(57)【要約】  本発明は、被験体における癌の治療及び／又は予防に使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーに関する。本発明は該化合物を含む医薬組成物に更に関する。本発明の別の態様は、アミノヘテロアリール化合物の上記（Ｓ）−エナンチオマー又は上記医薬組成物の有効性を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、（ａ）被験体から細胞又は組織サンプルを得る工程と、（ｂ）被験体のＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１状態を決定する工程とを含み、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１陽性細胞又は組織サンプルが効果的な癌の治療及び／又は予防の指標となる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。加えて、アミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーの標的を同定するスクリーニング方法が本明細書に提示される。さらに、本発明において、本明細書に記載の化合物はＭＴＨ１の生物活性を阻害する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における癌の治療及び／又は予防のために用いられる、
式（１）によって表される以下の化学構造を有する、アミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー、又は
その薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグ：
【化１】
2015529665.tif 000057
（式中、
Ｒ１は−ＮＨ２、−ＮＲ２Ｈ、−ＯＨ又は−ＳＨであり、
Ｒ２はＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル又はＣ２〜６アルキニルであり、
Ｒ３はＣ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、Ｃ２〜３アルキニル又はシクロプロピルであり、
ＹはＮ又はＣＲ４であり、
Ｒ４は水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル又はＣ３〜６シクロアルキルであり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は各々独立してフッ素、塩素、臭素又はヨウ素であり、
Ｒ８は水素又は−Ａ−Ｂｎ−Ｘであり、ここで、
Ａは単結合、−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−であり、
ＢはＣ１〜４アルキレン、Ｃ２〜４アルケニレン又は−（ＯＣＨ２ＣＨ２）−であり、
ｎは０、１、２、３、４又は５であり、
Ｘは−ＮＨＲ２、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＯＨ又はＯ−アルキルである）。
【請求項２】
請求項１に記載の用途に用いられる、
Ｒ１が−ＮＨ２、−ＯＨ又はＳＨであり、
Ｒ３がメチルであり、
ＹがＣＲ４であり、
Ｒ４が水素又はハロゲンであり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が各々独立してフッ素又は塩素であり、
Ｒ８が水素又は−Ａ−Ｂｎ−Ｘであり、ここで、
ＢがＣ１〜４アルキレン又は−（ＯＣＨ２ＣＨ２）−であり、
ｎが１、２又は３であり、
Ｘが−ＮＨ２である、
請求項１に記載の化合物、又は
その薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の用途に用いられる、
Ｒ８が水素、
−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２、
−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２、又は、
−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２である、
請求項１又は２に記載の化合物、又は
その薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【請求項４】
請求項１に記載の用途に用いられる、
式（２）〜（５）によって表される以下の化学構造：
【化２】
2015529665.tif 000058
2015529665.tif 000059
2015529665.tif 000060
の１つを有する、化合物。
【請求項５】
癌の治療及び／又は予防に使用される医薬組成物であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物と薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項６】
各々が式（１）〜（５）によって表される化学構造の１つを有する少なくとも２つの成分を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
各々が式（２）〜（５）によって表される化学構造の１つを有する少なくとも２つの成分を含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記被験体の癌細胞又は組織が活性化ＲＡＳ突然変異及び／又は活性化ＥＧＦＲ突然変異を有する、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項５〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記被験体の癌細胞又は組織が活性化ＲＡＳ突然変異を有する、
請求項１〜４及び８のいずれか一項に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項５〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記活性化ＲＡＳ突然変異が活性化ＫＲＡＳ突然変異である、
請求項８若しくは９に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項８若しくは９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
被験体における癌の治療及び／又は予防が、該被験体の癌細胞又は組織のＡＬＫ状態及び／又はｃ−Ｍｅｔ状態とは無関係である、
請求項１〜４及び８〜１０のいずれか一項に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項５〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ＡＬＫ状態がＡＬＫ生物活性のレベル及び／又はＡＬＫ発現のレベルである、
請求項１１に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ｃ−Ｍｅｔ状態がｃ−Ｍｅｔ生物活性のレベル及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現のレベルである、
請求項１１に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記被験体の癌細胞又は組織がＡＬＫの遺伝子突然変異及び／又は染色体転座を有しない、
請求項１〜４及び８〜１３のいずれか一項に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項５〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記染色体転座がＥＭＬ４−ＡＬＫである、
請求項１４に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記被験体の癌細胞又は組織において、ｐ２１の生物活性及び／又は発現が低減又は欠如している、
請求項１〜４及び８〜１５のいずれか一項に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項５〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記被験体が哺乳動物である、
請求項１〜４及び８〜１６のいずれか一項に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項５〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記哺乳動物がヒト患者である、
請求項１７に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記癌が結腸癌、肺癌、乳癌、白血病、リンパ腫、皮膚癌、肝臓癌、膵臓癌、脳腫瘍、腎臓癌、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、前立腺癌、膀胱癌及び食道癌からなる群から選択される、
請求項１〜４及び８〜１８のいずれか一項に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項５〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記乳癌がエストロゲン受容体−α及びプロゲステロン受容体の発現を欠いており、ＨＥＲ２／ＮＥＵ癌遺伝子の過剰発現又は増幅を欠いている、
請求項１９に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記乳癌がＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２遺伝子突然変異を有する、
請求項１９若しくは２０に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項１９若しくは２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記化合物又は医薬組成物を放射線及び／又は化学療法剤とともに同時投与する、
請求項１〜４及び８〜２１のいずれか一項に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項５〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記化学療法剤がＤＮＡ損傷薬、アルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡに酸化的損傷をもたらす薬剤、細胞毒性化合物、代謝拮抗物質、ＤＮＡ修復機構を妨げる化合物、ＡＴＭキナーゼ阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害剤、ＣＨＫ１／２キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ阻害剤、一般的塩基除去修復阻害剤、ＤＮＡポリメラーゼβ阻害剤、Ｏ−６−メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）阻害剤、スルビビン抑制剤、活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する化合物、抗有糸分裂化合物又は以上のいずれかの組合せである、
請求項２２に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記化学療法剤がＰＡＲＰ阻害剤及び／又はＥＧＦＲ阻害剤である、
請求項２３に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記化学療法剤がシクロホスファミド、テモゾロマイド、メルファラン、カルムスチン、ブスルファン、シスプラチン、プロカルバジン、アントラサイクリン、カンプトテシン、イリノテカン、エトポシド、過酸化水素、レゾルシノール、キノン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、オラパリブ、ＡＢＴ−８８８、ネオカルジノスタチン、ブレオマイシン、デシタビン、５−アザシトシン、メトキシアミン塩酸塩（ＴＲＣ１０２）、ロメグアトリブ、ピペルロングミン、ケルセチン、ビンクリスチン、タキソール、ミトキサントロン、ＹＭ１５５、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ又は以上のいずれかの組合せである、
請求項２２若しくは２３に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項２２若しくは２３に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１〜４及び８〜２５のいずれか一項に記載の用途に用いられる化合物、又は
請求項５〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物
の有効性を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）被験体から細胞又は組織サンプルを得る工程と、
（ｂ）前記被験体のＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１状態を決定する工程と、
を含み、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１陽性細胞又は組織サンプルが効果的な癌の治療及び／又は予防の指標となる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２７】
前記ＮＵＤＴ／ＭＴＨ１状態がＭＴＨ１生物活性のレベル及び／又はＭＴＨ１発現のレベルである、請求項２６に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２８】
（ｃ）前記被験体のＲＡＳ状態を決定する工程、
を更に含み、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１に対して陽性かつ活性化ＲＡＳ突然変異に対して陽性の細胞又は組織サンプルが、効果的な癌の治療及び／又は予防の指標となる、請求項２６又は２７に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２９】
（ｃ）前記細胞又は組織サンプルが活性化ＲＡＳ突然変異を有するか否かを決定する工程、
を更に含み、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１に対して陽性かつ活性化ＲＡＳ突然変異に対して陽性の細胞又は組織サンプルが、効果的な癌の治療及び／又は予防の指標となる、請求項２６又は２７に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項３０】
（ｄ）前記細胞又は組織サンプルにおいてｐ２１の発現及び／又は生物活性が低減又は欠如しているか否かを決定する工程、
を更に含み、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１に対して陽性であり、ｐ２１の発現及び／又は生物活性が低減又は欠如している細胞又は組織サンプルが、効果的な癌の治療及び／又は予防の指標となる、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項３１】
前記細胞又は組織サンプルが癌細胞又は組織である、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項３２】
工程（ｂ）及び／又は（ｃ）及び／又は（ｄ）がＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、遺伝子シークエンシング、ＡＲＭＳ（増幅不応性突然変異系）、ペプチド核酸−ロックド核酸（ＰＮＡ−ＬＮＡ）ＰＣＲクランプ、ＰＣＲ−インベーダー、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ＰＣＲ／ＨＲＭＡ／ｄＨＰＬＣ、ＰＣＲ／ｆＩＲＦＬＰ、蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ＲＴ−ＰＣＲ、遺伝子アレイ及び遺伝子チップからなる群から選択される少なくとも１つの検出方法を含む、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項３３】
請求項２６〜３２のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法におけるキットの使用であって、該キットがＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１を検出することが可能なポリヌクレオチド及び／又は抗体を含む、使用。
【請求項３４】
前記キットがＲＡＳを検出することが可能なポリヌクレオチド及び／又は抗体を更に含む、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記キットがｐ２１を検出することが可能なポリヌクレオチド及び／又は抗体を更に含む、請求項３３又は３４に記載の使用。
【請求項３６】
式（１）によって表される以下の化学構造：
【化３】
2015529665.tif 000061
（式中、
Ｒ１は−ＮＨ２、−ＮＲ２Ｈ、−ＯＨ又は−ＳＨであり、
Ｒ２はＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル又はＣ２〜６アルキニルであり、
Ｒ３はＣ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、Ｃ２〜３アルキニル又はシクロプロピルであり、
ＹはＮ又はＣＲ４であり、
Ｒ４は水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル又はＣ３〜６シクロアルキルであり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は各々独立してフッ素、塩素、臭素又はヨウ素であり、
Ｒ８は水素又は−Ａ−Ｂｎ−Ｘであり、ここで、
Ａは単結合、−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−であり、
ＢはＣ１〜４アルキレン、Ｃ２〜４アルケニレン又は−（ＯＣＨ２ＣＨ２）−であり、
ｎは０、１、２、３、４又は５であり、
Ｘは−ＮＨＲ２、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＯＨ又はＯ−アルキルである）、
を有するアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー、又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグの標的を同定するスクリーニング方法であって、
（ａ）細胞溶解物を得る工程と、
（ｂ）前記アミノヘテロアリール化合物と前記細胞溶解物とを接触させる工程と、
（ｃ）分子が前記アミノヘテロアリール化合物に結合するか否かを決定する工程と、
を含み、分子が前記アミノヘテロアリール化合物に結合することが見出された場合に、かかる分子を該アミノヘテロアリール化合物の標的として同定する、スクリーニング方法。
【請求項３７】
式（１）の化合物中、
Ｒ１が−ＮＨ２、−ＯＨ又は−ＳＨであり、
Ｒ３がメチルであり、
ＹがＣＲ４であり、
Ｒ４が水素又はハロゲンであり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が各々独立してフッ素又は塩素であり、
Ｒ８が水素又は−Ａ−Ｂｎ−Ｘであり、ここで、
ＢがＣ１〜４アルキレン又は−（ＯＣＨ２ＣＨ２）−であり、
ｎが１、２又は３であり、
Ｘが−ＮＨ２である、
請求項３６に記載のスクリーニング方法。
【請求項３８】
式（１）の化合物中、Ｒ８が水素、
−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２、
−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２、又は、
−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２である、
請求項３６又は３７に記載のスクリーニング方法。
【請求項３９】
前記化合物、又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグが、式（２）〜（５）によって表される以下の化学構造：
【化４】
2015529665.tif 000062
2015529665.tif 000063
2015529665.tif 000064
の１つを有する、請求項３６に記載のスクリーニング方法。
【請求項４０】
（ｄ）アミノヘテロアリール化合物の前記（ｓ）−エナンチオマーが前記分子の生物活性を変化させるか否かを決定する工程、
を更に含み、アミノヘテロアリール化合物の前記（Ｓ）−エナンチオマーが前記分子の生物活性を変化させることが見出された場合に、かかる分子をアミノヘテロアリール化合物の該（Ｓ）−エナンチオマーの標的として同定する、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項４１】
前記細胞溶解物が癌患者、樹立癌細胞株又は非ヒト動物の細胞又は組織サンプルに由来する、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項４２】
前記生物活性の変化が生物活性の阻害である、請求項４０又は４１に記載のスクリーニング方法。
【請求項４３】
前記化合物がＭＴＨ１の生物活性を阻害する、請求項１〜４及び８〜２５のいずれか一項に記載の使用される化合物、請求項５〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の使用、又は請求項３６〜４２のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験体における癌の治療及び／又は予防に使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーに関する。本発明は該化合物を含む医薬組成物に更に関する。本発明の別の態様は、アミノヘテロアリール化合物の上記（Ｓ）−エナンチオマー又は上記医薬組成物の有効性を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、（ａ）被験体から細胞又は組織サンプルを得る工程と、（ｂ）被験体のＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１状態を決定する工程とを含み、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１陽性細胞又は組織サンプルが効果的な癌の治療及び／又は予防の指標となる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。加えて、アミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーの標的を同定するスクリーニング方法が本明細書に提示される。さらに、本発明において、本明細書に記載の化合物はＭＴＨ１の生物活性を阻害する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト使用を対象とする薬物は、有益な効果が潜在的副作用を上回ることを確実にするために、最終的に患者に適用する前に広範な毒物学的研究を必要とする。しかしながら、或る特定のオフターゲット効果は、長期使用後及びより広範な患者コホートを化合物に曝露した後にしか見ることができない。これらの条件は標準臨床試験において完全には評価することができないことが明らかである。ＢＣＲ−Ａｂｌキナーゼ阻害剤ダサチニブの化学的プロテオーム分析から、例えばこの化合物が慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者においてＢＴＫ及びＴＥＣキナーゼの阻害のために非定型感染症を引き起こし得ることが解明された１。患者に対する潜在的にマイナスの結果を除き、或る特定の薬物が、その臨床的有効性が幾つかの細胞タンパク質及び全て疾患に関連するそれぞれのシグナル伝達経路の同時干渉によるものであることを意味する、いわゆる「多重薬理（polypharmacology）」を示し得る２。このため、これらのオフターゲット活性も有益であり、患者にとって懸念すべきものではない可能性がある。しかしながら、薬物の分子標的プロファイル（すなわち遺伝子−薬物インタラクトーム）に関する広範な知識は、規定の分子的損傷に基づく患者の特異的な選択により治療有効性を更に向上し、副作用の予防を改善する可能性がある（「患者の層別化」）。さらに、新たな明白な患者群が、当初確立された標的とは独立して選択的にオフターゲット効果から恩恵を受ける場合がある。最終的に、この特に関連したオフターゲットに関する知識は、同じ又は異なる臨床状況において新規の標的化治療剤に対してより特異的なモジュレーターの開発を可能にするリード構造をもたらす場合もある。第２の医学的使用をかかるアプローチによって臨床的に確立された薬物について発見することができれば、当局による承認プロセスを大幅に加速することができるため、患者及び製薬会社はいずれもこの「薬物再活用」の恩恵を受けることができる。標的デコンボリューション戦略の中でも、化学プロテオミクスがあらゆるｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング戦略に優る、分子の細胞インタラクトームを解明する最も強力な技法である。第一に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイはキナーゼ等の或る特定のサブプロテオーム（subproteomes）に限定されるが、化学プロテオミクス実験では対象の化合物をキナーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素だけでなく、転写因子等を含む全ての酵素群を包含する完全なプロテオームに曝露する。特に、化学プロテオミクスのみがその天然存在度並びにリン酸化及びアセチル化等の翻訳後修飾（ＰＴＭ）の状態におけるタンパク質の評価を可能とする。
【０００３】
クリゾチニブ（ＰＦ−０２３４１０６６、ザーコリ（Ｘａｌｋｏｒｉ）（登録商標））は、Pfizerによって開発された未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）及び肝細胞成長因子受容体キナーゼ（ｃ−Ｍｅｔ）の新規の二重阻害剤である３。クリゾチニブは食品医薬品局（ＦＤＡ）によって初めて承認されたＡＬＫキナーゼ阻害剤であり、ＡＬＫ陽性腫瘍と診断された患者の治療に使用される。異常なＡＬＫシグナル伝達は形質転換、増殖を誘導し、細胞周期停止及びアポトーシスに拮抗する。発癌ＡＬＫ活性の背後にある分子的損傷は、ＡＬＫ遺伝子増幅、突然変異又は染色体転座、例えばＥＭＬ４−ＡＬＫと関連し得る４。ＥＭＬ４−ＡＬＫは、棘皮動物微小管関連タンパク質様４及びＡＬＫ遺伝子（ＥＭＬ４−ＡＬＫ）からなる発癌融合タンパク質である５。この転座は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のおよそ３％〜１３％の腺癌において生じ、報告された一症例を除き、ＥＧＦＲ又はＫＲＡＳの突然変異とは相互排他的であると考えられる６。患者は、ＥＭＬ４−ＡＬＫを検出する必須の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析に基づきクリゾチニブでの治療について選択される。クリゾチニブは、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、神経芽細胞腫（ＮＢ）及び炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）等の他のＡＬＫ陽性腫瘍においても疾患の制御から顕著な無進行生存及び寛解に及ぶ高い臨床的利益を示す７。
【０００４】
クリゾチニブの（Ｒ）−エナンチオマーが、ｃ−Ｍｅｔ活性の阻害においてラセミ型クリゾチニブよりも僅かに強力であり、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー（本明細書で（Ｓ）−クリゾチニブとも呼ばれる）よりも顕著に強力であることが示されている９。ｃ−Ｍｅｔ活性の阻害における（Ｒ）−クリゾチニブとクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーとの異なる能力は、ｃ−Ｍｅｔに結合するクリゾチニブの共結晶構造において解明された特異的結合と一致する９。実際に、臨床的には（Ｒ）−クリゾチニブのみが使用されている。加えて、上記に示したように、クリゾチニブがＡＬＫ陽性及びｃ−Ｍｅｔ依存性細胞において細胞増殖を潜在的に阻害することが全般的理解である３，２３。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
癌は経済先進国における死因の第１位であるとともに、発展途上国における死因の第２位である（World Health Organization. The Global Burden of Disease: 2004 Update. Geneva: World Health Organization; 2008; Jemal (2011) CA Cancer J Clin. 61: 69-90）。加えて、癌を標的とし、例えばＡＬＫ陽性及び／又はｃ−Ｍｅｔ依存性の選択癌細胞又は組織ではなく例えばＲＡＳ、例えばＫＲＡＳ依存性癌／癌細胞に限定される新規の療法が所望されている。したがって、本発明の根底にある技術的課題は増殖性疾患、特に癌性疾患／癌の医学的介入のための手段及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この技術的課題は本明細書に提示され、特許請求の範囲において特徴付けられる実施形態によって解決される。
【０００７】
したがって、本発明は、被験体における癌の治療及び／又は予防に使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー、又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグであって、該化合物が式（１）によって表される以下の化学構造：
【化１】
2015529665.tif 000002
（式中、
Ｒ１は−ＮＨ２、−ＮＲ２Ｈ、−ＯＨ又は−ＳＨであり、
Ｒ２はＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル又はＣ２〜６アルキニルであり、
Ｒ３はＣ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、Ｃ２〜３アルキニル又はシクロプロピルであり、
ＹはＮ又はＣＲ４であり、
Ｒ４は水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル又はＣ３〜６シクロアルキルであり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は各々独立してフッ素、塩素、臭素又はヨウ素であり、
Ｒ８は水素又は−Ａ−Ｂｎ−Ｘであり、ここで、
Ａは単結合、−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−であり、
ＢはＣ１〜４アルキレン、Ｃ２〜４アルケニレン又は−（ＯＣＨ２ＣＨ２）−であり、
ｎは０、１、２、３、４又は５であり、
Ｘは−ＮＨＲ２、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＯＨ又はＯ−アルキルである）を有する、
アミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー、又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグに関する。
【０００８】
本発明において、驚くべきことに、アミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（例えば、（Ｓ）−３−[１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ]−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミン；本明細書で「クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー」とも称される）をＲＡＳ依存性癌の治療又は予防に用いることができることが見出された。
【０００９】
クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーは良好な発癌キナーゼｃ−Ｍｅｔの阻害剤ではないため、抗癌薬として有用でないことが従来の科学的見解である。特に、Cui (2011) J. Med. Chem. 54: 6342-6363は、癌の治療のためのクリゾチニブ（すなわち（Ｒ）−クリゾチニブ）の使用を開示している。この従来技術の研究では、クリゾチニブが活性化ｃ−Ｍｅｔ又はＡＬＫ融合タンパク質を発現する細胞において抗腫瘍効果を有することが結論付けられている。重大なことには、Cui（前掲）は、クリゾチニブ（すなわち（Ｒ）−クリゾチニブ）とは対照的に、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーがｃ−Ｍｅｔを阻害しない又は（仮にあったとしても）殆ど阻害しないことを更に開示している。クリゾチニブがｃ−Ｍｅｔを効果的に阻害する（一方で（Ｓ）−エナンチオマーはｃ−Ｍｅｔ阻害活性を有しない）という従来技術における発見は、（Ｒ）−クリゾチニブがｃ−Ｍｅｔ結合ポケットに特異的に結合するということに起因すると考えられた（Cui（前掲））。ｃ−Ｍｅｔの阻害は、癌の治療に必要とされないため、Cui（前掲）はクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーによって癌を治療することはできないと教示している。加えて、国際公開第２００６／０２１８８１号は、物質３−[１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ]−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンの純粋な（Ｒ）−エナンチオマー（すなわちクリゾチニブ）が、クリゾチニブのラセミ体よりも著しく良好にｃ−Ｍｅｔを阻害することを開示している。このため、アミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー等）が実質的又は効果的にｃ−Ｍｅｔを阻害しないため、抗癌薬として好適でないということが従来技術における共通理解である。これと一致して、従来技術ではクリゾチニブ（すなわち（Ｒ）−クリゾチニブ）のみが癌細胞の成長の阻害に使用され、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーは使用されていない。
【００１０】
このため、従来技術における当業者には、これら２つのエナンチオマー化合物が完全に異なる生物学的挙動を有することが教示される。したがって、当業者は、クリゾチニブの（Ｒ）−エナンチオマーの生物活性からアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（例えばクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー）の活性を予想することができない。
【００１１】
さらに、従来技術では、活性化ＡＬＫ再構成がＲＡＳの突然変異とは相互排他的であることが見出されているため、クリゾチニブ（すなわち（Ｒ）−クリゾチニブ）がＲＡＳ（例えばＫＲＡＳ）依存性癌の治療に好適でないことが直接的に及び明確に教示される（Gainor (2013) Clinical Cancer Research 19, 4273-4281）。これと一致して、下記の例示的な実施例では、ｃ−Ｍｅｔ阻害がＫＲＡＳ突然変異ＳＷ４８０細胞の成長を抑制することが示される。しかしながら、本発明者らは本明細書において、下記の例示的な実施例に実証されるように、アミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー等）がｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＡＳ（例えばＫＲＡＳ）突然変異癌細胞の阻害において極めて強力であることを示す。したがって、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーがＲＡＳ依存性癌の治療又は予防に有用であるという本発明の発見は、利用可能な科学的証拠に基づいて予測することができなかった。
【００１２】
言い換えると、従来技術では、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーではなく（Ｒ）−エナンチオマーが癌の治療に有用であり、（Ｒ）−エナンチオマーがＲＡＳ依存性癌の治療に好適でないことが教示されている。このことは、クリゾチニブの純粋な（Ｓ）−エナンチオマーのようなアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーが癌、特にＲＡＳ依存性癌の阻害において極めて強力であるという本発明の発見と著しく相違している。
【００１３】
さらに、癌において活性化ＡＬＫが活性化ＲＡＳとは相互排他的であるため、クリゾチニブ（すなわち（Ｒ）−クリゾチニブ）はＲＡＳ依存性癌の治療に好適でない。驚くべきことに、本明細書に提示されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（例えばクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー）は、癌、特に活性化ＲＡＳ突然変異（例えばＫ−ＲＡＳの活性化突然変異）を有する癌の治療に効果的である。
【００１４】
さらに、下記の実施例及び添付の図面から明らかなように、驚くべきことに、癌細胞（複数の場合もあり）又は癌組織を、対応するキナーゼが該細胞（複数の場合もあり）及び／又は組織（複数の場合もあり）において活性／機能的でなくとも、キナーゼ阻害剤で首尾よく治療することができることが本発明において見出された。かかるキナーゼの一例は本明細書に記載の未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）である。本明細書で開示される抗ＡＬＫキナーゼ阻害剤が機能的であり、該キナーゼが全く存在しない若しくは活性でないか、又は該キナーゼの活性が単に低減した細胞において抗癌剤として使用することができることが見出され、本明細書に報告された。本明細書で示され、説明されるように、ＡＬＫ阻害剤が未分化リンパ腫キナーゼ、すなわち（ヒト）ｍｕｔＴホモログ１／ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、すなわちトリホスファターゼ（本明細書では７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン−トリホスファターゼ）とは異なる驚くべき標的を有することが更に見出された。本明細書においてキナーゼ阻害剤が逆の触媒活性を有する酵素の活性の阻害において首尾よく使用されることは極めて（insofar very）驚くべきことである。
【００１５】
本発明において、「ＮＵＤＴ１」は遺伝子に関し、「ＭＴＨ１」は上記のトリホスファターゼの発現タンパク質に関する。
【００１６】
本発明は、Ｒ１が−ＮＨ２、−ＯＨ又は−ＳＨであり、Ｒ３がメチルであり、ＹがＣＲ４であり、Ｒ４が水素又はハロゲンであり、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が各々独立してフッ素又は塩素であり、Ｒ８が水素又は−Ａ−Ｂｎ−Ｘであり、ここでＢがＣ１〜４アルキレン又は−（ＯＣＨ２ＣＨ２）−であり、ｎが１、２又は３であり、Ｘが−ＮＨ２である上記の式（１）の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグに関する。より好ましい実施形態では、本発明は、Ｒ８が水素、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２又は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２である上記の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグに関する。最も好ましい実施形態では、本発明は式（２）〜（５）によって表される以下の化学構造：
【化２】
2015529665.tif 000003
2015529665.tif 000004
2015529665.tif 000005
の１つを有する、上記の化合物に関する。
【００１７】
本発明は、被験体における癌の治療及び／又は予防に使用される本明細書で規定されるアミノヘテロアリール化合物であって、該アミノヘテロアリール化合物がその（Ｓ）−エナンチオマー配置にある、アミノヘテロアリール化合物に関する。
【００１８】
したがって、本発明は、かかる治療を必要とする被験体において癌を治療及び／又は予防する方法であって、該被験体に治療的に有効な量の本明細書で規定されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーを投与することを含む、方法に関する。したがって、本発明は、かかる治療（治療的又は予防的）を必要とする、癌を患う被験体を治療する手段及び方法を提供する。治療及び／又は予防が癌のＡＬＫ状態及び／又はｃ−Ｍｅｔ状態とは無関係であることに留意されたい。したがって、治療及び／又は予防対象の癌はＡＬＫ陰性癌（すなわち、活性化ＡＬＫ異常を有しない癌）及び／又はｃ−Ｍｅｔ陰性癌であり得る。
【００１９】
このため、本発明の一態様は、被験体における癌の治療及び／又は予防に使用される上記のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーであって、治療及び／又は予防が上記被験体の癌細胞又は組織のＡＬＫ状態及び／又はｃ−Ｍｅｔ状態とは無関係である、アミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーに関する。ＡＬＫ状態はＡＬＫ生物活性のレベル及び／又はＡＬＫ発現のレベルであり得る。ＡＬＫ生物活性のレベルは、例えばＡＬＫキナーゼ活性を測定することによって決定することができる。患者におけるＡＬＫキナーゼ活性を測定するために、該患者の癌細胞又は組織を単離し、ＡＬＫの下流の標的のリン酸化を、リン酸化特異的抗体を用いるウエスタンブロット法によって決定することができる。ＡＬＫ発現のレベルは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＴ）又はウエスタンブロット法によって決定することができる。ＡＬＫ生物活性及び／又はＡＬＫ発現が上記癌細胞又は組織において健常対照者のサンプルと比較して増大している場合に、癌細胞又は組織のＡＬＫ状態は陽性である。ＡＬＫ状態（すなわち、ＡＬＫ生物活性のレベル及び／又はＡＬＫ発現のレベル）がＡＬＫ遺伝子における活性化異常（例えば染色体転座）の存在に依存することが当該技術分野で一般に知られている。例えば、ＡＬＫ陽性癌細胞又は組織は、ＡＬＫ遺伝子が活性化異常（ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はキナーゼドメイン活性化突然変異、例えばＡＬＫ  Ｆ１１７４Ｌ等）を有する癌細胞又は組織に関する。これと一致して、ＡＬＫ陰性癌細胞又は組織は、ＡＬＫ遺伝子が活性化異常（ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はキナーゼドメイン活性化突然変異等）を有しない癌細胞又は組織に関する。活性化ＡＬＫ異常の存在は、例えばシークエンシング、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＴ）又はウエスタンブロット法によって決定することができる。
【００２０】
上記のように、本明細書で提供されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーは、癌のｃ−Ｍｅｔ状態とは無関係の癌の治療に有用である。本発明によると、ｃ−Ｍｅｔ状態はｃ−Ｍｅｔ生物活性のレベル及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現のレベルであり得る。ｃ−Ｍｅｔ生物活性のレベルはｃ−Ｍｅｔのキナーゼ活性を測定することによって決定することができる。患者におけるｃ−Ｍｅｔキナーゼ活性を測定するために、該患者の癌細胞又は組織を単離し、ｃ−Ｍｅｔの下流の標的のリン酸化を、リン酸化特異的抗体を用いるウエスタンブロット法によって決定することができる。ｃ−Ｍｅｔ発現のレベルは、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＴ又はウエスタンブロット法によって決定することができる。ｃ−Ｍｅｔ生物活性及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現が上記癌細胞又は組織において健常対照者のサンプルと比較して増大している場合に、癌細胞又は組織のｃ−Ｍｅｔ状態は陽性である。例えば、ｃ−Ｍｅｔ状態はｃ−Ｍｅｔにおける活性化突然変異の結果として陽性であり得る。かかる活性化突然変異は、健常対照被験体の細胞又は組織におけるｃ−Ｍｅｔの生物活性と比較した、癌細胞又は組織におけるｃ−Ｍｅｔの生物活性の増大をもたらし得る。
【００２１】
驚くべきことに、本明細書で提供されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（例えばクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー）は、下記の実施例のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ実験において実証されるように、癌のＡＬＫ−又はｃ−Ｍｅｔ状態とは無関係の（すなわち、癌細胞又は組織におけるＡＬＫ又はｃ−Ｍｅｔの生物活性のレベル又は発現のレベルとは無関係の）癌の治療に好適である。このため、上記癌細胞又は組織はＡＬＫ陰性（すなわち活性化ＡＬＫ異常を有し得ない）及び／又はｃ−Ｍｅｔ陰性（すなわち、健常対照被験体の細胞又は組織と比較したｃ−Ｍｅｔ又はキナーゼ活性化突然変異の発現の増大を有し得ない）であり得る。このことは、クリゾチニブ（すなわち（Ｒ）−クリゾチニブ）がＡＬＫ陽性及びｃ−Ｍｅｔ陽性癌細胞にしか効果的でないと記載されているため驚くべきことである。
【００２２】
本明細書に記載され、下記の実施例で説明されるように、驚くべきことに、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）及び肝細胞成長因子受容体キナーゼ（ｃ−Ｍｅｔ）の二重阻害剤であるクリゾチニブが、癌遺伝子誘導悪性形質転換及び癌細胞の老化からの逃避に関連付けられていたヒトＭｕｔＴホモログ１（ＭＴＨ１）である７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン−トリホスファターゼの極めて強力な阻害剤であることが見出された。さらに、驚くべきことに、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーが、このエナンチオマーがラセミ型又は（Ｒ）−クリゾチニブよりも著しく良好なＭＴＨ１阻害活性を示したため、特に良好なＭＴＨ１阻害剤であることが見出された。
【００２３】
これらの発見は、現在、クリゾチニブがＡＬＫ陽性及びｃ−Ｍｅｔ依存性細胞でしか細胞増殖を効果的に阻害しないことが一般的な理解であるために、極めて驚くべきことである３，２３。さらに、臨床的に、（Ｒ）−クリゾチニブしか使用されないことを考えると、このエナンチオマーがｃ−Ｍｅｔキナーゼ活性の阻害において（Ｓ）−エナンチオマーよりも著しく強力であることが示されることから９、本明細書に記載の発明は更に驚くべきものである。
【００２４】
薬物の細胞内標的プロファイルに関する広範な知識は、患者の層別化の重要な前提条件であり、それにより副作用を最小限に抑える一方で治療有効性が最大限に高められる。その上、癌等の深刻な疾患の治療に特に活性のあることが証明された薬物は、依然として付加的な又は更には完全に未知の作用様式を有する場合があり、これが解明されると新規の治療剤の開発につながる可能性がある。
【００２５】
クリゾチニブは、キナーゼ活性部位内のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）結合ポケットに結合することによって悪性ＡＬＫシグナル伝達を無効にするため、（ＡＴＰ）競合的キナーゼ阻害剤として作用する。本発明の発明者らは、クリゾチニブの高い有効性が、癌細胞の生存に関連するＡＬＫ以外の幾つかの標的による干渉に少なくとも部分的に起因し得ると仮定し、化学プロテオミクスによるクリゾチニブのプロファイルを開始した。特に、下記の実施例に示されるように、臨床的に極めて効率的なファーストインクラスの二重ＡＬＫ／ｃ−Ｍｅｔキナーゼ阻害剤クリゾチニブ（ザーコリ（登録商標））の潜在的に関連するオンターゲット又はオフターゲットを調査するために、本発明の発明者らは、幾つかの腫瘍細胞株を種々の遺伝子病変を用いて調査する化学プロテオミクスアプローチを適用した。幾つかのヒト腫瘍細胞株を調査することで、本発明の発明者らは驚くべきことに、突然変異体ＲＡＳによって誘導される悪性形質転換に関連付けられており、腫瘍が癌遺伝子誘導老化（ＯＩＳ）障壁を克服することを可能にすることが示されている予期せぬ非キナーゼ標的ヒトＭＴＨ１を含む、幾つかの未知のクリゾチニブのオフターゲットを同定した。
【００２６】
特に、下記の例示的な実施例で実証されるように、ラセミ型クリゾチニブによるＭＴＨ１触媒活性の阻害がｉｎ  ｖｉｔｒｏ発光ベース酵素アッセイにおいて確認することができ、低いナノモル効力が示された。ラセミ型クリゾチニブは、コメットアッセイによって実証されるようにＭＲＣ−５肺線維芽細胞におけるＤＮＡ損傷も誘導した。加えて、（Ｒ）−クリゾチニブではなく（Ｓ）−クリゾチニブがコメットアッセイにおいて顕著なテールモーメントをもたらした。同時に、細胞をクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーで処理した場合に、抗ＭＴＨ１  ｓｉＲＮＡで観察される効果と一致してＤＮＡ損傷の特異的マーカーである５３ＢＰ１の染色が増大した。ＭＴＨ１と発癌ＲＡＳの発現、活性酸素種（ＲＯＳ）、酸化的損傷及び腫瘍発生との強い関連性を考えると、本明細書で提示されるデータから驚くべきことにクリゾチニブ、好ましくはラセミ型クリゾチニブ、又はより好ましくはクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー等の小分子ＭＴＨ１阻害剤も、幾つかの多様なＡＬＫ陰性癌の治療に適用され得ることが示唆される。
【００２７】
「クリゾチニブ」という用語が「ＰＦ−２３４１０６６」としても知られ、化学物質３−[１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ]−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンの（Ｒ）−エナンチオマーに関することに留意されたい（例えば、Zou (2007) Cancer Res. 67: 4408-4417３、Cui (2011) J. Med. Chem. 54: 6342-6363９及びChristensen (2007) Mol Cancer Ther. 6: 3314-3322２３を参照されたい）。「クリゾチニブ」、「（Ｒ）−クリゾチニブ」及び「クリゾチニブの（Ｒ）−エナンチオマー」という用語は本明細書で区別なく使用される。簡潔に述べると、本明細書で使用される場合、「ラセミ型クリゾチニブ」又は「クリゾチニブのラセミ体」という用語は、化学物質３−[１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ]−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンのラセミ形態に関する。これと一致して、本明細書で使用される場合、「（Ｓ）−クリゾチニブ」及び「クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー」という用語は、化学物質３−[１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ]−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンの（Ｓ）−エナンチオマーに関する。
【００２８】
下記の例示的な実施例において実証されるように、ラセミ型クリゾチニブ、クリゾチニブの（Ｒ）−クリゾチニブ及び（Ｓ）−エナンチオマーのＭＴＨ１触媒活性を阻害する効力は著しく異なる。特に、ＭＴＨ１触媒活性の阻害を決定するアッセイにおいて、ラセミ型クリゾチニブについて決定されるＩＣ５０値は、エナンチオマー的に純粋な（Ｒ）−クリゾチニブについて観察されるものより約１０倍高かった。さらに、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーは（Ｒ）−クリゾチニブよりも１００倍超高い阻害効力を示した。明らかに、（Ｓ）−配座はアミノヘテロアリール化合物のＭＴＨ１に対する親和性の増大を示した。したがって、本発明において、驚くべきことにクリゾチニブ、より好ましくはラセミ型クリゾチニブ、更により好ましくはクリゾチニブの純粋な（Ｓ）−エナンチオマーがＲＡＳ誘導性癌の発生、進行及び維持に関連付けられていた酵素であるＭＴＨ１の極めて強力な阻害剤であることが実証された。
【００２９】
したがって、本発明は、本発明のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー等）がＭＴＨ１の生物活性（特に触媒活性）を効果的に阻害するという驚くべき発見をもたらす。ＭＴＨ１が突然変異体ＲＡＳによって誘導される悪性形質転換に関連付けられていたことを考えると、本発明の一態様は、本発明のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー等）を癌の治療及び／又は予防に使用することができることである。加えて、ＭＴＨ１の阻害は、癌のＡＬＫ状態及び／又はｃ−Ｍｅｔ状態とは無関係であることから、本発明の更なる態様は、本発明のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー等）をＡＬＫ陰性及び／又はｃ−Ｍｅｔ陰性癌の治療及び／又は予防に使用することができることである。
【００３０】
本明細書に記載されるように、本発明は、癌の治療及び／又は予防に使用される式（１）のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー等）、又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグに関する。本発明によると、治療及び／又は予防は治療対象の癌のＡＬＫ状態及び／又はｃ−Ｍｅｔ状態とは無関係である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】化学プロテオミクスのワークフローを示す図である（図１は、Superti-Furga (2012) Designing Multi-target Drugs, (eds. Richard Morphy and John Harris), Drug Discovery Series, Royal Society of Chemistry, Cambridge８（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）から引用した図を変更したものである）。
【図２】クリゾチニブ及び新たに合成された連結可能な誘導体の構造を示す図である。
【図３】両方のクリゾチニブエナンチオマーの化学構造を示す図である。
【図４】固定化された化合物のＡＬＫに結合するその能力に関する評価を示す図である。ＣｅＭＭ−１４６のみが、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において発現される両方のＡＬＫアイソフォームについて効果的に富化する。
【図５】同定されたクリゾチニブの相互作用物質を示す図である（表示は公式の遺伝子記号である）。キナーゼを円で示し、非キナーゼタンパク質を菱形で示す。
【図６】ＭＴＨ１阻害アッセイを示す図である。２つの異なるラセミ型クリゾチニブのバッチは、ＭＴＨ１触媒活性の阻害において光学的に純粋な（Ｒ）−クリゾチニブよりもおよそ１０倍強力である。対照的に、非特異的（promiscuous）ＢＣＲ−Ａｂｌキナーゼ阻害剤ボスチニブは顕著なＭＴＨ１阻害を全く示さない。
【図７】ＭＴＨ１阻害アッセイを示す図である。ラセミ型クリゾチニブから調製したＮ−アミノプロピル置換クリゾチニブ誘導体ＣｅＭＭ−１４６もＭＴＨ１触媒活性のナノモル阻害を示し、光学的に純粋な（Ｒ）−クリゾチニブよりも強力である。
【図８】ＭＴＨ１阻害アッセイを示す図である。ラセミ型クリゾチニブから調製されたＮ−アミノヘキシルカルボン酸誘導体ＣｅＭＭ−１４４は、およそ５００ｎＭのＩＣ５０値でＭＴＨ１触媒活性を阻害する。
【図９】ＭＴＨ１阻害アッセイを示す図である。ラセミ型クリゾチニブのピペリジン環でのＰＥＧベースのアミノアルキル置換基導入はＭＴＨ１阻害活性を妨げない。
【図１０】光学的に純粋な（Ｒ）−クリゾチニブ対ラセミ体について差次的ＭＴＨ１結合効力を示すＳＫ−ＥＳ−１ユーイング肉腫細胞溶解物のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図１１】ＭＴＨ１阻害アッセイを示す図である。クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーはＭＴＨ１触媒活性の低ナノモル阻害剤である。クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーは、（Ｒ）−エナンチオマー又はラセミ体と比較して顕著に低いＩＣ５０値をもたらし、（Ｓ）−配置が化合物の親和性を増大させることが示される。結果から少なくとも二連の実験（ｎ≧２）の代表的な技術的反復±ＳＥＭが示される。
【図１２】コロニー形成アッセイを示す図である。ＭＣＦ  ７（上）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（下）ヒト乳癌細胞を６−ウェルフォーマットで播種し、続いて指定濃度での薬物又はモック処理をプレーティングの２４時間後に行った。４週間後、細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色した。
【図１３】ＣｅＭＭ−１４４、ＣｅＭＭ−１４５及びＣｅＭＭ−１４６の調製を示す図である。
【図１４】クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの立体選択的調製を示す図である。試薬及び条件：（ａ）Ｐｈ３Ｐ、ＤＩＡＤ、ＴＨＦ、０℃、４時間；（ｂ）Ｆｅ、ＡｃＯＨ／ＥｔＯＨ、還流、１時間；（ｃ）ＮＢＳ、ＭｅＣＮ、０℃、１５分間；（ｄ）（Ｂｏｃ）２Ｏ、ＤＭＡＰ、ＤＭＦ、常温、１８時間；（ｅ）Ｐｄ（ｄｐｐｆ）２Ｃｌ２、ＫＯＡｃ、ＤＭＳＯ、８０℃、１８時間；（ｆ）Ｐｄ（Ｐｈ３Ｐ）２Ｃｌ２、Ｎａ２ＣＯ３、ＤＭＥ／Ｈ２Ｏ、８７℃、１６時間；（ｇ）脱保護（例えば４Ｎ  ＨＣｌ、１，４−ジオキサン／ＣＨ２Ｃｌ２、４０℃、１２時間）。
【図１５】ヒトＭＴＨ１に結合したクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの共結晶構造を示す図である。
【図１６】アミノヘテロアリールベースのＭＴＨ１阻害剤の好ましい構造的特徴を示すＭＴＨ１阻害剤ファーマコフォアを示す図である。
【図１７Ａ】ＳＷ４８０細胞に対するクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー対ＳＣＨ５１３４４の抗増殖有効性の比較を示す図である。
【図１７Ｂ】（Ｒ）−クリゾチニブ及びクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーによるＭＴＨ１のＩＴＣを示す図である。
【図１７Ｃ】クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーがＰＡＮＣ１（膵臓癌）及びＳＷ４８０（結腸癌）細胞のコロニー形成を阻害することを示す図である。
【図１８Ａ】コメットアッセイを示す図である。ＳＣＨ５１３４４及びクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの両方が一本鎖切断を誘導するが、（Ｒ）−クリゾチニブは誘導しない（陽性対照＝Ｈ２Ｏ２（１５０μＭ、１０分；ＭＴＭ、平均テールモーメント）。
【図１８Ｂ】ＳＷ４８０細胞における５３ＢＰ１フォーカス（foci）の増大を示す図である。
【図１８Ｃ】ヒトＭＴＨ１に結合したクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの共結晶構造を示す図である。水素結合相互作用は破線によって示される。
【図１８Ｄ】（Ｒ）−クリゾチニブ及びクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーとのＭＴＨ１相互作用を示す図である。左パネルは（Ｒ）−クリゾチニブを示し、細線はこの電子密度で分解されなかった（Ｒ）−クリゾチニブの部分を示す。右パネルはクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーを示し、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの非存在下での代替タンパク質配座をより濃い色で示す。
【図１８Ｅ】ＳＷ４８０マウス異種移植研究による結果を示す図である。上パネル：ＭＴＨ１阻害剤（Ｓ）−クリゾチニブ（すなわちクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー）による３５日間の処理（２５ｍｇ／ｋｇ  １日１回、毎日皮下）の腫瘍成長に対する効果（生存曲線はｐ＜０．０１で有意に異なる（マンテル−コックス検定））。下パネル：終了日（３５日間の処理）の腫瘍成長に対する効果（データは平均±ＳＥＭとして示す）。
【図１９】クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーが、（Ｒ）−クリゾチニブと比較して非特異的な細胞毒性の増大を全く示さないことを示す図である。対照的に、（Ｒ）−エナンチオマーは、コロニー形成アッセイにおいて非形質転換ＢＪ皮膚線維芽細胞の成長を低マイクロモル濃度で顕著に損なう。化合物を播種の２４時間後に細胞に添加し、プレートを１０日間インキュベートし、洗浄し、固定し、クリスタルバイオレットで染色した。画像は二連実験の代表的なものである。
【図２０】極めて強力な阻害剤（ＪＮＪ−３８８７７６０５）による薬理学的ｃ−Ｍｅｔキナーゼ阻害が、ＭＴＨ１阻害剤ＳＣＨ５１３４４及びクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーとは対照的にＫ−Ｒａｓ−突然変異ＳＷ４８０細胞の成長を抑制しないことを示す図である。
【図２１Ａ】ＭＴＨ１阻害剤ＳＣＨ５１３４４及びクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーがＳＷ４８０細胞における５３ＢＰ１フォーカスの数を増大させるが、（Ｒ）−クリゾチニブは増大させないことを示す図である。
【図２１Ｂ】同様に、ＭＴＨ１の一時的なノックダウンもＳＷ４８０細胞における５３ＢＰ１フォーカスの形成を誘導することを示す図である。
【図２２Ａ】クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーによるＭＴＨ１結晶構造の概要を示す図である。
【図２２Ｂ】図２２Ａと同様の結合部位ループを除くＭＴＨ１をカバーする分子表面を示す図である。
【図２３Ａ】１σで輪郭を付けた２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度図を示す（Ｒ）−クリゾチニブによるＭＴＨ１結晶構造を示す図である。
【図２３Ｂ】１σで輪郭を付けた２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度図を示すクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーによるＭＴＨ１結晶構造を示す図である。
【図２４】Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータのメタ分析を示す図である。ＭＴＨ１発現は上方調節されたＲａｓと強く相関し、これは肺癌及び結腸癌等のＲａｓ突然変異の保有率が高い癌が他の非関連癌型よりも高いＭＴＨ１レベルを発現することによっても反映される。
【図２５】化合物２−ｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（２−（（６−メトキシ−３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］キノリン−４−イル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（４）の合成を示す図である。文献（米国特許出願公開第５６０８０６７号）によると、水素化ナトリウム（３．３ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ、６０％分散液）をＮ−Ｂｏｃ−２，２’−（エチレンジオキシ）ジエチルアミン（７２３ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）に添加し、混合物を室温で２０分間撹拌した。４−クロロ−６−メトキシ−３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］キノリン（３）（Yang (2012) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 22, 235-239）（１８ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の添加の後、反応物を１１０℃に加熱し、一晩撹拌した。冷却後、水（５ｍＬ）を添加し、続いて酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／エタノール  １０：１）により帯黄色の結晶性固体が得られた。収率：１２．２ｍｇ（３７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １２．５０（ｓ，１Ｈ）、７．６４（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．５５（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．３０（ｄｄ，Ｊ＝９．３、２．７Ｈｚ，１Ｈ）、６．６８（ｓ，１Ｈ）、６．２１（ｓ，１Ｈ）、３．８８（ｓ，３Ｈ）、３．８２（ｑ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ）、３．６７（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ）、３．５５〜３．４９（ｍ，２Ｈ）、３．４４（ｄｄ，Ｊ＝５．９、３．５Ｈｚ，２Ｈ）、３．３５〜３．２９（ｍ，２Ｈ）、３．０１（ｑ，Ｊ＝１１．９、６．０Ｈｚ，２Ｈ）、２．７０（ｓ，３Ｈ）、１．３５（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ  ＥＳＩ  ｍ／ｚ（相対強度、％）  ３６０  ［Ｍ＋＋Ｈ］（１００）。  Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−６−メトキシ−３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］キノリン−４−アミン（２）。トリフルオロ酢酸（４０μＬ）をジクロロメタン（４ｍＬ）中の化合物４（８ｍｇ、ｙ  ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、混合物を室温で４５分間撹拌した。溶媒を除去した後、粗生成物をＭＰＬＣ（ジクロロメタン／メタノール  ９：１）によって精製し、黄色のろう様固体を得た。収率：３ｍｇ（４８％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １２．５３（ｓ，１Ｈ）、７．６５（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．５７（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．３１（ｄｄ，Ｊ＝９．３、２．７Ｈｚ，１Ｈ）、６．２５（ｓ，２Ｈ）、３．８９（ｓ，３Ｈ）、３．８３（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ）、３．６８（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ）、３．６１〜３．３７（ｍ，７Ｈ）、２．８３（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ）、２．７０（ｓ，３Ｈ）；ＭＳ  ＥＳＩ  ｍ／ｚ（相対強度、％）  ４６０［Ｍ＋＋Ｈ］（９７）、４０４（１００）、３６０（４７）。
【図２６】ＭＴＨ１の安定なノックダウンがＳＷ４８０細胞のコロニー形成を損なうことを示す図である。ＭＴＨ１の安定なノックダウンは、ＳＷ４８０細胞のコロニー形成を顕著に低減する。
【図２７】（Ｓ）−３−（１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エトキシ）−５−（１−（ピペリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）ピリジン−２−アミンの誘導体化が、（Ｓ）−５−（１−（１−（３−アミノプロピル）ピペリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−３−（１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エトキシ）ピリジン−２−アミンをもたらすことを示す図である。  図２７は、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル（３−（４−（３−（６−アミノ−５−（１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エトキシ）ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ピペリジン−１−イル）プロピル）カルバメートを示す。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  ７．７４（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．５８〜７．４６（ｍ，２Ｈ）、７．３０（ｄｄ，Ｊ＝８．９、４．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．０４（ｄｄ，Ｊ＝８．９、７．９Ｈｚ，１Ｈ）、６．８７（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ）、６．０７（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．７８（ｓ，２Ｈ）、４．１８〜４．０２（ｍ，１Ｈ）、３．４８（ｓ，１Ｈ）、３．２０（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、３．０５（ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，２Ｈ）、２．４７（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ）、２．２７〜１．９５（ｍ，６Ｈ）、１．８５（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）、１．７５〜１．６２（ｍ，２Ｈ）、１．４４（ｓ，９Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ：６０７（Ｍ＋Ｈ）。  図２７は、（Ｓ）−５−（１−（１−（３−アミノプロピル）ピペリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−３−（１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ）ピリジン−２−アミンを更に示す。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  ７．７６（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．６１〜７．４６（ｍ，２Ｈ）、７．３０（ｄｄ，Ｊ＝８．９、４．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．０４（ｄｄ，Ｊ＝８．９、７．９Ｈｚ，１Ｈ）、６．８７（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ）、６．０７（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．７６（ｓ，２Ｈ）、４．２０〜４．０１（ｍ，１Ｈ）、３．０７（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，２Ｈ）、２．８１（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ）、２．４７（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）、２．２３〜１．９４（ｍ，６Ｈ）、１．８５（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）、１．８０（ｓ，２Ｈ）、１．７３〜１．６３（ｍ，２Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ：５０７（Ｍ＋Ｈ）。
【図２８】抗癌特異性を示す図である。様々な同系ＢＪ線維芽細胞株を、コロニー形成アッセイにおいて幾つかの濃度のクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーで処理した。示されるように、調査した細胞株パネルは非形質転換（「野生型」）細胞、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）で不死化した細胞、ｈＴＥＲＴ及びＳＶ４０ラージＴ抗原（ＳＶ４０Ｔ）で形質転換した細胞、並びにｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０Ｔ及びＫＲＡＳ突然変異体Ｖ１２で形質転換した細胞を含むものであった。
【図２９】クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーによるＭＴＨ１触媒活性の阻害が基質依存性でないことを示す図である。図２９は、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーがＭＴＨ１による２−ＯＨ−ｄＡＴＰの加水分解も用量依存的に阻害することを示す。
【図３０】クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの活性に対するｐ５３／ｐ２１状態及びミスマッチ修復経路の影響を示す図である。図３０は、ｐ５３状態及び機能的ＭＬＨ１の存在又は非存在が、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの活性に影響を及ぼさないことを示す。しかしながら、ｐ２１の喪失はクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーによる処理に対するＨＣＴ１１６細胞の感度を増大するようである。
【図３１Ａ】ＭＴＨ１酵素機能がＤＮＡ中の８−オキソ−グアニンの含量を増大することを示す図である。（Ｓ）−クリゾチニブによるＢＪ線維芽細胞の処理は抗８−オキソ−グアニンマウスモノクローナル抗体の染色を増大させるが、（Ｒ）−クリゾチニブは増大させない。同時に、抗ＭＴＨ１  ｓｉＲＮＡについて観察される効果と一致してＤＮＡ損傷の特異的マーカーである５３ＢＰ１の染色が増大する。
【図３１Ｂ】ＭＴＨ１酵素機能がＤＮＡ中の８−オキソ−グアニンの含量を増大することを示す図である。（Ｓ）−クリゾチニブによるＢＪ線維芽細胞の処理は抗８−オキソ−グアニンマウスモノクローナル抗体の染色を増大させるが、（Ｒ）−クリゾチニブは増大させない。同時に、抗ＭＴＨ１  ｓｉＲＮＡについて観察される効果と一致してＤＮＡ損傷の特異的マーカーである５３ＢＰ１の染色が増大する。
【図３２】クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーがＤＮＡ修復機構を活性化し、活性化塩基除去修復（ＢＥＲ）により一本鎖切断の形成を誘導することを示す図である。クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーをアルカリコメットアッセイによって調査したが、これにより単一細胞電気泳動によるＤＮＡ一本鎖切断が明らかになる。ＳＷ４８０細胞を用い、両方の（Ｓ）−クリゾチニブがコメットアッセイにおいて顕著なテールモーメントをもたらすが、（Ｒ）−クリゾチニブはもたらさないことが見出された。また、ＤＮＡ損傷経路の活性化を示すＡＴＭリン酸化の増大が観察され、同様に（Ｓ）−クリゾチニブ特異的な効果が実証された。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の一実施形態は、
Ｒ１が−ＮＨ２、−ＯＨ又はＳＨであり、
Ｒ３がメチルであり、
ＹがＣＲ４であり、
Ｒ４が水素又はハロゲンであり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が各々独立してフッ素又は塩素であり、
Ｒ８が水素又は−Ａ−Ｂｎ−Ｘであり、ここで、
ＢがＣ１〜４アルキレン又は−（ＯＣＨ２ＣＨ２）−であり、
ｎが１、２又は３であり、
Ｘが−ＮＨ２である、
本発明の用途のために用いられる化合物、又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグに関する。
【００３３】
本発明の更なる実施形態は、Ｒ８が水素、
−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２、
−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２、又は、
−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２である、
本発明の用途のために用いられる化合物、又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグに関する。
【００３４】
本発明の別の実施形態は、式（２）〜（５）によって表される以下の化学構造：
【化３】
2015529665.tif 000006
2015529665.tif 000007
の１つを有する、本発明の用途のために用いられる化合物に関する。
【００３５】
本発明のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーを、被験体にファーマコフォア若しくは医薬組成物の使用における化合物自体として投与するか、又は薬剤として配合することができることも想定される。
【００３６】
したがって、本発明は、本発明の用途のために用いられる化合物と薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物に更に関する。したがって、本発明の一態様は、癌の治療及び／又は予防に使用される医薬組成物であって、本明細書で提示されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーと薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物に関する。
【００３７】
本発明の一態様は、被験体における癌の治療及び／又は予防に使用される、本明細書で提示されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーと薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物であって、治療及び／又は予防が上記被験体の癌細胞又は組織のＡＬＫ状態及び／又はｃ−Ｍｅｔ状態とは無関係である、医薬組成物に関する。上記ＡＬＫ状態はＡＬＫ生物活性のレベル及び／又はＡＬＫ発現のレベルであり得る。これと一致して、上記ｃ−Ｍｅｔ状態はｃ−Ｍｅｔ生物活性のレベル及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現のレベルであり得る。ＡＬＫ又はｃ−Ｍｅｔの生物活性のレベル又は発現のレベルを決定する方法は、本明細書で上記及び下記に記載している。
【００３８】
このため、治療対象の上記癌はＡＬＫ陰性（すなわち、活性化ＡＬＫ異常を有し得ない）及び／又はｃ−Ｍｅｔ陰性であり得る。本発明によると、上記の薬学的に許容可能な賦形剤は担体、希釈剤、充填剤、崩壊剤、平滑剤、結合剤、着色剤、顔料、安定剤、保存料又は酸化防止剤であり得る。
【００３９】
本明細書に記載されるように、本発明の一実施形態は、各々が式（１）〜（５）によって表される化学構造の１つを有する少なくとも２つの成分を含む、本発明の医薬組成物に関する。本発明の別の実施形態は、各々が式（２）〜（５）によって表される化学構造の１つを有する少なくとも２つの成分を含む、本発明の医薬組成物に関する。
【００４０】
上記に示したように、本発明は、被験体における癌の治療及び／又は予防に使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー及び医薬組成物に関する。本発明は、被験体における癌の治療及び／又は予防が該被験体の癌細胞又は組織のＡＬＫ状態及び／又はｃ−Ｍｅｔ状態とは無関係である、本発明の用途のために用いられる化合物又は本発明の医薬組成物に更に関する。このため、治療及び／又は予防対象の癌はＡＬＫ陰性（すなわち、活性化ＡＬＫ異常を有し得ない）及び／又はｃ−Ｍｅｔ陰性であり得る。
【００４１】
クリゾチニブは未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）及び肝細胞成長因子受容体キナーゼ（ｃ−Ｍｅｔ）の二重阻害剤である３。現在、クリゾチニブはＡＬＫ陽性腫瘍と診断された患者の治療にのみ使用されている。発癌ＡＬＫ活性の背後にある分子的損傷は、ＡＬＫ遺伝子増幅、突然変異又は染色体転座、例えばＥＭＬ４−ＡＬＫと関連し得る４。ＥＭＬ４−ＡＬＫは棘皮動物微小管関連タンパク質様４及びＡＬＫ遺伝子（ＥＭＬ４−ＡＬＫ）からなる発癌融合タンパク質である５。
【００４２】
上記に示したように、本発明において驚くべきことに、アミノヘテロアリール化合物（クリゾチニブ等）、好ましくはアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー等）がＭＴＨ１の生物活性を阻害することが可能であり、したがって癌のＡＬＫ状態及び／又はｃ−Ｍｅｔ状態とは無関係の被験体における癌の治療及び／又は予防にも使用することができることが見出された。したがって、本発明の更なる実施形態は、上記被験体の上記癌細胞又は組織がＡＬＫの遺伝子突然変異及び／又は染色体転座を有しない、本発明の用途のために用いられる化合物又は本発明の医薬組成物に関する。本発明の一態様は、上記染色体転座がＥＭＬ４−ＡＬＫである、本発明の用途のために用いられる化合物又は本発明の医薬組成物に関する。
【００４３】
この転座は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のおよそ３％〜１３％の腺癌において生じ、報告された一症例を除き、ＥＧＦＲ又はＫＲＡＳの突然変異とは相互排他的であると考えられる６。さらに、ＡＬＫ再構成が肺癌患者においてＲＡＳ又はＥＧＦＲファミリー遺伝子の突然変異と相互排他的であることが見出されたことから（Gainor (2013) Clinical Cancer Research 19, 4273-4281）、ＡＬＫキナーゼ阻害剤（Ｒ）−クリゾチニブはＫＲＡＳ又はＥＧＦＲに突然変異を有する患者の治療には好適でない。（Ｒ）−クリゾチニブ（ザーコリ（登録商標））に対する耐性を示した患者であってもＫＲＡＳ又はＥＧＦＲの突然変異を獲得しないように思われることに注目すべきであり（Gainor（前掲））、癌がＲＡＳ突然変異又はＥＧＦＲ発現の増大を有する患者を（Ｒ）−クリゾチニブ（ザーコリ（登録商標））で治療する論拠に欠けることが更に強調される。これと一致して、下記の例示的な実施例ではｃ−Ｍｅｔ阻害はＫＲＡＳ突然変異ＳＷ４８０細胞の成長を抑制しないことが示される。対照的に、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーはＳＷ４８０細胞の細胞成長をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおいて低減する。これらの結果から、クリゾチニブ（すなわち（Ｒ）−クリゾチニブ）とは対照的に、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーがＲＡＳ陽性癌の治療に有用であることが実証される。
【００４４】
驚くべきことに、下記の実施例においてクリゾチニブの純粋な（Ｓ）−エナンチオマーが従来技術ではＲＡＳ誘導性癌の発生、進行及び維持に関連付けられている酵素であるＭＴＨ１の極めて強力な阻害剤であることが実証された１３。従来技術では近年、ＥＧＦＲ及びＭＴＨ１の両方を抑制するマイクロＲＮＡ  ＭｉＲ−１４５がこれらの腫瘍において下方調節されるため、ＭＴＨ１が、ＥＧＦＲを発現する腺癌の有望な標的でもあり得ることが実証されていると述べられる３７。同様に従来技術において示されているように、ＭｉＲ−１４５の再発現はｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方でＥＧＦＲ及びＭＴＨ１の下方調節をもたらし、ＥＧＦＲ陽性細胞株の成長を損なった。加えて、下記の実施例に示されるように、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーは、どちらも活性化ＲＡＳ突然変異を有するヒト結腸腺癌細胞（ＳＷ４８０）及び膵臓癌細胞（ＰＡＮＣ１）のコロニー形成を効率的に阻害した。これらの結果と一致して、安定したＭＴＨ１のノックダウンはＳＷ４８０細胞のコロニー形成を顕著に低減した。さらに、本明細書に記載されるように、ヒト結腸腺癌細胞（ＳＷ４８０）を使用するマウス異種移植研究から、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーが腫瘍進行を損なうことが可能であることが実証された。特に、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの投与は５０％を超える腫瘍体積の低減をもたらした。同様にこの実験から明らかなように、動物が正常に挙動し、血液学的パラメーター又は体重の顕著な変化は観察されなかったため、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーは良好な耐容性を示す。
【００４５】
このため、本発明の一実施形態は、上記被験体の癌細胞又は組織が活性化ＲＡＳ突然変異及び／又は活性化ＥＧＦＲ突然変異を有する、本発明の用途のために用いられる化合物又は本発明の医薬組成物に関する。本発明の特定の一実施形態は、上記被験体の癌細胞又は組織が活性化ＲＡＳ突然変異を有する、本発明の用途のために用いられる化合物又は本発明の医薬組成物に関する。上記活性化ＲＡＳ突然変異は活性化ＫＲＡＳ突然変異（例えばＧ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ又はＧ１２Ｃ）であり得る。突然変異体ＲＡＳで形質転換した細胞を標的化ＭＴＨ１で処理することで、従来技術と一致して、突然変異体ＲＡＳによる細胞の形質転換がＲＯＳの産生の増大をもたらし得ることが示される１２。正常細胞については、ＲＯＳによって引き起こされる酸化的損傷は、癌細胞を休止又は老化（ＯＩＳ）、最終的にアポトーシスの状態にし得る。老化を克服するために、ＲＡＳ形質転換細胞は細胞を酸化的ＤＮＡ損傷から保護するＭＴＨ１を上方調節する。例えば、従来技術ではＨＲＡＳをトランスフェクトしたヒト皮膚線維芽細胞は老化を受けるが、この表現型がＭＴＨ１の同時過剰発現により奪回されると記載されている１２。その結果として、ＭＴＨ１抑制は突然変異体ＲＡＳを発現する癌細胞において増殖欠損を引き起こし得る１３。ＭＴＨ１−／−ノックアウトマウスは非常に軽度の表現型を示すため１４、小分子によるＭＴＨ１の標的化は治療が困難なＲＡＳ突然変異癌に対する新規の良好な耐容性を示す治療選択をもたらし得る。実際に、同様に下記の実施例で示されるように、臨床的に使用されるクリゾチニブの（Ｒ）−エナンチオマーは非形質転換細胞に対してクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーよりも高い毒性を示した。これと一致し、同様に下記の例示的な実施例に示されるように、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーは形質転換細胞と比較して野生型細胞又はテロメラーゼによってのみ不死化される細胞に対する毒性が低い。この結果からクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの癌特異的効果が強調される。
【００４６】
活性化ＲＡＳ  ＧＴＰアーゼシグナル伝達は発癌形質転換及び悪性疾患の重要な誘導因子である（Pylayeva-Gupta (2011) Nat Rev Cancer 11, 761-774）。約２０％〜３０％のヒト癌が１つのＲＡＳアイソフォームに突然変異を含有し（Parada (1982) Nature 297, 474-478; Der (1982) Proceedings of the National Academy of Sciences 79, 3637-3640）、予後不良及び低い全生存率を伴い、新たな阻害剤を同定する緊急の必要性が強調される。しかしながら、ＲＡＳタンパク質はその構造のために小分子に対して不良な標的である。代替的に、ＲＡＳ依存性癌の細胞モデルは従来技術においてＳＣＨ５１３４４等の特異的阻害剤の開発に使用されてきたが、分子標的は依然として殆ど謎である（Kumar (1995) Cancer Research 55, 5106-5117）。小分子によるＲＡＳ活性の直接的な変調は創薬において大きな難題となっている。したがって、例えば翻訳後修飾、例えばパルミトイル化によって調節されるＲＡＳプロセシングを妨げるため、活性タンパク質の成熟及び血漿膜への転座を防ぐために、代替アプローチが従来技術では用いられている（Xu (2012) Blood 119, 1032-1035; Dekker (2010) Nat Chem Biol 6, 449-456）。これらの標的化アプローチに加えて、表現型スクリーニングが従来技術ではＲＡＳ形質転換癌細胞を選択的に標的とするが、非形質転換細胞の成長には影響を及ぼさない小分子を検索するために用いられてきた（Yagoda  (2007) Nature 447, 865-869）。かかる戦略の利益は、活性化合物が癌細胞に対するその特異性及びその細胞活性に基づいて既に選択されていることである。１９９５年には、このアプローチによりＲＡＳ形質転換線維芽細胞並びにヒト結腸癌及び膵臓癌細胞株の定着非依存性成長を抑制するＳＣＨ５１３４４と呼ばれるピラゾロキノリン化合物が発見された（Kumar (1995) Cancer Research 55, 5106-5117）。重大なことには、下記の実施例で実証されるように、本明細書に提示されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（例えばクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー）は、ＲＡＳ依存性癌細胞の治療において化合物ＳＣＨ５１３４４よりも著しく効果的である。
【００４７】
幾つかのタンパク質が損傷ＤＮＡの修復において役割を果たす。これらのタンパク質としては、ＤＮＡリガーゼ、ＰＣＮＡ（スライディングクランプ）並びにｐ５３、ｐ２１及びＭＬＨ１が挙げられる。モデル系における研究から、ＭＴＨ１抑制の抗増殖効果が、既知の腫瘍抑制遺伝子であるｐ５３に依存し得ることが示された（Rai (2009) Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 169-174、Rai (2010) Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 703, 71-81）。特に、ｐ５３機能の喪失がＭＴＨ１遺伝子サイレンシングによる老化誘導を防ぐことが実証された。したがって、機能的ｐ５３シグナル伝達を有する患者は好ましくはＭＴＨ１阻害剤による治療から利益を得るようである。しかしながら、下記の例示的な実施例から、ｐ５３状態及び機能的ＭＬＨ１の存在又は非存在がクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの活性に影響を及ぼさないことが示される。しかしながら、ｐ２１の喪失は、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーによる治療に対する癌細胞（例えばＨＣＴ１１６細胞）の感度を増大する。したがって、非機能的ｐ２１シグナル伝達を有する患者は好ましくは本発明のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーによる治療から利益を得るようである。このため、本発明の一態様は、被験体の癌細胞又は組織においてｐ２１の生物活性及び／又は発現が低減又は欠如している、上記被験体における癌の治療及び／又は予防に使用される本明細書に提示されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー又は本明細書に記載の医薬組成物に関する。この点で、「低減した」という用語はｐ２１の生物活性及び／又はｐ２１の発現が、健常対照被験体（例えば健常対照者）の細胞又は組織サンプルにおけるｐ２１の生物活性又は発現と比較して低減していることを意味する。ヒトｐ２１はサイクリン−ＣＤＫ２及びサイクリン−ＣＤＫ４複合体を阻害し、Ｇ１期における細胞周期進行を調節する。ｐ２１発現の低減は前立腺、膀胱及び食道の癌を含む様々なヒト癌に関与する。腫瘍抑制因子ｐ２１は、主にサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）ＣＤＫ２及びＣＤＫ１（ＣＤＣ２としても知られる）に結合し、キナーゼ活性を阻害することによってその様々な生物活性を媒介する。このため、ｐ２１の生物活性を決定するために、ＣＤＫ２又はＣＤＫ１のキナーゼ活性を阻害する精製ｐ２１の能力を決定してもよい。ＣＤＫ活性（例えばＣＤＫ２の活性）は、放射性標識ＡＴＰを用いて基質リン酸化を決定することによってモニタリングすることができる。例えば、Ｃｄｋ２活性の測定のために、PerkinElmerの［３３Ｐ］ＡＴＰシンチレーション近接アッセイを使用することができる（例えば、http://www.perkinelmer.com/pages/020/proximitynews/enzymes/measurementofcdk2.xhtmlを参照されたい）。ｐ２１の発現は例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＴ又はウエスタンブロット法によって決定することができる。
【００４８】
本発明の一実施形態では、本明細書で提供されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー又は医薬組成物で治療される被験体の癌細胞又は組織は、遺伝子構成ｐ２１＋／−を有する（すなわち、ｐ２１の一方の対立遺伝子が欠失又は不活性化している）。本発明の別の実施形態では、上記癌細胞又は組織は遺伝子構成ｐ２１−／−を有する（すなわち、ｐ２１の両方の対立遺伝子が欠失又は不活性化している）。
【００４９】
上記のように、本発明は、被験体における癌の治療及び／又は予防に使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーに関する。本発明の一態様は、上記被験体が哺乳動物である、本発明の用途のために用いられる化合物又は本発明の医薬組成物に関する。本発明の更なる態様は、上記哺乳動物がヒト患者である、本発明の用途のために用いられる化合物又は本発明の医薬組成物に関する。
【００５０】
本明細書に記載され、下記の実施例で説明されるように、クリゾチニブ、好ましくはラセミ型クリゾチニブ、より好ましくはクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー、及びその構造的誘導体をＡＬＫ／Ｍｅｔ誘導性肺癌を除く様々な異なる腫瘍型だけでなく、ＲＡＳ誘導性結腸癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、ユーイング肉腫等の治療にも適用することができることが見出された。本明細書で示されるように、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーはＲＡＳ依存性癌細胞の成長及び進行を効率的に阻害する。したがって、活性化ＲＡＳ突然変異を有する癌を治療及び／又は予防するために本発明のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーの使用が優先される。この癌は例えば結腸癌であり得る。したがって、本発明の一実施形態は、前記癌が結腸癌、肺癌、乳癌、白血病、リンパ腫、皮膚癌、肝臓癌、膵臓癌、脳腫瘍、腎臓癌、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、前立腺癌、膀胱癌及び食道癌からなる群から選択される、本発明の用途のために用いられる化合物、又は本発明の医薬組成物に関する。
【００５１】
三種陰性乳癌細胞株は酸化的ＤＮＡ損傷に感受性が高く、この損傷はこれらの癌をＰＡＲＰ阻害剤等の他の化学療法剤に感受性にし得ることが従来技術において示されている１８。したがって、酸化的ＤＮＡ病変を誘導すると考えられているＭＴＨ１阻害剤を用いてこれらの腫瘍型を治療することができる。加えて、幾つかの乳癌型で突然変異しているＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２遺伝子が８−オキソ−グアニンベースの病変を含む酸化的ＤＮＡ損傷の修復に関与することが報告されている１７，３９。その結果として、本発明の一態様は、これらの腫瘍を標的とする本明細書で特定されたＭＴＨ１阻害剤の使用に関する。これに関連して、ＭＴＨ１阻害剤もＰＡＲＰ阻害剤等の他の標準治療薬剤と協同し得る。このため、ＭＴＨ１阻害剤を乳癌、好ましくは三種陰性乳癌の治療及び／又は予防に使用することが本発明において想定される。したがって、本発明は、被験体における乳癌の治療及び／又は予防のための本発明の用途のために用いられる化合物又は本発明の医薬組成物に更に関する。本発明の一実施形態は、上記乳癌がエストロゲン受容体−α及びプロゲステロン受容体の発現を欠いており、ＨＥＲ２／ＮＥＵ癌遺伝子の過剰発現又は増幅を欠いている（すなわち三種陰性乳癌）、本発明の用途のために用いられる化合物又は本発明の医薬組成物に関する。本発明の特定の態様は、上記乳癌がＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２遺伝子突然変異を有する、本発明の用途のために用いられる化合物又は本発明の医薬組成物に関する。本発明の用途のために用いられる化合物又は本発明の医薬組成物による治療及び／又は予防対象の乳癌又は肺癌は更にＥＧＦＲ依存性であり得る。
【００５２】
ＭＴＨ１抑制の生理的効果に基づくと、ＭＴＨ１阻害剤は放射線療法及び／又は化学療法剤、好ましくはＤＮＡ損傷化合物、ＤＮＡ修復機構を妨げる化合物、又はＲＯＳの産生を誘導するか若しくはＲＯＳの除去を阻害する化合物と協同するようである。
【００５３】
したがって、本発明の一実施形態は、前記化合物又は医薬組成物を放射線及び／又は化学療法剤とともに同時投与する、本発明の用途のために用いられる化合物、又は本発明の医薬組成物に関する。本発明の一態様は、前記化学療法剤がＤＮＡ損傷薬、アルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡに酸化的損傷をもたらす薬剤、細胞毒性化合物、代謝拮抗物質、ＤＮＡ修復機構を妨げる化合物、ＡＴＭキナーゼ阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害剤、ＣＨＫ１／２キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ阻害剤、一般的塩基除去修復阻害剤、ＤＮＡポリメラーゼβ阻害剤、Ｏ−６−メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）阻害剤、スルビビン抑制剤、活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する化合物、抗有糸分裂化合物又は以上のいずれかの組合せである、本発明の用途のために用いられる化合物又は本発明の医薬組成物に関する。上記に示したように、本発明の用途のために用いられる化合物又は本発明の医薬組成物は化学療法剤とともに同時投与することができる。本発明の好ましい態様は、上記化学療法剤がＰＡＲＰ阻害剤及び／又はＥＧＦＲ阻害剤である、本発明の用途のために用いられる化合物又は本発明の医薬組成物に関する。しかしながら、ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はＥＧＦＲ阻害剤に加えて、幾つかの他の化学療法薬を本発明の化合物又は本発明の医薬組成物とともに同時投与することができる。したがって、本発明の別の態様は、前記化学療法剤がシクロホスファミド、テモゾロマイド、メルファラン、カルムスチン、ブスルファン、シスプラチン、プロカルバジン、アントラサイクリン、カンプトテシン、イリノテカン、エトポシド、過酸化水素、レゾルシノール、キノン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、オラパリブ、ＡＢＴ−８８８、ネオカルジノスタチン、ブレオマイシン、デシタビン、５−アザシトシン、メトキシアミン塩酸塩（ＴＲＣ１０２）、ロメグアトリブ、ピペルロングミン、ケルセチン、ビンクリスチン、タキソール、ミトキサントロン、ＹＭ１５５、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ又は以上のいずれかの組合せである、本発明の用途のために用いられる化合物、又は本発明の医薬組成物に関する。したがって、本明細書に記載されるように、本明細書で規定されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーは、アルキル化剤等のＤＮＡ損傷薬（例えばシクロホスファミド、テモゾロマイド、メルファラン、カルムスチン、ブスルファン、シスプラチン、プロカルバジン等）、ＤＮＡインターカレーター（例えばアントラサイクリン）又はトポイソメラーゼ阻害剤（例えばカンプトテシン、イリノテカン、エトポシド）、ＤＮＡに酸化的損傷をもたらす薬剤（例えば過酸化水素、レゾルシノール、キノン）、他の細胞毒性化合物（例えばメトトレキサート、５−フルオロウラシル、サリドマイド及びその類似体、ネオカルジノスタチン、ブレオマイシン、デシタビン、５−アザシトシンを含む代謝拮抗物質）、ＤＮＡ修復機構を妨げる化合物（例えばＡＴＭ−、ＡＴＲ−又はＣＨＫ１／２キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ＤＮＡ���存性タンパク質キナーゼ阻害剤、メトキシアミン塩酸塩（ＴＲＣ１０２）等の一般的な塩基除去修復阻害剤、ＤＮＡポリメラーゼβ阻害剤、Ｏ−６−メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）阻害剤（例えばロメグアトリブ）、活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する化合物（例えばピペルロングミン、ケルセチン）、ビンクリスチン又はタキソール等の抗有糸分裂化合物、ＥＧＦＲ阻害剤（例えばエルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ）、並びにミトキサントロン及びＹＭ１５５を含む幾つかの化学療法薬とともに同時投与することができる。
【００５４】
本明細書に提示されるように、クリゾチニブ、より好ましくはラセミ型クリゾチニブ、更により好ましくはクリゾチニブの純粋な（Ｓ）−エナンチオマーはＭＴＨ１の極めて強力な阻害剤である。これはａ）ＭＴＨ１の小分子阻害剤がこれまでに報告されていないため、ｂ）クリゾチニブで治療される患者がそのｃ−Ｍｅｔ発現状態又はより好ましくはＡＬＫ発現状態により選択されるが、ＭＴＨ１が考慮されないため、及びｃ）下記の実施例で実証されるように、クリゾチニブのピペリジン窒素でのアミノアルキル置換基の導入がＡＬＫ及びＭＴＨ１阻害の両方に関して良好な耐容性を示すために特に興味を持たれている。後者の発見から国際公開第２００８／０５３１５７号、国際公開第２００６／０２１８８１号、国際公開第２００６／０２１８８６号及び国際公開第２００６／０２１８８４号に開示の化合物が強力であり、生物が利用可能なＭＴＨ１阻害剤であることも示唆される。したがって、本発明の一態様はＭＨＴ１を阻害し、それにより癌を治療及び／又は予防するための国際公開第２００８／０５３１５７号、国際公開第２００６／０２１８８１号、国際公開第２００６／０２１８８６号及び国際公開第２００６／０２１８８４号に開示の化合物の使用に関する。
【００５５】
本明細書に記載されるように、アミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーがＭＴＨ１の生物活性を効果的に阻害することが見出されている。したがって、本発明の化合物は、癌、特にＭＴＨ１が癌の発生及び／又は癌の進行に関与する癌の治療及び／又は予防に使用することができる。ＭＴＨ１が癌の発生及び／又は進行に関与するか否かを決定するために、ＭＴＨ１の状態（例えば遺伝子構成、発現及び／又は活性）を分析することができる。癌のＭＴＨ１状態は、該癌の発生及び／又は進行へのＭＴＨ１の関与の適切な指標である。したがって、癌患者をそのＭＴＨ１状態に関して層別化することが本発明の更なる態様である。
【００５６】
したがって、本発明の更なる実施形態は、本発明の用途のために用いられる化合物、又は本発明の医薬組成物の有効性を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）被験体から細胞又は組織サンプルを得る工程と、
（ｂ）前記被験体のＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１状態を決定する工程と、
を含み、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１陽性細胞又は組織サンプルが効果的な癌の治療及び／又は予防の指標となる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００５７】
このｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法の一態様では、前記ＮＵＤＴ／ＭＴＨ１状態がＭＴＨ１生物活性のレベル及び／又はＭＴＨ１発現のレベルである。ＭＴＨ１生物活性のレベルは、ＭＴＨ１を上記被験体に由来する上記細胞又は組織サンプルから精製し、ＭＴＨ１媒介８−オキソ−ｄＧＴＰ加水分解によって生成するＰＰｉの産生を測定することによってモニタリングすることができる。特に、精製ＭＴＨ１を８−オキソ−ｄＧＴＰと接触させ、ＰＰｉＬｉｇｈｔ無機ピロリン酸アッセイ（Lonza Rockland Inc.）を用いてＰＰｉの産生を測定することができる。本明細書に記載のクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー又は本明細書に記載の医薬組成物が癌患者の治療に好適であるか否かを決定するために、上記癌患者のサンプルにおけるＭＴＨ１のＭＴＨ１生物活性のレベル（すなわち産生されるＰＰｉの量）を、健常対照者のサンプルにおけるＭＴＨ１のＭＴＨ１生物活性のレベル（すなわち産生されるＰＰｉの量）と比較することができる。癌患者の細胞又は組織サンプルは、ＭＴＨ１生物活性のレベル（すなわち産生されるＰＰｉの量）が健常対照者のサンプルと比較して癌患者のサンプルで高い場合に「ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１陽性」である。この場合、本明細書に記載のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー又は本明細書に記載の医薬組成物は上記癌患者の治療に好適である。
【００５８】
ＭＴＨ１発現のレベルは、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＴ又はウエスタンブロット法によって決定することができる。細胞又は組織サンプルは、ＭＴＨ１の発現（すなわちＭＴＨ１  ｍＲＮＡ又はＭＴＨ１タンパク質の量）が健常対照者のサンプルと比較して癌患者のサンプルで高い場合に「ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１陽性」である。この場合、本明細書に記載のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー又は本明細書に記載の医薬組成物は上記癌患者の治療に好適である。加えて、下記により詳細に記載されるように、ＭＴＨ１状態の決定には幾つかの他の検出方法を適用することができる。
【００５９】
本発明の一態様は、
（ｃ）前記被験体のＲＡＳ状態を決定する工程、
を更に含み、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１に対して陽性かつ活性化ＲＡＳ突然変異に対して陽性の細胞又は組織サンプルが、効果的な癌の治療及び／又は予防の指標となる、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。したがって、これに関連して、「ＲＡＳ状態」という用語は活性化ＲＡＳ突然変異の存在に関する。
【００６０】
したがって、本発明の一態様は、
（ｃ）前記細胞又は組織サンプルが活性化ＲＡＳ突然変異を有するか否かを決定する工程、
を更に含み、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１に対して陽性かつ活性化ＲＡＳ突然変異に対して陽性の細胞又は組織サンプルが、効果的な癌の治療及び／又は予防の指標となる、前記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００６１】
活性化ＲＡＳ突然変異はＲＡＳの活性化異常である。特に、活性化ＲＡＳ突然変異はＲＡＳの生物活性（すなわち触媒活性）の増大をもたらすＲＡＳにおける突然変異に関する。当業者であれば幾つかの活性化ＲＡＳ突然変異を知ることが容易である。活性化ＲＡＳ突然変異の例は、例えばＫＲＡＳのＧ１２突然変異（例えばＧ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ又はＧ１２Ｃ）又はＫＲＡＳのＱ６１突然変異（例えばＱ６１Ｈ）である。これらの突然変異は例えばシークエンシングによって決定することができる。多数の活性化ＲＡＳ突然変異の更なる例も本明細書で下記に提示される。
【００６２】
上述のように、本発明において、驚くべきことにｐ２１の喪失がクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーによる治療に対する癌細胞の感度を増大することが特定された。したがって、本明細書に提示されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、
（ｄ）前記細胞又は組織サンプルにおいてｐ２１の発現及び／又は生物活性が低減又は欠如しているか否かを決定する工程、
を更に含むことができ、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１に対して陽性であり、ｐ２１の発現及び／又は生物活性が低減又は欠如している細胞又は組織サンプルが、効果的な癌の治療及び／又は予防の指標となる。
【００６３】
本発明において、驚くべきことに、本発明の用途のために用いられる化合物を用いた癌の効果的な治療が患者のＡＬＫ状態及び／又はｃ−Ｍｅｔ状態とは無関係であることが特定された。このため、具体的な一態様では、本発明は、
（ｄ）被験体のｃ−Ｍｅｔ状態を決定する工程、及び／又は、
（ｅ）被験体のＡＬＫ状態を決定する工程、
を更に含み、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１に対して陽性かつｃ−Ｍｅｔに対して陰性の細胞又は組織サンプルは効果的な治療の指標となり、及び／又はＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１に対して陽性かつＡＬＫに対して陰性の細胞又は組織サンプルは効果的な癌の治療及び／又は予防の指標となる、上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００６４】
本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法において得られる細胞又は組織サンプルは、癌患者から得られる癌細胞又は組織サンプルであり得る。したがって、本発明の更なる実施形態は、上記細胞又は組織サンプルが癌細胞又は組織である、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。ＭＴＨ１、ＲＡＳ、ｃ−Ｍｅｔ及び／又はＡＬＫの状態の決定のために、幾つかの検出法を適用することができる。したがって、本発明の一態様は、工程（ｂ）及び／又は（ｃ）がＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、遺伝子シークエンシング、ＡＲＭＳ（増幅不応性突然変異系）、ペプチド核酸−ロックド核酸（ＰＮＡ−ＬＮＡ）ＰＣＲクランプ、ＰＣＲ−インベーダー、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ＰＣＲ／ＨＲＭＡ／ｄＨＰＬＣ、ＰＣＲ／ｆＩＲＦＬＰ、蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ＲＴ−ＰＣＲ、遺伝子アレイ及び遺伝子チップからなる群から選択される少なくとも１つの検出方法を含む、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。本発明の別の態様は、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び／又は（ｅ）がＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、遺伝子シークエンシング、ＡＲＭＳ（増幅不応性突然変異系）、ペプチド核酸−ロックド核酸（ＰＮＡ−ＬＮＡ）ＰＣＲクランプ、ＰＣＲ−インベーダー、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ＰＣＲ／ＨＲＭＡ／ｄＨＰＬＣ、ＰＣＲ／ｆＩＲＦＬＰ、蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ＲＴ−ＰＣＲ、遺伝子アレイ及び遺伝子チップからなる群から選択される少なくとも１つの検出方法を含む、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。これらの方法は当該技術分野で既知であり、本明細書で下記にも記載されている。
【００６５】
本明細書に提示されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、癌患者がアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーによる治療から利益を得るか否かを評価するために、本明細書に記載のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーを投与する前に行うことができる。したがって、かかる治療を必要とする被験体において癌を治療及び／又は予防する方法であって、
（ｉ）上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を行うことと、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られる結果が癌の効果的な癌の治療及び／又は予防の指標となる場合に、上記被験体に有効量の本明細書に提示されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーを投与することと、
を含む、方法が本明細書に提示される。
【００６６】
このため、本発明は、かかる治療を必要とする被験体において癌を治療及び／又は予防する方法であって、
（ａ）上記被験体から細胞又は組織サンプルを得ることと、
（ｂ）被験体のＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１状態を決定することと、
（ｃ）任意に、被験体のＲＡＳ状態を決定することと、
（ｄ）任意に、上記細胞又は組織サンプルにおいてｐ２１の発現及び／又は生物活性が低減又は欠如しているか否かを決定することと、
を含み、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１に対して陽性であり、任意に活性化ＲＡＳ突然変異に対して陽性であり、任意にｐ２１の発現及び／又は生物活性が低減又は欠如している細胞又は組織サンプルが、上記被験体における効果的な癌の治療及び／又は予防の指標となる、方法を提供する。
【００６７】
本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は適切なキットを用いて実現することができる。したがって、本発明の別の実施形態は、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を行うためのキットであって、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１を検出することが可能なポリヌクレオチド及び／又は抗体を含む、キットに関する。一態様では、本発明は、ＲＡＳを検出することが可能なポリヌクレオチド及び／又は抗体を更に含む上記キットに関する。キットはＡＬＫ及び／又はｃ−Ｍｅｔを検出することが可能なポリヌクレオチド及び／又は抗体を付加的に含んでいてもよい。キットは、ｐ２１を検出することが可能なポリヌクレオチド及び／又は抗体を更に含み得る。ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、ＲＡＳ、ＡＬＫ、ｃ−Ｍｅｔ及びｐ２１の検出のための幾つかのポリヌクレオチド及び抗体が当該技術分野で既知であり、本明細書の下記にも提示される。
【００６８】
したがって、本発明は、本発明の用途のために用いられる化合物又は本発明の医薬組成物の有効性を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を行うためのキットであって、該方法が、
（ａ）被験体から細胞又は組織サンプルを得る工程と、
（ｂ）被験体のＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１状態を決定する工程と、
を含み、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１陽性細胞又は組織サンプルが効果的な癌の治療及び／又は予防の指標となる、キットに関する。
【００６９】
本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関連して開示される実施形態は、本発明のキットに変更すべきところは変更して適用される。
【００７０】
有利に、本発明のキットは、任意に（ａ）反応バッファー（複数の場合もあり）、貯蔵溶液、洗浄溶液及び／又は本明細書に記載されるアッセイの実施に必要とされる残りの試薬又は材料を更に含む。さらに、本発明のキットの部品はバイアル若しくはボトルに、又は容器若しくはマルチコンテナ単位の組合せで個々にパッケージングすることができる。これらのバイアル／ボトル／容器又はマルチコンテナは、本明細書に記載されるようなポリヌクレオチド及び／又は抗体に加えて貯蔵のための保存料又はバッファーを含んでいてもよい。加えて、キットは使用説明書を含んでいてもよく、特にキットは患者のＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１状態、任意に同様に患者のＲＡＳ状態、ＡＬＫ状態及び／又はｃ−Ｍｅｔ状態の決定を行うための取扱説明書を含んでいてもよい。
【００７１】
本発明のキットは、とりわけ本明細書に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を行うために有利に使用することができ、及び／又は様々な更なる用途に、例えば診断キット、研究ツール又は治療ツールとして用いることができる。加えて、本発明のキットは、科学的目的、医療目的及び／又は診断目的に好適な検出のための更なる手段を含み得る。本発明のキットの製造は、当業者に既知の標準手順に従うのが好ましい。
【００７２】
本発明の更なる実施形態は、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法におけるキットの使用であって、該キットがＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１を検出することが可能なポリヌクレオチド及び／又は抗体を含む、使用に関する。本発明は、キットがＲＡＳを検出することが可能なポリヌクレオチド及び／又は抗体を更に含む上記使用に更に関する。加えて、本発明は、キットがＡＬＫ及び／又はｃ−Ｍｅｔを検出することが可能なポリヌクレオチド及び／又は抗体を更に含む上記使用にも関する。さらに、本明細書に提示されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法における本明細書に記載のキットの使用であって、該キットがｐ２１を検出することが可能なポリヌクレオチド及び／又は抗体を更に含む、使用が本明細書に提示される。
【００７３】
本発明において、驚くべきことに、ＭＴＨ１がアミノヘテロアリール化合物（クリゾチニブ等）の新規の標的になることが特定された。さらに、下記の例示的な実施例では、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの標的を同定するスクリーニング方法を、突然変異体ＫＲＡＳを発現する結腸癌細胞株であるＳＷ４８０細胞において行う。得られる結果から、ＭＴＨ１（遺伝子名ＮＵＤＴ１）がクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの主な標的であることが明らかに実証され、化合物の特異性が強調される。したがって、本発明は、アミノヘテロアリール化合物の標的を同定するスクリーニング方法に更に関する。
【００７４】
このため、本発明の一実施形態は、式（６）によって表される以下の化学構造：
【化４】
2015529665.tif 000008
（式中、
Ｒ１は−ＮＨ２、−ＮＲ２Ｈ、−ＯＨ又は−ＳＨであり、
Ｒ２はＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル又はＣ２〜６アルキニルであり、
Ｒ３はＣ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、Ｃ２〜３アルキニル又はシクロプロピルであり、
ＹはＮ又はＣＲ４であり、
Ｒ４は水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル又はＣ３〜６シクロアルキルであり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は各々独立してフッ素、塩素、臭素又はヨウ素であり、
Ｒ８は水素又は−Ａ−Ｂｎ−Ｘであり、ここで、
Ａは単結合、−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−であり、
ＢはＣ１〜４アルキレン、Ｃ２〜４アルケニレン又は−（ＯＣＨ２ＣＨ２）−であり、
ｎは０、１、２、３、４又は５であり、
Ｘは−ＮＨＲ２、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＯＨ又はＯ−アルキルである）、
を有するアミノヘテロアリール化合物、又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグの標的を同定するスクリーニング方法であって、
（ａ）細胞溶解物を得る工程と、
（ｂ）前記アミノヘテロアリール化合物と前記細胞溶解物とを接触させる工程と、
（ｃ）分子が前記アミノヘテロアリール化合物に結合するか否かを決定する工程と、
を含み、分子が前記アミノヘテロアリール化合物に結合することが見出された場合に、かかる分子を該アミノヘテロアリール化合物の標的として同定する、スクリーニング方法に関する。
【００７５】
本発明の一態様は、式（６）の化合物において、
Ｒ１が−ＮＨ２、−ＯＨ又は−ＳＨであり、
Ｒ３がメチルであり、
ＹがＣＲ４であり、
Ｒ４が水素又はハロゲンであり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が各々独立してフッ素又は塩素であり、
Ｒ８が水素又は−Ａ−Ｂｎ−Ｘであり、ここで、
ＢがＣ１〜４アルキレン又は−（ＯＣＨ２ＣＨ２）−であり、
ｎが１、２又は３であり、
Ｘが−ＮＨ２である、
本発明のスクリーニング方法に関する。
【００７６】
本発明の更なる態様は、式（６）の化合物において、
Ｒ８が水素、
−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２、
−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２、又は、
−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２である、
本発明のスクリーニング方法に関する。
【００７７】
本発明の別の態様は、上記化合物、又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグが、式（７）〜（１０）によって表される以下の化学構造：
【化５】
2015529665.tif 000009
2015529665.tif 000010
の１つを有する、本発明のスクリーニング方法に関する。
【００７８】
両方のエナンチオマーを考慮する本明細書で規定されるアミノヘテロアリール化合物の完全なインタラクトームを評価するために、アミノヘテロアリール化合物のラセミ形態を使用することができる。しかしながら、（Ｒ）−又は（Ｓ）−エナンチオマー配座のアミノヘテロアリール化合物を使用することも想定される。しかしながら、本発明において、（Ｒ）−エナンチオマー配座よりも（Ｓ）−エナンチオマー配座を使用することがより好ましい。したがって、本発明の特定の一実施形態は、上記アミノヘテロアリール化合物が（Ｓ）−エナンチオマー配座にある、本発明のスクリーニング方法に関する。したがって、本発明のスクリーニング方法に適用される上記アミノヘテロアリール化合物は、本明細書で規定されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーであり得る。
【００７９】
このため、本発明の優先的な一態様は、式（１）によって表される以下の化学構造：
【化６】
2015529665.tif 000011
（式中、
Ｒ１は−ＮＨ２、−ＮＲ２Ｈ、−ＯＨ又は−ＳＨであり、
Ｒ２はＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル又はＣ２〜６アルキニルであり、
Ｒ３はＣ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、Ｃ２〜３アルキニル又はシクロプロピルであり、
ＹはＮ又はＣＲ４であり、
Ｒ４は水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル又はＣ３〜６シクロアルキルであり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は各々独立してフッ素、塩素、臭素又はヨウ素であり、
Ｒ８は水素又は−Ａ−Ｂｎ−Ｘであり、ここで、
Ａは単結合、−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−であり、
ＢはＣ１〜４アルキレン、Ｃ２〜４アルケニレン又は−（ＯＣＨ２ＣＨ２）−であり、
ｎは０、１、２、３、４又は５であり、
Ｘは−ＮＨＲ２、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＯＨ又はＯ−アルキルである）、
を有するアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー、又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグの標的を同定するスクリーニング方法であって、
（ａ）細胞溶解物を得る工程と、
（ｂ）前記アミノヘテロアリール化合物と前記細胞溶解物とを接触させる工程と、
（ｃ）分子が前記アミノヘテロアリール化合物に結合するか否かを決定する工程と、
を含み、分子が前記アミノヘテロアリール化合物に結合することが見出された場合に、かかる分子を該アミノヘテロアリール化合物の標的として同定する、スクリーニング方法に関する。
【００８０】
本発明の一実施形態は、式（１）の化合物において、
Ｒ１が−ＮＨ２、−ＯＨ又は−ＳＨであり、
Ｒ３がメチルであり、
ＹがＣＲ４であり、
Ｒ４が水素又はハロゲンであり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が各々独立してフッ素又は塩素であり、
Ｒ８が水素又は−Ａ−Ｂｎ−Ｘであり、ここで、
ＢがＣ１〜４アルキレン又は−（ＯＣＨ２ＣＨ２）−であり、
ｎが１、２又は３であり、
Ｘが−ＮＨ２である、
このスクリーニング方法に関する。
【００８１】
本発明の特定の実施形態は、式（１）の化合物において、
Ｒ８が水素、
−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２、
−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２、又は、
−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２である、
このスクリーニング方法に関する。
【００８２】
本発明の優先的な態様は、上記化合物、又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグが、式（２）〜（５）によって表される以下の化学構造：
【化７】
2015529665.tif 000012
2015529665.tif 000013
2015529665.tif 000014
の１つを有する、このスクリーニング方法に関する。
【００８３】
言及したように、本発明は、上記の工程（ａ）〜（ｃ）を含むスクリーニング方法に関する。本発明の特定の態様は、
（ｄ）アミノヘテロアリール化合物の前記（Ｓ）−エナンチオマーが前記分子の生物活性を変化させるか否かを決定する工程、
を更に含み、アミノヘテロアリール化合物の前記（Ｓ）−エナンチオマーが前記分子の生物活性を変化させることが見出された場合に、かかる分子を該アミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーの標的として同定する、本発明のスクリーニング方法に関する。
【００８４】
本発明のスクリーニング方法において、細胞溶解物を得て、アミノヘテロアリール化合物（例えばアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー）と接触させる。この細胞溶解物を生成するための細胞はヒト癌患者から得られる癌細胞であり得る。例えば、ヒト癌患者から得られる上記細胞は生検材料の生体物質を含み得る。「生検材料」の意味は当該技術分野で既知である。例えば、生検材料は、例えば主治医によって癌を患う患者から採取された癌細胞（複数の場合もあり）又は癌組織（複数の場合もあり）を含む。代替的には、細胞溶解物を生成する細胞は、（ａ）非ヒト動物（複数の場合もあり）、又は樹立ヒト癌細胞株等の樹立癌細胞株、又は改変細胞株から得られる。
【００８５】
したがって、本発明の一実施形態は、前記細胞溶解物が癌患者、樹立癌細胞株又は非ヒト動物の細胞又は組織サンプルに由来する、本発明のスクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング方法を行うために、ヒト癌患者から得られる腫瘍サンプルを用いて細胞溶解物を生成するのが好ましい。例えば、ヒト癌患者から得られる上記細胞は生検材料の生体物質を含み得る。細胞溶解物を樹立ヒト癌細胞株等の樹立癌細胞株を用いて生成するのも好ましい。例えば、上記細胞溶解物を生成するために、ユーイング肉腫ファミリーの腫瘍（ＥＳＦＴ）の細胞（例えばＳＫ  ＥＳ  １及びＳＫ  Ｎ  ＭＣ細胞）を使用することができる。本発明のスクリーニング方法において、幾つかの細胞溶解物を並行して生成及び分析することができる。例えば、細胞溶解物を調製するために、遺伝的背景の異なるヒト癌細胞株（例えばＡＬＫ陽性及びＡＬＫ陰性）を並行して使用及び分析することができる。
【００８６】
上述のように、本発明のスクリーニング方法において、アミノヘテロアリール化合物の上記（Ｓ）−エナンチオマーが上記分子の生物活性を変化させるか否かを決定することができる。上記分子の生物活性はアミノヘテロアリール化合物の上記（Ｓ）−エナンチオマーによって増大又は阻害し得る。しかしながら、上記分子の生物活性が阻害されることが好ましい。したがって、本発明の一態様は、生物活性の変化が生物活性の阻害である、本発明のスクリーニング方法に関する。
【００８７】
本発明の要旨は、アミノヘテロアリール化合物、好ましくはアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーがＭＴＨ１の極めて強力な阻害剤であることである。このため、本発明の好ましい実施形態は、前記化合物がＭＴＨ１の生物活性を阻害する、本発明の用途のために用いられる化合物、本発明の医薬組成物、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法、本発明のキット、本発明の使用、又は本発明のスクリーニング方法に関する。
【００８８】
上述のように、本発明はアミノヘテロアリール化合物の標的を同定するスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法は薬物プルダウンアッセイを含み得る。したがって、対象の化合物（例えばアミノヘテロアリール化合物）をセファロースビーズに固定化する直接的な化学プロテオミクスアプローチを用いることができる。かかる直接的な化学プロテオミクスアプローチは当該技術分野で既知であり、例えばSuperti-Furga (2012) Designing Multi-Target Drugs. Royal Society of Chemistry: Cambridge, 2012; p 256８に記載されている。本発明のスクリーニング方法において用いることができる実験的設定を図１に提示する。図１において「化合物中心化学プロテオミクス（Compound-centric chemical proteomics）」と記載される方法を本発明において使用するのが好ましい。活性に基づいたプローブプロファイリングも、本明細書で開示した化合物の１つを変更したものを用いて適用することができる。
【００８９】
セファロースビーズでの固体化は、化合物とビーズ基質との間の共有結合を確立する化学反応によって達成することができる。したがって、化合物は反応を行うのに適切な反応性官能基を必要とし、多くの場合、元の化合物の化学修飾が行われる。当然ながら、分子構造の変化により調査する化合物の相互作用挙動及び標的スペクトルも変化し得る。化合物を固定化する分子内の位置が結合に影響を及ぼし得ることにも留意されたい。このため、連結可能な全ての誘導体に対する既知の標的の結合を検査及び確認することが慣行である。下記の実施例において説明されるように、様々なリンカー長及び疎水性に関する化学的性質を包含する異なる化学的リンカーを有する３つのクリゾチニブの誘導体（すなわち、本明細書で規定されるＣｅＭＭ−１４４、ＣｅＭＭ−１４５及びＣｅＭＭ−１４６）を調製した。クリゾチニブ誘導体ＣｅＭＭ  １４４、ＣｅＭＭ  １４５及びＣｅＭＭ  １４６の化学合成は図１３に概説される。驚くべきことに、例示的な下記の実施例に示されるように、アミノプロピル置換ＣｅＭＭ−１４６は両方のＡＬＫアイソフォームを最も高度に富化し、その後にＰＥＧ−誘導体ＣｅＭＭ−１４５が続く。未変性クリゾチニブ及びＣｅＭＭ−１４４は、ＣｅＭＭ−１４６及びＣｅＭＭ−１４５よりも少ない程度でＡＬＫに結合する。
【００９０】
本発明のスクリーニング方法において、細胞溶解物とアミノヘテロアリール化合物とを接触させた後に、上記アミノヘテロアリール化合物に結合する分子をアミノヘテロアリール化合物の親和性精製によって同時精製する。親和性精製の方法は当該技術分野で既知であり、例えばSuperti-Furga (2012) Designing Multi-Target Drugs. Royal Society of Chemistry: Cambridge, 2012; p 256８に記載されている。上記アミノヘテロアリール化合物に結合する分子（例えばタンパク質）の精製の後、分子の同一性を決定することができる（例えば、アミノヘテロアリール化合物に結合するタンパク質を決定することができる）。この同定工程には質量分析が適用され得る。質量分析方法は当該技術分野で既知であり、例えばSuperti-Furga (2012) Designing Multi-Target Drugs. Royal Society of Chemistry: Cambridge, 2012; p 256８に記載されている。
【００９１】
従来技術に報告されているように、ＭＴＨ１抑制は、癌細胞の増殖欠損を引き起こすことが示された１３。このため、上記に示したように、ＭＴＨ１の標的化は、癌の治療に対する新規の治療選択をもたらし得る。これと一致して、ＭＴＨ１状態（特にＭＴＨ１活性のレベル）を用いて、癌患者の治療（すなわち療法）をモニタリングする（すなわちその有効性にアクセスする）ことができる。ＭＴＨ１の活性はＭＴＨ１の発現によって反映され得るため、ＭＴＨ１発現のレベルを用いて、癌患者の治療（すなわち療法）をモニタリングする（すなわちその有効性にアクセスする）こともできる。治療はＭＴＨ１阻害剤（複数の場合もあり）を含み得る。このため、癌患者の治療の有効性をモニタリングする方法であって、
（ａ）上記癌患者に由来する第１の組織サンプルにおけるＭＴＨ１活性及び／又は発現を第１の時点で決定する工程と、
（ｂ）上記癌患者に由来する第２の組織サンプルにおけるＭＴＨ１活性及び／又は発現を第２の時点で決定する工程と、
（ｃ）工程（ａ）で決定されたＭＴＨ１活性及び／又は発現と工程（ｂ）で決定されたＭＴＨ１活性及び／又は発現とを比較する工程と、
を含み、工程（ａ）で決定されたＭＴＨ１活性及び／又は発現と比較して、工程（ｂ）で決定されたＭＴＨ１の低減した活性及び／又は発現が効果的な治療の指標となり、
工程（ａ）で決定されたＭＴＨ１活性及び／又は発現と比較して、工程（ｂ）で決定されたＭＴＨ１の向上した又は同一の活性及び／又は発現が効果のない治療の指標となる、方法が本明細書に提示される。
【００９２】
治療、特に癌療法の有効性は、参照値を用いることによってもモニタリングすることができる。このため、癌患者の治療の有効性をモニタリングする方法であって、
（ａ）上記癌患者に由来する組織サンプルにおけるＭＴＨ１活性及び／又は発現を決定する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で決定されたＭＴＨ１活性及び／又は発現と参照値とを比較する工程と、
を含み、参照値と比較して、工程（ａ）で決定されたＭＴＨ１の低減した活性及び／又は発現が効果的な治療の指標となり、
参照値と比較して、工程（ａ）で決定されたＭＴＨ１の向上した又は同一の活性及び／又は発現が効果のない治療の指標となる、方法も本明細書に提示される。
【００９３】
本明細書に記載されるように、癌患者の治療の有効性をモニタリングする方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であり得る。癌患者の治療の有効性をモニタリングする上記の方法において、上記組織サンプルは、好ましくは癌組織サンプルである。
【００９４】
上記のように、ＭＴＨ１と発癌ＲＡＳ、活性酸素種（ＲＯＳ）、酸化的損傷及び腫瘍発生の発現との間には強い関連性がある。したがってＭＴＨ１の阻害剤は、癌の治療の有望な薬剤となる。このため、抗癌性物質を同定する方法を本明細書に提示する。この方法は、ＭＴＨ１活性の阻害剤であることが疑われる少なくとも１つの物質を同定する上で極めて有用である。この方法によって同定される強力な阻害剤は、癌の医学的介入に用いることができる。抗癌性物質を同定する方法は、
（ａ）ＭＴＨ１、又はＭＴＨ１を含む細胞、組織若しくは非ヒト動物と少なくとも１つの試験物質とを接触させる工程と、
（ｂ）ＭＴＨ１活性及び／又は発現を決定する工程と、
（ｃ）ＭＴＨ１活性及び／又は発現を低減する物質を選択する工程と、
を含み、ＭＴＨ１活性及び／又はＭＴＨ１発現を低減する能力が選択された物質の抗癌活性の指標となる。
【００９５】
抗癌性物質を同定する上記方法は、工程（ａ）が精製ＭＴＨ１タンパク質を含む無細胞組成物であり、工程（ｂ）が少なくとも１つの試験物質がＭＴＨ１の生物活性を阻害するか否かを決定することを含むことを特徴とし得る。抗癌性物質を同定する方法は、工程（ａ）がＭＴＨ１を発現する細胞、組織又は非ヒト動物を含み（該ＭＴＨ１の発現は、導入遺伝子の形態でのＭＴＨ１の発現でもあり得る）、工程（ｂ）が少なくとも１つの試験物質がＭＴＨ１の生物活性及び／又は発現を阻害するか否かを決定することを含むことも特徴とし得る。抗癌性物質を同定する方法の工程（ｂ）は、細胞、組織又は非ヒト動物に由来する細胞溶解物においてＭＴＨ１生物活性の低減及び／又はＭＴＨ１発現の低減を検出することを含み得る。
【００９６】
抗癌性物質を同定する方法の工程（ａ）に適用されるＭＴＨ１の殆どが機能的である、すなわち２−ＯＨ−ｄＡＴＰ及び８−オキソ−ｄＧＴＰ等の酸化ヌクレオチドを加水分解する能力を有するとみなされる。工程（ａ）に適用されるＭＴＨ１の少なくとも２５％又は５０％、好ましくは少なくとも５０％、７５％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９８％又は９９％が機能的であることが想定される。
【００９７】
抗癌性物質を同定する方法の工程（ａ）において、「ＭＴＨ１又はＭＴＨ１を含む細胞、組織若しくは非ヒト動物を少なくとも１つの試験物質と接触させる」という用語は、「ＭＴＨ１の誘導体若しくはＭＴＨ１の機能的断片、又はＭＴＨ１の誘導体若しくはＭＴＨ１の機能的断片を含む細胞、組織若しくは非ヒト動物を少なくとも１つの試験物質と接触させる」ことにも関することを留意されたい。「ＭＴＨ１の誘導体」及び「ＭＴＨ１の機能的断片」という用語の定義は本明細書の下記に提示する。
【００９８】
本明細書に記載の抗癌性物質を同定する方法によると、少なくとも１つの試験物質を、ＭＴＨ１を含む細胞、組織又は非ヒト動物と接触させる。例えば、上記細胞、組織又は非ヒト動物はＭＴＨ１遺伝子、特に同様にＭＴＨ１遺伝子の付加的なコピー（単数又は複数）、ＭＴＨ１突然変異遺伝子（複数の場合もあり）、組み換えＭＴＨ１遺伝子構築物等を発現し得る。したがって、ＭＴＨ１活性及び／又は発現を低減させる試験物質の能力は、ＭＴＨ１又は対応する遺伝子構築物のかかる遺伝子産物の発現レベル（例えばｍＲＮＡ又はタンパク質）を測定することによって決定することができ、（標準又は参照値と比較して）低い発現レベルはＭＴＨ１活性及び／又は発現を低減する試験物質の能力の指標となる。
【００９９】
本明細書に記載されるように、同定方法の一態様において抗癌性物質、上記細胞、組織又は非ヒト動物が遺伝子操作される。上記細胞、組織又は非ヒト動物はレポーター遺伝子発現構築物を含み得る。特に、上記レポーター遺伝子発現構築物はＭＴＨ１プロモーター及び／又はエンハンサー、又はレポーター遺伝子に結合したＭＴＨ１依存性因子のＭＴＨ１依存性プロモーター及び／又はエンハンサーを含み得る。ＭＴＨ１依存性プロモーター（すなわちＭＴＨ１依存性因子のプロモーター）は、ＭＴＨ１の下流に作用するタンパク質のプロモーターであり得る。例えば、上記タンパク質は、２−ＯＨ−ｄＡＴＰ及び８−オキソ−ｄＧＴＰ等の酸化ヌクレオチドの加水分解に応答して転写的に上方調節又は下方調節され得る。したがって、上記タンパク質がＭＴＨ１酵素活性に応答して転写的に上方調節される場合、レポーター遺伝子構築物の転写の低減がＭＴＨ１活性及び／又は発現の低減の指標となり得る。一方、上記因子がＭＴＨ１酵素活性に応答して転写的に下方調節される場合、レポーター遺伝子構築物の転写の向上がＭＴＨ１活性及び／又は発現の低減の指標となり得る。したがって、本明細書で規定及び開示される場合、「ＭＴＨ１を含む」という用語は当該技術分野で既知であり、本明細書に記載されるＭＴＨ１遺伝子（複数の場合もあり）又はタンパク質（複数の場合もあり）だけを指すものではない。ＭＴＨ１のプロモーター及び／又はエンハンサー領域を含むレポーター構築物も抗癌性物質を同定する方法に使用することができる。したがって、抗癌性物質を同定する方法において使用される細胞（複数の場合もあり）、組織（複数の場合もあり）及び／又は非ヒト動物（複数の場合もあり）はレポーター構築物を含み得る。例示的なレポーターはルシフェラーゼ及びＧＦＰ、ＲＦＰ等のような蛍光タンパク質である。ＭＴＨ１（又はＭＴＨ１依存性因子）を含むプロモーター及び／又はエンハンサー領域を含むレポーター構築物も使用することができる。したがって、本発明において使用される細胞（複数の場合もあり）、組織（複数の場合もあり）及び／又は非ヒト動物（複数の場合もあり）に、レポーター構築物を安定に又は一時的にトランスフェクトすることができる。
【０１００】
使用される非ヒト動物又は細胞は、トランスジェニック又は非トランスジェニックであり得る。上記トランスジェニック細胞又は非ヒト動物において、少なくとも１つのＭＴＨ１遺伝子が過剰発現されている場合もあり、それにより非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック細胞におけるＭＴＨ１活性が向上し得る。概して、ＭＴＨ１が本明細書に記載の抗癌性物質を同定する方法に使用される細胞（複数の場合もあり）、組織（複数の場合もあり）、非ヒト動物（複数の場合もあり）において高度に発現されていることが本明細書で好ましい。「トランスジェニック非ヒト動物」、「トランスジェニック細」又は「トランスジェニック組織」という用語は、本明細書で使用される場合、種々の遺伝物質を含む非ヒト動物、組織又は細胞を指す。これに関連する「遺伝物質」という用語は、任意の種類の核酸分子又はその類似体であり得る。「異なる」という用語は、野生型動物又は細胞のゲノムと比較して付加的な又はより少ない遺伝物質を意味する。トランスジェニック細胞／動物の生成に使用される異なる発現系の概要は、例えばMethods in Enzymology 153 (1987), 385-516, in Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544) and in Sawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9)、Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4)、Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463)、Griffiths et al., (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440)を指す。
【０１０１】
（トランスジェニック）非ヒト動物又はそれに由来する（トランスジェニック）細胞の非限定的な例は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット及びショウジョウバエからなる群から選択される。好ましい実施形態では、（トランスジェニック）非ヒト動物又は（トランスジェニック）細胞は哺乳動物の細胞であるか又はそれに由来する。概して、（トランスジェニック）細胞は真核細胞であり得る。例えば、本発明による（トランスジェニック）細胞は酵母、真菌、植物又は動物の細胞であり得るが、これらに限定されない。（トランスジェニック）細胞はヒト、例えばヒト癌組織に由来し得る。（トランスジェニック）細胞は樹立癌細胞株であり得る。概して、核酸構築物又はベクターによる細胞の形質転換又は遺伝子操作は、例えばSambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA; Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990に記載される標準方法によって行うことができる。
【０１０２】
抗癌性物質を同定する方法によると、決定されたＭＴＨ１の活性及び／又は発現は、それぞれＭＴＨ１活性及び／又は発現の標準又は参照値と比較することができる。標準／参照値は、試験物質と接触させていない細胞、組織又は非ヒト動物において決定することができる。ＭＴＨ１の活性及び／又は発現の低減は、日常的に使用される参照物質（複数の場合もあり）によってＭＴＨ１活性及び／又は発現の低減と比較することもできる。当業者は、ＭＴＨ１の活性及び／又は発現が（好ましくは統計的に有意に）低減されているか否かを容易に決定／評価する立場にある。
【０１０３】
抗癌性物質を同定する方法において、「接触させる」という用語はＭＴＨ１又はＭＴＨ１を含む細胞、組織若しくは非ヒト動物への少なくとも１つの試験物質の添加を指す。「接触させる」という用語は、試験物質が細胞取込みにより細胞に効果的となり、それによりＭＴＨ１に対するその阻害機能を発揮する形でのＭＴＨ１を含む細胞への試験物質の添加も指す。
【０１０４】
「試験物質」という用語は本明細書で使用される場合、抗癌性物質を同定する方法によって試験される分子若しくは物質若しくは組成物若しくは薬剤又はそれらの任意の組合せを指す。試験物質は原則的に任意の供給源から得ることができる。少なくとも１つの試験物質は、自然発生物質又はトランスジェニック生物によって産生され、任意に或る程度まで精製した及び／又は更に改変した物質である。実際的には、試験物質は化合物ライブラリーから取り出すことができる。
【０１０５】
試験物質はＭＴＨ１の活性及び／又は発現の潜在的阻害剤であり得る。試験物質は任意の化学物質、例えば、無機化学物質、有機化学物質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、ＭＴＨ１に対するｓｉＲＮＡ、ＭＴＨ１に対するｓｈＲＮＡ、若しくはそれらの組合せ、又は本明細書に記載される化合物若しくは組成物のいずれかであり得る。本明細書で使用する試験物質は、とりわけ自然発生し、及び／又は合成的に、組換えにより及び／又は化学的に作製された化学的又は生物学的な起源の物質又は組成物であり得る。このため、試験物質はタンパク質、タンパク質断片、ペプチド、アミノ酸及び／又はその誘導体、又はＭＴＨ１、ＭＴＨ１機能の調節タンパク質／配列若しくはその機能的断片に結合し及び／又はそれと相互作用する別の物質であり得る。合成化合物ライブラリーはMaybridge Chemical Co.（Trevillet，Cornwall，UK）、Comgenex（Princeton，N.J.）、Brandon Associates（Merrimack，N.H.）及びMicrosource（New Milford，Conn.）から市販されている。希少化学物質ライブラリーはAldrich（Milwaukee，Wis.）から利用可能である。代替的には、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然物質ライブラリーが例えばPan Laboratories（Bothell，Wash.）又はMycoSearch（N.C.）から利用可能であるか、又は容易に作製可能である。加えて、天然の及び合成的に作製されるライブラリー及び化合物は従来の化学的、物理的及び生化学的な手段によって容易に変更することができる。系統発生分析方法に基づく非オーファン化（deorphanisation）プログラムにより得られる結果は、ＭＴＨ１に結合し又はそれと相互作用する天然因子の発見の助けとなり、例えば潜在的にＭＴＨ１活性及び／又は発現を低減する能力を有する物質のコンピューターによるプロファイリングを可能とする。ＭＴＨ１に結合するか又はそれと相互作用する物質はＭＴＨ１の阻害剤であり、したがって抗癌性物質であり得る。
【０１０６】
ＭＴＨ１に結合するか又はそれと相互作用する潜在的因子の化学的ライブラリーの生成は当該技術分野で既知である。例えば、コンビナトリアル化学を用いて物質のライブラリーを生成することができる。コンビナトリアル化学ライブラリーは、多数の化学的な「構成要素」試薬を組み合わせることで化学合成又は生物学的合成によって生成する多様な化学物質のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリー等の線形コンビナトリアル化学ライブラリーは、アミノ酸を所与の長さのペプチドを得るのに考え得る全ての組合せで組み合わせることによって形成される。理論上は何百万という化学物質を、化学的構成要素のかかるコンビナトリアル混合によって合成することができる。例えば、或る評論家は、１００個の代替可能な化学的構成要素の系統的なコンビナトリアル混合が１億個の四量体化合物又は１００億個の五量体化合物の理論的合成をもたらすことを観察している（例えば、Gallop, Journal of Medicinal Chemistry, Vol. 37, No. 9, 1233-1250 (1994)を参照されたい）。天然産物ライブラリーを含む当業者に既知の他の化学的ライブラリーを用いることもできる。生成後、望ましい生物学的特性を有する物質についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする。例えば、薬物として又は薬物の開発に有用であり得る物質は、標的タンパク質（例えばＭＴＨ１）に結合する能力を有する可能性がある。
【０１０７】
加えて、本発明において、物質のライブラリーをスクリーニングして、ＭＴＨ１のアンタゴニスト又は阻害剤として機能し得る物質を同定することができる。初めに、小分子のライブラリーを当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー形成方法を用いて生成することができる。米国特許第５，４６３，５６４号及び同第５，５７４，６５６号は２つのかかる教示である。次いで、ライブラリーの物質をスクリーニングして、所望の構造的及び機能的特性を有するこれらの物質を同定することができる。ライブラリーをスクリーニングする方法は当該技術分野で既知であり、例えば米国特許第５，６８４，７１１号において論考されている。加えて、標的タンパク質の生化学的機能が既知である場合に多数の自然発生標的について広範なスクリーニング技法が知られている。例えば、幾つかの技法は、薬物リードを同定及び開発するために標的タンパク質を生化学的にかつ遺伝子学的に調査及び分析する小ペプチドの生成及び使用を含む。かかる技法としては、国際公開第９９／３５４９４号、同第９８／１９１６２号及び同第９９／５４７２８号に記載の方法が挙げられる。
【０１０８】
試験物質は多数の化学物質群を包含し、好ましくは有機化合物であり、より好ましくは本明細書で規定されるアミノヘテロアリール化合物等の小（有機）分子であり得る。
【０１０９】
試験物質はタンパク質（特にＭＴＨ１）との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの機能的化学基を含み得る。試験物質は上記の官能基の１つ又は複数で置換された炭素環又は複素環構造及び／又は芳香族若しくは多環芳香族構造を含むことが多い。試験物質及び／又は選択抗癌性物質は有効性、安定性、薬学的適合性等を向上するように修飾することができる。抗癌性物質の構造的同定を用いて、付加的な抗癌性物質を同定、生成又はスクリーニングすることができる。
【０１１０】
抗癌性物質を同定する本明細書に記載の方法によると、第１のスクリーニングにおいて選択された物質を、先の発見を検証し、最も強力なＭＴＨ１の阻害剤／アンタゴニストを選択するためにその後のスクリーニングに供することができる。複数回のスクリーニング及び選択により、ＭＴＨ１を阻害／拮抗する顕著な能力を示すこれらの物質が選択される。
【０１１１】
抗癌性物質を同定する方法の工程（ｃ）における「ＭＴＨ１活性及び／又は発現を低減する」という用語は、「ＭＴＨ１の活性及び／又は発現」がＭＴＨ１又はＭＴＨ１を含む細胞、組織若しくは非ヒト動物と少なくとも１つの試験物質との接触の際に、好ましくは（対照）標準又は参照値と比較して低減することを意味し、ＭＴＨ１活性及び／又は発現の低減が選択された物質の抗癌活性（すなわち、選択された物質の癌を改善する能力）の指標となる。
【０１１２】
本明細書に記載されるように、「ＭＴＨ１活性を低減する」物質は、ＭＴＨ１の生物活性（すなわち、２−ＯＨ−ｄＡＴＰ及び８−オキソ−ｄＧＴＰ等の酸化ヌクレオチドを加水分解する能力）を低減する物質に関する。ＭＴＨ１生物活性を測定する方法は当該技術分野で既知であり、本明細書にも提示される。加えて、「ＭＴＨ１発現を低減する」物質は、ＭＴＨ１タンパク質（複数の場合もあり）をコードする遺伝子（複数の場合もあり）の発現の低減に関する。したがって、ＭＴＨ１タンパク質（複数の場合もあり）をコードする遺伝子（複数の場合もあり）の発現の低減を評価するために、遺伝子産物（例えばタンパク質又はスプライスされた、スプライスされていない若しくは部分的にスプライスされたｍＲＮＡ）の定量的評価を行うことができる。当業者はこれに関連して使用される標準方法を認識しているか、又は標準的な教科書（例えば、Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001)）からこれらの方法を推定することができる。例えば、ＭＴＨ１に由来するｍＲＮＡのそれぞれの濃度／量に関する定量的データはノーザンブロット法、リアルタイムＰＣＲ等によって得ることができる。
【０１１３】
好ましくは、ＭＴＨ１活性及び／又は発現は、対照サンプルと比較して少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％低減し得る。言及したように、当業者はＭＴＨ１の活性又はＭＴＨ１（又はその断片）をコードする核酸分子の発現の決定又は定量化に使用される標準方法を認識している。加えて、ＭＴＨ１の活性を決定及び定量化する方法は本明細書及び下記の実施例に詳細に記載されている。加えて、ＭＴＨ１の発現は免疫凝集、免疫沈降（例えば免疫拡散、免疫電気泳動、免疫固定）、ウエスタンブロット法（例えば（ｉｎ  ｓｉｔｕ）免疫組織化学、（ｉｎ  ｓｉｔｕ）免疫細胞化学、親和性クロマトグラフィー、酵素免疫測定）等を利用することによってタンパク質レベルで決定することができる。溶液中の精製ポリペプチドの量は物理的方法、例えば測光によって決定することができる。混合物中の特定のポリペプチドを定量化する方法は、例えば抗体の特異的結合に依存する。抗体の特異性を用いた具体的な検出及び定量化方法は、例えば免疫組織化学（ｉｎ  ｓｉｔｕ）を含む。例えば細胞、組織又は非ヒト動物におけるＭＴＨ１タンパク質の濃度／量は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって決定することができる。代替的には、ウエスタンブロット分析又は免疫組織化学的染色を行うことができる。ウエスタンブロット法は、電気泳動によるタンパク質の混合物の分離と抗体を用いた特異的検出とを組み合わせたものである。電気泳動は２Ｄ電気泳動等の多次元であってもよい。通常は、ポリペプチドを１次元に沿う見掛けの分子量及び他の方向に沿う等電点によって２Ｄ電気泳動で分離する。
【０１１４】
発現は核酸レベル（例えば、遺伝子産物／コーディング核酸配列の産物がスプライスされていない／部分的にスプライスされた／スプライスされたｍＲＮＡである場合）でもノーザンブロット法又はｉｎ−ｓｉｔｕＰＣＲ若しくはリアルタイムＰＣＲのようなＰＣＲ法を利用することによって決定することができる。ｍＲＮＡの定量的決定は、ノーザンブロット法、ｍＲＮＡ転写産物に特異的な１つ若しくは複数のプローブ若しくはプローブセットを備えるマイクロアレイ若しくはＤＮＡチップでのハイブリダイゼーション、又は上記で言及した、リアルタイムＰＣＲ等の定量的ＰＣＲ法のようなＰＣＲ法を利用することによって行うことができる。（特異的な）ｍＲＮＡ又はタンパク質（複数の場合もあり）／ポリペプチド（複数の場合もあり）の濃度／量の検出及び／又は決定のためのこれらの及び他の好適な方法は当該技術分野で既知であり、例えばSambrook (2001)（上記引用文中））に記載されている。
【０１１５】
当業者はｍＲＮＡ又はポリペプチド／タンパク質、特に本明細書で上記した遺伝子産物の量を、例えば決定されるｍＲＮＡ又はポリペプチド／タンパク質の検出シグナルの強度と量との間の相関、好ましくは線形相関を利用することによって決定することが可能である。
【０１１６】
抗癌性物質を同定する方法によると、ＭＴＨ１活性及び／又は発現の低減量は、ＭＴＨ１（又は対応するレポーターシグナル）の活性及び／又は発現が強く低減する、好ましくは非常に低いか又は検出可能でない場合に統計的に有意であり、物質を選択することができる。例えば、ＭＴＨ１（又は対応するレポーターシグナル）の活性及び／又は発現は（対照）標準値と比較して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、より好ましくは少なくとも９０％低減し得る。
【０１１７】
本明細書で、特に式（１）及び（６）に関する実施形態において使用される場合、以下の定義が適用される。
【０１１８】
「ハロゲン」という用語には、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素が含まれる。
【０１１９】
Ｃ１〜６アルキルは、直鎖又は分岐アルキルを指す。例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシルが挙げられる。したがって、Ｃ１〜３アルキルは、直鎖又は分岐アルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルを指す。
【０１２０】
Ｃ２〜６アルケニルは、その任意の位置に１つ又は複数の二重結合を有する直鎖又は分岐アルケニルを指す。例としては、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、プレニル、ブタジエニル、ペンテニル、イソペンテニル、ペンタジエニル、ヘキセニル、イソヘキセニル、ヘキサジエニルが挙げられる。したがって、Ｃ２〜３アルケニルは、その任意の位置に１つ又は複数の二重結合を有する直鎖又は分岐アルケニルを指す。例としては、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニルが挙げられる。
【０１２１】
Ｃ２〜６アルキニルは、その任意の位置に１つ又は複数の三重結合を有する直鎖又は分岐アルキニルを指す。例としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニルが挙げられる。アルキニル基は、その任意の位置に二重結合を更に有していてもよい。したがって、Ｃ２〜３アルキニルは、その任意の位置に１つ又は複数の三重結合を有する直鎖又は分岐アルキニルを指す。例としては、エチニル及びプロピニルが挙げられる。
【０１２２】
Ｃ１〜４アルキレンは、直鎖の二価炭化水素鎖を指す。例としては、メチレン、エチレン、プロピレン及びブチレンが挙げられる。
【０１２３】
Ｃ２〜４アルケニレンは、その任意の位置に１つ又は複数の二重結合を有する直鎖の二価炭化水素鎖を指し、例えば、ビニレン、プロペニレン及びブテニレンを含む。
【０１２４】
本発明によると、「本発明のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」、「本発明の使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」及び「本発明の使用される化合物」という用語は、本明細書で規定される「アミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」に関する。加えて、本明細書で使用される場合、「本発明のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」、「本発明の使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」及び「本発明の使用される化合物」という用語は、式（１）〜（５）のいずれか１つに示され、添付の特許請求の範囲の請求項１に記載される「アミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」の同義語である。好ましくは、「本発明のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」、「本発明の使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」及び「本発明の使用される化合物」という用語は、項目１〜４、８〜２０及び３７に記載される「アミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」の同義語である。
【０１２５】
本明細書で実証されるように、（Ｒ）−クリゾチニブとは対照的に、「本発明の使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」は、ＡＬＫ陽性癌の治療における使用に限定されない。このため、「本発明の使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」はＡＬＫ陰性癌の治療にも使用することができる。したがって、「本発明のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」、「本発明の使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」及び「本発明の使用される化合物」という用語は、「癌の治療及び／又は予防が上記被験体の癌細胞又は組織のＡＬＫ状態及び／又はｃ−Ｍｅｔ状態とは無関係である、被験体における癌の治療及び／又は予防に使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」に更に関する。
【０１２６】
より具体的には、「本発明のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」、「本発明の使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」及び「本発明の使用される化合物」という用語は、ＭＴＨ１の生物活性（特に触媒活性）を阻害する能力を有する化合物に関する。したがって、「本発明のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」、「本発明の使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」及び「本発明の使用される化合物」という用語は、被験体において癌の治療及び／又は予防に使用されるＭＴＨ１の生物活性を阻害することが可能なアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーに関する。
【０１２７】
上述のように、「本発明のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」という用語は、ＡＬＫ陽性癌の治療における使用に限定されない。このため、「本発明のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」、「本発明の使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」及び「本発明の使用される化合物」という用語は、被験体における癌の治療及び／又は予防に使用されるＭＴＨ１の生物活性を阻害する能力を有し、癌の治療及び／又は予防が上記被験体の癌細胞又は組織のＡＬＫ状態及び／又はｃ−Ｍｅｔ状態とは無関係であるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーに更に関する。特定の化合物がＭＴＨ１の生物活性を阻害する能力を有するか否かを決定する手段及び方法は当該技術分野で既知であり、本明細書で下記に提示される。
【０１２８】
「本発明の使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」は、クリゾチニブの誘導体の（Ｓ）−エナンチオマー（ＣｅＭＭ−１４４、ＣｅＭＭ−１４５又はＣｅＭＭ−１４６等）であり得る。好ましくは、「本発明の使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」はＣｅＭＭ−１４６である。より好ましくは、「本発明の使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー」は（Ｓ）−クリゾチニブ（すなわち、化学物質３−［１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンの（Ｓ）−エナンチオマー）である。
【０１２９】
当業者は、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー（すなわち、化学物質３−［１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンの（Ｓ）−エナンチオマー）を合成する能力を有する。加えて、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー（すなわち、化学物質３−［１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンの（Ｓ）−エナンチオマー）の調製が本明細書で図１４に記載される。この合成戦略は光学的に純粋な出発物質の使用に依存し、以前に公表されたラセミ型及び／又は（Ｒ）−クリゾチニブの合成手順に従い得る。ラセミ型及び／又は（Ｒ）−クリゾチニブを合成する手順は、例えばde Koning (2011) Organic Process Research & Development, 15: 1018-1026３８（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に与えられる。
【０１３０】
ＭＴＨ１の「機能的断片」は、ＭＴＨ１の断片を含み、ＭＴＨ１の生物活性を有するポリペプチドである。本明細書で上記及び下記に記載されるように、ＭＴＨ１の生物活性はＭＴＨ１の触媒活性、すなわち２−ＯＨ−ｄＡＴＰ及び８−オキソ−ｄＧＴＰ等の酸化ヌクレオチドを加水分解する能力である。ＭＴＨ１の機能的断片は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４〜１６として本明細書に提示されるＭＴＨ１のアミノ酸配列の１つの断片を含むポリペプチドであり得る。ＭＴＨ１の機能的断片は、配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３として本明細書に提示されるＭＴＨ１のヌクレオチド配列の１つの断片によってコードされるポリペプチドであってもよい。ＭＴＨ１の機能的断片は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４〜１６として本明細書に提示されるＭＴＨ１のアミノ酸配列の１つの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％又は少なくとも９９％を含むポリペプチドであり得る。ＭＴＨ１の機能的断片は、配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３として本明細書に提示されるＭＴＨ１のヌクレオチド配列の１つの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％又は少なくとも９９％を含むヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドであり得る。
【０１３１】
ＭＴＨ１の「誘導体」はＭＴＨ１に対して相同性を有し、ＭＴＨ１の生物活性を有するポリペプチドである。ＭＴＨ１の誘導体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４〜１６として本明細書に提示されるＭＴＨ１のアミノ酸配列の１つに対して少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の相同性を有するポリペプチドであり得る。ＭＴＨ１の誘導体は、配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３として本明細書に提示されるＭＴＨ１のヌクレオチド配列の１つに対して少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドであってもよい。本明細書で上記及び下記に記載されるように、ＭＴＨ１の生物活性はＭＴＨ１の触媒活性、すなわち２−ＯＨ−ｄＡＴＰ及び８−オキソ−ｄＧＴＰ等の酸化ヌクレオチドを加水分解する能力である。
【０１３２】
本発明において、「に対して相同性を有する」という用語は、それぞれのアミノ酸又はヌクレオチド配列が本明細書に示される配列、例えばＭＴＨ１の配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有することを意味し、より高い同一性の値がより低いものよりも好ましい。本発明によると、２つ以上の核酸又はアミノ酸配列との関連での「同一性（単数又は複数）」又は「同一率（単数又は複数）」という用語は、当該技術分野で既知の配列比較アルゴリズムを用いて、又は手動のアラインメント及び目視検査によって測定される比較領域（window of comparison）又は指定された領域にわたる最大の一致で比較し、アラインメントした場合に同じであるか、又は特定の割合の同じアミノ酸残基又はヌクレオチド（例えば配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３のヌクレオチド配列、又は例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４〜１６のアミノ酸配列との例えば６０％又は７０％の同一性、好ましくは７０％〜９５％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性）を有する２つ以上の配列又は部分配列（subsequences）を指す。
【０１３３】
記載の同一性は、少なくとも約２５〜７５アミノ酸又はヌクレオチド長の領域にわたって存在するのが好ましい。記載の同一性が約７５〜１５０アミノ酸又はヌクレオチド長の領域にわたって存在するのがより好ましい。ヌクレオチド配列の場合、記載の同一性は少なくとも約７５〜２２５ヌクレオチド長の領域にわたって、より好ましくは少なくとも約２２５〜４５０ヌクレオチド長の領域にわたって存在することが最も好ましい。当業者は、例えば当該技術分野で既知のＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム（Thompson; 1994; Nucl Acids Res; 2; 4673-4680）又はＦＡＳＴＤＢ（Brutlag; 1990; Comp App Biosci; 6; 237-245）に基づくもののようなアルゴリズムを用いて配列間の同一率を決定する方法を知っているであろう。
【０１３４】
本発明によると、ＡＬＫ陰性癌の治療及び／又は予防に使用されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーが、ＭＴＨ１の生物活性を阻害する能力を有することが想定される。
【０１３５】
「生物活性」という用語は、本明細書で使用される場合、分子（例えばＭＴＨ１等のポリペプチド）の機能性に関する。分子（例えばポリペプチド）が「機能的」であるとは、本発明において、分子（例えばポリペプチド）が特異的な「機能」を行う能力を有することを意味する。したがって、「生物活性」という用語は、特異的機能を行う分子（例えばＭＴＨ１等の特異的タンパク質）の能力に関する。例えば、本発明において、ＭＴＨ１の生物活性は、ＭＴＨ１の触媒活性、すなわち２−ＯＨ−ｄＡＴＰ及び８−オキソ−ｄＧＴＰ等の酸化ヌクレオチドを加水分解し、対応する一リン酸塩及びピロリン酸塩（ＰＰｉ）を生じる能力を含む。アミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーがＭＴＨ１の生物活性を変化させる（例えば阻害する）能力を有するか否かを分析するために、組み換えＭＴＨ１を用いる酵素アッセイを行うことができる。例えば、ＭＴＨ１媒介８−オキソ−ｄＧＴＰ加水分解によって生成するＰＰｉの産生をモニタリングする発光ベースのアッセイを、ＭＴＨ１酵素動態を決定するために用いられてきたプロトコルに従って用いることができる（例えば、Svensson (2011) FEBS Lett. 585: 2617-2621１５を参照されたい）。
【０１３６】
より具体的には、ＭＴＨ１の生物活性を阻害する化合物の能力を決定するために、ＭＴＨ１を適切な宿主細胞（細菌細胞等）において発現させ、ＭＴＨ１を精製することができる。続いて、精製ＭＴＨ１を対象のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーとともにインキュベートすることができる。ＭＴＨ１の活性は、ＭＴＨ１媒介８−オキソ−ｄＧＴＰ加水分解によって生成するＰＰｉの産生を測定することによってモニタリングすることができる。
【０１３７】
加えて、本発明において、分子（例えばＭＴＨ１等のタンパク質）の「向上した」又は「高い」生物活性は、対照と比較して分子（例えばＭＴＨ１）の生物活性が向上していることを意味する。これと一致して、本発明において、分子（例えばＭＴＨ１）の「阻害された」、「低減した」、「低い」又は「より低い」生物活性は、分子（例えばＭＴＨ１）の生物活性が対照と比較して低減していることを意味する。例えば、対照と比較して分子（例えばＭＴＨ１等のタンパク質）の生物活性が低減する理由は、分子（例えばＭＴＨ１）の生物活性を阻害する化合物（例えばアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー）の存在であり得る。この点で、対照は同じサンプルであってもよいが、分子の生物活性を阻害する化合物を含まない。
【０１３８】
本明細書に記載の医薬組成物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20th Editionに公表されている技法のような当業者に既知の技法によって配合することができる。医薬組成物は、例えば経口投与用の投薬形態として配合することができる。しかしながら、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、動脈内投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与又は膣内投与等の非経口投与も想定される。本発明において、本明細書で規定されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー等）の最も好ましい投与経路は経口投与である。
【０１３９】
経口投与の投薬形態としては、被覆及び非被覆錠剤、ソフトゼラチンカプセル剤、ハードゼラチンカプセル剤、ロゼンジ剤、トローチ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤（elixiers）、再構成用の粉末剤及び顆粒剤、分散性粉末剤及び顆粒剤、薬用ガム、咀嚼錠剤並びに発泡錠剤が挙げられる。
【０１４０】
非経口投与の投薬形態としては、液剤、乳剤、懸濁剤、分散剤、再構成用の粉末剤及び顆粒剤が挙げられる。乳剤が非経口投与に好ましい投薬形態である。直腸投与及び膣内投与用の投薬形態としては、坐剤及び腟坐剤（ovula）が挙げられる。経鼻投与用の投薬形態は吸入及び吹送、例えば定量吸入器によって投与することができる。
【０１４１】
本発明に使用することができる化合物の薬学的に許容可能な塩は、様々な有機及び無機酸及び塩基によって形成することができる。酸付加塩の例としては、アセテート、アジペート、アルジネート、アスコルベート、ベンゾエート、ベンゼンスルホネート、硫酸水素、ボレート、ブチレート、シトレート、カンホラート、カンファースルホネート、シクロペンタンプロピオネート、ジグルコネート、ドデシルスルフェート、エタンスルホネート、フマレート、グルコヘプタノエート、グリセロホスフェート、ヘミスルフェート、ヘプタノエート、ヘキサノエート、ヒドロクロリド、ヒドロブロミド、ヒドロヨージド、２−ヒドロキシエタンスルホネート、ラクテート、マレエート、メタンスルホネート、２−ナフタレンスルホネート、ニコチネート、ニトレート、オキサレート、ペクチネート、パースルフェート、３−フェニルスルホネート、ホスフェート、ピクレート、ピバレート、プロピオネート、サリシレート、スルフェート、スルホネート、タータレート、チオシアネート、トシレート等のトルエンスルホネート、及びウンデカノエート等が挙げられる。塩基付加塩の例としては、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩、リチウム塩及びカリウム塩；アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウム塩及びマグネシウム塩；有機塩基（例えば、有機アミン）との塩、例えば、例えば、アルギニン、及びリシン等のアミノ酸との、ベンザゼチン（benzazethine）塩、ジシクロヘキシルアミン塩、ヒドラビン（hydrabine）塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミド塩、ｔ−ブチルアミン塩が挙げられる。
【０１４２】
本発明に使用することができる化合物の薬学的に許容可能な溶媒和物は水との溶媒和物、例えば水和物、又はメタノール、エタノール若しくはアセトニトリル等の有機溶媒との溶媒和物、すなわちそれぞれメタノール付加物、エタノール付加物又はアセトニトリル付加物の形態で存在し得る。
【０１４３】
本発明に使用することができる化合物の薬学的に許容可能なプロドラッグは、化学的又は代謝的に切断可能な基を有し、加溶媒分解によって又は生理学的条件下にてｉｎ  ｖｉｖｏで薬学的に活性な本発明の化合物となる誘導体である。プロドラッグ誘導体形態は、哺乳動物において溶解性、組織適合性又は遅延放出の利点をもたらすことが多い（Bundgaard, H., Design of Prodrugs, pp. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985を参照されたい）。
【０１４４】
本明細書に記載されるこれらの医薬組成物は、被験体に好適な用量で投与することができる。投薬計画は主治医及び臨床的因子によって決定される。医療分野で既知であるように、任意の一患者の投与量は患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、全身健康状態及び同時に投与される他の薬物等の多くの因子に依存する。概して、本明細書で規定されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーを含む医薬組成物の定期的投与としての計画は、１日あたり０．１μｇ〜５０００ｍｇ単位、一部の実施形態では１日あたり０．１μｇ〜１０００ｍｇ単位の範囲である。計画が経口投与である場合、これは１日あたり１００ｍｇ単位〜５０００ｍｇ単位、好ましくは１日あたり５００ｍｇ単位の範囲であり得る。この１日あたり５００ｍｇ単位は、１日に２回２５０ｍｇの投与量で投与してもよい。計画が持続注入である場合、これはそれぞれ体重１キログラム当たり１分に０．１ｎｇ〜１０μｇ単位の範囲であってもよい。進行は定期評価によってモニタリングすることができる。用量漸増をもたらす計画を使用することも想定される。本明細書に提示される医学的介入を必要とする患者が高投与量の本明細書で規定されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーを受けることが特に好ましい。かかる高投与量は１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇを含み得るが、他の投与計画も想定され、主治医によって対応され得る。下記の実施例に示されるように、異種移植マウス研究においては、２５ｍｇ／ｋｇ体重のクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーが良好な耐容性を示し、５０％を超える腫瘍体積の顕著な低減をもたらした。したがって、本明細書で規定されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーは２５ｍｇ／ｋｇ体重で投与することができる（例えばマウス等の動物に投与する場合）。本明細書で規定されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーを含む医薬組成物を化学療法剤、好ましくはＰＡＲＰ阻害剤及び／又はＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせた定期的投与としての計画が更に提供され、該複合調製物は同時、別個又は順次の使用のためである。本発明において、本明細書で規定されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーを含む医薬組成物を放射線療法と組み合わせて投与することも想定され、該複合投与は同時、別個又は順次の投与である。
【０１４５】
本発明において、単独又は放射線療法及び／又は化学療法剤（ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はＥＧＦＲ阻害剤等）と組み合わせた以下のアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー等）の投与様式が好ましい：
一定の又は漸増用量での経口投与、
一定の又は漸増用量での皮下投与、及び／又は、
一定の又は漸増用量での静脈内投与。
【０１４６】
最も好ましい投与様式は一定の用量での経口投与である。
【０１４７】
本明細書で上記及び下記に記載されるように、本発明は、かかる治療を必要とする被験体において癌を治療及び／又は予防する方法であって、有効量の本明細書に提示されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー又は本明細書に提示される医薬組成物を上記被験体に投与することを含む、方法を提供する。本発明の一態様は、被験体において癌を治療及び／又は予防する方法であって、治療及び／又は予防が上記被験体の癌細胞又は組織のＡＬＫ状態及び／又はｃ−Ｍｅｔ状態とは無関係であり、上記被験体に治療的に有効な量の本明細書で規定されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーを投与することを含む、方法に関する。このため、治療及び／又は予防対象の癌はＡＬＫ陰性（すなわち活性化ＡＬＫ異常を有し得ない）及び／又はｃ−Ｍｅｔ陰性であり得る。
【０１４８】
したがって、本発明はかかる治療（治療的又は予防的）を必要とする、癌を患う被験体を治療する手段及び方法を提供する。この癌はＡＬＫ陰性癌（すなわち、癌細胞又は癌組織が活性化ＡＬＫ異常を有しない癌）及び／又はｃ−Ｍｅｔ陰性癌であり得る。かかる障害を治療する方法は、薬学的に活性な量の本明細書で規定されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー等）を、単独で又は放射線療法及び／又は化学療法剤（ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はＥＧＦＲ阻害剤等）と組み合わせて投与することを含む。したがって、本発明において、本明細書に記載の治療方法は、付加的な化合物／薬剤と本明細書で規定されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー等）との同時投与も含み得る。特に、治療方法は本明細書で規定されるアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー等）の同時投与を含むのが好ましい。これらの連携療法アプローチ及び併用療法アプローチが本発明に関して想定される。
【０１４９】
「治療」、「治療する」等の用語は、本明細書で概して所望の薬理学的及び／又は生理的効果を得ることを意味するように使用される。効果は疾患又はその症状を完全又は部分的に予防するという点で予防的なものであっても、及び／又は疾患及び／又は疾患に起因する有害作用を部分的又は完全に治癒するという点で治療的ものであってもよい。「治療」という用語は、本明細書で使用される場合、被験体における任意の疾患の治療を包含し、（ａ）疾患の影響を受けやすい被験体において癌性疾患が起こるのを予防及び／又は改善すること、（ｂ）疾患を阻害する、すなわち癌進行の阻害及び／又は転移の発生の阻害のようにその発生を抑えること、又は（ｃ）疾患を軽減する、すなわち腫瘍及び／又は転移の抑制のように疾患を退行させることを含む。
【０１５０】
本発明によると、癌／癌性疾患を「予防」又は「予防する」という用語は、癌自体が発生又は更に悪い状況へと進行するのを妨げることができることを意味する。したがって、アミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー等）を癌、癌の進行及び／又は転移の発生の回避に用いることができることが本発明の利点の１つである。したがって、本発明によると、アミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー等）は、癌の発生の前に用いることができる。
【０１５１】
しかしながら、本明細書に開示及び提示されるように、アミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマー（クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー等）は、病的状態が既に発生した障害の改善及び／又は治療、すなわち既存の癌の治療に用いることもできる。したがって、「治療」という用語は、本明細書で使用される場合、既に確定し、現れた癌の治療のような既に現れた障害の医学的介入にも関する。
【０１５２】
「患者」及び「被験体」という用語は本明細書で区別なく使用される。本発明の目的のための「患者」又は「被験体」は脊椎動物であり得る。該脊椎動物はヒト等の哺乳動物であり得る。該脊椎動物はウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラクダ、ニワトリ、シチメンチョウ又は他の商業上重要な家畜であり得る。本発明の目的のための「患者」又は「被験体」はヒト及び他の動物の両方、特に哺乳動物及び他の生物を含む。このため、方法はヒト療法及び獣医学用途の両方に適用可能である。好ましい実施形態では患者は哺乳動物であり、最も好ましい実施形態では患者はヒトである。
【０１５３】
本発明による治療される又は治療を必要とする「患者」又は「被験体」は脊椎動物であり得る。該脊椎動物はヒト等の哺乳動物であり得る。該脊椎動物はウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラクダ、ニワトリ、シチメンチョウ又は他の商業上重要な家畜等の家畜であってもよい。本発明による治療される又は治療を必要とする「患者」又は「被験体」は哺乳動物であるのが好ましい。治療される「患者」又は「被験体」はヒトであるのが最も好ましい。特に、治療される「患者」又は「被験体」は、癌を患うヒト患者である。
【０１５４】
本発明によると、「状態」、特に「ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１状態」、「ＲＡＳ状態」、「ＡＬＫ状態」又は「ｃ−Ｍｅｔ状態」という用語は、それぞれのタンパク質の遺伝子の遺伝子構成、それぞれのタンパク質の発現及び／又はそれぞれのタンパク質の生物活性に関する。特に、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、ＲＡＳ、ＡＬＫ又はｃ−Ｍｅｔの「状態」は、それぞれＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、ＲＡＳ、ＡＬＫ又はｃ−Ｍｅｔの活性化又は不活性化異常の存在又は非存在によって反映され得る。したがって、「状態」という用語は、本明細書で使用される場合、対象の遺伝子又はタンパク質（例えばＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、ＲＡＳ、ＡＬＫ又はｃ−Ｍｅｔの遺伝子又はタンパク質）における活性化又は不活性化突然変異の存在にも関する。
【０１５５】
加えて、本発明において、遺伝子又はタンパク質の「状態」はそれぞれの遺伝子及び／又はタンパク質の「レベル」、すなわちＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、ＲＡＳ、ＡＬＫ又はｃ−Ｍｅｔのレベルにも関する。したがって、例えば本明細書で使用される「ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１状態」との関連での「状態」という用語は当該技術分野で既知であり、ＭＴＨ１生物活性及び／又はＭＴＨ１発現のレベル（例えば、ＭＴＨ１  ｍＲＮＡ及び／又はＭＴＨ１タンパク質のレベル）に関する。したがって、本明細書で使用される「ＲＡＳ状態」という用語は当該技術分野で既知であり、ＲＡＳ生物活性及び／又はＲＡＳ発現のレベル（例えば、ＲＡＳ  ｍＲＮＡ及び／又はＲＡＳタンパク質のレベル）に関する。したがって、本明細書で使用される「ＡＬＫ状態」という用語は当該技術分野で既知であり、ＡＬＫ生物活性及び／又はＡＬＫ発現のレベル（例えば、ＡＬＫ  ｍＲＮＡ及び／又はＡＬＫタンパク質のレベル）に関する。したがって、本明細書で使用される「ｃ−Ｍｅｔ状態」という用語は当該技術分野で既知であり、ｃ−Ｍｅｔ生物活性及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現のレベル（例えば、ｃ−Ｍｅｔ  ｍＲＮＡ及び／又はｃ−Ｍｅｔタンパク質のレベル）に関する。ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、ＲＡＳ、ＡＬＫ又はｃ−Ｍｅｔ発現のレベルはそれぞれＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、ＲＡＳ、ＡＬＫ又はｃ−Ｍｅｔの生物活性に反映され得る。したがって、「状態」という用語は本明細書で使用される場合、タンパク質、例えばＭＴＨ１、ＲＡＳ、ＡＬＫ又はｃ−Ｍｅｔの生物活性にも関する。
【０１５６】
特定のタンパク質のレベル（例えば、該タンパク質の発現レベル及び／又は生物活性のレベル）は増大又は低減し得る。特に、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、ＲＡＳ、ＡＬＫ又はｃ−ＭｅｔのレベルはそれぞれＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、ＲＡＳ、ＡＬＫ又はｃ−Ｍｅｔの活性化異常によって増大し得る。代替的には、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、ＲＡＳ、ＡＬＫ又はｃ−ＭｅｔのレベルはそれぞれＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、ＲＡＳ、ＡＬＫ又はｃ−Ｍｅｔの不活性化異常によって低減し得る。したがって、「状態」という用語は、本明細書で使用される場合、対象の遺伝子又はタンパク質における活性化又は不活性化突然変異の存在にも関する。加えて、本発明において、不活性化異常は機能喪失型突然変異体をもたらす突然変異であり得る。不活性化異常はそれぞれのタンパク質（例えばＭＴＨ１、ＲＡＳ、ＡＬＫ又はｃ−Ｍｅｔ）をコードする遺伝子の欠失又は部分的欠失であってもよい。これと一致して、本発明において、活性化異常は発現又は活性が向上したタンパク質（例えばＭＴＨ１、ＲＡＳ、ＡＬＫ又はｃ−Ｍｅｔ）をもたらす突然変異であり得る。かかる活性化異常は例えば活性化ＡＬＫ異常であり得る。活性化ＡＬＫ異常は例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫ等の遺伝子突然変異又は染色体転座であり得る。
【０１５７】
加えて、本明細書で使用される場合、「患者のＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１状態」、「患者のＲＡＳ状態」、「患者のＡＬＫ状態」又は「患者のｃ−Ｍｅｔ状態」等の「患者の状態」という用語は、「癌のＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１状態」、「癌のＲＡＳ状態」、「癌のＡＬＫ状態」又は「癌のｃ−Ｍｅｔ状態」等の上記患者の癌の状態に関する。特に、「患者の状態」（「患者のＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１状態」等）という用語は、上記患者の癌細胞又は組織の状態に関する。このため、「患者の状態」（「患者のＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１状態」等）という用語は、それぞれのタンパク質の遺伝子の遺伝子構成、それぞれのタンパク質の発現及び／又はそれぞれのタンパク質の生物活性に関する上記患者の癌細胞又は組織の状態に関する。
【０１５８】
これに関連して、「ＭＴＨ１陽性」、「ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１陽性」、「ＭＴＨ１に対して陽性の」及び「ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１に対して陽性の」という用語は本明細書で区別なく使用され、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１の生理学的な（すなわち「正常な」）及び増大した発現及び／又は生物活性両方に関する。ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１の「生理学的な」又は「正常な」発現及び／又は生物活性は、ＭＴＨ１を発現するが、活性化又は不活性化ＭＴＨ１異常を有しない細胞におけるＭＴＨ１の発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）に関する。ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１の「増大した」発現及び／又は生物活性は、ＭＴＨ１を発現し、活性化ＭＴＨ１異常を有する細胞におけるＭＴＨ１の発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）に関する。ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１の「増大した」発現及び／又は生物活性は、ＭＴＨ１を発現するが、活性化ＭＴＨ１異常を有しない細胞と比較して増大したＭＴＨ１の発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）に更に関する。活性化ＭＴＨ１異常はＭＴＨ１の増大した発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）をもたらす。したがって、「ＭＴＨ１陽性」という用語は、ＭＴＨ１の発現及び／又は生物活性の増大にも関する。活性化ＭＴＨ１異常の例は、ＭＴＨ１の発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）の増大をもたらす遺伝子増幅、遺伝子突然変異又は染色体転座である。
【０１５９】
これと一致して、「ＭＴＨ１陰性」、「ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１陰性」、「ＭＴＨ１に対して陰性の」及び「ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１に対して陰性の」という用語は本明細書で区別なく使用され、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１の低減した発現及び／又は生物活性に関する。ＭＴＨ１の「低減した」発現及び／又は生物活性は、ＭＴＨ１を発現しない細胞におけるＭＴＨ１の発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）に関する。ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１の「低減した」発現及び／又は生物活性は、ＭＴＨ１を発現するが、不活性化ＭＴＨ１異常を有しない細胞と比較して低減したＭＴＨ１の発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）に更に関する。加えて、ＭＴＨ１の「低減した」発現及び／又は生物活性は、ＭＴＨ１を発現し、不活性化ＭＴＨ１異常を有する細胞におけるＭＴＨ１の発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）に関する。不活性化ＭＴＨ１異常の例は、ＭＴＨ１の発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）の低減をもたらす遺伝子突然変異又は染色体転座である。
【０１６０】
同様に、本明細書で使用される場合、「ｃ−Ｍｅｔ陽性」及び「ｃ−Ｍｅｔに対して陽性の」という用語は本明細書で区別なく使用され、生理学的な（すなわち「正常な」）及び増大したｃ−Ｍｅｔの発現及び／又は生物活性の両方に関する。ｃ−Ｍｅｔ陽性細胞はｃ−Ｍｅｔ依存性の細胞、すなわち生存及び／又は増殖がｃ−Ｍｅｔの発現に依存する細胞であり得る。ｃ−Ｍｅｔの「生理学的な」又は「正常な」発現及び／又は生物活性は、ｃ−Ｍｅｔを発現するが、活性化又は不活性化ｃ−Ｍｅｔ異常を有しない細胞におけるｃ−Ｍｅｔの発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）に関する。ｃ−Ｍｅｔの「増大した」発現及び／又は生物活性は、ｃ−Ｍｅｔを発現し、活性化ｃ−Ｍｅｔ異常を有する細胞におけるｃ−Ｍｅｔの発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）に関する。ｃ−Ｍｅｔの「増大した」発現及び／又は生物活性は、ｃ−Ｍｅｔを発現するが、活性化ｃ−Ｍｅｔ異常を有しない細胞と比較したｃ−Ｍｅｔの増大した発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）に更に関する。活性化ｃ−Ｍｅｔ異常はｃ−Ｍｅｔの増大した発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）をもたらす。したがって、「ｃ−Ｍｅｔ陽性」という用語は、ｃ−Ｍｅｔの増大した発現及び／又は生物活性にも関する。活性化ｃ−Ｍｅｔ異常の例は、ｃ−Ｍｅｔの増大した発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）をもたらす遺伝子増幅、遺伝子突然変異又は染色体転座である。
【０１６１】
これと一致して、「ｃ−Ｍｅｔ陰性」及び「ｃ−Ｍｅｔに対して陰性の」という用語は本明細書で区別なく使用され、ｃ−Ｍｅｔの低減した発現及び／又は生物活性に関する。ｃ−Ｍｅｔ陰性細胞はｃ−Ｍｅｔ非依存性の細胞、すなわち生存及び／又は増殖がｃ−Ｍｅｔの発現に依存しない細胞である。ｃ−Ｍｅｔの「低減した」発現及び／又は生物活性は、ｃ−Ｍｅｔを発現しない細胞におけるｃ−Ｍｅｔの発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）に関する。ｃ−Ｍｅｔの「低減した」発現及び／又は生物活性は、ＭＴＨ１を発現するが、不活性化ｃ−Ｍｅｔ異常を有しない細胞と比較して低減したｃ−Ｍｅｔの発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）に更に関する。加えて、ｃ−Ｍｅｔの「低減した」発現及び／又は生物活性は、ｃ−Ｍｅｔを発現し、不活性化ｃ−Ｍｅｔ異常を有する細胞におけるｃ−Ｍｅｔの発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）に関する。不活性化ｃ−Ｍｅｔ異常の例は、ｃ−Ｍｅｔの発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）の低減をもたらす遺伝子突然変異又は染色体転座である。
【０１６２】
「ＡＬＫ陰性」、「ＡＬＫに対して陰性の」及び「活性化ＡＬＫ異常を有しない」という用語は本明細書で区別なく使用されることに留意されたい。したがって、「ＡＬＫ陰性」という用語は、ＡＬＫの生理学的な（すなわち「正常な」）及び低減した発現及び／又は生物活性の両方に関する。ＡＬＫの「生理学的な」又は「正常な」発現及び／又は生物活性は、ＡＬＫを発現するが、活性化ＡＬＫ異常を有しない細胞におけるＡＬＫ発現及び／又はＡＬＫ生物活性（すなわち触媒活性）に関する。ＡＬＫの「生理学的な」又は「正常な」発現及び／又は生物活性は、健常な非癌性細胞又は組織のＡＬＫ発現及び／又はＡＬＫ生物活性に更に関する。この非癌性細胞又は組織は活性化ＡＬＫ異常を有しないとみなされる。
【０１６３】
ＡＬＫの「低減した」発現及び／又は生物活性は、一態様において、ＡＬＫキナーゼの発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）がないことに関する。ＡＬＫの「低減した」発現及び／又は生物活性は、本明細書で上記に規定されるように生理学的ＡＬＫ発現及び／又は生理学的ＡＬＫ生物活性と比較して定性的又は定量的に低減したＡＬＫの発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）に更に関する。
【０１６４】
「ＡＬＫ陽性」、「ＡＬＫに対して陽性の」及び「活性化ＡＬＫ異常を有する」という用語は本明細書で区別なく使用され、活性化ＡＬＫ異常を有する癌細胞又は組織に関する。ＡＬＫ陽性細胞はＡＬＫ依存性の細胞、すなわち生存及び／又は増殖がＡＬＫの発現に依存する（癌及び／又は腫瘍）細胞であり得る。活性化ＡＬＫ異常は、ＡＬＫの増大した発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）に関する。ＡＬＫの「増大した」発現及び／又は生物活性は、ＡＬＫを発現するが、活性化ＡＬＫ異常を有しない細胞と比較して増大したＡＬＫの発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）に関する。加えて、「増大した」ＡＬＫ発現及び／又はＡＬＫ生物活性は、健常な非癌性細胞におけるＡＬＫキナーゼの生理学的発現及び／又は生物活性と比較して向上したＡＬＫの発現及び／又は生物活性に関する。したがって、「ＡＬＫ陽性」という用語は、ＡＬＫの向上した発現及び／又は生物活性に関する。活性化ＡＬＫ異常の例は、ＡＬＫの発現及び／又は生物活性（すなわち触媒活性）の増大をもたらす遺伝子増幅、遺伝子突然変異又は染色体転座である。活性化ＡＬＫ異常を示す染色体転座の例はＥＭＬ４−ＡＬＫである。
【０１６５】
タンパク質ＭＴＨ１の遺伝子名はＮＵＤＴ１である。現在、ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１の４つのアイソフォーム（ｐ１８、ｐ２１、ｐ２２及びｐ２６）が報告されており、ｐ１８が優性アイソフォームであると考えられている。アイソフォームｐ１８を本明細書に記載の実験に用いた。ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１のヌクレオチド及びアミノ酸配列を本明細書の下記に提示する。ＭＴＨ１の突然変異は報告されているが、その生理学的又は臨床的関連性は解明されていない。ＮＵＤＴ／ＭＴＨ１状態を決定する（例えば、ＮＵＤＴ／ＭＴＨ１のレベル（発現レベル等）を検出するか、又はＮＵＤＴ／ＭＴＨ１のヌクレオチド若しくはアミノ酸配列が特異的突然変異を含有するか否かを決定する）方法が当該技術分野で既知であり、本明細書で下記に記載される。
【０１６６】
ＲＡＳに関して、幾つかの遺伝子が存在する（すなわちＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ及びＭＲＡＳ）。代替スプライシングのために幾つかの既存のアイソフォームが存在する。既知の活性化ＲＡＳ突然変異としては、ＫＲＡＳの突然変異、例えばＧ１２突然変異（例えばＧ１２Ｃ）又はＱ６１突然変異（例えばＱ６１Ｈ）が挙げられる。ＲＡＳのヌクレオチド及びアミノ酸配列は本明細書で下記に提示される。加えて、例えば肺癌に見られる突然変異体Ｇ１２Ｃ  ＫＲＡＳのアミノ酸配列は、本明細書で下記に配列番号２３として提示される。ＲＡＳ状態を決定する（例えば、ＲＡＳのレベル（例えば発現レベル）を検出するか、又はＲＡＳのヌクレオチド若しくはアミノ酸配列が特異的突然変異を含有するか否かを決定する）方法は当該技術分野で既知であり、本明細書で下記に記載される。加えて、ＡＬＫ及びｃ−Ｍｅｔのヌクレオチド及びアミノ酸配列が本明細書で開示される（下記を参照されたい）。さらに、それぞれＲＡＳ、ＡＬＫ及びｃ−Ｍｅｔの幾つかの異常及び突然変異をもたらすＲＡＳ、ＡＬＫ及びｃ−Ｍｅｔのアミノ酸配列の配列注釈が本明細書で開示される（下記を参照されたい）。
【０１６７】
活性化及び不活性化異常としては、遺伝子突然変異等の遺伝子異常、遺伝子コピー数の増大、遺伝子発現の異常及びｍＲＮＡ発現の異常が挙げられる。上記異常を検出する遺伝子異常の技法の一般的概要を下記表１に示す。
【０１６８】
【表１】
2015529665.tif 000015
【０１６９】
腫瘍生検材料に由来するＤＮＡにおける増幅又は突然変異等のＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、ＡＬＫ、ＲＡＳ又はｃ−Ｍｅｔ異常（例えば遺伝子異常）の検出に使用することができる他の技法としては、本明細書で下記に記載されるようなペプチド核酸−ロックド核酸（ＰＮＡ−ＬＮＡ）ＰＣＲクランプ、ＰＣＲ−インベーダー、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ＰＣＲ／ＨＲＭＡ／ｄＨＰＬＣ、ＰＣＲ／ｆＩＲＦＬＰ、蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）及び免疫組織化学（ＩＨＣ）が挙げられる。
【０１７０】
ペプチド核酸−ロックド核酸（ＰＮＡ−ＬＮＡ）ＰＣＲクランプは、例えばＥＧＦＲ突然変異を非腫瘍細胞に由来する野生型ＥＧＦＲの１００倍〜１０００倍バックグラウンドの存在下で検出することができる、迅速かつ高感度の突然変異の検出系である２４。この方法は当該技術分野で既知であり、例えばNagai (2005) Cancer Res 65: 7276-7282２４に記載されている。
【０１７１】
ＰＣＲ−インベーダー。この系は、ＤＮＡ配列中の既知の単一核酸変化を同定し、シグナルを増幅するのに２つの同時反応を使用する。この方法は当該技術分野で一般に知られており、例えばTadokoro (2011) Transl Res. 158:169-79及びhttp://www.twt.com/invader/invader.htmlに記載されている。
【０１７２】
ＳＮａＰｓｈｏｔ。ＳＮａＰｓｈｏｔは、既知の単一ヌクレオチド突然変異の検出に使用することができる単一ヌクレオチドプライマー伸長アッセイである。この方法は当該技術分野で一般に知られており、例えばHurst (2009) BMC Research Notes 2:66及びhttps://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=600762&tab=DetailInfoに記載されている。
【０１７３】
ＰＣＲ／ＨＲＭＡ／ｄＨＰＬＣ。生検材料のＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、高分解能融解分析及び／又は変性高速液体クロマトグラフィーに供して、突然変異を検出する２５，２６。この方法は当該技術分野で一般に知られており、例えばJaenne (2006) Clin Cancer Res 12: 751-758２５及びNomoto (2006) Am J Clin Pathol 126: 608-615２６に記載されている。
【０１７４】
ＰＣＲ／ｆＩＲＦＬＰ。ＤＮＡを蛍光標識プライマーによるＰＣＲを用いて増幅する。断片を、突然変異を含有する領域を標的とする制限酵素で消化し、生成物を断片分析に供して、消化断片及び非消化断片を検出する２７。この方法は当該技術分野で一般に知られており、例えばPao (2005) PLoS Med 2 (3): e73２７に記載されている。
【０１７５】
蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）及び免疫組織化学（ＩＨＣ）。ＦＩＳＨは対象の遺伝子のＤＮＡのコピー数を測定するものであり、ＩＨＣは細胞内の一致したタンパク質を測定するものである。ＦＩＳＨは当該技術分野で一般に知られており、例えばKoivunen (2008) Clinical Cancer Research 14: 4275-4283に記載されている。ＩＨＣは当該技術分野で一般に知られており、例えばChen (2010) Cancer Research 70: 9827-9836に記載されている。ＡＬＫについては、特定のＦＩＳＨキットが利用可能である（Abbott LaboratoriesのＶｙｓｉｓ  ＡＬＫ  Ｂｒｅａｋ  Ａｐａｒｔ  ＦＩＳＨプローブキット（製品名：Ｖｙｓｉｓ  ＡＬＫ  Ｂｒｅａｋ  Ａｐａｒｔ  ＦＩＳＨプローブキット、Abbottの注文番号：０６Ｎ３８−０２０））。
【０１７６】
細胞遺伝学的異常の検出については、幾つかの検出方法が当該技術分野で既知であり、例えばSpeicher (2005) Nat Rev Genet 6 (10): 782-792２９に概説されている。
【０１７７】
全ての突然変異検出方法を最良の慣行で行うものとする。これは、全ての突然変異検出方法がロバストであり、確立された標準操作手順（ＳＯＰ）により最高水準まで行われることを意味する。プロセスの各々の工程の品質管理は適切である必要がある。突然変異検出方法を最良の慣行で行う方法は当該技術分野で既知であり、例えばEberhard (2008) Clin Oncol 26 (6): 983-993２８に記載されている。
【０１７８】
患者のＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１状態の検出に用いられる抗体、プローブ及びプライマーは当該技術分野で一般に知られており、以下にも示される。
【０１７９】
患者のＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１状態の検出のための抗体は、例えばNovus BiologicalsのＭＴＨ１抗体（ＮＢ１００−１０９）である。
【０１８０】
患者のＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１状態の検出のためのプライマーは、例えばKennedy (1998) FEBS Lett. 429 (1): 17-20３６（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に示されている。加えて、患者のＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１状態の検出のためのプライマーは、本明細書で下記及び添付の配列表にも提示されている。
ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１の検出のためのプライマー配列（配列番号１７）
５Ｐ−ＡＧＣＣＴＣＡＧＣＧＡＧＴＴＣＴＣＣＴＧ−３Ｐ
ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１の検出のためのプライマー配列（配列番号１８）
５Ｐ−ＧＡＴＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣ−３Ｐ
【０１８１】
患者のＲＡＳ状態の検出に用いることができる抗体、プローブ及びプライマーは当該技術分野で一般に知られており、以下にも示される。
【０１８２】
患者のＲＡＳ状態の検出のための抗体は、例えばCell SignalingのＲａｓ抗体＃３９６５である。
【０１８３】
患者のＲＡＳ状態の検出のためのプライマーは、例えばKeohavong (1996) Clin. Cancer. Res. 2 (2): 411-418３３及びGerry (1999) Mol. Biol. 292 (2): 251-262３４（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に示されている。
【０１８４】
患者のｃ−Ｍｅｔ状態の検出に用いることができる抗体、プローブ及びプライマーは当該技術分野で一般にしられており、以下にも示される。
【０１８５】
患者のｃ−Ｍｅｔ状態の検出のための抗体は、例えばCell SignalingのＭｅｔ抗体＃４５６０である。
【０１８６】
患者のｃ−Ｍｅｔ状態の検出のためのプライマー及びプローブは、例えばKubo (2009) Int. J. Cancer 124 (8): 1778-1784３５（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に示されている。
【０１８７】
患者のＡＬＫ状態の検出に用いることができる抗体、プローブ及びプライマーは当該技術分野で一般に知られており、以下にも示される。
【０１８８】
患者のＡＬＫ状態の検出のための抗体は、例えばCell Signalingの＃３６３３  ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）ＸＰ（商標）ウサギｍＡｂ及びＡＬＫ（Ｃ２６Ｇ７）ウサギｍＡｂ＃３３３３である。
【０１８９】
患者のＡＬＫ状態の検出のためのプローブ及びプライマーは、例えばKoivunen (2008) Clin. Cancer. Res. 14 (13): 4275-4283３０及びLin (2009) Mol. Cancer Res. 7 (9): 1466-1476３１（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に示されている。
【０１９０】
患者のＡＬＫ状態の検出のための更なるプライマーは、例えばChen (2008) Nature 455 (7215): 971-974３２（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に示されている。
【０１９１】
患者のｐ２１状態の検出に用いることができる抗体、プローブ及びプライマーは当該技術分野で一般に知られており、以下にも示される。
【０１９２】
ｐ２１を（例えばｑＰＣＲを用いることによって）検出することが可能なポリヌクレオチドは、以下の配列を有するヒトｐ２１／ＷＡＦ１−オリゴヌクレオチドである：
５’−ＣＴＧＴＧＡＴＧＣＧＣＴＡＡＴＧＧＣＧ−３’（配列番号４９）
５’−ＡＡＧＴＣＧＡＡＧＴＴＣＣＡＴＣＧＣＴＣＡ−３’（配列番号５０）
（例えば、Zeng (2006) Cancer Research 66, 10701-10708)を参照されたい）
【０１９３】
ｐ２１を検出することが可能な抗体は、例えばAbcamの抗ｐ２１抗体（ａｂ７９６０）及びCell Signalingのｐ２１  Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１（ＤＣＳ６０）マウス  ｍＡｂ＃２９４６である。
【０１９４】
「ポリヌクレオチド（複数の場合もあり）」という用語は、本明細書で使用される場合、プライマー（複数の場合もあり）及びプローブ（複数の場合もあり）を包含することに留意されたい。したがって、「ポリヌクレオチド（複数の場合もあり）」という用語は、本明細書で使用される場合、プライマー（複数の場合もあり）及びプローブ（複数の場合もあり）の両方を意味する。プライマー（例えば患者のＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１状態、患者のＲＡＳ状態、患者のＡＬＫ状態及び／又は患者のｃ−Ｍｅｔ状態を検出するプライマー）は、例えばＰｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓ（以下のＵＲＬで利用可能である：bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi；Rozen and Skaletsky, In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J., pp. 365-386, 2000を参照されたい）及びInvitrogenのベクターＮＴＩ専売ソフトウェア等の利用可能なソフトウェアを用いて設計することができる。プライマーを設計する他の方法が当業者に既知である。
【０１９５】
添付の図面は本発明を示し、説明するものである。
【実施例】
【０１９６】
以下の非限定的な実施例をもって本発明を説明する。
【０１９７】
材料及び方法：
一般的情報。ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ４００（Bruker，Billerica，MA，U.S）で記録した。化学シフトをｐｐｍで示し、結合定数をヘルツで示す。質量スペクトルをＸｅＶｏ−ＵＰＬＣ−ＴＱ−ＭＳシステム（Waters，Milford，MA，U.S.）を用いて記録した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＦＣＣ）による精製を、シリカゲル６０（Merck，Darmstadt，Germany）を用いて行い、ＭＰＬＣをＢｉｏｔａｇｅ  Ｉｓｏｌｅｒａシステム（Biotage，Uppsala，Sweden）で行った。合成した化合物の純度を求め、ＵＰＬＣ分析によって確認した。
【０１９８】
全ての合成化学物質はSigma-Aldrich及びSanta Cruzから購入し、更に精製することなく使用した。
【０１９９】
化学物質。全ての化学物質はSigma Aldrich又はFluka（Sigma Aldrich Austria）から購入し、更に精製することなく使用した。ラセミ型（ＲＳ）−クリゾチニブ及びＪＮＪ−３８８７７６０５はSelleck Chemicals（Selleck Chemicals LLC，Houston，TX，USA）から入手し、（Ｒ）−クリゾチニブはSelleck Chemicals、Tocris（Tocris Bioscience，Bristol，UK）及びChemieTek（ChemieTek，Indianapolis，IN，USA）から購入した。クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーはChemFuture（ChemFuture PharmaTech Ltd，Jiangsu，China）から入手した。ＳＣＨ５１３４４はCalbiochem（EMD Millipore，Billerica，MA，USA）から購入した。化合物２の合成を図２５に示す。
【０２００】
固体化及び親和性精製。薬物−親和性マトリックスは基本的に先に記載されるように調製した（Rix (2007) Blood 110, 4055-4063）。簡潔に述べると、２５ｎｍｏｌの化合物を５０μＬのＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗビーズ（GE Healthcare Bio-Sciences AB，Uppsala，Sweden）に固定化した。親和性クロマトグラフィー及び溶出を、１反復当たり１０ｍｇの全細胞溶解物をタンパク質インプットとして用いて先に報告されているように二連で行った（Fernbach (2009) Journal of Proteome Research 8, 4753-4765）。
【０２０１】
溶液トリプシン消化及びペプチド精製。溶出の後、富化されたタンパク質をジチオスレイトールによって還元し、ヨードアセトアミドとのインキュベーションによってシステイン残基をアルキル化し、サンプルを変性豚トリプシン（Promega，Madison，WI）で消化した。３パーセント（及びその倍数）の消化溶出物を精製し、ゲルフリー一次元液体クロマトグラフィー質量分析（１Ｄ−ＬＣＭＳ）によるその後の二連分析のためにＣ１８逆相材料によって濃縮した。ＬＣＭＳ方法の詳細は先に記載されている通りである（Maurer (2012) Journal of Proteome Research 12, 1040-1048）。
【０２０２】
タンパク質同定。その後のタンパク質同定のために、ピーク抽出及びＲＡＷファイルのＭＧＦフォーマットへの変換をｍｓｃｏｎｖｅｒｔ（ＰｒｏｔｅｏＷｉｚａｒｄ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｖ２．１．２７０８）で行った。初回のデータベース検索をより広い質量許容差で行い、最適な最終タンパク質同定のための質量リストを再検査した。初回のタンパク質データベース検索のために、Ｍａｓｃｏｔ（www.matrixscience.com、バージョン２．３．０２）を使用した。前駆体及び断片イオンの許容誤差はそれぞれ±１０ｐｐｍ及び±０．６Ｄａであり、データベース検索は最大で１つの切断ミスの完全なトリプシンペプチドに制限され、カルバミドメチルシステイン及びメチオニン酸化をそれぞれ不変及び可変修飾として設定した。Ｍａｓｃｏｔペプチドイオンスコア閾値を３０に設定し、１タンパク質当たり少なくとも３つのペプチド同定が必要であった。全タンパク質アイソフォームを含むヒトＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（www.uniprot.org release 2012-05）に対して検索を行った。
【０２０３】
初回のペプチド同定を用いて、理論値からの測定質量の平均二乗偏差を最小限に抑える前駆体及び断片質量に関する独立した線状変換を推測した。再検査した質量リストのファイルを、より狭い質量許容差（±４ｐｐｍ及び±０．３Ｄａ）を用いるＭａｓｃｏｔ及びＰｈｅｎｙｘ（GeneBio，SA、バージョン２．５．１４）検索エンジンの組合せによって同じヒトタンパク質データベースに対して検索した。１つのトリプシン切断部位のミスが許容された。カルバミドメチルシステインを不変修飾、酸化メチオニンを可変修飾として設定した。タンパク質を確認するために、内部で開発されたパーサーによってＭａｓｃｏｔ及びＰｈｅｎｙｘアウトプットファイルを処理した。スコアＴ１を超える２つ以上の独特なペプチド、又はスコアＴ２を超える単一ペプチドを有するタンパク質を明確な同定として選択した。スコアがＴ３を超えるこれらの確認されたタンパク質の付加的なペプチドも認められた。Ｍａｓｃｏｔ検索については、以下の閾値を使用した：Ｔ１＝１４、Ｔ２＝４０及びＴ３＝１０；Ｐｈｅｎｙｘの閾値はそれぞれ４．２、４．７５及び３．５（Ｐ値＜１０−３）に設定した。２つのアルゴリズムにより検索した確認されたタンパク質をマージし、スペクトル衝突を切り捨て、共通のペプチドに従ってグループ分けした。タンパク質同定については１％未満及びペプチドについては０．１％未満の偽発見率（ＦＤＲ）（より低いスコアでエクスポートされるものを含む）を、逆のタンパク質配列のデータベースに対して同じ手順を適用することによって求めた。
【０２０４】
バイオインフォマティクス分析。非特異的結合剤を、ＳＡＩＮＴソフトウェア（バージョン２．３．４）を用いて薬物プルダウンからフィルタリングした（Choi (2011) Nat Meth 8, 70-73）。タンパク質スペクトルカウントをタンパク質量の尺度として用い、実際のプルダウン対陰性対照実験のデータを比較し、ＳＡＩＮＴにより真のベイト（bait）相互作用物質としてのプレイ（prey）タンパク質の確率を算出する。
【０２０５】
ＳＡＩＮＴ確率カットオフ閾値はＴＵＢＡ１Ｂ及びＲＰＳ３Ａとして０．９９に設定し、既知の汚染物質が本発明者らの施設での千回を超えるＭＳ実験で観察され、それぞれ０．９９９３及び０．９８８２の確率であった。
【０２０６】
結晶化のためのＭＴＨ１の発現及び精製。発現構築物を、市販のＲｏｓｅｔｔａ細胞に由来するｐＲＡＲＥ２プラスミドを含有する大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換した。形質転換によるコロニーを使用して、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する１００ｍＬのＬＢ培地に接種した。培養物を３７℃で振盪しながらバッフル付き振盪フラスコで一晩成長させた。この培養物を使用して、１０ｍｌの培養物を１ＬのＬＢ（５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する）に添加することによってバッフル付き振盪フラスコ内のＬＢ培地に接種した。培養物がおよそ０．６のＯＤ６００を有した時、温度を１８℃に下げ、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドを０．５ｍＭまで添加することによってタンパク質発現を誘導した。培養物を１８℃で一晩振盪し続けた後、細胞ペレットを遠心分離によって採取した。細胞を、０．５ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）及び０．２ｍＭフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）を添加した結合バッファー（２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、５％グリセロール）に再懸濁した。再懸濁した細胞を−２０℃で保管した。
【０２０７】
再懸濁した細胞を融解し、超音波処理によって溶解させた。ポリエチレンイミンを０．１５％の濃度まで添加し、溶解物を４℃で遠心分離し、不溶性物質を除去した。上清を７．５ｍｌのニッケル−キレート樹脂にロードした。樹脂を結合バッファー、及び４０ｍＭイミダゾール、その後６０ｍＭイミダゾールを含有する結合バッファーで洗浄した。タンパク質を、２５０ｍＭイミダゾールを含有する結合バッファーで溶出させた。ヘキサヒスチジンタグを、ＴＥＶプロテアーゼを用いて４℃で一晩処理することによって除去した。消化したサンプルを５ｍｌ容量まで濃縮し、ＧＦバッファー（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過カラム（ＨｉＬｏａｄ  １６／６０、GE Healthcare）にロードした。ＭＴＨ１を含有する画分をプールし、２．５ｍｌニッケル−キレート樹脂のカラムに通した。フロースルー及び１０ｍＭイミダゾールを含有するＧＦバッファーによる溶出物を合わせた。タンパク質同一性をエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＬＣ／ＭＳＤ）により検証した。
【０２０８】
ＭＴＨ１複合体を、１０：１というおおよそのモル比で希釈タンパク質溶液に（Ｒ）−クリゾチニブ又はクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーを添加することによって調製した。ＭＴＨ１：クリゾチニブ複合体を２０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで限外濾過によって共に濃縮した。
【０２０９】
結晶化及びデータ収集。ＭＴＨ１複合体を、表３に詳述される１５０ｎＬのドロップを用いるシッティングドロップ蒸気拡散法によって結晶化した。全ての結晶を２５％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを添加したリザーバ溶液中で凍結防止処理し、液体窒素で急速冷凍した。Ｘ線回折データをＤＩＡＭＯＮＤシンクロトロン、１００Ｋで収集した。
【０２１０】
構造決定及び精密化。回折像をＭＯＳＦＬＭ（Leslie in Evolving Methods for Macromolecular Crystallography Vol. 245 NATO Science Series; eds RandyJ Read & JoelL Sussman; Ch. 4, 41-51; Springer Netherlands, 2007）を用いて処理した。総合データをスケーリングし、ＡＩＭＬＥＳＳ（Evans (2006) Acta Crystallographica Section D 62, 72-82）及びＣＣＰ４プログラム一式（Winn (2011) Acta Crystallographica Section D 67, 235-242）を用いてマージした。ＰＨＡＳＥＲ（McCoy (2007) J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674）を用いる分子置換によって構造を解明した。全ての構造モデルをＣＯＯＴ（Emsley (2010) Acta Crystallographica Section D 66, 486-501）を用いて構築し、ＲＥＦＭＡＣ５（Murshudov (2011) Acta Crystallographica Section D 67, 355-367）を用いて精密化した。リガンド抑制をＰＲＯＤＲＧ（Schuettelkopf (2004) Acta Crystallographica Section D 60, 1355-1363）で生成した。Ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙ（Chen (2010) Acta Crystallographica Section D 66, 12-21）を構造確認に用いた。データ収集及び精密化の統計は表４に見ることができる。
【０２１１】
細胞培養及び免疫ブロット法。ＢＪ細胞はATCCから入手した。ＳＷ４８０及びＤＬＤ１はWalter Bergerにより好意提供されたものであり、ＰＡＮＣ１はRudolf Oehlerにより好意提供されたものである。他の全ての細胞株はAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）又はLeibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭＺ）から入手した。ＳＷ４８０、ＰＡＮＣ１及びＢＪ細胞はＤＭＥＭ中、ＤＬＤ１はＲＰＭＩ中で培養した。全ての培地が１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１０Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）を含有するものであった。ＭＣＦ−７を１０％ＦＢＳ、１０Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン及び０．０１ｍｇ／ｍｌのウシインスリンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、１０％ＦＢＳ及び１０Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを含有するリーボビッツＬ−１５中で成長させた。抗体。抗ＡＬＫ抗体はCell Signaling Technologyから入手し、抗ＭＴＨ１はNovus（Novus Biologicals，Littleton，CO，USA）から購入した。以下の抗体をメーカーの使用説明書に従って使用した：ウサギ抗ＭＴＨ１（ＮＢ１００−１０９、Novus Biologicals）、ウサギ抗アクチン（ＡＡＮ０１、Cytoskeleton）、ウサギ抗ＡＬＫ（Ｃ２６Ｇ７、Cell Signaling Technology及び５１３９００、Invitrogen、Life Technologies）。
【０２１２】
組み換えＭＴＨ１の発現。Ｈｉｓタグ及びＴＥＶ部位を特徴とするｐＥＴＭ−１１ベクター（Gunther Stier，EMBL）にサブクローニングした、コドン最適化したヒトＭＴＨ１  ｃＤＮＡをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（GenScript，NJ，USA）により得て、大腸菌株ＢＬ２１  ＤＥ３（Life Technologies）で発現させた。採取後、リゾチーム（Sigma-Aldrich）及びＤＮａｓｅ  Ｉ（Roche）を含有するバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）で細菌を溶解させた。Ｈｉｓタグ付きタンパク質をＮｉＮＴＡアガロース（Qiagen）で精製し、バッファーで洗浄し、イミダゾール勾配で溶出させた。ＴＥＶプロテアーゼとのインキュベーションによるＨｉｓタグの除去の後、画分を透析し、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ、GE Healthcare）によって精製した。精製画分のタンパク質濃度をＵＶ（Ａ２８０）によって求めた。タンパク質の同一性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって確認し、タンパク質活性をＫｍ測定によって求めたところ、文献データ（Svensson (2011) FEBS Letters 585, 2617-2621）に一致する値が得られた。
【０２１３】
化学プロテオミクス実験。薬物プルダウン実験は基本的に、１反復当たり１０ｍｇの全溶解タンパク質を用いて先に記載されるように行った。競合実験のために、溶解物を純粋な未変性クリゾチニブ（最終濃度２０μＭ）とともに３０分間プレインキュベートした。プルダウン溶出物をトリプシンで消化し、ｉＴＲＡＱ試薬で標識し、ＬＣによって分取し、ＯｒｂｉＴｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ質量分析計で分析した。ピークリスト情報を得られたＭＳデータから抽出し、ヒトＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースバージョンｖ２０１０．０９＿２０１００８１２（ｖａｒｓｐｌｉｃ．ｐｌにより得られるアイソフォームを含む）から検索エンジンＭＡＳＣＯＴ（ｖ２．３．０２、MatrixScience，London，UK）及びＰｈｅｎｙｘ（ｖ２．５．１４、GeneBio，Geneva，Switzerland）で検索した２０。タンパク質データベース検索基準の詳細は他の部分に示す２１。定量的プロテオミクスデータの分析を、Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージｉｓｏｂａｒで行った２２。
【０２１４】
ＭＴＨ１アッセイ。ヒトＭＴＨ１（ＮＵＤＴ１）をコードし、大腸菌における発現について最適化されたｃＤＮＡはGenscriptから購入した。Ｈｉｓタグ付きＭＴＨ１は大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ３）（Stratagene）においてｐＥＴＭ−１１から発現させた。細菌を採取し、溶解させ、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Qiagen）を用いてＨｉｓタグ付きＭＴＨ１を精製した。ＨｉｓタグをＴＥＶ切断によって除去し、ＭＴＨ１タンパク質を、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（GE Healthcare）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてｐＨ７．５で更に精製した。タンパク質の同一性及び純度を、質量分析を用いて確認した。ＭＴＨ１の活性を、ＰＰｉＬｉｇｈｔ無機ピロリン酸アッセイ（Lonza Rockland Inc.）を用い、８−オキソ−ｄＧＴＰ（TriLink Biotechnologies）を使用してモニタリングした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを利用する非線形回帰分析を用いてＩＣ５０値を求めた。
【０２１５】
より具体的には、ＭＴＨ１触媒アッセイを以下のように行った。最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を、僅かに変更した先に記載されるような（Svensson (2011) FEBS Letters 585, 2617-2621）発光ベースのアッセイを用いて求めた。簡潔に述べると、化合物の段階希釈物をアッセイバッファー（０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０及び２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２）に溶解した。ＭＴＨ１組み換えタンパク質（最終濃度２ｎＭ）を添加した後、プレートをプレートシェーカー上で室温にて１５分間インキュベートした。８−オキソ−ｄＧＴＰ（TriLink Biotechnologies、最終濃度１６μＭ）を添加した後、ＭＴＨ１による８−オキソ−ｄＧＴＰ加水分解の結果としてのピロリン酸塩（ＰＰｉ）の生成を、ＰＰｉＬｉｇｈｔ無機ピロリン酸アッセイキット（Lonza Rockland）を用いて１５分間にわたってモニタリングした。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを利用する非線形回帰分析を用いて用量応答曲線をデータ点に適合させることによって求めた。
【０２１６】
ｓｉＲＮＡ実験。市販の抗ＭＴＨ１  ｓｉＲＮＡセット（ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ  ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ、Dharmacon）及びカスタム合成したｓｉＲＮＡ（Sigma-Aldrich）の両方を得た。カスタムｓｉＲＮＡ配列はＣＧＡＣＧＡＣＡＧＣＵＡＣＵＧＧＵＵＵであり、ＡｌｌＳｔａｒｓ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（Qiagen）を対照として使用した。トランスフェクションのために、細胞をｓｉＲＮＡ処理の２４時間前に２４ウェルプレートにおよそ３０％コンフルエンシーで播種した。翌日、培地を吸引し、トランスフェクションをＩＮＴＥＲＦＥＲｉｎ（Polyplus）でメーカーの使用説明書に従って１０ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度を用いて行った。細胞を２、３日間インキュベートし、洗浄し、トリプシンで剥離させ、６ウェルプレートに再プレーティングした。７日〜１０日後、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、氷冷メタノールで固定し、クリスタルバイオレット溶液（２５％メタノール中０．５％）で染色し、一晩乾燥させた。結果の定量化のために、クリスタルバイオレットのＵＶ吸光度を７０％エタノールによる可溶化後に５９５ｎｍで求めた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｔ検定、Ｐ＜０．０５）を用いてデータを分析した。
【０２１７】
ＳＷ４８０細胞を用いたコロニー形成アッセイ。処理の前日に、６ウェルプレートに１ウェル当たり１０４個の細胞を播種し、２４時間インキュベートする。翌日、ＤＭＳＯ（最高量の化合物希釈に等しい、最大で０．２％）又は漸増濃度の化合物を添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で７日間〜１０日間インキュベートした。ＰＢＳ（Gibco）で洗浄した後、細胞を氷冷メタノールで固定し、クリスタルバイオレット溶液（２５％メタノール中０．５％）で染色し、一晩乾燥させた。結果の定量化のために、７０％エタノールによる可溶化の後にクリスタルバイオレットのＵＶ吸光度を５９５ｎｍで求めた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを利用した非線形回帰分析を用いてデータを分析した（このコロニー形成アッセイはＭＣＦ  ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いることによっても行い、図１２に示される同様の結果をもたらした）。
【０２１８】
ＭＣＦ  ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いたコロニー形成アッセイ。１ウェル当たり１０００個の細胞を２ｍＬの完全培地に播種した（０日目）。培地を交換しながら薬物又はＤＭＳＯ（モック）を２４時間後（１日目）、１５日目及び２１日目に薬物を添加した。プレーティングの４週間後に、細胞をメタノールで固定した後、クリスタルバイオレットで染色した。
【０２１９】
コメットアッセイ。細胞を化合物で６日間処理し、ＤＮＡ一本鎖切断をアルカリ性条件下でコメットアッセイを用いてアッセイした。Ｈ２Ｏ２対照については、細胞をＰＢＳ中１５０μＭのＨ２Ｏ２（Sigma-Aldrich）で１０分間処理した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ゴムスクレーパーを用いて採取し、遠心分離によってペレット化し、ＰＢＳに再懸濁し、１％低ゲル化温度アガロース（SigmaのタイプＶＩＩ）と混合し、３７℃で維持した。細胞とアガロースとの混合物を、０．５％アガロースをプレコートした艶消しガラススライド上に成層し、スライドを氷上に置き、ゲル化した。後続の全ての工程の間スライドを暗所に維持した。スライドを予冷した溶解バッファー（２．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７０）、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％ＤＭＳＯ）に１時間浸漬し、予冷した蒸留水で２０分間３回洗浄し、予冷したアルカリ電気泳動バッファー（５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＤＭＳＯ（ｐＨ１２．８））中で４５分間インキュベートした。２５ボルトで２５分間の電気泳動の後、スライドを４℃で一晩暗所に置いた。翌日、スライドを０．４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で１時間中和し、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Invitrogen、蒸留水で１００００倍に希釈する）で３０分間染色した。コメットテールモーメント（コメットテールのＤＮＡ画分を乗算した、ＤＮＡによって移動した平均距離として規定される）を、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ細胞画像分析ソフトウェアを用いてスコアリングした。
【０２２０】
間接的免疫蛍光。細胞を化合物で６日間処理した後、ガラスカバースリップに付着させ、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ中の３％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。固定した細胞をＰＢＳですすぎ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で５分間透過処理した。ＰＢＳ洗浄したスライドをＰＢＳ中の１０％ＦＣＳ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００とともに１時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ中の１０％ＦＣＳ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００において抗５３ＢＰ１モノクローナル抗体（Ｈ−３００、Santa Cruz、６００倍希釈）で染色した。ＰＢＳですすいだ後、カバースリップをＰＢＳ中の１０％ＦＣＳ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００においてアレキサフルオール（Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ）（登録商標）５６８ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Invitrogen、４００倍希釈）とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ＤＮＡをＤＡＰＩ（Sigma-Aldrich）で１０分間対比染色し、カバースリップをＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Dako）でマウントした。画像をZeissの蛍光顕微鏡で支援ソフトウェアを用いて６３倍の倍率で分析した。
【０２２１】
異種移植研究。ＳＣＩＤマウス（雌性、５週齢〜６週齢、Scanbur、Germany）に、１×１０６個のＳＷ４８０細胞をマトリックスゲル（１：１）とともに仙骨部に皮下注射した。処理を細胞接種の１日後に開始した。ビヒクル又はＭＴＨ１阻害剤を２５ｍｇ／ｋｇで３５日間、１日１回皮下投与した。ＭＴＨ１阻害剤を１％ＤＭＳＯ、１０％エタノール、１０％ｃｒｅｍａｐｈｏｒｅ、１０％Ｔｗｅｅｎ  ８０、６９％ＰＢＳで希釈した。腫瘍サイズを週２回、体重を週１回測定した。終了時に、肉眼による検視を行った。血液を血液学的パラメーター及びＡＳＡＴ、ＡＬＡＴ、クレアチニン測定のために採取し、腫瘍をパラホルムアルデヒド（４％）中に採取した後、免疫組織学的分析のためにパラフィン包埋した（inbedded）。動物に関わる全ての実験は、Stockholms Norra djurfoersoeksetiska naemnd（ストックホルム動物実験倫理委員会）によって承認されたプロトコルに従うものとした。全ての動物は１週間順応させ、実験中に水及び食餌を自由摂取させた。動物は１２時間の明サイクル、並びに実験動物ガイドライン及び規則に従う温度及び湿度下に置いた。
【０２２２】
８−オキソ−グアニン染色。２４ウェルプレートに１ウェル当たり５０００個のＢＪ細胞を播種し、２４時間後に指定の化合物又はＤＭＳＯで処理した。細胞を７２時間後に固定し、それぞれの抗体（抗オキソグアニン８抗体［２Ｑ２３１１]（ａｂ６４５４８）、abcam）で染色した。
【０２２３】
実験及び結果：
実施例１：クリゾチニブ及びクリゾチニブの誘導体の固体化、並びにＡＬＫへのその結合
クリゾチニブの細胞間相互作用物質を調査するために、対象の化合物をセファロースビーズに固定化する直接化学プロテオミクスアプローチを遂行した（図１、「化合物中心化学プロテオミクス」）８。固体化は、化合物とビーズマトリックスとの間の共有結合を確立する化学反応によって達成される。したがって、化合物は反応が生じるのに適切な反応性官能基を必要とし、これにより元の化合物の化学修飾が強化されることが多い。当然ながら、分子構造の変化により調査対象の化合物の相互作用挙動及び標的スペクトルを変化させることができる。化合物を固定化する分子内の位置も結合に影響し得ることに留意されたい。このため、連結可能な全ての誘導体について既知の標的の結合を検査及び確認することが慣行である。３つのクリゾチニブの誘導体を、様々なリンカー長及び疎水性に関する化学的性質を包含する異なる化学的リンカーを用いて調製した（図２）。
【０２２４】
クリゾチニブは、メチル（ＣＨ３）基が結合する炭素にキラル中心を有する。したがって、２つのクリゾチニブのエナンチオマー、すなわち（Ｒ）−クリゾチニブ及びクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーが存在する（図３）。ｃ−Ｍｅｔキナーゼ活性の阻害において（Ｓ）−エナンチオマーよりも著しく強力であることが示されているため、臨床的には（Ｒ）−クリゾチニブのみが使用されている（ｃ−Ｍｅｔ  Ｋｉ（Ｒ）＝０．００２μＭ、Ｋｉ（Ｓ）＝０．１６１μＭ）９。実際には、クリゾチニブが特異的ｃ−Ｍｅｔキナーゼ阻害剤として実際に開発されている。両方のエナンチオマーを考慮して完全なインタラクトームを評価するために、ラセミ型クリゾチニブ（（Ｒ）−及び（Ｓ）−エナンチオマーの１：１混合物）を薬物プルダウンアッセイにおいて使用した。
【０２２５】
クリゾチニブ誘導体ＣｅＭＭ−１４４、ＣｅＭＭ−１４５及びＣｅＭＭ−１４６の化学合成は図１３に概説される。
【０２２６】
クリゾチニブ自体もＮ非置換ピペリジン部分の存在のために固体化手順に適合することから、ＣｅＭＭ−１４４、ＣｅＭＭ−１４５及びＣｅＭＭ−１４６を用いたリンカー評価実験に含めた。固体化がその同族標的に結合するクリゾチニブの能力を妨げないことを確認するために、４つ全ての化合物について薬物−ビーズマトリックスを生成した後、ＡＬＫ陽性ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を用いるプルダウン実験を行った。同様にＡＬＫに結合する非特異的ＢＣＲ−Ａｂｌキナーゼ阻害剤であるボスチニブ１０を陽性対照として使用した。溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法によって分析した（図４）。
【０２２７】
図４に示されるように、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は分子量の異なる２つのＡＬＫアイソフォームを発現する。アミノプロピル置換ＣｅＭＭ−１４６は両方のＡＬＫアイソフォームを、続いてＰＥＧ−誘導体ＣｅＭＭ−１４５を最も高い程度に富化する。非変性クリゾチニブ及びＣｅＭＭ−１４４は、ＡＬＫにＣｅＭＭ−１４６及びＣｅＭＭ−１４５よりも少ない程度で結合する。これらの結果に基づき、先の全ての実験にＣｅＭＭ−１４６を使用することとした。
【０２２８】
実施例２：クリゾチニブの相互作用物質の同定：クリゾチニブの新たな標的としてのＭＴＨ１
プロファイリングのために、異なる遺伝的背景を有する３つのヒト癌細胞株を選択した：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＮＢ、ＡＬＫ陽性）、ＮＣＩ−Ｈ３１２２（ＮＳＣＬＣ、ＥＭＬ４−ＡＬＫ陽性）及びＮＣＩ−Ｈ１６４８（ｃ−Ｍｅｔ増幅、ＡＬＫ陰性）。直接的な結合剤と間接的又は非特異的な結合剤とを区別するために、親和性精製工程の前に細胞溶解物を非変性クリゾチニブとともに２０μＭの最終濃度で３０分間プレインキュベートする競合実験を行った。相対的及び絶対的定量化（ｉＴＲＡＱ）の標識化用のアイソバリックタグを、ＭＳ実験におけるペプチドの定量化に使用した。全ての実験を二連で行った。通常対競合的プルダウンにおける標識ペプチドの比を比較するために、親和性ランキングを生成し、クリゾチニブの上位の直接相互作用物質である可能性があることから最も効率的に競合したタンパク質の優先順位を付けた。これら３つの全ての細胞株から同定された上位のタンパク質の分析の結果を図５にまとめる。
【０２２９】
予想の通り、ＡＬＫをＡＬＫ陽性ＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びＨ３１２２サンプルの両方において標的として同定することができた一方で、ｃ−ＭｅｔがＨ１６４８及びＨ３１２２プルダウンにおいて捕捉され、全実験的戦略が確認された。興味深いことに、幾つかの未知のキナーゼ標的を除いて、全サンプルにおけるクリゾチニブの共通標的として７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン−トリホスファターゼＭＴＨ１（遺伝子記号：ＮＵＤＴ１）が発見された。
【０２３０】
ＭＴＨ１がクリゾチニブと相互作用するという結果が、組み換えＭＴＨ１タンパク質を用いたサーマルシフト安定性アッセイにおいて小キナーゼ阻害剤コレクションをスクリーニングすることによって確認された。このサーマルシフト安定性アッセイを適用することによって、本発明者らは、二重Ｍｅｔ／ＡＬＫ阻害剤クリゾチニブがＭＴＨ１に対して高い親和性を示すことを発見した（データは示さない）。
【０２３１】
ヒトＭｕｔＴホモログ１（ＭＴＨ１）は、２−ＯＨ−ｄＡＴＰ及び８−オキソ−ｄＧＴＰ等の酸化ヌクレオチドの主要な除去酵素を表す１１。ＤＮＡ又はヌクレオチドプールへの活性酸素種（ＲＯＳ）の攻撃によって生成する酸化ヌクレオチドは、ＤＮＡ損傷及び突然変異を引き起こし得る。ＲＯＳの発生源としては、ミトコンドリア呼吸、化学物質又は放射線が挙げられる。頻繁に生じる８−オキソ−グアニン（８−オキソ−Ｇ）は例えば、複製中のトランスバージョン突然変異をもたらし得る。非酸化グアニンとは対照的に、８−オキソ−Ｇはシトシン又はアデニンとほぼ等しい効率で対合することが可能であり、それにより８−オキソ−Ｇが新生ＤＮＡ鎖の反対のＡに挿入される場合又は逆の場合に突然変異を生成する。誤って取り込まれた酸化ヌクレオチドがＤＮＡ修復系により認識されると、病変は塩基除去修復（ＢＥＲ）によって修復され得る。ＢＥＲは、誤って挿入された塩基及び後続の置換を除去する一時的な一本鎖切断の誘導を伴う。しかしながら、多量の８−オキソ−Ｇは、最終的に二本鎖切断（ＤＳＢ）へと進行することにより細胞周期停止（休止又は老化）及びアポトーシスを誘導する一本鎖切断の蓄積をもたらし得る。酸化三リン酸ヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼがもはや基質として使用することができない対応する一リン酸塩へと変換することによって、ＭＴＨ１は酸化塩基のＤＮＡへの組込み、ひいてはＲＯＳによって誘導される突然変異及び酸化的ＤＮＡ損傷を防ぐ。全腫瘍の約２０％で生じる突然変異体ＲＡＳ等の癌遺伝子による細胞の形質転換は、ＲＯＳ産生の増大ももたらし得る１２。正常細胞については、ＲＯＳによって引き起こされる酸化的損傷は、癌細胞を休止又は老化（ＯＩＳ）、最終的にはアポトーシスの状態にする可能性がある。老化を克服するために、ＲＡＳ形質転換細胞は細胞を酸化的ＤＮＡ損傷から保護するＭＴＨ１を上方調節する。例えば、ＨＲＡＳをトランスフェクトしたヒト皮膚線維芽細胞は老化を受けるが、この表現型をＭＴＨ１の同時過剰発現によって奪回することができることが示されている１２。その結果として、ＭＴＨ１抑制が突然変異体ＲＡＳを発現する癌細胞において増殖欠損を引き起こすことが報告により示されている１３。ＭＴＨ１−／−ノックアウトマウスは非常に軽度の表現型を示すため１４、小分子によるＭＴＨ１の標的化は、治療が困難なＲＡＳ突然変異体癌に対する新規かつ良好な耐容性を示す治療選択をもたらし得る。
【０２３２】
実施例３：クリゾチニブはＭＴＨ１の触媒活性を阻害する
公的に利用可能なタンパク質間相互作用データベースを調査して、ＭＴＨ１が「ピギーバッキング」、すなわち間接的相互作用をもたらし得るクリゾチニブのキナーゼ標的と相互作用し得るか否かを検査したが、これは本発明者らの分析においてＭＴＨ１ペプチドの富化をもたらすことも可能であった。しかしながら、かかる相互作用は報告されていない。クリゾチニブがこれらの細胞の成長を低ナノモル濃度で阻害することが見出されているため、この調査を異なる癌型であるユーイング肉腫ファミリーの腫瘍（ＥＳＦＴ）にも拡大した。この場合も、いずれもＥＷＳ−ＦＬＩ１癌遺伝子によって誘導されると考えられているＳＫ−ＥＳ−１及びＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を調査する全プルダウンにおいてＭＴＨ１が同定された。クリゾチニブが実際にＭＴＨ１の触媒活性を阻害することを確認するために、組み換えＭＴＨ１を用いて酵素アッセイを行った。細胞内でＭＴＨ１は２−ＯＨ−ｄＡＴＰ及び８−オキソ−ｄＧＴＰ等の酸化ヌクレオチドを加水分解し、対応する一リン酸塩及びピロリン酸塩（ＰＰｉ）を生じる。ＭＴＨ１媒介８−オキソ−ｄＧＴＰ加水分解によって生成するＰＰｉの産生をモニタリングする発光ベースのアッセイを、ＭＴＨ１酵素動態を求めるために用いられてきたプロトコルに従って行った１５。ＩＣ５０値を、臨床的に適用される光学的に純粋な（Ｒ）−エナンチオマー、並びに（Ｒ）−及び（Ｓ）−エナンチオマーを含有するラセミ型混合物の両方を考慮してクリゾチニブについて求めた（図６〜図９）。プルダウン結果を確認したところ、ラセミ型及び純粋な（Ｒ）−クリゾチニブの両方が８−オキソ−ｄＧＴＰを加水分解するＭＴＨ１の能力を阻害した。しかしながら、ラセミ体の阻害効力は、エナンチオマー的に純粋な（Ｒ）−クリゾチニブについて観察されるよりも約１０倍高かった。これらの結果を、異なる供給業者から入手した純粋な（Ｒ）−及びラセミ型クリゾチニブの両方の種々のバッチの分析によって確認した。異なるＡＬＫ阻害剤ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４１６も調査したが、これは１００μＭの濃度でＭＴＨ１触媒活性の顕著な阻害を示さなかった（データは示さない）。このことから、ＭＴＨ１阻害がＡＬＫキナーゼ阻害剤の一般現象ではなく、クリゾチニブの特定の化学型の特徴であることが示唆される。しかしながら、キナーゼ阻害剤はキナーゼ活性部位に結合するとＡＴＰを模倣するため、他のキナーゼ阻害剤もその天然基質がＡＴＰ及びＧＴＰの誘導体であることから強力なＭＴＨ１阻害剤である可能性がある。
【０２３３】
加えて、ＳＫ−ＥＳ−１細胞における競合的プルダウン実験をベイトとしてラセミ型ＣｅＭＭ−１４７、及び漸増濃度の光学的に純粋な（Ｒ）−クリゾチニブ又はラセミ体を用いて行った（図１０）。ＩＣ５０結果によって示唆されるように、ラセミ型クリゾチニブのみが最大２０μＭのプレインキュベーション濃度でＭＴＨ１の結合を効果的に妨げた。
【０２３４】
ＭＴＨ１に結合し阻害するクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの選好性を確認するために、光学的に純粋なクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーのバッチを再合成した（図１４）。合成戦略は光学的に純粋な出発物質の使用によって異なり、先に公開されたラセミ型及び／又は（Ｒ）−クリゾチニブの合成手順に従うものである（de Koning (2011) Organic Process Research & Development, 15: 1018-1026３８（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい）。実際に、ＭＴＨ１触媒アッセイにおいて評価したところ、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーについて求められたＩＣ５０値は、（Ｓ）−対（Ｒ）−エナンチオマーで１００倍超高い効力を示した（図１１）。
【０２３５】
臨床的に使用されている純粋な（Ｒ）−クリゾチニブ及びこれまで調査されていないクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの両方を調製し、試験した。純粋なクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーが低ナノモルＭＴＨ１阻害剤であり、（Ｒ）−エナンチオマーがマイクロモル範囲のＩＣ５０値をもたらすことが本発明者らにより見出されたことから、ＭＴＨ１触媒アッセイにおける両方のエナンチオマーの分析により、スクリーニングヒットバッチがラセミ型混合物を含有することが示唆された（図１１）。結果を直接結合アッセイ（ＩＴＣ）によって確認したところ、ＭＴＨ１に対する（Ｓ）−エナンチオマーの１６倍高い親和性が示された（図１７）。
【０２３６】
ヒト癌細胞に対する（Ｓ）−エナンチオマーの抗増殖活性を評価するために、２つの乳癌細胞株ＭＣＦ−７、及びＫＲＡＳ突然変異（Ｇ１３Ｄ）を有するＭＤＡ−ＭＢ−２３１を用いるコロニー形成アッセイを行った（図１２）。１０μＭ濃度では、（Ｒ）−及び（Ｓ）−エナンチオマーの両方がＤＭＳＯ処理細胞と比較して両細胞株の成長を顕著に低減した。
【０２３７】
これらのデータと一致して、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーは、ＳＣＨ５１３４４と同様にＳＷ４８０結腸癌及びＫ−Ｒａｓ突然変異ＰＡＮＣ１膵臓癌細胞のコロニー形成を効率的に阻害した（図１７Ａ及び図１７Ｃ）。重要なことには、正常ヒトＢＪ皮膚線維芽細胞を漸増濃度の（Ｒ）−クリゾチニブ又はクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーで処理したところ、臨床的に使用されている（Ｒ）−エナンチオマーが非形質転換細胞に対してクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーよりも高い毒性を有することが見出された（図１９）。このため、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーで観察された抗増殖効果は、非特異的細胞毒性の任意の増大によるものではなかった。別の２つのＡＬＫ及び３つの市販のＭｅｔ阻害剤もＭＴＨ１を阻害するその能力について試験したが、他の化合物は同等の効力を示さなかった（データは示さない）。クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーについて公表されているｃ−Ｍｅｔ  Ｋｉ値を考慮すると、本発明のデータから、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーがＭＴＨ１について少なくとも４倍選択的であることが示唆される（Cui (2011) Journal of Medicinal Chemistry 54, 6342-6363）。クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの抗増殖効果が潜在的オフターゲットｃ−Ｍｅｔの阻害によって媒介されることを除外するために、ＳＷ４８０細胞を特異的な低ナノモルｃ−Ｍｅｔ阻害剤で処理したが、増殖に対する顕著な効果は検出されなかった（図２０）。このため、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーはＲａｓ形質転換癌細胞に対する抗増殖活性を有する新規かつ強力なＭＴＨ１阻害剤である。
【０２３８】
ＭＴＨ１は８−オキソ−ｄＧＴＰを含む酸化ヌクレオチドのヌクレオチドプールを除去する（sanitise）ことによりＤＮＡへのその組込みを妨げると考えられているため、本発明者らはＭＴＨ１酵素機能の阻害がＤＮＡ中の８−オキソ−グアニン含量を増大すると推論した。結果として引き続いてＤＮＡ修復機構が活性化され、活性化塩基除去修復（ＢＥＲ）により一本鎖切断の形成が誘導される（Rai (2009) Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 169-174）。このことを試験するために、アルカリコメットアッセイにおいてクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー及びＳＣＨ５１３４４を調査したところ、単一細胞電気泳動によりＤＮＡ一本鎖切断が明らかとなった。クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマー及びＳＣＨ５１３４４の両方がコメットアッセイにおいて顕著なテールモーメントを生じるが、（Ｒ）−クリゾチニブは生じないことが見出された（図１８Ａ）。同時に、抗ＭＴＨ１  ｓｉＲＮＡで観察される効果と一致して、ＤＮＡ損傷の特異的マーカーである５３ＢＰ１の染色が増大した（図１８Ｂ及び図２１）。
【０２３９】
実施例４：アミノヘテロアリールベースのＭＴＨ１阻害剤の好ましい構造的特徴
ＭＴＨ１に結合する阻害剤の分子要件を決定するために、（Ｒ）−クリゾチニブ及びクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの両方をＭＴＨ１と共結晶化した。構造により、キラル中心のメチル基の望ましくないエクリプス配座及びベンジル環のハロゲン置換基が、活性部位における結合（Ｒ）−クリゾチニブのエネルギー優先傾向（energetic favourability）低減し得ることが明らかになった（図１８Ｃ、図１８Ｄ、図２２、図２３及び表３、表４）。この観察結果はＩＴＣデータによっても支持され、（Ｒ）−クリゾチニブとクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーとの間の結合の差が完全にエントロピックであり、したがってタンパク質との異なる結合相互作用によるものではないことが示唆される。
【０２４０】
上で述べたように、ヒトＭＴＨ１に結合するクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの共結晶構造を生成した（図１５を参照されたい）。ヒトＭＴＨ１に結合するクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの共結晶構造に基づいて、図１６に示されるＭＴＨ１阻害剤ファーマコフォアモデルを開発した。このファーマコフォアモデルは、アミノヘテロアリール化合物ベースのＭＴＨ１阻害剤の好ましい構造的特徴を示すものである。特に、図１６に示されるように、ＭＴＨ１阻害剤ファーマコフォアは、互いにオルト位に１つの水素結合アクセプタ（例えば−ＮＨ２、−ＲＮＨ、−ＲＮＲ、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＳＨ、−ＳＲ）及び１つの水素結合ドナー（例えば−ＮＨ２、−ＲＮＨ、−ＯＨ、−ＳＨ）を有する５員又は６員芳香族複素環を含む。水素結合アクセプタは、ハロゲン化ベンジル等の親油性ベンジル置換基を有するのが好ましい。ベンジル置換基はＣＨ２−炭素に付加的なメチル基を有するのが好ましい。得られるキラル中心に対して、ＭＴＨ１阻害の点では（Ｓ）−配置が好ましい。主要な芳香族複素環に対してパラ位に５員芳香族複素環（例えばピラゾール）等の付加的なアリール置換基を導入することができる。水素結合ドナー（例えばアミノプロピル、ピペリジン、ピペラジン）として作用することも可能であり得る陽イオン性官能基を特徴とする５員環は、脂肪族又は環状置換基を有するのが好ましい。
【０２４１】
このファーマコアモデルはアミノヘテロアリール化合物の（Ｓ）−エナンチオマーである、ＭＴＨ１阻害剤の下記式（１）：
【化８】
2015529665.tif 000016
（式中、
Ｒ１は−ＮＨ２、−ＮＲ２Ｈ、−ＯＨ又は−ＳＨであり、
Ｒ２はＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル又はＣ２〜６アルキニルであり、
Ｒ３はＣ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、Ｃ２〜３アルキニル又はシクロプロピルであり、
ＹはＮ又はＣＲ４であり、
Ｒ４は水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル又はＣ３〜６シクロアルキルであり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は各々独立してフッ素、塩素、臭素又はヨウ素であり、
Ｒ８は水素又は−Ａ−Ｂｎ−Ｘであり、ここで、
Ａは単結合、−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−であり、
ＢはＣ１〜４アルキレン、Ｃ２〜４アルケニレン又は−（ＯＣＨ２ＣＨ２）−であり、
ｎは０、１、２、３、４又は５であり、
Ｘは−ＮＨＲ２、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＯＨ又はＯ−アルキルである）に則している。
【０２４２】
【表２】
2015529665.tif 000017
【０２４３】
【表３】
2015529665.tif 000018
【０２４４】
【表４】
2015529665.tif 000019
【０２４５】
実施例５：マウス異種移植研究
腫瘍成長を無効にするクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーのｉｎ  ｖｉｖｏ潜在性を調査するために、ＳＷ４８０細胞を使用するマウス異種移植研究を行ったところ、５０％を超える腫瘍体積の低減によって示されるようにクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーが腫瘍進行を損なうことが可能であることが示された（図１８Ｅ）。動物が正常に挙同し、血液学的パラメーター（表５）又は体重の顕著な変化が観察されなかったため、（Ｓ）−エナンチオマーは良好な耐容性を示した（１８．８ｍｇ±１．２の（Ｓ）−クリゾチニブ対１９．１ｍｇ±２．０のビヒクル群）。
【０２４６】
要約すると、データからＭＴＨ１が薬物様小分子阻害剤によって容易に標的化され得るＲａｓ形質転換細胞の重要な成分であることが示唆される。癌細胞が増殖の増大のために高レベルの酸化ストレスを受け、ミトコンドリア呼吸の結果としてＲＯＳの産生をもたらすことが確立されている。ヌクレオチドプールはＲＯＳの主要な標的であり、ＤＮＡ塩基の酸化は突然変異及びＤＮＡ損傷に顕著に寄与する。その結果として、相当量の遺伝子異常及び同時のＤＮＡ修復機構の欠陥を有する腫瘍細胞は、ＲＯＳ誘導ＤＮＡ損傷に対して特に感受性が高い。酸化ヌクレオチドを除去してヌクレオチドプールの恒常性を維持することにより、ＭＴＨ１は、癌細胞の増殖ストレスを軽減するため、抗癌化合物の潜在的標的である。実際に、ＭＴＨ１レベルは肺癌（Speina (2005) Journal of the National Cancer Institute 97, 384-395、Kennedy (1998) FEBS Letters 429, 17-20）から腎臓癌（Okamoto (1996) Int J Cancer 65, 437-441）に及ぶＲａｓ発現癌において増大しており（図２４）、発癌形質転換と酸化ストレスとの間に関連性があることが示される。このことは、ＳＣＨ５１３４４がｖ−ａｂｌ等の様々な異なる癌遺伝子を感染させた線維芽細胞の成長も妨げることが示されていることによっても支持され、ＭＴＨ１の潜在的な包括的役割の更なる調査が促される。注目すべきことに、ノックアウトマウスのＭＴＨ１欠損は軽度の表現型をもたらし、ＭＴＨ１阻害剤の潜在的治療濃度域が存在することが示唆される（Tsuzuki (2001) Proceedings of the National Academy of Sciences 98, 11456-11461）。ＭＴＨ１の直接的かつ機能的な阻害剤としてのＳＣＨ５１３４４の同定により、新たな薬物の開発につながるような標的群としてのゲノム完全性関連タンパク質が明らかになる。さらに、ＡＬＫ異常の患者に適用される臨床的に承認されたキナーゼ阻害剤であるクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーが、Ｋ−Ｒａｓ陽性結腸癌異種移植モデルにおいて利益をもたらすファーストインクラスの低ナノモルＭＴＨ１阻害剤であるという本発明者らの発見は、癌の治療における新たな治療選択を広げる。
【０２４７】
【表５】
2015529665.tif 000020
【０２４８】
実施例６：ＭＴＨ１の安定なノックダウンはＳＷ４８０細胞のコロニー形成を損なう
抗ＭＴＨ１  ｓｉＲＮＡによるＭＴＨ１遺伝子サイレンシングが、突然変異体ＫＲＡＳの発現するＳＷ４８０結腸癌細胞の生存率を損なうという本発明者らの発見を実証するために、ｅＧＦＰ（対照）又はＭＴＨ１を標的とするｓｈＲＮＡを発現する安定な細胞株も作製した（Rai (2009) Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 169-174）。先の結果と一致して、ＭＴＨ１の安定なノックダウンはＳＷ４８０細胞のコロニー形成を顕著に低減した（図２６）。
【０２４９】
実施例７：（Ｓ）−クリゾチニブの包括的な細胞内標的プロファイル
細胞中のＭＴＨ１タンパク質を標的とするクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの特異性を決定するために、上記のショットガン質量分析を用いた化学プロテオミクス薬物プルダウンを行った。（Ｓ）−クリゾチニブの固体化のために、（Ｓ）−３−（１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エトキシ）−５−（１−（ピペリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）ピリジン−２−アミンの誘導体化をＣｅＭＭ−１４６について記載されるように行い、（Ｓ）−５−（１−（１−（３−アミノプロピル）ピペリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−３−（１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エトキシ）ピリジン−２−アミンを得た（図２７）。
【０２５０】
ケモプロテオミクス分析を、発癌ＫＲＡＳ突然変異体を発現するＳＷ４８０結腸癌細胞を用いて示されるように行った。結果を表６に示す。
【０２５１】
【表６】
2015529665.tif 000021
2015529665.tif 000022
2015529665.tif 000023
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2015529665.tif 000032
2015529665.tif 000033
【０２５２】
結果から、ＭＴＨ１（遺伝子名ＮＵＤＴ１）が突然変異体ＫＲＡＳを発現する結腸癌細胞株であるＳＷ４８０細胞における（Ｓ）−クリゾチニブの主要な標的であることが明らかに示され、化合物の特異性が強調される。
【０２５３】
実施例８：抗癌特異性
クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの抗癌特異性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで更に評価するために、様々な同系ＢＪ線維芽細胞株を、コロニー形成アッセイにおいて幾つかの濃度のクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーで処理した。調査した細胞株パネルには、非形質転換（「野生型」）細胞、テロメラーゼで不死化した細胞（ｈＴＥＲＴ）、ｈＴＥＲＴ及びＳＶ４０ラージＴ抗原（ＳＶ４０Ｔ）により形質転換した細胞、並びにｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０Ｔ及びＫＲＡＳ突然変異体Ｖ１２により形質転換した細胞が含まれていた（図２８）。
【０２５４】
データから、（Ｓ）−クリゾチニブが野生型細胞又はテロメラーゼによってのみ不死化された細胞よりも形質転換細胞に対する毒性が高いことが示唆され、癌特異的効果が強調される。
【０２５５】
実施例９：クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーによるＭＴＨ１触媒活性の阻害は基質依存性ではない
ＭＴＨ１は８−オキソ−ｄＧＴＰを加水分解するだけでなく、別の潜在的に変異原性のＤＮＡ前駆体である２−ヒドロキシ−デオキシアデノシン三リン酸（２−ＯＨ−ｄＡＴＰ）を切断することも可能であることが知られている（Fujikawa (1999) Journal of Biological Chemistry 274, 18201-18205）。したがって、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーがＭＴＨ１による２−ＯＨ−ｄＡＴＰの加水分解に影響を及ぼすか否かをｉｎ  ｖｉｔｒｏで先に記載されるルシフェラーゼベースのＰＰｉＬｉｇｈｔアッセイを用いて調査した。図２９に示されるように、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーは、ＭＴＨ１による２−ＯＨ−ｄＡＴＰの加水分解も用量依存的に阻害する。
【０２５６】
実施例１０：クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの活性に対するｐ５３／ｐ２１状態及びミスマッチ修復経路の影響
腫瘍抑制因子遺伝子ｐ５３は多数の様々な癌型で突然変異又は欠損しており、治療転帰に影響を及ぼす可能性がある。したがって、ｐ５３機能及びその下流のメディエーターｐ２１が、突然変異体ＫＲＡＳ  ＨＣＴ１１６結腸癌細胞においてクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの抗癌活性にどのように影響を与えるかを調査した。さらに、ＭＴＨ１の阻害がＤＮＡ複製中の塩基の誤対合を誘導するはずであるため、ＭＬＨ１等のミスマッチ修復遺伝子の欠損がクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーに対する感度をどのように変化させるかを、樹立ＨＣＴ１１６同系細胞株系を用いて評価しようとした（図３０）。ＨＣＴ１１６野生型細胞は機能的ｐ５３を有するがＭＬＨ１を欠いており、誘導体ＨＣＴ１１６＋ｃｈｒ３は染色体導入のために機能的ＭＬＨ１遺伝子を有する。
【０２５７】
結果から、ｐ５３状態及び機能的ＭＬＨ１の存在又は非存在がクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの活性に影響を与えないことが示される。しかしながら、ｐ２１の喪失はクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーの処理に対するＨＣＴ１１６細胞の感度を増大するようである。
【０２５８】
実施例１１：ＭＴＨ１阻害の結果としてのＤＮＡ損傷の誘導
ＭＴＨ１は８−オキソ−ｄＧＴＰを含む酸化ヌクレオチドのヌクレオチドプールを除去することによりＤＮＡへのその組込みを妨げると考えられているため、本発明者らはＭＴＨ１酵素機能の阻害がＤＮＡ中の８−オキソ−グアニン含量を増大すると推論した。実際に、（Ｓ）−クリゾチニブによるＢＪ線維芽細胞の処理は抗８−オキソ−グアニンマウスモノクローナル抗体の染色を増大させたが、（Ｒ）−クリゾチニブは増大させなかった。同時に、抗ＭＴＨ１  ｓｉＲＮＡで観察される効果と一致して、ＤＮＡ損傷の特異的マーカーである５３ＢＰ１の染色が増大した（図３１）。
【０２５９】
結果としてＤＮＡ修復機構が活性化され、活性化塩基除去修復（ＢＥＲ）により一本鎖切断の形成が誘導される。このことを試験するために、アルカリコメットアッセイにおいてクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーを調査したところ、単一細胞電気泳動によりＤＮＡ一本鎖切断が明らかとなった。ＳＷ４８０細胞を使用することにより、クリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーがコメットアッセイにおいて顕著なテールモーメントを生じるが、（Ｒ）−クリゾチニブは生じないことが見出された。ＤＮＡ損傷経路活性化を示すＡＴＭリン酸化の増大も観察され、同様に（Ｓ）−クリゾチニブ特異的効果が実証された（図３２）。
【０２６０】
概要
総合すると、データからクリゾチニブ、より好ましくはラセミ型クリゾチニブ、更により好ましくは純粋なクリゾチニブの（Ｓ）−エナンチオマーが、ＲＡＳ誘導性癌の発生、進行及び維持に関連付けられていた酵素であるＭＴＨ１の極めて強力な阻害剤であることが示される１３。これはａ）ＭＴＨ１の小分子阻害剤がこれまでに報告されていないため、ｂ）クリゾチニブで治療される患者がそのｃ−Ｍｅｔ発現状態又はより好ましくはＡＬＫ発現状態により選択されるが、ＭＴＨ１が考慮されないため、及びｃ）クリゾチニブのピペリジン窒素でのアミノアルキル置換基の導入がＡＬＫ及びＭＴＨ１阻害の両方に関して良好な耐容性を示すために特に興味深い。このため、国際公開第２００８０５３１５７号に記載の手順によって調製される化合物も、強力かつ生物が利用可能なＭＴＨ１阻害剤である。
【０２６１】
ＭＴＨ１抑制の生理的効果に基づくと、ＭＴＨ１阻害剤はＤＮＡ損傷化合物、ＤＮＡ修復機構を妨げる化合物、又はＲＯＳの産生を誘導するか若しくはＲＯＳの除去を阻害する化合物と協同すると結論付けられる。さらに、ＭＴＨ１阻害剤は、ＤＮＡ修復経路遺伝子に病変を有する又は相当量のＲＯＳを生じる腫瘍により合成致死性を示すと結論付けられる。例えば、８−オキソ−Ｇ病変の修復と関連付けられていた１７遺伝子ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２を欠いた乳癌細胞は酸化的ＤＮＡ損傷に対して特に感受性が高い１８。近年、ＭＴＨ１が老化等の腫瘍抑制効果を妨げるうえでＲＡＳ誘導腫瘍を特異的に支持し、一方で腫瘍の維持及び進行を可能にすることが示されている。したがって、ＭＴＨ１阻害が細胞増殖シグナル伝達、上皮間葉移行（ＥＭＴ）、進行性及び浸潤性腫瘍の特徴、アノイキス阻害及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ媒介生存促進性シグナル伝達を無効にすることにより腫瘍成長を損なう可能性がある１９。最近のデータにより、ＥＧＦＲ及びＭＴＨ１の両方を抑制するマイクロ−ＲＮＡ  ＭｉＲ  １４５がこれらの腫瘍を下方調節することから、ＭＴＨ１がＥＧＦＲを発現する腺癌で有望な標的であり得ることも示唆される３７。ＭｉＲ  １４５の再発現はＥＧＦＲ及びＭＴＨ１の下方調節をｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方でもたらし、ＥＧＦＲ陽性細胞株の成長を損なった。要約すると、クリゾチニブ及びそのエナンチオマー、並びにその構造的誘導体をＡＬＫ／Ｍｅｔ誘導性肺癌を除く様々な異なる腫瘍型だけでなく、ＲＡＳ誘導性肺癌又は乳癌、結腸癌、膵臓癌、ユーイング肉腫等の治療にも適用することができる。
【０２６２】
本発明は以下のヌクレオチド及びアミノ酸配列を指す。
【０２６３】
１．  ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１に関する配列
１．１  ＮＭ＿００２４５２．３→ＮＰ＿００２４４３．３  ７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニントリホスファターゼアイソフォームｐ１８：
説明
転写産物変異体：この変異体（１）は優性アイソフォーム（ｐ１８、ＭＴＨ１ｄとしても知られる）をコードする。変異体１、２Ａ、３Ａ及び４Ａは同じアイソフォームをコードする。
配列番号１：ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、アイソフォームｐ１８、転写産物変異体（１）のヌクレオチド配列（４７１ｎｔ）
配列番号２：ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、アイソフォームｐ１８、転写産物変異体（１）のアミノ酸配列（１５６ａａ）
【０２６４】
１．２  ＮＭ＿１９８９４８．１→ＮＰ＿９４５１８６．１  ７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニントリホスファターゼアイソフォームｐ１８：
説明
転写産物変異体：この変異体（２Ａ）は変異体１と比較して５’ＵＴＲが異なる。変異体１、２Ａ、３Ａ及び４Ａは同じアイソフォームをコードする（ｐ１８、ＭＴＨ１ｄとしても知られる）。
配列番号３：ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、アイソフォームｐ１８、転写産物変異体（２Ａ）のヌクレオチド配列（４７１ｎｔ）
配列番号４：ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、アイソフォームｐ１８、転写産物変異体（２Ａ）のアミノ酸配列（１５６ａａ）
【０２６５】
１．３  ＮＭ＿１９８９４９．１→ＮＰ＿９４５１８７．１  ７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニントリホスファターゼアイソフォーム  ｐ２２：
説明
転写産物変異体：この変異体（２Ｂ）は変異体１と比較して５’ＵＴＲ及び５’コーディング領域が異なり、上流のＡＴＧで翻訳開始を生じ、アイソフォームｐ１８と比較してより長いＮ末端を有するアイソフォーム（ｐ２２、ＭＴＨ１ｂとしても知られる）を生じる。変異体２Ｂ、３Ｂ及び４Ｂは同じアイソフォームをコードする。
配列番号５：ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、アイソフォームｐ２２、転写産物変異体（２Ｂ）のヌクレオチド配列（５４０ｎｔ）
配列番号６：ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、アイソフォームｐ２２、転写産物変異体（２Ｂ）のアミノ酸配列（１７９ａａ）
【０２６６】
１．４  ＮＭ＿１９８９５０．１→ＮＰ＿９４５１８８．１  ７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニントリホスファターゼアイソフォームｐ１８：
説明
転写産物変異体：この変異体（３Ａ）は変異体１と比較して５’ＵＴＲが異なる。変異体１、２Ａ、３Ａ及び４Ａは同じアイソフォームをコードする（ｐ１８、ＭＴＨ１ｄとしても知られる）。
配列番号７：ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、アイソフォームｐ１８、転写産物変異体（３Ａ）のヌクレオチド配列（４７１ｎｔ）
配列番号８：ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、アイソフォームｐ１８、転写産物変異体（３Ａ）のアミノ酸配列（１５６ａａ）
【０２６７】
１．５  ＮＭ＿１９８９５２．１→ＮＰ＿９４５１９０．１  ７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニントリホスファターゼアイソフォーム  ｐ２２：
説明
転写産物変異体：この変異体（３Ｂ）は変異体１と比較して５’ＵＴＲ及び５’コーディング領域が異なり、上流のＡＴＧで翻訳開始を生じ、アイソフォームｐ１８と比較してより長いＮ末端を有するアイソフォーム（ｐ２２、ＭＴＨ１ｂとしても知られる）を生じる。変異体２Ｂ、３Ｂ及び４Ｂは同じアイソフォームをコードする。
配列番号９：ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、アイソフォームｐ２２、転写産物変異体（３Ｂ）のヌクレオチド配列（５４０ｎｔ）
配列番号１０：ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、アイソフォームｐ２２、転写産物変異体（３Ｂ）のアミノ酸配列（１７９ａａ）
【０２６８】
１．６  ＮＭ＿１９８９５３．１→ＮＰ＿９４５１９１．１  ７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニントリホスファターゼアイソフォームｐ１８：
説明
転写産物変異体：この変異体（４Ａ）は変異体１と比較して５’ＵＴＲが異なる。変異体１、２Ａ、３Ａ及び４Ａは同じアイソフォームをコードする（ｐ１８、ＭＴＨ１ｄとしても知られる）。
配列番号１１：ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、アイソフォームｐ１８、転写産物変異体（４Ａ）のヌクレオチド配列（４７１ｎｔ）
配列番号１２：ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、アイソフォームｐ１８、転写産物変異体（４Ａ）のアミノ酸配列（１５６ａａ）
【０２６９】
１．７  ＮＭ＿１９８９５４．１→ＮＰ＿９４５１９２．１  ７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニントリホスファターゼアイソフォーム  ｐ２２：
説明
転写産物変異体：この変異体（４Ｂ）は変異体１と比較して５’ＵＴＲ及び５’コーディング領域が異なり、上流のＡＴＧで翻訳開始を生じ、アイソフォームｐ１８と比較してより長いＮ末端を有するアイソフォーム（ｐ２２、ＭＴＨ１ｂとしても知られる）を生じる。変異体２Ｂ、３Ｂ及び４Ｂは同じアイソフォームをコードする。
配列番号１３：ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、アイソフォームｐ２２、転写産物変異体（４Ｂ）のヌクレオチド配列（５４０ｎｔ）
配列番号１４：ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、アイソフォームｐ２２、転写産物変異体（４Ｂ）のアミノ酸配列（１７９ａａ）
配列番号１５：ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、ｐ２６アイソフォームのアミノ酸配列
＞ｓｐ｜Ｐ３６６３９｜８ＯＤＰ＿ＨＵＭＡＮ  ７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニントリホスファターゼ  ＯＳ＝ホモサピエンス  ＧＮ＝ＮＵＤＴ１  ＰＥ＝１  ＳＶ＝３
配列番号１６：ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１、ｐ２１アイソフォームのアミノ酸配列
＞ｓｐ｜Ｐ３６６３９−３｜８ＯＤＰ＿ＨＵＭＡＮ  ７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニントリホスファターゼのアイソフォームｐ２１  ＯＳ＝ホモサピエンス  ＧＮ＝ＮＵＤＴ１
【０２７０】
プライマー配列：
配列番号１７：ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１の検出のためのプライマー配列
（Sakumi (1993) Journal of Biological Chemistry 268: 23524-30に公表されるヒトＭＴＨ１配列の塩基９７〜１１６に対応する）
５Ｐ−ＡＧＣＣＴＣＡＧＣＧＡＧＴＴＣＴＣＣＴＧ−３Ｐ
配列番号１８：ＮＵＤＴ１／ＭＴＨ１の検出のためのプライマー配列
（Sakumi (1993) Journal of Biological Chemistry 268: 23524-30に公表されるヒトＭＴＨ１配列の塩基２４８〜２６６に対応する）
５Ｐ−ＧＡＴＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣ−３Ｐ
【０２７１】
２．  ＫＲＡＳに関する配列
２．１  ＮＭ＿００４９８５．３→ＮＰ＿００４９７６．２  ＧＴＰアーゼＫＲａｓアイソフォームｂ前駆体：
説明
転写産物変異体：この変異体（ｂ）は５つのエクソンから構成され、より長い転写産物変異体（ａ）に含まれるエクソン４ａを欠いている。この優性変異体（ｂ）はエクソン４ｂで終了し、アイソフォームｂをコードするｃｄｓを有する。
配列番号１９：ＫＲＡＳ、アイソフォームｂ前駆体、転写産物変異体（ｂ）のヌクレオチド配列（５６７ｎｔ）
配列番号２０：ＫＲＡＳ、アイソフォームｂ前駆体、転写産物変異体（ｂ）のアミノ酸配列（１８８ａａ）
【０２７２】
２．２  ＮＭ＿０３３３６０．２→ＮＰ＿２０３５２４．１  ＧＴＰアーゼＫＲａｓアイソフォームａ前駆体：
説明
転写産物変異体：この変異体（ａ）は、より短い転写産物変異体（ｂ）が欠いているエクソン４ａを含む６つのエクソンから構成される。この希少変異体（ａ）は、アイソフォームａと比較してエクソン４ａで終了し、独特なＣ末端をコードするｃｄｓを有する。
配列番号２１：ＫＲＡＳ、アイソフォームａ前駆体、転写産物変異体（ａ）のヌクレオチド配列（５７０ｎｔ）
配列番号２２：ＫＲＡＳ、アイソフォームａ前駆体、転写産物変異体（ａ）のアミノ酸配列（１８９ａａ）
【０２７３】
ＫＲＡＳ配列注釈
この配列注釈では、ＫＲＡＳの共通突然変異は「変異体」という用語によって示される。
【０２７４】
【表７】
2015529665.tif 000034
2015529665.tif 000035
2015529665.tif 000036
2015529665.tif 000037
【０２７５】
配列番号２３：突然変異体ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｃ  ＫＲＡＳ）のアミノ酸配列
【０２７６】
３．  ＨＲＡＳに関する配列
３．１  ＮＭ＿００１１３０４４２．１→ＮＰ＿００１１２３９１４．１  ＧＴＰアーゼＨＲａｓアイソフォーム１：
説明
転写産物変異体：この変異体（３）は変異体１と比較して３’ＵＴＲが異なる。変異体１及び３は同じタンパク質をコードする。
配列番号２４：ＨＲＡＳ、アイソフォーム１、転写産物変異体（３）のヌクレオチド配列（５７０ｎｔ）
配列番号２５：ＨＲＡＳ、アイソフォーム１、転写産物変異体（３）のアミノ酸配列（１８９ａａ）
【０２７７】
３．２  ＮＭ＿００５３４３．２→ＮＰ＿００５３３４．１  ＧＴＰアーゼＨＲａｓアイソフォーム１：
説明
転写産物変異体：この変異体（１）はより長いアイソフォーム（１）をコードする。変異体１及び３は同じタンパク質をコードする。
配列番号２６：ＨＲＡＳ、アイソフォーム１、転写産物変異体（１）のヌクレオチド配列（５７０ｎｔ）
配列番号２７：ＨＲＡＳ、アイソフォーム１、転写産物変異体（１）のアミノ酸配列（１８９ａａ）
【０２７８】
３．３  ＮＭ＿１７６７９５．３→ＮＰ＿７８９７６５．１  ＧＴＰアーゼＨＲａｓアイソフォーム２：
説明
転写産物変異体：この変異体（２）は３’ＵＴＲが異なり、変異体１と比較してその３’コーディング領域に別のエクソンを含む。得られるアイソフォーム（２）は異なるＣ末端を含有し、アイソフォーム１よりも短い。
配列番号２８：ＨＲＡＳ、アイソフォーム２、転写産物変異体（２）のヌクレオチド配列（５１３ｎｔ）
配列番号２９：ＨＲＡＳ、アイソフォーム２、転写産物変異体（２）のアミノ酸配列（１７０ａａ）
【０２７９】
ＨＲＡＳ配列注釈
この配列注釈では、ＨＲＡＳの共通突然変異は「変異体」という用語によって示される。
【０２８０】
【表８】
2015529665.tif 000038
2015529665.tif 000039
2015529665.tif 000040
2015529665.tif 000041
【０２８１】
ＮＲＡＳに関する配列
３．４  ＮＭ＿００２５２４．４→ＮＰ＿００２５１５．１  ＧＴＰアーゼＮＲａｓ：
配列番号３０：ＮＲＡＳのヌクレオチド配列（５７０ｎｔ）
配列番号３１：ＮＲＡＳのアミノ酸配列（１８９ａａ）
【０２８２】
ＮＲＡＳ配列注釈
この配列注釈では、ＮＲＡＳの共通突然変異は「変異体」という用語によって示される。
【０２８３】
【表９】
2015529665.tif 000042
2015529665.tif 000043
【０２８４】
４．  ＡＬＫに関する配列
４．１  ＮＭ＿００４３０４．４→ＮＰ＿００４２９５．２  ＡＬＫチロシンキナーゼ受容体前駆体：
配列番号３２：＿ＡＬＫチロシンキナーゼ受容体前駆体のヌクレオチド配列（４８６３ｎｔ）
配列番号３３：ＡＬＫチロシンキナーゼ受容体前駆体のアミノ酸配列（１６２０ａａ）
【０２８５】
ＡＬＫの異常
【０２８６】
【表１０】
2015529665.tif 000044
【０２８７】
ＡＬＫ配列注釈
この配列注釈では、ＡＬＫの共通突然変異は「変異体」という用語によって示される。
【０２８８】
【表１１】
2015529665.tif 000045
2015529665.tif 000046
2015529665.tif 000047
2015529665.tif 000048
【０２８９】
配列番号３４：ＥＭＬ４−ＡＬＫのヌクレオチド配列
＞ＥＮＡ｜ＥＵ２３６９４８｜ＥＵ２３６９４８．１  ホモサピエンスＥＭＬ４／ＡＬＫ融合タンパク質変異体３（ＥＭＬ４／ＡＬＫ融合）ｍＲＮＡ、完全なｃｄｓ.：位置：１．．２３９１
配列番号３５：ＥＭＬ４−ＡＬＫのアミノ酸配列
配列番号３６：ＥＭＬ４−ＡＬＫ変異体６のヌクレオチド配列
＞ＥＮＡ｜ＡＢ４６２４１１｜ＡＢ４６２４１１．１  融合タンパク質ＥＭＬ４−ＡＬＫ変異体６のホモサピエンスＥＭＬ４−ＡＬＫ変異体６  ｍＲＮＡ、完全なｃｄｓ.：位置：１．．３３６５
配列番号３７：ＥＭＬ４−ＡＬＫ変異体６のアミノ酸配列
配列番号３８：ＥＭＬ４−ＡＬＫ変異体７のヌクレオチド配列
＞ＥＮＡ｜ＡＢ４６２４１２｜ＡＢ４６２４１２．１  融合タンパク質ＥＭＬ４−ＡＬＫ変異体７のホモサピエンスＥＭＬ４−ＡＬＫ変異体７  ｍＲＮＡ、完全なｃｄｓ.：位置：１．．３４３５
配列番号３９：ＥＭＬ４−ＡＬＫ変異体７のアミノ酸配列
配列番号４０：ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質変異体８ａのヌクレオチド配列
＞ＥＮＡ｜ＧＵ７９７８９４｜ＧＵ７９７８９４．１  ホモサピエンスＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質変異体８ａ  ｍＲＮＡ、部分的なｃｄｓ.：位置：１．．１７１
配列番号４１：ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質変異体８ａのアミノ酸配列
配列番号４２：ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質変異体８ｂ
＞ＥＮＡ｜ＧＵ７９７８９５｜ＧＵ７９７８９５．１  ホモサピエンスＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質変異体８ｂ  ｍＲＮＡ、部分的なｃｄｓ.：位置：１．．２３６
配列番号４３：ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質変異体８ｂのアミノ酸配列
【０２９０】
５．  ＭＥＴ（ｃ−Ｍｅｔとしても知られる）に関する配列
５．１  ＮＭ＿０００２４５．２→ＮＰ＿０００２３６．２  肝細胞成長因子受容体アイソフォームｂ前駆体：
説明
転写産物変異体：この変異体（２）は、変異体１と比較してエクソンの最後に別のインフレームスプライス部位を用いる。得られるアイソフォーム（ｂ）は同じＮ末端及びＣ末端を有するが、アイソフォームａと比較して短い。
配列番号４４：ＭＥＴ、肝細胞成長因子受容体アイソフォームｂ前駆体、転写産物変異体（２）のヌクレオチド配列（４１７３ｎｔ）
配列番号４５：ＭＥＴ、肝細胞成長因子受容体アイソフォームｂ前駆体、転写産物変異体（２）のアミノ酸配列（１３９０ａａ）
【０２９１】
５．２  ＮＭ＿００１１２７５００．１→ＮＰ＿００１１２０９７２．１  肝細胞成長因子受容体アイソフォームａ前駆体：
説明
転写産物変異体：この変異体（１）はより長い転写産物を表し、より長いアイソフォーム（ａ）をコードする。
配列番号４６：ＭＥＴ、肝細胞成長因子受容体アイソフォームａ前駆体、転写産物変異体（１）のヌクレオチド配列（４２２７ｎｔ）
配列番号４７：ＭＥＴ、肝細胞成長因子受容体アイソフォームａ前駆体、転写産物変異体（１）のアミノ酸配列（１４０８ａａ）
【０２９２】
ＭＥＴの異常
【０２９３】
【表１２】
2015529665.tif 000049
【０２９４】
ＭＥＴ配列注釈
この配列注釈では、ＭＥＴの共通突然変異は「変異体」という用語によって示される。
【０２９５】
【表１３】
2015529665.tif 000050
2015529665.tif 000051
2015529665.tif 000052
2015529665.tif 000053
2015529665.tif 000054
【０２９６】
配列番号４８：抗ＭＴＨ１  ｓｉＲＮＡ
ＣＧＡＣＧＡＣＡＧＣＵＡＣＵＧＧＵＵＵ
配列番号４９：ｐ２１の検出のためのｑＰＣＲ−オリゴヌクレオチド
５’−ＣＴＧＴＧＡＴＧＣＧＣＴＡＡＴＧＧＣＧ−３’
配列番号５０：ｐ２１の検出のためのｐＰＣＲ−オリゴヌクレオチド
５’−ＡＡＧＴＣＧＡＡＧＴＴＣＣＡＴＣＧＣＴＣＡ−３’
【０２９７】
【表１４】
2015529665.tif 000055
2015529665.tif 000056
【図２】
2015529665.tif 000065
【図３】
2015529665.tif 000066
【図８】
2015529665.tif 000067
【図９】
2015529665.tif 000068
【図１３】
2015529665.tif 000069
【図１４】
2015529665.tif 000070
【図１７Ｂ】
2015529665.tif 000071
【図１８Ｅ】
2015529665.tif 000072
【図２４】
2015529665.tif 000073
【図２５】
2015529665.tif 000074
【図２６】
2015529665.tif 000075
【図２７】
2015529665.tif 000076
【図２８】
2015529665.tif 000077
【図２９】
2015529665.tif 000078
【図３０】
2015529665.tif 000079
【図３１Ｂ】
2015529665.tif 000080
【図１】
2015529665.tif 000081
【図４】
2015529665.tif 000082
【図５】
2015529665.tif 000083
【図６】
2015529665.tif 000084
【図７】
2015529665.tif 000085
【図１０】
2015529665.tif 000086
【図１１】
2015529665.tif 000087
【図１２】
2015529665.tif 000088
【図１５】
2015529665.tif 000089
【図１６】
2015529665.tif 000090
【図１７Ａ】
2015529665.tif 000091
【図１７Ｃ】
2015529665.tif 000092
【図１８Ａ】
2015529665.tif 000093
【図１８Ｂ】
2015529665.tif 000094
【図１８Ｃ】
2015529665.tif 000095
【図１８Ｄ】
2015529665.tif 000096
【図１９】
2015529665.tif 000097
【図２０】
2015529665.tif 000098
【図２１】
2015529665.tif 000099
【図２２】
2015529665.tif 000100
【図２３】
2015529665.tif 000101
【図３１Ａ】
2015529665.tif 000102
【図３２】
2015529665.tif 000103
【配列表】
2015529665000001.app
【国際調査報告】
2015529665.tif 000104
2015529665.tif 000105
2015529665.tif 000106
2015529665.tif 000107