(57)【要約】コロナウイルスに起因する感染の治療及び予防における、式Ｉ：【化１】2015520755.tif 000007[式中Ｒが、Ｈ、ＣＯＣＨ３（ＨＴＣＣ） から選択されるか又はＨ、ＣＯＣＨ３、Ｃ１２Ｈ２５（ＨＭ−ＨＴＣＣ）から選択される]のキトサンポリマーの使用。【選択図】なし
2015520755.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コロナウイルスに起因する感染の治療及び予防における、式Ｉ：
【化１】
2015520755.tif 000006
[式中Ｒは、Ｈ、ＣＯＣＨ３（ＨＴＣＣ）から選択されるか又はＨ、ＣＯＣＨ３、Ｃ１２Ｈ２５（ＨＭ−ＨＴＣＣ）から選択される]
のキトサンポリマーＨＴＣＣ及びＨＭ−ＴＣＣの使用。  
【請求項２】
前記ポリマーを、アルファコロナウイルスに起因する感染の治療及び予防において使用することを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記ポリマーを、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３に起因する感染の治療及び予防において使用することを特徴とする、請求項２記載の使用。
【請求項４】
前記ポリマーを、ベータコロナウイルスに起因する感染の治療及び予防において使用することを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項５】
前記ポリマーを、マウスコロナウイルスＭＨＶに起因する感染の治療及び予防において使用することを特徴とする、請求項４記載の使用。
【請求項６】
前記ポリマーを、ヒト又は動物の呼吸機能の不全及び障害として現れる呼吸器感染症の治療及び予防において使用することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記ポリマーを、
−上気道感染、
−下気道感染、
−小児クループ
−胃腸管感染、
−神経系感染、
−川崎病
の群から選択される感染の治療及び予防において使用することを特徴とする、請求項６記載の使用。
【請求項８】
前記キトサンポリマーＨＴＣＣを、キトサンとグリシジルトリメチルアンモニウムクロリドとを反応させることにより得ることを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項９】
前記キトサンポリマーＨＴＣＣを疎水基で置換することにより更に修飾してＨＭ−ＨＴＣＣポリマーを生じることを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項１０】
前記疎水基がｎ−ドデシル基であることを特徴とする、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
前記キトサンポリマーを、気道に適用される液体又はエーロゾルの形で溶液として使用することを特徴とする、請求項１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コロナウイルスの複製を抑制することによる、コロナウイルスに起因する感染の治療におけるキトサンポリマーの使用に関する。コロナウイルス科に属するヒトウイルスは、正常な呼吸機能の不全及び障害が現われる呼吸器感染を引き起こす。いくつかのコロナウイルスは、複数の動物種（コウモリ、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウ及び野鳥を含む）にも感染しえ、その結果、特に呼吸器系、消化管、肝臓、心血管系及び神経系に影響を及ぼす広範囲の疾病を引き起こす。
【０００２】
特に、本発明は、ヒト及び動物の上気道感染、下気道の感染、クループ、胃腸感染、神経系の感染、肝臓感染、心血管系の感染、川崎病の治療におけるキトサンポリマーの使用を含む。
【背景技術】
【０００３】
コロナウイルスは、一本鎖プラスセンスＲＮＡの形のゲノムを有するエンベロープウイルスである。当初、コロナウイルス科は、血清学的方法に基づいて３つのグループに分けられた。
【０００４】
その後分子技術の実施によりこのウイルス科は再編成され、現在、このウイルス科はアルファ−、ベータ−、ガンマ−及びデルタコロナウイルスから構成される。
【０００５】
アルファコロナウイルスは、多数の動物病原体（例えばネコ腹膜炎ウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス）、及び２つのヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ−２２９Ｅ及びＨＣｏＶ−ＮＬ６３）を含む。ベータコロナウイルスは、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ウマコロナウイルス、イヌコロナウイルスなどの動物ウイルス、及び３つのヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ −ＯＣ４３、 ＨＣｏＶ−ＨＫＵ１及びＳＡＲＳ−ＣｏＶ）を含む。ガンマ−及びデルタ−コロナウイルスは、鳥類及び海洋哺乳類に感染する病原体を含む。
【０００６】
従来技術により、ウイルスに結合しかつそれらの複製を抑制するキトサン及びその誘導体の能力が知られている。例えば、糖残基に結合できる典型的なインフルエンザウイルスのタンパク質であるヘマグルチニンタンパク質を介して、キトサンの糖誘導体がインフルエンザウイルスに結合する能力を有することが知られている（Ｌｉ Ｘ．等 （２０１１）、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１２： ３９６２ − ３９６９； Ｋａｌａｓｈｎｉｋｏｖａ Ｉ．等（２００８）、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ８０：２１８８−２１９８、Ｍａｋｉｍｕｒａ  Ｙ．等（２００６）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ  ３４１：１８０３−１８０８、Ｕ．Ｓ．６，６８０，０５４］。
【０００７】
同様に、微粒剤の形の未修飾キトサンは、口蹄疫（ＦＭＤＶ）感染の複製を抑制するために使用された。乳飲みマウスへの微粒剤の形でのキトサンの適用が結果として病徴の軽減を生じることが明らかにされている（Ｌｉ Ｄ． （２０１０）、 Ｖｉｒｏｌ Ｊ ７： １２５）。
【０００８】
スルホン化キトサン誘導体がＨＩＶ−１ウイルスの複製を抑制する抗ウイルス活性を有することも示されており、これはおそらくｇｐ１２０ウイルスタンパク質と感受性細胞の表面上にあるその受容体（ＣＤ４）との間の相互作用をブロックすることによると考えられる（Ａｒｔａｎ Ｍ．等（２０１０）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ ３４５： ６５６ − ６６２）。キトサンのスルホン酸誘導体が、他のレトロウイルス及びヘルペスウイルス科のメンバーの複製を抑制することを報告する文献がある（Ｕ．Ｓ． ２００９２８６７５７、Ｕ．Ｓ． ２００５２０９１８９、ＥＰ ０４９７９８８、ＤＥ ４２４２８１３ 及びＣ．Ｉｓｈｉｈａｗａ等（１９９３）、 Ｖａｃｃｉｎｅ １１： ６７０ − ６７４）。同様に、低分子量キトサンは、ネコカリチウイルス及びマウスノロウイルスに対する抗ウイルス活性を有する（Ｓｕ Ｘ. 等（２００９）、 Ｊ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ ７２： ２６２３ − ２６２８）。キトサン及びキトサン誘導体の抗ウイルス活性に関する特許出願及び特許も存在する。
【０００９】
しかしながら、可溶性キトサン並びにキトサンのスルホン酸誘導体は、コロナウイルスに対する活性を示さない。同様に、他のカチオン修飾ポリマーの使用はｉｎ ｖｉｔｒｏでウイルス複製を抑制しなかった。上記のものと対照的に、開発されたポリマーは、ヒトメタニューモウイルス、エンテロウイルス、インフルエンザウイルスＡ及びＢ、並びにヒトヘルペスウイルスタイプ１などの他のヒトウイルスに対する活性を示さなかった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、コロナウイルスの複製を抑制することによる、コロナウイルスに起因する感染の治療及び予防におけるキトサンポリマーの使用である。本発明の本質は、コロナウイルスに起因する感染の治療及び予防における、式中ＲがＨ又はＣＯＣＨ３（ＨＴＣＣ）から選択される式Ｉのキトサンポリマー、又は式中ＲがＨ、ＣＯＣＨ３又は Ｃ１２Ｈ２５（ＨＭ−ＨＴＣＣ）から選択される式Ｉのキトサンポリマーの使用である。
【００１１】
好ましくは、ポリマーは、アルファコロナウイルスに起因する感染の治療及び予防において使用され、かつ特に好ましくはＨＣｏＶ−ＮＬ６３に起因する感染の場合に使用される。
【００１２】
好ましくは、ポリマーは、ベータコロナウイルスに起因する感染の治療及び予防において使用され、かつ特に好ましくはマウスコロナウイルスＭＨＶに起因する感染の場合に使用される。
【００１３】
ヒト又は動物において呼吸機能の不全及び障害が現われる呼吸器感染の治療及び予防における本発明によるポリマーの使用も好ましく、上気道感染、下気道感染、小児クループ、胃腸感染、神経系の感染、及び川崎病の感染の治療及び予防における使用は特に好ましい。
【００１４】
キトサンポリマーＨＴＣＣは、キトサンとグリシジルトリメチルアンモニウムクロリドとを反応させることにより得られる。ＨＴＣＣは、疎水基での置換により更に修飾されてＨＭ−ＨＴＣＣを生じるが、疎水基がｎ−ドデシル基である場合が特に好ましい。
【００１５】
これらのポリマーは、好ましくは溶液として液体又はエーロゾルの形で使用され、コロナウイルスに起因する疾病の治療及び予防において上気道（咽頭、鼻、呼吸樹）に局所的に、胃腸系に経口的に、又は静脈内に適用される。
【００１６】
本発明の対象は、式中ＲがＨ又はＣＯＣＨ３ (ＨＴＣＣ) である式Ｉのキトサンポリマー、及び式中ＲがＨ、ＣＯＣＨ３、Ｃ１２Ｈ２５ (ＨＭ−ＨＴＣＣ)である式Ｉのキトサンポリマーを、溶液として、気道に適用される液体又はエーロゾルの形で使用することでもある。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＨＴＣＣを得る反応を示す。
【図２】ＦＴＩＲスペクトルを示す。
【図３】未修飾キトサンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図４】ＨＴＣＣの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】形態学的変化の評価を、位相差顕微鏡を用いて、実施した観察結果を示す。
【図６】ポリマー濃度の増加に関して実施した実験の結果を示す。
【図７】ポリマー濃度の増加に関して実施した実験の結果を示す。
【図８】ＨＡＥ培養物でのＨＴＣＣ及びＨＭ−ＨＴＣＣポリマーによるウイルス複製の抑制を示すグラフである。
【図９】ＨＡＥ培養物でのＨＴＣＣ及びＨＭ−ＨＴＣＣポリマーによるポリマーの細胞毒性（ＸＴＴアッセイにより測定）を示すグラフである。
【図１０】細胞を、形態学的変化に関して、位相差顕微鏡を用いて、感染の４８時間後に可視的に検査した結果を示す。
【図１１】ポリマー濃度の増加に関して実施した実験の結果を示す。
【図１２】ポリマー濃度の増加に関して実施した実験の結果を示す。
【図１３】０、１．０、２．０及び２．５ｇ／ｍｌのＳｅ−ＮＬ６３の存在下でのＦＩＴＣ−ＨＴＣＣの蛍光スペクトルを示すグラフである。
【図１４】〜λ＝５１３ｎｍでのＦＩＴＣ−ＨＴＣＣの相対蛍光強度（Ｉ／Ｉ0）のＳｅ−ＮＬ６３濃度依存性（λ〜ex ＝４９４ｎｍ、ｃFITC-HTCC ＝ ０．５ ｇ／ｍｌ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明を、実施例により更に詳しく説明する。
【００１９】
例１．キトサン誘導体ＨＴＣＣの合成
【００２０】
ポリマーの修飾を、文献中に既に記載された方法に基づいて実施した（Ｋａｍｉｎｓｋｉ Ｋ． 等（２０１０）． Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５３： ４１４１−４１４７）。図１に示した、ＨＴＣＣを得る反応において、キトサン２．５ｇを蒸留水１００ｍｌ中に分散させ、次いで０．５％酢酸１０ｍｌを加え、この混合物を３０分間撹拌した。次のステップで、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＧＴＭＡＣ）６．９ｍｌを滴加した。
【００２１】
マグネチックスターラーを用いて混合しながら、反応を５５℃で１８時間実施した。この時間の後に、反応混合物を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより、懸濁した未修飾キトサンを除去した。次いで、上澄みを過剰量のアセトンに注ぎ、得られる懸濁液を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
【００２２】
上澄みを傾瀉し、沈殿物を空気中で予備乾燥し次いで水中に溶解した。得られる溶液を再び遠心分離し、上澄み中に溶解したポリマーをアセトンの新しいバッチを用いて沈殿させた。溶解と沈殿のサイクルを更に２回繰り返した。最後の沈殿後に得られた生成物ＨＴＣＣを真空オーブン中で２４時間乾燥させた。ＧＴＭＡＣで置換されたグルコースユニットのパーセンテージとして定義して、６３％の修飾の割合を有するポリマーが得られた。
【００２３】
カチオン修飾キトサンＨＴＣＣの構造は、図２に示したＦＴＩＲスペクトルによって確認されるが、その際、より濃い線は修飾前のキトサンのスペクトルを示し、より薄い線は修飾後のキトサン（すなわちＨＴＣＣ）のスペクトルを示す。
【００２４】
修飾されたキトサンのＦＴＩＲスペクトルのうち、特に２つのバンドが区別できる。ひとつはメチル基の特徴である１５２０ｃｍ−１のバンドで、修飾キトサン中に存在するが未修飾キトサン中には存在せず、もうひとつは第１級アミンの特徴である１５９５ｃｍ−１のバンドで、未修飾キトサンのスペクトル中で観察されるが修飾キトサンのスペクトル中には存在しない。どちらの場合にも、アセチル化されたアミノ基中に存在する第１級アミド結合におけるＣ＝Ｏ由来のバンドが１６５０ｃｍ−１で観察される。
【００２５】
修飾されたキトサン（ＨＴＣＣ）の構造を１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを用いて更に確認した。１Ｈ  ＮＭＲ測定をＤ２ＯとＣＤ３ＣＯＯＤとの混合物中で実施した。修飾後のポリマーのスペクトルにおいて、第４級アミン窒素に結び付いたメチル基のプロトンの特徴である３．２ｐｐｍにバンドが現れた。未修飾キトサンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３に示し、ＨＴＣＣの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図４に示す。
【００２６】
例２．キトサン誘導体ＨＭ−ＨＴＣＣの合成
【００２７】
ＨＴＣＣ（グルコースユニット３ｍｍｏｌ、１ｇ）を、メタノールと１％酢酸溶液（ｐＨ＝５．５）との１：１比の混合物中に溶解した。メタノール２０ｍｌ中に、Ｎ−ドデシルアルデヒド０．３ｍｍｏｌ及びシアノ水素化｛すいそか｝ホウ素ナトリウム１．２５６８ｇ（２０ｍｍｏｌ）を溶解し、ＨＴＣＣ溶液に加えた。この反応混合物を、ゾルが形成されるまで２０℃で３６時間撹拌した。反応の終了後に、メタノールとジエチルエーテルの５０：５０ｖ／ｖ混合物を用いて、ポリマーを沈殿させた。沈殿したポリマーを、メタノールとエーテルで洗浄し、真空中で乾燥させた。得られた生成物（ＨＭ−ＨＴＣＣ）の構造を、その１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを測定することにより確認した。
【００２８】
例３．ヒトコロナウイルスＮＬ６３の例における、ポリマーＨＴＣＣ及びＨＭ−ＨＴＣの細胞毒性及びそれらの抗アルファコロナウイルス活性に関する研究
【００２９】
ポリマーＨＴＣＣ及びＨＭ−ＨＴＣＣの細胞毒性を、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスによる感染に感受性のＬＬＣ−ＭＫ２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７；アカゲザル腎の上皮細胞から誘導された細胞系）及びＡ５４９細胞（ヒト肺癌細胞から誘導されたＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５細胞系）を用いて研究した（ｖａｎ ｄｅｒ  Ｈｏｅｋ  Ｌ．等（２００４）．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １０：３６８−３７３；Ｓｃｈｉｌｄｇｅｎ  Ｏ．等（２００６）．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３８：２０７−２１０）。
【００３０】
細胞毒性を２つのアッセイを用いて測定した。先ず、ＸＴＴ染料（２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド）を着色されたホルマザン塩に還元するミトコンドリア酵素（コハク酸デヒドロゲナーゼ）の能力を基礎とする、比色テストを実施した。
【００３１】
細胞生存率と形成される染料の量との間には直接的相関関係があるため、この特別な染料に関する吸収極大に相当する波長で吸光度を測定することにより、細胞の状態を評価できる。細胞生存率の評価は、ニュートラルレッド染料を用いても実施した。
【００３２】
ニュートラルレッド（ＮＲ）は生細胞の細胞質内へ受動的に輸送されリソソーム中に蓄積する。生存細胞数及びその状態の分析はサンプルの比色評価により実施し、その後細胞溶解する。
【００３３】
研究において、ＬＬＣ−ＭＫ２又はＡ５４９細胞を、ＨＴＣＣ又はＨＭ−ＨＴＣＣポリマーの濃度を増加させながら、３％ウシ血清を添加したハンクス及びアール塩を有する最少必須培地(ＭＥＭ)中で６日間インキュベートした。この時間の後に、上記の２つの方法を用いて細胞毒性を評価した。更に、位相差顕微鏡を用いて、細胞形態におけるウイルス特異的変性の存在に関して細胞を試験した。結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
2015520755.tif 000003
【００３５】
行なわれた測定の結果は、細胞の形態学的変化の観察結果と一致した。手短に言うと、双方のポリマーのＣＣ50濃度は同じであった（ＬＬＣ−ＭＫ２細胞に関して〜２００μｇ／ｍｌ及びＡ５４９細胞に関して１００〜１５０ μｇ／ｍｌ）。
【００３６】
ＨＴＣＣ及びＨＭ−ＨＴＣＣポリマーによるヒトコロナウイルスＮＬ６３複製の抑制を評価した。実験は、増加する濃度のポリマーの存在下で感受性細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２）をＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスに感染させることにより行なった。実験の間、細胞を、３％ウシ血清を添加したハンクス及びアール塩を有するＭＥＭ培地中で培養した。
【００３７】
感染（細胞へのウイルス懸濁液の２時間インキュベーション）に続いて、培地を特定の濃度でＨＴＣＣ又はＨＭ−ＨＴＣＣポリマーを含むように交換した（ハンクス及びアール塩及び３％ウシ血清を有するＭＥＭ）。形態学的変化の評価を、位相差顕微鏡を用いて、感染の６日後に実施した。ＨＴＣＣポリマー（１０μｇ／ｍｌ）の存在下でウイルス複製の抑制が観察され、かつウイルス複製と関連した細胞変性効果は認められなかった。同様に、ＨＭ−ＨＴＣＣポリマー（５０μｇ／ｍｌ）の存在下でウイルス複製の抑制が観察され、かつ細胞変性効果は認められなかった(図５)。
【００３８】
一方、未修飾キトサンを用いた分析では、このポリマーによるＨＣｏＶ−ＮＬ６３複製の抑制は示されなかった。同様に、他のポリマー（例えばデキストラン又はＰＡＨ）のカチオン誘導体は、明確な抗コロナウイルス抑制活性を示さなかった。
【００３９】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の複製に対するＨＴＣＣ及びＨＭ−ＨＴＣＣポリマーの効果を、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを用いても分析した。この目的のために、既に記載された定量法を用いた（Ｐｙｒｃ Ｋ．等(２００６)、 Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５０： ２０００−２００８）。この研究において、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を、３％ウシ血清を添加したハンクス及びアール塩を有するＭＥＭ培地中で６日間インキュベートした。感染下で、ウイルス懸濁液で細胞を２時間インキュベーション後に、培地を除去し、細胞を滅菌リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ＨＴＣＣ又はＨＭ−ＨＴＣＣポリマーを特定の濃度で含む新たな培地（ハンクス及びアール塩、３％ウシ血清を有するＭＥＭ）で覆った。インキュベーション後に、全ＲＮＡを細胞の上澄みから単離し、続いて逆転写反応を定量ＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。
【００４０】
実験を、ポリマー濃度の増加に関して実施した。結果を図６及び７並びに表２に示す。ＨＴＣＣ及びＨＭ−ＨＴＣＣポリマーがＨＣｏＶ−ＮＬ６３複製の抑制をもたらす一方、対照サンプルにおいてはウイルスの複製が観察された。細胞毒性（ＣＣ50）及び抗ウイルス活性（ＩＣ50）に関するデータの分析により選択指数が推定でき、これも表２に含まれている。
【００４１】
ＨＴＣＣポリマーによる又はＨＭ−ＨＴＣＣポリマーによる濃度依存細胞毒性及びウイルス複製の抑制を説明するグラフを、図６及び図７にそれぞれ示す。
【００４２】
【表２】
2015520755.tif 000004
【００４３】
明らかに見て取ることができるように、ＨＴＣＣポリマーは、著しく低い濃度で活性を示し、その結果、より良好な選択指数を生じる。構造レベルで、ＨＴＣＣ及びＨＭ−ＨＴＣＣは、ＨＭ−ＨＴＣＣポリマーにのみ存在する疎水基に関する以外は同じである。従って、これらの基の付加がＨＴＣＣコアのアクセシビリティを制限するか、又はその特性を変更すると考えられる。
【００４４】
例４．完全に分化したヒト気道上皮（ＨＡＥ）培養物を利用した、ヒトコロナウイルスＮＬ６３の例でのポリマーＨＴＣＣ及びＨＭ−ＨＴＣＣの細胞毒性及びそれらの抗アルファコロナウイルス活性の研究
【００４５】
観察された抗アルファコロナウイルス効果が細胞特異的かどうかを決定するために、より自然な環境でポリマーの抑制活性を評価した；自然の誘導気管支上皮を真似たＨＡＥ培養物をこの目的のために使用した。ＨＡＥ培養物は、空気／液体中間相でのコラーゲン被覆プラスチック支持体上に成長する、多層の、完全に分化した第１ヒト気道上皮細胞によって形成される。手短に言うと、ヒト気管気管支上皮細胞をプラスチック上に広げ継代１（ｐａｓｓａｇｅ １）細胞を作成し、１ウェル当たり３×１０5細胞の密度で透過性トランスウェルインサート（直径６．５ｍｍ）支持体上で培養した。６〜８週間空気−液体界面を提供することによりヒト気道上皮（ＨＡＥ）培養物を産出して、生体内多列粘膜線毛上皮に類似する高分化型の極性培養物を形成させた。
【００４６】
先端面上への感染物質の接種により、ＨＡＥ培養物をＨＣｏＶ−ＮＬ６３に感染させた。３２℃で２時間インキュベーション後に、未結合ウイルスを１×ＰＢＳ洗浄（２回、それぞれ１００μｌ）により除去し、残りの実験の間ＨＡＥ培養物を空気−液体界面に保持した。更に、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３感染したＨＡＥ培養物及び偽感染したＨＡＥ培養物の先端面を、２４時間ごとに、所定の阻害剤を含有する培地１００μｌですすいだ。
【００４７】
細胞毒性を、ＸＴＴ染料（２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリド）を還元して着色ホルマザン塩を生じるミトコンドリア酵素（コハク酸デヒドロゲナーゼ）の能力を基礎とする比色試験を用いて測定した。
【００４８】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の複製を分析するために、感染の７２時間後に、１×ＰＢＳ１００μｌをＨＡＥの先端面に適用し、３２℃１０分のインキュベーション後に集めた。
【００４９】
ＨＡＥ培養物でのＨＴＣＣ及びＨＭ−ＨＴＣＣポリマーによるウイルス複製の抑制及びポリマーの細胞毒性（ＸＴＴアッセイにより測定）を示すグラフを、図８及び９にそれぞれ示す。
【００５０】
例５．マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）の例での、ポリマーＨＴＣＣ及びＨＭ−ＨＴＣＣの細胞毒性及びそれらの抗ベータコロナウイルス活性に関する研究
【００５１】
ＨＴＣＣ及びＨＭ−ＨＴＣＣポリマーの細胞毒性を、ＭＨＶウイルス感染に感受性のＬＲ７細胞で分析した（Ｋｕｏ  Ｌ．等（２０００）．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４：１３９３−１４０６；Ｒｏｓｓｅｎ  Ｊ．Ｗ. 等（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２４：３４５−３５１）。細胞毒性を、ＸＴＴ染料（２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリド）を還元して着色ホルマザン塩を生じるミトコンドリア酵素（コハク酸デヒドロゲナーゼ）の能力を基礎とする比色試験を用いて測定した。
【００５２】
細胞生存率と形成される染料の量との間には直接的相関関係があるため、この特定染料に関する吸収極大に相当する波長で吸光度を測定することにより、細胞の状態を評価できる。細胞生存率の評価は、ニュートラルレッド染料を用いても実施した。
【００５３】
この研究では、ＬＲ７細胞を、ＨＴＣＣ又はＨＭ−ＨＴＣＣポリマーの濃度を増加させながら、３％ウシ血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、４８時間インキュベートした。この時間の後に、細胞毒性を上記に従って評価した。更に、細胞を位相差顕微鏡を用いて形態学的変化に関して検査した。
【００５４】
得られた結果を表３に示す。
【００５５】
【表３】
2015520755.tif 000005
【００５６】
コロナウイルスＭＨＶ複製の抑制を、ＨＴＣＣ及びＨＭ−ＨＴＣＣポリマーの使用によって分析した。実験は、ポリマーの存在下で感受性細胞（ＬＲ７）をＭＨＶウイルスに感染させることにより行なった。アッセイの全期間にわたり、細胞を、３％ウシ血清を添加したＤＭＥＭ培地中に保持した。ウイルスとの細胞のインキュベーションの２時間後に、培地を除去し、細胞を滅菌リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ＨＴＣＣ又はＨＭ−ＨＴＣＣポリマーを含む新たな培地（３％ウシ血清を有するＤＭＥＭ）で覆った。
【００５７】
細胞を、形態学的変化に関して、位相差顕微鏡を用いて、感染の４８時間後に可視的に検査した(図１０)。ＭＨＶの複製に対するＨＴＣＣ及びＨＭ−ＨＴＣＣポリマーの影響を、リアルタイムでのＲＴ−ＰＣＲ分析による培地中のＲＮＡコピー数の計数を用いても分析した。定量法は、５´ＭＨＶ＿ＮＦ ＴＧＧ ＣＣＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＴＧ ＣＴＧ ＣＴＣ ＴＴＧ、３´ ＭＨＶ＿ＮＲ ＧＣＣ ＴＧＡ ＣＴＴ ＣＴＴ ＴＧＧ ＴＧＧ ＣＡＣ ＴＴＴ ＧＣＴプライマー及びＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ ＭＨＶ＿Ｎｐ ＴＴＴ ＧＧＣ ＴＡＡ ＧＣＴ ＣＧＧ ＴＡＡ ＡＧＡ ＴＧＣ ＣＧ蛍光プローブの使用により実施した。
【００５８】
反応は、既に記載されたのと同様の条件下で実施した(Ｐｙｒｃ Ｋ．等(２００６)Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５０： ２０００−２００８)。
【００５９】
実験を、ポリマー濃度の増加に関して実施した。結果を図１１及び１２並びに表３に示す。ＨＴＣＣ及びＨＭ−ＨＴＣＣポリマーがＭＨＶウイルス複製の抑制をもたらす一方、対照サンプルにおいてはウイルスの複製が観察された。
【００６０】
ＨＴＣＣポリマーによる又はＨＭ−ＨＴＣＣポリマーによる濃度依存的な細胞毒性及びウイルス複製の抑制を示すグラフを、図１１及び図１２にそれぞれ示す。
【００６１】
例６．ＨＴＣＣポリマーとＨＣｏＶ−ＮＬ６３ コロナウイルスのスパイクタンパク質（Ｓｅ−ＮＬ６３）との間の相互作用
【００６２】
Ｓｅ−ＮＬ６３とＨＴＣＣとの間の相互作用を研究するために、次の方法によりフルオレセインでポリマーをラベルした。ＨＴＣＣ１５０ｍｇを蒸留水５．０ｍｌとＤＭＳＯとの混合物中に溶解した。フルオレセインチオイソシアネート（ＦＩＴＣ）５ｍｇをアセトン１ｍｌ中に溶解し、この溶液をＨＴＣＣを含有するサンプルに加え、暗所で２４時間勢いよく混合した。続いて、ラベルされたポリマー（ＦＩＴＣ−ＨＴＣＣ）をアセトンで沈殿させ、それから４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより単離した。沈殿物をアセトンで洗浄し、水中に溶解し、水に対して２日間透析し更にアセトン：水混合物（１：４ｖ／ｖ）に対して１日透析し、それから凍結乾燥させた。ＨＴＣＣの１つのグルコース基当たりのＦＩＴＣ基の数として定義されるＦＩＴＣ−ＨＴＣＣの置換の割合は、ＵＶ−ＶＩＳスペクトルに基づき、１．６６％であることが分かった。
【００６３】
水中でのＦＩＴＣ−ＨＴＣＣの蛍光スペクトル（ｃFITC-HTCC ＝ ０．５ ｇ／ｍｌで）を、対照サンプル中と、濃度を増加させながらＳｅ−ＮＬ６３又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むサンプル中とで評価した。測定はλex ＝ ４９４ ｎｍを用いて行った。Ｓｅ−ＮＬ６３タンパク質及びサンプルの他の成分が、この励起波長で吸収しないこと及びＦＩＴＣ−ＨＴＣＣ蛍光強度を妨げないことが確証された。
【００６４】
ＨＩＴＣ−ＨＴＣＣの蛍光強度は、Ｓｅ−ＮＬ６３の濃度が増えるに従って明らかに減少した（図１３及び１４）。Ｓｅ−ＮＬ６３によるＦＩＴＣ−ＨＴＣＣ蛍光の顕著な消光は、Ｓｅ−ＮＬ６３とＦＩＴＣ−ＨＴＣＣとの間の強い相互作用（複合体形成又は結合）を示唆している。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下ではＦＩＴＣ−ＨＴＣＣの蛍光強度が減少しないことが観察されたが、このことは、ＢＳＡがＦＩＴＣ−ＨＴＣＣと相互に作用しないこと、従ってＳｅ−ＮＬ６３とＦＩＴＣ−ＨＴＣＣとの間の相互作用において何らかの特異性があることを示唆している。
【００６５】
０、１．０、２．０及び２．５ｇ／ｍｌのＳｅ−ＮＬ６３の存在下でのＦＩＴＣ−ＨＴＣＣの蛍光スペクトルを示すグラフ、及び〜λ＝５１３ｎｍでのＦＩＴＣ−ＨＴＣＣの相対蛍光強度（Ｉ／Ｉ0）のＳｅ−ＮＬ６３濃度依存性（λ〜ex ＝４９４ｎｍ、ｃFITC-HTCC ＝ ０．５ ｇ／ｍｌ）を示すグラフを、図１３及び図１４にそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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