(57)【要約】  本発明はセリアナノ複合体、これを含む薬学組成物及びその製造方法に関するものである。より詳しく言うと、本発明は界面活性剤で囲まれたセリアナノ粒子をポリエチレングリコールリン脂質でキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）した構造を持つセリアナノ複合体と、これを含む虚血性脳卒中治療又は予防用薬学組成物及びこれらの製造方法に関する。
2015518480.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面活性剤で囲まれたセリアナノ粒子をポリエチレングリコールリン脂質にキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）した構造を持つことを特徴とする、セリアナノ複合体。
【請求項２】
前記セリアナノ粒子の大きさが３ｎｍないし２０ｎｍであることを特徴とする、請求項１に記載のセリアナノ複合体。
【請求項３】
前記ナノ複合体の大きさが１５ｎｍないし１００ｎｍであることを特徴とする、請求項１に記載のセリアナノ複合体。
【請求項４】
前記界面活性剤がアルキルトリメチルアンモニウム塩（（ＣＨ３）３ＲＮＸ、ＲはＣ８−Ｃ２５で、ＸはＢｒ、ＣｌまたはＩ）、Ｃ６−Ｃ２０アルキルアミン、ポリ（アルキレンオキシド）トリブロック共重合体及びＣ１２−Ｃ１８脂肪酸のアルカリ塩よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のセリアナノ複合体。
【請求項５】
前記アルキルトリメチルアンモニウム塩がセチルトリメチルアンモニウムブロマイド、オクチルトリメチルアンモニウムブロマイド及びドデシルトリメチルアンモニウムブロマイドよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項４に記載のセリアナノ複合体。
【請求項６】
前記Ｃ６−Ｃ２０アルキルアミンがオレイルアミン、オクチルアミン、ヘキサデシルアミン及びオクタデシルアミンよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項４に記載のセリアナノ複合体。
【請求項７】
前記ポリ（アルキレンオキシド）トリブロック共重合体が（エチレンオキシド）２０（プロピレンオキシド）７０（エチレンオキシド）２０であることを特徴とする、請求項４に記載のセリアナノ複合体。
【請求項８】
前記Ｃ１２−Ｃ１８脂肪酸のアルカリ塩がオレイン酸、リノール酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸及びステアリン酸よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項４に記載のセリアナノ複合体。
【請求項９】
界面活性剤で囲まれたセリアナノ粒子をポリエチレングリコールリン脂質でキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）した構造を持つセリアナノ複合体を含むことを特徴とする、虚血性脳卒中治療又は予防用薬学組成物。
【請求項１０】
前記セリアナノ粒子の大きさが３ｎｍないし２０ｎｍであることを特徴とする、請求項９に記載の虚血性脳卒中治療又は予防用薬学組成物。
【請求項１１】
前記セリアナノ複合体の大きさが１５ｎｍないし１００ｎｍであることを特徴とする、請求項９に記載の虚血性脳卒中治療又は予防用薬学組成物。
【請求項１２】
前記界面活性剤がアルキルトリメチルアンモニウム塩（（ＣＨ３）３ＲＮＸ、ＲはＣ８−Ｃ２５で、ＸはＢｒ、ＣｌまたはＩ）、Ｃ６−Ｃ２０アルキルアミン、ポリ（アルキレンオキシド）トリブロック共重合体及びＣ１２−Ｃ１８脂肪酸のアルカリ塩よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項９に記載の虚血性脳卒中治療又は予防用薬学組成物。
【請求項１３】
前記アルキルトリメチルアンモニウム塩がセチルトリメチルアンモニウムブロマイド、オクチルトリメチルアンモニウムブロマイド及びドデシルトリメチルアンモニウムブロマイドよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１２に記載の虚血性脳卒中治療又は予防用薬学組成物。
【請求項１４】
前記Ｃ６−Ｃ２０アルキルアミンがオレイルアミン、オクチルアミン、ヘキサデシルアミン及びオクタデシルアミンよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１２に記載の虚血性脳卒中治療又は予防用薬学組成物。
【請求項１５】
前記ポリ（アルキレンオキシド）トリブロック共重合体が（エチレンオキシド）２０（プロピレンオキシド）７０（エチレンオキシド）２０であることを特徴とする、請求項１２に記載の虚血性脳卒中治療又は予防用薬学組成物。
【請求項１６】
前記Ｃ１２−Ｃ１８脂肪酸のアルカリ塩がオレイン酸、リノール酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸及びステアリン酸よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１２に記載の虚血性脳卒中治療又は予防用薬学組成物。
【請求項１７】
前記セリアナノ複合体の含量が０．５ｍｇ／ｋｇないし０．７ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする、請求項９に記載の虚血性脳卒中治療又は予防用薬学組成物。
【請求項１８】
前記の組成物の投与経路が経口投与、鼻腔投与、静脈内投与、直腸投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与であることを特徴とする、請求項９に記載の虚血性脳卒中治療又は予防用薬学組成物。
【請求項１９】
（ｉ）第１有機溶媒内でセリウム前駆体と界面活性剤を反応させてセリウム−界面活性剤錯化合物を形成する段階と、
（ｉｉ）前記（ｉ）段階のセリウム−界面活性剤錯化合物溶液を加熱しながら水を添加して界面活性剤で囲まれたセリウムナノ粒子を形成する段階と、
（ｉｉｉ）第２有機溶媒内で前記界面活性剤で囲まれたセリウムナノ粒子をポリエチレングリコールリン脂質で被覆させる段階を含むことを特徴とする、セリアナノ複合体の製造方法。
【請求項２０】
前記第１有機溶媒がキシレン、トルエン、メシチレン、オクチルエーテル、ブチルエーテル、ヘキシルエーテル、デシルエーテル、ピリジン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、オクタノール、デカンノール、オクタン、デカン、ドデカン、テトラデカン及びヘキサデカンよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１９に記載のセリアナノ複合体の製造方法。
【請求項２１】
前記セリウム前駆体がセリウム（ＩＩＩ）アセテート水和物、セリウム（ＩＩＩ）アセチルアセトネート水和物、セリウム（ＩＩＩ）カーボネート水和物、セリウム（ＩＶ）水酸化物、セリウム（ＩＩＩ）フッ化物、セリウム（ＩＶ）フッ化物、セリウム（ＩＩＩ）塩化物、セリウム（ＩＩＩ）塩化物七水和物、セリウム（ＩＩＩ）臭化物、セリウム（ＩＩＩ）沃化物、セリウム（ＩＩＩ）ニトラート六水和物、セリウム（ＩＩＩ）オキサラート水和物、セリウム（ＩＩＩ）硫酸塩、セリウム（ＩＩＩ）硫酸塩水和物及びセリウム（ＩＶ）硫酸塩よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１９に記載のセリアナノ複合体の製造方法。
【請求項２２】
前記界面活性剤がアルキルトリメチルアンモニウム塩（（ＣＨ３）３ＲＮＸ、ＲはＣ８−Ｃ２５で、ＸはＢｒ、ＣｌまたはＩ）、Ｃ６−Ｃ２０アルキルアミン、ポリ（アルキレンオキシド）トリブロック共重合体及びＣ１２−Ｃ１８脂肪酸のアルカリ塩よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１９に記載のセリアナノ複合体の製造方法。
【請求項２３】
前記アルキルトリメチルアンモニウム塩がセチルトリメチルアンモニウムブロマイド、オクチルトリメチルアンモニウムブロマイド及びドデシルトリメチルアンモニウムブロマイドよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２２に記載のセリアナノ複合体の製造方法。
【請求項２４】
前記Ｃ６−Ｃ２０アルキルアミンがオレイルアミン、オクチルアミン、ヘキサデシルアミン及びオクタデシルアミンよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２２に記載のセリアナノ複合体の製造方法。
【請求項２５】
前記ポリ（アルキレンオキシド）トリブロック共重合体が（エチレンオキシド）２０（プロピレンオキシド）７０（エチレンオキシド）２０であることを特徴とする、請求項２２に記載のセリアナノ複合体の製造方法。
【請求項２６】
前記Ｃ１２−Ｃ１８脂肪酸のアルカリ塩がオレイン酸、リノール酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸及びステアリン酸よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２２に記載のセリアナノ複合体の製造方法。
【請求項２７】
前記（ｉｉ）段階の加熱温度が８０℃ないし９０℃であることを特徴とする、請求項１９に記載のセリアナノ複合体の製造方法。
【請求項２８】
前記（ｉｉ）段階の加熱時間が３０分ないし３時間であることを特徴とする、請求項１９に記載のセリアナノ複合体の製造方法。
【請求項２９】
前記第２有機溶媒がクロロホルム、ジクロロメタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、エチルアセテート、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル及びトリクロロエチレンよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１９に記載のセリアナノ複合体の製造方法。
【請求項３０】
ポリエチレングリコールリン脂質で被覆されたセリアナノ粒子の大きさが１５ｎｍないし１００ｎｍであることを特徴とする、請求項１９に記載のセリアナノ複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明はセリアナノ複合体、これを含む薬学組成物及びその製造方法に関するものである。より詳しく言うと、本発明は界面活性剤で囲まれたセリアナノ粒子をポリエチレングリコールリン脂質でキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）した構造を持つセリアナノ複合体と、これを含む虚血性脳卒中治療又は予防用薬学組成物及びこれらの製造方法に関する。
［背景技術］
虚血性脳卒中（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ）はアメリカの１番目の主要成人障害（ａｄｕｌｔ  ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）原因で全世界的に２番目の主要な死亡原因である。過酸化物の陰イオン（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ａｎｉｏｎ、  Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）及びヒドロキシルラジカル（ＨＯ・）のような反応性酸素分子種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）が虚血期間中に生成されて、虚血性脳卒中損傷の原因になる最も致命的なメカニズムの一つである酸化的損傷（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｄａｍａｇｅ）を誘発する。しかし、臨床診療で虚血性脳卒中について立証された神経保護治療法（ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）は存在しない。
【０００２】
セリア（ｃｅｒｉａ、ＣｅＯ２）ナノ粒子は可逆的に酸素と結合し、ＣｅＯ２ナノ粒子の表面でＣｅ３＋とＣｅ４＋間の酸化状態変化によって自由ラジカル除去活性を持つことが知られている。（Ｃｅｌａｒｄｏ，  Ｉ．，  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，  Ｊ．  Ｚ．，  Ｔｒａｖｅｒｓａ，  Ｅ．  ＆  Ｇｈｉｂｅｌｌｉ，  Ｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃｅｒｉｕｍ  ｏｘｉｄｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ３，  １４１１−１４２０，  ２０１１）．
最近、セリアナノ粒子が、二つの主なＲＯＳ、つまり過酸化物の陰イオン及び過酸化水素から細胞を保護するため、過酸化物ジスムターゼ−類似の活性（セリウムがＣｅ４＋に酸化される場合）及びカタラーゼ−類似の活性（セリウムがＣｅ３＋に還元される場合）を示すと報告された。（Ｈｅｃｋｅｒｔ，  Ｅ．  Ｇ．，  Ｋａｒａｋｏｔｉ，  Ａ．  Ｓ．，  Ｓｅａｌ，  Ｓ．  ＆  Ｓｅｌｆ，  Ｗ．  Ｔ．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｅｒｉｕｍ  ｒｅｄｏｘ  ｓｔａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＳＯＤ  ｍｉｍｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｎａｎｏｃｅｒｉａ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２９，  ２７０５−２７０９，  ２００８；  Ｋｏｒｓｖｉｋ，  Ｃ．，  Ｐａｔｉｌ，  Ｓ．，  Ｓｅａｌ，  Ｓ．  ＆  Ｓｅｌｆ，  Ｗ．  Ｔ．  Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ｖａｃａｎｃｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃｅｒｉａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １０５６−１０５８，  ２００７）．
国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２４９６３号は治療組成物用セリウムナノ粒子を公開しながら、前記の組成物が脳卒中治療に使用できるだろうと言及している。しかし、前記ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２４９６３号にはセリウムナノ粒子を脳卒中治療に適用した実施例は全く記載されていない。
【０００３】
Ｅｓｔｅｖｅｚなどはセリアナノ粒子が脳卒中の治療に使用できると開示している。（Ａ  Ｙ  Ｅｓｔｅｖｅｚ，  Ｓ  Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，  Ｋ  Ｈａｒｐｅｒ，  Ｊ  Ｗ  Ａｓｔｏｎ，  Ａ  Ｌｙｎｃｈ，  Ｊ  Ｊ  Ｌｕｃｋｙ，  Ｊ  Ｓ  Ｌｕｄｉｎｇｔｏｎ，  Ｐ  Ｃｈａｔａｎｉ，  Ｗ  Ｐ  Ｍｏｓｅｎｔｈａｌ，  Ｊ  Ｃ  Ｌｅｉｔｅｒ，  Ｓ  Ａｎｄｒｅｅｓｃｕ，  Ｊ  Ｓ  Ｅｒｌｉｃｈｍａｎ，  “Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｃｅｒｉｕｍ  ｏｘｉｄｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｂｒａｉｎ  ｓｌｉｃｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉａ”，  ＦＲＥＥ  ＲＡＤＩＣＡＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，  Ｖｏｌｕｍｅ：  ５１，  Ｉｓｓｕｅ：  ６，  Ｐａｇｅｓ：  １１５５−１１６３，  ２０１１）．
しかし、前記Ｅｓｔｅｖｅｚなどの論文はただセリアナノ粒子に対してのみ記載しているだけで、セリアナノ複合体については全く記載していない。
【０００４】
本発明者たちはセリアナノ粒子をオレイルアミンなどのような界面活性剤で包んだ後、これをＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−リン脂質にキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）して製造されるセリアナノ複合体が、生体に毒性なく細胞膜を容易に透過して、細胞質内に効果的に拡散するという点に着目し、本発明を完成した。
【０００５】
また、本発明者たちは本発明のセリアナノ複合体が虚血性脳卒中の治療及び予防に効果的であることを明らかにしたことにより、前記のセリアナノ複合体を含む、虚血性脳卒中治療及び予防用薬学組成物を完成した。
［発明の詳細な説明］
［技術的課題］
本発明の基本的な目的は界面活性剤で囲まれたセリアナノ粒子をポリエチレングリコールリン脂質にキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）した構造を示すセリアナノ複合体を提供することである。
【０００６】
本発明の他の目的は界面活性剤で囲まれたセリアナノ粒子をポリエチレングリコールリン脂質にキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）した構造を持つセリアナノ複合体を含む、虚血性脳卒中治療又は予防用薬学組成物を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、（ｉ）第１有機溶媒内でセリウム前駆体と界面活性剤を反応させてセリウム−界面活性剤錯化合物を形成する段階；と（ｉｉ）前記（ｉ）段階のセリウム−界面活性剤錯化合物溶液を加熱しながら水を添加して界面活性剤で囲まれたセリウムナノ粒子を形成する段階；及び（ｉｉｉ）第２有機溶媒内で前記界面活性剤で囲まれたセリウムナノ粒子をポリエチレングリコールリン脂質で被覆させる段階を含む、セリアナノ複合体の製造方法を提供することである。
［技術的解決方法］
本発明の基本的な目的は界面活性剤で囲まれたセリアナノ粒子をポリエチレングリコールリン脂質にキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）した構造を持つセリアナノ複合体を提供することで達成することができる。
【０００８】
本明細書で「リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）」とは、脂質部分と燐含有親水性部分を含む両親媒性分子を意味する。前記親水性部分はホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルイノシトールが望ましい。
【０００９】
本明細書で「ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ））」は高分子鎖内のエチレンオキシドの数に応じて約１００Ｄａないし約１０，０００Ｄａの分子量を持つ化合物を意味する。
【００１０】
本明細書で「ポリエチレングリコールリン脂質（ＰＥＧ−ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）」は以下の化学式Ｉの構造を持つ化合物である。
【００１１】
【化１】
2015518480.tif 000003
前記の化学式ＩでＲはＣ１５−Ｃ２５直鎖型アルキル基であり、Ｍ＋はＮＨ４＋またはＮａ＋であり、ｎは３５ないし５５の整数である。
【００１２】
本発明のセリアナノ複合体は、セリアナノ粒子の表面に界面活性剤の親水性部位が物理的または化学的結合をし、ＰＥＧ−リン脂質分子のリン脂質部位の２本のアルキル基（Ｒ）が前記の界面活性剤の親油性部位を包む構造を持つ。
【００１３】
本発明のセリアナノ複合体において、前記セリアナノ粒子の大きさは３ｎｍないし２０ｎｍで、前記ナノ複合体の大きさは１５ｎｍないし１００ｎｍであることが望ましい。
また、本発明のセリアナノ複合体において、前記界面活性剤はセチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）、オクチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＯＣＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＤＴＡＢ）のように、８ないし２５個の炭素よりなるアルキルトリメチルアンモニウム塩（（ＣＨ３）３ＲＮＸ，ＲはＣ８〜Ｃ２５，ＸはＢｒ，Ｃｌ，Ｉ）系列の界面活性剤；オレイルアミン（ｏｌｅｙｌａｍｉｎｅ）、オクチルアミン（ｏｃｔｙｌａｍｉｎｅ）、ヘキサデシルアミン（ｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）、オクタデシルアミン（ｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）のように、６ないし２０個の炭素よりなるアルキルアミン（ａｌｋｙｌ  ａｍｉｎｅ（ＲＮＨ２））系界面活性剤：（エチレンオキシド）２０（プロピレンオキシド）７０（エチレンオキシド）２０のようなポリエチレンオキシド（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ、ＰＥＯ）−ポリプロピレンオキシド（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ、ＰＰＯ）−ポリエチレンオキシド系列のポリ（アルキレンオキシド）トリブロック共重合体（ｐｏｌｙ（ａｌｋｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）ｔｒｉｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）；または不飽和脂肪酸（オレイン酸（Ｃ１８）、リノール酸（Ｃ１８））と飽和脂肪酸（ラウリン酸（Ｃ１２）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸（Ｃ１８））を含めたＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸のアルカリ塩でありうる。
【００１４】
本発明の他の目的は界面活性剤で囲まれたセリアナノ粒子をポリエチレングリコール−リン脂質にキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）した構造を持つセリアナノ複合体を含む虚血性脳卒中治療又は予防用薬学組成物を提供することによって達成できる。
【００１５】
本発明の薬学組成物に含まれるセリアナノ複合体において、セリアナノ粒子の大きさは３ｎｍないし２０ｎｍで、前記セリアナノ複合体の大きさは１５ｎｍないし１００ｎｍであることが望ましい。
【００１６】
本発明の薬学組成物に含まれるセリアナノ複合体において、前記界面活性剤はセチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）、オクチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＯＣＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＤＴＡＢ）のように、８ないし２５個の炭素からなるアルキルトリメチルアンモニウム塩（（ＣＨ３）３ＲＮＸ，ＲはＣ８〜Ｃ２５，ＸはＢｒ，Ｃｌ，Ｉ）系列の界面活性剤；オレイルアミン（ｏｌｅｙｌａｍｉｎｅ）、オクチルアミン（ｏｃｔｙｌａｍｉｎｅ）、ヘキサデシルアミン（ｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）、オクタデシルアミン（ｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）のように、６ないし２０個の炭素からなるアルキルアミン（ａｌｋｙｌ  ａｍｉｎｅ（ＲＮＨ２））系界面活性剤：（エチレンオキシド）２０（プロピレンオキシド）７０（エチレンオキシド）２０と同じポリエチレンオキシド（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ、ＰＥＯ）−ポリプロピレンオキシド（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ、ＰＰＯ）−ポリエチレンオキシド系列のポリ（アルキレンオキシド）トリブロック共重合体（ｐｏｌｙ（ａｌｋｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）ｔｒｉｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）；または不飽和脂肪酸（オレイン酸（Ｃ１８）、リノール酸（Ｃ１８））と飽和脂肪酸（ラウリン酸（Ｃ１２）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸（Ｃ１８））を含めたＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸のアルカリ塩でありうる。
【００１７】
また、本発明の虚血性脳卒中治療又は予防用薬学組成物に含まれる前記セリアナノ複合体は投与対象の体重１ｋｇあたり０．５ｍｇないし０．７ｍｇであることが望ましい。
また、本発明の虚血性脳卒中治療又は予防用薬学組成物の投与経路は経口投与、鼻腔投与、静脈内投与、直腸投与、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）投与、皮下投与、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）投与でありうる。
【００１８】
本発明の他の目的は、（ｉ）第１有機溶媒内でセリウム前駆体と界面活性剤を反応させてセリウム−界面活性剤錯化合物を形成する段階；と（ｉｉ）前記（ｉ）段階のセリウム−界面活性剤錯化合物溶液を加熱しながら水を添加して界面活性剤で囲まれたセリウムナノ粒子を形成する段階；及び（ｉｉｉ）第２有機溶媒内で前記界面活性剤で囲まれたセリウムナノ粒子をポリエチレングリコールリン脂質で被覆させる段階を含む、セリアナノ複合体の製造方法を提供することによって達成できる。
【００１９】
前記第１有機溶媒はキシレン、トルエン、メシチレン（Ｍｅｓｉｔｙｌｅｎｅ）などの芳香族化合物：オクチルエーテル、ブチルエーテル、ヘキシルエーテル、デシルエーテルなどのエーテル（Ｅｔｈｅｒ）系化合物：ピリジン（Ｐｙｒｉｄｉｎｅ）などの異頂環式化合物（Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）；ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）；オクタノール、デカンノールなどのアルコール；またはオクタン、デカン、ドデカン、テトラデカン、ヘキサデカンなどのハイドロカーボンでありうる。前記セリウム前駆体はセリウム（ＩＩＩ）アセテート水和物、セリウム（ＩＩＩ）アセチルアセトネート水和物、セリウム（ＩＩＩ）カーボネート水和物、セリウム（ＩＶ）水酸化物、セリウム（ＩＩＩ）フッ化物、セリウム（ＩＶ）フッ化物、セリウム（ＩＩＩ）塩化物、セリウム（ＩＩＩ）塩化物七水和物、セリウム（ＩＩＩ）臭化物、セリウム（ＩＩＩ）沃化物、セリウム（ＩＩＩ）ニトラート六水和物、セリウム（ＩＩＩ）オキサラート水和物、セリウム（ＩＩＩ）硫酸塩、セリウム（ＩＩＩ）硫酸塩水和物  及びセリウム（ＩＶ）硫酸塩から選択できる。
【００２０】
前記界面活性剤はセチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）、オクチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＯＣＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＤＴＡＢ）のように、８ないし２５個の炭素からなるアルキルトリメチルアンモニウム塩（（ＣＨ３）３ＲＮＸ，ＲはＣ８〜Ｃ２５，Ｘは  Ｂｒ，Ｃｌ，Ｉ）系列の界面活性剤；オレイルアミン（ｏｌｅｙｌａｍｉｎｅ）、オクチルアミン（ｏｃｔｙｌａｍｉｎｅ）、ヘキサデシルアミン（ｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）、オクタデシルアミン（ｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）のように、６ないし２０個の炭素からなるアルキルアミン（ａｌｋｙｌ  ａｍｉｎｅ（ＲＮＨ２））系界面活性剤：（エチレンオキシド）２０（プロピレンオキシド）７０（エチレンオキシド）２０のようなポリエチレンオキシド（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ、ＰＥＯ）−ポリプロピレンオキシド（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ、ＰＰＯ）−ポリエチレンオキシド系列のポリ（アルキレンオキシド）トリブロック共重合体（ｐｏｌｙ（ａｌｋｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）ｔｒｉｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）；または不飽和脂肪酸（オレイン酸（Ｃ１８）、リノール酸（Ｃ１８））と飽和脂肪酸（ラウリン酸（Ｃ１２）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸（Ｃ１８））を含めたＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸のアルカリ塩でありうる。
【００２１】
前記（ｉｉ）段階の加熱温度は８０℃ないし９０℃で、加熱時間は３０分ないし３時間であることが望ましい。
前記（ｉｉｉ）段階の第２有機溶媒はクロロホルム、ジクロロメタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、エチルアセテート、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルまたはトリクロロエチレンでありうる。
【００２２】
前記（ｉｉｉ）段階で製造されるセリアナノ複合体の大きさは１５ｎｍないし１００ｎｍであることが望ましい。
［有利な効果］
本発明のセリアナノ複合体は細胞膜を通過して、細胞質内に効率的に到達できる。したがって、本発明のセリアナノ複合体は虚血性脳卒中の部位で効果的な治療効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本発明の実施例１で合成されたセリアナノ粒子の特性を示す。
【図２】図２は、本発明の実施例２で合成されたリン脂質−ＰＥＧで囲まれたセリアナノ粒子の水力学的大きさの分布（図２ａ）及び前記粒子の水分散液（図２ｂ）を示す。
【図３】図３は、本発明の実施例３のセリアナノ粒子分散液の色変化及び過酸化水素溶液添加後セリアナノ粒子分散液の色変化及びＵＶ／Ｖｉｓ吸光度を示す。
【図４】図４は、本発明の実施例４の局所脳虚血再灌流モデルでの生体内梗塞部及び虚血細胞死滅を示す。
【図５】図５は、本発明の実施例５の細胞の酸化的損傷の下で添加したセリアナノ粒子の濃度による細胞生存率変化を示す。
【図６】図６は、本発明の実施例５の、蛍光ローダミン染料が接合されたセリアナノ粒子を使用してインキュベーションしたＣＨＯ−Ｋ１細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図７】図７は、本発明の実施例６でのセリアナノ粒子の生体分布を示す。
【図８】図８は、本発明の実施例７でのセリアナノ粒子のＲＯＳの除去及びアポトーシス抑制効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、次の実施例または図面で発明をより具体的に説明する。しかし、次の実施例または図面に対する説明は本発明の具体的な実施態樣を特定して説明しようとするだけであり、本発明の権利範囲をこれらに記載された内容に限定したり、制限解析しようと意図するものではない。
実施例１．セリアナノ粒子の合成（逆ミセル方法）
１ｍｍｏｌ（０．４３ｇ）のセリウム（ＩＩＩ）アセテート（９８％、Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１２ｍｍｏｌ（３．２５ｇ）のオレイルアミン（Ｃ１８の含量約８０−９０％、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）を１５ｍｌのキシレン（９８．５％、Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。このように製造された溶液を２時間室温で攪拌した後、減圧下で９０℃まで加熱した。９０℃で激しく攪拌しながら、１ｍｌの脱イオン水を前記の溶液に注入し、溶液が灰白色（ｏｆｆ−ｗｈｉｔｅ）になったが、これは反応が開始されたことを意味する。こうして得た混合物を９０℃で３時間かけて熟成させて明るい黄色のコロイド溶液を得て、これを室温で冷却した。エタノール（１００ｍｌ）を前記混合物に添加してセリアナノ粒子を沈殿させた。遠心分離法を利用し、エタノールとアセトンで沈殿物を洗浄し、洗浄されたセリアナノ粒子はｎ−ヘキサン及びクロロホルムのような有機溶媒によく分散させた。
【００２５】
透過電子顕微鏡写真によると、分散させた（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）均一な３ｎｍの大きさのセリアナノ粒子が生成されたことが分かる（図１ａ）。高解像度ＴＥＭ写真を見ると前記セリアナノ粒子が交差−格子（ｃｒｏｓｓ−ｌａｔｔｉｃｅ）パターンを見せていることをわかるが、これは低い反応温度にもかかわらず、高い結晶性を持つということを示している（図１ｂ）。制限視野電子回折（ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ａｒｅａ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ（ＳＡＥＤ））パターン（図１ｃ）及びＸ線回折（ＸＲＤ）パターン（図１ｄ）を見ると、前記セリアナノ粒子が立方の蛍石構造（ｃｕｂｉｃ  ｆｌｕｏｒｉｔｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）（ＪＣＰＤＳ  ｃａｒｄ  Ｎｏ．：３４−０３９４）であることがわかる。シェラーの式（Ｓｃｈｅｒｒｅｒ  ｆｏｒｍｕｌａ）によって計算された粒子の大きさは３．３ｎｍであり、これはＴＥＭによって測定された値とよく一致する。
【００２６】
純粋なセリアナノ粒子の白色と対比して、このように製造されたナノ粒子は黄色っぽい（ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ）色だったが、その理由は前記の製造されたセリアナノ粒子が酸化セリウム（ＩＶ）だけでなく、酸化セリウム（ＩＩＩ）からも構成されたからである。Ｘ線光電子分光法（Ｘ−ｒａｙ  ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＸＰＳ））を使用してＣｅ３＋（８８５．０ｅＶ及び９０３．５ｅＶでピーク）及びＣｅ４＋（８８２．１ｅＶ、８８８．１ｅＶ、８９８．０ｅＶ、９００．９ｅＶ、９０６．４ｅＶ及び９１６．４０ｅＶでピーク）の原子価状態（ｖａｌｅｎｃｅ  ｓｔａｔｅ）を同定し、図１ｅに現れたとおり、混合された原子価状態を確認した。
実施例２．リン脂質−ＰＥＧで囲まれたセリアナノ粒子の合成
生体親和的なセリアナノ粒子を製造するために、ペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）を遂行した。セリアナノ粒子を添加したＣＨＣｌ３（１０ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌを、５０ｍｇの１、２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（Ａｖａｎｔｉ  Ｌｉｐｉｄｓ）を含有する５ｍｌのＣＨＣｌ３の溶液と１対１の割合で混合した。ロータリー蒸発器を使用して溶媒を蒸発させ、減圧下の８０℃で１時間の間、インキュベーションした。追加で５ｍｌの水を添加して透明で浅黄色の懸濁液となった。濾過後、超遠心分離によって過量のｍＰＥＧ−２０００ＰＥを除去した。前記精製されたリン脂質−ＰＥＧで囲まれた（ｃａｐｐｅｄ）セリアナノ粒子を蒸留水に分散させた。
【００２７】
前記のリン脂質−ＰＥＧで囲まれたセリアナノ粒子はりん酸塩緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ））内で優れたコロイド安定性を見せており、これらの水力学的直径は数週間１８ｎｍで維持された（図２）。
実施例３．自触媒活性（ａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）分析
様々な濃度の過酸化水素溶液（０Ｍ、０．１Ｍ、０．５Ｍ及び１Ｍ）を５ｍＭのセリアナノ粒子分散液に処理することで、自触媒活性を分析した。前記の分散液の色変化及び過酸化水素溶液を添加した後のＵＶ／Ｖｉｓ吸光度を測定した（図３）。対照群として、過酸化水素を添加しないセリアナノ粒子分散液を使用した。様々な濃度の過酸化水素溶液を５ｍＭのセリアナノ粒子を含有するＰＢＳに添加した時、可逆的自触媒活性が３週間後にも維持された。
実施例４．局所脳虚血再灌流モデル  
Ｌｏｎｇａなどによって開発された血管内、内頸動脈縫合法（ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ（ＩＣＡ）ｓｕｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄ）を若干変更した方法を使用して局所脳虚血再灌流モデル（ｆｏｃａｌ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ）を誘導した。３０％の酸素及び７０％の空気から３％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を使用して吸入麻酔した後、中間線頸部切開（ｍｉｄｌｉｎｅ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｉｎｃｉｓｉｏｎ）によって左側総頚動脈（ｃｏｍｍｏｎ  ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））をその分岐（ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ）位置で露出させた。外頸動脈（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ（ＥＣＡ））及びＣＣＡを５−０のシルク縫合糸で結紮した。前記ＣＣＡを横に切断し、５−０ナイロン単斜縫合糸（先を加熱して丸く処理した）を前記ＣＣＡ内部に挿入した。中大脳動脈（ｍｉｄｄｌｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ（ＭＣＡ））及び近位前方大脳動脈（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ）の起点（ｏｒｉｇｉｎ）を閉鎖するため、前記縫合糸を前記ＩＣＡ内部に２０ｍｍほど前進させた。前記縫合糸を結紮糸を使用してもとの場所に固定させ、前記の傷を縫合した。閉鎖後６０分が過ぎた後、前記単斜を除去した。サーミスタ−制御加熱カバー（ｔｈｅｒｍｉｓｔｏｒ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｈｅａｔｉｎｇ  ｂｌａｎｋｅｔ）を使用して直腸温度（ｒｅｃｔａｌ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を３７±０．５℃で維持した。
【００２８】
再灌流後直ちに、様々な量のセリアナノ粒子（０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを静脈内に注入した後ラットの脳の梗塞部（ｉｎｆａｒｃｔ  ｖｏｌｕｍｅ）を比較することにより、最適服用量を探した（図４ａ及び４ｂ）。低服用セリアナノ粒子（０．１ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇ）の場合には梗塞部が減少していない反面、０．５ｍｇ／ｋｇ及び０．７ｍｇ／ｋｇ濃度のセリアナノ粒子の場合には梗塞部が対照群の梗塞部の５０％に達するほど著しく減少した（ｐ＜０．０５）。しかし、より多くの服用量（１．０ｍｇ／ｋｇ及び１．５ｍｇ／ｋｇ）の場合には脳卒中からの保護効果を見せなかった。このような事実を支えるため、ＴＵＮＥＬ法（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｘｏｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄＵＴＰ−ｂｉｏｔｉｎ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）を使用して凍結断面（ｆｒｏｚｅｎ  ｓｅｃｔｉｏｎ）を持つ薄い脳の欠片（ｂｒａｉｎ  ｓｌｉｃｅ）で細胞死滅について顕微鏡分析を遂行した（図４ｃ）。定量分析で、セリア注入群（０．５ｍｇ／ｋｇ）でＴＵＮＥＬ−陽性細胞の個数が著しく減少した（ｐ＜０．０５；図４ｄ）。これにより、セリアナノ粒子の最適服用量（０．５ｍｇ／ｋｇないし０．７ｍｇ／ｋｇ）は齧歯類脳卒中モデルで、強力な神経保護効果を示すことがわかる。
実施例５．ｔＢＨＰを使用した細胞ＲＯＳ生成誘導、及び細胞生存率分析
９６−ウエルプレート内のＣＨＯ−Ｋ１細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１ｍＭのｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ  ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ（ｔＢＨＰ））溶液を添加した後１時間の間、インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄した後、セリアナノ粒子（０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ）を各ウエルに添加した。前記セリアナノ粒子を６時間処理した後、ＭＴＴ（３−［４、５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２、５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）分析（Ｓｉｇｍａ）を実行した。
細胞生存率を測定するために、ＭＴＴ（３−［４、５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２、５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）分析法（Ｓｉｇｍａ）を使用した。初期にＣＨＯ−Ｋ１細胞を２５，０００細胞／ウエルの密度で９６−ウエルプレートに３つずつ接種して、３７℃２４時間培地内で培養した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞をＰＢＳで２回洗浄し、各ウエルに様々な濃度のセリアナノ粒子（０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ及び０．５ｍＭ）を添加した。前記セリアナノ粒子を６時間処理した後、前記９６−ウエルプレート内の細胞に対する生存率を分析した。各ウエルに５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液２０μｌを添加し、５％ＣＯ２の湿潤雰囲気下で３７℃２時間、インキュベーションした。上澄液を吸引（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）して前記細胞を２００μｌのＤＭＳＯに溶解させた。３０分間振とう（ｓｈａｋｉｎｇ）した後、９６−ウエルプレートリーダー（９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、ｖｉｃｔｏｒ３）を使用して５４０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００２９】
前記ＭＴＴ分析で、１ＭのｔＢＨＰは、対照群と比較して、細胞死滅を著しく増加させたが、（８３％、ｐ＜０．０５；図５）、０．１２５ｍＭのセリアナノ粒子を添加した場合には細胞生存率が向上した（１１３％、ｐ＜０．０５）。また、ローダミン染料（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｄｙｅ）を使用した蛍光の映像に表れたように、セリアナノ粒子はほとんど細胞内空間（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐａｃｅ）で検出された（図６）。親油性高分子でコーティングされた５０ｎｍ未満のセリアナノ粒子は効果的に細胞膜を貫通後拡散して細胞質全体に位置するということが理解できる。このような結果は、細胞内に導入されたセリアナノ粒子が、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で、ＲＯＳ−誘導細胞死滅（ＲＯＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）に対する保護効果を持つという点を立証する。
実施例６．セリアナノ粒子の生体内分布
セリアナノ粒子を静脈内注入してから６時間ないし２４時間後に、局所脳虚血のラット（ｒａｔ）を断頭（ｄｅｃａｐｉｔａｔｉｏｎ）した後速やかに脳とほかの臓器を回収した。死後サンプルを得た後誘導結合高周波プラズマ質量分析法（ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｌａｓｍａ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＩＣＰ−ＭＳ））によって、脳、心臓、腎臓、肝臓及び血液内のセリア濃度を測定した。
【００３０】
肝臓でのセリアナノ粒子濃度は血液及び他の内部臓器でのセリアナノ粒子の濃度よりはるかに高かった（図７ａ）。ところで、非虚血脳でのセリアナノ粒子の濃度は非常に低かったが、虚血後６時間ないし２４時間後に格段に増加し（ｐ＜０．０５）、腎臓及び心臓でのセリアナノ粒子濃度よりはるかに高かった。ローダミンＢイソチオシアナート−接合（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）セリアナノ粒子及び蛍光顕微鏡分析法を使用してセリアナノ粒子を追跡した。図７ｂに示すように、陽性に染色された細胞が虚血半球（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ）内にかなり多く存在したが、非虚血半球内にはほとんど存在しなかった。前記蛍光信号について３次元再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）によるコンピュータ視覚増強（ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ｖｉｓｕａｌ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を実行し、前記の虚血半球内の梗塞周辺部（ｐｅｒｉ−ｉｎｆａｒｃｔ  ａｒｅａ）でセリアナノ粒子の信号が非常に増加したという事実がわかった（図７ｃ）。これにより、静脈内注入されたセリアナノ粒子が正常の脳の組織で十分透過しないが、虚血脳組織には透過するという点を立証した。実際に、セリアナノ粒子の直径が血液脳関門（ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）の穴の大きさより大きいため、セリアナノ粒子が正常脳を透過しないという点を見せた。しかし、脳虚血によって血液脳関門がかなり損傷されて、このような損傷により、セリアナノ粒子が脳に流入される。
実施例７．ＲＯＳの除去及びアポトーシス抑制効果の分析
脳虚血でのＲＯＳの生成をヒドロエチジン（ｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｎｅ（ＨＥｔ））を使用して検査した。ＨＥｔ溶液（１００μｌ、ジメチルスルホキシド内に２０ｍｇ／ｍｌ；米国ミズーリ州ルイスストリート所在のＳｉｇｍａ社）を虚血誘導１５分前に雄ＳＤ系ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔ）（大韓民国ソウル所在のＫｏａｔｅｃｈ社）に投与した。経心腔的灌流（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）による虚血誘導４時間後に前記ラットを殺した。ＨＥｔの検出について３５５ｎｍでの励起及び＞４１５ｎｍでの放出、または酸化されたＨＥｔの検出について５１０ｎｍないし５５０ｎｍでの励起及び＞５８０ｎｍでの放出で、顕微鏡を使用して蛍光を評価した。アポトーシス誘導たんぱく質（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を評価するために、前記ラットを断頭し、局所虚血−再灌流誘導後２４時間で脳を抽出した。半球ホモジネート（ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ  ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）を遠心分離した後、１０％ドデシル硫酸ナトリウム―ポリアクリルアミドゲル上で５０μｇのたんぱく質を分離してニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移した。この膜をブロッティングバッファー（ｐＨ７．５の５０ｍＭＴｒｉｓ内の５％脱脂乳、０．１５ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）内でインキュベーションさせ、ホスホ−Ｐ５３（ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｐ５３）、クリ−ブドカスパーゼ−３（ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３）及びゲルソリン（ｇｅｌｓｏｌｉｎ）（マサチューセッツ州ダンバーズ所在のＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈ．社）を認識する抗体を使用してブロット（ｂｌｏｔ）を検査した。増強化学発光（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）によって免疫反応性を視覚化し、測定値と対照群の平均値を比較して相対的な密度を決定した。
【００３１】
脳卒中発生後、酸化されたヒドロエチジン信号（ＲＯＳ検出者）が、対照群と比較して、セリアナノ粒子を注入した群で増加した（ｐ＜０．０５；図８ａ及び８ｂ）。このような結果は、セリアナノ粒子が虚血後の抗酸化剤としての役割を適切に行えたということを意味する。脳卒中後のアポトーシスに対するセリアナノ粒子の効果を分析するために、ＴＵＮＥＬ陽性アポトーシス細胞を分析した（形態学的基準によるＴＵＮＥＬ−陽性細胞の下位群）。セリアナノ粒子を注入した群でのアポトーシス細胞の数は対照群よりも非常に低く（ｐ＜０．０５；図８ｃ）、ホスホ−Ｐ５３、クリ−ブドカスパーゼ−３及びゲルソリンのようなアポトーシス誘導たんぱく質は、前記セリアナノ粒子を注入した群で減少した（ｐ＜０．０５；図８ｄ及び８ｅ）。ＲＯＳ生成及びアポトーシスは密接につながっているが、これらが同一の場所であるミトコンドリアで発生するためである。
【図６（ａ）】
2015518480.tif 000004
【図６（ｂ）】
2015518480.tif 000005
【図６（ｃ）】
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【図１】
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【図２】
2015518480.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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2015518480.tif 000015
2015518480.tif 000016
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