(57)【要約】  アブラナ属ＡゲノムＤＮＡを検出し、同定し、定量化するための方法および組成物が記載される。方法は、アブラナ属Ａゲノムに対して特異的であり、キャノーラ畑の混入の一因となり得る他のアブラナ属種、作物、または雑草種と交差反応しない。
2015517322.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおけるアブラナ属ＡゲノムＤＮＡの量を検出し、定量化するための方法であって、
（ａ）前記アブラナ属ＡゲノムのゲノムＤＮＡフラグメントを特異的に増幅するステップであって、前記増幅されたＤＮＡフラグメントが、配列番号：２５、２６、２７、２８、および３５からなる群から選択されるゲノム領域の、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むステップならびに
（ｂ）前記アブラナ属Ａゲノムの前記増幅されたフラグメントから、前記アブラナ属Ａゲノムを検出し、定量化するステップを含む方法。
【請求項２】
アブラナ属Ａゲノムの前記増幅されたフラグメントが、（ｉ）配列番号：２９、３０、もしくは３１の少なくとも１つのヌクレオチド配列または（ｉｉ）配列番号：２９、３０、もしくは３１の少なくとも１つの核酸フラグメントを含み、前記核酸フラグメントが、配列番号：２９、３０、または３１の約５０〜約ヌクレオチド位置４００、５０〜約ヌクレオチド位置１００、５０〜約ヌクレオチド位置３５０、４００〜約ヌクレオチド位置３５０、４００〜約ヌクレオチド位置２００、および４００〜約ヌクレオチド位置１００からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅が、配列番号：１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプライマー対により実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ゲノムＤＮＡが、ＦａｔＡ遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅が、アブラナ属ＢゲノムＤＮＡおよびＣゲノムＤＮＡを実質的に増幅しない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
サンプルにおけるアブラナ属トランスジェニックイベントの相対量を決定するための方法であって、
（ａ）アブラナ属Ａゲノム特異的ポリメラーゼ連鎖反応を実行するステップであって、前記分析が、前記アブラナ属ＡゲノムのゲノムＤＮＡフラグメントを特異的に増幅することを含み、前記増幅されたＤＮＡフラグメントが、配列番号：２５、２６、２７、２８、および３５からなる群から選択されるゲノム領域の、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むステップ、
（ｂ）前記サンプルにおけるアブラナ属ＡゲノムＤＮＡの総量を決定するステップ、
（ｃ）前記サンプルにおける前記トランスジェニックイベントの量を決定するために、前記トランスジェニックイベントについてイベント特異的アッセイを実行するステップ、ならびに
（ｄ）前記サンプルにおけるアブラナ属ＡゲノムＤＮＡの総量と前記トランスジェニックイベントＤＮＡの量を比較するステップを含む方法。
【請求項７】
アブラナ属Ａゲノムの前記増幅されたフラグメントが、約５０〜約４００のヌクレオチド位置の、配列番号：２９、３０、または３１の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅が、配列番号：１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプライマー対により実行される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ゲノムＤＮＡが、ＦａｔＡ遺伝子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅が、アブラナ属ＢゲノムＤＮＡおよびＣゲノムＤＮＡを実質的に増幅しない、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
サンプルにおけるアブラナ属トランスジェニックイベントの外因性の存在を決定するための方法であって、
（ａ）アブラナ属トランスジェニックイベントを含有することが疑われるサンプルを得るステップ、
（ｂ）プライマーによりアブラナ属Ａゲノム特異的ポリメラーゼ連鎖反応を実行するステップであって、前記プライマーが、前記アブラナ属Ａゲノムのゲノムの領域に結合し、前記ゲノム領域が、約５０〜約４００のヌクレオチド位置の、配列番号：２９、３０、または３１の少なくとも１つのヌクレオチド配列から選択されるステップ、
（ｃ）前記サンプルにおけるアブラナ属ＡゲノムＤＮＡの総量を決定するステップ、
（ｄ）前記サンプルにおけるトランスジェニックイベントＤＮＡの量を決定するために、前記トランスジェニックイベントについてイベント特異的定量的アッセイを実行するステップ、ならびに
（ｅ）前記サンプルにおけるアブラナ属の総量と前記トランスジェニックイベントの量を比較するステップを含む方法。
【請求項１２】
前記プライマーが、配列番号：１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号：２５、２６、２７、２８、および３５からなる群から選択されるゲノム領域の、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むアンプリコンであって、前記アンプリコンが、５００塩基対以下である、アンプリコン。
【請求項１４】
配列番号：１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴが、約１５〜５００ヌクレオチドである、オリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号：１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドならびに定量的反応を実行するための１つまたは複数の反応構成成分を含む検出キットであって、前記オリゴが、約５０未満のヌクレオチドである検出キット。
【請求項１６】
アブラナ属形質の形質純度を決定するための方法であって、
（ａ）アブラナ属形質のサンプルを得るステップならびに
（ｂ）請求項１に記載のアブラナ属Ａゲノム特異的アッセイを実行するステップを含む方法。
【請求項１７】
前記形質が、ＲＴ７３、ＲＴ２００、ＭＯＮ８８３０２、ＤＰ−０７３４９６、ＨＣＮ９２、Ｔ４５（ＨＣＮ２８）、２３−１８−１７、２３−１９８、ＯＸＹ−２３５、ＭＳＩ、ＭＳ３、ＭＳ６、ＭＳ８、ＲＦ１、ＲＦ２、ＲＦ３、およびＴｏｐａｓ  １９／２からなる群から選択される、請求項６または１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記決定が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を実行するステップを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
アブラナ属種子ロットの純度を確立するための方法であって、ポリメラーゼ連鎖反応を実行するステップを含み、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブが、アブラナ属Ａゲノムをアブラナ属ＢおよびＣゲノムから識別することができ、前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブが、前記アブラナ属Ａゲノムの標的領域に結合し、前記標的領域が、配列番号：２５、２６、２７、２８、および３５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブが、配列番号：１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
アブラナ属サンプルにおけるトランスジェニックエレメントの量を定量化するための方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応を実行するステップであって、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブが、アブラナ属Ａゲノムをアブラナ属ＢおよびＣゲノムから識別することができ、前記オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブが、配列番号：２９、３０、および３１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む前記アブラナ属Ａゲノムの標的領域に結合するステップ、
（ｂ）トランスジェニックエレメント特異的定量的ポリメラーゼ連鎖反応を実行するステップ、ならびに
（ｃ）前記サンプルにおけるアブラナ属ＡゲノムＤＮＡの量と比較することによって、キャノーラサンプルにおいて存在する前記トランスジェニックエレメントの量を決定するステップを含む方法。
【請求項２２】
アブラナ属Ａゲノムを含有することが疑われる種子サンプルの種子純度を決定するための方法であって、
（ａ）前記アブラナ属ＡゲノムのゲノムＤＮＡを特異的に増幅するステップであって、前記増幅されたＤＮＡが、配列番号：２５、２６、２７、２８、および３５からなる群から選択されるゲノム領域の、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むステップならびに
（ｂ）前記アブラナ属Ａゲノムの存在または非存在に基づいて前記種子サンプルの純度を決定するステップを含む方法。
【請求項２３】
前記種子サンプルが、ブロッコリー、メキャベツ、カラシナの種子、カリフラワー、コラード、キャベツ、ケール、コールラビ、カラシナまたはカブハボタンの少なくとも１つを含有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アブラナ属Ａゲノムの存在および／または数量を決定するための方法であって、
（ａ）前記アブラナ属ＡゲノムのＤＮＡをプローブと特異的にハイブリダイズさせるステップであって、前記プローブが、任意選択で高いストリンジェンシー条件下で、配列番号：２５、２６、２７、２８、および３５からなる群から選択されるゲノム領域のヌクレオチド配列の少なくとも１つに選択的に結合するステップならびに
（ｂ）前記アブラナ属Ａゲノムの存在および／または数量を検出するステップを含む方法。
【請求項２５】
前記プローブが、ヌクレオチド位置約５０〜約４００の、配列番号：２９、３０、または３１の少なくとも１つのヌクレオチド配列から選択される前記アブラナ属Ａゲノムのゲノム領域に結合する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プローブが、配列番号：１９、２０、２１、２２、２３、または２４のヌクレオチド配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
アブラナ属Ａゲノムの領域を配列決定するための方法であって、
（ａ）ＤＮＡサンプルを得るステップならびに
（ｂ）前記ＤＮＡサンプルの配列決定反応を実行するステップを含み、前記配列決定された領域が、配列番号：２５、２６、２７、２８、および３５からなる群から選択されるゲノム領域のヌクレオチド配列の少なくとも１つを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、植物分子生物学に関する。より詳細には、本開示は、アブラナ属ＡゲノムＤＮＡの検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
アブラナ属種は、植物油、動物飼料、野菜、および調味料の原料として使用される。野菜の生産のために使用されるアブラナ属植物は、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、ケール、コールラビ、カラシナ、およびカブハボタンを含む。しかしながら、世界的規模では、アブラナ属種の最も経済的に有力な用途は、種子由来植物油の生産のためのものである。油生産のために育てられる主なアブラナ属種は、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、次にカラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）およびブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）である。セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、およびブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）の種子は、菜種と呼ばれる。主として油生産のために育てられるアブラナ属種は、多くの場合、ナタネと呼ばれる。北アメリカにおいて、種子中のエルカ酸およびグルコシノレートのレベルが低いために選択されたナタネの一種、キャノーラは、ヒト消費用の植物油の生産のために育てられる主なアブラナ属植物である。
【０００３】
キャノーラは、３つの脂肪種子アブラナ属種（セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、ブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ））を含み、世界中の８０００万エーカー超で育てられている。キャノーラは、商業栽培されている種々様々の植物種を含むアブラナ属のメンバーである。
【０００４】
トランスジェニックキャノーラは、農業生産問題を解決する手段として、現在、世界的に栽培されている。トランスジェニックキャノーラおよび他のトランスジェニック作物の開発と共に、様々な国々は、トランスジェニック物質およびそれらの派生産物を同定するために、規制を設けた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による方法は、その定量的および定性的信頼性のために、導入遺伝子検出のための最適な方法として一般に認められた。この方法は、普通、導入遺伝子および対応する参照遺伝子の増幅および検出ならびに参照遺伝子の数量に対する導入遺伝子の数量の比較を必要とする。この系は、導入遺伝子に対して特異的な２つのプライマーおよび検出プローブのセットならびに内因性参照遺伝子に対する種特異的プライマーおよびプローブのもう一つのセットを必要とする。
【０００５】
標識および追跡管理の目的のために、導入遺伝子検出アッセイは、様々な国々の必要性を満たすために開発されている。欧州連合の規制６１９／２０１１は、検出方法の結果が、分類群特異的参照系を基準にしたトランスジェニック量の割合で表わされることを指示する。「分類群」特異的リアルタイムＰＣＲアッセイの標的は、分類群特異的であるだけではなく、安定した試験結果をもたらすために、様々な遺伝的背景において定量的に安定していることを必要とする。
【０００６】
ほとんどの作物において、特異的ＰＣＲアッセイを開発するための標的種は、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、およびイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）用などのように、特有である。たとえば、とうもろこし（トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ））畑において、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）畑に交差混入し（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅ）、そのため、とうもろこし導入遺伝子の定量化を複雑にしそうな他の密接に関係のあるトウモロコシ属の種はない。しかしながら、キャノーラは、かなり違っている。
【０００７】
Ｕの三角形（図１）は、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、ブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、および３つの他のアブラナ属種の間の進化および関係を示す（非特許文献１）。進化を通して、３つのベースとなる種（クロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）、ヤセイカンラン（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、およびブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ））は、組み合わさって、３つの異質四倍体種（ブラッシカ・カリナタ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、およびカラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ））を形成する。キャノーラ（カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、およびブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ））が存在する３つの種は、Ａゲノムを共有する（図１）。
【０００８】
内因性の系が、Ａゲノムを特異的に検出することを証明することができる場合、それは、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、およびブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）におけるトランスジェニックキャノーラの相対的な定量化を含む様々な適用のために内因性の参照系を提供することもあり得る。たとえば、現在、ほとんどの商業トランスジェニックキャノーラは、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）であるが、しかしながら、他の２つの種（ブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）およびカラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ））における今後のトランスジェニックに対する検出方法においてＡ特異的内因性参照系を利用することもあり得る。ブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、およびカラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）の広範囲の種類を検出することができることに加えて、アッセイは、キャノーラ穀物ロットまたは他の主な作物に混入し得るクロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）、ブラッシカ・カリナタ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）、ヤセイカンラン（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、および他の近縁種を検出してはならず、ここで、そのような交差検出は、アッセイの精度を低下させる。さらに、ナガミノアマナズナ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）、グンバイナズナ（Ｔｈｌａｓｐｉ  ａｒｖｅｎｓｅ）、オハツキガラシ（Ｅｒｕｃａｓｔｒｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、セイヨウノダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｒａｐｈａｎｉｓｔｒｕｍ）、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、およびノハラガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｒｖｅｎｓｉｓ）を含むが、これらに限定されない、キャノーラ畑に混入し得る他の密接に関係のあるアブラナ属近縁植物がある。そのため、キャノーラについて、標識および追跡管理の見地から、難題は、キャノーラ作物とみなされる種に対して特異的となるであろうリアルタイムＰＣＲアッセイを同定することである。
【０００９】
いくつかの内因性の参照系は、現在、リアルタイムＰＣＲを使用して、遺伝子修飾キャノーラの相対的なパーセンテージを測定するために存在している。しかしながら、これらの系は、信頼できる内因性の参照系ではない（非特許文献２）。それらは、関心のある分類群または作物に対して特異的ではなく、それらは、分類群または作物内の世界的に代表的なサンプルにわたって安定していることが示されていない。
【００１０】
本開示は、アブラナ属Ａゲノムに対して特異的であり、キャノーラ畑の混入の一因となり得る他のアブラナ属種、作物、または雑草種（ｗｅｅｄｙ  ｒｅｌａｔｉｖｅ）と有意に交差反応しない、検出および定量化の方法に関する。そのうえ、多様な地理的領域由来の複数の種類由来のサンプルに対して試験された場合に、この内因性の標的は、それぞれの３つのＡゲノム種内で安定している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｎａｇａｈａｒｕ  Ｕ（１９３５）Ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ．ｎａｐｕｓ  ａｎｄ  ｐｅｃｕｌｉａｒ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｂｏｔ  ７：３８９−４５２
【非特許文献２】Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，（２０１０）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｆｉｖｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，５８：２８１２−２８１７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
アブラナ属ＡゲノムＤＮＡを検出し、同定し、定量化するための組成物および方法が、本明細書において提供される。
【００１３】
第１の態様は、サンプルにおけるアブラナ属ＡゲノムＤＮＡの量を検出し、定量化するための方法を特徴づける。方法は、アブラナ属ＡゲノムのゲノムＤＮＡフラグメントを特異的に増幅するステップであって、増幅されたＤＮＡフラグメントが、配列番号：２５、２６、２７、２８、および３５からなる群から選択されるゲノム領域の、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むステップならびにアブラナ属Ａゲノムの増幅されたフラグメントから、アブラナ属Ａゲノムを検出し、定量化するステップを含む。
【００１４】
一実施形態において、アブラナ属Ａゲノムの増幅されたフラグメントが、約５０〜約ヌクレオチド位置４００、５０〜約ヌクレオチド位置１００、５０〜約ヌクレオチド位置３５０、４００〜約ヌクレオチド位置３５０、４００〜約ヌクレオチド位置２００、および４００〜約ヌクレオチド位置１００のヌクレオチド位置からなる群から選択される、配列番号：２９、３０、または３１の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
一実施形態において、アブラナ属Ａゲノムの増幅されたフラグメントが、（ｉ）配列番号：２９、３０、もしくは３１の少なくとも１つのヌクレオチド配列または（ｉｉ）配列番号：２９、３０、もしくは３１の少なくとも１つの核酸フラグメントを含み、核酸フラグメントが、配列番号：２９、３０、または３１の約５０〜約ヌクレオチド位置４００、５０〜約ヌクレオチド位置１００、５０〜約ヌクレオチド位置３５０、４００〜約ヌクレオチド位置３５０、４００〜約ヌクレオチド位置２００、および４００〜約ヌクレオチド位置１００からなる群から選択される。
【００１６】
一実施形態において、増幅が、配列番号：１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプライマー対により実行される。
【００１７】
一実施形態において、ゲノムＤＮＡが、ＦａｔＡ遺伝子を含む。
【００１８】
他の実施形態において、増幅が、アブラナ属ＢゲノムＤＮＡおよびＣゲノムＤＮＡを実質的に増幅しない。
【００１９】
他の態様は、サンプルにおけるアブラナ属トランスジェニックイベントの相対量を決定するための方法を特徴づける。方法は、アブラナ属Ａゲノム特異的ポリメラーゼ連鎖反応を実行するステップを含み、分析が、アブラナ属ＡゲノムのゲノムＤＮＡフラグメントを特異的に増幅するステップであって、増幅されたＤＮＡフラグメントが、配列番号：２５、２６、２７、２８、および３５からなる群から選択されるゲノム領域の、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むステップ、サンプルにおけるアブラナ属ＡゲノムＤＮＡの総量を決定するステップ、サンプルにおけるトランスジェニックイベントの量を決定するために、トランスジェニックイベントについてイベント特異的アッセイを実行するステップ
、ならびにサンプルにおけるアブラナ属ＡゲノムＤＮＡの総量とトランスジェニックイベントＤＮＡの量を比較するステップを含む。
【００２０】
一実施形態において、アブラナ属Ａゲノムの増幅されたフラグメントが、約５０〜ヌクレオチド位置約４００の、配列番号：２９、３０、または３１の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
一実施形態において、増幅が、配列番号：１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプライマー対により実行される。
【００２２】
他の実施形態において、ゲノムＤＮＡが、ＦａｔＡ遺伝子を含む。
【００２３】
一実施形態において、増幅が、アブラナ属ＢゲノムＤＮＡおよびＣゲノムＤＮＡを実質的に増幅しない。
【００２４】
他の態様は、サンプルにおけるアブラナ属トランスジェニックイベントの外因性の存在を決定するための方法を特徴づける。方法は、アブラナ属トランスジェニックイベントを含有することが疑われるサンプルを得るステップ、プライマーによりアブラナ属Ａゲノム特異的ポリメラーゼ連鎖反応を実行するステップであって、プライマーが、アブラナ属Ａゲノムのゲノムの領域に結合し、ゲノム領域が、ヌクレオチド位置約５０〜約４００の、配列番号：２９、３０、または３１の少なくとも１つのヌクレオチド配列から選択されるステップ、サンプルにおけるアブラナ属ＡゲノムＤＮＡの総量を決定するステップ、サンプルにおけるトランスジェニックイベントＤＮＡの量を決定するために、トランスジェニックイベントについてイベント特異的定量的アッセイを実行するステップ、ならびにサンプルにおけるアブラナ属の総量とトランスジェニックイベントの量を比較するステップを含む。
【００２５】
一実施形態において、プライマーが、配列番号：１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択される。
【００２６】
他の態様は、配列番号：２５、２６、２７、２８、および３５からなる群から選択されるゲノム領域の、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むアンプリコンを特徴づけ、アンプリコンが、５００塩基対以下である。
【００２７】
他の態様は、配列番号：１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを特徴づけ、オリゴが、約１５〜５００ヌクレオチドである。
【００２８】
他の態様は、配列番号：１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドならびに定量的反応を実行するための１つまたは複数の反応構成成分を含む検出キットを特徴づけ、オリゴが、約５０未満のヌクレオチドである。
【００２９】
他の態様は、アブラナ属形質の形質純度を決定するための方法を特徴づける。方法は、アブラナ属形質のサンプルを得るステップならびにアブラナ属ＡゲノムのゲノムＤＮＡフラグメントを特異的に増幅することによって、アブラナ属Ａゲノム特異的アッセイを実行するステップであって、増幅されたＤＮＡフラグメントが、配列番号：２５、２６、２７、２８、および３５からなる群から選択されるゲノム領域の、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むステップならびにアブラナ属Ａゲノムの増幅されたフラグメントから、アブラナ属Ａゲノムを検出し、定量化するステップを含む。
【００３０】
一実施形態において、形質が、ＲＴ７３、ＲＴ２００、ＭＯＮ８８３０２、ＤＰ−０７３４９６、ＨＣＮ９２、Ｔ４５（ＨＣＮ２８）、２３−１８−１７、２３−１９８、ＯＸＹ−２３５、ＭＳＩ、ＭＳ３、ＭＳ６、ＭＳ８、ＲＦ１、ＲＦ２、ＲＦ３、およびＴｏｐａｓ  １９／２からなる群から選択される。
【００３１】
一実施形態において、決定が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を実行するステップを含む。
【００３２】
他の態様は、アブラナ属種子ロットの純度を確立するための方法を特徴づけ、方法が、ポリメラーゼ連鎖反応を実行するステップを含み、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブが、アブラナ属Ａゲノムをアブラナ属ＢおよびＣゲノムから識別することができ、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブが、アブラナ属Ａゲノムの標的領域に結合し、標的領域が、配列番号：２５、２６、２７、２８、および３５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
一実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブが、配列番号：１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
他の態様は、アブラナ属サンプルにおけるトランスジェニックエレメントの量を定量化するための方法を特徴づける。方法は、ポリメラーゼ連鎖反応を実行するステップであって、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブが、アブラナ属Ａゲノムをアブラナ属ＢおよびＣゲノムから識別することができ、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブが、配列番号：２９、３０、および３１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアブラナ属Ａゲノムの標的領域に結合するステップ、トランスジェニックエレメント特異的定量的ポリメラーゼ連鎖反応を実行するステップ、ならびにサンプルにおけるアブラナ属ＡゲノムＤＮＡの量と比較することによって、キャノーラサンプルにおいて存在するトランスジェニックエレメントの量を決定するステップを含む。
【００３５】
さらなる態様は、アブラナ属Ａゲノムを含有することが疑われる種子サンプルの種子純度を決定するための方法を特徴づける。方法は、アブラナ属ＡゲノムのゲノムＤＮＡを特異的に増幅するステップであって、増幅されたＤＮＡが、配列番号：２５、２６、２７、２８、および３５からなる群から選択されるゲノム領域の、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むステップならびにアブラナ属Ａゲノムの存在または非存在に基づいて種子サンプルの純度を決定するステップを含む。
【００３６】
他の実施形態において、種子サンプルが、ブロッコリー、メキャベツ、カラシナの種子、カリフラワー、コラード、キャベツ、ケール、コールラビ、カラシナ、またはカブハボタンの少なくとも１つを含有する。
【００３７】
他の実施形態において、種子サンプルが、ブロッコリー、メキャベツ、カラシナの種子、カリフラワー、コラード、キャベツ、ケール、コールラビ、カラシナ、またはカブハボタンを含有するが、これらに限定されない。
【００３８】
他の態様は、アブラナ属Ａゲノムの存在および／または数量を決定するための方法を特徴づける。方法は、アブラナ属ＡゲノムのＤＮＡをプローブと特異的にハイブリダイズさせるステップであって、プローブが、任意選択で高いストリンジェンシー条件下で、配列番号：２５、２６、２７、２８、および３５からなる群から選択されるゲノム領域のヌクレオチド配列の少なくとも１つに選択的に結合するステップならびにアブラナ属Ａゲノムの存在および／または数量を検出するステップを含む。
【００３９】
一実施形態において、プローブが、ヌクレオチド位置約５０〜約４００の、配列番号：２９、３０、または３１の少なくとも１つのヌクレオチド配列から選択されるアブラナ属Ａゲノムのゲノム領域に結合する。
【００４０】
さらなる実施形態において、プローブが、配列番号：１９、２０、２１、２２、２３、または２４のヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
他の態様は、アブラナ属Ａゲノムの領域を配列決定するための方法を特徴づける。方法は、ＤＮＡサンプルを得るステップおよびＤＮＡサンプルの配列決定反応を実行するステップを含み、配列決定された領域が、配列番号：２５、２６、２７、２８、および３５からなる群から選択されるゲノム領域のヌクレオチド配列の少なくとも１つを含む。
【００４２】
本明細書において開示される方法および組成物は、他のゲノム（たとえばアブラナ属Ｂゲノムおよびアブラナ属Ｃゲノム）のゲノムＤＮＡの検出と比較して、アブラナ属Ａゲノムの検出を識別する。
【００４３】
図面の簡単な説明および配列表
本開示は、本出願の一部を形成する以下の詳細な説明ならびに添付の図面および配列表からより完全に理解することができる。配列表は、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれるＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３：３０２１−３０３０（１９８５）およびｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１９（Ｎｏ．２）：３４５−３７３（１９８４）において記載されるＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ標準に従って定義されるヌクレオチド配列文字についての１文字コードおよびアミノ酸についての３文字コードを含有する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データについて使用される記号およびフォーマットは、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２において記載される規則に従う。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、アブラナ属の異なる植物種の間の関係を示す「Ｕ」の三角形を示す図である（Ｎａｇａｈａｒｕ  Ｕ（１９３５）Ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ．ｎａｐｕｓ  ａｎｄ  ｐｅｃｕｌｉａｒ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｂｏｔ  ７：３８９−４５２）。染色体の数をｎによって示す。クロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）、ヤセイカンラン（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、およびブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）は、３つのベースとなる種である。異質四倍体種は、ブラッシカ・カリナタ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、およびセイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＦａｔＡの６つのコンセンサス配列の進化の関係を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、６つのコンセンサス配列への５３の配列決定した変種の分類を示す図である。
【図３】図３は、ＦａｔＡコンセンサス配列のアライメントを示す図である。円は、Ａ特異性の領域または塩基を示す。灰色の強調した塩基は、ＦａｔＡ（Ａ）リアルタイムＰＣＲアッセイのためのプライマーおよびプローブの場所を示す。左から右に、第１、第２、および第３の強調した領域は、それぞれ、フォワードプライマー、プローブ、およびリバースプライマーを示す。アンダーラインの塩基は、コンセンサス内のあいまい性があるところを示す。図においてアライメントされる配列は、Ａ１配列（配列番号：２９）、Ａ３（配列番号：３１）、Ａ２（配列番号：３０）、Ｂ（配列番号：３２）、Ｃ２（配列番号：３４）、およびＣ１（配列番号：３３）である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本明細書に添付される配列の説明および配列表は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１−１．８２５において記載されるように、特許出願におけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の開示に適用される規則に従う。配列表は、参照によって本明細書において組み込まれるＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３０２１−３０３０（１９８５）およびｔｈｅ  ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪ．２１９（２）：３４５−３７３（１９８４）において記載されるＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ標準に従って定義されるヌクレオチド配列文字についての１文字コードおよびアミノ酸についての３文字コードを含有する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データについて使用される記号およびフォーマットは、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２において記載される規則に従う。
【００４６】
配列番号：１は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来のＦａｔＡ−Ａ  １コンセンサスヌクレオチド配列である。配列番号：１を生成するために使用される変種は、４５Ｈ７３、ＮＳ１８２２ＢＣ、４６Ａ７６、ＮＳ５５３６ＢＣ、４３Ａ５６、ＮＷ１７１７Ｍ、ＮＷ４２１９ＢＣ、ＮＷ４２０１ＢＣ、４３６５５４、４５８９６７、５３１２７３、４５８９４１、４６９７３５、４５８６０５、３０５２７８、および６３３１５３を含む。
【００４７】
配列番号：２は、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）由来のＦａｔＡ−Ａ１．２コンセンサスヌクレオチド配列である。配列番号：２を生成するために使用される変種は、Ｔｏｂｉｎ、２５７２２９、１６３４９６、６４９１９０、および３９０９６２を含む。
【００４８】
配列番号：３は、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）由来のＦａｔＡ−Ａ１．３コンセンサスヌクレオチド配列である。配列番号：３を生成するために使用される変種は、ＪＳ０９１７ＢＣ、ＪＳ０９３６ＢＣ、ＪＳ１０５６ＢＣ、ＪＳ１２６０ＭＣ、ＪＳ１４３２ＭＣ、４１８９５６、４５８９４２、６０３０１１、および６４９１５６を含む。
【００４９】
配列番号：４は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来のＦａｔＡ−Ａ２．１コンセンサスヌクレオチド配列である。配列番号：４を生成するために使用される変種は、４５８９５４、４６９７３５、および３１１７２９を含む。
【００５０】
配列番号：５は、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）由来のＦａｔＡ−Ａ２．２コンセンサスヌクレオチド配列である。配列番号：５を生成するために使用される変種は、１６３４９６、３４７６００、３４６８８２、および３９０９６２を含む。
【００５１】
配列番号：６は、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）由来のＦａｔＡ−Ａ２．３コンセンサスヌクレオチド配列である。配列番号：６を生成するために使用される変種は、Ｒｅｗａｒｄを含む。
【００５２】
配列番号：７は、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）由来のＦａｔＡ−Ａ３．１コンセンサスヌクレオチド配列である。配列番号：７を生成するために使用される変種は、Ｔｏｂｉｎ、Ｋｌｏｎｄｉｋｅ、Ｒｅｗａｒｄ、４１Ｐ９５、２５７２２９、６４９１５９、１６３４９６、および６４９１９０を含む。
【００５３】
配列番号：８は、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）由来のＦａｔＡ−Ｂ．１コンセンサスヌクレオチド配列である。配列番号：８を生成するために使用される変種は、ＪＳ０８７９ＢＣ、ＪＳ０９１７ＢＣ、ＪＳ０９３６ＢＣ、ＪＳ１０５６ＢＣ、ＪＳ１２６０ＭＣ、ＪＳ１４３２ＭＣ、４１８９５６、４５８９４２、６０３０１１、および６４９１５６を含む。
【００５４】
配列番号：９は、ブラッシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ）由来のＦａｔＡ−Ｂ．２コンセンサスヌクレオチド配列である。配列番号：９を生成するために使用される変種は、６４９１５５および５９７８２２を含む。
【００５５】
配列番号：１０は、クロガラシ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎｉｇｒａ）由来のＦａｔＡ−Ｂ．３コンセンサスヌクレオチド配列である。配列番号：１０を生成するために使用される変種は、２７３６３８および６３３１４２を含む。
【００５６】
配列番号：１１は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来のＦａｔＡ−Ｃ１．１のコンセンサスヌクレオチド配列である。配列番号：１１を生成するために使用される変種は、４５Ｈ７３、ＮＳ１８２２ＢＣ、４６Ａ７６、ＮＳ５５３６ＢＣ、４６Ａ５６、ＮＷ１７１７Ｍ、ＮＷ４２１９ＢＣ、ＮＷ４２０１ＢＣ、４３６５５４、４５８９６７、４５８９５４、５３１２７３、４５８９４１、４６９７３５、４５８６０５、３１１７２９、３０５２７８、および６３３１５３を含む。
【００５７】
配列番号：１２は、ヤセイカンラン（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）由来のＦａｔＡ−Ｃ１．２のコンセンサスヌクレオチド配列である。配列番号：１２を生成するために使用される変種は、２８８８８、２９８００、３６５１４８、２９７９０、２８８５２、および３０８６２を含む。
【００５８】
配列番号：１３は、ヤセイカンラン（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）由来のＦａｔＡ−Ｃ１．３のコンセンサスヌクレオチド配列である。配列番号：１３を生成するために使用される変種は、３２５５０を含む。
【００５９】
配列番号：１４は、ヤセイカンラン（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）由来のＦａｔＡ−Ｃ２．１コンセンサスヌクレオチド配列である。配列番号：１４を生成するために使用される変種は、２４９５５６、２９０４１、２９８００、３０８６２、３０７２４、および３２５５０を含む。
【００６０】
配列番号：１５は、ブラッシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ）由来のＦａｔＡ−Ｃ２．２コンセンサスヌクレオチド配列である。配列番号：１５を生成するために使用される変種は、６４９１５５および５９７８２２を含む。
【００６１】
配列番号：１６は、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）由来のＦａｔＡ−他のコンセンサスヌクレオチド配列である。配列番号：１６を生成するために使用される変種は、ＪＳ１２６０ＭＣを含む。
【００６２】
配列番号：１７は、「Ｕ」の三角形における６つのアブラナ属種由来のいくつかの変種からおよそ５００塩基産物をＰＣＲするために使用される０９−０−２８１２プライマーである。０９−０−２８１２は、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）受入番号ＡＪ２９４４１９についてのＧｅｎｂａｎｋ  ＦａｔＡ配列についての位置１５００〜１５３０（５’〜３’）に相当する。
【００６３】
配列番号：１８は、「Ｕ」の三角形における６つのアブラナ属種由来のいくつかの変種からおよそ５００塩基産物をＰＣＲするために使用される０９−０−２８１３プライマーである。０９−０−２８１３は、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）受入番号ＡＪ２９４４１９についてのＧｅｎｂａｎｋ  ＦａｔＡ配列についての位置２２２６〜２１９７（５’〜３’）に相当する。
【００６４】
配列番号：１９は、Ａ特異的リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて使用される０９−０−３２４９アッセイプライマーである。
【００６５】
配列番号：２０は、０９−０−３２５１  ＦａｔＡ  Ａゲノム特異的リアルタイムＰＣＲアッセイプライマーである。
【００６６】
配列番号：２１は、ＦａｔＡ  Ａゲノム特異的リアルタイムＰＣＲアッセイのための０９−ＱＰ８７プローブである。
【００６７】
配列番号：２２は、１１−０−４０４６  ＦａｔＡ−Ａゲノム特異的ゲルベースＰＣＲアッセイプライマーである。１１−０−４０４６は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）受入番号Ｘ８７８４２についてのＧｅｎｂａｎｋ  ＦａｔＡ配列についての位置１７８２〜１８１３（５’〜３’）に相当する。１１−０−４０４６は、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）受入番号ＡＪ２９４４１９についてのＧｅｎｂａｎｋ  ＦａｔＡ配列についての位置６２〜９３（５’〜３’）に相当する。
【００６８】
配列番号：２３は、１１−０−４０４７  ＦａｔＡゲルベースＰＣＲアッセイプライマーである。１１−０−４０４７は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）受入番号Ｘ８７８４２についてのＧｅｎｂａｎｋ  ＦａｔＡ配列についての位置２００１〜１９７１（５’〜３’）に相当する。１１−０−４０４７は、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）受入番号ＡＪ２９４４１９についてのＧｅｎｂａｎｋ  ＦａｔＡ配列についての位置２７９〜２５２（５’〜３’）に相当する。
【００６９】
配列番号：２４は、１１−０−４２５３  ＦａｔＡゲルベースＰＣＲアッセイプライマーである。１１−０−４２５３は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕａ）受入番号Ｘ８７８４２についてのＧｅｎｂａｎｋ  ＦａｔＡ配列についての位置１９１８〜１８８９（５’〜３’）に相当する。１１−０−４２５３は、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）受入番号ＡＪ２９４４１９についてのＧｅｎｂａｎｋ  ＦａｔＡ配列についての位置１９６〜１６７（５’〜３’）に相当する。
【００７０】
配列番号：２５は、配列番号：２９、３０、および３１の１４ヌクレオチドコンセンサス領域である。
【００７１】
配列番号：２６は、配列番号：２９、３０、および３１の１５ヌクレオチドコンセンサス領域である。
【００７２】
配列番号：２７は、配列番号：２９、３０、および３１の１３ヌクレオチドコンセンサス領域である。
【００７３】
配列番号：２８は、配列番号：２９、３０、および３１の１５ヌクレオチドコンセンサス領域である。
【００７４】
配列番号：２９は、アライメントのために使用されるＡ１コンセンサス配列である。
【００７５】
配列番号：３０は、アライメントのために使用されるＡ２コンセンサス配列である。
【００７６】
配列番号：３１は、アライメントのために使用されるＡ３コンセンサス配列である。
【００７７】
配列番号：３２は、アライメントのために使用されるＢコンセンサス配列である。
【００７８】
配列番号：３３は、アライメントのために使用されるＣ１コンセンサス配列である。
【００７９】
配列番号：３４は、アライメントのために使用されるＣ２コンセンサス配列である。
【００８０】
配列番号：３５は、配列番号：２９、３０、および３１の１５ヌクレオチドコンセンサス領域である。
【００８１】
配列番号：３６は、ＣｒｕＡ  ０９−Ｏ−２８０９プライマーである。
【００８２】
配列番号：３７は、ＣｒｕＡ  ０９−Ｏ−２８１１プライマーである。
【００８３】
配列番号：３８は、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ  ０９−０−２８０７プライマーである。
【００８４】
配列番号：３９は、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ  ０９−０−２８０８プライマーである。
【００８５】
配列番号：４０は、ＣｒｕＡ  ＭＤＢ５１０フォワードプライマーである。
【００８６】
配列番号：４１は、ＭＤＢ５１１リバースプライマーである。
【００８７】
配列番号：４２は、ＣｒｕＡ  ＴＭ００３プローブである。
【００８８】
配列番号：４３は、ＦａｔＡ  ＦａｔＡ−Ｆフォワードプライマーである。
【００８９】
配列番号：４４は、ＦａｔＡ  ＦａｔＡ−Ｒリバースプライマーである。
【００９０】
配列番号：４５は、ＦａｔＡ  ＦａｔＡ−Ｐプローブである。
【００９１】
配列番号：４６は、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ  ｈｍｇ−Ｆフォワードプライマーである。
【００９２】
配列番号：４７は、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ  ｈｍｇ−Ｒリバースプライマーである。
【００９３】
配列番号：４８は、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ  ｈｍｇ−Ｐプローブである。
【００９４】
配列番号：４９は、ＢｎＡＣＣｇ８  ａｃｃｌフォワードプライマーである。
【００９５】
配列番号：５０は、ＢｎＡＣＣｇ８  ａｃｃ２リバースプライマーである。
【００９６】
配列番号：５１は、ＢｎＡＣＣｇ８  ａｃｃｐプローブである。
【００９７】
配列番号：５２は、ＰＥＰ  ｐｅｐ−Ｆフォワードプライマーである。
【００９８】
配列番号：５３は、ＰＥＰ  ｐｅｐ−Ｒリバースプライマーである。
【００９９】
配列番号：５４は、ＰＥＰ  ｐｅｐ−Ｐプローブである。
【０１００】
アブラナ属Ａゲノムに特異的であり、キャノーラ畑の混入の一因となり得る他のアブラナ属種、作物、または雑草種と実質的に交差反応しない、検出および定量化の方法が、開示される。多様な地理的領域由来の複数の変種由来のサンプルに対して試験された場合に、検出される内因性の標的は、それぞれの３つのＡゲノム種内で安定している。
【０１０１】
単位、識別コード、および記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で認められる形態で示される。別段の指示がない限り、核酸は、左から右に５’から３’方向に書かれ、アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシ方向に書かれる。本明細書内で列挙される数の範囲は、範囲を定める数を包み、かつ特定される範囲内のそれぞれの整数を含む。ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されるそれらの１文字記号によって本明細書において言及されてもよい。下記に定義される用語は、全体として本明細書への参照によってより完全に定義される。本明細書の全体にわたって提供される部の項目は、便宜上、提供され、本開示の様々な対象および実施形態を限定しない。
【０１０２】
本明細書において記載されるそれぞれの参考文献の開示は、それらが本明細書において記載される物質および方法に関する程度まで、その全体が参照によってこれによって組み込まれる。
【０１０３】
本明細書においておよび添付される請求項において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その」は、文脈上、明らかに他の意味を示す場合を除き、複数形の指示内容を含む。したがって、たとえば、「植物」への言及は、複数のそのような植物を含み、「細胞」への言及は、当業者らに知られている１つまたは複数の細胞およびその均等物を含む、などである。
【０１０４】
本明細書において使用されるように、用語「含む」は、「を含むが、これらに限定されない」を意味する。
【０１０５】
「植物」は、植物全体、植物器官、植物組織、植物ムカゴ、種子および植物細胞、ならびにその子孫への言及を含む。植物細胞は、限定を伴うことなく、種子由来の細胞、浮遊培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、新芽、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子を含む。
【０１０６】
本明細書において使用されるように、用語「キャノーラ」は、種子中のグルコシノレートおよびエルカ酸のレベルが低いアブラナ属の一種を指す。３つのキャノーラ特質のアブラナ属種が存在し、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、ブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）を含む。
【０１０７】
用語「双子葉類」および「双子葉植物」は、区別なく本明細書において使用される。
【０１０８】
用語「双子葉類」は、「双子葉植物綱」としても知られている被子植物の亜綱を指し、植物全体、植物器官（たとえば葉、幹、根など）、種子、植物細胞、およびその子孫への言及を含む。本明細書において使用される植物細胞は、限定を伴うことなく、種子、浮遊培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、新芽、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子を含む。
【０１０９】
用語「トランスジェニック植物」は、そのゲノム内に異種ポリヌクレオチドを含む植物を指す。一般に、異種ポリヌクレオチドは、ゲノム内に安定して統合され、ポリヌクレオチドは次の世代に伝えられる。異種ポリヌクレオチドは、ゲノムの中に、単独でまたは組換え発現カセットの一部として統合されてもよい。「トランスジェニック」は、任意の細胞、細胞系、カルス、組織、植物の一部、または植物を言及するために本明細書において使用され、その遺伝子型が、異種核酸の存在によって改変されており、最初にそのように改変されたトランスジェニック生物または細胞および最初のトランスジェニック生物または細胞から交配または無性繁殖によって作られたものを含む。本明細書において使用される用語「トランスジェニック」は、無作為な他家受精、非組換えウイルス感染、非組換え細菌形質転換、非組換え転位、または自然突然変異などのような、従来の植物育種法（つまり交配）によるまたは天然に存在するイベントによるゲノム（染色体または染色体外）の改変を包含しない。
【０１１０】
トランスジェニック「イベント」は、関心のある導入遺伝子を含む核酸発現カセットを含む異種ＤＮＡ構築物による植物細胞の形質転換、植物のゲノムへの導入遺伝子の挿入から生じる植物の集団の再生、および特定のゲノムの場所への挿入によって特徴づけられる特定の植物の選択によってもたらされる。イベントは、導入遺伝子の発現によって表現型的に特徴づけられる。遺伝子レベルで、イベントは、植物の遺伝的性質の一部となる。用語「イベント」はまた、形質転換体および異種ＤＮＡを含む他の変種の間の有性異系交配によって産生される子孫をも指す。反復親への戻し交配の繰り返しの後でさえ、形質転換された親由来の挿入されたＤＮＡおよびフランキングＤＮＡは、同じ染色体の場所で、交配した子孫に存在する。用語「イベント」はまた、挿入されたＤＮＡを含むある親株（たとえばもとの形質転換体および自家受粉から生じた子孫）ならびに挿入されたＤＮＡを含有しない親株の有性交配の結果としての、関心のある導入遺伝子を含む挿入されたＤＮＡを受け取る子孫に移されることが期待されるであろう、挿入されたＤＮＡおよび挿入されたＤＮＡにじかに隣接するフランキング配列を含む、もとの形質転換体由来のＤＮＡをも指す。
【０１１１】
本明細書において使用されるように、「挿入ＤＮＡ」は、植物の物質を形質転換するために使用される、発現カセット内の異種ＤＮＡを指し、一方、「フランキングＤＮＡ」は、植物などのような生物において天然に存在するゲノムＤＮＡまたはもとの挿入ＤＮＡ分子と無関係である、形質転換プロセスを介して導入された外来性の（異種）ＤＮＡ、たとえば、形質転換イベントと関連するフラグメントを含むことができる。本明細書において使用される「フランキング領域」または「フランキング配列」は、もとの外来性挿入ＤＮＡ分子のすぐ上流に連続してまたはそのすぐ下流に連続して配置される、少なくとも２０、５０、１００、２００、３００、４００、１０００、１５００、２０００、２５００、または５０００塩基対以上の配列を指す。
【０１１２】
本明細書において使用されるように、「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子、たとえば放射性同位体、リガンド、化学発光剤、酵素などが付加される、単離されたポリヌクレオチドである。そのようなプローブは、標的ポリヌクレオチドの鎖に対して、本発明の場合、標的サンプル由来の、たとえば関心のある形質由来のＤＮＡを含むサンプル由来の、単離されたＤＮＡの鎖に対して相補的である。プローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけではなく、標的ＤＮＡ配列の存在を特異的に検出することができるポリアミドおよび他のプローブ物質をも含む。
【０１１３】
本明細書において使用されるように、「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって、相補的な標的ＤＮＡ鎖に対してアニールされ、プライマーおよび標的ＤＮＡ鎖の間でハイブリッドを形成し、次いで、ポリメラーゼ、たとえばＤＮＡポリメラーゼによって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される、単離されたポリヌクレオチドである。プライマー対は、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来の核酸増幅方法による標的ポリヌクレオチドの増幅のためのそれらの使用を指す。「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特異的なＤＮＡセグメントの増幅のために使用される技術である（参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第４，６８３，１９５号明細書および米国特許第４，８００，１５９号明細書を参照されたい）。本明細書において開示されるプライマーの任意の組み合わせは、対がアブラナ属Ａゲノムの検出を可能にするように使用することができる。
【０１１４】
プローブおよびプライマーは、標的ＤＮＡ配列に結合し、かつ関心のあるポリヌクレオチドを特異的に検出するおよび／または同定するのに十分なヌクレオチド長をしている。ハイブリダイゼーション条件または反応条件は、この結果を達成するためにオペレーターによって決定することができることが認識される。この長さは、最適な検出方法において有用となる十分な長さである、任意の長さであってもよい。一般に、長さが８、１１、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００ヌクレオチド、もしくはそれを超えるまたは約１１〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、もしくはそれを超えるヌクレオチドが、使用される。そのようなプローブおよびプライマーは、高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的配列に対して特異的にハイブリダイズすることができる。実施形態によるプローブおよびプライマーは、標的配列と、連続したヌクレオチドの完全なＤＮＡ配列同一性を有していてもよいが、標的ＤＮＡ配列と異なり、標的ＤＮＡ配列を特異的に検出するおよび／または同定する能力を保持するプローブが、従来の方法によって設計されてもよい。したがって、プローブおよびプライマーは、標的ポリヌクレオチドに対して、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）、もしくはそれを超える配列同一性または相補性を共有することができるまたは１、２、３、４、５、６ヌクレオチド、もしくは以上、標的配列と異なり得る。プローブは、プライマーとして使用することができるが、一般に、標的ＤＮＡまたはＲＮＡに結合するように設計され、増幅プロセスにおいて使用されない。
【０１１５】
特異的なプライマーは、「特異的なプローブ」として使用することができるアンプリコンを産生するために統合フラグメント（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を増幅するために使用することができるまたは生物学的サンプルにおける関心のあるポリヌクレオチドを同定するためにそれ自体、検出することができる。その代わりに、プローブは、増幅イベントの検出を可能にするために、ＰＣＲ反応の間に使用することができる（つまりＴａｑｍａｎプローブまたはＭＧＢプローブ）（いわゆるリアルタイムＰＣＲ）。プローブが、サンプルへのプローブの結合を可能にする条件下で、生物学的サンプルのポリヌクレオチドとハイブリダイズする場合、この結合は、検出し、したがって、生物学的サンプルにおけるイベントの存在を示すのを可能にすることができる。結合プローブのそのような同定は、当技術分野において記載されている。一実施形態において、特異的なプローブが、最適化条件下で、所望の場所の５’または３’フランキング領域内の領域に特異的にハイブリダイズし、また、それと連続した外来性ＤＮＡの一部をも含んでいてもよい配列である。特異的なプローブは、標的ＤＮＡの特異的な領域に対して少なくとも８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、および９５〜１００％同一な（または相補的な）配列を含んでいてもよい。
【０１１６】
本明細書において使用されるように、「増幅されたＤＮＡ」または「増幅されたフラグメント」または、「アンプリコン」は、核酸鋳型の一部である標的ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド増幅の産物を指す。
【０１１７】
「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「核酸フラグメント」は、区別なく使用され、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであり、任意選択で、合成ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基、または改変されたヌクレオチド塩基を含有する。ヌクレオチド（普通、それらの５’一リン酸形態で見つけられる）について、それらの一文字名称を以下のように指す：アデニル酸またはデオキシアデニル酸については「Ａ」（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡについて）、シチジル酸またはデオキシシチジル酸については「Ｃ」、グアニル酸またはデオキグアニル酸については「Ｇ」、ウリジル酸については「Ｕ」、デオキチミジル酸については「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）については「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）については「Ｙ」、ＧまたはＴについては「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴについては「Ｈ」、イノシンについては「Ｉ」、および任意のヌクレオチドについては「Ｎ」。
【０１１８】
用語「一塩基多型」または「ＳＮＰ」は、ゲノム（または他の共有される配列）中の単一のヌクレオチド−Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ−が、種のメンバーの間で（または個人の対の染色体の間で）異なる場合に起こるＤＮＡ配列変異である。たとえば、異なる個人由来の２つの配列決定されたＤＮＡフラグメント、
【化１】
2015517322.tif 000003
は、単一のヌクレオチドにおいて差がある。この場合、発明者らは、２つの対立遺伝子：ＣおよびＴがあると言う。ほとんどすべての一般的なＳＮＰは、２つの対立遺伝子しか有していない。
【０１１９】
対立遺伝子は、様々な技術を使用して検出されてもよい（Ｎａｋｉｔａｎｄｗｅ  ｅｔ  ａｌ，２００７；本明細書において、参照によって組み込まれる）。
【０１２０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において区別なく使用される。用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマーおよび天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」、および「タンパク質」はまた、グリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、およびＡＤＰ−リボシル化を含むが、これらに限定されない修飾をも含む。
【０１２１】
プローブおよびプライマーは、ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的配列に対して特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの参考文献は、参照によって本明細書において組み込まれるＨｅｒｚｅｒ  ａｎｄ  Ｅｎｇｌｅｒｔ，２００２  Ｐａｌｍｉｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５を含むが、これらに限定されない。
【０１２２】
用語「ストリンジェントな条件下で」は、２つの配列が中程度にまたは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを意味する。より詳細には、中程度にストリンジェントな条件は、たとえばＤＮＡの長さに依存して、当業者らによって容易に決定することができる。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６  ａｎｄ  ７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１によって記載され、ニトロセルロースフィルターのための予洗溶液５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、約４０〜５０℃の約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件（または約４２℃の約５０％ホルムアミド中のシュタルク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などのような他の類似するハイブリダイゼーション溶液）、およびたとえば約４０〜６０℃、０．５〜６×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用を含む。好ましくは、中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃および６×ＳＳＣでのハイブリダイゼーション（および洗浄）を含む。高度にストリンジェントな条件もまた、たとえばＤＮＡの長さに依存して、当業者らによって容易に決定することができる。
【０１２３】
一般に、そのような条件は、中程度にストリンジェントな条件と比較して、高温および／または低塩濃度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄（約６５℃、６×ＳＳＣ〜０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションなど）を含む。たとえば、高度にストリンジェントな条件は、上記に定義されるハイブリダイゼーションおよびおよそ６５〜６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳでの洗浄を含む。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２Ｐ０４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）は、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）と、ハイブリダイゼーションバッファーおよび洗浄バッファーにおいて置換することができ、洗浄は、ハイブリダイゼーションが終了した１５分後に実行される。
【０１２４】
プローブとして放射性物質を使用しない、市販で入手可能なハイブリダイゼーションキットを使用することもまた、可能である。詳細な例は、ＥＣＬ  ｄｉｒｅｃｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ＆ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によるハイブリダイゼーションを含む。ストリンジェントな条件は、たとえば、５％（ｗ／ｖ）遮断試薬および０．５Ｍ  ＮａＣｌを補足した、キットに含まれるハイブリダイゼーションバッファーを使用する４時間、４２℃でのハイブリダイゼーションならびに２０分間、５５℃での０．４％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣ中で２回および５分間、室温での２×ＳＳＣ中で１回の洗浄を含む。本明細書において使用されるように、「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリコン」は、核酸鋳型の一部である標的核酸配列の核酸増幅の産物を指す。
【０１２５】
「ゲノム」は、それが植物細胞に適用されるように、核内に見つけられる染色体ＤＮＡだけではなく、細胞の細胞内構成成分（たとえばミトコンドリア、色素体）内に見つけられる細胞小器官ＤＮＡをも包含する。ゲノム領域は、たとえば増幅反応を通してまたは直接的な配列決定によって、特異的に検出するために標的にされるゲノムの一部分を指す。
【０１２６】
配列に関しての「異種」は、外来性の種に起源を持つまたは同じ種由来の場合、故意のヒトの介入によって組成および／またはゲノム遺伝子座がその天然の形態から実質的に修飾されている配列を意味する。
【０１２７】
用語「相同な」は、一般的な原型となる遺伝子から天然のまたは人為的なプロセスを通して誘導され（たとえば、同じ遺伝子ファミリーのメンバーであり）、したがって、典型的に、配列類似性を共有する核酸配列を指す。典型的に、相同な核酸は、配列のうちのその１つに対して十分な配列同一性を有するまたはその相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）は、選択的なハイブリダイゼーション条件下で他方に選択的にハイブリダイズする。用語「選択的にハイブリダイズする」は、非標的核酸配列に対するそのハイブリダイゼーションよりも、検出可能に大きな程度（たとえばバックグラウンドに対して少なくとも２倍）での、特定の核酸標的配列に対する、核酸配列の、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションおよび非標的核酸の実質的な除外への言及を含む。選択的にハイブリダイズする配列は、互いに、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。参照核酸に対して少なくともある程度のホモロジーを示す核酸は、参照核酸またはその相補的配列に対して特有のものとなり得るまたは同一のものとなり得る。
【０１２８】
「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳することができるＲＮＡを指す。
【０１２９】
「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ鋳型に対して相補的であり、酵素逆転写酵素を使用して鋳型から合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは、一本鎖とすることができるまたはＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを使用して、二本鎖形態に変換することができる。
【０１３０】
「単離された」は、通常、天然に存在する環境における物質を伴うまたはそれと相互作用する構成成分が実質的にないまたは他の場合にはそれから取り出される核酸分子および／またはタンパク質などのような物質を指す。単離されたポリヌクレオチドは、それらが天然に存在する宿主細胞から精製されてもよい。当業者に知られている従来の核酸精製方法は、単離されたポリヌクレオチドを得るために使用されてもよい。用語はまた、組換えポリヌクレオチドおよび化学的に合成されたポリヌクレオチドをも包含する。
【０１３１】
「組換え体」は、たとえば化学合成によるまたは遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作による、配列の２つのそうでなければ分離しているセグメントの人為的な組み合わせを指す。「組換え体」はまた、異種核酸の導入によって修飾された細胞もしくはベクターまたはそのように修飾された細胞に由来する細胞への言及をも含むが、故意のヒトの介入を伴わないで存在するものなどのような、天然に存在するイベント（たとえば自然突然変異、天然の形質転換／形質導入／転位）による細胞またはベクターの改変を包含しない。
【０１３２】
「組換えＤＮＡ構築物」は、自然界において通常一緒に見つけられない核酸フラグメントの組み合わせを指す。したがって、組換えＤＮＡ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列または同じ供給源に由来するが、自然界において通常見つけられるものと異なる形で並べられた調節配列およびコード配列を含んでいてもよい。
【０１３３】
「調節配列」は、コード配列の上流に（５’非コード配列）、コード配列内に、またはコード配列の下流に（３’非コード配列）配置され、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含むが、これらに限定されない。用語「調節配列」および「調節エレメント」は、区別なく本明細書において使用される。
【０１３４】
「プロモーター」は、他の核酸フラグメントの転写をコントロールすることができる核酸フラグメントを指す。
【０１３５】
「植物において機能的なプロモーター」は、その起源が植物細胞に由来するかどうかにかかわらず、植物細胞において転写をコントロールすることができるプロモーターである。
【０１３６】
「組織特異的プロモーター」および「組織に好ましいプロモーター」は、区別なく使用され、ある組織または器官において主に発現されるが、必ずしも排他的にではないが、ある特異的な細胞において発現されてもよいプロモーターを指す。
【０１３７】
「発生上調節されるプロモーター」は、その活性が発生上のイベントによって決定されるプロモーターを指す。
【０１３８】
「作動可能に連結される」は、一方の機能が他方によって調節される、単一のフラグメントにおける核酸フラグメントの関連性を指す。たとえば、それがその核酸フラグメントの転写を調節することができる場合、プロモーターは、核酸フラグメントと作動可能に連結されている。
【０１３９】
「発現」は、機能的な産物の生産を指す。たとえば、核酸フラグメントの発現は、核酸フラグメントの転写（たとえばｍＲＮＡもしくは機能的なＲＮＡをもたらす転写）および／または前駆体もしくは成熟タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳を指してもよい。
【０１４０】
「表現型」は、細胞または生物の検出可能な特徴を意味する。
【０１４１】
細胞への核酸フラグメント（たとえば組換えＤＮＡ構築物）の挿入についての文脈における「導入された」は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸フラグメントの組み込みへの言及を含み、核酸フラグメントが、細胞のゲノム（たとえば染色体、プラスミド、色素体、またはミトコンドリアＤＮＡ）の中に組み込まれ、自律的なレプリコンに変換されてもよいまたは一時的に発現されてもよい（たとえば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）。
【０１４２】
「形質転換された細胞」は、核酸フラグメント（たとえば組換えＤＮＡ構築物）が導入された任意の細胞である。
【０１４３】
本明細書において使用される「形質転換」は、安定した形質転換および一時的な形質転換の両方を指す。
【０１４４】
「安定した形質転換」は、遺伝的に安定した遺伝をもたらす、宿主生物のゲノムへの核酸フラグメントの導入を指す。一度、安定して形質転換されたら、核酸フラグメントは、宿主生物および任意の続く世代のゲノムに安定して統合される。
【０１４５】
「一時的な形質転換」は、遺伝的に安定した遺伝を伴わない遺伝子発現をもたらす、宿主生物の核またはＤＮＡ含有細胞小器官への核酸フラグメントの導入を指す。
【０１４６】
増幅
インビトロ増幅技術は、当技術分野においてよく知られている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑレプリカーゼ増幅、および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介性の技術（たとえばＮＡＳＢＡ）を含む、そのようなインビトロ方法に当業者らを導くのに十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ（すべて前掲）およびＭｕＵｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号明細書）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ））Ａｒｎｈｅｉｍ＆Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（（Ｏｃｔｏｂｅｒ  １，１９９０）Ｃ＆ＥＮ  ３６−４７）；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３，８１−９４；Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１１７３）；Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，１８７４）；Ｌｏｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５，１８２６）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，１０７７−１０８０）；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，２９１−２９４）；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ（（１９８９）Ｇｅｎｅ  ４，５６０）；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９，１１７）、およびＳｏｏｋｎａｎａｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｅｋ（（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−５６４）において見つけられる。インビトロにおいて増幅された核酸をクローニングするための改善された方法は、Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ，米国特許第５，４２６，０３９号明細書において記載される。ＰＣＲによって大きな核酸を増幅するための改善された方法は、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６８４およびその中の参考文献において概説され、４０ｋｂまでのＰＣＲアンプリコンが、生成される。当業者は、本質的に任意のＲＮＡを、逆転写酵素およびポリメラーゼを使用して、制限消化、ＰＣＲ増殖、および配列決定に適した二本鎖ＤＮＡに変換することができることを十分に理解するであろう。Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ、すべて前掲を参照されたい。
【０１４７】
本明細書において記載される本開示の実施形態において、アブラナ属Ａゲノムの増幅されたフラグメントが、（ｉ）配列番号：２９、３０、もしくは３１の少なくとも１つのヌクレオチド配列または（ｉｉ）配列番号：２９、３０、もしくは３１の少なくとも１つの核酸フラグメントを含み、核酸フラグメントが、配列番号：２９、３０、または３１の約５０〜約ヌクレオチド位置４００、５０〜約ヌクレオチド位置１００、５０〜約ヌクレオチド位置３５０、４００〜約ヌクレオチド位置３５０、４００〜約ヌクレオチド位置２００、および４００〜約ヌクレオチド位置１００からなる群から選択される。アブラナ属Ａゲノムの増幅されたフラグメントは、配列番号：２９、３０、または３１の少なくとも１つの核酸フラグメントを含み、核酸フラグメントが、ヌクレオチド位置約５０〜ヌクレオチド位置約４００からなる群から選択される。これは、位置約５０〜位置約４００の、任意の単一の数値間隔を含んでいてもよいが、これらに限定されない。核酸フラグメントは、ヌクレオチド位置５０〜ヌクレオチド位置４００を含む、任意の増幅されたフラグメントを含んでいてもよい。
【０１４８】
本開示の実施形態において、検出方法が、アブラナ属ＡゲノムのゲノムＤＮＡを含有する生物学的サンプルを配列決定するステップを含み、ゲノムＤＮＡが、（ｉ）配列番号：２９、３０、もしくは３１の少なくとも１つのヌクレオチド配列または（ｉｉ）配列番号：２９、３０、もしくは３１の少なくとも１つの核酸フラグメントを含み、核酸フラグメントが、配列番号：２９、３０、または３１またはその相補体の約５０〜約ヌクレオチド位置４００、５０〜約ヌクレオチド位置１００、５０〜約ヌクレオチド位置３５０、４００〜約ヌクレオチド位置３５０、４００〜約ヌクレオチド位置２００、および４００〜約ヌクレオチド位置１００からなる群から選択される。配列決定されたゲノムＤＮＡの一部分は、配列番号：２９、３０、または３１のうちの１つの内の任意の領域とすることができる。
【０１４９】
これらの方法によって産生されるアンプリコンは、複数の方法によって検出されてもよい。
【０１５０】
たとえば増幅反応においてプライマーとして使用されるおよび核酸配列プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、典型的に、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９）によって記載される固相ホスホラミダイトトリエステル方法に従って化学的に合成されるまたは単純に、商業的に注文することができる。
【０１５１】
ＤＮＡ検出キットは、本明細書において開示される組成物および当技術分野においてよく知られている方法を使用して開発することができる。
【０１５２】
２つの核酸配列またはポリペプチド配列についての文脈中の「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウにわたって最大の一致のためにアライメントした場合に、両方の配列において同じである残基を指す。
【０１５３】
「配列同一性パーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアライメントされた配列を比較することによって決定される値を指す。パーセンテージは、両方の配列が同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する位置の数を決定し、マッチした位置の数を決定し、比較ウィンドウにおける位置の総数によって、マッチした位置の数を割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算される。
【０１５４】
配列同一性のパーセンテージがタンパク質に関して使用される場合、同一でない残基位置は、多くの場合、アミノ酸残基が、類似する化学的性質（たとえば電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換されており、そのため、分子の機能特性を変化させない保存的アミノ酸置換によって異なることが認識される。配列が保存的置換によって異なる場合には、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質について補正するために上方に調節されてもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調節をなすための手段は、当業者らによく知られている。典型的に、これは、完全なではなく部分的なミスマッチとして保存的置換をスコア化し、それによって、パーセンテージ配列同一性を増加させることを伴う。したがって、たとえば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられる場合、非保存的置換は、０のスコアを与えられ、保存的置換は、０および１の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、たとえば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）において実行されるように、たとえば、Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１−１７のアルゴリズムに従って計算される。
【０１５５】
比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野においてよく知られている。比較のための配列の最適なアライメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）の局所的ホモロジーアルゴリズムによって；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）のホモロジーアライメントアルゴリズムによって；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４）の類似性検索方法によって；Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａによるＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム中のＣＬＵＳＴＡＬ；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されない、これらのアルゴリズムのコンピューター化された手段によって、行われてもよく、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３）；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：１０８８１−９０）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８：１５５−６５）、およびＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４：３０７−３３１）によって十分に記載される。
【０１５６】
データベース類似性検索のために使用することができるプログラムのＢＬＡＳＴファミリーは、ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのＢＬＡＳＴＮ；タンパク質データベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのＢＬＡＳＴＸ；タンパク質データベース配列に対するタンパク質クエリー配列のためのＢＬＡＳＴＰ；ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質クエリー配列のためのＴＢＬＡＳＴＮ；およびヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのＴＢＬＡＳＴＸを含む。たとえばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １９，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｄｓ．，（１９９５）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照されたい。
【０１５７】
ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、たとえば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して、公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードとアライメントした場合に、いくらかの正の値の閾値スコアＴとマッチするまたはそれを満たす、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、ハイスコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを伴う。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含有する、より長いＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシード（ｓｅｅｄ）として働く。次いで、ワードヒットは、累積的なアライメントスコアが増加し得る限り、それぞれの配列に沿って両方向に伸長する。累積的なスコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（マッチする残基のペアについての報酬スコア（ｒｅｗａｒｄ  ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチする残基についてのペナルティースコア（ｐｅｎａｌｔｙ  ｓｃｏｒｅ）；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスは、累積的なスコアを計算するために使用される。それぞれの方向におけるワードヒットの伸長は、累積的なアライメントスコアが、その最大達成値から数量Ｘ減少する；累積的なスコアが、１つもしくは複数の負のスコアリング残基アライメントの蓄積により０またはそれ未満になる；または一方の配列の末端部に到達する場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２のスコアリングマトリックスを使用する（たとえばＨｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照されたい）。
【０１５８】
配列同一性パーセントの計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性の統計分析をも実行する（たとえばＫａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性についての１つの測定値は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間のマッチが偶然生じるであろう確率の指標を提供する最小確率和（ｔｈｅ  ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））である。
【０１５９】
ＢＬＡＳＴ検索は、タンパク質をランダム配列としてモデル化することができることを仮定している。しかしながら、多くの実際のタンパク質は、ホモポリマー域、短周期リピート、または１つもしくは複数のアミノ酸が豊富な領域となり得る非ランダム配列の領域を含む。たとえ、タンパク質の他の領域が全体的に類似していなくても、そのような低複雑性領域は、無関係なタンパク質の間でアライメントされ得る。多くの低複雑性フィルタープログラム（ｌｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｆｉｌｔｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ）は、そのような低複雑性アライメントを低下させるために用いることができる。たとえば、ＳＥＧ（Ｗｏｏｔｅｎ  ａｎｄ  Ｆｅｄｅｒｈｅｎ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３）およびＸＮＵ（Ｃｌａｖｅｒｉｅ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｅｓ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１９１−２０１）の低複雑性フィルターは、単独でまたは組み合わせて用いることができる。
【０１６０】
本明細書において使用される標準的な組換えＤＮＡ技術および分子クローニング技術は、当技術分野においてよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（以降「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）においてより完全に記載される。
【実施例】
【０１６１】
以下の実験方法および結果は、本開示の実施に関連するプロトコールおよび手順の特定の態様に関するさらなる詳細について提供する。主張される本発明を例証するために限定を伴うことなく提供される例は、当業者らによく知られており、本明細書において引用される参考文献において詳述されるプロトコールの適用を含む。
【０１６２】
実施例１：Ａゲノム特異的内因性参照系の開発
植物材料の選択
様々な国由来の種子を、「Ｕ」の三角形を構成する６つのアブラナ属種：ブラッシカ・カリナタ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、クロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）、ヤセイカンラン（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、ならびにブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）（およびブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）亜種）変種から選択した（図１）。キャノーラにおいてまたはその周辺で見つけられ得るアブラナ属関連種もまた、この研究に含めた。これは、ナガミノアマナズナ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓｉｔａｖａ）、オハツキガラシ（Ｅｒｕｃａｓｔｒｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、グンバイナズナ（Ｔｈｌａｓｐｉ  ａｒｖｅｎｓｅ）、シロガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）、ならびにノハラガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｒｖｅｎｓｉｓ）（およびノハラガラシ（Ｓ．ａｒｖｅｎｓｉｓ）亜種）を含む。他の作物由来の種子：とうもろこし、米、モロコシ、とまと、綿、大豆もまた、含めた。大多数の種子は、Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ、ＣａｎａｄａのＰｉｏｎｅｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｉｎｃ．からならびにまたＡｍｅｓ、ＩＡおよびＧｅｎｅｖａ、ＮＹのＵＳＤＡ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）からも得た。表１は、使用した種子の供給源を示す。ＵＳＤＡから得た種子については、ＵＳＤＡ受入番号（ＡＣＮＯ）が含まれる。
【０１６３】
【表１】
2015517322.tif 000004
【０１６４】
【表２】
2015517322.tif 000005
【０１６５】
【表３】
2015517322.tif 000006
【０１６６】
【表４】
2015517322.tif 000007
【０１６７】
種子からのゲノムＤＮＡ抽出
一貫性のために、ゲノムＤＮＡはすべて、同じＤＮＡ抽出方法を使用して種子から抽出した：さらなる精製のためにＱｉａｇｅｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔｉｐ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に沈殿したＤＮＡを通す、ＣＴＡＢに基づく溶解方法。このＤＮＡ抽出プロトコールは、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、およびセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）について社内で検証した。ＤＮＡサンプルはすべて、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用して定量化した。アッセイの特異性比較のために、ほとんどのＤＮＡを、合計９回の反応（つまり三通りで３回実行）で試験した。例外を表２に列挙する。
【０１６８】
【表５】
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【０１６９】
プライマーおよびプローブ
本明細書において使用するプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）で合成し、プローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で合成した。配列決定のためのＰＣＲ産物を生成するために使用したすべてのプライマーの配列を表３に列挙し、特異性試験のためのすべてのプライマーおよびプローブについての配列を表４に列挙する。プローブはすべて、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙプローブ９以外、関連する参考文献において記載されるように標識した。ＳＤＳ２．３ソフトウェアが、ＨＥＸについての検出器を有していないので、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙプローブは、ＶＩＣ染料がＨＥＸ染料に類似する波長で蛍光を発するという理由から、ＨＥＸの代わりにＶＩＣにより標識した。
【０１７０】
【表６】
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【０１７１】
【表７】
2015517322.tif 000010
【０１７２】
表４における参考文献：
１．ＥＵＲＬ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ：１）Ｔ４５（ｈｔｔｐ：／／ｇｍｏ−ｃｒｌ．ｊｒｃ．ｅｃ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｓｕｍｍａｒｉｅｓ／Ｔ４５＿ｖａｌｉｄａｔｅｄ＿ＲＴＰＣＲ＿ｒｎｅｔｈｏｄ．ｐｄｆ），２）ＭＳ８（ｈｔｔｐ：／／ｇｍｏ−ｃｒｌ．ｊｒｃ．ｅｃ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｓｕｍｍａｒｉｅｓ／Ｍｓ８＿ｖａｌｉｄａｔｅｄ＿Ｍｅｔｈｏｄ＿Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ％２０ｖｅｒｓｉｏｎ％２０１．ｐｄｆ），３）ＲＦ３（ｈｔｔｐ：／／ｇｍｏ−ｃｒｌ．ｊｒｃ．ｅｃ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｓｕｍｍａｒｉｅｓ／Ｒｆ３＿ｖａｌｉｄａｔｅｄ＿Ｍｅｔｈｏｄ．ｐｄｆ），ａｎｄ  ４）ＲＴ７３（ｈｔｔｐ：／／ｇｍｏ−ｃｒｌ．ｊｒｃ．ｅｃ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／  ｓｕｍｍａｒｉｅｓ／ＲＴ７３＿ｖａｌｉｄａｔｅｄ＿Ｍｅｔｈｏｄ．ｐｄｆ）
２．Ｗｕ，Ｙ．，Ｗｕ，Ｇ．，Ｘｉａｏ，Ｌ．，Ｌｕ，Ｃ．Ｅｖｅｎｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒａｐｅｓｅｅｄ  Ｈｙｂｒｉｄｓ  ＭＳＩ  ｘ  ＲＦ１  ａｎｄ  ＭＳＩ  ｘ  ＲＦ２；Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００７，５５，８３８０−８３８９
３．Ｗｅｎｇ，Ｈ．；Ｙａｎｇ，Ｌ．；Ｌｉｕ，Ｚ．；Ｄｉｎｇ，Ｊ．；Ｐａｎ，Ａ．；Ｚｈａｎｇ，Ｄ．Ｎｏｖｅｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｅ，Ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ−ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ／Ｙ，ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒａｐｅｓｅｅｄ  ｃｕｌｔｉｖａｒｓｌ  Ｊ．ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．２００５，８８，５７７−５８４
４．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍ．；Ｒｉｏ，Ａ．；Ｅｓｔｅｖｅ，Ｔ．；Ｐｒａｔ，Ｓ．；Ｐｌａ，Ｍ．Ａ  ｒａｐｅｓｅｅｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ，Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  Ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ａｓ  ａ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｘｅｄ  ｆｏｏｄ  ｓａｍｐｌｅｓ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００１，４９，３６２２−３６２７．
５．Ｚｅｉｔｌｅｒ，Ｒ．；Ｒｉｅｔｓｃｈ，Ｋ．；Ｖａｉｂｌｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｒａｐｅｓｅｅｄ；Ｅｕｒ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ（２００２）２１４：３４６−３５１．
【０１７３】
ＣｒｕＡ、ＨＭＧ  Ｉ／Ｙ、およびＦａｔ  Ａ  ＰＣＲ設計および鋳型ＤＮＡの選択
Ａゲノム特異的内因性リアルタイムＰＣＲアッセイを設計するために、３つの遺伝子を選択した：ＣｒｕＡ、ＨＭＧ  Ｉ／Ｙ、およびＦａｔＡ。「Ｕ」の三角形における６つの種の複数の変種由来のこれらの遺伝子由来のおよそ５００ｂｐ領域の増幅および配列決定を実行した。プライマーは、「Ｕ」の三角形の６つのメンバーから入手可能な配列における同定された保存領域において設計した。配列は、３つの遺伝子すべてについて、アブラナ属種の６つすべてから入手可能ではなかったが、アライメントを生成し、プライマーを、入手可能な配列の保存領域において設計した。いくつかの変種（Ｎ＝３８）由来の種子を、Ａゲノム種（ブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、およびカラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ））の配列多様性を捕らえ、アッセイを開発するために、様々な地理的領域から選択した。残りの３つの種（ヤセイカンラン（Ｂ．ｏｌｅａｒｃｅａ）、ブラッシカ・カリナタ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）、およびクロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ））から配列決定した変種の数は、より少なかった（Ｎ＝１５）。
【０１７４】
ＦａｔＡ、ＣｒｕＡ、およびＨＭＧ遺伝子の領域のＰＣＲ／クローニング／配列決定のためのプライマー設計
「Ｕ」種の三角形由来のＦａｔＡ、ＣｒｕＡ、およびＨＭＧのＧｅｎＢａｎｋ配列を選択し、保存配列を見つけて、プライマーを設計し、これらの遺伝子のそれぞれからおよそ５００ｂｐの領域を増幅するためにアライメントした。表３は、アライメントにおいて使用する配列のＧｅｎｂａｎｋ受入番号ならびに選択したプライマーの位置およびアンプリコンサイズ（セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）受入について）を示す。ＧｅｎＢａｎｋ配列は、これらの３つの遺伝子について、ブラッシカ・カリナタ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）およびクロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）については入手可能ではなかった。
【０１７５】
プライマーは、それぞれの遺伝子の領域をＰＣＲし、クローニングし、かつ配列決定するために選択した。ＣｒｕＡについては、選択したプライマー（０９−０−２８０９／０９−Ｏ−２８１１）は、参照リアルタイムアッセイ（ＭＤＢ４１０、ＭＤＢ５１１、ＴＭ００３）を包含し、リアルタイムＰＣＲアンプリコンを５’に５９９塩基および３’に４７塩基伸長させる。ＨＭＧ−Ｉ／Ｙについては、選択したプライマー（０９−０−２８０７／０９−Ｏ−２８０８）は、参照リアルタイムアッセイ（ｈｍｇ−Ｆ、ｈｍｇ−Ｒ、ｈｍｇ−Ｐ）を包含し、リアルタイムＰＣＲアンプリコンを５’に２７３塩基および３’に１３１塩基伸長させる。ＦａｔＡについては、選択したプライマー（０９−Ｏ−２８１２／０９−Ｏ−２８１３）は、ＦａｔＡアッセイ（ＦａｔＡＦ、ＦａｔＡ−Ｒ、ＦａｔＡ−Ｐ）のわずかに下流にあり、リアルタイムＰＣＲアンプリコンを５’に３２塩基除き、３’に４６２塩基伸長させる。
【０１７６】
ＰＣＲ、クリーンアップ、およびクローニング
５３の種子の変種（表１におけるイタリック体の変種を参照されたい）から単離したゲノムＤＮＡ（１００〜１２０ｎｇ）を、クローニングしかつ配列決定するための関心のある領域をＰＣＲするために、鋳型として使用した。種子の選択は、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）（Ｎ＝１７）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）（Ｎ＝９）、ブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）（Ｎ＝１２）、クロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）（Ｎ＝３）、ブラッシカ・カリナタ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）（Ｎ＝２）、およびヤセイカンラン（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）（Ｎ＝１０）についての様々な地理的領域由来の複数の変種からなる。精製したＰＣＲ産物は、ＰＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターの中にクローニングした。およそ６つのクローンを、Ｔ７ベクタープライマーおよびＳＰ６ベクタープライマーを使用して配列決定するために選択した。ある場合には、異質四倍体種において両方のゲノムのカバー率（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を達成するためにより多くのクローンを単離し、配列決定した。
【０１７７】
配列分析ならびにＡ特異的リアルタイムＰＣＲプライマーおよびプローブの最適化
Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ｖ．４．８は、ＣｒｕＡ、ＨＭＧ、およびＦａｔＡ遺伝子由来のクローニングＰＣＲ産物の配列分析のために使用した。最終のコンティグのアライメントは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩにおいて行った。ＦａｔＡのＡゲノムに対して特異的ないくつかのプライマー／プローブの組み合わせの設計の後に、最適なプライマー／プローブの組み合わせを、Ａゲノム特異性、サイクル閾値（Ｃｔ）値、およびＰＣＲ効率に基づいて選択した。最適なプライマーおよびプローブの濃度は、Ｃｔ値、デルタＲｎ値、およびＰＣＲ効率に基づいて選択した。
【０１７８】
一度、アッセイが最適化されたら、希釈シリーズを、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）ゲノムＤＮＡにより調製した。４０ｎｇ／ｕｌ希釈液のゲノムＤＮＡを、１：２で連続的に４回希釈した。この希釈シリーズは、５ｕｌの希釈液を使用して、最適化リアルタイムアッセイにおいて試験した（ＰＣＲにおけるインプット鋳型ＤＮＡは、２００ｎｇ〜１２．５ｎｇの範囲にわたった）。ＰＣＲ効率およびＲ２係数を評価した。
【０１７９】
６つの内因性リアルタイムＰＣＲアッセイによる特異性試験
６つの菜種の内因性リアルタイムＰＣＲアッセイを、本明細書において記載されるＦａｔＡ（Ａ）アッセイを含む特異性試験のために選択した。一貫性のために、反応はすべて、２０ｕｌの最終反応容積について、１５ｕｌのｍａｓｔｅｒｍｉｘ（プライマー、プローブ、水、および１０ｕｌのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗ／ｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧを含む）ならびに５ｕｌの２０ｎｇ／ｕｌゲノムＤＮＡ（＝１００ｎｇゲノムＤＮＡ）を含んだ。プライマーおよびプローブの濃度は、関連する参考文献において記載され、表４において列挙されるとおりとした。
【０１８０】
リアルタイムＰＣＲ実行についてのサイクリングパラメーターは、以下のとおりとした：１０分間、９５℃での最初の変性；１５秒間９５℃（変性）ならびに６０秒間６０℃（アニーリングおよび伸長）の４０サイクル。リアルタイムＰＣＲ実行は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ機器において３８４ウェルプレート上で実行した。データは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＳＤＳ）ｖ．２．３を使用して分析した。ほとんどの試験サンプル（表１を参照されたい）について、ＰＣＲは、３つの別々のリアルタイムＰＣＲ実行に対して三通り実行した。ＤＮＡのうちのいくらかは、供給量が限られており、二通り実行したおよび／またはＰＣＲの実行がより少なかった。供給量が限られたＤＮＡによるそれぞれのアッセイにおける実行および反復実験の数の説明については、表２を参照されたい。変種ＮＷ４２１９ＢＣ、４６９７３５、ＪＳ０８７９ＢＣ、ＪＳ０９１７ＢＣ、および５９７８２９は、ＤＮＡの欠如ではなく、ＰＣＲ結果が不十分であったため、反復実験がより少なかった。
【０１８１】
実施例２：ＣｒｕＡ、ＨＭＧ  Ｉ／Ｙ、およびＦａｔＡ領域の配列決定
選択したプライマーは、６つの種すべてにおいて増幅をもたらした。異質四倍体種（セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、およびブラッシカ・カリナタ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ））内の両方のゲノム上で増幅が生じる可能性を最大限にするために、さらなるクローンを選択した。
【０１８２】
一度、ＰＣＲ産物が、６つの種内の複数の変種からクローニングされたら、いくつかのクローン（≧６）を、生じたＰＣＲ産物から可能性のあるすべての多様性を捕らえる見込みを増加させるために、配列決定するために選択した。異質四倍体種について、目標は、両方のゲノムから配列を得ることであった。
【０１８３】
配列分析に続いて、いくつかのさらなるクローンを、異質四倍体種についてのゲノムカバー率（ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）におけるギャップを埋めるために選択し、配列決定した。
【０１８４】
実施例３：ゲノムに相当するコンセンサスへの配列データの割り当て
コンセンサス配列を、様々なコンセンサスグループに割り当て、基本種（ブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）、ヤセイカンラン（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、およびクロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ））ならびに異質四倍体種（セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、およびブラッシカ・カリナタ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ））の重複に基づいて、これらを、Ａ、Ｂ、またはＣゲノムにさらに割り当てた。種の間のＡ、Ｂ、およびＣゲノムの遺伝的変異により、いくつかの場合において、１つを超えるコンセンサス配列が、それぞれのゲノムに対して特定された。
【０１８５】
ＣｒｕＡ
ＣｒｕＡ配列決定プロジェクトについては、２つのＡおよび２つのＣゲノムコンセンサスを同定した。しかしながら、Ｂゲノムについてのコンセンサスの特定は、困難であった。カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）（ＡＡＢＢ）からクローニングしたＰＣＲ産物はすべて、Ａコンセンサス内にあった。そのうえ、いくつかのカラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）変種は、ＰＣＲするのが困難であった。２つのブラッシカ・カリナタ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）（ＢＢＣＣ）変種は、ＣゲノムのみからクローニングＰＣＲ産物をもたらした。Ｂコンセンサスを決定する際の困難さは、Ｂゲノムに対するプライマーの不十分な結合性によることも、Ｂ配列は、Ａコンセンサスと有意に異なっていないこともある。配列決定したブラッシカ・カリナタ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）（ＢＢＣＣ）およびクロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）（ＢＢ）由来の変種の数が限られていたこともまた、Ｂコンセンサスを区別する際の困難さの一因となり得る。ＡＣＮＯ  ６３３１５３由来の配列は、ＡおよびＣの両方のコンティグに割り当てられ、この変種が間違って分類されたこと、また、実際には、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）（ＡＡＣＣ）変種であることを示唆する。２つのクロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）変種（ＡＣＮＯ  ６３３１４２およびＡＣＮＯ  ６４９１５６）は、２つの異なるコンセンサスに、６３３１４２は特徴的ではないコンセンサスに、６４９１５６はＡコンセンサスに割り当てられ、これらの２つの変種が同じ種ではないことを示唆する。ＣｒｕＡ由来の２つのＡゲノムコンセンサス内に、リアルタイムアッセイの設計に適した保存領域はなかった。
【０１８６】
ＨＭＧ
ＨＭＧ配列決定プロジェクトについては、４つのＡゲノムコンセンサスおよび１つのＣゲノムコンセンサスを同定した。また、Ｂコンセンサスは、ＡおよびＣコンセンサスとＢコンセンサスを区別することができなかったのでまたはＰＣＲプライマーによりＢコンセンサスを増幅することができなかったので、同定することができなかった。ＡおよびＣに割り当てられたＡＣＮＯ  ４５８９４２以外、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）変種（ＡＡＢＢ）由来の配列はすべて、Ａコンセンサスに割り当てられた。クロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）変種（ＢＢ）は、Ａゲノムに割り当てられ、ブラッシカ・カリナタ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）変種（ＢＢＣＣ）は、Ｃコンセンサスに割り当てられた。Ｂゲノムについてのコンセンサスを得ることができなかったのは、Ｂゲノム上の標的に対するプライマーの非効率的な結合性またはＡコンセンサスとの重複によるものであり得た。小さなサンプルサイズのクロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）およびブラッシカ・カリナタ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）変種を配列決定したが、これは、Ｂコンセンサスを見つけ出すのをより困難にし得る。ＣｒｕＡに関しては、ＡＣＮＯ  ６３３１５３は、ＡおよびＣゲノムコンセンサスに割り当てられた配列によりグループ化された。２つのクロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）種は、２つの異なるコンセンサスにグループ化された。ＡＣＮＯ  ６３３１４２は、ＡコンセンサスにもＣコンセンサスにもグループ化されず、ＡＣＮＯ  ６４９１５６は、Ａコンセンサスにグループ化された。保存Ａゲノム特異的領域は、ＨＭＧの配列決定領域から同定することができなかった。
【０１８７】
ＦａｔＡ
ＦａｔＡについては、６つのコンセンサス配列があった：Ａゲノムについて３つ、Ｃゲノムについて２つ、およびＢゲノムについて１つ。ＡＣＮＯ  ６３３１５３由来の配列は、Ｃ１およびＡ１コンティグにグループ化され、それが、ブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）変種ではなく、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）であることが検証された。そのうえ、ＡＣＮＯ  ６４９１５６配列は、ＡおよびＢコンセンサス内に分類され、それが、クロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）ではなく、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）変種であることが検証された。ＦａｔＡ由来の６つのコンセンサス配列をＶＮＴＩにおいてアライメントし、６つの配列について推定される進化の関係を、図２−Ａに示す。図２−Ｂは、６つのコンセンサスへの様々な種の分布を示す。
【０１８８】
実施例４．Ａ特異的リアルタイムＰＣＲアッセイの設計および最適化
いくつかのリアルタイムプライマーおよびプローブを、３つすべてのＡコンセンサスのＦａｔＡの間で保存され、ＢおよびＣゲノムのＦａｔＡと相違した領域において設計した。最も低いＣｔ値および最も高いＰＣＲ効率を示したプライマー／プローブセットを、さらなる分析のために選択した。選択したプライマーおよびプローブを、図３におけるコンセンサスアライメント上に示す。
【０１８９】
より小さなセットに対する特異性についての試験の後に、リアルタイムＰＣＲアッセイを最適化した。３回の実行を、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）変種４５Ｈ７３由来のＤＮＡの希釈シリーズに対して行った。これらの実行の結果を、表５に示す。
【０１９０】
【表８】
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【０１９１】
実施例５．６つの菜種の内因性リアルタイムＰＣＲアッセイ特異性比較
ＦａｔＡ（Ａ）リアルタイムＰＣＲアッセイが既存の系よりも優れた特異性を提供することを検証するために、ＤＮＡのパネルを、Ｆａｔ（Ａ）アッセイおよび他の５つの菜種の内因性リアルタイムＰＣＲアッセイにより試験した。ＤＮＡの供給源は、１）配列分析において使用した種子変種（ＡＣＮＯ  ６４９１５６を除く）；２）ブラッシカ・カリナタ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）およびクロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）のさらなる変種；３）キャノーラ畑に混入し得る他の種；ならびに４）様々な他の作物由来の種子を含んだ。リアルタイムアッセイは、表４において記載される様々なアッセイについて、参考文献において記載されるように、プライマーおよびプローブ（ならびに反応における最終濃度）を使用して実行した。ほとんどの場合、リアルタイムアッセイは、３回の別々のＰＣＲ実行に対して三通り実行した。ＤＮＡ収率のばらつきにより、いくつかのＤＮＡは、供給量が限られ、反復実験および／または実行がより少なかった（表２を参照されたい）。この特異性試験からの平均Ｃｔ値を表６に示す。
【０１９２】
１つの例外（クロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）変種ＡＣＮＯ  ２７３６３８）を除いて、ＦａｔＡ（Ａ）アッセイは、Ａゲノムを含有するアブラナ属種：セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、ブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）、およびカラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）変種を除いて、試験したすべてのＤＮＡについて≧３５の平均Ｃｔ値をもたらした。ＦａｔＡ（Ａ）アッセイにおけるＡＣＮＯ  ２７３６３８  クロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）変種の平均Ｃｔ値は、他のＡゲノムサンプルよりもおよそ９サイクル遅く、そのため、このクロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）サンプルに、Ａゲノム種のうちの１つが混入した可能性があった。Ａゲノムは、この変種の配列決定の間に検出されなかったが、もし増幅が混入ＡゲノムＤＮＡによるものである場合、それは、遅いＣｔ値に基づいて非常に低レベルとなる。
【０１９３】
試験した他のアッセイはすべて、ＦａｔＡ（Ａ）アッセイよりも低い特異性を示した；たとえば、非アブラナ属種との交差反応性および／またはＡゲノムに対して特異的ではない。ＢｎＡＣＣｇ８は、ＡおよびＢゲノムならびにシロガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）、ノハラガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｒｖｅｎｓｉｓ）（およびノハラガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｒｖｅｎｓｉｓ）亜種  アルベンシス（ａｒｖｅｎｓｉｓ））を検出し、ＰＥＰは、ＡおよびＣゲノムを検出し、ＨＭＧは、主としてＡおよびＢを検出し、Ｃゲノムといくらかの交差反応性を有し、また、ノハラガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｒｖｅｎｓｉｓ）変種のうちのいくつかと交差反応性を有する。ＣｒｕＡアッセイは、Ａ、Ｂ、およびＣゲノムすべてならびに近縁種グンバイナズナ（Ｔｈｌａｓｐｉ  ａｒｖｅｎｓｅ）、オハツキガラシ（Ｅｒｕｃａｓｔｒｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、セイヨウノダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｒａｐｈａｎｉｓｔｒｕｍ）、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、シロガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）、ならびにノハラガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｒｖｅｎｓｉｓ）（および亜種：ノハラガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｒｖｅｎｓｉｓ）亜種  アルベンシス（ａｒｖｅｎｓｉｓ））を検出するように思われる。ＦａｔＡアッセイは、Ａ、ＢおよびＣゲノムならびにナガミノアマナズナ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）、セイヨウノダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｒａｐｈａｎｉｓｔｒｕｍ）、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、シロガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）、ノハラガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｒｖｅｎｓｉｓ）（および亜種：ノハラガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｒｖｅｎｓｉｓ）亜種  アルベンシス（ａｒｖｅｎｓｉｓ））、ならびにシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）を検出する。
【０１９４】
【表９】
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【０１９５】
【表１０】
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【０１９６】
【表１１】
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【０１９７】
【表１２】
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【０１９８】
【表１３】
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【０１９９】
実施例６：それぞれのＡゲノム種内の不均一性についての試験
特異性に加えて、望ましい内因性参照系は、変種間で対立遺伝子変異を示さないこともある。ＦａｔＡ（Ａ）アッセイは、Ａゲノム、そのため、一倍体ゲノムサイズが変動する３つの異なる種を認識する。そのため、安定性の測定を、それぞれの種内の変種のＣｔ値の比較に制限した。種内のそれらの変種にＣｔ比較を制限することによって、それは、基本種（ブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）、ＡＡ）ならびに異質四倍体種（カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）／ＡＡＢＢおよびセイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）ＡＡＣＣ）の間のゲノムサイズのばらつきによって引き起こされるＣｔのばらつきを排除する。この分析の結果を表７に示す。セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）については、Ｃｔ値は、２１．６〜２２．５の範囲にわたり、ブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）については、Ｃｔ値は、２０．７〜２２．１の範囲にわたり、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）については、Ｃｔ値は、２１．５〜２２．０の範囲にわたった。セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）およびカラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）種において、Ｃｔ範囲は、１Ｃｔ値内にあり、ブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）については、Ｃｔ範囲は、１．４Ｃｔ内にある。すべての場合において、平均からの偏差は、１Ｃｔ値内にある。
【０２００】
【表１４】
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【０２０１】
【表１５】
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【０２０２】
前述のものは、理解の明瞭さのために詳細に記載されたが、形態および詳細における様々な変更が、真の範囲から逸脱することなくなすことができることは、本開示の解釈から当業者に明らかであろう。たとえば、上記に記載される技術、方法、組成物、装置、および系はすべて、様々な組み合わせで使用されてもよい。本明細書において引用される刊行物、特許、特許出願、または他の文書はすべて、あたかも、それぞれの個々の刊行物、特許、特許出願、または他の文書が、事実上、参照によって組み込まれるように個々に示されるのと同じ程度まで、事実上、それらの全体が参照によって組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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