(57)【要約】【課題】炭素源の発酵のための微生物の成長に適したｐＨを保つように炭素源基質および塩基を流加式で供給する段階を含む流加式培養方法、およびこれを用いた有機酸製造方法を提供する。【解決手段】本発明は、微生物の発酵による有機酸生産の際に二炭酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよびアルカリ金属含有弱塩基などの中和剤と、炭素源基質とを共に流加式で供給することにより、炭素源発酵のための微生物の生存に適したｐＨを保つと同時に、原料物質たる炭素源基質の注入速度を適切に調節する。本発明は、有機酸の生産性、収率および生成濃度を高め、ｐＨの変化に応じて塩基と炭素源基質が自動的に注入されるので発酵工程運転の信頼度および簡便性を高めることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素源基質および有機酸生産菌株を含む反応器に、炭素源基質と、二炭酸アンモニウム(ammonium bicarbonate)、炭酸アンモニウム（ammonium carbonate）およびアルカリ金属含有弱塩基から選ばれる一つ以上の塩基とを含む基質−塩基混合液を流加式で供給する流加式培養によって炭素源基質を発酵させる有機酸製造方法。
【請求項２】
炭素源基質、有機酸生産菌株、および前記菌株の成長成分を含む培養液を準備する段階と、
前記培養液のｐＨが前記有機酸生産菌株の成長に適したｐＨ範囲に保たれるように、炭素源基質と、二炭酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよびアルカリ金属含有弱塩基から選ばれる一つ以上の塩基とを含む基質−塩基混合液を前記培養液に流加式で供給しながら、炭素源基質を発酵させる段階と、
前記培養液から、炭素源基質の発酵によって生成された有機酸を回収する段階とを含んでなる、流加式培養による有機酸製造方法。
【請求項３】
前記アルカリ金属含有弱塩基が二炭酸ナトリウム(sodium bicarbonate)、炭酸ナトリウム（sodium carbonate）、二炭酸カリウム(potassium bicarbonate)、 炭酸カリウム（potassium carbonate）およびこれらの混合物であることを特徴とする、請求項１または２に記載の有機酸製造方法。
【請求項４】
前記炭素源基質はグルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、砂糖黍、糖蜜、および澱粉加水分解物から選ばれる一つ以上の糖類であることを特徴とする、請求項１または２に記載の有機酸製造方法。
【請求項５】
前記有機酸は酪酸、乳酸、酢酸、蟻酸、クエン酸、アジピン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルカル酸、イタコン酸、アクリル酸、およびムコン酸から選ばれる一つ以上の有機酸であることを特徴とする、請求項１または２に記載の有機酸製造方法。
【請求項６】
前記有機酸生産菌株はクロストリジウム(Clostridium)属菌株、シュードモナス(Pseudomonas)属菌株、リゾプス(Rhizopus)属菌株、アスペルギルス(Aspergillus)属菌株、コリネバクテリム(Corynebacterium)属菌株、アクチノバチルス（Actinobacillus）属菌株、酵母(Yeast)、カンジダ(Candida)酵母、ピチア(Pichia)酵母、大腸菌(E. coli)、および乳酸菌(Lactic acid bacteria)から選ばれる微生物であることを特徴とする、請求項１または２に記載の有機酸製造方法。
【請求項７】
前記発酵はｐＨ調節センサー、ガスメーター、またはこれらの全てが取り付けられた発酵器で行われることを特徴とする、請求項１または２に記載の有機酸製造方法。
【請求項８】
炭素源基質の発酵段階で前記基質−塩基混合液の投入が完了した後、培養液中の炭素源基質の発酵が完了するまでアンモニア水、アルカリ金属水酸化物水溶液、アルカリ土金属水酸化物水溶液、またはこれらの混合物を供給しながら、培養液のｐＨを、前記有機酸生産菌株の成長に適したｐＨの範囲に保たせることを特徴とする、請求項２に記載の有機酸製造方法。
【請求項９】
前記菌株の成長成分は窒素源、ビタミン、無機塩類、および炭素源分解酵素から選ばれる一つ以上の成分であることを特徴とする、請求項２に記載の有機酸製造方法。
【請求項１０】
炭素源基質、酪酸生産菌株、および前記菌株の成長成分を含む培養液を準備する段階と、
前記培養液のｐＨが４．５〜７の範囲に保たれるように、炭素源基質と、二炭酸アンモニウム、二炭酸ナトリウム、二炭酸カリウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムおよびこれらの混合物から選ばれる塩基とを前記培養液に流加式で供給しながら、炭素源基質を発酵させる段階と、
前記培養液から、炭素源基質の発酵によって生成された酪酸を回収する段階とを含んでなる、流加式培養による酪酸製造方法。
【請求項１１】
前記酪酸生産菌株がクロストリジウム属微生物であることを特徴とする、請求項１０に記載の酪酸製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流加式培養による有機酸製造方法に関する。より具体的に、本発明は、炭素源基質と塩基を流加式で供給して有機酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機酸製造のための発酵は、各種食品や食品添加物、化学材料などに活用されるなど長期にわたって行われてきた。最近、有機酸は、環境調和・新再生エネルギーの開発に伴い、燃料および化学物質生産の原料物質として活用可能性が高い資源と評価されている。
有機酸の発酵は、一般に、回分式(batch)発酵方法によって実現することができる。回分式発酵による有機酸の生成は米国特許第５，５０３，７５０号、同第５，７６６，４３９号などに開示されている。回分式発酵方法は、微生物が有機酸を生成するように発酵させる発酵器に糖、窒素源、無機物などを同時に仕込み、微生物を注入して発酵させることにより有機酸を得る方法である。一定量の糖から得られる有機酸の収率は制限的であるため、回分式発酵で高濃度の有機酸を得るためには初期に高濃度の糖を注入しなければならない。ところが、高濃度の糖は微生物の成長を阻害して発酵速度を低下させる原因となる。このような問題点を解決するために考案された方法が流加式(fed-batch)培養である。
【０００３】
流加式培養は、初期に適当な糖濃度を設定して回分式培養を行い、使用者が所望の濃度の生成物を得るために高濃度の糖を漸進的に注入して培養液内で糖が低濃度に保たれるようにする方法である。この際、どの時期にどんな方法でどれ位の糖を注入するかによって様々な流加式培養方法が存在し、それぞれの方法に応じて微生物の生長速度や生成物の収率などに影響を与えることができる。
現在まで知られた糖制御方式は、微生物の生長パターン分析に基づいて使用者が糖の注入速度を決定して一定に糖を注入する方式、または、ＤＯ（溶存酸素量）或いはｐＨ（水素イオン指数）の値を認知し、それに応じて自動的に糖を注入する方式が知られている。前者の方式を用いた流加式培養の場合、回分式培養に比べては生産性および収率の向上を図ることができるが、微生物の生長および糖消耗速度を正確に調節することができなくて非効率的な部分があり、使用者が糖の注入量を持続的に観察しなければならないという困難さがある。
【０００４】
一方、後者のｐＨ ｓｔａｔまたはＯＤ ｓｔａｔ流加式培養方法は、糖濃度の変化が少なく、微生物の生長傾向によく合うと知られており、大腸菌などの好気性微生物の培養に広く使用されている。特に、ｐＨ−ｓｔａｔ流加式培養方法は、大腸菌などの好気性微生物が糖を摂取して代謝しながら発生するｐＨ降下(drop)現象を糖の注入に活用したものであって、最小限の糖濃度を保ちながら微生物の活性は低下させない範囲内で糖を注入することを目的としている。これは所望のｐＨを設定し、微細なｐＨ上昇があるときに少量の糖を注入する方式であって、少量の糖が代謝されるとｐＨは微細に減少し、糖が全て消尽するとさらにｐＨは上昇するため、糖を再び注入する循環を繰り返す。ところが、有機酸生産のための発酵の場合、生成された有機酸によってｐＨの持続的な減少はあるが、糖の消耗による微細なｐＨ上昇のような現象が発生しないので、ｐＨ ｓｔａｔなどの既存の流加式方法は使用することができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、発酵が進むにつれてｐＨが持続的に減少する有機酸生産発酵にｐＨ ｓｔａｔなどの既存の流加式培養方法を使用することが不適であることを見出し、炭素源基質（糖）と塩基を共に供給して有機酸生成のための嫌気性微生物の生長のための最適条件を提供することが可能な流加式培養による有機酸製造方法を提供しようとする。
【０００６】
本発明の目的は、有機酸発酵の際に簡便で信頼性のある炭素源注入方式による流加式培養法を用いて、高い水準の有機酸の濃度、生産性および収率を得ることが可能な有機酸製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のある観点によれば、ｉ）炭素源基質と、ii）二炭酸アンモニウム(ammonium bicarbonate)およびアルカリ金属含有弱塩基（例えば、二炭酸ナトリウム(sodium bicarbonate)、二炭酸カリウム(potassium bicarbonate)）から選ばれる一つ以上の塩基とを混合した培地を、炭素源基質および有機酸生産菌株を含む反応器に流加式で供給することにより、発酵の進行によるｐＨおよび炭素源基質濃度の変化に対応して適切なｐＨへの調節と炭素源基質（例えば、糖類）の供給を同時に達成する、流加式培養による有機酸製造方法を提供する。
本発明の他の観点によれば、本発明の流加式培養方法によって酪酸を製造する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ｐＨの変化による塩基注入に伴って炭素源を注入し、塩基注入速度に応じて炭素源の注入速度を決定する方式であって、有機酸生成のための発酵システムに炭素源基質と塩基を共に流加式で供給することにより、培養液内の炭素源の濃度を一定に保つことができる。よって、炭素源の濃度またはｐＨを直接測定し或いは使用者が微生物の生長を時間帯別に確認して糖の注入速度を決定する既存の方式に比べて、簡便で再現性が高いうえ、有機酸の生産性および収率に優れる。
また、本発明によれば、発酵器内の全ての炭素源を消費するまで発酵が持続するので、工程効率を最大限に高めることができ、酢酸などの副産物の生産が比較的少なく、高価の種菌培養(seed culture)用培地の必要性を無くし或いは減少させることができるので、発酵工程の費用を節減する経済的な方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明に係る流加式培養による有機酸製造方法の具現例を概略的に示す図である。
【図２】実施例２の流加式培養による酪酸と酢酸の生成プロファイルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、微生物によって消耗した炭素源の含量と生産された有機酸の含量（すなわち、低くなったｐＨ）との間に直接的な関連がある事実に基づいたものである。本発明は、有機酸生産によって消失した炭素源を補充すると同時に、有機酸生成の際に生成された有機酸によって低くなったｐＨを高める役割を果たすことができるように、炭素源基質と、二炭酸アンモニウム(ammonium bicarbonate)およびアルカリ金属含有弱塩基から選ばれる一つ以上の塩基とを含有する基質−塩基混合液を流加式で供給することにより、有機酸生成効率を向上させるためのものである。
【００１１】
有機酸発酵で生成される有機酸を中和させるためにＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）2などの強塩基を使用した例があるが、このような強塩基、特にカルシウム（Ｃａ）を含む塩基はタンパク質を変形および沈殿させる性質がある。よって、このような強塩基が培地と混合される場合、培地の窒素源を変形させて微生物の利用を阻害する副作用があって発酵効率を低下させるので使用が難しい。よって、本発明では、弱塩基、特に二炭酸アンモニウムまたはアルカリ金属含有弱塩基である二炭酸ナトリウム、二炭酸カリウムまたはこれらの混合物を有機酸の中和に使用する。特に、二炭酸アンモニウムは、微生物の生長に必要なアンモニウムイオンを供給することにより、有機酸中和機能以外に栄養素として作用するという点で有利である。
【００１２】
以下、本発明をより具体的に説明する。
本発明のある観点は、炭素源基質の発酵のための微生物の成長に適したｐＨを保つように、ｉ）炭素源基質と、ii）二炭酸アンモニウム(ammonium bicarbonate) 、炭酸アンモニウム（ammonium carbonate）またはアルカリ性塩基から選ばれる一つ以上の塩基とを含む基質−塩基混合液を、炭素源基質および有機酸生産菌株を含む発酵反応器に流加式で供給する段階を含む、炭素源基質の発酵による有機酸製造方法を提供する。
【００１３】
本発明の一具現例では、流加式培養による有機酸製造方法を提供するが、前記方法は、
炭素源基質、有機酸生産菌株、および前記菌株の成長に必須的な成分（菌株成長成分）を含む培養液を準備する段階と、
前記培養液のｐＨが有機酸生産菌株の成長に適したｐＨ範囲に保たれるように炭素源基質と、前記二炭酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよびアルカリ金属含有弱塩基から選ばれる一つ以上の塩基とを含む基質−塩基混合液を培養液に流加式で供給しながら、菌株の成長に適した環境の下で炭素源基質を発酵させる段階と、
前記培養液から、炭素源基質の発酵によって生成された有機酸を回収する段階とを含んでなる。
【００１４】
本発明において、アルカリ金属含有弱塩基とは、周期律表第１族のアルカリ金属を含む弱塩基であって、二炭酸ナトリウム、二炭酸カリウムを含むものと解析される。
本発明の一具現例において、炭素源基質は、糖類であって、単糖類、二糖類、多糖類またはこれらの混合物を含み、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、砂糖黍、糖蜜(Molasses)、澱粉加水分解物などが挙げられるが、これに制限されるものではない。
発酵の際に供給される基質−塩基混合液内の炭素源基質と塩基の含量比は、塩基の溶解度や有機酸の生成速度などを考慮して使用者が発酵特性に合うように任意に調節することができる。炭素源基質と塩基の含量比は、供給される炭素源基質と塩基の滅菌状態が保たれるという前提の下で発酵工程中にも任意に変更可能である。
流加式で供給される炭素源基質は、発酵反応器内の培養液に最初に含まれた炭素源基質とは同じでもよく、異なってもよい。
菌株の成長に必須的な成分としては、炭素源基質以外に、窒素源、ビタミン、無機塩類、および／またはインベルターゼなどの炭素源分解酵素などが例示されるが、これに制限されるものではない。通常の技術者は、公知の技術に基づいて、菌株に応じて成長に必須的な成分を容易に決定することができる。
本発明において、流加式培養によって生成される有機酸は、酪酸、乳酸、酢酸、蟻酸、クエン酸、アジピン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルカル酸、イタコン酸、アクリル酸、ムコン酸などのバイオ燃料およびバイオケミカルとして活用することができる様々な有機酸を含むものと解析される。
【００１５】
本発明において、有機酸生産菌株は、炭素源を発酵させて有機酸を生産することが可能な微生物を全て含むことができ、例えば、クロストリジウム(Clostridium)属菌株、シュードモナス(Pseudomonas)属菌株、リゾプス(Rhizopus)属菌株、アスペルギルス(Aspergillus)属菌株、コリネバクテリム(Corynebacterium)属菌株、アクチノバチルス（Actinobacillus）属菌株、酵母(Yeast)、カンジダ(Candida)酵母、ピチア(Pichia)酵母、大腸菌(E. coli)、および乳酸菌(Lactic acid bacteria)から選択でき、より具体的に、クロストリジウム・チロブチリカム(C. tyrobutyricum)、クロストリジウム・ブチリカム(C. butyricum)、クロストリジウム・アセトプチリカム(C. acetobutyricum)、シュードモナス・エルジノーサ(P. aeruginosa)、シュードモナス・プチダ(P. putida)、シュードモナス・フルオレッセンス(P. fluorescens)、リゾプス・アリズス(R. arrhizus)、リゾプス・オリーゼ(R. oryzae)、アスペルギルス・オリーゼ(A. oryzae)、コリネバクテリウム・グルタミカム(C. glutamicum)、ラクトバチルス・アシドフィルス(L. acidophilus)などを挙げることができる。
【００１６】
適切な各菌株別発酵条件は、当業界に公知になっている。
本発明において、菌株の成長に適した環境とは、菌株を用いた発酵に適した嫌気条件、温度範囲およびｐＨ範囲を意味し、これらの条件は、使用される菌株によって異なる。通常の技術者は、公知の技術に基づいて、発酵反応器の環境が菌株の成長に適するように調節することができる。例えば、温度は２０〜５０℃の範囲であり、ｐＨは４〜７の範囲であってもよい。
【００１７】
本発明の一具現例は、クロストリジウム属菌株の存在下で糖類を発酵させて酪酸を生産する方法であって、糖類と、二炭酸アルミニウム、二炭酸ナトリウム、二炭酸カリウムから選ばれる一つ以上の塩基とを流加式で供給する段階を含む、酪酸生産方法を提供する。必要に応じて、発酵のために通常必要な成分である炭素源基質、窒素源、ビタミンおよび無機塩類、および／またはインベルターゼ(invertase)などの酵素を添加して培養を行うことができる。
より具体的に、本発明の一具現例によれば、炭素源基質、酪酸生産菌株、および前記菌株の成長に必須的な成分を含む培養液を準備する段階と、前記培養液のｐＨが４．５〜７の範囲に保たれるように、炭素源基質と、二炭酸アンモニウム、二炭酸ナトリウム、二炭酸カリウムおよびこれらの混合物から選ばれる塩基とを培養液に流加式で供給しながら、菌株の成長に適した環境の下で炭素源基質を発酵させる段階と、前記培養液から、炭素源基質の発酵によって生成された酪酸を回収する段階とを含んで、流加式培養によって酪酸を製造する。
酪酸生産菌株としては、クロストリジウム属菌株、より具体的に、クロストリジウム・チロブチリカム(C. tyrobutyricum)、クロストリジウム・ブチリカム(C. butyricum)、クロストリジウム・アセトプチリカム(C. acetobutyricum)などの菌株を挙げることができる。
【００１８】
次に、図１を参照して本発明の具現例を説明する。
本発明は、発酵器で微生物を用いて炭素源基質を有機酸発酵させるとき、供給タンクから、炭素源基質と塩基（例えば、二炭酸アンモニウム）とを含む中和溶液を発酵器に流加式で供給する。
発酵器にはｐＨ調節センサーおよび／またはガスメーターの装着が可能である。
ｐＨ調節センサーは、発酵器内の培養液のｐＨを、有機酸生成微生物の成長に適したｐＨに設定するためのものである。発酵反応器内には、炭素源以外に、有機窒素源などの通常的発酵液成分を含むことができる。発酵が進むにつれて、設定された範囲をｐＨが外れると、炭素源基質と塩基（例えば、二炭酸アンモニウム）との混合溶液が自動的に注入されるように設計される。各有機酸生成微生物の成長に適したｐＨは当業界に公知になっている。例えば、生産される有機酸が酪酸である場合、酪酸生成微生物の成長に適した最適のｐＨは４．５〜７の範囲である。
【００１９】
また、発酵器内で生成されるガス量およびガス生成速度を測定するために、必要に応じてｐＨ調節センサーと共に或いは別個にガスメーターが連結されて使用でき、ガス生成速度によって炭素源基質と塩基との混合溶液の注入速度または注入中断時点などが調節できる。
炭素源基質と塩基との混合溶液の注入中断時点は、前述したようにガス生成速度を考慮して決定することができ、或いは注入される混合溶液の量などを考慮して通常の技術者が容易に決定することができる。
一般に、有機酸発酵は、発酵過程で生成される有機酸による阻害作用(product inhibition)があるため、発酵が進むほど漸次的に発酵性能が低下し、場合に応じては、炭素源基質を全て消耗せずに発酵が中断し、残っている炭素源が損失することがある。本発明では、流加式培養のために注入される培地が高いｐＨに影響されないように、弱塩基性中和剤である二炭酸アンモニウムなどを使用するが、二炭酸アンモニウムなどの塩基は、酪酸などの有機酸を中和させ、二酸化炭素（ＣＯ2）および水素（Ｈ2）ガスを排出する。この際、排出されるガスの生成速度によって発酵の性能を判断した後、適正な時点まで持続的に炭素源基質を供給することができる。よって、本発明によれば、炭素源基質を全て消耗して発酵が進み、これにより常に適正な時点に炭素源基質の供給を止めることができて残留炭素源基質の損失なしで最適の発酵性能を発揮するように工程を効率よく運営することができる。供給タンク内のｐＨ調節剤、すなわち炭素源基質および塩基の発酵が完了した後、発酵槽のｐＨ調節は、残っている炭素源基質の発酵が完了するまで、当業界における公知の通常の方法、例えば、アンモニア水、アルカリ金属水酸化物水溶液、アルカリ土金属水酸化物水溶液、またはこれらの混合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム水溶液を一定の速度で供給するなどの方法によって行われ得る。
【００２０】
また、本発明に係る流加式培養方法を用いて有機酸の発酵を行う場合、一般に、バクテリア系発酵の種菌培養に必要な高価の培地を使用することなく、本発酵培地をシードトレイン(seed train)の最終培養の培地としても使用可能であって、発酵の経済性を大きく向上させることができる。既存の酪酸発酵では、本発酵での効能を高めるために種菌培養はＲＣＭ(Reinforced Clostridial Medium)或いはこれと類似する高栄養分の培地を用いて行った。ところが、このような高価の種菌培養培地は、発酵の経済性を悪くして生産物の原価を上昇させる要因となる。しかし、本発明に係る流加式培養の場合、最終シードトレインの培地成分を本発酵成分と共に使用しても性能の減少なしで正常的に発酵できる。
【００２１】
以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２２】
比較例１：回分式培養
５０Ｌの嫌気発酵器に砂糖黍液と無機質を入れ（糖濃度１５０〜２００ｇ／Ｌ、３０Ｌ）、窒素パージングを介して反応液を嫌気にし、クロストリジウム・チロブチリカム(Clostridium tyrobutyricum)を培養液の１％〜２０％で接種した後、３７℃に維持しながらアンモニア水を用いて発酵液のｐＨを６．０に保った。発酵が進むにつれて発生する二酸化炭素（ＣＯ2）と水素（Ｈ2）によって、培養液は嫌気条件を保ちながら発酵が行われる。
【００２３】
実施例１：流加式培養
５０Ｌの嫌気発酵器に砂糖黍液と無機質を入れ（糖濃度２０〜４０ｇ／Ｌ、１０〜１５Ｌ）、比較例１と同様の微生物を接種した後、３７℃に維持しながら、二炭酸アンモニウムと混合された砂糖黍液（二炭酸アンモニウム濃度８０〜１２０ｇ／Ｌ、糖濃度２００〜３００ｇ／Ｌ、１５〜２０Ｌ）を用いて発酵液のｐＨを６．０に保った。流加式培養の場合、培養初期の体積は回分式の場合より小さいが、最終菌培養液の体積は同一であり、最終菌培養液の体積調節が可能である。培養が進むにつれて発生するＣＯ2とＨ2のガス発生速度を点検し、この速度が１．５〜２．５Ｌ／Ｌ反応器／ｈｒの範囲の適正水準に到達したとき、二炭酸アンモニウムと混合された砂糖黍液の供給を終了すると、その後、そのときまで提供された糖を全て消耗しながら発酵が終了する。
比較例１と実施例１の２つの培養方法はいずれも、酪酸が６％以上の濃度まで生産された。同一比較のために、同濃度の酪酸濃度を達成した時点で２つの培養方法の効果を比較した。細胞の濃度（ＯＤ600-MAX）、酪酸生産性（ＰBA）、酪酸生産収率（ＹBA）、酢酸生産収率（ＹAA）に対する比較例１（回分式培養）と実施例１（流加式培養）の結果は表１のとおりである。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
表１に示すように、試験された全ての発酵結果指標において、流加式培養が優れることが分かる。特に、実施例１では、副産物たる酢酸（ＡＡ）の生産が抑制されて酪酸の生産収率が大きく向上することが分かる。このような発酵性能の増加は、微生物の生長を阻害しない水準に糖濃度が保たれるにつれて微生物の生長阻害が大きく減少することにより現れるものと解釈される。これに対し、比較例１の回分式培養の場合、適正な初期糖濃度を維持しても、発酵の回分および回分によって変わる微生物の状態によって、糖が在る状態でも発酵がもはや進まなくて微量の糖が残る場合がある。ところが、本発明に係る流加式培養の場合、培養が進むにつれて発生するＣＯ2とＨ2のガス発生速度によって糖の供給中断時期を調節することができるため、糖の損失なく常に糖を全て消耗して発酵を進ませることができる。本発明によって生成される酪酸（ＢＡ）の生産収率は、一般回分式培養および階段式で糖を数回に分けて加糖する方式（下記比較例２参照）に比べて大きく増加した水準であり、これは本発明で提示した二炭酸アンモニウムと培地の混合によるｐＨ調節の加糖方法が信頼性および効率性に優れることを示す。
【００２６】
実施例２：二炭酸アンモニウムと培地混合供給による流加式培養
本実施例では、流加式培養を用いる場合、生産される酪酸（ＢＡ）の濃度を大きく向上させることができることを示す。ＢＡの発酵生産の際に生成されるＢＡは自体毒性を持っているため、生成物抑制(product inhibition)によって、糖が残存する場合にももはや生成物を生成することができない現象が発生し、これにより生成酸の濃度が制限されるか、或いは糖が培養液に残って損失が起こる場合がある。本実施例では、微生物に及ぼす浸透圧の変化を適正な糖濃度の調節によって最小化してストレスを減少させることにより、微生物の活性を維持させて高濃度のＢＡを生成することができるようにする。
本実施例では、供給タンクと発酵器の２つの反応器を用いて、発酵器は所望の最終体積の２０％〜５０％の体積で培養を開始し、残りの体積はｐＨの変化に応じて供給タンクから基質−塩基混合液（炭素源基質と塩基とを含むｐＨ調節剤）を供給することにより満たされる。
発酵器の培地組成は次のとおりである。砂糖黍シロップ源液０．８Ｌ、有機窒素源ＣＳＰ(Corn Steep Powder)１８０ｇおよびＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏを１．８ｇ溶かして１４Ｌの発酵液を作り、ここに１．５ｍＬの消泡剤を投入した後、オートクレーブして発酵反応器のための培地を準備する。１Ｌの容器にＫＨ2ＰＯ4５４ｇを溶かし、オートクレーブして完全に冷やした後、予め準備された培地と共に発酵器に注入する。供給タンクには砂糖黍シロップ源液７．４Ｌと水とを混合して溶かした溶液１９．５Ｌを入れ、ここに２ｍＬの消泡剤を投入する。オートクレーブが終わった後、二炭酸アンモニウム（ＮＨ4ＨＣＯ3）２ｋｇを入れる。注入後１２時間撹拌し続けて二炭酸アンモニウムを完全に溶解させる。
クロストリジウム・チロブチリカム(Clostridium tyrobutyricum)の種菌培地３Ｌを発酵反応器に接種する。必要に応じて、数ｐｐｍの酵素（インベルターゼ(invertase)）を反応器に添加した。
接種直後、アンモニア水を用いてｐＨを６．３に合わせる。反応条件は次のとおりである。ｐＨ：６．３、温度：３７℃、撹拌速度：２００ｒｐｍ。
反応が行われると、適正量のＣＳＰをさらに注入することができる。ガス発生速度を観察し、その速度が１．５〜２．５Ｌ／Ｌ反応器／ｈｒの範囲の適正な水準に到達したときに供給を止め、発酵が完了するまではアンモニア水を用いてｐＨを調節した。
【００２７】
比較例２
実施例２と発酵結果を比較するために、既存の回分式培養によって発酵を行った。発酵器の培地組成は次のとおりである。砂糖黍シロップ源液８Ｌ、有機窒素源ＣＳＰ(Corn Steep Powder)３３０ｇおよびＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏを１．６ｇを溶かして２７Ｌの発酵液を作り、ここに３ｍＬの消泡剤を投入した後、オートクレーブして発酵反応器のための培地を準備する。１Ｌの容器にＫＨ2ＰＯ4を４９ｇ溶かし、オートクレーブして完全に冷やした後、予め準備された培地と共に発酵器に注入する。オートクレーブが終わった後、クロストリジウム・チロブチリカム(Clostridium tyrobutyricum)の種菌培地３Ｌを発酵反応器に接種する。必要に応じて、数ｐｐｍの酵素（インベルターゼ(invertase)）を反応器に添加した。
接種直後、アンモニア水を用いてｐＨを６．３に合わせる。反応条件は次のとおりである。ｐＨ：６．３、温度：３７℃、撹拌速度：２００ｒｐｍ。
実施例２と比較例２の発酵を経て得られた結果を表２に示す。表２に示すように、既存の回分式培養（比較例２）に比べて、本発明に係る流加式培養（実施例２）の場合、全ての発酵性能の増加およびＢＡ滴定量(titer)の大きい増加を示すことが分かる。図２は生成されるＢＡおよび副酸物たる酢酸（ＡＡ）の生成プロファイルを示す。図２より、本発明に係る流加式培養の場合にＡＡの減少があり、このようなＡＡの減少が発酵収率の向上およびＢＡの生成に寄与することが分かる。
【００２８】
【表２】
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【００２９】
比較例３
本比較例では、間欠的糖注入方式および多様な塩基を用いて流加式培養方法による有機酸生成効果を確認しようとする。発酵開始前、初期の発酵槽のｐＨをアンモニア水によって調節することにより、有機酸生産菌株に適した環境を造成した。発酵開始後、下記表３に記載された塩基溶液をｐＨプローブ(probe)によって自動的に添加し、その他に糖のみからなる溶液を間欠的に注入した。間欠的糖注入は、表３に示すように一定の時間間隔で糖を注入する方法、または持続的に糖の濃度を分析して追加する方法によって行われた。
５０Ｌの嫌気発酵器に糖液、有機窒素成分（ＲＣＭ：Reinforced Clostridial Medium）および無機質を入れ（糖濃度３０〜１００ｇ／Ｌ、３０Ｌ）、窒素パージングを介して反応液を嫌気にした後、クロストリジウム・チロブチリカム(Clostridium tyrobutyricum)を培養液の１％〜２０％で接種し、しかる後に、３７℃に維持しながらアンモニア水を用いて発酵液の初期ｐＨを６．０に合わせた。発酵開始後、発生する水素と二酸化炭素によって、培養液は嫌気条件が保たれながら発酵が行われる。
【００３０】
発酵開始後の発酵条件と発酵によって生成された最終酪酸（ＢＡ）の最終濃度、生成率、収率および選択度を図３に示した。
Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ＃１：全体発酵に必要な糖を３回にわたって均等分割して注入し、各糖は存在する糖の濃度が１〜１０ｇ／Ｌであるときに注入した。使用した塩基はアンモニア希釈液であり、その使用量が表３に示されている。
Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ＃２：全体発酵に必要な糖を６回にわたって均等分割して注入し、各糖は存在する糖の濃度が２０ｇ／Ｌであるときに注入した。これにより、全体糖濃度を２０〜４０ｇ／Ｌに保つようにした。使用した塩基はアンモニア希釈液であり、その使用量が表３に示されている。
Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ＃３：全体発酵に必要な糖を３回にわたって均等分割して注入し、各糖は存在する糖の濃度が１〜１０ｇ／Ｌであるときに注入した。これは＃１の条件と同一であるが、使用する塩基の種類をアンモニアからＣａ（ＯＨ）2に変更して塩基種類の変更による効果があるかを確認した。
Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ＃４：全体発酵に必要な糖を持続的に少量で投入して（１０回以上）糖濃度を３０ｇ／Ｌに保った。これは＃２の条件と類似するが、＃２より多段階で注入して発酵期間における糖濃度の変化が大きくならないようにした。
【００３１】
【表３】
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【００３２】
表３の結果からみて、このような注入戦略では、有意に高い生成物の濃度、収率および生成率の増加は現れなかった。特に、Ｆｅｄ ｂａｔｃｈ＃２の場合、生成率が増加したが、生成物の選択度は低下する結果を示した。
また、間欠的糖注入運転方式は、適切な糖濃度への調節に失敗する高い危険性、高い人力依存度、低い自動化可能性、および頻繁な分析による汚染可能性の増加などにより実工程で使用することは困難であった。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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