(57)【要約】本発明は、ヒドロゲルの存在下および抗凍結剤の非存在下で生物試料を凍結する工程を含む、該生物試料を凍結保存する方法を提供する。前記ヒドロゲルは、ａ）３０〜７０℃、好ましくは４０〜５０℃、最も好ましくは５０℃の温度にてアルカリ性条件下で、トリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）、エピクロルヒドリン、ホルムアルデヒド、水溶性カルボジイミドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される網状化剤を用いて、プルラン、デキストラン、硫酸デキストラン、スクレログルカン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルプルラン、寒天、アルギン酸塩、フコイダン、キトサン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、ヘパリン硫酸模倣剤またはヘパラン硫酸模倣剤およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの多糖の化学的に架橋する工程によって得られる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロゲルの存在下で生物試料を凍結する工程を含む、該生物試料を凍結保存する方法であって、
前記ヒドロゲルは、
ａ）３０〜７０℃、好ましくは４０〜５０℃、最も好ましくは５０℃の温度にてアルカリ性条件下で、トリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）、エピクロルヒドリン、ホルムアルデヒド、水溶性カルボジイミドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される網状化剤を用いて、プルラン、デキストラン、硫酸デキストラン、スクレログルカン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルプルラン、寒天、アルギン酸塩、フコイダン、キトサン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、ヘパリン硫酸模倣剤またはヘパラン硫酸模倣剤およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの多糖を化学的に架橋する工程
によって得られ、
前記凍結する工程は標準圧力条件にて０℃以下の温度で実施され、
前記凍結する工程はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を実質的に含まずまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いずに実施される、方法。
【請求項２】
ヒドロゲルの存在下で生物試料を凍結する工程を含む、該生物試料を凍結保存する方法であって、
前記ヒドロゲルは、
ａ）３０〜７０℃、好ましくは４０〜５０℃、最も好ましくは５０℃の温度にてアルカリ性条件下で、トリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）、エピクロルヒドリン、ホルムアルデヒド、水溶性カルボジイミドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される網状化剤を用いて、プルラン、デキストラン、硫酸デキストラン、スクレログルカン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルプルラン、寒天、アルギン酸塩、フコイダン、キトサン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、ヘパリン硫酸模倣剤またはヘパラン硫酸模倣剤およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの多糖を化学的に架橋する工程、
ｂ）ヒドロゲル粒子を得るためにａ）において得られたヒドロゲルを研磨する工程、
ｃ）任意に、工程ｂ）において得られた前記ヒドロゲル粒子を洗浄する工程、
ｄ）任意に、工程ｂ）または工程ｃ）において得られた前記ヒドロゲル粒子を篩にかける工程、
ｅ）任意に、好ましくは生理食塩水、好ましくは蒸留水中で完全にリンスしたリン酸緩衝食塩水を用いて、工程ｂ）または工程ｄ）において得られた前記ヒドロゲル粒子を洗浄する工程、
ｆ）工程ｂ）または工程ｅ）において得られた前記ヒドロゲル粒子を、好ましくはエタノール／水浴中で脱水する工程、
ｇ）乾燥ヒドロゲル粒子を得るために、工程ｆ）において得られた前記ヒドロゲル粒子を、好ましくは５０℃にて乾燥する工程、
ｈ）任意に、工程ｇ）において得られた乾燥粒子を篩にかける工程、および
ｉ）ヒドロゲルを得るために、工程ｈ）において得られた乾燥ヒドロゲル粒子を、膨張溶液中で膨張させる工程
によって得られ、
前記凍結する工程は標準圧力条件にて０℃以下の温度で実施され、
前記凍結する工程はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を実質的に含まずまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いずに実施される、方法。
【請求項３】
前記凍結する工程は−３０℃以下の温度で実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記凍結する工程は、−７０℃以下の温度、好ましくは−７０℃から−１５６℃の温度での機械的冷凍工程である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記凍結する工程は、−１９６℃の温度にて液体窒素中で行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記凍結する工程は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される抗凍結剤を実質的に含まずまたは該抗凍結剤を用いずに実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
膨張液が、
ｉ）好ましくは、１〜１０％、最も好ましくは約５％のグリセロールの濃度にて生理食塩水およびグリセロールを含む、溶液ＳＧｌｙ；
ｉｉ）好ましくは、５〜２０％、最も好ましくは約１０％のグルコースの濃度にて生理的血清およびグルコースを含む、溶液ＳＧＬＵ；および
ｉｉｉ）好ましくは、生理食塩水１リットル当たり１５ｇのポリエチレングリコールの濃度にて生理食塩水およびポリエチレングリコールを含む、溶液ＳＰＥＧ１５
からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記生物試料は、哺乳動物細胞、植物細胞、血液細胞、卵母細胞もしくは精細胞などの生殖細胞、胚細胞、幹細胞、臍帯由来の細胞、卵巣皮質の細胞、造血系幹細胞または膵島などの細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記生物試料は動物胚、ヒトまたは非ヒトである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物試料は、心臓、肺、皮膚、血管、角膜、卵巣、肝臓、腎臓、膵臓、腸、眼または脾臓などの器官または組織である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物試料は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、種々の細胞、器官および組織の凍結保存のための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
凍結保存およびガラス化は、生物試料が氷点下の温度で保存されることによるプロセスである。生体反応は温度を下げることにより遅延することが知られている。しかしながら、前記技術は、生存細胞が含まれる場合、注意深く実施されなければならない。実際に、水が生存細胞の主要成分およびそれらの生育環境であり、それらの完全性を保存するために氷晶の形成が前記生存細胞の凍結の間に制御されなければならない。
【０００３】
凍結は、生物試料、特に生存細胞に対する損傷を引き起こし得ることが報告されている。実際に、凍結の間、氷晶が形成され、細胞に対して非常に有害な作用を有する。細胞内結晶は細胞壁および構造を損傷させ得、一方、氷晶としての水の細胞外沈殿は細胞に損傷を引き起こし得るレベルまで塩濃度を増加させる。
【０００４】
したがって、化学的または物理的安定剤、すなわち凍結防止剤として機能する化合物が、凍結の間に出くわすストレスに対して細胞を保護するために広範に使用されている。細胞内へのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの現在の古典的凍結防止剤の拡散は、細胞内の水の部分的置換を生じ、凍結の間の氷形成から脱水を防ぐのに役立つ。
【０００５】
しかしながら、ＤＭＳＯは、ＨＴ−６０、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０などの一部の細胞株の分化を誘導することが知られている（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９７８）。さらに、ＤＭＳＯは生殖細胞などの細胞および胚にさらすことにより、形質転換し、これは凍結保存に許容可能でないことが報告されている。
【０００６】
より重要なことには、非常に急速であるＤＭＳＯ酸化は毒性化合物の形成を誘導する。最後に、ＤＭＳＯはリン脂質膜の不安定化の原因となることが報告されている（Ａｎｃｈｏｒｄｏｇｕｙら、２００３）。
【０００７】
したがって、ＤＭＳＯは、現在、凍結保存に使用するのに非常に適していない。実際に、凍結防止剤の毒性は低温生物学における重要な制限要因である。したがって、これらの剤の使用は凍結損傷（ｃｒｙｏｉｎｊｕｒｙ）の形態で現れ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、生殖細胞および胚などの細胞を含む、種々の生物試料に有用であり、抗凍結剤の毒性、凍結した生物試料の凍結損傷および／または前記試料の形質転換に関連する損傷を生じない凍結保存技術についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、非常に特有のヒドロゲルの使用により、ＤＭＳＯなどの古典的な抗凍結剤を使用せずにまたはそれらの使用をかなり減少させて種々の細胞および組織の凍結保存を可能にすることを示した。
【００１０】
したがって、本発明の方法は古典的抗凍結剤の使用を回避するので、凍結保存される生物試料に与えられる毒性の危険性を制限する。抗凍結剤の使用を回避または制限することによって、凍結細胞の毒性または形質転換の危険性を制限し、本発明は凍結保存およびガラス化の有望な戦略を提供する。
【００１１】
したがって、本発明は一般的に使用される凍結保存の技術的欠点を軽減する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明者らによって開発された種々のサイズの凍結生物ゲルの肉眼的に見える写真である。
【図２】ａ）プルラン系のヒドロゲルの熱特性。スペクトルはＴｇのバリエーション（プルランヒドロゲルについて１４５°および重合ヒドロゲルについて１５２°）を表し、生成されたヒドロゲルを特徴付けることができる。ｂ）本発明に関して有用な乾燥ヒドロゲル粒子の膨張率。乾燥ヒドロゲルの膨張率は本発明の関連において有用である。１時間室温にて、１０ｍｇのヒドロゲルを、ＰＢＳ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳの溶液中で膨張させたままにした。過剰な液体を取り除き、ヒドロゲルを秤量した。
【図３】凍結バイオゲルおよびＤＭＳＯについての結晶化温度および氷中の結晶化溶液の％。この図はゲルが使用された場合の結晶氷形成の減少を示す。
【図４】種々の培地中のＨＵＶＥＣ細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の生存率。細胞をゲルの存在下およびゲルの非存在下で凍結させた。その結果を、参照−ＤＭＥＭ、１０％ＳＶＦ、１０％ＤＭＳＯの混合物と比較した。この図は、本発明に係るヒドロゲルの使用が参照と比較してより高いパーセンテージの細胞生存率を与えることを示す。
【図５】解凍後の細胞の増殖曲線。細胞を種々の培地：参照、ＳＧｌｙ、およびＳＧｌｙ中で凍結生物ゲルの存在下および非存在下ならびにＤＭＳＯまたはＦＣＳの非存在下で凍結させた（×１０３／ｃｍ２）。細胞増殖は、ＤＭＳＯの非存在下にも関わらず、ヒドロゲルの存在下で参照の増殖と同一であった。
【図６】種々の培地中のＨＵＶＥＣ細胞の生存率および凍結するための標準参照（＋ＤＭＳＯ＋ＳＶＦ）との比較。細胞生存率は参照のものと同一であった。
【図７】１０％ＤＭＳＯおよび本発明者らによって開発された凍結生物ゲルの異なる培地中の大動脈の凍結保存。結果を新鮮な大動脈と比較した。同じ結果をＤＭＳＯの非存在下の凍結生物ゲルで得た。
【図８】本発明者らによって開発されたヒドロゲルと種々の市販のヒドロゲルとの視覚的比較。室温にて１時間、１０ｍｇの各ヒドロゲルを生理的血清中で膨張させたままにした。
【図９】本発明者らによって開発されたヒドロゲルとＡｎｇａｒｇｅｌ（登録商標）の粘度の視覚的比較。膨張後、チューブをひっくり返してヒドロゲルをチューブの底部に付着させたままにした。これは、これらの適用にも使用した市販のゲル、例えばＡｇａｒｇｅｌなどの場合は見られなかった。
【図１０】凍結生物ゲルで凍結保存したＨＵＶＥＣ細胞中の管形成の免疫蛍光染色による観察または至適基準技術（１０％ＤＭＳＯ、１０％ＦＳＯ）による観察。
【図１１】至適基準法（１０％ＤＭＳＯ、１０％ＦＣＳ）と比較した凍結生物ゲルによる液体窒素中の１ヶ月の凍結保存後の大動脈ラット血管構造および内皮細胞層の評価。
【図１２】凍結保存した大動脈の機械的特性（ヤング係数）の評価。３つの膨張溶液を使用した：実験溶液（ＳＧｌｙ、０％ＤＭＳＯ）、および２つの臨床市販溶液（ＳＣＯＴ  １５（登録商標）およびＳＣＯＴ  ３０（登録商標）、０％ＤＭＳＯ、ＭａｃｏＰｈａｒｍａ、フランス）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
本明細書で使用される場合、「凍結保護」、「凍結保存」または「凍結保持」という用語は、生物試料が劣化から保存されることによる凍結工程に関与するプロセスを指す。この用語は従来の凍結保存技術およびガラス化技術を包含する。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「ガラス化」とは、細胞があらゆる結晶構造を含まないガラス状無定形固体に変換される凍結保存戦略を指す。前記プロセスは一般に、高濃度の抗凍結剤と非常に高い冷却速度の組合せにより達成される。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「凍結防止剤」または「抗凍結剤」という用語は、凍結により誘導される損傷から生物試料を保護するために使用される剤を指す。より特に、前記剤は凍結工程に供される細胞内の氷形成に関連する損傷から生物試料を保存するのに有用である。現在の古典的な抗凍結剤の非限定的な例は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、プロパンジオール、スクロース、トレハロースである。抗凍結剤のさらなる例は、グルコース、ラクトース、フルクトース、ラフィノース、プロピレングリコール、１，２／２，３ブタンジオール、アセトアミド、デキストラン、ポリマーポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルデンプン、プロピレングリコール、１，２−プロパンジオール、ブタンジオール、ホルムアミド、フィコール、マンニトール、およびグルコネート、カルボキシメチルセルロース、およびデキストランである。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「多糖」という用語は、２つ以上の単糖単位を含む分子を指す。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「アルカリ性溶液」という用語は、厳密に７より高いｐＨを有する水溶液を指す。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「水溶液」という用語は、主な溶媒が水である溶液を指す。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「架橋」という用語は、共有結合による１つの多糖鎖の別の多糖鎖への連結を指す。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「ヒドロゲル」または「凍結生物ゲル（ｃｒｙｏｂｉｏｇｅｌ）」という用語は、本発明者らによって開発された方法によって得られる非常に特有の組成物を指す。前記ヒドロゲルは、５０℃の温度にてアルカリ性条件下でトリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）などの網状化剤（ｒｅｔｉｃｕｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を用いた、プルランなどの多糖の化学的架橋によって得られる。前記表現は、
網状化剤を用いて多糖を架橋することによって直接得られるヒドロゲル、および
乾燥したヒドロゲル粒子の膨張後に得られるヒドロゲル
を独立して指してもよい。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「ヒドロゲル粒子」という用語は、球形、円筒形または立方体のような異なる形態を有する粒子を指す。したがって、前記ヒドロゲル粒子は研磨工程の後に得られるヒドロゲルの粒子である。他に特定されない限り、「ヒドロゲル粒子」という表現は乾燥していない。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「乾燥したヒドロゲル粒子」、「乾燥した粒子」および「乾燥した凍結生物ゲル」という表現は、５ｍｍ未満、好ましくは１ｎｍ未満、好ましくは５０μｍ未満、好ましくは２５μｍ未満のサイズ範囲を有する乾燥したヒドロゲル粒子を指す。前記乾燥したヒドロゲル粒子はヒドロゲル粒子を乾燥させることによって得られる。前記乾燥したヒドロゲル粒子はヒドロゲルを得るために適切な膨張溶液中で膨張される。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「膨張したヒドロゲル」という表現は、乾燥したヒドロゲル粒子の膨張から得られるヒドロゲルを指す。網状化剤を用いて多糖を架橋することによって直接得られるヒドロゲル、および乾燥したヒドロゲル粒子を膨張させた後に得られるヒドロゲルは、同じ技術的および機能的特徴を共有している。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「乾燥したヒドロゲルビーズ」および「乾燥したヒドロゲル球形」という表現は交換可能に使用され、実質的に球形または卵形を有するヒドロゲル粒子を指す。
【００２５】
本発明は、ヒドロゲルの存在下で生物試料を凍結する工程を含む、前記生物試料を凍結保存する方法であって、前記ヒドロゲルは、
ａ）３０〜７０℃、好ましくは４０〜５０℃、最も好ましくは５０℃の温度にてアルカリ性条件下で、トリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）、エピクロルヒドリン、ホルムアルデヒド、水溶性カルボジイミドおよびグルタルアルデヒド（ｇｌｕｒａｔａｌｄｅｈｙｄｅ）からなる群から選択される網状化剤を用いて、プルラン、デキストラン、硫酸デキストラン、スクレログルカン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルプルラン、寒天、アルギン酸塩、フコイダン（ｆｕｃｏｉｄａｎ）、キトサン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、ヘパリン硫酸模倣剤またはヘパラン硫酸模倣剤およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの多糖を化学的に架橋することによって得られる、方法に関する。
【００２６】
好ましくは前記網状化剤はトリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）である。
【００２７】
上記のヒドロゲルの粒子、特にヒドロゲルを復元するためにさらに膨張し得る乾燥ヒドロゲル粒子を使用することは非常に有益である。したがって、粒子は、凍結保存される細胞、組織または器官の種類およびサイズに適合できる粒子のサイズのために、より容易な使用を提供する。
【００２８】
したがって、本発明は、ヒドロゲルの存在下で生物試料を凍結する工程を含む、生物試料を凍結保存する方法であって、
前記ヒドロゲルは、
ａ）３０〜７０℃、好ましくは４０〜５０℃、最も好ましくは５０℃の温度にてアルカリ性条件下で、トリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）、エピクロルヒドリン、ホルムアルデヒド、水溶性カルボジイミドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される網状化剤を用いて、プルラン、デキストラン、硫酸デキストラン、スクレログルカン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルプルラン、寒天、アルギン酸塩、フコイダン、キトサン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、ヘパリン硫酸模倣剤またはヘパラン硫酸模倣剤およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの多糖を化学的に架橋する工程、
ｂ）ヒドロゲル粒子を得るためにａ）において得られたヒドロゲルを研磨する工程、
ｃ）任意に、工程ｂ）において得られた前記ヒドロゲル粒子を洗浄する工程、
ｄ）任意に、工程ｂ）または工程ｃ）において得られた前記ヒドロゲル粒子を篩にかける工程、
ｅ）任意に、好ましくは生理食塩水、好ましくは蒸留水中で完全にリンスしたリン酸緩衝食塩水を用いて、工程ｂ）または工程ｄ）において得られた前記ヒドロゲル粒子を洗浄する工程、
ｆ）工程ｂ）または工程ｅ）において得られた前記ヒドロゲル粒子を、好ましくはエタノール／水浴中で脱水する工程、
ｇ）乾燥ヒドロゲル粒子を得るために、工程ｆ）において得られた前記ヒドロゲル粒子を、好ましくは５０℃にて乾燥する工程、
ｈ）任意に、工程ｇ）において得られた乾燥粒子を篩にかける工程、
ｉ）ヒドロゲルを得るために、工程ｈ）において得られた乾燥ヒドロゲル粒子を、膨張溶液中で膨張させる工程
によって得られる、方法に関する。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「ヒドロゲル粒子」または「粒子」という用語は、本発明に係るヒドロゲルを研磨する工程によって得られる生成物を指す。典型的に、前記研磨する工程は、２０００〜１００００回転／分の可変速度でＧｒｉｎｄｏｘｍｉｘ  ＧＭ２００ナイフミルを使用して操作される。好ましくは、工程ｇ）において得られた乾燥ヒドロゲル粒子は乾燥ヒドロゲルビーズである。
【００３０】
好ましくは、前記凍結する工程は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を実質的に含まずまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いずに実施される。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」とは、約１％未満、好ましくは約０．５％未満、より好ましくは約０．１％未満の濃度で存在すること、最も好ましくは完全に存在しないことを意味する。典型的に、「抗凍結剤を実質的に含まない」は、従来の方法に使用される抗凍結剤の量より３倍少ない量に対応し得る。
【００３２】
特定の実施形態において、前記凍結する工程は、１，２−プロパンジオールを実質的に含まずに、好ましくは従来の方法に使用される１，２−プロパンジオールの量より３倍少ない量で実施される。あるいは、前記凍結する工程は１，２−プロパンジールを用いずに実施される。
【００３３】
本明細書で使用される場合、所与の抗凍結剤を「用いない」とは、本発明を実施している間に前記抗凍結剤が完全に存在しないこと（０％）を指す。
【００３４】
好ましくは、前記凍結する工程は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、プロパンジオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される抗凍結剤を実質的に含まずまたは用いずに実施される。
【００３５】
好ましくは、前記凍結する工程は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、スクロース、およびトレハロースから選択される抗凍結剤を実質的に含まずまたは該抗凍結剤を用いずに実施される。
【００３６】
より好ましくは、前記凍結する工程は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、プロパンジオール、スクロース、およびトレハロースから選択される抗凍結剤を実質的に含まずまたは該抗凍結剤用いずに実施される。
【００３７】
より好ましくは、前記凍結する工程は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、プロパンジオール、スクロース、トレハロース、グルコース、ラクトース、フルクトース、ラフィノース、プロピレングリコール、１，２／２，３ブタンジオール、アセトアミド、デキストラン、ポリマーポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルデンプン、プロピレングリコール、１，２−プロパンジオール、ブタンジオール、ホルムアミド、フィコール、マンニトール、グルコネート、カルボキシメチルセルロース、およびデキストランから選択される抗凍結剤を実質的に含まずまたは抗凍結剤を用いずに実施される。
【００３８】
より好ましくは、前記凍結する工程は、抗凍結剤を実質的に含まずに実施される。
【００３９】
典型的に、前記凍結する工程は、従来の技術に従って実施される。
【００４０】
好ましくは、前記凍結する工程は、標準圧力条件にて０℃以下の温度で実施される。
【００４１】
好ましくは、前記凍結する工程は、−１０℃、−２０℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃以下、好ましくは−７０℃以下の温度にて実施される。より好ましくは、前記凍結する工程は、−７０℃〜−１５６℃の温度にて実施される。より好ましくは、前記凍結する工程は、−１９６℃の温度にて実施される。
【００４２】
好ましくは、前記工程は、−７０℃以下の温度、好ましくは適切な制御冷却速度にて−７０℃から−１５６℃の温度での機械的冷却工程である。あるいは、前記凍結する工程は−１９６℃の温度にて液体窒素で行われる。別の実施形態において、前記凍結する工程はガラス化技術を使用することによって行われる。このような技術の詳細は当業者の一般知識の範囲内である。
【００４３】
好ましくは、生物試料を凍結する工程は、前記生物試料を凍結保存するのに十分な量のヒドロゲルの存在下で行われる。したがって、当業者は本発明のプロセスを効果的に実施するために十分な量の前記ヒドロゲルを与えることに注意するであろう。当業者はまた、生物試料に対する損傷を引き起こさない量の前記ヒドロゲルを与えることに注意するであろう。
【００４４】
当業者は、正確な凍結保存溶液にヒドロゲルの量を容易に適合し、特定および規定された量の生物試料を凍結保存するのに容易に適合するであろう。典型的に、本発明の方法が乾燥ヒドロゲル粒子の使用を含む場合、前記量はヒドロゲル粒子のサイズ、すなわちこのようなヒドロゲル粒子の粒度分布に依存する。
【００４５】
典型的に、１０４〜１０６個の細胞を含有する溶液を凍結保存するために、２０〜６０ｍｇ、好ましくは１５〜２５ｍｇのヒドロゲルまたはヒドロゲル粒子を使用できる。
【００４６】
典型的に、洗浄する工程ｅ）は、生理食塩水、好ましくはｐＨ７．４にてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で実施されてもよい。ＰＢＳを用いていくつかの洗浄工程を開始できる。例えば以下のようにヒドロゲルを洗浄できる：
１．５Ｍの濃度にてＰＢＳで３回、
０．１５Ｍの濃度にてＰＢＳで２回、
０．０１５Ｍの濃度にてＰＢＳで３回。
【００４７】
各回、ヒドロゲルは約２０分の間、完全に洗浄される。次いでヒドロゲルは、６〜８のｐＨ、好ましくは約７、より好ましくは７．４のｐＨを用いて、ヒドロゲルを得るのに十分な時間、蒸留水中で完全にリンスされる。あるいは、ヒドロゲルは、徐々に減少させた濃度で蒸留水、続いて緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の連続流でリンスされ、次いで種々の濃度のエタノール浴を使用して脱水されてもよい。
【００４８】
典型的に、脱水する工程ｆ）はエタノール／水浴中で実施される。当業者は前記浴の性質および適切な数を知っている。この脱水する工程に関して、いくつかの異なるエタノール／水浴が存在し得る。例えば以下を使用できる：
７０％のエタノールの濃度にてエタノール／ＰＢＳ  ０．０１５Ｍを有する２つの浴、
５０％のエタノールの濃度にてエタノール／ＰＢＳ  ０．０１５Ｍを有する２つの浴、
無水エタノールを有する１つの浴。
【００４９】
典型的に、乾燥する工程ｇ）は５０℃にて実施され得る。典型的に、前記工程は真空手段により実施される。本発明の方法は、工程ｇ）の後で工程ｈ）の前に、粉末を得るようにヒドロゲル粒子を研磨するさらなる工程ｇ’）を含んでもよい。
【００５０】
篩にかける工程ｈ）は所望の直径を有する基準粒子の形成を導く。この工程は幅広い範囲の粒径分布を与える。典型的に、前記粒子の直径は、５μｍ〜２ｍｍ、好ましくは２０μｍ〜１．５ｍｍである。典型的に、前記篩にかける工程は振動性篩振とう器を用いて実施されてもよい。２つのパラメータはこの機器で調節され得る：１．０〜４ｍ／ｓ２に設定され得る篩底部加速度、０．２０〜３ｍｍである可変振動振幅。
【００５１】
膨張させる工程ｉ）は異なる膨張溶液を用いて実施されてもよい。前記膨張溶液は当業者に公知である任意の適切な媒質であってもよい。しかしながら、本発明者らは、乾燥ヒドロゲル粒子を膨張するために使用する場合、一部の非常に特定の媒質がより良い結果を与えることを証明している。
【００５２】
好ましくは、前記膨張溶液は生理食塩水である。
【００５３】
あるいは、前記膨張溶液は、ＳＣＯＴ３０、ＳＣＯＴ１５、Ｐｅｒｆａｄｅｘ、Ｓｔｅｍ、アルファ溶液、ビアスパン（Ｖｉａｐｓａｎ）、セルシオ（ｃｅｌｓｉｏｒ）溶液、ＵＷ溶液、ＶＳ４溶液、バイオキセル（Ｂｉｏｘｅｌｌ）溶液、イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地、ハンクス（Ｈａｎｋｓ）溶液、またはダルベッコ改変イーグル培地などの市販の溶液であってもよい。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「生理食塩水」または「生理溶液」という表現は、塩化ナトリウム水溶液を指す。典型的に、前記溶液は０．９％の塩化ナトリウムを含む。典型的に、前記溶液は無菌であり、等張性である。すなわち、前記溶液は血液と同じ浸透圧を有する。したがって、前記生理食塩水は生理的である。
【００５５】
好ましくは、前記膨張溶液は以下からなる群から選択される：
ｉ）溶液ＳＧｌｙ、該溶液は好ましくは、１〜１０％、最も好ましくは約５％のグリセロールの濃度にて生理食塩水およびグリセロールを含む；
ｉｉ）溶液ＳＧＬＵ、該溶液は好ましくは、５〜２０％、最も好ましくは約１０％のグルコースの濃度にて生理的血清およびグルコースを含む；および
ｉｉｉ）溶液ＳＰＥＧ１５、該溶液は好ましくは、生理食塩水１リットル当たり１５ｇのポリエチレングリコールの濃度にて生理食塩水およびポリエチレングリコールを含む。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「ＳＧｌｙ」という表現は、好ましくは１〜１０％、最も好ましくは約５％のグリセロールの濃度にて生理食塩水およびグリセロールを含む膨張溶液を指す。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「ＳＧＬＵ」という表現は、好ましくは５〜２０％、最も好ましくは約１０％のグルコースの濃度にて生理食塩水およびグルコースを含む膨張溶液を指す。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「ＳＰＥＧ１５」という表現は、好ましくは生理食塩水１リットル当たり１５ｇのポリエチレングリコールの濃度にて生理食塩水およびポリエチレングリコールを含む膨張溶液を指す。
【００５９】
膨張溶液の量はヒドロゲル粒子の量および冷凍保存に対する生物試料の性質に依存する。したがって、当業者は、乾燥ヒドロゲル粒子が膨張する膨張溶液の特定の量を容易に決定する。
【００６０】
本発明の方法は生物試料を凍結した後により高い生存率を提供する。
【００６１】
一実施形態において、前記生物試料は、哺乳動物細胞、植物細胞、血液細胞、卵母細胞または精細胞などの生殖細胞、胚細胞、幹細胞、臍帯由来の細胞、卵巣皮質の細胞、造血系幹細胞または膵島などの細胞である。前記生物試料はまた、動物胚、ヒトまたは非ヒトなどの胚であってもよい。
【００６２】
本発明者らは、本発明の非常に特異的なヒドロゲルに起因して、凍結保存した卵母細胞の生存率が、３倍少ない１，２−プロパンジオール（ＰＲＯＨ）を使用した状態で、ＰＲＯＨの使用を含む従来の方法で得た生存率より高い様式を示した。
【００６３】
細胞または胚を凍結保存した場合の浸透圧衝撃のあらゆる危険性を防ぐために、ヒドロゲル内に細胞を注入することが好ましい。前記ヒドロゲル内への前記細胞の注入は任意の従来の技術に従って実施され得る。典型的に、ヒドロゲルは標的細胞を凍結保存するのに十分な量でクライオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）内、または高安全ストロー内に配置される。装置の選択は凍結保存される細胞の性質に依存する。次いで細胞はヒドロゲル内に注入される。次いで凍結する工程が行われてもよい。
【００６４】
別の実施形態において、前記生物試料は、心臓、肺、皮膚、血管、角膜、卵巣、肝臓、腎臓、膵臓、腸、眼または脾臓などの器官である。この特定の実施形態において、ヒドロゲルの一部内にのみ器官を最初に配置し、その後、ヒドロゲルの残りの量を提供することが好ましい。典型的に、プロセスを実施する前に、当業者は標的器官を凍結乾燥するのに十分な量のヒドロゲルを決定する。次いで、１０〜６０％、好ましくは２０〜４０％のこのヒドロゲルが適合されるクライオチューブ、ストローまたはパウチ内に配置される。器官がヒドロゲル内に配置されると、４０〜９０％、好ましくは６０〜８０％の残りのヒドロゲルが前記クライオチューブ、ストロー、またはパウチ内に配置される。次いで凍結する工程が行われてもよい。
【００６５】
さらに別の実施形態において、前記生物試料はＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸である。典型的に、前記核酸はＤＮＡまたはＲＮＡを抽出するための慣例の手順により得られる。
【００６６】
典型的に、本発明を実施するのに有用な乾燥ヒドロゲル粉末は１から３０００％を含む膨張比を有する。乾燥ヒドロゲル粒子の膨張比は生理食塩水中で決定される。典型的に、乾燥凍結生物ゲルの重量は、生理食塩水、好ましくはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中への浸漬前に記録される（Ｗｄ）。インキュベーションの１時間後、過剰な水が除去され、膨張した凍結生物ゲルが秤量される（Ｗｓ）。膨張比は以下の式に従って計算される。
ＳＲ＝［（Ｗｓ−Ｗｄ）／Ｗｄ］×１００
【００６７】
本発明の乾燥ヒドロゲルは、Ａｇａｒ（登録商標）またはＡｇａｒｇｅｌ（登録商標）などの市販のヒドロゲルより高い膨張特性を提供する。本発明を実施するのに有用な乾燥ヒドロゲルは任意の他の市販のヒドロゲルと比べて予期せぬ結果を示す。この結果は本発明のヒドロゲルの非常に特定の性質により証明される。したがって、本発明者らによって開発された方法は、前記ヒドロゲルに対して非常に特定の特徴を提供するように明らかに見える。所望の場合、生物試料は解凍される。典型的に、解凍する工程は、凍結またはガラス化生物試料を解凍溶液中に配置することによって実施される。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「解凍」溶液という用語は、その生存能力を保存しながら、生物試料を解凍できる溶液を指す。このような媒体は、特定の生物試料についての基本媒体として適切であることが当該技術分野において知られている任意の媒体であってもよい。
【００６９】
本発明は生殖細胞および／または動物胚を凍結する方法に関する。インビトロ受精処理が多胎妊娠を回避するために少数の胚を用いて実施される場合、卵母細胞、精細胞および胚を凍結保存するための効果的な方法についての必要性が存在する。したがって、本発明は動物（ヒトおよび非ヒト）の生殖細胞および胚を凍結保存するのに非常に有用である。
【００７０】
典型的に、胚は、発生の種々の段階、好ましくは桑実胚および胞胚期などの早期に凍結保存に供されてもよい。
【００７１】
本発明はさらに、抗凍結剤としてのヒドロゲルの使用に関し、前記ヒドロゲルは、
ａ）３０〜７０℃、好ましくは４０〜５０℃、最も好ましくは５０℃の温度にてアルカリ性条件下で、トリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）、エピクロルヒドリン、ホルムアルデヒド、水溶性カルボジイミドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される網状化剤を用いて、プルラン、デキストラン、硫酸デキストラン、スクレログルカン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルプルラン、寒天、アルギン酸塩、フコイダン、キトサン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、ヘパリン硫酸模倣剤またはヘパラン硫酸模倣剤およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの多糖を化学的に架橋する工程
によって得られる。
【００７２】
本発明はさらに、抗凍結剤としてのヒドロゲルの使用に関し、前記ヒドロゲルは、
ａ）３０〜７０℃、好ましくは４０〜５０℃、最も好ましくは５０℃の温度にてアルカリ性条件下で、トリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）、エピクロルヒドリン、ホルムアルデヒド、水溶性カルボジイミドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される網状化剤を用いて、プルラン、デキストラン、硫酸デキストラン、スクレログルカン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルプルラン、寒天、アルギン酸塩、フコイダン、キトサン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、ヘパリン硫酸模倣剤またはヘパラン硫酸模倣剤およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの多糖を化学的に架橋する工程、
ｂ）ヒドロゲル粒子を得るために、ａ）において得られたヒドロゲルを研磨する工程、
ｃ）任意に、工程ｂ）において得られた前記ヒドロゲル粒子を洗浄する工程、
ｄ）任意に、工程ｂ）または工程ｃ）において得られたヒドロゲル粒子を篩にかける工程、
ｅ）任意に、好ましくは生理食塩水、好ましくは蒸留水中で完全にリンスしたリン酸緩衝食塩水を用いて、工程ｂ）または工程ｄ）において得られたヒドロゲル粒子を洗浄する工程、
ｆ）好ましくはエタノール／水浴中で、工程ｂ）または工程ｅ）において得られたヒドロゲル粒子を脱水する工程、
ｇ）乾燥ヒドロゲル粒子を得るために、好ましくは５０℃にて、工程ｆ）において得られたヒドロゲル粒子を乾燥する工程、
ｈ）任意に、工程ｇ）において得られた乾燥粒子を篩にかける工程、
ｉ）ヒドロゲルを得るために、膨張溶液中で、工程ｈ）において得られた乾燥ヒドロゲル粒子を膨張させる工程
によって得られる。
【００７３】
上記の技術的特徴の全てが利用可能である。
【００７４】
以下において、本発明を以下の実施例および図面によって例示する。
【実施例】
【００７５】
実施例１：細胞および組織保存
多糖系ヒドロゲル粒子バンク（凍結生物ゲル）は、５０℃にてアルカリ性条件下でトリメタリン酸三ナトリウム網状化剤（ＳＴＭＰ、１０％（ｗ／ｗ、Ｓｉｇｍａ））を用いて、プルラン（ＭＷ２００，０００  Ｈａｙａｓｈｉｂａｒａ、岡山、日本）を化学的に架橋することによって得た。
【００７６】
得られたヒドロゲルをストレーナ（５ｍｍ直径）上で篩にかけ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄し、蒸留水中で完全にリンスした。次いで、ヒドロゲルをエタノール／水浴中で脱水した（連続して７０％エタノール中で１回、５０％エタノール中で１回、および無水エタノール中で３回）。５０℃にて真空中で乾燥後、大きな粒子を破砕し、粗調製したヒドロゲル粒子（０．１〜１．５ｍｍ直径）を得るために篩にかけた。
【００７７】
Ａ）凍結生物ゲルの特性付け
ａ）プロトコル
膨張分析
生理環境中のヒドロゲル粒子の挙動を定義するために、これらのヒドロゲルの膨張比を生理的血清中で求めた。乾燥した凍結生物ゲルの重量をＰＢＳ中への浸漬前に記録した（Ｗｄ）。インキュベーションの１時間後、過剰な水を取り除き、膨張した凍結生物ゲルを秤量した（Ｗｓ）。膨張比を以下の式に従って計算した：
ＳＲ＝［（Ｗｓ−Ｗｄ）／Ｗｄ］×１００
【００７８】
リン酸塩含有量
生物バイオゲル中の結合したリン酸塩含有量を、リン酸塩アッセイを使用して定量した。手短に述べると、５０ｍｇのヒドロゲル粒子を、ヒドロゲルが完全に分解するまで１０５℃にて１０％のＨＮＯ３中でインキュベートした。次いでメタバナジン酸アンモニウム溶液（ＮＨ４ＶＯ３、１１ｍｍｏｌ／Ｌ）およびヘプタモリブデン酸アンモニウム溶液（（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、４３ｍｏｌ／Ｌ）を分解したヒドロゲル溶液に加えた。校正範囲は０．４ｍｍｏｌ／ＬのＨ３ＰＯ４溶液を使用して行った。試料のスペクトルはスペクトロメータを使用して４０５ｎｍにて記録した。
【００７９】
熱機械分析
ヒドロゲルを効果的に使用する方法を定義するために、まず、それらの組成に応じてそれらの熱特性を研究することが必要とされる。実際に、合成されたヒドロゲルのこの系統的な熱特性評価は凍結生物学におけるそれらの使用のための決定要因である。
【００８０】
示差走査熱量計
凍結細胞学において広範に使用されているこの技術（Ｂｏｕｔｒｏｎら、１９７９；Ｄｅｖｉｒｅｄｄｙ、１９９８；Ｂｉｓｃｈｏｆ、２０００）により、数ミリグラムの試料において動的条件下での相転移の観察が可能である。非晶質状態の対応するガラス形成傾向および安定性はこのように示差走査熱量測定から評価される。測定は、Ｓｅｔａｒａｍ  ＤＳＣ１３１熱分析計で実施した。−１０℃／分にて試料を２０℃〜−１５０℃に冷やした。熱分析ソフトウェアＳＥＴＳＯＦＴ２０００を使用してサーモグラムを分析した。
【００８１】
ｂ）結果
実施に有用なヒドロゲル粒子を図１に表す。前記粒子の特定の性質を本明細書以下に記載する。
【００８２】
膨張比
図２の左に示すように、膨張比は粒子が膨張する膨張溶液の性質に依存する。
熱機械分析
図２の右は、本発明の方法を実施するのに有用な凍結生物ゲルの特徴を示す。
【００８３】
Ｂ）凍結生物ゲルの調製
凍結生物ゲルを１ｍｌの膨張溶液で膨張させた。４種類の膨張溶液を使用した。
１）生理食塩水および５％グリセロールからなるＳＧＬＹ；
２）生理食塩水および１０％の濃縮したグルコール溶液からなるＳＧＬＵ；
３）生理食塩水およびポリエチレングリコール（１５ｇ／Ｌ）からなるＳＰＥＧ１５。
ＤＭＥＭ、１０％ＤＭＳＯおよび１０％ＦＣＳの溶液は対照として使用した。
【００８４】
Ｃ）細胞凍結および解凍
細胞凍結
２０ｍｇの凍結生物ゲル（粒径＜５ｍｍ）を、９００μｌの凍結保存溶液を含有する２ｍｌのクライオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）中で膨張させた。１０５／ｍｌのＨｕｖｅｃ細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）またはＣＤ３４＋細胞を含有する１００μＬの凍結保存溶液を、膨張した凍結生物ゲルまたは対照培地を含有するクライオチューブに加えた。クライオチューブを自動フリーザ（Ｆｒｅｅｚａｌ、Ａｉｒ  Ｌｉｑｕｉｄｅ、フランス）に移した。冷却速度は−１℃／分で室温から−８０℃または−１９６℃であった。クライオバイアルは−８０℃のフリーザに即座に移したか、または液体窒素容器に入れた。
【００８５】
細胞解凍
クライオバイアルを３７℃にて２分間水浴中に浸漬した。細胞および凍結生物ゲルは、過剰な培地の存在下で４０μｍの細胞ストレーナ（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ、フランス）で分離した。遠心分離工程はこの段階で必要とされなかった。対照のために、細胞を１０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。次いで凍結培地を取り出した。細胞溶液を培養フラスコに移し、加湿５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃にてインキュベートした。培地は２日毎に変化させた。
【００８６】
細胞生存
解凍後にトリパンブルー染色を使用して細胞生存を評価した。この方法は壊死細胞とアポトーシス細胞とを見分けることができないので、レサズリンを蛍光分子、レゾルフィンに変換する生細胞の自然減少力を使用するレサズリン（ａｌｍａｒＢｌｕｅ）指示染料を使用することによっても細胞生存を評価した。生存細胞はレサズリンをレゾルフィンに連続して変換するので、生存および細胞毒性の定量的尺度が生じる（Ａｌ−Ｎａｓｉｒｙ、Ｓ．ら（２００７）、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｌａｍａｒＢｌｕｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｒｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２２：１３０４−１３０９）。
【００８７】
細胞培養
細胞増殖実験のために、ＨＵＶＥＣ細胞（５×１０３個の細胞）を、３７℃、９５％湿度、５％ＣＯ２にて１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）を追加したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）中で２４ウェルプレート中に播種した。培地は２日毎に変化させた。１、３および７日目に、トリプシン−ＥＤＴＡにより細胞を収集し、Ｍａｌａｓｓｅｚ血球計算器（ｈｅｍａｔｏｃｙｍｅｔｅｒ）でカウントした。全ての実験は少なくとも２回および４連の試料で実施した。
【００８８】
Ｄ）組織の採取、凍結および解凍
組織採取
胸部大動脈を２５０ｇの体重のオスのラット（ｗｉｓｔａｒ、ｗｓ／ｗｓ）から採取した。全ての手順および動物処置は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（フランス農林省からの承認番号００６２３５）により発行されている実験動物ケアの指針に従った。一般的な麻酔の後、胸部壁を切開し、胸部大動脈を大動脈弓の下で採取し、実験前に０．９％ＮａＣｌ溶液（ＣＤＭ  Ｌａｖｏｉｓｉｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中に浸した。１ｃｍのこれらの切片を各血管から得た。
【００８９】
組織凍結
６０ｍｇのヒドロゲル（粒径＜０．１ｍｍ）を、１ｍｌの凍結保存溶液または抗凍結剤としてジメチルスルホキシド（Ｍｅ２ＳＯ）を有する対照培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ）を含有する２ｍｌのクライオバイアル中で膨張させた。次いで１ｃｍの大動脈をクライオバイアル中に入れた。クライオチューブを自動フリーザ（Ｆｒｅｅｚａｌ、Ａｉｒ  Ｌｉｑｕｉｄｅ、フランス）に移し、−１℃／分の冷却速度を適用して−８０℃または−１９６℃に到達させた。クライオバイアルを即座に−８０℃のフリーザまたは液体窒素容器に移した。
【００９０】
組織解凍
保存後、クライオバイアルを３７℃にて水浴中に浸漬することによって迅速に解凍した。クライオバイアルを濾過により除去した。凍結した試料を含有するクライオバイアルを３７℃にて２分間水浴中に浸漬した。組織を鉗子により除去して、生理食塩水中に浸漬し、ヒドロゲルを除去した。あるいは、過剰な培地を加え、大動脈を容易に採取した。
【００９１】
Ｅ）細胞および組織生存の評価
細胞生存
解凍後にトリパンブルー染色により細胞生存を評価した。この方法は壊死細胞とアポトーシス細胞とを見分けることができないので、レサズリンを蛍光分子、レゾルフィンに変換する生細胞の自然減少力を使用するレサズリン（ａｌｍａｒＢｌｕｅ）指示染料を使用することによっても細胞生存を評価した。生存細胞はレサズリンをレゾルフィンに連続して変換するので、生存および細胞毒性の定量的尺度が生じる（Ａｌ−Ｎａｓｉｒｙ、Ｓ．ら（２００７）、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｒｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２２：１３０４−１３０９）。
【００９２】
５００μｌの細胞溶液（２×１０４個の細胞／ｍｌ）を、５０μｌのブルーレサズリン溶液を含む２４ウェルプレートのウェルに移し、加湿した５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にてインキュベートした。４時間後、ＦｌｕｏＳｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ蛍光光度計を使用してレサズリン減少を測定し、同じ濃度にて凍結保存前の細胞の減少と比較した。以下の式を使用して細胞生存のパーセンテージを計算した：
細胞生存のパーセンテージ（％）＝［（解凍後の細胞の吸光度）／（解凍前の細胞の吸光度）］×１００
対照培地は、ＨＵＶＥＣ細胞についてＤＭＥＭ、１０％ＤＭＳＯ、１０％ＦＣＳまたはＣＤ３４＋細胞についてＤＭＥＭ、１０％ＤＭＳＯ、５％アルブミンであった。
【００９３】
細胞増殖
細胞増殖実験のために、ＨＵＶＥＣ細胞（５×１０３個の細胞）を、３７℃、９５％湿度、５％ＣＯ２にて１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）を追加した２４ウェルプレート中のダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）中で播種した。培地は２日毎に変化させた。１、３および７日目に、トリプシン−ＥＤＴＡによって細胞を収集し、Ｍａｌａｓｓｅｚ血球計算器でカウントした。全ての実験は少なくとも２回および４連の試料で実施した。
【００９４】
組織生存
ＭＴＴアッセイを使用して組織細胞生存を測定した。ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、テトラゾール）を生細胞のミトコンドリア中で紫色のホルマザンに還元し、この還元はミトコンドリア還元酵素が活性化される場合にのみ行われる。手短に述べると、大動脈切片（１ｃｍ）を１ｍｌのＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、フランス）中に入れ、ＲＴにて３時間インキュベートした。得られたホルマザン結晶を、３００μｌのイソプロパノールを１９時間添加することによって可溶化した。５７０ｎｍにおける光学密度を測定し、細胞生存のパーセンテージを以下の式を使用して計算した：
細胞生存のパーセンテージ（％）＝［（実験大動脈切片の吸光度）／（新鮮な大動脈切片の吸光度）］×１００
【００９５】
結果
以前に開示されたプロトコルを使用して、本発明者らは種々の培地中のＨＵＶＥＣ細胞の生存を比較した（図４）。凍結生物ゲルＳＧｌｙおよびＲＧｌｙは、従来の培地（ＤＭＳＯおよびＳＶＦからなる）と比較してＤＭＳＯおよびＦＣＳの非存在下でさえ、より良い結果を与えた。
【００９６】
図５はまた、解凍後の細胞増殖が、従来のＳＧｌｙ培地と比較して凍結生物ゲル培地中で向上することを示す。本発明者らはまた、ＳＧｌｙ凍結生物ゲルが参照培地と同様の結果を与えることを実証した。
【００９７】
図６は、ＳＧｌｕ凍結生物ゲルが、ＨＵＶＥＣ細胞を凍結保存するのに優れた結果を与えることを示す。ゆっくりとした機械的凍結の後、解凍後の結果は、対照および参照培地と比較してヒドロゲルの存在下で同一の細胞生存率を表した。
【００９８】
実施例２：大動脈血管凍結保存
動脈試料を凍結保存のために、抗凍結剤として凍結生物ゲルおよび凍結保存培地を含有するまたは抗凍結剤としてジメチルスルホキシド（Ｍｅ２ＳＯ）を含む対照培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ）を含有する２ｍｌの液体窒素保存バイアル（Ｎｕｃｌｏｎ−Ｉｎｔｅｒｍｅｄ、Ｎｕｎｃ  Ａ／Ｓ、Ｒｏｓｋｉｌｄｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に入れた。次に、動脈切片を、−８０℃に到達する１℃／分の段階的な温度減少速度にて自動化制御凍結に供し、切片をこの温度で１日間、フリーザに保存した。この保存期間の後、切片を３７℃にて水浴に浸漬することによって迅速に解凍した。過剰な培地を加え、大動脈を容易に回収した。凍結生物ゲルを濾過により除去した。図７は以下の細胞生存率を示す
ａ）新鮮な大動脈血管；
ｂ）ＤＭＳＯの存在下での大動脈血管；
ｃ）凍結生物ゲルおよび生理食塩水の存在下での大動脈血管。
【００９９】
本発明者らは、本発明によって開発されたプロセスがＤＭＳＯを使用した従来の技術と同じほど効果的であることを示した。ＭＴＴ試験は細胞生存および適切なミトコンドリア機能の証明を与え、この機能がヒドロゲルで保存されることを実証しており、さらにこの見解はＤＭＳＯを用いた観察のものに匹敵する。得られた結果は新鮮な大動脈を用いた結果と同様であった。
【０１００】
実施例３：本発明に係るヒドロゲルと、Ａｇａｒ（登録商標）またはＡｇａｒｇｅｌ（登録商標）などの市販のヒドロゲルとの膨張特性の比較
本発明者らは、本発明に関して使用したヒドロゲル粒子が、凍結保存プロセスに使用できる非常に特定の特性を与える唯一のものであることを示した。
【０１０１】
図８に示されるように、本発明者らは、市販のＡｇａｒ（登録商標）、Ａｇａｒｇｅｌ（登録商標）およびＰｈｙｔｏｇｅｌ（登録商標）と、本発明に関して使用されるヒドロゲル粒子との特性を比較した。図９に示されるように、膨張後、本発明のヒドロゲルの粘度は高いように見える。
【０１０２】
実施例４：ウサギ胚凍結
材料および方法
性的に成熟したニュージーランドホワイト雌ウサギを使用した（ｎ＝１４）。動物を平坦なデッキケージ内に収容し、標準的なペレット食餌を自由に与え、自由に水を取らせた。１６時間の明および８時間の暗の交互周期を使用した。単独または組換えヒトＬＨ（ｒｈＬＨ；Ｌｕｖｅｒｉｓ７５；Ｓｅｒｏｎｏ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）と共にｒｈＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ−Ｆ７５；Ｓｅｒｏｎｏ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して排卵を誘導し、雌を受精させた。胚を以前に記載したぎっしり詰まった桑実胚期にて人工授精の７２時間後に採取した。手短に述べると、動物を、０．４ｍＬのキシラジン２％（Ｒｏｍｐｕｎ；Ｂａｙｅｒ  ＡＧ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、ドイツ）の筋肉内注射および１．２ｍＬ／ｋｇ体重のケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ；Ｍｅｒｉａｌ  Ｓ．Ａ．、Ｌｙｏｎ、フランス）の静脈注射により麻酔した。次いで、腹部を剃り、消毒し、動物を安楽死させる前に卵巣および子宮角を注意深く取り除いた。卵巣の肉眼検査を排卵率を決定するために実施した。各々の子宮角を、０．２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｑｕｉｍｉｃａ  Ｓ．Ａ．、Ｍａｄｒｉｄ、スペイン）を含有する５０ｍＬのダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）でフラッシュした。回収したフラッシュ培地を立体顕微鏡下での実験のために滅菌ペトリ皿に移した。胚を、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ分類に従う形態学的基準によってスコア付けした。均質の割球ならびに通常のムチンコートおよび透明帯の両方を有する桑実胚期における胚のみを正常な胚とみなした。全部で５３４個の胚を凍結した。
【０１０３】
連続して胚を５分間、Ｅｍｂｒｙｏ  Ｈｏｌｄｉｎｇ培地ＡＲＴ０１９４４９（Ｉｍｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、４ｇ／ＬのＢＳＡおよび１０％のＤＭＳＯ（参照）または５％のＤＭＳＯ（対照として）または５％のＤＭＳＯおよびヒドロゲル粒子（粒度分布＜０．５ｍｍ；８０ｍｇから＜２０ｍｇの濃度範囲）からなる異なる凍結保存培地に入れた。次いで凍結保存培地中に懸濁した胚を、気泡により分離されるＤＰＢＳの２滴の間の０．２５ｍＬの滅菌プラスチックストロー（ＩＭＶ、Ｌ’Ａｉｇｌｅ、フランス）内に充填し、滅菌プラグで密封した。次いでストローを、プログラム可能なフリーザ（Ｃｒｙｏｌｏｇｉｃ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ、Ｍｕｌｇｒａｖｅ、オーストラリア）に直接入れ、Ｍｅｎｅｚｏの２工程スロー凍結プロトコルに従って凍結した。手短に述べると、胚を−７℃にて１０分間、平衡にし、５分の平衡時間の後、手動の播種を行った。次いで、ストローを液体窒素に直接入れる前に０．５℃／分の凍結速度で胚を−３５℃まで冷やした。３日後、室温にて１０〜１５秒間、ストローを静置させることによって解凍を行い、その後、それらを２０℃にて１分間、水浴に入れた。解凍後、凍結保存培地を取り除いた。全部で５３４個の凍結−解凍胚を培養した。３８．５℃、５％ＣＯ２、および飽和湿度にて、培地ＴＣＭ−１９９＋２０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｑｕｉｍｉｃａ  Ｓ．Ａ．、Ｍａｄｒｉｄ、スペイン）中で胚を４８時間培養した。解凍した胚の胚生存率および発生段階を評価した。
【０１０４】
結果
胚のインビトロでの生存率に関する結果を以下の表１に示す：
【０１０５】
【表１】
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【０１０６】
ＧＰ１粒子群から得た凍結−解凍胚の発生能は参照群（培地＋１０％ＤＭＳＯ）と同様であり、対照群（培地＋５％ＤＭＳＯ）と比較して顕著に高かった。培地へのＧＰ粒子の添加により、臨床的利用に興味深いＤＭＳＯ濃度の顕著な低下が可能となる。
【０１０７】
ＧＰ５群と対照群との間で相違は観察されなかった。結果は粒径とヒドロゲル濃度との間に相関関係があった。
【０１０８】
実施例５：ヒト卵母細胞の凍結
種々の濃度で使用したヒドロゲルを、最初にＵＶにより３０分間浄化し、次いで４ウェルプレート中で７００μＬの完全ＤＭＥＭ培地（１０％ＳＶＦおよび１％ＰＳＡ）の存在下で膨張させた。ヒドロゲルの膨張後、卵母細胞を各ウェルに加えた。
【０１０９】
これらのヒト卵母細胞は、Ｂｉｃｈａｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌｌｙ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｐｒｏｃｒｅａｔｉｏｎ（ＭＡＰ）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより提供された。卵母細胞は凍結するための滅菌した高い安全性のプラスチックストロー内に充填されなければならない。プラスチックストローが適合する特別なチップを有する１ｍｌの注射器による吸引を使用してストローを充填した。装置全体は滅菌され、使い捨て可能である（１回使い切り）。次に、Ｎｉｃｏｏｌ  Ｆｒｅｅｚａｌ（登録商標）（ＡＩＲ  ＬＩＱＵＩＤＥ）を使用して凍結を実施した。これは、全ての種類の感受性生物試料：ストロー、チューブ、バッグなどのために設計されているプログラム可能な低温フリーザである。以下の凍結プログラムを選択した：２℃／分で−７℃に到達させ（手動の播種）、次いで−０．３℃／分で−７℃から−２５℃にし、次いで−２５℃／分で−１５０℃に到達させた。播種の結果、結晶が生じた。−７℃で安定化した後、凍結を開始するために卵母細胞から反対側のストローにおいて「播種棒」（液体窒素に浸漬されている）を用いて播種を実施する必要がある。凍結サイクルの終わりに、すなわち、温度が−１５０℃に到達した場合、ピンセットを使用してストローをＦｒｅｅｚａｌから除去した。それらをボックス内に置き、液体窒素に入れた。
【０１１０】
凍結後に卵母細胞の形態学的外観を評価するために、光学顕微鏡を使用してそれらを観察し、異なる段階：凍結前、卵母細胞単独、次いでヒドロゲルを含有する培地と接触した卵母細胞（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３濃度において）、および凍結後において撮影した。
【０１１１】
卵母細胞の形態は、それらを処理するたびに規則的に評価した。最初の工程は、卵母細胞が浸透圧衝撃を受けないこと、およびそれらが損傷を受けないままであることを確実にするために卵母細胞を２０分間ヒドロゲルに入れる工程からなった。４ウェルプレートをこの目的のために使用し、その中でヒドロゲルを種々の濃度（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３）にてＤＭＥＭ中で膨張させた。２０分後、卵母細胞を回収し、ペトリ皿内に単離した。
【０１１２】
実施例６：皮膚の凍結
材料および方法
種々の濃度で使用したヒドロゲル粒子を、最初にＵＶにより３０分間浄化し、次いで４ウェルプレート中で７００μＬの完全ＤＭＥＭ培地（１０％ＳＶＦおよび１％ＰＳＡ）の存在下で膨張させた。ゲルの膨張後、ラットの皮膚（６ｍｍ直径）を各ウェルに加え、吸引を使用してストローを充填した。ＤＭＥＭ、１０％のジメチルスルホキシドを参照（対照）として使用した。次に、凍結（ゆっくりとした凍結またはガラス化）を、Ｎｉｃｏｏｌ  Ｆｒｅｅｚａｌ（登録商標）（ＡＩＲ  ＬＩＱＵＩＤＥ）を使用して実施した。次いで試料を液体窒素タンクに入れた。液体窒素保存の１ヶ月後、皮膚を解凍し、以前に記載されているＭＴＴ法によって組織生存を研究した。
【０１１３】
結果
結果を以下の表２にまとめる：
【０１１４】
【表２】
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【０１１５】
凍結保存培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ）への凍結生物ゲルの添加は、ＤＭＳＯを添加せずに、１０％ＤＭＳＯにいて凍結した皮膚と同じ割合で細胞組織生存を保存する。
【０１１６】
実施例７：凍結生物ゲルを用いたＨＵＶＥＣ細胞凍結保存の後のＣＤ３１免疫染色
この実験において、本発明者らは、細胞分解に対する、凍結生物ゲルを用いたＨＵＶＥＣ凍結保存の効果を調べた。これは、マトリゲル上でのインビトロ管形成（特異的マーカーＣＤ３１を識別するための免疫蛍光染色に起因する）により、ならびに至適基準法として本明細書において指定した、ＤＭＥＭ、１０％ＤＭＳＯおよび１０％ＦＣＳの溶液に関する方法との比較により試験した。
【０１１７】
マトリゲルを４℃にて一晩解凍し、２４ウェルプレートの各ウェル（２４０μｌ、１０ｍｇタンパク質／ｍｌ）に均一に広げ、３７℃にて３０分超の間重合した。細胞を解凍し、次いでＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ中で６時間インキュベートし、５×１０４個の細胞／ウェルの密度にてマトリゲルの層上に播種した。
【０１１８】
インキュベーションの２４時間後、管形成を観察した（図１０）。同様の管形成を、凍結生物ゲルまたは至適基準技術（１０％ＤＭＳＯ、１０％ＦＣＳ）で凍結乾燥したＨＵＶＥＣ細胞中で観察した。
【０１１９】
このように本発明者らは、本発明の凍結生物ゲルが、分化する組織の能力に関して従来技術の至適基準法と同じ結果を提供することを示した。
【０１２０】
実施例８：液体窒素中の大動脈ラット血管の凍結保存
１．組織構成に対する効果
大動脈ラット血管構造および内皮細胞層保存を、凍結生物ゲルを含む液体窒素中の１ヶ月の凍結保存後に評価した。結果を至適基準法（１０％ＤＭＳＯ、１０％ＦＣＳ）と比較した。
【０１２１】
図１１に示したように、至適基準技術と凍結生物ゲルとの間の組織構成において相違は発見されなかった。
【０１２２】
弾性板は平行であり、内皮細胞の層を保存した（ＲＥＣＡ１免疫染色）。対照的に、対照条件（すなわち凍結生物ゲルを加えていない）において、２つの弾性板の間の弾性板の分解および大きな空間が観察された（オルセイン染色、黄色の矢印）。さらに、内皮細胞の層は対照条件において存在しなかった。したがって、本発明の凍結生物ゲルは、凍結保存細胞の組織構成に対してネガティブな影響を有さない。
【０１２３】
２．機械的性質に対する効果
本発明者らはさらに、液体窒素中で１ヶ月後、凍結生物ゲルの存在下で凍結保存した大動脈の機械的性質を調べた。大動脈の機械的性質に対する凍結生物ゲルの存在下での凍結保存の影響を長手方向において引張試験によって評価し、新鮮な大動脈および至適基準法（１０％ＤＭＳＯ、１０％ＦＣＳ）で保存した大動脈と比較した。
【０１２４】
３つの凍結保存溶液を使用した：
実験溶液（ＳＧｌｙ、０％ＤＭＳＯ）、および
２つの臨床的市販溶液（ＳＣＯＴ  １５（登録商標）およびＳＣＯＴ  ３０（登録商標）、０％ＤＭＳＯ、ＭａｃｏＰｈａｒｍａ、フランス）。
【０１２５】
図１２に示したように、計算したヤング係数は、対照条件と比較して凍結生物ゲルの存在下の凍結保存で良好であり、ＳＣＯＴ溶液についての至適基準法と同様であった。ＳＧｌｙ溶液は新鮮な大動脈と同様の結果を示した。
【０１２６】
したがって、本発明の凍結生物ゲルは凍結保存細胞の機械的特性に対してネガティブな影響を有さない。対照的に、本発明の方法は、高いヤング係数を示す、すなわち良好な機械的特性を示す、凍結保存した大動脈を提供する。
【０１２７】
実施例９：マウス卵母細胞凍結保存の生存率
本発明者らは、以下のように１，２−プロパンジオール（ＰＲＯＨ）を使用して３つの異なる実験においてラットの卵母細胞の生存率を比較した：
Ｉ群：ＰＲＯＨ１．５ｍｏｌ／Ｌ、スクロース０．３％（臨床的至適基準）；
ＩＩ群（対照）：ＰＲＯＨ０．５ｍｏｌ／Ｌ、アルブミン１０％；および
ＩＩＩ群：ＰＲＯＨ０．５ｍｏｌ／Ｌ、凍結生物ゲル、アルブミン１０％。
結果は以下の通りである。
【０１２８】
【表３】
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【０１２９】
本発明者らは、本発明の非常に特異的な凍結生物ゲルのおかげで、それらが、従来の方法におけるよりも３倍少ないＰＲＯＨを使用しながら、凍結保存した卵母細胞の高い生存率を得たことを証明した。
【０１３０】
参考文献
本出願全体を通して、種々の参考文献が本発明に関する技術状況を記載している。これらの参考文献の開示は参照により本開示内に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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