(57)【要約】本発明は一般に、皮膚外観の向上の分野に関する。本発明の一態様は、より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の低減又は予防に使用するための、４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物を提供することを目的とする。本発明はまた、より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の低減又は予防のための、４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物の美容的使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
まだら症、白斑、損傷又は炎症に関連した皮膚状態、アジソン病、クッシング病、黒色表皮腫及び甲状腺疾患から成る群より選択される状態から生じる、より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の低減又は予防に使用するための、４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物。
【請求項２】
４−オキソ−２−ペンテン酸が、ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５又はビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００から得ることができる、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
組成物１ｋｇ当たり少なくとも１ｍｇ、好ましくは組成物１ｋｇ当たり少なくとも１０ｍｇ、例えば組成物１ｋｇ当たり５０ｍｇ〜５０ｇの量で４−オキソ−２−ペンテン酸を含む、請求項１又は２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
体重１ｋｇ当たり２μｇ〜２０ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸、好ましくは体重１ｋｇ当たり２０μｇ〜２ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸、例えば体重１ｋｇ当たり４０μｇ〜１ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸に相当する一日量で投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
食品組成物、医薬組成物、食品添加剤、機能性食品、飲料、ペット食品組成物、粉末、クリーム、ローション又はゲルから成る群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の低減又は予防のための、４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物の美容的使用。
【請求項７】
美白のための、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域が、黒子、母斑、黒皮症、そばかす、年齢によるしみ又はこれらの組合せから成る群より選択される、請求項６又は７に記載の使用。
【請求項９】
４−オキソ−２−ペンテン酸が天然源から得られた、請求項６〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
４−オキソ−２−ペンテン酸が、ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５又はビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００から得ることができる、請求項６〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
組成物が、組成物１ｋｇ当たり少なくとも１ｍｇ、好ましくは組成物１ｋｇ当たり少なくとも１０ｍｇ、例えば組成物１ｋｇ当たり５０ｍｇ〜５０ｇの量で４−オキソ−２−ペンテン酸を含む、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
組成物が、体重１ｋｇ当たり２μｇ〜２０ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸、好ましくは体重１ｋｇ当たり２０μｇ〜２ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸、例えば体重１ｋｇ当たり４０μｇ〜１ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸に相当する一日量で投与される、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
組成物が局所投与される、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
組成物が経口投与される、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
組成物が、食品組成物、食品添加剤、飲料、ペット食品組成物、化粧品組成物、粉末、クリーム、ローション又はゲルから成る群より選択される、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［説明］
本発明は一般に、皮膚の外観を向上させる分野に関する。本発明の一態様は、より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の低減又は予防に使用するための、４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物を提供することを目的とする。本発明はまた、より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の低減又は予防のための、４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物の美容的使用に関する。
【０００２】
皮膚は、人体で最大の器官である。皮膚は、環境に対する我々の防御の第一線であり、病原微生物から身体を保護し、過剰な水の喪失を予防する。皮膚の構造組織及び皮膚を構成する細胞の幅広い種類のため、皮膚は、創傷治癒、免疫応答、体温調節及びビタミンＤ生成を含む、広範囲の生物学的機能を確保している。皮膚は、皮膚における茶色色素であるメラニンを生成するメラノサイト細胞を介して、日焼け止めにも関与する。
【０００３】
皮膚色は、メラニンの量及び種類によって主に決定される。より少ないメラニンの量ではより明るい皮膚色が生じるが、より多い量ではより暗色の皮膚色が生じる。皮膚における色素沈着過剰は、皮膚におけるメラニンの過剰発現又は蓄積により引き起こされる。その結果、メラニン生成に関与する経路が、生成レベルを低減するために多数の阻害剤の標的となってきた。メラニン経路に関与する主要な酵素の１つが、酸化によるチロシンからのメラニンの生成を触媒するチロシナーゼである。
【０００４】
メラニンの合成は、メラノサイト刺激ホルモンと前駆体プロオピオメラノコルチンから生成される副腎皮質刺激ホルモンペプチドとを含む、ホルモン制御下でのプロセスである。メラニンの合成は、チロシナーゼのトランスクリプトーム調節を介して、ＵＶＢ放射によっても刺激される。
【０００５】
皮膚における色素分の発現を改変して、均一な皮膚の色合い又はより明色の皮膚の色合いを促進することができれば、今日の多数の社会において非常に望ましい。一般的な懸念は、周囲の皮膚と調和しない色素沈着、例えば黒子、母斑、そばかす、年齢によるしみ又は白斑を有する、皮膚の領域に関する。その他の人々は、日光にさらされることにより引き起こされる、皮膚の暗色化を低減することを望んでいる。これらの必要を満たすために、色素沈着を低減又は予防する組成物を開発しようとする多数の試みがなされてきたが、これまでに開発された組成物は、低効率、望ましくない副作用又はこれらの両方を有する傾向がある。低色素沈着（皮膚色の喪失）を引き起こすことが知られた、異なる作用物質についての総説が公開されている（Ｆ．Ｓｏｌａｎｏら、Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９、５５０〜５７１（２００６年））。
【０００６】
５０年以上にもわたって、ヒドロキノンは、皮膚への適用時に色素沈着を低減することが知られている。ヒドロキノンは、とりわけチロシナーゼの作用を阻害することにより、メラニンの生成を阻害する。残念ながら、ヒドロキノンは、細胞毒性及び皮膚刺激性等の副作用のため欠点を有することがある。ヒドロキノンは、いくつかの国で一般用化粧品向けに禁止されている。
【０００７】
皮膚の色素沈着を低減することを意図されたその他の外用製剤は、コウジ酸、アスコルビン酸、過酸化水素、コロイド状硫黄及びモノベンゾンを含むものであった。モノベンゾンは、ヒドロキノンのモノベンジルエーテルである。しかしながら、これらの作用物質は、潜在的な安定性及び／又は安全性の問題のため望ましくない。ヒドロキノン等のコウジ酸はチロシナーゼ阻害剤であるが、アレルギー及び皮膚刺激性等の望ましくない副作用を同様にもたらす恐れがあり、しばしば化粧品配合物中で不安定である。色素沈着を予防又は低減するために時折使用されるアスコルビン酸は、容易に酸化される恐れがあり、しばしば化粧品等の高い含水量を有する組成物中で不安定である。アスコルビン酸は、微量の金属イオンが存在するときフリーラジカルの大幅な増大を誘導することがあるため、悪影響を引き起こす恐れもある。過酸化水素溶液は、保存安定性及び安全性に問題を有することがある。コロイド状硫黄は異臭を有するので、美白剤の成分として使用するのが困難なことがある。モノベンゾンは、メラノサイトの破壊及び永久的な脱色を引き起こす恐れがある。モノベンジルは、白斑以外の皮膚状態には推奨されない。
【０００８】
レーザー処理及びケミカルピールが提案されてきたのと同様に、外用レチノイド及び外用コルチコステロイドが色素脱失剤として提案されてきもしたが、しばしば望ましい応答に達しなかった。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を有する美白組成物が、国際公開第２０１０／０６６６３９号で説明されている。
【０００９】
天然材料は、アジア及びヨーロッパで数百年間、皮膚を漂白する又は色白の皮膚の外観を向上させる試みに使用されてきた。これらには、レモン、オレンジ、キュウリ、イチョウ、イナゴマメ、エイジツ、ゲンノショウコ、ニッケイ、スイートマージョラム及びマンネンロウの使用が挙げられる。
【００１０】
異常な色素沈着に関連した障害に対処するため又は皮膚の色合いを明色化するために、皮膚への局所適用時にチロシナーゼ活性を低減する様々な化合物が提案されてきた。残念ながら、現在利用できる処置は、特に特定の外用剤を用いると起きる恐れがある皮膚刺激性等の副作用の観点から完全に満足なものではない。
【００１１】
したがって、利用できる処置選択肢の範囲を広げ、その結果、選択及び個人の必要への順応を向上させるためには、いくつかの従来技術の欠点を有さず、より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域を低減又は予防する、更なる組成物を利用できるようにすることが非常に望ましいであろう。特に、天然源から有効成分を得られる有効な組成物を見出すことは望ましいであろう。
【００１２】
本発明の目的は、現況技術を改善すること、特に、より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の低減又は予防に使用するための組成物を提供して、上述した欠点の少なくとも一部を克服することである。
【００１３】
本発明者らは、本発明の目的が独立請求項の主題により達成され得ることを見出して驚いた。従属請求項は、本発明の着想を更に発展させている。
【００１４】
驚くべきことに、４−オキソ−２−ペンテン酸がメラニンの生成を有効に抑制することが、本発明者らにより見出された。本発明者らは、メラニン合成の最初のステップに関与する酵素である、チロシナーゼの生成が４−オキソ−２−ペンテン酸により減少することも見出した。
【００１５】
本発明者らはまた、４−オキソ−２−ペンテン酸をいくつかの細菌菌株から得ることができることを見出して驚いた。例えば、ビフィドバクテリウム・ブレヴェ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）ＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５及びビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）の細菌調製物は両方とも、６時間９０℃で加熱されたときに４−オキソ−２−ペンテン酸を産生した。４−オキソ−２−ペンテン酸は、熱処理された細菌調製物を遠心分離及びろ過した後、可溶性画分の中にあることが見出された。
【００１６】
ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５を、ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ  ＮＡＴＩＯＮＡＬＥ  ＤＥ  ＣＵＬＴＵＲＥＳ  ＤＥ  ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＥＳ（ＣＮＣＭ）、ＩＮＳＴＩＴＵＴ  ＰＡＳＴＥＵＲ、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅ、２００７年１１月１５日によって沈着した。
【００１７】
ビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡから商標ＡＴＣＣ１５７００の下で購入することができる。
【００１８】
結果として、本発明は部分的に、より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の低減又は予防に使用するための、４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物に関する。
【００１９】
本発明は、より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の低減又は予防ための組成物の調製への、４−オキソ−２−ペンテン酸の使用にも関する。
【００２０】
暗色の色素沈着を有する皮膚の領域は、損傷又は炎症に関連した皮膚状態、切創、やけど又はにきび（ａｃｎｅ  ｂｒｅａｋｏｕｔ）から生じ得、したがって、より暗色の皮膚の色素沈着の低減は、治療手段の修復ステップと考えることができる。
【００２１】
皮膚の暗色の色素沈着は通常、色素沈着過剰と呼ばれる状態の、局所領域へのメラニンの蓄積の結果である。色素沈着過剰には、アジソン病、クッシング病、黒色表皮腫、甲状腺疾患及び黒皮症を含む、いくつかの疾患が伴う。したがって、色素沈着過剰の予防は、本発明の予防用の用途である。
【００２２】
結果として、本発明の組成物は、治療への使用のためのものであり得る。４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物は、まだら症、白斑、損傷又は炎症に関連した皮膚状態、アジソン病、クッシング病、黒色表皮腫及び甲状腺疾患から成る群より選択される状態から生じる、より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の低減又は予防に使用するためのものであり得る。白斑は、皮膚の部分の脱色を引き起こす状態である。白斑の場合、本発明によるより暗色の色素沈着を有する皮膚の領域は、冒されていない領域であってよい。
【００２３】
４−オキソ−２−ペンテン酸は、ＣＡＳ番号４７４３−８２−２及び下記の式
【化１】
2015517987.tif 000002
を有する。
【００２４】
「より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の低減」は、より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の合計面積の低減及び／又はより暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の数の低減及び／又はこうした皮膚の領域の色素沈着の暗さの低減を意味すると理解されている。「より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の予防」は、より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の形成の完全又は部分的な予防を含むと理解されている。皮膚の領域はサイズが限定されず、体表面の全体にわたって拡大することができる。
【００２５】
本発明は、４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物の治療以外への使用も提供する。本発明の一実施形態は、より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の低減又は予防のための、４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物の美容的使用であり得る。
【００２６】
本発明は、美白における４−オキソ−２−ペンテン酸の美容的使用を提供することができる。美白は、皮膚の領域における皮膚の色素沈着の総合的な度合いを低減する行為である。美白は、一部の人々には、日光にさらされた効果を後退させるため又は特定の文化において生じるより明色の皮膚に対する流行に追従するために望ましいと考えられることがある。
【００２７】
本発明は、より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の低減又は予防における、４−オキソ−２−ペンテン酸の美容的使用を更に提供することができ、ここで、より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域が、黒子、母斑、黒皮症、そばかす、年齢によるしみ又はこれらの組合せから成る群より選択される。これは、皮膚色素欠陥のない均一な顔色を多数の人々が美的に望ましいと考えるため有利である。
【００２８】
本発明では、４−オキソ−２−ペンテン酸を得ることができ、例えば天然源から得ることができる。多数の人々が、化学原料から工業的に合成される材料の安全性について懸念しており、これらの材料が摂取されることになる場合は特に、天然源から得られた材料を好んでいる。
【００２９】
驚くべきことに、本発明者らは、いくつかの系統の細菌が４−オキソ−２−ペンテン酸の天然源をもたらすことを見出した。特に、本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸をビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５又はビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）（ビフィドバクテリウム・ブレヴェの基準系統）から得ることができることを見出した。大量の４−オキソ−２−ペンテン酸の生成が例えば生物反応器を用いて実現可能であるとき、４−オキソ−２−ペンテン酸の供給源として細菌を使用することは、特に有利である。したがって、本発明では、４−オキソ−２−ペンテン酸が入手可能になり得、例えばビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５又はビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）から得られる。
【００３０】
細菌は、商業的な生成プロセスにより約６０〜１８０℃、好ましくは約８０〜１６０℃、例えば約１１０〜１５０℃で熱処理することができる。本発明者らは、これらの温度での熱処理が、許容される時間内で満足な収率の４−オキソ−２−ペンテン酸をもたらしたことを見出した。理論に拘束されることを望むわけではないが、熱処理の温度を増大させると、４−オキソ−２−ペンテン酸の形成の速度が増大するが、分解の速度も増大すると理解されている。したがって、これらの温度は、４−オキソ−２−ペンテン酸の形成の速度と分解との間に良好なバランスを与える。
【００３１】
４−オキソ−２−ペンテン酸を含む一般的な組成物は、少なくとも１ｍｇ／組成物１ｋｇの量で４−オキソ−２−ペンテン酸を含み得る。一般に、組成物が少なくとも１０ｍｇ／組成物１ｋｇの量で、例えば組成物１ｋｇ当たり５０ｍｇ〜５０ｇの量で４−オキソ−２−ペンテン酸を含むならば好ましい。
【００３２】
投与しようとする４−オキソ−２−ペンテン酸の最適量は、熟練技術者ならば容易に決定することができる。
【００３３】
治療用途では、組成物は、障害及び／又はその合併症の症状を少なくとも部分的に治癒又は停止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療有効用量」と規定されている。この目的に有効な量は、障害の重症度並びに患者の重量及び全身状態等、当業者に知られたいくつかの因子に依存する。
【００３４】
予防用途では、本発明による組成物は、障害を進行させる危険性を少なくとも部分的に低減するのに十分な量で、特定の障害の危険性に影響されやすい又は危険性がある患者に投与される。このような量は、「予防有効用量」であると規定されている。更に、正確な量は、患者の健康状態及び重量等のいくつかの患者特異的因子に依存する。
【００３５】
美容的使用のためには、本発明による組成物は、個人の身体的外観の視認可能又は触知可能な欠陥を少なくとも部分的に低減するのに十分な量で個人に投与される。このような量は、「美容有効用量」と規定されている。更に、正確な量は、個人の性別、人種、顔色、年齢又は健康状態等のいくつかの個人特異的因子に依存する。
【００３６】
一般に、本発明の組成物は、治療有効用量、予防有効用量又は美容有効用量で投与することができる。
【００３７】
本発明の組成物は、体重１ｋｇ当たり２μｇ〜２０ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸、好ましくは体重１ｋｇ当たり２０μｇ〜２ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸、例えば体重１ｋｇ当たり４０μｇ〜１ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸に対応する一日量で投与することができる。
【００３８】
色素沈着、例えばそばかす又は年齢によるしみを低減するために皮膚の特定の領域を標的とすることが有利であり得、ここで、目的は周囲の皮膚領域の色を調和させることである。組成物の局所適用は、このような標的化送達を可能にする。したがって、本発明において、組成物は局所投与することができる。
【００３９】
本発明による組成物は、経口投与することもできる。これは、迅速で比較的制限のない投与方式により組成物が皮膚全体に一括で作用するという利点がある。
【００４０】
より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域は、動物並びにヒトを冒し得る。したがって、ヒト、ペット又は家畜に投与される組成物を提供することは利点である。組成物は、美的に快くあるべきペットに対する所有者の満足を向上させることができ、皮膚色素沈着の欠陥は、品評会における動物の成功を限定し、動物の知覚価値を低減することがある。本発明は、ヒト、ペット又は家畜に投与することができる組成物を提供する。
【００４１】
４−オキソ−２−ペンテン酸及び本発明で説明した組成物は、成体及び／又は年長者に投与することができる。
【００４２】
対象は、相対的に成熟した年齢ならば、成体だと考えられる。一般的に、対象は、性的に成熟しており繁殖できる場合、成体だと考えられる。
【００４３】
対象は、出生国における平均期待寿命の最初の３分の２を超過したならば、好ましくは出生国における平均期待寿命の最初の４分の３を超過したならば、より好ましくは出生国における平均期待寿命の最初の５分の４を超過したならば、「年長者」だと考えられる。例えば、２０１０年に英国で誕生したヒトの男性は、英国のＯｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓによれば誕生時に７８年の平均余命を有し、したがって、５２歳超、好ましくは５８歳６か月超、より好ましくは６２歳５か月超の年齢において年長者だと考えられる。ペット及び家畜においては、種及び品種を考慮に入れるべきである。例えばヨークシャーテリア犬は、約１２年の平均余命を有し（Ｅ．Ｊ．Ｔａｙｌｏｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、５４、６４５〜６５６（１９９５年））、そのため、８歳超、好ましくは９歳超、より好ましくは９歳７か月超の年齢において年長者だと考えられる。
【００４４】
年齢によるしみ（日光黒子）、雀斑、肝斑及び黒皮症（褐色斑としても知られている）等のより暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の発生は、しばしば、日光又はサンベッド（ｓｕｎｂｅｄ）からの紫外線放射に長期的にさらされることに起因している。より長く生きてきた人々は、より長く紫外線にさらされてきた可能性がより高い。本発明の組成物は、成人及び／又は年長者に投与することができる。
【００４５】
組成物の性質は特に限定されない。より暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の低減又は予防に使用するための組成物は、食品組成物、医薬組成物、食品添加剤、機能性食品、飲料、ペット食品組成物、粉末、クリーム、ローション又はゲルから成る群より選択することができる。機能性食品は、健康上の利益をもたらす、（強化食品、経口サプリメント又は栄養補助食品のような）食品である。本発明による組成物は、選択した投与方法のために通常利用できる生薬形態のいずれであってもよい。担体は、検討中の組成物の種類に応じて多様な性質になり得る。
【００４６】
美容的使用のための組成物は、食品組成物、食品添加剤、飲料、ペット食品組成物、化粧品組成物、粉末、クリーム、ローション又はゲルから成る群より選択することができる。
【００４７】
本発明による食品組成物は特徴が多様であり、例えば、牛乳、ヨーグルト、チーズ、発酵乳、牛乳を主体とする発酵製品、アイスクリーム、穀類を主体とする製品又は発酵した穀類を主体とする製品、牛乳を主体とする粉末、チルドした飲物又は常温保存可能な飲物、菓子類、動物飼料、特に飼育動物用の動物飼料である。
【００４８】
食品組成物は、タンパク質源、炭水化物源、脂質源、ミネラル源及び／又はビタミン源を更に含んでいてもよい。タンパク質、炭水化物、脂質、ミネラル及び／又はビタミンの存在は、いくつかの利点を有することがある。これらの化合物は、最終製品の味及び口触りに一般に寄与し、有益な栄養素を身体に供給する。これらの化合物は、完全栄養処方としての本発明の組成物の配合も可能にし、その結果、更なる栄養が必要にならない。
【００４９】
水溶性の化合物は、多くの方法で、例えば、液剤として又はカプセル剤若しくは錠剤で経口的に、吸入により、局所適用用の水性ゲル剤又はクリーム剤で、浴用石けん、シャワーゲル若しくはシャンプーで、又は点眼薬、点鼻薬若しくは点耳薬として簡便に投与できるという利点がある。４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物は、水を主体とすることができ、例えば組成物は、水に溶解した４−オキソ−２−ペンテン酸を含んでいてよい。
【００５０】
当業者ならば、明細書で開示されている本発明のすべての特徴を自由に組み合わせることができることは理解されよう。特に、本発明の異なる実施形態について説明した特徴は、組み合わせることができる。例えば、治療への使用のための組成物について説明した特徴は、本発明の美容的使用について説明した特徴と組み合わせることができ、逆もまた同様である。本発明の更なる利点及び特徴は、下記の図及び非限定的な例から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】対照（その他の化合物を加えていないＢ１６マウスメラノサイトの培養物）により生成されたメラニンの百分率として表されている、４−オキソ−２−ペンテン酸又はコウジ酸で予備処理したＢ１６マウスメラノサイトによるメラニン生成を示す図である。
【図２】対照（その他の化合物を加えていないＢ１６マウスメラノサイトの培養物）により生成されたチロシナーゼの百分率として表されている、４−オキソ−２−ペンテン酸又はコウジ酸で予備処理したＢ１６マウスメラノサイトによるチロシナーゼ生成を示す図である。
【図３】水に溶解した４−オキソ−２−ペンテン酸標準物質の一般的なクロマトグラムを示す図である。ｍ／ｚ  １１３→６９の遷移反応に伴うＳＲＭが高くなるほど、一方では、ｍ／ｚ  １１３→４１の遷移反応に対応するＳＲＭが低くなる。保持時間は、分により表されている（ｘ軸）。信号強度（ｙ軸）は、Ｃｐｓにより表されている。
【図４】９０℃（円○（円）で示している）、１２０℃（三角△（三角）で示している）及び１４０℃（四角□（四角）で示している）で、２分、１５分、３０分及び６０分加熱した、ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５（ＯＤ４０）の粗調製物のＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いた、４−オキソ−２−ペンテン酸定量化を示す図である。
【００５２】
実施例１：皮膚の色素沈着への４−オキソ−２−ペンテン酸の効果
皮膚の色素沈着への４−オキソ−２−ペンテン酸の効果を見積もるために、本発明者らは、マウスメラノサイト（Ｂ１６）の培養物を使用して２回の試験：メラニン生成の評価及びチロシナーゼ生成の評価を実施した。
【００５３】
細胞培養条件
Ｂ１６細胞を、５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿したチャンバー内で、フェノールレッドを有さず１０％ウシ胎児血清が追加されたＤＭＥＭ  １ｇ／Ｌグルコースにおいて培養した。（ＤＭＥＭは、ダルベッコ改変イーグル培地である。）
【００５４】
Ｂ１６マウスメラノサイト細胞株によるメラニンの生成
細胞を、７μＭの濃度の４−オキソ−２−ペンテン酸又は４００μｇ／ｍＬのコウジ酸（公知のメラニン生成阻害剤）の試験参照と一緒に７２時間インキュベートした。これを、ＭＳＨ（メラノサイト刺激ホルモン）の類縁体のＮＤＰ−ＭＳＨが存在するとき又は存在しないときに実施した。（細胞外及び細胞内の）メラニンの合計量を、ＮＤＰ−ＭＳＨが存在するとき又は存在しないときのメラニン標準物質に対する、各試料の４０５ｎｍにおける光学密度を測定することにより見積もった。対照条件は、培地だけで処理しその他の化合物を加えていない、Ｂ１６マウスメラノサイトの培養物に対応する。
【００５５】
Ｂ１６マウスメラノサイト細胞株によるチロシナーゼの生成
細胞を、７μＭの濃度の４−オキソ−２−ペンテン酸又は４００μｇ／ｍＬのコウジ酸の試験参照と一緒に４８時間インキュベートした。チロシナーゼの生成を免疫標識により見積もった。対照条件は、培地だけで処理しその他の化合物を加えていない、Ｂ１６マウスメラノサイトの培養物に対応する。
【００５６】
結果は、対照に対する百分率として表されている。コウジ酸は予想通り、対照において起きたメラニン生成の４８％までメラニン生成の減少を誘導したが、４−オキソ−２−ペンテン酸は、メラニン生成を０まで低減しており、図１を参照されたい。
【００５７】
チロシナーゼの生成もまた、コウジ酸と４−オキソ−２−ペンテン酸の両方により減少しており（図２）、メラニンの減少がチロシナーゼ阻害に少なくとも部分的に起因したことを示唆していた。４−オキソ−２−ペンテン酸は、コウジ酸よりメラニン生成の抑制において有効だったが、チロシナーゼ生成の抑制において有効でなく、４−オキソ−２−ペンテン酸がこの酵素の上流又は下流で作用する機構にも影響することを指し示している可能性がある。
【００５８】
提供されたデータにより、本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸をより暗色の色素沈着を有する皮膚の領域の低減又は予防に使用することができると結論できる。
【００５９】
実施例２：４−オキソ−２−ペンテン酸の供給源としての細菌菌株
３つの細菌菌株を使用して、微生物：ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５（ＮＣＣ２９５０）、ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３９１４（ＮＣＣ４６６）及びビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）（ＮＣＣ２７９１）から４−オキソ−２−ペンテン酸を得ることができるかどうかを調査した。ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３９１４を、ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ  ＮＡＴＩＯＮＡＬＥ  ＤＥ  ＣＵＬＴＵＲＥＳ  ＤＥ  ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＥＳ（ＣＮＣＭ）、ＩＮＳＴＩＴＵＴ  ＰＡＳＴＥＵＲ、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅ、２００８年２月５日によって沈着した。
【００６０】
各系統において、０．０５％システインを有する１０ｍｌのＭＲＳ寒天に２０μｌのグリセロールストックを播種し、嫌気性条件下３７℃で一晩インキュベートして、前培養物を形成した。次いで更なる培養物を、１０ｍｌのＭＲＳに０．０５％システインを前培養物と一緒に播種することにより作製した（０．１において最終的ＯＤ６００を調節した）。培養物を嫌気性条件下１６時間３７℃でインキュベートして、Ｐ２培養物を形成した。０．０５％システインを有する２００ｍｌのＭＲＳにＰ２培養物（０．１において最終的ＯＤ６００を調節した）を播種し、ボトルを嫌気性条件下１６時間３７℃でインキュベートした。
【００６１】
ＯＤ６００を測定し、培養物を３３００ｇにおいて１０分遠心分離し、細菌ペレットを冷たい１×  ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で２回洗浄して、１×  ＰＢＳによってＯＤ５０に正規化した。
【００６２】
各細菌菌株について２つの方法により細菌画分：「粗調製物」及び「純粋調製物」を得た。
【００６３】
細菌「粗調製物」を次のようにして得た。５ｍｌのＯＤ５０細菌調製物を、加熱ブロック（Ｔｅｃｈｎｅ、Ｓｔａｆｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ製のＤｒｉ−Ｂｌｏｃｋ  ＤＢ−３加熱ブロック）中で、６時間９０℃で加熱した。加熱した細菌調製物を、３３００ｇにおいて１０分＋４℃で遠心分離し、上澄みを、０．２２μｍシリンジフィルターを用いてろ過し、更なる分析まで＋４℃で貯蔵した。
【００６４】
細菌「純粋調製物」を次のようにして得た。５ｍｌのＯＤ５０細菌調製物を、３３００ｇにおいて１０分＋４℃で遠心分離し、細菌ペレットを、５ｍｌの水によって再懸濁した。細菌細胞を、冷蔵室内でｍｉｎｉ  ｂｅａｄ  ｂｅａｔ（ＭＢＢ）装置を用いて粉砕した（最大速度における９０秒の６サイクル、各サイクル間には１０分の中断）。粉砕した細胞を、１時間３３００ｇにおいて＋４℃で遠心分離し、ペレットを、５ｍｌの１×  ＰＢＳによって再懸濁し、加熱ブロック中で、６時間９０℃で加熱した。加熱した調製物を１０分３３００ｇにおいて＋４℃で遠心分離した。上澄みを、０．２２μｍシリンジフィルターを用いてろ過し、更なる分析まで＋４℃で貯蔵した。
【００６５】
実施例３：ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる４−オキソ−２−ペンテン酸の定量化
４−オキソ−２−ペンテン酸を定量化するために、高速液体クロマトグラフィーをエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法（ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）と結びつけるものである、高い処理能力の分析法を開発した。
【００６６】
４−オキソ−２−ペンテン酸標準物質は、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ、ＵＳＡ）から購入した。ＨＰＬＣグレード水、メタノール及び酢酸をＬｉｃｈｒｏｓｏｌｖ（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＨＰＬＣバイアル及び２ｍｍインサートをＡｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）から購入した。４−オキソ−２−ペンテン酸は、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌまで水に可溶であることが見出された。４−オキソ−２−ペンテン酸標準物質化合物を水に可溶化して１０ｍｇ／ｍｌの最終的なストック溶液にし、水に更に希釈して校正曲線を作成した。
【００６７】
ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析を、３２００Ｑ  ＴＲＡＰ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に連結した乱流クロマトグラフィー（ＴＦＣ）システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により実施した。使用した分析カラムは、室温において６００μｌ／分の一定の流量で運転する、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入したＨｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄ  ＡＱ（３×５０ｍｍ、５μｍ）であった。移動相は、０．０５％酢酸を含む水である溶媒Ａ）と、０．０５％酢酸を含むメタノールである溶媒Ｂ）とによって構成されていた。グラジエントプログラムは、０分では０％Ｂで、４０秒（０〜０．６７分）間０％Ｂに保持し、１８０秒（０．６７〜３．６７分）で５０％Ｂに増大させ、１０秒（３．６７〜３．８３分）で５０〜９０％Ｂに増大させ、１２０秒（５．８３分）間９０％Ｂに保持し、０％Ｂに戻していく前に、更に３００秒（５．８３〜１０．８３分）間保持するというものであった。注入体積は５μｌであった。
【００６８】
ＭＳデータ取得は、エレクトロスプレー陰イオン化モードにより実現した。ＭＳ調節は、溶媒Ａ及び溶媒Ｂ（８０／２０のｖ：ｖ、０．６ｍｌ／分）のＨＰＬＣフローと混合した４−オキソ−２−ペンテン酸標準物質の溶液（５μｇ／ｍｌの水溶液）を、Ｔ型連結器を用いて１０μｌ／分の流量で注入することにより実施した。窒素を、噴霧器及びカーテンガス（ｃｕｒｔａｉｎ  ｇａｓ）のために使用した。界面加熱器（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｈｅａｔｅｒ）を作動させてブロックソース温度を７００℃に維持し、キャピラリー電圧を−４．５ｋＶに設定した。窒素は、媒体圧力選択における衝突気体としても使用した。ＭＳ／ＭＳ検出を、選択した反応監視（ＳＲＭ）取得モードを用いて実現した。２つの最も強烈なフラグメントイオンを、５０ｍｓの一定の滞留時間（１１０ｍｓの合計走査時間）を用いて、ｍ／ｚ  １１３→６９（１１ｅＶの衝突エネルギー）及びｍ／ｚ  １１３→４１（２６ｅＶの衝突エネルギー）を走査することにより選択した。脱クラスター化電圧を−２９Ｖに設定した。定量的分析は、最も強烈なＳＲＭ信号を用いて実施したが、２回目の遷移は、標準溶液から計算した適当な面積比に基づいた分析物確認のために使用した。データ処理は、Ａｎａｌｙｓｔ  １．５．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。
【００６９】
ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＰＢＳ及び水中の４−オキソ−２−ペンテン酸の検出
４−オキソ−２−ペンテン酸を１×  ＰＢＳ又は水に可溶化し、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる検出を、上記の部分で説明したようにして実施した。ｍ／ｚ  １１３→６９の遷移反応に伴うＳＲＭは、１．２５分の保持時間における遷移ｍ／ｚ  １１３→４１に伴うＳＲＭよりも強烈な信号を明らかにした。両方の遷移に関して類似した保持時間が、分析の妥当性を確認したときに観察された（図３）。分子４−オキソ−２−ペンテン酸を、１×  ＰＢＳ（データは図示せず）と水の両方で検出することに成功した（図３）。
【００７０】
４−オキソ−２−ペンテン酸標準曲線の確立
細菌画分中の４−オキソ−２−ペンテン酸の量を正確に定量化するために、標準曲線を、１×  ＰＢＳ又はＨＰＬＣグレード水等の簡便な媒体中の４−オキソ−２−ペンテン酸に関して確立した。商業的な４−オキソ−２−ペンテン酸を、異なる用量で１×  ＰＢＳ及び水に懸濁した。次いでＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ法を使用して、見積もった用量の４−オキソ−２−ペンテン酸を定量化した。良好な線形性が、４−オキソ−２−ペンテン酸（０．１〜２５μｇ／ｍｌ）の量と、１×  ＰＢＳとＨＰＬＣグレード水の両方で得られた強度（ｃｐｓで表している）との間に観察された。
【００７１】
細菌画分中の４−オキソ−２−ペンテン酸の定量化
４−オキソ−２−ペンテン酸を、上述の熱処理した細菌調製物中で定量化した。すべての試料を、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析前にＨＰＬＣグレード水に希釈した（３希釈物／試料）。結果は表Ａに要約している。
【００７２】
【表１】
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【００７３】
実施例４：ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５からの４−オキソ−２−ペンテン酸の生成への加熱温度及び時間の影響
熱処理の際のビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５からの４−オキソ−２−ペンテン酸の生成を特性決定するために、様々な温度を用いて速度実験を実施した。この実験に使用したバイオマスの「マスターストック」は、嫌気性のｐＨ調整した条件下で、３７℃の生物反応器中でＭＲＳ培地によって生成した。増殖培養（１６時間）の後、培地を除去し、細胞を１×  ＰＢＳで２回洗浄し、１０％グリセロールを有する１×  ＰＢＳ中でＯＤ１３４（１．５Ｅ＋１０ｃｆｕ／ｍｌ）まで濃縮し、次いで５０ｍｌの一定分量にして−８０℃で貯蔵した。
【００７４】
次いでビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５の「実用バイオマス（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｂｉｏｍａｓｓ）」を、次のようにしてバイオマスマスターストックから調製した。バイオマスを１×  ＰＢＳで２回洗浄し、１×  ＰＢＳ中でＯＤ４０に調節した。これはそれぞれ１  Ｅ１０  ｃｆｕ／ｍｌ及び０．５  Ｅ１０  ｃｆｕ／ｍｌに対応する。
【００７５】
昇温装置（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｈｅａｔｉｎｇ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）（ＴＨＡ）を使用して、異なる加熱時間及び温度の効果を調査した。このシステムは、生成環境中に見出される一般的な装置の小型版である。蒸気を使用して、バイオマスのカートリッジを含む保持管を加熱する。９０℃、１２０℃及び１４０℃の試料温度を、最大６０分の期間をかけて施用した。次いで、熱処理した５ｍｌの各バイオマスを１０分５０００ｇで遠心分離し、上澄みをろ過し（０．２μｍ）、４−オキソ−２−ペンテン酸含量をＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより定量化した。生じた４−オキソ−２−ペンテン酸の量は、図４に示している。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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