(57)【要約】  本開示は、植物の窒素応答に関する。実施形態は、植物における窒素源及び／又はそれらの代謝物に対する応答に寄与する調節因子に関する。
2015511486.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物における栄養効率を増加させる方法であって、
少なくとも１つの異種ポリペプチドを植物の根組織に導入するステップを含み、前記異種ポリペプチドがＴＧＡ１、ＴＧＡ４及びそれらの組合せからなる群から選択される、方法。
【請求項２】
異種ポリペプチドがＴＧＡ１である場合、異種ポリペプチドが配列番号１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異種ポリペプチドがＴＧＡ４である場合、異種ポリペプチドが配列番号１１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
栄養素利用効率の増加が、同一種の植物と比較して硝酸塩調節の効率の増加を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
植物における根の成長を増加させる方法であって、
異種ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを植物の根組織に導入し、それにより、異種ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを含む改変植物を作製するステップを含み、改変植物が異種ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを含まない同一種の植物と比較して、根の成長の増加を含む、方法。
【請求項６】
根の成長が一次根又は側根の成長である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
異種ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを導入するステップが、核酸を根組織に導入するステップを含み、核酸が異種ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
窒素制限条件で改変植物を生育させるステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
異種ポリペプチドがＴＧＡ１転写因子である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ＴＧＡ１転写因子が配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
異種ポリペプチドがＴＧＡ４転写因子である、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
ＴＧＡ４転写因子が配列番号１１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＴＧＡ１転写因子ヌクレオチド配列が配列番号１５と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列又は配列番号１５からなる核酸とハイブリダイズする核酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
ＴＧＡ４転写因子ヌクレオチド配列が配列番号１６と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列又は配列番号１６からなる核酸とハイブリダイズする核酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
根組織が根細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
異種ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドをコードする核酸配列が根組織特異的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法により作製された改変植物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の改変植物から産生された種子。
【請求項１９】
農業機能を有する核酸配列を含む核酸分子であって、核酸配列が、配列番号１５と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列、配列番号１５からなる核酸とハイブリダイズする核酸配列、配列番号１６と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列、及び配列番号１６からなる核酸とハイブリダイズする核酸配列からなる群から選択され、前記核酸配列が異種転写可能ポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、核酸分子。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸分子により安定的に形質転換された遺伝子導入植物細胞。
【請求項２１】
遺伝子導入植物を作製する方法であって、
異種ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸を植物の根組織に導入し、それにより遺伝子導入植物を作製するステップを含む、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法により作製された遺伝子導入植物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の遺伝子導入植物により産生された種子。
【請求項２４】
植物が、同一種の野生型植物と比較して、図５に示す遺伝子の発現の増加を含む、請求項２２に記載の遺伝子導入植物。
【請求項２５】
遺伝子が硝酸トランスポーターＮＲＴ２．１、硝酸トランスポーターＮＲＴ２．２又は亜硝酸還元酵素（ＮＩＲ）である、請求項２２に記載の遺伝子導入植物。
【請求項２６】
同一種の野生型植物と比較して、高い一次根及び／又は側根の成長を含む、請求項２２に記載の遺伝子導入植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、「硝酸塩レベルに関連する植物における転写因子及びそれを用いる方法」について２０１２年３月５日に出願した米国仮特許出願第６１／６０６，８５２号の出願日の利益を主張するものである。
【０００２】
本開示は、植物における遺伝子発現に対する窒素の影響に関する。実施形態は、環境における窒素含有分子に対する植物の応答に寄与する、遺伝子及びそれによりコードされる調節因子に関する。
【背景技術】
【０００３】
窒素（Ｎ）は、植物の必須主要栄養素であり、その利用可能性は、植物の成長及び作物の生産の主要な制限因子である。硝酸塩（ＮＯ３）は、好気性土壌中の植物のための無機窒素の主な源である。例えば、Crawford及びGlass(1998年) Trends Plant Sci.、3巻、389〜95頁、Hirsch及びSussman(1999年)、Trends Biotechnol.、17巻356〜61頁を参照のこと。硝酸塩は、ＡｔＮＲＴ１．１（Tsayら(1993年) 、Cell、72巻、705〜13頁）、ＡｔＮＲＴ１．２（Huangら(1999年)、Plant Cell、11巻、1381〜92頁）、ＡｔＮＲＴ２．１（Littleら(2005年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、102巻、13693〜8頁）及びＡｔＮＲＴ２．２（Liら(2007年)、Plant Physiol.、143巻、425〜33頁）などの特定のトランスポーターを介して植物根によって取り込まれる。いったん根細胞に入れば、硝酸塩は、それぞれ硝酸還元酵素（ＮＲ）及び亜硝酸還元酵素（ＮＩＲ）の作用により亜硝酸塩（ＮＯ２−）に、次にアンモニウム（ＮＨ４＋）に還元され得る（Crawford及びGlass(1998年)、前出）。結果として生じるアンモニウムは、次にグルタミン合成酵素（ＧＳ）及びグルタミン酸合成酵素（ＧＯＧＡＴ）サイクルによりグルタミン酸及びグルタミンに同化される（Stitt(1999年)、Curr. Opin. Plant Biol.、2巻、178〜86頁）。
【０００４】
シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）において、硝酸塩は、栄養素としての、また遺伝子発現及び発育応答を制御する強力なシグナルとしての機能を果たす（Vidal及びGutierrez(2008年)、Curr. Opin. Plant Biol.、11巻、521〜9頁、Kroukら(2010年a)、Curr. Opin. Plant Biol.、13巻、266〜73頁、Tsayら(2011年)、Annu. Rev. Plant Biol.、62巻、207〜26頁）。亜硝酸塩と同様に、硝酸塩もシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における全体的な遺伝子発現を調節するシグナルとしての機能を果たし得る（Wangら(2007年) Plant Physiol、145巻、1735〜45頁）。亜硝酸塩のシグナル伝達作用についてはほとんどわかっておらず、特定の機能が亜硝酸応答遺伝子に関連付けられなかった。しかし、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）根における硝酸塩検出システムが硝酸塩と同様に亜硝酸塩も認識することが提唱された。その理由は、両シグナルが広範な重複した応答を有するためである（同上）。
【０００５】
硝酸トランスポーター、ＮＲ及びＮＩＲ、転写因子、ストレス応答遺伝子、Ｎ／Ｃバランスに関与する炭素（Ｃ）同化酵素、並びにその産物がシグナル伝達経路に関与する遺伝子を含む、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における硝酸応答遺伝子は、多く、変化する（Vidal及びGutierrez(2008年)、前出、Kroukら(2010年a)、前出、Tsayら(2010年)、前出）。トランスクリプトミクス解析により、多くのシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）硝酸応答遺伝子が同定された（Wangら(2003年)、Plant Physiol.、132巻、556〜7頁、Scheibleら(2004年)、Plant Physiol.、136巻、2483〜99頁、Wangら(2004年)、Plant Physiol.、136巻、2512〜22頁、Gutierrezら(2007年)、Genome Biol.、8巻、R7頁）。しかし、硝酸応答の惹起に関与するほんの一握りの調節因子が同定されたにすぎなかった。
【０００６】
硝酸トランスポーターＮＲＴ１．１は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における硝酸塩センサーとして報告された（Hoら(2009年)、Cell、138巻、1184〜94頁）。さらに、ＮＩＮ様タンパク質７転写因子は、硝酸塩同化の調節に関与すると記載された（Castaingsら(2009年)、Plant J.、57巻、426〜35頁）が、ANR1 MADS-box遺伝子は、外部硝酸塩に応答する側根成長のレギュレーターとして同定された（Zhang及びForde(1998年)、Science、279巻、407〜9頁）。さらに、カルシニューリンＢ様（ＣＢＬ）相互作用プロテインキナーゼ（ＣＩＰＫ）遺伝子ＣＩＰＫ８が硝酸塩の検出に関与することが見いだされた（Huら(2009年)、Plant J.、57巻、264〜78頁）。また、Ｎ応答遺伝子を抑制するＬＢＤ３７／３８／３９転写因子が硝酸塩の取込み及び同化に必要であることが見いだされた（Rubinら(2009年)、Plant Cell、21巻、3567〜84頁）。つい最近、硝酸応答ｍｉＲ３９３／ＡＦＢ３モジュールがシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における外部及び内部Ｎ利用可能性に応じて根系構造を制御することが見いだされ（Vidalら(2010年b)、Proc. Natl. Sci. USA、107巻、4477〜82頁）、側根構造の制御に関与する根におけるグルタミンによる細胞特異的調節がｍｉＲ１６７／ＡＲＦ８モジュールに帰せられた（Giffordら(2008年)、Proc. Natl. Acad. Sci, USA、105巻、803〜8頁）。
【発明の概要】
【０００７】
新規な窒素応答調節因子ＴＧＡ１及びＴＧＡ４を本明細書で説明する。ＴＧＡ１及びＴＧＡ４は、窒素の取込み及び還元に関与する遺伝子の発現の窒素調節を媒介する。実施形態において、これらの転写因子は、根組織の成長に影響を及ぼし、及び／又は植物の成長及び生産性に影響を及ぼす、窒素の吸収及び同化を改善するために用いることができる。
【０００８】
一次根及び側根の成長は、硝酸塩の存在下で根の成長を促進する正の役割を示す、ｔｇａ１／ｔｇａ４二重突然変異体において影響を受けることが認められた。したがって、いくつかの実施形態において、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４は、例えば、窒素制限条件下での植物における一次根及び／又は側根の成長を促進するために用いることができる。
【０００９】
ＴＧＡ１及びＴＧＡ４の調節制御下でｔｇａ１／ｔｇａ４二重突然変異植物において同定された遺伝子のほぼすべて（９７％）が窒素により調節される。したがって、いくつかの実施形態において、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４は、窒素に応答する遺伝子（例えば、図５で特定した遺伝子）の発現に用いることができる。例えば、特定の実施形態において、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４は、硝酸トランスポーターＮＲＴ２．１、ＮＲＴ２．２及び／又は亜硝酸還元酵素ＮＩＲの発現に影響を及ぼすために用いることができる。特定の実施形態において、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４は、ＴＧＡ１又はＴＧＡ４結合モチーフに作動可能に連結された遺伝子の発現に用いることができる。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本明細書で述べる方法に用いるＴＧＡ１ポリペプチドは、配列番号１〜１０、又は配列番号１〜１０の１つ若しくは複数と配列同一性を共有する相同体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で述べる方法に用いるＴＧＡ４ポリペプチドは、配列番号１１〜１４、又は配列番号１１〜１４の１つ若しくは複数と配列同一性を共有する相同体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で述べる方法に用いる核酸は、ＴＧＡ１又はＴＧＡ４ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含み得る。
【００１１】
いくつかの実施形態は、異種ＴＧＡ１ポリペプチド及び／又はＴＧＡ１コード核酸、並びに／又は異種ＴＧＡ４ポリペプチド及び／又はＴＧＡ４コード核酸を含む遺伝子導入植物又はその子孫を含む。特定の実施形態において、異種ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４コード核酸は、遺伝子導入植物又はその子孫において発現する。特定の実施形態において、異種ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４コード核酸が発現する組織は、根である。いくつかの実施形態による方法は、制限窒素源を有する環境条件下で前述の遺伝子導入植物又はその子孫を生育させるステップを含む。いくつかの例において、異種ＴＧＡ１及び／若しくはＴＧＡ４ポリペプチド並びに／又は異種ＴＧＡ１及び／若しくはＴＧＡ４コード核酸を含む遺伝子導入植物又はその子孫は、窒素制限条件（例えば、低窒素条件）下で成長及び／又は耐性の増大を示す。
【００１２】
いくつかの実施形態は、一次根及び／又は側根の成長が促進される、植物を作製する方法を含む。そのような方法は、例えば、及び制限なしに、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４コード核酸（例えば、ベクター中）を植物又はその細胞若しくは組織に導入するステップと、植物を再生するために細胞又は組織を場合によって培養するステップと、一次根及び／又は側根の成長の促進を目的として植物を選択するステップとを含み得る。いくつかの例において、選択される植物は、窒素制限条件下で栽培する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本明細書で述べる方法に用いる植物は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の種であり得る。いくつかの実施形態において、植物は、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、ブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）、トウダイイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、ヤナギ科（Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ）及びフトモモ科（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）からなる群から選択することができる。前述の方法のいずれかにより得られる植物、植物物質、植物細胞及び種子も特定の実施形態の特徴である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】硝酸塩に対する、及び硝酸塩還元のシグナル下流に対するＴＧＡ１及びＴＧＡ４の応答の例示を含む図である。図１Ａは、野生型「Ｃｏｌ−０」植物におけるＴＧＡ１の硝酸応答を含む。図１Ｂは、Ｃｏｌ−０植物におけるＴＧＡ４の硝酸応答を含む。図１Ｃは、ＮＲヌル突然変異植物におけるＴＧＡ１の硝酸応答を含む。図１Ｄは、ＮＲヌル突然変異植物におけるＴＧＡ４の硝酸応答を含む。ＴＧＡ１（Ｅ）及びＴＧＡ４（Ｆ）遺伝子の亜硝酸応答。ＴＧＡ１（Ｇ）及びＴＧＡ４（Ｈ）遺伝子のアンモニウム応答。アステリスク（＊）は、対照条件と処理条件の間で有意に異なることを意味する（Ｐ＜０．０５）。
【図２】アンモニウムと比較した、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４の亜硝酸応答の例示を含む図である。図２Ａは、ＴＧＡ１の亜硝酸応答を含む。図２Ｂは、ＴＧＡ４の亜硝酸応答を含む。図２Ｃは、ＴＧＡ１のアンモニウム応答の欠如を示している。図２Ｄは、ＴＧＡ４のアンモニウム応答の欠如を示している。アステリスク（＊）は、対照条件と処理条件の間で有意に異なることを意味する（Ｐ＜０．０５）。
【図３】硝酸塩に応答する一次根及び側根の成長に対するＴＧＡ１及びＴＧＡ４の効果の例示を含む図である。図３Ａは、ｔｇａ１／ｔｇａ４及びＣｏｌ−０植物の出始めている及び出現している側根（initiating and emerging root）の数を含む。図３Ｂは、ＫＮＯ３又はＫＣｌで処理したときのＣｏｌ−０、ｔｇａ１、ｔｇａ４及びｔｇａ１／ｔｇａ４植物の１５日目に測定した一次根の長さを含む。バーは、標準偏差を表す。異なる文字は、統計的に異なる平均値を示す（Ｐ＜０．０５）。
【図４】内鞘細胞におけるＴＧＡ１及びＴＧＡ４の硝酸塩調節の例示を含む図である。図４Ａは、ＫＮＯ３又はＫＣｌで２時間処理した幼植物の内鞘細胞におけるＲＴ−ｑＰＣＲにより測定したＴＧＡ１  ｍＲＮＡの相対量を含む。図４Ｂは、ＫＮＯ３又はＫＣｌで２時間処理した幼植物の内鞘細胞におけるＲＴ−ｑＰＣＲにより測定したＴＧＡ４  ｍＲＮＡの相対量を含む。プロットした値は、３回の反復測定の平均値±標準偏差である。アステリスク（＊）は、処理の間で有意に異なることを意味する（Ｐ＜０．０５）。
【図５】Ｎ代謝に関与する遺伝子を含む、ＴＧＡ１／ＴＧＡ４により制御される硝酸応答遺伝子ネットワークの表出を含む図である。個々の遺伝子を三角形（転写因子）及び正方形（標的遺伝子）として示す。緑色の直線は、予測転写活性化を示すが、赤色の直線は、予測転写抑制を示す。細い直線は、対応する遺伝子の上流領域における１つの転写因子結合部位を示すが、太い直線は、結合部位の過剰表出を示す。矢印は、正の調節を示すが、末端に垂直線を有する端は、負の調節を示す。結節点（nodes）は、次のように機能に基づいて色分けされている：シグナル伝達（紫）、未知遺伝子（白）、ストレス応答（緑がかった青）、窒素代謝（黄）及び他の機能（灰）。
【図６】ＮＩＲ、ＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２遺伝子の硝酸依存性上方制御に対するＴＧＡ１及びＴＧＡ４の効果の例示を含む図である。図６Ａは、示した時間にわたりＫＮＯ３又はＫＣｌで処理したＣｏｌ−０及びｔｇａ１／ｔｇａ４植物におけるＮＲＴ２．１  ｍＲＮＡ転写物レベルを含む。図６Ｂは、示した時間にわたりＫＮＯ３又はＫＣｌで処理したＣｏｌ−０及びｔｇａ１／ｔｇａ４植物におけるＮＲＴ２．２  ｍＲＮＡ転写物レベルを含む。図６Ｃは、示した時間にわたりＫＮＯ３又はＫＣｌで処理したＣｏｌ−０及びｔｇａ１／ｔｇａ４植物におけるＮＩＲ  ｍＲＮＡ転写物レベルを含む。
【図７】ＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２プロモーター領域への硝酸依存的様式でのＴＧＡ１結合の例示を含む図である。抗ＴＧＡ１を用いてＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２プロモーターを含むＤＮＡを免疫沈降させた。非特異的ＩｇＧを陰性対照として用いた。免疫沈降プロモーターＤＮＡは、ＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２プロモーター領域と対照してデザインしたプライマーを用いた定量的ＰＣＲにより定量した。
【図８】硝酸塩に応答するＴＧＡ１及びＴＧＡ４の発現がｃｈｌ１−５及びｃｈｌ１−９突然変異体において影響を受けることを示す図である。Ｃｏｌ−０、ｃｈｌ１−５、ｃｈｌ１−９及びＴ１０１Ｄ植物を唯一の窒素源としての１ｍＭアンモニウムを用いて水耕法で栽培した。１５日目の明期の開始時に、植物を５ｍＭ  ＫＮＯ３又は対照としての５ｍＭ  ＫＣｌで示した時間にわたり処理した。ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ｑＰＣＲによりｍＲＮＡレベルを測定した。クラスリン遺伝子（Ａｔ４ｇ２４５５０）を標準化基準として用いた。（Ａ）ＴＧＡ１転写物レベル、（Ｂ）ＴＧＡ４転写物レベル。プロットした値は、３つの独立した生物学的反復測定の平均値±標準偏差に相当する。アステリスクは、突然変異及び野生型植物間で有意に異なる平均値を示す（Ｐ＜０．０５）。
【図９】側根及び一次根の維管束組織において発現したＴＧＡ１及びＴＧＡ４を示す図である。ｐＴＧＡ１：ＧＵＳ及びｐＴＧＡ４：ＧＵＳ系（lines）を唯一の窒素源としての１ｍＭアンモニウムを用いて２週間にわたり水耕法で栽培し、５ｍＭ  ＫＮＯ３又はＫＣｌで２時間にわたり処理し、ＧＵＳ活性について染色した。５ｍＭ  ＫＮＯ３処理ｐＴＧＡ１：ＧＵＳ（Ａ）、５ｍＭ  ＫＣｌ処理ｐＴＧＡ１：ＧＵＳ（Ｂ）、５ｍＭ  ＫＮＯ３処理ｐＴＧＡ４：ＧＵＳ（Ｃ）及び５ｍＭ  ＫＣｌ処理ｐＴＧＡ４：ＧＵＳ（Ｄ）。一次根の成熟部分の断面（Ｅ）及び硝酸塩で処理したｐＴＧＡ１：ＧＵＳ植物の一次根から出現した側根の縦断面（Ｇ）。一次根の成熟部分の断面（Ｆ）及び硝酸塩で処理したｐＴＧＡ４：ＧＵＳ植物の側根及び一次根の縦断面（Ｈ）。（スケールバー：０．１ｍｍ）。（Ｅ）及び（Ｆ）における数は、１：中心柱及び２：内皮を示す。同様の局在化パターンが各遺伝子型についての８つの独立した遺伝子導入系に認められた。
【図１０】唯一のＮ源としての１ｍＭアンモニウムを用いて２週間水耕法で栽培した表皮（Ｅｐｉ）、皮層（Ｃｏｒｔｅｘ）、内皮（Ｅｎｄｏ）、内鞘（Ｐｅｒｉ）及び中心柱（Ｓｔｅｌｅ）ＧＦＰマーカー系のＴＧＡ１及びＴＧＡ４転写物レベルを示す図であり、１５日目に幼植物を５ｍＭ  ＫＮＯ３又は５ｍＭ  ＫＣｌで２時間処理した。
【図１１】ＮＴＲ２．１、ＮＴＲ２．２及びＮＩＲ遺伝子の硝酸塩による細胞特異的調節を示す図である。表皮（Ｅｐｉ）、皮層（Ｃｏｒｔｅｘ）、内皮（Ｅｎｄｏ）、内鞘（Ｐｅｒｉ）及び中心柱（Ｓｔｅｌｅ）ＧＦＰマーカー系を唯一のＮ源としての１ｍＭアンモニウムを用いて２週間水耕法で栽培した。１５日目の夜明けに幼植物を５ｍＭ  ＫＮＯ３又は５ｍＭ  ＫＣｌで２時間処理した。全ＲＮＡを単離し、ＮＴＲ２．１、ＮＴＲ２．２及びＮＩＲのｍＲＮＡレベルをＲＴ−ｑＰＣＲにより測定した。（Ａ）ＮＴＲ２．１転写物レベル、（Ｂ）ＮＴＲ２．２転写物レベル及び（Ｃ）ＮＩＲ転写物レベルを例示する。
【図１２】低硝酸塩濃度での処理のもとでのＮＴＲ２．１及びＮＴＲ２．２の発現のＴＧＡ１及びＴＧＡ４調節を示す図である。Ｃｏｌ−１及びｔｇａ１／ｔｇａ４植物を唯一の窒素源としての１ｍＭアンモニウムを用いて水耕法で栽培した。１５日目の明期の開始時に、植物を２５０μＭ  ＫＮＯ３又は対照としての５μＭ  ＫＣｌで２時間処理した。ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ｑＰＣＲによりｍＲＮＡレベルを測定した。（Ａ）ＮＴＲ２．１転写物レベル、（Ｂ）ＮＴＲ２．２転写物レベル並びに（Ｃ）Ｃｏｌ−０及びｔｇａ１／ｔｇａ４植物の正味の硝酸塩取込みを例示する。
【図１３】示した時間にわたり５ｍＭ  ＫＮＯ３又は５ｍＭ  ＫＣｌに曝露したＴＧＡファミリーメンバーの硝酸応答を示す図である。
【図１４】示した時間にわたり５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ又は５ｍＭ  ＫＣｌに曝露した植物におけるＧＤＨ２に対する影響を示す図である。
【図１５】示した時間にわたり５ｍＭ  ＫＮＯ３又は５ｍＭ  ＫＣｌに曝露したｃｈｌ１−５及びＴ１０１Ｄ突然変異体における硝酸塩に応答したＮＲＴ２．１の発現を示す図である。
【図１６】５ｍＭ  ＫＮＯ３又は５ｍＭ  ＫＣｌで処理したＣｏｌ−０及びｔｇａ１／ｔｇａ４植物のＮＩＡ１遺伝子ｍＲＮＡレベルの硝酸依存性上方制御を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
Ｉ．いくつかの実施形態の概要
硝酸塩の同化は、変化する環境における植物の最適の生育のために他の代謝及び生理的過程と正しく調和させなければならないエネルギーの必要な過程であるので、硝酸塩取込み及び同化遺伝子の転写調節は、植物にとって非常に重要である。本明細書で開示することは、硝酸塩に対する植物の応答における転写因子ＴＧＡ１及びＴＧＡ４の新規な役割である。
【００１６】
統合バイオインフォマティクスアプローチを用いて、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４がシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）根における窒素応答を媒介する調節因子と同定された。ＴＧＡ１及びＴＧＡ４  ｍＲＮＡは両方とも、硝酸塩及び亜硝酸塩処理後に根組織に急速に蓄積する。ＴＧＡ１及びＴＧＡ４は、硝酸塩調節一次根及び側根成長に関与し、硝酸塩処理によるＮＴＲ２．１、ＮＴＲ２．２及びＮＩＲ遺伝子の正常な誘導は、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４を必要とする。ｔｇａ１／ｔｇａ４二重突然変異植物の表現型解析により、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４が硝酸依存性一次根成長及び硝酸依存性側根成長の両方に必要であることが示された。網羅的遺伝子発現解析により、ｔｇａ１／ｔｇａ４二重突然変異体における発現の変化を有する遺伝子の９７％が硝酸塩処理により調節されることが明らかになり、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４転写因子が根における硝酸応答において特異的役割を有することがわかる。
【００１７】
遺伝子発現の正常な窒素調節のためのＴＧＡ１及びＴＧＡ４に依存する硝酸応答遺伝子のうちで、硝酸トランスポーター遺伝子ＮＲＴ２．１、ＮＲＴ２．２及び亜硝酸還元酵素（ＮＩＲ）遺伝子が同定された。これらの標的遺伝子のプロモーター上のその同族ＤＮＡ配列へのＴＧＡ１の特異的結合は、クロマチン免疫沈降アッセイにより確認された。
【００１８】
ＴＧＡ因子は、病原体攻撃に対する植物の防御、ストレス応答（Kesarwaniら(2007年)、Plant Physiol.、144巻、336〜46頁）及び葯の発達（Murmuら(2010年)、Plant Physiol.、154巻、1492〜1504頁）に関連付けられた。しかし、ＴＧＡ転写因子は、以前には硝酸応答又はいずれかの栄養素応答に関連付けられなかった。したがって、本開示は、窒素とＴＧＡ１及びＴＧＡ４転写因子に関連する防御シグナル伝達との間の新規かつ予期しない相互作用を明らかにする。
【００１９】
本明細書における実施例で述べるトランスクリプトミクスデータのネットワーク解析に基づいて、硝酸応答の調節に関与する前述の遺伝子のいずれもＴＧＡ１及びＴＧＡ４の下流に存在しないと思われる。Vidalら(2010年a)、Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med.、2巻、683〜93巻を参照のこと。また、CIPK8、NLP7及びLDB37/38/39レベルの変化は、先の網羅的遺伝子発現解析に基づいて、硝酸塩に応答するＴＧＡ１又はＴＧＡ４発現に影響を及ぼさない。Castaingsら(2009年)、前出、Huら(2009年)、前出、Rubinら(2009年)、前出を参照のこと。したがって、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４は、以前に特徴付けられたものと異なり、無関係の硝酸及び／又は亜硝酸応答を調節する経路において機能する可能性が高い。
【００２０】
ＩＩ．略語
ＡＮＯＶＡ  分散分析
ｂＺＩＰ  塩基性ロイシンジッパードメイン
ＢＬＡＳＴ（登録商標）  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ
ＣｈＩＰ  クロマチン免疫沈降
ＥＬＩＳＡ  酵素結合免疫吸着測定法
ＥＭＳＡ  電気泳動移動度シフトアッセイ
ＦＡＣＳ  蛍光活性化セルソーティング
ＦＤＲ  偽陽性率
ＮＣＢＩ  国立バイオテクノロジー情報センター
ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
ｑＰＣＲ  定量的ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＭＡ  頑健マルチアレイ解析（robust multi-array analysis）
ＲＴ−ＰＣＲ  逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
【００２１】
ＩＩＩ．用語
本開示の様々な実施形態の再検討を促進するために、特定の用語についての以下の説明を記載する。
【００２２】
内因性：本明細書で用いているように、「内因性」という用語は、特定の生物、組織又は細胞内に由来する物質（例えば、核酸分子及びポリペプチド）に適用される。例えば、植物細胞において発現する「内因性」ポリペプチドは、同一種の非遺伝子改変植物の同タイプの細胞において通常発現するポリペプチドを意味し得る。同様に、植物細胞に含まれる「内因性」核酸は、同一種の非遺伝子改変植物の同タイプの細胞中に通常見いだされる核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）を意味し得る。例えば、「天然」又は「内因性」核酸は、核酸が通常天然で見いだされる染色体又は他の遺伝物質に通常存在するもの以外の核酸エレメントを含まない核酸（例えば、遺伝子）である。内因性遺伝子転写物は、その天然染色体座におけるヌクレオチド配列によりコードされ、細胞に人工的に供給されない。
【００２３】
対照的に、「外因性」又は「異種」分子は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列及び／又はゲノム位置に関して、並びにポリペプチドのアミノ酸配列及び／又は細胞局在に関して、特定の系（例えば、生殖質、品種、優良品種及び／又は植物）に生来的なものでない分子である。実施形態において、外因性又は異種ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、生体系（例えば、植物細胞、植物遺伝子、特定の植物種若しくは品種及び／又は植物染色体）に人工的に供給された分子であり得、当該特定の生体系に生来的なものでない。したがって、「外因性」としての核酸の意味は、核酸が天然に存在する源以外の源に由来することを示し得るか、又は核酸が非天然構造、遺伝子座若しくはエレメントの配置を有することを示し得る。
【００２４】
発現：本明細書で用いているように、コーディング配列（例えば、遺伝子又は導入遺伝子）の「発現」は、核酸転写単位（例えば、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを含む）のコード化情報が細胞の作動（operational）、非作動又は構造部分（例えば、タンパク質）に変換される過程を意味する。遺伝子発現は、外部シグナル、例えば、その中に含まれる遺伝子の発現を増大又は低下させる物質への細胞、組織又は生物の曝露による影響を受け得る。遺伝子の発現は、ＤＮＡからＲＮＡへの、ＲＮＡからタンパク質への経路のどこにおいても調節することができる。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送及びプロセシング、ｍＲＮＡなどの中間分子の分解に作用する制御により、及び／又はそれらが構築された後の特定のタンパク質分子の活性化、不活性化、コンパートメント化若しくは分解により、又は前述のもののいずれかの組合せにより、起こる。遺伝子発現は、制限なしに、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ又はｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質活性アッセイ（複数可）を含む、当技術分野で公知の方法によりＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで測定することができる。
【００２５】
発現増加：本明細書で用いているように、「発現増加」という用語は、発現の開始並びに鋳型構築物から産生される発現産物の量の量的な増加を意味する。いくつかの実施形態において、遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現を増加させるために、少なくとも１つの異種遺伝子を、同じ遺伝子の内因性コピーを別に含む細胞又は生物に供給することができる。そのような実施形態において、発現の増加は、異種及び内因性遺伝子を含む細胞において産生されたポリペプチドの量と内因性遺伝子のみを含む細胞において産生された量との比較により判断することができる。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドの制御下の遺伝子によりコードされる第２のポリペプチドの発現を増加させるために、転写に影響を及ぼす第１のポリペプチド（例えば、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４）を細胞又は生物に供給することができる。そのような実施形態において、発現の増加は、第１のポリペプチドの存在下で遺伝子から産生されたポリペプチドの量と第１のポリペプチドの非存在下で遺伝子から産生された量との比較により判断することができる。いくつかの実施形態において、遺伝子の発現を増加させるために、調節配列を遺伝子に作動可能に連結させることができる。そのような実施形態において、発現の増加は、遺伝子への調節配列の作動可能連結の後に遺伝子から産生されたポリペプチドの量と調節配列の作動可能連結又は導入の前に遺伝子から産生された量との比較により判断することができる。
【００２６】
異種：本明細書で用いているように、「異種」という用語は、特定の生物、組織、又は細胞内に由来しない物質（例えば、核酸分子及びポリペプチド）を意味する。例えば、植物細胞において発現する「異種」ポリペプチドは、同一種の非遺伝子改変植物からの同タイプの細胞において通常は発現しないポリペプチドを意味し得る（例えば、同じ生物の異なる細胞、又は異なる生物の細胞において発現するポリペプチド）。
【００２７】
単離（した）：「単離（した）」生体成分（核酸又はポリペプチド等）は、成分の化学的又は機能変化を生じさせている間に、該成分が天然で存在する生物の細胞中の他の生体成分（例えば、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ並びにタンパク質）から実質的に分離され、から別にして産生され、又はから引き離して精製されている。例えば、核酸は、染色体における残りのＤＮＡに該核酸を連結している化学結合を切断することによって染色体から単離することができる。「単離」された核酸分子及びタンパク質は、標準的精製方法により精製された核酸分子及びタンパク質を含み得る。該用語は、宿主細胞中の組換え発現により調製された核酸及びタンパク質並びに化学的に合成された核酸分子、タンパク質及びペプチドを包含する。
【００２８】
窒素制限条件：本明細書で用いているように、「窒素制限条件」という用語は、限られた量の窒素源（例えば、硝酸塩及びアンモニウム）が土壌又は培地中に存在する状態を意味する。「制限」である量は、いくつかの例において、０．０〜０．２ｍＭ、例えば、０〜０．１ｍＭ、０〜０．０３ｍＭ、０〜０．０５ｍＭの窒素濃度範囲にある。
【００２９】
核酸分子：本明細書で用いているように、「核酸分子」という用語は、ＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖両方、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ並びに上述のものの合成体及び混合ポリマーを含み得る、ヌクレオチドの多量体型を意味し得る。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及びいずれかの型のヌクレオチドの修飾形態を意味し得る。「核酸分子」は、本明細書で用いているように、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」と同義である。核酸分子は、特に指定しない限り、通常長さが少なくとも１０塩基である。該用語は、一本及び二本鎖型のＤＮＡを含む。核酸分子は、天然及び／又は非天然ヌクレオチド結合により結合した天然及び修飾ヌクレオチドのいずれか又は両方を含み得る。核酸分子は、当業者により容易に理解されるように、化学的若しくは生化学的に修飾することができ、又は非天然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。
【００３０】
いくつかの実施形態は、特定の型の核酸、すなわちオリゴヌクレオチド（例えば、「プライマー」オリゴヌクレオチド）を用いる。オリゴヌクレオチドは、一般的に５０個又はそれより少ない核酸塩基を含む（一部のオリゴヌクレオチドは５０個を超える核酸塩基を含み得るが）比較的に短い核酸分子である。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド配列を含むより長い核酸の切断（例えば、制限消化）により形成させることができ、又は個々のヌクレオシドホスホルアミダイトから配列特異的様式で化学的に合成することができる。
【００３１】
オリゴヌクレオチドは、特定のヌクレオチド配列を含む核酸分子を検出するためのプローブ配列として用いることができる。前述のことによれば、オリゴヌクレオチドプローブは、合成により又はクローニングにより調製することができる。適切なクローニングベクターは、当業者に公知である。オリゴヌクレオチドプローブは、標識されていても又は非標識でもあってもよい。例えば、及び制限なしに、用いるヌクレオチドが、例えば、放射性３２Ｐで標識されている、ニック翻訳、ランダムプライミング及び末端デオキシトランスフェラーゼによるテイリングによる放射性標識を含む、核酸分子を標識するための多種多様な技術が存在する。用いることができる他の標識は、例えば、及び制限なしに、発蛍光団、酵素、酵素基質、酵素補因子及び酵素阻害剤を含む。或いは、それ自体で又は他の反応性物質とともに検出可能なシグナルをもたらす標識を使用することは、それら自体で又は他の試薬とともにのいずれかで検出可能なシグナルをもたらすために受容体が標識されている（例えば、上で示した標識により）場合に、受容体が結合する配位子をその代わりとすることができる。例えば、Learyら(1983年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、80巻、4045〜9頁を参照のこと。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態は、ヌクレオチド標的配列と「特異的にハイブリダイズし得る」又は「特異的に相補的」であるポリヌクレオチドを含む。「特異的にハイブリダイズし得る」及び「特異的に相補的」は、ポリヌクレオチドと特定のヌクレオチド標的配列を含む核酸分子との間に安定的及び特異的な結合が起こるような十分な程度の相補性を示す用語である。核酸分子は、特異的にハイブリダイズし得るためにその標的配列と１００％相補的である必要はない。特異的結合が望まれる条件下、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で非標的配列への核酸の非特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性が存在する場合に、核酸分子は、特異的にハイブリダイズし得る。
【００３３】
特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、最適なハイブリダイゼーション方法の性質並びにハイブリダイズする核酸配列の組成及び長さによって異なる。洗浄時間もストリンジェンシーに影響を及ぼすが、一般的に、ハイブリダイゼーションの温度及びハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特にＮａ＋及び／又はＭｇ＋＋濃度）は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに寄与する。特定の程度のストリンジェンシーを達成するのに必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、当業者に公知であり、例えば、Sambrookら(編)、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、1-3巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989年、9及び11章並びにHames 及び Higgins(編)、Nucleic Acid Hybridization、IRL Press、Oxford、1985年に述べられている。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらなる詳細な説明書及び手引きは、例えば、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes、Part 1、2章におけるTijssen、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays」、Elsevier、NY、1993年及びAusubelら編、Current Protocols in Molecular Biology、2章、Greene Publishing and Wiley-Interscience、NY、1995年に見いだすことができる。
【００３４】
本明細書で用いているように、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的との間に２５％未満のミスマッチが存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を含む。「ストリンジェントな条件」は、さらなる特定レベルのストリンジェンシーを含む。したがって、本明細書で用いているように、「軽度にストリンジェト」な条件は、２５％を超える配列ミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「中度にストリンジェント」な条件は、１５％を超えるミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「高度にストリンジェント」な条件は、１０％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。「非常に高度にストリンジェント」な条件は、６％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。
【００３５】
特定の実施形態において、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション緩衝液（例えば、６ｘ生理食塩水−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液、５ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００μｇせん断サケ精巣ＤＮＡ）中で６５℃で終夜のハイブリダイゼーションとそれに続く０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳによる６５℃における４０分の連続洗浄である。
【００３６】
作動可能に連結したヌクレオチド配列：第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列と機能的関係にある場合、第１のヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列と又はそれに「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターがコーディング配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コーディング配列に作動可能に連結されている。組換えにより産生させる場合、作動可能に連結したヌクレオチド配列は、一般的に隣接しており、２つのタンパク質コーディング領域を連結するために必要な場合、同じ読み枠にある。しかし、ヌクレオチド配列は、作動可能に連結させるために隣接している必要はない。
【００３７】
「作動可能に連結」という用語は、遺伝子調節配列及びコーディング配列に関して用いる場合、調節配列が連結したコーディング配列の発現に影響を及ぼすことを意味する。「調節配列」又は「制御エレメント」は、転写の時期及びレベル／量、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は作動可能に連結したコーディング配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を意味する。通常の調節配列は、例えば、及び制限なしに、５’非翻訳領域、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、エンハンサー、ステム−ループ構造、レプレッサー結合配列、終結配列及びポリアデニル化認識配列を含む。特定の調節配列は、それに作動可能に連結されているコーディング配列の上流及び／又は下流に位置し得る。また、コーディング配列に作動可能に連結されている特定の調節配列は、二本鎖核酸分子の関連相補鎖上に位置し得る。
【００３８】
コーディング配列に「作動可能に連結」させることができるエレメントは、プロモーター又は他の通常の調節配列に限定されない。例えば、いくつかの実施形態において、転写因子ポリペプチド（例えば、ＴＧＡ１又はＴＧＡ４）は、コーディング配列の上流又は下流にあるヌクレオチド配列に結合して、コーディング配列の転写に影響を及ぼし得る。そのような例において、ヌクレオチド配列が転写因子の非存在下でコーディング配列の転写に全く影響を及ぼし得ないにしても、該転写因子ポリペプチドが結合しているヌクレオチド配列は、コーディング配列に「作動可能に連結」されている。
【００３９】
調節エレメント：本明細書で用いているように、「調節エレメント」という用語は、遺伝子調節活性を有する核酸分子、すなわち、作動可能に連結した転写可能核酸分子の転写又は翻訳に影響を及ぼす能力を有するものを意味する。プロモーター、リーダー、イントロン及び転写終結領域などの調節エレメントは、生存細胞における遺伝子の全体的な発現における不可欠な役割を果たす遺伝子調節活性を有する非コーディング核酸分子である。したがって、植物において機能する単離調節エレメントは、分子工学の技術により植物の表現型を改変するのに有用である。したがって、「調節エレメント」は、特定の遺伝子が、発現するかどうか、いつ、どのようなレベルで発現するかを決定する一連のヌクレオチドであり得る。いくつかの例において、調節エレメントは、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４などの調節タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列である。
【００４０】
本明細書で用いているように、「遺伝子調節活性」という用語は、作動可能に連結した核酸分子の転写又は翻訳に対して核酸分子又はポリペプチドによって及ぼされた効果を意味する。遺伝子調節活性を有する単離核酸分子は、作動可能に連結した核酸分子の、時間的若しくは空間的発現をもたらし、及び／又は発現のレベルと速度を調節し得る。本明細書で述べるいくつかの例において、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４は、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチド（複数可）に特異的に結合する調節ＤＮＡエレメントに作動可能に連結されている少なくとも１つのヌクレオチド配列の発現を増加させる、遺伝子調節活性を有するポリペプチドとして提供される。
【００４１】
プロモーター：本明細書で用いているように、「プロモーター」という用語は、転写の開始の上流にあってよく、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写を達成するための他のタンパク質の認識及び結合に関与し得るＤＮＡの領域を意味する。プロモーターは、細胞中での発現のためにコーディング配列に作動可能に連結させることができ、又はプロモーターは、細胞中での発現のためにコーディング配列に作動可能に連結させることができるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結させることができる。「植物プロモーター」は、植物細胞中で転写を開始することができるプロモーターであり得る。
【００４２】
発達制御下のプロモーターの例は、特定の組織、例えば、及び制限なしに、葉、根、種子、繊維、木質導管、仮導管又は厚壁組織における転写を優先的に開始するプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、「組織優先型」と呼ばれる。特定の組織における転写のみを開始するプロモーターは、「組織特異的」と呼ばれる。「細胞型特異的」プロモーターは、１つ又は複数の器官における特定の細胞型、例えば、及び制限なしに、根又は葉における維管束細胞における転写を主としてもたらす。具体例としての組織特異的又は組織優先型プロモーターは、例えば、及び制限なしに、根優先型プロモーター（例えば、ファセオリン遺伝子プロモーター）；キャブ又はルビスコからのそれなどの葉特異的及び光誘導性プロモーター；ＬＡＴ５２からのそれなどの葯特異的プロモーター；Ｚｍ１３からのそれなどの花粉特異的プロモーター；及びａｐｇからのそれなどの小胞子優先型プロモーターを含む。
【００４３】
「誘導性」プロモーターは、環境制御下にあるプロモーターであり得る。Wardら(1993年)、Plant Mol, Biol.、22巻、361〜366頁を参照のこと。誘導プロモーターにより転写を開始し得る環境条件の例は、例えば、及び制限なしに、嫌気性条件及び光の存在を含む。誘導性プロモーターにより、転写の速度は、誘発剤に反応して増加する。具体例としての誘導性プロモーターは、銅に応答するＡＣＥＩシステムからのプロモーター；ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤に応答するトウモロコシからのＩｎ２遺伝子プロモーター；Ｔｎ１０からのＴｅｔレプレッサー；及びその転写活性がグルココルチコステロイドホルモンにより誘導され得る、ステロイドホルモン遺伝子からの誘導性プロモーターを含むが、これらに限定されない（Schenaら(1991年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88巻0421頁）。
【００４４】
組織特異的、組織優先型、細胞種特異的及び誘導性プロモーターは、「非構成的」プロモーターのクラスを構成する。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件下で活性であり得るプロモーターである。具体例としての構成的プロモーターは、例えば、及び制限なしに、植物ウイルスプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ））からの３５Ｓプロモーター；イネアクチン遺伝子からのプロモーター；ユビキチンプロモーター；ｐＥＭＵ；ＭＡＳ；トウモロコシＨ３ヒストンプロモーター；及びＡＬＳプロモーター、すなわち、アブラナ（Brassica napus）ＡＬＳ３構造遺伝子の５’側のＸｂａｌ／ＮｃｏＩ断片（又はＸｂａｌ／ＮｃｏＩ断片と類似のヌクレオチド配列）（ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９６／３０５３０）を含む。
【００４５】
前述の構成的及び非構成的プロモーターのいずれかは、特定の実施形態で用いることができる。例えば、植物細胞中で硝酸塩及び  又は亜硝酸塩により調節される遺伝子を植物細胞に供給することができ、該遺伝子がＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチド（複数可）並びにプロモーターに特異的に結合する調節ＤＮＡエレメントに作動可能に連結される。さらなる例として、ＴＧＡ１又はＴＧＡ４遺伝子を細胞に供給することができ、ＴＧＡ１又はＴＧＡ４遺伝子の発現を可能にし、プロモーターにより制御される状況下のシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の硝酸応答の特性を与えるために、該遺伝子が構成的及び非構成的プロモーターに作動可能に連結される。
【００４６】
配列同一性：「配列同一性」（又は「同一性」）という用語は、本明細書で用いているように、２つの核酸又はポリペプチド配列という状況で、特定の比較ウインドウにわたる最大の一致を得るように整列させたときに同じである２つの配列における残基を意味し得る。
【００４７】
本明細書で用いているように、「配列同一性の百分率」という用語は、比較ウインドウにわたり２つの最適に整列させた配列（例えば、核酸配列及びアミノ酸配列）を比較することによって決定される値を意味し、比較ウインドウにおける配列の一部が、２つの配列の最適な整列のために参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。百分率は、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基が両配列に存在する位置の数を測定して、一致する位置の数を求め、一致する位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を乗じて、配列同一性の百分率を得る。
【００４８】
比較のために配列を整列させる方法は、当技術分野で周知である。様々なプログラム及びアライメントアルゴリズムが例えば、Smith及びWaterman(1981年)、Adv. Appl. Math.、2巻、482頁、Needleman及びWunsch(1970年)、J. Mol. Biol.、48巻、443頁、Pearson及びLipman(1988年)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、85巻、2444頁、Higgins及びSharp(1988年)、Gene、73巻237〜44頁、Higgins及びSharp(1989年)、CABIOS、5巻、151〜3頁、Corpetら(1988年)、Nucleic Acids Res.、16巻、10881〜90頁、Huangら(1992年)、Comp. Appl. Biosci.、8巻、155〜65頁、Pearsonら(1994年)、Methods Mol. Biol.、24巻、307〜31頁、Tatianaら(1999年)、FEMS Microbiol. Lett.、174巻、247〜50頁に記載されている。配列整列法及び相同性計算の詳細な検討は、例えば、Altschulら(1990年)、J. Mol. Biol.、215巻、403〜10頁に見いだすことができる。
【００４９】
いくつかの配列解析プログラムとともに用いるための国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）；Altschulら(1990年)）がインターネットを含むいくつかの情報源から入手できる。このプログラムを用いて配列同一性をどのようにして決定するのかの説明は、ＢＬＡＳＴ（商標）の「ｈｅｌｐ」セクションのもとでインターネット上で入手できる。核酸配列の比較のために、デフォルトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」関数を用いることができる。参照配列とのより大きい類似性を有する核酸配列は、この方法により評価するとき、同一性の百分率の増加を示す。
【００５０】
ヌクレオチド配列に関して本明細書で用いているように、「実質的に同一」という用語は、８５％を超えて同一である配列を意味し得る。例えば、実質的に同一のヌクレオチド配列は、参照配列と少なくとも８５．５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％同一であり得る。
【００５１】
特異的結合：ポリペプチド及びタンパク質ドメインに関して本明細書で用いているように、「特異的結合」という用語は、結合相手（複数可）との安定的及び特異的な結合が起こるが、特異的に結合するポリペプチドにより認識される特定のアミノ酸配列又は特定のヌクレオチド配列を欠く他の分子とのそれが起こらないような、ポリペプチド又はタンパク質ドメインとその結合相手（複数可）（例えば、特定のヌクレオチド配列を含む核酸（複数可））との間の十分に強い相互作用を意味する。安定的及び特異的な結合は、「プルダウン」アッセイ（例えば、ＧＳＴプルダウン）、酵母−２−ハイブリッドアッセイ、酵母−３−ハイブリッドアッセイ、ＥＬＩＳＡ等などの当業者が常用の技術により確認することができる。互いに対する「特異的結合」の特性を有する分子は、互いに「特異的に結合する」と言うことができる。
【００５２】
形質転換：本明細書で用いているように、「形質転換」という用語は、１つ又は複数の核酸分子（複数可）の細胞内への転移を意味する。核酸分子の細胞ゲノム内への取込みにより、又はエピソーム複製のいずれかにより、核酸分子が細胞により安定的に複製される状態になる場合に、細胞は、細胞内に転移した核酸分子により「形質転換」される。本明細書で用いているように、「形質転換」という用語は、核酸分子をそのような細胞に導入することができるすべての技術を含む。例は、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクターによる形質転換、エレクトロポレーション（Frommら(1986年)、Nature、319巻、791〜3頁）、リポフェクション（Felgnerら(1987年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、84巻、7413〜7頁）、マイクロインジェクション（Muellerら(1978年)、Cell、15巻、579〜85頁）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介転移（Fraleyら(1983年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、80巻、4803〜7頁）、直接ＤＮＡ取込み及び微粒子ボンバードメント（Kleinら(1987年)、Nature、327巻、70頁）を含むが、これらに限定されない。
【００５３】
導入遺伝子：外因性核酸配列。いくつかの例において、導入遺伝子は、ＴＧＡ１又はＴＧＡ４ポリペプチドをコードする配列であり得る。いくつかの例において、導入遺伝子は、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４に特異的に結合する調節ＤＮＡエレメントに作動可能に連結した対象の遺伝子（例えば、リポーター遺伝子又は農業上重要な植物の形質に寄与する遺伝子）をコードし得る。これら及び他の例において、導入遺伝子は、導入遺伝子コーディング配列に作動可能に連結した１つ又は複数の調節配列を含み得る。本開示の目的のために、「遺伝子導入」という用語は、生物（例えば、植物）に適用するために用いる場合、外因性核酸配列を含む生物に適用される。いくつかの例において、外因性核酸配列を含む生物は、分子形質転換技術により核酸配列が導入された生物であり得る。他の例において、外因性核酸配列を含む生物は、例えば、遺伝子移入又は植物における人工授粉により核酸配列が導入された生物であり得る。
【００５４】
ベクター：本明細書で用いているように、「ベクター」という用語は、例えば、形質転換細胞を得るために、細胞に導入することができる核酸分子を意味する。ベクターは、複製起点のような、宿主細胞内でそれが複製することを可能にする核酸配列を含み得る。ベクターの例は、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ及び外因性ＤＮＡを細胞中に運ぶウイルスを含むが、これらに限定されない。ベクターは、１つ若しくは複数の遺伝子、アンチセンス分子及び／又は選択可能マーカー遺伝子並びに当技術分野で公知の他の遺伝要素も含み得る。ベクターは、細胞に形質導入し、形質転換し、又は感染させ、それにより、細胞に核酸分子及び／又はベクターによりコードされるタンパク質を発現させる。ベクターは、細胞内への核酸分子の侵入を達成する助けとなる物質を場合によって含む（例えば、リポソーム、タンパク質コーティング等）。
【００５５】
特に示さない又は暗示しない限り、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という語は、本明細書で用いているように、「少なくとも１つ」を意味する。
【００５６】
特に説明しない限り、本明細書で用いているすべての技術及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。分子生物学における一般的用語の定義は、例えば、Lewin B.、Genes V、Oxford University Press、1994年(ISBN 0-19-854287-9); Kendrewら(編)、The Encyclopedia of Molecular Biology、Blackwell Science Ltd.、1994年(ISBN 0-632-02182-9);及びMeyers R. A.(編)、Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.、1995年(ISBN 1-56081-569-8)に見いだすことができる。
【００５７】
ＩＶ．窒素応答調節因子ＴＧＡ１及びＴＧＡ４
本開示は、転写因子ＴＧＡ１及びＴＧＡ４の新規及び予期しない使用を活用する組成物及び方法を提供する。本明細書で開示するように、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４は、環境における特定の窒素源に応答する多くの特定の標的遺伝子の発現に影響を及ぼす転写因子である。したがって、例えば、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４は、植物細胞、植物物質、植物組織又は植物の硝酸及び／又は亜硝酸応答を調節するために用いることができる。本明細書で述べるＴＧＡ１及びＴＧＡ４の特性は、例えば、変更された硝酸及び亜硝酸応答表現型を有する遺伝子導入植物を得るために、及び対象の遺伝子が、植物又は植物細胞に利用可能な窒素源（又はその欠如）によって少なくとも一部調節される、遺伝子導入植物又は植物細胞を得るために用いることができる。例えば、植物における一次根及び／又は側根の成長を開始し、及び／又は増大させるためにＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４を植物において発現又は過剰発現させることができる。
【００５８】
いくつかの実施形態は、ＴＧＡ１塩基性ロイシンジッパー転写因子ポリペプチドを含む。特定の実施形態によるＴＧＡ１ポリペプチドは、配列番号１（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＴＧＡ１）と整列させるとき、漸増（increasing）同一性百分率を示すアミノ酸配列を含む。これら及び他の実施形態内の特定のアミノ酸配列は、配列番号１との例えば、少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含み得る。例えば、いくつかの実施形態は、配列番号２（ハロフィラ（Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ  ｈａｌｏｐｈｉｌａ））、配列番号３（ミヤマハタザオ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｌｙｒａｔａ））、配列番号４（カブ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ））、配列番号５（アラビドプシス・アレノサ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ａｒｅｎｏｓａ））、配列番号６（ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ））、配列番号７（インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））、配列番号８（タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ））、配列番号９（ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ））及び配列番号１０（ヒマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ））からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴＧＡ１ポリペプチドを含む。
【００５９】
いくつかの実施形態は、ＴＧＡ４塩基性ロイシンジッパー転写因子ポリペプチドを含む。特定の実施形態によるＴＧＡ４ポリペプチドは、配列番号１１（シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＴＧＡ４）と整列させるとき、漸増同一性百分率を示すアミノ酸配列を含む。これら及び他の実施形態内の特定のアミノ酸配列は、配列番号１１との例えば、少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含み得る。例えば、いくつかの実施形態は、配列番号１２（タルウマゴヤシ（Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ））、配列番号１３（ブドウ（Ｖ．ｖｉｎｉｆｅｒａ））及び配列番号１４（トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ））からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴＧＡ４ポリペプチドを含む。
【００６０】
多くの実施形態において、配列番号１（ＴＧＡ１ポリペプチド）及び／又は配列番号１１（ＴＧＡ４ポリペプチド）と整列させるとき前述の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、硝酸及び亜硝酸応答調節活性を有するペプチド内に又はそのようなペプチドの一部に含まれる。ＴＧＡ１ポリペプチドは、例えば、配列番号１との閾配列同一性を有するポリペプチド配列に関する配列データベースを検索することによって同定することができる。ＴＧＡ４ポリペプチドは、例えば、配列番号１１との特定の配列同一性を有するポリペプチド配列に関する配列データベースを検索することによって同定することができる。有用な配列データベースは、当業者に公知の多くの方法のいずれか（例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ（登録商標）ツールを用いて）により検索することができる。他のデータベースは、様々な公的及び私的な商業的情報源により多くの植物及び他の生物について利用可能である。当業者により理解されるように、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４は、相同タンパク質であり、したがって、配列番号１又は配列番号１１と配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むと認められる特定のポリペプチドは、配列番号１及び１１のその他との配列同一性も共有し得る。
【００６１】
いくつかの実施形態は、上述のような、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。例えば、いくつかの実施形態における核酸配列は、配列番号１５（シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＴＧＡ１）及び／又は配列番号１６（シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＴＧＡ４）と整列させるとき、漸増同一性百分率を示す。これら及び他の実施形態内の特定の核酸配列は、配列番号１５及び／又は配列番号１６との例えば、及び制限なしに、少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含み得る。
【００６２】
ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む多数の核酸は、当業者が容易に同定することができる。例えば、核酸分子は、例えば、コドン同義性に従って許容されるヌクレオチド置換を導入することにより、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を実質的に変更せずに修飾することができる。したがって、所定のアミノ酸配列を有する任意のＴＧＡ１又はＴＧＡ４ポリペプチドを多くの重複ヌクレオチド配列のいずれかに直接的にリバースエンジニアリングすることができることは、理解される。さらなる例として、ＴＧＡ１又はＴＧＡ４ポリペプチドをコードする遺伝子は、多くの利用可能な植物ゲノムライブラリ、ｃＤＮＡライブラリ、ＥＳＴライブラリなどのいずれかから選択することができ（例えば、配列番号１４若しくは配列番号１５との相同性により、又はコードされたポリペプチドと配列番号１〜１４の１つ若しくは複数のものとの配列類似性により）、又は、そのような遺伝子は、分子生物学における信頼でき及び周知の技術により生物からクローニングすることができる。
【００６３】
ありとあらゆるＴＧＡ１ポリペプチド、ＴＧＡ４ポリペプチド及びそれをコードする核酸分子は、本発明の特定の実施形態において使用される。
【００６４】
いくつかの実施形態は、調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結されているヌクレオチド配列に硝酸及び／又は亜硝酸制御を付与するように、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドに特異的に結合する調節ヌクレオチド配列を含む核酸を含む。いくつかの例において、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドに特異的に結合する調節ヌクレオチド配列は、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４により調節される遺伝子、例えば、及び制限なしに、ＮＲＴ２．１、ＮＲＴ２．２及びＮＩＲからなる群から選択される遺伝子の内因性シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）プロモーター内に含まれる。調節ヌクレオチド配列へのＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドの特異的結合は、当業者に公知の任意の技術、例えば、クロマチン免疫沈降又はＥＭＳＡにより検出することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本発明の核酸分子は、遺伝子調節エレメント（例えば、プロモーター）を含む。プロモーターは、ベクター構築物が挿入される細胞型に基づいて選択することができる。細菌、酵母及び植物において機能するプロモーターは、当技術分野で周知である。プロモーターはまた、それらの調節上の特徴に基づいて選択することができる。そのような特徴の例は、転写活性の増大、誘導性、組織特異性及び発育段階特異性を含む。植物において、誘導性であり、ウイルス又は合成由来であり、構成的に活性であり、時間的に調節され、空間的に調節されるプロモーターが記載された。例えば、Poszkowskiら(1989年)、EMBO J.、3巻、2719頁、Odellら(1985年)、Nature、313巻、810頁及びChauら(1989年)、Science、244巻、174〜81頁を参照のこと。
【００６６】
有用な誘導性プロモーターは、例えば、解毒剤（置換ベンゼンスルホンアミド除草剤）の施用により誘導されるサリチル酸又はポリアクリル酸により誘導されるプロモーター、熱ショックプロモーター、ホウレンソウ硝酸レダクターゼ転写性核酸分子配列に由来する硝酸塩誘導性プロモーター、ホルモン誘導性プロモーター並びにＲｕＢＰカルボキシラーゼ及びＬＨＣＰファミリーの小サブユニットに関連する光誘導性プロモーターを含む。
【００６７】
他の有用なプロモーターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の腫瘍誘導プラスミド上で運ばれる、ノパリンシンターゼ、マンノピンシンターゼ及びオクトピンシンターゼプロモーター；ＣａＭＶ１９Ｓ及び３５Ｓプロモーター；増強ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター；フィグオート（Figwort）モザイクウイルス３５Ｓプロモーター；リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）の光誘導性プロモーター；タバコのＥＩＦ−４Ａプロモーター（Mandelら(1995年)、Plant Mol. Biol.、29巻、995〜1004頁）；トウモロコシスクロースシンテターゼ；トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼＩ；トウモロコシ光収穫複合体（light harvesting compolex）；トウモロコシ熱ショックタンパク質；シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のキチナーゼプロモーター；ＬＴＰ（脂質輸送タンパク質）プロモーター；ペチュニアカルコンイソメラーゼ；マメグリシンリッチプロテイン１；ジャガイモパタチン；ユビキチンプロモーター；並びにアクチンプロモーターを含む。特に有用なプロモーターは、根特異的プロモーターを含む。
【００６８】
異種遺伝子（複数可）のより高い発現を得るために、遺伝子が発現宿主細胞（例えば、植物細胞、例えば、カノーラ、イネ、タバコ、トウモロコシ、綿及びダイズ）中でより十分に発現するように遺伝子（複数可）をリエンジニアリングすることが好ましい可能性がある。したがって、植物発現のためのＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドをコードする遺伝子の設計における任意選択の追加のステップ（すなわち、１つ又は複数の遺伝子調節エレメントの用意に加えて）は、最適発現のための異種遺伝子タンパク質コーディング領域のリエンジニアリングである。特定の実施形態は、最初の（すなわち、非修飾）シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子配列により形質転換された第２の植物種からの植物細胞よりも第２の植物種からの遺伝子導入植物細胞における発現レベルを増加させる（すなわち、より多くのタンパク質を産生する）ように最適化された再設計シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子を含む。
【００６９】
遺伝コードの重複性／同義性によってもたらされる可塑性（すなわち、いくつかのアミノ酸が複数のコドンにより指定される）のため、異なる生物又は生物のクラスにおけるゲノムの進化は、同義コドンの差別的使用をもたらした。この「コドンバイアス」は、タンパク質コーディング領域の平均塩基組成に反映される。例えば、比較的に低いＧ＋Ｃ含量を有するゲノムを有する生物は、同義コドンの第３の位置にＡ又はＴを有するより多くのコドンを利用するが、より高いＧ＋Ｃ含量を有するそのような生物は、第３の位置にＧ又はＣを有するより多くのコドンを利用する。さらに、ｍＲＮＡ内の「マイナー」コドンの存在が、特にマイナーコドンに対応する荷電ｔＲＮＡの相対存在量が低い場合に当ｍＲＮＡの絶対翻訳速度を低下させ得ると考えられる。この推論の拡張は、個々のマイナーコドンによる翻訳速度の減少は、複数のマイナーコドンに対して少なくとも相加的であるということである。したがって、特定の発現宿主における比較的高い相対含量のマイナーコドンを有するｍＲＮＡは、それに相応して低い翻訳速度を有することとなる。この速度は、それに相応して低いレベルのコード化タンパク質に反映され得る。
【００７０】
植物細胞（例えば、イネ、タバコ、トウモロコシ、綿及びダイズ）における発現のためにＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドをコードする最適化遺伝子を遺伝子工学により改変するに際して、予期される宿主植物（複数可）のコドンバイアスが決定されたならば、有益である。植物ゲノム又は様々な植物遺伝子のタンパク質コーディング領域のコドン分布に関する情報を見いだすことができる、多数の公的に利用できるＤＮＡ配列データベースが存在する。
【００７１】
コドンバイアスは、発現宿主がそのタンパク質のアミノ酸をコード化するために用いるコドンの統計的分布である。コドンバイアスは、すべてのアミノ酸に対するコドンと比べた、単一コドンが用いられる頻度として計算することができる。或いは、コドンバイアスは、当該アミノ酸に対するすべての他のコドン（同義コドン）と比べた、特定のアミノ酸をコードするために単一コドンが用いられる頻度として計算することができる。
【００７２】
ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドの植物発現のために最適化コーディング領域を設計するに際して、複数の選択が存在する場合、植物により選ばれる第１の（「第一選択」）コドン並びに選好コドンの第２、第３、第４等の選択を決定すべきである。次に、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドのアミノ配列をコードする新たなＤＮＡ配列を設計することができ、新たなＤＮＡ配列は、アミノ配列内の各位置におけるアミノ酸を指定する発現宿主選好（第１の選好、第２の選好、第３の選好又は第４の選好等）コドンの置換が、天然ＤＮＡ配列（ポリペプチドをコードする）と異なる。次に、新たな配列を、修飾によって作られた可能性がある制限酵素部位について解析する。これらのコドンを次の選好コドンで置換することによって同定された推定制限部位をさらに修飾して、制限部位を除去する。異種配列の転写又は翻訳に影響を及ぼし得る配列における他の部位は、エクソン：イントロン接合（５’若しくは３’）、ポリＡ付加シグナル及び／又はＲＮＡポリメラーゼ終結シグナルである。配列をさらに解析し、修飾して、ＴＡ又はＣＧダブレットの頻度を減少させる。これらのダブレットに加えて、約６個を超え、同じであるＧ又はＣヌクレオチドを有する配列ブロックも配列の転写又は翻訳に悪影響を及ぼし得る。したがって、これらのブロックは、第１又は第２選択等のコドンを次の好ましい最適のコドンで置換することにより有利に修飾される。
【００７３】
上述のような方法は、遺伝子が植物において最適に発現するように当業者が個々の植物に異質である遺伝子（複数可）を修飾することを可能にするものである。方法は、ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９７／１３４０２Ａ１にさらに説明されている。したがって、いくつかの実施形態のＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４遺伝子と機能的に同等である最適化合成遺伝子を植物及び植物細胞を含む宿主を形質転換するために用いることができる。さらに、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４をコードするヌクレオチド配列も最初のアミノ酸配列からｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計することができる。合成遺伝子の産生に関するさらなる手引きは、例えば、米国特許第５，３８０，８３１号に見いだすことができる。
【００７４】
ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４をコードするヌクレオチド配列が紙上又はｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計されたならば、設計された配列と配列が正確に対応するように該配列を含む実際の核酸分子を実験室において合成することができる。そのような合成ＤＮＡ分子は、あたかもそれらが自然又は天然源から得られたかのように、クローニングし、他の方法で正確に操作することができる。
【００７５】
Ｖ．  ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４による植物窒素応答の媒介
いくつかの実施形態は、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４が、正常な硝酸塩調節遺伝子発現（例えば、ＮＲＴ２．１、ＮＲＴ２．２及びＮＩＲの発現）のために、並びに硝酸塩及び亜硝酸塩に対する植物の応答を生成させるために必要であるという発見を活用している。特定の実施形態において、例えば、及び制限なしに、ＴＧＡ１若しくはＴＧＡ４をコードする核酸を細胞又は生物に導入することにより、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを細胞又は生物に導入することにより、並びに／又はシグナル（複数可）と細胞若しくは生物におけるＴＧＡ１又はＴＧＡ４をコードする核酸に作動可能に連結された調節エレメントとの相互作用によるＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドの発現を促進するのに十分な正若しくは負のシグナルを与えることにより、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを細胞又は生物において発現又は過剰発現させることができる。さらなる実施形態において、例えば、及び制限なしに、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４をコードする核酸（例えば、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４遺伝子（複数可））を破綻させる、突然変異させる又は不活性化することにより、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドをコードする核酸を標的とするアンチセンス核酸を細胞又は生物に導入することにより、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを抗体又は他の特異的結合タンパク質と結合させることにより細胞又は生物の細胞機構からＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを物理的に除去することにより、並びに／又はシグナル（複数可）と細胞若しくは生物におけるＴＧＡ１又はＴＧＡ４をコードする核酸に作動可能に連結された調節エレメントとの相互作用によるＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドの発現を減少又は無くすのに十分な正又は負のシグナルを与えることにより、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを細胞又は生物においてノックアウト又は過小発現させることができる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、硝酸トランスポーターＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２の１つ又は両方の発現を促進するために、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを植物細胞又は生物において発現又は過剰発現させることができる。さらなる実施形態において、硝酸トランスポーターＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２の１つ又は両方の発現を減少又は無くすために、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを植物細胞又は生物において除去又は過小発現させることができる。
【００７７】
ＮＲＴ２．１及び／又はＮＲＴ２．２の発現の増加は、多くの理由のために望ましい場合があり得る。その硝酸塩輸送機能に加えて、ＮＲＴ２．１トランスポーターは、側根の発生及び側根の成長を統合する役割を果たす（Littleら(2005年)、前出、Remansら(2006年)、Plant Physiol.、140巻、909〜21頁）。ｎｒｔ２．１／ｎｒｔ２．２シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）突然変異系統は、硝酸塩を添加した培地中で側根成長の減少を示した（Liら(2007年)、前出）。したがって、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４の発現のみを変化させることによる又は植物の栄養状態の付随する変化と併せてその発現を変化させることによるＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２のレベルの操作は、植物における根の成長及び発育プログラムの変化をもたらし得る。
【００７８】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの他の窒素応答遺伝子の発現を促進するために、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを植物細胞又は生物において発現又は過剰発現させることができる。例えば、図５に示す遺伝子の発現を促進するために、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを植物細胞又は生物において発現又は過剰発現させることができる。さらなる実施形態において、少なくとも１つの他の窒素応答遺伝子の発現を減少又は無くすために、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを植物細胞又は生物において除去又は過小発現させることができる。例えば、図５に示す遺伝子の発現を減少又は無くすために、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを植物細胞又は生物において除去又は過小発現させることができる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、一次根及び／又は側根の成長（例えば、硝酸塩に応答する）に影響を及ぼすために、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４の発現を植物細胞又は植物において操作することができる。例えば、一次根及び／又は側根の成長を刺激し、及び／又は増加させるために、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを植物細胞又は生物において発現又は過剰発現させることができる。逆に、一次根及び／又は側根の成長を無くし、及び／又は減少させる（例えば、硝酸塩に応答する一次根及び／又は側根の成長を減少させる）ために、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを植物細胞又は生物において除去又は過小発現させることができる。
【００８０】
いくつかの実施形態において、窒素制限条件下の植物細胞又は植物の成長に影響を及ぼすために、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４の発現を植物細胞又は植物において操作することができる。例えば、窒素制限条件下の植物の成長を刺激し、及び／又は増加させるために、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを植物細胞又は生物において発現又は過剰発現させることができる。逆に、窒素制限条件下の植物の成長を無くし、及び／又は減少させる（例えば、硝酸塩に応答する植物の成長を減少させる）ために、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドを植物細胞又は生物において除去又は過小発現させることができる。
【００８１】
ＴＧＡ１は、リン酸化（Popescuら(2009年)、Genes Dev.、23巻、80〜92頁）又はＳ−ニトロシル化（Lindermayrら(2010年)、Plant Cell、22巻、2894〜907頁）により翻訳後修飾することができる。これら及び他の翻訳後修飾は、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４の調節に役割を果たし得る。例えば、生理学的一酸化窒素（ＮＯ）ドナーである、Ｓ−ニトロソグルタチオンによる処理の後に、ＴＧＡ１をＳ２３ニトロシル化することができることが最近示された（Lindermayrら(2010年)、前出）。このＳ２３ニトロシル化は、ＴＧＡ１のＤＮＡ結合活性を増大させる（同上）。ＮＯの産生がＮＲ活性に関連しており（Kolbert及びErdei(2008年)、Plant Signal Behav.、3巻、972〜3頁）、亜硝酸塩がＮＯの形成のための基質としての役割を果たす（Yamasakiら(1999年)、Trends Plant Sci.、4巻、128〜9頁、Rockelら(2002年)、J. Exp. Bot.、53巻、103〜10頁、Leaら(2004年)、Planta、219巻、59〜65頁、Meyerら(2005年)、Photosynth. Res.、83巻、181〜9頁、Planchetら(2005年)、Plant J.、41巻、732〜43頁）ため、硝酸塩由来代謝物（例えば、亜硝酸塩又はＮＯ）は、硝酸／亜硝酸転写応答を達成するためにＴＧＡ１及びＴＧＡ４転写因子活性を活性化することに関与している可能性がある。
【００８２】
したがって、特定の実施形態は、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４の活性に影響を及ぼすために、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４の翻訳後修飾の操作又は模倣を含む。さらに、例えば、熟練医師の裁量内で影響を所望のレベルに調整するために、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４発現と並行して硝酸応答経路の上流シグナル伝達分子を備えるか又は除去することができる。
【００８３】
特定の理論に拘束されるものでないが、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４は、硝酸塩処理に応答して活性化される少なくとも２つの調節機構の一部であり得る。第１に、硝酸塩及び／硝酸塩由来シグナル（例えば、亜硝酸塩又はＮＯ）は、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４転写因子を活性化して、それらの標的遺伝子のプロモーター領域へのＴＧＡ１及びＴＧＡ４の結合を可能にするであろう。その結果として、これらの硝酸応答標的遺伝子の発現が増加して、細胞（及び細胞を含む植物）を硝酸塩に富む環境に蓄積させるであろう。第２に、硝酸塩及び／又は硝酸塩由来シグナルは、比較的より長い期間にわたりＴＧＡ１及びＴＧＡ４遺伝子発現の誘導ももたらし得る。この遺伝子発現の誘導は、独立した調節機能の一部であり得る。これらの応答の時間差は、調節される過程の性質（例えば、代謝対発育）及び／又は異なる空間的機能（局所的対全身性）に関連し得る。したがって、特定の実施形態において、１つ又は複数の特定の所望の硝酸応答（複数可）を達成するために、ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４を植物又は細胞において時間依存的様式で操作することができる。
【００８４】
ＶＩ．ＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４を含む植物、植物部分及び植物物質
いくつかの実施形態は、１つ又は複数のＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチド（述べたような、前出）並びに  又はＴＧＡ１及び／又はＴＧＡ４ポリペプチドをコードする核酸配列を含む１つ又は複数の核酸分子（複数可）を含む形質転換細胞を産生する方法を対象とする。そのような核酸分子は、例えば、プロモーターなどの非コーディング調節エレメントも含み得る。他の配列も非コーディング調節エレメント及び転写可能核酸分子配列とともに細胞に導入することができる。これらの他の配列は、３’転写ターミネーター、３’ポリアデニル化シグナル、他の非翻訳配列、トランジット又は標的配列、選択マーカー、エンハンサー及びオペレーターを含み得る。
【００８５】
形質転換の方法は、一般的に適切な宿主細胞を選択し、宿主細胞を組換えベクターにより形質転換し、形質転換宿主細胞を得るステップを含む。細胞へのＤＮＡの導入のための技術は、当業者に周知である。これらの方法は、一般的に以下の５つのカテゴリーに分類することができる：（１）化学的方法（Graham及びVan der Eb(1973年)、Virology、54巻(2号)、536〜9頁、Zatloukalら(1992年)、Ann. N.Y. Acad. Sci.、660巻、136〜53頁）、（２）マイクロインジェクション（Capechi(1980年)、Cell、22巻(2号)、479〜88頁）、エレクトロポレーション（Wong及びNeumann(1982年)、Biochim. Biophys. Res. Commun.、107巻(2号)、584〜7頁、Frommら(1985年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82巻(17号)、5824〜8頁、米国特許第５，３８４，２５３号）及び粒子加速（Johnston及びTang(1994年)、Methods Cell Biol.、43巻(A)、353〜65頁、Fynanら(1993年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90巻(24号)、11478〜82頁）などの物理的方法、（３）ウイルスベクター（Clapp(1993年)、Clin. Perinatol.、20巻(1号)、155〜68頁、Luら(1993年)、J. Exp. Med.、178巻(6号)、2089〜96頁、Eglitis及びAnderson(1988年)、Biotechniques、6巻(7号)、608〜14頁）、（４）リポーター媒介メカニズム（Curielら(1992年)、Hum. Gen. Ther.、3巻(2号)、147〜54頁、Wagnerら(1992年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89巻(13号)、6099〜103頁）並びに（５）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いるなどの細菌媒介メカニズム。或いは、核酸は、植物の生殖器官に直接注入することにより花粉に直接導入することができる（Zhouら(1983年)、Methods in Enzymology、101巻、433頁、Hess(1987年)、Intern. Rev. Cytol.、107巻、367頁、Luoら(1988年)、Plant Mol. Biol. Reporter、6巻、165頁、Penaら(1987年)、Nature、325巻、274頁）。他の形質転換の方法は、例えば、米国特許第５，５０８，１８４号に示されているようなプロトプラスト形質転換を含む。核酸分子を未熟胚に注入することもできる（Neuhausら(1987年)、Theor. Appl. Genet.、75巻、30頁）。
【００８６】
植物細胞の形質転換に最も一般的に用いられている方法は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介ＤＮＡ転移法（Fraleyら(1983年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、80巻、4803頁）（米国特許第５，８２４，８７７号、米国特許第５，５９１，６１６号、米国特許第５，９８１，８４０号及び米国特許第６，３８４，３０１号に例示されている）及びバイオリスティック又は微粒子ボンバードメント媒介法（すなわち、遺伝子銃）（米国特許第５，５５０，３１８号、米国特許第５，５３８，８８０号、米国特許第６，１６０，２０８号、米国特許第６，３９９，８６１号及び米国特許第６，４０３，８６５号に記載されているような）である。一般的に、核形質転換が望ましいが、葉緑体又はアミロプラストなどの色素体を特に形質転換することが望ましい場合、例えば、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、タバコ、ジャガイモ及びアブラナ属(Brassica)種などの特定の植物種における所望の核酸分子の微粒子媒介送達を用いて、植物色素体を形質転換することができる。
【００８７】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する遺伝子組換え土壌細菌を使用することにより達成される。いくつかのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種は、ＤＮＡの任意の所望の断片を多くの植物種内に運ぶように遺伝子工学手法により改変することができる「Ｔ−ＤＮＡ」として公知の特定のＤＮＡの転移を媒介する。Ｔ−ＤＮＡ媒介性病原の過程を特徴付ける主要な事象は、病原性遺伝子の誘導並びにＴ−ＤＮＡのプロセッシング及び転移である。この過程は、多くのレビューの主題である。例えば、Ream(1989年)、Ann. Rev. Phytopathol.、27巻、583〜618頁、Howard及びCitovsky(1990年)、Bioassays、12巻、103〜8頁、Kado(1991年)、Crit. Rev. Plant Sci.、10巻、1〜32頁、Zambryski(1992年)、Annual rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.、43巻、465〜90頁、Gelvin(1993年)、In Transgenic Plants、Kung及びWu編、Academic Press、San Diego、CA、49〜87頁、Binns及びHowitz(1994年)、In Bacterical Pathogenesis of Plants and Animals、Dang編、Berlin: Springer Verlag、119〜38頁、Hooykaas及びBeijersbergen(1994年)、Ann. Rev. Phytopathol.、32巻、157〜79頁、Lessl及びLanka(1994年)、Cell、77巻、321〜4頁並びにZupan及びZambryski(1995年)、Annual Rev. Phytopathol.、27巻、583〜618頁を参照のこと。
【００８８】
形質転換の方法論に無関係に形質転換植物細胞を選択又は評価するために、細胞に導入されるＤＮＡは、他の状態では有毒な化合物に対する耐性を植物組織に付与する化合物を産生するために再生可能植物組織において機能する遺伝子を含んでいてもよい。選択可能、スクリーニング可能又は評価可能マーカーとして用いる対照の遺伝子は、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ及び抗生物質又は除草剤耐性遺伝子を含むが、これらに限定されない。抗生物質耐性遺伝子の例は、ペニシリン、カナマイシン（及びネオマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン）、メトトレキセート（及びトリメトプリム）、クロラムフェニコール並びにテトラサイクリンに耐性を付与する遺伝子を含む。例えば、グリホセート耐性は、除草剤耐性遺伝子により付与され得る（Della-Cioppaら(1987年)、Bio/Technology、5巻、579〜84頁）。例えば、及び制限なしに、ホスフィノトリシン、ビアラホスに対する耐性及び正の選択メカニズム（Joersbroら(1998年)、Mol. Breed.、4巻、111〜7頁）を含む、他の選択デバイスも導入することができ、本発明の実施形態の範囲内にあると考えられる。
【００８９】
選択又はスクリーニングにより同定し、再生を支持する適切な培地中で培養した形質転換細胞は、次に植物中で成熟させることができる。
【００９０】
今回開示する方法は、任意の形質転換可能な植物細胞又は組織とともに用いることができる。形質転換可能な細胞及び組織は、本明細書で用いているように、さらに増殖して、植物になることができる細胞又は組織を含むが、これらに限定されない。当業者は、外因性ＤＮＡの挿入後及び植物細胞又は組織が分化植物を形成し得る適切な培養条件で、多くの植物細胞又は組織が形質転換可能であることを認識している。これらの目的に適する組織は、未熟胚、胚盤組織、懸濁細胞培養、未熟花部、茎頂分裂組織、節外植片、カルス組織、胚軸組織、子葉、根及び葉を含み得るが、これらに限定されない。
【００９１】
形質転換植物プロトプラスト又は外植片からの植物の再生、発育及び栽培は、当技術分野で公知である（Weissbach及びWeissbach(1988年)、Methods for Plant Molecular Biology、(編) Academic Press, Inc.、San Diego、CA; Horschら(1985年)、Science、227巻、1229〜31頁）。この再生及び発育過程は、一般的に形質転換細胞を選択し、根付き幼植物の段階までの胚の発育の通常の段階までそれらの細胞を培養するステップを含む。遺伝子導入胚及び種子も同様に再生させる。この方法において、形質転換細胞は、一般的に、成功裏に形質転換された細胞を選択し、苗条の再生を誘発する選択培地の存在下で培養する（Fraleyら(1993年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、80巻、4803頁）。これらの苗条は、一般的に２〜４カ月以内に得られる。得られた遺伝子導入根付き苗条をその後、土壌などの適切な植物増殖培地に植える。選択剤への曝露で生残した細胞又はスクリーニングアッセイで陽性と評価された細胞は、植物の再生を支持する培地中で培養することができる。次いで、苗条を、選択剤及び細菌の増殖を防ぐための抗生物質を含む適切な根誘導培地に移すことができる。苗条の多くは、根を発達させる。次いで、これらを根の持続的な発達を可能にする土壌又は他の培地に移植する。上で略述した方法は、用いられる個々の植物の系統によって一般的に異なり、したがって、方法の詳細は、当業者の裁量内にある。
【００９２】
再生遺伝子導入植物は、同型接合性遺伝子導入植物を得るために自家受粉させることができる。或いは、再生遺伝子導入植物から得られる花粉は、好ましくは農学的に重要な種の近交系の非遺伝子導入植物と交配させることができる。逆に、非遺伝子導入植物からの花粉を再生遺伝子導入植物に受粉するのに用いることができる。
【００９３】
遺伝子導入植物は、形質転換核酸配列をその子孫に伝え得る。遺伝子導入植物は、好ましくは形質転換核酸配列に対して同型接合性であり、当配列を、有性生殖により、またその結果として、その子孫のすべてに伝達する。子孫は、遺伝子導入植物によって産生された種子から生育することができる。これらの付加的な植物は、植物の真の育種系統を得るために自家受粉させることができる。
【００９４】
これらの植物からの子孫は、とりわけ、遺伝子発現について評価することができる。遺伝子発現は、ウエスタンブロッティング、ノーザンブロッティング、免疫沈降及びＥＬＩＳＡなどのいくつかの一般的な方法により検出することができる。形質転換植物は、導入されたＤＮＡの存在並びに本発明の核酸分子及びアミノ酸分子によってもたらされる発現レベル及び／又は脂肪酸プロファイルについても解析することができる。当業者は、形質転換植物の解析に利用可能な多くの方法を知っている。例えば、植物の解析の方法は、サザンブロット又はノーザンブロット、ＰＣＲベースのアプローチ、生化学的アッセイ、表現型スクリーニング法、実地評価及び免疫診断アッセイを含むが、これらに限定されない。
【００９５】
双子葉植物を特異的に形質転換する方法は、当業者に周知である。これらの方法を用いる形質転換及び植物再生は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のメンバー、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｙｔｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）及びアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）のメンバーを含むが、これらに限定されない多くの作物について記載された。主としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いて双子葉植物を形質転換し、遺伝子導入植物を得る方法は、綿（米国特許第５，００４，８６３号、米国特許第５，１５９，１３５号、米国特許第５，５１８，９０８号）、ダイズ（米国特許第５，５６９，８３４号、米国特許第５，４１６，０１１号、McCabeら(1988年)、Biotechnology、6巻、923頁、Christouら(1988年)、Plant Physiol.、87巻、671〜4頁）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）（米国特許第５，４６３，１７４号）、ラッカセイ（Chengら(1996年)、Plant Cell Rep.、15巻、653〜7頁、McKentlyら(1995年)、Plant Cell Rep.、14巻、699〜703頁）、パパイヤ及びナシ（Grant(1995年)、Plant Cell Rep.、15巻、254〜8頁）について公表された。
【００９６】
単子葉植物を形質転換する方法も当業者に周知である。これらの方法を用いる形質転換及び植物再生は、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒａｅ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、オートムギ（Ａｖｅｎａ  ｓａｙｔｉｖａ）、カモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、インディカ及びジャポニカ品種を含む）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐ）、ヒロハノウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）、芝生種（例えば、ハイコヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ）、ケンタッキーブルーグラス（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）、イヌシバ（Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ  ｓｅｃｕｎｄａｔｕｍ））、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）及びムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）を含むが、これらに限定されない多くの作物について記載された。任意の数の関心のある標的作物のための安定的な遺伝子導入植物を生産するために、多くの形質転換の方法を用いることができ、改変することができることは、当業者には明らかである。
【００９７】
今回開示する方法に用いるためにあらゆる植物を選択することができる。本発明による改変に好ましい植物は、例えば、及び制限なしに、油料種子植物、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の種（例えば、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ））、ルリジサ（Ｂｏｒａｇｅ  ｓｐｐ．）、カノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ．）、カストール（Ｒｉｃｉｍｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ココアマメ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｓｐｐ）、ハマナ属種（Ｃｒａｍｂｅ  ｓｐｐ．）、クフェア属種（Ｃｕｐｈｅａ  ｓｐｐ．）、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｓｐｐ．）、レスクェレラ（Ｌｅｓｑｕｅｒｅｌｌａ）及びリムナンテス（Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ）属種、リノラ、ノウゼンハレン（Ｔｒｏｐａｅｏｌｕｍ  ｓｐｐ．）、マツヨイグサ属種（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ  ｓｐｐ．）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｓｐｐ．）、ヤシ（Ｅｌａｅｉｓ  ｓｐｐ．）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｓｐｐ．）、ナタネ、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｓｐｐ．）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ及びＳｏｊａ  ｓｐｐ．）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐｐ．）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｐｐ．）、ベルノニア属種（Ｖｅｒｎｏｎｉａ  ｓｐｐ．）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐｐ．）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｓｐｐ．）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓｐｐ．）、オートムギ（Ａｖｅｎａ  ｓｐｐ．）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｓｐｐ．）及びライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｓｐｐ．）又はイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）の他のメンバーを含む。
【００９８】
任意の数の関心のある標的作物から安定的な遺伝子導入植物を生産するために、多くの形質転換の方法を用いることができ、改変することができることは、当業者には明らかである。
【００９９】
以下の実施例は、特定の個別の特徴及び／又は実施形態を例示するために記載する。これらの実施例は、本発明を記載する個別の特徴又は実施形態に限定すると解釈すべきではない。
［実施例］
【実施例１】
【０１００】
材料及び方法
硝酸塩調節遺伝子を予測するためのバイオインフォマティクス解析：硝酸塩調節遺伝子を特定するために植物遺伝子相互作用のネットワークモデルを用いてバイオインフォマティクス解析を実施した。モデルの予測を充実させるために、硝酸塩処理に対応する利用可能なマイクロアレイ発現データを用いた（Wangら(2003年)、前出、Scheibleら(2004年)、前出、Wangら(2004年)、前出、Gutierrezら(2007年)、前出）。
【０１０１】
第１に、すべてのシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）転写因子遺伝子を選択した。第２に、硝酸塩により有意に調節された遺伝子を選択した。第３に、マイクロアレイ解析のそれぞれにおいて処理及び対照実験を比較した場合に認められた大きさ（変化倍率）に基づいて順位スコアを遺伝子に割り当てた。第４に、ネットワークモデルで認められた接続の数に基づいて順位スコアを遺伝子に割り当てた（Gutierrezら(2007年)、前出）。高度に接続された遺伝子は、「調節ハブ」であり得る（Barabasi及びOltvai(2004年)、Nat. Rev. Genet.、5巻、101〜13頁）。第５に、我々は遺伝子ファミリーのサイズに基づいて順位スコアを遺伝子に割り当てた。遺伝子ファミリーサイズは、Gutierrezら(2004年)、Genome Biol.、5巻、R53頁の方法を用いてＢＬＡＳＴＣＬＵＳＴ（商標）を用いて決定した。この最後の基準は、機能的冗長性に起因して対応する突然変異体に表現型の欠如の可能性を減少させるために用いた。最後に、すべての独立に得られたスコア順位の中央値を計算し、順位付けし、それにより、遺伝子の最終リストを得た。
【０１０２】
植物物質及び生育条件：野生型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｏｌｕｍｂｉａ−０（「Ｃｏｌ−０」）をすべての実験に用いた。用いたすべての突然変異体もＣｏｌ−０バックグラウンドにあった。ｔｇａ１、ｔｇａ４単一突然変異体及びｔｇａ１／ｔｇａ４二重突然変異植物は、Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡのＤｒ．Ｘｉｎｎｉａｎ  Ｄｏｎｇによってご好意により提供された（Kesarwani(2007年)、前出）。硝酸還元酵素（ＮＲ）−ＮＵＬＬ突然変異体系列は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡのＮｉｇｅｌ  Ｃｒａｗｆｏｒｄ氏によってご好意により提供された（Wangら(2004年)、前出）。内鞘（Ｅ３７４）を標識する用いたＧＦＰ系統の源は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＧＦＰエンハンサートラップラインから入手できる。
【０１０３】
植物は、窒素不含有のＭＳ３１修正基礎塩類培地（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて水耕栽培で生育させた。この培地に０．５ｍＭコハク酸アンモニウム及び３ｍＭスクロースを添加した。２２℃で長日（１６／８時間明／暗）条件下（Ｐｅｒｃｉｖａｌインキュベーター中）で１４日後に、植物を１５日目の明サイクルの開始時に表示した期間にわたり５ｍＭ  ＫＮＯ３又は対照としての５ｍＭ  ＫＣｌで処理した。硝酸塩処理に対する根の応答の表現型解析のために、幼植物を上述のように生育させ、５ｍＭ  ＫＮＯ３又は５ｍＭ  ＫＣｌ（陰性対照としての）で３日間処理した。一次根の測定のために、ＥＰＳＯＮ（商標）Ｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ  Ｖ７００  Ｐｈｏｔｏスキャナーを用いて植物の画像を取得し、ＩＭＡＧＥＪ（商標）プログラムを用いて根を測定した。側根は、ＮＩＫＯＮ（商標）Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ顕微鏡上のＤＩＣ光学系を用いて計数した。
【０１０４】
ＲＮＡ単離及びＲＴ−ｑＰＣＲ：ＲＮＡは、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従ってＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬を用いて全根から単離した。ｃＤＮＡ合成は、製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示に従ってＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ（商標）逆転写酵素を用いて行った。ＲＴ−ｑＰＣＲは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ３０００Ｐ  ｑＰＣＲシステムでＢｒｉｌｌｉａｎｔ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＱＰＣＲ試薬を用いて行った。ＲＮＡレベルは、クラスリン（Ａｔｇ４ｇ２４５５０）に対して標準化した。図１３に示すように、プロットした値は、３つの生物学的複製物（replicates）の平均値±標準偏差に相当する。統計学的に異なる平均値は認められなかった（ｐ＜０．０５）。
【０１０５】
内鞘細胞のプロトプラストの生成及び細胞選別：内鞘を標識したエンハンサートラップラインＥ３７４幼植物を上で述べたのと同じ実験条件下で生育させた。唯一の窒素源としての０．５ｍＭコハク酸アンモニウムを用いて水耕法で生育させた植物を１５日目の始まりに５ｍＭ  ＫＮＯ３又は５ｍＭ  ＫＣｌで２時間処理した。根を採取し、Birnbaumら(2005年)、Nat. Methods、2巻、615〜9頁及びGiffordら(2008年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、105巻、803〜8頁の方法に従ってセルラーゼ及びペクトリアーゼを用いて処理することにより、プロトプラストを生成させた。ＧＦＰ２４発現系統は、ＦＡＣＳを用いて単離し、ｍｉｒＶａｎａ（商標）全ＲＮＡ抽出キット（Ａｍｂｉｏｎ、１５６０Ｍ）から溶解緩衝液中に直接収集した。ｃＤＮＡ合成及び遺伝子発現解析は、前述のように実施した。
【０１０６】
遺伝子発現及びネットワーク解析：ｃＤＮＡ合成、アレイハイブリダイゼーション及びシグナル強度の標準化は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘにより提供された説明書に従って実施した。データは、頑健マルチアレイ解析（ＲＭＡ）を用いてＲソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で標準化した（Irizarryら(2003年)、Biostatistics、4巻、249〜64頁）。標準化データを偽発見率を５％として２元ＡＮＯＶＡ分析（Ｐ＜０．０５）に供した。ＡＮＯＶＡ分析のために、以下のような所定の遺伝子Ｙの式を考慮したモデルを用いた：
Ｙｉ＝β０Ｔ＋β１Ｇ＋β２ＴＧ＋ε                    式１
ここで、β０は、総平均値であり、β１、β２及びβ３は、それぞれ処理、遺伝子型及びこれらの２つの因子間の相互作用の効果であり、εは、非説明分散である。
【０１０７】
重要な処理を処理する遺伝子の分子ネットワーク：遺伝子型相互作用因子を、ＶｉｒｔｕａｌＰｌａｎｔ（商標）（ｖｉｒｔｕａｌｐｌａｎｔ．ｏｒｇ）を介して利用可能な「Ｇｅｎｅ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ」ツールを用いて構築した。上流遺伝子領域における少なくとも１つの転写因子結合部位及びゲノムにおけるすべての上流配列における平均存在量を上回る転写因子結合部位の過剰表出（２標準偏差）を考慮した、タンパク質−ＤＮＡ相互作用を含めた。調節相互作用予測を改善するために、その発現値が我々のマイクロアレイ実験において有意に相関していた（Ｐ＜０．０５）転写因子／標的対のみを含めるためにタンパク質−ＤＮＡ相互作用をフィルターした。得られたネットワークをＣｙｔｏｓｃａｐｅ（商標）ソフトウエアを用いて視覚化した（Shannonら(2003年)、Genome Res.、13巻、2498〜504頁）。
【０１０８】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ：ＣｈＩＰアッセイは、Salehら(2008年)、Nat. Protoc.、3巻、1018〜25頁の方法に従って実施した。手短に述べると、唯一の窒素源としての０．５ｍＭコハク酸アンモニウムを用いて２週間水耕法で生育させた植物を１５日目の明け方（明期の始まり）に５ｍＭ  ＫＮＯ３又は対照としての５ｍＭ  ＫＣｌで処理した。根を採取し、直ちに室温で真空中で１％ホルムアルデヒドで１０分間固定した。０．１２５Ｍの最終濃度にグリシンを加えることにより架橋を停止させた。
【０１０９】
クロマチンの単離のために核を準備した。単離したクロマチンを１サイクル及び４０％振幅でそれぞれ１５秒間にわたり２２回音波処理した（Ｄｒ．Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ  ＧｍｂＨ  Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ）。せん断クロマチンの小アリコートを除去して、対照（インプット）とした。希釈クロマチンを抗ＴＧＡ１抗体とともにＩＰに用い、非特異的ＩｇＧを陰性対照として用いた。免疫沈降ＤＮＡを次のプライマーの組を用いて定量的ＰＣＲにより増幅した：ＡｔＮＲＴ２．１（フォワード、５’−ＣＴＡＴＣＣＴＧＴＡＴＣＡＣＴＧＴＡＴＧＴＡＡＣＣＡＧ（配列番号１７）；リバース、５’−ＧＧＡＴＧＧＡＴＡＧＴＣＡＡＣＡＡＴＡＴＧＧＴＴＧＴＧ（配列番号１８））及びＡｔＮＲＴ２．２（フォワード、５’−ＣＴＣＡＡＣＡＧＡＧＧＧＡＡＣＡＣＣＧＧ（配列番号１９）；リバース、５’−ＣＣＣＡＡＡＡＴＡＴＡＴＴＡＣＡＡＴＧＴＡＧＴＴＧ（配列番号２０））。
【０１１０】
多様なデータ型を統合するために順位付けシステムを開発した。このシステムにより、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４がシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における窒素応答を制御する潜在的に重要な調節因子であると同定された。我々は、重要な窒素応答調節因子としてのＴＧＡ１及びＴＧＡ４の重要性を実験的に実証し、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４が硝酸塩の取込み及び還元に関与する重要な遺伝子の窒素調節を媒介することをさらに実証した。ＴＧＡ１及びＴＧＡ４が硝酸塩に応答する一次根及び側根の成長の重要な調節因子であることも確定された。これらの結果は、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４転写因子が植物の根の窒素応答における重要な調節因子であることを確認するものである。
【実施例２】
【０１１１】
シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における硝酸応答調節因子の決定
実施例１で示した方法に従って、硝酸塩処理に対する絶対応答に基づいて転写因子を各実験において順位付けした（最強応答が最良の順位、誘導又は抑制）。各実験の順位を平均して、硝酸塩調節に関する１つのスコアを得た。解析の最上位候補は、硝酸応答に以前に関連付けられなかったｂＺＩＰ転写因子であるＴＧＡ１（Ａｔ５ｇ６５２１０）であった。ｂＺＩＰファミリーの密接に関連するメンバーであるＴＧＡ４（Ａｔ５ｇ１００３０）もより低いスコアを有する順位付けにあることが認められた。それらの報告された機能的冗長性（Kesarwaniら(2007年)、前出）のため、ＴＧＡ１及びＴＧ４の両方をさらなる解析のために選択した。
【実施例３】
【０１１２】
硝酸塩はＴＧＡ１及びＴＧＡ４の発現を調節する
硝酸応答におけるこれらの転写因子の可能な役割を解析するための第１のステップとして、硝酸塩処理後の経時的実験でＴＧＡ１及びＴＧＡ４  ｍＲＮＡレベルを測定した。野生型Ｃｏｌ−０植物を唯一の窒素源としての０．５ｍＭコハク酸アンモニウムを用いて水耕法で２週間生育させた。１５日目の明期の開始時に、植物を５ｍＭ  ＫＮＯ３又はＫＣｌ（対照）に曝露した。その後１、２、４及び８時間目にＲＮＡの単離のために根組織を採取した。ＴＧＡ１及びＴＧＡ４の転写レベルを定量的ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて測定し、クラスリン遺伝子を参照標準として用いた。ｍＲＮＡレベルは、時間０を基準とした（図１（Ａ〜Ｂ））。図１Ａ及び１Ｂに示すように、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４  ｍＲＮＡの両方がＫＮＯ３処理の後に急速に蓄積したが、ＫＣｌ処理の後には蓄積しなかったことから、これらの遺伝子の発現が根における硝酸塩処理により調節されることがわかる。ＴＧＡ１及びＴＧＡ４の硝酸塩調節がすべてのＴＧＡファミリーメンバーに共通であるかどうかを評価するために（Jakobyら(2002年)、Trends Plant Sci.、7巻、106〜11頁）、ＴＧＡ２、ＴＧＡ３、ＴＧＡ５、ＴＧＡ６、ＴＧＡ７、ＴＧＡ９、ＴＧＡ１０及びＰＡＮについてｍＲＮＡレベルを測定した。上述と同じ実験条件下で、硝酸塩処理は、図１３に示すように、これらの他のＴＧＡ転写因子の発現に影響を及ぼさなかった。同じ実験条件下で、硝酸塩処理は、他のＴＧＡ転写因子の発現に影響を及ぼさなかった。これらの結果は、硝酸塩処理が根におけるＴＧＡ１及びＴＧＡ４発現に特異的に影響を及ぼすことを示すものである。
【実施例４】
【０１１３】
硝酸塩代謝物はＴＧＡ１及びＴＧＡ４の発現を調節する
観察された調節が硝酸塩に直接的に起因するのか、又は硝酸塩の還元の後に産生したＮ−代謝物に起因するのかを評価するために、同様な実験をＮＲヌル突然変異体において行った（Wangら(2004年)、前出）。植物を唯一の窒素源としてのアンモニウムを含む水耕栽培用培地中で生育させた。１５日目の明期の開始時に、根を採取する（時間０）か又は２５０ｍＭ  ＫＮＯ３、２５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ又は５ｍＭ  ＫＣｌに示した時間にわたり曝露した。根を採取し、全ＲＮＡをＲＴ−ｑＰＣＲ解析のために単離し、クラスリン遺伝子をＲＮＡレベルの標準化のために用いた（図１Ｃ及び１Ｄ）。
【０１１４】
ＮＲヌル突然変異体におけるＮＲ活性の欠如は、硝酸塩の還元を妨げ、下流シグナルの産生を阻止する（Wangら(2004年)、前出）。したがって、野生型及びＮＲヌル突然変異体の両方における硝酸塩に応答する遺伝子は、硝酸塩により直接的に調節される。ＮＲヌル突然変異体においては、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４  ｍＲＮＡレベルの両方が１時間後に硝酸塩処理により誘導された（図１Ｃ及び１Ｄ）。しかし、硝酸塩処理の後のＴＧＡ１及びＴＧＡ４  ｍＲＮＡの蓄積は、野生型植物と比較して、ＮＲヌル突然変異体において有意に低かった。大幅な減少にもかかわらず、硝酸塩処理の後のＮＲヌル突然変異植物におけるＴＧＡ１及びＴＧＡ４  ｍＲＮＡレベルの増加が検出されたことは、硝酸塩及び他のＮ代謝物によるこれらの遺伝子の発現の調節を示すものである。
【０１１５】
ＴＧＡ１及びＴＧＡ４の調節に寄与するさらなるＮ代謝シグナルを同定するために、我々は、亜硝酸塩又はアンモニウム処理の後のＴＧＡ１及びＴＧＡ４  ｍＲＮＡレベルの時間的推移を評価した。以前の試験で、２５０μＭ亜硝酸塩が亜硝酸応答遺伝子の誘導のピークを得るための最適濃度であることが示された（Wangら(2007年)）。２５０μＭ亜硝酸塩処理により、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４転写レベルの両方が誘導された（図１Ｅ及び１Ｆ）。ＧＤＨ２及び他のアンモニウム応答遺伝子のアンモニウム調節を評価するための報告された条件（Pattersonら、2010年）（図14）を用いたアンモニウム処理後のこれらの遺伝子についてｍＲＮＡレベルの有意な変化は認められなかった（図１Ｇ及び１Ｈ）。これらの結果は、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４がシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）根において硝酸塩及び亜硝酸塩により誘導されることを示すものである。
【実施例５】
【０１１６】
亜硝酸塩はＴＧＡ１及びＴＧＡ４の発現を調節する
ＴＧＡ１及びＴＧＡ４の調節に寄与するさらなる窒素代謝シグナルを同定するために、亜硝酸塩又はアンモニウム処理の後のＴＧＡ１及びＴＧＡ４  ｍＲＮＡレベルの時間的推移を評価した。亜硝酸塩処理は、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４転写レベルの両方を誘導した（図２（Ａ〜Ｂ））。しかし、いずれのｍＲＮＡのレベルの有意な変化もアンモニウム処理の後のＴＧＡ１及びＴＧＡ４について認められなかった（図２（Ｃ〜Ｄ））。これらの結果は、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４が根において硝酸塩及び亜硝酸塩により誘導されることを示すものであり、これらの転写因子が硝酸塩の取込み及び還元の両方の初期のＮ−代謝ステップの調節に関与し得ることが示唆される。
【実施例６】
【０１１７】
ＴＧＡ１及びＴＧＡ４は一次根及び側根の成長を促進する
根の成長及び発達に対するＴＧＡ１及びＴＧＡ４の影響を評価するために、ｔｇａ１、ｔｇａ４単一突然変異体及びｔｇａ１／ｔｇａ４二重突然変異植物の３日ＫＮＯ３又はＫＣｌ（対照）処理に対する応答（Kesarwaniら(2007年)、前出）を解析した。上述と同じ実験条件下で２週間にわたり水耕法で生育させた植物において、及び３日間の５ｍＭ  ＫＮＯ３又はＫＣｌ処理の後に一次根長を測定した。具体的には、植物を唯一の窒素源としての０．５ｍＭコハク酸アンモニウムを用いて水耕法で２週間生育させた。１５日目の明け方に、幼植物を５ｍＭ  ＫＮＯ３又は５ｍＭ  ＫＣｌで３日間処理した。Ｃｏｌ−０、ｔｇａ１、ｔｇａ４及びｔｇａ１／ｔｇａ４植物のこれらの条件下の一次根長を実施例１で述べたように測定した（図３）。
【０１１８】
両ｔｇａ１及びｔｇａ４単一突然変異体は、ＫＮＯ３及びＫＣｌ処理の両方のもとで野生型植物と比較したとき正常な一次根成長を示した（図３Ａ）。単一突然変異体系列における表現型の欠如は、これらの２つの遺伝子間の高い配列類似性（Xiangら(1997年)、Plant Mol. Biol.、34巻、403〜15頁）及び病原性応答調節の文脈内のそれらの以前に報告された機能的冗長性（Kesarwaniら(2007年)、前出）と一致していた。
【０１１９】
単一突然変異体と対照的に、ｔｇａ１／ｔｇａ４二重突然変異体は、ＫＮＯ３処理のもとでの野生型植物と比較して低い一次根成長を示したが、ＫＣｌ対照処理のもとではそうでなかった（図３Ａ）。さらに、同じ実験条件下で硝酸塩に応答する側根密度を評価したところ、硝酸塩処理が、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４対立遺伝子を含む野生型（Ｃｏｌ−０）植物における側根密度を増加させた。しかし、ｔｇａ１／ｔｇａ４二重突然変異植物は、側根応答の変化を示し、硝酸塩処理において野生型植物と比較して低い側根密度を示した（図３Ｂ）。
【０１２０】
内鞘は、中心柱の最も外側の部分であり、側根は、内鞘組織から発生する（Dolanら(1993年)、Development、119巻、71〜84頁、Malamy及びBenfey(1997年)、Development、124巻、33〜44頁）。硝酸塩処理が内鞘細胞層におけるＴＧＡ１及びＴＧＡ４の発現を調節するかどうかを評価するために、内鞘マーカーライン植物を唯一の窒素源としての０．５ｍＭコハク酸アンモニウムを用いて水耕法で２週間生育させた。１５日目の明け方に、幼植物を５ｍＭ  ＫＮＯ３又は５ｍＭ  ＫＣｌで２時間処理した。プロトプラストを根から調製し、ＧＦＰを発現する内鞘細胞をＦＡＣＳにより選別した。全ＲＮＡを内鞘細胞から単離し、ＲＴ−ｑＰＣＲを用いてＴＧＡ１及びＴＧＡ４のｍＲＮＡレベルを測定した。ＴＧＡ１及びＴＧＡ４  ｍＲＮＡは、内鞘細胞において、ＫＮＯ３処理後に蓄積することが認められたが、ＫＣｌ処理後には認められなかった（図４）。この結果は、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４発現が、側根の発生が起こる、内鞘細胞において硝酸塩処理により調節されることを示すものである。これらの結果は、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４が硝酸塩に応答して根系の構造を調節するのに重要であることを示すものである。
【実施例７】
【０１２１】
ＴＧＡ１及びＴＧＡ４により制御される硝酸応答遺伝子ネットワーク
窒素の存在下での一次根及び側根の成長におけるこれらの転写因子の役割の基礎にあり得るＴＧＡ１及びＴＧＡ４標的遺伝子を同定するために、我々は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子チップ（ＡＴＨ１；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて野生型及びｔｇａ１／ｔｇａ４二重突然変異植物の根における硝酸塩の影響を評価するためにトランスクリプトミクス解析を実施した。植物は、唯一の窒素源としてのコハク酸アンモニウムを含むＭＳ培地中で生育させ、上述のように５ｍＭ  ＫＮＯ３又はＫＣｌで２時間処理した。全ＲＮＡを根組織から単離し、実施例１で述べたような遺伝子チップハイブリダイゼーションに備えた。遺伝子発現データをＲＭＡを用いて標準化し、Kroukら(2009年)、PloS Comput. Biol.、5巻、e1000326頁の方法に従って２元ＡＮＯＶＡを用いて差次的遺伝子発現を確認した。ＡＮＯＶＡモデルに考慮した要因は、植物遺伝子型（Ｇ）、処理（Ｔ）及び遺伝子型と処理との交互作用（ＴＧ）であり、５％ＦＤＲを遺伝子発現の有意な変化を定義するために用いた。結果は、我々の実験条件下では８２７遺伝子が硝酸塩処理（Ｔ）により調節されることを示すものであった。これらの実験において硝酸塩により調節された遺伝子の数及び性質は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）硝酸応答の全ゲノム解析で以前に報告されたものと同等であった（Wangら(2003年)、前出、Scheibleら(2004年)、前出、Wangら(2004年)、前出）。
【０１２２】
ＴＧ要因が有意であった９６遺伝子が同定された。これらの９６遺伝子は、硝酸塩に対するその応答が野生型ＴＧＡ１／ＴＧＡ４植物と比較してｔｇａ１／ｔｇａ４二重突然変異体において変化している遺伝子に対応する。４つの遺伝子のみがモデルにおける唯一の有意な要因としての遺伝子型を示し、ｔｇａ１／ｔｇａ４突然変異の効果が硝酸応答の状況において最も周知のものであることがわかる。全体的にみて、遺伝子の１５％がｔｇａ１／ｔｇａ４二重突然変異体における硝酸塩に応答する発現の調節の変化を示した。さらに、ｔｇａ１／ｔｇａ４二重突然変異体における遺伝子発現の変化を有する遺伝子の９７％も硝酸塩により調節された。この結果は、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４を硝酸応答の特異的な側面と強く関連付けている。
【０１２３】
硝酸塩に対するその応答がＴＧＡ１及びＴＧＡ４に依存する遺伝子の調節相互作用を明らかにするために、有意なＴＧ因子を示す遺伝子のネットワーク図をＶｉｒｔｕａｌＰｌａｎｔ（商標）ウェブサイトを介して利用可能であるＧｅｎｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓツールを用いて生成させた（Katariら(2010年)、Plant Physiol.、152巻、500〜15頁）。Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ（商標）を用いて得られたネットワークを視覚化したが、遺伝子は、調節相互作用を示す端により接続された結節点として表出されている（図５）。ネットワークによれば、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４の両方が硝酸トランスポーターＮＲＴ２．２の発現を正に調節する。ＮＲＴ２．２は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における硝酸塩の取込みのために重要である（Liら(2007年)、前出）。さらに、他のシグナル伝達経路に関与する遺伝子がネットワークに認められた。例えば、セリン／トレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ、Ａｔ５ｇ２５５１０）；タンパク質ホスファターゼ２Ｃ（ＰＰ２Ｃ、Ａｔ４ｇ３８５２０）；ＣＢＬ相互作用プロテインキナーゼ３（ＣＩＰＫ３、Ａｔ２ｇ２６９８０）及びオーキシン／インドール−３−酢酸７（ＩＡＡ７、Ａｔ３ｇ２３０５０）転写因子である。ペルオキシダーゼなどのストレス応答に関与するいくつかの遺伝子もＴＧＡ１及びＴＧＡ４により調節されることが認められた。
【０１２４】
これらの結果は、硝酸塩処理に応答して、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４が硝酸塩の取込み並びに細胞シグナル伝達及びストレス応答に関与する標的遺伝子の発現を調節することを示すものである。ｔｇａ１／ｔｇａ４二重突然変異体における硝酸塩処理に応答するそのような標的遺伝子の発現の調節の変化は、認められた表現型の変化を説明し得るものである。
【実施例８】
【０１２５】
硝酸応答におけるＴＧＡ１及びＴＧＡ４の調節的役割
我々のデータは、硝酸塩の取込みに直接的に関与する遺伝子が硝酸応答におけるＴＧＡ１及びＴＧＡ４の標的であることを予測するものである。硝酸塩の取込み及び還元に関与する遺伝子の発現がｔｇａ１／ｔｇａ４二重突然変異体において影響を受けるかどうかを判断するために、公知の硝酸応答遺伝子ＮＲＴ２．１、ＮＲＴ２．２、ＮＩＡ１及びＮＩＲのｍＲＮＡレベルを、野生型及びｔｇａ１／ｔｇａ４突然変異植物における硝酸塩処理の後にＲＴ−ｑＰＣＲを用いて測定した。具体的には、Ｃｏｌ−０及びｔｇａ１／ｔｇａ４植物を唯一の窒素源としてのアンモニウムを含む水耕栽培システムにおいて生育させた。１５日目の明期の開始時に、植物を５ｍＭ  ＫＮＯ３又は５ｍＭ  ＫＣｌ（対照）で示した時間にわたり処理した。ＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡレベルをＲＴ−ｑＰＣＲにより測定し、クラスリン遺伝子を標準化のために用いた。
【０１２６】
野生型植物においては、４つの遺伝子のすべてＮＲＴ２．１、ＮＲＴ２．２、ＮＩＡ１及びＮＩＲが硝酸塩処理により高度に誘導された。しかし、ＮＲＴ２．１、ＮＲＴ２．２及びＮＩＲ遺伝子の硝酸塩誘導は、ｔｇａ１／ｔｇａ４突然変異体において有意により低かった。図６Ａ〜Ｂ（野生型よりもそれぞれＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２について処理後２時間に２５％及び４８％低い）；図６Ｃ（野生型よりもＮＩＲについて処理後１時間目に４１％低い）。野生型植物とｔｇａ１／ｔｇａ４突然変異植物の間にＮＩＡ１の発現の差は認められなかった。これらの結果から、ＮＲＴ２．１、ＮＲＴ２．２及びＮＩＲが硝酸塩処理に応答してＴＧＡ１及びＴＧＡ４によって調節されることがわかる。
【０１２７】
硝酸塩の還元に関与する遺伝子の発現がＴＧＡ１及びＴＧＡ４により調節されるかどうかを判断するために、我々は同じ実験条件下でのＮＩＡ１及びＮＩＲの発現を評価した。野生型植物とｔｇａ１／ｔｇａ４突然変異植物の間にＮＩＡ１の発現の差は認められなかった（図１６）。しかし、ＮＩＲ遺伝子の硝酸塩誘導は、硝酸塩処理後１時間目にｔｇａ１／ｔｇａ４突然変異体において有意により低かった（４１％）（図６Ｃ）。これらの結果から、ＮＲＴ２．１、ＮＲＴ２．２及びＮＩＲがＴＧＡ１及びＴＧＡ４の標的遺伝子であることがわかる。
【０１２８】
ＴＧＡ１及びＴＧＡ４が組織特異的様式で調節されるので、我々は硝酸塩処理に応答するＴＧＡ１／ＴＧＡ４標的遺伝子の根細胞特異的発現を評価した。図１１Ａ及び１１ＢにＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２が表皮、内皮  内鞘及び中心柱において硝酸塩により調節されることを示す。対照的に、ＮＩＲは、すべての細胞型において硝酸塩により調節される。ＴＧＡ１／ＴＧＡ４発現ドメインとそれらの標的遺伝子との間に重複が存在するが、硝酸塩に応答するＮＲＴ２．１、ＮＲＴ２．２及びＮＩＲの組織特異的パターンを調節するためにさらなる調節因子が必要である。
【実施例９】
【０１２９】
ＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２の発現に対するＴＧＡ１の影響
ネットワークモデルは、ＮＲＴ２．２の発現に対するＴＧＡ１の直接的な影響も予測するものである。以前の報告で、ＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２がシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のゲノム内に非常に接近して位置していることが示された（Orselら(2002年)、Plant Physiol.、129巻、886〜96頁）。他の研究で、同様な転写メカニズムがＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２の硝酸応答に関与していることが提唱された（Girinら(2007年)、Plant Cell Environ.、30巻、1366〜80頁）。ＮＲＴ２．１がＴＧＡ１の直接的な標的であるかどうかを判断するために、ＮＲＴ２．１のプロモーター領域を手作業で調べたところ、ＴＧＡ１結合モチーフ（Schindlerら(1992年)、Plant Cell、4巻、1309〜19頁）が転写開始部位から−３０９位と−３０４位との間に存在することがわかった。これらの知見から、ＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２の発現がＴＧＡ１により直接調節されることが示唆される。
【０１３０】
ＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２の発現がＴＧＡ１により直接調節されることを検証するために、ＴＧＡ１特異抗体及び陰性対照としての非特異的ＩｇＧを用いてクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを実施した。植物を１５日目の明け方に５ｍＭ  ＫＮＯ３又は５ｍＭ  ＫＣｌで２０、６０又は１２０分間処理した。免疫沈降ＤＮＡは、ＴＧＡ１結合モチーフを含むＮＲＴ２．１又はＮＲＴ２．２プロモーター領域と対照して設計した特異的プライマーを用いてｑＰＣＲにより定量した。ＴＧＡ１は、ＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２プロモーターに硝酸塩依存的様式で結合する。（図７）。これらの特異的占有は、非特異的ＩｇＧを用いた又はＫＣｌ処理植物試料における免疫沈降では認められなかった。したがって、ＴＧＡ１は、硝酸塩処理に応答するＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２遺伝子の発現を直接調節する転写因子である。さらに、硝酸塩処理後２０分という早期に、ＴＧＡ１がその標的遺伝子のプロモーター領域に検出され、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４が硝酸塩／亜硝酸塩に対する早期応答に役割を果たすことが示唆される。
【実施例１０】
【０１３１】
ＴＧＡ１／ＴＧＡ４表現型は、硝酸塩の取込みの欠陥に起因しない
ＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２は、低い硝酸塩濃度のもとでの硝酸塩の取込みに必要な高親和性輸送システム（ＨＡＴＳ）の一部である（Liら(2007年)）。Huらは、ＮＲＴ２．１が広範囲の硝酸塩濃度により誘導され、ＮＲＴ２．１硝酸応答が低及び高親和性相から構成されることを示した（Huら、2009年）。図６Ａ及び６Ｂに示すように、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４は、低親和性範囲にある濃度である５ｍＭのＫＮＯ３処理のもとでのＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２の硝酸塩誘導に必要である。ＴＧＡ１及びＴＧＡ４が高親和性相におけるＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２の硝酸塩誘導に関与するかどうかを探究するために、我々は、２５０μＭ  ＫＮＯ３又は２５０μＭ  ＫＣｌ処理の２時間後におけるＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２遺伝子発現を評価した。図１２Ａ及び１２ＢにＴＧＡ１及びＴＧＡ４が２５０μＭ  ＫＮＯ３処理のもとでのＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２の硝酸塩誘導に必要であることを示す。これらの結果から、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４が、低及び高親和性相の両方におけるＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２遺伝子発現の正の調節因子であることがわかる。
【０１３２】
ｔｇａ１／ｔｇａ４二重突然変異体におけるＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２の発現の低下が硝酸塩の取込みに影響を及ぼすかどうかを判断するために、我々は、１５ＮＯ３−同位体標識を用いた正味の硝酸塩取込み実験を実施した。植物は、上述のように水耕法で生育させ、１０％１５ＮＯ３−で強化した２５０μＭ又は５ｍＭ  ＮＯ３−で示した時間にわたり処理した。正味の硝酸塩取込みは、野生型及びｔｇａ１／ｔｇａ４二重突然変異植物で同様であることが認められた（図１２Ｃ）。我々は長期１５ＮＯ３−曝露（８時間）において野生型とｔｇａ１／ｔｇａ４との間の硝酸塩取込みの差を認めなかった（図１２Ｃ）ことから、図３Ａ及び３Ｂに示す観察されたｔｇａ１／ｔｇａ４表現型は、硝酸塩の吸収の欠陥に起因しない可能性がある。この結果から、ｔｇａ１／ｔｇａ４における硝酸塩に応答する遺伝子発現に対する影響がシグナル伝達経路の欠陥に起因する可能性があることが示唆される。
【実施例１１】
【０１３３】
ＴＧＡ１はＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２プロモーターに硝酸依存的様式で結合する
ネットワークモデル（図５）は、ＮＲＴ２．２の発現に対するＴＧＡ１／ＴＧＡ４の直接的な影響を予測する。ＮＲＴ２．１もＴＧＡ１／ＴＧＡ４の直接的標的であるかどうかを判断するために、我々は、ＮＲＴ２．１のプロモーター領域を手作業で調べたところ、翻訳開始部位から−１３３８位と−１３３３位との及び−３７１位と−２６６位との間の２つの以前に記載されたＴＧＡ１結合モチーフ（Schindlerら、1992年）を認めた。興味深いことに、Girinら、2007年は、硝酸塩誘導を制御する領域を同定するためにＮＲＴ２．１プロモーターの欠失を作り、−４５６と−２４５との間の領域を欠失させた場合に硝酸塩に応答する遺伝子発現の強い減少を観察した（Girinら、2007年）。したがって、ＴＧＡ１結合部位は、遺伝子発現の硝酸塩誘導に重要であるＮＲＴ２．１プロモーターの領域に含まれている。我々は、ＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２がＴＧＡ１の直接的な標的遺伝子であるかどうかを評価するために、ＴＧＡ１特異抗体及び陰性対照としての非特異的ＩｇＧを用いたクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを用いた。植物は、上で行ったように１５日目の明け方に５ｍＭ  ＫＮＯ３又は陰性対照としての５ｍＭ  ＫＣｌで２０、６０又は１２０分間処理した。
【０１３４】
免疫沈降ＤＮＡは、−３７１及び−３６６位におけるＴＧＡ１結合モチーフを含むＮＲＴ２．１プロモーター領域又は−１２８７及び−１２８２並びに−１１９４及び−１１８９位における２つのＴＧＡ１結合モチーフを含むＮＲＴ２．２プロモーター領域と対照して設計した特異的プライマーを用いてｑＰＣＲにより定量した。図７Ａ及び７Ｂに示すように、ＴＧＡ１は、ＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２プロモーターに硝酸依存的様式で結合する。我々がＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２コーディング配列と対照して設計したプライマーを用いた場合に増幅が認められなかったので、この結合は、ＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２プロモーター領域に対して特異的であり、該遺伝子の他の領域に対して特異的でない（図７）。硝酸塩に応答する、ＮＲＴ２．１発現レベルは、ＮＲＴ２．２よりも３倍高く（図６）、したがって、ＴＧＡ１は、ＮＲＴ２．２プロモーター領域よりもＮＲＴ２．１プロモーター領域に大きい程度に動員される。我々がＴＧＡ１及びＴＧＡ４により調節されない硝酸応答遺伝子である、ＮＩＡ１プロモーター領域を増幅した場合に占有は認められなかった（図７）。ＴＧＡ１占有は、非特異的ＩｇＧを用いた又はＫＣｌを用いた対照条件における免疫沈降で認められなかった。この結果から、それらの発現を調節するための硝酸塩処理によってＮＲＴ２．１及びＮＲＴ２．２のプロモーター領域にＴＧＡ１が動員されることがわかる。
【実施例１２】
【０１３５】
硝酸塩に応答するＮＲＴ２．１の発現はｃｈｌ１−５及びＴ１０１Ｄ突然変異体において影響を受ける
Ｃｏｌ−０、ｃｈｌ１−５、Ｃｈｌ１−９及びＴ１０１Ｄ植物を材料及び方法で述べたシュー実験条件（thewe experimental conditions）を用いて水耕法で生育させた。１５日目の明期の開始時に、植物を５ｍＭ  ＫＮＯ３又は対照としての５ｍＭ  ＫＣｌで示した時間にわたり処理した。ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ｑＰＣＲによりＮＲＴ２．１  ｍＲＮＡレベルを測定した。クラスリン遺伝子（Ａｔ４ｇ２４５５０）を標準化基準として用いた。プロットした値は、３つの独立した生物学的反復測定の平均値±標準偏差に相当する（図１５）。アステリスクは、突然変異体系統とＣｏｌ−０との間で有意に異なる平均値を示す（Ｐ＜０．０５）。
【実施例１３】
【０１３６】
ｐＴＧＡ１：ＧＵＳ及びｐＴＧＡ４：ＧＵＳ遺伝子融合の構築並びにＧＵＳ活性アッセイ
キメラｐＴＧＡ１：ＧＵＳ及びｐＴＧＡ４：ＧＵＳ遺伝子融合のために、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４翻訳開始コドンの上流の２０００ｂｐ断片をシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎｓａ）生態型Ｃｏｌ−０のゲノムＤＮＡから増幅した。以下のプライマーを用いて、ＴＧＡ１及びＴＧＡ４プロモーターを増幅し、ＢａｍＨＩ及びＮｃｏＩ部位を導入するように設計した：ＴＧＡ１プロモーター（フォワード、５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＡＣＧＴＣＡＣＣＡＧＡＡＴＣ（配列番号２１）及びリバース、５’−ＡＡＣＣＡＴＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧ（配列番号２２））並びにＴＧＡ４プロモーター（フォワード、５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＧＴＴＧＴＧＧＴＣＡＣＣ（配列番号２３）及びリバース、５’−ＡＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＣＴＴＣＡＡＣＴＡＧＣＡＡＣ（配列番号２４））。組換えプラスミドをＢａｍＨＩ及びＮｃｏＩで消化し、ＤＮＡ断片をｐＣＡＭＢＩＡ１３８１（ＣＡＭＢＩＡ、Ｃａｎｂｅｒｒａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）にライゲーションした。構築物の構造をＤＮＡ配列決定により検証した。次いで、構築物をエレクトロポレーションによりアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１に導入した。シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介形質転換は、フローラルディッププロトコール（Clough及びBent、1998年）を用いて遂行した。Ｔ１世代の種子をハイグロマイシンに対する耐性のために選択した。少なくとも８つの独立した遺伝子導入系が各構築物について得られ、導入遺伝子の存在は、ＰＣＲにより検証した。ＧＵＳ活性の組織化学的分析のために、幼植物をＧＵＳ反応緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．５ｍＭフェリシアン化カリウム、０．５ｍＭフェロシアン化カリウム、０．１％（容積／容積）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％（重量／容積）ラウロイルサルコシンナトリウム）に１ｍＭ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）を補充した緩衝液中で３７℃でインキュベートした。染色後、試料を２０％メタノール中０．２４Ｎ  ＨＣｌとともに５７℃で１５分間インキュベートすることにより透明にした。この溶液を６０％エタノール中７％ＮａＯＨ、７％ヒドロキシルアミン−ＨＣｌで置換し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、幼植物をそれぞれ４０％、２０％及び１０％エタノール中で５分間再水和し、５％エタノール、２５％グリセロールで１５分間浸透させた。試料を５０％グリセロールに入れてガラス製顕微鏡スライド上にマウントし、ＮＩＫＯＮ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ顕微鏡上のＤＩＣ光学系を用いて撮像した。各マーカーライン及び処理について、少なくとも１５個の植物を分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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