(57)【要約】  本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療に関し、特に非アルコール性脂肪性肝炎の治療に用いるためのmiR-21発現を阻害する化合物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非アルコール性脂肪性肝炎の患者の治療に用いるためのmiR-21阻害化合物。
【請求項２】
２本鎖ＲＮＡ、アンタゴmir、アンチセンス核酸及び酵素的ＲＮＡ分子からなる群から選択される請求項１に記載のmiR-21阻害化合物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のmiR-21阻害化合物を含む、非アルコール性脂肪性肝炎の患者の治療に用いるためのベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）とは、糖尿病及び肥満の世界的流行との密接な関連のため、ますます関連する公衆衛生上の問題である(Ratziu et al. (2010), J.Hepatol. 53(2):372-384)。ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨは、それぞれ最も一般的な慢性肝疾患の一つである。実際に、最近のＵＳの調査において、慢性肝疾患の３９％の新たに同定されたケースはＮＡＦＬＤを有していた(Weston et al. (2005), Hepatology 41(2):372-379)。慢性的炎症及び繊維症は、比較的に良性のＮＡＦＬＤと区別されるＮＡＳＨの重要な特徴である。ＮＡＳＨは、繊維症、肝硬変、代償不全及び肝細胞癌の潜在性を有する。その重症度及び有病率にもかかわらず、ＮＡＳＨの認可された治療は無い。従って、ＮＡＳＨの治療に適する新たな薬物の開発が必要である。このように、ＮＡＳＨにおける新たな治療ターゲットの特徴付けが強く望まれる。
【０００３】
マイクロＲＮＡ（miRNAs）は、非コードＲＮＡのファミリーであり、長さが１９〜２２ヌクレオチドであり、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解、又は翻訳の阻害を介して、転写後レベルにおける遺伝子発現を制御する(Bartel (2009), Cell 136(2):215-233)。
【０００４】
ＮＡＳＨにおけるmiR-21の機能的役割、miR-21のＮＡＳＨとの因果関係、ＮＡＳＨの治療におけるmiR-21発現を阻害する化合物の使用による薬効の提供については、本技術分野において公表されていない。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ＮＡＳＨの治療が必要な患者におけるＮＡＳＨの治療に用いるためのmiR-21阻害化合物に関する。
【０００６】
本発明者らは、miR-21特異的阻害剤の、アンタゴｍｉｒ−２１（antagomir-21）に基づくインビボのアプローチを用いて、ＮＡＳＨにおけるmiR-21の役割を研究し、同定することを目的とした。
【０００７】
本発明者らは、異常が無い又は軽度の異常があるコントロールと比較して、ＮＡＳＨ患者の肝臓におけるmiR-21発現をまず測定した。本発明者らは、miR-21がＮＡＳＨ患者の肝臓において過剰発現することを実証した。また、本発明者らは、高脂肪飼料が与えられたLdlr-/-マウスにおけるmiR-21発現を評価した。miR-21はこれらのマウスの肝臓でアップレギュレートされたため、このＮＡＳＨマウスモデルはヒトの特徴を再現した。また、本発明者らは、miR-21がＮＡＳＨ患者及び高脂肪飼料が与えられたLdlr-/-マウスの胆嚢及び肝臓の炎症性細胞において主に発現することを実証した。本発明者らは、驚くことに、アンタゴmir-21を用いたLdlr-/-マウスの治療は、アンタゴmirコントロールで処理されたLdlr-/-マウス及びＰＢＳで処理されたマウスのみならず、野生型マウスと比較して、肝臓のmiR-21発現を低減させることを見出した。
【０００８】
また、本発明者らは、miR-21がＮＡＳＨにおける肝細胞の損傷、炎症、繊維化に寄与するか否かを評価した。本発明者らは、血清ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノ基転移酵素）及びＡＬＴ（アラニンアミノ基転移酵素）濃度を測定し、炎症性細胞マーカーのＣＤ６８（活性型クッパー細胞）及びＣＤ３（Ｔ細胞）を肝領域で染色し、炎症性（Tnfα及びMcp1）及び繊維化（Tgfβ及びコラーゲン（collagen）-1α2）遺伝子及びタンパク質の肝臓における発現を分析した。本発明者らは、ＮＡＳＨのマウスモデルにおいて、血清ＡＳＴ及びＡＬＴレベル、肝臓のＣＤ６８及びＣＤ３染色、肝臓のＭＣＰ１及びＴＮＦαの発現、並びにＴｇｆβ及びコラーゲン-1α2の発現が、固形飼料（chow diet）が与えられたＷＴマウスよりも高脂肪飼料（high fat diet）が与えられたLdlr-/-マウスの方がより高いことを実証した。
【０００９】
本発明者らは、驚くことに、アンタゴmir-21が血清ＡＳＴ及びＡＬＴレベルの両方を低減したため、アンタゴmir-21が肝臓の損傷を低減したことを見出した。また、アンタゴmir-21は、コントロールマウス（ＰＢＳ又はアンタゴmirコントロールで処理された高脂肪飼料が与えられたLdlr-/-マウス）と比較して、高脂肪飼料が与えられたLdlr-/-マウスの肝臓における炎症性マーカーＭＣＰ１及びＴＮＦαを低減したため、アンタゴmir-21は、浸潤したＴ細胞の数を低減し、肝臓の炎症を低減する。また、アンタゴmir-21は、２つの周知の肝臓における繊維形成関連遺伝子であるＴｇｆβ及びコラーゲン-1α2を低減したため、肝臓の繊維症を低減する。
【００１０】
本発明者らは、miR-21の発現の阻害は、患者におけるＮＡＳＨ治療に適することを証明した。
【００１１】
治療方法
従って、本発明は、ＮＡＳＨの治療が必要な患者におけるその治療に使用するためのmiR-21阻害化合物に関する。
【００１２】
本明細書において用いられる「miR-21」の用語は、本技術分野における一般的な意味を有し、miR Baseのデータベース（http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/）のAccessionナンバーMI0000077から得られるmiR-21配列を意味する。
【００１３】
本明細書において用いられる「患者」の用語は、哺乳動物を意味する。本発明の好ましい実施形態において、本発明に係る患者は、ＮＡＳＨに苦しめられている又はその可能性が高い患者（好ましくはヒト）を意味する。
【００１４】
本明細書において用いられる「ＮＡＳＨ」の用語は、本技術分野におけるその一般的な意味を有し、非アルコール性脂肪性肝炎を意味する。
【００１５】
本明細書において用いられる「miR-21阻害化合物」の用語は、miR-21の作用を妨げることができるヌクレオチド化合物を意味する。本発明のmiR-21阻害化合物は、miR-21の活性を阻害する又は低減する化合物である。しかしながら、miR-21の活性の減少及び／又は低減は、miR-21発現を阻害することにより得られ得る。「miR-21発現の阻害」の用語は、治療後の肝臓又は肝細胞におけるmiR-21の産生量が、治療前に産生される量よりも少ないことを意味する。当業者は、例えばmiRNA転写レベルを測定するための技術を用いて、肝臓又は肝細胞においてmiR-21発現が阻害されているかどうか容易に決定できる。
【００１６】
適当なmiR-21阻害化合物は、二本鎖ＲＮＡ（短鎖若しくは低分子干渉ＲＮＡ、又は「siRNA」）、アンタゴmir、アンチセンス核酸、及びリボザイム等の酵素的ＲＮＡ分子を含む。これらの化合物のそれぞれは、所定のmiRNAに標的とされ、標的miRNAを破壊できる又は標的miRNAの破壊を誘導できる。例えば、所定のmiRNAの発現は、該miRNAの少なくとも一部と少なくとも９０％、例えば９５％、９８％、９９％又は１００％の配列相同性を有する単離された二本鎖ＲＮＡ（「dsRNA」）分子のＲＮＡ干渉を誘導することにより阻害され得る。好ましい実施形態において、dsRNA分子は、「短鎖又は低分子干渉ＲＮＡ」又は「siRNA」である。
【００１７】
本方法に有益なsiRNAは、長さが約１７ヌクレオチドから２９ヌクレオチド、好ましくは約１９から２５ヌクレオチドの短鎖二本鎖ＲＮＡを含む。siRNAは、標準のワトソン‐クリック塩基対相互作用（以下、「塩基対」という）により互いにアニールされたセンスＲＮＡ鎖及び相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を含む。センス鎖は、標的miRNA内に含まれる核酸配列と実質的に同一の核酸配列を含む。
【００１８】
本明細書において用いられる、標的mRNA内に含まれる標的配列と「実質的に同一」であるsiRNAの核酸配列は、標的配列と同一の核酸配列、又は１つ又は２のヌクレオチドが標的配列と異なる核酸配列である。siRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、２つの相補的な１本鎖ＲＮＡ分子を含み得る、又は２つの相補的部分が塩基対となり、１本鎖の「ヘアピン」領域により共有結合される単一の分子を含み得る。siRNAは、１つ又はそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は変更により自然発生ＲＮＡと異なる変更されたＲＮＡであってもよい。そのような変更は、siRNAの末端又はsiRNAの１つ若しくはそれ以上の内部ヌクレオチド等における非ヌクレオチド材料の付加、又はヌクレアーゼ消化に対する耐性をsiRNAに設けるための修飾、又はsiRNAにおける１つ若しくはそれ以上のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドへの置換を含み得る。
【００１９】
siRNAの１つ又は両方の鎖は、３’側のオーバーハングを含み得る。本明細書において用いられる「３’オーバーハング」は、二本鎖のＲＮＡ鎖の３’末端から少なくとも１つの対でないヌクレオチドが延びていることを意味する。従って、一実施形態において、siRNAは、長さが１から約６ヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドを含む）、好ましくは１から約５ヌクレオチド、より好ましくは１から約４ヌクレオチド、特に好ましくは約２から約４ヌクレオチドの少なくとも１つの３’オーバーハングを含む。好ましい実施形態において、３’オーバーハングは、siRNAの両方の鎖にあり、長さが２ヌクレオチドである。例えば、siRNAのそれぞれの鎖は、ジチミジル酸（「ＴＴ」）又はジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’オーバーハングを含み得る。
【００２０】
siRNAは、上記のように、化学的若しくは生物学的に生成され得る、又は組換えプラスミド若しくはウイルスベクターから発現され得る。dsRNA又はsiRNA分子の生成及び試験のための代表的な方法は、Gewirtzの米国出願公開２００２／０１７３４７８及びReichらの米国出願公開２００４／００１８１７６に記載されており、それらの全体の開示は参照として本明細書に組み込まれる。
【００２１】
また、所定のmiRNAの発現は、アンチセンス核酸により阻害され得る。本明細書において用いられる「アンチセンス核酸」は、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ペプチド核酸の核酸相互作用により標的ＲＮＡに結合する核酸分子を意味し、それは、標的ＲＮＡの活性を変更する。本方法において用いるのに適するアンチセンス核酸は、一般にmiRNAにおける連続する核酸配列に相補的な核酸配列を含む１本鎖核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ、ＰＮＡ）である。好ましくは、アンチセンス核酸は、miRNAにおける連続する核酸配列に対して５０〜１００％の相補性、より好ましくは７５〜１００％の相補性、最も好ましくは９５％〜１００％の相補性を有する核酸配列を含む。miRNAの核酸配列は、表Ａに示される。いかなる理論に束縛されるものではないが、アンチセンス核酸は、miRNA／アンチセンス核酸の二本鎖を消化するRNase H又は他の細胞性ヌクレアーゼを活性化すると信じられている。好ましい実施形態において、阻害剤は、アンタゴmir及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２２】
本明細書において用いられる「アンタゴmir」又は「アンタゴmiR-21」の用語は、miR-21を発現抑制するのに用いられる化学的に設計された低分子ＲＮＡを意味する。アンタゴmirは、誤対合又は所定の種の塩基修飾を有する特定のmiRNAターゲットと相補的である。アンタゴmirは、分解に対するより強い耐性を得るためのいくつかの修飾を含み得る。好ましい実施形態において、アンタゴmirは、化学的に設計されたコレステロール結合１本鎖ＲＮＡアナログである。
【００２３】
miRNAの阻害は、アンチセンス２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）オリゴリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、ホスホロチオエート、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノオリゴマーを用いて、又はレンチウイルス若しくはアデノウイルスで発現されたアンタゴmirの使用により達成され得る（Stenvang and Kauppinen(2008), Expert Opin. Biol. Ther. 8(1):59-81）。さらに、１本鎖ＲＮＡアナログのＭＯＥ（２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエート）又はＬＮＡ（ロックド核酸（ＬＮＡ）ホスホロチオエート）での化学修飾は、miRNA活性を阻害するために用いられ得る。
【００２４】
アンチセンス核酸は、標的特異性、ヌクレアーゼ耐性、到達量、又は分子の有効性に関する他の特性を増強するために、核酸骨格又は糖の骨格、及び塩基部分（又はその同等物）の修飾を含み得る。そのような修飾は、コレステロール部分、アクリジン等の二本鎖介入物、又は１つ若しくはそれ以上のヌクレアーゼ耐性基の含有を含む。
【００２５】
アンチセンス核酸は、化学的又は生物学的に生成でき、以下に記載のように組換えプラスミド又はウイルスベクターから発現され得る。生成及び試験のための代表的な方法は、当業者に周知であり、例えば、Stein and Cheng (1993), Science 261:1004、及びWoolfらの米国特許第５８４９９０２を参照でき、これらの全体の開示は参照として本明細書に組み込まれる。
【００２６】
所定のmiRNAの発現は、酵素的核酸により阻害され得る。本明細書で用いられる「酵素的核酸」は、miRNAの連続する核酸配列に対する相補性を有する基質結合領域を含む核酸を意味し、それはmiRNAを特異的に切断できる。好ましくは、酵素的核酸の基質結合領域は、miRNAにおける連続する核酸配列に対して、５０〜１００％の相補性、より好ましくは７５〜１００％の相補性、最も好ましくは９５〜１００％の相補性を有する。酵素的核酸は、塩基、糖及び／又はリン酸基における修飾を含み得る。本方法における使用のための代表的な酵素的核酸は、リボザイムである。
【００２７】
酵素的核酸は、以下に記載のように、化学的又は生物学的に生成され得る、又は組換えプラスミド又はウイルスベクターから発現され得る。dsRNA又はsiRNA分子を生成する及び試験するための代表的な方法は、Werner and Uhlenbeck (1995), Nucl. Acids Res. 23:2092-96; Hammann etal. (1999), Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 9:25-31; 及びCechらの米国特許４９８７０７１に記載されており、それらの全体の開示は本明細書に参照として組み込まれる。
【００２８】
本発明のmiR-21阻害化合物は、多くの標準的な技術を用いて得られ得る。例えば、本発明のmiR-21阻害化合物は、本技術分野に周知の方法を用いて、化学的に合成され得る、又は組換えで生成され得る。一般に、本発明のmiR-21阻害化合物は、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成器を用いて化学的に合成される。合成ＲＮＡ分子又は合成試薬の供給者は、例えばProligo (Hamburg, Germany), Dharmacon Research (Lafayette, Colo.,USA), Pierce Chemical (part of Perbio Science, Rockford, 111., USA), GlenResearch (Sterling, Va., USA), ChemGenes (Ashland, Mass., USA) and Cruachem(Glasgow, UK)を含む。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の合成miR-21阻害化合物は、１つ又はそれ以上のデザイン要素を含む。これらのデザイン要素は、以下のものに限定されないが、（i）相補的領域の５’末端におけるヌクレオチドのリン酸基又は水酸基の置換基；（ii）１つ又はそれ以上の糖修飾を含む。特定の実施形態において、本発明の合成miR-21阻害化合物は、リン酸基及び／又は水酸基が他の化学基に置換された相補的領域の５’末端におけるヌクレオチドを有する（「置換デザイン」という）。いくつかの場合においてはリン酸基が置換され、他の場合においては水酸基が置換されている。特定の実施形態において、置換基はビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、２’Ｏ−Ｍｅ（２’オキシゲンメチル）、ＤＭＴＯ（酸素含有４，４’−ジメトキシトリチル）、フルオレセイン、チオール又はアクリジンであるが、他の置換基は当業者に周知であり、同様に用いられ得る。特定の実施形態において、糖修飾は、２’Ｏ−Ｍｅ修飾である。更なる実施形態において、相補的領域の最初若しくは最後の２〜４残基、又は最初若しくは最後の４〜６残基に、１つ又はそれ以上の糖修飾がある。
【００３０】
特定の実施形態において、本発明のmiR-21阻害化合物は、ヌクレアーゼによる分解に対して耐性がある。当業者は、例えばmiRNA内に2’位に修飾が与えられた１つ又はそれ以上のリボヌクレオチドを組み込むことによってヌクレアーゼ耐性が付与された核酸を容易に合成し得る。適当な2’修飾リボヌクレオチドは、２’位にフルオロ、アミノ、アルキル、アルコキシ及びＯ−アリールによる修飾を含む。
【００３１】
また、本発明は、ＮＡＳＨの治療に用いるための本発明に係るmiR-21阻害化合物を含むベクターに関する。
【００３２】
代替的に、本発明のmiR-21阻害化合物は、適当なプロモーターを用いて、組換え環状又は直鎖状ＤＮＡプラスミドから発現され得る。プラスミドからＲＮＡを発現するのに適するプロモーターは、例えばＵ６若しくはＨＩＲＮＡｐｏｌIIIプロモーター配列、又はサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適当なプロモーターの選択は、当業者の技能の範囲内である。本発明の組換えプラスミドは、肝細胞における本発明のmiR-21阻害化合物の発現のための誘導性プロモーター又は制御性プロモーターを含み得る。
【００３３】
組換えプラスミドから発現される本発明のmiR-21阻害化合物は、標準的な技術により培養細胞発現系から単離され得る。組換えプラスミドから発現される本発明のmiR-21阻害化合物は、肝細胞に輸送され、また肝細胞において直接に発現され得る。肝細胞に本発明のmiR-21阻害化合物を輸送するための組換えプラスミドの使用については、以下により詳細に説明される。
【００３４】
本発明のmiR-21の阻害化合物は、別々の組換えプラスミドから発現され得る、又は特有の組換えプラスミドから発現され得る。好ましくは、本発明のmiR-21阻害化合物は、単一のプラスミドから核酸前駆体分子として発現され、その前駆体分子は、肝細胞内にあるプロセシング系を含む適当なプロセシング系により機能性miR-21阻害化合物にプロセシングされる。他の適当なプロセシングシステムは、例えばTuschlらの米国出願公開２００２／００８６３５６に記載されているようなインビトロショウジョウバエ細胞溶解液システム、及びYangらの米国特許出願公開２００４／００１４１１３に記載されているE.coliRNAse IIIシステムを含み、それらの全体の開示は参照として本明細書に組み込まれる。本発明のmiR-21阻害化合物を発現するのに適当なプラスミドの選択、遺伝子産物を発現するためのプラスミド内に核酸配列を挿入する方法、及び所望の細胞に組換えプラスミドを輸送する方法は、当業者の技能の範囲内である。例えばZeng et al. (2002), Molecular Cell 9:1327-1333; Tuschl (2002), Nat. Biotechnol, 20:446-448; Brummelkampet al. (2002), Science 296:550-553; Miyagishi et al. (2002), Nat. Biotechnol.20:497-500; Paddison et al. (2002), Genes Dev. 16:948-958; Lee et al. (2002),Nat. Biotechnol. 20:500-505;及び Paul et al. (2002), Nat.Biotechnol. 20:505-508を参照でき、これらの全体の開示は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００３５】
一実施形態において、本発明のmiR-21阻害化合物を発現するプラスミドは、ＣＭＶ初期中間（intermediateearly）プロモーターの制御下にmiR-21阻害化合物前駆体をコードする配列を含む。本明細書で用いられるプロモーターの「制御下」とは、そのプロモーターがmiR-21阻害化合物をコードする配列の転写を開始できるように、核酸がプロモーターの３’側に位置することを意味する。
【００３６】
本発明のmiR-21阻害化合物は、組換えウイルスベクターから発現され得る。本発明のmiR-21阻害化合物は、別々の組換えウイルスベクターから、又は特有のウイルスベクターから発現され得ることが考えられる。組換えウイルスベクターから発現されるmiR-21阻害化合物は、標準的技術により培養細胞発現系から単離され得る、又は肝細胞に直接に発現され得る。肝細胞にmiR-21阻害化合物を輸送するための組換えウイルスベクターの使用については、以下により詳細に説明される。
【００３７】
本発明の組換えウイルスベクターは、本発明のmiR-21阻害化合物をコードする配列、及び該miR-21阻害化合物配列を発現するのに適当なプロモーターを含む。適当なプロモーターは、例えばＵ６若しくはＨＩＲＮＡｐｏｌIIIプロモーター配列、又はサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適当なプロモーターの選択は、当業者の技能の範囲内である。本発明の組換えウイルスベクターは、肝細胞にmiR-21阻害化合物を発現するための誘導性又は制御性プロモーターを含み得る。
【００３８】
本発明のmiR-21阻害化合物のコード配列を許容可能なウイルスベクターとしては、例えばアデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）及びヘルペスウイルス等が用いられ得る。ウイルスベクターの指向性は、適切な方法で、他のウイルスからのエンベロープタンパク質又は他の表面抗原を用いてベクターをシュードタイピングすることにより、又は異なるウイルス性カプシドタンパク質に置換することにより変更され得る。例えば、本発明のレンチウイルスベクターは、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ及びモコラ等からの表面タンパク質を用いてシュードタイピングされ得る。本発明のＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質のセロタイプを発現するためのベクター設計をすることにより、異なる細胞を標的にさせ得る。例えば、セロタイプ２ゲノムにおけるセロタイプ２カプシドを発現するＡＡＶベクターはＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ２／２におけるこのセロタイプ２カプシド遺伝子は、ＡＡＶ２／５ベクターの生成のためのセロタイプ５カプシド遺伝子により置換され得る。異なるカプシドタンパク質セロタイプを発現するＡＡＶベクターを構築するための技術は、当業者の技能の範囲であり、例えばRabinowitz J. E. et al. (2002), J Virol 76:791801を参照でき、この全体の開示は参照として本明細書に組み込まれる。
【００３９】
本発明の使用に適する組換えウイルスベクターの選択、そのベクター内に本発明のmiR-21阻害化合物を発現するための核酸配列を挿入する方法、所望の細胞にそのウイルスベクターを輸送する方法、及び発現されたmiR-21阻害化合物産物の回収は、当業者の技能の範囲内である。例えば、Dornburg(1995), Gene Therap. 2:301-310; Eglitis (1988), Biotechniques 6:608-614; Miller(1990), Hum. Gene Therap. 1:5-14;及びAnderson (1998),Nature 392:25-30を参照することができ、それらの全体の開示は参照として本明細書に組み込まれる。
【００４０】
好ましいウイルスベクターは、ＡＶ及びＡＡＶ由来のベクターである。本発明のmiR-21阻害化合物を発現するのに適するＡＶベクター、その組換えＡＶベクターを構築するための方法、及び標的細胞内にそのベクターを輸送するための方法は、Xia et al. (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010に記載されており、その全体の開示は参照として本明細書に組み込まれる。本発明のmiR-21阻害化合物の発現に適するＡＡＶベクター、その組換えＡＡＶベクターを構築するための方法、及び標的細胞内にそのベクターを輸送するための方法は、Samulski et al. (1987),J. Virol. 61:3096-3101; Fisher et al. (1996), J. Virol., 70:520-532; Samulskiet al. (1989), J. Virol. 63:3822-3826；米国特許第５２５２４７９号；米国特許第５１３９９４１号；国際特許出願ＷＯ９４／１３７８８；及び国際特許出願ＷＯ９３／２４６４１に記載されており、それらの全体の開示は参照として本明細書に組み込まれる。好ましくは、本発明のmiR-21阻害化合物は、ＣＭＶ初期中間プロモーターを含む単一の組換えＡＡＶベクターから発現される。
【００４１】
一実施形態において、本発明の組換えＡＡＶウイルスベクターは、ヒトＵ６ＲＮＡプロモーターの制御下で、ポリＴ終結配列に機能可能に接続するmiR-21阻害化合物前駆体をコードする核酸配列を含む。本明細書において用いられる「ポリＴ終結配列に機能可能に接続する」とは、センス鎖又はアンチセンス鎖をコードする核酸配列が５’方向においてポリＴ終結シグナルにすぐ側に隣接することを意味する。そのベクターのmiR-21阻害化合物配列の転写の間、ポリＴ終結シグナルは転写終結に作用する。
【００４２】
miR-21阻害化合物は、患者の肝臓又は肝細胞にその化合物を輸送するのに適する手段により患者に投与され得る。例えば、miR-21阻害化合物は、その化合物、又はその化合物をコードする配列を含む核酸を患者の細胞にトランスフェクトするのに適する方法により投与され得る。好ましくは、その細胞には少なくとも１つのmiR-21阻害化合物をコードする配列を含むプラスミド又はウイルスベクターをトランスフェクトされる。
【００４３】
miR-21阻害化合物は、適当な腸内又は腸管外投与経路により患者に投与され得る。本方法に適する腸内投与経路は、例えば経口、直腸内又は鼻腔内投与を含む。適当な腸管外投与経路は、例えば血管内投与（例えば静脈内ボーラス注射、静脈内注射、動脈内ボーラス注射、動脈内注射及び血管内カテーテル点滴注入）；組織周囲及び組織内注射（例えば網膜内注射又は網膜下注射）；（浸透圧ポンプ等による）皮下注入を含む皮下注射又は堆積；例えばカテーテル又は他の配置デバイス（例えば網膜ペレット、座薬、又は多孔性、非多孔性若しくはゼラチン状材料）による所望の組織への直接の適用；並びに吸入を含む。好ましい投与経路は、注射、注入、及び肝組織内への直接の注射である。
【００４４】
本方法において、miR-21阻害化合物は、輸送試薬と組み合わされたネイキッドＲＮＡ、又はmiR-21阻害化合物を発現する配列を含む核酸（例えば組換えプラスミド又はウイルスベクター）として投与され得る。適当な輸送試薬は、例えばMinis Transit TKO親油性試薬；lipofectin;lipofectamine（登録商標）; cellfectin; ポリカチオン (例えばポリリジン)；及びリポソームを含む。
【００４５】
miR-21阻害化合物を発現する配列を含む組換えプラスミド及びウイルスベクター、並びに肝細胞にそのようなプラスミド及びベクターを輸送するための技術は上記のとおりである。
【００４６】
好ましい実施形態において、リポソームは、患者にmiR-21阻害化合物（又はそれをコードする配列を含む核酸）を輸送するのに用いられる。リポソームは、遺伝子産物又は核酸の血中半減期を増大し得る。本発明における使用に適するリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、それは一般に、中性又は負荷電リン脂質、及びコレステロール等のステロールを含む。資質の選択は、一般に、所望のリポソームサイズ及び血流内のリポソームの半減期等の因子の検討により導かれる。
【００４７】
リポソームの調製の種々の方法は周知であり、例えばSzoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467、並びに米国特許第４２３５８７１号、第４５０１７２８号、第４８３７０２８号及び第５０１９３６９号に記載されており、それらの全体の開示は参照として本明細書に組み込まれる。本方法で使用されるリポソームは、肝細胞にリポソームを向けるリガンド分子を含み得る。肝細胞抗原に結合するモノクローナル抗体等の肝細胞のいたる所にある受容体に結合するリガンドが好ましい。本方法で用いるためのリポソームは、単核球マクロファージ系（ＭＭＳ）及び細網内皮系（ＲＥＳ）によるクリアランスを避けるために修飾され得る。そのような修飾リポソームは、表面上にある、又はリポソーム構造内に組み込まれたオプソニン作用阻害部分を有する。特に好ましい実施形態において、本発明のリポソームは、オプソニン作用阻害部分及びリガンドの両方を含み得る。
【００４８】
本発明のリポソームを調製するのに用いるためのオプソニン作用阻害部分は、典型的にリポソーム膜に結合される高分子量親水性ポリマーである。本明細書において用いられるように、例えば脂質‐可溶性アンカーの膜自体の中へのインターカレーションにより、又は膜脂質の活性基に直接に結合することにより、オプソニン作用阻害部分が膜に化学的又は物理的に付着する場合に、オプソニン作用阻害部分がリポソーム膜に「結合」される。これらのオプソニン作用阻害親水性ポリマーは、米国特許第４９２００１６号に記載されているように、ＭＭＳ及びＲＥＳによりリポソームの取り込みを顕著に低減する保護表面層を形成し、その全体の開示は参照として本明細書に組み込まれる。リポソームの修飾に適するオプソニン作用阻害部分は、約５００から約４００００ダルトン、より好ましくは約２０００から約２００００ダルトンの数平均分子量を有する水溶性ポリマーであることが好ましい。そのようなポリマーは、例えばメトキシＰＥＧ若しくはＰＰＧ及びＰＥＧ若しくはＰＰＧステアレートといったポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；ポリアクリルアミド又はポリＮ−ビニルピロリドン等の合成ポリマー；直鎖型、分枝型又はデンドリマー型ポリアミドアミン；ポリアクリル酸；カルボキシル基又はアミノ基が化学的に結合されている、例えばポリビニルアルコール及びポリキシリトールといったポリアルコール、並びにガングリオシドＧＭ１等のガングリオシドを含む。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ若しくはメトキシＰＰＧのコポリマー、又はそれらの誘導体も適する。さらに、オプソニン作用阻害ポリマーは、ＰＥＧのコポリマーと、ポリアミノ酸、多糖類、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン又はポリヌクレオチドのいずれかとを遮断し得る。オプソニン作用阻害ポリマーは、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギニン酸、カラギーナンといったアミノ酸若しくはカルボキシル酸を含む天然多糖類；アミノ化多糖類若しくはオリゴ糖類（直鎖型若しくは分枝型）；又は、例えばカルボキシル基の結合部分を有するカルボン酸の誘導体と反応されたカルボキシル化多糖類若しくはオリゴ糖類であってもよい。好ましくは、オプソニン作用阻害部分は、ＰＥＧ、ＰＰＧ又はそれらの誘導体である。ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは、時折「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれる。
【００４９】
オプソニン作用阻害部分は、多くの周知技術のうちのいずれか１つによりリポソーム膜に結合され得る。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルは、ホスファチジルエタノールアミン脂溶性アンカーに結合され、その後、膜に結合され得る。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３、及び、例えばテトラヒドロフルラン及び水が３０：１２の比であり６０℃であるような溶媒混合物を用いた還元的アミノ化を介して、ステアリルアミン脂溶性アンカーを用いて誘導体化され得る。
【００５０】
オプソニン作用阻害部分で修飾されたリポソームは、非修飾リポソームよりも長く血液循環内に維持される。この理由のため、そのようなリポソームは、時折「ステルス」リポソームと呼ばれる。ステルスリポソームは、多孔性又は「漏出性」の微細血管系により組織内に蓄積されることが知られている。従って、そのような微細血管系の欠陥により特徴付けられる組織は、それらのリポソームを有効に蓄積するであろう（Gabizon, et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 18:6949-53を参照）。さらに、ＲＥＳによる減少された取り込みは、肝臓及び脾臓内のリポソームの顕著な蓄積を防止することによりステルスリポソームの毒性を低減する。従って、オプソニン作用阻害部分で修飾されたリポソームは、肝細胞にmiR-21阻害化合物（又はそれをコードする配列を含む核酸）を輸送するのに特に適する。
【００５１】
当業者は、所定の患者に投与されるための前記化合物の治療的有効量を、その患者のサイズ及び重量、疾病の浸透の度合、年齢、患者の健康状態及び性別、投与経路、並びに投与が局部的であるか、全身的であるか等の因子を考慮することにより容易に決定できる。前記化合物の有効量は、治療される患者のおおよその又は概算の体重に基づかれ得る。好ましくは、そのような有効量は、本明細書に記載されるように、非経口的に又は経腸的に投与される。例えば、患者に投与される化合物の有効量は、約５〜１００００μｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは約５〜３０００μｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは約７００〜１０００μｇ／ｋｇ（体重）、より好ましくは１００μｇ／ｋｇ（体重）より大きい範囲とすることができる。当業者は、所定の患者への化合物の投与のための適切な用法を容易に決定することができる。例えば、化合物は、患者に１度投与され得る（例えば、単一の注射又は堆積）。
【００５２】
医薬組成物
本発明のmiR-21阻害化合物は、医薬組成物で用いられ得る又は調製され得る。
【００５３】
一実施形態において、本発明は、ＮＡＳＨの治療が必要な患者の治療に用いるための、miR-21阻害化合物及び医薬的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物に関する。
【００５４】
本発明のmiR-21阻害化合物は、本技術分野において周知の技術に従って、患者への投与前に、医薬組成物として調製されることが好ましい。本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌で且つ発熱物質を含まないものとして特徴付けられる。本明細書で用いられる「医薬製剤」は、ヒト及び動物への使用のための製剤を含む。本発明の医薬組成物を調製する方法は、当業者の技能の範囲内であり、例えばRemington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack PublishingCompany, Easton, Pa. (1985)に記載されており、その全体の開示は参照として本明細書に組み込まれる。
【００５５】
本医薬製剤は、医薬的に許容可能なキャリアと混合されたmiR-21阻害化合物（例えば０．１重量％〜９０重量％）、又はその生理学的に許容可能な塩を含む。本発明の医薬製剤は、リポソームにより被包されたmiR-21阻害化合物、及び医薬的に許容可能なキャリアを含み得る。好ましい医薬的に許容可能なキャリアは、水、緩衝用水、通常生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン及びヒアルロン酸等である。
【００５６】
本発明の医薬組成物は、従来の医薬的賦形剤及び／又は添加剤を含み得る。適当な医薬的賦形剤は、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤及びｐＨ調整剤を含む。適当な添加剤は、例えば生理学的生体適合性緩衝剤（例えばトロメタミン塩酸塩）、追加のキレート剤（例えばＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ‐ビスアミド等）若しくはカルシウムキレート複合体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ‐ビスアミド等）、又は任意に、追加のカルシウム若しくはナトリウム塩（例えば塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム又は乳酸カルシウム等）を含む。本発明の医薬組成物は、液体で使用するためにパッケージされ、凍結乾燥され得る。
【００５７】
本発明の固体医薬組成物のために、従来の非毒性の固体の医薬的許容可能キャリアは、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカン、セルロース、グルコース、スクロース及びカルボン酸マグネシウム等が用いられ得る。
【００５８】
例えば、経口投与のための固体医薬組成物は、上記のキャリア及び賦形剤と、１０〜９５％、好ましくは２５〜７５％のmiR-21阻害化合物とを含み得る。エアロゾル（吸入）投与のための医薬組成物は、上述のようなリポソームに被包された０．０１〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％のmiR-21阻害化合物と、噴霧剤とを含み得る。キャリア、例えば鼻腔投与のためのレシチンが、所望どおりに含まれ得る。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、ＮＡＳＨの予防又は治療に用いられる更なる薬剤を含み得る。例えば、抗ＮＡＳＨは、抗繊維化剤、抗炎症剤、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）、メトホルミン及びビグアニド等のインスリン増感剤、スタチン及びフィブレート等の脂質降下剤、ビタミンＥ等の抗酸化剤、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）等の肝臓保護剤、並びにレニン‐アンジオテンシン系（ＲＡＳ）、プロバイオティクス及び多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を抑制する他の薬剤を含み得る。
【００６０】
一実施形態において、上記の添加される活性剤は、同一の組成物に含まれ得る、又は別々に投与され得る。
【００６１】
他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＮＡＳＨの治療に同時、別々又は連続的に使用するための組み合わせ製剤に関する。
【００６２】
本発明は、以下の図面及び実施例によりさらに説明される。しかしながら、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして、どのようにしても解釈されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ＮＡＳＨ患者（Ａ）及び高脂肪飼料が与えられたLdlr-/-マウス（ｂ）の肝臓に過剰発現されたmiR-21の量を示すグラフである。Ａは、ＮＡＳＨ患者の肝臓、及び組織学的に正常な肝臓を有する個体の肝臓（コントロール）におけるU6 snRNAで基準化されたmiR-21の発現を示す。Ｂは、溶媒（ＰＢＳ）、アンタゴmirコントロール又はアンタゴmir-21でそれぞれ処理された、固形飼料が与えられた野生型（ＷＴ）マウス、及び高脂肪飼料が与えられたLdlr-/-マウスにおけるU6 snRNAで基準化されたmiR-21の発現を示す。*,p < 0.05 vs. PBSで処理されたLdlr-/-マウス; **, p < 0.01 vs. PBSで処理されたLdlr-/-マウス; #,p < 0.05 vs. アンタゴmirコントロールで処理されたLdlr-/-マウス; ##,p < 0.01 vs.アンタゴmirコントロールで処理されたLdlr-/-マウス; §§, p<0.01 vs.野生型マウス。データは、平均値（横線）及び四分位範囲（エラーバー）で示される。
【図２】アンタゴmir-21が肝臓の損傷及び炎症を抑制することを示す。Ａはアンタゴmir-21が血清ＡＳＴレベルを低減することを示し、Ｂはアンタゴmir-21が血清ＡＬＴレベルを低減することを示し、Ｃはアンタゴmir-21がＣＤ６８＋細胞の浸潤を低減することを示し、Ｄはアンタゴmir-21がＭＣＰ１肝臓タンパク質レベルを低減することを示し、Ｅはアンタゴmir-21がＴＮＦα肝臓タンパク質レベルを低減することを示す。*, p < 0.05 vs. PBSで処理されたLdlr-/-マウス; **, p < 0.01 vs. PBSで処理されたLdlr-/-マウス; #, p < 0.05 vs. アンタゴmirコントロールで処理されたLdlr-/-マウス; ##, p < 0.01 vs.アンタゴmirコントロールで処理されたLdlr-/-マウス。データは、平均値（横線）及び四分位範囲（エラーバー）で示される。サンプルはマウスの各群においてランダムに選択された。
【図３】アンタゴmir-21は肝臓の炎症を抑制することを示す。Ａはアンタゴmir-21が肝臓のＣＤ３＋浸潤の抑制を定量化したものを示し、ＢはＧａｐｄｈで基準化されたＭｃｐＩのｍＲＮＡ発現を示し、ＣはＧａｐｄｈで基準化されたＴｎｆαのｍＲＮＡ発現を示す。*, p < 0.05 vs. PBSで処理されたLdlr-/-マウス; **, p < 0.01 vs. PBSで処理されたLdlr-/-マウス; #, p < 0.05 vs. アンタゴmirコントロールで処理されたLdlr-/-マウス; ##, p < 0.01 vs.アンタゴmirコントロールで処理されたLdlr-/-マウス。データは、平均値（横線）及び四分位範囲（エラーバー）で示される。
【図４】アンタゴmir-21は肝臓の繊維化及び繊維形成性関連遺伝子の発現を抑制することを示す。Ａはアンタゴmir-21が肝臓のコラーゲン染色（Sirius Red）を低減することを示し（定量化）、Ｂはアンタゴmir-21が肝臓のＧａｐｄｈで基準化されたＴｇｆβのｍＲＮＡ発現を示し、Ｃはンタゴmir-21が肝臓のＧａｐｄｈで基準化されたコラーゲン-1α2のｍＲＮＡ発現を示す。*, p< 0.05 vs. PBSで処理されたLdlr-/-マウス; **, p < 0.01 vs. PBSで処理されたLdlr-/-マウス; #, p < 0.05 vs. アンタゴmirコントロールで処理されたLdlr-/-マウス; ##, p < 0.01 vs.アンタゴmirコントロールで処理されたLdlr-/-マウス。データは、平均値（横線）及び四分位範囲（エラーバー）で示される。サンプルはマウスの各群においてランダムに選択された。
【図５】アンタゴmir-21は肝臓脂質の蓄積を変更しない。Ａは全体重に対する肝臓重量の割合を示し、Ｂは肝臓のトリグリセリドレベルを示し、Ｃは総コレステロールレベルを示し、Ｄはヘマトキシリン及びエオシン染色による肝脂肪の定量を示す。脂肪滴を有する肝細胞の割合として定義された脂肪肝の量を以下のスケールでスコア化した。0 (<5%), 1 (5-33%), 2(34-66%) 及び3(>67%)。**, p < 0.01 vs. PBSで処理されたLdlr-/-マウス; ##, p < 0.01 vs.アンタゴmirコントロールで処理されたLdlr-/-マウス; §§, p<0.01 vs.アンタゴmir-21で処理されたLdlr-/-マウス。これらのパラメータのいずれにおいても３群全てのLdlr-/-マウスの間に差はなかった。データは、平均値（横線）及び四分位範囲（エラーバー）で示される。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
方法
患者
２０１２年の２月から６月の間に肝臓の摘出を受けた１０人の患者を含めた。５人はＳＡＦスコア{Bedossa, 2012 #76}を用いて定義されたＮＡＳＨを罹患し、５人は肝臓の組織学的試験において異常がない又は軽度の異常を有する。全ての患者にインフォームド・コンセントを与えた。全ての患者の特性は表１に示される。
【００６５】
動物
すべてのマウスをC57BL/6の種とした。８週齢のオスのLdl受容体欠損（Ldlr-/-）(Charles River, L’isled’Abresle, France)マウスに、１．２５％のコレステロール及び１５％のカカオバター(SafeDiets)を含む高脂肪飼料を１４週間与えた。１２週齢から１７週齢のときに、マウスに対しantagomir-21(配列 5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3’; 16 mg/kg（体重）, VBC Biotech, Vienna, Austria)、又はアンタゴmirコントロール（配列5’-AAGGCAAGCUGACCCUGAAGUU-3’; 16 mg/kg（体重）; VBC Biotech Vienna, Austria)、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を眼窩後の静脈に注射した。全てのマウス群を２２週齢で安楽死させた。全ての試験は、実験動物の使用に係る欧州共同体により定められたガイドライン(L358-86/609EEC)に従って行われ、フランスの農務省により承認された(agreement n° A75-15-32)。同週齢のC57BL/6野生型未処理マウスをコントロールとして用いた。
【００６６】
一昼夜の絶食期間後、屠殺の２日前に血液を眼窩静脈叢から回収し、血清を得るための処理をした（室温で１００００ｇ、１０分間の条件で一回遠心分離を行った。）。屠殺の日に、マウスを、２．５％イソフルオレン（isofluorane）を用いて鎮静させ、３．８％クエン酸ナトリウムでコーティングされた２５ゲージ×１’針で血液を下大静脈から回収した。血液を１５００×ｇで１５分間回転させ、乏血小板血漿を調製し、−８０℃で保存した。その後、マウスを人道的に安楽死させた。肝臓を分離し、液体窒素で急速凍結し、−８０℃で保存、又はホルマリン固定及びパラフィン包埋を行った。
【００６７】
ＲＮＡの単離及びマイクロＲＮＡの定量
総ＲＮＡを、製造者の説明書(Invitrogen, Paris, France)に従ってトリゾール試薬を用いて急速冷凍されたヒト又はマウスの肝臓サンプルから抽出した。MiR-21レベルを、製造者の説明書に従ってTaqman assay (Tm00397, Applied Biosystems)を用いて定量した。U6 snRNA (Tm 001973,Applied Biosystems)を内在性コントロールとして用いた。
【００６８】
インサイチュ（In situ）ハイブリダイゼーション
インサイチュハイブリダイゼーションは、先に開示された方法（Bonauer, 2009 #101）を適応した。簡単に言うと、厚さが３μｍのパラフィンに包埋された肝臓切片を４％パラホルムアルデヒドで１０分間の後固定を行い、その後１０分間のアセチル化を行った。ＰＢＳで洗浄した後、切片を、プロテインキナーゼＫ(Sigma-Aldrich)と３７℃で５分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、切片をハイブリダイゼーションバッファーと室温で５時間インキュベートした。MiRNAプローブ［miR-21、5’-3’-ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ラベル化ＬＮＡプローブ、２０ｎｍｏｌ／Ｌ；U6snRNA、3’-ＤＩＧラベル化ＬＮＡプローブ、１０ｎｍｏｌ／Ｌ、Exiqon］を１５０μＬの変性バッファーと混合し、その後、切片と５６℃で一晩中インキュベートした。その後、切片を、濃度を徐々に低減させたクエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）バッファー（Invitrogen）で洗浄し（それぞれ５６℃、５分間の洗浄であって、５×ＳＳＣバッファーを用いて１回、その後、１×ＳＳＣバッファーを用いて２回、その後０．２×ＳＳＣバッファーを用いて３回）、その後、ＰＢＳで洗浄した。ブロッキング液（Tris＋３％ウシ胎児血清＋０．１％Tween-20）中に１時間インキュベートした後、切片を、アルカリホスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗体(Roche; 1:2000)と共に４℃で一晩中インキュベートした。その後、切片をＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Promega）及びレバミゾール(0.2 mmol/L; Sigma-Aldrich)を含むＮＴＭＴバッファーと暗所において室温で４８時間インキュベートした。ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液を１２時間ごとに交換した。その後スライドを４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、Fluoprep (Biomerieux)を用いてマウントした。
【００６９】
代謝分析
血清アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）の活性、並びに空腹時血糖値、総コレステロール、ＨＤＬ及びトリグリセリドのレベルを、市販の酵素キットを用いてDxC800 analyzer(Beckman-Coulter, Villepinte, France)で測定した。
【００７０】
血圧の測定
動脈圧を、ＣＯＤＡ非観血式血圧測定器(Kent Scientific Corporation)を用いて覚醒マウスの尻尾において３０秒ごとに測定した（８回の測定の平均値）。
【００７１】
組織診断
パラフィン包埋肝臓切片（３μｍ厚）を、ヘマトキシリン‐エオシン(HE; ヘマトキシリン, RAL diagnostics;及びエオシン, RAL diagnostics)、ピクロシリウス（シリウスレッド, RALdiagnostics;ピクリン酸, VWR Prolabo)、ウサギ抗ＣＤ３抗体(DAKO, #A0452)、並びにモノクローナルラット抗マウスＣＤ６８抗体(AbDSerotec)を用いて染色した。脂肪肝を、大サイズ又は中間サイズの脂肪滴を含む肝臓細胞の割合として定義した。脂肪肝を、臨床データ及び研究室データを知らない一人の熟練の病理医によって、ヘマトキシリン‐エオシン染色切片に基づいてスコア化した。以下のスケールを用いた：0 (<5%), 1 (5-33%), 2 (34-66%) 及び 3(>67%)。シリウスレッド陽性領域を、血管又は嚢がない少なくとも１０の領域で測定し（倍率×２００）、ImageJソフトウェアを用いて定量化した。免疫細胞（ＣＤ３＋又はＣＤ６８＋）を、１５以上の顕微鏡視野においてカウントし（原寸、×２００）、陽性領域の割合として記録した。
【００７２】
凍結肝臓切片（４μｍ）を、脂肪肝の確認のために中性脂肪マーカーのオイルレッドＯ(Sigma-Aldrich)で染色した。
【００７３】
リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応
ｃＤＮＡ合成をQuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen)を用いて行った。ポリメラーゼ連鎖反応を、Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)を用いてABI StepOne Plusで行った。マウスＧａｐｄｈをサンプル増幅の基準化のために用いた。相対的遺伝子発現の測定のために2 Ct 計算を用いた。
【００７４】
肝臓脂質の分析
５０ｍｇの凍結肝臓組織を１ｍＬのアセトン中で超音波処理することにより均質化した。４℃で一晩中インキュベートした後、サンプルを４０００ｇで１０分間の遠心分離にかけた。その後、上清において、トリグリセリド（Diasys, Holzheim, Germany）及び総コレステロール(Biomerieux,Craponne, France)含量を、製造者の説明書に従って酵素キットを用いて測定した。トリグリセリド及び総コレステロールの含量を、Dc Protein Assay (BioRad, Marnes la Coquette, France)により測定されたタンパク質含量で基準化した。
【００７５】
肝臓のサイトカイン及びケモカインタンパク質のレベル
サイトカインを、総肝臓タンパク質抽出物において定量化した。そのために、凍結肝臓組織サンプルを、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤のカクテル（Roche）を含むＴＮＥバッファー(1% ノニデットP40, 10 mmol/L Tris-HCl [pH 7.5], 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L エチレンジアミン四酢酸)中で均質化した。その懸濁液を、４℃、２００００ｇで２０分間、遠心分離した。その後、上清を使用前に−８０℃で保存した。肝臓抽出物中の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α及び単球走化性タンパク質‐１（ＭＣＰ−１）のレベルを、cytometric bead array (Mouse Flowcytomix, eBiosciences)を用いて測定した。サイトカインレベルをDc Protein Assay (BioRad, Marnes la Coquette, France)により測定されたタンパク質含量で基準化した。
【００７６】
ＰＰＡＲ発現の分析
肝臓タンパク質を、ＲＩＰＡバッファー(50 mmol/L Tris-HCl [pH 7.4], 1 mmol/L EDTA, 150 mmol/L NaCl, 20mmol/L グリセロリン酸, 0.1% SDS, 0.1% デオキシコール酸, 1% Triton, コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテルタブレット[Roche])で調製した。メンブレンを抗ＰＰＡＲα（Abcam）と共にインキュベートした。二次抗体（Amersham）とのインキュベートの後、免疫検出を増強された化学発光キット（ECLPlus, Amersham）を用いて行い、バンドを、Las1000 imaging system及びImage Gauge software (Fuji)を用いて検出した。最初の免疫検出の後、全てのメンブレンにおいて抗体を取り除き、抗ＧＡＰＤＨ抗体（Millipore）を用いて再プローブ化した。
【００７７】
統計
量的変数を中央値として表した（四分位範囲）。独立した量的変数の群間の比較を、Mann-Whitneyテストを用いて行った。全てのテストを、両側性で、０．０５の有意水準で行った。データ分析をSPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL)を用いて行った。
【００７８】
結果
miR-21の発現は、ＮＡＳＨ患者及び高脂肪飼料が与えられたLdlr-/-マウスにおける、胆嚢、及び肝臓の炎症性細胞において増大される。
【００７９】
本発明者らは、まず、ＮＡＳＨ患者の肝臓におけるmiR-21発現をリアルタイムＰＣＲにより測定し、肝臓の組織診断において異常がない又は軽度であるコントロールと比較した。図１Ａに示すように、miR-21はＮＡＳＨ患者の肝臓において過剰発現された。我々は、高脂肪飼料が与えられたLdlr-/-マウスにおけるmiR-21発現を評価した。miR-21がそれらのマウスの肝臓においてアップレギュレートされていることから、このＮＡＳＨのマウスモデルはヒトにおいての特徴を再現した（図１Ｂ）。インサイチュハイブリダイゼーションを用いて、我々は、miR-21が主にＮＡＳＨ患者及び高脂肪飼料が与えられたLdlr-/-マウスの胆嚢、及び肝臓における炎症性細胞で発現したことを観察した（図示せず）。リアルタイムＰＣＲの結果によると、miR-21の染色の度合及び強度は、コントロールよりもＮＡＳＨ患者及び高脂肪飼料が与えられたLdlr-/-マウスの方が高かった。これらのコントロールにおいて、miR-21染色は、胆嚢細胞に限定され、薄かった。
【００８０】
ＮＡＳＨにおけるmiR-21の潜在的役割を決定するために、本発明者らはアンタゴmirストラテジーを用いた。図１Ｂに示すように、アンタゴmir-21は、高脂肪飼料が与えられたLdlr-/-マウスにおける肝臓のmiR-21発現を強く抑制した。表２に示すように、アンタゴmir-21は、空腹時血糖、総コレステロール、ＨＤＬ及びトリグリセリドのレベルに影響しなかった。アンタゴmir-21は、動脈圧にも影響しなかった。これらの結果は、ＮＡＳＨにおけるmiR-21の役割を調べるための有効なストラテジーとして、高脂肪飼料が与えられたLdlr-/-マウスにおけるアンタゴmir-21の使用を確立する。
【００８１】
アンタゴmir-21は肝臓損傷及び肝臓炎症を抑制する。
【００８２】
miR-21がＮＡＳＨにおける肝臓細胞の損傷及び炎症に寄与するか否か決定するために、本発明者らは、血清のアミノ基転移酵素レベルを測定し、炎症細胞マーカーＣＤ６８（活性型クッパー細胞）及びＣＤ３（Ｔ細胞）のために肝臓切片を染色し、また、肝臓ＭＣＰ１及びＴＮＦαのｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルを分析した（図２及び図３）。ＮＡＳＨのこのマウスモデルで期待されるように、血清のＡＳＴ及びＡＬＴレベル、肝臓のＣＤ６８及びＣＤ３染色、並びに肝臓のＭＣＰ１及びＴＮＦα発現は、固形飼料が与えられた野生型マウスよりも高脂肪飼料が与えられたLdlr-/-マウスの方が高かった。
【００８３】
アンタゴmir-21は、血清ＡＳＴ及びＡＬＴレベルの両方が低減したことから、肝臓細胞損傷を抑制した（図２Ａ及びＢ）。ＣＤ６８陽性切片のスコア化は、アンタゴmir-21で処理された高脂肪飼料が与えられたLdlr-/-マウスにおける泡沫状クッパー細胞のサイズの低減により行った（図２Ｃ及びＤ）。図３Ａ及びＢに示すように、アンタゴmir-21は、浸潤Ｔ細胞の数を低減した。さらに、アンタゴmir-21処理の結果、肝臓の炎症が抑制されることを確認するために、遺伝子及びタンパク質の両方の発現分析は、アンタゴmir-21で処理された高脂肪飼料が与えられたLdlr-/-マウスの肝臓における炎症性マーカーＭＣＰ１及びＴＮＦαが、コントロールマウス（ＰＢＳ又はアンタゴmirコントロールで処理された高脂肪飼料が与えられたLdlr-/-マウス）と比較して顕著に低減したことを示した（図２Ｄ及びＥ、並びに図３Ｂ及びＣ）。
【００８４】
アンタゴmir-21は、肝臓の繊維化を抑制する。
【００８５】
肝臓の繊維化は、ＮＡＳＨの進行した症状の一つとして認められる。シリウスレッドによるコラーゲン染色によって証明されるように、高脂肪飼料を与えた１４週後に、Ldlr-/-マウスは、固形飼料が与えられた野生型マウスよりも肝臓の繊維化が多く認められた（図４Ａ）。アンタゴmir-21ストラテジーは肝臓の繊維化を強く抑制した（図４Ａ）。肝臓における２つの周知の繊維形成関連遺伝子であるTgfβ及びcollagen-1α2の遺伝子発現は、シリウスレッド染色の所見を確認した（図４Ｂ及びＣ）。
【００８６】
アンタゴmir-21は、肝臓の脂肪蓄積を変更しない。
【００８７】
全体重に対する肝臓の重さの比率、肝臓のトリグリセリド及び総コレステロールのレベル、並びにヘマトキシリン及びエオシン染色によって証明されたように（図５）、高脂肪飼料を与えた１４週後に、Ldlr-/-マウスは、固形飼料が与えられた野生型マウスと比較して、明らかに脂肪肝が増大した。図５に示すように、全てのこれらの技術は、アンタゴmir-21が肝臓脂肪レベルを変更しないことを示した。
【００８８】
結論
上記結果は、miR-21がＮＡＳＨにおいて重要な役割を果たし、miR-21の阻害がＮＡＳＨの治療のために適する方法であることをインビボで証明する。
【００８９】
【表１】
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【００９０】
データは、中央値（四分位数範囲）又は頻度（％）である。脂肪肝のスコアは、泡状の小滴ではなく、大きい又は中間サイズの脂肪滴の量を評価し、０〜３でスコア化した：Ｓ０：＜５％；Ｓ１：５〜３３％；Ｓ２：３４〜６６％；Ｓ３：＞６７％。バルーニングは、０〜２でスコア化した：０，立方体状でピンク色の好酸性細胞質を有する通常の肝細胞；１，丸みを帯びた形状で大抵は網状の蒼白細胞質を有する肝細胞の群が存在する；２，正常細胞の少なくとも２倍に拡大した細胞を有するグレード１と同様の群が存在する{Bedossa, 2012 #45}。小葉の炎症は、小葉に２以上の炎症細胞の集まりとして定義した。それらの集まりは、２０×の倍率でカウントした：０，なし；１，２０倍の視野で２以下の炎症細胞の集まり；２，２０倍の視野で２よりも多いの炎症細胞の集まり。繊維化のステージは、以下のようにＮＡＳＨ−ＣＲＮに記載されたスコアを用いて評価した：ステージ０（Ｆ０），なし；ステージ１（Ｆ１），類洞周囲（perisinusoidal）Zone3又は門脈の繊維化がある；ステージ２（Ｆ２），ブリッジングがなく類洞周囲及び門脈周囲の繊維化がある；ステージ３（Ｆ３），ブリッジング繊維化がある；ステージ４（Ｆ４），硬変がある{Kleiner, 2005 #44}。略記：ＮＡＳＨ，非アルコール性脂肪性肝炎。
【００９１】
【表２】
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【００９２】
データは中間値（四分位数範囲）である。固形飼料が与えられた野生型マウスでは、ＰＢＳ、アンタゴmirコントロール又はアンタゴmir-21で処置されたLdlr-/-マウスよりも、顕著な低下した血清トリグリセリド、総及びＨＤＬコレステロールを示した（各比較においてp<0.001）。それらのパラメータのいずれにおいても、アンタゴmirコントロールで処置されたLdlr-/-マウスとアンタゴmir-21で処置されたLdlr-/-マウスにおいて、また、アンタゴmirコントロールで処置されたLdlr-/-マウスとＰＢＳで処置されたLdlr-/-マウスとにおいて顕著な差異はなかった。アンタゴmir-21は、ＰＢＳと比較して血清総コレステロールを低減した（p=0.003）が、他の変化はなかった。略記：ＮＡ，入手不可能；ＷＴ，野生型。
【００９３】
参考文献
本願の全体を通じて、種々の参考文献は、本発明に関する最先端の技術を記載している。それらの参考文献の開示は、本開示中に参照として組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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