(57)【要約】  本開示は、無細胞の培養上清から抗体を結晶化するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶形態のモノクローナル抗体を調製する方法であって、
ａ）モノクローナル抗体を含む無細胞の細胞培養上清を用意する工程と、
ｂ）低イオン強度緩衝液を前記無細胞の細胞培養上清に前記抗体の結晶化を促進するために十分な量で添加する工程と、
ｃ）結晶化前の溶液のｐＨを調整して結晶を生成する工程と、
ｄ）工程ｃ）で形成された結晶を単離する工程と
を含み、無細胞の細胞培養上清に含有された抗体の少なくとも５０％が工程ｄで単離される、上記方法。
【請求項２】
精製モノクローナル抗体を調製する方法であって、
ａ）モノクローナル抗体を含む組成物を低イオン強度緩衝液に対して透析し、組成物から不純物を沈殿させる工程と、
ｂ）沈殿物を除去して第１の清澄化した組成物を生成する工程と、
ｃ）場合により前記清澄化した組成物を低イオン強度緩衝液に対して透析して組成物から不純物を沈殿させ、第２の清澄化した組成物を生成する工程と、
ｄ）工程ｃ）の組成物から沈殿物を除去する工程と、
ｅ）第１または第２の清澄化した組成物のｐＨをモノクローナル抗体のｐＩ付近に調整し、場合により１種以上の添加物を添加して結晶を生成する工程と、
ｆ）工程ｅ）で形成された結晶を単離する工程と
を含む、上記方法。
【請求項３】
結晶形態のモノクローナル抗体を細胞培養上清から直接的に調製する方法であって、
ａ）モノクローナル抗体を含む無細胞の細胞培養上清を低イオン強度緩衝液に対して透析する工程と、
ｂ）工程ａ）で形成された沈殿物が存在する場合は上清から除去し、清澄化した上清を生成する工程と、
ｃ）場合により清澄化した上清を濃縮する工程と、
ｄ）場合によりｂ）またはｃ）の清澄化した上清を低イオン強度緩衝液に対して透析して前処理溶液を生成する工程と、
ｅ）工程ｄ）の前処理溶液に沈殿物が存在する場合は除去する工程と、
ｆ）工程ｄ）またはｅ）の前処理溶液のｐＨをモノクローナル抗体のｐＩ付近に調整し、場合により１種以上の添加物を添加して、結晶を生成する工程と、
ｇ）工程ｆ）で形成された結晶を単離する工程と
を含む、上記方法。
【請求項４】
工程ｂ）の前に無細胞の培養上清を濃縮する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
低イオン強度緩衝液が約１２ｍＳ  ｃｍ−１以下の伝導度を与えるものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
調整工程前の低イオン強度緩衝液のｐＨが、抗体が溶解可能で結晶化または沈殿しないｐＨ付近である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
低イオン強度緩衝液がヒスチジン緩衝液である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
低イオン強度緩衝液が少なくとも１種以上の塩を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
低イオン強度緩衝液が少なくとも１種以上の糖を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ｐＨがトリス緩衝液を使用して調整される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ｐＨが、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールおよび糖からなる群から選択される１種以上の添加物を含む緩衝液を使用して調整される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
無細胞の培養上清に含まれている抗体の少なくとも約５０％が、単離工程で単離される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
結晶化抗体の純度が少なくとも約９０％である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
単離された結晶を溶液に溶解することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
溶液のｐＨをモノクローナル抗体のｐＩ付近に調整することによりモノクローナル抗体を再結晶化させることをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
細胞培養上清の初期タンパク質濃度を調整することにより、結晶サイズを制御することをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
特定の速度で基質を攪拌することにより結晶サイズを制御することをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
結晶化が、１Ｗ  Ｌ−１未満の体積あたりの投入動力の攪拌によって起こる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
最大局所エネルギー消費（εｍａｘ）が、約０．００９Ｗ  ｋｇ−１〜約１．３Ｗ  ｋｇ−１である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
最大の局所エネルギー消費（εｍａｘ）が、約０．１〜約０．４Ｗ  ｋｇ−１である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
３ブレードセグメントインペラが攪拌に使用される、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年５月１１日に出願された米国特許仮出願第６１／６４５，８５５号への優先権を主張する。
【０００２】
本開示はモノクローナル抗体を結晶化および精製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本開示は、培養上清（例えば、モノクローナル抗体が上清に分泌された細胞培養液の無細胞（cell-free）上清）から直接的に結晶形態のモノクローナル抗体を高収率で調製および精製することに関する。タンパク質の結晶化には、例えば、以下の問題点がある：１）特別な設備の必要性、２）多形結晶の生成、３）結晶化を開始するための播種の必要性、４）時間集約的プロセス（例えば、６０〜８０時間）、５）結晶化の前のクロマトグラフィー工程（例えば、プロテインＡ、イオン交換（ＩＥＸ）、７）好ましくない添加物および／または賦形剤（例えば、ポリエチレングリコール）の使用、ならびに８）保存の困難性。モノクローナル抗体は、従前、細胞培養上清から直接的に結晶化されていたが、その収率は低かった。さらに、従前の方法は、ポリエチレングリコールなどの添加物の使用が必要であった。本明細書に記載の方法によれば、驚くべきことに、高純度の結晶化モノクローナル抗体が、高収率で、無細胞の培養上清から、高価な工程または装置を使用することなく生成される。この新規方法により、多くの利点、例えば、医薬品への処方に適した高濃度の安定な結晶化抗体、ならびに顕著な時間的および費用的利益などが提供される。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、モノクローナル抗体の精製の間に典型的に生じる問題を解決する独創的方法に関する。本明細書に記載の方法は、モノクローナル抗体を含む混合物から精製モノクローナル抗体調製物を得ることに驚くほどに有用である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の独創的方法は、高純度の結晶化モノクローナル抗体を、高収率で直接的に無細胞の培養上清から生成する方法を提供する。本明細書に記載の詳細な実施形態において、本方法は、低イオン強度緩衝液を使用して達成される。いくつかの実施形態において、結晶形態のモノクローナル抗体を調製する方法は、低イオン強度緩衝液を、モノクローナル抗体を含有する無細胞の細胞培養上清に、沈殿を促進させる適切なｐＨ条件下で添加することを含み得る。得られた沈殿物は、主に不純物を含んでおり、その後、典型的には（例えば、清澄化した上清を生成させるために）除去される。清澄化した上清は、その後、場合により濃縮してもよい。次いで適切な緩衝液を添加して前処理溶液を生成させてもよい。前処理溶液のｐＨは、タンパク質の結晶化に適切なレベルであり得、またはそのレベルに調整されてもよい（例えば、ｐＩが６．８であるまたはその付近で結晶化するタンパク質に関しては、ｐＨは約６．８であろう）。また１種以上の添加物（例えば、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコール、糖）を含めてもよい。得られた結晶を、次いで、例えば、遠心分離により単離してもよい。特定の実施形態を図１に示す。いくつかの実施形態において、生成物は、初期の無細胞の培養上清に存在したタンパク質（例えば、抗体）の少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％を含む。使用に先立ち、結晶を適切な溶液に溶解し、次いで、溶液のｐＨをタンパク質が結晶化する範囲に調整することによって、場合により再結晶化してもよい（例えば、ｐＩが６．８であるまたはその付近で結晶化するタンパク質に関しては、ｐＨは約６．８であろう）。生じる結晶のサイズは、例えば、細胞培養上清の初期タンパク質濃度を調整することによって、および／または任意の工程における基質を特定の速さで攪拌することによって、制御することができる。結晶化した抗体を含む組成物、および再溶解された抗体も提供される。
【０００５】
本発明の方法はクロマトグラフィー工程を行わなくてもよい。本発明の方法の１つ以上の工程からクロマトグラフィーが除外される利点としては、結晶形態の精製モノクローナル抗体を生成する時間が大幅に短縮されることが挙げられる。本発明の特定の実施形態によれば、出発材料または続く工程の生成産物に対して何らクロマトグラフィーを行わない。本発明の特定の実施形態には、結晶化工程の前にクロマトグラフィーを行わない形態が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】例示的な結晶化方法を示す図面である。
【図２】例示的な結晶化条件を示す図面である。
【図３】例示的な結晶を示す図面である。
【図４】例示的な条件下での結晶化に対するｐＨの影響を示す図面である。
【図５】例示的な条件下での結晶化の動態を示す図面である。
【図６】さらなる例示的な条件下での結晶化の動態を示す図面である。
【図７】例示的な結晶を示す図面である。
【図８】例示的な結晶を示す図面である。
【図９】例示的な結晶を示す図面である。
【図１０】例示的な結晶を示す図面である。
【図１１】例示的な結晶を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
上記に概略を述べたように、また下記に詳細に記載されるように、本開示はモノクローナル抗体の精製方法に関する。本明細書に記載の方法は、驚くべきことに、精製モノクローナル抗体調製物を、モノクローナル抗体を含む組成物から得るために使用することができる。上述のように、この方法は低イオン強度緩衝液を使用することにより達成された。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、高純度の結晶化モノクローナル抗体を、高収率で直接的に無細胞の培養上清から生成する方法を提供する。いくつかの実施形態において、結晶形態のモノクローナル抗体を調製する方法は、モノクローナル抗体を含む無細胞の細胞培養上清を用意する工程、低イオン強度緩衝液を前記無細胞の細胞培養上清に前記抗体の結晶化を促進するために十分な量で添加する（例えば、希釈または交換（例えば、部分もしくは完全透析）する）工程、得られた溶液のｐＨを調整して結晶を生成する工程、および生成された結晶を単離する工程の１つ以上を含んでよく、無細胞の細胞培養上清に含有された抗体の少なくとも５０％が単離される。
【０００８】
いくつかの実施形態において、結晶形態のモノクローナル抗体を調製する方法は、抗体を低イオン強度緩衝液中で結晶化させるｐＨの範囲を決定する工程、前記緩衝液を細胞培養上清に前記抗体の結晶化を促進するために十分な量で、結晶化前の溶液を生成する範囲のｐＨで添加する（希釈または交換（例えば、部分もしくは完全透析）する）工程、前記結晶化前の溶液のｐＨを上記決定工程で決定した範囲に調整して結晶を生成する工程、および結晶を単離する工程の１つ以上を含んでよく、無細胞の細胞培養上清に含有された抗体の少なくとも５０％が単離される。
【０００９】
いくつかの実施形態において、結晶形態のモノクローナル抗体を調製する方法は、ａ）モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマの無細胞の培養上清を得て、場合によりこの上清を濃縮する工程、ｂ）上清を緩衝液（例えば、低イオン強度緩衝液）に対して透析して適切なｐＨとする工程、ｃ）工程ｂ）で形成された沈殿物が存在する場合は上清から除去し、清澄化した上清を生成する工程、ｄ）場合により清澄化した上清を濃縮する工程、ｅ）場合によりｃ）またはｄ）の清澄化した上清を適切な緩衝液に対して透析して前処理溶液を生成する工程、ｆ）工程ｅ）の前処理溶液に沈殿物が存在する場合は除去する工程、ｇ）工程ｅ）またはｆ）の前処理溶液のｐＨをモノクローナル抗体が結晶化する適切なレベル（例えば、ｐＩが６．８であるまたはその付近で結晶化するモノクローナル抗体に関しては、ｐＨは約６．８であろう）に調整し、場合により１種以上の添加物を添加して、結晶化溶液を生成する工程、およびｈ）工程ｇ）で形成された結晶を、例えば、遠心分離によって単離する工程の１つ以上を含み得る。
【００１０】
モノクローナル抗体は、従前、細胞培養上清から結晶化されていたが、その収率は低かった。従前の方法は、典型的に、ポリエチレングリコールなどの添加物の使用を必要とする。また標準的な結晶化スクリーニングは通常、低イオン強度緩衝液を含まない。タンパク質の溶解度に対するｐＨの影響は非常に強い（過飽和性を減少させ得る）。本明細書（例えば、実施例）に示されるように、低イオン強度緩衝液を含有するタンパク質溶液のｐＨの単純な変化を使用することにより、驚くべきことに、モノクローナル抗体の溶解度を減少させることができた（例えば、ｐＨ５での＞２００ｇ  Ｌ−１からｐＨ６．８での０．３ｇ  Ｌ−１）。このことは非常に高い過飽和および結晶化をもたらし（例えば、ｐＨ６．８では沈殿なし）、ｐＨ５（抗体は溶解した）では、不純物の沈殿がもたらされた（不純物の一部は結晶化を阻害する可能性があった）。本明細書に記載の方法は、予想外にも、無細胞の培養上清からの、高収率で直接的な、高純度の結晶化モノクローナル抗体の生成を提供する。特定の実施形態を図１に示す。特定の実施形態において、工程ａ）で生成される清澄化した上清は濃縮してもよい。いくつかの実施形態においては、ｐＨは、場合により塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールおよび糖からなる群から選択される１種以上の添加物を含む緩衝液を使用して調整してもよい。いくつかの実施形態においては、驚くべきことに、初期の無細胞の培養上清（例えば、上記工程ａ）の上清）に存在する抗体の少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％を含む生成物をもたらす（例えば、高収率）。使用に先立ち、結晶は、適切な溶液（例えば、医薬組成物）に溶解させてもよい。また結晶を溶解し、次いで場合により、例えば、溶液のｐＨを適切なレベル（例えば、約６．８のｐＩを有するモノクローナル抗体については、ｐＨは約６．８であろう）に調整して、再結晶化してもよい。これらの方法において、生じる結晶のサイズは、例えば、細胞培養上清の初期タンパク質濃度を調整することによって、および／または任意の段階の基質を特定の速さで攪拌することによって制御してもよい。これらの方法、生じる生成物、およびかかる生成物の使用に関するさらなる詳細は、以下に説明する。
【００１１】
本明細書に記載の方法は、通常、結晶化を予定するモノクローナル抗体を生成する細胞の無細胞の培養上清を用いることから開始する（例えば、工程ａ））。他の出発原料（例えば、ハイブリドーマ培養物、腹水、結晶化する抗体を含有する半精製または精製済調製物）も使用し得ることが理解されるべきである。これらの方法は、血清などから「精製された」ポリクローナル抗体を単離するためにも適している。無細胞の培養上清は、培養物からそのまま（例えば、直接的に）使用してもよく、または処理に先だって濃縮して使用してもよい。無細胞の培養上清は、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０倍に濃縮させて、より体積を小さく、したがってより高濃度のタンパク質（および他の成分）としてもよい（例えば、１００ｍｌを１０ｍｌとする場合、１０倍または１０：１）。無細胞上清のタンパク濃度は、例えば、約１〜１００ｇ／Ｌ（約１０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、または５０ｇ／Ｌなど）であり得る。濃縮は、当業者に理解されるように、いくつかの広く利用されている技術、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム濃縮、回転遠心分離、および／または限外濾過（例えば、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０メンブレンを備えたＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ）のいずれかを使用して達成し得る。これらおよび他の適切な出発材料は当業者により理解される。
【００１２】
実施例に記載されるように、無細胞の培養上清（例えば、場合により濃縮物）は、通常、モノクローナル抗体以外の多くの成分（例えば、不純物）を含んでいる。細胞培養の媒体は、本明細書に記載の方法で使用するには適切でない場合があり、したがって別の緩衝液に交換してもよい。このように、無細胞の培養上清は、本明細書に記載の方法と適合する成分を含有する緩衝液（例えば、１０ｍＭのヒスチジンなどのヒスチジン緩衝液、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５に調整するための酢酸、クロスフロー型限外濾過ユニットを使用などの低イオン強度緩衝液）（例えば、約ｐＨ４〜１０（例えば、約４．９、５．０、５．５、６．０、６．５、６．８、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０または９．５）の適切なｐＨを提供するもの）と交換（例えば、希釈または透析）し得る。緩衝液は、例えば、「低イオン強度」緩衝液（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ｍＳ  ｃｍ−１以下の伝導度を与えるもの）であり得る。例えば、例示的な適切な緩衝液は、１種以上の塩を含むまたは含まない１０ｍＭのヒスチジン緩衝液、例えば、１０ｍＭのヒスチジン緩衝液／２０ｍＭの塩化ナトリウム、または１０ｍＭのヒスチジン緩衝液／１００ｍＭの塩化ナトリウム（伝導度：１０．９ｍＳ  ｃｍ−１）が挙げられ得る。そのような緩衝液は、無細胞の培養上清からの不純物の沈澱も促進し得る。いくつかの実施形態においては、管状透析膜（Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｕｂｉｎｇ  Ｖｉｓｋｉｎｇ（ＭＷＣＯ）１４０００）を利用してもよい。不純物が透析／緩衝液交換の間および／または後に沈殿する場合、沈殿物を濾過または遠心分離（例えば、３０００〜５０００ｒｃｆ（例えば、３２００ｒｃｆ、５２５２ｒｃｆ）で１０、１５または２０分間の遠心分離）などの技術を使用して、抗体（および他の非沈殿成分）から分離してもよい。いくつかの実施形態において、抗体を含有する生成溶液は、「清澄化した上清」（または、実施例に示されるように、「前処理回収液（pre-treated harvest）」）として参照する場合がある。清澄化した上清（または前処理回収液）の伝導度は約０．１、０．２、０．３、０．４、０．４６、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１（例えば、１０．９）または１２ｍＳ  ｃｍ−１であることが好ましい。本明細書に記載の方法に使用するプロセスを行うための前処理回収液を調製する他の方法も、当業者に理解されるように適切であり得る。
【００１３】
次いで、清澄化したスーパータント（supertant）は、当業者に理解されるように、例えば、いくつかの広く利用されている技術（例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム濃縮および／または限外濾過）のいずれかを使用して場合により濃縮してもよい。次いで清澄化した上清（濃縮していないものまたは濃縮したもの）は、場合により、別の緩衝液（例えば、低イオン強度緩衝液）に対して透析（例えば、交換）して、「前処理溶液」を生成させてもよい（例えば、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＮａＣｌ、酢酸を使用してｐＨ５に調整などのヒスチジン緩衝液、クロスフロー型限外濾過ユニットを使用）。緩衝液は、例えば、緩衝成分（例えば、約１〜１５ｍＭのヒスチジン（例えば、３、１０、１４ｍＭ）（約ｐＨ４〜１０（例えば、約４．９、５．０、５．５、６．０、６．５、６．８、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０または９．５））、１種以上の塩（例えば、ＮａＣｌ）、および／または１種以上の糖（例えば、トレハロース）を含有していてもよい。そのような緩衝液を添加することにより、通常、不純物を含有する沈殿物が形成される。沈殿物は次いで濾過または遠心分離（例えば、３０００〜５０００ｒｃｆ（例えば、３２００ｒｃｆ、５２５２ｒｃｆ）で１０、１５または２０分間））などの技術を使用して抗体（および他の非沈殿成分）と分離して、「清澄化された前処理溶液」を生成してもよい。清澄化された前処理溶液の伝導度は約０．１、０．２、０．３、０．４、０．４６、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１（例えば、１０．９）または１２ｍＳ  ｃｍ−１であることが好ましい。この清澄化された前処理溶液は、次いで、結晶化のための基質として通常使用されるが、前処理回収液も適切であり得る。結晶化のための前処理溶液を調製するための他の方法も、当業者に理解されるように適切であり得る。
【００１４】
次いで、典型的には、前処理溶液のｐＨを、特定のタンパク質が結晶化する適切なレベルに調整する。典型的には、適切なｐＨは、結晶化するタンパク質のｐＩと一致するｐＨである。例えば、約６．８のｐＩを有するタンパク質に対しては、ｐＨは約６．８となろう。ｐＨは、例えば、ＴＲＩＳ（例えば、約４、６、７、８、９、１２、１２．８、１４、１５、１６、１８ｍＭなどの約２〜２０ｍＭのＴＲＩＳ（例えば、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ））、ヒスチジン（例えば、約１０または約１４．２５ｍＭなどの約５〜２０ｍＭのヒスチジン）、ＨＥＰＥＳ（例えば、約１０ｍＭなどの約５〜２０ｍＭのＨＥＰＥＳ））、リン酸塩（例えば、約１０ｍＭなどの約５〜２０ｍＭのリン酸塩）、カコジル酸塩（例えば、約約１０ｍＭなどの約５〜２０ｍＭ）を含む適切な緩衝液によって、場合により酸また塩基（例えば、酢酸、ＨＣｌおよび／またはＮａＯＨ（例えば、１０％または０．５Ｍの原液より））と共に、タンパク質に応じた適切なｐＨ（例えば、約４〜１０の対応するｐＩを有するタンパク質については通常ｐＨ４〜１０（例えば、約４．９、５．０、５．５、５．５〜７．７、６．０、６．４、６．５、６．６、６．８、７．０、７．５、７．６、８．０、８．５、９．０または９．５））が実現され、および場合により１種以上のさらなる添加物（例えば、約５〜１００ｍＭのＮａＣｌ（例えば、約１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０または８０ｍＭ）；約２〜８％ｗ／ｖのＰＥＧ  ＭＭＥ  ２０００；約２〜８％ｗ／ｖのＰＥＧ  ＭＭＥ  ５０００；約０．８〜１．６ｍＭのＭｇＳＯ４；約５〜１１ｍＭ  ｍＭのＫＣｌ（例えば、約５．４ｍＭまたは１０．８ｍＭ）；約１〜１０ｍＭのＣａＣｌ２（例えば、約１．８、３．６または１０ｍＭ）、約２ｍＭのＥＤＴＡ、約１０〜２０ｍＭのＬｉ２ＳＯ４；約１０〜４０ｍＭのＬｉＣｌ（例えば、約１０、２０、４０または４０ｍＭのＬｉＣｌ）、約１０〜２０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ；約１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４；ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ１００００（例えば、約１〜２０％ｖ／ｖ、例えば、約２〜８％（例えば、ＰＥＧ１００００）、４％、４〜８％（例えば、ＰＥＧ３０００）または６〜１０％（例えば、ＰＥＧ１５００）ｖ／ｖ）；１種以上の糖（例えば、スクロース、トレハロース（例えば、約４０〜４００ｍＭ（約２５０ｍＭなど））；グリセリン（例えば、約５〜２０％ｖ／ｖ）；２−プロパノール（例えば、約１〜２０％ｖ／ｖ）；１，４−ジオキサン（約１〜２０％ｖ／ｖ）；ヘキシレングリコール（例えば、約１〜５％ｖ／ｖ）；エタノール（例えば、約１〜２５％ｖ／ｖ）；および／またはヘキシレングリコール）と共に、適切な結晶化溶液が生成される。結晶は、次いで、適切な期間（約１〜１５０分、例えば、３、３５、６０または１２０分）をかけて、適切な温度（例えば、１０℃、２０℃、２５℃、または３０℃、好ましくは約１０℃）で、形成させることができる。タンパク質濃度は、典型的には約０．１〜１００ｇ／Ｌ（例えば、約１、２、４、１０、２５、２６、５０ｇ／Ｌ）である。適切な結晶化溶液は、典型的に、一つ、いくつかまたは全てのそのような成分��含有し、沈澱のない結晶化をもたらす（例えば、誘導する）。結晶化に先立って、または結晶化の間に、予め形成された結晶を使用して結晶化溶液の播種を行ってもよいし、行わなくてもよい。そのように形成された結晶は、その後、例えば、濾過または遠心分離（例えば、約６０〜５５０００×ｇ（例えば、５２５２×ｇまたは５０３７７×ｇ）によって約１〜１０（例えば、約３分間））単離してもよい。これらの方法を使用して最終的に得られる結晶のサイズは、例えば、細胞培養上清の初期タンパク質濃度を適切なレベル（例えば、約１、３、５、１０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｇ／Ｌ）に調整すること、および／または特定の機器および／または特定の速さで１つ以上のいずれの工程における基質を攪拌することにより、少なくともある程度制御することができる。例えば、いくつかの実施形態においては、穏やかな流体力学条件（例えば、約１Ｗ  ｋｇ−１未満の体積あたりの投入動力）を提供するおよび／または適切な多ブレードセグメントインペラ（例えば、３ブレードセグメントインペラ）などの懸濁下で結晶を維持するおよび／または約５０〜３００ｒｐｍ（例えば、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０または３００ｒｐｍ）で攪拌するインペラを利用することが有益な場合がある。これらの実施形態は、高い過飽和をもたらし、核形成および結晶成長率の増加につながり得る。
【００１５】
核形成速度の増加は、最大局所エネルギー消費（maximum local energy dissipation）（εｍａｘ）の特定の範囲で攪拌することによっても達成され得る。適切なεｍａｘ範囲は、例えば、約０．００９Ｗ  ｋｇ−１〜約１．３Ｗ  ｋｇ−１（例えば、約０．００９、０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３のいずれか；または約３００ｒｐｍ）であり得る。最適な範囲は、例えば、約０．１〜約０．４Ｗ  ｋｇ−１の間（例えば、約０．１、０．２、０．３、または０．４Ｗ  ｋｇ−１）であり得る。適切な範囲は、使用される反応器の種類に依存する場合があり、シリコーンオイル／界面活性剤／水乳濁液の粒径分布の測定によって定まり得る。適切な範囲は、シリコン（silicon）オイル滴のサイズが平衡に達するまで減少する点として選択され得る。この系の粒径分布は完全に、反応器に特異的な粉砕プロセスに応じて定まる。このように、粒径と局所流体力学的ストレスの最大強度εｍａｘ（＝最大局所エネルギー消費）との間には依存性があり、εｍａｘが大きくなるほどより小さい粒子が生じる（Henzler,H.Particle Stress in Bioreactors,Adv.Biochem.Eng.67:59(2000)）。２０ｍｍ２  ｓ−１の低粘度と０．９８ｇ  ｃｍ−３（２５℃にて）の密度を有するシリコーンオイル（ｂａｙｓｉｌｏｎ  ｏｉｌ  ＰＫ  ２０）を使用することにより、低攪拌速度（例えば、３０ｒｐｍ〜３５０ｒｐｍの間）であっても実験を行うことが可能な特性となる。例えば、９体積の８％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を有する水溶液を、１体積のＳｕｄａｎ  ＩＶ染色シリコーンオイルで注意深く積層した。２４時間、１０℃で系を攪拌した後、画像分析（例えば、光学的）により決定された総体積総分布の媒体オイルの液滴直径である平衡粒子径（ｄ５０，３）。結晶化に対して用いられるｄ５０，３値は、３００μｍと２４００μｍの間であった。他のタンパク質（例えば、リゾチーム）は、より速い核形成速度（例えば、約４４０μｍのｄ５０，３値））で結晶化し得る。対応するεｍａｘの値を推定するために、下に説明するように１リットルの反応器でさらに特性評価を行った。平均電力消費量εは、トルクセンサーを使用して測定した。比率εｍａｘ／εは、次の方程式（例えば、Henzler、supra、equation 20）から見積もることができる：
【００１６】
【数１】
2015517306.tif 000002
式中、ｄはインペラの直径であり、Ｄはタンク内径であり、ｈはインペラブレードの垂直高さであり、Ｈは充填深さ（fill height）であり、ｚはインペラブレードの数であり、αは水平面に対するブレードの傾きであり、ｚＩはインペラの数である。例えば、ｄ＝０．０６ｍ；Ｄ＝０．１２ｍ；ｈ＝０．０４ｍ；Ｈ＝０．１２ｍ；ｚ＝３；α＝４５°；ｚＩ＝１である場合、ａは４と算出された。εｍａｘの値は、０．０３Ｗ  ｋｇ−１〜１Ｗ  ｋｇ−１の間と見積もられた。約４４０μｍのｄ５０，３値は、推定εｍａｘ値０．５Ｗ  ｋｇ−１に相当する。εｍａｘは、パラメータとして反応器の設計および幾何学的な寸法とは独立してタンパク質結晶化のスケーリングのためのパラメータとして使用し得ることが分かった。結晶化プロセスをより短縮させる最適εｍａｘ値があることにより、パラメータはさらに適切となる。
【００１７】
実施例に記述されているように、６ｍｌの攪拌バッチ反応器において、２００ｒｐｍでの最大結晶長は６０μｍであり、１２０ｒｐｍでの最大結晶長は１２０μｍであった。したがって、攪拌速度をより遅くすると、より長い結晶を形成することができる。当業者であれば、他の実施形態も理解される。
【００１８】
このように、結晶の形成は、特に以下の例示的な結晶化溶液／条件のいずれかを使用して達成し得る：約１５ｍＭまでのＮａＣｌを含む６ｍＭのＴＲＩＳ；約１０、２０もしくは３０ｍＭのＮａＣｌを含む８ｍＭのＴＲＩＳ；１０ｇ／Ｌ（タンパク質）、７ｍＭのＴＲＩＳ、２５ｍＭのＮａＣｌ；５０ｇ／Ｌ（タンパク質）、１２．８ｍＭのＴＲＩＳ、４０ｍＭのＮａＣｌ；１２もしくは１６ｍＭのＴＲＩＳおよび２０ｍＭのＮａＣｌ；２５．９ｇ／Ｌ（タンパク質）、１４．２５ｍＭのヒスチジン、９ｍＭのＴＲＩＳおよび２５ｍＭのＮａＣｌ；１０ｇ／Ｌ（タンパク質）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．５；１０ｇ／Ｌ（タンパク質）、１０ｍＭのカコジル酸緩衝液、ｐＨ７；１０ｇ／Ｌ（タンパク質）、１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．５；２５ｇ／Ｌ（タンパク質）、１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．５；２５ｇ／Ｌ（タンパク質）、１０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５；５０ｇ／Ｌ（タンパク質）、１０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５；２、４もしくは１０ｇ／Ｌ（タンパク質）、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、５〜２０％のグリセリン；２、４もしくは１０ｇ／Ｌ（タンパク質）、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１〜２０％の２−プロパノール；２、４もしくは１０ｇ／Ｌ（タンパク質）、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１〜２０％の１，４−ジオキサン；２、４もしくは１０ｇ／Ｌ（タンパク質）、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１〜５％のヘキシレングリコール；２、４もしくは１０ｇ／Ｌ（タンパク質）、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１〜２２％のエタノール；１、２、４もしくは１０ｇ／Ｌ（タンパク質）、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、６〜１０％のＰＥＧ１５００；１、２、４もしくは１０ｇ／Ｌ（タンパク質）、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、４〜８％のＰＥＧ３０００；１、２、４もしくは１０ｇ／Ｌ（タンパク質）、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、２〜８％のＰＥＧ１００００；または２５ｇ／Ｌ（タンパク質）、５２ｍＭのトレハロース、１０ｍＭのヒスチジン、１５ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ６．８。これらの中でも好ましい緩衝液は、何ら限定的なものではないが、緩衝剤としてのヒスチジン；イオン強度を調整するためのＮａＣｌ；ｐＨを調整するためのＮａＯＨ、ＴＲＩＳ、酢酸またはＨＣｌ；添加物としてのＰＥＧ１００００；および等張液を生成するためのトレハロースを含み得る。上述のように、結晶化は、適切なｐＨ（例えば、約５．５〜約７．７、好ましくは約６．８）、温度（例えば、０℃、５℃、１０℃、２０℃、２５℃、または３０℃、好ましくは約１０℃）、および時間（約１〜１５０分、例えば、約３、３５、６０または１２０分）で実行し得る。いくつかの実施形態において、平衡化は、１〜６０分の間（例えば、３または３０分未満で９０％）に達成し得る。また無細胞の培養上清からの抗体の収率は、高収率、例えば、約３０％〜約１００％（例えば、約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、７７％、８０％、８５％、９０％、９０．５％、９５％、９５．８％、９８．２％または９９％）であることが好ましい。驚くべきことに、本明細書に記載の方法は、存在するモノクローナル抗体の初期精製を必要とすることなく、および／またはポリエチレングリコールなどの添加物を使用することなく、無細胞の培養上清から直接的にそのような高収率が得られる。このように、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法によれば、結晶化モノクローナル抗体が、高収率で直接的に無細胞の細胞培養上清から（例えば、クロマトグラフィーによる精製なしに）、ポリエチレングリコールを含まない結晶化溶液を使用して得られる。結晶化した抗体は、通常、容認し得る長期保存特性（例えば、低い凝集および断片（fragment）特性）を提供する。例えば、遠心分離によってあらゆる液体を除去した後、結晶は、低い凝集および断片形成（例えば、それぞれ約１％および２％未満（例えば、約０．５％の凝集および約１．５％の断片））を示すであろう。
【００１９】
本明細書に記載のプロセスを使用して製造される結晶化モノクローナル抗体を、組成物（その一部は医薬組成物であり得る）に処方してもよい。本明細書に記載の組成物は、研究での使用および／または宿主（例えば、ヒトなどの哺乳類）への投与に適した任意の形態をとり得る。適切な形態としては、例えば、液剤、カプセル剤、乳剤、顆粒剤、フィルム、植込剤、溶液、ロゼンジ、多重微粒子、サシェ、固形剤、錠剤、トローチ、ペレット剤、散剤および／または懸濁液が挙げられる。液体処方物は、希釈剤（例えば、水またはアルコール、例えば、エタノール、ベンジルアルコール、およびポリエチレンアルコール）を、薬学的に許容される界面活性剤を伴ってまたは伴わずに、含んでもよい。カプセル形態はゼラチンで形成してもよい（例えば、ハードシェルまたはソフトシェル）。そのような組成物はいずれも、例えば、界面活性剤、滑沢剤および不活性充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプンおよび／または他の同様の成分を含むことができる。錠剤形態には、例えば、賦形剤および／または他の薬剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸、微結晶セルロース、アカシア、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、崩壊剤（例えば、クロスカルメロースナトリウム）、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、保存剤、および／または芳香剤を含めてもよい。ロゼンジ形態も、通常、不活性基材（例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア、乳剤、ゲル剤）と共にと共に用いることができる。組成物は、凍結乾燥形態で調製してもよい。また当業者に理解されるように、他の形態も適切であり得る。
【００２０】
医薬組成物は、上述のまたは当該技術分野で知り得るようないずれの形態であってもよい。医薬組成物は、研究で使用および／または宿主（例えば、ヒトなどの動物）への投与の前に１つ以上の薬学的に許容される担体を用いて調製してもよい。薬学的に許容される担体は、生物学的にまたは他の点で好ましくないものでない材料であり、例えば、研究で使用および／または対象に投与されたとき、何らかの好ましくない生物学的作用を引き起こすことがなく、または使用する医薬組成物に含まれるおよび／または反応する他の任意の成分と有害な様式で相互作用することがない材料である。当業者にとって周知であるように、担体は、活性成分のあらゆる低下が最小限で、対象におけるあらゆる有害な副作用が最小限となるように選択することが当然である。適切な医薬担体およびそれらの処方は、例えば、Remington's:The Science and Practice of Pharmacy,21stEdition,David B.Troy,ed.,Lippicott Williams & Wilkins(2005)に記載されている。通常は、製剤に適切な量の薬学的に許容される塩を使用して製剤を等張にする。薬学的に許容される担体の例としては、限定されないが、滅菌水、食塩水、リンゲル液のような緩衝液、およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、一般的に、約５〜約８、または約７〜約７．５である。他の担体としては、ポリペプチドまたはその断片を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性調製物が挙げられる。マトリックスは、成形された物品（例えば、フィルム、リポソームもしくは微粒子）の形態であってもよい。当業者であれば、特定の担体が、例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に依存してより好ましいものになり得ることが明らかであろう。さらに、処置を必要とする宿主に組成物を投与する（例えば、医薬組成物として）ことによる疾患の処置方法が提供される。適切な投与経路としては、例えば、経口、口腔、直腸、経粘膜、局所、経皮、皮内、腸管、および／または非経口経路が挙げられる。当業者に理解されるように、本明細書に記載される以外の投与経路および／または組成物の形態も適切であり得る。
【００２１】
本明細書に記載の組成物は、種々の疾患（癌および非癌病態が挙げられるがこれに限定されない）の処置に使用することができる。本明細書に記載されるように生成されたモノクローナル抗体および／またはそれを含む組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、細胞、組織等におけるタンパク質および／または核酸の機能／発現を検出するために研究で使用することができる。例えば、モノクローナル抗体を使用して、特定のタンパク質の発現を特定するために細胞に印をつけてもよい。モノクローナル抗体は、検出ラベルおよび／または細胞毒性部分に結合されていてもよい。当業者に容易に理解されるように、本明細書の記載にしたがって製造されたモノクローナル抗体の他の用途も意図される。
【００２２】
また無細胞上清からモノクローナル抗体を結晶化するために必要な試薬を含むキットも提供される。例示的なキットには、１つ以上の結晶化溶液および／または緩衝液（例えば、透析／緩衝液交換用）を含めてもよい。またキットには、本明細書に記載の方法を実施するために必要となり得る種々の種類の設備（例えば、フィルタまたは同様のもの）を備えてもよい。キットにはさらに本方法が所望するように機能していることを確認するために使用し得るポジティブおよび／またはネガティブコントロールを含めてもよい。また使用説明書を含めてもよい。モノクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体を含有する組成物を含むキットも提供される。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載の組成物またはその混合物を含む１つ以上の容器と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで使用するための説明書を含む。例えば、キットには、本明細書に記載の組成物を含有する容器および該組成物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に添加（例えば、組成物をバルクまたは単一細胞の細胞培養物に加えることにより）することについての説明書を含めることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏで使用する場合に関しては、キットに、抗体の組成物を含有する容器および該組成物を動物（例えば、ヒト）に投与して、疾患状態を予防または治療することについての説明書を含めることができる。当業者に理解されるように、キットの他の実施形態も提供される。
【００２３】
本明細書において、範囲は、ある特別のおよその値から、および／または別の特別のおよその値までを表すものであり得る。そのような範囲を表現する場合、別の態様には、１つの特別の値からおよび／または別の特別の値までが含まれる。同様に、値が約またはおよそという先行詞の使用によって近似値として表される場合、特別の値が別の態様を形成することが理解されるであろう。範囲の各々の終点が、別の終点と関連するものおよび別の終点と独立したものの両方として意義を有することがさらに理解されるであろう。範囲（例えば、９０〜１００％）は、範囲自体だけでなく、あたかも各値が別個に列挙されているように、範囲内の個々の値を含むことも意味する。
【００２４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に明記のない限り、複数の参照物も含むものであることに留意しなければならない。したがって、例えば、断片への言及は、断片の混合物を含む場合があり、薬学的担体またはアジュバントへの言及は、２以上のそのような担体またはアジュバントの混合物を含む場合がある。用語「約」、「およそ」ならびに同様の語句は、数値の列挙または範囲に先行するとき、列挙された個々の値または範囲内の値それぞれについて、あたかもそれらの用語が列挙された個々の値または範囲内の値のすぐ前に先行されているように、参照される。これらの用語は、その値が指す値に正確に同じもの、近似するもの、または類似するものを指していることを意味する。本明細書で使用するとき、対象または宿主は、個体を意味する。場合に応じてまたは場合によりとは、続いて記述される事象または状況が起こるまたは起こらない可能性があり、したがってその記述が事象または状況が起こる場合と起こらない場合とを含んでいることを意味する。例えば、場合により、組成物は組合せを含みうるという表現は、組成物が異なる分子からなる組合せを含んでもよくまたは組合せを含まなくてもよいことを意味し、したがってその記述には、組合せが存在する場合と組合せが存在しない場合（即ち、組合せの成分が個別である場合）との両方を含む。
【００２５】
本明細書に引用される全ての参照文献は、参照によりその全体が本開示に組み込まれる。本発明およびその多くの利点のさらなる理解が、例示として提供される以下の実施例から得られるであろう。
【実施例１】
【００２６】
Ａ．タンパク質、塩および緩衝液の濃度
１４ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ４．９）中の純粋なｍＡｂ０３１の結晶化領域を、ｍｌバッチ実験（１０μｌ、Ｔｅｒａｓａｋｉプレート）において１０℃でタンパク濃度（１０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌおよび５０ｇ／Ｌ）と、塩濃度（１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０または８０ｍＭのＮａＣｌ）と、種々の量のＴＲＩＳを用いてｐＨ（４ｍＭ＝ｐＨ５．５、８ｍＭ＝ｐＨ６．４、９ｍＭ＝ｐＨ６．６、１６ｍＭ＝ｐＨ７．５、１８ｍＭ＝ｐＨ７．６）とを変化させて決定した。図２Ａ〜Ｃに示されるように、結晶化に帰着する条件は、沈澱に帰着する条件と明確に区別された。例えば、試験された各タンパク質濃度に関して、６ｍＭのＴＲＩＳおよび最大約１５ｍＭのＮａＣｌまたは８ｍＭのＴＲＩＳおよび約１０、２０もしくは３０ｍＭのＮａＣｌでは、沈殿することなく結晶形成がもたらされた。１０ｇ／Ｌにおいて結晶化に適切な条件には、例えば、７ｍＭのＴＲＩＳ／２５ｍＭのＮａＣｌも含まれることが測定された（図３Ａ）。５０ｇ／Ｌにおいて結晶化にふさわしい条件には、例えば、１２．８ｍＭのＴＲＩＳ／４０ｍＭのＮａＣｌも含まれることが測定された（図３Ｂ）。結晶化に帰着する他の条件も、図２Ａ〜Ｃから明らかである。
【００２７】
Ｂ．ｐＨ調整による結晶化の開始
純粋なｍＡｂ０１を、６ｍｌの攪拌バッチ実験において１０℃および４０ｒｐｍで結晶化した。結晶化条件は、２５．９ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１４．２５ｍＭのヒスチジン、９ｍＭのＴＲＩＳおよび２５ｍＭのＮａＣｌとした。結晶化は、ＴＲＩＳを使用してｐＨを６．６に調整することにより開始させた。３５分後に９０．５％の収率に達した。平衡時（０．４６ｇ／ＬのｍＡｂ０１）には９８．２％の収率が観察され、平衡の約９０％に約３０分後には達していたことが示された。
【００２８】
Ｃ．他の緩衝系／添加物／塩類
上記に示されるように、ヒスチジン／ＴＲＩＳ緩衝系は、非常に効果的である。他の緩衝系でも良好に実施されることが分かった。例えば、一定した結晶形態学的結晶化が、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ１００００、グリセリン、２−プロパノール、１，４−ジオキサン、ヘキシレングリコールまたはエタノールを使用して達成された。いくつかの良好に実施された試験系として以下が挙げられる：１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．５；１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのカコジル酸緩衝液、ｐＨ７；１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．５；２５ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．５；２５ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５；５０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５；２、４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、５〜２０％のグリセリン；２、４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１〜２０％の２−プロパノール；２、４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１〜２０％の１，４−ジオキサン；２、４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１〜５％のヘキシレングリコール；２、４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１〜２２％のエタノール；１、２、４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、６〜１０％のＰＥＧ１５００；１、２、４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、４〜８％のＰＥＧ３０００；および１、２、４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、２〜８％のＰＥＧ１００００。１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１４ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＣａＣｌ２；１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１４ｍＭのヒスチジン、１０もしくは２０ｍＭのＬｉ２ＳＯ４；２、４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１４ｍＭのヒスチジン、１０もしくは２０ｍＭのＬｉＣｌ；４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１４ｍＭのヒスチジン、３０ｍＭのＬｉＣｌ；１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１４ｍＭのヒスチジン、４０ｍＭのＬｉＣｌ；２、４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１４ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ；１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１４ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ；４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１４ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４；２、４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１３ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．８ｍＭのＭｇＳＯ４；４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１３ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭのＮａＣｌ、１．６ｍＭのＭｇＳＯ４；４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１３ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．８ｍＭのＭｇＳＯ４、２ｍＭのＥＤＴＡ；２、４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１３ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭのＮａＣｌ、１．６ｍＭのＭｇＳＯ４、２ｍＭのＥＤＴＡ；４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１３ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭのＮａＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ２；１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１３ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭのＮａＣｌ、３．６ｍＭのＣａＣｌ２；２、４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１３ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭのＮａＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのＥＤＴＡ；４ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１３ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭのＮａＣｌ、３．６ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのＥＤＴＡ；４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１３ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ；２もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１３ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭのＮａＣｌ、１０．８ｍＭのＫＣｌ；２、４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１３ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ；２、４もしくは１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１３ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭのＮａＣｌ、１０．８ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ。これらの条件の各組合せも容認される結果をもたらした。
【００２９】
Ｄ．結晶安定性についての温度およびｐＨの影響
ｍＡｂ０１の結晶懸濁液を、６ｍｌの攪拌バッチで１０℃、２５０ｒｐｍ（２５ｇ／ＬのｍＡｂ０１、２０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ５）、１６ｍＭのＴＲＩＳ（最終ｐＨ６．８））において作製した。結晶化が平衡に達した後に、温度とｐＨを、１０℃、２０℃、２５℃または３０℃、およびｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０および９．５に調整し、安定性を溶液中のタンパク質の量に基づいて評価した（例えば、溶液中のタンパク質量が高いほど安定性が低いことを示す）。結果を図４に示す。認識できるように、温度を下げると、より広い範囲のｐＨで安定性がもたらされた（例えば、１０℃では安定性が約ｐＨ５．５〜７．７で観察され、温度が高いほど安定性は減少した）。
【００３０】
Ｅ．純粋なｍＡｂ０１結晶の溶解
純粋なｍＡｂ０１結晶の溶解は迅速に生じることが測定された。結晶化は凝集をもたらさず、結晶化抗体の生物活性は高かった。純粋なｍＡｂ０１の溶解は、ｐＨを下げることによって数分以内に達成された。簡潔には、約３００ｍｇのｍＡｂ０１結晶を６ｍＬの水に懸濁させ、２０℃にて６ｍＬバッチ反応器中で攪拌した。結晶を溶解させるために、４．５ｍＭの酢酸を加えてｐＨを５．４に調整した。結晶は５分以内に溶解し、３５ｇ／ＬのｍＡｂ０１を含有する溶液が生成された。別の実験では、１Ｌのバッチプロセスで得たｍＡｂ０１結晶を、１０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ５）に溶解し、１０％酢酸を使用して、ｐＨを５に調整した。高濃度の液体で粘性のｍＡｂ０１溶液２００ｇ／Ｌを得た。別の試験において、ｍＡｂ０１調製物（８ｇ／Ｌ）を、１０℃で５ｍＬの攪拌バッチにおいて、１０ｍＭのヒスチジン／２０〜２２ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ６．７）中で結晶化し、遠心分離（１６１００ｒｃｆ、３分、１０℃）によって分離した。これらの結晶を、１ｍＬの１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ４．９、ｐＨは１０％の酢酸で調整した）を加えて、室温でピペット操作することにより、再懸濁および溶解した。結晶は２分以内に溶解した。結晶の分析（ＳＥＣ）により、結晶化後に副生成物の増加や生成物の劣化がないことが示された。結晶化後の生物活性は、わずかに増加し、約４〜５％であった。
【００３１】
Ｆ．非常に迅速な結晶化動態および高収率を伴った６ｍＬ攪拌バッチから１Ｌ攪拌バッチ反応器への純粋なｍＡｂ０１の結晶化のスケールアップ
６ｍｌ攪拌バッチでの結晶化と１Ｌ攪拌バッチでの結晶化の動態を比較した。６ｍｌ攪拌バッチを、１０℃で、２５０ｒｐｍで攪拌しながら、以下の結晶化条件を使用して調製した：１０ｇ／ＬのｍＡｂ０１、１０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭのＮａＣｌ、１６ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ６．８。図５に、この反応の動態を示す。収率は３５分後で８６．６％であり、平衡時の収率は９３．１％（０．６９ｇ／Ｌ）であった。平衡濃度の９０パーセントに約３０分後には到達していた。１Ｌの攪拌バッチを、１０℃で、１５０ｒｐｍで攪拌しながら、以下の結晶化条件を使用して調製した：２５ｇ／ＬのｍＡｂ０１、５２ｍＭのトレハロース、１０ｍＭのヒスチジン、１５ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ６．８。図６に、この反応の動態を示す。収率は３分後で９５．８％であり、平衡時の収率は９８．３％（０．４２ｇ／Ｌ）であった。平衡濃度の９０パーセントに３分未満で到達していた。
【００３２】
Ｇ．純粋ｍＡｂ０１結晶の安定性
長期保存を、遠心分離によって液体を除去した後、ｍＡｂ０１結晶を２０℃で１ヶ月間保存することによりシミュレートした。対照液体として、７０ｇ／ＬのｍＡｂ０１を含有する２０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ５．０）も保存した。ＳＥＣ分析により、液体製剤では、０．５％の凝集と１．５％の断片が示された。試験結晶では、凝集はわずか０．３％であり、断片は１．４％であった。これらの試験から、ｍＡｂ０１結晶が長期保存に適している（例えば、安定している）ことが示される。
【００３３】
Ｈ．タンパク質含有量
高濃度のｍＡｂ０１は遠心分離によって得ることができる。例えば、５２５２ｇで３分間の遠心分離により、２１４ｇ／ＬのｍＡｂ０１を含有する結晶ペレットが得られた。また５０３７７ｇで３分間の遠心分離により、３１５ｇ／ＬのｍＡｂ０１を含有する結晶ペレットが得られたが、この濃度は、液体製剤において可能な最大濃度よりも著しく高い。
【００３４】
Ｉ．結晶化の間における結晶サイズおよび結晶長
攪拌速度とタンパク濃度の影響を評価した。６ｍｌ攪拌バッチ反応器における２００ｒｐｍでの最大結晶長は６０μｍであった。６ｍｌ攪拌バッチ反応器における１２０ｒｐｍでの最大結晶長は１２０μｍであった。したがって、攪拌速度を遅くすることにより、より長い結晶の形成が可能となる。種々の濃度のｍＡｂ０１を１０ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭのトレハロース、およびＴＲＩＳ中でｐＨを６．８に調整して結晶化させると、種々の結晶長となった（表１を参照）。
【００３５】
【表１】
2015517306.tif 000003
【実施例２】
【００３６】
細胞培養上清からの抗体の結晶化
驚くべきことに、ｍＡｂ０１を、無細胞の培養上清から直接的に結晶化できることが分かった。この上清を、ＳＥＣによって最初に分析したところ、多くの不純物を含有していることが分かった。４５ｍｌのｍＡｂ０１−Ａ細胞培養上清試料（２．３１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ０１）を、回転遠心分離（Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０メンブレンを備えたＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ）によって４．５ｍｌに濃縮した。次いで、濃縮した上清を、管状透析膜（Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｕｂｉｎｇ  Ｖｉｓｋｉｎｇ（ＭＷＣＯ）１４０００）を使用して、１Ｌの１０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ５）に対して透析した。得られた６．５ｍｌの透析物（ｐＨ５．０）を、遠心分離（５分、１６１００×ｇ）によって清澄化した。この「前処理回収液１」は、１２．９ｇ／ＬのｍＡｂ０１濃度（ＳＥＣによって測定）および０．７ｍＳ  ｃｍ−１の伝導度を有するｍＡｂ０１を含んでいた。次いで、結晶化を、μｌバッチ実験においてパラフィンオイルで密封したＴｅｒａｓａｋｉプレートを使用して１０℃で行った。図７Ａは、５μｌの前処理回収液１と５μｌの結晶化溶液１（１２ｍＭのＴＲＩＳ、２０ｍＭのＮａＣｌ）からなる１０μｌバッチにおいてｐＨを６．８前後（より大きなスケールの実験で確認）として調製したｍＡｂ０１結晶を示す。図７Ｂは、５μｌの溶液（７６．９μｌの前処理回収液１；２．４μｌの０．２Ｍヒスチジン緩衝液、ｐＨ４．９；４５．７μｌの水）と５μｌの結晶化溶液１（１２ｍＭのＴＲＩＳ、２０ｍＭのＮａＣｌ）とからなる１０μｌのバッチで調製したｍＡｂ０１結晶を示す。図７Ｃは、５μｌの前処理回収液１と５μｌの結晶化溶液（１２ｍＭのＴＲＩＳ、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．８）とからなる１０μｌのバッチで調製したｍＡｂ０１結晶を示す。図７Ｄは、５μｌの前処理回収液１と５μｌの結晶化溶液（１６ｍＭのＴＲＩＳ、２０ｍＭのＮａＣｌ）とからなる１０μｌのバッチで調製したｍＡｂ０１結晶を示す。図７Ｅは、５μｌの溶液（７６．９μｌの前処理回収液１、２．４μｌの０．２Ｍのヒスチジン緩衝液、ｐＨ４．９、および４５．７μｌの水）と５μｌの結晶化溶液１または結晶化溶液２（それぞれｐＨは６．８）とからなる１０μｌのバッチで調製したｍＡｂ０１結晶を示す。試験した条件それぞれから緻密な結晶が得られ、濃縮し、透析した細胞培養上清のバッチから結晶化が可能であることが実証された。
【００３７】
事前濃縮なしで結晶化が可能であるかを判断するための実験も行った。この目的のために、４５ｍｌのｍＡｂ０１−Ａ細胞培養上清試料（２．３１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ０１）を、管状透析膜（Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｕｂｉｎｇ  Ｖｉｓｋｉｎｇ（ＭＷＣＯ）１４０００）を使用して、５Ｌの１０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ５）に対して終夜透析した。生成した透析物を、５２５２ｒｃｆで１５分間遠心分離して清澄化し、続けて０．２μｍのフィルタを使用して濾過して「前処理回収液２」を生成した。前処理回収液２はｐＨ５．０であり、伝導度が０．７ｍＳ  ｃｍ−１であった。次いで、２５ｍｌの前処理回収液２を、２．５Ｌの１０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ５）に対して終夜透析した。得られた透析物を、５２５２ｒｃｆで１５分間遠心分離し、続けて０．２μｍのフィルタを使用して濾過した。この「前処理回収液３」はｐＨ４．９であり、伝導度は０．６ｍＳ  ｃｍ−１であった。次いで、前処理回収液２および３それぞれに対する結晶化を、Ｔｅｒａｓａｋｉプレートを用い、以下の条件（ｐＨ６．８前後）を使用したμＬバッチ実験により行った：５μｌの前処理回収液２および５μｌ含有の１４ｍＭのＴＲＩＳ（図８Ａ）；５μｌの前処理回収液２および５μｌ含有の１２ｍＭのＴＲＩＳ；５μｌの前処理回収液２および５μｌ含有の１６ｍＭのＴＲＩＳ；５μｌの前処理回収液２および５μｌ含有の１６ｍＭのＴＲＩＳおよび２０ｍＭのＮａＣｌ；５μｌの前処理回収液２、５μｌ含有の１２ｍＭのＴＲＩＳおよび２０ｍＭのＮａＣｌ；５μｌの前処理回収液２、５μｌ含有の１２ｍＭのＴＲＩＳおよび４０ｍＭのＮａＣｌ；５μｌの前処理回収液２、５μｌ含有の１６ｍＭのＴＲＩＳおよび４０ｍＭのＮａＣｌ；５μｌの前処理回収液２、５μｌ含有の１４ｍＭのＴＲＩＳおよび４％のＰＥＧ１００００；５μｌの前処理回収液２、５μｌ含有の１６ｍＭのＴＲＩＳおよび４％のＰＥＧ１００００；５μｌの前処理回収液３および５μｌ含有の１０ｍＭのＴＲＩＳ；５μｌの前処理回収液３および５μｌ含有の１２ｍＭのＴＲＩＳ；５μｌの前処理回収液３および５μｌ含有の１４ｍＭのＴＲＩＳ（図８Ｂ）；５μｌの前処理回収液３および５μｌ含有の１６ｍＭのＴＲＩＳ（図８Ｃ）；５μｌの前処理回収液３、５μｌ含有の１２ｍＭのＴＲＩＳ、２０ｍＭのＮａＣｌ；５μｌの前処理回収液３、５μｌ含有の１４ｍＭのＴＲＩＳ、２０ｍＭのＮａＣｌ；５μｌの前処理回収液３および５μｌ含有の１４ｍＭのＴＲＩＳ、４０ｍＭのＮａＣｌ；５μｌの前処理回収液３および５μｌ含有の１２ｍＭのＴＲＩＳ、４％のＰＥＧ１００００；５μｌの前処理回収液３および５μｌ含有の１４ｍＭのＴＲＩＳ、４％のＰＥＧ１００００；および５μｌの前処理回収液３および５μｌ含有の１６ｍＭのＴＲＩＳ、４％のＰＥＧ１００００。試験した条件それぞれから結晶が得られ、透析された細胞培養上清から、バッチの濃縮をせずに結晶化が可能であることが実証された。
【００３８】
５ｍｌ攪拌バッチからの結晶化も試験した。水（２９４０μｌ）、５ＭのＮａＣｌ（１０μｌ）および前処理回収液１を合わせ、２５０ｒｐｍ、１０℃で混合した。３０μｌの１ＭのＴＲＩＳを加え、ｐＨを６．８前後に調整することにより、結晶化を開始した。最初の結晶は約１５分後に現れ、実験は約３時間後に停止した。結晶を遠心分離（３分、１６１００ｇ）によって分離し、０．５ｍｌの１０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ５）に溶解した。５μｌの１０％酢酸を加えることによりｐＨを５に調整し、ｍＡｂ０１を含有する約６５０μｌの溶液を調整した。ＳＥＣ分析により、９６．５％の高純度が示された。溶解した結晶溶液のタンパク濃度は３８．９ｇ／ＬのｍＡｂ０１であった。
【００３９】
攪拌バッチ（５ｍｌ、２５０ｒｐｍ、１０℃）での結晶化に対するＰＥＧの作用も試験した。２５００μｌの前処理回収液３と２６４０μｌの水と４５μｌの１ＭのＴＲＩＳとの混合物を調製し、１８．５μｌの０．５Ｍ酢酸を加えることによりｐＨを６．８に調整した。この前処理回収液３（ＰＥＧ非含有）の伝導度は０．４０ｍＳ／ｃｍ−１であった。得られた結晶を図９に示す。ＳＥＣ分析により、９０．５％の純度が示された。別の攪拌バッチは、２５００μｌの前処理回収液３、２２１０μｌの水、４０μｌの１ＭのＴＲＩＳ、および２５０μｌの４０％のＰＥＧ１０００を使用し、ｐＨを２．５μｌの１ＭのＴＲＩＳを加えることにより６．８に調整し、調製した。この得られた前処理回収液３のＰＥＧ＋溶液の伝導度は、０．４６ｍＳ／ｃｍ−１であった。ＰＥＧまたはトレハロースの追加により核形成の速度が増加し得ることが観察されたが、そのような物質が必ずしも必要ということではない。
【００４０】
攪拌バッチ中の前処理回収液２に同様の試験を行った。攪拌バッチは、２５００μｌの前処理回収液２、２２１５μｌの水、３５μｌの１ＭのＴＲＩＳ、および２５０μｌの４０％のＰＥＧ１０００を使用し、ｐＨを８．０μｌの１ＭのＴＲＩＳを加えることにより６．８に調整し、調製した。この前処理回収液２溶液の伝導度は０．４６ｍＳ／ｃｍ−１であった。得られた結晶を図１０に示す。ＳＥＣ分析により、９２％の純度が示された。わずかに０．３ｇ  Ｌ−１の抗体が上清に残った。このデータにより、ほとんどの抗体が結晶化後に上清に残らず、結晶が高純度の抗体を含有していたことが実証される。これらの実験により、５ｍｌの攪拌バッチ中の透析回収液（前処理回収液２または３）からｍＡｂ０１の結晶化が可能であることが実証される。
【００４１】
透析濾過したが濃縮はしていない１００ｍｌバッチからの結晶化も試験した。１００ｍｌの無細胞回収液（ｍＡｂ０１−Ｂ、３．３ｇ／Ｌ）を、１５０ｒｐｍ（１０℃）の攪拌反応器中で、クロスフロー型限外濾過ユニットを使用して、４００ｍｌの１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＮａＣｌ（酢酸を使用してｐＨを５．０に調整）に対して透析濾過した。遠心分離は、３２００ｒｃｆで１５分間行い、続けて０．２μｍのフィルタを通して濾過した。この回収液（「前処理回収液４」）の伝導度は１．７ｍＳ  ｃｍ−１であった。次いで、６０ｍｌの前処理回収液４を、２％ｗ／ｖのＰＥＧ１００００を加えることによって１００ｍｌ攪拌バッチ反応器中１５０ｒｐｍ（１０℃）で結晶化させ、０．７ｍｌの１ＭのＴＲＩＳを加えることによりｐＨを６．８に調整した。得られた結晶（離散性の強健な桿状結晶）の分離は、３２００ｒｃｆで１５分間の遠心分離によって達成した。ＳＥＣ分析により、９２％の純度が示された。これらの実験により、１００ｍｌの攪拌バッチ反応器中の透析濾過回収液から、結晶形態を変化させることなく、高純度結晶の結晶化が可能であることが示された（例えば、図１１）。
【００４２】
さらにｍＡｂ０１は、事前に濃縮することなく、ｐＨ滴定および透析濾過された前処理回収液から結晶化された。７５２ｍｌの無細胞回収液（ｍＡｂ０１−１１５０６Ａ、３．３ｇ／Ｌ）を、１０％の酢酸を使用してｐＨ５まで滴定した。生成した沈殿を、３２００ｒｃｆで１５分間、遠心分離することによって除去した。上清をクロスフロー型限外濾過ユニット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ；ＭＷＣＯ  ３０ｋＤａ；３０５１４４５９  ０２Ｅ−ＳＷ  Ｈｙｄｒｏ−３０Ｋ００４）を使用して、７Ｌの１０ｍＭのヒスチジン緩衝液（酢酸でｐＨ５に調整）に対して透析濾過した。透析濾過の間に、上清はヒスチジン緩衝液で９９４ｍｌに希釈された。生成した沈殿物を、３２００ｒｃｆで１５分間遠心分離して除去し、続けて０．２μｍのフィルタを使用して濾過した。この溶液（前処理回収液５）の伝導度は０．７ｍＳ  ｃｍ−１であった。前処理回収液５からの結晶化は１５０ｒｐｍ（１０℃）で１Ｌの攪拌バッチ反応器中で行った。最初に、０．５８４ｇのＮａＣｌおよび１９．８８ｇのＰＥＧ１００００を、前処理回収液５に溶解した。結晶化は、１ＭのＴＲＩＳを１４ｍｌ加えてｐＨを６．８に調整することにより開始した。最初の結晶は１時間後に見られ、結晶化は２時間で完了した。結晶を遠心分離（３２００ｒｃｆ、２０分）によって分離し、１０ｍＭのヒスチジン緩衝液に溶解した。
【００４３】
このプロセスの結果の概要を表２に示す。後に抗体はｐＨを６．８に調整することにより再結晶化した。分析のために再結晶化した抗体結晶を遠心分離（３２００ｒｃｆ、２０分）によって分離し、１０ｍＭのヒスチジン緩衝液に溶解した。これらの実験は、ｐＨ滴定と透析濾過を行った回収液から結晶化が可能であったことを実証する。１Ｌの攪拌バッチ反応液へのスケールアップが首尾よく行われた。結晶化は驚くほど速かった。全プロセスで高収率（７５％）が実証された（表２）。また、良好な精製がＳＥＣおよび宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）分析によって確認され、その精製はプロテインＡクロマトグラフィーによる精製に匹敵する。
【００４４】
【表２】
2015517306.tif 000004
【００４５】
２０℃で安定性試験も行った。結晶化後、結晶を４４，０００ｒｃｆで３分間遠心分離することによって分離し、上清を除去した。ｍＡｂ０１結晶（約２２０ｇ／Ｌ）を保存し、液体対照試料（７０ｇ．ＬのｍＡｂ０１、２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ５．０）と比較した。結果を表３に示す。
【００４６】
【表３】
2015517306.tif 000005
【００４７】
結果は、１ヶ月後の液体対照と比較して結晶生成に不利な点がないことを示していた。
【００４８】
純粋なｍＡｂ０１の存在下、希釈した無細胞上清回収液からのｍＡｂ０１の結晶化も、μｌバッチ（１０℃、１０ｍＭのヒスチンド（histinde）、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ＰＥＧ１００００、純粋ｍＡｂ０１、およびｍＡｂ０１回収液（３．３ｇ／ＬのｍＡｂ０１を含有））で行った。表４に示されるように、条件を設定することで結晶化が可能であった。
【００４９】
【表４】
2015517306.tif 000006
【００５０】
このデータから、最大５０％の回収液が結晶化プロセスで許容されたことが示された。１）ＰＥＧ１００００が無細胞上清（例えば、回収液）の塩の阻害作用を減少したこと、２）純粋なｍＡｂ０１を含む希釈ｍＡｂ０１回収液からのｍＡｂ０１の結晶化が可能であること、３）回収液から沈澱反応のないｍＡｂ０１の結晶化が実現可能であることが認識され得る。したがって、無細胞上清（例えば、回収液）を沈殿なしで濃縮させてｍＡｂ０１を結晶化すること、無細胞上清を沈殿なしで希釈し、次いでｍＡｂ０１を結晶化することは可能である。
【００５１】
無細胞回収液の濃縮および希釈によるｍＡｂ０１の結晶化
３．２ｇ／ＬのｍＡｂ０１を含有する無細胞回収液を、４〜１０倍に濃縮した。次いで、濃縮した回収液を、結晶化に適した緩衝液で希釈し、得られた溶液を、２５０ｒｐｍの攪拌されたｍＬ反応器中１０℃でｐＨを６．８前後に調整することによって結晶化した。結晶化後、遠心分離によって結晶を分離し、ＳＥＣによって分析した（表５参照）。
【００５２】
【表５】
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【００５３】
部分的に精製された溶液からのｍＡｂ０１の結晶化
回収液からのｍＡｂ０１を、従来の方法（プロテインＡクロマトグラフィー）で最初に部分的に精製し、次いで低ｐＨでウイルス不活化を行い（この溶液はＶＩＮと称した）。後に、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行った（この溶液はＡＥＣと称した）。ＶＩＮとＡＥＣからのｍＡｂ０１を、ヒスチジンを１０ｍＭまで加えて、１Ｍのトリスを数μＬ加えてｐＨを約６．８に調整することにより、攪拌された６ｍＬの結晶器内で８ｇ／ＬのｍＡｂ０１で結晶化した。最初の結晶化後、結晶を、溶解および再結晶化するか、または１０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．８）で洗浄した。収率、純度、ＨＣＰ含量および生物学的活性について定量した（表６参照）。
【００５４】
【表６】
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【００５５】
ＳＥＣ分析により、結晶化工程の結果として生じた凝集や劣化はなく、高レベルの精製が達成されたことが示された。バイオアッセイにより、生物学的に活性なタンパク質が結晶に好ましく組み込まれていることが示された。明瞭なＨＣＰ減少が全ての結晶化および洗浄工程において認識された。ＡＥＣの工程から開始しても、結晶化は、ＣＥＣと比較して同様のＨＣＰ減少に達した。
【００５６】
既存の大規模ＧＭＰ精製工程における結晶化の適応性
１リットルスケールにスケールアップした精製工程について試験した。精製は、回収液の前処理、結晶化、再結晶、低ｐＨでのウイルス不活化、陰イオン交換クロマトグラフィー、ナノ濾過および最終結晶化により構成した。出発原料は、無細胞回収液とした。１．２Ｌの無細胞回収液を、１０ｋＤａのＭＷカットオフメンブレン（Ｓａｒｔｏｃｏｎ（登録商標）Ｓｌｉｃｅ）を使用して、６倍に濃縮した。その後、ｐＨを１０ｍＬの１．２Ｍ酢酸を加えることによりｐＨ５．０へ滴定し、溶液を遠心分離（１５分、３２００ｒｃｆ）によって清澄化した。同じメンブレンを使用して、緩衝液を５透析濾過体積（１０ｍＭのヒスチジン緩衝液（酢酸でｐＨ５．０に調整）と交換した。溶液は遠心分離（１５分、３２００ｒｃｆ）および濾過（０．２μｍ）によって清澄化した。この前処理工程の収率は９４．７％であった。その溶液を１０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．０（酢酸で調整））で希釈し、全体積を１リットルとした。伝導度は０．５ｍＳ  ｃｍ−１であった。結晶化は攪拌された１リットルの反応器中で１０℃、１５０ｒｐｍで行った。結晶化条件は、０．８７６ｇの塩化ナトリウムおよび１３ｍＬの１ＭのＴＲＩＳ（伝導度１．８ｍＳ  ｃｍ−１およびｐＨ６．７７）を加えることにより調整した。さらに、２％ｗ／ｖのＰＥＧ１００００を加えた。結晶を遠心分離（１５分、３２００ｒｃｆ）によって分離し、１０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ５）に溶解し、０．８ｍＳ  ｃｍ−１の伝導度およびｐＨ５．２を有する１１６ｍｌの溶液を得た。結晶化の収率は８７．２％であった。再結晶化は１０℃および２００ｒｐｍで１００ｍＬスケールの攪拌された結晶器で行った。結晶化を、０．１１２ｇの塩化ナトリウムおよび１．９ｍＬの１ＭのＴＲＩＳを加えること（伝導度２．０ｍＳ  ｃｍ−１およびｐＨ６．８を導く）により開始した。前述のように結晶の分離を行った。その後、低ｐＨでの標準ウイルス不活化工程、陰イオン交換クロマトグラフィー工程、およびナノ濾過工程が、何ら問題なく、結晶化後に容易に実施できた。したがって提唱したプロセスはＧＭＰ条件下で操作し得ることが示された。２５０ｍＭのトレハロースを存在させて最終的な結晶化を行い、等張溶液を得た。この等張化は注射用懸濁液とするために重要である。全プロセスにより、３０３０倍のＨＣＰの低減が導かれた。驚いたことに、ＤＮＡは、再結晶化工程後はもはや少しも存在しなかった（表７参照）。
【００５７】
【表７】
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【００５８】
本発明を好ましい実施形態の観点から説明しているが、当業者であれば変更および改変を想定することが理解される。したがって、添付の特許請求の範囲は、請求される発明の範囲内に入るそのような全ての均等な変更を包含することを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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