(57)【要約】逆相クロマトグラフィー用材料は固体支持体に結合した表面修飾無極性および荷電基を含み、前記荷電基は表面修飾基の約０．２５〜約２２％の量、または３．６μｍｏｌ／ｍ２の表面修飾基の総量を有する材料の固体支持体の表面に対して約０．０１μｍｏｌ／ｍ２〜０．８μｍｏｌ／ｍ２の量で存在する。こうした材料およびペプチドのような活性医薬成分（ＡＰＩ）の適切な精製条件は、（ａ）対象のＡＰＩの等電点（ｐＩ）を決定し、（ｂ）固相材料が安定である範囲内のｐＨを選択し、（ｃ）ｐＩ−ｐＨ差を決定し、（ｄ）ｐＩ−ｐＨ差が正である場合、アニオン交換（ＡＩＥＸ）材料を選択する、またはｐＩ−ｐＨ差が負である場合、カチオン交換（ＣＩＥＸ）材料を選択することにより、評価することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体支持体に結合した表面修飾基を含む逆相クロマトグラフィー用材料であって、前記表面修飾基が水平重合せず、前記表面修飾基が無極性非荷電基および極性基を含み、前記極性基が荷電基であり、前記荷電基が正電荷または負電荷のいずれかを有し、前記荷電基が表面修飾基の約０．２５〜約２２％の量、または３．６μｍｏｌ／ｍ２の表面修飾基の総量を有する材料の固体支持体の表面に対して約０．０１μｍｏｌ／ｍ２〜０．８μｍｏｌ／ｍ２の量で存在する、材料。
【請求項２】
前記無極性非荷電基が直鎖Ｃ４〜Ｃ１８アルキル基、好適にはＣ８基であり、前記荷電基が、Ｃ３基のような、脂肪族Ｃ１〜Ｃ１８基の末端置換基である、請求項１に記載の材料。
【請求項３】
前記荷電基の前記脂肪族基が、無極性Ｃ８基と組み合わせた荷電Ｃ３基のような、無極性基の長さと比べて短いまたは同様の長さを有する、請求項１または２に記載の材料。
【請求項４】
前記荷電基が−ＮＲ３＋、好適にはＲが水素、もしくはメチルのようなＣ１〜Ｃ２アルキルである−ＮＲ３＋、または−ＳＯ３−から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の材料。
【請求項５】
前記固体支持体がシリカゲル、５０〜３００Å、好適には約１００Åの多孔性、および５〜１００μｍ、好適には１０〜２０μｍの孔径を有する好適には高純度シリカゲルである、請求項１〜４のいずれかに記載の材料。
【請求項６】
活性医薬成分（ＡＰＩ）、好適にはペプチドの逆相クロマトグラフィー分離方法であって、（ａ）対象のＡＰＩの等電点（ｐＩ）を決定し、
（ｂ）固相材料が安定である範囲内のｐＨを選択し、
（ｃ）ｐＩ−ｐＨ差を決定し、
（ｄ）ｐＩ−ｐＨ差が正（ｐＩ＞ｐＨ）である場合、アニオン交換（ＡＩＥＸ）材料を選択する、または
ｐＩ−ｐＨ差が負（ｐＩ＜ｐＨ）である場合、カチオン交換（ＣＩＥＸ）材料を選択する
ことにより、適切な逆相材料、とくに請求項１〜５のいずれかに記載の逆相材料、およびＡＰＩ精製条件を評価するステップを含む、方法。
【請求項７】
（ｅ）溶離条件を適応することにより所望の保持時間を評価する
ステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記溶離条件が緩衝液のイオン強度の決定を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記溶離条件が溶離系、初期溶離液組成および勾配の決定を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶離液が水性緩衝液およびアセトニトリルである、請求項６〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ｐＨが３〜９、好適には４〜７から選択される、請求項６〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ｐＩ＞ｐＨである条件下でのタンパク質の逆相精製のための、固体支持体に結合した表面修飾基を含む逆相クロマトグラフィー用材料であって、前記表面修飾基が無極性非荷電基および極性基を含み、前記極性基が正荷電基、とくに請求項１〜５のいずれかに記載の正荷電材料である、材料の使用。
【請求項１３】
ｐＩ＜ｐＨである条件下でのタンパク質の逆相精製のための、固体支持体に結合した表面修飾基を含む逆相クロマトグラフィー用材料であって、前記表面修飾基が無極性非荷電基および極性基を含み、前記極性基が負荷電基、とくに請求項１〜５のいずれかに記載の負荷電材料である、材料の使用。
【請求項１４】
すべての表面修飾基を無極性基および極性荷電基を含む液体溶液から同時に付着させるステップ、ならびに任意で付着した無極性およびイオン性基の量を測定するステップを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の逆相クロマトグラフィー用材料の製造方法。
【請求項１５】
無極性基を付着させる第１ステップ、およびその後荷電基を付着させる第２ステップまたは逆を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の逆相クロマトグラフィー用材料の製造方法において、前記第１ステップがいくつかの利用可能なシラノール基が反応しないように行われ、任意で実際に付着したイオン性基が測定される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は２０１２年３月２８日に出願されたスイス特許出願第０４３９／１２号の優先権を主張し、その全開示を本明細書に参照により組み入れる。
【０００２】
本発明は、クロマトグラフィーによるペプチドのような活性医薬成分の精製の分野、とくに逆相クロマトグラフィー用のシリカゲル系材料に関する。
【背景技術】
【０００３】
逆相クロマトグラフィーは広く用いられているペプチドの精製方法である。液体クロマトグラフィーにおいて固定相として用いるいくつかの材料は、支持体または担体およびその上に付着した官能基を含む。こうした材料は結合相としても知られる。一般的に用いられる担体は、適切なシランにより適切に表面修飾してもよい、シリカゲルである。シランのさまざまな表面との化学反応はよく研究されている。シランのシリカ系クロマトグラフィー支持体材料の表面との反応の一般的な議論は、ＨＰＬＣ  Ｃｏｌｕｍｎｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕ．Ｄ．Ｎｅｕｅ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）に記載されている。シランの多孔質シリカとの反応についてのさらなる詳細は、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｓｕｒｆａｃｅ，Ｅ．Ｆ．Ｖａｎｓａｎｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂ．Ｖ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）に開示されている。シランのさまざまな材料との反応の広範な説明は、Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  Ｂｏｎｄｅｄ  Ｐｈａｓｅｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｉｎ  ＬＣ，Ｒ．Ｐ．Ｗ．Ｓｃｏｔｔ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）に記載されている。
【０００４】
結合相の調製は、異なる強さの結合層をもたらす単官能性、二官能性および三官能性シランを用いて行うことができる。
【０００５】
単、二または三官能性シランが用いられるかにかかわらず、平衡反応および立体障害のため、すべてのシラノール基をシリル化試薬と反応させることは不可能である。ほぼ完全な表面被覆はシリル化試薬が水平重合した場合のみ得られる。もっとも積極的なシラン化反応でも、シラノール基の５０％以下しかシリル化誘導体に変換することができないことが報告されている。
【０００６】
ほとんどの市販の結合相は、二および三官能性シランを用いる結合相の調製には再現性に難点があるため、単官能性シランをベースとする。
【０００７】
もとのシラノール基のかなりの部分が残るので、遮蔽されない限りこれらは親シラン性分析物と相互作用し得る。これらの相互作用を低減するのに一般的に用いられる方法は、いわゆるエンドキャッピングである。ここでは小さな単官能性シラン（例えばトリメチルクロロシラン）をシリカゲル表面と反応させ、シリカゲル表面の追加の被覆をもたらす。
【０００８】
米国特許第ＵＳ７，１２５，４８８Ｂ２号は、極性修飾固定相材料であって、極性修飾をもたらす特定のシランで修飾したシリカゲルのような無機支持体を有する材料を提供することにより、これまで存在していた問題を解決することを教示する。極性修飾は、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−のような基を含む。
【０００９】
最近では、バイモーダルな化学表面特性を有する固定相の開発がとくに重視されている。逆相／イオン交換（ＲＰ／ＩＥＸ）混合モード固定相が知られ、より多くの非極性、イオン性および非イオン性分析物に加え、さまざまな荷電極性化合物を保持および分離する  高い汎用性および性能を約束する。官能基の構成により、ＲＰ／ＩＥＸバイモーダルカラムは４つのカテゴリーに分類することができる。材料の１つのタイプはＲＰおよびＩＥＸビーズの混合物である。材料の別のタイプは同じビーズに付着した同様の量のアミンおよびカルボン酸のような無極性基および極性基を含み、材料の第３のタイプは先端に極性基を有する無極性鎖を含み、混合モード材料の第４のタイプは無極性鎖内に埋め込まれたアニオンまたはカチオン荷電基を含む。
【００１０】
英国特許第ＧＢ２０７４８９２Ａ号は、１種類のリガンドがイオン性または逆相リガンドから選択され、第２の種類がジオール、ジオール前駆体またはアミドのような親水性基である、混合表面を有する材料について記載する。
【００１１】
また英国特許第ＧＢ２４３１３９９Ａ号は、２つの異なるシリル部分が結合した混合表面について開示する。これらのシリル部分のそれぞれは、２つのＣ１〜Ｃ６アルキル鎖および１つのさらなる基を含む。好適な実施形態では、前記さらなる基は、シリル基の１つの上の無極性基および他のシリル基の上の無極性鎖に埋め込まれた極性基である。
【００１２】
ナノポリマーシリカハイブリッド技術に基づくトライモーダルカラムもすでに知られている。こうしたカラムはＤｉｏｎｅｘのＡｃｃｌａｉｍ（登録商標）Ｔｒｉｎｉｔｙ（商標）Ｐ１を含む。この材料は、荷電（例えばカチオン交換官能基を有するような）ナノポリマー粒子でコーティングされ、シリカゲルの内孔領域がＲＰおよびＩＥＸ特性をもたらす有機層で修飾された、高純度多孔質球状シリカゲルで構成される。
【００１３】
他の混合モード材料が開発され、商標Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）（Ａｋｚｏ  Ｎｏｂｅｌ所有）で記載されている。これらの一粒子多樹脂固定相は、５０％または２５％の極性官能基（ＣＮ、ＮＨ２、ジオール）のような異なる官能基を含むことが記載されている。これらの相はいくつかの例でより良い分離をもたらすが、それらはまだ多くの用途について十分ではない。
【００１４】
中国特許第ＣＮ１０１８２９５５１Ａ号は、乳試料からのメラミンおよびいくつかの植物ホルモンの分離に用いられる、無極性リガンドおよびアニオン性リガンドと結合したクロマトグラフィー材料について開示する。アニオン性基の密度は３３〜６６％であることが開示されている。
【００１５】
水平重合により向上したリガンド密度を有する材料もすでに知られている。これらの材料は、ただグラフトした材料よりかなり高いリガンド密度を有することが見出された。最初、水平重合材料は、Ｆａｉｒｂａｎｋ  ａｎｄ  Ｗｉｒｔｈ，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ−ａｄｓｏｒｂｅｄ  ｗａｔｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，８３０（１９９９）２８５−２９１により記載され、Ｌｉ，Ｃａｒｒ  ａｎｄ  Ｅｖａｎｓ，Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌｌｙ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ  ｂｏｎｄｅｄ  ｐｈａｓｅ  ｆｏｒ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，８６８（２０００）１５３−１６７によりさらに研究された。この技術の異なる種類のリガンド、すなわち無極性および極性リガンドまたは無極性およびイオン性リガンドへの適応は、国際公開第ＷＯ２０１１／０１２０１９号およびＷｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｎｅｗ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ／ｓｔｒｏｎｇ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｍｉｘｅｄ−ｍｏｄｅ  ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｐｈａｓｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｐｏｌａｒ−ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ  ａｃｉｄｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，１２４６（２０１２）１２９−１３６に記載されている。
【００１６】
こうした水平重合材料の問題は、製造の成功が吸着水に依存し、よってかなり複雑な手順を用いて製造しなければならず、非常に高価となり、これにより予備用途には適さなくなることである。加えて、こうした材料は特定のアリストロキン酸の分析用の濃縮には成功裏に適用されたが、予備用途では失敗した（Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００１７】
最新の材料は、分離の質に関して、および／または保持時間に関して、および／または−とくに予備用途に望まれる場合−それらの製造コストに関して十分ではないので、向上した材料の必要性はまだ存在する。
【発明の概要】
【００１８】
従って、本発明の一般的な目的は、特定の活性医薬成分（ＡＰＩ）の精製または分離、とくに特定のＡＰＩの予備精製または分離に適応した逆相クロマトグラフィー用の固定相材料を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、逆相クロマトグラフィーによるＡＰＩ精製に適切な固定相材料および／または適切な溶離条件を選択することができる方法を提供することである。
【００２０】
ここで、説明が進むにつれより容易に明らかとなるこれらのおよびまたさらなる本発明の目的を実行するため、逆相クロマトグラフィー用材料は固体支持体に結合した表面修飾基を含み、前記表面修飾基は水平重合せず、無極性非荷電基および極性基を含むが、前記極性基は荷電基であり、前記荷電基は正電荷または負電荷のいずれかを有し、前記荷電基は表面修飾基の約０．２５〜約２２％の量、または３．６μｍｏｌ／ｍ２の表面修飾基（すなわち無極性非荷電基および荷電基）の総量を有する材料の固体支持体の表面に対して約０．０１μｍｏｌ／ｍ２〜０．８μｍｏｌ／ｍ２の量で存在するという特徴により示される。
【００２１】
表面修飾基の総量は元素分析のような標準的な技術により測定され、荷電基の量はイオン滴定により測定することができる。
【００２２】
本発明による逆相クロマトグラフィー用材料は、荷電基を多くとも２２％、好適には多くとも２０％、１５％または１０％の小さな（ドーピング）量で含むので、ドープ材料、逆相クロマトグラフィー用ドープ材料またはドープ逆相材料とも称される。
【００２３】
ドーピング効果は、無極性および荷電基での総表面被覆率が高すぎない、すなわち水平重合で得られるほどは高くない場合、最良であると考えられる。水平重合で得られるこの高い表面被覆率は、Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．に報告される予備分離実験における悪い結果の原因である可能性があると考えられる。
【００２４】
ＡＰＩの語は、本明細書において用いられる場合、無極性および荷電基を有する分子、とくにペプチド、好適には最大約５０個のアミノ酸（ａａ）を有するペプチドを示す。
【００２５】
固体支持体それ自体は実質的に遮蔽されるので、クロマトグラフィーの目的について知られるいずれの固体支持体を用いることもできる。シリカゲルが、しかしながら、例えばシランとの反応によって修飾基の容易な付着を可能にする表面上のシラノール基のため好まれる。適切なシランは、例えばモノクロロ置換シランのような単官能性シランまたはトリメトキシシランのような三官能性シランである。現在トリメトキシシランが、最大３つの隣接するシラノール基と反応し、これによりシラノール基を遮蔽し、同時に修飾置換基の固定を強化することができるので、好まれている。また、表面は、三官能性シランが用いられた場合でも、置換基／表面修飾基で十分に覆われることを示した。加えて、三官能性シランについての最新の報告におけるこれまでの再現性の問題は見られなかった。
【００２６】
適切なシリカゲルは、５０〜３００Å、好適には約１００Åの多孔性、および５〜１００μｍ、好適には１０〜２０μｍの粒径を有する高純度シリカゲルである。
【００２７】
好適な無極性非荷電基は直鎖Ｃ４〜Ｃ１８アルキル基、とくにＣ８アルキル基であるが、アルケニルおよびアルキニル基を用いることもできる。アルキル基は、最大の運動自由度を有するので、好まれる。
【００２８】
荷電基は好適には、荷電基が非荷電、無極性基より優勢にならないように無極性基より短いまたは同様の長さの脂肪族鎖上に配置する。より短い鎖は、例えば最大６つのＣＨ２基、通常は最大５つのＣＨ２基、好適には３〜５つのＣＨ２基分短くてもよい。従って、荷電基を有する炭化水素鎖はＣ１〜Ｃ１８鎖であってもよい。荷電基を炭化水素鎖中に埋め込むことが知られているが、現在炭化水素鎖の末端位置または先端位置それぞれの置換基が好まれている。
【００２９】
荷電置換基は、同じ電荷を有するアミノ酸に反発し、反対の電荷を有するアミノ酸を誘引する効果を有する。荷電置換基の電荷は重要ではないが、現在、Ｒ＝水素もしくはＣ１〜Ｃ２アルキルである−ＮＲ３＋、または−ＳＯ３−のような単一荷電置換基が多重荷電置換基より好まれている。すでに単一荷電した置換基は少量で十分な効果を有する。
【００３０】
精製するＡＰＩおよび分離条件に応じて、異なるドープ逆相材料が適切であり得る。最良の材料およびＡＰＩ精製条件は、
（ａ）対象のＡＰＩの等電点（ｐＩ）を決定し、
（ｂ）固相材料が安定である範囲内のｐＨを選択し、
（ｃ）ｐＩ−ｐＨ差を決定し、
（ｄ）ｐＩ−ｐＨ差が正（ｐＩ＞ｐＨ）である場合、アニオン交換（ＡＩＥＸ）材料を選択する、または
ｐＩ−ｐＨ差が負（ｐＩ＜ｐＨ）である場合、カチオン交換（ＣＩＥＸ）材料を選択する
ことにより選択することができる。
【００３１】
よって、本発明は、
（ｉ）ｐＩ＞ｐＨである条件下でのＡＰＩ、とくにタンパク質の逆相精製のための、固体支持体に結合した表面修飾基を含む逆相クロマトグラフィー用材料であって、前記表面修飾基が無極性非荷電基および極性基を含み、前記極性基が正荷電基、とくに上で定義したような正荷電材料である、材料の使用、および
（ｉｉ）ｐＩ＜ｐＨである条件下でのＡＰＩ、とくにタンパク質の逆相精製のための、固体支持体に結合した表面修飾基を含む逆相クロマトグラフィー用材料であって、前記表面修飾基が無極性非荷電基および極性基を含み、前記極性基が負荷電基、とくに上で定義したような負荷電材料である、材料の使用
も含む。
【００３２】
等電点の決定は、実験的測定、アミノ酸（ａａ）配列からの計算、個人の知識を含む文献または他の情報源中のそれぞれの情報の検索も含む。
【００３３】
ｐＨは材料の寿命に影響しないように選択されるべきである。シリカゲルについては３〜９のｐＨが好まれ、４〜７のｐＨがさらにより好まれる。
【００３４】
材料が選択された場合、所望の保持時間を固定することができ、次に緩衝液のイオン強度を決定することにより、ならびに／または移動相の溶媒系（溶離系）および勾配を決定することにより溶離条件をこれに適応することができる。
【００３５】
考えられる溶離系は、少なくとも１つの極性溶媒、好適には水、例えば特定のｐＨの水、および水の極性より低い極性を有する少なくとも１つのさらなる極性溶媒の組み合わせを含む、またはこれで構成される。こうした低極性溶媒は、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン（ｔｈｆ）、アセトニトリルおよびこれらの組み合わせを含む、またはこれらで構成される群から選択してもよい。好適な実施形態では、単純に特定のｐＨの水ではなく、緩衝水溶液が用いられる。
【００３６】
異なる分離用途に適していることが示された１つの溶離系は、水性緩衝液およびアセトニトリルである。溶離系の出発組成および最終組成ならびに勾配は、通常の方法により測定することができる。
【００３７】
下記のその詳細な説明を考慮すると、本発明がより良く理解され、上で記載したもの以外の目的が明らかになるだろう。こうした説明は添付の図面を参照する：
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】反応混合物中のアニオン性官能基（−ＳＯ３−）とシリカゲルに付着したアニオン性官能基との間の相関を示す。
【図２】反応混合物中のカチオン性官能基（−ＮＲ３＋）とシリカゲルに付着したカチオン性官能基との間の相関を示す。
【図３ａ】緩衝液濃度（図３ａは３００ｍＭの酢酸塩、図３ｂは５００ｍＭの酢酸塩、図３ｃは８００ｍＭの酢酸塩）の、さまざまなカラム上での正荷電ＡＰＩの保持時間に対する効果を示す。
【図３ｂ】緩衝液濃度（図３ａは３００ｍＭの酢酸塩、図３ｂは５００ｍＭの酢酸塩、図３ｃは８００ｍＭの酢酸塩）の、さまざまなカラム上での正荷電ＡＰＩの保持時間に対する効果を示す。
【図３ｃ】緩衝液濃度（図３ａは３００ｍＭの酢酸塩、図３ｂは５００ｍＭの酢酸塩、図３ｃは８００ｍＭの酢酸塩）の、さまざまなカラム上での正荷電ＡＰＩの保持時間に対する効果を示す。
【図４ａ】アセトニトリル勾配の変更の保持時間に対する効果を示し、図４ａは同じ溶離条件を用いて特定のカラムの保持時間を示す。
【図４ｂ】アセトニトリル勾配の変更の保持時間に対する効果を示し、図４ｂは初期組成および／または勾配を変えることにより保持時間をまとめることができることを示す。
【図５】異なるカラム材料上および２つの異なるｐＨでのインスリン／デサミド−インスリン（インスリンｐＩ＝５．３）の分離についての選択性を示す。
【図６】実施例５による合成ペプチド１の予備精製を示す。
【図７】実施例６による合成ペプチド２の予備精製を示す。
【図８】実施例７による合成ペプチド３の予備精製を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
現在好まれている表面修飾方法により、すべての表面修飾基は、無極性基および極性荷電基を含む液体溶液から同時に付着させる。用いられる置換基に応じて、反応は荷電または無極性基に多少有利であり得ることが見出された。従って、実際に得られた材料は例えばイオン滴定により測定しなければならない。
【００４０】
反応はいくつかのステップで、すなわちまず無極性基、その後荷電基の付着またはその逆で行うことも可能である。この手順では、しかしながら、反応条件は、第１ステップでいくつかの利用可能なシラノール基が反応しないように選択しなければらない。いずれにせよ、２（以上）ステップの手順でも、実際に付着したイオン性基は、例えばイオン滴定により測定しなければならない。
【００４１】
荷電基の好適および／または入手可能な範囲は荷電基ごとに変わり得る。−ＳＯ３−の通常の範囲は０．０１μｍｏｌ／ｍ２〜０．０４μｍｏｌ／ｍ２であり、−ＮＲ３＋の通常の範囲は０．０１μｍｏｌ／ｍ２〜０．８μｍｏｌ／ｍ２であるが、より高い量は容易に製造することができる（以下の実施例参照）。例えばＲ＝ＣＨ３である、より高い−ＮＲ３＋ドープ材料は、しかしながら、より良くないことが見出された（図３および４参照）。イオン性基の量の下限は、可視効果のため存在しなければならないドーピングイオン性基の最小数である。上限は吸着の強さまたは弱さそれぞれによりもたらされる。よって、指示量より高いイオン性基を用いてもよいが、より悪い分離および／または不適切な保持時間をもたらす可能性がある。
【００４２】
ドーピングの効果は、正荷電したＡＰＩ（それぞれ、等電点ｐＩ−ｐＨ＝正、またはｐＩ＞ｐＨ）の場合、ＡＩＥＸ材料、例えば−ＮＲ３＋ドープ材料上の吸着は弱く（反発）、ＣＩＥＸ材料、例えば−ＳＯ３−ドープ材料上では強く（誘引）、逆の場合も同様である。
【００４３】
上で示したとおり、無極性基は好適には少なくともＣ４基であり、通常はＣ１８基以下であり、Ｃ８基が現在好まれている。荷電基はいずれかの荷電置換基、好適にはＣ１〜Ｃ１８炭化水素に付着した荷電置換基、より好適には無極性鎖よりわずかに小さいまたはほぼ同じ長さを有する炭化水素に付着した荷電置換基を含む。置換基が水素より大きいという事実のため、荷電置換基含有基は通常および好適には、無極性基のＣ８と比べてわずかに短い鎖、例えばＣ３を有する。いずれの解釈によっても本発明の範囲を低減することを望むことなく、本発明者らは、より短い炭化水素鎖によるイオン性基の付着は、イオン性基の弱い遮蔽、およびよって分析物中の分子のより低い誘引または反発をもたらすと考える。
【実施例】
【００４４】
本発明をここでいくつかの実施例によりさらに説明する。
【００４５】
（実施例１）
いくつかのＣＩＥＸおよびＡＩＥＸ材料を、標準的な手順に従って、Ｃ８含有オクチルトリメトキシシランおよび（０％）、５％、１０％、１５％または５０％の−ＳＯ３−荷電または−ＮＲ３＋荷電Ｃ３化合物を含む組成を用いることにより調製した。
【００４６】
−ＮＲ３＋材料（Ｒ＝メチル）を、所望の量のシリカゲル、オクチルトリメトキシシラン、塩化Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム、およびｐ−トルエンスルホン酸（触媒）を組み合わせ、トルエン中、還流下で６時間沸騰させることにより製造した。
【００４７】
所望の量は下記のとおりだった：
（１−ｘ）×５．６×１０−６ｍｏｌ／ｍ２×Ｓ×Ｍ×ＭＷｔの濃度のオクチルトリメトキシシランであって、式中、
ｘは−ＮＲ３＋基の所望の重量パーセントであり、
Ｓはシリカゲルの比表面（ｍ２／ｇ）であり、
Ｍは用いたシリカゲルの質量（ｇ）であり、
ＭＷｔはオクチルトリメトキシシランの分子量（ｇ／ｍｏｌ）である。
【００４８】
塩化Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムを、メタノール中の５０重量％のシランの溶液として用い、用いた溶液量は
ｘ×２ｇ／ｇ×Ｍ＝ｘ×２×Ｍであって、式中、
ｘは上述したように−ＮＲ３＋基のパーセントであり、
Ｍはシリカゲルの質量（ｇ）である。
【００４９】
ｐ−トルエンスルホン酸（触媒）を、オクチルトリメトキシシランおよび塩化Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムの８．６×１０−３ｇ／ｇの濃度で用いた。
【００５０】
６時間後、材料をエンドキャップし、すなわち反応させず、まだアクセス可能なシラノール基をトリメチルクロロシランと標準的な技術により反応させ、異なる極性を有する一連の溶媒で洗浄した。
【００５１】
−ＳＯ３−材料を、所望の量のシリカゲル、オクチルトリメトキシシラン、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、およびｐ−トルエンスルホン酸をトルエン中で組み合わせ、還流下で６時間沸騰させることにより製造した。
【００５２】
所望の量は下記のとおりだった：
（１−ｘ）×５．６×１０−６ｍｏｌ／ｍ２×Ｓ×Ｍ×ＭＷｔの濃度のオクチルトリメトキシシランであって、式中、
ｘは−ＳＯ３−基の所望の重量パーセントであり、
Ｓはシリカゲルの比表面（ｍ２／ｇ）であり、
Ｍは用いたシリカゲルの質量（ｇ）であり、
ＭＷｔはシランの分子量（ｇ／ｍｏｌ）である。
【００５３】
メルカプトプロピルトリメトキシシランを
ｘ×５．６×１０−６ｍｏｌ／ｍ２×Ｓ×Ｍ×ＭＷｔの濃度で用い、式中、
ｘは−ＳＯ３−基の所望の重量パーセントであり、
Ｓはシリカゲルの比表面（ｍ２／ｇ）であり、
Ｍは用いたシリカゲルの質量（ｇ）であり、  
ＭＷｔはシランの分子量（ｇ／ｍｏｌ）である。
【００５４】
ｐ−トルエンスルホン酸を、用いたオクチルトリメトキシシランおよびメルカプトプロピルトリメトキシシランの総量の８．６×１０−３ｇ／ｇの濃度で用いた。
【００５５】
材料を次に標準的な技術を用いることによりエンドキャップし、異なる極性を有する一連の溶媒で洗浄した。
【００５６】
−ＳＯ３−基を、メルカプト基を下記のように酸化することにより形成した：材料をＨ２Ｏ２中の３０体積％（水中の３０重量％）のアセトンの溶液に入れ、溶液中に室温で１２時間保持した。最後に材料を水およびメタノールで洗浄した。
【００５７】
溶液中の濃度の関数としてのイオン滴定により測定される付着した荷電基の量は、アニオン性官能基−ＳＯ３−については図１に、カチオン性官能基−ＮＲ３＋については図２に示す。
【００５８】
こうして調製したＣＩＥＸカラムはＣ５（溶液中５％のアニオン性基）、Ｃ１０（溶液中１０％のアニオン性基）、Ｃ１５（溶液中１５％のアニオン性基）、Ｃ５０（溶液中５０％のアニオン性基）、およびＣ１００（溶液中１００％のアニオン性基）、中性カラムはＲＰ（溶液中０％のイオン性基）、ＡＩＥＸカラムはＡ５（溶液中５％のカチオン性基）、Ａ１０（溶液中１０％のカチオン性基）、Ａ１５（溶液中１５％のカチオン性基）、およびＡ５０（溶液中５０％のカチオン性基）と称した。付着荷電基の量（滴定により測定）は図１および２から得ることができる。
【００５９】
（実施例２）
１１〜１２のｐＩを有するペプチド（合成ペプチド１）に、異なるカラムならびにｐＨ４．８および約１９％ＡｃＮで開始する０．５１体積％／分の同じアセトニトリル（ＡｃＮ）勾配を有する用いた酢酸塩緩衝液の異なるイオン強度での分離を行った。
【００６０】
図３ａ〜３ｃのそれぞれからわかるように、−ＮＲ３＋／Ｃ８材料上での正荷電ペプチドの吸着は低く（反発）、−ＳＯ３−／Ｃ８材料上では強い（誘引）。いくつかのカラムを同じ条件下で試験し、保持時間を互いに比較した。わかるように、カラムＡ１５は吸着も強い反発もそれぞれほとんどなく、材料Ｃ１５は強い吸着、およびよって長い保持時間を有する。Ａ１５材料は対象のペプチドが吸着しないので使用不能であり、Ｃ１５材料は精製プロセスに時間がかかりすぎ、かなりの量の溶媒を要するので、経済的観点であまり良くない。
【００６１】
図３ａ〜３ｃの比較からわかるように、約１μｍｏｌ／ｍ２のカラムＡ１５は、５分未満の望ましくなく短い保持時間を有するだけでなく、イオン強度（緩衝液濃度）の変化にも反応しない。これはこの材料が意図した用途に適さないという別の証拠である。
【００６２】
これとは対照的に、低ドープ材料は反応条件の変化にかなり敏感に反応し、それらのすべてを有用な逆相材料とした。緩衝液濃度を３００ｍＭの酢酸塩から８００ｍＭの酢酸塩まで向上させることにより、Ｃ１５上での保持時間を３０分超から２５分未満まで低減することができた。また、高い緩衝液濃度ではすべてのカラムの保持時間はより近くなり、塩（酢酸塩）はドープ材料が非ドープＲＰ材料と同様に作用するように電荷を遮蔽することを示した。
【００６３】
上ですでに示したように、カラムＡ１５のみについて効果が見られなかった。いずれの解釈によっても限定されることを望むことなく、本発明者らは、この予想外の作用はこの材料が非常に反発性であり、用いた緩衝液濃度がこの反発を克服するほど十分ではないことを示し得ると考える。
【００６４】
（実施例３）
この実施例では、出発濃度および勾配の変化の、異なるカラムの保持時間に対する効果を調べた。緩衝塩の効果を最小化するため、１００ｍＭのみの酢酸塩緩衝液を用いた。またこの実施例では、ＡＰＩは１１〜１２のｐＩを有する合成ペプチド１だった。
【００６５】
ＡｃＮ勾配は０．２５体積％／分だった。
【００６６】
１つの実験ではＡｃＮ初期濃度は２２％ＡｃＮであり（図４ａ参照）、第２の実験ではＡｃＮ初期濃度は保持時間ｔＲ＝３０±３分を保証するように変えた（図４ｂ）。
【００６７】
図４ａの図４ｂとの比較からわかるように、保持時間は初期ＡｃＮ濃度に高度に依存する。
【００６８】
すべてのカラムについて図４ｂに示される結果をもたらす条件を以下の表１に挙げる：
【表１】
2015520657.tif 000002
【００６９】
（実施例４）
ｐＨ４．８およびｐＨ６．８でのインスリン／デサミド−インスリン（インスリンｐＩ＝５．３）の分離における異なるカラムの選択性を調べた。結果は図５に示す。
【００７０】
実験条件は下記のとおりだった：
−溶離液：２４０ｍＭの酢酸塩（それぞれｐＨ４．８または６．８）および約３２分のインスリンの保持時間ｔＲを保証する量のＡｃＮ；ならびに
−均一濃度溶離。
【００７１】
ｐＨ４．８でのインスリン／デサミド−インスリン選択性は下記のとおりだった：
−ＣＩＥＸ材料上でＳ＜１
−ＲＰ上でＳ＞１
−ＣＩＥＸ−ＲＰ材料上でＳ?１
−ＡＩＥＸ−ＲＰ材料上でＳ＞＞１
【００７２】
図５からわかるように、ｐＨ４．８
2015520657.tif 000003
では、−ＮＲ３＋／Ｃ８材料は純粋なＣ８材料と比べてかなり向上した選択性を示す。より高いｐＨ
2015520657.tif 000004
では選択性は逆になる。よって、反発材料は誘引材料、すなわち−ＳＯ３−／Ｃ８より良い。
【００７３】
（実施例５）
この実施例は、１１〜１２のｐＩについて選択された合成ペプチド１の精製について記載する。移動相のｐＨはペプチドｐＩより低く、すなわちペプチドは正電荷を有していた。
【００７４】
移動相はｐＨ＝４．８、５００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液＋アセトニトリルだった。
【００７５】
出発濃度および勾配の情報を表２に挙げる：
【表２】
2015520657.tif 000005
【００７６】
結果：図６からわかるように、ＡＩＥＸ−ＲＰ材料（Ａ１０）を用いることにより、収率を９４％の固定純度で２５％増加させることができた。
【００７７】
（実施例６）
この実施例は、９〜１０のｐＩについて選択された合成ペプチド２の精製について記載する。移動相のｐＨはペプチドｐＩより低く、すなわちペプチドは正電荷を有していた。
【００７８】
移動相はｐＨ＝４．８、１２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液＋アセトニトリルだった。
【００７９】
出発濃度および勾配の情報を表３に挙げる：
【表３】
2015520657.tif 000006
【００８０】
結果：図７からわかるように、ＡＩＥＸ−ＲＰ材料（Ａ１０）を用いることにより、収率を９４％の固定純度で７．４％増加させることができた。
【００８１】
（実施例７）
この実施例は、４．５〜５．５のｐＩについて選択された合成ペプチド３の精製について記載する。移動相のｐＨはペプチドｐＩより高く、すなわちペプチドは負電荷を有していた。
【００８２】
移動相はｐＨ＝６．５、１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液＋アセトニトリルだった。
【００８３】
出発濃度および勾配の情報を表４に挙げる：
【表４】
2015520657.tif 000007
【００８４】
結果：図８からわかるように、この例では、ＡＰＩの負電荷のため、−ＳＯ３−／Ｃ８材料はより良い性能を示す。またここでは反発材料がより良い。ＣＩＥＸ−ＲＰ材料（Ｃ１０）を用いることにより、収率を８７％の固定純度で５．９％増加させることができた。
【００８５】
（結論）
すべての実験は反発的にドープした材料が向上した性能を有することを示す。これは、性能向上のためには追加の吸着位置を形成しなければならないという一般的な見解とは正反対である。本結果は、反発位置を形成することにより材料の性能が向上することを示す。
【００８６】
本発明の現在好まれている実施形態を図示および説明しているが、本発明はこれらに限定されず、下記の特許請求の範囲内で他にさまざまに実施および実践してもよいことが明白に理解されるべきである。
【図１】
2015520657.tif 000008
【図２】
2015520657.tif 000009
【図３ａ】
2015520657.tif 000010
【図３ｂ】
2015520657.tif 000011
【図３ｃ】
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【図４ａ】
2015520657.tif 000013
【図４ｂ】
2015520657.tif 000014
【図５】
2015520657.tif 000015
【図６】
2015520657.tif 000016
【図７】
2015520657.tif 000017
【図８】
2015520657.tif 000018
【国際調査報告】
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2015520657.tif 000020
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