(57)【要約】  本発明は高濃度の幹細胞を製造する方法に関するものである。本発明に従うと、短期間に幹細胞を臨床に適用できる程度の量で増殖させることができて、投与された幹細胞が安定的に標的の組織へ到達して活性を示す効能をより効率的に高めることができるので幹細胞を利用した細胞治療の効能を画期的に増進させることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を基本培地；及びＮＡＣ、アスコルビン酸、インシュリンまたはインシュリン類似因子、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、ｂＦＧＦ、ヘパラン硫酸、２−メルカプトエタノール、ＥＧＦ及び抗酸化剤で構成された群から選択される二つ以上の成分を含有する培地で幹細胞を３回〜５回の継代培養する段階を含む、１×１０７〜５×１０８細胞数／ｍＬの幹細胞の製造方法。
【請求項２】
前記の基本培地はＭ１９９／Ｆ１２（ｍｉｘｔｕｒｅ）（ＧＩＢＣＯ）、ＭＥＭ−ａｌｐｈａ培地（ＧＩＢＣＯ）、低濃度グルコース含有ＤＭＥＭ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）、ＭＣＤＢ１３１培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）、ＩＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）、Ｋ−ＳＦＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＰＣＭ培地及びＭＳＣ拡張培地（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で構成された群から選択されることを特徴にする請求項１に記載の１×１０７〜５×１０８細胞数／ｍＬの幹細胞の製造方法。
【請求項３】
前記の抗酸化剤はセレニウム、ビタミンＥ、カテキン、リコピン、βカロチン、コエンザイムＱ−１０、ＥＰＡ及びＤＨＡで構成された群から選択されることを特徴にする請求項１に記載の１×１０７〜５×１０８細胞数／ｍＬの幹細胞の製造方法。
【請求項４】
前記の抗酸化剤はセレニウムであることを特徴にする請求項３に記載の１×１０７〜５×１０８細胞数／ｍＬの幹細胞の製造方法。
【請求項５】
前記の培地はＦＢＳ、カルシウム及びＥＧＦで構成された群から選択される成分を追加に含有することを特徴にする請求項１に記載の１×１０７〜５×１０８細胞数／ｍＬの幹細胞の製造方法。
【請求項６】
前記の幹細胞は脂肪組織由来の中間葉幹細胞であることを特徴にする請求項１に記載の１×１０７〜５×１０８細胞数／ｍＬの幹細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は高濃度の幹細胞を製造する方法に関するし、さらに詳しくには臨床に適用できる程度の高い収率で幹細胞を増殖させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞（stem cell）は自己複製の能力を持ちながら二つ以上の細胞へ分化する能力を持つ細胞といわれ、全能性幹細胞（totipotent stem cell）、多能性幹細胞（pluripotent stem cell）、多分化能幹細胞（multipotent stem cell）に分類できる。全能性幹細胞はひとつの完全な固体へと発生していくことが出来る万能の性質を持っている細胞で卵子と精子の受精以後、８細胞期までの細胞がこのような性質を持ち、この細胞を分離して子宮に移植するとひとつの完全な固体へ発生していくことが出来る。多能性幹細胞は外胚葉、中胚葉、内胚葉層由来の多様な細胞と組織に発生できる細胞として、受精４〜５日後に現れる胚盤胞（blastocyst）の内側に位置した内細胞塊（inner cell mass）で由来して、これを胚芽幹細胞といい多様な他組織細胞に分化されるが新しい生命体を形成することはできない。多分化能幹細胞はこの細胞が含まれている組織及び器官に特異的な細胞だけに分化できる幹細胞として、胎児期、新生児期及び成体期の各組織及び臓器の成長と発達は勿論成体組織の恒常性の維持と組織損傷時の再生を誘導する機能に関与しており組織特異的な多能性細胞らを総称して成体幹細胞という。
【０００３】
成体幹細胞は人体の各種臓器にすでに存在している細胞を採取、幹細胞を発展させたもので特定の組織だけに分化される特徴がある。しかしながら最近では成体幹細胞を用いて、肝細胞など各種のいろんな組織へ分化させる実験が成功をあげていることが注目される。特に、病気または事故による機能障害または不調和に落ちた生体組織及び臓器の再生及び機能回復のために細胞を積極的に活用して実施する治療法である再生医療において、患者本人から幹細胞、血液由来の単核細胞あるいは骨髄由来の単核細胞を収集する段階、試験管培養で細胞増殖及び／または分化を誘導する段階、及び選択された未分化（幹細胞及び／または前駆細胞）及び／または分化細胞を着床によって患者自身の体に導入する段階を含む方法が数多く利用されている。このように、既存の古典的な薬物措置または手術的な方法を通じた疾病治療は損傷された細胞・組織・臓器を健康なものに変える細胞・組織代替治療法に代替されることが予測されるので、幹細胞の活用度はさらに高まることである。
【０００４】
ここに、現在幹細胞の多様な機能が研究されている実情で、その中でも中間葉幹細胞（mesenchymal stem cells）を利用した細胞治療技術が脚光を浴びるようになり始めてから、人体から分離された中間葉幹細胞を治療に適合するように改善する為の技術が開発されている（国際公開第２００６／０１９３５７号、韓国登録特許第０７９５７０８号公報、韓国登録特許第０８１８２１４号公報）。しかしながら、分離された幹細胞を臨床に適用できる程度の量で増殖させる技術は未だに十分ではない状態である。
【０００５】
ここに、本発明者らは幹細胞の大量生産のために一生懸命に努力した結果、基本培地；及びＮＡＣ（N-acetyl-L-cysteine）、アスコルビン酸（ascorbic acid）、インシュリンまたはインシュリン類似因子、ヒドロコルチゾン、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）、ＥＧＦ（epidermal growth factor）及び抗酸化剤で構成された群から選択される二つ以上の成分を含有する培地で幹細胞を培養すると幹細胞を短期間で高い濃度で増殖させることができることを確認して、本発明を完成するようになった。
【０００６】
本背景技術の部分に記載された前記の情報はただ本発明の背景に対する理解を向上させるためであり、ここに本発明の属する技術分野で通常の知識を持つ者において、すでに知られた先行技術を形成する情報を含まないこともあり得る。
【発明の開示】
【技術的課題】
【０００７】
本発明の目的は短期間に高濃度の幹細胞を製造する方法を提供することである。
【技術的解決】
【０００８】
前記の目的を達成するために、本発明は幹細胞を基本培地；及びＮＡＣ、アスコルビン酸、インシュリンまたはインシュリン類似因子、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、ｂＦＧＦ、ヘパラン硫酸（heparan sulfate）、２−メルカプトエタノール（2-mercaptoethanol）、ＥＧＦ及び抗酸化剤で構成された群から選択される二つ以上の成分を含有する培地で幹細胞を培養する段階を含む、高濃度の幹細胞の製造方法を提供する。
【０００９】
本発明のほかの特徴及び具現の例は次の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲からさらに明白になるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】２０代、３０代、７０代、及び８０代の成人の男子から収得した脂肪由来の幹細胞を各培地の組成で四日間培養する間の細胞集団倍化レベル（Cell population doubling level）を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
別に定義されてない限り、本明細書で使用したすべての技術的及び科学的な用語は本発明の属する技術分野で熟練された専門家によって通常的に理解されるものと同一な意味を持つ。一般的に、本発明書で使用された命名法及び以下に技術する実験方法は本技術分野でよく知られており、通常的に使用されるものである。
【００１２】
本発明で使用する用語「幹細胞」というのは自己複製の能力を持ちながら二つ以上の細胞へ分化する能力を持つ細胞をいい、「成体幹細胞」は発生過程が進行されて、胚芽の各臓器が形成される段階あるいは成体段階で現す幹細胞を意味する。
【００１３】
本発明で使用する用語「中間葉幹細胞」は人間または哺乳類の組織から分離された未分化の幹細胞で、多様な組織から由来することができる。特に、臍帯由来の中間葉幹細胞、臍帯血由来の中間葉幹細胞、骨髄由来の中間葉幹細胞、脂肪由来の中間葉幹細胞、筋肉由来の中間葉幹細胞、神経由来の中間葉幹細胞、皮膚由来の中間葉幹細胞、羊膜由来の中間葉幹細胞及び胎盤由来の中間葉幹細胞も可能で、各組織から幹細胞を分離する技術は当該の業界ですでに周知されている。
【００１４】
本発明で使用する用語「脂肪組織由来の中間葉幹細胞」というのは脂肪組織から分離された未分化の成体の幹細胞として、本明細書で縮約して「脂肪由来の成体幹細胞」、「脂肪幹細胞」または「脂肪由来の幹細胞」として称することもある。これは当業界で周知された通常の方法を通じて修得できることで、その分離方法はたとえば次のようでありえる。すなわち、脂肪吸入術から得られる生理食塩水に浮遊された脂肪含有サスペンション（suspension）を培養した後、フラスコなどの培養容器に付着された幹細胞の層をトリプシンで処理した後回収したり、スクレイパーでこそげて少量の生理食塩水に浮遊されているものを直接に回収したりする方法などを通じて脂肪由来の中間葉幹細胞が分離できる。
【００１５】
本発明で「高濃度の幹細胞の製造」というのは幹細胞の数を高い収率で増殖させることを意味することで、本明細書で「高濃度の幹細胞」は「大量の幹細胞」と称したりもする。本発明のひとつの実施例によると、組織から分離した幹細胞を本発明に従う培地で培養する場合収得できる幹細胞の数が確実に増えることを確認した。望ましくは３回〜５回の継代培養時１０７〜５×１０８細胞数／ｍＬの幹細胞が収得できることを確認した。
【００１６】
本発明で「継代培養」というものは細胞を健康な状態で持続的に長期間培養するために周期的に細胞の一部を新しい培養容器に移した後、培養培地を取り替えながら細胞の代を引き続いて培養する方法を意味する。限定された空間を持つ培養容器内で細胞の数が増えて一定時間が立つと増殖栄養分が消費されたり汚染物質が溜まって細胞が自然に死んでいくことで、健康な細胞の数を増やすための方法として使用され、通常的に１回の培地（培養容器）を交替することまたは細胞群を分けて培養するのを１継代（1 passage）という。継代培養の方法は当業界に周知された方法を制限なしに使用できるが、望ましいことには機械的な分離または酵素的な分離で行うこともできる。
【００１７】
本発明で「機械的な分離」というのは物理的または機械的に細胞の塊を分離することを意味し、当業界で周知された方法を制限なしに使用できるが、望ましいことにはブレード（blade）、組織粉砕機（tissue chopper）、針（needle）、ピペッティング（pipetting）またはスクレイパー（scrapper）を用いて分離することもありえる。本発明の望ましい一つの具現の例に従うとブレードまたは組織粉砕機を用いて継代培養して幹細胞が大量に増殖されることを確認した。
【００１８】
本発明で、「化学的分離」というのは酵素の処理を通じて細胞の塊を分離することを意味し、当業界で周知された方法を制限なしに使用できるが、望ましいことにはコラゲナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶを含むコラゲナーゼ（Collagenase）、アキュターゼ（Accutase）、ディスパーゼ（Dispase）またはトリプシンを処理して分離したものを継代培養することができる。
【００１９】
幹細胞は多様な方法、たとえば、静脈内、動脈内または腹腔内投与などの方法で身体内に投与されるが、その中でも静脈内投与は外科的の手術なしでも簡便でありながらも安全に疾病を治療できるので有用である。しかしながら静脈内に投与された幹細胞が実際に標的の部位へ安定的に到達して目的にする治療効果を示すためには色々な要件が満足されなければならない。まず、標的部位に到達した幹細胞が目的にする治療効果を示すように一定の濃度以上の細胞投与が前提とされなければならない。したがって、臨床的に適用しようとする幹細胞を大量に収得するのが重要である。また、血管内へ投与された幹細胞が血流内の速度を減少させたり、血栓を形成させないように血管内への投与に適合な大きさでなければならない。しかのみならず、血管内へ投与される前に細胞の破砕も凝集も形成されてはならないことで、血管内へ投与された後でも単一細胞（single cell）として細胞の破壊も凝集の形成もなく標的部位に安定的に到達することが前提とされなければならない。
【００２０】
前記の色々な要件中、本発明は臨床に効果的であるために一定の濃度以上の幹細胞を提供するためである。従来の方法による幹細胞培養によると、高い収率の幹細胞を得るためには継代培養を何回も行わなければならないことで人力及び時間が沢山所要され、特に継代培養に必要な培地成分中の一部は凄く高価であり、経済的にも長所が存在しなかった。しかしながら、本発明は単に３回〜５回の継代培養だけでも臨床的に適用可能な程度の高濃度の幹細胞を製造することが出来る。
【００２１】
従って、本発明は一観点から、幹細胞を基本培地；及びＮＡＣ、アスコロビン酸、インシュリンまたはインシュリン類似因子、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、ｂＦＧＦ、ヘパラン硫酸、２−メルカプトエタノール、ＥＧＦ及び抗酸化剤で構成された群から選択される二つ以上の成分を含有する培地で幹細胞を培養する段階を含む、高濃度の幹細胞の製造方法を提供する。
【００２２】
本発明で使用される幹細胞は望ましいことには成体幹細胞、その中でも脂肪組織、または毛嚢・羊膜などの上皮組織から得られる成体幹細胞が利用できる。最も望ましいことには脂肪組織由来の成体幹細胞が使用できる。中間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）を用いることができ、特に脂肪組織由来の中間葉幹細胞（Adipose tissue-derived mesencymal stem cell，ＡｄＭＳＣｓ）もありえる。前記の脂肪または上皮組織は哺乳類由来のものが望ましく、その中でも人間由来のものが最も望ましい。本発明の一つの実施例では人間の脂肪組織由来の中間葉幹細胞（Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell，ＡｄＭＳＣｓ）を用いた。
【００２３】
本発明で使用される基本培地（basal medium）は当業界で幹細胞の培養に適合すると知られている簡単な組成を有する通常的な培地を意味する。一般的に培養に利用されている基本培地としてはＭＥＭ（Minimal Essential Medium）、ＤＭＥＭ（Dulbecco modified Eagle Medium）、ＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute Medium）、Ｋ−ＳＦＭ（Keratinocyte Serum Free Medium）などがあり、この他にも当該業界で利用されている培地なら十分である。望ましいことにはＭ１９９／Ｆ１２（ｍｉｘｔｕｒｅ）（ＧＩＢＣＯ）、ＭＥＭ−ａｌｐｈａ培地（ＧＩＢＣＯ）、低濃度グルコース含有ＤＭＥＭ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）、ＭＣＤＢ１３１培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）、ＩＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）、Ｋ−ＳＦＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＰＣＭ培地及びＭＳＣ拡張培地（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で構成された群から選択できる。特に、この中でも望ましいことにはＫ−ＳＦＭ培地を用いることが出来る。
【００２４】
前記の中間葉幹細胞の培養物の獲得に用いられる基本培地は当業界で周知された、中間葉幹細胞の未分化された表現型の増殖を促進しながら分化は抑制する添加剤で補充されることが出来る。また、培地は等張液中の中性緩衝剤（たとえばリン酸塩及び／または高濃度の重炭酸塩）及びタンパク質の栄養分（たとえば血清、たとえばＦＢＳ、ＦＣＳ（fetal calf serum）、ウマ血清、血清代替物、アルブミン、または必須アミノ酸及び非必須アミノ酸、たとえばグルタミン、Ｌ−グルタミン）を含有することが出来る。さらに、脂質（脂肪酸、コレステロール、血清のＨＤＬまたはＬＤＬ抽出物）及びこの種類の大部分の保存液培地で発見される他の成分（たとえばインシュリンまたはトランスフェリン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、ピルビン酸塩、任意のイオン化形態または塩の糖源、たとえばグルコース、セレニウム、グルココルチコイド、たとえばヒドロコルチゾン及び／または還元剤、たとえばβ−メルカプトエタノール）を含有することが出来る。
【００２５】
また、培地は細胞がお互いに癒着したり、容器の壁に癒着したり、あまり大きな束を形成するのを防止する目的で、抗凝集剤（anti-clumping agent）、たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの販売しているもの（Ｃａｔ＃００１００５７ＡＥ）を含むのが有益になりうる。
【００２６】
その中でも、下記の一つ以上の追加の添加剤を使用するのが有利になりうる。
・幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｃ−キットを二量化する別のリガンドまたは抗体、及び同一な信号伝達経路の別の活性剤
・別のチロシンキナーゼ関連の受容体、たとえば血小板−誘導された成長因子（Platelet-Derived Growth Factor；ＰＤＧＦ）、大食細胞コロニー−刺激因子、Ｆｌｔ−３リガンド及び血管内被成長因子（Vascular Endothelial Growth Factor；ＶＥＧＦ）の受容体のためのリガンド
・環形ＡＭＰ濃度を高める因子、たとえばフォルスコリン
・ｇｐ１３０を誘導する因子、たとえばＬＩＦまたはＯｎｃｏｓｔａｔｉｎ−Ｍ
・造血母の成長因子、たとえばトロンボポエチン（ＴＰＯ）
・変形性の成長因子、たとえばＴＧＦβ−１
・ニューロトロフィン、たとえばＣＮＴＦ
・抗生剤、たとえばゲンタマイシン（gentamicin）、ペニシリン、ストレプトマイシン
【００２７】
本発明で使用される培地は前記の基本培地のほかに、ＮＡＣ、アスコルビン酸、インシュリンまたはインシュリン類似因子、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、ｂＦＧＦ、ヘパラン硫酸、２−メルカプトエタノール、ＥＧＦ及び抗酸化剤で構成された群から選択される二つ以上の成分を追加に含有することが出来る。
【００２８】
具体的に、インシュリンを代替する成分としてインシュリン類似因子を含有することができるが、これはブドウ糖代謝とタンパク質代謝を向上させて細胞成長を促進する役割をする。特に組み替えＩＧＦ−１（Insulin-like growth factor-1）を用いるのが望ましい。インシュリン類似因子の望ましい含量は１０〜５０ｎｇ／ｍＬで、この成分が１０ｎｇ／ｍＬ未満である場合にはアポトーシス（Apoptosis）を招来し、５０ｎｇ／ｍＬを超える場合には細胞毒性及び費用増加の問題点がある。
【００２９】
繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有することができるが、これはｉｎ  ｖｉｖｏ状態で多様な形態の細胞増殖を引き起こすことができるので、望ましいことには組み替えタンパク質を使用する。繊維雅細胞増殖因子の望ましい含量は１〜１００ｎｇ／ｍＬである。
【００３０】
抗酸化剤としてはセレニウム（selenium）、アスコルビン酸、ビタミンＥ、カテキン、リコピン、βカロチン、コエンザイムＱ−１０、ＥＰＡ（eicosapentaenoic acid）、ＤＨＡ（docosahexanoic acid）などが使用できて望ましいことにはセレニウムを使用することが出来る。本発明の一つの実施例では抗酸化剤としてセレニウムを使用し、使用されたセレニウムの量は０．５〜１０ｎｇ／ｍＬであるのが望ましい。このとき、この含量が０．５ｎｇ／ｍＬ未満であると酸素毒性に敏感で、１０ｎｇ／ｍＬを超えると深刻な細胞毒性を招来するためである。
【００３１】
本発明で使用される培地は、ＦＢＳ（fetal bovin serum）、カルシウム及びＥＧＦで構成された群から選択される成分を追加で含有できる。上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）はｉｎ  ｖｉｖｏ状態で多様な形態の細胞増殖を引き起こすことができるので、望ましいことには組み替えタンパク質を使用する。上皮細胞成長因子の望ましい含量は１０〜５０ｎｇ／ｍＬで、この含量が１０ｎｇ／ｍＬ未満ならば特別な効果がなく、５０ｎｇ／ｍＬを超えると細胞へ毒性を持つ。
【００３２】
本発明に従う培地で培養された幹細胞は、望ましいことには３回〜５回の継代培養時１×１０７〜５×１０８細胞数／ｍＬにその数が増殖する。また、前記の継代培養を通じて幹細胞の数を増加させる間、機能的／形態学的に細胞の変形も起こらないことから本発明に従う幹細胞は臨床に効果的に適用できる。
【００３３】
本発明の一つの実施例では、本発明に従う培地で脂肪由来の中間葉幹細胞を培養した。脂肪由来の中間葉幹細胞は次のような方法で獲得することが出来る。まず、脂肪吸入術（Liposuction）などにより腹部から得られた人間の脂肪組織を分離してＰＢＳで洗浄した後、組織を細かく切った後、コラーゲン分解酵素を添加したＤＭＥＭ培地を用いて分解後、ＰＢＳで洗浄して１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上層液は除去し、底に残っているペレットはＰＢＳで洗浄した後１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。１００μｍメッシュを用いて浮遊物を除去した後、ＰＢＳで再び洗浄した。ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  ＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸）培地で培養して、一晩経過後培養容器の底に付着してない細胞はＰＢＳで洗浄して、ＮＡＣ、アスコルビン酸、カルシウム、ｒＥＧＦ、インシュリン、ｂＦＧＦ、ヒドロコルチゾン及びセレニウムを含有したＫ−ＳＦＭ培地を二日毎に交替しながら培養して中間葉幹細胞を分離して継代培養して中間葉幹細胞を得ることができる。しかしながらこのほかにも当業界で周知された方法で中間葉幹細胞を得ることができる。
【００３４】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例により制限されるもので解析されないことは当業界で通常の知識をもっている者において自明なことである。
【００３５】
≪実施例１：人間脂肪組織由来の中間葉幹細胞の分離≫
脂肪吸入術により腹部から得られた脂肪組織を各々分離してＰＢＳで洗浄した。洗浄された脂肪組織を細かく切った後コラゲナーゼタイプＩ（１ｍｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ培地を用いて３７℃で２時間の間組織を分解させた。コラゲナーゼで処理された組織をＰＢＳで洗浄した後、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上層液を除去し、ペレットをＰＢＳで洗浄した後１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１００μｍメッシュでフィルタリングして浮遊物を除去した後ＰＢＳで洗浄して、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  ＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸の添加されたＤＭＥＭ培地で培養した。
【００３６】
一晩過ぎた後、付着されていない細胞はＰＢＳで洗浄して、５％ＦＢＳ、２ｍＭ  ＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸、０．０９ｍＭカルシウム、５ｎｇ／ｍＬ  ｒＥＧＦ、５μｇ／ｍＬインシュリン、１０ｎｇ  ｂＦＧＦ、７４ｎｇ／ｍＬヒドロコルチゾン及び１ｎｇ／ｍＬのセレニウムを含有したＫ−ＳＦＭ培地を二日毎に交替しながら４継代まで脂肪由来の中間葉幹細胞を培養した。
【００３７】
≪実施例２：幹細胞の増殖能に影響を及ぼす培地成分の探索≫
実施例１で使用されたＫ−ＳＦＭ培地に添加される活性成分であるＦＢＳ、ＮＡＣ、アスコルビン酸、インシュリン、ヒドロコルチゾン、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ及びセレニウムをすべて含有する培地（培地１）は前記の活性成分中、一つ以上を除去した培地（培地２〜培地９）を下記のように製造した。具体的な培地成分は次のようである：
培地１（Ｍ１）：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＦＢＳ＋ＮＡＣ＋アスコルビン酸＋インシュリン＋ヒドロコルチゾン＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ＋セレニウム
培地２（Ｍ２）：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＮＡＣ＋アスコルビン酸＋インシュリン＋ヒドロコルチゾン＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ＋セレニウム（培地１の成分中ＦＢＳ除外）
培地３（Ｍ３）：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＦＢＳ＋ＮＡＣ＋アスコルビン酸＋インシュリン＋ヒドロコルチゾン＋ＥＧＦ＋セレニウム（培地１の成分中ｂＦＧＦ除外）
培地４（Ｍ４）：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＦＢＳ＋ＮＡＣ＋アスコルビン酸＋ヒドロコルチゾン＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ＋セレニウム（培地１の成分中インシュリン除外）
培地５（Ｍ５）：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＦＢＳ＋ＮＡＣ＋アスコルビン酸＋インシュリン＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ＋セレニウム（培地１の成分中ヒドロコルチゾン除外）
培地６（Ｍ６）：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＦＢＳ＋ＮＡＣ＋アスコルビン酸＋インシュリン＋ヒドロコルチゾン＋ｂＦＧＦ＋セレニウム（培地１の成分中ＥＧＦ除外）
培地７（Ｍ７）：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＦＢＳ＋ＮＡＣ＋インシュリン＋ヒドロコルチゾン＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ＋セレニウム（培地１の成分中アスコルビン酸除外）
培地８（Ｍ８）：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＦＢＳ＋アスコルビン酸＋インシュリン＋ヒドロコルチゾン＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ＋セレニウム（培地１の成分中ＮＡＣ除外）
培地９（Ｍ９）：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＦＢＳ＋ＮＡＣ＋アスコルビン酸＋インシュリン＋ヒドロコルチゾン＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ（培地１の成分中セレニウム除外）
培地１０（Ｍ１０）：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＦＢＳ＋ＮＡＣ＋アスコルビン酸＋インシュリン＋ヒドロコルチゾン＋セレニウム（培地１の成分中ｂＦＧＦ及びＥＧＦ除外）
【００３８】
前記の培地で脂肪由来の幹細胞を培養した。脂肪幹細胞は２０代、３０代、７０代、及び８０代の成人の男子から収得した脂肪由来の幹細胞を用いた。前記の各々の培地で前記の収得した脂肪由来の幹細胞を4継代まで継代した後、トリプシンを処理した後共焦点顕微鏡（confocal microscope）で細胞数を確認した。下記表１では３継代目の脂肪由来の中間葉幹細胞１×１０５個を接種して四日間培養した時培地別、日次別に収得細胞数を表記した。その結果、本発明に従う培養方法によると幹細胞を四日間培養する場合、培地成分によって最大２．５×１０６細胞数／ｍＬの幹細胞を製造することが確認できた。（表１）。また、年齢別で多少の差はあるが、培地９番の場合細胞集団倍化レベル（ＣＰＤＬ）の値が最も高かった。２０代及び３０代の場合１×１０５細胞数／ｍＬの幹細胞を接種して四日間培養すると細胞数が１３〜２５倍増加し、７０代及び８０代の場合には細胞数が７〜１５倍増加することが確認された（図１）。また、変異が起こった細胞は確認されなかった（図示してない）。
【００３９】
【表１】
2015526067.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明に従うと、３回〜５回の継代培養だけでも臨床に適用できる程度の量で幹細胞を大量生産することが出来るので幹細胞の投与による細胞治療の効能を画期的に増進させることが出来る。
【００４１】
以上で、本発明の内容の特定な部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を持っている者において、このような具体的な記述は単に望ましい実施の様態だけで、これによって本発明の範囲が制限されることのないのは明白なことである。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物によって定義されることである。
【図１】
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【国際調査報告】
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2015526067.tif 000006
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