(57)【要約】  本発明は、ワイヤグリッド上での試薬循環を用いたＤＮＡシーケンシングに関する。そのシーケンシングアプローチは、洗浄ステップを必要とすることなく単一の流体を使用するのを可能にするアプローチで提案されている。励起光及び切断光の強い光閉じ込めに基づき、基板を洗浄することなく、シーケンシング反応を読み取ることができる。段階的なシーケンシングが、光学的に切断可能なブロッキング部分を有したヌクレオチドを使用することによって達成される。読み取り後、組み込まれたヌクレオチドは、同じ基板を通った切断光によって非ブロック化される。これは、結合したヌクレオチドのみが非ブロック化されるのを確実にする。
2015503357.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸シーケンシングを光学的に制御するため、特に、反復性の段階的な反応を光学的に制御して、合成によって核酸の配列を決定するための装置であって、
基板であり、該基板の第１の表面上に少なくとも１つの分子を結合させるための基板と、
光学装置と、
を含み、
前記光学装置は、少なくとも第１の励起波長λＥｘ１の励起光を前記基板に向けて、前記基板の第１の表面上に結合した前記分子内に取り込まれた第１のヌクレオチドの蛍光ラベルを励起させるように構成され、
前記光学装置は、前記結合した分子内に取り込まれた第１のヌクレオチドの蛍光ラベルによって放射される蛍光を受信及び検出するように構成され、
前記光学装置は、切断波長λＣＬの切断光、好ましくは紫外線を前記基板に向けて、前記第１の取り込まれたヌクレオチドにて光化学的切断反応を光学的に誘導し、前記第１の取り込まれたヌクレオチドからブロッキング部分及び前記蛍光ラベルを切断するように構成され、
前記基板は、前記励起光を閉じ込めるように構成され、さらに、前記基板の第１の表面にて前記励起光のエバネッセント波を定めるように構成され、さらに、
前記基板は、前記切断光、好ましくは紫外線を閉じ込めるように構成され、さらに、前記基板の第１の表面にて切断光のエバネッセント波を定めるように構成される、装置。
【請求項２】
前記基板の第１の表面に結合した前記分子と
複数のヌクレオチド及び酵素を有した溶液と、
をさらに含み、
前記ヌクレオチドはそれぞれ、ブロッキング部分を含み、
前記ブロッキング部分は、それぞれの前記ヌクレオチドが、前記第１の表面に結合した分子内に取り込まれた場合に、前記酵素の合成活性をブロックするように構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記ブロッキング部分は、光切断可能な３′−非ブロック化可逆性ターミネーターである、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記ブロッキング部分は、ニトロフェニルエチルの誘導体、５−メチル（２−（２−ニトロフェニル）プロピル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログ、５−メチル（２−オキソ−１，２−ジフェニルエチル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログ、及び、そのいかなる組み合わせも含む群から選ばれる、請求項２に記載の装置。
【請求項５】
前記基板は、前記励起光に対する、及び、前記切断光に対するワイヤグリッドとして構成される、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記切断反応には時間ｔ切断がかかり、
前記切断反応時間ｔ切断は、照射される前記切断光の強度次第であり、
前記結合した分子内への第２のヌクレオチドの取り込みには、時間ｔ取り込みがかかり、さらに、
前記光学装置は、ｔ切断＜ｔ取り込みであるように強度を有した前記照射される切断光を提供するように構成される、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
前記基板は、第１の方向に沿って前記第１の表面に分子を結合させるための、いくつかの隣接する結合位置を含み、
当該装置は、前記第１の方向に沿って互いに相対的に前記基板及び前記光学装置を動かすことによって光学走査を行うように構成され、さらに、
当該装置は、各結合位置が、前記第１の方向に沿った動きにおいて、第一に、前記少なくとも第１の波長λＥｘ１の励起光で照射され、後に第二に、前記切断波長λＣＬの切断光で照射されるように前記光学走査を行うよう構成される、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
当該装置は、前記結合した分子のヌクレオチドの配列に相補的な配列を有するヌクレオチドの取り込みを段階的且つ光学的に誘導するように構成され、
当該装置は、前記結合した分子内に取り込まれた前記ヌクレオチドの配列を段階的且つ光学的に読み取る及び決定するように構成され、さらに、
当該装置は、前記取り込まれたヌクレオチドの配列の決定を、それぞれの前記取り込まれたヌクレオチドの蛍光ラベルによって放射され、受信及び検出したそれぞれの蛍光に基づかせるように構成される、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
核酸シーケンシングを光学的に制御するため、特に、反復性の段階的な反応を光学的に制御して、合成によって核酸の配列を決定するための方法であって、
基板を提供するステップであり、前記基板の第１の表面上に分子が結合した基板を提供するステップと、
光学装置によって、少なくとも第１の励起波長λＥｘ１の励起光で前記基板を照射し、その結果、前記基板上の結合した分子内に取り込まれた第１のヌクレオチドの蛍光ラベルを光学的に励起するステップと、
前記基板によって前記励起光を閉じ込め、その結果、前記基板の第１の表面にて、前記基板によって前記切断光のエバネッセント波を定めるステップと、
前記光学装置によって、前記第１の取り込まれたヌクレオチドの前記励起された蛍光ラベルの蛍光を受信及び検出するステップと、
前記光学装置によって、切断波長λＣＬの切断光、好ましくは紫外線で前記基板を照射し、その結果、前記第１の取り込まれたヌクレオチドにて光化学的切断反応を光学的に誘導するステップと、さらに、
前記基板によって前記切断波長λＣＬの切断光を閉じ込め、その結果、前記基板の第１の表面にて、前記基板によって前記切断光のエバネッセント波を定めるステップと、
を含む方法。
【請求項１０】
複数のヌクレオチド及び酵素を有した溶液を提供するステップであって、前記ヌクレオチドはそれぞれ、前記蛍光ラベルを含むブロッキング部分を含む、ステップと、
前記それぞれのヌクレオチドが、前記第１の表面に結合した前記分子内に取り込まれた場合に、前記ブロッキング部分によって前記酵素の合成活性をブロックするステップと、
をさらに含み、
光化学的切断反応を引き起こすステップが、前記蛍光ラベルを含むブロッキング部分が、前記取り込まれたヌクレオチドから切断されるように行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ブロッキング部分が、ニトロフェニルエチルの誘導体、５−メチル（２−（２−ニトロフェニル）プロピル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログ、５−メチル（２−オキソ−１，２−ジフェニルエチル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログ、及び、そのいかなる組み合わせも含む群から選ばれるステップをさらに含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記基板が、いくつかの隣接する分子結合位置を含み、該位置にて、分子が、第１の方向に沿って前記第１の表面にそれぞれ結合する、請求項９乃至１１のいずれか一項に記載の方法であって、
前記第１の方向に沿って互いに相対的に前記基板及び前記光学装置を動かすことによって光学走査を行うステップと、
各結合した分子が、前記第１の方向に沿った動きにおいて、第一に、前記少なくとも第１の波長λＥｘ１の励起光で照射され、後に第二に、前記切断波長λＣＬの切断光で照射されるように前記光学走査を行うステップと、
をさらに含む方法。
【請求項１３】
前記切断反応には時間ｔ切断がかかり、
前記切断反応時間ｔ切断は、照射される前記切断光の強度次第である、請求項９乃至１２のいずれか一項に記載の方法であって、
前記結合したＤＮＡ分子内に第２のヌクレオチドを取り込むステップであり、前記取り込みには、時間ｔ取り込みがかかる、ステップと、
ｔ切断＜ｔ取り込みであるように、前記照射される切断光の強度を前記光学装置にて選択するステップと、
をさらに含む方法。
【請求項１４】
ＤＮＡシーケンシングを光学的に制御するため、特に、反復性の段階的な反応を光学的に制御して、合成によって核酸の配列を決定するためのプログラム要素であって、当該プログラム要素は、プロセッサによって実行される場合に、
光学装置によって、少なくとも第１の励起波長λＥｘ１の励起光で基板を照射し、その結果、前記基板の第１の表面上に結合した分子内に取り込まれた第１のヌクレオチドの蛍光ラベルを光学的に励起するステップと、
前記基板によって前記励起光を閉じ込め、その結果、前記基板の第１の表面にて、前記基板によって前記励起光のエバネッセント波を定めるステップと、
前記光学装置によって、前記第１の取り込まれたヌクレオチドの前記励起された蛍光ラベルの蛍光を受信及び検出するステップと、
前記光学装置によって、切断波長λＣＬの切断光、好ましくは紫外線で前記基板を照射し、その結果、前記第１の取り込まれたヌクレオチドにて光化学的切断反応を光学的に誘導するステップと、
前記基板によって、前記切断波長λＣＬの切断光を閉じ込め、その結果、前記基板の第１の表面にて、前記基板によって前記切断光のエバネッセント波を定めるステップと、
を実行するよう適応されるプログラム要素。
【請求項１５】
ＤＮＡシーケンシングを光学的に制御するため、特に、反復性の段階的な反応を光学的に制御して、合成によって核酸の配列を決定するためのコンピュータプログラムが記憶されるコンピュータ可読媒体であって、前記コンピュータプログラムは、プロセッサによって実行される場合に、
光学装置によって、少なくとも第１の励起波長λＥｘ１の励起光で基板を照射し、その結果、前記基板の第１の表面上に結合した分子内に取り込まれた第１のヌクレオチドの蛍光ラベルを光学的に励起するステップと、
前記基板によって前記励起光を閉じ込め、その結果、前記基板の第１の表面にて、前記基板によって前記励起光のエバネッセント波を定めるステップと、
前記光学装置によって、前記第１の取り込まれたヌクレオチドの前記励起された蛍光ラベルの蛍光を受信及び検出するステップと、
前記光学装置によって、切断波長λＣＬの切断光、好ましくは紫外線で前記基板を照射し、その結果、前記第１の取り込まれたヌクレオチドにて光化学的切断反応を光学的に誘導するステップと、
前記基板によって、前記切断波長λＣＬの切断光を閉じ込め、その結果、前記基板の第１の表面にて、前記基板によって前記切断光のエバネッセント波を定めるステップと、
を実行するよう適応される、コンピュータ可読媒体。
【請求項１６】
ＤＮＡシーケンシングにおける、ブロッキング部分としての部分の使用であって、
前記部分は、ニトロフェニルエチルの誘導体、５−メチル（２−（２−ニトロフェニル）プロピル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログ、５−メチル（２−オキソ−１，２−ジフェニルエチル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログ、及び、そのいかなる組み合わせも含む群から選ばれる、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の配列の決定に関する。特に、本発明は、反復性の段階的な反応を光学的に制御して核酸の配列を決定するための装置、反復性の段階的な反応を光学的に制御して核酸の配列を決定するための方法、プログラム要素、プログラム要素が記憶されるコンピュータ可読媒体、及び、ＤＮＡシーケンシングにおけるブロッキング部分としての部分の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡシーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（Ｓｏｌｅｘａ技術を使用）、Ｌｉｆｅ社（Ｓｏｌｉｄ技術を使用）及びＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（４５４技術を使用）等のキープレーヤーと共に急速に発展している分野である。これらの会社が使用するシーケンシング方法の欠点は、配列情報が、試薬の交換及び洗浄を伴ういくつかのステップの反復によって得られるということである。これは、厄介且つ時間がかかり、多くの高価な試薬を無駄にする。反復の数は、調べられるヌクレオチドの数、すなわち、リード長に等しい。リード長を増やすという願望と共に、この問題は、将来より苛酷になる。現在のところ、これは、大きなアレイ上での超並列シーケンシングによって補われている。しかし、臨床用途に対して、これはあまり所望されない。むしろ、速い回答及びより低い多重化を有するほうがいい場合もある。同時に、塩基対あたりのコストは、著しく下がっていなければならない。全てのステップの後、すなわち、ヌクレオチド取り込み後、表面全体が洗浄される必要があるため、全試薬が結局無駄になる。総試薬消費はリード長に比例し、今のところ、シーケンシングの顕著なコスト要因である。
【０００３】
例えばＤＮＡ等の特定の標的を配列決定するプロセスは、取り込み反応の後に活性化反応を必要とし、さらに、その間に念入りな洗浄ステップが要求されるため、より複雑になっている。
【０００４】
Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のもののような別のアプローチは、全ての分子に対して別々に、リアルタイムでのヌクレオチドの取り込みを求めるため、より効率的である。この方法において、洗浄は要求されない。そのようなシステムに対する光学的要求は、一方で、４つの異なる色に対してリアルタイムでの単一のフルオロフォア感度を必要とするため、非常に苛酷である。これは、高倍率を用いた対物レンズの視野が実用的なシステム及び強いレーザー光源に対して制限されるため、制限された領域に対してのみ達成することができる。制限された領域を用いて、試料の小さな選択部分のみを配列決定することができ、さらに、読取りしそこなったものによるエラーのリスクは高い。ラベルされたヌクレオチドからの蛍光信号は、ヌクレオチドがポリメラーゼによって組み入れられながら、偶然同じ位置にある同じ種類の分子のものから識別される必要がある。これは、蛍光信号のパルス長を分析することによって行われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
改善された核酸の配列の決定を提供する必要があり得る。本発明はこの必要性に応じる。
【０００６】
本発明の目的は、改善された核酸の配列の決定を定めるとして見ることができる。
【０００７】
本発明の目的は、独立請求項の発明特定事項によって解決される。本発明のさらなる実施形態及び利点が、従属請求項に組み込まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書において記載される実施形態は、同様に、反復性の段階的な反応を光学的に制御して核酸の配列を決定するための方法、反復性の段階的な反応を光学的に制御して核酸の配列を決定するための装置、コンピュータプログラム要素、コンピュータ可読媒体、及び、ＤＮＡシーケンシングにおけるブロッキング部分としての部分の使用に関連するということに留意されたい。相乗効果が、実施形態の種々の組み合わせから生じてもよく、それらは、詳細に記載されていなくてもよい。
【０００９】
この先、方法に関する本発明の全ての実施形態が、記載されたステップの順で実行されてもよく、それでも、これは、唯一及び必要な方法のステップの順ではないということに留意されたい。方法のステップの異なる順及び組み合わせは全て、本明細書において記載される。
【００１０】
本発明と関連して、「ブロッキング部分」という用語は、酵素が合成プロセスを行う分子内にブロッキング部分が取り込まれる場合に、酵素の合成活性をブロックする部分として理解されることになる。ブロッキング部分は、例えばブロッキング分子であってもよい。
【００１１】
本発明と関連して、「切断可能な」という用語は、波長λＣＬの切断光（ｃｌｅａｖａｇｅ  ｌｉｇｈｔ）を吸収することによって切断されるのを可能にするとして理解されるべきである。
【００１２】
本発明と関連して、本明細書において開示される光学装置の全ての実施形態は、偏光励起光及び偏光切断光を放射するように構成されてもよいということが理解されるべきである。従って、偏光子又はすでに偏光された光源を使用してもよい。詳細は後に記載される。
【００１３】
さらに、本発明と関連して「励起光」という用語は、波長λＥｘ１、λＥｘ２、λＥｘ３及びλＥｘ４それぞれにあてはまる。
【００１４】
本発明の例証的な実施形態によると、ＤＮＡ配列を光学的に制御するための装置が示されている。特に、当該装置は、反復性の段階的な反応を光学的に制御して、合成によって核酸の配列を決定するように構成される。或いは、合成によるシーケンシングの代わりに、ライゲーションによる合成も、本発明の範囲において理解されることになる。示される装置は基板を含み、基板の第１の表面上に少なくとも１つの分子を結合するためのものである。当該装置は、少なくとも第１の励起波長λＥｘ１の励起光を基板に向けて、基板の第１の表面上に結合した分子内に取り込まれた第１のヌクレオチドの蛍光ラベルを励起させるように構成される光学装置をさらに含む。光学装置は、結合した分子内に取り込まれた第１のヌクレオチドの蛍光ラベルによって放射される蛍光を受信及び検出するようさらに構成される。さらに、光学装置は、切断波長λＣＬの切断光、好ましくは紫外線を基板に向けて、第１の取り込まれたヌクレオチドにて光化学的切断反応を光学的に誘導し、第１の取り込まれたヌクレオチドからブロッキング部分及び蛍光ラベルを切断するように構成される。さらに、基板は、励起光を閉じ込めるように構成され、従って、基板の第１の表面にて励起光のエバネッセント波を定めるように構成される。さらに、基板は、切断光、好ましくは紫外線を閉じ込めるように構成され、基板の第１の表面にて切断光のエバネッセント波を定めるようさらに構成される。
【００１５】
次に、既知のシーケンシング装置の利点を組み合わせることができる装置が提案される。当該装置は、アンサンブルベースの容易な読取りを可能にするが、洗浄ステップは要求されないか又は減少した数の洗浄ステップが要求され、全読取りに対する単一の試薬の充填を意味している。
【００１６】
言い換えると、単一の流体でシーケンシングを実行するのを可能にする、及び、洗浄ステップは要求されないか又は減少した数の洗浄ステップが要求されるシーケンシング装置が、本発明によって示されている。要求される試薬の量、すなわちコストは、リード長（５０乃至１００）に等しい因子によって減らされる。基板、すなわち、ワイヤグリッドのようなナノフォトニックな表面構造体上の励起光の強い閉じ込めに基づき、シーケンシング反応は、表面を洗浄することなく読み取ることができる。全反射を使用して、エバネッセント波を提供してもよい。
【００１７】
段階的なシーケンシングは、光学的に切断可能なブロッキング群を有したヌクレオチドを使用することによって達成される。読取り後、組み込まれたヌクレオチドは、同じナノフォトニックな基板を通る例えば紫外線のような切断光によって非ブロック化される。これは、結合したヌクレオチドのみが非ブロック化されるということを確実にする。ＤＮＡシーケンシングのコスト及び速度は、試薬の消費に強く関係する。その速度、並びに、シーケンシングワークステーション、道具、及びカートリッジの複雑さは、主として、反復反応及び洗浄ステップに対する流体の取扱いの必要性によって決定される。どちらの態様も、本発明によって改善され、シーケンシングの劇的な例証及びコスト削減をもたらす。
【００１８】
以下において詳細に説明されるように、当該光学装置は、第１、第２、第３及び第４の励起波長λＥｘ１、λＥｘ２、λＥｘ３及びλＥｘ４の励起光を基板に向けて、基板の第１の表面上に結合した分子内に取り込まれた第１のヌクレオチドの蛍光ラベルを励起するように構成されてもよい。その結果、例えばアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及びシトシン（Ｃ）のような例えば４つの異なるヌクレオチドを、それぞれのヌクレオチドが特定及び差別化された蛍光ラベルを使用する場合に区別することができるということを確実にすることができる。しかし、所望される場合、上記の４つの励起波長λＥｘ１、λＥｘ２、λＥｘ３及びλＥｘ４のうち１つ、２つ又は３つのみ、当該装置によって基板の方に向け、分子、すなわち、結合した分子内に取り込まれたヌクレオチドの蛍光ラベルを励起することもできる。上記のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及びＴに対する４つの異なる蛍光ラベルが使用される４つのカラーシステムについての詳細は、以後、以下の図１及び２に関してより詳細に説明される。結合した分子は、ＤＮＡ断片であってもよく、さらに、本発明によってヌクレオチドの配列が決定される核酸として理解することができる。
【００１９】
さらに、配列決定又はＤＮＡ配列決定する当業者は、波長λＥｘ１、λＥｘ２、λＥｘ３及びλＥｘ４は、例えばヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及びＴに対して使用される４つの蛍光ラベルと組み合わせて選ばれるという事実に気付く。言い換えると、波長は、使用される蛍光ラベルを、考慮された励起光によって光学的に励起することができるように選ばれる。さらに、波長λＣＬは、使用されるヌクレオチドの所望された切断反応を、前記切断光を照らすことによって光学的に引き起こすことができるように選ばれる。
【００２０】
例証的な実施形態として、当業者は明白に開示された波長から離れるかもしれないけれども、以下の波長を使用してもよい。励起波長は、以下のもの、すなわち、可視スペクトルにわたる、及び、例えばＦＡＭ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００若しくはＡｔｔｏ７００、又は類似のもの等、最も一般的に使用される色素の吸収スペクトルに従った励起波長の最適な間隔に基づき選んでもよい。励起波長は、例えば４０５、５３２、６３３及び７８０ｎｍを有した、例えば固体レーザーの光源のような光源の有効性に適合させることもできる。しかし、本発明は、前記励起波長に限定されない。それぞれの色素の発光極大は、隣接の励起波長との重複が発生しないように選んでもよい。さらに、切断光、好ましくは紫外線は、２５０乃至４００ｎｍ、好ましくは３００乃至３７０ｎｍの範囲にあってもよい。しかし、本発明は、前記励起波長に限定されない。
【００２１】
基板の第１の表面にて結合した分子は、例えば、ＤＮＡ断片、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ又は別の核酸であってもよいということに留意されたい。さらに、本明細書において後に記載される酵素も、基板の第１の表面に結合されてもよい。本発明と関連して、「結合した」という用語は、基板の第１の表面に要素が固定化される状態として理解されるべきである。
【００２２】
加えて、当該基板は、蛍光を検出することによって受信される光信号を増やすために同一の分子のクローンで覆うことができるスポットを定める。従って、基板は、シーケンシングの処理量が増加するようにそれぞれ異なるクローンを有したそのようなスポットのアレイとして提供されてもよい。
【００２３】
言い換えると、先に示した本発明の装置は、合成によって核酸の配列を決定する全プロセスを、基板上で単一の溶液において実行することができるように、洗浄ステップを必要としないアセンブリベースの光学的なシーケンシングプロセスを可能にする。当該プロセスのステップは、光学的に制御することができる。本発明において活性化として理解されるべきである、取り込まれたヌクレオチドの非ブロック化のプロセスは、切断光の表面選択的なエバネッセント放射物の照射によって実行することができる。好ましくは、そのような照射は、紫外線で行われる。当該プロセスは、切断波長λＣＬの切断光を基板に向けて、第１の取り込まれたヌクレオチドにて光化学的な切断反応を光学的に誘導するとして記載される。従って、示される装置は、切断光のエバネッセント波で基板を照射することによって、第１の取り込まれたヌクレオチドから蛍光ラベルのみを切断するように構成される。従って、取り込まれたヌクレオチドのみが、切断光のエバネッセント場の局在化により、非ブロック化、活性化、又は切断される。同じエバネッセント場の照明が、溶液中の蛍光ラベルの背景に対して、取り込まれた塩基又はヌクレオチドの蛍光を読み取るために、示される装置によって使用される。少なくとも第１の励起波長λＥｘ１を含む励起光の光場の局在化は、前記励起光のエバネッセント場によって達成される。
【００２４】
例えば、切断光のエバネッセント波及び励起光のエバネッセント波は、ワイヤグリッドを定めることによって、示される装置の基板によって生成することができる。これは、フォトオプティカル反応が、表面と非常に近い非常に限られた領域において高速で発生するように、高い強度の集束ビームを使用することを可能にし得る。光学装置は、蛍光の励起及び検出、すなわち読取りのためのそれぞれの光学的要素、並びに、非ブロック化、すなわち活性化のためのそれぞれの光学的要素を、単一の光学装置ユニットにおいて含んでもよく、又は、物理的に差別化された要素において包含されてもよい。
【００２５】
さらに、それぞれの励起光源は、当該光学装置によって含まれてもよい。さらに、切断光を放射するための光源は、当該光学装置によって含まれてもよい。切断のための照明、すなわち非ブロック化及び読取り、すなわち蛍光の励起及び検出のための照明は、任意選択で、同じレンズを介して生じ得る。しかし、所望であれば、非ブロック化及び読取りのための２つの異なる光学的機構も示すことができる。
【００２６】
本発明において使用されるエバネッセント波・場は、第１の表面からの距離と共に指数関数的に減衰し、その減衰長は、金属ワイヤ間の開口部が適切な波長での光学解像度よりも小さい状況下での、例えば金属等のワイヤグリッドの材料及びワイヤ間の媒質の材料の複素屈折率次第である。例えば、開口部は、紫外線に対する限度をかなり下回る７０ｎｍであってもよい。減衰長は、１６．８ｎｍ（以下を参照）として推定され、これは、場が、金属ワイヤ及び基板のインターフェースからのその距離での照射強度の１／ｅまで減らされたということを意味している。これは、ワイヤ間の第１の表面のアンダー・エッチングにより、第１の表面とはわずかに異なってもよい。
【００２７】
言い換えると、示される装置は、表面選択的切断光照射及び励起光照射の表面を定める。基板は、上記の励起光及び切断光の光閉込め、さらに、切断光及び励起光のエバネッセント波が生成されるように、ナノフォトニックな表面構造体として構成してもよい。特に、励起光、すなわち読取りオプティクスと切断光との組み合わせは、反復性の段階的な反応を可能にし、合成によって核酸の配列を決定する。これは、洗浄ステップを省くことができるという利点を有している。後に、示される装置を用いて行われる上記のステップ及びサイクルを何度も繰り返して、結合した分子内への段階的な１つ以上のさらなるヌクレオチドの取り込み及びその後の、前記ヌクレオチドが上記のように取り込まれたか否かの読取りを可能にすることができる。
【００２８】
当該装置は、当該装置によって光学的に制御される光学的に段階的な作用に基づき、結合した分子内に取り込まれた核酸の差を述べるデータを得るようさらに構成してもよい。
【００２９】
さらに、基板は、例えばポリ−（シクロ−）オレフィン、ポリカーボネート、ポリエステル又はＰＭＭＡ等のポリマーを材料としてもよい。金属及び半導体も使用することができる。
【００３０】
本発明の別の例証的な実施形態によると、当該装置は、基板の第１の表面に結合する分子をさらに含む。当該装置は、複数のヌクレオチド及び酵素を有した溶液をさらに含む。その点で、ヌクレオチドは、ブロッキング部分をそれぞれ含む。ブロッキング部分は、当該装置の第１の表面に結合した分子内にそれぞれの部分が取り込まれる場合に、酵素の合成活性をブロックするように構成される。
【００３１】
所望であれば、ブロッキング部分は蛍光ラベルを含む。しかし、ブロッキング部分及び蛍光ラベルは、異なる位置での第１のヌクレオチドにて取り込まれるか、又は、そこに置かれてもよい。ブロッキング部分及び蛍光ラベルは、単一の切断プロセスにおいて、又は、異なる切断プロセスにおいて切断されてもよい。これは、本発明の全ての実施形態に適用される。
【００３２】
本明細書において示される実施形態は、取り込みの反応が、含まれたブロッキング部分により、それ自体で停止するという利点を定める。例えば、立体障害をブロッキング部分によって使用して、酵素の合成活性をブロックすることができる。これは、多くのスポットで同時に発生している反応の局所的な読取りを行うことを可能にする。従来技術においては、装置内の試料における使用される酵素の作用は、同時に発生することはできない。しかし、本発明はヌクレオチドの取り込みを可能にし、それは、全てのステップの後に読取りと共に段階的に有利に行うことができる。その利点は、ヌクレオチドが取り込まれた後に酵素の活性をブロックする、ブロッキングヌクレオチドであってもよい上記のブロッキング部分を使用することによって達成される。活性な非ブロッキング化は、次のヌクレオチドの取り込みと共に続くように要求され、それは、本発明が、ブロッキング部分を切断するよう切断光を向けるように構成される光学装置によって可能にする。ブロッキング部分は、蛍光ラベルを含んでもよい。
【００３３】
例証的な実施形態として、ブロッキング部分は、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｌ．Ｍｅｔｚｋｅｒによる“Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１（２０１０）、３１〜４６において記載及び規定されているように、３′−ブロックされた可逆性ターミネーターとして、又は、３′−非ブロック化可逆性ターミネーターとして具体化することができる。その点で、「非ブロック化された」とも呼ばれる前記ブロッキング部分の３′−非ブロック化可逆性ターミネーターは、酵素の活性をブロックするとして使用することができる。可逆性ターミネーターは、取り込み後のいかなる後のヌクレオチドの取り込みも停止するヌクレオチド／リボースユニットに付着したリガンドとして理解することができる。可逆性ターミネーターは、化学的又は光化学的手段による切断と同時にこのプロセスを無効にすることができ、さらに、ポリメラーゼが次のヌクレオチドを組み入れることができる場合に可逆的である。さらに、Ｍｅｔｚｋｅｒ等の３′−ブロックされた可逆性ターミネーターは、例えば化学的に改良して、それらを光切断可能にすることができる。次に、切断光を用いた光切断を、本発明によって行うことができる。加えて、後に記載されるように、他の複合体を、それぞれの酵素と組み合わせたブロッキング部分として使用してもよい。当業者は、どの酵素とブロッキング部分との組み合わせが、酵素の合成活性をブロックするという所望の効果をもたらすかということを知っている。
【００３４】
本明細書において使用される、前記ブロッキング部分に関する専門用語は、当該論文の開示に応じ且つ該開示に適応される。前記部分の第２の分類は、リボースユニットの３′−位置がブロックされず、次のヌクレオチドの取り込みが、リボースユニットの５′−位置での塩基対部分に付着した蛍光ラベルも含有する巨大な基（ｂｕｌｋｙ  ｇｒｏｕｐ）によって防がれている場合のように、さらなる利点のものである。これは、以下の図６及びその説明から推測することもできる。ヌクレオチドオリゴマーの普及は、この基が付着している限り防がれる。しかし、次のヌクレオチドの取り込みは、巨大な基の除去後に可能にされる。本発明は、光化学的切断反応を誘導することによって、そのような除去を定める。より有利には、本発明は、そのような切断反応を、切断光のエバネッセント波が生成されるという事実のために、分子が結合する表面の非常に近くのみで使用する。
【００３５】
以下の説明に加えて、蛍光ラベルを含んだブロッキング部分が開示されている図６、８及び１０に関する詳細を考慮に入れるべきである。
【００３６】
本発明の別の例証的な実施形態によると、ブロッキング部分は、光切断可能な３′−非ブロック化可逆性ターミネーターである。
【００３７】
別の例証的な実施形態によると、ブロッキング部分は、ニトロフェニルエチルの誘導体、５−メチル−（２−（２−ニトロフェニル）プロピル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログ、５−メチル（２−オキソ−１，２−ジフェニルエチル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログ、及び、そのいかなる組み合わせも含む群から選ばれる。
【００３８】
別の例証的な実施形態によると、基板は、励起光のため及び切断光のためのワイヤグリッドとして構成される。
【００３９】
ワイヤグリッドは、例えばガラス基板の上の金属ワイヤのパターンを含んでもよい。ワイヤ間のスペーシングは、主要な寄与が２つの基本モードから生じる金属被覆スラブ導波路として作用する。例えば、本発明の基板のワイヤ上へのＴＥ偏光励起光入射に対して、ワイヤ間の結果として生じるモードは、λ＝６３０ナノメートルに対して１６．８ナノメートルの例証的な減衰長を有するエバネッセントモードである。その点で、水の屈折率、ｎ＝１．３３を有する媒質で基板のワイヤは満たされていると仮定する。ＴＭ偏光に対して、ワイヤグリッドのための結果として生じるモードは、普及モードと呼ばれ、この例において１．２μｍの減衰長を有する。例えば、ワイヤの高さは、例において６０ナノメートルであってもよい。その点で、ＴＭ偏光モードは、約１０％以下の光の損失で伝えられるが一方、ＴＥ偏光モードは、弱まって減衰する。
【００４０】
ワイヤグリッドを理解するための異なる方法は、ワイヤと平行の偏光（ＴＥ偏光）を有した励起光を反射する、及び、ワイヤと直交の偏光（ＴＭ偏光）を伝える金属として例えばアルミニウムワイヤを考えることである。ＴＭ偏光の最大伝達は、９５％よりも高くあり得る。入射ＴＥ励起光の場合のエバネッセント場が、図３ａにおいても３ｂにおいても描かれている。本発明の光学装置によって照射される励起光及び切断光は、本発明のこの実施形態及び全ての他の実施形態においてそのような偏光のものであってもよい。
【００４１】
当業者は、明白に、使用するワイヤグリッドの幾何学的パラメータは、当該光学装置によって照射される励起光及び切断光に適応されることになるということを、先において示した説明から見出す。例えば、ワイヤ間のワイヤグリッドの開口部が適切な波長での光学的解像度よりも小さくあるべきである、すなわち開口部＜＜光学的解像度〜λ／２ＮＡである状態である。以下の図と関連して、開口部は、スリットのような隙間と呼ばれる。
【００４２】
示される装置のワイヤグリッド基板の使用は、極度な光閉込めを定める。次のヌクレオチドの取り込みの継続を防ぐためのヌクレオチド上のいわゆるブロッキング部分を分離するために使用される速い光化学的切断と組み合わせて、指摘されてきた利点が実現される。ワイヤグリッドの使用は、大部分は、入射における角度次第であるというさらなる利点を有する。従って、集束ビームと組み合わせて使用し、局所的に高い強度を、残りを暗い箇所で維持しながら達成することができる。言い換えると、ワイヤグリッドは、エバネッセント場における表面に非常に近い例えばＤＮＡ断片等のそれらの分子のみを励起すること、及び、該分子のみに感受性があることを可能にし、従って、エバネッセント場の外側にあるいかなるラベルヌクレオチドの検出又は該ヌクレオチドに対する効果は引き起こされない。例えば、エバネッセント場は、基板の第１の表面から約２０ナノメートル長くなり得る。これは、励起光及び切断光両方に対するケースであってもよい。
【００４３】
ワイヤグリッド基板は、第１の表面とは反対の第２の表面を含み、さらに、当該光学装置は、励起光及び切断光で基板の第２の表面を照射するように構成される。言い換えると、当該光学装置における基板は、切断光及び励起光が基板の第２の表面に向かって直接向けられるように、互いに相対的に置かれる。これは、基板の逆放射として見ることができる。前面、すなわち第１の表面には、規則的なワイヤ構造が、ワイヤグリッドによって示されている。規則的な金属ワイヤ間、すなわち、ワイヤグリッド間の空間には、例えばＤＮＡ断片等の分子が結合又は固定化される。
【００４４】
本発明と関連して「励起光」という用語は、波長λＥｘ１、λＥｘ２、λＥｘ３及びλＥｘ４それぞれにあてはまる。その結果、４つの励起波長全てに対して、基板は、それぞれの光のエバネッセント波の閉込め及び生成が生じるということを確実にする。所望される場合、さらなる又はより少ない光源及び／若しくは蛍光ラベルを、本発明から逸脱することなく使用することができる。
【００４５】
本発明の別の例証的な実施形態によると、切断反応には時間ｔ切断がかかり、それは、照射される切断光の強度次第である。さらに、結合した分子内への第２のヌクレオチドの取り込みは、時間ｔ取り込みがかかる。本明細書において示される装置は、ｔ切断＜ｔ取り込みであるように強度を有した照射される切断光を提供するように構成及び調整される光学装置を含む。
【００４６】
光切断は、すでに取り込まれ且つ表面に結合した分子においてのみ発生するべきである。大量の反応は、ブロックされていない試薬をもたらし、それは、気づくことなく組み込まれ、このようにして、シーケンシング結果にエラーを導入してしまう。従って、局所的にのみ短期間照明して、酵素によるヌクレオチドの取り込みの速度と比較して切断反応を速くすることに価値がある。酵素及びブロッキング部分の作動原理は、先においてすでに記載している。その開示は、本明細書において記載される例証的な実施形態においてあてはまる。示される実施形態は、次のヌクレオチドの取り込みを同時に発生することを可能にし、検出される蛍光信号は非常に信頼できるということを確実にする。
【００４７】
切断光は基板に対してエバネッセントモードにあるという事実は、繰り返される曝露が、漂白され且つその機能を解放した溶液中の蛍光ラベルをもたらさないという利点を定める。言い換えると、示される実施形態は、そのような溶液中の蛍光ラベルの漂白及び機能の解放を回避する。
【００４８】
いくつかの結合分子でのいくつかのヌクレオチドにおける、改善された同時発生の取り込みに対して、切断光を用いた非ブロック化ステップは、可能な限り速く、すなわち、可能な限り強い切断光強度で実行されるべきである。これは、切断光、好ましくは紫外線を、レンズに集束する、及び、レンズ又は基板を動かすことによって表面を走査することにより達成することができる。非ブロック化ステップは、シーケンシング読取りステップの後に実行してもよい。この読取りは、集束ビームを走査すること、又は、場照明（ｆｉｅｌｄ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）を用いたステップアンドスキャン（ｓｔｅｐ  ａｎｄ  ｓｃａｎ）によって実行することができる。全表面に対する例えば紫外線の単発フラッシュとして切断光を具体化することも可能である。シーケンシング反応のための塩基取り込みに対する反応率を考慮して、局所的な切断光の照明時間は、例えば１分未満であるべきである。
【００４９】
別の例証的な実施形態によると、基板は、第１の方向に沿った第１の表面に対する分子の結合のための、いくつかの隣接する結合位置を含む。当該装置は、第１の方向に沿って互いに相対的に基板及び光学装置を動かすことによって光学走査を行うようさらに構成される。さらに、当該装置は、各結合位置が、第１の方向に沿った動きにおいて、第一に、少なくとも第１の波長λＥｘ１の励起光で照射され、後に第二に、切断波長λＣＬの切断光で照射されるように光学走査を行うよう構成される。
【００５０】
言い換えると、切断光及び励起光の結合が示され、同時に、蛍光信号を読み取る、及び、さらなるヌクレオチドを取り込むことができるように切断反応を使用するというさらなる利点を提供する。これは、強力な光源の必要性を有することなく、使用される電磁放射の高い局所的強度を定めることができる走査モードにおいて行われる。この構成において、切断光の集束光ビーム及び励起光の集束光ビームが有用である。その点で、非ブロック化ステップを、シーケンシング読取りステップの後に実行することができる。好ましい実施形態において、単一のアクチュエーター内に両方の光ビームを統合することによって、読取り−走査（ｒｅａｄ−ｓｃａｎｎｉｎｇ）を、非ブロック化走査に合わせることができる。さらに、所望であれば、単レンズでさえ使用して、２つの光ビームを整列させることさえもできる。別の２つのレンズを１つの段階に統合することができるか、又は、２つの別々の段階が同期的に作動することができる。これも、ステップアンドスキャン読取りアプローチにおいて実行することができ、そこでは、励起光源と同じ領域を照射することによって、切断ステップもステップアンドスキャンモードにおいて実行される。
【００５１】
所望であれば、示される装置は、そのような光学走査を、基板に沿った１つの連続した動きにおいて形成するように構成される。その点で、繰り返される連続した走査が可能である。従って、当該装置は、第一に、第１のヌクレオチドが、例えばＤＮＡ断片等の分子内に取り込まれているか否かを読み取るように構成され、第二に、以前に読み取ったヌクレオチドが、分子内に取り込まれている場合に、そのヌクレオチドにて光化学的切断反応を引き起こすように構成される。
【００５２】
本発明の別の例証的な実施形態によると、ＤＮＡシーケンシングを光学的に制御するため、特に、反復性の段階的な反応を光学的に制御して、合成によって核酸の配列を決定するための方法が示されている。当該方法は、基板を提供するステップであって、前記基板の第１の表面上に分子が結合した基板を提供するステップ、光学装置によって、少なくとも第１の励起波長λＥｘ１の励起光で前記基板を照射し、その結果、前記基板上の結合した分子内に取り込まれている第１のヌクレオチドの蛍光ラベルを光学的に励起するステップを含む。当該方法は、前記基板によって前記励起光を閉じ込め、その結果、前記基板の第１の表面の基板によって切断光のエバネッセント波を定めるステップをさらに含む。さらなるステップとして、当該方法は、前記光学装置によって、前記第１の取り込まれているヌクレオチドの前記励起された蛍光ラベルの蛍光を受信及び検出するステップを規定する。さらに、前記光学装置によって、切断波長λＣＬの切断光、好ましくは紫外線で前記基板を照射し、その結果、前記第１の取り込まれているヌクレオチドにて光化学的切断反応を光学的に誘導するステップがさらに含まれる。方法は、前記基板によって前記切断波長λＣＬの切断光を閉じ込め、その結果、前記基板の第１の表面にて、前記基板によって前記切断光のエバネッセント波を定めるステップをさらに規定する。
【００５３】
ブロッキング部分及び蛍光ラベルは、例えばブロッキング部分が蛍光ラベルを含む場合には同時に切断してもよく、又は、異なるステップにおいて切断してもよい。
【００５４】
言い換えると、示される方法は、励起光の表面選択的照射及び切断光の表面選択的照射を定める。従って、示される方法は、基板の第１の表面に結合した分子内に取り込まれているヌクレオチドに取り込まれた蛍光ラベルのみが、光学的に励起されて蛍光信号を送るということを確実にする。そのような第１の表面に近い蛍光ラベルのみの蛍光信号が、次に、光学装置によって検出される。これは、受信及び検出した蛍光信号の質を高める。加えて、示される方法は、蛍光ラベルのみが、基板の第１の表面に結合した分子内に取り込まれているヌクレオチドから切断されるということを確実にする。この点で、当該装置によって含まれる溶液の分解、又は、その中に含まれる部分の分解を回避することができる。言い換えると、合成のプロセスに使用することができるヌクレオチドの効果的な濃度は、偶発的には減らされない。
【００５５】
従って、示される方法は、溶液中の蛍光ラベルが漂白され且つその機能を解放するということを回避する。これは、例えばＤＮＡシーケンシングのような核酸の配列を決定するプロセスのコストをさらに下げることができる。
【００５６】
本発明の別の例証的な実施形態によると、ＤＮＡシーケンシングを光学的に制御するため、特に、反復性の段階的な反応を光学的に制御して、合成によって核酸の配列を決定するためのプログラム要素が示されており、当該プログラム要素は、プロセスによって実行される場合に、光学装置によって、少なくとも第１の励起波長λＥｘ１の励起光で基板を照射し、その結果、前記基板の第１の表面上に結合した分子内に取り込まれている第１のヌクレオチドの蛍光ラベルを光学的に励起するステップ、前記基板によって前記励起光を閉じ込め、その結果、前記基板の第１の表面にて、前記基板によって前記励起光のエバネッセント波を定めるステップ、前記光学装置によって、前記第１の取り込まれているヌクレオチドの前記励起された蛍光ラベルの蛍光を受信及び検出するステップ、前記光学装置によって、切断波長λＣＬの切断光、好ましくは紫外線で前記基板を照射し、その結果、前記第１の取り込まれているヌクレオチドにて光化学的切断反応を光学的に誘導するステップ、並びに、前記基板によって、前記切断波長λＣＬの切断光を閉じ込め、その結果、前記基板の第１の表面にて、前記基板によって前記切断光のエバネッセント波を定めるステップ、を実行するよう適応される。
【００５７】
本発明の別の例証的な実施形態によると、ＤＮＡシーケンシングを光学的に制御するため、特に、反復性の段階的な反応を光学的に制御して、合成によって核酸の配列を決定するためのコンピュータプログラムが記憶されるコンピュータ可読媒体が示されており、前記コンピュータプログラムは、プロセッサによって実行される場合に、光学装置によって、少なくとも第１の励起波長λＥｘ１の励起光で基板を照射し、その結果、前記基板の第１の表面上に結合した分子内に取り込まれている第１のヌクレオチドの蛍光ラベルを光学的に励起するステップ、前記基板によって前記励起光を閉じ込め、その結果、前記基板の第１の表面にて、前記基板によって前記励起光のエバネッセント波を定めるステップ、前記光学装置によって、前記第１の取り込まれているヌクレオチドの前記励起された蛍光ラベルの蛍光を受信及び検出するステップ、前記光学装置によって、切断波長λＣＬの切断光、好ましくは紫外線で前記基板を照射し、その結果、前記第１の取り込まれているヌクレオチドにて光化学的切断反応を光学的に誘導するステップ、並びに、前記基板によって、前記切断波長λＣＬの切断光を閉じ込め、その結果、前記基板の第１の表面にて、前記基板によって前記切断光のエバネッセント波を定めるステップ、を実行するよう適応される。
【００５８】
コンピュータプログラム要素は、コンピュータプログラムの一部であってもよいが、それ自体でプログラム全体でもあり得る。例えば、コンピュータプログラム要素を使用し、すでに存在しているコンピュータプログラムを更新して本発明になってもよい。コンピュータ可読媒体は、例えば、ＵＳＢスティック、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイ、データ記憶装置、ハードディスク、又は、いかなる他の媒体等、上記のプログラム要素を記憶することができる記憶媒体として見ることができる。
【００５９】
核酸配列を決定するための新たなアプローチを定めることを、本発明の要点として見ることができる。従って、シーケンシングは単一の流体において実行することができ、さらにここでは、洗浄ステップは要求されない。第一に励起光及び第二に切断光の、例えばワイヤグリッドのような対応して構成される基板による強力な閉込めに基づき、シーケンシング反応は、表面を洗浄することなく読み取ることができる。段階的なシーケンシングは、溶液中のヌクレオチドに付着した光学的に切断可能なブロッキング部分を有したヌクレオチドであって、基板の表面に結合した分子内に取り込まれることになるヌクレオチドを使用することによって達成される。蛍光を使用する励起光での読取り後、組み込まれた又は取り込まれたヌクレオチドは、同じ基板を通る切断光を照射することによって非ブロック化される。これは、結合したヌクレオチドのみが非ブロック化されることを確実にする。言い換えると、本発明の方法及び装置は、結合した分子のヌクレオチドの配列に対応する配列を有するヌクレオチドの段階的且つ光学的に誘導した取り込みに適するように構成される。さらに、当該方法及び装置は、結合した分子内に取り込まれているヌクレオチドの配列を段階的且つ光学的に読み取る並びに決定するように構成される。さらに、本発明の方法及び装置は、取り込まれているヌクレオチドの配列の決定を、それぞれの取り込まれているヌクレオチドの蛍光ラベルによって放射され、受信及び検出したそれぞれの蛍光に基づかせるように構成される。
【００６０】
別の例証的な実施形態によると、ＤＮＡシーケンシングにおけるブロッキング部分としての部分の使用が示されており、前記部分は、ニトロフェニルエチルの誘導体、５−メチル（２−（２−ニトロフェニル）プロピル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログ、５−メチル（２−オキソ−１，２−ジフェニルエチル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログ、及び、そのいかなる組み合わせも含む群から選ばれる。
【００６１】
ブロッキング部分５−メチル（２−（２−ニトロフェニル）プロピル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログを、ＤＮＡシーケンシング装置において使用することは、２つの利点を有する。第一に、光化学的な切断後に、画定されたより反応性の少ない残遺物を与え、より明確なプロセスを生じている。第二に、高い反応率を有する。他の光切断可能な分子と比較すると、新たな分子は、ニトロベンゼンにより得られる光産物をもたらすニトロフェニルエチル部分の誘導体であり、前記光産物は、ニトロフェニルメチルより得られる分子の光化学によって生成されるニトロ化合物よりもはるかに安定している。さらに、ＣＯ２の生成は、駆動力であり、さらに、光化学反応速度を効率的に上げるための明瞭な方法である。ＤＮＡシーケンシングにおける前記ブロッキング部分の使用の別の利点は、非常に低い切断光の強度にて反応が完了されるという事実によって実証されている。これは、１つのスポットあたりの必要とされるエネルギーの量を、ＤＮＡシーケンシング装置において減らすことができるということを意味している。数の例が、図７及び図９と関連して後に与えられる。
【００６２】
本発明の前記及び他の特徴が、以下に記載の実施形態から明らかになり、以下に記載の実施形態を参考にして説明される。
【００６３】
本発明の例証的な実施形態が、以下の図面において描かれる。
【００６４】
原則として、同じ又は類似の部分には、図において同じ参照記号が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の例証的な実施形態による装置を示した概略図である。
【図２】本発明の例証的な実施形態による装置を示した概略図である。
【図３ａ】本発明の例証的な実施形態において使用される、結合した分子の領域においてエバネッセント波を作り出す基板を示した概略図である。
【図３ｂ】本発明の例証的な実施形態において使用される、結合した分子の領域においてエバネッセント波を作り出す基板を示した概略図である。
【図４】本発明の例証的な実施形態による装置を示した概略図である。
【図５】本発明の例証的な実施形態による方法を示した流れ図である。
【図６】２つのブロッキング部分を示した概略図である。
【図７】光化学的切断率の時間経過プロットを示した概略図である。
【図８】光化学的切断プロセスを示した概略図である。
【図９】光変換グラフを示した概略図である。
【図１０】本発明の例証的な実施形態において使用される５−メチル（２−オキソ−１，２−ジフェニルエチル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログの光化学的切断プロセスを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
図１は、反復性の段階的な反応を光学的に制御して、合成によって核酸の配列を決定するための装置１００を描いている。当該装置は基板１０１を含み、該基板の第１の表面１０３上に少なくとも１つの分子１０２を結合させるための基板を含む。基板１０１の第１の表面又は前面１０３上に結合した分子１０２は、例えば、ＤＮＡの断片であり得る。さらに、光学装置１０４が図１において示されている。図１は、光学装置が、例えば第１の励起波長λＥｘ１の励起光１１０を基板に向けるように構成されるということを概略的に示している。さらに、４つの異なるヌクレオチドが概略的に示され、さらに、参照番号１０９、１１６、１１７及び１１８を用いて描かれている。例えば、第１のヌクレオチド１０９が、チミンＴとして示されている。ヌクレオチド１０９は、ブロッキング部分１１９を含む。さらに、ブロッキング部分１１９は、第１の蛍光ラベル１０５を含む。アナログな方法で、第２のヌクレオチド１１６が、図１において概略的に描かれており、そこから、ブロッキング部分１１９及び第２の蛍光ラベル１０６も含まれるということを推測することができる。第３のヌクレオチド１１７も、ブロッキング部分及び第３の蛍光ラベル１０７を含む。加えて、ブロッキング部分及び第４の蛍光ラベル１０８を含む第４のヌクレオチド１１８も、概略的に描かれている。しかし、試料１１４が、はるかに多くのそのようなヌクレオチドを含んでもよく、さらに、ヌクレオチド１０９、１１６、１１７及び１１８は、ここでは単に象徴的な描写として示されている。さらに、図１は、ヌクレオチド及び酵素１１５が含まれている溶液１１４を示している。示された４つのヌクレオチドのうちの１つが結合した分子１０２内に取り込まれた場合、示される装置１００は、以下の利点を定める。光学装置は、結合した分子１０２内に取り込まれている第１のヌクレオチドの蛍光ラベルによって放射される蛍光を受信及び検出するように構成される。
【００６７】
図１からさらに推測することができるように、光学装置は、切断波長λＣＬの切断光１１２を基板に向けるように構成される。これは、第１の取り込まれているヌクレオチドにて光化学的切断反応を光学的に誘導して、第１の取り込まれているヌクレオチドからそれぞれの蛍光波を切断することを可能にする。さらに、基板１０１は、基板の第１の表面での励起光のエバネッセント波が作り出されるように、励起光を閉じ込めるよう構成される。さらに、基板は、基板の第１の表面での切断光のエバネッセント波が作り出されるように、切断光も閉じ込めるよう構成される。これは、図３ａ及び３ｂにおいても見ることができる。図１の実施形態において、基板は、励起光１１０及び切断光１１２に対するワイヤグリッド１１３として構成される。従って、ワイヤグリッド１１３は、例えば規則的な金属ワイヤ構造のような規則的なパターンを含む。図１から推測することができるように、スリットのような隙間が、規則的なパターン間に提供され、その隙間において、結合した分子１０２は、基板１０１の第１の表面１０３にて固体化される。さらに、図１は、コンピュータプログラム要素１２２が記憶されるコンピュータ可読媒体１２１を含む処理装置１２０を描いている。前記プログラム要素１２２は、処理装置１２０に命令し、さらに、上記及び以下に記載の、反復性の段階的な反応を光学的に制御して、合成によって核酸の配列を決定するための方法を行うよう装置１００に命令するように適応される。図１の装置１００は、結合した分子１０２のヌクレオチドの配列に相補的な配列を有するヌクレオチド１０９、１１６、１１７及び１１９の段階的且つ光学的に誘導した取り込みに適するように構成される。分子１０２がＤＮＡ断片である場合、試料１１４によって含まれるヌクレオチドは、分子１０２のヌクレオチド配列に対応する配列において、分子１０２内に取り込まれる。
【００６８】
当該装置は、取り込まれているヌクレオチドの配列の決定を、それぞれの取り込まれているヌクレオチドの蛍光ラベルによって放射され、受信及び検出した応答蛍光に基づかせるようさらに構成される。従って、図１の示される装置１００は、第一に、励起光のエバネッセント波の使用によって、結合した分子１０２内に取り込まれているヌクレオチドのみが励起光１１０によって読み取られるということを確実にする。第二に、図１の装置１００は、結合したヌクレオチドのみが切断光によって非ブロック化され、分子１０２によってまだ含有されていない、すなわち取り込まれていないヌクレオチドの非ブロック化を回避するということを確実にする。従って、光１１１として見ることができる検出された蛍光信号１００は、核酸の配列の決定に対して非常に信頼できるものである。
【００６９】
従って、図１の装置１００を用いて行われるＤＮＡシーケンシングのコスト及び速度は、どちらも改善される。いかなる洗浄ステップも必要ではないため、より少ない流体が必要とされる。図１の装置１００は、シーケンシングの簡素化及びコスト削減を示している。図１の示される装置１００は、いかなる洗浄ステップも必要としない、すなわち、全ての読み取りに対して単一の試薬充填を意味するアセンブリベースの容易な読取りを可能にすることによって、新たなプロセスの組み合わせを可能にする。例証的なヌクレオチド１０９、１１６、１１７及び１１８内で使用されるブロッキング部分は、例えば、光切断可能な３´−非ブロック化可逆性ターミネーターであってもよい。しかし、例えば立体障害を使用した他のブロッキング部分も、所望の上記効果に到達するために使用することができる。
【００７０】
さらに、図１において示されている光学装置１０４は、切断反応時間ｔ切断が、第２のヌクレオチドを分子１０２内に取り込むのにかかる時間よりも短いように強度を有した照射される切断光を提供するように構成してもよい。切断反応時間ｔ切断は、照射される切断光の強度次第であるため、図１は、特定のブロッキング部分を有したヌクレオチドと、切断光の強度に関する光学装置の構成との選択された組み合わせを定めてもよい。言い換えると、図１の装置の切断光の強度は、ヌクレオチドとブロッキング部分との使用される組み合わせに対して、切断反応時間ｔ切断がｔ取り込みよりも短いように適応される。
【００７１】
所望であれば、加えて、又或いは、以下の装置１００の機構をユーザに提供してもよい。滞留は、平均滞留時間として、及び、取り込まれていないヌクレオチドの切断光のスポットにおいて見ることができる。光学装置は、ｔ切断がｔ滞留よりも短いように強度を有した照射される切断光を提供するようさらに構成してもよい。従って、望まれていない切断反応による遊離及び結合していないヌクレオチドの分解は発生しない。このように、ｔ切断がｔ滞留よりも短いように装置を構成することによって、取り込まれていないヌクレオチドが切断によって影響を受ける可能性は減らされるか又は取り除かれる。言い換えると、大量の切断反応を回避するために、ワイヤグリッドのエバネッセント場における分子の平均滞留時間は、適切な強度での切断に要求される反応時間よりも短いか又ははるかに短くあるべきである。約２５ｎｍ以下のエバネッセント場の深さ、及び、約１ｅ−１０ｍ２／ｓのヌクレオチドの拡散係数で、エバネッセント場の中及び外に分子が拡散するのにかかる時間は、（５ｅ−８ｍ）２／１ｅ−１０＝２５マイクロ秒として推定することができる。結合した分子を非ブロック化するのに要求される照明時間に応じて、ダメージの可能性を得ることができる。０．１ｓの照明時間を仮定すると、これは１：４０００になり、１０ｍｓの照明時間では、１：４００になる等である。
【００７２】
同様に、全ダメージは、エバネッセント場における体積分率を試薬溶液の全体積で割ったものに比例する。１００μｍのチャンバの高さで、比は１：４０００である。これは、エバネッセント場における全ての分子にダメージを与えるという最悪のケースにおいて、０．０２５％の分子のみがダメージを受けるということを意味する。１００のリード長で、最終的には、溶液中２．５％の分子がダメージを受け（最悪のケース）、これは、シーケンシングの観点から、依然として容認可能であるだろう。
【００７３】
以下において、図１の装置だけでなく、図２及び４の装置１００を使用するための情報が提供される。改善された同期化に対して、非ブロック化ステップは、可能な限り速く、すなわち、可能な限り高い強度で実行されるべきである。これは、レンズに紫外線を集束させること、及び、レンズ又は基板を動かすことにより表面を走査することによって達成することができる。非ブロック化ステップは、シーケンシング読取りステップの後に実行される。この読取りは、集束ビームを走査すること、又は、場照明を用いたステップ−アンド−スキャンによって実行することができる。好ましい実施形態において、両方の光ビームを整列させることにより、両方の光ビームを単一のアクチュエーター内に統合させることによって、おそらく単レンズ内でさえも統合させることによって、読取り走査は、非ブロック化走査と合わせることができる。或いは、２つのレンズを１つの段階に統合させることができるか、又は、２つの別々の段階が同期的に作動することができる。これも、ステップアンドスキャン読取りアプローチにおいて実行することができ、ここでは、ＵＶステップも、読み取り機として同じ場を照明することによって、ステップアンドスキャンモードで実行される。好ましい実施形態は、利用可能な紫外線源及びその動力次第である。十分な動力が利用可能である、及び／又は、シーケンシング表面の領域が限定されている場合、全表面に対するＵＶの単発フラッシュも構想され得る。シーケンシング反応のための塩基の取り込みに対する反応率を考慮して、局所的ＵＶ照明時間は、１分を大きく下回るべきである。
【００７４】
図２は、反復性の段階的な反応を光学的に制御して、合成によって核酸の配列を決定するように構成される装置１００を示している。図１と同様に、複数の分子１０２が固定化、すなわち結合されたワイヤグリッド基板１１３が示されている。図２から見ることができるように、規則的なパターン２１４が、スリットのような隙間２１５を定めており、その隙間の中で、分子２０２が第１の表面２０３上に結合している。基板は、第１の方向２１３に沿って分子を第１の表面に結合させるためのいくつかの隣接する結合位置２０９、２１０、２１１及び２１２を含む。前記結合位置は、生成される光学信号を増やすことができるように、同じ分子のクローンで覆うことができるスポットとして見ることができる。基板１０１は、従って、それぞれ異なるクローンを有したそのようなスポットのアレイ、すなわち、そのような結合位置のアレイを定める。これは、処理量を増やすことができる。図１及び２の装置１００はどちらも、１つの液体のみを用いたＤＮＡシーケンシングを可能にし、その結果、溶液が変えられる洗浄ステップを定める必要性を回避する。さらに、光学装置１０４は、５つの異なる光源２０１から２０５を含む。光源２０１から２０４は、先において記載したように４つの異なる励起波長λＥｘ１からλＥｘ４までを定める励起光源として見ることができる。光源２０５は、波長λＣＬを有した切断光を定める。例えば、光源２０５は、紫外線を放射してもよい。参照番号２０６は、光学装置１０４が、５つの波長λＥｘ１からλＥｘ４まで及びλＣＬの間でスイッチを切り換えるのを可能にするスイッチング装置を象徴的に描いている。さらに、前記光源２０１から２０５のうち少なくとも１つによって放射される光は、偏光フィルタ２００の方に向けられる。さらに、放射された光源２０１から２０５の光を、基板１０１に向けて送るダイクロイックミラー２０７が示されている。蛍光ラベルが、励起光（波長λＥｘ１からλＥｘ４までのうち少なくとも１つ）のエバネッセント波によって励起された後、１つ又は複数の蛍光ラベルによって放射される蛍光光子は、ダイクロイックミラー２０７の方に向けられ、さらに、蛍光検出器２０８の方に向けられる。図２から見ることができるように、光学装置１０４は、方向２１３に沿って走査することができる。従って、図２の装置１００は、第１の方向２１３に沿って基板１０１及び光学装置１０４を互いに相対的に動かすことによって光学走査を行うように構成される。従って、当該装置は、第１の方向２１３に沿った動きにおいて、各結合位置が第一に励起光で照射され、後に第二に、切断波長の切断光で照射されるように、光学走査を行うことが可能である。切断光を使用した非ブロック化ステップは、従って、励起された取り込まれているヌクレオチドの蛍光の読み取り後に実行することができる。
【００７５】
図３ａ及び３ｂは、ワイヤグリッド１１３として具体化される基板１０１を示している。規則的な金属ワイヤ構造として具体化してもよい規則的なパターン２１４は、スリットのような隙間２１５を定め、その隙間の中で、分子１１２は固定化される。矢印によって象徴化されるように、励起光１１０及び切断光１１２は、基板の第２の表面の方へ基板に向けられる。第２の表面は、分子が結合した第１の表面１０３と反対である。従って、ワイヤグリッドは、後ろから照明される。さらに、図３ａ及び３ｂは、いくつかの結合していないヌクレオチド１０９が溶液中に存在しているということを示し、それらのヌクレオチドは、後に、第１の表面上に結合した分子１０２内に取り込まれ得る。図３ａ及び３ｂは、光ビームの波長での光学解像度よりも小さい寸法を有した金属構造間のエバネッセント波３００を描いている。エバネッセント波は、場の強度の変移に一致する明度の変移により図３ｂによって描かれている。図３ｂは、ＴＥ偏光で照明されたワイヤグリッド電磁場の強さを示している。高い明度は高い強度を示し、さらに、低い明度は低い強度を示す。本明細書において示される基板は、図１及び２の装置だけでなく、図４の装置においても例証的に使用することができる。しかし、エバネッセント波による表面閉込めは、当業者が知る他の方法において達成することができるということに留意するべきである。
【００７６】
本発明のこの実施形態又はいかなる他の実施形態においても、全反射を使用してエバネッセント波を提供してもよい。
【００７７】
図４は、基板１０１を連続して走査するための装置１００を示している。装置１００は、励起光を放射するための光源４００を有した光学装置１０４を定める。回転させることができるカラーフィルタによって、ことなる励起波長を提供することができる。加えて、切断光源４０２が提供されている。光ガイド部材４０３、４０４が、それぞれの光学要素４０５、４０６に光を向けるために示されている。見ることができるように、別々のレンズ及び光学チャネルが、励起光に対して及び切断光に対して使用される。しかし、所望であれば、両方の光源の光学経路と組み合わせることもできる。図４において示された光学装置１０４は、４０７の方向において基板１０１と光学装置１０４との相対的移動を可能にしている。
【００７８】
図４は、励起光を送るように構成され、さらに、使用された蛍光ラベルによって放射された蛍光を反射するように構成されたダイクロイックミラーも含んでよい。さらに、基板は、第１の偏光のみを送るように構成してもよく、さらに、第１の偏光とは垂直に偏光された第２の偏光を反射するように構成してもよい。偏光フィルタは、第１の偏光のみを送るように構成される。図４の装置は、該装置によって光学的に制御される光学的に段階的な作用に基づき、結合した分子内に取り込まれた核酸の配列を述べるデータを生成するように構成される。
【００７９】
図５は、反復性の段階的な反応を光学的に制御して、合成によって核酸の配列を決定するための方法の流れ図を示している。当該方法は、ステップＳ１において基板を提供するステップであって、基板の第１の表面上に分子が結合した基板を提供するステップを含む。光学装置によって、少なくとも第１の励起波長λＥｘ１の励起光で基板を照射し、その結果、基板の上の結合した分子内に取り込まれている第１のヌクレオチドの蛍光ラベルを光学的に励起するステップが、ステップＳ２で示されている。さらに、ステップＳ３は、基板によって励起光を閉じ込め、その結果、基板の第１の表面にて、基板による切断光のエバネッセント波を定めるステップを描いている。光学装置によって、第１の取り込まれているヌクレオチドの励起された蛍光ラベルの蛍光を受信及び検出するステップがステップＳ４によって示されている。光学装置によって、切断波長λＣＬの切断光、好ましくは紫外線で基板を照射して、その結果、第１の取り込まれているヌクレオチドにて光化学的切断反応を光学的に誘導するステップＳ５が、ステップＳ５で描かれている。さらに、ステップＳ６において、基板によって切断波長λＣＬの切断光を閉じ込め、その結果、基板の第１の表面にて、基板によって切断光のエバネッセント波を提供するステップが提供される。
【００８０】
示される方法のステップＳ１からＳ６を繰り返すことによって、ユーザは、基板の第１の表面に結合した分子内に取り込まれた核酸の配列を決定することを可能にされる。従って、ステップＳ１からＳ６の後、ユーザは、所望であれば、以下のステップ、すなわち、基板の第１の表面にて結合した分子内に第２のヌクレオチドを取り込むステップ、次に、第２のヌクレオチドによって、分子へのその取り込みの後、酵素の活性をブロックするステップを行ってもよい。光学装置によって、励起光で基板を照射し、その結果、第２の取り込まれているヌクレオチドの蛍光ラベルを光学的に励起するステップも行ってよい。基板によって励起光を閉じ込め、その結果、基板の第１の表面にて、基板によって励起光のエバネッセント波を提供するステップが、この第２のサイクルのさらなるステップである。第２の取り込まれているヌクレオチドの励起された蛍光ラベルの蛍光を受信及び検出するステップを、次に行ってもよい。光学装置によって、切断光、好ましくは紫外線で基板を照射し、その結果、第２の取り込まれているヌクレオチドにて光化学的切断反応を光学的に誘導するステップも行うことができる。別のステップとして、基板によって切断光を閉じ込め、その結果、基板の第１の表面にて、基板によって切断光のエバネッセント波を定めるためのステップが示される。
【００８１】
図６は、第一に、３´−ブロックされた可逆性ターミネーターを使用することによって、さらに第二に、３′−非ブロック化可逆性ターミネーターを使用することによって、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｌ．Ｍｅｔｚｋｅｒによる“Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１（２０１０）３１のブロッキング部分を示している。図６において見ることができるように、第二のクラスは、この場合リボースユニットの３´位置が非ブロック化され、さらに、次のヌクレオチドの取り込みが、リボースユニットの５´位置の塩基対部分に付着した蛍光ラベルも含有する巨大な基によって防がれているため、非常に興味深いものである。
【００８２】
本発明は、ワイヤグリッド技術を使用してもよく、さらに、非ブロック化ステップが、例えば、３６５ｎｍの偏光された紫外線で行われる。従って、この非ブロック化ステップの後、次のラベルされたヌクレオチドが組み込まれ、さらに、表面のＤＮＡ断片でのラベルされたヌクレオチドのみが検出されるように偏光を使用してワイヤグリッドを走査することによって検出される。これが行われた後、再度、紫外線を使用した非ブロック化ステップを提供することによって、次のラベルされたヌクレオチドを組み込み且つ検出すること等ができる。このプロセスを機能させるために、以下のことが必要とされ得る。１．光切断可能な３′−非ブロック化可逆性ターミネーターは、３´ブロックされた変異体のように、３−ブロッキング基（−Ｎ３又は−ＣＨ２）の除去が、同相で行われなければならない。２．光切断反応は、ポリメラーゼによる新たなヌクレオチドの取り込みよりも速くあるべきである。Ｍｅｔｚｋｅｒ等によって発明されたいわゆる３´−ＯＨ非ブロック化ターミネーター、すなわち、２−ニトロベンジルアルキル化ＨＯＭｅｄＵ三リン酸塩は、後に示すブロッキング部分と比較してこの目的に対して遅いかもしれない。図８から１０を参照されたい。
【００８３】
図７は、ターミネーターポリメラーゼを使用してＢＯＤＩＰＹ−ＦＬでラベルされたプリマー−１／ｏｌｉｇｏＴｅｍｐｌａｔｅ−４複合体内に取り込まれたｄＵ．Ｉ−ｄＵ．Ｖの光化学的切断率の時間経過プロットを示している。図７は、Ｖ．Ａ．Ｌｉｔｏｓｈ、Ｗ．Ｗｕ、Ｂ．Ｐ．Ｓｔｕｐｉ、Ｊ．Ｗａｎｇ、Ｓ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ、Ｍ．Ｎ．Ｈｅｒｓｈ及びＭ．Ｌ．Ｍｅｔｚｋｅｒ、“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ３´−ＯＨ  ｕｎｂｌｏｃｋｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｕｎｉｎｇ  ｏｆ  ２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ  ａｌｋｙｌａｔｅｄ  ＨＯＭｅｄＵ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ”、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、Ｖｏｌ３６、ｉｓｓｕｅ６、２０１１、Ｅ３９から得られた。この図７から明瞭に見ることができるように、光切断効果が生じる時間は、約１０ｓである。又は、「全ての５−（２−ニトロベンジルオキシ）メチル−ｄＵＴＰアナログを、アジド溶液において、〜０．７Ｗ／ｃｍ２の強度を有した３６５ｎｍ紫外線曝露にて６０ｓ内で１００％の効率まで光化学的に切断した。」とこれらの著者によって結論づけられている。重要なことは、これらの著者は、ターミネーターポリメラーゼは、１Ｗ／ｃｍ２までの強度で、１５０分間３６５ｎｍの紫外線に曝露された後でさえも優れた活性を示し続けたということも発見した。
【００８４】
しかし、この光切断化学作用は、使用した異なるブロッキング部分で本発明者等が発見したものと比べてより遅い。本発明者等のアプローチは、提案した非循環反応を改善するかもしれない。Ｍｅｔｚｋｅｒ等による化学作用において必要とされた光の強度は、１Ｗ／ｃｍ２であり、１０ｎＷ／（μｍ）２に変換されることに留意されたい。本発明者等は、ＤＮＡシーケンシングにおいて、ブロッキング部分としてニトロフェニルエチルの誘導体である部分を使用した化学作用を使用した。例えば、５−メチル（２−（２−ニトロフェニル）プロピル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログは、２つの利点を有する。第一に、光化学的な切断後に、画定されたより反応性の少ない残遺物を与え、より明確なプロセスを生じている。第二に、独立して決定したように（図９を参照）、より速い反応率を有する。
【００８５】
Ｍｅｔｚｇｅｒによって述べられた光切断可能な分子と比較すると、新たな分子は、ニトロベンゼンにより得られる光産物をもたらすニトロフェニルエチル部分の誘導体であり、前記光産物は、Ｍｅｔｚｇｅｒのニトロフェニルメチルより得られる分子の光化学によって生成されるニトロ化合物よりもはるかに安定している。さらに、ＣＯ２の生成は、駆動力であり、さらに、光化学反応速度を効率的に上げるための明瞭な方法である。本発明者等の化学作用の１つのさらなる利点は、光化学の観点から、図８の分子に非常に類似した化合物１０１の光化学的切断反応が、４ｍＷ／ｃｍ２を生成する１０ｃｍでのＰＬ１０ランプを使用して３０分以内に完了するという事実によって実証される。化合物１０１は、図９において下に描かれている。データに対しても、図９を参照されたい。このように、反応は、上記の参照化合物ではあるが２５０ｘ低い強度の例として、より遅く完了される。これは、１つのスポットあたりに必要とされるエネルギーの量が５０分の１であるということを意味する。
【００８６】
図９は、化合物１０１の光３６５ｎｍでの光変換の効率（本発明者等のデータ）を示している。１時間のＵＶ吸収後の、青からピンクのスペクトルのスペクトル変化に留意されたい。（Ｂ）は、３６５ｎｍでの励起の関数としての、３１９ｎｍでのスペクトルピークの上昇による光化学反応の発生のグラフである。エタンオールにおけるこのデータは、４ｍＷ／ｃｍ２のエネルギーと等しい１０ｃｍでのＰＬ１０ランプを用いた励起によって３０分後に発生が完了する（及び、２０分後には８０％が完了する）ということを示しているということに留意されたい。
【００８７】
ニトロ−化合物に対する可能な代替物は、図１０において示された「５−メチル（２−オキソ−１，２−ジフェニルエチル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログ」であり、これも、効率的な光化学的切断を示し、所望であれば、本発明のいかなる実施形態においてもブロッキング部分として使用されてもよい。
【００８８】
さらに、以下の化合物
【００８９】
【化１】
2015503357.tif 000003
を、本発明によるブロッキング部分として使用してもよい。
【００９０】
以下の異形、すなわち、Ｘ＝Ｏ（ＣＨ２）ｎＺ（ｎ＝１から１８までの整数）又はＸ＝Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＣＨ２Ｚ（ｎ＝１から２０までの整数）（Ｚ＝Ｈ、若しくは、蛍光部分に接続したリンカー）、並びに、Ｙ＝（ＣＨ２）ｎＡ（ｎ＝０から１８までの整数）又はＹ＝Ｏ（ＣＨ２）ｎＡ（ｎ＝１から１８までの整数）若しくはＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＣＨ２Ａ（ｎ＝１から２０までの整数）（Ａ＝Ｈ、若しくは、蛍光部分に接続したリンカー）を有した化合物１も、本発明によるブロッキング部分として使用してもよく、そのような組み合わせにおいて、Ａ又はＺの基のうち少なくとも１つは、蛍光部分に接続したリンカーを有する。
【００９１】
さらに、以下の化合物
【００９２】
【化２】
2015503357.tif 000004
を、本発明によるブロッキング部分として使用してもよい。
【００９３】
ここで、Ｘ及びＹは、独立して（ＣＨ２）ｎＺ（ｎ＝１から１８までの整数）、又は、（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＣＨ２Ｚ（ｎ＝１から２０までの整数）（Ｚ＝Ｈ若しくは蛍光部分に接続したリンカー）であり、そのような組み合わせにおいて、Ｘ又はＹの基のうち少なくとも１つは、蛍光部分に接続したリンカーを有するＺ基を有する。
【００９４】
開示された実施形態に対する他の異形は、請求された発明を実行する際に、図面、明細書、及び付随の特許請求の範囲の調査から当業者により理解及びもたらすことができる。特許請求の範囲において、「含む」という用語は、他の要素又はステップを除外せず、不定冠詞はその複数形を除外しない。１つのプロセッサ又は他のユニットは、特許請求の範囲内に列挙されたいくつかの項目又はステップの機能を満たすことができる。特定の手段が互いに異なる従属項において記載されているという単なる事実は、これらの手段の組合せを役立つよう使用することができないと示しているわけではない。コンピュータプログラムは、他のハードウェアと共に若しくはその一部として供給される、光記憶媒体又は固体記憶媒体等、適した媒体上に記憶／分布することができるが、インターネット又は他の有線若しくは無線の通信システムを介して等、他の形状で分布することもできる。特許請求の範囲におけるいかなる参照番号も、その範囲を限定するとして解釈されるべきではない。
【図１】
2015503357.tif 000005
【図２】
2015503357.tif 000006
【図３ａ】
2015503357.tif 000007
【図３ｂ】
2015503357.tif 000008
【図４】
2015503357.tif 000009
【図５】
2015503357.tif 000010
【図６】
2015503357.tif 000011
【図７】
2015503357.tif 000012
【図８】
2015503357.tif 000013
【図９】
2015503357.tif 000014
【図１０】
2015503357.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成26年7月15日(2014.7.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸シーケンシングを光学的に制御するため、特に、反復性の段階的な反応を光学的に制御して、合成によって核酸の配列を決定するための装置であって、
基板であり、該基板の第１の表面上に少なくとも１つの分子を結合させるための基板と、
光学装置と、
複数のヌクレオチド及び酵素を有した溶液と、
を含み、
前記光学装置は、少なくとも第１の励起波長λＥｘ１の励起光を前記基板に向けて、前記基板の第１の表面上に結合した前記分子内に取り込まれた第１のヌクレオチドの蛍光ラベルを励起させるように構成され、
前記光学装置は、前記結合した分子内に取り込まれた第１のヌクレオチドの蛍光ラベルによって放射される蛍光を受信及び検出するように構成され、
前記光学装置は、切断波長λＣＬの切断光、好ましくは紫外線を前記基板に向けて、前記第１の取り込まれたヌクレオチドにて光化学的切断反応を光学的に誘導し、前記第１の取り込まれたヌクレオチドからブロッキング部分及び前記蛍光ラベルを切断するように構成され、
前記基板は、前記励起光を閉じ込めるように構成され、さらに、前記基板の第１の表面にて前記励起光のエバネッセント波を定めるように構成され、さらに、
前記基板は、前記切断光、好ましくは紫外線を閉じ込めるように構成され、さらに、前記基板の第１の表面にて切断光のエバネッセント波を定めるように構成され、
前記ヌクレオチドはそれぞれ、ブロッキング部分を含み、
前記ブロッキング部分は、それぞれの前記ヌクレオチドが、前記第１の表面に結合した分子内に取り込まれた場合に、前記酵素の合成活性をブロックするように構成される、装置。
【請求項２】
前記ブロッキング部分は、光切断可能な３′−非ブロック化可逆性ターミネーターである、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記ブロッキング部分は、ニトロフェニルエチルの誘導体、５−メチル（２−（２−ニトロフェニル）プロピル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログ、５−メチル（２−オキソ−１，２−ジフェニルエチル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログ、及び、そのいかなる組み合わせも含む群から選ばれる、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記基板は、前記励起光に対する、及び、前記切断光に対するワイヤグリッドとして構成される、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
前記切断反応には時間ｔ切断がかかり、
前記切断反応時間ｔ切断は、照射される前記切断光の強度次第であり、
前記結合した分子内への第２のヌクレオチドの取り込みには、時間ｔ取り込みがかかり、さらに、
前記光学装置は、ｔ切断＜ｔ取り込みであるように強度を有した前記照射される切断光を提供するように構成される、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記基板は、第１の方向に沿って前記第１の表面に分子を結合させるための、いくつかの隣接する結合位置を含み、
当該装置は、前記第１の方向に沿って互いに相対的に前記基板及び前記光学装置を動かすことによって光学走査を行うように構成され、さらに、
当該装置は、各結合位置が、前記第１の方向に沿った動きにおいて、第一に、前記少なくとも第１の波長λＥｘ１の励起光で照射され、後に第二に、前記切断波長λＣＬの切断光で照射されるように前記光学走査を行うよう構成される、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
当該装置は、前記結合した分子のヌクレオチドの配列に相補的な配列を有するヌクレオチドの取り込みを段階的且つ光学的に誘導するように構成され、
当該装置は、前記結合した分子内に取り込まれた前記ヌクレオチドの配列を段階的且つ光学的に読み取る及び決定するように構成され、さらに、
当該装置は、前記取り込まれたヌクレオチドの配列の決定を、それぞれの前記取り込まれたヌクレオチドの蛍光ラベルによって放射され、受信及び検出したそれぞれの蛍光に基づかせるように構成される、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
核酸シーケンシングを光学的に制御するため、特に、反復性の段階的な反応を光学的に制御して、合成によって核酸の配列を決定するための方法であって、
基板を提供するステップであり、前記基板の第１の表面上に分子が結合した基板を提供するステップと、
光学装置によって、少なくとも第１の励起波長λＥｘ１の励起光で前記基板を照射し、その結果、前記基板上の結合した分子内に取り込まれた第１のヌクレオチドの蛍光ラベルを光学的に励起するステップと、
前記基板によって前記励起光を閉じ込め、その結果、前記基板の第１の表面にて、前記基板によって前記切断光のエバネッセント波を定めるステップと、
前記光学装置によって、前記第１の取り込まれたヌクレオチドの前記励起された蛍光ラベルの蛍光を受信及び検出するステップと、
前記光学装置によって、切断波長λＣＬの切断光、好ましくは紫外線で前記基板を照射し、その結果、前記第１の取り込まれたヌクレオチドにて光化学的切断反応を光学的に誘導するステップと、さらに、
前記基板によって前記切断波長λＣＬの切断光を閉じ込め、その結果、前記基板の第１の表面にて、前記基板によって前記切断光のエバネッセント波を定めるステップと、
複数のヌクレオチド及び酵素を有した溶液を提供するステップであって、前記ヌクレオチドはそれぞれ、前記蛍光ラベルを含むブロッキング部分を含む、ステップと、
前記それぞれのヌクレオチドが、前記第１の表面に結合した前記分子内に取り込まれた場合に、前記ブロッキング部分によって前記酵素の合成活性をブロックするステップと、
を含み、
光化学的切断反応を引き起こすステップが、前記蛍光ラベルを含むブロッキング部分が、前記取り込まれたヌクレオチドから切断されるように行われる、方法。
【請求項９】
前記ブロッキング部分が、ニトロフェニルエチルの誘導体、５−メチル（２−（２−ニトロフェニル）プロピル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログ、５−メチル（２−オキソ−１，２−ジフェニルエチル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログ、及び、そのいかなる組み合わせも含む群から選ばれるステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記基板が、いくつかの隣接する分子結合位置を含み、該位置にて、分子が、第１の方向に沿って前記第１の表面にそれぞれ結合する、請求項８乃至９のいずれか一項に記載の方法であって、
前記第１の方向に沿って互いに相対的に前記基板及び前記光学装置を動かすことによって光学走査を行うステップと、
各結合した分子が、前記第１の方向に沿った動きにおいて、第一に、前記少なくとも第１の波長λＥｘ１の励起光で照射され、後に第二に、前記切断波長λＣＬの切断光で照射されるように前記光学走査を行うステップと、
をさらに含む方法。
【請求項１１】
前記切断反応には時間ｔ切断がかかり、
前記切断反応時間ｔ切断は、照射される前記切断光の強度次第である、請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の方法であって、
前記結合したＤＮＡ分子内に第２のヌクレオチドを取り込むステップであり、前記取り込みには、時間ｔ取り込みがかかる、ステップと、
ｔ切断＜ｔ取り込みであるように、前記照射される切断光の強度を前記光学装置にて選択するステップと、
をさらに含む方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の方法に従って、ＤＮＡシーケンシングを光学的に制御するため、特に、反復性の段階的な反応を光学的に制御して、合成によって核酸の配列を決定するためのプログラム要素であって、当該プログラム要素は、プロセッサによって実行される場合に、
光学装置によって、少なくとも第１の励起波長λＥｘ１の励起光で基板を照射し、その結果、前記基板の第１の表面上に結合した分子内に取り込まれた第１のヌクレオチドの蛍光ラベルを光学的に励起するステップと、
前記基板によって前記励起光を閉じ込め、その結果、前記基板の第１の表面にて、前記基板によって前記励起光のエバネッセント波を定めるステップと、
前記光学装置によって、前記第１の取り込まれたヌクレオチドの前記励起された蛍光ラベルの蛍光を受信及び検出するステップと、
前記光学装置によって、切断波長λＣＬの切断光、好ましくは紫外線で前記基板を照射し、その結果、前記第１の取り込まれたヌクレオチドにて光化学的切断反応を光学的に誘導するステップと、
前記基板によって、前記切断波長λＣＬの切断光を閉じ込め、その結果、前記基板の第１の表面にて、前記基板によって前記切断光のエバネッセント波を定めるステップと、
を実行するよう適応されるプログラム要素。
【請求項１３】
請求項８に記載の方法に従って、ＤＮＡシーケンシングを光学的に制御するため、特に、反復性の段階的な反応を光学的に制御して、合成によって核酸の配列を決定するためのコンピュータプログラムが記憶されるコンピュータ可読媒体であって、前記コンピュータプログラムは、プロセッサによって実行される場合に、
光学装置によって、少なくとも第１の励起波長λＥｘ１の励起光で基板を照射し、その結果、前記基板の第１の表面上に結合した分子内に取り込まれた第１のヌクレオチドの蛍光ラベルを光学的に励起するステップと、
前記基板によって前記励起光を閉じ込め、その結果、前記基板の第１の表面にて、前記基板によって前記励起光のエバネッセント波を定めるステップと、
前記光学装置によって、前記第１の取り込まれたヌクレオチドの前記励起された蛍光ラベルの蛍光を受信及び検出するステップと、
前記光学装置によって、切断波長λＣＬの切断光、好ましくは紫外線で前記基板を照射し、その結果、前記第１の取り込まれたヌクレオチドにて光化学的切断反応を光学的に誘導するステップと、
前記基板によって、前記切断波長λＣＬの切断光を閉じ込め、その結果、前記基板の第１の表面にて、前記基板によって前記切断光のエバネッセント波を定めるステップと、
を実行するよう適応される、コンピュータ可読媒体。
【請求項１４】
ＤＮＡシーケンシングにおける、ブロッキング部分としての部分の使用であって、
前記部分は、５−メチル（２−（２−ニトロフェニル）プロピル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログ、５−メチル（２−オキソ−１，２−ジフェニルエチル）カーボネート−ｄＵＴＰアナログ、及び、そのいかなる組み合わせも含む群から選ばれる、使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のもののような別のアプローチは、全ての分子に対して別々に、リアルタイムでのヌクレオチドの取り込みを求めるため、より効率的である。この方法において、洗浄は要求されない。そのようなシステムに対する光学的要求は、一方で、４つの異なる色に対してリアルタイムでの単一のフルオロフォア感度を必要とするため、非常に苛酷である。これは、高倍率を用いた対物レンズの視野が実用的なシステム及び強いレーザー光源に対して制限されるため、制限された領域に対してのみ達成することができる。制限された領域を用いて、試料の小さな選択部分のみを配列決定することができ、さらに、読取りしそこなったものによるエラーのリスクは高い。ラベルされたヌクレオチドからの蛍光信号は、ヌクレオチドがポリメラーゼによって組み入れられながら、偶然同じ位置にある同じ種類の分子のものから識別される必要がある。これは、蛍光信号のパルス長を分析することによって行われる。
ＷＯ２００６／００７２０７Ａ２は、核酸配列決定のための方法を開示しており、この方法において、核酸は表面に付けられ、引き続き、光学的に検出可能なラベルを付着させたデオキシヌクレオチドトリホスフェートに曝露される。検出後、ラベルは、光切断によってそのヌクレオチドから取り除くことができる。特定の実施形態において、検出は、エバネッセント波照明を使用して実行される。
ＷＯ２００６／０４４０７８Ａ２は、光切断可能な可逆性ブロッキング基の例を開示している。ＷＯ２００９／０６０３６０Ａ２、ＥＰ  ２  ２２１  ６０５Ａ１及びＷＯ２００９／１０７０４１Ａ１は、ワイヤグリッドを有したセンサの異なる用途を開示している。
【国際調査報告】
2015503357.tif 000016
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