(57)【要約】  本発明は、ADAMTS-5のスペーサードメインに含まれるエピトープを認識および結合できる抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント、同物をコードしている核酸および発現ベクター、その産生方法および使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ADAMTS-5の配列番号2の領域aa.732からaa.874に含まれるエピトープを認識および結合できる抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号62、65、68、71、74、77、80、83、86、89および92からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%の同一性を有する少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDRH3)アミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項３】
配列番号61、64、67、70、73、76、79、82、85、88および91からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%の同一性を有する重鎖相補性決定領域(CDRH2)アミノ酸配列をさらに含む、請求項2に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項４】
配列番号60、63、66、69、72、75、78、81、84、87および90からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%の同一性を有する重鎖相補性決定領域(CDRH1)アミノ酸配列をさらに含む、請求項3に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項５】
配列番号29、32、35、38、41、44、47、50、53、56および59からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する少なくとも1つの軽鎖相補性決定領域(CDRL3)アミノ酸配列をさらに含む、請求項2から4のいずれか一項に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項６】
配列番号28、31、34、37、40、43、46、49、52、55および58からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する1つの軽鎖相補性決定領域(CDRL2)アミノ酸配列をさらに含む、請求項5に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項７】
配列番号27、30、33、36、39、42、45、48、51、54および57からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する1つの軽鎖相補性決定領域(CDRL1)アミノ酸配列をさらに含む、請求項6に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項８】
配列番号60、63、66、69、72、75、78、81、84、87および90からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する重鎖相補性決定領域(CDRH1)アミノ酸配列ならびに配列番号61、64、67、70、73、76、79、82、85、88および91からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する重鎖相補性決定領域(CDRH2)アミノ酸配列ならびに配列番号62、65、68、71、74、77、80、83、86、89および92からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する重鎖相補性決定領域(CDRH3)アミノ酸配列を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項９】
配列番号27、30、33、36、39、42、45、48、51、54および57からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する軽鎖相補性決定領域(CDRL1)アミノ酸配列ならびに配列番号28、31、34、37、40、43、46、49、52、55および58からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する軽鎖相補性決定領域(CDRL2)アミノ酸配列ならびに配列番号29、32、35、38、41、44、47、50、53、56および59からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する軽鎖相補性決定領域(CDRL3)アミノ酸配列をさらに含む、請求項8に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
配列番号60に少なくとも80%同一性を有するCDRH1アミノ酸配列、配列番号61に少なくとも80%同一性を有するCDRH2アミノ酸配列および配列番号62に少なくとも80%同一性を有するCDRH3アミノ酸配列を含む、請求項8に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
配列番号27に少なくとも80%同一性を有するCDRL1アミノ酸配列、配列番号28に少なくとも80%同一性を有するCDRL2アミノ酸配列および配列番号29に少なくとも80%同一性を有するCDRL3アミノ酸配列をさらに含む、請求項10に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
配列番号81に少なくとも80%同一性を有するCDRH1アミノ酸配列、配列番号82に少なくとも80%同一性を有するCDRH2アミノ酸配列および配列番号83に少なくとも80%同一性を有するCDRH3アミノ酸配列を含む、請求項8に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
配列番号48に少なくとも80%同一性を有するCDRL1アミノ酸配列、配列番号49に少なくとも80%同一性を有するCDRL2アミノ酸配列および配列番号50に少なくとも80%同一性を有するCDRL3アミノ酸配列をさらに含む、請求項12に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
配列番号87に少なくとも80%同一性を有するCDRH1アミノ酸配列、配列番号88に少なくとも80%同一性を有するCDRH2アミノ酸配列および配列番号89に少なくとも80%同一性を有するCDRH3アミノ酸配列を含む、請求項8に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
配列番号54に少なくとも80%同一性を有するCDRL1アミノ酸配列、配列番号55に少なくとも80%同一性を有するCDRL2アミノ酸配列ならびに配列番号56に少なくとも80%同一性を有するCDRL3アミノ酸配列をさらに含む、請求項14に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
モノクローナル抗体またはキメラもしくはヒト化もしくは脱免疫化もしくは完全なヒト抗体である、請求項1から15のいずれか一項に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
軟骨分解に関連する状態の処置および/または予防における使用のための、請求項1から16のいずれか一項に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
変形性関節症または関節リウマチのヒトでの処置および/または予防における使用のための、請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
請求項1から18に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントをコードしている核酸分子。
【請求項２０】
配列番号99から配列番号120からなる群から選択される少なくとも1つの核酸配列を含む、請求項19に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントをコードしている核酸分子。
【請求項２１】
請求項1から18のいずれか一項に記載の抗体をコードしている発現ベクター。
【請求項２２】
請求項19または20に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２３】
請求項1から18のいずれか一項に記載の抗体を産生する、請求項22に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
請求項23に記載の抗体を産生する細胞を培養する工程および細胞培養物から抗体を回収する工程を含む、請求項1から18のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法。
【請求項２５】
請求項1から18のいずれか一項に記載の少なくとも1つの抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物。
【請求項２６】
関節内投与における使用のための請求項25に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨分解に関連する状態の処置において有用な抗ADAMTS-5抗体に関する。
【０００２】
具体的にはそのような分解は、変形性関節症および他の形態の関節炎において観察される。
【背景技術】
【０００３】
変形性関節症(OA)は、重複する別個の疾患の集まりであり、異なる病因を有するが類似する生物学的、形態学的および臨床転帰を有する場合がある。疾患経過は、関節軟骨を冒すだけでなく、軟骨下骨、靱帯、包、滑膜および関節周囲筋肉を含む接合部全体を巻き込む。最終的には関節軟骨は、細線維化、亀裂、潰瘍および接合部表面の全層の厚さの損失を伴って変性する。この状態は、骨の肥大(骨棘および軟骨下骨硬化症)ならびに包の肥厚を伴う滑膜接合部内の関節軟骨の損失のある局所的領域によって特徴付けられる。それは、傷害への滑膜接合部の反応として解釈できる。この現象はいかなる接合部においても生じる場合があるが、最も一般的には手、脊椎、膝、足および臀部の選択された接合部においてである。この病理学的変化は、重度の場合、放射線学的変化(接合部腔の損失および骨棘)を生じ、さまざまな接合部部位でOAの有病率を推定するために疫学的研究において使用されている。OAの発症の根底の分子的および細胞的機序は、現在未知であり、異常な負荷および外傷が関与する可能性があると仮定されているが、遺伝および遺伝的因子も関与していることは確実であると考えられる。炎症は(存在する場合)、原発事象に続発するにすぎない。
【０００４】
OAは、関節炎の最も一般的な形態である。世界保健機関(WHO)は、世界的に60歳以上の男性の9.6%および女性の18%が症候性のOAを有すると推定しており、OAを女性において4番目、男性において8番目の身体障害の原因として分類している。身体障害の危険性は、膝のOAと心疾患とにおいて同じであると考えられている。
【０００５】
関節炎の別の一般的形態である関節リウマチ(RA)は、軟骨分解、骨びらんおよび疼痛を導く関節滑膜炎によって特徴付けられ、重度の身体障害および若年死亡を導く慢性炎症性疾患である。
【０００６】
OAおよびRAは、異なる原因によって引き起こされ、異なる経路によって進行する場合があるが、それらは、軟骨マトリクス合成および崩壊における不均衡からなる根底にあるプロセスを共有し、結果として接合部運動の制限、接合部不安定性、疼痛および慢性身体障害を生じる関節軟骨の破壊を導く。さらに、かなりの数の患者がOAおよびRAによって冒されているにもかかわらず、それらの病因学、病因および進行に関しては比較的わずかしか周知でない。さらに印象的には、それらの処置のためには疾患修飾剤(disease-modifying agent)抗リウマチ薬(DMARD)はほとんどなく、主にRAに限定されている。
【０００７】
OAについて、治療法がないことから、処置は対症療法的にすぎない場合があり、セレコキシブなどのCOX-2選択的阻害剤、ならびにナプロキセンおよびジクロフェナクなどの伝統的非ステロイド性抗炎症剤(NSAID)、またはアセトアミノフェンなどの疼痛管理のためのさらに古い薬物の使用に限られている。コンドロイチンおよび硫酸グルコサミンなどの化合物を含む薬物の追加的分類も、OAのための任意選択処置として存在するが、多数の医師はそれらの効能に関して確信がもてないままである。
【０００８】
RAに関しては過去10年間に、DMARD(具体的にはメトトレキサート)の最適な使用、および鎮痛を提供し、ある程度炎症を管理する典型的にはNSAIDおよび/または副腎皮質ステロイドによって支持される新規生物学的薬剤(biologic agent)の利用可能性が、その順調なマネジメントを劇的に増強した。しかし伝統的DMARDは、作用の遅い出現および頻繁なモニタリングを要求する毒性を有する。さらにNSAID使用は、古典的NSAID薬物を考える場合には胃腸管副作用によって、選択的COX-2阻害剤を考える場合には心血管系および腎臓の副作用によって影を投げかけられてきた。
【０００９】
したがって、集団の平均年齢の増加に伴って予測される出現の増加を有しているOAおよびRAは世界中の数百万の人々を冒すことから、軟骨分解を予防する新規治療剤のための研究は非常に関心の持たれるものである。
【００１０】
OAおよびRAにおいて生じる軟骨分解は、その構造要素の酵素切断の結果である。軟骨は、軟骨細胞ならびにプロテオグリカン(主にアグリカン)、コラーゲンおよび水からなる細胞外マトリクス(ECM)によって主に構成されている。マトリクス内では、アグリカン、ヒアルロン酸(HA)およびII型コラーゲンの間の相互作用が軟骨に特有の圧縮性および弾性、荷重負担および接合部運動機能に対する生体力学的特性を提供する。アグリカンは3個の球状領域:G1およびタンパク質のN-末端付近のG2およびC-末端のG3からなる。G1およびG2領域は、短い球間ドメイン(IGD)によって分離されており、一方G2およびG3領域は長いグルコサミノグリカン(GAG)付着領域によって分離されている。G1ドメインは、補助的なタンパク質を通じて、HAへのアグリカンの結合領域を構成する。アグリカンのGAG付着領域は、水に結合するために必要な高アニオン性電荷密度を提供し、軟骨にその機能を保証するための特有の浸透性特性を付与する。したがって、アグリカン切断を導く生化学的機序を理解することは、OA疾患を遮断または管理するために好適な治療を開発する助けになる可能性がある。関節炎における軟骨完全性の損失は、タンパク質のタンパク質分解性切断によるアグリカン完全性の低下と関連している。アグリカナーゼ(主にアグリカナーゼ-2(ADAMTS-5とも称される)およびアグリカナーゼ-1(ADAMTS-4とも称される))は、近年、軟骨分解についての鍵となる酵素に属するとして同定された。具体的には、刊行物Glasson et al., 2005. Nature. 434:644〜648)およびStanton et al., 2005. Nature. 434:648〜652)は、ADAMTS-5がマウスにおけるOAおよびRAの2つのモデルに関連する病理学的接合部変化において基礎的な役割を演じることを実証した。ADAMTS-4および-5の両方は、グルタミルエンドペプチダーゼであり、5個の特異的部位:Glu373-Ala374(球間ドメイン-IGD)、Glu1545-Gly1546、Glu1714-Gly1715、Glu1819-Ala1820、およびGlu1919-Leu1920結合(ヒト配列)でアグリカンを切断し、軟骨の破壊を生じる。
【００１１】
ヒトADAMTS-4(図1、配列番号1)およびADAMTS-5(図1、配列番号2)は、細胞から細胞外腔へ分泌される多ドメインメタロプロテイナーゼである。両酵素は、シグナル配列(SS)、プロドメイン(Pro)、触媒メタロプロテイナーゼドメイン(Cat)、ディスインテグリン(Dis)ドメイン、トロンボスポンジンI型(TS)ドメイン、システインリッチ(CysR)ドメインおよびスペーサー(Sp)ドメインからなる類似するドメイン配置を有する。付加的にADAMTS-5は、スペーサードメイン後に外部TSドメインを含有する。触媒ドメイン外側の上に述べたすべてのドメイン領域は、天然タンパク質基質の認識およびプロセシングにおいて重要な役割を演じ、「エキソサイト」と称される。
【００１２】
例えば、アグリカナーゼのSpおよびCysRドメインは、プロテイナーゼのそれらの基質に対する親和性を調節するGAG-結合モチーフを含有することが実証された(Kashiwagi et al., 2004. J Biol Chem. 279:10109〜10119); (Gendron et al., 2007. J Biol Chem. 282:18294〜18306); (Flannery, Curr. 11:614〜619); (Zeng et al., 2006. Biochim Biophys Acta. 1760:517〜524)。
【００１３】
したがって、OAおよび/またはRAの処置のためのADAMTS-4および-5に対する阻害剤の開発における関心が高まっている。多数のメタロプロテイナーゼ阻害剤が開発されており、いくつかはがん(Zucker et al., 2000. Oncogene. 19:6642〜6650)および関節リウマチ(Milner and Cawston, 2005. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4:363〜375)を有する患者において臨床的に検査されたが、それらは効能を示すことができず筋骨格痛および中程度の血小板減少症などの副作用を示した(Zucker et al., 2000. Oncogene. 19:6642〜6650)。これらの失敗は、阻害剤の選択性の欠如および生物学的に重要な標的外メタロプロテイナーゼの阻害および他の効果によると考えられている。それにより選択性は、無毒性治療用阻害剤のための必須条件である。特定のメタロプロテイナーゼに対する選択性を増加させる1つの方法は、アロステリックまたはエキソサイト結合を生成することである。酵素エキソサイトに結合する阻害剤は、天然ECM基質との相互作用を遮断でき、それらが高度に特異的であり、標的基質の加水分解だけを効果的に遮断し、それによりin vivo副作用を最少化する可能性があることから、活性部位特異的阻害剤への魅力的な代替である可能性がある(Troeberg et al., 2008. Faseb J. 22:3515〜3524)。
【００１４】
出願WO 2011/002968は、ヒトADAMTS-5の触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインの両方に結合できる抗体を開示している。文書WO 01/11074およびWO 00/53774は、ADAMTS-5タンパク質を開示し、そのようなタンパク質に対する抗体を一般に参照している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】WO 2011/002968
【特許文献２】WO 01/11074
【特許文献３】WO 00/53774
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Glasson et al., 2005. Nature. 434:644〜648
【非特許文献２】Stanton et al., 2005. Nature. 434:648〜652
【非特許文献３】Kashiwagi et al., 2004. J Biol Chem. 279:10109〜10119
【非特許文献４】Gendron et al., 2007. J Biol Chem. 282:18294〜18306
【非特許文献５】Flannery, Curr. 11:614〜619
【非特許文献６】Zeng et al., 2006. Biochim Biophys Acta. 1760:517〜524
【非特許文献７】Zucker et al., 2000. Oncogene. 19:6642〜6650
【非特許文献８】Milner and Cawston, 2005. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4:363〜375
【非特許文献９】Troeberg et al., 2008. Faseb J. 22:3515〜3524
【非特許文献１０】Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980
【非特許文献１１】Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991
【非特許文献１２】Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901〜917, 1987
【非特許文献１３】Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619〜1633, 2008
【非特許文献１４】Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91, 2007
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【非特許文献１６】Clarkson et al., Nature 352:624〜628, 1991
【非特許文献１７】Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865〜881(1999)
【非特許文献１８】Visintin et al., 2004. J Immunol Methods. 290:135〜153)
【非特許文献１９】Giudicelli et al., 2005. Stud Health Technol Inform. 116:3〜8
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【非特許文献２２】Orlandi et al., 1992. Biotechnology. 24:527〜531
【非特許文献２３】Visintin and Cattaneo, 2001. Antibody Engineering. 1:790
【非特許文献２４】Visintin et al., 2004. Methods. 34:200〜214
【非特許文献２５】Visintin et al., 2002. J Mol Biol. 317:73〜83
【非特許文献２６】Visintin et al., 1999. Proc Natl Acad Sci U S A. 96:11723〜11728
【非特許文献２７】Hanahan, 1983. J Mol Biol. 166:557〜580
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【非特許文献２９】Umetsu et al., 2003. J Biol Chem. 278:8979〜8987. Epub 2003 Jan 8977
【非特許文献３０】Schuck, 1997. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26:541〜566
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【非特許文献３２】Mason et al., 2001. Osteoarthritis Cartilage. 9:85〜91
【非特許文献３３】Mankin et al., 1971. J Bone Joint Surg Am. 53:523〜537
【非特許文献３４】Pritzker et al., 2006. Osteoarthritis Cartilage.14:13〜29
【非特許文献３５】Echtermeyer, F. et al. 2009. Nat Med. 15(9):1072〜6
【非特許文献３６】Noe et al., 2005. Bioorg Med Chem Lett. 15:2808〜2811
【非特許文献３７】Mosyak et al., 2008. Protein Sci. 17:16〜21
【非特許文献３８】Fushimi et al., 2008. J Biol Chem. 283:6706〜6716
【非特許文献３９】Troeberg et al., 2009. Matrix Biol. 28:463〜469
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明において、本発明者らは、ADAMTS-5のスペーサードメインに含まれるエピトープを認識および結合する抗体を単離した(すなわち抗Sp_ADAMTS-5抗体)。抗体は、ヒトにおける治療適用に有用である。典型的には抗体は、患者に投与された際の抗体に対する免疫応答についての危険性を最少化するために完全なヒトまたはキメラまたはヒト化されている。本明細書に記載のとおり、例えば抗原結合抗体フラグメント、抗体誘導体および多特異性分子などの他の抗原結合分子も設計され、そのような抗体から由来できる。本発明の抗体は、軟骨マトリクス変性に対して阻害作用を示し、それらは軟骨マトリクス分解酵素産生を管理し、軟骨マトリクス合成を改善し、それにより軟骨分解を処置および/または予防する。したがって抗体は、軟骨分解に関連する状態の処置および/または予防において使用できる。そのような状態は、変形性関節症(OA)、関節リウマチ(RA)、痛風、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、化膿性関節炎、リウマチ性多発筋痛症、強直性脊椎炎、偽痛風、多発性筋炎、線維筋痛症またはライム病を含む。
【００１８】
具体的には本発明の抗体は、OAおよびRAの早期から進行期に分類される疾患を処置および/または予防するために使用できる。OAの初期段階から進行期からの各段階は、OARSIおよびMankin分類に従って分類される。
【００１９】
両病態では、上に述べたグレードまたはスコアのいずれかに分類された疾患は、疾患の状態として軟骨変性を伴っている。本発明の抗体は、OAおよびRAの初期から進行期に分類される疾患を処置または予防するために効果的に使用できる。
【００２０】
そのような抗体の抗体結合フラグメント、および操作された抗体フラグメント、抗体誘導体、二特異性抗体および他の多特異性分子を含むそのような抗原結合フラグメントを含む分子も本発明の対象である。
【００２１】
医薬組成物およびキットまたは本発明の抗体を含む他の物品も本発明の一部である。
【００２２】
したがってADAMTS-5の配列番号2のaa.732からaa.874領域に含まれるエピトープを認識および結合できる抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは本発明の対象である。好ましくはエピトープは、配列番号2のaa.732からaa745に、好ましくは配列番号2のaa746からaa763に、好ましくは配列番号2のaa764からaa779に、好ましくは配列番号2のaa780からaa795に、好ましくは配列番号2のaa796からaa811に、好ましくは配列番号2のaa812からaa827に、好ましくは配列番号2のaa828からaa843に、好ましくは配列番号2のaa844からaa859に、好ましくは配列番号2のaa860からaa874に含まれる。さらに好ましくはエピトープは、配列番号2のaa.757からaa771領域に含まれる。
【００２３】
好ましくは上に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号:62、65、68、71、74、77、80、83、86、89および92からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDRH3)アミノ酸配列を含む。
【００２４】
好ましくはさらに上に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号61、64、67、70、73、76、79、82、85、88および91からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する重鎖相補性決定領域(CDRH2)アミノ酸配列を含む。
【００２５】
好ましくは本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号60、63、66、69、72、75、78、81、84、87および90からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する重鎖相補性決定領域(CDRH1)アミノ酸配列をさらに含む。
【００２６】
好ましい実施形態では上に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号29、32、35、38、41、44、47、50、53、56および59からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する少なくとも1つの軽鎖相補性決定領域(CDRL3)アミノ酸配列をさらに含む。
【００２７】
好ましい実施形態では本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55および58からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する1つの軽鎖相補性決定領域(CDRL2)アミノ酸配列をさらに含む。
【００２８】
好ましい実施形態では上に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54および57からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する1つの軽鎖相補性決定領域(CDRL1)アミノ酸配列をさらに含む。
【００２９】
好ましくは本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号60、63、66、69、72、75、78、81、84、87および90からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する重鎖相補性決定領域(CDRH1)アミノ酸配列ならびに配列番号61、64、67、70、73、76、79、82、85、88および91からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する重鎖相補性決定領域(CDRH2)アミノ酸配列ならびに配列番号62、65、68、71、74、77、80、83、86、89および92からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する重鎖相補性決定領域(CDRH3)アミノ酸配列を含む。
【００３０】
好ましい実施形態では上に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号27、30、33、36、39、42、45、48、51、54および57からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する軽鎖相補性決定領域(CDRL1)アミノ酸配列ならびに配列番号28、31、34、37、40、43、46、49、52、55および58からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する軽鎖相補性決定領域(CDRL2)アミノ酸配列ならびに配列番号29、32、35、38、41、44、47、50、53、56および59からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%同一性を有する軽鎖相補性決定領域(CDRL3)アミノ酸配列をさらに含む。
【００３１】
さらに好ましい実施形態では上に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号60に少なくとも80%同一性を有するCDRH1アミノ酸配列、配列番号61に少なくとも80%同一性を有するCDRH2アミノ酸配列、配列番号62に少なくとも80%同一性を有するCDRH3アミノ酸配列を含む。
【００３２】
さらに好ましい実施形態では本発明の抗体、組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号27に少なくとも80%同一性を有するCDRL1アミノ酸配列、配列番号28に少なくとも80%同一性を有するCDRL2アミノ酸配列および配列番号29に少なくとも80%同一性を有するCDRL3アミノ酸配列をさらに含む。
【００３３】
さらに好ましい実施形態では上に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号81に少なくとも80%同一性を有するCDRH1アミノ酸配列、配列番号82に少なくとも80%同一性を有するCDRH2アミノ酸配列および配列番号83に少なくとも80%同一性を有するCDRH3アミノ酸配列を含む。さらに好ましい実施形態では本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号48に少なくとも80%同一性を有するCDRL1アミノ酸配列、配列番号49に少なくとも80%同一性を有するCDRL2アミノ酸配列および配列番号50に少なくとも80%同一性を有するCDRL3アミノ酸配列をさらに含む。
【００３４】
好ましくは本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号87に少なくとも80%同一性を有するCDRH1アミノ酸配列、配列番号88に少なくとも80%同一性を有するCDRH2アミノ酸配列および配列番号89に少なくとも80%同一性を有するCDRH3アミノ酸配列を含む。さらに好ましくは抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号54に少なくとも80%同一性を有するCDRL1アミノ酸配列、配列番号55に少なくとも80%同一性を有するCDRL2アミノ酸配列および配列番号56に少なくとも80%同一性を有するCDRL3アミノ酸配列をさらに含む。
【００３５】
本発明では「少なくとも80%同一性」は、同一性が参照配列に少なくとも80%または少なくとも85%もしくは90%もしくは95%もしくは100%配列同一性であってよいことを意味する。
【００３６】
好ましくは上に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体またはキメラもしくはヒト化、もしくは脱免疫化(deimmunized)もしくは完全なヒト抗体である。
【００３７】
医学的使用のための上に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは本発明のさらなる対象である。好ましくは、変形性関節症および/または関節リウマチなどの軟骨分解に関連する状態の処置および/または予防における使用のため。好ましくは上に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、シンデカン-4によって介在される病理学的応答、具体的にはシンデカン-4によって介在される軟骨細胞の病理学的応答の処置のために使用できる。
【００３８】
上に定義の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントをコードしている核酸分子は、本発明のさらなる対象である。好ましくは本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントをコードしている核酸分子は、配列番号99から配列番号120からなる群から選択される少なくとも1つの核酸配列を含む。好ましくは核酸は、次の配列：配列番号99、100、113、114、117および118の少なくとも1つを含む。
【００３９】
本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントをコードしている発現ベクターは、本発明のさらなる対象である。
【００４０】
上に記載の核酸を含む宿主細胞は、本発明のさらなる対象である。好ましくは宿主細胞は、本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントを産生する。
【００４１】
上に記載の抗体を産生する細胞を培養する工程および細胞培養物から抗体を回収する工程を含む本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントを産生する方法は、本発明のさらなる対象である。
【００４２】
上に記載の少なくとも1つの抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物は、本発明の別の対象である。組成物は、抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントの有効量を含む。医薬組成物は、この分野では従来法であり、通常の一般的知識だけに基づいて当業者によって作製できる。抗体ならびに/またはそのフラグメントおよび/もしくは組換え誘導体および/もしくはコンジュゲートを少なくとも1つの薬学的に許容される添加剤および/またはビヒクルとの混合で含む医薬組成物は、本発明の範囲に含まれる。
【００４３】
好ましい実施形態では本発明による組成物は、関節内投与における使用のためである。
【００４４】
上に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントの治療有効量を投与する工程を含む、変形性関節症、関節リウマチおよび関節炎の他の形態などの軟骨分解に関連する状態を処置および/または予防する方法も本発明の対象である。上に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントの治療有効量を投与する工程を含む、接合部破壊を治療および/または予防するための、自己免疫および/または炎症性疾患の処置および/または予防のための方法も本発明の対象である。
【００４５】
上に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントの有効量を投与する工程を含む、ADAMTS-5を低減するおよび/または阻害する方法は本発明の対象である。
【００４６】
本発明では、開示のCDRの変異体は、CDRの配列中の1つまたは複数のアミノ酸に変異導入する工程によって生成できる。CDR中に適切に位置付けられた単一アミノ酸置換が親和性を改善するために十分である場合があることは周知である。研究者らは、いくつかの免疫グロブリン産生物の親和性を約10倍増大させるために部位特異的変異導入を使用した。CDRに変異導入する工程によって抗体の親和性を増大させるまたは減少させる(すなわち調節する)この方法は、一般的知識である(例えば、Paul, W. E., 1993を参照されたい)。したがって、結合親和性または特異性を増大させるまたは減少させる(すなわち調節する)ための本発明のCDRへのアミノ酸の置換、欠失または付加も本発明の範囲内である。
【００４７】
簡潔にするために、本発明による好ましい抗体は、Table III(表3)に示すとおり名称CRB0017(配列番号3および配列番号4を含む)、CRB0102(配列番号17および配列番号18を含む)ならびにCRB0123(配列番号21および配列番号22を含む)で同定される。一方本発明は、(本発明の例示として)そのような抗体に注目し、当業者は、本開示が提示された際に、他の類似の抗体、およびその抗体フラグメントならびにこれらの類似の抗体の抗体フラグメントが本発明の範囲内で産生および使用できることを認識する。そのような類似の抗体は、当業者による妥当な量の実験作業によって産生できる。
【００４８】
さらに好ましくは抗体は、エピトープ結合領域を含有するscFv、Fvフラグメント、Fabフラグメント、F(ab)2フラグメント、多量体抗体、ペプチドまたはタンパク質分解性フラグメントである。好ましくはscFvフラグメントは、配列番号125から132および配列番号135、136、137の群から選択される配列を含む。
【００４９】
本発明の抗体またはその機能性誘導体をコードしている核酸、または上記核酸とハイブリダイズする、またはその変性配列からなる核酸は、本発明のさらなる対象である。
【００５０】
モノクローナル抗体の調製のための方法は、当業者の技能の範囲内であり、標準的手順により宿主細胞を培養する工程および抗体を単離する工程を含む。
【００５１】
本発明の産業的態様に関する限り本明細書に開示の抗体は、本技術分野において通常行われるとおり医薬組成物中に好適に製剤されるべきである。
【００５２】
本発明の抗体は、アミノ酸4個以下の、好ましくはアミノ酸2個以下の1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または挿入を含有する上に定義の少なくとも1つのCDRHを含む場合がある。本発明の抗体は、アミノ酸4個以下の、好ましくはアミノ酸2個以下の1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または挿入を含有する上に定義の少なくとも1つのCDRLをさらに含む場合がある。
【００５３】
本発明の抗体は、ADAMTS-5への結合について競合する。軟骨分解に関連する状態を処置するまたは予防するための方法は、上に記載の少なくとも1つの抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントの有効量をそれを必要とする患者に投与する工程を含む。いくつかの態様では本発明は、上に記載の少なくとも1つの抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントの有効量を投与する工程を含む対象におけるADAMTS-5のアグリカンへの結合を阻害する方法を含む。
【００５４】
本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、ADAMTS-5のスペーサードメインに、好ましくは≦2nMであるKdで選択的に結合する。
【００５５】
いくつかの態様では本発明は、対象における軟骨分解に関連する状態を処置するまたは予防するための方法を含み、方法は、本発明の少なくとも1つの抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントの有効量を、疼痛を特異的に遮断する薬剤と同時にまたは連続的にそれを必要とする対象に投与する工程を含む。
【００５６】
本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、ADAMTS-5に結合し、ADAMTS-5がアグリカンに結合する可能性を低減する中和抗体(すなわち、関連抗原の生物学的活性を低減するまたは無効にする抗体)である。
【００５７】
好ましくは、本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号2の残基732〜874内の位置でADAMTS-5に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは(ADAMTS-5に結合する場合)、ADAMTS-5の次の残基の少なくとも1つから8オングストローム以下に位置付けられる:T732、K733、I734、V735、G736、T737、F738、N739、K740、K741、S742、K743、G744、Y745、T746、D747、V748、V749、R750、I751、P752、E753、G754、A755、T756、H757、I758、K759、V760、R761、Q762、F763、K764、A765、K766、D767、Q768、T769、R770、F771、T772、A773、Y774、L775、A776、L777、K778、K779、K780、N781、G782、E783、Y784、L785、I786、N787、G788、K789、Y790、M791、I792、S793、T794、S795、E796、T797、I798、I799、D800、I801、N802、G803、T804、V805、M806、N807、Y808、S809、G810、W811、S812、H813、R814、D815、D816、F817、L818、H819、G820、M821、G822、Y823、S824、A825、T826、K827、E828、I829、L830、I831、V832、Q833、I834、L835、A836、T837、D838、P839、T840、K841、P842、L843、D844、V845、R846、Y847、S848、F849、F850、V851、P852、K853、K854、S855、T856、P857、K858、V859、N860、S861、V862、T863、S864、H865、G866、S867、N868、K869、V870、G871、S872、H873またはT874。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、抗体がADAMTS-5の残基の8オングストローム以内でADAMTS-5に結合することから遮断する。いくつかの実施形態ではADAMTS-5の残基は、次のADAMTS-5残基の少なくとも1つから選択される:T732、K733、I734、V735、G736、T737、F738、N739、K740、K741、S742、K743、G744、Y745、T746、D747、V748、V749、R750、I751、P752、E753、G754、A755、T756、H757、I758、K759、V760、R761、Q762、F763、K764、A765、K766、D767、Q768、T769、R770、F771、T772、A773、Y774、L775、A776、L777、K778、K779、K780、N781、G782、E783、Y784、L785、I786、N787、G788、K789、Y790、M791、I792、S793、T794、S795、E796、T797、I798、I799、D800、I801、N802、G803、T804、V805、M806、N807、Y808、S809、G810、W811、S812、H813、R814、D815、D816、F817、L818、H819、G820、M821、G822、Y823、S824、A825、T826、K827、E828、I829、L830、I831、V832、Q833、I834、L835、A836、T837、D838、P839、T840、K841、P842、L843、D844、V845、R846、Y847、S848、F849、F850、V851、P852、K853、K854、S855、T856、P857、K858、V859、N860、S861、V862、T863、S864、H865、G866、S867、N868、K869、V870、G871、S872、H873またはT874。
【００５９】
好ましくは本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、アグリカンがADAMTS-5に結合する位置と重複する位置でADAMTS-5に結合する。
【００６０】
好ましくは本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、ADAMTS-5上の次の残基の少なくとも1つの8オングストローム以内でアグリカンがADAMTS-5に結合する可能性を低減する:T732、K733、I734、V735、G736、T737、F738、N739、K740、K741、S742、K743、G744、Y745、T746、D747、V748、V749、R750、I751、P752、E753、G754、A755、T756、H757、I758、K759、V760、R761、Q762、F763、K764、A765、K766、D767、Q768、T769、R770、F771、T772、A773、Y774、L775、A776、L777、K778、K779、K780、N781、G782、E783、Y784、L785、I786、N787、G788、K789、Y790、M791、I792、S793、T794、S795、E796、T797、I798、I799、D800、I801、N802、G803、T804、V805、M806、N807、Y808、S809、G810、W811、S812、H813、R814、D815、D816、F817、L818、H819、G820、M821、G822、Y823、S824、A825、T826、K827、E828、I829、L830、I831、V832、Q833、I834、L835、A836、T837、D838、P839、T840、K841、P842、L843、D844、V845、R846、Y847、S848、F849、F850、V851、P852、K853、K854、S855、T856、P857、K858、V859、N860、S861、V862、T863、S864、H865、G866、S867、N868、K869、V870、G871、S872、H873またはT874。
【００６１】
本発明は、本明細書に開示の抗体の治療有効量、pHを約4.5から約6.5の範囲に維持する緩衝剤、および場合により界面活性剤を含む製剤を提供する。
【００６２】
製剤は、典型的には約0.1mg/mlから約100mg/mlの活性構成成分濃度としての本明細書に開示の抗体、本発明のその組換えまたは合成抗原結合フラグメントについてである。特定の実施形態では、抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント濃度は、約0.1mg/mlから1mg/ml;好ましくは1mg/mlから10mg/ml、好ましくは10から100mg/mlである。
【００６３】
本明細書の目的のための「医薬組成物」は、哺乳動物、特にヒトへの投与のために適合され好適なものである。したがって組成物は、哺乳動物における疾患または障害を処置するために使用できる。さらに組成物中の抗体は、治療的使用を妨害する可能性がある夾雑物(複数可)がそれから分離される1つまたは複数の精製または単離工程に供される。一般に医薬組成物は、治療用タンパク質および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。組成物は、通常無菌であり、凍結乾燥されてよい。医薬調製物は、下により詳細に記載される。
【００６４】
1つまたは複数の抗体の治療用製剤は、所望の程度の純度を有する抗体と生理学的に許容される担体、添加剤または安定化剤とを場合により混合する工程によって凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で調製できる(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980)。許容される担体、添加剤または安定化剤は、用いられる用量および濃度でレシピエントに無毒性であり、緩衝剤、抗酸化物質、保存剤、ペプチド、タンパク質、親水性ポリマー、EDTAなどのキレート剤、糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属複合体(例えば、Zn-タンパク質複合体);および/またはTWEEN(登録商標)、PLURONICS(登録商標)またはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤を含む場合がある。
【００６５】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術によってまたは界面重合化(例えば、それぞれヒドロキシメチルセロースもしくはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル、コロイド性薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)にまたはマクロエマルジョン)によって調製されたマイクロカプセル中に封じ込められていてよい。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980)に開示されている。in vivo投与のために使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、滅菌ろ過膜を通じたろ過によって容易に達成される。
【００６６】
別の実施形態では(疾患の予防または処置のための)本発明の1つまたは複数の抗Sp-ADAMTS-5抗体の適切な用量は、処置される疾患の種類、疾患の重症度および経過、抗体が予防または治療目的のいずれで投与されるか、薬歴、患者の病歴および抗体への応答ならびに主治医の裁量に依存する。抗体は、患者に一度にまたは一連の処置にわたって好適に投与される。疾患の種類および重症度に応じて、抗体またはそのフラグメント約1μg/kgから15mg/kgが、例えば1回もしくは複数回投与によるまたは継続的注入による患者への投与のための初回用量の候補である。状態に応じた数日またはそれ以上での反復投与のために、処置は疾患症状の所望の抑制が生じるまで維持される。しかし他の投与計画も有用である場合がある。この治療の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
【００６７】
抗体組成物は、適正な医療行為と一致する様式で製剤、投薬および投与されるべきである。本発明の抗体/誘導体は、任意の適切なルートで投与できる。これは(これだけに限らないが)、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、関節内、気管内、経口、経腸的、非経口、鼻腔内または皮膚投与を含む。投与の好ましい様式は、関節内ルートである。この内容において考慮すべき要因は、処置される具体的な障害、処置される具体的な哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与スケジュールおよび医師に周知の他の因子を含む。投与される抗体の「治療有効量」は、そのような考慮すべき要因によって左右され、疾患または障害を予防、回復または処置するために必要な最少量である。抗体は、問題の障害を予防または処置するために現在使用されている1つまたは複数の薬剤と共に製剤される必要はない(しかし場合により製剤される)。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害または処置の種類および上に考察された他の因子に依存する。
【００６８】
本明細書において用語「抗体」は、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、これだけに限らないがモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体(例えば、二特異性抗体)および抗体フラグメントを含む広義で種々の抗体構造を包含して使用される。
【００６９】
「抗体フラグメント」は、無処置抗体が結合する抗原に結合する無処置抗体の一部を含む無処置抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例は、これだけに限らないがFv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;二重特異性抗体;直鎖抗体;1本鎖抗体分子(例えばscFv);および抗体フラグメントから形成される多特異性抗体を含む。
【００７０】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合的アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を50%以上遮断する抗体を指し、反対に参照抗体は、競合的アッセイにおいて抗体のその抗原への結合を50%以上遮断する。例示的競合的アッセイは、本明細書で提供される。
【００７１】
用語「キメラ」抗体は、重鎖および/または軽鎖の一部が具体的な供給源または種に由来するが、重鎖および/または軽鎖の残りの部分は異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
【００７２】
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体の5個の主なクラスがあり:IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM、これらのいくつかはサブクラスにさらに分けられる場合がある(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2である。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ「アルファ」、「デルタ」、「イプシロン」、「ガンマ」および「ミュー」と称される。
【００７３】
本明細書における用語「Fc領域」は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のC-末端領域を限定して使用される。用語は、天然配列Fc領域および変種Fc領域を含む。本明細書で他に指定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載のとおりEUインデックスとも称されるEU番号付けシステムによる。
【００７４】
「フレームワーク」または「FR」は、高頻度可変領域(HVR)残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般にFRドメイン4個:FR1、FR2、FR3およびFR4からなる。したがってHVRおよびFR配列は、一般にVH(またはVL)において次の配列と考えられる:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。用語「全長抗体」、「無処置抗体」および「全抗体」は、天然抗体構造に実質的に類似の構造を有する、または本明細書に定義のFc領域を含有する重鎖を有する抗体を指して本明細書で互換的に用いられる。
【００７５】
用語「宿主細胞」「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」は、互換的に用いられ、外来性核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の後代を含む。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、初代形質転換細胞およびそれに由来する後代を継代数に関わらず含む。後代は、親細胞と核酸内容物について完全に同一ではない場合があり、変異を含有する場合がある。元の形質転換細胞において選別されたまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体後代は、本明細書に含まれる。「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生される抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源由来の抗体のものに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に排除する。
【００７６】
「ヒト共通フレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般にヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91〜3242, Bethesda MD (1991), vols. 1〜3におけるサブグループである。
【００７７】
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVR由来のアミノ酸残基およびヒトFR由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態ではヒト化抗体は、少なくとも1つの(典型的には2つの)可変ドメインの実質的にすべてを含み、HVR(例えばCDR)のすべてまたは実質的にすべては非ヒト抗体のものに対応し、FRのすべてまたは実質的にすべてはヒト抗体のものに対応する。場合によりヒト化抗体は、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでよい。抗体例えば非ヒト抗体は「ヒト化形態」、ヒト化を受けた抗体を指す。
【００７８】
「脱免疫化」抗体は、HLA結合の破損、T細胞刺激のための基本的な必要条件に基づいた免疫原性の低減を有する抗体である。
【００７９】
本明細書において使用される用語「高頻度可変性領域」または「HVR」は、配列において高頻度可変性であるおよび/または構造的に定められたループ(「高頻度可変性ループ」)を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、天然4本鎖抗体は、HVRを6個含み;3個はVH中にあり(HI、H2、H3)、3個はVL中にある(LI、L2、L3)。HVRは、一般に高頻度可変性ループ由来のおよび/または「相補性決定領域」(CDR)由来のアミノ酸残基を含み、後者は配列可変性が最も高いおよび/または抗原認識に関与する。例示的高頻度可変性ループは、アミノ酸残基26〜32(LI)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(HI)、53〜55(H2)および96〜101(H3)に生じる(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901〜917, 1987)。例示的CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3)は、LIのアミノ酸残基24〜34、L2の50〜56、L3の89〜97、HIの31〜35B、H2の50〜65およびH3の95〜102に生じる(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)。VH中のCDR1を除いて、CDRは、一般に高頻度可変性ループを形成するアミノ酸残基を含む。CDRは、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」または「SDR」も含む。SDRは、短縮CDRまたはa-CDRと称されるCDR領域内に含有される。例示的a-CDR(a-CDR-Ll、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-Hl、a-CDR-H2およびa-CDR-H3)は、LIのアミノ酸残基31〜34、L2の50〜55、L3の89〜96、HIの31〜35B、H2の50〜58およびH3の95〜102に生じる(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619〜1633, 2008を参照されたい)。他に示す場合を除いて、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基(例えば、FR残基)は、本明細書でKabatらに従って番号付けされる。
【００８０】
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一の抗体集団から得られた抗体を指し、すなわち集団を含む個々の抗体は(例えば、天然に存在する変異を含有するまたはモノクローナル抗体調製物の産生の際に生じる)可能性がある変種抗体(そのような変種は、一般に少量で存在する)を除いて同一であり、および/または同じエピトープに結合する。さまざまな決定基(エピトープ)に対して方向付けられたさまざまな抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して方向付けられている。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られた抗体の特徴を示し、いかなる具体的方法による抗体の産生を必要とすると解釈されない。例えば本発明により使用されるモノクローナル抗体は、これだけに限らないが融合細胞法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法およびヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含有しているトランスジェニック動物を利用する方法を含む種々の技術によって作製でき、そのような方法およびモノクローナル抗体を作るための他の例示的方法は本明細書に記載されている。
【００８１】
用語「パッケージ挿入物」は、治療用産生物の市販パッケージに通例含まれる説明書を指して使用され、そのような治療用産生物の使用に関する適応症、使用法、用量、投与、組合せ療法、禁忌および/または警告についての情報を含む。
【００８２】
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性百分率(%)」は、配列を配列比較し、最大の配列同一性百分率を達成するためにギャップを導入(必要な場合)した後に、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性百分率を決定する目的のための配列比較は、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して当業者の技能の範囲内である種々の方法で達成できる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大の配列比較を達成するために必要ないかなるアルゴリズムも含んで、配列を配列比較するための適切なパラメーターを決定できる。
【００８３】
用語「医薬製剤」は、それに含有される活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、製剤が投与される対象に許容されないほど毒性である追加的要素を含有しない調製物を指す。
【００８４】
「薬学的に許容される担体」は、対象に無毒性である活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、これだけに限らないが、緩衝剤、添加剤、安定剤または保存剤を含む。
【００８５】
本明細書において使用される「処置」(および「処置」または「処置する」などの文法的変化形)は、処置される個体の自然経過を変更させる試みにおける臨床的介入を指し、予防のためにまたは臨床病理的経過の際にのいずれでも実施できる。処置の望ましい効果は、これだけに限らないが、疾患の発症または再発を予防する、症状の軽減、疾患の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移を予防する、疾患進行の速度の低下、疾患状態の回復または緩和および寛解または予後の改善を含む。いくつかの実施形態では本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるためまたは疾患の進行を遅くするために使用される。
【００８６】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体から抗原への結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン(それぞれVHおよびVL)は、一般に類似の構造を有し、各ドメインは保存されたフレームワーク領域(FR)4個およびの高頻度可変性領域(HVR、例えばKindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91, 2007を参照されたい)3個を含む。単一のVHまたはVLドメインが抗原結合特異性を付与するために十分である場合がある。さらに、具体的な抗原に結合する抗体は、相補的VLまたはVHドメインのライブラリーを選別するための抗原に結合する抗体由来のVHまたはVLドメインを使用して単離できる(例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880〜887, 1993; Clarkson et al., Nature 352:624〜628, 1991参照されたい)。
【００８７】
本明細書において使用される用語「ベクター」は、それが連結する別の核酸を増やすことができる核酸分子を指す。用語は、自己複製核酸構造としてのベクターおよび、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらの作動可能に連結された核酸の発現を方向付けることができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
【００８８】
別の態様では抗体またはその誘導体は、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22または24の群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(VH)配列を含む。
【００８９】
別の態様では抗体またはその誘導体は、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21または23の群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VKまたはVL)配列を含む。
【００９０】
特定の実施形態では、前記配列番号に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一性を有するVH配列またはVK/VL配列は、参照配列と比較して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含有するが、その配列を含む抗Sp-ADAMTS-5抗体はADAMTS-5のスペーサードメインに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号62などのCDRH3の配列において合計アミノ酸1個から4個が置換、挿入および/または欠失されている。特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、HVRの外側の領域中(すなわちFR中)で生じる。
【００９１】
好ましくは本発明の抗体は、Table III(表3)に定義のとおり抗体CRB0017、CRB0093、CRB0094、CRB0102、CRB0123、CRB0124である。
【００９２】
特定の実施形態では本発明の抗体またはそのフラグメントは、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nMまたは<0.001nM以下、例えば10-8Mから10-13M、例えば10-9Mから10-13Mの解離定数(Kd)を有する。
【００９３】
一実施形態ではKdは、記載のとおり目的の抗体のFabバージョンおよびその抗原で次のアッセイによって実施される放射標識抗原結合アッセイ(RIA)によって測定される。抗原に対するFabの溶液結合親和性は、未標識抗原の滴定系列の存在下において(I)-標識抗原の最少濃度でFabを平衡化する工程、次いで抗Fab抗体コートプレートで結合抗原を捕捉する工程によって測定される(例えばChen et al., J. Mol. Biol. 293:865〜881(1999)を参照されたい)。
【００９４】
本発明は、次の図を参照する非限定的例によってここに記載される。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ADAMTS-4およびADAMTS-5の模式図である。両酵素は、細胞から細胞外腔へ分泌される多ドメインメタロプロテイナーゼである。両酵素は、シグナル配列(SS)、プロドメイン(Pro)、触媒メタロプロテイナーゼドメイン(Cat)、ディスインテグリン(Dis)ドメイン、トロンボスポンジンI型(TS)ドメイン、システインリッチ(CysR)ドメインおよびスペーサー(Sp)ドメインからなる類似のドメイン配置を有する。付加的にADAMTS-5は、スペーサードメイン後に外部TSドメインを含有する。
【図２】タンパク質のFLAGタグに対する抗体を使用するFPLC精製後のADAMTS-5 p75のウエスタンブロット分析を示す図である。ウエスタンブロットは、FLAGペプチド配列を含有する融合タンパク質を認識するモノクローナル抗体(Sigma Aldrich、モノクローナル抗FLAG M2、1:1000希釈)で探索された。化学発光ペルオキシダーゼ基質を使用する検出のために、抗マウスIgG-ペルオキシダーゼ(1:10,000)が用いられた。TS5=ADAMTS-5形質転換細胞;NT=非形質転換細胞;M=偽。
【図３】単離された抗Sp_ADAMTS-5 scFvのスペーサーGSTおよびGST陰性対照とのELISA反応性を示すグラフである。スペーサーGSTおよびGST抗原は、10μg/mLでコートされた。抗Sp_ADAMTS-5scFvを50および/または5μg/mLで使用した(データ記載せず)。二重ウェルで実施された実験の450nmでの平均吸光度は、バーで示されるSDと共に示されている。
【図４】サンドイッチELISAを示すグラフである。コートされたCRB0017_IgG4のスペーサーGSTおよび/またはGST(30μg/Mlの溶液中の)への結合での希釈曲線。二次抗体として抗GST(1:1000)が使用され、最終検出のために抗ウサギIgG HRP(1:2000)が続いた。二重ウェルで実施された実験の450nmでの平均吸光度は、バーで示されるSDと共に示されている。
【図５】溶液中でのスペーサーGSTに結合するCRB0017_IgG4のBiacore X-100を使用した動力学的分析を示す図である。CRB0017_IgG4の5610RUはCM5チップに固定された。会合および解離はそれぞれ180秒間および800秒間実施された。CRB0017_IgG4/スペーサーGST相互作用について決定された動力学的速度定数および親和性を下の表に示す。
【図６】CRB0017_IgG4によるADAMTS-5全長(TS5-FL)の免疫沈降(IP)を示す図である。透析/親和性精製されたTS5-FL 0.1μgは抗Sp_ADAMTS-5 CRB0017_IgG4抗体(レーン1、2および3にそれぞれ11、22および25μg)または陰性対照としての非関連抗体11μg(レーン4)で免疫沈降(IP)された。免疫沈降物は、抗FLAG抗体(1:1000)での免疫ブロット法で分析された。CRB0017_IgG4-免疫沈降物約81kDa TS5-FLバンドがTS5-FL p75タンパク質に対応して観察された。免疫沈降TS5-FLタンパク質の分子量は、そのアミノ酸組成から予測されるよりもわずかに高い。この差異は、Dis、CysR、SpドメインへのNグリコシル化およびC末端ドメインでのOグリコシル化による。分子量マーカーは、図の左側に示されている。
【図７】CRB0017_IgG4によるADAMTS-4全長(TS4-FL)のIPを示す図である。透析/親和性精製されたTS4-FL 0.2μgは抗Sp_ADAMTS-5 CRB0017_IgG4抗体(レーン1および2にそれぞれ30および60μg)でまたは陰性対照としての非関連抗体(30μg)(レーン3)で免疫沈降(IP)された。レーン4では、透析/親和性精製されたTS4-FLが陽性対照としてロードされた。免疫沈降物は、抗FLAG抗体(1:1000)での免疫ブロット法で分析された。CRB0017_IgG4-免疫沈降約75kDa TS5-FLバンドはTS4-FL p68タンパク質に対応して観察された。免疫沈降TS4-FLタンパク質の分子量は、そのアミノ酸組成から予測されるよりもわずかに高く、これは主にタンパク質中のNおよびOグリコシル化による。分子量マーカーは、図の左側に示されている。
【図８】IL-1αによって誘導されたウシ軟骨のin vitroタンパク質分解における抗Sp_ADAMTS-5 IgG4の効果を示すグラフである。図は、CRB0017 IgG4の非存在下または存在下での48時間のインキュベーション後でのIL-1α  5ng/ml活性を表す(3種の異なる独立した実験)。各実験における陰性対照としてヒト天然IgG4(Serotec)が使用された。各実験における陽性対照として合成ADAMTS-5阻害剤(Cpd23)および天然ADAMTS-5阻害剤(TIMP-3)が使用された。結果は、%GAG放出として、すなわち培養物中に軟骨から放出されたアグリカンフラグメントの形態でのグルコサミノグリカン(GAG)の定量として表され、この方法は、軟骨代謝を模倣してサイトカイン効率を測定する。
【図９】変形性関節症のSTR/ortマウスモデルにおけるヘリックスB-ADAMTS-5結合タンパク質CRB0016_IgG4の効果の評価を示すグラフである。CRB0016_IgG4は、各動物の両膝の関節内に、実験の開始時および6週間後に再度、膝1カ所あたり1.2および12μgの用量で投与された。初回投与の3カ月後に、CRB0016_IgG4は組織病理学的に査定されたとおりSTR/ortマウス株におけるOAの経過を変えなかった。グレードは関節軟骨に通じる病変の深さとして定義される。ステージは、基礎となるグレードとは関わりなく接合部コンパートメントの一方の側中の軟骨関与の水平方向の程度として定義される。総合的に、両者は変形性関節症の経過の重症度または病理学的進行の指標を構成し、実際にOARSIスコアはグレードxステージとして定義される。細胞損失は、検討される関節コンパートメント内で細胞死を起こしている関節軟骨細胞の画分として定義される。GAG(グルコサミノグリカン)損失は、例えばトルイジンブルーまたはサフラニンOなどのGAGに対して異染色性を表す陽イオン染色の損失によって規定およびアセスメントされる。Mankinは、グレード、細胞損失およびGAG損失の合計として彼のスコアを定義し、一方合計スコアはOARSIスコアと細胞損失およびGAG損失の合計として定義される。上のすべてのパラメーターは、OAの特性を構成し、そのスコアは病態の重症度および進行の測定値をもたらす。
【図１０】変形性関節症のSTR/ortマウスモデルにおけるCRB0017_IgG4  の効果の評価を示すグラフである。CRB0017_IgG4は、各動物の両膝の関節内に、実験の開始時に1回および6週間後に再度、膝1カ所あたり1.2および12μgの用量で投与された。初回投与の3カ月後に、CRB0017_IgG4はSTR/ortマウスモデルにおけるOA重症度の低減において用量依存的活性を示した。すべてのパラメーターは図9のとおり定義される。
【図１１】A)CRB0017_IgG4が透過性または非透過性細胞から分泌されるADAMTS-5を用量依存的様式で認識できることを示すグラフである。対照として、ADAMTS-5市販抗体の抗触媒性および抗cysドメイン2個が使用された。B)CRB0017_IgG4がHEK29細胞の細胞表面上のいかなるタンパク質とも交差反応しないことを示すグラフである。
【図１２】Hek293-ADAMTS-5(ADAMTS-5 cond.培地)およびHek293(Hek-293 cond.培地)から採取された上清は、下の材料セクションに記載のとおりコートしたmAb CRB0017_IgG4を使用するサンドイッチELISAにチャレンジされたことを示すグラフである。「mAb CRB0017不含有」は、ウェルがCRB0017_IgG4でコートされていない対照条件であり、「培地不含有」は、上清がウェルに添加されなかった対照条件であり、「Ab」は、二次抗体だけがウェルに添加された対照条件である。図に示すとおりCRB0017_IgG4は、HEK293発現細胞から分泌されるADAMTS-5を高い特異性で認識できる。
【図１３】片側内側半月板断裂モデル(MMT)は、広く使用されている膝OAのラット外科処置モデルである。軟骨細胞およびプロテオグリカン損失、マトリクス細線維化ならびに中裂、骨棘形成からなる急速進行性の変性的変化が生じる。外科処置1週間後、ラットは関節内にCRB0017_IgG4膝1カ所あたり35μg、CRB0017膝1カ所あたり70μgまたはビヒクルで処置されたことを示すグラフである。注射の3週間後、動物は屠殺され、大腿脛骨接合部は組織学のために処理された。全ての組織学スコアは、ビヒクルと比較してCRB0017_IgG4での処置によって用量依存的に減少していた。
【図１４】遊離シンデカン-4によるmAb ADAMTS-5のmAb CRB0017コートプレートへの結合の競合的阻害を示すグラフである。mAb CRB0017(コーティング緩衝液中2μg/ml)をブロッキングの前にイムノプレートに吸着させた。ADAMTS-5(4μg/ml)は固定化mAb CRB0017への添加の前にシンデカン-4(0.1μg/ml)の存在下でインキュベートされた。ADAMTS-5のmAb CRB0017コートプレートへの結合は抗FLAG市販抗体を使用して明らかにされた。
【図１５】mAb抗スペーサーCRB0017_IgG4、CRB0093_IgG4、CRB094_IgG4およびCRB0124_IgG4が、サンドイッチELISAにおいて同等の特異性を有して全長ADAMTS-5を特異的に認識できることを示すグラフである。mAb CRB0123_IgG4は、このアッセイにおいて他の抗スペーサーmAbよりも高い結合能力をADAMTS-5に対して示す。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
材料および方法
ヒトリンパ球由来のSPLINTライブラリー
ヒト疾患の処置における使用のための治療用抗体の開発は、抗体分野における多くの研究者の長年の目標である。これらの抗体を得る1つの方法は、ヒトリンパ球から構築された細胞内抗体のシングルポットライブラリー(SPLINTライブラリー)によってである。SPLINT技術は、pMV1ベクターにクローニングされたヒトscFv(単鎖抗体フラグメント)ライブラリーをVP16活性化ドメインへの融合物として発現する(ベクターはpLinker220ベクター由来)(Visintin et al., 2004. J Immunol Methods. 290:135〜153)。可変領域は小さなペプチドリンカー(SGGSTSGSGKPGSGEGSSGT、配列番号138)と連結される。pMV1はプラスミドの維持および酵母株L40でのロイシンを欠く培地での選択を可能にするLEU2遺伝子ならびに大腸菌(E.coli)でのプラスミドの選択を可能にするbla遺伝子を含有する。
【００９７】
ヒトSPLINTライブラリーの構築のために、100名の非免疫化ドナー由来の末梢血の供血が使用された。各ドナー由来の血液試料およそ2〜20mlが集められた。B-リンパ球は末梢血からフィコールプラーク試薬(Amersham、USA)を使用して単離された。簡潔には希釈血液試料(血液対PBS、1:1)はフィコールプラーク試薬上に慎重に重層され、次いで2層の溶液は400×g、30分間、遠心分離された。B-リンパ球は2相の間の界面から集められた。全RNAはB-リンパ球からRNeasy Mini kit(Qiagen)によって製造者の説明書に従って抽出された。全RNAは、Bリンパ球から調製され、mRNAの単離のために使用される前に合わせてプールされた。mRNAはOligotex mRNA mini kit(Qiagen)を製造者の説明書に従って使用して調製された。ThermoScript(商標)RT-PCR System(Invitrogen)はcDNA合成反応のために製造者の説明書に従って使用された。Oligo(dT)20はV-遺伝子レパートリーのcDNAを合成するために使用された。増幅バイアスを低減するために本発明者らは、V遺伝子セグメントを増幅するためにプライマーセット(huSPLINT_09についてTable I(表1)を参照されたい;huSPLINT_10についてTable II(表2)を参照されたい)内のすべての可能な組合せを使用して、62回(huSPLINT_09について)および75回(huSPLINT_10について)の独立したPCR反応を実施した。
【００９８】
ヒト抗体遺伝子のレパートリー全体を理論的に包含するプライマー配列をIMGT/遺伝子-DBから得て(Giudicelli et al., 2005. Stud Health Technol Inform. 116:3〜8)、以前公表されたプロトコールに従って修飾した(Sblattero and Bradbury, 1998. Immunotechnology. 3:271〜278); (Marks et al., 1991. Eur J Immunol. 21:985〜991);(Orlandi et al., 1992. Biotechnology. 24:527〜531)。この方法では個々の再配置重鎖および軽鎖可変領域が別々に増幅され、クローニングのために使用される最終scFv産生物をもたらす一連の重複するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)工程を通じて連結される(Visintin et al., 2004. J Immunol Methods. 290:135〜153)。
【００９９】
huSPLINT_9(Table I(表1))についてのPCR反応は、VHリバースプライマー4個と対になるVHフォワードプライマー7個を含み、合計28回の反応になった;一方、リバースプライマー4個と対になるVκフォワードプライマー4個は合計16回の反応になり;Vλリバースプライマー2個と対になるVλフォワードプライマー9個は合計18回の反応になった。
【０１００】
【表１】
2015518476.tif 000002
【０１０１】
huSPLINT_10(Table II(表2))についてのPCR反応は、VHリバースプライマー4個と対になるVHフォワードプライマー6個を含み、合計24回の反応になった;一方Vκリバースプライマー5個と対になるVκフォワードプライマー6個は合計30回の反応になり;Vλリバースプライマー3個と対になるVλフォワードプライマー7個は合計21回の反応になった。
【０１０２】
【表２】
2015518476.tif 000003
【０１０３】
PCRは、想定されるすべてのフレームワークアセンブリ由来の可変領域のレパートリーでの提示を導いた。すべてのプライマーは、BssHIIもしくはNheI制限部位のいずれかまたはリンカー配列を含有した。最終プットスルー(final pull-through)PCRは、プライマー(PTfwおよびPTrv)2個と行われてよい。最終scFv遺伝子レパートリーはBssHIIおよびNheIで連続的に消化された後に、それらは消化前、脱リン酸化pMV1ベクターに直接ライゲーションされた。各ライブラリーについて1回のライゲーション反応および30回の電気穿孔法から、本発明者らは未挿入ライゲーション由来のクローン0.04%を含んでそれぞれ約108個の異なるscFv分子からなる最終huSPLINT_09およびhuSPLINT_10ライブラリーを得ることができた。
【０１０４】
スペーサーADAMTS-5ベイトのクローニングおよび酵母細胞L40における発現
ヒトスペーサーADAMTS-5(配列番号123)をコードしているcDNAはプライマー:
5'-TGGCTGGAATTCACAAAGATTGTTGGA-3' 配列番号211
5'-GTCGACGGATCCTTAAGTGTGTGATCCCAC-3' 配列番号212
を使用してADAMTS-5 pSecTag2Aから増幅された。
【０１０５】
EcoRI-BamHI消化cDNAは、細菌性クロラムフェニコール耐性、TRP1遺伝子(このプラスミドを含有する酵母がトリプトファンを含まない最少培地において増殖できるようにする)および2μ複製開始点を含有するように設計されたpMICBD1ベクターにクローニングされた(Visintin et al., 2004. J Immunol Methods. 290:135〜153)。このプラスミドは、(酵母アルコールデヒドロゲナーゼI(ADH1)プロモーターから発現され、cDNA挿入のためのポリリンカーが続きlexAへのインフレーム融合を生成する)大腸菌lexAタンパク質の全領域を含有する。ベイトは、ベクター中での挿入物のlexA結合ドメインとのインフレーム融合を確認するために配列分析された。
【０１０６】
L40酵母細胞は、リチウムアセテート形質転換プロトコールを使用する工程によってベイトSp_ADAMTS-5/MICBD1ベクターで形質移入された。形質転換体は、YC-Lys/- Ura/-His/-Trpプレートでヒスチジン原栄養性(prototropy)についてアッセイされた(Visintin and Cattaneo, 2001. Antibody Engineering. 1:790; Visintin et al., 2004. J Immunol Methods. 290:135〜153.; Visintin et al., 2004. Methods. 34:200〜214; Visintin et al., 2002. J Mol Biol. 317:73〜83.; Visintin et al., 1999. Proc Natl Acad Sci U S A. 96:11723〜11728)。酵母コロニーはβ-ガラクトシダーゼ活性についてコロニーリフトフィルターを使用して以前記載のとおりアッセイされた(Visintin and Cattaneo, 2001. Antibody Engineering. 1:790)。ベイトの形質移入は、lacZ遺伝子の活性化をもたらさなかった(データ記載せず)。
【０１０７】
ヘリックスB-ADAMTS-5ベイトのクローニングおよび酵母細胞L40における発現
ADAMTS-5のヒト触媒ドメインの表面位置のα-ヘリックス(ヘリックスB、配列番号124)をコードしているcDNAはプライマー:
5'-AATTCAACGCTGCCACCACACTCAAGAACTTTTGCAAGTGGCAGCACCAACACAACTAACTGCA-3' 配列番号213
5'-GTTAGTTGTGTTGGTGCTGCCACTTGCAAAAGTTCTTGAGTGTGGTGGCAGCGTTG-3' 配列番号214
を使用して組み立てられた。
【０１０８】
EcoRI-PstI消化cDNAはpMICBD1ベクターにクローニングされた(Visintin et al., 2004. J Immunol Methods. 290:135〜153)。L40酵母細胞はリチウムアセテート形質転換プロトコールを使用する工程によってベイトヘリックスB/MICBD1ベクターで形質移入された。形質転換体はYC-Lys/- Ura/-His/-Trpプレートでヒスチジン原栄養性についてアッセイされた(Visintin and Cattaneo, 2001. Antibody Engineering. 1:790)。酵母コロニーはβ-ガラクトシダーゼ活性についてコロニーリフトフィルターを使用して以前記載のとおりアッセイされた(Visintin and Cattaneo, 2001. Antibody Engineering. 1:790)。ベイトの形質移入は、lacZ遺伝子の活性化をもたらさなかった(データ記載せず)。
【０１０９】
スペーサーADAMTS-5ベイトのウエスタンブロット分析
酵母終夜培養物はYC培地5mlにOD600 0.15で希釈され、OD600 0.6まで30℃で増殖された。培養物1mlは10000xgで5分間遠心分離され、細胞沈殿はLaemmli緩衝液中に再懸濁され、12%SDS-PAGEで分離され、PVDF膜(Millipore)に転写された。ポリクローナル抗体抗LexA(Invitrogen)が使用され、抗ウサギ-HPR(DAKO)が続いた。ECL-化学発光システム(Amersham)が検出のために使用された(データ記載せず)。
【０１１０】
SPLINT選択
SPLINTライブラリーは、ベイト(Sp_ADAMTS-5/MICBD1またはヘリックスB-ADAMTS-5/MICBD1)を発現しているL40酵母株にリチウムアセテート方法および選択を記載のとおり使用して形質転換された(Visintin and Cattaneo, 2001. Antibody Engineering. 1:790; Visintin et al., 2004. J Immunol Methods. 290:135〜153.; Visintin et al., 2004. Methods. 34:200〜214; Visintin et al., 2002. J Mol Biol. 317:73〜83.; Visintin et al., 1999. Proc Natl Acad Sci U S A. 96:11723〜11728)。形質転換酵母細胞は、Trp(W)、Leu(L),ウラシル(U)、Lys(K)およびHis(H)を含有していない固形培地(YC-WHULK)上に蒔かれた。選択マーカーTrp(W)の発現はpMICBD1プラスミドによって、Leu(L)はpMV1プラスミドによって提供され、ウラシル(U)、Lys(K)およびHis(H)は酵母株の原栄養株マーカーである。陽性クローンは、選択培地YC-WHULK上で増殖された。β-ガラクトシダーゼアッセイは、記載のとおり実施された(Visintin and Cattaneo, 2001. Antibody Engineering. 1:790; Visintin et al., 2004. J Immunol Methods. 290:135〜153.; Visintin et al., 2004. Methods. 34:200〜214; Visintin et al., 2002. J Mol Biol. 317:73〜83.; Visintin et al., 1999. Proc Natl Acad Sci U S A. 96:11723〜11728)。11個の陽性抗Sp_ADAMTS-5scFvは、異なるSPLINTライブラリー(mSPLINT、huSPLINT_09およびhuSPLINT_10)の4回の独立したスクリーニングからの二次スクリーニング後に単離された。Sp_ADAMTS
-5ベイトについて実施された選択の結果はTable III(表3)に要約されている。
【０１１１】
【表３】
2015518476.tif 000004
【０１１２】
組換えスペーサーADAMTS-5-GSTタンパク質のクローニングおよび発現
ADAMTS-5(配列番号121および123)のヒトスペーサードメインは、pET41b(Novagen)のNco-XhoI制限部位にクローニングされた。スペーサードメインをコードしているcDNAは、ADAMTS-5 pSecTag2Aからプライマー:
5'-ATCCATGGTCACAAAGATTGTTGGAACC-3' 配列番号215
5'-ATCTCGAGTTAAGTGTGTGATCCCACTTTATTG-3' 配列番号216
を使用して増幅された。
【０１１３】
Sp_ADAMTS-5-GST/pET41bプラスミドは、熱ショック形質転換システムによってRosetta 2(DE3)大腸菌(Novagen)に形質転換され(Hanahan, 1983. J Mol Biol. 166:557〜580.)LB Kan/Camプレートに蒔かれた。
【０１１４】
翌日、単一コロニーは、LB Kan/Cam培地10mLに接種および希釈された。形質転換された細菌は、一晩、37℃、250RPMでの震盪で増殖された。
【０１１５】
翌日、終夜増殖細菌をLB Kan/Cam培地500mLに希釈し、次いで培養物はOD(600)=0.7に達するまで37℃、250RPM震盪で増殖された。次いで0.2mM(最終濃度)IPTGが添加された。誘導された細菌は5〜6時間、25℃、250RPM震盪でインキュベートされた。最終的に細菌は、6000RPM、15分間遠心分離され、沈殿は-80°℃で凍結された。
【０１１６】
全IgG抗体への抗ADAMTS-5scFvの再編成
抗触媒_ADAMTS-5 CRB0016 scFvおよび抗Sp_ADAMTS-5 CRB0017 scFvは、ネズミ抗原結合可変ドメインをヒト定常ドメインにカップリングする工程によってキメラIgG抗体全体に再編成された。各抗体について、軽鎖および重鎖(ヒトIgG4由来Fc)をコードしているcDNAは、サブクローニングのための好適な制限部位と共にGENEART(Germany)によって生成された。配列は、哺乳動物での発現(CHO-S細胞株)のために最適化された(配列番号95および96;97および98)。両鎖の合成後、cDNAは発現プラスミド(目的の遺伝子の発現のための、伸長されたCMVプロモーターを含有するpcDNA3.1誘導体)にHindIIIおよびXhoIをクローニング部位として使用してサブクローニングされた。各抗体鎖について発現プラスミド2個(1つのプラスミドは軽鎖をコードしているcDNAを含有し、1つは重鎖をコードしているcDNAを含有していた)が生成された。正しい挿入物を含有している発現プラスミドは、制限分析および挿入物のDNA配列分析によって確認された。
【０１１７】
抗Sp_ADAMTS-5 CRB0093、CRB0094、CRB0102、CRB0123およびCRB0124 scFvも上に記載のCRB0016およびCRB0017について適合されたクローニング手順に従って完全なヒトIgG4抗体全体に再編成された。
【０１１８】
形質移入細胞からの組換えキメラCRB0016_IgG4およびCRB0017_IgG4抗体の産生
抗ADAMTS-5抗体は、形質移入細胞から産生された。CHO-S細胞は、CRB0016およびCRB0017重鎖および軽鎖をコードしているプラスミドで形質移入された。形質移入細胞からの培地上清は、細胞および細片を除去する工程によって回収された。清澄化培地上清は、プロテインA-セファロースカラムにロードされた。非特異的結合は、十分に結合緩衝液洗浄(20mMリン酸ナトリウム、pH7.0)によって除去された。プロテインAカラム上の結合抗体タンパク質は、プロテインAからの酸性抗体溶出(0.1Mグリシン-HCl、pH3.0)によって回収された。溶出タンパク質は、1M Tris-HCl pH=9.0(溶出画分1mLあたり100μL)で直ちに中和された。プールされた溶出画分は、PBSに対して透析された。凝集抗体タンパク質はサイズ排除クロマトグラフィーによって除去された。
【０１１９】
組換えスペーサーADAMTS-5-GSTタンパク質の精製
融解したSp_ADAMTS-5-GST誘導および発現細菌は、溶解緩衝液(PBS、10μg/mL DNase、20μg/mLリゾチーム)20mL中に再懸濁された。再懸濁沈殿は、45分間、4℃で揺らしてインキュベートされた。インキュベーション後、溶解された細菌は氷中で3回(各15秒間)超音波処理された。6000RPM、4℃での10分間の遠心分離後、上清は集められ、0.2ミクロンフィルターでろ過され、精製のために処理された。GST Trapカラム(GE)はAKTA Purifier(GE)に接続され、5CVの水、5mL/分の流量で洗浄された。次いでカラムは5CVのPBS、5mL/分の流量で洗浄された。次いでカラムは、ペリスタルティックポンプに接続され、1mL/分の流量でろ過上清をロードされた。5CVのPBS、5mL/分の流量での洗浄後、カラムはAKTA purifierに再接続され、2CVのPBS、5mL/分の流量で再度洗浄された。タンパク質は、100%溶出緩衝液(PBS、10mMグルタチオン)で溶出された。ピーク画分は2mLエッペンドルフチューブに集められた。PBS中に希釈した3個の主な中央画分のプールは、製造者の仕様書に従ってAmicon Ultra 15を使用して濃縮された。濃縮タンパク質は、Protein 80 BioAnalyser(Agilent)で定量された。一定分量を-80℃で保存した。
【０１２０】
大腸菌の細胞質中での抗Sp_ADAMTS-5scFvの発現およびリフォールディング
抗Sp_ADAMTS-5 scFvフラグメント(配列番号125、126、127、128、129、130、131、132、135、136、137)はpETM-13細菌性発現ベクターのNcoI/NotI制限部位にサブクローニングされた。発現プラスミドを持つ大腸菌BL21DE3は、2YT/Kan培地500mL中で対数増殖期の中央(OD600=0.75)まで培養され、次いでIPTG(1.5mM)で、追加的に5〜6時間、37℃、震盪(180rpm)して誘導された。細胞は6000rpm(Beckman)で採取され、沈殿は封入体(IB)調製のために使用された。大腸菌の封入体としての大規模発現法はin vitroリフォールディングを使用して最適化された(Patil et al., 2008. J Biotechnol. 134:218〜221. Epub 2008 Jan 2018); (Umetsu et al., 2003. J Biol Chem. 278:8979〜8987. Epub 2003 Jan 8977)。沈殿はIBR緩衝液(50mM Tris/HCl、0.5mM EDTA、20μg/mLリゾチーム、10μg/mL DNase、pH8)に5mL/g-1で再懸濁され、1時間、RTで震盪プレートに置かれた。試料は45秒間、氷上、3回超音波処理され、次に1分間、氷上でインキュベーションされた。次いで溶解物は、10分間、4℃、6,000rpmで遠心分離された。沈殿は、洗浄緩衝液(10mM Tris pH8、1mM EDTA、1%Triton X-100)20mL中に再懸濁され、撹拌され、次いで封入体は10,000rpm、10分間、4℃での遠心分離によって沈降された。沈殿は、洗浄緩衝液2(10mM Tris pH8、1mM EDTA、1M NaCl) 20mLで洗浄され、撹拌され、次いで10,000rpm、10分間、4℃で遠心分離された。最終沈殿は、洗浄緩衝液3(10mM Tris pH8、1mM EDTA)20mLで洗浄され、撹拌され、10,000rpm、10分間、4℃で遠心分離された。IB調製物は可溶化緩衝液(100mM Tris/HCl;6MグアニジンHCl;1mM EDTA;100mM DTT、pH8)で5mLg-1で可溶化された。可溶化されたタンパク質は2時間、室温で強くかき混ぜながらインキュベートされた。タンパク質溶液のpHをpH4に1M HClで低下させた後に、不溶性材料は10,000rpm、10分間の遠心分離によって除去された。DTTを溶質から除去するためにIBD緩衝液(6MグアニジンHCl、pH4)に対する透析3回が実施された。可溶化され、定量されたタンパク質は、冷REF緩衝液(100mMTris/HCl;0.5Mアルギニン;375μM酸化l-グルタチオン;5mM EDTA、pH8.5)中35mg/Lに可能な限り迅速に希釈された。タンパク質溶液は、50分間ごとに撹拌しながらピペットでREF緩衝液中に直接分注された。最後の添加の16時間後に試料はまず濃縮され、残りのグアニジンはIEXA緩衝液への透析によって除去された(scFvのpIに従ってイオン交換プロトコールが次に用いられた)。リフォールドしたscFvは、イオン交換クロマトグラフィーによって精製され、-80℃で一定分量で保存された。
【０１２１】
特異性ELISA:抗Sp_ADAMTS-5 scFv対Sp_ADAMTS-5-GST
Nunc Maxi-Sorp Immunoplateはコーティング緩衝液(100mM Na2CO3、pH9.6)中10μg/mLのSp_ADAMTS-5-GSTおよびGST 100mLでコートされた。プレートは一晩、4℃でインキュベートされた。翌日、未結合抗原は廃棄され、プレートはPBSで3x洗浄された。非特異的結合は3%MPBS(PBS中3%無脂肪乳)200mLを添加する工程によってブロッキングされた。プレートは、1時間、RTでインキュベートされた。プレートはTPBS(PBS中0.1%Tween20)で3xおよびPBSで3x洗浄された。3%MPBS中の抗Sp_ADAMTS-5scF(0.5〜50μg/mL)の系列希釈物100μLは適切なウェルに添加された。次いでプレートは2時間、RTでインキュベートされた。TPBSで3xおよびPBSで3xの洗浄後、3%MPBS中に1:5000希釈した抗V5抗体(Invitrogen)100μLが各ウェルに添加された。プレートは1時間30分間、RTでインキュベートされた。TPBSで3xおよびPBSで3xの洗浄後、3%MPBS中に1:2000希釈した抗マウスHRP(DAKO)100μLが各ウェルに添加された。プレートは1時間、RTでインキュベートされた。TPBSで3xおよびPBSで3xの洗浄後、TMB(Sigma)80μLが添加された。プレートは、試料が所望のシグナルに達するまで暗チャンバー内でインキュベートされた。停止溶液(500mM H2SO4)80μLは読み取りの前に各ウェルに添加された。データはLD 400 Luminescence Detector(Beckman Coulter)によってOD(450nm)を測定する工程で集められた。
【０１２２】
サンドイッチELISA:抗Sp_ADAMTS-5 mAb対Sp_ADAMTS-5-GST
Nunc Maxi-Sorp Immunoplateは、コーティング緩衝液(100mM Na2CO3 pH9.6)中の抗Sp_ADAMTS-5免疫グロブリンの系列希釈物100mLでコートされた。プレートは、4℃で一晩、インキュベートされた。翌日、未結合抗体は廃棄され、プレートはPBSで3x洗浄された。非特異的結合は3%MPBS(PBS中3%無脂肪乳)200μLを添加する工程によってブロッキングされた。プレートは、1時間、RTでインキュベートされた。プレートはTPBS(PBS中0.1%Tween20)で3xおよびPBSで3x洗浄された。3%MPBS中のSp_ADAMTS-5-GSTおよびGST(30μg/mL)100μLは適切なウェルに添加された。次いでプレートは2時間、RTでインキュベートされた。TPBSで3xおよびPBSで3xの洗浄後、3%MPBS中に1:1000希釈した抗GST抗体(Sigma)100μLが各ウェルに添加された。プレートは1時間30分間、RTでインキュベートされた。TPBSで3xおよびPBSで3xの洗浄後、3%MPBS中に1:2000希釈した抗ウサギHRP(DAKO)100μLが各ウェルに添加された。プレートは1時間、RTでインキュベートされた。TPBSで3xおよびPBSで3xの洗浄後、TMB(Sigma Aldrich)80μLが添加された。プレートは、試料が所望のシグナルに達するまで暗チャンバー内でインキュベートされた。停止溶液(500mM H2SO4)80μLは読み取りの前に各ウェルに添加された。データはLD 400 Luminescence Detector(Beckman Coulter)によってOD(450nm)を測定する工程で集められた。
【０１２３】
抗Sp_ADAMTS-5scFvおよび/またはmAb親和性および動力学定数の表面プラズモン共鳴測定による評価
CM5チップのカルボキシメチルデキストランマトリクスにアミンカップリングによって固定された抗Sp_ADAMTS-5抗体(scFvまたはIgG)へのSp_ADAMTS-5-GST結合の結合動力学。標準的固定手順が使用された(Schuck, 1997. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26:541〜566)。scFvまたはIgG 20〜50μg/mLは酢酸緩衝液(正電荷を得るために免疫グロブリンのpIよりも少なくとも2pH単位低い好適な予備濃縮緩衝液)に溶解された。リガンドの低密度固定を得るために免疫グロブリンについて5000RUおよびscFvについて1000RUの固定レベルが設定された。チップの中程度の再生条件(接触時間30秒間、10mMグリシン、pH2)が使用された。
【０１２４】
Sp_ADAMTS-5-GSTはPBS+0.005%Tween20実行緩衝液中に5倍系列希釈で(マイクロモル範囲で開始し、1:2に希釈)希釈され、流速30μl/分でアプライされた。試料コンディショニング工程は、最初に接触時間60秒間および解離時間400秒に設定された。得られたセンサーグラムに基づいて、動力学/親和性工程では分析物濃度、接触時間、解離時間および再生溶液が調整された。
【０１２５】
データはBioevaluationソフトウェアによって解析された:データフィッティングの品質はChi2値およびU-値によって確認できる。
【０１２６】
ADAMTS-5標的抗原への抗スペーサーADAMTS-5 mAbの結合能力の評価
mAb抗スペーサーCRB0017_IgG4、CRB0093_IgG4、CRB0094_IgG4、CRB0123_IgG4およびCRB0124_IgG4は、100mM Na2CO3 pH9.6中、2μg/mLでコートされ、4℃で一晩インキュベートされた。翌日、未結合免疫グロブリンはプレートから廃棄され、TBSで3x洗浄された。プレートはタンパク質を含まないブロッキング緩衝液(Pierce-未希釈)200μLを添加し、1時間、37℃でインキュベートする工程によってブロッキングされた。プレートは上のとおり洗浄された。次いでブロッキング緩衝液(TBS中1:2希釈)中の精製ADAMTS-5(4μg/ml)1ウェルあたり100μLおよび陰性対照としてのブロッキング緩衝液(TBS中1:2希釈)1ウェルあたり100μlが添加された。プレートは1時間、37℃でインキュベートされた。プレートは、次にTTBSで3X洗浄された。マウス抗Flag-抗体(Sigma; cod F3165)1:8000希釈1ウェルあたり100μlは、ブロッキング緩衝液(TTBSで1:2希釈)に添加された。プレートは、1時間、37℃でインキュベートされた。プレートはTTBSで3X洗浄された。抗マウス抗体(DAKO)TTBS中1:2000希釈100μlは添加され、プレートは1時間、37℃でインキュベートされた。プレートは最後にTTBSで3XおよびTBSで3X洗浄された。検出のためにTMB100μlが添加され、暗所でシグナルが見られるまで(通常5〜15分間)インキュベートされた。1ウェルあたり100μLの停止溶液が反応を停止するためにO.D.測定前に添加された。
【０１２７】
ADAMTS-4およびADAMTS-5 3xFLAG全長形態のクローニングおよび発現
ヒトADAMTS-5(配列番号133)およびヒトADAMTS-4(配列番号134)配列をコードしているcDNAは、Kpn I(5'末端)およびXho I(3'末端)に対する制限部位を導入し、プロペプチドをコードしている領域を除去するために増幅された。KpnIおよびXhoIでの消化後に、挿入物はpSecTag2Aベクター(Invitrogen)にサブクローニングされた。
【０１２８】
ADAMTS-5 3XFLAG/pSecTag2AおよびADAMTS-4 3XFLAG/pSecTag2Aは、FreeStyle(商標)293-F細胞株に形質移入された。細胞は、FreeStyle(商標)293発現培地での懸濁培養に適合された。抗凝集剤(Invitrogen)が形質移入前または後に培地に添加された。細胞は、動物由来成分を含まないOptiMEM(商標)SFM中でFreeStyle(商標)MAX試薬複合体で形質移入された。形質移入細胞は、37°C、8% CO2、75rpmに設定したステアプラットホーム上でインキュベートされた。100μg/mlヘパリンが形質移入24時間後に培養物に添加された。ADAMTS-5 3XFLAGおよびADAMTS-4 3XFLAG発現は形質移入後48〜72時間で顕著なタンパク質活性に達した。2〜3日後、上清は採取され、精製まで-80℃で保存された。
【０１２９】
全長ADAMTS-4/ADAMTS-5 3xFLAGタンパク質精製
ADAMTS-5 3XFLAG/ADAMTS-4 3XFLAG上清300mlは、抗FLAG M2親和性ゲル(Sigma-Aldrich)1mLにロードされた。試料は、流速1mL/分、圧力0.5MPaでアプライされ、カラムは50mMTris-HCl(pH7.4)、10mM CaCl2、10μM ZnCl、0.02%Brij-35含有1M NaCl 10体積で酵素に結合したヘパリンを除去するために洗浄された。FLAG融合タンパク質の溶出は、アグリカナーゼ反応緩衝液(50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、10mM CaCl2、10μM ZnCl、0.02%Brij-35)中の3XFLAGペプチド(Sigma-Aldrich)200μg/mlとの競合によって達成された。流速1mL/分は、精製手順を通じて維持され、1.0mlの画分が集められた。溶出タンパク質を含有する画分は、合わせてプールされ、Vivaspin concentrator(Sartorius)(カットオフ30kD)を使用して5X濃縮された。
【０１３０】
ADAMTS-4/ADAMTS-5 3xFLAG精製タンパク質のウエスタンブロット分析
ADAMTS-5 3X FLAGおよびADAMTS-5 3X FLAG精製試料は、試料緩衝液(Invitrogen)に再懸濁され、10分間加熱され、10%SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動システム(Invitrogen、NuPage System)にロードされ、次いでウエスタンブロッティングに供された。分離されたタンパク質は、PVDF膜(GE Healthcare)に転写された。膜はStarting Block Solution(Pierce)で30分間ブロッキングされ、1時間、一次モノクローナル抗体抗3XFLAG(Sigma)1:1000とRTでインキュベートされた。ペルオキシダーゼカップル二次抗体抗マウス(AbCam)、1:10,000希釈とのRTでの(1時間)インキュベーション後、タンパク質バンドがSuper Signal Dura West(Pierce)を使用する工程によって検出された。画像はLas3000 Imaging System(Fuji)を使用してCCDカメラで取得された(ADAMTS-5ウエスタンブロットについて図2を参照されたい)。
【０１３１】
酵素活性の分析
精製全長酵素ADAMTS-4 3X FLAGおよびADAMTS-5 3X FLAGは、酵素アッセイによって活性について検査された。ポリアクリルアミド中に捕捉されたウシ鼻軟骨から精製されたアグリカン(Nagase and Woessner, 1980. Anal Biochem. 107:385〜392)はアグリカン分解活性を決定するための基質として使用された。
【０１３２】
アグリカン/ポリアクリルアミド粒子試料(乾燥重量5.0±0.2mg)は1.5mLチューブにTNC(0.1M Tris-HCl、0.1M NaCl、10mM CaCl2、0.1%CHAPS;pH7.5)400μLならびに(一過的に形質移入されたFreeStyle-293細胞で発現された)組換えADAMTS-4(p68、FL)およびADAMTS-5(p75、FL)調製物100μLと共に入れられ、37℃、6または24時間インキュベートされた。反応は、停止溶液(50Mm Tris、200mM酢酸ナトリウム、100mM EDTA;pH=6.8)500μLで停止され、粒子は液相から遠心分離(10000rpm、4分間、4°C)によって分離された。上清中の硫酸化グルコサミノグリカン(GAG)の量は比色定量アッセイ(1,9ジメチルメチレンブルー、DMB)によって決定された。標準曲線(ウシ気管から抽出されたコンドロイチン硫酸)および試料は、PBS-1%BSAに希釈された。5〜20分間の反応後、試料は590nmで読み取られた。各試料のGAG濃度は吸光度測定値(ブランク減算)から算出され、参照標準曲線と比較された。
【０１３３】
軟骨移植片および培養
ウシ鼻軟骨ディスクは8カ月齢オスウシ鼻中隔から得られた。簡潔には、軟骨の直径2mmパンチが鼻軟骨から得られた。パンチは最初にPBS-AASS緩衝液(1xPBS、100U/mlペニシリンG、100μg/mlストレプトマイシンおよび2.5μg/mlアンホテリシンB)で3回洗浄された。パンチは、次に10%DMEM、100U/mlペニシリンG、100μg/mlストレプトマイシンおよび2.5μg/mlアンホテリシンB(DMEM-AASS培地)を含有するマイクロプレートウェル中、37℃、5%CO2の雰囲気中でインキュベートされた。3時間後、試料はPBS-AASS緩衝液で洗浄され、DMEM-AASS培地でインキュベートされた。軟骨細胞の調製48時間後、試料はさまざまな濃度の阻害剤(すなわちCRB0017_IgG4およびTIMP-3)を加えた5ng/mL IL-1αで処置され、DMEM、0.1%BSA+AASS中で48時間インキュベートされた。処置後、上清および軟骨の小片は集められ、GAG分析(GAG放出の測定は、培養物中の軟骨から放出されたアグリカンフラグメント形態でのグルコサミノグリカン-GAGの定量である)のために使用された。軟骨のパンチは、組織に残っている総GAGの百分率の測定のために、最初に500μg/mLパパイン65℃、2時間インキュベートされた。硫酸化グルコサミノグリカン(GAG)決定は、1,9ジメチルメチレンブルー(DMB)での比色定量アッセイによって行われる。標準曲線(ウシ気管から抽出されたコンドロイチン硫酸)、培地試料および消化された軟骨試料は1%PBS-BSA中に希釈された。5〜20分間の反応後、試料は590nmで読み取られた。
【０１３４】
ADAMTS-5およびADAMTS-4 3xFLAG全長タンパク質の免疫沈降
免疫沈降はプロテインG免疫沈降キット(SIGMA)を使用して実施された。無関係な細胞性タンパク質のプロテインGアガロースへの非特異的吸着によって生じるバックグラウンドを低減するために、予備クリーニング工程が実施された。プロテインGアガロース懸濁物50μlは微量遠心チューブ中で試料(ADAMTS-5またはADAMTS-4精製タンパク質)に添加され、2時間、4℃で揺らしながらインキュベートした。ビーズは微量遠心チューブ中での12,000g、30秒間の遠心分離によって沈殿され、集められた上清(予備クリーニング試料)は、新たなチューブに移された。この試料は免疫沈降のために使用された。試料に抗Sp_ADAMTS-5が添加され、IP緩衝液中で容量を600μLに調整された。この試料はキャップ付きスピンカラムに入れられ、一晩、4℃でインキュベートされた。翌日、洗浄されたプロテインGアガロースビーズ50μLはカラムに添加された。4℃、2時間揺らしてのインキュベーション後、スピンカラムの先端が折られ、カラムは2mLエッペンドルフチューブに入れられた。チューブは、12,000xg、30秒間、4℃で遠心された。スピンカラム中のビーズは1xIP緩衝液700μlに再懸濁され、次いでカラムは12,000xg、30秒間、4℃で遠心分離された。この洗浄工程は3回繰り返された。最終洗浄は0.1xIP緩衝液で実施された。ビーズは熱1xLaemmli試料緩衝液50μLで再懸濁された。95℃での10分間のインキュベーションの後、タンパク質は13,000xg、1分間の遠心分離によって溶出された。試料は、ウエスタンブロット分析のためにSDS-PAGEゲルにロードされた。
【０１３５】
細胞-ELISAフォーマットにおけるHek-293-ADAMTS-5-3XFLAG/Hek-293への本発明の抗体の結合
細胞に基づくELISAフォーマットは、標的細胞性タンパク質が同一ウェル中で分析されることを可能にし、それによりウェル対ウェル変動を最小化する。ADAMTS-5 3XFLAGを安定に発現しているFreeStyle(商標)293-F細胞株が使用された。細胞は、FreeStyle(商標)293発現培地中で懸濁培養物として培養された。ADAMTS-5 3XFLAGを発現しているFreeStyle(商標)293-F細胞およびFreeStyle(商標)293-F細胞は、96ウェルプレートに播種され(細胞100,000個/ウェル)、1時間、37℃でインキュベートされた。次いで細胞はCRB0017_IgG4(最終濃度10-5-2μg/ml)で処置され、1時間、37℃でインキュベートされた。次いで細胞はHBSS(Ca/Mgを含む)中の4%p-ホルムアルデヒド(50μL/ウェル)で15分間、RTで固定され、ウェルでTBS中の0.1%イゲパル(100μL/ウェル)100μlで15分間、RTで透明処理されたまたはされなかった。次いで細胞はTBS(100μL/ウェル)で洗浄され、TBS中1%H2O2(100μL/ウェル)で20分間、RTでの消光が続いた。次に細胞はTBS(100μL/ウェル)で洗浄され、TBS中5%BSA(100μL/ウェル)、30分間、RTでのブロッキングが続いた。細胞をTBS中0.1%Tween(TTBS)(100μL/ウェル)で3X洗浄後、次いで細胞は、二次抗体(TTBS中1:5000ロバ抗ヒト-HRP抗体100μL/ウェル)と30分間、RTでインキュベートされた。細胞をTTBS(200μL/ウェル)で3X洗浄後、細胞はTMB 100μL/ウェルを添加して検出された。反応は停止され、15分間以内での0.5M H2SO4(100μL/ウェル)での検出。pAb抗ADAMTS-5 Cys636-649(Abcam#ab111918)およびpAb抗ADAMTS-5 Cys 600-700(Abcam # ab41037)がADAMTS-5の有効性保持および/または分泌を検出するために使用された。
【０１３６】
ADAMTS-5への本発明の抗体の結合能力の評価
mAb CRB0017_IgG4は100mM Na2CO3 pH9.6中2μg/mLでコートされ、4℃、一晩インキュベートされた。翌日、未結合免疫グロブリンはプレートから廃棄され、TBSで3x洗浄された。プレートはタンパク質を含まないブロッキング緩衝液(Pierce-未希釈)200μlを添加し、1時間、37℃でインキュベートする工程によってブロッキングされた。プレートは上のとおり洗浄された。次いでヘパリン100μl/mlを補充したHEK-293-ADAMTS-5-3XFLAGまたはHEK-293(陰性対照)のいずれかの培養上清1ウェルあたり100μLが添加された。プレートは1時間、37℃でインキュベートされた。プレートは、次にTTBSで3X洗浄された。マウス抗Flag-抗体(Sigma; cod F3165)1:8000希釈1ウェルあたり100μlはブロッキング緩衝液(TTBSで1:2希釈)に添加された。プレートは、1時間、37℃でインキュベートされた。プレートはTTBSで3X洗浄された。TTBS中1:2000に希釈された抗マウス抗体(DAKO)100μlが添加され、プレートは1時間、37℃でインキュベートされた。プレートは最後にTTBSで3XおよびTBSで3X洗浄された。検出のためにTMB 100μlが添加され、暗所でシグナルが見られるまで(通常5〜15分間)インキュベートされた。停止溶液1ウェルあたり100μLが反応を停止するためにO.D.測定前に添加された。
【０１３７】
CRB0017_IgG4抗スペーサーADAMTS-5のADAMTS-5抗原への結合を妨害するシンデカン-4の能力の評価
CRB0017_IgG4(2μg/ml)1ウェルあたり100μlがコーティング緩衝液(2μg/ml)中でイムノプレートにコートされ、4℃、一晩インキュベートされた。未結合免疫グロブリンはプレートから廃棄され、TBSで3x洗浄された。非特異的結合はブロッキング緩衝液(未希釈)1ウェルあたり200μlを添加し、1時間、37℃でインキュベートする工程によってブロッキングされた。その間にチューブはブロッキング緩衝液TBS中1:2希釈中の[ADAMTS-5(4μg/ml)+シンデカン-4(R&D System# 2918-SD-050)で調製された;シンデカン-4について検査された濃度範囲:0.05〜2μg/ml;このアッセイのために設定された条件において、最大妨害効果が0.1μg/mlで得られた。次いでプレートは上に記載のとおり洗浄された。ブロッキング緩衝液TBS中1:2希釈ADAMTS-5(4μg/ml)または[ADAMTS-5(4μg/ml)+シンデカン-4(0.1μg/ml)のいずれかの1ウェルあたり100μlが添加された。陰性対照として、いくつかのウェルにブロッキング緩衝液TBS中1:2希釈100μlが添加された。いくつかのウェルは対照としてシンデカン-4(適切な濃度)100μlが添加された。プレートは、1時間、37℃でインキュベートされた。インキュベーション後、プレートはTTBSで3X洗浄された。ブロッキング緩衝液(TTBSで1:2希釈)中に1:2000希釈した抗Flag抗体(Sigma)1ウェルあたり100μlが添加された。シンデカン-4だけのウェルには、ブロッキング緩衝液(TTBSで1:2希釈)中1:5000希釈された抗シンデカン-4(Santa Cruz Biotechnology # sc-12766)1ウェルあたり100μlが添加された。次いでプレートは1時間、37℃でインキュベートされた。インキュベーション後、プレートはTTBSで3X洗浄された。TTBS中1:5000希釈されたペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウス抗体(Jackson ImmunoResearch)を1ウェルあたり100μlが添加され、プレートは1時間、37℃でインキュベートされた。プレートは最後にTTBSで3XおよびTBSで3X洗浄され、TMB 1ウェルあたり100μlが添加された。プレートはシグナルが見られるまで(通常5〜15分間;いずれの場合でも30分間を超えない)暗所でインキュベートされた。停止溶液1ウェルあたり100μlがO.D.測定前に添加された。
【０１３８】
変形性関節症のSTR/ortマウスモデルにおける抗ADAMTS-5 mAbの効果の評価
STR/ortオスマウス(Mason et al., 2001. Osteoarthritis Cartilage. 9:85〜91)は、5月齢で採用され(n=20〜22)、各ケージに処置のためにケージ1個あたり動物4匹で無作為化され、重さを測られ、抗ADAMTS-5 IgG4 1.2μg、抗ADAMTS-5 IgG4 12μgまたはビヒクルのいずれかで各膝の関節内を処置された。6週間後、抗ADAMTS-5 IgG4の関節内投与がいくつかの用量で反復された。採用の3カ月後、動物は頸椎脱臼によって屠殺され、後肢を取り出され、ホルマリン中o/nで固定された。後肢はパラフィンに包埋され、5ミクロン厚切片が生産され、トルイジンブルーで染色され、次いで盲検でMankin's(Mankin et al., 1971. J Bone Joint Surg Am. 53:523〜537)およびOARSI法(Pritzker et al., 2006. Osteoarthritis Cartilage. 14:13〜29)の両方に従ってスコア化された。この方法は、最も進行したグレード(6)およびより広がっているステージ(4)に基づいて0〜24の範囲のOAスコアを導く。統計解析は、スチューデントのt検定でビヒクル対基礎を比較して、および全処置群対ビヒクルを比較するダンまたはダネット検定が続くANOVAで実施された。
【０１３９】
変形性関節症の内側半月板断裂(MMT)ラットモデルにおける本発明の抗体の評価
ラットにおける片側内側半月板断裂(MMT)は、軟骨細胞およびプロテオグリカン損失、細線維化、骨棘形成および軟骨細胞クローニングよって特徴付けられる急速進行性の軟骨変性的変化を生じる。進行性変性的変化は、外科処置後3〜6週間で生じ、脛軟骨変性は、マトリクス周囲および顕著な骨棘における重症度の低い変性的変化を伴って局所的に重度である場合がある。
【０１４０】
体重200gのオスルイスラットが使用された。右膝は外科処置またはシャム外科処置を受けた。内側側副靱帯は横切開され、内側半月板は止血鉗子で把握され、大腿骨に向かって近位に示された。半月板はメスまたは小外科用ハサミで横切開された。シャム手術は、皮膚および包を開く工程だけからなる。外科処置1週間後、ラットは、手術された膝の関節内をCRB0017_IgG4 34μg、CRB0017_IgG4 72μgまたはビヒクルのいずれかなどの本発明の抗体で処置された。
【０１４１】
外科処置4週間後、動物は頸椎脱臼によって屠殺され、手術された膝は取り出され、ホルマリン中o/nで固定され、パラフィンに包埋され;5-ミクロン厚切片が生産されトルイジンブルーで染色され、次いで盲検でMankin'sおよびOARSI法の両方に従ってスコア化された。統計解析は、スチューデントのt検定でビヒクル対シャムを比較して、およびANOVAで実施された。
【０１４２】
結果
SPLINT技術を使用する特異的抗スペーサードメイン抗体の選択
SPLINT技術によってADAMTS-5の特異的抗スペーサードメインを選択するために、ADAMTS-5のスペーサードメイン(配列番号2のaa732からaa874)はLexA(LexA-Sp_ADAMTS-5;配列番号93)の3'にクローニングされ、マウスSPLINT(mSPLINT)および2つの異なるヒトSPLINT(huSPLINT_09およびhuSPLINT_10)ライブラリーにチャレンジするために使用された(Visintin et al., 2004. J Immunol Methods. 290:135〜153)。選択手順からヒスチジン非存在で増殖でき、β-ガラクトシダーゼの活性化を示す合計325個のコロニーが得られた。scFv-VPプラスミドが単離され、それらの制限パターンおよび配列によってソートされた。さまざまなDNAフィンガープリントとのscFvの特異性は、LexA-Sp_ADAMTS-5および無関係の抗原としてのLexA-laminを発現している酵母株を使用して再分析された。それにより11個の異なる抗スペーサードメインscFvが同定された。選択された抗スペーサーscFvのV領域ヌクレオチド配列の分析は、それらがごくわずかな体細胞変異を有して生殖系列V領域遺伝子(Table IV(表4))由来であることを明らかにした(データ記載せず)。
【０１４３】
【表４】
2015518476.tif 000005
【０１４４】
単離された抗Sp_ADAMTS-5scFvのV領域のアミノ酸配列は、配列番号:3および4;5および6;7および8;9および10;11および12;13および14;15および16;17および18;19および20;21および22;23および24からなる配列の群にある。
【０１４５】
大腸菌の細胞質中の抗スペーサーscFvの発現およびリフォールディング
潜在的抗スペーサーin vivo結合剤を同定するために、抗Sp_ADAMTS-5 scFvを発現するcDNAは、大腸菌pET41b発現ベクターにクローニングされた。タンパク質は、細胞質において十分に発現され、大部分が封入体(IB)に保持されていた。scFvフラグメントは、IBの可溶化後に透析によってリフォールディングできた。(Umetsu et al., 2003. J Biol Chem. 278:8979〜8987. Epub 2003 Jan 8977)。本発明者らは、希釈によるリフォールディング技術を実施した(Patil et al., 2008. J Biotechnol. 134:218〜221. Epub 2008 Jan 2018)。scFvのリフォールディング条件は各試料について最適化された。リフォールドされたscFvは、次にBioanalyzer 2100(Agilent)によって定量され、ELISAおよびBiacore分析によって検査された。
【０１４６】
抗ADAMTS-5のヒトADAMTS-5への結合特異性
SPLINTライブラリーから単離された抗Sp_ADAMTS-5scFvのパネルの特異性を理解するために、これらの抗体のスペーサーGST(配列番号94)およびADAMTS-5 FLに対する免疫反応性が実証された。すべての単離された抗スペーサーscFvは、ADAMTS-5のトランケート型のGST融合タンパク質とELISAアッセイにおいて反応性であった。しかしCRB0017、CRB0018およびCRB0093 scFvは、高度に特異性であり、陰性対照として使用されたGSTタンパク質への弱い結合だけが観察された(図3)。
【０１４７】
再編成されたキメラ免疫グロブリンCRB0017_IgG4は、ELISAアッセイにおいて用量依存性の様式で同じ免疫反応性パターンを示す(図4)。同様の結果がモノクローナル抗体CRB0102およびCRB0123で得られた(データ記載せず)。さらに、キメラ抗Sp_ADAMTS-5 CRB0017_IgG4(マウス可変領域を含む)は、組換えADAMTS-5 FLタンパク質および組換えヒトADAMTS-4 FLを免疫沈降できる(図6および図7)。付加的に本発明者らは、表面プラズモン共鳴(SPR)分析をCRB0017_IgG4の結合動力学を決定するために実行した。キメラモノクローナル抗体(mAb)は、CM5チップに固定され、次にSp_ADAMTS-5-GSTの種々の濃度の注射が続く、またはSp_ADAMTS-5-GST固定センサーチップとの組合せでリガンドをとして使用されるのいずれかであった。二価結合モデルを使用して、本発明者らは定常状態結合定数(KD2)を決定した。結合剤を使用する場合、本発明者らは、SPRによって約ナノモル以下の結合強度を測定した-KD2 7nM(データ記載せず)。センサーチップに固定された場合にCRB0017_IgG4も強い親和性を示し(約2nMのKD1)(図5)、抗原特異的ELISAによって決定された結合値とよく相関した(図4)。
【０１４８】
ADAMTS-5標的抗原への抗スペーサーADAMTS-5 mAbの結合能力の評価
精製ADAMTS-5酵素は、コーティングされたmAb CRB0017_IgG4、CRB0093_IgG4、CRB094_IgG4、CRB0123_IgG4およびCRB0124_IgG4を使用してELISAでチャレンジされた。図15に示すとおり、mAb CRB0017、CRB0093、CRB0094およびCRB00124がADAMTS-5に匹敵する特異性を示した一方で、このアッセイでmAb CRB0123_IgG4は、mAb CRB0017_IgG4よりも高い結合能力をADAMTS-5に対して示した(図15)。
【０１４９】
細胞-ELISAフォーマットにおけるHek-293-ADAMTS-5-3XFLAG/Hek-293への本発明の抗体の結合
細胞ELISAでは、培養細胞でのタンパク質発現または翻訳後修飾を測定するために定量的免疫細胞化学を使用する。細胞は96-ウェルプレート中で固定され、目的の標的は高特異性の十分に特徴付けられたモノクローナル抗体で検出され、レベルは酵素標識二次抗体で定量される。この方法を使用して、安定HEK293株によって発現される全長ADAMTS-5とCRB0017_IgG4との間の結合が評価された。酵素は、この細胞株によって効率的に分泌される、および細胞外マトリクス(ECM)中に保持されるの両方である。CRB0017_IgG4がこの組換え細胞株でチャレンジされた場合、それは酵素ADAMTS-5をその天然フォールディング状態で(用量依存的に)認識できた(図11)。
【０１５０】
ADAMTS-5へのmAb CRB0017の結合能力の評価
ADAMTS-5 3XFLAGを安定に発現しているFreeStyle(商標)293-F細胞株から採取された(採取工程は安定に形質移入された細胞のプールの希釈ごとに行われた)上清(天然全長酵素ADAMTS-5およびFreeStyle(商標)293-F細胞株を含有していた)はコートされたmAb CRB0017_IgG4を使用してサンドイッチELISAアッセイでチャレンジされた。上清はADAMTS-5の機能を保存し、酵素の自己消化を可能な限り避けるために集めた後、直ちに使用された。
【０１５１】
図12に示すとおり抗体は、培養上清中に存在する酵素  ADAMTS-5を高い特異性で認識できた。
【０１５２】
ADAMTS-5抗原に結合するCRB0017_IgG4抗スペーサーADAMTS-5を妨害するシンデカン-4の能力の評価
シンデカン-4が、ADAMTS-5介在アグリカン切断の活性化を阻害することを通じて肥大性OA軟骨細胞による軟骨分解に機能的に関与していることが実証された(Echtermeyer, F. et al. 2009. Nat Med. 15(9):1072〜6)。ADAMTS-5活性化は、変形性関節症の軟骨細胞表面でのシンデカン-4との直接相互作用に依存しており;軟骨分解に関与している機序はシンデカン-4へのADAMTS-5の直接結合およびERK依存性様式でシンデカン-4によって制御されるMMP-3によるADAMTS-5活性化の制御の両方を含むと考えられる。
【０１５３】
それによりシンデカン-4発現がOAの際に誘導される正確な経路および軟骨組織修復に関与する機序は、今もなお熱心に調査されている。mAb抗ADAMTS-5 CRB0017がシンデカン-4によって介在される軟骨細胞の病理学的応答を調節できる可能性を評価するために、本発明者らは、ADAMTS-5-シンデカン-4相互作用を妨害するmAb CRB0017の能力を実証するための予備的in vitroアッセイを設定する。図14に示すとおり、シンデカン-4がウェルに添加される場合、ODはADAMTS-5だけがCRB0017_IgG4に添加されたウェルに対して減少する。これは、ADAMTS-5とmAb CRB0017との間の特異的相互作用がシンデカン-4によって効率的に解離されたことを実証している。
【０１５４】
スペーサードメインおよびTSP1型ドメインが細胞外マトリクスとの密接な相互作用のために重要であることが実証された。さらに、ADAMTS-5はシンデカン-4のヘパラン硫酸鎖に結合され、この機序によって細胞表面に固定されることが実証された。ADAMTS-5のどのドメインがシンデカン-4との結合に関与するのかはまだ理解されていない。抗体作用の最終結果としての結合の損失は、十分に機能しない結合特性を最終的に導く任意の機序がADAMTS-5とシンデカン-4との間の相互作用の損失を生じるとしても現在のところ解離についての直接競合(同じ結合エピトープ)対間接的(立体障害)機序についていかなる結論も認めていない。
【０１５５】
抗ADAMTS-5中和活性の測定
本発明者らは、ウシ軟骨組織におけるIL-1α-誘導アグリカン分解の阻害も評価した。処置48時間後、組織中に残っている全GAGの割合が測定された。この分析は、CRB0017_IgG4が20nM濃度で組織からのGAG放出を阻害(50%阻害)したことを明らかにした(図8)。この実験では対照抗体(nhIgG4)は、同じ濃度で酵素を妨害できなかった。さらに天然阻害剤TIMP-3は、20nMの濃度で検査した場合にIL-1α介在転換および放出プロセスの著しい阻害を示さなかった(データ記載せず)。化学化合物Cpd23、アグリカナーゼおよびMMP-13の3,3-ジメチル-5-ヒドロキシピペコリン酸ヒドロキサメートに基づく阻害剤(1μMの濃度で使用される、Noe et al., 2005. Bioorg Med Chem Lett. 15:2808〜2811)は、このアッセイにおいて天然阻害剤TIMP-3に対してより良い阻害効果を示すことから、陽性対照として使用された。
【０１５６】
変形性関節症のSTR/ortマウスモデルにおけるCRB0016_IgG4の効果の評価
ヘリックスB-ADAMTS-5結合タンパク質CRB0016_IgG4が、各動物の両膝関節内に、実験の開始時に1回および6週間後に再度、膝1カ所あたり1.2および12μgの用量で投与された。
【０１５７】
3カ月後本発明者らは、ビヒクル処置動物由来の膝が、軟骨下骨への関節軟骨の中裂およびびらんを伴い、目立った軟骨骨異形成ならびにしばしば炎症およびパンヌスを伴って、重度のOAを示したことを観察した。検討されたいかなるパラメーターもCRB0016_IgG4のいずれの用量においても投与に関連する顕著な変化はなかった。
【０１５８】
組織学的試料の盲検スコアリングの手順は、軟骨損傷を低下させる化合物の効果を示さなかった。総合するとこれらのデータは、3カ月に2回のヘリックスB-ADAMTS-5結合タンパク質CRB0016_IgG4の膝関節内投与がSTR/ortマウスにおいて変形性関節症の病態の重症度を低減できなかったことを示している。
【０１５９】
変形性関節症のSTR/ortマウスモデルにおけるCRB0017_IgG4の効果の評価
CRB0017_IgG4が、各動物の両膝関節内に、実験の開始時に1回および6週間後に再度、膝1カ所あたり1.2および12μgの用量で投与された。3カ月後本発明者らは、ビヒクル処置動物由来の膝が、軟骨下骨への関節軟骨の中裂およびびらんを伴い、目立った軟骨骨異形成ならびにしばしば炎症およびパンヌスを伴って、重度のOAを示したことを観察した。OA Mankin'sスコアは、ビヒクルと比較してCRB0017_IgG4 12μg群において有意に減少していた。OAグレードxステージは、損傷の深さ(グレード)だけでなく、関節表面でのその広がり(ステージ)も考慮に入れる。OAグレードxステージは、ビヒクルと比較してCRB0017_IgG4 12μg群において有意に低くなっていた。CRB0017_IgG4 1.2μgの投与は、両方のスコアリング法での減少傾向に関連していた。結論として本発明者らは、CRB0017_IgG4が、組織学的に査定される軟骨崩壊を遅延させることによってSTR/ortマウス株においてOAの経過を変えることができることを観察した。組織学的試料の盲検スコアリングの手順は、軟骨損傷を減少させる化合物の用量依存的効果を明確に示した。
【０１６０】
総合するとこれらのデータは、3カ月に2回のCRB0017_IgG4の膝関節内投与がSTR/ortマウスにおいて変形性関節症の病態の重症度を用量依存的に低減したことを示している。
【０１６１】
変形性関節症の内側半月板断裂(MMT)ラットモデルにおける本発明の抗体の評価
注射3週間後、本発明者らは、ビヒクル処置動物由来の膝が、軟骨下骨への関節軟骨の中裂およびびらんを伴い、目立った骨棘、炎症およびパンヌスを伴って、重度のOAを示したことを観察した。CRB0017_IgG4の投与は全ての組織学的病理学的重症度スコアにおいて用量依存性の減少と関連した(図13)。組織学的試料の盲検スコアリングの手順は、CRB0017_IgG4での関節内処置後のOA重症度における用量依存性の減少を示した。
【０１６２】
いくつかのタンパク質分解性酵素は、それらの触媒ドメインに加えて、酵素と基質または阻害剤との間の相互作用の重要なモジュレーターである非触媒性補助ドメインも有する。酵素のADAMTSファミリーメンバーはプロテオグリカンを分解し、それにより組織アーキテクチャーを変更させ、細胞性機能を制御する可能性を有する。
【０１６３】
具体的には、ADAMTS-4およびADAMTS-5は、種々の部位でアグリカンを切断でき、コンドロイチンおよび組織由来分子のケラタン硫酸保持領域を放出する。これは、変形性関節症の発症の早期で決定的な工程であることが実証された。これらの酵素は、変更させられたタンパク質分解性活性を有するさらに小さなアイソフォームにタンパク質分解される場合もある。
【０１６４】
残念ながら、全長アグリカナーゼの3Dドメインアーキテクチャーは、これらの酵素のX-線構造を得ることが、それらの複雑な産生および精製のために、非常に難しいことから知られていない。
【０１６５】
今日までにADAMTS-1、ADAMTS-4およびADAMTS-5酵素の全X-線構造の一部だけが利用可能であり(X-線結晶解析によって解像された構造は触媒性およびディスインテグリンドメインだけを含む)、そのため、触媒ドメインに関連するすべてのドメインの配置および方向性を推定することは不可能である。Mosyakによって決定されたADAMTS-4およびADAMTS-5の触媒性およびディスインテグリンドメインの結晶構造(Mosyak et al., 2008. Protein Sci. 17:16〜21)は、酵素が、阻害剤に結合される場合に「開」形態を示し、自己阻害および非結合である場合に「閉」形態を示すことを示した。これに基づいて本発明者らは、成熟アグリカナーゼが2つの異性体の混合物として存在し、平衡して共存できることを提案した。この「アンサンブル」では、この形態の1つだけがタンパク質分解的に活性である。さらに、ADAMTS-5およびADAMTS-4の両方の全長形態は、それらの天然基質、アグリカンに対して、高度に活性であり、酵素のC-末端非触媒ドメインの欠失は、それらの活性を大きく低減することが実証された(Kashiwagi et al., 2004. J Biol Chem. 279:10109〜10119); (Gendron et al., 2007. J Biol Chem. 282:18294〜18306); (Fushimi et al., 2008. J Biol Chem. 283:6706〜6716)。これは、それら自体またはタンパク質結合様式中のドメインがさらなる開形態へ平衡を乱す場合があることを示唆する。
【０１６６】
本発明は、ADAMTS-5のスペーサードメインなどの補助的非触媒ドメインに方向付けられた抗体が、このタンパク質の酵素活性を強く阻害する証拠を提供する。具体的には抗スペーサードメイン抗体CRB0017_IgG4で得られた結果は、スペーサードメイン中のアグリカナーゼ-2の阻害が、触媒ドメイン内での酵素の阻害よりもさらに効果的であるとの概念を例示する。注目すべきことに、CRB0017_IgG4がin vitroおよびin vivoでのADAMTS-5のタンパク質分解性効果を強く阻害し得る一方で、CRB0016_IgG4などの抗触媒性抗体は、そのような効果を生じさせ得ないことが示されている。
【０１６７】
本発明の抗体で得られた優れた結果は、具体的には、CRB0017_IgG4では、ADAMTS-5のスペーサードメインの上のそれらのブロッキング特性による。Troebergによって仮定されたとおり(Troeberg et al., 2009. Matrix Biol. 28:463〜469)、ADAMTS-5の活性部位への結合によって、本発明の抗体は酵素が「閉」形態になる引き金になると考えられ、それにより酵素を直接的に阻害するまたはその天然阻害剤TIMP-3と酵素との相互作用に有利に働く。
【０１６８】
さらに、得られたデータはいままでのところ、mAb CRB0017_IgG4によるADAMTS-5とシンデカン-4との間の結合の阻害が、シンデカン-4によって介在される軟骨細胞の病理学的応答を調節する役割を有している可能性がある。
【０１６９】
活性化軟骨細胞による酵素の誘導とは別に、シンデカン-4の機能はマトリクス分子と細胞表面プロテオグリカンとの相互作用によってさらに制御される。シンデカン-4は、ADAMTS-5の活性に不可欠であると考えられる膜貫通ヘパラン硫酸プロテオグリカンである。
【０１７０】
シンデカン-4活性の損失が、ネズミDMM OAモデルにおいてOA軟骨病態を著しく低減したことが実証された。これは、シンデカン-4特異的抗体を含む関節内注射によって局所的に処置されたシンデカン-4ノックアウトおよびWTマウスの両方において実証された。in vitro研究は、ADAMTS-5とのシンデカン-4の直接相互作用を同定した。付加的に、ADAMTS-5活性がMMP-3に依存し、後者の活性がシンデカン-4によって管理されていることが実証された。
【０１７１】
シンデカンは、マトリクスメタロプロテイナーゼおよびエンドプロテイナーゼのメトジンシンファミリーによって膜近くの外部ドメイン部位で制御されたタンパク質分解性切断を受け、プロセスは排出と称され、通常の代謝回転の一部としておよび外部刺激への応答としての両方であり、複数の経路によって制御される。シンデカンシグナル伝達を途絶させる工程に加えて、放出された可溶性外部ドメインは、そのリガンドについて無処置シンデカンと競合するアンタゴニストとして作用する。シンデカン外部ドメイン排出が生理学的刺激によって活性化されることは周知である一方で、外部ドメインは病態生理学的役割であると見なされ、具体的には腫瘍形成および炎症では、それらの細胞表面からの放出がどのように制御されるかについてほとんどわかっていない。そのため、抗ADAMTS-5 CRB0017_IgG4がこのプロセスのさらなる理解の助けとなり得るかを確認することは、興味深いものとなり得る。
【配列表フリーテキスト】
【０１７２】
配列番号1:ATS4_ヒト、トロンボスポンジンモチーフ4を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ(UniProtKB/Swiss-Prot:O75173.3)
配列番号2:ATS5_ヒト、トロンボスポンジンモチーフ5を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ(UniProtKB/Swiss-Prot:Q9UNA0.2)
以下において:VK=軽鎖、VH=重鎖、CDRL=軽鎖の相補性決定領域、CDRH=重鎖の相補性決定領域
配列番号3から配列番号94、配列番号125から132および配列番号135から配列番号137はアミノ酸配列であり、配列番号95から120はヌクレオチド配列である。
配列番号3:CRB0017VK
配列番号4:CRB0017VH
配列番号5:CRB0018VK
配列番号6:CRB0018VH
配列番号7:CRB0019VK
配列番号8:CRB0019VH
配列番号9:CRB0091VK
配列番号10:CRB0091VH
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配列番号12:CRB0092VH
配列番号13:CRB0093VK
配列番号14:CRB0093VH
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配列番号16:CRB0094VH
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配列番号18:CRB0102VH
配列番号19:CRB0122VL
配列番号20:CRB0122VH
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配列番号92:CDRH3_124
配列番号93:lexA-スペーサー
配列番号94:スペーサー-GST
配列番号95:CRB0016_VK
配列番号96:CRB0016_IgG4
配列番号97:CRB0017_VK_CK
配列番号98:CRB0017_IgG4
配列番号99:CRB0017_VK
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配列番号114:CRB0102_VH
配列番号115:CRB0122_VL
配列番号116:CRB0122_VH
配列番号117:CRB0123_VK
配列番号118:CRB0123_VH
配列番号119:CRB0124_VL
配列番号120:CRB0124_VH
配列番号121:ヒトスペーサードメイン_AA
配列番号122:ヘリックス_B_ADAMTS-5_AA
配列番号123:ヒトスペーサードメイン
配列番号124:ヘリックス_B_ADAMTS-5
配列番号125:CRB0017_scFv
配列番号126:CRB0018_scFv
配列番号127:CRB0019_scFv
配列番号128:CRB0091_scFv
配列番号129:CRB0092_scFv
配列番号130:CRB0093_scFv
配列番号131:CRB0094_scFv
配列番号132:CRB0102_scFv
配列番号133:ヒトADAMTS-5_cDNA
配列番号134:ヒトADAMTS-4_cDNA
配列番号135:CRB0122_scFv
配列番号136:CRB0123_scFv
配列番号137:CRB0124_scFv
配列番号138:小さなペプチドリンカー
配列番号139〜216:合成プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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