(57)【要約】血液または血漿を採取し、安定化するための、抗凝血剤、抗血小板剤、および可溶化剤を含有し、場合に応じて、少なくとも１種の他の血液安定剤を含んでもよい器具を開示する。臨床医学におけるこの器具の作製方法および使用方法も提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液または血漿を採取し、安定化するための器具であって、
第１の末端および第２の末端と、全血または血漿を受け入れるための貯液部分を画定する少なくとも１枚の内壁とを備え、
抗凝血剤と、プロスタグランジン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、またはこれらの２種以上の組合せを含む抗血小板剤と、可溶化剤とを含み、
前記抗凝血剤および前記抗血小板剤は、血液または血漿を安定化する量でそれぞれ存在することを特徴とする器具。
【請求項２】
前記抗凝血剤は、ＥＤＴＡまたはその塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、ヘパリン；クエン酸塩、テオフィリン、アデノシン、およびジピリダモールの組合せ（ＣＴＡＤ）；ポリアネトールスルホン酸ナトリウム、クエン酸デキストロース、ならびにこれらの２種以上の組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項３】
前記抗凝血剤は、器具に採取された血液または血漿の体積を基準として、約１ｍＭから約２００ｍＭの濃度で存在することを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項４】
前記抗血小板剤は、プロスタグランジンであることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項５】
前記プロスタグランジンは、プロスタグランジンＥ１、プロスタグランジンＥ２、またはこれらの組合せを含むことを特徴とする請求項４に記載の器具。
【請求項６】
前記プロスタサイクリンが、カルバプロスタサイクリン、ベラプロスト、イロプロスト、５，６−ジヒドロプロスタサイクリン、シプロステン、リマプロスト、１３，１４−デヒドロ−１５−シクロヘキシルカルバプロスタサイクリン、タプロステン、またはこれらの２種以上の組合せを含むことを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項７】
前記抗血小板剤は、イロプロストを含むことを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項８】
前記抗血小板剤は、器具に採取された血液または血漿の体積を基準として、約１×１０−１０から約１×１０−１Ｍの濃度で存在することを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項９】
前記抗血小板剤は、器具に採取された血液または血漿の体積を基準として、約１×１０−７から約１×１０−５Ｍの濃度で存在することを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１０】
前記ホスホジエステラーゼ阻害剤は、ＭＥＰ−１、ミルリノン、シロスタミン、ジピリダモール、ザプリナスト、およびＩＢＭＸ、ならびにこれらの２種以上の組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１１】
前記シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、非ステロイド性抗炎症剤であることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１２】
前記非ステロイド性抗炎症剤は、アスピリン、インドメタシン、イブプロフェン、ナプロキセン、メロキシカム、ジクロフェナク、ピロキシカム、テノキシカム、テニダップ、およびこれらの２種以上の組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の器具。
【請求項１３】
前記可溶化剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）、ＰＥＧ脂質、アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、およびシクロデキストリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１４】
前記可溶化剤は、シクロデキストリンであることを特徴とする請求項１３に記載の器具。
【請求項１５】
前記シクロデキストリンは、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンであることを特徴とする請求項１４に記載の器具。
【請求項１６】
前記抗凝血剤、前記抗血小板剤、および前記可溶化剤は、前記器具の貯液部に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１７】
前記抗凝血剤は、前記器具の内壁の少なくとも一部分に接して配置されていることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１８】
前記抗凝血剤、前記抗血小板剤、および前記可溶化剤は、噴霧適用によって、または粉末、結晶、凍結乾燥、もしくは液体の形態で器具に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１９】
プロテアーゼ阻害剤、または１種もしくは複数のプロテアーゼ阻害剤の混合物をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項２０】
前記内壁は、プラスチックまたはガラスを含むことを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項２１】
隔離要素をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項２２】
前記隔離要素が、チキソトロープゲル組成物を含むことを特徴とする請求項２１に記載の器具。
【請求項２３】
前記隔離要素が、機械的隔離要素を含むことを特徴とする請求項２１に記載の器具。
【請求項２４】
採取された血液またはその血小板含有部分をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項２５】
少なくとも部分的に真空排気されていることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項２６】
滅菌されていることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項２７】
管であることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項２８】
毛細採取管であることを特徴とする請求項２７に記載の器具。
【請求項２９】
前記抗凝血剤は、ＥＤＴＡ二カリウム塩であり、前記抗血小板剤は、イロプロストであり、前記可溶化剤は、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンであることを特徴とする請求項２７に記載の器具。
【請求項３０】
プロテアーゼ阻害剤をさらに含むことを特徴とする請求項２９に記載の器具。
【請求項３１】
前記プロテアーゼ阻害剤が、セリンプロテアーゼ阻害剤と、異なる部類のプロテアーゼの阻害剤とを含むことを特徴とする請求項３０に記載の器具。
【請求項３２】
エステラーゼ阻害剤をさらに含むことを特徴とする請求項１または３０に記載の器具。
【請求項３３】
２種以上のプロテアーゼ阻害剤のカクテルをさらに含み、前記カクテルが、ａ）セリンプロテアーゼの阻害剤とエキソペプチダーゼの阻害剤、ｂ）セリンプロテアーゼの阻害剤とシステインプロテアーゼの阻害剤、ｃ）セリンプロテアーゼの阻害剤とジペプチジルペプチダーゼの阻害剤、ｄ）セリンプロテアーゼの阻害剤とエキソペプチダーゼの阻害剤とジペプチジルペプチダーゼの阻害剤とシステインペプチダーゼの阻害剤、およびｅ）セリンプロテアーゼの阻害剤とエキソペプチダーゼの阻害剤とジペプチジルペプチダーゼの阻害剤からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項３１に記載の器具。
【請求項３４】
貯蔵の間、血液または血漿を安定化する方法であって、第１の末端および第２の末端と、全血または血漿を受け入れるための貯液部分を画定する少なくとも１枚の内壁とを備え、抗凝血剤と、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、またはこれらの２種以上の組合せを含む抗血小板剤と、可溶化剤とを含み、前記抗凝血剤および前記抗血小板剤は、血液または血漿を安定化する量でそれぞれ存在する器具に、全血または血漿を採取するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
前記血液または血漿は、直接器具に採取されることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
血液または血漿のパラメータを測定する方法であって、ａ）第１の末端および第２の末端と、全血または血漿を受け入れるための貯液部分を画定する少なくとも１枚の内壁とを備え、抗凝血剤と、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、またはこれらの２種以上の組合せを含む抗血小板剤と、可溶化剤とを含み、前記抗凝血剤および前記抗血小板剤は、血液または血漿を安定化する量でそれぞれ存在する器具に、全血または血漿を採取するステップと、ｂ）採取に引き続いて、所定の時間に血液パラメータを測定し、測定された血液パラメータを、対照と相互に関連付けるステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
前記血液パラメータは、血球数であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記血液パラメータは、疾患または病状のバイオマーカーの存在または量であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年２月２日出願の米国仮特許出願第６１／５９４，１５２号の出願日の権益を主張するものであり、この開示を参照により本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は、カルシウムおよび他のいくつかの金属イオンをキレート化する、孤立対電子を有する４つのカルボン酸基および２つのアミン基を含んだ多プロトン酸（ｐｏｌｙｐｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄ）である。ＥＤＴＡは、細胞を保存でき、したがって全血球計算（ＣＢＣ）や末梢血塗抹などの臨床血液学的検査の精度を確保できることに基づいて、採血および臨床血液検査の分野で最適な抗凝血剤として久しく推奨されてきた。凝血カスケードの広範な酵素反応にはカルシウムが必要である。採取された血液からのカルシウムの除去は、後続の血液学的検査の妨げとなる、採取器具において血液を貯蔵する間の血液凝固を防ぐ目的で必須である。
【０００３】
臨床検査の量および複雑さが著しく増したために、血漿プロテオミクス研究、たとえば、サイトカイン、タンパク質およびペプチド、他の心臓病マーカーの測定におけるその使用の分野における様々な革新的検査を含めて、この抗凝血剤の潜在的な適用範囲は拡大している。ＥＤＴＡのキレート化作用は、多くのプロテアーゼが金属を必要とするために、この点で有利である。結果として、ＥＤＴＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで酵素による高度の分解を受けやすい分子の採取および貯蔵に最適な抗凝血剤である。一部の分子は、ＥＤＴＡのみでは効率的に安定化することができず、したがって、プロテアーゼ阻害剤などの他の抗タンパク質分解物質を加えることが必要となる。たとえば、特許文献１（米国特許第７，３０９，４６８号明細書）を参照されたい。
【０００４】
しかし、ＥＤＴＡの使用には、この抗凝血剤によって引き起こされる場合のある血液細胞の変化が大きな妨げとなる可能性もある。たとえば、血小板がＥＤＴＡに曝されると、形状変化および凝集物の形成を含めて、その形態の破壊を招き、ＥＤＴＡが、全血液像の一部としての血小板活性化の測定、および血小板の機能検定に不向きになりかねない。追加の問題は、ＥＤＴＡによって凝血が阻止された検体における、血小板が凝集する、または白血球に付着するために少ない血小板数を通常、特徴とする、偽性血小板減少症の発現の潜在的可能性である。偽性血小板減少症により、血小板減少性障害が潜む患者において血小板数を正確に判定することが複雑になりかねない。
【０００５】
より一般には、採血サンプルにおける血小板凝集は、自動化された血液計器において不正確な結果をもたらす場合がある。ＥＤＴＡのみを含有する管に採取された臨床血液検体の１０パーセント（１０％）もが、ある程度の凝集を伴う（非特許文献１；Ｓａｖａｇｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．８１：３１７〜３２２（１９８４））。最新の血液分析装置は、操作員に凝集したサンプルを警告するようにプログラミングされてはいるものの、そうしたアルゴリズムは、必ずしも完璧に機能するとは限らない。その場合、凝集塊の有無について、血液塗抹標本を顕微鏡で精査する。しかし、ＥＤＴＡ血が試験管中で静置されると、採取後早くも１時間で、細胞形態の変化が起こり始め、これにより解釈は難しくなる（非特許文献２；Ｎａｒａｓｉｍｈａ  Ａら、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓ．２４：４３〜８（２００８））。
【０００６】
さらに、ＥＤＴＡは、血小板を活性化させ、これがその抗凝血剤特性を損なう。血小板活性化は、細胞内カルシウムの動員、α顆粒膜タンパク質であるＰ−セクレチンの表面発現、およびα顆粒の内容物の選択的放出を特徴とするが、これらの多くは、創傷修復、凝血、および炎症に関与する。結果として、ある特定のサイトカイン、ケモカイン、および成長因子のレベルが増幅されるため、これらは、体循環に存在する実際の量をもはや反映しない場合もある。この結果は、プロテオーム解析において、分子生物学、ウイルス学および感染性疾患の分野の試験において、ならびに血液バンキングや細胞療法などの、サンプル安定性の確保が求められる用途においてＥＤＴＡを使用することに難題となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７，３０９，４６８号明細書
【特許文献２】米国特許第７，５８２，０４９号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５１６，９５３号明細書
【特許文献４】米国特許第６，４０６，６７１号明細書
【特許文献５】米国特許第６，４０９，５２８号明細書
【特許文献６】米国特許第６，４９７，３２５号明細書
【特許文献７】米国特許第５，０５３，１３４号明細書
【特許文献８】米国特許第５，０９６，６６９号明細書
【特許文献９】米国特許第５，１１２，４５５号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，８２１，３９９号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，６２８，９６１号明細書
【特許文献１２】米国特許第７，４１９，８２１号明細書
【特許文献１３】米国特許第６，７５０，０５３号明細書
【特許文献１４】米国特許Ｄ３３７，１６４
【特許文献１５】米国特許第４，８１６，４５６号明細書
【特許文献１６】米国特許第４，７５４，０５０号明細書
【特許文献１７】米国特許第２，６０７，７７３号明細書
【特許文献１８】米国特許第４，８３３，１３８号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓａｖａｇｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．８１：３１７〜３２２（１９８４）
【非特許文献２】Ｎａｒａｓｉｍｈａ  Ａら、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓ．２４：４３〜８（２００８）
【非特許文献３】Ｌｏｆｔｓｓｏｎ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９３（５）：１０９１〜１０９９（２００４）
【非特許文献４】Ｌｏｆｔｓｓｏｎら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．２：３３５〜５１（２００５）
【非特許文献５】Ｊａｎｓｏｏｋら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９９（２）：７１９〜２９（２０１０）
【非特許文献６】Ｍｅｎｔｌｅｉｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４、８２９（１９９３）
【非特許文献７】Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅ、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｒｅｌａｘａｎｔ  ｓｕｃｃｉｎｙｌｃｈｏｌｉｎｅ」、出典：Ｋａｌｏｗ（編）Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ、１５〜５０頁
【非特許文献８】Ｇｅｍｍａら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９（１１）：３４２１〜２５（２００６）
【非特許文献９】Ｃａｍｐｓら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７：４０９〜１７（２０００）
【非特許文献１０】Ｂｅｎｃｈａｒｉｔら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０：３４１〜９（２００３）
【非特許文献１１】Ｃａｍｐｉａｎｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４８：１９１９〜２９（２００５）
【非特許文献１２】Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：３６３〜７３（２００３）
【非特許文献１３】Ｓａｖｉｎｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１１：１７７９〜８２（２００１）
【非特許文献１４】Ｐｉａｚｚｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：２２７９〜８２（２００３）
【非特許文献１５】Ｈｙａｔｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５０：５７２７〜３４（２００７）
【非特許文献１６】Ｍｅｙｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  １１９：１０６４〜７４（２０１２）
【非特許文献１７】Ｓｅｍｐｌｅら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：２６４〜７４（２０１１）
【非特許文献１８】Ｄａｎｅｓｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：２０１１〜５（２００４）
【非特許文献１９】Ａｒｎｏｃｚｋｙ、Ａｍ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．３９：ＮＰ８〜９（２０１１）
【非特許文献２０】Ａｈｎａｄｉら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９０：９４０〜８（２００３）
【非特許文献２１】Ｙｕａｎａら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１０５：３９６〜４０８（２０１１）
【非特許文献２２】Ｇａｒｃｉａら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．４：１５１６〜１５２１（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そのため、当分野では、ＥＤＴＡなどの抗凝血剤が、血小板活性化を引き起こさずに、凝血の防止において機能するのを可能にする血液および血漿採取器具が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様は、血液または血漿を採取し、安定化するための器具であって、第１の末端および第２の末端と、全血または血漿を受け入れるための貯液部分を画定する少なくとも１枚の内壁とを備え、抗凝血剤と、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、またはこれらの２種以上の組合せを含む抗血小板剤と、可溶化剤とを含み、前記抗凝血剤および前記抗血小板剤は、血液または血漿を安定化する量でそれぞれ存在する器具を対象とする。一部の実施形態では、たとえば、採取された血液または血漿を、（疾患状態と相互に関連付けられる）バイオマーカーの存在または量について引き続き分析するとき、器具は、好ましくはその貯液部に、プロテアーゼ阻害剤の少なくとも１種、好ましくはカクテル、および／または少なくとも１種のエステラーゼ阻害剤も含有する。
【００１１】
本発明の別の態様は、貯蔵の間、血液または血漿を安定化する方法であって、第１の末端および第２の末端と、全血または血漿を受け入れるための貯液部分を画定する少なくとも１枚の内壁とを備え、抗凝血剤と、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、またはこれらの２種以上の組合せを含む抗血小板剤と、可溶化剤とを含み、前記抗凝血剤および前記抗血小板剤は、血液または血漿を安定化する量でそれぞれ存在する器具に、全血または血漿を採取するステップを含む方法を対象とする。
【００１２】
本発明の別の態様は、血液または血漿のパラメータを測定する方法であって、ａ）第１の末端および第２の末端と、全血または血漿を受け入れるための貯液部分を画定する少なくとも１枚の内壁とを備え、抗凝血剤と、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、またはこれらの２種以上の組合せを含む抗血小板剤と、可溶化剤とを含み、前記抗凝血剤および前記抗血小板剤は、血液または血漿を安定化する量でそれぞれ存在する器具に、全血または血漿を採取するステップと、ｂ）採取に引き続いて、予め決められた時間に血液パラメータを測定し、測定された血液パラメータを対照と比較するステップとを含む方法を対象とする。
【００１３】
一部の実施形態では、器具は、隔離材も収容する。一部の実施形態では、器具は、プロテアーゼ阻害剤、エステラーゼ阻害剤、または両方を含むものでよい、（たとえば、貯液部に配置されたおよび／もしくは内壁上に配置された、または両方の）追加の血液安定剤も収容する。他の一部の実施形態では、追加の安定剤は、複数またはカクテルのプロテアーゼ阻害剤（たとえば、セリンプロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、エキソペプチダーゼ阻害剤、およびジペプチジルペプチダーゼ阻害剤、ならびにこれらの２種以上の組合せ）を、エステラーゼ阻害剤と共に、またはエステラーゼ阻害剤なしで含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の採血器具の透視図である。
【図２Ａ】ＥＤＴＡが、血小板α顆粒の放出を誘発するが、密顆粒／リソソーム放出は誘発しないことを示す（ＣＤ６２Ｐ発現％をＣＤ６３発現％と比較する）棒グラフである。
【図２Ｂ】ＣＤ６２Ｐ＋血小板の百分率平均値（棒グラフ±ＳＤ）（に加えて蛍光強度中央値（ＭＦＩ）に関して、イロプロストが、ＥＤＴＡを媒介とする脱顆粒を阻害すること、およびイロプロストの広範な濃度範囲にわたって阻害が生じることを示す棒グラフである。
【図３Ａ】α顆粒（３Ａ）について、イロプロストが、ＥＤＴＡにおける作動薬誘発血小板脱顆粒を阻害することを示す棒グラフである。各条件についてのＣＤ６２Ｐ＋事象の百分率を３対象の平均±ＳＤとして示す。
【図３Ｂ】密顆粒／リソソーム放出（３Ｂ）について、イロプロストが、ＥＤＴＡにおける作動薬誘発血小板脱顆粒を阻害することを示す棒グラフである。各条件についてのＣＤ６３＋事象の百分率を３対象の平均±ＳＤとして示す。
【図４Ａ−１】ＣＤ６２Ｐ発現プロフィールをＥＤＴＡのみと比較した例（１対象）に関して、イロプロストが、ＥＤＴＡを媒介とする血小板脱顆粒を２４時間のサンプル休止の最後まで阻害する能力を実証するヒストグラムである。
【図４Ａ−２】ＣＤ６２Ｐ発現プロフィールをＥＤＴＡのみと比較した例（１対象）に関して、イロプロストが、ＥＤＴＡを媒介とする血小板脱顆粒を２４時間のサンプル休止の最後まで阻害する能力を実証するヒストグラムである。
【図４Ｂ】中央のパネルにおいて、１０対象の平均±ＳＤとして示す、ＥＤＴＡ、およびイロプロストを加えたＥＤＴＡについての各時点でのＣＤ６２Ｐ＋事象の百分率を表す棒グラフである。
【図５】ＥＤＴＡにおける白血球−血小板凝集塊のレベルの増大が、イロプロストによって抑制された（ｎ＝６）ことを示す棒グラフである。
【図６】ＥＤＴＡとイロプロストの組合せによって、血小板体積平均値（ＭＰＶ）がＥＤＴＡのみと比べて減少することを実証するＣＢＣ分析のグラフである。
【図７Ａ】ＰＤＧＦａ／ａのレベルが、イロプロスト存在下で、ＥＤＴＡのみと比べて低下したことによって実証される、ＥＤＴＡを媒介とするバイオマーカー（成長因子、サイトカイン、およびケモカイン）の自発的放出の阻害を示すドットプロットグラフである。
【図７Ｂ】ＴＧＦβ１のレベルが、イロプロスト存在下で、ＥＤＴＡのみと比べて低下したことによって実証される、ＥＤＴＡを媒介とするバイオマーカー（成長因子、サイトカイン、およびケモカイン）の自発的放出の阻害を示すドットプロットグラフである。
【図７Ｃ】ＶＥＧＦのレベルが、イロプロスト存在下で、ＥＤＴＡのみと比べて低下したことによって実証される、ＥＤＴＡを媒介とするバイオマーカー（成長因子、サイトカイン、およびケモカイン）の自発的放出の阻害を示すドットプロットグラフである。
【図７Ｄ】ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）のレベルが、イロプロスト存在下で、ＥＤＴＡのみと比べて低下したことによって実証される、ＥＤＴＡを媒介とするバイオマーカー（成長因子、サイトカイン、およびケモカイン）の自発的放出の阻害を示すドットプロットグラフである。
【図７Ｅ】ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）のレベルが、イロプロスト存在下で、ＥＤＴＡのみと比べて低下したことによって実証される、ＥＤＴＡを媒介とするバイオマーカー（成長因子、サイトカイン、およびケモカイン）の自発的放出の阻害を示すドットプロットグラフである。
【図８Ａ】２４時間以内にＥＤＴＡ血漿中の血小板由来マーカー（ＣＤ６２Ｐ）を測定するとき、イロプロストによって、全対象間でバックグラウンドレベル変動性が低減し、一貫性が改善されることを実証するグラフである。
【図８Ｂ】２４時間以内にＥＤＴＡ血漿中の血小板由来マーカー（ＴＧＦβ１）を測定するとき、イロプロストによって、全対象間でバックグラウンドレベル変動性が低減し、一貫性が改善されることを実証するグラフである。
【図８Ｃ】２４時間以内にＥＤＴＡ血漿中の血小板由来マーカー（ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５））を測定するとき、イロプロストによって、全対象間でバックグラウンドレベル変動性が低減し、一貫性が改善されることを実証するグラフである。
【図８Ｄ】２４時間以内にＥＤＴＡ血漿中の血小板由来マーカー（ＰＤＧＦａ／ａ）を測定するとき、イロプロストによって、全対象間でバックグラウンドレベル変動性が低減し、一貫性が改善されることを実証するグラフである。
【図８Ｅ】２４時間以内にＥＤＴＡ血漿中の血小板由来マーカー（ＶＥＧＦ）を測定するとき、イロプロストによって、全対象間でバックグラウンドレベル変動性が低減し、一貫性が改善されることを実証するグラフである。
【図９Ａ】ＣＤ６２Ｐと選択因子（ＰＤＧＦａ／ａ（Ａ）およびＴＧＦβ１（Ｃ））の表面発現の強い相関によって示されるとおり、ＣＤ６２Ｐが、血小板由来バイオマーカー測定の代用となる良好なマーカーであることを示すグラフである。ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）（Ｂ）およびＶＥＧＦ（Ｄ）については、弱い相関しか確認されず、ＩＬ−８（Ｅ）については相関が確認されなかった。
【図９Ｂ】ＣＤ６２Ｐと選択因子（ＰＤＧＦａ／ａ（Ａ）およびＴＧＦβ１（Ｃ））の表面発現の強い相関によって示されるとおり、ＣＤ６２Ｐが、血小板由来バイオマーカー測定の代用となる良好なマーカーであることを示すグラフである。ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）（Ｂ）およびＶＥＧＦ（Ｄ）については、弱い相関しか確認されず、ＩＬ−８（Ｅ）については相関が確認されなかった。
【図９Ｃ】ＣＤ６２Ｐと選択因子（ＰＤＧＦａ／ａ（Ａ）およびＴＧＦβ１（Ｃ））の表面発現の強い相関によって示されるとおり、ＣＤ６２Ｐが、血小板由来バイオマーカー測定の代用となる良好なマーカーであることを示すグラフである。ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）（Ｂ）およびＶＥＧＦ（Ｄ）については、弱い相関しか確認されず、ＩＬ−８（Ｅ）については相関が確認されなかった。
【図９Ｄ】ＣＤ６２Ｐと選択因子（ＰＤＧＦａ／ａ（Ａ）およびＴＧＦβ１（Ｃ））の表面発現の強い相関によって示されるとおり、ＣＤ６２Ｐが、血小板由来バイオマーカー測定の代用となる良好なマーカーであることを示すグラフである。ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）（Ｂ）およびＶＥＧＦ（Ｄ）については、弱い相関しか確認されず、ＩＬ−８（Ｅ）については相関が確認されなかった。
【図９Ｅ】ＣＤ６２Ｐと選択因子（ＰＤＧＦａ／ａ（Ａ）およびＴＧＦβ１（Ｃ））の表面発現の強い相関によって示されるとおり、ＣＤ６２Ｐが、血小板由来バイオマーカー測定の代用となる良好なマーカーであることを示すグラフである。ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）（Ｂ）およびＶＥＧＦ（Ｄ）については、弱い相関しか確認されず、ＩＬ−８（Ｅ）については相関が確認されなかった。
【図１０】ＣＤ６２Ｐの発現が、イロプロストの存在下と非存在下の両方において、ＥＤＴＡとプロテアーゼ阻害剤カクテルを加えたＥＤＴＡとで類似していることを示す棒グラフであり、ＥＴＤＡ／プロテアーゼ阻害剤バックグラウンドでのバイオマーカーの人為的な放出が、イロプロストによって阻害されることを示している。
【図１１】（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン存在下でのイロプロスト回収率の向上を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の採取器具は、全血または血漿を採取し、安定化するのに使用する。大まかには、本発明の血液サンプル採取器具は、試験管、毛細管、遠心管などの管；真空排気された採血管、採取バッグなどの密閉系採血器具；シリンジ、特に予め充填されたシリンジ；カテーテル；マイクロタイターおよび他の多穴プレート；アレイ；フラスコ、スピナーフラスコ、ローラーボトル、バイアル、顕微鏡スライド、顕微鏡スライド組立品、カバーガラス、フィルム、多孔質基体および組立品などの実験室用容器；ピペットおよびピペットチップ；組織および他の生体サンプル採取容器；および生体サンプルを保持するのに適する他のいずれかの容器を含めた任意の採取器具、ならびにサンプルの移送およびアフェレーシスの実施（後者の説明は、特許文献２（米国特許第７，５８２，０４９号明細書）に記載されている）に関わる容器および要素を包含しうる。こうしたいくつかの器具の例および説明は、共同所有された特許文献１（米国特許第７，３０９，４６８号明細書）で開示されている。
【００１６】
特許文献１（米国特許第７，３０９，４６８号明細書）でも説明されている図１は、本発明において有用な、典型的な採血器具１０を示すものであり、器具は、内部チャンバーまたは貯液部１４の輪郭をなす容器１２を含む。例示する実施形態において、容器１２は、側壁１６、閉じた底部末端１８、および開いた上部末端２０を有する中空間である。場合に応じて、容器チャンバー１４内に隔離部材１３が設けられる。隔離部材１３は、たとえば遠心分離による血液サンプル成分の分離を支援する働きをする。容器１２は、適切な体積の血液の採取に必要な大きさになっている。無菌製品が求められる場合、開いた末端２０を覆って容器１２を密閉するための密閉具２２が必要である。一部の実施形態では、管は、ねじ蓋用に成形される。しかし、管が真空排気される実施形態では、必要な貯蔵期間の間真空を閉じ込めるために、ぴったり閉まるゴム弾性の栓が一般に用いられる。密閉具２２は、容器１２を効果的に密閉し、生体サンプルをチャンバー１４に保持することのできるシールをなすことが好ましい。密閉具２２は、限定はしないが、ゴム密閉具、ＨＥＭＯＧＵＡＲＤ（商標）密閉具、金属製シール、金属バンド付きのゴムシール、ならびにポリマーおよび設計の異なるシールを含めた様々な形態の１つでよい。保護シールド２４は、密閉具２２の上に重なるものでよい。
【００１７】
容器１２は、たとえば、プラスチック（たとえば、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリエステル、シリコーン、ポリウレタン、エポキシ、アクリル、ポリアクリレート、ポリエステル、ポリスルホン、ポリメタクリレート、ＰＥＥＫ、ポリイミド、およびフルオロポリマー）、および石英ガラスを始めとするガラス製品を含めて、実験室用容器に適するいずれかの材料でできたものでよい。容器１２は、透明であることが好ましい。容器１２に適する透明な熱可塑性材料の例としては、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリエチレンテレフタレートが挙げられる。プラスチック材料は、空気不透過性材料でもよく、または空気不透過性または半透性の層を含んでいてもよい。あるいは、容器１２は、透水性および通気性のプラスチック材料製のものでもよい。
【００１８】
チャンバー１４における圧力は、所定体積の生体サンプルがチャンバー１４に引き込まれるように選択する。密閉具２２は、大気圧と大気圧未満の圧力との内部差圧を保つことのできる弾性材料製であることが好ましい。密閉具２２は、当技術分野で知られているように、針２６または他のカニューレで穴を開けて、生体サンプルを容器１２に導入することができるようなものである。密閉具２２は、再密閉可能であることが好ましい。密閉具２２に適する材料としては、たとえば、シリコーンゴム、天然ゴム、スチレンブタジエンゴム、エチレンプロピレンコポリマー、およびポリクロロプレンが挙げられる。
【００１９】
容器１２の適切な例としては、単一壁および多層の管が挙げられる。
【００２０】
容器１２は、ゲル、機械的隔離材、または他の種類の隔離部材（たとえば、濾紙など）などの隔離材を収容してもよい。隔離材は、血漿調製、具体的には、ヒトまたは動物全血からの血漿の分離に有用である。ゲルは、チキソトロープポリマーゲル調合物であることが望ましい。ゲルは、ホモポリマーでも、またはコポリマーでよく、シリコーン系ゲル、たとえば、ポリシロキサン、または有機炭化水素系ゲル、たとえば、ポリアクリル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ）、ポリエステル、ポリオレフィン、酸化ｃｉｓポリブタジエン、ポリブテン、エポキシ化ダイズ油と塩素化炭化水素のブレンド、二酸とプロパンジオールのコポリマー、水素化シクロペンタジエン、およびαオレフィンのジアルキルマレエートとのコポリマーを含めることができる。本発明において使用することのできる機械的隔離材の例は、特許文献３（米国特許第６，５１６，９５３号明細書）、特許文献４（米国特許第６，４０６，６７１号明細書）、特許文献５（米国特許第６，４０９，５２８号明細書）、および特許文献６（米国特許第６，４９７，３２５号明細書）に記載されている。
【００２１】
容器１２は、リンパ球および単球を、全血サンプルのより重い相から遠心分離によって分離するように適合させてもよい。そのような実施形態では、器具は、密度勾配液体媒質と、遠心分離より前に密度勾配液体媒質が血液サンプルと混ざるのを防ぐ手段とを収容してもよい。適切なリンパ球／単球採取管の例は、特許文献７（米国特許第５，０５３，１３４号明細書）で開示されている。
【００２２】
図１で図解する実施形態に加えて、本発明での使用に適する、市販品として入手可能な他の採血管として、以下のものが挙げられるが、すべて、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓによって販売され、すべての登録および商標は、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙに属する。ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）ＥＤＴＡ管（たとえば、カタログ番号３６７６５０、３６７６５３、３６６４５０、３６７８４１、３６７８５６、および３６７８６１）、ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）ＰＳＴ管（たとえば、カタログ番号３６７９６０、３６７９６４、３６７９６２、および３６７９６１）、ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）ＣＰＴ管（たとえば、カタログ番号３６２７５３および３６２７６０）、ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）ヘパリン管（たとえば、カタログ番号３６７８８４、３６７６７１、および３６７８７４）、ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）クエン酸管（たとえば、カタログ番号３６３０８３、３６６４１５、および３６９７１４）  ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）ＡＣＤ管（たとえば、カタログ番号３６４６０６、３６４０１２、および３６４８１６）、ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｇａｒｄ（商標）密閉具を備えた非真空ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）管（たとえば、カタログ番号３６５９８７、３６５９６５、および３６５９７４）、従来型ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）管（たとえば、カタログ番号３６５９５６、３６５９５７、３６５９５８、３６５９５９、３６５９７１、および３６５９７３）、およびＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＭＡＰ管（たとえば、カタログ番号３６３７０６）。多くの市販の採血管は、通常は２５０マイクロリットルから約１０．０ｍｌまで（約１０．０ｍｌを含める）、場合によっては１６ｍｌまでの標準体積を備える。典型的な体積として、２５０、４００、および５００マイクロリットル、ならびに２．０ｍｌ、３．５ｍｌ、４．０ｍｌ、５．０ｍｌ、８．０ｍｌ、８．５ｍｌ、および１０．０ｍｌが挙げられる。
【００２３】
他の実施形態では、器具は、２から２００マイクロリットル、より好ましくは５０〜１５０マイクロリットルの範囲の体積の全血を収容することのできる、試験カートリッジ内に一体化された貯液部を含んでもよい。このようなカートリッジは、たとえば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（イリノイ州Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ）によって、ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍの商品名で販売されており、このカートリッジと接続して機能しうる手持ち式分析装置と一緒に使用可能である。本発明と一緒に使用可能なこのようなカートリッジおよび手持ち式分析装置の例としては、それぞれ、ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）ＣＨＥＭ８＋カートリッジおよびｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）１手持ち式分析装置が挙げられる。こうした器具は、たとえば、特許文献８（米国特許第５，０９６，６６９号明細書）、特許文献９（米国特許第５，１１２，４５５号明細書）、特許文献１０（米国特許第５，８２１，３９９号明細書）、特許文献１１（米国特許第５，６２８，９６１号明細書）、特許文献１２（米国特許第７，４１９，８２１号明細書）、特許文献１３（米国特許第６，７５０，０５３号明細書）、および特許文献１４（米国特許Ｄ３３７，１６４）で教示されている。
【００２４】
抗凝血剤
本発明における使用に適した抗凝血剤の代表例としては、ヘパリン、クエン酸塩、シュウ酸塩、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびその二カリウム塩などの塩；クエン酸塩、テオフィリン、アデノシン、およびジピリダモールの組合せ（ＣＴＡＤとして知られる）；ポリアネトールスルホン酸ナトリウム、およびクエン酸デキストロースが挙げられる。一部の実施形態では、抗凝血剤は、ＥＤＴＡ二カリウム塩である。大まかには、抗凝血剤は、器具中に、凝血の阻止に有効な量で存在する。この量は、一般に、器具に採取された血液または血漿の体積を基準として、約１ｍＭから約２００ｍＭ、他の一部の実施形態では、約１０ｍＭから約５０ｍＭの範囲になる。
【００２５】
抗血小板剤
本発明における使用に適する抗血小板剤としては、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、およびこれらの２種以上の組合せが挙げられる。プロスタグランジンは、その構造に応じて、それぞれが（Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨまたはＩ）の文字で示される異なるファミリーに分けられる。この文字に加えて、個々の各プロスタグランジンには、その脂肪酸側鎖中の二重結合の数を示す数字が伴う。たとえば、プロスタグランジンＥｌ（ＰＧＥ１）は、Ｅファミリーに属し、その側鎖中に１個の二重結合しかもたない。ＰＧＥ１に加えて、本発明の実施において有用となりうる別のプロスタグランジンの例として、ＰＧＥ２が挙げられる。
【００２６】
プロスタサイクリンとして知られている種々のプロスタサイクリン類似体も、本発明の実施において抗血小板剤として有用となりうる。代表例としては、ＰＧＩ２（プロスタサイクリンとしても知られる）、カルバプロスタサイクリン、ベラプロスト、イロプロスト、５，６−ジヒドロプロスタサイクリン、シプロステン（ｃｉｐｒｏｓｔｅｎｅ）、リマプロスト、１３，１４−デヒドロ−１５−シクロヘキシルカルバプロスタサイクリン、タプロステン（ｔａｐｒｏｓｔｅｎｅ）、およびトレプロスチニル（およびその塩、たとえば、ＵＴ−１５Ｃとしても知られているトレプロスチニルジエタノールアミン）が挙げられる。ある特定の実施形態では、プロスタサイクリンは、イロプロストである。一方、タプロステンは、本発明における使用に適さない場合もある。
【００２７】
ホスホジエステラーゼ阻害剤も、本発明の実施において抗血小板剤として有用となりうる。ホスホジエステラーゼ阻害剤は、ホスホジエステラーゼ酵素（ＰＤＥ）のサブタイプ（ＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ５、およびＰＤＥ１０）の１種または複数をブロックし、細胞における二次メッセンジャーとして知られている細胞内の環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）および環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の不活性化を阻害する。非選択的および選択的ＰＤＥ阻害剤が有用となりうる。ＰＤＥ阻害剤の代表例としては、ＭＥＰ−１、ミルリノン、シロスタミン（Ｃｉｌｏｓｔａｍｉｎｅ）、ジピリダモール、ザプリナストおよびＩＢＭＸ（３−イソブチル−ｌ−メチルキサンチン  カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、アミノフィリン、オキストリフィリン（ｏｘｔｒｉｐｈｙｌｌｉｎｅ）、ジフィリン（ジロル（Ｄｉｌｏｒ）としても知られる）、ペントキシフィリン、イソブチルメチルキサンチン、およびパパベリンが挙げられる。
【００２８】
シクロオキシゲナーゼ阻害剤も、本発明の実施において抗血小板剤として有用となりうる。プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ（ＰＴＧＳ）としても知られるシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）は、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、およびトロンボキサンを始めとするプロスタノイドの合成を触媒する。シクロオキシゲナーゼ阻害剤の代表例としては、非ステロイド性抗炎症剤、たとえば、アスピリン、インドメタシン、イブプロフェン、ナプロキセン、メロキシカム、ジクロフェナク、ピロキシカム、テノキシカム、テニダップ、およびこれらの２種以上の組合せが挙げられる。
【００２９】
大まかには、抗血小板剤は、血小板凝集を阻害するのに有効な量で器具中に存在する。この量は、一般に、器具に採取された血液または血漿の体積を基準として、約１×１０−１０から約１×１０−１Ｍ、他の一部の実施形態では約１０−８から約１０−４Ｍ、他の一部の実施形態では約１×１０−７から約１×１０−５Ｍの濃度の範囲となる。
【００３０】
可溶化剤
本発明の器具中に可溶化剤が存在してもよい。可溶化剤は、格別の利点として、製造工程の間、抗血小板剤（および存在しうる他の任意の血液安定剤）の安定性を促進し、増強する。本発明の実施において有用となりうる安定剤の代表例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）、ＰＥＧ脂質、アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、およびシクロデキストリンが挙げられる。シクロデキストリンの例は、非特許文献３（Ｌｏｆｔｓｓｏｎ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９３（５）：１０９１〜１０９９（２００４））；非特許文献４（Ｌｏｆｔｓｓｏｎら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．２：３３５〜５１（２００５））；および非特許文献５（Ｊａｎｓｏｏｋら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９９（２）：７１９〜２９（２０１０））に記載されている。好ましいシクロデキストリンは、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。大まかには、可溶化剤は、器具に採取された血液または血漿の体積を基準として、約１×１０−６から約１×１０２ｍｇ／ｍｌ、一部の実施形態では約１×１０−３から約１×１０−１ｍｇ／ｍｌの濃度で器具中に存在する。
【００３１】
追加の血液安定剤
一部の実施形態では、本発明の採血容器は、少なくとも１種の追加の安定剤を含んでもよく、その種類および数は、血液または血漿が投じられる臨床検査の種類などの要因に基づいて選択することができる。安定剤としては、（ＥＤＴＡ以外の）プロテアーゼ阻害剤を挙げることができる。本発明において有用なプロテアーゼ阻害剤は、たとえば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリン／システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギン酸／カルパインプロテアーゼ、エキソペプチダーゼ、およびジペプチジルペプチダーゼを始めとする１または複数の部類のプロテアーゼに対して阻害活性を示す。これらプロテアーゼの２種以上のありとあらゆる組合せが、本発明によって企図される。したがって、器具は、たとえば、セリンプロテアーゼの阻害剤とエキソペプチダーゼの阻害剤、セリンプロテアーゼの阻害剤とシステインプロテアーゼの阻害剤、セリンプロテアーゼの阻害剤とジペプチジルペプチダーゼの阻害剤、エキソペプチダーゼの阻害剤とジペプチジルペプチダーゼの阻害剤、セリンプロテアーゼの阻害剤とエキソペプチダーゼの阻害剤とジペプチジルペプチダーゼの阻害剤とシステインペプチダーゼの阻害剤、ならびにセリンプロテアーゼの阻害剤とエキソペプチダーゼの阻害剤とジペプチジルペプチダーゼの阻害剤を始めとして、このような阻害剤の２種以上のカクテルを含有してもよい。たとえば、特許文献１（米国特許第７，３０９，４６８号明細書）を参照されたい。本明細書に記載のとおり、疾患状態と相互に関連することがわかっているまたは推測されるタンパク質性バイオマーカーまたはペプチドバイオマーカーの存在または量の測定を必然的に伴うプロテオミクスに関しては、少なくとも１種のプロテアーゼ阻害剤、たとえば、セリンプロテアーゼの阻害剤が存在することが望ましい。
【００３２】
セリンプロテアーゼ阻害剤の代表例としては、アンチパイン、アプロチニン、アンチトロンビン、キモスタチン、ＤＦＰ、エラスタチナール、ＡＰＭＳＦ、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ＡＥＢＳＦ、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ、ロイペプチン、トリプシン、およびダイズトリプシンインヒビターが挙げられる。セリンプロテアーゼ阻害剤の濃度は、一般に、約０．１μΜから約１００μΜの範囲となる。
【００３３】
本発明において有用となりうるエキソペプチダーゼ阻害剤の代表例としては、アマスタチン、ベスタチン、ジプロチンＡ、およびジプロチンＢが挙げられる。エキソペプチダーゼ阻害剤の濃度は、一般に、約０．０１ｍＭから約１ｍＭの範囲となる。
【００３４】
血液循環中に存在するジペプチジルペプチダーゼ活性（ＤＰＰＩＶ活性およびＤＰＰＩＶ様活性を含む）は、生理活性ペプチドのＮ末端からジペプチドを遊離させ、ペプチド基質のＮ末端側配列の最後から二番目の位置がプロリンまたはアラニンになる点で非常に特異的である。グルコースによって誘発される膵臓からのインスリン分泌を強化する、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチドＧＩＰ１  ４２およびＧＬＰ１７  ３６（インクレチン）は、ＤＰＰＩＶの基質である。ＤＰＰＩＶ酵素は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、これらのペプチドのＮ末端から、ジペプチドのチロシニルアラニンおよびヒスチジルアラニンをそれぞれ遊離させる。非特許文献６（米国特許第６，４９７，３２５号明細書）。本発明において有用となりうるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）の阻害剤の代表例としては、ビルダグリプチン、シタグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン、およびアログリプチンが挙げられる。他のＤＰＰＩＶ阻害剤としては、イソロイシン、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｖａｌなどのアミノ酸と、チアゾリジン基またはピロリジン基とから形成されるジペプチド化合物およびその立体異性体、たとえば、Ｌ−ｔｈｒｅｏ型およびＬ−ａｌｌｏ型、ならびにその無機塩および有機塩（たとえば、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、およびフマル酸塩）が挙げられる。ジペプチド化合物の具体例としては、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−イソロイシル−チアゾリジド、Ｌ−ａｌｌｏ−イソロイシル−チアゾリジド、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−イソロイシル−ピロリジド、およびＬ−ａｌｌｏ−イソロイシル−ピロリジドが挙げられる。ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤の濃度は、一般に、約０．０１ｍＭから約１ｍＭの範囲となる。
【００３５】
他の安定剤として、他の部類のプロテアーゼの阻害剤が挙げられる。したがって、別の実施形態では、採血器具は、システインプロテアーゼ（たとえば、ＩＡＡ（インドール酢酸）およびＥ６４）、セリン／システインプロテアーゼ（たとえば、ロイペプチン、ＴＰＣＫ、ＰＬＣＫ  ＨＣＬ、２ヘプタノンＨＣＬ、およびアンチパインＨＣ１）、アスパラギン酸プロテアーゼ（たとえば、ペプスタチンおよびＶｄＬＰＦＦＶｄＬ）、メタロプロテアーゼ（たとえば、ＥＤＴＡ、ベスタチン、１，１０フェナントロリン、およびホスホラモドン（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｏｄｏｎ））、チオールプロテアーゼ、アスパラギン酸／カルパインプロテアーゼ（たとえば、ペプスタチン、Ｎ−アセチルｌｅｕ  ｌｅｕノルロイシナール、およびＮ−アセチルｌｅｕ  ｌｅｕメチオニナール）、カスパーゼ、エンドペプチダーゼ（たとえば、α２マクログロブリン（汎用エンドペプチダーゼ阻害剤と呼ばれる）、α１抗トリプシン、およびチオルファン）の阻害剤、およびその２種以上の組合せを含有してもよい。プロテアーゼ阻害剤の追加の例としては、ダイズまたはライマメトリプシンインヒビター、膵臓プロテアーゼ阻害剤、卵白オボスタチン、および卵白システインが挙げられる。プロテオミクスの分野の技術者には、所与の阻害剤が、同じプロテアーゼ部類の１種または複数のプロテアーゼに対して阻害活性を示しうるだけでなく、異なるプロテアーゼ部類の１種または複数のプロテアーゼに対しても阻害活性を示しうることは理解されている。たとえば、ベスタチンおよびアマスタチンは、メタロプロテアーゼに加えて、エキソペプチダーゼに対して阻害活性を示す。
【００３６】
一部の実施形態では、追加の安定剤として、エステラーゼ、たとえば、ブチルコリンエステラーゼやアセチルコリンエステラーゼなどのカルボキシエステラーゼの阻害剤を挙げることができる。こうした安定剤によって、生理活性に脂肪族エステル基を必要とするタンパク質およびペプチドをｅｘ  ｖｉｖｏ分解から付加的に保護することができる。一例は、糖尿病などの代謝性疾患のマーカーである、グレリンである。エステラーゼ阻害剤によって、他の神経ペプチドの安定化を増強することもできる。
【００３７】
血清または血漿コリンエステラーゼとしても知られているブチルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）（Ｅ．Ｃ．３．１．１．８）は、身体がコカイン、およびスクシニルコリンやアスピリンなどの他の薬物を代謝する能力において役割を果たすと考えられている。非特許文献７（Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅ、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｒｅｌａｘａｎｔ  ｓｕｃｃｉｎｙｌｃｈｏｌｉｎｅ」、出典：Ｋａｌｏｗ（編）Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ、１５〜５０頁）を参照されたい。ＢＣｈＥは、ヒト血漿中に、約５ｍｇ／１（または約５Ｕ／ｍｌ）の量で存在するのが普通である。本発明において有用なＢＣｈＥ阻害剤は、Ｋｉ値が約０．５μΜ（５００ｎＭ）以下であり、または一部の実施形態では、Ｋｉは約０．０５μΜ（５０ｎＭ）以下であり、またはさらに他の実施形態では、Ｋｉは約０．０１０μΜ（１０ｎＭ）以下（そのすべての部分範囲を含める）である。各Ｋｉは、（分子量、融点、沸点などの物理的性質とは対照的に）動力学的変数であり、そのため、特に、この値を求めるのに使用される方法に応じて、比較的広く変動する場合がある。したがって、本明細書でＫｉ値に関連して使用する用語「約」は、５０％の変動性（すなわち、±の値）を指す。
【００３８】
本発明において有用なＢＣｈＥ阻害剤は、タクリンとしても知られる化合物９−アミノ−１，２，３，４テトラヒドロアクリジン（およびその誘導体）である。特許文献１５米国特許第４，８１６，４５６号明細書）を参照されたい。タクリンは、アルツハイマー病の治療についてＦＤＡに承認されている中枢作用性のコリンエステラーゼ阻害剤である。この阻害剤は、Ｓｃｉｅｌｅ  ＰｈａｒｍａによってＣＯＧＮＥＸの商品名で市販されている。本発明における使用に適合しうるタクリン誘導体の代表例は、特許文献１６（米国特許第４，７５４，０５０号明細書）（その中の式（Ｉ））で教示されている。
【００３９】
特許文献１６の式（Ｉ）に包含される具体的なタクリン誘導体としては、以下のものが挙げられる。
９−アミノ−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−アミノ−３，４−ジヒドロ−６−メチルアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−アミノ−３，４−ジヒドロ−６−メトキシアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−アミノ−３，４−ジヒドロ−６−フルオロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−アミノ−６−クロロ−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−アミノ−７−クロロ−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−アミノ−３，４−ジヒドロ−６−トリフルオロメチルアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−アミノ−３，４−ジヒドロ−７−ニトロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；７，９−ジアミノ−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；Ｎ−［９−アミノ−３，４−ジヒドロ−１（２Ｈ）−オキソアクリジン−７−イル］アセトアミド；３，４−ジヒドロ−９−メチルアミノアクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−メチルアミノ−７−ニトロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−プロピルアミノアクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−ベンジルアミノ−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−ベンジルアミノ−３，４−ジヒドロ−６−メチルアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−ベンジルアミノ−３，４−ジヒドロ−６−フルオロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−ベンジルアミノ−６−クロロ−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−ベンジルアミノ−３，４−ジヒドロ−６−トリフルオロメチルアクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（２−メチルベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（３−メチルベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（４−メチルベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（２−メトキシベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（３−メトキシベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（４−メトキシベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（２−フルオロベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（３−フルオロベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（４−フルオロベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；６−クロロ−３，４−ジヒドロ−９−（４−フルオロベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−（２−クロロベンジルアミノ）−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−（３−クロロベンジルアミノ）−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−（４−クロロベンジルアミノ）−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−［（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）アミノ］アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（２−トリフルオロメチルベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−６−フルオロ−９−（２−トリフルオロメチルベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（４−トリフルオロメチルベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−フェネチルアミノアクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（４，４−ジフェニルブチル）アミノアクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（４，４−ジフェニルブチルアミノ）−６−トリフルオロメチルアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−［４，４−ビス（３−フルオロフェニル）ブチルアミノ］−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−［４，４−ビス（４−フルオロフェニル）ブチルアミノ］−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（３−フェノキシプロピルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−［２−［ビス（４−フルオロフェニル）メトキシ］エチルアミノ−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−［４−（ベンジルオキシ）ベンジルアミノ］−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−［（２−チエニル）メチルアミノ］アクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−アミノ−２，３−ジヒドロ−シクロペンタ［ｂ］キノリン−１−オン；９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−アミノ−６−クロロ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−アミノ−７−クロロ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−アミノ−６−メトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−アミノ−６−フルオロ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−トリフルオロメチルアクリジン−１−オール；９−メチルアミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−プロピルアミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−ベンジルアミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−ベンジルアミノ−６−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−ベンジルアミノ−６−フルオロ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−ベンジルアミノ−６−クロロ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−ベンジルアミノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−トリフルオロメチルアクリジン−１−オール；９−（２−メチルベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（３−メチルベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（４−メチルベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（２−メトキシベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（３−メトキシベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（４−メトキシベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（２−フルオロベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（３−フルオロベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（４−フルオロベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；６−クロロ−９−（４−フルオロベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（２−クロロベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（３−クロロベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（４−クロロベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；１，２，３，４−テトラヒドロ−９−（２−トリフルオロメチルベンジル）アミノアクリジン−１−オール；６−フルオロ−１，２，３，４−テトラヒドロ−９−（２−トリフルオロメチルベンジルアミノ）アクリジン−１−オール；１，２，３，４−テトラヒドロ−９−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）アクリジン−１−オール；１，２，３，４−テトラヒドロ−９−（４−トリフルオロメチルベンジルアミノ）アクリジン−１−オール；９−［（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）アミノ］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−フェネチルアミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（４，４−ジフェニルブチル）アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−［４，４−ビス（３−フルオロフェニル）ブチルアミノ］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−［４，４−ビス（４−フルオロフェニル）ブチルアミノ］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（３−フェノキシプロピルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−［［２−［ビス（４−フルオロフェニル）メトキシ］エチル］アミノ］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−［４−（ベンジルオキシ）ベンジルアミノ］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−［（２−チエニル）メチルアミノ］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−アミノ−３，４−ジヒドロアクリジン；９−アミノ−１−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−アミノ−３，４−ジヒドロ−２−メチレンアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−シクロペンタ［ｂ］キノリン−１−オール；２−（３−オキソクロヘキセン−１−イル）アミノベンゾニトリル；および４−クロロ−２−（３−オキソシクロヘキセン−１−イル）アミノベンゾニトリル。
【００４０】
本発明における使用に適合しうる他のブチリルコリンエステラーゼ阻害剤としては、エトプロパジン、フェノプロパジン（ｐｈｅｎｏｐｒｏｐａｚｉｎｅ）、およびこれらの誘導体などのタクリン二量体が挙げられる。たとえば、特許文献１７（米国特許第２，６０７，７７３号明細書）および特許文献１８（米国特許第４，８３３，１３８号明細書）を参照されたい。エトプロパジン塩酸塩は、パーキンソン病の治療における使用についてＦＤＡに承認されている。
【００４１】
さらに他のブチリルコリンエステラーゼ阻害剤としては、タクリンと（−）−フペルジンＡ（フペルジア科のヒカゲノカズラ属（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）の種である、トウゲシバ（Ｈｕｐｅｒｚｉａ  ｓｅｒｒａｔａ）というヒカゲノカズラから単離された鏡像異性体のリコジンアルカロイド（ｌｙｃｏｄｉｎｅ  ａｌｋａｌｏｉｄ）である）のハイブリッドが挙げられる。フペルジンＡタクリンハイブリッドの例は、化合物５ａ、５ｂおよび５ｃ、ならびにフプリンＸ（ＨｕｐｒｉｎｅＸ）として当技術分野で知られている。これらの対応する化学名は、以下のとおりである。
（（９Ｅ）−Ｎ１−（７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）ヘプチル）−９−エチリデン−４，４，７−トリメチルビシクロ［３．３．１］ノナ−６−エン−１，３−ジアミン）（５ａ）；（（９Ｅ）−Ｎ１−（７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）ヘプチル）−９−エチリデン−４７−メチルビシクロ［３．３．１］ノナ−６−エン−１，３−ジアミン）（５ｂ）；（（９Ｅ）−Ｎ１−（７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）ヘプチルアミノ）−９−エチリデン−３−メチルビシクロ［３．３．１］ノナ−３−エン−１−カルボン酸メチルエステル）（５ｃ）；および（１Ｓ）−７−クロロ−１５−エチル−１０−アザテトラシクロ［１１．３．１．０＾｛２，１１｝．０＾｛４，９｝］ヘプタデカ−２（１１），３，５，７，９，１４−ヘキサエン−３−アミン）（フプリンＸ）。これら化合物の合成方法は、非特許文献８（５ａ、５ｂおよび５ｃ）（Ｇｅｍｍａら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９（１１）：３４２１〜２５（２００６））ならびに非特許文献９（フプリンＸ）（Ｃａｍｐｓら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７：４０９〜１７（２０００））において開示されている。
【００４２】
ＢＣｈＥの濃度は、一般に、約５μΜから約５００ｍＭ（すなわち、５×１０８ｎＭ）、一部の実施形態では約０．５μΜから約５０ｍＭ、さらの他の実施形態では約０．１μΜから約１０ｍＭの範囲となる。これらの範囲内のすべての部分範囲も意図している。Ｋｉ値の場合のように、本明細書で開示するすべての濃度の値に関連して使用する用語「約」は、５０％の変動性（すなわち、±の値）を指す。
【００４３】
追加の安定剤として、別の種類の血清エステラーゼ、具体的には別のＢエステラーゼ（ＢＣｈＥはこの仲間である）の阻害剤も挙げることもできる。こうしたエステラーゼには、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）（ＥＣ３．１．１．７）および非特異的カルボキシルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．１）が含まれる。ＡＣｈＥの阻害剤は、コリンエステラーゼに作用し、この酵素が、身体において神経伝達物質として機能するアセチルコリンを破壊するのを妨げる。タクリンやフペルジンＡなどの一部のＢＣｈＥ阻害剤は、アセチルコリンエステラーゼも阻害することが知られている。タクリンは、ＡＣｈＥについてのＫｉが６．９ｎｍであると報告されている（非特許文献１０：Ｂｅｎｃｈａｒｉｔら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０：３４１〜９（２００３））。フペルジンＡは、ＡＣｈＥについてのＫｉが４７ｎｍであると報告されている（非特許文献８：Ｇｅｍｍａら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９（１１）：３４２１〜２５（２００６））。ＢＣｈＥがヒト血清における合計エステラーゼ活性のかなりの部分を占める（すなわち、ＡＣｈＥの０．００８ｍｇ／Ｌに対してＢＣｈＥは約５ｍｇ／Ｌ）ことを考えると、採血管に阻害剤を含めることには選択の余地がある。
【００４４】
本発明における使用に適するＡＣｈＥ阻害剤の各Ｋｉは、通常は約５００ｎｍ以下、他の実施形態では約４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、または１０ｎｍ未満である。本明細書で開示するとおり、所与のＡＣｈＥ阻害剤のＫｉ値は、標準の検定技術に従って求めることができる。
【００４５】
したがって、本発明において有用となりうる他のＡＣｈＥ阻害剤としては、以下のものが挙げられる。
フプリンＸ（（１Ｓ）−７−クロロ−１５−エチル−１０−アザテトラシクロ［１１．３．１．０＾｛２，１１｝．０＾｛４，９｝］ヘプタデカ−２（１１），３，５，７，９，１４−ヘキサエン−３−アミン）（Ｋｉ  ０．０２６ｎｍ）、タクリン二量体４ａ（メチルビス［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）プロピル］アミン）（Ｋｉ  ０．０６ｎｍ）、タクリン二量体４ｄ（２−｛ビス［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）プロピル］アミノ｝エタン−１−オール｜Ｎ，Ｎ−ビス［３−［（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）アミノ］プロピル］−Ｎ−ヒドロキシエチルアミン）（Ｋｉ  ０．６５ｎｍ）、タクリン誘導体２（６，８−ジクロロ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ  １．０ｎｍ）、タクリン二量体３ｂ（ホモ二量体のタクリン類似体３ｂ｜Ｎ−［７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）ヘプチル］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン｜タクリンホモ二価化合物３ａ）（Ｋｉ  １．３ｎｍ）、タクリン二量体４ｃ（Ｎ，Ｎ−ビス［３−［（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）アミノ］プロピル］−Ｎ−アリルアミン｜プロパ−２−エン−１−イルビス［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）プロピル］アミン）（Ｋｉ  １．６ｎｍ）、タクリン二量体３ｃ（ホモ二量体のタクリン類似体３ｃ｜Ｎ−［８−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）オクチル］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ  １．９ｎｍ）、タクリン二量体４ｂ（Ｎ，Ｎ−ビス［３−［（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）アミノ］プロピル］−Ｎ−エチルアミン｜エチルビス［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）プロピル］アミン）（Ｋｉ  ２．８ｎｍ）、タクリンヘテロ二価化合物３ｃ（Ｎ−｛７−［（６，８−ジクロロ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）アミノ］ヘプチル｝−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ  ６．０ｎｍ）、フペルジンＡ−タクリンハイブリッド５ｃ（（９Ｅ）−７−（７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）ヘプチルアミノ）−９−エチリデン−３−メチルビシクロ［３．３．１］ノナ−３−エン−１−カルボン酸メチルエステル｜メチル（１Ｓ）−９−エチリデン−３−メチル−７−｛［７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）ヘプチル］アミノ｝ビシクロ［３．３．１］ノナ−３−エン−１−カルボキシレート）（Ｋｉ  ６．４ｎｍ）、タクリン二量体４ｊ（Ｎ−メチル−Ｎ−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）−Ｎ−［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルスルファニル）プロピル］−１，３−プロパンジアミン｜メチル［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）プロピル］［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルスルファニル）プロピル］アミン）（Ｋｉ  ９．１ｎｍ）、フペルジ��Ａ−タクリンハイブリッド５ｂ（（９Ｅ）−Ｎ１−（７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）ヘプチル）−９−エチリデン−７−メチルビシクロ［３．３．１］ノナ−６−エン−１，３−ジアミン｜Ｎ−（７−｛［（１Ｓ）−１−アミノ−９−エチリデン−７−メチルビシクロ［３．３．１］ノナ−６−エン−３−イル］アミノ｝ヘプチル）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ  １５．７０ｎｍ）、フペルジンＡ−タクリンハイブリッド５ａ（９Ｅ）−Ｎ１−（７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）ヘプチル）−９−エチリデン−４，４，７−トリメチルビシクロ［３．３．１］ノナ−６−エン−１，３−ジアミン｜Ｎ−（７−｛［（１Ｓ）−１−アミノ−９−エチリデン−４，４，７−トリメチルビシクロ［３．３．１］ノナ−６−エン−３−イル］アミノ｝ヘプチル）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ  １６．５０ｎｍ）、ＡＰ２２３８  ３−（４−｛［ベンジル（メチル）アミノ］メチル｝−フェニル）−６，７−ジメトキシ−２Ｈ−２−クロメノン｜３−（４−｛［ベンジル（メチル）アミノ］メチル｝フェニル）−６，７−ジメトキシ−２Ｈ−クロメン−２−オン）（Ｋｉ  ２１．７０ｎｍ）、タクリン二量体４ｉ（Ｎ−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）−Ｎ−［８−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）オクタ−１−イル］アミン｜Ｎ−［８−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）オクチル］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ  ３０ｎｍ）、タクリンヘテロ二価化合物３ｇ（６，８−ジクロロ−Ｎ−［７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルスルファニル）ヘプチル］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ  ４１ｎｍ）、タクリン二量体４ｍ（Ｎ−［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）プロピル］−Ｎ−［４−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルスルファニル）ブチル］アセトアミド）（Ｋｉ  ４７ｎｍ）、９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン（６−クロロ−２−メトキシアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ  ４９ｎｍ）、タクリン二量体４ｋ（Ｎ−［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）プロピル］−Ｎ−［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルスルファニル）プロピル］アセトアミド）（Ｋｉ  ５０ｎｍ）、タクリンヘテロ二価化合物３ｉ（Ｎ−［６−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルスルファニル）ヘキシル］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ  １００ｎｍ）、タクリンホモ二価化合物３ｂ（６，８−ジクロロ−Ｎ−｛７−［（６，８−ジクロロ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）アミノ］ヘプチル｝−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ  １５０ｎｍ）、タクリン二量体３ａ（Ｎ−［５−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）ペンチル］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン���（Ｋｉ  ２１０ｎｍ）、タクリン二量体４ｇ（Ｎ−［８−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルスルファニル）オクチル］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ  ２５０ｎｍ）、タクリンヘテロ二価化合物３ｆ（Ｎ−｛７−［（６，８−ジクロロ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）スルファニル］ヘプチル｝−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ  ２９０ｎｍ）、１，２−ジオン系化合物８（１，２−ジヒドロナフタレン−１，２−ジオン｜１，２−ナフトキノン）（Ｋｉ  ３２０ｎＭ）、タクリン二量体４ｆ（Ｎ−［７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルスルファニル）ヘプチル］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン｜タクリンヘテロ二価化合物３ｅ）（Ｋｉ  ３４０ｎｍ）、および６，９−ジアミノ−２−エトキシアクリジン（７−エトキシアクリジン−３，９−ジアミン）（Ｋｉ  ４９０ｎｍ）。前述のＡｃｈＥ阻害剤について本明細書で開示するＫｉ値は、非特許文献８（Ｇｅｍｍａら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９（１１）：３４２１〜２５（２００６））；非特許文献１１（Ｃａｍｐｉａｎｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４８：１９１９〜２９（２００５））；非特許文献１２（Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：３６３〜７３（２００３））；非特許文献１３（Ｓａｖｉｎｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１１：１７７９〜８２（２００１））；非特許文献１４（Ｐｉａｚｚｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：２２７９〜８２（２００３））；非特許文献１０；および非特許文献１５（Ｈｙａｔｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５０：５７２７〜３４（２００７））において報告されている。
【００４６】
本発明において有用となりうるＡＣｈＥ阻害剤のさらに別の例として、有機リン酸エステル（たとえば、メトリホネート、エコチオフェート、フルオロリン酸ジイソプロピル、シクロサリン、ジメトエート、サリン、ソマン、タブン、ＶＸ、ＶＥ、ＶＧ、ＶＭ、ダイアジノン、マラチオン、およびパラチオン）、カルバメート（たとえば、フィゾスチグミン、ネオスチグミン、ピリドスチグミン、アンベノニウム、デマルカリウム（Ｄｅｍａｒｃａｒｉｕｍ）、リバスチグミン、アルジカルブ、ベンジオカルブ（Ｂｅｎｄｉｏｃａｒｂ）、ブフェンカルブ（Ｂｕｆｅｎｃａｒｂ）、カルバリル、カルベンダジム、カルベタミド、カルボフラン、クロルブファム、クロロプロファム、エチオフェンカルブ、ホルメタネート、メチオカルブ、メトミル、オキサミル、フェンメディファム、ピンミカルブ（Ｐｉｎｍｉｃａｒｂ）、ピリミカルブ、プロパモカルブ、プロファム、およびプロポクスル）、フェナントレン誘導体（たとえば、ガランタミン）、ピペリジン（たとえば、ドネペジル（Ｅ２０２０）（Ｋｉ  ２．９ｎｍ））、エドロホニウム、および天然化合物（たとえば、ガランタミンおよびオンキダール（Ｏｎｃｈｉｄａｌ））が挙げられる。
【００４７】
一部のＢＣｈＥ阻害剤は、強力なＡＣｈＥ阻害活性も示すので、本発明の実施形態は、ＢＣｈＥとＡＣｈＥ両方の阻害活性を有する単一のエステラーゼ阻害剤を含むものでよい。
【００４８】
採血器具中に存在してよい追加の血清エステラーゼ阻害剤の濃度は、一般に、約０．１μΜから約７０ｍＭ、一部の実施形態では約１ｍＭから約７ｍＭの範囲となる。
【００４９】
別の実施形態では、カクテルは、セリンプロテアーゼ阻害剤と、少なくとも１種の他の部類のプロテアーゼ阻害剤、たとえば、システインプロテアーゼ阻害剤、および／または少なくとも１種のエステラーゼ阻害剤とを含む。血液安定剤（たとえば、抗凝血剤、抗血小板剤、および任意の追加の血液安定剤）および可溶化剤（一括して「安定剤」と呼ぶ）は、液体（たとえば、溶液および懸濁液）、固体（たとえば、ペレット、錠剤、カプセル剤、噴霧乾燥材料、フリーズドライ材料、粉末、粒子、血漿、および凍結乾燥材料）、および半固体（たとえば、ゲル）を始めとする適切などんな形態で器具中に存在してもよい。凍結乾燥は、（たとえば、安定剤の貯蔵寿命を最大限に延ばすことに関して）良好な安定性が得られ、後続の滅菌も可能になるという点で、特に有用となりうる。たとえば、安定剤を液体組成物の形で器具の容器に導入し、次いで、標準技術によって凍結乾燥することができる。フリーズドライ法は、たとえば、液体組成物を凍結させ、次いで、凍結後に、真空を同時に適用しながらゆっくりと温めるために、フリーズドライされた粉末が採取器具中に残るものである。ＰＶＰやトレハロースなどの種々の添加剤を、フリーズドライ法の前に液体組成物に加えて、安定剤のペレット化、および凍結乾燥した薬剤の血液と接触後の再溶解を円滑にすることもできる。液体組成物を加えた後に、真空乾燥を使用してもよい。他の実施形態では、安定剤を液体または固体エアロゾルの形態にし、容器の内部の１または複数の表面に吹き付ける。安定剤を錠剤の形にカプセル化または製剤することにより、安定剤が光への露出から保護され、阻害剤と容器中の他の要因の望ましくない他の相互作用が防止される。サンプル採取後に溶解する錠剤およびカプセル剤の製造において有用なカプセル化材料および賦形剤は、当技術分野でよく知られている。
【００５０】
安定剤は、貯液部に配置されるだけでなく、採取された血液と接触する、採取器具のどの表面上に位置してもよい。たとえば、安定剤は、器具を密閉するための栓およびシールに接して、または器具内に置かれた機械的挿入物もしくは他の挿入物に接して位置していてもよい。
【００５１】
安定剤に加えて、本発明の器具は、担体媒質（たとえば、水またはアルコール）、安定化媒質または再溶解媒質（たとえば、ポリビニルピロリドン、トレハロース、マンニトールなど）、および／または血液および血漿採取の分野において有用であり、ペプチドおよびタンパク質に対して実質上不活性である、１種または複数の他の添加剤も含有してよい。典型的な添加剤として、フェノール、フェノール／クロロホルム混合物、アルコール、アルデヒド、ケトン、有機酸、有機酸の塩、ハロゲン化物のアルカリ金属塩、有機キレート剤、蛍光色素、抗体、結合剤、酸化防止剤、還元剤、および緩衝剤が挙げられる。阻害剤が錠剤形態である場合、所望であれば、当業者に知られている医薬用の錠剤崩壊材を含めてもよい。
【００５２】
本発明の器具の有用な製造工程は、管などの採取容器を入手するステップと、添加剤の溶液または懸濁液を容器中に吹き付け、次いで通風乾燥によって溶媒を除去する工程によって、抗凝血剤、抗血小板剤、可溶化剤、および他のいずれかの安定剤を容器に加えるステップとを含む。添加剤の溶液または懸濁液は、有機溶媒中、または好ましくは水中で調合することができる。あるいは、溶媒を除去するのに、凍結乾燥を使用することもできる。次いで、容器を排気し、滅菌する。所望であれば、容器に隔離部材を付け加えてもよい。適切な凍結乾燥／排気工程の一例は、次のとおりである。約７６０ｍｍの圧力下、温度約−４０℃で容器を約６〜８時間凍結させ、約０．０５ｍｍの圧力下で、温度を−４０℃から約２５℃に上昇させながら、容器を約８〜１０時間乾燥させ、次いで、約１２０ｍｍの圧力下、温度約２５℃で、容器を約０．１時間排気する。滅菌技術は、コバルト６０照射によるものであることが好ましい。
【００５３】
全血またはその血漿含有成分は、介在するいかなる工程ステップも入れずに、患者から直接採血器具に引き込むことができる。患者から全血を直接採取し、サンプルを、安定剤を含有する器具に直接導入することで、安定剤と合わせる前のサンプルの貯蔵時に、そうしなければ起こるタンパク質の活性化が実質的に防止される。本発明の方法は、開放系採取器具と、開口部が密閉手段によって密閉されている密閉系採取器具の両方で有用である。
【００５４】
好ましい実施形態では、採取器具は、採取の時点で直ちに血小板を安定化するために全血サンプルを直接患者から引き抜くのに使用する管である。採取管は、採血用の真空系でもよい。あるいは、管は、採血用の部分的真空系または非真空系（たとえば、毛細採取管）でもよい。真空系の適切な例は、密閉系の管である。手作業でのシリンジの引き抜きは、部分的真空系および非真空系両方の適切な例である。非真空系には、自動引き抜き系も含めることができる。真空系が特に好ましい。
【００５５】
次いで、本発明を使用して採取された血液またはその血小板含有部分を、幾種類もの臨床分析にかけることができる。
【００５６】
たとえば、血液検査には、血液細胞、またはヘモグロビンなどのその構成成分の分析が含まれる。最もよく実施される検査は、全血球数（ＦＢＣ）とも呼ばれる全血球計算値（ＣＢＣ）である。実際には、最も小さな血液検査室を除くすべての検査室で、精巧さの様々な血液分析装置（「血球計数器」）が、細胞の計数に使用されている。細胞数、および回収された情報のグラフ表示の提供に加えて、こうした計器はまた、異形の細胞が見出されたとの警告（「フラグ」）を発し、推定に基づいてその異常を特定する。自動化された血液計器では、血小板凝集によって、血小板の偽抑制の結果が引き起こされる場合があり、こうした計器は通常、操作員に凝集したサンプルを警告するようにプログラミングされている（こうしたアルゴリズムは、必ずしも正確に機能しない場合もある）。その場合、凝集塊が存在するかについて、血液塗抹標本を顕微鏡で精査する。正確な血小板数が求められる場合、患者から新鮮な血液サンプルを同じ抗凝血剤（ＥＤＴＡ）またはクエン酸塩中に取得する。ＥＤＴＡのみの中に採取された臨床血液検体の１０％までもが、ある程度の血小板集塊を伴う。末梢血塗抹には、自動化血液分析装置によって得られた情報を補うための末梢血の鏡検が含まれる。血液検査は、獣医学においても、動物および家禽の健康状態を評価するのに日常的に使用され、ＥＤＴＡは、動物における血液検査に最適な抗凝血剤である。しかし、正確な血小板数の決定は、特に、インピーダンス型の血液分析装置を使用するとき、血小板の顕著な凝集によって、また大きすぎて計数できない血小板の存在によって、たびたび悪影響を受ける。本発明は、血小板集塊の発生を減少させるのに役立てることができる。したがって、こうした状況で本発明を用いることは有利となる。
【００５７】
血漿プロテオミクスの分野は、疾患状態と相関があるまたは疾患状態に特徴的である、血清／血漿中のタンパク質またはペプチドが特定されることによって発展した。こうしたバイオマーカーの存在またはレベルの測定は、治療に対する反応をモニターする観点からも臨床上有利な場合がある。こうしたバイオマーカーは、循環系から取り出されたほぼ直後に、内因性プロテアーゼによる系統立った分解を受けやすい。ＥＤＴＡは、そのキレート化作用ゆえに、血漿プロテオミクスに最適な抗凝血剤である。しかし、ＥＤＴＡを媒介とする血小板の自発的活性化が、ｅｘ  ｖｉｖｏでのタンパク質分解につながり、結果として血漿サンプルにおいて明確な複数のペプチドシグナルが生じかねない。本発明を使用して血液を安定化すると、プロテアーゼ酵素に触媒されるバイオマーカー分解の量を低減することができる。
【００５８】
ＴＧＦβ１、ＰＤＧＦ、フィブロネクチン、β−トロンボグロブリン、ｖＷＦ、フィブリノゲン、ＦＶ、ＦＸＩＩＩなど、血小板α顆粒に含まれている因子の多くは、創傷修復、凝血、および炎症に関与する。これら因子のいくつかが正確に測定されることは、重要な臨床的因果関係をもつ。たとえば、冠動脈疾患および悪性腫瘍を始めとするいくつかのヒト疾患でレベルの上昇が報告されているＴＧＦβ１の測定は、採血および／血漿調製の際に血小板ＴＧＦβ１がｉｎ  ｖｉｔｒｏで制御されずに放出されることにより、混乱しかねない（非特許文献１６：Ｍｅｙｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  １１９：１０６４〜７４（２０１２）
）。
【００５９】
血小板は、その止血活性のほか、免疫および炎症を促進する細胞としても機能する（非特許文献１７：Ｓｅｍｐｌｅら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：２６４〜７４（２０１１））。血小板の炎症誘発性活性は、受容体を媒介とした、異なる細胞とのクロストークおよびその活性化、ならびにその顆粒中に貯蔵された強力な生理活性メディエーターの放出を含めた複合的な機序によって生じる。この相互作用は、活性化した細胞が、今度は血小板を活性化させるので、双方向性である。これにより、ある特定のサイトカイン、ケモカイン、および成長因子のレベルが増幅されるため、検定が、体循環に存在する実際の量をもはや反映しない場合もある。たとえば、（ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌを介した）Ｔ細胞との相互作用は、血小板活性化を引き起こし、急性および慢性炎症のメディエーターである顆粒性ＲＡＮＴＥＳの放出を誘発する（非特許文献１８：Ｄａｎｅｓｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：２０１１〜５（２００４））。したがって、サイトカイン測定に使用するとき、ＥＤＴＡによって凝血が阻止された血液は、血小板活性化の結果として生じる偽性放出を回避するために、可能な限り迅速に処理すべきである。本発明の器具の使用により、偽性放出の発生は低減される。
【００６０】
血液バンキング−毎年何百万もの血液製剤が輸血されており、したがって多くの命が輸血によって直接関係している。輸血に使用される三大不安定血液製剤は、赤血球濃縮液、血小板濃縮液、および新鮮凍結血漿である。全血献血から血液製剤を調製する標準手順は、次のとおりである。全血は、クエン酸リン酸デキストロース（ＣＰＤ）抗凝血剤を含有するプラスチック袋に採取したなら、血液細胞をその大きさおよび密度に応じて分離するために遠心分離する。赤血球（ＲＢＣ）は沈降し、血漿は上部に留まる。白血球および血小板（ＰＬＴ）は、界面に「バフィーコート」層を形成する。最後に、もとの全血献血を含有する、遠心分離にかけた袋に半自動圧力をかけることにより、３種の成分を、相互接続した滅菌血液バッグに分配する。
【００６１】
実際に、白血球は、病原体を含有する細胞となりうるので、血液製剤は、体系的に白血球除去される。しかし、貯蔵の間、こうした成分の変性または劣化が起こる場合もあり、保存損傷として知られる。ＲＢＣについては、貯蔵が生化学的変化を引き起こし、流動学的性質（形状変化、変形性、凝集性、および細胞内粘度）およびタンパク質の酸化状態に影響を及ぼす。血小板保存損傷（ＰＳＬ）は、形態学的変化、血小板活性化、血小板タンパク質分解、および血小板表面受容体発現を伴う。血小板膜糖タンパク質の変化も報告されている。顆粒の放出および血小板活性化は、それぞれ、貯蔵媒質中のβ−トロンボグロブリンおよび血小板因子４の蓄積と、Ｐ−セクレチン（ＣＤ６２Ｐ）の表面レベルの増大とによって示されるとおり、ＰＬＴ貯蔵の間に起こる。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの血液老化だけでなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの不安定血液製剤保存損傷のバイオマーカー発見は、輸血医療界にとって高い関心の的である。こうした血液関連の研究はすべて、抗凝血剤の選択などの分析前条件（ｐｒｅ−ａｎａｌｙｔｉｃｓ）に強く影響される場合がある。本発明に従って血小板活性化を弱めることにより、血液保存損傷が低減、または解消さえされ、これによって、不安定なバイオマーカーの質が保たれ、輸血療法の効率が確保される。
【００６２】
多血小板血漿（ＰＲＰ）は、自家血小板の濃縮された供給源であり、いくつかの異なる成長因子、および骨および軟組織の治癒を刺激する他のサイトカインを含有する。ＰＲＰは、整形外科およびスポーツ医学、または心臓、形成、および口腔外科を含めたいくつかの医療用途において使用されている。ＰＲＰ調製は、全血のクエン酸系抗凝血剤中への採取、ＰＲＰ画分の分離、および治癒過程を刺激する因子を放出させるための活性化を含む。治療用ＰＲＰは、血小板がベースラインのほぼ５倍に濃縮されている（非特許文献１９：Ａｒｎｏｃｚｋｙ、Ａｍ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．３９：ＮＰ８〜９（２０１１））。スポーツ医学における手術技法）。しかし、血小板濃縮技術のばらつきによって、血小板脱顆粒特性が変化し、臨床的成果に影響が及ぶこともある。抗凝血剤の役割も、血小板の代謝要求を支え、損傷を与えないようにして血小板の生存可能な分離を可能にしなければならないので、同様に重要である。それほどではないとしても、クエン酸抗凝血剤は、人為的な血小板活性化を誘発することも知られており（非特許文献２０：Ａｈｎａｄｉら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９０：９４０〜８（２００３））、本発明に従ってこれを弱めることにより、ＰＲＰサンプルの質が保たれ、療法の効率が確保される。
【００６３】
細胞免疫療法は、一部のがんに有効であることがわかっており、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞などの免疫エフェクター細胞を用いる。免疫療法の活性薬剤は、一括して免疫調節薬と呼ばれ、多種多様な組換え型、合成、および天然の製剤、多くの場合、サイトカインまたはケモカイン、たとえばＣＣＬ３に相当する。ＣＣＬ３は、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）としても知られているので、急性炎症状態において、多形核白血球の動員および活性化に関与し、活性化した血小板からも放出される場合がある。本発明の使用によって人為的な血小板活性化を弱めることにより、療法目的の細胞製剤におけるこうした免疫調節性制御因子の放出は減少し、または排除さえされる。
【００６４】
マイクロパーティクル（ＭＰ）は、活性化されて様々な細胞から放出される小さい（約０．１μｍ）膜小胞である。血液中で検出されるＭＰの大半は、血小板から生じるが、他の血液細胞、たとえば、白血球、赤血球、内皮細胞、およびさらには悪性細胞も、ＭＰを出すことがある（非特許文献２１：Ｙｕａｎａら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１０５：３９６〜４０８（２０１１））。ＭＰの血漿レベルは、血管障害、がん、および自己免疫疾患を始めとする多くの病状において上昇する（非特許文献２２：Ｇａｒｃｉａら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．４：１５１６〜１５２１（２００５））。したがって、生理学および病理学におけるＭＰの役割を研究することへの関心は、ますます高まっている。しかし、個々の研究は、広範な種類の分析前手順および分析手順を使用しており、それらはすべて、ＭＰ測定の成果に影響を及ぼす恐れがある。血小板活性化は、結果としてα顆粒、密顆粒、および血小板ＭＰの放出を招くので、採血の際、ｅｘ  ｖｉｖｏでの血小板活性化を防ぐことが必要である。したがって、この状況における本発明の使用は、同様に有利であることがわかる。
【００６５】
ここで、本発明について、以下の非限定的な例を挙げて説明する。
【００６６】
＜実施例＞
実施例１
イロプロストは、ＥＤＴＡを媒介とする自発的血小板脱顆粒を阻害する
【００６７】
血小板活性化は、α顆粒、密顆粒、およびリソソームの活発かつ急速な放出をもたらす場合があり、これらの内容物は、様々な自己分泌およびパラ分泌シグナル伝達事象を促進する働きをする。ＣＤ６２Ｐ（Ｐ−セクレチン）は、α顆粒の放出後に血小板形質膜上に一過性に発現される接着分子であり、白血球上に発現されるＰ−セクレチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２）との連結によって、血小板−白血球凝集塊を媒介することがある。密顆粒およびリソソーム放出は、区別はされないが、ＣＤ６３表面発現を用いて測定することができる。以前の研究によって、ＥＴＤＡがＣＤ６２ＰおよびＣＤ６３の表面発現を誘発することは実証されている。
【００６８】
ＣＤ６２ＰおよびＣＤ６３の表面発現によって判断される、血小板活性化に対するＥＤＴＡの効果を、血小板安定剤（イロプロスト）の存在下または非存在下で評価した。ＥＤＴＡ、またはＥＤＴＡと最終濃度０．５、５、および５０μΜのイロプロストを含有する管に、全血を採取した。所定量のαＣＤ６１  ＰｅｒＣＰ、αＣＤ６２Ｐ  ＰＥ、αＣＤ６３  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、および／または適切なアイソタイプ対照を含有する抗体カクテルを、コニカル底マイクロタイタープレートに加えた。改良ＨＥＰＥＳ−タイロード緩衝液を使用して、各染色反応について最終体積を１００μＬに釣り合わせた。適切な染色混合物に５μＬの全血を加え、暗所条件下にて室温で１５分間インキュベートすることにより、血小板表面染色を行った。その後、反応液全部を、１ｍＬのＨＥＰＥＳ−タイロード緩衝液を含有する５ｍＬ容ポリスチレン製丸底スナップキャップ管に移して、各サンプルを最終的に希釈した。サンプルを手短にボルテックスし、ＢＤ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ計器を使用してデータを取得した。血小板サイズおよび形態をＲＢＣおよびＷＢＣ集団と識別するために、ＦＳＣおよびＳＳＣ設定を対数スケールで設定した。血小板に特異的な事象をさらに見分けるために、ＰｅｒＣＰのみの対照を使用して、ＣＤ６１＋ゲートを設定した。ＣＤ６３は、血小板特異的マーカーではないので、単一血小板形態集団についてさらにゲート制御して、血小板に結合した白血球からのＣＤ６３サインを回避することが必要であった。ＰｅｒＣＰのみの対照を使用して、ＣＤ６２Ｐ−／ＣＤ６３−集団用の蛍光検出器電圧も設定した。電圧および補償の設定を終えた後、各試験サンプルについて単一血小板当たりＣＤ６１＋事象を１０，０００件取得した。
【００６９】
図２Ａおよび２Ｂに示すとおり、イロプロストを０．５、５、および５０μΜの漸増量で加えることで、ＣＤ６２Ｐ発現の頻度が４４．７％から、それぞれ１５．０％、１４．１％、および１３．９％に減少した。ＣＤ６２Ｐ発現は、どの濃度のイロプロストでも排除はされなかったが、ＰＥ蛍光中央値は、ＥＤＴＡのみの４４．７から、漸増曲線に沿って７．３１、７．１２、および７．０６に落ち込み、イロプロスト処理サンプル中に残存するＣＤ６２Ｐ＋血小板では、発現レベルがより低かったことが示唆される。
【００７０】
実施例２
イロプロストは、α顆粒および密顆粒／リソソームの放出について、ＥＤＴＡにおける作動薬誘発血小板脱顆粒を阻害する
【００７１】
血小板活性化に対するイロプロストの効果を、強力な血小板活性化剤であるＡＤＰおよびトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ）の存在下で調査した。１０μＬの生理食塩水（０．８５％）、ＡＤＰ、またはＴＲＡＰ−６を含有する微小遠心管に３００μＬの血液を加え、室温でおよそ２分間インキュベートすることにより、血小板刺激を行った。ＡＤＰおよびＴＲＡＰ−６の最終濃度は、それぞれ６．５μΜおよび３２μΜとした。その後、全血フローサイトメトリーを前述のとおりに実施した。採血およびフローサイトメトリーは、実施例１に記載のとおりに実施した。
【００７２】
ＡＤＰを加えると、ＣＤ６２Ｐ発現は、ＥＤＴＡのみ（休止サンプル）の４４．６％から８５．１％に増加し、ＴＲＡＰ活性化では９９．４％に達した（図３Ａ）。イロプロストを加えた結果、ＣＤ６２Ｐの発現は、０．５μΜのイロプロストの添加で、休止サンプルでは１５．０％、ＡＤＰまたはＴＲＡＰで活性化したサンプルでは１７．３％または３３．４％に減少した。発現は、異なるイロプロスト濃度でもほとんど不変のままであった。ＣＤ６３（図３Ｂ）については、ＡＤＰを加えた結果、表面発現が非刺激条件（２．１３％）に比べてごくわずかに増加した（７．６７％）。イロプロストを加えると、非刺激およびＡＤＰ刺激両方のＣＤ６３発現が１．１７％から１．３０％の範囲に減少し、ＡＤＰ反応は効果的にブロックされた。ＴＲＡＰで刺激すると、ＣＤ６３発現は、堅調に６９．３％に上向き調節されたが、イロプロストを加えたことで、これが４．３％から５．２％の範囲に減少した。まとめると、ＡＤＰまたはＴＲＡＰに反応したＣＤ６２ＰおよびＣＤ６３の複合上向き調節は、イロプロストを加えることにより著しく低減された。
【００７３】
実施例３
イロプロストは、ＥＤＴＡを媒介とする血小板脱顆粒を２４時間のサンプル休止の最後まで阻害する
【００７４】
図４Ａに示すとおり、ＣＤ６２Ｐの発現を、ｔ＝０、２、８および２４時間のサンプル休止時に、実施例１に記載のとおりに分析した。図４Ｂは、１０対象の平均±ＳＤとして示す、各条件についての各時点でのＣＤ６２＋事象の百分率を示すものである。以下の表に、すべての血小板事象について、各時点での１０対象の蛍光強度中央値を示す。
【００７５】
【表１】
2015506482.tif 000003
【００７６】
実施例４
イロプロストは、ＥＤＴＡにおける白血球−血小板凝集塊のレベルを低減する
【００７７】
血液を実施例１に記載のとおりに採取した。予め決められた量のαＣＤ６１（血小板マーカー）、αＣＤ４５（白血球マーカー）、および／または適切なアイソタイプ対照を含有する抗体カクテルを使用して、血小板−白血球凝集塊を、実施例１に記載のとおりに、フローサイトメトリーを使用しながら、ｔ＝０、４、２４および１４４時間のサンプル休止時に検出した。図５に示すとおり、白血球に結合した血小板の各時点の百分率は、イロプロストを加えることで減少した。データは、６対象を代表するものである。
【００７８】
実施例５
イロプロストは、血小板集塊を減少させる
【００７９】
血液を実施例１に記載のとおりに採取した。Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＥ−２１００を製造者の指示どおりに使用して、全血球計算値（ＣＢＣ＋ＤＩＦＦ）および他の血液検査パラメータを測定した。図６に示すとおり、イロプロストの存在下では、血小板体積平均値（ＭＰＶ）が、ＥＤＴＡのみと比べて低くなっていた（ｐ＜０．００１、対応のある検定）。同様に、他の血小板特異的パラメータ、すなわち、ＰＤＷおよびＰ−ＬＣＲについても、ＥＤＴＡ／イロプロストでは、ＥＤＴＡのみと比べて低いレベルが認められた（データ表示なし）。以下の表において下側パネル（Ｂ）に示すとおり、３００名の健常対象の調査において、イロプロストの追加は、血小板凝集塊がＥＤＴＡのみと比べて４０％減少したことと関連付けられた。
【００８０】
【表２】
2015506482.tif 000004
【００８１】
実施例６
イロプロストは、ＥＤＴＡを媒介とするバイオマーカーの自発的な放出を阻害する
【００８２】
血液を実施例１に記載のとおりに採取した。管を３０００ｒｃｆで１０分間遠心分離することにより、示した時点（０、２、８および２４時間のサンプル休止時）で血漿を調製し、市販品として入手可能なＥＬＩＳＡキットを製造者の指示どおりに使用してのＰＤＧＦａ／ａ、ＴＧＦβ１、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、およびＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）のレベルの測定に使用した。図７Ａ〜ＣおよびＥに示すとおり、イロプロストを加えた結果、分析したすべての時点で、ＰＤＧＦａ／ａ、ＴＧＦβ１、ＶＥＧＦ、ＲＡＮＴＥＳの発現が、ＥＤＴＡのみ（塗りつぶしのない菱形）と比べて減少した。図７Ｄに示すとおり、ＩＬ−８の発現は、ＥＤＴＡのみとイロプロストを加えたＥＤＴＡとで似通っていた。
【００８３】
実施例７
イロプロストによって、ＥＤＴＡによる人為的な活性化が引き起こす対象間変動が緩和される
【００８４】
血液を採取し、（ＣＤ６２Ｐについては）実施例３、（ＴＧＦβ１、ＲＡＮＴＥＳ、ＰＤＧＦａ／ａ、およびＶＥＧＦについては）実施例６に記載のとおりに処理した。図８Ａ〜Ｅは、実施例３および６で測定した、ＥＤＴＡまたはＥＤＴＡ／イロプロストについてのＣＤ６２Ｐ、ＴＧＦβ１、ＲＡＮＴＥＳ、ＰＤＧＦａ／ａ、およびＶＥＧＦの発現を、すべての時点を集約して表すものである。ＥＤＴＡのみでの発現は、イロプロストを加えたＥＤＴＡにおける発現より有意に高かった（各要因についての各条件での発現レベル平均値を示した）。以下の表は、イロプロストによって、ＥＤＴＡが引き起こす対象間変動が、２４時間のサンプル休止の最後まで統計学的に有意に軽減されたことを示している。
【００８５】
【表３】
2015506482.tif 000005
【００８６】
実施例８
ＣＤ６２Ｐは、ＣＤ６２Ｐの表面発現と選択因子の強い相関によって証明されるとおり、血小板由来バイオマーカー測定のための良好な代理マーカーである
【００８７】
ＰＤＧＦａ／ａ、ＴＧＦβ１、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、およびＲＡＮＴＥＳの発現（実施例６で測定したとおり）をＣＤ６２Ｐの発現（実施例３で測定したとおり）と相互に関連付けた。図９Ａおよび９Ｃに示すとおり、ＰＤＧＦａ／ａ（Ｒ２＝０．９２６８）およびＴＧＦβ１（Ｒ２＝０．８２９４）について、ＣＤ６２Ｐとの強い相関が明らかになった。図９Ｂおよび９Ｄに示すとおり、ＲＡＮＴＥＳ（Ｒ２＝０．６８０３）およびＶＥＧＦ（Ｒ２＝０．６０５１）については、相関の弱い正の関係が明らかになり、血小板に加えて、他の細胞型もこれらの因子を発現させることが示唆された。図９Ｅは、ＣＤ６２ＰとＩＬ−８（Ｒ２＝０．０３８１）とに相関がないことを示しており、ＩＬ−８の発現が血小板と無関係であることが示唆される。
【００８８】
実施例１０
ＣＤ６２Ｐの発現は、イロプロストの存在下および非存在下の両方で、ＥＤＴＡと、プロテアーゼ阻害剤カクテルを加えたＥＤＴＡとで似通っている
【００８９】
血小板脱顆粒に対するイロプロストの効果を、ＥＤＴＡおよびＥＤＴＡ／プロテアーゼ阻害剤バックグラウンドで測定した。ＥＤＴＡ、イロプロストを加えたＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテル（「ＰＩＣ」、特許文献１の表ＩＩに記載されている各部類の阻害剤から１種のプロテアーゼ阻害剤を含む）、およびイロプロストを加えたカクテルを含有する管に、全血を採取した。ＣＤ６２Ｐ発現を測定する全血フローサイトメトリーを、実施例１に記載のとおりに実施した。図１０に示すとおり、ＣＤ６２＋事象の百分率は、５対象の平均±９５％信頼度として示されるように、ＥＤＴＡおよびＰＩＣバックグラウンドの両方について、イロプロストを加えたことで減少した。こうした結果から、ＥＴＤＡ／プロテアーゼ阻害剤バックグラウンドにおけるバイオマーカーの人為的な放出も、イロプロストの追加によって阻害されることが示唆される。以下の表に、すべての血小板事象について、５対象の蛍光強度中央値を示す。
【００９０】
【表４】
2015506482.tif 000006
【００９１】
実施例１１
イロプロスト回収率は、（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンの存在下で向上する
【００９２】
Ｋ２ＥＤＴＡ（最終濃度、２３ｍＭ）およびイロプロスト（最終濃度、７．２μｇ／ｍＬ）を用いて採血管を準備した。さらに、バイアル中の基本処方に次の成分を加えた。ａ）添加剤なし、ｂ）（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン（最終濃度、０．３６ｍｇ／ｍＬまたは０．２６ｍＭ）、ｃ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン基剤（ＴＲＩＳ、３．６ｍｇ／ｍＬまたは３０ｍＭの最終濃度）、ｄ）ウシ血清からのアルブミン（最終濃度、０．３６ｍｇ／ｍＬ）、およびｅ）（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンとアルブミンの組合せ。サンプル管は、周囲条件下、換気フード内で週末にかけて乾燥させた。次いで、個々のバイアルの内容物を１５０μＬの精製水で抽出し、３．９×１５０ｍｍ  Ｃ−１８逆相カラムにおいて４８％のアセトニトリルおよび５８％の０．０２Ｍリン酸カリウム（ｐＨ３．０）からなる定組成移動相を使用し、１ｍＬ／分で進行させたＨＰＬＣによって分析した。イロプロストを２０７ｎｍのＵＶ吸収によって検出した。３．８４μｇ／ｍＬのサンプルからのイロプロストの完全な回収を計算すると、２１９ｍＡＵ＊秒の合計吸光度シグナルとなった。乾燥サンプルの回収を、添加剤のもとの保存液と比較した。
【００９３】
図１１に示すとおり、イロプロストは、（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンを含有するバイアルから、またそれほどではないが、アルブミンを含有するバイアル（データ表示なし）から回収された。Ｋ２ＥＤＴＡのみまたはＫ２ＥＤＴＡプラスＴＲＩＳを含有するバイアルからは、イロプロストは回収されなかった。シクロデキストリン添加剤の中でも、（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンで、イロプロストが最もよく回収された（データ表示なし）。イロプロストの回収は、管へのγ線照射による影響を受けなかった（データ表示なし）。
【００９４】
本明細書において、本発明を特定の実施形態に即して説明してきたが、こうした実施形態は、本発明の原理および適用例を例示するものにすぎないと理解されたい。したがって、例示的な実施形態に対して数多くの変更を加えてもよく、また添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の真意および範囲から逸脱することなく、他の取合わせを考案してもよいと理解されたい。
【００９５】
すべての特許刊行物および非特許刊行物は、本発明が属する分野の業者の技量のレベルを示すものである。それら刊行物はすべて、個々の各刊行物について、参照により援用されることが詳細かつ個別に示されているかのごとく、参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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