(57)【要約】  サンプル中のアナライトを検出する方法であって、（ａ）前記サンプルとペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブとを接触させる工程と、（ｂ）前記サンプルに対して電気化学インピーダンス分光（ＥＩＳ）測定を実施する工程と、（ｃ）前記ＥＩＳ測定から前記アナライトの有無、量、及び同一性の少なくともいずれかを決定する工程とを含み、  前記アナライトが、核酸を含み、  前記サンプルを採取したときの前記サンプル中の前記アナライトの量が、前記サンプルを前記ＥＩＳ測定に付したときの前記サンプル中の前記アナライトの量と実質的に同じである方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のアナライトを検出する方法であって、
（ａ）前記サンプルとペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブとを接触させる工程と、
（ｂ）前記サンプルに対して電気化学インピーダンス分光（ＥＩＳ）測定を実施する工程と、
（ｃ）前記ＥＩＳ測定から前記アナライトの有無、量、及び同一性の少なくともいずれかを決定する工程と
を含み、
前記アナライトが、核酸を含み、
前記サンプルを採取したときの前記サンプル中のアナライトの量が、前記サンプルを前記ＥＩＳ測定に付したときの前記サンプル中の前記アナライトの量と実質的に同じであることを特徴とする方法。
【請求項２】
工程（ｂ）の前に、サンプルの増幅工程及び濃縮工程の少なくともいずれかを実施しない請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アナライトが、リボソームＲＮＡ及びゲノムＤＮＡの少なくともいずれかを含む請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
アナライトの核酸が、１，０００塩基（１ｋｂ）以上を含む請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）の前にＰＣＲ工程を実施しない請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）の前にＲＴＰＣＲ工程を実施しない請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）が、
（ｉ）アナライトに交流電圧を印加する工程と；
（ｉｉ）前記アナライトを横切るＥＩＳ測定値の変化率を決定する工程と；
（ｉｉｉ）前記変化率のデータから前記アナライトの有無、同一性、及び量の少なくともいずれかを決定する工程と
を含む請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＥＩＳ測定値が、電子移動抵抗Ｒｅｔの測定値である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＥＩＳ測定値が、ナイキストプロットにおける半円形の幅を見出すことから計算される測定値である請求項７から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｂ）が、
（ｉ）アナライトに交流電圧を印加する工程であって、前記交流電圧が、電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）によって前記アナライトの存在を識別するのに十分な複数の重畳周波数を含む工程と；
（ｉｉ）ＥＩＳデータから前記アナライトの有無、同一性、及び量の少なくともいずれかを決定する工程と
を含む請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＥＩＳデータが、複素インピーダンス（ｘ＋ｉｙ）に由来するデータパラメータを含み、前記パラメータが、
・実数成分（ｘ）
・虚数成分（ｙ）
・係数又は絶対値［ｒ＝｜ｚ｜＝（ｘ２＋ｙ２）１／２］
・角度［θ＝ｔａｎ−１（ｙ／ｘ）］
・主成分１
・主成分２
のうちの１以上から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
複数の周波数が、統計解析及び経験的方法の少なくともいずれかによって工程（ａ）の前に決定される請求項１０から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
重畳周波数の最低数が、２〜２０である請求項１０から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
重畳周波数の数が、少なくとも３〜１０である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
重畳周波数の数が、少なくとも７である請求項１０から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）が、ＥＩＳデータに対してフーリエ変換を実施する工程を含む請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ＥＩＳ測定のために系に電解質を添加する請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
電解質が、遷移金属錯体である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
遷移金属錯体が、［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−系を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＥＩＳ測定のために系において液体媒体を使用する請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
液体媒体が、酸性又は塩基性である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
２以上のアナライトを分析するための方法であって、各アナライトを１以上のラベルで標識して、前記ラベルによって互いに識別可能な標識アナライトを形成する工程を更に含む請求項１から２１に記載の方法。
【請求項２３】
１以上のラベルが、光学的検出及び電気的検出の少なくともいずれかに適している請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ラベルが、ナノ粒子、単一分子、化学発光酵素、及びフルオロフォアから選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ラベルが、分子及び原子の少なくともいずれかの集合体を含むナノ粒子である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ナノ粒子が、金属、金属ナノシェル、金属二元化合物、及び量子ドットから選択される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
光学的検出方法が、吸着された色素からの光学発光検出、吸光度検出、光散乱検出、スペクトルシフト検出、表面プラズモン共鳴撮像、及び表面増強ラマン散乱から選択される請求項２３から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
光学的検出が、光学発光検出であり、ラベルを励起することができる光を標識アナライトに照射し、前記ラベルからの発光の周波数及び強度を検出する工程を含む請求項２３から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
光が、レーザー光である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
光が、赤外光、可視光、及び紫外光から選択される請求項２８から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
光が、白色光である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＰＮＡプローブが、スペーサー部分及びＰＮＡ部分を含む請求項１から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
スペーサー部分が、表面にスペーサーを結合させるための末端基、アルキル基、エーテル基、及びカルボニル基から選択される２以上の基を含むか、
スペーサー部分が、骨格中に３以上の原子を含むか、又は
スペーサー部分が、表面にスペーサーを結合させるための末端基、アルキル基、エーテル基、及びカルボニル基から選択される２以上の基を含み、且つ骨格中に３以上の原子を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
スペーサー部分が、以下の式を含む請求項３２から３３のいずれかに記載の方法
【化１】
2015503095.tif 000012
（式中、Ｔは、表面に結合し得る末端基であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、各々独立して、有機基であり；ｗは、０又は１の整数であり；ｘは、０〜１５の整数であり；ｙは、０〜１５の整数であり；ｚは、０又は１の整数であり；ｎは、０〜１０の整数であり；ｍは、０〜１５の整数であり；［ｎ．ｍ＋ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚ］は、少なくとも３である）。
【請求項３５】
工程（ａ）の前に、サンプルをサンプル調製工程に付す工程を更に含み、前記サンプル調製工程が、核酸を断片化することを含み、好ましくは、前記サンプル調製工程が、サンプルの加熱及びサンプルの超音波処理の少なくともいずれかを含む請求項１から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
核酸配列の平均長さが、１，０００ｂｐ未満（ｂｐ＝塩基対）、８００ｂｐ未満、５００ｂｐ未満、２０ｂｐ以上、３０ｂｐ以上、４０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、６０ｂｐ以上、７０ｂｐ以上、８０ｂｐ以上、９０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、１１０ｂｐ以上、１２０ｂｐ以上、１３０ｂｐ以上、１４０ｂｐ以上、１５０ｂｐ以上、２０ｂｐ〜８００ｂｐ、３０ｂｐ〜６００ｂｐ、４０ｂｐ〜５００ｂｐ、５０ｂｐ〜４００ｂｐ、６０ｂｐ〜３５０ｂｐ、７０ｂｐ〜３００ｂｐ、８０ｂｐ〜２５０ｂｐ、９０ｂｐ〜２００ｂｐ、１００ｂｐ〜１８０ｂｐ、又は約１２０ｂｐになるように、サンプル調製工程でサンプル中の核酸を断片化する請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
核酸を含むサンプル中のアナライトを検出する方法であって、
（ａ）前記サンプルをサンプル調製工程に付して、核酸を断片化する工程と、
（ｂ）前記サンプルとペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブとを接触させる工程と、
（ｃ）前記サンプルに対して電気化学インピーダンス分光（ＥＩＳ）測定を実施する工程と、
（ｄ）前記ＥＩＳ測定からアナライトの有無、量、及び同一性の少なくともいずれかを決定する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
核酸が、長さ１，０００ｂｐ以上であり、例えば、大きな核酸、ｇＤＮＡ、又はｒＲＮＡである請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
サンプル調製工程が、サンプルの加熱及びサンプルの超音波処理の少なくともいずれかを含む請求項３７から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
得られる核酸配列の平均長さが、１，０００ｂｐ未満（ｂｐ＝塩基対）、８００ｂｐ未満、５００ｂｐ未満、２０ｂｐ以上、３０ｂｐ以上、４０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、６０ｂｐ以上、７０ｂｐ以上、８０ｂｐ以上、９０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、１１０ｂｐ以上、１２０ｂｐ以上、１３０ｂｐ以上、１４０ｂｐ以上、１５０ｂｐ以上、２０ｂｐ〜８００ｂｐ、３０ｂｐ〜６００ｂｐ、４０ｂｐ〜５００ｂｐ、５０ｂｐ〜４００ｂｐ、６０ｂｐ〜３５０ｂｐ、７０ｂｐ〜３００ｂｐ、８０ｂｐ〜２５０ｂｐ、９０ｂｐ〜２００ｂｐ、１００ｂｐ〜１８０ｂｐ、又は約１２０ｂｐになるように、サンプル調製工程で核酸を断片化する請求項３７から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
被験体の創傷における病原体を検出する方法であって、請求項１から４０のいずれかに記載の方法を実施することによって前記病原体に特徴的な核酸を検出することを含むことを特徴とする方法。
【請求項４２】
サンプルが、被験体の創傷から採取されたサンプルである請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
被験体が、ヒトである請求項４１から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
病原体が、治療耐性である病原体である請求項４１から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
病原体が、大腸菌及びＭＲＳＡから選択される請求項４１から４４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、向上した電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）技術を用いてアナライトを検出して、核酸アナライトに関するデータを得る方法に関する。この方法は、核酸アナライトを増幅する必要なしに実施することができるので有益である。このことから、手順が簡略化され、また、公知のアッセイ方法よりも迅速に行うことができる。したがって、結果取得時間（ＴＴＲ）を改善し、患者の身辺環境において行うかかるアッセイの開発を促進することができる。本方法は、創傷、具体的には、創傷に感染している病原体の分析において特に有益である。
【背景技術】
【０００２】
アナライトを検出する方法は、生化学的分析の分野において周知である。従来の方法では、アナライトを同定するために、通常、例えば蛍光検出によって検出することができる蛍光ラベルでアナライトを標識する。
【０００３】
過去数年間において、ＤＮＡ検出の分野では、ラベルとしてナノ粒子が用いられている。このラベルは、標識が可能であり且つ結合を伴う任意の系において機能する可能性があるので、タンパク質及び核酸に加えて生細胞系においても有用であり得る。ナノ粒子は、コスト、使用容易性、感度、及び選択性を含む従来の蛍光ラベルにおける数々の制約を克服することが見出されている（非特許文献１）。ナノ粒子は、光学的検出、電気的検出、電気化学的検出、及び重量測定検出を含む多数の異なるＤＮＡ検出法において使用されている（非特許文献１）。コロイド状金タグの電気化学的ストリッピング検出に基づくＤＮＡハイブリダイゼーションの検出では、金ナノ粒子が成功裏に使用されている（非特許文献２）。また、ＤＮＡハイブリダイゼーション試験用の蛍光ラベルとして、量子ドットとも呼ばれる半導体ナノ結晶及び金ナノ粒子が成功裏に使用されている（非特許文献３）。
【０００４】
ＤＮＡ検出法において従来の蛍光ラベルの代わりにナノ粒子を用いることの優位性が見出されているにもかかわらず、前記検出法の感度、選択性、及び特に速度を改善することが更に必要とされている。各検出法は、ある程度の感度及び選択性を有しているが、各々異なる制約があったり、様々な誤差が生じたり、また、特に短時間（例えば、約１０分間）で結果を出すことが望ましい患者の身辺環境において所望通り迅速ではなかったりする。
【０００５】
かかる方法に加えて、ナノ粒子標識は、ＤＮＡの検出において電気泳動と併用されている（特許文献１参照）。電気泳動は、電極表面における相補的プローブに対するＤＮＡの結合を加速させるために用いられる。この方法は、公知のアッセイ法よりも優れた速度及び感度を得ることができるので有利である。
【０００６】
これに加えて、患者の身辺環境における特にＤＮＡの安価且つ簡便な検出法の必要性が高まっている。コストを下げ、方法を簡略化し、検出速度を改善するために、標識を全く行わない方法が知られている。ラベルを使用しない検出法は上記のような利点を有するが、ラベルによって得られる検出の柔軟性及び感度を達成するのは困難である。
【０００７】
従来、ラベルを使用してアナライトに関するデータを得るための電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）技術とラベルを使用せずにアナライトに関するデータを得るためのＥＩＳ技術の両方が検討されている。以下の参照文献により、背景技術の詳細を提供する；
バイオセンシングに対するＥＩＳの応用の総説（非特許文献４）。
バイオセンシングに対するＥＩＳの応用の総説（非特許文献５）。
ＫＣｌ溶液中における様々な寸法のナノスケール電極のインピーダンススペクトルの特性評価（非特許文献６）。
酵素活性を検出するための交流インピーダンス及び分光法（非特許文献７）。
統合システムにおける交流インピーダンス及びＩＤＥ（非特許文献８）。
非特許文献９。
【０００８】
これから分かる通り、交流インピーダンス測定（電気化学インピーダンス分光法又はＥＩＳと呼ばれることも多い）は、通常、２つの電極間に振幅の小さな（〜１０ｍＶ）正弦波交流電圧摂動を印加し、交流周波数の関数として前記電極間に流れる電流を測定し、これから、周波数の関数としてインピーダンスを計算することを含む。かかるインピーダンススペクトルの変化により、特に櫛型マイクロ電極（ＩＭＥ）又は櫛型ナノ電極（ＩＮＥ）等の櫛型電極（ＩＤＥ）を用いるとき、電極上の特定の表面フィルムにおけるプローブ−ターゲット結合をラベルを使用せずに高感度で測定する方法が得られることが見出されている。しかし、これら測定は、通常、電極及び電極に結合しているプローブのいずれかに対するアナライトの結合の平衡に基づいているが、その理由は、前記平衡が、層において結合しているターゲットの量を決定するためである。したがって、ＥＩＳ応答は、平衡熱力学に従う。この手順は、測定前にプローブ−ターゲット結合を確実に完了させるために、長時間（数時間である場合が多い）且つ時に高温で平衡化させることを必要とする。このことから、迅速に結果を出すことができない。
【０００９】
これに加えて、ＩＤＥのインピーダンス応答は、理論的に考察されており、分析は、通常、電気化学的応答の変化を示す特徴的な物理的パラメータ（例えば、拡散係数、濃度、層の厚み）を抽出することができる等価電気回路素子（レジスタ、キャパシタ、ワールブルグ素子等）についてのパラメータを得るために広い周波数に亘る応答に適合する適切な電気等価回路を用いて実施される。更に、通常、各周波数における逐次測定が使用される。これら要因は、長い分析及び測定時間の原因となるので、これら要因が上述の比較的長い結果取得時間に加味される。
【００１０】
したがって、公知のＥＩＳ法、特にラベルを用いない方法は、通常、緩慢であり、本発明において必要とされる患者の身辺環境設定において使用するのに申し分のない結果取得時間が得られない。特許文献２には、ＥＩＳを用いる核酸の検出における核酸プローブの使用が開示されている。ＰＮＡプローブが好ましいが、ＤＮＡプローブを用いてもよい。サンプルを増幅しない代わりに、サンプル中のアナライトを濃縮することによってシグナルを増強する。この技術は、検出感度の向上に役立つが、濃縮工程は、通常長く、更に複雑な化学を必要とする。即ち、増幅工程と同じ問題点を有する。特に、結果取得時間が非常に重要である患者の身辺環境におけるアッセイには適していない。
【００１１】
特許文献３には、特に核酸を検出するためのバイオセンサが開示されている。前記バイオセンサは、通常、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡを検出するためにＰＮＡプローブを使用する。しかし、これも、ＥＩＳを用いて分析する前に増幅工程を使用する。したがって、本明細書に記載した他の公知の方法と同じ問題点を有する。
【００１２】
これまでに記載した関連技術の方法は全て、高感度ＥＩＳ及びラベルを用いない検出を使用する場合でさえも、検出の前にサンプル中の核酸の量を（濃縮又は増幅によって）増加させることが必要である。しかし、上述の通り、増幅技術等は、かなりの時間と余分な化学的及び物理的資源（反応材料、方法工程、装置等）とを必要とする。したがって、速度及び感度が重要である場合、核酸検出には独自の問題が提起される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２００９／１１２５３７号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１０／０１３３１１８号明細書
【特許文献３】国際公開第２００９／１２２１５９号パンフレット
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｆｒｉｔｚｓｃｈｅ  Ｗ，Ｔａｔｏｎ  Ｔ  Ａ，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４（２００３）Ｒ６３−Ｒ７３“Ｍｅｔａｌ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｌａｂｅｌｓ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ，ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”
【非特許文献２】Ｗａｎｇ  Ｊ，Ｘｕ  Ｄ，Ｋａｗｄｅ  Ａ，Ｐｏｓｌｋｙ  Ｒ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１），７３，５５７６−５５８１“Ｍｅｔａｌ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”
【非特許文献３】Ｗｅｓｔ  Ｊ，Ｈａｌａｓ  Ｎ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００３，５：２８５−２９２“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｓｅｎｓｉｎｇ，Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”
【非特許文献４】Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｊ．Ｓ．，Ｐｏｕｒｍａｎｄａ，Ｎ．，“Ｌａｂｅｌ−Ｆｒｅｅ  Ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ：Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ”，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，１９，２００７，１２３９−１２５７．
【非特許文献５】Ｋａｔｚ，Ｅ．，Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．，“Ｐｒｏｂｉｎｇ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｔ  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｂｙ  Ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｒｏｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｐｅｄｉｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｓ，ＤＮＡ−Ｓｅｎｓｏｒｓ，ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ”，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ  １５，２００３，９１３−９４７．
【非特許文献６】Ｌａｕｒｅｙｎ，Ｗ．，Ｖａｎ  Ｇｅｒｗｅｎ，Ｐ．，Ｓｕｌｓ，Ｊ．，Ｊａｃｏｂｓ，Ｐ．，Ｍａｅｓ，Ｇ．，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，１３，２００１，２０４−２１１．
【非特許文献７】Ｌａｕｒｅｙｎ，Ｗ．，Ｖａｎ  Ｇｅｒｗｅｎ，Ｐ．，Ｓｕｌｓ，Ｊ．，Ｊａｃｏｂｓ，Ｐ．，Ｍａｅｓ，Ｇ．，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，１３，２００１，２０４−２１１．
【非特許文献８】Ｚｏｕ，Ｚ．，Ｋａｉ，Ｊ．，Ｒｕｓｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｈａｎ，Ｊ．，Ａｈｎ，Ｃ．Ｈ．，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｎａｎｏ  ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ  ａｒｒａｙｓ  ｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｂｉｏ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｉｍｐｅｄｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．”Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｓ．Ａ，１３６，２００７，５１８−５２６．
【非特許文献９】“Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＮＡ／ＤＮＡ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ”，Ｊ  Ｌｉｕ，Ｓ．Ｔｉａｎ，Ｐ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｗ．Ｋｎｏｌｌ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００５，２９６９−２９７１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、上記関連技術に関連する問題を解決することにある。具体的には、本発明の目的は、感度及び選択性に優れ、速度及び結果取得時間が改善されており、安価で、且つ実施が容易である核酸アナライトの検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
したがって、本発明は、サンプル中のアナライトを検出する方法であって、
（ａ）前記サンプルとペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブとを接触させる工程と、
（ｂ）前記サンプルに対して電気化学インピーダンス分光（ＥＩＳ）測定を実施する工程と、
（ｃ）前記ＥＩＳ測定から前記アナライトの有無、量、及び同一性の少なくともいずれかを決定する工程と
を含み、
前記アナライトが、核酸を含み、前記サンプルを採取したときの前記サンプル中の前記アナライトの量及び濃度の少なくともいずれかが、前記サンプルを前記ＥＩＳ測定に付したときの前記サンプル中の前記アナライトの量及び濃度の少なくともいずれかと実質的に同じである方法を提供する。
【００１７】
幾つかの実施形態では、「サンプルを採取したときの前記サンプル中のアナライトの量及び濃度の少なくともいずれかが、前記サンプルをＥＩＳ測定に付したときの前記サンプル中のアナライトの量及び濃度の少なくともいずれかと実質的に同じである」とは、簡潔に述べると、核酸増幅工程を実施しないことを意味し得る。したがって、本発明は、サンプル中のアナライトを検出する方法であって、
（ａ）前記サンプルとペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブとを接触させる工程と、
（ｂ）前記サンプルに対して電気化学インピーダンス分光（ＥＩＳ）測定を実施する工程と、
（ｃ）前記ＥＩＳ測定から前記アナライトの有無、量、及び同一性の少なくともいずれかを決定する工程と
を含み、
前記アナライトが、核酸を含み、前記サンプルを前記ＥＩＳ測定に付す前に核酸増幅工程を実施しない方法を提供する。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、サンプル中の核酸を含むアナライトを検出する方法であって、
（ａ）前記サンプルをサンプル調製工程に付して、核酸を断片化する工程と、
（ｂ）前記サンプルとペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブとを接触させる工程と、
（ｃ）前記サンプルに対して電気化学インピーダンス分光（ＥＩＳ）測定を実施する工程と、
（ｄ）前記ＥＩＳ測定から前記アナライトの有無、量、及び同一性の少なくともいずれかを決定する工程と
を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
添付図面を参照して本発明を更に詳細に説明する。
【図１】図１は、マクロ金電極（小さなＺ値）及び櫛型マイクロ（ＩＭＥ）電極から得られたＥＩＳデータの典型的なナイキストプロットを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、マクロ電極におけるポジティブコントロール及び固定化プローブについてのデータに関する、周波数に対する実数成分（ｘ）及び角度（θ）のプロットを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、マクロ電極におけるポジティブコントロール及び固定化プローブについてのデータに関する、周波数に対する虚数成分（ｙ）及び主成分１のプロットを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、マクロ電極におけるポジティブコントロール及び固定化プローブについてのデータに関する、周波数に対する係数（ｒ）、及び主成分２のプロットを示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、櫛型電極におけるポジティブコントロール及び固定化プローブについてのデータに関する、周波数に対する実数成分（ｘ）及び角度（θ）のプロットを示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、櫛型電極におけるポジティブコントロール及び固定化プローブについてのデータに関する、周波数に対する虚数成分（ｙ）及び主成分１のプロットを示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、櫛型電極におけるポジティブコントロール及び固定化プローブについてのデータに関する、周波数に対する係数（ｒ）、及び主成分２のプロットを示す。
【図３】図３は、約２３秒間の同時ＦＦＴ分析を用いた正常単一正弦波逐次ＥＩＳ測定から得られた金タンパク質マクロ電極（６，７００ｐＭ抗体）のＥＩＳ応答を示す（黒−２分間に亘る記録時間；赤−９秒間に亘る５個の多重正弦波のＥＩＳ測定；青−９秒間毎の１５個の多重正弦波のＥＩＳ測定）。
【図４】図４は、６９ｍｅｒのＨＣＶ  ＤＮＡプローブを備え、１ｍＭのＭＣＨでブロッキングされた修飾金電極（菱形）及び１μＭの相補的ターゲット（ＩＴＩ０２５）とのハイブリダイゼーション（四角形）のナイキストプロットの比較を示す。インピーダンス測定は、ＩＤＥ対における電極間の印加電位を０Ｖにして１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−及び１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−（＋プローブ又はターゲット）を含有する２×ＳＳＣ中で実施した。
【図５】図５は、６９ｍｅｒのＨＣＶ  ＤＮＡプローブを備え、１ｍＭのＭＣＨでブロッキングされた修飾金電極（菱形）、１μＭの非相補的ターゲット（ＩＴＩ０１２）とのハイブリダイゼーション（四角形）、１ｎＭの相補的ターゲット（ＩＴＩ０２５）とのハイブリダイゼーション（三角形）、及び５０ｎＭの相補的ターゲットとのハイブリダイゼーション（円形）のナイキストプロットの比較を示す。インピーダンス測定は、ＩＤＥ対における電極間の印加電位を０Ｖにして１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−及び１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−（＋プローブ又はターゲット）を含有する２×ＳＳＣ中で実施した。
【図６】図６は、プローブ（チオール−ＤＮＡ）層形成中（菱形）、ＭＣＨによるブロッキング後（四角形）、１μＭの相補的ターゲットとのハイブリダイゼーション中（三角形）、及びハイブリダイゼーション後の洗浄（円形）における時間対ＲｅｔのＥＩＳ測定値を示す。
【図７】図７は、相補的ターゲット（５０ｎＭ）結合及び２０ｎＭのＱＤインキュベーションのＥＩＳ測定後の蛍光測定を示す；ＰＭＴ設定１８０。
【図８】図８は、４つのデバイスチップ、アラインメントマスク、及びリフトオフ処理を加速させるためのダミー金属線を含む金櫛型マイクロ電極構造のマスクレイアウトを示す。各電極のディジット数（Ｎ）は、好ましくは、５〜１０である。各ディジットの長さ（Ｌ）は、好ましくは、７５μｍ〜１５０μｍである。各ディジットの幅（Ｗ）及び各ディジット間のギャップの幅（Ｇ）は、各々好ましくは、１．５μｍ〜１０μｍであり、ＷとＧとは、好ましくは同じである。
【図９】図９は、１μＭのターゲットとのハイブリダイゼーション前及び後のＤＮＡプローブによるＥＩＳ応答（電子移動抵抗値（Ｒｃｔ））を示す。
【図１０】図１０は、１μＭのターゲットとのハイブリダイゼーション前及び後のＰＮＡプローブによるＥＩＳ応答（Ｒｃｔ）を示す。ＰＮＡプローブとＤＮＡプローブとの感度の大きな差は、ＰＮＡが、ＤＮＡ分子とは異なり負帯電リン酸骨格を有しない中性分子であることに起因する。負帯電核酸ターゲットのハイブリダイゼーションにより、電極表面の全体的な電荷が大きく変化する。これにより、ファラデーＥＩＳ検出に用いられる負帯電電気活性種（フェリシアニド／フェロシアニド）の大きな反発作用が生じ、延いては、電子移動抵抗値（Ｒｃｔ）を大きく増加させる。
【図１１】図１１は、予め増幅することなしに様々な濃度の大腸菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡとハイブリダイズさせた大腸菌特異的ＰＮＡプローブ（Ｐ５１）を用いた、インピーダンスにより大腸菌の種を同定するための用量反応曲線を示す。
【図１２】図１２は、様々な量のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細胞（１０５細胞〜１０８細胞／ｍＬ偽創傷液（ＭＷＦ））に加えて、コントロールとしてＭＷＦに添加した１０８細胞／ｍＬメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）及びバッファコントロールのインキュベーション物（２×ＳＳＣ）から抽出したゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーション前及び後のＥＩＳ応答（電子移動抵抗値（Ｒｃｔ））を示す。
【図１３】図１３は、ＭＲＳＡから回収したＤＮＡテンプレートを用いて実施した試験から得られたｑＰＣＲの結果を示す。プロットは、ＷＦ由来の濃度（細胞／ｍＬ）対サイクル閾値を示す。
【図１４】図１４は、創傷液中１０８細胞／ｍＬのＭＲＳＡから抽出したときのｇＤＮＡ収量の変動を示すｑＰＣＲデータを示す。
【図１５】図１５は、（Ａ）プロトタイプポテンシオスタットの画像及び（Ｂ）２３ｂｐの完全に相補的なオリゴヌクレオチド（１μＭ）を導入する前と導入した１０分間後のナイキストプロットを示す。
【図１６】図１６は、各々０分間、１分間、及び５分間９５℃で熱処理した後のＭＲＳＡ  ｇＤＮＡのバイオアナライザーデータを示す。
【図１７】図１７は、熱処理無し、９５℃で１分間熱処理後、及び９５℃で５分間熱処理後のＭＲＳＡサンプルのアガロースゲル電気泳動を示す。
【図１８】図１８は、１０７細胞／ｍＬの懸濁液から抽出したＭＲＳＡ  ｇＤＮＡとのハイブリダイゼーション前及び後のＰＮＡ修飾金電極において行ったＥＩＳ測定のナイキストプロットを示す。ランドルズ回路−ＲＳ＝溶液抵抗、ＣＤＬ＝二重層キャパシタンス、ＲＣＴ＝電荷移動抵抗、及びＺＷ＝ワールブルグ拡散素子。
【図１９】図１９は、４つの異なるスペーサーを含有するプローブを用いた１０７細胞／ｍＬの濃度の細胞の懸濁液から抽出したＭＲＳＡのゲノムＤＮＡのインキュベーションに応答したシグナル増加比を示す。ｎ＝３であり、エラーバー＝標準偏差である。
【図２０】図２０は、ＥＩＳシグナルに対するターゲットサイズの影響を示す。（Ａ）抽出したＭＲＳＡ  ｇＤＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ分析。（Ｂ）ＤＮＡ１２０００キットを用いて２×ＳＳＣ中で５分間９５℃にてＭＲＳＡ  ｇＤＮＡをインキュベートしたときに観察可能なＤＮＡの断片化のＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ分析。（Ｃ）０分間、１分間、又は５分間２×ＳＳＣ中で９５℃にて変性させた後のＭＲＳＡ  ｇＤＮＡとのインキュベーションに対するＥＩＳ応答。ｎ＝３であり、エラーバー＝標準偏差である。
【図２１】図２１は、（Ａ）ＭＲＳＡのゲノムＤＮＡについての用量反応曲線（ｎ＝５であり、エラーバー＝標準偏差であり、線＝０ＭＲＳＡ細胞／ｍＬ＋３×標準偏差である）；並びに（Ｂ）ＭＳＳＡ、大腸菌、及びＭＲＳＡの特異的及び非特異的なシグナル変化（ｎ＝３であり、エラーバー＝標準偏差である）を示す。
【図２２】図２２は、ヒト創傷液に添加したＭＲＳＡ細胞及び未接種ヒト創傷液から抽出したｇＤＮＡと共にインキュベートすることによって生じたシグナル増加比を示す。シグナル増加比は、サンプル添加１０分間後に測定し、ｎ＝３であり、エラーバー＝標準偏差である。
【図２３】図２３は、１０６細胞／ｍＬの細胞の懸濁液から抽出した後ＭＲＳＡ及び大腸菌のｇＤＮＡに曝露した後のセンサ挙動を示す。ｎ＝３であり、エラーバー＝標準偏差である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
通常、サンプル調製工程は、核酸を断片化するためにサンプルを加熱、超音波処理、又は制限酵素処理することを含む。通常、加熱又は超音波処理は、制限酵素処理の場合に必要となる時間、費用、及び余分な試薬を回避するために使用される。好ましい実施形態では、得られる核酸配列の平均長さ又は最低長さが、１，０００ｂｐ以下（ｂｐ＝塩基対）、９００ｂｐ以下、８００ｂｐ以下、７００ｂｐ以下、６００ｂｐ以下、５００ｂｐ以下、２０ｂｐ以上、３０ｂｐ以上、４０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、６０ｂｐ以上、７０ｂｐ以上、８０ｂｐ以上、９０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、１１０ｂｐ以上、１２０ｂｐ以上、１３０ｂｐ以上、１４０ｂｐ以上、又は１５０ｂｐ以上、２０ｂｐ〜１，０００ｂｐ、３０ｂｐ〜９００ｂｐ、４０ｂｐ〜８００ｂｐ、５０ｂｐ〜７００ｂｐ、６０ｂｐ〜６００ｂｐ、７０ｂｐ〜６００ｂｐ、８０ｂｐ〜６００ｂｐ、９０ｂｐ〜６００ｂｐ、１００ｂｐ〜６００ｂｐ、１００ｂｐ〜５００ｂｐ、１００ｂｐ〜４００ｂｐ、１００ｂｐ〜３００ｂｐ、１１０ｂｐ〜２００ｂｐ、及び約１２０ｂｐになるように加熱又は他の方法で核酸を断片化することによってサンプルを調製する。この実施形態では、通常、サンプルを採取したときの前記サンプル中のアナライトの量及び濃度の少なくともいずれかは、前記サンプルをＥＩＳ測定に付したときの前記サンプル中のアナライトの量及び濃度の少なくともいずれかと実質的に同じである。これは、通常、核酸増幅工程を実施しないことを意味する。
【００２１】
本発明のこの態様では、サンプル調製工程において実施される処理は、核酸を断片化する限り特に限定されない。通常、この処理により、核酸配列の平均長さ又は最低長さが上記好ましい範囲内に入る。限定するものではないが、通常、前記処理は、核酸を断片化する加熱工程である。これは、サンプルが、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）又はリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）等の大きな核酸を含む場合に特に好ましい。通常、かかる大きな核酸を加熱すると、１，０００ｂｐ以下の配列に断片化される。通常のＰＣＲは、通常、核酸を加熱して変性する（複製するために二本鎖核酸を一本鎖核酸に変換する）ことを含むが、これは、ＤＮＡサンプルの分解を防ぐために断片化を回避することを目的とする。このことは、“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｇｅｎｅ．，１９９３，１２３（２），ｐｐ２４１−４において確認され、この論文においてＧｕｓｔａｆｓｏｎ等は、
ＰＣＲ反応の開始前に多く使用されるのだが、ｐＨ７．０〜８．０で１分間〜７分間という長時間に亘ってテンプレートＤＮＡを変性させることにより、テンプレートが著しく分解されることが示された。これにより、５００ｂｐ超のＰＣＲ産物の収率が、最大９９％と著しく低下する場合がある。．．．この産物収率の低下は、増幅前変性（ＰＡＤ）の結果テンプレート又はターゲットＤＮＡの分解が増加したことに起因している可能性がある。したがって、ＤＮＡの大きな断片を増幅する場合、テンプレート溶液の出発ｐＨにかかわらず、テンプレートＤＮＡをＰＣＲ反応前にＰＡＤに付すべきではないことが推奨される。
と述べている。
【００２２】
したがって、ゲノムＤＮＡ等の大きな核酸を処理するとき、重大な問題が発生するので、断片化を引き起こす処理（熱処理等）は避けられていた。しかし、本発明者らは、驚くべきことに、本方法では断片化が分析結果に悪影響を与えるのではなく望ましいことを見出した。即ち、本発明者らは、断片化がＥＩＳシグナルを改善し得るので、ＰＣＲ等によってアナライトを増幅する必要を完全になくすことが有用であることを見出した。
【００２３】
使用される加熱時間の長さ及び温度は、試験されるサンプルの性質に依存し、また、サンプルを取り囲む媒体の化学的性質（ｐＨ、バッファ、塩、触媒の存在等）にも依存する。これらは、適切に断片化される限り、特に限定されない。通常、１０秒間〜１時間が使用され、好ましくは、３０秒間〜３０分間、１分間〜２０分間、２分間〜１５分間、及び３分間〜１０分間である。通常、約５分間が好ましい。温度は、通常、６０℃〜１００℃、７０℃〜９９℃、８０℃〜９９℃、９０℃〜９９℃であり、通常、約９５℃である。
【００２４】
図２０から、２×ＳＳＣ中にて９５℃で５分間ゲノムＤＮＡを変性させると、同時にＤＮＡの断片化も増加し、インピーダンスシグナルも増加することが分かる。ＤＮＡ断片化の役割は、ハイブリダイゼーション時間の長いガラスマイクロアレイについては評価されているが、インピーダンス検出のためのゲノムＤＮＡの結合については未だ調べられていない。上で強調した通り、９５℃等の高温でＤＮＡをインキュベートすることにより、長いＤＮＡ鎖が断片化され、ＰＣＲ効率が低下することが知られている。熱によるＤＮＡの断片化によって、８００ｂｐ未満の鎖が生じることが示されている。理論に縛られるものではないが、９５℃で５分間ＤＮＡをインキュベートした後にＥＩＳシグナルが最も大きくなったのは、より短い断片の方が、電極表面に近接して存在するプローブ配列に対してより多く接近し結合することができたのだと説明するのが最も妥当である。核酸のハイブリダイゼーションをＥＩＳに基づいて計測する場合、断片サイズとシグナル増加との間にトレードオフが存在する。より長い断片の方が、溶液中のレドックスプローブに対する静電的効果が増加するため、また、センシング層を介したトンネル電流をより多くブロックすることにより、シグナルをより多く増加させるはずである。しかし、長い断片のハイブリダイゼーション効率は、電極表面における立体障害効果及び二次構造が形成される可能性によって低下する。本明細書に記載する実施例では、ターゲットの断片化時間についてのデータから、プローブ長さと断片長さとＥＩＳシグナルとの間にこの関係が存在することが示される。断片化に関するデータは、長さ約１２０ｂｐのターゲット鎖が、ＥＩＳシグナル増加に寄与し、延いては、増幅なしに核酸を検出するのに役立ち得ることを示唆している。これとは対照的に、ＥＩＳに基づく核酸検出に関する文献の多くは、短い（２０ｂｐ）人工オリゴヌクレオチドを用いて得られる結果について報告している。
【００２５】
本発明において、幾つかの実施形態では、通常、例えば、増幅を避けたり、アナライトを濃縮するように複数のサンプルを合わせたりするのを避けたり、例えば液体媒体を除去することによってサンプルを濃縮するのを避けたりして、サンプル中のアナライトの量又は濃度を増加させることなしにサンプルをＥＩＳに付す。したがって、サンプルを採取したときの前記サンプル中のアナライトの量及び濃度の少なくともいずれかは、前記サンプルをＥＩＳ工程に付したときの前記サンプル中のアナライトの量及び濃度の少なくともいずれかと実質的に同じである。この場合、量又は濃度は、絶対的に同一である必要はなく、実際、標準的なサンプル調製技術は、時に、量又は濃度を多少変化させることがあるので、量又は濃度を絶対的に同一にすることが常に可能である訳ではない。したがって、同じであるとは、核酸をアッセイするための標準的なサンプル調製技術を許容できる程度に同じであることを意味する。かかる標準的なサンプル調製技術は、細胞の溶解、サンプルの洗浄等を含んでいてもよい。（例えば、アッセイに干渉する可能性のある種をサンプルから除去する場合等）濃縮又は増幅を引き起こさない限り、多少の精製を行ってもよい。幾つかの実施形態では、サンプルは、サンプル調製物を殆ど又は全く含まない粗形態でＰＮＡプローブに導入してよい。
【００２６】
したがって、幾つかの実施形態では、本発明は、ＥＩＳ測定前に増幅工程も濃縮工程も使用しない。したがって、これら実施形態では、関連技術の方法とは異なり、ＰＣＲ工程もＲＴＰＣＲ工程も使用しない。
【００２７】
アナライトは、核酸である限り、特に限定されない。任意の核酸を分析することができるが、典型的な実施形態では、核酸アナライトは、リボソームＲＮＡ及びゲノムＤＮＡ（ｒＲＮＡ及びｇＤＮＡ）の少なくともいずれか等の大きな核酸を含む。アナライトは、強いＥＩＳシグナルをもたらす種類であることが特に好ましい。したがって、幾つかの実施形態では、アナライト核酸は、１，０００（１ｋｂ）以上、より好ましくは１０ｋｂ以上、１００ｋｂ以上、１Ｍｂ以上、及び５Ｍｂ以上の塩基を含む。上述の通り、通常、ゲノムＤＮＡは、処理を補助するために断片化したり、より小さな断片に切断したりしてよい。したがって、ｇＤＮＡアナライトは、幾つかの実施形態では、１Ｍｂ以上、２Ｍｂ以上、３Ｍｂ以上、４Ｍｂ以上、又は５Ｍｂ以上のサイズであってよい。リボソームＲＮＡは、より多くのコピーが存在するので、ゲノムＤＮＡに比べてサイズが小さい場合があり、このことから、よりよいＥＩＳシグナルが得られる。通常、ｒＲＮＡアナライトは、１．０ｋｂ以上、１．１ｋｂ以上、１．２ｋｂ以上、１．３ｋｂ以上、１．４ｋｂ以上、又は１．５ｋｂ以上であってよい。或いは、ｒＲＮＡアナライトは、１．６ｋｂ以上、１．７ｋｂ以上、１．８ｋｂ以上、１．９ｋｂ以上、２．０ｋｂ以上、又は２．５ｋｂ以上であってよい。更に、ｒＲＮＡアナライトは、３．０ｋｂ以上、３．５ｋｂ以上、４．０ｋｂ以上、又は４．５ｋｂ以上であってもよい。上述の通り、核酸配列の平均長さが２０ｂｐ以上、３０ｂｐ以上、４０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、６０ｂｐ以上、７０ｂｐ以上、８０ｂｐ以上、９０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、１１０ｂｐ以上、１２０ｂｐ以上、１３０ｂｐ以上、１４０ｂｐ以上、又は１５０ｂｐ以上になるようにサンプルを処理することが更に好ましい。通常、処理後の核酸配列の平均長さは、１，０００ｂｐ以下、９００ｂｐ以下、８００ｂｐ以下、７００ｂｐ以下、６００ｂｐ以下、又は５００ｂｐ以下になるので、好ましい長さは、３０ｂｐ〜１，０００ｂｐ、４０ｂｐ〜９００ｂｐ、５０ｂｐ〜８００ｂｐ、５５ｂｐ〜６００ｂｐ、６０ｂｐ〜５００ｂｐ、７０ｂｐ〜４００ｂｐ、８０ｂｐ〜３００ｂｐ、９０ｂｐ〜２００ｂｐ、９０ｂｐ〜１８０ｂｐ、９０ｂｐ〜１５０ｂｐ、１００ｂｐ〜１４０ｂｐ、１１０ｂｐ〜１３０ｂｐ、及び約１２０ｂｐである。
【００２８】
ＰＮＡプローブは、対象アナライトの検出に適していれば、特に限定されない。ＥＩＳにおける検出感度を改善することができるので、ＰＮＡプローブが望ましい（図９及び図１０を参照されたい）。好適なＰＮＡプローブは、ターゲットアナライトに結合するように選択される。
【００２９】
限定されるものではないが、ＰＮＡプローブは、通常スペーサーを更に含むので、プローブは、スペーサー部分とＰＮＡ部分とを含む。スペーサー部分は、電極の表面から離れてプローブのＰＮＡ部分を持ち上げるために電極表面に優先的に結合することを目的とする。これにより、ＰＮＡプローブのハイブリダイゼーション効率を改善することができる。
【００３０】
スペーサーの性質は、ＰＮＡのハイブリダイゼーション効率に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。しかし、幾つかの実施形態では、スペーサーは、以下の基のうちの１以上を含む有機分子を含んでよい：表面に結合し得る末端基、好ましくは、末端アミン基（一級アミン基、二級アミン基、又は三級アミン基であってよい）、末端ヒドロキシ基、又は末端チオール基；アルカン基；アルケン基；アルキン基；エーテル基；及びカルボニル基。スペーサー基の骨格における原子（電極とＰＮＡ部分との間に直接配置される原子）の数は、ハイブリダイゼーション効率を改善するのに十分なスペースが得られる限り、特に限定されない。典型的な実施形態では、骨格中に３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、又は１２以上の原子が存在し得る。より典型的には、骨格中に５個〜３０個、又は６個〜２５個、又は７個〜２４個、又は８個〜２３個の原子が存在し得る。より典型的には、骨格中の原子の数は、９個〜２３個、１０個〜２３個、３個〜１８個、５個〜１５個、５個〜１３個、又は５個〜１０個であってよい。
【００３１】
好ましいスペーサーの例としては、以下の式を有する化合物が挙げられる：
【化１】
2015503095.tif 000002
（式中、Ｔは、表面に結合し得る末端基であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、各々独立して、有機基であり；ｗは、０又は１の整数であり；ｘは、０〜１５の整数であり；ｙは、０〜１５の整数であり；ｚは、０又は１の整数であり；ｎは、０〜１０の整数であり；ｍは、０〜１５の整数であり；［ｎ．ｍ＋ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚ］は、少なくとも３の整数である。式中、スペーサーの骨格中の原子数は、ｗ、ｘ、ｙ、ｚ、ｎによって決定され、単に［ｎ．ｍ＋ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚ］である）。
【００３２】
電極表面等の表面にプローブのスペーサー部分を結合させることができる基であれば、Ｔは、特に限定されない。しかし、通常、Ｔは、以下の基から選択される：−ＮＨ２、−ＮＨＲ７、−ＮＲ７Ｒ８、−ＳＨ、−ＳＲ９、−ＯＨ、−ＯＲ１０。
【００３３】
幾つかの実施形態では、スペーサーは、上記式中のｘが０である以下の式を有し得る：
【化２】
2015503095.tif 000003
（式中、変数は全て、既に定義したのと同じ意味を有する）。
【００３４】
通常、スペーサーは、以下の式のうちの任意の１つを有する任意の化合物であってよい：
【化３】
2015503095.tif 000004
（式中、全ての変数は、上に定義したのと同じ意味を有し、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、各々独立して、有機基である）。
【００３５】
上述の通り、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、各々独立して、有機基である。本発明に関連して記載する全ての実施形態では、上記及び下記のいずれにおいても、有機基は、特に限定されず、任意の官能基又は任意の原子、特に、Ｈ原子を含む有機化学において一般的な任意の官能基又は原子であってよい。したがって、有機基は、以下の意味のうちのいずれを有していてよい。有機基は、Ｂ、Ｓｉ、Ｎ、Ｐ、Ｏ、又はＳ原子等の周期律表の第ＩＩＩＡ族、第ＩＶＡ族、第ＶＡ族、第ＶＩＡ族、又は第ＶＩＩＡ族のうちのいずれかにおける１以上の原子（例えば、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ，ＮＲ２、ＳＨ、ＳＲ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４Ｈ２等）、或いはハロゲン原子（例えば、Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ、又はＩ）を含んでいてよい（式中、Ｒは、低級炭化水素（炭素原子数１〜６）又は高級炭化水素（炭素原子数７以上、例えば、炭素原子数７〜４０）である）。
【００３６】
有機基は、炭化水素基を含むことが好ましい。炭化水素基は、直鎖、分岐鎖、又は環状基を含んでいてよい。炭化水素基は、独立して、脂肪族基又は芳香族基を含んでいてよい。また、炭化水素基は、独立して、飽和基又は不飽和基を含んでいてよい。
【００３７】
炭化水素が不飽和基を含む場合、１以上のアルケン官能基及び１以上のアルキン官能基の少なくともいずれかを含んでいてよい。炭化水素が直鎖基又は分岐鎖基を含む場合、１以上の一級、二級、及び／又は三級のアルキル基を含んでいてよい。炭化水素が環状基を含む場合、芳香環基、脂環式基、複素環式基、及び／これら基の縮合環誘導体の少なくともいずれかを含んでいてよい。したがって、環状基は、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、インデン、フルオレン、ピリジン、キノリン、チオフェン、ベンゾチオフェン、フラン、ベンゾフラン、ピロール、インドール、イミダゾール、チアゾール、及び／又はオキサゾール基に加えて、上記基の位置異性体を含んでいてよい。
【００３８】
炭化水素基中の炭素原子数は、特に限定されないが、好ましくは、炭化水素は、１個〜４０個の炭素原子を含む。したがって、炭化水素基は、低級炭化水素（炭素原子数１〜６）又は高級炭化水素（炭素原子数７以上、例えば、炭素原子数７〜４０）であってよい。低級炭化水素基は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、若しくはヘキシル基、又はこれらの位置異性体（例えば、イソプロピル、イソブチル、ｔ−ブチル等）であってよい。環状基の環中の原子数は、特に限定されないが、好ましくは、環状基の環は、３個〜１０個、例えば３個、４個、５個、６個、又は７個の原子を含む。
【００３９】
上記ヘテロ原子に加えて上に定義した他の基のうちのいずれかを含む基は、Ｂ、Ｓｉ、Ｎ、Ｐ、Ｏ、又はＳ原子等の周期律表の第ＩＩＩＡ族、第ＩＶＡ族、第ＶＡ族、第ＶＩＡ族、又は第ＶＩＩＡ族のうちのいずれかにおける１以上のヘテロ原子、或いはハロゲン原子（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）を含んでいてよい。したがって、有機基は、有機化学において一般的な官能基のいずれか、例えば、ヒドロキシ基、カルボン酸基、エステル基、エーテル基、アルデヒド基、ケトン基、アミン基、アミド基、イミン基、チオール基、チオエーテル基、硫酸基、スルホン酸基、及びリン酸基等のうちの１以上を含んでいてよい。また、有機基は、カルボン酸アルデヒド及びカルボン酸ハロゲン化物等、これら基の誘導体を含んでいてもよい。
【００４０】
更に、任意の有機基は、上に定義した有機基及び／又は官能基のうちの２以上の組み合わせを含んでいてもよい。
【００４１】
幾つかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は全て、低級アルキル基であり、最も典型的には、全てＨ原子である。
【００４２】
典型的に、ｘ＋ｙは、１以上である。典型的に、ｗは１である。典型的に、ｚは１である。最も典型的には、ｗ及びｚの両方が１である。
【００４３】
典型的に、ｎ及びｍの倍数は、（［ｎ．ｍ＋ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚ］の値の制御の一部として）数が上述の通りになるように骨格中の原子数を好ましい数にするために制御される。通常、ｎは、１〜３の整数であり、最も典型的には、ｎは２である。幾つかの実施形態では、ｍは、１〜５の整数であり、最も典型的には、ｍは２又は３である。
【００４４】
幾つかのより典型的なスペーサーは、以下の式の化合物から選択される（式中、ｗ＝１、ｎ＝２、ｙ＝１、ｚ＝１であり、好ましくはｘ＝０である）：
【化４】
2015503095.tif 000005
（式中、変数は、既に定義したのと同じ意味を有し；ｍは、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、又は１〜３の整数であり、例えば、ｍは、１、２、３、４、５、６、又は７であり；ｘは、１〜１５、１〜１３、１〜１１、３〜１５、３〜１３、３〜１１、５〜１５、５〜１３、又は５〜１１の整数であり；Ｒ３及びＲ３’は、同じであっても異なっていてもよく、Ｒ４及びＲ４’は、同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、Ｒ３及びＲ３’は、同じであり、Ｒ４及びＲ４’も、同じである。より好ましくは、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４、及びＲ４’は、全て同じである。通常、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４、及びＲ４’は、全てＨである）。
【００４５】
殆どの実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１０は全て、低級アルキル基又はＨであり、最も典型的な実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１０は全て、Ｈ原子である。最も好ましいスペーサーの一部は、以下の式を有する：
【化５】
2015503095.tif 000006
（各々、骨格中に７個、９個、１２個、及び２３個の原子を有する）。
【００４６】
上記全ての式中、波線は、スペーサーとＰＮＡとの結合を表す。通常、スペーサーは、末端基を介して電極表面に結合する。
【００４７】
ＥＩＳ法は、アナライトの有無、同一性、及び量の少なくともいずれかを決定するのに十分である限り、特に限定されない。しかし、好ましくは、ＥＩＳ工程は、以下の小工程を含む：
ｉ）アナライトに交流電圧を印加する工程であって、前記交流電圧が、電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）によって前記アナライトの存在を識別するのに十分な複数の重畳周波数を含む工程と；
ｉｉ）ＥＩＳデータから前記アナライトの有無、同一性、及び量の少なくともいずれかを決定する工程。
【００４８】
本発明のこの態様は、好ましくは、工程（ｉ）で重畳及び印加される周波数のセットを決定するために統計解析を利用する。このように周波数を決定する統計的方法は、当技術分野において周知であり、当業者は、本方法で使用する周波数のセットを決定するために任意の公知の方法を使用してよい。かかる方法は、例えば、“Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐｈｙｓｉｃｓ”（第２版），Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏ．Ｐｔｅ．Ｌｔｄ．Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，Ｆ．Ｊａｍｅｓ編（２００６）ＩＳＢＮ９８１−２５６７９５に見出すことができる。
【００４９】
必要に応じて、周波数のセットを決定するために他の方法を使用してもよい。例えば、特定の系（例えば、特定の電極／溶液／アナライトの組み合わせ）の場合、前記特定の系について標準として十分である周波数のセットを見つけるために、事前に経験的方法を用いてもよい。その後、方法を実施するたびに必要な周波数を計算することなしに、前記系で前記標準を用いることができる。また、使用可能な周波数のセットが作成され且つＴＴＲに悪影響を及ぼさない限り、リアルタイムで又は事前に任意の他の方法を用いてもよい。
【００５０】
周波数のセットを決定するためにどの方法を使用する場合でも、前記セットは、ＥＩＳを用いてアナライトの存在を識別するのに十分であることが必要とされる少なくとも最低数の周波数を含んでいなくてはならない。無論、必要に応じて、最小数に加えて更なる周波数を用いてもよい。
【００５１】
方法は、幾つかの実施形態では、前記周波数のセットに加えて又は前記周波数のセットの代わりに、それ自体周波数のセットを定義する他のパラメータを決定することを含むので、アナライトの存在及び量の少なくともいずれかを検出するのに役立つ。いずれの場合も、周波数及びパラメータの少なくともいずれかは、データ解析を通して結果取得時間が最速となるように選択される。
【００５２】
通常、周波数のセット及びパラメータの少なくともいずれかは、アナライトの有無を識別するのに十分である。周波数のセットの仕様は、特に限定されず、特定の個々の周波数のセット、ある範囲内の周波数のセット、及び／又はそれからある間隔を有する単一の周波数として定義することができ、これらは、セットに含まれる更なる周波数を定義する。
【００５３】
重畳周波数を用いるＥＩＳ測定の結果は、好ましくは、統計的に解析され、等価回路分析法を使用する必要がないので、通常、より迅速な識別が可能になる。しかし、ＴＴＲが悪影響を受けない限り、等価回路法及び任意の他の方法を除外するものではない。高速フーリエ変換（ＦＦＴ）解析を用いて、必要なＥＩＳデータを抽出してよく、この情報は、アナライトの情報を得るために用いられる。かかるＦＦＴ技術は、当技術分野において周知であり、当業者は、必要に応じて本発明において任意のかかる技術を用いてよい。上述の通り、好ましくは、ＥＩＳデータからアナライトの有無に関する情報を得ることができ、より好ましくは、存在するアナライトの量を決定することができる。
【００５４】
本発明では、限られた範囲の周波数に亘る少数の点（実施例１（下記参照）では、１桁の周波数に亘って７つの点）を用いてＥＩＳバイオセンシング及び識別を実現できることが確認され、これにより、必要な情報を抽出するために用いられる高速フーリエ変換（ＦＦＴ）解析とともに、必要な周波数を含む多重波形（実施例１では、多重正弦波）ＥＩＳ摂動を同時に適用することが可能になる。かかる手順により、数秒間以内に市販の機器を用いて測定及び解析を行うことが可能になるので、迅速且つロバストな検出のために現実的なタイムスケールでＥＩＳ測定を行うことが可能になる。
【００５５】
本発明では、任意の核酸アナライトを検出することができる。検出方法は、対象アナライトの種類に依存する。本発明で使用する周波数のセットは、試験中の各特定の系について生じる結合の種類に加えて、系自体の物理的性質（電極の種類、電極の組成、電極の寸法、アナライトの組成、溶媒／液体媒体の種類、電解質等）に依存する。同様の系では、標準の周波数のセットを用いてよく、新規の系又はアナライトの場合は、上に説明した通り、リアルタイム統計計算を使用してよい。
【００５６】
上述の通り、ＥＩＳ工程は、特に限定されない。したがって、ＥＩＳ工程は、以下の小工程を含んでいてもよい：
ｉ）アナライトに交流電圧を印加する工程、
ｉｉ）前記アナライトを横切るＥＩＳ測定値の変化率を決定する工程、
ｉｉｉ）前記変化率のデータから前記アナライトの有無、同一性、及び量の少なくともいずれかを決定する工程。
【００５７】
本発明のこの態様では、ＥＩＳ測定は、電子移動抵抗Ｒｅｔの測定であることが特に好ましい。リアルタイムで行う典型的なＥＩＳ測定の場合、プローブフィルム形成及びプローブ−ターゲットハイブリダイゼーションに対して特に感度の高い１つのパラメータは、系に存在するレドックス対（例えば、［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−）の電子移動抵抗Ｒｅｔである。このパラメータは、当技術分野において周知であり、ＥＩＳスペクトルのナイキストプロットにおける半円形状の幅から計算することができる。
【００５８】
本発明のこの態様は、電極表面とアナライトとの結合又はプローブ−アナライトハイブリダイゼーションを介したアナライトの結合に対するＥＩＳ応答をインサイチュで速度論的に測定することができるＩＤＥ測定プロトコールを提供する。複数の重畳周波数の使用と同様に、ＥＩＳ測定時間が遥かに短くなる。また、第１の態様と同様に、任意のアナライトを検出することができ、検出方法の特異性は、対象アナライトの種類に依存する。一部のアナライトは、電極に直接結合することができるが、他のアナライトは、電極の表面上のプローブ又は相補的分子に結合する事ができる。Ｒｅｔデータの正確な性質は、試験中の各特定の系について予想される結合の種類に依存する。
【００５９】
上述の通り、本発明のこの態様では、レドックスプローブの両方の酸化状態（例えば、フェリシアニド及びフェロシアニド）が溶液中に存在することが好ましい。これにより、ＩＤＥにおけるＤＣ電位が、本方法全体を通してレドックスプローブの還元電位によって確実に固定される。即ち、外部参照電極を用いることなしに２つのＩＤＥ間に電位を印加できることを意味する。これにより、ＩＤＥにおける２つの電極間に小振幅ＥＩＳ摂動電圧を即座に印加してＥＩＳ応答を測定することが可能になる。かかる測定により、溶液に曝露されたときに経時的にＥＩＳ応答を測定することが可能になる。
【００６０】
上述の通り、現在知られているＥＩＳプロトコールは、電極／アナライト結合（又は、プローブが電極に結合している場合にはアナライト／プローブ結合）の平衡への接近を測定する。これにより、平衡を示す一定値にＥＩＳシグナルが変化（通常、増加）する。この場合、溶液中で測定を行うとき、平衡になるまでの時間及び平衡ＥＩＳシグナルがリアルタイムで求められるので、最適な平衡測定ができる。しかし、結果を求めることができるようになるには完全な平衡が必要であり、これはアナライトの結合及び解離の速度によって制御される長いプロセスであることが多いので、結果取得時間は長くなる。本発明のこの態様では、上記の通り、電極／アナライト結合（又はプローブ／アナライト結合）を速度論的に測定するとき、溶液中のアナライトの濃度を求めるためにＥＩＳシグナルの増加速度を用い、分析する。これは、数分間以下という遥かに迅速なＴＴＲで行うことができ、完全な平衡に達する必要はない。
【００６１】
本発明では、ＥＩＳデータは、好ましくは、複素インピーダンス（ｘ＋ｉｙ）に由来するデータパラメータを含む。これらパラメータは、当業者に周知であり、以下のうちの１以上から選択することができる：
・実数成分（ｘ）
・虚数成分（ｙ）
・係数又は絶対値［ｒ＝｜ｚ｜＝（ｘ２＋ｙ２）１／２］
・角度［θ＝ｔａｎ−１（ｙ／ｘ）］
・主成分１
・主成分２
【００６２】
本発明で使用される重畳周波数の数は、必要な精度でアナライトの同一性及び量の少なくともいずれかを得るためにＥＩＳを用いる分析に適している限り、特に限定されない。通常、重畳周波数の最低数は、２〜２０である。より好ましくは、重畳周波数の最低数は、少なくとも３〜１０、即ち、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０である。最も好ましくは、重畳周波数の数は、約７である。
【００６３】
上述の通り、本方法は、液体媒体中で行うことが好ましい。好ましくは、液体媒体は、プロセスに役立つように選択される。媒体は、方法に害を及ぼさない限り特に限定されず、酸性又は塩基性の媒体を使用してよい。
【００６４】
本発明の全ての態様の方法は、公知の方法に対して多数の特別な利点を有する：患者の身辺環境の要件に適合する数秒間から数分間という迅速な結果取得時間（ＴＴＲ）；様々なプローブ−ターゲット系に対するアプローチの広い適応性；データ収集を強化するための迅速多重正弦波ＥＩＳとの適合性；電子制御及び測定とのＥＩＳ検出適合性；及びラベルを用いない検出。
【００６５】
本発明の方法を用いて、単一のアナライトを検出することも、複数の異なるアナライトを同時に検出することができる。
【００６６】
好ましくは、本発明の方法は、ラベルを用いない方法である。即ち、検出を補助するためにアナライトを標識する必要がない。しかし、幾つかの状況では、ラベルを使用してもよい。例えば、複数の異なるアナライトを同時に検出するためにこの方法を用いる場合、異なるアナライトを、各々、アナライトに関連付け得る１以上の異なるラベルで標識してよい。或いは、表面上にアナライト用のプローブのセットを配置する等、空間的に分離することによって複数のアナライトを検出してもよい。複数の異なるアナライトの検出は、多重化としても知られている。
【００６７】
本発明の電気化学的検出法では、アナライトは、液体媒体の溶液又は懸濁液中で試験される。液体媒体は、ＥＩＳを用いる分析に適している限り、特に限定されない。好ましくは、液体媒体は、ＥＩＳ測定を促進するために電解質を含む。電解質は、不活性イオンを含有する溶媒又はバッファ、例えば、ＰＢＳであり、通常、遥かに低濃度のレドックス活性種を後で添加する。電解質は、特に限定されず、当技術分野において公知の任意の電解質を含み得る。しかし、Ｆｅ（ＩＩ）／Ｆｅ（ＩＩＩ）電解質系等の遷移金属レドックス系を含有する電解質が好ましい。［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−が、特に好ましい。
【００６８】
複数の異なるラベルを用いて異なるアナライトを標識する場合、ビオチン化されている検出抗体と共にラベルを導入してもよい。好ましくは、各ラベルは、電気化学的検出法のために異なる酸化電位を有するので、得られるデータには異なるシグナルピークが生じる。例えば、金属ナノ粒子を異なるアナライト用のラベルとして用いる場合（以下を参照されたい）、異なる酸化電位を有する異なる金属を各アナライト用に用いてよい。
【００６９】
好ましい実施形態では、電極に印加される交流電位は、特に限定されず、使用される媒体に依存する。したがって、実際、ＥＩＳの最大可能振幅は、溶媒の種類によって制限される（水の場合、約２Ｖであり、ｒｍｓ振幅は約１Ｖ〜約２Ｖとなる）。したがって、水性媒体中では、電位は、＋１．０Ｖ〜＋２．０Ｖであってよく、好ましくは、＋１．２Ｖ〜＋１．８Ｖである。系においてレドックス種を用いる場合、酸化種及び還元種の両方が存在し、これにより、通常、２５０ｍＶ未満の振幅が使用される。より好ましい実施形態では、電極間に印加される交流電圧の二乗平均平方根（ｒｍｓ）振幅は、約１０ｍＶである。これにより、例えば、等価回路分析用に応答を線形化することができる。より高い振幅応答を用いることができる（特徴的なシグナルを抽出するために統計的方法を使用する場合、前記シグナルは、異なっていてもよく、有利であり得る）。
【００７０】
好ましい実施形態では、電気的検出方法をチップ上で実施する。光学的検出のためにラベルを使用する本発明の多重化実施形態では、アナライトが異なるラベルで同時に標識されている場合、光学的検出及び電気的検出を１つのチップ上で実施してよい。或いは、アナライトを２つのアリコートに分け、別々に標識した場合、１つのチップ上で光学的検出及び電気的検出を行うために、標識した後にアリコートを合わせてもよく、２つの別個のチップ上で光学的検出及び電気的検出を別々に実施してもよい。
【００７１】
ＥＩＳを用いて、存在するアナライトの量を定量する事ができる。定量データは、積分、即ち、生じた各シグナルピークのグラフ下面積を求めることによってシグナルピークから得ることができる。
【００７２】
標識を使用する実施形態
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、特に多重化が望ましい場合、ラベルを使用する。言及されるラベルは、特に限定されないが、好ましくは、ナノ粒子、単一分子、特定のヌクレオチド又はアミノ酸等のターゲットの固有成分、及び化学発光酵素から選択される。好適な化学発光酵素としては、ＨＲＰ及びアルカリホスファターゼが挙げられる。ラベルの光学的検出は、本発明の電気化学的方法と容易に組み合わせられるので、蛍光ラベルが特に好ましい。
【００７３】
好ましくは、ラベルは、ナノ粒子である。ナノ粒子は、電気的検出法においてうまく機能するので、本発明のこれら実施形態において特に有利である。ナノ粒子の表面への近接は、特に重要ではなく、このことにより、アッセイの融通性が高くなる。好ましい実施形態では、ナノ粒子は、分子の集合体を含むが、その理由は、単一分子を用いるときよりも光学的及び電気的検出法においてより大きなシグナルが得られるためである。
【００７４】
好ましくは、ナノ粒子は、金属、金属ナノシェル、金属二元化合物、及び量子ドットから選択される。好ましい金属又は他の元素の例は、金、銀、銅、カドミウム、セレニウム、パラジウム、及び白金である。好ましい金属二元化合物及び他の化合物としては、ＣｄＳｅ、ＺｎＳ、ＣｄＴｅ、ＣｄＳ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＨｇＩ、ＺｎＴｅ、ＧａＡｓ、ＨｇＳ、ＣｄＡｓ、ＣｄＰ、ＺｎＰ、ＡｇＳ、ＩｎＰ、ＧａＰ、ＧａＩｎＰ、及びＩｎＧａＮが挙げられる。
【００７５】
金属ナノシェルは、薄い金属の殻に取り囲まれているコアナノ粒子を含む球形ナノ粒子である。金属ナノシェルの例は、薄い金の殻によって取り囲まれている硫化金又はシリカのコアである。
【００７６】
量子ドットは、半導体ナノ結晶であり、これは、光吸収性の高い発光ナノ粒子である（Ｗｅｓｔ  Ｊ，Ｈａｌａｓ  Ｎ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００３，５：２８５−２９２“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｓｅｎｓｉｎｇ，Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”）。量子ドットの例は、ＣｄＳｅ、ＺｎＳ、ＣｄＴｅ、ＣｄＳ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＨｇＩ、ＺｎＴｅ、ＧａＡｓ、ＨｇＳ、ＣｄＡｓ、ＣｄＰ、ＺｎＰ、ＡｇＳ、ＩｎＰ、ＧａＰ、ＧａＩｎＰ、及びＩｎＧａＮナノ結晶である。
【００７７】
上記ラベルは、いずれも抗体に結合することができる。
【００７８】
ラベルのサイズは、好ましくは、直径２００ｎｍ未満、より好ましくは、直径１００ｎｍ未満、更により好ましくは、直径２ｎｍ〜５０ｎｍ、更により好ましくは、直径５ｎｍ〜５０ｎｍ、更により好ましくは、直径１０ｎｍ〜３０ｎｍ、最も好ましくは、１５ｎｍ〜２５ｎｍである。
【００７９】
本発明の方法が、複数のアナライトを検出するためのものである場合、アナライトに関連付け得る１以上の異なるラベルで各異なるアナライトを標識する。本発明のこの態様では、ラベルは、その組成及び／又は種類によって異なっていてもよい。例えば、ラベルがナノ粒子である場合、ラベルは、異なる金属ナノ粒子であってよい。ナノ粒子が金属ナノシェルである場合、コア及びシェル層の寸法を変えて、異なるラベルを作製してもよい。これに加えて又はこれに代えて、ラベルは、例えば、サイズ、形状、及び表面粗度等の異なる物性を有する。１つの実施形態では、ラベルは、同じ組成及び／又は種類と異なる物性とを有していてもよい。
【００８０】
異なるアナライト用の異なるラベルは、好ましくは、光学的検出法及び電気的検出法において互いに識別可能である。例えば、ラベルは、異なる発光周波数、異なる散乱シグナル、及び異なる酸化電位を有していてよい。
【００８１】
多重化等、標識を使用する本発明の実施形態では、方法は、通常、アナライトを１以上のラベルで標識して標識アナライトを形成する更なる初期工程を含む。
【００８２】
アナライトを標識する手段は、特に限定されず、当技術分野において多くの好適な方法が周知である。例えば、アナライトがＤＮＡ又はＲＮＡである場合、リガンド又は反応部位におけるハイブリダイゼーション後標識によって、或いは、未標識ターゲットとラベル−オリゴヌクレオチド複合体プローブとの「サンドイッチ」ハイブリダイゼーションによって標識してよい（Ｆｒｉｔｚｓｃｈｅ  Ｗ，Ｔａｔｏｎ  Ｔ  Ａ，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４（２００３）Ｒ６３−Ｒ７３“Ｍｅｔａｌ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｌａｂｅｌｓ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ，ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”）。
【００８３】
オリゴヌクレオチドとナノ粒子とを複合体化するための多くの様々な方法が当技術分野において公知であり、例えば、自発的に金ナノ粒子に結合するチオール修飾及びジスルフィド修飾オリゴヌクレオチド、ジ−及びトリ−スルフィド修飾複合体、オリゴチオール−ナノ粒子複合体、及びＮａｎｏｐｒｏｂｅ製のホスフィン修飾ナノ粒子由来のオリゴヌクレオチド複合体である（Ｆｒｉｔｚｓｃｈｅ  Ｗ，Ｔａｔｏｎ  Ｔ  Ａ，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４（２００３）Ｒ６３−Ｒ７３“Ｍｅｔａｌ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｌａｂｅｌｓ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ，ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”の図２を参照されたい）。
【００８４】
１つの実施形態では、ＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖の両方をビオチン化してよい。ビオチン化されたターゲット鎖を、オリゴヌクレオチドプローブでコーティングされた磁気ビーズにハイブリダイズさせてよい。次いで、ストレプトアビジンでコーティングされた金ナノ粒子を、補足されたターゲット鎖に結合させてよい（Ｗａｎｇ  Ｊ，Ｘｕ  Ｄ，Ｋａｗｄｅ  Ａ，Ｐｏｓｌｋｙ  Ｒ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１），７３，５５７６−５５８１“Ｍｅｔａｌ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”）。磁気ビーズにより、ハイブリダイズしていないＤＮＡを磁気的に除去することが可能になる。
【００８５】
ＥＩＳ工程を実施するために、一対の電極を用いなければならない。電極は、特に制限されないが、典型的な実施形態では、スクリーン印刷電極又はマクロ金電極であるか、或いは、櫛型電極（ＩＥＤ）である。電極の材料は、核酸アナライトが電極表面上のＰＮＡプローブに結合するときに生じる化学的プロセスに干渉しない限り、特に制限されない。通常、電極は、金等の不活性金属から形成される。４つのデバイスチップ、アラインメントマスク、及びリフトオフ処理を加速させるためのダミー金属線を含む金櫛型マイクロ電極構造のマスクレイアウトを図８に示す。各電極のディジット数（Ｎ）は、好ましくは、５〜１０である。各ディジットの長さ（Ｌ）は、好ましくは、７５μｍ〜１５０μｍである。各ディジットの幅（Ｗ）及び各ディジット間のギャップの幅（Ｇ）は、各々好ましくは、１．５μｍ〜１０μｍであり、ＷとＧとは、好ましくは同じである。
【実施例】
【００８６】
ほんの一例として、本発明を更に説明する。
【００８７】
実施例１  −  多重周波数分析のためのＥＩＳパラメータの検討
本発明の１つの態様の方法において使用する最適パラメータを調べるために、任意のＥＩＳ設定を使用してよい。しかし、通常、パラメータをできる可能な限り最適に近づけるために、最終的な分析において必要とされる電極、電解質、液体媒体、アナライト（及び用いられる場合はプローブ）が用いられる。
【００８８】
この実施例では、Ａｂｔｅｃｈ製の市販の金櫛型電極（ＩＤＥ）におけるプローブ−ターゲットハイブリダイゼーションについて研究した。電気化学的洗浄サイクルを用い、清浄な金電極の安定なサイクリックボルタモグラム（ＣＶ）特性が見られるまで、３０〜４０の完全サイクルに亘って、掃引速度５０ｍＶで、５０ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４水溶液中のＡｇ／ＡｇＣｌに対して−０．６Ｖ〜＋１．６５Ｖの線形電位掃引をＩＤＥ対の両電極に印加した。ＤＮＡ（６９ｍｅｒ、ＩＴＩ０２１）溶液を調製する前に、ジスルフィド保護されているヌクレオチドを５ｍＭ  ＴＣＥＰ溶液で切断した後、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（商標）Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に通すことによってＤＮＡプローブを精製した。
【００８９】
マクロ金電極及び櫛型マイクロ（ＩＭＥ）電極の両方について、ＥＩＳの大きな周波数範囲のナイキストプロットをプロットし、これらを図１に示す。これらは、各々、相補的ターゲット結合について個々のシグナルを示す。
【００９０】
複素インピーダンス（ｘ＋ｉｙ（式中、ｉは、（−１）１／２である）と書くことができる）に由来するパラメータの観点で、ポジティブコントロール（相補的ターゲットが結合しているプローブ）とネガティブコントロール（プローブのみ又は非相補的ターゲットを含むプローブ）との差を比較した。前記パラメータは、
・実数成分（ｘ）
・虚数成分（ｙ）
・係数又は絶対値［ｒ＝｜ｚ｜＝（ｘ２＋ｙ２）１／２］
・角度［θ＝ｔａｎ−１（ｙ／ｘ）］
・主成分１
・主成分２
である。
【００９１】
周波数の対数に対してこれらをプロットすることによって、各量の観点でこれら差を調べた（図２を参照されたい）。
【００９２】
図２は、大きな（マクロ）電極及び小さな（櫛型マイクロ）電極の両方について、実数成分及び係数から類似の情報が得られ、特に周波数範囲の下限において、ポジティブコントロール及び固定化プローブに由来するＥＩＳシグナルを最もよく識別することを示す。虚数成分は、周波数範囲の中央においてＥＩＳシグナルを最もよく識別する。
【００９３】
結果取得時間（ＴＴＲ）を最適化するために、本発明は、全ての実験条件について異なるＥＩＳデータを最もよく識別する最も有用な周波数範囲及び測定の最低数を選択するので、等価回路等のフィッティングモデルを使用する必要がない。この実施例における統計解析では、ポジティブコントロールのＥＩＳシグナルと固定化プローブのＥＩＳシグナルとの倍数変化を用いてマクロ金電極及び櫛型マイクロ電極（ＩＭＥ）の両方について７点最適周波数範囲を決定した。
【００９４】
結果を表１に要約する。
【表１】
2015503095.tif 000007
表１：相補的ハイブリダイゼーションとターゲットを含まない固定化プローブとの比較に基づく、マクロ電極及び櫛型マイクロ電極についての７点最適周波数範囲（Ｈｚ）の結果概要
【００９５】
両タイプの電極において、係数データ及び実数成分から、１桁の周波数に及ぶ範囲でＥＩＳ測定について非常に類似する最適周波数範囲が得られることは注目に値する。両タイプの電極において、虚数成分からは、同じく１桁の周波数に及ぶ範囲で実数成分及び係数のデータよりも僅かに高い周波数において最適なシグナルが得られる。マクロ電極とＩＭＥとの電極寸法の非常に大きな変化は、応答が電極面積には殆ど関係ないことと同様に、測定に最適な周波数範囲に対して殆ど影響を及ぼさなかった。このことから、ＥＩＳ測定は簡略化される。倍数変化を用いる偽ハイブリダイゼーション対相補的ハイブリダイゼーションの微分解析から、固定化プローブシグナル対相補的ハイブリダイゼーションの微分解析と類似する最適周波数範囲が得られ（表２）、このことから、同じ測定範囲を用いてよいことが確認された。
【表２】
2015503095.tif 000008
表２：偽ハイブリダイゼーションと相補的ハイブリダイゼーションとの比較に基づくマクロ金電極の７点最適周波数範囲（Ｈｚ）
【００９６】
これらデータを迅速に得られるようにするために、多重正弦波技術を使用して、必要とされる複数の周波数を同時に印加し、ＦＦＴを用いて結果を解析し、これらデータを抽出した。図３は、タンパク質マクロ電極実験系について５個の多重正弦波（１桁の周波数に亘る）及び１５個の多重正弦波（２桁の周波数に亘る）のＥＩＳ測定について測定された応答に対する、単一正弦波を逐次印加する従来使用されている方法のＥＩＳナイキストプロットの比較を示す。実験データの収集、解析、及び表示には、ＰＣを用いて、逐次印加の場合は数分間、５個の正弦波の場合は約７秒間、及び１５個の正弦波の場合は約２３秒間かかった。この多重正弦波実験の成分周波数は、統計解析によって決定された周波数範囲（図示されるＥＩＳナイキストプロットにおける電荷移動の半円形状全体に亘る）全体に及ぶ。全てのデータが非常に緊密に一致している（通常０．０５％以内）ことは、多重正弦波ＥＩＳアプローチによって、測定の精度を損なうことなしに数秒間のＥＩＳ測定及び解析（延いては、ＴＴＲ）に適応できるより迅速なＥＩＳパラメータ抽出が行われることを示す。
【００９７】
実施例２  −  ＥＩＳを用いるリアルタイム速度論的測定の研究
この実施例では、Ａｂｔｅｃｈ製の市販のＩＤＥにおけるプローブ−ターゲットハイブリダイゼーションの速度について研究した。電気化学的洗浄サイクルを用い、清浄な金電極の安定なサイクリックボルタモグラム（ＣＶ）特性が見られるまで、３０〜４０の完全サイクルに亘って、掃引速度５０ｍＶで、５０ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４水溶液中のＡｇ／ＡｇＣｌに対して−０．６Ｖ〜＋１．６５Ｖの線形電位掃引をＩＤＥ対の両電極に印加した。ＤＮＡ（６９ｍｅｒ、ＩＴＩ０２１）溶液を調製する前に、ジスルフィド保護されているヌクレオチドを５ｍＭ  ＴＣＥＰ溶液で切断した後、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（商標）Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に通すことによってＤＮＡプローブを精製した。
【００９８】
洗浄直後、室温で２×ＳＳＣバッファ並びに各１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−及び［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−（１０ｍＭ  ［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−）中１０μＭのＤＮＡ溶液にチオール−ＤＮＡプローブ層を浸漬した。電極を前記ＤＮＡ溶液に浸漬した直後にＥＩＳ測定を開始し、３時間〜４時間継続した。上述の通り、これら実験全体を通して０ＶのＤＣ電圧でＩＤＥ対の電極間に１０ｍＶ  ＲＭＳ振幅の正弦波電圧を印加した。その理由は、等濃度の［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−及び［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−が存在することにより、各電極のＤＣ電位が［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−の還元電位に確実に固定されるためである。次いで、修飾された表面を２×ＳＳＣで数分間洗浄し、室温で３０分間１ｍＭのＭＣＨ水溶液でブロッキングした。２×ＳＳＣバッファで１０分間〜２０分間洗浄した後、１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−を含む２×ＳＳＣバッファ中で電極のＥＩＳシグナルを再度測定して、ブロッキング工程後の変化を確認した。次いで、２×ＳＳＣに溶解しており且つ１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−を含有しているターゲット（相補的である又は相補的ではない）ＤＮＡに電極を浸漬して、再度０ＶのＤＣにおけるＥＩＳ測定を行った。
【００９９】
図４は、１μＭの相補的ターゲット（ＩＴＩ０２５）とハイブリダイズする前後の、前記６９ｍｅｒのチオール−ＤＮＡ修飾プローブ電極の典型的なインピーダンスプロットを示す。高周波数の半円形は、マクロ電極及びＩＤＥ電極の両方に共通の特徴であり、これから、電極表面におけるプローブフィルム層を通じた電荷移動についての情報が得られる。１μＭの相補的ターゲットを添加した後、プローブ層における相補的なターゲット−プローブ結合に起因して、予想通り、高周波数の半円形の直径は増加したが、一方、低周波数の拡散特性は本質的に変化しないままであった。これは、（予想通り）電極間の拡散に対する影響が少ないことを示す。
【０１００】
図５は、同じ方法で調製したＩＤＥの別の例を示す。この場合、ブロッキング後にネガティブコントロールを実施した：２×ＳＳＣ中に１μＭの非相補的（ＩＴＩ０１２）ターゲット及び１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−を含有する溶液中で数時間ＥＩＳをモニタリングした。予想通り、インピーダンスシグナルに変化はみられず、これは、非相補的ターゲット−プローブ結合が生じなかったことを示す。この電極を２×ＳＳＣバッファですすいだ後、２×ＳＳＣ中に１ｎＭの相補的ターゲットＤＮＡ及び１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−を含有する溶液中で応答を測定した。１時間後、応答が安定であった場合、電極を５０ｎＭのターゲット溶液に浸漬し、一晩測定した。プローブと１ｎＭターゲットとの差は、小さいが有意であり、一方、５０ｎＭの場合は明確である。したがって、ＥＩＳは、既に確立されている平衡を待つ方法を用いて相補的ターゲット結合を調べている。
【０１０１】
図６は、リアルタイムで行われた典型的なＥＩＳ測定を示し、プローブフィルム形成及びプローブ−ターゲットハイブリダイゼーションに対して感度の高いパラメータは、［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−の電子移動抵抗Ｒｅｔであり、これは、各ＥＩＳスペクトルのナイキストプロットにおける半円形状の幅から計算した。これは、この図においては時間の関数として（電子移動のＲｅｔとして）プロットされている。
【０１０２】
これらデータは、情報が豊富であり、プローブフィルムの確立（菱形）、ブロッキング及び洗浄（四角形）、並びにプローブ−ターゲットハイブリダイゼーション速度（三角形）を示す。金電極をプローブフィルム溶液に曝露した場合（菱形）、Ｒｅｔの値は、最初の１時間、即ちプローブフィルム形成に起因して上昇し、次いで、３時間〜４時間後に安定な表面フィルムを示す定常状態値まで低下する。これは、プローブ溶液の除去及び洗浄によって観察値が殆ど変化しないことから確認される。任意の残りの金表面をブロッキングするためにメルカプトヘキサノール（ＭＣＨ）を添加しても、［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−を含むバッファ中で経時的に抵抗を測定したとき、抵抗は殆ど変化しない（四角形）。これも、安定なプローブフィルムを示す。安定なプローブフィルムが確立されたら、次いで、速度論的技術を用いて、相補的ターゲット及びフェリシアニド／フェロシアニドを含有する溶液中でプローブ−ターゲット結合をモニタリングした。プローブフィルムをこの溶液に曝露した際（三角形）、相補的ターゲット−プローブ結合に起因して中程度のＲｅｔ増加がみられる。初期応答は即時であり、最初の時点でＲｅｔの増加を示し、最初の１時間以内にこの値は２倍超になる。この方法により、数秒間毎にＥＩＳ応答を速度論的に測定することが可能になる（多重正弦波ＩＤＥを参照されたい）。プローブ−ターゲット結合の増加速度は、通常、ターゲット濃度において一次である（確実にターゲット濃度に依存する）と予測されるので、ＥＩＳ上昇速度の解析では、数秒間から数分間のタイムスケールでターゲット濃度を得ることが可能である。この後数時間に亘ってインピーダンスはより緩徐に増加するのは妥当であり、これは、平衡応答に接近するのに長い時間を要することを示し、これによって平衡測定のＴＴＲが制限される。ターゲット溶液を除去し、洗浄し、次いで、［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−を含むバッファ中における応答を測定したところ（円形）、Ｒｅｔの一時的な変化の後、値は、最初に、既に観察された値に戻る。これは、応答がプローブ−ターゲット結合の指標となることを示す。
【０１０３】
金電極上でプローブ層形成及びハイブリダイゼーションが生じたことを確認するために、ビオチンで標識されたターゲットを用い、次いで、ストレプトアビジンで標識されたＱドット（ＱＤバッファ中２０ｎＭ）と共に（室温で１時間）インキュベートした。
【０１０４】
予想通り、蛍光強度の最も高い領域がＩＤＥの金フィンガー上に存在することは、得られた蛍光画像（図７）から明らかである。このことから、ハイブリダイゼーション後に観察されるＲｅｔの上昇は、金ＩＤＥ表面上のフィルムにおけるプローブ−ターゲットハイブリダイゼーションに起因することが確認される。
【０１０５】
実施例３  −  ＤＮＡプローブとＰＮＡプローブとの比較
ＤＮＡプローブの場合のＥＩＳプロトコール（図９）
洗浄後、金マクロディスク電極を、２００ｎＭ  チオール修飾オリゴヌクレオチド溶液＋１Ｍ  ＮａＣｌ中８００ｍＭ  メルカプトヘキサノール＋５ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋１ｍＭ  ＥＤＴＡの溶液と共に３０℃で１６時間インキュベートした。チオール修飾オリゴヌクレオチドは、メルカプトエチル保護基を有するジスルフィドとして製造業者から提供された。このメルカプトエチル保護基を除去した後、５ｍＭ  ＴＣＥＰと共に３０分間インキュベートすることによって固定化し、次いで、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ｓｐｉｎ  Ｇ−２５マイクロカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でゲル抽出精製を行った。１ｍＭメルカプトヘキサノール水溶液で３０℃にて１時間、固定化プローブを有する電極をブロッキングした。次いで、固定化バッファ（１Ｍ  ＮａＣｌ＋５ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、１×ＰＢＳ、及び１×ＰＢＳ＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡで各１０分間電極を洗浄した。
【０１０６】
ハイブリダイゼーション前後に、Ａｕｔｏｌａｂポテンシオスタット（Ｍｅｔｒｏｈｍ，Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）に接続されているＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極及び白金ワイヤ対電極（両方ともＭｅｔｒｏｈｍ（Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）製）を含む三電極系を用いてＥＩＳ測定を実施した。１ｍＭ  Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］＋６０ｍＭ  ＫＣｌ中にて周波数範囲１００，０００Ｈｚ〜０．１Ｈｚ（１５個の周波数）、振幅１０ｍＶ、０．２４ＶでＥＩＳ測定を実施した。５０℃で２時間、２×ＳＳＣ中１μＭの相補的人工ターゲット（２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド）及びターゲットを含まないハイブリダイゼーションバッファのみ（ネガティブコントロール）と電極とをそれぞれハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、２×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣ溶液、及びＥＩＳ測定バッファで各１０分間電極を洗浄した。
【０１０７】
ＰＮＡプローブの場合のＥＩＳプロトコール（図１０）
洗浄後、金マクロディスク電極を、３０℃で１０分間インキュベートした後、１．５μＭチオール修飾ＰＮＡ溶液＋５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中３０μＭメルカプトヘキサノールの溶液と共に３０℃で１６時間インキュベートした。電極を５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯですすぎ、５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中１ｍＭメルカプトヘキサノール中にて３０℃で１時間インキュベートした。次いで、５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ及びＥＩＳ測定バッファ（０．１ｍＭ  Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］＋１０リン酸バッファ）で各１０分間電極を洗浄した。
【０１０８】
ハイブリダイゼーション前後に、Ａｕｔｏｌａｂポテンシオスタット（Ｍｅｔｒｏｈｍ，Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）に接続されているＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極及び白金ワイヤ対電極（両方ともＭｅｔｒｏｈｍ（Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）製）を含む三電極系を用いてＥＩＳ測定を実施した。０．１ｍＭ  Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］＋１０リン酸バッファ中にて、周波数範囲１００，０００Ｈｚ〜０．１Ｈｚ（１５個の周波数）、振幅１０ｍＶ、０．２４ＶでＥＩＳ測定を実施した。
【０１０９】
５０℃で２時間、２×ＳＳＣ中１μＭの相補的人工ターゲット（２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド）、２×ＳＳＣ中１μＭの非相補的人工ターゲット（２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド）、及びターゲットを含まないハイブリダイゼーションバッファのみ（ネガティブコントロール）と電極とをそれぞれハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、２×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣ溶液、及びＥＩＳ測定バッファで各１０分間電極を洗浄した。
【０１１０】
実施例４  −  大腸菌ｒＲＮＡの検出（図１１）
ＰＮＡプローブを用いるＲＮＡ検出のためのＥＩＳプロトコール
洗浄後、金マクロディスク電極を、３０℃で１０分間インキュベートした後、１．５μＭチオール修飾ＰＮＡ溶液＋５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中３０μＭメルカプトヘキサノールの溶液と共に３０℃で１６時間インキュベートした。電極を５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯですすぎ、３０℃で１時間、５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中１ｍＭメルカプトヘキサノール中でインキュベートした。次いで、５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ及びＥＩＳ測定バッファ（０．１ｍＭ  Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］＋１０リン酸バッファ）で各１０分間電極を洗浄した。
【０１１１】
ハイブリダイゼーション前後に、Ａｕｔｏｌａｂポテンシオスタット（Ｍｅｔｒｏｈｍ，Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）に接続されているＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極及び白金ワイヤ対電極（両方ともＭｅｔｒｏｈｍ（Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）製）を含む三電極系を用いてＥＩＳ測定を実施した。０．１ｍＭ  Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］＋１０リン酸バッファ中にて周波数範囲１００，０００Ｈｚ〜０．１Ｈｚ（１５個の周波数）、振幅１０ｍＶ、０．２４ＶでＥＩＳ測定を実施した。
【０１１２】
５０℃で２時間、核酸ターゲットの２×ＳＳＣ溶液と電極とをハイブリダイズさせた。大腸菌から抽出した１６ＳリボソームＲＮＡを完全長ｒＲＮＡとして適用した。ハイブリダイゼーション後、２×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣ溶液、及びＥＩＳ測定バッファで各１０分間電極を洗浄した。
【０１１３】
ＲＮＡ抽出プロトコール
・  ２．５ｍＬのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（１０ｇ／Ｌバクトトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）にＬＢ寒天培地由来の大腸菌ＦＨ１０βコロニーを接種し、振盪培養器内にて３７℃で１６時間インキュベートする。
・  １５ｍｇ／ｍＬリゾチームを含有するＴＥバッファを調製する。
・  ２体積のＲＮＡ保護細菌試薬を１体積の細菌培養物に添加し、直ちにボルテックスし、次いで、室温で５分間インキュベートする。
・  １３，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去する。
・  ２００μＬのリゾチーム含有ＴＥバッファに１０μＬ〜２０μＬのＱＩＡＧＥＮプロテナーゼＫを添加し、ピペッティングすることによって、ペレットを再懸濁する。
・  ３０分間室温でローラーミキサにおいてインキュベートする。
・  ７００μＬのバッファＲＬＴを添加し、激しくボルテックスする。白色の沈殿物が存在している場合、１３，５００ｒｐｍで遠心分離し、以下の工程で上清を用いる。
・  ５００μＬの１００％エタノールを添加し、激しく振盪させる。
・  ７００μＬの溶解物を２ｍＬの回収管内のＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉスピンカラムに移し、１３，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離する。素通り画分を廃棄し、残りのサンプルを添加し、再度遠心分離する。素通り画分を廃棄する。
・  ３５０μＬのＲＷ１をＲＮｅａｓｙスピンカラムに添加し、１３，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、素通り画分を廃棄する。
・  １０μＬのＤＮａｓｅ  Ｉ原液と７０μＬのバッファＲＤＤとを混合し、反転させ、スピンダウンする。８０μＬの溶液を直接カラムに添加し、室温で１５分間インキュベートする。
・  ３５０μＬのバッファＲＷ１をスピンカラムに添加し、更に５分間インキュベートする。
・  １３，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、素通り画分を廃棄する。
・  カラムを２ｍＬの試験管に移し、５００μＬのＲＰＥバッファをカラムに添加する。１３，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離する。
・  １３，５００ｒｐｍで２分間遠心分離するこの工程を繰り返し行う。
・  ｒＲＮＡを３０μＬの脱イオン水に溶出し、ナノドロップを用いて定量する。
【０１１４】
実施例５  −  本発明の方法を用いるＭＲＳＡ  ｇＤＮＡの検出（図１２）
白金対電極及び銀／塩化銀参照電極を含む三電極系において金電極を用いた。金電極表面を０．１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４中でサイクリックボルタンメトリーによって洗浄し、走査速度０．１Ｖ／ｓにて０Ｖ〜１．６Ｖの電位で１０回、０Ｖ〜１．３Ｖの電位で１０回走査した。金マクロ電極の場合、サイクリックボルタンメトリーに先行して、１）アルミナスラリーにより電極を研磨することと２）１０分間ピラニア溶液へ電極を浸漬することとを含む更なる洗浄工程がプロトコールに含まれていた。
【０１１５】
洗浄後、１．５μＭチオール修飾ＰＮＡ溶液＋５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中３０μＭメルカプトヘキサノールを含有する溶液と共に金電極を１６時間インキュベートした。次いで、１ｍＭメルカプトヘキサノール中で電極を１時間インキュベートすることによってブロッキングを実施した。ブロッキングが完了したら、電極を５０％ＤＭＳＯで２時間洗浄し、ＥＩＳ測定バッファ（０．１ｍＭ  Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］＋０．１ｍＭ  Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］＋ｐＨ７．０  １０ｍＭリン酸バッファ）で洗浄した。
【０１１６】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）のｇＤＮＡを得るために、細菌をＣｏｌｕｍｂｉａ血液寒天培地で継代培養し、ＣＯ２雰囲気下で３７℃にて一晩インキュベートした。細胞を生理食塩水に接種し、Ｄｅｎｓｉｃｈｅｃｋ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を用いて光学密度を測定した。これにより、懸濁液中の細菌の細胞濃度に比例してマクファーランド単位の値が得られる。約１０８細胞／ｍＬの細菌細胞の生理食塩水懸濁液又は偽創傷液（ＭＷＦ）懸濁液をこの方法で作製し、この懸濁液から１０２細胞／ｍＬになるまで１０倍希釈を行った。
【０１１７】
１０分間５，０００×ｇで懸濁液１ｍＬを遠心分離することによって細菌細胞をペレット化した。上清を廃棄し、２００μＬの酵素溶解バッファ（２×ＴＥバッファ、１．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、５０μｇ／ｍＬリソスタフィン）に細菌ペレットを再懸濁させた後、３７℃で３０分間インキュベートした。２００μＬの細菌溶解物を２０μＬのプロテナーゼＫに添加し、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  ｅａｓｙＭＡＧ自動プラットフォームを用いてＤＮＡを抽出した。グアニジンチオシアネートは、溶解バッファ中の活性カオトロピック剤であり、細胞材料から核酸を精製及び抽出する際にタンパク質変性剤として作用した。次いで、磁気シリカペレットを除去することなしに容器から精製核酸溶液を取り出し、ＤＮＡを１００μＬの水に溶出した。
【０１１８】
０．１ｍＭ  Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］＋０．１ｍＭ  Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］＋１０ｍＭリン酸バッファ中にて、周波数範囲１００，０００Ｈｚ〜０．１Ｈｚ（１５個の周波数）を用いて、振幅１０ｍＶｒｍｓ、ＤＣ電位０．２４ＶでＥＩＳ測定を実施した。４５μＬのサンプルと５μＬの２０×ＳＳＣとを混合し、次いで、９５℃で５分間加熱し、氷上で２分間保管し、２５℃で５分間加熱することによって、ＭＲＳＡ  ｇＤＮＡサンプルを調製した。振盪（６５０ｒｐｍ）しながら５５℃で２時間電極を前記サンプルと共にインキュベートした。前記サンプルと共にインキュベートした後、２×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣ、及びＥＩＳ測定バッファで各１０分間電極を洗浄した。ハイブリダイゼーション前後にＥＩＳ測定を実施した。
【０１１９】
偽創傷液（ＭＷＦ）の調製
リンゲル（クレブス）溶液：
・  １１８．４ｍＭ  ＮａＣｌ（ｍｗｔ  ５８．４４ｇ／Ｌ〜６．９１ｇ／Ｌ）
・  ４．７ｍＭ  ＫＣｌ（ｍｗｔ  ７４．５６ｇ／Ｌ〜０．３５０ｇ／Ｌ）
・  ２．５２ｍＭ  ＣａＣｌ２（ｍｗｔ  １４７．０２ｇ／Ｌ〜０．３７０ｇ／Ｌ）
・  １．１８ｍＭ  ＭｇＳＯ４（ｍｗｔ  ２４６．５ｇ／Ｌ〜０．２９０ｇ／Ｌ）
・  １．１８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｍｗｔ  １３６．０９ｇ／Ｌ〜０．１６０ｇ／Ｌ）
・  ２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｍｗｔ  ８４．０１ｇ／Ｌ〜２．１０ｇ／Ｌ）
・  ｐＨ７．４
【０１２０】
全ての成分を９００ｍＬの脱イオン水に溶解させ、溶液のｐＨを７．４に調整した。脱イオン水で体積を１リットルに調整し、使用前にｐＨを確認した。リンゲル溶液をウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ  ｒｅｆ  １６０００−０３６）と１：１で混合して、偽創傷液を作製した。
【０１２１】
実施例６  −  オンラインＥＩＳ実験
電極の調製及び測定情報
オンライン検出のために、スクリーン印刷金電極（作用電極直径１．６ｍｍ）をＤｒｏｐＳｅｎｓ（Ｏｖｉｅｄｏ，Ｓｐａｉｎ）から購入した。０．１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４中でサイクリックボルタンメトリーによって各電極を予め洗浄した。表面上に形成された任意の気泡をピペットで除去するように注意しながら、０Ｖ〜１．６Ｖで２０サイクル電極電位を走査した。次いで、サイクリックボルタンメトリーを再度実施して、０．１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４中で２回目の洗浄を行った。このとき、０Ｖ〜１．３Ｖの電位で２０サイクル電極を走査した。最後に、電極を脱イオン水で十分すすぎ、窒素流下で乾燥させた。洗浄後、湿度室内で室温にて１６時間、１．５μＭチオール修飾ＰＮＡ溶液＋５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中３０μＭメルカプトヘキサノールの溶液と共にスクリーン印刷電極をインキュベートした。表面をブロッキングするために、電極を５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯですすぎ、湿度室内にて室温で１時間５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中１ｍＭメルカプトヘキサノールにおいてインキュベートした。最後に、５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ及びＥＩＳ測定バッファ（０．１ｍＭ  Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］＋０．１ｍＭ  Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］＋ｐＨ７．０  １０ｍＭリン酸バッファ）で電極を洗浄した。Ａｕｔｏｌａｂポテンシオスタットに接続されているスクリーン印刷電極（ＷＥ−Ａｕ、ＣＥ−Ｐｔ、ＲＥ−Ａｇ）を用いてオンラインＥＩＳ測定を実施した。０．１ｍＭ  Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］＋０．１ｍＭ  Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］＋ｐＨ７．０  １０ｍＭリン酸バッファ中で周波数範囲１００，０００Ｈｚ〜０．１Ｈｚ（１５個の周波数）を用いて、振幅１０ｍＶｒｍｓ、ＤＣ電位０．０３ＶでＥＩＳ測定を実施した。
【０１２２】
ＤＮＡ断片化実験
加熱前処理後のＤＮＡサンプルの挙動を分析した。これは、サンプルの断片化がＥＩＳの結果に影響を及ぼすかどうかを調べるために行った。これら実験は、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００  Ｅｘｐｅｒｔバイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。純水及び２×ＳＳＣを含む様々な溶液中で０分間、１分間、又は５分間９５℃で加熱することによって、単離した細菌ｇＤＮＡのサンプルを調製した。処理後、サンプル１μＬをＤＮＡ５００  Ｌａｂｃｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の個々のウェルにロードされた。各チップは、１２個のウェルを含んでおり、必要に応じて電気泳動前にロードした。自動電気泳動プログラムが完了したら、所有権を主張できるソフトウェアを用いて結果を解析した。これにより、個々のピークの分解及びポジショニングを行うことができ、ピーク面積を求めるために積分によってＤＮＡを定量することもできた。
【０１２３】
スペーサー分子の化学構造
電極表面におけるハイブリダイゼーション効率を向上させるために、スペーサー分子をＰＮＡプローブに組み込んだ。ＡＥＥＡ（プローブ０１）及びＡＥＥＥＡ（プローブ０２）エチレングリコールリンカーの化学構造は、以下の通りであった。
【化６】
2015503095.tif 000009
【０１２４】
結果
ｇＤＮＡサンプルのｑＰＣＲ及び定量
以下の２つの方法でゲノムＤＮＡのサンプルを調製した。
１）  創傷液に添加した１０８細胞／ｍＬ（１マクファーランド標準）のＭＲＳＡサンプルからｇＤＮＡを抽出した。次いで、１０８細胞／ｍＬ〜１０２細胞／ｍＬに等しい濃度範囲になるように、得られたＤＮＡを１：１０系列希釈した。
２）  創傷液中にて１０８細胞／ｍＬのＭＲＳＡを培養し、次いで、１０８細胞／ｍＬ〜１０２細胞／ｍＬに等しい調製範囲になるように創傷液で１：１０系列希釈を行った。各濃度のＭＲＳＡに対してＤＮＡ抽出プロセスを実施した。
【０１２５】
次いで、上記２つの方法を用いて調製したサンプルに対してｑＰＣＲを実施したところ、方法１を用いて調製したサンプルの方が、サイクル閾値がより低く、より高い線形度を示すことが分かった。これは、１０８細胞／ｍＬの培養物から抽出したｇＤＮＡを希釈した方が、ＭＲＳＡの培養物を希釈し、次いでＤＮＡを抽出するよりも、より信頼性の高い希釈系列を得られることを意味する。結果を図１３に示す。
【０１２６】
ＥＩＳデータでみられる任意の変動についてより理解するために、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いてゲノムＤＮＡの抽出物を定量した（表３を参照されたい）。ＭＲＳＡゲノムＤＮＡの収量は、ヒト創傷液のみから回収したＤＮＡのレベルと共にかなりの変動を示すことが分かる。ＤＮＡ抽出プロセスの不均質な性質は、ＥＩＳデータにおいてみられる変動の原因である可能性がある。データの優れた再現性を確保することを試みた。図１４に示す通り（図１４は、創傷液中１０８細胞／ｍＬのＭＲＳＡから抽出したときのｇＤＮＡ収量の変動を示すｑＰＣＲデータを示す）、単一バッチの創傷液では再現性が良好であった。バッチ間の変動はより広く、これは、ヒト創傷液の変動性、ＭＲＳＡの凝集等の他の実験的要因、及びリゾスタフィンによるＭＲＳＡ細胞壁の酵素分解プロセスに固有の変動性に起因している可能性がある。
【表３】
2015503095.tif 000010
表３：ＮａｎｏＤｒｏｐを用いたＭＲＳＡ全ＤＮＡの定量
【０１２７】
ポイントオブケア試験のためのプロトタイプポテンシオスタット
ポイントオブケア試験を考慮してプロトタイプポテンシオスタットを設計し、組み立てた。ポテンシオスタットは、合計２００米ドル未満の部品で組み立てられ、１００，０００Ｈｚ〜０．１Ｈｚの周波数範囲に亘って位相及び振幅の変化を測定することができた。最初に、完全に相補的な短い人工ターゲットを用いてこの系を評価したところ、ターゲット添加後の電荷移動抵抗の増加を観察可能であることが見出された。図１５は、（Ａ）プロトタイプポテンシオスタットの画像及び（Ｂ）２３ｂｐの完全に相補的なオリゴヌクレオチド（１μＭ）を導入する前と導入した１０分間後のナイキストプロットを示す。
【０１２８】
ＤＮＡ断片化
図１６のＡ、Ｂ、及びＣは、各々、０分間、１分間、及び５分間、９５℃で熱処理した後のＭＲＳＡ  ｇＤＮＡのバイオアナライザーデータを示す。熱変性と同時に、より小さなＤＮＡ断片が生成されたことが分かる。また、同様のサンプルをゲル電気泳動によって分析したところ（図１７）、熱処理された断片からＤＮＡ断片化は観察されたが、サンプルがスメアになったので長さを求めることはできなかった。
【０１２９】
実施例７  −  更なるＥＩＳ実験
材料及び方法
ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｍｅｔａｂｉｏｎ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＰＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＵＫ）を介してＰａｎａｇｅｎｅ（Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）から取り寄せた。ＰＣＲキット並びにＤＮｅａｓｙ血液及び組織キットは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｒａｗｌｅｙ，ＵＫ）から購入した。フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、クエン酸緩衝液（ＳＳＣ）、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）から購入した。ラムダエキソヌクレアーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）。実験全体を通して脱イオン水を用いた（＞１８ＭΩ）。
【表４】
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表４：試験中に用いたオリゴヌクレオチドの配列及び構造
【０１３０】
黄色ブドウ球菌からのＤＮＡ抽出
Ｃｏｌｕｍｂｉａ血液寒天培地で細菌を継代培養し、５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃にて一晩インキュベートした。細胞を生理食塩水に接種し、Ｄｅｎｓｉｃｈｅｃｋ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を用いて光学密度を測定した。これにより、懸濁液中の細菌の細胞濃度に比例して、マクファーランド単位の値が得られた。約１０８細胞／ｍＬの細菌細胞懸濁液をこの方法で作製し、この懸濁液から１０２細胞／ｍＬになるまで１０倍希釈を行った。リアルタイムＰＣＲを実施して、希釈系列からのＤＮＡの収量を求めた。
【０１３１】
１０分間５，０００×ｇで懸濁液１ｍＬを遠心分離することによって細菌細胞をペレット化した。上清を廃棄し、２００μＬの酵素溶解バッファ（２×ＴＥバッファ、１．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、５０μｇ／ｍＬリソスタフィン）に細菌ペレットを再懸濁させた後、３７℃で３０分間インキュベートした。２００μＬの細菌溶解物を２０μＬのプロテナーゼＫに添加し、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  ｅａｓｙＭＡＧ自動プラットフォームを用いてＤＮＡを抽出した。グアニジンチオシアネートは、溶解バッファ中の活性カオトロピック剤であり、細胞材料から核酸を精製及び抽出する際にタンパク質変性剤として作用した。次いで、磁気シリカペレットを除去することなしに容器から精製核酸溶液を取り出し、ＤＮＡを１００μＬの水に溶出した。
【０１３２】
電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）
金ディスク電極（直径２ｍｍ）は、ＩＪ  Ｃａｍｂｒｉａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃａｒｍｓ，ＵＫ）から購入した。１分間０．０５μｍアルミナ粉末（ＩＪ  Ｃａｍｂｒｉａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃａｒｍｓ，ＵＫ））で機械的に研磨し、水ですすぎ、（任意の残留アルミナを除去するために）１分間超音波水浴に浸漬し、最後にピラニア溶液（６ｍＬ濃Ｈ２ＳＯ４＋２ｍＬ  ３０％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２溶液）中で１０分間洗浄することによって、各固体金作用電極を十分に予洗浄した。次いで、電極を水で十分に洗浄し、窒素流下で乾燥させた。洗浄後、３０℃で１６時間、１．５μＭチオール修飾ＰＮＡ溶液＋５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中３０μＭメルカプトヘキサノールの溶液と共に金ディスク電極をインキュベートした。電極を５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯですすぎ、３０℃で１時間、５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中１ｍＭメルカプトヘキサノールにおいてインキュベートした。次いで、電極を５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯで洗浄し、各々２時間及び１時間、ＥＩＳ測定バッファ（０．１ｍＭ  Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］＋０．１ｍＭ  Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］＋１０ｍＭリン酸バッファ）で洗浄した。
【０１３３】
ＦＲＡソフトウェアを実行するＡｕｔｏｌａｂポテンシオスタット（Ｍｅｔｒｏｈｍ，Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）に接続されているＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極及び白金ワイヤ対電極（両方ともＭｅｔｒｏｈｍ（Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）製）を含む三電極系を用いてバッチエンドポイントアッセイにおけるＥＩＳ測定を実施した。０．１ｍＭ  Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］＋０．１ｍＭ  Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］＋１０ｍＭリン酸バッファ中にて、周波数範囲１００，０００Ｈｚ〜０．１Ｈｚ（１５個の周波数）を用いて、振幅１０ｍＶｒｍｓ、ＤＣ電位０．２４ＶでＥＩＳ測定を実施した。４５μＬのサンプルと５μＬの２０×ＳＳＣとを混合し、次いで、９５℃で５分間加熱し、氷上で２分間保管し、３０℃で５分間加熱することによって、ＤＮＡサンプルを調製した。振盪（６５０ｒｐｍ）しながら５５℃で２時間、電極をサンプルと共にインキュベートした。サンプルと共にインキュベートした後、２×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣ、及びＥＩＳ測定バッファで各１０分間電極を洗浄した。ハイブリダイゼーション前後にＥＩＳ測定を実施した。
【０１３４】
スクリーン印刷電極を用いた連続ＥＩＳ測定値を記録することによってオンラインアッセイを実施した。Ｓｃｈｏｔｔ  Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ１６ウェル自己接着性超構造（Ｓｔａｆｆｏｒｄ，ＵＫ）から単一セルを切り取り、５０μＬのＥＩＳ測定バッファが存在する電極の周りに取り付けた。Ｓｃｈｏｔｔ  Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ１６ウェル自己接着性超構造キット（Ｓｔａｆｆｏｒｄ，ＵＫ）の接着性の蓋を用いてウェルを密封した。４５μＬのサンプルを５μＬの１０×ＥＩＳ測定バッファと混合し、５分間９５℃で加熱することによって予熱し、氷上で２分間保管し、５分間３０℃で加熱した。サンプルが調製されたら、電極表面からＥＩＳ測定バッファを除去し、５０μＬのサンプル＋測定バッファ溶液と置換した。接着性の蓋で再密封し、ＥＩＳ測定を継続した。
【０１３５】
結果及び考察
前述の試験では、ｍｅｃＡ遺伝子のプローブ配列を同定し、５５０ｂｐのｍｅｃＡ  ＰＣＲサンプルのインピーダンス検出のために最適化した。プローブ（Ｐ４８）は、マイクロアレイ系においてはＤＮＡ形態、ＥＩＳ測定の場合はＰＮＡ形態で５’構造におけるｍｅｃＡ配列の結合において最も有効であることが見出された。
【０１３６】
バッチエンドポイントアッセイフォーマットにおけるＭＲＳＡからのゲノムＤＮＡの直接検出
電荷移動抵抗（ＲＣＴ）の値を得るために、ハイブリダイゼーション前後にＥＩＳ測定を実施し、ナイキストプロット（図１８を参照されたい）の形態で記録した。１０７細胞／ｍＬの懸濁液から抽出したＭＲＳＡ  ｇＤＮＡと共にインキュベートした後、ＲＣＴが明らかに著しく増加したことが見出された（図１８を参照されたい）。ＲＣＴの値を得るために、（図の上部に記載する）Ｒａｎｄｌｅｓ回路及びＦＲＡ  Ａｕｔｏｌａｂソフトウェアのフィッティング関数を用いてデータをフィッティングした。フィッティングＲＣＴに関連する不確実性は、記録した実験について６％〜１２％の範囲であった。特定の濃度のｇＤＮＡについて、ハイブリダイゼーション後に得られたＲＣＴ値をハイブリダイゼーション前に得られた値で除した。データを表すこのアプローチにより、ＲＣＴの出発値における変動を補正するシグナル増加の尺度が得られた。かかるデータを示すプロットは、「シグナル増加比」と記載されているｙ軸を有する。ハイブリダイゼーションによって誘導されるインピーダンス増加を表すための同様のアプローチが、論文で使用されている。用いられる場合、標準偏差（Ｓ．Ｄ）を分散の平方根として定義する。
【０１３７】
ハイブリダイゼーション効率  −  プローブ配列への様々なスペーサーの組み込みの影響
マイクロアレイ及び他の表面系ＤＮＡ検出技術において、ＤＮＡハイブリダイゼーションの速度は、溶液中における表面プローブの種に対する接近可能性を高めることによって向上させることができる。ハイブリダイゼーション速度は、プローブ配列が電極表面に近接していることによって妨げられる可能性があり、したがって、更にスペーサースキームを含有することを除いてオリジナル（Ｐ４８）と同一配列を有する３つのプローブ（０１、０２、及び０３）を、１０７細胞／ｍＬの濃度のＭＲＳＡ  ｇＤＮＡとハイブリダイズさせた後の応答について試験した。プローブのスペーサーの詳細を表４に示す。２つのエチレングリコール単位を含有するリンカーを表すためにＡＥＥＡという略語を用い、３つのエチレングリコール単位を含有するリンカーを表すためにＡＥＥＥＡという略語を用いる。スペーサー分子の化学構造は、既に記載した通りである。
【０１３８】
図１９は、試験した４つのプローブのうち、プローブＰ４８＿０２が、サンプルのインキュベーション後に最も大きなシグナル増加比を示したことを示す。Ｃ１１スペーサー（骨格に１１個の炭素原子を有するスペーサー）は、固液界面におけるＤＮＡ結合速度を向上させることを試みた場合、この試験において最も有効であることが証明された。Ｃ１１スペーサーを用いたＤＮＡ結合速度の向上は、より高密度で充填されており且つより規則正しい混合フィルムの形成によるものであり、また、Ｃ１１スペーサーからのファンデルワールス力の上昇に起因するものであると考えられる可能性が高い。更に、Ｃ１１スペーサーと長いＰＥＧ分子とを併用することにより、優れた可撓性を有するプローブ分子が得られ、電極表面をコーティングするアルカンチオールフィルムの上方に確実にプローブ配列を突き出させることができる。残りの試験については、電極表面上の認識要素としてプローブＰ４８＿０２を使用した。
【０１３９】
ハイブリダイゼーション効率  −  アッセイ性能におけるＤＮＡ断片化の役割
これら実験では、１０７細胞／ｍＬで培養した細菌由来のサンプルを、２時間電極と共にインキュベートした後、洗浄及び測定を行った。ゲル電気泳動と同時に、サンプル変性中のＤＮＡ断片化の程度を評価する実験を実施した。この実験は、純水中又は２×ＳＳＣ中で、７５℃又は９５℃の温度にて、０分間、１分間、及び５分間、ＭＲＳＡ  ｇＤＮＡ（１０７細胞／ｍＬ）のサンプルを加熱することによって実施した。観察可能な断片化は、サンプルを２×ＳＳＣ中で５分間９５℃にて加熱したときに生じることが見出された（図２０Ａ及び２０Ｂを参照されたい）。ＭＲＳＡゲノムは、約２．８Ｍｂである。ＭＲＳＡから抽出された未処理ｇＤＮＡは、１，０００ｂｐ〜１５，０００ｂｐの大きな断片を含んでおり、５分間の熱変性後に観察された断片は、平均約１２０ｂｐであることが見出された。
【０１４０】
図２０から、２×ＳＳＣ中にて９５℃で５分間ゲノムＤＮＡを変性させると、同時にＤＮＡの断片化も増加し、インピーダンスシグナルも増加することが分かる。ＤＮＡ断片化の役割は、ハイブリダイゼーション時間の長いガラスマイクロアレイについては評価されているが、インピーダンス検出のためのゲノムＤＮＡの結合については未だ調べられていない。９５℃等の高温でＤＮＡをインキュベートすることにより、長いＤＮＡ鎖が断片化され、ＰＣＲ効率が低下することが知られている。熱によるＤＮＡの断片化によって、８００ｂｐ未満の鎖が生じることが示されている。この試験における熱変性後に得られたＤＮＡは、一本鎖であり得る場合があるので、電気泳動後に長さを求める際により短く見える。９５℃でインキュベートすることにより、高分子量ＭＲＳＡ  ｇＤＮＡが断片化され、これにより、インピーダンスシグナルが改善されると考えられる。スペーサーの選択及びＤＮＡ断片化の役割に対する理解が得られたので、ＤＮＡターゲットのおおよそのサイズが得られるキャピラリーゲル電気泳動測定を用いて、ＭＲＳＡ  ｇＤＮＡのアッセイを考案し、評価した。
【０１４１】
ＭＲＳＡ  ｇＤＮＡのバッチエンドポイントアッセイの開発
ＭＲＳＡバッチエンドポイントアッセイを開発した。断片化するために５分間のＤＮＡ変性時間を使用し、アッセイの特異性を評価できるように大腸菌及びメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）由来のｇＤＮＡの非特異的配列についても試験した。試験したＭＲＳＡの濃度は、１０３細胞／ｍＬ〜１０８細胞／ｍＬであった。
【０１４２】
図２１Ａは、生理食塩水に添加したＭＲＳＡ細胞から抽出したＭＲＳＡ  ｇＤＮＡのハイブリダイゼーションの検出が可能であったことを示す。０ＭＲＳＡ細胞／ｍＬのインキュベーションから得られたシグナル増加比＋３×標準偏差という定義を用いた場合、Ｌ．Ｏ．Ｄ．は１０６細胞／ｍＬであった。この結果の重要性は、抽出されたＤＮＡに対してＰＣＲを行うことなしにｍｅｃＡ遺伝子のハイブリダイゼーションを検出することが可能であったという点にある。１０６細胞／ｍＬで添加され、抽出されたサンプル由来のｍｅｃＡ遺伝子の最高濃度は、〜５００ｆＭであった。
【０１４３】
ＭＲＳＡ  ｇＤＮＡのアッセイの特異性を確認するために、ＭＲＳＡ試験と同等の濃度の大腸菌ｇＤＮＡ及びＭＳＳＡ  ｇＤＮＡの存在下でプローブ修飾電極のインキュベーションを実施した。図２１（Ｂ）は、かかるインキュベーションから生じたシグナル増加を表し、これらシグナル増加は、大腸菌及びＭＳＳＡのｇＤＮＡの存在下では観察されなかったことが分かる。３ｐＭ〜６ｐＭという濃度は、１０７細胞／ｍＬの細菌懸濁液から抽出されたＤＮＡの収量に等しかった。
【０１４４】
ヒト創傷液に添加したサンプルからのオンラインＭＲＳＡ  ｇＤＮＡ検出及び特異性試験
リアルタイムで且つ干渉マトリクスの存在下でｇＤＮＡの結合を検出できることは、ポイントオブケア試験の観点で極めて有利であるということになる。これを考慮して、金マクロディスク電極からスクリーン印刷電極にアッセイを変更した。スクリーン印刷電極では、サンプル導入を室温で且つ少体積で行うことができる。スクリーン印刷電極の更なる利点は、価格（各３ドル未満）であり、これは、ポイントオブケア試験にとって魅力的な要因である。これら実験において、約２分間毎に作製される完全ナイキストプロットを用いて連続的にＥＩＳ測定を実施した。ＥＩＳ測定バッファ１００μＬを電極上でインキュベートし、一連のベースライン測定後、予め熱変性されているＭＲＳＡ  ｇＤＮＡ（９５℃で５分間）又は同様に処理されている創傷液調製物から抽出したヒトＤＮＡ１００μＬに置換した。電荷移動抵抗を時間に対してプロットし、サンプル添加後の様々な時点におけるシグナル増加比を測定することができ（図２２）、それによって、ＤＮＡハイブリダイゼーションプロセスに関連する結合等温式を得ることができた（図２３）。
【０１４５】
図２２から、ヒト創傷液に添加し、回収したＭＲＳＡ  ｇＤＮＡにより、ヒト創傷液の希釈系列から抽出したＤＮＡサンプルよりも遥かに多くインピーダンスシグナルが増加したことが分かる。したがって、このフォーマットでは、抽出されたヒトＤＮＡによって引き起こされるバックグラウンドシグナルを超えるＭＲＳＡ  ｇＤＮＡハイブリダイゼーションを測定することができた。図２３は、等量のＭＲＳＡ  ｇＤＮＡ及び大腸菌ｇＤＮＡをセンサに添加したとき、この場合の特異的結合と非特異的結合とを識別することができたことを示す。これら結果の重要性は、検出時間が遥かに短いオンライン試験においてＭＲＳＡ検出が可能であることが示された点にある。例えば、図２２のデータは、サンプル添加の１０分間後にシグナル増加を示すが、図２３は、１０７細胞／ｍＬのＭＲＳＡ及び大腸菌を添加した後の結合曲線間の分岐が、サンプル添加の僅か約５分間後に明らかになったことを示す。
【０１４６】
広義において、これら結果は、ＭＲＳＡ  ｇＤＮＡの検出が、ナノ構造又はポリマー層の使用を通して電極を修飾することなしに可能であったことを示す。更に、金ナノ粒子及びプロテインＧ等のシグナル強化ストラテジは、ＥＩＳによりＰＣＲ産物のハイブリダイゼーションを検出することができる方法として使用されてきた。本明細書に詳述した電極調製プロセスが比較的簡便であり且つタンパク質又はナノ粒子に基づくシグナル増幅工程が存在しないことは、他の多くの電気化学検出スキームよりも有利である。
【０１４７】
スペーサーの選択及びターゲットの断片化時間についてのデータは、プローブの長さ、断片の長さ、及びＥＩＳシグナルが互いに関連していることを示す。断片化データは、長さ約１２０ｂｐのターゲット鎖が、ＥＩＳシグナルの増加に寄与することを示唆している。ＥＩＳに基づく核酸検出に関する文献の多くは、短い（〜２０ｂｐ）人工オリゴヌクレオチドについて得られた結果を報告している。
【０１４８】
本検出スキームが比較的簡便であること（及びプロトタイプポータブルポテンシオスタットが、ベンチトップポテンシオスタットと同程度優れており、スクリーン印刷電極に適合し、且つコストが２００米ドル未満であること）は、既に知られており、即ち、このアッセイは、ポイントオブケア設定において実施することが十分に認められる。
【０１４９】
結論
ラベルを用いずにＭＲＳＡを検出するための高感度且つ特異的バイオセンサについて説明した。ＰＮＡプローブ配列の使用により、ＭＲＳＡのゲノムＤＮＡを高感度で検出することが可能になったので、このアッセイは、ＰＣＲ増幅工程を必要としない。ＤＮＡの断片化及び電極表面からプローブ配列までの距離は、アッセイ性能において重要な要因であることが示されている。断片は、長さ約１２０ｂｐであることが見出され、これは、ＥＩＳ実験で通常報告されているＤＮＡ配列よりも長い。ＭＲＳＡ  ｇＤＮＡの検出は、マクロ金電極におけるバッチアッセイ及びスクリーン印刷電極におけるオンラインフォーマットにおいて可能であることが示された。また、ＤＮＡをヒト創傷液等の干渉性マトリクスから抽出したときにも検出が可能であった。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2015503095.tif 000015
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
2015503095.tif 000019
【図３】
2015503095.tif 000020
【図４】
2015503095.tif 000021
【図５】
2015503095.tif 000022
【図６】
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【図７】
2015503095.tif 000024
【図８】
2015503095.tif 000025
【図９】
2015503095.tif 000026
【図１０】
2015503095.tif 000027
【図１１】
2015503095.tif 000028
【図１２】
2015503095.tif 000029
【図１３】
2015503095.tif 000030
【図１４】
2015503095.tif 000031
【図１５】
2015503095.tif 000032
【図１６】
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【図１７】
2015503095.tif 000034
【図１８】
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【図１９】
2015503095.tif 000036
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
2015503095.tif 000041
2015503095.tif 000042
2015503095.tif 000043