(57)【要約】  トランスデューサは、電磁放射源と、複数の貫通流れ経路を有する基材と、受光器とを含む。複数のナノ粒子が基材上に配置されており、放射源からの電磁放射に応答した光子励起プラズモンを支持するように構成されている誘電率を有する材料を含む。受光器は電磁放射を測定し、基材と光学的に接続して配置される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスデューサシステムであって、
電磁放射源と、
放射源から放射を受けるように配置された本質的に多孔質の誘電体基材であって、複数の既成の内部貫通流れ経路を備える基材と、
基材上に配置された複数のナノ粒子であって、放射源からの電磁放射に応答した光子励起プラズモンを支持する範囲内の誘電率を有する材料を含む複数のナノ粒子と、
基材と光学的に接続して配置された、電磁放射を測定するための受光器と
を備える、トランスデューサシステム。
【請求項２】
前記基材が、放射源からの放射に関してプラズモン不活性の材料を含む、請求項１記載のシステム。
【請求項３】
前記基材が、酸化アルミニウム、ガラス、石英、二酸化ケイ素及び窒化ガリウムの１種以上を含んでいて、基材が多孔質であり、前記経路が基材に分布した細孔を含む、請求項１又は請求項２記載のシステム。
【請求項４】
前記基材が、陽極酸化アルミニウム（ＡＡＯ）基材を含んでいて、基材が多孔質であり、前記経路が基材に分布した細孔を含む、、請求項３記載のシステム。
【請求項５】
前記基材が、流体を流すことのできる複数のナノ細孔を基板全体に含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のシステム。
【請求項６】
前記基材が、５個以上のナノ粒子の分布を支持する厚さを有し、細孔が２００ｎｍの細孔を含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のシステム。
【請求項７】
複数のナノ粒子がロッド、球、シェル、ディスク、リング、三日月形、穴、回転楕円球、ピラミッド形及び立方体の少なくとも１として賦形される、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のシステム。
【請求項８】
複数のナノ粒子が実質的に非凝集である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載のシステム。
【請求項９】
複数のナノ粒子が金ナノロッドを含む、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のシステム。
【請求項１０】
受光器が演算装置と接続された分光計を含み、分光計及び演算装置の少なくとも一方が、経路内のアナライトの屈折率の変化に基づいて複数の対象物を同定するように構成されている、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載のシステム。
【請求項１１】
複数の内部貫通流れ経路を有する基材に電磁放射を当てる段階であって、基材がその上に配置された複数のナノ粒子を含んでいて、複数のナノ粒子が、放射源からの電磁放射に応答した光子励起プラズモンを支持する範囲内の誘電率を有する材料を含んでおり、基材と光学的に接続して受光器が配置されている、段階と、
電磁放射を測定する段階と、
前記経路を通して対象物を流す段階と
を含む方法。
【請求項１２】
対象物を有するアナライトを、フロースルー基材を通して流すことをさらに含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
基材を通して流れるアナライトの屈折率の変化を測定して測定変化を得ることをさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
測定変化に基づいて複数の対象物を同定することをさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
受光器が、演算装置と接続された分光計を含んでおり、当該方法が、屈折率の変化に基づいて分光計及び演算装置の少なくとも一方で対象物を同定することをさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
レイヤー・バイ・レイヤー法を使用して基材内に複数のナノ粒子を埋め込むことをさらに含む、請求項１１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
共有結合化学プロセスを用いて基材内に複数のナノ粒子を埋め込むことをさらに含む、請求項１１乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
前記基材が、酸化アルミニウム、ガラス、石英、二酸化ケイ素、窒化ガリウムの１種以上を含んでいて、基材が多孔質であり、前記経路が基材に分布した細孔を含む、、請求項１１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
前記基材が、２００ｎｍ径の細孔を有する陽極酸化アルミニウム（ＡＡＯ）基材を含み、当該方法が、細孔を通してアナライトを流すことをさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
複数のナノ粒子が、ロッド、球、シェル、ディスク、リング、三日月形、穴、回転楕円球、ピラミッド形又は立方体として賦形される、請求項１１乃至請求項１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
複数のナノ粒子が実質的に非凝集である、請求項１１乃至請求項２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
複数のナノ粒子が金ナノロッドを含む、請求項１１乃至請求項２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
基材が電磁放射に関してプラズモン不活性である、請求項１１乃至請求項２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
変化を測定する段階が、ノイズ除去、データ取得加速及び故障確認を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項２５】
前記測定に基づいて、識別情報、動態情報及び濃度情報を提供することをさらに含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
測定する段階が、流動誘起センサ応答エラー、センサ毎のばらつき、アナライト濃度に関係しない試料状態の効果、及び光学読み取りのばらつきを補正する、請求項２４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してトランスデューサに関し、より詳細には、被分析対象物の検出に使用するためのトランスデューサシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
利用可能な複数の生物学的検出技術があるが、要件は所期の使用設定に依存する。大抵の場合、設定が分析研究室から現場に転じると、性能要件（例えば、検出限界、感度、信頼性）が損なわれ、一方、非性能要件（例えば、時間、使いやすさ、可搬性、試料容量）はより厳しくなる。性能要件の妥協及び非性能要件の強化は、机上から現場への技術移行として理解することができる。例えば、最も一般的に使用されているプラズモン法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）であり、これは、高い特異性及び信頼性で優れた検出限界をもたらすが、可搬性に問題がある（すなわち、非性能要件を犠牲にして性能要件を満たす）。
【０００３】
現場設定において理想的なのは、検出限界に優れ、ダイナミックレンジが大きく、試薬量が削減された、アナライトの同一性を確認するための直交の検出手段を有する技術であろう。ＳＰＲは、優れた検出限界及び高いダイナミックレンジを有するリアルタイムで無標識の生物学的検出器であるため、これらの要件の多くを達成することができる。さらに、ＳＰＲは、誤検出を排除するために結合定数をリアルタイムで求めることによって検出の信頼性を高めることが可能である。しかしながら、ＳＰＲは、複数のノイズ源を抑制するために、費用がかかり場所をとる設計及び処理工程を必要とし、それによって、その可搬性及び現場における有用性が制限される。環境ノイズを抑制し、ＳＰＲの有益な特徴を保持し、なお可搬性及び使いやすさを高めるためのメカニズムを特定することができれば有利となろう。簡潔に言えば、ＳＰＲに対するノイズ源は、本質的にはその信号生成メカニズムに関連する。ＳＰＲの背後にある物理現象は、光子エネルギー及び運動量が、負実数、及びわずかに正の虚数の誘電率を有する材料（例えば、金、銀）の伝導帯内の電子に結合することである。ＳＰＲのこの結合を達成するための条件は、金属膜の面内の数百ミクロン以内で、表面の上のバルクに向かって２００〜１０００ｎｍまでの金属膜表面における屈折率に大きく依存する。これらの励起された電子は、表面伝播プラズモン（ＳＰＰ）と称され、ＳＰＰを利用するすべての方法をＳＰＲと総称する。
【０００４】
様々なＳＰＲ装置においてＳＰＰの励起を可能にするための構成要素の物理的配置は変動し、非限定的な例においては、クレッチマン構成、オットー構成、格子、共鳴マイクロスフィアを含む。通常、５０ｎｍ未満の金属表面以内で発生する金属膜上の受容体へのアナライトの結合によって、金属膜における屈折率が変わり、表面伝播プラズモン（ＳＰＰ）の励起に必要な条件が変化し、それによって、信号が生成される。１ｍＫ程度の低い温度変動のようなノイズは、バルク溶液内の屈折率の変化に由来する。そのため、充填係数（バルクが占める検知容量に対する、生物層が占める検知容量の割合）によって定義される全体的な信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）は、ＳＰＲについては低い。ＳＰＰはアナライト層に対して大量のバルクをサンプリングするため、すべてのＳＰＲ実施形態は、ノイズを抑制するか、又はより大きい割合の検知容量を充填するためのアナライト層をもたらす設計方法を使用することによってＳ／Ｎを向上させなければならないが、そのような設計ソリューションは、機器のフットプリントが大きく拡大することによってユニットの可搬性を低減する。例としては、ユニット、試料、及び試薬を熱的に安定させようという多大な努力、並びに、検知容量により密接に整合するアナライト容量をもたらすために金の上に配位子修飾デキストラン層を利用することが挙げられる。
【０００５】
別の例において、局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）は、ナノサイズ構造（例えば、好ましくは約１〜１６００ｎｍサイズの構造）を必要とする。ＬＳＰＲ活性構造を上回る局所屈折率とともに組成（依然として負実数、及び正の虚数の誘電率を有していなければならない）並びにサイズ及び形状（両方ともナノサイズである）によって、どれだけの光子のエネルギーが吸収され、ＬＳＰＲに結合されることになるかが決まる。したがって、ＬＳＰＲ構造のサイズ、形状、及び材料は、超音波−可視−近赤外線波長（好ましくは１００〜１６００ｎｍ、より好ましくは６００〜１０００ｎｍ）内にある光子を吸収するように選択される。ＬＳＰＲとＳＰＲとの間の決定的な差は、局在プラズモンは、ＬＳＰＲ支持構造の３０ｎｍ以内の屈折率に対して反応するように制約されることである。局在表面プラズモンのみを許容するこれらのシステムは、ＳＰＲよりもはるかに良好な充填率を有し、したがって、Ｓ／Ｎを高めるためにそれほど設計を必要としない。しかしながら、ＬＳＰＲ構造の必要とされるナノサイズ寸法は、アナライト（例えば、対象物）のナノサイズ表面への質量流束を大幅に低減し、そのため、達成される質量流束を、ＳＰＲのようなマクロサイズ構造に整合させるために、アッセイ時間、試料容量、及び／又は試料濃度が増大することが示されている（Paul E. Sheehan and Lloyd J. Whitman, Nanoletters 2005, 5 (4), 803-807）。
【０００６】
さらに、様々な他のプラズモン検出方法は、上記の制限の多くを受け、そのような方法は、どの特定の波長の光がプラズモンを励起し受光器によって検出され得るかに影響を与える屈折率の局所変化に対して反応する基材材料を利用する。
【０００７】
したがって、結果が得られる速度を増大させながら精度を維持し、可搬性を高める場検出のためのシステム及び方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Paul E. Sheehan and Lloyd J. Whitman, Nanoletters 2005, 5 (4), 803-807
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、一態様では、電磁放射源と、プラズモン材料が配置されたフロースルー基材と、プラズモン受光器とを含むトランスデューサシステムを提供する。基材は、それを通してアナライトを流すことができ、アナライトを、基材上及び基材内部に配置されたプラズモン体と相互作用させることができる。基材は、プラズモン体が、複数又は単一のプラズモン活性体（例えば、ナノ粒子又はナノロッド）に放射されている電磁放射源からの電磁放射に反応することも可能にする。プラズモン体は、優先的な局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）反応を達成するためにチャネル内に位置づけられる。支持基材内のフロースルーチャネル当たりのプラズモン活性体の数は少なくとも５以上である。プラズモン受光器は、基材を通して流れるアナライトとの相互作用に応答して、基材上の及び基材に貫入したプラズモン活性体の反応の変化を試験する。
【００１０】
本発明は、別の態様では、フロースルー基材上及びその内部にプラズモン材料が配置されたフロースルー基材の製造方法を提供する。特定の実施形態では、層毎の体積又は共有結合を通して、基材の上に及び基材を通って堆積された後、ナノ構造の非凝集プラズモン特性は維持される。これらの埋め込みプラズモンナノ構造は、好ましくはナノ粒子又はナノロッドである。プラズモン体は、優先的な局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）反応を達成するためにチャネル内に位置づけられる。支持基材内のフロースルーチャネル当たりのプラズモン活性体の数は少なくとも５以上である。ナノ構造は、基材内に埋め込む前に、アナライト特異性をもたらすために修飾する（か、又は修飾されないままにする）ことができ、好ましい実施形態では、この方法は、基材上の及び基材に貫入したプラズモンナノ構造をさらに修飾することを可能にする。
【００１１】
本発明は、別の態様では、プラズモン材料をフロースルー基材上に配置することを含む、対象物の検出に使用するための方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、複数のナノ粒子をフロースルー基材内に埋め込むことを含む、局所屈折率の変化の検出に使用するための方法を提供する。複数の対象物を含むアナライトが、フロースルー基材を通して流れる。電磁放射が複数のナノ粒子のようなフロースループラズモン基材に加えられて、プラズモン基材がプラズモンを支持するようにされるか、又は、単一若しくは複数のナノ粒子が局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）を支持するようにされる。好ましくはＬＳＰＲを支持する単一又は複数のナノ粒子であるプラズモン基材に複数の対象物が結合すること、及び放射を加えることに起因して、基材を通して流れるアナライトの屈折率の変化が測定される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明のとみなされる主題を、本明細書の結びにある特許請求の範囲において特に指摘し、明瞭に特許請求する。本発明の上記の及び他の態様、特徴及び利点は、添付の図面とともに取り上げられる以下の好ましい実施形態の詳細な説明からより容易に理解されることとなる。
【図１】本発明によるトランスデューサシステムのブロック図である。
【図２】基材にわたるマイクロチャネルフロー及び第２の基材を通るフローを示す図である。
【図３】基材内部の金コロイドの走査型電子顕微鏡画像を示す図である。
【図４】レイヤー・バイ・レイヤー法を用いて基材内に埋め込まれた金コロイドの吸収スペクトルを示す図である。
【図５】溶液内の金コロイドの屈折率反応性を示す図である。
【図６】２００ｎｍ細孔及び陽極酸化アルミニウム基材内部の８０８ｎｍにおいて共鳴している金ナノロッドの走査型電子顕微鏡画像を示す図である。
【図７】質量流束の比色検出を示す概略図である。
【図８】陽極酸化アルミニウム基材のビオチン表面被覆の蛍光画像を示す図である。
【図９】フロースルー流体構成対フローオーバー流体構成の斜視分解図である。
【図１０】時間の関数としての、フロースループロット及びフローオーバープロットを示すオルト−ニトロフェノールの吸収のグラフ図である。
【図１１】フロースループロット及び対照プロットを示す、ビオチンを欠く対照基材についての吸収の変化のグラフ図である。
【図１２】様々な試料におけるナノ細孔埋め込み金ナノロッド上のビオチンの表面被覆を示す図である。
【図１３】水中で収集される表面修飾の前後の金ナノロッドによって作成される有孔ＬＳＰＲ基材の反応性のグラフ図である。
【図１４】裸基材及び修飾基材の屈折率反応性のグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の原理によれば、プラズモン検出方法（例えば、局在表面プラズモン共鳴）を使用したトランスデューサシステムが提供される。
【００１４】
図１に示す例示的な実施形態では、トランスデューサシステム１０は、フロースルー基材２０と、電磁放射（例えば、光）源３０と、演算装置５０に結合された受光器４０（例えば、分光計）とを含む。
【００１５】
基材２０は、ナノ細孔のような内部貫通流れ経路を含むことができ、側方寸法におけるそのサイズは、１０００μｍ〜３０ｎｍ、又はより好ましくは５００ｎｍ〜５０ｎｍであることが好ましい。ナノ細孔の深さ、又は高さ若しくは長さは、１００００μｍ〜５００ｎｍ、又はより好ましくは１０μｍ〜１０００μｍであることが好ましい。基材２０には、プラズモン（ＳＰＲ）、好ましくはＬＳＰＲ、及びより好ましくはＬＳＰＲを支持する金ナノロッドを支持することが可能な構造が埋め込まれ、又は上に配置されてもよい。そのようなナノロッドは、基材２０の内部又は表面のナノ細孔を流れるアナライト内の対象化合物に結合することができる。ナノロッドは、そのような結合及びＬＳＰＲ属性を促進するために、分散されているか、又は実質的に非凝集であってもよい。
【００１６】
基材内のアナライトの屈折率の変化は、プラズモンを支持するための条件の変化、従ってプラズモンを励起するための光の波長の変化に影響を及ぼし得る。そのような屈折率の変化は、ナノロッドに結合している対象化合物の同定を可能にすることができる受光器４０（例えば、分光計）によって検出することができる。
【００１７】
金属ナノ粒子（例えば、金ナノロッド）は、それらのサイズ、形状、組成、及び局所誘電環境に応じて多様な色を呈する。局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）とは、光がナノスケールの金属物体に衝突したときに発生する、波長選択的な吸収を引き起こす、金属の伝導電子の共鳴振動を発生させる現象を指す。ナノ粒子の吸収最大値（λｍａｘ）は、局所（＜３０ｎｍ）誘電環境の屈折率に依存する。例えば、生体分子の結合による、ナノ粒子表面、又はプラズモンを支持する他の表面における局所化学（例えば、気体、液体、固体）又は物理（例えば、温度）組成の変化を通じた屈折率の変化によって、λｍａｘは異なる波長へシフトする。金属表面上で利用可能な界面化学を利用することによって、ナノ粒子は、アナライトの選択的検出を可能にするバイオレセプタによって官能化することができる。一例では、ＬＳＰＲセンサは、抗体−抗原相互作用、ＤＮＡハイブリダイゼーション、タンパク質レクチン結合、脂質二重層形成、及びタンパク質立体構造変化の検出に使用されてもよく、これらのすべてが認識されると屈折率の局所変化をもたらす。ＬＳＰＲセンサを含んでもよいＳＰＲセンサは、限定ではないが、球、ロッド、シェル、ディスク、リング、三日月形、穴、回転楕円球、ピラミッド形、立方体、及び複数の他の幾何学的及び非幾何学的形状を含む、一定範囲のナノスケール形状寸法を組み込み得る。これらの形状は、ナノ粒子の物理的、光学的、及び電子的特性に影響を与える可能性があるが、特定の形状が粒子の、ナノ粒子としての適格性に影響を与えることはない。また、ナノ形状寸法はナノ粒子と同じであり得る。
【００１８】
便宜上、ナノ粒子のサイズは「直径」で表して述べることができる。球形状のナノ粒子の場合、直径は一般に理解されているように使用される。非球形状のナノ粒子について、直径という用語は、別途定義されない限り、非球形状のナノ粒子全体が収まる回転半径（例えば、最小回転半径）を指す。
【００１９】
さらに、基材（例えば、基材２０）上に配置される、又はその中に埋め込まれるものとして上述されているナノ粒子は、多波長（又は単一波長又は単一波長及び複数の波長の間の値）を与えられた吸収（又は透過の欠如）として観察されるものとしての光子励起プラズモンを支持することができ、光の波長を下回る少なくとも１つの寸法を有する材料によって形成されてもよい。
【００２０】
基材（例えば、基材２０）は、プラズモンの支持を回避する、すなわち、特定の発生源からの放射に対してプラズモン的に不活性である任意のタイプの材料であり得る。基材（例えば、基材２０）の材料の一例は、ほぼ透明で湿らされ得る陽極酸化アルミニウム（ＡＡＯ）を含む。他の材料は、ガラス、石英、二酸化ケイ素、窒化ガリウム、炭素、グラファイト、多孔質ポリマー（物理的又は化学的にエッチングされたポリマーなど）、セルロース、ニトロセルロース、ＰＴＦＥを含む。基材は、アナライトが流通することを可能にする、基材全体を通る複数のナノチャネル又はナノ細孔（例えば、整理された、独立した又はねじれた経路のうちのいずれか）を含み得る。基材内に埋め込まれたナノ粒子は、基材を通して流れるアナライト内で、プラズモン支持基材の共鳴波長（例えば、その自由溶液、非凝集の共鳴波長の±１００ｎｍである共鳴波長）に影響を与えないように実質的に非凝集とすることもできる。
【００２１】
好ましい環境は、例えば、ＳＰＲと比較して優れた信号対雑音性能及び小型化の可能性を有することに起因して、信号伝達モダリティとしてＬＳＰＲ（例えば、システム１０内で利用されるような）に結合することである。トランスデューサ又はセンサ（例えば、システム１０）は、正及び負の両方の界面化学によってナノ粒子を固定化することを可能にするために、基材２０（例えば、２００ｎｍ径の細孔を有する陽極酸化アルミニウム（ＡＡＯ）基材）の細孔内部に金ナノ粒子を固定化することによって製造され、理論的に、任意の溶液相のナノ粒子形状寸法で表面修飾が可能になる。製造されると、これらの多孔質ＬＳＰＲ基材（例えば、基材２０）は、３００〜４００ｎｍ／ＲＩＵの屈折率反応性を呈することができ、これは、基材効果、及び平面ＬＳＰＲセンサについて以前に報告された値とよく一致することに起因して、最小の反応性損失を実証している。そのような平面センサは、本明細書に記載する基材（例えば、基材２０）内にあるようなフロースルーチャネルの代わりに、アナライトの表面チャネル（例えば、側方フローセンサ）を有するものを含んでいる。図２は、そのようなフローアクロスＬＳＰＲセンサ対本発明のフロースルーセンサ又はトランスデューサを示している。
【００２２】
以前のナノホールバイオセンシングは、主に、基材面の方向で数百ミクロンだけ基材の上にある、特徴的に大きい（約２００ｎｍ）検知容量で表面伝播プラズモン（ＳＰＰ）を支持する金属ナノホール膜を用いて実施されていた。これらの大きい検知深さは、環境内の不均質な熱、圧力、及び濃度勾配に由来する大きな変動を検出してしまうことによって、バイオアッセイにおけるノイズに寄与する。対照的に、本明細書に記載するようなＬＳＰＲセンサは、生物学的アナライトのサイズスケールに密接に整合する２５ｎｍ程度の検知容量を有し、したがって、バルク環境からの信号干渉を回避する。
【００２３】
例えば、以前に、プラズモン活性金属薄膜内にナノホールを設けることによってフロースルー基材が製造された。これは、Sinton他(C. Escobedo, A.G. Brolo, R.Gordon, D. Sinton, Nanofluidics Meets Plasmonics: Flow-Through Surface-Based Sensing, Paper no. FEDSM-ICNMM2010-30176 pp. 599-604, doi:10.1115/FEDSM-ICNMM2010-30176, ASME 2010 8th International Conference on Nanochannels, Microchannels, and Minichannels collocated with 3rd Joint US-European Fluids Engineering Summer Meeting (ICNMM2010), August 1−5, 2010 , Montreal, Quebec, Canada; De Leebeeck, A.; Kumar, L. K. S.; de Lange, V.; Sinton, D.; Gordon, R.; Brolo, A. G., Anal. Chem. 2007, 79 (11), 4094-4100.; Eftekhari, F.; Escobedo, C.; Ferreira, J.; Duan, X.; Girotto, E. M.; Brolo, A. G.; Gordon, R.; Sinton, D., Anal. Chem. 2009, 81 (11), 4308-4311.; Escobedo, C.; Brolo, A. G.; Gordon, R.; Sinton, D., Anal. Chem. 2010, 82 (24), 10015-10020.)、Masson他( Live, L. S.; Bolduc, O. R.; Masson, J.-F. o., Anal. Chem. 2010, 82 (9), 3780-3787.)、及びAltug他(Yanik, A. A.; Huang, M.; Artar, A.; Chang, T.-Y.; Altug, H., Appl. Phys. Lett. 2010, 96 (2), 021101.)によって示されている。これらのナノホールは、流体流のためのチャネルの目的、及び基材上でプラズモンを生成する目的を果たす。穿孔プラズモン膜を有する基材は、プラズモンを伝搬させることに大きく寄与してしまい、局在プラズモンの利点を低減する。加えて、薄膜（約５０ｎｍ厚）及び薄膜内の穴によって、それに応じた約５０ｎｍの領域しか、アナライトとプラズモン構造との相互作用に与えられない。さらに、そのようなナノホールアレイの製造及び取り扱いは、そうでなければ流れが不安定であることによってナノホール支持膜が容易に破壊されてしまうため、ナノホールを通る液体流を制御するのに重大な設計が必要になり、困難であることが分かっている。しかしながら、フロースルー基材を利用する質量流束の利点が、これらの研究によって確立された。
【００２４】
対照的に、本明細書に開示するフロースルー生物学的検出のための方法及びシステムは、ナノチャネル全体にわたって分散した局在ＳＰＲを支持する個々のランダムに分配したプラズモンナノ粒子に対して機能する。これらの粒子はランダムに分配しており、細孔当たりの粒子の数はナノホールアレイ内の金属薄膜の厚さよりも大きいため、チャネル当たりのより多数の相互作用領域（すなわち、細孔）を提供する。Whitman他によって記載されているようなナノ構造の質量流束の欠点は、局在ＳＰＲを支持するナノ粒子を、試料が局在ＳＰＲを支持する埋め込みナノ粒子を含むナノチャネルを通して流されるときに増大した質量流束をもたらすナノチャネルに配置することによって補償されている。
【００２５】
フロースルー形式の基材（例えば、基材２０）によって、アッセイ時間及び試料容量を低減することが可能になり、机上及び現場の両方でナノスケールセンサの有用性が向上する。下記に説明するように、単純な比色分析（非プラズモン）読み取り方式は、ＡＡＯナノチャネルによるフロースルー形式が観測反応速度を２０倍増大させることを示している。フローオーバーと比較して２０倍の質量流束の利得は、同じフロースルーアッセイでナノ粒子を備えたＡＡＯを使用することでも分かっている。
【００２６】
本明細書において、プラズモン粒子（好ましくはＬＳＰＲナノ粒子）を基材に埋め込むための２つの最良の方法を説明する。基材２０内に埋め込まれるナノ粒子（例えば、金ナノロッド）は、レイヤー・バイ・レイヤー（ＬｂＬ）組立又は共有結合化学による、制御された準単分子層表面被覆を可能にすることが示されている２つの体積方法を使用してその中に埋め込まれ得る。そのような方法によって、そうでなければナノ粒子の共鳴位置及び反応性の両方に劇的な影響を与えることになり、一般的に吸収ピーク幅を広くし、反応性を低くする、ナノ粒子の凝集が最小限に抑えられる。
【００２７】
一例において、この用法とは異なった作用をするように、クエン酸をキャッピングした金コロイドをＡＡＯ細孔の内部に堆積するためにBruening (Dotzauer, D.M., Dai, J., Sun, L., & Bruening, M.L., (2006). Catalytic Membranes Prepared Using Layer-by-Layer Adsorption of Polyelectrolyte/Metal Nanoparticle Films in Pourous Supports.  Nano Letters, 6 (10), 2268-2272)によって開発されたＬｂＬプロトコルを変更したものが使用されており、ここで、これは、光学活性されていない多孔性の高い触媒床としてのみ使用されており、プラズモンスペクトルはモニタリングされなかった。Bruening他において、凝集がないこと、又は、凝集がないことが、埋め込みナノ構造の局在プラズモンに及ぼす影響を示すためのスペクトルデータは提供されなかった。ＬｂＬは、ナノ粒子をナノ細孔又はナノチャネル内に配置するために他者(Ko, H.; Chang, S.; Tsukruk, V. V., ACS Nano 2008, 3 (1), 181-188.)によっても使用されており、これは、非凝集プラズモン吸収ピークがそれに対応して低下していることによる凝集を示している。Ko他も、ＬｂＬが非凝集ナノ粒子をナノチャネル内に配置して、ナノ粒子の所望の非凝集プラズモン構造を維持するのに適した方法ではないことを示すデータを含んでいる。
【００２８】
プラズモン活動（好ましくは局在表面プラズモン共鳴）を呈するナノ構造をナノチャネル内に埋め込むために共有結合を利用することに関して、従来技術（例えば、Sehayek他(Sehayek, T.; Lahav, M.; Popovitz-Biro, R.; Vaskevich, A.; Rubinstein, I., Chem. Mater. 2005, 17 (14), 3743-3748.)（Bruening他においても参照されている）は、共有結合を通してナノ粒子をナノ細孔内に付着させようと試みることによって、ナノ粒子の著しい凝集がもたらされることを示している。そのような凝集によって、埋め込みナノ粒子の所望の非凝集プラズモン構造が劣化することになる。
【００２９】
本明細書に記載する手法において、ＡＡＯは、最初に紫外線−オゾン焼成を使用して洗浄され、その後、続いてＬｂＬ高分子電解質に暴露するためにステンレス鋼フィルタホルダ内に載置した。２０ｍＭ  ＰＡＡのフロースルーによって、正電荷を呈する表面高分子電解質層がもたらされた。その後、２０ｍＭ  ＰＡＨのフロースルーを行い、負電荷を呈する高分子電解質がもたらされ、もう一度２０ｍＡ  ＰＡＡのフロースルーを行った。最終結果として、正電荷及び負電荷の３つの交互の層を有するＡＡＯ膜がもたらされており、表面は正電荷を呈する。最終段階において、１０倍希釈した４０ｎｍクエン酸キャッピングＡｕコロイドを官能化ＡＡＯを通して流した。負に帯電した金コロイドと正に帯電したＰＡＡ内のアミン基との間の静電的及び共有結合性相互作用によって、図３に示すような、ＡＡＯ細孔及び表面全体にわたって均一な分散したＡｕコロイドの堆積がもたらされた。図３は、２００ｎｍ  ＡＡＯ細孔内部の４０ｎｍ  Ａｕコロイドの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示している。基材の分光学的同定によって、図４に示すように５２０ｎｍにおいて最大値を有する単一の吸収ピークが明らかになり、ナノ粒子の分散した堆積（すなわち、非凝集）がさらに確認された。Ａｕコロイドは、１００  ｎｍ／ＲＩＵの屈折率反応性を呈した（図５）。
【００３０】
別の例において、８０８ｎｍにおいて共鳴するＣＴＡＢキャッピングＡｕナノロッドが、ＡＡＯをアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）で修飾子、官能化ＡＡＯをＡｕナノロッドに曝露することによって埋め込まれた。この結果、Ａｕナノロッドの均一な分散した堆積がもたらされ（図６）、アミン基とＡｕナノロッド表面との間の共有結合性相互作用が、ナノロッドをＡＡＯ内に堆積するための主な駆動力であることが確認された。
【００３１】
非限定的な例において、上述のような２００ｎｍ細孔ＡＡＯから形成された基材２０は、注目のアナライトが（表面流とは対照的に）流通することを可能にする。ナノ粒子のないＡＡＯテンプレートを使用した比色分析読み取りによるバイオアッセイ（図７）が実施されて、ＬＳＰＲと関係のない質量輸送速度が検証された。マレイミド共役ビオチンによる後続の修飾を可能にするために、テンプレート表面が全体にわたってチオール基末端シラン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ、ＭＰＴＭＳ）を用いて共有結合によって修飾された。ビオチンの表面被覆が、ビオチン化ＡＡＯ及び非ビオチン化対照を蛍光性複合化ストレプトアビジン内でインキュベートし、図８に示すように蛍光強度について画像化することによって確認された。バイオアッセイを実施するために、図９に示すようなフロースルー又はフローオーバー構成においてビオチン化ＡＡＯを自作フローセル内に載置した。図９は、アナライト溶液がＡＡＯ膜のナノ細孔を通して（フロースルー）又は膜の上に（フローオーバー）方向づけられるフロースルー対フローオーバー構成を示す。透明窓によって、反射型プローブを使用してフローセル内部の吸光度を収集することが可能であった。その後、ビオチン化ＡＡＯを５ｍＬのガラクトシダーゼ−ストレプトアビジン複合体に、１ｍＬ／分の一定の流速で曝露した。複合体のストレプトアビジン部分は、ビオチンに特異的に結合し、β−ガラクトシダーゼ部分をＡＡＯ表面に固定化する。最終段階において、ビオチンとストレプトアビジンとの間の反応の進行が、５ｍＬのオルトニトロフェノールを基材の上に流すことによって定量化されており、β−ガラクトシダーゼは無色ＯＮＰＧをＯＮＰに変換し、この吸収ピークは４２０ｎｍにある。このβ−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジンサイクルの後、ＯＮＰＧをアッセイ毎に８〜１０回繰り返した。各５分サイクル後に定常状態測定を行い、反応の進行を定量化した。その後、図１０に示すように、各間隔における吸収強度を時間の関数としてフローオーバー及びフロースルーの両方のセンサ構成についてプロットした。データに適合する一次速度動態が、反応速度の定量的測度をもたらした。
【００３２】
図１０は、０．５μｇ／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジンを用いて実施されたフロースルーアッセイの結果を、５μｇ／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジンを用いて実施されたフローオーバーアッセイの結果と比較している。この例において使用されたアッセイ時間及びＯＮＰＧ（それぞれ４０分及び５ｍｇ／ｍＬ）について、フローオーバーアッセイは、０．５μｇ／ｍＬβ−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジンを使用したとき、すべての時点において４２０ｎｍでの無視できる吸光度を呈した。それゆえ、反応の速度を加速し、フロースルーアッセイとの比較を容易にするために、β−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジン濃度を１０倍増大させる必要があった。０．５μｇ／ｍＬβ−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジンを用いて実施されたフロースルーアッセイは、２１分間のビオチン−ストレプトアビジン結合に対してオン速度（ｋｏｎ）を呈した。比較すると、５μｇ／ｍＬβ−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジンを用いて実施されたフローオーバーアッセイは、２５分間のビオチン−ストレプトアビジン結合に対してオン速度を呈した。各アッセイを３セット繰り返し、フロースルーについて２４分間、及びフローオーバーについて３７分間の平均ｋｏｎ値が与えられた。フロースルー吸収測定の経路長は、フローオーバー測定の経路長の２倍であり、それによって、図１０において観測した飽和状態における吸収値の差はベールの法則に基づいて予測されることに留意されたい。未ビオチン化ＡＡＯがβ−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジン及びＯＮＰＧの連続サイクルに曝露された対照は、ＯＮＰＧの３７０ｎｍでの吸収ピークに起因して０．０３未満の吸収値を示した。このアッセイによって、マイクロチャネルにおけるフローオーバーと比較してナノホールにおけるフロースルーについて質量輸送増大が確認されており、フローオーバーは、フロースルーと同様の結合速度を達成するのに１０倍高い濃度のアナライトを必要とする。１０倍低い濃度をフロースルーに使用したことを、１．８倍速い結合速度と合わせて考えると、フロースルーセンサの質量輸送において１８倍の利得になる。言い方を変えると、フローオーバーセンサと同じアッセイ時間を達成するのにフロースルーセンサが必要とするアナライトは１／１８であった。
【００３３】
作製済みのＬＳＰＲナノロッド基材（例えば、基材２０）を使用して同様のバイオアッセイを実施したが、これを、これらの質量流束利得を単純なナノ多孔質基材からプラズモンナノ多孔質基材に変換することができることを実証するために説明する。バイオアッセイを実施する前に、ＡｕナノロッドのＬＳＰＲ信号トランスデューサとしての選択を検証するために、基材の屈折率反応性を定量化した。加えて、蛍光エンドポイントアッセイを使用して、ナノロッド表面をバイオレセプタで共有結合によって修飾することができることを検証した（図１２）。最初に、ナノロッドを備えたＡＡＯ膜を、屈折率（Ｒ．Ｉ．）が変動するグリセロール水溶液に曝露した。この時点においてナノロッドは修飾されておらず、それらの合成に使用されるＣＴＡＢ界面活性剤を示しており、これは本明細書においては「裸」基材として指定している。各溶液内で基材のλｍａｘを測定し、屈折率の関数としてプロットしており、これは３６６ｎｍ／ＲＩＵのＲ．Ｉ．反応性を示している。この実験後、ＣＴＡＢ界面活性剤を３０秒の空気プラズマ処理を使用して表面から除去し、それによって、続いてＡｕナノロッド表面が自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を用いて修飾された。オクタンチオール（ＯＴ）及び１１−メルカプトウンデカン酸（ＭＵＡ）の混合ＳＡＭがナノロッド表面上に形成され、ＭＵＡとのカルボジイミド媒介共有結合形成によってアミン修飾ビオチンの結合が可能になった。ビオチン結合の後、一切の非特異的吸着部位をブロックするためにリン酸緩衝生理食塩水内の３％  ｗ／ｗウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）においてインキュベートした。ＳＡＭ、ビオチン及びＢＳＡを用い洗浄及び修飾された、結果としてのＬＳＰＲ基材を、「修飾」基材として指定する。ミリＱ  Ｈ2Ｏにおけるこれらの基材の各々の吸収スペクトルを図１３にプロットしており、裸及び修飾基材のピーク形状及びピーク幅が同様であることは、修飾手順がナノロッドのプラズモン特性に悪影響を与えないことを示している。グリセロール水溶液に曝露することによって修飾基材の屈折率を再び測定しており、この反応性を図１４において裸基材の反応性と比較している。ナノロッド表面上に吸着質があることによってＲ．Ｉ．反応性は３６６ｎｍ／ＲＩＵから２９２ｎｍ／ＲＩＵへと低減しており、これはナノロッド表面から遠ざかるときのＬＳＰＲ検知場の指数関数的減衰に基づいて予測される。しかしながら、２９２ｎｍ／ＲＩＵという反応性は、ＬＳＰＲセンシングにおいて使用される数値寸法よりも依然として高く、それゆえ生物学的結合事象に対して高い反応性をもたらす。
【００３４】
抗ビオチンＩｇＧ抗体をアナライトとして使用して、フローオーバー構成とフロースルー構成とにおけるビオチン化ＬＳＰＲ基材の質量輸送の差をアッセイした。１００ｎＭ濃度で１ｍＬ容量の抗ビオチンを、流速１ｍＬ／分で、プラズモンセンサの上又はプラズモンセンサを通して流した。この最初のフロー後、抗ビオチンのビオチン化センサ表面への結合を、流れを止めた状態でセンサ信号が飽和に達するまで継続した。飽和すると、センサを１ｍＬのＰＢＳで流速１ｍＬ／分で洗浄して抗ビオチンを解離した。センサ信号が釣り合うまで、流れを止めた状態で解離を続けた。抗ビオチンが会合又は解離するのと並行してリアルタイムでＬＳＰＲ  λｍａｘの変化をモニタリングすることによって、抗体の表面被覆の測度がもたらされる。それゆえ、これらのλｍａｘ変化を一次指数関数に適合させることによって、２つのアッセイについて会合速度（ｋａ）及び解離速度（ｋｄ）を求めることが可能になる。
【００３５】
上述の電磁放射源（例えば、電磁放射３０の発生源）は、上述のようにプラズモンを励起することができる光又は他のタイプの電磁放射を、基材（例えば、基材２０）に向けて方向づける任意の手段であり得る。
【００３６】
同じく上述したように、受光器４０は、分光計であってもよく、さらには、（例えば、ＬＳＰＲ現象に起因する）アナライトに加えられる電磁放射（例えば、光）の波長の変化を検出することによって、基材内のアナライトの屈折率の変化を検知するように構成されている任意の他のタイプの受光器であり得る。したがって、受光器は、気体、液体、固体又は物理的（例えば、温度）組成の変化に起因する、プラズモン基材付近の環境の変化を測定する。さらに、受光器４０は、吸収の変化を求めるための、吸収、又は光の特定若しくは複数の波長（例えば、フィルタリングされた光電子倍増管）の透過の低減に対して反応性であるデバイスであり得る。そのような受光器は、それゆえに基材内のアナライトの屈折率の変化に関する情報を提供するプラズモンを励起する光の波長に対して反応性であることになる。
【００３７】
さらに、受光器（例えば、受光器４０）は、基材と光学的に接続して配置されてもよく、光学的連通は、基材の表面の上又は付近の材料（例えば、基材）の光学的特性を測定するように位置づけられていることとして定義される。受光器は、有線又は無線接続を介して図１に示すような演算装置に結合されてもよく、受光器は、（例えば、基材内のアナライトの屈折率の変化を検知してナノ粒子に結合している対象分子の同定を可能にするための）処理のために演算装置にデータを送ってもよく、且つ／又は受光器自体が、そのような処理を実施する電子プロセッサを含んでもよい。
【００３８】
ナノ細孔を有し、ＬＳＰＲアナライトと結合されるナノ粒子を埋め込まれているフロースルー基材を使用することによって、基材上のアナライトの表面流に対する、基材を通して流れるアナライトの質量流束比も最大化しながら、他の技術（例えば、ＳＰＲ）に対して信号対雑音比を最大化する利点がもたらされる。上述のように従来技術において、そのようなＬＳＰＲ利点は質量流束を犠牲にしていた。プラズモン（例えば、ＬＳＰＲ）基材をナノ細孔（例えば、１０００ｎｍ〜１００ｎｍ）に埋め込むことによって、他の方法に対してそのような流速を改善しながら、質量流束を犠牲にすることが回避され得る。
【００３９】
さらに、上述のような受光器（例えば、受光器４０）による検知及び対象化合物の同定は、ノイズ及び他の信号劣化によって悪影響を受ける可能性がある。そのようなノイズ及び劣化は、センサの欠陥、流動誘起センサ応答エラー、センサ毎のばらつき、アナライト濃度に関係しない試料状態の効果、及び光学読み取りのばらつきを含み得る。そのようなノイズ及び劣化の原因は、プラズモン共鳴構造の反応、フロースルー構造の屈曲又は目詰り、検知構造の欠陥、基材から基材への再現性に伴う問題、試験試料液の散乱及び吸収、コリメート光のばらつき、分光計の不安定性、光源の不安定性、並びに液流の不安定性を含み得る。
【００４０】
さらに、センサ欠陥の例は、金属構造の形状寸法のばらつき、層、単分子層、又は準単分子層の化学的及び生物学的組成、金属構造及び非金属構造の形態を含む。流動誘起センサ応答エラーの例は、構造の屈曲及び目詰りを含む。センサ毎のばらつきの例は、幾何学的、形態的、化学的、生物学的、及び物理的な意図的でない差異を含む。アナライト濃度に関係しない試料状態の効果の例は、試料の色、試料の濁り、温度、及び溶媒が不均質であることに起因する屈折率の変動を含む。光学読み取りのばらつきの例は、光源の不安定性、センサ配置のばらつき、光波長選択素子の不安定性、光検出器（単一チャネル又はマルチチャネル）の不安定性を含む。
【００４１】
センサ（例えば、受光器４０）から収集される光スペクトルが（例えば、演算装置５０によって）分析されて、上述のノイズ及び劣化の原因が補正され得る。例えば、（例えば、演算装置５０によって）定量的な生物学的分析が実施されて、識別情報、動態情報、及び濃度情報を提供され得る。そのような情報を提供するためのツールは、ノイズ除去ツール、データ取得加速ツール、故障確認ツール、及び高スループット分析のための多重測定のためのツールを含んでもよい。ノイズ除去ツールの非限定例は、平滑化、ピーク適合、ウェーブレット解析を含む。データ取得加速ツールの非限定例は、ウェーブレット解析及びフーリエ解析を含む。故障確認ツールの非限定例は、Ｑ統計量及びＴ2統計量である。高スループット分析のための多重測定のためのツールの非限定例は、顕微鏡画像化及び連続光学式走査である。上述のツールはコンピュータ（例えば、演算装置５０）によって、記載のようなセンサ（例えば、受光器４０）から収集されるデータの分析に使用できる。
【００４２】
上記の記載は、例示的なものであり、制限的ではないことが意図されていることを理解されたい。例えば、上述の実施形態（及び／又はその態様）は、互いに組み合わせて使用されてもよい。加えて、特定の状況又は材料を様々な実施形態の教示にそれらの範囲から逸脱することなく適合させるために多くの変更を行うことができる。本明細書に記載の材料の寸法及びタイプは様々な実施形態のパラメータを定義することが意図されているが、それらは決して限定ではなく、例示にすぎない。上記の記載を検討すれば、多くの他の実施形態が当業者には明らかとなろう。それゆえ、様々な実施形態の範囲は、添付の特許請求の範囲が権利付与される均等物の全範囲とともに、添付の特許請求の範囲を参照して決定されるべきである。さらに、以下の特許請求の範囲において、用語「第１の」、「第２の」及び「第３の」などは、ラベルとしてのみ使用され、それらの対象物に数値要件を課すようには意図されていない。以下の特許請求の範囲の限定は、ミーンズ−プラス−ファンクション形式では書かれておらず、そのような特許請求項の限定が語句「するための手段（ｍｅａｎｓ  ｆｏｒ）」を明示的に使用し、その後にさらなる構造を欠いた機能が述べられるまでは、米国特許法第１１２条第６段落に基づいて解釈されるようには意図されていない。任意の特定の実施形態に従って、必ずしも上述したすべてのそのような目的及び利点が達成され得るとは限らないことは理解されたい。したがって、例えば、本明細書に記載のシステム及び技法は、必ずしも本明細書に教示又は示唆され得るような他の目的又は利点を達成することなく、本明細書に教示されているような１つの利点又は利点群を達成又は最適化するように具現化又は実施されてもよいことを、当業者は認識しよう。
【００４３】
本発明を限られた数の実施形態のみに関連して詳細に説明したが、本発明はそのような開示されている実施形態には限定されないことは容易に理解されるはずである。むしろ、本発明は、これまで記載しなかった任意の数の変形形態、変更形態、置換形態又は均等な構成を組み込むように変更することができるが、これらは本発明の精神及び範囲に相応のものである。加えて、本発明の様々な実施形態を説明してきたが、本発明の態様は記載の実施形態の一部のみを含んでもよいことは理解されたい。したがって、本発明は、上記の記載によって限定されているとみなされるべきではなく、添付の特許請求項の範囲のみによって限定される。
【００４４】
本明細書書面は、最良の形態を含む本発明を開示し、また当業者が、任意のデバイス又はシステムを作成及び使用することと、任意の組み込まれている方法を実施することとを含め、本発明を実践することを可能にするための例を使用している。本発明の特許可能な範囲は、特許可能な範囲によって定義され、当業者に想起される他の例を含んでもよい。そのような他の例は、それらが特許請求の範囲の文言と異ならない構造的要素を有する場合、又は、それらが特許請求の範囲の文言とわずかな差しかない均等な構造的要素を含む場合、特許請求項の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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