替物
非接着性基質上での培養に関して、培地は、場合によって塩基性増殖因子（bFGF）、bFGFアナローグ、1つ以上の他の増殖因子と併用されるbFGF、又はbFGFが添加されない1つ以上の増殖因子を含むことができる。増殖因子には、EHNA化合物（Burton et al (2010) Biochem Soc Trans. 38:1058-1061）、骨形態発生タンパク質-2（BMP-2）、血管内皮増殖因子（VEGF）、白血病抑制因子（LIF）、インスリン増殖因子-1若しくは-2（IGF-1、IGF-2）、形質転換増殖因子-ベータ（TGF-ベータ）などが含まれる。
本開示は、bFGFの代替物としてMAPK（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）を介して作用する任意の増殖因子又はリガンドを提供する。MAPKは最初ERK（細胞外シグナル調節キナーゼ）と称された。
このメカニズムを介して作用する増殖因子の古典的リストにはFGF、EGF、PDGF、NT3/4、BDNF、NGF、VEGFが含まれる。付け加えれば、これらはまたTNF、IL-1、TGFb、FASLと同じ態様で作用する。これら増殖因子は主としてマイトジェンとして作用する。
開発し得る迅速増殖の別のメカニズムは、受容体チロシンキナーゼ（例えばEGF、IGFなど）及びGPCR（Gタンパク質共役受容体）を介してPI3K-AKT経路を刺激する。
上記経路を刺激する天然のリガンドに加えて、該阻害剤と拮抗する薬剤を製造のためのin vitro使用で考慮することができる。そのような阻害剤の例はPI3K-AKT系で作用するPTEN阻害剤である。
他の癌治療はこの経路の単一標的に対抗する薬剤を用いる。In vivo治療で既に用いられている単一標的の例には、例えばRafキナーゼ阻害剤ソラフェニブ、SB590885、PLX4720、XL281、RAF265、LGX818、ヴェムラフェニブ；MEK阻害剤XL518、CI-1040、PD035901、MEK162、セルメチニブ、トラメチニブ（GSK1120212）が含まれる。
【００５７】
これらの処置とは対照的に、本開示は、in vitro製造のために癌の増加を促進する（アゴニスト）リガンドを用いる。
本開示で用いられるリガンド（例えばFGF、EGF）の形態発生効果は、前記列挙経路を介して転写因子（例えばNanog、cKit、Sox2、Oct3/4）を刺激することによって癌幹細胞集団の優先的増加に寄与する。
上記天然及び合成リガンドの1つ以上又はそれらの任意の組み合わせを、非接着性培養時に例えば低接着性フラスコ、非常に低接着性フラスコ又は超低接着性フラスコ中の培養培地に添加するか、又は接着性培養時の培養培地に添加できる。以下は接着性培養における増殖に関する。bFGFは接着性培養時には絶対に必要というわけではないが、それは、転写因子（例えばNanog、cKit、Sox2、Oct3/4）を刺激することによって癌細胞の“幹細胞”状態の維持に役立ち得る。反対に、bFGFの無計画な使用又は過剰使用は、腫瘍性でない集団（例えば正常な線維芽細胞又は上皮細胞）の増殖を強化し得る。したがって、接着状態における前記の使用は、癌幹細胞集団の純度を評価することによって時間的に制限されるべきである。製造における球体形成工程は正常細胞集団の増加を妨げ、それが増殖因子を広範囲に用いることができるポイントであり、不純化が疑われる場合はこの工程（球体形成工程）を繰り返すことができる。
【００５８】
本開示の主要な特色には以下が含まれる（ただしこれらに全く限定されない）：（1）非接着性状態での増殖、好ましくは単一の増殖因子、又は増殖因子の併用、又は阻害物質のアンタゴニストを伴う増殖；（2）球状体を単離することによって（他の癌幹細胞単離方法を一切用いない）癌幹細胞を選別する。球状体は、重量による方法、遠心分離、ろ過などによって単離できる；（3）接着性状態での増殖、好ましくは1つ以上の増殖因子を伴う増殖；及び（4）場合によって非接着性プロセスを繰り返す。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
【表２】
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【００６１】
【表３】
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【００６２】
【表４】
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【００６３】
【表５】
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【表５】
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【００６４】
図面の詳細な説明
図１
神経内分泌系及び間葉系表現型を有するメラノーマ幹細胞は、弁別的付着及び血清枯渇方法を用いる精製プロセス中に濃縮される。培養期間の開始時（酵素消化物）、部分的精製の時点（中間物）、及び精製完了後（精製物）におけるCD146及びCD271に関する代表的なフローサイトメトリープロットを示す。正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）をコントロールとして含めた。別個に処理した8つのサンプルのデータの要旨が示されている。表示の値は平均+/-SDである。
図２
この柱状図は、異なる3つの調製段階における細胞に関してCD146及びCD271を発現する細胞のパーセントを開示する。前記段階は酵素消化物、中間物及び精製物である。表12は、能動的な特異的免疫療法のために樹状細胞のローディングに用いられた自己メラノーマ細胞株におけるCD146及びCD271の発現パーセンテージを示す。当該ヒストグラムを構成する個々の患者についてN＝63である。
【００６５】
【表６】
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【表７】
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【００６６】
図３
能動的な特異的免疫療法で樹状細胞のローディングに用いられた自己メラノーマ細胞株は、神経冠及び間葉起源に付随する抗原を発現する細胞を含んでいた。照射及び凍結保存した精製自己メラノーマ細胞をCD146及びCD271の発現についてフローサイトメトリーによってアッセイした。N＝36で、表示の値は+/-SDである。
図４
標準的な又は球体発生方法論のどちらかによって誘導したメラノーマ幹細胞株は同じ表現型の細胞を生じる。図に示す各々の条件の細胞を、二重陽性測定でCD146及びCD271についてフローサイトメトリーによってアッセイした。図3の所見と比較した図4の所見は、いくつかの事例では、インキュベーション中に球体を形成しない細胞の消失及びCD271発現の増加の少なくとも1つが存在し得ることを示唆する。
図５
精製メラノーマ細胞株をニューロン幹細胞培地又は標準的な血清含有増加用培地（15％FBS/RPMI）のどちらかに7日間配置した。その後、前記細胞を接着細胞の場合にはトリプシン処理により、癌幹細胞球体では単純な収集により採集した。図に示す各条件の細胞をCD146、CD271、MHCクラスI及びMHCクラスIIについて同時にフローサイトメトリーによってアッセイした。MHC IIのより高い発現は、免疫応答を支援しこれを維持することができるCD4メモリー細胞を活性化サイトカインの分泌によって刺激する。
図６
弁別的付着及び血清枯渇を用いるメラノーマ癌幹細胞精製プロセスの模式図である（方法I）。酵素で消化した外科的腫瘍サンプルである腫瘍塊を、血清含有細胞培養培地で1−3日間インキュベートし、続いて2回洗浄してリンパ球を除去した。続いて、線維芽細胞、非癌幹細胞及び癌幹細胞の付着混合物を、低血清細胞培養条件（1−5％の範囲のウシ胎児血清）及び一連の弁別的付着工程に平均して120日間コースにわたって付した。この弁別的付着工程は、基質から細胞混合物を酵素により剥がすこと、新しい土台（標準的血漿処置細胞培養フラスコ）に5−20分間、細胞の25−30％が付着するまでプレートすることから成る。続いて、非付着細胞を新しいフラスコに移し、前記付着工程を4−6回連続して繰り返す。このプロセスは、癌細胞の付着速度と比較して線維芽細胞の付着速度が高いという特徴を利用する。さらにまた、低い血清条件は、夾雑線維芽細胞の増殖及び非癌幹細胞の増殖速度を、癌幹細胞と比較してこれらの細胞のより高い栄養要求性のために抑制するであろう。
【００６７】
図７
癌幹細胞を単離する超低接着性幹細胞条件と前記に続く接着増加条件を用いる精製プロセスの模式図である（方法2）。いくつかの実施では、コーニング（Corning）(商標) の独自物質で被覆したポリスチレンを用いて超低接着性を促進する。ポリプロピレンは構造的に固有の疎水性特性を有し、前記特性はまた超低接着性を促進する。コーニング(商標)独自技術のコーティングの他に、薄い寒天コーティング(多糖類)、ポリアミド又はシロキサンを用いてもよい。酵素で消化した外科的腫瘍サンプルである腫瘍塊を、超低接着性又は接着性条件下にて幹細胞培地でインキュベートし、14日後に癌幹細胞球体を出現させる。接着性は、増殖している表面に付着したままの細胞を意味する。非付着細胞は洗浄及び採集時に除去されるであろう。非接着性条件は、細胞が同様な生細胞以外の基質に付着しない培養環境を意味する。疎水性材料又は生物的汚れが付着しない処置を用いて非接着性条件を達成できる。すなわちアガロース、ポリエチレン、フルオロポリマー、シロキサンである。非接着性条件を促進できる条件には、培地又は基質から血清成分を欠如させるか、又はインテグリンに固有の末端（RGD、IKVAV、YIGSR、RETTAWA）をもつペプチドを欠如させることが含まれる。膜膨張剤又は張力活性物質（プルロニックF-68、Tween-80、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリエチレングリコール（PEG））の添加は非接着性条件を促進できる。ヒアルロニダーゼ（高濃度で可動性酵素として作用できる）は細胞の剥離を引き起こすことができる。前記はまたCD44依存固定の欠如を引き起こし得る。哺乳動物細胞培養の技術分野に習熟した者は、超低接着性の培養フラスコ、培養皿及び他の培養容器と低接着性の当該物との相違を容易に識別することができる。
これは、夾雑細胞集団（例えばリンパ球及び線維芽細胞並びに非癌性幹細胞の腫瘍細胞）の除去をもたらす。これらの球体ではCD146/CD271陽性癌幹細胞集団が濃縮されている。続いて、これらの球体を機械的に又は酵素によりバラバラにして、接着性表面にプレートし、さらに30−45日間複製させる。続いて免疫療法で全細胞又は溶解物として使用するために前記細胞を採集する。
【００６８】
図８
図８は精製プロセス中の癌幹細胞の濃縮を開示する。図8Aはフローサイトメトリーの結果を示し、図8Bはフローサイトメトリーの結果の要旨である柱状図を示す。これらの結果は、当該細胞調製物について、酵素消化物（腫瘍塊、空隙棒線）でもっとも優勢な細胞タイプはCD146マイナス/CD271マイナスであること、本開示の精製工程でもっとも優勢な細胞タイプはCD146プラス/CD271マイナスであることを明らかにしている。中間物段階では、CD146プラス/CD271細胞及びCD146マイナス/CD271プラス細胞が大ざっぱに等しいパーセンテージで存在した。
図９
図9は、腫瘍塊細胞、本開示の“癌幹細胞”及び標準的方法によって作製された“精製細胞株”におけるCD146及びCD271の発現を開示する。
図9に関して、腫瘍塊細胞では、CD146マイナス/CD271マイナス細胞（棒線の空隙部分）が細胞の最大部分を占め、CD146マイナス/CD271プラス細胞（棒線の部分で下向き斜線の線影）が次に優勢な細胞である。“癌幹細胞”では、CD146プラス/CD271プラス細胞（棒線の部分で十字線影）がもっとも優勢な細胞タイプである。“精製細胞株”では、CD146プラス/CD271プラス細胞（棒線の部分で十字線影）及びCD146プラス/CD271マイナス細胞（棒線の部分で上向き斜線の線影）の割合が大ざっぱに等しく、CD146プラス/CD271プラス細胞はCD146プラス/CD271マイナス細胞よりもいくぶん大きなパーセンテージで存在した。図9は表13のデータを表す。
【００６９】
【表８】
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【００７０】
実施例
本開示は、細胞依存免疫療法で使用するために、メラノーマサンプルの生検から間葉系及び神経冠起源の癌幹細胞を単離し増加させる方法及び試薬を提供する。方法論には、神経冠及び／又は間葉系表現型をもつ腫瘍幹細胞の別個の集団を単離し、続いて増殖させるための培地処方物の使用が含まれる。CD146は間葉系細胞でしばしば見出されるマーカーであり、高度に侵襲性の表現型に付随する。CD271（神経増殖因子受容体p75）は、神経前駆細胞によって発現され、メラノーマ開始細胞で発現される。提供されるものは、転移メラノーマ調製物で見出すことができるCD146+/CD271-、CD146+/CD271+又はCD146-/CD271+のいずれかである細胞タイプを単離する工程及びそれらを増加させる工程である。さらにまた、これらの細胞はまた、全体で又は部分的にCD44、Twist、Zeb1/2、Snail、Slug、SIP、CD133、CD166、CXCR4、Notch-1及びCD90について陽性であり得る。前記細胞を非接着性条件下にて10−14日間幹細胞培地で培養し、続いて非幹細胞増加用培地下の接着性条件に切り替える。最後の接着性工程は、主要組織適合複合体のアップレギュレーション及び免疫抑制分子（例えばインドールアミン-ピロール-2,3-ジオキシゲナーゼ、腫瘍増殖因子-ベータ及びインターロイキン-10）のダウンレギュレーションを促進することができる。本開示は、腫瘍塊生検又は精製非接着性癌幹細胞よりはむしろ前記の細胞を患者の免疫に使用する。したがって、本開示は、分化した非増殖性細胞集団（腫瘍塊生検で優勢な細胞である）又は免疫抑制癌幹細胞（非接着性“球状体”状態でなお存在する）とは全く異なる、腫瘍を形成すると同定された細胞を使用する。Selvanらはメラノーマ組織サンプルを処理する試薬及び方法を開示する（Selvan et al (2010) Melanoma Res. 20:280-292）。
【００７１】
細胞依存免疫療法は、腫瘍関連新抗原の存在のために自己系環境で有効であると期待される。しかしながら、自己の腫瘍塊調製物の使用は、おそらく腫瘍塊に存在する細胞集団は主として分化した細胞であり癌幹細胞を体現する細胞のパーセンテージは低いという事実のために期待された臨床結果をもたらさなかった。本開示の技術は、癌幹細胞を濃縮してもっとも有効であるように処理しなければならないことを示した。特に、本プロセスは、球体形成プロセスを用いて、CD146+/CD271-（間葉系癌細胞）又はCD271/CD146（間葉系の特徴をもつ癌幹細胞）のどちらかである細胞の濃縮をもたらす。
しかしながら、続いてこれらの細胞を免疫療法で使用する前に最後の増殖工程のために基質（例えば培養フラスコ）に付着させ、癌幹細胞の免疫抑制作用に備える必要がある（Wei et al (2010) Glioma-associated cancer-initiating cells induce immunosuppression. Clin Cancer Res. 16:461-473；Schatton et al (2010) Modulation of T-cell activation by malignant melanoma initiating cells. Cancer Res. 70:697-708）。
【００７２】
接着性基質（例えば標準的な細胞培養フラスコ又は同様な表面）で細胞を増加させる工程の影響は、主要組織適合複合体（MHCクラスI及びクラスII）と称される重要な免疫関連タンパク質のアップレギュレーションである。これらのタンパク質複合体は、免疫系が外来性又はウイルス感染細胞を認識しこれに応答する主要なメカニズムである。癌幹細胞は、剥離された球状体増殖相ではそれら分子をダウンレギュレートし、付着させた増加増殖相ではそれらをアップレギュレートする。癌幹細胞を増加時に非接着性状態から接着性状態へ移す作業は、癌幹細胞が免疫応答を抑制する能力を低下又は排除すると期待される。MHCクラスI及びクラスIIタンパク質に加えて、癌幹細胞はまた、他の免疫抑制分子（例えば形質転換増殖因子-ベータ（TGF-b）、インドールアミン-ピロール-2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）及びインターロイキン-10（IL-10））をアップレギュレートする（A.  Jewett  and  H.C.  Tseng,  Yumor  induced  inactivation  of  natural  killer  cell  cytotoxic  function;  implication in growth, expression and differentiation of cancer stem cells. J Cancer, 2011. 2:443-457）。引き続いてこれらの因子は基質への接着に応答してダウンレギュレートされるはずである。
【００７３】
パーセントダウンレギュレーション及びパーセントアップレギュレーション
本開示は、接着性表面上での培養が免疫抑制分子のダウンレギュレーションをもたらす細胞並びに関連方法及び組成物を提供し、ここで（i）該免疫抑制分子はインドールアミン-ピロール-2,3-ジオキシゲナーゼ、腫瘍増殖因子-ベータ及びインターロイキン-10（IL-10）の少なくとも1つであり、さらに（ii）接着性表面上での培養前の該少なくとも１つの免疫抑制分子の発現は100％で、接着性表面上での培養後のダウンレギュレーションは、最初の100％と比較して80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満のレベルの発現を生じる。
本開示はまた、接着性表面上での培養が免疫抑制分子のダウンレギュレーションをもたらす細胞並びに関連方法及び組成物を提供し、ここで（i）該免疫抑制分子はインドールアミン-ピロール-2,3-ジオキシゲナーゼであり、さらに（ii）接着性表面上での培養前の該免疫抑制分子の発現は100％で、接着性表面上での培養後のダウンレギュレーションは、最初の100％と比較して80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満のレベルの発現を生じる。
提供されるものはまた、接着性表面上での培養が免疫抑制分子のダウンレギュレーションをもたらす細胞並びに関連方法及び組成物であり、ここで（i）該免疫抑制分子は腫瘍増殖因子-ベータであり、さらに（ii）接着性表面上での培養前の該免疫抑制分子の発現は100％で、接着性表面上での培養後のダウンレギュレーションは、最初の100％と比較して80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満のレベルの発現を生じる。
別の特徴では、提供されるものは接着性表面上での培養が免疫抑制分子のダウンレギュレーションをもたらす細胞並びに関連方法及び組成物であり、ここで（i）該免疫抑制分子はインターロイキン-10（IL-10）であり、さらに（ii）接着性表面上での培養前の該免疫抑制分子の発現は100％で、接着性表面上での培養後のダウンレギュレーションは、最初の100％と比較して80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満のレベルの発現を生じる。
【００７４】
実施態様では、個々の核酸又はポリペプチドのアップレギュレーションは、細胞集団の少なくとも20％で、細胞集団の少なくとも30％で、少なくとも40％で、少なくとも50％で、少なくとも60％で、少なくとも70％で、少なくとも80％で、少なくとも90％で検出され得る。ダウンレギュレーションに関しては、個々の核酸又はポリペプチドのダウンレギュレーションは、細胞集団の少なくとも20％で、細胞集団の少なくとも30％で、少なくとも40％で、少なくとも50％で、少なくとも60％で、少なくとも70％で、少なくとも80％で、少なくとも90％で検出され得る。
実施態様では、個々の核酸又はポリペプチドのアップレギュレーションは、癌幹細胞集団の少なくとも20％で、癌幹細胞集団の少なくとも30％で、少なくとも40％で、少なくとも50％で、少なくとも60％で、少なくとも70％で、少なくとも80％で、少なくとも90％で検出され得る。ダウンレギュレーションに関しては、個々の核酸又はポリペプチドのダウンレギュレーションは、細胞集団の少なくとも20％で、癌幹細胞集団の少なくとも30％で、少なくとも40％で、少なくとも50％で、少なくとも60％で、少なくとも70％で、少なくとも80％で、少なくとも90％で検出され得る。
【００７５】
上記に記載の関連方法及び組成物は、細胞培養の方法、樹状細胞（DC）に癌幹細胞をロードする方法、ワクチンを調製する方法、メラノーマ癌幹細胞をロードしたDCを含むワクチンである組成物、ある対象動物、メラノーマのリスクがある対象動物又はメラノーマを含む対象動物に該ワクチンを投与する方法、及び少なくとも１つのメラノーマ特異的抗原に対して特異的な免疫応答を刺激する方法、RECIST基準によって測定できる目的のエンドポイントを改善する方法、及び臨床的エンドポイント（例えば進行を伴わない生存（PFS）、遠位転移までの期間（TDM）又は全生存期間（OS））を改善する方法を包含する。
本開示は、接着性表面上での培養が、MHC-Iの、MHC-IIの又はMHC-1及びMHC-IIの両方のアップレギュレーションをもたらす細胞並びに関連方法及び組成物を提供し、さらにここで（ii）接着性表面上での培養前の該MHC-Iの、MHC-IIの又はMHC-1及びMHC-IIの両方の発現は100％で、接着性表面上での培養後のアップレギュレーションは、最初の100％と比較して少なくとも125％、少なくとも150％、少なくとも200％（2倍増加）、少なくとも250％、少なくとも300％、少なくとも400％（4倍増加）、少なくとも500％のレベルの発現を生じる。MHCは主要組織適合複合体である。MHCクラスI又はMHCクラスIIの発現を測定する、及びアップレギュレーション又はダウンレギュレーションとして発現を定量する複数の方法が利用可能である（例えば以下を参照されたい：Pantel et al (1991) Cancer Res. 51:4712-4715；Vertuani et al (2009) Cancer Immunol Immunother. 58:653-664；Yadav et al (2009) J Immunol. 182:39-43；Lollini et al (1998) Int J Cancer. 77:937-941）。
インドールアミン-ピロール-2,3-ジオキシゲナーゼ（Orabona et al (2006) Blood. 107:2846-2854）、インターロイキン-10（IL-10）（Hedrich and Bream (2010) Immunol Res. 47:185-206）及び腫瘍増殖因子-ベータ（Kleon et al (1997) Cancer. 80:2230-2239）の発現又はアップレギュレーションを検出する多様な非制限的方法が列挙されている。
【００７６】
本開示は、調製メラノーマ細胞、該調製メラノーマ細胞をロードした樹状細胞、及び該調製メラノーマ細胞をロードした樹状細胞を含むワクチンを提供し、ここで免疫抑制は、最大免疫抑制の90％未満、最大免疫抑制の85％未満、80％未満、75％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満などに低下する。この文脈で、“免疫抑制”は、1つ以上のメラノーマ抗原、精製メラノーマ抗原をロードされた樹状細胞を含むワクチン、又は処理されたメラノーマ細胞をロードされた樹状細胞を含むワクチンの免疫抑制（耐性）能力を指し、すなわちここでは1つ以上のメラノーマ特異的腫瘍抗原に対して耐性が生じている。以下に全く限定されないが、本開示のワクチンは、球体をロードされた、球体を含む細胞集団をロードされた、球体から誘導された細胞集団をロードされかつDCへのローディングの前に接着性表面上で増加させた細胞集団をロードされた、球体へのローディング前に均質化又は超音波処理に付された球体をロードされた、DCへのローディング前に均質化又は超音波処理を付された増加細胞集団をロードされたワクチンなどを含むことができる。
間葉系の特徴をもつ腫瘍幹細胞のin vitro細胞培養技術による濃縮は、細胞依存免疫療法プロトコルにおけるこれらの細胞の使用を可能にするであろう。これらの方法を、乳癌、神経膠芽細胞腫、中皮腫、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、肝癌及び結腸癌の生検に由来するサンプルで用いることができる。
【００７７】
表14は、弁別的付着及び血清枯渇の標準的な方法により誘導した細胞における一般的なメラノーマ関連抗原の発現を開示する。以下の文献もまた参照されたい：Selvan et al (2008) Int J Cancer. 122:1374-1383；Selvan et al (2010) Melanoma Res. 20:280-292。
【表９】
2015526087.tif 000012
【００７８】
例示的な実施では、本開示は癌幹細胞の単離された集団を提供し、ここで、該細胞の少なくとも20％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％はCD146+/CD271-であり、同一細胞の約0％、約5％、約10％、約20％、約40％、約60％、約80％、約90％、又は少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％又は少なくとも95％は、CD44、Twist、Zeb1/2、Snail、Slug、SIP、CD133、CD166、CXCR4、Notch-1及びCD90の1つ以上を発現する。
例示的な実施では、本開示は癌幹細胞の単離された集団を提供し、ここで、該細胞の少なくとも20％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％はCD146-/CD271+であり、同一細胞の約0％、約5％、約10％、約20％、約40％、約60％、約80％、約90％、又は少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％又は少なくとも95％は、CD44、Twist、Zeb1/2、Snail、Slug、SIP、CD133、CD166、CXCR4、Notch-1及びCD90の1つ以上を発現する。
【００７９】
例示的な実施では、本開示は癌幹細胞の単離された集団を提供し、ここで、該細胞の少なくとも20％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％はCD146+/CD271+であり、同一細胞の約0％、約5％、約10％、約20％、約40％、約60％、約80％、約90％、又は少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％又は少なくとも95％は、CD44、Twist、Zeb1/2、Snail、Slug、SIP、CD133、CD166、CXCR4、Notch-1及びCD90の1つ以上を発現する。
例示的な実施では、該癌幹細胞の単離集団は、約100細胞、約1,000細胞、約2,000細胞、約5,000細胞、約10,000細胞、約20,000細胞、約50,000細胞、約100,000細胞、約200,000細胞、約500,000細胞、約1ｘ106細胞、約2ｘ106細胞、約5ｘ106細胞、約10ｘ106細胞、約20ｘ106細胞、約50ｘ106細胞、約100ｘ106細胞、約200ｘ106細胞、約500ｘ106細胞、約1ｘ109細胞、約2ｘ109細胞、約5ｘ109細胞、約10ｘ109細胞、約20ｘ109細胞、約50ｘ109細胞、約100ｘ109細胞などである。
【００８０】
方法
方法１．メラノーマ癌細胞株を作出する標準的な方法論
引用の臨床試験で用いられた精製腫瘍細胞株を作出する方法は弁別的付着及び血清枯渇であり、前記によって線維芽細胞及び正常な間質細胞は除外される（Dillmann et  al  (1993)  Establishing  in  vitro  cultures  of  autologous  tumor  cells  for  use  in  active  specific  immunotherapy. J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 14:65-69）。
少なくとも約数百細胞の外科標本を病理学試験後に入手し、外科用メスによる細切及びコラゲナーゼ消化（酵素消化）によって処理し単一細胞浮遊物にした。得られた精製細胞培養を約2億個の細胞に増加させ、凍結保存及び液体窒素中での保存の前に照射した。適切な患者にアフェレーシスを実施して単球を入手し溶出洗浄により精製した。続いて精製単球を、AIMV（Invitrogen）中で178ng/mLのGM-CSF及び80ng/mLのIL-4（Cell Genetics）を用いて樹状細胞へ分化させた。続いて、得られた樹状細胞に照射精製腫瘍細胞を抗原としてロードした（DC+TC）。患者は、500マイクログラムのGM-CSF中で再懸濁させたDC+TCの8回皮下注射を受けた。いくつかの事例では、GM-CSFを増加させるか又はGM-CSFをTLRアゴニスト及びCD40リガンドの少なくとも1つと（完全に又は部分的に）置き換えることができることは本開示の範囲内であるということは当業者には理解されよう。
【００８１】
メラノーマ株で発現される抗原パネルの発現は免疫化学的方法を用いて決定した。簡単に記せば、細胞を1000IU/mLのIFN-cの存在下又は非存在下で8チャンバーの培養スライド（Thermo Fisher）で培養した。72時間後、細胞をリン酸緩衝食塩水（PBS）で3回洗浄し、冷アセトンで固定した。内因性ペルオキシダーゼを封鎖した後、列挙した抗原に対する適切な一次抗体とともに前記細胞をインキュベートした。ビオチニル化抗マウス又は抗ウサギ免疫グロブリン、超鋭敏酵素結合ストレプトアビジン標識、セイヨウワサビペルオキシダーゼ色原体及び基質キット（Biogenex, Fremont, CA）を用いて免疫組織化学を実施した。以下の抗ヒトポリクローナル又はモノクローナル抗体の反応性をアイソタイプ一致コントロール抗体で精査した：S-100及びHMB-45（Biogenex）、Mel-2、Mel-5、Mart-1（Signet）、チロシナーゼ、MAGE-1（Thermo Scientific, Waltham, MA）、Melan-A、HLAクラスI 及びHLAクラスII（Dako, Carpinteria, CA）。
【００８２】
方法2．癌細胞株精製における癌幹細胞球状体方法
外科的腫瘍サンプルを外科用メスによる細切とコラゲナーゼ消化によって処理した。得られた細胞浮遊物を超低接着性細胞培養フラスコ（Corning）中のニューロン幹細胞培地（Neuroblast stem cell media, California Stem Cell, Irvine, CA）に0.05−0.2ｘ106細胞/mLで21日間置いた。超低接着性基質上での培養時にはbFGFは絶対的に必要というわけではないが、bFGFはより迅速な増殖を促進する。本開示は、bFGFが超低接着性基質上での培養中に用いられないか、或いはbFGFが超低接着性基質上での培養中に実際に含まれる、細胞集団、球体集団、及び関連方法を提供する。腫瘍幹細胞球体は沈降を用いて回収され、2−3日毎に新鮮な培地で再培養された。21日の球状体培養期間後に、球体を酵素トリプシン処理によってバラバラにして単一細胞浮遊物を得る。続いて該細胞を、15％ウシ胎児血清を含むRPMI培地又は動物生成物を含まない増殖用培地（Omega Scientific, Tarzana, CA）の標準的な細胞培養フラスコ（Corning, Corning, NY）に入れて増加させ、増殖性接着細胞培養物を樹立した。接着性癌細胞集団の迅速な増加を担保するために適切な栄養物を提供する他の増殖用培地処方物を用いてもよい。
【００８３】
精製腫瘍細胞培養物、癌幹細胞球体、及び酵素消化サンプルを以下の1つ以上の発現について、凍結保存から融解させた後で又は細胞培養中にフローサイトメトリーによってアッセイした：MHCクラスI、MHCクラスII並びにCD146及びCD271（BD Biosciences, San Jose, CA）。さらに、正常ヒト皮膚線維芽細胞のコントロールサンプルもまたアッセイした。細胞を4％のパラホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）中で15分間固定し、リン酸緩衝食塩水（PBS）（Omega Scientific）で2回洗浄し、百万細胞/mLで再浮遊させた。細胞を10μLのCD146及びCD271又はアイソタイプコントロール（BD Biosciences）で30分間染色し、PBSで洗浄し、ビーズ検定FACS Calibur（BD Biosciences）で製造業者の指示にしたがいフローサイトメトリーを実施した。
細胞増加における例示的実施では、工程に付される細胞は、約1細胞（厳密には1細胞）、約10細胞、約20細胞、約50細胞、100細胞、約1,000細胞、約2,000細胞、約5,000細胞、約10,000細胞、約20,000細胞、約50,000細胞、約100,000細胞、約200,000細胞、約500,000細胞、約1ｘ106細胞、約2ｘ106細胞、約5ｘ106細胞、約10ｘ106細胞、約20ｘ106細胞、約50ｘ106細胞、約100ｘ106細胞、約200ｘ106細胞、約500ｘ106細胞、約1ｘ109細胞、約2ｘ109細胞、約5ｘ109細胞、約10ｘ109細胞、約20ｘ109細胞、約50ｘ109細胞、約100ｘ109細胞などである。
【００８４】
いくつかの事例では、以下の工程の1つ以上を方法2に加えることは有用であり得る。腫瘍の酵素消化の実質的にすぐ後の血漿処理組織培養フラスコへの接着工程で、フラスコに付着しないリンパ球及び残骸を除去する洗浄工程がその後に続く。インキュベーション工程、ここでは該洗浄工程の後に癌細胞及び正常細胞の接着混合物のニューロン幹細胞培地でのインキュベーションが続き、該培地は癌幹細胞球体を該フラスコ表面から発芽させるであろう。収集工程、ここでは出芽した癌幹細胞を収集して更なる増殖のために超低接着性条件に置くことができる。
【００８５】
改変方法2．癌細胞株精製における癌幹細胞球状体方法
以下は、微小球体技術によって作出される腫瘍細胞株を処理及び特徴付けるための非制限的プロトコルである。微小球体技術を下記に開示する。
工程1．酵素消化した8つのメラノーマ腫瘍サンプルをランダムに選択する。
工程2．凍結バイアルを37℃に設定した水浴中で融解させて細胞浮遊物を得る。5％RPMI培地を含む15mLの円錐チューブに前記浮遊物を一滴ずつ加える。
工程3．1200rpmで5分間遠心分離する。
工程4．10mLのニューロブラスト培地に再浮遊させる。
工程5．血球計算盤を用いて細胞計測及び生存率検査を実施する。
工程6．Neuroplast プラス10ng/mL bFGFに80,000生存細胞/mLで再浮遊させ、0.52mL/cm2で超低接着性フラスコに配置する。
工程7．2−3日毎に細胞を900rpmで5分間遠心分離し、新しい培地に再配置した。前記を最初の3回の培地交換について繰り返し、続いて合計21日の残りの培養期間について受動的沈降に切り替える。受動的沈降は、該細胞浮遊物を50mLの円錐チューブに移す工程及び平坦表面上のホルダーに該円錐チューブを3−5分間配置する工程から成る。該円錐チューブの底に微小球体が収集されるのを観察する。上清を除去し、10ng/mLのbFGFを補充したNeuroblastプラス5％FBSに前記細胞ペレットを再浮遊させる。21日の終了時に受動沈降を実施する。
工程8．上清を除去し、TrypLEを10分間用い穏やかなピペット操作により細胞ペレットを解離させる。細胞計測を実施し、血球計算盤を用いて生存率を判定する。
工程9．標準的な接着性細胞培養フラスコ中の10ng/mLのbFGF補充NeuroBlast プラス5％FBSに20,000から30,000生存細胞/cm2で細胞を再浮遊させる。培地の扱い方に応じて週に2−3回培地を交換しながら該細胞培養を3−4週間維持する。周期的に位相差顕微鏡写真を撮影する。
工程10．増加期間の終了時に、TrypLEで細胞を継代し、細胞計測を実施する。
工程11．調製細胞のサンプルの特徴を以下のように調べることができる。CD146及びCD271に対する抗体を用いるフローサイトメトリーによる特徴付けのために、3−5ｘ106細胞をパラホルムアルデヒド中でインキュベートすることによって固定する。細胞は、アイソタイプIgG1-PE及びIgG1-FITC、CD146-PE及びCD271-FITC標識抗体でもまたPBS中で30分間、室温で暗所にて染色された。染色細胞を400ｘgで5分間遠心分離し、さらにPBSで洗浄する。続いて細胞を0.4mLのPBSに再浮遊させ、BD FACSCalibur(商標)装置によるフローサイトメトリーに使用する。
【００８６】
対象動物への投与
樹状細胞ワクチンは皮下（SC）に投与される。各1回分用量は5−20ｘ106の範囲でロードされたDCであり、1シリーズ8回で繰り返される。注射（4）は最初の1ヶ月は毎週、その次の4注射後は毎月与えられる。また別の例示的実施では、投与は1週間に1回で3週間、続いて1ヶ月に1回で5カ月間、合計8週間である。いくつかの例示的実施では、ブーストアジュバント（GM-CSF）は各投与と同時に与えられる。また別の例示的実施では、GM-CSFブーストアジュバントが与えられるが、全ての単一投与で与えられるわけではない。他の例示的実施では、GM-CSFブーストアジュバントは全く存在しない。
以下に限定されないが、樹状細胞（例えば自己又は同種異系樹状細胞）は、細胞溶解物、酸溶出、細胞抽出物、部分精製抗原、精製抗原、単離抗原、部分精製ペプチド、精製ペプチド、単離ペプチド、合成ペプチド又は前記の任意の組み合わせとして癌幹細胞抗原と接触される。続いて、該樹状細胞は対象動物に、例えば癌を含む対象動物又は癌を含まないコントロール対象動物に投与される。例示的実施では、樹状細胞は、1つ以上のルート（皮下、リンパ節内、筋肉内、静脈内、鼻内、吸入、経口）、腸管への適用などによって接触されるか、注射されるか又は投与される（例えば以下を参照されたい：O’Neill et al (2004) Blood. 104:2235-2246；Sabado and Bhardwaj (2010) Immunotherapy. 2:37-56）。
【００８７】
上記のごとく、例示的実施及び／又はその局面で適用される本開示の基本的で新規な特色を提示し記載し指摘してきたが、該例示的実施、開示及びその局面における形態及び詳細で、多様な省略、再配置及び置換え、並びに変更が本開示及び／又は特許請求の範囲を逸脱することなく当業者によって実施され得ることは理解されよう。例えば、実質的に同一の機能を実質的に同一の態様で実施し同一の結果を達成するそれら要素及び／又は方法の工程の全ての組み合わせが本開示の範囲内にあることは明確に意図されている。さらにまた、一切の開示の形態又は実施と関連して提示及び／又は記載された構造及び／又は要素及び／又は方法の工程は一般的な設計選択事項として他の一切の開示又は記載又は示唆された形態又は実施に組み入れることができることは認識されるべきである。したがって、本開示の範囲を制限しないことを意図する。そのような改変はいずれも添付の特許請求の範囲内であることが意図される。
本明細書に引用された全ての刊行物、特許、特許出願及び参考文献は、参照により完全に本明細書で提示されたかのように本明細書に組み入れられる。
現時点でもっとも実用的で好ましい実施、例示及び／又は実施態様とという観点から方法及び装置を記載してきたが、本開示は、当該開示の実施、例示及び／又は実施態様に限定される必要がないことは理解されよう。特許請求の意図及び範囲内に含まれる多様な改変及び類似の構成を包含することが意図され、その範囲は、そのような改変及び類似の構造を全て包含するようにもっとも広い解釈と一致すべきである。
【００８８】
本発明の本質から逸脱することなく多様な変更を為し得ることもまた理解されるべきである。そのような変更は本記述に当然に含まれ、本開示の範囲内である。本開示は別個に及び全体的な系として、さらに方法及び装置の両態様で多様な局面をカバーする特許を得ようとするものであることは理解されるべきである。
さらにまた、本開示、例示、その局面及び特許請求の範囲の多様な要素の各々はまた多様な態様で達成され得る。本開示は、そのような多様性の各々を、たとえいずれの装置、方法又はプロセスの多様性であっても又はこれら要素のいずれかの単なる多様性であっても包含すると理解されるべきである。
特に、本開示は請求項の要素と関連するので、各要素を示す語は、たとえその機能又は結果のみしか同一でないとしても、等価の装置の用語又は方法の用語によって表現され得る。
そのような等価のより広い又はより一般的でさえある用語は、各要素又は動作の記述に包含されると考えるべきである。そのような用語は、本発明が意図する暗黙の広い適用範囲を明確にすることを所望する場合に代用され得る。
全ての動作は、当該動作を起こす手段として又は当該動作を引き起こす要素として表現され得ることは理解されよう。
同様に、開示の各物理的成分は、当該物理的要素が容易にする動作の開示を包含すると理解されるべきである。
【００８９】
本特許出願に記載のいずれの特許、刊行物又はその他の参考文献も参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
最後に、本出願と一緒に又はその後に提出される情報開示陳述書又は他の情報申告書に列挙される全ての参考文献は、これにより添付され参照により本明細書に組み入れられるが、しかしながら上記の各々に関しては、参照により組み入れられるそのような情報又は陳述書が特許請求される発明の特許性と一致しないと考えられる場合、そのような陳述書は出願人によって為されたと考えられるべきではないのは明らかである。
これに関しては、実際的な理由からかつ数百となる可能性がある請求項の付加を回避するために、出願人は初期の従属項のみとともに請求項を提示している。
新規事項に関する法律（35 USC§132又はそのような法律を含む）の下で要求される範囲において、1つの独立請求項又は概念の下に、従属項又は要素として提示される多様な任意の従属項又は他の要素を任意の他の独立項又は概念の下に付加することを許容するサポートが存在すると理解されるべきである。
実質的でない代用が為されている場合、出願人が具体的ないずれかの実施態様を文字通り包含するように請求項を実際に作製しなかった場合、さらに別の適用が可能な場合、出願人がそのような適用範囲を全く意図しなかったとか、又は現実に前記を放棄したと解されるべきではない。なぜならば、出願人は単に全ての不測の事態を予測できなかった可能性があるからである。当業者がそのような代替実施態様を文言上包含する請求項を作製するのが合理的であったと期待するべきではない。
【００９０】
さらにまた、移行句“comprising”は、伝統的な請求項の解釈にしたがって、“オープンエンド”請求項を維持するために用いられる。したがって、文脈が別の意味を要求しないかぎり、“compromise”又は変化形、例えば“comprises”又は“comprising”という用語は、記載の要素又は工程又は要素若しくは工程のグループの包含を意味することを意図するが、ただし他の任意の要素又は工程又は要素若しくは工程のグループを除外することを意図しない。
そのような用語は、出願人に最大の適用範囲を法的に許容し得るように、それら用語のもっとも拡張的な形式で解釈されるべきである。
本要約は、読者が本技術的開示の性質及び要点を迅速に確認することを可能にするために、37 CFR§1.72(b)にしたがって提供される。本要約は、それが特許請求の範囲又は意味を解釈又は制限するために用いられることはないということを理解して提出される。
【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【国際調査報告】
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