(57)【要約】  液体（Ｌ）を含むチャネル（２）内で物体（Ｏ）の多層凝集体（１２０）を形成する方法であって、該方法は、ａ）チャネル（２）の第１及び第２の重ね合わせ領域（５０）、（６０）に物体（Ｏ）を準備することと、ｂ）各領域内で、選択的には横断方向音波、好ましくは定在波を物体（Ｏ）に印加することによって物体（Ｏ）の第１及び第２の凝集体（１１０）、（１１１）を得ることと、ｃ）第１及び第２の凝集体（１１０）、（１１１）に、−音波が存在しない状態で重力を受けさせること、又は、−第１及び第２の凝集体（１１０）、（１１１）を互いの方へ向かわせる移動を誘起する音波を、選択的には定在波を、受けさせることによって、第１及び第２の凝集体（１１０）、（１１１）を接触させて、物体（Ｏ）の多層凝集体（１２０）を形成することと、を含む。【選択図】図１
2015506181.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体（Ｌ）を含むチャネル（２）内で物体（Ｏ）の多層凝集体（１２０）を形成する方法であって、
ａ）前記チャネル（２）の第１の重ね合わせ領域（５０）及び第２の重ね合わせ領域（６０）に前記物体（Ｏ）を準備するステップと、
ｂ）前記各領域内で、選択的には横断方向音波、好ましくは定在波を、前記物体（Ｏ）に印加することによって前記物体（Ｏ）の第１の凝集体（１１０）及び第２の凝集体（１１１）を得るステップと、
ｃ）前記第１の凝集体（１１０）及び第２の凝集体（１１１）に、
音波が存在しない状態で重力を受けさせること、又は
前記第１の凝集体（１１０）及び第２の凝集体（１１１）の互いに向かう移動を誘起する音波、選択的には定在波を受けさせること、
によって、前記第１の凝集体（１１０）及び第２の凝集体（１１１）を接触させて、前記物体（Ｏ）の多層凝集体（１２０）を形成するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記ステップｂ）及び／又はｃ）において用いられる前記音波を、前記チャネル（２）の厚さ（ｔ）に沿って発生させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップｃ）は、前記凝集体（１１０、１１１）に、
前記ステップｂ）において印加される前記音波とは異なる数の、選択的にはそれより少ない、波節、及び／又は
前記ステップｂ）において印加される前記音波の波節の横断方向位置とは異なる横断方向位置を有する少なくとも１つの波節、及び／又は
前記ステップｂ）において印加される前記音波の波腹の横断方向位置とは異なる横断方向位置を有する少なくとも１つの波腹、及び／又は
前記ステップｂ）において印加される前記音波の振幅より小さい振幅、
を有する音波を受けさせることを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記チャネル（２）は、前記チャネルの長さの少なくとも一部にわたって、厚さが可変の壁を含み、選択的に少なくとも第１の音場発生器（１００ａ）及び第２の音場発生器（１００ｂ）が前記チャネル（２）の長さに沿って存在し、前記第１の音場発生器（１００ａ）及び第２の音場発生器（１００ｂ）は、それぞれ、異なる厚さを有する前記チャネルの壁部分に面する、請求項１〜請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
少なくとも第１の音場発生器（１００ａ）及び第２の音場発生器（１００ｂ）が前記チャネル（２）の長さに沿って存在し、
前記第１の音場発生器（１００ａ）及び第２の音場発生器（１００ｂ）は、前記ステップｂ）及びｃ）において音波を放射し、
前記チャネル（２）は、前記第１の音場発生器（１００ａ）及び第２の音場発生器（１００ｂ）に対向してそれぞれ位置する第１の壁及び第２の壁を有し、前記第１の壁及び第２の壁は、前記ステップｃ）において印加される前記音波が前記第２の壁上に位置する波節及び／又は波腹を有するように、異なる厚さを有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記チャネル（２）の幅（ｗ）及び／又は厚さ（ｔ）は、前記チャネルの長さの少なくとも一部にわたって変化する、選択的には減少する、請求項１〜請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
少なくとも第１の音場発生器（１００ａ）及び第２の音場発生器（１００ｂ）が、前記ステップｂ）及びｃ）において前記音波をそれぞれ発生させるために、前記チャネル（２）の長さに沿って存在し、
前記第１の音場発生器（１００ａ）及び第２の音場発生器（１００ｂ）は、前記ステップｂ）及びｃ）において、実質的に同じ主振動数を有する音波を放射し、
前記ステップｃ）において印加される前記音波が前記ステップｂ）において印加される前記音波とは異なる数の、選択的にはそれより少ない、波節を有するように、前記チャネル（２）の幅（ｗ）及び／又は厚さ（ｔ）は、前記チャネルの長さの少なくとも一部にわたって変化する、選択的には減少する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップｃ）において印加される前記音波の主振動数は、前記ステップｃ）において印加される前記音波が前記ステップｂ）において印加される前記音波とは異なる数の、選択的にはそれより少ない、波節を有するように、前記ステップｂ）において印加される前記音波の前記主振動数とは異なる、請求項１〜請求項４及び請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ａ）前記チャネル（２）の第１の重ね合わせ領域、第２の重ね合わせ領域及び第３の重ね合わせ領域に前記物体（Ｏ）を準備するステップと、
ｂ）前記各領域内で、選択的に横音波、具体的には定在波を、前記物体（Ｏ）に印加することによって、前記物体（Ｏ）の第１の凝集体、第２の凝集体及び第３の凝集体を得るステップと、
ｃ）前記物体（Ｏ）の前記多層凝集体を形成するために、前記第１の凝集体、第２の凝集体及び第３の凝集体に、
音波が存在しない状態で重力を受けさせること、又は
前記第１の凝集体、第２の凝集体及び第３の凝集体を互いに向かって移動させる力を誘起する音波を受けさせること、
によって、前記第１の凝集体、第２の凝集体及び第３の凝集体を接触させるステップと、
を含む、請求項１〜請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップａ）において、前記チャネル（２）の前記第１の重ね合わせ領域（５０）、第２の重ね合わせ領域（６０）、及び選択的に第３の重ね合わせ領域に物体（Ｏ）の層（５１；６１）が準備され、前記層（５１；６１）は、選択的に流体力学的集中によって得られるものである、請求項１〜請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップａ）において前記第１の領域内に存在する物体（Ｏ）は、前記ステップａ）において前記第２の領域及び／又は前記第３の領域の少なくとも１つに存在する物体（Ｏ）とは異なるサイズ及び／又は性質を有する、請求項１〜請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記物体（Ｏ）は、単分散又は多分散の生物学的細胞であり、好ましくは、哺乳類の腫瘍若しくは非腫瘍細胞株、幹細胞又は初代細胞株である、請求項１〜請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記物体（Ｏ）は、正の音響コントラスト因子を有する、請求項１〜請求項１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記物体（Ｏ）は、負の音響コントラスト因子を有する、請求項１〜請求項１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記物体（Ｏ）は、気泡、微小気泡、ナノ気泡、液滴、脂肪細胞、血中脂質、リン脂質小胞、又はそれらの混合物の中から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ステップｂ）の後に、前記物体の少なくとも１つの特徴、例えば少なくとも１つの音響学的特徴の決定を含む、請求項１〜請求項１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記ステップｂ）の後に、前記物体（Ｏ）の合体ステップを含み、前記合体は、具体的には、前記物体（Ｏ）が前記チャネル（２）内に存在するときに全部又は一部が実行される、請求項１〜請求項１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記物体（Ｏ）は、前記ステップｃ）の後で、前記チャネルの外側に、例えば容器内に排出される、請求項１〜請求項１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の凝集体（１１０）及び第２の凝集体（１１１）、並びに選択的に第３の凝集体のうちの少なくとも１つは、少なくとも１００の物体（Ｏ）、具体的には少なくとも２５０の物体（Ｏ）、具体的には少なくとも５００の物体（Ｏ）、具体的には少なくとも７５０の物体（Ｏ）、具体的には少なくとも１０００の物体（Ｏ）、具体的には少なくとも１５００の物体（Ｏ）を含む、請求項１〜請求項１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記ステップｂ）及び／又はｃ）において前記音波を発生させるための複数の音波発生器（１００ａ；１００ｂ）が前記チャネル（２）の長さに沿って存在し、前記音波発生器は、好ましくは前記チャネル（２）の同じ側に存在する、請求項１〜請求項１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記液体（Ｌ）は、少なくとも前記ステップｂ）及び／又はｃ）の間は流れており、前記液体（Ｌ）の前記流れのレイノルズ数は、選択的には１０未満である、請求項１〜請求項２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記液体（Ｌ）は、前記ステップｂ）の間は流れていない、請求項１〜請求項２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記方法の全部又は一部が、１０ｍ／ｓ2以下、具体的には９．５ｍ／ｓ2以下、具体的には９ｍ／ｓ2以下、具体的には８．５ｍ／ｓ2以下、具体的には８ｍ／ｓ2以下、具体的には７．５ｍ／ｓ2以下、具体的には７ｍ／ｓ2以下、具体的には６．５ｍ／ｓ2以下、具体的には６ｍ／ｓ2以下、具体的には５．５ｍ／ｓ2以下、具体的には５ｍ／ｓ2以下、具体的には４．５ｍ／ｓ2以下、具体的には４ｍ／ｓ2以下、具体的には３．５ｍ／ｓ2以下、具体的には３ｍ／ｓ2以下、具体的には２．５ｍ／ｓ2以下、具体的には２ｍ／ｓ2以下、具体的には１．５ｍ／ｓ2以下、具体的には１ｍ／ｓ2以下、具体的には０．５ｍ／ｓ2以下の強さの重力場において実行される、請求項１〜請求項２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記方法の全部又は一部が、地表における重力場の強さとは実質的に異なる強さの重力場において実行される、請求項１〜請求項２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記液体（Ｌ）が細胞培養培地であり、
前記第１の凝集体（１１０）及び第２の凝集体（１１１）、並びに選択的に第３の凝集体のうちの少なくとも１つが細胞を含み、
前記細胞は、前記第１の凝集体（１１０）及び第２の凝集体（１１１）、並びに選択的に第３の凝集体のうちの少なくとも１つの中に存在している間に培養される、
請求項１〜請求項２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞培養によって少なくとも１つの組織が形成される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞培養によって骨組織が形成される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
幾らかの細胞培養培地が、前記細胞培養中に少なくとも一回、前記チャネル（２）内に導入される、請求項２５〜請求項２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞培養培地は、前記細胞培養中に少なくとも一回、新しくされる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の凝集体及び第２の凝集体並びに選択的に第３の凝集体が、少なくとも一時間、具体的には少なくとも一日間、具体的には少なくとも一週間、保持される、請求項１〜請求項２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の凝集体（１１０）及び第２の凝集体（１１１）、並びに選択的に第３の凝集体は、３Ｄ凝集体である、請求項１〜請求項３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の凝集体（１１０）及び第２の凝集体（１１１）、並びに選択的に第３の凝集体の複数の組が、前記チャネル（２）の長手方向軸線に沿って存在する、請求項１〜請求項３１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体を含むチャネル内で物体の多層凝集体を形成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織工学分野では、生体材料を生細胞と組み合わせることによる、再生医療のための刺激的な方法が提示されている。新規生体材料（足場）と生細胞との組合せは、例えば、骨、動脈及び膀胱といった広範囲の機能性組織の再建において、ある程度の臨床的成功をもたらしてきた。しかしながら、足場の生分解の後で炎症反応及び病理的線維化状態が生じるので、いかなる生分解性細胞外基質代替物も使用せずに２次元の細胞シートを積層することによって３Ｄ（３次元）の機能性組織を構築する、「細胞シート工学」と呼ばれる新しい組織工学的方法が出現した。
【０００３】
それでもなお、細胞シートの主な欠点は、機能的適用に関連したときにその力学的性質が不十分であることである。細胞シートは、培養面から取り外すときに広範囲にわたって収縮して移植片のサイズを小さくしてしまう。臨床環境においては、特定の移植片サイズ及び形状を特定の適用に合わせて制御することが理想的である。そのうえ、細胞シートの脆弱性が、その取り扱いを困難なものにしている。足場に基づく技術を避けたとしても、これらの課題を解決する方法は、依然として、力学的に頑強で操作しやすい３Ｄ組織の効果的な再建における大きな障害となっている。
【０００４】
再生医療治療がより進歩するにつれて、予測される需要を満たすために細胞及び組織培養の規模を拡大する戦略を開発する必要性が高まっている。これに対応して、自動化された細胞及び組織培養システムの使用が注目されており、その成功は、監視及び制御戦略に依存する。２Ｄ（２次元）及び３Ｄ凝集体をイン・ビトロで懸濁液中で生成するための種々の培養技術、例えば、平坦な剛性のプラスチック／ガラス表面上での２Ｄ細胞播種、ペレット、スフェロイド及び懸滴培養、足場法、液体オーバーレイ（ｌｉｑｕｉｄ  ｏｖｅｒｌａｙ）、スピナーフラスコ及び旋回回転法［非特許文献３］が存在する。しかしながら、これらの方法は、長い培養時間、不均等なサイズの凝集体の形成、又は機械的アクセスの困難性のいずれかによって制限される場合がある。従って、これらは、ハイスループット・アッセイに必要な形式での２Ｄ／３Ｄ凝集体の標準化された迅速かつ大規模な生産には適さない場合がある。
【０００５】
薄いチャンバ内で作用する定常音場によって発生する音響力：
【数１】
2015506181.tif 000003
を用いて、ミクロン及びサブミクロン・サイズの粒子の操作を達成することができる。Ｖは粒子の体積であり、〈ｅ〉は平均音響エネルギーであり、ｋ＝２π／λは波数であり、
2015506181.tif 000004
は、粒子及び懸濁流体の音響学的性質に依存する音響コントラスト因子（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｆａｃｔｏｒ）である。
【０００６】
このチャンバは、「音響共鳴器」と呼ぶことができる。この共鳴器は、放射壁及び反射壁を含む。定在波は、チャンバの厚さｗと音の波長λとが次式：ｗ＝ｎλ／２に示す関係にあるときに生じることが可能であり、式中、ｎは、チャンバの厚さの中で作り出される節の数である。この厚さ方向で可変の力場音響の影響下にある粒子は、音響コントラスト因子
2015506181.tif 000005
に応じて、定在波の節又は腹へと押しやられることがあり、この音響コントラスト因子は、積ｐiｃiとして定義される音響インピーダンスの関数であり、ここでｐi及びｃiは、流体又は懸濁粒子の密度及び音速である。
【０００７】
宇宙飛行士の要求に応じた組織工学の技術を開発することもまた興味深い。宇宙の無重力条件下では、培地内の細胞は、リアクタ内部で遊走し、凝集体が、さらにまた組織が増殖すべき場所である足場又は基質の方に自然に向かうことはないので、細胞培養は困難である。無重力下で凝集体を形成するには、さらに日数を要し得る。
【０００８】
前述の従来の細胞培養方法より有利な、２Ｄ及び３Ｄ細胞凝集体の迅速な形成を可能にする方法に対する要求がある。
細胞などの生物学的物体から成る多層構造体の形成を可能にする方法を得ることに対する要求がある。
組織模倣構築物を生成するための方法を得ることに対する別の要求がある。
組織工学の改善された技術を得ることに対する別の要求がある。
本発明は、前述の要求のいくつか又は全てを満たすことを目的とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／００６７１２８Ａ１号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃａｌｌｅｎｓ他、「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２００８年、第８０巻、ｐ．４８６６−４８７５
【非特許文献２】Ｗｉｌｌｉａｍｓ他、「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２００８年、第８０巻、ｐ．７１０５−７１１５
【非特許文献３】Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａ他、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ」、２００９年、第２５巻、第３号、ｐ．８３４−８４１
【発明の概要】
【００１１】
第一の態様によれば、本発明は、液体を含むチャネル内で物体の多層凝集体を形成する方法を提供し、該方法は、
ａ）チャネルの第１及び第２の重ね合わせ領域（ｓｕｐｅｒｐｏｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）に物体を準備することと、
ｂ）物体の第１及び第２の凝集体を得ることと、
ｃ）第１及び第２の凝集体に、
・音波が存在しない状態で重力を受けさせること、又は
・第１及び第２の凝集体を互いの方へ向かわせる移動を誘起する音波を、選択的には定在波を、受けさせること
によって、第１及び第２の凝集体を接触させて、物体の多層凝集体を形成することと、
を含む。
【００１２】
「物体の凝集体」とは、以下の特徴の全てを満たす物体の層を意味する。
−層内に含まれる少なくとも２つの物体、特に層内に含まれる物体の少なくとも１０％、さらには２５％、好ましくは５０％が、接触していること、及び
−層が、その横断寸法の少なくとも１つに沿って移動したときに、その長さの少なくとも一部において、連続した物体を呈すること。
【００１３】
得られる凝集体は、２Ｄ又は３Ｄ凝集体とすることができる。
得られる凝集体は、平面内に延びるものとすることができ、かつ、並置された物体の列を含む（特に、並置された物体の列にある）ものとすることができる。この場合、凝集体は、２Ｄ凝集体と呼ばれる。
別の実施形態において、得られる凝集体は、２Ｄ凝集体の積層体を含む。このような実施形態が３Ｄ凝集体の例である。
凝集体は、一軸のみに沿って延びる物体の線とは異なる。換言すれば、物体の線は、幅方向にただ１つの物体、厚さ方向にただ１つの物体、及び、長さに沿って連続した物体を含む。
【００１４】
本発明は、有利には、凝集体を損なうことなく連続的に収集することを可能にすることができる。
本発明は、有利には、同種又は異種の物体の多層凝集体の形成を可能にすることができる。
本発明は、有利には、同一寸法の細胞凝集体（２Ｄ及び／又は３Ｄ）の、制御されプログラムされた生成を可能にすることができる。
【００１５】
本発明は、有利には、例えば組織模倣構築物を生成するために、低侵襲的方法で層状に配置される２Ｄ細胞シート（ホモタイプ及び／又はヘテロタイプ、すなわち同じ細胞型又は異なる細胞型）を同時に形成することを可能にすることができる。
【００１６】
本発明は、有利には、凝集体の操作及び制御を可能にすることができ、並びに、物体とチャネル壁とが接触するとそれらの特性を変化させてしまうことがあるが、それらの間の接触の回避を可能にすることができる。
【００１７】
本発明は、さらに有利には、物体の凝集体、特に３Ｄ細胞凝集体の迅速な取得を可能にする。
本発明は、有利には、比較的容易に製造することができるとともに無菌状態で用いることができる装置を用いて、多層凝集体を取得することを可能にする。本発明による方法で用いられる装置は、標準的な超音波機器を含むことができる。
【００１８】
チャネルの第１及び第２の重ね合わせ領域における物体の層をステップａ）において準備することができ、これらの層は、選択的に流体力学的集束によって得られる。
ステップａ）において第１の領域内に存在する物体は、ステップａ）において第２の領域内に存在する物体とは異なるサイズ及び／又は性質を有するものとすることができる。
【００１９】
第１及び第２の物体の凝集体は、ステップｂ）において、横断方向音波、選択的には定在波を、各領域内に印加することによって得ることができる。
【００２０】
変形例では、物体の第１及び第２の凝集体は、ステップｂ）において流体力学的集束によって得ることができる。この場合、凝集体を形成する物体は、有利には、物体同士を互いにより近くに移動させる表面相互作用、例えば静電相互作用を呈するものとすることができる。
【００２１】
１つの実施形態によれば、音場は、ステップｃ）において停止され、物体の凝集体が重力によって接触し、それにより凝集体同士を互いに重なり合って配置させて、例えば組織化された層状組織模倣構築物がもたらされる。
【００２２】
このような実施形態は、有利には、細胞シートとして構成された細胞を懸濁液中で作製することを可能にし、それにより細胞シートの収縮を回避することができる。そのような実施形態はまた、低侵襲性でもあり、取り扱いを容易にすることができる。
【００２３】
いくつかの実施形態によれば、ステップｃ）は、凝集体に、
−ステップｂ）において印加される音波とは異なる数の、選択的にはそれより少ない、波節、及び／又は、
−ステップｂ）において印加される音波の波節（それぞれ波腹）の横断方向位置とは異なる横断方向位置を有する、少なくとも１つの波節（それぞれ波腹）、及び／又は
−ステップｂ）において印加される音波の振幅より小さい振幅
を有する音波を受けさせることを含む。
【００２４】
１つの特定の実施形態によれば、少なくとも第１及び第２の音場発生器がチャネルの長さに沿って存在し、
−第１及び第２の音場発生器は、ステップｂ）及びｃ）において音波を放射し、
−チャネルは、第１及び第２の音場発生器に対向してそれぞれ位置する第１及び第２の壁を有し、これらの壁は、ステップｃ）において印加される音波が第２の壁上に位置する節及び／又は腹を有するように、異なる厚さを有する。
この実施形態は、有利には、形成された物体の多層凝集体がチャネルの壁の一方の上に位置することを可能にし、従って容易に分離されるようにする。
【００２５】
１つの特定の実施形態によれば、それぞれステップｂ）及びｃ）において音波を発生させるための少なくとも第１及び第２の音場発生器がチャネルの長さに沿って存在し、
−第１及び第２の音場発生器は、ステップｂ）及びｃ）において実質的に同じ主振動数を有する音波を放射し、
−チャネルの幅及び／又は厚さは、ステップｃ）において印加される音波がステップｂ）において印加される音波とは異なる数の、選択的にはそれより少ない、波節を有するように、その長さの少なくとも一部にわたって変化し、選択的には減少する。
【００２６】
１つの特定の実施形態によれば、ステップｃ）において印加される音波の主振動数は、ステップｃ）において印加される音波がステップｂ）において印加される音波とは異なる数の、選択的にはそれより少ない、波節を有するように、ステップｂ）において印加される音波の主振動数と異なるものとすることができる。
【００２７】
１つの特定の実施形態によれば、本発明は、
ａ）チャネルの第１、第２及び第３の重ね合わせ領域に物体を準備することと、
ｂ）各領域内で、選択的には横断方向音波、特に定在波を物体に印加することによって、第１、第２及び第３の物体の凝集体を得ることと、
ｃ）物体の多層凝集体を形成するために、第１、第２及び第３の凝集体に
・音波が存在しない状態で重力を受けさせること、又は
・第１、第２及び第３の凝集体を互いの方へ向かって移動させる力を誘起する音波を受けさせること
によって、第１、第２及び第３の凝集体を接触させることと
を含む方法に関する。
【００２８】
本発明の特定の実施形態において、第１及び第２並びに選択的に第３の凝集体のうちの少なくとも１つは、少なくとも１００、具体的には少なくとも２５０、具体的には少なくとも５００、具体的には少なくとも７５０、具体的には少なくとも１０００、具体的には少なくとも１５００の物体を含む。
本発明の好ましい実施形態において、第１及び第２並びに選択的に第３の凝集体のうちの少なくとも１つは、少なくとも１００、具体的には少なくとも２５０、具体的には少なくとも５００、具体的には少なくとも７５０、具体的には少なくとも１０００、具体的には少なくとも１５００の細胞を含む。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態において、第１及び第２並びに選択的に第３の凝集体の各々が、少なくとも１００、具体的には少なくとも２５０、具体的には少なくとも５００、具体的には少なくとも７５０、具体的には少なくとも１０００、具体的には少なくとも１５００の物体を含む。
本発明の好ましい実施形態において、第１及び第２並びに選択的に第３の凝集体の各々が、少なくとも１００、具体的には少なくとも２５０、具体的には少なくとも５００、具体的には少なくとも７５０、具体的には少なくとも１０００、具体的には少なくとも１５００の細胞を含む。
【００３０】
上述のように、本発明は、細胞凝集体の迅速かつ簡単な取得を可能にすることが有利であり、数百の細胞の３Ｄ構築物が数秒で形成されることが好ましい。
【００３１】
１つの特定の実施形態によると、方法の全部又は一部は、１０ｍ／ｓ2以下、具体的には９．５ｍ／ｓ2、具体的には９ｍ／ｓ2、具体的には８．５ｍ／ｓ2、具体的には８ｍ／ｓ2、具体的には７．５ｍ／ｓ2、具体的には７ｍ／ｓ2、具体的には６．５ｍ／ｓ2、具体的には６ｍ／ｓ2、具体的には５．５ｍ／ｓ2、具体的には５ｍ／ｓ2、具体的には４．５ｍ／ｓ2、具体的には４ｍ／ｓ2、具体的には３．５ｍ／ｓ2、具体的には３ｍ／ｓ2、具体的には２．５ｍ／ｓ2、具体的には２ｍ／ｓ2、具体的には１．５ｍ／ｓ2、具体的には１ｍ／ｓ2、具体的には０．５ｍ／ｓ2の強さの重力場において実行される。
【００３２】
特定の実施形態においては、本発明による方法の全部又は一部は、９．８１ｍ／ｓ2に等しい地表における重力場の強さとは実質的に異なる強さの重力場において実行される。
「地表における重力場の強さとは実質的に異なる強さの重力場」とは、９．８１ｍ／ｓ2とは少なくとも５％異なる強さの重力場を意味する。
【００３３】
ステップｂ）において音波を用いることが特に有利であり、なぜならこの場合、本方法は、重力条件によって、例えば該方法が無重力又は地球の重力条件下で実行されるという事実によって、顕著な影響を受け得ないからである。実際、音響放射力は、音場と物質との間の相互作用により生成されるものであり、これは重力場とは無関係である。従って、種（ｓｐｅｃｉｅｓ）を平衡位置に向けること、例えば定在波の場の中の例えば節へと向かわせることは、人工重力を有することに類似である。
【００３４】
ステップｂ）において音波が用いられる場合、唯一の違いは、１ｇにおける凝集体の平衡位置が０ｇにおける平衡位置のわずかに下方に位置するということである。
例えば、０ｇにおいて細胞凝集体の平衡位置は波節に置くことができ、１ｇにおいてはこれを波節のわずかに下方の、チャネルの壁からは遙かに離れたところに置くことができる。
【００３５】
本発明による方法は、地表における重力場の強さ（ｇ＝９．８１ｍ／ｓ2）より弱い重力場で用いられる場合に特に有利である。実際、例えば超音波定在波のような音波が用いられると、生成される音響力は、他のいかなる外力も必要とすることなく物体、例えば遊走細胞を集めることができる。
従って、本発明による方法は、弱い重力場において、例えば無重力において実行される場合であっても、物体、例えば細胞の、密集した３Ｄ構築物を得ることを可能にすることが有利である。
【００３６】
特定の実施形態において、本発明は、上記で定義された方法であって、
−液体（Ｌ）が細胞培養培地であり、
−第１及び第２の凝集体（１１０）、（１１１）、並びに選択的に第３の凝集体のうちの少なくとも１つが細胞を含み、
−該細胞が、第１及び第２の凝集体（１１０）、（１１１）、並びに選択的に第３の凝集体のうちの少なくとも１つの中に存在している間に培養される、
方法に関する。
従って、本発明による方法を実行すると、第１及び第２、並びに選択的に第３の凝集体のうちの少なくとも１つの中に存在する細胞を増殖させることができ、該細胞の数は、細胞培養中に少なくとも２倍になり、さらには５倍にもなる。
【００３７】
好ましい実施形態において、細胞培養によって少なくとも１つの組織が形成され、具体的には細胞培養によって骨組織が形成される。形成される組織は、３Ｄ組織であることが好ましい。
【００３８】
細胞培養は、地表における重力場の強さとは実質的に異なる強さの重力場、特にそれより弱い重力場において実行されることが好ましい。
微小重力における細胞培養は、二重の意味で興味深い。
第一に、微少重力下においては、正常な生理的条件における場合と同様に、適切に発育する組織にとって理想的な環境を提供する浮力の中で３Ｄ組織を発育させることができる。
第二に、上述のように、宇宙飛行士の要求に合わせた組織工学の技術、すなわち、骨の再建及び組織損傷の置換のための技術を開発することは有利である。
本発明は、例えば密集した３Ｄ構築物を作製するために、微小重力下で他のいかなる外力も必要とすることなく遊走細胞を集めることを可能にすることが有利である。
【００３９】
好ましい実施形態において、第１及び第２並びに選択的に第３の凝集体は、少なくとも一時間、具体的には少なくとも一日間、具体的には少なくとも一週間、保持される。
これらの第１及び第２並びに選択的に第３の凝集体に音波を印加して、安定した凝集体をその中で数時間、数日間又は数週間の間、固まった状態で保持することができる音響トラップを作り出すことが特に好ましい。
【００４０】
特定の実施形態において、幾らかの細胞培養培地が、細胞培養中に少なくとも一回、チャネル内に導入される。
特定の実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養中に少なくとも一回、新しくされる。「細胞培養培地が新しくされる」という表現は、初期に凝集体と接触していた細胞培養培地が、新たにチャネル内に導入される、化学的性質が同じものでも異なるものでもよい別の細胞培養培地によって完全に置き換えられることを意味する。
【００４１】
本発明では、これらの凝集体は特に安定であるので、凝集体を乱すことなく細胞培養培地を新しくすることが可能になることが有利である。本発明を用いない場合には培地を容易に交換することができないので、こうした利点は興味深いことであり、実際、微小重力条件下では、流れが、凝集体を引きずり出す摂動を生じさせることがある。
【００４２】
微少重力下ではどんな摂動でも構築物の無制御の移動を生じさせるので、組織増殖を向上させるために凝集体にせん断刺激を与えることは困難であり得る。一方、本発明では、構築物を３Ｄ平衡位置の周りに保持しながら、せん断応力を発生させる振動又は周期的変動を与えることが可能である。
【００４３】
特定の実施形態において、第１及び第２並びに選択的に第３の凝集体は、３Ｄ凝集体である。
特定の実施形態において、第１及び第２並びに選択的に第３の凝集体の複数の組が、チャネルの長手方向軸線に沿って存在する。
好ましい実施形態において、第１及び第２の３Ｄ凝集体の複数の組が、チャネルの長手方向軸線に沿って存在し、これら凝集体の組は、地表における重力場の強さよりも弱い重力場においてステップｂ）を実行することによって得られたものである。
【００４４】
音場発生器、音波、及び物体の浮揚
ステップｂ）及び／又はｃ）において用いられる音波は、１０ＭＨｚ以下、好ましくは０．５ＭＨｚと１０ＭＨｚとの間に含まれる、主振動数ｆmaxを有するものとすることができる。
このような振動数範囲内で音場発生器を使用することにより、有利には、小胞、リポソーム、細菌又はウイルスといった生細胞又は物体の、完全性の維持を容易にすることができる。
ステップｂ）及び／又はｃ）において用いられる音波は、有利には、チャネルの厚さに沿って発生させることができる。
【００４５】
音場発生器は、圧電性のもの、例えばセラミックとすることができる。
例えば、デンマーク、ＫｖｉｓｔｇａｒｄのＦｅｒｒｏｐｅｒｍ  Ｐｉｅｚｏｃｅｒａｍｉｃｓ社によって製品番号ＰＺ２６として販売されている音場発生器を用いることが可能である。
チャネルの壁と接触する音場発生器の部分は、円形又は矩形とすることができる。
この部分の面積は、チャネルの面積、すなわち長さ掛ける幅、より大きくても、小さくてもよい。この面積は、凝集体を生成するために必要とされる構造に応じて、チャネルの面積と等しくすることもできる。
【００４６】
音場発生器は、正弦波張力で駆動するものとすることができる。変形例において、音場発生器は、三角波又は矩形波張力で駆動するものとすることができる。
音場発生器は、デジタル制御又はアナログ制御することができる。
音場発生器は、例えば、イスラエルのＴａｂｏｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓによって販売されている５０６２型の波発生器で駆動することができる。
【００４７】
波発生器によって放射された波は、増幅器によって増幅することができ、かかる増幅器は、例えば、イスラエルのＴａｂｏｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓによって販売されている９２５０型である。
波発生器は、ステップｂ）及び／又はｃ）の間に、０Ｖｐ−ｐ（ピーク間ボルト）と４０Ｖｐ−ｐとの間に含まれる振幅を有する波を発生させることができる。
ステップｂ）及び／又はｃ）の間に生成される音響エネルギー密度は、１Ｊ／ｍ3（ジュール／ｍ3）と１０００Ｊ／ｍ3との間、例えば１Ｊ／ｍ3と３００Ｊ／ｍ3との間、例えば５Ｊ／ｍ3と５０Ｊ／ｍ3との間に含まれるものとすることができ、例えば１０Ｊ／ｍ3とすることができる。
【００４８】
ステップｂ）及び／又はｃ）において用いられる音波は、チャネルの横断方向寸法の１つに沿ったチャネルの共鳴振動数である主振動数を有するものとすることができる。
チャネルの横断方向寸法は、チャネルの厚さ及び幅である。
「チャネルの横断方向寸法の１つに沿ったチャネルの共鳴振動数である主振動数」とは、チャネルの長手方向軸線に沿った所与の位置において測定されるチャネルの横断方向寸法ｚが
【数２】
2015506181.tif 000006
であり、式中ｎが整数であり、
【数３】
2015506181.tif 000007
であり、式中ｃfが、チャネル内に存在する液体内での該液体の温度（例えば２０℃）における音速である場合の、振動数ｆ0を意味する。
換言すれば、振動数ｆ0は、チャネルの長手方向軸線に沿った所与の位置において、チャネル内の音波の共鳴条件と、考慮した横断方向寸法に沿った定在波の形成とをかなえる、理論的振動数に対応する。
【００４９】
ステップｂ）及び／又はｃ）において用いられる音波は、０．５ｆ0と１．５ｆ0との間、具体的には０．７５ｆ0と０．９５f0との間、又は１．０５ｆ0と１．２５f0との間に含まれる主振動数を有するものとすることができる。
このような振動数の使用により、有利には、所望の物体集束を得るのに十分な強さの音響力の生成を可能にすることができる。
【００５０】
音場発生器は、チャネルの壁の１つに固定することができる。この固定は、必要に応じて当業者に知られた任意の手段を用いて、具体的には接着によって、行うことができる。
【００５１】
音響調節材料の層が、音場発生器とチャネルの壁の少なくとも１つとの間に存在してもよい。
音響調節は、当業者に知られた任意の適切な材料の使用によって行うことができる。
【００５２】
ステップｂ）及び／又はｃ）において音波を発生させるための複数の音場発生器がチャネルの長さに沿って存在してもよく、これら音場発生器はチャネルの同じ側に存在することが好ましい。
【００５３】
チャネル
本発明によれば、その内容が引用によりここに組み込まれるＨｏｙｏｓ他の特許文献１（「Ｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ」）に記載のチャネルを用いることが可能である。
【００５４】
幾何学的特徴
チャネルの幅及び／又は厚さを、その長さの少なくとも一部において変化させること、選択的には減少させることができる。
従って、チャネルの長手方向軸線に沿って移動したときのチャネルの厚さは、一定であっても、変化してもよい。チャネルは、具体的には、互いに軸方向に続いた、厚さが異なる少なくとも２つの区間を含むことができる。
【００５５】
チャネルは、その長さの少なくとも一部において、具体的にはその長さ全体において、３ｃｍ以下、より良好には１ｃｍ以下の厚さを有するものとすることができる。チャネルは、例えばマイクロチャネルである。
「マイクロチャネル」とは、その長さ全体にわたって１ｍｍ以下の厚さを有するチャネルを意味する。
【００５６】
チャネルは、その長さの少なくとも一部において、具体的にはその長さ全体にわたって、５０μｍと３ｍｍとの間、好ましくは１００μｍと５００μｍとの間に含まれる厚さを呈するものとすることができる。
【００５７】
チャネルの幅は、該チャネルの長手方向軸線に沿って移動したとき、一定であっても、変化してもよい。チャネルは、例えば、互いに軸方向に続いた、幅が異なる２つの区画を呈するものとすることができる。
【００５８】
「チャネルの長手方向軸線」とは、チャネルの断面の重心を相互に結ぶ線を意味する。チャネルの長手方向軸線は、直線であっても曲線であってもよく、平面内に含まれるものとすることができ、該平面は、幾つかのチャネル断面についての対称面、さらには全てのチャネル断面についての対称面とすることができる。
【００５９】
実施形態において、チャネル幅は変化するものとすることができ、チャネルは、上方から見たときにピラミッド形のものとすることができる。この特定の事例において、音場発生器は、矩形であってもよく矩形でなくてもよい。
変形例において、チャネルは、上方から見て、サブチャネル、特に直線状サブチャネルによって接続された円の形を有するものとすることができる。
後者の構造においては、音場発生器は円筒形にすることができ、該構造は、特に凝集体のモザイクの生成を可能にする。
【００６０】
チャネルは、その長さの少なくとも一部わたって、具体的にはその長さの全体にわたって、１ｍｍと４０ｍｍとの間、好ましくは５ｍｍと２０ｍｍとの間に含まれる幅を有するものとすることができる。
チャネルの長手方向軸線に沿って測定されたチャネルの長さは、例えば、３ｍｍと１０００ｍｍとの間、好ましくは１０ｍｍと５００ｍｍとの間に含まれる。
チャネルは、例えば、長さ１００ｍｍ、幅１０ｍｍ及び厚さ０．４ｍｍである。
別の例示的な実施形態によると、チャネルの長さは、１０ｍｍと１０００ｍｍとの間に含まれるものとすることができ、チャネルの幅は、１ｍｍと４０ｍｍとの間に含まれるものとすることができ、チャネルの厚さは、０．５ｍｍと３ｍｍとの間に含まれるものとすることができる。
【００６１】
チャネルは、その長手方向軸線に沿って移動させたときに実質的に一定の横断面を含むものとすることができる。
チャネルは、その長さの少なくとも一部にわたって、具体的にはその長さ全体にわたって、矩形の横断面を有するものとすることができる。
変形例において、チャネルは、その長さの少なくとも一部にわたって、具体的にはその長さ全体にわたって、正方形又は円形の横断面を有するものとすることができる。
【００６２】
チャネルは、有利には、幅／厚さ、及び／又は、長さ／厚さの比が１０以上であるものとすることができる。
このような比は、有利には、流れプロファイルにおける３次元効果を防ぐことができる。
好ましい実施形態において、チャネルは、その長さの少なくとも一部にわたって、具体的にはその長さの全体にわたって、矩形横断面を有し、幅／厚さの比≧１０である。
【００６３】
チャネルの壁は、小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）形状とすることができる。
チャネルの壁は、その長さの少なくとも一部にわたって、具体的には全体にわたって、０．５ｍｍと５ｍｍとの間に含まれる厚さを有するものとすることができる。
チャネルは、その長さの少なくとも一部にわたって、その厚さが変化する壁を含むことができる。
このような構造により、異なる厚さの壁部分の近傍に音の波節又は波腹を作り出すことが可能になり、それにより凝集体をこの領域の近傍で互いに接触させることができる。
音波を発生させる壁に対向する壁は、本発明による方法が実行されているときに自由振動することができる。
【００６４】
入口及び出口
チャネルは、少なくとも１つ、具体的には少なくとも２つの入口と流体連通することができる。
チャネルは、少なくとも１つ、具体的には少なくとも２つの出口と流体連通することができる。
【００６５】
複数の入口及び／又は出口、例えば２つの入口及び２つの出口を含むチャネルを、安定なフレーム内、又は、重力加速度を変更するために傾けることができるフレーム内に配置することができる。
【００６６】
チャネル入口及び／又は出口は、シリンジ・ポンプ及び／又は蠕動ポンプに接続することができる。蠕動ポンプに接続される場合には、蠕動ポンプとチャネル入口及び／又は出口との間に流体力学的緩衝装置を付加することができる。
【００６７】
チャネルは、本発明による方法によって形成される多層凝集体を排出することができる１つ又はそれ以上の出口と流体連通することができる。
それゆえ、形成された多層凝集体を収集するために必ずしもチャネルを開放する必要がない場合がある。
【００６８】
好ましくは、入口のうちの少なくとも１つは、チャネルの幅を下回らない幅を有し、及び／又は、実質的に矩形の断面を有する。
本発明の実施形態において、少なくとも１つの入口は、チャネルの底壁及び上壁の一方に開口し、別の入口は、チャネルの底壁及び上壁のもう一方に開口する。
一例として、２つの入口は、互いに面して配置される。
変形例において、全ての入口がチャネルの底壁又は上壁のどちらかに開口する。
本発明の実施形態において、少なくとも２つの入口がチャネルの長手方向軸線に沿って互いに片寄らせて配置される。
少なくとも１つの入口が、チャネルの長手方向軸線に対して実質的に平行に、又は垂直に、チャネル内に開口する。
【００６９】
本発明の実施形態において、少なくとも１つの供給孔がダクトを介して少なくとも１つの入口と流体連通しており、該ダクトは、具体的にはダクトの先端部から分岐する分岐部を含み、供給孔は、該先端部に隣接して、具体的にはダクトに対して垂直に、ダクト内に開口する。
ダクトのこの分岐部は、物質のシートを供給点から開始して形成することを可能にする。
【００７０】
本発明の実施形態において、少なくとも第１及び第２の出口は、チャネルと流体連通しており、チャネルの厚さに沿って測定された高さが非ゼロの横断方向分離壁によって互いに分離される。
出口は、本発明による方法によって形成される多層凝集体の回収を可能にすることができる。
少なくとも２つの出口をチャネルの長手方向軸線に沿って互いに片寄らせて配置することができる。変形例において、少なくとも２つの出口は、互いに面するものとすることができる。
【００７１】
本発明の実施形態において、チャネルは、少なくとも第１、第２及び第３の出口と流体連通しており、第２の出口は、チャネルの厚さに沿って第１の出口と第３の出口との間に配置される。
【００７２】
本発明の実施形態において、少なくとも１つの出口孔がダクトを介してチャネルの出口と流体連通しており、該ダクトは、側方に狭まる断面の部分、具体的には先端に向かって収束する部分を含み、該部分は上方から観察したときに三角形の形状であり、例えば、出口孔は、例えば先端に隣接して、具体的にはダクトに対して垂直に、ダクト内に開口する。
ダクトのこの収束部は、出口孔におけるよどみ点の形成を回避する役割を果たすことができる。
【００７３】
チャネルを構成する材料
チャネルの壁は、有機又は無機ガラス、石英、熱可塑性材料、特にＰＭＭＡ又はポリカーボネート、及び金属の中から選択される材料を含むことができ、特にこれら材料から成るものとすることができる。より一般的には、高い音響インピーダンス、すなわち流体の音響インピーダンスより少なくとも１０倍大きい音響インピーダンスを有する任意の材料を用いることが可能である。
【００７４】
チャネルは、マイクロ流体工学の分野において用いられている種類の従来の製作方法を用いて製作することができる。
適切な場合には、マイクロチャネルに少なくとも１つの弁、例えば電磁弁を設けることができる。
【００７５】
液体及び物体
液体は、血液のような、生物学的液体とすることができる。
変形例において、液体は水とすることができる。
液体は、可視光線に対して透明なものとすることができる。
液体は、ステップｂ）の間は流れていなくてもよい。
実施形態によれば、液体は、少なくともステップｂ）及び／又はｃ）の間は流れており、液体の流れのレイノルズ数は、選択的には１０未満である。
【００７６】
物体は、単分散又は多分散の生物学的細胞、具体的には血液細胞、例えば血球とすることができる。
【００７７】
特定の実施形態において、物体は、正の音響コントラスト因子を有する。
「音響コントラスト因子」は、下記に詳述されるように定義される。
音響放射力は、次式を有する。
Ｆac＝〈Ｅac〉ＶpｋＡ（ρ，β）Ｓｉｎ（２ｋｙ）
式中、〈Ｅac〉は平均音響エネルギー密度であり、Ｖpは粒子種の体積であり、ｋ＝２π／λであり、λは超音波の波長であり、
音響コントラスト因子は、次式を有し、
Ａ（ρ，β）＝［（５ρp−２ρf）／（２ρp＋ρf）］−βp／βf
式中、
−ρp及びρfは、それぞれ、粒子ｐ及び懸濁流体ｆの密度であり、
−βp及びβfは、それぞれ、粒子ｐ及び懸濁流体ｆの圧縮率であり、
−ｙは、定在波の節平面からの距離である。
【００７８】
特定の実施形態において、物体は、負の音響コントラスト因子を有する。
特定の実施形態において、物体は、気泡、微小気泡、ナノ気泡、液滴、脂肪細胞、血中脂質、リン脂質小胞、又はそれらの混合物の中から選択される。
【００７９】
負の音響コントラスト因子を有する物体は、ステップｂ）の後、異なる波腹に配置され得る。変形例において、負の音響コントラスト因子を有する物体は、波節と波腹との間に配置され得る。
例えば、第１の物体は、ステップｂ）の後で第１の波腹に配置され、第２の物体は、ステップｂ）の後で第２の波腹に配置され、第２の波腹は、第１の波腹とは異なるとともにこれと重ね合わされ、第２の物体は、第１の物体とは異なり、例えば、異なる密度又は異なる弾性定数を有する。第１及び第２の物体は、同じサイズを有していてもよい。
【００８０】
特定の実施形態において、方法は、ステップｂ）の後で、物体の少なくとも１つの特徴の判定、例えば少なくとも１つの音響学的特徴、例えば物体の音響インピーダンス、の判定を含む。
【００８１】
特定の実施形態において、方法は、ステップｂ）の後で、物体の合体ステップを含み、合体は、具体的には、物体がチャネル内に存在するときに全部又は一部が実行される。
【００８２】
特定の実施形態において、物体は、ステップｃ）の後で、チャネルの外側に、例えば容器内に排出される。
【００８３】
物体は、剛性又は変形可能な粒子、例えばポリスチレン粒子とすることができる。
より一般的には、物体は、剛性又は変形可能な粒子、多分散粒子、生物学的細胞、具体的には血液細胞、例えば血液又は血球試料内のがん細胞、細菌、コロイド状又は非コロイド状エマルション、タンパク質又はリポソームとすることができる。
【００８４】
チャネル内に存在する物体の平均サイズは、１００μｍ以下とすることができる。
「平均サイズ」とは、Ｄ５０として知られる、母集団の半分における統計的粒度分析寸法を意味する。
【００８５】
用いられる流速は、処理する試料、チャネルの容積及び印加される音響力に応じたものとすることができる。
例えば、液体は、本発明による方法の全部又は一部の間、０．１ｍｌ／分から１００ｍｌ／分の間に含まれる流速で流れるものとすることができる。
特定の実施形態において、液体は、最大音響一次力（ｍａｘｉｍｕｍ  ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｆｏｒｃｅ）が重力と同じオーダーであるとき、すなわち直径１０μｍのラテックス粒子又は細胞に対して１ｐＮ（ピコ・ニュートン＝１０-9）であるとき、容積１ｍｌのチャネルに対して流速０．１ｍｌ／分で流れるものとすることができる。
【００８６】
物体の体積分率は、該物体がチャネル内に注入されるときに測定して０．１％（ｖ／ｖ）以上とすることができる。物体の体積分率は、［（物体の体積）／（物体を含んだ液体の体積）］×１００％に対応する。
【００８７】
本発明は、非限定的な例の、その実施に関する下記の詳細な説明を読むことにより、及び、添付の図面を吟味することにより、より良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明による方法を実行するための装置を示す。
【図２】本発明の方法によって得られる凝集体を示す。
【図３】図１で用いられるチャネルをＩＩＩ−ＩＩＩで見た図である。
【図４】図１に示される方法によって形成される多層凝集体の排出の例である。
【図５】本発明による方法を実行するための装置の変形例である。
【図６】本発明による方法を実行するための装置の変形例である。
【図７】本発明による方法を実行するための装置の変形例である。
【図８】本発明による方法を実行するための装置の変形例である。
【図９】本発明による方法において用いることができるチャネルの実施形態である。
【図１０】本発明による方法によって得られた実験結果を示す。
【図１１Ａ】本発明による方法によって得られた実験結果を示す。
【図１１Ｂ】本発明による方法によって得られた実験結果を示す。
【図１２Ａ】本発明による方法によって得られた実験結果を示す。
【図１２Ｂ】本発明による方法によって得られた実験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
図１は、本発明による方法において用いることができる装置１を示す。装置１は、長手方向軸線Ｘに沿って延びるチャネル２を含む。
チャネル２は、上述のように、マイクロチャネルとすることができる。
チャネル２は、例えば矩形の断面を呈する。記載例では、チャネル２の長さ／厚さ比は１０より大きい。
チャネル２は、底壁３及び上壁４を有する。チャネル２は、図示されるように、入口７、例えば５つの入口７と流体連通している。
図示されるように、入口７は、チャネル２の上壁４及び底壁３内に開口し、４つの入口７がＸ軸に対して垂直に開口している。さらに、チャネル２の上壁４内に開口する入口７は、Ｘ軸に対して平行にチャネル２内に開口している。
図示されていない変形例において、入口は全てチャネルの底壁内に開口する。
【００９０】
入口７は、実質的に矩形断面であり、チャネル２の幅と等しい幅である。
入口７は、長手方向軸線Ｘに対して垂直な横断方向分離壁１０によって分離される。
入口７は、図示されるように、チャネル２の厚さより小さい、例えばその厚さの半分より小さい、厚さを呈する。
【００９１】
図１に示された実施形態において、入口７のうち幾つかは、分離壁１０のようにＸ軸に沿って片寄らせることができる。
少なくとも１つの入口７が、図示されるように、第１の区間４５内に開口し、該第１の区間４５は、別の入口７がその中に開口した、チャネル２の厚さに沿って測定された厚さがより大きい第２の区間４６に接続されている。
第２の区間４６は、チャネル２の中央区間４７に接続している。
区間４５と区間４６との間、及び、区間４６と区間４７との間の厚さの差は、分離壁１０間の高さの差に対応する。
【００９２】
装置１は、以下のように本発明による方法において用いることができる。
例えば図１に示されるように、キャリア液体Ｌ及び複数の物体Ｏを、入口７を介して流す。
物体Ｏは、単分散でも多分散でもよく、物体Ｏは、生物学的細胞とすることができ、液体Ｌは、例えば血液などの生物学的液体とすることができる。
適切な場合には、装置１は、入口７を介した物体Ｏの注入を制御するための１つ又はそれ以上の弁を有していてもよく、この場合、かかる弁は、例えば単一の流路又は複数の流路を呈する電磁弁とすることができる。
入口７を介した物体Ｏの注入を、頻度及び流速に関して制御して、装置１が大量の物体を処理するために連続的に動作することを可能にさせることができる。
【００９３】
かかる装置１は、流体力学的集束技術によって、チャネル２の第１の重ね合わせ領域５０及び第２の重ね合わせ領域６０に物体Ｏを準備する（ステップａ）。
物体Ｏの第１の層５１及び第２の層６１が、それぞれ第１の重ね合わせ領域５０及び第２の重ね合わせ領域６０に存在し、第１の層５１及び第２の層６１の厚さは、流体力学的集束によって制御される。
【００９４】
物体Ｏの第１の層５１及び第２の層６１は、図１に示されるように、純液体Ｌの層によって分離される。第１の層５１内に存在する物体Ｏは、第２の層６１内に存在する物体Ｏと同一であってもよい。変形例において、第１の層５１内に存在する物体Ｏ及び第２の層６１内に存在する物体Ｏは、異なる種に属する。変形例において、第１の層５１内に存在する物体Ｏは、第２の層６１内に存在する物体Ｏとは異なるサイズを有する。
【００９５】
このような物体の層は、流れの下での多重浮揚にとって有害であり得る流体力学的せん断によって誘起される拡散［非特許文献２］を受けることがある。
従って、装置１には、音場発生器１００ａ及び１００ｂが設けられ、これらは図示されるようにチャネル２の上壁４に固定される。図１において、音場発生器１００ａ及び１００ｂはチャネル２に沿って配置され、チャネル２の同じ側に存在する。図示されていない変形例において、音場発生器をチャネルに沿って配置してチャネル２の両側に存在させることができる。
【００９６】
音場発生器１００ａは、ステップｂ）において、物体Ｏの第１の凝集体１１０及び第２の凝集体１１１の形成を可能にする。図１に示されるように、物体Ｏは、音場発生器１００ａによって発生した波の波節の周りの多重浮揚の中に配置される。換言すれば、第１の凝集体１１０及び第２の凝集体１１１の各々が、ステップｂ）の最後には、異なる波節に位置することになる。音場発生器１００ａは、チャネル２の厚さに沿って２つの節を含む定在波の形成を可能にする振動数で動作することができる。変形例において、音場発生器１００ａは、チャネル２の厚さに沿った定在波を生成しないが、凝集体の形成を可能にする音響力場を作り出すことができる。
【００９７】
「音響浮揚」という表現は、音響操作が、重力に抗して平衡位置に物体を配置しようとする場合に用いられる。平衡位置は、物体及び懸濁液の音響学的性質、音響出力、並びに音波の節の位置及び数に依存する。同じ又は異なる種の粒子又は凝集体がチャネル内の異なる平衡位置にある（浮揚している）とき、「音響多重浮揚」という表現が用いられる。
【００９８】
液体Ｌは、本発明による方法の間、流しておくことができ、ステップｂ）における第１及び第２の凝集体１１０、１１１の形成は、ストップ・フロー期間無しで行うことができる。
音響集束は、上述の流体力学的せん断により誘起される拡散に対抗する。
ステップｂ）は、０．１秒と５分との間に含まれる所要時間を有するものとすることができる。
【００９９】
図示されていない他の変形例において、本発明による方法は、３層又はそれより多くの層を含む多層凝集体の形成を可能にする。
【０１００】
上で説明したように、物体の凝集体は、物体の層より密集した（コンパクトな）ものであり得る。図２は、本発明によるステップｂ）の最後に得られた第１の凝集体１１０の上面図を示す。第１の凝集体１１０は、互いに接触した物体Ｏの組を含み、例えば凝集体１１０を構成する物体Ｏの少なくとも５０％が互いに接触しているものとすることができる。
【０１０１】
本発明は、例えば、用いられる音場の強さ及び流体力学的パラメータに依存して、２Ｄ及び／又は３Ｄ凝集体の形成を可能にすることができる。そうした２Ｄ及び３Ｄ凝集体の定義を下記に示す。
さらに、第１の凝集体１１０は、チャネル２の幅に沿った移動に対応するＹ軸に沿って移動したときに物体Ｏの連続物１１０1を含む。第１の凝集体１１０は、チャネル２の厚さに沿って移動したときにも物体Ｏの連続物を含む。それゆえ第１の凝集体１１０は３Ｄ凝集体である。
実施形態において、凝集体は、チャネルの幅に沿って移動したときには物体の連続物を含むが、少なくとも１つの物体で形成された厚さを有する。この場合、凝集体は２Ｄ凝集体である。
【０１０２】
図１に戻って、本発明によるステップｃ）の例をここで詳述する。図１において、第１及び第２の凝集体１１０、１１１が接触して物体Ｏの多層凝集体１２０が形成される。多層凝集体１２０は、第１及び第２の凝集体１１０、１１１に、第１の凝集体１１０と第２の凝集体１１１とが互いの方に向かうような移動を誘起する音波を受けさせることによって形成される。
【０１０３】
これらの音波は、チャネル２の厚さに沿って１つの節を含む定在波の形成を可能にする振動数で動作することができる音場発生器１００ｂによって発生される。変形例において、音場発生器１００ｂは、チャネル２の厚さに沿った定在波を生成しないが、多層凝集体の形成を可能にする音響力場を作り出すことができる。
【０１０４】
図１に示された例において、ステップｃ）は、凝集体１１０及び１１１に、ステップｂ）において印加される音波より少ない波節を有する音波を受けさせることを含む。さらに、図示された例において、ステップｃ）で形成される波節は、ステップｂ）において印加される音波の波節の横断方向位置とは異なる横断方向位置を有する。
【０１０５】
従って、凝集体１１０及び１１１は、節の数が減少する区域を通過することができ、そこで、形成された凝集体の再集束が導かれることにより多層凝集体１２０が生成される。
ステップｃ）は、１０秒と６０分との間に含まれる所要時間を有するものとすることができる。
【０１０６】
図３に示されるように、音響インピーダンス調節装置として機能するゲル層１０１が音場発生器１００ａとチャネル２の上壁４との間に存在してもよい。
【０１０７】
図４は、図１に示された方法で形成される多層凝集体１２０の排出を示す。
図４に示される実施形態において、チャネル２は、複数の出口８と流体連通している。チャネル２は、図示されるように３つの出口８と接続することができ、図４に示されるように、これらの出口８のうち２つは互いに面するものとすることができ、１つは外に向かって、１つはチャネル２の底壁３内に、もう１つは上壁４内に開口することができる。
形成された多層凝集体１２０は、中央出口を通して放出することができ、これを３層又はそれより多層の多層凝集体にまで拡張することができる。
【０１０８】
本発明による方法の別の実施形態が図５に示される。この図において、第１及び第２の凝集体１１０、１１１は、ステップｂ）の最後に例えば図１と同じ方式で形成される。
しかしながら、この場合、音波が存在しない状態で第１及び第２の凝集体１１０、１１１に重力を受けさせることによって、第１及び第２の凝集体１１０、１１１を接触させて多層凝集体１２０が形成される。
この例において、第１及び第２の凝集体１１０、１１１は、音場の強度が低減された、具体的には音場が存在しない、区間４８に入ることができる。従って、凝集体１１０及び１１１が沈降して多層凝集体１２０を形成することが可能になる。
【０１０９】
変形例において、ステップｂ）における第１及び第２の凝集体１１０、１１１は、ストップ・フロー期間後に形成することができ、次いで、厚さ及び組成が制御された多層凝集体１２０が生成するように凝集体１１０及び１１１が沈降することを可能にするために、音波の振動数及び／又は振幅を調整することができる。
【０１１０】
図６に示された例において、第１及び第２の凝集体１１０、１１１は、図１に示される実施形態において詳述されたように形成される。しかしながら、チャネル２の底壁３は、変化する厚さを有する。この例においては、底壁３の厚さの変化によって、音場発生器１００ｂによって発生した音波が底壁３に位置する節又は腹を有することを可能にすることができる。この場合、第１及び第２の凝集体１１０、１１１は、ステップｃ）の間にチャネル２の底壁３に向かって移動することができ、図示されるように、第２の凝集体１１１を底壁３と接触させることができる。
形成される多層凝集体１２０は、チャネル２の底壁３上に配置されることになる。
【０１１１】
図７は、チャネル２の厚さｔがその長さの少なくとも一部にわたって減少しており、ステップｃ）において印加される音波がステップｂ）において印加される音波より少ない波節を有するようになっている、別の実施形態を示す。図示された例において、第１及び第２の音場発生器１００ａ、１００ｂは、ステップｂ）及びｃ）において実質的に同じ主振動数を有する音波を放射する。
【０１１２】
図示されていない変形例において、第１及び第２の音場発生器は、ステップｂ）及びｃ）において異なる主振動数を有する音波を放射する。主振動数間の差は、ステップｃ）において、ステップｂ）において印加される音波とは異なる数の、選択的にはそれより少ない、波節を有する音波の生成を可能にすることができる。
【０１１３】
図示されていない変形例において、チャネルの厚さは、ステップｃ）において印加される音波がステップｂ）において印加される音波とは異なる数の波節を有するように、その長さの少なくとも一部にわたって増大する。
【０１１４】
図示されていない変形例において、節／腹の数を増加させることによって、凝集体を接触させて、物体の多層凝集体を形成することができる。
【０１１５】
図８は、チャネル２に沿って形成された多層凝集体１２０を除去するための、可能な構造を示す。
一連の多層凝集体１２０をチャネル２に沿って形成することができ、次いで、流れを止めることができる。第１及び第２の音場発生器１００ａ、１００ｂに対向する壁３に配置された一連のウェル２００を、多層凝集体１２０を受けるために用いることができる。
形成された多層凝集体１２０は、次いで、遅い流れを用いてウェル２００まで運ばれる。この多層凝集体１２０の廃棄システムは、直列で生成することができる。
【０１１６】
図９は、上方から見たチャネル２の実施形態を示し、これは図９に示されるようにチャネル２２０によって接続された円２１０の形状を有する。後者の構造において、音場発生器は円筒形とすることができ、凝集体のモザイクを生成することができる。
【実施例】
【０１１７】
本発明による方法によって得られた実験結果を、以下に詳述する。
図１０は、厚さ２５０μｍのチャネル内で得られた浮揚中のがん細胞の２Ｄ凝集体を示す。
【０１１８】
図１１Ａ及び図１１Ｂは、粒子の多重浮揚を示す。２種の粒子、すなわち直径１０μｍのラテックス及びシリカの粒子の両方が、チャネルの厚さ（２５０μｍ）内の２つの異なる位置において平衡状態にある。図１１Ａは、本発明によるステップｂ）の最後におけるこれらの粒子を示し、図１１Ｂは、本発明によるステップｃ）の最後におけるこれらの粒子を示す。
【０１１９】
図１２Ａは、浮揚した２層を形成している１０μｍのラテックス（暗色）及びシリカ（明色）粒子の２つの２Ｄ層を示す。
図１２Ｂは、３Ｄラテックス粒子凝集体及びシリカ粒子凝集体から成る２層を示す。
【０１２０】
「１つ（ａ）／１つ（ｏｎｅ）を含む」という表現は、「少なくとも１つを含む」と理解されたい。
「間の（ｏｆ  ｂｅｔｗｅｅｎ）」という表現は、端点を含むと理解されたい。
【符号の説明】
【０１２１】
１：装置
２：チャネル
３：底壁
４：上壁
７：入口
８：出口
１０：横断方向分離壁
４５：第１の区間
４６：第２の区間
４７：中央区間
４８：音場の強度が低減された区間
５０：第１の重ね合わせ領域
５１：第１の層
６０：第２の重ね合わせ領域
６１：第２の層
１００ａ：第１の音場発生器
１００ｂ：第２の音場発生器
１０１： ゲル層
１１０：第１の凝集体
１１０1：物体の連続物
１１１：第２の凝集体
１２０：多層凝集体
２００：ウェル
Ｌ：液体
Ｏ：物体
ｔ：厚さ
ｗ：幅
Ｘ：長手方向軸線
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【国際調査報告】
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