(57)【要約】  種々の実施形態において、突然変異Ｇｌｙ１６Ａｓｐ、Ｇｌｕ２２Ａｌａ、およびＴｈｒ８７Ｇｌｎを含む抗鎌状化−βグロビンポリペプチドをコードする抗鎌状化ヒトβグロビン遺伝子を含む核酸構築物を含む発現カセットを含む組換えレンチウイルスベクターが提供され、該レンチウイルスベクターは、ＴＡＴ非依存性および自己不活性化（ＳＩＮ）である。ある特定の実施形態において、ベクターはさらに、１つ以上のインスレーターエレメントを含有する。ベクターは、鎌状赤血球症の治療のための遺伝子治療において有用である。
2015529466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）であって、
突然変異Ｇｌｙ１６Ａｓｐ、Ｇｌｕ２２Ａｌａ、およびＴｈｒ８７Ｇｌｎを含む抗鎌状化−βグロビンポリペプチドをコードする抗鎌状化ヒトβグロビン遺伝子を含む核酸構築物を含む発現カセットを含み、
前記ＬＶは、ＴＡＴ非依存性および自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターである、組換えレンチウイルスベクター。
【請求項２】
前記抗鎌状化ヒトβ−グロビン遺伝子は、ヒトβ−グロビン遺伝子５’プロモーターおよびヒトβ−グロビン３’エンハンサーの制御下でエクソンおよびイントロンを含む約２．３ｋｂの組換えヒトβ−グロビン遺伝子を含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記β−グロビン遺伝子は、ＩＶＳ２からの３７５ｂｐのＲｓａＩ欠失を有するβ−グロビンイントロン２と、ＨＳ２、ＨＳ３、およびＨＳ４を含む複合ヒトβ−グロビン遺伝子座制御領域と、を含む、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
３’ＬＴＲにインスレーターをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のベクター。  
【請求項５】
前記インスレーターは、ニワトリβ−グロビン５’ＤｎａｓｅＩ−高感受性領域４（５’ＨＳ４）の最小ＣＴＣＦ結合部位エンハンサー遮断成分を含有する７７ｂｐのインスレーターエレメントＦＢ（ＦＩＩ／ＢＥＡＤ−Ａ）を含む、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
前記ベクターは、ψ領域ベクターゲノムのパッケージングシグナルを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項７】
５’ＬＴＲは、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項８】
Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項９】
中央ポリプリン区域を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１０】
翻訳後調節エレメントを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１１】
転写後調節エレメントは、修飾ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
組換えを通して野生型レンチウイルスを再構成することができない、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のベクターを導入した、宿主細胞。
【請求項１４】
前記細胞は、幹細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記細胞は、骨髄由来の幹細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記細胞は、２９３Ｔ細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記細胞は、ヒト造血前駆細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記ヒト造血前駆細胞は、ＣＤ３４＋細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
対象における鎌状赤血球症を治療する方法であって、
前記対象からの幹細胞および／または前駆細胞を、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のベクターで形質導入することと、
前記形質導入された細胞またはそれに由来する細胞を前記対象に移植することであって、前記細胞またはその誘導体は、前記抗鎌状化ヒトβグロビン遺伝子を発現する、移植することと、を含む、方法。
【請求項２０】
前記細胞は、幹細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞は、骨髄由来の幹細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞は、ヒト造血前駆細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヒト造血前駆細胞は、ＣＤ３４＋細胞である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年９月１４日に出願された米国特許出願第６１／７０１，３１８号の利益およびそれに対する優先権を主張するものであり、参照により、その全体が全ての目的のために本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府援助に関する記載
［該当なし］
【背景技術】
【０００３】
鎌状赤血球症（ＳＣＤ）は、世界的に最も一般的な一遺伝子性疾患の１つであり、罹病率および早期死亡の主要原因である（Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．５ｔｈ  ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ）。ＳＣＤは、約８０，０００人の米国人に発症し、著しい神経損傷、肺損傷、および腎損傷、ならびに生活の質に有害な影響を及ぼす重度の急性および慢性疼痛を引き起こす。アフリカでは毎年約２４０，０００人の小児がＳＣＤを伴って出生し、８０％が２歳の誕生日までに死亡する。米国においてＳＣＤに罹患する対象の平均寿命は約４０年であり、これは過去３０〜４０年にわたって変化していない。
【０００４】
ＳＣＤは、ヘモグロビンの重合および赤血球（ｒｂｃ）の鎌状化をもたらすβ−グロビンにおける単一のアミノ酸変化（Ｇｌｕ  ６からＶａｌ  ６へ）によって引き起こされる。ＳＣＤは、典型的には、継続的な軽度の虚血および突発性の増悪または「危機」をもたらし、その結果として組織虚血、臓器障害、および早期死亡を引き起こす。
【０００５】
ＳＣＤは十分に特徴付けられているが、依然として理想的な長期治療が存在しない。現在の治療法は、鎌状ヘモグロビン（ＨｂＳ）の重合（Ｖｏｓｋａｒｉｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ，１１５（１２）：２３５４−２３６３）および細胞内脱水（Ｅａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｏｆｒｉｃｈｔｅｒ（１９８７）Ｂｌｏｏｄ，７０（５）：１２４５−１２６６）を阻害するための胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の誘導、または輸血によるＨｂＳのパーセンテージの減少（Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．３ｒｄ  ｅｄ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ：ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ）に基づいている。骨髄（ＢＭ）または臍帯血（ＵＣＢ）または動員末梢血幹細胞（ｍＰＢＳＣ）からの同種ヒト幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、潜在的に根治療法であるが、この手技を受けるのはごく少数の患者のみであり、それは主としてＨＬＡが一致する同胞ドナーを有する、重篤な症状を伴う小児である（Ｂｏｌａｎｏｓ−Ｍｅａｄｅ  ａｎｄ  Ｂｒｏｄｓｋｙ（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１（２）：１５８−１６１；Ｒｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｌａｎｃｅｔ，３７６（９７５７）：２０１８−２０３１；Ｓｈｅｎｏｙ（２０１１）Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ．２０１１：２７３−２７９）。
【０００６】
同種細胞の移植は、高い罹病率の原因となり得る移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを伴う。適合非血縁ドナーからのＵＣＢを使用したＨＳＣＴは、ＢＭの使用と比較すると急性または慢性ＧｖＨＤのリスクが低いが、より少ない細胞用量および免疫学的未熟性の結果として、ＵＣＢを使用することで生着不全のより高い確率が存在する（Ｋａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１８（８）：１２６５−１２７２；Ｌｏｃａｔｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｐａｇｌｉａｒａ（２０１２）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ．５９（２）：３７２−３７６）。
【０００７】
自家ヒト幹細胞（ＨＳＣ）を用いた遺伝子治療は、適合ドナーを探す限界、ならびにＧｖＨＤおよび移植片拒絶のリスクを回避するため、同種ＨＳＣＴの代替である。ＳＣＤ患者における遺伝子治療の適用の場合、以前に記載された、ＳＣＤ患者の自家末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）を採取するためにＧ−ＣＳＦが使用されたときの合併症のために、自家ＨＳＣの最も安全な源はＢＭであろう（Ａｂｂｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｌａｎｃｅｔ３５１（９１０７）：９５９；Ａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ，９７（１０）：３３１３−３３１４；Ｆｉｔｚｈｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，１１（４）：４６４−４７１）。全身麻酔もＳＣＤ患者にリスクを負わせるが、現在の最良の医療はこれらを最小限に抑えることができる（Ｎｅｕｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．５７（２）：１０１−１０８）。
【０００８】
β−グロビン遺伝子導入のための組み込みベクターの開発は、高レベルの赤血球特異的発現に必要とされる複雑な調節エレメントに起因して困難であった（Ｌｉｓｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｄｅｌａｉｎ（２００８）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１４１（３）：３３５−３４５）。γ−レトロウイルスベクターは、β−グロビン発現カセットをインタクトな状態で導入することができなかった（Ｇｅｌｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２７１：１３５−１４８；Ｇｅｌｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３１６Ｂ：２３５−２４９）。対照的に、レンチウイルスベクター（ＬＶ）は、比較的高い効率でβ−グロビンカセットをインタクトな状態で導入することができるが、より単純なカセットを保持するベクターの力価と比較すると、これらのベクターの力価は低減する（Ｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０６（６７９１）：８２−８６；Ｐａｗｌｉｕｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４（５５５０）：２３６８−２３７１）。この１０年で、多くのグループが、β−異常ヘモグロビン症を標的とする異なるβ−グロビンＬＶを開発してきており、マウスモデルにおいて生体外で操作したＨＳＣの移植後に好ましい治療結果が認められている（Ｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ４０６（６７９１）：８２−８６；Ｐａｗｌｉｕｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４（５５５０）：２３６８−２３７１；Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ，１０２（１３）：４３１２−４３１９；Ｈａｎａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ，１０４（８）：２２８１−２２９０；Ｐｕｔｈｅｎｖｅｅｔｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ，１０４（１２）：３４４５−３４５３；Ｍｉｃｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５（３０）：１０５４７−１０５５２；Ｐｅｓｔｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（２）：２４５−２５２）。
【０００９】
遺伝性高胎児ヘモグロビン症（ＨｂＦ）（ＨＰＦＨ）を伴う鎌状赤血球症患者は、ＨｂＦが閾値を超えて上昇した（例えば、全細胞Ｈｂの８％〜１５％）場合に、生存率の向上および臨床症状の寛解を示し、最大の臨床的有用性が観察される（Ｖｏｓｋａｒｉｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ，１１５（１２）：２３５４−２３６３；Ｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３０（２３）：１６３９−１６４４）。そのため、いくつかの遺伝子治療戦略は、ヒトγ−グロビン遺伝子（ＨＢＧ１／２）を担持するウイルスベクターを用いてきた。しかしながら、γ−グロビン遺伝子の高レベルの発現には胎児特異的転写因子が必要であるため、これらの構築物は、成人赤血球細胞においてＨｂＦを十分に発現しなかった（Ｃｈａｋａｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ１０５（５）：２１５４−２１６０；Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．７９（６）：５１６−５２５）。これらの限界は、ヒトβ−グロビン遺伝子５′プロモーターおよび３′エンハンサーエレメント内にヒトγ−グロビンをコードするエクソンを組み込むことによって克服されてきた（Ｈａｎａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ，１０４（８）：２２８１−２２９０；Ｐｅｒｓｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｌｏｏｄ，１０１（６）：２１７５−２１８３；Ｐｅｒｕｍｂｅｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ，１１４（６）：１１７４−１１８５）。Ｂｒｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，７（３）：ｅ３２３４５は、ＳＣＤ患者からのＣＤ３４＋由来赤血球細胞における正常なＨｂＡの発現を増加させるために、ヒトヘモグロビン（ＨＢＢ）遺伝子をコードするＬＶベクターを使用したが、ＨＢＢ遺伝子を使用した場合に必要とされる発現レベルは、ＳＣＤ患者において治療効果を達成するためにＨＢＧ１／２遺伝子発現に必要とされるレベルよりも高かった。
別のアプローチは、γ−グロビンからの主要アミノ酸を置換することによって、抗鎌状化活性を付与するようにβ−グロビン遺伝子を修飾することである。修飾されたβ−グロビンカセットは、成人赤血球細胞において必要とされる高レベルの赤血球特異的発現を生じるはずである。Ｐａｗｌｉｕｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４（５５５０）：２３６８−２３７１は、アミノ酸修飾Ｔ８７Ｑを有するヒトβ−グロビン遺伝子を担持するＬＶを設計した。γ−グロビンの８７位のグルタミンが、ＨｂＦの抗鎌状化活性と関連付けられた（Ｎａｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７６（２）：６７０−６７２）。この抗鎌状化構築物は、疾患の２つのマウスモデルにおいてＳＣＤを修正しており、また、類似するＬＶが、フランスでβサラセミアおよびＳＣＤの臨床試験に使用されている（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ，４６７（７３１３）：３１８−３２２）。
Ｔｏｗｎｅｓらは、同様のアプローチを取り、元の（ＨｂＡ）と比較して３つのアミノ置換を有する、β−グロビンタンパク質（ＨｂＡＳ３）をコードする組換えヒト抗鎌状化β−グロビン遺伝子（ＨＢＢＡＳ３）を開発した：ＨｂＳの古典的Ｖａｌ  ６との側面接触を遮断するためのＴ８７Ｑ、軸方向の接触を妨げるＥ２２Ａ（３２）、およびα−グロビンポリペプチドとの相互作用のために鎌状β−グロビン鎖に勝る競合的利点を付与するＧ１６Ｄ。精製したＨｂＡＳ３タンパク質の機能分析は、この組換えタンパク質が、ＨｂＳ四量体の重合を阻害する強力な活性を有することを示した（３３）。Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９）は、ＳＣＤのマウスモデルからのＢＭ幹細胞の、ＨＢＢＡＳ３導入遺伝子を担持する自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＶによる効率的な形質導入が、正常なｒｂｃの生理機能をもたらし、ＳＣＤの病態の顕在化を予防したことを示した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願第６１／７０１，３１８号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）
【非特許文献２】Ｖｏｓｋａｒｉｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）
【非特許文献３】Ｅａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｏｆｒｉｃｈｔｅｒ（１９８７）
【非特許文献４】Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（２００１）
【非特許文献５】Ｂｏｌａｎｏｓ−Ｍｅａｄｅ  ａｎｄ  Ｂｒｏｄｓｋｙ（２００９）
【非特許文献６】Ｋａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）
【非特許文献７】Ｌｏｃａｔｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｐａｇｌｉａｒａ（２０１２）
【非特許文献８】Ａｂｂｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）
【非特許文献９】Ａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）
【非特許文献１０】Ｆｉｔｚｈｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）
【非特許文献１１】Ｎｅｕｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）
【非特許文献１２】Ｌｉｓｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｄｅｌａｉｎ（２００８）
【非特許文献１３】Ｇｅｌｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）
【非特許文献１４】Ｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）
【非特許文献１５】Ｐａｗｌｉｕｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）
【非特許文献１６】Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）
【非特許文献１７】Ｈａｎａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）
【非特許文献１８】Ｐｕｔｈｅｎｖｅｅｔｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）
【非特許文献１９】Ｍｉｃｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）
【非特許文献２０】Ｐｅｓｔｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）
【非特許文献２１】Ｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）
【非特許文献２２】Ｃｈａｋａｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）
【非特許文献２３】Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００７）
【非特許文献２４】Ｐｅｒｓｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）
【非特許文献２５】Ｐｅｒｕｍｂｅｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）
【非特許文献２６】Ｂｒｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）
【非特許文献２７】Ｎａｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）
【非特許文献２８】Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
抗鎌状化（βＡＳ３）β−グロビン遺伝子カセットを担持する改善されたレンチウイルスベクターが、ＳＣＤドナーからのヒトＢＭ由来ＣＤ３４＋細胞を形質導入する能力は、特に、ＳＣＤのための遺伝子治療の臨床試験における使用に関して特徴付けられた。例示的なベクターが、健常ドナーまたはＳＣＤドナーからのＢＭ  ＣＤ３４＋細胞の効率的な形質導入を達成した。ベクターの遺伝子発現活性をｍＲＮＡおよびタンパク質レベルで評価し、ＨＢＢＡＳ３の発現が脱酸素化ｒｂｃの鎌状化に与える影響を特徴付けた。インビトロアッセイで潜在的な遺伝毒性を検出した。また、形質導入されたＢＭ  ＣＤ３４＋細胞を免疫不全マウスにも異種移植し、２〜３ヶ月後、マウスの骨髄からヒト造血前駆細胞を再度単離し、インビトロでの赤血球分化に供したところ、抗鎌状化ＨＢＢＡＳ３遺伝子を発現し続けることが分かった。これらの結果は、本明細書に記載されるベクター（複数可）が、ＳＣＤ  ＢＭ  ＣＤ３４＋前駆細胞を効率的に形質導入し、ＳＣＤの臨床的遺伝子治療に用いることができるｒｂｃの生理学的パラメータを向上させるのに十分なレベルの抗鎌状化Ｈｂタンパク質を生成することを示している。
【００１３】
したがって、種々の態様において、本明細書で企図される本発明（複数可）は、限定される必要はないが、以下の実施形態のうちのいずれか１つ以上を含んでもよい。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
実施形態１：突然変異Ｇｌｙ１６Ａｓｐ、Ｇｌｕ２２Ａｌａ、およびＴｈｒ８７Ｇｌｎを含む抗鎌状化βグロビンポリペプチドをコードする抗鎌状化ヒトβグロビン遺伝子を含む核酸構築物を含む発現カセットを含む組換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）であり、該ＬＶは、ＴＡＴ非依存性および自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＶである。
【００１５】
実施形態２：抗鎌状化ヒトβ−グロビン遺伝子は、ヒトβ−グロビン遺伝子５’プロモーターおよびヒトβ−グロビン３’エンハンサーの制御下でエクソンおよびイントロンを含む約２．３ｋｂの組換えヒトβ−グロビン遺伝子を含む、実施形態１のベクター。
【００１６】
実施形態３：β−グロビン遺伝子は、ＩＶＳ２からの３７５ｂｐのＲｓａＩ欠失を有するβ−グロビンイントロン２と、ＨＳ２、ＨＳ３、およびＨＳ４を含む複合ヒトβ−グロビン遺伝子座制御領域とを含む、実施形態２のベクター。
【００１７】
実施形態４：３’ＬＴＲにインスレーターをさらに含む、実施形態１〜３のいずれか１つによるベクター。
【００１８】
実施形態５：インスレーターは、ニワトリβ−グロビン５’ＤｎａｓｅＩ−高感受性領域４（５’ＨＳ４）の最小ＣＴＣＦ結合部位エンハンサー遮断成分と、ヒトＴ細胞受容体δ／α  ＢＥＡＤ−１インスレーターの類似領域とを含有する、７７ｂｐのインスレーターエレメントＦＢ（ＦＩＩ／ＢＥＡＤ−Ａ）を含む、実施形態４のベクター。（例えば、Ｒａｍｅｚａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｔｅｍｃ  Ｃｅｌｌ  ２６：３２５７−３２６６を参照）。
【００１９】
実施形態６：インスレーターは、全長ニワトリβ−グロビンＨＳ４もしくはその細断片、および／またはアンキリン遺伝子インスレーター、および／または他の合成インスレーターエレメントを含む、実施形態４のベクター。
【００２０】
実施形態７：ベクターは、ψ領域ベクターゲノムのパッケージングシグナルを含む、実施形態１〜６のいずれか１つによるベクター。
【００２１】
実施形態８：５’ＬＴＲは、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含む、実施形態１〜７のいずれか１つによるベクター。
【００２２】
実施形態９：５’ＬＴＲは、ＣＭＶ、ＲＳＶ、または他の強力なエンハンサー／プロモーターを含む、実施形態１〜７のいずれか１つによるベクター。
【００２３】
実施形態１０：Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含む、実施形態１〜９のいずれか１つによるベクター。
【００２４】
実施形態１１：中央ポリプリン区域（ｃＰＰＴ）を含む、実施形態１〜１０のいずれか１つによるベクター。
【００２５】
実施形態１２：翻訳後調節エレメントを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つによるベクター。
【００２６】
実施形態１３：転写後調節エレメントは、修飾されたウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である、実施形態１２のベクター。
【００２７】
実施形態１４：転写後調節エレメントは、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）であるか、またはベクターによって誘導されるＲＮＡ転写物を安定させる他の核酸配列である、実施形態１２のベクター。
【００２８】
実施形態１５：組換えを通して野生型レンチウイルスを再構成することができない、実施形態１〜１４のいずれか１つによるベクター。
【００２９】
実施形態１６：実施形態１〜１５のいずれか１つによるベクターで形質導入された、宿主細胞。
【００３０】
実施形態１７：細胞は、ウイルスプロデューサー細胞である、実施形態１６の宿主細胞。
【００３１】
実施形態１８：細胞は、幹細胞である、実施形態１６の宿主細胞。
【００３２】
実施形態１９：細胞は、骨髄（ＢＭ）由来の幹細胞である、実施形態１６の宿主細胞。
【００３３】
実施形態２０：細胞は、臍帯血（ＣＢ）由来の幹細胞である、実施形態１６の宿主細胞。
【００３４】
実施形態２１：細胞は、動員末梢血幹細胞（ｍＰＢＳＣ）由来の幹細胞である、実施形態１６の宿主細胞。
【００３５】
実施形態２２：人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）である、実施形態１６の宿主細胞。
【００３６】
実施形態２３：細胞は、２９３Ｔ細胞である、実施形態１６の宿主細胞。
【００３７】
実施形態２４：細胞は、ヒト造血前駆細胞である、実施形態１６の宿主細胞。
【００３８】
実施形態２５：ヒト造血前駆細胞は、ＣＤ３４＋細胞である、実施形態２４の宿主細胞。
【００３９】
実施形態２６：対象における鎌状赤血球症（ＳＣＤ）を治療する方法であって、当該対象からの幹細胞および／または前駆細胞を、実施形態１〜１５のいずれか１つによるベクターで形質導入することと、当該形質導入された細胞またはそれに由来する細胞を対象に移植することであって、当該細胞またはその誘導体は、有効量の当該抗鎌状化ヒトβグロビン遺伝子を発現することとを含む、方法。
【００４０】
実施形態２７：細胞は、幹細胞である、実施形態２６の方法。
【００４１】
実施形態２８：細胞は、ＢＭ由来の幹細胞である、実施形態２６の宿主細胞。
【００４２】
実施形態２９：細胞は、ＣＢ由来の幹細胞である、実施形態２６の方法。
【００４３】
実施形態３０：細胞は、動員末梢血幹細胞（ｍＰＢＳＣ）由来の幹細胞である、実施形態２６の方法。
【００４４】
実施形態３１：細胞は、ＩＰＳＣである、実施形態２６の方法。
【００４５】
実施形態３２：細胞は、ヒト造血前駆細胞である、実施形態２６の方法。
【００４６】
実施形態３３：ヒト造血前駆細胞は、ＣＤ３４＋細胞である、実施形態３２の方法。
【００４７】
実施形態３４：実施形態１〜１５のいずれか１つによるベクターを含むおよび／またはそれを使用して生成される、ウイルス粒子。
【００４８】
定義
「組換え」は、単一配列の一部として天然では一緒に発生しない部分を含むか、または天然に発生する配列と比較して再編成されている核酸配列を指して、当該技術分野におけるその用法と一致するように使用される。組換え核酸は、人の手を必要とするプロセスによって作製され、かつ／または、人の手によって（例えば、複製、増幅、転写等の１つ以上のサイクルによって）作製された核酸から生成される。組換えウイルスは、組換え核酸を含むウイルスである。組換え細胞は、組換え核酸を含む細胞である。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「組換えレンチウイルスベクター」または「組換えＬＶ」という用語は、ヒトによる介入および操作の結果としてＬＶおよび複数の追加セグメントから組み立てられる、人工的に作製されるポリヌクレオチドベクターを指す。
【００５０】
「グロビン核酸分子」は、グロビンポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。種々の実施形態において、グロビン核酸分子は、コード配列の上流および／または下流の調節配列を含んでもよい。
【００５１】
「グロビンポリペプチド」は、ヒトα、β、またはγグロビンに対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を意味する。
【００５２】
「治療的に機能的なグロビン遺伝子」という用語は、その発現が異常ヘモグロビン症の表現型を生成しないグロビンをもたらし、かつ欠陥グロビン遺伝子を有する個体に治療効果を提供するのに有効なヌクレオチド配列を指す。機能的なグロビン遺伝子は、治療を受ける哺乳動物個体に適切な野生型グロビンをコードし得るか、または、好ましくは、優れた特性、例えば、優れた酸素輸送特性もしくは抗鎌状化特性を提供する、グロビンの突然変異型であってもよい。機能的なグロビン遺伝子は、エクソンとイントロンの両方、ならびにグロビンプロモーターおよびスプライスドナー／アクセプターを含む。
【００５３】
「有効量」とは、必要な薬剤の量、または未治療の患者に関する疾患の症状を寛解もしくは排除するための薬剤を含む組成物の量を意味する。疾患の治療的処理のための本明細書に記載される方法を実施するために使用される組成物（複数可）の有効量は、投与様式、対象の年齢、体重、および総体的健康に依存して異なる。最終的には、担当医師または獣医師が、適切な量および投与計画を決定する。そのような量は、「有効な」量と称される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本明細書において企図されるＬＶの一実施形態を概略的に示す。
【図２】鎌状化を誘導する条件下における、遺伝子治療を施していない（パネルＡ）および施した（パネルＢ）ｒｂｃの画像を示す。
【図３】本明細書に記載される組成物および方法による例示的なＬＶの構造を示す。
【図４Ａ】ＨＢＢＡＳ３カセットを担持するＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶプロウイルス。ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶプロウイルスは、ＨｂＡＳ３タンパク質をコードするための３つの置換を有するヒトβ−グロビン遺伝子エクソン（矢印）、イントロン、３′および５′隣接領域、ならびに高感受性領域２〜４を有するβ−グロビンミニ遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）を含むＨＢＢＡＳ３発現カセットを有する。３′ＬＴＲは、ＳＩＮ欠失およびＦＢインスレーター（どちらもプロウイルスＤＮＡの５′ＬＴＲへの逆転写（ＲＴ）の間に導入された）を含有する。
【図４Ｂ】ＨＢＢＡＳ３カセットを担持するＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶプロウイルス。ＦＢインスレーターの安定性を調べるために、ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のインビトロ培養の１４日目に収集した細胞からのＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行った：モック形質導入（レーン１）、ＣＣＬ−βＡＳ３  ＬＶで形質導入（レーン２）、およびＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶで形質導入（レーン３）。５′ＬＴＲ（ＡからＢ）もしくは３′ＬＴＲ（ＣからＤ）のいずれか、またはプロウイルスの両方のＬＴＲ（ＡからＤ）のＦＢ挿入部位をプライマーで増幅した。これらのプライマー対を用いたＰＣＲ生成物の予想される大きさを、ＣＣＬ−βＡＳ３  ＬＶおよびＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶについて示す。ＮＴＣ：鋳型なしの対照。
【図４Ｃ】ＨＢＢＡＳ３カセットを担持するＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶプロウイルス。ＣＴＣＦ−結合タンパク質ＣｈＩＰ。ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶ（ＦＢ）、ＣＣＬ−βＡＳ３−１．２ｋｂ  ｃＨＳ４  ＬＶ（ｃＨＳ４）、またはインスレーター（Ｕ３）を欠損するＣＣＬ−βＡＳ３ベクターで形質導入したＫ５６２細胞からクロマチンを単離した。ＨＩＶ  ＳＩＮ  ＬＴＲ（Ｕ３、ｃＨＳ４、およびＦＢ）、ならびに陰性対照としてのベクター骨格（ＲＲＥ）のＨＩＶ  ＲＲＥ領域、またはＣＴＣＦに結合することが分かっている細胞のｃ−ＭｙｃおよびＨ１９／ＩＣＲ部位に対するプライマーを使用して、ｑＰＣＲ増幅を行った。＊Ｐ＝０．００６。図示する値は、平均±ＳＤである。
【図５Ａ】ＣＦＵアッセイにおける、インビトロ赤血球分化培養下でのＢＭ  ＣＤ３４＋細胞の形質導入および造血能の評価。インビトロＣＦＵアッセイにおいて造血コロニーに成長した播種ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のパーセンテージを示す。提示される値は、健常ドナー（ＨＤ）−モックの平均±ＳＤ、ｎ＝１３；ＨＤ−βＡＳ３−ＦＢ、ｎ＝１６；ＳＣＤ−モック、ｎ＝１８；およびＳＣＤ−βＡＳ３−ＦＢ、ｎ＝２４である。
【図５Ｂ】ＣＦＵアッセイにおける、インビトロ赤血球分化培養下でのＢＭ  ＣＤ３４＋細胞の形質導入および造血能の評価。ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞によって形成される造血コロニー種の分布。図５Ａと同じパターンに従って、同定された異なる種類の造血コロニーのパーセンテージを提示する。ＨＤ−モック、ｎ＝５回の独立した実験；ＨＤ−βＡＳ３−ＦＢ、ｎ＝７回の独立した実験；ＳＣＤ−モック、ｎ＝６回の独立した実験；およびＳＣＤ−βＡＳ３−ＦＢ、ｎ＝８回の独立した実験。図示する値は、平均±ＳＤである。＊二元配置ＡＮＯＶＡでＰ＝０．０４８。
【図５Ｃ】ＣＦＵアッセイにおける、インビトロ赤血球分化培養下でのＢＭ  ＣＤ３４＋細胞の形質導入および造血能の評価。形質導入したＳＣＤ  ＣＤ３４＋ＢＭから増殖させたインビトロ単一ＣＦＵを、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢベクタープロウイルスの存在およびＶＣ／細胞についてｑＰＣＲにより分析した（ｎ＝１９１コロニー、５回の独立した実験）。グラフは、ｑＰＣＲによってベクターについて陰性であったＣＦＵ（白色、ｎ＝１３４）、または１〜２個（薄灰色、ｎ＝５０）、３〜６個（濃灰色、ｎ＝６）、および７〜９個（黒色、ｎ＝１）のＶＣ／細胞を有するＣＦＵのパーセンテージを示す。
【図５Ｄ】ＣＦＵアッセイにおける、インビトロ赤血球分化培養下でのＢＭ  ＣＤ３４＋細胞の形質導入および造血能の評価。インビトロ赤血球分化培養下で増殖させたＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢで形質導入したＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のＶＣ／細胞。各点は、独立した形質導入および培養を表す。ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞は、ＨＤ（黒丸、ｎ＝１１）またはＳＣＤドナー（白抜き四角、ｎ＝１５）に由来する。エラーバーは、平均値±ＳＤを表す。
【図６Ａ】ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のインビトロ赤血球分化。インビトロ赤血球分化条件下で継時的に増殖させたＢＭ  ＣＤ３４＋細胞からの倍増殖。代表的な実験からの増殖曲線を示す。ＨＤ−モック、黒三角；ＨＤ−βＡＳ３−ＦＢ形質導入、黒丸；ＳＣＤ−モック、白抜き三角；ＳＣＤ−βＡＳ３−ＦＢ形質導入、白抜き四角。
【図６Ｂ】ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のインビトロ赤血球分化。インビトロ赤血球培養中にＣＤ３４＋ＢＭ  ＳＣＤで形質導入した試料の免疫表現性分析。フローサイトメトリーにより、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７１、およびＧｐＡの発現について細胞を分析した。各バーは、３日目（白いバー）、１４日目（ピンクのバー）、および２１日目（赤いバー）の、図示される表面マーカーの発現のパーセンテージを表す。示される値は、４回の独立した実験の平均±ＳＤである。ＤＮＡ色素ＤＲＡＱ５で染色することにより、２１日目に脱核ｒｂｃのパーセンテージを評価した（７回の独立した実験の平均±ＳＤ）。
【図６Ｃ】ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のインビトロ赤血球分化。脱核ｒｂｃを定量化するための赤血球培養のフローサイトメトリー分析。ＤＲＡＱ５、およびヒト赤血球マーカーＧｐＡに対する抗体で細胞を染色することにより分析を行った。脱核赤血球を左上象限にＤＲＡＱ５陰性細胞、ＧｐＡ陽性細胞として表す。
【図６Ｄ】ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のインビトロ赤血球分化。８日目および１４日目の赤芽球から正赤芽球へ、そして２１日目の脱核網状赤血球および赤血球のほぼ均一な集団までの赤血球分化の進行を示す、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａによって染色した培養からの細胞遠心調製物の顕微鏡写真。
【図７Ａ】ＣＤ３４＋ＢＭ試料からのインビトロ赤血球分化後のＨＢＢＡＳ３の発現。形質導入した細胞からｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡの発現対異なるＶＣ／細胞。各試料から達成されたＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡのパーセンテージは、ｑＰＣＲによって測定されたその対応するＶＣ／細胞と関連していた。合計で２０の独立した形質導入が示される。ＨＤ、黒丸（ｎ＝４）；ＳＣＤ、白抜き四角（ｎ＝１６）。
【図７Ｂ】ＣＤ３４＋ＢＭ試料からのインビトロ赤血球分化後のＨＢＢＡＳ３の発現。存在するＨｂ四量体を定量化するために使用された代表的なＩＥＦ膜。一番左のレーンは、ヒトＨｂ四量体のｐＩ標準値を上から下に示す：ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＦ、およびＨｂＡ（ならびにＨｂＡＳ３の予想されるｐＩ）。レーン１〜６は、モック形質導入（レーン１）またはＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶで形質導入した（レーン２〜６）かのいずれかであるＳＣＤ  ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞を用いて開始した赤血球培養からのライセートのＩＥＦを示す。モック形質導入試料中にＨｂＡＳ３タンパク質は検出されなかった（レーン１）が、ＨｂＡＳ３は、全Ｈｂのうち次のように提示された：２１．７８％（レーン２、１．１４ＶＣ）、１８．１１％（レーン３、１．０８ＶＣ）、１９．３４％（レーン４、１．１３ＶＣ）、２１．３４％（レーン５、０．９９ＶＣ）、および２０．４０％（レーン６、１．１１ＶＣ）。濃度測定分析を使用して全Ｈｂ四量体のうちのＨｂＡＳ３のパーセンテージを決定し、ｑＰＣＲを使用して同じ試料中のＶＣ／細胞を測定した。
【図７Ｃ】ＣＤ３４＋ＢＭ試料からのインビトロ赤血球分化後のＨＢＢＡＳ３の発現。形質導入された細胞から生成したＨｂＡＳ３タンパク質対異なるＶＣ／細胞（ｎ＝１０）。
【図７Ｄ】ＣＤ３４＋ＢＭ試料からのインビトロ赤血球分化後のＨＢＢＡＳ３の発現。ＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡ（ｎ＝１６）およびＨｂＡＳ３四量体（タンパク質、ｎ＝１０）の測定に基づくＶＣ／細胞当たりのＨＢＢＡＳ３発現の概要。エラーバーは、平均値±ＳＤを表す。
【図８Ａ】ＳＣＤ表現型修正。脱酸素化赤血球細胞の位相差顕微鏡写真。ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞の赤血球分化培養からの細胞を二亜硫酸ナトリウムで処理し、位相差顕微鏡を使用してそれらの形態を評価した。鎌状ｒｂｃの５つの例を上段パネルにわたって示し、正常なｒｂｃの５つの例を下段パネルにわたって示す。
【図８Ｂ】ＳＣＤ表現型修正。二亜硫酸ナトリウムで脱酸素化された、モック形質導入したＳＣＤ  ＣＤ３４＋細胞（左パネル）対ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢで形質導入したＳＣＤ  ＣＤ３４＋細胞（右パネル）からのｒｂｃの代表的な領域。
【図８Ｃ】ＳＣＤ表現型修正。ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢで形質導入したＳＣＤ  ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞の各個々の培養における形態学的に「修正された」細胞対ＶＣ／細胞のパーセンテージの相関関係。修正されたｒｂｃのパーセンテージは、形質導入した試料中の非鎌状細胞のパーセンテージから、適合する非形質導入試料中の非鎌状細胞のバックグラウンド値を差し引いたものとして定義される。
【図９Ａ】ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶ形質導入のインビボ評価。ＮＳＧマウスにおけるヒト細胞の生着。各移植群（番号１〜６）のマウスから単離したＢＭ細胞をフローサイトメトリーによって分析し、生着の尺度として骨髄中の全てのＣＤ４５＋細胞（ヒトおよびマウス）におけるヒトＣＤ４５＋細胞のパーセンテージを測定した。モック形質導入、白抜き三角；ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ形質導入、黒三角。ＨＤからのＢＭ試料を移植片３、４、および６に使用し、ＳＣＤドナーからの試料を移植片１、２、および５に使用した。
【図９Ｂ】ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶ形質導入のインビボ評価。形質導入されたＢＭ  ＣＤ３４＋細胞を移植したＮＳＧマウスから単離したヒト細胞の免疫表現性分析。フローサイトメトリーを使用して、Ｂリンパ球細胞（ＣＤ１９、白）、骨髄系前駆細胞（ＣＤ３３、薄灰色）、造血前駆細胞（ＣＤ３４、濃灰色）、および赤血球細胞（ＣＤ７１、黒）のマーカーについて陽性を示したヒトＣＤ４５＋細胞のパーセンテージを数えた。３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。モック、ｎ＝４；βＡＳ３−ＦＢ、ｎ＝８匹のマウス。
【図９Ｃ】ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶ形質導入のインビボ評価。形質導入されたＢＭ  ＣＤ３４＋細胞を移植したＮＳＧマウスから培養されたヒト細胞中のＶＣ／細胞。黒丸は、ＨＤ  ＢＭを移植したマウスからの試料を表し、白抜き四角は、ＳＣＤ  ＢＭを移植したマウスを表す。モック形質導入したマウスから調べた全てのヒト細胞は、ｑＰＣＲによってＶＣ分析に陰性を示した。
【図９Ｄ】ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶ形質導入のインビボ評価。形質導入された細胞からｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡの発現対異なるＶＣ／細胞。５つの独立した形質導入を示す。ＨＤ、黒丸（ｎ＝６）；ＳＣＤ、白抜き四角（ｎ＝４）。
【図１０Ａ】ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶベクターの遺伝毒性の評価の結果を示す。癌関連遺伝子中および近傍のベクター（組み込み部位）ＩＳの頻度を示す。バーは、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．に定義されるように、転写領域内または癌関連遺伝子のプロモーターの５０ｋｂ以内の組み込み頻度を表す（インビトロ３２．１％、インビボ３４．３％）（４４）。
【図１０Ｂ】ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶベクターの遺伝毒性の評価の結果を示す。転写開始部位（ＴＳＳ）周辺の組み込み頻度を示す。遺伝子ＴＳＳの中央にある２０ｋｂウィンドウ内の４つの５ｋｂ  ｂｉｎにおけるベクターＩＳの頻度をプロットした。ＩＳを以下について示す：２週間インビトロで増殖させ（レンチ、インビトロ、ｎ＝２０９１；灰色のバー）、ＮＳＧマウスにおいて２〜３ヶ月インビボで生着させた後（レンチ、インビボ、ｎ＝４１４；黒いバー）で分析したＢＭ  ＣＤ３４＋細胞、ならびに、臨床遺伝子治療試験からのＭＬＶ  γ−レトロウイルスベクターのデータセット（ＭＬＶインビトロ、ｎ＝８２８；白いバー）（４５）、およびコンピュータで作成し、同一方法によって分析したランダムデータセット（ランダム、ｎ＝１２，８３７；黒線）。
【図１０Ｃ】ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶベクターの遺伝毒性の評価の結果を示す。インビトロ不死化（ＩＶＩＭ）アッセイ。形質導入後８日目にｑＰＣＲによって測定されたバルクＶＣ／細胞に対して修正されたＬ−Ｃａｌｃソフトウェアを使用して、ポアソン統計に基づいて計算した、異なるベクターで形質導入したマウス系統陰性細胞の再播種頻度を示す。図の下部にわたって提示される分数は、クローンが形成されなかった陰性アッセイの数を、そのベクターについて行われたアッセイの合計数で除したものを表す。水平線は、全ての陽性アッセイの平均再播種頻度を表す。＊フィッシャーの両側直接確率検定でＰ＝０．００２。
【図１１Ａ】βＡＳ３  ＬＶプラスミドマップおよびＴＡＴタンパク質の存在下または非存在下における生成。ＨＩＶ−１エンハンサーおよびプロモーターによって駆動される転写がＴＡＴに依存する親ＤＬ−βＡＳ３（上）と、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターが５’ＬＴＲにおいて置換され、ＴＡＴの必要性が排除されたＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ（下）のベクタープラスミド形態。どちらの場合も、ＨＩＶ−１パッケージング配列（Ψ）、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、中央ポリプリン区域（ｃＰＰＴ）、およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が示される。
【図１１Ｂ】βＡＳ３  ＬＶプラスミドマップおよびＴＡＴタンパク質の存在下または非存在下における生成。ＤＬ−βＡＳ３、ＣＣＬ−βＡＳ３、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ、および陽性対照ＣＣＬＭＮＤ−ＧＦＰ  ＬＶベクターを、ＨＩＶ−１  ＴＡＴ発現プラスミドの存在下（黒いバー）または非存在下（白いバー）でパッケージした。３つの実験の平均およびＳＤを示す。
【図１２】プロウイルスの全長完全性を確認するためにサザンブロット分析を行った。プロウイルスの各ＬＴＲを切断し、ほぼ全長のゲノム断片（８．６Ｋｂ）を放出するＡｆｌＩＩで、モック形質導入したかまたはＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶで形質導入した２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡ（ｑＰＣＲによって分析された平均ＶＣ／細胞１０）を消化した。レーン１にＤＮＡラダーを示し、続いてモック形質導入細胞をレーン２に、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢで形質導入した細胞をレーン３に示す：正しいサイズのインタクトなプロウイルスを表す固有のバンドが存在する。
【図１３】赤血球または骨髄培養の１４日目のＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡの発現を、内在性対照遺伝子ＡＣＴＢと比較して分析した。３つの個別の実験において、ＡＣＴＢと比較した相対的な発現の骨髄条件（０．０４±０．０１）では、ＨＢＢＡＳ３導入遺伝子によるｍＲＮＡの発現は検出されなかった。対照的に、赤血球条件下で増殖させた同じ細胞は、ＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡの高い発現を示した（２３５．３５±７７．７７）。各条件におけるｍＲＮＡの発現を、ぞれぞれ赤血球および骨髄試料から得られたＶＣ／細胞に対して正規化した。図示する値は、平均±ＳＤである。
【図１４】ＣＣＬ−βＡＳ３またはＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶで形質導入したＳＣＤドナーからのＢＭ−ＣＤ３４＋細胞によって生成された赤血球細胞からのＨＢＢＡＳ３カセットの発現を、ＲＴｑＰＣＲによって分析し、ＶＣ／細胞当たりのＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡのパーセンテージ（黒塗りの菱形）を決定するか、またはＩＥＦによって分析し、ＶＣ／細胞当たりのＨｂＡＳ３タンパク質のパーセンテージ（白抜き菱形）を決定した。全β−グロビン様ｍＲＮＡのＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡのパーセンテージ（ｐ＝０．１２、両側ｔ検定）、またはＣＣＬ−βＡＳ３もしくはＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶで形質導入した赤血球細胞中の全ＨｂのＨｂＡＳ３のパーセンテージ（ｐ＝０．８９、両側ｔ検定）に、差は認められなかった。したがって、これらの結果は、ＦＢインスレーターが位置非依存性発現を改善するための障壁作用を提供しなかったことを示唆している（ＦＢインスレーターの付加が、非遮蔽ＬＶと比較してＨＢＢＡＳ３カセットの発現を変化させなかったため）。エラーバーは、平均値を表す。
【図１５】赤血球条件、メチルセルロース培地（ＣＦＵ）、骨髄条件において増殖させ、生着したＮＳＧ  ＢＭから増殖させた、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢで形質導入したＢＭ  ＣＤ３４＋細胞において、ｑＰＣＲにより決定したＶＣ／細胞を示す。赤血球培養アッセイにおいて増殖させた細胞からのＶＣ／細胞測定値は、骨髄培養において増殖させた細胞中（＊ｐ＝０．０００３）、またはＮＳＧ  ＢＭから増殖させた細胞中（＊＊ｐ＜０．０００１）で測定されるものよりも有意に高かった。図示する値は、平均±ＳＤである。
【図１６】鎌状赤血球病の細胞ベースの遺伝子治療における典型的なステップを概略的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
鎌状赤血球症（ＳＣＤ）は、急性疾患の重篤な発作および進行性臓器障害に関連する多系統疾患であり、世界的に最も一般的な一遺伝子性疾患の１つである。ＳＣＤは、成人ＨＳＣから生成されるｒｂｃの異常から起こるため、健常な（同種）ドナーからのＨＳＣＴは、生涯にわたって正常な赤血球の生成の源を提供することにより、ＳＣＤに罹患する患者に恩恵をもたらすことができる。しかしながら、同種ＨＳＣＴは、十分に適合するドナーの入手可能性によって、ならびに移植片拒絶および移植片対宿主病の免疫学的合併症によって制約される。
【００５６】
我々は、ＳＣＤの自家幹細胞遺伝子治療が、現在の同種ＨＳＣＴ手法の免疫抑制を必要とすることなく、この疾病を治療する潜在性を有すると考える。具体的には、我々は、抗鎌状化ヒトβグロビンを造血細胞（またはその前駆細胞）に導入する自家幹細胞遺伝子治療が、ＳＣＤに有効な治療（例えば、ｒｂｃの生理機能の正常化、およびＳＣＤの顕在化の予防を含む）を提供することができると考える。
【００５７】
したがって、種々の実施形態において、抗鎌状化βグロビンを、それを必要とする対象（例えば、鎌状細胞突然変異を有する対象）に次いで移植することができる幹細胞および前駆細胞（例えば、造血幹細胞および造血前駆細胞）に導入するための改善されたＬＶが提供される。ある特定の実施形態において、ベクターに使用されるヒトβグロビン遺伝子の抗鎌状化型は、３つの突然変異Ｇｌｙ１６Ａｓｐ、Ｇｌｕ２２Ａｌａ、およびＴｈｒ８７Ｇｌｎを含む（例えば、Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（２６）：２７５１８−２７５２４を参照）。特定の理論に拘束されるわけではないが、Ｇｌｕ２２Ａｌａ突然変異がα鎖への親和性を増加させ、Ｔｈｒ８７Ｇｌｎ突然変異がβＳタンパク質のＶａｌ６との側面接触を遮断し、Ｇｌｙ１６Ａｓｐ突然変異がグロビン鎖間の軸方向の接触を減少させると考えられる。
【００５８】
種々の実施形態において、本明細書に記載されるＬＶは、β−グロビンをコードする以前のレンチウイルス構築物には含まれなかった追加の安全性特徴を有する。ある特定の実施形態において、これらの特徴は、インスレーター（例えば、３’ＬＴＲのＦＢインスレーター）の存在を含む。付加的にまたは代替的に、ある特定の実施形態において、パッケージング中にＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質を包含することなく、より力価の高いベクターを生じさせるように、ＨＩＶ  ＬＴＲが代替のプロモーター（例えば、ＣＭＶ）で置換されている。他の強力なプロモーター（例えば、ＲＳＶ等が使用されてもよい）。
【００５９】
さらに、後に説明するように、ＳＣＤに罹患する患者のＢＭからのＨＳＣを使用した本明細書に記載されるベクターの有効性も初めて実証された。
【００６０】
原理証明として、パッケージングのためのｔａｔ非依存性を付与するようにｐＣＣＬ  ＬＶベクター骨格に挿入されたβＡＳ３グロビン発現カセットを含むＬＶを製造した（例えば、種々のベクターおよび構築戦略を示す図１、３、４Ａ、および４Ｂを参照）。ある特定の実施形態において、ＦＢ（ＦＩＩ／ＢＥＡＤ−Ａ）複合エンハンサーを遮断するインスレーター（Ｒａｍｅｚａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２６：３２５７−３２６６）を３’ＬＴＲに挿入してβＡＳ３−ＦＢ  ＬＶを提供した。
【００６１】
健常ドナーまたはＳＣＤドナーからのヒトＢＭ  ＣＤ３４＋細胞をβＡＳ３  ＬＶベクターで形質導入することによって評価を行った。ｑＰＣＲおよびサザンブロット法により、効率的（０．５〜２ベクターコピー／細胞）および安定な遺伝子伝達を決定した。
【００６２】
ＣＦＵアッセイは、これらの細胞が十分に造血能を維持することができること、およびｑＰＣＲ分析に基づいて３１±４％が形質導入されたことを示した。ヒト造血幹細胞および造血前駆細胞（ｈｕＨＳＰＣ）に関連して赤血球特異的βＡＳ３カセットの有効性を判定するために、赤血球分化のインビトロモデルを最適化した。最大で７００倍の増殖を達成し、ＳＣＤおよびＨＤからのＣＤ３４＋細胞に由来する完全に成熟した脱核ｒｂｃは８０％超であった。
【００６３】
ＳＣＤ  ＢＭ  ＣＤ３４＋形質導入細胞に由来するｒｂｃから、等電点電気泳動（ＩＥＦ）によりβＡＳ３グロビン遺伝子の発現を分析し、ベクターコピー数（ＶＣＮ）当たり、生成された全グロビンにわたって平均１８％のＨｂＡＳ３を得た。βＡＳ３とβおよびβＳ転写物とをそれぞれ識別することができるように、形質導入細胞におけるβＡＳ３  ｍＲＮＡの発現をｑＲＴ−ＰＣＲアッセイにより分析し、ＩＥＦによって得られた定量的発現の結果を確認した。ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶで形質導入したＳＣＤ  ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞からインビトロで分化させたｒｂｃの形態学的修正も証明した。脱酸素化を誘導したところ、非形質導入試料に対して４２％少ない細胞が、βＡＳ３遺伝子で修飾した試料中で鎌形状を示した（例えば、図２を参照）。
【００６４】
最後に、インビボ試験を行った。ＮＳＧマウスにおいてＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶで形質導入したＳＣＤおよびＨＤからのＢＭ  ＣＤ３４＋細胞を移植した後、ＶＣ当たりの全β様転写物のうち、平均１９％のβＡＳ３  ｍＲＮＡを検出することができた。ベクターの安全性を評価するための手法からの予備的結果は、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶで形質導入したマウス造血幹細胞および前駆細胞における挿入形質転換の欠如を示した。これらの結果は、βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶが、ＣＤ３４＋前駆細胞に抗鎌状化β−グロビン遺伝子を効率的に伝達させて十分に発現させることができ、成熟ｒｂｃの生理的パラメータの改善をもたらすことを証明するものである。
【００６５】
これらの結果を考慮すると、本明細書に記載されるＬＶ、例えば、抗鎌状化ヒトβグロビンを発現する組換えＴＡＴ非依存性ＳＩＮ  ＬＶは、ＳＣＤに罹患する対象（例えば、鎌状細胞突然変異を有する対象）を効果的に治療するために使用することができると考えられる。これらのベクターは、ＳＣＤの治療のためにそれを必要とする対象に導入することができる幹細胞（例えば、造血幹細胞および前駆細胞）の修飾に（例えば、図１６に示すように）使用することができると考えられる。さらに、得られた細胞は、対象の健康に有意な改善を示すのに十分なトランスジェニックβ−グロビンタンパク質を生成すると考えられる。また、標的（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）のインビボ形質導入を達成し、それによって治療を必要とする対象の治療も達成するために、ベクターを対象に直接投与することができると考えられる。
【００６６】
上述のように、種々の実施形態において、本明細書に記載されるＬＶは、以前のこの種のベクターには含まれなかった安全性特徴を含む。具体的には、パッケージング中にＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質を包含することなく、より力価の高いベクターを生じさせるように、ＨＩＶ  ＬＴＲがＣＭＶプロモーターで置換されている。ある特定の実施形態において、インスレーター（例えば、ＦＢインスレーター）が、安全性のために３’ＬＴＲに導入される。また、ＬＶは、効率的な形質導入および高い力価を提供するためにも構築される。
【００６７】
ある特定の実施形態において（例えば、図１、４Ａ、および４Ｂを参照）、ベクターの構成要素は、少なくとも下記のエレメント１および２、または少なくとも下記のエレメント１、２、および４、または少なくとも下記のエレメント１、２、４、および５、または少なくとも下記のエレメント１、２、４、５、および６、または少なくとも下記のエレメント１、２、４、５、および６、または少なくとも下記のエレメント１、２、４、５、６、および７、または少なくとも下記のエレメント１、２、３、４、５、６、および７を含む。
１）抗鎌状化ヒトβ−グロビンをコードする発現カセット（例えば、βＡＳ３）
２）自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲ構成
３）（任意選択的）インスレーターエレメント（例えば、ＦＢ）
４）パッケージングシグナル（例えば、Ψ）
５）スプライシングされていないベクターＲＮＡの核外輸送を促進するためのＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）
６）ベクターゲノムの核内輸送を促進するための中央ポリプリン区域（ｃＰＰＴ）
７）ベクターゲノムの安定性を促進し、ベクターの力価を向上させるための転写後調節エレメント（ＰＲＥ）（例えば、ＷＰＲＥ）
【００６８】
上記エレメントは、例示的であって、限定的である必要はないことを理解されたい。本明細書において提供される教示を考慮すると、これらのエレメントの好適な代替は、当業者によって認識され、本明細書において提供される教示の範囲内であることが企図される。
【００６９】
抗鎌状化βグロビン遺伝子および発現カセット
上に示したように、種々の実施形態において、本明細書に記載されるＬＶは、抗鎌状化ヒトβ−グロビン遺伝子をコードする発現カセットを含む。例示的ではあるが非限定的なカセットは、βＡＳ３であり、転写調節エレメント（例えば、ヒトβ−グロビン遺伝子５’プロモーター（例えば、約２６６ｂｐ）、ヒトβ−グロビン３’エンハンサー（例えば、約２６０ｂｐ）、ＩＶＳ２からの約３７５ｂｐのＲｓａＩ欠失を有するβ−グロビンイントロン２、および約３．４ｋｂの複合ヒトβ−グロビン遺伝子座制御領域（例えば、ＨＳ２：約１２０３ｂｐ、ＨＳ３：約１２１３ｂｐ、ＨＳ４：約９５４ｂｐ）の制御下で、３つのアミノ酸置換（Ｔｈｒ８７Ｇｌｎ、Ｇｌｙ１６Ａｓｐ、およびＧｌｕ２２Ａｌａ）を有する約２．３ｋｂの組換えヒトβ−グロビン遺伝子（エクソンおよびイントロン）を含む。βＡＳ３カセットの一実施形態は、Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：４３１２−４３１９によって記載されている。
【００７０】
しかしながら、βＡＳ３カセットは、例示的であって、限定的である必要はない。本明細書に記載される既知のカセットを使用すると（例えば、実施例１を参照）、当業者には多数の変形例が利用可能であろう。そのような変形例は、例えば、非鎌状化特性をさらに促進するためのβ−グロビンに対するさらなるおよび／または代替の突然変異、転写調節エレメント（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）における変更、イントロンのサイズ／構造等の変動を含む。
【００７１】
ＴＡＴ非依存性および自己不活性化レンチウイルスベクター
さらに安全性を向上するために、種々の実施形態において、本明細書に記載されるＬＶは、ＴＡＴ非依存性の自己不活性化（ＳＩＮ）構成を含む。よって、種々の実施形態において、本明細書に記載されるＬＶに、野生型ＬＴＲと比較して低いプロモーター活性を有するＬＴＲ領域を用いることが望ましい。効率的に「自己不活性化」（ＳＩＮ）してバイオセイフティー特徴を提供する、そのような構築物を提供することができる。ＳＩＮベクターは、形質導入細胞における全長ベクターＲＮＡの生成が大きく低下されたかまたは完全に無効にされたベクターである。この特徴は、複製可能な組換え体（ＲＣＲ）が出現するリスクを最小限に抑える。さらに、それによって、ベクター組み込み部位に隣接して位置する細胞コード配列が異常に発現されるリスクが低減される。
【００７２】
また、ＳＩＮの設計は、ＬＴＲと導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターとの間の干渉の可能性を減少させる。ＳＩＮ  ＬＶは、内部プロモーターの完全な活性を可能にすることが多い。
【００７３】
ＳＩＮの設計は、ＬＶのバイオセイフティ―を高める。大多数のＨＩＶ  ＬＴＲは、Ｕ３配列からなる。Ｕ３領域は、感染細胞において、細胞活性化に応じたＨＩＶゲノムの基礎発現および誘導発現を調節するエンハンサーおよびプロモーターエレメントを含有する。これらのプロモーターエレメントのうちのいくつかは、ウイルスの複製に必要不可欠である。いくつかのエンハンサーエレメントは、ウイルス分離体の間で高度に保存され、ウイルス病原性における重要な毒性因子であるとされてきた。エンハンサーエレメントは、ウイルスの異なる細胞標的における複製速度に影響を与えるように作用し得る。
【００７４】
５’ＬＴＲのＵ３領域の３’末端でウイルスの転写が開始すると、これらの配列はウイルスｍＲＮＡの一部ではなくなり、３’ＬＴＲからのそのコピーが、組み込まれたプロウイルス中の両方のＬＴＲを生成するための鋳型として作用する。Ｕ３領域の３’コピーをレトロウイルスベクター構築物中で変化させると、ベクターＲＮＡは、なおもプロデューサー細胞中のインタクトな５’ＬＴＲから生成されるが、標的細胞中で再生することはできない。そのようなベクターの形質導入は、子孫ウイルスにおいて両方のＬＴＲの不活性化を引き起こす。よって、レトロウイルスは自己不活性化（ＳＩＮ）され、これらのベクターはＳＩＮ伝達ベクターとして知られる。
【００７５】
ある特定の実施形態において、自己不活性化は、ベクターＤＮＡ、すなわち、ベクターＲＮＡを生成するために用いられるＤＮＡの３’ＬＴＲのＵ３領域に欠質を導入することによって達成される。ＲＴの間に、この欠失がプロウイルスＤＮＡの５’ＬＴＲに導入される。典型的には、ＬＴＲの転写活性を大きく低下させるかまたは完全に無効にし、それによって形質導入細胞における全長ベクターＲＮＡの生成を大きく低下させるかまたは無効にするために、Ｕ３配列を十分に排除することが望ましい。しかしながら、一般的には、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５にわたって典型的に広がる機能であるウイルスＲＮＡのポリアデニル化に関与するＬＴＲのこれらのエレメントを保持することが望ましい。したがって、ある特定の実施形態において、転写的に重要なモチーフをＬＴＲからできる限り多く排除する一方で、ポリアデニル化決定基を残すことが望ましい。
【００７６】
ＳＩＮの設計は、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２（１２）：９８７３−９８８０および米国特許第５，９９４，１３６号に詳細に記載されている。しかしながら、それらに記載されるように、３’ＬＴＲの欠失の程度には限界がある。第一に、Ｕ３領域の５’末端は、ベクターの輸送において別の必要不可欠な機能を果たし、組み込みに必要とされる（末端ジヌクレオチド＋ａｔｔ配列）。よって、末端ジヌクレオチドおよびａｔｔ配列は、欠失させることができるＵ３配列の５’境界を意味し得る。さらに、大まかに定義された領域は、Ｒ領域の下流ポリアデニル化部位の活性に影響を与え得る。３’ＬＴＲからのＵ３配列の過度の欠失は、ベクター転写物のポリアデニル化を減少させ、プロデューサー細胞内のベクターの力価、および標的細胞内の導入遺伝子発現の両方に有害な結果をもたらす場合がある。
【００７７】
さらなるＳＩＮの設計は、米国特許公開第２００３／００３９６３６号に記載されている。それに記載されるように、ある特定の実施形態において、ＬＴＲから除去されたレンチウイルス配列が、非レンチウイルス性レトロウイルスの同等の配列で置き換えられ、それによってハイブリッドＬＴＲを形成する。具体的には、ＬＴＲ内のレンチウイルスＲ領域を、非レンチウイルス性レトロウイルスのＲ領域で完全にまたは部分的に置き換えることができる。ある特定の実施形態において、ＴＡＴタンパク質と相互作用してウイルスの複製を促進する配列であるレンチウイルスＴＡＲ配列が、好ましくは完全に、Ｒ領域から除去される。次いで、ＴＡＲ配列が、非レンチウイルス性レトロウイルスのＲ領域の同等部分で置き換えられ、それによってハイブリッドＲ領域を形成する。レンチウイルスのＵ３およびＵ５領域の全部または一部を除去するように、かつ／または非レンチウイルス性配列で置き換えるように、ＬＴＲをさらに修飾することができる。
【００７８】
したがって、ある特定の実施形態において、ＳＩＮ構成は、そのＴＡＲ配列の全部または一部を欠損するハイブリッドレンチウイルスＲ領域を含むレトロウイルスＬＴＲを提供し、それによって、あらゆる可能性のあるＴＡＴによる活性化を排除し、ＴＡＲ配列またはその一部が、非レンチウイルス性レトロウイルスのＲ領域の同等部分によって置き換えられ、それによってハイブリッドＲ領域を形成する。具体的な実施形態において、レトロウイルスのＬＴＲはハイブリッドＲ領域を含み、ハイブリッドＲ領域は、ＴＡＲ配列を欠損するＨＩＶ  Ｒ領域の一部（例えば、米国特許出願公開第２００３／００３９６３６号の配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる部分）と、ＨＩＶ  Ｒ領域から欠損するＴＡＲ配列に相当するＭｏＭＳＶ  Ｒ領域の一部（例えば、米国特許出願公開第２００３／００３９６３６号の配列番号９に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる部分）とを含む。別の特定の実施形態において、ハイブリッドＲ領域全体が、米国特許出願公開第２００３／００３９６３６号の配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。
【００７９】
Ｒ領域が由来し得る好適なレンチウイルスは、例えば、ＨＩＶ（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、ＥＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩＶを含む。非レンチウイルス性配列が由来し得る好適なレトロウイルスは、例えば、ＭｏＭＳＶ、ＭｏＭＬＶ、フレンド、ＭＳＣＶ、ＲＳＶ、およびスプーマウイルスを含む。例示的な一実施形態において、レンチウイルスはＨＩＶであり、非レンチウイルス性のレトロウイルスはＭｏＭＳＶである。
【００８０】
米国特許出願公開第２００３／００３９６３６号に記載される別の実施形態において、ハイブリッドＲ領域を含むＬＴＲは、左（５’）ＬＴＲであり、ハイブリッドＲ領域の上流にプロモーター配列をさらに含む。好ましいプロモーターは、元々は非レンチウイルス性であり、例えば、非レンチウイルス性レトロウイルスのＵ３領域（例えば、ＭｏＭＳＶ  Ｕ３領域）を含む。特定の一実施形態において、Ｕ３領域は、米国特許出願公開第２００３／００３９６３６号の配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、左（５’）ＬＴＲは、ハイブリッドＲ領域の下流にレンチウイルスＵ５領域をさらに含む。一実施形態において、Ｕ５領域は、ゲノムの組み込みに必要なＨＩＶ  ａｔｔ部位を含むＨＩＶ  Ｕ５領域である。別の実施形態において、Ｕ５領域は、米国特許出願公開第２００３／００３９６３６号の配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態において、左（５’）ハイブリッドＬＴＲ全体が、米国特許出願公開第２００３／００３９６３６号の配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００８１】
別の例示的な実施形態において、ハイブリッドＲ領域を含むＬＴＲは、右（３’）ＬＴＲであり、ハイブリッドＲ領域の上流に修飾された（例えば、切断された）レンチウイルスＵ３領域をさらに含む。修飾されたレンチウイルスＵ３領域は、ａｔｔ配列を含むことができるが、プロモーター活性を有するあらゆる配列を欠損し、それによって、ベクターが、ウイルス転写が染色体組み込み後に最初のラウンドの複製より先に進めないようにするという点から、ＳＩＮされる。特定の実施形態において、ハイブリッドＲ領域の上流の修飾されたレンチウイルスＵ３領域は、レンチウイルスのＵ３  ａｔｔ部位までのかつそれを含むレンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）Ｕ３領域の３’末端からなる。一実施形態において、Ｕ３領域は、米国特許出願公開第２００３／００３９６３６号の配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、右（３’）ＬＴＲは、ハイブリッドＲ領域の下流にポリアデニル化配列をさらに含む。別の実施形態において、ポリアデニル化配列は、米国特許出願公開第２００３／００３９６３６号の配列番号１６に示されるヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態において、右（５’）ＬＴＲ全体が、米国特許出願公開第２００３／００３９６３６号の配列番号２または１７に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００８２】
よって、ＨＩＶに基づくＬＶの場合、そのようなベクターは、ベクター力価を著しく低下させることなく、ＬＴＲ  ＴＡＴＡボックスの除去を含む著しいＵ３欠失（例えば、−４１８〜−１８の欠失）に耐えることが発見されている。これらの欠失は、ＬＴＲの転写能力を約９０％以下に低下させるという点から、ＬＴＲ領域を実質的に転写的に不活性にする。
【００８３】
また、導入ベクター構築物中の上流ＬＴＲの一部が構成的活性型プロモーター配列によって置き換えられると、Ｔａｔのトランス作用機能が不要になることも示されている（例えば、Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３−８４７１を参照。さらに、トランスでのｒｅｖの発現が、ｇａｇおよびｐｏｌのみを含有するパッケージング構築物から高力価のＨＩＶ由来ベクターストックの生成を可能にすることを示す。この設計は、プロデューサー細胞内においてのみ利用可能な相補性を、パッケージング機能の発現の条件とする。得られた遺伝子送達系は、ＨＩＶ−１の９つの遺伝子のうち３つのみを保存し、形質導入用粒子の生成については別個の４つの転写単位に依存する。
【００８４】
実施例１に示される一実施形態において、抗鎌状化β−グロビンを発現するカセット（例えば、βＡＳ３）は、５’ＬＴＲ内に置換されたＣＭＶエンハンサー／プロモーターを有するＳＩＮベクターであるｐＣＣＬ  ＬＶ骨格内に配置される。
【００８５】
ＣＭＶプロモーターは、典型的には、高レベルの非組織特異的発現を提供することを認識されたい。同様の構成的活性を有する他のプロモーターは、限定されないが、ＲＳＶプロモーター、およびＳＶ４０プロモーターを含む。βアクチンプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、伸長因子１αプロモーター、チューブリンプロモーター等の哺乳動物プロモーターもまた使用され得る。
【００８６】
上記ＳＩＮ構成は、例示的であって、限定的ではない。多数のＳＩＮ構成が当業者に既知である。上に示したように、ある特定の実施形態において、ＬＴＲの転写が約９５％〜約９９％低下される。ある特定の実施形態において、ＬＴＲは、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％転写的に不活性にされてもよい。
【００８７】
インスレーターエレメント
ある特定の実施形態において、バイオセイフティーをさらに強化するために、本明細書に記載されるＬＶにインスレーターが挿入される。インスレーターは、ゲノム全体に存在するＤＮＡ配列エレメントである。これらは、クロマチンを修飾して領域ごとに遺伝子発現を変化させるタンパク質に結合する。本明細書に記載されるベクター内にインスレーターを配置することで、とりわけ、１）隣接する染色体による発現の斑入り位置効果からベクターを保護すること（すなわち、障壁作用）、および２）ベクターによる遺伝子発現の挿入トランス活性化から隣接する染色体を保護すること（エンハンサー遮断）を含む、種々の潜在的な利益を提供する。よって、インスレーターは、それらの発現が、さもなければゲノムまたは遺伝学的状況において調節シグナルによる影響を受ける可能性がある、遺伝子、またはゲノムもしくは遺伝学的状況に埋め込まれた転写単位の独立した機能を保存するのに役立ち得る（例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｅｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１６４３３；およびＺｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１０９：４７１を参照）。本発明の文脈において、インスレーターは、ゲノムＤＮＡ中に存在するシス作用エレメントによって媒介され、導入された配列の無秩序な発現を引き起こす可能性のある組み込み部位の影響から、レンチウイルスを発現した配列を保護することに寄与し得る。種々の実施形態において、細胞ゲノム内に組み込まれるベクターの１つもしくは両方のＬＴＲ、または領域内の他の場所にインスレーター配列が挿入されたＬＶが提供される。
【００８８】
最初の、かつ最も特徴付けられた脊椎動物のクロマチンインスレーターは、ニワトリβ−グロビン遺伝子座制御領域内に位置する。ＤＮａｓｅ−Ｉ高感受性領域−４（ｃＨＳ４）を含有するこのエレメントは、ニワトリβ−グロビン遺伝子座の５′境界を構成すると考えられる（Ｐｒｉｏｌｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：４０３５−４０４８）。ｃＨＳ４エレメントを含有する１．２ｋｂ断片は、細胞株においてグロビン遺伝子プロモーターおよびエンハンサーの相互作用を遮断する能力（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｃｅｌｌ，  ７４：  ５０５−５１４）、ならびにショウジョウバエ（同上）、形質転換細胞株（Ｐｉｋａａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：２８５２−２８６２）、およびトランスジェニック哺乳動物（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：２３９−２４３；Ｔａｂｏｉｔ−Ｄａｍｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．，８：２２３−２３５）において位置効果から発現カセットを保護する能力を含む、古典的なインスレーター活性を示す。これらの活性の多くは２５０ｂｐ断片に含まれる。この区間内には、エンハンサー遮断アッセイに関係するジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質ＣＴＣＦと相互作用する（Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ，９８：３８７−３９６）４９ｂｐのｃＨＳ４コアがある（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９４：５７５−５８０）。
【００８９】
例示的かつ好適な１つのインスレーターは、Ｒａｍｅｚａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２６：３２５７−３２６６によって記載される、ニワトリβ−グロビン５’ＨＳ４インスレーターの最小ＣＴＣＦ結合部位エンハンサー遮断成分と、ヒトＴ細胞受容体α／δ遮断エレメントα／δＩ（ＢＥＡＤ−Ｉ）インスレーターの相同領域とを含有する、７７ｂｐのインスレーターエレメントＦＢ（ＦＩＩ／ＢＥＡＤ−Ａ）である。ＦＢ「合成」インスレーターは、完全なエンハンサー遮断活性を有する。このインスレーターは、例示的であって、限定的ではない。例えば、全長ニワトリβ−グロビンＨＳ４またはそのインスレーター細断片、アンキリン遺伝子インスレーター、および他の合成インスレーターエレメントを含む、他の好適なインスレーターが使用されてもよい。
【００９０】
パッケージングシグナル
種々の実施形態において、本明細書に記載されるベクターは、パッケージングシグナルをさらに含む。「パッケージングシグナル」、「パッケージング配列」、または「ｐｓｉ配列」は、核酸のパッケージングを誘導するのに十分な任意の核酸配列であり、その配列は、レトロウイルス粒子中にパッケージングシグナルを含む。この用語は、天然に発生するパッケージング配列、および遺伝子操作されたその変異体も含む。レンチウイルスを含む多くの異なるレトロウイルスのパッケージングシグナルが、当該技術分野において既知である。
【００９１】
Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるＬＶは、スプライシングされていないＲＮＡの核外輸送を促進するために、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含む。ＲＲＥは、当業者に周知である。例示的なＲＲＥとして、限定されないが、ＨＩＶ  ＮＬ４−３ゲノムの７６２２〜８４５９位に位置するようなＲＲＥ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ００３８８７）、およびＨＩＶまたは他のレトロウイルスの他の株からのＲＲＥが挙げられる。そのような配列は、Ｇｅｎｂａｎｋから、またはｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｎｄｅｘのＵＲＬを有するデータベースから容易に入手可能である。
【００９２】
中央ポリプリン区域（ｃＰＰＴ）
種々の実施形態において、本明細書に記載されるベクターは、中央ポリプリン区域をさらに含む。レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１）ベクター構築物に中央ポリプリン区域（ｃＰＰＴ）を含む断片の挿入は、報告によると、セントラルＤＮＡフラップを通るウイルスｃＤＮＡの核内輸送を促進することにより、形質導入の効率を劇的に高めることが分かっている。
【００９３】
発現を刺激する転写後調節エレメント（ＰＲＥ）
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるＬＶは、転写物中におけるその存在が異種核酸（例えば、βＡＳ３）の発現をタンパク質レベルで増加させる様々な転写後調節エレメント（ＰＲＥ）のうちのいずれを含んでもよい。ＰＲＥは、ある特定の実施形態において、特に中程度のプロモーターを用いるレンチウイルス構築物に関与する実施形態において、特に有用であり得る。
【００９４】
ＰＲＥの１つの種類は、遺伝子発現を刺激することができる発現カセット内に位置するイントロンである。しかしながら、イントロンは、レンチウイルスの生活環事象の間にスプライシングで切り出される可能性がある。故に、イントロンがＰＲＥとして用いられる場合、それらは、典型的には、ベクターゲノム転写物と反対の配向で配置される。
【００９５】
スプライシング事象に依存しない転写後調節エレメントは、ウイルスの生活環の間に除去されないという利点を提供する。いくつかの例は、単純ヘルペスウイルスの転写後プロセシングエレメント、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＰＲＥ）およびウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）の転写後調節エレメントである。これらのうち、ＷＰＲＥは、ＨＰＲＥには見られない付加的なシス作用エレメントを含有するため、典型的には好ましい。この調節エレメントは、典型的には、導入遺伝子のＲＮＡ転写物中には含まれるが、導入遺伝子翻訳単位の停止コドンの外側に位置するように、ベクター内に配置される。
【００９６】
ＷＰＲＥは、米国特許第６，１３６，５９７号において特徴付けられ、また説明されている。そこに記載されるように、ＷＰＲＥは、核から細胞質へのＲＮＡの効率的な輸送を媒介するＲＮＡ核外輸送エレメントである。ＷＰＲＥは、エレメントおよび導入遺伝子が単一の転写物内に含まれるように、シス作用核酸配列の挿入により導入遺伝子の発現を促進する。センス配向のＷＰＲＥの存在が、導入遺伝子の発現を最大で７〜１０倍増加させることが分かった。イントロンは、概して、レトロウイルス粒子の形成をもたらす一連の事象の間にスプライシングで切り出されるため、レトロウイルスベクターは、完全なイントロン含有遺伝子の代わりに、ｃＤＮＡの形状で配列を導入する。イントロンは、スプライシング機構により一次転写物の相互作用を媒介する。スプライシング機構によるＲＮＡのプロセシングは、スプライシングおよび輸送機構の連結によってそれらの細胞質輸送を促進するため、ｃＤＮＡが非効率的に発現されることが多い。よって、ベクターにＷＰＲＥを包含することは、結果的に導入遺伝子の発現を増強させる。
【００９７】
形質導入された宿主細胞および細胞形質導入の方法
本明細書に記載される組換えＬＶおよび結果として得られるウイルスは、核酸（例えば、抗鎌状化β−グロビンをコードする核酸）配列を哺乳動物細胞に導入することができる。細胞への送達のために、本発明のベクターは、好ましくは、好適なパッケージング細胞株と一緒に用いられるか、または本発明のベクターをパッケージングすることおよび細胞に感染することができる複製能力のないウイルス粒子を形成するために必要なレトロウイルス遺伝子（例えば、ｇａｇおよびｐｏｌ）を含有する他のベクタープラスミドとともに、インビトロで細胞内に共トランスフェクトされる。
【００９８】
本明細書に記載されるベクター組換えＬＶおよび結果として得られるウイルスは、核酸（例えば、抗鎌状化β−グロビンをコードする核酸）配列を哺乳動物細胞に導入することができる。細胞への送達のために、本発明のベクターは、好ましくは、好適なパッケージング細胞株と一緒に用いられるか、または本発明のベクターをパッケージングすることおよび細胞に感染することができる複製能力のないウイルス粒子を形成するために必要なレトロウイルス遺伝子（例えば、ｇａｇおよびｐｏｌ）を含有する他のベクタープラスミドとともに、インビトロで細胞内に共トランスフェクトされる。
【００９９】
典型的には、ベクターは、パッケージング細胞株へのトランスフェクションを介して導入される。パッケージング細胞株は、ベクターゲノムを含有するウイルス粒子を生成する。トランスフェクションの方法は、当業者に周知である。パッケージングベクターおよび導入ベクターをパッケージング細胞株に共トランスフェクションした後、培地から組換えウイルスが回収され、当業者に用いられる標準的な方法によって滴定される。よって、パッケージング構築物は、通常、ネオマイシン、ＤＨＦＲ、グルタミンシンターゼ等の主要な選択可能マーカーとともに、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔によってヒト細胞株に導入することができ、その後、適切な薬物の存在下における選択およびクローンの単離が続く。ある特定の実施形態において、選択可能マーカー遺伝子は、構築物中のパッケージング遺伝子と物理的に連結させることができる。
【０１００】
パッケージング機能が好適なパッケージング細胞によって発現されるように構成される安定な細胞株が既知である（例えば、パッケージング細胞について記載する米国特許第５，６８６，２７９号を参照）。一般的に、ウイルス粒子の生成のために、レンチウイルスのＧａｇおよびＰｏｌ遺伝子の発現に適合する任意の細胞、またはそのような発現を支持するように遺伝子操作することができる任意の細胞を用いることができる。例えば、２９３Ｔ細胞およびＨＴ１０８０細胞等のプロデューサー細胞が用いられてもよい。
【０１０１】
レンチウイルスベクターが組み込まれたパッケージング細胞は、プロデューサー細胞を形成する。よって、プロデューサー細胞は、対象となる治療遺伝子（例えば、修飾されたβ−グロビン）を担持するパッケージングされた感染性ウイルス粒子を生成または放出することができる細胞または細胞株である。これらの細胞はさらに、足場依存性であり得る：これはすなわち、これらの細胞は、ガラスまたはプラスチック等の表面に付着させると、最適に増殖するか、生存するか、または機能を維持することを意味する。ベクターが複製可能である場合にレンチウイルスベクターパッケージング細胞株として用いられる足場依存性細胞株のいくつかの例として、ＨｅＬａまたは２９３細胞およびＰＥＲＣ．６細胞が挙げられる。
【０１０２】
したがって、ある特定の実施形態において、細胞を本明細書に記載されるレンチウイルスベクターを含有するウイルス粒子と接触させることを含む、次いで細胞のゲノムに組み込まれる遺伝子を細胞に送達する方法が提供される。細胞（例えば、組織または器官の形態である）は、生体外でウイルス粒子と接触させる（例えば、感染させる）ことができ、次いで、遺伝子（例えば、抗鎌状化β−グロビン）が発現される対象（例えば、哺乳動物、動物、またはヒト）に送達することができる。種々の実施形態において、細胞は、対象にとって自家性（すなわち、対象に由来する）であってもよいか、または対象にとって非自家性（すなわち、同種もしくは異種）であってもよい。さらに、本明細書に記載されるベクターは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に送達され得るため、細胞は、例えば、骨髄細胞、間葉系幹細胞（例えば、脂肪組織から得られた）、ならびにヒトおよび動物源に由来する他の一次細胞を含む幅広い種類に由来してもよい。代替として、ウイルス粒子は、対象または対象の局所的な領域（例えば、骨髄）にインビボで直接投与されてもよい。
【０１０３】
当然のことながら、上述のように、本明細書に記載されるレンチベクターは、骨髄、末梢血、または臍帯血のいずれかから得られたヒト造血前駆細胞または造血性幹細胞の形質導入、およびＣＤ４＋Ｔ細胞、末梢血Ｂ、またはＴリンパ球細胞等の形質導入に特に有用である。ある特定の実施形態において、特に好ましい標的はＣＤ３４＋細胞である。
【０１０４】
遺伝子治療
さらに他の実施形態において、本発明は、造血幹細胞を含むヒト細胞の集団を、ベクターによる当該集団中のヒト造血前駆細胞の形質導入を実現するための条件下で、上記レンチベクターのうちの１つと接触させることを含む、ヒト造血幹細胞を形質導入するための方法を対象とする。幹細胞は、最終的な用途に応じてインビボまたはインビトロで形質導入されてもよい。たとえ、ヒト幹細胞の遺伝子治療等のヒト遺伝子治療であっても、幹細胞をインビボで形質導入するか、または代替としてインビトロで形質導入した後に、形質導入された幹細胞をヒト対象に注入することができる。この実施形態の一態様において、ヒト幹細胞は、当業者に周知の方法を用いて、ヒト、例えば、ヒト患者から除去することができ、上述のように形質導入することができる。形質導入された幹細胞は、次いで、同じかまたは異なるヒトに再導入される。
【０１０５】
幹細胞／前駆細胞遺伝子治療
種々の実施形態において、本明細書に記載されるレンチベクターは、骨髄、末梢血、または臍帯血のいずれかから得られたヒト造血前駆細胞または造血性幹細胞（ＨＳＣ）の形質導入、およびＣＤ４＋Ｔ細胞、末梢血ＢまたはＴリンパ球細胞等の形質導入に特に有用である。ある特定の実施形態において、特に好ましい標的はＣＤ３４＋細胞である。
【０１０６】
細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞、樹状細胞、末梢血細胞、または腫瘍細胞が生体外で形質導入される場合、ベクター粒子は、通常、１〜５０感染多重度（ＭＯＩ）（またこれは、１０５細胞当たりのウイルスベクターの１×１０５〜５０×１０５形質導入単位にも相当する）の用量を用いて細胞とともにインキュベートされる。当然ながら、これは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、および５０ＭＯＩに対応するベクターの量を含む。典型的には、ベクターの量は、ＨｅＬａ形質導入単位（ＴＵ）で表すことができる。
【０１０７】
実施例１に示すように、２×１０７ＴＵ／ｍｌ未満のベクター濃度についてのみ、達成された遺伝子導入において用量依存性の増加（ｑＰＣＲによって測定される平均ＶＣ／細胞）が認められたことに留意されたい。より高いベクター濃度では形質導入の有効性は増加されず、実際のところ、形質導入の程度に悪影響を与えることが多かった（データは図示せず）。これらの知見に基づいて、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢベクターを２×１０７ＴＵ／ｍｌ（ＭＯＩ＝４０）の標準濃度で使用した。
【０１０８】
ある特定の実施形態において、細胞に基づく治療は、幹細胞および／または造血前駆細胞を提供すること、細胞を抗鎌状化ヒトβ−グロビンをコードするレンチウイルスで形質導入すること、次いで、形質転換細胞をそれを必要とする対象（例えば、鎌状細胞突然変異を有する対象）に導入することを含む。
【０１０９】
ある特定の実施形態において、方法は、細胞、例えば、幹細胞の集団を対象から単離することを含み、任意選択的に、組織培養中で細胞を増殖させ、細胞におけるその存在が抗鎌状化β−グロビンの生成をもたらすレンチウイルスベクターを細胞中にインビトロで投与することを含む。次いで、細胞が対象に戻され、そこで、細胞は、例えば、抗鎌状化βグロビンを生成する赤血球細胞の集団を提供し得る（例えば、図１６を参照）。
【０１１０】
本発明のいくつかの実施形態において、細胞株に由来するかまたは対象以外の個体に由来する細胞であってもよい細胞の集団を使用することができる。幹細胞、免疫系細胞等を対象から単離し、それらを対象に戻す方法は、当該技術分野で周知である。そのような方法は、例えば、化学療法を受けている患者への骨髄移植、末梢血幹細胞移植等に用いられる。
【０１１１】
幹細胞を使用する場合、そのような細胞は、骨髄（ＢＭ）、臍帯血（ＣＢ）ＣＢ、動員末梢血幹細胞（ｍＰＢＳＣ）等を含む多数の源に由来してもよいことを認識されたい。ある特定の実施形態において、人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）の使用が企図される。造血幹細胞（ＨＳＣ）を単離し、そのような細胞を形質導入し、それらを哺乳動物対象に導入する方法は、当業者に周知である。
【０１１２】
ある特定の実施形態において、βＡＳ３抗鎌状化β−グロビン遺伝子を鎌状赤血球症に罹患する患者の骨髄幹細胞に導入した後で自家移植することによって、Ｌｅｎｔｉ−βＡＳ３−ＦＢレンチウイルスベクターがＳＣＤの幹細胞遺伝子治療に使用される。そのような方法は、本明細書において実施例１に例示される。
【０１１３】
ベクターの直接導入
ある特定の実施形態において、ベクターの直接導入による対象の直接的な治療が企図される。レンチウイルス組成物は、限定されないが、非経口（例えば、静脈内）、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、直腸内、および膣内を含む、任意の利用可能な経路によって送達されるように製剤化されてもよい。一般的に用いられる送達経路は、吸入、非経口、および経粘膜を含む。
【０１１４】
種々の実施形態において、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせてＬＶを含むことができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という文言は、医薬品投与に適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤等を含む。補助的な活性化合物もまた、組成物に組み込むことができる。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、活性薬剤、すなわち、本明細書に記載されるレンチウイルスおよび／またはベクターと一緒に投与される他の薬剤は、移植片およびマイクロカプセル化送達系を含む徐放性製剤等の、体内からの急速な排出から化合物を保護する担体とともに調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解性の生体適合性ポリマーが使用されてもよい。そのような組成物の調製のための方法は、当業者には明白である。好適な材料は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手されてもよい。リポソームも薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような当業者に既知の方法に従って調製することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、ウイルスによって感染される特定の細胞型または細胞を標的とする。例えば、組成物は、モノクローナル抗体を使用して、細胞表面マーカー、例えば、内在性マーカーまたは感染細胞の表面上に発現されるウイルス抗原を標的としてもよい。
【０１１６】
投与の簡便性および投薬量の均一性のために、組成物を単位剤形で製剤化することが有利である。本明細書において使用される単位剤形は、治療を受ける対象のための単位投薬量として適切な、物理的に個別の単位を指す：各単位は、薬学的担体と共同で所望の治療効果を生み出すように計算された所定量のＬＶを含む。
【０１１７】
単位用量は、単回注射として投与される必要はないが、一定期間にわたる持続注入を含んでもよい。本明細書に記載されるＬＶの単位用量は、ＨｅＬａまたは２９３等の細胞株にベクターを滴定することによって定義されるように、レンチベクターの形質導入単位（Ｔ．Ｕ．）に関連して都合よく説明することができる。ある特定の実施形態において、単位用量は、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３Ｔ．Ｕ．およびそれ以上の範囲であってもよい。
【０１１８】
薬学的組成物は、例えば、約１〜約１０週間；約２〜約８週間；約３〜約７週間；約４週間；約５週間；約６週間の間、１週間に１回等、必要に応じて種々の間隔で異なる期間にわたって投与することができる。治療組成物を無期限に投与することが必要であるかもしれない。当業者は、限定されないが、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の総体的健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むある特定の要因が、対象を効果的に治療するために必要とされる投薬量およびタイミングに影響を及ぼすことを理解するであろう。ＬＶを用いた対象の治療は単回治療を含むことができるが、多くの場合、一連の治療を含むことができる。
【０１１９】
遺伝子治療ベクターの投与のための例示的な用量および好適な用量を決定するための方法は、当該技術分野で既知である。さらに、ＬＶの適切な用量は、特定のレシピエントおよび投与様式に依存し得るということを理解されたい。いずれか特定の対象のための適切な用量レベルは、対象の年齢、体重、総体的健康、性別、および食生活、投与期間、投与経路、排泄率、投与される他の治療剤等を含む様々な要因に依存し得る。
【０１２０】
ある特定の実施形態において、レンチウイルス遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与、または定位的注入によって対象に送達することができる（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３０５４を参照）。ある特定の実施形態において、ベクターは、経口的にまたは吸入によって送達されてもよく、分解からそれらを保護し、組織または細胞等への取り込みを促進するためにカプセル化されてもよいか、または別様に操作されてもよい。薬学的調製物は、許容される希釈剤中にＬＶを含むことができるか、またはＬＶが埋め込まれた徐放性マトリックスを含むことができる。代替的または付加的に、本明細書に記載されるようなレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターの場合におけるように、ベクターを組換え細胞からインタクトに生成することができる場合、薬学的調製物は、ベクターを生成する１つ以上の細胞を含むことができる。本明細書に記載されるＬＶを含む薬学的組成物は、任意選択的に投与のための指示と一緒に、容器、パック、またはディスペンサー内に、含まれてもよい。
【０１２１】
上記組成物、方法、および使用は、限定的ではなく例示的であることを意図するものである。本明細書に提供される教示を用いると、当業者には組成物、方法、および使用に対する他の変形例が容易に利用可能であろう。
【実施例】
【０１２２】
以下の実施例は、請求される発明を限定するものではなく、例示するために提供される。
【０１２３】
実施例１
鎌状赤血球症のためのヒト骨髄へのβ−グロビン遺伝子導入
自家造血幹細胞遺伝子治療は、同種移植よりも低い罹患率につながり得る鎌状赤血球症（ＳＣＤ）患者を治療するための手法である。我々は、鎌状ヘモグロビンの重合（ＨＢＢＡＳ３）を妨害するように遺伝子操作したヒトβ−グロビン（ＨＢＢ）遺伝子をコードするＬＶ（ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ）が、ＳＣＤドナーからのヒトＢＭ  ＣＤ３４＋細胞を形質導入し、インビトロ分化によって引き起こされるｒｂｃの鎌状化を防止する可能性を調べた。ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶは、定量的ＰＣＲおよびコロニー形成単位前駆細胞の分析に基づいて、健常ドナーまたはＳＣＤドナーのいずれかからのＢＭ  ＣＤ３４＋細胞を同様のレベルで形質導入した。ＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡおよびＨｂＡＳ３タンパク質の一貫した発現が、全β−グロビン様転写物およびＨｂ四量体の４分の１を低下させた。脱酸素化すると、鎌状ドナーからのモック形質導入細胞と比較してより低いパーセンテージのＨＢＢＡＳ３で形質導入したｒｂｃが鎌状化を示した。形質導入ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞を免疫不全マウスに移植し、２〜３か月後に回収されたヒト細胞を赤血球分化のために培養したところ、インビトロで直接分化させたＣＤ３４＋細胞に見られるものと同様のＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡのレベルを示した。これらの結果は、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶが、ヒトＳＣＤ  ＢＭ  ＣＤ３４＋前駆細胞における効果的な抗鎌状化β−グロビン遺伝子の効率的な導入および一貫した発現を可能にし、結果として得られるｒｂｃの生理学的パラメータを向上させることを示すものである。
【０１２４】
結果
ＨＢＢＡＳ３カセットを担持するＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶベクター
Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９）によってＨＢＢＡＳ３カセット（ＤＬ−βＡＳ３）を担持するように生成された最初のＬＶは、高力価ベクターの生成のためにＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質に対する依存を生じさせるインタクトなＨＩＶ  ５′ＬＴＲを含有していた。パッケージング中のＴＡＴの必要性を排除するために、ＨＢＢＡＳ３カセットおよびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を、５′ＬＴＲで置換されたＣＭＶエンハンサー／プロモーターを有するＳＩＮベクターであるｐＣＣＬ  ＬＶ骨格（Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３−８４７１）に移動し、ＴＡＴの必要性を排除した。このｐＣＣＬ骨格を、１．２ｋｂのニワトリβ−グロビンＨＳ４（ｃＨＳ４）インスレーターの２５０ｂｐコアの最小ＣＴＣＦ結合部位（ＦＩＩ）と、ヒトＴ細胞受容体δ／α  ＢＥＡＤ−１インスレーターの類似領域とを含有する、ＦＢと命名された３′ＬＴＲのＵ３領域に、小型（７７ｂｐ）のインスレーターを有するようにさらに修飾した（Ｒａｍｅｚａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２６（１２）：３２５７−３２６６）。得られたＳＩＮ−ＬＶをＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢと名付け、プロウイルス形態を図４Ａに示す。
【０１２５】
３回の独立した実験において、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢベクター、ならびにＦＢインスレーターを欠損する形態（ＣＣＬ−βＡＳ３）、親ＤＬ−βＡＳ３ベクター、および陽性対照として増強されたＧＦＰを発現するベクター（ＣＣＬ−ＭＮＤ−ＧＦＰ）の調製物をパッケージングした。ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質を発現したプラスミドを含めておよび含めずにベクター調製物を作製した。力価は、許容細胞株（ＨＴ２９ヒト結腸癌）を形質導入し、ベクタープロウイルスのＨＩＶパッケージングシグナル（Ｐｓｉ）に対するプライマーを用いた定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用してベクターコピー（ＶＣ）／細胞を測定することにより決定した（Ｓａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９（１７）：１１５５−１１６２；ならびに図１１Ａおよび１１Ｂ）。ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢベクター、および非遮蔽型は、ＴＡＴの非存在下において、元のＤＬ−βＡＳ３ベクターよりも１０倍高い力価まで生成することができ（Ｐ＝０．０１７、両側ｔ検定；ＣＣＬ−βＡＳ３およびＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢを組み合わせたものをＤＬ−βＡＳ３と比較）、ＦＢインスレーターの包含はベクターの力価を低下させなかった。
【０１２６】
ＦＢインスレーターの安定性を、形質導入ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のバルク集団におけるＦＢ含有断片サイズのＰＣＲ分析によって（図４Ｂ）、クローンレベルで評価した（合計３２個の単一ＣＦＵコロニー、データは図示せず）。全ての試料が、ＰＣＲ分析後に予想されたサイズの単一バンドを示し、ＦＢインスレーターのインタクトな継代が証明された。さらに、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢで形質導入した細胞のサザンブロット分析により、全長ベクタープロウイルスについて予想されたサイズの単一バンドの存在が示された（図１２）。
【０１２７】
ＦＢインスレーターの機能的活性を評価するために、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢのＬＴＲに対するＣＴＣＦタンパク質の結合を形質導入したＫ５６２細胞においてＣｈＩＰにより評価した（図４Ｃ）。ＣｈＩＰは、インプット対照と比較して、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＴＲにおけるＣＴＣＦ結合の１２倍濃縮を示した。ＦＢインスレーターを欠損するＣＣＬ−βＡＳ３ベクターでは濃縮は見られなかったことから、ＦＢ配列に対するＣＴＣＦの特異的結合が示唆された。ＣＴＣＦからＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＴＲへの会合は、１．２ｋｂのｃＨＳ４インスレーター（Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ，９８（３）：３８７−３９６）、ｃ−Ｍｙｃプロモーター（Ｗｉｔｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｓｏｎ（２００９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．３４（３）：２７１−２８４）、またはＨ１９刷り込み制御領域（Ｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ，４０５（６７８５）：４８２−４８５）等のＣＴＣＦに結合することが分かっている他の配列と少なくとも同じくらい高かった。
【０１２８】
ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞の形質導入能および造血能の評価
ヒトＢＭ  ＣＤ３４＋細胞を形質導入するための最も効率的なＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢベクター濃度を決定するために、２×１０６〜２×１０８形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）（ＭＯＩ＝４〜４００）の形質導入中のベクター濃度範囲を用いて予備用量反応実験を行った。２×１０７ＴＵ／ｍｌ未満のベクター濃度についてのみ、達成された遺伝子導入において用量依存性の増加（ｑＰＣＲによって測定される平均ＶＣ／細胞）が認められた。より高いベクター濃度では形質導入の有効性は増加されず、実際のところ、形質導入の程度に悪影響を与えることが多かった（データは図示せず）。これらの知見に基づいて、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢベクターを２×１０７ＴＵ／ｍｌ（ＭＯＩ＝４０）の標準濃度で後続の全ての試験に使用した。
【０１２９】
ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のコロニー形成能は、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢベクターで形質導入されているかどうかにかかわらず、ＳＣＤドナーまたは健常ドナー（ＨＤ）対照からの試料について類似しており、メチルセルロースに播種した場合に細胞の約１０％がコロニーを形成し、群間での有意差は認められなかった（比較した全ての群において、二元配置ＡＮＯＶＡでＰ＞０．１）（図５Ａ）。我々は、ＨＤ試料（ＨＤ−モック中３０．６７％±１７．０６％およびＨＤ−βＡＳ３−ＦＢ中２８．６２％±１２．９１％）と比較して、ＳＣＤ試料（ＳＣＤ−モック中４１．３４％±１９．８７％およびＳＣＤ−βＡＳ３−ＦＢ中４２．３３％±１７．７９％）中のより高いパーセンテージのバースト形成単位の赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）（赤血球）コロニーを認めた（二元配置ＡＮＯＶＡでＰ＝０．０４８）（図５Ｂ）。ＳＣＤ患者のＢＭ由来前駆細胞について同様の赤血球の歪みが報告されており（Ｃｒｏｉｚａｔ  ａｎｄ  Ｎａｇｅｌ  ＲＬ（１９８８）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１６（１１）：９４６−９４９）、これは、根底にある溶血性貧血に起因するＳＣＤ患者の赤血球形成レベルの増加を反映している可能性がある。ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢベクター配列を検出するための個々のＣＦＵのｑＰＣＲにより、ＳＣＤドナーのＢＭに由来する形質導入したコロニー形成前駆細胞のパーセンテージを明らかにした。１９１個のうち５７個のコロニーが、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢベクターを含有しており（５回の独立した実験において２９．８４％±１６．６８％の陽性コロニー）、赤血球分化条件においてインビトロ培養したバルク集団では平均して０．９２±０．５７ＶＣ／細胞であった。分析したベクター陽性コロニーのほとんどが１〜２ＶＣ／細胞（８８％）を有していたが、１１％が３〜６ＶＣ／細胞を、そして２％が７〜９ＶＣ／細胞を有していた（９コピーを超えるコロニーは存在しなかった）（図５Ｃ）。インビトロ赤血球分化条件下で２週間培養した後、ＨＤからのＣＤ３４＋細胞（ｎ＝１１）の形質導入により、ＳＣＤドナー（ｎ＝１５）の０．９３±０．３７と比較して１．２８±０．５１ＶＣ／細胞がもたらされたが、これは境界有意差であった（Ｐ＝０．０５、ウィルコクソン順位和検定）（図５Ｄ）。
【０１３０】
ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のインビトロ赤血球分化
赤血球特異的ＨＢＢＡＳ３カセットの発現を評価するために、ヒトＢＭ  ＣＤ３４＋細胞からの赤血球標的分化を支持するインビトロモデルを使用した（Ｄｏｕａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８２：１２７−１４０）。ＳＣＤドナーおよびＨＤのＢＭに由来するＣＤ３４＋細胞をＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶで形質導入し、対照試料をモック形質導入した。形質導入後（ｐＴＤ）２４時間から開始して、細胞を２１日間分化させた。赤血球培養中、３週間にわたって連続的に細胞を数えて生存率および細胞増殖を決定した。ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶで形質導入したか、またはモック形質導入したかのいずれかである細胞について、ＨＤとＳＣＤドナーの間で細胞増殖における差は認められなかった（図６Ａは、代表的な実験を示す）。培養終了までには、最大で７００倍の細胞数の増大に達した。赤血球分化培養中にフローサイトメトリーを行い、造血前駆細胞（ＣＤ３４およびＣＤ４５）ならびに赤血球前駆細胞（グリコホリンＡ［ＧｐＡ］およびＣＤ７１）のマーカーにおける変化を分析した。単離後にＣＤ３４＋細胞のパーセンテージを分析したところ、平均して７６．７４％±３．０１％のＣＤ３４＋細胞を示した。培養の３日後に、異なるドナー間でＣＤ３４の発現に高い変動性が観察され、３日目〜１４日目には、全ての試料においてＣＤ３４の発現に急激な低下が見られた（図６Ｂ）。３日目に全細胞集団によって汎白血球マーカーＣＤ４５が発現され、網状赤血球および成熟ｒｂｃの場合に予想されたように、１４日目〜２１日目には本質的に検出不能となった（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．２８（２）：１６９−１８０）。培養期間の早期（３日目〜１４日目）にＣＤ７１（トランスフェリン受容体）が発現されたが、予想されたように培養期間の終了（２１日目）までには低下した。１４日目までには、９０％を超える細胞にＧｐＡの発現が検出され、培養の終了まで持続した。
【０１３１】
分化の終了時（１８日目〜２１日目）には、赤血球膜糖タンパク質ＧｐＡに対する抗体およびＤＮＡを標識する蛍光色素ＤＲＡＱ５を用いた二重染色によって脱核ｒｂｃが同定された：脱核ｒｂｃはＧｐＡ＋ＤＲＡＱ５−であると定義された。複数培養間の脱核ｒｂｃの頻度は、６５％〜８５％の範囲（ＳＣＤ−モック（ｎ＝７）で６７．６１％±１７．６８％、ＳＣＤ−βＡＳ３−ＦＢ（ｎ＝７）で６９．６９％±１８．１１％（図６Ｂ）、ＨＤ−モック（ｎ＝７）で８３．４０％±１０．０７％、およびＨＤ−βＡＳ３−ＦＢ（ｎ＝３）で７９．０４％±１０．１９％）であり、モック形質導入した試料とＬＶで形質導入した試料との間に有意差は認められなかった（ＳＣＤモック対βＡＳ３−ＦＢ、Ｐ＝０．８０；ＨＤモック対βＡＳ３−ＦＢ、二元配置ＡＮＯＶＡでＰ＝０．６９）。大規模な細胞増殖および高レベルの脱核を伴うロバストな赤血球分化（図６Ｃおよび６Ｄ）が、ＨＢＢＡＳ３導入遺伝子の活性を特徴付けるためのさらなる分析を支持した。
【０１３２】
ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のインビトロ赤血球分化後のＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡの発現
ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞からの良好なｒｂｃ生成、および効率的な遺伝子導入の確認によって、ＨＢＢＡＳ３カセットの機能を評価することができた。ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶで形質導入したか、またはモック形質導入したかのいずれかである、ＳＣＤドナーおよびＨＤのＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のインビトロ赤血球分化培養から１４日目に収集された細胞中のＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡの発現レベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイにより評価し、内在性ＨＢＢおよびＨＢＢＳ遺伝子（鎌状突然変異を担持するＨＢＢ遺伝子）からのｍＲＮＡレベルと比較した。ＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡレベルは、ＳＣＤおよびＨＤのＢＭ  ＣＤ３４＋細胞の培養からの赤血球細胞中の全β−グロビン様ｍＲＮＡの１５．７３％±８．３６％および１７．１２％±７．２５％をそれぞれ占めていた。分析した各ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶ−形質導入ＢＭ試料（ＳＣＤおよびＨＤ）について、検出されたＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡのパーセンテージをその試料のｑＰＣＲによって得られたＶＣ／細胞と比較した。ＶＣ／細胞とＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡのパーセンテージの間には強い正の相関が存在し（ピアソン相関＝０．７３、Ｐ＝０．０００３）、一貫した発現が示唆された（図７Ａ）。変化し易い遺伝子導入を調節するためにＶＣ／細胞に対して正規化したところ、ＶＣ／細胞当たりの平均ＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡの発現は、ＳＣＤでは２６．２２％±１０．７１％、ＨＤ細胞では１７．８４％±１１．６０％であった。平均して、調べた全ての試料（ｎ＝２０、ＳＣＤでは１６個の試料、ＨＤでは４個の試料）から、ＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡは、ＶＣ／細胞当たり２４．５５％±１１．０３％を占めていた。
【０１３３】
最後に、骨髄および赤血球分化条件下での平行培養に分配した、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶで形質導入したＢＭ  ＣＤ３４＋細胞におけるＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡの発現を分析することにより、ＨＢＢＡＳ３カセットの発現の赤血球特異性を評価した。赤血球条件下で生成された細胞中に、本質的に測定不可能であった骨髄条件と比較してより高いＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡの発現が認められた（図１３）。
【０１３４】
ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のインビトロ赤血球分化後のＨｂＡＳ３タンパク質発現
ＩＥＦを使用して、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶで形質導入したＢＭ  ＣＤ３４＋細胞からインビトロで生成された赤血球細胞中に存在するＨｂ四量体を調べた。３つのアミノ酸が異なるにもかかわらず、ＨｂＡＳ３四量体は、正味電荷が同一であるためにＩＥＦによってＨｂＡと識別することができない。しかしながら、古典的鎌状突然変異によって導入されたＧｌｕ６Ｖａｌ置換がタンパク質の負電荷を消去し、ＨｂＳのより正である相対的正味電荷をもたらすため、ＨｂＡＳ３の生成は、容易にＨｂＳと識別することができる。したがって、ＳＣＤドナーからの細胞のみを、ＩＥＦによるＨｂＡＳ３の発現について分析した。代表的な実験からのＩＥＦ膜を、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶによる５つの独立したＳＣＤ  ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞の形質導入、およびモック形質導入した試料とともに示す（図７Ｂ）。
【０１３５】
赤血球分化後に合計で１０個のＳＣＤ試料を分析した。各試料中に存在するＨｂＡＳ３のパーセンテージとＶＣによって測定される形質導入の程度の間には強い相関が存在した（ピアソン相関＝０．８８、Ｐ＝０．００１）（図７Ｃ）。ＨＰＬＣおよびＩＥＦにより、いくつかの赤血球細胞試料の同時分析を行ったところ、両方の方法から類似する結果が示された（表１）。
【表１】
2015529466.tif 000003
【０１３６】
次いで、ＶＣ／細胞当たりに正規化したＨＢＢＡＳ３  ＲＮＡとタンパク質の発現レベルを比較した（図７Ｄ）。ＶＣ／細胞当たりのタンパク質と比較して、ＶＣ／細胞当たりのＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡ値にはより大きな変動性が存在したが、ＨＢＢＡＳ３の発現については２つの方法が類似する値を示し（ＶＣ／細胞当たり２４．５５％±１１．０３％のＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡ、およびＶＣ／細胞当たり１７．９６％±３．０９％のＨｂＡＳ３タンパク質）、ここでも同様に、一貫した発現が示唆された。４つの独立した質導入において、ＦＢインスレーターの存在下または非存在下においてＨＢＢＡＳ３カセットからの発現（ｍＲＮＡおよびタンパク質）を比較した（図１４）。我々は、ＦＢインスレーターの付加が、非遮蔽ＬＶと比較してＨＢＢＡＳ３カセットの発現を変化させなかったことを発見した。
【０１３７】
ＳＣＤ表現型修正
ＨＢＢＡＳ３の発現が、ＳＣＤ  ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞からインビトロで生成されたｒｂｃの鎌状化に及ぼす機能的影響を評価するために、臨床実験室でＳＣＤを診断するために使用されるアッセイを適合させて最適化した：ＨｂＳの重合を誘導するための細胞の還元剤二亜硫酸ナトリウムへの暴露。赤血球培養の終了時（２１日目）にｒｂｃを採取し、スライドガラスの密閉チャンバ内で二亜硫酸ナトリウムとともにインキュベートした。インキュベーション後、位相差顕微鏡を使用して個々のｒｂｃの形態および形状を分析し、鎌状に見えるｒｂｃ（ｓｒｂｃ）と、丸みを帯びた、円盤状の、非鎌状の正常なｒｂｃ（ｎｒｂｃ）のパーセンテージを定量化した（図８Ａおよび８Ｂ）。各実験において、各試料につき２００〜９００個の細胞を分析した。ＨＤ対照からのｒｂｃは、二亜硫酸ナトリウムの存在下では鎌状化せず、９８％超がその円い形態を保持した。対照的に、ＳＣＤ  ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞からインビトロで生成されたｒｂｃは、ｓｒｂｃが平均８８％±９％およびｎｒｂｃが平均１２％±９％と、二亜硫酸ナトリウム中でかなりの程度の鎌状化を受けた。ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶで形質導入したＳＣＤ試料において、ｓｒｂｃが６９％±１６％およびｎｒｂｃが３１％±１６％と、鎌状化を受けなかったｒｂｃのパーセンテージの増加が見られ、非形質導入試料と比較して１９％±８％多くのｎｒｂｃを示した。これらの結果は、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶによる発現が、脱酸素化中のｒｂｃの鎌状化を低減することを証明した。修正された鎌状細胞のパーセンテージは、存在するＶＣと正の相関を示した（スピアマン相関＝０．７７、Ｐ＝０．０４）（図８Ｃおよび表２）。
【表２】
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【０１３８】
ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶ形質導入のインビボ評価
より原始的なヒト造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）においてＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶによる遺伝子導入および発現を特徴付けるために、ＳＣＤドナーおよびＨＤ対照からのβＡＳ３−ＦＢで形質導入したＢＭ  ＣＤ３４＋細胞を免疫不全ＮＯＤ  Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに異種移植した。形質導入条件は、インビトロ分析に用いたものと同じであり、細胞を一晩形質導入した後、直ちに移植した。移植した細胞用量は、細胞の入手可能性に応じてマウス１匹当たり１０５〜１０６細胞の範囲であった（各移植に使用したＢＭ源、細胞用量、ならびにモック形質導入およびβＡＳ３形質導入マウスの数を表３に提供する）。移植から８〜１２週間後、マウスを安楽死させ、ＦＡＣＳ分析のためにＢＭを採取した。ＮＳＧ  ＢＭから回収されたヒト細胞を、さらなる分析のために赤血球分化条件下で培養した。
【表３】
2015529466.tif 000005
【０１３９】
ＦＡＣＳ分析を行って、全ＣＤ４５＋集団（マウスＣＤ４５＋およびヒトＣＤ４５＋）のヒトＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして定義される、マウスＢＭにおけるヒト細胞の生着を判定した。異なる移植片間で生着の値に変動性が認められた（最大７８％）（図９Ａ）。ＳＣＤドナーまたはＨＤ対照からのＢＭ  ＣＤ３４＋細胞を用いた生着（二元配置ＡＮＯＶＡでＰ＝０．６）、またはβＡＳ３−ＦＢ  ＬＶで形質導入した細胞もしくはモック形質導入した細胞間（二元配置ＡＮＯＶＡでＰ＝０．８）に一貫した差は見られなかった。
【０１４０】
移植マウスからのヒトＣＤ４５＋集団を、Ｂ−リンパ球細胞（ＣＤ１９）、骨髄前駆細胞（ＣＤ３３）、造血前駆細胞（ＣＤ３４）、および赤血球細胞（ＣＤ７１）のマーカーの発現についてさらに分析した。モック形質導入したかまたはＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶで形質導入したＢＭ  ＣＤ３４＋細胞を用いて生着させたマウス間に、異なる種類のヒト細胞の相対的比率における差は認められず、ヒト細胞の大半はＢリンパ球細胞であったことから（図９Ｂ）、形質導入が細胞の分化能を変化させなかったことが証明された。
【０１４１】
ＮＳＧマウスからＢＭを採取し、免疫磁気ビーズを使用してマウスＣＤ４５＋細胞を欠失させるによってヒト細胞を濃縮した。次いで、インビトロ赤血球分化条件下で細胞を増殖させて末端赤血球分化を誘導し、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用してＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶベクターによるＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡの発現を評価することができた。
【０１４２】
ヒトＣＤ４５＋細胞を生着させたマウスから増殖させた細胞において測定されたＶＣ／細胞は、０．０５〜０．９１の範囲であった（図９Ｃ）。ＳＣＤドナーおよびＨＤからのＢＭ  ＣＤ３４＋細胞を移植したマウスからの試料において、同様のレベルの遺伝子マーキングが見られた（２つの試料によってＰ＝０．３、両側ｔ検定）。全体として、ｑＰＣＲによって評価したＶＣ／細胞値は、赤血球分化条件下においてインビトロで増殖させた細胞で最も高く（１．１８±０．６４ＶＣ／細胞）、ＣＦＵ（０．７１±０．７５ＶＣ／細胞）、およびインビトロ骨髄分化培養によって生成した細胞（０．４６±０．３３ＶＣ／細胞）においてより低く、ＮＳＧマウスから回収されたヒト細胞において最も低かった（０．３４±０．３１ＶＣ／細胞）（図１５）。
【０１４３】
ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＮＳＧマウスから単離した細胞のインビトロ赤血球分化によって生成されたヒト赤血球細胞によって発現されたＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡの定量化を行った。ベクター転写物の発現は、ＶＣ／細胞と相関しており、平均値は全β−グロビン様ｍＲＮＡ／ＶＣの２１．６９％±８．３５％であった（ピアソン相関＝０．８９、Ｐ＝０．０００４）（図９Ｄ）。よって、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶによる発現は、インビトロで直接分化させた形質導入ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞の発現と同様の、ＮＳＧマウスにおいて生着させたヒト細胞から分化した赤血球細胞におけるレベルであった。ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶの遺伝毒性評価。系統特異的β−グロビン発現カセットの一部として強力な赤血球エンハンサーエレメントを含有するＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶの潜在的な遺伝毒性を評価するために、ベクター組み込み部位（ＩＳ）分析およびインビトロ不死化（ＩＶＩＭ）アッセイの２つの評価を行った。
【０１４４】
形質導入したヒトＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のベクターＩＳは、非制限的ライゲーション−増幅ＰＣＲ（ｎｒＬＡＭＰＣＲ）、およびバイオインフォマティクスアッセイを用いたヒトゲノムに隣接する配列のマッピングにより同定した。ベクターに関連する遺伝毒性の証拠として、癌関連遺伝子（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ７２１−Ｄ７２６）または転写開始部位（ＴＳＳ）の近傍に組み込み体を含有するクローンの優先的インビボ選択の証拠を探すために、短期インビトロ増殖後とＮＳＧマウスにおける生着後に形質導入ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞におけるベクター組み込みパターン間の比較を行った。
【０１４５】
インビボ増殖の後、癌関連遺伝子近傍のベクターのパーセンテージに増加は見られなかった（二項検定、Ｐ＝０．３２；Ｐ値は二項検定を用いて決定し、インビトロ条件における癌遺伝子対近傍ＩＳの比率を生着マウスにおいてそのようなＩＳを観察する確率の推定値とした）（図１０Ａ）。また、ランダムデータセットと比較して、遺伝子のＴＳＳ近傍にベクター組み込みを有する細胞の頻度にも増加は認められず（表４）、対照的に、γ−レトロウイルスベクターを用いた臨床試験からの比較ベクターＩＳデータセット（Ｃａｎｄｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｌｏｏｄ，１（１８）：３６３５−３６４６）が、ＴＳＳ近傍でランダムよりも高い組み込みを示した（図１０Ｂ）。
【表４】
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【０１４６】
βＡＳ３−グロビンＬＶベクターによる挿入形質転換のリスクをさらに評価するために、限界希釈で増殖させたマウス系統陰性ＢＭ細胞の挿入形質転換によって不死化事象を定量化するＩＶＩＭアッセイを使用して遺伝毒性試験を行った（Ｍｏｄｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ，１０８（８）：２５４５−２５５３）。ＬＶベクターＣＣＬ−βＡＳ３、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ、およびＣＣＬ−βＡＳ３−ｃＨＳ４の不死化能を、陽性対照としてのγ−レトロウイルスＲＳＦ９１−ＧＦＰ−ｗＰＲＥおよび陰性対照としてのモック形質導入細胞のものと比較した。ＲＳＦ９１−ＧＦＰ−ｗＰＲＥは、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）ＬＴＲを担持し、このアッセイにおいて高い確率で挿入変異によって一次マウス細胞を形質転換することが分かっている。
【０１４７】
以前の報告と一致して、ＳＦＦＶ  ＬＴＲによって駆動されるＲＳＦ９１−ＧＦＰベクターは、最大５．２６−０２（または１９細胞中１）の高い再播種頻度でクローンを頻繁に生成した（１４の形質導入のうち８）。対照的に、全部で２２個の独立した形質導入（ＣＣＬ−βＡＳ３、ｎ＝４；ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ、ｎ＝１４；およびＣＣＬ−βＡＳ３−ｃＨＳ４、ｎ＝４）のうち、βＡＳ３−グロビンＬＶベクターは、再播種ステップの後にいずれのクローンも生じなかったことが分かった（図１０Ｃおよび表５）。このインビトロ設定では、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢが、ＳＦＦＶ  ＬＴＲによって駆動されるγ−レトロウイルスベクターＲＳＦ９１−ＧＦＰよりも遺伝毒性が有意に低かった（両側フィッシャーの正確確率検定でＰ＝０．００２）（図１０Ｃ）。
【表５】
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【０１４８】
考察
ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶがｒｂｃの鎌状化を阻害するのに必要なレベルの抗鎌状化ＨＢＢＡＳ３遺伝子の導入および発現を達成する潜在的適合性を評価するために、ＳＣＤドナーからのヒトＢＭ  ＣＤ３４＋細胞を使用して試験を行った。ＢＭは、ＳＣＤ患者におけるＧ−ＣＳＦを用いたＰＢＳＣの動員によるリスクが高いため、ＳＣＤの遺伝子治療に臨床的に使用される可能性の高い自家ＨＳＣ源である（Ａｂｂｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｌａｎｃｅｔ３５１（９１０７）：９５９；Ａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ，９７（１０）：３３１３−３３１４；Ｆｉｔｚｈｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，１１（４）：４６４−４７１）。
【０１４９】
ＳＣＤのための同種ＨＳＣＴにおいて、安定なドナーＨＳＣの１０％〜３０％のキメラ化は、ＨｂＳ含有レシピエント由来ｒｂｃの短期生存と比較して正常ドナー由来ｒｂｃの選択的な生存優位性のために、有意な血液学的および臨床的改善をもたらすことができる（Ｗａｌｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．７（１２）：６６５−６７３；Ａｎｄｒｅａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，９６（１）：１２８−１３３；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１３９（３）：５０４−５０７；Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１４（１１）：１２７０−１２７８）。ＨＰＦＨを伴うＳＣＤ患者では、８％〜１５％またはそれ以上のＨｂＦレベル（Ｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３０（２３）：１６３９−１６４４；Ｃｈａｒａｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｌｏｏｄ，６９（１）：１０９−１１６）が、臨床症状の重症度および頻度を改善する。ＨＢＢＡＳ３遺伝子を発現するｒｂｃがＨＤからのＨＢＢのみを発現するｒｂｃと同じくらい有益であるかどうかは分からないため、これらの臨床的知見は、ＳＣＤに恩恵をもたらす遺伝子修正ＨＳＣの自家移植の最小閾値を定義する。よって、少なくとも８％〜１５％のＨｂＡＳ３を発現するｒｂｃを生成する少なくとも１０％〜３０％生着した遺伝子修正ＨＳＣが、同様のレベルの同種ドナーの生着と同じ治療効果を潜在的に達成するために必要となる。ヒトＣＤ３４＋細胞は、許容細胞株と比べてＬＶベクターによる遺伝子導入に対して比較的耐性を示し、ベクターの力価が低い場合にこれが顕著となる。よって、必要とされる頻度（例えば、１０％〜３０％）で遺伝子修正ＨＳＣの生着を引き起こすように十分なパーセンテージのＣＤ３４＋細胞を形質導入することが主要課題である。ＬＶベクターおよび完全細胞切除条件を用いたＸ−ＡＬＤおよびβサラセミアの臨床試験において、遺伝子操作した自家ＨＳＣの安定な１０％〜２０％の生着が示され、ＳＣＤの設定においてもこれが達成可能であることが示唆された（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ，４６７（７３１３）：３１８−３２２；Ｃａｒｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６（５９５４）：８１８−８２３）。我々の試験では、ＣＦＵアッセイによって、コロニー形成前駆細胞の３０％が形質導入されたことが示された。生着ＨＳＣのこのパーセンテージの形質導入は、臨床試験の標的範囲内であると考えられる。
【０１５０】
ＨＢＢＡＳ３遺伝子の抗鎌状化活性は、インビトロでＨｂＦと同等であることが分かっているため（Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（２６）：２７５１８−２７５２４）、８％〜１５％よりも高い全ＨｂレベルでのＨｂＡＳ３の生成は、臨床的に有益な様式で鎌状化を阻害し得る。ＳＣＤのマウスモデルにおいて、親ＬＶ  ＤＬ−βＡＳ３が、全Ｈｂの２０％〜２５％のＨｂＡＳ３を発現し、残りはヒトＨＢＢＳ導入遺伝子からのものであった（Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ，１０２（１３）：４３１２−４３１９）。これらの以前の結果は、ＨＢＢＡＳ３遺伝子のＬＶ媒介性導入が遺伝子治療において臨床的に有効であり得ることを示唆している。我々の試験において、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶの発現および機能的活性は、著しく一貫しており、効果的であった。形質導入ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞から生成された一次ヒト赤血球細胞において、全β−グロビン様ＲＮＡ転写物およびＨｂ四量体の１５％〜２５％を占める、ベクターによるＨＢＢＡＳ３遺伝子の再現性の高いレベルの発現が認められた。ＨｂＡＳ３タンパク質の発現は、脱酸素化しても鎌状化しないＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢで形質導入したＳＣＤ  ＣＤ３４＋細胞から生成されるｒｂｃのパーセンテージを一貫して増加させたことから、γ−グロビン発現の効果に類似する機能的保護が示唆された。これらの結果は、親ＤＬ−βＡＳ３  ＬＶが、ＢＭ移植したＳＣＤマウスにおいて異常なｒｂｃ形態および血液学的パラメータを修正した、ＴｏｗｎｅｓらによるＨＢＢＡＳ３遺伝子を用いた最初の試験と一致した（Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｂｌｏｏｄ，  １０２（１３）：４３１２−４３１９）。
【０１５１】
我々は、標的範囲内のベクター形質導入レベルおよびＨｂＡＳ３タンパク質の生成を実現した。しかしながら、ＨＢＢＡＳ３導入遺伝子を担持するより高いパーセンテージのＨＳＣは、抗鎌状化ＨｂＡＳ３を含有するｒｂｃのより大きな集団を提供する可能性が高く、したがって、より大きな臨床的有用性を提供し得る。β−グロビンＬＶベクターを改善しようとする試みは、β−グロビン調節エレメントを除去することにより力価および形質導入効率が向上することを示した：しかしながら、これでは発現レベルが損なわれた（Ｌｉｓｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｄｅｌａｉｎ（２００７）Ｂｌｏｏｄ，１１０（１３）：４１７５−４１７８）。導入遺伝子発現を損なうことなくβ−グロビンベクターの形質導入効率を向上させるためのさらなる努力は、この分野において重要な前進であろう。我々は、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢと称される、元のＤＬ−βＡＳ３  ＬＶ（Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ，１０２（１３）：４３１２−４３１９）の誘導体を開発および試験し、５′ＬＴＲのＨＩＶプロモーターをＣＭＶエンハンサー／プロモーターに置き換え、パッケージングプロセスの間にＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質を発現させる必要性を排除した（Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３−８４７１）。元のＬＶ骨格におけるこの修飾は、パッケージングステップからＴＡＴ遺伝子を排除することによってベクターのバイオセイフティ―を改善することができる。これはまた、元のウイルスと比較してベクターの力価の少なくとも１０倍の増加をもたらした。しかしながら、この改善にもかかわらず、β−グロビン遺伝子の高レベルの発現に必要な大量の調節エレメントがこの種類のＬＶを複雑にし、より単純な遺伝子カセットを有するベクターと比較して達成可能な力価を低下させる。
【０１５２】
導入された遺伝子の十分な発現のために強力なエンハンサーおよび他の調節エレメントが必要とされる、いくつかの遺伝子治療設定において（例えば、慢性肉芽腫症、βサラセミア）、インスレーターエレメントが付加されると、これらのエレメントの遺伝毒性が低下され得る（Ｅｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９７（１６）：９１５０−９１５５）。インスレーターは、エンハンサー遮断活性、ヘテロクロマチンバリア活性のいずれか、またはその両方として顕在化し得る、隣接するクロマチンドメイン間の相互作用を阻害する境界エレメントとして作用するＤＮＡ配列である。インスレーターのエンハンサー遮断活性は、隣接する細胞の遺伝子のプロモーターからの転写のトランス活性を低下させる。インスレーターのバリア活性は、周辺のへトロクロマチンがベクタープロウイルス内に広がることによって引き起こされる導入遺伝子サイレンシングを減少させる（Ｒａａｂ  ａｎｄ  Ｋａｍａｋａｋａ（２０１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１１（６）：４３９−４４６）。
【０１５３】
脊椎動物におけるインスレーターのエンハンサー遮断活性に関連する主要なＤＮＡ結合タンパク質は、高度に保存された偏在するジンクフィンガータンパク質（Ｌｏｂａｎｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，５（１２）：１７４３−１７５３；Ｆｉｌｉｐｐｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６（６）：２８０２−２８１３；Ｖｏｓｔｒｏｖ  ａｎｄ  Ｑｕｉｔｓｃｈｋｅ（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（５２）：３３３５３−３３３５９）であるＣＴＣＦ（ＣＣＣＴＣ結合因子）タンパク質（Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ，９８（３）：３８７−３９６）である。ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶに用いられるＦＢインスレーターは、レポータープラスミドトランスフェクションアッセイにおいて、完全な１．２ｋｂのｃＨＳ４インスレーターに類似するエンハンサー遮断活性を有し、２５０ｂｐコアのｃＨＳ４インスレーター断片の遮断活性を超えることが以前に示されている（Ｒａｍｅｚａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２６（１２）：３２５７−３２６６）。
【０１５４】
ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶにおいて、比較的小さいＦＢインスレーター（７７ｂｐ）を３’ＬＴＲのＵ３領域に挿入したとき、親ＣＣＬ−βＡＳ３  ＬＶの力価を低下させなかった。それは、ＲＴの間に５’ＬＴＲに忠実に伝達され、形質導入したヒトＣＤ３４＋細胞およびインビトロで増殖させたクローンＣＦＵのプールからのＦＢインスレーター領域のサザンブロット分析またはＰＣＲ分析によると、ベクタープロウイルスの検出可能な欠失または損失は見られなかった。ＦＢインスレーターを欠損する親ベクターもＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶもクローンの成長を引き起こさなかったため、ＦＢインスレーターがＩＶＩＭアッセイにおいて遺伝毒性のリスクを低減する機能的能力を評価することができなかった。しかしながら、Ｋ５６２細胞からのＣｈＩＰ分析によって評価したところ、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  のＬＴＲ領域に対するＣＴＣＦタンパク質の非常に高い結合に基づくＦＢインスレーターのインビトロ活性の証拠が観察された。
【０１５５】
β−サラセミアの治験でＢＭ  ＣＤ３４＋細胞の形質導入に使用されたＬＶの２５０ｂｐのｃＨＳ４インスレーターエレメント内での異常なスプライシングに関する最近の報告を考慮して（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ，４６７（７３１３）：３１８−３２２）、ＦＢインスレーター配列のコンピュータによるスプライス部位分析を行った。ＮｅｔＧｅｎｅ２サーバー（Ｂｒｕｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２０（１）：４９−６５）は、Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ，４６７（７３１３）：３１８−３２２によってｃＨＳ４インスレーター内に発見された潜在性スプライス部位を同定したが、それは、ＦＢ含有ＳＩＮ  ＬＴＲにおけるスプライシングシグナルを予測しなかった。これらの試験は、ＦＢインスレーターが、ベクターの力価を低下させず、インタクトで伝達され、エンハンサー遮断活性を生じることに寄与する主要な細胞因子に結合し、潜在性スプライス部位として機能することは予測されないことを示唆している：しかしながら、ベクター中のＦＢインスレーターの存在が、臨床用途において安全性を増加させるかどうかは分かっていない。
【０１５６】
ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢで形質導入したマウスＢＭ細胞を用いたＩＶＩＭアッセイ、およびＮＳＧマウスにインビボで移植したヒトＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のベクターＩＳ分析を使用した安全性評価では、いずれの遺伝毒性の証拠も明らかにならなかったが、これらの代替アッセイの感度は、比較的低い可能性がある。ＬＶについて観察されたベクターＩＳのパターンは、ＨＩＶ−１に基づくＬＶについて以前に記載されたものと一致しており、遺伝子内への優先的組込みが見られたが、ＴＳＳ近傍の組み込みは優先されなかった（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３００（５６２６）：１７４９−１７５１）。これは、最近公開されたγ−レトロウイルスのＩＳデータセットと矛盾していた（Ｃａｎｄｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｌｏｏｄ，１（１８）：３６３５−３６４６）。
【０１５７】
全体として、これらの試験は、ＳＣＤのためのＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶを用いた遺伝子治療の臨床試験への移行を支持するのに十分に効果的なＳＣＤ患者由来ヒトＢＭ  ＣＤ３４＋前駆細胞の形質導入に関する前臨床データを提供する。ＳＣＤの遺伝子治療の臨床的有用性を定義するために、遺伝子操作したＨＳＣの自家移植の結果を、進歩し続ける同種移植手法からの結果と比較する必要がある。
【０１５８】
方法
ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のＬＶ形質導入
形質導入のために、ＳＣＤおよびＨＤからのＢＭ  ＣＤ３４＋細胞試料を解凍し、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（２０μｇ／ｍｌ、Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ  Ｃｏ．）で予めコーティングした組織培養皿に１×１０６細胞／ｍｌで播種した。１×グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシン（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を含有するＸ−Ｖｉｖｏ  １５培地（Ｌｏｎｚａ）で１８〜２４時間予備刺激を行った。サイトカインを次の濃度で加えた：５０ｎｇ／ｍｌヒトＳＣＦ（ｈＳＣＦ）（ＳｔｅｍＧｅｎｔ）、５０ｎｇ／ｍｌヒトｈＦｌｔ３リガンド（ｈＦｌｔ３−ｌ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、５０ｎｇ／ｍｌヒトトロンボポエチン（ｈＴＰＯ）および２０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−３（ｈＩＬ−３）（どちらもＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから）。行われた全ての実験について、最終濃度２×１０７ＴＵ／ｍｌ（ＨＴ２９細胞の力価に基づいてＭＯＩ＝４０）のＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶの濃縮ウイルス上清で細胞を形質導入した。形質導入の２４時間後、ＣＦＵアッセイのために細胞をメチルセルロースに播種し、またインビトロ赤血球分化培養にも播種し、ＮＳＧマウスに異種移植するために使用した。
【０１５９】
インビトロ赤血球分化培養
使用したインビトロ赤血球分化技術は、Ｇｉａｒｒａｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｄｏｕａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８２：１２７−１４０）から適合させた３段階プロトコルに基づいている。予備刺激および形質導入のために２日間培養した後、細胞を赤血球培養に移した。基本の赤血球培地は、１０％ＢＳＡ、４０μｇ／ｍｌイノシトール、１０μｇ／ｍｌ葉酸、１．６μＭモノチオグリセロール、１２０μｇ／ｍｌトランスフェリン、および１０μｇ／ｍｌインスリン（全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから）を補充したＩｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（１×グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシン）であった。第１段階（６日間）の間は、１０〜６Ｍヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｎｇ／ｍｌ  ｈＳＣＦ、５ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−３、および３ＩＵ／ｍｌエリスロポエチン（Ｅｐｏ）（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）の存在下で細胞を培養した。第２段階（３日間）では、Ｅｐｏ（３ＩＵ／ｍｌ）のみを添加した基本の赤血球培地を用いて、細胞を間質細胞層（ＭＳ−５、マウス間質細胞株（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｌｅｕｋｅｍｉａ，６（５）：４５２−４５８）（Ｇａｙ  Ｃｒｏｏｋｓ，ＵＣＬＡより提供）に移した。１１日目に、培地から全てのサイトカインを除去し、１８〜２１日目までＭＳ−５間質層上で細胞を共培養した。
【０１６０】
ＶＣ／細胞の決定のためのｑＰＣＲ
赤血球分化の１４日目に、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したゲノムＤＮＡ単離のために、赤血球培養から１０５細胞を採取した。ＬＶプロウイルスにおけるＨＩＶ−１パッケージングシグナル配列（Ｐｓｉ）の多重ｑＰＣＲにより平均ＶＣ／細胞を決定し、細胞の常染色体遺伝子シンデカン４（ＳＤＣ４）に対して正規化して平均ＶＣ／細胞を算出した。この多重ｑＰＣＲ法は、以前に記載されている（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１７７（１）：１−９）。
【０１６１】
ｑＲＴ−ＰＣＲによるＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡの定量化
ＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡの発現を決定するために、赤血球分化の１４日目に１〜２×１０５細胞を採取した。ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を製造者の指示に従って使用してＲＮＡを抽出した。キットに含まれるゲノムＤＮＡ排除カラムを使用して、抽出中に可能性のあるＤＮＡ汚染物質を排除した。ランダムプライマー、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、およびＲＮＡｓｅＯＵＴ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を製造者のプロトコルに従って使用し、第一鎖ｃＤＮＡを合成した。ＶｉｉＡ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で白金Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡのＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎによるｑＰＣＲ増幅を行った。
【０１６２】
ベクターＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢに起源を有するｍＲＮＡ転写物（ＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡ）を、分化したｒｂｃ中で特異的に検出し、それらを内在性β−グロビン様ｍＲＮＡ（それぞれ、ＨＤ試料中のＨＢＢおよびＳＣＤ試料中のＨＢＢＳ）のレベルと比較するために、２セットの対立遺伝子特異的プライマーを設計した（ＨＢＢＡ／ＨＢＢＳおよびＨＢＢＡＳ３；表６）。ＨＢＢＡＳ３対ＨＢＢおよびＨＢＢＳ転写物の相対的発現から、全てのβ−グロビン様転写物中のＨＢＢＡＳ３転写物のパーセンテージ（ＨＢＢＡＳ３（％））をそれぞれ決定し、１０８〜１０１分子／μｌ  ＤＮＡの範囲の絶対プラスミド標準曲線を使用して測定されたμｌ  ｃＤＮＡ当たりの転写物の絶対数を比較した。両方のプライマーセットを、９５℃で１５秒の変性ステップおよび７２℃で１分間のアニーリング／伸長ステップを伴う、合計４０サイクルの２ステップＰＣＲプロトコルに使用した。全ての反応は２通り行い、各反応ごとに解離曲線分析を実行して非特異的増幅を除外した。
【０１６３】
ＩＥＦによるＨｂＡＳ３四量体の定量化
Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を製造者の指示に従って使用してＨｂのＩＥＦを行った。端的に述べると、赤血球分化の２１日目に最低３×１０６細胞を採取した。Ｈｅｍｏｌｙｓａｔｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて指示通りに細胞を溶解し、４℃で一晩インキュベートした。必要であれば、Ｍｉｃｒｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＹＭ−３０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してライセートを翌日濃縮した：５μｌの試料をＴｉｔａｎ  ＩＩＩ酢酸セルロースプレート（Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に負荷し、３５０ボルトで２５分間電気泳動した。Ｈｂ四量体の可視化のためにプレートをＰｏｎｃｅａｕ  Ｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により染色し、Ｃｌｅａｒ  Ａｉｄ溶液（Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して透徹し、乾燥させた。Ｈｅｌｅｎａ  Ｈｅｍｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓとの比較によりＨｂバンドを同定し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して濃度測定により定量化した。
【０１６４】
ＳＣＤ表現型修正アッセイ
赤血球分化の２１日目に、表現型修正アッセイのために条件当たり２．５×１０５細胞を採取した。試料を遠心沈殿し（５００ｇで５分間）、得られたペレットを１０μｌの上清中で採取し、１０μｌの２０μｇ／ｍｌ二亜硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を各試料に加えた。この混合物をガラス製顕微鏡スライド上に負荷し、カバーを被せ、端で密封した。５％  ＣＯ２、３７℃で試料を２５〜４０分間インキュベートした。次いで、Ｎｉｋｏｎ  ＤＳ−Ｆｉ１カメラを備えた反転顕微鏡により、１０倍の倍率で、連続する視野から細胞の画像を取得した。コンピュータビジョンを利用して各視野内で細胞を単離し、次いで、治療群にわたる無作為化した不偏性様式での正常または鎌状形態の視覚的分析のために、それらを個別にユーザに提示した。
【０１６５】
免疫不全マウスにおける形質導入したヒトＢＭ  ＣＤ３４＋細胞の移植
９〜１２週齢のＮＳＧマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を２５０ｃＧｙで全身照射した後、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢベクターで形質導入したか、またはモック形質導入したＨＤまたはＳＣＤドナーからのＢＭ  ＣＤ３４＋細胞（１０５〜１０６細胞）を尾静脈注射により移植した。８〜１２週後、マウスを安楽死させ、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ４５対ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＣＤ４５を使用したフローサイトメトリーによりヒト細胞の生着についてＢＭを分析した。抗体でインキュベートした後、ＢＤ  ＦＡＣＳ−Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してｒｂｃを溶解した。生着したヒト細胞のパーセンテージは次のように定義した：ｈｕＣＤ４５＋％／（ｈｕＣＤ４５＋％＋ｍｕＣＤ４５＋％）。ペリジニン−クロロフィルコンジュゲート（ＰｅｒＣＰ）抗ヒトＣＤ３４、Ｖ４５０−コンジュゲート抗ヒトＣＤ４５、ＦＩＴＣ−コンジュゲート抗ヒトＣＤ１９、ＰＥ−コンジュゲート抗ヒトＣＤ３３、およびＡＰＣ−コンジュゲート抗ヒトＣＤ７１（全ての抗体はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）について染色することにより、存在する異なる造血細胞種の分析を行った。生着マウスからのＢＭは、免疫磁気分離法（ＣＤ４５  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ−マウス；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ）を使用してマウスＣＤ４５＋細胞を欠失させた。ｍＣＤ４５陰性断片を前述のようにインビトロ赤血球分化のために培養し、ＶＣ／細胞およびＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡの発現の分析のために細胞を生成した。プロウイルスのパッケージング（Ｐｓｉ）領域を増幅させるためのプライマーを使用して各試料にｑＰＣＲを行い、常染色体ヒト遺伝子ＳＤＣ４（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１７７（１）：１−９）に対するプライマーを使用してＤＮＡコピーに対して正規化し、培養中のマウス細胞の潜在的存在に合わせて調節した。
【０１６６】
ベクターＩＳの分析
入手可能性に応じて、細胞から単離した１〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡを使用して、非限定的な線形増幅によって媒介される（ｎｒ−ＬＡＭ）ＰＣＲを行い、ベクターＩＳを同定した（Ｐａｒｕｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１００  Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．５（８）：１３７９−１３９５）。端的に述べると、プライマーＨＩＶ３線形（ビオチン−ＡＧＴ  ＡＧＴ  ＧＴＧ  ＴＧＣ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＧＴ（配列番号１））を用いて１００サイクルの線形増幅を行った。１．５体積のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して線形反応物を精製し、Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｌ）上に捕捉した。６５℃で２時間、１０μｌの反応物中でＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して、捕捉したｓｓＤＮＡをリード２リンカー（ｐｈｏｓ−ＡＧＡ  ＴＣＧ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＡＣＧ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  Ｃ−  ３Ｃスペーサー（配列番号２））に連結させた。プライマーＨＩＶ３右（ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＡＣＧ  ＧＣＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＡＣＴ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＴＣＡ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＡＧＴ  Ｃ（配列番号３））およびインデックスを付加した適切な逆方向プライマー（ＣＡＡ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＧＡＴ−ｉｎｄｅｘ−ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＡＣＧ  ＴＧＴ（配列番号４））を使用して、これらのビーズ上でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を混合し、プローブに基づくｑＰＣＲにより定量化し、適当な量を用いてＩｌｌｕｍｉｎａ  ｖ３フローセルに負荷した。特注のリード１プライマー（ＣＣＣ  ＴＣＡ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＣＴＡ  ＧＣＡ（配列番号５））を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００機器上でペアエンド５０ｂｐシーケンシングを行った。
【０１６７】
Ｂｏｗｔｉｅを用いて、リードをｈｇ１９ビルドのヒトゲノムにアラインし（Ｌａｎｇｍｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．１０（３）：Ｒ２５）、アライメントを凝縮し、特注のＰｅｒｌ  ａｎｄ  Ｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用してアノテートし、ＵＣＳＣデータベースから得られたＲｅｆＳｅｑ遺伝子アノテーションに対してベクターの組み込みを位置付けた。癌関連遺伝子のプロモーターの５０ｋｂのまたは５０ｋｂ以内の転写領域におけるＩＳ頻度（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ７２１−Ｄ７２６に定義される）を決定した。ＬＶベクターの構造、生成、および滴定、ＦＢインスレーター完全性についてのＰＣＲ、サザンブロット、ＣｈＩＰ、ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞単離、ＣＦＵ前駆細胞アッセイ、骨髄培養、赤血球培養中のフローサイトメトリー、ＩＶＩＭアッセイ、ならびに赤血球および骨髄条件におけるＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡの発現の詳細については、後述の補助的方法を参照されたい。
【０１６８】
統計
実験条件による平均およびＳＤ等の連続的結果変数に関する記述統計学を数字で提示する。力価、ＶＣ／細胞、脱核のパーセンテージ、コロニー増殖のパーセンテージ等の連続的結果の場合、実験の設計に応じて、一元配置または二元配置ＡＮＯＶＡ（Ｔｕｋｅｙ（１９５７）Ａｎｎ．Ｍａｔｈ  Ｓｔａｔｉｓｔ．２８（１）：４３−５６）を使用して全体的な群間差を評価した。さらに、２試料ｔ検定（２群を超える場合はＡＮＯＶＡのフレームワーク内）によって、または正規性の仮定が満たされない場合はウィルコクソン順位和検定によって、２群間比較を行った。ピアソン相関（Ｓｎｅｄｅｃｏｒ  ａｎｄ  Ｃｏｃｈｒａｎ  ＷＧ（１９８９）Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．７ｔｈ  ｅｄ．Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ，ＵＳＡ：Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、ＶＣ／細胞とＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡのパーセンテージとの相関、ならびにＶＣ／細胞とＨｂＡＳ３のパーセンテージとの相関を測定し、スピアマン相関（Ｌｅｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｂｒｅｒａ（２００６）Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃｓ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｒａｎｋｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）を用いて、ＶＣ／細胞と修正した鎌状細胞のパーセンテージとの相関を評価した。ＩＶＩＭアッセイにおける再播種条件等のバイナリ結果（陽性対陰性）の場合、フィッシャー直接確率法（Ｆｉｓｈｅｒ（１９２２）Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｔ．Ｓｏｃ．８５（１）：８７−９４）を用いてＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢベクターをＲＳＦ９１−ＧＦＰベクターと比較した。インビトロで増殖させた細胞の癌関連遺伝子近傍のＩＳの比率をマウスに生着させた細胞と比較するために、インビトロ条件における癌遺伝子対近傍ＩＳの比率を生着マウスにおいてそのようなＩＳを観察する確率の推定値として用いて二項検定を行った。全ての統計的検討に関して、有意性についての検定は両側検定であった。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であると見なした。全ての統計的分析は、ＳＡＳバージョン９．３（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（２０１１）．ＳＡＳ／ＳＴＡＴ  ９．３  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ：：Ｔｈｅ  ＲＥＧ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（Ｃｈａｐｔｅｒ）．Ｃａｒｅｙ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ：ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）、Ｇｒａｐｈ−Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０ｄ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）、およびＭＡＴＬＡＢ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．１２．０．６３５（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．）を使用して実行した。
【０１６９】
試験の承認
全てのヒト試料は、ＵＣＬＡ  ＩＲＢプロトコル番号１０−００１３９９に従って使用された。これらの試験に用いた対象からは、書面によるインフォームド・コンセントを得た。マウスに関する全ての作業は、ＵＣＬＡ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコル下で行われた。
【０１７０】
補助的材料および方法
ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ  ＬＶベクターの構造
ＡＳ３−順方向プライマー（Ｆ）−および逆方向プライマーＡＳ３（Ｒ）−とともにＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ＨＢＢＡＳ３カセット（３つのアミノ酸置換、ＨＢＢプロモーター、３’ＨＢＢエンハンサー、およびＤＮＡａｓｅ高感受性領域ＨＳ２、ＨＳ３、およびＨＳ４を有するヒトＨＢＢ遺伝子）ならびにＷＰＲＥを、ＤＬ−βＡＳ３  ＬＶプラスミド（Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ，１０２（１３）：４３１２−４３１９）（ＵＡＢ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬのＴｉｍ  Ｔｏｗｎｅｓ氏から寛大にも提供された）からＰＣＲによって増幅した。６．６ＫｂのＰＣＲ産物をＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＱｕｉｃｋＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により精製し、プラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニングした。ｐＣＣＬｃＰＰＴ−ｘ−プラスミドの３’ＬＴＲにＦＢインスレーターを含めるために、プライマーＰＨＲ’３’ＬＴＲ−ａｍｐ−ｏｒｉ  ＦおよびＰＨＲ’３’ＬＴＲ−ａｍｐ−ｏｒｉ  Ｒ２を使用して、１−ＬＴＲ（ＳＩＮ）プラスミドを作製するためのｐＨＲ’−ＣＭＶ−ＥＧＦＰを使用してＰＣＲ反応を行った。１−ＬＴＲプラスミドをＥｃｏＲＶおよびＰｖｕＩＩで消化し、ホスファターゼ処理し、ＦＢ（７７ｂｐ）インスレーター配列（ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＧＡＴ  ＧＴＡ  ＣＧＴ  ＣＣＣ  ＴＡＡ  ＣＣＣ  ＧＣＴ  ＡＧＧ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＴＧＣ  ＣＧＣ  ＣＴ  ＧＣＣ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＧＧＴ  ＣＣＡ  ＧＴＣ（配列番号６））（Ｒａｍｅｚａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２６（１２）：３２５７−３２６６）を含有するリン酸化オリゴヌクレオチドカセットを用いて連結させて１−ＬＴＲ−ＦＢプラスミドを得た。
【０１７１】
１−ＬＴＲ−ＦＢクローンを確認した後、プライマー３’ＬＴＲ  Ｆ（Ｖｏｓｔｒｏｖ  ａｎｄ  Ｑｕｉｔｓｃｈｋｅ（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（５２）：３３３５３−３３３５９）および３’ＬＴＲ  Ｒ  （同上）とともに１−ＬＴＲ−ＦＢプラスミドを用いて、次いで、プライマーｐＣＣＬ  ＬＴＲインサートＦ（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３００（５６２６）：１７４９−１７５１）およびｐＣＣＬ  ＬＴＲインサートＲ（Ｂｒｕｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２０（１）：４９−６５）を使用してｐＣＣＬ−ｃＰＰＴエンプティ骨格とともにＰＣＲを行った。これらのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ  ＣＡ）に使用した。２つの断片は、３’ＬＴＲで重複して、ｐＣＣＬ−ｃＰＰＴ−ｘ−ＦＢ骨格を形成していた。前述のようにｐＨＲ’から作製した１−ＬＴＲプラスミドをＥｃｏＲＶおよびＰｖｕＩＩで消化することによって、ｐＣＣＬ−ｃＰＰＴ−ｘ−ｃＨＳ４骨格を作製した。プライマー１．２ｋｂ−Ｆおよび１．２ｋｂ−Ｒを使用して１．２ｋｂのｃＨＳ４インスレーターを増幅した。得られた生成物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ  ＣＡ）により直線化１−ＬＴＲプラスミドにクローニングした。ＦＢ含有ＬＴＲのために、前述のように完全な３’ＬＴＲをｐＣＣＬ−ｃＰＰＴ−ｘに導入した。ｐＣＣＬ−ｃＰＰＴ−ｘ−骨格にＰＡＳ３−ＷＰＲＥ断片を含めるために、ＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＰＡＳ３−ＷＰＲＥプラスミドをＳｅａｌおよびＫｐｎｌで消化し、精製した生成物をＸｈｏｌで平滑末端化および消化した。ＰＡＳ３−ＷＰＲＥ断片に対応する６．６ｋｂのバンドをゲル精製によって単離し、ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏｌにより以前に消化したｐＣＣＬ−ｃＰＰ−ｘ−骨格にクローニングした。得られたｐＣＣＬ−ｃＰＰＴ−ＰＡＳ３−ＷＰＲＥ（ＣＣＬ−ＰＡＳ３と称される）ベクタープラスミドを完全に配列決定して構造を確認した。同じ手順を行って遮蔽型ＣＣＬ−ＰＡＳ３−ＦＢおよびＣＣＬ−ＰＡＳ３−ｃＨＳ４を開発し、以前に記載されたｐＣＣＬ−ｃＰＰＴ−ｘ−ＦＢおよびｐＣＣＬ−ｃＰＰＴ−ｘ−ｃＨＳ４骨格のＰＡＳ３−ＷＰＲＥカセットにそれぞれクローニングした（プライマー配列を表６に提供する）。
【表６】
2015529466.tif 000008
【０１７２】
ｐＡＳ３−グロビンＬＶの生成および滴定
力価分析のためのＬＶの小規模生成のために、トランスフェクションの２４時間前に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）、１Ｘグルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシン（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｅｓｔ  Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）を含むＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）からなる１０ｍｌのＤ１０培地中のＰｏｌｙ  Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でコーティングした１０ｃｍ細胞培養皿当たり２９３Ｔ細胞（５×１０６）（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を播種した。トランスフェクション当日、１ｐｇのＤＮＡ当たり３ｐｌのＴｒａｎｓＩＴ−２９３（Ｍｉｒｕｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用した。各条件に必要なＴｒａｎｓＩＴの量を５００ｕｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と混合し、ボルテックスし、室温で２０分インキュベートした。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ／ＴｒａｎｓＩＴ溶液を、（ａ）５ｐｇの導入プラスミド、（ｂ）５ｐｇのｐＭＤＬ  ｇａｇ−ｐｏｌ／ｐＲＲＥ、（ｃ）２．５ｐｇのｐＲＳＶ−Ｒｅｖ（どちらもＣｅｌｌＧｅｎｅｓｙｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡのＬｕｉｇｉ  Ｎａｌｄｉｎｉ氏から寄贈されたもの）、および（ｄ）１ｐｇのｐＭＤＧ−ＶＳＶ−Ｇ（３）と混合した。ＴＡＴを用いて行われたトランスフェクションでは、２．５ｐｇのｐＳＶ２−ｔａｔを使用した（４）（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤより提供）。ＤＮＡおよびＯＰＴＩ−ＭＥＭ／ＴｒａｎｓＩＴ溶液を室温で１５〜３０分間インキュベートした。各プレートにトランスフェクション混合物を加える前に、２９３Ｔ細胞を１０ｍｌのＤ１０で洗浄した。トランスフェクション後約１８〜２０時間で、トランスフェクトした細胞の培地を、１０ｍＭ酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有する培地に変更した。６〜８時間後、ＤＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）で細胞を洗浄し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有する６ｍｌの培地を加えた。４８時間後、ベクターを回収し、濾過し（０．４５ｐｍ）、以前に記載したようにｑＰＣＲにより滴定した（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１７７（１）：１−９）。大規模ウイルス調製物を生成し、接線フロー濾過を用いて濃縮し、以前に記載されたようにｑＰＣＲにより滴定した（同上）。
【０１７３】
ＣＣＬ−ＰＡＳ３−ＦＢプロウイルスにおけるＦＢインスレーターの完全性
ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してゲノムＤＮＡを単離した後、インビトロ赤血球培養の１４日目に形質導入したＢＭ  ＣＤ３４＋細胞の両方のＬＴＲからＰＣＲによってＦＢインスレーターの完全性を分析した。第１のプライマーのセット（５’ＬＴＲ−Ｆおよび５’ＬＴＲ−Ｒ）は、ＦＢ挿入部位に隣接する５’ＬＴＲを増幅するように設計し、ＦＢインスレーターが存在し、かつインタクトである場合、３８２ｂｐのバンドが予想された。第２のプライマーのセット（３’ＬＴＲ−Ｆおよび３’ＬＴＲ−Ｒ）は、３’ＬＴＲを特異的に増幅するように設計した：この場合、ＦＢインスレーターの存在下で予想されるバンドは２４９ｂｐであった。５’ＬＴＲ−Ｆおよび３’ＬＴＲ−Ｒを組み合わせて第３のＰＣＲ反応を行い、両方のＬＴＲからＦＢインスレーターを自然に増幅させた。この場合、対応する増幅産物は、１３５ｂｐの長さを有していた（全てのプライマー配列を表６に提供する。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）サーモサイクラー上でＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＮａｔｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してＰＣＲを実行した。２％アガロースゲル上でＧｅｌＧｒｅｅｎによってＰＣＲ産物を可視化した。
【０１７４】
サザンブロット法
サザンブロット分析を行って、ゲノム中のＣＣＬ−ＰＡＳ３−ＦＢ  ＬＶプロウイルスの完全性を確認した。２９３Ｔ細胞をＣＣＬ−ＰＡＳ３−ＦＢ  ＬＶで形質導入し、２週間にわたって増殖させた後、ゲノムＤＮＡの単離を行った（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。１０ｐｇのゲノムＤＮＡをＡｆｌ  ＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）により消化し、０．８％アガロースゲル内にて一晩２０ボルトで電気泳動し、ナイロン膜に写し、３２Ｐ標識ＷＰＲＥ断片で一晩プローブした。
【０１７５】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）
Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ  ＃  ＣＣＬ−２４３(商標)）を、各ベクターにつき２×１０８ＴＵ／ｍｌの濃度で、ＣＣＬ−ｐＡＳ３、ＣＣＬ−ｐＡＳ３−ＦＢ、およびＣＣＬ−  ｐＡＳ３−ｃＨＳ４  ＬＶベクターで形質導入した。２×１０７形質導入Ｋ５６２細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、室温で５分間、１％ホルムアルデヒド中でインキュベートすることにより架橋結合させた。ｔｒｕＣｈＩＰ  Ｌｏｗ  Ｃｅｌｌ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｓｈｅａｒｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｏｖａｒｉｓ、Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を使用して核を単離し、ＣＯＶＡＲＩＳ  Ｍ２２０超音波処理器内で製造者の指示に従ってＤＮＡ−タンパク質複合体を６分間剪断した。「ＭＡＧｎｉｆｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」プロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に従って５ｐｇの抗ＣＴＣＦ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）またはウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を陰性対照として使用して、剪断したクロマチンを４℃で１２〜１６時間免疫沈降した（３通り）。架橋結合を反転させた後、「Ｑｕａｎｔ−ＩＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してＤＮＡを定量化した。以下の条件でＶｉｉａ７  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのリアルタイムＰＣＲマシンを使用して、免疫沈降したＣＴＣＦ、ＩｇＧ対照、およびインプットＤＮＡ試料からの同量のＤＮＡを用いてリアルタイムｑＰＣＲを３通り行った：保持段階：５０℃で２分間、９５℃で１０分間；ＰＣＲ段階：９５℃で１５秒、６０℃で１分間（４０サイクル）。（プライマー配列を表６に記載する）。ＡＢＩ  Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２「Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａ．ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ．ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ．  ２００１；（Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２）：１−３６）、およびＬｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  ＥＭＢＯ  Ｊ．２０（９）：２２２４−２２３５に記載されるように、相対定量法を用いてデータを分析した。端的に述べると、以下の式を用いて特定の標的配列の倍濃縮を決定した：倍濃縮＝ＡＥ（Ｃｔインプット−ｃｔ  ＩＰ）。ＡＥ＝増幅効率、インプット＝インプットＤＮＡ中の標的配列の量；ＩＰ＝免疫沈降した中の標的配列の量。
【０１７６】
ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞の単離
ＨＤおよびＳＣＤドナー（ｂｅｔａＳ／ｂｅｔａＳまたはｂｅｔａＳ／ｂｅｔａｔｈａｌ０）のＢＭ吸引液からヒトＣＤ３４＋細胞を単離した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上の密度勾配遠心分離によって得られた単核画分をＨｕｍａｎ  ＣＤ３４  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して処理し、回収されたＣＤ３４＋細胞を凍結保存した。
【０１７７】
メチルセルロース中のＣＦＵ前駆細胞アッセイ
ＣＤ３４＋濃縮細胞からのヒト造血前駆細胞の最適な増殖を支持するように濃縮されたメチルセルロース培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、３５ｍｍ格子付き細胞培養皿当たり１００、３００、および１０００個のＢＭ  ＣＤ３４＋細胞（非形質導入または形質導入）を２通り播種した。５％  ＣＯ２、３７℃、および湿潤雰囲気下で１４日培養した後、異なる種類のコロニーをそれらの形態に基づいて同定し、次いで数を数え、ゲノムＤＮＡの単離（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＸＳ，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）のためにプラッキングし、以前に記載されたようにｑＰＣＲによりＶＣ／細胞を決定した（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１７７（１）：１−９）。
【０１７８】
骨髄培養
赤血球培養と並行して、条件当たり５×１０４細胞を骨髄条件で１４日間増殖させ、前述のようにｑＰＣＲによりＶＣ／細胞を測定した（同上）。基本の骨髄培地は、２０％のＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、３５％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）、１Ｘグルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシン、５ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−６（どちらもＲ＆Ｄから）、ならびに２５ｎｇ／ｍｌ  ｈＳＣＦ（ＳｔｅｍＧｅｎｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を補充したＩＭＤＭからなる。
【０１７９】
赤血球培養中のフローサイトメトリー
インビトロ赤血球分化の３日目、１４日目、および２１日目に、フローサイトメトリー分析のために２×１０５細胞を収集した。以下の抗体で試料を染色した：フィコエリトリン（ＰＥ）−コンジュゲート抗ヒトＣＤ３４、Ｖ４５０−コンジュゲート抗ヒトＣＤ４５、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）−コンジュゲート抗ヒトＣＤ７１（全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡから）、およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−コンジュゲート抗グリコホリンＡ（ＧｐＡ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）。２１日目に、生成された脱核ＲＢＣのパーセンテージを二重染色によって測定した（核染色およびＦＩＴＣ−コンジュゲート抗ＧｐＡにＤＲＡＱ５（Ｂｉｏｓｔａｔｕｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＵＫ））：脱核ＲＢＣはＧｐＡ＋／ＤＲＡＱ５−であると定義された。全てのフローサイトメトリー分析は、ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａセルアナライザー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で行った。
【０１８０】
インビトロ不死化（ＩＶＩＭ）アッセイ
ＢＭから系統陰性（幹細胞濃縮）集団を得るために、未処理の７〜１２週齢の雄Ｂ６．ＳＪＬ−ＰｔｐｒｃａＰｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ（「Ｐｅｐ  Ｂｏｙｓ」）をドナーとして使用した。各マウスの長管骨（大腿骨２、脛骨２、および上腕骨２）からのＢＭ細胞を１０％ＦＢＳを補充したＩＭＤＭ内に収集した。Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の指示に従って使用して、系統陰性細胞を全ＢＭ細胞の単一細胞懸濁液から単離し、アリコートで凍結保存した。解凍したら、ベクター粒子に曝露する前に、２４ウェルプレートのＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（２０ｐ，ｇ／ｍｌ）でコーティングしたウェル内で、５０ｎｇ／ｍｌ  ｍＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌヒトインターロイキン−１１（ｈＩＬ−１１）、２０ｎｇ／ｍｌ  ｍＩＬ−３（全てＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）、１００ｎｇ／ｍｌ  ｈＦｌｔ３−Ｌ（Ｃｅｌｌｄｅｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ）および１Ｘグルタミン、ペニシリン、ならびにストレプトマイシンを含有するＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ無血清増殖培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）中、０．５〜１×１０６細胞ｓ／ｍｌの濃度で系統陰性細胞を２日間予備刺激した。レトロウイルスの形質導入のために、１〜２０の範囲の感染多重度で、４０℃にて３０分間１０００ｇで遠心分離することにより、２４ウェルプレートのＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎでコーティングしたウェル上にＲＳＦ９１−ＧＦＰ−ＷＰＲＥウイルス粒子を前負荷した。３日目に、ウイルス上清を吸引し、１×１０５の予備刺激した系統陰性細胞を、サイトカインを含有する５００μＬのＳｔｅｍＳｐａｎ培地に加えた。４日目に、増加する細胞数を説明するべく、１ｍＬのレトロウイルス粒子で新たに前負荷された新しい２４ウェルプレートに細胞を移した。ＬＶ形質導入のために、３日目に、サイトカインを含有する５００μＬのＳｔｅｍＳｐａｎ培地中２×１０７ＴＵ／ｍＬおよび２×１０８ＴＵ／ｍｌで濃縮したＣＣＬ−βＡＳ３、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ、およびＣＣＬ−βＡＳ３−ｃＨＳ４  ＬＶ上清を用いて、１ｘ１０５の予備刺激した系統陰性細胞を形質導入した。４日目に、増加する細胞数を説明するべく、５００μＬの培地を加えた。５日目（ｐＴＤ１日目）から、モック、レトロウイルス、およびレンチウイルスで形質導入した試料を、１０％  ＦＢＳ、１Ｘグルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシン、５０ｎｇ／ｍｌ  ｍＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−１１、２０ｎｇ／ｍｌ  ｍＩＬ−３および１００ｎｇ／ｍｌ  ｈＦｌｔ３−Ｌを補充したＩＭＤＭ中で、２週間大量培養として増殖させた。この期間中、４日目、６日目、８日目、１１日目、およびｐＴＤ  １３日目に、細胞密度を５×１０５／ｍｌに調節した。ｐＴＤ１５日目に、限界希釈アッセイにおいて、ＦＢＳ、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびサイトカインを補充した１００μｌ  ＩＭＤＭ中の９６ウェルプレートに、それぞれ、１００細胞／ウェルおよび１０００細胞／ウェ���の密度で細胞を播種した。２週間後、陽性のウェルを数え、Ｌ−Ｃａｌｃ  ソフトウェア（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、ポアソン統計に基づいて再播種細胞の頻度を計算した。
【０１８１】
赤血球および骨髄条件におけるＨＢＢＡＳ３  ｍＲＮＡの発現
ＢＭ−ＣＤ３４＋細胞を形質導入した後、試料を骨髄および赤血球分化条件下における平行培養に分割した。培養の１４日目に、各群につき１．５×１０５細胞を採取した。材料と方法の項目に記載するようにＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成を行った。ｄｄＨＢＢＡＳ３アッセイ配列を表６に提供する。Ｐ−アクチン、ＡＣＴＢ（Ｈｓ  ９９９９９９０３＿ｍ１）を、プライマーとＦＡＭ−ＭＧＢＮＦＱプローブの２０ｘプレミックスとして購入した（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。１×ｄｄＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、関連するプライマーおよびプローブ（ＡＣＴＢプライマーおよびプローブにつき、それぞれ９００ｎＭおよび２５０ｎＭ；ｄｄＨＢＢＡＳ３プライマーおよびプローブにつき５００ｎＭおよび１００ｎＭ）、ならびに１μｌのｃＤＮＡを含む体積２０μｌの反応混合物を調製した。Ｈｉｎｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８３（２２）：８６０４−８６１０に記載される通りに液滴発生を行った。次いで、マルチチャネルピペットを用いて液滴エマルションを９６ウェルプロピレンプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に移し、ホイルで加熱密封し、従来のサーマルサイクラー（Ｔ１００  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で増幅させた。サーマルサイクル条件は、９５℃で１０分、９４℃で３０秒、および６０℃で１分（５５サイクル）、９８℃で１０分（１サイクル）、ならびに１２℃で保持から構成されていた。ＰＣＲの後、９６ウェルプレートをＤｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒとともに提供されるＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてｄｄＰＣＲデータの取得および分析を行った。ＨＢＢＡＳ３の濃度（コピー数／μｌ）をＡＣＴＢの濃度で除し、ＶＣ／細胞に正規化することにより、ＨＢＢＡＳ３／ＡＣＴＢの相対的な発現を算出した。
【０１８２】
本明細書に記載される実施例および実施形態は、例示目的のためであるに過ぎず、それらに関する種々の修正または変更が当業者に提案され、本明細書の主旨および範囲内、ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることを理解されたい。本明細書に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照により、それらの内容全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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