(57)【要約】本発明は、ｉ）炭素源の発酵によって炭化水素モノマーを合成し、ｉｉ）合成が可能である炭化水素モノマーによって少なくとも構成されるポリマーを解重合するために遺伝子が組み換えられた微生物に関する。また、本発明は、当該種の遺伝子を組み換えられた微生物を用いて炭化水素モノマーを生成するための方法、および、目的のポリマーを合成可能である別の微生物を用いた前記微生物の共培養物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）炭素源の発酵によって炭化水素モノマーを合成し、
ｉｉ）少なくとも合成が可能である炭化水素モノマーによって構成されるポリマーを解重合する、
ために遺伝子が組み換えられた微生物。
【請求項２】
前記モノマーは、好ましくは、酸、アルコール、およびアミン基の形態で、酸素および窒素から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
ｉｉｉ）合成が可能である前記炭化水素モノマーの分解経路を減じる、
ために遺伝子が組み換えられた、請求項１または請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
ｉｖ）少なくとも合成が可能である前記炭化水素モノマーによって構成されるポリマーを合成する、
ために遺伝子が組み換えられた、請求項１〜３のうちの１項に記載の微生物。
【請求項５】
ポリエステルを解重合し、前記ポリエステルのエステル化の中間体、酸、および／またはアルコールの合成をするために遺伝子が組み換えられた、請求項１〜４のうちの１項に記載の微生物。
【請求項６】
ポリ乳酸（ＰＬＡ）の解重合および乳酸の合成のために遺伝子が組み換えられた、請求項５に記載の微生物。
【請求項７】
乳酸を合成するために、プロテイナーゼＫ、リパーゼ、およびＰＬＡデポリメラーゼ、ならびに／または乳酸デヒドロゲナーゼから選択されるＰＬＡを解重合する少なくとも１つの酵素を発現する、請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
前記微生物は乳酸微生物、好ましくは乳酸菌である、請求項６または請求項７に記載の微生物。
【請求項９】
‐請求項１〜８のうちの１項に記載の微生物を、炭素源、および前記微生物によって解重合されることが可能なポリマーに接触させるステップと、ならびに選択的に、
‐生成された炭化水素モノマーを回収するステップと、
を含む、炭化水素モノマーを生成する方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のうちの１項に記載の少なくとも１つの第１微生物と、前記第１微生物によって生成されたモノマーにより少なくとも構成されたポリマーを合成可能であり、選択的に遺伝子が組み換えられた、少なくとも１つの第２微生物とを含む微生物の共培養物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の微生物の共培養物を用いてポリマーを合成する方法であり、
‐前記微生物の共培養物を、炭素源、および前記第１微生物によって分解されることが可能なポリマーと接触させるステップと、ならびに選択的に、
‐前記第２微生物によって生成されたポリマーを回収するステップと、
を含む方法。
【請求項１２】
ＰＬＡの生成のための請求項１１に記載の合成方法であり、前記第１微生物は請求項６〜８のうちの１項に記載の微生物であり、前記第２微生物は乳酸モノマーから開始してＰＬＡを合成するために遺伝子が組み換えられる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマー合成に使用される炭化水素モノマーを生成するための組換え微生物に関する。より正確には、本発明は、炭素源から、そして培地に存在するポリマーの解重合によっても、当該種のモノマーを生成するように遺伝子が組み換えられた微生物に関する。また、本発明は、当該種の組換え微生物を用いたモノマーの生成方法、および生成されたモノマーからポリマーを合成する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリマーは、非常に多くの技術分野、食品包装から、衣服、自動車産業、医療分野まで、特にプラスチック材料の形態で用いられている。例として、ポリアミド、およびより具体的にナイロンは、靴用底面の製造用や外科縫合糸用のマイクロフィラメントの形態の双方で用いられている。同様に、特定のポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）など）は、衣服製造や包装、また自動車あるいは他の部品の製造用熱硬化樹脂の形態においても用いられる。
【０００３】
大半の産業で使用されるポリマーは、近年まで、再生可能ではない石油などの化石燃料源から取得されていた。しかし、このような高分子材料の再利用に伴う困難と増していく再生不可能な化石燃料の不足とが、それらの使用に対しさらに疑問を投げかけている。
【０００４】
ゆえに、再生可能な原材料からの、またはバイオマスからのポリマー製造が長い間に進歩してきている。例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）は石油化学製品産業で得られるポリマーの性質と並ぶ機械的性質を有する乳酸から生成される生分解性ポリマーである。微生物は、再生可能である適切な炭素源から炭化水素モノマーおよび／またはポリマーを生成するその能力のため、単離および／または開発されてきている。
【０００５】
例として、デンプン、ペントースなどの炭素源から乳酸を生成するために、様々な微生物が開発されてきている。特に、乳酸デヒドロゲナーゼを発現する組換え酵母は、適切な培地で乳酸を合成するために生成されている（国際公開第０３１０２１５２号）。
【０００６】
同じように、酵母は、フマル酸レダクターゼを発現し、フマル酸からコハク酸を生成するために遺伝子を組み換えられている（国際公開第２００９０６５７７８号）。
【０００７】
このような組換えまたは組換えでない微生物は、通常、高価な基質（グルコース、ショ糖など）を含む適切な培地で培養される必要がある。そのような微生物の生産能を向上するためには、製造費用をさらに増大させるような培地条件の最適化（温度、撹拌、炭素源の種類など）も必要である。
【０００８】
製造費用を抑制するため、テンサイ汁（国際公開第２００８０００６９９号）、ナツメ果汁（Ｂｏｕｄｊｅｌａｌ他、Ｒｅｖ．Ｅｎｅｒｇ．Ｒｅｎ，：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｅｔ  Ｖａｌｏｒｉｓａｔｉｏｎ−Ｂｉｏｍａｓｓｅ  ［バイオマス‐生成およびアップグレード］（２００１年）、４１−４６）などの直接的にはアップグレード不可能であるバイオマスから、代謝物を直接生成するような取り組みがおこなわれてきている。だがしかし、微生物の増殖を促進するようなバイオマスの前処理は複雑で長い、すなわち、製造費用を納得のいく方法において下げることはできない。
【０００９】
さらに、微生物によって生成される炭化水素モノマー量は、最適な培地においてすら、辛うじて３０ｇ／Ｌを超える程度である。
【００１０】
加えて、微生物によって生成される炭化水素モノマーおよび／または関連ポリマーの量は未だ比較的少なく、実際にポリエチレン（ＰＥ）およびそのほかの石油化学製品ポリマーの代替にするには関連費用が著しくかさむ。再生可能な原料からポリマーを生成するという着想は魅力的であるが、費用および／または生産量の問題を克服し、需要に十分に対応することのできる発酵による生成用システムは現在では存在していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ポリマーの合成に使用される多量の炭化水素モノマーを生成可能である組換え微生物を提案して、上述で述べた問題のうちの少なくとも１つを少なくとも部分的に克服することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そのため、本発明は、炭素源の発酵によって１つ以上のモノマーを合成すること、そして、培地に存在するポリマーを、そこから構築されるモノマーを遊離可能にするように同時またはその他の方法で解重合すること、を可能にするために遺伝子が組み換えられた、微生物、特に細菌、酵母、または菌類の提案をする。同一の微生物によって生成されるモノマーは、２つの異なる、そして独立した原料に由来する。さらに、この種の発明の微生物の使用ではポリマーが再利用可能であり、ゆえにプラスチックごみの堆積問題が克服できることを意味する。実際に、本発明の微生物によって解重合されることが可能であるポリマーは、プラスチック材料から製造される製品に統合されること、および、溶液またはその他の方法で培地において直接利用されることの両方が可能である。有利には、本発明の微生物は、高分子量ポリマーを、低分子量を有するオリゴマーにだけでなく基本構成要素またはモノマーにも解重合できる。
【００１３】
このように、本発明は、
ｉ）炭素源の発酵によって炭化水素モノマーを合成し、そして、
ｉｉ）合成が可能である炭化水素モノマーによって少なくとも構成されるポリマーを解重合する、ために遺伝子が組み換えられた微生物に関する。
【００１４】
また、本発明は、炭化水素モノマーを生成する方法に関し、
‐本発明の微生物を、炭素源、および前記微生物によって解重合されることが可能であるポリマーと接触させるステップ、および選択的に、
‐生成された炭化水素モノマーを回収するステップ、を含む。
【００１５】
また、本発明は、本発明による少なくとも１つの第１微生物、および、前記第１微生物によって生成されたモノマーにより少なくとも構成されるポリマーを合成することが可能であり、選択的に遺伝子が組み換えられた、少なくとも１つの第２微生物、を含む微生物の共培養物を想定する。
【００１６】
本発明は、また、本発明による微生物の共培養物を用いてポリマーを合成するための方法に関し、
‐微生物の共培養物を、炭素源、および第１微生物によって分解されることが可能なポリマーと接触させるステップ、および選択的に、
‐第２微生物によって生成されたポリマーを回収するステップ、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、４つの濃度レベルのプロテイナーゼＫの存在下におけるＰＬＡの乳酸への分解を示す（◆１．２５ｇ／Ｌ、■２．５ｇ／Ｌ、▲３．７５ｇ／Ｌ、●５ｇ／Ｌ）。
【図２】図２は、いずれの添加もない（◆）、２０ｇ／ＬのＰＬＡおよび３．７５ｇ／ＬのプロテイナーゼＫを含む（■）、または、２０ｇ／ＬのＰＬＡを含む（▲）、ＣＤＭにおけるＬ．ラクティスＩＬ  １４０３の（Ａ）増殖速度および（Ｂ）バイオマスの変化を示す。
【図３】図３は、いずれの添加もない（◆）、２０ｇ／ＬのＰＬＡおよび３．７５ｇ／ＬのプロテイナーゼＫを含む（■）、または、２０ｇ／ＬのＰＬＡを含む（▲）、ＣＤＭにおけるＬ．ラクティスＩＬ  １４０３の（Ａ）グルコース濃度および（Ｂ）比グルコース消費速度の変化を示す。
【図４】図４は、いずれの添加もない（◆）、２０ｇ／ＬのＰＬＡおよび３．５ｇ／ＬのプロテイナーゼＫを含む（■）、または、２０ｇ／ＬのＰＬＡを含む（▲）、ＣＤＭにおけるＬ．ラクティスＩＬ  １４０３の（Ａ）ラクテート濃度の変化、ならびにＰＬＡありの状態となしの状態との（Ｂ）ラクテートの差異の算出結果を表す。
【図５】図５は、いずれの添加もない（◆）、２０ｇ／ＬのＰＬＡおよび３．７５ｇ／ＬのプロテイナーゼＫを含む（■）、または、２０ｇ／ＬのＰＬＡを含む（▲）、ＣＤＭにおけるＬ．ラクティスＩＬ  １４０３のラクテートの比生産速度の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の文脈において、「微生物」という用語は、酵母、微細藻類および菌類などの任意の単細胞真核生物、または、バクテリアなどの原核生物を意味する。
【００１９】
微生物は、好ましくは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、サーモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から選択される属の微生物である。好ましくは、微生物は、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｎｉｇｅｒ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、プチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・エントモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・アンタルチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｔｉｃａ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）、フサリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、および巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）から選択される。
【００２０】
「遺伝子が組み換えられた」微生物という用語は、その微生物のゲノムが前記微生物が合成および解重合の２つの経路を示すというような方法で組み換えられたということを意味する。例として、微生物は、炭素源から目的のモノマーを合成することが自然に可能であり、所望の解重合もしくはその逆において必要な酵素（単数または複数）を発現するために遺伝子が組み換えられた微生物であってよい。また、微生物は、所望の合成および解重合経路のいずれかを自然に示さなくともよく、これら２つの経路のために遺伝子を組み換えられてもよい。微生物はまた、これらの経路の一方、および／または、他方を自然に有してもよく、関連する遺伝子の発現を促進および／または増進するために遺伝子が組み換えられてもよい。本発明によると、微生物のゲノムは、炭化水素モノマーの生合成用の経路、および／もしくは、ポリマーの解重合に関する少なくとも１つの酵素をコードするか、または生物学的に活性であるそのフラグメントをコードするかの、少なくとも１つの核酸配列を統合するために組み換えられる。前記核酸配列は、任意の適切な分子クローニング法を用いて、前記微生物またはその祖先のうちの１つのゲノムに導入されてもよい。本発明の文脈において、「微生物のゲノム」とは、例えばプラスミド、エピソーム、合成染色体などに含有される染色体外の遺伝物質を含む、前記微生物に含有されるすべての遺伝物質を意味する。導入された核酸配列は、異種配列、つまり自然の状態で前記微生物中に存在しないか、または相同配列であってよい。有利には、１つ以上のプロモーターの制御下に配置された、目的の核酸配列を含む転写ユニットは、微生物のゲノムに導入される。
【００２１】
本発明の微生物により使用される炭素源は、好ましくは、グルコース、ガラクトース、キシロース、ショ糖などの精製糖類を含むが、発酵性糖類を生成するために微生物によって分解されることが可能な野菜もしくは動物由来の任意の有機物、またはバイオマスをも含む。ゆえに、炭素源は、例えば、糖蜜、および／またはサトウキビバガス、砂糖精製廃水もしくは廃液、砂糖結晶化母液などの、ヘミセルロース、セルロース、リグノセルロース系等のバイオマスを含んでもよい。また、炭素源はグリセリンまたは油類（トリグリセリド）を含んでもよい。あらゆる場合において、炭素源は本発明のポリマーの解重合によって生成されたモノマーを含まない。
【００２２】
本発明の同時の発酵および解重合の特性は、微生物が炭素源、そしてポリマーに、同時に（または、例えば最大１５分の指定など、ごく短時間に）、同一の物理化学条件下で（例えば温度、ｐＨ、および／または培地）接触することにより定義される。つまり、２つの経路（発酵と解重合）により生成される炭化水素モノマーは培地において同時に回収されてもよい。
【００２３】
「炭化水素モノマー」という用語は、基本的に炭素原子と水素とから構成される脂肪族または芳香族モノマーを指す。これは一般に１〜８の炭素原子、好ましくは２〜６の炭素原子を含む。炭化水素モノマーはまた、通常は、酸、アルコール、アミン基などの形態における窒素または酸素などの少なくとも１つのヘテロ原子をも含む。
【００２４】
特に、本発明の炭化水素モノマーは、ジカルボン酸もしくは酸ニ無水物などのその誘導体のうちの１つ、ジオール、α−ヒドロキシル酸などのヒドロキシル酸、ジエステル、ラクトン、環状ジエステル（グリコリド、ラクチドなど）、ジアミン、またはヒドロキシルアミンであってよい。
【００２５】
これらのモノマーの非限定的リストは、乳酸、グリコール酸、３−ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ吉草酸、ブタンジオール、プロパンジオール、エチレングリコール、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、テレフタル酸、フランジカルボン酸、カプロラクトン、カプロラクタム、プトレシン、カダベリン、ヘキサメチレンジアミン、エステル類、エステルアミド類などで構成される。
【００２６】
「オリゴマー」という用語は、１つ以上のモノマー、および微生物に供給されるポリマーよりも少ないモノマーを含む、本発明によるモノマーの継承を意味する。
【００２７】
本発明の微生物により解重合可能なポリマーは、その主鎖が基本的に炭素原子、ならびに特にポリエステルおよび／またはポリアミドにより構成されるポリマーである。本発明のポリマーは、分岐され得るホモポリマーまたはコポリマーであってよい。ポリエステルは脂肪族および／または芳香族であってよい。言及される脂肪族ポリエステルの例は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシアルカノエート類（ＰＨＡｓ）、ポリ（ブチレンサクシネート）（ＰＢＳ）、ポリ（ブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート）（ＰＢＳＡ）、またはポリ−β−カプロラクトン（ｐＣＡＰＡ）である。特に言及される脂肪族ポリエステルは、ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）、ポリ（トリメチレンテレフタレート）（ＰＴＴ）、ポリ（ブチレンテレフタレート）（ＰＢＴ）、またはポリ（ブチレン−アジペート−テレフタレート）（ＰＢＡＴ）である。特に言及され得るポリアミドは、ポリ（カプロラクタム）またはナイロン−６、ポリ（ウンデカンアミド）またはナイロン−１１、ポリ（ヘキサメチレンジアミン−アジペート）またはナイロン−６，６を含む。
【００２８】
特に、本発明は、脂肪族ポリエステルの解重合、および、前記ポリエステルのエステル中間体、酸、および／またはアルコールのすべてまたは一部の合成を描出し、例としては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）の解重合および乳酸の合成、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）の解重合および３−ヒドロキシ酪酸の合成、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシバリレート）（ＰＨＢＶ）の解重合ならびに３−ヒドロキシ酪酸および／または４−ヒドロキシ吉草酸の合成、ポリ（ブチレン−サクシネート）（ＰＢＳ）の解重合ならびに１，４−ブタンジオールおよび／またはコハク酸の合成、ポリ（ブチレン−サクシネート−ｃｏ−アジペート）（ＰＢＳＡ）の解重合ならびに１，４−ブタンジオール、および／またはコハク酸および／またはアジピン酸の合成である。
【００２９】
また、本発明は、芳香族ポリエステルの解重合、および、関連するモノマーのすべてまたは一部の合成を描出し、例としては、ポリ（エチレン−テレフタレート）（ＰＥＴ）の解重合ならびにエチレングリコールおよび／またはテレフタル酸の合成、ポリ（トリメチレン−テレフタレート）（ＰＴＴ）の解重合ならびに１，３−プロパンジオールおよび／またはテレフタル酸の合成、ポリ（ブチレン−テレフタレート）（ＰＢＴ）の解重合ならびに１，４−ブタンジオールおよび／またはテレフタル酸の合成、ポリ（ブチレン−アジペート−テレフタレート）（ＰＢＡＴ）ならびに１，４−ブタンジオールおよび／またはアジピン酸および／またはテレフタル酸の合成である。
【００３０】
また、本発明は、ポリアミドの解重合、および、関連するモノマーのすべてまたは一部の合成を描出し、例としては、ポリ（カプロラクタム）またはナイロン−６の解重合およびカプロラクタムまたは６−アミノ−ヘキサン酸の合成、ポリ（ウンデカンアミド）またはナイロン−１１の解重合およびウンデカンアミドの合成、ポリ（ヘキサメチレンジアミン−アジペート）またはナイロン−６，６の解重合ならびにヘキサメチレンジアミンおよび／またはアジピン酸の合成である。
【００３１】
本発明によると、同一の微生物は、少なくとも１つの炭化水素モノマーの合成および少なくともその同じモノマーによって構成されるポリマーの解重合が可能である。また本発明によると、微生物は前記ポリマーから目的のモノマーを回収するための方法で前記ポリマーの解重合ができる。ポリマーがその他のモノマーを含む場合、前記ポリマーは目的のモノマーを遊離するために部分的に解重合されるのみで、その他のモノマーは場合によりオリゴマーの形態での最終解重合形態であってよい。
【００３２】
本発明の特定の実施形態では、微生物はまた、合成が可能である炭化水素モノマーの分解のための少なくとも１つの経路を減じるように遺伝子が組み換えられた。
【００３３】
本発明の微生物は、実際にいくつかの場合において、増殖のために炭素源として合成されるモノマーを用いることが自然に可能である。しかし、これらのモノマーは、特にその後のポリマーの合成のため特別な工業上の関心になり得り、その分解を防ぐことは有利である。このため、本発明では、任意の適切な組換えか、欠失かの少なくとも一方の方法を用いて、目的のモノマーの分解に関わる酵素（単数または複数）をコードする遺伝子のすべてまたは一部を欠失させることが可能である。また、目的のモノマーの分解に関わる遺伝子のすべてまたは一部の発現を減じることも可能である。ゆえに、これら遺伝子の発現を減じることのできる転写因子、干渉ＲＮＡｓ、ｓｉＲＮＡなどのレギュレーターをコードする１つ以上の核酸配列を導入することが、例として可能である。同様に、転写の減衰か、防止かの少なくとも一方をおこなうため、目的のモノマー分解に関わる遺伝子のうちの少なくとも１つのプロモーター配列を組み換えることが可能である。
【００３４】
合成モノマーの分解を防ぐため、上述の遺伝子組み換えの代わりに、またはその捕足として、微生物の培地を微生物によって資化されやすい基質で定常的に強化し、合成モノマーよりもそれらの基質が優先的に用いられるようにすることも可能である。
【００３５】
本発明の微生物は、合成が可能であるモノマーによって全体または一部が構成されるポリマーを合成することができるように遺伝子を組み換えられてもよい。例として、微生物は、特定のポリマー合成酵素をコードする核酸配列を統合および発現するように遺伝子を組み換えられてもよい。つまり、本発明では、同一の微生物が発酵およびポリマーの標的解重合を用いてモノマーを生成して、再利用か、分解かの少なくとも一方をおこない、生成されたモノマーを用いて新しいポリマーを生成してもよい。目的のポリマーがヘテロポリマーの場合、培地を前記ポリマーの他の構成モノマー（単数または複数）で強化することが可能である。
【００３６】
本発明は、特に、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシアルカノエート類（ＰＨＡｓ）などの、脂肪族ポリエステルの解重合、そして関連するモノマーのすべてまたは一部の合成を描出する。
【００３７】
ゆえに、第１の実施形態において、本発明の微生物は、ＰＬＡを解重合して乳酸を取得し、同時に炭素源から乳酸を合成するように遺伝子が組み換えられた。
【００３８】
ＰＬＡを解重合する酵素は、有利には、セリンプロテアーゼ、リパーゼ、およびＰＬＡデポリメラーゼから選択される。好ましくは、ＰＬＡ解重合のための酵素は、トリチラチウム・アルブム（tritirachiumalbum）のプロテイナーゼＫ、アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）からのリパーゼＡ、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）からのリパーゼＡＹ、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）からのリパーゼＦ、バークホルデリア属（Burkholderiasp.）からのリパーゼＰＳ、またはクリプトコッカス属（Cryptococcus sp.）のＳ−２株からのリパーゼクチナーゼ様酵素から選択される。同様に、乳酸を合成する酵素は、有利には乳酸デヒドロゲナーゼである。特定の実施例では、微生物は、例えば自然に乳酸デヒドロゲナーゼを排出する、すなわち自然の状態の乳酸菌などの乳酸微生物である。
【００３９】
本発明はまた、炭化水素モノマーを生成するための方法を提供し、
‐本発明の微生物を、炭素源、および前記微生物によって解重合されることが可能なポリマーと、接触させるステップ、および選択的に、
‐生成された炭化水素モノマーを回収するステップ、を含む。
【００４０】
発酵および解重合の両方によって生成された炭化水素モノマーは、培地に有利に現れる。そして、モノマーを単離するおよび／または精製するために、任意の既知の技術を用いてこれらのモノマーに富む培地を処理することができる。
【００４１】
本発明では、使用される微生物および導入される遺伝子組換えを単に適合させて、あらゆる種類のモノマーを生成することができる。微生物の選択および提供される遺伝子組換えは、本願の教示を鑑みて当業者によっておこなわれる範囲内である。
【００４２】
温度、ｐＨなどの微生物を炭素源およびポリマーに接触させる条件は、ポリマーの解重合によるモノマーの生成および炭素源に発する発酵によるモノマーの生成の両方を最適化するか、選択するかの少なくとも一方をおこなうことで、当業者によって適合されてもよい。
【００４３】
また、本発明は、例えば発酵槽内などにおいて、少なくとも２つの微生物の共培養物を提供し、微生物のうちの１つは本発明による遺伝子を組み換えられた微生物であり、２つめの微生物は少なくとも本発明の微生物によって生成されるモノマーによって構成されるポリマーを微生物自身が合成可能である。
【００４４】
ゆえに、本発明の微生物によって生成され、培地に排出されるモノマーは第２の微生物によって使用され、任意の業種において使用され得る目的のポリマーを生成する。このように、本発明の方法は、再び使用され得るモノマーへの解重合から、新規適用のためにプラスチックの形態において使用される新規ポリマーの形態での再使用まで、ポリマーを完全に再利用するように用いられることが可能である。
【００４５】
また、例えば、本発明の微生物は、少なくとも１つの乳酸デヒドロゲナーゼ、ならびに、ＰＬＡデポリメラーゼ、プロテアーゼおよびリパーゼから選択されるＰＬＡを解重合可能である少なくとも１つの酵素を発現する、遺伝子を組み換えられた乳酸菌である。この乳酸菌は、遺伝子を組み換えられ、ＰＬＡを合成可能な、別の微生物と共に共培養されてもよい。共培養される２つの微生物は、有利には、培地に存在する炭素源、好ましくは糖類を競い合わないように選択される。本発明の特定の実施形態では、「含む」という用語は「本質的に〜から構成される」または「から構成される」ということを意味する。
【実施例】
【００４６】
本発明の全く非限定的である描出による下記の実施例から、本発明をより深く理解することができる。
【００４７】
〔実施例１：ＰＬＡデポリメラーゼを発現する組換え乳酸菌〕
＜方法および装置＞
組換えプラスミドの調製に用いられるクローニング技術はＳａｍｂｒｏｏｋ等による１９８９年の出版物（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ」）に記載されている技術に準拠したものである。
【００４８】
配列番号１（Ｎａｋａｍｕｒａ他、２００１、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６７：３４５−３５３）の配列を伴うアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）Ｋ１０４−１からのｐｌｄ遺伝子を、相同組換えによってプラスミドｐＮＺ８０４８に導入する（Ｋｕｉｐｅｒｓ他、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、６４：１５−２１）。ｐｌｄ遺伝子を統合した組換えプラスミドは「ｐＮＺ−ｐｌｄ」と呼ばれる。
【００４９】
野生型株ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＭＧ１３６３は、Ｈｏ等（「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４７：１９５−１９９）による１９９５年の著作による方法を用いて、エレクトロポレーションによって細胞に導入されたプラスミドｐＮＺ−ｐｌｄにより形質転換される。プラスミドｐＮＺ−ｐｌｄを統合する組換え細菌は「ＭＧ１３６３−ｐＮＺ−ｐｌｄ」を示す。陰性対照「ＭＧ１３６３−ｐＮＺ８０４８」は空のプラスミドｐＮＺ８０４８により形質転換される野生型株ラクトコッカス・ラクティスＭＧ１３６３に相当する。
【００５０】
＜ＰＬＡデポリメラーゼ活性＞
ＭＧ１３６３−ｐＮＺ−ｐｌｄおよびＭＧ１３６３−ｐＮＺ８０４８株を、ＣＤＭ（「既知組成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）」）を含む２Ｌの発酵槽において、嫌気状態下、３０℃で並行して培養する。
【００５１】
グルコースを培地に添加して１％（重量／容量）の最終濃度にし、ＮａＯＨの自動添加によりｐＨを６．５に保持する。
【００５２】
培養は各々２つの継代培養に分割され、２つの継代培養の各グループ（ＭＧ１３６３−ｐＮＺ−ｐｌｄ−１、ＭＧ１３６３−ｐＮＺ８０４８−１およびＭＧ１３６３−ｐＮＺ−ｐｌｄ−２、ＭＧ１３６３−ｐＮＺ８０４８−２）は同一の条件下で保持される。
【００５３】
第２グループ（ＭＧ１３６３−ｐＮＺ−ｐｌｄ−２、ＭＧ１３６３−ｐＮＺ８０４８−２）にのみ、０.１％（重量／容量）に乳化した分子量２２０，０００ＤａのＰＬＡ（島津製作所、日本国、京都）を培地中へ添加する。
【００５４】
ＰＬＡデポリメラーゼ活性は、Ｎａｋａｍｕｒａ等による２００１年の著作の方法（「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｃ−ａｃｉｄ）  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｏｉｌ  ｉｓｏｌａｔｅ  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．  Ｓｔｒａｉｎ  Ｋ１０４−１」  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６７：３４５−３５３）を適用して培養の２日後に測定される。
【００５５】
培養の２日後に、第１グループの培養上清を取り除き、乳酸成分を評価するため質量分析器（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ  ５００）で解析する。
【００５６】
２つのサンプル（ＭＧ１３６３−ｐＮＺ−ｐｌｄ−１およびＭＧ１３６３−ｐＮＺ８０４８−１）で、発酵によって細菌から生成された乳酸に対応して、９０Ｄａでの単一ピークが観察される。つまり、組換え株ＭＧ１３６３−ｐＮＺ−ｐｌｄは、培地に存在するグルコースの発酵による乳酸の生成に非常に適している。
【００５７】
同時に、第２グループの培養上清を取り除き、存在する乳酸オリゴマー（基本的に二量体および三量体）量を評価するため質量分析器（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ  ５００）で解析する。
【００５８】
２つのサンプル（ＭＧ１３６３−ｐＮＺ−ｐｌｄ−２およびＭＧ１３６３−ｐＮＺ８０４８−２）において、培地に存在するＰＬＡに対応して、１つのピークが２２０，０００Ｄａで観察され、乳酸に対応して、１つのピークが９０Ｄａで観察される。さらに、ＭＧ１３６３−ｐＮＺ８０４８−２の培地に対応するサンプルでは、中分子量を有するいくつかのピークの存在が観察され、これらのピークはＭＧ１３６３−ｐＮＺ８０４８−１には存在しない。これらの中間ピークは、培地のＰＬＡが組換え株ＭＧ１３６３−ｐＮＺ−ｐｌｄ−２によって確かに分解されたことを確証する様々なサイズの乳酸オリゴマーに相当する。
【００５９】
ＰＬＡデポリメラーゼを発現する組換え株ＭＧ１３６３−ｐＮＺ−ｐｌｄは、発酵により乳酸を生成し、培地における高分子量ＰＬＡの解重合をすることが実際に可能である。
【００６０】
〔実施例２：乳酸生成の評価〕
遊離した乳酸量を測定するため、ＭＧ１３６３−ｐＮＺ−ｐｌｄ−１、ＭＧ１３６３−ｐＮＺ−ｐｌｄ−２、ＭＧ１３６３−ｐＮＺ８０４８−１、およびＭＧ１３６３−ｐＮＺ８０４８−２グループに対応する実施例１の培養上清をＨＰＬＣで解析する。このため、サーモスタットで５０℃に調節し、５ｍＭ硫酸溶液によって０．５ｍＬ／ｍｉｎで溶出される、ＡｍｉｎｅｘのＨＰＸ−８７Ｈカラムが定量化に用いられる。
【００６１】
この解析は、ＭＧ１３６３−ｐＮＺ−ｐｌｄ−２グル−プの上清内の乳酸量が、他の３つの条件（ＭＧ１３６３−ｐＮＺ−ｐｌｄ−１、ＭＧ１３６３−ｐＮＺ８０４８−１およびＭＧ１３６３−ｐＮＺ８０４８−２）の乳酸量より高いことを示す。同様に、乳酸二量体は、ＭＧ１３６３−ｐＮＺ−ｐｌｄ−２グル−プからの培養上清内のみで観察される。
【００６２】
Ｃ１８カラムの補完的解析は、Ｖｕ等による２００５年の著作の方法（「Ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｆｌｕｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ，  ２３６，１２５−１３５）を用いておこなわれる。ＭＧ１３６３−ｐＮＺ−ｐｌｄ−２グル−プからの培養上清の解析により、重合度６までの乳酸オリゴマーの存在が確認される。
【００６３】
〔実施例３：プロテイナーゼＫの存在におけるラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＩＬ  １４０３の培養〕
以下の実施例では、乳酸の生成のためのラクトコッカス・ラクティスＩＬ  １４０３株およびプロテイナーゼＫの組合せを取り扱う。プロテイナーゼＫは、ＥＵＲＯＭＥＤＥＸ（ＥＵ００９０で照会）から利用可能なトリチラチウム・アルブムからのプロテイナーゼＫである。
【００６４】
３．１  株と培地の選択
使用される株はラクトコッカス・ラクティスＩＬ  １４０３株である。この株を５ｇ／Ｌのグルコースで補完した既知組成培地（ＣＤＭ培地）において培養し、そしてｐＨ８に緩衝化した。分解されるＰＬＡと競合し得るプロテイナーゼＫを好む培地基質を含まないように、（ペプトン、タンパク質またはオリゴペプチド源を含む）富栄養培地を用いなかった。
【００６５】
表１はｐＨ８での既知組成培地（ＣＤＭ）の組成である。
【００６６】
【表１】
2015511496.tif 000002
【００６７】
３．２  培養条件の選択
この目的は、Ｌ．ラクティスＩＬ  １４０３の増殖速度を、ｐＨ６．６、７．０、７．５および８．０の４つの値において測定することである。実験は、５ｇ／Ｌのグルコースを含む１５ｍＬの既知組成培地を含む管内にて、３０℃でおこなわれた。これらの実験は嫌気状態および好気状態でおこなわれた。
【００６８】
光学密度を５８０ｎｍで２４時間測定して増殖をモニターし、平均増殖速度を測定した。
【００６９】
表２は、嫌気および好気状態下の異なるｐＨにおけるＬ．ラクティスＩＬ  １４０３の増殖パラメータである。
【００７０】
【表２】
2015511496.tif 000003
【００７１】
ｐＨ６．６の条件はＬ．ラクティスＩＬ  １４０３の参照条件に相当する一方で、最大増殖速度はｐＨ７．５でわずかに減少するものの、ｐＨ８．０でわずかに増加する（２５〜３０％）。通気条件にはほとんど影響されなかった。
【００７２】
これらの結果は、Ｌ．ラクティスＩＬ  １４０３が、ｐＨ８．０で、その増殖速度にほとんど影響なく培養されるということを示す。
【００７３】
３．３  ＰＬＡ解重合条件の選択
最初の実験は、プロテイナーゼＫの加水分解の効果を、様々な濃度で（１．２５、２．５、３．７５および５ｇ／Ｌ）、既知組成培地において（Ｌ．ラクティスＩＬ  １４０３用の増殖培地）、３０℃（乳酸菌の増殖温度）、そしてｐＨ８で（プロテイナーゼＫの最適ｐＨ）測定するためにおこなわれた。加水分解の２４時間後に遊離した乳酸の濃度は、ＰＬＡの５つの初期濃度（２．５、５、１０、２０、および４０ｇ／Ｌ）ならびにプロテイナーゼＫの４つ濃度（１．２５、２．５、３．７５、および５ｇ／Ｌ）で、ＨＰＬＣによって測定された（図１）。
【００７４】
図１では、プロテイナーゼＫの４つの濃度レベルの存在におけるＰＬＡの分解と乳酸とを比較する。
【００７５】
この実験は、２４時間後に、８．０の初期ｐＨで、ＣＤＭにおいて、プロテイナーゼＫによるＰＬＡの加水分解によって、２７ｍＭ〜５４ｍＭの乳酸が取得されるということを示す。最適な加水分解の収率はＰＬＡおよびプロテイナーゼＫの濃度がそれぞれ２０ｇ／Ｌおよび３．７５ｇ／Ｌで取得される。
【００７６】
３．４  乳酸菌およびＰＬＡデポリメラーゼの組合せ
この実験はコンピュータ制御された２Ｌの発酵槽（Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｂ  ｐｌｕｓ、  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１Ｌの利用量）内においておこなわれた。わずかに２．５ｇ／Ｌのグルコースを含有する既知組成培地から開始して、３つの培養条件がテストされた。１０ＮのＫＯＨを添加してｐＨを８．０の値に調節した。温度は３０℃であった。上述の３つの条件を下記に記載する。
【００７７】
Ａ：ＣＤＭ＋ＩＬ  １４０３
Ｂ：ＣＤＭ＋ＩＬ  １４０３＋ＰＬＡ２０ｇ／Ｌ＋プロテイナーゼＫ（３．７５ｇ／Ｌ）
Ｃ：ＣＤＭ＋ＩＬ  １４０３＋ＰＬＡ２０ｇ／Ｌ
発酵槽内で、ＰＬＡを直接オートクレーブ乾燥した。無菌状態下で、培地およびプロテイナーゼＫを添加した。
【００７８】
培養を動的にモニターした。２時間毎にサンプリングし、５８０ｎｍで光学密度を測定し、ＨＰＬＣにより基質および副産物を次に解析するため、遠心分離後に培養上清を冷凍した。Ｌ．ラクティスＩＬ  １４０３株の光学密度（ＯＤ）と乾燥重量との相関性は１ｇ／Ｌ＝０．３ＯＤＵとして既知である。
【００７９】
３．４．１  増殖
ＰＬＡなしおよびありで培養されたＬ．ラクティスＩＬ  １４０３の増殖速度の特性は類似する。μｍａｘは０．６５ｈ−１（ＰＬＡなし）および０．７０ｈ−１（ＰＬＡあり）である。対照的に、プロテイナーゼＫをＰＬＡへのサプリメントとして培地に添加する場合の増殖速度特性は大きく異なる。μｍａｘは０．８５ｈ−１（図２Ａ）である。この結果はバイオマスのモニタリングと相関する（図２Ｂ）。ＰＬＡの添加によってバイオマスの生成は変化しない。ほとんど同一の特性、および、ＰＬＡの添加なしまたはありでそれぞれ０．５２ｇ／Ｌおよび０．４７ｇ／Ｌの最大バイオマスを観察することができる。プロテイナーゼＫの存在によって、０．７５ｇ／Ｌの実質的により高い最大バイオマスが得られることを意味する。バイオマスにおけるこの増加は、プロテイナーゼＫによるＰＬＡの加水分解にかかる光学密度（ＯＤ）の干渉には関連しない。
【００８０】
培地の状態に関わらず増殖は培養の４時間半後に停止し、これはグルコースの完全な消費に相当する。
【００８１】
３．４．２  異化バランス
Ｌ．ラクティスＩＬ  １４０３の様々な培養条件は９時間以上動的にモニターされ、最終的な２つのサンプルを１５時間と２４時間とに採取した。
【００８２】
培地におけるグルコース濃度の変化は、３つの培養条件でまったく類似する。グルコースは培養の４時間後に完全に消費される（図３Ａ）。指数関数的増殖段階中（１〜３時間）の比グルコース消費速度に関して、ＰＬＡなしおよびＰＬＡありの培地において非常に近似する。比グルコース消費速度（ｑグルコース）の最大値はそれぞれ２７および２４ｍｍｏｌｅ／ｇ／ｈである。プロテイナーゼＫを培地に添加する時、このｑグルコースは１７ｍｍｏｌｅ／ｇ／ｈに留まる。このｑグルコースの相違はプロテイナーゼＫを含む発酵槽におけるより高いバイオマスと合致する。
【００８３】
ラクテートは主要な発酵生成物である。ＰＬＡおよびプロテイナーゼＫの添加は株のホモ乳酸性質をいかようにも変化させない。９０％以上のピルベートストリームにより乳酸の生成がもたらされるが、７％未満は酢酸の生成に向かう。異化炭素バランスは、代謝によって生成されるＣＯ２を考慮して、８９％〜９５％の間で理論的に平衡になる。培養の２４時間後に算出される炭素のｍＭにおける全体的な当量バランスを以下に記載する。
【００８４】
＊ＩＬ  １４０３
０〜２４時間、１４．２グルコース→２４．７ラクテート＋２．１アセテート＋２．１ＣＯ２
＊ＰＬＡを含むＩＬ  １４０３
０〜２４時間、１４．３グルコース→２３．８ラクテート＋１．５アセテート＋１．５ＣＯ２
＊ＰＬＡおよびプロテイナーゼＫを含むＩＬ  １４０３
０〜２４時間、１４．３グルコース→２３．８ラクテート＋１．５アセテート＋１．５ＣＯ２
全体的に、ラクテート濃度の変化は３つの培養条件における同一の特性に追従するが、ＰＬＡがプロテイナーゼＫを含む場合または伴わない場合に、培養の開始にわずかな差異を伴う（図４Ａ）。実際に、ＰＬＡは熱的な脆弱性または自己加水分解を場合により引き起こしてオートクレーブされた。ＰＬＡ無添加の条件において、この濃度の差異（５ｍＭ未満、図４Ｂ参照）は大きく有意ではない。また、プロテイナーゼＫの存在下または非存在下においても精密に同一であり、ゆえに、プロテイナーゼＫによるＰＬＡの加水分解にいかようにも寄与しない。比ラクテート生産速度に関し（図５）、３つの条件間で有意な差異は認められない。
【００８５】
３．５  結果
ｐＨを制御した発酵槽においておこなわれた該テストにおいて、プロテイナーゼＫによるＰＬＡの乳酸への分解は検出されなかった。ラクテートの生成はグルコースの消費のみが起源になると考えられ、グルコースのｍｍｏｌｅ毎に１．６６〜１．７４ｍｍｏｌｅのラクテートが生成され、この値はこの株に通常見出されるものである。
【００８６】
これは単にＰＬＡデポリメラーゼを乳酸の培養に加えることによって、この方法で生成される乳酸は増加しないということを示す。
【００８７】
〔実施例４：コハク酸塩の生成のための組換え株〕
４．１  ＰＢＳデポリメラーゼを発現するエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株の構築
ＰＢＳデポリメラーゼ（クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｓ−２からのクチナーゼ様酵素（ＣＬＥ））を発現するエスケリキア・コリ株ＳＢＳ５５０  ＭＧ−ＰＨＬ４１３を構築する。ＣＬＥの遺伝子配列は配列番号２で表され、対応するアミノ酸配列は配列番号３で表される。
【００８８】
そのため、ＣＬＥの遺伝子は、クリプトコッカス属Ｓ−２株のゲノムＤＮＡから開始するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって増幅される（Ｍａｓａｋｉ他、２００５年、Ｋａｚｕｏ  Ｍａｓａｋｉ、Ｎｕｍｂｉ  Ｒａｍｕｄｕ  Ｋａｍｉｎｉ、Ｈｉｒｏｋｏ  Ｉｋｅｄａ、およびＨａｒｕｙｕｋｉ  Ｉｅｆｕｊｉ、「Ｃｕｔｉｎａｓｅ−Ｌｉｋｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  Ｓｔｒａｉｎ  Ｓ−２  Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｓ  Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ」、ＡＥＭ、７１、７５４８−７５５０）。
【００８９】
下記のプライマー、
-ＢａｍＨＩ制限部位を備えるセンスプライマー
ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＧＴＣＣＡＧＣＧＣＴＴＧＴＣＣＧ（配列番号６）、
-ＸｈｏＩ制限部位を備えるアンチセンスプライマー
ＣＣＧＧＡＡＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＡＣＣＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＴＧ  （配列番号７）、が用いられる。
【００９０】
同時に、ベクターｐＥＴ２６ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化することで線状化する。
【００９１】
挿入および線状化ベクターは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル上で精製される。リガーゼＴ４（Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）でライゲーションをおこなう。ライゲーション製品をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａ中で形質転換し、そして４０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ−アガー培地上に拡散させる。３７℃で一晩放置した後、１つのコロニーを取り除き、４０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍＬのＬＢ培地中で、３７℃で一晩培養する（１６〜１８時間）。増幅されたベクターは、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製され、配列決定により検証される。
【００９２】
取得されたベクターはｐＥＴ２６ｂ−ＣＬＥを示す。
【００９３】
ベクターｐＥＴ２６ｂ−ＣＬＥをＥ．ｃｏｌｉ  ＳＢＳ５５０ＭＧ-ＰＨＬ４１３株中で形質転換する（Ｓａｎｃｈｅｚ他、２００５、Ａｉｌｅｎ  Ｍ．  Ｓａｎｃｈｅｚ、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｎ．  Ｂｅｎｎｅｔｔ、Ｋａ−Ｙｉｕ  Ｓａｎ、「Ｎｏｖｅｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｙｉｅｌｄ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７、（２００５年）２２９-２３９）。陰性対照はＥ．ｃｏｌｉ  ＳＢＳ５５０ＭＧ-ＰＨＬ４１３中で空のベクターｐＥＴ２６ｂの形質転換により構築される。取得された２つの株は、それぞれＥ．ｃｏｌｉ  ＳＢＳ５５０ＭＧ-ＣＬＥおよびＥ．ｃｏｌｉＳＢＳ５５０ＭＧｐＥＴ２６ｂを示す。
【００９４】
４．２  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＢＳ５５０ＭＧ-ＣＬＥ株の培養によるコハク酸の生成
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＢＳ５５０ＭＧ-ＣＬＥおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＳＢＳ５５０ＭＧｐＥＴ２６ｂ株を、２０ｇ／Ｌのグルコースおよび２０ｇ／ＬのＰＢＳで補完した無機培地中において、２Ｌ発酵槽内で培養する（ビオノーレ（Ｂｉｏｎｏｌｌｅ）１００１、昭和高分子株式会社（日本国、東京）、５００μｍに微細化したもの）。温度を３７℃に維持し、ＫＯＨの添加によりｐＨを６．５にする。好気状態下の第１培養フェーズはバイオマスを生成する。６００ｎｍでの光学密度が０．６に達する時、１ｍＭの最終濃度を得るために、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＳＢＳ５５０ＭＧ-ＣＬＥ株の培養に対応して発酵槽内でのＰＢＳ−デポリメラーゼの生成を誘導するために、ＩＰＴＧ溶液を各発酵槽に添加する。すべてのグルコースが消費されるまで、０．４ｖｖｍのＣＯ２を継続的に注入することによって、嫌気状態下で培養を継続する。
【００９５】
細菌の増殖を測定するため、そして上清の組成を解析するために、一定間隔で培地からサンプルを取る。グルコース濃度およびコハク酸生成を、Ｂｉｏ−ｒａｄ  ＨＰＸ  ８７ＨカラムにおいてＨＰＬＣにより測定する。検出は屈折率測定によりおこなわれる。
【００９６】
実際に、グルコースは発酵中に各株によって消費され、コハク酸が生成される。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＢＳ５５０ＭＧ-ＣＬＥ株の培養の発酵槽は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＢＳ５５０ＭＧ-ＣＬＥ株によって発現されたＣＬＥ（ＰＢＳ−デポリメラーゼ）によるＰＢＳの解重合に対応して高いコハク酸の生成を示す。
【００９７】
〔実施例５：１，３−プロパンジオールの生成のための組換え株〕
５．１  ＰＴＴ−デポリメラーゼを発現するクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）株の構築
クチナーゼＴｆＨに対応する遺伝子Ｂｔａ１はサーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）ＤＳＭ  ４３７９３株から取得されるゲノムＤＮＡから増幅される。クチナーゼＴｆＨのＢｔａ１遺伝子の配列は配列番号４に示され、対応するアミノ酸配列は配列番号５に示される。同時に、クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４からのセルラーゼのシグナルペプチドＰＳ−Ｃｅｌ４８Ａ（Ｃｅｌ４８Ａ、Ｓａｂａｔｈe，Ｆ．、Ａ．ＢｅｌａｉｃｈおよびＰ．Ｓｏｕｃａｉｌｌｅ．２００２年、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘ  （ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅ）  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２１７：１５-２２）をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって増幅した。
【００９８】
発現ベクターｐＳＯＳ９５２（Ｐｅｒｒｅｔ，Ｓ．、Ｃａｓａｌｏｔ，Ｌ．、Ｆｉｅｒｏｂｅ  Ｈ．Ｐ．、Ｔａｒｄｉｆ，Ｃ．、Ｓａｂａｔｈｅ，Ｆ．、Ｂｅｌａｉｃｈ，Ｊ．Ｐ．、およびＢｅｌａｉｃｈ，Ａ．、２００４年、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｓ  ｂｙ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８６、２５３-２５７）は、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮａｒ  Ｉで消化することによって線状化される。
【００９９】
最後に、上述のシグナルペプチドＰＳ−Ｃｅｌ４８Ａの遺伝子Ｂｔａ１を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて線状化ベクターにクローン化する。取得されるベクターはｐＳＯＳ９５２−ｂｔａ１を示す。
【０１００】
ベクターｐＳＯＳ９５２−ｂｔａ１は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２２７５（ｐＡＮ１）内に導入されるので、ＭｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎおよびＰａｐｏｕｔｓａｋｉｓ（１９９３年）ならびにＧｒｅｅｎ等（１９９６年）による著述の方法を用いてメチルトランスフェラーゼφ３Ｔ  Ｉによってメチル化されることが可能である。精製後、クロストリジウム・アセトブチリカムＤＧ１（ｐＳＰＤ５）（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、２００５年）株内にエレクトロポレーションによってプラスミドを導入する。取得される組換え株は、Ｃ．アセトブチリカムＤＧ１−ｐＳＯＳ９５２−ｂｔａ１を示す。
【０１０１】
対照株（陰性対照）をクロストリジウム・アセトブチリカムＤＧ１（ｐＳＰＤ５）内におけるベクターｐＳＯＳ９５２の導入によって構築する。
【０１０２】
５．２．  Ｃ．アセトブチリカムＤＧ１−ｐＳＯＳ９５２−ｂｔａ１株の培養による１，３−プロパンジオールの生成
取得された２つの株の前培養は、炭素源としてのグリセリン１０ｇ／Ｌを含む合成培地上において３５℃で、嫌気状態下でおこなわれる（密封フラスコおよび窒素内、Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、２００５年）。各前培養は、６００ｎｍにおいてｔ０で０．０５と等しい吸光度を有するように、２５０ｍＬ発酵槽の播種に用いられる。培地は、５０ｇ／ＬのグリセリンおよびＰＴＴ（ポリトリメチレンテレフタレート、５００μｍに微細化したソロナ（Ｓｏｒｏｎａ）、デュポン社）で補完された、Ｇｏｎｚａｌｅｚ等の著述（２００５年）による合成培地により構築され、窒素雰囲気下において嫌気状態で保持される。発酵槽のｐＨをＮＨ４ＯＨの添加により６．５に保持する。
【０１０３】
細菌の増殖を測定するため、そして上清の組成を解析するために、一定間隔で培地のサンプルを取り出す。グリセリンの濃度および１，３−プロパンジオールの生成を、Ｂｉｏ−ｒａｄ  ＨＰＸ  ９７ＨカラムにおいてＨＰＬＣにより測定する。検出は屈折率測定によりおこなわれる。
【０１０４】
発酵中、グリセリンは実際に各株によって消費され、１，３−プロパンジオールおよびアセテートが生成される。Ｃ．アセトブチリカムＤＧ１−ｐＳＯＳ９５２−ｂｔａ１株の培養に対応する発酵槽は、１，３−プロパンジオールのより高い生成、および培地に分泌されるＰＴＴ−デポリメラーゼによるＰＴＴの解重合に該当するテレフタル酸の生成を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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