(57)【要約】  本発明は、ｍＲＮＡを肺の中で発現させるための方法を開示するものであり、発現させるｍＲＮＡをポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と組み合わせて該ｍＲＮＡとＰＥＩとを含む組合せを提供し；該ｍＲＮＡとＰＥＩとを含む該組合せは肺へ投与されて肺細胞内に入り；そして該ｍＲＮＡを肺細胞内で発現させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡを肺の中で発現させるための方法であって、
−発現させるｍＲＮＡをポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と組み合わせて該ｍＲＮＡとＰＥＩとを含む組合せを提供し；
−該ｍＲＮＡとＰＥＩとを含む該組合せは肺へ投与されて肺細胞内に入り；そして
−該ｍＲＮＡを肺細胞内で発現させる、前記方法。
【請求項２】
肺が、ヒト患者、好ましくは肺障害、特にサーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰＢ）欠損症、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー３（ＡＢＣＡ３）欠損症、嚢胞性線維症、α−１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、肺癌、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰＣ）欠損症、肺胞タンパク症、サルコイドーシス、急性及び慢性気管支炎、気腫、マクラウド症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支喘息、気管支拡張症、塵肺症、石綿症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、新生児呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）、肺浮腫、肺好酸球増加症、レフレル肺炎、ハンマン・リッチ症候群、特発性肺線維症、間質性肺疾患、原発性線毛機能不全症、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）及びＳＴＡＴ５ｂ欠損症、凝固障害、特に血友病Ａ及びＢ；補体障害、特にプロテインＣ欠損症、血栓性血小板減少性紫斑病、及び先天性血色素症、特にヘプシジン欠損症；肺感染症、好ましくは呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）感染症、インフルエンザウイルス感染症、ライノウイルス感染症、及び重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）感染症、結核、緑膿菌感染症、バークホルデリア・セパシア感染症、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症、及びインフルエンザ菌感染症から選択される肺障害のあるヒト患者の肺である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＥＩが、１ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、好ましくは１０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、特に２０〜３０ｋＤａの分子量を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＰＥＩが、標的化（tergeting）リガンド、好ましくはＩＰ１受容体リガンド、より好ましくはプロスタサイクリン類似体、特に、イロプロスト（５−｛（Ｅ）−（１Ｓ，５Ｓ，６Ｒ，７Ｒ）−７−ヒドロキシ−６［（Ｅ）−（３Ｓ，４ＲＳ）−３−ヒドロキシ−４−メチル−１−オクテン−６−イニル］−ビシクロ［３．３．０］オクタン−３−イリデン｝ペンタン酸）又はトレプロスチニル（（１Ｒ，２Ｒ，３ａＳ，９ａＳ）−［［２，３，３ａ，４，９，９ａ−ヘキサヒドロ−２−ヒドロキシ−１−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシオクチル］−１Ｈ−ベンズ［ｆ］インデン−５−イル］オキシ］酢酸）；又はβ２−アドレナリン受容体リガンド、特に、クレンブテロール、ラクトフェリン、ウロン酸、又はレクチンを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ｍＲＮＡが、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰＢ）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー３（ＡＢＣＡ３）又はα−１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰＣ）、エリスロポエチン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ヴィレブランド因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＡＤＡＭＴＳ１３、ヘプシジン、アンジオテンシン変換酵素ＩＩ、又はウイルス性及び細菌性病原体の抗原をコードする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ｍＲＮＡとＰＥＩとを含む組合せが、肺へ気管内投与される、好ましくはエアゾール剤として、特に高圧でスプレーすることによって投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ｍＲＮＡを肺の中で発現させる方法に使用するための、ｍＲＮＡとＰＥＩとを含む医薬組成物。
【請求項８】
肺障害、特に、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰＢ）欠損症、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー３（ＡＢＣＡ３）欠損症、嚢胞性線維症、α−１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、肺癌、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰＣ）欠損症、肺胞タンパク症、サルコイドーシス、急性及び慢性気管支炎、気腫、マクラウド症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支喘息、気管支拡張症、塵肺症、石綿症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、新生児呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）、肺浮腫、肺好酸球増加症、レフレル肺炎、ハンマン・リッチ症候群、特発性肺線維症、間質性肺疾患、原発性線毛機能不全症、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）及びＳＴＡＴ５ｂ欠損症、凝固障害、特に血友病Ａ及びＢ；補体障害、特にプロテインＣ欠損症、血栓性血小板減少性紫斑病、及び先天性血色素症、特にヘプシジン欠損症；肺感染症、好ましくは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）感染症、インフルエンザウイルス感染症、ライノウイルス感染症、及び重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）感染症、結核、緑膿菌感染症、バークホルデリア・セパシア感染症、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症、及びインフルエンザ菌感染症から選択される肺障害を治療するための、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＰＥＩが、１ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、好ましくは１０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、特に２０〜３０ｋＤａの分子量を有する、請求項７又は８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＰＥＩが、標的化リガンド、好ましくはＩＰ１受容体リガンド、より好ましくはプロスタサイクリン類似体、特に、イロプロスト（５−｛（Ｅ）−（１Ｓ，５Ｓ，６Ｒ，７Ｒ）−７−ヒドロキシ−６［（Ｅ）−（３Ｓ，４ＲＳ）−３−ヒドロキシ−４−メチル−１−オクテン−６−イニル］−ビシクロ［３．３．０］オクタン−３−イリデン｝ペンタン酸）又はトレプロスチニル（（１Ｒ，２Ｒ，３ａＳ，９ａＳ）−［［２，３，３ａ，４，９，９ａ−ヘキサヒドロ−２−ヒドロキシ−１−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシオクチル］−１Ｈ−ベンズ［ｆ］インデン−５−イル］オキシ］酢酸）；又はβ２−アドレナリン受容体リガンド、特に、クレンブテロール、ラクトフェリン、ウロン酸、又はレクチンを含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ｍＲＮＡが、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰＢ）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー３（ＡＢＣＡ３）又はα−１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰＣ）、エリスロポエチン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ヴィレブランド因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＡＤＡＭＴＳ１３、ヘプシジン、アンジオテンシン変換酵素ＩＩ、又はウイルス性及び細菌性病原体の抗原をコードする、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つのフルオロカーボンをさらに含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
エアゾール剤である、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
エアゾール剤が、磁気粒子、特に直径が最小５ｎｍで最大８００ｎｍである磁気粒子を含有する、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
磁気粒子の直径が、最小５０ｎｍで最大７５０ｎｍ、好ましくは最小１００ｎｍで最大７００ｎｍ、より好ましくは最小１５０ｎｍで最大６００ｎｍ、さらにより好ましくは最小２００ｎｍで最大５００ｎｍ、特に好ましくは最小２５０ｎｍで最大４５０ｎｍ、最も好ましくは最小３００ｎｍで最大４００ｎｍである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ＰＥＩが磁気粒子に結合している、請求項７〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
磁気粒子が、金属及び／又はその酸化物及び／又は水酸化物から成るか、あるいは金属及び／又はその酸化物及び／又は水酸化物を含有する、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
金属が、鉄、コバルト、又はニッケルから成る群より選択され；酸化物又は水酸化物が、Ｆｅ３Ｏ４、γ−Ｆｅ２Ｏ３、二価若しくは三価の鉄イオンとＣｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｒ３＋、Ｇｄ３＋、Ｄｙ３＋、若しくはＳｍ３＋との複酸化物又は複水酸化物、及びそれらの混合物から成る群より選択される、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
磁気粒子を含有するエアゾール剤が、治療すべき気道及び／又は肺の領域の表面へ磁場によって沈着される、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
磁場強度が、少なくとも１００ｍＴ（ミリテスラ）、少なくとも２００ｍＴ、少なくとも５００ｍＴ、又は少なくとも１Ｔ（テスラ）である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
磁場勾配が、１Ｔ／ｍより大きいか又は１０Ｔ／ｍより大きい、請求項１９又は２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
磁場が、パルス磁場、振動磁場、又はパルス−振動磁場である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
磁場が患者の呼吸と動的に適合しており、吸息と呼息の間又は呼息と吸息の間の休止期でのみアクティブである、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ｐＨが、６．５未満、好ましくは３〜６、特に４〜５．５である、請求項７〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
２５℃導電率が、１００００μＳ／ｃｍ以下、好ましくは１０００μＳ／ｃｍ以下、特に１００μＳ／ｃｍ以下である、請求項７〜２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｍＲＮＡを肺中で発現させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、主に、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンをヌクレオシドとして含むヌクレオシドリン酸の構成要素（building blocks）から組み立てられるポリマーであり、中間的な担い手として、細胞核のＤＮＡ由来の遺伝情報を細胞質へ持ち込み、そこでそれはタンパク質へ翻訳される。従って、それらは、遺伝子発現の代替手段として適している。
【０００３】
細胞内の生化学プロセスの解明とヒトゲノムの解明により、欠損遺伝子と疾患との間の関連が明らかになってきた。従って、欠損遺伝子による疾患を遺伝子治療によって治癒するという願望が久しくある。この期待は大きかったが、これへの当初の試みは失敗し、進歩が報告されたのはごく最近である。遺伝子治療に対する最初のアプローチは、欠損又は障害遺伝子のインタクトＤＮＡをベクター内で細胞核へ持ち込み、そのインタクト遺伝子の発現を達成して、それにより欠失又は障害タンパク質を提供することにあった。これらの試みはほとんど成功せず、さらに不成功な試みでは、実質的な副作用、特に腫瘍形成の上昇が重荷になった。ごく最近、より有望な結果が報告されたものの、それらは承認されるにはまだほど遠い。
【０００４】
さらに、遺伝子欠損に起因していない、タンパク質の欠失又はタンパク質の欠損による疾患がある。このような症例でも、ＤＮＡの投与によって生体内で関連タンパク質を産生することが考慮される。代謝において何らかの役割を担って、病理学的又は非病理学的な理由のために破壊されるか又は阻害される因子の提供も、副作用が無いか又は少ない核酸治療によって有効になる可能性がある。
【０００５】
遺伝性疾患の治療にｍＲＮＡを使用して、疾患をもたらす遺伝子障害を治療することもすでに提唱されている。この利点は、ｍＲＮＡを細胞の細胞質へ導入するだけでよく、核内へ移行させる必要がないことである。核内への移行は困難で非効率であり、その上に、ベクター又はその一部がゲノム内へ取り込まれれば、染色体ＤＮＡが改変されるかなりのリスクがある。
【０００６】
試験管内で転写されるメッセンジャーＲＮＡが哺乳動物の組織中で実際に発現され得ることは確かに示せたが、ｍＲＮＡを疾患の治療に使用する試みにはさらなるハードルが現れた。ｍＲＮＡの安定性欠如により、所望のタンパク質が哺乳動物の組織において十分な量で入手し得ないという影響があったのである。ｍＲＮＡがかなりの免疫学的反応の引き金になるという事実からは、さらに実質的な欠点が生じた。これらの強い免疫反応は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びヘリカーゼＲＩＧ−１のようなＴｏｌｌ様受容体への結合を通して生じると推定されている。
【０００７】
免疫学的反応を防ぐために、特許文献１では、４種のリボヌクレオチドのうち１つが修飾ヌクレオチドに置換されたＲＮＡを使用することが提唱された。特に、ウリジンを完全にシュードウリジンに置換した場合に、ｍＲＮＡがどのように挙動するのかが検討された。このようなＲＮＡ分子は、免疫原性が有意に低いことが見出された。さらに、タンパク質又はタンパク質断片をコードする配列を有するＲＮＡ（ここで、このＲＮＡは非修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの組合せを含有し、ウリジンヌクレオチドの５〜５０％とシチジンヌクレオチドの５〜５０％がそれぞれ修飾ウリジンヌクレオチドと修飾シチジンヌクレオチドに置換されている）を使用することが提唱された。そのようなＲＮＡ分子は、免疫原性が有意に低く、より安定でさえあることが見出された。さらに、そのようなＲＮＡを使用して、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）欠損症に罹患しているマウスの死を、マウスにおける反復的な気管内エアゾール適用によって防ぎ得ることが提唱された。このように、これらの観察事実は、生命を脅かす遺伝性及び獲得性の肺疾患を治療して未充足な高い医療ニーズに対処することに対するＲＮＡの有望性を実証するものである。しかしながら、患者での適用に関して言えば、この適用手順は、麻酔が求められること及び標準的な臨床使用ネブライザーを使用するときＲＮＡが分解することのために、反復エアゾールの適用にはまだ適していなかった。
【０００８】
身体の肺に必要又は有益なタンパク質を提供すること、及び／又は欠失又は欠損タンパク質による疾患をＲＮＡで治療することが可能であるためには、患者の反復麻酔を回避した反復エアゾール適用の方法を利用可能にすることが望ましい。しかしながら、同時に、この方法は、ＲＮＡの効力を有意な度合いまで低下させてはならない。
【０００９】
特許文献２では、反復麻酔と噴霧化の方法に伴う、効率が試験管内トランスフェクションと比較して顕著に低下するという以前からの未解決問題を克服するのに適した、遺伝子を肺へエアゾール送達するためのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）２５ｋＤａ／ＤＮＡ製剤を使用することが提唱された。ＰＥＩ／ＤＮＡ製剤は、ジェットネブライザーによって生体内送達されるとき、ジェットネブライザー誘発性のトランスフェクション効率低下に抵抗するので、それまでに最適化された脂質ベースの製剤より優れていることが見出された。具体的には、特許文献２は、遺伝子巨大分子とポリエチレンイミンとの複合体の水性分散液を微粒子エアゾールにより個体の気道を介して送達する工程を含む、気道を介した遺伝子治療のような標的化治療の方法を開示する。この発明の方法による遺伝子巨大分子の代表的な例には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び他の核酸分子種が含まれた。しかしながら、この発明は、その特許に含まれる実施例はＤＮＡ送達に関する実施のみになっており、ｍＲＮＡに関する実施はない。さらに、目的遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡとＰＥＩとの複合体は、水に溶かしたプラスミドＤＮＡをＰＢＳに溶かした適正量のＰＥＩと混合することによって形成されている。しかしながら、非特許文献１は、低浸透圧性の蒸留水にて組み立てられて噴霧化される場合のＰＥＩ−ＤＮＡ複合体が、等張５％ブドウ糖液又はＨｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水におけるものより、マウス肺においてそれぞれ５７倍及び１８５倍高い発現レベルを生じることを実証した。驚くべきことに、ＰＢＳにて組み立てられて噴霧化される場合のＰＥＩ−ＤＮＡ複合体は完全に無効であった。これは、主に、ＰＢＳにて製剤化されたＰＥＩ遺伝子ベクターの直径が大きくなり（８４８±１４２ｎｍ）、それが動力学的に不安定で沈殿をもたらすという事実に起因していた。また、ＰＥＩと複合体化したナノグラム量のエアゾール化ｐＤＮＡ（３５０ｎｇ）では、気管内挿管によりマウス肺へ直接適用された１４０倍高い用量（５０μｇ）の同じベクターより、１５倍高いトランスフェクションレベルを生じることが見出された。
【００１０】
さらに、非特許文献２は、ポリエチレンイミン（分岐鎖ＰＥＩ  ２５ｋＤａ及び直鎖ＰＥＩ  ２２ｋＤａ）、ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ、５４ｋＤａ）、又はデンドリマーに基づいたポリプレックス（polyplexes）ではなく、リポプレックス（lipoplexes）が、トランスフェクトされたＢ１６−Ｆ１０細胞においてｍＲＮＡの効率的な翻訳に介在することを実証した。無細胞翻訳アッセイにおけるＰＥＩ  ２５ｋＤａ／ｍＲＮＡ又はＰＬＬ  ５４ｋＤａ／ｍＲＮＡの発現欠如とそれに続くＲａｔ１細胞への細胞質注入は、これらのポリプレックスがｍＲＮＡを放出するには安定すぎることを示した。このｍＲＮＡとトランスフェクション剤との間の静電相互作用の強さは、達成される発現レベルに劇的な効果を及ぼし、熱力学的に安定したポリプレックスベクター、例えばＰＥＩ−ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳にあまり適していないことが実証された。より短いポリカチオンを使用することによって担体とｍＲＮＡとの間の静電相互作用を減少させると、発現の大幅な増加をもたらし、低分子量のＰＥＩ及びＰＬＬを使用して形成したｍＲＮＡポリプレックスでは、ＤＯＴＡＰ／ｍＲＮＡより５倍大きいルシフェラーゼ発現レベルを達成した。しかしながら、低分子量ポリカチオンを使用して形成したポリプレックスは、そのエンドソーム溶解活性を失い、ｍＲＮＡ発現に介在するにはクロロキンを必要とした。低分子量ＰＥＩを膜作用性ペプチドのメリチンへコンジュゲートさせることによってエンドソーム溶解性が回復し、クロロキン非存在下で高レベルのｍＲＮＡ発現が実証された。まとめると、上記の観察事実は、一本鎖ｍＲＮＡのカチオン性ポリマーへの結合は、ｐＤＮＡの結合より概ね強いことを示している。このことは、核移行の前提条件としてのカチオン性ポリマーからのｐＤＮＡ放出、転写、及び成功裡の導入遺伝子発現に、細胞質ＲＮＡが関与していることを示唆した非特許文献３によってさらに確認されている。結論として、上記の観察事実は、ＰＥＩ  ２５ｋＤａが細胞内への機能的なｍＲＮＡ送達に介在できないことを示唆している。
【００１１】
挿管を含む連続反復処置は生命の質の要件に適合し得ないので、本発明の根底にある課題は、メッセンジャーＲＮＡの肺送達に適合した非侵襲性の方法を提供し、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を肺で発現させることであった。
【００１２】
先行技術には、ｍＲＮＡ肺送達のための非侵襲的な方法がない。
【００１３】
従って、本発明の目的は、コードされたタンパク質を肺の中で有効レベルで産生する、非侵襲的な肺への適用によるｍＲＮＡ治療薬剤の送達方法を提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ  ２００７／０２４７０８  Ａ
【特許文献２】ＥＰ  １  １７３  ２２４  Ｂ１
【特許文献３】ＷＯ  ２０１１／０７６３９１  Ａ
【特許文献４】ＥＰ  １  ９２４  ２４４  Ａ
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｒｕｄｏｌｐｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００５、１２：４９３−５０１
【非特許文献２】Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１、２９：３８８２−９１
【非特許文献３】Ｈｕｔｈら、Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．２００６、８：１４１６−１４２４
【非特許文献４】Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７（２００３）、２５４−２６１
【非特許文献５】Ｅｌｆｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００９、１３５：２３４−２４１
【非特許文献６】Ｅｌｆｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００７、２８：３４４８−３４５５
【非特許文献７】Ｗｅｉｓｓら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６、２７：２３０２−２３１２
【非特許文献８】Ｂｉｅｓら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００４、５６：４２５−４３５
【非特許文献９】Ｇｒｕｄｚｉｅｎら、２００６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８１、１８５７−６７
【非特許文献１０】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）「分子クローニング：実験室マニュアル」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク、第１、２、及び３巻
【非特許文献１１】Ｒｕｄｏｌｐｈら、Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．２００５、７：５９−６６
【非特許文献１２】Ｈｏｎｉｇら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１０、１１：１８０２−１８０９
【非特許文献１３】Ｂｕｃｋｌｅｙ  ＳＭ、Ｈｏｗｅ  ＳＪ、Ｗｏｎｇ  ＳＰ、Ｂｕｎｉｎｇ  Ｈ、ＭｃＩｎｔｏｓｈ  Ｊら（２００８）「Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａ−ｎａｓａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｒａ−ｎａｓａｌ  ｒａｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｉｎｔｒａ−ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（鼻腔内ベクター送達後のルシフェリン検出は、腹腔内よりも鼻腔内のルシフェリン投与によって改善される）」Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．
【発明の概要】
【００１６】
故に、本発明は、ｍＲＮＡを肺の中で発現させるための方法を提供するものであり、
−発現させるｍＲＮＡをポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と組み合わせて該ｍＲＮＡとＰＥＩとを含む組合せを提供し；
−該ｍＲＮＡとＰＥＩとを含む該組合せは肺へ投与されて肺細胞内に入り；そして
−該ｍＲＮＡを肺細胞内で発現させる。
【００１７】
本発明は、ヒトの医学における使用に特に適している。故に、本発明に従って治療される肺は、好ましくはヒト患者、好ましくは、肺障害、特に、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰＢ）欠損症、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー３（ＡＢＣＡ３）欠損症、嚢胞性線維症、α−１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、肺癌、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰＣ）欠損症、肺胞タンパク症、サルコイドーシス、急性及び慢性気管支炎、気腫、マクラウド症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支喘息、気管支拡張症、塵肺症、石綿症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、新生児呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）、肺浮腫、肺好酸球増加症、レフレル肺炎、ハンマン・リッチ症候群、特発性肺線維症、間質性肺疾患、原発性線毛機能不全症、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）、及びＳＴＡＴ５ｂ欠損症から選択される肺障害のあるヒト患者の肺である。
【００１８】
さらに、ヒト患者の肺は、エリスロポエチン、血友病Ａ及びＢのような凝固障害、プロテインＣ欠損症、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ、ＡＤＡＭＴＳ１３欠損症）、及び先天性血色素症（例えばヘプシジン欠損症）のような補体障害のように、ｍＲＮＡによって発現されるタンパク質が肺細胞から血液循環中へ分泌されるためのバイオリアクターとして役立ち得る。
【００１９】
ｍＲＮＡの肺細胞からの発現は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）感染症、インフルエンザウイルス感染症、ライノウイルス感染症、及び重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）感染症、結核、緑膿菌感染症、バークホルデリア・セパシア感染症、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症、及びインフルエンザ菌感染症のような肺感染症に対する予防接種にも使用し得る。そのような予防接種の目的では、送達されるｍＲＮＡが病原体の１以上の抗原をコードする。
【００２０】
本発明の過程において投与されるＰＥＩは通常臨界的ではないが（非特許文献４）、本発明の過程では、１ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、好ましくは１０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、特に２０〜３０ｋＤａの分子量を有するＰＥＩを使用することが有利である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ＥＰＯ  ｍＲＮＡとＰＥＩ  ２５ｋＤａとを含む組合せ（ＥＰＯと表示）、又は化学修飾ＥＰＯ  ｍＲＮＡとＰＥＩ  ２５ｋＤａとを含む組合せ（ＥＰＯ  ｍｏｄと表示）でエアゾール処理後２４時間のマウス肺溶解液における、ＥＬＩＳＡで測定したＥＰＯ発現の結果を未処理マウス（ｗ／ｏ）と比較して示す。ＥＰＯレベルは、両処理群で、未処理マウスと比較した場合に有意に増加している。
【図２】図２は、化学修飾ＭｅｔＬｕｃ  ｍＲＮＡとＰＥＩ  ２５ｋＤａとを含む組合せ（Ｍｅｔ−Ｌｕｃと表示）、又は対照として役立つ、化学修飾ＥＧＦＰＬｕｃ  ｍＲＮＡとＰＥＩ  ２５ｋＤａとを含む組合せ（ＥＧＦＰ−Ｌｕｃと表示）でエアゾール処理後２４時間のマウスの肺溶解液における、発光活性で測定したメトリディア（Metridia）・ルシフェラーゼ発現の結果を示す。メトリディア・ルシフェラーゼレベルは、化学修飾ＭｅｔＬｕｃ  ｍＲＮＡ／ＰＥＩ  ２５ｋＤａで処理したマウス群において、化学修飾ＥＧＦＰＬｕｃ  ｍＲＮＡ／ＰＥＩ  ２５ｋＤＡで処理した対照マウスと比較した場合に有意に増加している。
【図３】図３は、化学修飾Ｌｕｃ  ｍＲＮＡをＰＥＩ  ２５ｋＤａとの組合せとして肺にエアゾール送達すると、マウス肺細胞において有効に発現することを示す（図３ａ及び３ｂ）。
【図４】図４は、キャップ−１を含む化学修飾Ｌｕｃ  ｍＲＮＡで、ルシフェラーゼ発現が最も高いことを示す。
【図５ａ】図５ａは、噴霧水で処理した対照動物の肺ではＬｕｃ発現が見られないことを示す。
【図５ｂ】図５ｂは、図５ａに対して、化学修飾Ｌｕｃ  ｍＲＮＡをＰＥＩ  ２５ｋＤａとの組合せとして肺にエアゾール送達すると、ブタの肺細胞において有効に発現することを示す。
【図６】図６は、ＰＥＩ製剤において注射用水（ＷＦＩ）が化学修飾ｍＲＮＡを安定にすることを示す：  レーン１：水＋ヘパリン中の修飾ｍＲＮＡ：  レーン２：ＰＢＳ＋ヘパリン中の修飾ｍＲＮＡ：  レーン３：ＰＢＳ／水＋ヘパリン中のｂｒＰＥＩ  ２５ｋＤａ／修飾ｍＲＮＡ（ｐＨ７．４）（特許文献２による方法）：  レーン４：ＰＢＳ＋ヘパリン中のｂｒＰＥＩ  ２５ｋＤａ／修飾ｍＲＮＡ（ｐＨ７．４）（Ｅｔｈｒｉｓの方法）：  レーン５：水＋ヘパリン中のｂｒＰＥＩ  ２５ｋＤａ／修飾ｍＲＮＡ（ｐＨ７．４）：  レーン６：水＋ヘパリン中のｂｒＰＥＩ  ２５ｋＤａ／修飾ｍＲＮＡ（ｐＨ６．０）：  レーン７：水＋ヘパリン中のｂｒＰＥＩ  ２５ｋＤａ／修飾ｍＲＮＡ（ｐＨ５．０）
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の好ましい態様によれば、ＰＥＩは、標的化リガンド、好ましくはＩＰ１受容体リガンド、より好ましくはプロスタサイクリン類似体、特にイロプロスト（５−｛（Ｅ）−（１Ｓ，５Ｓ，６Ｒ，７Ｒ）−７−ヒドロキシ−６［（Ｅ）−（３Ｓ，４ＲＳ）−３−ヒドロキシ−４−メチル−１−オクテン−６−イニル］−ビシクロ［３．３．０］オクタン−３−イリデン｝ペンタン酸）又はトレプロスチニル（（１Ｒ，２Ｒ，３ａＳ，９ａＳ）−［［２，３，３ａ，４，９，９ａ−ヘキサヒドロ−２−ヒドロキシ−１−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシオクチル］−１Ｈ−ベンズ［ｆ］インデン−５−イル］オキシ］酢酸）；又はβ２−アドレナリン受容体リガンド、特にクレンブテロール（非特許文献５）、ラクトフェリン（非特許文献６）、ウロン酸（非特許文献７）、又はレクチン（非特許文献８）を含む。
【００２３】
ＩＰ１受容体リガンド、より好ましくはプロスタサイクリン類似体の、ＰＥＩベースの医薬製剤を肺細胞へ、特に気管支又は肺胞上皮細胞へ標的特異的に送達することへの使用については、特許文献３に開示されており、利用可能になっている。
【００２４】
本発明による方法では、医学的な恩恵を有するｍＲＮＡ、特に、肺において病原性の作用がある遺伝子に置き換わる、それを克服する、それに拮抗する、若しくはそれを抑制するｍＲＮＡ、又はこの患者のためになるｍＲＮＡを肺細胞へ送達することが好ましい。その肺細胞において欠陥遺伝子と置換するｍＲＮＡを送達することが特に好ましい。従って、本発明の好ましい態様は、ｍＲＮＡが、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰＢ）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー３（ＡＢＣＡ３）又はα−１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰＣ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ヴィレブランド因子、ＡＤＡＭＴＳ１３、ヘプシジン、アンジオテンシン変換酵素ＩＩ、又はウイルス性及び細菌性病原体の抗原をコードする、方法及び組成物である。
【００２５】
本発明は、ｍＲＮＡを肺の中で発現させるための方法に使用するための、ｍＲＮＡとＰＥＩとを含む医薬組成物にも関する。本発明による医薬組成物は、肺障害、特に、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰＢ）欠損症、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー３（ＡＢＣＡ３）欠損症、嚢胞性線維症、α−１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症；肺癌、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰＣ）欠損症、肺胞タンパク症、サルコイドーシス、急性及び慢性気管支炎、気腫、マクラウド症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支喘息、気管支拡張症、塵肺症、石綿症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、新生児呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）、肺浮腫、肺好酸球増加症、レフレル肺炎、ハンマン・リッチ症候群、特発性肺線維症、間質性肺疾患、原発性線毛機能不全症、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）、及びＳＴＡＴ５ｂ欠損症、凝固障害、特に血友病Ａ及びＢ；補体障害、特にプロテインＣ欠損症、血栓性血小板減少性紫斑病、及び先天性血色素症、特にヘプシジン欠損症；肺感染症、好ましくは呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）感染症、インフルエンザウイルス感染症、ライノウイルス感染症、及び重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）感染症、結核、緑膿菌感染症、バークホルデリア・セパシア感染症、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症、及びインフルエンザ菌感染症から選択される肺障害の治療に特に適している。
【００２６】
本発明による好ましい医薬組成物は、少なくとも１つのフルオロカーボンをさらに含む。ペルフルオロカーボン類を用いるエアゾール療法は、一般に、そのペルフルオロカーボンの分子構造や蒸気圧とは無関係に、ガス交換の改善及び肺炎症反応の低下を示す。蒸気圧と分子構造の違いにより最適な投薬戦略が異なる場合はあるものの、いくつかの異なるペルフルオロカーボン類、例えば、ペルフルオロシクロエーテル（ＦＣ７７）、ペルフルオロオクチルブロミド、又はペルフルオロトリブチルアミン（ＦＣ４３）は、エアゾール療法に主に適していることが示された。
【００２７】
従って、本発明は、好ましくは、エアゾール剤として提供される。好ましい態様において、肺内投与を企図された本発明による医薬組成物は、トランスフェクション効率を高めるために医薬組成物より前か同時に投与されるペルフルオロカーボンと組み合わされる。
【００２８】
好ましい態様において、本発明によるｍＲＮＡ／ＰＥＩの組合せは、例えば吸入による、肺からの取込みに適した形態で提供される。これに適した処方は当業者に公知である。この場合、製剤は、例えば噴霧用の液剤又は散剤として、通常のネブライザー又は吸入器により気道へ導入できる形態である。液体としての投与用デバイスも公知であり、超音波ネブライザー又はノズルジェットネブライザーに比べて低い剪断力で作動する穿孔振動膜付きネブライザーが好適である。粉末エアゾール剤も好適である。ＰＥＩとの複合体であるｍＲＮＡは、糖のスクロースとともに凍結乾燥された後に粉末として利用可能であり、その後呼吸可能な大きさまで破砕することができ、そしてさらに生物活性を示す。
【００２９】
ｍＲＮＡ／ＰＥＩの組合せは、エアゾール剤として高圧でスプレーすることによって、気管内に投与されることが好ましい。
【００３０】
本発明の特に好ましい態様では、医薬製剤は、磁気粒子を含有するエアゾール剤、特に、エアゾール剤が、最小５ｎｍで最大８００ｎｍの直径を有する磁気粒子をｍＲＮＡ／ＰＥＩの組合せと一緒に含有する製剤として提供される（特許文献４）。磁気粒子は、通常最小５０ｎｍで最大７５０ｎｍ、好ましくは最小１００ｎｍで最大７００ｎｍ、より好ましくは最小１５０ｎｍで最大６００ｎｍ、さらにより好ましくは最小２００ｎｍで最大５００ｎｍ、特に好ましくは最小２５０ｎｍで最大４５０ｎｍ、最も好ましくは最小３００ｎｍで最大４００ｎｍの直径を有する。
【００３１】
好ましい態様によれば、ＰＥＩは、エアゾール剤において磁気粒子と結合している。
【００３２】
好ましくは、本発明による磁気粒子を含有するエアゾール剤は、金属及び／又はその酸化物及び／又は水酸化物から成るか、あるいはそれらを含有する。好ましい態様によれば、磁気粒子は、金属から成るか又はそれらを含有し、鉄、コバルト、又はニッケル、Ｆｅ３Ｏ４、γ−Ｆｅ２Ｏ３のような磁性酸化鉄又は水酸化鉄、二価若しくは三価の鉄イオンとＣｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｒ３＋、Ｇｄ３＋、Ｄｙ３＋、若しくはＳｍ３＋のような他の二価若しくは三価の金属イオンとの複酸化物又は複水酸化物、及びこれらのそれらの混合物から成る群より選択される。
【００３３】
磁気粒子を含有するこのようなエアゾール剤を適用する場合、この磁気粒子を含有するエアゾール剤は、治療すべき気道及び／又は肺の領域の表面へ磁場によって沈着され得る。好ましくは、磁場強度は、少なくとも１００ｍＴ（ミリテスラ）、少なくとも２００ｍＴ、少なくとも５００ｍＴ、又は少なくとも１Ｔ（テスラ）である。好ましくは、磁場勾配は、１Ｔ／ｍより大きいか又は１０Ｔ／ｍより大きい。この方法の好ましい態様によれば、磁場は、パルス磁場、振動磁場、又はパルス−振動磁場である。好ましくは、磁場は患者の呼吸と動的に適合しており、吸息と呼息の間又は呼息と吸息の間の休止期でのみアクティブである（特許文献４）。
【００３４】
特に適しているのは、タンパク質又はタンパク質断片をコードするｍＲＮＡを製剤化するために使用されるＰＥＩ  ２５ｋＤａであり、この製剤は、蒸留水で作製され、ジェットネブライザーを使用してエアゾール剤として肺へ適用される。
【００３５】
本発明の特に好ましい態様は、低ｐＨ及び低導電率の水性緩衝液及び溶媒を使用することによって調製される。ＰＢＳ緩衝液は、ｐＨ７．４及び導電率１６，５００±５００μＳ／ｃｍ（２５℃）である。本発明による組成物中のｍＲＮＡは、驚くべきことに、より低導電率及び／又はより低ｐＨの溶液剤を適用すれば、安定性が増加する。例えば、高圧滅菌した超純水は、導電率１±０．２μＳ／ｃｍ（米国薬局方では、２５℃での導電率の上限が１．３であることを必要とする）及びｐＨ５．０〜７．０である。０．２μｍフィルターに通して濾過した水道水は、導電率３００±５μＳ／ｃｍである。本発明の好ましい態様では、ＰＢＳ緩衝液よりｐＨも導電率も低い水性の緩衝液及び溶媒が適用される。故に、本発明による医薬組成物は、好ましくはｐＨ６．５未満、好ましくは３〜６、特に４〜５．５、及び／又は２５℃導電率（即ち、２５℃での導電率）１００００μＳ／ｃｍ以下、好ましくは１０００μＳ／ｃｍ以下、特に１００μＳ／ｃｍ以下である。例えば、特に好ましい態様は、（ＰＢＳのような緩衝液の代わりに）米国薬局方において定義されるような医薬的に許容される水（注射用水）を含有する。
【００３６】
当然ながら、本発明による医薬製剤は、医薬的に許容される担体、及び／又はさらなる補助化合物、特にヒト肺へ送達されるエアゾール組成物において通常提供される化合物をさらに含有することができる。
【００３７】
遺伝子治療の分野では、トランスフェクション効率の高さ故に、複製欠損ウイルスが最も成功裡に使用されてきた。しかしながら、それらを安全に適用するためには、挿入変異と望ましくない免疫応答誘発のリスクが依然として重大なままである。一方、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）送達については、非ウイルスベクターがより安全な代替手段として集中的に検討されてきたが、それらの遺伝子導入効率は、ウイルスベクターより依然として数倍低く、これは、ｐＤＮＡの核内への輸送が不十分であることに主に起因するとされてきた。非ウイルス遺伝子送達の分野では、最近、ｐＤＮＡに代わって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が魅力的で有望な代替手段として台頭してきた。この戦略は、ｐＤＮＡと比較していくつかの利点を兼ね備えている：ｉ）ｍＲＮＡがその機能を発揮するのは細胞質なので、ｐＤＮＡの重大な障壁である核膜を回避することができる；ｉｉ）挿入変異のリスクを排除することができる；ｉｉｉ）効率的なプロモーターの決定及び使用が省略される；ｉｖ）反復適用が可能である；ｖ）ｍＲＮＡは非分裂細胞においても有効である、並びにｖｉ）ベクター誘発性の免疫原性が回避可能であり得る。
【００３８】
ｍＲＮＡに基づいた遺伝子導入担体は、遺伝性疾患の潜在的な治療又は（抗腫瘍）予防接種のための、ＤＮＡより作製される担体に対する魅力的な代替手段として台頭してきた。癌免疫療法では、全抗原のすべてのエピトープを１つの工程で一緒に送達することが可能であるだけでなく、操作及び精製がかなり簡便でもあるという理由で、その成功した応用が実証されてきた。加えて、ｍＲＮＡはゲノム内に組み込まれず、トランスフェクションは一過性のままであるので、この戦略には、医薬品の安全性に関していくつかの利点がある。万能（versatile）抗原をコードするｍＲＮＡを樹状細胞（ＤＣ）への送達と組み合わせることは、癌患者において免疫応答を誘発するための強力で有望なアプローチである。
【００３９】
これまで、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）は、非ウイルス遺伝子導入のために主に使用されてきた。しかしながら、それは、非分裂性の哺乳動物細胞へはほとんどトランスフェクトできず、その上、細菌の非メチル化ＤＮＡ  ＣｐＧモチーフは、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）を介して強い免疫応答を誘発する。例えば、エレクトロポレーション、カチオン性ポリマー、又はカチオン性脂質の手段によってトランスフェクトされるＤＣは１〜１０％にすぎない。一方、ｍＲＮＡのエレクトロポレーションによるトランスフェクション効率は、トランスフェクト細胞が最大９５％に達すると以前に示されたことがある。上記の観察事実は、ｍＲＮＡ導入がｐＤＮＡ導入と比較して非常に有効であることを示唆するものであり、これは、大部分が、ｍＲＮＡを核内へ輸送する必要がないからである。その結果として、初期の劇的に高いタンパク質発現が報告された。
【００４０】
非ウイルス遺伝子導入にｍＲＮＡを使用することの上記に列挙した利点は強調されるべきであるが、ｍＲＮＡは真核細胞内でのメチル化を含めてほぼ１３種の異なるヌクレオシド修飾を受け、試験管内で転写されるｍＲＮＡでは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８に介在される強い免疫応答を引き起こし、それがその成功裡の生体内適用にとって重大な課題となっていることも注目しなければならない。しかしながら、修飾ヌクレオシドは、後に考察するように、これら免疫刺激作用の抑制に寄与する場合もある。
【００４１】
真核細胞内の成熟ｍＲＮＡは、５種の主要部分：キャップ構造（［ｍ７Ｇｐ３Ｎ（Ｎ：あらゆるヌクレオチド）］）、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、及び１００〜２５０アデノシン残基のテール（ポリ（Ａ）テール）から成る。試験管内で転写されるｍＲＮＡは、Ｔ７、ＳＰ６、又はＴ３のようなバクテリオファージプロモーターを有するプラスミドＤＮＡから入手することができる。試験管内転写は、市販のキットを使用する一般的な技術であり、十分量の機能性ｍＲＮＡを得る。これまでに、実行可能性と技術改良が劇的に進歩してきた。
【００４２】
キャップの１／３〜１／２は、試験管内転写のあいだに逆配向で取り込まれ、キャップ結合タンパク質である真核細胞翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）にとって認識し得ないものになることが見出された。正常なキャップ構造の代わりに、正常キャップの３’ＯＨ基が除去されているか又はＯＣＨ３で置換されている抗リバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）であるｍ２７，３’ＯＧｐ３Ｇ及びｍ７３’ｄＧｐ３Ｇであれば、誤った配向でのキャップ取込みを回避し得ることが発見された。その後、ＡＲＣＡに対する数多くの修飾が報告されてきた。きわめて興味深いことに、Ｃ３’位だけでなく、Ｃ２’位での修飾も逆の取込みを防ぐことが見出された。さらに、四リン酸ＡＲＣＡは、他のキャップ類似体より効率的に翻訳を推進することができる。結果として、試験管内ＡＲＣＡキャップ化転写産物（ＡＲＣＡ−ｍＲＮＡ）は、ウサギ網状赤血球溶解液において、正常なキャップ化転写産物（ＣＡＰ−ｍＲＮＡ）と比較して、有意に高い翻訳効率を示した。さらに、α−β−連結又はβ−γ−連結中の架橋酸素がそれぞれメチレン基で置換されたｍ２７，３’ＯＧｐｐＣＨ２ｐＧ又はｍ２７，３’ＯＧｐＣＨ２ｐｐＧは、デキャッピング酵素の１つであるヒトＤｃｐ２による加水分解に試験管内で耐性であり、ｍＲＮＡ安定性を高めると報告された（非特許文献９）。しかしながら、ｍ２７，３’ＯＧｐｐＣＨ２ｐＧは、ｅＩＦ４Ｅへの親和性を、ｍ２７，３’ＯＧｐ３Ｇと比較して５２〜６８％しか示さなかった。ホスホロチオエート担持ＡＲＣＡ（Ｓ−ＡＲＣＡ）は安定化し、翻訳効率を高めることが近年報告された。ＡＲＣＡのβ−リン酸部分の非架橋酸素をイオウで置換したｍ２７，２’ＯＧｐｐｓｐＧ（Ｄ２）でキャップ化されたルシフェラーゼ（ｌｕｃ）ｍＲＮＡは、正常キャップより５．１倍効率的に翻訳されることが見出された。別のジアステレオ異性型（Ｄ１）も、２．８倍高い翻訳効率を示した。Ｓ−ＡＲＣＡとＡＲＣＡのあいだで、翻訳効率に有意差は無かった。しかしながら、Ｄ２のｔ１／２（２５７分）は、正常キャップ（８６分）又はＡＲＣＡ（１５５分）と比較して、明確に延長されることがわかった。故に、ホスホロチオエートは、加水分解耐性に寄与するようである。
【００４３】
ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡの翻訳及び安定性に重要な役割を担う。ポリ（Ａ）テールは、ポリアデノシル結合タンパク質（ＰＡＢＰ）へ結合する。ＰＡＢＰは、ｅＩＦ４ＧのＮ末端と相互作用して、それがｍＲＮＡの環化をもたらす。加えて、ポリ（Ａ）テールは、数多くのＰＡＢＰに結合することができ、それがｅＩＦ４Ｇと相互作用することで、キャップ構造に対するｅＩＦ４Ｅの親和性が高まる。このキャップ−ポリ（Ａ）相互作用は、ｍＲＮＡの５’端と３’端とのあいだの物理的な相互作用から協同的に生じる。ポリ（Ａ）テールが除去されるか又は１２未満の残基へ短縮されると、５’キャップ構造の切断と５’→３’へのエクソヌクレオチド消化又は３’→５’への分解により、ｍＲＮＡの分解が生じる。これらの観察事実は、デキャッピング及びｍＲＮＡ分解を阻害するのにポリ（Ａ）テールがきわめて重要であることを例証している。試験管内転写では、鋳型プラスミドＤＮＡがポリｄ（Ａ／Ｔ）テールを含有していなければ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼによって転写後ポリアデニル化される場合がある。しかしながら、この場合、ポリ（Ａ）テールの長さは反応ごとに変動する場合があるものの、１つのアプローチの中では、この変動性は驚くほど低いままである。
【００４４】
大変興味深いことに、キャップ化ポリアデニル化ｍＲＮＡの翻訳が外因性ポリ（Ａ）のトランス付加によって阻害されるのに対し、キャップ化非ポリアデニル化ｍＲＮＡの翻訳は、あるポリ（Ａ）濃度の下でむしろ刺激されることが報告された。しかしながら、１０〜１８０残基から成る外因性ポリ（Ａ）のトランス付加は、ウサギ網状赤血球溶解液において、１００アデノシン残基のポリ（Ａ）テールを有するキャップ化ｍＲＮＡの翻訳を１１倍刺激した。１５〜６００残基の範囲にあるポリ（Ａ）テールの付加は、リポフェクションを使用するＡＲＣＡ−ｌｕｃ  ｍＲＮＡ−Ａ１００の同時トランスフェクションによって、タンパク質発現を２．３倍刺激した。
【００４５】
その上、キャップ構造もポリ（Ａ）テールも、タンパク質発現レベルに個別に寄与することが報告されてきた。ＡＲＣＡ−ｌｕｃ  ｍＲＮＡ−Ａ６４又は１００は、マウス樹状細胞（ＪＡＷＳＩＩ）においてリポフェクションを使用すると、ＣＡＰ−ｌｕｃ  ｍＲＮＡ−Ａ６４又は１００より、それぞれ２５倍及び５０倍高いルシフェラーゼ活性を示した。加えて、ＡＲＣＡ−ｌｕｃ  ｍＲＮＡ−Ａ１００は、ＣＡＰ−ｌｕｃ  ｍＲＮＡ−Ａ６４より７００倍高いルシフェラーゼ活性を示した。従って、樹状細胞では、長いポリ（Ａ）テールを修飾キャップ構造のＡＲＣＡと組み合わせることで、発現効率が大いに改善される。
【００４６】
酵素反応の性質に在るのは、ルシフェラーゼ活性がタンパク質発現レベルを間接的にしか測定しないことであり、そのことは、翻訳効率に対する実際の効果は依然として決定されていないことを意味する。ポリ（Ａ）テールの長さ（Ａ０、Ａ２０、Ａ４０、Ａ６０、Ａ８０、及びＡ１００）が樹状細胞だけでなく他の細胞種においても発現レベルに影響を及ぼすかどうかが検証された。興味深いことに、ラット由来骨芽細胞様の骨肉腫細胞株ＵＭＲ−１０６では、長さがＡ６０までのポリ（Ａ）テールを使用すると翻訳効率は高まり、それ以上にポリ（Ａ）テールの長さが増えると、翻訳効率は低下することが見出された。故に、ポリ（Ａ）の長さの翻訳に及ぼす効果は、細胞種に依存するのかもしれない。
【００４７】
また、ｍＲＮＡ修飾の安定性及び翻訳効率に対する影響が樹状細胞において検討された。ｉ）ポリ（Ａ）の長さをＡ１２０まで延長すること；ｉｉ）鋳型プラスミドベクターの線状化を行う際、ポリ（Ａ）テールの３’端での突出を回避して平滑末端のポリ（Ａ）テールを得るために、ＳａｐＩ及びＢｐｉＩのようなＩＩＳ型制限酵素を使用すること；ｉｉｉ）ヒトβ−グロビン遺伝子の２つの連続した３’ＵＴＲを、ＯＲＦとポリ（Ａ）テールとのあいだにクローン化することによって、ｍＲＮＡの安定性と翻訳効率を高めるのに重要な様々な因子を発見した。
【００４８】
様々なトランスフェクション試薬について、ｍＲＮＡ送達能が評価されてきた。現在まで、ほとんどの公表文献は、ｍＲＮＡトランスフェクション用リポプレックス、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、２５及び２２ｋＤａ）に基づくポリプレックス）は、かなり不良な結果をもたらすと示唆している。しかしながら、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリ（Ｌ−リジン）、及びデンドリマーが試験管内でｍＲＮＡを細胞内へトランスフェクトすることが可能であったにもかかわらず、ポリカチオンの使用については、これまで文献にほとんど記載されていない。
【００４９】
カチオン性脂質を利用する、哺乳動物細胞へのｍＲＮＡ導入の実行可能性については、１９８０年代後半にすでに記載されている。リポソーム（リポフェクチン）に取り込んだ合成カチオン性脂質ＤＯＴＭＡを使用して、試験管内でｍＲＮＡが異なる細胞株へ効率的にトランスフェクトされたのである。様々な量のｍＲＮＡの適用により、ルシフェラーゼ活性の線形応答が得られた。現在、最も効率的で最も広く使用されているカチオン性脂質は、比較的安価で試験管内及び生体内のｍＲＮＡ送達適用において効率的であるＤＯＴＡＰであろう。加えて、カチオン性ポリマーも、ｍＲＮＡトランスフェクションに使用し得る。還元性ポリカチオンに基づいたある種の合成ベクターは、２５ｋＤａ  ＰＥＩのｍＲＮＡトランスフェクション効率を圧倒的に超えた。しかしながら、その修飾ベクターを生体内の遺伝子導入に直接使用し得るかどうかは検討されていない。トランスフェクション機序に関して言えば、カチオン性のポリマー又は脂質とのあいだの結合力が、ｍＲＮＡ発現効率に影響を及ぼす重要なパラメータの１つを代表することが見出された。プラスミドＤＮＡ送達に有効であってｍＲＮＡに強固に結合する、分岐鎖ＰＥＩ  ２５ｋＤａ及び直鎖ＰＥＩ  ２２ｋＤａのようなカチオン性ポリマーでは検出可能な発現が生じないのに対し、低分子量のＰＥＩ  ２ｋＤａ結合ｍＲＮＡは、クロロキン又は化学的に結合したメリチンのようなエンドソーム溶解剤の存在下で、さほど効率的ではないものの、ＤＯＴＡＰに匹敵する高発現レベルをもたらした。上記の観察事実は、カチオン性ポリマーに結合する一本鎖ｍＲＮＡの方が、ｐＤＮＡ結合より強いことを示している。核移行と転写の前提条件としてカチオン性ポリマーからｐＤＮＡが放出されるには、細胞質ＲＮＡが関与することが示唆された。故に、ｍＲＮＡ送達用の新規カチオン性ポリマーの設計には、核酸の結合力に注意深く対処しなければならず、ｐＤＮＡ送達に使用される効率的なカチオン性ポリマーは、ｍＲＮＡ送達に適していない可能性がある。
【００５０】
ポリマー及びリポソームのベクター系とは別に、ここ数年の間に注目されるようになった興味深いさらなる選択肢は、エレクトロポレーションの使用である。外因性ＲＮＡの送達用のプロトコールが開発され、ヒト造血細胞とヒト胚性幹細胞において５０〜９０％のトランスフェクション効率をもたらした。ｍＲＮＡは核に入る必要がないので、穏やかな電気パルスをかければよく、細胞毒性が抑えられる。エレクトロポレーションの別の利点は、ＲＮＡが細胞質内へ直接輸送されるので、おそらくは固有のＲＮＡ受容体によって感受されず、それにより望ましくない免疫応答が回避され得ることであろう。
【００５１】
細菌ＤＮＡの生体内適用が、特に非メチル化ＣｐＧモチーフを介して、強い免疫応答をもたらし得ることがすでに示されている。軽度のサイトカイン応答しか誘発しない裸のＤＮＡとは対照的に、カチオン性脂質とのその複合体は強いサイトカイン応答をもたらす。カチオン性脂質の投与経路を変えても、炎症性サイトカインの発現を顕著に変化させなかったが、静脈内注射又はエアゾール送達の後のＰＥＩ−ＤＮＡは、カチオン性脂質と比較して、より低い肺サイトカインレベルをもたらした。これはおそらくは、それらのエンドソーム取込みの違いと、それによるＴＬＲ９受容体との相互作用の違いによるものであろう。
【００５２】
ＲＮＡ送達に対する応答についてはさらに探究されていない。ＤＮＡもＲＮＡもＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性化を通して哺乳動物の自然免疫系を刺激する。ヒト及びマウスにおいて、１３種のＴＬＲ（単にＴＬＲ１〜ＴＬＲ１３と命名されている）がすでに同定されており、このうちの多くの等価型が他の哺乳動物種で発見されている。注目すべきことに、様々なＴＬＲが、いくつかの構造的に無関係なリガンドを認識することができる。ＴＬＲ介在性の自然免疫系は蝶タイ構造（a bow-tie architecture）を有しており、多様な病原体とその分子が、非常に少数のリガンドによって表される。様々なＴＬＲの細胞内局在化は、それらのリガンドの分子パターンとある程度相関している。従って、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９はいずれも核酸様構造の認識に関与しているが、これらは、細胞内部に局在化している。ＴＬＲ３がｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｍＲＮＡを認識するのに対し、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８はｓｓＲＮＡに結合し、ＣｐＧ  ＤＮＡモチーフの認識はＴＬＲ９により介在される。
【００５３】
ＤＮＡ  ＣｐＧのメチル化（これは、ＴＬＲ９を介した認識を抑制する）と合致して、ＲＮＡの免疫原性は、類似した修飾型の制御下にあるらしい。試験管内で転写されたＲＮＡは、哺乳動物に典型的な修飾を示さなくても、樹状細胞による強いＴＮＦ−α応答をもたらした。大変興味深いことに、特定のヌクレオチドの修飾（例えばＮ６−メチルアデノシン又はシュードウリジン）は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８に介在されるサイトカイン分泌とＤＣの活性化を劇的に低下させた。従って、試験管内転写反応に修飾ＮＴＰを導入することによって、生体内で増幅される免疫応答を消失させることが可能であるかもしれない。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）では、ウリジン及びシチジンのわずか２５％を２−チオウリジン及び５−メチル−シチジンに置換すると、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＲＩＧ−Ｉのようなパターン認識受容体へのｍＲＮＡ結合が相乗的に減少した。これらの修飾は、試験管内及び生体内で自然免疫系の活性化を実質的に減少させると同時にｍＲＮＡの安定性を高め、培養ヒト及びマウスＩＩ型肺胞上皮細胞の８０％強において、細胞培養上清及びマウス血清のフローサイトメトリー及びサイトカインＥＬＩＳＡによって実証されるように、延長された高レベルの細胞内タンパク質発現を可能にした。内在性のｍＲＮＡ免疫原性を克服することは、例えば、遺伝性及び代謝性の疾患の治療のために、又は再生医学の分野において、反復投薬が求められる新規の治療法を可能にするのに不可欠であると考えられている。
【００５４】
上記のこととは対照的に、ＲＮＡの強い免疫刺激作用は、治療用のワクチン接種に使用される。特に、樹状細胞（ＤＣ）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として、ワクチン免疫原の標的とされ、抗原特異的Ｔ細胞及びＢ細胞の活性化がこれに続く。いくつかの生体内及び試験管内の試験は、ＤＣをｍＲＮＡの標的とすると腫瘍免疫又は抗腫瘍応答が誘発されることを示した。ｐＤＮＡのトランスフェクションと比較して、ｍＲＮＡベースの遺伝子導入は、ＤＣの腫瘍抗原負荷がより高く、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を刺激する可能性がより高かった。抗腫瘍アプローチとは別に、ＲＮＡをトランスフェクトされたＤＣを使用して、ＡＩＤＳ、Ｃ型肝炎、又は真菌感染症のような感染性疾患を治癒又は予防することも熱望された。ＲＮＡ予防接種を達成するための別の洗練された戦略は、抗原及びＲＮＡレプリカーゼをコードするバイシストロン性複製ＲＮＡによって標的抗原を発現させ、それによりアルファウイルスの能力を利用して多量のウイルスｍＲＮＡを産生することである。細胞がトランスフェクトされると、それ自体が多くのゲノムＲＮＡポジティブ鎖のＲＮＡレプリカーゼによる合成の鋳型となる、ゲノムのネガティブ鎖を合成するレプリカーゼ複合体によって、ウイルスＲＮＡが増幅される。このアプローチはマウスモデルにおいてすでに使用されており、免疫寛容を破綻させてメラノーマに対する免疫性を提供した。
【００５５】
本発明は、ｍＲＮＡを肺細胞に効率的に送達し、そのｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を上記細胞内で有効に発現させる好適な方法を可能にした。
【００５６】
本発明を以下の実施例及び付随の図面においてより詳しく説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５７】
１．ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と製剤化した、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及びメトリディア・ルシフェラーゼ（ｍｅｔＬｕｃ）をコードする化学修飾ｍＲＮＡ及び非修飾ｍＲＮＡのマウス肺への生体内エアゾール適用
化学物質
分岐鎖ＰＥＩ（平均分子量＝２５ｋＤａ）をシグマ・アルドリッチ（シュネルドルフ、ドイツ）より入手し、さらに精製せずに使用した。ＰＥＩを再蒸留水で希釈し、ＨＣｌでｐＨ７に調整した。再蒸留したエンドトキシン除去水をＤｅｌｔａ  Ｐｈａｒｍａ（ベーリンガー・インゲルハイム、ドイツ）より購入した。
【００５８】
ｍＲＮＡの産生
マウスＥＰＯ（ｍＥＰＯ）ｃＤＮＡのｐＶＡＸＡ１２０ベクターへのクローニング
ｍＥＰＯをコードするｃＤＮＡを、ｐＣＲ４ＥＰＯプラスミド（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより購入、カタログ番号：ＭＭＭ１０１３−９９８２９１５３）よりＥｃｏＲＩ消化により切り出し、ｐＶＡＸＡ１２０のそれぞれの部位へクローニングした。クローンを、ＰｍｅＩ消化を使用して挿入物についてスクリーニングし、ＮｈｅＩ（一本鎖消化）及びＳｍａＩ−ＸｂａＩ（二本鎖消化）を使用して配向についてスクリーニングした。３種すべての消化で正しいクローンをＲＮＡ産生に使用した。
【００５９】
ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡの産生
試験管内転写用の鋳型を作製するために、プラスミドをＸｂａＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で３７℃にて一晩消化することにより、ポリ（Ａ）テールの下流で線状化し、非特許文献１０に記載のようなクロロホルム抽出及び酢酸ナトリウム沈殿を使用して精製した。プラスミド鋳型の完全な線状化を１％アガロースゲルで確認した。
【００６０】
抗リバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ；Ｐ１−（５’−（３’−ｏ−メチル）−７−メチル−グアノシル）Ｐ３−（５’−（グアノシル））三リン酸ナトリウム塩、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ）を使用するＲｉｂｏＭＡＸラージスケールＲＮＡ産生システム−Ｔ７（プロメガ、ドイツ）を３０℃及び３７℃で用いて、製造業者のプロトコールに従い、ｐＶＡＸＡ１２０−ｍＥＰＯの試験管内転写を行った。化学修飾ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡ（ＥＰＯ  Ｍｏｄ）の試験管内転写では、シチジン−５’−三リン酸及びウリジン−５’−三リン酸のそれぞれ２５％を５−メチルシチジン−５’−三リン酸（ＴｒｉＬｉｎｋ、米国）及び２−チオウリジン−５’−三リン酸（ＴｒｉＬｉｎｋ、米国）に置換した。クロロホルム抽出及びＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア、ドイツ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによってｍＲＮＡの精製を実施した。産生したｍＲＮＡを、気管支上皮細胞株（ＢＥＡＳ−２Ｂ）及びヒト胚性腎上皮細胞株（ＨＥＫ２９３）のトランスフェクション、並びにＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ、ドイツ）によるｍＥＰＯ量の測定により、活性についてスクリーニングした。３０℃で産生したｍＥＰＯ  ｍＲＮＡでトランスフェクトされたＢＥＡＳ−２Ｂから、３７℃で産生したその対照物と比較して、有意に高量のｍＥＰＯを定量することができた。
【００６１】
メトリディア・ルシフェラーゼ（ＭｅｔＬｕｃ）ＯＲＦのｐＶＡＸＡ１２０ベクターへのクローニング
ＭｅｔＬｕｃ（クローンテック配列）をコードするＯＲＦを合成し、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ（ドイツ）によるｐＶＡＸＡ１２０のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。受領したｐＶＡＸＡ１２０−ＭｅｔＬｕｃプラスミドを、試験管内転写にさらに使用した。
【００６２】
化学修飾ＭｅｔＬｕｃ  ｍＲＮＡの産生
試験管内転写用の鋳型を作製するために、プラスミドをＸｂａＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で３７℃にて一晩消化することにより、ポリ（Ａ）テールの下流で線状化し、非特許文献１０に記載のようなクロロホルム抽出及び酢酸ナトリウム沈殿を使用して精製した。プラスミド鋳型の完全な線状化を１％アガロースゲルで確認した。
【００６３】
抗リバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ；Ｐ１−（５’−（３’−ｏ−メチル）−７−メチル−グアノシル）Ｐ３−（５’−（グアノシル））三リン酸ナトリウム塩、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ）を使用するＲｉｂｏＭＡＸラージスケールＲＮＡ産生システム−Ｔ７（プロメガ、ドイツ）を３０℃で用いて、製造業者のプロトコールに従い、ｐＶＡＸＡ１２０−ＭｅｔＬｕｃの試験管内転写を行った。化学修飾ＭｅｔＬｕｃ  ｍＲＮＡの試験管内転写では、シチジン−５’−三リン酸及びウリジン−５’−三リン酸のそれぞれ２５％を５−メチルシチジン−５’−三リン酸（ＴｒｉＬｉｎｋ、米国）及び２−チオウリジン−５’−三リン酸（ＴｒｉＬｉｎｋ、米国）に置換した。クロロホルム抽出及びＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア、ドイツ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによってｍＲＮＡの精製を実施した。産生したｍＲＮＡを、マウス線維芽細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）のトランスフェクション、及びメトリディア・ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用するＭｅｔＬｕｃ活性の測定により、活性についてスクリーニングした。
【００６４】
動物
６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｊａｎｖｉｅｒ（Ｒｏｕｔｅ  Ｄｅｓ  Ｃｈｅｎｅｓ  ＳｅｃｓＢＰ５、Ｆ−５３９４０  Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  Ｓｔ．Ｉｓｌｅ、フランス）より入手し、特定病原体のない条件下に維持した。実験に先立って、マウスを、この動物施設の環境に少なくとも７日間適応させた。すべての動物実験は、当地の倫理委員会によって承認及び管理されたものであり、動物の生命保護に関するドイツの法律のガイドラインに従って行った。
【００６５】
ＰＥＩ−ｍＲＮＡポリプレックスの調製
ポリプレックスを以下のように製剤化した：ｍＲＮＡ及びＰＥＩを４．０ｍｌの再蒸留水に希釈し、それぞれの濃度を２５０μｇ／ｍｌ  ｍＲＮＡ及び３２６．３μｇ／ｍｌ  ＰＥＩとした（Ｎ／Ｐ比１０に相当）。このｍＲＮＡ溶液をＰＥＩ溶液へピペット注入し、上下のピペッティングによって混合して、最終ｍＲＮＡ濃度を１２５μｇ／ｍｌとした。この複合体を、使用前に周囲温度で２０分間インキュベートした。本発明の過程の中では、複合体形成には、緩衝液を含まない水のみを使用することが特に有利であることが観測された。そうしなければ、ナノ粒子がマウスの肺において凝集するか又は効果がなくなり得るからである（非特許文献１）。
【００６６】
エアゾールデバイスの設計
全身デバイスにおける噴霧化手順では、蓋で密封し得る９．８×１３．２×２１．５ｃｍのプラスチック箱にマウスを入れる。この箱の一方の短辺面に、４個の小穴がエアゾール流出口として位置している。この箱は、反対の短辺面にある穴から直径２．１ｃｍの接続部品を介して幅１５．４ｃｍ×長さ４１．５ｃｍのプラスチックシリンダーに接続されている。このシリンダーの底は、シリンダーの他端に接続したジェットネブライザー（ＰＡＲＩ  ＢＯＹ（登録商標）ＬＣ  ｐｌｕｓ、ＰＡＲＩ  ＧｍｂＨ）によって産生されるエアゾールを乾燥するために１５０ｇのシリカゲル（１〜３ｍｍ、＃８５３３０；Ｆｌｕｋａ、スイス）で均等に覆われている（詳細は非特許文献１１に記載）。
【００６７】
肺ホモジネートにおけるＥＰＯ活性とＭｅｔＬｕｃ活性の測定
投与から２４時間後に、メデトミジン（１１．５μｇ／ｋｇ体重）、ミダゾラム（１１５μｇ／ｋｇ体重）、及びフェンタニル（１．１５μｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射によってマウスを麻酔し、正中切開によって腹膜を開いた。正中切開によって腹膜を開けた後で、動物より肺を切除し、ＰＢＳで灌流処理した。肺を液体窒素中で瞬間凍結させて凍結した状態で乳鉢及び乳棒でホモジナイズした。２５ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及びコンプリートプロテアーゼインヒビター（ロシュ・ダイアグノスティックスＧｍｂＨ、ペンツベルク、ドイツ）を含有する溶解緩衝液４００μｌを添加後、試料を氷上で２０分間インキュベートした。引き続き、タンパク質溶解液を１０，０００ｒｃｆで５分間遠心分離した。上清中のＥＰＯ活性をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄバイオシステムズ）で測定し、非特許文献１２に記載のようなセレンテラジン添加時の発光活性の測定によってＭｅｔＬｕｃ活性を分析した。
【００６８】
結果：
第一の実験は、非修飾ＥＰＯ  ｍＲＮＡ及び化学修飾ＥＰＯ  ｍＲＮＡが、ＰＥＩ  ２５ｋＤａとの組合せとして肺エアゾール送達されると、動物の肺細胞において有効に発現されることを示す。このことは、肺への送達方法がｍＲＮＡの化学組成とは無関係であることを示している。第二の実験は、メトリディア・ルシフェラーゼが、ＰＥＩ  ２５ｋＤａとの組合せとして肺エアゾール送達されると、動物の肺細胞において有効に発現されることを示す。このことは、肺への送達方法は、一本鎖のコーディングｍＲＮＡに制限されるものではなく、ｍＲＮＡがコードする配列とは無関係であることを示している。まとめると、上記のことは、本発明の目的が本発明による方法及び医薬製剤によって適切に対処し得ることを示している。
【００６９】
２．ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と製剤化した、ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする化学修飾ｍＲＮＡのマウスの肺への生体内エアゾール適用
化学物質
分岐鎖ＰＥＩ（平均分子量＝２５ｋＤａ）をシグマ・アルドリッチ（シュネルドルフ、ドイツ）より入手し、さらに精製せずに使用した。ＰＥＩを注射用水で希釈し、ＨＣｌでｐＨ７に調整した。エンドトキシン除去水をＢ．Ｂｒａｕｎ（メルズンゲン、ドイツ）より購入した。
【００７０】
化学修飾Ｌｕｃ  ｍＲＮＡの産生
試験管内転写（ＩＶＴ）用の鋳型を作製するために、プラスミドｐＶＡＸＡ１２０−ＬｕｃをＮｏｔＩで制限消化することにより線状化した。鋳型をクロロホルム−エタノール沈殿によってさらに精製した。鋳型の品質を非変性アガロースゲル電気泳動によって決定した。リボヌクレオチド三リン酸、抗リバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ、ｍ７，３’−ＯＧｐｐｐＧ）、及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含有する標準ＩＶＴミックスを用いてＩＶＴを行った。２５％の５−メチル−シチジン−５’−三リン酸及び２５％の２−チオ−ウリジン−５’−三リン酸を使用して修飾を導入した。ＡＲＣＡを使用して、キャップが所望の配向でのみ取り込まれることを確実にした。キャッピング後の手順を使用してキャップ−０又はキャップ−１の構造を含有するｍＲＮＡを作製するために、キャップ類似体を用いずにＩＶＴを実施したところ、５’端三リン酸を含有するｍＲＮＡを生じた。ワクシニアウイルスキャッピング酵素ｒＧＴＰ、及びメチルドナーとしてのＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を使用してキャッピングを実施し、７−メチルグアニル酸キャップ−０構造（ｍ７ＧｐｐｐＧ）を先のｍＲＮＡの５’端へ付加した。キャッピング後の手順より生じるｍＲＮＡの５’端にあるキャップ−０構造に隣接する第１のヌクレオチドの２’−Ｏ位にメチル基を付加するために、ｍＲＮＡキャップ２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼとＳＡＭを使用した。このメチル化は、ｍＲＮＡキャップのキャップ−１構造（ｍ７ＧｐｐｐＧｍ）をもたらした。酢酸アンモニウム沈殿によってｍＲＮＡの精製を実施した。修飾Ｌｕｃ  ＲＮＡを注射用水に再懸濁させ、ＵＶ測定、非変性アガロースゲル電気泳動、及びＮＩＨ３Ｔ３細胞内でのトランスフェクションを使用して、品質検査を実施した。
【００７１】
動物
６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスをＪａｎｖｉｅｒ（Ｒｏｕｔｅ  Ｄｅｓ  Ｃｈｅｎｅｓ  ＳｅｃｓＢＰ５、Ｆ−５３９４０  Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  Ｓｔ．Ｉｓｌｅ、フランス）より入手し、特定病原体のない条件下に維持した。実験に先立って、マウスを、この動物施設の環境に少なくとも７日間適応させた。すべての動物実験は、当地の倫理委員会によって承認及び管理されたものであり、動物の生命保護に関するドイツの法律のガイドラインに従って行った。
【００７２】
ＰＥＩ−ｍＲＮＡポリプレックスの調製
ポリプレックスを以下のように製剤化した：ｍＲＮＡ及びＰＥＩを４．０ｍｌの再蒸留水に希釈し、それぞれの濃度を２５０μｇ／ｍｌ  ｍＲＮＡ及び３２６．３μｇ／ｍｌ  ＰＥＩとした（Ｎ／Ｐ比１０に相当）。このｍＲＮＡ溶液をＰＥＩ溶液へピペット注入し、上下のピペッティングによって混合して、最終ｍＲＮＡ濃度を１２５μｇ／ｍｌとした。この複合体を、使用前に周囲温度で２０分間インキュベートした。本発明の過程の中では、複合体形成には、緩衝液を含まない水のみを使用することが特に有利であることが観測された。そうしなければ、ナノ粒子がマウスの肺において凝集するか又は効果がなくなり得るからである（非特許文献１）。
【００７３】
エアゾールデバイスの設計
全身デバイスにおける噴霧化手順では、蓋で密封し得る９．８×１３．２×２１．５ｃｍのプラスチック箱にマウスを入れる。この箱の一方の短辺面に、４個の小穴がエアゾール流出口として位置している。この箱は、反対の短辺面にある穴から直径２．１ｃｍの接続部品を介して幅１５．４ｃｍ×長さ４１．５ｃｍのプラスチックシリンダーに接続されている。このシリンダーの底は、シリンダーの他端に接続したジェットネブライザー（ＰＡＲＩ  ＢＯＹ（登録商標）ＬＣ  ｐｌｕｓ、ＰＡＲＩ  ＧｍｂＨ）によって産生されるエアゾールを乾燥するために１５０ｇのシリカゲル（１〜３ｍｍ、＃８５３３０；Ｆｌｕｋａ、スイス）で均等に覆われている（詳細は非特許文献１１に記載）。
【００７４】
生体内生物発光造影法を使用する、マウス肺におけるＬｕｃ活性の測定
投与から２４時間後に、メデトミジン（１１．５μｇ／ｋｇ体重）、ミダゾラム（１１５μｇ／ｋｇ体重）、及びフェンタニル（１．１５μｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射によってマウスを麻酔した。Ｄ−ルシフェリン基質（３ｍｇ／５０μｌ  ＰＢＳ／マウス）を鼻腔内経路より適用した（非特許文献１３）。１０分後に、ＩＶＩＳ１００造影システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、アラメダ、米国）及び以下のカメラ設定：視野１０、Ｆストップ  Ｆ１、高解像ビニング、及び露光時間１０分を使用して生物発光を測定した。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、バージョン２．５０（Ｘｅｎｏｇｅｎ、アラメダ、米国）を使用して、このシグナルを定量化して解析した。
【００７５】
結果：
この実験は、化学修飾Ｌｕｃ  ｍＲＮＡが、ＰＥＩ  ２５ｋＤａとの組合せとして肺エアゾール送達されると、マウスの肺細胞において有効に発現されることを示す（図３）。ルシフェラーゼ発現は、キャップ−１を含む化学修飾Ｌｕｃ  ｍＲＮＡにおいて最高である（図４）。まとめると、上記のことは、本発明の目的が本発明による方法及び医薬製剤によって適切に対処し得ることを示している。
【００７６】
３．ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と製剤化した、ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする化学修飾ｍＲＮＡのブタの肺への生体内エアゾール適用
化学物質
上記の実施例２を参照のこと。
【００７７】
化学修飾Ｌｕｃ  ｍＲＮＡの産生
上記の実施例２を参照のこと。
【００７８】
実験手順
アザペロン２ｍｇ／ｋｇ体重、ケタミン１５ｍｇ／ｋｇ体重、アトロピン０．１ｍｇ／ｋｇ体重の麻酔前投薬によってブタの沈静化を開始し、その後、外耳介静脈に静脈内ラインを挿入した。必要に応じて、プロポフォール３〜５ｍｇ／ｋｇ体重の静脈内注射によってブタを麻酔した。必要に応じて、１％プロポフォールの連続静脈内注入で麻酔を維持した。換気パラメータを呼気終末二酸化炭素に適合させ、必要であれば調整した。麻酔、呼吸、及び心臓血管系のパラメータについて、パルスオキシメトリー、カプノグラフィー、直腸温度プローブ、及び反射状態を用いて連続的にモニターした。ブタは、平衡電解液の注入を１０ｍｌ／ｋｇ／時で受けた。麻酔の継続時間はおよそ８０〜１２０分であった。ブタは、エアゾール適用（Ａｅｒｏｎｅｂ  メッシュネブライザー）が完了した後の沈静後に、外耳静脈を介したペントバルビタール１００ｍｇ／ｋｇ体重のボーラス注射でと殺した。肺を切り出してスライスし、およそ１ｃｍ厚の組織標本を様々な肺部位より採取して、インキュベーター内で３７℃（５％二酸化炭素）にて２４時間細胞培養培地中でインキュベーションした。ルシフェラーゼ活性を測定するために、ＰＢＳ中にＤ−ルシフェリン基質を含む（１００μｇ／ｍｌ）培地浴において組織標本を３７℃にて３０分間インキュベートし、体外ルシフェラーゼ生物発光造影法（ＩＶＩＳ  １００、Ｘｅｎｏｇｅｎ、アラマダ、米国）へ処した。
【００７９】
ＰＥＩ−ｍＲＮＡポリプレックスの調製
２チャンネルシリンジポンプ（ＫＤＳ−２１０−ＣＥ、ＫＤサイエンティフィック）を使用してポリプレックスを形成した。ｍＲＮＡ及びＰＥＩをそれぞれ１２．０ｍｌの再蒸留水で希釈し、それぞれの濃度を５００μｇ／ｍｌ  ｍＲＮＡ及び６５０μｇ／ｍｌ  ＰＥＩとした（Ｎ／Ｐ比１０に相当）。シリンジポンプの吸引機能を５ｍＬ／分の速度で使用して、両方の溶液を別々の２０ｍＬシリンジへ充填した。両方の試料を混合するために、２つのシリンジをＴ字形の管（Ｓａｆｅｆｌｏｗ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｓｅｔ、Ｂ．Ｂｒａｕｎ）を介して連結した。シリンジポンプの吸引機能を４０ｍＬ／分の速度で使用して混合を実施した。この複合体を、使用前に周囲温度で３０分間インキュベートした。本発明の過程の中では、複合体形成には、緩衝液を含まない水のみを使用することが特に有利であることが観測された。そうしなければ、ナノ粒子がマウスの肺において凝集するか又は効果がなくなり得るからである（非特許文献１）。
【００８０】
結果：
この実験は、噴霧水で処理した対照動物の肺ではルシフェラーゼ発現が見られない（図５ａ）のに対し、化学修飾Ｌｕｃ  ｍＲＮＡは、ＰＥＩ  ２５ｋＤａとの組合せとして肺エアゾール送達されると、ブタの肺細胞において有効に発現される（図５ｂ）ことを示す。まとめると、上記のことは、本発明の目的が本発明による方法及び医薬製剤によって適切に対処し得ることを示している。
【００８１】
４．注射用水（ＷＦＩ）は、ＰＥＩ製剤中の化学修飾ｍＲＮＡを安定化する
ｍＲＮＡ安定性に対する注射用水の効果を、アガロースゲル電気泳動によってＰＢＳと比較して検証した（図６）。ＰＢＳ中でＰＥＩと複合体化したｍＲＮＡでは、ｍＲＮＡ分解産物のスメアによって示されるように、室温で４時間のインキュベーション後に早くもｍＲＮＡ分解が生じるのに対し、ＷＦＩ中のＰＥＩ／ｍＲＮＡ製剤は、ｍＲＮＡ分解産物がより少ないこと（図５）及びｍＲＮＡ主要産物のバンド強度がより大きいことによって示されるように、顕著に安定化している。この効果は、短いＬｕｃ  ｍＲＮＡよりもＣＦＴＲ  ｍＲＮＡのような大きいｍＲＮＡでより明瞭であり、室温で２４時間のインキュベーション後ではさらにより明白になる。重要なことには、ｍＲＮＡ分解は、ｐＨ低下に伴って減少し、ｐＨ５で最小値に達する。この観測事実は、ｍＲＮＡをエアゾール送達するためにＰＥＩ製剤にＷＦＩを使用することの最も好ましい特性及び必要性を説明している。何故なら、ＷＦＩが通常ｐＨ５の酸性ｐＨであるため、水性ＰＥＩ製剤中での分解に抗してｍＲＮＡを本質的に安定化するからである。
【００８２】
実験手順
ｍＲＮＡ−ＰＥＩポリプレックスの調製。分岐鎖ＰＥＩ  ２５ｋＤａ（シグマ・アルドリッチ、シュネルドルフ）ストック溶液を、Ａｑｕａ  ａｄ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉａ（ＷＦＩ、Ｂ．  Ｂｒａｕｎ、メルズンゲン）又はダルベッコＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ダーマシュタット）で１０ｍｇ／ｍｌ及び５ｍｇ／ｍｌに調製し、ｐＨをＨＣｌでｐＨ７．４、ｐＨ６．０、又はｐＨ５．０に調整した。
【００８３】
２５μｌの修飾ｍＲＮＡ（１μｇ／μｌ）及び３．３μｌのＰＥＩストック溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を、５０μｌのＷＦＩ又はＤ−ＰＢＳで希釈し、それぞれ濃度を０．５μｇ／μｌ  ｍＲＮＡ及び０．６６μｇ／μｌ  ＰＥＩとした（Ｎ／Ｐ比１０に相当）。特許（特許文献２）に従って、修飾ｍＲＮＡ（１μｇ／μｌ）２５μｌ及びＤ−ＰＢＳ中のＰＥＩストック溶液（５ｍｇ／ｍｌ）６．６μｌを、５０μｌ  ＷＦＩで希釈した。ＰＥＩ溶液をゆっくりボルテックスし、それにＤＮＡ溶液を加えて、最終容量１００μｌとした。この混合物を使用前にそのまま室温で２０分間放置した。
【００８４】
非変性アガロースゲル電気泳動を使用する放出アッセイでは、１μｌのポリプレックス溶液を、４μｌのヘパリン溶液（ＷＦＩ中４０ｍｇ／ｍｌ）に加えた。この混合物を室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、５μｌの２×ＲＮＡローディング色素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を加え、試料を７０℃で１０分間インキュベートした。その後、試料を氷上に２分間置いてから、１％アガロースゲルにロードした。このゲルを１８０Ｖで１〜１．５時間操作して、Ｉｎｔａｓ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して可視化した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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