(57)【要約】  生体活性材料のための乾燥安定化組成物は、糖及び加水分解されたタンパク質を含有し、そしては生体活性材料のための増大した安定性を提供する錠剤又他の形態に形成されてもよい。生体活性材料を含有する組成物は、（ａ）生体活性材料と他の成分を水性溶媒中で混合して粘着性のスラリーを形成し；（ｂ）液体窒素中で前記スラリーを瞬間凍結し（snap-freezing）、固体凍結粒子、ビーズ、液滴、又は紐（strings）を形成し；（ｃ）その凍結温度を上回る温度においてそれを維持する一方で、真空下での工程（ｂ）の生成物の水の除去により一次乾燥し；そして（ｄ）０．３Ａｗ未満まで水分活性を減少させるのに十分な時間、最大真空、且つ２０℃以上の温度において、工程（ｃ）の生成物を二次乾燥すること、を含む方法により生産されてもよい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物の合計重量に基づいて、約１０％〜８０％のオリゴ糖、約５％〜３０％の二糖、及び約１％〜１０％の多糖を含む炭水化物成分；並びに約０．５％〜４０％の加水分解された動物性又は植物性タンパク質を含むタンパク質成分を含む、生体活性材料のための乾燥安定化組成物。
【請求項２】
前記加水分解されたタンパク質成分が、加水分解されたカゼイン、加水分解されたホエータンパク質、加水分解されたエンドウマメタンパク質、加水分解されたダイズタンパク質又はこれらの混合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記加水分解されたカゼイン、加水分解されたホエータンパク質、加水分解されたエンドウマメタンパク質、及び加水分解されたダイズタンパク質が、広範囲にわたり加水分解されているタンパク質である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記多糖が、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、カルボキシ−メチル−セルロース、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸の塩、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース、カラギーナン、ジェランガム、グアーガム、アカシアガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、キトサン及びキトサン誘導体、コラーゲン、ポリグリコール酸、デンプン、修飾デンプン、又はこれらの混合物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記オリゴ糖が、シクロデキストリン、イヌリン、マルトデキストリン、デキストラン、フルクト−オリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクト−オリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナン−オリゴ糖（ＭＯＳ）又はこれらの混合物を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記二糖が、トレハロース、スクロース、ラクトース、又はこれらの混合物を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物の合計重量に基づいて、約０．５％〜１０％のカルボン酸を含む、カルボン酸成分をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記カルボン酸成分が、乳酸、アスコルビン酸、マイレン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸、これらの塩、又はこれらの混合物を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、前記生体活性材料と組み合わされる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記生体活性材料が、生、死若しくは弱毒化細胞、微生物、ウイルス、細菌、プロバイオティック細菌、植物性細菌、土壌細菌、真菌、酵母、細胞培養物、タンパク質、組み換えタンパク質、酵素、ペプチド、ホルモン、ワクチン、抗生物質、薬物又はこれらの混合物を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、非晶質ガラス状態において乾燥している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、空気乾燥、真空乾燥、流動層乾燥及び噴霧乾燥からなる群から選択される１又は２以上のプロセスにより乾燥される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
（ａ）生体活性材料と少なくとも前記炭水化物成分及び前記タンパク質成分とを水性溶媒中で混合して粘着性のスラリーを形成し；（ｂ）前記スラリーを液体窒素中で瞬間凍結し（snap-freezing）、固体凍結粒子、ビーズ、液滴、又は紐（strings）を形成し；（ｃ）その凍結温度を上回る温度においてそれを維持しつつ、工程（ｂ）の生成物の真空下での水の除去により一次乾燥し；そして（ｄ）０．３Ａｗ未満まで水分活性を減少させるのに十分な時間、最大真空、且つ２０℃以上の温度において、工程（ｃ）の生成物を二次乾燥すること；を含む、請求項９に記載の組成物を生産する方法。
【請求項１４】
前記スラリーが、瞬間凍結前に、ｐＨ又は温度変化により、あるいは金属イオンによるポリマー鎖の架橋により、硬いヒロドゲルに固形化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記スラリーが、所望の形状に成形される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記一次水除去工程が、２０００ｍＴＯＲＲ超の真空圧力下で行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記乾燥された材料が、切断、破砕、粉砕、又はそれぞれ流動性粉末（free flowing powder）まで微粉砕される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記粒子径が約１０００μｍ未満である、請求項１７に記載の方法により製造される組成物。
【請求項１９】
請求項９に記載の組成物を含有する、再構成液体、粉砕粉末、錠剤、ペレット、カプセル、食品若しくは飼料又は被覆種子製品。
【請求項２０】
請求項９に記載の組成物を含む、栄養補助食品、医薬製品、農業製品又はワクチン製品。
【請求項２１】
請求項９に記載の組成物を含有する、バー、液体製剤、コロイド懸濁液、粉末、錠剤、カプセル及び被覆種子の形態における、食品、食品添加物、動物飼料、動物飼料添加物、栄養補助食品、医薬製品、農業製品又はワクチン製品。
【請求項２２】
請求項１３に記載の方法により製造された組成物。
【請求項２３】
１又は複数の糖及び１又は複数の加水分解されたタンパク質を含む、乾燥したガラス状且つ非晶質組成物中に組み込まれ、傷つきやすい生体活性材料の圧縮により製造された、錠剤、丸薬又はペレットであって、前記組成物の合計乾燥重量に基づいて、前記糖が約１０％〜６０％で含まれ、そして前記加水分解されたタンパク質が約１％〜４０％で含まれる、錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項２４】
前記生体活性材料が、生、死若しくは弱毒化細胞、微生物、ウイルス、細菌、プロバイオティック細菌、植物性及び土壌細菌、真菌若しくは酵母、細胞培養物、タンパク質、組み換えタンパク質、酵素、ペプチド、ホルモン、ワクチン、抗生物質、薬物又はこれらの混合物を含む、請求項２３に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項２５】
前記加水分解されたタンパク質が、幅広く加水分解されたカゼイン、ホエータンパク質、エンドウマメタンパク質、ダイズタンパク質又はこれらの混合物を含む、請求項２３又は２４に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項２６】
前記糖が、トレハロース、スクロース、ラクトース及びこれらの混合物からなる群から選択される二糖である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項２７】
前記ガラス増強化合物が、組成物中に含まれ、前記ガラス増強化合物が、組成物の合計乾燥重量に基づいて、約１％〜２０％で含まれる、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項２８】
前記ガラス増強化合物が、ギ酸、シュウ酸、アスコルビン酸、リン酸、又はこれらの組み合わせのイオンを含む、請求項２７に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項２９】
前記組成物が、多糖若しくはオリゴ糖又はこれらの混合物をさらに含む、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項３０】
前記組成物が、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、カルボキシ−メチル−セルロース、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸の塩、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース、カラギーナン、ジェランガム、グアーガム、アカシアガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、キトサン及びキトサン誘導体、コラーゲン、ポリグリコール酸、デンプン、修飾デンプン及びこれらの混合物からなる群から選択される多糖を含み、そして前記多糖は、組成物の合計乾燥重量に基づいて、約０．１％〜１０％で含まれる、請求項２９に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項３１】
前記組成物が、シクロデキストリン、イヌリン、マルトデキストリン、デキストラン、フルクト−オリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクト−オリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナン−オリゴ糖（ＭＯＳ）及びこれらの混合物からなる群から選択されるオリゴ糖を含み、そして前記オリゴ糖は、組成物の合計乾燥重量に基づいて、約０．５％〜２０％で含まれる、請求項２９又は３０に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項３２】
前記組成物が、非晶質ガラス状態において乾燥される、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項３３】
前記組成物が、空気乾燥、真空乾燥、流動層乾燥及び噴霧乾燥からなる群から選択される１又は２以上のプロセスを含む方法により乾燥される、請求項３２に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項３４】
前記乾燥したガラス状且つ非晶質組成物中に組み込まれた傷つきやすい生体活性材料を圧縮することを含み、前記乾燥したガラス状且つ非晶質組成物は、（ａ）生体活性材料と少なくとも１又は複数の糖及び１又は複数の加水分解されたタンパク質を水性溶媒中で混合して粘着性のスラリーを形成し；（ｂ）液体窒素中で前記スラリーを瞬間凍結し（snap-freezing）、固体凍結粒子、ビーズ、液滴、又は紐（strings）を形成し；（ｃ）その凍結温度を上回る温度においてそれを維持する一方で、真空下で工程（ｂ）の生成物の水を除去することにより一次乾燥し；そして（ｄ）０．３Ａｗ未満まで水分活性を減少させるのに十分な時間、最大真空、且つ２０℃以上の温度において、工程（ｃ）の生成物を二次乾燥すること；を含むプロセスにより製造される、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の錠剤、丸薬又はペレットを生産するための方法。
【請求項３５】
前記スラリーが、瞬間凍結前に、ｐＨ又は温度変化により、あるいは金属イオンによるポリマー鎖の架橋により、硬いヒロドゲルに固化される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記一次水除去工程が、２０００ｍＴＯＲＲ以上の真空下で行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記乾燥された材料が、切断、破砕、粉砕、又はそれぞれ流動性粉末（free flowing powder）まで微粉砕される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記粉末の粒子径が、約１０００μｍ未満である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記生体活性材料が、打錠装置中の圧縮又は圧搾において安定である、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項４０】
請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の錠剤、丸薬又はペレットを含む、飲料、食品、動物飼料、栄養補助食品、医薬製品、農業製品又はワクチン製品。
【請求項４１】
請求項３４に記載の方法により製造される、錠剤、丸薬又はペレット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１月２８日に出願された米国仮出願第６１／２９９，３１５号に基づく優先権を主張する、２０１１年１月２８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／２２８２１号の国内移行である、２０１２年３月２９日に出願された米国出願第１３／３７８，１０６号の一部継続出願である。本出願は、２０１０年８月１３日に出願された米国仮出願第６１／３７３，７１１号に基づく優先権を主張する、２０１１年８月１２日に出願された米国出願第１３／２０８，４５９号の一部継続出願である。本出願は、さらに、２０１２年３月２３日に出願された米国仮出願第６１／６１４，９９４号、２０１２年５月３日に出願された米国仮出願第６１／６４２，０９４号、及び２０１２年５月１３日に出願された米国仮出願第６１／６４６，３３７号に基づく優先権を主張する。上記の出願の全ての内容は、全ての目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
高温及び高湿度における長期保存における生体材料の構造及び機能の保持は、食品、栄養補助食品及び医薬産業において、根本的に重要である。傷つきやすい生体材料、例えばタンパク質、酵素、細胞、細菌、及びウイルスは、後の使用のための長期保存のために、しばしば保護されなければならない。保存において生体材料を安定化するために、多くの方法が試みられているが、多くは、傷つきやすい生体活性物質、例えば生又は弱毒化細菌及びウイルスに好適ではない。例えば、典型的な凍結乾燥は、凍結及び乾燥の双方によるストレスを兼ね備える。このプロセスの凍結工程は、望ましくない影響、例えばタンパク質及び酵素の変性、並びに細胞の破裂、を有する。
【０００３】
幅広い範囲の生体材料に有用であり、例えば材料の輸送及び保存の間に直面するような上昇した温度及び変化する湿度において、長期間にわたる生体材料の優れた安定化及び／又は保護を提供する一方で、さらに再水和において著しい量の活性を未だ保持する、安定化組成物に対する需要は存在する。また、その多くが錠剤形成の間に直面する高圧及び温度に傷つきやすい生体材料の活性を過剰に損なうことなく、錠剤形成用途に用いることができる安定化組成物についての需要も存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
１つの態様において、本発明は、生体活性材料のための乾燥安定化組成物であって、組成物の合計重量に基づいて、約１０％〜８０％のオリゴ糖、約５％〜３０％の二糖、及び約１％〜１０％の多糖を含む炭水化物成分；並びに約０．５％〜４０％の加水分解された動物又は植物性タンパク質を含むタンパク質成分を含む、組成物を提供する。前記組成物は、生体活性材料と組み合わされてもよい。
【０００５】
別の態様において、本発明は、前記生体活性材料と組み合わされた上記組成物を生産する方法であって、（ａ）生体活性材料と少なくとも前記炭水化物成分及び前記タンパク質成分を水性溶媒中で混合して粘着性のスラリーを形成し；（ｂ）液体窒素中で前記スラリーを瞬間凍結し（snap-freezing）、固体凍結粒子、ビーズ、液滴、又は紐（strings）を形成し；（ｃ）その凍結温度を上回る温度においてそれを維持する一方で、真空下で工程（ｂ）の生成物の水を除去することにより一次乾燥し；そして（ｄ）０．３Ａｗ未満まで水分活性を減少させるのに十分な時間、最大真空、且つ２０℃以上の温度において、工程（ｃ）の生成物を二次乾燥すること；を含む、方法を提供する。
【０００６】
別の態様において、本発明は、１又は複数の糖及び１又は複数の加水分解されたタンパク質を含む、乾燥したガラス状且つ非晶質組成物中に組み込まれる、傷つきやすい生体活性材料の圧搾により製造される、錠剤、丸薬又はペレットであって、ここで、前記糖は、組成物の合計乾燥重量に基づいて、約１０％〜６０％で含まれ、そして前記加水分解されたタンパク質が約１％〜４０％で含まれる、錠剤、丸薬又はペレットを提供する。
【０００７】
さらに別の態様において、本発明は、上述の錠剤、丸薬又はペレットを生産するための方法であって、前記乾燥したガラス状且つ非晶質組成物中に組み込まれた傷つきやすい生体活性材料を圧搾することを含み、ここで前記乾燥したガラス状且つ非晶質組成物は、（ａ）生体活性材料と少なくとも１又は複数の糖及び１又は複数の加水分解されたタンパク質を水性溶媒中で混合して粘着性のスラリーを形成し；（ｂ）液体窒素中で前記スラリーを瞬間凍結し（snap-freezing）、固体凍結粒子、ビーズ、液滴、又は紐（strings）を形成し；（ｃ）その凍結温度を上回る温度においてそれを維持する一方で、真空下で工程（ｂ）の生成物の水を除去することにより一次乾燥し；そして（ｄ）０．３Ａｗ未満まで水分活性を減少させるのに十分な時間、最大真空、且つ２０℃以上の温度において、工程（ｃ）の生成物を二次乾燥すること；を含むプロセスにより製造される、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、市販のプロバイオティック細菌及び本発明の乾燥組成物中のプロバイオティック細菌の加速安定性を示す。
【０００９】
【図２】図２は、加速した保存条件下（３７℃且つ３３％ＲＨ）におけるプロバイオティック安定性（Ｌ．パラカゼイ（L. paracasei））に関する、組成物中のガラス増強剤（glass enhancers）と炭水化物混合物との様々なモル比の影響を示す。
【００１０】
【図３】図３は、プロバイオティック細菌であるＬ．アシドフィルス（L. acidophilus）の保存安定性に関する本発明の組成物の効果を示す。乾燥プロバイオティック細菌の安定性を、５３７日間、２４℃且つ３３％ＲＨの加速保存条件において試験した。
【００１１】
【図４】図４は、プロバイオティック細菌であるＬ．アシドフィルスの保存安定性に関する様々なガラス増強化合物の影響を示す。乾燥プロバイオティック細菌の安定性を、１８０日間、２４℃且つ４３％ＲＨの加速保存条件において試験した。
【００１２】
【図５】図５は、プロバイオティック細菌であるビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）の保存安定性（３５℃且つ４３％ＲＨ）に関する様々なタンパク質加水分解産物／糖比の影響を示す。
【００１３】
【図６】図６は、プロバイオティックであるＬ．ラムノサス（L. rhamnosus）の最大の安定性のためのｐＨ最適化を示す（８週間、４０℃且つ３３％ＲＨにおける加速保存条件）。
【００１４】
【図７】図７及び８は、本発明の方法に従って、凍結固体ビーズとして様々なマトリックス及びガラス形成剤を含有する、様々な乾燥組成物の目視及び顕微鏡観察を示す。
【図８】同上。
【００１５】
【図９】図９は、乾燥組成物におけるその初期のＣＦＵカウントに関する、新鮮、凍結ビーズ又は乾燥粉末培養物のようなＬ．ラムノサス培養物形態の影響。
【００１６】
【図１０】図１０は、乾燥組成物における細菌の初期のＣＦＵカウントに関する、液体窒素又は−８０℃ディープフリーザー中の凍結固体ビーズとして、あるいは＋４℃における非凍結粘着性スラリーとしてＬ．ラムノサスを含有する組成物の凍結温度の影響を示す。結果は、乾燥前にパージの更なる工程を含まない前記スラリーの凍結温度の影響のみを示す。
【００１７】
【図１１】図１１は、乾燥組成物における細菌の初期のＣＦＵカウントに関する、液体窒素中の凍結固体ビーズとして、あるいは＋４℃における非凍結粘着性スラリーとしてビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）を含有する組成物の凍結温度の影響を示す。結果は、乾燥前にパージの更なる工程を含まない前記スラリーの凍結温度の影響のみを示す。
【００１８】
【図１２】図１２は、乾燥組成物におけるＬ．ラムノサスの初期のＣＦＵカウントに関する、凍結固体ビーズの真空下でのパージ期間の影響。
【００１９】
【図１３】図１３は、本発明の方法に従った、組成物の凍結乾燥機中の乾燥プロファイルを示す。
【００２０】
【図１４】図１４は、本発明の組成物及び乾燥方法における、Ｌ．ラムノサスのプロセス及び乾燥損失を示す。
【００２１】
【図１５】図１５は、４０℃且つ３３％の相対湿度での保存における、乾燥プロバイオティック細菌であるＬ．ラムノサス組成物の安定性の傾向を示す。
【００２２】
【図１６】図１６は、本発明の組成物及び方法における、一般的な凍結乾燥がされたＬ．アシドフィルス種又は製剤化後の４０℃且つ４３％ＲＨにおける保存安定性を示す。
【００２３】
【図１７】図１７は、本発明の組成物及び方法における、一般的な凍結乾燥がされたＬ．ラムノサス種又は製剤化後の４０℃且つ４３％ＲＨ並びに３０℃且つ６０％ＲＨにおける保存安定性を示す。
【００２４】
【図１８】図１８は、本発明の組成物において、安定化及び保護されたプロバイオティックであるＬ．ラムノサスの４０℃且つ４３％ＲＨにおける生存能力及び保存安定性に関する打錠機における圧搾の影響を実証する。
【００２５】
【図１９】図１９は、本発明の組成物において、安定化及び保護されたプロバイオティックであるＬ．ラムノサスの生存能力に関する、マルチビタミン及びミネラルの混合物での錠剤化、並びに４０℃且つ４３％ＲＨにおける保存曝露の影響を示す。
【００２６】
【図２０】図２０は、フリーの形態で又は本発明の組成物中で保護されたプロテアーゼ及びリパーゼ酵素の活性に関する打錠機における圧搾の影響を例証する。前記酵素は、個別に錠剤化され、あるいは等量において混合され、その後錠剤化される。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図しないことは、理解される。本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形「a」、「an」及び「the」は、その内容が、他に明確に表されない限り、複数形の指示物も含む。従って、例えば「タンパク質（a protein）」への言及は、単数のタンパク質又は２以上のタンパク質の組み合わせを含み；「酵素（enzyme）」、「細菌（bacteria）」等への言及は、１つ又はいくつかの種類の混合物等を含む。
【００２８】
本発明の記載及び特許請求の範囲において、以下の用語は、以下に説明する定義に従って、用いられる。
【００２９】
「生体活性成分」、「生体活性材料」及び「生体物質」とは全て、生体活性を可能にする微生物及び成分を意味する。本発明で使用のために好適な生体活性材料としては、限定することなく、ペプチド、タンパク質、酵素、ホルモン、核酸、抗体、薬物、ワクチン、酵母、真菌、細菌（プロバイオティック又はその他）、土壌微生物、ウイルス及び／又は細胞懸濁液が挙げられる。
【００３０】
「生体組成物」とは、生体活性成分又は生体活性剤の生体活性が明白に有効的であることを可能にする、かかる形態における調製物を意味する。
【００３１】
「ガラス増強剤（glass enhancers）」、「ガラス増強化合物（glass enhancing compound）」及び「ガラス形成剤（glass forming agent）」とは、臨界温度、即ちガラス転移温度（Ｔｇ）未満において、非晶質又はガラス構造を形成することができる能力を有する化合物を表すために、本明細書で互換的に用いられる。ガラス構造の形成の間、生体物質を、ガラス構造に埋めこむことができる。本発明での使用のために好適なガラス増強剤としては、限定することなく、有機酸、例えば、乳酸、アスコルビン酸、マイレン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸等の塩が挙げられる。塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン（phosphate）等が挙げられる。他の有用なガラス増強剤としては、タンパク質、タンパク質加水分解物、ポリペプチド及びアミノ酸が挙げられる。ガラス形成剤の組み合わせはまた、単一の組成物内で考えられる。本発明の目的のためのガラス構造を得るために用いられるプロセスは、一般的に、溶媒昇華及び／又は蒸発技術である。理想的には、ＧＲＡＳ化合物である化合物は、ＧＲＡＳでないものよりも好ましい。
【００３２】
「糖（sugars）」とは、主として、炭素、水素、及び酸素からなる糖質（saccharides）である。有用な糖質としては、還元及び非還元糖、並びに糖アルコール及び二糖が挙げられる。２つの単糖は結合して二糖を形成する。二糖を形成するために用いられる２つの単糖は、同一でも異なってもよい。本発明の組成物に用いられる二糖の例としては、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、イソマルトースが挙げられる。硫酸化した二糖を用いてもよい。
【００３３】
「炭水化物（carbohydrates）」又は「ポリヒドロキシ化合物」とは、主として、炭素、水素、及び酸素からなる糖質（saccharides）を意味する。糖質は、典型的には、そのいくつかが正若しくは負に帯電した化学基を含む、線形又は非線形形態において結合した繰り返し構造単位の糖主鎖からなる。前記繰り返し単位は、２〜数百万の範囲にわたる。有用な糖質としては、還元及び非還元糖、糖アルコール、二糖、オリゴ糖、水溶性多糖、及びこれらの誘導体が挙げられる。２つの単糖は結合して二糖を形成する。二糖を形成するために用いられる２つの単糖は、同一でも異なってもよい。本発明の炭水化物混合物に用いることのできる二糖の例としては、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、イソマルトースが挙げられる。硫酸化した二糖を用いてもよい。少数（典型的には３〜１２）の単糖が結合してオリゴ糖を形成する。オリゴ糖を形成するために用いられる単糖は、同一又は異なる成分の糖でもよい。使用に好適なオリゴ糖の例としては、イヌリン、マルトデキストリン、デキストラン、フルクト−オリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクト−オリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナン−オリゴ糖（ＭＯＳ）及びこれらの組み合わせが挙げられる。多数（典型的には１２超）の単糖が結合して多糖を形成する。多糖を形成するために用いられる単糖は、同一又は異なる成分の糖でもよい。使用に好適な多糖の例としては、限定することなく、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース及びヒプロメロース；水溶性デンプン又はデンプン画分、キサンタンガム、グアーガム、ペクチン、カラギーン、ガラクトマンナン、ジェランガム、これらの任意の誘導体、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、カルボキシ−メチル−セルロース、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸の塩、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、アカシアガム、ローカストビーンガム、キトサン及びキトサン誘導体、コラーゲン、ポリグリコール酸、デンプン及び修飾デンプン、並びにシクロデキストリンが挙げられる。
【００３４】
「加水分解されたタンパク質」とは、約１ｋＤａ〜約５０ｋＤａの分子量を有する加水分解されたタンパク質を生ずる、部分的若しくは完全に酸又は酵素的加水分解に供されたタンパク質を意味する。実施形態によっては、本明細書で、「広く（extensively）加水分解されたタンパク質」とは、少なくとも２０％のタンパク質基質が、２００〜２０００ダルトンの分子量を有するペプチドに変換されることを意味する。前記加水分解されたタンパク質は、完全なタンパク質とほぼ同じアミノ酸組成を有し、いくつかの市販の供給源から得てもよい。低アレルギー性であるので、加水分解されたタンパク質は、高い感受性を有する消費者、例えば幼児及び高齢者のための特定の食品に有利に用いられ得る。
【００３５】
「安定的な」製剤又は組成物とは、それら中の生体活性材料を、保存において、その物理的安定性、化学的安定性及び／又は生体活性を本質的に保持しているものである。安定性は、選択された期間における選択された温度及び湿度条件において測定することができる。傾向分析は、材料が実際に長期間保存される前に、予測される寿命を推定するために用いることができる。生細菌について、例えば、安定性は、温度、湿度、及び期間の規定された条件下での、乾燥製剤１ｇあたり、１ｌｏｇのＣＦＵを損なうのにかかる時間として定義される。
【００３６】
細菌に関して「生存能力」とは、細菌の増殖に適した栄養培地上でコロニーを形成する能力（ＣＦＵ又はコロニー形成単位）を意味する。ウイルスに関して「生存能力」とは、宿主細胞の菌叢上のプラークの形成をもたらす、好適な宿主細胞における感染及び複製する能力を意味する。
【００３７】
「周囲の（ambient）」室温又は条件とは、所定の環境における所定の時間におけるものを意味する。典型的に、周囲室温は、２２〜２５℃であり、周囲大気圧及び周囲湿度は、容易に測定され、一年のうちの時期、天気、及び気候条件、高度等に依存して変化する。
【００３８】
乾燥製剤組成物において、「水分活性」又は「Ａｗ」とは、水の利用性を意味し、系における水分のエネルギー状態を表す。これは、同一の温度における純水の蒸気圧により割られる、サンプルの水蒸気圧として定義される。純粋な蒸留水は、正確に１、即ちＡｗ＝ｌ．０の水分活性を有する。
【００３９】
保存安定性において「相対湿度」又は「ＲＨ」とは、所定の温度における空気中の水蒸気の量を意味する。相対湿度は、通常、空気を飽和するために要求されるものよりも少なく、飽和湿度の百分率において表される。
【００４０】
「乾燥」及びそれらの変形とは、脱水又は無水の、即ち、実質的に液体が欠乏した物理的状態を意味する。乾燥としては、例えば噴霧乾燥、流動層乾燥、凍結乾燥、及び真空乾燥が挙げられる。
【００４１】
「凍結乾燥（Lyophilize）」又は凍結乾燥（freeze drying）とは、迅速な凍結及び凍結状態における脱水（しばしば昇華とも称される）による乾燥形態における組成物の調製を意味する。凍結乾燥は、糖の結晶化をもたらす温度において行なわれる。このプロセスは、凍結生成物維持するのに十分な真空下、実施形態によっては、約２０００ｍＴＯＲＲ未満において行なわれてもよい。
【００４２】
本明細書に記載するプロセスに関して、「一次水分除去」又は「一次乾燥」工程又は「液体乾燥」とは、凍結粒子を融解する時点から、二次乾燥を開始する時点まで行なわれる脱水乾燥を意味する。典型的に、一次乾燥のバルクは、広範な（extensive）蒸発により行なわれる一方で、生成物温度は加熱源の温度よりも著しく低く維持される。このプロセスは、融解した生成物を維持するのに十分な真空下、実施形態によっては、約２０００ｍＴＯＲＲ未満において行なわれてもよい。
【００４３】
本明細書に記載するプロセスに関して、「二次乾燥」とは、加熱源の温度に近い製剤の温度において行なわれる乾燥工程を意味する。このプロセスは、製剤の水分活性を減少させるのに十分な真空下、実施形態によっては、約１０００ｍＴＯＲＲ未満において行なわれる。典型的な製剤乾燥プロセスにおいて、二次乾燥工程は、製剤の水分活性を０．３Ａｗ以下まで減少させる。
【００４４】
本発明は、保存において傷つきやすい生体活性材料、例えばペプチド、タンパク質、ホルモン、核酸、抗体、薬物、ワクチン、酵母、細菌（プロバイオティック又はその他のもの）、ウイルス及び／又は細胞懸濁液を保護するための組成物及び乾燥方法を含む。
【００４５】
傷つきやすい生体活性材料、例えばペプチド、タンパク質、ホルモン、核酸、抗体、薬物、ワクチン、酵母、細菌、ウイルス及び／又は細胞懸濁液を含有する、本発明の前記組成物及び乾燥方法は、乾燥状態において著しく延長された寿命を有し、費用効率が高く、且つ工業的に拡張可能な乾燥製剤を提供するという課題を解決する。本発明は、高い水溶性化合物の非晶質ガラス構造により包まれた生体材料を含む、保護組成物及び乾燥方法を提供する。前記乾燥プロセスは、液体スラリー中で生体材料及び組成物を混合すること、前記組成物スラリーを液体窒素中で瞬間凍結し、液滴、紐又はビーズを形成し、続いて、圧力を減少させる一方で組成物に熱を供給する計画下で、水分を蒸発させることにより糖ガラス形態において、生体活性材料を乾燥させることを含む。
【００４６】
本発明は、生体材料を、実質的な活性を維持しながら、ガラス構造において保護することができるという顕著な発見に基づく。生体材料が前記組成物混合物と合わされ、本発明に従って乾燥される場合、優れた安定性は、過酷な温度及び湿度条件下に曝露される延長された時間、達成された。本発明は、生体材料、及び水溶性炭水化物とガラス増強カルボン酸塩の混合物を含む。本発明の組成物は、典型的な凍結乾燥プロセス下で単純に乾燥された非粘着性又は濃縮された糖組成物と、これらの物理的構造及び機能において、本質的に異なる。例えば、米国特許第６，９１９，１７２号は、肺投与のためのエアロゾル化した粉末組成物を開示し、これは、様々な炭水化物及びクエン酸ナトリウムの混合物を含む。しかしながら、該特許に記載される組成物は、更なる安定化のために必須であり、そして高濃度の糖を有する溶液の乾燥の間における所望の物理的な構造の形成のために必須である更なるタンパク質性の化合物を欠いていた。該特許における所望の組成物はまた、増強したガラス形成のための溶解した又は未凍結の溶液の十分な乾燥を可能にする粘性又はヒドロゲル構造を欠く。対称的に、本発明の組成物及び乾燥プロセスは、これらの問題を克服する一方で、生体材料の優れた安定性を達成する。先行技術はまた、生体材料を保護及び安定化する加水分解されたタンパク質との相乗効果を奏する更なるカルボン酸成分を欠く。
【００４７】
増強されたガラス構造は、通常、真空下で、溶液を発泡又は沸騰させることにより、当該技術分野において達成され、効率的な乾燥を促進する。発泡工程は、一般的に、未凍結溶液の乾燥の避けられない結果である溶液の幅広い沸騰及び爆発をもたらし、そして結果として、バイアル又はベッセル中の溶液の大変低い積載能力（loading capacity）のみが達成される（例えば、最終発泡製品の厚みが２ｍｍ未満である、米国特許第６，５３４，０８７号を参照のこと）。本発明の組成物及び乾燥方法は、本製剤の沸騰及び発泡を回避し、これにより乾燥面積当たりの材料の非常に高い積載を可能にし、その結果として、特別に設計されたベッセル及びトレイ又は装置を使用することなく、材料の大量の生産に容易にスケールアップすることができる。
【００４８】
生体材料の広い範囲は、本発明の水性保護媒体を形成する本発明の組成物とともに用いることができる。この保護媒体は、生体材料の安定的な乾燥粉末を製造するために、本発明の乾燥プロセスに供することができる。これらの生体材料は、限定することなく、酵素、例えば膵酵素、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ；タンパク質、例えばインスリン；ワクチン；ウイルス、例えばアデノウイルス；原核細胞（細菌及び真菌を含む）及び真核細胞を含む細胞；薬物、核酸、ペプチド、ホルモン、ビタミン、カロテノイド、ミネラル、抗生物質、殺菌剤、真菌剤、除草剤、殺虫剤、殺精子剤、抗体及び脂質小胞を含む他の生体材料が挙げられる。
【００４９】
プロバイオティック細菌は、本発明の組成物及び乾燥方法から特に利益を得るために示される。安定的な乾燥プロバイオティック粉末は、プロバイオティック細菌の新鮮な、凍結した又は乾燥培養物を、炭水化物とガラス増強化合物の混合物と混合すること、液体窒素中で粘着性組成物を瞬間凍結して、凍結固体液滴、紐若しくはビーズを形成し、そして最初に、凍結温度を上回る製剤温度を上昇させるのに十分な真空を適用し、そして一次水分除去を促進にするために、２０℃以上の加熱源を供給することにより乾燥させることを含む、本発明の組成物及び方法に従って調製することができる。凝固点を上回る製剤の温度の維持は、真空を調節することにより、及び製剤への熱の伝導により、達成することができる。乾燥プロセスを完了させ、製剤の水分活性を０．３Ａｗ以下に更に減少させるために、二次乾燥工程は、最大真空且つ最大７０℃の上昇した温度において適用される。かかる組成物は、図１５に示すように、３０日間以上、４０℃且つ３３％ＲＨの保存条件において安定であった。
【００５０】
圧縮錠中の生きている微生物、例えばプロバイオティック細菌は、本発明の組成物及び乾燥方法から特に利益を得るために示される。安定的な乾燥生体粉末は、単細胞生物の新鮮な、凍結した又は乾燥培養物を、糖、加水分解されたタンパク質及び抗酸化剤、並びに潜在的に更なる量の多糖及びオリゴ糖及びガラス増強化合物を含む混合物と混合すること、液体窒素中で粘着性製剤を瞬間凍結して、凍結固体液滴、紐若しくはビーズを形成し、そして最初に、その凍結温度を上回る製剤温度を上昇させるのに十分な真空を適用し、そして一次水分除去を促進するために、２０℃以上の加熱源を供給することにより水分を蒸発させることを含む、本発明の組成物及び方法に従って調製することができる。凝固点を上回る製剤の温度を維持することは、真空を調節することにより、及び製剤への熱の伝導により、達成することができる。乾燥プロセスを完了し、製剤の水分活性を０．３Ａｗ以下に更に減少させるために、二次乾燥工程は、最大真空及び最大７０℃の上昇した温度において適用される。
【００５１】
本発明の組成物
実施形態によっては、前記製剤は、二糖、オリゴ糖、多糖の炭水化物混合物を含み、前記生体活性材料が、組み込まれる。好適な多糖の例としては、限定することなく、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、カルボキシ−メチル−セルロース、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸の塩、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース、カラギーナン、ジェランガム、グアーガム、アカシアガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、キトサン及びキトサン誘導体、コラーゲン、ポリグリコール酸、デンプン及び修飾デンプンが挙げられる。好適なオリゴ糖の例としては、限定することなく、シクロデキストリン、フルクタン、イヌリン、ＦＯＳ、マルトデキストリン、デキストラン等及びこれらの組み合わせが挙げられる。好適な二糖の例としては、限定することなく、ラクトース、トレハロース、スクロース等が挙げられる。１つの特定の実施形態によれば、好適な典型的な多糖は、アルギン酸ナトリウム又はジェランガムである。別の実施形態によれば、前記製剤は、合計乾燥物質の重量の百分率で、０．１〜２０％のアルギン酸ナトリウムを含む。
【００５２】
実施形態によっては、前記炭水化物混合物は、合計乾燥物の重量百分率で、０．１〜１０％の多糖、１〜１０％のオリゴ糖及び１０〜９０％の二糖を含む。更なる実施形態によれば、前記炭水化物混合物は、１０：０．１〜４：０．１〜２の重量比において二糖、オリゴ糖、及び多糖を含み、あるいは二糖／オリゴ糖／多糖の重量比が、約１０：０．２：０．１〜約１０：２：１である。
【００５３】
実施形態によっては、前記炭水化物混合物中の前記二糖画分は、様々な糖及び糖アルコールを含む。好適な二糖は、水分除去の間、凍結温度（例えば、−２０℃未満）において、製剤中の生体活性材料を結晶化及び／又は損傷若しくは不安定化させないものである。例えば、生体活性材料は、乾燥プロセスを通して分子構造の保持を助成し、乾燥状態における非晶質マトリックスに構造的剛性を与えるために、ガラス形成糖、例えばスクロース、ラクトース又はトレハロースの存在下で乾燥させることができる。好適な二糖は、乾燥の間に喪失する水和水を効率的に置き換え、細胞膜への損傷及び酵素の変性を防ぐ（Crowe et al., 1998による総説を参照のこと）。組成物中の二糖の他の機能は、損傷を与える光、酸素、酸化剤、及び水分への曝露から生体活性材料を保護することを含み得る。好適な二糖は、溶液中に容易に溶解すべきである。トレハロースは、干ばつの期間における休止状態において生存する植物及び生きている生物（例えば細菌、真菌、及び無脊椎動物、例えば昆虫及び線虫）において発見される非還元二糖であるので、特に魅力的な保護材である。場合によっては、二又はそれ以上の異なる種類の二糖、例えばトレハロース及びスクロースの混合物を含むことが有用であり、これは結晶の形成を阻害し、延長された期間の保存条件における乾燥生体活性材料製剤の安定性を増大させ、そしてコストを減少させる。
【００５４】
実施形態によっては、炭水化物混合物中のオリゴ糖画分は、イヌリン、マルトデキストリン、デキストラン、フルクト−オリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクト−オリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナン−オリゴ糖（ＭＯＳ）及びこれらの組み合わせを含む。前記オリゴ糖は、様々な保護された生体材料のための保護材としてトレハロースの単独使用に関連するいくつかの問題を軽減する。脱水及び再水和の間における生体材料の保護に大変有用であるが、安定剤としての、トレハロースの単独使用は、延長された期間、特に高温及び／又は湿度環境において、所望の保存安定性を提供しない。この問題は、炭水化物混合物へのオリゴ糖、例えばイヌリンの添加により、本発明において解決された。
【００５５】
炭水化物混合物中の糖質の好適な典型的な質量比は、１０：０．１〜１０：０．１−２の二糖／オリゴ糖／多糖であり、実施形態によっては、前記二糖／オリゴ糖／多糖の質量比は約１０：０．２：０．１〜約５：１０：１である。実施形態によっては、前記炭水化物混合物は、合計乾燥物質の重量による百分率で、１０〜９０％の二糖、１〜１０％のオリゴ糖及び０．１〜１０％の多糖を含む。他の実施形態では、前記炭水化物混合物は、合計乾燥物質の重量による百分率で、１０〜５０％の二糖、１０〜８０％のオリゴ糖及び０．１〜１０％の多糖を含む。
【００５６】
特定の実施形態では、前記製剤は、オリゴ糖の混合物を含む。オリゴ糖混合物は、組成物中のガラス増強材料として単一のオリゴ糖単独の使用に関連するいくつかの問題を軽減する。オリゴ糖は、ガラス転移温度の上昇において著しく効果的であるが、迅速に結晶及び沈殿する傾向があり、これにより、特に高温及び／又は高湿度環境において、ガラス非晶質構造を寸断する。この問題は、単一の種類のオリゴ糖に代わってオリゴ糖の混合物実施形態によっては、フルクタン及び低ＤＥデキストリンの混合物を添加することにより、本発明において解決される。実施形態によっては、前記炭水化物混合物は、合計乾燥物質の重量による百分率で、５〜４０％のフルクタン及び５〜４０％の低ＤＥデキストランを含む。
【００５７】
１つの好適な組成物は、少なくとも二糖、オリゴ糖及び多糖を含む約０．５％〜約９０％の炭水化物成分、並びに約０．５％〜約４０％の加水分解されたタンパク質を含むタンパク質成分を含む。実施形態によっては、前記組成物は、約３０％〜約７０％の炭水化物成分、並びに約１０％〜約４０％のガラス増強剤成分、例えばタンパク質、加水分解されたタンパク質及びカルボン酸を含み、ここで前記炭水化物成分は、約１０％〜９０％又は約４０％〜８０％の二糖；約１％〜約１０％又は約５％〜１０％のオリゴ糖；及び約０．１〜約１０％又は約５％〜約１０％の多糖を含む。前記組成物は、別のガラス増強剤成分であると考えられる有機酸の塩をさらに含み、組成物の合計重量に基づいて、約０．５％〜２０％のカルボン酸を含む。
【００５８】
さらなる実施形態では、前記組成物は、１：１〜１０の重量比のアルギン酸ナトリウム及びオリゴ糖、又他は１：１〜５のアルギン酸ナトリウム／オリゴ糖の混合物を含む。
【００５９】
本発明のさらに別の実施形態では、組成物は、二価金属イオンと架橋して硬いヒドロゲルを形成する。実施形態によっては、架橋されたヒドロゲル製剤は、二価金属イオン溶液を含む槽中にスラリーを噴霧又は押し出しすることにより、あるいはスラリーに直接二価金属イオンを添加することにより、製剤を硬化し、ヒドロゲルを形成することを可能にする。ヒドロゲル製剤を、その後、瞬間冷凍（flash frozen）し、本発明の乾燥方法に従って乾燥させた。
【００６０】
他の実施形態では、前記組成物は、有機酸、例えば、乳酸、アスコルビン酸、マイレン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸等の塩を含む、多量のガラス増強化合物を含む。塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等が挙げられる。例としては、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、マレイン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、アスコルビン酸ナトリウム等が挙げられる。高いガラス転移温度（Ｔｇ）及び高い水溶性を有する塩は、好ましい。典型的な有機酸は、クエン酸及びその塩（例えば、クエン酸ナトリウム若しくはカリウム、クエン酸ナトリウム無水物）並びにアスコルビン酸及びその塩（例えばアスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸マグネシウム）が挙げられる。例えば、実施形態によっては、本発明の組成物は、二糖、オリゴ糖、及び多糖の混合物の炭水化物、並びに有機酸、例えばクエン酸及び／又はアスコルビン酸のイオンを含む。
【００６１】
前記組成物に用いられるガラス増強剤の量は、全体の組成物、及びその意図する乾燥保存条件に応じて変わる。一般的に、組成物中のガラス増強化合物の量は、合計乾燥物の重量より２％超高い一方で、溶液又は分散液のｐＨはわずかにアルカリ（ｐＨ７〜７．５）に維持される。理論に拘束されることなく、本明細書に記載されるような、相対的に高い含量におけるガラス増強化合物の機能は、得られる乾燥組成物の所望の非晶質及び強固なガラス構造に寄与するのみならず、有害な光、酸素、酸化剤及び水分への曝露から生体活性材料を保護すると考えられる。好適な典型的な組成物は、合計乾燥物の重量百分率で、１〜２０％、又は約２〜１０％のガラス増強化合物を含む。
【００６２】
その安定性をさらに増加させるための、組成物中に含まれる他の好適なガラス増強剤としては、タンパク質、タンパク質加水分解産物、ポリペプチド及びアミノ酸を含む。これらは、ゼラチン、アルブミン、ホエータンパク質、ダイズタンパク質、カゼイン、カゼイン塩、免疫グロブリン、ダイズタンパク質、エンドウマメタンパク質、綿実タンパク質又は他の食品及び乳製品又は植物性タンパク質及び／又はこれらの加水分解物又は任意の他の加水分解されたタンパク質が挙げられる。ポリアミノ酸の例としては、ポリアラニン、ポリアルギニン、ポリグリシン、ポリグルタミン酸等が挙げられる。有用なアミノ酸としては、リジン、グリシン、アラニン、アルギニン、又はヒスチジン及び疎水性アミノ酸（トリプトファン、チロシン、ロイシン、フェニルアラニン等）及びメチルアミン、例えばベタインが挙げられる。
【００６３】
実施形態によっては、カゼイン若しくはエンドウマメタンパク質、又は加水分解されたカゼイン若しくは加水分解されたエンドウマメタンパク質が用いられる。実施形態によっては、組成物混合物中の加水分解されたタンパク質画分としては、部分的に加水分解された又は広く加水分解されたタンパク質、ポリペプチド及びアミノ酸が挙げられる。本明細書に用いられる広く加水分解されたタンパク質は、タンパク質の修飾（分解）のためのプロテアーゼの使用による、広い（extensive）酵素的加水分解により得られるものである。実施形態によっては、加水分解された動物性又は植物性タンパク質、例えばカゼイン、ホエイ、ダイズ若しくはエンドウマメタンパク質、又は広く加水分解されたカゼイン若しくはエンドウマメタンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態は、８０％超の約１ｋＤａ〜約５０ｋＤａの分子量を有する短鎖ペプチドを有する、広く加水分解されたタンパク質を用い、そして少なくとも２０％のタンパク質基質は、２００〜２０００ダルトンの分子量を有するペプチドに変換される。理論に拘束されることなく、本明細書に記載されるような糖及び広く加水分解されたタンパク質から得られる混合物は、迅速な乾燥を可能にし、得られる乾燥組成物の所望の非晶質及び強固なガラス構造に寄与すると考えられる。酵素加水分解されたタンパク質は、当業者に知られる方法により調製されてもよく、市販の供給源から得てもよい。好適な典型的な組成物は、合計乾燥物の重量による百分率で、５〜４０％の広く加水分解されたタンパク質を含む。
【００６４】
乾燥組成物中のタンパク質、加水分解されたタンパク質又は広く加水分解されたタンパク質及びアミノ酸の好適な典型的な合計量は、乾燥混合物の合計質量の約１％〜約４０％、又は約５％〜約４０％、又は約１０％〜約３０％である。
【００６５】
前記組成物中のガラス増強剤の適切な量は、乾燥組成物の所望の特性に依存してもよいことは注目されるべきである。例えば、炭水化物混合物及びタンパク質又はタンパク質加水分解物を含む組成物は、中程度の温度及び相対湿度、例えば２５℃且つ２５％ＲＨにおいて保存される間、生体材料の化学的安定性を増大させるために用いることができる。ガラス増強剤の適切な量、及び特に二糖とオリゴ糖の相対比の決定は、所望の保存条件に従ってなされるべきである。例えば、二糖／オリゴ糖の高い比で含む組成物は、中程度の温度及び相対湿度、例えば２５℃且つ２５％ＲＨにおいて保存される間、生体材料の化学的安定性を増大させるために用いられる。二糖／オリゴ糖の低い比で含む組成物は、高い温度及び相対湿度、例えば３０℃且つ４０％ＲＨ以上において保存される間、生体材料の化学的安定性を増大させるために用いられる。
【００６６】
アスコルビン酸イオンは、実施形態によっては、高温及び湿度曝露における安定化の更なる利益を得るために、ガラス増強剤として、好ましい。あるいは、実施形態によっては、別のガラス増強剤、例えばタンパク質又はタンパク質加水分解産物とのクエン酸及び／又はアスコルビン酸イオンの組み合わせは、より好ましい。
【００６７】
実施形態によっては、前記製剤は、糖及び加水分解されたタンパク質の混合物を含み、ここで生体活性材料が組み込まれる。好適な糖の例としては、限定することなく、二糖、例えばラクトース、トレハロース、スクロース及びこれらの混合物が挙げられる。好適な加水分解されたタンパク質の例としては、限定することなく、広く加水分解されたゼラチン、アルブミン、ホエータンパク質、ダイズタンパク質、カゼイン、カゼイン塩、免疫グロブリン、ダイズタンパク質、エンドウマメタンパク質、綿実タンパク質、又は乳製品、動物若しくは植物起源からの任意の他の広く加水分解されたタンパク質、及びこれらの混合物が挙げられる。乾燥組成物中の好適な典型的な糖の合計量は、乾燥混合物の合計質量の約１０％〜約８０％又は約１０％〜約６０％である。
【００６８】
１つの典型的な実施形態では、ガラス形成剤は、二糖及び加水分解されたタンパク質の混合物を含む。特定の実施形態では、好適な典型的なガラス形成剤は、トレハロース及び加水分解されたタンパク質の混合物である。実施形態によっては、前記製剤は、合計乾燥物の重量の百分率で、１０〜９０％のトレハロース及び０．１〜３０％の加水分解されたタンパク質、又は２０〜８０％のトレハロース及び０．１〜２０％の加水分解されたタンパク質、又は４０〜８０％のトレハロース、及び０．１〜２０％加水分解されたタンパク質を含む。
【００６９】
理想的には、一般的に安全であるとして認識される（ＧＲＡＳ）化合物は、ＧＲＡＳでないものよりも好ましい。その他は、賦形剤の塩、例えば硫酸マグネシウム；ポリオール、例えば三価又は高級糖アルコール（例えば、グリセリン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトール）；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；プルロニック；界面活性剤；及びこれらの混合物が挙げられる。
【００７０】
実施形態によっては、前記生体材料は、生細菌（例えば、プロバイオティック細菌）を含む。好適な微生物の例としては、限定することなく、酵母、例えばサッカロマイセス属（Saccharomyces）、デバロマイセス属（Debaromyces）、カンジダ属（Candida）、ピキア属（Pichia）及びトルロプシス属（Torulopsis）、真菌、例えばアスペルギルス属（Aspergillus）、リゾプス属（Rhizopus）、ムコール属（Mucor）、ペニシリウム属（Penicillium）及びトルロプシス属（Torulopsis）、並びに細菌、例えばビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、クロストリジウム属（Clostridium）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、メリッソコッカス属（Melissococcus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）属、ラクトコッカス属（Lactococcus）、コクリア属（Kocuriaw）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ペプトストレプトコッカス属（Peptostrepococcus）、バチルス属（Bacillus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ミクロコッカス属（Micrococcus）、リューコノストック属（Leuconostoc）、ワイセラ属（Weissella）、アエロコッカス属（Aerococcus）、オエノコッカス属（Oenococcus）及びラクトバチルス属（Lactobacillus）が挙げられる。好適なプロバイオティック微生物の特定の例は、以下に記載の種により代表され、これらの種内の全ての培養バイオタイプを含む：アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、Ａ．オリザエ（A. oryzae）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．メセンテリカス（B. mesentericus）、Ｂ．プミルス（B. pumilus）、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）、Ｂ．ナットウ（B. natto）、バクテロイデス・アミドフィルス（Bacteroides amylophilus）、Ｂａｃ．カピロスス（Bac. capillosus）、Ｂａｃ．ルミノコラ（Bac. ruminocola）、Ｂａｃ．スイス（Bac. suis）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、Ｂ．アニマリス（B. animalis）、Ｂ．ブレーヴェ（B. breve）、Ｂ．ビフィダム（B. bifidum）、Ｂ．インファンティス（B. infantis）、Ｂ．ラクティス（B. lactis）、Ｂ．ロンガム（B. longum）、Ｂ．シュードロンガム（B. pseudolongum）、Ｂ．サーモフィラム（B. thermophilum）、カンジダ・ピントレペシイ（Candida pintolepesii）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）、エンテロコッカス・クレモリス（Enterococcus cremoris）、Ｅ．ジアセチラクチス（E. diacetylactis）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．インテーミディウム（E. intermedius）、Ｅ．ラクティス（E. lactis）、Ｅ．ムントディ（E. muntdi）、Ｅ．サーモフィルス（E. thermophilus）、大腸菌（Escherichia coli）、クリーベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、ラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、Ｌ．アリメンタリウス（L. alimentarius）、Ｌ．アミロボラス（L. amylovorus）、Ｌ．クリスパタス（L. crispatus）、Ｌ．ブレビス（L. brevis）、Ｌ．カゼ４（L. case 4）、Ｌ．カルバタス（L. curvatus）、Ｌ．セロビオサス（L. cellobiosus）、Ｌ．デルブルッキ亜種ブルガリクス（L. delbrueckii ss. bulgaricus）、Ｌ．ファルシミニス（L farciminis）、Ｌ．フェルメンタム（L. fermentum）、Ｌ．ガッセリ（L. gasseri）、Ｌ．ヘルベチカス（L. helveticus）、Ｌ．ラクティス（L. lactis）、Ｌ．��ランタラム（L. plantarum）、Ｌ．ジョンソニイ（L. johnsonii）、Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）、Ｌ．ラムノサス（L.rhamnosus）、Ｌ．サケイ（L. sakei）、Ｌ．サリバリウス（L. salivarius）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenleroides）、Ｐ．セレヴィシエ（ダムノサス）（P. cereviseae（damnosus））、ペディオコッカス・アシジラクティシ（Pediococcus acidilactici）、Ｐ．ペントーサセウス（P. pentosaceus）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒイ（Propionibacterium freudenreichii）、Ｐｒｏｐ．シェルマニイ（Prop. shermanii）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cereviseae）、スタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）、Ｓｔａｐｈ．キシロサス（Staph. xylosus）、ストレプトコッカス・インファンタリウス（Streptococcus infantarius）、Ｓｔｒｅｐ．サリバリウス亜種サーモフィルス（Strep. salivarius ss. thermophilus）、Ｓｔｒｅｐ．サーモフィルス（Strep. Thermophilus）及びＳｔｒｅｐ．ラクティス（Strep. lactis）。
【００７１】
組成物を作製する方法
生体材料と組成物の１つの好適な混合プロセスは、濃縮培養物又は生体材料を含有する媒体溶液中に、全ての乾燥組成物混合物を添加することによる。培養培地中の生体材料の重量は、典型的に、約５％〜３０％ｗ／ｖ、又は約１０％〜２０％ｗ／ｖである。培養培地中の組成物の添加される重量は、典型的に、約１０％〜約６０％ｗ／ｖ、又は約２０％〜４０％ｗ／ｖである。混合されたスラリー中の最終的な固体含量は、約２０％〜約６０％、より具体的には約３０％〜約５０％である。実施形態によっては、前記溶液は、粘性溶液中に材料が溶解するのを助けるために、室温において、あるいは僅かに暖められて、混合される（例えば、２０℃〜４０℃）。本発明の変形において、製剤中の炭水化物混合物の合計量は、乾燥工程の間に生じ得るゴム状の形成又は過剰な発泡を避けつつ、効率的な乾燥を可能にする、所望の製剤粘性及び密度を達成するために調節される。好適な、典型的なスラリー粘度は、約１，０００ｃＰ〜約５００，０００ｃＰ、又は約５，０００ｃＰ〜約３００，０００ｃＰである。最終的なスラリーの所望の粘性及び密度は、当該技術分野において知られている任意の手段、例えば、炭水化物混合物中の多糖の量をわずかに調節することにより、あるいは、脱気又例えば空気、窒素、二酸化炭素、アルゴン等のガスを注入することによりにより達成することができる。
【００７２】
本発明の生体材料スラリーは、典型的に、−３０℃〜−１８０℃で瞬間凍結され、あるいは前記製剤は、液体窒素中に噴霧又は滴下することにより、あるいは液体窒素槽に注入することにより、瞬間凍結される。液体窒素槽からの粒子、ビーズ、紐、又は液滴の回収、及び凍結乾燥器又は真空乾燥器中での乾燥、あるいは凍結形態における後の使用のための、あるいは後の乾燥、例えば噴霧乾燥のためのディープフリーザー（−３０℃〜−８０℃）におけるこれらの保存。
【００７３】
一般的に、有用な乾燥プロセス技術は、噴霧乾燥；又はスラリーの凍結温度を上回る温度（−２０〜５０℃）における真空オーブン、又は遠心エバポレータにおける非凍結溶液の蒸発乾燥；これに続く所望の粒子径への製粉を含む。得られた粉末粒子は、生体材料の大部分をガラス状材料で被覆したガラス状である。生体材料をガラス状材料で被覆する利点は、製品の物理的安定性を向上すること、及び粒子内の有害な分子間反応の減少である。好適な、典型的な実施形態では、凍結粒子は、トレイ上に積載され、そして、乾燥プロセスが以下の３つの主な工程：（１）２０００ｍＴＯＲＲ未満の真空圧下での、任意で、短期のパージ及び凍結粒子の構造安定化工程、（２）２０００ｍＴＯＲＲ超の真空下、且つスラリーの凝固点を上回る温度における一次乾燥工程、及び（３）０．３Ａｗ以下における乾燥製剤の水分活性を減少させるのに十分な時間、完全な真空圧下及び上昇した温度で、ガラス状の非晶質材料の二次及び最終乾燥工程、において行なわれる真空乾燥チャンバーに即時に移される。
【００７４】
本発明の１つの特定の実施形態では、乾燥製剤は、厳しい温度及び湿度条件への短期間の曝露において、増大した保護を得るために、溶融脂質の混合物と造粒される。
【００７５】
乾燥した且つ安定的な生体組成物は、フレークとして直接用いられ、あるいは粉末に砕かれ、そして約１０μｍ〜約１０００μｍの平均粒子径にふるいを掛けられ得る。前記製剤は、濃縮された粉末、再構成された液体（例えば飲料）として、ヒトを含む動物に、直接的に投与され得、あるいはフレーク又は粉末形態のいずれかにおいて、存在する食品、又は飼料、又は農業製品に組み込まれ得る。
【００７６】
実施形態によっては、本発明の生体材料の安定的な凍結又は乾燥された粉末の調製のための組成物は、炭水化物混合物及びガラス増強剤を含む。生体活性材料と混合される場合、かかる材料は、前記生体活性材料の保存及び投与のための、大量の安定的な乾燥組成物を提供するために、窒素中においてビーズ、紐、又は液滴を形成し、そして本発明の方法に従った非晶質ガラス状構造において効率的に乾燥されてもよい（乾燥後の様々な製剤の可視及び顕微鏡観察並びに水分活性（Ａｗ）については、図７及び８を参照のこと）。炭水化物混合物は、高温及び高湿度、例えば３０℃超及び４０％ＲＨにおける製剤に対して、構造的安定性を提供し、そして／あるいは物理的及び化学的保護は、生体活性材料に利益を与え、再構成又は再水和における有害な影響を予防又は減少させる。
【００７７】
炭水化物混合物中の多糖画分は、製剤への濃い粘性、真空下での製剤密度特性に対する優れた制御、及び本発明の乾燥製剤組成物に増加した構造的強度を提供する（特定の製剤のガラス状構造及び乾燥について図８〜写真４、４ｂ、４ｃを参照のこと）。特に、生きている有機物にとって好適な多糖は、水溶性ガムであり、それらの独特の特性において、中程度の温度で粘着性のゲルを形成する。特定の濃度におけるガムは、製剤に適切な粘性及び密度を提供し、そして特定の粘度において、一次水分除去工程の間、製剤の効率的な乾燥を可能にすることにより、真空下で製剤構造を効率的に安定化することが見出された。特定のガムは、二価又は多価のカチオンと架橋することより（例えば、アルギネート、ペクチン、キトサン）、あるいは、温度又はｐＨ変化により（例えば、ゼラチン、ＣＭＣ、ＣＡＰ、ジェランガム）、ヒドロゲルを形成することができる。ヒドロゲル化された溶液は、凍結溶液の真空乾燥に関連する問題を予防する。特定の濃度におけるガムはまた、製剤を効率的に安定化し、そして非晶質ガラス構造の形成を促進し、そして真空下で乾燥プロファイルを増大させることが見出された（図７〜写真３ａ、３ｂ、３ｃ、４、及び図８〜４ｃ、及び図１３を参照のこと）。
【００７８】
とりわけ、下記の図１に説明する結果と組み合わせて、図７の写真を見ることにより、サンプル３ｂ、３ｃ、４、５及び６は、全て、非晶質ガラス構造において、十分に乾燥され、いくらかの多孔性を提供したことは明らかである。
【００７９】
【表１】
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【００８０】
例えば、生体活性材料の乾燥形態は、組成物粉末混合物を含有する溶液又は懸濁液に製剤化され得る。前記組成物混合物は、冷却及び生体活性材料との混合の前に低い剪断撹拌をしながら温かい水溶液に溶解されてもよい。前記生体活性材料、例えば培養されたウイルス又は細菌は、製剤への再懸濁の前に、濃縮され、そして培養培地から遠心分離又は濾過により分離されてもよい。あるいは、製剤中の水の全て又は部分が、濃縮された生体材料の液体中に提供されてもよい。前記懸濁液を、室温を僅かに上回る温度において維持し、乾燥組成物粉末混合物は、生体材料を含有する温かい（２５℃〜４０℃）懸濁液にゆっくりと添加する。前記懸濁液を、一般的に、全ての成分が十分に分散又は溶解し、均一なスラリーが得られるまで、プラネタリー型攪拌器において撹拌する。
【００８１】
粘性のスラリーは、金属イオンを添加することにより、あるいは、スラリーの温度又はｐＨを変化させることにより、架橋してヒドロゲルを形成することができ（多糖の特性に依存する）、その後本発明の乾燥方法に従って乾燥される。あるいは、前記スラリーは、ノズルを通して噴霧することにより、ドライアイス又は液体窒素槽中に滴下又は注入することにより瞬間凍結させ、小粒子又は固体液滴紐又はビーズを形成することができる。凍結固体粒子は、安定的凍結製品として後の使用のために、あるいは乾燥まで、−３０℃〜−８０℃のディープフリーザーにおいて、保存してもよい。好適な、典型的な乾燥方法は、製品温度が、その凍結温度を僅かに上回って維持される、真空乾燥である。凍結液滴又はビーズは、約０．１ｋｇ／ｓｑ  ｆｔ〜約１．５ｋｇ／ｓｑ  ｆｔの積載能力において、トレイ上に置かれ、そして本発明の方法に従って、乾燥される。実施形態によっては、前記乾燥プロセスは、短いパージ工程により開始され、これは、前記製品を初期温度に順応させ、凍結粒子の構造を弛緩させ、そして安定化することを可能にし、過剰な空気は脱気される。典型的に、パージする工程は、製品の粘性及びトレイの積載に応じて、１〜６０分間を要する。ビーズ又は粒子は、全体のパージ工程の間、固体凍結形態において維持されるべきである。前記製品温度は、その後、その凍結温度を上回り、そして一次水除去工程は、全ての遊離水が製品から蒸発するまで続けられる。一度製剤の温度が所望の温度に達すると、熱がその温度を維持するように調節され、蒸発による一次液体乾燥工程が進行する。この工程においては、前記製剤は、すでに融解し、加速した水蒸発が、何らかの沸騰又は発泡することなく行なわれる。前記乾燥プロセスは、最大真空及び上昇した温度における更なる二次乾燥フェーズにより完了する。
【００８２】
先行技術分野における典型的な方法は、傷つきやすい生体物質に損傷を与え、高い積載能力における工業的なスケールアップに対する困難性を引き起し得る、過剰な発泡及び／又は飛び散り、並びに強烈な沸騰を含む（例えば、適用される真空圧力が強烈な沸騰及び発泡をもたらす、米国特許第６，５３４，０８７号を参照のこと）。しかしながら、本組成物及び本方法は、著しく早い乾燥速度を達成し、前記製剤の高い積載能力を可能にする一方で、製剤の沸騰又は発泡を回避する。加えて、粘性液体スラリーの完全且つ効率的な脱気は、困難であり、長い時間を要求し得る。これらの障害は、沸騰及び過剰な発泡なく、ガラス状構造を形成しつつ、効率的な一次水除去を可能にする好適な組成物を用いることにより、本発明において全て解決されている。スラリー又は粘性シロップとは対称的に、固体凍結粒子のトレイ上への積載は、先行技術に従って得られるよりも、さらに高いトレイ上の乾燥領域当たりの積載能力を可能にする。
【００８３】
本発明の１つの好適な例では、前記生体材料は、生きている濃縮されたプロバイオティック細菌培養物である。実施形態によっては、粉末組成物混合物は、１〜４％のアルギン酸ナトリウム若しくはジェランガム、５０〜７５％のトレハロース、１〜１０％のイヌリン若しくはＦＯＳ、１０〜２０％のタンパク質加水分解産物、例えばカゼイン、ホエイ、エンドウマメ、ダイズ若しくは綿実加水分解物、並びに１〜１０％のクエン酸ナトリウム又はアスコルビン酸ナトリウムを含む。前記プロバイオティック培養物は、新鮮でもよく、凍結されてもよく、あるいは乾燥粉末の形態に既に乾燥されてもよい。
【００８４】
本発明の別の好適な例では、前記生体材料は、生きている濃縮された微生物培養物である。粉末組成物混合物は、１〜４％のアルギン酸ナトリウム若しくはジェランガム、５〜３０％のトレハロース、５〜４０％のイヌリン、５〜４０％の低ＤＥマルトデキストリン、１０〜３０％の広く加水分解されたタンパク質、例えばカゼイン、ホエイ、エンドウマメ、ダイズ若しくは綿実タンパク質を混合することにより調製される。更なる０．１〜１０％のガラス増強剤、例えばクエン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、又はアスコルビン酸ナトリウムは、任意で、前記組成物に含まれてもよい。微生物、又は胞子（spore）培養物は、新鮮でもよく、凍結されてもよく、あるいは乾燥粉末の形態に既に乾燥されてもよい。
【００８５】
前記組成物混合物は、濃縮されたプロバイオティック培養培地に添加され、４０〜６０％（ｗ／ｗ）までの溶液混合物の固体含量、及びリン酸又はクエン酸イオンを用いて、６．５〜７．５まで調製されたｐＨをもたらす。前記溶液は、全ての成分が完全に溶解するまで、室温を僅かに上回る温度（典型的には２５℃〜３７℃）において混合される。粘性スラリーは、液体窒素中に滴下され、小さい液滴又はビーズを形成し、これはその後液体窒素から回収され、袋にパックされ、乾燥まで−８０℃におけるディープフリーザー中で保存される。
【００８６】
生きているプロバイオティック細菌の典型的な乾燥方法は、１００〜１５００ｇ／ｓｑ  ｆｔの積載能力において、均一な層に固体凍結ビーズをトレイ上に広げることであり、前記トレイは、凍結乾燥器中に即時に置かれる。真空は、その後約１０００ｍＴＯＲＲ以下において適用され、凍結乾燥器のサイズ及び加熱源に応じて、棚の温度を調節し、前記粒子を約−２０〜約−３０℃において、維持した。固体凍結ビーズを約１〜約６０分間パージし、真空を２０００〜１０，０００ｍＴＯＲＲに調節し、熱伝達を増加させて製剤温度を−２０℃〜０℃、又は−１０℃〜０℃、典型的には約−１０℃に上昇させる。これらの温度及び／又は真空圧力条件は、トレイ積載に応じて数時間〜２４時間続けられ得る、一次水除去工程の間維持される。一次水乾燥プロセスの間のいくつかの時点において、溶媒の蒸発の速度は、遅くなり、そして製剤温度は乾燥チャンバー中の過剰な熱供給により上昇し始める。この時点は、本発明における一次乾燥工程の終了を示唆する。溶媒が製剤から追い出されるので、それが液体として流れるのが止まるまで溶液中のガラス形成化合物は濃縮され、濃くなり、非晶質及び／又は安定的なガラス構造を形成する。
【００８７】
二次乾燥工程は、その後最大真空且つ３０℃〜５０℃の製剤温度において行なわれる。二次乾燥工程の目的は、残っている捕捉されていた、あるいは結合していた水分を除去し、周囲温度において延長される期間、保存において安定的である組成物を提供するためである。前記二次乾燥工程は、数時間続けられ、その終了時点は、製剤が完全に乾燥し、その水分活性が０．３Ａｗ未満となった時である。
【００８８】
本発明の乾燥方法は、非晶質ガラス組成物内の前記化合物及び他の分子の著しく減少した移動性により、非晶質ガラス状構造内に包み込まれた生物学的に活性な材料をもたらし、これによりタンパク質のアンフォールディング又は変性を予防し、分子相互作用又は交差反応性を著しく遅延させる。そのガラス転移温度未満、且つ残存水分が比較的低い限りにおいて非晶質固体構造が維持され、前記プロバイオティック細菌は、比較的安定に維持することができる（図１５を参照のこと）。いくつかの生体材料はより結晶状態において、よりよいので、ガラス構造を達成することは、長期の安定性に必須ではないことは、注目されるべきである。
【００８９】
乾燥したガラス構造は、一纏めにして用いられ、所望の形状及びサイズに切断され、あるいは容易な後段の加工、例えば湿式若しくは乾式造粒、顆粒化、錠剤化、圧搾、ペレット化、又は送達プロセスの任意の他の種類を提供する流動性粉末に破砕及び製粉され得る。破砕、製粉、粉砕、微粉砕のためのプロセスは、当該技術分野においてよく知られている。例えば、ハンマー製粉機、気流式製粉機、衝撃式製粉機、ジェット製粉機、ピン型製粉機、ウィリー製粉機、又は同様の製粉デバイスを用いることができる。好適な典型的な粒子径は、約１０００μｍ未満であり、実施形態によっては、５００μｍ未満である。
【００９０】
本発明の別の例では、生体活性材料を含有する乾燥安定粉末は、溶融脂質とともに造粒される。前記乾燥粉末は、４０℃のプラネタリー混合機に入れ、そして溶融脂質、例えばココアバター、天然ワックス、若しくは水素添加油又はこれらの混合物は、撹拌しながら暖められた粉末に撹拌下でゆっくりと添加し、そして前記混合物は、脂質の融解温度未満に冷却しつつ、混合は、造粒された粉末の視覚的に均一なサイズが達成されるまで、連続される。組成物中の溶融脂質混合物の重量は、約２０％〜約７０％であり、実施形態によっては、約３０〜５０％である。最終生成物は、造粒された形態において摂取され、あるいは打錠機において圧搾され、そして錠剤の形態において摂取され得る。
【００９１】
１つの特定の例において、前記乾燥粉末は、打錠機において圧搾され、所望の形状及びサイズにおいて錠剤を形成する。安定的且つ乾燥した生物学的組成物は、任意で充填剤と混合され、錠剤の効力を所望の用量に調整する。充填剤としては、限定することなく、マルトデキストリン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、コロイド状二酸化ケイ素、及びこれらの組み合わせがあげられる。任意で、崩壊促進剤はまた、錠剤化混合物に含まれる。崩壊促進剤の例としては、限定することなく、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン（不溶性ポリビニルピロリドン）、デンプングリコール酸（gycolate）ナトリウム、デンプングルコン酸（glyconate）ナトリウム、α化デンプン等が挙げられる。本明細書において用いられるように錠剤化混合物は、任意で、フロー剤を含んでもよい。前記フロー剤としては、限定することなく、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛（zinc state）、ステアリン酸、ヒュームドシリカ、例えば疎水性又は親水性ヒュームドシリカが挙げられる。
【００９２】
安定的な生物学的組成物及び他の錠剤成分から錠剤を生産するための好適な方法は、標準的なプレス錠剤化方法、多層錠剤を生産するために従来用いられるものを含む。１００Ｎ未満の引張強度（Erweka equipment）に対応する最大５０ｋＮ／ｃｍ2の圧搾圧力での錠剤化が好ましいが、しかしながら温度曝露は、生物材料が生きている微生物である場合において、６０℃未満に限定されるべきである。
【００９３】
前記錠剤は、噛まずに丸ごと、噛んで、あるいは発泡性飲料錠剤として摂取されるように設計されても良い。前記錠剤が、摂取に際して、口の中、飲料中又は胃の中で崩壊する場合、生体材料は、前記錠剤構造によりそれらから分離されていた他の活性材料に曝露される。これは、有害な材料の局所濃度が高すぎる場合、潜在的に、生体材料に損傷を与える可能性がある。それ故、生物活性材料の分解は、錠剤中の他の活性成分の含量を希釈及び分散することを可能するために遅延される実施形態は、好ましい。この問題は、本明細書に記載されるように、硬化した、あるいは架橋された構造の組成物を形成することにより、本発明において解決される。いくつかの実施形態において、前記生体材料は、水中で混合された場合、組成物マトリックス内で無傷のままである。実施形態によっては、前記生体材料は、動物の消化管を通って、所望の作用部位において組成物マトリックスから無害に放出される。
【００９４】
本発明の錠剤は、許容される限度内で、乾燥のそれらの最初の状態を保護するために、かかる方法においてパッケージされてもよい。これは、錠剤を、水分不浸透性の区画、例えばチューブ若しくはブリスターパック、又は乾燥剤、例えば容器内の水分活性を減少させる、水を吸収するためのシリカゲルを含む容器中にパッケージングすることを含んでもよい。酸素から保護するために、かかるパックは、脱酸素材料、例えばＦｒｅｓｈＰａｘ（登録商標）、Ａｇｅｌｅｓｓ（商標）、アスコルビン酸パルミテート若しくは他のアスコルビン酸塩、没食子酸プロピル若しくは他の没食子酸、α−トコフェロール、硫酸マグネシウム若しくはナトリウム、ブチルヒドロキシアニソール又はブチルヒドロキシトルエン等を含んでもよい。
【００９５】
本明細書に記載する前記組成物及び方法は、周囲温度及び相対湿度を上回る温度及び相対湿度において、延長された保存期間、生体材料を安定化し、その活性を保護する。例えば、前記組成物は、上昇した温度（例えば、４０℃）及び高湿度（例えば、３３％ＲＨ又は４３％ＲＨ）に供され、そして製剤の生体活性を測定することにより、安定性について試験される。生きているプロバイオティック細菌についての例としては、これらの研究の結果は、これらの組成物において製剤化された前記細菌は、少なくとも６０日間安定的であることを実証する。安定性は、１ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇ効力喪失あたりの時間として定義される。かかる製剤は、高い濃度で生物学的に活性な材料が用いられる場合においてでさえ、安定的である。従って、これらの製剤は、これらが、長期間、室温以上において輸送、及び保存されてもよい点において、利益を有する。
【実施例】
【００９６】
実施例
実施例１
乾燥及び安定的な組成物の調製
基本の炭水化物混合物
約７０ｇのトレハロース（Cargill Minneapolis, MN）、約５ｇのインスタントイヌリン（Cargill Minneapolis, MN)及び約３ｇのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）を乾燥形態において、均一に混合した。
【００９７】
基本のガラス増強剤混合物
約１７ｇのカゼイン加水分解物又はエンドウマメ加水分解物（限外濾過された加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）及び５ｇのクエン酸ナトリウム、又はアスコルビン酸ナトリウム（Sigma, St. Louis, MO）を乾燥形態において、均一に混合した。
【００９８】
プロバイオティック細菌の安定化
ラクトバチルス・ラムノサスの新鮮な濃縮物（発酵収穫物からから直接得られる、１０％固体において１００ｍｌ）をブレンダー中に添加し、３５℃で維持した。約７８ｇの基本炭水化物混合物及び約２２ｇの基本ガラス増強剤混合物をプロバイオティック培養物にゆっくりと添加し、混合を１０分間３５℃において行なった。粘着性スラリーを、多孔底を有するベッセルに移し、液体窒素を含む槽に滴下した。ビーズを液体窒素から回収し、即時に乾燥に移した。
【００９９】
プロバイオティック細菌を含む凍結ビーズの乾燥
凍結したビーズを２００ｇ／ｓｑ  ｆｔの積載能力を有するトレイに広げ、凍結乾燥器（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中の棚に直ぐさま置いた。その後、真空を２０００〜２７００ｍＴＯＲＲに調節し、棚の温度を＋３０℃に上昇させた。これらの温度及び真空圧力設定を５時間維持した。任意で、凍結ビーズの温度を、約１０００ｍＴＯＲＲにおける真空圧力を適用し、凍結ビーズに約１０分間パージすることを可能にすることにより、一次液体乾燥を開始する前に、約−２０℃に順応させた。一次乾燥工程は、真空圧力を２０００〜２７００ｍＴＯＲＲに調節し、棚の温度を＋３０℃に上昇させた。これらの温度及び真空圧力設定を５時間維持した。二次乾燥工程を、完全な真空（１５０〜２００ｍＴＯＲＲ）において行い、棚の温度を、さらに３時間、３０℃〜５０℃で維持した。製剤は、完全に乾燥し、その水分活性は、Ａｗ＝０．２３において、HygropalmAwl instrument（Rotonic Instrument Corp., Huntington, NY.）により測定された。
【０１００】
実施例２
乾燥プロバイオティック細菌の保存安定性
図１は、実施例１の乾燥安定化プロバイオティック細菌及び市販の乾燥プロバイオティック細菌（Culturelle, Amerifit, Inc., Cromwell, CT）の、４０℃且つ３３％ＲＨ及び３０℃且つ４３％ＲＨの２つの異なる加速保存条件下での保存安定性を示す。市販のプロバイオティック細菌は、加速された保存条件下において、最初の数週間のうちにその活性を完全に喪失した一方で、本発明のプロバイオティック細菌の前記乾燥組成物は、６０日後、３０℃且つ４３％ＲＨにおいて１．１８ｌｏｇのみ喪失し、そして４０℃且つ３３％ＲＨにおいて１．０９ｌｏｇのみ喪失した。
【０１０１】
実施例３
プロバイオティック細菌であるラクトバチルス・ラムノサスを含む安定化乾燥組成物のスケールアップ生産
ラクトバチルス・ラムノサス（商業的供給源からの４００ｇ凍結濃縮物）を、ジャケット付きのデュアルプラネタリーミキサー（DPM, lqt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA）中で３７℃において融解し、固体含量を１０固体重量％に蒸留水で調整した。約２１２ｇのトレハロース（Cargill Minneapolis, MN）、約２０ｇのインスタントイヌリン（Cargill Minneapolis, MN）、約１２ｇのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）、約１３６ｇのカゼイン加水分解物（限外濾過した加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）及び約２０ｇのアスコルビン酸ナトリウム（Sigma, St. Louis, MO）を乾燥形態において均一に混合した。前記粉末混合物をプロバイオティック培養物にゆっくりと添加し、混合を１０分間３７℃で４０ＲＰＭにおいて行なった。前記スラリーを、その後、穴の空いた底を有するベッセルに移し、液体窒素を含む槽中に滴下した。前記ビーズを液体窒素から回収し、密閉されたアルミホイルバッグに入れ、そして数週間、−８０℃においてディープフリーザー中で保存した。
【０１０２】
乾燥の間、凍結ビーズを、５００から最大１５００ｇ／ｓｑ  ｆｔの範囲の積載能力において、トレイ上に均一に広げ、そしてトレイを凍結乾燥器（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中のふるいの上に置いた。一次液体乾燥工程は、２０００〜２７００ｍＴＯＲＲの真空圧力に調節することにより開始され、製品温度を上昇させ、−１０〜−５℃において安定化した。時間とともに（約１０〜１６時間）、前記製品温度は、約２０〜２５℃に上昇し、その時点において、二次乾燥工程は最大真空（１５０〜２００ｍＴＯＲＲ）で開始され、製品温度は、３０〜４０℃でさらに１４時間維持される。前記製剤は、完全に乾燥され、その水分活性は、０．２３Ａｗにおいて測定された。
【０１０３】
実施例４
プロバイオティック細菌であるビフィドバクテリウム・ラクティスを含有する安定化乾燥組成物のスケールアップ生産
ビフィドバクテリウム・ラクティス（商業的供給源からの４００ｇ凍結濃縮物）を、ジャケット付きのデュアルプラネタリーミキサー（DPM, lqt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA）中で３７℃において融解した。約２１２ｇのトレハロース（Cargill Minneapolis, MN）、約２０ｇのインスタントイヌリン（Cargill Minneapolis, MN）、約１２ｇのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）及び約２０ｇのアスコルビン酸ナトリウム（Sigma, St. Louis, MO）を乾燥形態において均一に混合した。前記粉末混合物をプロバイオティック培養物にゆっくりと添加した。約１３６ｇのエンドウマメ加水分解物（限外濾過した加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）を８０ｇの蒸留水に溶解し、前記混合物を、溶解が完了するまで、短時間電子レンジにかけ、あるいは６０℃の水槽中で暖め、その後約３５℃に冷却した。乾燥混合粉末及びエンドウマメタンパク質加水分解産物を含有する溶液をプロバイオティック濃縮物に添加し、混合を２０分間、４０ＲＰＭ且つ３７℃において行なった。前記スラリーを、その後、穴の空いた底を有するベッセルに移し、液体窒素を含む槽中に滴下した。前記ビーズを液体窒素から回収し、密閉されたアルミホイルバッグに入れ、そして数週間、−８０℃においてディープフリーザー中で保存した。
【０１０４】
乾燥の間、凍結ビーズを、８００ｇ／ｓｑ  ｆｔの積載能力において、トレイ上に均一に広げ、そしてトレイを凍結乾燥器（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中のふるいの上に置いた。一次液体乾燥工程は、２０００〜２７００ｍＴＯＲＲの真空圧力に調節することにより開始され、製品温度を上昇させ、−１０〜−５℃において安定化した。時間とともに（約１０〜１６時間）、前記製品温度は、約２０〜２５℃に上昇し、その時点において、二次乾燥工程は最大真空（１５０−２００ｍＴＯＲＲ）で開始され、製品温度は、３０〜４０℃でさらに１４時間維持される。前記製剤は、完全に乾燥され、その水分活性は、０．２３Ａｗにおいて測定された。
【０１０５】
実施例５
プロバイオティック細菌であるビフィドバクテリウム・ラクティスを含有するヒドロゲル製剤の調製
ビフィドバクテリウム・ラクティスの濃縮されたプロバイオティックスラリーは、実施例１に従って調製される。基本製剤に、０．５ｇの二塩基性リン酸カルシウム、続いて０．５ｇのグルコノラクトンを添加する。前記スラリーを、さらに２時間、室温において硬化させ、固体ヒドロゲルを形成させる。硬化したゲルを、市販のスライサー／剪断機を用いて、薄く、長い糸（thread）にスライスした。薄い糸を湿った形態においてトレイに直接積載し、あるいは液体窒素中で瞬間凍結し、そして５００ｇ／ｓｑ  ｆｔの積載能力を有するトレイ上に積載し、実施例３に記載するように、乾燥のために凍結乾燥器においた。製剤の水分活性（Ａｗ）は、０．０５である（Measured by HygroPalmAwl , Rotonic Huntington, NY）。前記乾燥製剤を、標準的なハンマー型製粉装置を用いて、さらに製粉し、そして５０〜２５０ミクロンスクリーンを通してふるいに掛けた。
【０１０６】
実施例６
ガラス増強剤と炭水化物混合物とのモル比の最適化
様々なモル比のガラス増強剤及びを有する炭水化物混合物を含有するいくつかの組成物は、実施例１に従って調製された。プロバイオティック細菌であるＬ．パラカゼイの濃縮された培養物を、商業的供給源から得て、スラリーが瞬間凍結及びパージ工程を経ずに湿った形態においてトレイ上に即座に積載されることを除いて、実施例１に記載されるように、乾燥組成物において調製した。前記棚温度を一次及び二次乾燥段階の間、４０℃に上昇させたことを除いて、前記スラリーを、実施例１及び３に記載されるように、一次及び二次段階において乾燥させた。前記安定的な粉末を、８４日間、３７℃且つ３３％ＲＨの加速保存条件に供した。図２は、乾燥した細菌の安定性に関する様々なモル比の影響を示す。結果は、ガラス増強剤と炭水化物混合物の最適なモル比が、約０．１２〜０．１５であることを示した。
【０１０７】
実施例７
プロバイオティック細菌であるＬ．アシドフィルスの保存安定性に関する本発明の組成物の影響
炭水化物混合物及びガラス増強剤混合物を含有する組成物を、実施例１に記載されるように調製した。プロバイオティック細菌であるＬ．アシドフィルスの濃縮された培養物を、商業的供給源から得て、実施例１及び３に記載されるように、乾燥組成物において調製し、そして前記安定的な粉末を、５３７日間、２４℃且つ３３％ＲＨの加速保存条件に供した。図３は、本発明の組成物を用いて製剤化されたプロバイオティックの優れた安定性を実証した。結果は、プロバイオティック生存能力が、特定された条件下、５３７日間にわたる保存において０．１８ｌｏｇのみ減少したことを示した。
【０１０８】
実施例８
プロバイオティック細菌であるＬ．アシドフィルスの保存安定性に関する様々なガラス増強剤の影響
実施例１に記載される炭水化物混合物、並びにカゼイン加水分解物及びクエン酸ナトリウム若しくはアスコルビン酸ナトリウム又は両者の組み合わせを含有するガラス増強剤混合物を含有するいくつかの組成物を調製した。プロバイオティック細菌であるＬ．アシドフィルスの濃縮された培養物を、商業的供給源から得て、前記スラリーが瞬間凍結及びパージ工程を経ないで、湿った形態においてトレイ上に即座に積載されることを除いて、実施例１に記載されるように、乾燥組成物において調製した。前記スラリーを、実施例１及び３に記載されるように、一次及び二次段階において乾燥させ、前記安定的な粉末を、１８０日間、２４℃且つ４３％ＲＨの加速保存条件に供した。図４は、乾燥した細菌の安定性に関する様々なガラス増強化合物の影響を示す。結果は、タンパク質加水分解産物に加えて、さらなるガラス増強剤の含有により、著しく優れた安定性が得られたことを示す。特に、酢酸ナトリウム及びアスコルビン酸ナトリウムの等量の含有は、最も安定的な組成物を与えた。実施例５及び６の両者からの結果は、様々なガラス増強剤は、より効果的であり得る、あるいは細菌株に応じては、不安定化剤としてさえも作用し得ることを示す。
【０１０９】
実施例９
プロバイオティック細菌であるビフィドバクテリウム・ラクティスの保存安定性に関する様々なタンパク質加水分解産物／糖の比の影響
実施例１に記載されるような炭水化物混合物とガラス増強剤を含有するいくつかの組成物と、アスコルビン酸ナトリウムを含むあるいは含まない、エンドウマメ加水分解物／トレハロースを等量であるが、様々な比で含む組成物とを調製した。プロバイオティック細菌であるビフィドバクテリウム・ラクティスの濃縮された培養物を、商業的供給源から得て、実施例１及び３に記載されるような乾燥組成物において調製し、そして前記安定的な粉末を、７週間、３５℃且つ４３％ＲＨの加速保存条件に供した。図５は、乾燥させた細菌の安定性に関する、アスコルビン酸ナトリウムを含むあるいは含まない、エンドウマメ加水分解物／トレハロースの１：４、１：２．５及び１：１．５の比の影響を示す。結果は、著しく優れた安定化は、エンドウマメ加水分解物／トレハロースの増加した比において得られたことを示す。特に、１：１．５エンドウマメ加水分解物／トレハロースの比は、より安定的な組成物を提供する。高いエンドウマメ加水分解物／トレハロース比におけるアスコルビン酸ナトリウムの含有は、アスコルビン酸ナトリウムを含まない製剤と比較して、優れた安定性をもたらした。
【０１１０】
実施例１０
プロバイオティックであるＬ．ラムノサスの最大の安定性のためのｐＨ最適化
様々なｐＨにおいて、実施例１に記載される炭水化物混合物及びガラス増強剤混合物を含有するいくつかの組成物を調製した。プロバイオティック細菌であるＬ．ラムノサスの濃縮された培養物を、商業的供給源から得て、実施例１及び３に記載されるように、乾燥組成物において調製した。前記安定的な粉末を、８週間、４０℃且つ３３％ＲＨの加速保存条件に供した。図６は、乾燥させた細菌の安定性に関する、スラリーのｐＨの影響を示す。結果は、最適な安定性が、中性ｐＨ（約７）において達成されたことを示す。
【０１１１】
実施例１１
酵素を含有する安定的な乾燥粉末
４０重量％のフィターゼ（phitase）（BASF, GmBH）を含有するヒドロゲル製剤を、１０００ｍｌの水中で、４００ｇの炭水化物混合物、及び実施例１及び４に記載するような２００ｇのガラス増強剤混合物、及び４００ｇのフィターゼを混合することにより調製した。剪断されたヒドロゲル製剤は、液体窒素中で瞬間凍結させ、５０℃の一次及び二次乾燥温度において、真空オーブン中で乾燥させた。乾燥された製剤の積載及び保存安定性の決定のために、乾燥サンプルは、マイクロ遠心チューブ中で正確に計量する（＜１００ｍｇ）。２００μｌ部分のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加する。前記製剤は、ボルテックスすることによりＤＭＳＯバッファ中に溶解する。このサンプルに、０．０５Ｎ  ＮａＯＨ、０．５％ＳＤＳ及び０．０７５Ｍクエン酸（三ナトリウム塩）を含有する０．８ｍｌの溶液を添加する。前記チューブは、４５℃で１０分間超音波処理され、その後、１０分間、５，０００ｒｐｍにおいて短い遠心分離をする。透明なＤＭＳＯ／ＮａＯＨ／ＳＤＳ／クエン酸溶液の一部をマイクロプレートのウェルに採取し、ブラッドフォードアッセイ法を用いてタンパク質含量について分析した。９５℃で２０分間曝露後、安定的な酵素乾燥組成物の安定性は、本発明の組成物を含まない乾燥酵素よりも著しく高い。
【０１１２】
実施例１２
感染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）ワクチンを含有する安定的な乾燥粉末
０．５％酢酸中２０ｍｌの４％のキトサン溶液を、ＩＳＡＶワクチン濃縮物と炭水化物混合物とガラス増強剤とを含有するスラリーに添加したことを除いて、ＩＳＡＶワクチン（Novozyme, Denmark）の濃縮されたスラリーを、実施例４に従って調製した。０．５ｇの二塩基性リン酸カルシウム、続いて０．５ｇのグルコノラクトンを添加する。前記スラリーは、さらに２時間、室温において硬化させ、固体ヒドロゲルを形成する。硬化したゲルを、市販のスライサー／剪断機を用いて、薄く、長い糸（thread）にスライスした。薄い糸を湿った形態においてトレイに直接積載し、あるいは液体窒素中で瞬間凍結し、そして１５００ｇ／ｓｑ  ｆｔの積載能力を有するトレイ上に積載し、実施例３に記載するように、乾燥のために凍結乾燥器においた。製剤の水分活性（Ａｗ）は、０．２５である。前記乾燥製剤は、標準的なハンマー型製粉装置を用いて、さらに細かく製粉され、そして５０〜１５０ミクロンスクリーンを通してふるいに掛けた。前記安定的な乾燥ＩＳＡＶ組成物を、乾燥組成物を用いて市販の飼料を上塗りし、そしてタイセイヨウサケに給餌することにより、経口ワクチン接種のために用いる。
【０１１３】
実施例１３
侵襲性種餌（invasive species bait）の調製
本発明の特別に標的化された侵襲性種のためのペレット状の餌は、殺虫剤を含有して調製される。実施例９に記載されるような２００ｇの製剤は、調製され、そして２００ｇｍの水に添加される。この溶液に、９０ｇｍのロテノン及び０．５ｇｍの二塩基性リン酸カルシウム、続いて０．５ｇｍのグルコノラクトンを添加する。前記スラリーは、標準的な産業用噴霧（pray）乾燥器中で即座に噴霧乾燥され、そして乾燥製剤は、環境又は近くのエコシステムに関して毒素の有害な影響を与えることなく、特定の侵襲性種を標的化するために用いられる。
【０１１４】
実施例１４
保護された植物性プロバイオティック製剤の調製
生物学的防除剤、例えばリゾバクテリア（Rhizobacteria）は、実施例４に従って、乾燥組成物中で調製される。乾燥リゾバクテリア組成物の有効性は、ノトバイオート条件下におけるレタス成長に関して評価される。１植物あたり、１００ｍｇのリゾバクテリア乾燥組成物の用量を、砂とともにジャーに植菌し、催芽した（２４時間）レタス実生を植えた。５ｍｌの滅菌したホーグランド溶液の栄養用量をジャー中の植物に適用する。ジャーは、１２時間の光周期で、２８℃に維持された増殖チャンバー中でランダムに配列された。植え付け後、７日毎に、植物及び接着する砂を注意深くジャーから回収する。滅菌したリン酸バッファ（ｐＨ７．０）中で根を洗浄し、根の長さの測定値を記録する。
【０１１５】
実施例１５
乾燥且つ安定的なプロバイオティック物質の調製
基本製剤
７５ｇの一部のトレハロース（Cargill Minneapolis, MN）及び２２ｇの広く加水分解されたカゼイン（Marcor, Carlstadt, NJ）を乾燥形態において、３ｇのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）と均一に混合した。ラクトバチルス・アシドフィラスの新鮮な濃縮物（発酵収穫物から直接、少なくとも１０％固体を含む１００ｍｌ）を攪拌器に添加し、３５℃で維持した。ガム、糖、及び加水分解されたタンパク質の乾燥混合物をプロバイオティック培養物にゆっくりと添加し、混合を３５℃で１０分間行なった。粘性スラリーを、その後、多孔底を有するベッセルに移し、窒素を含む槽に滴下した。その後、ビーズを液体窒素から除去し、即時に乾燥に移した。
【０１１６】
基本製剤の凍結ビーズの乾燥
凍結したビーズを１００ｇ／ｓｑ  ｆｔの積載能力を有するトレイに均一に広げ、凍結乾燥器（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中の棚に直ぐさま置いた。真空圧力を１０００ｍＴＯＲＲで適用し、固体凍結ビーズを１０分間パージした。真空をその後２７００ｍＴＯＲＲに調節し、棚の温度を＋３０℃に上昇させた。これらの温度及び真空圧設定を３時間維持した。二次乾燥工程は、その後、完全な真空（１５０〜２００ｍＴＯＲＲ）において行なわれ、棚の温度は、さらに２時間、３０℃に上昇させた。製剤は、完全に乾燥され、その水分活性は、Ａｗ＝０．２３において、Hygropalm Awl instrument（Rotonic Instrument Corp., Huntington, NY.）により測定された。
【０１１７】
実施例１６
プロバイオティック細菌であるラクトバチルス・ラムノサスＬＧＧを含有する安定的な乾燥組成物
ラクトバチルス・ラムノサスＬＧＧ（商業的供給源からの５００ｇ凍結濃縮物）を、ジャケット付きのデュアルプラネタリーミキサー（DPM, lqt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA）中で３７℃において融解した。２つのガラス形成剤；トレハロース（３８７ｇ、Cargill Minneapolis, MN）及び広く加水分解されたカゼイン（８３ｇ、Marcor, Carlstadt, NJ）を、２つのマトリックス形成剤；アルギン酸ナトリウム（１５ｇ、ISP Corp., Wayne, NJ）及びインスタントイヌリン（２５ｇ、Cargill Minneapolis, MN）とを乾燥形態において均一に混合した。前記乾燥混合物を融解したプロバイオティック培養物にゆっくりと添加し、混合を１０分間３７℃で４０ＲＰＭにおいて行なった。前記スラリーの粘性を５０〜２００ｍｌ水の添加により、１２，０００Ｃｐに調整した。前記スラリーを、その後、穴の空いた底を有するベッセルに移し、液体窒素を含む槽中に滴下した。前記ビーズを液体窒素から回収し、密閉されたアルミホイルバッグに入れ、そして数週間、−８０℃においてディープフリーザー中で保存した。
【０１１８】
乾燥の間、凍結ビーズを、１００から最大５００ｇ／ｓｑ  ｆｔの範囲の積載能力において、トレイ上に均一に広げ、そしてトレイを凍結乾燥器（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中のふるいの上に置いた。真空圧力を１０００ｍＴＯＲＲで適用し、棚の温度を＋２０℃に調整した。前記固体ビーズを１〜３０分間の範囲の期間、パージした。パージ工程は、一次乾燥工程に続き、真空圧力を２７００ｍＴＯＲＲに調整し、棚の温度を＋３０℃に上昇させた。これらの温度及び真空圧力は１２時間維持される。二次乾燥工程は、その後完全真空（１５０〜２００ｍＴＯＲＲ）にされ、そして棚の温度はさらに４時間３０℃で維持される。前記製剤は、完全に乾燥され、その水分活性は、０．２３Ａｗにおいて測定された。図１３は、プロバイオティック製剤の乾燥プロファイルを示す。
【０１１９】
様々な温度（＋４℃、−８０℃及び−１８０℃）におけるスラリーの凍結後、及び凍結ビーズの調製を含む乾燥プロセス、及び凍結乾燥器中での乾燥後の生存能力の喪失を図１０、１１及び１４に示す。全体のプロセスについての生存能力の喪失は、一般的に、細菌培養物の種類、及び粘性スラリーの凍結温度に依存して、１ｌｏｇ未満である。結果は、液体窒素（−１８０℃）におけるプロバイオティック細菌の瞬間凍結が、−８０℃における凍結よりも、より損傷が少ないプロセスであったことを示す。
【０１２０】
図１２及び１５は、乾燥組成物中におけるプロバイオティック細菌の初期カウント、及び４０℃且つ３３％ＲＨの加速保存条件下における保存安定性に関する、０分（パージなし）〜３０分にわたる、様々なパージ時間の影響を示す。結果は、長いパージ時間は、一般的に、乾燥製剤中の細菌の初期カウントを改善するが、プロバイオティック製剤の保存安定性に関して影響を与えなかったことを示す。
【０１２１】
実施例１７
トレハロース（７５２ｇ、Cargill Minneapolis, MN）、広く加水分解されたエンドウマメタンパク質（１６７ｇ、Marcor, Carlstadt, NJ）、アルギン酸ナトリウム（３０ｇ、ISP Corp., Wayne, NJ）及びインスタントイヌリン（５０ｇ、Cargill Minneapolis, MN）を乾燥形態において均一に混合した。乾燥混合物を、ジャケット付きのデュアルプラネタリーミキサー（DPM, lqt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA）中で、８０℃において、１０００ｍｌの熱い脱イオン水にゆっくりと添加し、混合を４０ＲＰＭで１０分間行なった。混合物の温度を３７℃まで低下させ、商業的供給源から得られた１００ｇのラクトバチルス・ラムノサスＬＧＧの乾燥粉末をゆっくりと添加し、混合を２０分間続けた。その後、前記スラリーを液体窒素を含む槽に２ｍｍのオリフィス針を通して押し出した。その後紐／ビーズを液体窒素から回収し、密閉されたアルミホイルバッグに入れ、そして数週間、−８０℃においてディープフリーザー中で保存した。乾燥の間、凍結した紐／ビーズを、１００から最大５００ｇ／ｓｑ  ｆｔの範囲の積載能力において、トレイ上に均一に広げ、そしてトレイを凍結乾燥器（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中のふるいの上に置き、実施例１６に記載されるように乾燥させた。全ての製剤は、平静にトレイ内に保持され、そして飛び散り又は発泡は、すべての積載レベルにおいて観察されなかった。前記製剤は高い積載能力においてさえも完全に乾燥され、水分活性は、全てのサンプルについて、０．２６Ａｗ未満で測定された。
【０１２２】
実施例１８
プロバイオティック細菌であるビフィドバクテリウム種を含有するヒドロゲル製剤の調製
ビフィドバクテリウム種の濃縮されたプロバイオティックスラリーは、実施例１５に従って調製される。基本製剤に、０．５ｇの二塩基性リン酸カルシウム、続いて０．５ｇのグルコノラクトンを添加する。前記スラリーは、さらに２時間、室温において硬化させ、固体ヒドロゲルを形成する。硬化したゲルを、市販のスライサー／剪断機を用いて、薄く、長い糸にスライスした。薄い糸を液体窒素中で瞬間凍結し、そして７００ｇ／ｓｑ  ｆｔの積載能力を有するトレイ上に積載し、実施例１６に記載するように、乾燥のために凍結乾燥器においた。製剤の水分活性（Ａｗ）は、０．０５であった（HygroPalmAwl , Rotonic Huntington, NYにより測定される）。前記乾燥製剤は、標準的なハンマー型製粉装置を用いて、さらに細かく製粉し、そして５０〜２５０ミクロンスクリーンを通してふるいに掛けた。
【０１２３】
実施例１９
プロバイオティック細菌であるラクトバチルス・アシドフィラスを含有するアレルゲンフリー組成物
トレハロース（７５２ｇ、Cargill Minneapolis, MN）、広く加水分解されたエンドウマメタンパク質（１６７ｇ、Marcor, Carlstadt, NJ）、アルギン酸ナトリウム（３０ｇ、ISP Corp., Wayne, NJ）及びインスタントイヌリン（５０ｇ、Cargill Minneapolis, MN）を乾燥形態において均一に混合した。乾燥混合物を、ジャケット付きのデュアルプラネタリーミキサー（DPM, lqt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA）中で、８０℃において、１０００ｍｌの熱い脱イオン水に添加し、混合を４０ＲＰＭで１０分間行なった。混合物の温度を３７℃まで低下させ、商業的供給源から得られたラクトバチルス・アシドフィラスを含有する１０００ｇの凍結ビーズをゆっくりと添加し、混合を１０分間続けた。その後、前記スラリーを、液体窒素を含む槽に２ｍｍのオリフィス針を通して押し出した。その後紐／ビーズを液体窒素から回収し、密閉されたアルミホイルバッグに入れ、そして数週間、−８０℃においてディープフリーザー中で保存した。乾燥の間、凍結紐／ビーズを、１０００ｇ／ｓｑ  ｆｔの積載能力において、トレイ上に均一に広げ、そしてトレイを凍結乾燥器（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中のふるいの上に置き、実施例１６に記載されるように乾燥させた。乾燥組成物中のプロバイオティック細菌の初期のＣＦＵカウントは、１０．５３ｌｏｇ／ｇであり、４０℃且つ３３％ＲＨの加速保存条件下で４２日保存後の生存能力喪失は、０．６９ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇであった。
【０１２４】
実施例２０
本発明の乾燥製剤を含有する調製粉乳
ラクトバチルス・ラムノサスを含有する安定的な乾燥製剤は、実施例１６に従って調製され、２つの粒子径郡にふるい分けされた（５０μｍ超及び１５０μｍ未満）。調製粉乳は、９９．９ｇのニュートラミゲン（Nutramigen）（Mead Johnson; Evansville, IL）と０．１ｇの５０μｍ〜１５０μｍの範囲におけるサイズの乾燥製剤粒子と混合することにより調製された。最終製品は、１００ｇの調製粉乳あたり、約１０8ｃｆｕのラクトバチルス・ラムノサスを含む。
【０１２５】
実施例２１
本発明の安定的乾燥製剤を含有するプロバイオティック補助食品
ラクトバチルス・アシドフィラスを含有する安定的乾燥組成物は、経口投与形態、例えば錠剤、カプレット、又はカプセルに製剤化される。９９．９ｇの圧搾剤（デキストロース）及び０．１ｇの５０μｍ〜１５０μｍの範囲のサイズにおける乾燥製剤粒子を含有するオレンジ風味の錠剤を、１／２”円形の標準的な凹面工具（tooling）を用いた回転機において、直接圧搾することにより調製される。最終製品は、約１０8ｃｆｕ／単位用量を含む。錠剤の硬化は、８〜１０ｋｐの範囲内であり、崩壊時間は、約２０秒である。前記圧縮錠は、各１００錠剤の１８０ｃｃ  ＨＤＰＥボトルにパッケージされ、４０℃／３３％ＲＨの制御された温度／湿度に曝露される。前記製品は、１２ヶ月の期間にわたり、あるいは１ｘ１０6／単位用量を下回るアッセイカウントの減少観察されるまで、毎月、微生物学的安定性試験に供される。
【０１２６】
実施例２２
本発明の安定的乾燥製剤を含有する機能性飲料
７１％スクロース、１４％マルトデキストリン、１０％イヌリン、２％デキストロース、１％クエン酸無水物、０．３％アカシアガム、０．３％香料、０．３％リン酸三カルシウム及び０．１％乾燥プロバイオティック製剤粒子（Ｌ．アシドフィルス）を含む乾燥混合物を、５０μｍ〜２５０μｍのサイズ範囲において調製する。前記最終生成物は、約１０9ｃｆｕ／単位用量（３０ｇ乾燥混合物）を含む。前記生成物は、３４０ｍｌの水中に撹拌することにより、飲むための小さいアルミホイルバッグ（３０ｇ単位用量／バッグ）にパッケージされる。飲料乾燥混合物中のプロバイオティック細菌の安定性は、１２ヶ月の期間にわたり、あるいは１ｘ１０7／単位用量を下回るアッセイカウントの減少観察されるまで、毎月、微生物学的安定性試験に供される。
【０１２７】
実施例２３
プロバイオティックペットフードの調製
市販のペレット化されたイヌ用のペットフードは、対流式オーブンで、水分活性が０．１になるまで乾燥させ、そしてその後、実施例１７に記載するように調製された安定的なプロバイオティック乾燥製剤で被覆される。前記乾燥ペレットは、約５％の脂質に基づく水分バリア（４０％のトリ脂質、４０％のカカオバター及び２０％の蜜蝋の混合物）で噴霧され、乾燥粉末製剤（通常、１０8ＣＦＵ／ｇの用量を提供する０．１〜０．５％の合計ペットフード）とともにドラムタンブラー中で混合され、最後に脂質に基づく水分バリアのさらなる被覆で噴霧される。被覆の合計量は、約１５％（ペットフードの）である。被覆時間は、約３０分である。
【０１２８】
実施例２４
いくつかのプロバイオティック微生物を含む魚用飼料の調製
本発明の魚用ペレット状飼料は、いくつかのプロバイオティックの混合物で調製される。Ｌ．ラムノサス、Ｌ．アシドフィルス及びビフィドバクテリウム・ラクティスの混合物を含有する安定的な乾燥プロバイオティック製剤を実施例１５に記載されるように調製する。サケ用の市販のスターター飼料（Zeigler Bros., Gardners, PA）を、まず、対流式オーブン中で、水分活性が０．１になるまでを乾燥させ、その後ドラムタンブラー中で、プロバイオティック製剤で被覆する。前記ペレット（１０００ｇ）は、まず、約５％重量の脂質に基づく水分バリア（４０％魚油、４０％ココアバター及び２０％蜜蝋の混合物）で噴霧し、その後、１ｇの安定的な乾燥プロバイオティック製剤と（１ｇの飼料あたり１０7ｃｆｕの用量に到達するまで）混合し、最後に、脂質に基づく水分バリアの更なる被覆により噴霧する。被覆の合計量は、（魚用飼料の）約１０％である。
【０１２９】
実施例２５
酵素を含有する安定的乾燥粉末
４０重量％のサビナーゼ（Novozymes, Denmark）を含有するヒドロゲル製剤は、実施例１８に記載される６００ｇの製剤と、１０００ｇの水溶液中４００ｇのサビナーゼを混合することにより調製される。剪断されたヒドロゲル製剤は、液体窒素中で瞬間凍結され、５０℃の製剤乾燥温度において真空オーブン中で乾燥させる。乾燥された製剤の積載及び保存安定性の決定のために：乾燥サンプルをマイクロ遠心チューブ中で正確に計量する（＜１００ｍｇ）。２００μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加する。前記製剤をボルテックスによりＤＭＳＯバッファ中に溶解する。このサンプルに、０．０５Ｎ  ＮａＯＨ、０．５％ＳＤＳ及び０．０７５Ｍクエン酸（三ナトリウム塩）を含有する０．８ｍｌの溶液を添加する。チューブを１０分間、４５℃で超音波処理し、その後５，０００ｒｐｍで１０分間、短時間遠心分離をする。透明なＤＭＳＯ／ＮａＯＨ／ＳＤＳ／クエン酸溶液の一部をマイクロプレートのウェルに採取し、ブラッドフォードアッセイ法を用いてタンパク質含量について分析した。安定的な酵素製剤の保存安定性は、本発明の製剤を含まない乾燥酵素よりも著しく高い。
【０１３０】
実施例２６
ビタミンＡを含有する安定的乾燥粉末
３０重量％のビタミンＡを含有する製剤は、１０００ｇの水中、３２０ｇのインスタントイヌリン、３２０ｇのマルトデキストリンＤＥ−１（Tate&Lyle, London, UK）、５０ｇカルボキシメチルセルロースナトリウム（Ashland Aqualon Functional Ingredients, Wilmington, DE）、１０ｇのアスコルビン酸ナトリウム及び３００ｇのビタミンＡ結晶（BASF Corp., Florham Park, NJ）を混合することにより調製される。湿った製剤は、それぞれ１８０℃及び８０℃のインレット及びアウトレット温度において、Ｍｏｂｉｌｅ−Ｍｉｎｏｒ噴霧乾燥器（GEA Process Engineering Inc., Columbia MD）において、噴霧乾燥され、あるいは液体窒素中で瞬間凍結され、その後、１０００ｇ／ｓｑ  ｆｔの積載能力においてトレイに広げ、実施例１６に記載するように乾燥させる。前記ビタミンＡ組成物は、４０℃且つ７５％ＲＨにおいて、３ヶ月間安定的である（＞８０％）。
【０１３１】
実施例２７
増大した生物学的利用性を有する保護製剤中のカロテンの調製
保存の間、又は生物に給餌後、飼料中の他の成分により酸化をうけるカロテンの生物学的利用性を保護及び増大させる製剤は、本発明の製剤及び方法に従って、調製される。６ｇの水溶性キトサン（LSK BioPartners, Inc. Salt Lake City, Utah）を含有する製剤は、２００ｇの水に溶解される。この溶液に、９０ｇの天然のアスタキサンチン（Naturose（商標）, Cyanotech Corp., Kailua-Kona, HI）を添加し、前記スラリーは噴霧され、あるいは５％ナトリウムトリポリリン酸を含む槽に押し出される。前記ヒドロゲル化マイクロ粒子又は紐を、４時間にわたり室温で硬化させる。前記粒子を架橋槽から回収し、水で洗浄し、そして９０ｇスクロースと１０ｇの広く加水分解されたカゼインの乾燥ブレンドと混合する。糖／タンパク質積載粒子を、瞬間凍結し、即座に５００ｇ／ｓｑ  ｆｔにおけるトレイに置き、そして水分活性が０．３未満に減少するまで、凍結乾燥器で凍結乾燥される。前記乾燥製剤は、さらに所望のサイズ分布まで製粉され、パッケージされる。
【０１３２】
実施例２８
侵襲性種餌の調製
特別に標的化された侵襲性種のためのペレット化餌は、本発明に従って、調製される。実施例１に記載するような殺虫剤を含有する２００ｇの製剤が調製され、２００ｇｍの水に添加される。この溶液に、９０ｇｍのロテノン及び０．５ｇｍの二塩基性リン酸カルシウム、その後０．５ｇｍのグルコノラクトンを添加する。前記スラリーを、さらに２時間、室温において硬化させる。硬化したゲルを、市販のスライサー／剪断機を用いて、薄く、長い糸にスライスする。薄い糸をトレイに積載し、そして凍結乾燥器中に置かれる。棚の温度を−３０℃に設定し、前記製剤を完全な真空が適用される前に凍結させ、棚の温度を、一晩の乾燥にわたり＋６０℃まで上昇させる。前記乾燥製剤は、標的化された特別な種のために、餌サイズ仕様に適切なサイズ分布まで製粉される。
【０１３３】
実施例２９
水不溶性製剤中の保護された殺虫剤の調製
保存の間又は環境に適用後、製剤中の他の成分により分解される、殺虫剤の保護された顆粒製剤は、本発明の製剤及び方法により調製される。６ｇのペクチン及び１０２ｇスクロースを含有する製剤は、２００ｇの水に添加される。この溶液に、９０ｇの傷つきやすい殺虫剤の乾燥製剤、及び１．５ｇの二塩基性リン酸カルシウムと０．５ｇの塩化カルシウムとを含有する混合物、続いて０．８５ｇのグルコノラクトンを添加する。前記スラリーを、室温において４時間にわたり、硬化させ、その後スライサー／剪断機を用いて、薄く、長い糸（thread）にスライスした。薄い糸をトレイ上に積載し、そして０．１の水分活性に到達するまで凍結乾燥器中で乾燥させる。前記乾燥製剤を、所望のサイズ分布になるまでさらに製粉し、パッケージングする。
【０１３４】
実施例３０
保護された植物性プロバイオティック製剤の調製
生物学的防除剤、例えばリゾバクテリアは、実施例１８に従って、乾燥組成物中で調製される。乾燥リゾバクテリア組成物の有効性は、ノトバイオート条件下におけるレタス成長に関して評価される。１植物あたり、１００ｍｇのリゾバクテリア乾燥組成物の用量を、砂とともにジャーに植菌し、催芽した（２４時間）レタス実生を植える。５ｍｌの滅菌したホーグランド溶液の栄養用量をジャー中の植物に適用する。ジャーを、１２時間の光周期で、２８℃に維持された成長チャンバー中にランダムに配列する。植え付け後、７日毎に、植物及び接着する砂を注意深くジャーから回収する。滅菌したリン酸バッファ（ｐＨ７．０）中で根を洗浄し、根の長さの測定値を記録する。
【０１３５】
実施例３１
プロバイオティック細菌であるラクトバチルス・アシドフィラス（ＤＳＭ−２０３５６）を含有する安定的乾燥組成物の生産
凍結した細菌濃縮物（局所的な（local）発酵プロセスから得られた１０ｇ）を水槽中で３７℃において融解し、固体含量を１０固体湿重量％に蒸留水で調整した。約５ｇの加水分解されたエンドウマメタンパク質（限外濾過した加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）を５０ｇの暖めた水に完全に溶解し、融解した細菌培養物に添加する。約２．５ｇのトレハロース（Cargill Minneapolis, MN）、約５ｇのインスタントイヌリン、約５ｇマルトデキストリンＤＥ−ｌ（Cargill Minneapolis, MN）及び約１．５ｇのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）を乾燥形態において均一に混合した。前記粉末混合物を細菌培養物にゆっくりと添加し、混合を２０分間３７℃で小さいスパチュラを用いて行なった。前記スラリーを、液体窒素を含む槽中に滴下した。前記ビーズを液体窒素から回収し、密閉されたアルミホイルバッグに入れ、乾燥まで、−８０℃においてディープフリーザー中で保存した。
【０１３６】
乾燥の間、凍結ビーズを、５００から最大１５００ｇ／ｓｑ  ｆｔの範囲の積載能力において、トレイ上に均一に広げ、そしてトレイを凍結乾燥器（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中のふるいの上に置いた。一次液体乾燥工程は、２０００〜２７００ｍＴＯＲＲの真空圧力に調節することにより開始し、製品温度を上昇させ、−１０〜５℃において安定化した。時間とともに（約１０〜１６時間）、前記製品温度は、約２０〜２５℃に上昇し、その時点において、二次乾燥工程は最大真空（１５０〜２００ｍＴＯＲＲ）で開始され、製品温度は、３０〜４０℃でさらに１４時間維持される。前記製剤は、完全に乾燥され、その測定された水分活性は、０．３Ａｗ未満であった。前記製剤を、市販のハンマー型製粉装置を用いて製粉し、粒子を１００ミクロン未満にふるい分けた。
【０１３７】
細菌の一般的な凍結乾燥粉末とともに、安定的なプロバイオティック細菌の生存能力を、希釈及びＬＭＲＳアガープレート上へのプレーティングの標準的な手順に基づいて、毎週観察した。図１６は４０゜ＲＨにおいて１４日後、本発明の組成物中で製剤化されたプロバイオティック細菌の安定性は、一般的な凍結乾燥細菌の安定性よりも２ｌｏｇ高かったことを示す。これらの結果は、プロバイオティック細菌の安定性は、本発明の組成物及び方法を用いた場合、多湿且つ非冷蔵保存条件下において、劇的に改善されることを実証する。
【０１３８】
実施例３２
プロバイオティック細菌であるラクトバチルス・アシドフィラス（ＤＳＭ−２０３５６）を含有する安定的乾燥溶融脂質造粒組成物の生産
１０ｇの乾燥粉末組成物を実施例３１に従って生産した。前記乾燥粉末を４０℃の水槽中でビーカーに入れ、８部のココアバターと２部のステアリン酸（27-Stearine, Loders Croklaan, Channahon, IL）を含有する１０ｇの溶融脂質混合物を、温かい粉末に撹拌下でゆっくりと添加した。前記混合物を１０℃まで冷却し、凝集粉末のサイズが可視的に均一になるまで、混合を続けた。
【０１３９】
実施例３３
プロバイオティック細菌であるラクトバチルス・ラムノサス種を含有する乾燥組成物の４０℃且つ４３％ＲＨ、又は３０℃且つ６０％ＲＨにおける保存安定性
プロバイオティック細菌であるラクトバチルス・ラムノサス種（局所的な発酵源から得られる）を含有する１０ｇの乾燥粉末組成物を実施例３１に記載されるように生産した。前記乾燥安定組成物をデシケーター中に置き、４０℃且つ４３％ＲＨ又は３０℃且つ６０％ＲＨに曝露した。細菌の一般的な凍結乾燥粉末とともに、安定的なプロバイオティックの生存能力を、希釈及びＬＭＲＳアガープレート上へのプレーティングの標準的な手順に基づいて、毎週観察した。図１７は４０℃且つ４３％ＲＨにおいて１４日後、本発明の組成物中で製剤化されたプロバイオティック細菌の安定性は、一般的な凍結乾燥細菌の安定性よりも３ｌｏｇ高かったことを示す。３０℃且つ６０％ＲＨにおいて７日後、本発明の組成物中で製剤化されたプロバイオティック細菌の安定性は、一般的な凍結乾燥細菌の安定性よりも３ｌｏｇ高かった。これらの結果は、プロバイオティック細菌の安定性は、本発明の組成物及び方法を用いた場合、多湿且つ非冷蔵保存条件下において、劇的に改善されることを実証する。
【０１４０】
実施例３４
病原性微生物に対するプロバイオティック細菌を含有する安定的乾燥組成物を含有する動物飼料の生産
去勢牛（steers）又はニワトリ用の約１０ｋｇの市販の動物飼料を、実施例３１又は３２に記載されるような１部の製粉された生体材料と２部の植物油、例えばコーン油とを含有する３％の油混合物で、ドラムタンブラー中でトップコートした。プロバイオティック細菌のＣＦＵカウントは、１ｇの飼料あたり、１Ｅ９である。被覆された飼料は、４０℃において４３％相対湿度チャンバーに置かれ、これらの過酷な条件において、１４日間保存後；プロバイオティック細菌の生存能力喪失は、初期のＣＦＵよりも１ｌｏｇ低い。別の被覆された飼料は、３０℃において３３％相対湿度チャンバーに置かれ、これらの条件に６ヶ月後；プロバイオティック細菌の生存能力喪失は、初期のＣＦＵよりも１ｌｏｇ低い。これらの例は、伴侶動物（companion animals）を含む様々な動物を処置するために用いられる微生物、例えばラクトバチルス属種が、本発明の組成物及び乾燥方法において保護され、そして棚での長期保存のために、又は未被覆の飼料が保存される典型的な湿度及び温度条件下で給餌ホッパーにおいて少なくとも２週間の保存のために被覆され得ることを実証する。
【０１４１】
実施例３５
単細胞真菌であるＳ．セレビシエを含有する安定的な乾燥組成物の生産
新鮮なパン用酵母ペースト（地域の（local）流通業者から得られる１００ｇ）を、１０℃において水槽中に置く。約５０ｇの加水分解されたエンドウマメタンパク質（限外濾過した加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）を５００ｇの温かい水に完全に溶解する。前記溶液を、１０℃に冷却し、撹拌下で前記酵母ペーストに添加する。約２５ｇのスクロース（地域の食料品店から得られる）、約５０ｇのインスタントイヌリン、約５０ｇマルトデキストリンＤＥ−ｌ（Cargill Minneapolis, MN）、約１２ｇのアスコルビン酸ナトリウム（Sigma）及び約１５ｇのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）を乾燥形態において均一に混合する。前記粉末混合物を酵母培養物にゆっくりと添加し、混合を１０℃で２０分間、４０ＲＰＭで行なう。前記スラリーを、多孔底を有するベッセルに移し、液体窒素を含む槽に滴下した。前記ビーズを液体窒素から除去し、密閉されたアルミホイルバッグに入れ、数週間、−８０℃においてディープフリーザー中で保存した。乾燥及び製粉を実施例３１に記載するように行なう。
【０１４２】
実施例３６
単細胞真菌であるＳ．セレビシエを含有する安定的乾燥組成物の噴霧乾燥
酵母スラリーを実施例３４に記載するように調製する。前記スラリーを冷たい（１０℃）蒸留水でさらに希釈し、約１０００〜２０００ｃＰの粘性を得る。希釈されたスラリーは、１８０℃／６０℃に設定されたインレット／アウトレット温度を用いて、噴霧乾燥される（Mobile Minor spray drier, GEA Niro Inc., Columbia, MD）。
【０１４３】
実施例３７
単細胞真菌を含有する安定的乾燥組成物を用いたトウモロコシの種子の被覆
約１０ｋｇの市販のトウモロコシの種子を、実施例３４又は実施例３５に記載されるような１部の製粉された生体材料と、２部の植物油、例えばヤシ又はココナッツ油とを含有する３％溶融油混合物で、４０℃においてドラムタンブラー中でトップコートする。酵母ＣＦＵカウントは、１ｇの種子あたり、１Ｅ８である。前記被覆種子は、３０℃において６０％相対湿度チャンバーに置かれ、これらの条件で３ヶ月保存後；酵母の生存能力喪失は、初期のＣＦＵよりも１ｌｏｇ低い。この例は、農業用種菌、例えばペニシリウム属種の様々な株として用いられる微生物が、本発明の組成物及び乾燥方法において保護され、そして未被覆の種子が保存される典型的な湿度及び温度条件下で、長期間、穀物を被覆し得ることを実証する。
【０１４４】
実施例３８
プロバイオティック細菌であるビフィドバクテリウム属種を含有するヒドロゲル組成物の調製
ビフィドバクテリウム属種の濃縮したプロバイオティックスラリーを実施例３１に従って調製する。前記粉末混合物に５ｇの二塩基性リン酸カルシウムを添加する。前記粉末混合物を、撹拌下で前記プロバイオティックに添加し、続いて５ｇのグルコノラクトンを添加する。前記スラリーを、次の２時間、室温において硬化させ、固体ヒドロゲルを形成する。硬化したゲルを、市販のスライサー／剪断機を用いて、薄く、長い糸（thread）にスライスした。薄い糸を湿った形態においてトレイに直接積載し、あるいは液体窒素中で瞬間凍結し、そして５００ｇ／ｓｑ  ｆｔの積載能力を有するトレイ上に積載し、実施例３１に記載するように、乾燥のために凍結乾燥器においた。前記乾燥製剤を、標準的なハンマー型製粉装置を用いて、さらに細かい粉末に製粉し、そして５０ミクロンスクリーンを通してふるいに掛けた。
【０１４５】
実施例３９
プロバイオティック細菌を含有する安定的な発酵乳の生産
１００ｇの低温殺菌されたプレーンの発酵乳（Dannon、地域の食料品店から得られる）を、実施例３７に記載されるような安定的なプロバイオティックを含有する０．５ｇの架橋された粉末とともに添加する。発酵乳中の初期のＣＦＵカウントは、１ｇ発酵乳あたり１Ｅ９である。発酵乳は、６週間、４℃で冷蔵庫において保存される。冷蔵された発酵乳中のプロバイオティック細菌の生存能力喪失は、初期のＣＦＵよりも１ｌｏｇ低い。この例は、前記プロバイオティック細菌、例えばラクトバチルス属及びビフィドバクテリウム属の様々な株が、本発明の組成物及び乾燥方法において保護され得ることを実証する。従って、前記組成物中のプロバイオティック細菌は、完全に水和され、そして保護されなかったプロバイオティック細菌が生存しない典型的な条件下において、延長された期間、乳製品中において活性を維持することができる。
【０１４６】
実施例４０
酵素を含有する安定的乾燥組成物
４０重量％のフィターゼ（Marcor, Carlstadt, NJ）を含有するヒドロゲル製剤は、実施例３４に記載されるような２５０ｇの粉末混合物と約５０ｇ加水分解されたエンドウマメタンパク質を含有する５００ｍｌの水溶液中２００ｇのフィターゼを混合することにより調製される。剪断されたヒドロゲル製剤を、液体窒素中で瞬間凍結させ、５０℃の一次及び二次乾燥温度において、真空オーブン中で乾燥させる。乾燥された製剤の積載及び保存安定性の決定のために、乾燥サンプルを、マイクロ遠心チューブ中で正確に計量する（＜１００ｍｇ）。２００μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加する。前記製剤を、ボルテックスすることによりＤＭＳＯバッファ中に溶解する。このサンプルに、０．０５Ｎ  ＮａＯＨ、０．５％ＳＤＳ及び０．０７５Ｍクエン酸（三ナトリウム塩）を含有する０．８ｍｌの溶液を添加する。前記チューブは、４５℃で１０分間超音波処理され、その後、１０分間、５，０００ｒｐｍにおいて短い遠心分離をする。透明なＤＭＳＯ／ＮａＯＨ／ＳＤＳ／クエン酸溶液の一部をマイクロプレートのウェルに採取し、ブラッドフォードアッセイ法を用いてタンパク質含量について分析する。９５℃で２０分間曝露後、安定的な酵素乾燥組成物の安定性は、本発明の組成物を含まない乾燥酵素よりも著しく高い。
【０１４７】
実施例４１
植物性生物学的防除剤を含有する安定的乾燥組成物
生物学的防除剤、例えばリゾバクテリアは、実施例３４に従って、乾燥組成物中で調製される。乾燥リゾバクテリア組成物の有効性は、ノトバイオート条件下におけるレタス成長に関して評価される。１植物あたり、１００ｍｇのリゾバクテリア乾燥組成物の用量を、砂とともにジャーに植菌し、催芽した（２４時間）レタス実生を植えた。５ｍｌの滅菌したホーグランド溶液の栄養用量をジャー中の植物に適用する。ジャーを、１２時間の光周期で、２８℃に維持された成長チャンバー中にランダムに配列する。植え付け後、７日毎に、植物及び接着する砂を注意深くジャーから回収する。滅菌したリン酸バッファ（ｐＨ７．０）中で根を洗浄し、根の長さの測定値を記録する。リゾバクテリア組成物で処理されたレタス実生は、未処理の実生よりも促進された成長を示す。
【０１４８】
実施例４２
プロバイオティック細菌であるラクトバチルス・ラムノサス種の安定的乾燥組成物を含有する錠剤の生産
凍結した細菌濃縮物（局所的な発酵プロセスから得られた１０ｇ）を水槽中で３７℃において融解し、固体含量を１０％固体湿重量に蒸留水で調整した。約５ｇの加水分解されたエンドウマメタンパク質（限外濾過した加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）を５０ｇの暖めた水に完全に溶解し、融解した細菌培養物に添加する。約５ｇのトレハロース（Cargill Minneapolis, MN）及び約２．５ｇのアスコルビン酸ナトリウムを乾燥形態において均一に混合した。任意で、約５ｇのインスタントイヌリン、約５ｇマルトデキストリンＤＥ−１（Cargill Minneapolis, MN）及び約１．５ｇのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）を添加し、粘性のスラリーを約５０，０００ｃＰの所望の粘度において形成し、乾燥材料のガラス構造をさらに増大させた。前記粉末混合物を細菌培養物にゆっくりと添加し、混合を２０分間３７℃で行なった。前記粘性細菌懸濁液を、液体窒素槽中にゆっくりと滴下した。前記凍結ビーズを液体窒素から回収し、密閉されたアルミホイルバッグに入れ、乾燥まで、−８０℃においてディープフリーザー中で保存した。
【０１４９】
乾燥の間、凍結ビーズを、５００から最大１５００ｇ／ｓｑ  ｆｔの範囲の積載能力において、トレイ上に均一に広げ、そしてトレイを凍結乾燥器（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中のふるいの上に置いた。一次水分除去工程は、２０００〜２７００ｍＴＯＲＲの真空圧力に調節することにより開始され、製品温度を上昇させ、−１０〜５℃において安定化した。時間とともに（約１０〜１６時間）、前記製品温度は、約２０〜２５℃に上昇し、その時点において、二次乾燥工程は最大真空（５０〜２００ｍＴＯＲＲ）で開始され、製品温度は、３０〜４５℃でさらに１４時間維持される。前記製剤は、完全に乾燥され、その測定された水分活性は、０．３Ａｗ未満であった。前記製剤を、コーヒー粉砕機を用いて製粉し、粒子を２５０ミクロン未満にふるい分けた。
【０１５０】
錠剤形成のために、乾燥した安定的なプロバイオティック組成物（１００ｍｇ）を２％ｗ／ｗステアリン酸マグネシウム及び２％ｗ／ｗ親水性ヒュームドシリカ（ＡＥＲＯＳＩＬ（登録商標）２００、Evonik Industries）を含有する４００ｍｇのマルトデキストリンＤＥ−１と混合し、ハンドヘルド打錠装置において（１／２”錠剤直径ハウジングを用いて）圧搾した。前記プロバイオティック細菌の一般的な凍結粉末（フリーのプロバイオティック）を含有する同様の錠剤もまた、調製し、保護されたプロバイオティック細菌を含有する錠剤との比較のために用いた。
【０１５１】
安定的なプロバイオティック細菌、並びにフリーのプロバイオティックの錠剤形成前後、及び４０℃且つ４３％ＲＨにおける保存の間の生存能力を、希釈及びＬＭＲＳアガープレート上へのプレーティングの標準的な手順に基づいて、毎週観察した。図１８は、フリーのプロバイオティック細菌が、錠剤化プロセスにおいて、１ｇの生存能力を喪失した一方で、保護された細菌の生存能力は、錠剤化プロセス後、実質的に同様に維持されたことを示す。４０℃且つ４３％ＲＨにおいて１４日後、本発明の組成物中で製剤化されたプロバイオティック細菌の生存能力は、約０．３ｌｏｇわずかに減少した一方で、一般的な凍結乾燥細菌の生存能力はさらに約０．６ｌｏｇまで減少した。これらの結果は、本発明の組成物及び方法が、プロバイオティック細菌の錠剤形成の間の圧搾圧力及び関連する加熱に対して、及び多湿且つ非冷蔵保存条件下における保存において、著しい保護を提供することを実証する。
【０１５２】
実施例４３
プロバイオティック細菌であるラクトバチルス・ラムノサス種の安定的乾燥組成物を含有するマルチビタミン／プロバイオティック錠剤の調製
本明細書に開示されるような組成物及び方法の保護を、その後マルチビタミン成分を含有する錠剤においてさらに調査した。１０ｇの乾燥粉末組成物を、実施例４２に記載されるように生産した。錠剤形成のために、乾燥した安定的なプロバイオティック組成物（１００ｍｇ）を２％ｗ／ｗステアリン酸マグネシウム及び２％ｗ／ｗ親水性ヒュームドシリカ（ＡＥＲＯＳＩＬ（登録商標）２００、Evonik Industries）を含有する４００ｍｇのマルチビタミン粉末（Ｃｅｎｔｒｕｍ（登録商標）、Pfizer）と混合し、ハンドヘルド打錠装置において（１／２”錠剤直径ハウジングを用いて）圧搾した。前記プロバイオティック細菌の一般的な凍結乾燥粉末（フリーのプロバイオティック）を含有する同様の錠剤はまた、調製され、保護されたプロバイオティック細菌を含有する錠剤との比較のために用いた。得られた錠剤を、その後、合計プロバイオティックカウントのために試験した。結果を図１９に示す。
【０１５３】
図１９に示すように、フリーのプロバイオティック細菌は、マルチビタミン成分プロセスを含む錠剤において生存能力を２ｌｏｇ超喪失した一方で、保護された細菌の生存能力は、１ｌｏｇ未満減少した。４０℃且つ４３％ＲＨにおいて１４日後、本発明の組成物中で製剤化されたプロバイオティック細菌の生存能力は、実質的に同様を維持した一方で、一般的な凍結乾燥細菌の生存能力はさらに３ｌｏｇ減少した。これらの結果は、本発明の組成物及び方法が、錠剤混合物における有害な化合物からの傷つきやすい生体材料の著しい保護を提供し、これにより、これらの全体的な効能に影響を与えることなく、様々な生体材料を１つの錠剤に混合することを可能にする。
【０１５４】
実施例４４
保護された酵素を含有する安定的乾燥組成物の錠剤形成
プロテアーゼ又はリパーゼ（双方ともにSigma社製）を含有する乾燥した安定的な組成物を、実施例４２に記載のように調製した。最終乾燥組成物は、１０％のプロテアーゼ又はリパーゼ、４０％のトレハロース、２０％の広く加水分解されたエンドウマメタンパク質、１０％のアスコルビン酸ナトリウムを含有した。加えて、６％のアルギン酸ナトリウム及び１４％のイヌリンも組成物中に含んだ。
【０１５５】
錠剤形成のために、乾燥した酵素組成物（各５０ｍｇ）を２％ｗ／ｗステアリン酸マグネシウム及び２％ｗ／ｗ親水性ヒュームドシリカを含有する４５０ｍｇのマルトデキストリンＤＥ−１と混合し、ハンドヘルド打錠装置において（１／２”錠剤直径ハウジングを用いて）圧搾した。当量の両方の保護された酵素を含有する錠剤を、２５ｍｇのプロテアーゼと２５ｍｇのリパーゼを４５０ｍｇのマルトデキストリンＤＥ１と混合物を混合することにより調製した。フリーの形態における酵素の乾燥粉末を含有する同様の錠剤（フリーの酵素又は両者の混合物）を調製し、保護された酵素を含有する錠剤との比較のために用いた。
【０１５６】
錠剤形成前の粉末混合物におけるこれらの活性と比較した錠剤形成後のプロテアーゼ及びリパーゼの残存する活性を、基質としてそれぞれ、アゾカゼイン及びｐＮＰ−パルミテートを用いて、当該技術分野において知られている方法に従って、決定した。
【０１５７】
図２０に示すように、フリーのプロテアーゼ単独、又はフリーのリパーゼと組み合わされたフリーのプロテアーゼのいずれかを錠剤形成は、約４０％の活性を喪失した一方で、保護されたプロテアーゼは、単独で錠剤化された場合、活性を何ら喪失せず、保護されたリパーゼとの混合において錠剤化された場合、約１７％のみ喪失した。フリーの又は保護されたリパーゼの錠剤形成は、活性の何ら著しい喪失をもたらさなかった。しかしながら、フリーのプロテアーゼの存在下におけるフリーのリパーゼの錠剤形成は、６４％の活性の喪失をもたらした一方で、保護されたプロテアーゼの存在下における保護されたリパーゼの錠剤形成は、３３％のみの活性の喪失をもたらした。これらの結果は、本発明の組成物及び方法が、酵素の錠剤形成の間の圧搾圧力及び関連する加熱に対して著しい保護を提供したことを実証する。結果はまた、本発明の組成物及び方法が、錠剤混合物において、他の消化酵素からの保護を提供し、これにより、これらの全体的な活性に影響を与えることなく、様々な所望の酵素を１つの錠剤中に混合することを可能にすることを示す。
【０１５８】
実施例４５
病原性微生物に対するプロバイオティック細菌を含有する安定的乾燥組成物を含有する動物飼料の錠剤形成
本明細書に開示するような組成物及び方法の保護は、動物飼料成分を含有する錠剤において、さらに調査される。プロバイオティック細菌であるＬ．アシドフィルス種を含有する約１００ｇの乾燥した安定的な組成物は、実施例４２に記載されるように調製及び乾燥される。最終乾燥組成物は、１０％の乾燥細菌細胞バイオマス、５４％のトレハロース、２０％広く加水分解されたエンドウマメタンパク質、１０％アスコルビン酸ナトリウムを含有する。さらに、６％アルギン酸ナトリウムが前記組成物中に含まれる。
【０１５９】
約１０ｋｇの市販のドッグフード又はニワトリ用の完成された（finished）飼料ペレットは、４０℃において一晩空気乾燥され、その後流動性粉末に細かく製粉される。安定的な乾燥プロバイオティック組成物は、飼料粉末と混合され、ハンドヘルド打錠装置において（１／８〜７／８”丸薬直径ハウジングを用いて）圧搾され、１ｇの飼料あたり約１００億個の生細胞を含有する約２００〜２０００ｍｇサイズ丸薬を形成する。ニワトリ処理のために、前記プロバイオティック飼料丸薬を、撹拌しながら、１００ｋｇの標準的な市販の飼料にゆっくりと注ぐ。処理され、完成された飼料は、鶏に容易に給餌され、病原体、例えばサルモネラ属に対する耐性がブーストされる。安定性試験のために、プロバイオティック丸薬を、４０℃において４３％相対湿度チャンバーに置き、これらの過酷な条件において１４日間保存後、プロバイオティック細菌の生存能力の喪失は、初期のＣＦＵの１ｌｏｇ未満であった。この例は、伴侶動物（companion animals）を含む様々な動物の処置のために用いられる微生物、例えば様々なラクトバチルス属種が、本発明の組成物及び乾燥方法において保護され、その後打錠機において圧搾され、典型的な湿度及び温度条件下の典型的な給餌ホッパーにおいて標準的な給餌を提供することができることを実証する。
【０１６０】
実施例４６
プロバイオティック細菌の安定的乾燥組成物を含有する発泡性（fizzy effervescent）飲料の調製
プロバイオティック細菌であるＬ．アシドフィルス種又はビフィドバクテリウム属種を含有する約１０ｇ粉末の乾燥した安定的な組成物は、実施例４２及び４５に記載されるように調製及び乾燥される。
【０１６１】
発泡性錠剤、例えばＡｌｋａ  Ｓｅｌｔｚｅｒ（登録商標）、Ｆｉｚｚｉｅｓ（登録商標）又はスポーツドリンクは、流動性粉末に細かく製粉される。安定的な乾燥プロバイオティック組成物は、発泡性粉末と混合され、ハンドヘルド打錠装置において（７／８”錠剤直径ハウジングを用いて）圧搾され、錠剤あたり、約１００億個の生細胞を含有する約２０００ｍｇサイズの錠剤を形成する。安定性試験のために、プロバイオティック発泡性錠剤を、３３℃において４３％相対湿度チャンバーに置き、これらの過酷な条件において９０日間保存後、プロバイオティック細菌の生存能力の喪失は、初期のＣＦＵの１lｏｇ未満であった。この例は、傷つきやすい生体材料、例えば生きているプロバイオティック細菌が、本発明の組成物及び乾燥方法において保護及び安定化され、その後打錠機において圧搾され、過酷な消費条件の湿度及び温度において保存することができることを実証する。
【０１６２】
実施例４７
膣感染症、例えば酵母又は細菌性膣疾患を治療するためのプロバイオティック細菌の安定的乾燥組成物を含有する錠剤の調製
プロバイオティック細菌であるＬ．アシドフィルス種を含有する約１５ｇ粉末の乾燥した安定的な組成物を実施例１及び４に記載されるように調製及び乾燥させる。
【０１６３】
前記乾燥プロバイオティック組成物を７４ｇのラクトース、１０ｇのトウモロコシデンプン、０．５ｇのステアリン酸マグネシウム、０．０１ｇのナトリウムカルボキシメチルセルロース、０．０１ｇのポリビニルピロリドン及び０．０１ｇの疎水性ヒュームド・シリカと混ぜ、１５分間混合する。粉末にされた混合物は、ハンドヘルド打錠装置において圧搾される。得られる錠剤の重量は、約１．５ｇである。最大錠剤硬度は、６〜８ｋｇである。前記錠剤は、水中で約３０秒で崩壊した。
【０１６４】
実施例４８
プロバイオティック細菌であるラクトバチルス・アシドフィラス（DSM-20356）の安定的乾燥組成物を含有する油懸濁液の生産
凍結したＬ．アシドフィルス濃縮物（局所的な発酵プロセスから得られた２００ｇ）を水槽中で３７℃において融解し、２００ｇの３％加水分解されたエンドウマメタンパク質（限外濾過した加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）溶液とともに添加した。前記細菌懸濁液を１５分間４０００ｇにおいて遠心分離し（Sorvall RC-5B, Du-Pont Company, Wilmington, DE）、上清を移した。前記細菌沈殿物を、３％加水分解されたエンドウマメタンパク質溶液でもとの重量（２００ｇ）までもどした。さらに５０ｇの加水分解されたエンドウマメタンパク質を２０％ＮａＯＨ溶液でｐＨ９に調整した８０ｇの温かい水に完全に溶解し、細菌培養物に添加した。８５．６ｇのスクロース（地域の市場から得られる）、３０ｇのシクロデキストリン−７（Cargill Minneapolis, MN）、２０ｇアスコルビン酸ナトリウム（Sigma）及び１５ｇのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）を乾燥形態において均一に混合した。前記粉末混合物を細菌培養物にゆっくりと添加し、混合を３７℃で２０分間、１ｑｔプラネタリーミキサー（Charles Ross & Son Company, Hauppauge, New York）において行なった。前記スラリーを、液体窒素を含む槽中にゆっくりと滴下した。前記凍結したビーズを液体窒素から回収し、密閉されたアルミホイルバッグに入れ、乾燥まで−８０℃においてディープフリーザー中で保存した。
【０１６５】
乾燥の間、凍結ビーズを、５００から最大１５００ｇ／ｓｑ  ｆｔの範囲の積載能力において、トレイ上に均一に広げ、そしてトレイを凍結乾燥器（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中のふるいの上に置いた。一次乾燥工程を、２０００〜２７００ｍＴＯＲＲの真空圧力に調節することにより開始し、製品温度を上昇させ、−１２℃〜−５℃において安定化した。時間とともに（約１０〜１６時間）、前記製品温度は、約２０〜２５℃に上昇し、その時点において、二次乾燥工程は最大真空（１００〜１５０ｍＴＯＲＲ）で開始され、製品温度は、３０〜４０℃でさらに１４時間維持される。前記製剤は、完全に乾燥され、その測定された水分活性は、０．３Ａｗ未満であった。前記製剤を、市販のハンマー型製粉装置を用いて製粉し、粒子を２５０ミクロン未満にふるい分けた。
【０１６６】
プロバイオティック細菌の安定的な組成物の生存能力を、乾燥粉末形態において、又はコーン油懸濁液（１００ｇの油中に混合された１ｇの乾燥粉末）中で、又は４５ｇのニワトリ用飼料ペレット上に１０ｇ油懸濁液を被覆後、４０℃且つ４３％ＲＨにおいて、１４日間試験した（飼料ペレットを、２週間３３％ＲＨ湿度チャンバーにおいて最初に馴化した）。４０℃且つ４３％ＲＨにおいて１４日間インキュベート後、プロバイオティック細菌は、乾燥形態において維持した場合０．５ｌｏｇのＣＦＵ／ｇのみ、油懸濁液中に混合された場合０．３４ｌｏｇ、ニワトリ用飼料上に被覆された場合０．６５ｌｏｇの喪失であった。これらの結果は、プロバイオティック細菌の生存能力は、本発明の組成物及び方法を用いた場合、多湿且つ非冷蔵保存条件下において１４日曝露後においても、様々な飼料適用において、保護されることを実証する。
【０１６７】
実施例４９
ビブリオ・アングイラルム（Vibrio anguillarum）に対する生きているファージを含有する安定的乾燥組成物の生産
濃縮された生きているファージ培養物（製造者から得られた１００ｇ）を１０℃において、ジャケット付きのデュアルプラネタリーミキサーに入れる。約５０ｇの加水分解されたエンドウマメタンパク質（限外濾過した加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）を３００ｇの温かい水に完全に溶解する。前記溶液を１０℃に冷却し、撹拌下でファージ培養物に添加する。１７４ｇのスクロース（地域の市場から得られる）、６０ｇのシクロデキストリン−７（Cargill Minneapolis, MN）、４０ｇアスコルビン酸ナトリウム（Sigma）及び３０ｇのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）を乾燥形態において、均一に混合する。前記粉末混合物をファージ培養物にゆっくりと添加し、混合を２０分間１０℃で１ｑｔプラネタリーミキサーにおいて行なう。前記スラリーを、その後、液体窒素を含む槽中にゆっくりと滴下する。その後前記凍結ビーズを液体窒素から回収し、密閉されたアルミホイルバッグに入れ、乾燥まで−８０℃においてディープフリーザー中で保存する。乾燥及び製粉を実施例４８に記載するように行なう。１０ｇの乾燥組成物粉末を１００ｇの魚油と混合し、前記懸濁液を１０ｋｇのタイセイヨウサケ飼料ペレットに被覆する。被覆された飼料は、その後典型的な倉庫保存条件下で保存される。魚飼料中のファージの生存能力は、本発明の組成物及び方法を用いた場合、多湿且つ非冷蔵保存条件下において１４日曝露後においても、保護される。
【０１６８】
もっとも、本発明は、特定の実施形態に関して本明細書に例証及び記載され、本発明は、示される詳細に限定することを意図しない。むしろ様々な修飾は、本発明から離れることなく、特許請求項の等価の範囲（scope）及び範囲（range）内で、詳細になされ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年11月20日(2014.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は複数のオリゴ糖、１又は複数の二糖、及び１又は複数の多糖を含む炭水化物成分；並びに加水分解された動物性又は植物性タンパク質を含むタンパク質成分を含む、生体活性材料のための乾燥安定化組成物。
【請求項２】
前記加水分解されたタンパク質成分が、加水分解されたカゼイン、加水分解されたホエータンパク質、加水分解されたエンドウマメタンパク質、加水分解されたダイズタンパク質又はこれらの混合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記加水分解されたカゼイン、加水分解されたホエータンパク質、加水分解されたエンドウマメタンパク質、及び加水分解されたダイズタンパク質が、広範囲にわたり加水分解されているタンパク質である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記多糖が、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、カルボキシ−メチル−セルロース、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸の塩、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース、カラギーナン、ジェランガム、グアーガム、アカシアガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、キトサン及びキトサン誘導体、コラーゲン、ポリグリコール酸、デンプン、修飾デンプン、又はこれらの混合物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記オリゴ糖が、シクロデキストリン、イヌリン、マルトデキストリン、デキストラン、フルクト−オリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクト−オリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナン−オリゴ糖（ＭＯＳ）又はこれらの混合物を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記二糖が、トレハロース、スクロース、ラクトース、又はこれらの混合物を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物の合計重量に基づいて、約０．５％〜１０％のカルボン酸を含む、カルボン酸成分をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記カルボン酸成分が、乳酸、アスコルビン酸、マイレン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸、これらの塩、又はこれらの混合物を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、前記生体活性材料と組み合わされる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記生体活性材料が、生、死若しくは弱毒化細胞、微生物、ウイルス、細菌、プロバイオティック細菌、植物性細菌、土壌細菌、真菌、酵母、細胞培養物、タンパク質、組み換えタンパク質、酵素、ペプチド、ホルモン、ワクチン、抗生物質、薬物又はこれらの混合物を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、非晶質ガラス状態において乾燥している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、空気乾燥、真空乾燥、流動層乾燥及び噴霧乾燥からなる群から選択される１又は２以上のプロセスにより乾燥される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
（ａ）生体活性材料と少なくとも前記炭水化物成分及び前記タンパク質成分とを水性溶媒中で混合して粘着性のスラリーを形成し；（ｂ）前記スラリーを液体窒素中で瞬間凍結し（snap-freezing）、固体凍結粒子、ビーズ、液滴、又は紐（strings）を形成し；（ｃ）その凍結温度を上回る温度においてそれを維持しつつ、工程（ｂ）の生成物の真空下での水の除去により一次乾燥し；そして（ｄ）０．３Ａｗ未満まで水分活性を減少させるのに十分な時間、最大真空、且つ２０℃以上の温度において、工程（ｃ）の生成物を二次乾燥すること；を含む、請求項９に記載の組成物を生産する方法。
【請求項１４】
前記スラリーが、瞬間凍結前に、ｐＨ又は温度変化により、あるいは金属イオンによるポリマー鎖の架橋により、硬いヒロドゲルに固形化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記スラリーが、所望の形状に成形される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記一次水除去工程が、２０００ｍＴＯＲＲ超の真空圧力下で行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記乾燥された材料が、切断、破砕、粉砕、又はそれぞれ流動性粉末（free flowing powder）まで微粉砕される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記粒子径が約１０００μｍ未満である、請求項１７に記載の方法により製造される組成物。
【請求項１９】
請求項９に記載の組成物を含有する、再構成液体、粉砕粉末、錠剤、ペレット、カプセル、食品若しくは飼料又は被覆種子製品。
【請求項２０】
請求項９に記載の組成物を含む、栄養補助食品、医薬製品、農業製品又はワクチン製品。
【請求項２１】
請求項９に記載の組成物を含有する、バー、液体製剤、コロイド懸濁液、粉末、錠剤、カプセル及び被覆種子の形態における、食品、食品添加物、動物飼料、動物飼料添加物、栄養補助食品、医薬製品、農業製品又はワクチン製品。
【請求項２２】
請求項１３に記載の方法により製造された組成物。
【請求項２３】
１又は複数の糖及び１又は複数の加水分解されたタンパク質を含む、乾燥したガラス状且つ非晶質組成物中に組み込まれ、傷つきやすい生体活性材料の圧縮により製造された、錠剤、丸薬又はペレットであって、前記組成物の合計乾燥重量に基づいて、前記糖が約１０％〜６０％で含まれ、そして前記加水分解されたタンパク質が約１％〜４０％で含まれる、錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項２４】
前記生体活性材料が、生、死若しくは弱毒化細胞、微生物、ウイルス、細菌、プロバイオティック細菌、植物性及び土壌細菌、真菌若しくは酵母、細胞培養物、タンパク質、組み換えタンパク質、酵素、ペプチド、ホルモン、ワクチン、抗生物質、薬物又はこれらの混合物を含む、請求項２３に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項２５】
前記加水分解されたタンパク質が、幅広く加水分解されたカゼイン、ホエータンパク質、エンドウマメタンパク質、ダイズタンパク質又はこれらの混合物を含む、請求項２３又は２４に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項２６】
前記糖が、トレハロース、スクロース、ラクトース及びこれらの混合物からなる群から選択される二糖である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項２７】
前記ガラス増強化合物が、組成物中に含まれ、前記ガラス増強化合物が、組成物の合計乾燥重量に基づいて、約１％〜２０％で含まれる、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項２８】
前記ガラス増強化合物が、ギ酸、シュウ酸、アスコルビン酸、リン酸、又はこれらの組み合わせのイオンを含む、請求項２７に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項２９】
前記組成物が、多糖若しくはオリゴ糖又はこれらの混合物をさらに含む、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項３０】
前記組成物が、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、カルボキシ−メチル−セルロース、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸の塩、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース、カラギーナン、ジェランガム、グアーガム、アカシアガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、キトサン及びキトサン誘導体、コラーゲン、ポリグリコール酸、デンプン、修飾デンプン及びこれらの混合物からなる群から選択される多糖を含み、そして前記多糖は、組成物の合計乾燥重量に基づいて、約０．１％〜１０％で含まれる、請求項２９に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項３１】
前記組成物が、シクロデキストリン、イヌリン、マルトデキストリン、デキストラン、フルクト−オリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクト−オリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナン−オリゴ糖（ＭＯＳ）及びこれらの混合物からなる群から選択されるオリゴ糖を含み、そして前記オリゴ糖は、組成物の合計乾燥重量に基づいて、約０．５％〜２０％で含まれる、請求項２９又は３０に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項３２】
前記組成物が、非晶質ガラス状態において乾燥される、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項３３】
前記組成物が、空気乾燥、真空乾燥、流動層乾燥及び噴霧乾燥からなる群から選択される１又は２以上のプロセスを含む方法により乾燥される、請求項３２に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項３４】
前記乾燥したガラス状且つ非晶質組成物中に組み込まれた傷つきやすい生体活性材料を圧縮することを含み、前記乾燥したガラス状且つ非晶質組成物は、（ａ）生体活性材料と少なくとも１又は複数の糖及び１又は複数の加水分解されたタンパク質を水性溶媒中で混合して粘着性のスラリーを形成し；（ｂ）液体窒素中で前記スラリーを瞬間凍結し（snap-freezing）、固体凍結粒子、ビーズ、液滴、又は紐（strings）を形成し；（ｃ）その凍結温度を上回る温度においてそれを維持する一方で、真空下で工程（ｂ）の生成物の水を除去することにより一次乾燥し；そして（ｄ）０．３Ａｗ未満まで水分活性を減少させるのに十分な時間、最大真空、且つ２０℃以上の温度において、工程（ｃ）の生成物を二次乾燥すること；を含むプロセスにより製造される、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の錠剤、丸薬又はペレットを生産するための方法。
【請求項３５】
前記スラリーが、瞬間凍結前に、ｐＨ又は温度変化により、あるいは金属イオンによるポリマー鎖の架橋により、硬いヒロドゲルに固化される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記一次水除去工程が、２０００ｍＴＯＲＲ以上の真空下で行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記乾燥された材料が、切断、破砕、粉砕、又はそれぞれ流動性粉末（free flowing powder）まで微粉砕される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記粉末の粒子径が、約１０００μｍ未満である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記生体活性材料が、打錠装置中の圧縮又は圧搾において安定である、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項４０】
請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の錠剤、丸薬又はペレットを含む、飲料、食品、動物飼料、栄養補助食品、医薬製品、農業製品又はワクチン製品。
【請求項４１】
請求項３４に記載の方法により製造される、錠剤、丸薬又はペレット。
【請求項４２】
前記組成物の合計重量に基づいて、前記１又は複数の二糖が１０〜９０％で存在し、前記１又は複数のオリゴ糖が１〜１０％で存在し、そして前記１又は複数の多糖が０．１〜１０％で存在する、請求項１に記載の乾燥安定化組成物。
【請求項４３】
前記組成物の合計重量に基づいて、前記１又は複数の二糖が１０〜５０％で存在し、前記１又は複数のオリゴ糖が１０〜８０％で存在し、そして前記１又は複数の多糖が０．１〜１０％で存在する、請求項１に記載の乾燥安定化組成物。
【請求項４４】
前記組成物の合計重量に基づいて、前記加水分解された動物性又は植物性タンパク質が、０．５％〜４０％で存在する、請求項１に記載の乾燥安定化組成物。
【国際調査報告】
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