(57)【要約】  単独療法を上回る活性の増加をもたらす、またはいくつかの事例では、少なくとも否定的な相互作用の予想外の欠如をもたらす抗新生物薬の組合せ。詳細には、B-Raf 阻害剤、特に、N-{3-[5-(2-アミノ-4-ピリミジニル)-2-(1,1-ジメチルエチル)-1,3-チアゾール-4-イル]-2-フルオロフェニル}-2,6-ジフルオロベンゼンスルホンアミド、または製薬上許容されるその塩、および／あるいはMEK 阻害剤、特に、N-{3-[3-シクロプロピル-5-(2-フルオロ-4-ヨード-フェニルアミノ)6,8-ジメチル;-2,4,7-トリオキソ-3,4,6,7-テトラヒドロ-2H-ピリド[4,3-d]ピリミジン-1-イル]フェニル}アセトアミド 、または製薬上許容されるその塩もしくは溶媒和物とともに、MAGE-A3免疫療法薬を含む薬物の組合せが記載される。【選択図】図１
2015503503.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とするヒトにおいて感受性癌（susceptible cancer）を治療する方法であって、治療上有効な量の
（i）MAGE-A3免疫療法薬、ならびに
（a）式（I）の化合物
【化１】
2015503503.tif 000009
または製薬上許容されるその塩、および
（b）構造（II）の化合物
【化２】
2015503503.tif 000010
または製薬上許容されるその塩もしくは溶媒和物
のうちの一方あるいは双方を投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
式（I）の化合物または製薬上許容されるその塩が、メタンスルホン酸塩の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
構造（I）の化合物が、ジメチルスルホキシド溶媒和物の形態である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
MAGE-A3免疫療法薬が、プロテインD-MAGE-A3融合タンパク質である、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
MAGE-A3免疫療法薬が、配列番号２を含む融合タンパク質である、請求項１〜４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
MAGE-A3免疫療法薬がアジュバントを含有する、請求項１〜５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
式（I）および／もしくは（II）の化合物または製薬上許容されるその塩が更に、製薬上許容される希釈剤または担体を含有する、請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
癌が、頭頸部癌、乳癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、神経膠腫、膠芽細胞腫、星状細胞腫、多形性膠芽腫、Bannayan-Zonana症候群、カウデン病、レルミット・ダクロス病、炎症性乳癌、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、上衣腫、髄芽腫、腎臓癌、肝臓癌、黒色腫、膵臓癌、肉腫、骨肉腫、骨巨細胞腫、甲状腺癌、リンパ芽球性T細胞白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、AML、慢性好中球性白血病、急性リンパ芽球性T細胞白血病、形質細胞腫、免疫芽球性大細胞型白血病、マントル細胞白血病、多発性骨髄腫、巨核芽球性白血病、多発性骨髄腫、急性巨核球性白血病、前骨髄球性白血病、赤白血病、悪性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、T細胞性リンパ芽球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、神経芽細胞腫、膀胱癌、尿路上皮癌、外陰癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、中皮腫、食道癌、唾液腺癌、肝細胞癌、胃癌、鼻咽頭癌、口腔癌（buccal cancer, cancer of the mouth）、GIST（消化管間質腫瘍）および精巣癌より選択される、請求項１〜７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
癌が黒色腫である、請求項１〜８のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物における癌の治療方法およびこのような治療に有用な組合せに関する。詳細には、その方法は、MAGEA3免疫療法薬を、B-Raf阻害剤、特に、N-{3-[5-(2-アミノ-4-ピリミジニル)-2-(1,1-ジメチルエチル)-1,3-チアゾール-4-イル]-2-フルオロフェニル}-2,6-ジフルオロベンゼンスルホンアミド、または製薬上許容されるその塩、および／あるいはMEK阻害剤、特に、N-{3-[3-シクロプロピル-5-(2-フルオロ-4-ヨード-フェニルアミノ)6,8-ジメチル;-2,4,7-トリオキソ-3,4,6,7-テトラヒドロ-2H-ピリド[4,3-d]ピリミジン-1-イル]フェニル}アセトアミド、または製薬上許容されるその塩もしくは溶媒和物とともに含む新規組合せ、これを含む医薬組成物、ならびに、B-Rafの阻害およびMAGEA3特異的免疫応答の上昇が有効である状態、例えば、癌の治療におけるこのような組合せおよび組成物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌などの過剰増殖性障害の効果的な治療は、腫瘍学分野において継続的に存在している目標である。通常、癌は、細胞分裂、分化およびアポトーシス細胞死を制御する正常な過程の脱制御（deregulation）によって生じ、無制限の増殖、局所的な拡大および全身転移の可能性を有する悪性細胞の増殖を特徴とする。正常な過程の脱制御は、シグナル伝達経路の異常、および正常細胞において見られるものとは異なる因子への応答を含む。
【０００３】
近年、B-Raf阻害剤は、Ras-Raf-MEK-ERKキナーゼ経路（MAPK経路として知られている）に対する理解の増加により、癌の治療に用いるために研究されている。具体的には、増殖因子、ホルモン、サイトカインなどに応答したRasタンパク質の活性化が、Rafキナーゼのリン酸化および活性化を促進し、それが次にMEK1およびMEK2キナーゼをリン酸化および活性化し、それがその後ERK1および2キナーゼをリン酸化および活性化するという理解である。
【０００４】
MAPK置換キナーゼにおける突然変異は、その経路の増殖シグナル機能に悪影響を及ぼし、多様なヒトの癌の形成、発達、および進行を引き起こすと考えられる。B-Rafキナーゼにおける自然発生突然変異は、ヒト黒色腫（Davies, H.ら、Nature (2002) 9:1-6；Garnett, M.J.およびMarais, R., Cancer Cell (2004) 6:313-319）ならびに甲状腺癌（Cohenら、 J. Nat. Cancer Inst. (2003) 95(8) 625-627およびKimuraら、Cancer Res. (2003) 63(7) 1454-1457）のかなりの割合で観察されており、同様に、より低いが依然としてかなりの頻度で、他の多くの癌において観察されている。
【０００５】
また近年、MEK阻害剤が、癌治療に使用するために研究されている。分裂促進因子活性化タンパク質（MAP）キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）キナーゼ（以下MEKと呼ばれる）は、Raf-MEK-ERKシグナル伝達経路を仲介するキナーゼとして細胞増殖の調節に関与することが知られており、Rafファミリー（B-Raf、C-Rafなど）はMEKファミリー（MEK-1、MEK-2など）を活性化し、MEKファミリーはERKファミリー（ERK-1およびERK-2）を活性化する。癌、特に、結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌、乳癌などにおけるRaf-MEK-ERKシグナル伝達経路の活性化は、高い頻度で観察されている。
【０００６】
加えて、増殖因子、サイトカインなどのシグナル分子によって生じるシグナルはMEK-ERKの活性化に収束するので、これらの機能の阻害剤は、RTK、RasおよびRafなどの上流のキナーゼの機能の抑制よりも、より効果的にRaf-MEK-ERKシグナル伝達を抑制すると考えられる。
【０００７】
更に、MEK阻害活性を有する化合物は、ERK1/2活性の阻害および細胞増殖の抑制を効果的に誘導することもまた知られており（The Journal of Biological Chemistry, vol. 276, No. 4, pp. 2686-2692, 2001）、その化合物は、望ましくない細胞増殖によって引き起こされる疾患、例えば、腫瘍発生および／または癌などに効果を示すことが予想される。
【０００８】
キナーゼ阻害剤以外の有望な癌治療の中では、腫瘍抗原を標的とする免疫療法的アプローチが期待されている。異なる腫瘍抗原のファミリーの中で、癌／精巣抗原（CT抗原）ファミリーは特に興味深い発現パターンを有する。MAGE-A3遺伝子は、この癌／精巣抗原に属し、密接に相関しているMAGE遺伝子ファミリー（X染色体上に位置し、それらのコード配列において64〜85％の同一性を共有する）に属する。
【０００９】
対応するMAGE-A3タンパク質は、もともと、自己黒色腫細胞に特異的な細胞傷害性Tリンパ球（CTL）による認識を通じて定義された抗原である（そのため、黒色腫抗原（melanoma antigen）に対するMAGEという用語である）。MAGE-A3はヒトにおいて免疫原性であり、いくつかのMAGE-A3に由来するエピトープが同定されている[Cancer Immunome Database 2010]。MAGE-A3遺伝子は厳密に腫瘍特異的である。それは、精巣以外の正常な成体組織では発現されず、胎児発生のいくつかの時点での胎児組織において、または胎盤の栄養膜細胞によって発現されている[DePlaen, 1994, De Smet, 1994, Takahashi, 1995, Chomez, 1996, De Smet, 1996]。その遺伝子は、それらの表面上にHLA分子を持たない細胞（すなわち、精巣の精原細胞および胎盤の栄養膜）の細胞質で発現される[Haas, 1988, Boel, 1995, Chomez, 2001, Jungbluth, 2007]；従って、MAGE-A3に由来するエピトープは、CD8+またはCD4+ T細胞に提示されず、それらによって認識され得ない。その結果、MAGE-A3抗原に対する免疫付与は、ヒトにおいて免疫関連毒性を誘導しないと考えられ、もっぱらMAGE-A3を発現する癌細胞に対する免疫応答を引き起こすであろう。MAGE-A3は、65％；頭頸部癌、65％；膀胱癌、62％；肝癌、48％；食道癌、47％；NSCLC、35％；卵巣癌、30％；白血病、29％；および前立腺癌、18％などの、異なる組織型の多くの異なる腫瘍のいくらかの割合で発現される [Van den Eynde, 1997からのデータ]。
【００１０】
このように、MAGE-A3のようなCT抗原は、抗原に対して引き起こされる免疫応答が正常組織に影響を及ぼさず、抗原を発現している癌細胞のみに影響を及ぼすはずであるため、特異的な癌免疫療法の標的候補である。黒色腫および膀胱癌を有する被験体において、このようなCT抗原に基づく免疫療法による腫瘍の退縮が実証されている（例えば、Nishiyamaら、Immunotherapy of Bladder Cancer Using Autologous Dendritic Cells Pulsed with Human Lymphocyte Antigen-A24-specific MAGE-3 Peptide 2001, Clin. Cancer Res., 7:23-31; Thurnerら、Vaccination with Mage-3A1 Peptide-Pulsed Mature, Monocyte-Derived Dendritic Cells Expands Specific Cytotoxic T Cells and Induces Regression of Some Metastases in Advanced Stage IV Melanoma 1999, J. Exp. Med., 190:1669-1678; Coulieら、A monoclonal cytolytic T-lymphocyte response observed in a melanoma patient vaccinated with a tumor-specific antigenic peptide encoded by gene MAGE-3, Proc Natl Acad Sci USA 98(18): 10290-10295 (2001)参照）。50以上の癌／精巣抗原が記載されており、それらの多くに対して、Tリンパ球によって認識される特異的エピトープが同定されている。
【００１１】
B-Raf阻害剤、MEK阻害剤、および癌／精巣抗原のような抗原などの化合物を用いて、癌の治療における多くの最近の進歩がなされているが、依然として、癌の影響を受けている個体のより効果的かつ／または改善された治療の必要性が残っている。
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らは、単独療法を上回る活性の増加をもたらす、またはいくつかの事例では、少なくとも否定的な相互作用の予想外の欠如をもたらす治療薬の組合せを同定した。詳細には、B-Raf阻害剤N-{3-[5-(2-アミノ-4-ピリミジニル)-2-(1,1-ジメチルエチル)-1,3-チアゾール-4-イル]-2-フルオロフェニル}-2,6-ジフルオロベンゼンスルホンアミドまたは製薬上許容されるその塩と併用した、および／あるいはMEK 阻害剤：N-{3-[3-シクロプロピル-5-(2-フルオロ-4-ヨード-フェニルアミノ)6,8-ジメチル;-2,4,7-トリオキソ-3,4,6,7-テトラヒドロ-2H-ピリド[4,3-d]ピリミジン-1-イル]フェニル}アセトアミドまたは製薬上許容されるその塩もしくは溶媒和物と併用した、MAGEA3免疫療法薬の複合薬を用いた治療方法が記載される。
【００１３】
本発明のある態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）MAGE-A3免疫療法薬、および
（ii）式（I）の構造によって表されるB-Raf阻害剤：
【化１】
2015503503.tif 000003
【００１４】
または製薬上許容されるその塩（本明細書において「化合物A」と総称される）
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００１５】
本発明のある態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）MAGE-A3免疫療法薬、および
（ii）構造（II）によって表されるMEK阻害剤：
【化２】
2015503503.tif 000004
【００１６】
または製薬上許容されるその塩もしくは溶媒和物（本明細書において「化合物B」と総称される）
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００１７】
本発明のある態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）MAGE-A3免疫療法薬、
（ii）化合物A、および
（iii）化合物B
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性黒色腫を治療する方法であって、
（i）MAGE-A3免疫療法薬、および
（ii）化合物A
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００１９】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性黒色腫を治療する方法であって、
（i）MAGE-A3免疫療法薬、および
（ii）化合物B
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００２０】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性黒色腫を治療する方法であって、
（i）MAGE-A3免疫療法薬、
（ii）化合物A、および
（iii）化合物B
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００２１】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）MAGE-A3免疫療法薬、および
（ii）N-{3-[5-(2-アミノ-4-ピリミジニル)-2-(1,1-ジメチルエチル)-1,3-チアゾール-4-イル]-2-フルオロフェニル}-2,6-ジフルオロベンゼンスルホンアミドメタンスルホン酸塩
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００２２】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）MAGE-A3免疫療法薬、および
（ii）N-{3-[3-シクロプロピル-5-(2-フルオロ-4-ヨード-フェニルアミノ)6,8-ジメチル;-2,4,7-トリオキソ-3,4,6,7-テトラヒドロ-2H-ピリド [4,3-d]ピリミジン-1-イル]フェニル}アセトアミドジメチルスルホキシド
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００２３】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）MAGE-A3免疫療法薬、および
（ii）N-{3-[5-(2-アミノ-4-ピリミジニル)-2-(1,1-ジメチルエチル)-1,3-チアゾール-4-イル]-2-フルオロフェニル}-2,6-ジフルオロベンゼンスルホンアミドメタンスルホン酸塩、および
（iii）N-{3-[3-シクロプロピル-5-(2-フルオロ-4-ヨード-フェニルアミノ)6,8-ジメチル;-2,4,7-トリオキソ-3,4,6,7-テトラヒドロ-2H-ピリド [4,3-d]ピリミジン-1-イル]フェニル}アセトアミドジメチルスルホキシド
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００２４】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）MAGE-A3免疫療法薬、ならびに
（ii）製薬上許容される希釈剤および／または担体とともに、化合物A
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００２５】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）MAGE-A3免疫療法薬、ならびに
（ii）製薬上許容される希釈剤および／または担体とともに、化合物B
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００２６】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）MAGE-A3免疫療法薬、
（ii）製薬上許容される希釈剤および／または担体とともに、化合物A
（iii）製薬上許容される希釈剤および／または担体とともに、化合物B
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００２７】
本発明の別の態様では、
（i）MAGE-A3免疫療法薬、および
（ii）ヒトにおける感受性癌の治療のための、化合物A
を含有する組合せの使用が提供される。
【００２８】
本発明の別の態様では、
（i）MAGE-A3免疫療法薬、および
（ii）ヒトにおける感受性癌の治療のための、化合物B
を含有する組合せの使用が提供される。
【００２９】
本発明の別の態様では、
（i）MAGE-A3免疫療法薬、
（ii）ヒトにおける感受性癌の治療のための、化合物A、および
（iii）ヒトにおける感受性癌の治療のための、化合物B
を含有する組合せの使用が提供される。
【００３０】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）プロテインD-MAGE-A3融合タンパク質を含むMAGE-A3免疫療法薬、および
（ii）化合物A
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００３１】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）プロテインD-MAGE-A3融合タンパク質を含むMAGEA3免疫療法薬、および
（ii）化合物B
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００３２】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）プロテインD-MAGE-A3融合タンパク質を含むMAGEA3免疫療法薬、
（ii）化合物A、および
（iii）化合物B
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００３３】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性黒色腫を治療する方法であって、
（i）プロテインD-MAGE-A3融合タンパク質を含むMAGEA3免疫療法薬、および
（ii）化合物A
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００３４】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性黒色腫を治療する方法であって、
（i）プロテインD-MAGE-A3融合タンパク質を含むMAGEA3免疫療法薬、および
（ii）化合物B
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００３５】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性黒色腫を治療する方法であって、
（i）プロテインD-MAGE-A3融合タンパク質を含むMAGEA3免疫療法薬、
（ii）化合物A、および
（iii）化合物B
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００３６】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）プロテインD-MAGE-A3融合タンパク質を含むMAGEA3免疫療法薬、および
（ii）N-{3-[5-(2-アミノ-4-ピリミジニル)-2-(1,1-ジメチルエチル)-1,3-チアゾール-4-イル]-2-フルオロフェニル}-2,6-ジフルオロベンゼンスルホンアミドメタンスルホン酸塩
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００３７】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）プロテインD-MAGE-A3融合タンパク質を含むMAGEA3免疫療法薬、および
（ii）N-{3-[3-シクロプロピル-5-(2-フルオロ-4-ヨード-フェニルアミノ)6,8-ジメチル;-2,4,7-トリオキソ-3,4,6,7-テトラヒドロ-2H-ピリド [4,3-d]ピリミジン-1-イル]フェニル}アセトアミドジメチルスルホキシド
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００３８】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）プロテインD-MAGE-A3融合タンパク質を含むMAGEA3免疫療法薬、
（ii）N-{3-[5-(2-アミノ-4-ピリミジニル)-2-(1,1-ジメチルエチル)-1,3-チアゾール-4-イル]-2-フルオロフェニル}-2,6-ジフルオロベンゼンスルホンアミドメタンスルホン酸塩、および
（iii）N-{3-[3-シクロプロピル-5-(2-フルオロ-4-ヨード-フェニルアミノ)6,8-ジメチル;-2,4,7-トリオキソ-3,4,6,7-テトラヒドロ-2H-ピリド [4,3-d]ピリミジン-1-イル]フェニル}アセトアミドジメチルスルホキシド
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００３９】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）プロテインD-MAGE-A3融合タンパク質を含むMAGEA3免疫療法薬、ならびに
（ii）製薬上許容される希釈剤および／または担体とともに、化合物A
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００４０】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）プロテインD-MAGE-A3融合タンパク質を含むMAGEA3免疫療法薬、ならびに
（ii）製薬上許容される希釈剤および／または担体とともに、化合物B
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００４１】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）プロテインD-MAGE-A3融合タンパク質を含むMAGEA3免疫療法薬、
（ii）製薬上許容される希釈剤および／または担体とともに、化合物A、ならびに
（iii）製薬上許容される希釈剤および／または担体とともに、化合物B
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００４２】
本発明の別の態様では、
（i）プロテインD-MAGE-A3融合タンパク質を含むMAGEA3免疫療法薬、および
（ii）ヒトにおける感受性癌の治療のための、化合物A
を含有する組合せの使用が提供される。
【００４３】
本発明の別の態様では、
（i）プロテインD-MAGE-A3融合タンパク質を含むMAGEA3免疫療法薬、および
（ii）ヒトにおける感受性癌の治療のための、化合物B
を含有する組合せの使用が提供される。
【００４４】
本発明の別の態様では、
（i）プロテインD-MAGE-A3融合タンパク質を含むMAGEA3免疫療法薬、
（ii）化合物A、および
（iii）ヒトにおける感受性癌の治療のための、化合物B
を含有する組合せの使用が提供される。
【００４５】
本発明の更なる態様では、治療を必要とする哺乳動物において癌を治療する方法であって、治療上有効な量の本発明の組合せを投与することを含み、その組合せは特定の期間内に特定の時間投与される、上記方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】MAGE-A3 ASCI +/- BRAF阻害剤またはMEK阻害剤で２回免疫したマウスにおける、サイトカイン産生CD4+T細胞の割合を示す。
【図２】MAGE-A3 ASCI +/- B-RAF阻害剤またはMEK阻害剤で２回免疫したマウスにおける、サイトカイン産生CD8+T細胞の割合を示す。
【図３】MAGE-A3 ASCI +/- B-RAF阻害剤またはMEK阻害剤で２回免疫したマウスにおける抗体応答の平均力価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
MAGEタンパク質およびrecMAGEA3
MAGE-A3として知られる癌-精巣抗原は、11個の既知のメンバー（MAGE-A 1〜6および8〜12）を含むMAGE-Aサブファミリーに属する。他の「MAGE-A」（黒色腫抗原ファミリーA）遺伝子が報告されているが（例えば、MAGE-A7、A13〜15など）、これらの遺伝子の発現パターンは、それらが偽遺伝子であることを示唆する（例えば、Chomezら、Cancer Research, 61:5544 (2001)参照）。WO 94/23031は、MAGE-A3を記載する。ヒトMAGE-A3（MAGE-3、MAGEA3、またはMAGE A3としても知られている）は、黒色腫、非小細胞肺癌（NSCLC）、膀胱癌、頭頸部癌、食道扁平上皮癌、および肝細胞癌などの、関連性のない組織学的起源の様々なヒト腫瘍型で発現されることが発見されている。しかし、特定の腫瘍型（例えば黒色腫）を有するすべての個体が、MAGE-A3を発現する腫瘍を有するとは限らない。加えて、単一の腫瘍内で、一部の腫瘍細胞は特定の癌-精巣抗原を発現する一方、他の細胞はそれを発現していないこともありうる。
【００４８】
一般論では、MAGE-Aタンパク質は、タンパク質のC末端の方に位置するコア配列シグネチャー（core sequence signature）を含むものとして定義され得る（例えば、309アミノ酸のMAGE-A1タンパク質については、コアシグネチャー（core signature）はアミノ酸195-279に相当する）。コアシグネチャーのコンセンサスパターンは、下記に記載され（配列番号１）、そこで、xは任意のアミノ酸を表し、小文字の残基は保存されており（保存的変異は許容される）、大文字の残基は完全に保存されている。
【００４９】
MAGE-Aコア配列シグネチャー：
LixvL(2x)I(3x)g(2x)apEExiWexl(2x)m(3-4x)Gxe(3-4x)gxp(2x)llt(3x)Vqex
YLxYxqVPxsxP(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv（配列番号１）
保存的置換はよく知られており、通常、配列アラインメントコンピュータープログラムの初期設定スコアリングマトリックスとして設定される。これらのプログラムは、PAM250 (Dayhoft M.O.ら、(1978), “A model of evolutionary changes in proteins”,  In “Atlas of Protein sequence and structure” 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington、ならびにBlosum 62 (Steven HenikoftおよびJorja G. Henikoft (1992), “Amino acid substitution matrices from protein blocks”), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919を含む。
【００５０】
本明細書において用いられる場合、「アジュバント」は、被験体にワクチン、免疫療法薬、または他の抗原もしくは免疫原含有組成物とともに投与された際、（アジュバントの非存在下で得られるであろう免疫応答と比較して）投与された抗原もしくは免疫原に対する被験体の免疫応答を増加または向上させる化合物あるいは物質を意味する。これは、癌治療との関連において、癌が再発する危険性を低下させるために一次治療後に行われる付加的な治療として、米国国立衛生研究所の国立癌研究所（the National Cancer Institute of the United States Institutes of Health）によって定義される、「アジュバント療法（adjuvant therapy）」とは区別されるべきである。
【００５１】
本明細書において用いられる場合、「感受性癌」は、任意の適切な方法を用いて評価して、MAGEA3タンパク質の発現について陽性の癌である。例えば、Trefzerら、Melanoma Research, 20 (eSupplement A):e34-e35 (June 2010)を参照されたい。
【００５２】
本発明における使用に適した免疫療法薬は、MAGE-A3特異的免疫応答を引き起こすことができるもの（「MAGEA3免疫療法薬」）である。その免疫療法薬は、MAGEA3遺伝子産物由来の少なくとも１つのエピトープを含むMAGEA3抗原を含有するであろう。このようなエピトープは、ペプチド抗原として存在しうる。あるいは、より大きなタンパク質断片または完全長MAGEA3が使用されうる。しかし、MAGEA3抗原は、適切に提示された場合、MAGE-A3特異的免疫応答を引き起こすことができなければならない。MAGEA3タンパク質、ペプチドまたは断片は、融合パートナーと結合することによって融合タンパク質を提供しうる。
【００５３】
MAGE-A3抗原および融合パートナーは、化学的にコンジュゲートされてもよく、または組換え融合タンパク質として発現されてもよい。抗原および融合パートナーが組換え融合タンパク質として発現される実施形態では、非融合抗原と比較して、発現系で産生されるレベルの増加が可能となりうる。従って、融合パートナーは、ヒトによって認識されるTヘルパーエピトープなどの、Tヘルパーエピトープの提供を補助し（免疫学的融合パートナー）、および／または、天然型の組換えタンパク質より高い収量でタンパク質を発現することを補助しうる（発現エンハンサー）。１つの実施形態では、融合パートナーは、免疫学的融合パートナーと発現促進パートナーとの両方でありうる。
【００５４】
本発明の１つの実施形態では、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性細菌、Haemophilus influenza Bの表面タンパク質であるプロテインD (WO91/18926)またはその誘導体に由来する。プロテインDは、18残基の長さのシグナル配列を有する前駆体として合成され；プロセシングされていないプロテインDのアミノ酸位置19のシステイン残基は、シグナル配列の切断後、アミノ末端になる（Jansonら、Infection & Immunology 60(4):1336-42 (1992)）。１つの実施形態では、プロテインDまたはその断片は脂質付加されうる。
【００５５】
１つの実施形態では、プロテインD誘導体は、プロセシングされたタンパク質の最初の約1/3、具体的には、最初の109〜112アミノ酸のようなN-末端の最初の約100-120アミノ酸、より具体的には最初の109アミノ酸（またはその108アミノ酸）を含む。１つの実施形態では、プロテインD誘導体は、プロセシングされたプロテインDのアミノ酸20〜127を含みうる。リポタンパク質D融合パートナーの最初の109残基は、付加的な外因性T細胞エピトープを提供し、大腸菌（Escherichia coli）での発現レベルを増加させうる（従って、免疫学的融合パートナーおよび発現エンハンサーの双方として機能する）。１つの実施形態では、プロテインDの上記の部分は更に、18アミノ酸のシグナル配列を含む。従って、免疫療法融合タンパク質は、MAGEA3抗原、またはその免疫原性断片のN-末端に融合された、本明細書に記載されるようなプロテインDのN-末端部分を含みうる。プロテインDおよびMAGEA3抗原のN-末端の融合は、MAGEA3抗原がプロテインDの切断されたC-末端断片に置き換わり、プロテインDのN-末端が融合タンパク質のN-末端となるように起こりうる。
【００５６】
他の融合パートナーは、プロテインDに代わって、またはそれに加えて、本明細書に記載されるような治療用融合タンパク質に使用されうる。このような融合パートナーの１つは、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質、NS1（血球凝集素）であり；通常、N末端の81アミノ酸が使用されるが、Tヘルパーエピトープを含むならば異なる断片が使用されてもよい。
【００５７】
別の実施形態では、免疫学的融合パートナーは、LytAとして知られているタンパク質である。LytAは、N-アセチル-L-アラニンアミダーゼを合成する肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）に由来し、（LytA遺伝子によってコードされる{Garciaら、Gene, 43 (1986) page 265-272}）アミダーゼLytAは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶菌酵素である。LytAタンパク質のC-末端ドメインは、コリンまたはDEAEのようないくつかのコリン類似体への親和性に関与している。この特性は、融合タンパク質の発現に有用なE. coliのC-LytA発現プラスミドの作製に利用されている。そのアミノ末端にC-LytA断片を有するハイブリッドタンパク質の精製が記載されている（Ortegaら、Biotechnology: 10, (1992) page 795-798）。１つの実施形態では、その分子のC末端部分が使用されうる。その実施形態は、残基178から始まるC末端で見出されるLytA分子の反復部分を利用しうる。１つの実施形態では、LytA部分は残基188〜305を含みうる。
【００５８】
本発明で使用するための免疫療法融合タンパク質は、例えば、5個から9個の、例えば6〜7個のヒスチジン残基を含むヒスチジンテールのような、親和性タグを含みうる。これらの残基は、例えば、プロテインDの末端部分（プロテインDのN-末端など）にあってもよく、および／または、MAGEA3抗原の末端部分に融合されてもよい。しかし通常は、ヒスチジンテールは、例えば抗原のC-末端など、抗原の末端部分に位置する。ヒスチジンテールは、精製の補助に有益である。
【００５９】
本発明において有用なMAGE-A3およびその融合タンパク質は、WO99/40188；EP1053325；EP1659178に記載されている。外科手術、化学療法および／または放射線療法などの他の抗癌治療と併用したMAGE-A3免疫療法薬の使用は、WO2008/084040に記載されている。本発明の１つの実施形態では、免疫療法薬はプロテインDおよびMAGE-A3の融合タンパク質を含み、そこで融合タンパク質は、プロセシングされていないプロテインDの最初の約127アミノ酸、または厳密に最初の127アミノ酸を含む（プロテインDのアミノ酸K-2およびL-3は、アミノ酸D-2およびP-3によって置換されている、もしくは置換されていない。下記を参照；この番号付けは、18アミノ酸のシグナル配列を含むプロテインDのアミノ酸配列に対する）。１つの実施形態では、プロテインD-MAGE-A3融合タンパク質は、プロテインDの18アミノ酸シグナル配列を含まない。融合タンパク質は、プロテインD配列および／またはMAGE-A3配列の前に1〜2個のリンカーアミノ酸を含みうる。融合タンパク質は更に、任意でヒスチジンテール、例えば7個のヒスチジン残基を含んでもよく、更に、MAGE-3配列とヒスチジンテールとの間に1〜2個のリンカーアミノ酸を含んでもよい。このようなプロテインD-MAGE-A3融合タンパク質の１つは、下記の配列を有し（配列番号２）；この構築物は、本明細書においてrecMAGEA3と呼ばれる：
2015503503.tif 000005
配列番号２において、最初の127アミノ酸は、初めの18アミノ酸シグナル配列を含み、残基2-3に置換されたAsp-Proを有するプロテインDであり；残基128-129でのMet-Aspは、プロテインD配列とMAGE-A3配列との間にあり；残基130-441は、MAGE-A3の312アミノ酸であり；残基442-443のGly-Glyは、MAGE-A3配列と7個のヒスチジンテールとの間に置かれる。例えば、WO 99/40188；EP1053325；およびEP1659178を参照されたい。あるいは、recMAGEA3のアミノ酸128-441は、２番目のアミノ酸位置に置換されたAspを有する完全長の（314アミノ酸）MAGE-A3と記載することもできる。
【００６０】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）recMAGEA3、および
（ii）化合物A
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００６１】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）recMAGEA3、および
（ii）化合物B
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００６２】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）recMAGEA3、
（ii）化合物A、および
（iii）化合物B
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００６３】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性黒色腫を治療する方法であって、
（i）recMAGEA3、および
（ii）化合物A
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００６４】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性黒色腫を治療する方法であって、
（i）recMAGEA3、および
（ii）化合物B
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００６５】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性黒色腫を治療する方法であって、
（i）recMAGEA3、
（ii）化合物A、および
（iii）化合物B
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００６６】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）recMAGEA3、および
（ii）N-{3-[5-(2-アミノ-4-ピリミジニル)-2-(1,1-ジメチルエチル)-1,3-チアゾール-4-イル]-2-フルオロフェニル}-2,6-ジフルオロベンゼンスルホンアミドメタンスルホン酸塩
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００６７】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）recMAGEA3、および
（ii）N-{3-[3-シクロプロピル-5-(2-フルオロ-4-ヨード-フェニルアミノ)6,8-ジメチル;-2,4,7-トリオキソ-3,4,6,7-テトラヒドロ-2H-ピリド [4,3-d]ピリミジン-1-イル]フェニル}アセトアミドジメチルスルホキシド
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００６８】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）recMAGEA3、
（ii）N-{3-[5-(2-アミノ-4-ピリミジニル)-2-(1,1-ジメチルエチル)-1,3-チアゾール-4-イル]-2-フルオロフェニル}-2,6-ジフルオロベンゼンスルホンアミドメタンスルホン酸塩、および
（iii）N-{3-[3-シクロプロピル-5-(2-フルオロ-4-ヨード-フェニルアミノ)6,8-ジメチル;-2,4,7-トリオキソ-3,4,6,7-テトラヒドロ-2H-ピリド [4,3-d]ピリミジン-1-イル]フェニル}アセトアミドジメチルスルホキシド
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００６９】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）recMAGEA3、および
（ii）製薬上許容される希釈剤または担体とともに、化合物A
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００７０】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）recMAGEA3、および
（ii）製薬上許容される希釈剤または担体とともに、化合物B
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００７１】
本発明の別の態様では、治療を必要とするヒトにおいて感受性癌を治療する方法であって、
（i）recMAGEA3、
（ii）製薬上許容される希釈剤または担体とともに、化合物A、および
（iii）製薬上許容される希釈剤または担体とともに、化合物B
を含有する組合せを投与することを含む、上記方法が提供される。
【００７２】
別の態様では、
（i）recMAGEA3および
（ii）ヒトにおける感受性癌の治療のための、化合物A
を含有する組合せの使用が提供される。
【００７３】
別の態様では、
（i）recMAGEA3および
（ii）ヒトにおける感受性癌の治療のための、化合物B
を含有する組合せの使用が提供される。
【００７４】
別の態様では、
（i）recMAGEA3
（ii）化合物A、および
（iii）ヒトにおける感受性癌の治療のための、化合物B
を含有する組合せの使用が提供される。
【００７５】
本発明の１つの実施形態では、MAGE-A3タンパク質は、誘導体化された遊離チオールを含みうる。このような抗原およびそれらの作製方法は、WO99/40188に記載されている。詳細には、カルボキシアミド化（carboxyamidated）またはカルボキシメチル化（carboxymethylated）誘導体が使用されうる。
【００７６】
Kruitら、Immunization with recombinant MAGE-A3 protein combined with adjuvant systems AS15 or AS02B in patients with unresectable and progressive metastatic cutaneous melanoma: A randomized open-label phase II study of the EORTC Melanoma Group (16032- 18031),  ASCO Meeting Abstracts 2008 J. Clinical Oncology 26(May 20 Suppl; Abstract 9065) (2008)もまた参照されたい。
【００７７】
あるいは、免疫療法タンパク質をコードしているDNAを含むベクターが投与されうる。免疫応答は、コードDNAを有するベクターに対して生じうるため、従って、全般的な免疫応答が促進されうる（すなわち、ベクターは、それ自体アジュバントとして機能している）。免疫療法は、例えば、プライムブースト法として投与されうる。
【００７８】
従って、本発明は、MAGE-A3を発現している癌、例えば、黒色腫、乳癌、膀胱癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、結腸癌、食道および頭頸部扁平上皮癌などを有するヒト被験体を治療するために使用されうる。
【００７９】
BRAF阻害剤
本明細書において用いられる場合、BRaf阻害剤N-{3-[5-(2-アミノ-4-ピリミジニル)-2-(1,1-ジメチルエチル)-1,3-チアゾール-4-イル]-2-フルオロフェニル}-2,6-ジフルオロベンゼンスルホンアミドまたは製薬上許容されるその塩は、下記の化学式（I）：
【化３】
2015503503.tif 000006
【００８０】
または製薬上許容されるその塩によって表される。便宜上、可能な化合物および塩の群を化合物Aと総称する。化合物Aへの言及は、選択肢中の任意の化合物または製薬上許容されるその塩を指すことを意味する。
【００８１】
化合物Aは、製薬上許容されるその塩とともに、特に癌の治療において、BRaf活性の阻害剤として有用なものとして、PCT特許出願PCT/US09/42682において記載され、その権利が主張されている。化合物Aは、その出願の実施例58a〜58eに記載されている。そのPCT出願は、国際公開WO2009/137391として2009年11月12日に公開されており、参照によりこれを本明細書に組み入れる。
【００８２】
通常、本発明の塩は、製薬上許容される塩である。「製薬上許容される塩」という用語の中に含まれる塩は、本発明の化合物の毒性のない塩を指す。本発明の化合物の塩は、本発明の化合物の置換基上の窒素から誘導される酸付加塩を含みうる。代表的な塩は、下記の塩を含む：酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム塩、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クラブラン酸塩、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストラート塩、エシラート塩（esylate）、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩（hexylresorcinate）、ヒドラバミン塩（hydrabamine）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩（mesylate）、臭化メチル塩（methylbromide）、硝酸メチル塩（methylnitrate）、硫酸メチル塩（methylnitrate）、マレイン酸一カリウム塩（monopotassium maleate）、ムチン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、N-メチルグルカミン塩、シュウ酸塩、パモ酸（エンボン酸）塩、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、カリウム塩、サリチル酸塩、ナトリウム塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシラート塩（tosylate）、トリエチオダイド塩、トリメチルアンモニウム塩および吉草酸塩である。製薬上許容されない他の塩は、本発明の化合物の調製において有用な場合があり、これらは本発明の更なる態様を形成する。塩は当業者によって容易に調製されうる。
【００８３】
化合物Aは、溶媒和物として与えられうる。本明細書において用いられる場合、「溶媒和物」という用語は、溶質（本発明では、化学式（I）の化合物またはその塩）および溶媒によって形成される種々の化学量論（variable stoichiometry）の複合体を指す。本発明のためのこのような溶媒は、溶質の生物学的活性を妨げてはならない。適切な溶媒の例は、水、メタノール、ジメチルスルホキシド、エタノールおよび酢酸を含むが、それらに限定されない。１つの実施形態では、使用される溶媒は、製薬上許容される溶媒である。
【００８４】
医薬組成物は、単位用量あたり事前に定められた量の活性成分を含有する単位投与剤型で与えられうる。当業者に知られているように、用量あたりの活性成分の量は、治療されている症状、投与経路および患者の年齢、体重および状態に依存する。好ましい単位投与組成物は、活性成分の1日用量もしくは副用量（sub-dose）、または適切なその分割量を含有するものである。更に、このような医薬組成物は、薬学技術分野において周知の任意の方法によって調製されうる。より詳細な投与方法は、PCT公開WO2009/137391に記載されている。
【００８５】
適切には、本発明の組合せの一部として投与される化合物Aの量（塩ではなく／溶媒和物ではない量の重量に基づく）は、約10mg〜約600mgより選択される量である。適切には、その量は、約30mg〜約300mgより選択され；適切には、その量は、約30mg〜約280mgより選択され；適切には、その量は、約40mg〜約260mgより選択され；適切には、その量は、約60mg〜約240mgより選択され；適切には、その量は、約80mg〜約220mgより選択され；適切には、その量は、約90mg〜約210mgより選択され；適切には、その量は、約100mg〜約200mgより選択され、適切には、その量は、約110mg〜約190mgより選択され、適切には、その量は、約120mg〜約180mgより選択され、適切には、その量は、約130mg〜約170mgより選択され、適切には、その量は、約140mg〜約160mgより選択され、適切には、その量は、150mgである。従って、本発明の組合せの一部として投与される化合物Aの量は、約10 mg〜約300mgより選択される量である。例えば、本発明の組合せの一部として投与される化合物Aの量は、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、275mg、280mg、285mg、290mg、295mgおよび300mgより適切に選択される。適切には、選択された量の化合物Aは、1日に1〜4回投与される。適切には、選択された量の化合物Aは、1日2回投与される。適切には、化合物Aは、150mgの量で1日2回投与される。適切には、選択された量の化合物Aは、1日1回投与される。
【００８６】
MEK阻害剤
本明細書において用いられる場合、MEK阻害剤N-{3-[3-シクロプロピル-5-(2-フルオロ-4-ヨード-フェニルアミノ)6,8-ジメチル;-2,4,7-トリオキソ-3,4,6,7-テトラヒドロ-2H-ピリド [4,3-d]ピリミジン-1-イル]フェニル}アセトアミドまたは製薬上許容されるその塩もしくは溶媒和物は、下記の構造（I）の化合物：
【化４】
2015503503.tif 000007
【００８７】
または製薬上許容されるその塩もしくは溶媒和物によって表される。便宜上、考えられる化合物ならびに／または塩および／もしくは溶媒和物の群は、化合物Bと総称され、化合物Bという呼び方は、選択肢の中で任意の化合物ならびに／または製薬上許容されるその塩および／もしくは溶媒和物を指すことを意味する。
【００８８】
化合物Bは、製薬上許容されるその塩および溶媒和物とともに、特に癌の治療において、MEK活性の阻害剤として有用なものとして、2005年6月10日の国際出願日；国際公開番号WO 2005/121142および2005年12月22日の国際公開日を有する国際出願番号PCT/JP2005/011082に記載され、その権利が主張されており、その開示全体は参照により本明細書に組み入れられる。化合物Bは実施例4-1の化合物である。化合物Bは、国際出願番号PCT/JP2005/011082に記載されるように調製され得る。化合物Bは、2006年1月19日に公開された米国特許公開番号US 2006/0014768に記載されるように調製されることができ、その開示全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【００８９】
適切には、化合物Bは、ジメチルスルホキシド溶媒和物の形である。適切には、化合物Bは、ナトリウム塩の形である。適切には、化合物Bは、下記より選択される溶媒和物の形である：水和物、酢酸、エタノール、ニトロメタン、クロロベンゼン、1-ペンタノール （1-pentanci）、イソプロピルアルコール、エチレングリコールおよび3-メチル-1-ブタノールの溶媒和物。これらの溶媒和物および塩の形態は、国際出願番号PCT/JP2005/011082または米国特許公開番号US 2006/0014768における記載から、当業者によって調製され得る。
【００９０】
通常、本発明の塩は、製薬上許容される塩である。「製薬上許容される塩」という用語の中に含まれる塩は、本発明の化合物の毒性のない塩を指す。本発明の化合物の塩は、本発明の化合物の置換基上の窒素から誘導される酸付加塩を含みうる。製薬上許容されない他の塩は、本発明の化合物の調製において有用な場合があり、これらは本発明の更なる態様を形成する。塩は当業者によって容易に調製されうる。
【００９１】
化合物Bは、溶媒和物として与えられうる。本明細書において用いられる場合、「溶媒和物」という用語は、溶質（本発明では、構造（I）の化合物またはその塩）および溶媒によって形成される種々の化学量論の複合体を指す。本発明のためのこのような溶媒は、溶質の生物学的活性を妨げてはならない。適切な溶媒の例は、水、メタノール、ジメチルスルホキシド、エタノールおよび酢酸を含むが、それらに限定されない。１つの実施形態では、使用される溶媒は、製薬上許容される溶媒である。
【００９２】
医薬組成物は、単位用量あたり事前に定められた量の活性成分を含有する単位投与剤型で与えられうる。当業者に知られているように、用量あたりの活性成分の量は、治療されている症状、投与経路および患者の年齢、体重および状態に依存する。好ましい単位投与組成物は、活性成分の1日用量もしくは副用量（sub-dose）、または適切なその分割量を含有するものである。更に、このような医薬組成物は、薬学技術分野において周知の任意の方法によって調製されうる。より詳細な投与方法は、米国特許公開番号US 2006/0014768に記載されている。
【００９３】
適切には、本発明の組合せの一部として投与される化合物Bの量（塩ではなく／溶媒和物ではない量の重量に基づく）は、約0.125mg〜約10mgより選択される量であり；適切には、その量は、約0.25mg〜約9mgより選択され；適切には、その量は、約0.25mg〜約8mgより選択され；適切には、その量は、約0.5mg〜約8mgより選択され；適切には、その量は、約0.5mg〜約7mgより選択され；適切には、その量は、約1mg〜約7mgより選択され；適切には、その量は、約5mgである。従って、本発明の組合せの一部として投与される化合物Bの量は、約0.125mg〜約10 mgより選択される量である。例えば、本発明の組合せの一部として投与される化合物Bの量は、0.125mg、0.25mg、0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg、5mg、5.5mg、6mg、6.5mg、7mg、7.5mg、8mg、8.5mg、9mg、9.5mg、10mgであり得る。適切には、選択された量の化合物Bは、1日に1〜4回投与される。適切には、選択された量の化合物Bは、1日2回投与される。適切には、選択された量の化合物Bは、1日1回投与される。
【００９４】
治療方法
本発明の組合せは、B-Rafおよび／またはMEK活性の阻害ならびにMAGEA3に対する特異的免疫応答の上昇が有効である疾患において効用を有すると考えられる。従って、本発明はまた、治療において、特に、B-Rafおよび／またはMEK活性の阻害ならびにMAGEA3に対する特異的免疫応答の上昇が有効である疾患、特に癌の治療において使用するための、本発明の組合せを提供する。
【００９５】
本発明の更なる態様は、B-Rafおよび／またはMEK活性の阻害ならびにMAGEA3に対する特異的免疫応答の誘導が有効である疾患を治療する方法を提供し、その方法は、本発明の組合せを投与することを含む。
【００９６】
本発明の更なる態様は、B-Rafおよび／またはMEK活性の阻害ならびにMAGEA3に対する特異的免疫応答の誘導が有効である疾患を治療するための薬剤の製造における、本発明の組合せの使用を提供する。
【００９７】
本明細書において用いられる場合、「併用投与または同時投与」は、治療成分が体内に同時に導入されるような、または、最初に投与された治療が、後続の治療が投与される時点で、まだ被験体の系内にある（まだ代謝、排出などされていない）時間的に十分近いような、２つ（以上）の治療の投与を指す。投与は、異なる経路によってでもよい。本明細書において用いられる場合、併用して（concurrently）および同時に（concomitantly）という用語は、置き換えが可能である。
【００９８】
本明細書において用いられる場合、「治療への応答」とは、抗癌治療への応答が当技術分野において既知であり認められているような任意の方法で測定されうることを意味し、下記の腫瘍の応答が含まれる（腫瘍の完全な退縮（完全寛解）、腫瘍のサイズもしくは体積の減少（部分寛解）；明らかな腫瘍の増殖もしくは進行がない（安定した疾患）、または混合的な応答（一部の腫瘍は退縮もしくは安定化するが他はそうではない））。あるいは、抗癌治療の効果は、下記の患者によって、例えば、生存期間、または疾患進行時間（無病生存期間）を測定し比較することによって、評価されうる。いずれの応答の評価も、その治療を受けなかった個体、または代替治療を受けた個体と比較されうる。
【００９９】
MAGE-A3免疫療法薬については、治療への応答は、治療されるべきヒト内での遺伝子シグネチャーの検出によって予測されうる。WO2010/029174；WO2009/068621；およびWO2007/140958は、治療前に、腫瘍微小環境内の特定の遺伝子（多くの免疫関連遺伝子を含む）の発現レベルまたは発現の差異を検出することによって、免疫療法薬を用いた治療への応答者または非応答者として被験体を分類する方法を記載する。応答者として分類される被験体は、MAGEA3免疫療法のような免疫に基づく療法による治療に応答する可能性が高い。１つの実施形態では、このような方法は、黒色腫を有する被験体のrecMAGEA3を用いた治療を検討する際に有用である。例えば、Louahedら、Expression of defined genes identified by pretreatment tumor profiling: Association with clinical responses to the GSK MAGE-A3 immunotherapeutic in metastatic melanoma patients (EORTC 16032-18031), ASCO Meeting Abstracts 2008,  J. Clinical Oncology 26(May 20 Suppl; Abstract 9045) (2008)を参照されたい。
【０１００】
本発明の組合せは、B-Rafおよび／またはMEK活性の阻害ならびにMAGEA3に対する特異的免疫応答の誘導が有益な効果を有するような癌の治療における使用に適している。本発明の組合せによる治療に適した癌の例は、原発性と転移型との両方の頭頸部癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、結腸癌、卵巣癌、および前立腺癌を含むが、それらに限定されない。適切には、癌は、下記より選択される。すなわち、脳腫瘍（神経膠腫）、膠芽細胞腫、星状細胞腫、多形性膠芽腫、Bannayan-Zonana症候群、カウデン病、レルミット・ダクロス病、乳癌、炎症性乳癌、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、上衣腫、髄芽腫、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、骨肉腫、骨巨細胞腫、甲状腺癌、リンパ芽球性T細胞白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、AML、慢性好中球性白血病、急性リンパ芽球性T細胞白血病、形質細胞腫、免疫芽球性大細胞型白血病、マントル細胞白血病、多発性骨髄腫、巨核芽球性白血病、多発性骨髄腫、急性巨核球性白血病、前骨髄球性白血病、赤白血病、悪性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、T細胞性リンパ芽球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、神経芽細胞腫、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、外陰癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、中皮腫、食道癌、唾液腺癌、肝細胞癌、胃癌、鼻咽頭癌、口腔癌（buccal cancer, cancer of the mouth）、GIST（消化管間質腫瘍）および精巣癌。
【０１０１】
加えて、治療される癌の例は、バレット腺癌；胆道癌；乳癌；子宮頸癌；胆管癌；膠芽細胞腫、星状細胞腫（例えば、多形性膠芽腫）および上衣腫などの原発性CNS腫瘍、ならびに二次性CNS腫瘍（すなわち、中枢神経系外に由来する腫瘍の中枢神経系への転移）などの中枢神経系腫瘍；大腸の結腸癌などの結腸直腸癌；胃癌；頭頸部の扁平上皮癌などの頭頸部の癌；急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病（AML）、骨髄異形成症候群、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、巨核芽球性白血病、多発性骨髄腫および赤白血病などの白血病ならびにリンパ腫を含む血液癌；肝細胞癌；小細胞肺癌および非小細胞肺癌などの肺癌；卵巣癌；子宮内膜癌；膵臓癌；下垂体腺癌；前立腺癌；腎臓癌；肉腫；黒色腫などの皮膚癌；ならびに甲状腺癌を含む。
【０１０２】
適切には、本発明は、BRAF V600-突然変異、MAGE-A3陽性の腫瘍、例えば、BRAF V600-突然変異、MAGE-A3陽性の脳腫瘍（神経膠腫）、膠芽細胞腫、Bannayan-Zonana症候群、カウデン病、レルミット・ダクロス病、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫および甲状腺癌などより選択される癌を治療する、またはその重症度を軽減する方法に関する。
【０１０３】
加えて、本発明は、BRAF V600E-突然変異、MAGE-A3陽性の腫瘍、例えば、BRAF V600E-突然変異、MAGE-A3陽性の脳腫瘍（神経膠腫）、膠芽細胞腫、Bannayan-Zonana症候群、カウデン病、レルミット・ダクロス病、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫および甲状腺癌などより選択される癌を治療する、またはその重症度を軽減する方法に関する。
【０１０４】
適切には、本発明は、黒色腫、詳細には、BRAF V600-突然変異、MAGE-A3陽性の黒色腫、より詳細には、BRAF V600E-突然変異、MAGE-A3陽性の黒色腫を治療する、またはその重症度を軽減する方法に関する。
【０１０５】
他に定義されないかぎり、本明細書に記載されるすべての投与プロトコールにおいて、併用されるB-Rafおよび／またはMEK阻害剤化合物ならびにMAGEA3免疫療法薬の投薬計画は、治療の開始と同時に始める必要はなく、治療の終了とともに終わる必要はない。ただ、治療の間のある時点で、B-Rafおよび／またはMEK阻害剤とMAGEA3免疫療法薬との両方が、同じ日に投与される必要がある。B-Raf阻害剤は1日1回の用量で投与されうるが、MAGEA3免疫療法薬の投与は、数週間の間隔で行われ、数か月毎に追加投与が行われうる。（例えば、WO2007/137986参照）。
【０１０６】
本明細書において用いられる場合、「新生物」という用語は、細胞または組織の異常増殖を指し、良性、すなわち非癌性増殖、および悪性、すなわち癌性増殖を含むことが理解される。「新生物の（neoplastic）」という用語は、「新生物の」または「新生物に関する」、を意味する。
【０１０７】
本明細書において用いられる場合、「薬剤（agent）」という用語は、組織、系、動物、哺乳動物、ヒト、または他の被験体において望ましい効果をもたらす物質を意味すると理解される。従って、「抗新生物薬（anti-neoplastic agent）」という用語は、組織、系、動物、哺乳動物、ヒト、または他の被験体において抗新生物効果をもたらす物質を意味すると理解される。「薬剤」は、単一の化合物、単一の抗原、または２つ以上の化合物もしくは抗原の組合せもしくは組成物でありうることもまた、理解されるべきである。
【０１０８】
本明細書において用いられる場合、「治療」という用語およびその派生語は、治療的療法（therapeutic therapy）を意味する。特定の疾患に関して、治療とは、下記を意味する。すなわち、（1）疾患または疾患の1つ以上の生物学的兆候を改善すること、（2）（a）疾患または（b）疾患の1つ以上の生物学的兆候を引き起こすもしくはその原因となる、生物学的カスケードにおける1つ以上の点を妨げること、（3）1つ以上の症状、疾患もしくは1つ以上の症状と関連した作用または副作用、疾患もしくはその治療と関連した作用または副作用、を軽減すること、あるいは（4）疾患または疾患の1つ以上の生物学的兆候の進行を遅らせること。
【０１０９】
本明細書において用いられる場合、「予防」は、疾患もしくはその生物学的兆候の可能性もしくは重症度を実質的に減少させるため、またはこのような疾患もしくはその生物学的兆候の発症を遅らせるための、薬物の予防的投与を指すと理解される。当業者は、「予防」が絶対的な用語ではないことを理解するであろう。予防的治療は、例えば、被験体が癌の強い家族歴を有する場合、または被験体が発癌物質に曝された場合など、被験体が癌を発症する危険性が高いと考えられる場合に適している。
【０１１０】
本明細書において用いられる場合、「有効な量」という用語は、例えば、研究者もしくは臨床医によって探求されている組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答を引き起こす薬物あるいは医薬品の量を意味する。更に、「治療上有効な量」という用語は、このような量を与えられなかった対応する被験体と比較して、疾患、障害、もしくは副作用の改善された治療、回復、予防、もしくは改善、または疾患もしくは障害の進行速度の減少をもたらす、任意の量を意味する。この用語はまた、その範囲内に、正常な生理的機能を向上させるために有効な量を含む。
【０１１１】
化合物Aおよび／または化合物B、ならびにMAGE-A3免疫療法薬は、併用投与または同時投与に使用されうる。従って、１つの実施形態では、1回以上の用量の化合物Aが、1回以上の用量のMAGE-A3融合タンパク質と同時に、または別々に投与される。
【０１１２】
「負荷用量」という用語は、本明細書において用いられる場合、例えば、薬物の血中濃度レベルを急速に上昇させるための、被験体に投与される維持用量より高い用量を有する化合物A、化合物B、および／またはMAGE-A3免疫療法薬の単回投与または短期間の投薬計画を意味すると理解される。「維持用量」という用語は、本明細書において用いられる場合、連続的に投与される（例えば；少なくとも2回）用量を意味すると理解され、これは、化合物の血中濃度レベルを治療上有効なレベルに徐々に上昇させること、またはこのような治療上有効なレベルを維持することを目的とする。維持用量は、通常1日1回投与され、維持用量の1日用量は、負荷用量の全1日用量より低い。
【０１１３】
１つの実施形態では、本発明の方法および使用における哺乳動物はヒトである。
【０１１４】
適切には、本発明は、Raf、Ras、MEK、およびPI3K/Ptenのそれぞれについて野生型もしくは突然変異のいずれかである癌を治療するまたはその重症度を軽減する方法に関する。これは、RAFについては突然変異、RASについては野生型、MEKについては野生型、およびPI3K/PTENについては野生型の癌；RAFについては突然変異、RASについては突然変異、MEKについては野生型、およびPI3K/PTENについては野生型の癌；RAFについては突然変異、RASについては突然変異、MEKについては突然変異、およびPI3K/PTENについては野生型の癌；ならびにRAFについては突然変異、RASについては野生型、MEKについては突然変異、およびPI3K/PTENについては野生型の癌を有する患者を含むが、それらに限定されない。
【０１１５】
「野生型」という用語は、当技術分野において理解されているように、遺伝子改変されていない天然の個体群に見られるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を指す。また、当技術分野において理解されているように、「突然変異」は、それぞれ、野生型ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドにおいて見られる対応するアミノ酸または核酸と比較して、アミノ酸または核酸に少なくとも１つの変更を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を含む。最も高頻度に見られる（野生型の）核酸鎖と比較して、核酸鎖の配列中に単一塩基対の差異が存在する一塩基多型（SNP）は、突然変異という用語に含まれる。
【０１１６】
Raf、Ras、MEKについて野生型もしくは突然変異のいずれかである、またはPI3K/Ptenについて突然変異である癌は、既知の方法によって同定される。例えば、野生型または突然変異腫瘍細胞は、DNA増幅および配列決定法、それぞれノーザンブロットおよびサザンブロットを含むがそれに限定されないDNAおよびRNA検出法、ならびに／または様々なバイオチップおよびアレイ技術によって同定され得る。野生型および突然変異ポリペプチドは、ELISA、ウェスタンブロットまたは免疫細胞化学などの免疫診断技術を含むがそれらに限定されない様々な手法によって検出され得る。適切には、加ピロリン酸分解活性化重合（PAP）および／またはPCR法が使用されうる。Liu, Qら; Human Mutation 23:426-436 (2004)。
【０１１７】
示されたように、治療上有効な量の化合物Aは、上記で議論される。本発明の更なる治療薬の治療上有効な量は、例えば、哺乳動物の年齢および体重、治療を必要とする正確な症状、その症状の重症度、製剤の性質、ならびに投与経路などの、多数の要因によって決まる。最終的には、治療上有効な量は、担当医または担当獣医の裁量による。相対的な投与時期は、望ましい複合的な治療効果を達成するために選択される。
【０１１８】
組合せ
１つの実施形態では、本発明の治療方法は、開示されたBRaf阻害剤および／またはMEK阻害剤ならびにMAGE-A3免疫療法薬、ならびに少なくとも１つの更なる抗新生物薬の投与を含む。
【０１１９】
通常、治療されている感受性腫瘍に対して活性を有する任意の抗新生物薬は、本発明の癌の治療において同時投与されうる。このような薬剤の例は、V.T. DevitaおよびS. Hellman（編）によるCancer Principles and Practice of Oncology、第６版 (2001年2月15日)、Lippincott Williams & Wilkins Publishersにおいて見ることができる。上記で議論されたBRafおよびMEK阻害剤との組合せに有用な、代表的な抗新生物薬は、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイドなどの微小管阻害剤；白金錯体；ナイトロジェンマスタード、オキサザホスホリン、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、およびトリアゼンなどのアルキル化剤；アントラサイクリン、アクチノマイシンおよびブレオマイシンなどの抗生物質；エピポドフィロトキシンなどのトポイソメラーゼII阻害剤；プリンおよびピリミジン類似体ならびに抗葉酸化合物などの代謝拮抗剤；カンプトテシンなどのトポイソメラーゼI阻害剤；ホルモンおよびホルモン類似体；シグナル伝達経路阻害剤；受容体チロシンキナーゼ阻害剤；セリン・トレオニンキナーゼ阻害剤；非受容体チロシンキナーゼ阻害剤；血管新生阻害剤；免疫療法薬；アポトーシス促進剤；ならびに細胞周期シグナル伝達阻害剤を含むが、それらに限定されない。
【０１２０】
ジテルペノイドおよびビンカアルカロイドなどの微小管阻害剤または抗有糸分裂剤（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンなど）；パクリタキセル（TAXOL（登録商標））およびその類似体ドセタキセルなどのジテルペノイド；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金錯体；シクロホスファミド、メルファラン、およびクロラムブシルなどのアルキル化剤；ブスルファンなどのスルホン酸アルキル；カルムスチンなどのニトロソウレア；ならびにダカルバジンなどのトリアゼン。
【０１２１】
本発明とともに使用されうる更なる抗新生物薬は、抗生物質性抗新生物薬、例えば、ダクチノマイシンのようなアクチノマイシン、ダウノルビシンおよびドキソルビシンのようなアントラサイクリン、ならびにブレオマイシンなど；トポイソメラーゼII阻害剤、例えば、エトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシンなどを含む。
【０１２２】
本発明とともに使用されうる更なる抗新生物薬は、代謝拮抗性抗新生物薬、例えば、フルオロウラシル（5-フルオロ-2,4- (1H,3H) ピリミジンジオン、5-フルオロデオキシウリジン（フロクスウリジン）および5-フルオロデオキシウリジン一リン酸）、メトトレキサート、シタラビン、メルカプトプリン（PURINETHOL（登録商標））、チオグアニン（TABLOID（登録商標））、ならびにゲムシタビン（GEMZAR（登録商標））などを含む。
【０１２３】
本発明とともに使用されうる更なる抗新生物薬は、トポイソメラーゼI阻害剤として利用可能な、または開発中のカンプトテシンならびにカンプトテシン誘導体を含む、例えば、イリノテカン、トポテカン、および様々な光学型の7-(4-メチルピペラジノ-メチレン)-10,11-エチレンジオキシ-20-カンプトテシン；イリノテカン塩酸塩（CAMPTOSAR（登録商標））；イリノテカン；およびトポテカン塩酸塩（HYCAMTIN（登録商標））などのカンプトテシン類を含む。
【０１２４】
本発明とともに使用されうる更なる抗新生物薬は、リツキシマブ（RITUXAN（登録商標）およびMABTHERA（登録商標））；オファツムマブ（ARZERRA（登録商標））；ラパマイシンおよびラパログ（rapalogs） を含むがそれらに限定されないmTOR阻害剤、RAD001またはエベロリムス（Afinitor）、CCI-779またはテムシロリムス、AP23573、AZD8055、WYE-354、WYE-600、WYE-687およびPp121；ベキサロテン（Targretin（登録商標））；ならびにソラフェニブ（Nexavar（登録商標））を含む。
【０１２５】
本発明の組合せは、癌の治療に有用なホルモンと組み合わせて使用されうる。癌治療に有用なホルモンおよびホルモン類似体の例は、プレドニゾンおよびプレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド；アナストロゾール、レトロゾール（letrazole）、ボロゾール（vorazole）、およびエキセメスタンなどのアミノグルテチミドおよび他のアロマターゼ阻害剤；酢酸メゲストロールなどのプロゲストリン；エストロゲン、アンドロゲン、ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロンのような抗アンドロゲン、ならびにフィナステリドおよびデュタステリドなどの5α-レダクターゼ；タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェンなどの抗エストロゲン、ならびに米国特許第5,681,835号、第5,877,219号、および第6,207,716号に記載されるものなどの選択的エストロゲン受容体モジュレーター（SERMS）；ならびに、前立腺癌の治療のために黄体形成ホルモン（LH）および/または卵胞刺激ホルモン（FSH）の放出を促進する、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）およびその類似体、例えば、酢酸ゴセレリンおよびロイプロリド（luprolide）などのLHRHアゴニストおよびアンタゴニストを含むがそれらに限定されない。
【０１２６】
本発明の組合せは、シグナル伝達経路阻害剤、例えば、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ、SH2/SH3ドメイン遮断薬、セリン・トレオニンキナーゼ、ホスファチジルイノシトール-3キナーゼ、ミオイノシトールシグナル伝達、ならびに、Rasがん遺伝子、例えば、上皮増殖因子受容体（EGFr）、血小板由来増殖因子受容体（PDGFr）、erbB2、erbB4、ret、血管内皮増殖因子受容体（VEGFr）、免疫グロブリン様ドメインおよび上皮増殖因子相同ドメインを有するチロシンキナーゼ（TIE-2）、インスリン様増殖因子-I（IGFI）受容体、マクロファージコロニー刺激因子（cfms）、BTK、ckit、cmet、繊維芽細胞増殖因子（FGF）受容体、Trk受容体（TrkA、TrkB、およびTrkC）、エフリン（eph）受容体、およびRETがん原遺伝子を含む増殖因子受容体などの阻害剤と、更に組み合わせて使用されうる。典型的なシグナル伝達経路阻害剤は、ラパチニブ（Tykerb/Tyverb（登録商標））、EGFR/ErbB2二重阻害剤である。
【０１２７】
増殖因子受容体キナーゼではないチロシンキナーゼは、非受容体チロシンキナーゼと呼ばれる。抗癌薬の標的または潜在的標的である、本発明に有用な非受容体チロシンキナーゼには、cSrc、Lck、Fyn、Yes、Jak、cAbl、FAK（焦点接着キナーゼ）、ブルトン(Bruton）型チロシンキナーゼおよびBcr-Ablが含まれる。このような非受容体キナーゼおよび非受容体チロシンキナーゼ機能を阻害する薬剤は、Sinh, S.およびCorey, S.J., (1999) Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research 8 (5): 465-80；ならびにBolen, J.B., Brugge, J.S., (1997) Annual review of Immunology. 15: 371-404に記載されている。
【０１２８】
SH2/SH3ドメイン遮断薬は、SH2またはSH3ドメインが、PI3-K p85サブユニット、Srcファミリーキナーゼ、アダプター分子（Shc、Crk、Nck、Grb2）およびRas-GAPなどの様々な酵素またはアダプタータンパク質に結合することを妨げる薬剤である。抗癌薬の標的としてのSH2/SH3ドメインは、Smithgall, T.E. (1995), Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 34(3) 125-32において議論されている。
【０１２９】
セリン・トレオニンキナーゼの阻害剤は、Rafキナーゼ（rafk）、分裂促進因子または細胞外調節キナーゼMitogen or Extracellular Regulated Kinase（MEK）、および細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）の遮断薬を含むMAPキナーゼカスケード遮断薬；ならびにPKCs（α、β、γ、ε、μ、λ、ι、ζ）の遮断薬などのプロテインキナーゼCファミリーメンバー遮断薬を含む。IkBキナーゼファミリー（IKKa、IKKb）、PKBファミリーキナーゼ、aktキナーゼファミリーメンバー、およびTGFβ受容体キナーゼ。このようなセリン・トレオニンキナーゼおよびその阻害剤は、Yamamoto, T., Taya, S., Kaibuchi, K., (1999), Journal of Biochemistry. 126 (5) 799-803; Brodt, P, Samani, A.,およびNavab, R. (2000),  Biochemical Pharmacology, 60. 1101-1107; Massague, J., Weis-Garcia, F. (1996) Cancer Surveys. 27:41-64; Philip, P.A.,およびHarris, A.L. (1995), Cancer Treatment and Research. 78: 3-27, Lackey, K.ら、Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, (10), 2000, 223-226;米国特許第6,268,391号;ならびにMartinez-Iacaci, L.,ら、Int. J. Cancer (2000), 88(1), 44-52に記載されている。
【０１３０】
PI3-キナーゼ、ATM、DNA-PK、およびKuの遮断薬を含むホスファチジルイノシトール-3キナーゼファミリーメンバーの阻害剤もまた、本発明に有用である。このようなキナーゼは、Abraham, R.T. (1996), Current Opinion in Immunology. 8 (3) 412-8; Canman, C.E., Lim, D.S. (1998), Oncogene 17 (25) 3301-3308; Jackson, S.P. (1997), International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 29 (7):935-8;およびZhong, H.ら、Cancer res, (2000) 60(6), 1541-1545において議論されている。
【０１３１】
ホスホリパーゼC遮断薬およびミオイノシトール類似体などのミオイノシトールシグナル伝達阻害剤もまた、本発明に有用である。このようなシグナル阻害剤は、Powis, G.,およびKozikowski A., (1994) New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy ed., Paul Workman and David Kerr, CRC press 1994, Londonに記載されている。
【０１３２】
他のグループのシグナル伝達経路阻害剤は、Rasがん遺伝子の阻害剤である。このような阻害剤は、ファルネシルトランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、およびCAAXプロテアーゼの阻害剤ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムおよび免疫療法を含む。このような阻害剤は、野生型突然変異rasを有する細胞においてras活性化を阻害し、それによって抗増殖剤として作用することが示されている。Rasがん遺伝子の阻害は、Scharovsky, O.G., Rozados, V.R., Gervasoni, S.I. Matar, P. (2000), Journal of Biomedical Science. 7(4) 292-8; Ashby, M.N. (1998), Current Opinion in Lipidology. 9 (2) 99-102; およびBioChim. Biophys. Acta, (19899) 1423(3):19-30において議論されている。
【０１３３】
上述のように、受容体キナーゼリガンド結合に対する抗体アンタゴニストもまた、シグナル伝達阻害剤として機能しうる。このグループのシグナル伝達経路阻害剤は、受容体チロシンキナーゼの細胞外リガンド結合ドメインに対するヒト化抗体の使用を含む。例えば、Imclone C225 EGFR特異的抗体（Green, M.C.ら、Monoclonal Antibody Therapy for Solid Tumors, Cancer Treat. Rev., (2000), 26(4), 269-286参照）；Herceptin（登録商標）erbB2抗体（Tyrosine Kinase Signalling in Breast cancer:erbB Family Receptor Tyrosine Kinases, Breast cancer Res., 2000, 2(3), 176-183参照）；および2CB VEGFR2特異的抗体（Brekken, R.A.ら、Selective Inhibition of VEGFR2 Activity by a monoclonal Anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice, Cancer Res. (2000) 60, 5117-5124参照）。
【０１３４】
非受容体MEK血管新生阻害剤（non-receptorMEKngiogenesis inhibitors）を含む抗血管新生剤もまた有用でありうる。血管内皮増殖因子の効果を阻害するような抗血管新生剤、（例えば、抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ[Avastin（商標）]、ならびに他の機序によって作用する化合物（例えば、リノマイド、インテグリンαvβ3機能の阻害剤、エンドスタチンおよびアンギオスタチン）；
免疫療法に使用される薬剤もまた、本発明の化合物との併用に有用でありうる。例えば、インターロイキン2、インターロイキン4または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などのサイトカインによるトランスフェクションなどの、患者の腫瘍細胞の免疫原性を高めるex-vivoおよびin-vivoでのアプローチ、T細胞アナジーを低下させるアプローチ、サイトカインをトランスフェクトされた樹状細胞のようなトランスフェクトされた免疫細胞を用いたアプローチ、サイトカインをトランスフェクトされた腫瘍細胞株を用いたアプローチおよび抗イディオタイプ抗体を用いたアプローチを含む、免疫療法アプローチ。
【０１３５】
アポトーシス促進療法に使用される薬剤（例えば、bcl-2アンチセンスオリゴヌクレオチド）もまた、本発明の組合せに使用されうる。
【０１３６】
細胞周期シグナル伝達阻害剤（CDK2、CDK4、およびCDK6ならびにこれらに対する阻害剤を含む）は、例えば、Rosaniaら、Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(2):215-230に記載されている。
【０１３７】
アジュバント
「アジュバント」という用語が、本明細書において免疫療法の成分を指すために用いられる場合、それは、免疫療法の免疫原成分に対する患者の免疫応答を強化するために免疫療法とともに投与される物質を指す（例えば、WO 02/32450参照）。これは、上述のような、癌の一次治療後に行われる付加的な治療である、「アジュバント療法（adjuvant therapy）」とは区別されるべきである。従って、免疫療法はアジュバント療法（adjuvant treatment）でありえ；免疫療法組成物は、下記に論じられるようなアジュバント化合物を含有しうる。このようなアジュバントは、当技術分野において周知であり、個別の製剤で投与されることができ、または免疫療法の免疫原成分を含有する製剤の成分であってもよい。従って、本明細書に記載されるような免疫療法薬は、ワクチンアジュバント、および／または免疫刺激性サイトカインもしくはケモカインを更に含有しうる。
【０１３８】
本発明での使用に適したワクチンアジュバント、例えば、フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Difco Laboratories, Detroit, MI）；Merck Adjuvant 65（Merck and Company, Inc., Rahway, NJ）；AS02（水中油型エマルション中にMPLおよびQS21を含有するアジュバント系；SmithKline Beecham, Philadelphia, PA）；AS15（MPL、QS21、CpGおよびリポソームを含有するアジュバント系）；水酸化アルミニウムゲル（アラム、alum）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄、または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；陽イオンまたは陰イオンに誘導体化された多糖類；ポリホスファゼン；生分解性マイクロスフェア；モノホスホリルリピドAおよびquil Aなどは、市販されている。GM-CSFまたはインターロイキン-2、-7、もしくは-12などのサイトカイン、およびケモカインもまた、アジュバントとして使用されうる。
【０１３９】
本発明の製剤において、アジュバント組成物は主にTh1型の免疫応答を誘導することが望ましいかもしれない。高レベルのTh1型サイトカイン（例えば、IFN-γ、TNFα、IL-2およびIL-12）は、投与された抗原に対する細胞性免疫応答の誘導に有利に働く傾向がある。応答が主にTh1型である１つの実施形態では、Th1型サイトカインのレベルは、Th2型サイトカインのレベルより大きな程度まで上昇するであろう。これらのサイトカインのレベルは、標準的なアッセイを用いて容易に評価されうる。サイトカインのファミリーの総説については、MosmannおよびCoffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989を参照されたい。
【０１４０】
従って、主にTh1型応答を誘導するために使用されうる適切なアジュバントは、例えば、アルミニウム塩と併用した、3-O-デスアシル-4’-モノホスホリルリピドAのようなモノホスホリルリピドA（MPL）の組合せを含む。MPLまたはWO9850399、WO0134617およびWO03065806に開示されるようなアミノアルキルグルコサミニドホスフェート（AGP）などの他のToll様受容体4（TLR4）リガンドはまた、主にTh1型応答を引き起こすために単独でも使用されうる。
【０１４１】
Th1型免疫応答を優先的に誘導しうる他の既知のアジュバントは、非メチル化CpGモチーフを有する合成オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）（CpGまたはCpG含有オリゴデオキシヌクレオチド）のようなTLR9アンタゴニストを含む。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えばWO 96/02555に記載されている。
【０１４２】
CpG含有オリゴデオキシヌクレオチドはまた、単独で、または他のアジュバントと組み合わせて使用されうる。例えば、増強システムは、CpG含有オリゴデオキシヌクレオチドとサポニン誘導体との組合せ、特に、WO00/09159およびWO00/62800に開示されるようなCpGとQS21（キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の分画21；Antigenics, New York, NY, USA）との組合せを含む。
【０１４３】
製剤は更に、水中油型エマルションおよび／またはトコフェロールを含有しうる。
【０１４４】
他の適切なアジュバントは、サポニン、例えばQS21であり、単独で、または他のアジュバントと組み合わせて使用されうる。例えば、増強システムは、モノホスホリルリピドAとサポニン誘導体との組合せ、例えば、WO 94/00153に記載されるようなQS21とMPLとの組合せなど、またはWO 96/33739に記載されるような、QS21がコレステロールによって緩和された反応原性の弱い組成物を含む。他の適切な製剤は、水中油型エマルションおよびα-トコフェロールを含有する。水中油型エマルション中にQS21、MPLおよびα-トコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤は、WO 95/17210に記載されている。
【０１４５】
別の実施形態では、アジュバントは、リポソーム組成物中に調製されうる。
【０１４６】
使用されるMPLの量は、通常少ないが、免疫療法製剤に応じて1用量あたり1〜1000μg、1用量あたり1〜500μg、または1用量あたり1〜100μgの範囲でありうる。
【０１４７】
ある実施形態では、アジュバント系は、WO 95/17210に記載されるように、リポソーム製剤または水中油型エマルションのいずれかの中で与えられる３つの免疫刺激剤：CpG含有オリゴヌクレオチド、MPLおよびQS21を含有する。
【０１４８】
本発明のアジュバントまたは免疫療法薬におけるCpG含有オリゴデオキシヌクレオチドまたは免疫刺激オリゴヌクレオチドの量は、通常少ないが、免疫療法製剤に応じて1用量あたり1〜1000μg、1用量あたり1〜500μg、または1用量あたり1〜100μgの範囲でありうる。
【０１４９】
本発明のアジュバントに用いるためのサポニンの量は、1用量あたり1〜1000μg、1用量あたり1〜500μg、1用量あたり1〜250μg、または1用量あたり1〜100μgの範囲でありうる。
【０１５０】
通常、各ヒト用量は、1〜1000μgのタンパク質抗原を含みうる。１つの実施形態では、1用量は、30〜300μgのタンパク質抗原を含みうる。特定の免疫療法薬のため、および／または特定の腫瘍型の治療のために有用な用量は、ワクチン接種された被験体における適切な免疫応答の観察を含む標準的な研究によって確定され得る。初回接種後、被験体は、1回または数回の追加免疫を適切に間隔を置いて受けうる。
【０１５１】
１つの実施形態では、アジュバントは、MPL、QS21および免疫刺激CpG含有オリゴデオキシヌクレオチドの1つ以上を含有しうる。ある実施形態では、３つすべての免疫刺激剤が存在する。別の実施形態では、MPLおよびQS21は、水中油型エマルション中で、CpG含有オリゴデオキシヌクレオチドの非存在下で与えられる。
【実施例】
【０１５２】
実験
黒色腫におけるBRAF V600突然変異およびMAGE発現の保有率
臨床研究の間に、RNAlater（商標）中の53個の新鮮な腫瘍組織のDNAを採取した。Maxwell Tissue DNA精製キット（Promega）を用いてDNAを抽出し、分光分析によって定量した。その後、Response Genetics（RGI）によって開発された対立遺伝子特異的PCRアッセイを用いてBRAF変異状態を検査した。簡潔には、対照アッセイを用いて、BRAF遺伝子のエクソン13の多型を持たない領域を増幅することにより、サンプル中の全DNAを評価した。並行して、BRAF V600E、V600KおよびV600D*変異型を特異的に検出するように開発された３つのBRAF変異型特異的突然変異アッセイを用いて、BRAF変異状態を決定した。サンプルは下記のように考えられた。すなわち、
デルタCt値[(BRAF V600E Ct)-(BRAF Ex13 Ct)]が6.5を下回った場合、突然変異したBRAF V600Eであり；
デルタCt値[(BRAF V600K Ct)-(BRAF Ex13 Ct)]が6.5を下回った場合、突然変異したBRAF V600Kであり；
デルタCt値[(BRAF V600D Ct)-(BRAF Ex13 Ct)]が6.7を下回った場合、突然変異したBRAF V600Dであり；
３つの前記のデルタCt値がそれらのそれぞれの境界値を上回った場合、野生型BRAFである。
【０１５３】
同一の生検のqRTPCRによって、MAGEA3発現レベルを測定した。
【０１５４】
表１は、結果として得られたMAGEA3発現状態およびBRAF遺伝子型を示す。
【表１】
2015503503.tif 000008
【０１５５】
マウスでのMAGE免疫療法に対するBRAF阻害剤またはMEK阻害剤の悪影響はない
7群のメスの22 CB6F1マウスに、下記のように投与した。1）PBS、2）MAGE-A3/AS15、3）ビヒクル、4）BRAF阻害剤（GSK436）、5）MEK阻害剤（GSK212）、6）ASCI＋GSK 436の組合せ、および7）ASCI＋GSK 212の組合せ。MAGE-A3/AS15を0日目および14日目に筋内（IM）投与した。B-RAF阻害剤およびMEK阻害剤は、胃チューブ（IG）によって0日目から14日目まで毎日投与された。
【０１５６】
2回目の免疫の2週間後（28日目）に、1群につき12匹（3匹ずつの4集団）のマウスの脾臓細胞において、CD4+およびCD8+ T細胞応答を分析し＝主要評価項目、1群につき12匹において抗体応答を測定した。
【０１５７】
T細胞応答
T細胞応答の分析は主要評価項目と考えられ、実験はそれに応じて行われた。アッセイは、2週間間隔で2回、MAGE-A3 ASCIで免疫された12匹/群（3匹ずつの4集団）のマウスからの脾臓細胞において、最後の免疫付与の2週間後に行われ、そのアッセイは、フローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン染色（ICS）であり、サイトカイン（IFNγおよび／またはTNFα）を産生することができるCD4+またはCD8+ T細胞の割合が評価された。
【０１５８】
免疫された動物の脾臓細胞を、培地（刺激なし）によって、または、共刺激抗体：各2μg/mlの抗CD49dおよび抗CD28を含有する最終容量200μlのRPMI 5％FCS中の、MAGE-A3の全配列に及ぶ、10AAずつ重複している15merペプチド（1μg/ml/ペプチド）の57個のプールによって、37℃で2時間、96Wプレート中で再度刺激した。インキュベーション後、RPMI 5％FCS中のブレフェルジン（1/1000）50μlを添加することによって、サイトカインの分泌を阻害した。
【０１５９】
その後、細胞を96W（円錐形のウェル）プレートに移し、遠心分離し（1000rpm、4℃で5分間）、250μlのFACSバッファー（PBS 1％FCS）で洗浄した。細胞ペレットをFACSバッファーで1/50×希釈した50μlの2.4G2とともに、4℃で10分間インキュベートして、Fc受容体への非特異的な結合を阻害した。FACSバッファー中に蛍光抗体（CD4-PE mAb: 1/100およびCD8PerCP mAb: 6/100）を含有するマスターミックス50μlを添加することによって、CD4+およびCD8+ T細胞を染色した（4℃で30分間）。
【０１６０】
細胞をFACSバッファーで洗浄し、遠心分離した（1200RPM-10分間）。200μlのcytoFix-cytoPerm（商標）溶液を4℃で20分間添加し、細胞を遠心分離した。滅菌水中1×濃度の透過処理溶液（permWASH（商標））を添加し、細胞を遠心分離した（1000RPM-5分間）。ペレットを、permWASH（商標）1×溶液中のIFNγ APC（mAb: 1/50）およびTNFα FITC（mAb: 1/50）に対する蛍光抗体の混合物50μlとともに、4℃で2時間インキュベートした。細胞を洗浄し、遠心分離し（1000RPM）、FACS分析（Becton Dickinson社のLSR2）前にFACSバッファー中に再懸濁した。
【０１６１】
生存T細胞に対するゲーティング後（1）、合計で約20000 のCD4+ T細胞および約10000のCD8+ T細胞が得られ（2）、データは、サイトカインを産生するこれらのCD4+またはCD8+ T細胞の割合として表された（3）。
【０１６２】
無刺激細胞（培地）によって得られたデータを、MAGE-A3ペプチドで刺激された細胞によって得られたデータから差し引く。バックグラウンドレベルは通常、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を与えられたマウスの対照群では、検出されない、または非常に低く、0.01〜0.05％である。バックグラウンドによっては、0.1のパーセンテージは、陽性応答と見なすことができる。
【０１６３】
応答の正規分布および分散の均一性を実現するために、データを最初にlog10基底に変換した。一元配置分散分析および多重比較（Tukey検定）を適用して、群間の有意差を明らかにした。
【０１６４】
2回の免疫付与の14日後、細胞内サイトカイン染色アッセイを用いて、免疫された動物の脾臓細胞におけるT細胞応答を測定した。1群につき3匹のマウスの4集団としてデータを分析した。CD4+ T細胞応答は図１に示す。CD8+ T細胞応答は図２に示す。
【０１６５】
CD4+T細胞応答に関して、ASCIとASCI＋B-RAF阻害剤との間の幾何平均値の比は、[0.7-1.16]の95％信頼区間を有する0.9であり、完全に[0.3-3]に含まれた。また、ASCIとASCI＋MEK阻害剤との間の幾何平均値の比は、[0.55-0.92]の95％信頼区間を有する0.71であり、完全に[0.3-3]に含まれた。
【０１６６】
CD8+T細胞応答に関して、ASCIとASCI＋B-RAF阻害剤との間の幾何平均値の比は、[0.53-1.78]の95％信頼区間を有する0.97であり、完全に[0.3-3]に含まれた。ASCIとASCI＋MEK阻害剤との間の幾何平均値の比は、[0.35-1.16]の95％信頼区間を有する0.64であり、完全に[0.3-3]に含まれた。
【０１６７】
抗体応答
抗体応答は、最後の免疫付与の2週間後に、1群につき12匹のマウスにおいて評価した。2回の免疫付与の14日後、マウス血清をMAGE-A3特異的抗体の存在についてELISAによって検査した。
【０１６８】
血清の添加前に、イムノプレートを、バキュロウイルスで産生されたMage3抗原で4℃で一晩コーティングした。血清と37℃で90分間反応させた後、マウス免疫グロブリンに対するビオチン化されたヒツジ全抗体を37℃で90分間添加した。ストレプトアビジン-ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体と37℃で30分間インキュベートすることによって、抗原抗体複合体を明らかにした。その後、テトラメチルベンジジン（TMB）を室温で10分間添加することによって、この複合体を露呈させ、0.2 M H2SO4によって反応を停止させた。450nmで光学密度を記録した。
【０１６９】
標準血清（MAGE-A3 ASCIで免疫されたマウスの血清プール- LIMS 20100152）を用いて作成した標準曲線を参照することによって、個々のマウスの抗MAGE-A3力価を計算し、各群の平均値を計算した。
【０１７０】
応答の正規分布および分散の均一性を実現するために、データを最初にlog10基底に変換した。一元配置分散分析および多重比較（Tukey検定）を適用して、群間の有意差を明らかにした。
【０１７１】
被覆抗原としてバキュロウイルス発現系で産生された精製組換えMAGE-A3タンパク質を用いたELISAによって、抗体応答を測定した。1群につき12匹のマウスからの血清を個別に試験した。図３は、1群につき12匹のマウスの平均力価+/-標準偏差を示す。
【０１７２】
ASCIとASCI＋B-RAF阻害剤との間の抗体力価の幾何平均値の比は、[0.91-1.3]の95％信頼区間を有する1.08であり、完全に[0.3-3]に含まれた。ASCIとASCI＋MEK阻害剤との間の幾何平均値の比は、[0.9-1.3]の95％信頼区間を有する1.07であり、完全に[0.3-3]に含まれた。
【０１７３】
BRAF阻害剤で治療された癌患者における全体的な免疫能力の障害はない
V600突然変異BRAF 特異的阻害剤であるGSK2118436（化学式（I）の化合物）による治療を受けた、BRAF突然変異を有する腫瘍を持つ13人の患者を試験して、突然変異BRAF阻害の全身性免疫に対する影響を評価した。1回または2回の28日の治療サイクルの前後に、末梢血免疫観察を行った。
【０１７４】
結果として、GSK2118436治療は、血清サイトカインレベル、末梢血細胞数、白血球サブセット頻度、ならびに記憶CD4+およびCD8+ T細胞リコール応答などの、試験されたほとんどの免疫パラメーターに対して検出可能な影響を及ぼさなかった。治療の過程にわたって血清TNF-αのわずかな増加が観察された。加えて、4人のヒト白血球抗原A2陽性患者のうち3人は、BRAF（V600）阻害剤治療の後、循環腫瘍抗原特異的CD8+ T細胞がわずかに増加した。
【０１７５】
結論として、GSK2118436治療は、既存の全身性免疫または腫瘍特異的T細胞の新たな産生に対して検出可能な悪影響をもたらさなかった。
【０１７６】
基礎となる分析および結果のより詳細な報告は、Hong DS、Vence L、Falchook G、Radvanyi LG、Liu C、Goodman Vら、BRAF(V600) Inhibitor GSK2118436 Targeted Inhibition of Mutant BRAF in Cancer Patients Does Not Impair Overall Immune Competency. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. 2012;18:2326-35において提供され、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
2015503503.tif 000011
【図２】
2015503503.tif 000012
【図３】
2015503503.tif 000013
【配列表】
2015503503000001.app
【国際調査報告】
2015503503.tif 000014
2015503503.tif 000015