(57)【要約】  本発明は、形質細胞増殖障害（例えば、多発性骨髄腫および／またはＭＧＵＳ）の最小残存病変を、該障害と相関する１以上のクロノタイプによりモニタリングするための、配列決定に基づく方法に関する。幾つかの実施形態においては、そのような方法は以下の工程を含む：（ａ）患者から末梢血のサンプルを入手し、（ｂ）該サンプルからの核酸の分子を増幅し、ここで、該核酸分子は免疫グロブリン遺伝子からの組換えＤＮＡ配列を含み、（ｃ）該核酸の増幅分子を配列決定してクロノタイププロファイルを形成し、（ｄ）該クロノタイププロファイルから、形質細胞増殖障害と相関する１以上の患者特異的クロノタイプおよびその系統学的クロノタイプの存在、非存在および／またはレベルを決定する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）患者から末梢血のサンプルを入手し、
（ｂ）該サンプルからの核酸の分子を増幅し、ここで、該核酸の分子は免疫グロブリン遺伝子からの組換えＤＮＡ配列を含み、
（ｃ）該核酸の増幅分子を配列決定してクロノタイププロファイルを形成し、
（ｄ）該クロノタイププロファイルから、多発性骨髄腫と相関する１以上の患者特異的クロノタイプおよびその系統学的クロノタイプの存在、非存在および／またはレベルを決定する工程を含む、患者における多発性骨髄腫残存病変をモニタリングする方法。
【請求項２】
患者における多発性骨髄腫残存病変をモニタリングするために工程（ａ）〜（ｄ）を反復する工程を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該クロノタイププロファイルのそれぞれが、９９％の確率で．０１％以上の頻度で存在するクロノタイプを全て含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該クロノタイププロファイルのそれぞれが少なくとも１０４個のクロノタイプを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
多発性骨髄腫と相関する前記の１以上の患者特異的クロノタイプを患者の骨髄サンプルから決定する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
（ａ）該患者から骨髄のサンプルを入手し、
（ｂ）該骨髄のサンプルからの核酸分子を増幅し、ここで、該核酸の分子は免疫グロブリン遺伝子からの組換えＤＮＡ配列を含み、
（ｃ）該核酸の増幅分子を配列決定してクロノタイププロファイルを形成し、
（ｄ）多発性骨髄腫と相関する１以上の患者特異的クロノタイプを、最高頻度を有するクロノタイププロファイルのクロノタイプと関連づける工程により、該多発性骨髄腫と相関する前記の１以上の患者特異的クロノタイプを決定する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
該決定の工程が、少なくとも１０−５の感度で多発性骨髄腫と相関する前記の１以上の患者特異的クロノタイプのレベルを測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
該決定の工程が、少なくとも１０−６の感度で多発性骨髄腫と相関する前記の１以上の患者特異的クロノタイプのレベルを測定することを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該入手工程が、顆粒球のサンプルを枯渇させることを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）Ｂ細胞、形質細胞ならびに／またはＢ細胞および／もしくは形質細胞からの無細胞核酸を含む、患者からの末梢血サンプルを入手し、
（ｂ）該末梢血サンプルから核酸サンプルを抽出し、
（ｃ）該核酸サンプルからの核酸の分子をポリメラーゼ連鎖反応において増幅し、ここで、該核酸の分子はＩｇＨのＶＤＪ再編成を含み、
（ｃ）該核酸の増幅分子を配列決定してクロノタイププロファイルを形成し、
（ｄ）該クロノタイププロファイルから、多発性骨髄腫と相関する１以上の患者特異的クロノタイプのそれぞれのレベルを決定する工程を含み、ここで、そのようなレベルはそのような１以上の患者特異的クロノタイプのそれぞれの系統学的クロノタイプを含む、患者における多発性骨髄腫をモニタリングする方法。
【請求項１１】
該配列決定工程が、各クロノタイプの配列を決定するために２０〜４００ヌクレオチドの範囲の配列リードを得ること含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記の１以上の患者特異的クロノタイプのレベルに基づいて骨髄を移植することにより該患者を治療する工程を更に含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）患者から末梢血のサンプルを入手し、
（ｂ）該サンプルから顆粒球を取り出して枯渇サンプルを得、
（ｃ）該枯渇サンプルからの核酸の分子を増幅し、ここで、該核酸の分子は免疫グロブリン遺伝子からの組換えＤＮＡ配列を含み、
（ｄ）該核酸の増幅分子を配列決定してクロノタイププロファイルを形成し、
（ｅ）該クロノタイププロファイルから、多発性骨髄腫と相関する１以上の患者特異的クロノタイプおよびその系統学的クロノタイプの存在、非存在および／またはレベルを決定する工程を含む、患者における多発性骨髄腫残存病変をモニタリングする方法。
【請求項１４】
Ｂ細胞受容体のＣ遺伝子セグメントの少なくとも一部をそれぞれが含む組換え配列を含む、個体の末梢血のサンプルを入手し、
該組換え配列からアンプリコンを生成し、ここで、該アンプリコンの各配列はＣ遺伝子セグメントの一部を含み、
該アンプリコンを配列決定して、Ｂ細胞受容体のＶＤＪ領域の少なくとも一部とＣ遺伝子セグメントの少なくとも一部とをそれぞれが含むクロノタイプのクロノタイププロファイルを生成し、
該クロノタイププロファイルから、形質細胞増殖障害と相関する１以上の患者特異的クロノタイプおよびそれらのそれぞれのイソタイプならびにそれらの系統学的クロノタイプの存在、非存在および／またはレベルを決定する工程を含む、形質細胞増殖障害をモニタリングする方法。
【請求項１５】
該Ｃ遺伝子セグメントが、該Ｂ細胞受容体のＩｇＨ鎖をコードするヌクレオチド配列からのものである、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は米国仮特許出願第６１／７１６，２５１号（２０１２年１０月１９日付け出願）、第６１／８６６，４７２号（２０１３年８月１５日付け出願）および第６１／８７３，０６３号（２０１３年９月３日付け出願）（それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
形質細胞増殖障害は、形質細胞のクローン集団により特徴づけられる一群の新生物（腫瘍）である。そのような障害には、良性単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）が含まれる（例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｙｅｌｏｍａ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１２１：７４９−７５７（２００３））。しばしば、ＭＧＵＳの比較的軽度な状態からＳＭＭへの、そして最終的には、痛みを伴いながら衰弱する不治の病態である完全なＭＭへの進行が患者において見られるが、モニタリングおよび治療の両方における最近の進歩は病態を有意に改善してきており、多数の患者の寿命を延長させている。
【０００３】
ＭＭは通常、血清および／または尿中のモノクローナルタンパク（Ｍタンパク質）、骨髄（ＢＭ）におけるクローン性形質細胞の蓄積、骨劣化ならびに関連器官または組織の障害の存在により診断される。ＭＭ患者は典型的に、免疫グロブリン、Ｍタンパク質および遊離免疫グロブリン軽鎖アッセイを用いて治療中および治療後にモニタリングされるが、フローサイトメトリーおよび患者特異的ＰＣＲによるモニタリングの方が、より優れた予後的重要性を有することが示されている（例えば、Ｐａｉｖａら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｂ，７８Ｂ：２３９−２５２（２０１０）；Ｏｗｅｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，４９：６７２−６７５（１９９６）；Ｄａｖｉｅｓら，Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１５（１）：１９７−２２２（２００２））。これらの技術の感度の不足、および患者に対するその付随的リスクおよび不便さのために、それらの用途は一般にＢＭの評価に限定されている。それにもかかわらず、末梢において測定される形質細胞の量は形質細胞増殖障害の進行に関する重要な予後因子であることが認められており、ここで、末梢血における、より高レベルの形質細胞は、より進行した病期への進行の、より高い可能性を示す（例えば、Ｂｉａｎｃｈｉら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２７（３）：６８０−６８５（２０１３）；Ｎｏｗａｋｏｗｓｋｉら，Ｂｌｏｏｄ，１０６：２２７６−２２７９（２００５）；Ｒａｗｓｔｒｏｎら，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，９７：４６−５５（１９９７）；Ｂｉｌｌａｄｅａｕら，Ｂｌｏｏｄ，８８（１）：２８９−２９６（１９９６））。
【０００４】
Ｔ細胞もしくはＢ細胞受容体またはそれらの成分のような免疫分子をコードする核酸のプロファイルは生物の健康または疾患の状態に関する豊富な情報を含んでおり、したがって、診断または予後因子としてのそのようなプロファイルの使用が多種多様な状態に関して提案されてきた（例えば、ＦａｈａｍおよびＷｉｌｌｉｓ，米国特許公開第２０１０／０１５１４７１号および第２０１１／０２０７１３４号；Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１８１７−１８２４（２００９）；Ｂｏｙｄら，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，１（１２）：１２ｒａ２３（２００９）；Ｈｅら，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（２０１１年３月８日）。配列に基づくそのようなプロファイルは、免疫レパートリーまたはそれらの成分クロノタイプを測定する上で、他のアプローチより遥かに高い感度をもたらすことができる（例えば、ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１７：２２５７−２３１７（２００３）；Ｏｔｔｅｎｓｍｅｉｅｒら，Ｂｌｏｏｄ，９１：４２９２−４２９９（１９９８））。
【０００５】
最小の残存病変を信頼性高くモニタリングおよび検出するための、より高感度で簡便なアッセイ、特に、患者の末梢血サンプルのみを必要とするような高感度のアッセイが利用可能となれば、形質細胞増殖障害の患者にとって好都合であろう。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概括
本発明は、配列に基づく末梢血サンプルの免疫レパートリー分析を用いて、多発性骨髄腫のような形質細胞増殖障害に罹患している患者を最小残存病変に関してモニタリングするための方法に関する。本発明は多数の実施および用途において例示されており、それらのうちの幾つかは後記および本明細書の全体において要約されている。
【０００７】
１つの態様において、本発明は、形質細胞増殖障害と相関する１以上の患者特異的クロノタイプにより患者における形質細胞増殖障害の残存病変をモニタリングする方法を提供する。そのような方法は以下の工程：すなわち、（ａ）形質細胞および／または形質細胞からの無細胞核酸を含む、患者からの末梢血サンプルを入手し、（ｂ）該サンプルの形質細胞からの核酸および／または該サンプル中の形質細胞からの無細胞核酸の分子を増幅し、ここで、該核酸の分子は免疫グロブリン遺伝子からの組換えＤＮＡ配列を含み、（ｃ）該核酸の増幅分子を配列決定してクロノタイププロファイルを形成し、（ｄ）形質細胞増殖障害と相関する１以上の患者特異的クロノタイプ（その系統学的クロノタイプを含む）の存在、非存在および／またはレベルを該クロノタイププロファイルから決定することを含みうる。幾つかの実施形態においては、形質細胞増殖障害は多発性骨髄腫である。更に詳細な実施形態においては、該方法は、診断時に１以上の患者特異的クロノタイプを決定する初期工程を含む。
【０００８】
もう１つの態様において、本発明は、以下の工程：すなわち、（ａ）Ｂ細胞受容体のＣ遺伝子セグメントの少なくとも一部をそれぞれが含む組換え配列を含む、個体の末梢血のサンプルを入手し、（ｂ）該組換え配列からアンプリコンを生成し、ここで、該アンプリコンの各配列はＣ遺伝子セグメントの一部を含み、（ｃ）該アンプリコンを配列決定して、Ｂ細胞受容体のＶＤＪ領域の少なくとも一部とＣ遺伝子セグメントの少なくとも一部とをそれぞれが含むクロノタイプのクロノタイププロファイルを生成し、（ｄ）該クロノタイププロファイルから、形質細胞増殖障害と相関する１以上の患者特異的クロノタイプおよびそれらのそれぞれのイソタイプならびにそれらの系統学的クロノタイプの存在、非存在および／またはレベルを決定することにより、ＭＧＵＳのような形質細胞増殖障害をモニタリングする方法を提供する。
【０００９】
本発明のこれらの前記で特徴づけられた態様および他の態様は幾つかの例示されている実施例および応用例において体現されており、それらの幾つかは図面に示されており、添付の特許請求の範囲において特徴づけられている。しかし、前記概要は、本発明の例示されている実施形態のそれぞれを記載することも、また、本発明の全ての実施例を記載することも意図していない。
【００１０】
本発明の新規特徴は添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点のより深い理解は、本発明の原理が利用されている例示実施形態を記載している以下の詳細な説明および後記の添付図面を参照することにより得られる。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明の実施は、特に示されていない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、バイオインフォマティクス、細胞生物学および生化学の通常の技術および記述を利用することができ、これらは当技術分野の技量の範囲内である。そのような通常の技術には、血液細胞のサンプル採取および分析、核酸配列決定および分析などが含まれるが、これらに限定されるものではない。適当な技術の具体的な例示は、本明細書における下記実施例を参照することにより得ることができる。しかし、他の同等の通常の方法も勿論用いられうる。そのような通常の技術および説明は、標準的な実験マニュアル、例えばＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ）；ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（全てＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓからのもの）などに見出されうる。
【００１２】
本発明に関連した工程、技術およびプロトコールならびにそれらの適用のための指針は、そのような教示に関して参照により本明細書に組み入れる以下の参考文献に開示されている：ＦａｈａｍおよびＷｉｌｌｉｓ，米国特許第８，２３６，５０３号ならびにＦａｈａｍおよびＷｉｌｌｉｓ，米国特許公開第２０１１／０２０７１３４Ａ１号。
【００１３】
本発明は、組織または流体、特に末梢血における形質細胞を検出および／または計数するための高感度な方法に関する。本発明の方法は、特に、多発性骨髄腫（ＭＭ）のような形質細胞増殖障害に罹患している及び／又は該障害に対して治療されている患者における最小残存病変（ＭＲＤ）をモニタリングするのに有用である。そのような疾患の細胞は組換え免疫グロブリン遺伝子を含有し、そのような組換え免疫グロブリン遺伝子が特定されれば、該遺伝子により該細胞が検出され計数されうる。そのような特定された組換え免疫グロブリン遺伝子は本明細書においては「相関クロノタイプ」または幾つかの実施形態においては「親クロノタイプ」と称される。相関クロノタイプは典型的には形質細胞増殖障害の診断時に特定され、その診断は、骨髄細胞およびそのクロノタイプの分析を含む一群の症状および測定を含みうる。相関クロノタイプまたは親クロノタイプは、以下のもののいずれかをコードする核酸を含みうる。該組換え配列は、ＩｇＨのＶＤＪ再編成、ＩｇＨのＤＪ再編成、ＩｇＫのＶＪ再編成またはＩｇＬのＶＪ再編成からなる群から選択されるゲノム再編成を含む。後記に更に詳細に記載されているとおり、幾つかの実施形態においては、クロノタイプの長さは２５〜４００ヌクレオチドの範囲で選択される。他の実施形態においては、そのような長さは２５〜２００ヌクレオチドの範囲で選択される。そのようなクロノタイプは、本発明の方法の配列決定工程において得られた配列リード（ｒｅａｄ；読取）から構築される。幾つかの実施形態においては、配列リード長は少なくともクロノタイプ長の長さである。他の実施形態においては、配列リードは、それを使用して作製されたクロノタイプの長さより短いことが可能である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１０個の配列リードを使用してクロノタイプを作製する。クロノタイプは、免疫受容体分子をコードする組換え配列の種々の領域にわたることが可能である。幾つかの実施形態においては、クロノタイプはＩｇＨのＶＤＪ領域の少なくとも一部を含み、他の実施形態においては、クロノタイプはＩｇＨのＶＤＪ領域にわたり、更に他の実施形態においては、クロノタイプはＩｇＨのＣ領域の少なくとも一部を含んでいて、ＩｇＨのイソタイプを決定することが可能である。
【００１４】
１以上の相関クロノタイプは、典型的には、診断時に骨髄細胞のクロノタイププロファイルにおける最高頻度クロノタイプとして特定される。そのような特定の後、前記のとおり、例えば治療後の患者のモニタリングが以下の工程で行われうる：（ａ）形質細胞および／または形質細胞からの無細胞核酸を含む、患者からの末梢血サンプルを入手し、（ｂ）組換え免疫グロブリン遺伝子を含む核酸の分子を配列決定してクロノタイププロファイルを形成し、（ｃ）該クロノタイププロファイルから、形質細胞増殖障害と相関する１以上の患者特異的クロノタイプ（その系統学的クロノタイプを含む）の存在、非存在および／またはレベルを決定することを含みうる。幾つかの実施形態においては、該配列決定工程は、１以上の増幅工程、すなわち、該サンプルの形質細胞からの核酸および／または該サンプル中の形質細胞からの無細胞核酸の分子であって、ここで、該核酸の分子は免疫グロブリン遺伝子からの組換えＤＮＡ配列を含むものを増幅させた後で行われうる。幾つかの実施形態において、相関クロノタイプのイソタイプが望まれる場合には、サンプルからの核酸分子はＲＮＡ分子、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子であり、これは、通常の技術を用いて得られうる。幾つかの実施形態において、クロノタイプを使用してサンプル中の形質細胞またはリンパ球を計数する場合には、サンプルからの核酸分子はゲノムＤＮＡ分子である。幾つかの実施形態においては、ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡの両方をサンプルから抽出し、例えば、それらを２つの部分に分割して、配列決定前にｍＲＮＡからｃＤＮＡが作製されうるようにする。
【００１５】
後記で更に詳しく説明されるとおり、本発明の方法は、細胞レベルを決定するために相関クロノタイプの配列がサンプルにおいて計数される意味において「デジタル」であるため、末梢血サンプルのサイズは、所望のレベルの感度が得られるように選択されうる。１つの実施形態においては、末梢血サンプルのサイズ（または体積）は、障害と相関する形質細胞が１０−５以上の頻度でＢ細胞のなかに存在する場合にはいつでも、それらが９９％以上の確率で検出されるように選択される。もう１つの実施形態においては、末梢血サンプルのサイズ（または体積）は、障害と相関する形質細胞が１０−６以上の頻度でＢ細胞のなかに存在する場合にはいつでも、それらが９９％以上の確率で検出されるように選択される。もう１つの実施形態においては、末梢血サンプルのサイズは、障害と相関する形質細胞が１０−７以上の頻度でＢ細胞のなかに存在する場合にはいつでも、それらが９９％以上の確率で検出されるように選択される。幾つかの実施形態においては、末梢血サンプルのサイズはその体積である。
【００１６】
前記のとおり、形質細胞増殖障害のようなほとんどのリンパ系新生物においては、疾患細胞は、病態と相関するクロノタイプを発現する。すなわち、クロノタイププロファイルにおける疾患細胞により産生されるクロノタイプのレベルは病態と単調に関連づけられる。形質細胞増殖障害のようなリンパ系新生物の場合、相関クロノタイプのレベルは典型的に疾患の負の予後と直接的に関連している。幾つかの場合には、この関係は、クロノタイププロファイルのクローン性（クロナリティ）尺度を用いて数字として表されうる。すなわち、クローン性尺度は複雑なデータセット（クロノタイププロファイル）を単一の数字に変換し、その値は、クロノタイププロファイルが１個または数個のクロノタイプによりどのように支配されるかの尺度である。典型的には、クロノタイププロファイルのクローン性が大きくなればなるほど、病態は悪くなる。多発性骨髄腫の相関クロノタイプは種々の技術により決定されうる。１つのアプローチにおいては、１以上の相関クロノタイプが（例えば、骨髄のサンプルからの）クロノタイププロファイルにおける主要クロノタイプとして診断時に特定される。部分的に、本発明は、末梢血サンプルから誘導されたクロノタイププロファイルにおける疾患相関クロノタイプのレベルを決定することにより多発性骨髄腫の病態が決定および／またはモニタリングされうるという認識および理解である。特に、（無傷細胞からの、または無細胞核酸、例えば無細胞ＤＮＡからの）多発性骨髄腫の患者の末梢血における相関クロノタイプの存在は、相関クロノタイプが全く検出されない場合またはより低いレベルの相関クロノタイプが検出される場合より不良な、疾患の進行に関する予後を示す。
【００１７】
サンプル
本発明の方法のためのクロノタイププロファイルは、末梢血から抽出された核酸のサンプルから形成される。該サンプルの核酸は末梢血中のＢ細胞からのもの、または無細胞核酸からのものでありうる。Ｂ細胞は免疫グロブリン（抗体、Ｂ細胞受容体）を発現しうる。１つの実施形態においては、サンプルは少なくとも１，０００個のＢ細胞を含むが、より典型的には、サンプルは少なくとも１０，０００個のＢ細胞を含み、より典型的には、少なくとも１００，０００個のＢ細胞を含む。もう１つの態様においては、サンプルは１０００〜１，０００，０００個のＢ細胞の範囲のＢ細胞数を含む。該細胞の適当なサンプル採取は、「クロノタイプ」および「レパートリー」の定義において後記で更に詳細に記載されているとおり、レパートリーデータを解釈する重要な態様である。サンプルにおける細胞数は測定感度に制限を加える。例えば、１，０００個のＢ細胞を含有するサンプルにおいては、そのような細胞のＤＮＡを配列決定により分析する場合にどのくらい多数の配列決定リードが得られるかに無関係に、検出可能なクロノタイプの最低頻度は１／１０００または．００１である。
【００１８】
該サンプルは核酸、例えばＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ）を含みうる。該核酸は、例えば循環系から抽出された、無細胞ＤＮＡまたはＲＮＡでありうる（Ｖｌａｓｓｏｖら，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，１０：１４２−１６５（２０１０）；Ｓｗａｒｕｐら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５８１：７９５−７９９（２００７））。提供する本発明の方法においては、分析されうる被験体からのＲＮＡまたはＤＮＡの量は、例えば、幾つかの用途（例えば、較正試験）における僅か１個の細胞、ならびに６ｐｇ〜６０μｇのＤＮＡおよび約１ｐｇ〜１０μｇの範囲に相当する１０００万個以上もの細胞を含む。幾つかの実施形態においては、核酸サンプルは６ｐｇ〜６０μｇのＤＮＡサンプルである。他の実施形態においては、核酸サンプルは末梢血１００μＬ〜１０ｍＬのＤＮＡサンプルであり、より詳細には、そのようなＤＮＡサンプルは末梢血１００μＬ〜１０ｍＬの無細胞画分からのものである。
【００１９】
幾つかの実施形態においては、リンパ球または無細胞核酸のサンプルは、異なる個別のクロノタイプを有する実質的に全てのＢ細胞が表されることによりクロノタイプの「レパートリー」を形成するのに十分な程度に大きい。１つの実施形態においては、それぞれの異なるクロノタイプの十分な表現を得るためには、．００１％以上の頻度で存在する集団の各クロノタイプを９９％の確率で含有するサンプルを採取する。もう１つの実施形態においては、．０００１％以上の頻度で存在する集団の各クロノタイプを９９％の確率で含有するサンプルを採取する。そしてもう１つの実施形態においては、．００００１％以上の頻度で存在する集団の各クロノタイプを９９％の確率で含有するサンプルを採取する。１つの実施形態においては、Ｂ細胞のサンプルは少なくとも５０万個の細胞を含み、もう１つの実施形態においては、そのようなサンプルは少なくとも１００万個の細胞を含む。
【００２０】
核酸サンプルは、通常の技術、例えばＩｎｎｉｓら編，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９０）に記載の方法などを用いて、末梢血から得られうる。例えば、白血球は、通常の技術、例えばＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐキット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、血液サンプルから分離されうる。血液サンプルは１００μＬ〜１０ｍＬの体積の範囲であることが可能であり、１つの態様においては、血液サンプルの体積は２００  １００μＬ〜２ｍＬの範囲である。ついで、本発明の方法における使用のための通常の技術、例えばＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、そのような血液サンプルからＤＮＡおよび／またはＲＮＡが抽出されうる。所望により、通常の技術、例えば蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）などを用いて、白血球のサブセット、例えばリンパ球が更に単離されうる。例えば、記憶Ｂ細胞は表面マーカーＣＤ１９およびＣＤ２７により単離されうる。
【００２１】
無細胞ＤＮＡも、通常の技術、例えばＬｏら，米国特許第６，２５８，５４０号、Ｈｕａｎｇら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４４４：２０３−２０８（２００８）など（それらを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載の技術を用いて、末梢血サンプルから抽出されうる。非限定的な例であるが、末梢血はＥＤＴＡチューブ内に集められ、ついでそれは遠心分離により血漿、赤血球および白血球成分に分画されうる。無細胞血漿画分（例えば、０．５〜２．０ｍＬ）からのＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）などを該製造業者のプロトコールに従い使用して抽出されうる。
【００２２】
識別組換えはそれぞれの個体の適応免疫細胞のＤＮＡおよびそれらの関連ＲＮＡ転写産物に存在するため、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかは、提供している本発明の方法において配列決定されうる。免疫グロブリン分子をコードするＢ細胞からの組換え配列またはその一部はクロノタイプと称される。該ＤＮＡまたはＲＮＡは、抗体をコードする免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子からの配列に対応しうる。
【００２３】
本発明の方法において分析されるＤＮＡおよびＲＮＡは、重鎖免疫グロブリン（ＩｇＨ）をコードする配列に対応する。各鎖は定常（Ｃ）および可変領域から構成される。重鎖の場合、可変領域は可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）および連結（Ｊ）セグメントから構成される。各タイプのこれらのセグメントをコードする幾つかの特徴的な配列がゲノム内に存在する。特異的ＶＤＪ組換え事象はＢ細胞の発生中に生じて、その細胞を特徴づけて、特異的重鎖を産生する。体細胞突然変異が、しばしば、組換え部位の近傍で生じて、幾つかのヌクレオチドの付加または欠失を引き起こして、Ｂ細胞により産生される重鎖の多様性を更に増大させる。したがって、Ｂ細胞により産生された抗体の可能な多様性は、異なる重鎖および軽鎖によって生み出されるものである。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原認識（または結合）領域または部位を生成するように寄与する。この多様性に加えて、何らかのエピトープに対して特異的応答が惹起された後に生じうる体細胞高頻度突然変異の過程が存在する。
【００２４】
本発明においては、プライマーは、Ｂリンパ球から抽出された組換え核酸のアンプリコンを産生するように選択されうる。そのような配列は本明細書においては「体細胞再編成領域」または「体細胞組換え領域」または「組換え配列」と称されうる。体細胞再編成領域は、発生中の又は完全に発生したリンパ球からの核酸を含むことが可能であり、ここで、発生中のリンパ球は、完全なＶ（Ｄ）Ｊ領域を有する分子を生成するまで免疫遺伝子の再編成が完了していない細胞である。典型的な不完全な体細胞再編成領域の例としては、不完全なＩｇＨ分子（例えば、Ｄ−Ｊ領域のみを含有する分子）が含まれる。
【００２５】
感度の増強のための顆粒球の減少
幾つかの実施形態においては、末梢血におけるＭＭ細胞検出の感度は、核酸抽出前にサンプルから非リンパ球を除去することにより増強されうる。末梢血の重要な非リンパ球成分は顆粒球からなり、これは好中球、好塩基球および好酸球を含む。１つの実施形態においては、末梢血のサンプルから顆粒球を除去する工程は、該サンプルを含む反応混合物において以下のとおりに行われうる：（ｉ）赤血球を細胞溶解し、（ｉｉ）顆粒球をアフィニティ捕捉し、（ｉｉｉ）該捕捉顆粒球を該反応混合物から分離する。幾つかの実施形態においては、アフィニティ捕捉の工程は、磁気ビーズ、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）のような固体支持体に結合した顆粒球特異的抗体により行われうる。他の実施形態においては、顆粒球またはその成分サブタイプは、リセッティング（ｒｅｓｅｔｔｉｎｇ）および／または密度勾配遠心分離、例えばＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）、ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）により除去されうる。本発明においては、顆粒球は、好中球、好塩基球または好酸球の全て又はいずれか１つのみを別々に除去することにより除去されうる。顆粒球特異的抗体は商業的に入手可能であり、通常の方法を用いて、例えば顆粒球特異的抗体をビオチン化し、サンプルの存在下のインキュベーションの後、ストレプトアビジン化磁気ビーズによりコンジュゲートを捕捉することにより、固体支持体に直接的または間接的に簡便に結合されうる。
【００２６】
核酸集団の増幅
後記のとおり、核酸の標的集団のアンプリコンは種々の増幅技術により作製されうる。本発明の１つの態様においては、多重ＰＣＲを用いて、核酸の混合物、特に、組換え免疫分子、例えばＴ細胞受容体、Ｂ細胞受容体またはそれらの一部を含む混合物の成分を増幅する。そのような免疫分子の多重ＰＣＲを行うための指針は以下の参考文献（それらを参照により本明細書に組み入れることとする）に見出される：Ｆａｈａｍら，米国特許公開第２０１１／０２０７１３４号；Ｌｉｍら，米国特許公開第２００８／０１６６７１８号など。後記で更に詳細に記載されているとおり、１つの態様においては、個々の核酸分子を空間的に単離する工程は、標的配列に非相補的な尾部をそれぞれが有するフォワードおよびリバースプライマーを使用して、予め選択された体細胞再編成領域またはその一部（すなわち、標的配列）の一次多重増幅を行うことにより、更なる操作を可能にする共通配列を各末端に有する成分配列を有する第１アンプリコンを産生させることで達成される。例えば、そのような共通末端は、それぞれの多数のフォワードプライマーおよびリバースプライマーではなく、単一のフォワードプライマーおよび単一のリバースプライマーのみを使用して、連続的増幅するためのプライマー結合部位、または固体表面上で個々の分子を架橋増幅するためのプライマー結合部位などを含みうる。そのような共通末端は、前記のとおり、単一の増幅において付加されることが可能であり、あるいはそれらは、２工程法において付加されることで、製造に伴う問題、および長いプライマー（例えば、５０〜７０塩基以上）の混合物に対する品質管理の実施に伴う問題を回避することが可能である。そのような２工程法（後記で更に詳細に記載されている）においては、一次増幅は、第１アンプリコンの配列の末端にフォワードおよびリバースプライマー結合部位のみを供与するようにプライマー尾部の長さが制限されることを除き、前記のとおりに行われる。ついで、これらのプライマー結合部位に特異的な二次増幅プライマーを使用して、二次増幅を行うことで、第２アンプリコンの末端に更なる配列を付加する。該二次増幅プライマーは、標的配列に非相補的な尾部を有し、これは第２アンプリコンの末端を形成し、第２アンプリコンのクロノタイプの配列決定において使用されうる。１つの実施形態においては、例えばＳｏｌｅｘａ（ソレクサ）に基づく配列決定を用いる場合に、そのような付加配列は、配列リードを生成するプライマー結合部位と、空間的に単離された個々の分子のクローン集団を得るために固体表面上で架橋ＰＣＲを行うためのプライマー結合部位とを含みうる。この後者のアプローチにおいては、第２アンプリコンからの配列のサンプルを、該サンプルの配列にアニールしうる相補的オリゴヌクレオチドが結合している固体表面上に配置し、ついで、鋳型のクローン集団が形成されるまで、プライマー伸長、変性、アニーリングのサイクルを行う。好ましくは、サンプルのサイズは、（ｉ）それが元のサンプルにおけるクロノタイプの有効な表現を含み、そして（ｉｉ）固体表面上のクローン集団の密度が、クロノタイプの一義的な配列決定を可能にする範囲内となるように選択される。
【００２７】
増幅される領域は、完全なクローン配列またはクローン配列の一部分（免疫グロブリン遺伝子のＶ−Ｄ連結部、Ｄ−Ｊ連結部を含む）、免疫グロブリンの完全な可変領域、抗原認識領域、あるいはＣＤＲ、例えば相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含みうる。
【００２８】
ゲノムからのＤＮＡの増幅（またはＲＮＡを逆転写することによるｃＤＮＡの形態の核酸の増幅）の後、個々の核酸分子は単離され、所望により再増幅され、ついで個別に配列決定されうる。典型的な増幅法はｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１７：２２５７−２３１７（２００３）またはｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎら，米国特許公開第２００６／０２３４２３４号（これらを参照により本明細書に組み入れることとする）において見出されうる。簡潔に説明すると、典型的な方法は以下のとおりである：反応バッファー：ＡＢＩ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩまたはＡＢＩ  Ｇｏｌｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；５０μＬの最終反応体積；１００ｎｇのサンプルＤＮＡ；１０ｐｍｏｌの各プライマー（後記のとおりに増幅を釣り合わせるための調節に付される）；最終濃度２００μＭのｄＮＴＰ；最終濃度１．５ｍＭのＭｇＣｌ２（標的配列およびポリメラーゼに応じた最適化に付される）；Ｔａｑポリメラーゼ（１〜２Ｕ／チューブ）；サイクリング条件：９５℃で７分間の前活性化；６０℃でのアニーリング；サイクリング時間：３０秒間の変性；３０秒間のアニーリング；３０秒間の伸長。本発明の方法における増幅に使用されうるポリメラーゼは商業的に入手可能であり、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅポリメラーゼまたはＰｆｕを包含する。使用するポリメラーゼの選択は、忠実度が優先されるか効率が優先されるかに基づいて行われうる。
【００２９】
プールから核酸を単離するための方法は、核酸をＤＮＡベクター内にサブクローニングし、細菌を形質転換すること（細菌クローニング）、固体基体（例えば、ガラススライド）上の二次元の該分子の空間的分離、ミセル内の溶液中の三次元の該分子の空間的分離（例えば、該分子をビーズのような固体表面上に固定化し又は固定化しないで油エマルションを使用して達成されうるもの）、または例えば微小流体もしくはナノ流体チップにおける微小反応チャンバーを使用することを含む。与えられた体積、空間領域、ビーズまたは反応チャンバー内に平均して単一の分子が存在することを保証するために、希釈が行われうる。個々の核酸分子を単離するそのような方法のための指針は以下の参照文献において見出される：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１ｓ）；Ｓｈｅｎｄｕｒｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９：１７２８−１７３２（補遺を含む）（２００５）；米国特許第６，３００，０７０号；Ｂｅｎｔｌｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ，４５６：５３−５９（補遺を含む）（２００８）；米国特許第７，３２３，３０５号；Ｍａｔｓｕｂａｒａら，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，２０：１４８２−１４９０（２００５）：米国特許第６，７５３，１４７号など。
【００３０】
初期工程においてリアルタイムＰＣＲ、ピコグリーン染色、ナノ流体電気泳動（例えば、ＬａｂＣｈｉｐ）またはＵＶ吸収測定が用いて、増幅可能物質の機能的量を判断することができる。
【００３１】
１つの態様においては、出発集団における配列の相対量が増幅集団またはアンプリコンにおいても実質的に同じとなるように多重増幅を行う。すなわち、サンプル集団のメンバー配列間の増幅バイアスが最小となるように多重増幅を行う。１つの実施形態においては、そのような相対量が実質的に同じと言えるのは、アンプリコンにおける各相対量が出発サンプルにおけるその値の５倍以内である場合である。もう１つの実施形態においては、そのような相対量が実質的に同じと言えるのは、アンプリコンにおける各相対量が出発サンプルにおけるその値の２倍以内である場合である。後記で更に詳細に記載されているとおり、予め決定されたレパートリーについて、任意のサンプルの非バイアス増幅をもたらすＰＣＲプライマーのセットが選択されうるように、通常の技術を用いて、ＰＣＲにおける増幅バイアスが検出され補正されうる。
【００３２】
１つの実施形態においては、２工程増幅（前記のとおり）を行うことにより増幅バイアスを回避することが可能であり、この場合、標的配列に対して非相補的な尾部を有するプライマーを使用して、第１または一次段階において少数の増幅サイクルを行う。該尾部は、一次アンプリコンの配列の末端に付加されたプライマー結合部位を含み、そのような部位は、単一フォワードプライマーおよび単一リバースプライマーのみを使用する第２段階の増幅において使用され、それにより増幅バイアスの主要原因が排除される。幾つかの実施形態においては、一次ＰＣＲは、異なるプライマーによる増幅の相違を最小にするのに十分な程度に小さいサイクル数（例えば、５〜１０）を有する。二次増幅は、１対のプライマーを使用して行い、したがって、増幅の相違の問題は最小限に抑えられる。一次ＰＣＲの１％を二次ＰＣＲに直接使用する。それらの２つの増幅の間で用いる３５サイクル（１００倍希釈工程を伴わない〜２８サイクルに匹敵する）は、サイクルの中断が一次１サイクルおよび二次３４サイクルであったか一次２５サイクルおよび二次１０サイクルであったかに無関係に、頑強（ロウバスト）な増幅を示すのに十分であった。理想的には一次ＰＣＲにおいて１サイクルのみを行うことで増幅バイアスが低減されうるとしても、他の考慮事項も存在する。この１つの態様は表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）である。これは、出発投入量が、最終的に得られるリード（読取）の数を超えない場合に、役割を果たす。例えば、１，０００，０００個の投入分子から出発して１，０００，０００個のリードが得られる場合、１００，０００個の分子からの表現のみを二次増幅に使用することは、元のサンプルにおける種々の種の相対存在量の推定の精度を低下させるであろう。それらの２工程の間の１００倍希釈は、１００個を有意に上回る分子を一次ＰＣＲ増幅が産生しない限り、表現が低減されることを意味する。これは、少なくとも８サイクル（２５６倍）、好ましくは１０サイクル（〜１，０００倍）が使用されうることを示している。その代替手段は、一次ＰＣＲの１％以上を二次ＰＣＲに使用することであるが、一次ＰＣＲにおいて使用されるプライマーは高濃度であるため、これらのプライマーが増幅を阻害し配列間の増幅バイアスを悪化させないことを保証するために、大きな希釈係数が用いられうる。もう１つの代替手段は、より小さな希釈を可能にするために精製または酵素工程を加えることで一次ＰＣＲからプライマーを排除することである。この例においては、一次ＰＣＲは１０サイクルであり、二次ＰＣＲは２５サイクルであった。
【００３３】
簡潔に説明すると、ＩｇＨコード化核酸（ＲＮＡ）を増幅するためのＦａｈａｍおよびＷｉｌｌｉｓ（前記で引用）の方法が図１Ａ〜１Ｃに例示されている。核酸（１２００）をサンプル中のリンパ球から抽出し、Ｃ領域（１２０３）に特異的なプライマー（１２０２）および免疫グロブリンまたはＴＣＲ遺伝子の種々のＶ領域（１２０６）に特異的なプライマー（１２１２）とＰＣＲにおいて併用する。プライマー（１２１２）はそれぞれ、増幅の第２段階のためのプライマー結合部位を供与する同一尾部（１２１４）を有する。前記のとおり、プライマー（１２０２）はＣ領域（１２０３）とＪ領域（１２１０）との間の連結部（１２０４）に隣接して配置される。該ＰＣＲにおいては、Ｃコード領域（１２０３）の部分、Ｊコード領域（１２１０）、Ｄコード領域（１２０８）およびＶコード領域（１２０６）の部分を含有するアンプリコン（１２１６）が産生される。アンプリコン（１２０６）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＤＮＡ配列決定装置における使用のために設計された尾部（１２２４および１２２１／１２２３）をそれぞれ有するプライマーＰ５（１２２２）およびプライマーＰ７（１２２０）を使用する第２段階において更に増幅される。プライマーＰ７（１２２０）の尾部（１２２１／１２２３）は、所望により、配列決定プロセスにおける別のサンプルを標識するためのタグ（１２２１）を含んでいてもよい。第２段階の増幅は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＤＮＡ配列決定装置において使用されうるアンプリコン（１２３０）を産生する。
【００３４】
イソタイプ決定
ＭＧＵＳのような幾つかの形質細胞増殖障害においては、形質細胞のクローン集団のイソタイプは種々の予後と相関する（例えば、Ｒａｊｋｕｍａｒら，Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．，８５（１０）：９４５−９４８（２０１０））。１つの態様においては、本発明は、イソタイプ情報を含むクロノタイププロファイルを得ることを含む。クロノタイプは、免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）をコードするヌクレオチドの配列リードから構築される。幾つかの実施形態においては、本発明のクロノタイプはＶＤＪコード領域の部分およびその付随定常領域（またはＣ領域）の部分を含む。イソタイプは、Ｃ領域の部分をコードするヌクレオチド配列から決定される。１つの実施形態においては、Ｃ領域の部分はＶＤＪコード領域に隣接していて、ＦａｈａｍおよびＷｉｌｌｉｓ，米国特許公開第２０１１／０２０７１３４号（それを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような簡便な技術により単一の連続配列が増幅されうる。Ｃ領域をコードするクロノタイプの部分は、特徴的な対立遺伝子の存在によりイソタイプを特定するために使用される。１つの実施形態においては、８〜１００個のＣ領域コード化ヌクレオチドがクロノタイプ内に含まれ、もう１つの実施形態においては、８〜２０個のＣ領域コードヌクレオチドがクロノタイプ内に含まれる。１つの実施形態においては、そのようなＣ領域コード部分は、後記で更に詳細に記載されているとおり、ＩｇＨコード配列の増幅中に捕捉される。そのような増幅においては、生じるアンプリコンにおいて前記範囲内の幾つかのＣ領域コード化ヌクレオチドが捕捉されるように、１以上のＣ領域プライマーが配置される。
【００３５】
ギリシャ文字α、δ、ε、γおよびμにより示される５つのタイプの哺乳類ＩｇＧ重鎖が存在する。存在する重鎖のタイプは抗体のクラスを定め、これらの鎖はそれぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体において見出される。特徴的な重鎖はサイズおよび組成において異なり、αおよびγは約４５０アミノ酸を含有し、一方、μおよびεは約５５０アミノ酸を有する。各重鎖は２つの領域、すなわち、定常領域および可変領域を有する。定常領域は同一イソタイプの全抗体においては同一であるが、異なるイソタイプの抗体においては異なる。重鎖γ、αおよびδは、柔軟性の付加のためのヒンジ領域および３つの縦列（一列の）Ｉｇドメインから構成される定常領域を有し、重鎖μおよびεは、４つの免疫グロブリンドメインから構成される定常領域を有する。重鎖の可変領域は、その抗体を産生したＢ細胞によって異なるが、単一のＢ細胞またはＢ細胞クローンにより産生された全抗体に関して同じである。各重鎖の可変領域は約１１０アミノ酸長であり、単一のＩｇドメインから構成される。ヒト（他の）ＩｇＨ  Ｃ領域のヌクレオチド配列は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）のような公に利用可能なデータベースから入手可能である。
【００３６】
配列リードの作製
核酸を配列決定するための任意のハイスループット技術が本発明の方法において用いられうる。好ましくは、そのような技術は大量の配列を費用効果的に作製する能力を有し、該配列から少なくとも１０００個のクロノタイプが決定可能であり、好ましくは、少なくとも１０，０００〜１，０００，０００個のクロノタイプが決定可能である。そのような容量で種々の配列決定技術が利用可能であり、それらはＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などから商業的に入手可能である。幾つかの実施形態においては、個々の分子を固体表面上で空間的に単離し、該部位においてそれらを並行的に配列決定する工程を含むハイスループット配列決定法が用いられる。そのような固体表面は無孔表面（例えば、Ｓｏｌｅｘａ配列決定、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ，４５６：５３−５９（２００８）またはＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ配列決定、例えば、Ｄｒｍａｎａｃら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２７：７８−８１（２０１０））、ビーズまたは粒子結合鋳型を含みうるウェルのアレイ（例えば、４５４の場合、例えば、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，４３７：３７６−３８０（２００５）またはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ配列決定，米国特許公開第２０１０／０１３７１４３号もしくは第２０１０／０３０４９８２号）、微細加工膜（例えば、ＳＭＡＲＴ配列決定の場合、例えば、Ｅｉｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２３：１３３−１３８（２００９））またはビーズアレイ（ＳＯＬｉＤ配列決定またはポロニー（ｐｏｌｏｎｙ）配列決定、例えば、Ｋｉｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１６：１４８１−１４１４（２００７））を含みうる。もう１つの態様においては、そのような方法は、該単離分子を、それらが固体表面上で空間的に単離される前に増幅することを含む。前増幅は、エマルションに基づく増幅、例えば、エマルションＰＣＲ、またはローリングサークル増幅を含みうる。特に関心が持たれるのは、Ｓｏｌｅｘａ（ソレクサ）に基づく配列決定であり、この場合、個々の鋳型分子を固体表面上で空間的に単離し、ついでそれらを、別々のクローン集団またはクラスターを得るために架橋（ｂｒｉｄｇｅ）ＰＣＲにより並行的に増幅し、ついで配列決定し、これは、Ｂｅｎｔｌｅｙら（前記引用）および製造業者の説明書（例えば、ＴｒｕＳｅｑ（商標）  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ｓｈｅｅｔ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，２０１０）ならびに更に以下の参考文献に記載されているとおりに行われる：米国特許第６，０９０，５９２号、第６，３００，０７０号、第７，１１５，４００号およびＥＰ０９７２０８１Ｂ１（それらを参照により本明細書に組み入れることとする）。１つの実施形態においては、固体表面上に配置され増幅される個々の分子は少なくとも１０５クラスター／ｃｍ２の密度または少なくとも５×１０５クラスター／ｃｍ２の密度または少なくとも１０６クラスター／ｃｍ２の密度でクラスターを形成する。
【００３７】
幾つかの実施形態においては、個体の、配列に基づくクロノタイププロファイルは、以下の工程を用いて得られる：（ａ）個体の形質細胞から核酸サンプルを得、（ｂ）そのような核酸サンプルから誘導された個々の分子を空間的に単離し（個々の分子のそれぞれは、該サンプル中の核酸から生成した少なくとも１つの鋳型を含み、該鋳型は体細胞再編成領域またはその一部を含み、それぞれの個々の分子は少なくとも１つの配列リードを産生しうる）、（ｃ）前記の空間的に単離された個々の分子を配列決定し、（ｄ）該核酸サンプルからの核酸分子の種々の配列の存在量または頻度を決定して、クロノタイププロファイルを作製する。幾つかの実施形態においては、形質細胞からの核酸サンプルは個体のリンパ球からの核酸サンプル中に含まれうる。
【００３８】
１つの態様においては、本発明は、以下の工程を含む、個体のＴ細胞受容体および／またはＢ細胞受容体のクロノタイププロファイルを決定するための方法に関する：（ａ）該個体のリンパ球から核酸サンプルを入手し、（ｂ）そのような核酸サンプルから誘導された個々の分子を空間的に単離し（個々の分子は、それぞれ該サンプル中の核酸から生成した鋳型のネスティッドセット（ｎｅｓｔｅｄ  ｓｅｔ）を含み、それぞれは体細胞再編成領域またはその一部を含み、各ネスティッドセットは、該ネスティッドセットを与えた核酸上の異なる位置からそれぞれが出発し同じ方向にそれぞれが伸長している複数の配列リードを産生しうる）、（ｃ）前記の空間的に単離された個々の分子を配列決定し、（ｄ）該核酸サンプルからの核酸分子の種々の配列の存在量を決定して、クロノタイププロファイルを作製する。例示として、鋳型のネスティッドセットの作製を図３Ａ〜３Ｄに図示する。
【００３９】
１つの実施形態においては、配列決定の工程は、該ネスティッドセットのそれぞれに関する複数の配列リードを得ることを含む。幾つかの実施形態においては、複数の配列リードは１０〜１０００個の範囲の配列リードである。もう１つの実施形態においては、該体細胞再編成領域のそれぞれはＶ領域およびＪ領域を含み、そのような複数の配列リードのそれぞれはＶ領域内の異なる位置から出発し、その付随Ｊ領域の方向に伸長する。１つの実施形態においては、該体細胞再編成領域のそれぞれはＶ領域およびＪ領域の少なくとも一部を含み、もう１つの実施形態においては、該体細胞再編成領域のそれぞれはＣ領域およびＶ（Ｄ）Ｊ領域の少なくとも一部を含み、更にもう１つの実施形態においては、該体細胞再編成領域のそれぞれはＪ領域およびＶ領域の少なくとも一部を含む。もう１つの実施形態においては、前記方法は以下の工程を含む：（ａ）該個体の白血球から核酸サンプルを入手し、（ｂ）そのような核酸サンプルから誘導された個々の分子を空間的に単離し（個々の分子は、それぞれ該サンプル中の核酸から生成した鋳型のネスティッドセット（ｎｅｓｔｅｄ  ｓｅｔ）を含み、それぞれは体細胞再編成領域またはその一部を含み、各ネスティッドセットは、該ネスティッドセットを与えた核酸上の異なる位置からそれぞれが出発し同じ方向にそれぞれが伸長している複数の配列リードを産生しうる）、（ｃ）前記の空間的に単離された個々の分子を配列決定し、（ｄ）該核酸サンプルからの核酸分子の種々の配列の存在量を決定して、クロノタイププロファイルを作製する。１つの実施形態においては、配列決定する工程は、該ネスティッドセットのそれぞれに関する複数の配列リードを得ることを含む。
【００４０】
幾つかの実施形態においては、個体からの各サンプルに関して、本発明の方法において用いられる配列決定技術は１実施当たり少なくとも１０００個の配列リードを与え、もう１つの態様においては、そのような技術は１実施当たり少なくとも１００，０００個の配列リードを与え、もう１つの態様においては、そのような技術は１実施当たり少なくとも５００，０００個の配列リードを与え、もう１つの態様においては、そのような技術は１実施当たり少なくとも１，０００，０００個の配列リードを与える。ここで用いる「実施」なる語は、商業的に入手可能なＤＮＡ配列決定装置を使用する通常のバッチ配列決定操作を意味する。更にもう１つの態様においては、そのような技術は個々のサンプル当たり１実施当たり１００，０００〜１０，０００，０００個の配列リードを与える。
【００４１】
幾つかの実施形態においては、個体からの各サンプルに関して、本発明の方法において用いられる配列決定技術は配列リードから１実施当たり少なくとも１０００個のクロノタイプを与え、もう１つの態様においては、そのような技術は配列リードから１実施当たり少なくとも１０，０００個のクロノタイプを与え、もう１つの態様においては、そのような技術は配列リードから１実施当たり少なくとも１００，０００個のクロノタイプを与え、もう１つの態様においては、そのような技術は配列リードから１実施当たり少なくとも５００，０００個のクロノタイプを与え、もう１つの態様においては、そのような技術は配列リードから１実施当たり少なくとも１，０００，０００個のクロノタイプを与える。更にもう１つの態様においては、そのような技術は配列リードから個々のサンプル当たり１実施当たり１００，０００〜１，０００，０００個のクロノタイプを与える。
【００４２】
提供する本発明の方法において用いられる配列決定技術は約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約６０ｂｐ、約７０ｂｐ、約８０ｂｐ、約９０ｂｐ、約１００ｂｐ、約１１０ｂｐ、約１２０ｂｐ、約１５０ｂｐ、約２００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約３００ｂｐ、約３５０ｂｐ、約４００ｂｐ、約４５０ｂｐ、約５００ｂｐ、約５５０ｂｐまたは約６００ｂｐの配列リードを与えうる。
【００４３】
配列データからのクロノタイプの作製
配列リード（配列読取）データからのクロノタイプの構築はＦａｈａｍおよびＷｉｌｌｉｓ（前記引用）（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。簡潔に説明すると、配列リードデータからのクロノタイプの構築は、部分的には、そのようなデータを得るために用いた配列決定方法に左右される。なぜなら、方法が異なれば、予想されるリード長およびデータの質も異なるからである。１つのアプローチにおいては、分析用の配列リードデータを得るためにＳｏｌｅｘａ（ソレクサ）配列決定装置を使用する。１つの実施形態においては、所望により行われうる増幅の後で鋳型分子（またはクラスター）の１００万個以上の対応クローン集団を与えうる少なくとも１００万個の鋳型分子を得るために少なくとも０．５〜１．０×１０６個のリンパ球を与えるサンプルを得る。Ｓｏｌｅｘａアプローチを含むほとんどのハイスループット配列決定アプローチにおいては、配列決定の精度を増加させるために大きな多重度で各鋳型配列が決定されるように、このようなクラスターレベルでのオーバーサンプリングをすることが望ましい。Ｓｏｌｅｘａに基づく実施の場合、好ましくは、それぞれの独立した鋳型の配列を１０回以上決定する。異なる予想リード長およびデータ品質を有する他の配列決定アプローチにおいては、比較しうる配列決定精度のために、異なるレベルの多重度が用いられうる。当業者は、前記パラメータ、例えばサンプルサイズ、多重度などは、個々の用途に関連して設計上選択するものであることを認識している。
【００４４】
１つの態様においては、ＩｇＨ鎖（図２Ａに例示されている）のクロノタイプは、Ｃ領域において出発し、関連するＶ領域の方向に伸長する少なくとも１つの配列リード（本明細書においては「Ｃリード」（２３０４）と称される）、およびＶ領域において出発し関連するＪ領域の方向に伸長する少なくとも１つの配列リード（本明細書においては「Ｖリード」（２３０６）と称される）により決定される。そのようなリードは重複領域（２３０８）を有していても有していなくてもよく、そのような重複は、図２Ａに示されているＮＤＮ領域（２３１５）を含んでいても含んでいなくてもよい。重複領域（２３０８）は全体がＪ領域内に存在することが可能であり、全体がＮＤＮ領域内に存在することが可能であり、全体がＶ領域内に存在することが可能であり、あるいはそれはＪ領域−ＮＤＮ領域境界またはＶ領域−ＮＤＮ領域境界またはそのような両方の境界を含む（図２Ａに例示されているとおり）ことが可能である。典型的には、そのような配列リードは、合成−配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）反応においてポリメラーゼを使用して、配列決定プライマー、例えば図２Ａにおける（２３０２）および（２３１０）を伸長させることにより得られる（例えば、Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１：３１−４６（２０１０）；Ｆｕｌｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２７：１０１３−１０２３（２００９））。プライマー（２３０２）および（２３１０）の結合部位は、それらが配列リードの初期アライメントおよび分析のための出発点または固着点を与えうるように、予め決定されている。１つの実施形態においては、Ｃリードは、それがＩｇＨ鎖のＤおよび／またはＮＤＮ領域を含み隣接Ｖ領域の一部を含むように位置する（例えば、図２Ａおよび２Ｂに例示されているとおり）。１つの態様においては、Ｖ領域内のＣリードおよびＶリードの重複を用いて該リードを互いにアライメント（整列）させる。他の実施形態においては、配列リードのそのようなアライメントは必ずしも必要ではなく、Ｖリードは、クロノタイプの個々のＶ領域を特定するのに十分な長さのみを有することが可能である。この後者の態様は図２Ｂに例示されている。配列リード（２３３０）は、もう１つの配列リードとの重複を伴って又は伴わないで、Ｖ領域を特定するために使用され、もう１つの配列リード（２３３２）はＮＤＮ領域を横切り、その配列を決定するために使用される。Ｖ領域内に伸長する配列リード（２３３２）の一部（２３３４）は、クロノタイプを決定するために、配列リード（２３３２）の配列情報を配列リード（２３３０）の配列情報と関連づけるために使用される。幾つかの配列決定方法、例えば、Ｓｏｌｅｘａ配列決定法のような塩基ごとのアプローチの場合、配列決定実施時間および試薬の費用は、分析における配列決定サイクルの数を最小にすることにより減少する。所望により、図２Ａに例示されているとおり、アンプリコン（２３００）は、異なる生物学的サンプル（例えば、異なる患者）に由来するクロノタイプを識別するためのサンプルタグ（２３１２）を伴って産生される。サンプルタグ（２３１２）は、プライマーをプライマー結合領域（２３１６）アニーリングさせ、それを伸長させて（２３１４）、タグ（２３１２）にわたる配列リードを得ることにより特定可能であり、該配列リードから解読されうる。
【００４５】
本発明の１つの態様においては、クロノタイプの配列は、例えば、選択された鎖のＶ（Ｄ）Ｊ領域に沿った１以上の配列リードからの情報を組合せることにより決定されうる。もう１つの態様においては、クロノタイプの配列は、複数の配列リードからの情報を組合せることにより決定される。そのような複数の配列リードは、センス鎖に沿った１以上の配列リード（すなわち、「フォワード」配列リード）、および対応相補鎖に沿った１以上の配列リード（すなわち、「リバース」配列リード）を含みうる。同じ鎖に沿った複数の配列リードを得る場合、まず、配列リードの種々の位置に関して選択されたプライマーでサンプル分子を増幅することにより別々の鋳型を得る。この概念は図３Ａに例示されており、この場合、プライマー（３４０４、３４０６および３４０８）を使用して、単一反応においてアンプリコン（それぞれ３４１０、３４１２および３４１４）を得る。そのような増幅は同じ反応または別々の反応において行われうる。１つの態様においては、ＰＣＲを用いる場合はいつでも、別々の増幅反応を用いて別々の鋳型を得、そしてこれらを組合せ、使用して、同じ鎖に沿った複数の配列リードを得る。プライマー濃度（および／または他の反応パラメータ）を釣り合わせる必要性を回避し、複数の鋳型の同等増幅（本明細書においては「バランス増幅」または「非バイアス増幅」と称されることもある）を保証するためには、この後者のアプローチが好ましい。別々の反応における鋳型の作製は図３Ｂ〜３Ｃに例示されている。それにおいては、ＩｇＨ（３４００）を含有するサンプルを３つの部分（３４７０、３４７２および３４７４）に分割し、それらを、Ｊ領域プライマー（３４０１）およびＶ領域プライマー（それぞれ３４０４、３４０６および３４０８）を使用する別々のＰＣＲに加える。ついで後者のアンプリコンを、Ｐ５およびＰ７プライマーを使用する二次ＰＣＲ（３４８０）において組合せて、架橋ＰＣＲおよびＩｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡ配列決定装置などの装置における配列決定のための鋳型（３４８２）を得る。
【００４６】
本発明の配列リードは、１つには用いられる配列決定技術に応じて、多種多様な長さを有しうる。例えば、幾つかの技術の場合には、その実施において、例えば、（ｉ）鋳型当たりの配列リードの数および長さ、ならびに（ｉｉ）配列決定操作のコストおよび持続時間において、幾つかの妥協がなされうる。１つの実施形態においては、配列リードは２０〜３４００ヌクレオチドの範囲であり、もう１つの実施形態においては、配列リードは３０〜２００ヌクレオチドの範囲であり、更にもう１つの実施形態においては、配列リードは３０〜１２０ヌクレオチドの範囲である。１つの実施形態においては、各クロノタイプの配列を決定するために１〜４個の配列リードを得、もう１つの実施形態においては、各クロノタイプの配列を決定するために２〜４個の配列リードを得、もう１つの実施形態においては、各クロノタイプの配列を決定するために２〜３個の配列リードを得る。前記実施形態においては、示されている数は、異なる個体からのサンプルを特定するために使用される配列リードを除いたものである。また、後記実施形態において使用される種々の配列リードの長さは、該リードにより得られることが求められる情報に基づいて変動しうる。例えば、配列リードの出発位置および長さは、ＮＤＮ領域およびそのヌクレオチド配列の長さが得られるように設計可能であり、したがって、ＮＤＮ領域全体にわたる配列リードが選択される。他の態様においては、Ｄおよび／またはＮＤＮ領域を（別々にではなく）組合されて含む１以上の配列リードで十分である。
【００４７】
本発明のもう１つの態様においては、クロノタイプの配列は、部分的には、配列リードを１以上のＶ領域参照配列および１以上のＪ領域参照配列とアライメント（整列）させることにより、そして部分的には、例えば高可変ＮＤＮ領域の場合のように参照配列に対するアライメントを伴わない塩基決定により決定される。種々のアライメントアルゴリズムが配列リードおよび参照配列に適用されうる。例えば、アライメント法を選択するための指針はＢａｔｚｏｇｌｏｕ，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，６：６−２２（２００５）（これを参照により本明細書に組み入れることとする）において得られうる。１つの態様においては、ＶリードまたはＣリード（前記のとおり）をＶおよびＪ領域参照配列に対してアライメントさせ、例えば、Ｇｕｓｆｉｅｌｄ（前記引用）およびＣｏｒｍｅｎら，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｔｈｅ  ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，２００９）に一般的に記載されているとおりに、木構造検索アルゴリズムを使用する。
【００４８】
配列リードからのＩｇＨクロノタイプの構築は、以下の少なくとも２つの要因により特徴づけられる：ｉ）アライメントをより困難にする体細胞突然変異の存在、およびｉｉ）Ｖセグメントの一部をＣリードに位置づけることがしばしば不可能となるほどにＮＤＮ領域がより大きい。本発明の１つの態様においては、この問題は、Ｖ領域に沿った種々の位置に位置するＶリードを得るための複数のプライマーセットを使用することにより克服され、好ましくは、該プライマー結合部位は非重複性であり、隔てられて配置され、少なくとも１つのプライマー結合部位はＮＤＮ領域に隣接しており、例えば、１つの実施形態においてはＶ−ＮＤＮ連結部から５〜５０塩基、あるいはもう１つの実施形態においてはＶ−ＮＤＮ連結部から１０〜５０塩基の位置に位置する。複数のプライマーセットの多重性は、１個または２個のプライマーが体細胞突然変異により影響を受けた結合部位を有さないためにクロノタイプを検出できないというリスクを最小にする。また、ＮＤＮ領域に隣接した少なくとも１つの結合部位の存在は、ＶリードがＣリードと重複してＣリードの長さを有効に伸長させる可能性を高くする。これは、ＮＤＮ領域の全サイズにわたりＮＤＮ領域の両側の実質的に全ＶおよびＪ領域をも位置づけうる連続配列の生成を可能にする。そのような方法を実施するための実施形態を図３Ａおよび３Ｄに例示する。図３Ａにおいては、Ｖ領域（３４０２）の連続的に長くなる部分（３４１１、３４１３、３４１５）を含む異なる長さを有し同じＮＤＮ領域を全てが含む複数のネスティッドアンプリコン（例えば、３４１０、３４１２、３４１４）を得るために、単一セットのＪ領域プライマー（３４０１）および複数（３つが示されている）セットのＶ領域（３４０２）プライマー（３４０４、３４０６、３４０８）で鎖を増幅することにより各鎖に関する複数のアンプリコンを得ることにより、ＩｇＨ鎖（３４００）を含むサンプルを配列決定する。ネスティッドセットのメンバーは、それらのそれぞれのＮＤＮ、Ｊおよび／またはＣ領域の同一性（または実質的な同一性）に注目することにより配列決定後に一緒に分類されることが可能であり、それにより、限られたリード長および／または配列品質を有する配列決定法に関してそうでない場合より長いＶ（Ｄ）Ｊセグメントの再構築を可能にする。１つの実施形態においては、プライマーセットの個数は２〜５個の範囲でありうる。もう１つの実施形態においては、該個数は２〜３個であり、更にもう１つの実施形態においては、該個数は３個である。複数のプライマーの濃度および位置は大きく変動しうる。それらのＶ領域プライマーの濃度は同じであっても同じでなくてもよい。１つの実施形態においては、ＮＤＮ領域に最も近いプライマーは該複数個のその他のプライマーより高い濃度を有していて、例えば、ＮＤＮ領域を含有するアンプリコンが、生じるアンプリコンにおいて表現されることを保証する。３個のプライマーを使用する特定の実施形態においては、６０：２０：２０の濃度比を用いる。Ｊ領域プライマー（３４３２）により産生された配列リード（３４４２）と重複する１以上の配列リード（例えば、３４３４および３４３６）を産生させ、それにより、重複領域（３４４０）における塩基呼出の質を改善するために、ＮＤＮ領域（３４４４）に隣接する１以上のプライマー（例えば、図３Ｄにおける３４３５および３４３７）が使用されうる。複数のプライマーからの配列リードは隣接下流プライマー結合部位および／または隣接下流配列リードと重複しても重複しなくてもよい。１つの実施形態においては、ＮＤＮ領域に近い配列リード（例えば、３４３６および３４３８）は、該クロノタイプに関連した個々のＶ領域を特定するために使用されうる。そのような複数のプライマーは、免疫グロブリン発生中にプライマー結合部位の１つが超突然変異している場合の不完全または無効な増幅の可能性を減少させる。それはまた、Ｖ領域の超突然変異により導入された多様性がクロノタイプ配列内に獲得される可能性を増加させる。例えば、例示されているとおりのＰ５（３４０１）およびＰ７（３４０４、３４０６、３４０８）プライマーで増幅してアンプリコン（３４２０、３４２２および３４２４）を得ることにより、配列決定のためのネスティッドアンプリコンを得るために、二次ＰＣＲを行うことが可能であり、該アンプリコンは固体表面上に単一分子として分布することが可能であり、その部位においてそれらは架橋ＰＣＲなどの技術により更に増幅される。
【００４９】
体細胞超突然変異。１つの実施形態においては、体細胞超突然変異を受けた、ＩｇＨに基づくクロノタイプを、以下のとおりに決定する。体細胞突然変異は、統計的に有意な数のリードに存在する、（関連セグメント、通常はＶ、ＪまたはＣの）参照配列の対応塩基とは異なる、配列決定された塩基と定義される。１つの実施形態においては、Ｃリードは、位置づけられたＪセグメントに関する体細胞突然変異を見出すために、そして同様にＶリードはＶセグメントに関して使用されうる。ＪまたはＶセグメントに直接的に位置づけられた、あるいはＮＤＮ境界までのクロノタイプ伸長の内部に存在するＣおよびＶリードの一部分のみが使用される。このようにして、ＮＤＮ領域が回避され、（実際には僅かに異なっている組換えＮＤＮ領域であるヌクレオチドを突然変異として誤って分類することを回避するために）クロノタイプ決定のために既に用いられたのと同じ「配列情報」は、突然変異を見出すためには使用されない。各セグメントのタイプに関して、位置づけられたセグメント（主要対立遺伝子）がスカフォールド（骨格）として使用され、リードの位置づけ（マッピング）の段階中にこの対立遺伝子に位置づけられ全てのリードが考慮される。少なくとも１つのリードが位置づけられた参照配列の各位置を体細胞突然変異に関して分析する。１つの実施形態においては、非参照塩基を妥当な突然変異として受け入れる基準は以下のものを含む：１）与えられた突然変異塩基を有する少なくともＮリード、２）少なくとも与えられた一部のＮ／Ｍリード（ここで、Ｍは、この塩基位置における、位置づけられたリードの総数である）、および３）非突然変異塩基を有するリードの数（Ｎ−Ｍ）、突然変異塩基におけるＮリードの平均Ｑスコアおよび二項分布に基づく統計的カット。好ましくは、前記パラメータは、クロノタイプ当たりの突然変異の偽発見率が１／１０００未満、より好ましくは１／１００００となるように選択される。
【００５０】
ＰＣＲエラーは、ＰＣＲの初期サイクルにおいて突然変異した幾つかの塩基に集中すると予想される。配列決定エラーは何らかの系統的バイアスを有する可能性が高いため、たとえそれが完全にランダムであったとしても、多数の塩基に分布すると予想される。幾つかの塩基は、より高い率、例えば５％（平均の５％）の配列決定エラーを有すると仮定される。これらの仮定を考慮すると、配列決定エラーが主要エラー型となる。ＰＣＲエラーを高関連性クロノタイプの存在から区別することは分析に影響を与えるであろう。２以上の高関連性クロノタイプが存在することを決定することの生物学的有意性を考慮して、そのようなコールを行うための保守的なアプローチが採用される。１個を超えるクロノタイプが存在することが高い信頼性（例えば、９９．９％）で保証されるように、非主要クロノタイプの十分な検出が考慮される。１００コピー／１，０００，０００で存在するクロノタイプの例では、非主要変異体は、それが独立クロノタイプと称されるためには、１４倍以上検出される。同様に、１，０００コピー／１，０００，０００で存在するクロノタイプでは、非主要変異体は、独立クロノタイプと称されるためには、７４倍以上検出されうる。このアルゴリズムは、各配列決定塩基で得られる塩基品質スコア（ｂａｓｅ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ）を使用することにより増強されうる。品質スコアとエラー率との間の関係が前記のように実証されれば、全塩基に関する保存的な５％のエラー率を用いる代わりに、品質スコアを用いて、独立クロノタイプと呼ぶために存在することが必要とされるリードの数を決定することができる。該リードの全てにおける特定の塩基のメジアン品質スコアを用いることが可能であり、あるいはより厳格には、各リードにおける特定の塩基の品質スコアが与えられれば、エラーである可能性が算出可能であり、ついで、その塩基に関する配列決定エラーの考えられうる数を推定するために、（独立を仮定すると）該確率が組合されうる。結果として、異なる品質スコアを有する異なる塩基に関する配列エラー仮説を棄却する異なる閾値が存在する。例えば、１，０００コピー／１，０００，０００で存在するクロノタイプの場合、非主要変異体が独立性だと言えるのは、エラーの確率が０．０１および０．０５のときには、それがそれぞれ２２倍および７４倍で検出される場合である。
【００５１】
配列決定エラーの存在下、各真正クロノタイプは、配列に関して種々の数のエラーを有するリードの「クラウド（ｃｌｏｕｄ）」により包囲される。配列決定エラーの「クラウド」は、配列空間におけるクロノタイプからの距離が増加するにつれて、密度において減少する。配列リードをクロノタイプに変換するためには種々のアルゴリズムが利用可能である。１つの態様においては、配列リードの合体（すなわち、１以上の配列決定エラーを有すると決定された候補クロノタイプの併合）は以下の少なくとも３つの要因に左右される：比較されるクロノタイプのそれぞれに関して得られた配列の数、それらが異なる塩基の数、およびそれらが合致しない位置における配列決定品質スコア。予想エラー率およびエラーの二項分布に基づく尤度比が得られ、評価されうる。例えば、１つは１５０個のリードを有し、もう１つは２個のリードを有し、それらの間に不良な配列決定の質の領域における１つの相違が存在する、２つのクロノタイプは、それらは配列決定エラーにより生じる可能性が高いため、合体される可能性が高いであろう。一方、１つは１００個のリードを有し、もう１つは５０個のリードを有し、それらの間に相違が存在する２つのクロノタイプは、合体されない。なぜなら、それらは配列決定エラーにより生じそうにないとみなされるからである。本発明の１つの実施形態においては、配列リードからクロノタイプを決定するために後記アルゴリズムが使用されうる。本発明の１つの実施形態においては、配列リードを、まず、候補クロノタイプに変換する。そのような変換は、用いる配列決定法に左右される。高いＱスコアの長い配列リードを与える方法の場合、配列リードまたはその一部は候補クロノタイプとして直接的に採用されうる。より低いＱスコアのより短い配列リードを与える方法の場合、関連配列リードの組合せを候補クロノタイプに変換するために幾つかのアライメントおよび構築（アセンブリー）工程が要求されうる。例えば、Ｓｏｌｅｘａに基づく方法の場合、幾つかの実施形態においては、前記のとおり複数（例えば、１０個以上）のクラスターからのペアになったリードの集団から候補クロノタイプを得る。
【００５２】
各候補クロノタイプを包囲する配列リードのクラウドは、二項分布、および単一塩基エラーの確率に関する単純モデルを用いてモデル化されうる。この後者のエラーモデルは、ＶおよびＪセグメントを位置づけること、または自己整合性および収束によるクロノタイプ発見アルゴリズム自体から推論されうる。Ｘが配列空間のこの領域における唯一の真のクロノタイプであるという帰無（ヌル）モデル下、リードカウントＣ２およびＥエラー（配列Ｘに関するもの）を有する与えられた「クラウド」配列Ｙが、完全なリードカウントＣ１を有する真のクロノタイプ配列Ｘの一部である確率に関して、モデルを構築する。パラメータＣ１、Ｃ２およびＥに従い配列ＹをクロノタイプＸに合体させるべきか否かの判断がなされる。任意の与えられたＣ１およびＥに関して、配列Ｙを合体させることを決定するために最大値Ｃ２を予備計算する。ＹがクロノタイプＸの一部であるという帰無仮説下でＹを合体させない確率が、配列Ｘの近傍におけるエラーＥを有する全ての可能な配列Ｙにわたって積分した後で或る値Ｐより小さくなるように、Ｃ２の最大値が選択される。値Ｐは該アルゴリズムの挙動を制御し、該合体を多少なりとも許容性にする。
【００５３】
配列Ｙが、そのリードカウントがクロノタイプＸとの合体に関する閾値Ｃ２を超えるため、クロノタイプＸに合体されない場合、それは、別のクロノタイプをシード化（ｓｅｅｄ；播種）するための候補となる。そのような原理を実行するアルゴリズムは、この配列Ｙ（これはＸから独立していると既にみなされている）に「より接近している」任意の他の配列Ｙ２、Ｙ３などがＸに合体されないことを保証する。「接近性」のこの概念はＹおよびＸに関するエラーカウントならびにＸおよびＹの絶対的リードカウントの両方を含む。すなわち、それは、クロノタイプＸの周囲のエラー配列のクラウドに関する前記モデルと同様にモデル化される。このように、「クラウド」配列は、それらが偶然に２以上のクロノタイプに「接近して」存在していれば、それらの正しいクロノタイプに適切に帰属されうる。
【００５４】
１つの実施形態においては、アルゴリズムは、最高リードカウントを有する配列Ｘから出発することによりトップダウン式に進行する。この配列は第１クロノタイプをシード化する。近傍配列は、それらのカウントが予備計算閾値（前記を参照されたい）より低い場合にはこのクロノタイプに合体され、あるいはそれらが該閾値より大きい、または合体されない別の配列に「より接近している」場合には、そのままにされる。最高エラーカウント内の全ての近傍配列を検索した後、リードをクロノタイプＸに合体させる過程を終了する。そのリード、およびそれに合体された全リードが明らかにされ、他のクロノタイプを得るために利用可能なリードのリストから除去される。ついで、最高リードカウントを有する次の配列に移る。前記のとおりに近傍リードをこのクロノタイプに合体させ、与えられた閾値を超えるリードカウントを有する配列がそれ以上存在しなくなるまで、例えば、１を超えるカウントを有する全ての配列がクロノタイプのシードとして使用されるまで、この過程を継続する。
【００５５】
前記のとおり、前記アルゴリズムのもう１つの実施形態においては、関連配列リードの品質スコアを考慮して候補配列Ｙを既存クロノタイプＸに合体させるべきかどうかを決定するためのもう１つの試験を加えることが可能である。平均品質スコアは配列Ｙに関して決定される（配列Ｙを有する全リードにわたって平均される）（配列ＹおよびＸは異なる）。平均スコアが所定値を超える場合には、合体されるべきでない真に異なるクロノタイプを該相違が示す可能性がより高く、平均スコアがそのような所定値より低い場合には、配列Ｙが配列決定エラーにより生じ、したがってＸに合体されるべきである可能性がより高い。
【００５６】
関連クロノタイプの族集団
しばしば、リンパ球は関連クロノタイプを産生する。すなわち、類似した配列を有するクロノタイプを産生する複数のリンパ球が存在または発生しうる。これは、超ＩｇＨ分子の場合の突然変異のような種々のメカニズムによるものでありうる。もう１つの例としては、リンパ系新生物のような癌においては、単一リンパ球前駆体は多数の関連リンパ球後代を与えることが可能であり、それらのそれぞれは、塩基置換、異常再配列などのような癌関連体細胞突然変異ゆえに、若干異なるＴＣＲまたはＢＣＲ、したがって異なるクロノタイプを有し、および／または発現する。一群のそのような関連クロノタイプは本明細書においては「族集団（ｃｌａｎ）」と称される。幾つかの場合、族集団のクロノタイプは別の族集団メンバーの突然変異から生じうる。そのような「後代」クロノタイプは系統学的クロノタイプと称されうる。族集団内のクロノタイプは親クロノタイプまたはお互いに対する関連性の１以上の尺度により特定されうる。１つの実施形態においては、後記で更に詳細に記載されているとおり、クロノタイプは相同性（％）により同一族集団に分類されうる。もう１つの実施形態においては、クロノタイプはＶ領域、Ｊ領域および／またはＮＤＮ領域の共通の利用頻度により族集団に帰属されうる。例えば、族集団は、共通のＪおよびＮＤ領域を有するが異なるＪ領域を有するクロノタイプにより定義されうる。あるいはそれは、（同じ塩基置換突然変異を含む）同じＶおよびＪ領域を有するが異なるＮＤＮ領域を有するクロノタイプにより定義されうる。あるいはそれは、族集団メンバーを生成するように１〜１０個の塩基または１〜５個の塩基または１〜３個の塩基の１以上の挿入および／または欠失を受けたクロノタイプにより定義されうる。もう１つの実施形態においては、族集団のメンバーは以下のとおりに決定される。
【００５７】
クロノタイプが同一族集団に帰属されるのは、それらが以下の基準を満たす場合である：ｉ）それらは同じＶおよびＪ参照セグメントに位置づけられ、該位置づけは該クロノタイプ配列内の同一相対位置において生じる；ならびにｉｉ）それらのＮＤＮ領域は実質的に同一である。族集団のメンバーであることに関する「実質的」は、ＮＤＮ領域内で体細胞突然変異が生じた可能性があるため、ＮＤＮ領域内の幾つかの小さな相違が許容されることを意味する。好ましくは、１つの実施形態においては、ＮＤＮ領域内の突然変異を誤って認定（コール）することを避けるために、塩基置換が癌関連突然変異として受け入れられるかどうかは族集団のＮＤＮ領域のサイズに直接的に左右される。例えば、ある方法がクロノタイプを族集団メンバーとして受け入れうるのは、それが癌関連突然変異としての族集団ＮＤＮ配列との１塩基の相違を有し、族集団ＮＤＮ配列の長さがｍヌクレオチド以上、例えば９ヌクレオチド以上である場合であり、そうでない場合には、それは受け入れられず、あるいはそれが癌関連突然変異としての族集団ＮＤＮとの２塩基の相違を有し、族集団ＮＤＮ配列の長さがｎヌクレオチド以上、例えば２０ヌクレオチド以上である場合であり、そうでない場合には、それは受け入れられない。もう１つの実施形態においては、族集団のメンバーは、以下の基準を用いて決定される：（ａ）Ｖリードは同じＶ領域に位置づけられる、（ｂ）Ｃリードは同じＪ領域に位置づけられる、（ｃ）実質的に同一のＮＤＮ領域（前記のとおり）、ならびに（ｄ）Ｖ−ＮＤＮ境界とＪ−ＮＤＮ境界との間のＮＤＮ領域の位置は同じである（あるいは同等に、Ｄへの下流塩基付加の数およびＤへの上流塩基付加の数は同じである）。単一サンプルのクロノタイプを幾つかの族集団に分類することが可能であり、種々の時点で得られた連続的サンプルからの族集団を互いに比較することが可能である。特に、本発明の１つの態様においては、リンパ系新生物のような疾患と相関するクロノタイプを含有する族集団を各サンプルのクロノタイプから特定し、直前のサンプルのものと比較して、例えば連続的寛解、初期再発、更なるクローン進化の証拠などのような病態を決定する。族集団に関して本明細書中で用いる「サイズ」は該族集団におけるクロノタイプの数を意味する。
【００５８】
前記のとおり、１つの態様においては、本発明の方法は個々のクロノタイプではなくクロノタイプの族集団のレベルをモニタリングする。これはクローン進化の現象に基づくものである（例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０５：１３０８１−１３０８６（２００８）；Ｇｅｒｌｉｎｇｅｒら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１０３：１１３９−１１４３（２０１０））。診断サンプル中に存在するクローンの配列は後のサンプル（例えば、疾患の再発時に採取されたサンプル）におけるものと全く同じままではないかもしれない。したがって、該診断サンプル配列に一致する厳密なクロノタイプ配列に従っている場合、再発の検出に失敗する可能性があるであろう。そのような進化クローンは配列決定により容易に検出され、特定される。例えば、該進化クローンの多くはＶ領域置換（ＶＨ置換と称される）により生じる。これらのタイプの進化クローンはリアルタイムＰＣＲ技術によっては見逃される。なぜなら、誤ったＶセグメントをプライマーが標的化するからである。しかし、Ｄ−Ｊ連結部が進化クローンにおいて無傷なままであると仮定すると、個々の空間的に単離された分子の配列決定を用いる本発明においては、それは検出され特定されうる。更に、診断サンプルにおけるかなりの頻度でのこれらの関連クロノタイプの存在はクロノタイプの関連性の可能性を増大させる。同様に、免疫受容体配列における体細胞超突然変異の発生はリアルタイムＰＣＲプローブ検出を妨げうるが、配列決定読出しに適用される適当なアルゴリズム（前記で開示されているとおり）はクロノタイプを進化クロノタイプとして尚も認識しうる。例えば、ＶまたはＪセグメントにおける体細胞超突然変異が認識されうる。これは、最も近い生殖系列ＶおよびＪ配列にクロノタイプを位置づけることにより行われる。生殖系列配列との相違は体細胞超突然変異に起因すると考えられうる。したがって、ＶまたはＪセグメントにおける体細胞超突然変異を経て進化するクロノタイプは容易に検出され特定されうる。ＮＤＮ領域における体細胞超突然変異は予測されうる。残りのＤセグメントが、認識され位置づけられるのに十分に長い場合、それにおける任意の体細胞突然変異が容易に認識されうる。Ｎ＋Ｐ塩基（または位置づけ不可能なＤセグメント）における体細胞超突然変異は確実には認識され得ない。なぜなら、これらの配列は、癌性クロノタイプの後代ではない可能性のある新たに組換えられた細胞において修飾されうるからである。しかし、体細胞突然変異によるものであるという高い可能性を有する塩基変化を特定するためのアルゴリズムが容易に構築される。例えば、同じＶおよびＪセグメントを有し、元のクローンとのＮＤＮ領域内の１塩基の相違を有するクロノタイプは、体細胞組換えの結果であるという高い可能性を有する。ＶおよびＪセグメントに他の体細胞超突然変異が存在すれば、この可能性は増大されうる。なぜなら、これは、体細胞超突然変異の対象物であるものとして、この特定のクロノタイプを特定するからである。したがって、元のクロノタイプからの体細胞超突然変異の結果であるというクロノタイプの可能性は、幾つかのパラメータ、すなわち、ＮＤＮ領域内の相違の数、ＮＤＮ領域の長さ並びにＶおよび／またはＪセグメントにおける他の体細胞超突然変異の存在を用いて計算されうる。
【００５９】
クローン進化データは有益でありうる。例えば、主要クローンが進化クローン（これまでに存在せず、したがってこれまでに記録されていないもの）である場合、これは、潜在的な選択上の利点を伴う新たな遺伝的変化を腫瘍が獲得したという指標である。これは、免疫細胞受容体における特異的変化が該選択的利点の原因であるということではなく、それらがそれに関するマーカーに相当しうるということである。進化したクロノタイプを有する腫瘍は、潜在的に異なった治療後の経過予想に関連づけられうる。本発明の１つの態様においては、リンパ系新生物、例えば白血病のような疾患の患者特異的バイオマーカーとして用いられるクロノタイプは、モニタリングされるクロノタイプの体細胞突然変異体であるこれまでに記録されていないクロノタイプを含む。もう１つの態様においては、任意のこれまでに記録されていないクロノタイプが、患者特異的バイオマーカーとして働く既存クロノタイプまたはクロノタイプ群に対して少なくとも９０％相同である場合はいつでも、そのような相同クロノタイプは、その後モニタリングされるクロノタイプと共に又は該クロノタイプの群に含まれる。すなわち、１以上の患者特異的クロノタイプがリンパ系新生物において特定され、（例えば、それほど侵襲的でない方法で得られた血液サンプルに関する測定を行うことにより）該疾患を定期的にモニタリングするために使用される場合、および１つのそのような測定の経過中に、現在の集合のクロノタイプの体細胞突然変異である新たな（これまでに記録されていない）クロノタイプが検出された場合には、それは、後続の測定のためにモニタリングされる患者特異的クロノタイプの族集合に加えられる。１つの実施形態においては、そのようなこれまでに記録されていないクロノタイプが現在の集合のメンバーに対して少なくとも９０％相同である場合には、それは、患者に対して行われる次の試験のためのクロノタイプバイオマーカーの患者特異的集合に加えられ、すなわち、そのようなこれまでに記録されていないクロノタイプは、（クロノタイプデータの前記分析に基づいて）それが由来するクロノタイプの現在の集合のメンバーの族集団に含まれる。もう１つの実施形態においては、これまでに記録されていないクロノタイプが現在の集合のメンバーに対して少なくとも９５％相同である場合に、そのような包含が行われる。もう１つの実施形態においては、これまでに記録されていないクロノタイプが現在の集合のメンバーに対して少なくとも９８％相同である場合に、そのような包含が行われる。
【００６０】
細胞は突然変異の蓄積と共に、ＮＤＮ領域を置換するものの、ＶおよびＪセグメントを維持する過程を経て進化する可能性もある。そのような細胞は、共通のＶおよびＪセグメントの特定により、これまでに記録されていない癌クロノタイプとして特定されうる。ただし、それらが、十分な数の突然変異を含有しており、独立して誘導された可能性が小さい場合に限る。もう１つの制約としては、ＮＤＮ領域が、これまでに配列決定されたクローンに類似したサイズのものであることが挙げられうる。
【００６１】
クロノタイプを計数することによるサンプルにおける細胞数の決定
幾つかの実施形態においては、充分な量のリンパ球または形質細胞のサンプルを採取することは本発明の重要な態様である。例えば、１，０００個のリンパ球を含有するサンプルから出発して、得られる配列決定リードの個数に無関係に該アッセイが感受性である最小頻度が得られる。したがって、幾つかの実施形態においては、投入免疫受容体分子の数を定量するための幾つかの工程を行う。特に、これは、ＭＲＤのモニタリングの一部として末梢血中の形質細胞のレベルを決定するために行われうる。幾つかの実施形態においては、コピーの絶対数を得るために、既知数の免疫受容体コピーを有する内部標準と共に多重プライマーを使用するリアルタイムＰＣＲを行う。このリアルタイムＰＣＲ測定は、後に配列決定される又は同じサンプルの別のアリコートで行われうる増幅反応から行われうる。ＤＮＡの場合には、再編成免疫受容体分子の絶対数は細胞数に容易に変換されうる（評価される特異的免疫受容体の、２個の再編成コピーを有する細胞もあれば、１個を有する細胞もあるため、２倍以内）。ｃＤＮＡの場合には、リアルタイムサンプルにおける再編成分子の測定総数を外挿することで、同じサンプルの別の増幅反応において用いられるこれらの分子の総数を決定することができる。また、この方法をＲＮＡの総量を決定するための方法と組み合わせることで、ｃＤＮＡ合成の比効率を仮定して、単位量（例えば、１μｇ）のＲＮＡにおける再編成免疫受容体分子の数を決定することができる。ｃＤＮＡの総量を測定する場合には、ｃＤＮＡ合成の効率を考慮する必要はない。細胞数も既知である場合には、細胞当たりの再編成免疫受容体コピー数を計算することができる。細胞数が不明の場合には、全ＲＮＡからそれを推定することが可能である。なぜなら、特定のタイプの細胞は、通常、同程度の量のＲＮＡを産生するからである。したがって、１μｇ当たりの再編成免疫応答分子のコピー数から、細胞当たりのこれらの分子の数を推定することが可能である。
【００６２】
配列決定のために処理される反応からの別のリアルタイムＰＣＲを行う１つの欠点は、その他の反応からのリアルタイムＰＣＲにおいて異なる抑制効果が存在しうることである。なぜなら、異なる酵素、投入ＤＮＡおよび他の条件が利用されうるからである。配列決定のためのリアルタイムＰＣＲの産物を処理することで、この問題は改善されるであろう。しかし、リアルタイムＰＣＲを用いた場合の低いコピー数は、低いコピー数、抑制効果、または該反応における他の最適でない条件を原因とするものでありうる。
【００６３】
用いられうるもう１つのアプローチは、既知配列を有する既知量の特有の免疫受容体（すなわち、既知量の１以上の内部標準）を不明量のサンプルからのｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに加えることである。該既知添加配列に関して得られた分子の相対数を、同じサンプルの配列の残りと比較して計数することにより、初期ｃＤＮＡサンプルにおける再編成免疫受容体分子の数を推定することが可能である（分子計数のためのそのような技術はよく知られている；例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒら，米国特許第７，５３７，８９７号（これを参照により本明細書に組み入れることとする））。前記の特有の添加配列の配列決定からのデータは、リアルタイムＰＣＲ較正も用いられている場合に、異なる可能性を区別するために用いられうる。ＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）における再編成免疫受容体の低コピー数は、サンプル配列の残りと比較された添加配列の分子数の高い比を与えるであろう。一方、リアルタイムＰＣＲによる測定された低コピー数が該反応における非効率によるものであれば、該比は高くないであろう。
【００６４】
１つの態様においては、本発明は、細胞レベルでクロノタイプ発現を測定するための方法を提供する。すなわち、前記のとおり、クロノタイプは、リンパ球を計数するために用いられうる。したがって、ゲノムＤＮＡに由来するクロノタイプおよびＲＮＡに由来する同じクロノタイプを測定することにより、クロノタイプの、細胞に基づく発現が決定されうる。サンプルにおけるリンパ球数およびクロノタイプ発現レベルを同時に測定するための方法は、（ａ）Ｔ細胞および／またはＢ細胞を含むサンプルを個体から入手し、（ｂ）該細胞のゲノムＤＮＡに由来する空間的に単離された個々の分子を配列決定し（そのような空間的に単離された個々の分子は、該サンプルにおけるリンパ球の数に対応する数のクロノタイプを含む）、（ｃ）該細胞のＲＮＡに由来する空間的に単離された個々の分子を配列決定し（そのような空間的に単離された個々の分子は、該サンプルのリンパ球におけるクロノタイプの発現レベルに対応する数のクロノタイプを含む）、（ｄ）該細胞のゲノムＤＮＡに由来する単離された個々の分子から決定された数と、該細胞のＲＮＡに由来する単離された個々の分子から決定された数とを各クロノタイプに関して比較することにより、該サンプルのリンパ球におけるクロノタイプ発現レベルを決定する工程を含みうる。商業的に入手可能なキット、例えばＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡは同じサンプルから容易に抽出される。前記のとおり、１つの実施形態においては、更に詳細に決定する工程は、既知量の内部標準を該ゲノムＤＮＡに加えることにより、該サンプルにおけるリンパ球の数を決定することを含む。もう１つの実施形態においては、例えば該サンプルが末梢血である場合、該サンプルは、該リンパ球の濃度が該サンプルにおいて決定されることを可能にする一定体積を有する。典型的には、そのような一定体積は１ｍＬ〜５０ｍＬの範囲、より通常は１ｍＬ〜１０ｍＬの範囲である。もう１つの実施形態においては、ＲＮＡに由来する単離された個々の分子から決定されたクロノタイプの数を、ゲノムＤＮＡに由来する単離された個々の分子から決定されたクロノタイプの数で単に割り算することにより、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡに由来する同じクロノタイプの数を比較する。そのような２群のクロノタイプは、標識の使用により、特に、サンプル調製プロセス中に結合されるオリゴヌクレオチドタグの使用により、同じ配列決定実施において容易に区別される。Ｓｏｌｅｘａに基づく配列決定の場合、そのような標識は、異なるサンプルを特定するために使用されるタグと一体化されることが可能であり、これは、（例えば）ＤＮＡまたはＲＮＡを示すために該タグに単一ヌクレオチドを加えることにより、または各患者サンプルが２つのタグ（１つはゲノムＤＮＡ画分に関するものであり、１つはＲＮＡ画分に関するものである）で標識されるように追加的なタグを単に使用することにより行われうる。したがって、該ＲＮＡに由来する空間的に単離された個々の分子を配列決定する該工程は、前記の空間的に単離された個々の分子のそれぞれを、そのＲＮＡ起源を示す第１標識で���識することを含むことが可能であり、該ゲノムＤＮＡに由来する空間的に単離された個々の分子を配列決定する該工程は、前記の空間的に単離された個々の分子のそれぞれを、そのゲノムＤＮＡ起源を示す第２標識で標識することを含むことが可能であり、第１標識は第２標識から識別可能である。１つの実施形態においては、そのような標識は、配列決定により特定される特徴的なオリゴヌクレオチドタグである。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、免疫グロブリン遺伝子を増幅し配列決定するための２段階ＰＣＲ法を示す。
【図２】図２Ａは、図１ＣのＰＣＲ産物のヌクレオチド配列を決定する１つの実施形態の詳細を例示する。図２Ｂは、図１ＣのＰＣＲ産物のヌクレオチド配列を決定するもう１つの実施形態の詳細を例示する。
【図３】図３Ａは、単一反応においてＩｇＨ鎖から３つの配列決定鋳型を作製するためのＰＣＲ法を例示する。図３Ｂ〜３Ｃは、３つの別々の反応においてＩｇＨ鎖から３つの配列決定鋳型を作製するためのＰＣＲ法を例示しており、その後、得られたアンプリコンは、Ｐ５およびＰ７プライマー結合部位を付加するための二次ＰＣＲのために一緒にされる。図３Ｄは、ＩｇＨ鎖に関して得られた配列リード（配列読取）の位置を例示する。
【００６６】
実施例１
多発性骨髄腫患者の末梢血における骨髄腫細胞のモニタリング
この実施例においては、診断時および治療後の時点における末梢血中に骨髄腫細胞を有する６０名の多発性骨髄腫（ＭＭ）患者の割合を決定するために、本発明の方法を多施設研究において使用した。これら６０名のＭＭ患者のコホートにおいて、末梢血における骨髄腫細胞レベルが骨髄で見出される疾患のレベルと相関し、末梢血における骨髄腫細胞レベルが、病態の尺度として、従来のモノクローナルタンパク質（Ｍタンパク質）レベルと同等のものであることを確認した。
【００６７】
骨髄および末梢血サンプルにおける骨髄腫クローンの存在をＪＧＨおよびＩＧＫ遺伝子座の増幅および配列決定により特徴づけた。まず、比較的高い疾患負荷を有するサンプルからの骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）および／または骨髄ＣＤ１３８＋細胞を使用して、各サンプルにおけるそれらの頻度に基づいて骨髄腫特異的クローンを特定した。第２の時点からのＢＭＭＣが利用可能であった場合には、ＤＮＡを単離し、ＩＧＨおよびＩＧＫ遺伝子座を増幅し、配列決定し、サンプル中の骨髄腫クローンの存在を評価した。
【００６８】
骨髄腫クローンの同定の後、対応する血液サンプル（末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、血清および／または血漿）を分析して、骨髄腫クローンが末梢血中に存在するかどうかを決定した。末梢血サンプルを３つのワークフローに分割した。１つのワークフローにおいては、ＤＮＡを血漿および血清サンプルから単離し、ＩＧＨおよびＩＧＫを増幅し、配列決定し、骨髄腫クローンの存在に関して分析した。第２のワークフローにおいては、ＤＮＡおよびＲＮＡをＰＢＭＣから単離し、ＩＧＨおよびＩＧＫ遺伝子座を増幅し、配列決定し、骨髄腫クローンの存在に関して分析した。この配列データはサンプルにおける骨髄腫クロノタイプに関する定量的尺度を与える。第３のワークフローにおいては、正常ナイーブＢ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３８−ＣＤ１９＋ＣＤ２７−）および正常抗原経験（ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄ）Ｂ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３８−ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋）（本明細書においては正常Ｂ細胞と総称される）ならびに骨髄腫免疫表現型（ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３８＋）を有する細胞をフローサイトメトリーにより選別した。ＤＮＡをこれらの選別細胞から単離し、ＩＧＨおよびＩＧＫ遺伝子を増幅し、配列決定した。骨髄腫細胞に合致した免疫表現型を有する細胞に該骨髄腫クローンが実際に存在することを実証するために、これらの選別サンプルを使用した。
【００６９】
未選別および選別配列決定データは２つの相補的な目的に役立った。高い疾患負荷を有するサンプルからの未選別配列決定データは、頻度閾値に基づく各患者における骨髄腫クローンの特定を可能にした。未選別配列データからの結果は、サンプル（血液または骨髄）における個々の骨髄腫分子（すなわち、骨髄腫クローン）のレベルを定量するためにも使用した。一方、選別集団からの配列データは、骨髄腫疾患クローンを検証するために使用した。骨髄腫クローンは、その頻度が選別骨髄腫において上昇し、正常Ｂ細胞においては下降する場合に確認された。したがって、未選別データは骨髄腫クローンのレベルに関する定量的尺度を与え、一方、選別データは疾患クローンの定量的検証のために使用されるに過ぎない。
【００７０】
臨床サンプル
合計６０個のペアになった骨髄および末梢血のサンプルを分析した。４７個のペアになった骨髄および末梢血のサンプルを、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅまたはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄｓにより承認されたプロトコールに基づいて集めた。試料採集前に書面のインフォームドコンセントを得、研究における使用の前に、ヘルシンキ宣言に従い、サンプルを非特定化（ｄｅ−ｉｄｅｎｔｉｆｙ）した。サンプルを疾患の全段階（新たに診断された、治療中、移植後、再発など）における患者から採取した。年齢、性別、試料採集時の状態およびＭタンパク質レベルを含むベースライン人口統計学的および臨床情報を集めた。１３個のペアになった骨髄および末梢血のサンプルを商業的入手元（ＡｌｌＣｅｌｌｓ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）から購入した。凍結保存単核細胞（骨髄または血液）、磁気的富化（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）後にＣＤ１３８陰性および陽性画分に分離された凍結保存骨髄細胞、血漿または血清として、サンプルを保存した。サンプル特性を表１に要約する。
【表１】
2015535178.tif 000002
【００７１】
フローサイトメトリーおよび細胞選別
凍結保存細胞の解凍の直後に、バイアル体積の３分の１を洗浄し、直ちに細胞溶解した。各バイアルの残部を、２％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ／２ＦＢＳ）に懸濁させ、１回洗浄した後、抗体標識に付した。フローサイトメトリーおよび細胞選別による分析のためにＢｉｏＬｅｇｅｎｄまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの以下の抗体と共に単核細胞をインキュベートした：抗ＣＤ１９（クローンＨＩＢ１９）、ＣＤ４５（クローンＨＩ３０）、ＣＤ１３８（クローンＤＬ−１０１）、ＣＤ３８（クローンＨＩＴ２）およびＣＤ２７（クローンＯ３２３）。インキュベーション後、細胞を洗浄し、非生細胞の排除を可能にする４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含有するＰＢＳ／２ＦＢＳに懸濁させた。細胞を得、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して選別した。各患者サンプルから、正常ナイーブＢ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３８−ＣＤ１９＋ＣＤ２７−）、正常抗原経験Ｂ細胞および骨髄腫（ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３８＋として定義される）細胞を選別した。選別細胞をペレット化し、核酸単離のためにＲＬＴ  Ｐｌｕｓバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）中で細胞溶解した。フローサイトメトリーデータの分析を、ＦｌｏｗＪｏ（Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して行った。
【００７２】
ＭＲＤ測定
前記および以下の参考文献に記載されているとおりに、骨髄腫細胞のレベルを測定するために、本発明の方法を使用した：Ｆａｈａｍ  Ｍら，Ｄｅｅｐ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１２０（２６）：５１７３−５１８０；およびＧａｗａｄ  Ｃら，Ｍａｓｓｉｖｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｌｏｃｕｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１２０（２２）：４４０７−４４１７。簡潔に説明すると、生殖系列ＩＧＨおよびＩＧＫ配列の全既知対立遺伝子の増幅を可能にするように設計されたＩＧＨ−ＶＤＪ、ＩＧＨ−ＤＪおよびＩＧＫに対する遺伝子座特異的プライマーセットを使用して、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡを増幅した。少なくとも２つの同一配列決定リードが得られた場合に、クロノタイプが定められた。
【００７３】
各クロノタイプに関する配列決定リードの数を計算し、サンプルにおける通過配列決定リードの総数で割り算することにより、サンプルにおける各クロノタイプの頻度を決定した。骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）または骨髄ＣＤ１３８陽性細胞における約５％の頻度閾値を用いて、骨髄腫遺伝子再編成を特定した。予備研究においては、正常Ｂ細胞集団における個々のクロノタイプの頻度は一貫してこの閾値より低かった。
【００７４】
骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）またはＣＤ１３８陽性細胞において特定された骨髄腫由来配列を、末梢血サンプル（すなわち、末梢血単核細胞、血漿または血清）におけるＭＲＤの存在を評価するための標的として使用した。ＭＲＤ定量のために、多重配列決定リードを該反応における各再編成Ｂ細胞に関して得た。例えば、ＩＧＨ再編成を含有する細胞（すなわち、Ｂ細胞）においては、Ｂ細胞当たり約１０×カバレージ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）が得られるようにＭＲＤアッセイを設計した。サンプル中に存在する全骨髄腫由来分子の絶対的尺度を決定し、例えば、Ｆａｈａｍ  Ｍら，Ｄｅｅｐ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１２０（２６）：５１７３−５１８０に記載されているとおりに、各サンプルに関して最終ＭＲＤ（これは１００万細胞相当物当たりの骨髄腫由来分子の数である）を得た。
【００７５】
骨髄サンプルにおいて特定された骨髄腫クローン
６０名のＭＭ患者からのＢＭＭＣおよび骨髄ＣＤ１３８＋細胞における免疫細胞受容体遺伝子再編成、すなわち、ＩＧＨ−ＶＤＪ、ＩＧＨ−ＤＪおよびＩＧＫを検出するために、該配列決定アッセイを用いた。該６０名中４８名が少なくとも１つの受容体（本明細書においては「較正受容体」と称される）に関する高頻度の遺伝子再編成を示した。ＩＧＨ−ＶＤＪは最も有益な較正受容体であり、６０名中４４名（７３％）の患者においてＩＧＨ骨髄腫クローンが見出された（表２）。較正時に高い疾患負荷を有するＭＭ患者に該分析を限定した場合には、５１名中４８名（９４％）のＭＭ患者において骨髄腫クローンが検出された（表２）。高い疾患負荷は、免疫組織化学またはフローサイトメトリー分析により５％を超える骨髄腫細胞と定義された。
【表２】
2015535178.tif 000003
【００７６】
末梢血単核細胞および無細胞サンプルにおける骨髄腫クローンの検出
ついで、対応する末梢血サンプルにおいて骨髄腫クローンを検出するために、前記配列決定アッセイを用いた。この分析は、ＢＭＭＣまたは骨髄ＣＤ１３８＋細胞においてＩＧＨ−ＶＤＪまたはＩＧＫ骨髄腫クローンが検出された４６名の患者に限定された。２名の患者はＩＧＨ−ＤＪ骨髄腫クローンだけを含有し、不十分なＤＮＡゆえにこの分析から除外された。該骨髄腫クローンは、４６名中３６名（７８％）の患者において、ＩＧＨ−ＶＤＪまたはＩＧＫ  ＤＮＡアッセイを用いて、未選別ＰＢＭＣ区画において検出された（表３）。この検出率は、ＩＧＨ  ＲＮＡアッセイで該ＰＢＭＣサンプルを評価した場合には、４６名中４４名（９６％）の患者に増加した（表３）。このことは、該ＲＮＡアッセイが、該ＤＮＡアッセイと比べて高い感度をもたらしうることを示唆している。無細胞ＤＮＡサンプルの一部のみが分析のために末梢血から採集されたが、これらのサンプルの大部分（８３％）は該骨髄腫クローンの存在を示した（表３）。末梢血からのＰＢＭＣおよび無細胞区画の両方を組合せた場合には、該骨髄腫クローンは４６名中４５名（９８％）のＭＭ患者において検出された（表３）。
【表３】
2015535178.tif 000004
【００７７】
フローサイトメトリーを使用する骨髄腫クローンの検証
頻度のみに基づいて特定された骨髄腫クローンを検証するために、疾患クローン頻度を各個体における末梢血からの３つの選別集団（精製骨髄腫細胞集団および２つの正常Ｂ細胞集団）において評価した。骨髄腫クローンは実際に、ナイーブおよび抗原経験正常Ｂ細胞の両方において、遥かに低い頻度で存在した。選別正常Ｂ細胞においては骨髄腫クローンの低（非ゼロ）頻度が予想される。なぜなら、通常の蛍光標示式細胞分取は純粋集団の単離を可能にしないからである。更に、標的細胞が非常に低い頻度である場合には、選別純度は最低である。濃度が実質的に低下しなかった少数のサンプルは、低い正常Ｂ細胞頻度を示した。ほとんどの選別正常Ｂ細胞において、骨髄腫クローンは存在しなかった。特に、平均骨髄腫クローン頻度はＰＢＭＣにおいては１２．５％（中央値０．３５％）であり、これに対して、正常ナイーブ（ＣＤ４５＋ＣＤ３８−ＣＤ１９＋ＣＤ２７−）および正常抗原経験（ＣＤ４５＋ＣＤ３８−ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋）Ｂ細胞においてはそれぞれ０．０５％（中央値０％）および０．４１％（中央値０％）であった。これとは対照的に、骨髄腫クローンは、骨髄腫細胞マーカー（ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３８＋）に関して選別された細胞において、ある患者においては１００倍以上富化された（図２Ｃ）。富化の度合は、未選別細胞における骨髄腫クローン頻度が高い患者サンプルにおいて最低であった。これは、骨髄腫クローン頻度が未選別ＰＢＭＣサンプルにおいて高く、選別によっては更には富化され得なかったことによるものである。骨髄腫細胞マーカーに関して選別された細胞においては幾つかの骨髄腫クローンは存在せず、これは選別ＰＢＭＣサンプルにおける低い細胞数により説明されうる。要約すると、これらの結果は、末梢血において検出される骨髄腫クローン配列は骨髄腫細胞に存在するという仮定を実証している。
【００７８】
血液および骨髄における骨髄腫クローンのレベルの間の直接的な関係
ペアになった未選別ＰＢＭＣおよびＢＭＭＣにおける骨髄腫クローンレベルを比較して、それらの２つの区画の間に定量的相関性が存在するかどうかを決定した。この分析に含まれる患者は２つの基準を満たした。第１に、ペアになった未選別ＢＭＭＣ（ＣＤ１３８＋精製体ではない）およびＰＢＭＣサンプルが、該相関分析に含まれる各患者に関して入手可能であったこと。第２に、ＩＧＨ−ＶＤＪ  ＤＮＡまたはＩＧＫアッセイを用いて、ペアになったＰＢＭＣおよびＢＭＭＣサンプルにおいて骨髄腫クローンが検出されたこと。３３名の患者がこれらの基準を満たし、該相関分析に加えられ、２名の患者は複数の時点からのサンプルを有していた。ＩＧＨ−ＶＤＪまたはＩＧＫアッセイを用いてＤＮＡレベルを比較し、末梢血および骨髄における骨髄腫クローンレベル間で直接相関性が見出された（Ｒ２＝０．５７）。重要なことに、末梢血骨髄腫クローンレベルは、ペアになった骨髄サンプルにおけるレベルより約１００倍低かった。
【００７９】
配列決定とＭタンパク質レベルとの比較
ＭＭ患者における疾患負荷の確立された尺度である、血清タンパク質電気泳動（モノクローナルタンパク質、Ｍタンパク質）を用いて測定された疾患レベルと、配列決定により得られた骨髄腫クローンレベルとの一致性を評価した。この分析は、対応Ｍタンパク質値が入手可能である未選別ＢＭＭＣ（２４名の患者）またはＰＢＭＣ（３５名の患者）を有するＩＧＨ−ＶＤＪまたはＩＧＫ較正患者に限定された。１３名の患者に関しては２以上の時点が含まれた。重要なことに、該配列決定アッセイは、Ｍタンパク質試験の結果を知ることなく行われた。
【００８０】
骨髄区画においては、それらの２つの方法は、２７個中２４個（８９％）のサンプルにおいて、一致した結果を示した。２７個中３個（１１％）のサンプルにおいては、骨髄腫細胞レベルは配列決定によっては陽性であったが、Ｍタンパク質によっては検出不能であった。末梢血サンプルにおいては、結果は５２個中４９個（９４％）のサンプルにおいて一致し、両方の方法により４５個（８６％）は陽性であり、４個（８％）は陰性であった。４９個中６個の陽性一致サンプルにおいて、ＰＢＭＣから単離されたＲＮＡを配列決定することにより骨髄腫クローンが検出された。該陽性一致サンプルの２個において、該配列決定アッセイは無細胞区画における骨髄腫クローンを特定した。結果は、５２個中３個（６％）のサンプルにおいて、それらの２つの方法の間で一致しなかった。それらの３個の不一致サンプル中の２個においては、骨髄腫クローンレベルは配列決定によっては陽性であったが、Ｍタンパク質アッセイによっては陰性であった。残りの不一致サンプルにおいては、Ｍタンパク質レベルは陽性であったが、配列決定によっては検出不能であった。このサンプルにおける配列決定試験により分析されたＤＮＡは２７５，０００個の投入細胞に相当した。該配列決定アッセイの感度は投入細胞の数により制限されるため、より大量の出発物質が供給されていれば、骨髄腫クローンは該配列決定アッセイにより検出された可能性がある。
【００８１】
実施例２
多発性骨髄腫患者におけるクロノタイプのオリゴクローン性
この実施形態においては、患者の診断用骨髄サンプルのクロノタイププロファイルから多発性骨髄腫の多数のクロノタイプ特性を決定する。そのような相関性または親クロノタイプおよびその系統学的クロノタイプは、本発明に従って末梢血においてモニタリングされうる。
【００８２】
新たに診断されたＭＭ患者の２つのコホートをこの分析に含めた（Ｎ＝１２５，Ｎ＝６８）。汎用（ユニバーサル）プライマーセットを使用して、ＩＧＨおよびＩＧＫの可変（ｖａｒｉａｂｌｅ）、多様（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）および連結（ｊｏｉｎｉｎｇ）遺伝子セグメントを、初期診断時に採集された骨髄からのゲノムＤＮＡまたはＲＮＡから増幅した。増幅産物を配列決定し、クロノタイプ決定用の標準化アルゴリズム（ＦａｈａｍおよびＷｉｌｌｉｓ（前記引用）ならびにＦａｈａｍら，Ｂｌｏｏｄ，１２０（２６）：１７３−１８０（２０１２））を使用して分析した。第１コホート（Ｎ＝１２５）においては、１２０名の患者におけるＩＧＨ−ＶＤＪおよびＩＧＫ遺伝子座における遺伝子再編成を、ＲＮＡのみを使用して評価し、５名の患者においては、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を使用してＩＧＨ−ＶＤＪ、ＩＧＨ−ＤＪおよびＩＧＫ遺伝子座を評価した。第２コホート（Ｎ＝６８）においては、ＩＧＨ−ＶＤＪ、ＩＧＨ−ＤＪおよびＩＧＫ遺伝子座における遺伝子再編成を、ゲノムＤＮＡを使用して分析した。各患者に関して、該診断用サンプルにおけるＢ細胞レパートリー内の高い頻度（５％）に基づいて、骨髄腫特異的クロノタイプを特定した。２以上の細胞に存在するクロノタイプを特定するために、細胞において最大で１つの機能的および１つの非機能的なクロノタイプを有するといったパターンに合致しないパターンを探した。
【００８３】
１９３名中２３名（１２％）のＭＭ患者においてオリゴクローン性が認められた。オリゴクローン性の第１モデルに合致する無関連Ｉｇ配列は１９３名中８名（４％）の患者に存在した。１９３名中１５名（８％）の患者は、オリゴクローン性の第２モデルに合致する関連Ｉｇクローンを示した。それらの１５名中４名の患者においては、クローンは体細胞超突然変異過程により互いに関連しており、数個の塩基だけが異なっており（後記を参照されたい）、一方、他の１１名の患者においては、同じＶＤＪ配列が２つの異なるイソタイプ（ＩｇＡおよびＩｇＧ）に関連づけられた。
【００８４】
この実施例はＭＭ患者における頻繁なオリゴクローン性を証明しており、この現象が、独立したクローンに合致した無関連配列として、またはＭＭ悪性病変発生後の進化（すなわち、親または相関クロノタイプの系統学的クロノタイプの発生）に合致した関連配列として、２つの異なる過程により生じることを示唆している。この分析は、骨髄腫特異的クローンの特定に関して５％の閾値を用いた高頻度クローンに限定された。
【００８５】
生殖系列Ｖ、Ｄ、Ｊ配列は最上部に示されており、枠で囲まれた配列はクロノタイプに存在し、枠で囲まれてない塩基は、クロノタイプを形成するようにＶＤＪ組換え中に欠失した配列を表す。中および下の配列は、４９％および４０％の頻度で存在する２つの検出クローンを表す。該クローンにおける非鋳型塩基付加（Ｎ塩基）は第一の生殖系列塩基に対応しないものである。赤色の塩基は、体細胞超突然変異を受けた塩基である。クローン１には存在しない突然変異が３つ、クローン２には存在する。
【化１】
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【００８６】
本発明は幾つかの特定の例示実施形態に関して記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、それに対して多数の変更が施されうる、と当業者は認識するであろう。本発明は、上記のものに加えて、種々のセンサー装置および他の目的物に適用可能である。
【００８７】
定義
本明細書中に特に示されていない限り、本明細書中で用いられている核酸化学、生化学、遺伝学および分子生物学の用語および記号は、当分野における標準的な論文および教科書［例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７５）；ＳｔｒａｃｈａｎおよびＲｅａｄ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）；Ａｂｂａｓら，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｕｎｄｅｒｓ，２００７）］のものに準拠している。
【００８８】
「アライメント」は、何らかの配列距離尺度に基づいてどの参照配列または参照配列のどの部分が最も近いかを決定するために、例えば配列リードのような試験配列を１以上の参照配列と比較する方法を意味する。ヌクレオチド配列のアライメントの典型的な方法はスミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムである。距離尺度はハミング（Ｈａｍｍｉｎｇ）距離、レベンシュタイン（Ｌｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ）距離などを含む。距離尺度は、比較される配列のヌクレオチドの品質値に関連した成分を含みうる。
【００８９】
「アンプリコン」はポリヌクレオチド増幅反応の産物、すなわち、ポリヌクレオチドのクローン集団を意味し、それは一本鎖または二本鎖であることが可能であり、１以上の出発配列から複製される。１以上の出発配列は同一配列のコピーの１以上であることが可能であり、あるいはそれらは種々の配列の混合物でありうる。好ましくは、アンプリコンは単一の出発配列の増幅により形成される。アンプリコンは種々の増幅反応により産生されることが可能であり、その産物は１以上の出発または標的核酸の複製物を含む。１つの態様においては、反応物（ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド）の塩基対形成が、反応産物の生成に要求される鋳型ポリヌクレオチドにおける相補体を含む点において、アンプリコンを産生する増幅反応は「鋳型駆動性」である。１つの態様においては、鋳型駆動性反応は核酸ポリメラーゼでのプライマー伸長または核酸リガーゼでのオリゴヌクレオチド連結である。そのような反応には、限定的なものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リニア（ｌｉｎｅａｒ）ポリメラーゼ反応、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅などが含まれ、これらは、参照により本明細書に組み入れる以下の参照文献に開示されている：Ｍｕｌｌｉｓら，米国特許第４，６８３，１９５号；第４，９６５，１８８号；第４，６８３，２０２号；第４，８００，１５９号（ＰＣＲ）；Ｇｅｌｆａｎｄら，米国特許第５，２１０，０１５号（「タックマン（ｔａｑｍａｎ）」プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ）；Ｗｉｔｔｗｅｒら，米国特許第６，１７４，６７０号；Ｋａｃｉａｎら，米国特許第５，３９９，４９１号（「ＮＡＳＢＡ」）；Ｌｉｚａｒｄｉ，米国特許第５，８５４，０３３号；Ａｏｎｏら，日本国特許公開ＪＰ  ４−２６２７９９（ローリングサークル増幅）など。１つの態様においては、本発明のアンプリコンはＰＣＲにより産生される。増幅反応が進行するにつれて反応産物が測定されることを可能にする検出化学が利用可能である場合には、増幅反応は「リアルタイム」増幅となりうる（例えば、後記の「リアルタイムＰＣＲ」、またはＬｅｏｎｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６：２１５０−２１５５（１９９８）などの参考文献に記載されている「リアルタイムＮＡＳＢＡ」）。本明細書中で用いる「増幅する」なる語は、増幅反応を行うことを意味する。「反応混合物」は、反応中に選択されたレベルにｐＨを維持するための緩衝剤、塩、補因子、スカベンジャーなど（これらに限定されるものではない）を含みうる、反応を行うための必要な反応物の全てを含有する溶液を意味する。
【００９０】
本明細書中で用いる「クローン性」は、レパートリーのクロノタイプにおけるクロノタイプ存在の分布が単一または数個のクロノタイプに傾いている度合の尺度を意味する。大雑把に言うと、クローン性はクロノタイプ多様性の逆尺度である。本発明におけるクローン性尺度に用いられうる種存在関係を記載している生態学から多数の尺度または統計学が利用可能である（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １７＆１８，Ｐｉｅｌｏｕ，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９６９））。１つの態様においては、本発明で用いるクローン性尺度はクロノタイププロファイル（すなわち、検出される異なるクロノタイプの数およびそれらの存在量）の関数であり、したがって、クロノタイププロファイルを測定した後、それからクローン性を計算して単一の数を得ることが可能である。１つのクローン性尺度として、シンプソン（Ｓｉｍｐｓｏｎ’ｓ）尺度が挙げられ、これは単に、２つのランダムに抽選されたクロノタイプが同一となる確率である。他のクローン性尺度には、情報に基づく尺度、およびＰｉｅｌｏｕ（前記引用）に開示されているマッキントッシュ（ＭｃＩｎｔｏｓｈ’ｓ）多様性指数が含まれる。
【００９１】
「クロノタイプ」は、免疫受容体をコードするリンパ球の組換えヌクレオチド配列またはその一部を意味する。より詳しくは、クロノタイプは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードするＴ細胞またはＢ細胞の組換えヌクレオチド配列あるいはその一部を意味する。種々の実施形態においては、クロノタイプは、ＩｇＨのＶＤＪ再編成、ＩｇＨのＤＪ再編成、ＩｇＫのＶＪ再編成、ＩｇＬのＶＪ再編成、ＴＣＲβのＶＤＪ再編成、ＴＣＲβのＤＪ再編成、ＴＣＲαのＶＪ再編成、ＴＣＲγのＶＪ再編成、ＴＣＲδのＶＤＪ再編成、ＴＣＲδのＶＤ再編成、Ｋｄｅ−Ｖ再編成などの全部または一部をコードしうる。クロノタイプはまた、Ｂｃｌ１−ＩｇＨまたはＢｃｌ１−ＩｇＨのような免疫受容体遺伝子を含む、転座切断点領域をコードしうる。1つの態様においては、クロノタイプは、それが由来する免疫分子の多様性を表現または反映するのに十分に長い配列を有し、その結果、クロノタイプの長さは大きく変動しうる。幾つかの実施形態においては、クロノタイプは２５〜４００ヌクレオチドの範囲の長さを有し、他の実施形態においては、クロノタイプは２５〜２００ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
【００９２】
「クロノタイププロファイル」は、リンパ球の集団に由来する異なるクロノタイプおよびそれらの相対存在量の一覧を意味する。典型的には、リンパ球の集団は組織サンプルから得られる。「クロノタイププロファイル」なる語は、以下のような参考文献に記載されている免疫「レパートリー」の免疫学的概念に関連しているが、それより一般的である：Ａｒｓｔｉｌａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：９５８−９６１（１９９９）；Ｙａｓｓａｉら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，６１：４９３−５０２（２００９）；Ｋｅｄｚｉｅｒｓｋａら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４５（３）：６０７−６１８（２００８）など。「クロノタイププロファイル」なる語は、リンパ球の選択されたサブセット（部分集合）（例えば、組織浸潤性リンパ球、免疫表現性サブセットなど）由来の再編成免疫受容体コード化核酸、又は完全免疫受容体と比べて低減した多様性を有する免疫受容体の部分をコードする再編成免疫受容体コード化核酸の、多種多様な一覧およびその存在量を含む。幾つかの実施形態においては、クロノタイププロファイルは少なくとも１０３個の異なるクロノタイプを含みうる。他の実施形態においては、クロノタイププロファイルは少なくとも１０４個の異なるクロノタイプを含みうる。他の実施形態においては、クロノタイププロファイルは少なくとも１０５個の異なるクロノタイプを含みうる。他の実施形態においては、クロノタイププロファイルは少なくとも１０６個の異なるクロノタイプを含みうる。そのような実施形態においては、なクロノタイププロファイルは異なるクロノタイプのそれぞれの存在量または相対頻度を更に含みうる。１つの態様においては、クロノタイププロファイルは、個体のリンパ球の集団においてそれぞれＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）またはそれらの断片をコードする異なる組換えヌクレオチド配列（それらの存在量を伴う）の集合であり、ここで、該集合のヌクレオチド配列は、該集団のリンパ球の実質的に全てに関して、異なるリンパ球またはそれらのクローン性亜集団に１対１の対応を有する。１つの態様においては、クロノタイプを定める核酸セグメントは、個体における実質的に全てのＴ細胞もしくはＢ細胞またはそれらのクローンがそのようなレパートリーの特有の核酸配列を含有するようにそれらの多様性（すなわち、該集合における異なる核酸配列の数）が十分に大きくなるように選択される。すなわち、好ましくは、サンプルの、それぞれの異なるクローンは、異なるクロノタイプを有する。本発明の他の態様においては、レパートリーに対応するリンパ球の集団は循環Ｂ細胞であることが可能であり、あるいは循環Ｔ細胞であることが可能であり、あるいは前記集団の亜集団、例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋  Ｔ細胞、または細胞表面マーカーにより定められる他の亜集団など（これらに限定されるものではない）であることが可能である。そのような亜集団は、特定の組織、例えば骨髄またはリンパ節などからサンプルを採取することにより、あるいは１以上の細胞表面マーカー、サイズ、形態学的特徴などに基づいてサンプル（例えば、末梢血）からの細胞を選別または富化することにより得られうる。更に他の��様においては、レパートリーに対応するリンパ球の集団は、例えば腫瘍組織、感染組織などのような疾患組織から誘導されうる。１つの実施形態においては、ヒトＴＣＲβ鎖またはその断片を含むクロノタイププロファイルは０．１×１０６〜１．８×１０６個の範囲または０．５×１０６〜１．５×１０６個の範囲または０．８×１０６〜１．２×１０６個の範囲の多数の異なるヌクレオチド配列を含む。もう１つの実施形態においては、ヒトＩｇＨ鎖またはその断片を含むクロノタイププロファイルは０．１×１０６〜１．８×１０６個の範囲または０．５×１０６〜１．５×１０６個の範囲または０．８×１０６〜１．２×１０６個の範囲の多数の異なるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態においては、本発明のクロノタイププロファイルは、ＩｇＨ鎖のＶ（Ｄ）Ｊ領域の実質的に全てのセグメントをコードするヌクレオチド配列の集合を含む。１つの態様においては、本明細書中で用いる「実質的に全て」は、．００１％以上の相対存在量を有する各セグメントを意味し、もう１つの態様においては、本明細書中で用いる「実質的に全て」は、．０００１％以上の相対存在量を有する各セグメントを意味する。もう１つの特定の実施形態においては、本発明のクロノタイププロファイルは、ＴＣＲβ鎖のＶ（Ｄ）Ｊ領域の実質的に全てのセグメントをコードするヌクレオチド配列の集合を含む。もう１つの実施形態においては、本発明のクロノタイププロファイルは、２５〜２００ヌクレオチドの範囲の長さを有しＴＣＲβ鎖のＶ、ＤおよびＪ領域のセグメントを含むヌクレオチド配列の集合を含む。もう１つの実施形態においては、本発明のクロノタイププロファイルは、２５〜２００ヌクレオチドの範囲の長さを有しＩｇＨ鎖のＶ、ＤおよびＪ領域のセグメントを含むヌクレオチド配列の集合を含む。もう１つの実施形態においては、本発明のクロノタイププロファイルは、異なるＩｇＨ鎖を発現するリンパ球の数と実質的に等価である数の異なるヌクレオチド配列を含む。もう１つの実施形態においては、本発明のクロノタイププロファイルは、異なるＴＣＲβ鎖を発現するリンパ球の数と実質的に等価である数の異なるヌクレオチド配列を含む。更にもう１つの実施形態においては、「実質的に等価」は、９９％の確率で、クロノタイププロファイルが、．００１％以上の頻度で個体の集団の各リンパ球により含有または発現されるＩｇＨもしくはＴＣＲβをコードするヌクレオチド配列またはその一部を含むことを意味する。更にもう１つの実施形態においては、「実質的に等価」は、９９％の確率で、ヌクレオチド配列のレパートリーが、．０００１％以上の頻度で存在する各リンパ球により含有または発現されるＩｇＨもしくはＴＣＲβをコードするヌクレオチド配列またはその一部を含むことを意味する。幾つかの実施形態においては、クロノタイププロファイルは、１０５〜１０７個のリンパ球を含むサンプルから誘導される。そのような数のリンパ球は１〜１０ｍＬの末梢血サンプルから得られうる。
【００９３】
「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、免疫グロブリン（すなわち、抗体）またはＴ細胞受容体の領域であって、該分子が抗原のコンホメーションを相補し、それにより、該分子の特異性および特異的抗原との接触を決定する領域を意味する。Ｔ細胞受容体および免疫グロブリンのそれぞれは３個のＣＤＲを有し、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は可変（Ｖ）ドメイン内に存在し、ＣＤＲ３はＶドメインの一部、多様性（Ｄ）ドメイン（重鎖のみ）および連結（Ｊ）ドメインの全部、ならびに定常（Ｃ）ドメインの一部を含む。
【００９４】
「合体」は、配列相違を有する２つの候補クロノタイプを同じものとして処理することを意味し、ここで、そのような相違は実験的または測定エラーによるものであり、真正な生物学的相違によるものではないことを判定することにより該処理を行う。１つの態様においては、より高い頻度の候補クロノタイプの配列を、より低い頻度の候補クロノタイプと比較し、所定基準が満たされれば、より低い頻度の候補クロロタイプの数を、より高い頻度の候補クロノタイプのものに加え、より低い頻度の候補クロノタイプを以降は無視する。すなわち、より低い頻度の候補クロノタイプに関連したリードカウントを、より高い頻度の候補クロノタイプのものに加える。候補クロノタイプのそのような合体には種々の所定基準が用いられうる。例えば、幾つかの実施形態においては、該所定基準は以下の３つの要因を含みうる：（ａ）比較されるクロノタイプのそれぞれに関して得られた配列の数、（ｂ）それらが異なる塩基の数、および（ｃ）それらが合致しない位置における配列決定品質スコア。また、該データに基づいて、予想エラー率およびエラーの二項分布に基づく尤度比（候補クロノタイプが同じものとして処理されるべきもの）を得、評価することが可能である。
【００９５】
「顆粒球」または同等な「多形核白血球」は、それらの細胞質および分節または多葉（通常は三葉）核における顆粒により形態学的に特徴づけられる白血球のカテゴリーを意味する。幾つかの実施形態においては、顆粒球は、白血球である好中球、好酸球および好塩基球であり、それらのそれぞれは細胞表面抗原により免疫表現型的に特徴づけられ、そのような特徴的細胞表面抗原に特異的な抗体を使用して混合物から選択的に枯渇されうる。
【００９６】
「内部標準」は、サンプルにおける標的ポリヌクレオチドの絶対的または相対的定量を可能にするために１以上の標的ポリヌクレオチドと同じ増幅反応において増幅される核酸配列を意味する。内部標準は内因性または外因性でありうる。すなわち、内部標準はサンプル中に天然で存在することが可能であり、あるいはそれは増幅前にサンプルに加えられうる。１つの態様においては、複数の外因性内部標準配列を一連の所定濃度で反応混合物に加えて、サンプルにおけるその対応標的ポリヌクレオチドの量を決定するために標的アンプリコンを比較しうる較正体（キャリブレーション）を提供しうる。外因性内部標準の数、配列、長さ、および他の特性の選択は当業者にとって通常の設計上の選択肢である。好ましくは、本明細書においては「参照配列」とも称される内因性内部標準は、サンプルにとって天然の配列であって、一定の細胞周期非依存的転写レベルを示す、調節が最小の遺伝子に対応する配列である（例えば、Ｓｅｌｖｅｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ，１５：３０７−３１１（２００１））。典型的参照配列には、以下の遺伝子からの配列が含まれるが、それらに限定されるものではない：ＧＡＰＤＨ、β２−ミクログロブリン、１８ＳリボソームＲＮＡおよびβ−アクチン（Ｓｅｌｖｅｙら，前掲を参照されたい）。
【００９７】
「最小残存病変」または「ＭＲＤ」は、治療後に残存している癌細胞を意味する。多種多様な癌において、治療直後（例えば、２〜３週間ないし２〜３カ月）に測定されるＭＲＤの値は治療結果に関する重要な予後因子であり、ここで、ＭＲＤが高いほど、より不良な予後が示唆される。ＭＲＤ尺度は、用いられる技術（例えば、ＡＳＯ−ＰＣＲ、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、配列決定）、およびＭＲＤ分析のためにサンプルが採取された組織［例えば、（原発腫瘍部位、例えば骨髄と対比される）末梢血］に応じて大きく変動しうる。
【００９８】
参照配列と別の配列（「比較配列」）との比較に関して用いられる「相同性（％）」、「同一性（％）」などの語は、それらの２つの配列間の最適アライメントにおいて、示されている百分率と同等のサブユニット位置数において（ここで、該サブユニットはポリヌクレオチド比較の場合にはヌクレオチドであり、あるいはポリペプチド比較の場合にはアミノ酸である）、比較配列が参照配列と同一であることを意味する。本明細書中で用いる、比較される配列の「最適アライメント」は、アライメントの構築において用いられるギャップの数を最小にしサブユニット間の適合を最大にするアライメントである。同一性（％）は、商業的に入手可能なアルゴリズム［例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩの「ギャップ（ＧＡＰ）」プログラム）に記載されているものなど］の実行により決定されうる。アライメントを構築し同一性（％）を計算する当技術分野における他のソフトウェアパッケージまたは他の類似手段には、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，２：４８２−４８９（１９８１）のアルゴリズムに基づく「ＢｅｓｔＦｉｔ」プログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が含まれる。言い換えると、例えば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列におけるヌクレオチドの５％までが欠失し又は別のヌクレオチドで置換されることが可能であり、あるいは参照配列におけるヌクレオチドの総数の５％までのヌクレオチド数が参照配列内に挿入されうる。
【００９９】
「形質細胞増殖障害」は、良性単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）または多発性骨髄腫（ＭＭ）を意味し、特に、それらの障害は、以下の参考文献に記載されている基準により診断される：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｙｅｌｏｍａ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１２１：７４９−７５７（２００３）；Ｒａｊｋｕｍａｒら，Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．，８５（１０）：９４５−９４８（２０１０）；Ｋｙｌｅら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２３（１）：３−９（２００９）；Ｋｙｌｅら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２４（６）：１１２１−１１２７（２０１０）。
【０１００】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」はＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長による特異的ＤＮＡ配列のインビトロ増幅のための反応を意味する。言い換えると、ＰＣＲは、プライマー結合部位に隣接した標的核酸の複数のコピーまたは複製物を得るための反応であり、そのような反応は、以下の工程の、１以上の反復を含む：（ｉ）標的核酸を変性させ、（ｉｉ）プライマーをプライマー結合部位にアニールさせ、（ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸の存在下で核酸ポリメラーゼによりプライマーを伸長させる。通常、サーマルサイクラー装置において各工程に関して最適化された種々の温度により該反応を循環させる。個々の温度、各工程の持続時間および工程間の変化速度は、例えば以下の参考文献に例示されている当業者によく知られた多数の要因に左右される：ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編，ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ＡｐｐｒｏａｃｈおよびＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，それぞれ１９９１および１９９５）。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用する通常のＰＣＲにおいては、二本鎖標的核酸を９０℃を超える温度で変性させ、プライマーを５０〜７５℃の範囲の温度でアニールさせ、プライマーを７２〜７８℃の範囲の温度で伸長させることが可能である。「ＰＣＲ」なる語は、該反応の誘導形態、例えばＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネスティッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、多重ＰＣＲなど（これらに限定されるものではない）を含む。反応体積は数百ナノリットル、例えば２００ｎＬから数百μＬ、例えば２００μＬまでの範囲である。「逆転写ＰＣＲ」または「ＲＴ−ＰＣＲ」は、標的ＲＮＡを相補的一本鎖ＤＮＡに変換する逆転写反応の後で該ＤＮＡを増幅するＰＣＲを意味する（例えば、Ｔｅｃｏｔｔら，米国特許第５，１６８，０３８号（これを参照により本明細書に組み入れることとする））。「リアルタイムＰＣＲ」は、反応が進行するにつれて反応産物（すなわち、アンプリコン）の量がモニタリングされるＰＣＲを意味する。反応産物をモニタリングするために用いられる検出化学において主に異なる多数の形態のリアルタイムＰＣＲが存在する（例えば、Ｇｅｌｆａｎｄら，米国特許第５，２１０，０１５号（“ｔａｑｍａｎ”）；Ｗｉｔｔｗｅｒら，米国特許第６，１７４，６７０号および第６，５６９，６２７号（インターカレート色素）；Ｔｙａｇｉら，米国特許第５，９２５，５１７号（分子ビーコン）（それらの特許を参照により本明細書に組み入れることとする））。リアルタイムＰＣＲのための検出化学はＭａｃｋａｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０：１２９２−１３０５（２００２）（これも参照により本明細書に組み入れることとする）に概説されている。「ネスティッドＰＣＲ」は、２段階ＰＣＲであって、第１ＰＣＲのアンプリコンが、新たなプライマーセットを使用する第２ＰＣＲのサンプルとなり、該プライマーセットの少なくとも１つが第１アンプリコンの内部位置に結合するものを意味する。ネスティッド増幅反応に関して本明細書中で用いる「初期プライマー」は、第１アンプリコンを産生させるために使用されるプライマーを意味し、「第２プライ���ー」は、第２のネスティッドアンプリコンを産生させるために使用される１以上のプライマーを意味する。「多重ＰＣＲ」は、複数の標的配列（または単一の標的配列および１以上の参照配列）を同一反応混合物中で同時に使用するＰＣＲを意味する（例えば、Ｂｅｒｎａｒｄら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７３：２２１−２２８（１９９９）（二色リアルタイムＰＣＲ））。通常、増幅される各配列に対して、異なるプライマーセットを使用する。典型的には、多重ＰＣＲにおける標的配列の数は２〜５０個、または２〜４０個、または２〜３０個の範囲である。「定量的ＰＣＲ」は、サンプルまたは試料における１以上の特異的標的配列の存在量を測定するために設計されたＰＣＲを意味する。定量的ＰＣＲはそのような標的配列の絶対的定量および相対的定量の両方を含む。標的配列と一緒に又は別々にアッセイされうる１以上の参照配列または内部標準を使用して定量的測定を行う。参照配列はサンプルまたは試料にとって内因性または外因性であることが可能であり、後者の場合には１以上の競合鋳型を含みうる。典型的な内因性参照配列は以下の遺伝子の転写産物のセグメントを含む：βアクチン、ＧＡＰＤＨ、β２ミクログロブリン、リボソームＲＮＡなど。定量的ＰＣＲのための技術は、参照により本明細書に組み入れる以下の参考文献に例示されているとおり、当業者によく知られている：Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２６：１１２−１２６（１９９９）；Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：９４３７−９４４７（１９８９）；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２１：２６８−２７９（１９９６）；Ｄｉｖｉａｃｃｏら，Ｇｅｎｅ，１２２：３０１３−３０２０（１９９２）；Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：９４３７−９４４６（１９８９）など。
【０１０１】
「プライマー」は、ポリヌクレオチド鋳型との二本鎖形成に際して核酸合成の開始点として作用し該鋳型に沿ってその３’末端から伸長されて伸長二本鎖を形成しうる天然または合成オリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの伸長は通常、核酸ポリメラーゼ、例えばＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼを使用して行われる。伸長プロセスにおいて加えられるヌクレオチドの配列は鋳型ポリヌクレオチドの配列により決定される。通常、プライマーはＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。プライマーは通常、１４〜４０ヌクレオチドの範囲または１８〜３６ヌクレオチドの範囲の長さを有する。プライマーは、種々の核酸増幅反応、例えば、単一プライマーを使用するリニア（ｌｉｎｅａｒ）増幅反応、または２以上のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応において使用される。個々の用途のためのプライマーの長さ及び配列を選択するための指針は、参照により本明細書に組み入れる以下の参考文献に記載されているとおり、当業者によく知られている：Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ編，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００３）。
【０１０２】
「品質スコア」は、個々の配列位置における塩基帰属が正しい確率の尺度を意味する。例えば、様々な配列決定化学、検出システム、塩基コールアルゴリズムの結果としてコールされる塩基などのような状況に関して、品質スコアを計算するための種々の方法が当業者によく知られている。一般に、品質スコア値は、正しい塩基コーリングの確率に単調に関連づけられる。例えば、１０の品質スコアまたはＱは、塩基が正しくコールされる確率が９０％であることを意味しうる。２０のＱは、塩基が正しくコールされる確立が９９％であることを意味しうる。幾つかの配列決定プラットフォーム、特に、合成による配列決定の化学を用いるものの場合、平均品質スコアは配列リード長の関数として減少し、配列リードの出発部分の品質スコアは配列リードの終結部分のものより高く、そのような減少は不完全な伸長、繰越伸長、鋳型の喪失、ポリメラーゼの喪失、キャッピング不全、脱保護不全などのような現象によるものである。
【０１０３】
「配列リード」は、配列決定技術により得られた配列またはデータストリームから決定されたヌクレオチドの配列を意味し、該決定は、例えば、該技術に関連した塩基コーリングソフトウェア、例えば、ＤＮＡ配列決定プラットフォームの商業的供給業者から得られる塩基コーリングソフトウェアにより行われる。配列リードは通常、該配列における各ヌクレオチドに関する品質スコアを含む。典型的には、配列リードは、例えばＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼを使用して、鋳型核酸に沿ってプライマーを伸長させることにより作られる。データは、そのような伸長に伴う光学的、化学的（例えば、ｐＨ変化）または電気的シグナルを記録することにより得られる。そのような初期データは配列リードに変換される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【国際調査報告】
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