(57)【要約】  上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）発現およびリン酸化は、抗クラステリン抗体で処理した癌細胞において増大する。このような処理はまた、癌細胞表面でのＥ−カドヘリン発現の増大によって決定されるように、癌細胞の上皮表現型の再現も伴う。従って、クラステリン阻害剤は、上皮間葉表現型の逆転を誘導すると共に、ＥＧＦＲ阻害剤に対する癌細胞の感受性も回復し得る。ゆえに、本発明によって、クラステリン阻害剤とＥＧＦＲの併用、並びに癌治療におけるそれらの使用が提供される。
2015512877.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラステリン阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤を含む併用薬剤。
【請求項２】
前記クラステリン阻害剤が、上皮間葉移行を阻害することができる、請求項１に記載の併用薬剤。
【請求項３】
前記クラステリン阻害剤が、抗クラステリン抗体またはその抗原結合性フラグメントである、請求項１または２に記載の併用薬剤。
【請求項４】
前記抗クラステリン抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ヒトクラステリンのβサブユニットのＣ末端部分のアミノ酸４２１〜４４３に結合する、請求項３に記載の併用薬剤。
【請求項５】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、チロシンキナーゼ阻害剤または抗ＥＧＦＲ抗体もしくはその抗原結合性フラグメントである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の併用薬剤。
【請求項６】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ラパチニブまたはセマジニブである、請求項５に記載の併用薬剤。
【請求項７】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ゲフィチニブである、請求項５に記載の併用薬剤。
【請求項８】
前記抗体が、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、またはメツズマブである、請求項５に記載の併用薬剤。
【請求項９】
癌を有するか、または癌を有することが疑われる個体に、クラステリン阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤を投与することを含む、癌の治療方法。
【請求項１０】
前記クラステリン阻害剤が、上皮間葉移行（ＥＭＴ）を阻害することができる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記クラステリン阻害剤が、抗クラステリン抗体またはその抗原結合性フラグメントである、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗クラステリン抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ヒトクラステリンのβサブユニットのＣ末端部分のアミノ酸４２１〜４４３に結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、チロシンキナーゼ阻害剤または抗ＥＧＦＲ抗体もしくはその抗原結合性フラグメントである、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ラパチニブまたはセマジニブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ゲフィチニブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、またはメツズマブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗クラステリン阻害剤及び前記ＥＧＦＲ阻害剤が、逐次投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗クラステリン阻害剤が、前記ＥＧＦＲ阻害剤の前に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗クラステリン阻害剤が、前記ＥＧＦＲ阻害剤と同時に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＥＧＦＲ阻害剤の投与前に、癌細胞の上皮間葉表現型の逆転について試験することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌が、前立腺癌、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、肺癌、膵臓癌または腎臓癌である、請求項９〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記乳癌が、トリプルネガティブ乳癌または基底細胞型乳癌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記肺癌が、非小細胞肺癌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が、ＥＧＦＲ阻害剤に対し耐性であるものとして特性決定された細胞を含む、請求項９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌が、ＥＭＴマーカを発現する細胞を含む、請求項９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９または配列番号５０に記載の相補性決定領域を含む、請求項９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体またはその抗原結合性領域が、配列番号１に示すＣＤＲＨ１、配列番号２に示すＣＤＲＨ２、および配列番号３に示すＣＤＲＨ３を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体またはその抗原結合性領域が、配列番号４５に示すＣＤＲＨ１、配列番号４６に示すＣＤＲＨ２、および配列番号４７に示すＣＤＲＨ３を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体またはその抗原結合性領域が、配列番号４に示すＣＤＲＬ１、配列番号５に示すＣＤＲＬ２、および配列番号６に示すＣＤＲＬ３を含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体またはその抗原結合性領域が、配列番号４８に示すＣＤＲＬ１、配列番号４９に示すＣＤＲＬ２、および配列番号５０に示すＣＤＲＬ３を含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３１】
癌の治療を目的とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の併用薬剤の使用。
【請求項３２】
癌の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜９のいずれか１項に記載の併用薬剤の使用。
【請求項３３】
クラステリン阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤を含む、キット。
【請求項３４】
前記クラステリン阻害剤が、抗体またはその抗原結合性フラグメントである、請求項３３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療に用いるためのクラステリン阻害剤と上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の阻害剤の併用に関する。より具体的には、本発明は、ＥＧＦＲ阻害剤に対する癌細胞の感受性を回復する、またはＥＧＦＲ阻害剤の作用を増強することを目的とする、抗クラステリン抗体などのクラステリン阻害剤の使用を包含する。
【背景技術】
【０００２】
化学療法に対する耐性の発生、および他の二次部位への浸潤は、悪性固形腫瘍に共通する特徴である。化学療法薬に対する耐性の発生は、薬物に含まれるタンパク質の過剰発現およびアポトーシス耐性によって引き起こされることはよく知られている。また、浸潤プロセスについても文献にかなり詳しく記載されている。腫瘍浸潤は、癌細胞の運動性増加と、細胞外マトリックス中のタンパク質分解を引き起こす遺伝子の発現によって起こる。化学療法薬に対する耐性および腫瘍浸潤は、上皮間葉移行（ＥＭＴ）と呼ばれる生物学的プロセスを通して共通の開始点を有し得るという証拠が次々と上がっている。近年の研究によって、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）は、ＥＭＴの決定的メディエータであり得ることが証明された。こうした進歩にもかかわらず、化学療法耐性の発生および他の器官への癌の広がりを阻害するために利用できる治療手段はほとんどない。また、近年の文献に、ＥＭＴを経た特定の腫瘍細胞が、脱分化して、幹細胞様特性を呈する（癌幹細胞またはＣＳＣ）ことが明らかにされている。正常な幹細胞の場合と同様に、ＣＳＣは、本来的に化学療法および放射線療法に対して耐性である。従って、ＥＭＴおよびＣＳＣ維持の特定の調節因子をターゲティングすることは、化学療法薬に対する応答を高めて、癌の再発を予防する非常に有望な治療戦略を提供する。
【０００３】
ＥＭＴのモデルとして十分に特性決定された細胞株を使用して、ＥＭＴの誘導時に上方調節されるタンパク質が同定された。これらの１つである、クラステリン（ｓＣＬＵ）と呼ばれる分泌タンパク質は、ＥＭＴの間に刺激されることが判明し、自然にＥＭＴプロセスを促進することができる（Ｌｅｎｆｅｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ｓＣＬＵと相互作用する複数の高親和性抗体を作製して、それらがＥＭＴを阻止する能力について細胞ベースアッセイで試験したところ、ＥＭＴを中和した抗体はすべて、ｓＣＬＵタンパク質の同じ重要なアミノ酸配列に結合した。この発見によって、ｓＣＬＵの特定の領域が、ＥＭＴ促進活性を担っていることが証明された。ｓＣＬＵのＥＭＴエピトープをブロックすることにより、抗体、とりわけ１６Ｂ５と称する抗体は、癌細胞とインキュベートすると、上皮細胞マーカであるＥ−カドヘリンの膜発現の維持によって例証されるように、ＥＭＴを阻止することができた。さらに、前立腺癌および膵臓がん腫瘍を用いた異種移植片動物試験により、腫瘍関連ｓＣＬＵの活性をブロックすると、腫瘍増殖の有意な低減によって測定されるように、ドセタキセルおよびゲムシタビンなどの標準的化学療法薬に対する応答の増大が起こることが判明した。まとめると、これらの結果は、ｓＣＬＵの特定の領域と相互作用することができる抗体でＥＭＴを阻止することにより、腫瘍増殖阻害および細胞傷害性薬物に対する応答の増加が起こることを証明した（国際公開第２００７／０３０９３０号パンフレットの下、公開された国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００６／００１５０５号明細書および国際公開第２０１１／０６３５２３号パンフレットの下、公開された国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００１８８２号明細書を参照。
【０００４】
肺癌は、最も一般的な癌の１つで、世界的に死因の第１位であり、毎年百万を超える患者が診断され、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は全肺癌の８０％超を占めている。診断および治療手法が近年向上したにもかかわらず、患者の大部分は、進行性ＮＳＣＬＣと診断され、その生存期間中央値は低いままである（Ａｄａｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０００５】
ＮＳＣＬＣの最も重要な標的の１つは、受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーのメンバーである上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）であるが、これは、癌細胞の増殖および生存に重要な役割を果たす細胞膜受容体である。これは、ＥＧＦの受容体および複数の別の内在性リガンドとして作用する大きな膜貫通糖タンパク質である。これは、細胞外領域、膜貫通ドメイン、および細胞内チロシンキナーゼ（ＴＫ）ドメインからなる３つのドメインを有する。機能的に、ＥＧＦＲに結合するリガンドは、受容体二量体化を誘導し、これは、細胞内ＴＫドメインの自己リン酸化および活性化を促進する構造変化を引き起こす。その結果、ＥＧＦＲ活性化は、Ｒａｓ／Ｒａｆ／マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）およびホスファチジルイノシトール−３’−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ経路などの複数の下流シグナル伝達経路に影響を与え、これらの経路は、細胞増殖、浸潤性、死亡率、生存期間およびアポトーシスに影響を与える（Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０００６】
ＥＧＦＲは、偏在的に発現されるが、多くの場合、腫瘍細胞において改変される。これらの改変には、遺伝子増幅、リガンドおよび／または受容体の過剰発現ならびに突然変異の活性化が含まれる。ＥＧＦＲもしくはその一次リガンドの過剰発現または異常調節は、肺癌などの多くのヒト固形腫瘍に特徴的である。ＮＳＣＬＣの場合、腫瘍の４３〜８３％がＥＧＦＲを過剰発現する（Ａｄａｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。細胞外ドメインまたは小細胞をターゲティングするモノクローナル抗体などのＥＧＦＲに対するいくつかの薬剤が、ＴＫ活性を阻害することができる。
【０００７】
転移性ＮＳＣＬＣにおけるＥＧＦＲの状態および化学療法薬に対する応答は、多くの論議の主題である。腫瘍が高比率でＥＧＦＲの発現増大を呈するにもかかわらず、臨床研究の中には、これは、第１選択治療の応答の不十分な予測因子であることを示すものもあった（Ｂａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。さらに、化学療法単独の場合と比較して、シスプラチン、ビノレルビンおよびセツキシマブ（ＥＧＦＲモノクローナル抗体）と併用して第１選択治療を実施した患者に穏やかではあるが有意な応答があったにもかかわらず、セツキシマブとＥＧＦＲ過剰発現との間に相関はなかった（Ｍｉｒｓｈａｈｉｄｉ  ａｎｄ  Ｈｓｕｅｈ，２０１０）。全体として、ＮＳＣＬＣにおいてＥＧＦＲ阻害剤を用いた圧倒的量の臨床結果から、受容体の状態は第１選択治療には重要ではないことが示されたが、近年の研究によって、セツキシマブと化学療法による治療を受けた高ＥＧＦＲ発現の患者が、化学療法単独の場合と比較して、生存期間全体に増加を示したことを明らかにする結果が報告された（Ｐｉｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。これらの結果から、ＥＧＦＲ阻害剤に対するＮＳＣＬＣ患者の応答に影響を与える、腫瘍におけるＥＧＦＲに関連する他の機序があることが明らかである。
【０００８】
阻害剤の応答に影響を与えると考えられるＥＧＦＲの別の特性は、小分子と受容体のＴＫ活性の結合を可能にするものである。癌適応（ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）のために数種が開発され、承認されており、例えば、ゲフィチニブおよびエルロチニブが挙げられるが、これらは、この領域へのＡＴＰ結合を模倣することにより、細胞内シグナル伝達を阻止する２つの小分子である。これらの阻害剤のいずれも、第１選択治療においてＮＳＣＬＣで活性であることは見出されていないが、有意な臨床上の応答が第２および第３選択療法で達成された（Ｍｉｒｓｈａｈｉｄｉ  ａｎｄ  Ｈｓｕｅｈ，２０１０）。興味深いことに、ＥＧＦＲ過剰発現は、患者の応答に影響を及ぼさないが、ＥＧＦＲおよび特定の他の遺伝子における活性化突然変異は重大であることが見出された。例えば、活性化突然変異は、ゲフィチニブで治療した患者における無増悪生存期間の有意な増加をもたらすことが判明した（Ｃｏｓｔａｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。さらに、ＫＲＡＳと呼ばれる遺伝子にも突然変異を有する、エルロチニブで治療したＮＳＣＬＣ患者は、全く応答を示さなかった（Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｌｅｒ，２００８）。従って、患者の選択は、彼らがＥＧＦＲ  ＴＫ阻害剤に対してレスポンダーであるか否かを理解しようとする試みにとって決定的である。
【０００９】
上に記載したように、ＥＭＴは、腫瘍細胞が治療に応答する様式に甚だしい影響をもたらす可能性があり、癌細胞が上皮細胞であることを維持する能力はこの応答にとって決定的である。細胞ベース研究において、上皮細胞マーカであるＥ−カドヘリンの発現が増大した細胞は、ＥＧＦＲ阻害剤に対して感受性がより高い（Ｂａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。これらの知見と一致して、Ｅ−カドヘリン発現とエルロチニブに対する感受性との間には相関があった（Ｙａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。腫瘍レベルでは、Ｅ−カドヘリン発現の回復が、ＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性を高めることが判明した（Ｗｉｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。しかしながら、今日まで、臨床試験においてＥＭＴとＥＧＦＲ状態の関連は、明確には調査されていない。それでも、ＥＧＦＲ過剰発現とＥＧＦＲ阻害剤に対する応答の間の相関の欠如、並びにそれらの応答に対する活性化ＥＧＦＲ突然変異の影響を仮定すると、恐らく、ＥＭＴのような別の影響が、ＮＳＣＬＣ患者におけるＥＧＦＲ阻害剤の効力を高めるのに直接関与していると考えられる。
【００１０】
本出願は、ＥＧＦＲを発現する腫瘍においてｓＣＬＵを阻害することによる、ＥＭＴをブロックする抗体を用いた治療方法を提供する。これらの腫瘍におけるＥＧＦＲ状態は、ＥＧＦＲ遺伝子増幅またはＥＧＦＲリガンドの増幅を含み得る。さらに、腫瘍細胞は、ＥＧＦＲとＥＧＦＲタンパク質パートナーによる自己分泌シグナル伝達の増大を含み得る。ＥＧＦＲ状態はまた、受容体に増大した活性を呈示させるＥＧＦＲの突然変異活性化も含み得る。別の実施形態において、腫瘍は、ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体または、ＥＧＦＲの活性を無効にする小分子阻害剤などのＥＧＦＲ阻害剤に対して感受性でも耐性でもあり得る。さらに、ＥＧＦＲ状態は、ＥＧＦＲを再取得した、ＥＧＦＲ発現について先験的に陰性であった腫瘍も含み得る。
【００１１】
ｓＣＬＵを発現するＮＳＣＬＣ細胞株を抗クラステリン抗体に曝露すると、ＥＧＦＲの発現および活性化の両方が増大する。同時に、抗クラステリン抗体によるＥＭＴ阻害のために、ＮＳＣＬＣ細胞株は、Ｅ−カドヘリン発現の増大も呈示する。これらを総合すると、ＥＧＦＲ阻害剤と併用したクラステリン阻害剤により治療したＮＳＣＬＣ患者は、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答の増大を示すと考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、概して、癌治療のためのクラステリン阻害剤とＥＧＦＲ阻害剤の併用に関する。
【００１３】
本発明の方法は、必要とする個体に、上皮間葉移行（ＥＭＴ）を阻害することができるクラステリン阻害剤とＥＧＦＲ阻害剤を投与することを含む。ＥＧＦＲ阻害剤はまた、クラステリン阻害剤と個別に、同時にまたは逐次投与してもよい。
【００１４】
クラステリン阻害剤は、特に、ＥＧＦＲ耐性が認められた、検出された、または疑われる場合に投与してよい。
【００１５】
本発明の方法は、ＥＧＦＲ耐性を予防するために、またはＥＧＦＲ阻害剤に対して癌細胞を敏感にするためにクラステリン阻害剤を投与することも含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】肺癌細胞株は、クラステリンを発現する。この図は、ＮＳＣＬＣ由来の複数の細胞株におけるクラステリンｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す（上方パネル）。対照として、各反応での等量の出発材料を確実にするように、アクチンからのｍＲＮＡも増幅した（下方パネル）。
【図２】肺癌細胞株は、クラステリン（ｓＣＬＵ）を発現する。この図は、肺癌細胞系により分泌されるｓＣＬＵの定量を示す。これらの量は、ｓＣＬＵ特異的ＥＬＩＳＡで測定し、ｎｇ／ｍｌで表示する。
【図３】ｈ１６Ｂ５は、肺癌細胞株のＥ−カドヘリン発現を増大させる。この図は、ｓＣＬＵ阻害剤、ｈ１６Ｂ５と一緒にインキュベートしたときの、Ａ５４９  ＮＳＣＬＣ細胞の上皮特性の増大を示す。左側パネルは、対照ＩｇＧと一緒に４８時間インキュベートした細胞を示し、右側パネルは、同一条件下で、ｈ１６Ｂ５と一緒にインキュベートした細胞を示す。
【図４】ｈ１６Ｂ５でのＮＳＣＬＣの処理により、ＥＧＦＲ発現の増大が起こる。対照ビヒクルまたはｈ１６Ｂ５の存在下でのＥＧＦＲ発現は、Ａ５４９またはＨ２２６細胞のいずれかから調製した全細胞溶解物のＥＧＦＲ特異的抗体を用いて測定した。
【図５】ｈ１６Ｂ５でのＮＳＣＬＣの処理により、ＥＧＦＲリン酸化の増大が起こる。対照ビヒクルまたはｈ１６Ｂ５の存在下でのＥＧＦＲリン酸化は、Ａ５４９またはＨ２２６細胞のいずれかから調製した全細胞溶解物のホスホチロシン特異的抗体を用いて測定した。
【図６】ｈ１６Ｂ５でのＮＳＣＬＣの処理により、ＥＧＦＲリン酸化の増大が起こる。対照ビヒクル、ｈ１６Ｂ５または対照ＩｇＧの存在下でのＥＧＦＲリン酸化は、Ａ５４９またはＨ２２６細胞のいずれかから調製した全細胞溶解物のホスホチロシン特異的抗体を用いて測定した。
【図７】ｈ１６Ｂ５とエルロチニブの併用により、抗腫瘍効果の増大が起こる。組換えクラステリンの存在または非存在下で、ｈ１６Ｂ５とエルロチニブを併用して、Ｈ１２９９およびＨ４６０癌細胞の生存を判定した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、複数のタイプの上皮癌に過剰発現する。ＥＧＦＲ遺伝子改変の存在が、腫瘍をＥＧＦＲ阻害剤に対してより感受性にすると考えられる。しかし、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に対して初期応答を有する患者は、平均１年以内に再発する。ＥＧＦＲエキソン９またはＬ８５８Ｒ突然変異の欠失によって、好ましい臨床結果が得られることがわかっているが、突然変異Ｔ７９０Ｍ、Ｌ７４７Ｓおよび／またはＤ７６１Ｙなどの二次分子イベントは、耐性および腫瘍再発に関連する。ＭＥＴ受容体の増幅およびＩＧＦＲシグナル伝達の活性化は、いずれもＥＧＦＲとは独立にＰＩ３／ＡＫＴ経路を活性化するが、これらも二次耐性を駆動することが判明した。
【００１８】
出願人は、ＥＧＦＲ発現およびリン酸化が、クラステリン阻害剤で処理した癌細胞において増大するという予想外の発見をするに至った。また、クラステリン阻害剤による癌細胞の処理は、細胞表面でのＥ−カドヘリン発現の増大によって示されるように、癌細胞の上皮表現型の再現も伴う。
【００１９】
このように、クラステリン阻害剤は、ＥＭＴ表現型の逆転を誘導するだけではなく、ＥＧＦＲ阻害剤に対する癌細胞の感受性も回復し得る。
【００２０】
本発明は、概して、癌治療に用いるためのクラステリン阻害剤とＥＧＦＲ阻害剤の併用に関する。
【００２１】
併用薬剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ）は、特に、薬学的に許容される担体と結合したクラステリン阻害剤と、薬学的に許容される担体と結合したＥＧＦＲ阻害剤とを含んでよい。
【００２２】
本発明の方法は、必要とする個体に、クラステリン阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤を投与することを含む。ＥＧＦＲ阻害剤は、クラステリン阻害剤と個別に、同時にまたは逐次投与してよい。
【００２３】
クラステリン阻害剤は、特に、ＥＧＦＲ耐性が認められた、検出された、または疑われる場合に投与してよい。
【００２４】
本発明の方法は、ＥＧＦＲ耐性を予防するために、またはＥＧＦＲ阻害剤に対して癌細胞を敏感にするためにクラステリン阻害剤を投与することも含む。
【００２５】
本発明の一態様において、クラステリン阻害剤は、ＥＧＦＲ阻害剤の前に投与してよい。例えば、クラステリン阻害剤は、ＥＧＦＲ阻害剤の投与の数時間〜数日前または数ヵ月前に投与してよい。別の態様では、クラステリン阻害剤は、ＥＧＦＲ阻害剤による各治療と同時（例えば、同じ日）に、またはＥＧＦＲ阻害剤による各治療の間に投与してもよい。
【００２６】
本発明によれば、クラステリン阻害剤は、ＥＧＦＲ阻害剤の投与前に複数用量で、例えば、毎日、隔日、週１回、週２回などで投与してもよい。
【００２７】
本方法はまた、ＥＧＦＲ阻害剤の投与前に、癌細胞の上皮間葉表現型の逆転についての試験も含み得る。ＥＭＴ状態は、例えば、Ｅ−カドヘリン、ＲＡＢ２５、インテグリンβ６、ビメンチン、ＺＥＢＩおよびＳＩＰＩから選択される１つまたは複数の遺伝子／タンパク質の発現レベルを測定することにより、判定することができる。
【００２８】
クラステリン阻害剤は、それらが、クラステリン発現、分泌またはクラステリン活性を弱める能力によって同定することができる。
【００２９】
クラステリン阻害剤の例示的実施形態としては、例えば、分泌クラステリン（ｓＣＬＵ）またはＴＧＦ−βのＥＭＴ促進作用を妨害する能力によって同定されるものが挙げられる。例えば、癌細胞（例えば、４Ｔ１：乳癌細胞、ＤＵ１４５：前立腺癌細胞など）を、ＴＧＦ−βまたはｓＣＬＵの存在下、推定クラステリン阻害剤で処理してから、ＥＭＴのマーカを以下に記載するように評価することができる。上皮細胞マーカの発現を増大する、および／または間葉系細胞マーカの発現を低減することができる推定化合物を、好適なクラステリン阻害剤として同定することができる。
【００３０】
あるいは、推定クラステリン阻害剤の存在下で癌細胞の運動性を評価してもよい。例えば、ＰＣＴ／ＣＡ２００６／００１５０５号明細書に記載されているように、ＴＧＦ−βまたはｓＣＬＵの存在下で、癌細胞を推定クラステリン阻害剤で処理してから、外傷治癒アッセイまたは黒インク運動アッセイ（ｂｌａｃｋ  ｉｎｋ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ）を実施してもよい。これらのタイプのアッセイにおいて癌細胞の運動性を阻害または低減することができる推定化合物を、好適なクラステリン阻害剤として同定することができる。好適なクラステリン阻害剤を同定するために、他の方法を用いてもよいことは理解すべきである。
【００３１】
特に本発明に含まれるクラステリン阻害剤としては、例えば、抗クラステリン抗体またはその抗原結合性フラグメントが挙げられる。
【００３２】
本発明によれば、クラステリン阻害剤には、ＥＭＴ（例えば、癌細胞において）を阻害することができる抗クラステリン抗体またはその抗原結合性フラグメントが含まれる。
【００３３】
一般に用いられるＥＭＴの分子マーカとしては、例えば、Ｅ−カドヘリン、サイトケラチンおよびβ−カテニン（膜内）の発現の低減、および／またはＳｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、Ｔｗｉｓｔ、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２、Ｎ−カドヘリン、ビメンチン、α−平滑筋アクチン、マトリックスメタロプロテイナーゼなどの発現の増大がある（例えば、ＫａｌｌｕｒｉおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１１９（６），ｐ１４２０−１４２８；２００９；Ｆａｓｓｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２５；ｐ８６−９９；２０１２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＣＢ；１７２；ｐ９７３−９８１；２００６）。ＥＭＴ表現型はまた、遊走、浸潤の能力の増大、またはアノイキス／アポトーシスに対する抵抗性によっても識別することができる。上皮間葉転移を被った細胞は、したがって、上皮マーカの低減および間葉マーカまたはＥＭＴ表現型の出現によって検出することができる。
【００３４】
マーカの発現は、一般に、別の状態に対して、ある状態の細胞発現のレベル（遺伝子レベルまたはタンパク質レベル（例えば、細胞表面発現など）を比較することにより、判定することができる。例えば、１つまたは複数の特定のマーカの発現のレベルは、非癌細胞と比較して、癌細胞において判定することができる。あるいは、１つまたは複数の特定のマーカの発現のレベルは、ＥＧＦＲ阻害剤に対して敏感な癌細胞と比較して、ＥＧＦＲ阻害剤に対して耐性の癌細胞において判定することができる。さらに、１つまたは複数の特定のマーカの発現のレベルは、統計的に、対照に典型的な値に対して評価することもできる。
【００３５】
このような治療から利益を受ける個体としては、前立腺癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブまたは基底細胞型）、子宮内膜癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸直腸癌、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、膵臓癌、腎細胞癌等（これらの癌の進行または転移形態を含む）などの癌（すなわち、上皮性癌）を有する者が挙げられる。
【００３６】
本発明を実施するために用いることができる抗クラステリン抗体の例示的実施形態としては、ヒトクラステリンのβサブユニットのＣ末端部分のアミノ酸４２１および４４３に結合することができるものがある。本発明に含まれる抗体または抗原結合性フラグメントのより具体的実施形態としては、国際公開第２００７／０３０９３０号パンフレットの下、公開された国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００６／００１５０５号明細書および国際公開第２０１１／０６３５２３号パンフレットの下、公開された国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００１８８２号明細書に記載されているものが挙げられる。
【００３７】
本発明は、特に、１６Ｂ５、２１Ｂ１２、２０Ｅ１１、１６Ｃ１１および１１Ｅ２として同定される抗体のものと同一の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２および／またはＣＤＲＬ３）を含む抗体および抗原結合性フラグメントを包含する。より具体的には、本発明は、特に、１６Ｂ５、２１Ｂ１２、２０Ｅ１１、１６Ｃ１１および１１Ｅ２として同定されるもの（また、ＰＣＴ／ＣＡ２００６／００１５０５号明細書を参照）またはヒト化１６Ｂ５（ｈ１６Ｂ５）、ヒト化２１Ｂ１２（ｈ２１Ｂ１２）、ｈ１６Ｂ５ＶＬコンセンサス１、ｈ１６Ｂ５ＶＬコンセンサス２、ｈ１６Ｂ５ＶＬコンセンサス３、ｈ１６Ｂ５ＶＨコンセンサス１、ｈ１６Ｂ５ＶＨコンセンサス２、ｈ１６Ｂ５ＶＨコンセンサス３、ｈ２１Ｂ１２ＶＬコンセンサス１、ｈ２１Ｂ１２ＶＬコンセンサス２、ｈ２１Ｂ１２ＶＬコンセンサス３、ｈ２１Ｂ１２ＶＨコンセンサス１、ｈ２１Ｂ１２ＶＨコンセンサス２もしくはｈ２１Ｂ１２ＶＨコンセンサス３として同定されるもの（ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００１８８２号明細書も参照）と同一の軽鎖および／または重鎖を有する抗体および抗体結合性フラグメントを包含する。
【００３８】
２０Ｅ１１、１６Ｃ１１および１１Ｅ２として同定される抗体の軽鎖および／または重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号６２〜６７に示され、ここで、推定相補性製決定領域は太字で示す。
【００３９】
抗体および抗原結合性フラグメントの他の例示的実施形態としては、本明細書で同定される抗体と競合し得るものが挙げられる。
【００４０】
本発明は、本明細書に記載する特徴を有するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体（単離された）ならびに本明細書に記載の特徴を有する抗原結合性フラグメントを包含する。また、モノクローナル、キメラ、ヒト化もしくはヒト抗体同士の軽鎖および／または重鎖の並び替えを含む抗体または抗原結合性フラグメントも本発明に含まれる。
【００４１】
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、従って、ヒト抗体のヒト定常領域のアミノ酸および／またはフレームワークアミノ酸を含み得る。
【００４２】
用語「抗体」は、無傷抗体、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を指す。用語「抗体」はまた、二重特異的抗体などの多重特異的抗体を包含する。ヒト抗体は、通常、２つの軽鎖と２つの重鎖から成り、それぞれ可変領域および定常領域を含む。軽鎖可変領域は、本明細書においてフレームワーク領域の側面に位置するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として同定されている３つのＣＤＲを含む。重鎖可変領域は、本明細書においてフレームワーク領域の側面に位置するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３として同定される３つのＣＤＲを含む。
【００４３】
本明細書において用語「抗原結合性フラグメント」は、抗原に結合する能力を保持している１つまたは複数のフラグメント（例えば、ＫＡＡＧ１、ＫＡＡＧ１の分泌形態、またはその変異体）を指す。抗体の抗原結合機能は、無傷抗体のフラグメントによって実施され得ることが明らかにされてきた。抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語に包含される結合性フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、即ちＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、即ちヒンジ領域におけるジスルフィド架橋を介して連結される２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一群（ｓｉｎｇｌｅ  ａｒｍ）のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、ＶＨ  ＣＤＲ３が挙げられる。更にまた、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は、別々の遺伝子によってコードされるが、組み換え方法を用いて、合成リンカーにより、これらを単一ポリペプチド鎖とすることができ、この単一ポリペプチド鎖内でＶＬ領域とＶＨ領域が対合することによって１価分子が形成される（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３）を参照のこと）。そのような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語に包含されるように意図されたものである。更にまた、抗原結合性フラグメントは、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合された結合ドメインポリペプチド（例えば、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはリンカーペプチドを介して軽鎖可変領域に融合された重鎖可変領域）と、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域と、（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域と、を含んでなる結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質を含む。ヒンジ領域は、１つまたは複数のシステイン残基をセリン残基で置換することによって、二量体化が防止されるように修飾してもよい。そのような結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は更に、米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１３３９３９号明細書に開示されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を使用して取得され、これらのフラグメントは、無傷抗体と同じ方法で、利用のためにスクリーニングされる。
【００４４】
典型的な抗原結合部位は、軽鎖免疫グロブリンと重鎖免疫グロブリンとを対にして形成された可変領域から構成される。抗体可変領域の構造は非常に整合性がとれており、極めて類似した構造を呈する。これらの可変領域は典型的に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのハイパー可変領域で離間された比較的相同的なフレームワーク領域（ＦＲ）から構成される。抗原結合性フラグメントの全般的な結合活性は多くの場合、ＣＤＲの配列によって指令される。ＦＲは、往々にして、最適な抗原結合のために、ＣＤＲの３次元での適切な位置決めおよびアライメントにおいてある役割を果たす。
【００４５】
本発明の抗体および／または抗原結合性フラグメントは、例えば、マウス、ネズミもしくは他のいずれかの哺乳動物、または他の供給源（組み換えＤＮＡ技術によるものなど）に由来するものであってよい。
【００４６】
他のクラステリン阻害剤としては、例えば、限定されないが、ｓｉＲＮＡ（例えば、標的クラステリンＲＮＡ）およびアンチセンス（例えば、標的クラステリンＲＮＡ）を挙げることができる。
【００４７】
アンチセンスの例示的実施形態として、例えば、米国特許第７，５６９，５５１号明細書（その全内容を参照として本明細書に組み込む）に記載されているものがあり、特に、ＯＧＸ−０１１（クスチルセンナトリウムとしても知られる；ＯｎｃｏＧｅｎｅｘ、配列番号６１も参照のこと）が挙げられる。
【００４８】
ＥＧＦＲ阻害剤の例示的実施形態として、例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ラパチニブまたはセマジニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤が挙げられる。ＥＧＦＲ阻害剤のその他の例示的実施形態としては、例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、またはメツズマブなどのモノクローナル抗体がある。
【００４９】
本発明の併用薬剤による治療の利益を受け得るその他の個体としては、１つまたは複数のＥＧＦＲ阻害剤に対して耐性の腫瘍を有する者が挙げられる。このような個体は、併用薬剤の投与の前に選択することができる。
【００５０】
ＥＧＦＲ耐性は、腫瘍再発などの臨床パラメータを評価するか、または耐性の分子マーカ、例えば、ＥＧＦＲもしくはＥＧＦＲ経路における突然変異、増幅（ＲＡＳ／ＭＡＰＫ、ホスホリパーゼＣ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ／ＡＫＴ、ＳＲＣ／ＦＡＫ経路など）および／またはＥＭＴマーカを測定することにより、決定することができる。
【００５１】
従って、ＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性についての試験は、ＥＧＦＲにおける突然変異（例えば、チロシンキナーゼドメインでの突然変異、短縮型変異、挿入）の存在の判定、ＥＧＦＲ増幅の判定を含んでよい。
【００５２】
更に、本明細書において使用される「薬学的に許容可能な担体」または「医薬担体」は当該技術分野において公知であり、０．０１〜０．１Ｍもしくは０．０５Ｍのリン酸バッファー、または０．８％生理食塩水を包含するが、これらに限定されない。加えて、そのような薬学的に許容可能な担体は、水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンであってもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝媒体を含む）が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充液、電解質補充液、例えばリンガーデキストロース系、およびこれらに類するものが挙げられる。保存料および他の添加剤、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、照合剤、不活性ガス、およびこれらに類するものもまた、存在し得る。
【００５３】
本明細書に記載する実験は、１６Ｂ５のヒト化形態（ｈ１６Ｂ５）を用いて実施した。
【実施例】
【００５４】
実施例１
ＮＳＣＬＣ細胞株はｓＣＬＵを発現する
クラステリンが、ＮＳＣＬＣ腫瘍由来の細胞株に発現されたか否かの判定を試みた。第１ステップとして、各細胞株から全ＲＮＡを用意し、これをテンプレートとして用いて、ランダムプライムドオリゴヌクレオチドによりｃＤＮＡを作製した。ヒトクラステリン遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いて、当業者には公知の方法によりＲＴ−ＰＣＲを実施した。５’−プライマー（ｏｇｓ１７８８）は、配列番号５７に示す配列によりコードされ、３’−プライマー（ｏｇｓ１７２１）は、配列番号５８に示す配列によりコードされる。ＰＣＲ産物は、長さ１４１２ｂｐである。各反応における全ＲＮＡの量のコントロールとして、ヒトハウスキーピング遺伝子アクチンに特異的なオリゴヌクレオチドを用いてパラレルＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。５’−プライマー（ｏｇｓ３８７）は、配列番号５９に示す配列によりコードされ、３’−プライマー（ｏｇｓ９６５）は、配列番号６０に示す配列によりコードされる。ＰＣＲ産物は、長さ７４６ｂｐである。図１に示すように、分析したＮＳＣＬＣ細胞株は、１つを除くすべてが、クラステリンをコードするｍＲＮＡを含んでおり、これは、それぞれ異なるレベルで検出された。予想したように、すべてのＲＮＡサンプルにアクチンが存在していたが、これは、各ＲＴ−ＰＣＲ反応においてほぼ当量の出発全ＲＮＡが存在したことを示している。この分析に用いた細胞株は、次の通りである：レーン１、Ａ５４９；レーン２、ＥＫＶＸ；レーン３、ＨＯＰ−６２；レーン４、ＨＯＰ−９２；レーン５、Ｈ３２２Ｍ；レーン６、Ｈ２２６；レーン７、Ｈ２３；レーン８、Ｈ４６０；およびレーン９、Ｈ５２２。
【００５５】
並行して、ＮＳＣＬＣ細胞株によりｓＣＬＵが分泌されるか否かを判定した。Ａ５４９、Ｈ２２６、Ｈ２９２、Ｈ４６０およびＨ１２９９細胞をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、製造業者の指示に従って培養した。培養して数日が経過し、細胞が密集状態（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達したら、各細胞株からの順化培地を分析のために回収した。ヒトクラステリンを測定するように設計された市販のＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ  ＬＬＣ，Ｃａｎｄｌｅｒ，ＮＣ）を取得し、製造業者の指示に従って分析を実施した。図２の表に示すように、５つの培地サンプルは、１０ｎｇ／ｍｌを下回るレベルであったＨ２２６細胞株を除いて、すべてが、１３．６ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌを超える範囲のｓＣＬＵレベルを含んでいた。
【００５６】
総合すると、これらの結果は、ＮＳＣＬＣを有する患者からの癌細胞株は、ｓＣＬＵを多量に分泌し、ｓＣＬＵのＥＭＴ誘導活性を阻害するｈ１６Ｂ５などの抗体に応答する可能性があることを示している。
【００５７】
実施例２
ｈ１６Ｂ５とのＮＳＣＬＣ細胞のインキュベーションは、上皮細胞マーカ、Ｅ−カドヘリンの発現増大を引き起こす
また、免疫蛍光法を用いて、Ａ５４９細胞の表面での発現をモニターすることにより、Ｅ−カドヘリンの発現も調べた。手短には、細胞をカバーガラスに接種し、１０μｇ／ｍｌの対照ＩｇＧまたはｈ１６Ｂ５のいずれかと一緒に４８時間インキュベートした。このインキュベーション後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定してから、マウス抗ヒトＥ−カドヘリン抗体（製造業者）と一緒に１時間インキュベートした。洗浄後、Ｅ−カドヘリンで染色した細胞をローダミンレッド−Ｘに結合させた二次抗体と一緒にインキュベートした。スライドを取り付け、特異的Ｅ−カドヘリン染色を蛍光顕微鏡により視覚化した。図３に示すように、Ａ５４９細胞は、その細胞表面でのＥ−カドヘリン発現は低く、非特異的ＩｇＧと４８時間のインキュベーションによってそのタンパク質のレベルは増加しなかった（左側パネルを参照）。これに対し、ｈ１６Ｂ５と細胞のインキュベーションでは、Ａ５４９細胞の表面でのＥ−カドヘリン染色の強度に顕著な増加が起こった（右側パネルを参照）。これは、細胞の上皮特性が非常に高いことを示している。
【００５８】
実施例３
ｈ１６Ｂ５によるｓＣＬＵの阻害は、ＮＳＣＬＣ細胞におけるＥＧＦＲ発現およびリン酸化の増大を引き起こす
この実施例では、ｈ１６Ｂ５を用いてＥＭＴを阻害することによって、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＥＧＦＲの状態に何らかの作用が起こるか否かを調べた。この問題に取り組むため、これらの細胞における受容体の発現およびリン酸化を測定するために条件を最適化した。ＥＧＦＲは、ＥＧＦなどのそのリガンドへの曝露後、極めて急速にリン酸化することがわかっている。このリン酸化と並行して、この受容体は、内在化され、再循環されるため、その存在は細胞表面から消失する。比較的高レベルのｓＣＬＵを分泌する２つの細胞株、Ａ５４９およびＨ２２６をこの分析のために選択した。細胞をマルチウェルプレート内に接種し、１０μｇ／ｍｌのｈ１６Ｂ５、１０μｇ／ｍｌの対照ＩｇＧまたはビヒクルのＰＢＳで４８時間処理した。このインキュベーション後、細胞をＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理し、細胞を様々な時点で採取して、細胞溶解物に変換した。これらの溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動させ、タンパク質をナイロン膜に転移させた後、ウエスタンブロットに用いることにより、ＥＧＦＲの発現またはリン酸化を調べた。ＥＧＦＲの発現を測定するために、クローン１００５と称する市販の抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を使用し、また、ＥＧＦＲのリン酸化は、クローン４Ｇ１０と称する抗ホスホチロシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｅｔｏｂｉｃｏｋｅ，ＯＮ）を用いてモニターした。図４に示すように、ビヒクル対照で４８時間、その後ＥＧＦＲで処理したＡ５４９細胞は、予想通り、ＥＧＦＲ発現の低減を示したが、１０分後に急速に回復する（上方パネル：レーン１とレーン２を比較）。対照的に、ｈ１６Ｂ５抗ｓＣＬＵ抗体で処理したＡ５４９細胞は、受容体のＥＧＦ誘導による分解から細胞を防御した（上方パネル：レーン５とレーン６を比較）。各レーンのタンパク質の量を照査するため、膜に抗アクチン抗体（クローンＡＣ−１５、Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）を再ブロッティングし、上記抗体を、ゲル上で分離した各サンプルに等しく発現させた。同じ手法を用いて、他のＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ２２６を調べたところ（下方パネル）、観察された結果は、Ａ５４９細胞で認められたものと類似していた。この場合、細胞を対照で４８時間処理すると、ＥＧＦＲのＥＧＦ誘導分解はさらに顕著であった（下方パネル、レーン１〜４）。ｈ１６Ｂ５で処理した細胞の場合、ＥＧＦＲの減少は見られなかった（下方パネル、レーン５〜８）。これもまた、抗体によるｓＣＬＵの阻害によって、ＥＧＦＲ発現の維持がもたらされることを示すものであった。従って、これらの知見から、細胞が、ＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性の増大を呈示することが示唆される。
【００５９】
これらの細胞におけるＥＧＦＲの活性化も調べた。この場合、受容体のチロシン−リン酸化形態としか相互作用しない抗体を膜にブロッティングした。予想したように、Ａ５４９細胞において、ＥＧＦの非存在下でＥＧＦＲのリン酸化は認められなかった（図５参照、上方パネル、レーン１およびレーン５）。しかし、細胞をＥＧＦで処理したところ、２分後であっても、リン酸化チロシン残基の出現が検出された（上方パネル、レーン２およびレーン６）。ｈ１６Ｂ５で４８時間処理した細胞は、非処理のまま放置した細胞と比較して、ＥＧＦＲに、より多量のリン酸化チロシン残基を示した。ＥＧＦＲのリン酸化のこのような相違は、Ｈ２２６細胞でも再現された（図５参照、下方パネル、レーン２〜４をレーン６〜８と比較）。追加の対照として、ＥＧＦに曝露する前に、Ａ５４９細胞を対照抗体でも４８時間処理した（図６）。ここでもやはり、ＥＧＦＲのリン酸化量の変化は、ｈ１６Ｂ５で処理した細胞でしか認められなかった（レーン２、３（対照）および８、９（ＩｇＧ）とレーン５、６（ｈ１６Ｂ５）を比較）。
【００６０】
総合すると、以上の結果から、肺癌細胞におけるＥＭＴのブロッキングは、これらの細胞のＥＧＦＲ状態に影響を与えることがわかる。特に、ｈ１６Ｂ５などのモノクローナル抗体によるｓＣＬＵ  ＥＭＴ誘導活性の阻害は、これらの細胞におけるＥＧＦＲ状態が停止される機序の１つである。本発明者らは、ｈ１６Ｂ５で処理した肺癌細胞は、Ｅ−カドヘリンの発現を増大させたことから、これらがより上皮細胞性であることを証明した。ＥＧＦＲ感受性の増大と、抗体でｓＣＬＵをブロックすることによるＥＭＴの阻害との組合せは、ＥＧＦＲ阻害剤の効力を高めると考えられる。最後に、ＥＧＦＲを発現し、ＥＭＴを経たあらゆる癌細胞が、肺癌細胞と同様に、モノクローナル抗体などのｓＣＬＵの阻害剤に応答すると考えられる。
【００６１】
実施例４
ｈ１６Ｂ５の存在下でＥＧＦＲ阻害剤に対する癌細胞の感受性を増大する方法
抗クラステリン抗体でｓＣＬＵをブロックすることにより癌細胞のＥＭＴを阻害すると、細胞表面でのＥＧＦＲ発現の増大もしくはＥＧＦＲリン酸化の増大、またはその両方が起こる。従って、ＥＧＦＲの阻害剤は、ＥＭＴがクラステリン阻害剤で阻害される条件下で、増大した効力を有すると考えられる。
【００６２】
例えば、癌細胞株をマルチウェルプレートに接種し、集密状態に近づいたら、細胞を抗クラステリン抗体（例えば、ｈ１６Ｂ５）で処理することにより、ＥＭＴを阻害する。先験的に、ｓＣＬＵ、ＴＧＦβ、ＥＧＦなどのＥＧＦＲのリガンド、またはその他の類似分子などの公知の誘導物質で、ＥＭＴを誘導するのが有用な場合もある。
【００６３】
ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、受容体に対するリガンド結合をブロックするか、またはＥＧＦＲの二量体化を阻止するモノクローナル抗体、ＴＫ阻害剤など）も、抗クラステリン抗体と一緒に、またはその後に（例えば、数時間後）ウェルに添加する。場合により、ＥＧＦＲ阻害剤は、抗クラステリン抗体の前に、ウェルに添加してもよい。
【００６４】
ＥＧＦＲ阻害剤は、１ｆモル／Ｌ〜１００マイクロモル／Ｌの範囲の様々な濃度で添加してよい。ｈ１６Ｂ５でｓＣＬＵを阻害したとき、ＥＧＦＲ阻害剤の細胞傷害性が増大するか否かを判定するために、残った細胞の数を、増殖アッセイ、浸潤アッセイ、アポトーシスアッセイまたは遊走アッセイなどの標準プロトコルを用いて決定する。このアッセイに適した癌細胞としては、ＥＧＦＲ阻害剤に耐性の癌細胞、または野生型ＥＧＦＲ、活性突然変異を含むＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ遺伝子増幅およびＥＧＦＲの状態を改変しうるその他の状態を発現する癌細胞が挙げられる。
【００６５】
クラステリン阻害剤とＥＧＦＲ阻害剤の併用については、十分に確立された癌のモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで試験することもできる。例えば、ＥＧＦＲを発現するヒト癌細胞株を免疫不全マウスに注射し、腫瘍異種移植片が移植されるまで、増殖させる。ＥＭＴをブロックするために、ＥＧＦＲ阻害剤（同時または逐次投与）と併用して、抗クラステリン抗体（例えば、１６Ｂ５、ｈ１６Ｂ５など）で動物を処理する。カリパスなどの計器を用いた直接サイズ測定を含む様々な方法により、腫瘍の増殖をモニターする。腫瘍増殖を測定するのに用いられる他の方法としては、蛍光または生物発光が挙げられ、その場合、腫瘍細胞は、蛍光または生物発酵を発現するように遺伝子改変される。別の例では、腫瘍増殖は、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）またはコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン手法を用いてモニターすることもできる。これらのアッセイにおいて、クラステリン阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤は、静脈内、皮下、筋内、腫瘍内または経口などの様々な経路により反復して投与することができる。典型的用量は、１マイクログラム／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【００６６】
この方法の適用に基づき、ＥＧＦＲ阻害剤と併用した、ＥＭＴをブロックする薬剤（例えば、１６Ｂ５、ｈ１６Ｂ５など）での治療により、個別に投与するいずれかの薬剤と比較して、増強した抗腫瘍効果が得られる。
【００６７】
この実施例では、ＥＧＦＲ阻害剤に対する癌細胞の応答は、ｈ１６Ｂ５などのｓＣＬＵの阻害剤と並行して投与したとき、増大し得ることを実証する。野生型ＥＧＦＲを発現することがわかっている２つのＮＣＳＬＣ細胞株、Ｈ１２９９およびＨ４６０（Ａｋａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）を、ｓＣＬＵ（０．２５μｇ／ｍｌ）、ＴＧＦβ（２ｎＭ）のいずれか、または２つのタンパク質の組合せで、４８時間処理することにより、ＥＭＴを刺激した。この誘導後、エルロチニブ（２０μＭ）で９６時間処理した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、細胞の数を決定した。対照として、別の細胞は、ｓＣＬＵまたはＴＧＦβで誘導しなかった。図７Ａに示すように、Ｈ１２９９細胞は、Ｈ４６０細胞よりエルロチニブに対して感受性が高かった。エルロチニブとｈ１６Ｂ５の併用によって、細胞数はさらに減少した（Ｈ１２９９およびＨ４６０細胞はそれぞれ１０．２％および１３．８％減少）が、これは、内在的に発現したｓＣＬＵの活性（図２参照）をブロックすることにより、エルロチニブが、ＥＧＦＲ陽性肺癌細胞を殺傷する能力が増大したことを示している。また、ｓＣＬＵまたはＴＧＦβのいずれかで、ＥＭＴを経るように誘導した細胞でのエルロチニブに対する応答も比較した。図７Ｂに示すように、ＥＭＴの刺激によって、エルロチニブに対する細胞の応答性は変化しなかった。しかし、細胞数の減少は、ＥＭＴを経ていない細胞と比較し、これらの条件下で、ｈ１６Ｂ５の存在下の方が大きかった（Ｈ１２９９およびＨ４６０細胞についての１６．１％および２４．０％）。これは、エルロチニブ応答の増大は、ＥＭＴが阻害された細胞でより大きいことを示している。注目すべきことに、エルロチニブ応答性の増加は、このＥＧＦＲ阻害剤に対し、より耐性であるＨ４６０細胞で、より大きいことが認められた。この最後の結果は、ＥＧＦＲ阻害剤に対して耐性になった肺癌患者を治療する戦略として、ｈ１６Ｂ５によるｓＣＬＵ阻害の可能性を示すものである。
【００６８】
実施例５
他の癌適応での使用を目的とする併用薬剤
トリプルネガティブ（すなわち、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体の発現の欠乏、ならびにＨＥＲ２発現の非存在）または基底細胞型であることがわかっている乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、ゲフィチニブと併用した抗クラステリン抗体またはゲフィチニブ単独で治療した。細胞増殖を標準アッセイにより数日の期間にわたって測定した。
【００６９】
抗クラステリン抗体とゲフィチニブの併用は、腫瘍細胞増殖を阻害する上で、ゲフィチニブ単独の場合より有効であった（データは示していない）。
【００７０】
実施例１〜５に記載したものと同様の方法を用いて、他の抗クラステリン抗体および／またはＥＧＦＲ阻害剤の組合せを試験してもよい。
【図２】
2015512877.tif 000003
【図３】
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【図７】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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