(57)【要約】【課題】結核菌群菌を弱毒化して結核ワクチンを製造する方法の提供。【解決手段】本発明は、真核細胞、好ましくはマクロファージ、を含む宿主において結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）菌による感染を予防するワクチンを製造するための、結核菌群に属するマイコバクテリウム株の使用であって、上記株には、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のポリンＡを発現するｍｓｐＡ遺伝子が挿入されており、該マイコバクテリウム形質転換株の上記真核細胞における増殖性が低下している、使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞、好ましくはマクロファージ、を含む宿主において結核菌群菌による感染を予防するワクチンを製造するための、結核菌群に属するマイコバクテリウム株の使用であって、
前記株には、マイコバクテリウム・スメグマチスのポリンＡを発現するｍｓｐＡ遺伝子が挿入されており、
このマイコバクテリウム形質転換株の前記真核細胞における増殖性が低下している、使用。
【請求項２】
哺乳動物又は鳥類の結核を予防するワクチンを製造するための、請求項１に記載のヒト型結核菌の形質転換株の使用であって、
前記真核細胞がマクロファージである、使用。
【請求項３】
ヒトの結核を予防するワクチンを製造するための、請求項２に記載の株の使用。
【請求項４】
前記株に挿入されたｍｓｐＡ遺伝子が、前記結核菌群に属するマイコバクテリウムにおいて前記ｍｓｐＡ遺伝子を発現させるプロモーターの制御下にあることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記遺伝子と前記プロモーターがプラスミドに挿入されることを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記結核菌群に属するマイコバクテリウム株がヒト型結核菌株であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記ヒト型結核菌株の由来がＨ３７Ｒｖ株であることを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記ｍｓｐＡ遺伝子が配列番号１の配列を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記ｍｓｐＡ遺伝子が、配列番号４からなるｈｓｐ６０プロモーターの発現エレメントの制御下にあることを特徴とする請求項４〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記株が形質転換株であり、英国ＮＣＴＣコレクションに整理番号１２０４２６０１として２０１２年４月２６日付で寄託されたものである請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用によって得られるワクチンであって、
前記結核菌群に属するマイコバクテリウム形質転換株を含み、
この株には、このマイコバクテリウムにおいてマイコバクテリウム・スメグマチスのＭｓｐＡポリンを発現するｍｓｐＡ遺伝子が挿入されている、ワクチン。
【請求項１２】
前記株がヒト型結核菌の形質転換株であることを特徴とする請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記株が、英国ＮＣＴＣコレクションに整理番号１２０４２６０１として２０１２年４月２６日付で寄託された株であることを特徴とする請求項１２に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核菌群菌を弱毒化して結核ワクチンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
結核は、結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）のうちの一種、すなわち具体的には、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）（及びそれ由来のＢＣＧ株）、マイコバクテリウム・アフリカナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウム・カネッティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｎｅｔｔｉｉ）、マイコバクテリウム・カプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・ミクロティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｃｒｏｔｉ）及びマイコバクテリウム・ピニペディ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｉｎｎｉｐｅｄｉｉ）（非特許文献１［１９］）や、マイコバクテリウム・ムンギイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｎｇｉｉ）（非特許文献２［２０］）によって引き起こされる、ヒトや動物を冒す感染性疾患である。結核は、世界中で毎年約９００万の新たな感染例が発生しており、毎年約３００万人が亡くなっている。発展途上国においては、ＨＩＶ感染の流行と結核の再出現とが同時に起こっており、第一選択薬である抗結核性抗生物質に耐性のある結核菌株の出現も懸念されている。結核は伝染病であり、桿菌性の肺結核の患者、すなわち、その喀出物中に結核菌群に属するマイコバクテリウムの生菌を排出する者から伝染し得る。
【０００３】
長年、肺結核に対する予防は、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）によるワクチン接種に頼ってきた。カルメット・ゲラン桿菌はウシ型結核菌を弱毒化した弱毒株である。ウシ型結核菌はヒト型結核菌に非常に近縁のマイコバクテリウムであり、ヒトや動物の結核、主にウシの結核の原因菌でもある。しかしながら、ＢＣＧワクチンの有効性は臨床の状況や、その有効性を調べた国によってかなり異なる。該有効性は、防御率０％から６０％までの幅がある。このようにＢＣＧワクチンの肺結核に対する防御率が乏しいことから、いくつかの国では保健当局がこのワクチン接種を廃止している。フランスがそうであり、フランスでは、医療提供者などの一部の特定の集団を除き、２００７年７月からＢＣＧワクチン接種は義務ではなくなっている。
【０００４】
ＢＣＧワクチンの防御特性を向上させるために、ヒト型結核菌のゲノムを遺伝子操作する種々の方法を用いた実験的な検討が行われてきたものの、これらの構築物からは今のところ、結核、特に肺結核から防御するためのＢＣＧの代替ワクチンの開発には至っていない。第一の方策は、サイトカインを産出し分泌するＢＣＧの変異体を開発することである（非特許文献３［１］）。第二の方策は、ヒト型結核菌の３０キロダルトンの抗原タンパク質を発現する遺伝子組換えＢＣＧを構築しようとするものである。なお、この構築物は動物モデルにおいては防御効果を示した。最後に、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）菌のリステリオリシンを分泌させて、結核に対する防御に関与するＣＤ８及びＣＤ４リンパ球を刺激するようにＢＣＧ株のゲノムを操作することがいくつかの研究で検討されている（非特許文献４[２]）。最後の方策は、ｐｈｏＰ遺伝子やｍｃｅ遺伝子などの病原性遺伝子を不活性化することによりヒト型結核菌を弱毒化した弱毒株を製造することである（非特許文献５、６［３、４］）。これらの構築物は、動物モデルにおいてはヒト型結核菌による感染に対してＢＣＧよりも高い防御効果を示した（非特許文献５、６［３、４］）。
【０００５】
周知であるように、ヒトや動物における感染の原因となるこのようなマイコバクテリウムの弱毒株はワクチンの製造に使用することができ、特にそのワクチンに弱毒化した細菌を導入することによってワクチンが製造される。
【０００６】
知られているように、ワクチンとして使用されるマイコバクテリウム株、特にＨ３７Ｒｖ株は、真核細胞において特に生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で培養した場合、３０日よりも長く生存することはできない。実際に、増殖速度が低下すると、上記細胞における特に生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での上記細菌の寿命も短くなる。
【０００７】
ＭｓｐＡポリンは、Ｍ．スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）の膜抽出物中で、２０ｋＤａのサブユニットからなるオリゴマータンパク質として発見された（非特許文献７［５］）。ＭｓｐＡポリンはＭ．スメグマチスの主要な最も含有量の多いポリンであると考えられた（非特許文献７、８［５、６］）。ＭｓｐＡをコードするｍｓｐＡ遺伝子を抑制すると、Ｍ．スメグマチスの外膜のグルコース透過率（非特許文献９［７］）、ホスフェート透過率（非特許文献１０［８］）、金属イオン透過率及びアミノ酸透過率（非特許文献１１［９］）が減少するが、このことは、該ポリンがＭ．スメグマチス内において種々の物質を拡散する全般的な主要経路であること、さらに、該ポリンによってマイコバクテリウム外部の培地から養分を流入させることができることを示している（非特許文献１０、１１［８、９］）。ＭｓｐＡポリンをコードする遺伝子は、マイコバクテリウム・ケロネー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎａｅ）（非特許文献１２［１０］）やマイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）（非特許文献１３［１１］）などの他の迅速発育マイコバクテリアにおいても検出されている。ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）及びウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）においてＭｓｐＡポリンの発現が起こると、抗生物質に対する感受性が増加することが示されている（非特許文献１４［１２］）。同様に、Ｍ．スメグマチスのＭｓｐＡポリンは、無菌培地中におけるウシ型結核菌ＢＣＧ株の増殖速度を高める（非特許文献１５［１４］）。これらの先行研究では（非特許文献１４、１５［１２、１４］）、各著者は、無菌のミドルブルック７Ｈ１０寒天培地中で増殖させることにより、対照株のヒト型結核菌Ｈ３７ＲｖとＭｓｐＡ発現株に対する抗生物質の最小発育阻止濃度を決定している。
【０００８】
最後に、Ｍ．スメグマチスのｍｓｐＡ遺伝子を欠失させると、マウスマクロファージ内でのＭ．スメグマチスの生存率が増加することが示されている（非特許文献１６［１３］）。
【０００９】
したがって、上記文献から以下のことが言える。
１）これまで種々の生物工学的技術を用いて変異体や欠失体が作製され、結核菌群菌の弱毒株が構築されてきた。ｐｈｏＰ遺伝子やｍｃｅ遺伝子などの病原性遺伝子を不活性化することによってヒト型結核菌の弱毒株を製造する方策［３、４］では、マウスやモルモットの動物モデルにおいて、ヒト型結核菌による感染に対してＢＣＧよりも高い防御効果が得られることが示されている［３、４］。しかしながら、これらの生物工学的技術は、結核菌群菌のゲノムを含まない遺伝子を付加して、ワクチンとして使用する又はワクチンを製造する目的では有効には用いられていない。
【００１０】
２）先行技術での検討では、いずれも、ｍｓｐＡ遺伝子の発現が、真核細胞モデルや動物モデルにおいて結核菌群菌の増殖を減弱させる可能性があることが示されておらず、ましてや、ｍｓｐＡ遺伝子の発現をワクチンとして又はワクチンを製造するために利用できることは示されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｄｙｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ＷＨＯ  ＤＯＴＳ  ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｌａｎｃｅｔ  １９９８；３５２：１８８６−９１．３
【非特許文献２】Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＫＡ，Ｌａｖｅｒ  ＰＮ，Ｍｉｃｈｅｌ  ＡＬ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｍ，ｖａｎ  Ｈｅｌｄｅｎ  ＰＤ，Ｗａｒｒｅｎ  ＲＭ，Ｇｅｙ  ｖａｎ  Ｐｉｔｔｉｕｓ  ＮＣ．Ｎｏｖｅｌ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐａｔｈｏｇｅｎ，Ｍ．ｍｕｎｇｉ．Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２０１０；１６：１２９６−９
【非特許文献３】Ｍｅｔｃｈｏｃｋ  ＢＧ，Ｎｏｌｔｅ  ＦＳ，Ｗａｌｌａｃｅ  ＲＪ  Ｊｒ．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ｉｎ：Ｍｕｒｒａｙ  ＰＲ，Ｊｏ  Ｂａｒｏｎ  Ｈ，Ｐｆａｌｌｅｒ  ＭＡ，Ｔｅｎｏｖｅｒ  ＦＣ，Ｙｏｌｋｅｎ  ＲＨ，Ｅｄｓ．Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，１９９９；３９９−４３７
【非特許文献４】Ｇｒｏｄｅ  Ｌ，Ｓｅｉｌｅｒ  Ｐ，Ｂａｕｍａｎｎ  Ｓ，Ｈｅｓｓ  Ｊ，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，Ｎａｓｓｅｒ  Ｅｄｄｉｎｅ  Ａ，Ｍａｎｎ  Ｐ，Ｇｏｏｓｍａｎｎ  Ｃ，Ｂａｎｄｅｒｍａｎｎ  Ｓ，Ｓｍｉｔｈ  Ｄ，Ｂａｎｃｒｏｆｔ  ＧＪ，Ｒｅｙｒａｔ  ＪＭ，ｖａｎ  Ｓｏｏｌｉｎｇｅｎ  Ｄ，Ｒａｕｐａｃｈ  Ｂ，Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＳＨ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｓｅｃｒｅｔｅ  ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００５；１１５：２４７２−９
【非特許文献５】Ｇｉｏｆｆｒｅ  Ａ，Ｉｎｆａｎｔｅ  Ｅ，Ａｇｕｉｌａｒ  Ｄ，Ｓａｎｔａｎｇｅｌｏ  ＭＰ，Ｋｌｅｐｐ  Ｌ，Ａｍａｄｉｏ  Ａ，Ｍｅｉｋｌｅ  Ｖ，Ｅｔｃｈｅｃｈｏｕｒｙ  Ｉ，Ｒｏｍａｎｏ  ＭＩ，Ｃａｔａｌｄｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｃｅ  ｏｐｅｒｏｎｓ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ２００５；７：３２５−３３４
【非特許文献６】Ｍａｒｔｉｎ  Ｃ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ａ，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐａｎｄｏ  Ｒ，Ｃａｒｄｏｎａ  ＰＪ，Ｇｏｒｍｌｅｙ  Ｅ，Ｂｏｒｄａｔ  Ｙ，Ｓｏｔｏ  ＣＹ，Ｃｌａｒｋ  ＳＯ，Ｈａｔｃｈ  ＧＪ，Ａｇｕｉｌａｒ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｌｉｖｅ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｐｈｏＰ  ｍｕｔａｎｔ  ｓｔｒａｉｎ  ｉｓ  ｍｏｒｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｔｈａｎ  ＢＣＧ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００６；２４：３４０８−３４１９
【非特許文献７】Ｎｉｅｄｅｒｗｅｉｓ，Ｍ．，Ｅｈｒｔ，Ｓ．，Ｈｅｉｎｚ，Ｃ．，Ｋｌｏｃｋｅｒ，Ｕ．，Ｋａｒｏｓｉ，Ｓ．，Ｓｗｉｄｅｒｅｋ，Ｋ．Ｍ．，Ｒｉｌｅｙ，Ｌ．Ｗ．ａｎｄ  Ｂｅｎｚ，Ｒ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｓｐＡ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｐｏｒｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９；５：９３３−９４５
【非特許文献８】Ｏｊｈａ  Ａ，Ｈａｔｆｕｌｌ  ＧＦ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｔｈｅ  ｅｘｏｃｈｅｌｉｎ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｉｒｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７；６６：４６８−８３
【非特許文献９】Ｓｔａｈｌ，Ｃ．Ｋｕｂｅｔｚｋｏ，Ｓ．Ｋａｐｓ，Ｉ．Ｓｅｅｂｅｒ，Ｓ．Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｈ．Ｎｉｅｄｅｒｗｅｉｓ，Ｍ．ＭｓｐＡ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｔｈｅ  ｍａｉｎ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１；４０；４５１−６４
【非特許文献１０】Ｗｏｌｓｃｈｅｎｄｏｒｆ  Ｆ，Ｍａｈｆｏｕｄ  Ｍ，Ｎｉｅｄｅｒｗｅｉｓ  Ｍ．Ｐｏｒｉｎｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ｂｙ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００７；１８９：２４３５−４２
【非特許文献１１】Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｊ，Ｂｅｎｄｅｒ  Ｊ，Ｗｏｌｓｃｈｅｎｄｏｒｆ  Ｆ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｃ，Ｒｏｔｈ  Ｅ，Ｍａｉｌａｎｄｅｒ  Ｃ，Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ  Ｈ，Ｎｉｅｄｅｒｗｅｉｓ  Ｍ．Ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｏｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｘ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５；５８：７１４−３０
【非特許文献１２】Ｔｒｉａｓ，Ｊ．，Ｊａｒｌｉｅｒ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｂｅｎｚ，Ｒ．Ｐｏｒｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９２；２５８：１４７９−１４８１
【非特許文献１３】Ｒｉｅｓｓ，Ｆ．Ｇ．，Ｄｏｒｎｅｒ，Ｕ．，Ｓｃｈｉｆｆｌｅｒ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｂｅｎｚ，Ｒ．Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｃｈａｎｎｅｌ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ．Ｊ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ  ２００１；１８２：１４７−５７
【非特許文献１４】Ｍａｉｌａｅｎｄｅｒ  Ｃ，Ｒｅｉｌｉｎｇ  Ｎ，Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ  Ｈ，Ｂｏｓｓｍａｎｎ  Ｓ，Ｅｈｌｅｒｓ  Ｓ，Ｎｉｅｄｅｒｗｅｉｓ  Ｍ．Ｔｈｅ  ＭｓｐＡ  ｐｏｒｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  ａｎｄ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００４；１５０：８５３−８６４
【非特許文献１５】Ｓｈａｒｂａｔｉ−Ｔｅｈｒａｎｉ  Ｓ，Ｍｅｉｓｔｅｒ  Ｂ，Ａｐｐｅｌ  Ｂ，Ｌｅｗｉｎ  Ａ．Ｔｈｅ  ｐｏｒｉｎ  ＭｓｐＡ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４；２９４：２３５−４５
【非特許文献１６】Ｆａｂｒｉｎｏ  ＤＬ，Ｂｌｅｃｋ  ＣＫ，Ａｎｅｓ  Ｅ，Ｈａｓｉｌｉｋ  Ａ，Ｍｅｌｏ  ＲＣ，Ｎｉｅｄｅｒｗｅｉｓ  Ｍ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  Ｇ，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ  ＭＧ．Ｐｏｒｉｎｓ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．２００９；１１：８６８−７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、免疫原性を維持しつつ増殖速度を低下させた結核菌群の新規菌株を提供することである。
【００１３】
ワクチン分野の当業者は、常に、そのワクチンの有効性を向上させつつ副作用は抑えるよう多様なワクチンの実施形態を生み出し、またワクチン接種で恩恵を受け得る哺乳動物、特に畜牛などの家畜の有効範囲を拡げようとしている。
【００１４】
遺伝子を不活性化したり除去したりすることによりマイコバクテリウムを不活性化してワクチン用途に使用できるようにする方策とは異なり、本発明によれば、本発明者らは、驚くべきことに、分子工学的方法を用いて遺伝子を付加し、発現させることにより結核菌群菌を弱毒化できることを見出した。
【００１５】
したがって、本発明は、ワクチンとして使用することを目的として、マイコバクテリウム・スメグマチスのポリンＡをコードするｍｓｐＡ遺伝子をマイコバクテリウムに付加し、発現させることによって、結核菌群に属するマイコバクテリウム株の真核細胞における増殖性を低下させる方法を提供する。
【００１６】
Ｇｅｏｒｇｉａｎａ  Ｅ．Ｐｕｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ７３．Ｎｏ．５．２００９年９月１日、ｐ．８４４−８５７）において、著者らは、他のほとんどのヒト型結核菌株よりも病原性が高く［３１］、それ故ワクチンとしての使用には適していないヒト型結核菌ＣＤＣ１５５１株を用いており、また、マウスのマクロファージがマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、別名ＲＡＷ  ２６４．７細胞に感染していたことから、そのマウスマクロファージ内でのｍｓｐＡポリンを発現する上記形質転換株の生存率が減少したことを報告している［２８］。ウイルス干渉現象によって、マクロファージなどの免疫系の細胞を第一のウイルス（ＭｕＬＶ）に感染させると、第二の細菌である、上記細胞に感染するヒト型結核菌の生存率が減少することが実際に知られている［２９］。このため、著者らは、結核ワクチンを製造することを目的として宿主の免疫を高めるために上記ヒト型結核菌変異体を使用した場合の効果については言及していない。
【００１７】
Ｍａｉｌａｅｎｄｅｒら［１２］は、ｍｓｐＡポリンを発現する形質転換株はヒト型結核菌の野生株と比較して培地での増殖性が高いという結果から、当業者に対し、このような形質転換株は宿主の真核細胞における増殖性が低下しないと示唆している。Ｍａｉｌａｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００４［１２］によれば、著者らは得られた実験データを解釈する際に、天然抗生物質（ユビキチン由来のペプチド）に対して上記ヒト型結核菌株の感受性が増加することを、新しいワクチンを提供するためではなく、抗結核活性を有する新規分子を提供することを目的とした観点でしか解釈していない。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明によれば、まずウイルスに感染していないマクロファージ細胞株を使用して、なかでも特に健常人ボランティアドナーの細胞に対してアッセイを行うことにより、ワクチンとして有利に使用できるヒト型結核菌の改善された弱毒株が得られることを見出した。この結果は、下記実施例４に報告する通り、動物の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での実験データによって確認された。本発明の変異株が無害であることを示す上記結果は、当該分野でＢＣＧに対して現在公表されている全ての結果［３０］を凌ぐものであり、結核に対する改良ワクチンの土台となるものである。
【００１９】
より具体的には、本発明は、真核細胞、好ましくはマクロファージ、を含む宿主において結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）菌による感染を予防するワクチンを製造するための、結核菌群に属するマイコバクテリウム株の使用であって、上記株には、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のポリンＡを発現するｍｓｐＡ遺伝子が挿入されており、このマイコバクテリウム形質転換株の上記真核細胞における増殖性が低下している、使用を提供する。
【００２０】
より特定の実施形態では、本発明の目的の１つは、哺乳動物又は鳥類の結核を予防するワクチンを製造するための、本発明におけるヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の形質転換株の使用であって、上記細胞がマクロファージである、使用である。
【００２１】
さらに特定の実施形態では、本発明の目的の１つは、ヒトの結核を予防するワクチンを製造するために使用される本発明における形質転換株の使用である。
【００２２】
本発明によれば、以下のことが観察された。
ａ）このように形質転換された結核菌群に属するマイコバクテリウム株は、その結核菌群に属するマイコバクテリウムにおいてＭｓｐＡポリンを発現させることができるが、真核細胞を含んでいない培地（無菌培地）中においてヒト型結核菌の野生株よりも強い増殖性を示す。この点について、本発明者らは過去に公表された文献に記載の結果を確認することができた［１２、１４］。
【００２３】
ｂ）しかしながら、３種類の異なる真核細胞培地、特にマウスマクロファージ及びヒトマクロファージを含む培地を用いて検証したところ、驚くべきことに、真核細胞との共培養において上記形質転換株を増殖させると、該ヒト型結核菌変異体の増殖性は、元の野生株と比較して減少する。上記マクロファージは、特に結核や免疫原性の反応に関与し、したがってワクチンとしての使用に際して防御反応に関与する。マクロファージは、ヒト型結核菌マイコバクテリアを食菌してそれらを破壊しようとするとともに、免疫系の他の細胞に対してマイコバクテリア抗原を提示するヒト又は動物の細胞である［２５］。
【００２４】
このような真核細胞の共培養における細胞内増殖の結果は全く想定外であった。というのも、この結果は、真核細胞を含まない無菌培地中での培養に関する国際文献［１２、１４］に公表されている本発明者らが得た知見に反するものであったからである。
【００２５】
さらに、マウスの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのアッセイにより、上記増殖性の低下は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で維持され、弱毒株の免疫原性特性も維持されるということが確認された。したがって、これらは、ヒトの結核、より広くは哺乳動物や鳥類の結核を予防するワクチンを製造するために、さらには該ワクチンとして有利に利用できる。
【００２６】
より特定の実施形態では、上記ｍｓｐＡ遺伝子が上記株に挿入されており、上記結核菌群に属するマイコバクテリウムにおいて上記ｍｓｐＡ遺伝子を発現させるプロモーターの制御下にある。
【００２７】
さらに特定の実施形態では、上記ｍｓｐＡ遺伝子を有するプラスミドが、上記結核菌群菌において上記ｍｓｐＡ遺伝子を発現させるプロモーターの制御下で導入される。
【００２８】
さらにより特定の実施形態では、上記ｍｓｐＡ遺伝子と、上記結核菌群菌での上記ｍｓｐＡ遺伝子の発現を制御する上記エレメントが、上記結核菌群菌の染色体に挿入されている。
【００２９】
本明細書において、「結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）菌」とは、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）及びそのクローン又はＢＣＧ亜種、マイコバクテリウム・アフリカナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウム・カネッティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｎｅｔｔｉｉ）、マイコバクテリウム・カプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・ミクロティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、マイコバクテリウム・ピニペディ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｉｎｎｉｐｅｄｉｉ）及びマイコバクテリウム・ムンギイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｎｇｉｉ）の中から選択される少なくとも１種の細菌を意味する。これらの種は全て近縁種であり、現時点で配列が決定されているものに関して、９９％超の相同性を有するゲノムを有している。よって、これらの種は全て、同一の臨床疾患を引き起こし、感染した器官において、マクロファージ型の巨細胞と共に肉芽種を形成することを特徴とする同一の組織病変をもたらす［２６］。
【００３０】
本発明のある好ましい実施形態において、上記結核菌群に属する株はヒト型結核菌株である。
【００３１】
より特定の実施形態では、上記ヒト型結核菌株の由来はＨ３７Ｒｖ株である。
【００３２】
さらに特定の実施形態では、上記ｍｓｐＡ遺伝子は、本願明細書に付属の配列表の配列番号１の配列を含む。
【００３３】
さらにより特定の実施形態では、上記ｍｓｐＡ遺伝子は、本願明細書に付属の配列表の配列番号４からなる「ｈｓｐ６０プロモーター」と呼ばれる発現エレメントの制御下にある。上記真核細胞が哺乳動物又は鳥類の細胞、好ましくはヒトの細胞であるのが有利である。上記細胞がマクロファージ細胞であるのがより好ましい。
【００３４】
また、本発明は、結核菌群菌の形質転換株を含むワクチンであって、上記株には、上記マイコバクテリウムにおいてマイコバクテリウム・スメグマチスのポリンＡを発現するｍｓｐＡ遺伝子が挿入されており、これにより本発明の方法を実施することができる、ワクチンも提供する。
【００３５】
より特定の実施形態では、上記形質転換株はヒト型結核菌の形質転換株である。
【００３６】
さらに特定の実施形態では、上記形質転換株は、ＮＣＴＣ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）コレクション（英国  ＳＰ４  ０ＪＧ  ウィルトシャー州，ソールズベリー，ポートンダウン，Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ）に整理番号１２０４２６０１として２０１２年４月２６日付で寄託された株（以下、Ｈ３７ＲｖｐＶＶＭｓｐＡと呼ぶ）である。この寄託はブダペスト条約に基づいて行われた。
【００３７】
本発明における「形質転換株」は、より特定の実施形態では、真核細胞における該細菌の増殖性が、細胞培養液１ｍｌ当たりの細菌数として９０％以上、さらには９９％以上低下している。言い換えれば、細胞培養液１ｍｌ当たりの細菌数は１０分の１以下、さらには１００分の１以下になる。
【００３８】
本発明におけるマイコバクテリウム形質転換株は、真核細胞培養において特に生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での生存期間が６０日以下、好ましくは５０日以下である。
【００３９】
実際に、増殖性が低下すると、上記細胞における特に生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での上記細菌の寿命も少なくとも３〜１０日短くなる。
【００４０】
本発明の他の特徴及び利点は、図１〜３を参照して以下の実施例を読めばより明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＭｓｐＡポリンの発現量を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。レーンＭは分子量マーカーを示す。レーン１はＭ．スメグマチスのタンパク質抽出物の分離を示し、レーン２はヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶ１６のタンパク質抽出物の分離を示し、レーン３はヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶＭｓｐＡのタンパク質抽出物の分離を示す。ＭｓｐＡタンパク質は２０ＫＤａで見られた。
【図２】実施例１のＭｓｐＡポリン存在下の７Ｈ９無菌培地上でのヒト型結核菌の増殖の増加を示す曲線であり、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）をＹ軸方向に沿って０から１まで、１８日間（Ｘ軸は「ｔ」）にわたって測定したものである。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、種々の真核細胞：実施例２及び３のＡ．ポリファガ（Ａ．ｐｏｌｙｐｈａｇａ）（図３Ａ）、ＢＭＤＭ（図３Ｂ）及びｈＭｄＭ（図３Ｃ）におけるヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶ１６及びヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ＭｓｐＡの細胞内増殖を示すグラフであり、０〜１４日間培養後（Ｘ軸は「ｔ」）の細胞溶解物のＣＦＵ／ｍｌとして０から１００００００まで（Ｙ軸）測定したものである。
【図４】濃度を変えて（１００００ＣＦＵ／１００μｌ及び１００００ＣＦＵ／１００μｌ）野生型Ｈ３７Ｒｖ株及びＨ３７Ｒｖ／ｐＶＶＭｓｐＡ改変株に感染させたマウスについて、時間（ｔ）の関数として０日から３９日までのマウスの体重（ｗ、単位はグラム（ｇ））の傾向を示す。
【図５】実施例４で検討したような、野生株のヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ（■）及び本発明におけるヒト型結核菌株（□）の接種後の肝臓（Ａ）、脾臓（Ｂ）及び肺（Ｃ）の細菌量（ＣＦＵ数）を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４２】
実施例１．無菌培地中でのＭｓｐＡ発現ヒト型結核菌の増殖
最初に、本発明者らは、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のゲノムから、ＭｓｐＡポリンをコードする遺伝子を増幅し、その後、ハイグロマイシン及びカナマイシン（選択マーカー）に対して耐性のあるタンパク質をコードする２つの遺伝子が存在することを特徴とする発現ベクターｐＶＶ１６［１６］に増幅産物を導入してプラスミドｐＶＶＭｓｐＡを得た。次に本発明者らは、ｐＶＶＭｓｐＡプラスミドを電気穿孔法によってヒト型結核菌ＨＳ７Ｒｖ株に組み入れ、形質転換されたクローンの選別を抗生物質としてハイグロマイシン及びカナマイシンを用いて行った。
【００４３】
実験プロトコル
１）ｐＶＶＭｓｐＡプラスミドの構築
最初に本発明者らは、Ｍ．スメグマチスｍｃ１５５株（ＡＴＣＣ７０００８４）からゲノムＤＮＡを抽出し、標準的なＰＣＲ法を用いてＭｓｐＡポリンをコードする遺伝子を増幅した［５］。
【００４４】
上記遺伝子の配列ｇｉ＿１１８４６７３４０は以下の配列（配列番号１）である。
【００４５】
５’−ＡＴＧＡＡＧＧＣＡＡＴＣＡＧＴＣＧＧＧＴＧＣＴＧＡＴＣＧＣＧＡＴＧＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＧＣＧＧＣＧＣＴＴＴＴＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＴＣＴＣＡＣＧＣＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＧＣＣＴＣＧＴＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＧＡＣＣＧＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＧＣＡＡＣＣＧＴＣＴＴＡＣＣＣＧＴＧＡＧＴＧＧＴＴＣＣＡＣＴＣＣＧＧＴＣＧＣＧＣＣＡＡＧＴＡＣＡＴＣＧＴＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＴＧＣＣＧＡＣＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＡＣＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＧＧＣＴＡＣＣＡＧＡＴＣＧＧＣＴＴＣＣＣＧＴＧＧＴＣＧＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＴＡＣＡＣＣＡＣＣＣＣＧＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＧＡＣＧＧＴＧＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＡＡＣＴＣＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＣＣＧＡＡＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＣＧＡＴＣＴＣＧＧＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＡＡＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＧＣＡＡＣＧＴＴＣＴＣＧＧＴＣＧＡＣＧＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＣＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＣＧＡＡＣＧＣＣＣＡＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＧＣＧＧＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＣＣＧＣＣＴＧＡＴＣＧＣＣＴＣＧＡＣＣＧＧＴＧＡＣＴＣＧＧＴＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＡ−３’
【００４６】
用いたプライマーは、
・ＭＳＰＡ−ｐＶＶ１６Ｆ：５’−ｃｃｃｃｃｃｃａｔａｔｇａａｇｇｃａａｔｃａｇｔｃ−３’（配列番号２）と
・ＭＳＰＡ−ｐＶＶ１６ｎｄｅＩ：５’−ｃｃｃｃａｔａｔｇｔｃａｇｔｔｃａｔｇｔｔｃｃａｇｇｇ−３’（配列番号３）である。
【００４７】
これらのプライマーは、発現ベクターｐＶＶ１６におけるクローニングと、その後のその構成的発現を可能とするため、制限酵素Ｎｄｅｌによって切断される切断部位（この酵素的切断部位は上記プライマー配列に下線を付して表している）を両端に有するｍｓｐＡ遺伝子（６３６ｂｐ）の全体に相当するＰＣＲ産物が生成されるように決定した。
【００４８】
ｐＭＳ３［１５］、ｐＭＶ２６１［１６］などの他の発現ベクターのように、ｐＶＶ１６ベクターは、ハイグロマイシン耐性カセットと、マイコバクテリアにおける発現のためのｈｓｐ６０プロモーター（配列番号４）を有する［１６］。ｐＶＶ１６に特有の特性は、（クローニングの際にプラスミドが構築されているか否かを確認するために使用する）大腸菌における発現のためのプロモーターと、二重選択を可能にするカナマイシン耐性カセットである［１６］。
【００４９】
次に、ＰＣＲフラグメントをｐＶＶ１６プラスミドのＮｄｅＩ部位でクローン化してｐＶＶＭｓｐＡプラスミドを得た。これを最も簡素な方法であるヒートショックを用いて大腸菌ＤＨ５αに導入した。このプラスミドの構築を酵素消化及びＰＣＲ増幅によって確認した後、配列決定（シークエンシング）を行った。
【００５０】
ｈｓｐ６０プロモーターの配列（配列番号４）は以下の通りである。
【００５１】
５’−ＡＡＣＧＣＧＴＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＣＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＣＡＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＴＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＣＧＴＧＧＧＣＧＣＣＴＧＧＧＣＧＧＧＣＧＧＣＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＧＴＴＧＣＣＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＴＧＣＧＧＡＣＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＡＣＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＣＧＧＴＣＧＧＣＡＡＡＣＡＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＴＧＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＣＣＧＧＴＧＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＡＣＧＣＧＣＣＣＧＣＴＴＴＧＡＴＣＧＧＧＧＡＣＧＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＡＣＣＡＴＴＴＡＣＧＧＧＴＣＴＴＧＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＣＧＧＴＣＡＴＧＧＧＣＣＧＡＡＣＡＴＡＣＴＣＡＣＣＣＧＧＡＴＣＧＧＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＡＧＧＴＣＧＡＡＣＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＣＣＣＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＧＣＡＣＴＣＧＧＣＡＴＡＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＡＡＧＡＡＴＡＡＣＧＴＴＧＧＣＡＣＴＣＧＣＧＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＧＧＴＣＧＧＧＡＣＧＧＴＧＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＧＴＣＧＴＣＧＣＡＧＣＧＡＧＴＧＧＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＡＧＣＣＧＴＣＣＧＴＣＧＣＧＧＧＣＡＣＴＧＣＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＴＡＡＧＴＡＧＣＧＧＧＧＴＴＧＣＣＧＴＣＡＣＣＣＧＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＧＴＴＴＣＡＴＣＣＣＣＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＡ−３’
【００５２】
ｈｓｐ６０プロモーターの制御下にあるｍｓｐＡ遺伝子の発現カセットは、配列番号４と配列番号１が並列したものからなる。
【００５３】
２）エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ヒト型結核菌マイコバクテリアの調製及びｐＶＶＭｓｐＡプラスミドの導入
エレクトロコンピテント（プラスミドの導入が可能な）ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ株（ＡＴＣＣ２７２９４）［１７］を、Ｖａｎ  ＫｅｓｓｅｌとＨａｔｆｕｌｌ［１８］によって既に開示されている方法で調製した。手短に言うと、光学密度（ＯＤ６００）が０．８〜１．０のヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖの培養液からヒト型結核菌マイコバクテリアを回収し、１０％グリセリンで３回洗浄し、同じ緩衝液に再懸濁した。プラスミドｐＶＶ１６（増殖性の変化が発現ベクターそのものによるものではなく、実際にｍｓｐＡ遺伝子の存在によるものであることを確認するための対照）及びｐＶＶＭｓｐＡ（目的のＭｓｐＡポリンの遺伝子を含むプラスミド）をそれぞれ、エレクトロポレーター（参照番号：Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ／Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ  ２５１０（ル・ペック、フランス））を用いて１０００Ω、２．５ｋＶ、２５ｕＦの条件下で電気穿孔法によりマイコバクテリアに導入した。電気穿孔処理したマイコバクテリアを１ｍＬの強化ミドルブルック７Ｈ９液体培地（シグマアルドリッチ（リヨン、フランス））中に回収し、３７℃で１２時間培養した後、カナマイシンとハイグロマイシンを添加して選択培地としたミドルブルック７Ｈ１０培地上に拡げて、３７℃で３〜４週間インキュベートした。形質転換されたヒト型結核菌マイコバクテリアでのｍｓｐＡ遺伝子の転写及び翻訳はＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
【００５４】
ＭｓｐＡポリンは熱による変性に対して安定であることを特徴とする［５］。図１では、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶ１６（レーン２）、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶＭｓｐＡ（レーン３）及びＭ．スメグマチス（陽性対照）（レーン１）のタンパク質抽出物を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を行った。これらの抽出物は高温での選択抽出によって調製した［２７］。図１は、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ及び対照株であるＭ．スメグマチスにおけるｍｓｐＡ遺伝子の発現を示す。検出されたタンパク質のスポットをゲルから切り取り、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析した。タンパク質のスポットを同定すると、配列包括度が２１％〜２９％であり、２０ｋＤａのＭ．スメグマチスのＭｓｐＡタンパク質配列に対して相同性を有していた。
【００５５】
３）形質転換された又は形質転換されていないヒト型結核菌の液体培地中における増殖
ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶ１６（ＭｓｐＡポリンを発現しない対照形質転換株）及びヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶＭｓｐＡ（ＭｓｐＡポリンを発現する形質転換株）を５ｍＬのミドルブルック７Ｈ９培地（ベクトン・ディッキンソン（ル  ポン  ド  クレ、フランス））中でＤＯ６００値が１になるまで１５日間前培養した。その後、マイコバクテリアを渦流下で激しく撹拌混合して細胞塊を除去し、回収し、１０ｍｌの新鮮な７Ｈ９培地で希釈した。３つの独立した培養液中の両株について、ＢＡＣＴＥＣ  ＭＧＩＴ  ９６０システム（ベクトン・ディッキンソン（ル  ポン  ド  クレ、フランス））を用いてＤＯ６００を測定することで増殖速度を決定した。この完全に自動化されたシステムは好気性細菌による酸素の消費の検出に基づくものである。
【００５６】
４）結果
ヒト型結核菌の増殖に対するＭｓｐＡタンパク質の影響を検討するために、本発明者らはヒト型結核菌／ｐＶＶ１６株及びヒト型結核菌／ｐＶＶＭｓｐＡ株を用いて、７Ｈ９無菌液体培地中で３つの独立した培養系で生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での増殖実験を行った。本発明者らは細胞の懸濁液を使用し、細菌の増殖性をＢＡＣＴＥＣ  ＭＧＩＴ  ９６０システムにより１７日間測定した。対照株であるヒト型結核菌／ｐＶＶ１６株及びヒト型結核菌／ｐＶＶＭｓｐＡ株の世代時間は、それぞれ１９時間１０分±１０分、１７時間１６分±１２分であった（図２）。したがって、本発明者らは、ＭｓｐＡポリンを発現する株の増殖速度は対照株よりもずっと速いことを確認した（ｐ≦０．０５）。この実験は３回行ったが、ＭｓｐＡポリンの発現によってヒト型結核菌の増殖速度が上昇することが示された。
【００５７】
実施例２．アメーバＡ．ポリファガ（Ａ．ｐｏｌｙｐｈａｇａ）との共培養におけるＭｓｐＡ発現ヒト型結核菌の増殖
【００５８】
１）実験プロトコル
アメーバの懸濁液１０ｍｌ（１ｍｌ当たり約１０５個のアメーバ）を１ｍｌ当たり約１０６個のマイコバクテリア（ＭＯＩ＝１０）と共に接種した。対照として、Ａ．ポリファガとマイコバクテリアを別々にＰＡＳ緩衝液（Ｐａｇｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｅｆｆ’ｓ  ａｍｏｅｂａ  ｓａｌｉｎｅ）中で培養した（２１、２２、２３）。３２℃で２４時間インキュベートした後、その共培養液をＰＡＳで３回洗浄し、１０ｍｌのＰＡＳ中で１０〜１５分間、３２℃でインキュベートした。
【００５９】
２）結果
アメーバを真核細胞として使用して、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶ１６及びヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶＭｓｐＡの両株がこの実験で生き残ったことが確認できた。しかしながら、ＭｓｐＡポリンを発現するヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶＭｓｐＡマイコバクテリアの菌数は共培養８日目で有意に減少した（ｐ≦０．０５；スチューデントの統計的検定）。１２日目には、コロニー数は、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶ１６が２×１０５±６×１０４であり、これに対しヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶＭｓｐＡは８×１０３±５×１０３であった（図３Ａ）。
【００６０】
図３Ａは、真核細胞：Ａ．ポリファガの培養液中でのヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶ１６及びヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ＭｓｐＡの細胞内増殖を示すグラフである。
【００６１】
これらのデータは、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶ１６株と比較してヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶＭｓｐＡの細胞内増殖が約２ｌｏｇ減少したこと、すなわち培養液１ｍｌ当たりの細菌数が約９９％減少したことを示している。
【００６２】
実施例３．ヒトマクロファージ（ｈＭｄＭ）又はマウスマクロファージ（ＢＭＤＭ）との共培養におけるＭｓｐＡ発現ヒト型結核菌の増殖
【００６３】
１）実験プロトコル
Ｆｉｃｏｌｌ勾配（ＭＳＬ、Ｅｕｒｏｂｉｏ（クルタブフ、フランス））を用いてロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｃｋ）（フランス血液機構（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ）（マルセイユ、フランス））から分離した後に鑑別したＢＭＤＭ［２４］及びｈＭｄＭを別々に、２４ウェル培養プレートに入った１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に接種した（１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。ＢＭＤＭ及びｈＭｄＭを別々にヒト型結核菌、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶ１６及びヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶＭｓｐＡに２４時間感染させ、その後マクロファージを洗浄して遊離のマイコバクテリアを除去した後、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で様々な時間インキュベートした。対照として、各タイプの細胞及びマイコバクテリアを別々に培養した。
【００６４】
細胞内マイコバクテリアの菌数（ＣＦＵ）の決定
所定の時点で、感染した細胞を０．１％硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）により３０分間溶解させ、その後２６ゲージ針に通して確実に完全に溶解させた。溶解物（５００μＬ）をＰＢＳで３回洗浄し、７Ｈ１０固体培地（ベクトン・ディッキンソン（ルポン  ド  クレ、フランス））上に拡げ、３７℃で１５日間インキュベートして、細胞内マイコバクテリアのコロニー数（ＣＦＵ）を測定した。全ての実験を三連で行った。
【００６５】
２）結果
ＢＭＤＭマクロファージを真核細胞として使用して、本発明者らは、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶ１６及びヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶＭｓｐＡの両株が実験期間（１４日間）生き延びたことを確認した。本発明者らは、４日目から１４日目の間、対照株であるＨ３７Ｒｖ／ｐＶＶ１６がＭｓｐＡ発現株よりも有意に大きな増殖性を示した（ｐ≦０．０５）ことを確認した（図３Ｂ）。１４日目においてコロニー数は、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶ１６が１×１０６±７×１０５であり、これに対しヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶＭｓｐＡが４×１０５±１×１０５であった（ｐ≦０．０５）。
【００６６】
形質転換された又は形質転換されていないヒト型結核菌のヒトマクロファージとの共培養
ｈＭｄＭマクロファージを真核細胞として使用して、本発明者らは、４日目以降、実験が終了するまで、対照株であるヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶ１６がＭｓｐＡ発現株よりも有意に大きい増殖性を示した（ｐ≦０．０５）ことを確認した（図３Ｃ）。１４日目においてコロニー数は、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶ１６が２×１０４±２×１０３であり、これに対しヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶＭｓｐＡが５×１０３±７×１０２であった。
【００６７】
まとめると、これらの結果は、ヒト型結核菌におけるＭｓｐＡポリンの発現によって、３つのタイプの被験真核細胞において該細菌の増殖が対照株と比較して困難になることを示している。
【００６８】
図３Ｂ及び図３Ｃは、種々のマクロファージ（ＢＭＤＭ（図３Ｂ）及びｈＭｄＭ（図３Ｃ））培養液中でのヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶ１６及びヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ＭｓｐＡの細胞内増殖を示すグラフである。
【００６９】
これらのデータは、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶ１６株と比較して、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶＭｓｐＡの細胞内増殖が約１ｌｏｇ減少したこと、すなわち培養液１ｍｌ当たりの細菌数が約９０％減少したことを示している。
【００７０】
実施例４．動物モデルにおけるＭｓｐＡ発現ヒト型結核菌の増殖及び結核からの防御
【００７１】
１）実験プロトコル
動物での試験は、動物実験の倫理委員会の地方事務局から承認を受けた後、３日間ＮＳＢの実験室で行われた。６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（１つの群につき１０匹）を１００μＬの細菌培養液を用いて腹膜内経路で感染させた。上記株（野生型Ｈ３７Ｒｖ  ＡＴＣＣ２７２９４株及びヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶＭｓｐＡ変異株）のそれぞれについて２つの異なる接種菌液（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬと１×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）を使用した。対照として、マウスの１群を１００μＬの無菌ＰＢＳを用いて感染処理した。マウスの体重、能力及び生存率を１ヶ月監視した。
【００７２】
他の研究者が公表しているプロトコルに従って、感染したマウスの検査を行った［３］。また、第１相において、何匹かの生存マウスを屠殺し、脾臓、肝臓及び肺を病理解剖によって分析し、培養液ごとに組織１グラム当たりの細菌量（単位ＣＦＵ）を測定した。第２相では、２つの群の生存マウスに１０７ＣＦＵ／ｍＬのヒト型結核菌ｈ３７Ｒｖを再度接種し、同様の観察プロトコルを行った。
【００７３】
２）結果
現在のデータによると、本発明における改変株に感染させたマウスはほとんど行動面における問題はなく、ヒト型結核菌の野生株に感染させたマウスよりも体重増加が早い（図４及び５）。
【００７４】
他の研究者が公表しているプロトコルに沿って、感染したマウスの検査を行った［３］。感染から１０週間後、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶＭｓｐＡ変異株に感染させたマウスは全て生き残っていたが、野生株に感染させたマウスは死亡率が５０％であった。この生存率は、肺におけるヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶＭｓｐＡのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数が非常に少ないことと関係がある。ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶＭｓｐＡ変異株を接種したマウスは、小さな肉芽腫を有する組織病変がほとんど生じていなかった。野生株のヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖを接種したある１匹のマウスは腹瘻を示した。巨視的分析を行ったところ、野生株のヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖを接種したマウスの脾臓の重量は、変異株を接種したマウスよりも有意に大きいことが示された。また、それぞれの肉芽腫の数は、肝臓では２４±２１対０、脾臓では６１±２７対８±７であり、これらの差は有意ある（ｐ＜０．０５）。脾臓でのマイコバクテリアの菌数は、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ／ｐＶＶＭｓｐＡ変異株では、野生株のヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖと比較してＣＦＵ数が有意に減少していた。細胞アッセイで試験した免疫原性は保存されていた。
【００７５】
最初の接種から９０日後、本発明者らは再び野生株のヒト型結核菌Ｈ３７ＲＶを１ｍｌ当たり１０７ＣＦＵの接種菌液を使用して２つの群のマウスに接種した。マウスを９０日間再び監視した。最初の接種で野生株を接種した４匹のマウスのうちの１匹を除いて、全てのマウスが生き残った。
【００７６】
また、摂取から３８日目以降に観察されるように、本発明のワクチン株を最初に接種したマウスの群では、最初に野生株を接種したマウスと比較して体重増加が有意に大きかった（Ｐ＜０．０５）（ｐ＝２つの系列の２つの平均値が異なるという断定が誤りである確率（ここでは＜５％）を示すスチューデントの統計的検定）。
【００７７】
マウスは、２回目の接種から９０日後に安楽死させた。組織の組織病理学的分析によると、最初に本発明のワクチン株を接種したマウス（小結節数：２１±２５）と比較して、最初に野生型結核菌を接種した群の肺肉芽腫の小結節の数（小結節数：３３±３７）は有意に多かった（ｐ＜０．０５）。
【００７８】
最後に、ヒト型結核菌Ｈ３７ＲＶの細菌量（ＣＦＵ数）は、最初に本発明のワクチン株を接種したマウス群よりも、最初に野生型結核菌を接種したマウス群において有意に多かった（ｐ＜０．０５）（図５）。
【００７９】
このようにして発明者らは３つの証拠：臨床的証拠（死亡率）、組織学的証拠（器官当たりの肉芽腫の数）及び微生物学的証拠（接種後の細菌量）を得た。これらから、ヒト型結核菌Ｈ３７ＲＶ／ＰＶＶＭＳＰＡ変異株が、上記動物モデルにおける野生型結核菌に対する防御効果を付与するという結論が導かれる。
【００８０】
これらの結果から、本発明の変異株の無害性と、ヒト型結核菌による感染に対する本発明のヒト型結核菌変異株の防御特性は、当該分野でＢＣＧについて現在公開されている全ての結果［３０］を凌ぐものであり、結核に対する改良ワクチンの土台となるものである。
【００８１】
Ｂｒａｎｄｔ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ  ２００２［３０］においては、人間に感染する可能性を考慮すると非常に重要なことであるにもかかわらず、ヒト型結核菌による感染後６週間経過した時点で結核による死亡を防ぐ防御効果が全く示されていない。また、脾臓及び肺におけるヒト型結核菌の細菌量の減少は非常に穏やかである。
【００８２】
書誌参照
［１］Ｍｅｔｃｈｏｃｋ  ＢＧ，Ｎｏｌｔｅ  ＦＳ，Ｗａｌｌａｃｅ  ＲＪ  Ｊｒ．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ｉｎ：Ｍｕｒｒａｙ  ＰＲ，Ｊｏ  Ｂａｒｏｎ  Ｈ，Ｐｆａｌｌｅｒ  ＭＡ，Ｔｅｎｏｖｅｒ  ＦＣ，Ｙｏｌｋｅｎ  ＲＨ，Ｅｄｓ．Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，１９９９；３９９−４３７
［２］Ｇｒｏｄｅ  Ｌ，Ｓｅｉｌｅｒ  Ｐ，Ｂａｕｍａｎｎ  Ｓ，Ｈｅｓｓ  Ｊ，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，Ｎａｓｓｅｒ  Ｅｄｄｉｎｅ  Ａ，Ｍａｎｎ  Ｐ，Ｇｏｏｓｍａｎｎ  Ｃ，Ｂａｎｄｅｒｍａｎｎ  Ｓ，Ｓｍｉｔｈ  Ｄ，Ｂａｎｃｒｏｆｔ  ＧＪ，Ｒｅｙｒａｔ  ＪＭ，ｖａｎ  Ｓｏｏｌｉｎｇｅｎ  Ｄ，Ｒａｕｐａｃｈ  Ｂ，Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＳＨ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｓｅｃｒｅｔｅ  ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００５；１１５：２４７２−９
［３］Ｇｉｏｆｆｒｅ  Ａ，Ｉｎｆａｎｔｅ  Ｅ，Ａｇｕｉｌａｒ  Ｄ，Ｓａｎｔａｎｇｅｌｏ  ＭＰ，Ｋｌｅｐｐ  Ｌ，Ａｍａｄｉｏ  Ａ，Ｍｅｉｋｌｅ  Ｖ，Ｅｔｃｈｅｃｈｏｕｒｙ  Ｉ，Ｒｏｍａｎｏ  ＭＩ，Ｃａｔａｌｄｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｃｅ  ｏｐｅｒｏｎｓ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ２００５；７：３２５−３３４
［４］Ｍａｒｔｉｎ  Ｃ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ａ，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐａｎｄｏ  Ｒ，Ｃａｒｄｏｎａ  ＰＪ，Ｇｏｒｍｌｅｙ  Ｅ，Ｂｏｒｄａｔ  Ｙ，Ｓｏｔｏ  ＣＹ，Ｃｌａｒｋ  ＳＯ，Ｈａｔｃｈ  ＧＪ，Ａｇｕｉｌａｒ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｌｉｖｅ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｐｈｏＰ  ｍｕｔａｎｔ  ｓｔｒａｉｎ  ｉｓ  ｍｏｒｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｔｈａｎ  ＢＣＧ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００６；２４：３４０８−３４１９
［５］Ｎｉｅｄｅｒｗｅｉｓ，Ｍ．，Ｅｈｒｔ，Ｓ．，Ｈｅｉｎｚ，Ｃ．，Ｋｌｏｃｋｅｒ，Ｕ．，Ｋａｒｏｓｉ，Ｓ．，Ｓｗｉｄｅｒｅｋ，Ｋ．Ｍ．，Ｒｉｌｅｙ，Ｌ．Ｗ．ａｎｄ  Ｂｅｎｚ，Ｒ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｓｐＡ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｐｏｒｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ．Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９；５：９３３−９４５
［６］Ｏｊｈａ  Ａ，Ｈａｔｆｕｌｌ  ＧＦ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｔｈｅ  ｅｘｏｃｈｅｌｉｎ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｉｒｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７；６６：４６８−８３
［７］Ｓｔａｈｌ，Ｃ．  Ｋｕｂｅｔｚｋｏ，Ｓ．  Ｋａｐｓ，  Ｉ．Ｓｅｅｂｅｒ，Ｓ．  Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｈ．Ｎｉｅｄｅｒｗｅｉｓ，Ｍ．ＭｓｐＡ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｔｈｅ  ｍａｉｎ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１；４０；４５１−６４
［８］Ｗｏｌｓｃｈｅｎｄｏｒｆ  Ｆ，Ｍａｈｆｏｕｄ  Ｍ，Ｎｉｅｄｅｒｗｅｉｓ  Ｍ．Ｐｏｒｉｎｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ｂｙ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００７；１８９：２４３５−４２
［９］Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｊ，Ｂｅｎｄｅｒ  Ｊ，Ｗｏｌｓｃｈｅｎｄｏｒｆ  Ｆ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｃ，Ｒｏｔｈ  Ｅ，Ｍａｉｌａｎｄｅｒ  Ｃ，Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ  Ｈ，Ｎｉｅｄｅｒｗｅｉｓ  Ｍ．Ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｏｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｘ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５；５８：７１４−３０
［１０］Ｔｒｉａｓ，Ｊ．，Ｊａｒｌｉｅｒ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｂｅｎｚ，Ｒ．Ｐｏｒｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９２；２５８：１４７９−１４８１
［１１］Ｒｉｅｓｓ，Ｆ．Ｇ．，Ｄｏｒｎｅｒ，Ｕ．，Ｓｃｈｉｆｆｌｅｒ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｂｅｎｚ，Ｒ．Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｃｈａｎｎｅｌ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ．Ｊ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ  ２００１；１８２：１４７−１５７
［１２］Ｍａｉｌａｅｎｄｅｒ  Ｃ，Ｒｅｉｌｉｎｇ  Ｎ，Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ  Ｈ，Ｂｏｓｓｍａｎｎ  Ｓ，Ｅｈｌｅｒｓ  Ｓ，Ｎｉｅｄｅｒｗｅｉｓ  Ｍ．Ｔｈｅ  ＭｓｐＡ  ｐｏｒｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  ａｎｄ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００４；１５０：８５３−８６４
［１３］Ｆａｂｒｉｎｏ  ＤＬ，Ｂｌｅｃｋ  ＣＫ，Ａｎｅｓ  Ｅ，Ｈａｓｉｌｉｋ  Ａ，Ｍｅｌｏ  ＲＣ，Ｎｉｅｄｅｒｗｅｉｓ  Ｍ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  Ｇ，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ  ＭＧ．Ｐｏｒｉｎｓ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．２００９；１１：８６８−７５
［１４］Ｓｈａｒｂａｔｉ−Ｔｅｈｒａｎｉ  Ｓ，Ｍｅｉｓｔｅｒ  Ｂ，Ａｐｐｅｌ  Ｂ，Ｌｅｗｉｎ  Ａ．Ｔｈｅ  ｐｏｒｉｎ  ＭｓｐＡ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４；２９４：２３５−４５
［１５］Ｓｃｈｏｌｚ，Ｏ．，Ｔｈｉｅｌ，Ａ．，Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．＆Ｎｉｅｄｅｒｗｅｉｓ，Ｍ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０００；２６７，１５６５−１５７０
［１６］Ｓｔｏｖｅｒ  ＣＫ，Ｄｅ  ｌａ  Ｃｒｕｚ  ＶＦ，Ｆｕｅｒｓｔ  ＴＲ，Ｂｕｒｌｅｉｎ  ＪＥ，Ｂｅｎｓｏｎ  ＬＡ，Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＬＴ，Ｂａｎｓａｌ  ＧＰ，Ｙｏｕｎｇ  ＪＦ，Ｌｅｅ  ＭＨ，Ｈａｔｆｕｌｌ  ＧＦ，Ｓｎａｐｐｅｒ  ＳＢ，Ｂａｒｌｅｔｔａ  ＲＧ，Ｊａｃｏｂｓ  ＷＲ，Ｂｌｏｏｍ  ＢＲ．Ｎｅｗ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＢＣＧ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９１：３５１：４５６−４６０
［１７］Ｃｏｌｅ  ＳＴ，Ｂｒｏｓｃｈ  Ｒ，Ｐａｒｋｈｉｌｌ  Ｊ，Ｇａｒｎｉｅｒ  Ｔ，Ｃｈｕｒｃｈｅｒ  Ｃ，Ｈａｒｒｉｓ  Ｄ，Ｇｏｒｄｏｎ  ＳＶ，Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒ  Ｋ，Ｇａｓ  Ｓ，Ｂａｒｒｙ  ＣＥ，３ｒｄ  ｅｔ  ａｌ：Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９８，３９３（６６８５）：５３７−５４４
［１８］Ｖａｎ  Ｋｅｓｓｅｌ，Ｊ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｈａｔｆｕｌｌ，Ｇ．Ｆ．（２００７）Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：１４７−１５２
［１９］Ｄｙｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ＷＨＯ  ＤＯＴＳ  ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｌａｎｃｅｔ  １９９８；３５２：１８８６−９１．３
［２０］Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＫＡ，Ｌａｖｅｒ  ＰＮ，Ｍｉｃｈｅｌ  ＡＬ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｍ，ｖａｎ  Ｈｅｌｄｅｎ  ＰＤ，Ｗａｒｒｅｎ  ＲＭ，Ｇｅｙ  ｖａｎ  Ｐｉｔｔｉｕｓ  ＮＣ．Ｎｏｖｅｌ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐａｔｈｏｇｅｎ，Ｍ．ｍｕｎｇｉ．Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２０１０；１６：１２９６−９
［２１］Ｒｏｗｂｏｔｈａｍ，Ｔ．Ｊ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ｆｒｏｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  ｖｉａ  ａｍｏｅｂａｅ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｏｓｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｍｏｅｂａｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  １９８３；３６：９７８９８６
［２２］Ｌａ  Ｓｃｏｌａ，Ｂ．，Ｍｅｚｉ，Ｌ．，Ｗｅｉｌｌｅｒ，Ｐ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｒａｏｕｌｔ，Ｄ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ａｎｉｓａ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ａｍｏｅｂｉｃ  ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００１；３９：３６５−３６６
［２３］Ｇｒｅｕｂ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｒａｏｕｌｔ，Ｄ．Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｆｒｅｅ−ｌｉｖｉｎｇ  ａｍｏｅｂａｅ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２００４；１７：４１３−４３３
［２４］Ｃｏｏｋ，Ｐ．，Ｔｏｔｅｍｅｙｅｒ，Ｓ．，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｃ．，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．Ａ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．，Ａｋｉｒａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＳｉｐＢ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−４  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ａｄａｐｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｒａｍ  ａｎｄ  Ｔｒｉｆ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００７；１２２：２２２−２２９
［２５］Ｇｅｎｇｅｎｂａｃｈｅｒ  Ｍ，Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＳＨ．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：ｓｕｃｃｅｓｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｏｒｍａｎｃｙ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．２０１２；３６：５１４−３２
［２６］Ｉｓａｚａ  Ｒ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎ  ａｌｌ  ｔａｘａ．Ｉｎ：  Ｆｏｗｌｅｒ  ＭＥ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＲＥ，ｅｄｓ．Ｚｏｏ  ａｎｄ  Ｗｉｌｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．５ｔｈ  ｅｄ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；２００３：６８９−６９６
［２７］Ｈｅｉｎｚ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｎｉｅｄｅｒｗｅｉｓ，Ｍ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０００；２８５；１１３−１２０
［２８］ＨＡＲＴＬＥＹ  Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００８，５：１
［２９］Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ  Ｍｅｄｉｃａｌｅ．Ｊａｗｅｔｚ  Ｅ．Ｍｅｌｎｉｃｋ  ＪＬ，Ａｄｅｌｂｅｒｇ  ＥＡ．Ｍａｌｏｉｎｅ  ＳＡ  Ｅｄｉｔｏｒ，１９７３，ｐ３８４
［３０］Ｂｒａｎｄｔ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２００２；７０：６７２−６７８
［３１］Ｍａｎｃａ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；６２：６７４０−６
【図２】
2015518719.tif 000002
【図３】
2015518719.tif 000003
【図４】
2015518719.tif 000004
【図５】
2015518719.tif 000005
【図１】
2015518719.tif 000006
【配列表】
2015518719000001.app
【国際調査報告】
2015518719.tif 000007
2015518719.tif 000008
2015518719.tif 000009
2015518719.tif 000010