(57)【要約】  アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）由来の真菌αアミラーゼが提供される（ＡｃＡｍｙ１）。ＡｃＡｍｙ１は、最適ｐＨ  ４．５を有し、３０〜７５℃で作用可能であり、この酵素は、糖化反応において、グルコアミラーゼ及びイソアミラーゼと組み合わせて使用できる。これにより、ｐＨ及び温度がαアミラーゼ又はグルコアミラーゼの使用に最適となるよう再調節されなければならないバッチプロセスとして糖化反応を実施する必要がなくなる。また、ＡｃＡｍｙ１は、デンプン基質のオリゴ糖組成物への糖化を触媒し、このオリゴ糖組成物では、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）由来のαアミラーゼにより触媒される糖化生成物と比較して、ＤＰ２及び（ＤＰ１＋ＤＰ２）が著しく富化されている。これにより、例えば、同時糖化発酵プロセスにおける発酵微生物によるオリゴ糖組成物の利用が促進される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンプンを含む組成物を糖化して、グルコースを含む組成物を生産する方法であって、
（ｉ）デンプンを含む前記組成物を、イソアミラーゼ、及びα−アミラーゼ活性を有し、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体と接触させることと、
（ｉｉ）デンプンを含む前記組成物を糖化させて、グルコースを含む前記組成物を生産することと、を含み、前記イソアミラーゼ、及び前記単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、前記デンプン組成物のグルコースへの前記糖化を触媒する、方法。
【請求項２】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、同一条件下で、同量の残留デンプンを減少させるために、ＡｋＡＡの添加量の約１７％〜５０％、又は場合により約１７％〜３４％で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記糖化により、残留デンプンが、同一条件下で前記イソアミラーゼ及びＡｋＡＡにより糖化を実施した場合と比較して約５％〜１２％低減されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、同一条件下で、同量のＤＰ３＋を減少させるために、ＡｋＡＡの添加量の約１７％〜５０％、又は場合により約１７％〜３４％で添加される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、同一条件下で、同量のエタノール収率をもたらすために、ＡｋＡＡの添加量の約１７％〜５０％、又は場合により約１７％〜３４％で添加される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
グルコースを含む前記組成物が、同一の条件下でＡｋＡＡと前記イソアミラーゼとにより生産されたグルコースを含む第２の組成物と比較して、ＤＰ１、ＤＰ２、又は（ＤＰ１＋ＤＰ２）を富化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量の残留デンプンを減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１添加量の約５０％で添加され、かつ場合により、前記イソアミラーゼが、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で同量の残留デンプンを減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約２０％で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のＤＰ３＋を減少させるのに必要とされる前記ＡｃＡｍｙ１の前記添加量の約５０％で添加され、かつ場合により、前記イソアミラーゼが、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のＤＰ３＋を減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１添加量の約２０％で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のエタノール収率をもたらすのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の前記添加量の約５０％で添加され、かつ場合により、前記イソアミラーゼが、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のエタノール収率をもたらすのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約２０％で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６、又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６、又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６、又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７からなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
デンプンを含む前記組成物が、液化デンプン、糊化デンプン、又は粒状デンプンを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
糖化が約３０℃〜約７５℃の温度範囲で実施される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記温度範囲が、４７℃〜７４℃である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
糖化が、ｐＨ  ２．０〜ｐＨ  ７．５のｐＨ範囲で実施される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｐＨ範囲が、ｐＨ  ３．５〜ｐＨ  ５．５である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｐＨ範囲が、ｐＨ  ４．０〜ｐＨ  ５．０である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記グルコース組成物を発酵させて、発酵終了（ＥＯＦ）産物を生産することを更に含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記発酵が、同時糖化発酵（ＳＳＦ）反応である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記発酵が、ｐＨ  ２〜８、２５℃〜７０℃の温度範囲にて２４〜７０時間実施される、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＥＯＦ産物が、エタノールを含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＥＯＦ産物が、８（体積／体積）％〜１８（体積／体積）％のエタノールを含む、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法が、マッシュ及び／又は糖化液を、前記イソアミラーゼ、及び前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体と接触させることを更に含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が、
（ａ）マッシュを準備する工程と、
（ｂ）前記マッシュを濾過して糖化液を得る工程と、
（ｃ）前記糖化液を発酵させて発酵飲料を得る工程と、を更に含み、
ここで、イソアミラーゼ、及びＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、
（ｉ）工程（ａ）の前記マッシュ、及び／又は
（ｉｉ）工程（ｂ）の前記糖化液、及び／又は
（ｉｉｉ）工程（ｃ）の前記糖化液に加えられる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＥＯＦ産物が、代謝産物を含む、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記代謝産物が、クエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコδ−ラクトン、エリトルビン酸ナトリウム、ω  ３脂肪酸、ブタノール、アミノ酸、リジン、イタコン酸、１，３−プロパンジオール、又はイソプレンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
グルコアミラーゼ、ヘキソキナーゼ、キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、トレハラーゼ、イソアミラーゼ、酸化還元酵素、エステラーゼ、トランスフェラーゼ、ペクチナーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、リアーゼ、加水分解酵素、又はこれらの組み合わせを前記デンプン組成物に添加することを更に含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記グルコアミラーゼが、０．１〜２グルコアミラーゼユニット（ＧＡＵ）／ｇ（ｄｓ）の添加量で加えられる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記グルコアミラーゼが、約４９．４μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）の添加量で加えられる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記イソアミラーゼが、約０．６３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）〜約１．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）の添加量で加えられる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、宿主細胞により発現及び分泌される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記宿主細胞が、前記イソアミラーゼを更に発現及び分泌する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
デンプンを含む前記組成物を、前記宿主細胞と接触させる、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記宿主細胞が、更にグルコアミラーゼを発現及び分泌する、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記宿主細胞が、前記グルコース組成物を発酵させ得るものである、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１の方法により生産されたグルコースを含む組成物。
【請求項３９】
請求項１の方法により生産された液化デンプン。
【請求項４０】
請求項２０〜３７のいずれか一項に記載の方法により生産された発酵飲料。
【請求項４１】
デンプンを含む組成物の糖化に使用するための組成物であって、イソアミラーゼ、及びα−アミラーゼ活性を有し（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を含む、組成物。
【請求項４２】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対して少なくとも９０％、９５％、又は９９％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７からなる、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記組成物が、培養された細胞材料である、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記組成物が、グルコアミラーゼを更に含む、請求項４１〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が精製される、請求項４１〜４５、及び４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が宿主細胞により発現及び分泌される、請求項４１〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記宿主細胞が、糸状真菌細胞である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記宿主細胞が、アスペルギルス種（Aspergillus sp.）又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）細胞である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５２】
グルコースを含む組成物の生産における、請求項１〜５１のいずれか一項に記載のＡｃＡｍｙ１又はその変異体の使用。
【請求項５３】
液化デンプンの生産における、請求項１〜５１のいずれか一項に記載のＡｃＡｍｙ１又はその変異体の使用。
【請求項５４】
発酵飲料の生産における、請求項１〜５１のいずれか一項に記載のＡｃＡｍｙ１又はその変異体の使用。
【請求項５５】
前記発酵飲料又は最終発酵産物が、
ｉ）麦芽のみのビール、「ビール純粋令」下で醸造されたビール、エール、ＩＰＡ、ラガー、ビター、発泡酒（第２のビール）、第３のビール、ドライビール、ニア・ビール、ライト・ビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボック・ビール、スタウト、モルト・リカー、ノンアルコールビール、及びノンアルコールモルト・リカーからなる群から選択されるビール、並びに
ｉｉ）果実フレーバーの麦芽汁飲料、蒸留酒フレーバーの麦芽汁飲料、及びコーヒーフレーバーの麦芽汁飲料酒からなる群から選択される穀草又は麦芽汁飲料、からなる群から選択される、請求項２０〜３４のいずれか一項に記載の方法、請求項４５に記載の発酵飲料、又は請求項４９に記載の使用。
【請求項５６】
食品組成物の生産方法であって、
（ｉ）１種以上の食品原料と、
（ｉｉ）α−アミラーゼ活性を有し、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６、又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とを組み合わせることを含み、
ここで、前記単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、前記食品原料中に存在するデンプン成分の前記加水分解を触媒してグルコースを生成する、方法。
【請求項５７】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、同一条件下で、同量の残留デンプンを減少させるために、ＡｋＡＡの前記添加量の約１７％〜５０％、又は場合により約１７％〜３４％で添加される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、同一の条件下で、同量のＤＰ３＋を減少させるために、ＡｋＡＡの前記添加量の約１７％〜５０％、又は場合により約１７％〜３４％で添加される、請求項５６又は５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記食品組成物が、同一の条件下でＡｋＡＡと前記イソアミラーゼとにより生産された第２の食品組成物と比較して、ＤＰ１、ＤＰ２、又は（ＤＰ１＋ＤＰ２）を富化されている、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のデンプン成分を減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約５０％で添加され、かつ場合により、前記イソアミラーゼは、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のデンプン成分を減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約２０％で添加される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のＤＰ３＋を減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約５０％で添加され、かつ場合により、前記イソアミラーゼは、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のＤＰ３＋を減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約２０％で添加される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のエタノール収率をもたらすのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の前記添加量の約５０％で添加され、かつ場合により、前記イソアミラーゼは、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のエタノール収率をもたらすのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約２０％で添加される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６、又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５６〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６、又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項５６〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７からなる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記食品組成物が、食品、焼成組成物、食品添加物、動物性食品、飼料、飼料添加物、油、肉、及びラードからなる群から選択される、請求項５９〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記１種以上の食品原料が、焼成原材料又は添加剤を含む、請求項５９〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記１種以上の食品原料が、製粉穀物、抗劣化アミラーゼ、ホスホリパーゼ、リン脂質、マルトース生成αアミラーゼ、又はマルトース生成性αアミラーゼ活性を有するその変異体、ホモログ、若しくは突然変異体、パン用キシラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８）、及びリパーゼからなる群から選択される、請求項５６〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記１種以上の食品原料が、
（ｉ）バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）由来のマルトース生成αアミラーゼ、
（ｉｉ）バチルス（Bacillus）、アスペルギルス（Aspergillus）、サーモミセス（Thermomyces）又はトリコデルマ（Trichoderma）由来のものであるベーカリー用キシラナーゼ、
（ｉｉｉ）フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）由来のグリコリパーゼ、からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記食品組成物が、ドウ又はドウ生成物を含み、好ましくは、加工されたドウ生成物を含む、請求項５６〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記食品組成物を焼成して焼成製品を生産することを含む、請求項５６〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記方法が、
（ｉ）デンプン媒質を準備すること、
（ｉｉ）前記デンプン媒質に前記イソアミラーゼ及び前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を加えること、及び
（ｉｉｉ）工程（ｂ）の間又は後に前記デンプン媒質に熱を加えて、ベーカリー用生成物を生産すること、を更に含む、請求項５６〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
食品組成物の生産に使用するための組成物であって、イソアミラーゼ、及びα−アミラーゼ活性を有し（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体と、１種以上の食品原料とを含む、組成物。
【請求項７５】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対して少なくとも９０％、９５％、又は９９％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７を含む、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７８】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７からなる、請求項７７に記載の組成物。
【請求項７９】
食品組成物の調製における請求項７４〜７８のいずれか一項に記載のイソアミラーゼ、及びＡｃＡｍｙ１又はその変異体の使用。
【請求項８０】
前記食品組成物が、ドウ又はドウ生成物を含み、好ましくは、加工されたドウ生成物を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記食品組成物が、ベーカリー組成物である、請求項７９又は８０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８２】
前記ドウ生成物の劣化、好ましくは、前記ドウ生成物の有害な老化を遅延又は減少させるための、ドウ生成物における請求項７４〜７８のいずれか一項に記載のイソアミラーゼ、及びＡｃＡｍｙ１又はその変異体の使用。
【請求項８３】
洗濯物、食器類、又は織物類からデンプン性の染みを除去する方法であって、前記洗濯物、前記食器類、又は前記織物類の表面を、有効な量のイソアミラーゼ、及びα−アミラーゼ活性を有し（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を含む水性組成物の存在下でインキュベートすること、並びに前記イソアミラーゼ、及び前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体に、前記デンプン性の染み中に存在するデンプン成分を加水分解させて、前記水性組成物に溶解するデンプン由来のより小さな分子を生成すること、並びに前記表面をすすぎ洗いすることにより前記デンプン性の染みを前記表面から除去すること、を含む、方法。
【請求項８４】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、同一条件下で、同量の残留デンプンを減少させるために、ＡｋＡＡの添加量の約１７％〜５０％、又は場合により約１７％〜３４％で添加される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、同一の条件下で、同量のＤＰ３＋を減少させるために、ＡｋＡＡの添加量の約１７％〜５０％、又は場合により約１７％〜３４％で添加される、請求項８３又は８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記デンプン由来分子が、同一の条件下でＡｋＡＡと前記イソアミラーゼにより生産されるデンプン由来分子と比較して、ＤＰ１、ＤＰ２、又は（ＤＰ１＋ＤＰ２）に富む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のデンプン成分を減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約５０％で添加され、かつ場合により、前記イソアミラーゼは、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のデンプン成分を減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約２０％で添加される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のＤＰ３＋を減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約５０％で添加され、かつ場合により、前記イソアミラーゼは、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のＤＰ３＋を減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約２０％で添加される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のエタノール収率をもたらすのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約５０％で添加され、かつ場合により、前記イソアミラーゼは、前記イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のエタノール収率をもたらすのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約２０％で添加される、請求項８３に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６、又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６、又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６、又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７からなる、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
洗濯物、食器類、又は織物類からのデンプン性の染みの除去に使用するための組成物であって、イソアミラーゼ、及びα−アミラーゼ活性を有し（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体と、界面活性剤とを含む、組成物。
【請求項９５】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対して少なくとも９０％、９５％、又は９９％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９６】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７を含む、請求項９５に記載の組成物。
【請求項９７】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９８】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７からなる、請求項９７に記載の組成物。
【請求項９９】
前記組成物が、洗濯洗剤、洗濯洗剤添加剤、又は手洗い用若しくは自動食器洗い洗剤である、請求項９４〜９８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１００】
織物を湯通しする方法であって、前記織物を湯通しするのに十分な時間にわたって湯通し組成物を織物と接触させること、ここで、該湯通し組成物は、イソアミラーゼ、及びα−アミラーゼ活性を有し（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を含むものであり、並びに前記イソアミラーゼ、及び前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を前記デンプン性の染み中に存在するデンプン成分に湯通しさせて、前記水性組成物に溶解するデンプン由来のより小さな分子を生成すること、並びに前記表面をすすぎ洗いすることにより前記表面から前記デンプン性の染みを除去すること、を含む、方法。
【請求項１０１】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、同一条件下で、同量の残留デンプンを減少させるために、ＡｋＡＡの添加量の約１７％〜５０％、又は場合により約１７％〜３４％で添加される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、同一の条件下で、同量のＤＰ３＋を減少させるために、ＡｋＡＡの添加量の約１７％〜５０％、又は場合により約１７％〜３４％で添加される、請求項１００又は１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記デンプン由来分子が、同一の条件下でＡｋＡＡと前記イソアミラーゼにより生産されるデンプン由来分子と比較して、ＤＰ１、ＤＰ２、又は（ＤＰ１＋ＤＰ２）を富化される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量の残留デンプンを減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約５０％で添加され、かつ場合により、前記イソアミラーゼは、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量の残留デンプンを減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約２０％で添加される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のＤＰ３＋を減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約５０％で添加され、かつ場合により、前記イソアミラーゼは、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のＤＰ３＋を減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約２０％で添加される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のエタノール収率をもたらすのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約５０％で添加され、かつ場合により、前記イソアミラーゼは、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のエタノール収率をもたらすのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約２０％で添加される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６、又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１００〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６、又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７を含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１００〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ＡｃＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７からなる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
織物の湯通しにおける、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を含む湯通し組成物の使用。
【請求項１１２】
グルコアミラーゼ、ヘキソキナーゼ、キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、トレハラーゼ、イソアミラーゼ、酸化還元酵素、エステラーゼ、トランスフェラーゼ、ペクチナーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、リアーゼ、加水分解酵素、又はこれらの組み合わせを、前記単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体に加えることを更に含む、請求項５６〜７３、７９〜９３、及び１００〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記グルコアミラーゼが、０．１〜２グルコアミラーゼユニット（ＧＡＵ）／ｇ（ｄｓ）の添加量で加えられる、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記グルコアミラーゼが、約４９．４μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）の添加量で加えられる、請求項１１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願特許第６１／６８３，９６５号（２０１２年８月１６日出願）に対する利益を主張し、該特許文献は、参照によりその全体を本願に援用する。
【０００２】
配列表
配列番号１〜１３を含む配列表を添付し、その全体が参照により本出願に援用される。
【０００３】
（発明の分野）
（１）イソアミラーゼ、及び（２）アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）由来のαアミラーゼ（ＡｃＡｍｙ１）又はその変異体を、デンプンの糖化、例えば、同時糖化発酵（ＳＳＦ）に使用する方法。
【背景技術】
【０００４】
デンプンはアミロース（１５〜３０（重量／重量％））及びアミロペクチン（７０〜８５（重量／重量％））の混合物から構成される。アミロースは、約６０，０００〜約８００，０００の分子量（ＭＷ）を有するα−１，４−結合型グルコース単位の線状鎖から構成される。アミロペクチンはグルコース単位２４〜３０個毎にα−１，６分岐点を含有する分岐状ポリマーであり、その分子量は１００×１０６にも達し得る。
【０００５】
現在、デンプン由来の糖を濃縮デキストロースシロップ形態で製造する際には、酵素により触媒されるプロセス：（１）αアミラーゼによる、固体デンプンのデキストリン（平均重合度約７〜１０）への液化（又は減粘）、並びに（２）アミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ又はＧＡとも呼ばれる）による、得られた液化デンプン（すなわち、デンプン加水分解産物）の糖化、が包含される。得られるシロップは高グルコース含量を有する。市販のグルコースシロップの多くは、続いて酵素により、イソシロップとして知られるブドウ糖／フルクトース混合物へと異性化される。得られたシロップを酵母などの微生物により発酵させて、最終産物を生成することもできる。最終産物はアルコール、又は場合によりエタノールとすることができる。最終産物は、有機酸、アミノ酸、バイオ燃料、並びに、エタノール、クエン酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、イタコン酸及びその他のカルボン酸、グルコδ−ラクトン、エリトルビン酸ナトリウム、リジン、ω  ３脂肪酸、ブタノール、イソプレン、１，３−プロパンジオール、及びバイオディーゼルが挙げられるがこれらに限定されないその他のバイオケミカルとすることもできる。発酵及び糖化を同時に実施することで（すなわち、ＳＳＦプロセス）、経済性と効率性を向上させることができる。
【０００６】
αアミラーゼは、デンプン、グリコーゲン、及び関連する多糖類の、内部のα−１，４−グルコシド結合をランダムに切断し、加水分解する。特にバチルス（Bacilli）由来のαアミラーゼは、デンプンの液化及び糖化、織物の湯通し、紙パルプ工業におけるデンプンの変性、醸造、焼成、食品工業用シロップの生産、発酵プロセス用フィードストックの生産、及び動物用飼料においては消化性の向上などの、多様な異なる目的で使用されてきた。これらの酵素は、食器洗い及び洗濯中にデンプン質の汚れ及び染みを除去するために使用することもできる。
【０００７】
Ａ．クラバタス（A. clavatus）を含む複数のアスペルギルス（Aspergillus）種は、酸性条件下でも保有される強力なアミロース分解挙動を示す。Ｎａｈｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９５６年）「アスペルギルス（Aspergillus）属における分類研究。ＶＩＩＩ．アスペルギルス（Aspergillus）における形態学的特徴及びアミロース分解特性間の関連（Taxonomic studies on the genus Aspergillus. VIII. The relation between the morphological characteristics and the amylolytic properties in the Aspergillus）」Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ  ３４：３９１〜９９，４２３〜２８，４５７〜６３を参照されたい。Ａ．クラバタス（A. clavatus）は、例えば、複雑な多糖類を分解する酵素の中でも、この真菌に環境中の複雑な炭水化物を消化させ得るアミラーゼ活性酵素を分泌する。Ｏｇｕｎｄｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）「ナイジェリア養鶏飼料由来のアスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）毒素産生株の多糖類分解酵素（Polysaccharide degrading enzymes of a toxigenic strain of Aspergillus clavatus from Nigerian poultry feeds）」Ｄｉｅ  Ｎａｈｒｕｎｇ  １０：９９３〜１０００を参照されたい。Ａ．クラバタス（A. clavatus）の粉砕飼料分解能に対するｐＨ作用を測定した所、Ａ．クラバタス（A. clavatus）は、試験した３．２〜７．８の全てのｐＨ値にわたって飼料を分解した。Ｏｇｕｎｄｅｒｏ（１９８７）「毒性真菌及びナイジェリア養鶏飼料の変質（Toxigenic fungi and the deterioration of Nigerian poultry feeds）」Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａ  １００：７５〜８３を参照されたい。最新の研究では、Ａ．クラバタス（A. clavatus）をトウモロコシ酵母エキス培地又は小麦酵母エキス培地で増殖させた場合、Ａ．クラバタス（A. clavatus）のアミラーゼ活性はｐＨ  ７〜８で最大であることを示している。Ａｄｉｓａ（１９９４）「収穫後トウモロコシ及び小麦粒の真菌叢並びにカビ類によるそれらの汚染の意味（Mycoflora of post−harvest maize and wheat grains and the implications of their contamination by molds）」Ｄｉｅ  Ｎａｈｒｕｎｇ  ３８（３）：３１８〜２６。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）由来のαアミラーゼ（ＡｃＡｍｙ１）は、適温及び酸性ｐＨにて長期にわたって糖化を触媒する。アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）ＮＲＲＬ１（配列番号１）由来の既知のαアミラーゼ、αアミラーゼ変異体、コード核酸、及びポリヌクレオチドを発現する宿主の例を提供する。ＡｃＡｍｙ１は酸性の作用範囲を有し、同時糖化発酵（ＳＳＦ）において、例えば、特にグルコアミラーゼと組み合わせて使用した場合に、高エタノール収率及び低残留デンプンに寄与する。Ａｄｉｓａ（１９９４）は、Ａ．クラバタス（A. clavatus）アミラーゼ活性は２５〜３０℃下ではｐＨ  ７〜８で最大になると報告しているが、ＡｃＡｍｙ１の最適ｐＨは５０℃下ではｐＨ  ４．５である。ＡｃＡｍｙ１は高温及び低ｐＨ下で高活性を示すため、ＡｃＡｍｙ１は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ（ＡｎＧＡ）又はトリコデルマ（Trichoderma）グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）などの真菌グルコアミラーゼの存在下での糖化プロセスにおいて効率的に使用することができる。ＡｃＡｍｙ１は、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）αアミラーゼ（ＡｋＡＡ）により触媒される糖化産物と比較して、ＤＰ１及びＤＰ２（すなわち、グルコース及びマルトース）に著しく富むオリゴ糖組成物へのデンプン糖化を有利に触媒する。ＡｃＡｍｙ１をＡｋＡＡよりも少量で使用し、同程度の量のエタノールを産生することもできる。ＡｃＡｍｙ１は、植物（例えば、穀草及び穀物）由来の酵素と組み合わせて使用することができる。ＡｃＡｍｙ１は、宿主細胞により分泌される、又は宿主細胞にとって内因性の酵素と組み合わせて使用することもできる。例えば、ＡｃＡｍｙ１は、１つ以上のアミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、フィターゼ、エステラーゼ、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、又はその他の酵素が産生宿主により分泌されている間に、発酵又はＳＳＦプロセスに加えることができる。ＡｃＡｍｙ１は、内因的に、非分泌的に生産される宿主酵素と組み合わせて作用させることもできる。別の例では、ＡｃＡｍｙ１は、発酵又はＳＳＦ中に、産生宿主細胞により単独で、又はその他の酵素とともに分泌させることができる。ＡｃＡｍｙ１アミラーゼは、基質の糊化温度未満の反応温度で、シロップ及び／又はバイオケミカル（例えば、アルコール、有機酸、アミノ酸、その他のバイオケミカル及びバイオマテリアル）用のデンプンを直接加水分解するのにも有効であり得る。ＡｃＡｍｙ１は、発酵又はＳＳＦ中に、その他の酵素とともに宿主細胞により分泌され得る。
【０００９】
したがって、組成物を糖化する方法が提供され、組成物はグルコースを含む組成物を生産するためデンプンを含み、方法は、（ｉ）デンプンを含む組成物を、イソアミラーゼ、及びα−アミラーゼ活性を有しかつ（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体と接触させること、並びに（ｉｉ）デンプンを含む組成物を糖化させてグルコースを含む組成物を生成すること、を含み、イソアミラーゼ及び単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体の単体、又はその他の酵素との組み合わせは、デンプン組成物のグルコース、ＤＰ２、ＤＰ３、ＤＰ４などへの、又はその他のオリゴ糖類又は多糖類への糖化を触媒する。
【００１０】
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、同一の条件下で、同量の残留デンプンを減少させるために、ＡｋＡＡの添加量の約１７％〜５０％、又は場合により約１７％〜３４％で添加することができる。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、同一の条件下で、同量のＤＰ３＋を減少させるために、ＡｋＡＡの添加量の約１７％〜５０％、又は場合により約１７％〜３４％で添加することもできる。
【００１１】
一部の実施形態では、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、約１．７〜約１０μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）で添加される。更なる実施形態では、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、約１．７〜約６．６μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）で添加される。尚更なる実施形態では、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、約３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）で添加される。
【００１２】
グルコースを含む組成物は、同一の条件下でＡｋＡＡとイソアミラーゼとにより生成されたグルコースを含む第２の組成物と比較して、ＤＰ１、ＤＰ２、又は（ＤＰ１＋ＤＰ２）が富化されている。
【００１３】
一部の実施形態では、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量の残留デンプンを減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１添加量の約５０％で添加され、かつ場合により、イソアミラーゼは、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量の残留デンプンを減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１添加量の約２０％で添加される。更なる実施形態では、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のＤＰ３＋を減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約５０％で添加され、かつ場合により、イソアミラーゼは、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のＤＰ３＋を減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約２０％で添加される。尚更なる実施形態では、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のエタノール収率をもたらすのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約５０％で添加され、かつ場合により、イソアミラーゼは、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のエタノール収率をもたらすのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約２０％で添加される。
【００１４】
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６、又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。また、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７を含み得る。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり得る。また、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７からなり得る。
【００１５】
デンプン組成物は、液化デンプン、糊化デンプン、又は粒状デンプンを含み得る。糖化は、約３０℃〜約７５℃の温度範囲で実施することができる。温度範囲は、更に４７℃〜７４℃であってもよい。糖化は、ｐＨ  ２．０〜ｐＨ  ７．５のｐＨ範囲で実施することができる。ｐＨ範囲は、更にｐＨ  ３．５〜ｐＨ  ５．５であってもよい。ｐＨ範囲は、更にｐＨ  ３．５〜ｐＨ  ４．５であってもよい。
【００１６】
方法は、グルコース組成物を発酵させて発酵終了（ＥＯＦ）産物を産生させることを更に含む。発酵は同時糖化発酵（ＳＳＦ）反応であり得る。発酵は、ｐＨ  ２〜８、２５℃〜７０℃の温度範囲で２４〜７０時間実施することができる。ＥＯＦ産物は、８（体積／体積）％〜１８（体積／体積）％のエタノールを含み得る。ＥＯＦ産物は代謝産物を含み得る。最終産物はアルコール、又は場合によりエタノールであり得る。最終産物は、有機酸、アミノ酸、バイオ燃料、並びに、エタノール、クエン酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、イタコン酸及びその他のカルボン酸、グルコδ−ラクトン、エリトルビン酸ナトリウム、リジン、ω  ３脂肪酸、ブタノール、イソプレン、１，３−プロパンジオール、及びバイオディーゼルが挙げられるがこれらに限定されないその他のバイオケミカルでもあり得る。
【００１７】
発酵飲料の生産における、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼの使用も提供され、並びに発酵飲料の製造方法は、マッシュ及び／又は糖化液を、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼと接触させることを含み得る。発酵飲料の製造方法は、（ａ）マッシュを準備すること、（ｂ）マッシュを濾過して糖化液を得ること、並びに（ｃ）糖化液を発酵させて発酵飲料を得ること、を含んでよく、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼが、（ｉ）工程（ａ）のマッシュ及び／又は、（ｉｉ）工程（ｂ）の糖化液、及び／又は（ｉｉｉ）工程（ｃ）の糖化液に加えられる。本開示の方法により製造される発酵飲料も提供される。
【００１８】
発酵飲料又は最終発酵産物は、麦芽のみのビール（full malted beer）、「ビール純粋令」下で醸造されたビール、エール、ＩＰＡ、ラガー、ビター、発泡酒（第２のビール）、第３のビール、ドライビール、ニア・ビール、ライト・ビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボック・ビール、スタウト、モルト・リカー、ノンアルコールビール、及びノンアルコールモルト・リカーからなる群から選択されるビール、又は果実フレーバーの麦芽汁飲料、蒸留酒フレーバーの麦芽汁飲料、及びコーヒーフレーバーの麦芽汁飲料などの穀草若しくは麦芽飲料であり得る。
【００１９】
方法は、グルコアミラーゼ、トレハラーゼ、ヘキソキナーゼ、キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、プルラナーゼ、βアミラーゼ、ＡｃＡｍｙ１ではないαアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、イソアミラーゼ、酸化還元酵素、エステラーゼ、トランスフェラーゼ、ペクチナーゼ、αグルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、リアーゼ、又はその他の加水分解酵素、又はこれらの組み合わせをデンプン組成物に加えることを更に含む。例えばＰＣＴ公報ＷＯ  ２００９／０９９７８３号を参照されたい。グルコアミラーゼは０．１〜２グルコアミラーゼユニット（ＧＡＵ）／ｇ（ｄｓ）で加えてもよい。
【００２０】
宿主細胞により単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を発現及び分泌させてもよい。デンプン組成物を宿主細胞に接触させてもよい。宿主細胞に、グルコアミラーゼ及び／又はその他の酵素を更に発現及び分泌させることもできる。好ましい実施形態では、その他の酵素はイソアミラーゼである。宿主細胞には、更にグルコース組成物を発酵し得るものであってもよい。
【００２１】
したがって、デンプンを含む組成物の糖化に使用するための組成物が提供され、この組成物は、α−アミラーゼ活性を有し（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を含み得る。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり得る。
【００２２】
組成物は培養された細胞材料であってよい。組成物は、グルコアミラーゼを更に含み得る。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体及び／又はイソアミラーゼは精製されていてもよい。
【００２３】
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体及び／又はイソアミラーゼは、宿主細胞により発現及び分泌させることもできる。宿主細胞は、糸状真菌細胞、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞又は藻細であってよい。宿主細胞はアスペルギルス種（Aspergillus sp.）又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）細胞であってよい。
【００２４】
したがって、焼成される材料に焼成組成物を加えること、並びにこの材料を焼成して焼成製品を生産することを含む焼成方法が提供され、焼成組成物は、イソアミラーゼ、及びα−アミラーゼ活性を有し（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を含み、単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、材料中に存在するデンプン成分の加水分解を触媒して、デンプン由来のより小さな分子を生成する。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり得る。焼成組成物は、製粉穀物、抗劣化アミラーゼ、ホスホリパーゼ、及び／又はリン脂質を更に含み得る。
【００２５】
したがって、食品組成物の生産方法も提供され、方法は、（ｉ）１種以上の食品原料と、（ｉｉ）イソアミラーゼ、及びα−アミラーゼ活性を有し（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とを組み合わせることを含み、イソアミラーゼ及び単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、食品原料中に存在するデンプン成分の加水分解を触媒して、グルコースを生成する。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり得る。方法は、食品組成物を加熱して焼成製品を生産することを更に含み得る。方法は、（ｉ）デンプン媒質を準備すること、（ｉｉ）デンプン媒質にイソアミラーゼ及びＡｃＡｍｙ１、又はその変異体を加えること、並びに（ｉｉｉ）工程（ｂ）中又は後にデンプン媒質に熱を加えてベーカリー用生成物を生産すること、を更に含む。
【００２６】
食品組成物は、同一の条件下でＡｋＡＡとイソアミラーゼとにより生産される第２の焼成製品と比較して、ＤＰ１、ＤＰ２、又は（ＤＰ１＋ＤＰ２）が富化され得る。食品組成物は、食品、焼成組成物、食品添加物、動物性食品、飼料、飼料添加物、油、肉、及びラードからなる群から選択され得る。食品組成物は、ドウ又はドウ生成物を含んでよく、好ましくは加工されたドウ生成物を含み得る。
【００２７】
１種以上の食品原料は、焼成原材料又は添加剤を含み得る。１種以上の食品原料は、製粉穀物、抗劣化アミラーゼ、ホスホリパーゼ、リン脂質、マルトース生成αアミラーゼ、又はマルトース生成性αアミラーゼ活性を有するその変異体、ホモログ、若しくは突然変異体、パン用キシラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８）、及びリパーゼからなる群から選択されてもよい。１種以上の食品原料は、更に、（ｉ）バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）由来のマルトース生成αアミラーゼ、（ｉｉ）バチルス（Bacillus）、アスペルギルス（Aspergillus）、サーモミセス（Thermomyces）又はトリコデルマ（Trichoderma）由来のベーカリー用キシラナーゼ、（ｉｉｉ）フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）由来のグリコリパーゼ、からなる群から選択され得る。
【００２８】
したがって、食品組成物の生産に使用するための組成物も提供され、組成物は、イソアミラーゼ、及びα−アミラーゼ活性を有し（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体と、１種以上の食品原料とを含む。食品組成物の調製における請求項７４〜７８のいずれか一項に記載のイソアミラーゼ、及びＡｃＡｍｙ１又はその変異体の使用も提供される。食品組成物は、加工されたドウ生成物を含む、ドウ又はドウ生成物を含み得る。食品組成物はベーカリー組成物であってよい。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体をドウ生成物に使用して、ドウ生成物の劣化、好ましくは、有害な老化を遅延又は減少させることもできる。
【００２９】
したがって、洗濯物、食器類、又は織物類からデンプン性の染みを除去する方法が提供され、方法は、洗濯物、食器類、又は織物類の表面を、有効な量のイソアミラーゼ、及びα−アミラーゼ活性を有し（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を含む水性組成物の存在下でインキュベートすること、並びにイソアミラーゼ、及びＡｃＡｍｙ１又はその変異体に、デンプン性の染み中に存在するデンプン成分を加水分解させて、水性組成物に溶解するデンプン由来のより小さな分子を生成すること、並びに表面をすすぎ洗いすることによりデンプン性の染みを表面から除去すること、を含み得る。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６、又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなってよい。
【００３０】
したがって、洗濯物、食器類、又は織物類からのデンプン性の染みの除去に使用するための組成物が提供され、組成物は、イソアミラーゼ、及びα−アミラーゼ活性を有し（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体と、界面活性剤を含み得る。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６、又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなってよい。組成物は、洗濯洗剤、洗濯洗剤添加剤、又は手洗い若しくは自動食器洗い洗剤であってもよい。
【００３１】
したがって、織物を湯通しする方法も提供され、方法は、織物を湯通しするのに十分な時間にわたって湯通し組成物を織物と接触させること（湯通し組成物は、イソアミラーゼ、及びα−アミラーゼ活性を有し（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７に対し少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を含む）、並びにＡｃＡｍｙ１又はその変異体にデンプン性の染み中に存在するデンプン成分を湯通しさせて、水性組成物に溶解するデンプン由来のより小さな分子を生成すること、並びに表面をすすぎ洗いすることにより表面からデンプン性の染みを除去すること、を含む。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、（ａ）配列番号１の残基２０〜６３６、又は（ｂ）配列番号１の残基２０〜４９７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなってよい。
【００３２】
したがって、グルコース組成物の生産におけるイソアミラーゼ、及びＡｃＡｍｙ１又はその変異体の使用も提供される。本願の方法により生産されるグルコース組成物も提供される。液化デンプンの生産におけるイソアミラーゼ、及びＡｃＡｍｙ１又はその変異体の使用も更に提供される。本願の方法により調製される液化デンプンも開示される。
【００３３】
更に、イソアミラーゼ、及びＡｃＡｍｙ１又はその変異体を含み得る湯通し組成物の、織物の湯通しにおける使用、並びにＡｃＡｍｙ１又はその変異体を含む焼成組成物の、焼成製品の生産における使用が開示される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
添付の図面は、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成し、本願に開示される多様な方法及び組成物を例示する。図面は次の通りである。
【図１Ａ】ＡｃＡｍｙ１の触媒コア、リンカー領域、及び炭水化物結合ドメイン（それぞれ、配列番号１の残基２０〜４９７、４９８〜５２８、及び５２９〜６３６）、又は全長と、Ｔ．スティピタトゥス（T. stipitatus）ＡＴＣＣ  １０５００（それぞれ配列番号４の残基２０〜４９７及び５２０〜６２７）、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）ＦＧＳＣ  Ａ４（それぞれ配列番号５の残基２０〜４９７及び５１６〜６２３）、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆ２９３（それぞれ配列番号１２の残基２４〜５０２及び５２３〜６３０）、並びにＡ．テレウス（A. terreus）ＮＩＨ２６２４（それぞれ配列番号１３の残基２１〜４９７及び５００〜６０７）の由来のαアミラーゼの相当する残基とのＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを示す。図１中アスタリスクにより記される残基は、配列番号４〜５及び１２〜１３中に保存されている残基に相当するＡｃＡｍｙ１残基である。
【図１Ｂ】ＡｃＡｍｙ１の触媒コア、リンカー領域、及び炭水化物結合ドメイン（それぞれ、配列番号１の残基２０〜４９７、４９８〜５２８、及び５２９〜６３６）、又は全長と、Ｔ．スティピタトゥス（T. stipitatus）ＡＴＣＣ  １０５００（それぞれ配列番号４の残基２０〜４９７及び５２０〜６２７）、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）ＦＧＳＣ  Ａ４（それぞれ配列番号５の残基２０〜４９７及び５１６〜６２３）、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆ２９３（それぞれ配列番号１２の残基２４〜５０２及び５２３〜６３０）、並びにＡ．テレウス（A. terreus）ＮＩＨ２６２４（それぞれ配列番号１３の残基２１〜４９７及び５００〜６０７）の由来のαアミラーゼの相当する残基とのＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを示す。図１中アスタリスクにより記される残基は、配列番号４〜５及び１２〜１３中に保存されている残基に相当するＡｃＡｍｙ１残基である。
【図２】ＡｃＡｍｙ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むｐＪＧ１５３発現ベクターのマップを示す。ｐＪＧ１５３（Ｔｅｘ３ｇＭ−ＡｃＡｍｙ１）。
【図３Ａ】アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）αアミラーゼ（ＡｋＡＡ）のα−アミラーゼ活性（相対ユニット）のｐＨ依存性を示す。
【図３Ｂ】ＡｃＡｍｙ１のα−アミラーゼ活性（相対ユニット）のｐＨ依存性を示す。α−アミラーゼ活性は、２ｐｐｍ（酵素）とし、５０℃下でジャガイモアミロペクチン基質から還元糖を放出させることにより分析した。
【図４Ａ】ＡｋＡＡのα−アミラーゼ活性（相対ユニット）の温度依存性を示す。
【図４Ｂ】ＡｃＡｍｙ１のα−アミラーゼ活性（相対ユニット）の温度依存性を示す。α−アミラーゼ活性は２ｐｐｍ（酵素）とし、ｐＨ  ４．０（ＡｋＡＡ）又はｐＨ  ４．５（ＡｃＡｍｙ１）下でジャガイモアミロペクチン基質から還元糖を放出させることにより分析した。
【図５Ａ】記載の時間ｐＨ  ３．５又は４．８でインキュベートした後のＡｋＡＡの残存α−アミラーゼ活性（相対ユニット）を示す。
【図５Ｂ】ｐＨ  ３．５又は４．８で記載の時間に関し、ＡｃＡｍｙ１の残存α−アミラーゼ活性（相対ユニット）を示す。α−アミラーゼ活性は２ｐｐｍ（酵素）とし、ジャガイモアミロペクチン基質から還元糖を放出させることにより分析した。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）（ＡｃＡｍｙ１）由来の真菌αアミラーゼが提供される。ＡｃＡｍｙ１はｐＨ  ４．５に最適ｐＨを有し、ｐＨ  ３〜ｐＨ  ７の範囲にわたって少なくとも７０％活性を有する。酵素は６６℃に最適温度を有し、ｐＨ  ４．５で試験した場合に、４７°〜７４℃の温度範囲にわたって少なくとも７０％活性を有する。これらの特性により、酵素を、同一の反応条件下でグルコアミラーゼ及び／又はその他の酵素と組み合わせて使用することが可能になる。好ましい実施形態では、その他の酵素はイソアミラーゼである。これにより、ｐＨ及び温度がαアミラーゼ又はグルコアミラーゼの使用に最適となるよう調節されなければならないバッチプロセスとして糖化反応を実施する必要がなくなる。
【００３６】
ＡｃＡｍｙ１及びイソアミラーゼもデンプンを含む組成物のグルコースへの糖化を触媒する。例えば、ＤＰ７、アミロペクチン、又はマルトデキストリン基質を使用し、５０℃、ｐＨ  ５．３にて２時間の糖化後、オリゴ糖組成物が生成される。組成物は、同一の条件下でイソアミラーゼ及びＡｋＡＡにより触媒される糖化産物と比較して、ＤＰ１、ＤＰ２、及び（ＤＰ１＋ＤＰ２）が富化されている。これにより、例えばＳＳＦプロセスにおいて、発酵生物によるオリゴ糖組成物の利用が促進される。この役割において、ＡｃＡｍｙ１は、より少量の酵素添加によりＡｋＡＡと同様のエタノール収率をもたらしつつ、不溶性残留デンプンは減少させ、不溶性残留デンプンが最終産物の品質に及ぼす何らかの悪影響は最小限に抑える。
【００３７】
一部の実施形態では、イソアミラーゼの存在下で、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量の残留デンプンを減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１添加量の約５０％で添加され、かつ場合により、イソアミラーゼは、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量の残留デンプンを減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１添加量の約２０％で添加される。更なる実施形態では、イソアミラーゼの存在下で、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のＤＰ３＋を減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１添加量の約５０％で添加され、かつ場合により、イソアミラーゼは、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のＤＰ３＋を減少させるのに必要とされるＡｃＡｍｙ１添加量の約２０％で添加される。尚更なる実施形態では、イソアミラーゼの存在下で、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のエタノール収率をもたらすのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約５０％で添加され、かつ場合により、イソアミラーゼは、イソアミラーゼの非存在下、同一の条件下で、同量のエタノール収率をもたらすのに必要とされるＡｃＡｍｙ１の添加量の約２０％で添加される。
【００３８】
ＡｃＡｍｙ１及びそれらのアミラーゼ変異体に代表的な用途は、デンプン糖化プロセス、例えば、織物の加工（例えば、湯通し）の際に、洗濯物、食器類、及びその他の表面を洗浄するための洗剤組成物などの、洗浄組成物を調製するＳＳＦプロセスにおけるものである。
【００３９】
１．用語の定義及び略号
この発明を実施するための形態に従い、以下の略記及び定義が適用される。単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他のことを指し示していない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば「酵素」という場合には、複数のこうした酵素が含まれ、「添加量」という場合には、当業者には周知の１つ以上の添加量及びその等価物などが含まれる。
【００４０】
特に定義されない限りは、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はいずれも、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。以下の用語を下記に示す。
【００４１】
１．１．略語及び頭字語
以下の省略形／頭字語は、特に定めのない限り、以下の意味を有する。
【００４２】
【表１−１】
2015534456.tif 000003
【００４３】
【表１−２】
2015534456.tif 000004
【００４４】
１．２．用語の定義
用語「アミラーゼ」又は「アミロース分解酵素」は、とりわけデンプンの分解を触媒し得る酵素を指す。αアミラーゼは、デンプン中のα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グルコシド結合を切断する加水分解酵素である。一般的に、αアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１；α−Ｄ−（１→４）−グルカングルカノヒドロラーゼ）は、デンプン分子内部のα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グルコシド結合をランダムに切断して、（１〜４）−α−結合型Ｄ−グルコース単位を３つ以上含有する多糖類を生成するエンド作用型酵素として定義される。対照的に、エキソ作用型アミロース分解酵素、例えば、βアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２；α−Ｄ−（１→４）−グルカンマルトヒドロラーゼ）及びいくつかのマルトース生成αアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３３）のような生成物特異的アミラーゼなどは、基質の非還元末端から多糖分子を切断する。βアミラーゼ、α−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０；α−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ）、グルコアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３；α−Ｄ−（１→４）−グルカングルコヒドロラーゼ）、及びマルトテトラオシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６０）及びマルトヘキサオシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９８）などの生成物特異的アミラーゼは、特定の長さのマルト−オリゴ糖類、又は特定のマルトオリゴ糖類の富化シロップを生成し得る。
【００４５】
用語「プルラナーゼ」（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４１、プルラン６−グルカノヒドロラーゼ）は、アミロペクチン中に存在するα−１，６−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒し得る酵素のクラスを指す。プルラナーゼはプルラン中に存在するα−１，６−Ｄ−グルコシド結合を加水分解して、三糖類のマルトトリオースを生成する。
【００４６】
本明細書で使用するとき、用語「イソアミラーゼ」は、デンプン、グリコーゲン、アミロペクチン、グリコーゲン、β−限界デキストリン、及びそれらに由来するオリゴ糖類のα−１，６−Ｄ−グルコシド結合を加水分解し得る脱分岐酵素（Ｅ．Ｃ．３．２．１．６８）を指す。イソアミラーゼはプルランを加水分解しない。
【００４７】
本明細書で使用するとき、「酵素ユニット」は、特定条件のアッセイ下で、時間あたりに生成される生成物量を指す。例えば、「グルコアミラーゼ活性ユニット」（ＧＡＵ）は、６０℃、ｐＨ  ４．２にて、可溶性デンプン基質（４％  ＤＳ）から１時間当たり１ｇのグルコースを生成する酵素量として定義される。「可溶性デンプンユニット」（ＳＳＵ）は、ｐＨ  ４．５、５０℃にて、可溶性デンプン基質（４％  ＤＳ）から１分当たり１ｍｇのグルコースを生成する酵素量である。ＤＳは「乾燥固体」を意味する。
【００４８】
本明細書で使用するとき、用語「デンプン」とは、アミロース及びアミロペクチンで構成され、化学式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘを有し、ここでＸが任意の数字であり得る、植物の複合多糖炭水化物からなる材料を指す。この用語は、穀物、穀草、草、塊茎及び根などの植物性材料を含み、より具体的には、小麦、大麦、トウモロコシ、ライ麦、米、サトウモロコシ、ふすま、キャッサバ、アワ、ジャガイモ、サツマイモ、及びタピオカから得られた材料を含む。用語「デンプン」は、粒状デンプンを含む。用語「粒状デンプン」は、未加工の、すなわち加熱調理されていないデンプン、例えば、糊化を受けていないデンプンを指す。
【００４９】
ポリペプチドに関し、「野生型」、「親」、又は「参照」なる用語は、１つ以上のアミノ酸位置において人工的な置換、挿入、又は欠失を有さない、天然型ポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関し、「野生型」、「親」、又は「参照」なる用語は、人工的なヌクレオシドの変化を有さない、天然型ポリヌクレオチドを指す。しかしながら、野生型、親又は参照ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは天然型ポリヌクレオチドに限定されず、野生型、親又は参照ポリペプチドをコード化するあらゆるポリヌクレオチドが含まれる。
【００５０】
野生型タンパク質の参照には、成熟型のタンパク質が包含されると解釈される。「成熟」ポリペプチドは、シグナル配列が取り除かれているＡｃＡｍｙ１ポリペプチド又はこれらの変異体を意味する。例えば、シグナル配列は、ポリペプチドの発現中に切除され得る。成熟ＡｃＡｍｙ１は、配列番号１の、Ｎ末端から数えて２０〜６３６番目にあたり、長さにしてアミノ酸６１７残基である。野生型ＡｃＡｍｙ１のシグナル配列は長さにしてアミノ酸１９残基であり、配列番号３に記載の配列を有する。成熟ＡｃＡｍｙ１又はこれらの変異体は、異なるタンパク質から取り込まれたシグナル配列を含み得る。成熟タンパク質は、成熟ポリペプチドとシグナル配列ポリペプチドとの融合タンパク質である場合もある。
【００５１】
ＡｃＡｍｙ１の「触媒コア」は、配列番号１の残基２０〜４９７に及ぶ。ＡｃＡｍｙ１の「リンカー」又は「リンカー領域」は残基４９８〜５２８に及ぶ。アミノ酸残基５２９〜６３６は、ＡｃＡｍｙ１の「炭水化物結合ドメイン」を形成する。
【００５２】
ポリペプチドに関し用語「変異体」は、特定の野生型、親、又は参照ポリペプチドとは異なっており、天然に生じる又は人工的なアミノ酸置換、挿入、又は欠失を１つ以上含むポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関し、用語「変異型」は、特定の野生型、親、又は参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる、ポリヌクレオチドを指す。野生型、親、又は参照ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの同一性は、文脈から明らかとなろう。ＡｃＡｍｙ１の「変異体」及び「αアミラーゼポリペプチド変異体」は、本願では同義である。
【００５３】
親αアミラーゼの場合、「活性」は本願に記載の通りに測定され得るαアミラーゼ活性を指す。
【００５４】
対象とする細胞、核酸、タンパク質、又はベクターに関し使用する場合、用語「組み換え型」は、対象が天然の状態から改変を受けていることを意味する。したがって、例えば、組み換え細胞は、天然（非組み換え）型の細胞では見られない遺伝子を発現し、又は本来見られるものとは異なるレベルで、若しくは異なる条件下で天然遺伝子を発現する。組み換え核酸は、１つ以上のヌクレオチドが天然の配列とは異なっており、及び／又は異種配列と操作可能に連結されており、例えば、発現ベクターにおいて異種プロモーターと操作可能に連結されている。組み換えタンパク質は、１つ以上のアミノ酸が天然の配列とは異なっている、及び／又は異種配列と融合されている可能性がある。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体をコードする核酸を含むベクターは組み換えベクターである。
【００５５】
用語「回収」、「単離」及び「分離」は、化合物、タンパク質（ポリペプチド）、細胞、核酸、アミノ酸、あるいは天然において見られる通り天然に関連付けられる少なくとも１種のその他の物質又は成分から取り出されるその他の特定の物質若しくは成分を指し、例えば、ＡｃＡｍｙ１はＡ．クラバタス種（A. clavatus sp.）細胞から単離される。「単離」ＡｃＡｍｙ１又はその変異体としては、分泌ＡｃＡｍｙ１又は変異体ポリペプチドを含有する培養ブロス、及び異種宿主細胞（すなわち、Ａ．クラバタス（A. clavatus）とは異なる宿主細胞）で発現したＡｃＡｍｙ１又は変異体ポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５６】
本明細書で使用するとき、用語「精製」は、物質（例えば、単離されたポリペプチド又はポリヌクレオチド）が、比較的純粋な状態であること、例えば、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋、又は更には少なくとも約９９％純粋であることを指す。
【００５７】
酵素に関連して、用語「熱安定性」及び「熱安定」は、高温に曝露された後も活性を保有する酵素の能力を指す。アミラーゼ酵素などの酵素の熱安定性は、定義された条件下で酵素活性の半分が失われる分数、時間数又は日数で与えられる半減期（ｔ１／２）により測定される。半減期は、高温への暴露（すなわち、負荷）後に残存α−アミラーゼ活性を測定することによって計算することもできる。
【００５８】
酵素に関連して、「ｐＨ範囲」は、酵素が触媒活性を示すｐＨ値の範囲を指す。
【００５９】
本明細書で使用するとき、酵素に関連し、用語「ｐＨ安定」及び「ｐＨ安定性」は、規定の時間後に、（例えば、１５分、３０分、１時間）幅広いｐＨ範囲にわたって活性を保持する酵素の能力に関する。
【００６０】
本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」に関して同義のものであり、互換的に使用される。このようなアミノ酸配列は「酵素」として参照することのできる活性を示す。アミノ酸残基には一般的な１文字又は３文字表記を使用し、アミノ酸配列は、標準的な、アミノ末端からカルボキシ末端へと向かう配向（すなわち、Ｎ→Ｃ）で表される。
【００６１】
用語「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ２本鎖、及びポリペプチドをコード化することが可能な合成分子を包含する。核酸は１本鎖又は２本鎖であってよく、化学修飾されてもよい。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互換可能に用いられる。遺伝子コードは縮重しているため、特定のアミノ酸のコード化に１つを超えるコドンが用いられる場合があり、本発明の組成物及び方法には、特定のアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列が包含される。別途記載のない限り、核酸配列は、５’から３’に向かう方向で示される。
【００６２】
本明細書で使用するとき、「ハイブリッド形成」は、転写ハイブリッド法及びＰＣＲ法の間に生じるものとして、ある１本の核酸鎖が、相補鎖と二本鎖を形成する、すなわち、塩基対を生じるプロセスを指す。厳密なハイブリッド形成条件は、次の条件下でのハイブリッド形成により例示される：６５℃及び０．１Ｘ  ＳＳＣ（ここで、１Ｘ  ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  Ｎａ３クエン酸塩、ｐＨ  ７．０）。ハイブリッド形成した核酸二本鎖は、ハイブリッド形成させた核酸の半分が相補鎖との塩基対形成から外れる溶解温度（Ｔｍ）により特徴づけられる。二本鎖内でミスマッチしていたヌクレオチドはＴｍが低くなる。変異体αアミラーゼをコードする核酸は、配列番号２のヌクレオチドと、その同一の相補鎖との間で形成される二本鎖と比較して、１℃〜３℃以上低下しているＴｍを有し得る。
【００６３】
本明細書で使用するとき、「合成」分子は、生物により生成されるというよりは、生体外での化学的又は酵素学的合成により生成される。
【００６４】
本明細書で用いるとき、細胞に関して使用される用語「形質転換された」、「安定に形質転換された」及び「遺伝子組み換えの」は、細胞が、そのゲノム内に組み込まれる、又は複数世代にわたって維持されるエピソームとして保有される、非天然の（例えば異種の）核酸配列を含むことを意味する。
【００６５】
核酸配列を細胞内に挿入する状況における用語「導入された」とは、当該技術分野において既知のように「形質移入」、「形質転換」又は「形質導入」を意味する。
【００６６】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、発現ベクター、ファージ、ウィルス、あるいは対象とするポリペプチド（例えば、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体）をコードしているポリヌクレオチドなどその他のＤＮＡコンストラクトを導入された生物である。宿主細胞の例は、対照とするポリペプチドを発現する及び／又は糖類を発酵することのできる微生物細胞である（例えば、細菌、糸状真菌、及び酵母）。用語「宿主細胞」は、細胞から作られたプロトプラストを含む。
【００６７】
ポリヌクレオチド又はタンパク質に関する用語「異種」は、宿主細胞中に天然に存在しないポリヌクレオチド又はタンパク質のことをいう。
【００６８】
ポリヌクレオチド又はタンパク質に関する用語「内因性」は、宿主細胞中に天然に存在するポリヌクレオチド又はタンパク質のことをいう。
【００６９】
本明細書で使用するとき、用語「発現」は、ポリペプチドが核酸配列に基づいて産生されるプロセスを指す。プロセスは、転写及び翻訳の両方を包含する。
【００７０】
「選択的マーカー」又は「選択マーカー」は、遺伝子を保有する宿主細胞の選択を容易にするために、宿主内で発現可能な遺伝子を指す。選択マーカーの例としては、限定するものではないが、抗菌剤（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール）、及び／又は代謝優位性を付与する遺伝子、例えば宿主細胞に対する栄養上の優位性を付与する遺伝子が挙げられる。
【００７１】
「ベクター」は、核酸を１つ以上の細胞型に導入するよう設計されたポリヌクレオチド配列を指す。ベクターとしては、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセットなどが挙げられる。
【００７２】
「発現ベクター」は、目的のポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を含むＤＮＡコンストラクトを指し、このコード配列は、好適な宿主中でＤＮＡを発現させることが可能な好適な調節配列に操作可能に連結される。このような調節配列には、転写に作用するプロモーター、転写を調節するための任意選択的なオペレータ配列、ｍＲＮＡ上の適切なリボソーム結合部位をコードしている配列、エンハンサー、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が包含され得る。
【００７３】
用語「操作可能に連結される」とは、特定の構成要素が、意図された方法で機能することを可能にする関係（並置を含むが、これに限定されない）にあることを意味する。例えば、コード配列の発現が調節配列の調節下になるよう、調節配列は、調節可能なようにコード配列に連結される。
【００７４】
「シグナル配列」は、タンパク質のＮ−末端部分に付着しているアミノ酸の配列であり、これが細胞外へのタンパク質の分泌を促進させる。成熟型の細胞外タンパク質には、分泌プロセス中に切断されるシグナル配列は存在しない。
【００７５】
本明細書で使用するとき、「生物活性」は、配列が、酵素活性などの特定の生物活性を有することを指す。
【００７６】
本明細書で使用するとき、「布片」は、染みが付けられた布地などの材料片である。材料は、例えば、木綿、ポリエステル、又は天然繊維及び合成繊維の混合物から作製される。布片は、更に、濾紙又はニトロセルロースなどの紙、あるいはセラミック、金属、又はガラスなどの硬質材料片でもあり得る。アミラーゼに関し、染みはデンプン性のものであるものの、血液、乳汁、インク、草類、お茶、ワイン、ホウレンソウ、肉汁、チョコレート、卵、チーズ、クレイ、顔料、油、又はこれらの混合物これらの化合物を含み得る。
【００７７】
本明細書で使用するとき、「小布片」は、一穴パンチ装置により切りだされた、又は特別製造された９６穴パンチ装置により切りだされた布片部分であり、多穴パンチのパターンは標準的な９６ウェルマイクロタイタープレートに合うものであり、あるいはこの部分は布片から取り出される。布片は、織物、紙、金属、又はその他の好適な材料であり得る。小布片は、２４、４８、又は９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに配置する前又は後のいずれかで付着させた染みを有し得る。小布片は、材料の小片に染みを付着させることによって作製することもできる。例えば、小布片は、染みを付着させた、直径１．５９ｃｍ又は０．６４ｃｍ（５／８’’又は０．２５’’）の布地片であり得る。特別製造されるパウチは、９６枚の布片を９６ウェルプレートの全てのウェルに同時に供給するような方式で設計される。この装置は、同じ９６ウェルプレートに単に複数回装填をすることにより１ウェル当たり１枚以上の布片を供給可能である。多穴パンチ装置は、任意のフォーマットのプレート、限定するものではないが２４ウェル、４８ウェル、及び９６ウェルプレートなどに布片を同時に供給するためのものを着想することができる。別の着想され得る方法では、被汚染試験プラットフォームは、金属、プラスチック、ガラス、セラミックから作製された、又は汚れ物質により被覆されている別の好適な材料から作製された、ビードであり得る。次に、１つ以上の被覆ビードを、好適な緩衝液及び酵素を含有させた９６、４８、若しくは２４ウェルプレート、又はより大きいフォーマットのウェルに配置する。
【００７８】
本明細書で使用するとき、「ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を含む培養された細胞材料」又は類似の用語は、成分としてＡｃＡｍｙ１又はその変異体を含む細胞可溶化物又は上清（培地を含む）を指す。細胞材料は、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を産生させる目的で培養により増殖させた異種宿主由来のものであってよい。
【００７９】
「配列合一性（％）」は、デフォルトパラメータを用いＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムを使用して整列させたときに、変異体が、野生型ＡｃＡｍｙ１と同一のアミノ酸残基を少なくとも特定の割合で有することを意味する。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０を参照されたいＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗルゴリズムのデフォルトパラメータは、次の通りである。
【００８０】
【表２】
2015534456.tif 000005
【００８１】
欠失は、参照配列と比較して非同一性である残基として計数される。いずれかの末端に生じた欠失が包含される。例えば、配列番号１の成熟ＡｃＡｍｙ１ポリペプチドのＣ末端に５つのアミノ酸の欠失を有する変異体は、成熟ポリペプチドに対して９９％（６１２／６１７同一残基×１００、整数に四捨五入）の配列同一性（％）を有することになるこのような変異体には、成熟ＡｃＡｍｙ１ポリペプチドに対し「少なくとも９９％配列同一性」を有する変異体により包含される。
【００８２】
「融合」ポリペプチド配列は、連結、すなわち、２つのポリペプチド配列間のペプチド結合により操作可能に連結される。
【００８３】
用語「糸状真菌」は、糸状形態の全て真菌類（Eumycotina）亜門を指す。
【００８４】
用語「重合度」（ＤＰ）は、既定の糖中の無水−グルコピラノース単位の数を指す。ＤＰ１の例は、単糖のグルコース及びフルクトースである。ＤＰ２の例は、二糖類のマルトース及びスクロースである。用語「ＤＥ，」又は「デキストロース当量」は、シロップ中の総炭水化物画分としての、還元糖、すなわち、Ｄ−グルコースの割合として定義される。
【００８５】
本明細書で使用するとき、用語「固形分」（ｄｓ）は、乾燥重量（％）で、スラリー中の総固体を指す。用語「スラリー」は、不溶性固体を含有する水性混合物を指す。
【００８６】
句「同時糖化発酵（ＳＳＦ）」は、エタノール生成微生物などの微生物と、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体などの少なくとも１種の酵素が同一のプロセス工程中に存在する、バイオケミカルの産生プロセスを指す。ＳＳＦは、同じ反応容器中で、デンプン基質（粒状、液化、又は可溶化）の、糖（グルコースなど）への加水分解と、糖の、アルコール、又はその他のバイオケミカル若しくはバイオマテリアルへの発酵を同時期に包含する。
【００８７】
本明細書で使用するとき、「エタノール生成微生物」は、糖又はオリゴ糖をエタノールへと変換する能力を有する微生物を指す。
【００８８】
用語「発酵飲料」は、微生物発酵、例えば、細菌及び／又は酵母発酵などの発酵プロセスを含む方法により生産される、任意の飲料を指す。
【００８９】
「ビール」はこのような発酵飲料の例であり、及び用語「ビール」は、デンプンを含有する植物材料の発酵／醸造により生産される任意の発酵糖化液を含むことを意味する。多くの場合、ビールは、麦芽若しくは添加剤、又は麦芽及び添加剤の任意の組み合わせのみから産生される。ビールの例には、麦芽のみのビール、「ビール純粋令」下で醸造されたビール、エール、ＩＰＡ、ラガー、ビター、発泡酒（第２のビール）、第３のビール、ドライビール、ニア・ビール、ライト・ビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボック・ビール、スタウト、モルト・リカー、ノンアルコールビール、ノンアルコールモルト・リカー、及び同様物が包含されるものの、別の穀草及び麦芽汁飲料、例えば、果実フレーバーの麦芽汁飲料（例えば、シトラスフレーバー、レモン、オレンジ、ライム）、又はベリーフレーバーの麦芽汁飲料、蒸留酒フレーバーの麦芽汁飲料、例えば、ウォッカ、ラム、又はテキーラフレーバーのモルト・リカー、あるいはコーヒーフレーバーの麦芽汁飲料（カフェインフレーバーのモルト・リカー）、及び同様物も包含される。
【００９０】
用語「麦芽」は、任意の麦芽入り穀物、麦芽入り大麦又は小麦を指す。
【００９１】
用語「添加剤」は、大麦又は小麦麦芽などの麦芽ではない任意のデンプン及び／又は糖含有植物材料を指す。添加剤の例としては、一般的なコーングリッツ、精製コーングリッツ、醸造用粉砕酵母、米、ソルガム、精製コーンデンプン、大麦、大麦デンプン、脱穀された大麦、小麦、小麦スデンプン、炒って加熱処理された穀草、穀草フレーク、ライ麦、オーツ麦、ジャガイモ、タピオカ、キャッサバ及びシロップ（コーンシロップ、サトウキビシロップ、反転型糖シロップ、大麦及び／又は小麦シロップ、並びに同様物）が挙げられる。
【００９２】
用語「マッシュ」は、任意のデンプン及び／又は糖含有植物材料、例えば、製粉用穀物（例えば、破砕大麦麦芽、破砕大麦、及び／若しくはその他の添加剤、又はこれらの組み合わせを含む）などの水性スラリーを指し、このスラリーは、水と混合した後に、糖化液及び粕に分離される。
【００９３】
用語「糖化液」は、マッシュ中の製粉用穀物の抽出後に放出される未発酵の液体を指す。
【００９４】
「ヨウ素陽性デンプン」又は「ＩＰＳ」は、（１）液化及び糖化後に加水分解されていないアミロース、又は（２）老化したデンプンポリマーを指す。糖化デンプン又は糖液をヨウ素により試験したとき、高ＤＰｎアミロース又は老化デンプンポリマーはヨウ素と結合し、特徴的な青色をもたらす。したがって、糖蒸留酒は、「ヨウ素陽性糖類」、又は「青色糖類」と呼ばれる。
【００９５】
用語「老化デンプン」又は「デンプンの老化」は、デンプンペースト又はゲルに経時的に自然に生じる変化を指す。
【００９６】
用語「約」は、参照する値の±１５％を指す。
【００９７】
２．アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）αアミラーゼ（ＡｃＡｍｙ１）及びその変異体
α−アミラーゼ活性を有する、Ａ．クラバタス種（A. clavatus sp.）又はその変異体由来の単離及び／又は精製ＡｃＡｍｙ１ポリペプチドが提供される。ＡｃＡｍｙ１ポリペプチドは、配列番号１に記載のポリペプチド配列の残基２０〜６３６を含む、成熟ＡｃＡｍｙ１ポリペプチドであり得る。ポリペプチドには、Ｎ末端及び／又はＣ末端にて追加のアミノ酸配列を融合させることもできる。追加のＮ末端配列は、例えば、配列番号３で示される配列を有し得るシグナルペプチドであってよい。いずれかの末端に融合されているその他のアミノ酸配列は、タンパク質の標識又は精製に有用な融合パートナーポリペプチドを含有する。
【００９８】
例えば、Ａ．クラバタス（A. clavatus）由来の既知のαアミラーゼはＡ．クラバタス（A. clavatus）ＮＲＲＬ１由来のαアミラーゼである。Ａ．クラバタス（A. clavatus）ＮＲＲＬ１  αアミラーゼ前駆体、すなわち、シグナルペプチドを含有する前駆体は、
次のアミノ酸配列（配列番号１）を有する：
2015534456.tif 000006
【００９９】
ＮＣＢＩ登録番号ＸＰ＿００１２７２２４５．１を参照されたい（＞ｇｉ｜１２１７０８７７８｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿００１２７２２４５．１｜ａｌｐｈａ  ａｍｙｌａｓｅ，ｐｕｔａｔｉｖｅ［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ  ＮＲＲＬ  １］）。
【０１００】
上記のボールド体のアミノ酸は、Ｃ末端炭水化物結合（ＣＢＭ）ドメイン（配列番号１０）を構成する。グリコシル化リンカー領域（上記ハイライトされているボールド体のアミノ酸；配列番号１１）は、Ｎ末端触媒コアをＣＢＭドメインと連結させる。ＡｃＡｍｙ１中のＣＢＭドメインは、αアミラーゼ、βアミラーゼ、グルコアミラーゼ、及びシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを含むデンプン分解酵素の多くで見つかっている、ＣＢＭ２０ドメインに保存されている。ＣＢＭ２０は、２つのデンプン結合部位１及び２を備える逆平行β−バレル構造として折りたたまれる。これらの２つの部位は機能的に異なると考えられる：部位１は、初期デンプン認識部位として作用し得るのに対し、部位２は、デンプンの適切な領域を特異的に認識するのに関与し得る。Ｓｏｒｉｍａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）「β−シクロデキストリンに結合したアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼの粒状デンプン結合ドメインの溶液構造（Solution structure of the granular starch binding domain of Aspergillus niger glucoamylase bound to beta−cyclodextrin）」Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５（５）：６４７〜６１を参照されたい。デンプン結合部位１及び２により保存されているＡｃＡｍｙ１  ＣＢＭドメイン中の残基を、次の配列においてそれぞれ番号１及び２により示す。
2015534456.tif 000007
【０１０１】
ＡｃＡｍｙ１変異体は、配列番号１０のＣＢＭドメイン又は配列番号１１のリンカーのアミノ酸残基をいくつか含んでよく、あるいは全く含まなくてもよい。あるいは、変異体は、配列番号１０のＣＢＭドメインに対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％配列同一性を有するＣＢＭドメインを含んでもよい。変異体は、異種又は遺伝子操作されたＣＢＭ２０ドメインを含んでもよい。
【０１０２】
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、例えば、リンカー配列の適切なグリコシル化を可能にする、例えば、糸状真菌細胞などの真核宿主細胞で発現させることもできる。
【０１０３】
ＡｃＡｍｙ１をコードする代表的なポリヌクレオチドは、配列番号２に示すポリヌクレオチド配列である。ＮＣＢＩ登録番号ＡＣＬＡ＿０５２９２０はこのようなポリヌクレオチドを開示する。上記イタリックで示すポリペプチド配列、ＭＫＬＬＡＬＴＴＡＦＡＬＬＧＫＧＶＦＧ（配列番号３）は、タンパク質が適切な宿主細胞で発現されたときに切断されるＮ末端シグナルペプチドである。
【０１０４】
ＡｃＡｍｙ１のポリペプチド配列は、その他の真菌αアミラーゼと類似する。例えば、ＡｃＡｍｙ１は、次の真菌αアミラーゼに対し高い配列同一性を有する：
タラロミセス・スティピタトゥス（Talaromyces stipitatus）ＡＴＣＣ  １０５００由来の推定αアミラーゼと７７％配列同一性（ＸＰ＿００２４８７０３．１；配列番号４）；並びに
アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）ＦＧＳＣ  Ａ４（ＸＰ＿６６１００６．１；配列番号５）由来のタンパク質ＡＮ３４０２．２と７２％配列同一性。
【０１０５】
配列同一性は、配列番号１（すなわち、残基２０〜６３６）のＡｃＡｍｙ１の成熟形態をクエリー配列として使用するＢＬＡＳＴアラインメントにより決定される。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０を参照されたい。
【０１０６】
ＡｃＡｍｙ１ポリペプチドの変異体が提供される。変異体は、配列番号１の残基２０〜６３６、又は残基２０〜４９７のポリペプチドに対し少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドからなり、又はこれを含み、変異体は、配列番号４、５、１２、及び／又は１３中の１つ以上の対応するアミノ酸の、置換、挿入、又は欠失から選択される、１種以上のアミノ酸の変更を含む。例えば、配列番号１の残基２０〜６３６のポリペプチドに対し少なくとも９９％配列同一性を有するポリペプチドからなる変異体は、配列番号１のＡｃＡｍｙ１と比較して１〜６個のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を有し得る。比較すると、配列番号１の残基２０〜４９７のポリペプチドに対し少なくとも９９％配列同一性を有するポリペプチドからなる変異体は、最大で５つのアミノ酸の変更を有することになる。挿入又は欠失は、例えば、ポリペプチドのいずれかの末端のものであり得る。あるいは、変異体は、配列番号１の残基２０〜６３６、又は２０〜４９７のポリペプチドに対し、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドからなるポリペプチドを含み得る。このような変異体では、追加のアミノ酸残基がポリペプチドのいずれかの末端に融合され得る。例えば、変異体は、配列番号１の残基２０〜６３６のポリペプチドと比較して、１つ以上のアミノ酸置換又は欠失を有するポリペプチドにインフレームで融合された配列番号３のシグナル配列を含み得る。変異体は、変異体が既定のアミノ酸配列を「含む」又は「これからなる」のいずれかにかかわらず、グリコシル化され得る。
【０１０７】
ＡｃＡｍｙ１（配列番号１）と、Ｔ．スティピタトゥス（T. stipitatus）ＡＴＣＣ  １０５００（配列番号４）、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）ＦＧＳＣ  Ａ４（配列番号５）、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆ２９３（配列番号１２）、及びＡ．テレウス（A. terreus）ＮＩＨ２６２４（配列番号１３）由来のαアミラーゼとのＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを図１に示す。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０を参照されたい。原則として、関連するタンパク質配列のアラインメントにおいてアミノ酸が保存されている度合いは、タンパク質機能に対するそのアミノ酸位置の相対的重要性に比例する。すなわち、全ての関連する配列において共通のアミノ酸は、機能上重要な役割を果たし、容易には置換できない傾向がある。同様に、配列間で変化している位置は、タンパク質の活性は維持したままその他のアミノ酸により置換できる傾向があり、あるいは修正され得る。
【０１０８】
マルトースが活性部位に結合している酵素複合体を含め、Ａ．ニガー（A. niger）αアミラーゼの結晶構造は決定されている。例えば、Ｖｕｊｉｃｉｃ−Ｚａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）「解像度１．８Å下の、マルトースと複合体を形成しているアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）αアミラーゼの単斜晶」Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｆ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６２（８）：７１６〜２１を参照されたい。Ｖｕｊｉｃｉｃ−Ｚａｇａｒ（２００６）に開示されているＡ．ニガー（A. niger）αアミラーゼは、Ａ．オリゼ（A. oryzae）αアミラーゼホモログのＴＡＫＡアミラーゼとしても既知である。ＴＡＫＡアミラーゼ（配列番号６）のアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用してアラインメントしたとき、ＡｃＡｍｙ１の残基２１〜４９７にわたって、ＡｃＡｍｙ１に対し６８％配列同一性を有する。ＴＡＫＡアミラーゼ及びＡｃＡｍｙ１間でアミノ酸配列の保存性が相対的に高いことから、ＡｃＡｍｙ１では、多くの二次構造が導入されており、ＴＡＫＡアミラーゼと類似する構造／機能関係を保有していることが見込まれる。例えば、ＡｃＡｍｙ１は、ＴＡＫＡアミラーゼに対し類似の、高親和性Ｃａ２＋結合部位及びマルトース結合溝を有するものと見込まれる。この予想と一致し、ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｄ２０６、Ｅ２３０、及びＤ２９７により触媒される加水分解反応に関与する３つの酸性アミノ酸は、全て野生型ＡｃＡｍｙ１で保存される。結合溝付近に位置する、ＴＡＫＡアミラーゼの位置Ｙ１５５、Ｌ１６６、Ｄ２３３、及びＤ２３５もＡｃＡｍｙ１で保存される。他の保存されているＡｃＡｍｙ１位置は、ＴＡＫＡアミラーゼの、高親和性のＣａ２＋結合部位を構成するＮ１２１、Ｅ１６２、Ｄ１７５、及びＨ２１０に相当する。Ｖｕｊｉｃｉｃ−Ｚａｇａｒ（２００６）を参照されたい。
【０１０９】
アラインメントを図１に示し、ＴＡＫＡアミラーゼ結晶構造から確認される構造の関連性は、例えば、α−アミラーゼ活性を有するＡｃＡｍｙ１変異体ポリペプチドの構築の指針となり得る。ＡｃＡｍｙ１変異体ポリペプチドとしては、配列番号４、５、１２、及び／又は１３中の対応するアミノ酸の置換、挿入、又は欠失から選択されるアミノ酸の修正を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。図１に示されるアラインメントを参照することにより、ＡｃｙＡｍｙ１と、配列番号４、５、１２、及び１３のαアミラーゼとの間の一致度が決定される。例えば、ＡｃＡｍｙ１変異体ポリペプチドは置換Ｇ２７Ｓを有することができ、この場合、セリンは図１のアラインメントを参照して、配列番号４、５、１２、及び１３において一致するアミノ酸である。ＡｃＡｍｙ１変異体ポリペプチドには、無作為に選択された１、２、３、又は４つのアミノ酸の修正を有するものも含まれるがこれらに限定されない。アミノ酸の修正は、オリゴヌクレオチド指定突然変異導入法などの周知の方法を使用してなすことができる。
【０１１０】
ＡｃＡｍｙ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸も提供される。ＡｃＡｍｙ１をコードする核酸はゲノムＤＮＡであり得る。あるいは、核酸は、配列番号２を含むｃＤＮＡであり得る。当業者には良好に理解される通り、遺伝子コードは縮重し、すなわち、場合によっては複数のコドンが同一のアミノ酸をコードし得る。核酸は、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体をコードする全てのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡ配列を含む。
【０１１１】
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、シグナル配列を含む場合、「前駆体」、「未熟」、又は「完全長」となり、シグナル配列を含まない場合には「成熟」となる。αアミラーゼ変異体は、得られるポリペプチドがα−アミラーゼ活性を保持する限りは、Ｎ又はＣ末端で切断されていてもよい。
【０１１２】
２．１．ＡｃＡｍｙ１変異体の特性
ＡｃＡｍｙ１変異体ポリペプチドはα−アミラーゼ活性を保有する。それらのポリペプチドは、野生型ＡｃＡｍｙ１ポリペプチドよりも高い又は低い比活性を有し得る。ＡｃＡｍｙ１変異体の更なる特徴としては、例えば、安定性、ｐＨ範囲、酸化安定性、及び熱安定性が挙げられる。例えば、変異体は、ｐＨ  ３〜約ｐＨ  ７、例えば、ｐＨ  ３．０〜７．５、ｐＨ  ３．５〜５．５、ｐＨ  ３．５〜５．０、ｐＨ  ３．５〜４．８、ｐＨ  ３．８〜４．８、ｐＨ  ３．５、ｐＨ  ３．８、又はｐＨ  ４．５にて２４〜６０時間ｐＨ安定性であり得る。ＡｃＡｍｙ１変異体は、野生型ＡｃＡｍｙ１の性能特性を保持させつつ野生型ＡｃＡｍｙ１よりも高レベルで発現させることができる。ＡｃＡｍｙ１変異体は、親αアミラーゼと比較して酸化安定性が変更されていてもよい。例えば、酸化安定性の低下は、デンプン液化用組成物において有利なものであり得る。ＡｃＡｍｙ１変異体は、野生型αアミラーゼと比較して熱安定性が変更されていてもよい。このようなＡｃＡｍｙ１変異体は、焼成、又は高温が必要とされるその他のプロセスで使用するのに有利である。発現及び酵素活性レベルは、以降に開示されるものを含む、当業者に既知の標準アッセイ法を使用して評価することができる。ＡｃＡｍｙ１変異体は、野生型酵素と比較して、１つ以上のバイオケミカル特性、物理特性及び／又は性能特性が変更され得る。
【０１１３】
３．ＡｃＡｍｙ１及びその変異体の生産
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、例えば、宿主細胞からＡｃＡｍｙ１又は変異体を分泌させることにより、宿主細胞から単離され得る。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を含む培養された細胞材料は、宿主細胞からのＡｃＡｍｙ１又は変異体の分泌により得ることができる。ＡｃＡｍｙ１又は変異体は、場合により使用前に精製される。ＡｃＡｍｙ１遺伝子は、当業者に周知の手法によりクローン化し、発現させることができる。好適な宿主細胞としては、細菌、植物、酵母細胞、藻細胞、又は真菌細胞、例えば、糸状真菌細胞が挙げられる。特に有用な宿主細胞としては、アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）若しくはトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、又はその他の真菌宿主が挙げられる。その他の宿主細胞としては、細菌細胞、例えば、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）又はバチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、植物、藻類、及び動物宿主細胞が挙げられる。
【０１１４】
宿主細胞は、同種、又は異種グルコアミラーゼ、すなわち、宿主細胞と同一の種のものではないグルコアミラーゼ、あるいは１種以上のその他の酵素をコードする核酸を更に発現し得る。グルコアミラーゼは、変異体グルコアミラーゼ、例えば、米国特許第８，０５８，０３３号（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ社）に開示されるものなどのグルコアミラーゼ変異体などであり得る。加えて、宿主は１種以上のアクセサリー酵素、タンパク質、ペプチドを発現し得る。これらは、前処理、液化、糖化、発酵、ＳＳＦ、蒸留廃液などのプロセスの助けとなり得る。更に、宿主細胞は、各種フィードストックの消化に使用される酵素に加えてバイオケミカルを生産し得る。このような宿主細胞は、酵素を加える必要性を低減又は排除するため、発酵又は同時糖化発酵プロセスに有用であり得る。
【０１１５】
宿主細胞は、同種、又は異種イソアミラーゼ、すなわち、宿主細胞と同一の種又は属のものではないイソアミラーゼ、あるいは１種以上のその他の酵素をコードする核酸を更に発現し得る。イソアミラーゼは、例えば、米国特許第５，３５２，６０２号に開示されるものなどのイソアミラーゼ変異体又はイソアミラーゼ断片であってもよい。加えて、宿主は１種以上のアクセサリー酵素、タンパク質、及び／又はペプチドを発現し得る。これらは、液化、糖化、発酵、ＳＳＦ、蒸留廃液などのプロセスの助けとなり得る。更に、宿主細胞は、炭素フィードストックを消化するのに使用される酵素に加えて、バイオケミカルの産生に使用されるバイオケミカル及び／又は酵素を生産し得る。このような宿主細胞は、酵素を加える必要性を低減又は排除するため、発酵又は同時糖化発酵プロセスに有用であり得る。
【０１１６】
３．１．ベクター
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体をコードする核酸を含むＤＮＡコンストラクトを構築して、宿主細胞で発現させることができる。ＡｃＡｍｙ１をコードする代表的な核酸としては配列番号２が挙げられる。遺伝子暗号において周知の縮重により、同一のアミノ酸配列をコードする変異体ポリペプチドを常軌の手法により設計及び作成することができる。特定の宿主細胞のためコドンの使用を最適化することも、当業界では周知である。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体をコードする核酸をベクターに組み込むことができる。以降に記載のものなどの周知の形質転換法を使用し、ベクターを宿主細胞に移入させることができる。
【０１１７】
ベクターは、宿主細胞を形質変換させ、細胞内で複製させることのできる任意のベクターであり得る。例えば、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体をコードする核酸を含むベクターを形質転換させ、ベクターを増殖及び増幅する手法により細菌宿主細胞において複製させることができる。コードする核酸が、機能性のＡｃＡｍｙ１又はその変異体として発現され得るよう、ベクターにより発現宿主を形質転換させることもできる。発現宿主として提供される宿主細胞としては、例えば、糸状真菌を挙げることができる。真菌遺伝子保管管理センター（ＦＧＳＣ）の株カタログには、真菌宿主細胞における発現に好適なベクターが掲載されている。ＦＧＳＣ、株カタログ、ミズーリ大学、ｗｗｗ．ｆｇｓｃ．ｎｅｔ（最新改訂版２００７年１月１７日）を参照されたい。図２は、代表的なベクター、ｐＪＧ１５３（Ｔｅｘ３ｇＭ−ＡｃＡｍｙ１）のプラスミドマップを示す。ｐＪＧ１５３は、細菌宿主で複製され得る、プロモーターをもたないＣｒｅ発現ベクターである。Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｕｎｅ  ２０１１）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７７：３９１６〜２２を参照されたい。ｐＪＧ１５３（Ｔｅｘ３ｇＭ−ＡｃＡｍｙ１）は、ＡｃＡｍｙ１をコードする核酸を含み、真菌宿主細胞において核酸を発現し得る、ｐＪＧ１５３ベクターである。ｐＪＧ１５３（Ｔｅｘ３ｇＭ−ＡｃＡｍｙ１）は、ＡｃＡｍｙ１変異体をコードする核酸を含み、発現するよう常規の手法により改変することができる。
【０１１８】
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体をコードする核酸は、宿主細胞における転写を可能にする好適なプロモーターに操作可能に連結され得る。プロモーターは、宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、宿主細胞にとって同種又は異種のいずれかであるタンパク質をコードしている遺伝子に由来し得る。特に細菌宿主における、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体をコードするＤＮＡ配列の転写を目的とするプロモーター例は、大腸菌（E. coli）のｌａｃオペロンのプロモーター、ストレプトミセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子ｄａｇＡ又はｃｅｌＡプロモーター、バチルス・リケニフォルミスαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バチルス・アミロリケファシエンス（bacillus amyloliquefaciens）αアミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーターなどである。真菌宿主における転写の際に有用なプロモーターの例としては、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性αアミラーゼ、Ａ．ニガー（A. niger）酸安定性αアミラーゼ、Ａ．ニガー（A. niger）グルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、Ａ．オリゼ（A. oryzae）アルカリプロテアーゼ、Ａ．オリゼ（A. oryzae）トリオースリン酸異性化酵素、又はＡ．ニデュランス（A. nidulans）アセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するものが挙げられる。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体をコードする遺伝子が、大腸菌（E. coli）などの細菌種で発現されるとき、好適なプロモーターは、例えば、Ｔ７プロモーター及びファージλプロモーターを含むバクテリオファージプロモーターから選択され得る。酵母種の発現に好適なプロモーターの例としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＧａｌ１及びＧａｌ１０プロモーター及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＡＯＸ１又はＡＯＸ２プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、図２に記載のｐＪＧ１５３ベクターはＡｃＡｍｙ１に操作可能に連結されたｃｂｈ１プロモーターを含有する。ｃｂｈ１は、内因性の、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）由来の誘導型プロモーターである。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）「セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子（ｃｂｈ１）プロモーターの最適化によるトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）における異種遺伝子発現の改良（Improved heterologous gene expression in Trichoderma reesei by cellobio hydrolase I gene（cbh1）promoter optimization）」、Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）４０（２）：１５８〜６５、を参照されたい。
【０１１９】
コード配列は操作可能にシグナル配列に連結され得る。シグナル配列をコードするＤＮＡは、発現されるＡｃＡｍｙ１遺伝子と天然に関連付けられるＤＮＡ配列であってよい。例えば、ＤＮＡは、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体をコードする核酸に操作可能に連結される、配列番号３のＡｃＡｍｙ１シグナル配列をコードし得る。ＤＮＡは、Ａ．クラバタス（A. clavatus）以外の種由来のシグナル配列をコードする。ＤＮＡコンストラクト又はベクターを含むシグナル配列及びプロモーター配列は、真菌宿主細胞に導入することができ、同種に由来するものであってもよい。例えば、シグナル配列は、ｃｂｈ１プロモーターに操作可能に連結されたｃｂｈ１シグナル配列である。
【０１２０】
発現ベクターは、好適な転写終結配列、及び真核細胞においては、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体をコードしているＤＮＡ配列に操作可能に連結されるポリアデニル化配列も含み得る。転写終結及びポリアデニル化配列は、プロモーターと同種から好適に由来し得る。
【０１２１】
ベクターには、宿主細胞におけるベクターの複製を可能にするＤＮＡ配列を更に含有させることもできる。このような配列例としては、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１及びｐＩＪ７０２の複製起点が挙げられる。
【０１２２】
ベクターには、選択マーカー、例えば、遺伝子バチルス・スブチリス（B. subtilis）又はバチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）由来のｄａｌ遺伝子、あるいは例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、又はテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与する遺伝子などの、単離宿主細胞における欠損を補填する産物の遺伝子を含ませてもよい。更に、ベクターは、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ、及びｘｘｓＣなどのアスペルギルス（aspergillus）選択マーカーを含んでもよく、マーカーは、ハイグロマイシン耐性をもたらし得るものであり、あるいは選択は当該技術分野において既知の同時形質転換により実施されてもよい。例えば、国際公開第９１／１７２４３号を参照されたい。
【０１２３】
細胞内発現はいくつかの態様で有利である場合があり、例えば、特定の細菌又は真菌を宿主細胞として使用するときに、多量のＡｃＡｍｙ１又はその変異体を生産させ、以降で精製することもできる。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体の培養培地への細胞外分泌を使用して、単離ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を含む培養された細胞材料を作製することができる。
【０１２４】
発現ベクターは、典型的には、例えば、選択された宿主生物におけるベクターの自律増殖を可能にする配列、及び選択目的の、表現形により検出可能な１つ以上のマーカーなどの、クローニングベクター成分を含む。発現ベクターは、通常、プロモーター、オペレータ、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル及び場合により、リプレッサー遺伝子又は１つ以上の活性化遺伝子などの調節ヌクレオチド配列を含む。加えて、発現ベクターには、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体に、宿主細胞の細胞小器官（ペルオキシソームなどの）、又は特定の宿主細胞区画を標的とさせ得るアミノ酸配列をコードする配列を含ませることができる。このような標的配列としては、配列、ＳＫＬが挙げられるがこれらに限定されない。調節配列の指示下での発現に関し、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体の核酸配列は、発現に関連して適切な方法で調節配列に操作可能に連結される。
【０１２５】
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体をコードするＤＮＡコンストラクト、プロモーター、ターミネーター及びその他の配列をそれぞれ連結させ、並びに複製に必要な情報を含有する好適なベクターにそれらを挿入するのに使用される手法は当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，「分子クローニング：実験の手引き第２版（Molecular Cloning:ALaboratory Manual）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９年、及び第３版、２００１年を参照されたい）。
【０１２６】
３．２．宿主細胞の形質転換及び培養
ＤＮＡコンストラクト又は発現ベクターのいずれかを含む単離細胞は、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体の組み換え産生において、宿主細胞として有利に使用される。細胞は、宿主染色体にＤＮＡコンストラクト（１つ以上のコピー）を都合よく組み込むことにより、酵素をコードするＤＮＡコンストラクトで形質転換することができる。ＤＮＡ配列がより安定的に細胞に維持される傾向があることから、この組み込みは一般的に有利なものと考えられる。ＤＮＡコンストラクトの宿主染色体への組み込みは、例えば、同種又は異種組み換え法によるものなどの従来法により実施することができる。あるいは、細胞は、異なる種類の宿主細胞に関連して上記される通りに発現ベクターにより形質転換させることができる。
【０１２７】
好適な細菌宿主生物の例としては、バチルス（Bacillaceae）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、ゲオバチルス（Geobacillu）（旧称バチルス（Bacillus））ステアロサーモフィルス（stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（Bacillusalk alophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillusamylolique faciens）、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ロータス（Bacillus lautus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、及びバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、ストレプトミセス種（Streptomyces）、例えば、ストレプトミセス・ミュリナス（Streptomyces murinus）、乳酸細菌種、例えば、ラクトコッカス種（Lactococcussp.）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcuslactis）、ラクトバチルス種（LactoBacillus sp.）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、リューコノストック種（Leuconostocsp.）、ペディオコッカス種（Pediococcussp.）、及びストレプトコッカス種（Streptococcussp.）などのグラム陽性細菌種が挙げられる。あるいは、大腸菌（E. coli）を含む、エンテロバクテリアセエ（Enterobacteriaceae）に属する、又はシュードモナダセエ（Pseudomonadaceae）に属するグラム陰性細菌種が宿主生物として選択され得る。
【０１２８】
好適な酵母宿主生物は、生物工学的に関連のある酵母種、例えば、限定するものではないが、ピキア種（Pichiasp.）、ハンゼヌラ種（Hansenulasp.）、又はクリベロミセス（Kluyveromyces）、ヤロウイア（arrowinia）などの酵母種、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）種又はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などのサッカロミセス（Saccharomyces）種、あるいは例えば、Ｓ．ポンベ（S. pombe）種などのシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）に属する種から選択され得る。メチロトローフ酵母種であるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株を、宿主生物として用いてもよい。あるいは、宿主生物はハンゼヌラ（Hansenula）種であり得る。糸状真菌の中でも好適な宿主生物としては、アスペルギルス（aspergillus）種、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・チュービゲネシス（Aspergillus tubigensis）、アワモリコウジカビ（Aspergillus awamori）、又はアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）が挙げられる。あるいは、フザリウム（Fusarium）種、例えば、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、又はリゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）などのリゾムコール（Rhizomucor）種を宿主生物として使用することができる。他の好適な株としては、サーモミセス（Thermomyces）及びムコール（Mucor）種が挙げられる。加えて、トリコデルマ種（Trichoderma sp.）を宿主として使用することができる。アスペルギルス（aspergillus）宿主細胞の形質転換に好適な手順としては、例えば、欧州特許第２３８０２３号に記載のものが挙げられる。真菌宿主細胞により発現されるＡｃＡｍｙ１又はその変異体はグリコシル化されてよく、すなわち、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体はグリコシル部分を含み得る。グリコシル化パターンは、野生型ＡｃＡｍｙ１に存在するものと同様であり得る。あるいは、宿主生物は、藻類、細菌、酵母、又は植物発現宿主であってよい。
【０１２９】
形質転換させる発現ベクターにより遺伝子の欠損が補填され得る場合、発現宿主から遺伝子を欠失させることも有利である。不活性化された遺伝子を１つ以上有する真菌宿主細胞を得るにあたり既知の方法を使用することができる。遺伝子の不活性化は、完全な又は部分的な欠失により、挿入による不活性化により、又は遺伝子が機能性タンパク質の発現を阻害されるように意図される目的のために遺伝子を非機能的にする任意の他の手段により、実行できる。クローニングされているトリコデルマ種（Trichoderma sp.）、又はその他の糸状真菌宿主に由来する任意の遺伝子、例えば、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、及びｅｇｌ２遺伝子を欠失させることができる。遺伝子の欠失は、不活性化させることが所望される遺伝子を、当該技術分野において既知の方法によりプラスミドに挿入することで実行できる。
【０１３０】
宿主細胞へのＤＮＡ構築体又はベクターの導入には、形質転換、電気穿孔法、核微量注入法、形質導入、トランスフェクション、例えば、リポフェクションを介した、及びＤＥＡＥ−デキストリンを介したトランスフェクション、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿を用いたインキュベーション、ＤＮＡコーティングされた微粒子銃による高速導入、及びプロトプラスト融合といった技術が含まれる。一般的な形質転換法が当該技術分野において既知である。例えば、上掲Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）を参照されたい。トリコデルマ（trichoderma）における異種タンパク質の発現が、例えば、米国特許第６，０２２，７２５号に開示される。同様に、アスペルギルス（aspergillus）株の形質転換に関しては、Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：９９１〜１００１も参照される。遺伝的に安定な形質転換体をベクター系で構築することで、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体をコードする核酸を宿主細胞染色体に安定的に組み込むことができる。次に、形質転換体を選択し、既知の手法により精製する。
【０１３１】
形質転換のためのトリコデルマ種（Trichoderma sp.）の調製は、例えば、糸状菌からのプロトプラスト調製を包含し得る。Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６を参照されたい。菌糸は、出芽させた栄養胞子から得ることができる。細胞壁を消化する酵素により菌糸を処理することで、プロトプラストが得られる。懸濁培地に浸透圧安定剤を存在させることでプロトプラストを保護する。これらの安定剤としては、ソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム及び同様物が挙げられる。通常、これらの安定剤の濃度は、０．８Ｍ〜１．２Ｍで変更され、例えば、１．２Ｍソルビトール溶液が懸濁培地で使用され得る。
【０１３２】
宿主トリコデルマ種（Trichoderma sp.）株へのＤＮＡ取り込みはカルシウムイオン濃度に依存する。一般的に、約１０〜５０ｍＭ  ＣａＣｌ２が取り込み用溶液に使用される。更に好適な化合物としては、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）；１ｍＭＥＤＴＡ）又は１０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ  ６．０）及びポリエチレングリコールなどの緩衝系が挙げられる。ポリエチレングリコールは細胞膜を融合させ、培地の内容物をトリコデルマ種（Trichoderma sp.）株の細胞質へ送達するものと考えられる。この融合は、宿主の染色体に組み込まれたプラスミドＤＮＡの複数のコピーを高頻度に残すことになる。
【０１３３】
通常、トリコデルマ種（Trichoderma sp.）の形質転換には、プロトプラスト、又は密度１０５〜１０７／ｍＬ、特に２×１０６／ｍＬで透過処理のなされた細胞が使用される。適切な溶液（例えば、１．２Ｍソルビトール及び５０ｍＭ  ＣａＣｌ２）に入れた容量１００μＬのこれらのプロトプラスト又は細胞を所望のＤＮＡと混合することができる。概して、高濃度のＰＥＧが取り込み用溶液に加えられる。０．１〜１容量の２５％  ＰＥＧ  ４０００をプロトプラスト懸濁液に加えることができるものの、約０．２５容量をプロトプラスト懸濁液に加えることが有用である。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム、及び同様物などの添加剤を取り込み用溶液に加えて、形質転換を促進させることもできる。同様の手順が他の真菌宿主細胞についても利用可能である。例えば、米国特許第６，０２２，７２５号を参照のこと。
【０１３４】
３．３．発現
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体の産生方法は、酵素の産生の助けとなる条件下で上記の通りの宿主細胞を培養すること、細胞及び／又は培養培地から酵素を回収すること、を含む。
【０１３５】
細胞の培養に使用される培地は、対象とする宿主細胞を増殖させ、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体の発現を得るのに好適な任意の一般的な培地であり得る。好適な培地及び培地成分は市販元から入手可能であり、あるいは公開されている処方に従って調製することもできる（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関のカタログに記載の通り）。
【０１３６】
宿主細胞から分泌される酵素は全ブロス製剤で使用することができる。本方法では、組み換え微生物の馴化全発酵ブロス（spent whole fermentation broth）の調製は、αアミラーゼの発現が得られる、当該技術分野において既知の任意の培養法を使用し実施され得る。したがって、発酵には、アミラーゼの発現又は単離を可能とする好適な培地中及び条件下で行われる、フラスコ振盪培養法、実験用又は工業用発酵槽での小規模又は大規模発酵（連続発酵、回分発酵、流加発酵、又は固体発酵など）が含まれるものと理解され得る。本明細書において、用語「馴化全発酵ブロス」は、培養培地、細胞外タンパク質（例えば、酵素）、及び細胞バイオマスを含有する、発酵材料の未分画成分として定義される。用語「馴化全発酵ブロス」には、当該技術分野において周知の方法を用い可溶化又は透過処理された細胞バイオマスが包含されることも理解される。
【０１３７】
宿主細胞から分泌される酵素は、遠心分離又は濾過による培地からの細胞の分離、並びにいくつかの場合では清澄化したブロスの濃縮を含む、周知の手法により、培養培地から都合よく回収される。更に、プロセスは、硫酸アンモニウムなどの塩による手法により培地のタンパク質性成分を沈降させた後、イオン交換クロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を使用することを含み得る。
【０１３８】
ベクターにおいて、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらし得るよう、調節配列に操作可能に連結させることができ、すなわち、ベクターは発現ベクターである。調節配列は、例えば、調節配列が転写性モジュレーターに更に応答的になるよう、更なる転写調節配列を付加することにより、改変することもできる。調節配列は、特に、プロモーターを含み得る。
【０１３９】
宿主細胞は、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体の発現を可能にする好適な条件下で培養され得る。酵素の発現は、持続的に産生される常時発現型、あるいは発現を開始するための刺激を必要とする誘導型であり得る。発現誘導型の場合、タンパク質生産は、必要とされたときに、例えば、培養培地に誘導物質、例えば、デキサメタゾン又はＩＰＴＧ又はソホロースを加えることにより開始することができる。ポリペプチドは、ＴＮＴ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）ウサギ網状赤血球系などの生体外無細胞系で、組み換えにより発現させることもできる。
【０１４０】
発現宿主は、好気的条件下で、宿主に適切な培地において培養することもできる。宿主の要求並びに所望されるＡｃＡｍｙ１又はその変異体の生産に応じ、宿主に適切な温度下、例えば、約２５℃〜約７５℃（例えば、３０℃〜４５℃）で生じる生産に関し、振盪、又は撹拌及び通気の併用を実施することができる。培養は、約１２〜約１００時間又はそれ以上実施することができる（及び、例えば、２４〜７２時間の間の任意の時間数）。典型的には、培養ブロスは、同様にＡｃＡｍｙ１又はその変異体の産生に関連する宿主に必要とされる培養条件に応じ、ｐＨ約４．０〜約８．０である。
【０１４１】
３．４．ＡｃＡｍｙ１活性の確認
宿主細胞においてＡｃＡｍｙ１又はその変異体の発現を評価するため、アッセイでは、発現タンパク質、対応するｍＲＮＡ、又はα−アミラーゼ活性を測定することができる。例えば、好適なアッセイとしては、適切に標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用するノザンブロット、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、及びインサイツハイブリダイゼーションが挙げられる。好適なアッセイとしては、例えば、培養培地中のグルコースなどの還元糖を直接測定するアッセイによる、サンプル中ＡｃＡｍｙ１活性の測定も挙げられる。例えば、グルコース濃度は、グルコース試薬キット番号１５−ＵＶ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）又は、Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ  Ａｕｔｏａｎａｌｙｚｅｒなどの装置を使用して測定することもできる。α−アミラーゼ活性は、以下に記載のＰＡＨＢＡＨ又はＡＢＴＳアッセイなどの任意の既知の方法により測定することもできる。
【０１４２】
３．５．ＡｃＡｍｙ１及びその変異体の精製方法
発酵、分離、及び濃縮法は当該技術分野において周知であり、濃縮ＡｃＡｍｙ１又はαアミラーゼ変異体ポリペプチド含有溶液を調製するために都合のよい手法を使用することができる。
【０１４３】
アミラーゼ溶液を得る目的で、発酵後に発酵ブロスを得て、残存する発酵原材料を含む、微生物細胞及び各種懸濁固体が濃縮分離法により除去される。濾過、濃縮、精密濾過、回転真空ドラム濾過、限外濾過、遠心後限外濾過、抽出、又はクロマトグラフィーなどが一般的に使用される。
【０１４４】
回収率を最適化するためには、ＡｃＡｍｙ１又はαアミラーゼ変異体ポリペプチド含有溶液の濃縮が望ましい。未濃縮の溶液の使用には、精製酵素沈殿物を回収するためのインキュベート時間を延長させる必要がある。
【０１４５】
酵素含有溶液は、従来の濃縮法を使用し、所望の酵素濃度が得られるまで濃縮する。酵素含有溶液の濃縮は、本願で記載の任意の手法により実施され得る。精製法の例としては、回転真空濾過及び／又は限外濾過が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４６】
酵素溶液は、濃縮ＡｃＡｍｙ１又はαアミラーゼ変異ポリペプチド含有溶液の酵素活性が所望のレベルになるまで濃縮して濃縮酵素溶液とする。
【０１４７】
濃縮は、例えば、金属ハロゲン化物沈殿剤などの沈殿剤を使用して実施してもよい。金属ハロゲン化物沈殿剤としては、アルカリ金属塩化物、アルカリ金属臭化物、及びこれらの金属ハロゲン化物のうちの２種以上の配合物が挙げられるがこれらに限定されない。金属ハロゲン化物の例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、及びこれらの金属ハロゲン化物のうちの２種以上の配合物が挙げられるがこれらに限定されない。金属ハロゲン化物沈殿剤、塩化ナトリウムも保存料として使用できる。
【０１４８】
金属ハロゲン化物沈殿剤は、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を沈殿させるのに有効な量で使用する。酵素の沈澱をもたらすのに少なくとも有効な量及び最適な量の金属ハロゲン化物の選択、並びにインキュベート時間、ｐＨ、温度及び酵素濃度を含む回収率を最大にするための沈澱条件は、当業者には常規の試験後に容易に明らかとなろう。
【０１４９】
一般的に、少なくとも約５（重量／体積）％〜約２５（重量／体積）％の金属ハロゲン化物を濃縮酵素溶液に加え、通常、少なくとも８（重量／体積）％を加える。一般的に、約２５（重量／体積）％以下の金属ハロゲン化物を濃縮酵素溶液に加え、通常、約２０（重量／体積）％以下を加える。金属ハロゲン化物沈殿剤の最適濃度は、特に、具体的なＡｃＡｍｙ１又はαアミラーゼ変異体ポリペプチドの性質、並びにその濃縮酵素溶液中濃度によって異なる。
【０１５０】
酵素を沈殿させる別の代替法は、有機化合物を使用するものである。有機化合物沈殿剤の例としては、４−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、４−ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル、及びこれらの有機化合物のうちの２種以上の配合物が挙げられる。金属ハロゲン化物沈殿剤を加える前に、同時に又はそれに続いて、有機化合物沈殿剤を加えることができ、並びに両方の沈殿剤、有機化合物及び金属ハロゲン化物は連続的に又は同時に加えてもよい。
【０１５１】
一般的に、有機沈殿剤は、４−ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩（ナトリウム又はカリウム塩など）、及び４−ヒドロキシ安息香酸の線状又は分岐状アルキルエステル、及びこれらの有機化合物のうちの２種以上の配合物からなる群から選択され、ここで、アルキル基は、炭素原子を１〜１２個含有する。有機化合物沈殿剤は、例えば、４−ヒドロキシ安息香酸の線状又は分岐状アルキルエステル、及びこれらの有機化合物のうちの２種以上の配合物であってよく、ここで、アルキル基は、炭素原子を１〜１０個含有する。有機化合物例は、４−ヒドロキシ安息香酸の線状アルキルエステル、及びこれらの有機化合物のうちの２種以上の配合物であり、ここで、アルキル基は、炭素原子を１〜６個含有する。４−ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のブチルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のエチルエステル、及びこれらの有機化合物のうちの２種以上の配合物を使用することもできる。追加の有機化合物としては、４−ヒドロキシ安息香酸メチル（メチルパラベン）、４−ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル（プロピルパラベン）も挙げられ、両方ともアミラーゼ保存材であるが、これらに限定されない。更なる記載に関しては、例えば、米国特許第５，２８１，５２６号を参照されたい。
【０１５２】
有機化合物沈殿剤の追加により、ｐＨ、温度、ＡｃＡｍｙ１又はαアミラーゼ変異体ポリペプチド濃度、沈殿剤濃度、及びインキュベート時間に関し、沈澱条件が非常に柔軟なものになるという利点がもたらされる。
【０１５３】
有機化合物沈殿剤は、金属ハロゲン化物沈殿剤を用いることによる酵素の沈澱を向上させるのに有効な量で使用する。有機化合物沈殿剤の有効な量及び最適な量の選択、並びにインキュベート時間、ｐＨ、温度及び酵素濃度を含む回収率を最大にするための沈澱条件は、当業者には、常規の試験後に本願の見地から容易に明らかとなろう。
【０１５４】
一般的に、少なくとも約０．０１（重量／体積）％の有機化合物沈殿剤を濃縮酵素溶液に加え、通常、少なくとも約０．０２（重量／体積）％を加える。一般的に、約０．３（重量／体積）％以下の有機化合物沈殿剤を濃縮酵素溶液に加え、通常、約０．２（重量／体積）％以下を加える。
【０１５５】
金属ハロゲン化物沈殿剤及び有機化合物沈殿剤を含有する濃縮ポリペプチド溶液は、精製する酵素に応じ、必要とされるｐＨに調整することができる。一般的に、ｐＨは、アミラーゼの等電点付近に調整する。ｐＨは、等電点（ｐＩ）からｐＨ単位が約２．５低いｐＨから、等電点（ｐＩ）からｐＨ単位が約２．５高いｐＨまでの範囲のｐＨに調整することができる。
【０１５６】
精製酵素の沈殿を得るのに必要とされるインキュベート時間は、具体的な酵素の性質、酵素濃度、及び具体的な沈殿剤、及びその（それらの）濃度に応じて異なる。一般的に、酵素を沈殿させるのに有効な時間は、約１〜約３０時間であり、通常、約２５時間を超過することはない、有機化合物沈殿剤の存在下では、インキュベート時間は、約１０時間未満に減少させることができ、多くの場合は約６時間に減少させることができる。
【０１５７】
一般的に、インキュベート中の温度は約４℃〜約５０℃である。通常、方法は、約１０℃〜約４５℃の温度（例えば、約２０℃〜約４０℃）で実施される。沈殿を生じさせるのに最適な温度は、溶液条件、及び使用する酵素又は沈殿剤（１つ又は複数）に従い変化する。
【０１５８】
精製酵素沈殿物の最終的な回収率、及び実施するプロセスの効率は、酵素を含む溶液を撹拌すること、加える金属ハロゲン化物、及び加える有機化合物により向上される。撹拌工程は、金属ハロゲン化物及び有機化合物の加える間、及び続くインキュベート時間の間の両方に行う。好適な撹拌方法としては、機械的撹拌又は振盪、積極的な通気、又は任意の類似の手法が挙げられる。
【０１５９】
インキュベート期間後、精製酵素は、次に、解離した（dissociated）顔料及びその他の不純物から分離し、従来の分離法、例えば濾過、遠心分離、精密濾過、回転真空濾過、限外濾過、加圧濾過、クロス式膜精密濾過、クロスフロー式膜精密濾過、又は同様の方法などにより回収する。精製酵素沈殿物の更なる精製は、沈殿物を水で洗浄することにより得ることができる。例えば、精製酵素沈殿物を、金属ハロゲン化物沈殿剤を含有する水、又は金属ハロゲン化物及び有機化合物沈殿剤を含有する水で洗浄する。
【０１６０】
発酵中、ＡｃＡｍｙ１又はαアミラーゼ変異体ポリペプチドは培地ブロス中に蓄積される。所望のＡｃＡｍｙ１又はαアミラーゼ変異体の単離及び精製の際、培養ブロスを遠心分離又は濾過して細胞を除去し、得られる無細胞液を酵素精製に使用する。一実施形態では、無細胞ブロスには、約７０％飽和硫酸アンモニウムにより塩析を行い、次に、７０％飽和沈殿画分を緩衝液に溶解させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１００カラムなどのカラムにかけ、及び溶出し酵素活性化区分を回収する。更なる精製の際、イオン交換クロマトグラフィーなどの一般的な手法を使用することもできる。
【０１６１】
精製酵素は、洗濯及び洗浄用途に有用である。例えば、それらは洗濯洗剤及び染み抜き剤に使用することができる。精製酵素は、液体（溶液、スラリー）又は固体（顆粒剤、粉末）のいずれかの最終生成物として製造することができる。
【０１６２】
より具体的な精製例は、Ｓｕｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）「新型デンプン結合ドメイン：バチルス種（Bacillus sp.）１９５  α−アミラーゼのＣ末端領域中ダイレクトリピートモチーフはデンプン結合及びデンプン原材料の分解に寄与する（New type of starch−binding domain: the direct repeat motif in the C−terminal region of Bacillus sp.195 α−amylase contribute stostarch binding and raw starch degrading）」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５０：４７７〜４８４に記載されており、本明細書に簡単に要約される。ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）ＴＫ２４培養上清４Ｌから得た酵素を８０％飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４により処理する。１０，０００×ｇ（２０分及び４℃）にて遠心分離により沈殿物を回収し、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．０）に再溶解した。溶解させた沈殿物を次に同じ緩衝液に対して透析した。透析したサンプルを、次に予め２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、（ｐＨ  ７．０）、５ｍＭ  ＣａＣｌ２により平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００カラムに装填し、同じ緩衝液により線流速７ｍＬ／ｈｒで溶出した。カラムからの画分を回収し、酵素アッセイ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥをもとに判定されるものとして活性について評価した。タンパク質は更に次の通りに精製した。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ５５カラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ；カタログ番号１９８１２）を、５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．０）により平衡化した。５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ  ７．０中、１．５〜０Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４の直線勾配により酵素を溶出した。活性化区分を回収し、酵素を８０％飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４により沈殿した。沈殿物を上記の通りに回収し、再溶解し、透析した。透析したサンプルを、次に５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．０）により予め平衡化したＭｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ５／５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ；カタログ番号１７−５１６７−０１）に流速６０ｍＬ／ｈｏｕｒで利用した。活性画分を回収し、１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４溶液に加えた。活性酵素画分を、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ５５カラムに対し前述同様に再度クロマトグラフィー処理をし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判断される通り均質な酵素を得た。方法及びそれらの変法に関する一般的な考察についてはＳｕｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５０：４７７〜４８４を参照されたい。
【０１６３】
生産規模の回復のため、ＡｃＡｍｙ１又はαアミラーゼ変異体ポリペプチドは、一般的に、上記の通りに、ポリマーによる凝集を介し細胞を除去することにより部分的に精製することができる。あるいは、酵素は、精密濾過による精製後に、入手可能な膜及び装置を使用して限外濾過により濃縮することができる。しかしながら、ある種の用途に関しては、酵素を精製する必要はなく、全部ロス培養物を溶解し、更なる処理はせずに使用することができる。次に、酵素は例えば顆粒へと加工することができる。
【０１６４】
４．ＡｃＡｍｙ１及びその変異体の組成物及び使用
ＡｃＡｍｙ１及びその変異体は、多様な工業用途に関し有用である。例えば、ＡｃＡｍｙ１及びその変異体は、デンプン変換プロセス、特に液化したデンプンの糖化プロセスで有用である。所望の最終製品は、酵素によるデンプン基質の変換により生産され得る任意の生成物であってよい。最終産物はアルコール、又は場合によりエタノールとすることができる。最終産物は、有機酸、アミノ酸、バイオ燃料、並びに、エタノール、クエン酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、イタコン酸及びその他のカルボン酸、グルコδ−ラクトン、エリトルビン酸ナトリウム、リジン、ω  ３脂肪酸、ブタノール、イソプレン、１，３−プロパンジオール、及びバイオディーゼルが挙げられるがこれらに限定されないその他のバイオケミカルとすることもできる。例えば、所望の生成物は、ＨＦＣＳの調製などのその他のプロセスで使用することのできる、あるいは数多くのその他の有用な生成物（アスコルビン酸中間体（例えば、グルコン酸塩、２−ケト−Ｌ−グロン酸、５−ケト−グルコン酸塩、及び２，１５−ジケトグルコン酸塩）、１，３−プロパンジオール；芳香族アミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン及びトリプトファン）、有機酸（例えば、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、イソクエン酸、及びオキサロ酢酸）、アミノ酸（例えば、セリン、及びグリシン）、抗生物質、抗菌剤、酵素、ビタミン類、及びホルモンなど）へと変換することができる、富グルコース及びマルトースシロップであり得る。
【０１６５】
デンプン変換プロセスは、燃料用アルコール又は飲料用アルコール（すなわち、飲用アルコール）の生産のため設計された発酵プロセスよりも前のプロセス、又は同時のプロセスとすることができる。当業者は、これらの最終産物の生産に使用することのできる多様な発酵条件に見当がつくであろう。ＡｃＡｍｙ１及びその変異体も食品の調製に関係する組成物及び方法に有用である。ＡｃＡｍｙ１及びその変異体のこれらの多様な用途は、以降により詳細に記載される。
【０１６６】
４．１．デンプン基質の調製
一般的な当業者は、本開示のプロセスで使用するデンプン基質の調製に使用し得る、利用可能な方法をよく理解している。例えば、有用なデンプン基質は、特に塊茎類、根類、茎類、豆類、穀草類又は未精製の穀物から得ることができる。より具体的には、粒状デンプンは、トウモロコシ、トウモロコシ穂軸、小麦、大麦、ライ麦、ライコムギ、ミロ、サゴ、アワ、キャッサバ、タピオカ、ソルガム、米、さや豆、豆、バナナ、又はジャガイモから得ることができる。トウモロコシは約６０〜６８％のデンプンを含有し、大麦は約５５〜６５％のデンプンを含有し、キビは約７５〜８０％のデンプンを含有し、小麦は約６０〜６５％のデンプンを含有し、精白米は７０〜７２％のデンプンを含有する。具体的には、想到されるデンプン基質はトウモロコシデンプン及び小麦デンプンである。穀物由来のデンプンは粉末状でも未精製でもよく、穀粒、糠、及び／又は穂軸といったトウモロコシ固形分を含む。デンプンは、高精製した生デンプン、又はデンプン精製プロセスで得られる原材料であってよい。様々なデンプンもまた市販されている。例えば、トウモロコシデンプンは、Ｃｅｒｅｓｔａｒ，Ｓｉｇｍａ，ａｎｄ  Ｋａｔａｙａｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．（Ｊａｐａｎ）から、小麦デンプンはＳｉｇｍａから、サツマイモデンプンはＷａｋｏ  ＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．（Ｊａｐａｎ）から、そしてジャガイモデンプンはＮａｋａａｒｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｊａｐａｎ）から入手可能である。
【０１６７】
デンプン基質は、粉砕した未精製の穀物から得た粗デンプンであってよく、非デンプン分画、例えば胚芽残渣及び繊維を含む。粉砕には、湿式又は乾式粉砕又は磨砕のいずれかが含まれ得る。湿式粉砕法では、未精製の穀物を水又は希酸に浸して、穀物をその構成部分（例えば、デンプン、タンパク質、胚芽、油、穀粒繊維）に分離する。湿式粉砕法は胚芽と穀粉（ミール）（すなわち、デンプン顆粒とタンパク質）を効率的に分離し、シロップの調製に特に好適である。乾式粉砕法又は磨砕法では、未精製の穀粒を挽いて細かい粉末にし、多くの場合、穀物をその構成部分に分画せずに加工する。いくつかの場合では、仁由来の油が回収される。そのため、乾式粉砕された穀物は、デンプンに加えて、大量の非デンプン炭水化物化合物を含む。デンプン基質の乾式粉砕を使用して、エタノール及びその他のバイオケミカルを生産することができる。加工するデンプンは、高精製のデンプン品質のものであってよく、例えば、純度が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９．５％であってもよい。
【０１６８】
４．２．デンプンの糊化及び液化
本明細書で用いる用語「液化」又は「液化する」は、デンプンを、より粘性が低く及び短鎖のデキストリンに転換するプロセスを意味する。一般的に、このプロセスは、αアミラーゼを加えるのと同時の、又はそれに続くデンプンの糊化を包含するものの、場合により追加の液化誘導酵素を加えてもよい。いくつかの実施形態では、上記に述べたようにして調製したデンプン基質を、水とともにスラリー化する。デンプンスラリーは、乾燥固形分重量％として、約１０〜５５％、約２０〜４５％、約３０〜４５％、約３０〜４０％、又は約３０〜３５％のデンプンを含有し得る。αアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）は、例えば定量ポンプによりスラリーに加えることもできる。この用途で典型的に使用されるαアミラーゼは、熱的に安定な細菌αアミラーゼであり、例えば、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）αアミラーゼである。αアミラーゼは、通常、例えば、デンプン乾燥物質１ｋｇ当たり約１５００ユニットで供給する。αアミラーゼの安定性及び活性を最適化するため、スラリーのｐＨは、典型的には約ｐＨ  ５．５〜６．５に調整し、及び典型的には、約１ｍＭカルシウム（約４０ｐｐｍ遊離カルシウムイオン）を加える。ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）変異体、又はその他のαアミラーゼは、異なる条件を要求し得る。液化後にスラリー中に残存する細菌αアミラーゼは、続く反応工程においてｐＨを低下させることを含む多様な方法を介し、あるいは酵素がカルシウムに依存する場合に、スラリーからカルシウムを除去することにより、失活させてもよい。
【０１６９】
１０５℃に蒸気加熱したジェットクッカーにより、デンプンとαアミラーゼとのスラリーを連続的に送り込むこともできる。これらの条件下では、糊化が急速に生じ、また酵素活性が有意なせん断力と組み合わされて、デンプン基質の加水分解が始まる。ジェットクッカー中滞留時間は短時間である。部分的に糊化したデンプンを、１０５〜１１０℃に維持された一連の保持管に注入した後、約５〜８分間保持して、糊化プロセスを完了することができる（「第１液化」）。８５〜９５℃又はそれ以上の温度の保持槽において約１〜２時間かけて、必要とされるＤＥへの加水分解を完了する（「第２液化」）。逆混合を防ぐために、これらの槽にはバッフルを備えてもよい。本明細書で使用するとき、用語「第２液化時間（分）」は、第２液化の開始からデキストロース当量（ＤＥ）が測定されるまでに経過した時間を指す。次に、スラリーは室温に冷却させる。この冷却工程は、３０〜１８０分であってよく、例えば９０分〜１２０分である。
【０１７０】
上記のプロセスから得られる液化デンプンは、典型的には、約９８％オリゴ糖類及び約２％マルトース及び０．３％  Ｄ−グルコースを含有する。液化デンプンは、典型的には、固形分を約１０〜５０％、約１０〜４５％、約１５〜４０％、約２０〜４０％、約２５〜４０％、又は約２５〜３５（重量／重量）％有するスラリーの形態である。
【０１７１】
液化プロセスにおいて、ＡｃＡｍｙ１及びその変異体を細菌αアミラーゼの代わりに使用することができる。ＡｃＡｍｙ１及びその変異体による液化は、有利なことに、ｐＨを約ｐＨ  ５．５〜６．５に調整する必要なく、低ｐＨで実施することができる。ＡｃＡｍｙ１及びその変異体は、ｐＨ範囲２〜７、例えば、ｐＨ  ３．０〜７．５、ｐＨ  ４．０〜６．０、又はｐＨ  ４．５〜５．８で液化に使用することができる。ＡｃＡｍｙ１及びその変異体は、約８０℃〜９５℃、例えば、８５℃、９０℃、又は９５℃の温度範囲で液化活性を維持得る。例えば、液化は、２５％乾燥固体トウモロコシデンプン溶液において、８００μｇ  ＡｃＡｍｙ１又はその変異体により、例えば、ｐＨ  ５．８及び８５℃、又はｐＨ  ４．５及び９５℃で１０分実施することができる。液化活性は、当該技術分野において既知の任意の多数の粘度アッセイを使用しアッセイすることができる。
【０１７２】
４．３．糖化
液化デンプンは、イソアミラーゼ、並びにＡｃＡｍｙ１及びその変異体を、場合により別の酵素の存在下で使用して、富低ＤＰ（例えば、ＤＰ１＋ＤＰ２）単糖類シロップへと糖化することができる。糖化産物の正確な組成は、使用される酵素の組み合わせ、並びに加工される粒状デンプンの種類に依存する。有利に、提供されるＡｃＡｍｙ１及びその変異体を使用して得られるシロップは、糖化デンプンにおける総オリゴ糖類のうち３０重量％超、例えば、４５重量％〜６５重量％又は５５重量％〜６５重量％の重量割合でＤＰ２を含み得る。糖化デンプン中の（ＤＰ１＋ＤＰ２）の重量％は、約７０％例えば、７５％〜８５％又は８０％〜８５％を超過し得る。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体をイソアミラーゼと組み合わせても、シロップ生成物において、比較的高いグルコース収率、例えば、ＤＰ１＞２０％がもたらされる。
【０１７３】
液化は、一般的に、連続的なプロセスとして実施されるのに対し、糖化は、多くの場合バッチプロセスとして実施される。糖化は、典型的には、約６０〜６５℃の温度及び約４．０〜４．５のｐＨ、例えば、ｐＨ  ４．３で最も効果的であり、液化デンプンの冷却及びｐＨ調整が必要とされる。糖化は、例えば、約３０℃、約４０℃、約５０℃、又は約５５℃〜約６０℃又は約６５℃の温度で実施することができる。糖化は、通常、充填又は排出するのに数時間を必要とし得る撹拌槽で実施する。酵素は、典型的には、槽が充填されるにともない乾燥固形分に対し一定比で加えられ、あるいは充填段階の開始時に、単回添加物として加えられる。シロップを作製するための糖化反応は、典型的には、約２４〜７３時間、例えば、２４〜４８時間実施する。最大又は所望のＤＥが得られたとき、例えば８５℃で５分間加熱して反応を停止させる。更にインキュベートすることで、酵素による逆転反応により及び／又は熱力学的な平行作用により堆積したグルコースは、イソマルトース及び／又はその他の元の生成物へと再重合され、低ＤＥから、最終的には約９０ＤＥが得られる。ＡｃＡｍｙ１ポリペプチド又はその変異体を使用するとき、糖化は、約３０℃〜約７５℃、例えば、４５℃〜７５℃又は４７℃〜７４℃の温度範囲で最適に実施される。糖化は、約ｐＨ  ３〜約ｐＨ  ７例えば、ｐＨ  ３．０〜ｐＨ  ７．５、ｐＨ  ３．５〜ｐＨ  ５．５、ｐＨ  ３．５、ｐＨ  ３．８、又はｐＨ  ４．５のｐＨ範囲で実施され得る。
【０１７４】
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体及び／又はイソアミラーゼは、組成物の形態でスラリーに加えることもできる。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を、約０．６〜１０ｐｐｍ  ｄｓ例えば、２ｐｐｍ  ｄｓの量で粒状デンプン基質のスラリーに加えることができる。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、全ブロス、清澄化、部分精製、又は精製酵素として加えることができる。精製ＡｃＡｍｙ１又はその変異体の比活性は、例えば、ＰＡＨＢＡＨアッセイにより測定したとき約３００Ｕ／ｍｇであり得る。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を全ブロス製剤として加えることもできる。
【０１７５】
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体及び／又はイソアミラーゼを、単離酵素溶液としてスラリーに加えることもできる。例えば、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体及び／又はイソアミラーゼは、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体及び／又はイソアミラーゼを発現する宿主細胞により生産される、培養された細胞材料の形態で加えることができる。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体及び／又はイソアミラーゼも、発酵又はＳＳＦプロセス中に、宿主細胞により、酵素が反応培地に持続的に提供されるよう反応培地に分泌され得る。ＡｃＡｍｙ１又は変異体を生産及び分泌する宿主細胞は、グルコアミラーゼ及び／又はイソアミラーゼなどの追加の酵素も発現し得る。例えば、米国特許第５，４２２，２６７号は、アルコール飲料の生産用の酵母におけるグルコアミラーゼの使用を開示している。例えば、宿主細胞、例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）又はアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）を、糖化中にＡｃＡｍｙ１又はその変異体、及びグルコアミラーゼ、例えば、ＨｇＧＡ、ＴｒＧＡ、若しくはＴｒＧＡ変異体、及び／又はイソアミラーゼ、及び／又はその他の酵素を同時発現するよう遺伝子操作することができる。宿主細胞は、宿主の内因性のグルコアミラーゼ及び／又はイソアミラーゼ及び／又はその他の酵素、タンパク質、又はその他の材料を発現しないよう遺伝的に改質することができる。宿主細胞は、広域スペクトルの各種糖分解性酵素を発現するよう遺伝子操作され得る。例えば、組み換え酵母宿主細胞は、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ、五炭糖を利用する酵素、αアミラーゼ、プルラナーゼ（pullulanse）、βアミラーゼ、イソアミラーゼ、及び／又はイソプルラナーゼ、及び／又はその他の加水分解性酵素、及び／又はプロセスにおいて有益なその他の酵素をコードする核酸を含み得る。例えば、国際公開第２０１１／１５３５１６（Ａ２）号を参照されたい。
【０１７６】
４．４．異性体
ＡｃＡｍｙ１若しくはその変異体、及び／又はイソアミラーゼを用いる処理により生産される可溶性デンプン加水分解産物は、高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）などの高フルクトースデンプン系シロップ（ＨＦＳＳ）に変換され得る。この変換は、グルコースイソメラーゼ、特に固体支持体上に固定化されたグルコースイソメラーゼを使用し行うことができる。ｐＨは、約６．０〜約８．０、例えば、ｐＨ  ７．５に上昇させ、及びＣａ２＋はイオン交換により除去する。好適なイソメラーゼとしては、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標）、ＩＴ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｇ−ｚｙｍｅ（登録商標）ＩＭＧＩ、及びＧ−ｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ９９３、Ｋｅｔｏｍａｘ（登録商標）、Ｇ−ｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ９９３、Ｇ−ｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ９９３液体、及びＧｅｎＳｗｅｅｔ（登録商標）ＩＧＩが挙げられる。異性体化後、混合物は、典型的には約４０〜４５％フルクトース、例えば、４２％フルクトースを含有する。
【０１７７】
４．５．発酵
可溶性デンプン加水分解産物、特に富グルコースシロップは、デンプン加水分解産物を、典型的には約３２℃の温度下（２８℃〜６５℃）で発酵微生物と接触させることにより発酵させることができる。ＥＯＦ産物は代謝産物を含有する。最終産物はアルコール、又は場合によりエタノールであり得る。最終産物は、有機酸、アミノ酸、バイオ燃料、並びに、エタノール、クエン酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、イタコン酸及びその他のカルボン酸、グルコδ−ラクトン、エリトルビン酸ナトリウム、リジン、ω  ３脂肪酸、ブタノール、イソプレン、１，３−プロパンジオール、及びバイオディーゼルが挙げられるがこれらに限定されないその他のバイオケミカルとすることもできる。
【０１７８】
エタノール生成微生物としては、アルコール脱水素酵素及びピルビン酸脱炭酸酵素を発現する、酵母、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、及び細菌、例えば、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas moblis）が挙げられる。エタノール生成微生物は、キシロースをキシルロースに変換する、キシロース還元酵素及びキシリトール脱水素酵素を発現することができる。エタノール生成微生物の改良株、例えば、更に高温に耐性を示し得る改良株は、当該技術分野において既知であり、使用することができる。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｓｈｅｎｇ  Ｗｕ  Ｇｏｎｇ  Ｃｈｅｎｇ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ  ２７（７）：１０４９〜５６を参照されたい。市販の酵母としては、エタノールＲＥＤ（登録商標）（ＬｅＳａｆｆｒｅ）、Ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ）、ＲＥＤ  ＳＴＡＲ（登録商標）（Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ）、ＦＥＲＭＩＯＬ（登録商標）（ＤＳＭ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）、及びＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（登録商標）（Ａｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。発酵により、クエン酸及び乳酸などのその他の代謝産物を生産する微生物も当該技術分野において既知である。例えば、Ｐａｐａｇｉａｎｎｉ（２００７）「Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ，ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ，」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２５（３）：２４４〜６３；Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）「Ｄｉｒｅｃｔ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ：ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２７（２）：１４５〜５２を参照されたい。
【０１７９】
糖化及び発酵プロセスは、ＳＳＦプロセスとして実施してもよい。発酵は、例えば、続いてエタノールの精製及び回収が含まれ得る。発酵中、ブロス又は「ビール」のエタノール含量は、約８〜１８（体積／体積）％例えば、１４〜１５（体積／体積）％に達し得る。ブロスは、蒸留して富化された、例えば純度９６％のエタノール溶液を生産することもできる。更に、発酵により生成されるＣＯ２は、ＣＯ２気体洗浄装置により回収し、圧縮し、及び他の用途のために、例えば、炭酸飲料、又はドライアイスの生産用に販売することもできる。発酵プロセス由来の固体廃棄物は、富タンパク質製品、例えば、家畜用飼料として使用することもできる。
【０１８０】
上記の通り、ＳＳＦを通して持続的にＡｃＡｍｙ１又はその変異体を発現及び分泌する真菌細胞によりＳＳＦプロセスを実施することができる。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を発現する真菌細胞は、発酵微生物、例えば、エタノール生成微生物であってもよい。したがって、エタノール生産は、外因的な酵素をほとんど又は全く加える必要がなくなるよう、十分にＡｃＡｍｙ１又はその変異体を発現する真菌細胞を使用して実施することができる。真菌宿主細胞は、適切に遺伝子操作された真菌株由来であり得る。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体に加えてその他の酵素を発現及び分泌する真菌宿主細胞も使用できる。このような細胞は、グルコアミラーゼ及び／又は、プルラナーゼ、ヘキソキナーゼ、キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、βアミラーゼ、αアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、トレハラーゼ、イソアミラーゼ、酸化還元酵素、エステラーゼ、トランスフェラーゼ、ペクチナーゼ、αグルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、リアーゼ、又はその他の加水分解酵素、別の酵素、又はこれらの組み合わせを発現し得る。例えば、国際公開第２００９／０９９７８３号を参照されたい。
【０１８１】
このプロセスの変化形が、「流加発酵」システムであり、このシステムでは、発酵の進行に伴い基質が徐々に加えられる。流加発酵システムは、異化産物抑制によって細胞の代謝が阻害される可能性があり、培地中の基質の量が限定されていることが望ましい場合に有用である。流加発酵システムにおける実際の基質濃度は、ｐＨ、溶存酸素、及びＣＯ２などの排出ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。回分発酵及び流加発酵は一般的なものであり、当該技術分野では周知のものである。
【０１８２】
連続発酵は、規定の発酵培地をバイオリアクターに連続的に加え、等量の調整培地を処理加工用に同時に取り出す開放システムである。連続発酵は一般的に、培養物を一定の高密度に維持し、ここで細胞は主として対数増殖期にある。連続発酵では、細胞増殖及び／又は生成物濃度の調節が可能である。例えば、炭素源又は窒素源などの制限栄養素が一定に維持され、他の全てのパラメータは適度に調整される。増殖は一定に維持されることから、培地が抜き出されることによる細胞の損失は、発酵中の細胞増殖率に対し調整すべきである。連続発酵プロセスを最適化し、生成物の形成速度を最大化する方法は、工業微生物学の技術分野において周知である。
【０１８３】
４．６．ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を含む組成物
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体及び／又はイソアミラーゼは、グルコアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３）例えば、トリコデルマ（Trichoderma）グルコアミラーゼ又はその変異体と組み合わせることもできる。グルコアミラーゼの例は、優れた比活性及び熱安定性を保有するトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）及びその変異体である。米国特許出願公開第２００６／００９４０８０号、同第２００７／０００４０１８号、及び同第２００７／００１５２６６号（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．）を参照されたい。好適なＴｒＧＡ変異体としては、グルコアミラーゼ活性を有し、野生型ＴｒＧＡに対し少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％配列同一性であるものが挙げられる。ＡｃＡｍｙ１及びその変異体は、ＴｒＧＡにより触媒される糖化プロセスにおいて、有利にグルコース生産収率を増加させる。
【０１８４】
あるいは、グルコアミラーゼは、植物、菌類、又は細菌に由来する別のグルコアミラーゼであってもよい。例えば、グルコアミラーゼは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｇ１若しくはＧ２グルコアミラーゼ又はその変異体（例えば、Ｂｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１０９７〜１１０２；国際公開第９２／００３８１；国際公開第００／０４１３６（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ））、並びにアワモリコウジカビ（A. awamori）グルコアミラーゼ（例えば、国際公開第８４／０２９２１（Ｃｅｔｕｓ  Ｃｏｒｐ．））であってよい。その他の想到されるアスペルギルス（Aspergillus）グルコアミラーゼとしては、熱安定性の増強された変異体、例えば、Ｇ１３７Ａ及びＧ１３９Ａ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９：４９９〜５０５）；Ｄ２５７Ｅ及びＤ２９３Ｅ／Ｑ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．８：５７５〜５８２）；Ｎ１８２（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０１：２７５〜２８１）；Ａ２４６Ｃ（Ｆｉｅｒｏｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５：８６９８〜８７０４）、及び位置Ａ４３５及びＳ４３６にＰｒｏ残基を有する変異体（（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：１１９９〜１２０４）が挙げられる。その他の想到されるグルコアミラーゼとしては、タラロミセス（Talaromyces）グルコアミラーゼ、特にＴ．エマーソニイ（T. emersonii）（例えば、国際公開第９９／２８４４８号（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）、Ｔ．レイセタヌ（T. leycettanu）（例えば、米国再発行特許第３２，１５３号（ＣＰＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．））、Ｔ．デュポンチ（T. duponti）、又はＴ．サーモフィル（T. thermophilu）（例えば、米国特許第４，５８７，２１５号）由来のものが挙げられる。想到される細菌グルコアミラーゼとしては、クロストリジウム（Clostridium）属、特に、Ｃ．サーモアミロリチカム（C. thermoアミロlyticum）（例えば、欧州特許第１３５，１３８号（ＣＰＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）、Ｃ．サーモヒドロスルフリカム（C. thermohydrosulfuricum）（例えば、国際公開第８６／０１８３１号（Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））由来のグルコアミラーゼが挙げられる。好適なグルコアミラーゼとしては、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来のグルコアミラーゼ（国際公開第００／０４１３６号（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）において配列番号２で示されるグルコアミラーゼなど）が挙げられる。同様に、市販のグルコアミラーゼ、例えば、ＡＭＧ  ２００Ｌ、ＡＭＧ  ３００  Ｌ、ＳＡＮ（商標）ＳＵＰＥＲ及びＭＧ（商標）Ｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、ＯＰＴＩＤＥＸ（登録商標）３００及びＯＰＴＩＤＥＸ  Ｌ−４００（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．）、ＡＭＩＧＡＳＥ（商標）及びＡＭＩＧＡＳＥ（商標）ＰＬＵＳ（ＤＳＭ）、Ｇ−ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９００（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｉｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及びＧ−ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９９０  ＺＲ（低プロテアーゼ含量のＡ．ニガー（A. niger）グルコアミラーゼ）などが好適である。更にその他の好適な��ルコアミラーゼとしては、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）グルコアミラーゼ、タラロミセス（Talaromyces）グルコアミラーゼ、チエラビア（Thielavia）グルコアミラーゼ、ホウロクタケ（Trametes）グルコアミラーゼ、サーモミセス（Thermomyces）グルコアミラーゼ、アテリア（Athelia）グルコアミラーゼ、フミコラ（Humicola）グルコアミラーゼ（例えば、ＨｇＧＡ）が挙げられる。グルコアミラーゼは、典型的には、約０．１〜２グルコアミラーゼユニット（ＧＡＵ）／ｇ（ｄｓ）例えば、約０．１６ＧＡＵ／ｇ（ｄｓ）、０．２３ＧＡＵ／ｇ（ｄｓ）、又は０．３３ＧＡＵ／ｇ（ｄｓ）の量で加えられる。
【０１８５】
特に、本明細書で想到されるグルコアミラーゼは、デンプン変換プロセスに使用することができ、特にフルクトースシロップ、特別の糖類用のデキストロースの生産に、並びにデンプン含有基質の発酵から生産されるアルコール及びその他の最終産物（例えば、有機酸、アミノ酸、バイオ燃料、及びその他のバイオケミカル）の生産に使用することができる（例えば、Ｇ．Ｍ．Ａ．ｖａｎ  Ｂｅｙｎｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．（１９８５）ＳＴＡＲＣＨ  ＣＯＮＶＥＲＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．ＮＹ；同様に米国特許第８，１７８，３２６号を参照されたい）。想到されるグルコアミラーゼ変異体は、また、内因的に生産される又は遺伝子操作された植物酵素と相乗的に作用し得る。加えて、想到されるグルコアミラーゼ変異体は、所望の最終製品を生産する宿主由来の内因性、遺伝子操作性、分泌性、又は非分泌性酵素（例えば、有機酸、アミノ酸、バイオ燃料、及びその他のバイオケミカル、限定するものではないが、エタノール、クエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、イタコン酸及びその他のカルボン酸、グルコδ−ラクトン、エリトルビン酸ナトリウム、リジン、ω  ３脂肪酸、ブタノール、イソプレン、１，３−プロパンジオール、及びバイオディーゼルなど）と相乗的に作用し得る。更に、想到されるグルコアミラーゼ変異体を発現する宿主細胞は、各種フィードストックの消化に使用される酵素に加えて、バイオケミカルも生産し得る。このような宿主細胞は、酵素を加える必要性を低減又は排除するため、発酵又は同時糖化発酵プロセスに有用であり得る。
【０１８６】
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体と使用することのできるその他の好適な酵素としては、別のグルコアミラーゼ、ヘキソキナーゼ、キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、βアミラーゼ、αアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、トレハラーゼ、イソアミラーゼ、酸化還元酵素、エステラーゼ、トランスフェラーゼ、ペクチナーゼ、αグルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、リアーゼ、又はその他の加水分解酵素、又はこれらの組み合わせが挙げられる。例えば、国際公開第２００９／０９９７８３号を参照されたい。例えば、イソアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．６８）などの脱分岐酵素を、当業者に周知の有効な量で加えることができる。プルラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４１）、例えば、Ｐｒｏｍｏｚｙｍｅ（登録商標）も好適である。プルラナーゼは、典型的には、１００Ｕ／ｋｇ（ｄｓ）で加えられる。更に好適な酵素としては、真菌、酵母、及び細菌プロテアーゼ、植物プロテアーゼ及び藻類プロテアーゼなどのプロテアーゼが挙げられる。真菌プロテアーゼには、Ａ．ニガー（A. niger）、アワモリコウジカビ（A. awamori）、Ａ．オリゼ（A. oryzae）などのアスペルギルス（Aspergillus）、ムコール（Mucor）（例えば、Ｍ．ミエヘイ（M. miehei））、クモノスカビ（Rhizopus）、及びトリコデルマ（trichoderma）から得られるものが含まれる。
【０１８７】
βアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２）は、１，４−α−グルコシド結合のアミロペクチン及び関連するグルコースポリマーへの加水分解を触媒することによりマルトースを放出する、エキソ作用型マルトース生成アミラーゼである。βアミラーゼは、多様な植物及び微生物から単離されている。Ｆｏｇａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）ｉｎＰＲＯＧＲＥＳＳ  ＩＮ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１１２〜１１５を参照されたい。これらのβアミラーゼは、４０℃〜６５℃の範囲の最適温度、及び約４．５〜約７．０の範囲の最適ｐＨを有する。使用が考えられるβ−アミラーゼとしては、大麦由来のβ−アミラーゼであるＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＢＢＡ  １５００、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＤＢＡ、Ｏｐｔｉｍａｌｔ（商標）ＭＥ、Ｏｐｔｉｍａｌｔ（商標）ＢＢＡ（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．）、並びにＮｏｖｏｚｙｍ（商標）ＷＢＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１８８】
５．焼成及び食品調製のための組成物及び方法
本発明は、「食品組成物」、限定するものではないが、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼを含む食品、動物用飼料及び／又は食品／飼料添加物などにも関し、並びにＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼと、１種以上の食品原料とを混合することを含む、このような食品組成物を調製するための方法、あるいはそれらの使用にも関する。
【０１８９】
更に、本発明は、食品組成物の調製におけるＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼの使用に関し、ここで、食品組成物は、本発明のポリペプチドを加えた後で焼成する。本明細書で使用するとき、用語「焼成組成物」は、焼成用製粉穀物、ドウ、焼成添加剤、及び／又は焼成製品が挙げられるがこれらに限定されない、焼成食品の提供プロセスで調製される任意の組成物及び／又は添加剤を意味する。食品組成物又は添加剤は液体又は固体であり得る。
【０１９０】
本明細書で使用するとき、用語「製粉穀物」は、粉砕又は磨砕された穀物を意味する。用語「製粉穀物」は、磨砕又はすり潰されたサゴ又は塊茎製品も意味する。一部の実施形態では、製粉穀物は、粉砕又はすり潰された穀草又は植物材料に加えて構成成分も含有する。追加の構成成分の実施例としては、膨張剤が挙げられるがこれらに限定されない。穀物としては、小麦、オート麦、ライ麦、及び大麦が挙げられる。塊茎産物としては、製粉タピオカ、製粉キャッサバ、及びカスタード粉末が挙げられる。用語「製粉穀物」には、磨砕トウモロコシ粉、トウモロコシミール、米粉、全粉粒、ふくらし粉入りの小麦粉、製粉タピオカ、製粉キャッサバ、磨砕米、強化小麦粉、及びカスタード粉末も含まれる。
【０１９１】
焼成及び食品調製用の、商用及び家庭用製粉穀物に関し、製粉穀物中で適切なレベルのα−アミラーゼ活性を維持することは重要である。活性レベルが高過ぎると、粘着性になり及び／又は締まりがなくなり、したがって商品にならない恐れがある。α−アミラーゼ活性が不十分な製粉穀物では、適切に酵母を機能させるのに十分な糖が含有されず、乾燥した、ぼろぼろと砕けやすいパン類又は焼成製品となる恐れがある。したがって、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を、それらそのものを、又はその他のαアミラーゼ（１種又は複数種）と組み合わせて製粉穀物に加え、製粉穀物中の内因性のα−アミラーゼ活性レベルを増加させることもできる。
【０１９２】
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体と、イソアミラーゼを、更に、単独で、又はその他のアミラーゼと組み合わせて加えて、劣化、すなわち、焼成製品の硬化を予防又は遅延させることができる抗劣化アミラーゼの量は、典型的には、製粉穀物１ｋｇ当たり０．０１〜１０ｍｇの酵素タンパク質の範囲であり、例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ（ｄｓ）である。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体と組み合わせて使用できる追加の抗劣化アミラーゼとしては、エンドアミラーゼ、例えば、バチルス（Bacillus）由来の細菌エンドアミラーゼが挙げられる。追加のアミラーゼは、例えば、バチルス（Bacillus）由来のその他のマルトース生成αアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３３）であってもよい。Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）は、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）株ＮＣＩＢ  １１８３７由来のマルトース生成αアミラーゼ例であり、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｔａｒｃｈ  ５０：３９〜４５に記載される。その他の抗劣化エンドアミラーゼの例としては、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）又はＢ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）などのバチルス（Bacillus）、由来の細菌αアミラーゼが挙げられる。抗劣化アミラーゼは、βアミラーゼなどのエキソアミラーゼであってよく、例えば、大豆などの植物由来、又はバチルス（Bacillus）などの細菌由来であり得る。
【０１９３】
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼを含む焼成組成物には、更にホスホリパーゼ、又はホスホリパーゼ活性を有する酵素を含ませることもできる。ホスホリパーゼ活性を有する酵素は、リパーゼユニット（ＬＵ）で測定することのできる活性を有する。ホスホリパーゼは、リン脂質から脂肪酸を除去してリゾリン脂質を生成するＡ１又はＡ２活性を有し得る。ホスホリパーゼは、リパーゼ活性、すなわち、トリグリセリド基質に対する活性を有しても有さなくてもよい。ホスホリパーゼは、典型的には３０〜９０℃（例えば、３０〜７０℃）の範囲に最適温度を有する。加えるホスホリパーゼは、動物由来、例えば、膵臓由来（例えば、ウシ又はブタ膵臓由来）、ヘビ毒液又は蜂毒液由来であり得る。あるいは、ホスホリパーゼは、微生物由来、例えば、糸状真菌、酵母、又は細菌由来であってもよい。
【０１９４】
ホスホリパーゼは、焼成後しばらくの間、特に焼成後最初の２４時間の間のパンのやわらかさを向上させる量で加えられる。ホスホリパーゼの量は、典型的には、製粉穀物１ｋｇ当たり０．０１〜１０ｍｇの範囲の酵素タンパク質、例えば、０．１〜５ｍｇ／ｋｇであり得る。すなわち、ホスホリパーゼ活性は、一般的に、製粉穀物１ｋｇ当たり２０〜１０００ＬＵ／ｋｇの範囲であり、ここでリパーゼユニットは、アラビアゴムを乳化剤とし、トリブチリンを基質とし、３０℃、ｐＨ  ７．０にて１分当たり１μｍｏｌの酪酸を放出させるのに必要とされる酵素量として定義される。
【０１９５】
ドウ組成物は、一般的に、小麦全粒粉又は小麦粉、及び／又はその他種類のミール、製粉穀物、又はデンプン（トウモロコシ粉、トウモロコシデンプン、ライ麦ミール、ライ麦粉、オート麦粉、オートミール、大豆粉、ソルガムミール、ソルガム粉、ジャガイモミール、ジャガイモ粉、又はジャガイモデンプン）を含む。ドウは、新鮮、凍結、又は半焼成のものであってよい。ドウは、発酵させたドウ、又は発酵させるドウであってよい。ドウは、化学的な発酵剤（例えば、重炭酸ナトリウム）を加えること、あるいは発酵を加えること（すなわちドウを発酵させることにより）などの、多様な方法により発酵させることができる。ドウは、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）（パン菓子用酵母）、例えば、Ｓ．セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）の市販株の培養など、好適な酵母培養物を加え、発酵させることもできる。
【０１９６】
ドウには、その他の一般的なドウ原材料、例えば、タンパク質（乳汁粉末、グルテン、及び大豆、卵（例えば、全卵、卵黄、又は卵白））、酸化剤（アスコルビン酸、臭素酸カリウム、ヨウ素酸カリウム、アゾジカーボンアミド（ＡＤＡ）、又はアンモニウム過硫酸塩）、Ｌ−システインなどのアミノ酸、糖、又は塩類（塩化ナトリウム、酢酸カルシウム、硫酸ナトリウム、又は硫酸カルシウムなど）を含ませることもできる。ドウには、更に脂肪、例えば、トリグリセリド（粒状脂肪又はショートニングなど）を含ませることもできる。ドウには、更に乳化剤、すなわちモノ又はジグリセリド、モノ又はジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、モノグリセリドの乳酸エステル、モノグリセリドの酢酸エステル、ステアリン酸ポリオキシエチレン、又はリゾレシチンなどを含ませることもできる。特に、ドウは乳化剤を加えずに作製することができる。
【０１９７】
ドウ生成物は、揚げ焼き、揚げ、ロースト、焼成、蒸し上げ、及び茹で上げされたドウ、すなわち蒸し上げパン及び餅類などの、任意の加工のなされたドウ生成物であってよい。一実施形態では、食品はベーカリー製品である。典型的なベーカリー（焼成）製品としては、ローフ類、ロール類、丸パン類、ベーグル類、ピザ生地などのパン類、ペストリー、プレッツェル類、トルティーヤ類、ケーキ類、クッキー類、ビスケット類、クラッカー類などが挙げられる。
【０１９８】
所望により、追加の酵素を抗劣化アミラーゼ及びホスホリパーゼとともに使用してもよい。追加の酵素は、第２のアミラーゼ、すなわちアミログルコシダーゼ、βアミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼであってよく、あるいは追加の酵素は、ペプチダーゼ、特に、エキソペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、例えば、国際公開第９５／００６３６号に開示されるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、分岐酵素（１，４−α−グルカン分岐酵素）、４−α−グルカノトランスフェラーゼ（デキストリングリコシルトランスフェラーゼ）、又は酸化還元酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、グルコース酸化酵素、ピラノース酸化酵素、リポオキシゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸酸化酵素、又はカルボヒドレートオキシダーゼであってよい。追加の酵素（１種又は複数種）は、哺乳類及び植物を含む任意の由来であってよく、特に微生物（細菌、酵母、又は真菌）由来であってよく、当該技術分野で一般に使用される手法により得ることができる。
【０１９９】
キシラナーゼは、典型的には微生物由来であり、例えば、バクテリア、又は真菌（アスペルギルス（Aspergillus）株など）である。キシラナーゼには、例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）から製造された市販のキシラナーゼ製剤であるＰｅｎｔｏｐａｎ（登録商標）及びＮｏｖｏｚｙｍ  ３８４（登録商標）が含まれる。アミログルコシダーゼはＡ．ニガー（A.niger）アミログルコシダーゼ（ＡＭＧ（登録商標））であってよい。その他の有用アミラーゼ製剤としては、Ｇｒｉｎｄａｍｙｌ（登録商標）Ａ  １０００又はＡ  ５０００（Ｇｒｉｎｄｓｔｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）及びアミラーゼ（登録商標）Ｈ又はアミラーゼ（登録商標）Ｐ（ＤＳＭ）が挙げられる。グルコース酸化酵素は、真菌グルコース酸化酵素、特に、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコース酸化酵素（Ｇｌｕｚｙｍｅ（登録商標）など）であってよい。プロテアーゼ例はＮｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）である。
【０２００】
やわらかい又はクリスピー様の特徴のいずれかであり、精白、色白又は色黒のいずれかであるドウから焼成製品を調製する、任意の種類のプロセスを使用することができる。例は、パン、特に、典型的には、ローフ類又はロール類の形態の精白パン、全粒粉パン又はライ麦パンであり、すなわち、フレンチバゲット式のパン、ピタパン、トルティーヤ類、ケーキ類、パンケーキ類、ビスケット類、クッキー類、パイ生地、クリスピーパン、蒸しパン、及びピザなどであるがこれらに限定されない。
【０２０１】
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体をイソアミラーゼを、製粉穀物とともに抗劣化アミラーゼ、ホスホリパーゼ、及び／又はリン脂質を含むプレミックスに使用することもできる。プレミックスには、その他のドウを改良する及び／又はパンを改良する添加剤、例えば、上記の酵素を含む任意の添加剤を含有させることができる。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体は、焼成添加剤として使用するための、抗劣化アミラーゼ及びホスホリパーゼを含む酵素製剤の構成成分となり得る。
【０２０２】
酵素製剤は、場合により、粒状又は凝集粉末の形態である。製剤は、粒子の９５％（重量％）超が２５〜５００μｍの範囲内にある狭い粒度分布を有してよい。粒状及び凝集粉末は、従来の方法により、例えば、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を流動床造粒機内で担体に噴霧することにより調製することもできる。担体は、好適な粒径を有する粒子コアからなってよい。担体は、可溶性又は不溶性の、例えば、塩（ＮａＣｌ又は硫酸ナトリウムなど）、糖（スクロース又はラクトース）、糖アルコール（ソルビトールなど）、デンプン、米、コーングリッツ、又は大豆であってよい。
【０２０３】
封入粒子、すなわち、αアミラーゼ粒子には、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体を含ませることができる。封入αアミラーゼ粒子を調製するために、酵素を、全てのαアミラーゼ粒子を懸濁させるのに十分な量の食品グレードの脂質と接触させる。本明細書で使用するとき食品グレードの脂質は、水には不溶性であるものの炭化水素又はジエチルエーテルなどの無極性有機溶媒には可溶性である任意の天然の有機化合物である。好適な食品グレードの脂質としては、飽和又は不飽和である脂肪又は油のいずれかの形態のトリグリセリドが挙げられるがこれらに限定されない。脂肪酸、及び飽和トリグリセリドを構成するそれらの組み合わせの例としては、酪酸（乳汁脂肪由来）、パルミチン酸（動物及び植物性脂肪由来）、及び／又はステアリン酸（動物及び植物性脂肪由来）が挙げられるがこれらに限定されない。脂肪酸、及び表面の不飽和トリグリセリドを構成するそれらの組み合わせ例としては、パルミトレイン酸（動物及び植物性脂肪由来）、オレイン酸（動物及び植物性脂肪由来）、リノール酸（植物油由来）、及び／又はリノレン酸（亜麻仁油由来）が挙げられるがこれらに限定されない。その他の好適な食品グレードの脂質としては、上記のトリグリセリド、リン脂質、及び糖脂質に由来するモノグリセリド及びジグリセリドが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２０４】
食品グレードの脂質、特に液体形態のものを、脂質材料が、少なくとも大部分、例えば、１００％のαアミラーゼ粒子の表面の少なくとも一部分を覆うような様式で、粉末形態のαアミラーゼ粒子と接触させる。したがって、各αアミラーゼ粒子はそれぞれ脂質に封入される。例えば、全て又は実質的に全てのαアミラーゼ粒子には、脂質の薄く連続的な封入フィルムが備わっている。これは、最初に大量の脂質を容器に注ぎ入れ、次に脂質が各αアミラーゼ粒子の表面を十分に濡らすようαアミラーゼ粒子をスラリーにすることによりなすことができる。短時間撹拌した後、相当量の脂質を表面上に保持する封入αアミラーゼ粒子を回収する。このようにしてαアミラーゼ粒子に塗布されるコーティングの厚みは、使用する脂質の種類を選択することにより、及び所望される場合には、より厚みのあるフィルムが形成されるよう操作を繰り返すことにより調節することができる。
【０２０５】
装填される送達分散媒の保管、取り扱い、及び組み込みは、パッケージ化ミックス法を用い実施できる。パッケージミックスには封入αアミラーゼを含ませることができる。しかしながら、パッケージミックスには、製造元又は焼成者により必要とされる通りの追加の原材料を更に含有させることができる。封入αアミラーゼをドウに組み込んだ後、焼成者は、製品のための通常の生産プロセスを続ける。
【０２０６】
αアミラーゼ粒子の封入による利点は２要素からなる。第１に、食品グレードの脂質は、熱に不安定な酵素の焼成プロセス中に、これらの酵素を熱分解から保護する。結果的に、準備及び焼成段階でαアミラーゼは安定化されかつ保護される一方、最終焼成製品において保護コーティングから放出され、ポリグルカン中のグルコシド結合を加水分解する。装填される送達分散媒は、活性酵素の持焼成製品への続放出性ももたらす。すなわち、焼成プロセス後、活性αアミラーゼは、劣化機序に対抗し、したがってその速度を減じる速度で、保護コーティングから持続的に放出される。
【０２０７】
一般的に、αアミラーゼ粒子に塗布される脂質量は、脂質の性質、αアミラーゼ粒子への塗布方法、処理するドウ混合物の性質、及び包含されるドウ混合操作の厳格さに応じ、αアミラーゼの総重量の数％から重量の数倍へと変更することができる。
【０２０８】
装填される送達分散媒、すなわち、脂質封入酵素を、焼成製品有効量の調製に使用される原材料に加えて、焼成製品の貯蔵寿命を延長する。焼成者は、所望の抗劣化効果を得るのに必要とされる、上記の通りに調製された封入αアミラーゼの量を計算する。必要とされる封入αアミラーゼ量は、封入される酵素濃度、及び特定の製粉穀物に対するαアミラーゼの割合をもとに算出する。幅広い濃度が有効であることが見出されているものの、これまでに議論されている通り、抗劣化において観察可能な改良はαアミラーゼ濃度と直線的には一致せず、ただし特定の最低濃度を超えると、αアミラーゼ濃度が大幅に上昇するためほとんど追加の改良はない。具体的なベーカリー製品で実際に使用されるαアミラーゼ濃度は、焼成者に対し、焼成者による故意ではない測定誤差へのある程度の保険を提供するのに必要とされる最低濃度よりも十分に高いものであり得る。酵素濃度の下限は、焼成者が得ることを望む最低限の抗劣化効果をもとに決定する。
【０２０９】
焼成製品の調製方法は、ａ）実質的に全てのαアミラーゼ粒子が被覆されている脂質により被覆されたαアミラーゼ粒子を調製すること、ｂ）製粉穀物を含有するドウを混合すること、ｃ）混合が完了する前に、脂質により被覆されたαアミラーゼをドウに加え、脂質の被覆がαアミラーゼから剥がれ始める前に混合を終了させること、ｄ）ドウに防腐処理すること、並びにｅ）ドウを焼成して焼成製品を生成すること、を含んで良く、αアミラーゼは混合、防腐、及び焼成段階において不活性であり、焼成製品中で活性である。
【０２１０】
封入αアミラーゼは、混合サイクル中、例えば、混合サイクルの終了付近でドウに加えることができる。封入αアミラーゼは、ドウ中に封入αアミラーゼを十分に分散させる混合段階で加えるが、しかしながら、混合段階は、アミラーゼ粒子（１種又は複数）から保護コーティングが剥がれ始める前に終了させる。ドウの種類及び体積、並びに混合様式及び速度に応じ、封入αアミラーゼのドウへの混合に必要とされる時間は１〜６分又はそれ以上となるものの、２〜４分が平均である。したがって、多変数が正確な手順を決定し得る。第１に、封入αアミラーゼの量は、封入αアミラーゼをドウミックス中に行き渡らせるのに十分な合計量を有する必要がある。封入αアミラーゼ製剤が高濃度である場合、プレミックスには、封入αアミラーゼをドウに加える前に、追加の油を加える必要がある場合がある。レシピ及び生産プロセスは、個別に変更する必要があるものの、一般的に、パン生地の配合においては油を２５％に指定したときにドウが提供され、このドウは、混合サイクルの終了付近で濃縮封入αアミラーゼが加えられるときに、この酵素の担体として使用され、良好な結果が得られる。パン、又はその他の焼成製品、特に低脂肪含量を有する、例えば、フランスパンにおいて、封入αアミラーゼを適切にドウに混合するには、封入αアミラーゼ混合物は乾燥製粉穀物重量の約１％で十分である。好適な割合の範囲は広く、処方、最終製品、及び個々の焼成者に必要とされる生産方法によって異なる。第２に、封入αアミラーゼ懸濁液は、加えた後、混合物を完全にドウにするのに十分な時間にわたって、ただし、過剰な機械作用により封入αアミラーゼ粒子から保護脂質コーティングが剥がされるようものではない時間にわたって混合する必要がある。
【０２１１】
本発明の更なる態様では、食品組成物はＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼを含む油、肉、ラード、組成物である。この文脈で、用語［油／肉／ラード］組成物」は、それぞれ、油、肉、又はラードをもとにする、これからなる及び／又はこれを含有する任意の組成物を意味する。本発明のその他の態様は、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼを含む油若しくは肉若しくはラード組成物及び／又は添加剤の調製方法に関し、本発明のポリペプチドを油／肉／ラード組成物及び／又は添加剤原材料と混合することを含む。
【０２１２】
本発明の更なる態様では、食品組成物は、ＡｃＡｍｙ１及びその変異体とイソアミラーゼを含む動物用飼料組成物、動物用飼料添加物及び／又はペットフードである。本発明は、更に、このような動物用飼料組成物、動物用飼料添加物組成物及び／又はペットフードの調製方法に関し、ＡｃＡｍｙ１及びその変異体とイソアミラーゼを、１つ以上の動物用飼料原材料及び／又は動物飼料添加物原材料及び／又はペットフード原材料と混合することを含む。更に、本発明は、動物用試料組成物及び／又は動物用飼料添加物組成物及び／又はペットフードの調製におけるＡｃＡｍｙ１及びその変異体とイソアミラーゼの使用に関する。
【０２１３】
用語「動物」は、全ての非反芻及び反芻動物を含む。特定の実施形態では、動物は、馬及び単胃動物などの非反芻動物である。単胃動物の例としては、豚及び家畜豚（子豚、育成豚、雌豚など）、鶏（七面鳥、アヒル、鶏、ブロイラー、産卵鶏など）、魚（鮭、鱒、テラピア、ナマズ、及び鯉）、及び甲殻類（海老及び車海老）が挙げられるがこれらに限定されない。更なる実施形態では、動物は反芻動物であり、畜牛、幼若牛、ヤギ、羊、キリン、バイソン、ヘラジカ、エルク、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、リャマ、レイヨウ、エダツノレイヨウ、及びニルガイが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２１４】
この文脈において、用語「ペットフード」は、イヌ、ネコ、スナネズミ、ハムスター、チンチラ、高級ラット、モルモット、飼育用鳥類、カナリア、インコ、及びオウム、飼育用爬虫類、亀、とかげ、及びヘビ、並びに飼育用水生生物、熱帯魚、及び蛙などの、ただしこれらに限定されない家庭内飼育用動物のための飼料を意味するものと理解されることが意図される。
【０２１５】
用語「動物用飼料組成物」、「飼料」及び「飼葉」は互換的に使用され、かつａ）シリアル類、例えば、小粒穀物（例えば、小麦、大麦、ライ麦、エンバク、及びこれらの組み合わせ）、及び／又は大粒穀物（例えば、コーン又はサトウモロコシなど）など、ｂ）シリアル類を原料とする製品、例えば、コーングルテンミール、蒸留粕（ＤＤＧＳ）（特にコーン系の蒸留粕（ｃＤＤＧＳ）、小麦ふすま、粗びき小麦粉、小麦ショート（wheat shorts）、米ぬか、もみ殻、オーツ麦のもみ殻、パーム核、及び柑橘パルプ、ｃ）タンパク質類、例えば、大豆、ヒマワリ、落花生、ルピナス、エンドウ豆、ソラマメ、綿、セイヨウアブラナ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉骨粉飼料、ポテトタンパク質、乳清、コプラ、ゴマなどの供給源から得られるタンパク質など、ｄ）油類及び脂肪類、例えば、植物資源及び動物資源から得られる油類及び脂肪類、ｅ）ミネラル類及びビタミン類、からなる群から選択される１種以上の飼料材料を含み得る。
【０２１６】
６．織物湯通し組成物及び使用
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼを使用する組成物及び布地を処理する（例えば、織物を湯通しする）方法も想到される。布地の処理方法は当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，０７７，３１６号を参照されたい）。例えば、布地の感触及び外観は、布地を、溶液中でＡｃＡｍｙ１又はその変異体と、イソアミラーゼと接触させることを含む方法により向上され得る。布地は、圧力下で溶液により処理され得る。
【０２１７】
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼは、織物の製織中又はその後に適用することができ、あるいは湯通し段階、又は１つ以上の追加の布地加工段階中に適用することができる。織物の製織、織り糸は相当な機械的な歪にさらされる。機械式織機での製織前、縦糸は、しばしば糊付けデンプン又はデンプン誘導体により被覆され、引っ張り強度が向上され、断裂が予防される。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼを、製織中又は後に適用して、これらの糊付けデンプン又はデンプン誘導体を除去することができる。製織後、布地を更に加工する前にＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼを使用して、糊付けコーティングを除去し、均質性及び洗浄検査結果を保証することができる。
【０２１８】
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼを、単独で、又はその他の湯通し用化学試薬及び／又は湯通し用酵素とともに、洗剤添加剤として（例えば、水性組成物として）使用して、綿含有布地などを湯通しすることができる。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼは、藍染めされた布地及び衣類にストーンウォッシュされた風合いをもたらすための組成物及び方法に使用することもできる。衣服の製造に際し、布地を裁断し、衣服又は衣類に縫製し、その後仕上げることができる。特にデニムジーンズの製造に関し、異なる酵素による仕上げ方法が開発されている。デニム衣類の仕上げは、通常、酵素による湯通し工程により開始され、この間、衣類はアミロース分解酵素による作用を受け、布地には柔軟性がもたらされ、木綿は以降の酵素による仕上げ工程による作用を受けやすくなる。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼは、デニム製衣類の仕上げ（例えば、「生物作用を利用したストーンウォッシュ加工」）、酵素による湯通し、及び布地に対する柔軟性の付与、及び／又は最終加工をする方法に使用することができる。
【０２１９】
７．洗浄組成物
本発明の組成物及び方法の一態様は、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼを構成成分として含有する洗浄組成物である。アミラーゼポリペプチドとイソアミラーゼは、手洗い、洗濯洗浄、食器洗い、及びその他の硬質表面洗浄用の洗剤組成物の構成成分として使用することができる。
【０２２０】
７．１．概略
好ましくは、洗剤にアミラーゼが一般的に使用される濃度で、又は濃度付近で、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼを洗剤に組み込む。例えば、アミラーゼポリペプチドは、洗浄／食器洗い液１Ｌ当たりアミラーゼ０．００００１〜１ｍｇ（高純度酵素タンパク質として計算）に相当する量で加えることができる。次に例示する通り、配合例を本明細書において提供する。
【０２２１】
アミラーゼポリペプチドは、唯一の酵素として、又はその他のアミロース分解酵素を含むその他の酵素とともに洗剤組成物の構成成分としてもよい。そのため、非散布顆粒、安定化液体、又は保護化酵素の形態で洗剤組成物に含有させることもできる。非散布顆粒は、米国特許第４，１０６，９９１号及び第４，６６１，４５２号に開示される通りに生成されてもよく、場合により、当該技術分野において既知の方法により、コーティングされてもよい。ワックスコーティング材料の例としては、平均分子量１，０００〜２０，０００を有するポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６〜５０個のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、エトキシ化脂肪アルコール（ここで、アルコールは、１２〜２０個の炭素原子を含有し、１５〜８０個のエチレンオキシド単位が存在する）、脂肪アルコール、脂肪酸、及び脂肪酸のモノ−及びジ−及びトリグリセリドである。流動層技術による適用に適当なフィルム形成コーティング材料の例は、例えば、米国特許第１４８３５９１号において与えられる。液体酵素製剤は、例えば、確立された方法に従い、ポリオール（例えば、プロピレングリコール）、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を加えることにより、安定化させてもよい。その他の酵素安定剤は、技術分野において既知である。保護化酵素は、例えば、欧州特許第２３８  ２１６号に開示される方法に従って調製することができる。ポリオールは、長きにわたりタンパク質安定剤として、並びにタンパク質溶解度を改良するとして認識されてきた。
【０２２２】
洗剤組成物は、例えば、粉末、顆粒、ペースト、又は液体などの任意の有用な形態であってよい。液体洗剤は水性であってよく、典１０，型的には、最大で約７０％の水及び０％〜約３０の有機溶媒から構成され得る。液体洗剤は、水をわずか約３０％含有するコンパクトジェルタイプの形態であってもよい。
【０２２３】
洗剤組成物は、１種以上の界面活性剤を含む、それぞれアニオン性、非イオン性、カチオン性、又は双極性であり得る。洗剤は、通常、０％〜約５０％のアニオン性界面活性剤、例えば、線状アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）、α−オレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ）、アルキル硫酸塩（脂肪族アルコール硫酸塩）（ＡＳ）、アルコールエトキシ硫酸塩（ＡＥＯＳ又はＡＥＳ）、第ニ級アルカンスルホン酸塩（ＳＡＳ）、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル又はアルケニルコハク酸、又は石鹸を含有し得る。組成物には、０％〜約４０％の非イオン性界面活性剤、例えば、アルコールエトキシレート（ＡＥＯ又はＡＥ）、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えば、国際公開第９２／０６１５４号に記載のものなど）を含有させることもできる。
【０２２４】
洗剤組成物には、追加して、１つ以上のその他の酵素、例えば、任意の組み合わせでプロテアーゼ、その他のアミロース分解酵素、クチナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペルヒドロラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、及び／又はラッカーゼなどを含ませることもできる。
【０２２５】
洗剤には、約１〜約６５％の洗剤結合剤、又は錯化剤、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＭＰＡ）、アルキル−又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（例えば、ＨｏｅｃｈｓｔのＳＫＳ−６）を含有させてもよい。洗剤は無ビルダー系であってよく、すなわち、洗剤ビルダーを本質的に不含有である。酵素は、酵素の安定性に適合性のある任意の組成物に使用することができる。酵素は、一般的に、既知の形態の封入により、例えば、造粒又はヒドロゲル中への隔離により、有害な成分から保護することができる。酵素、及び具体的にはデンプン結合ドメインを有する又は有さないアミラーゼを、洗濯及び食器洗い用途、表面クリーナー、並びにデンプン又はバイオマスからのエタノール生産用組成物を含む、多様な組成物に使用することができる。
【０２２６】
洗剤は、１種以上のポリマーを含んでいてもよい。例としては、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリカルボキシラート、例えば、ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー類、及びラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー類が挙げられる。
【０２２７】
洗剤には、Ｈ２Ｏ２供給源、例えば、過ホウ酸塩又は過炭酸塩（漂白活性化剤を形成する過酸、例えば、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）又はノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩（ＮＯＢＳ）と組み合わせてもよい）を含む漂白系を含有させてもよい。あるいは、漂白系は、ペルオキシ酸（例えば、アミド、イミド、又はスルホン型ペルオキシ酸）を含むものであってもよい。漂白系は、酵素系漂白系、例えば、国際公開第２００５／０５６７８３号に記載されるものなどのペルヒドロラーゼであってもよい。
【０２２８】
洗剤組成物の酵素は、通常の安定化剤、例えば、プロピレングリコール又はグリセロールなどのポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸又はホウ酸誘導体、例えば、芳香族ホウ酸塩エステルを用いて安定化されてもよく、組成物は、例えば、国際公開第９２／１９７０９号及び国際公開第９２／１９７０８号に記載される通り、配合することもできる。
【０２２９】
洗剤には、他の通常の洗剤成分、例えば、クレイを含む布地コンディショナ、起泡促進剤、抑泡剤、防食剤、汚れ懸濁化剤、汚れ再付着防止剤、染料、殺菌剤、変色防止剤、光学的光沢剤、又は香料を含有させてもよい。
【０２３０】
ｐＨ（使用濃度の水溶液で測定）は通常中性又はアルカリ性であり、例えば、ｐＨ約７．０〜約１１．０である。
【０２３１】
αアミラーゼを含有させための特定の形態の洗剤組成物を以降に記載する。
【０２３２】
７．２．重質液体（ＨＤＬ）洗濯洗剤組成物
ＨＤＬ洗濯洗剤組成物例には、アニオン性洗浄界面活性剤（線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアルコキシ化硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩、及び／又はこれらの混合物からなる群から選択される）、及び場合により非イオン性界面活性剤（線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換アルキルアルコキシ化アルコール、例えば、Ｃ８〜Ｃ１８アルキルエトキシ化アルコール及び／又はＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレートからなる群から選択される）を含有する洗浄界面活性剤（１０％〜４０（重量／重量）％）が含まれ、非イオン性洗浄界面活性剤に対するアニオン性洗浄界面活性剤（６．０〜９の親水性指数（ＨＩｃ）を有する）の重量比は１：１超である。好適な洗浄界面活性剤には、カチオン性洗浄界面活性剤（アルキルピリジニウム化合物、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルキル第四級ホスホニウム化合物、アルキル第三級スルホニウム化合物、及び／又はこれらの混合物からなる群から選択される）、双極性及び／又は両性洗浄界面活性剤（アルカノールアミンスルホベタインからなる群から選択される）、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、並びにこれらの混合物も含まれる。
【０２３３】
組成物には、場合により、両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマー（アルコキシル化ポリアルキレンイミンなどの、分岐状親水及び疎水特性を有するアルコキシル化ポリマーからなる群から０．０５重量％〜１０重量％の範囲で選択される）、及び／又はランダムグラフトポリマー（典型的には、不飽和Ｃ１〜Ｃ６カルボン酸、エーテル、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、糖単位、アルコキシ単位、マレイン酸無水物、グリセロールなどの飽和多価アルコール、及びこれらの混合物からなる群から選択されるモノマーを含む、親水性主鎖、Ｃ４〜Ｃ２５アルキル基、ポリプロピレン、ポリブチレン、飽和Ｃ１〜Ｃ６モノカルボン酸のビニルエステル、アクリル酸又はメタクリル酸のＣ１〜Ｃ６アルキルエステル、及びこれらの混合物からなる群から選択される疎水性側鎖（１種又は複数種）、を含む）から構成される界面活性増強ポリマーを含ませることもできる。
【０２３４】
組成物には、汚れ放出ポリマー（アニオン性末端保護ポリエステル、例えば、ＳＲＰ１、ランダム又はブロック構成で、糖、ジカルボン酸、ポリオール及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのモノマー単位を含むポリマー、ランダム又はブロック構成のエチレンテレフタラート系ポリマー及びそれらのコポリマー、例えば、Ｒｅｐｅｌ−ｏ−ｔｅｘ  ＳＦ、ＳＦ−２及びＳＲＰ６、Ｔｅｘｃａｒｅ  ＳＲＡ１００、ＳＲＡ３００、ＳＲＮ１００、ＳＲＮ１７０、ＳＲＮ２４０、ＳＲＮ３００及びＳＲＮ３２５、Ｍａｒｌｏｑｕｅｓｔ  ＳＬを含む）、再付着防止ポリマー（分子量５００〜１００，０００Ｄａの範囲の、アクリル酸、マイレン酸（若しくはマレイン酸無水物）、フマル酸、イタコン酸、アコニット酸、メサコン酸、シトラコン酸、メチレンマロン酸、及びこれらの任意の混合物から選択される少なくとも１種のモノマーを含むポリマー、ビニルピロリドンホモポリマー、及び／又はポリエチレングリコールなどのカルボキシラートポリマーを０．１重量％〜１０重量％含む）、セルロースポリマー（アルキルセルロース、アルキルアルコキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、アルキルカルボキシアルキルセルロース、例えば、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、メチルカルボキシメチルセルロース、及びこれらの混合物など、から選択されるものを含む）、並びに高分子カルボキシラート（マレアート／アクリレートランダムコポリマー又はポリアクリレートホモポリマーなど）などの追加のポリマーを含有させることもできる。
【０２３５】
組成物には、飽和又は不飽和脂肪酸、好ましくは飽和又は不飽和Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸（０重量％〜１０重量％）、付着助剤（例としては、多糖類、好ましくは、セルロースポリマー、ポリジアリールジメチルアンモニウムハロゲン化物（ＤＡＤ  ＭＡＣ）、及びランダム又はブロック構成の、ＤＡＤ  ＭＡＣとビニルピロリドン、アクリルアミド、イミダゾール、イミダゾリニウムハロゲン化物、及びこれらの混合物とのコポリマー、カチオン性グアーガム、カチオン性セルロース、例えば、カチオン性ヒドロキシエチルセルロース、カチオン性デンプン、カチオン性ポリアシルアミド、及びこれらの混合物など、を更に含有させることもできる。
【０２３６】
組成物には、更に移染防止剤、例えば、マンガンフタロシアニン、ペルオキシダーゼ、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドン及びＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール、及び／又はこれらの混合物、キレート剤、例えば、エチレン−ジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＴＰＭＰ）、ヒドロキシ−エタンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンＮ，Ｎ’−二コハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド（ＨＰＮＯ）、又はメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸Ｎ，Ｎ二酢酸（Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸テトラナトリム塩（ＧＬＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、４，５−ジヒドロキシ−ｍ−ベンゼンジスルホン酸、クエン酸及びそれらの塩、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノジ酢酸（ＨＥＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、エチレンジアミンテトラプロピオン酸（ＥＤＴＰ）、及びこれらの誘導体、を含ませることもできる。
【０２３７】
組成物に好ましく含有される酵素（一般的に、約０．０１重量％活性酵素〜０．０３重量％活性酵素）は、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ，リゾホスホリパーゼ、アシル基転移酵素、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、及びこれらの任意の混合物から選択される。組成物には酵素安定剤を含ませることもできる（例えば、プロピレングリコール又はグリセロールなどのポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸、可逆性プロテアーゼ阻害剤、ホウ酸、又はホウ酸誘導体、例えば、芳香族ホウ酸エステル、あるいはフェニルボロン酸誘導体、例えば、４−ホルミルフェニルボロン酸などを含む）。
【０２３８】
組成物は、場合により、シリコーン又は脂肪酸系抑泡剤、色相染料、カルシウム及びマグネシウムカチオン、視覚的シグナル成分、消泡剤（０．００１重量％〜約４．０重量％）、及び／又は構造剤／増粘剤（０．０１重量％〜５重量％、ジグリセリド及びトリグリセリド、エチレングリコールジステアレート、微小結晶セルロース、セルロース系材料、微小繊維セルロース、バイオポリマー、キサンタンガム、ジェランガム、及びこれらの混合物からなる群から選択される）を含む。
【０２３９】
組成物は任意の液体形態であってよく、例えば、液体又はジェル形態、あるいはこれらの組み合わせてあってよい。組成物は、任意の単回用量形態であってよく、例えば、パウチであってもよい。
【０２４０】
７．３．重質乾燥／固体（ＨＤＤ）洗濯洗剤組成物
ＨＤＤ洗濯洗剤組成物例には、アニオン性洗浄界面活性剤（例えば、線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアルコキシ化硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩及び／又はこれらの混合物）、非イオン性洗浄界面活性剤（例えば、線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換Ｃ８〜Ｃ１８アルキルエトキシレート、及び／又はＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレート）、カチオン性洗浄界面活性剤（例えば、アルキルピリジニウム化合物、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルキル四級ホスホニウム化合物、アルキル第三級スルホニウム化合物、及びこれらの混合物）、双極性及び／又は両性洗浄界面活性剤（例えば、アルカノールアミンスルホベタイン）、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、及びこれらの混合物を含む洗浄界面活性剤、無リン酸ビルダー（例えば、ゼオライトＡ、ゼオライトＸ、ゼオライトＰ、及びゼオライトＭＡＰなどのゼオライトビルダーを０重量％〜１０重量％未満の範囲）、リン酸塩ビルダー（例えば、ナトリウム三ポリホスフェートを０重量％〜１０重量％未満の範囲）、クエン酸、クエン酸塩及びニトリロ三酢酸、ケイ酸塩（例えば、ケイ酸ナトリウム若しくはカリウム、又はメタケイ酸ナトリウムを０重量％〜１０重量％未満の範囲、あるいは層状ケイ酸塩（ＳＫＳ−６））を含むビルダー、炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウム及び／又は重炭酸ナトリウムを０重量％〜８０重量％未満の範囲）、及び光漂白剤（例えば、スルホン化亜鉛フタロシアニン、スルホン化アルミニウムフタロシアニン、キサンテン染料、及びこれらの混合物）疎水性又は親水性漂白活性化剤（例えば、デカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシ安息香酸又はそれらの塩、３，５，５−トリメチ（trimethy）ヘキサノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、テトラアセチルエチレンジアミン−ＴＡＥＤ、ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩−ＮＯＢＳ、ニトリルクァット（nitrilequats）、及びこれらの混合物）、過酸化水素源（例えば、過ホウ酸ナトリムの一又は四水和物、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩、又は過ケイ酸塩などの無機過水和物塩）、予形成親水性及び／又は疎水性過酸（例えば、過カルボン酸及び塩、過炭酸及び塩、過ヨウ素酸及び塩、ペルオキシ一硫酸及び塩、及びこれらの混合物）、及び／又は漂白触媒（例えば、イミン系漂白増進剤（イミニウムカチオン及びポリイオンを含む）、イミニウム両性イオン、変性アミン、変性アミンオキシド、Ｎ−スルホニルイミン、Ｎ−ホスホニルイミン、Ｎ−アシルイミン、チアジアゾールジオキシド、ペルフルオロイミン、環状糖ケトン、及びこれらの混合物、並びに金属含有漂白触媒（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン、又は亜鉛若しくはアルミニウムなどの補助金属カチオンとともにマンガンカチオン、及びエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）などの金属イオン封鎖剤、及びこれらの水溶性塩）を含む漂白剤、が含まれる。
【０２４１】
組成物は、好ましくは酵素、例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ，リゾホスホリパーゼ、アシル基転移酵素、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、及びこれらの任意の混合物を含む。
【０２４２】
組成物には、場合により香料マイクロカプセル剤、デンプン封入香料調合物、色相剤、布地一体性及びカチオン性ポリマーを含む追加のポリマー、染料固定原材料、布地柔軟剤、光沢剤（例えば、Ｃ．Ｉ．蛍光光沢剤）、凝集剤、キレート化剤、アルコキシル化ポリアミン、布地付着助剤、及び／又はシクロデキストリンを含む追加の洗剤成分を含有させることもできる。
【０２４３】
７．４．自動食器洗い（ＡＤＷ）洗剤組成物
ＡＤＷ洗剤組成物例には、０〜１０％重量％の量で存在する、エトキシル化非イオン性界面活性剤、アルコールアルコキシル化界面活性剤、エポキシ保護ポリ（オキシアルキル化された）アルコール、又はアミンオキシド型界面活性剤を含む、非イオン性界面活性剤、５〜６０％の範囲の、リン酸塩ビルダー（例えば、モノリン酸塩、ジリン酸塩、トリポリリン酸、その他のポリホスフェートオリゴマー、トリポリリン酸ナトリウム−ＳＴＰＰ）及び無リン酸塩ビルダー（例えば、メチル−グリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）及びそれらの塩及び誘導体、グルタミン酸−Ｎ，Ｎ二酢酸（ＧＬＤＡ）及びそれらの塩及び誘導体、イミノ二コハク酸（ＩＤＳ）及びそれらの塩及び誘導体、カルボキシメチルイヌリン及びそれらの塩及び誘導体、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｂ−アラニン二酢酸（Ｂ−ＡＤＡ）及びそれらの塩、などのアミノ酸系化合物）、を含むビルダー、０．５％〜５０％重量％の範囲の、ポリカルボン酸ホモポリマー及びコポリマー類及びそれらの部分的に又は完全に中和された塩、ポリカルボン酸単量体、並びにヒドロキシカルボン酸及びそれらの塩、寸法安定性のため、約０．１重量％〜約５０重量％の範囲の、スルホン酸化／カルボキシル化ポリマー、約０．１重量％〜約１０重量％の範囲の乾燥助剤（例えば、ポリエステル、特にアニオン性ポリエステル（場合により重縮合を実施するための３〜６官能性、典型的には酸、アルコール又はエステル官能性を有するモノマーを更に一緒に含む）、ポリカーボネート−、ポリウレタン−及び／又はポリ尿素−ポリオルガノシロキサン化合物、又はそれらの、特に、反応性環状炭酸及び尿素型の前駆体化合物）約１％〜約２０％重量％の範囲のケイ酸塩（ケイ酸ナトリウム又はカリウム、例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、及び結晶質フィロケイ酸塩）、無機漂白剤（例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩、及び過ケイ酸塩などの過水和物塩）及び有機漂白剤（例えば、ジアシル及びテトラアシルペルオキシド、特に、ジペルオキシドデカン二酸、ジペルオキシテトラデカン二酸、及びジペルオキシヘキサデカン二酸を含む有機ペルオキシ酸）、漂白活性化剤（すなわち、約０．１％〜約１０％重量％の範囲の有機過酸前駆体）、漂白触媒（例えば、マンガントリアザシクロノナン、及び関連する錯体、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ、及びＦｅビスピリジルアミン、及び関連する錯体、及びペンタミン酢酸コバルト（ＩＩＩ）及び関連する錯体）、約０．１％〜５％重量％の範囲の金属ケア剤（例えば、ベンザトリアゾール、金属塩及び錯体、及び／又はケイ酸塩）、自動食器洗い洗剤組成物１ｇ当たり約０．０１〜５．０ｍｇの活性酵素の範囲の酵素（例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リゾホスホリパーゼ、アシル基転移酵素、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、及びこれらの混合物）、並びに酵素安定剤成分（例えば、オリゴ糖類、多糖類、及び無機二価金属塩類）が含まれる。
【０２４４】
７．５．追加の洗剤組成物
本発明のアミラーゼを加えることができる追加の洗剤配合物例を、以降の付番した段落に記載する。
【０２４５】
１）次のものを含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒剤として配合される、洗剤組成物：線状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約７％〜約１２％、アルコールエトキシ硫酸塩（例えば、Ｃ１２〜１８アルコール、１〜２エチレンオキシド（ＥＯ））又はアルキル硫酸塩（例えば、Ｃ１６〜１８）約１％〜約４％、アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１４〜１５アルコール、７  ＥＯ）約５％〜約９％、炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約１４％〜約２０％、可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約２〜約６％、ゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）約１５％〜約２２％、硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）０％〜約６％、クエン酸ナトリウム／クエン酸（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）約０％〜約１５％、ナトリウム過ホウ酸塩（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）約１１％〜約１８％、ＴＡＥＤ約２％〜約６％、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）及び０％〜約２％、ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸、コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）０〜３％、酵素（純粋な酵素として計算）０．０００１〜０．１％タンパク質、及び微量成分（例えば、抑泡剤、香料、光学的光沢剤、光漂白剤）０〜５％。
２）次のものを含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する、顆粒剤として配合される洗剤組成物：線状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約６％〜約１１％、アルコールエトキシ硫酸塩（例えば、Ｃ１２〜１８アルコール、１〜２  ＥＯ）又はアルキル硫酸塩（例えば、Ｃ１６〜１８）約１％〜約３％、アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１４〜１５アルコール、７  ＥＯ）約５％〜約９％、炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約１５％〜約２１％、可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約１％〜約４％、ゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）約２４％〜約３４％、硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）約４％〜約１０％、クエン酸ナトリウム／クエン酸（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）０％〜約１５％、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％、ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）１〜６％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％、微量成分（例えば、抑泡剤、香料）０〜５％。
３）次のものを含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する、顆粒剤として配合される洗剤組成物：線状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約５％〜約９％、アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７  ＥＯ）約７％〜約１４％、脂肪酸としての石鹸（例えば、Ｃ１６〜２２脂肪酸）約１〜約３％、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）約１０％〜約１７％、可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約３％〜約９％、ゼオライト（ＮａＡ１ＳｉＯ４として）約２３％〜約３３％、硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）０％〜約４％、ナトリウム過ホウ酸塩（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）約８％〜約１６％、ＴＡＥＤ約２％〜約８％、ホスホン酸塩（例えば、ＥＤＴＭＰＡ）０％〜約１％、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％、ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）０〜３％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％、微量成分（例えば、抑泡剤、香料、光学的光沢剤）０〜５％。
４）次のものを含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する、顆粒剤として配合される洗剤組成物：線状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約８％〜約１２％、アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７  ＥＯ）約１０％〜約２５％、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）約１４％〜約２２％、可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約１％〜約５％、ゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）約２５％〜約３５％、硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）０％〜約１０％、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％、ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）１〜３％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％、及び微量成分（例えば、抑泡剤、香料）０〜５％。
５）次のものを含む水性液体洗剤組成物：線状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約１５％〜約２１％、アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７  ＥＯ又はＣ１２〜１５アルコール、５  ＥＯ）約１２％〜約１８％、脂肪酸として石鹸（例えば、オレイン酸）約３％〜約１３％、アルケニルコハク酸（Ｃ１２−１４）０％〜約１３％、アミノエタノール約８％〜約１８％、クエン酸約２％〜約８％、ホスホン酸塩０％〜約３％、ポリマー（例えば、ＰＶＰ、ＰＥＧ）０％〜約３％、ホウ酸（例えば、Ｂ４Ｏ７）０％〜約２％、エタノール０％〜約３％、プロピレングリコール約８％〜約１４％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％、及び微量成分（例えば、懸濁剤、抑泡剤、香料、光学的光沢剤）０〜５％。
６）次のものを含む水性構造化液体洗剤組成物：線状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約１５％〜約２１％、アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７  ＥＯ、又はＣ１２〜１５アルコール、５  ＥＯ）３〜９％、脂肪酸として石鹸（例えば、オレイン酸）約３％〜約１０％、ゼオライト（ＮａＡ１ＳｉＯ４として）約１４％〜約２２％、クエン酸カリウム約９％〜約１８％、ホウ酸（例えば、Ｂ４Ｏ７）０％〜約２％、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ＰＶＰ）０％〜約３％、アンカリングポリマー（例えば、ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーなど、モル比２５：１、分子量３８００）０％〜約３％；グリセロール０％〜約５％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％、及び微量成分（例えば、懸濁剤、抑泡剤、香料、光学的光沢剤）０〜５％。
７）次のものを含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する、顆粒剤として配合される洗剤組成物：脂肪族アルコール硫酸塩約５％〜約１０％、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド約３％〜約９％、脂肪酸として石鹸０〜３％、炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約５％〜約１０％、可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約１％〜約４％、ゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）約２０％〜約４０％、硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）約２％〜約８％、過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）約１２％〜約１８％、ＴＡＥＤ約２％〜約７％、ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）約１％〜約５％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％、及び微量成分（例えば、光学的光沢剤、抑泡剤、香料）０〜５％。
８）次のものを含み、顆粒剤として配合される洗剤組成物：線状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約８％〜約１４％、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド約５％〜約１１％、脂肪酸として石鹸０％〜約３％、炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約４％〜約１０％、可溶性ケイ酸塩（Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約１％〜約４％、ゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）約３０％〜約５０％、硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）約３％〜約１１％、クエン酸ナトリウム（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）約５％〜約１２％、ポリマー（例えば、ＰＶＰ、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）約１％〜約５％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％、及び微量成分（例えば、抑泡剤、香料）０〜５％。
９）次のものを含み、顆粒剤として配合される洗剤組成物：線状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約６％〜約１２％、非イオン性界面活性剤約１％〜約４％、脂肪酸として石鹸約２％〜約６％、炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約１４％〜約２２％、ゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）約１８％〜約３２％、硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）約５％〜約２０％、クエン酸ナトリウム（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）約３％〜約８％、過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）約４％〜約９％、漂白活性化剤（例えば、ＮＯＢＳ、又はＴＡＥＤ）約１％〜約５％、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％、ポリマー（例えば、ポリカルボキシレート、又はＰＥＧ）約１％〜約５％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％、及び微量成分（例えば、光学的光沢剤、香料）０〜５％。
１０）次のものを含む水性液体洗剤組成物：線状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約１５％〜約２３％、アルコールエトキシ硫酸塩（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、２〜３ＥＯ）約８％〜約１５％、アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７  ＥＯ、又はＣ１２〜１５アルコール、５  ＥＯ）約３％〜約９％、脂肪酸として石鹸（例えば、ラウリン酸）０％〜約３％、アミノエタノール約１％〜約５％、クエン酸ナトリウム約５％〜約１０％、ヒドロトロープ（例えば、ナトリウムトルエンスルホン酸塩）約２％〜約６％、ホウ酸（例えば、Ｂ４Ｏ７）０％〜約２％、カルボキシメチルセルロース０％〜約１％、エタノール約１％〜約３％、プロピレングリコール約２％〜約５％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％、及び微量成分（例えば、ポリマー、懸濁剤、香料、光学的光沢剤）０〜５％。
１１）次のものを含む水性液体洗剤組成物：線状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約２０％〜約３２％、アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７  ＥＯ、又はＣ１２〜１５アルコール、５  ＥＯ）６〜１２％、アミノエタノール約２％〜約６％、クエン酸約８％〜約１４％、ホウ酸（例えば、Ｂ４Ｏ７）約１％〜約３％、ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、アンカリングポリマー、例えば、ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー）０％〜約３％、グリセロール約３％〜約８％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％、及び微量成分（例えば、ヒドロトロープ、懸濁剤、香料、光学的光沢剤）０〜５％。
１２）次のものを含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する、顆粒剤として配合される洗剤組成物：アニオン性界面活性剤（線状アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホン酸塩、石鹸）約２５％〜約４０％、非イオン性界面活性剤（例えば、アルコールエトキシレート）約１％〜約１０％、炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約８％〜約２５％、可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約５％〜約１５％、硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）０％〜約５％、ゼオライト（ＮａＡ１ＳｉＯ４）約１５％〜約２８％、過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３．４Ｈ２Ｏ）０％〜約２０％、漂白活性化剤（ＴＡＥＤ又はＮＯＢＳ）約０％〜約５％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％、微量成分（例えば、香料、光学的光沢剤）０〜３％。
１３）上記組成物１）〜１２）に記載の通りの洗剤組成物であって、線状アルキルベンゼンスルホン酸塩の全て又は一部が（Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキル硫酸塩により置き換えられている組成物。
１４）次のものを含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有し、顆粒剤として配合される洗剤組成物：（Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキル硫酸塩約９％〜約１５％、アルコールエトキシレート約３％〜約６％、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド約１％〜約５％、ゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）約１０％〜約２０％、層化ニケイ酸エステル（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ由来のＳＫ５６）約１０％〜約２０％、炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約３％〜約１２％、可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）０％〜約６％、クエン酸ナトリウム約４％〜約８％、ナトリウム過炭酸塩約１３％〜約２２％、ＴＡＥＤ約３％〜約８％、ポリマー（例えば、ポリカルボキシレート及びＰＶＰ）０％〜約５％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％、及び微量成分（例えば、光学的光沢剤、光漂白剤、香料、抑泡剤）０〜５％。
１５）次のものを含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有し、顆粒剤として配合される洗剤組成物：（Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキル硫酸塩約４％〜約８％、アルコールエトキシレート約１１％〜約１５％、石鹸約１％〜約４％、ゼオライトＭＡＰ又はゼオライトＡ約３５％〜約４５％、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）約２％〜約８％、可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）０％〜約４％、ナトリウム過炭酸塩約１３％〜約２２％、ＴＡＥＤ  １〜８％、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約３％、ポリマー（例えば、ポリカルボキシレート及びＰＶＰ）０％〜約３％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％、及び微量成分（例えば、光学的光沢剤、ホスホン酸塩、香料）０〜３％。
１６）上記１）〜１５）に記載される通りの洗剤配合物であって、追加成分として、又はすでに記載されている漂白系の代替として安定化又は封入された過酸を含有する配合物。
１７）上記１）、３）、７）、９）、及び１２）に記載される通りの洗剤配合物であって、過ホウ酸塩が過炭酸塩により置き換えられている、配合物。
１８）上記１）、３）、７）、９）、１２）、１４）、及び１５）に記載される通りの洗剤配合物であって、マンガン触媒を更に含有する、配合物。マンガン触媒は、例えば、「低温漂白に効果的なマンガン触媒（Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching）」Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６３７〜６３９（１９９４）に記載の化合物のうちの１つである。
１９）液体非イオン性界面活性剤、例えば、線状アルコキシル化一級アルコールなど、ビルダー系（例えば、リン酸）、及び酵素（１種又は複数種）、及びアルカリを含む非水性洗剤液体として配合された洗剤組成物。洗剤には、アニオン性界面活性剤及び／又は漂白系を含ませることもできる。
【０２４６】
上記の通り、本発明のアミラーゼポリペプチドは、従来洗剤において採用されていた濃度で組み込むことができる。本発明では、洗剤組成物において、酵素は、洗浄液１Ｌ当たり０．００００１〜１．０ｍｇ（純粋な酵素タンパク質として計算）のアミラーゼポリペプチドに相当する料で添加され得ることが想到される。
【０２４７】
洗剤組成物には、その他の従来の洗剤原材料、例えば、解膠剤、充填材、消泡剤、抗腐食剤、汚れ懸濁剤、キレート化剤、抗汚れ再付着剤、脱水剤、染料、殺菌剤、蛍光剤、増粘剤、及び香料も含有させることができる。
【０２４８】
洗剤組成物は、染みの付着した布地の前処理剤、及びすすぎ時添加型布地柔軟剤組成物に好適な洗濯添加剤組成物を含む、手洗い（手動）又は機械（自動）洗濯洗剤組成物として配合することもでき、あるいは一般的な家庭用硬質表面洗浄操作で使用するための洗剤組成物として配合することもでき、あるいは手動又は自動食器洗い操作のために配合することもできる。
【０２４９】
本明細書に記載の任意の洗浄組成物には任意の数の追加の酵素を含有させることもできる。一般的には、酵素（１種又は複数種）は選択された洗剤と適合する必要があり（例えば、最適ｐＨが適合する、並びにその他の酵素及び非酵素成分と適合するなど）、並びに酵素（１種又は複数種）は有効な量で存在させる必要がある。次の酵素が例として提供される。
【０２５０】
プロテアーゼ：適当なプロテアーゼには、動物、野菜又は微生物起源のものを含む。化学修飾した又はタンパク質工学による変異体、並びに天然にプロセシングを受けたタンパク質が含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼ、アルカリ性微生物プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、又はキモトリプシン様プロテアーゼであってよい。アルカリプロテアーゼの例としては、サブチリシン、特に、例えば、バチルス（Bacillus）由来のサブチリシンＮｏｖｏ、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン３０９（例えば、米国特許第６，２８７，８４１号を参照されたい）、サブチリシン１４７、及びサブチリシン１６８が挙げられる。トリプシン様プロテアーゼの例としては、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源のもの）、フザリウム（Fusarium）プロテアーゼ（例えば、国際公開公報第８９／０６２７０号及び国際公開公報第９４／２５５８３号を参照）が挙げられる。有用プロテアーゼの例としては、国際公開第９２／１９７２９号、国際公開第９８／２０１１５号、国際公開第９８／２０１１６号、及び国際公開第９８／３４９４６号に記載の変異体も挙げられるがこれらに限定されない。市販のプロテアーゼ酵素としては、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（商標）、ＤＵＲＡＬＡＳＥ（商標）、ＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（商標）、及びＢＬＡＺＥ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ及びＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ  ＯＸＰ（商標）、ＦＮ２（商標）、及びＦＮ３（商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．）が挙げられるがこれらに限定されない。その他のプロテアーゼ例としては、バチルス・アミロリキファシエンス（Bacillus amylo liquifaciens）由来のＮｐｒＥ、及びセルロモナス種（Cellulomonas sp.）株６９Ｂ４由来のＡＳＰが挙げられる。
【０２５１】
リパーゼ：好適なリパーゼとしては、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学修飾した又はタンパク質の分解により変更を受けた又はタンパク質工学による変異体が含まれる。有用なリパーゼの例としては、フミコラ（Humicola）由来のリパーゼ（異名：サーモマイセス（Thermomyces））例えば、Ｈ．ラヌギノーサ由来（H.lanuginosa）（Ｔ．ラヌギノサス（T.lanuginosus））（例えば、欧州特許第２５８０６８号及び欧州特許第３０５２１６号を参照されたい）、Ｈ．インソレン（H.insolen）由来（例えば、国際公開第９６／１３５８０号を参照されたい）、シュードモナス（Pseudomonas）リパーゼ（例えば、Ｐ．アルカリゲネス（P.alcaligenes）又はＰ．シュードアルカリゲネス（P.pseudoalcaligenes）、例えば、欧州特許第２１８  ２７２号を参照されたい）、Ｐ．セパシア（P.cepacia）（例えば、欧州特許第３３１  ３７６号を参照されたい）、Ｐ．スツッツェリ（P.stutzeri）（例えば、英国特許第１，３７２，０３４号を参照されたい）、Ｐ．フルオレセンス（P.fluorescens）、シュードモナス（Pseudomonas）ｓｐ．株ＳＤ  ７０５（例えば，国際公開第９５／０６７２０号及び国際公開第９６／２７００２号を参照されたい）、Ｐ．ウィスコンシンシ（P.wisconsinensi）（例えば、国際公開第９６／１２０１２号を参照されたい）、バチルス（Bacillus）リパーゼ（例えば、Ｂ．スブチリシン（B.subtilis）、例えば、Ｄａｒｔｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１３１：２５３〜３６０（１９９３）を参照されたい）、Ｂ．ステアロサーモフィル（B.stearothermophilu）（例えば、日本特許第６４／７４４９９２号を参照されたい）、又はＢ．プミル（B.pumilu）（例えば、国際公開第９１／１６４２２号を参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない。配合物における使用が想到される追加のリパーゼ変異体としては、例えば、国際公開第９２／０５２４９号、国際公開第９４／０１５４１号、国際公開第９５／３５３８１号、国際公開第９６／００２９２号、国際公開第９５／３０７４４号、国際公開第９４／２５５７８号、国際公開第９５／１４７８３号、国際公開第９５／２２６１５号、国際公開第９７／０４０７９号、国際公開第９７／０７２０２号、欧州特許第４０７２２５号、及び欧州特許第２６０１０５号、に記載のものが挙げられる。いくつかの市販のリパーゼ酵素としては、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）及ぼいＬＩＰＯＬＡＳＥ  ＵＬＴＲＡ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ及びＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）が挙げられる。
【０２５２】
ポリエステラーゼ：例えば、国際公開第０１／３４８９９号、国際公開第０１／１４６２９号、及び米国特許第６９３３１４０号に記載のものなどの好適なポリエステラーゼを組成物に含有させることができる。
【０２５３】
アミラーゼ：組成物は、生産性を増強させるものではないアミラーゼなどの、その他のアミラーゼと組み合わせることができる。これらとしては、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）及びＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ及びＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）、ＰＯＷＥＲＡＳＥ（登録商標）、及びＰＵＲＡＳＴＡＲ（登録商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．）などの市販のアミラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５４】
セルラーゼ：セルラーゼを組成物に加えることができる。好適なセルラーゼには、細菌又は真菌由来のものが含まれる。化学修飾した変異体又はタンパク質を遺伝子操作した変異体が含まれる。好適なセルラーゼとしては、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、フミコラ（Humicola）属、フザリウム（Fusarium）属、チエラビア（Thielavia）属、アクレモニウム（Acremonium）属由来のセルラーゼ、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号、米国特許第５，６４８，２６３号、米国特許第５，６９１，１７８号、米国特許第５，７７６，７５７号、及び国際公開公報第８９／０９２５９号などに開示される、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Myceliophthora thermophila）及びフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）から産生される真菌セルラーゼが挙げられる。用いるために企図された典型的なセルラーゼは、布に対し有益な色ケア効果を有するものである。このようなセルラーゼの例は、例えば、欧州と特許第０４９５２５７号、欧州特許第０５３１３７２号、国際公開第９６／１１２６２号、国際公開第９６／２９３９７号、及び国際公開第９８／０８９４０号に記載のセルラーゼである。その他の例は、国際公開第９４／０７９９８号、国際公開第９８／１２３０７号、国際公開第９５／２４４７１号、国際出願ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９号、欧州特許第５３１３１５号、米国特許第５，４５７，０４６号、米国特許第５，６８６，５９３号、及び米国特許第５，７６３，２５４号に記載のものなどのセルラーゼ変異体である。市販のセルラーゼとしては、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）及びＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ及びＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＣＬＡＺＩＮＡＳＥ（登録商標）及びＰＵＲＡＤＡＸＨＡ（登録商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．）、及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（Ｋａｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。
【０２５５】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：組成物において用いるために企図された適当なペルオキシダーゼ／オキシダーゼには、植物、細菌又は真菌起源のものを含む。化学修飾した変異体又はタンパク質を遺伝子操作した変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、国際公開公報第９３／２４６１８号、国際公開公報第９５／１０６０２号、及び国際公開公報第９８／１５２５７号に記載される、コプリナス（Coprinus）由来、例えば、コプリナス・シネレウス（C. cinereus）由来のペルオキシダーゼ、及びその変異体が挙げられる。市販のペルオキシダーゼとしては、例えば、ＧＵＡＲＤＺＹＭＥ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ及びＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）が挙げられる。
【０２５６】
洗剤組成物には、２，６−β−Ｄ−フルクタン加水分解酵素を含ませてもよく、これは、本発明の家庭用及び／又は工業用織物／洗濯物上に存在するバイオフィルムの除去／洗浄に有効である。
【０２５７】
洗剤酵素（１種又は複数種）は、１つ以上の酵素を含有する別個の添加剤を加えることにより、又はこれらの酵素の全てを含む組み合わせた添加剤を加えることにより、洗剤組成物に含有させることもできる。洗剤添加剤、すなわち、別個の添加剤又は組み合わせた添加剤は、例えば、顆粒剤、液体、及びスラリーなどとして配合することができる。洗剤添加剤配合物例としては、顆粒剤、特に非散布顆粒顆粒剤、液体、特に安定化された液体又はスラリーが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２５８】
非散布顆粒は、米国特許第４，１０６，９９１号及び第４，６６１，４５２号に開示される通りに生成されてもよく、場合により、当該技術分野において既知の方法により、コーティングされてもよい。ワックスコーティング材料の例としては、平均分子量１，０００〜２０，０００を有するポリ（エチレンオキシド）製品（例えば、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６〜５０個のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、エトキシ化脂肪アルコール（ここで、アルコールは、１２〜２０個の炭素原子を含有し、１５〜８０個のエチレンオキシド単位が存在する）、脂肪アルコール、脂肪酸、及び脂肪酸のモノ及びジ及びトリグリセリドである。流動層技術による適用に適当なフィルム形成コーティング材料の例は、例えば、米国特許第１４８３５９１号において与えられる。液体酵素製剤は、例えば、確立された方法に従い、ポリオール（例えば、プロピレングリコール）、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を加えることにより、安定化させてもよい。保護化酵素（Protectedenzyme）を、欧州公開公報第２３８，２１６号に開示される方法に従い調製してもよい。
【０２５９】
洗剤組成物は、任意の便利な形態であってよく、例えば、バー、錠剤、粉末、顆粒剤、ペースト、又は液体であってよい。液体洗剤は水性であってよく、典型的には、最大で約７０％の水及び０％〜約３０の有機溶媒から構成され得る。約３０％以下の水を含有するコンパクト洗剤ジェルも想到される。洗剤組成物には、場合により１つ以上の界面活性剤を含ませることができ、界面活性剤は、半極性などの非イオン性及び／又はアニオン性及び／又はカチオン性及び／又は双極性であってよい。界面活性剤は、約０．１重量％〜約６０％重量％の広範な範囲で存在させることができる。
【０２６０】
含有させる際、洗剤には、典型的には、約１％〜約４０％でアニオン性界面活性剤、例えば、線状アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩（脂肪族アルコール硫酸塩）、アルコールエトキシ硫酸塩、第ニ級アルカンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル又はアルケニルコハク酸、又は石鹸などを含有させる。
【０２６１】
含有させる際、洗剤には、通常、約０．２％〜約４０％で非イオン性界面活性剤、例えば、アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ−アシル−Ｎ−アルキル誘導体（「グルカミド」）を含有させる。
【０２６２】
洗剤には、０〜約６５％洗剤ビルダー、又は錯化剤、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル−又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（例えば、ＨｏｅｃｈｓｔのＳＫＳ−６）を含有させてもよい。
【０２６３】
洗剤は、１種以上のポリマーを含んでいてもよい。ポリマー例としては、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート、例えば、ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー類）、及びラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー類が挙げられる。
【０２６４】
洗剤組成物の酵素（１種又は複数種）は、一般的な安定化剤、例えば、ポリオール（例えば、プロピレングリコール又はグリセロール）、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体（例えば、芳香族ホウ酸エステル）、又はフェニルボロン酸誘導体（例えば、４−ホルミルフェニルボロン酸）を使用し安定化することもできる。組成物は、国際公開第９２／１９７０９号及び国際公開第９２／１９７０８号に記載の通りに配合することができる。
【０２６５】
洗剤組成物には、特に酵素変異体を、洗浄液１Ｌ当たり酵素タンパク質約０．０１〜約１００ｍｇに相当する量で加えることができるものと想到される（例えば、洗浄液１Ｌ当たり約０．０５〜約５．０ｍｇの酵素タンパク質、又は洗浄液１Ｌ当たり０．１〜約１．０ｍｇの酵素タンパク質）。
【０２６６】
本発明の組成物及び方法は以降の詳細を参照して記載されているものの、多様な変更をなすことができることは理解されたい。
【０２６７】
７．６．洗剤組成物中のアミラーゼ活性を評価する方法
布片及び微小布片アッセイを含む、数多くのαアミラーゼ洗浄アッセイが当該技術分野において既知である。添付の実施例は、このようなアッセイをほんのわずかに記載する。
【０２６８】
組成物及び方法、並びにそれらの利点を更に説明する目的で以降の具体例が提供され、これらの例は、制限を意図するというよりは例示を意図するものであることは理解される。
【０２６９】
８．醸造組成物
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼは、醸造プロセス、すなわち、発酵麦芽飲料の作製に使用される醸造組成物の構成成分とすることもできる。非発酵性炭水化物が、最終的なビールにおける溶解固体の大部分を形成する。この残留物は、デンプンのα１，６結合を加水分解する麦芽アミラーゼが作用しないために残留する。非発酵性炭水化物は、ビール３５４．９ｍＬ（１２オンス）当たり約５０カロリーをもたらす。ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼを、グルコアミラーゼ及び場合によりプルラナーゼ及び／又はイソアミラーゼと組み合わせることにより、デンプンのデキストリン及び発酵性糖類への変換が補助され、最終的なビール中に残留する非発酵性炭水化物が減少する。
【０２７０】
これらの飲料の製造に使用される主要な原材料は、水、ホップ、及び麦芽である。加えて、一般的なコーングリッツ、精製コーングリッツ、醸造者により粉砕された酵母、米、ソルガム、精製コーンデンプン、大麦、大麦デンプン、脱穀された大麦、小麦、小麦デンプン、炒って加熱処理された穀草、穀草フレーク、ライ麦、オーツ麦、ジャガイモ、タピオカ、及びシロップ、例えばトウモロコシシロップ、サトウキビシロップ、反転型糖シロップ、大麦及び／又は小麦シロップ、及び同様物、などの添加剤をデンプン源として使用することもできる。
【０２７１】
数多くの理由により、選別された大麦品種から主として作製される麦芽は、ビールの最終的な特徴及び品質に大きく影響を与える。第１に、麦芽はビールにおける主要な矯味矯臭剤である。第２に、麦芽は発酵性糖の大部分を提供する。第３に、麦芽はビールのボディ及び泡の特徴に関係するタンパク質を提供する。第４に、麦芽はマッシュ中に必要な酵素活性を提供する。ホップもビールの芳香を含む品質の大部分に関係する。具体的には、ホップ（又はホップ構成成分）は、好ましい苦味物質をビールに加える。加えて、ホップはタンパク質沈殿剤として作用し、防腐剤となり、泡の形成及び安定化を補助する。
【０２７２】
穀物、例えば、大麦、オーツ麦、小麦、並びに植物成分、トウモロコシ、ホップ、及び米も、工業用及び家庭用醸造の両方の醸造に使用される。醸造に使用される成分は、麦芽生成されていなくてもよく、あるいは麦芽生成されていてよく、すなわち、部分的に発芽させ、結果として、αアミラーゼを含む酵素濃度を上昇させることもできる。首尾よく醸造するため、発酵に適切な濃度の糖を保証するため、αアミラーゼ酵素の活性レベルは適切である必要がある。したがって、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体そのものを、又はその他のαアミラーゼ（１種又は複数種）と組み合わせて、醸造に使用される構成成分に加えることもできる。
【０２７３】
本明細書で使用するとき、用語「ストック」は、圧搾又は破壊された穀物及び植物成分を意味する。例えば、ビールの生産に使用される大麦は、発酵用マッシュの生産に適切な稠度を得るため、粗く磨砕し又は破砕した穀粒である。本明細書で使用するとき、用語「ストック」は、破砕又は粗く磨砕された形態の、前述の任意の種類の植物又は穀物を含む。本明細書に記載の方法を使用して、製粉穀物及びストックの両方におけるα−アミラーゼ活性のレベルを判定することもできる。
【０２７４】
ビールの製造プロセスは当該技術分野において周知である。例えば、Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｋｕｎｚｅ（２００４）「醸造及び麦芽製造技術（Technology Brewing and Malting）」、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅａｃｈｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（ＶＬＢ），３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．を参照されたい。簡潔に述べると、プロセスは、（ａ）マッシュを準備すること、（ｂ）マッシュを濾過して糖化液を調製すること、及び（ｃ）糖化液を発酵させて、ビールなどの発酵飲料を得ること、を包含する。典型的には、粉砕又は破砕麦芽を水と混合し、温度調節下で一定時間保持し、麦芽中に存在する酵素に、麦芽中に存在するデンプンを発酵性糖類に変換させる。次にマッシュをマッシュフィルタに移し、穀物残渣から液体を分離する。この甘みのある液体を「糖化液」と呼び、後に残った穀物残渣を「粕」と呼ぶ。マッシュは、典型的には抽出され、抽出は、残留可溶性抽出物を粕から回収する目的で水をマッシュに加えることを包含する。次に糖化液を激しく沸騰させて糖化液を滅菌し、色、香り及び匂いの展開を補助する。沸騰中のどこかの時点でホップを加える。糖化液を冷却し、発酵層に移す。
【０２７５】
次に、発酵槽内で糖化液を酵母と接触させる。発酵槽を冷却し、発酵を停止させてもよい。酵母の凝集塊は除去する。最後に、ビールを冷却し、ビールを清澄化させ芳香を展開させる間に一定時間貯蔵し、ビールの見た目、芳香及び貯蔵寿命を損なう任意の物質を沈降させる。ビールは、通常、約２％〜約１０（体積／体積）％のアルコールを含有するものの、高アルコール含量、例えば、１８（体積／体積）％を得ることもできる。充填前、ビールには炭酸を加え、所望により、濾過及び低温殺菌する。
【０２７６】
ＡｃＡｍｙ１又はその変異体とイソアミラーゼを、グルコアミラーゼ及び場合によりプルラナーゼ及び／又はイソアミラーゼと組み合わせて含む、醸造組成物を、上記工程（ａ）のマッシュに、すなわちマッシュの調製中に加えることもできる。あるいは、又は加えて、醸造組成物を上記工程（ｂ）のマッシュに、すなわち、マッシュの濾過中に加えることもできる。あるいは、又は加えて、醸造組成物を上記工程（ｃ）の糖化液に、すなわち、糖化液の発酵中に加えることもできる。
【０２７７】
上記の方法のいずれかにより、ビールなどの発酵飲料を生産することができる。発酵飲料は、麦芽のみのビール、「ビール純粋令」下で醸造されたビール、エール、ＩＰＡ、ラガー、ビター、発泡酒（第２のビール）、第３のビール、ドライビール、ニア・ビール、ライト・ビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボック・ビール、スタウト、モルト・リカー、ノンアルコールビール、ノンアルコールモルト・リカー、及び同様物が包含されるものの、別の穀草及び麦芽汁飲料、例えば、果実フレーバーの麦芽汁飲料（例えば、シトラスフレーバー、レモン、オレンジ、ライム）、又はベリーフレーバーの麦芽汁飲料、蒸留酒フレーバーの麦芽汁飲料、例えば、ウォッカ、ラム、又はテキーラフレーバーのモルト・リカー、あるいはコーヒーフレーバーの麦芽汁飲料（カフェインフレーバーのモルト・リカー）、及び同様物などのビールであり得る。
【０２７８】
９．ヨウ素陽性デンプンの減少
液化及び／又は糖化方法に使用するとき、ＡｃＡｍｙ１及びその変異体とイソアミラーゼは、ヨウ素陽性デンプン（ＩＰＳ）を減少させ得る。ＩＰＳの供給源の１つは、加水分解を逃れたアミロースに由来し、及び／又はデンプンポリマーの老化に由来する。デンプン分子には、別の分子に結合し、結晶化度を増加させる傾向があるため、時間経過とともに、デンプンの老化はデンプンペースト、又はジェルに自然に生じる。低濃度の溶液は、デンプン分子が積極的により大きな物体へと会合するため、濁度が増加する。沈澱が自然発生した場合、沈殿したデンプンは、その元来の冷水不溶性の状態を取り戻しているように思われる。高濃度のペーストは、冷却によりジェルに変化し、時間経過とともに、デンプン分子の会合が増加することにより着実に堅固さを増す。これは、近接するデンプン分子上のヒドロキシ基間に水素結合が形成される傾向が強くあることから生じる。Ｊ．Ａ．Ｒａｄｌｅｙ，ｅｄ．，デンプン及びその誘導体（Starch And Its Derivatives）１９４〜２０１（Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９６８））を参照されたい。
【０２７９】
糖液中にＩＰＳが存在すると、最終生成物の品質に悪影響が生じ、下流の加工で重要な問題となる。ＩＰＳは濾過系に詰まり又は減速させ、精製に使用される炭素カラムを塞ぐ。ＩＰＳが十分な高濃度に達すると、ＩＰＳは炭素カラムを通過して漏れだし、生産効率を低下させる。加えて貯蔵時に、最終生成物に、最終生成物の品質に望ましくない濁りを生じさせる恐れがある。ＩＰＳの量は、糖化槽を隔離し、内容物を戻し混合することにより減少させることができる。それでも尚、ＩＰＳは、とりわけ炭素カラム及び濾過系に蓄積する。したがって、ＡｃＡｍｙ１又はその変異体の使用は、ＩＰＳの量を減少させることにより最終的なプロセスの性能を改良するものと見込まれる。
【実施例】
【０２８０】
実施例１：ＡｃＡｍｙ１のクローニング
アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）のゲノムを配列決定した。インターネット上の、ｈｔｔｐ：／／ａｓｐｇｄ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ａｓｐ２＿ｖ３／ｓｈａｒｅｄ／ｓｈｏｗ＿ｏｒｇａｎｉｓｍ．ｃｇｉ？ｓｉｔｅ＝ａｓｐ２＿ｖ３＆ｉｄ＝２で、アスペルギルス（Aspergillus）１０−ｗａｙ比較データベースａｓｐ２＿ｖ３を参照されたい（２０１０年５月２４日ダウンロード）。Ａ．クラバタス（A. clavatus）は、ＢＬＡＳＴ検索から決定される通り、その他の真菌αアミラーゼと相同性を有するグリコシル加水分解酵素をコードする。図１を参照されたい。８つのイントロンを含むＡｃＡｍｙ１遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号２に記載する。類似配列はＮＣＢＩ参照番号ＸＭ＿００１２７２２４４．１で存在するアスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）ＮＲＲＬ  １αアミラーゼ（推定）である（ＡＣＬＡ＿０５２９２０；配列番号７）。ＮＣＢＩ参照番号ＸＭ＿００１２７２２４４．１で開示されるポリヌクレオチドは、８つのイントロン配列を欠くＡｃＡｍｙ１をコードするｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡ配列を表す。
【０２８１】
ＡｃＡｍｙ１遺伝子は、次のプライマー：プライマー１（Ｎｏｔ  Ｉ）５’−ｇｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃｃａｃｃＡＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣ−３’（配列番号８）、及びプライマー２（Ａｓｃ  Ｉ）５’−ｃｃｃｇｇｃｇｃｇｃｃｔｔａＴＣＡＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＴＣＣＡＣ−３’（配列番号９）を使用し、アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）のゲノムＤＮＡから増幅した。Ｎｏｔ  Ｉ及びＡｓｃ  Ｉによる消化後、同じ制限酵素により消化したｐＴｒｅｘ３ｇＭ発現ベクター（米国特許出願第２０１１／０１３６１９７（Ａ１）号に記載）にＰＣＲ産物をクローニングし、得られたプラスミドはｐＪＧ１５３とラベルした。ｐＪＧ１５３のプラスミドマップを図２に提供する。ＡｃＡｍｙ１遺伝子の配列はＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。この配列は、配列番号２とは２つの位置、すなわち塩基１１６５（Ｇ→Ａ）及び１１６８（Ｔ→Ｃ）が異なる。このヌクレオチド配列における変化はＡｃＡｍｙ１アミノ酸配列に変化を与えない。
【０２８２】
実施例２：ＡｃＡｍｙ１の発現及び精製
遺伝子銃法（Ｔｅ’ｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５１：３９３〜９９，２００２）を使用して、プラスミドｐＪＧ１５３により、４つの遺伝子を欠失させたトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）株（国際公開第０５／００１０３６号に記載）を形質転換させた。タンパク質を細胞外培地に分泌させ、この培地を濾過し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びαアミラーゼ活性アッセイに使用して、酵素の発現を確認した。
【０２８３】
硫安沈澱に加えて更に２段階クロマトグラフィーを使用し、ＡｃＡｍｙ１タンパク質を精製した。約９００ｍＬのブロスに、最終硫酸アンモニウム濃度が３Ｍになるよう硫酸アンモニウムを加えた。サンプルを１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、ペレットを２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）、１Ｍ硫酸アンモニウム（緩衝液Ａ）に再懸濁した。濾過後、このサンプルを、緩衝液Ａにより平衡化した７０ｍＬ  Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムに装填した。装填後、カラムは、カラム体積の３倍量の緩衝液Ａで洗浄した。標的タンパク質は０．６Ｍ硫酸アンモニウムで溶出した。Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムからの画分を回収し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）（緩衝液Ｃ）に対し一晩透析した後、緩衝液Ｃにより平衡化した５０ｍＬ  Ｑ−ＨＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに装填した。標的タンパク質は、カラム体積の２０倍量の０〜１００％緩衝液Ｃと１Ｍ  ＮａＣｌ（緩衝液Ｄ）により勾配溶出した。ＡｃＡｍｙ１含有画分を回収し、１０ｋＤａ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５装置を使用し濃縮した。サンプルの純度は９０％超であり、−８０℃にて４０％グリセロール中で保存した。
【０２８４】
実施例３：ＡｃＡｍｙ１  α−アミラーゼ活性の測定
ジャガイモアミロペクチン基質からの還元糖の放出をもとにα−アミラーゼ活性をアッセイした。ＰＡＨＢＡＨアッセイによる比色測定で還元糖の生成をモニターした。活性数は、１分当たりのグルコース放出当量として記録する。
【０２８５】
１．２５ｇ乾燥固体を５０ｇ水／０．００５％  Ｔｗｅｅｎに入れた後、電子レンジで１分間加熱し、１５秒置いた後撹拌して、２．５％ジャガイモアミロペクチン（ＡＰ，Ｆｌｕｋａカタログ番号１０１１８）基質を調製した。０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．８）５ｍＬ、１Ｍ  ＮａＣｌ  ２．５ｍＬ、０．５Ｍ  ＣａＣｌ２０．２ｍＬ、及び水／Ｔｗｅｅｎ（１６７ｍＭ酢酸ナトリウム、１６７ｍＭ  ＮａＣｌ、６．６７ｍＭ  ＣａＣｌ２）７．３ｍＬを混合することにより緩衝液カクテルを調製した。
【０２８６】
精製酵素を水／Ｔｗｅｅｎにより０．４ｍｇ／ｍＬ（４００ｐｐｍ）に希釈し原液とした。非結合マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６４１）の第１列に１９５μＬの水を加え、残りの全てのウェルに１００μＬ水／Ｔｗｅｅｎを入れた。４００ｐｐｍ酵素５μＬを第１列に加え、ウェル中酵素濃度を１０ｐｐｍとし、反応中の最終酵素濃度を２ｐｐｍとした。７つのウェルを通して２倍連続希釈を実施し（４０μＬ＋４０μＬ）、８つめのウェルは酵素を不含有のブランクとして残した。自動ピペットを使用し、緩衝液カクテル１５μＬと、その次にアミロペクチン２５μＬをＰＣＲプレートに分注した。酵素希釈系列１０μＬをＰＣＲプレートに分注し、ボルテックスミキサーにより手早く混合し、加熱蓋（８０℃）を乗せて５０℃のＰＣＲヒートブロックにより１０分インキュベートを行い、反応を開始した。正確に１０分後、０．５Ｎ  ＮａＯＨ  ２０μＬをプレートに加え、ボルテックス処理し、反応を停止させた。
【０２８７】
チューブ内に存在する総還元糖をＰＡＨＢＡＨ方法によりアッセイした：０．５Ｎ  ＮａＯＨ  ８０μＬをＰＣＲマイクロチューブプレートに分注した後、ＰＡＨＢＡＨ試薬（０．５Ｎ  ＨＣｌ中５（体積／重量）％の４−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）２０μＬを分注した。マルチチャンネルピペットを使用して、各列に、反応を停止させたサンプル１０μＬを加え、ピペッティングを行い簡単に上下に混合した。装填したプレートを錫箔で密閉し、９５℃で２分間インキュベートした。反応展開液８０μＬをポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  ９０１７）に移し入れ、４１０ｎｍでＯＤを測定した。得られるＯＤ値を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用し酵素濃度に対しプロットした。線形回帰を使用してプロットの線状部分のスロープを求めた。等式１を使用し、アミラーゼ活性を定量した。
比活性（Ｕｎｉｔ／ｍｇ）＝スロープ（酵素）／スロープ（ｓｔｄ）×１００（１），
式中、１Ｕｎｉｔ＝１μｍｏｌグルコース当量／分
【０２８８】
ＡｃＡｍｙ１及び基準アミラーゼＡｋＡＡの代表的な比活性を表１に示す。
【０２８９】
【表３】
2015534456.tif 000008
【０２９０】
実施例４：ＡｃＡｍｙ１  α−アミラーゼ活性に対するｐＨの作用
ｐＨ範囲３．０〜１０．０で実施例３に記載される通りのαアミラーゼアッセイプロトコルを使用して、ＡｃＡｍｙ１アミラーゼ活性に対するｐＨ作用をモニターした。１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ストック（ｐＨ  ３．０〜６．０）、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ストック（ｐＨ  ６．０〜ｐＨ  ９．０）、及び１Ｍ  ＣＡＰＳ緩衝液ストック（ｐＨ  １０．０）として緩衝液ストックを調製した。希釈緩衝液は、２．５ｍＬの１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ３．５〜６．５）又は１Ｍ  ＨＥＰＥ（ｐＨ  ７〜９）（各ｐＨ単位０．５刻み）、２．５ｍＬの１Ｍ  ＮａＣｌ及び５０μＬの２Ｍ  ＣａＣｌ２、１０ｍＬ水／Ｔｗｅｅｎ（各１６７ｍＭ緩衝液及びＮａＣｌ、６．６７ｍＭ  ＣａＣｌ２）を含有することから、最終的に酵素反応混合物は、各緩衝液及びＮａＣｌを５０ｍＭ、ＣａＣｌ２を２ｍＭ含有する。
【０２９１】
ＰＡＨＢＡＨアッセイの線形範囲の濃度で水／０．００５％  Ｔｗｅｅｎにより酵素ストックを調製した。自動ピペットを使用して、希釈緩衝液（酢酸ナトリウムを使用してｐＨ  ３．５〜７．０、ＨＥＰＥＳを使用してｐＨ  ６．０〜９．０）１５μＬ、続いてアミロペクチン２５μＬをＰＣＲプレートに分注した。酢酸ナトリウム及びＨＥＰＥＳ緩衝液をｐＨ値６．０、６．５、及び７．０で別個に使用して、酵素活性に対し緩衝液による影響がないことを確認した。酵素ストック１０μＬをＰＣＲプレートに分注し、ボルテックスミキサーにより手早く混合し、加熱蓋（８０℃）を乗せて５０℃のＰＣＲヒートブロックにより１０分インキュベートを行い、反応を開始した。反応を３回再現して実施した。異なるｐＨ緩衝液のみを使用したブランクサンプルを包含させた。正確に１０分後、０．５Ｎ  ＮａＯＨ２０μＬをプレートに加え、ボルテックス処理し、反応を停止させた。上記のＰＡＨＢＡＨ法により、ウェル中に存在する総還元糖をアッセイした。最適ｐＨを１００％活性と定義し、得られるＯＤ値を相対活性率（％）に変換した。ｐＨの関数として相対活性率をプロットし、図３Ａ（基準ＡｋＡＡ）及び図３Ｂ（ＡｃＡｍｙ１）に示す。加水分解を５０℃にて測定した場合の、最適ｐＨ及び最大活性の＞７０％でのｐＨ範囲を、表２に掲載する。
【０２９２】
【表４】
2015534456.tif 000009
【０２９３】
実施例５：ＡｃＡｍｙ１  αアミラーゼ活性に対する温度の作用
温度範囲３０℃〜９５℃で実施例４に記載の通りのαアミラーゼアッセイプロトコルを使用し、真菌αアミラーゼ活性をモニターした。各酵素の最適ｐＨの濃縮緩衝液は、２．５ｍＬの１Ｍ緩衝液（酵素の最適ｐＨに合わせて酢酸ナトリウム又はＨＥＰＥＳ）、２．５ｍＬの１Ｍ  ＮａＣｌ及び５０μＬの２Ｍ  ＣａＣｌ２、１０ｍＬの水／Ｔｗｅｅｎ、のように調製し（１６７ｍＭ緩衝液及び１６７ｍＭ  ＮａＣｌ、６．６７ｍＭ  ＣａＣｌ２）、最終的な反応混合物には、５０ｍＭ緩衝液及び５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２が含有される。
【０２９４】
上記の通り酵素ストックを調製した。自動ピペットを使用して、緩衝液ストック１５μＬ（所定の最適ｐＨ）、続いてアミロペクチン２５μＬをＰＣＲプレートに分注した。酵素１０μＬをＰＣＲプレートに分注し、ボルテックスミキサーで手早く混合し、インキュベート温度と同温度又はそれ以上のインキュベート温度に加熱した蓋を乗せ３０〜９５℃（５〜１０℃毎）ＰＣＲヒートブロックで１０分間インキュベートした。反応を３回再現して実施した。異なるｐＨ緩衝液のみを使用したブランクサンプルを包含させた。正確に１０分後、０．５Ｎ  ＮａＯＨ  ２０μＬをプレートに加え、ボルテックス処理し、反応を停止させた。チューブ中に存在する総還元糖を上記のＰＡＨＢＡＨ法によりアッセイした。最適温度を１００％活性と定義し、得られるＯＤ値を相対活性率（％）に変換した。真菌αアミラーゼの温度プロファイルを図４Ａ（ＡｋＡＡ基準）及び図４Ｂ（ＡｃＡｍｙ１）に示す。記載の酵素最適ｐＨ下で測定した場合の、最適温度及び最大活性＞７０％の範囲の温度を表３に掲載する。
【０２９５】
【表５】
2015534456.tif 000010
【０２９６】
実施例６：持続的低ｐＨがＡｃＡｍｙ１  α−アミラーゼ活性に対し及ぼす影響
ＳＳＦは、通常、３２℃で５５時間にわたってｐＨ  ３．５〜５．５で実施され、プロセスで使用される酵素は、全プロセスの間活性を維持し得るものでなければならない。したがって、αアミラーゼの低ｐＨ安定性を知ることは有用である。ｐＨ安定性の試験には次のプロトコルを使用する。
【０２９７】
酵素を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ３．５及び４．８）により上記のαアミラーゼアッセイ線形範囲内の濃度に希釈した。希釈した酵素を室温でインキュベートし、アッセイ用にｔ＝０、２、４、１９、２４、２８、及び４３時間に１０μＬサンプル採取した。基質としてアミロペクチンを使用して、還元糖用にはＰＡＨＢＡＨを使用して、上記の通りｐＨ  ５、５０℃にて標準条件下でアッセイを実施した。グルコース標準に対しシグナルを正規化し、時間に対する関数として、ｔ＝０に対する残存活性の割合としてプロットすることによりデータを処理した。図５Ａ及び図５Ｂは、ｐＨ  ３．５又は４．８下で、異なる時間インキュベートした後の、それぞれ基準となるＡｋＡＡ及びＡｃＡｍｙ１の残存活性を示す。ＡｋＡＡ及びＡｃＡｍｙ１は、いずれもｐＨ  ３．５で長期間インキュベートした後に＞６０％活性を維持する。ＡｃＡｍｙ１がｐＨ  ４．８下で保持した活性はＡｋＡＡよりも低かった。対照的に、微生物由来のアミラーゼ活性は、これらの条件下で数時間後には活性のほとんどを失っていた（データ不掲載）。
【０２９８】
実施例７：ＡｃＡｍｙ１製剤プロファイル分析
多糖類に対する真菌αアミラーゼの触媒作用による生成物をアッセイするために、アミラーゼを３種の異なる基質、ＤＰ７、アミロペクチン、及び液状マルトデキストリンＤＥ１０と、５０℃下、ｐＨ  ５．３にて２時間インキュベートした。酵素により放出されるオリゴ糖類をＨＰＬＣにより分析した。
【０２９９】
５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭ（ｐＨ  ５．３）クエン酸ナトリウム緩衝液に最終濃度１０ｐｐｍのアミラーゼ及び０．５（重量／体積）％基質を入れ、５０℃で１２０分間インキュベートした。次に同量のエタノールを加えて反応を停止させ、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ミリＱ水を使用し上清を１０倍希釈し、このうち１０μＬを、屈折率検出器を取り付けたＨＰＬＣカラムＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−４２Ａ（３００ｍＭ×７．８ｍｍ）に装填した。移動相はミリＱ水とし、流量は８５℃にて０．６ｍＬ／分とした。
【０３００】
表４は、基準となるＡｃＡｍｙ１及びＡｋＡＡによる各種基質のオリゴ糖化プロファイルを示す。ＤＰ１−ＤＰ７を有するオリゴ糖類のみを示す。表中の数字は、ＤＰ１〜ＤＰ７の合計に対する割合として各ＤＰｎの重量％を反映する。ＡｃＡｍｙ１はほとんどＤＰ１及びＤＰ２を生成し、ＤＰ２は、試験した全ての基質に関し主要な生成物であった。ＡｃＡｍｙ１は、ＤＰ１〜ＤＰ７の合計量に比較して少なくとも５０（重量／重量）％のＤＰ２を含有する糖組成物を生成した。それに対し、ＡｋＡＡはＤＰ１〜ＤＰ４に、より均一に分布する、生成プロファイルを生成した。
【０３０１】
【表６】
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【０３０２】
実施例８：液化
ＡｃＡｍｙ１を使用して、２５％  ＤＳトウモロコシデンプン溶液を液化した。８００μｇ  ＡｃＡｍｙ１をトウモロコシデンプン溶液に加え、ｐＨ  ５．８及び８５℃にて、並びにｐＨ  ４．５及び９５℃にて１０分間置く。ＲＶＡによる粘度試験により液化活性をアッセイした。表５は、ＡｃＡｍｙ１による粘度の低下を示す。
【０３０３】
【表７】
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【０３０４】
実施例９：ＳＳＦエタノール発酵
ＡｃＡｍｙ１のエタノール産生能及び不溶性残留デンプン（ＩＲＳ）減少能をＳＳＦで試験した。結果により、ＡｃＡｍｙ１は、より少ない添加量でＡｋＡＡと同等の効果を達成することができることが見て取れる。
【０３０５】
液化物は、特に、発酵終了（ＥＯＦ）トウモロコシスラリー中に相対的に多量の残留デンプンが含有されるよう調製して、不溶性残留デンプン（ＩＲＳ）、及びＩＲＳによる目詰りを低減させ、差別化性能を補助する。以降の手順に従って、ＦＰＬＣ（米国特許第８，０５８，０３３  Ｂ２号（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．）を参照されたい）を使用して測定される少なくとも１．１５のＤＰ７性能指数を有するトリコデルマ（Trichoderma）グルコアミラーゼ変異体の存在下で、ＡｋＡＡ又はＡｃＡｍｙ１によりＳＳＦを実施した。ＳＳＦ後、サンプルは（ｉ）ＨＰＬＣを使用してエタノール収率及びＤＰ３＋還元について、並びに（ｉｉ）ヨウ素アッセイを使用してＩＲＳについて分析する。空隙容量によりＤＰ３＋濃度を測定する。この濃度の低下は、一般的に液化糖化効率を反映するものと解釈される。
【０３０６】
液化調製：凍結液化（３０％乾燥固体）を４℃で一晩インキュベートした後、完全に解凍されるまで７０℃の水浴に置く（１〜３時間）。液化温度を３２℃に調整した。液化を計量し、６００ｐｐｍになるよう固体尿素を加えた。液化ｐＨは６Ｎ硫酸又は２８％水酸化アンモニウムを使用して調整した。
【０３０７】
発酵：ＥＴＨＡＮＯＬ  ＲＥＤ（登録商標）（ＬｅＳａｆｆｒｅ）酵母を使用してグルコースをエタノールに変換した。液化バッチに乾燥酵母を０．１（重量／重量）％になるように加え、組成物をよく混合し、室温で３０分間インキュベートした。別個にラベルを付けた１５０ｍＬ三角フラスコに１００ｇ＋／−０．２ｇ液化（３２％乾燥固体）を計量した。添加量を０．３２５ＧＡＵ／ｇ（固体）、０．２２７５ＧＡＵ／ｇ（固体）、及び０．１６２５ＧＡＵ／ｇ（固体）と変えて、各フラスコにグルコアミラーゼを加えた。最高添加量を２０μｇタンパク質／ｇ（固体）（１００％添加）とし、添加量を変えて各フラスコにＡｋＡＡ又はＡｃＡｍｙ１  αアミラーゼを加えた。２００ｒｐｍで混合しながら、混合物を、ｐＨ  ３．５〜４．８にて３２℃で５４又は７０時間にわたって強制対流式インキュベータ内でインキュベートした。約ｔ＝０、３、１９、２３、２７、４３、５２、及び／又は７０時間の時点でＥＯＦトウモロコシスラリーサンプル約１ｍＬを回収し、凍結保存した。エタノール収率及びＤＰ３＋減少度、及びＩＲＳについてＥＯＦサンプルをアッセイした。
【０３０８】
（ｉ）エタノール収率及びＤＰ３＋減少度
エタノール収率及びＤＰ３＋減少度を測定するため、各時点のサンプルを４℃で解凍し、１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。微量遠心チューブ内でそれぞれのサンプル上清１００μＬを１．１Ｎ硫酸１０μＬと混合し、室温で５分間インキュベートした。各チューブに１ｍＬの水を加え、チューブを１５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。２００μＬのサンプルをＨＰＬＣプレート上に濾過した。溶出時間８分としてＲｅｚｅｘ  Ｆａｓｔ  Ｆｒｕｉｔ  ＲＦＱカラムを使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣでプレートを解析した。Ｓｕｐｅｌｃｏ燃料エタノール（Ｓｉｇｍａカタログ番号４８４６８−Ｕ）を使用して、上記の成分の検量線を作成した。ソフトウェアＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎを使用して、ＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３＋、グリセロール、酢酸、乳酸、及びエタノールの濃度（ｇ／Ｌ）を求めた。エタノール産生は反応混合物の（体積／体積）％に変換した。
【０３０９】
ｐＨ  ４．８にてＡｃＡｍｙ１及びグルコアミラーゼにより得られたエタノール産生速度は、ＡｋＡＡ及びグルコアミラーゼにより得られるものと同等であった（データ不掲載）。ｐＨ  ３．５及びｐＨ  ３．８でも、エタノール産生及びＤＰ３＋加水分解の速度及び収率について同様の結果が得られた（データ不掲載）。２１時間の時点で、対照、及びＡｃＡｍｙ１（αアミラーゼ）について、エタノール収率は約８（体積／体積）％であった。約４８時間の時点でも、類似のエタノール収率が観察された。しかしながら、ＤＰ３＋の加水分解速度は、ＡｃＡｍｙ１及びグルコアミラーゼを使用することで顕著に改良された。６時間の時点では、ＤＰ３＋（重量／体積）は、ＡｃＡｍｙ１及びグルコアミラーゼにより２３％〜約８〜９％に減少したのに対し、対照では約１４％だった。４８時間の時点での最終的な量は、両方の場合において約２％であった。ＡｋＡＡよりも少量のＡｃＡｍｙ１を使用して、同様の結果が、ｐＨ  ４．８下でのエタノール収率並びにＤＰ３＋加水分解速度及び程度で得られた（データ不掲載）ため、ＡｃＡｍｙ１は、添加量を減らしてもＡｋＡＡに匹敵し得ることが示された。
【０３１０】
（ｉｉ）ヨウ素陽性デンプン
次の手順は、従来の液状トウモロコシの発酵後にアミロースをヨウ素染色することにより、定性的に残留デンプン濃度を予測する方法を記載する。１ｇのＥＯＦトウモロコシスラリーを、それぞれラベル付けした微量遠心チューブに入れた。各チューブに２００μＬの脱イオン水を加え、次に、各チューブには２０μＬのヨウ素溶液を加えて、十分に混合した。５ｇヨウ素及び１０ｇヨードカリウムを１００ｍＬ水に溶解させ、ヨウ素溶液（Ｌｕｇｏｌ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を調製した。ヨウ素により染色されたチューブを、青色の濃さにより等級付けした。青／黒に染色されるサンプルは高濃度の残留デンプンを含有する。
【０３１１】
市販のＭｅｇａｚｙｍｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｔａｒｃｈ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を、液状トウモロコシの一般的な発酵の残留デンプン量を定量測定するよう構成した。ＥＯＦトウモロコシスラリー８００ｍｇ（＋／−２０ｍｇ）をポリプロピレン製試験管に入れ、続いて５０ｍＭ  ＭＯＰＳ  緩衝液（ｐＨ  ７．０）２ｍＬを入れた。次に、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ  ７．０）３ｍＬに入れた熱安定性αアミラーゼ（３００Ｕ）を加え、チューブを激しく撹拌した。チューブを熱湯浴で１２分間インキュベートした（チューブは４分経過時及び８分経過時に激しく撹拌した）。続いて２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ４．５）４ｍＬと、アミログルコシダーゼ（５０Ｕ）０．１ｍＬを加えた。チューブをボルテックスミキサーで撹拌し、６０℃の水浴で６０分間インキュベートした。混合物を３，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清８μＬを、ＧＯＰＯＤ試薬２４０μＬを入れたマイクロタイタープレートに入れる。グルコース対照８μＬ及び試薬ブランク８μＬもＧＯＰＯＤ試薬２４０μＬに加え、サンプルを５０℃で２０分間インキュベートした。インキュベート後、５１０ｎｍでの吸光度を直接測定した。ＥＯＦトウモロコシスラリーに測定されたグルコース量を、残留デンプン量に変換した。
【０３１２】
表６は、ＡｃＡｍｙｌ及びＡｋＡＡによるＳＳＦ後のＥＯＦトウモロコシスラリー中の残留デンプン量を示す。ＡｋＡＡを１０μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）（５０％添加量）使用した場合とＡｃＡｍｙ１を３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）（１７％添加量）使用した場合とで、残留デンプンはおおよそ同様であったことが判明した。データを考慮すると、残留デンプンの除去においては、ＡｃＡｍｙ１が、ＡｋＡＡの少なくとも３倍超効率が良いことは明らかである。
【０３１３】
【表８】
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【０３１４】
実施例１０：イソアミラーゼ及びグルコアミラーゼによるＳＳＦエタノール発酵
ＡｃＡｍｙ１とイソアミラーゼ及びグルコアミラーゼが、エタノールを生産し、不溶性残留デンプン（ＩＲＳ）を減少させる能力を、ＳＳＦで試験した。結果から、アミラーゼの添加量を減少させたものの、ＡｃＡｍｙ１とイソアミラーゼ及びグルコアミラーゼでは、ＡｋＡＡとイソアミラーゼ及びグルコアミラーゼのものと匹敵する効果を得られることが見て取れる。
【０３１５】
液化物はＬｉｎｃｏｌｎｗａｙ  Ｅｎｅｒｇｙ  ＬＬＣ（Ｎｅｖａｄａ，ＩＡ，ＵＳＡ）から得た。以降の手順に従って、ＦＰＬＣ（米国特許第８，０５８，０３３  Ｂ２号（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．）を参照されたい）を使用して測定される少なくとも１．１５のＤＰ７性能指数を有するトリコデルマ（Trichoderma）グルコアミラーゼ変異体の存在下で、ＡｋＡＡ又はＡｃＡｍｙ１と、イソアミラーゼとを用い、又はイソアミラーゼは用いずに、ＳＳＦを実施した。ＳＳＦ後、（ｉ）ＨＰＬＣを使用してエタノール収率及びＤＰ３＋減少について、並びに（ｉｉ）残留デンプンアッセイを使用して残留デンプンについてサンプルを分析した。空隙容量によりＤＰ３＋濃度を測定する。この濃度の低下は、一般的に液化糖化効率を反映するものと解釈される。
【０３１６】
液化物の調製：凍結液化物（３１％乾燥固体）を使用前に室温で一晩解凍した。液化物を計量し、４Ｎ硫酸を使用してｐＨを４．８に調整し、最終濃度６００ｐｐｍになるよう尿素を加えた。
【０３１７】
発酵：ＥＴＨＡＮＯＬ  ＲＥＤ（登録商標）（ＬｅＳａｆｆｒｅ）酵母を使用してグルコースをエタノールに変換した。液化バッチに乾燥酵母を０．１（重量／重量）％になるように加え、組成物をよく混合し、室温で１５分間インキュベートした。別個にラベルを付けた１５０ｍＬ三角フラスコに５０ｇ＋／−０．１ｇ液化（３１％乾燥固体）を計量した。各フラスコにグルコアミラーゼを４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）加えた。添加量を変えて、ＡｋＡＡ又はＡｃＡｍｙ１αアミラーゼを各フラスコに加えた。添加量を変えて、イソアミラーゼを各フラスコに加えた。１００ｒｐｍで混合しながら、混合物を、ｐＨ４．８にて３２℃で５３時間にわたって強制対流式インキュベータ内でインキュベートした。約５、２２、２９、４６、及び５３時間経過時点でトウモロコシスラリーサンプルを約１ｍＬ回収し、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。微量遠心チューブ内でそれぞれのサンプル上清１００μＬを１．１Ｎ硫酸１０μＬと混合し、室温で５分間インキュベートした。各チューブに１ｍＬの水を加え、チューブを９５℃で５分間インキュベートした。以降の分析のためチューブを４℃で保管した。エタノール収率、ＤＰ３＋減少、及び残留デンプンについてサンプルを分析した。
【０３１８】
（ｉ）エタノール収率及びＤＰ３＋減少度
エタノール収率及びＤＰ３＋減少を測定するため、各時点のサンプルを濾過し、ＨＰＬＣプレートに回収した。溶出時間６分としてＲｅｚｅｘ  Ｆａｓｔ  Ｆｒｕｉｔ  ＲＦＱ  カラムを使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣでサンプルを分析した。標準プロトコルを使用し、上記成分に関し検量線を作成した。
【０３１９】
ｐＨ  ４．８下で３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｃＡｍｙ１とイソアミラーゼ及びグルコアミラーゼにより得られたエタノール生産速度は、１０μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｋＡＡとイソアミラーゼ及びグルコアミラーゼにより得られたものと同等であった。２２時間では、３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｃＡｍｙ１と、０．６３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）イソアミラーゼ及び４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）グルコアミラーゼとの組み合わせではエタノール収率は約８．８（体積／体積）％であり、１０μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｋＡＡと、０．６３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）イソアミラーゼ及び４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）グルコアミラーゼとの組み合わせの８．６（体積／体積）％と同等であった。同様に、約４６時間の時点で、両方に関し類似するエタノール収率が観察された：３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｃＡｍｙ１を０．６３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）イソアミラーゼ及び４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）グルコアミラーゼと組み合わせたエタノール収率は１２．７（体積／体積）％であったのに対し、１０μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｋＡＡを０．６３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）イソアミラーゼ及び４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）グルコアミラーゼと組み合わせたものは１２．８（体積／体積）％であった。５３時間後、３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｃＡｍｙ１を使用し得られるエタノール生産と、１０μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｋＡＡを使用し得られるエタノール生産とで同様の結果が得られたことから、酵素を４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）グルコアミラーゼ及び０．６３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）イソアミラーゼの不変の組み合わせと組み合わせた場合、ＡｃＡｍｙ１は、ＡｋＡＡと比較して少量で使用することができることが示された。表７を参照されたい。エタノール収率に対する同様の効果は、イソアミラーゼの添加量を１．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）に増加させた場合にも見られる。３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｃＡｍｙ１又は１０μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｋＡＡを４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）グルコアミラーゼ及び１．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）イソアミラーゼと組み合わせた場合、ｐＨ  ４．８では、投与量が異なるにもかかわらず、５３時間後に、エタノール収率の程度に関しほぼ同様の結果が得られた。表７を参照されたい。
【０３２０】
【表９】
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【０３２１】
しかしながら、表８に示される通り、ＤＰ３＋加水分解速度は、ＡｃＡｍｙ１とイソアミラーゼ及びグルコアミラーゼを使用することにより著しく改良された。５３時間後に、３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｃＡｍｙ１を使用し得られるＤＰ３＋加水分解度と、１０μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｋＡＡを使用して得られるＤＰ３＋加水分解度とが同様であったことから（すなわち、０．７（重量／体積）％）、酵素を４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）グルコアミラーゼ及び０．６３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）イソアミラーゼの不変の組み合わせと組み合わせた場合、ＡｃＡｍｙ１は、ＡｋＡＡと比較して少量で使用することができることが示された。ＤＰ３＋加水分解に対する同様の効果は、イソアミラーゼの添加量を１．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）に増加させた場合にも見られた。例えば、３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｃＡｍｙ１又は１０μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｋＡＡを４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）グルコアミラーゼ及び１．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）イソアミラーゼと組み合わせた場合、５３時間後のＤＰ３＋加水分解度に関しほぼ同様の結果、すなわち、０．６〜０．７（重量／体積）％が得られた。実際に、５３時間後に残存するＤＰ３＋が少ないことから見ても、より低投与量のＡｃＡｍｙ１の方が、より高投与量のＡｋＡＡよりもわずかに効率が高かった。
【０３２２】
【表１０】
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【０３２３】
【表１１】
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【０３２４】
表９は、ｐＨ  ４．８にて、αアミラーゼを更に４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）グルコアミラーゼと組み合わせた場合に、３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｃＡｍｙ１を１．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）イソアミラーゼと組み合わせて使用した場合と、６．６μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｃＡｍｙ１をイソアミラーゼと組み合わせずに使用した場合とで、５３時間後に同様のＤＰ３＋加水分解（すなわち、０．６（重量／体積）％）結果が得られたことを示す。換言すれば、０．６３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）イソアミラーゼを加えた場合、αアミラーゼを更に４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）グルコアミラーゼと組み合わせた場合に、αアミラーゼの添加量は半分程度に抑えることができる。
【０３２５】
【表１２】
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【０３２６】
表１０は、ｐＨ  ４．８にて、αアミラーゼを更に４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）グルコアミラーゼと組み合わせた場合に、３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｃＡｍｙ１を１．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）イソアミラーゼと組み合わせて使用した場合と、６．６μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｃＡｍｙ１をイソアミラーゼと組み合わせずに使用した場合とで、２９時間後に同様のエタノール加水分解（すなわち、１０．５〜１０．８（重量／体積）％）結果が得られたことを示す。換言すれば、０．６３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）イソアミラーゼを加えた場合、αアミラーゼを更に４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）グルコアミラーゼと組み合わせた場合に、αアミラーゼの添加量は半分程度に抑えることができる。イソアミラーゼの添加量（１．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体））は、イソアミラーゼの非存在下でほぼ同様の結果を得るのに必要とされるαアミラーゼの添加量（６．６μｇ（タンパク質）／ｇ（固体））の２０％に相当する。
【０３２７】
【表１３】
2015534456.tif 000018
【０３２８】
表１１は、比較目的で同一添加量のαアミラーゼ（３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）を使用し、ＡｃＡｍｙ１及びＡｋＡＡをイソアミラーゼ及びグルコアミラーゼと組み合わせることによるＳＳＦの２９時間後の生成物プロファイルを示す。
【０３２９】
結果から、いずれかの酵素をイソアミラーゼ及びグリコアミラーゼと組み合わせてＳＳＦに使用したとき、２９時間では、ＡｃＡｍｙ１を使用した場合に、ＡｋＡＡを使用した場合と同様にＤＰ１が富化されたことが見て取れる。ＤＰ２及びＤＰ１＋ＤＰ２も同一の条件下で富化させた。
【０３３０】
（ｉｉ）残留デンプン
市販のＭｅｇａｚｙｍｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｔａｒｃｈ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を、液状トウモロコシの一般的な発酵の残留デンプン量を定量測定するよう構成した。ＥＯＦトウモロコシスラリー８００ｍｇ（＋／−２０ｍｇ）をポリプロピレン製試験管に入れ、続いて５０ｍＭ  ＭＯＰＳ  緩衝液（ｐＨ  ７．０）２ｍＬを入れた。次に、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ  ７．０）３ｍＬに入れた熱安定性αアミラーゼ（３００Ｕ）を加え、チューブを激しく撹拌した。４分経過時及び８分経過時に激しく撹拌しつつチューブを熱湯浴で１２分間インキュベートした。続いて２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ４．５）４ｍＬと、アミログルコシダーゼ（５０Ｕ）０．１ｍＬを加えた。チューブをボルテックスミキサーで撹拌し、６０℃の水浴で６０分間インキュベートした。混合物を３，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清８μＬを、ＧＯＰＯＤ試薬２４０μＬを入れたマイクロタイタープレートに入れる。グルコース対照８μＬ及び試薬ブランク８μＬもＧＯＰＯＤ試薬２４０μＬに加え、サンプルを５０℃で２０分間インキュベートした。インキュベート後、５１０ｎｍでの吸光度を直接測定した。ＥＯＦトウモロコシスラリーに測定されたグルコース量を、残留デンプン量に変換した。
【０３３１】
表１２は、ＡｃＡｍｙｌ及びＡｋＡＡをイソアミラーゼ及びグルコアミラーゼと組み合わせて用いたＳＳＦ後のＥＯＦトウモロコシスラリー中の残留デンプン濃度を示す。イソアミラーゼ及びグルコアミラーゼの添加量をを一定に保持したとき、１０μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）のＡｋＡＡを使用した場合と、３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）のＡｃＡｍｙ１を使用した場合の残留デンプンはほとんど同様であることが判明した。ｐＨ  ４．８では、４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）グルコアミラーゼ及び０．６３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）イソアミラーゼと組み合わせた場合に、３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｃＡｍｙ１を使用した場合と、１０μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｋＡＡを使用した場合とで、５３時間後に残留デンプン濃度に関しわずかに良好な結果が得られ、すなわち、ＡｋＡＡでは０．７４９±０．０８８（重量／体積）％なのに対し、ＡｃＡｍｙ１では０．６９８±０．０８０（重量／体積）％であった。酵素を４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）グルコアミラーゼ及び０．６３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）イソアミラーゼの不変の組み合わせと組み合わせた場合、ＡｃＡｍｙ１は、ＡｋＡＡと比較して少量で使用できることが示される。残留デンプン濃度に対する同様の効果は、イソアミラーゼの添加量を１．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）に増加させた場合にも見られた。例えば、３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｃＡｍｙ１又は１０μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｋＡＡを４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）グルコアミラーゼ及び１．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）イソアミラーゼと組み合わせた場合、５３時間後の残留デンプン濃度に関し、１０μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｋＡＡよりも３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｃＡｍｙでわずかに良好な結果が得られ、すなわち、ＡｋＡＡは０．８６１±０．１０２（重量／体積）％であったのに対しＡｃＡｍｙ１は０．７６３±０．０５１（重量／体積）％であった。
【０３３２】
データを考慮すると、残留デンプンの除去においては、ＡｃＡｍｙ１をイソアミラーゼ及びグルコアミラーゼと組み合わせると、ＡｋＡＡをイソアミラーゼ及びグルコアミラーゼと組み合わせるよりも少なくとも３倍超効率が良いことは明らかである。
【０３３３】
【表１４】
2015534456.tif 000019
【０３３４】
表１３は、同一添加量のＡｃＡｍｙｌ及びＡｋＡＡをイソアミラーゼ及びグルコアミラーゼと組み合わせて用いたＳＳＦ後のＥＯＦトウモロコシスラリー中の残留デンプン濃度を示す。イソアミラーゼの添加量を０．６３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）とし、イソアミラーゼの添加量を４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）としたとき、残留デンプンは、ＡｃＡｍｙ１を３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）使用した場合に、ＡｋＡＡを３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）使用した場合よりも１２％減少することが判明した。イソアミラーゼの添加量を１．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）とし、グルコアミラーゼの添加量を４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）としたとき、残留デンプンは、ＡｃＡｍｙ１を３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）使用した場合に、ＡｋＡＡを３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）使用した場合よりも５％減少することが判明した。
【０３３５】
【表１５】
2015534456.tif 000020
【０３３６】
【表１６】
2015534456.tif 000021
【０３３７】
表１４は、ＡｃＡｍｙ１とグルコアミラーゼを、イソアミラーゼと用いる及びイソアミラーゼは用いないＳＳＦ後のＥＯＦトウモロコシスラリー中の残留デンプン濃度を示す。αアミラーゼを更に４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）グルコアミラーゼと組み合わせたとき、３．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）ＡｃＡｍｙ１を１．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）イソアミラーゼと組み合わせて使用した場合に、イソアミラーゼを使用せずに６．６μｇ（タンパク質）／ｇ（ＡｃＡｍｙ）を使用した場合と同様の結果（すなわち、０．７０１〜０．７６３（重量／体積）％）が得られたことを示す。換言すれば、０．６３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）イソアミラーゼを加えた場合、αアミラーゼを更に４９．５μｇ（タンパク質）／ｇ（固体）グルコアミラーゼと組み合わせた場合に、αアミラーゼの添加量は半分程度、又は５０％に抑えることができる。イソアミラーゼの添加量（１．３μｇ（タンパク質）／ｇ（固体））は、イソアミラーゼの非存在下でほぼ同様の結果を得るのに必要とされるαアミラーゼの添加量（６．６μｇ（タンパク質）／ｇ（固体））の２０％に相当する。
【０３３８】
配列表
配列番号１
野生型ＡｃＡｍｙ１のタンパク質配列：
2015534456.tif 000022
【０３３９】
配列番号２
ＡｃＡｍｙ１遺伝子のヌクレオチド配列：
2015534456.tif 000023
【０３４０】
配列番号３
ＡｃＡｍｙ１シグナルペプチドのアミノ酸配列：
ＭＫＬＬＡＬＴＴＡＦＡＬＬＧＫＧＶＦＧ
【０３４１】
配列番号４
タラロミセス・スティピタトゥス（Talaromyces stipitatus）由来の推定αアミラーゼＡＴＣＣ  １０５００（ＸＰ＿００２４８７０３．１）
＞ｇｉ｜２４２７７５７５４｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿００２４７８７０３．１｜  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ，  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ［Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ  ＡＴＣＣ  １０５００］
2015534456.tif 000024
【０３４２】
配列番号５
アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）ＦＧＳＣ  Ａ４由来のタンパク質ＡＮ３４０２．２（ＸＰ＿６６１００６．１）
＞ｇｉ｜６７５２５８８９｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿６６１００６．１｜  ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＮ３４０２．２  ［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ＦＧＳＣ  Ａ４］
2015534456.tif 000025
【０３４３】
配列番号６
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のαアミラーゼ（タンパク質データベースエントリー２ＧＵＹ｜Ａ）
2015534456.tif 000026
【０３４４】
配列番号７
アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）ＮＲＲＬ１αアミラーゼをコードするｃＤＮＡ、推定（ＡＣＬＡ＿０５２９２０）
＞ｇｉ｜１２１７０８７７７｜ｒｅｆ｜ＸＭ＿００１２７２２４４．１｜Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ  ＮＲＲＬ１  ａｌｐｈａ  ａｍｙｌａｓｅ，  ｐｕｔａｔｉｖｅ（ＡＣＬＡ＿０５２９２０），ｐａｒｔｉａｌ  ｍＲＮＡ
2015534456.tif 000027
【０３４５】
配列番号８
合成プライマー：
５’−ｇｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃｃａｃｃＡＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣ−３’
【０３４６】
配列番号９
合成プライマー：
５’−ｃｃｃｇｇｃｇｃｇｃｃｔｔａＴＣＡＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＴＣＣＡＣ−３’
【０３４７】
配列番号１０
ＡｃＡｍｙ１炭水化物結合ドメイン
ＣＫＴＡＴＴＶＰＶＶＬＥＥＳＶＲＴＳＹＧＥＮＩＦＩＳＧＳＩＰＱＬＧＳＷＮＰＤＫＡＶＡＬＳＳＳＱＹＴＳＳＮＰＬＷＡＶＴＬＤＬＰＶＧＴＳＦＥＹＫＦＬＫＫＥＱＮＧＧＶＡＷＥＮＤＰＮＲＳＹＴＶＰＥＡＣＡＧＴＳＱＫＶＤＳＳＷＲ
【０３４８】
配列番号１１
ＡｃＡｍｙ１リンカー（リンカー領域）
ＳＴＴＴＬＶＴＡＴＴＴＰＴＧＳＳＳＳＴＴＬＡＴＡＶＴＴＰＴＧＳ
【０３４９】
配列番号１２
アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）Ａｆ２９３由来のαアミラーゼ（ＸＰ＿７４９２０８．１）
2015534456.tif 000028
【０３５０】
配列番号１３
アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）ＮＩＨ２６２４由来のαアミラーゼ前駆体（ＸＰ＿００１２０９４０５．１）
2015534456.tif 000029
【図１Ａ】
2015534456.tif 000030
【図１Ｂ】
2015534456.tif 000031
【図２】
2015534456.tif 000032
【図３Ａ】
2015534456.tif 000033
【図３Ｂ】
2015534456.tif 000034
【図４Ａ】
2015534456.tif 000035
【図４Ｂ】
2015534456.tif 000036
【図５Ａ】
2015534456.tif 000037
【図５Ｂ】
2015534456.tif 000038
【配列表】
2015534456000001.xml
【国際調査報告】
2015534456.tif 000043
2015534456.tif 000044
2015534456.tif 000045
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