(57)【要約】ヒト乳がんに対する免疫のための組成物および方法が開示される。一の実施形態において、多価抗原性組成物はヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインおよびκ−カゼインからなる群から選択される免疫原性ポリペプチドを含むように提供される。
2015520129.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
請求項１に記載の多価抗原性組成物であって、
Ｉ．α−ラクトアルブミン（配列番号：１）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号：１に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド；および
αＳ１カゼイン（配列番号：２）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号２に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド；
ＩＩ．α−ラクトアルブミン（配列番号：１）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号：１に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド；および
β−カゼイン（配列番号：３）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号３に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド；
ＩＩＩ．α−ラクトアルブミン（配列番号：１）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号：１に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド；および
κ−カゼイン（配列番号：４）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号４に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド；
ＩＶ．α−ラクトアルブミン（配列番号：１）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号：１に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド；
αＳ１カゼイン（配列番号：２）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号２に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド；および
β−カゼイン（配列番号：３）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号３に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド；
Ｖ．α−ラクトアルブミン（配列番号：１）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号：１に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド；
αＳ１カゼイン（配列番号：２）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号２に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド；および
κ−カゼイン（配列番号：４）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号４に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド；または
ＶＩ．α−ラクトアルブミン（配列番号：１）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号：１に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド；
αＳ１カゼイン（配列番号：２）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号２に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド； 
β−カゼイン（配列番号：３）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号３に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド；および
κ−カゼイン（配列番号：４）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号４に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド、
を含む、多価抗原性組成物。
【請求項２】
配列番号：１のポリペプチド；および
配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４からなる群から選択される２つ以上のポリペプチド、
を含む請求項１に記載の多価抗原性組成物。
【請求項３】
該ポリペプチドの一つが免疫増強サイトカインと共有結合している、請求項１または２に記載の多価抗原性組成物。
【請求項４】
サイトカインが顆粒球マクロファージ刺激因子、インターロイキン−２およびインターロイキン−４からなる群から選択される、請求項３に記載の多価抗原性組成物。
【請求項５】
さらにアジュバントを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の多価抗原性組成物。
【請求項６】
該ポリペプチドの２つ以上が互いに連結された、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多価抗原性組成物。
【請求項７】
リンカーが、２つ以上のアミノ酸を含む、請求項６に記載の多価抗原性組成物。
【請求項８】
少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号：１に含まれるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド；
少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号：２に含まれるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド；
少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号：３に含まれるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド；および
少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号：４に含まれるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド、
を含む、請求項１に記載の多価抗原性組成物。
【請求項９】
該ポリペプチドの各々が共に連結している、請求項８に記載の多価抗原性組成物。
【請求項１０】
該ポリペプチドの各々が互いに直鎖で、少なくとも２つのアミノ酸を含むリンカー部分を通じて連結している、請求項９に記載の多価抗原性組成物。
【請求項１１】
有効量の請求項１に記載の免疫原性組成物、患者に投与することを含む、必要とされる患者に抗原特異的免疫応答を誘導する方法。
【請求項１２】
該方法が予防的または治療的ワクチン接種を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、該方法が、
エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびヒト表皮成長受容体２を発現できない腫瘍を有するがん患者を同定する；
これらの同定された乳がん患者を選択し、配列番号：１のポリペプチド、または配列番号：１の１５アミノ酸断片；および
配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４からなる群から選択される２つ以上のポリペプチドまたは配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４の１５アミノ酸断片、を含む多価組成物を投与する、
段階を含み、
任意に、処置がさらに化学療法薬および／または放射線療法および／または免疫療法を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
ヒト免疫系のＴ細胞が患者にポリペプチドを投与した後に活性化される請求項１に記載の多価抗原性組成物であって、該活性化Ｔ細胞がＣＤ４＋またはＣＤ８＋である、抗原性組成物。
【請求項１５】
炎症性免疫応答がα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインまたはκ−カゼインとのその後の接触で誘導され、任意に炎症性免疫応答がＴ細胞によるＩＮＦγの産生を含み、応答が乳房組織特異的である、請求項１に記載の多価抗原性組成物。
【請求項１６】
ヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインおよび／またはκ−カゼインに対してヒト患者を免疫する方法であって、該方法は患者に請求項８に記載の多価ワクチンを投与する段階を含む、方法。
【請求項１７】
ヒト患者における乳房組織特異的炎症性応答を誘導できるヒトＴ細胞を活性化する方法であって、該方法はＴ細胞を以前に請求項１に記載の組成物にさらされた単離ヒト樹状細胞と接触させる段階を含み、任意に、活性化ヒトＴ細胞がＣＤ４＋またはＣＤ８＋である、方法。
【請求項１８】
活性化ヒトＴ細胞がＩＦＮγを産生する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
活性化ヒトＴ細胞がヒトαーラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインまたはκ−カゼインを発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
該ポリペプチドの各々が、該ヒトαーラクトアルブミン、ヒトαＳ１カゼイン、ヒトβ−カゼインおよびヒトκ−カゼインポリペプチドの各々の全ての親水性ドメインを含む、１つの融合抗原として互いに連結される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多価抗原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、３５ＵＳＣセクション１１９の下、２０１２年４月１６日に出願された米国仮出願番号６１／６２４，６８０の優先権を主張し、本仮出願は、出典明示により本願に組み込まれる。
【０００２】
電子的に提出された物件の参照による組み込み
２０１３年４月１５日に作成され、「ＰＣＴ  ｓｅｑ  ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられた６，２２２バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルで特定され、本明細書と同時に提出されたコンピューター読み取り可能な配列表の全体が、出典明示により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
背景
乳がんは女性の間で、がんの関連の死の全ての原因の中で２番目の原因である。現在、乳がんの予防の大部分は、身体検査およびマンモグラフィーを通した早期発見、閉経後の不要なホルモン療法の回避、アルコール消費の減少、体重減少、身体的活動の向上および乳がん１型および２型感受性遺伝子（それぞれ、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２）の変異の遺伝子試験を含む、修正可能なリスクを減少させることを伴う。高リスクの患者へのより積極的なアプローチは、予防的な両側の乳房切除および卵巣摘出、ならびにタモキシフェン、ラロキシフェン、およびアロマターゼ阻害薬での化学的予防を含む。
【０００４】
乳がんの強い健康上のリスクおよび不十分な予防の努力にもかかわらず、乳がんのための免疫治療は、標準的療法の不可欠な部分として開発されていない。腫瘍特異的抗原は長い間、がんワクチン接種のための標的としての最適な結果をほとんど提供していない。がんワクチン接種の全体的な目標は伝統的に、腫瘍特異的抗原への潜在的な免疫反応を上げることである。アプローチは、腫瘍で過剰発現するが、正常組織では発現しない蛋白質またはペプチドでの免疫を含む抗原ベースの戦略、ならびに自己または同種腫瘍全体の免疫を含む細胞ベースのプロトコルを含む。ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）およびムチン（ＭＵＣ１）は、ヒト乳がんワクチンの試用に使用される代表的な抗原である。これらの抗原を使用するワクチン接種は、腫瘍減少効果を示し得るが、両方ともさまざまな正常組織および腫瘍で発現されるので、どちらの抗原もいかなる組織または腫瘍への特異性を提供しない。それゆえ、免疫で標的とされたＨＥＲ２およびＭＵＣ１の、本質的な組織特異性の欠如は、正常な免疫応答の兆候でも、全身性の自己免疫性後遺症をかなりもたらし得る。
【０００５】
標的となる乳房の障害を誘導するために十分な強度の自己免疫発作は、標的抗原が乳房の腫瘍で構成的に発現するならば、定着した乳房の悪性腫瘍に対して有効な治療を提供できる。さらに、選択された標的抗原が容易に回避可能な条件下で通常の乳房組織で発現されるならば、ワクチンは乳がんの発症に対して安全で有効な保護を提供でき得る。
【０００６】
ヒトアルファ−ラクトアルブミン（α−ラクトアルブミン）は、大部分の乳房の悪性腫瘍で見出される、条件付きで発現される乳房に特異的な分化蛋白質である。乳糖生合成の調節に関する必須の分化蛋白質として、α−ラクトアルブミンの発現は、乳房に特異的であり、その発現および合成において、授乳期による条件付きである。ヒトα−ラクトアルブミンはまた、大部分の乳房の腫瘍において構成的に過剰発現し、乳房に特異的であり、有効な炎症性免疫応答を誘導できる程度に免疫原性である。それゆえ、ヒトα−ラクトアルブミンに対する免疫は乳がん予防のための安全で効果的なワクチン接種戦略を提供する。
【０００７】
マウス腫瘍モデルにおけるα−ラクトアルブミン免疫を使用する我々の鋭意な研究は、特に予防の設定または早期の乳房の腫瘍形成の間に投与されると、乳房の腫瘍増殖を抑制するその大きな潜在的可能性を示す。α−ラクトアルブミンでの研究に基づいて、出願人はワクチン接種および乳がん予防のための免疫療法の標的を選択する指針の組、すなわち、１）抗原は大部分の標的となる腫瘍で構成的に過剰発現されなければならない；２）正常組織での標的抗原の発現は条件的でなければならない；および３）正常組織での標的抗原の発現を測定する条件が容易に利用可能でなければならない、を確立した。これらの前提条件の下、胸の機能的条件に制限され、依存される発現により特徴付けられる授乳期の蛋白質は予防的な乳がんワクチン接種のための理想的な候補として際立つ存在である。
【０００８】
正常組織への付随的な炎症の欠如におけるα−ラクトアルブミンワクチン接種で達成された有意な抗腫瘍応答に基づいて、出願人は、２個以上の候補授乳期蛋白質を含む多価ワクチンが実質的に乳房の腫瘍に対してワクチン接種の効力を高めると結論づけた。多価ワクチン接種アプローチを使用することによる抗腫瘍効果の増強は、２つのレベルで：１）１つ以上の腫瘍特異的標的に反応する複数のＴ細胞系統を含むより大きいＴ細胞レパートリーの活性化により発生する腫瘍に対する免疫応答の強度を増加させることによって：２）α−ラクトアルブミンなどの一価のワクチン接種アプローチで標的とされる蛋白質を発現しないものを含む、より広い範囲の腫瘍をカバーすることによって、達成されるであろう。さらに、多価ワクチンは１つ以上の蛋白質の、損失したかまたは下方制御された発現または転写異常調節による代替蛋白質の後天的な発現を有する標的腫瘍に対して、それらの正常から形成異常、上皮内がん、侵襲性および乳房の腫瘍の進展の転移段階への進展の間に、潜在性を有する。言い換えると、多価ワクチンアプローチは早期および進展した腫瘍の療法への強大な免疫圧力を加えるであろう。それはその結果、腫瘍回避およびワクチンへ抵抗の発生の可能性を下げることによって、より広い腫瘍のバラエティーをカバーし、予防の効力を増加させ、より効果的な療法を提供するであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
概要
出願人は、４個の授乳期依存蛋白質の候補、すなわちα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインおよびκ−カゼインを同定した。各々のタンパク質は４Ｔ１マウスの乳房の腫瘍および多くのヒトの乳房の腫瘍で過剰発現し、ならびに授乳期のマウスおよびヒトの乳房組織だけに分離された発現で特徴づけられる。一の実施形態によると、これらのタンパク質の各々は、脳、心臓、肺、腎臓、肝臓、脾臓、胃、腸、子宮、卵巣、および膀胱を含む他の正常組織と同様に、通常の乳房組織へのいかなる付随的な障害がないとき、乳がんの発症に対する免疫防御を引き起こすために使用される。
【００１０】
一の実施形態によると、組成物がヒトの授乳期蛋白質から選択された２つ以上の免疫原性ヒトポリペプチドを含む、多価抗原性組成物を提供する。一の実施形態において、授乳期ポリペプチドは、α−ラクトアルブミン（配列番号：１）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、αＳ１カゼイン（配列番号：２）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、β−カゼイン（配列番号：３）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、κ−カゼイン（配列番号：４）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号１に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド、少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号２に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド、少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号３に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド、および少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号４に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される。通常、多価抗原性組成物はさらにヒト患者への投与に適した医薬上許容し得る担体を含むであろう。一の実施形態において、多価抗原性組成物は３つの異なるヒトの授乳期ポリペプチドを含み、更なる実施形態において、多価抗原性組成物は４つの異なるヒトの授乳期ポリペプチドを含むであろう。
【００１１】
一の実施形態において、多価抗原性組成物は、α−ラクトアルブミン（配列番号：１）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号１に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド；
αＳ１カゼイン（配列番号：２）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号２に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド；
β−カゼイン（配列番号：３）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号３に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド；および
κ−カゼイン（配列番号：４）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、または少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号４に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド、を含む。
【００１２】
一の実施形態において、患者において授乳期の蛋白質に特異的な免疫応答を誘導する方法が提供される。方法は、本明細書で開示された授乳期ペプチド含有組成物の有効量を患者に投与することを含む。組成物は、がんが検出される前に予防的に（例えば、乳がん一型および２型感受性遺伝子（それぞれＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２）の変異の遺伝子検査への対応において）投与されるか、または組成物は治療的に（単独または他の抗がん治療と組み合わせて）投与できる。一の実施形態において、ヒト患者における乳房組織特異的炎症反応を誘導できるヒトＴ細胞を活性化する方法が提供される。方法は、本明細書に開示された授乳期ポリペプチド含有組成物に過去にさらされた単離されたヒト樹状細胞を含む組成物とＴ細胞を接触させる段階を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｃは組換え型マウスα−ラクトアルブミンの免疫原性を示す。リンパ節細胞は、ＳＷＸＪ雌マウスのα−ラクトアルブミンでの免疫の１０日後に評価され、以下の再現応答（ｒｅｃａｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を示した：ａ）用量範囲において、組み換えマウスα−ラクトアルブミンに抗原特異的であるが、組み換えヒトコクリン（ｃｏｃｈｌｉｎ）には非抗原特異的である（図１Ａ参照）；
【図１−２】ｂ）精製ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方から、２５ｍｇ／ｍｌのα−ラクトアルブミンへの応答が引き出された（図１Ｂ参照）；および
【図１−３】ｃ）ＩＦＮγおよびＩＬ−２の高い生産量および２型サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびラクトアルブミンの低い生産で、炎症性１型サイトカインプロフィールと一致した。すべてのエラーバーは±ＳＥＭを示す。
【図２】図２は、自己免疫誘導乳房障害の間の乳房組織の分析を示す。授乳期の乳房組織のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、有意に上昇したＩＦγの発現レベル（ｐ＝０．００１）を示したが、ＩＬ−１０では示さなかった（ｐ＞０．１０）。すべてのエラーバーは±ＳＥＭを示す。各々の＊は統計的に有意な差を示す。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｂは、α−ラクトアルブミンワクチン接種が乳房の腫瘍の増殖を予防的に抑制することを示す。自然発症の乳房の腫瘍の増殖は８週齢でα−ラクトアルブミンで免疫した１０カ月齢のＭＭＴＶ−ｎｅｕマウスで有意に抑制された（ｐ＝０．０００４；  図３Ａ）。
【図３−２】移植された４Ｔ１腫瘍の増殖は、腫瘍接種の１３日前でのα−ラクトアルブミンでの予防的な免疫に続いて、有意に抑制される（ｐ＝０．０００６；図３Ｂ）。すべてのエラーバーは±ＳＥＭを示す。各々の＊は統計的に有意な差を示す。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｃは、α−ラクトアルブミンワクチン接種が、移植された乳房の腫瘍の確立された増殖を治療することを示す。４Ｔ１腫瘍増殖の有意な阻害は、腫瘍接種の５日後のα−ラクトアルブミン免疫に続いて生じた（ｐ＜０．０１；図４Ａ）。
【図４−２】腫瘍接種の１３日後の場合にも生じた（ｐ＜０．０１、図４Ｂ）。
【図４−３】腫瘍接種の２１日後の場合には生じなかった（ｐ＞０．１０、図４Ｃ）。すべてのエラーバーは±ＳＥＭを示す。各々の＊は統計的に有意な差を示す。
【図５】図５は、α−ラクトアルブミンワクチン接種が、定着した自然発症の乳房の腫瘍の確立された増殖を治療することを示す。非常に悪性の自然発症の腫瘍の増殖における有意な阻害（ｐ＜０．０００６）が、６週齢のＭＭＴＶ−ＰｙＶＴトランスジェニックマウスのα−ラクトアルブミン免疫に続いて、生じる。大規模な多病巣性の腫瘍増殖のため、ＭＭＴＶ−ＰｙＶＴマウスの腫瘍は一方向だけで測定の影響を受けやすい。すべての１０個のＭＭＴＶ−ＰｙＶＴ腫瘍で最も長い測定は、毎日のｍｍの総腫瘍負荷を計算するために加えられる。
【図６−１】６Ａ−６Ｃは、α−ラクトアルブミン特異的Ｔ細胞が腫瘍炎症および細胞毒性を誘導することを示す。ＥＬＩＳＡによって測定されるα−ラクトアルブミンへの再現応答はＩＬ−５およびＩＬ−１０と比べて、ＩＦＮγの高い生産量にかかわる炎症性１型表現型を示す（図６Ａ）。
【図６−２】ＴＩＬのＥＬＩＳＰＯＴ分析は、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりむしろＣＤ４＋細胞がＩＦＮγを生産することを示す（図６Ｂ）。
【図６−３】培養された４Ｔ１腫瘍細胞の死が、ＬＮＣで感作された培養α−ラクトアルブミンの、マウスＣＤ８に特異的な抗体での処理によって阻害され、ＣＤ８＋Ｔ細胞仲介４Ｔ１特異的細胞毒性を示す（図６Ｃ）。
【図７−１】図７Ａ−７Ｄは、α−ラクトアルブミンワクチン接種による腫瘍増殖の抑制がＴ細胞によって仲介されることを示す。４Ｔ１腫瘍の接種と同日のナイーブな受容ＢＡＬＢ／ｃマウスへのα−ラクトアルブミン感作ＬＮＣの転送は、以下をもたらす：ａ）腫瘍増殖の有意な抑制（ｐ＜０．０００１；図７Ａ）；
【図７−２】ｂ）腫瘍に曝されたマウスの発症の有意な減少（ｐ＜０．０３；図７Ｂ）；
【図７−３】ｃ）最終的な腫瘍の重さの有意な減少（ｐ＜０．０００８；図７Ｃ）。
【図７−４】オボアルブミン（ＯＶＡ）感作ＬＮＣと比較して、有意な腫瘍増殖阻害が、α−ラクトアルブミン感作ＬＮＣからの磁気ビーズ分離で濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞（ｐ＝０．００２；図７Ｄ、左パネル）またはＣＤ８＋Ｔ細胞（ｐ＝０．００３；図７Ｄ、右パネル）のいずれかを受容するナイーブなマウスに起こる。すべてのエラーバーは±ＳＥＭを示す。各々の＊は統計的に有意な差を示す。
【図８】図８は、ヒトα−ラクトアルブミン反応Ｔ細胞レパートリーの有用性を試験するための、樹状細胞（ＤＣ）由来血液を使用する、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）Ｔ細胞のインビトロ感作を示す。α−ラクトアルブミンでのＰＭＢＣの感作は、その後に続くα−ラクトアルブミンの存在による、ＩＦＮγ生産Ｔ細胞の頻度の増加をもたらす（再現応答）。
【図９】図９、ヒト乳がん細胞株における、授乳期蛋白質の差次的発現。ヒト乳がん細胞株、ＳＫ−ＢＲ−３およびＨＣＣ１９３７細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から抽出されたＲＮＡは、遺伝子特異的プライマーでの３８サイクルのＲＴ−ＰＣＲ増幅を受けた。原発性悪性乳腫瘍から得られたトリプルネガティブＨＣＣ１９３７乳がん細胞は、β−カゼインを除く全ての蛋白質の増幅を示し、一方で、転移性乳腫瘍から得られたＨＥＲ２陽性ＳＫ−ＢＲ−３乳がん細胞は、α−ラクトアルブミンを発現せず、他の授乳期タンパク質のすべてを発現した。β−アクチンハウスキーピング遺伝子の発現は全ての細胞株で生じたが、ヒトα−ラクトアルブミンだけを発現するように設計された我々の対照ベクターのその後の増幅は生じなかった。
【図１０−１】図１０Ａ−１０Ｂ、ＢＡＬＢ／ｃＪ雌マウスの精製授乳期蛋白質の免疫原性。Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティーカラムからの蛋白質解離液は、１０％のＴｒｉｓ−ＨＣｌポリアクリルアミドゲル上で電気泳動された（図１０Ａ参照）。クマシー染色ゲルは、精製授乳期蛋白質のバンドを、各々の蛋白質のカレイドスコープマーカーの右側のレーンで、予想されたサイズで示した。
【図１０−２】（図１０Ｂ参照）。ＬＮＣを排出する、ＣＦＡ中の組換えマウスα−ラクトアルブミンまたは組換えマウスα−カゼインの１００μｇでの雌のＢＡＬＢ／ｃＪマウス（ｎ＝３／群）の免疫の１０日後に、再現増殖応答（３Ｈ−チミジン取り込み）が試験された。両方のタンパク質はα−ラクトアルブミン（左のパネル）およびαカゼイン（右のパネル）への抗原特定的再現応答、および対照抗原、ＯＶＡおよび鶏卵リゾチーム、後者はα−ラクトアルブミンと実質的な相関関係を有する、への無応答をもつ、高い免疫原性であった。
【図１１−１】図１１Ａ−１１Ｂ、異なるマウス系統での精製授乳期蛋白質の免疫原性可変性。さまざまな変異ハプロタイプを示す系統からの正常雌マウス（ｎ＝３／系統）は、ＣＦＡで１００μｇの組換えマウスα−ラクトアルブミン（図１１Ａ参照）、
【図１１−２】または組換えマウスα−カゼイン（図１１Ｂ参照）で免疫された。１０日後に、ＬＮＣ排出が、感作イムノゲンへの再現増殖応答（３Ｈ−チミジン取り込み）のために試験された。κカゼインは、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいてα−ラクトアルブミンより免疫原性であったが、ＲＩＩＩＳ／Ｊ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、およびＦＶＢマウスでは応答を全く生じなかった。
【図１２】図１２Ａ−１２Ｂ、上昇したＩＦＮｇ遺伝子発現は、終了後の授乳期蛋白質（Ｒｅｔｉｒｅｄ  Ｌａｃｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）で免疫された正常で健康な非授乳期のマウスから試験されたいかなる非リンパ組織でも生じなかった。コンベンショナルＲＴ−ＰＣＲにより、正常非授乳期マウスからの全ＲＮＡが、αラクトアルブミン（図１２Ａ参照）、またはκ−カゼイン（図１２Ｂ参照）での免疫の６週間後に、ＩＦＮｇ遺伝子発現のために分析された。ＩＦＮγ遺伝子発現はいかなる非リンパ組織でも検出されなかった。
【図１３】図１３、乳がんの調節における授乳期蛋白質に対する多価ワクチン接種の効力。完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）での対照ワクチン接種と比較すると、ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス中に移植された４Ｔ１乳腫瘍の増殖は、個々のイムノゲンとしてのα−ラクトアルブミンまたはα−カゼインの免疫に続いて、またはα−ラクトアルブミンおよびα−カゼインの療法の共免疫に続いて、有意に阻害された（全ての場合でｐ＜０．０１）。すべてのワクチン接種は腫瘍接種の日に行った。すべてのエラーバーは±ＳＥを示す。
【図１４】図１４、ヒト乳がんにおける授乳期蛋白質の差次的発現。ヒト乳がん細胞株、ＳＫ−ＢＲ−３およびＨＣＣ１９３７細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から抽出されたＲＮＡは、遺伝子特異的プライマーでの３８サイクルのＲＴ−ＰＣＲ増幅を受けた。原発性悪性乳腫瘍から得られたトリプルネガティブＨＣＣ１９３７乳がん細胞は、α−ラクトアルブミンおよびα−カゼインの両方の増幅を示し、一方で、転移性乳腫瘍から得られたＨＥＲ２陽性ＳＫ−ＢＲ−３乳がん細胞は、α−カゼインを発現したが、α−ラクトアルブミンを発現しなかった。β−アクチンハウスキーピング遺伝子の発現は両方の細胞株で生じたが、ヒトα−ラクトアルブミンだけを発現するように設計された我々の対照ベクターのその後の増幅は生じなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
定義
本発明の明細書、請求の範囲において、以下に詳細に説明された定義に従って以下の用語は使用されるであろう。
【００１５】
本明細書で使用される、「医薬上許容できる担体」なる用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水、油中水型または水中油型エマルジョンなどのエマルジョン、各種の湿潤剤などの標準製剤の担体のいずれかを含む。また、用語は米国連邦政府の監督官庁によって承認されるか、またはヒトを含む動物における使用のために米国薬局方に記載された剤のいずれかを含む。
【００１６】
本明細書で使用される、「処置」なる用語は、特定の疾患または症状の予防、または特定の疾患または症状に関連する兆候の緩和、および／または該兆候の予防または除去を含む。
【００１７】
本明細書で使用される、医薬の「有効」量または「治療法上有効な量」は、無毒であるが、医薬が所望の効果を提供できる程度の量を示す。例えば、１つの所望の効果は、乳がんの予防または処置であろう。「有効な」量は、供される対象の、個々の年齢および通常状態、投与形態等によって異なるであろう。それゆえ、正確な「有効量」を特定することは、常に可能というわけではない。しかしながら、いかなる個々の場合でも適切な「有効な」量を当業者が通常の実験を用いて決定し得る。
【００１８】
用語「非経口」は、消化管を通してではなく、鼻腔内、吸入、皮下、筋肉内、髄腔内、または静脈などの他の経路によることを意味する。
【００１９】
本明細書で使用される、「リンカー」は、２つの別々の実体をお互いに連結する結合、分子または分子の群である。リンカーは、２つの実体の最適の空間を提供するか、またはさらに２つの実体がお互いから分離する不安定な連結を提供し得る。物理変化を起こしやすい連結は光開裂基、酸性で不安定な部分、塩基性で不安定な部分および酵素開裂基を含む。
【００２０】
本明細書で使用される用語、「患者」は、さらなる指定がなければ、あらゆる温血脊椎家畜動物（例えば、家畜、馬、猫、犬、および他のペットを含むが、これらに限定されない）およびヒトを含むことを意図する。
【００２１】
実施形態
一の実施形態によると、多価抗原性組成物は、患者で免疫反応を誘導するために提供される。一の実施形態において、多価抗原性組成物は、乳がんを予防するために予防的に投与される。一の例示的な態様において、組成物は乳がんの発症リスクのある非授乳期の女性に投与される。あるいは、一の実施形態において、組成物は乳がんの処置のために、任意に他の知られた抗がん療法と組み合わせて投与される。一の実施形態によると、多価抗原性組成物は、例えば、α−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインまたはκ−カゼインを含む、２つ以上の授乳期蛋白質、またはそれらの抗原断片を含む。
【００２２】
一の実施形態において、２つ以上の免疫原性授乳期ポリペプチドを含む多価ヒト乳がんワクチンが開示される。一の実施形態において、アミノ酸配列によると、免疫原性授乳期ポリペプチドの１つはヒトα−ラクトアルブミンを含む。一の実施形態において、ヒトα−ラクトアルブミンは：ＫＱＦＴＫＣＥＬＳＱ  ＬＬＫＤＩＤＧＹＧＧ  ＩＡＬＰＥＬＩＣＴＭ  ＦＨＴＳＧＹＤＴＱＡ  ＩＶＥＮＮＥＳＴＥＹ  ＧＬＦＱＩＳＮＫＬＷ  ＣＫＳＳＱＶＰＱＳＲ  ＮＩＣＤＩＳＣＤＫＦ  ＬＤＤＤＩＴＤＤＩＭ  ＣＡＫＫＩＬＤＩＫＧ  ＩＤＹＷＬＡＨＫＡＬ  ＣＴＥＫＬＥＱＷＬＣ  ＥＫＬ  （配列番号：１）配列を含む。
【００２３】
一の実施形態によると、２、３または４つの抗原性授乳期ポリペプチドを含む、多価抗原性組成物が提供される。一の実施形態において、多価抗原性組成物はヒトα−ラクトアルブミン（配列番号：１）、αＳ１カゼイン、β−カゼインまたはκ−カゼインから選択される２つ以上のペプチドを含み、ここで、αＳ１カゼインの配列は：
ＲＰＫＬＰ  ＬＲＹＰＥＲＬＱＮＰ  ＳＥＳＳＥＰＩＰＬＥ  ＳＲＥＥＹＭＮＧＭＮ  ＲＱＲＮＩＬＲＥＫＱ  ＴＤＥＩＫＤＴＲＮＥ  ＳＴＱＮＣＶＶＡＥＰ  ＥＫＭＥＳＳＩＳＳＳ  ＳＥＥＭＳＬＳＫＣＡ  ＥＱＦＣＲＬＮＥＹＮ  ＱＬＱＬＱＡＡＨＡＱＥＱＩＲＲＭＮＥＮＳ  ＨＶＱＶＰＦＱＱＬＮ  ＱＬＡＡＹＰＹＡＶＷ  ＹＹＰＱＩＭＱＹＶＰ  ＦＰＰＦＳＤＩＳＮＰ  ＴＡＨＥＮＹＥＫＮＮＶＭＬＱＷ  （配列番号：２）であり；
β−カゼインの配列は
ＡＬＡＬＡＲＥＴＩＥ  ＳＬＳＳＳＥＥＳＩＴ  ＥＹＫＱＫＶＥＫＶＫ  ＨＥＤＱＱＱＧＥＤＥ  ＨＱＤＫＩＹＰＳＦＱ  ＰＱＰＬＩＹＰＦＶＥ  ＰＩＰＹＧＦＬＰＱＮ  ＩＬＰＬＡＱＰＡＶＶ  ＬＰＶＰＱＰＥＩＭＥ  ＶＰＫＡＫＤＴＶＹＴ  ＫＧＲＶＭＰＶＬＫＳ  ＰＴＩＰＦＦＤＰＱＩ  ＰＫＬＴＤＬＥＮＬＨ  ＬＰＬＰＬＬＱＰＬＭ  ＱＱＶＰＱＰＩＰＱＴ  ＬＡＬＰＰＱＰＬＷＳ  ＶＰＱＰＫＶＬＰＩＰ  ＱＱＶＶＰＹＰＱＲＡ  ＶＰＶＱＡＬＬＬＮＱ  ＥＬＬＬＮＰＴＨＱＩ  ＹＰＶＴＱＰＬＡＰＶ  ＨＮＰＩＳＶ  （配列番号：３）であり；そして
κ−カゼインの配列は
ＥＶＱＮＱＫＱＰＡＣ  ＨＥＮＤＥＲＰＦＹＱ  ＫＴＡＰＹＶＰＭＹＹ  ＶＰＮＳＹＰＹＹＧＴ  ＮＬＹＱＲＲＰＡＩＡ  ＩＮＮＰＹＶＰＲＴＹ  ＹＡＮＰＡＶＶＲＰＨ  ＡＱＩＰＱＲＱＹＬＰ  ＮＳＨＰＰＴＶＶＲＲ  ＰＮＬＨＰＳＦＩＡＩ  ＰＰＫＫＩＱＤＫＩＩ  ＩＰＴＩＮＴＩＡＴＶ  ＥＰＴＰＡＰＡＴＥＰ  ＴＶＤＳＶＶＴＰＥＡ  ＦＳＥＳＩＩＴＳＴＰ  ＥＴＴＴＶＡＶＴＰＰ  ＴＡ  （配列番号：４）である。
【００２４】
一の実施形態において、多価抗原性組成物は配列番号：１のポリペプチド、または配列番号：１と１個のアミノ酸改変によって異なるポリペプチド、および配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４、または配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４と１個のアミノ酸改変によって異なるポリペプチドからなる群から選択される２つ以上のポリペプチドを含み、ここで、アミノ酸改変はアミノ酸の置換、欠失または挿入、またはアミノ酸の翻訳後修飾である。一の実施形態において、１個のアミノ酸改変は保存的アミノ酸置換である。
【００２５】
一の実施形態において、多価抗原性組成物はα−ラクトアルブミン（配列番号：１）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、αＳ１カゼイン（配列番号：２）  の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、β−カゼイン（配列番号：３）の  １５アミノ酸断片を含むポリペプチド、κ−カゼイン（配列番号：４）の１５アミノ酸断片を含むポリペプチド、少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号１に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド、少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号２に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド、少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号３に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチド、および少なくとも２０アミノ酸長で、配列番号４に含まれるアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される。一の実施形態において、抗原性組成物はさらに医薬上許容される担体を含む。
【００２６】
一の実施形態において、抗原性組成物は、
α−ラクトアルブミン（配列番号：１）の８、１０、１５または２０アミノ酸断片を含むポリペプチドまたは少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：１に含まれるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチド、および
αＳ１カゼイン（配列番号：２）の８、１０、１５または２０アミノ酸断片を含むポリペプチドまたは少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：２に含まれるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチド、を含む。
【００２７】
一の実施形態において、抗原性組成物は、
α−ラクトアルブミン（配列番号：１）の８、１０、１５または２０アミノ酸断片を含むポリペプチドまたは少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：１に含まれるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチド、および
β−カゼイン（配列番号：３）の８、１０、１５または２０アミノ酸断片を含むポリペプチドまたは少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：３に含まれるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチド、を含む。
【００２８】
一の実施形態において、抗原性組成物は、
α−ラクトアルブミン（配列番号：１）の８、１０、１５または２０アミノ酸断片を含むポリペプチドまたは少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：１に含まれるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチド、および
κ−カゼイン（配列番号：４）の８、１０、１５または２０アミノ酸断片を含むポリペプチドまたは少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：４に含まれるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチド、を含む。
【００２９】
一の実施形態において、抗原性組成物は、
α−ラクトアルブミン（配列番号：１）の８、１０、１５または２０アミノ酸断片を含むポリペプチドまたは少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：１に含まれるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチド；
αＳ１カゼイン（配列番号：２）の８、１０、１５または２０アミノ酸断片を含むポリペプチドまたは少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：２に含まれるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチド；および
β−カゼイン（配列番号：３）の８、１０、１５または２０アミノ酸断片を含むポリペプチドまたは少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：３に含まれるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチド、を含む。
【００３０】
一の実施形態において、抗原性組成物は、
α−ラクトアルブミン（配列番号：１）の８、１０、１５または２０アミノ酸断片を含むポリペプチドまたは少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：１に含まれるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチド；
αＳ１カゼイン（配列番号：２）の８、１０、１５または２０アミノ酸断片を含むポリペプチドまたは少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：２に含まれるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチド；および
κ−カゼイン（配列番号：４）の８、１０、１５または２０アミノ酸断片を含むポリペプチドまたは少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：４に含まれるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチド、を含む。
【００３１】
一の実施形態において、抗原性組成物は、
α−ラクトアルブミン（配列番号：１）の８、１０、１５または２０アミノ酸断片を含むポリペプチドまたは少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：１に含まれるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチド；
αＳ１カゼイン（配列番号：２）の８、１０、１５または２０アミノ酸断片を含むポリペプチドまたは少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：２に含まれるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチド；
β−カゼイン（配列番号：３）の８、１０、１５または２０アミノ酸断片を含むポリペプチドまたは少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：３に含まれるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチド；および
κ−カゼイン（配列番号：４）の８、１０、１５または２０アミノ酸断片を含むポリペプチドまたは少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：４に含まれるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチド、を含む。
【００３２】
一の実施形態において、多価ワクチンは、
少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：１に含まれるアミノ酸配列と９５％の配列同一性を有するポリペプチド；
少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：２に含まれるアミノ酸配列と９５％の配列同一性を有するポリペプチド；
少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：３に含まれるアミノ酸配列と９５％の配列同一性を有するポリペプチド；および
少なくとも２０または４０アミノ酸長で、配列番号：４に含まれるアミノ酸配列と９５％の配列同一性を有するポリペプチド、を含むものとして提供される。
【００３３】
一の実施形態において、抗原性組成物のポリペプチドは結合部分を通してお互いに連結された。一の実施形態において、ポリペプチドはヘッドトゥテールの様式（すなわち、１つのポリペプチドのアミノ末端が第二のポリペプチドのカルボキシ末端に連結される）で連結する。さらなる実施形態において、ポリペプチドはアミノ酸リンカーによって連結され、一の実施形態において、リンカーはジペプチドまたはトリペプチドである。通常、連結アミノ酸はグリシンおよびアラニンから選択され、一の実施形態において、ポリペプチドはＧｌｙ−ＧｌｙまたはＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａリンカーで連結される。
【００３４】
投与された授乳期蛋白質がインビボでプロテアーゼによって、抗原提示細胞上でＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できる、より小さいペプチド断片に処理されることが理解される。次に、Ｔ細胞受容体は、ペプチドが結合したＭＨＣ分子を認識して結合し、免疫応答を開始する一次シグナルを形成する。
【００３５】
一の実施形態において、ワクチンはさらにアジュバントおよび医薬上許容できる担体を含む。本明細書で使用される「アジュバント」なる用語は、免疫系を刺激して、ワクチンへの応答を増加させる剤をいう。ワクチンアジュバントは当業者に周知である。例示的に、ＧＰＩ−０１００はワクチンのための適当なアジュバントである。本明細書で使用される「担体」なる用語は、製剤における活性成分以外の成分をいう。担体の選択は大体において特定の投与方法または用途などの要素、溶解度および安定性への担体の効果、および投与形態の本質による。ポリペプチド抗原の医薬上許容される担体は当分野で周知である。
【００３６】
一の実施形態において、ワクチンは、乳がんを予防するために予防的に投与される。一の例示的な態様において、乳がんの発症リスクを有する非授乳期女性にワクチンを投与する。
【００３７】
一の実施形態において、ワクチンは、腫瘍細胞の増殖を抑制するために投与される。ワクチンは患者の乳房の腫瘍細胞の検出の前後に投与され得る。腫瘍細胞の増殖の抑制が、腫瘍細胞の増殖の予防、遅延、停止、または破壊について言及することが理解される。
【００３８】
一の例示的な態様において、ヒト免疫系のＴ細胞はヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインおよび／またはκ−カゼインを含む免疫原性組成物の投与後に活性化する。活性化したＴ細胞はＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得る。
【００３９】
一の実施形態において、ヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインおよび／またはκ−カゼインを含むワクチンの投与後に、炎症性応答はその後のαラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインまたはκ−カゼインの免疫細胞との接触で誘導される。炎症性免疫応答は、炎症性サイトカインおよび／またはケモカイン、例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）および／またはインターロイキン２（ＩＬ−２）の生産を含む。炎症性サイトカインおよびケモカインは当分野で周知である。一の実施形態によると、多価抗原性組成物のポリペプチドはさらに、一つ以上のポリペプチドと共有結合した免疫増強サイトカインを有するように改変される。一の実施形態において、サイトカインは顆粒球マクロファージ刺激因子、インターロイキン−２およびインターロイキン−４からなる群から選択される。
【００４０】
乳がんワクチンが、その乳房組織がヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインまたはκ−カゼインを適切な量で活性的に生産しない患者（すなわち、非授乳期の女性、または乳房の腫瘍細胞が生産するα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインまたはκ−カゼインの生産を欠く女性）に投与されたときに、ヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼインでの免疫は乳房組織での実質的な炎症性免疫応答（すなわち、それは乳房の組織損傷を引き起こすことができる）を引き起こさないことが理解されるであろう。発症している腫瘍細胞で発現されるようなヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインまたはκ−カゼインとのその後の接触が、免疫系による再現応答を引き起こす。再現応答は、α−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインまたはκ−カゼイン発現細胞への強力な免疫系を促進する、ＩＦＮγおよびＩＬ−２などの炎症性サイトカインの生産の増加を含むが、これらに限定されない。
【００４１】
ヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインおよび／またはκ−カゼインがヒトの乳房細胞によってのみ生産される例では、炎症性免疫応答は乳房組織特有になるであろう。
【００４２】
一の実施形態において、ヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインおよび／またはκ−カゼインに対してヒト患者を免疫する方法が開示される。方法は、ヒトα−ラクトアルブミン（配列番号：１）、αＳ１カゼイン（配列番号：２）、β−カゼイン（配列番号：３）および／またはκ−カゼイン（配列番号：４）から選択される２つ以上のポリペプチドを含むポリペプチドを含む免疫原性組成物を患者に投与する段階を含む。一の態様において、免疫原性組成物は、ヒトα−ラクトアルブミン、およびαＳ１カゼイン、β−カゼインおよびκ−カゼインからなる群から選択される他のポリペプチドから実質的になるポリペプチドを含む。
【００４３】
一の実施形態において、ヒト患者において乳房組織に特異的な炎症性応答を誘導することができるヒトＴ細胞を活性化する方法が開示される。方法はヒトα−ラクトアルブミン（配列番号：１）、αＳ１カゼイン（配列番号：２）、β−カゼイン（配列番号：３）および／またはκ−カゼイン（配列番号：４）から選択される２つ以上のポリペプチドを含むポリペプチドに以前に暴露された単離ヒト樹状細胞を含む組成物をＴ細胞と接触させる段階を含む。活性化Ｔ細胞は、続いてヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインまたはκ−カゼインを示すと、再現応答を示す。再現応答は、例えばＩＦＮγを含む、炎症性サイトカインおよびまたはケモカインの生産を含む。
【００４４】
一の実施形態において、乳がんを予防または処置するためにワクチンが開示される。ワクチンはヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインまたはκ−カゼインから選択される２つ以上のポリペプチドを含む免疫原性ポリペプチドを含む。α−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインまたはκ−カゼインを生産する乳房組織を有する患者に投与された後、ワクチンは乳房組織に特異的な炎症性応答を誘導する。
【００４５】
一の実施形態において、ヒト患者のがんを処置する方法が開示される。方法は、ヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインおよびκ−カゼインから選択される２つ以上のポリペプチド、アジュバントおよび医薬上許容される担体を含む組成物を、ヒト患者の乳房組織に特異的な炎症性応答を誘導するために有効な量で患者に投与する段階を含む。一の実施形態において、アジュバントはＧＰＩ−０１００である。
【００４６】
一の実施形態において、ヒト患者のがんを処置する方法が開示される。方法は、本明細書で開示された組成物を授乳期の患者に投与する段階を含む。一の実施形態において、組成物はヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインまたはκ−カゼインを、ヒト患者に乳房組織に特異的な炎症応答を誘導するために有効な量で導入された単離ヒト樹状細胞を含む。
【００４７】
一の実施形態において、ヒト患者において、乳房組織に特異的な炎症応答を誘導する方法が開示される。方法は、ヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインおよびκ−カゼインから選択される２つ以上のポリペプチド、アジュバントおよび医薬上許容される担体を含む組成物を患者に投与する段階を含み、ここで、α−ラクトアルブミン反応性ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の増加が組成物の投与後にもたらされる。
【００４８】
ヒト患者において、乳房組織に特異的な炎症応答を誘導する方法が開示される。方法は、ヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインまたはκ−カゼインを、ヒト患者に乳房組織に特異的な炎症応答を誘導するために有効な量で導入された単離ヒト樹状細胞を含む組成物を患者に投与する段階を含み、ここで、α−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインまたはκ−カゼイン反応性ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の増加が組成物の投与後にもたらされる。有効量のヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインまたはκ−カゼインは、免疫応答を引き起こすために抗原提示細胞および／または活性化Ｔ細胞により十分に取り込まれるヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインまたはκ−カゼインの量をいう。
【００４９】
乳がんの処置または予防のための様々な実施形態によると、ワクチンの１つ以上のブースター注射が投与される。
【００５０】
Ｔ細胞は、免疫系のマクロファージおよび樹状細胞上で典型的に発現される抗原提示分子の文脈で示された蛋白質抗原の個別のペプチドを認識する。ペプチド認識は典型的に、抗原提示細胞による抗原の貪食過程およびＭａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＨＣ）クラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子への小さいペプチド断片の導入に続いて起こる。ＣＤ４＋Ｔ細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示されるペプチドを認識した後、それらは急速に増殖し、他の免疫エフェクター細胞を活性化し得るエフェクターＴ細胞になる。
【００５１】
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それらが特定の蛋白質を発現する細胞を溶解および排除できる細胞傷害性エフェクター細胞へ発展するＭＨＣクラスＩ分子によって提示されたペプチドを認識すると信じられている。ＣＤ４およびＣＤ８分子は、それらとＭＨＣ分子との相互作用により、共受容体として機能する。それらは有効なＴ細胞仲介免疫応答に必要であると信じられている。
【００５２】
乳がんに対するワクチンで有効なポリペプチド抗原となる、ヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインおよび／またはκ−カゼインを含む多価抗原性組成物の能力は、ヒトα−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインまたはκ−カゼインが炎症性免疫応答を生じるためにヒトで十分に免疫原性であるかどうかに依存する。ヒトα−ラクトアルブミンなどの特定のタンパク質の免疫原性は、かなり予測不能であり、その取り込みおよび抗原提示細胞によるより小さいペプチド断片への加工、ＭＨＣ結合ポケットの文脈において、ペプチドを認識し、結合できる特異的受容体配列をもつ適切な反応性Ｔ細胞の利用可能性などに一部依存する。
【００５３】
多価蛋白質は、がんおよび他の関連する疾患の処置に用いられる他の治療法と連続的にまたは組み合わせて投与され得る。これらの治療法はＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、インターロイキン−１、インターロイキン−２、腫瘍壊死因子、マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージ活性化因子、リンホトキシン、線維芽細胞増殖因子（天然源由来または組換え型による発現）などを含む。あるいは、多価ワクチンは５−フルオロウラシル、パクリタキセル；エトポシド；カルボプラチン；シスプラチン；トポテカン、メトトレキサート、などの従来の化学療法薬および／または放射線療法と連続してまたは組み合わせて投与され得る。そのような併用療法は、有利にそれらの剤の従来の用量以下を利用し得るか、またはそれほど極端でないレジメンを含み得、それゆえ、それらの療法に関連するいかなる潜在的毒性または危険を避ける。
【００５４】
一の実施形態によると、抗原性ポリペプチドは融合ペプチドとして共に連結された、いくつかのポリペプチドの発現を含んで、組換え的に作出され得る。一の実施形態において、多価ワクチンは局所療法の効果を生むためにいかなる医薬上許容される様式で、腫瘍内に、腫瘍周辺に、病巣内に、静脈に、筋肉内に、皮下に、または局所経路により投与できる。多価ワクチンを投与することに代わる手段として、ワクチンをコードする遺伝子は、感染細胞を、例えばＤＮＡ取り込みを許容するためのそれらの掻き取り、電気穿孔法、直接注入などで処理することによってがん細胞に導入し得る。
【００５５】
本発明の一の態様において、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４の免疫原性変異ペプチドを生成する方法が提供される。方法は、（ｉ）親ペプチドを得ること、（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入で親ペプチドを改変する、および（ｉｉｉ）（ｉｉ）の改変ペプチドを免疫原性について試験する、を含む。ペプチドはまた、さまざまな方法でＨＬＡ−Ａ２への結合を試験できる。（１）Ｔ２細胞の安定したＨＬＡ−Ａ２発現の効果による結合を評価するために、５０ｕＭのペプチドをＴ２細胞と一晩インキュベートし、過剰なペプチドを洗浄して、次にＦＡＣを実施することによって。（２）混合リンパ球反応で自家正常ドナー単核細胞由来樹状細胞に導入されたときの、Ｔ細胞応答（ＩＦＮガンマＥＬＩＳＡアッセイで測定される）を誘導するペプチドの能力を調べることによって。
【００５６】
本発明の一の態様において、抗原に対する抗血清の製造方法が提供され、該方法は、本発明の多価組成物、または授乳期ポリペプチドをコードする核酸、そのような核酸配列を含む発現ベクター、または本発明の細胞またはＴ細胞を非ヒト哺乳動物に導入し、該哺乳動物から免疫血清を回収することを含む。また、該血清から入手可能な抗体も提供される。
【００５７】
本発明のペプチドは長さが８から５０のアミノ酸長、８から４０、８から３０、８から２５、８から２０のアミノ酸、であり得る。例えば、ペプチドは、９から５０、または９から２５のアミノ酸長であり得る。例えば、本発明のペプチドは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５のアミノ酸長であり得る。一の実施形態において、本発明のペプチドは９または１０のアミノ酸長である。本明細書で使用される「エピトープ」は、ＭＨＣ分子に結合でき、免疫応答を引き起こすペプチドの一部をいう。それはＴ細胞エピトープであり得る。
【００５８】
それゆえ、本発明は、ペプチドのＭＨＣ分子への結合に影響を与える、容易にするまたは貢献する配列番号１、２、３または４から選択される２つ以上の免疫原性授乳期ポリペプチドまたはそれらの機能的な変異体を含む。本発明のさらなる態様において、免疫原性変異ペプチドを製造する方法が提供され、該方法は、（ｉ）親ペプチドを得ること、該親ペプチドは配列番号：１、２、３または４の９個の連続したアミノ酸断片を含む（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入で親ペプチドを改変する（結果、変異ペプチドを生じる）、および（ｉｉｉ）（ｉｉ）の改変ペプチドを免疫原性について試験する、を含む。特に、変異体のそのＭＨＣ分子への結合能、Ｔ細胞特異的免疫応答の誘導能について試験され得る。変異ペプチドの免疫原性についての試験方法は当分野で周知である。そのような技術は、例えばＴ２細胞表面上のＨＬＡ−Ａ２分子の安定性を示す、Ｔ２細胞へのペプチドによる結合の評価を含む。これは、ペプチドのオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）示すために、同時点で、または時間的経過にて実施できる。更なる技術は：ｉ）単核細胞由来樹状細胞がペプチドと共に導入され、Ｔ細胞の刺激を増殖アッセイ（３Ｈ−チミジン）により評価する混合リンパ球反応、ｉｉ）サイトカイン分泌アッセイ（ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定されたＩＦＮガンマ分泌）、ｉｉｉ）フローサイトメトリーによる細胞内サイトカインアッセイで測定されたＩＦＮガンマ生産、ｉｖ）刺激に続いて産生されるサイトカインのアレイの測定のためのＣＢＡビーズアッセイ、ｖ）フローサイトメトリーアッセイまたはｐＭＨＣアレイにおいてストレプタマー（ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ）、テトラマーまたはペンタマー（すなわち、それらがＭＨＣに提示される特異的ペプチドを認識するならばＴ細胞が結合する、ペプチド−ＭＨＣ多量体）を使用する、特異的Ｔ細胞の提示または増加の定量的測定およびｖｉ）サイトカイン分泌またはＣＴＬ死（ｖｉ参照）のさらなる研究のためのストレプタマー、テトラマーまたはペンタマーを用いるペプチド特異的Ｔ細胞の精製およびｖｉｉ）標的細胞がペプチド負荷されるか内因的に対象の抗原を発現し得て、ＣＦＳＥ染色またはＴ細胞増殖またはクロム遊離によりＴ細胞の標的への応答が測定される、ＣＴＬ死滅アッセイ（クロム遊離、インビボＣＴＬアッセイまたはＪＡＭアッセイ）、を含む。
【実施例】
【００５９】
実施例１
出願人は、乳がんの予防または処置のためのワクチンに使用される授乳期依存蛋白質の４つの候補、すなわち、α−ラクトアルブミン、αＳ１カゼイン、β−カゼインおよびκ−カゼイン、を同定した。各々の蛋白質は、４Ｔ１マウスの乳房の腫瘍および多くのヒトの乳房の腫瘍での過剰発現ならびに授乳期のマウスおよびヒトの乳房組織だけに限定される分離された発現により特徴付けられる。一の実施形態によると、各々のこれらの蛋白質は、正常乳房組織ならびに脳、心臓、肺、腎臓、肝臓、脾臓、胃、腸、子宮、卵巣、および膀胱を含む他の正常組織へのいかなる付随的な障害がないとき、乳がんの発症に対する免疫防御を引き起こすために使用される。各々の組換えマウス蛋白質は、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫させるために使用されるであろう。免疫原性は、１０日の感作リンパ節細胞でのＴ細胞頻度を決定することにより測定され、接種された４Ｔ１乳房腫瘍に対する保護能力は、ワクチン接種の２週間後から測定されるであろう。正常なワクチン接種マウスおよび腫瘍に曝されたワクチン接種されたマウスからの乳房および多の組織は、炎症について組織学およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる炎症性メディエータの発現で検査されるであろう。我々の研究は、各組み換えタンパクが乳房の腫瘍増殖に対する臨床的に有効な保護を仲介する能力およびそのような保護が正常組織の炎症なしで起こるかどうかを決定するであろう。首尾よく選択された標的蛋白質候補は、多価ワクチンが単一の一価ワクチンよりも乳房の腫瘍増殖の抑制により有効かどうか決定するために組み合わせて使用されるであろう。最終的に、我々の最適化された多価ワクチンに含ませるために選択された各候補蛋白質は、ヒト組み換え変異体でのインビボ感作による女性の免疫原性および炎症性サイトカイン、インターフェロンガンマを産生するＴ細胞の抗原特異的頻度を試験されるであろう。
【００６０】
我々の研究はヒトの乳房の腫瘍のいかなる切迫した増殖に対して最適化された免疫学的圧力を誘導するように設計された多価乳がん予防ワクチンに含有させる標的蛋白質成分を特定するであろう。
【００６１】
我々のデータは、乳房特異的授乳期蛋白質、α−ラクトアルブミンでの単一の免疫が、切迫した乳房の腫瘍の増殖に対して、特にヒトの乳房の悪性腫瘍でのα−ラクトアルブミンの広範な検出およびα−ラクトアルブミンで免疫された正常マウスにいかなる検出可能な炎症がないという観点から、有意なレベルであるが安全な予防を提供することを示す。我々のデータはまた、我々のワクチン設計への他の授乳期蛋白質標的の組み込みが、不均一集団でのワクチンへのより広い応答および新たに発生した腫瘍のより広い認識を、自己免疫性合併症の可能性を実質的に全く広げることなく、容易にすることを示す。
【００６２】
実施例２：α−ラクトアルブミン免疫は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋炎症性Ｔ細胞の両方を活性化する。
組換え型マウスα−ラクトアルブミンは、変性条件の下で、ニッケルニトリロ三酢酸親和性クロマトグラフィーおよびそれに続く逆相ＨＰＬＣを使用することで精製される。雌ＳＷＸＪマウスは組換え型のマウスα−ラクトアルブミンで免疫される。免疫の１０日後に、マウスリンパ節細胞（ＬＮＣ）は、α−ラクトアルブミンへの再現応答に用量依存性増殖を示し、実質的に同一の様式でＥ．ｃｏｌｉで産生する組換えヒトコクリンへの無応答を示す（図１Ａ参照）。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方がα−ラクトアルブミンへの応答に関与する（図１Ｂ参照）。さらに、α−ラクトアルブミンは、炎症性表現型がインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）とＩＬ−２の高い生産量、およびＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０の低い生産量を伴うことを示す（図１Ｃ参照）。
【００６３】
実施例３：非授乳期のマウスのα−ラクトアルブミンでの免疫は乳房の炎症を誘導できない。
α−ラクトアルブミンで免疫された非授乳マウスからの乳房組織は、炎症性浸潤を示さないが、代わりに分離した個々のＣＤ３＋Ｔ細胞が乳房の柔組織を通って移動することを常に示す。しかしながら、広範なＴ細胞の浸潤はα−ラクトアルブミンで免疫された授乳期のマウスの乳房組織中に常に起こる。ＣＦＡのみで免疫された授乳期の対照マウスからの乳房組織は、広範なＴ細胞浸潤を示さない。フローサイトメトリーによる乳房に浸潤しているＴ細胞の分析は、ＣＤ４４抗活性マーカーを発現するＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の高い頻度を示す。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる分析は、未処置の正常な非授乳期または授乳期マウス、またはＣＦＡのみで免疫された授乳期マウスの乳房組織で発現されたレベルと比べて、α−ラクトアルブミンで免疫されたマウスからの乳房組織が、ＩＬ−１０（ｐ＞０．１０）ではなく、有意に上昇したＩＦＮγ（ｐ＝０．００１）の発現レベルを有することを示す（図２参照）。
【００６４】
実施例４：予防的なα−ラクトアルブミンワクチン接種は乳房の腫瘍の増殖を抑制する。
ＭＭＴＶ−ｎｅｕマウスは、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）の長い末端反復の調節の下で非活性ｎｅｕ（ＥｒｂＢ２かＨＥＲ２／ｎｅｕ）プロトオンコジーンを発現し、２０５日齢で５０％の自然発生的な乳房の腫瘍の発生を示す。８週齢のＭＭＴＶ−ｎｅｕマウスが、ＣＦＡ中のα−ラクトアルブミンまたはＣＦＡ単独で免疫される。最初の腫瘍が直径１７ｍｍに達したとき（約１０ヶ月齢）、すべてのネズミが安楽死させられる。実験の終了の際に、すべてのＣＦＡ免疫対照マウスが、乳房の腫瘍を発症した。対照的に、α−ラクトアルブミンで免疫されたマウスは、いかなる検出可能な乳房の腫瘍も示さない（ｐ＝０．０００４；図３Ａ参照）。
【００６５】
α−ラクトアルブミンでの予防的なワクチン接種もまた、可植性４Ｔ１腫瘍に対して有効である。４Ｔ１腫瘍細胞の接種の１３日前にα−ラクトアルブミンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスは、有意な増殖阻害を示す（ｐ＝０．０００６；図３Ｂ参照）。
【００６６】
実施例５：α−ラクトアルブミンワクチン接種は定着した移植４Ｔ１乳房腫瘍の増殖を抑制する。
２×１０４の４Ｔ１腫瘍細胞のＢＡＬＢ／ｃマウスへの皮下移植に続いて、腫瘍は接種後５日以内に定着し、触知可能な腫瘤が接種後２〜３週間以内に存在した。４Ｔ１腫瘍細胞の接種後に、α−ラクトアルブミンでのワクチン接種が、接種の５日後、接種の１３日後、および接種の２１日後に実施される。腫瘍増殖の有意な抑制は、５日でのワクチン接種（ｐ＜０．０１；図４Ａ参照）および１３日でのワクチン接種（ｐ＜０．０１；図４Ｂ参照）において観察されるが、２１日でのワクチン接種のときには観察されない（図４Ｃ参照）。接種２１日後にワクチン接種されたマウスの腫瘍増殖阻害の不足は、腫瘍が接種時から安楽死を強要される最大サイズに達するまでの間の期間が、１１日間の短い観察期間によるためであり得る。
【００６７】
実施例６：α−ラクトアルブミンワクチン接種は定着した自然発症の乳房の腫瘍の増殖を抑制する。
ＭＭＴＶ−ＰｙＶＴトランスジェニックマウスは、導入遺伝子の発現と同時に授乳期能の損失を示し、完治できる非常に活発な増殖を示す乳房の腫瘍を５週齢で発症する。この実施例では、ＭＭＴＶ−ＰｙＶＴトランスジェニックマウスは６週齢にα−ラクトアルブミンでワクチン接種される。ＭＭＴＶ−ＰｙＶＴの非常に活発な定着した自然発症の腫瘍の増殖への有意な抑制が観察される（ｐ＜０．０００６；図５参照）。それゆえ、α−ラクトアルブミンワクチン接種は、乳房の腫瘍の増殖に対して有効な保護および療法を示し、免疫がＭＭＴＶ−ＰｙＶＴトランスジェニックマウスの触知可能な腫瘤の発現の前に起こると、特に有効である。
【００６８】
実施例７：α−ラクトアルブミン特異的Ｔ細胞は腫瘍炎症および細胞毒性を誘導する。
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、α−ラクトアルブミンでワクチン接種されて、４Ｔ１細胞を接種される。接種の約３２日後に、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腫瘍は、ＣＤ３＋Ｔ細胞の広範な浸潤を示す。対照的に、これらの炎症性浸潤はＣＦＡで免疫された対照マウスからの腫瘍では起こらない。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬｓ）のフローサイトメトリー分析は、ＣＤ８＋Ｔ細胞（１４．４％）と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞（６４．３％）が優勢であることを示す。
【００６９】
さらに、ＥＬＩＳＡによって測定される５０μｇ／ｍｌα−ラクトアルブミンへの再現応答は、ＩＬ−５およびＩＬ−１０と比べて、ＩＦＮγの高い生産量にかかわる１型炎症性表現型を示す（図６Ａ参照）。ＴＩＬのＥＬＩＳＰＯＴ分析は、培養Ｔ細胞によるそのＩＦＮγ分泌がクラスＩではなくクラスＩＩ特異的抗体での処置で阻害されるので、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりむしろＣＤ４＋が生産されることを示す（図６Ｂ参照）。しかしながら、培養４Ｔ１腫瘍細胞の死はマウスＣＤ４ではなく、マウスＣＤ８に特異的な抗体での、培養されたα−ラクトアルブミン感作ＬＮＣの処置により阻害される（図６Ｃ参照）。この結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が４Ｔ１特異的細胞毒性を仲介することを示す。
【００７０】
実施例８：α−ラクトアルブミンワクチン接種による乳房の腫瘍の増殖の抑制はＴ細胞によって仲介される。
同じ日に、ナイーブなレシピエントＢＡＬＢ／ｃマウスは４Ｔ１腫瘍およびα−ラクトアルブミン感作ＬＮＣでワクチン接種される。腫瘍成長の有意な抑制がこれらのマウスで観察される（ｐ＜０．０００１；図７Ａ参照）。さらに、がん出現マウスの発生は本実施例で有意に減少し（ｐ＜０．０３；図７Ｂ参照）、また最終的な腫瘍重量も有意に減少する（ｐ＜０．０００８；図７Ｃ参照）。
【００７１】
ナイーブなマウスはさらに、ａ）α−ラクトアルブミン感作ＬＮＣから磁気ビーズ分離で濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞、ｂ）α−ラクトアルブミン感作ＬＮＣから磁気ビーズ分離で濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞、またはｃ）対照オボアルブミン（ＯＶＡ）感作ＬＮＣ、を受容した。有意な腫瘍増殖阻害は、ＯＶＡ−感作ＬＮＣと比較して、α−ラクトアルブミン感作ＬＮＣから磁気ビーズ分離で濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞を受容したマウス（ｐ＝０．００２；図７Ｄ、左パネル参照）およびα−ラクトアルブミン感作ＬＮＣから磁気ビーズ分離で濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞（ｐ＝０．００３；図７Ｄ、右パネル参照）で観察される。本実施例は、活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＴＩＬが乳房の腫瘍の増殖へのα−ラクトアルブミンワクチン接種の保護および治療効果を仲介することを示す。
【００７２】
実施例９：女性におけるα−ラクトアルブミン応答性Ｔ細胞の有用性
Ｔ細胞レパートリーの有用性および重要さは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）でのα−ラクトアルブミンに対するインビトロ感作および得られるＩＦＮγ産生Ｔ細胞の抗原特異的頻度の測定によって評価される。単核細胞由来ＤＣは２９歳の女性患者から採取されたＰＢＭＣから調製された。付着細胞選択に続いて、５００Ｕ／ｍｌのｒｈＧＭＣＳＦおよびｒｈｌＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，  Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，  ＮＪ）を含むＸ−ＶＩＶＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）での培養が行われた。培養開始の６日後に、ＤＣは７５μｇ／ｍｌの精製ヒト組み換えα−ラクトアルブミン（ｒｈα−ラクトアルブミン）でパルス処理され、４８時間後に徹底的に洗浄された。洗浄されたＤＣは同じドナーからのナイロンウール精製Ｔ細胞と１：５の比率（Ｔ細胞に対するＤＣ）で共培養された。共培養の約７２時間後に、同じドナーからのインビトロ感作されたＴ細胞および非感作Ｔ細胞は、ナイロンウールを通すことにより濃縮され、抗ヒトＩＦＮγ捕捉抗体（＃Ｍ−７００Ａ；  Ｅｎｄｏｇｅｎ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）でプレコートされたＥＬＩＳＰＯＴプレート（Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｃｓ，  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，  ＭＡ）上でフィーダー細胞としてのγ照射（３０００ｒａｄ）ＰＢＭＣと、１：１０（Ｔ細胞に対するフィーダー）の比率で共培養された。α−ラクトアルブミン応答性ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の頻度は、４８時間後に、二次ビオチン化マウス抗ヒトＩＦＮγ（＃Ｍ７０１；  Ｅｎｄｏｇｅｎ）およびＥＬＩＳＰＯＴの分解を用いて、自動化されたＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  ＯＨ）を使用して測定された。
【００７３】
α−ラクトアルブミンでの感作の後に、ＰＭＢＣはα−ラクトアルブミンへのその後の露出の際に、ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の増加した頻度を示す（再現応答）（図８参照）。観察された応答は抗原特異的であり、リコール抗原としてのＯＶＡおよび組換えヒトコクリン（ｒｍＣｏｃｈｌｉｎ）、組み換えヒトα−ラクトアルブミンの生産と同様の方法で産生される内耳蛋白質）はＩＦＮγ産生Ｔ細胞の増加を生じない。
【００７４】
まとめると、本明細書に記載された結果は、１）α−ラクトアルブミンでの免疫がＣＤ４＋およびＣＤ８＋炎症性Ｔ細胞の両方を活性化すること；２）α−ラクトアルブミンでの非授乳期哺乳動物の免疫は乳房の炎症を誘導できないこと；３）予防的α−ラクトアルブミンワクチン接種は、乳房の腫瘍の増殖および発生を抑制すること；および４）αラクトアルブミンワクチン接種は定着した腫瘍の増殖を抑制すること、を示す。αラクトアルブミン免疫はいくつかのネズミ科乳がんモデルに安全で有効なワクチン接種を供給する。
【００７５】
重要なことは、ヒトα−ラクトアルブミンがヒトにおいてＴ細胞を活性化し、炎症性免疫再現応答を引き出すために十分に免疫原性であることが本明細書に示される。それゆえ、ヒトαラクトアルブミンでのヒトの免疫は、安全で有効なワクチンをヒトの乳がんに提供する能力がある。
【００７６】
本発明が以上の記述で詳細に例証され、記載される一方で、そのような例証および記載が例示的であり、特徴が制限されないとみなされる例示的な実施形態のみが記載され、本発明の範囲内でもたらされるすべての変化および改変が保護されることが望ましいことが理解される。当業者は、本明細書に記載された特徴の１つ以上を組み込むそれら自身の実現について容易に工夫でき、その結果、本発明の範囲内に該当する。
【００７７】
実施例１０：多価乳がんワクチン接種
実施例４〜７は、乳房に特異的な授乳期蛋白質、α−ラクトアルブミン、での単一の免疫が、発生する乳房の腫瘍の増殖に対して、特にヒトの乳房の悪性腫瘍でのα−ラクトアルブミンの広範な検出およびα−ラクトアルブミンで免疫された正常マウスにいかなる検出可能な炎症がないという観点から、有意なレベルであるが安全な予防を提供することを示した（実施例３）。α−ラクトアルブミンワクチン接種はまた、定着した乳房の腫瘍の増殖に対して使用したときに有効な治療を提供することを示した。さらなる実験は、他の乳房特異的授乳期蛋白質、α−カゼインに対するワクチン接種が、個別のイムノゲンとして使用されるかまたはα−ラクトアルブミンと共免疫されるときに、乳房の腫瘍に対して同様の保護を提供することを示す。両方の授乳期蛋白質での共免疫が、４Ｔ１乳房腫瘍に対して少しも増加した保護を生じなかったことは明白である。しかしながら、多価ワクチン接種の目的が、より多くの女性が免疫を発生し、より多くの腫瘍が、よりさまざまな免疫で影響を受けるであろう可能性を広げること、であることに注意することが重要である。いかなるヒト対象もいかなる所定の個々の標的蛋白質（応答者対不応答者）を提供できる利用可能なＴ細胞レパートリーを有し得るかまたは有し得ず、各々の発生したヒト乳房腫瘍はいかなる所定の個々の標的蛋白質を発現し得るかまたはし得ない（図１４）。
【００７８】
乳がん診断および処置は腫瘍増殖を刺激することが知られている３つの受容体：エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、およびヒト表皮成長受容体２（ＨＥＲ２）の、存在または不在に実質的に基づく。乳がんに関する最も多くの成功した処置はこれらの受容体を標的とする。乳房の腫瘍がこれらの受容体のいずれも発現しないとき、すなわち、腫瘍がＥＲ陰性／ＰＲ陰性／ＨＥＲ２陰性であるとき、診断はトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）に分類される。ＴＮＢＣはトラスツズマブ（ハーセプチン）などのＨＥＲ２指定療法およびタモキシフェンまたはアロマターゼ阻害薬などの内分泌腺の療法を含む乳がん治療に利用可能な最も効果的な療法のいくつかに非感受性である。さらに、ほとんどの遺伝的なＢＲＣＡ１関連の乳がんがＴＮＢＣであり、ＴＮＢＣの女性はＥＲ＋ＢＣ、最も一般的な形態のＢＣ、の女性よりも３倍の病気からの死亡の危険性を有する。それゆえ、ＴＮＢＣの女性は、活性化した腫瘍、再発および転移、および乳がんによる死の不均衡なより高い速度を有する。一般に、ＴＮＢＣは最も致命的な形式の乳がんとして認識される。
【００７９】
プロゲステロン受容体（ＰＲ）に結合するプロゲステロンが、授乳期の終端およびα−ラクトアルブミンおよびα−カゼインを含む授乳期蛋白質の合成のための強い阻害シグナルを提供することが知られている。ＰＲ陰性の乳房の腫瘍は授乳期蛋白質の合成のこの強い阻害をシグナル化することができない。それゆえ、出願人は、ＴＮＢＣを含むＰＲ陰性の乳房の腫瘍がα−ラクトアルブミン合成のプロゲステロン仲介阻害のシグナル化できず、その結果、α−ラクトアルブミンの有意な過剰発現となるであろうと推論した。この問題を調べるため、ＯＮＣＯＭＩＮＥ、様々なヒトのがんにおける、分化遺伝子発現の何千もの研究およびそれらのサブタイプのオンライン検索と分析のためのがんのマイクロアレイデータベースと統合データマイニングプラットホーム、の検索が実施された。ＯＮＣＯＭＩＮＥ検索の結果は、明確にＴＮＢＣにおける授乳期蛋白質の非常に有意な過剰発現を示す多数の研究を提供する。
【００８０】
ヒトの乳房の腫瘍のインビボでの増殖の間のＴＮＢＣにおける授乳期蛋白質のこの過剰発現を確認するため、我々はトリプルネガティブＨＣＣ１９３７乳がん細胞株（ＡＴＣＣ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）をヒトのα−ラクトアルブミンプロモーターの制御の下でホタルルシフェラーゼの発現を提供するレンチウイルスベクターに感染させた。このように、α−ラクトアルブミン遺伝子（ＬＡＬＢＡ）が活性化した転写を受けている場合だけ、生物発光はルシフェリン基質の存在下で起こるであろう。α−ラクトアルブミン転写の可視化は、免疫不全の許容状態のヌードマウスに接種されたＨＣＣ１９３７ヒトトリプルネガティブの乳房の腫瘍のインビボでの増殖の間に生じた。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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