(57)【要約】  本願発明は、目的タンパク質種をμＬスケールで分離及び濃縮する装置及び方法、わずかピコグラム単位の目的原料を用いて、特定のイソ型タンパク質に対して優れた選択性を有する、それらのバリアントに対する試薬を調製する装置及び方法を提供する。
2015520123.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
入口と出口とを有する鋸歯状のマイクロ流体チャネル、及び前記チャネルの対向する歯の間にあるゲートを含む、化学的又は物理的パラメータに基づき、生体試料中の目的タンパク質種を分離するＤＣ−ｉＧＤＥＰ装置であって、
前記ゲートの間隔が１ｍｍから始まり０．５ｎｍまで減少する装置。
【請求項２】
前記歯が、三角形状、非対称の形状、三日月状、星状、又は丸みを帯びた形状である、請求項１に記載の装置
【請求項３】
前記歯が、底辺と高さとを有する等辺三角形状である、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
最も小さい歯が、底辺の長さ２〜１０μｍ、高さ２〜１０μｍであり、
１〜１０個の繰り返しごとに、後続の歯の辺長及び幅が２５〜５０μｍ大きくなる、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記最も小さい歯が、底辺の長さ６μｍ、高さ５．２μｍであり、６個の繰り返しごとに、後続の歯の辺長及び幅が４０μｍ大きくなる、請求項３に記載の装置。
【請求項６】
最初の前記ゲートの間隔が約９４５μｍであり、最後の前記ゲートの間隔が約２７μｍである、請求項１〜５の何れか１項に記載の装置。
【請求項７】
最初の前記ゲートの間隔が約５０μｍであり、最後の前記ゲートの間隔が約１ｎｍである、請求項１〜５の何れか１項に記載の装置。
【請求項８】
最初の前記ゲートの間隔が約５０μｍであり、最後の前記ゲートの間隔が約１μｍである、請求項１〜５の何れか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記マクロ流体チャネルが約１０〜２０μｍの深さを有する、請求項１〜８の何れか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記マクロ流体チャネルが約１３〜１６μｍの深さを有する、請求項１〜８の何れか１項に記載の装置。
【請求項１１】
化学的又は物理的パラメータに基づき、生体試料から目的種を分離する方法であって、
（ａ）請求項１〜１０の何れか１項に記載の装置を提供し、
（ｂ）入口に添加量の前記試料を添加し、
（ｃ）化学的又は物理的パラメータに基づいて、前記装置に電場を適用して、前記試料中の粒子又は分子を分離し、そして
（ｄ）前記目的種を回収する
ことを含む方法。
【請求項１２】
前記化学的又は物理的パラメータが、電荷、大きさ、誘電率、変形、又は形状である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記目的種が、Ａβ凝集物である、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
回収された前記Ａβ凝集物を抗体に接触させて、前記Ａβ凝集物の大きさを確かめることをさらに含む、請求項１１〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が、オリゴマーＡβ凝集物に特異的である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、ナノボディである、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ナノボディが、Ｃ６、Ａ４、Ｅ１、Ｄ５、１０Ｈ、６Ｅ、Ｄ１０又はＢＳＥＣ１ナノボディである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体試料が、１００μＬ未満の量である、請求項１１〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体試料が、約５０μＬの量である、請求項１１〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体試料が、脳組織、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、又は唾液である、請求項１１〜１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
２０分未満の間、前記電場を適用する、請求項１１〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
約５〜１５分の間、前記電場を適用する、請求項１１〜２１の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記目的Ａβ凝集物が数桁濃縮される、請求項１１〜２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記目的Ａβ凝集物が、前記添加量に対して１０６濃縮される、請求項１１〜２３の何れか１項に記載の方法。
【請求項２５】
目的種がタンパク質である、請求項１１〜２４の何れか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記タンパク質が、ｐ５３、膵島アミロイドポリペプチド、βアミロイド、タウ、α−シヌクレイン、ハンチントン、又はスーパーオキシドジスムターゼである、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、その全開示を本明細書に参照により組み入れる、２０１２年３月２９日出願の米国仮特許出願第６１／６１７，４７６号の優先権を主張する。
【０００２】
[政府支援についての記載］
本発明は、国立衛生研究所から与えられる政府支援の２ＲＯ１ＥＢ００４７６１−０６及びＲ２１ＥＢ０１０１９１−０１Ａ１によって行った。政府がこの発明に関して特定の権利を有する。
【０００３】
[配列表］
現出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂによりＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全開示を参照により本願明細書に援用する。２０１３年２月２１日に作成されたこのＡＳＣＩＩの複製は、「１７５５５．００７ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔ」と名付けられ、３４９０４バイトのサイズがある。
【背景技術】
【０００４】
二者択一的にプロセシングされた、異常な折り畳み構造を有するタンパク質を含むタンパク質バリアントは、数多くのヒトの疾病と関連している。例えば、異常折り畳み構造のタンパク質の凝集物は、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病、及び癌を含む、多くのヒトの疾病で重要な役割を果たしている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、異なる疾病の発生や進行におけるタンパク質バリアントの役割の評価は、生体内におけるイソ型タンパク質を区別できる試薬がないために、困難である。このような試薬の開発は、二つの主要な要因によって妨げられてきた。すなわち、タンパク質バリアントは、しばしば、生体内でわずかな量しかなく、また、バリアントは原型タンパク質の形状とわずかに異なるだけであり、それらを分離し、精製することが困難であった。これらのタンパク質バリアントと十分に特異的に区別できる試薬を作製するために、新たな分子認識プロトコールによってわずかなタンパク質バリアントを分ける新しい分離技術が必要であった。従って、哺乳類組織から単離された特定のイソ型タンパク質に対して高い選択性を有する試薬を調製することができる技術が要求され続けていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明は、入口と出口とを有する、隙のある鋸歯状のマイクロ流体チャネル、及びチャネルのそれぞれの歯の間にあるゲートを含む、様々な化学的及び物理的パラメータに基づいて生体試料中の目的タンパク質種を分離するＤＣ−ｉＧＤＥＰ装置であって、上記ゲートの間隔が５０μｍから始まり、２ｃｍ以上かけて、１μｍまで減少し、上記歯が隣のゲートと分離している装置を提供する。ここで、ゲートの隙間距離（ギャップ距離）は、は、装置の向かい合った側のお互いに対向する歯の距離である。
【０００７】
本願発明は、電荷、大きさ、誘電率、変形、形状、及び他の要因を含む様々な化学的、物理的パラメータに基づいて、生体試料から目的種を分離する方法であって、
（ａ）入口と出口とを有する隙のある鋸歯状のマイクロ流体チャネル、及びチャネルのそれぞれの歯の間のゲートを含む、様々な化学的及び物理的パラメータに基づいて生体試料中の目的タンパク質種を分離する装置であって、上記ゲートの間隔が５０μｍから始まり、２ｃｍ以上かけて、１μｍまで減少し、上記歯が隣のゲートと分離している装置を提供すること
（ｂ）上記入口に添加量の上記試料を添加し
（ｃ）上記装置に電場を適用して、上記試料中の粒子又は分子を分離し、そして
（ｄ）目的種を回収する
ことを含む方法を提供する。
【０００８】
ある態様において、上記目的種は、Ａβ凝集物である。ある態様においては、抗体と共にＡβ凝集物が分離されて、Ａβ凝集物の大きさが確かめられる。ある態様においては、上記抗体は、オリゴマーＡβ凝集物に対して特異的である。ここで、「オリゴマー」の用語は、ダイマー、トリマー、又はテトラマー、もしくはそれより大きな凝集物をいう。ある態様においては、上記抗体はナノボディである。ここで、「抗体」の用語は、ｓｃＦｖ（いわゆる「ナノボディ」）、ヒト化抗体、完全なヒト抗体又はキメラ抗体、単鎖抗体、ダイアボディ型抗体、及び抗体の抗原結合部断片（例えば、Ｆａｂ断片）を含む。ある態様において、上記ナノボディは、Ｃ６、Ａ４、Ｅ１、Ｄ５、１０Ｈ、６Ｅ、Ｄ１０又はＢＳＥＣ１ナノボディである。
【０００９】
ある態様において、上記生体試料は、１００μＬ未満の量である。ある態様において、上記生体試料は、約５０μＬの量である。ある態様において、上記生体試料は、脳組織、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、又は唾液である。ある態様において、上記力は、２０分未満（例えば、５〜１５分など）適用される。ある態様において、目的Ａβ凝集物は、数桁濃縮される。ある態様において、目的Ａβ凝集物は、添加量と比べて、１０６まで濃縮される。ある態様において、上記タンパク質は、ｐ５３、膵島アミロイドポリペプチド、β−アミロイド、タウ、α−シヌクレイン、ハンチンチン、又はスーパーオキシドジスムターゼである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】現行のＤＣ−ｉＧＤＥＰ設計を示す概略図（上段）は、モノマーではなく（中段左）、Ａβ原繊維を捉える（中段右）のに使用される。提案された（計画中の）改良装置（下段）は、１）Ａβモノマーを捉えるために、最大ＤＥＰ力を７００倍まで増やし、２）隣接するゲート間の局所的なＤＥＰ力の差異を正確にし、３）異なる空洞内に、様々なＡβ凝集物（ダイマー、トリマー、・・・原繊維まで）を分離し濃縮することを可能とする。
【図２】図２は、いくつかのナノボディの核酸配列及びアミノ酸配列を示す。下線部は、ＣＤＲ領域（又はＣＤＲ領域をコードする核酸）を示す。
【図３】図３は、本願発明の装置の一態様である。ＤＣ−ｉＧＤＥＰ装置の図である。分離された鋸歯パターンは、左から右に強度が増すように局所的な不均一の電場勾配を作り出すため、先細のマイクロ流体チャネルに統合されている。
【図４】図４Ａ−図４Ｄは、Ａβモノマー試料（３０μＭ）に４００Ｖ（４Ａ）、６００Ｖ（４Ｂ）、８００Ｖ（４Ｃ）、１０００Ｖ（４Ｄ）を適用した、ＤＣ−ｉＧＤＥＰの最も狭い部分における蛍光画像である。拡散した光の部分は、チャネル中に分布した蛍光標識されたＡβモノマーを示している。モノマーの流れは（Ｃ）と（Ｄ）でより視覚的に明らかである。
【図５】図５Ａ−図５Ｄは、図４と同様に、Ａβ原繊維（３０μＭ）に４００Ｖ（５Ａ）、６００Ｖ（５Ｂ）、８００Ｖ（５Ｃ）、１０００Ｖ（５Ｄ）を適用した、ＤＣ−ｉＧＤＥＰの最も狭い部分における蛍光画像である。パターン化された鋸歯上の隔離物の先端の間に局在する強い蛍光領域は、原繊維が捕捉、濃縮された小さな領域を示す。
【図６】図６は、図５で用いた成熟Ａβ原繊維のＴＥＭ画像である。スケールバーは１００ｎｍ。原繊維試料はＴｒｉｓへのバッファー交換前にＰＢＳ内にあった。
【図７】図７は、対象領域（ＲＯＩｓ）を本文に記載されるように示した。各領域における蛍光強度により、捕捉領域における原繊維濃度を決定するため、３つの異なる領域を選択した。ここに示された領域は、見やすくするために、実際のＲＯＩｓよりも大きい。
【図８】図８は、ゲート幅に対する、マイクロチャネルの中心線に沿って測定された∇|Ｅ|２の大きさを示した図である。縦軸は、対数のスケールで示している。傾向線は、べき関数を用いてデータ点間の関係を近似化したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明者らは、μＬスケールでタンパク質バリアントを分離、濃縮し、わずかピコグラムの標的原料を用いて特定のイソ型タンパク質に対して優れた選択性を有する、バリアントに対する試薬を調製する方法を見出した。この特性は、多くの種類のヒトの疾病に関連するタンパク質バリアントに広く適用することができる。ある態様において、この方法は、アルツハイマー病（ＡＤ）に関係するアミロイドβタンパク質（Ａβ）のイソ体に対する試薬を作製することができる。異なる凝集体種のアレイ中の異常折り畳み構造のＡβは、ＡＤの発生や進行に関連している。異なった長さや凝集体型のＡβが、ヒト脳組織内で同定されている。新しい電場分離法を用いて、ＡＤ脳内に存在する唯一のＡβ型が、分離され、隔離される。抗体に基づく試薬は、異なるＡβ種に選択的に結合でき、どの試薬が健常人の脳組織とＡＤの脳組織とをよく区別できるか判断することに用いられる。
【００１２】
本願発明は、よく特徴づけられたヒトＡＤ及び健常人の死後の脳組織の利用可能性という点でも利益がある。本願発明は、新たな電場に基づく特性を利用しており、最小限の原料のみを用いて、異なるイソ型タンパク質を素早く分離、濃縮できる。これにより、ヒトＡＤの組織から分離した、いくつかの別個のＡβイソ体を、ナノリットル量に分離することができる。抗体ライブラリの表面表示と併せて、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を利用することにより、特定のタンパク質形態に対する、単鎖の可変性ドメインの抗体断片（ｓｃＦｖｓ、あるいは「ナノボディ」とも呼ばれる）の単離ができる新たな手法を開発した。これらの手法は、タンパク質の修飾を必要とせず、わずかピコグラムの原料を用いて、特定の凝集体形態に対するナノボディの単離を可能とする。パニング技術は、ＡＤ組織から単離されたＡβイソ体に対するナノボディを調製するのに用いられる。目的抗原の精製や修飾を必要とせず、わずかマイクロリットルの目的たんぱく質溶液しか必要とせずに、異なる種の形態に対して結合特異性のあるナノボディの特性を明らかにする手法が開発された。ヒトの疾病に含まれるわずかなタンパク質バリアント（例えば、ＡＤ脳組織から単離されたイソ型Ａβ）を単離し、また、ＡＤと健常人の脳組織を区別する、重要なイソ体に対するナノボディ試薬を調製し及び特性付けられる技術が開発された。
【００１３】
特定の生化学種の同定が極端に困難であることから、疾病の進行の基礎となる分子の理解は、しばしばとても困難で複雑な問題である。ここの生体分子は、不安定で互いに分散することがあり、異なる型の同定及び単離は、技術的に大きな問題である。決定的に重要で困難な、密接に関連するタンパク質バリアントの一つのクラスは、同じタンパク質の異なる折り畳み構造である。異常折り畳み構造の凝集タンパク質バリアントは、しばしば、多くの解析法によっても区別することができない。癌（ｐ５３）、糖尿病（膵島アミロイドポリペプチド）、アルツハイマー（β−アミロイド、タウ）、パーキンソン（α−シヌクレイン）、ハンチントン病（ハンチントン）、筋萎縮性側索硬化症（スーパーオキシドジスムターゼ）、及びプリオンに基づく疾病を含む、タンパク質の異常折り畳み又はプロセシング異常に関連する、３０を超えるヒト疾病が知られている。多くの疾病において、アミロイド−β（Ａβ）タンパク質の可溶性の小さなオリゴマー型のような、特定の異常折り畳みタンパク質バリアントや、プリオンタンパク質の異常折り畳み型は、細胞の機能障害及び疾病の進行に関連している。疾病におけるタンパク質発現の役割は、プロテオミクス及びゲノミクスの解析や、ＲＮＡ抑制技術を用いて、とても効果的に研究することができるが、これらの技術は、一般に、異常折り畳みや二者択一的なプロセシングのタンパク質バリアントを区別することができない。異なるタンパク質バリアントは、しばしば、代謝され、わずかな違いだけを含んでいる。異常タンパク質型を選択的に同定し、扱うことができる強力なツールは、タンパク質バリアントに関連する多くの疾病の研究や制御に、非常に有用であろう。
【００１４】
特定のタンパク質バリアントを選択的に認識できる試薬が少ないため、現在、これらの疾病のメカニズムの解明や、適切な治療方法の開発の研究は、妨げられている。これらの重要な必要性に取り組むため、わずかに異なるタンパク質バリアントを効率的に単離し、濃縮する独特の電場に基づく手法が開発され、種に関連する特定の疾病やメカニズムを同定することができる選択的分子認識試薬を調製する新たなバイオパニング法が開発された。
【００１５】
この技術を証明するため、アミロイド−β（Ａβ）タンパク質の異なる凝集種の異なるアレイと選択的に結合する試薬が単離された。Ａβは２０年以上前にアルツハイマー病（ＡＤ）と関連付けられたが、ＡＤにおけるＡβの役割はまだ分かっておらず、当初の望みよりもより分かりにくくなっていた。ＡＤにおけるＡβの役割の混乱の多くは、生体内で発生する様々な種類のＡβ種に起因している。Ａβの凝集は、ＡＤの進行における関連要因としての理解は乏しいが、とても重要である。ＡＤのアミロイド斑は、Ａβ凝集物原繊維を含み、様々な小さなＡβ凝集種もまた形成され、様々な可溶性オリゴマーＡβ種が神経毒性やシナプス機能の低下に関連していることを示す証拠が増えてきた。皮質における可溶性Ａβの量は、記憶障害やシナプス機能の低下とよく相関している。小さな可溶性Ａβ凝集物（Ａβ由来拡散性リガンド（ＡＤＤＬｓ）と呼ばれる）及び前原繊維と呼ばれる球状又は環状の凝集物は、神経毒性を有することが示されている。インビトロで作られる又は培養細胞に由来するＡβのオリゴマー型は、長期増強（ＬＴＰ）を抑制する。Ａβのオリゴマー型の濃度は、ＡＤモデルトランスジェニックマウス及びＡＤ脳内でも高まっている。神経経路の崩壊は、Ａβ斑及び原繊維の近傍で起こっており、原繊維の毒性が示唆されている。しかしながら、神経経路の崩壊は、Ａβ原繊維の沈着がない領域でも起こっており、毒性は、わずかな量のオリゴマーＡβ、原繊維の形状と同等なもの、それらの上に存在するもの、によるかもしれないことも示唆している。オリゴマーＡβのハローが、Ａβ斑の周りに見られ、シナプスの欠損と関連していることが示されている。ＡＤモデルトランスジェニックマウスにおいて、オリゴマーＡβによって、認識機能が崩壊することもまた示されている。
【００１６】
ＡＤとＡβの関連性の研究を妨げる主要な障壁は、異なるＡβ種を同定し、局在化する適切な試薬がないことである。以前作られた選択されたＡβ型に対する抗体としては、例えば、可溶性Ａβオリゴマーを用いて免疫法で調製した抗体（Lambert, M.P., et al., Vaccination with soluble Abetaoligomers generates toxicity-neutralizing antibodies. J Neurochem, 2001. 79: p.595-605）、オリゴマーＡβ類似物を用いて免疫法で調製した抗体（Kayed, R., et al., Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis. Science, 2003. 300: p.486-9）がある。これらの試薬は、例えば、ＡＤ脳内でオリゴマーＡβが存在することを確認したり、オリゴマーＡβがシナプスリガンドを標的としたり、ニューロン樹状突起と強く結合することを示したり、オリゴマーＡβがアミロイド班近傍のシナプス欠損に関連することを示したりすることによって、ＡＤにおけるオリゴマーＡβの重要性を立証することに有用であった。しかし、現在の試薬は、可溶性Ａβ凝集物の重要性を指摘することに有用である一方で、それらの結合特異性は、通常、よく特定されておらず、試薬の親和性や特異性は、特定のオリゴマー種や少濃度の種の存在を同定するには十分でなく、試薬の親和性や特異性は、通常、正確な組織化学的研究や、その場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）や生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で特定の細胞の位置に種を局在化させることに適していない。さらに、これらは、細胞内の研究に適していない。
【００１７】
Ａβ、α−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）、及びタウの可溶性凝集物は全て神経変性の疾病に関与しているので、疾病におけるこれらの異なる型のタンパク質の役割を解明するには、特定のタンパク質の特定の形態を認識できる試薬が必要である。従って、ＡＤにおけるＡβ凝集物の役割の研究を促進したり、関連する毒性のＡβ種を同定したり、どこでいつＡβの凝集が始まり、どのようにＡＤが進行するかをはっきりさせたりするために、特定のＡβ型を認識する、特徴づけられた試薬が非常に必要とされている。ＡＤのメカニズムを理解し、診断を促進し、治療介入の監視のための適切なマーカーの開発に、この情報は極めて重要である。同様の試薬は、パーキンソン、糖尿病、癌などの他の重要なヒトの疾病のタンパク質バリアントの機能を調べることにも必要とされている。
【００１８】
この目的に対応するため、わずかなタンパク質バリアントを分離、精製し、そして特定のタンパク質型を認識する試薬を調製し特性を明らかにするために、新たな方法を開発した。特定のタンパク質バリアントに対する試薬を調製する本願の技術の能力を証明するため、インビトロで産生した様々なＡβ種を分離するように方法は改良された。これらの条件は、ＡＤ脳内に存在する複雑なＡβ集団を分離することに用いられる。
【００１９】
二者択一的なプロセシングや折り畳み構造を含む区別しにくいタンパク質バリアントは、数多くのヒト疾病で重要な役割を果たしている。そして、それらの多くは、ゲノミクスやプロテオミクス技術で区別することができない。個々のイソ型タンパク質を同定することの困難さから、ヒト疾病におけるタンパク質バリアントの重要性にもかかわらず、これらの現象を研究し、扱うことができるツールはわずかしかない。タンパク質バリアントにはわずかな違いしかなく、多くは微量レベルしか存在せず、安定ではない場合があることから、個々のタンパク質バリアントを単離し、それぞれの型を選択的に認識できる試薬を調製することは困難な問題であった。これらの困難を打破するため、特定のタンパク質バリアント型の単離と濃縮、及び、わずかな微量の目的物を用いて、特定のタンパク質バリアントに選択的に結合する試薬の調製を可能とする方法を開発した。
【００２０】
［ＤＣ−ｉＧＤＥＰ分離装置及び方法］
本発明の一つの側面は、タンパク質のイソ体を分離するために、誘電泳動（ＤＥＰ）及び動電学的な（ＥＫ）の力の性能を利用することにある。ＤＥＰ力は、一般に、分岐粒子系に用いられたり、高勾配領域（又は、低勾配、正のＤＥＰに対する負）において特定の標的を捕捉したりする際に用いられる。ここに記載の取り組みは、アーチ状の勾配が形成され、独特の特性によって特定の標的を局在化させる点で（すなわち、ＩＥＦにおけるｐＩとＤＥＰ／ＥＫは、ＤＣ−ｉＧＤＥＰにおいてつりあっている）、等電点分画法（ＩＥＦ）と異なるわけではない分離機構を形成するために、これらの力を利用している。局所電場勾配は、離れた入口と出口の貯蔵部内に位置する電極から適用された静電場を用いて、分離構造と共に形成される（Cummings, E.B. and A.K. Singh, Dielectrophoresisin Microchips Containing Arrays of Insulating Posts: Theoretical and Experimental Results. Anal. Chem., 2003. 75: p.4724-4731; Cummings, E.B., Streaming Dielectrophoresis for Continuous-Flow Microfluidic Devices. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine, 2003. Nov/Dec: p.75-84; Lapizco-Encinas, B.H., et al., Insulator-based dielectrophoresis for the selective concentration and separation of live bacteria in water. Electrophoresis, 2004. 25: p.1695-1704; Lapizco-Encinas, B.H., et al., Dielectrophoretic Concentration and Separation of Live and Dead Bacteria in an Array of Insulators. Anal. Chem., 2004. 76: p.1571-1579; Barrett, L.M., et al., Dielectrophoreticmanipulation of particles and cells using insulating ridges in faceted prism microchannels. Analytical Chemistry, 2005. 77: p.6798-6804; Lapizco-Encinas, B.H., et al., An insulator- based (electrodeless) dielectrophoreticconcentrator for microbes in water. Journal of Microbiological Methods, 2005. 62: p.317-326; Simmons, B.A., et al., The development of polymeric devices as dielectrophoretic separators and concentrators. MRS Bulletin, 2006. 31: p.120-124; Davalos, R.V., et al., Performance impact of dynamic surface coatings on polymeric insulator-based dielectrophoretic particle separators. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2008. 390: p.847-855）。
【００２１】
本願発明の方法は、全体的な勾配を系に付与する。そのため、単純な二つの構成成分の分画とは異なり、混合物の長さ方向の分離を可能にする（Pysher, M.D. and M.A. Hayes, Electrophoretic and dielectrophoreticfield gradient technique for separating bioparticles. Analytical Chemistry, 2007. 79: p.4552-4557; Chen, K.P., et al., Insulator-based Dielectrophoretic Separations of Small Particles in Sawtooth Channel. Electrophoresis, 2009. 30: p.1441-1448; Jones, P.V., S.J.R. Staton, and M.A. Hayes, Blood Cell Capture in a Gradient DielectrophoreticMicroChannel. Anal. Bioanal. 2011. 401: p.2103-2111; Staton, S.J.R., et al., Characterization of particle capture in a sawtoothpatterned insulating electrokinetic microfluidic device. Electrophoresis, 2010. 31: p.3634-3641; Weiss, N.G., et al., Dielectrophoreticmobility determination in DC insulator-based dielectrophoresis. Electrophoresis, 2011. 32, 2292-2297; Staton, S.R., et al., Gradient Insulator Based DielectrophoresisIsolation and Concentration of A-beta AmyloidFibrils. Analyst, 2012. 137, in press (RSC ID: AN-COM-01-2012-035138)）。
【００２２】
マイクロ流体チャネルの長さに沿って、局所的な増加勾配が導入されるように、分離構造は形成される（図１）。この鋸歯状の構造は、高い多重極モーメントに基づいて分離を可能としている。一般に、単なる電気泳動は、分子や粒子の単極の電気特性を利用している。複雑な分子群や生体粒子群においては、分離に用いることができる、いくつかの複雑な電気的な幾何学的形状が存在する（Jones, T.B. and M. Washizu, Generalized multipolar dielectrophoreticforce and electrorotational torque calculation. Journal of Electrostatics, 1996. 38: p.199-211などを参照）。それぞれの目的物の特定の特徴に基づいて、勾配に沿って、穏やかに（細胞が生存したまま）いくつかの目的物を分離するため、手法が開発された。これらの特徴は、変形性と同じくらい微妙であり、又は大きさと同じくらい簡便でありえます。モデル粒子に焦点を当ててきた従来の試行に加え、ヒト全血液からバクテリア及び細胞のいくつかの種が単離されてきた（本願の方法をサポートするモデルに加えて（Chen, K.P., et al., Insulator-based DielectrophoreticSeparations of Small Particles in Sawtooth Channel. Electrophoresis, 2009. 30: p.1441- 1448)）。そして、異なるＡβ種を独自に捕捉することができることを示してきた。これらの結果を生み出す全ての装置は、ＡＺ  Ｐ４６２０と共に組み立てられたフォトリソグラフィーの鋳型から考案された（Pysher, M.D. and M.A. Hayes, Electrophoretic and dielectrophoreticfield gradient technique for separating bioparticles. Analytical Chemistry, 2007. 79: p.4552- 4557）。
【００２３】
基本的な取り組みは、増加勾配に沿って単離された、直径２０ｎｍから１μｍのサイズのポリスチレン粒子によって証明された（Staton, S.J.R., et al., Characterization of particle capture in a sawtoothpatterned insulating electrokinetic microfluidic device. Electrophoresis, 2010. 31: p.3634-3641）。発明者らの、実際には粒子が最も狭い部分を通ることないというモデル研究と一致せず、装置の最も狭い部分である分離した構造（ゲート）の先端間の狭い間隔は、詰まらない（Chen, K.P., et al., Insulator-based DielectrophoreticSeparations of Small Particles in Sawtooth Channel. Electrophoresis, 2009. 30: p.1441- 1448）。異なる動きが、同じサイズの粒子の二つの集団で見られた。これは、誘電泳動力が、サイズを超えて、要因（たぶん、不均質な誘電率）に従って働くことを示している（Staton, S.J.R., et al., Characterization of particle capture in a sawtoothpatterned insulating electrokinetic microfluidic device. Electrophoresis, 2010. 31: p.3634-3641）。生きたバクテリアと死んだバクテリアは、この装置により、詰まることなく容易に分離され、マイクロ及びナノ粒子のモデルされた動きは確かめられた（Pysher, M.D. and M.A. Hayes, Electrophoretic and dielectrophoreticfield gradient technique for separating bioparticles. Analytical Chemistry, 2007. 79: p.4552-4557）。また、他の細胞細片やタンパク質から、赤血球（ＲＢＣｓ）を分離することもできた（Blood Cell Capture in a Gradient DielectrophoreticMicroChannel. Anal. Bioanal. 2011. 401: p.2103-2111）。このシステムの構成要素もまたモデル化された。すなわち、収束せず粒子同士の相互作用が含まれない、７個の連続する歯の組み合わせである（Chen, K.P., et al., Insulator-based DielectrophoreticSeparations of Small Particles in Sawtooth Channel. Electrophoresis, 2009. 30: p.1441-1448）。これらの限定した制約を用いることで、動電学的な力（電気泳動的なそして電気浸透的な、μｅｐ＋μｅｏｆ流動性）及び誘電泳動力の割合が、それぞれのゲートにおいて特有のものであることを示した。見積もられた電場の形と、実際の電場勾配は、分離構造の形に大きく影響される。
【００２４】
［インビトロで産生した全範囲のＡβ種を単離するＤＣ−ｉＧＤＥＰ装置の開発］
ＡＤ患者に特異的な正確なＡβ凝集物のプローブ一式を作製するため、ＤＣ−ｉＧＤＥＰの独特の特性は、ナノボディの調整まで広げられた。これを成し遂げるため、ＤＣ−ｉＧＤＥＰ装置は、ダイマーから原繊維までの範囲のＡβ凝集物種（準安定な（数分単位の）中間物を含む）の解像度を最大化するように組み立てられた。ＤＣ−ｉＧＤＥＰ装置内に、Ａβ４０及び４２の凝集物種が単離、濃縮された局所が見られ、様々なタンパク質領域や形態に正確な親和性を有するナノボディの存在を解明してきた。
鋸歯状の開いたチャネルの鋸歯の設計を用いて、以下の様々な系において、分離の結果が得られてきた。異なるサイズのポリスチレン粒子を含む系（Staton, S.J.R., et al., Characterization of particle capture in a sawtoothpatterned insulating electrokinetic microfluidic device. Electrophoresis, 2010. 31: p. 3634-3641）、赤血球を含む系（Blood Cell Capture in a Gradient Dielectrophoretic MicroChannel. Anal. Bioanal. 2011. 401: p.2103- 2111）、及びバクテリアを含む系（Pysher, M.D. and M.A. Hayes, Electrophoretic and dielectrophoreticfield gradient technique for separating bioparticles. Analytical Chemistry, 2007. 79: p.4552- 4557）である。そして、分離特性を予測する理論的なモデルも開発されてきた（Chen, K.P., et al., Insulator-based DielectrophoreticSeparations of Small Particles in Sawtooth Channel. Electrophoresis, 2009. 30: p.1441-1448）。
【００２５】
発明者らは、モノマーは自由に通過するが、完全に形成されたＡβ原繊維を分離、濃縮できる設計であることもまた示した（図１）。この設計では、Ａβ原繊維は、２７μｍの間隔の「ゲート」（分離している歯が最も接近している部分）で捕捉されていた。結果として、正方形領域の電場強度勾配が、約１０１８Ｖ２／ｍ３と計算された（ＣＯＭＳＯＬ  ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ）。これらの結果は、約４０μＬのモノマー又は原繊維溶液／コロイドを装置に添加した後、５〜１５分の間に得られた。このデータから、この独特の分離機構が、よく制御され、凝集した中間体の選択的な単離や濃縮に理想的に適していることが分かる。
【００２６】
ＤＥＰ及びＥＫに基づく基本理論によれば、粒子／分子の正味速度は、粒子半径（α）２乗と比例している［νＤＥＰ＝μＤＥＰ∇Ε２，μＤＥＰ∝α２：νＤＥＰはＤＥＰ力による粒子の速度であり、Εは局所電場を示す（Chen, K.P., et al., Insulator-based DielectrophoreticSeparations of Small Particles in Sawtooth Channel. Electrophoresis, 2009. 30: p.1441-1448; Weiss, N.G., et al., Dielectrophoretic mobility determination in DC insulator-based dielectrophoresis. Electrophoresis, 2011. 32, 2292-2297)］。この関係を利用し、そして単量体のＡβが名目上は約１．５ナノメートル幅であること、及び原繊維の長さの特徴がナノメートルの１０ｓから１００ｓであることに留意すれば（Roychaudhuri, R., et al., Amyloid beta-Protein Assembly and Alzheimer Disease. Journal Of Biological Chemistry, 2009. 284: p.4749-4753）、予想される必要なＤＥＰ力は、事実上、括弧内に示される［ＣＯＳＭＯＬからΕ、ΔΕ２を見積もる、１．２０ｘ１０−４ｃｍ２／ＶｓのＡβ（１−４０）モノマーμＥＰ（１０．０ｍＭ ＴＲＩＳ  バッファー、ｐＨ７．８）と、１．０７２ｘ１０−４ｃｍ２／ＶｓのＡβ（１−４２）モノマーμＥＰ（１０．０ｍＭ ＴＲＩＳ  バッファー、ｐＨ７．８）（Ａβ４０とＡβ４２とで、約４個のピーク幅が異なる）を使用する（Picou, R., et al., Analysis of monomelic A beta (1-40) peptide by capillary electrophoresis. Analyst, 2010. 135: p.1631-1635; Picou, R.A., et al., Analysis of A-beta (1-40) and A-beta (1-42) Monomer and Fibrils by Capillary Electrophoresis. Journal of Chromatography B, 2011DOI: 10.1016/j.jchromb.2011.01.030)］。５０μｍから始まり、２ｃｍ以上にわたって１μｍまで減少するゲート間隔を備えた装置は、それぞれの点で、モノマーから原繊維までの範囲のＡβ種を効率的に捕捉する（図１、下の図）。ＣＯＳＭＯＬ  ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｓは、この装置の設計に用いられ、構造の基礎となる結果が、フォトリソグラフィーのプレートを作製するために、ＡｕｔｏＣＡＤに転送される。
【００２７】
この設計により、均一ではなく（均等に間隔があき、又は唯一に分離される）、モノマーから完全に形成された原繊維までの範囲の、様々なＡβ種が分離される。これは、典型的な速度、〜１０−４ｍ／ｓにより（ＥＰのみ、装置の開いた部分）、数分のうちに起こる。さらに、約５０μＬの添加量と比べ、特定の目的物は、数桁（１０６まで）まで濃縮できる。
【００２８】
［装置］
マイクロチャネルジオメトリーは、連続して大きくなる、チャネルの両端に並んだ等辺三角形状の一群から構成されている（図３）。それぞれの三角形の先端は、チャネルの逆側の対向する三角形と対応し、収束する鋸状の歯に沿って順次狭くなる隙間を形成している。最も小さい三角形（チャネル（経路）の入口近くに位置する）は、辺６μｍ、高さ５．２μｍである。等辺三角形の辺長は、６つの繰り返し単位ごとに、４０μｍまで増加する。これにより、最初の隙間の間隔は９４５μｍであり、最後の隙間の間隔は２７μｍとなる。全体のチャネル（経路）の長さは、約４．１ｃｍで、平均奥行きは１４±１μｍである。
【００２９】
［材料と方法］
ガラスとポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）とからなるマイクロ流体装置を試験に用いた。白金電極を、マイクロチャネルのそれぞれの端部にある貯蔵部に、小さなアクセス路を通して挿入した。そして、装置を通して電位を適用した。
ＰＤＭＳ（Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４、ダウコーニング、ミッドランド、ＭＩ）は、フォトレジストの鋳型に注がれ、シリコンウエハ上にパターンを形成し、硬化された。貯蔵部にアクセスするため、チャネルの端部に、ＰＤＭＳを貫通する直径２ミリメートルの穴があけられた。ガラススライドと共に、ＰＤＭＳは、酸素プラズマ処理によって酸化され、そして不可逆的に接着された。
【００３０】
細胞試料は、主として、リン酸バッファーに回収され、実験を通して視覚化をしやすくするため、蛍光で染色させた（Ｖｙｂｒａｎｔ  Ｄｉｏ、インビトロジェン社、カールスバッド、ＣＡ）。
【００３１】
バッファーは、入口の貯蔵部にピペットで添加し、毛細現象によりチャネルに受動的に満たされた。装置を点検し、均一な溶液の分布を確認した後に、試料を入口の貯蔵部に添加した。圧力駆動流を通して被検物の生体粒子が装置に入れられ、チャネル内に均一に分布した後、流体力学の圧力のバランスをとるために反対側の貯蔵部にバッファーを添加した。一度この順で装置の準備を行い、白金電極（外径０．４０４ｍｍ、純度９９．９％、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、ワードヒル、ＭＡ）をアクセス路を通して貯蔵部内に挿入し、電力供給源（Ｓｅｒｉｅｓ２２５  ＤＣ  ｐｏｗｅｒ  ｓｕｐｐｌｙ，Ｂｅｒｔａｎ  Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｃｏｒｐ．，ヒックスビル，ＮＹ）に接続した。実験は、オリンパスＩＸ７０顕微鏡を用いて観察した。試料は、広域スペクトルの水銀灯（Ｈ３０  １０２ｗ／２、ＯＳＲＡＭ）、及びオリンパスＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ広帯域キューブ（オリンパス、センターバレー、ＰＡ）を用いて照らされた。
【００３２】
（ナノボディの調製）
発明者らは、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）の強力なイメージング性能と、ファージ提示ライブラリーの分子認識多様性（Barkhordarian, H., et al., Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies. Protein Eng Des Sel, 2006. 19: p.497-502; Shlyakhtenko, L.S., et al., Single-molecule selection and recovery of structure-specific antibodies using atomic force microscopy. Nanomedicine, 2007. 3: p.192-7）とを組み合わせて、特定のタンパク質構造を認識する試薬を調製することができる新たな技術を開発した。発明者らは、ＡＦＭを利用して、わずかナノグラムの原料を用いて、これらの試薬の特異的結合の評価を可能にする革新的な技術も開発した（Wang, M.S., et al., Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM. Langmuir, 2008）。個々の凝集型に対する単鎖抗体断片（又はナノボディ）を単離するために、目的タンパク質の形態を視覚化できるＡＦＭバイオパニング技術が開発された（Barkhordarian, H., et al., Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies. Protein Eng Des Sel, 2006. 19: p.497-502; PCT US11/57887; PCT US11/57925; PCT/US11/57904）。
【００３３】
目的タンパク質は修飾することなくマイカ表面に添加されるように、タンパク質の操作が最小限となり、わずかな量のタンパク質を使用し、低いナノグラム量で十分以上であり、標的タンパク質は精製を必要としないので、この方法は、特に、異なるタンパク質形態に対するナノボディを単離することに適している。この基本技術は、モノマーＡβ及びα−シヌクレイン（Emadi, S., et al., Inhibiting Aggregation of alpha-Synuclein with Human Single Chain Antibody Fragments. Biochemistry, 2004. 43: p.2871-2878; Zhou, C, et al., A human single-chain Fv intrabody blocks aberrant cellular effects of overexpressed alpha-synuclein. Mol Ther, 2004. 10: p.1023-31 ; Liu, R., et al., Single chain variable fragments against beta-amyloid (Abeta) can inhibit Abeta aggregation and prevent abeta- induced neurotoxicity. Biochemistry, 2004. 43: p.6959-67; Zameer, A., et al., Single Chain Fv Antibodies against the 25-35 AbetaFragment Inhibit Aggregation and Toxicity of Abeta42. Biochemistry, 2006. 45: p.11532-9）、Ａβ及びα−シヌクレインの原繊維（Barkhordarian, H., et al., Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies. Protein Eng Des Sel, 2006. 19: p.497-502; Marcus, W.D., et al., Characterization of an antibody scFv that recognizes fibrillarinsulin and beta-amyloid using atomic force microscopy. Nanomedicine, 2008. 4: p.1-7）、異なる二種のα−シヌクレイン種オリゴマー（Emadi, S., et al., Isolation of a human single chain antibody fragment against oligomericalpha-synuclein that inhibits aggregation and prevents alpha-synuclein-induced toxicity. J Mol Biol, 2007. 368: p.1132-44; Emadi, S., et al., Detecting morphologically distinct oligomericforms of alpha-synuclein. J BiolChem, 2009. 284: p.11048-58）、及び異なる三種のＡβ種オリゴマー（Zameer, A., et al., Anti- oligomeric Abetasingle-chain variable domain antibody blocks Abeta-induced toxicity against human neuroblastoma cells. J Mol Biol, 2008. 384: p.917-28; Kasturirangan, S., et al., Nanobody specific for oligomericbeta-amyloid stabilizes non-toxic form. Neurobiol Aging, 2010. In press; Kasturirangan, S., et al., Isolation and Characterization of a Nanobodythat Selectively Binds Brain Derived Oligomeric Beta-Amyloid. (Submitted)）の異なる領域を認識するナノボディを単離することに使用されてきた。
【００３４】
それぞれのオリゴマー種特異的なナノボディは、交差反応性を示さない。なので、Ａβオリゴマーに結合するナノボディは、α−シヌクレインオリゴマー結合せず、またその逆もない。異なるナノボディによって認識されるそれぞれの凝集種は、ＡＤ又はＰＤのヒト組織内で本来発生し、そしてナノボディは、ＡＤ、ＰＤ及び健常な脳組織、異なる凝集種による毒性を区別することができるので、ナノボディは、一般的なＥＬＩＳＡ及び免疫組織化学の分析でよく機能する（Emadi, S., et al., Isolation of a human single chain antibody fragment against oligomericalpha-synuclein that inhibits aggregation and prevents alpha-synuclein-induced toxicity. J Mol Biol, 2007. 368: p.1132-44; Emadi, S., et al., Detecting morphologically distinct oligomericforms of alpha-synuclein. J BiolChem, 2009. 284: p.11048-58; Zameer, A., et al., Anti-oligomeric Abetasingle-chain variable domain antibody blocks Abeta-induced toxicity against human neuroblastoma cells. J Mol Biol, 2008. 384: p. 917-28; Kasturirangan, S., et al., Nanobody specific for oligomericbeta-amyloid stabilizes non-toxic form. Neurobiol Aging, 2010. In press）。これまでに開発されたナノボディは、従来の抗体に対していくつかの有利な点がある：１）ナノボディは、単一の標的タンパク質の特定の形態を標的とする。例えば、α−シヌクレインオリゴマー型には反応せず、選択されたＡβオリゴマー型を認識する。２）ナノボディは、フェムトモルレベルで親和性を有する。３）標的又はタグの配列を、遺伝子的に改良できる。４）ナノボディは細胞内Ａβ種を同定するために、細胞内抗体として細胞内に発現できる。５）ナノボディの特性は、慎重に明らかにされている。
【００３５】
新たな分離及び分子認識技術の融合により、ヒトの疾病の組織と関連する特定のイソ型タンパク質を同定、濃縮し、疾病の特徴である様々なイソ型タンパク質を選択的に認識するナノボディ試薬を調製することが可能となった。ナノボディは、ＡＤ分野において、ＡＤの進行における異なるＡβ種の役割を明らかにするための強力なツールとなった。この試みは、正確な試薬開発の全体的な戦略の、明確かつ使いやすい例を提供する。
【００３６】
ある態様において、本願発明で使用できる抗体断片を、以下の表１に一覧にする（図２も参照）。
【００３７】
【表１】
2015520123.tif 000003
【００３８】
ある態様において、上記Ｃ６ナノボディは、以下の配列番号１を有する。
ＥＸＰＩＡＹＧＳＲＷＩＶＩＴＲＧＰＡＧＨＧＰＧＴＡＡＧＶＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＹＧＳＶＫＩＳＣＦＤＹＷＧＱＳＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＮＳＮＮＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＥＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＦＹＳＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡＡＨＨＨＨＨＨＧＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤ
【００３９】
ある態様において、抗体断片は、配列番号１の１６−２９２番目のアミノ酸残基を含む。ある態様において、抗体断片は、アミノ酸配列番号１を、含む又はのみから構成されている。ある態様において、抗体断片は長さ５００アミノ酸未満であり、例えば、長さ２００−４５０アミノ酸、又は長さ３００アミノ酸未満である。
【００４０】
［形態特異的なナノボディと反応する、単離されたＡβ４０／４２フラクションの同定］
本発明者らにより、異なるＡβ形態に対する様々なナノボディが開発された。Ａβ形態としては、Ａβ原繊維のみに選択的に結合するもの（Marcus, W.D., et al., Characterization of an antibody scFv that recognizes fibrillarinsulin and beta-amyloid using atomic force microscopy. Nanomedicine, 2008. 4: p.1-7）、又は３種の異なるＡβオリゴマー種に選択的に結合するもの（Zameer, A., et al., Anti-oligomeric Abetasingle-chain variable domain antibody blocks Abeta-induced toxicity against human neuroblastoma cells. J Mol Biol, 2008. 384: p.917-28; Kasturirangan, S., et al., Nanobody specific for oligomericbeta-amyloid stabilizes non-toxic form. Neurobiol Aging, 2010. In press; Kasturirangan, S., et al., Isolation and Characterization of a Nanobodythat Selectively Binds Brain Derived Oligomeric Beta-Amyloid. (Submitted)）が含まれる。この形態的に特異的なナノボディの集合は、ＤＣ−ｉＧＤＥＰで別個のＡβ種が分離されるかの確認や、選択的な試薬がなかった新たなＡβ種を同定などに用いられた。
【００４１】
（Ａβフラクションの分離及び回収）
Ａβフラクションは、鋸歯状のゲートによって分離、濃縮された。それぞれのＡβフラクションは、「セル」（上記ゲート間の領域）と呼ばれる内部に捕捉された（Staton, S.J.R., et al., Characterization of particle capture in a sawtoothpatterned insulating electrokinetic microfluidic device. Electrophoresis, 2010. 31: p.3634- 3641）。追加の設計特徴により、様々な試薬が到達可能な限られた体積内部に分離された目的物を維持することが必要とされた。電場が装置の長軸に沿って形成されているとき、側面のチャネルは、電気的に無として用いられる。装置の上方および下方に位置する貯蔵部内に電極を設置し、チャネルと対応させることにより、続く分析で捕捉されたＡβ種は回収される。
【００４２】
（Ａβフラクションとナノボディとの反応性）
目的抗原の有効性や安定性により、異なる目的Ａβ形態に対して分離されたそれぞれのナノボディの反応特異性を測定するために、多くの技術がある。ＤＣ−ｉＧＤＥＰによって単離された異なるＡβ種に対する反応特異性を明らかするにあたり、ほとんどのＡβ種は、極少量でわずかな体積中に存在する。このような場合には、種の反応性は、何の修飾をすることなく少量の原料を利用することができる、ＡＦＭを用いて分析される。Ａβ形態が適切な量得られた場合には、目的凝集物の精製がどれほど容易かに依存するが、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、又はドットブロットにより反応特異性が測定される。これらの評価のそれぞれの手法は、日常的に用いられている（Emadi, S., et al., Inhibiting Aggregation of alpha-Synuclein with Human Single Chain Antibody Fragments. Biochemistry, 2004. 43: p.2871-2878; Zhou, C, et al., A human single-chain Fv intrabody blocks aberrant cellular effects of overexpressed alpha- synuclein. Mol Ther, 2004. 10: p.1023-31; Liu, R., et al., Single chain variable fragments against beta-amyloid (Abeta) can inhibit Abeta aggregation and prevent abeta-induced neurotoxicity. Biochemistry, 2004. 43: p.6959-67; Zameer, A., et al., Single Chain Fv Antibodies against the 25-35 AbetaFragment Inhibit Aggregation and Toxicity of Abeta42. Biochemistry, 2006. 45: p.11532-9; Emadi, S., et al., Isolation of a human single chain antibody fragment against oligomericalpha-synuclein that inhibits aggregation and prevents alpha-synuclein-induced toxicity. J Mol Biol, 2007. 368: p.1132-44; Liu, R., et al., Residues 17-20 and 30-35 of beta-amyloid play critical roles in aggregation. JNeurosci Res, 2004. 75: p.162-71; Liu, R., et al., Proteolytic antibody light chains alter beta-amyloid aggregation and prevent cytotoxicity. Biochemistry, 2004. 43: p.9999-10007）。ある態様において、いくつかのＡβオリゴマー試料に特異的なナノボディは、上記に記載のように、ウェスタンブロットなどの従来の方法により測定できないかもしれない。上記記載のように分析で安定でない、又は極微量しか使用できない、標的抗原に対する抗体の特異性を測定するために、数種のＡＦＭが用いられる。例えば、高さ分布解析によるナノボディの特異性解析（(Wang, M.S., et al., Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM. Langmuir, 2008）、又は撮影画像認識によるナノボディの特異性解析（Marcus, W.D., et al., Isolation of an scFvtargeting BRG1 using phage display with characterization by AFM. Biochem Biophys Res Commun, 2006. 342: p. 1123-9）などである。
【００４３】
モノマー型、数種のオリゴマー型、及び原繊維型を含む少なくとも５種のＡβフラクションが分離される。ある態様において、もし側面のチャネルが、電気的に十分に無でなければ、又は拡散条件の下、処理中に側面のチャネルがアクセス可能な場合は、単純な空気弁の概念が用いられる（Unger, M.A., et al., Monolithic microfabricatedvalves and pumps by multilayer soft lithography. Science, 2000. 288: p.113-116）。装置は、ゴム製のポリマーから形成されているため、側面のチャネルの頂部（ルーフ）は、圧力により閉じられている。圧力はわずかであり、機械によって加えられる。
発明は、以下の非限定的な例で例示される。
【実施例】
【００４４】
［実施例１］
以下に、ＤＣ分離勾配誘電泳動（ＤＣ−ｉＧＤＥＰ）を用いた、アルツハイマー病に関連する、Ａβアミロイド原線維の操作及び濃縮に関する新たな方法を示す。原繊維の濃縮は、〜４００％まで見られる。シュミレーションでは、全範囲のアミロイドタンパク質凝集物の捕捉が、最適化された装置により可能であるとしている。
【００４５】
タンパク質凝集物は、アルツハイマー病、パーキンソン病、２型糖尿病を含む、２５以上の疾病と関連している。結果として、医療、生化学、分析化学の分野の研究者は、アミロイド凝集形成のメカニズムの理解や、毒性のある種の同定に励んでいる。アミロイド原線維の形成前に形成される一過性の準安定なオリゴマーの凝集物である、前原繊維は、発病に関連しており、細胞毒性を有すると考えられている。アミロイド凝集は、インビトロでオリゴマー種の異種物の混合物を形成することが示されてきた。しかし、細胞毒性種の特定の構造、アミロイド原線維形成との関係、及び毒性のメカニズムは不明であった。様々な凝集構造物を操作したり濃縮したりすることができる技術は、非常に重要である。なぜなら、全ての凝集種の成分に関する特定の情報は、凝集プロセスを破壊したり変更したりすることに基づく治療法の効果的な開発に必要だからである。モノマーから完全原繊維に至るまでのそれぞれの異なる凝集種は、異なる毒性の基となる、独特の化学的、物理的性質を有している。
【００４６】
様々なオリゴマー、Ａβアミロイド原繊維、及び他の異常な折り畳み構造のタンパク質を単離する従来の方法は、沈殿、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）などの技術に大いに依存してきた。沈殿では、一般的に多量の標品を使用し、オリゴマーを効率的に亜集団中に分離できなかった。そして沈殿により、構造的な類似物、少量の凝集サンプルが得られる。ＣＥは、少量のサンプルを使用し、他の分離集団と比べて優れた分解能を有しているが、標的となる集団は、一般的に、分離中に、濃縮というよりも希釈される。同様に、ＳＥＣは、比較的安定な前原繊維種を、効率的に分離することが分かっている。しかし、ＣＥのように、一般的には分離中にサンプルが希釈され、そしていくつかのタンパク凝集物は破壊される。Ａβ凝集物を分離したり特性を明らかにしたりする他の方法としては、ＨＰＬＣ、ゲル電気泳動、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）が含まれる。しかし、これらの方法から、アミロイド線維形成中にオリゴマー集団が共存することの理解できる説明は得られていない。ＴＥＭ測定は、大規模なサンプル調製後になされ、一般的には安定なエンドポイントの種のみが捕捉される。アミロイド原繊維形成が可逆的な連続反応であることを考慮すれば、全ての分離の企ては、分離前に存在する凝集物種の集団を変えてしまうことを示唆する。例えば、前原繊維はモノマーに戻ってしまう。試料中の実際の凝集物集団の像を得るには、分離技術は、できるだけ素早く穏やかであるべきだ。
【００４７】
ここに記載の技術、すなわちＤＣ−ｉＧＤＥＰは、単一の分離チャネル内で、電気泳動と誘導泳動のバランスをとることにより、粒子を素早く分離する（S. J. R. Staton, K. P. Chen, T. J. Taylor, J. R. Pacheco and M. A. Hayes, Electrophoresis, 2010, 31, 3634-3641.）。キャピラリー電気泳動分離と関連して、誘導泳動力の付加により、周囲媒質と同様の（すなわち、一致する）粒子の導磁率及び誘電率を含むため、分析物の特異的分離ベクトルが増す。これらの力を反対に組み合わせると、別個の回収点（目的種が濃縮されている点）に変換する。これにより、直接定量化又はこれらの構造の特性の研究に使用するための、Ａβアミロイド構造の分離と濃縮が短い時間で成し遂げられる。この分離は、固定相と凝集物との相互作用によるものではない。すなわち、凝集構造物の分離工程の効果を減らすものではない。
【００４８】
以前、ＤＣ−ｉＧＤＥＰによって、２０ｎｍから１μｍの球状の合成ポリマーのナノ又はマイクロ粒子を分離、濃縮できることを示した（S. J. R. Staton, K. P. Chen, T. J. Taylor, J. R. Pacheco and M. A. Hayes, Electrophoresis, 2010, 31, 3634- 3641; M. D. Pysher and M. A. Hayes, Anal. Chem. 2007, 79, 4552-4557.）。ＤＣ−ｉＧＤＥＰが、アミロイド凝集物のサイズ、形状、化学的特性によってうまく処理することができるかは知られていない。ここに、ＤＣ−ｉＧＤＥＰによって、Ａβアミロイド凝集物を素早く選択的に濃縮でき、チャネル設計を適合させることで、より小さな前原繊維凝集物の集合を分析する見込みがあることを示す最初の成果を示す。
【００４９】
ＤＣ−ｉＧＤＥＰ装置の設計及び製作は、Staton et al.に詳細に記載されている（S. J. Pv. Staton, K. P. Chen, T. J. Taylor, J. R. Pacheco and M. A. Hayes, Electrophoresis, 2010, 31, 3634-3641）。簡略すれば、ＤＣ−ｉＧＤＥＰマイクロ流体チャネルは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）とカバーガラススライドとでできている（図３）。そして、２０μＬのＡβ試料を、チャネルの広がった端部にある貯蔵部に注ぐ。ＰＢＳ中のＡβモノマーと原繊維は、以前示したように調製した（B. O'Nuallain, A. K. Thakur, A. D. Williams, A. M. Bhattacharyya, S. Chen, T. Geethaand R. Wetzel, Methods Enzymol, 2006, 413, 34-74; R. Picou, J. P. Moses, A. D. Wellman, I. Kheterpaland S. D. Gilman, Analyst, 2010, 135, 1631-1635; I. Kheterpal, K. D. Cook and R. Wetzel, Methods Enzymol. 2006, 39, 584-593; R. A. Picou, I.Kheterpal, A. D. Wellman, M. Minnamreddy, G. Ku and S. D. Gilman, J. Chromatogr. B, 2011, 879, 627-632.）。ＤＣ−ｉＧＤＥＰの製作及びＡβ試料の調製に関する追加の情報は、実施例２に記載した。モノマー及び原繊維試料は、ＤＣ−ｉＧＤＥＰによって、別個に試験をした。ここに示す結果は、一貫しており、モノマーと原繊維の３つの独立した調製物及び多数の装置を用いた多数の装置の代表例である。実験は、各試験で、チャネルの長さ全体に４００〜１０００Ｖの電圧を、１〜１５分間かけて行った。
【００５０】
ＤＣ−ｉＧＤＥＰの試験は、蛍光顕微鏡で監視した。ＤＣ−ｉＧＤＥＰチャネルに添加された時、モノマーは、すべての電圧（４００〜１０００Ｖ）において、一貫した流動パターンを示した。それは、電圧が高いほどはっきりしていた（図４）。チャネルの中心線にそってあらわれたその流動パターンは、電気泳動力が影響することを示した。しかし、モノマーが捕捉できた条件はなかった。
【００５１】
反対に、同様の条件でＤＣ−ｉＧＤＥＰチャネルを用いて、Ａβアミロイド原繊維試料の評価をした場合、原繊維の分離と濃縮を確認できた（図５）。この実験に用いた原繊維試料のＴＥＭが、図６である。そして、完全（成熟）アミロイド原繊維の存在がはっきりと示されている。チオフラビンＴ（１０μＭ）染色により、凝集物が７日後に完全になることを測定した。チャネルの長さ全体にわたり４００Ｖ未満をかけた実験の画像では、捕捉されずに、原繊維の動きを示した。４００〜１０００Ｖの適用において、Ａβ原繊維は、局所的な蛍光強度と同様に、チャネル内の狭い点に捕捉され、濃縮された。合成ナノ粒子を用いた事前に試験により、粒子の捕捉は一般にチャネルを遮らないこと、及び捕捉閾値より小さいのナノ粒子は、捕捉濃縮された大きい粒子を含む交点部分を通り過ぎていくことが分かった（S. J. R. Staton, K. P. Chen, T. J. Taylor, J. R. Pacheco and M. A. Hayes, Electrophoresis, 2010, 31, 3634-3641.）。
【００５２】
非選択的な補足とＤＣ−ｉＧＤＥＰにより制御された補足とを区別するため、Ａβの捕捉及び濃縮後、かけた電圧を除き、明るい領域が捕捉領域から分散していくのをモニターした。Ａβ原繊維の分散及びわずかな対流により、図５に示される明るい蛍光領域は、捕捉領域から離れて分散した。短い時間の後、再度電圧をかけると、選択的な補足が再度起こった。この過程は、アミロイド凝集物を再現よく処理するというこの技術の性能を示すと同様に、捕捉がＤＣ−ｉＧＤＥＰの結果であること確認するために、何度も繰り返した。原繊維は、鋸歯状で区切ったチャネルの先端近くに集まった。捕捉の位置から、これらの実験条件下において、原繊維は正の誘電泳動と一致する特性を示すことを示している。すなわち濃縮点は最も電場が強い位置であることを意味している（S. J. R. Staton, K. P. Chen, T. J. Taylor, J. R. Pacheco and M. A. Hayes, Electrophoresis, 2010, 31, 3634-3641 ; H. A. Pohl, Dielectrophoresis, Cambridge University Press, 5 Cambridge, 1978; K. P. Chen, J. R. Pacheco, M. A. Hayes and S. J. R. Staton, Electrophoresis, 2009, 30, 1441-1448.）。古典的な理論によれば、正の誘電泳動の捕捉を受ける粒子は、周囲媒質よりも浸透性が低い。アミロイド凝集物の非特異的な吸収が、チャネル表面に沿って観察された。表面処理や塗装はなく、非特異的なタンパク質の吸収は、ＰＤＭＳチャネルで一般的である。
【００５３】
原繊維を濃縮するＤＣ−ｉＧＤＥＰ法の性能が、分離前のチャネル内のバックグラウンドレベル、及び捕捉が検出されていない領域と比べて、捕捉点における蛍光強度を調べることにより、半定量的に評価された。原繊維の量は、電圧に依存して、約３５０％から５００％を超える範囲であった（実施例２参照）。しかしながら、より少ない原繊維添加によるより理想的な条件においては、潜在的な捕捉効果は６００％（単にバックグランド蛍光強度を引くことによる）にもなる。最大値は、６００Ｖで、５２０％であった。
【００５４】
本研究の全体的な目標は、成熟アミロイド原繊維形成の間に生じる全範囲の凝集構造物を分離、捕捉、濃縮することである。Ａβモノマーではなく成熟Ａβ原繊維が、この装置と記載した実験条件を用いて、捕捉、濃縮されることを、ここに示した実験の結果は証明している。ＣＯＳＭＯＬ（有限要素法のマルチフィジックスモデリングソフト）計算は、実験で試されていない、択一的に装置設計のパラメータを探索することによる、装置設計開発を可能とした。ＣＯＳＭＯＬによるモデリングでは、現行のＤＣ−ｉＧＤＥＰ装置設計において、Ａβモノマーは幾つかの理にかなった実験条件で捕捉されないと確認された。装置の粒子捕捉の電圧（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）のに用いられたモデルの詳細は、実施例２に示す。また、最も小さい鋸歯状のギャップ距離を、現行設計の２７μｍから、〜１０ｎｍに減らすことにより、全ての中間物と共にモノマーを補足するのに必要な増強した電場勾配力が生み出されるであろうこともモデリングは予測した。電気泳動及び誘導泳動の特性に基づいて、アミロイド凝集物、オリゴマー、及びモノマーをモデリングすることにより、特有の生体試料を捕捉し、チャネルの長さに沿ってそれらを配置することに適合する一方で、装置設計開発の速度が加速された。
【００５５】
結論として、ＤＣ−ｉＧＤＥＰが、Ａβモノマーは捕捉しないが、Ａβアミロイド原繊維を操作し、選択的に捕捉することに用いられることを証明した。ＤＣ−ｉＧＤＥＰは、費用効果の良いプラットフォームにおいて、原繊維の高濃縮（５２０％まで）と、短時間の分析（１〜１５分）をうまく組み合わせた。ＰＤＭＳを用いたＤＣ−ｉＧＤＥＰマイクロ装置の製造と運転は、非常に簡単である。この試験と関連するシュミレーションによれば、この技術が、モノマーと成熟原繊維の間の、様々なＡβ凝集物構造物の中間体を素早く単離、濃縮できる能力を有していることを示している。アミロイド凝集物の単離と特性を明らかにする、新たな素早くそして穏やかな分離技術の開発は、アミロイドに関連する疾病における、タンパク質凝集の役割を理解するために、非常に重要である。
【００５６】
［実施例２］
Ａ）ＤＣ−ｉＧＤＥＰ装置製作の詳細
ＤＣ−ｉＧＤＥＰは、一般的なフォトリソグラフィー、成型加工、接着の技術を用いて製造された（C. Mack, Fundamental Principles of Optical Lithography: The Science of Microfabrication, Wiley, Hoboken, 2008.）。フォトマスクはＡｕｔｏＣＡＤで設計され（Ａｕｔｏｄｅｓｋ；  サンラフェル，  ＣＡ，  ＵＳＡ）、フォトリソグラフィーのポジティブスタンプはＡＺ  Ｐ４６２０フォトレジスト（ＡＺ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ；  ブランチバーグ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）、及びコントラスト強調材料ＣＥＭ３８８ＳＳ（Ｓｈｉｎ−Ｅｔｓｕ  ＭｉｃｒｏＳｉ；  フェニックス，  ＡＺ，  ＵＳＡ）を用いて製造された。装置のチャネルは、顕微鏡のスライドカバープレートとポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から製造された。ＰＤＭＳチャネルは、Ｓｙｌｇａｒｄ１８４シリコンエラストマーキットＰＤＭＳ（Ｄｏｗ／Ｃｏｒｎｉｎｇ；  ミッドランド，  ＭＩ，  ＵＳＡ）を用いて鋳造された。簡単には、装置のＰＤＭＳ部分が製造された後、穴あけパンチを用いて貫通孔を形成し（直径３ｍｍ、ＰＤＭＳの０．５〜１ｃｍを貫通して）、それから、装置のＰＤＭＳ部分は、密着接着に続くプラズマ酸化によって、ガラスカバープレートでシールされた（K. Haubert, T. Drier and D. Beebe, Lab Chip, 2006, 6, 1548-1549.）。ＤＣ−ｉＧＤＥＰチャネルの分離部分の構造は、局所的な電場勾配が生じるように隙間が広がった、連続する三角形状のユニットで構成されている。隔離しているＰＤＭＳの６０°三角形は、底辺６μｍ、高さ５．２μｍで始まる。その辺長と幅は、６個の繰り返しごとに、４０μｍ増え（図３）、結果として最初のギャップ距離が９４５μｍ、最後のギャップ距離が２７μｍとなる。ＤＣ−ｉＧＤＥＰのチャネルの分離部分は、穴あけパンチによって形成された二つの貯蔵部と接続されている。その貯蔵部から、試料とバッファーは、チャネルに導入される。チャネルの深さは１３から１６μｍの範囲である。
【００５７】
試料は大きいギャップ距離を持つチャネル端部の貯蔵部から導入される。試料導入後、白金線電極（プラチナ線電極、直径０．４０４ｍｍ、純度９９．９％；Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ；  ワード・ヒル，  ＭＡ，  ＵＳＡ）を、溶液と接触するように、各貯蔵部に設置し、電力供給源（Ｓｅｒｉｅｓ  ２２５、Ｂｅｒｔｒａｍ）と接続させた。電圧は、実験に応じて、０と１０００Ｖの間の電位で、１〜１５分間、適用された。可視化は、ＯＳＲＡＭの水銀短アーク灯Ｈ３０  １０３  ｗ／２、及びオリンパスＤＡＰI、ＦＩＴＣ、テキサスレッド、トリプルバンドパスキューブ（Ｏｌｙｍｐｕｓ；  センターバレー，  ＰＡ，  ＵＳＡ）と共に、オリンパス倒立顕微鏡ＩＸ７０を用いて行った。
【００５８】
ビデオと画像は、モノクロＱＩＣＡＭ冷却ＣＣＤカメラ（Ｑｌｍａｇｉｎｇ，  Ｉｎｃ．；  サリー，  ＢＣ，  Ｃａｎａｄａ）と、ＳｔｒｅａｍｐｉｘＩＩＩ  ｉｍａｇｅ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎｏｒｐｉｘ，  Ｉｎｃ．；  モントリオール，  ＱＣ，  Ｃａｎａｄａ）を用いて集めた。蛍光強度は、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ；  ベセスダ、ＭＤ）を用いて分析した。３つの異なる対象領域（ＲＯI）を選択した（図７）。対象領域は、捕捉領域（ゲート）、チャネル内のバックグラウンド領域（陥凹）、及びチャネル外のバックグラウンド（ＰＤＭＳ）を示す。表２は、図７と同じＲＯＩを使用している。表３は、同じ領域で起きた単離について多数回分析（ｎ＞３）した結果を示している。チャネルの外側の装置のバックグラウンドと同様に、試料で満たされたマイクロ流体チャネルの残り部分と比較して、捕捉領域の蛍光原繊維の量を決定するために、様々なＲＯＩの割合を用いた。それぞれのＲＯＩは、同じ大きさであった。
表２  ＲＯＩ内の原繊維試料の蛍光強度値
【００５９】
【表２】
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【００６０】
Ｂ）Ａβ（１−４０）モノマーと原繊維の調製
Ａβ（１−４０）モノマー及び原繊維試料は、上記に記載したように調製した（R. Picou, J. P. Moses, A. D. Wellman, I. Kheterpal and S. D. Gilman, Analyst, 2010, 135, 1631-1635; R. A. Picou, I. Kheterpal, A. D. Wellman, M. Minnamreddy, G. Ku and S. D. Gilman, J Chromatogr. B, 2011, 879, 627-632; B. CWuallain, A. K. Thakur, A. D. Williams, A. M. Bhattacharyya, S. Chen, G. Thiagarajanand R. Wetzel, in Methods Enzymol. 2006, 413, 34-74.）。簡単には、Ａβ（１−４０）ペプチド（Ｗ．Ｍ  Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ； ニューヘイブン，  ＣＴ）及びカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）ラベル化Ａβ（１−４０）ペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ  Ｉｎｃ．； フリーモント，  ＣＡ）は、まず、前から存在する凝集物を除くために、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）で処理した。Ａβモノマー試料について、溶媒を蒸発させ、ペプチドを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．７９）に溶解した。ＦＡＭ−Ａβ（１−４０）モノマーは、質量比１：４で、Ａβ（１−４０）と混合させた。モノマー溶液のＡβの総量は、以前記載ように、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ-ＵＶを用いて、２１５ｎｍの検出で、３０μＭに決定した（R. Picou, J. P. Moses, A. D. Wellman, I. Kheterpaland S. D. Gilman, Analyst, 2010, 135, 1631-1635; R. A. Picou, I. Kheterpal, A. D. Wellman, M. Minnamreddy, G. Ku and S. D. Gilman, J Chromatogr. B, 201 1, 879, 627-632; B. O'Nuallain, A. K. Thakur, A. D. Williams, A. M. Bhattacharyya, S. Chen, G. Thiagarajanand R. Wetzel, in Methods Enzymol. 2006, 413, 34-74.）。
【００６１】
Ａβ（１−４０）原繊維試料について、ＴＦＡを蒸発させ、ペプチドをＨＦＩＰに溶解させた。それぞれのペプチドの濃度は、ＨＰＬＣ−ＵＶを用いて決定した。ＦＡＭ−Ａβ（１−４０）モノマーは、質量比１：４で、Ａβ（１−４０）と混合させた。ＨＦＩＰを蒸発させ、ペプチド混合物を徐々に、等量の２．０ｍＭ  ＮａＯＨと、２２．８ｍＭリン酸塩、２７４ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％ＮａＮ３を含む２Ｘ  リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）とに溶解した。試料を、４℃で最小限の１０時間（１０ｈ）、５００００ｇで遠心した。原繊維形成は、前の原繊維合成から、上澄に少量の原繊維凝集物（総Ａβモノマーが０．１重量％）を添加することにより始まった。混合物は３７℃で７日間（７ｄ）放置した。原繊維形成の間、モノマーの消耗を、上記に記載した、ＨＰＬＣ-ＵＶを用いた２１５ｎｍの検出により監視した（R. Picou, J. P. Moses, A. D. Wellman, I. Kheterpaland S. D. Gilman, Analyst, 2010, 135, 1631-1635; R. A. Picou, I. Kheterpal, A. D. Wellman, M. Minnamreddy, G. Ku and S. D. Gilman, J Chromatogr. B, 201 1, 879, 627-632; B. O'Nuallain, A. K. Thakur, A. D. Williams, A. M. Bhattacharyya, S. Chen, G. Thiagarajanand R. Wetzel, in Methods Enzymol. 2006, 413, 34-74.）。原繊維の成長は、ＴｈＴ蛍光を用いて、完了するまで（５〜７日間）監視し、電子顕微鏡によって原繊維の量を測定した。ＤＣ−ｉＧＤＥＰ分析のＡβ（１−４０）モノマー試料と直接比較するため、原繊維試料は、ＰＢＳから１０．００ｍＭ  Ｔｒｉｓ電気泳動バッファー（ｐＨ７．７９）に交換した（I. Kheterpal, S. Zhou, K. D. Cook and R. Wetzel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 13597- 13601.）。全ての試料のモノマー等量濃度は、ＨＰＬＣ−ＵＶによって、３０μＭに決定した。
【００６２】
Ｃ）ＣＯＳＭＯＬの正確なモデリング
鋸歯状にパターン化されたマイクロ流体チャネル内の粒子の動きの理解、解釈を促進するために、マイクロ装置内の電場分布を数値的に決定し、プロットした。これは、有限要素法のソフト、ＣＯＳＭＯＬマルチフィジックス４．１（ＣＯＭＳＯＬ，  Ｉｎｃ．，  バーリントン，  ＭＡ）を用いて、「電動メディアＤＣ」（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｍｅｄｉａ  ＤＣ）モードで行った。このモードで作成されたモデルは、水溶液媒介中の電場強度の時間依存的な計算である。ＣＯＳＭＯＬは、チャネル全体における、あらかじめ定義された網目状の様々な点の電位分布のため、ラプラス方程式、∇２（φ）＝０、を解くことで電場を算出した。境界の条件は、チャネルの入口、出口、電気的な隔離部におけるチャネルの壁のそれぞれの電位によって定められた。
【００６３】
主要なチャネル構造の適当なスケールのモデルを作製し、ＣＯＳＭＯＬ環境に取り込んだ。モデルを単純化するため、チャネルの２Ｄ近似値を利用した。別個の貯蔵部の電極の設置、及びチャネルの幅と深さの高い割合のため、電位におけるチャネル深さの効果は無視される。電場分布上の粒子の効果もまた無視される。
【００６４】
貯蔵部−チャネル接続は、実験の間使用されるものと同様に、予め電位がセットされる。ＶｉｎｌｅｔとＶｏｕｔｌｅｔは、それぞれ、０Ｖと５５０Ｖである。他のすべての境界（ＰＤＭＳとガラス壁）は、完全に絶縁（隔離）されている；近似は、チャネル壁と液体媒体の間の導電率の大きな差異により、正当化される。導電率と、相関する媒体の誘電率は、それぞれ、１．２Ｓ／ｍと７８に設定した。この導電率は、一般的なＰＢＳを用いて得ることができる値と一致する。
【００６５】
三角形状の網目状は、チャネル領域全体に適用した。網目には、約９７０００の三角形の構成部分及び６８０の頂点の構成部分が含んでいた。有限要素分析を通して、ソフトフェアは、それぞれの網目状ポイントにおける電位を近似する。これらの数値から、動電学的な力や誘導泳動に関連する他の有用なパラメータ、例えば電場力、｜Ｅ｜や、電場の２乗の勾配、∇｜Ｅ｜２などが測定できるかもしれない。内蔵のツールにより、結果値の図示化が可能である。
【００６６】
誘電泳動力は、∇｜Ｅ｜２に比例しているので、チャネルの中心線に沿った誘導泳動の強度は、２Ｄカットラインを用いたＣＯＳＭＯＬモデルから導き出せる。このひとまとまりの結果からの局所的な最大値は、鋸歯のパターンに沿って、チャネルの締め付け部分、又はゲートに対応している。∇｜Ｅ｜２の数値をゲート幅の関数としてプロットした場合、その関係は、べき関数として近似できる（図８）。この方法によるデータの可視化から、チャネルの幾何学的な収縮が増えるにつれ、誘導泳動力が素早く拡大縮小することが説明される。
【００６７】
他の項目の中では、誘導泳動力は粒子サイズに比例している。タンパク質モノマーのような小さな粒子の捕捉には、より大きな∇｜Ｅ｜２が必要とされるであろう。図８は、非常に大きい∇ ｜Ｅ｜２値が、ゲートの収縮比率を大きくすることで得られることを示している。以下の仮説と図８で求めた∇｜Ｅ｜２値を用いることで、Ａβモノマーの捕捉には、〜１０ｎｍのゲート幅で十分であることが分かった。この計算に用いた仮定は、無視できる電気浸透流があり、Ａβモノマーは直径〜２．５ｎｍの球状であり、モノマーのμＥＰが１．２×１０−４ｃｍ２／（Ｖｓ）であり、媒体の粘度と誘電率は水と同等であり、Ａβモノマーの導電率は媒体溶液よりも優位に小さいこと、である。
【００６８】
上記の明細書は、発明を全体として開示し、全体として実施可能としているが、ここに付加されたクレームによっても定義される、発明の範囲に限定することを意図するものではない。
【００６９】
全ての公開物、特許、特許文献は、参照によりここに組み込まれる。上記の明細書において、この発明はある態様との関係で記載され、説明を目的として多くの詳細な説明がされているが、当業者であれば、発明には追加の態様が許容されており、ここに記載されたある詳細は発明の基本原理から外れなければかなり広げられることは、明らかであろう。
【００７０】
ここに別な示唆があり、又は内容に矛盾しない限りは、発明を記載する文脈における、「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」及び同様の指示句の用語の使用は、単一及び複数の両方を意味するものと解釈される。他に断りのない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、制限のない用語（例えば「含むがそれに限定されない」の意味として）として解釈される。ここに別の示唆がない限りは、数値範囲の列挙は、範囲内に含まれるそれぞれの分離した数値を個々に引用する略式的な記載として用いることを意図している。そして、それぞれの分離した数値は、そこに記載されているかのように、明細書中に組み込まれている。ここに別な示唆がある、又は内容に矛盾しない限りは、ここに記載のすべての方法はあらゆる適切な方法により実施できる。他に主張されていない限り、ここで用いられる、幾つかの又は全ての具体例、又は例示的言語（「例えば（ｓｕｃｈ  ａｓ）」など）の使用は、単に発明をより分かりやすくすることを意図しており、発明の範囲の限定を意図するものではない。明細書中の言語は、発明の実施に必須として、ク主張されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【００７１】
この発明の態様は、発明を実施するために発明者が知るベストな様式を含むように、ここに記載されている。そのような態様の変動は、当業者が上記の明細書を読むことで明らかになるであろう。発明者らは、当業者が、適切な方法でそのような変動を採用することを予測しており、発明者らはここに具体的に記載されていない他の方法で実施される発明も意図している。従って、本願発明は、準拠法で許されるように、ここに付加されるクレームに記載された主題の全ての改良及び類似を含む。さらに、別な示唆があり、又は内容に矛盾しない限りは、全ての可能な変化において、上記記載の要素のあらゆる組み合わせが本願発明には含まれる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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