(57)【要約】補体活性化を検出する方法は、ｉＣ３ｂのレベルを対象由来の試料において検出する工程であって、該検出は、該ｉＣ３ｂと、それに対する非交差反応性抗体との特異的相互作用を伴う、工程、検出されたレベルを基準レベルと比較する工程であって、該基準レベルは約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５，０００ｎｇ／ｍＬの範囲内にあり、該検出されたレベルが該基準レベルを超えることが決定されることは、該対象が、望ましくないかつ／または病理学的な補体活性化を受けているか、あるいは受けやすいことを示す、工程、および、該検出されたレベルが該基準レベルを超えるならば、望まれない補体活性化を処置するための処置を施す工程を含む。ｉＣ３ｂを測定することを伴うか、または伴わない、補体活性化を検出する他の方法もまた提供される。
2015518570.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インタクトＣ３のレベルを対象由来の試料において検出する工程であって、該検出は、該インタクトＣ３と、それに対する非交差反応性抗体との特異的相互作用を伴う、工程；
検出されたレベルを基準レベルと比較する工程であって、該基準レベルは約３５０ｕｇ／ｍＬ〜約１，７００ｕｇ／ｍＬの範囲内にあり、該検出されたレベルが該基準レベル未満であることが決定されることは、該対象が、望ましくないかつ／または病理学的な補体活性化を受けているか、あるいは受けやすいことを示す、工程；および
該検出されたレベルが該基準レベル未満であるならば、望ましくない補体活性化を処置するための処置を施す工程
を含む方法。
【請求項２】
前記非交差反応性抗体は、ｉＣ３ｂの１ｕｇ／ｕＬの溶液により、約１ｎｇ／ｍＬ未満のＣ３に相当するシグナルがもたらされることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非交差反応性抗体はＨＭ２０７５であるか、または、ＨＭ２０７５を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出する工程および比較する工程は約３０分間以下で実施され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記望ましくないかつ／または病理学的な補体活性化は、全身性エリテマトーデス、外傷、炎症性ストレス、自己免疫障害、頭蓋内出血、感染、移植拒絶反応、眼疾患、心疾患、虚血／再灌流障害、加齢性黄斑変性、発作性夜間ヘモグロビン尿症、遺伝性血管浮腫、腎疾患、妊娠関連障害および神経障害からなる群から選択される障害によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試料は、全血、血清、血漿、尿、涙液、唾液、創傷滲出液、気管支肺胞洗浄液および脳脊髄液からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記検出する工程は、該工程の実施により、前記試料内の補体が実質的に活性化されないような制御された条件のもとで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記検出する工程および比較する工程は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して実施されない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記検出する工程および比較する工程は、側方流動アッセイを使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ｉＣ３ｂのレベルを対象由来の試料において検出する工程であって、該検出は、該ｉＣ３ｂと、それに対する非交差反応性抗体との特異的相互作用を伴う、工程；
検出されたレベルを基準レベルと比較する工程であって、該基準レベルは約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５，０００ｎｇ／ｍＬの範囲内にあり、該検出されたレベルが該基準レベルを超えることが決定されることは、該対象が、望ましくないかつ／または病理学的な補体活性化を受けているか、あるいは受けやすいことを示す、工程；および
該検出されたレベルが該基準レベルを超えるならば、望まれない補体活性化を処置するための処置を施す工程
を含む方法。
【請求項１１】
前記非交差反応性抗体は、Ｃ３の１ｕｇ／ｕＬの溶液により、約１ｎｇ／ｍＬ未満のｉＣ３ｂに相当するシグナルがもたらされることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記非交差反応性抗体は、Ａ２０９、ＭＣＡ２６０７およびＨＭ２１９９からなる群から選択される抗体であるか、または、該抗体を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出する工程および比較する工程は約３０分以下で実施され得る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記望ましくないかつ／または病理学的な補体活性化は、全身性エリテマトーデス、外傷、炎症性ストレス、自己免疫障害、頭蓋内出血、感染、移植拒絶反応、眼疾患、心疾患、虚血／再灌流障害、加齢性黄斑変性、発作性夜間ヘモグロビン尿症、遺伝性血管浮腫、腎疾患、妊娠関連障害および神経障害からなる群から選択される障害によって引き起こされる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料は、全血、血清、血漿、尿、涙液、唾液、創傷滲出液、気管支肺胞洗浄液および脳脊髄液からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出する工程は、該工程の実施により、前記試料内の補体が実質的に活性化されないような制御された条件のもとで行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出する工程および比較する工程は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して実施されない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出する工程および比較する工程は、側方流動アッセイを使用して実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
インタクトＣ３レベル対ｉＣ３ｂレベルの比率を試料において検出する工程であって、該検出は、該インタクトＣ３、該ｉＣ３ｂまたは両者と、それに対する非交差反応性抗体との特異的相互作用を伴う、工程；
検出されたレベルを約０．００１の基準比率と比較する工程であって、該検出されたレベルが該基準レベル未満であることが決定されることは、該対象が、望ましくないかつ／または病理学的な補体活性化を受けているか、あるいは受けやすいことを示す、工程；および
該検出されたレベルが該基準レベル未満であるならば、望ましくない補体活性化を処置するための処置を施す工程
を含む方法。
【請求項２０】
前記検出する工程および比較する工程は約３０分間以下で実施され得る、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
インタクトＣ３を検出するための前記非交差反応性抗体はＨＭ２０７５であるか、または、ＨＭ２０７５を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ｉＣ３ｂを検出するための前記非交差反応性抗体は、Ａ２０９、ＭＣＡ２６０７およびＨＭ２１９９からなる群から選択される抗体であるか、または、該抗体を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記望ましくないかつ／または病理学的な補体活性化は、全身性エリテマトーデス、外傷、炎症性ストレス、自己免疫障害、頭蓋内出血、感染、移植拒絶反応、眼疾患、心疾患、虚血／再灌流障害、加齢性黄斑変性、発作性夜間ヘモグロビン尿症、遺伝性血管浮腫、腎疾患、妊娠関連障害および神経障害からなる群から選択される障害によって引き起こされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料は、全血、血清、血漿、尿、涙液、唾液、創傷滲出液、気管支肺胞洗浄液および脳脊髄液からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出する工程は、該工程の実施により、前記試料内の補体が実質的に活性化されないような制御された条件のもとで行われる、請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記検出する工程および比較する工程は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して実施されない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記検出する工程および比較する工程は、側方流動アッセイを使用して実施される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
炎症は、損傷、感染症および一定の疾患に対する血管新生組織の生理反応である。炎症プロセスは、外傷性損傷後の創傷治癒のために、および感染を取り除くために生物学的に必要なものである。しかし、炎症は、自己組織を傷つけることもある。このため、炎症は、諸刃の剣と見なされることが多い。
【０００２】
補体は、免疫系の最古来の武器であり、炎症プロセスに深く関わっている。補体タンパク質カスケードは、侵入微生物に対する防御の第一線であり、創傷治癒プロセスに極めて重要な役割を果たすものである。この補体カスケードは、３０を超える血清および細胞タンパク質を伴い、先天免疫および適応免疫に重要な役割を果たす。補体活性化は、古典的経路、副経路およびレクチン経路という３つの主要経路によって起こり得る。補体活性化の三つの主要経路すべてが、中心的タンパク質補体成分３（Ｃ３）に収束する。Ｃ３は、炎症の中心的媒介因子であり、炎症を引き起こす大多数の要因によって活性化される。図１および２は、Ｃ３およびその活性化産物の概略概観図である。
【０００３】
補体、および特にＣ３は、急性および慢性両方の幾つかの疾患適応症に関連している。例としては、外傷、呼吸困難、敗血症、他の形態の感染症、感染性疾患（例えば、出血熱）、多臓器不全、加齢性黄斑変性、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、虚血／再灌流障害、炎症性腸疾患、頭蓋内出血、心筋梗塞および心停止が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００４】
幾つかの報告により、補体活性化は損傷直後に起こり、損傷の重症度と相関することが示されている。ある研究において、外傷患者の補体タンパク質の循環レベルは患者転帰と相関することが判明した。Ｈｅｃｋｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｒａｕｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ−−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｊｕｒｙ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｐｓｉｓ，ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．（１９９７）２５（１２）：２０１５−２４を参照。この研究において、著者らは、損傷直後およびＩＣＵにおいて損傷後数日間、Ｃ３ａと全Ｃ３の両方の血漿濃度を測定した。彼らは、損傷後最も早い時点で補体Ｃ３活性化の証拠を検出した。しかし、最初の八時間は、生存者より非生存者のほうが補体活性化が顕著であった。最も早い時点でのＣ３活性化度は、患者転帰と相関した。Ｈｅｃｋｅらは、全補体に対する比として考えたときの、Ｃ３分割産物であるＣ３ａの比のほうが、Ｃ３ａ単独より良好な転帰予測因子であることも見出した。
【０００５】
Ｚｉｌｏｗらによる類似の研究（Ｚｉｌｏｗら、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  Ｃ３ａ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｔ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９０）７９：１５１−５７）により、頻繁な（６時間）間隔でのＣ３ａおよび全Ｃ３のモニタリングは、呼吸困難のリスクの高い患者または呼吸困難の早期にある患者の同定に有用であり得ることが遡及的に判明した。これらの研究者は、損傷２時間以内に第一の血漿試料を採り、最初の４８時間は６時間試料採取を繰り返し、その後は一日間隔で行った。Ｚｉｌｏｗらは、６および１２時間の時点でのＣ３ａレベルとＣ３ａ：全Ｃ３比との間に有意な相関関係を見出し、５日目からは外れることも見出した。
【０００６】
外傷ケアの分野では、損傷後最初の一時間は、時として、「ゴールデン・アワー」と呼ばれる。理論により拘束されることを望まないが、外傷性損傷後の最初の一時間以内の介入は、患者の転帰を大きく向上させると一般に考えられる。より早くもたらされるより良い診断情報は、処置を決定する際の救命救急診療専門家の洞察力の向上に役立つだろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈｅｃｋｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｒａｕｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ−−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｊｕｒｙ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｐｓｉｓ，ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．（１９９７）２５（１２）：２０１５−２４
【非特許文献２】Ｚｉｌｏｗら、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  Ｃ３ａ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｔ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９０）７９：１５１−５７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ネイティブまたはインタクトなＣ３および／またはｉＣ３ｂの定性的測定および定量的測定のための新しい方法およびアッセイを開発した。本発明者らはさらに、そのような方法およびアッセイのポイント・オブ・ケア実行を提供する。
【０００９】
提供される方法およびアッセイは、例えば、診断学および治療学における使用を含めて医療における使用のために好適であり、特に、臨床の場における使用のために好適である。とりわけ、提供される方法およびアッセイは、外傷性損傷または他の生理的クリーゼの直後における最も早期の時点での患者ケアを導く際の使用のために好適である。代替において、または加えて、提供される方法およびアッセイは、例えば、補体活性化の存在またはレベルによって影響される１つ以上の疾患状態に苦しむか、または罹りやすい患者のための処置を選択するための、モニターするための、および／または調節するための使用のために好適である。そのような疾患状態には、例えば、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデスなど）が挙げられる。
【００１０】
干渉するクロストークを回避する捕捉抗体および検出抗体のペアを注意深く選択することによって、本発明者らは驚くべきことに、ネイティブまたはインタクトなＣ３および／またはｉＣ３ｂを含む補体活性化のバイオマーカーを、これらの分析物のためのより多くの従来の検査方法を悩ましている偽陽性結果を避けながら検出し、定量することが可能であることを見出した。本発明は様々な方式で適用され得る；本発明者らはさらに、側方流動アッセイタイプ方式により、特に側方流動イムノアッセイ方式により、格別な利点および驚くべき特徴が提供されることを見出した。
【００１１】
補体応答は、疾患に対する重要な防御システムであるが、いくつかの特徴が、臨床的に関連する期間においては特に、補体活性化の正確な測定を困難にしている。公知の技術では、補体のレベルを決定するために１時間を必要とし、しばしば２時間以上を必要とする。この期間中に、著しい、または、不可逆的でさえある、損傷が生じてしまうまでは視覚的に現れない患者状態の著しい悪化が生じつつある場合がある。加えて、補体タンパク質が、取り扱い条件および他の実験条件によって容易に活性化されることが公知である。本出願人らはとりわけ、補体を活性化するとは以前には認識されていなかったレベルまたはタイプの取り扱いが実際には、アッセイ結果に著しい影響を与え得ることを発見した。恐らく最も驚くべきことに、本出願人らは、時間の経過が、取り扱いがない場合でさえ、自発的な補体活性化における重大な要因であることを本明細書中において明らかにする。
【００１２】
本発明は、様々な問題のこれらのこれまで特定されていなかった根源に対処する技術を提供する。例えば、一部の実施形態において、本発明は、関連の工程がすべて、限られた期間の範囲内で行われる方法を提供する。本発明によれば、そのような方法は、自発的な補体活性化を最小限に抑えること、および、あるいはまたは加えて、臨床的に関連があるデータを、標準的な方法論と比較して実質的に削減された期間（これは対象からの試料採取の開始から測定される）のうちに提供することを含めて様々な利点を提供する。一部の実施形態において、提供されるアッセイは、約６０分未満、約５０分以下、約４０分以下、約３０分以下、約２０分以下、約１０分以下または約５分以下である期間（これは対象からの試料採取の開始から測定される）のうちに完了する。対照的に、多くの先行技術アッセイでは、データが何時間もの間にわたって提供されない。そのような時間の差は、患者にとっては生死に関わる差になり得る。
【００１３】
本発明はさらに、全補体タンパク質レベルにおける変化（例えば、低下）を検出する先行技術アッセイに関するある問題のこれまで認識されていなかった根源を特定する。そのような先行技術アッセイの背後にある理論的根拠が、傷害または疾患が甚だしい補体活性化の引き金となり得、この結果、全補体タンパク質レベルにおける低下を生じさせ得るということである。しかしながら、本発明は、これまでに認識されていたよりも高いレベルの補体活性化が、非病源的事象（例えば、運動など）によって個体体内において、そしてまた、取り扱いによってまたは時間の経過によってさえも試料内において誘発され得るという知見を包含する。したがって、本発明は、先行技術アッセイでは、補体タンパク質が減少する理由、または、関連性がある補体タンパク質の運命を区別することができないという点で特異性がないことを明らかにする。対照的に、本発明の様々な実施形態では、望ましくないかつ／または病理学的な補体活性化と、望ましくはなくはないかつ／または病理学的な補体活性化との区別を可能にするアッセイが提供される。例えば、いくつかのそのような提供されるアッセイにより、インタクトＣ３のレベルおよび／または１つ以上の活性化産物（例えば、ｉＣ３ｂなど）のレベルが測定される。全補体タンパク質ではなく、むしろ、補体タンパク質レベルを本発明に従って評価することにより、例えば、ライフスタイルの変化などに応じて生じることがあるような、循環している補体タンパク質における全身的低下から生じる望ましくないかつ／または病理学的な補体活性化が区別される。
【００１４】
一つの態様において、本発明は、インタクトＣ３のレベルを対象由来の試料において検出する工程であって、該検出は、該インタクトＣ３と、それに対する非交差反応性抗体との特異的相互作用を伴う、工程、検出されたレベルを基準レベルと比較する工程であって、該基準レベルは約３５０ｕｇ／ｍＬ〜約１，７００ｕｇ／ｍＬの範囲内にあり、該検出されたレベルが該基準レベル未満であることが決定されることは、該対象が、望ましくないかつ／または病理学的な補体活性化を受けているか、あるいは受けやすいことを示す、工程、および、必要な場合には、前記検出されたレベルが前記基準レベル未満であるならば、処置を施す工程を含む方法を提供する。
【００１５】
一つの態様において、本発明は、ｉＣ３ｂのレベルを対象由来の試料において検出する工程であって、該検出は、該ｉＣ３ｂと、それに対する非交差反応性抗体との特異的相互作用を伴う、工程、検出されたレベルを基準レベルと比較する工程であって、該基準レベルは約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５，０００ｎｇ／ｍＬの範囲内にあり、該検出されたレベルが該基準レベルを超えることが決定されることは、該対象が、望ましくないかつ／または病理学的な補体活性化を受けているか、あるいは受けやすいことを示す、工程、および、必要な場合には、前記検出されたレベルが前記基準レベルを超えるならば、処置を施す工程を含む方法を提供する。
【００１６】
一つの態様において、本発明は、インタクトＣ３レベル対ｉＣ３ｂレベルの比率を試料において検出する工程であって、該検出は、該インタクトＣ３、該ｉＣ３ｂまたは両者と、それに対する非交差反応性抗体との特異的相互作用を伴う、工程、検出されたレベルを約０．００１の基準比率と比較する工程であって、該検出されたレベルが該基準レベル未満であることが決定されることは、該対象が、望ましくないかつ／または病理学的な補体活性化を受けているか、あるいは受けやすいことを示す、工程、および、必要な場合には、前記検出されたレベルが前記基準レベル未満であるならば、処置を施す工程を含む方法を提供する。
【００１７】
これらおよび他の目的、特徴、実施形態および利点は、後に続く詳細な説明および添付の特許請求の範囲を読むことで当業者には明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、補体系の概略概観図を提供する。補体は、３つの主要経路によって活性化され、これらの経路のすべてがインタクトＣ３の活性化に収束する。Ｃ３のタンパク質分解的活性化は、Ｃ３分割産物Ｃ３ａおよびＣ３ｂを生じさせる。Ｃ３ｂは、さらにタンパク質分解的に修飾されて、Ｃ３活性化についてのバイオマーカーであるｉＣ３ｂを形成する。インタクトＣ３およびｉＣ３ｂは、概略図において丸で囲まれている。
【００１９】
【図２】図２は、Ｃ３活性化および非活性化の略図を提供する。インタクトＣ３は、Ｃ３ａおよびＣ３ｂへとタンパク質分解的に活性化される。表面に共有結合で付いているＣ３ｂ分子もあり；水と反応し、循環内に留まるものもある。Ｃ３ｂは、プロテアーゼ第１因子（Ｆａｃｔｏｒ  １）によって非活性化される。その第一の非活性化産物がｉＣ３ｂであり、これは、短鎖ペプチドであるＣ３ｆを除去する第１因子の活性化によって形成される。ｉＣ３ｂは、Ｃ３ｃおよびＣ３ｄｇへとさらに分解され、そのＣ３ｄｇが最終的にＣ３ｄへと分解される。
【００２０】
【図３】図３は、抗体ペアによるインタクトＣ３およびｉＣ３ｂの特異的認識の略図である。（Ａ）インタクトＣ３は、二つの抗体によって認識される：第一抗体は、インタクトＣ３分子中にしか存在しないＣ３ａを認識する；第二抗体は、インタクトＣ３とｉＣ３ｂの両方に存在するＣ３ｄ中の領域を認識する。第二抗体は、Ｃ３およびその誘導体の他のタンパク質分子からの識別に関与するが、ｉＣ３ｂとインタクトＣ３の識別には関与しない。インタクトＣ３に対する抗体の代替ペアとしては、Ｃ３ａおよびＣ３ｆを認識する抗体が挙げられる。（Ｂ）ｉＣ３ｂタンパク質は、別の抗体ペアによって認識される。第一抗体は、前記タンパク質と、そのＣ３ｇ領域付近に位置すると考えられるネオエピトープで接触する。このエピトープは、第１因子がＣ３ｆ断片を除去すると現れる。第１因子がｉＣ３ｂをＣ３ｃおよびＣ３ｄｇへと分解すると、そのネオエピトープは妨げられる。第二抗体は、Ｃ３ｄエピトープを認識する。ｉＣ３ｂに対する代替ペアとしては、上述のｉＣ３ｂ抗体と、活性化されたＣ３ｄを認識する第二のもの（Ｑｕｉｄｅｌ（登録商標）Ａ２５０）が挙げられる。
【００２１】
【図４】図４は、本発明の側方流動イムノアッセイの一つの実施形態の概略図である。
【００２２】
【図５】図５は、本発明による側方流動イムノアッセイの二つの実施形態の略図である。（Ａ）は、単一分析物の検出のための側方流動イムノアッセイを示す。（Ｂ）は、並列メンブレンストリップで二つの別個の分析物（インタクトＣ３およびｉＣ３ｂ）を検出するための側方流動イムノアッセイを示す。
【００２３】
【図６】図６は、単一分析物用側方流動イムノアッセイの三つの実施形態の描画である。（Ａ）は、全Ｃ３側方流動イムノアッセイのための検査カセットを示す。（Ｂ）は、インタクトＣ３側方流動イムノアッセイのための検査カセットを示す。（Ｃ）は、ｉＣ３ｂ側方流動イムノアッセイのための検査カセットを示す。
【００２４】
【図７】図７は、インタクトＣ３およびｉＣ３ｂの評価のための、二分析物用側方流動イムノアッセイ検査カセットの二つの実施形態の描画である。（Ａ）は、試料ローディング用の二つの独立したポートと並の二つのメンブレンストリップ（各分析物につき一つ）とを含む検査カセットを示す。（Ｂ）は、試料ローディング用の単一のポートと並列の二つのメンブレンストリップ（各分析物につき一つ）とを備えている検査カセットを示す。
【００２５】
【図８】図８は、全Ｃ３、インタクトＣ３およびｉＣ３ｂの評価のための、三分析物用側方流動イムノアッセイ検査カセットの二つの実施形態の描画である。（Ａ）は、試料ローディング用の三つの独立したポートと並列の三つのメンブレンストリップ（各分析物につき一つ）とを含む検査カセットを示す。（Ｂ）は、試料ローディング用の単一のポートと並列の三つのメンブレンストリップ（各分析物につき一つ）とを備えている検査カセットを示す。
【００２６】
【図９】図９は、側方流動イムノアッセイの二つの実施形態の略図である。（Ａ）は、単一分析物の検出のための側方流動イムノアッセイを示す。（Ｂ）は、同じメンブレンストリップ上で直列に二つの別個の分析物（インタクトＣ３およびｉＣ３ｂ）を検出するための側方流動イムノアッセイを示す。
【００２７】
【図１０】図１０は、直列での複数の分析物のための側方流動イムノアッセイの二つの実施形態の描画である。（Ａ）は、同じメンブレンストリップ上で直列に二つの分析物および一つの対照を検出するための側方流動イムノアッセイを示す。（Ｂ）は、同じメンブレンストリップ上で直列に三つの分析物および一つの対照を検出するための側方流動イムノアッセイを示す。
【００２８】
【図１１】図１１は、本側方流動イムノアッセイの三つの実施形態についての感度、ダイナミックレンジ、検査間のばらつき、およびアッセイ時間の比較を示す。（Ａ）は、カセットケースなしでｉＣ３ｂを検出する検査ストリップについての標準曲線グラフを示す。（Ｂ）は、検査試料容積のより制御された管理を可能にするカセットに検査ストリップを入れている、側方流動イムノアッセイの一つの実施形態の標準曲線グラフを示す。金コンジュゲーションに使用する抗体溶液の濃度は０．５ｍｇ／ｍＬであり、ＢＳＡを反応混合物に含める。（Ｃ）は、金コンジュゲーションに使用される抗体溶液の濃度が１ｍｇ／ｍＬであり、ＢＳＡを反応混合物から除去している、カセットに組み込まれた検査ストリップのもう一つの実施形態の標準曲線グラフを示す。このアッセイの感度は１０ｎｇ／ｍＬに達し、ダイナミックレンジは１０ｕｇ／ｍＬに及ぶ。
【００２９】
【図１２】図１２は、本明細書に記載するｉＣ３ｂ用の側方流動イムノアッセイの１実施形態の感度を示す。感度は、１０ｎｇ／ｍＬから１０ｕｇ／ｍＬの範囲である。標準誤差は、２０分の時点で３％未満である。Ｒ二乗＝０．９８９２。
【００３０】
【図１３】図１３は、本明細書に記載するインタクトＣ３についての側方流動イムノアッセイの１実施形態の感度を示す。感度は、２０ｎｇ／ｍＬから１０ｕｇ／ｍＬの範囲である。標準誤差は、２０分の時点で３％未満である。Ｒ二乗＝０．９９６４。エラーバーを示すが、プロットした点よりそれらのほうが小さい。
【００３１】
【図１４】図１４は、例示的な側方流動イムノアッセイにおけるインタクトＣ３とｉＣ３ｂ抗体間のクロストークを示す。
【００３２】
【図１５】図１５は、本明細書に記載する例示的な側方流動イムノアッセイによってアッセイしたときの、一人の個体からの基礎涙液中のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂレベルを１２時間間隔で示す。
【００３３】
【図１６】図１６は、正常健常個体からの全血中のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂレベルを示す。結果は、健常ドナーからの全血中のｉＣ３ｂより、おおよそ２５００倍多いインタクトＣ３を示す。
【００３４】
【図１７】図１７は、健常個体からの全血中のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂレベルを示す。結果は、健常ドナーからの全血中のｉＣ３ｂより、おおよそ３３３倍多いインタクトＣ３を示す。
【００３５】
【図１８】図１８は、重い運動（１００マイル自転車走行）の２時間後の正常個体のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂレベルを示す。結果は、運動後の健常個体からの全血中のｉＣ３ｂより、１０００倍多いインタクトＣ３を示す。
【００３６】
【図１９】図１９は、本明細書に開示するアッセイおよび方法での使用に好適な例示的体液の表である。
【００３７】
【図２０】図２０は、ただ一つの分析物を試料から測定するために使用され得る本発明の側方流動実施形態の二つの略図を示す。（Ａ）は本発明の例示的実施形態の概略図を示す。（Ｂ）は、本発明の様々な態様に従う例示的プロセスの概略図を示す。
【００３８】
【図２１】図２１は、本発明の１つ以上の態様を実施する例示的方法を示す。本方法が実施されるとき、本方法がどのように見え得るかの例示的な図示、ならびに、本発明の様々な態様に従うアッセイ検査ストリップおよび検査ストリップリーダーの写真もまた示される。
【００３９】
【図２２】図２２は、図２３における標準曲線を作製するために、実施例に記載するような本発明のある特定の実施形態に従って使用されたアッセイ検査ストリップの写真を示す。図２３における各データ点をこの図２２に示される三連の測定から得た。
【００４０】
【図２３】図２３は、試料調製後１０分、２０分および３０分のネイティブＣ３タンパク質のレベルを示す、本発明の方法に従って作製されたいくつかの標準曲線を示す。
【００４１】
【図２４】図２４は、図２２に示される試料についてネイティブＣ３についての測定値および図２３に示されるデータにおける分散を示す。
【００４２】
【図２５】図２５は、図２６における標準曲線を作製するために使用されたアッセイ検査ストリップの写真を示す。図２６における各データ点をこの図に示される三連の測定値から得た。
【００４３】
【図２６】図２６は、試料調製後１０分、２０分および３０分のｉＣ３ｂタンパク質のレベルを示す、本発明の方法に従って作製されたいくつかの標準曲線を示す。
【００４４】
【図２７】図２７は、本発明の方法に従ってアッセイされる場合のただ一つの血液試料からの（Ａ）ネイティブＣ３および（Ｂ）ｉＣ３ｂの三連測定を示す。
【００４５】
【図２８】図２８は、本発明の方法に従って全血、血清および血漿において測定される場合の３名のドナーからのネイティブＣ３レベルの測定値を示す。
【００４６】
【図２９】図２９は、本発明の方法に従って測定され、公知のＥＬＩＳＡ法と比較される場合の血漿または血清におけるｉＣ３ｂレベルの測定値を示す。パネル（Ａ）、パネル（Ｂ）およびパネル（Ｃ）はドナー毎のデータを棒グラフ形式で示し、一方、パネル（Ｄ）は３名すべてのドナーからのデータを表形式で示す。
【００４７】
【図３０】図３０は、本発明の方法に従って測定され、公知のＥＬＩＳＡ法と比較される場合の精製ｉＣ３ｂタンパク質の試料からのｉＣ３ｂレベルを示し、かつ、本発明のアッセイまたは従来的ＥＬＩＳＡのどちらかを使用して血漿の試料から得られるデータに対する比較を示す。
【００４８】
【図３１】図３１は、２名のドナーから得られる全血、血漿または血清の試料から測定される場合のｉＣ３ｂタンパク質のレベルを示す。これらのアッセイを、試料が新鮮であるとき、または、試料が室温に４時間さらされたときに行った。
【００４９】
【図３２】図３２は、ｉＣ３ｂ標準曲線（「ｉＣ３ｂ」と表示される）に対して比較される場合の、全血の試料での測定されたｉＣ３ｂレベル（「血液」と表示される）に対する時間の影響を示す。試料を、（Ａ）５分間、（Ｂ）１０分間、（Ｃ）１５分間または（Ｄ）２０分間、室温にさらした。
【００５０】
【図３３】図３３は、３名のドナーからの血漿または血清の試料における測定されたｉＣ３ｂレベルを示す。各ドナーからの試料を、二つの条件のうちの一つ、すなわち、室温への五（５）分間の暴露または室温への六十（６０）分間の暴露のどちらかにさらした。ｉＣ３ｂのレベルを暴露時間の期間中に６回の間隔で測定し、レベルを直接的な比較のためにｉＣ３ｂ標準曲線に対して正規化した。
【００５１】
【図３４】図３４は、ヒト血漿試料におけるｉＣ３ｂの生成に対する時間の影響を示す。（Ａ）は、本発明の様々な態様に従う側方流動検査ストリップの写真を示す。（Ｂ）は、（Ａ）に示されるストリップから読み取られる場合の経時的なｉＣ３ｂ生成のグラフを示す。
【００５２】
【図３５】図３５は、ＥＬＩＳＡ方式のアッセイを使用して、（Ａ）２分間のインキュベーションの後および（Ｂ）５分間のインキュベーションの後でのヒトの血漿試料および血清試料におけるｉＣ３ｂ活性化を示す。
【００５３】
【図３６】図３６は、ＥＬＩＳＡ方式のアッセイにおいて、２分間、５分間、１５分間または６０分間のインキュベーションの後でのヒト血清の試料におけるｉＣ３ｂ活性化の棒グラフを示す。
【００５４】
【図３７】図３７は、抗原：抗体複合体の非存在下における経時的なヒト血清由来Ｃ３の沈着および活性化を示す。
【００５５】
【図３８】図３８は、抗体被覆ウェルの非存在下における経時的なヒト血清由来Ｃ３の沈着および活性化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
発明の特定の実施形態の詳細な説明
これまでは、補体活性化を処置の実施可能な期間のうちに測定するためのポイント・オブ・ケアアッセイがこの技術分野において公知でなかった。補体と疾患または外傷との様々な関連が長い間認識されていたにもかかわらず、Ｃ３がほんの少数の疾患または状態においてモニターされるだけである。そのような場合においてでさえ、現在のアッセイ法は様々な制限がある。第一に、ほとんどの場合において、従来の補体アッセイは、（例えば、濁度アッセイおよびＥＬＩＳＡを介して）標的分析物として全Ｃ３に向けられている。全Ｃ３は、インタクト（またはネイティブ）Ｃ３ならびにＣ３の活性化産物および非活性化産物の組合せである。これらの検査では一般に、循環している全Ｃ３レベルにおける低下が検出される。したがって、全Ｃ３の低下したレベルは、甚だしい活性化に起因するＣ３枯渇化を測定するだけである。しかしながら、他の要因（例えば、食事または運動など）により、Ｃ３のより低い定常状態レベルが引き起こされ得る。全Ｃ３アッセイはターンオーバーを測定しないので、活性化の原因を区別することができない。そのうえ、全Ｃ３を測定する検査では、患者ケアを導くことにおいて有用であると思われるＣ３活性化シグネチャーにおけるリアルタイム変化をモニターすることができない。例えば、（低下したＣ３レベルを特徴とする）外傷または全身性狼瘡に罹患する患者が、改善されたＣ３活性化モニタリングから利益を受けると思われる。現在、全身性狼瘡についての処置有効性が、低下したＣ３レベルが正常なレベルに戻ることによって測定される。しかしながら、医師は、根底にある疾患プロセスが停止させられているか、または、恒常性機構がＣ３を生理学的正常なレベルに戻すように十分に阻止されているだけであるかを見分けることが困難である。
【００５７】
現在のＣ３検査における第二の制限が、ほとんどのアッセイを行うために要求される時間である。補体活性化を検出するための典型的なＥＬＩＳＡアッセイでは、行うために数時間が要求され、また、実験室および熟練技術者が利用できる準備ができていることが要求される。したがって、このアッセイプラットホームは、炎症性機能不全を示すには有用でない。これは、この場合、バイオマーカーが分単位で変化し、かつ、臨床的介入が、同様の時間スケールで要求されるからである。
【００５８】
現在のＣ３検査における第三の制限がタンパク質カスケード自体の性質にある。補体は、悪名が高いほど細心の注意を必要とし、また、標準的な分析手順（取り扱い、貯蔵、および、分析中にＣ３と接触する異物への暴露）により活性化される可能性がある。補体は、侵入微生物を溶解すること、および、傷害部位における創傷治癒応答を開始させることにおいて非常に効果的である。この有効性は部分的には、Ｃ３が異物（例えば、細菌の細胞壁成分など）によって活性化される能力に起因する。この特性は、免疫応答を新しい外来病原体に向かわせることにおいて有用であるが、この同じ特性は、厄介な課題を実験研究および診断研究にもたらしている。試料取り扱いにおいて使用されるプラスチックなどの材料、試料そのものの操作、および、不適切な貯蔵条件もまた、補体活性化の引き金となり得る。所与のアッセイを行うために要求される処理工程および取り扱い工程が多くなるほど、アッセイ自体による補体の活性化に起因して、より多くの偽陽性が予想され得る。そのような偽陽性は従来の検査を複雑にし、そして、現在の検査法を、患者ケアをほぼリアルタイムで導く際における使用のためには不適切にする。
【００５９】
補体活性化を検査する際のさらなる検討事項が、炎症応答におけるリアルタイム変化を検出するための最も良いバイオマーカーの選択である。Ｃ３は、炎症におけるバイオマーカーとして幾つかの魅力的な品質を有する。第一に、補体系の中心的タンパク質として、Ｃ３が、補体活性化を引き起こすほとんどの刺激によって活性化される。第二に、Ｃ３が、傷害または感染の程度に比例して活性化する。第三に、Ｃ３が、生理学的傷害に対してほぼリアルタイムで応答する。補体活性化は、応答に数時間または数日を要する他の急性期炎症マーカーとは対照的に、クリーゼを引き起こす作用因子に対して直接応答して生じる。この迅速な応答特性が、臨床において頻繁に使用される他のバイオマーカーには存在しない。
【００６０】
具体的には、インタクト（またはネイティブ）Ｃ３が炎症状態の有益なマーカーである。インタクトＣ３は、活性化のために利用可能であるＣ３の量を表す。全Ｃ３は、インタクトＣ３、同様にまた、すべてのＣ３活性化産物を表す。現在、標準的な補体アッセイでは一般に、全Ｃ３が濁度アッセイまたはＥＬＩＳＡにより測定される。技術的には行うことがより容易であるにもかかわらず、全Ｃ３アッセイは、インタクトＣ３アッセイと同じくらい正確にＣ３枯渇化を検出することができない。インタクトＣ３をとりわけ経時的にモニターすることが、甚だしい補体活性化事象（例えば、外傷および他の全身的な補体活性化指標において生じる補体活性化事象など）を追跡するために有用である。インタクトＣ３を経時的にモニターすることにより、臨床医は、Ｃ３の枯渇化によって引き起こされる免疫抑制状態の開始を検出することが可能になる。さらに、インタクトＣ３は、補体活性化指数を計算するときには全Ｃ３よりも有用であり得る。インタクトＣ３アッセイは、部分的にはインタクトＣ３が非常に不安定であり、かつ、適切な取り扱いがなされないならば、変性または自己活性化し得るので、施行することまたは頼ることが困難であることが歴史的に判明している。
【００６１】
Ｃ３分割産物、すなわち、ｉＣ３ｂもまた、炎症応答の有益なマーカーである。ｉＣ３ｂは半減期が３０分〜９０分であり、このため、（Ｃ３ａと比較して）揮発性が低く、しかし、依然として迅速に応答し得るバイオマーカーとして役立つ。しかしながら、ｉＣ３ｂは、患者試料においてインタクトＣ３よりもはるかに低いレベルで存在する。インタクトＣ３タンパク質とｉＣ３ｂ特異的アッセイとの間における小さい程度のクロストーク（例えば、１％）でさえ、偽陽性のｉＣ３ｂシグナルが、正常な循環しているｉＣ３ｂのレベルの２倍のレベルでもたらされる。それ故、炎症の望ましいマーカーではあるが、これまで、ｉＣ３ｂは、著しい課題を診断検査において引き起こしている。
【００６２】
国際公開２０１０／１３５７１７（Ｚｈａｎｇら、２０１０年１１月２５日公開）は、バイオマーカーであるインタクトＣ３、ｉＣ３ｂおよび全Ｃ３により補体活性化を評価するための方法に関する。しかしながら、Ｚｈａｎｇらは、実験室処理および熟練技術者の専門知識を必要とする従来のサンドイッチ型イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡなど）に限定される。さらに、Ｚｈａｎｇらのアッセイおよび方法は、不安定なインタクトＣ３を活性化させ、偽陽性の検査結果をもたらし、これにより、インタクトＣ３を正確に測定する能力を妨げることが知られている試料調製工程、貯蔵工程および取り扱い工程を必要とする。そのうえ、Ｚｈａｎｇらのアッセイおよび方法は、処理するために何時間も必要であり、したがって、生理学的クリーゼ後の最も早期時点において患者ケアに影響を及ぼし得るほぼリアルタイムのデータを提供することができない。
【００６３】
ここに開示する主題の一つ以上の実施形態の詳細を本明細書に示す。本明細書に提供する情報の研究後、本明細書に記載する実施形態に対する変形および他の実施形態が、当業者には明白となるだろう。
【００６４】
以下の用語は当業者によく理解されていると考えられるが、ここに開示する主題の説明を助長するために定義を示す。
【００６５】
別の定義がない限り、本明細書において用いるすべての専門および科学用語は、ここに開示する主題が属する技術分野の通常の技術者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。
【００６６】
別の指摘がない限り、本明細書および特許請求の範囲で用いる成分の量および特性、例えば反応条件、などを表現するすべての数は、すべての場合、用語「約」によって修飾されていると解するべきである。したがって、相反する指摘がない限り、本明細書および特許請求の範囲に示す数値パラメータは、ここに開示する主題によって得ようと努める所望の特性に依存して変動し得る近似値である。
【００６７】
本明細書において用いる場合、用語「約」は、質量、重量、時間、容積、濃度または百分率の値または量を指すとき、明記されている量から、一部の実施形態では±２０％、一部の実施形態では±１０％、一部の実施形態では±５％、一部の実施形態では±１％、一部の実施形態では±０．５％、および一部の実施形態では±０．１％の変動を包含することを意図したものである。かかる変動は、開示する方法の実施に適切であるからである。
【００６８】
「分析物」は、評価されることとなる、例えばその量（例えば、濃度もしくは質量）、活性、組成または他の特性（単数もしくは複数）が検出、測定、定量、評価、分析などされることとなる、任意の実体、特に、化学的、生化学的または生物学的実体を意味する。「分析物」は、単一分子種である場合もあり、または多数の異なる分子種からなる場合もある。
【００６９】
「抗体」は、タイプＩｇＡ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＹのインタクトおよび／または完全長免疫グロブリン、完全免疫グロブリンの抗原結合断片または一本鎖（例えば、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、ｓｃＦｖ（一本鎖可変）およびｄＡｂ断片）、ならびに少なくとも一つの抗原結合免疫グロブリン可変領域を含む他のタンパク質、例えば、免疫グロブリン可変領域、例えば重（Ｈ）鎖可変領域（ＶＨ）および軽（Ｌ）鎖可変領域（ＶＬ）を含むタンパク質を包含する。抗体の軽鎖は、カッパタイプのものであることもあり、またはラムダタイプのものであることもある。抗体は、ポリクローナル抗体であることもあり、またはモノクローナル抗体であることもある。ポリクローナル抗体は、免疫グロブリン分子（複数）を含有し、該免疫グロブリン分子は、それらの相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列が異なり、したがって典型的には抗原の異なるエピトープを認識する。多くの場合、ポリクローナル抗体は、異なる特異性を有する抗体をそれぞれが生産する多数の異なるＢ細胞系統に由来する。ポリクローナル抗体は、それぞれが個々のＢ細胞系統に由来する幾つかの抗体亜集団で主として構成されることもある。モノクローナル抗体は、個々の免疫グロブリン分子で構成され、該個々の免疫グロブリン分子は、同じ配列のＣＤＲを含み、したがって同じエピトープを認識する（すなわち、この抗体は、単一特異性である）。多くの場合、モノクローナル抗体は、単一Ｂ細胞系統またはハイブリドーマに由来する。抗体は、例えば、齧歯動物起源の可変ドメインがヒト起源の定常領域に融合されている「ヒト化」抗体、または相補性決定領域アミノ酸の一部もしくはすべてが、多くの場合一つ以上のフレームワークアミノ酸と一緒に、齧歯動物（例えばマウス）抗体からヒト抗体に「移植され」、それ故、齧歯動物抗体の特異性を保持する「ヒト化」抗体であることがある。
【００７０】
もう一つの実施形態において、捕捉剤および／または検出剤は、他のリガンド、例えば、活性化Ｃ３の天然受容体（例えば、補体受容体１、２および３）、アプタマー、ペプチド、他の小分子リガンドならびにこれらに類するものを含む。
【００７１】
本発明の一定の実施形態の態様は、捕捉剤および検出剤として使用するための抗体の選択である。本発明者らは、多くの発表され、市販されている抗体が、インタクトＣ３と様々なＣ３切断産物との間の、または異なるＣ３切断産物間のクロストークを示すことを発見した。例えば、ヒトＣ３ａに対する一定のモノクローナル抗体は、Ｃ３ｂおよびｉＣ３ｂとの有意な予想外の交差反応性を示す。一定の状況では交差反応性が不正確さの大きな原因となり得ることが分かった。検査したｉＣ３ｂ抗体の多くで観察されたインタクトＣ３とｉＣ３ｂとの間のクロストークは、ｉＣ３ｂ用のアッセイを開発する上で特に重要な事柄であった。さらなる検査により、これらの抗体の少なくとも一部に関してＣ３ｂとｉＣ３ｂとの間のクロストークがよりいっそう重要であることが明らかになった。これはｉＣ３ｂレベルが、患者試料においてインタクトＣ３よりはるかに低いレベルで存在すると予想されるため、重要であった。本発明の一定の実施形態の一つの態様は、かかるクロストークを最小限にするために、インタクトＣ３またはｉＣ３ｂに対して特異性を有する抗体を選択することである。一定の実施形態では、インタクトＣ３またはｉＣ３ｂに対して特異性を有する抗体は、実質的に交差反応性でない。この文脈で、「実質的に交差反応性でない」は、約０．１％未満の交差反応性を意味し、これは、１ｕｇ／ｍＬのＣ３溶液が約１ｎｇ／ｍＬ未満のｉＣ３ｂとして示されなければならないことを意味する。約０．１％閾値は、正常個体におけるインタクトＣ３およびｉＣ３ｂの生理的レベルに基づく。正常ｉＣ３ｂレベルは、循環内の全Ｃ３のレベルのおおよそ０．５％である。補体活性アッセイにおいてＣ３クロストークがｉＣ３ｂシグナルに約２５％より大きく寄与すると、そのアッセイは、そのアッセイの有用性を無効にする偽陽性結果を生じさせることがある。
【００７２】
「体液」は、補体活性化についてアッセイすることができる体内の任意の流体を意味する。体液としては、全血、血清、血漿、尿、涙液、唾液、創傷滲出液、気管支肺胞洗浄液および脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。好適な体液の非限定的リストについての図１９を参照のこと。
【００７３】
「補体活性化レベル」は、所与の時点で活性化されている補体（一般にＣ３）の量を意味する。インタクトＣ３、ｉＣ３ｂおよび／または全Ｃ３の量（すなわちレベル）を典型的には濃度によって表現するが、質量または重量によって表現することもある。濃度は、様々な様式で、例えば、モル濃度、重量モル濃度、モル分率、質量分率（全混合物の質量の分率としての混合物中の物質の質量）、単位容積あたりの質量などによって、表現することができる。本明細書での説明のために、濃度（例えば、単位容積あたりの質量）を一般に用いることとする。補体活性化レベルをｉＣ３ｂのインタクトまたは全Ｃ３に対する比として、またはＣ３ａの全Ｃ３に対する比として記載することもある。
【００７４】
「補体関連障害」は、本明細書において用いる場合、補体活性化の修飾を特徴とする障害または状態を指す。補体関連障害の例としては、外傷、例えば、外傷性脳損傷、脊髄損傷、外科手術、および頭蓋内圧；炎症性苦痛、例えば、重症アレルギー、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）；多臓器不全（ＭＯＦ）、急性または成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症ショック、およびショック；発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）；遺伝性血管浮腫（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ａｎｇｉｏｄｅｍａ）；腎疾患、例えば、糸球体腎炎、感染症、ループス腎炎、および臓器移植を必要とする腎疾患；自己免疫疾患、例えば、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデス；虚血／再灌流障害；心疾患、例えば、心筋梗塞および心停止；妊娠（子癇前症および胎児低酸素症候群を含む）；眼疾患、例えば、加齢性黄斑変性、ドライアイ症候群、および眼感染症；臓器移植（移植拒絶反応、切迫拒絶反応（ｉｍｍｉｎｅｎｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）の検出、感染症の検出、および免疫抑制薬レジメンの調整のモニタリングを含む）；感染症（敗血症、肺炎、膀胱感染症、尿路感染症、および腎感染症を含む）；ならびに神経障害（多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症、および外傷後ストレス障害を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
「対照」は、公知の基準補体活性化レベルを有する試料を指す。一部の実施形態において、対照は、補体関連障害を経験していない個体のものに匹敵する補体活性化レベルを有するので、対照と比較して偏差を有する補体活性化レベルを有する検査試料は補体関連障害を示す。一定の実施形態において、補体関連障害は、検査試料補体活性化レベルが対照と比較して統計学的に有意に偏差を有するときに示される。
【００７６】
「Ｃ３活性化シグネチャー」は、本明細書において用いる場合、Ｃ３活性化レベルの経時的変化を意味する。
【００７７】
「偏差を有する」および「偏差」は、本明細書において用いる場合、対照の基準レベルと比較して統計学的に有意な偏差を指す。アッセイされる分析物に依存して、偏差を有する検査試料レベルは、対照レベルを基準にして上昇することもあり、または減少することもある。
【００７８】
対照の基準レベルと比較して「減少する」は、統計学的に有意に減少することを意味する。急性炎症反応の場合、インタクトＣ３レベルは、Ｃ３がその活性化産物へと分解されるにつれて枯渇する。一定の実施形態において、インタクトＣ３レベルは、対照の基準レベルと比較して約１０％減少すると考えられる。
【００７９】
対照の基準レベルと比較して「上昇する」は、統計学的に有意に上昇することを意味する。急性炎症反応の場合、ｉＣ３ｂレベルは、Ｃ３がその活性化産物へと分解されるにつれて増加する。一定の実施形態において、０．００５の標準比と比較して上昇している、ｉＣ３ｂのインタクトＣ３に対する比は、Ｃ３活性化を示す。
【００８０】
「エピトープ」は、かかるエピトープに結合する抗体によって認識され、したがって、かかるエピトープに結合する抗体の免疫特異性を決める、分子の最小部分を指す。非抗体特異的結合剤によって認識される分子の最小部分を指すためにもこの用語を本明細書では用いる。別の指摘がない限り、補体タンパク質に結合する特異的結合剤は、天然タンパク質中に存在して結合に利用できるエピトープ（すなわち、該エピトープはネオエピトープではない）に結合することが本明細書において推測される。
【００８１】
「炎症性苦痛」または「炎症性機能不全」は、炎症反応がその炎症反応を誘導する刺激を解消または除去できないときに起こる。かかる急性症例では、そのプロセスに対する恒常性制御が減退するまで炎症反応は増加する。１つの実施形態において、本明細書に開示するアッセイおよび方法によって決定される補体活性化レベルは、個体が経験している炎症性苦痛の重症度と直接相関する。例えば、ｉＣ３ｂ濃度がインタクトＣ３の約１２．５％であるとき、その患者の炎症性苦痛を少し重症であると言うことができる。ｉＣ３ｂ濃度がインタクトＣ３の約２．５〜５％であるとき、その患者の炎症性苦痛を中等度に重症であると言うことができる。ｉＣ３ｂ濃度がインタクトＣ３の５％より上であるとき、その患者の炎症性苦痛を高度に重症であると言う。患者の炎症性苦痛の重症度の理解は、その個体に対する医師の処置法についての情報を与えることができる。例えば、個体が、本明細書に開示するアッセイおよび方法によって示されるような、高度に重症の炎症性苦痛レベルを呈する場合、医師は、炎症性苦痛の最も早い時点の中で救急医療処置を施して、炎症反応からの障害を最小限にすることができる。
【００８２】
「標識」は、それが付いている分子の直接的もしくは間接的検出および／または定量的もしくは相対的測定を助長する部分を指す。検出可能標識は、例えば、蛍光、化学発光、放射能、色、磁場、磁気共鳴などを検出する計器の使用により、または場合によっては目視検査により、検出可能となるシグナル、例えば蛍光、化学発光、放射能、色、磁性または常磁性性質などを、多くの場合、生じさせる。標識は、例えば、蛍光物質；色素；化学発光もしくは発光物質；着色物質；磁性体；または非磁性金属粒子、例えば金コロイドであり得る。具体的な実施形態では、本方法およびアッセイでの使用に好適な検出抗体を、色シグナルを生じさせるコロイド金標識にコンジュゲートさせる。
【００８３】
「ネオエピトープ」は、補体成分または切断産物のタンパク質分解性切断の結果として生成されるかまたは検出可能になるエピトープを指す。
【００８４】
本明細書に開示するアッセイおよび方法の一定の実施形態において、検査する体液試料中に存在する補体は、そのアッセイまたは方法自体によって実質的に活性化されない。この文脈で用いる場合の「実質的に活性化されない」は、本発明の方法およびアッセイに、検査方法および／または材料に起因するｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化が実質的に含まれないことを意味する。このように、側方流動イムノアッセイは、迅速であり、試料操作が少なくてすみ、それ故、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ補体活性化の一因となる刺激の多くを避けられるので、補体活性化についての偽陽性検査結果を避けられる。
【００８５】
「ポイント・オブ・ケア」は、本明細書において用いる場合、ベッドサイドでまたは患者の損傷現場で使用または行うことができるデバイスまたは方法を指す。ポイント・オブ・ケア検査は、一般に、処理のために検査室に試料を輸送する必要がなく、また熟練した検査技師の専門技術を必要としない。本明細書に記載するポイント・オブ・ケア方法および検査は、臨床医が患者のベッドサイドで、または外傷損傷現場またはトリアージ現場で臨床情報を受け取ることを可能にし、それにより、補体活性化を誘発する生理的クリーゼ後の極めて重要な最初の短時間のうちに患者ケアを指示することができる。
【００８６】
「リーダー」は、標識によって生成されたシグナルの検出に好適な計器を指す。診断検査での標識シグナル検出用の様々な計器が当該技術分野において公知である。本発明の具体的な実施形態では、標識はコロイド金であり、リーダーは、標識によって生成される色シグナルの定性的および／または定量的検出に好適な計器である。好適なリーダーは、ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｗｏｒｋｓ（メリーランド州イジャムスヴィル）、Ｑｉａｇｅｎ（ドイツ国ヒルデン）からのＥＳＥ−Ｑｕａｎｔ、Ｅａｓｔｅｒｌｉｎｅ  ＬＲＥ（ドイツ国ネルトリンゲン）およびＤｅｔｅｋｔ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（テキサス州オースティン）をはじめとする様々な供給業者から市販されている。いくつかの具体的な実施形態では、リーダーは、インタクトＣ３、ｉＣ３ｂまたは全Ｃ３の量または濃度を定量する手持ち式リーダーである。
【００８７】
「処置」は、本明細書において用いる場合、個体に施される任意の診断的、治療的、予防的または矯正処置を包含する。一部の実施形態において、処置は、個体に対する追加の診断検査の実施を包含する。他の実施形態において、処置は、治療的処置、例えば、個体への治療薬の投与を包含する。一定の実施形態において、前記治療薬は、抗生物質、抗炎症薬および補体インヒビターからなる群より選択される。他の実施形態において、処置は、個体が既に受けたかまたは現在受けている処置の変更を包含する。例えば、一つの実施形態において、人工呼吸器を用いる個体の処置は、その人工呼吸器の最適化を包含する。
【００８８】
補体系の概観
補体系は、３０より多くの血清および細胞タンパク質を含み、先天免疫および適応免疫に重要な役割を果たす。三つの主要補体活性化経路がある。古典的経路は、主として、免疫複合体、特に、抗原に結合したＩｇＧ／ＩｇＭ抗体によって活性化される。他の活性化因子としては、リポ多糖類、ミエリン、ポリアニオン性化合物、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）ならびに微生物ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられる。レクチン経路は、遊離マンノース基を有する多糖類、ならびに真菌および細菌に共通である他の糖によって活性化される。副経路は、微生物細胞壁成分を多くの場合含む「外来」物質による直接Ｃ３活性化によって媒介される。補体活性化の三つの主要経路すべてが、中心的タンパク質補体成分３（Ｃ３）に収束する。Ｃ３は、中心的な炎症媒介因子であり、炎症を引き起こす大多数の要因によって活性化される。補体系の概略外観図について図１および２を参照のこと。
【００８９】
古典的経路は、ＩｇＭまたはＩｇＧアイソタイプに一般に属する抗体と結合している抗原の複合体である免疫複合体によって概して誘発される。次に、免疫複合体は補体成分Ｃ１に結合し、該Ｃ１は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓから構成される。Ｃ１ｑの抗体−抗原複合体への結合は、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓの活性化を誘発する。活性化されたＣ１ｓが次に成分Ｃ４を切断して、Ｃ４ａおよびＣ４ｂを生じさせる。Ｃ４ｂは、細胞表面に共有結合で付くことができるが、そうできるのは約５パーセントに過ぎない。残りの９５％は、水と反応して可溶性の活性化Ｃ４ｂを形成する。すると成分２は、Ｃ４ｂと結合することができ、その後、Ｃ１ｓによってＣ２ａおよびＣ２ｂへと活性化される。Ｃ４ｂおよびＣ２ａは組み合わされて、古典的経路（ＣＰ）Ｃ３コンバターゼであるＣ４ｂＣ２ａを形成する。
【００９０】
このＣＰコンバターゼは、Ｃ３を切断してＣ３ａおよびＣ３ｂを形成する。活性化Ｃ４ｂと同様に、Ｃ３ｂは、細胞表面に共有結合することができるか、またはＨ２Ｏと反応し、溶液中にとどまることができる。活性化Ｃ３ｂは、多数の役割を有する。単独で、Ｃ３ｂは、オプソニンとしての役割を果たして、より容易に食細胞に修飾細胞（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ  ｃｅｌｌ）または粒子を取り込ませることができる。加えて、Ｃ３ｂは、Ｃ４ｂＣ２ａ（ＣＰ  Ｃ３コンバターゼ）と結合してＣ５コンバターゼを形成することができる。Ｃ４ｂＣ２ａＣ３ｂと称するこの複合体をＣＰ  Ｃ５コンバターゼと言う。あるいは、Ｃ３ｂは、副経路（ＡＰ）Ｃ３コンバターゼと呼ばれる別のＣ３コンバターゼのコアを形成することができる。
【００９１】
副経路（ＡＰ）は、Ｃ３が活性化され得るもう一つのメカニズムである。典型的に、Ｃ３は、標的、例えば微生物表面ならびに様々な複雑な多糖類および他の材料によって活性化される。この副経路は、Ｃ３（Ｈ２Ｏ）を形成する水分子によるＣ３中のチオエステル結合の切断により、自発的に開始されることもある。Ｃ３（Ｈ２Ｏ）はＢ因子に結合し、それによりＤ因子はＢ因子を切断してＢａおよびＢｂにすることができる。Ｂｂは、Ｃ３（Ｈ２Ｏ）と結合したままＣ３（Ｈ２Ｏ）Ｂｂ複合体を形成し、この複合体がＣ３コンバターゼとして作用し、Ｃ３を切断し、結果としてＣ３ａおよびＣ３ｂが得られる。
【００９２】
このプロセスによって、または古典的もしくはレクチン経路によって形成されたＣ３ｂは、標的に（例えば細胞表面に）結合し、Ｂ因子と複合体を形成し、その後、このＢ因子がＤ因子によって切断され、Ｂｂになり、結果としてＣ３ｂＢｂが得られ、このＣ３ｂＢｂを副経路（ＡＰ）Ｃ３コンバターゼと言う。Ｃ３ｂの別の分子のＡＰ  Ｃ３コンバターゼへの結合はＣ３ｂＢｂＣ３ｂを生成し、このＣ３ｂＢｂＣ３ｂがＡＰ  Ｃ５コンバターゼである。
【００９３】
レクチン補体経路は、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）およびＭＢＬ結合セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）の炭水化物への結合によって開始される。ＭＢ１１遺伝子（ヒトではＬＭＡＮ１として公知）は、小胞体とゴルジ体との間の中間領域に局在する１型内在性膜タンパク質をコードする。ＭＢＬ２遺伝子は、血清中で見られる可溶性マンノース結合タンパク質をコードする。ヒトレクチン経路では、ＭＡＳｐ１およびＭＡＳＰ２が、Ｃ３コンバターゼをもたらすＣ４およびＣ２のタンパク質分解に関与し、それが、ＣＰについて上で説明したように、Ｃ５コンバターゼの生産につながる。
【００９４】
上記三経路のいずれかによって生成されたＣ５コンバターゼは、Ｃ５を切断してＣ５ａおよびＣ５ｂを生じさせる。その後、Ｃ５ｂは、Ｃ６、Ｃ７およびＣ８に結合し、これが、Ｃ９の重合を触媒し、Ｃ５ｂ−９膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を形成する。アッセンブルしているＭＡＣは自身を標的細胞膜内に挿入し、その結果、Ｃ９分子の環によって輪郭が示される孔が形成される。ＭＡＣ形成は、侵入微生物の細胞溶解を引き起こし、宿主細胞上でのＭＡＣ形成も溶解を引き起こすことがあるが、必ずしも溶解を引き起こすとは限らない。細胞膜上の溶解量以下（ｓｕｂｌｙｔｉｃ  ａｍｏｕｎｔ）のＭＡＣは、様々な形で細胞機能に影響を及ぼし得る。小さな切断産物Ｃ３ａ、Ｃ４ａおよびＣ５ａは、アナフィラトキシンであり、急性炎症反応の多数の反応を媒介する。Ｃ３ａおよびＣ５ａは、好中球およびマクロファージなどの免疫系細胞をクリーゼ領域に誘引する強力な走化性因子でもある。
【００９５】
生理的クリーゼについてのバイオマーカーとしての補体
補体成分Ｃ３は、何らかの形態の生理的クリーゼ、例えば損傷、感染症または他の疾患プロセスに身体が反応していることの一般警告バイオマーカーとして有用である。補体は、狼瘡、関節炎、頭蓋内出血、糖尿病、多発性硬化症、心疾患および加齢性黄斑変性をはじめとする多種多様な疾患と関連づけられている。多くの場合、疾患の重症度は、補体活性化レベルと相関する。場合によっては、補体は、疾患病態に一定の役割を果たすことがある。これらの場合、身体は、炎症の原因を首尾よく制御することができず、炎症が局所性から全身性へと進む。補体活性化は、組織を直接傷つけることもあり、または細胞を過活性化し（ｏｖｅｒ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）、免疫細胞をリクルートし、その結果として組織破壊を生じさせることにより、間接的に組織を傷つけることもある。過活性化の例としては、アナフィラキシーショック、多臓器不全（ＭＯＦ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）および全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）が挙げられる。
【００９６】
外傷直後の期間および外傷後早期の補体活性化は十分に立証されており、幾つかの異なるメカニズムによって起こり、これらのメカニズムは三つの主要経路すべてを含む可能性が高い。タンパク質分解酵素の放出および活性化は、補体成分を直接活性化し得る。組織損傷および内皮内層の破壊は、宿主組織を通常保護する内因性補体阻害分子を欠く表面を露出させる。これらの表面は、Ｃ３ｂの沈着および副経路活性化を受けやすい。補体活性化は、外傷後虚血の後の組織の再灌流によっても誘発される。
【００９７】
補体活性化は、１／Ｒ損傷、ＡＲＤＳ、ＭＯＤＳ、二次的ＣＮＳ損傷および敗血症に有意に寄与する重症外傷の合併症の多くにおける重要な要因であることを、多数の系統の証拠が示唆している。第一に、補体活性化がヒト外傷被害者の外傷直後の期間によくあることであることは明白であり、また幾つかの研究により、補体活性化の程度と転帰不良とに正の相関関係があることを示唆する証拠が提供されている。第二に、補体活性化はヒト外傷被害者ばかりでなく外傷の動物モデルにおいてもＩ／Ｒ損傷の主因であるという証拠が、かなりの数ある。第三に、補体欠損または補体インヒビターの投与は、組織損傷を低減させ、出血、Ｉ／Ｒ損傷およびＣＮＳ損傷をはじめとする様々な実験モデルにおいて転帰を向上させることが、非常に多数の研究により証明されている。
【００９８】
幾つかの研究により、重症外傷後の逐次的な時点で外傷患者の補体活性化が測定され、補体活性化と損傷重症度との相関関係の存在が調査された。有害事象、例えばＡＲＤＳ、多臓器不全、敗血症および死亡も、補体活性化に関してモニタリングされた。一つの研究では、ＡＲＤＳのリスクがある外傷患者において１４日にわたって補体パラメータが決定された。すべての患者が最初の２４時間の間にＣ３、Ｃ４、Ｃ５のならびにインヒビターＣ１−ＩＮＨ、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）および補体因子Ｉ（ＣＦＩ）の血清レベルの減少を見せ、これは、高レベルの補体活性化による消費を示していた。Ｃａｔａｎｉａら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｒａｕｍａ  ａｎｄ  ｓｈｏｃｋ、Ａｎｎ．Ａｃａｄ．Ｍｅｄ．Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  ２８：１２０−３２（１９９９）；Ｈｅｃｋｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｒａｕｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ−−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｊｕｒｙ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｐｓｉｓ，ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２５（１２）：  ２０１５２４（１９９７）；Ｈｕｂｅｒ−Ｌａｎｇら、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｅｐｓｉｓ、Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３２２３−３１（２００２）；Ｋａｎｇら、Ｃｈａｎｇｅ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｔｈｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｉｎｊｕｒｙ、Ｊ．Ｂｕｒｎ  Ｃａｒｅ  Ｒｅｈａｂｉｌ．２４：１４８−５３（２００３）；およびＹｏｕｎｇｅｒら、Ｄｅｔｒｉｍｅｎｔａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｈｏｃｋ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９０：４４１−４６（２００１）参照。
【００９９】
補体活性化の検出および定量のためのアッセイならびにそれらの使用方法
ここに開示するアッセイおよび方法は、当該技術分野において公知の以前の補体アッセイおよび方法に勝る幾つかの利点を提供する：例えば、本アッセイおよび方法は、ポイント・オブ・ケア使用に好適であり、数時間ではなく数分で結果を生じさせる。結果の迅速な返答により、臨床医は、準リアルタイムにおけるＣ３活性化の変化に基づいて行動して、外傷性損傷後の極めて重要な最初の短時間のうちに、または生理的クリーゼの開始に際して患者ケアを指示することができる。提供されるアッセイおよび方法は、使用が比較的簡単であり、外部検査室または熟練した検査技師を確保できることを求めない。あるいは、または加えて、提供されるアッセイおよび方法は、取り扱い工程が少なくてすみ、それ故、偽陽性検査結果をもたらす取り扱いおよび処理に起因するインタクトＣ３活性化を最小限にする。あるいは、または加えて、本明細書に記載する提供されるアッセイおよび方法は、補体タンパク質インタクトＣ３および／またはｉＣ３ｂ（Ｃ３の主要な活性化バイオマーカー）の測定を可能にするように注意深く選択された抗体ペアを用いる。旧来の全Ｃ３アッセイと比較して、このより正確な補体活性化測定は、Ｃ３のターンオーバー、および残存し活性化に利用できるＣ３の正確な量の分析を可能にする。
【０１００】
本発明の一つの態様が、インタクトＣ３のレベルを対象由来の試料において検出する工程であって、該検出は、該インタクトＣ３と、それに対する非交差反応性抗体との特異的相互作用を伴う、工程、検出されたレベルを基準レベルと比較する工程であって、該基準レベルは約３５０ｕｇ／ｍＬ〜約１，７００ｕｇ／ｍＬの範囲内にあり、該検出されたレベルが該基準レベル未満であることが決定されることは、該対象が、望ましくないかつ／または病理学的な補体活性化を受けているか、あるいは受けやすいことを示す、工程、および、前記検出されたレベルが前記基準レベル未満であるならば、望まれない補体活性化を処置するための処置を施す工程を含む方法を包含する。
【０１０１】
本発明の方法において用いられる試料は、本発明の特定の適用に従って変化し得る。代表的には、サンプルは、補体関連障害に罹患した個体から採取される。例示的な補体関連障害としては、外傷、炎症性苦痛、自己免疫障害、頭蓋内出血、感染症（例えば、菌血症）、移植拒絶反応、眼疾患、心疾患、虚血／再灌流障害、加齢性黄斑変性、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ｐａｒｏｘｙｓｍａｌ  ｎｏｃｔｕｒａｌ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ）（ＰＮＨ）、遺伝性血管浮腫（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ａｎｇｉｏｄｅｍａ）、腎疾患、妊娠関連障害および神経障害が挙げられる。一部の実施形態では、前記補体関連障害は自己免疫障害である。自己免疫障害としては、体内において通常見出される組織および物質に対する不適切な免疫応答に関連した様々な疾患および状態が挙げられる。自己免疫疾患の例としては、とりわけ、全身性エリテマトーデス、筋萎縮性側索硬化症、セリアック病、クローン病、グレーブス病および関節リウマチが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、前記補体関連障害は炎症性苦痛である。炎症性苦痛は、炎症性機能不全としても公知であり、過度の炎症に関連した様々な疾患および状態を含む。炎症性苦痛に関連した疾患および状態の例としては、臓器不全、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症、人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）、呼吸窮迫および肺炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
本発明のいくつかの態様において、前記試料は、体液またはそこから得られる試料であり得る。試料を構成し得るかまたは試料を生成するように処理され得る例示的な体液としては、全血、血清、血漿、尿、涙液、唾液、創傷滲出液、気管支肺胞（ｂｒｏｎｃｈｅｏａｌｖｅｏｌａｒ）洗浄液および脳脊髄液からなる群より選択される。好適な体液の非限定的リストについての図１９を参照のこと。いくつかの実施形態では、前記体液は、補体活性化を誘発する生理的イベントの一時間以内に個体から採取され得る。他の実施形態では、前記体液は全血であり得る。
【０１０３】
対照の基準値（すなわち、「正常」レベル）からの偏差（個体の補体が活性化されていることを示す）に関して、補体活性化レベルを評価し得る。一例として、一定の実施形態において、検査試料中のｉＣ３ｂのレベルまたは濃度は対照と比較して上昇していてもよく、このことは、Ｃ３が活性化され、その活性化産物ｉＣ３ｂへとさらに分割されたことを示す。さらなる例として、他の実施形態において、インタクトＣ３のレベルまたは濃度は対照と比較して減少しており、これは、インタクトＣ３がその分解または活性化産物に転換されたこと、それ故、その個体において枯渇していることを示す。
【０１０４】
一部の実施形態において、患者試料（例えば、身体体液）における「正常な」インタクトＣ３レベルが、下方限界と、該下方限界よりも大きい上方限界とを有する範囲内に含まれる。一部の実施形態では、前記下方限界が、３０ｕｇ／ｍＬ、３５ｕｇ／ｍＬ、４０ｕｇ／ｍＬ、４５ｕｇ／ｍＬ、５０ｕｇ／ｍＬ、５５ｕｇ／ｍＬ、６０ｕｇ／ｍＬ、６５ｕｇ／ｍＬ、７０ｕｇ／ｍＬ、７５ｕｇ／ｍＬ、８０ｕｇ／ｍＬ、８５ｕｇ／ｍＬ、９０ｕｇ／ｍＬ、９５ｕｇ／ｍＬ、１００ｕｇ／ｍＬ、１１０ｕｇ／ｍＬ、１２０ｕｇ／ｍＬ、１３０ｕｇ／ｍＬ、１４０ｕｇ／ｍＬ、１５０ｕｇ／ｍＬ、１６０ｕｇ／ｍＬ、１７０ｕｇ／ｍＬ、１８０ｕｇ／ｍＬ、１９０ｕｇ／ｍＬ、２００ｕｇ／ｍＬ、２１０ｕｇ／ｍＬ、２２０ｕｇ／ｍＬ、２３０ｕｇ／ｍＬ、２４０ｕｇ／ｍＬ、２５０ｕｇ／ｍＬ、２６０ｕｇ／ｍＬ、２７０ｕｇ／ｍＬ、２８０ｕｇ／ｍＬ、２９０ｕｇ／ｍＬ、３００ｕｇ／ｍＬ、３５０ｕｇ／ｍＬ、４００ｕｇ／ｍＬ、４５０ｕｇ／ｍＬ、５００ｕｇ／ｍＬ、５５０ｕｇ／ｍＬ、６００ｕｇ／ｍＬ  ６５０ｕｇ／ｍＬ、７００ｕｇ／ｍＬまたはそれより上からなる群から選択される。一部の実施形態では、前記上方限界が、２，０００ｕｇ／ｍＬ、１，９００ｕｇ／ｍＬ、１，８００ｕｇ／ｍＬ、１，７００ｕｇ／ｍＬ、１，６００ｕｇ／ｍＬ、１，５００ｕｇ／ｍＬ、１，４００ｕｇ／ｍＬ、１，３００ｕｇ／ｍＬ、１，２００ｕｇ／ｍＬ、１，１００ｕｇ／ｍＬ、１，０００ｕｇ／ｍＬ、９００ｕｇ／ｍＬ、８００ｕｇ／ｍＬ、７００ｕｇ／ｍＬ、６００ｕｇ／ｍＬ、５００ｕｇ／ｍＬ、４００ｕｇ／ｍＬ、３００ｕｇ／ｍＬまたはそれ未満からなる群から選択される。一部の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが３０ｕｇ／ｍＬ〜２，０００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれる；他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが１００ｕｇ／ｍＬ〜１，５００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれる；他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが２００ｕｇ／ｍＬ〜１，２００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれる；他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが２００ｕｇ／ｍＬ〜１，０００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれる；他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが２００ｕｇ／ｍＬ〜８００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれる；他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが２００ｕｇ／ｍＬ〜５００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれる；他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが６００ｕｇ／ｍＬ〜１，８００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれる；他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが７００ｕｇ／ｍＬ〜１，７００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれる。
【０１０５】
一部の実施形態において、試料が、血液、血漿または血清である場合、インタクトＣ３の「正常な」レベルが３００ｕｇ／ｍＬ〜１，７００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが４００ｕｇ／ｍＬ〜１，４００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；さらに他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが５００ｕｇ／ｍＬ〜１，３００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；さらに他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが５００ｕｇ／ｍＬ〜１，２００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；さらに他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが５００ｕｇ／ｍＬ〜１，１００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；さらに他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが５００ｕｇ／ｍＬ〜１，０００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；さらに他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが５００ｕｇ／ｍＬ〜９００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；なおさらに他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが５００ｕｇ／ｍＬ〜８００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；なおさらに他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが５００ｕｇ／ｍＬ〜７００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；なおさらに他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが５００ｕｇ／ｍＬ〜６００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る。
【０１０６】
より具体的な一例として、試料が全血である一部の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが５００ｕｇ／ｍＬ〜１，０００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る。
【０１０７】
より具体的な一例として、試料が血漿である一部の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが７００ｕｇ／ｍＬ〜１，７００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る。
【０１０８】
より具体的な一例として、試料が血清である一部の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが７００ｕｇ／ｍＬ〜１，７００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る。
【０１０９】
他の実施形態において、試料が涙液である場合、インタクトＣ３の「正常な」レベルが３０ｕｇ／ｍＬ〜１００ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが４０ｕｇ／ｍＬ〜９０ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；さらに他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが５０ｕｇ／ｍＬ〜８０ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；さらに他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが５０ｕｇ／ｍＬ〜７０ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；さらに他の実施形態では、インタクトＣ３の「正常な」レベルが５０ｕｇ／ｍＬ〜６０ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る。
【０１１０】
一部の実施形態において、インタクトＣ３が、ｉＣ３ｂの１ｕｇ／ｕＬの溶液により、約１ｎｇ／ｍＬ未満のＣ３に相当するシグナルがもたらされることを特徴とする非交差反応性抗体を使用して検出される。他の実施形態において、前記非交差反応性抗体はＨＭ２０７５である。
【０１１１】
補体活性化レベルは、炎症性苦痛の重症度と相関し得る：補体活性化レベルが高いほど、炎症性苦痛発症のリスクが高く、および／または個体が経験する炎症性苦痛の重症度が高い。したがって、本発明のいくつかの実施形態によれば、補体関連障害は炎症性苦痛であり、インタクトＣ３およびｉＣ３ｂのうちの一つ以上の濃度が炎症性苦痛の重症度と相関する。
【０１１２】
本方法によって決定される補体活性化レベルは、患者ケアを指示することができるポイント・オブ・ケア診断情報を提供し得る。補体関連障害のリスクまたは疾患もしくは障害の重症度に基づき、臨床医は、個体のための適切な処置を選択することができる。いくつかの実施形態において、前記処置は、炎症性苦痛の原因を決定するための追加の検査を個体に対して行うことを含む。例えば、呼吸のために人工呼吸器補助を必要とする重症外傷患者は、人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）または非感染性炎症性機能不全のいずれかに起因する急性呼吸困難のリスクがある。補体活性化のレベルは、呼吸クリーゼの臨床的徴候が呈示される前に活動性または切迫性炎症性機能不全を指摘することができる。本アッセイおよび方法は、個体がＶＡＰを経験しているのか、または非感染性呼吸苦痛を経験しているのかを指摘することができる。あるいは、本アッセイおよび方法は、現在の標準的実施より早い時点で追加の検査（例えば、気管支肺胞（ｂｒｏｎｃｈｅｏａｌｖｅｏｌａｒ）洗浄（ＢＡＬ））を指摘することができる。個体がＶＡＰに罹患している場合、その処置は、治療薬、例えば抗生物質または抗生物質のセットの投与を含み得る。炎症性機能不全が、非感染性手段に起因する場合、人工呼吸器調整、抗炎症薬および補体インヒビターからなる群より治療法を選択することができる。
【０１１３】
個体が全身性エリテマトーデスに罹患している場合、前記追加の検査は、遺伝的検査であり得る。個体が外傷性脳損傷または頭蓋内出血に罹患している場合、前記追加の検査は、追加の分析のための脳脊髄液試料の採取を含み得る。個体が、非治癒性創傷を含めて、創傷に罹患している場合、前記さらなる検査は、追加の分析のための創傷滲出液の試料の採取を含み得る。
【０１１４】
多くの補体インヒビターが当該技術分野において公知であり、本発明の方法での使用に好適である。いくつかの実施形態において、補体インヒビターは、天然補体インヒビターおよびその誘導体、コンプスタチンおよびその類似体、抗膜侵襲複合体（ＭＡＣ）抗体、抗Ｃ３抗体、抗Ｃ５抗体、Ｃ３ａ受容体アンタゴニストおよびＣ５ａ受容体アンタゴニストからなる群より選択される。追加の補体インヒビターの例は、例えば、Ｅｍｌｅｎら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ：ｎｅｗ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ、Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．３６（６）：６６０−６８（２１０１）；Ｗａｇｎｅｒら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．９（１）：４３−５６（２１０１０）；およびＲｉｃｋｌｉｎら、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５（１１）：１２６５−７５（２００７）において見つけることができ、前記参考文献の内容はそれら全体が参照により本明細書に援用されている。
【０１１５】
本発明の方法の恩恵の一つは結果の迅速な返答であり、それにより、臨床医は準リアルタイムで補体活性化の変化に応じて患者ケアを指示することができる。当該技術分野において公知の以前の補体活性化アッセイは、十分な検査室、熟練した技師、そして完了に何時間も必要とするが、本方法およびアッセイは、それよりはるかに短い時間枠内で結果を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、前記試料中の補体活性化レベルの測定値を約３０分以下で提供し得る。より他の実施形態では、前記方法は、試料中の補体活性化レベルを約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５または約３分以下で提供し得る。本方法の迅速性により、臨床医は、臨床的に重要な時間中に、補体活性化レベルを決定し、それに応じて適切な治療法を選択することができる。実際に、本方法は、ベッドサイドで、または外傷損傷現場においてさえ−例えば、救急車内または戦場での患者トリアージの際に−行うことができ、本アッセイおよび方法によって決定される補体活性化レベルは、外傷後の極めて重要な最初の１時間のうちに患者ケアを方向づけることができる。
【０１１６】
本発明のもう一つの態様が、ｉＣ３ｂのレベルを対象由来の試料において検出する工程であって、該検出は、該ｉＣ３ｂと、それに対する非交差反応性抗体との特異的相互作用を伴う、工程、検出されたレベルを基準レベルと比較する工程であって、該基準レベルは約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５，０００ｎｇ／ｍＬの範囲内にあり、該検出されたレベルが該基準レベルを超えることが決定されることは、該対象が、望ましくないかつ／または病理学的な補体活性化を受けているか、あるいは受けやすいことを示す、工程、および、前記検出されたレベルが前記基準レベルを超えるならば、望まれない補体活性化を処置するための処置を施す工程を含む方法を包含する。
【０１１７】
本発明の方法において用いられる試料は、種々の供給源のうちの任意のもの由来であり得る。代表的には、試料は、補体関連障害に罹患した個体から採取される。例示的な補体関連障害としては、外傷、全身性エリテマトーデス、炎症性苦痛、自己免疫障害、頭蓋内出血、感染（例えば、菌血症）、移植拒絶反応、眼疾患、心疾患、虚血／再灌流障害、加齢性黄斑変性、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ｐａｒｏｘｙｓｍａｌ  ｎｏｃｔｕｒａｌ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ）（ＰＮＨ）、遺伝性血管浮腫（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ａｎｇｉｏｄｅｍａ）、腎疾患、妊娠関連障害および神経障害が挙げられる。一部の実施形態では、前記補体関連障害は自己免疫障害である。自己免疫障害としては、体内において通常見出される組織および物質に対する不適切な免疫応答に関連した様々な疾患および状態が挙げられる。自己免疫疾患の例としては、とりわけ、全身性エリテマトーデス、筋萎縮性側索硬化症、セリアック病、クローン病、グレーブス病および関節リウマチが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、前記補体関連障害は炎症性苦痛である。炎症性苦痛は、炎症性機能不全としても公知であり、過度の炎症に関連した様々な疾患および状態を含む。炎症性苦痛に関連した疾患および状態の例としては、臓器不全、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症、人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）、呼吸窮迫および肺炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
本発明のいくつかの態様によれば、前記試料は、体液またはそこから得られる試料であり得る。試料を構成し得るかまたは試料を生成するように処理され得る例示的な体液としては、全血、血清、血漿、尿、涙液、唾液、創傷滲出液、気管支肺胞（ｂｒｏｎｃｈｅｏａｌｖｅｏｌａｒ）洗浄液および脳脊髄液が挙げられる。好適な体液の非限定的リストについては図１９を参照のこと。一部の実施形態では、前記体液は、補体活性化を誘発する生理的イベントの１時間以内に個体から採取され得る。他の実施形態では、前記体液は全血であり得る。
【０１１９】
一部の実施形態において、患者試料（例えば、身体体液）における「正常な」ｉＣ３ｂレベルが、下方限界と、該下方限界よりも大きい上方限界とを有する範囲内に含まれる。一部の実施形態では、前記下方限界が、７５ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、８５ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、９５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２１０ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ、２３０ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、２６０ｎｇ／ｍＬ、２７０ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ、２９０ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬまたはそれより上からなる群から選択される。一部の実施形態では、前記上方限界が、５ｕｇ／ｍＬ、４．５ｕｇ／ｍＬ、４ｕｇ／ｍＬ、３．５ｕｇ／ｍＬ、３ｕｇ／ｍＬ、２．５ｕｇ／ｍＬ、２ｕｇ／ｍＬ、１．９ｕｇ／ｍＬ、１．８ｕｇ／ｍＬ、１．７ｕｇ／ｍＬ、１．６ｕｇ／ｍＬ、１．５ｕｇ／ｍＬ、１．４ｕｇ／ｍＬ、１．３ｕｇ／ｍＬ、１．２ｕｇ／ｍＬ、１．１ｕｇ／ｍＬ、１．０ｕｇ／ｍＬ、０．９ｕｇ／ｍＬ、０．８ｕｇ／ｍＬ、０．７ｕｇ／ｍＬ、０．６ｕｇ／ｍＬ、０．５ｕｇ／ｍＬ、０．４ｕｇ／ｍＬ、０．３ｕｇ／ｍＬまたはそれ未満からなる群から選択される。一部の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが１００ｎｇ／ｍＬ〜５ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれる；他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが１００ｎｇ／ｍＬ〜４ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれる；他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが１００ｎｇ／ｍＬ〜３ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれる；他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが１００ｎｇ／ｍＬ〜２ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれる；他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが１００ｎｇ／ｍＬ〜１．５ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれる；他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが２００ｎｇ／ｍＬ〜１ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれる；他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが２００ｎｇ／ｍＬ〜０．７ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれる；他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが２００ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれる；他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが２００ｎｇ／ｍＬ〜０．３ｕｇ／ｍＬの範囲内に含まれる。
【０１２０】
一部の実施形態において、試料が、血液、血漿または血清である場合、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが１５０ｎｇ／ｍＬ〜５，０００ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが１５０ｎｇ／ｍＬ〜４，０００ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが１５０ｎｇ／ｍＬ〜３，０００ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが１５０ｎｇ／ｍＬ〜２，０００ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが１５０ｎｇ／ｍＬ〜１，０００ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが１７５ｎｇ／ｍＬ〜９００ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；さらに他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが２００ｎｇ／ｍＬ〜８００ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；さらに他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが２００ｎｇ／ｍＬ〜７００ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；さらに他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが２００ｎｇ／ｍＬ〜６００ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；さらに他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが２００ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；さらに他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが２００ｎｇ／ｍＬ〜４００ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；さらに他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが２００ｎｇ／ｍＬ〜３００ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る。
【０１２１】
より具体的な一例として、試料が全血である一部の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが１０ｎｇ／ｍＬ〜１，５００ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る。
【０１２２】
より具体的な一例として、試料が血漿である一部の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが１０ｎｇ／ｍＬ〜３，０００ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る。
【０１２３】
より具体的な一例として、試料が血清である一部の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが１０ｎｇ／ｍＬ〜５，０００ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る。
【０１２４】
一部の実施形態において、試料が涙液である場合、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが１ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；さらに他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが１ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；なおさらに他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが１ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；さらに他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが２ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る；なおさらに他の実施形態では、ｉＣ３ｂの「正常な」レベルが４ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得る。
【０１２５】
一部の実施形態において、ｉＣ３ｂが、インタクトＣ３の１ｕｇ／ｕＬの溶液により、約１ｎｇ／ｍＬ未満のｉＣ３ｂに相当するシグナルがもたらされることを特徴とする非交差反応性抗体を使用して検出される。他の実施形態において、前記非交差反応性抗体が、Ａ２０９、ＭＣＡ２６０７およびＨＭ２１９９からなる群から選択される。
【０１２６】
さらにもう一つの態様において、本発明は、インタクトＣ３レベル対ｉＣ３ｂレベルの比率を試料において検出する工程であって、該検出は、該インタクトＣ３、該ｉＣ３ｂまたは両者と、それに対する非交差反応性抗体との特異的相互作用を伴う、工程、検出されたレベルを約０．００１の基準比率と比較する工程であって、該検出されたレベルが該基準レベル未満であることが決定されることは、該対象が、望ましくないかつ／または病理学的な補体活性化を受けているか、あるいは受けやすいことを示す、工程、および、前記検出されたレベルが前記基準レベル未満であるならば、望ましくない補体活性化を処置するための処置を施す工程を含む方法を包含する。
【０１２７】
本発明のいくつかの実施形態は、０．００１〜０．００５の範囲における基準比率を含む。ある特定の実施形態では、前記基準比率が、０．００１、０．００２および０．００５からなる群から選択される。
【０１２８】
本発明の一部の実施形態の方法において、アッセイの形式が、試料におけるインタクトＣ３およびｉＣ３ｂのうちの１つ以上の存在または非存在を検出する側方流動イムノアッセイであり得る。前記方法の他の実施形態では、前記側方流動アッセイは全Ｃ３の存在を検出する。さらに他の実施形態では、前記側方流動イムノアッセイがリーダーによって読み取られる。より具体的な実施形態において、前記リーダーは、試料におけるインタクトＣ３およびｉＣ３ｂの１つ以上の濃度を定量する。もう一つの具体的な実施形態において、前記リーダーは、試料における全Ｃ３の濃度を定量する。
【０１２９】
本発明の側方流動アッセイの実施形態において、米国特許第７，９１０，３８１号（Ｆｏｒｄら）は、本発明に従って有用であるとして意図されるいくつかのそのようなアッセイを記載しており、この特許の開示は本明細書によりその全体が援用されている。開示された側方流動アッセイの様々な実施形態が現在、ＣＦＬＡＴ（登録商標）の名称で販売されている。図２０は、米国特許第７，９１０，３８１号の教示に従う側方流動アッセイカセットの一つの実施形態を示す。
【０１３０】
一定の実施形態において、臨床医は、患者が受ける処置に応じた補体活性化の減少を検出し得る。それに応じて、臨床医は、投与する薬物、例えば抗炎症薬もしくは補体インヒビターの投薬を調整することにより、または補体レベルが正常（すなわち、補体関連障害を経験していない個体におけるレベル）に戻ったら処置を中止することにより、個体の処置を変更し得る。他の実施形態では、臨床医は、患者が受けている処置に応じた補体活性化レベルの上昇を検出し得る。それに応じて臨床医は、補体活性化レベルの所望の安定化または減少が達成されるまで薬物、例えば抗炎症薬または補体インヒビターの投薬量を増加させることにより、個体の処置を変更し得る。補体活性化レベルの変化が検出されない場合、臨床医は、個体の処置を変更することも、補体活性化レベルの変化が観察されるまで個体の処置レジメンを維持することに決めることもできる。
【０１３１】
図４を参照して、本発明の側方流動イムノアッセイの実施形態を本明細書に記載し、そしてこれは、セルロースメンブレンストリップ３によって構成され、該ストリップ上には、試料流体を吸収し、試料−および−粒子−コンジュゲート免疫複合体のゆるやかな移動を可能にする試料パッド１と、該ストリップの遠位端にあり、その液体試料およびコンジュゲート材料を吸収して、該セルロースメンブレンストリップ３を通り抜ける毛管移動を助長するウィック６と、標識に結合した検出抗体または検出コンジュゲートを含む粒子コンジュゲートパッド２が置かれている。前記セルロースメンブレンストリップ３は検査ゾーン領域であり、該ストリップ上には、検出コンジュゲートを捕捉するための縞状のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む検査ライン４と、対照分析物、例えばＩｇＧに結合し、検査が首尾よく実行されたことを使用者に知らせる抗体を含む対照ライン５とが置かれている。前記側方流動イムノアッセイは、前記セルロースメンブレンストリップ３に接着したポリエステルフィルムバッキング７と、感圧性ラミネートフィルムバッキング８とをさらに含む。各側方流動イムノアッセイを、例えば、ＭＹＬＡＲ（登録商標）ｚｅｒｏ−ｖａｐｏｒ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｐｏｕｃｈの中にパッケージングし得る。
【０１３２】
検査試料を試料パッド１に適用すると、試料は試料パッド１から粒子コンジュゲートパッド２まで移動し、そこで、存在する任意の標的分析物が検出抗体コンジュゲートに結合する。その後、試料は、検査ライン４に到達するまでメンブレン３を横断して移動し続け、該検査ライン４で、標的／コンジュゲート複合体は、固定されている抗体に結合して、該メンブレン上に可視ラインを生じさせる。その後、試料は、対照ライン５に到達するまでメンブレンストリップ３に沿ってさらに移動し、該対照ライン５で、前記検査ラインに結合しなかった過剰な抗体コンジュゲートが該対照ラインに結合し、該メンブレン上に第二の可視ラインを生じさせることとなる。対照ラインリガンドは、多くの場合、コンジュゲート抗体のＦｅ領域に対する抗体である。この対照ラインは、試料が意図したとおりにメンブレンを横断して移動したことを示す。
【０１３３】
一定の実施形態において、本発明による側方流動イムノアッセイは、単一の分析物の検出のための単一のメンブレンストリップを含む。他の実施形態において、前記側方流動イムノアッセイは、二つ以上の分析物を検出する。前記側方流動イムノアッセイが二つ以上の分析物を検出するとき、並列に配置された多数のメンブレンストリップで検査を構成することも（例えば、図５（Ｂ）の略図参照）、単一のメンブレンストリップ上に直列に配列された多数の検査ラインで検査を構成することもできる（例えば、図９（Ｂ）の略図参照）。
【０１３４】
図６を参照して、一部の実施形態では、前記側方流動イムノアッセイのメンブレンストリップは、検査試料を滴下するためのポート１０と検査結果を見るためのウインドウ１１とを有する検査カセット９に入れられている。図６の側方流動イムノアッセイは、単一分析物についてアッセイするように構成され、それぞれが一本の検査ライン４および一本の対照ライン５を含む。
【０１３５】
図７を参照して、一部の実施形態では、前記側方流動イムノアッセイは、単一の検査カセットで並行して二つの分析物について検査するように構成される。一部の実施形態において、前記側方流動イムノアッセイは、検査試料を滴下するための二つのポート１０と各分析物用の独立したメンブレンストリップ３とを含む（図７（Ａ）参照）。他の実施形態において、前記側方流動イムノアッセイは、試料を滴下するための一つのポート１０と各分析物用の独立したメンブレンストリップ３とを含む（図７（Ｂ）参照）。
【０１３６】
図８を参照して、一部の実施形態では、前記側方流動イムノアッセイは、単一の検査カセットで並行して三つの分析物について検査するように構成され得る。一部の実施形態では、前記側方流動イムノアッセイは、検査試料を滴下するための三つのポート１０と各分析物用の独立したメンブレンストリップ３とを含み得る（図８（Ａ）参照）。他の実施形態では、前記側方流動イムノアッセイは、検査試料を滴下するための一つのポート１０と各分析物用の独立したメンブレンストリップ３とを含み得る（図８（Ｂ）参照）。
【０１３７】
図１０を参照して、一定の実施形態では、前記側方流動イムノアッセイは、単一の検査カセットで直列に多数の分析物について検査するように構成され得る。図１０（Ａ）は、直列に配置された二本の検査ライン４と一本の対照ライン５とを備えているメンブレンストリップ３を含む検査カセットを示す図である。図１０（Ｂ）は、直列に配置された三本の検査ライン４と一本の対照ライン５とを備えているメンブレンストリップ３を含む検査カセットを示す図である。
【０１３８】
ここに開示する側方流動イムノアッセイは、標的マーカーの定性的および／または定量的検出をもたらし得る。定性的には、前記メンブレン上の二本の明瞭なラインは陽性結果を提示し得、これに対して対照ゾーンの単一ラインは陰性結果を提示し得る。
【０１３９】
本発明のいくつかの実施形態では、補体タンパク質を含む体液試料中の補体活性化のマーカーについてのポイント・オブ・ケア検出のための例示的な側方流動イムノアッセイであって、メンブレンストリップと、前記マーカーの第一エピトープを結合する検出抗体と、前記マーカーの第二エピトープを結合する捕捉抗体を含む検査ラインと、対照分析物を結合する抗体を含む対照ラインとを含み、前記マーカーがインタクトＣ３およびｉＣ３ｂからなる群より選択される、側方流動イムノアッセイを提供する。
【０１４０】
そのようなデバイスの例示的な実施形態が図２０に示されており、（Ａ）は、メンブレンストリップがニトロセルロースメンブレンストリップであり、かつ、金標識されたコンジュゲートパッドを用いる該デバイス（これはある特定の適用において望ましい）の構造の概念的完成見取り図を示し、（Ｂ）は、試料における補体活性化レベルを評価するために（Ａ）に示される実施形態を使用する方法を示す。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、前記検出抗体は、臨床医が視覚的に読み取ることができるか、または市販用リーダーによって電子的に読み取ることができるシグナルをもたらす標識を含む。様々な標識がここに開示するアッセイでの使用に好適である。具体的な実施形態では、前記標識は図２０（Ａ）で示されるとおり、コロイド金であり得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態によれば、検出抗体と捕捉抗体とのペアは、Ｃ３とｉＣ３ｂとの間の干渉クロストークを避けるように注意深く選択すべきである。主な懸念は、ｉＣ３ｂの検出のためのアッセイにおいてシグナルを生じさせるインタクトＣ３である。両方の分子が同じタンパク質分子に由来するので、クロストークは問題を提起し得る。正常個体ではＣ３がｉＣ３ｂより約２００倍高いレベルで存在するので、微々たる程度のクロストークでさえ、ｉＣ３ｂおよびＣ３活性化の正確な測定に大きな影響を及ぼすことがある。これは、不適当な取扱い、不適当な保管、およびさらには試薬自体がｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃ３活性化の原因になり得るという事実によってさらに複雑化される。驚くべきことに、本出願人は、旧来のＥＬＩＳＡアッセイでの使用に好適なすべての抗体が本発明のアッセイでの使用に同等に好適というわけではないことを発見した。
【０１４３】
下の表１および２は、本発明のアッセイでの使用に好適な抗体ペアを同定することの難しさを示す。本発明者らは、インタクトＣ３イムノアッセイで１９の抗体ペアを、およびｉＣ３ｂ側方流動イムノアッセイで１８の抗体ペアを分析した。これらのペアのうち、Ｈｙｃｕｌｔ（登録商標）ＨＭ２０７５とＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（登録商標）５５２３７は、インタクトＣ３側方流動イムノアッセイにおいて、交差反応がなく、最高の結果をもたらした。ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（登録商標）５５２３７またはＱｕｉｄｅｌ（登録商標）Ａ２５０のいずれかとＱｕｉｄｅｌ（登録商標）Ａ２０９は、ｉＣ３ｂ側方流動イムノアッセイにおいて最高の結果をもたらした。興味深いことに、本発明者らは、旧来のＥＬＩＳＡアッセイでの使用に好適な抗体ペアが本明細書に記載する側方流動イムノアッセイでの使用に必ずしも同等に好適であるとは限らないことに注目した。例えば、Ｈｙｃｕｌｔ（登録商標）ＨＭ２１９８は、約１％交差活性があり、検査間のばらつきが相当あるアッセイをもたらした。この交差反応性は、偽陽性ｉＣ３ｂシグナルを正常循環ｉＣ３ｂのものの２倍のレベルで生じさせた。ｉＣ３ｂレベルの実際の二倍化または三倍化は、大量補体活性化のサインとなるため、１％交差活性を伴う側方流動イムノアッセイには臨床的有用性がない。ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（登録商標）（５５２３７）は、はるかに良好に機能して、臨床的有用性と適合性のある約０．５％未満（約０．０５％）の交差反応性しか生じさせなかった。しかし、両方の抗体が旧来のＥＬＩＳＡアッセイにおいて同様に良好に機能したことは注目に値する。
【表１】
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【表２】
2015518570.tif 000004
【０１４４】
一つの例示的な実施形態において、前記マーカーはインタクトＣ３であってもよく、前記検出抗体はインタクトＣ３の第一エピトープを結合し、該第一エピトープはインタクトＣ３上に存在するＣ３ａドメインであり、該Ｃ３ａドメインはＣ３の活性化により失われる。さらなる実施形態において、前記マーカーはインタクトＣ３であり、前記捕捉抗体はＣ３上の第二エピトープを結合し、該第二エピトープは、インタクトＣ３、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄ上に存在するＣ３ｄドメイン内の領域である。図３（Ａ）参照。
【０１４５】
もう一つの例示的な実施形態において、前記マーカーはｉＣ３ｂであってもよく、前記検出抗体はｉＣ３ｂの第一エピトープを結合し、前記第一エピトープはｉＣ３ｂ上のネオエピトープであり、該ネオエピトープは、Ｃ３ｂがｉＣ３ｂへと非活性化されると現れ、ｉＣ３ｂがＣ３ｃおよびＣ３ｄへとさらに分解されると妨げられる。さらなる実施形態において、前記マーカーはｉＣ３ｂであり、前記捕捉抗体はｉＣ３ｂ上の第二エピトープを結合し、該第二エピトープは、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄｇ上にのみ存在するネオエピトープである。図３（Ｂ）参照。
【０１４６】
具体的な例では、前記マーカーはインタクトＣ３であり、前記捕捉抗体はＨｙｃｕｌｔ（登録商標）ＨＭ２０７５であり、前記検出抗体はＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（登録商標）５５２３７である。もう一つの非常に具体的な例では、前記マーカーはｉＣ３ｂであり、前記捕捉抗体はＱｕｉｄｅｌ（登録商標）Ａ２０９であり、前記検出抗体はＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（登録商標）５５２３７である。もう一つの具体的な例では、前記マーカーはｉＣ３ｂであり、前記捕捉抗体はＱｕｉｄｅｌ（登録商標）Ａ２０９であり、前記検出抗体はＱｕｉｄｅｌ（登録商標）Ａ２５０である。
【０１４７】
様々な対照分析物が、本発明の方法において該アッセイが首尾よく完了したことを実証するために用いることに好適であることは、当業者には理解されるであろう。一つの実施形態において、前記対照分析物はＩｇＧである。
【０１４８】
本発明の方法のもう一つの利点は、偽陽性結果をもたらすことがある、検査自体による試料の実質的補体活性化の回避である。Ｃ３が、試料の取り扱い、保管、および外来材料または物質との接触に起因して自己活性化し得る、細心の注意を要するタンパク質であることは周知である。それ故、Ｃ３の性質は、広範な試料取り扱いおよび多数の工程を含む補体活性化についての旧来のＥＬＩＳＡおよび濁度アッセイにおいて偽陽性をもたらし得る。本発明の方法は、試料調製および取扱い工程の低減および／または削除によって、特に例えば側方流動イムノアッセイの状況で使用される場合に、かかる偽陽性を回避する。したがって、本発明の一つの実施形態では、体液試料中の補体は、実験的に該側方流動イムノアッセイによって実質的に活性化されない。
【０１４９】
本発明のいくつかの実施形態では、単一のアッセイで一つより多くの補体活性化マーカーを検出することができる側方流動イムノアッセイを有することが望ましい。例えば、体液の同じアリコート中のインタクトＣ３とｉＣ３ｂの両方を定性的かつ定量的に検出することができる二重側方流動イムノアッセイは、非常に望ましい場合がある。したがって、もう一つの実施形態では、補体タンパク質を含む体液試料中の補体活性化のマーカーについてのポイント・オブ・ケア検出のための側方流動イムノアッセイであって、メンブレンストリップと、インタクトＣ３の第一エピトープを結合する第一検出抗体と、インタクトＣ３の第二エピトープを結合する第一捕捉抗体を含む第一検査ラインと、ｉＣ３ｂの第一エピトープを結合する第二検出抗体と、ｉＣ３ｂの第二エピトープを結合する第二捕捉抗体を含む第二検査ラインと、対照分析物を結合する抗体を含む少なくとも一つの対照ラインを含む側方流動イムノアッセイを提供する。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、前記第一および第二検出抗体は、シグナルをもたらす標識を含む。様々な標識がここに開示する方法での使用に好適である。いくつかの実施形態において、前記標識はコロイド金である。
【０１５１】
本発明のいくつかの態様によれば、前記試料中の補体は、前記側方流動イムノアッセイ自体によっては実験的に実質的に活性化されない。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、前記第一検出抗体はインタクトＣ３の第一エピトープを結合し、該インタクトＣ３の第一エピトープは、インタクトＣ３上に存在するＣ３ａドメインであり、該Ｃ３ａドメインはＣ３の活性化によって失われる。
【０１５３】
さらに他の実施形態において、前記第一捕捉抗体はインタクトＣ３の第二エピトープを結合し、該第二エピトープは、インタクトＣ３、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄ上に存在するＣ３ｄドメイン内の領域である。
【０１５４】
さらに他の実施形態において、前記第二検出抗体はｉＣ３ｂの第一エピトープを結合し、該ｉＣ３ｂの第一エピトープはｉＣ３ｂ上のネオエピトープであり、該ネオエピトープは、Ｃ３ｂがｉＣ３ｂへと非活性化されると現れ、ｉＣ３ｂがＣ３ｃおよびＣ３ｄへとさらに分解されると妨げられる。
【０１５５】
なお他の実施形態において、前記第二捕捉抗体はｉＣ３ｂの第二エピトープを結合し、該ｉＣ３ｂの第二エピトープは、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄｇ上にのみ存在するネオエピトープである。
【０１５６】
さらに他の実施形態において、インタクトＣ３を結合する抗体と、ｉＣ３ｂを結合する抗体は、実質的に交差反応しない。
【０１５７】
いくつかの実施形態によれば、前記検出および比較の工程は、３０分以下で実施され得る。
【実施例】
【０１５８】
以下の実施例は、例示として与えるものであり、本発明の範囲を限定するためのものでは決してない。
【０１５９】
実施例１
患者トリアージ
最初の検査試料をアッセイする前に、１０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬのインタクトＣ３およびｉＣ３ｂ標準物質を使用して標準曲線を完成する。側方流動イムノアッセイカセットを２０分後に電子リーダーで読み取る。
【０１６０】
この検査を用いて、損傷１５、３０または６０分以内に損傷重症度を計測する。これは、目視検査でははっきり分からない損傷を被っているかもしれない患者に最も有用である。動脈ライン（Ａライン）またはフィンガースティックのいずれかで一滴の血液を採集する。容量固定ピペットを使用して１０ｕＬ試料を吸い上げる。次いで試料を９９０ｕＬの試料緩衝液と混合する。血液と試料緩衝液を混合する。容量固定ピペットの球部を使用して、１００ｕＬを吸い上げ、一体型インタクトＣ３およびｉＣ３ｂ検査ストリップを含んでいる側方流動イムノアッセイカセット上にピペットで置く。あるいは、１００ｕＬを独立のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂ側方流動アッセイカセットに適用することができる。１０分後、しかし４０分より前に、そのカセットを好ましくはリーダーによって電子的に読み取って結果を記録する。一回目の読み取りが、血液中５０μｇ／ｍＬより高いｉＣ３ｂレベル（または等価のｉＣ３ｂ：インタクトＣ３比）を有する場合、補体活性化および高度炎症の証拠が存在する。スタッフは、重症損傷を想定し、ＥＲスタッフの注意を喚起する（ａｌｅｒｔ）。そうでなければ、５分後に二回目の読み取りを行う。ｉＣ３ｂレベル（または等価のｉＣ３ｂ：インタクトＣ３比）が血液中５０μｇ／ｍＬより高いか、ｉＣ３ｂレベルが２５％より大きく増加されていた場合、患者が重症損傷を有すると想定し、ＥＲスタッフの注意を喚起する（ａｌｔｅｒ）。より少ない増加または無増加は、より重症度の低い損傷を示唆するが、決定的ではない。
【０１６１】
実施例２
外傷患者の軌跡モニタリング（ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）
シフトの開始時に、ＩＣＵスタッフは、１０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬのインタクトＣ３およびｉＣ３ｂ標準物質を使用して標準曲線を完成する。側方流動イムノアッセイカセットを２０分後に電子リーダーで読み取る。
【０１６２】
軌跡モニタリングの目的は、重症外傷後に安定した患者の炎症および免疫状態の変化を検出することである。この実施例では、肺炎または炎症性機能不全のいずれかによって引き起こされた呼吸困難を検出することができる。予想患者プロファイルは、１６以上の損傷重症度スコア（ＩＳＳ）を有し、呼吸のために人工呼吸器補助を必要とする者である。
【０１６３】
患者は、血糖値を検査する時点と同調する頻繁な間隔で補体検査を受ける。検査間のこの間隔は、通常、約二時間である。Ａラインまたはフィンガースティックいずれかによる血糖検査と同じ方法を用いて、血液を採集する。容量固定ピペットを使用して１０ｕＬ試料を吸い上げる。次いで試料を９９０ｕＬの試料緩衝液と混合する。血液と試料緩衝液を混合する。容量固定ピペットの球部を使用して、１００ｕＬを吸い上げ、一体型インタクトＣ３およびｉＣ３ｂ側方流動イムノアッセイカセットを含んでいるＬＦＡカセット（単数）上にピペットで置く。あるいは、１００ｕＬを独立のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂカセット（複数）に適用する。前記カセット（単数）またはカセット（複数）を患者のベッドサイドにあるリーダーの中に置く。２０分後に読み取りを行うようにリーダーを設定する。データを収集し、ｉＣ３ｂ、インタクトＣ３およびｉＣ３ｂ：（インタクトＣ３）値を各時点で記録する。
【０１６４】
インタクトＣ３もしくはｉＣ３ｂレベルの経時的変化、または変化率の変化は、炎症状態の変化を示し得る。インタクトＣ３の減少を随伴するｉＣ３ｂの急上昇は、切迫した呼吸困難を示す。次の行動方針として、臨床医は、患者に対して気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行って、その患者がＶＡＰを経験しているか否かを決定する。細菌が１ｍＬ当たり１０４個以上のレベルで存在する場合、ＶＡＰを指摘し、その患者を抗生物質療法に付す。そうでなければ、非感染性炎症性機能不全を想定し、その患者を抗炎症薬および／または補体インヒビターで処置することができる。その患者は、人工呼吸器設定を調整してもらうこともできる。
【０１６５】
実施例３
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を有する患者における疾患重症度および処置の有効性の決定
最初の検査試料をアッセイする前に、１０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬのインタクトＣ３およびｉＣ３ｂ標準物質を使用して標準曲線を完成する。側方流動イムノアッセイカセットを２０分後に電子リーダーで読み取る。
【０１６６】
この検査を用いて、初期疾患重症度、および治療の有効性を計測する。ＳＬＥ患者に対して行う標準診断の一つは、全Ｃ３レベルの測定である。ＳＬＥ患者のＣ３レベルは、通常低下しており、処置が成功すると正常（＞１ｍｇ／ｍＬ）に戻る。しかし、Ｃ３活性化が抑止されたのか、または十分遅くなり、通常の補充メカニズムが可能になり、Ｃ３レベルが正常値へ回復しただけであるのかは、一般に分からない。
【０１６７】
各病院訪問時に、患者の血液を全Ｃ３、インタクトＣ３およびｉＣ３ｂ検査のために採集する。併せた３検査でたった一滴しか必要としない。血液は、他の検査のために採血していない限りフィンガースティックによって採集し、他の検査のために採血している場合には、その供給源から血液を得ることとなる。容量固定ピペットを使用して１０ｕＬ試料を吸い上げる。次いで試料を９９０ｕＬの試料緩衝液と混合する。血液と試料緩衝液を混合する。容量固定ピペットの球部を使用して、１００ｕＬを吸い上げ、全Ｃ３、インタクトＣ３およびｉＣ３ｂを測定する一体型側方流動カセットを含んでいるＬＦＡカセット（単数）上にピペットで置く。あるいは、１００ｕＬを独立の各アッセイ用のカセット（複数）に適用することができる。前記カセット（単数）またはカセット（複数）を病院のリーダーの中に置く。２０分後に読み取りを行うようにリーダーを設定する。
【０１６８】
各病院訪問時にデータを収集する。初回病院訪問時、ｉＣ３ｂおよびインタクトＣ３検査の追加により、専門医は、患者の状態の重症度について、現在可能であるものよりも、多くの情報が得られる。専門医が患者の状態が安定していると見なすときに新たな情報を利用できるようになる。この時点でのｉＣ３ｂおよびインタクトレベルは、残りの疾患プロセスの程度を示す。特にｉＣ３ｂレベルが正常値より高い（一般に、＞１％）場合、基礎疾患プロセスはまだ非常に活動性であり、専門医は、抗炎症薬用量を増加させること、または追加の薬物療法を加えることによる治療法のさらなる調整を選ぶことができる。
【０１６９】
実施例４
健常個体の基礎涙液中の基礎インタクトＣ３およびｉＣ３ｂレベルの２４時間にわたる決定
最初の検査試料をアッセイする前に、１０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬおよび３０００ｎｇ／ｍＬのインタクトＣ３およびｉＣ３ｂ標準物質を使用して標準曲線を完成する。側方流動イムノアッセイカセットを２０分後に電子リーダーで読み取る。
【０１７０】
健常個体の眼におけるインタクトＣ３およびｉＣ３ｂレベルを決定するために、合計三回の読み取りを行った。時間＝０時間、１２時間および２４時間の試料を採集し、評価した。
【０１７１】
涙液回収のために、下瞼を引き寄せ、眼の下部にＫｉｍｗｉｐｅ（登録商標）を短時間、軽くあてる（ｄａｐ）。次いでＫｉｍｗｉｐｅ（登録商標）を素早く切断し、涙染みの周囲の二、三ミリメートルの乾いた端部を残して涙液を回収する。次いでそのＫｉｍｗｉｐｅ（登録商標）涙液試料を２２０ｕＬのＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｗｏｒｋｓ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒに入れ、十分に１０秒間ボルテックスにかける。一分間待った後、その試料を再び短時間ボルテックスにかける。次に、１００ｕＬの試料を各側方流動イムノアッセイ（インタクトＣ３およびｉＣ３ｂ）に移し、アッセイする。
【０１７２】
分析のために、各カセットをリーダーに挿入し、２０分後に読み取る。
【０１７３】
結果は、５０〜６０μ／ｍＬのインタクトＣ３および５〜８μ／ｍＬのｉＣ３ｂの範囲であった（図１５参照）。
【０１７４】
実施例５
一時点での二人の健常個体の基礎インタクトＣ３およびｉＣ３ｂレベルの決定
最初の検査試料をアッセイする前に、１０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬおよび３０００ｎｇ／ｍＬのインタクトＣ３およびｉＣ３ｂ標準物質を使用して標準曲線を完成する。側方流動イムノアッセイカセットを２０分後に電子リーダーで読み取る。
【０１７５】
安静時インタクトＣ３およびｉＣ３ｂレベルを二人の健常ドナーから収集する。側方流動イムノアッセイリーダーのスイッチを入れる。アルコールスワブを使用して指を清浄にする。指にランセットを刺し、優しく押して、ＭＩＣＲＯＳＡＦＥ（登録商標）Ｔｕｂｅを使用して毛管作用により１０ｕＬの血液を採集する。９９０ｍＬの試料アッセイ緩衝液を満たしたチューブに血液試料を直接排出して蓋をし、６〜８回反転させることによって混合した。１００ｕＬ  Ｅｘａｃｔ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｐｉｐｅｔを使用して１００ｕＬの血液試料混合物をＣｏｍｐＡｃｔインタクトＣ３検査に移した。次いで新たな１００ｕＬ  Ｅｘａｃｔ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｐｉｐｅｔを使用して第二の１００ｕＬの血液試料混合物をＣｏｍｐＡｃｔ  ｉＣ３ｂ検査に移した。両方の検査について２０分後に読み取るようにタイマーを設定した。
【０１７６】
第一の患者からの結果は、インタクトＣ３についてはおおよそ５００μｇ／ｍＬ、およびｉＣ３ｂについては２００ｎｇ／ｍＬであると決定された。これは、この個体に２５００のインタクトＣ３対ｉＣ３ｂ比が存在することを示す（図１６参照）。第二の個体の結果は、インタクトＣ３についてはおおよそ１０００μｇ／ｍＬ、およびｉＣ３ｂについては３００ｎｇ／ｍＬであった（図１７参照）。これらの値の両方が予想正常範囲内である。ｉＣ３ｂ値は、正常と見なされるものより低い範囲内にあった。
【０１７７】
実施例６
激しい運動後の一時点での健常個体の基礎インタクトＣ３およびｉＣ３ｂレベルの決定
実施例５についての上記プロトコルを用いて、健常個体の一方を激しい運動後に再び検査した（図１８参照）。運動はｉＣ３ｂまたはＣ３レベルを有意に変えなかった。
【０１７８】
実施例７
側方流動イムノアッセイにおけるインタクトＣ３抗体とｉＣ３ｂ抗体との間のクロストーク
１ミリリットル容積中、５０ｎｇ／ｍＬのｉＣ３ｂを様々な量（０ｎｇ／ｍＬから１００，０００ｎｇ／ｍＬの範囲）のインタクトＣ３と混合した。試料を６〜８回反転させることによって混合し、その後、０．１ｍＬをピペットでカセットに置いた。２０分の時点で読み取りを行った。１０ｎｇ／ｍＬから１００，０００ｎｇ／ｍＬまで生成した標準曲線を使用してリーダーアウトプットをｉＣ３ｂ濃度に変換した。緩衝液のみを用いて実行したカセットからのバックグラウンドを差し引いた。各時点でのｉＣ３ｂの見かけの濃度から実際のｉＣ３ｂ濃度（Ｃ３を加えていないｉＣ３ｂ検査からのもの）を引き、その後、実際のｉＣ３ｂ濃度に対して正規化することによって、寄与率を計算した。図１４参照。Ｈ０８Ｋ−０１カセットについては、検査したＣ３の最高濃度で、ｉＣ３ｂシグナルの約半分はインタクトＣ３から生じ、半分は実際のｉＣ３ｂから生じた。Ｊ２４Ｋ０３バージョンについては、インタクトＣ３クロストークから、実際のｉＣ３ｂからより４倍多いｉＣ３ｂシグナルが生じた。これらの抗体ペアは、ＥＬＩＳＡアッセイでは十分機能するが、側方流動イムノアッセイにおいて同じ分析物のために使用すると有意なクロストークを呈示する。生理的に妥当な２５０：１および５００：１比で、インタクトＣ３は、Ｊ２４Ｋ−０３ではｉＣ３ｂシグナルアウトプットにｉＣ３ｂ自体より大きく寄与する。
【０１７９】
Ｊ２４Ｋ−０３は、金コンジュゲート上にマウス抗Ｃ３ａモノクローナル、および検査ライン上にマウス抗Ｃ３ｄモノクローナルを備えているアッセイである。Ｈ０８Ｋ−０１は、金コンジュゲート上にマウス抗ｉＣ３ｂモノクローナル、および検査ライン上に抗Ｃ３ポリクローナルを有する。
【０１８０】
実施例８
側方流動イムノアッセイのためのｉＣ３ｂ標準曲線の生成
本発明の一つの実施形態は、カセットケースを伴わない側方流動アッセイストリップを含む。これらのストリップは、金にコンジュゲートした抗ｉＣ３ｂモノクローナル抗体（Ｑｕｉｄｅｌ（登録商標）Ａ２０９）およびストリップにコンジュゲートした抗Ｃ３抗体（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（登録商標）５５２３７）を有した。標準曲線を図１１（Ａ）に示す。これらの標準曲線は、約１０倍の線形範囲および約１００ｎｇ／ｍＬの感度を示した。本発明のもう一つの実施形態は、アッセイストリップへの試料の制御適用を可能にするカセットで使用するためのストリップを構成する。これは、アッセイへの時間依存性はまだ相当にあるが、アッセイ間の再現性を向上させた。標準曲線の結果を図１１（Ｂ）に示す。第三の実施形態は、金コンジュゲート上に適用する抗体濃度を０．５ｍｇ／ｍＬから１ｍｇ／ｍＬに増加させ、吸収緩衝液からＢＳＡを除去する。標準曲線の結果を図１１（Ｃ）に示す。
【０１８１】
標準曲線は、下の実施例９において説明するように生成する。
【０１８２】
実施例９
側方流動イムノアッセイのためのｉＣ３ｂ標準曲線の生成
２ｍＬ蓋付チューブを使用して、十（１０）μＬのｉＣ３ｂ（濃度１ｍｇ／ｍＬ）ストックを９９０ｕｌの試料希釈緩衝液で希釈して１０ｕｇ／ｍＬの作業用ストックを作った。１０〜１２回ゆっくりと反転させることによってチューブを混合した。研究員は、別の２ｍＬ蓋付チューブの中で５００ｕＬの１０ｕｇ／ｍＬストックを５００ｕＬ  ＢＡＷ  Ｂｕｆｆｅｒで希釈して５ｕｇ／ｍＬストックを作った。１０〜１２回チューブをゆっくりと反転させることによって混合を行った。上で説明したような１：１希釈（５００ｕＬ：５００ｕＬ）をさらに九回繰り返して、次の作業用ストックを作った：１０ｕｇ／ｍＬ、５ｕｇ／ｍＬ、２．５ｕｇ／ｍＬ、１．２５ｕｇ／ｍＬ、６２５ｎｇ／ｍＬ、３１３ｎｇ／ｍＬ、１５６ｎｇ／ｍＬ、７８ｎｇ／ｍＬ、３９ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、および０ｎｇ／ｍＬ（緩衝液のみ）。
【０１８３】
標識し、三群に割り付けることにより、側方流動イムノアッセイ（ＬＦＡ）カセットを調製した。各希釈について、研究員は、１００ｕＬの第一の作業用ストック（インタクトＣ３については１０ｕｇ／ｍＬ、およびｉＣ３ｂについては５ｕｇ／ｍＬ）を第１のＬＦＡの試料ポートにピペットで置いた。各濃度について、研究員は２０秒待ち、その後、１００ｕＬの同作業用ストックを第２のＬＦＡにローディングした。ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｗｏｒｋｓ  Ｒｅａｄｅｒ  ＬＦＤＲ  １０１（Ｆｏｒｓｉｔｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用し、検査ライン設定、続いて対照ライン設定を用いてカセットを１０、２０および３０分後に読み取り、データを記録した。
【０１８４】
実験完了後、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用してデータをプロットした。標準曲線は、３パラメータロジスティック方程式：Ｙ＝下限値＋（上限値−下限値）／（１＋ＥＣ５０／Ｘ）にフィットする。図１２参照。
【０１８５】
実施例１０
側方流動イムノアッセイのためのインタクトＣ３標準曲線の生成
２ｍＬ蓋付チューブを使用して、十（１０）μＬのインタクト（濃度１ｍｇ／ｍＬ）ストックを９９０ｕｌの試料希釈緩衝液で希釈して１０ｕｇ／ｍＬの作業用ストックを作った。１０〜１２回ゆっくりと反転させることによってチューブを混合した。研究員は、別の２ｍＬ蓋付チューブの中で５００ｕＬの１０ｕｇ／ｍＬストックを５００ｕＬ  ＢＡＷ  Ｂｕｆｆｅｒで希釈して５ｕｇ／ｍＬストックを作った。１０〜１２回チューブをゆっくりと反転させることによって混合を行った。上で説明したような１：１希釈（５００ｕＬ：５００ｕＬ）をさらに九回繰り返して、次の作業用ストックを作った：
【０１８６】
１０ｕｇ／ｍＬ、５ｕｇ／ｍＬ、２．５ｕｇ／ｍＬ、１．２５ｕｇ／ｍＬ、６２５ｎｇ／ｍＬ、３１３ｎｇ／ｍＬ、１５６ｎｇ／ｍＬ、７８ｎｇ／ｍＬ、３９ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、および０ｎｇ／ｍＬ（緩衝液のみ）。
【０１８７】
標識し、三群に割り付けることにより、ＬＦＡカセットを調製した。各希釈について、１００ｕＬの第一の作業用ストック（インタクトＣ３については１０ｕｇ／ｍＬ、およびｉＣ３ｂについては５ｕｇ／ｍＬ）を第１のＬＦＡの試料ポートにピペットで置いた。各濃度について、研究員は２０秒待ち、その後、１００ｕＬの同作業用ストックを第２のＬＦＡにローディングした。ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｗｏｒｋｓ  Ｒｅａｄｅｒ  ＬＦＤＲ  １０１（Ｆｏｒｓｉｔｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用し、検査ライン設定、続いて対照ライン設定を用いてカセットを１０、２０および３０分後に読み取り、データを記録した。
【０１８８】
実験完了後、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用してデータをプロットした。標準曲線は、３パラメータロジスティック方程式：Ｙ＝下限値＋（上限値−下限値）／（１＋ＥＣ５０／Ｘ）にフィットする。図１３参照。
【０１８９】
実施例１１
ＣｏｍｐＡｃｔ（商標）側方流動アッセイ手順の実施形態
図２１は側方流動方式イムノアッセイの例示的な実施形態を示す。最初、患者の指をアルコールスワブにより清浄化し、指にランセットを刺す。その後、指を圧搾して、血液の提示を容易にし、その後、血液をＭｉｃｒｏｓａｆｅ（商標）チューブに集める。血液をＭｉｃｒｏｓａｆｅ（商標）チューブからＣｏｍｐＡｃｔ（商標）検査カセットの試料ポートの中に直接に排出する。次に、３滴のアッセイ緩衝液を試料ポートの中に加えて、血液試料と混合し、希釈する。試料を所定の期間（例えば、１５分間〜２０分間）静置する。所望されるならば、第二の血液試料が記載されるように採血される場合があり、その後、この試料は第二のＣｏｍｐＡｃｔ（商標）検査カセット（「Ｂ」）に導入される場合がある。所望の期間が終了したときまたは終了する前のある時点において、それぞれの検査カセットが、対照ラインが容易に視認されること、および、試料の不鮮明化が、データの読み取りにおいて問題を引き起こす可能性がないことを確実にするために目視検査され得る。所望の期間が経過したら、各検査カセットが、例えば、図２１に示されるように、各検査からのデータを捕捉するために読み取りデバイスに導入され得る。図２１にはまた、清浄化手順および試料抽出手順の概念的スケッチ、ならびに、本発明の範囲内であると意図される検査カセットおよび検査リーダーの写真が示される。
【０１９０】
実施例１２
ヒトＣ３についてのＣｏｍｐＡｃｔ（商標）側方流動アッセイ実施形態の感度
十（１０）μＬの精製ヒトＣ３タンパク質（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．，＃Ａ１１３、１ｍｇ／ｍｌ）ストックを９９０ｕｌの試料希釈緩衝液（Ｓａｍｐｌｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒ）（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｗｏｒｋｓ，ＩＳＯＴ−００３）で希釈して、２ｍＬ蓋付チューブ中に１０ｕｇ／ｍＬの作業用ストックを作った。１０〜１２回ゆっくりと反転させることによって作業用ストックを混合した。研究員は、別の２ｍＬ蓋付チューブの中で５００ｕＬの１０ｕｇ／ｍＬストックを５００ｕＬ  ＢＡＷ  Ｂｕｆｆｅｒで希釈して５ｕｇ／ｍＬストックを作った。１０〜１２回チューブをゆっくりと反転させることによって混合を行った。上で説明したような１：１希釈（５００ｕＬ：５００ｕＬ）をさらに九回繰り返して、次の作業用ストックを作った：１０ｕｇ／ｍＬ、５ｕｇ／ｍＬ、２．５ｕｇ／ｍＬ、１．２５ｕｇ／ｍＬ、６２５ｎｇ／ｍＬ、３１３ｎｇ／ｍＬ、１５６ｎｇ／ｍＬ、７８ｎｇ／ｍＬ、３９ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、および０ｎｇ／ｍＬ（緩衝液のみ）。
【０１９１】
側方流動アッセイ（ＬＦＡ）カセットにラベルをつけ、３つからなる群で配置することによって準備した。三連検査の各セットを写真撮影し（６０ｍｍのＡＦ  Ｍｉｃｒｏ  Ｎｉｋｋｏｒレンズを取り付けたＮｉｋｏｎ  Ｄ８０）、画像を、Ｐａｉｎｔアプリケーションを使用して１枚の画像に組み合わせた。各レプリケートの写真を図２２に見ることができる。
【０１９２】
各希釈物について、１００ｕＬの第一作業用ストック（インタクトＣ３については１０ｕｇ／ｍＬおよびｉＣ３ｂについては５ｕｇ／ｍＬ）を第一ＬＦＡの試料ポートにピペットで注入した。各濃度について、研究員は２０秒待ち、その後、１００ｕＬの同作業用ストックを第二ＬＦＡにローディングした。カセットを、検査ライン設定、続いて対照ライン設定を使用するＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｗｏｒｋｓ  Ｒｅａｄｅｒ  ＬＦＤＲ−００１（Ｆｏｒｓｉｔｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して１０分後、２０分後および３０分後に読み取り、データを記録した。各時点についてのサンドイッチ値を下記のように百分率として計算した：［検査ライン］／［対照ライン］×１００％。結果を図２３に示す。本実施例で使用されるアッセイの変動性の評価を計算した。この評価を図２４に示す。
【０１９３】
実施例１３
ヒトｉＣ３ｂについてのＣｏｍｐＡｃｔ（商標）側方流動アッセイ実施形態の感度
十（１０）μＬの精製ヒトｉＣ３ｂタンパク質のストック（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、＃Ａ１１５、濃度：１ｍｇ／ｍＬ）を９９０ｕＬの試料希釈剤緩衝液（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｗｏｒｋｓ、ＩＳＯＴ−００３）で希釈して、２ｍＬの蓋付チューブにおいて１０ｕｇ／ｍＬの作業用ストックを作製した。この作業用ストックを、１０回〜１２回ゆっくり反転することによって混合した。研究員は１０ｕｇ／ｍＬのストックの５００ｕＬを５００ｕＬのＢＡＷ  Ｂｕｆｆｅｒで希釈して、５ｕｇ／ｍＬのストックを別の２ｍＬの蓋付チューブにおいて作製した。混合を、チューブを１０回〜１２回ゆっくり反転することによって行った。この１：１希釈（５００ｕＬ：５００ｕＬ）をさらに９回、上記のように繰り返して、下記の作業用ストックを作製した：１０ｕｇ／ｍＬ、５ｕｇ／ｍＬ、２．５ｕｇ／ｍＬ、１．２５ｕｇ／ｍＬ、６２５ｎｇ／ｍＬ、３１３ｎｇ／ｍＬ、１５６ｎｇ／ｍＬ、７８ｎｇ／ｍＬ、３９ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬおよび０ｎｇ／ｍＬ（緩衝液のみ）。
【０１９４】
側方流動イムノアッセイ（ＬＦＡ）カセットにラベルをつけ、３つからなる群で配置することによって準備した。三連検査の各セットを写真撮影し（６０ｍｍのＡＦ  Ｍｉｃｒｏ  Ｎｉｋｋｏｒレンズを取り付けたＮｉｋｏｎ  Ｄ８０）、画像を、Ｐａｉｎｔアプリケーションを使用して１枚の画像に組み合わせた。各レプリケートの写真を図２５に見ることができる。
【０１９５】
各希釈について、研究員は、１００ｕＬの第一の作業用ストック（インタクトＣ３については１０ｕｇ／ｍＬ、およびｉＣ３ｂについては５ｕｇ／ｍＬ）を第１のＬＦＡの試料ポートにピペットで置いた。各濃度について、研究員は２０秒待ち、その後、１００ｕＬの同作業用ストックを第２のＬＦＡにローディングした。ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｗｏｒｋｓ  Ｒｅａｄｅｒ  ＬＦＤＲ  ００１（Ｆｏｒｓｉｔｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用し、検査ライン設定、続いて対照ライン設定を用いてカセットを１０、２０および３０分後に読み取り、データを記録した。各時点についてのサンドイッチ値を下記のように百分率として計算した：［検査ライン］／［対照ライン］×１００％。結果を図２６に示す。
【０１９６】
実施例１４
側方流動アッセイ実施形態を使用するヒトのネイティブＣ３およびｉＣ３ｂの評価
全血を、安全ランセット（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、０２−６７５−１６０）を使用してフィンガースティックにより採取し、ピペットにより２ｍＬのチューブに移した。次に、３０ｕＬの血液を直ちに、別個の２ｍＬのチューブにおいて２７０ｕＬのＳａｍｐｌｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｗｏｒｋｓ、ＩＳＯＴ−００３）で希釈し、この１：１０血液希釈物の１００ｕＬをｉＣ３ｂ  ＬＦＡに適用した。この１：１０血液希釈物をＳａｍｐｌｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒでさらに希釈して１：３１６２の最終濃度にし、１００ｕＬをＣ３  ＬＦＡに適用した。検査ラインおよび対照ラインを、リーダー（Ｆｏｒｓｉｔｅ、＃ＬＦＤＲ−００１）を使用して２０分および３０分で各検査について読み取り、三連の試料を各データ点のために流した。ネイティブＣ３およびｉＣ３ｂの推定濃度を、試料についてのサンドイッチ値および特定のアッセイについての標準曲線を使用して導いた。これらのアッセイについてのデータを図２７に示す。
【０１９７】
実施例１５
ヒトの全血、血漿および血清の試料からのヒトＣ３レベルの評価
本研究では、全血、血漿および血清のヒトドナー試料をネイティブＣ３のレベルおよびｉＣ３ｂのレベルについて分析した。３名のドナーが、試料を、１週間の期間中に１日目、２日目および５日目での三つの異なる時点で採取された。試料を抽出し、それをカセットに導入するために使用される手順は実質的には、実施例１１に記載される通りであった。全血試料はＣｏｍｐＡｃｔ（商標）側方流動アッセイ検査により抽出後直ちに検査され、一方、血漿試料および血清試料は調製され、ＣｏｍｐＡｃｔ（商標）側方流動アッセイ検査または標準的ＥＬＩＳＡアッセイのどちらかにより検査された。
【０１９８】
ＣｏｍｐＡｃｔ（商標）側方流動アッセイを用いて検査される試料については、血漿−ＥＤＴＡおよび血清を製造業者のプロトコル（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）に従って新鮮な全血から調製し、小分けして−８０℃で冷凍した。アリコートを氷上で解凍し、ＣｏｍｐＡｃｔ（商標）アッセイによりアッセイした。推定されるｉＣ３ｂ濃度を精製タンパク質の標準曲線から得た。
【０１９９】
標準的ＥＬＩＳＡアッセイで検査される試料については、下記の手順を使用した。最初に、９６ウェルプレートを、１×ＰＢＳにおいて２ｕｇ／ｍＬに希釈されたモノクローナル抗体の５０ｕＬを使用して被覆した。ヒトＣ３のＥＬＩＳＡアッセイのために、Ｉｍｍｎｕｌｏｎ  ４ＨＢＸプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３８５５）をマウス抗ヒトＣ３／Ｃ３ａモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＨＭ２０７５）により被覆した。ヒトｉＣ３ｂのＥＬＩＳＡアッセイのために、Ｉｍｍｕｌｏｎ  １Ｂ  ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３３５５）をマウス抗ヒトｉＣ３ｂモノクローナル抗体（Ｑｕｉｄｅｌ、Ａ２０９）により被覆した。これらのＥＬＩＳＡプレートを室温で１時間〜２時間インキュベーションした。モノクローナル抗体を含有する液体を捨て、各ウェルを１×ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）（ＰＢＳ−Ｔ）により２回洗浄した。次に、ウェルを２００ｕＬのＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３７５３８）によりブロッキング処理し、室温で１時間インキュベーションした。その後、緩衝液を捨て、セルを１×ＰＢＳ−Ｔにより３回洗浄した。精製タンパク質の標準物を別個のマイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、＃９２０５）において１×ＰＢＳで希釈して１ｕｇ／ｍＬの濃度にした。使用されるヒトＣ３標準物はＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃからのものであり（＃Ａ１１３）、使用されるヒトｉＣ３ｂ標準物もまたＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．からのものである（＃Ａ１１５）。その後、それぞれの標準物を、等体積の１×ＰＢＳを使用して連続希釈した。
【０２００】
それぞれの血漿試料および血清試料を上記のように全血から調製し、その後、別個のマイクロタイタープレートに１×ＰＢＳにおいて１：２０に希釈し、その後、１×ＰＢＳを使用して連続希釈した。その後、５０ｕＬの各希釈試料をＥＬＩＳＡプレートの適切なウェルに移し、室温で１時間インキュベーションした。その後、液体を捨て、各ウェルを、１×ＰＢＳ−Ｔを使用して６回洗浄した。五十（５０）ｕＬのヤギ抗Ｃ３−ＨＲＰ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、＃５５２３７）をＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ緩衝液で１：２０００に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加えた。その後、試料を室温で１時間インキュベーションした。その後、液体を捨て、各ウェルを、１×ＰＢＳ−Ｔを使用して６回洗浄した。ＴＭＢ西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、＃１８５４０６０および＃１８５４０５０）の１：１混合物の五十（５０）ｕＬを各ウェルに加えた。３分後、２５ｕＬの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに加えて、反応を停止させた。その後、ＥＬＩＳＡプレートを、ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  ＰＯＬＡＲｓｔａｒｔ  Ｏｍｅｇａプレートリーダーを４５０ｎｍにおいて使用して分析した。これらの実験の結果を図２８および図２９において見ることができる。
【０２０１】
図２８は、本発明のＣｏｍｐＡｃｔ（商標）側方流動アッセイ実施形態を使用して評価されるヒトＣ３タンパク質のレベルが一般に、ＥＬＩＳＡ法を使用して得られた文献において認められるレベルに匹敵することを示す。
【０２０２】
図２９は、血漿試料および血清試料において検出されるｉＣ３ｂタンパク質のレベルが、ＣｏｍｐＡｃｔ（商標）側方流動アッセイ実施形態と、既知のＥＬＩＳＡ法との間で有意に異なることを示す。（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に示すデータは、ドナー毎による棒グラフとして示され、一方、（Ｄ）におけるデータは表において数値で示される。これは、本発明の方法およびアッセイの利点を強調する驚くべき結果であった。特定の理論にとらわれることを望まないが、出願人らは、ＣｏｍｐＡｃｔアッセイを使用してアッセイされるｉＣ３ｂの有意により低いレベルが、はるかにより遅くより多いＥＬＩＳＡ法と対比して、データが得られる迅速な速度に起因し得ることを提案する。反応時間を短くすることで、試料中の因子が補体タンパク質に作用して、潜在的に補体タンパク質を活性化させることがないようにすることが可能である。ＥＬＩＳＡによって要求される操作工程および取り扱い工程の増大した数はまた、例えば、インタクトＣ３と活性化剤との相互作用を容易にすることにより、同様な様式でこれらの結果に寄与するものであり得る。
【０２０３】
この仮説が、ｉＣ３ｂの精製試料が使用されるときには、ＣｏｍｐＡｃｔ（商標）検査およびＥＬＩＳＡ検査の両方が類似したデータをもたらすことが明らかである図３０に示されるように裏づけられる。しかしながら、体液由来の試料が使用されるときには、結果が有意に変化する。これらの結果の背後にあるメカニズムにかかわらず、同じ試料でのｉＣ３ｂの検出レベルにおけるそのような大きい違いは、誤った臨床診断を容易に引き起こす場合があり、このことから、本発明の実施形態の利点の一つが強調され得る。
【０２０４】
実施例１６
検出されたｉＣ３ｂレベルに対する時間の影響
室温にさらされる試料において検出されるｉＣ３ｂのレベルに対する時間の影響を、ＣｏｍｐＡｃｔ（商標）アッセイを使用して評価しようとする取り組みにおいて、実施例１５で得られる全血、血漿および血清の希釈試料を室温での４時間の後で再検査した。他のアッセイ法およびアッセイ条件は、実施例１５に記載されるのと同じであった。データを図３１に示す。データは、ｉＣ３ｂのレベルにおけるおよそ１００倍の増大が室温での時間経過に起因して各試料において認められることを明瞭に示す。以前には知られていないこの影響は、ｉＣ３ｂレベルにおける実質的な増大が室温において速やかに生じることを強く示している。このことから、本発明の実施形態の利点、および、データを得るために数時間を必要とするこれまでの方法（ＥＬＩＳＡアッセイを含む）によって生じる潜在的な誤ったデータがさらに強調される。
【０２０５】
様々な試料における経時的なＣ３活性化の増大に関してのより良好な解決策を達成しようとする取り組みにおいて、上記の実施例１５で得られる全血試料、血漿試料および血清試料のアリコートを、Ｃ３活性化がどのくらい速く観察され得るかを明らかにするために異なる時点で評価した。
【０２０６】
図３２は、全血の試料において本発明のＣｏｍｐＡｃｔ（商標）アッセイ実施形態を使用して検出されるｉＣ３ｂのレベルを、精製ｉＣ３ｂタンパク質の標準物を含有する試料と比較して示す。試料を、５分間、１０分間、１５分間または２０分間の室温への暴露の後で検査し、これらのアッセイを、実質的には実施例１５に記載されるように行った。（Ａ）は、ｉＣ３ｂにおけるいくらかの増大が、室温でのほんの５分の後で全血において検出され得ることを示す。この増大の程度は、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）におけるデータの増大する傾きによって認められ得るように経時的に加速するようである。
【０２０７】
図３３は、５分間または６０分間の室温への暴露の後で本発明のＣｏｍｐＡｃｔ（商標）アッセイ実施形態において検出されるｉＣ３ｂレベルにおける違いを示す。血漿および血清の試料を実施例１５について上記で記載されるように得て、調製した。図３３において認められ得るように、検出されるｉＣ３ｂレベルにおける増大が６０分では５分よりもはるかにロバストであった。加えて、また、予想外であったが、ｉＣ３ｂレベルにおける増大は、経時的な傾きにおける有意な変化によって立証されるように、経時的に一様に増大するわけではないようである。この現象は、さらなる層の複雑性を補体活性化の適正な分析に加えており、アッセイの時間および処理を最小限に抑えることの重要性をさらに強調する。本発明のいくつかの実施形態は、補体活性化の検出におけるこのようなこれまで知られていなかった問題に対処する。
【０２０８】
実施例１７
ヒト血漿におけるｉＣ３ｂの時間依存的生成
本実施例では、健常ドナーからのヒト血漿をＳａｍｐｌｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒで１：１０に希釈し、ｉＣ３ｂ  ＬＦＡストリップにより直ちにアッセイした。希釈血漿を室温でインキュベーションし続け、３０分間、１時間、２時間、４時間および７２時間（３日間）のさらなるインキュベーション時間の後で検査した。各時点についての検査ラインおよび対照ラインを、試料をＬＦＡに加えた３０分後にリーダー（Ｆｏｒｓｉｔｅ、＃ＬＦＤＲ−００１）によって読み取った。サンドイッチ値を、緩衝液単独試料から検査ラインシグナル（示されず）を差し引いた後で百分率（検査ライン／対照ライン×１００％）として計算した。図３４は血漿におけるｉＣ３ｂの時間依存的活性化を示し、（Ａ）はインキュベーション後の検査ストリップを示し、（Ｂ）は、Ｆｏｒｓｉｔｅリーダーによって読み取られるときのデータを示す。（Ｂ）のグラフは、時間がＸ軸上に、サンドイッチ値がＹ軸上にプロットされる。
【０２０９】
実施例１８
ＥＬＩＳＡを使用するヒト血漿およびヒト血清におけるｉＣ３ｂの時間依存的生成
本実施例では、図３５に示すように、健常ドナーからのヒト血漿およびヒト血清をＥＬＩＳＡ  Ｂｕｆｆｅｒで連続希釈し、抗ｉＣ３ｂモノクローナル抗体により被覆されるウェルとともに、（Ａ）２分間または（Ｂ）５分間インキュベーションし、その後、インキュベーションを除去および洗浄によって停止させた。その後、すべてのウェルを検出のためのＨＲＰコンジュゲート化抗Ｃ３ポリクローナル抗体とともにインキュベーションした。精製ｉＣ３ｂタンパク質もまた希釈し、血漿試料および血清試料と並行して、示される時間にわたってインキュベーションして、図３５に示すような各時点についての標準曲線を作製した。希釈血清におけるｉＣ３ｂの濃度を各時点についての対応するｉＣ３ｂ標準曲線から導いた。
【０２１０】
図３５の（Ａ）および（Ｂ）が示すように、ヒトの血漿および血清におけるｉＣ３ｂの活性化が、非常に素早く生じ得、それは場合によっては２分もの素早さでさえあり得る。ヒト血清におけるｉＣ３ｂの活性化が本実施例では特に強かった。この活性化から、ＥＬＩＳＡ型アッセイを使用して分析される試料に対して時間が有し得る劇的な影響が強調される。
【０２１１】
別の実験において、健常ドナーからのヒト血清をＥＬＩＳＡ  Ｂｕｆｆｅｒで連続希釈し、抗ｉＣ３ｂモノクローナル抗体により被覆されるウェルとともに、示される時間にわたってインキュベーションし、その後、インキュベーションを除去および洗浄によって停止させた。その後、すべてのウェルを検出のためのＨＲＰコンジュゲート化抗Ｃ３ポリクローナル抗体とインキュベーションした。精製ｉＣ３ｂタンパク質もまた希釈し、希釈血清と並行して、示される時間にわたってインキュベーションして、各時点についての標準曲線を作製した。希釈血清におけるｉＣ３ｂの濃度を各時点についての対応するｉＣ３ｂ標準曲線から導いた。図３６は、これらの試料において経時的に検出されるｉＣ３ｂの相対的レベルを示しており、ｉＣ３ｂレベルの倍増が、１５分という短いインキュベーションによって示される。
【０２１２】
実施例１９
抗原：抗体複合体の非存在におけるＣ３活性化
ウェルを抗オボアルブミン抗体（これはＣ３もｉＣ３ｂも認識しない）により被覆し、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ  ３７５３８）によりブロッキング処理した後、ヒト血清をこのようなウェルにおいてＶｅｒｏｎａｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｏｎｚａ、１２−６２４Ｅ）で希釈し、１０ｍＭのＥＤＴＡの存在下／非存在で１０分間または６０分間インキュベーションした。洗浄後、ウェルを、Ｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉ．、１８５４０６０）およびＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ＳｕｂｓｔｒａｔｅのＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉ．、１８５４０５０）を使用する検出のためのＨＲＰコンジュゲート化抗Ｃ３ポリクローナル抗体とともに６０分間インキュベーションした。ウェルを４５０ｎｍにおいて吸光度について読み取った。
【０２１３】
図３７は、本実験における血清由来Ｃ３がＯＶＡ被覆プレートでの１０分間または６０分間のインキュベーションの後で有意に活性化されたことを示す。特定の理論にとらわれることを望まないが、この活性化はＥＤＴＡ感受性の活性化経路を介してであると思われる。Ｃ３の沈着がオボアルブミンの非存在下において抗オボアルブミン抗体被覆ウェルの表面に生じたことは注目すべきことであり、このことは、オボアルブミン：オボアルブミン抗体複合体がＣ３の活性化および沈着のために要求されないことを示す。この非常に予想外の結果は、観察されたＣ３沈着がおそらくは、ＥＬＩＳＡアッセイに通常的に伴う従来の捕獲現象により生じていないことを意味する。
【０２１４】
実施例２０
抗体被覆ウェルの非存在下におけるＣ３活性化
ウェルを（抗体の非存在下で）ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒによりブロッキング処理し、ヒト血清をこのようなウェルにおいてＶｅｒｏｎａｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｏｎｚａ、１２−６２４Ｅ）で希釈し、１０ｍＭのＥＤＴＡの存在下／非存在で１０分間または６０分間インキュベーションした。洗浄後、ウェルを、Ｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉ．、１８５４０６０）およびＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ＳｕｂｓｔｒａｔｅのＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉ．、１８５４０５０）を使用する検出のためのＨＲＰコンジュゲート化抗Ｃ３ポリクローナル抗体とともに６０分間インキュベーションした。ウェルを４５０ｎｍにおいて吸光度について読み取った。
【０２１５】
図３８は、ヒト血清由来のＣ３が明らかに、ＥＤＴＡ感受性経路を介して活性化され、抗体の非存在下において緩衝液によりブロッキング処理されるウェルの表面に沈着することを示す。したがって、実施例１９で示されるように、抗原：抗体複合体がＣ３の活性化および沈着のために要求されないだけでなく、抗体さえもが、この現象を観察するために要求されない。上記の実施例１９の場合と同じように、この非常に予想外の結果は、観察されるＣ３沈着が、ＥＬＩＳＡイムノ検出に通常的に伴う捕獲現象でないことを示している。
【０２１６】
本発明の特定の実施形態を例証し、説明したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な他の変更および変形をなすことができることは当業者には明らかなことであろう。したがって、本発明の範囲内であるすべてのかかる変更および変形は、添付の特許請求の範囲に包含されると解釈される。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２８】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図１】
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【図８】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２１】
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【図２７】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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