(57)【要約】  本発明は、例えば食料、飲料（例えばビール）、飼料、バイオケミカルまたはバイオ燃料の生産における使用に好適な、改善された特性を有するグルコアミラーゼ活性を有する変異体およびそれらの変異体を含む組成物に関する。変異体をコードするＤＮＡ構築物およびグルコアミラーゼを宿主細胞中で生産する方法も開示される。さらに、例えば醸造プロセスにおける本発明によるグルコアミラーゼに関する様々な方法および使用が開示される。
2015526090.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の５０２、２９、４３、４８および１１６または親グルコアミラーゼ中の等価位置における残基からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号２の９８、９７、１４７、１７５、４８３および４８４または親グルコアミラーゼ中の等価位置における残基からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を含み、配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも８０％の配列同一性を有するグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２】
ａ）配列番号２の５０２位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換ならびに任意選択で配列番号２の２９、４３、４８および１１６または親グルコアミラーゼ中の等価位置における残基からなる界面アミノ酸の群から選択されるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号２の９８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換ならびに任意選択で配列番号２の９７、１４７、１７５、４８３および４８４または親グルコアミラーゼ中の等価位置における残基からなる触媒コアアミノ酸残基の群から選択される１つまたは２つのアミノ酸置換
を含み；
少なくとも前記界面アミノ酸の群または前記触媒コアアミノ酸残基の群から選択される１つのアミノ酸置換を有し；
配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項３】
ａ）配列番号２の５０２位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換、
ｂ）配列番号２の９８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換；および
ｃ）配列番号２の４８位もしくは親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換または配列番号２の１４７位もしくは親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換
を含み；
配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１または２に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項４】
ａ）配列番号２の５０２位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号２の９８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換；および
ｃ）配列番号２の１４７位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換
を含み；
配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項５】
ａ）配列番号２の５０２位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号２の９８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換；および
ｃ）配列番号２の４８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換
を含み；
配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項６】
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｈ５０２Ｓまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項７】
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｌ９８Ｅまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項８】
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｙ４８Ｖまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項９】
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｙ１４７Ｒまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１０】
配列番号２または１３のアミノ酸置換Ｈ５０２Ｓ；配列番号２または１３のアミノ酸置換Ｌ９８Ｅ；および配列番号２もしくは１３のアミノ酸置換Ｙ４８Ｖまたは配列番号２もしくは１３のアミノ酸置換Ｙ１４７Ｒを含み；配列番号２または１３と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１１】
前記親グルコアミラーゼが、配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１２】
前記親グルコアミラーゼが、配列番号２または１３である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１３】
配列番号２の２４、２６、２７、３０、４０、４２、４４、４６、４９、１１０、１１１、１１２、１１４、１１７、１１８、１１９、５００、５０４、５３４、５３６、５３７、５３９、５４１、５４２、５４３、５４４、５４６、５４７、５４８、５８０、５８３、５８５、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９４および５９６または親グルコアミラーゼ中の等価位置における残基からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１４】
配列番号２の、２４、２６、２７、２９、３０、４０、４２、４３、４４、４６、４８、４９、９７、９８、１１０、１１１、１１２、１１４、１１６、１１７、１１８、１１９、１４７、１７５、４８３および４８４を除く、１〜４８４位または親グルコアミラーゼ中の等価位置における残基からなる触媒コアアミノ酸の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１５】
少なくとも７４．５％のＲＤＦを示す、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１６】
配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１７】
配列番号２または１３と少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性を有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１８】
前記親グルコアミラーゼと比較して減少した熱安定性を示す、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１９】
低温殺菌により、例えば１６．８、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４低温殺菌単位（ＰＵ）未満を使用してビール中で不活化される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２０】
配列番号１４、１５または１７からなる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体を生産する方法であって、前記グルコアミラーゼ変異体の異種発現を有する宿主細胞中での前記グルコアミラーゼ変異体の合成を誘導する工程および任意選択で前記グルコアミラーゼ変異体を精製する工程を含む方法。
【請求項２２】
任意選択で、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、ペプチダーゼ（例えばプロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ）、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼおよび関連ベータ−グルカン加水分解アクセサリー酵素、キシラナーゼおよびキシラナーゼアクセサリー酵素（例えばアラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ）、アセトラクテートデカルボキシラーゼならびにグルコアミラーゼの中から、それらの任意の組合せを含み、選択される１つ以上のさらなる酵素を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の１つ以上のグルコアミラーゼ変異体を含む組成物、例えばアルコール発酵酵素組成物。
【請求項２３】
発酵における請求項１〜２０のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体または請求項２２に記載の組成物の使用であって、前記グルコアミラーゼ変異体または組成物を、発酵工程前またはその間に添加し、任意選択で前記発酵工程に低温殺菌工程が続き、例えば前記発酵を、発酵飲料を作製する方法に含める使用。
【請求項２４】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体または請求項２２に記載の組成物を、任意選択で低温殺菌工程が続く発酵工程前またはその間に添加することを含む方法。
【請求項２５】
以下の工程：
ａ）マッシュを調製すること、
ｂ）前記マッシュをろ過して麦汁を得ること、および
ｃ）前記麦汁を発酵させて発酵飲料を得ること
を含み、
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体または請求項２２に記載の組成物を、
ｉ．工程（ａ）の前記マッシュおよび／または
ｉｉ．工程（ｂ）の前記麦汁および／または
ｉｉｉ．工程（ｃ）の前記麦汁
に添加する、発酵飲料を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
参照により全体として本明細書に援用される配列番号１〜３１を含む配列表が付属される。
【０００２】
本発明は、例えば食料、飲料（例えばビール）、飼料、バイオケミカルまたはバイオ燃料の生産における使用に好適な、改善された特性を有するグルコアミラーゼ活性を有する変異体およびその変異体を含む組成物に関する。変異体をコードするＤＮＡ構築物およびグルコアミラーゼ変異体を宿主細胞中で生産する方法も開示される。さらに、例えば醸造プロセスにおける本発明によるグルコアミラーゼに関する様々な方法および使用が開示される。
【背景技術】
【０００３】
グルコアミラーゼ（グルカン１，４−α−グルコヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．３）は、デンプン加水分解エキソ作用型カルボヒドラーゼであり、デンプンまたは関連オリゴおよび多糖分子の非還元末端からの連続グルコース単位の除去を触媒する。グルコアミラーゼは、デンプンの直鎖および分枝鎖グルコシド結合（例えばアミロースおよびアミロペクチン）の両方を加水分解し得る。
【０００４】
グルコアミラーゼは、細菌、真菌、酵母および植物の多数の株により生産される。特に興味深く、商業的に重要なグルコアミラーゼは、例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；特許文献１；特許文献２および３）；タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）（特許文献４；特許文献５；および特許文献６）；クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）（非特許文献４；非特許文献５および特許文献７）；フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（特許文献８および特許文献９）；ならびにケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）（非特許文献６）の株から細胞外生産される真菌酵素である。これらの酵素をコードする遺伝子の多くは、酵母、真菌および／または細菌細胞中でクローニングおよび発現されてきた。商業的に、グルコアミラーゼは極めて重要な酵素であり、デンプンの加水分解を要求する多種多様の用途において使用されてきた（例えばデンプンからグルコースおよび他の単糖を生産するため）。グルコアミラーゼは、高フルクトースコーン甘味料を生産するために使用され、それらはアメリカ合衆国における甘味料市場の５０％超を構成する。
【０００５】
一般に、グルコアミラーゼはアルファ−アミラーゼとともに、デンプンをデキストリンに、次いでグルコースに加水分解するためにデンプン加水分解プロセスにおいて使用することができ、および一般に使用されている。次いで、グルコースは、他の酵素（例えばグルコースイソメラーゼ）によりフルクトースに変換することができ；結晶化することができ；または多数の最終生産物（例えばエタノール、クエン酸、乳酸、スクシネート、アスコルビン酸中間体、グルタミン酸、グリセロールおよび１，３−プロパンジオール）を生産するために発酵において使用することができる。デンプンおよび／またはセルロース含有材料の発酵においてグルコアミラーゼを使用することにより生産されるエタノールは、燃料の供給源としてまたはアルコール消費に使用することができる。
【０００６】
高グルコースコーンシロップ（ＨＧＣＳ）および高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）生産に商業的に使用される高固体濃度において、グルコアミラーゼは、グルコースから縮合反応により二糖、三糖および四糖を合成する。これは、デンプン中のアルファ−（１−６）−Ｄ−グルコシド結合の緩慢な加水分解およびＤ−グルコースからの種々の蓄積縮合生産物、主にイソマルトースの形成のために生じる。したがって、多くの慣用プロセスにおけるグルコース収率は、理論収率の９５％を超過しない。このプロセスにより世界的に生産されるシロップの量は、非常に多く、デンプン１トン当たりのグルコース収率の極めて小さい増加でさえ、商業的に重要である。
【０００７】
いくつかのグルコアミラーゼが、例えば特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５および特許文献１６に記載されている。
【０００８】
デンプン由来炭水化物の加水分解におけるグルコアミラーゼの使用は、醸造産業において、特に高希薄化（低カロリーと称されることもある）ビールの生産において重要になってきている。グルコースは、酵母によりアルコールに即時変換され、それにより醸造業者が発酵から極めて高いアルコール収率を得、同時に、残留炭水化物が非常に少ないビールを得ることが可能になる。発酵体は、水により所望のアルコール％まで希釈され、最終ビールは、「ローカーボ」として販売される。生産物安定性および法律に関する理由のため、添加される酵素活性が最終ビール中で除去／不活化されることが重要である。残念ながら、この要求は、グルコアミラーゼが通常の供給源の例えばアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、例えばクロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびアワモリコウジカビ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）；フミコラ属種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｓｐｐ．）；タラロミセス属種（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、例えばＴ．エメルソニイ（Ｔ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）；アセリア属種（Ａｔｈｅｌｉａ  ｓｐｐ．）、例えばＡ．ロルフシイ（Ａ．ｒｏｌｆｓｉｉ）；アオカビ属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、例えばアオカビ（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）に由来し、酵素が醸造プロセスにおいて発酵容器（ＦＶ）中に添加される場合、酵素の熱安定性に起因して実行することが困難である。
【０００９】
グルコアミラーゼのマッシング容器への添加または麦汁沸騰前の任意の段階における添加はこの問題を回避し得るが、これにより他の実用面で困難性が生じる。特許文献１７は、固体担体上で固定化されている醸造酵素グルコアミラーゼを含む反応器を用い、それにより酵素を生産物から回収することができる醸造プロセスを記載している。特許文献１８は、組換えグルコアミラーゼを発現する遺伝子操作酵母を用い、酵素をその酵母により分泌させる醸造プロセスを記載している。
【００１０】
したがって、例えば慣用の装置を使用して発酵飲料、例えばビールを調製する慣用のプロセスの任意の段階に添加することができ、活性を最終生産物から安全に除去することができるグルコアミラーゼ活性を有する組成物の形態のグルコアミラーゼが依然として必要とされている。
【００１１】
例えば、組成物の形態の加水分解活性を有するグルコアミラーゼ変異体を、発酵飲料の調製において使用される発酵容器（ＦＶ）中に添加することが特に効率的である。利益は、例えばより低い酵素投入量、発酵性炭水化物へのデンプン変換率の増加および酵母ストレスの低減である。このアプローチが一般に使用されない理由は、この場合、上記のとおり不所望な最終生産物中で活性酵素が存在し得ることである。市販のグルコアミラーゼは、一般に熱安定であり、発酵飲料の低温殺菌の間に適用されるエネルギーは、酵素を不活化するために十分でない。したがって、発酵後の低温殺菌により不活化することができる熱不安定グルコアミラーゼがさらに必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５，０２４，９４１号明細書
【特許文献２】米国特許第４，７９４，１７５号明細書
【特許文献３】国際公開第８８／０９７９５号パンフレット
【特許文献４】米国特許第４，２４７，６３７号明細書
【特許文献５】米国特許第６，２５５，０８４号明細書
【特許文献６】米国特許第６，６２０，９２４号明細書
【特許文献７】米国特許第４，８６３，８６４号明細書
【特許文献８】国際公開第０５／０５２１４８号パンフレット
【特許文献９】米国特許第４，６１８，５７９号明細書
【特許文献１０】国際公開第２００８／０４５４８９号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第２００９／０４８４８８号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第２００９／０４８４８７号パンフレット
【特許文献１３】米国特許第８０５８０３３号明細書
【特許文献１４】国際公開第２０１１／０２２４６５号パンフレット
【特許文献１５】国際公開第２０１１／０２０８５２号パンフレット
【特許文献１６】国際公開第２０１２／００１１３９号パンフレット
【特許文献１７】米国特許第４，６６６，７１８号明細書
【特許文献１８】米国特許第５，４２２，２６７Ａ号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４８：５２９−５４４（１９８３）
【非特許文献２】Ｂｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１０９７−１１０２（１９８４）
【非特許文献３】Ｈａｙａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３：９２３−９２９（１９８９）
【非特許文献４】Ａｓｈｉｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５０：９５７−９６４（１９８６）
【非特許文献５】Ａｓｈｉｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２：１２９−１３３（１９８９）
【非特許文献６】Ｈｏｕｇｈｔｏｎ−Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６２：２１０−２１７（２００３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、配列番号２の２９、４３、４８、１１６および５０２または親グルコアミラーゼ中の等価位置における残基からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号２の９７、９８、１４７、１７５、４８３および４８４または親グルコアミラーゼ中の等価位置における残基からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼ変異体に関する。
【００１５】
本発明はまた、本発明のグルコアミラーゼ変異体をコードし得る核酸に関する。
【００１６】
本発明はまた、本発明のグルコアミラーゼ変異体を発現し得る核酸に関する。本発明はさらに、その核酸を含み、または本発明のグルコアミラーゼ変異体を発現し得るプラスミドまたは発現ベクター、例えば組換え発現ベクターに関する。本発明はまた、本発明のグルコアミラーゼ変異体の異種発現を有する宿主細胞および上記定義のプラスミドまたは発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００１７】
本発明はさらに、本発明のグルコアミラーゼ変異体を単離し、生産し、および／または発現させる方法に関する。
【００１８】
本発明はまた、本発明の１つ以上のグルコアミラーゼ変異体を含む組成物に関する。
【００１９】
本発明はまた、発酵における本発明のグルコアミラーゼ変異体または組成物の使用であって、前記グルコアミラーゼ変異体または組成物を、発酵工程前またはその間に添加する使用に関する。
【００２０】
本発明はまた、醸造プロセスの発酵工程における発酵性糖の生産を向上させるための、本発明の熱不安定グルコアミラーゼ変異体の使用に関する。
【００２１】
本発明はまた、本発明のグルコアミラーゼ変異体または組成物を、発酵工程前またはその間に添加することを含む方法に関する。
【００２２】
本発明はまた、本発明の方法により生産される発酵飲料に関する。
【００２３】
本発明はまた、食料、飼料または飲料生産物、例えばアルコールまたはノンアルコール飲料、例えば穀類または麦芽ベース飲料、例えばビールまたはウイスキー、例えばワイン、シードル、酢、日本酒、醤油またはジュースを生産する方法であって、デンプンおよび／または糖含有植物材料を、本発明のグルコアミラーゼ変異体または組成物により処理する工程を含む方法に関する。
【００２４】
本発明はまた、第１または第２世代バイオ燃料、例えばバイオエタノールを生産する方法であって、デンプンを含む材料を本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体により処理する工程を含む方法およびそのような方法により得られる生産物に関する。本発明はまた、バイオケミカル、例えばバイオベースドイソプレンを生産する方法であって、デンプンを含む材料を本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体により処理する工程を含む方法およびそのような方法により得られる生産物に関する。本発明はさらに、第１もしくは第２世代バイオ燃料、例えばバイオエタノール生産における、またはバイオケミカル、例えばバイオベースドイソプレンの生産における、本明細書に開示のグルコアミラーゼ変異体または組成物の使用に関する。
【００２５】
本発明はまた、本発明のグルコアミラーゼ変異体または組成物；および前記グルコアミラーゼ変異体または組成物の使用指示書を含むキットに関する。
【００２６】
したがって、本発明の目的は、本発明の範囲内にいかなる従来の公知の生産物も、その生産物の方法も、作製も、その生産物の使用方法も包含せず、したがって本出願人らは本権利を有し、いかなる従来の公知の生産物も作製方法も使用方法も本明細書において放棄を開示する。本発明は、本発明の範囲内に、米国特許商標局（米国特許法第１１２条第１項）または欧州特許庁（欧州特許条約第８３条）の記述要件および実施可能要件を満たさないいかなる生産物も、その生産物の作製方法も、その生産物の使用方法も包含するものでなく、したがって本出願人らは本権利を有し、いかなる従来記載された生産物も、その生産物の作製方法も、その生産物の使用方法も本明細書において放棄を開示することにさらに留意されたい。
【００２７】
本開示において、特に特許請求の範囲および／または実施形態において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのような用語は、米国特許法に帰する意味を有し得；例えばそれらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得ること；ならびに「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」のような用語は、米国特許法におけるそれらに帰する意味を有し、例えばそれらは、明示されていない要素を許容するが、先行技術に見出されるまたは本発明の基本的もしくは新規特徴に影響を与える要素を排除することに留意されたい。
【００２８】
これらのおよび他の実施形態が開示され、または以下の詳細な説明から明らかであり、それにより包含される。
【００２９】
以下の詳細な説明は、例として挙げられるが、本発明を記載の具体的な実施形態にのみ限定するものではなく、添付の図面とともに最良に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１−１】エントリーベクター：Ａ）ｐＥｎｔｒｙ−ＧＡ  ＣＳ４およびＢ）ｐＥｎｔｒｙ−ＧＡ  ｗｔの略図である。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２】発現ベクター：Ａ）ｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−ＧＡＣＳ４およびＢ）ｐＴＴＴｐｙｒ２−ＧＡＣＳ４の略図である。
【図３】ＴｒＧＡ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。上図、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ変異体：Ｒ＿Ｃ＿１、Ｒ＿Ｃ＿２、Ｒ＿Ｃ＿５、Ｒ＿Ｃ＿１２、Ｒ＿Ｃ＿７  Ｒ＿Ｄ＿２、Ｒ＿Ｄ＿３およびＲ＿Ｄ＿５；下図、変異体Ｒ＿Ｃ＿１３、Ｒ＿Ｃ＿２２、Ｒ＿Ａ＿１、Ｒ＿Ａ＿２、Ｒ＿Ａ＿６、Ｒ＿Ａ＿７およびＴｒＧＡ（ｗｔ）。それぞれの変異体について、グルコアミラーゼ活性（ＧＡＵ／ｍＬ）を括弧内に示す。
【図４】ＴｒＧＡ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。上図、示されるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ変異体ＣＰＳ３−Ｂ０１〜ＣＰＳ２−Ｅ０８ならびに空ベクターおよびＴｒＧＡ−ＣＳ４の発酵産物。それぞれの変異体について、グルコアミラーゼ活性（ＧＡＵ／ｍＬ）を括弧内に示す。
【図５】精製ＴｒＧＡ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左から：分子量マーカーおよび示される精製トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ変異体Ｒ＿Ｃ＿１およびＲ＿Ｃ＿２。
【図６Ａ】側面から見たトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（黒色）（配列番号２）およびアワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（灰色）（配列番号５）の三次元構造の比較を示す。側面は活性部位に関して定められ、活性部位入口は分子の「上面」に存在する。
【図６Ｂ】側面から見たトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（黒色）（配列番号２）の三次元構造を示す。側面は活性部位に関して定められ、活性部位入口は分子の「上面」に存在する。触媒ドメインとデンプン結合部位との間で界面領域を形成する残基を透明な球状物として示す（触媒ドメインからの残基を暗灰色で着色し、デンプン結合ドメインからの残基を淡灰色で着色する）。
【図７】上面から見たトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（黒色）（配列番号２）およびアワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（灰色）（配列番号５）の三次元構造の比較を示す。
【図８】結合部位１および２を示す側面から見たＴｒＧＡ（配列番号２）およびＡｎＧＡ（配列番号６）の三次元構造のアラインメントを示す。
【図９】ＴｒＧＡ構造中でのアカルボースの結合のモデルを示す。
【図１０Ａ−１】アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）（ＡａＧＡ）（配列番号５）；クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（ＡｎＧＡ）（配列番号６）；ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（ＡｏＧＡ）（配列番号７）；トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（ＴｒＧＡ）（配列番号３）；フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）（ＨｇＧＡ）（配列番号８）；およびヒポクレア・ビノサ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｖｉｎｏｓａ）（ＨｖＧＡ）（配列番号９）からの親グルコアミラーゼの触媒ドメインのアラインメント比較を示す。同一アミノ酸をアスタリスク（＊）により示す。
【図１０Ａ−２】図１０Ａ−１の続き。
【図１０Ａ−３】図１０Ａ−２の続き。
【図１０Ｂ−１】アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）（ＡａＧＡ）（配列番号５）；クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（ＡｎＧＡ）（配列番号６）；ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（ＡｏＧＡ）（配列番号７）；トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（ＴｒＧＡ）（配列番号３）；フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）（ＨｇＧＡ）（配列番号８）；およびヒポクレア・ビノサ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｖｉｎｏｓａ）（ＨｖＧＡ）（配列番号９）からの親グルコアミラーゼの触媒ドメインのアラインメント比較を示す。同一アミノ酸をアスタリスク（＊）により示す。
【図１０Ｂ−２】図１０Ｂ−１の続き。
【図１０Ｃ】タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）グルコアミラーゼ（ＴｅＧＡ）成熟タンパク質配列（配列番号２３）を示す。
【図１０Ｄ−１】トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（配列番号１１）；フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）（ＨｇＧＡ）（配列番号２４）；サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（ＴｈＧＡ）（配列番号２５）；タラロミセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）（ＴｅＧＡ）（配列番号２６）；クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（ＡｎＧＡ）（配列番号２７）；アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）（ＡａＧＡ）（配列番号２８）；およびチエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）（ＴｔＧＡ）（配列番号２９）からの親グルコアミラーゼのデンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）を比較するアラインメントを示す。
【図１０Ｄ−２】図１０Ｄ−１の続き。
【図１０Ｅ−１】トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（配列番号１１）；フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）（ＨｇＧＡ）（配列番号２４）；サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（ＴｈＧＡ）（配列番号２５）；タラロミセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）（ＴｅＧＡ）（配列番号２６）；クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（ＡｎＧＡ）（配列番号２７）；アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）（ＡａＧＡ）（配列番号２８）；およびチエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）（ＴｔＧＡ）（配列番号２９）からの親グルコアミラーゼのデンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）を比較するアラインメントを示す。
【図１０Ｅ−２】図１０Ｅ−１の続き。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
配列
実施例の部に続き、参照により全体として本明細書に援用される配列を示す。
配列番号１：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ、全長；シグナルペプチドを有する
配列番号２：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ、成熟タンパク質；シグナルペプチドを有さない
配列番号３：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ触媒ドメイン、成熟ＴｒＧＡの１〜４５３、ＣＤ
配列番号４：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼｃＤＮＡ
配列番号５：アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）ＧＡ（ＡａＧＡ）；ＣＤ
配列番号６：クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（ＡｎＧＡ）、ＣＤ
配列番号７：ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（ＡｏＧＡ）、ＣＤ
配列番号８：フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）グルコアミラーゼ（ＨｇＧＡ）；ＣＤ
配列番号９：ヒポクレア・ビノサ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｖｉｎｏｓａ）グルコアミラーゼ（ＨｖＧＡ）；ＣＤ
配列番号１０：ＴｒＧＡ、リンカー領域
配列番号１１：ＴｒＧＡ、ＳＢＤ
配列番号１２：ＳＶＤＤＦＩ：ＴｒＧＡ成熟タンパク質の開始点
配列番号１３：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼＣＳ４変異体、成熟タンパク質；シグナルペプチドを有さない
配列番号１４：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼＲ＿Ａ＿１変異体、成熟タンパク質；シグナルペプチドを有さない
配列番号１５：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼＲ＿Ｃ＿１変異体、成熟タンパク質；シグナルペプチドを有さない
配列番号１６：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼＲ＿Ａ＿６変異体、成熟タンパク質；シグナルペプチドを有さない
配列番号１７：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼＲ＿Ｃ＿１３変異体、成熟タンパク質；シグナルペプチドを有さない
配列番号１８：アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ＡａＧＡ）、全長、シグナルペプチドを有する
配列番号１９：クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ（ＡｎＧＡ）、全長、シグナルペプチドを有する
配列番号２０：ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼ（ＡｏＧＡ）、全長、シグナルペプチドを有する
配列番号２１：フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）グルコアミラーゼ（ＨｇＧＡ）、全長、シグナルペプチドを有する
配列番号２２：ヒポクレア・ビノサ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｖｉｎｏｓａ）グルコアミラーゼ（ＨｖＧＡ）、全長、シグナルペプチドを有する
配列番号２３：タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）ＧＡ、成熟タンパク質
配列番号２４：フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）ＧＡ、ＳＢＤ
配列番号２５：サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）ＧＡ、ＳＢＤ
配列番号２６：タラロミセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）ＧＡ、ＳＢＤ
配列番号２７：クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＡ、ＳＢＤ
配列番号２８：アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）ＧＡ、ＳＢＤ
配列番号２９：チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）ＧＡ、ＳＢＤ
配列番号３０：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｗｔグルコアミラーゼ最適化ｃＤＮＡ（ｐＥｎｔｒｙ−ＧＡ  ＷＴ）
配列番号３１：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＣＳ４変異体グルコアミラーゼ最適化ｃＤＮＡ（ｐＥｎｔｒｙ−ＧＡ  ＣＳ４）
【００３２】
グルコアミラーゼは、デンプンの加水分解を要求する多種多様の用途において商業的に重要な酵素である。本出願人らは、親グルコアミラーゼのアミノ酸配列の特異的領域内の位置における変更を導入することにより、グルコアミラーゼ変異体が親グルコアミラーゼと比較して減少した熱安定性を、一部の実施形態においては糖化性能を減退させずに示すことを見出した。
【００３３】
グルコアミラーゼは、デンプンの加水分解を要求する多種多様の用途において商業的に重要な酵素である。本明細書において、デンプンの加水分解のための低減した熱安定性を有するグルコアミラーゼ変異体が開示される。これらのグルコアミラーゼ変異体は、触媒ドメインおよび／またはデンプン結合ドメイン内のアミノ酸置換を含有する。変異体は、変更された特性、例えば変更された熱安定性および／または変更された比活性を示す。
【００３４】
さらに、本明細書において、グルコアミラーゼ変異体のあるサブセットは、低温殺菌による不活化を可能とする酵素の好適な熱不安定性のため、例えばビール発酵の間の発酵容器中への添加に極めて有用であることが開示される。
【００３５】
低温殺菌実験をビールに対して実験室、パイロットおよびフルスケールで実施して醸造プロセスにおける本明細書に記載の変異体を不活化する能力を評価した。実験室スケール低温殺菌は、フルスケールトンネル型低温殺菌器中でグルコアミラーゼを有する瓶ビールに対して評価した（データ示さず）。本発明者らは、親グルコアミラーゼの多数の変異体を提供し、それらの変異体は一部の実施形態において発酵容器中で機能活性であり（高い糖化性能）、親グルコアミラーゼおよび／またはいくつかの他の試験グルコアミラーゼよりも顕著に熱不安定であることの両方が示された。これらのグルコアミラーゼ変異体は、１６．８低温殺菌単位（ＰＵ）未満により完全に不活化することができ、それはビール低温殺菌に好ましい。
【００３６】
一部の実施形態において、糖化プロセスにおいて本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体の使用は、高グルコース割合を有するシロップを生産する。一部の実施形態において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体の使用は、醸造工程のマッシングおよび／または発酵工程における発酵性糖の向上した生産をもたらす。一部の実施形態において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体の使用は、向上した真正発酵度をもたらす。これらの変更された特性は、親グルコアミラーゼ中の選択位置におけるアミノ酸残基を突然変異させる、例えば置換することにより得られる。これを以下にさらに詳細に記載する。
【００３７】
一態様において、本明細書において、配列番号２の残基２９、４３、４８、１１６および５０２または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号２の残基９７、９８、１４７、１７５、４８３および４８４または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼ変異体が記載される。
【００３８】
一態様において、本明細書において、
ａ）配列番号２の５０２位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換ならびに任意選択で配列番号２の残基２９、４３、４８および１１６または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる界面アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号２の９８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換ならびに任意選択で配列番号２の残基９７、１４７、１７５、４８３および４８４または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる触媒コアアミノ酸残基からなる群から選択される１つまたは２つのアミノ酸置換
を含み；
少なくとも前記界面アミノ酸の群または前記触媒コアアミノ酸残基の群から選択される１つのアミノ酸置換を有し；
配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも８０％の配列同一性を有するグルコアミラーゼ変異体が記載される。
【００３９】
一態様において、本明細書において、
ａ）配列番号２の５０２位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号２の９８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換；および
ｃ）配列番号２の４８位もしくは親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換または配列番号２の１４７位もしくは親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換
を含み；
配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも８０％の配列同一性を有するグルコアミラーゼ変異体が記載される。
【００４０】
一態様において、本明細書において、
ａ）配列番号２の５０２位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号２の９８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換；および
ｃ）配列番号２の１４７位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換
を含み；
配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも８０％の配列同一性を有するグルコアミラーゼ変異体が記載される。
【００４１】
一態様において、本明細書において記載されるのはグルコアミラーゼ変異体
ａ）配列番号２の５０２位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号２の９８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換；および
ｃ）配列番号２の４８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換
を含み；
グルコアミラーゼ変異体は配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【００４２】
一態様において、本明細書において、配列番号２または１３のアミノ酸置換Ｈ５０２Ｓ；配列番号２または１３のアミノ酸置換Ｌ９８Ｅ；および配列番号２もしくは１３のアミノ酸置換Ｙ４８Ｖまたは配列番号２もしくは１３のアミノ酸置換Ｙ１４７Ｒを含み；配列番号２または１３と少なくとも８０％の配列同一性を有するグルコアミラーゼ変異体が記載される。
【００４３】
一態様において、本明細書において、デンプン結合ドメインおよび触媒ドメインを有し、配列番号２の残基２９、４３、４８、１１６および５０２または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；および配列番号２の残基９７、９８、１４７、１７５、４８３および４８４または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼ変異体が記載される。
【００４４】
一態様において、本明細書において、配列番号２の残基２４、２６、２７、３０、４０、４２、４４、４６、４９、１１０、１１１、１１２、１１４、１１７、１１８、１１９、５００、５０４、５３４、５３６、５３７、５３９、５４１、５４２、５４３、５４４、５４６、５４７、５４８、５８０、５８３、５８５、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９４および５９６または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換をさらに含むグルコアミラーゼ変異体が記載される。
【００４５】
さらなる態様において、本明細書において、配列番号２の１〜４８４位（２４、２６、２７、２９、３０、４０、４２、４３、４４、４６、４８、４９、９７、９８、１１０、１１１、１１２、１１４、１１６、１１７、１１８、１１９、１４７、１７５、４８３および４８４位を除く）または親グルコアミラーゼ中の等価位置における残基からなる触媒コアアミノ酸の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換をさらに含むグルコアミラーゼ変異体が記載される。
【００４６】
一態様において、本明細書において、配列番号２の残基２４、２６、２７、２９、３０、４０、４２、４３、４４、４６、４８、４９、１１０、１１１、１１２、１１４、１１６、１１７、１１８、１１９、５００、５０２、５０４、５３４、５３６、５３７、５３９、５４１、５４２、５４３、５４４、５４６、５４７、５４８、５８０、５８３、５８５、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９４および５９６または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼ変異体が記載される。
【００４７】
さらなる態様において、本明細書において、配列番号２の１〜４８４位（２４、２６、２７、２９、３０、４０、４２、４３、４４、４６、４８、４９、１１０、１１１、１１２、１１４、１１６、１１７、１１８および１１９位を除く）または親グルコアミラーゼ中の等価位置における残基からなる触媒コアアミノ酸の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼ変異体が記載される。
【００４８】
一態様において、本明細書において、アッセイおよび方法の部の「醸造」分析に記載のとおり麦汁１ｍｌ当たり０．０５８ｍｇのＧＡにおいて投入された場合に少なくとも７４．５％、例えば少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％  ８６％、８７％、８８％、８９％または９０％などのＲＤＦを有するグルコアミラーゼ変異体が記載される。
【００４９】
一態様において、本発明は、低温殺菌により完全に不活化することができるビール中で十分に熱不安定であるＴｒＧＡ変異体のセットを誘導し、同時に真正発酵度により評価されるビール発酵全体にわたる高性能を維持するために使用される構造−機能関連を記載する。さらなる態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の残基Ｆ２９、Ｉ４３、Ｙ４８、Ｆ１１６およびＨ５０２（Ｉ４３における置換はＩ４３Ｑであり、Ｙ４８における置換はＹ４８Ｖである）または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号２の残基Ｓ９７、Ｌ９８、Ｙ１４７、Ｆ１７５、Ｇ４８３およびＴ４８４（Ｓ９７における置換はＳ９７Ｍであり、Ｇ４８３における置換はＧ４８３Ｓであり、Ｔ４８４における置換はＴ４８４Ｗである）または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を含む。
【００５０】
一態様において、本明細書に記載の親グルコアミラーゼは、配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２である。さらなる態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性を有する。一態様において、本明細書に記載の親グルコアミラーゼは、配列番号１、２、３、５、６、７、８、９および／もしくは１３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９．５％の配列同一性を有する触媒ドメインならびに／または配列番号１１、２４、２５、２６、２７、２８および／もしくは２９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９．５％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを有する。
【００５１】
さらなる態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２のアミノ酸の親配列からなり、アミノ酸の配列が、配列番号２の残基Ｆ２９、Ｉ４３、Ｙ４８、Ｆ１１６およびＨ５０２（Ｉ４３における置換はＩ４３Ｑであり、Ｙ４８における置換はＹ４８Ｖである）または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号２の残基Ｓ９７、Ｌ９８、Ｙ１４７、Ｆ１７５、Ｇ４８３およびＴ４８４（Ｓ９７における置換はＳ９７Ｍであり、Ｇ４８３における置換はＧ４８３Ｓであり、Ｔ４８４における置換はＴ４８４Ｗである）または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を有する。
【００５２】
さらなる態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２のアミノ酸の配列からなり、アミノ酸の配列が、配列番号２の残基Ｆ２９、Ｉ４３、Ｙ４８、Ｆ１１６およびＨ５０２（Ｉ４３における置換はＩ４３Ｑであり、Ｙ４８における置換はＹ４８Ｖである）からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号２の残基Ｓ９７、Ｌ９８、Ｙ１４７、Ｆ１７５、Ｇ４８３およびＴ４８４（Ｓ９７における置換はＳ９７Ｍであり、Ｇ４８３における置換はＧ４８３Ｓであり、Ｔ４８４における置換はＴ４８４Ｗである）からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を有する。
【００５３】
さらなる態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号１３のアミノ酸の配列からなり、アミノ酸の配列が、配列番号１３の残基Ｆ２９、Ｉ４３、Ｙ４８、Ｆ１１６およびＨ５０２（Ｉ４３における置換はＩ４３Ｑであり、Ｙ４８における置換はＹ４８Ｖである）からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号１３の残基Ｓ９７、Ｌ９８、Ｙ１４７、Ｆ１７５、Ｇ４８３およびＴ４８４（Ｓ９７における置換はＳ９７Ｍであり、Ｇ４８３における置換はＧ４８３Ｓであり、Ｔ４８４における置換はＴ４８４Ｗである配列番号１３）からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を有する。
【００５４】
一態様において、グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼと比較して変更された熱安定性を示す。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼ、例えばそれが最大配列同一性を有する親グルコアミラーゼと比較して減少した熱安定性を示す。一態様において、グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼ、例えばそれが最大配列同一性を有する親グルコアミラーゼと比較して変更された比活性を示す。一態様において、グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼ、例えばそれが最大配列同一性を有する親グルコアミラーゼと比較して類似のまたは増加した比活性を示す。一態様において、グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼ、例えばそれが最大配列同一性を有する親グルコアミラーゼと比較して減少した熱安定性および類似のまたは増加した比活性の両方を示す。
【００５５】
一態様において、グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼと比較して変更された、真性発酵度（ＲＤＦ）により計測されるＦＶ中での糖化性能を示す。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼ、例えばそれが最大配列同一性を有する親グルコアミラーゼと比較して類似のまたは減少した醸造におけるＲＤＦ値を生産する。
【００５６】
さらなる態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、低温殺菌により、例えば１６．８、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４低温殺菌単位（ＰＵ）未満を使用してビール中で不活化される。いっそうさらなる態様において、グルコアミラーゼ変異体は、０．０５〜１０ＧＡＵ／ｍｇ、例えば０．１〜５ＧＡＵ／ｍｇ、例えば０．５〜４ＧＡＵ／ｍｇ、例えば０．７〜４ＧＡＵ／ｍｇまたは例えば２〜４ＧＡＵ／ｍｇのグルコアミラーゼ活性（ＧＡＵ）を有する。
【００５７】
一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、その結晶形態である場合、主鎖原子の原子座標が等価主鎖原子のアラインメントに従ってＴｒＧＡの等価主鎖原子の原子座標（国際公開第２００９／０６７２１８号パンフレットの表２０に定義）から０．１３ｎｍ未満の平均二乗偏差を有し、リンカー領域、デンプン結合ドメインおよび触媒ドメインを有する結晶構造を有する。
【００５８】
一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２のＦ２９位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｆ２９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｓ／Ｔ／Ｑ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｖまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｆ２９Ｖまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２のＩ４３位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｉ４３Ｑまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２のＹ４８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｙ４８Ｖまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２のＦ１１６位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｆ１１６Ｍまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２のＨ５０２位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｈ５０２Ａ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｓ／Ｔ／Ｑ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｖ／Ｗ／Ｙまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｈ５０２Ｓ／Ｅまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２のＳ９７位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｓ９７Ｍまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２のＬ９８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｌ９８Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｓ／Ｔ／Ｑ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｖ／Ｙまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｌ９８Ｅまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２のＹ１４７位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｙ１４７Ｒまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２のＦ１７５位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｆ１７５Ｖ／Ｉ／Ｌまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２のＧ４８３位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｇ４８３Ｓまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２のＴ４８４位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｔ４８４Ｗまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む。
【００５９】
一態様において、配列番号２の残基２４、２６、２７、２９、３０、４０、４２、４３、４４、４６、４８、４９、１１０、１１１、１１２、１１４、１１６、１１７、１１８、１１９、５００、５０２、５０４、５３４、５３６、５３７、５３９、５４１、５４２、５４３、５４４、５４６、５４７、５４８、５８０、５８３、５８５、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９４および５９６または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる界面アミノ酸残基の群におけるアミノ酸置換（１）；ならびに配列番号２の１〜４８４位（２４、２６、２７、２９、３０、４０、４２、４３、４４、４６、４８、４９、１１０、１１１、１１２、１１４、１１６、１１７、１１８および１１９位を除く）または親グルコアミラーゼ中の等価位置におけるデンプン結合ドメインと直接接触しない残基からなる触媒コアアミノ酸残基の群におけるアミノ酸置換（２）の総数は、２、３または４つである。
【００６０】
一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号２または１３の以下のアミノ酸置換Ｆ２９Ｖ−Ｇ４８３Ｓ、Ｙ４８Ｖ−Ｌ９８Ｅ−Ｈ５０２Ｓ、Ｆ１１６Ｍ−Ｆ１７５Ｖ、Ｆ１７５Ｖ−Ｈ５０２Ｅ、Ｉ４３Ｑ−Ｆ１７５Ｉ、Ｉ４３Ｑ−Ｆ１７５Ｖ−Ｈ５０２Ｓ、Ｆ２９Ｖ−Ｓ９７Ｍ−Ｇ４８３Ｓ−Ｔ４８４ＷまたはＬ９８Ｅ−Ｙ１４７Ｒ−Ｈ５０２Ｓまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、以下のアミノ酸置換Ｌ４１７Ｖ、Ｔ４３０Ａ、Ｑ５１１Ｈ、Ａ５３９ＲおよびＮ５６３Ｉをさらに含む。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号１４、１５または１６である。一態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号１４、１５または１７である。さらなる態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号１４、１５または１６を含む。さらなる態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号１４、１５または１７を含む。
【００６１】
一態様において、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、フミコラ属種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｓｐｐ．）、アオカビ属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、タラロミセセ属種（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｅ  ｓｐｐ．）またはシゾサッカルミセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）から得られるグルコアミラーゼから選択される（図１０Ｃ、ＤおよびＥ）。さらなる態様において、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）またはアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）から得られる。
【００６２】
一態様において、あるアミノ酸配列の、別のアミノ酸配列とのまたはそれに対する同一性の割合は、タンパク質−タンパク質Ｂｌａｓｔ検索（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、デフォルト設定：スコア行列：ｂｌｏｓｕｍ６２、非冗長タンパク質配列データベースおよびｂｌａｓｔアルゴリズムの使用により決定される。
【００６３】
【表１】
2015526090.tif 000003
【００６４】
一態様において、グルコアミラーゼ変異体は、宿主細胞中での組換え発現により得られる。
【００６５】
一態様において、本発明は、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体をコードし得る核酸に関する。さらなる態様において、そのような核酸を含み、または本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体を発現し得る発現ベクターまたはプラスミドが開示される。一態様において、発現ベクターまたはプラスミドは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に由来するプロモーター、例えばＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩ由来プロモーターを含む。さらなる態様において、発現ベクターまたはプラスミドは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に由来するターミネーター、例えばＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩ由来ターミネーターを含む。いっそうさらなる態様において、発現ベクターまたはプラスミドは、１つ以上の選択マーカー、例えばアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳおよびｐｙｒＧを含む。別の態様において、発現ベクターまたはプラスミドは、宿主細胞中での非染色体プラスミド維持を可能とする１つ以上のテロメア領域を含む。
【００６６】
一態様において、本発明は、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体の異種発現を有する宿主細胞に関する。さらなる態様において、それによる宿主細胞は真菌細胞である。いっそうさらなる態様において、真菌細胞は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）のものである。いっそうさらなる態様において、真菌細胞は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）種のものまたはヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）種のものである。別の態様において、宿主細胞は、本明細書に記載のプラスミドまたは発現ベクターを含み、好ましくはそれにより形質転換されている。
【００６７】
一態様において、本発明は、本明細書に定義のグルコアミラーゼ変異体を単離する方法であって、前記グルコアミラーゼ変異体の異種発現を有する本明細書に定義の宿主細胞中でのグルコアミラーゼ変異体の合成を誘導する工程および前記宿主細胞により分泌された細胞外タンパク質を回収する工程および任意選択でグルコアミラーゼ変異体を精製する工程を含む方法に関する。さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義のグルコアミラーゼ変異体を生産する方法であって、前記グルコアミラーゼ変異体の異種発現を有する本明細書に定義の宿主細胞中でのグルコアミラーゼ変異体の合成を誘導する工程および任意選択でグルコアミラーゼ変異体を精製する工程を含む方法に関する。さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義のグルコアミラーゼ変異体を発現させる方法であって、本明細書に定義の宿主細胞を得ることおよび前記宿主細胞からグルコアミラーゼ変異体を発現させることおよび任意選択でグルコアミラーゼ変異体を精製することを含む方法に関する。別の態様において、本明細書に定義のグルコアミラーゼ変異体は、優勢分泌タンパク質である。
【００６８】
一態様において、本発明は、本明細書に記載の１つ以上のグルコアミラーゼ変異体を含む組成物に関する。一態様において、組成物は、デンプン加水分解組成物、糖化組成物、洗浄組成物、アルコール発酵酵素組成物および動物飼料動物飼料組成物の中から選択される。さらなる態様において、組成物は、１つ以上のさらなる酵素を含む。いっそうさらなる態様において、１つ以上のさらなる酵素は、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、ペプチダーゼ（例えばプロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ）、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼおよび関連ベータ−グルカン加水分解アクセサリー酵素、キシラナーゼおよびキシラナーゼアクセサリー酵素（例えばアラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ）、アセトラクテートデカルボキシラーゼならびにグルコアミラーゼ（それらの任意の組合せを含む）の中から選択される。さらなる態様において、そのようなグルコアミラーゼ変異体および／または１つ以上のさらなる酵素は、低温殺菌により不活化される。いっそうさらなる態様において、グルコアミラーゼ変異体および／または１つ以上のさらなる酵素は、低温殺菌により、例えば５０、４５、４０、３５、３０、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６または１５低温殺菌単位（ＰＵ）未満を使用することによりビール中で不活化される。
【００６９】
一態様において、本発明は、発酵における本明細書に開示のグルコアミラーゼ変異体または本明細書に開示の組成物の使用であって、前記グルコアミラーゼ変異体または組成物を発酵工程前またはその間に添加する使用に関する。さらなる態様において、前記発酵工程および任意選択のビールろ過工程に、低温殺菌工程が続く。一態様において、前記発酵を、発酵飲料を作製する方法に含める。一態様において、前記発酵飲料を、ビール、例えば低アルコールビールまたは低カロリービールからなる群から選択する。一態様において、本明細書に開示のグルコアミラーゼ変異体または組成物を、１つ以上のさらなる酵素、例えばアルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、ペプチダーゼ（例えばプロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ）、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼおよび関連ベータ−グルカン加水分解アクセサリー酵素、キシラナーゼおよびキシラナーゼアクセサリー酵素（例えばアラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ）、アセトラクテートデカルボキシラーゼならびにグルコアミラーゼ（それらの任意の組合せを含む）との組合せで添加する。さらなる態様において、グルコアミラーゼ変異体または１つ以上のさらなる酵素を、低温殺菌工程において不活化する。一態様において、グルコアミラーゼ変異体を、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．０１〜５０ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．０５〜２５ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．１〜１５ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．２〜１０ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり１〜５ｍｇの量で添加する。一態様において、本明細書において、醸造プロセスの発酵工程における発酵性糖の生産を向上させるための熱不安定グルコアミラーゼ変異体の使用であって、グルコアミラーゼ変異体が本明細書に開示のものである使用が記載される。
【００７０】
一態様において、本発明は、本明細書に開示のグルコアミラーゼ変異体または本明細書に開示の組成物を、発酵工程、例えば酵母を用いる発酵工程前またはその間に添加することを含む方法に関する。さらなる態様において、本方法は、発酵工程または任意選択のビールろ過工程後に低温殺菌工程を含む。さらなる態様において、前記発酵を、発酵飲料を作製する方法に含める。いっそうさらなる態様において、前記発酵飲料を、ビール、例えば低アルコールビール、低カロリービールからなる群から選択する。さらなる態様において、前記グルコアミラーゼ変異体または前記組成物を、１つ以上のさらなる酵素、例えばアルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、ペプチダーゼ（例えばプロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ）、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼおよび関連ベータ−グルカン加水分解アクセサリー酵素、キシラナーゼおよびキシラナーゼアクセサリー酵素（例えばアラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ）、アセトラクテートデカルボキシラーゼならびにグルコアミラーゼ（それらの任意の組合せを含む）の中から選択されるものとの組合せで添加する。別の態様において、グルコアミラーゼ変異体および／または１つ以上のさらなる酵素を、低温殺菌工程において不活化する。一態様において、グルコアミラーゼ変異体を、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．０１〜５０ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．０５〜２５ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．１〜１５ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．２〜１０ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり１〜５ｍｇの量で添加する。いっそうさらなる態様において、発酵飲料の生産方法は、以下の工程：
ａ）マッシュを調製すること、
ｂ）マッシュをろ過して麦汁を得ることおよび
ｃ）麦汁を発酵させて発酵飲料を得ること
を含み、
本明細書に開示のグルコアミラーゼ変異体または本明細書に開示の組成物を、工程（ａ）のマッシュおよび／または工程（ｂ）の麦汁および／または工程（ｃ）の麦汁に添加する。
【００７１】
さらなる態様において、発酵飲料を低温殺菌工程（ｄ）に供する。いっそうさらなる態様において、工程（ａ）におけるマッシュをグリストから得、例えばグリストは、麦芽化および／もしくは非麦芽化穀物または別の作物からのデンプンベース材料の１つ以上を含む。さらなる態様において、本方法は、工程（ａ）のマッシュを１つ以上のさらなる酵素と接触させることをさらに含み、例えば酵素を、デンプン枝切り酵素、Ｒ酵素、限界デキストリナーゼ、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、ペプチダーゼ（例えばプロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ）、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼおよび関連ベータ−グルカン加水分解アクセサリー酵素、キシラナーゼおよびキシラナーゼアクセサリー酵素（例えばアラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ）、アセトラクテートデカルボキシラーゼならびにグルコアミラーゼ（それらの任意の組合せを含む）の中から選択する。さらなる態様において、本方法は、工程（ｂ）または（ｃ）の麦汁を１つ以上のさらなる酵素と接触させることをさらに含み、酵素を、デンプン枝切り酵素、イソアミラーゼおよび限界デキストリナーゼ（それらの任意の組合せを含む）の中から選択する。
【００７２】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の方法により生産される発酵飲料に関する。さらなる態様において、発酵飲料は、ビール、例えば低アルコールビールまたは低カロリービールである。
【００７３】
さらなる態様において、本発明は、食料、飼料または飲料生産物、例えばアルコールまたはノンアルコール飲料、例えば穀類または麦芽ベース飲料、例えばビールまたはウイスキー、例えばワイン、シードル、酢、日本酒、醤油またはジュースを生産する方法であって、デンプンおよび／または糖含有植物材料を、本明細書に開示のグルコアミラーゼ変異体または本明細書に開示の組成物により処理する工程を含む方法に関する。
【００７４】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に開示のグルコアミラーゼ変異体または本明細書に開示の組成物；および前記グルコアミラーゼ変異体または組成物の使用指示書を含むキットに関する。
【００７５】
さらなる態様において、本発明は、第１または第２世代バイオ燃料、例えばバイオエタノールおよび／またはバイオブタノールの生産における、本明細書に開示のグルコアミラーゼ変異体または本明細書に開示の組成物の使用に関する。
【００７６】
さらなる態様において、本発明は、バイオケミカル、例えばバイオベースドイソプレンの生産における、本明細書に開示のグルコアミラーゼ変異体または本明細書に開示の組成物の使用に関する。
【００７７】
さらなる態様において、本発明は、第１または第２世代バイオ燃料、例えばバイオエタノールおよび／またはバイオブタノールを生産する方法であって、デンプンを含む材料を、本明細書に開示のグルコアミラーゼ変異体または本明細書に開示の組成物により処理する工程を含む方法に関する。
【００７８】
さらなる態様において、本発明は、バイオケミカル、例えばバイオベースドイソプレンを生産する方法であって、デンプンを含む材料を、本明細書に開示のグルコアミラーゼ変異体または本明細書に開示の組成物により処理する工程を含む方法に関する。
【００７９】
さらなる態様において、本発明は、本発明による方法により得られる生産物に関する。
【００８０】
さらなる態様において、本発明は、例えば０．１〜９９．９％の範囲である本発明による方法により得られる生産物を含む組成物に関する。
【００８１】
１．定義
別記されない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本開示が属する分野における当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｋｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）は、本明細書において使用される用語の多くの一般的な意味を当業者に提供する。さらにある用語は、明確性および参照の容易さのために以下に定義される。
【００８２】
本明細書において使用される用語「グルコアミラーゼ」（ＥＣ３．２．１．３）は、デンプンならびに関連オリゴ糖および多糖の非還元末端からのＤ−グルコースの放出を触媒する酵素を指す。
【００８３】
用語、「親」または「親配列」は、宿主細胞中の天然または天然存在の配列を指す。親グルコアミラーゼとしては、限定されるものではないが、配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１および２２のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ配列ならびに配列番号２に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するグルコアミラーゼが挙げられる。
【００８４】
本明細書において使用される用語「親」または「親配列」は、ＴｒＧＡ（配列番号２）と比較してＬ４１７Ｖ−Ｔ４３０Ａ−Ｑ５１１Ｈ−Ａ５３９Ｒ−Ｎ５６３Ｉを含む成熟ＴｒＧＡ変異体ＣＳ４（配列番号１３）も指し得る。ＴｒＧＡ  ＣＳ４の成熟形態は、配列番号１３のアミノ酸配列を有する触媒ドメイン、リンカー領域およびデンプン結合ドメインを含む。ＴｒＧＡ  ＣＳ４中のグルコアミラーゼアミノ酸のナンバリングはＴｒＧＡと類似しており、ＴｒＧＡ（配列番号２および／または３）とのグルコアミラーゼの配列アラインメントに基づく。ＴｒＧＡ  ＣＳ４の三次元構造は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの三次元構造と同一であると予測される（参照により本明細書に援用される国際公開第２００９／０６７２１８号パンフレット（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）９４〜２１６ページの表２０および参照により本明細書に援用される国際公開第２００９／０６７２１８号パンフレット（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）８９〜９３ページの実施例１１を参照のこと）。
【００８５】
本明細書に使用される「等価位置」は、ＴｒＧＡ参照グルコアミラーゼアミノ酸配列（配列番号２または１３）および三次元構造との、当該親グルコアミラーゼのアミノ酸配列のアライメントおよび当該親グルコアミラーゼの三次元構造のアライメントに基づく２つの親配列に共通する位置を意味する。したがって、配列アライメントまたは構造アライメントのいずれも、等価性を決定するために使用することもできる。
【００８６】
用語「ＴｒＧＡ」は、配列番号３に示される配列を有する触媒ドメインを含む、配列番号２に示される成熟タンパク質配列を有する親トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ配列を指す。ＴｒＧＡの単離、クローニングおよび発現は、両方とも参照により本明細書に援用される国際公開第２００６／０６００６２号パンフレットおよび米国特許第７，４１３，８８７号明細書に記載されている。一部の実施形態において、親配列は、タンパク質エンジニアリングのための出発点であるグルコアミラーゼ配列を指す。本明細書におけるグルコアミラーゼアミノ酸のナンバリングは、ＴｒＧＡ（配列番号２および／または３）とのグルコアミラーゼの配列アライメントに基づく。
【００８７】
用語「ＴｒＧＡ  ＣＳ４」または「ＣＳ４」は、ＴｒＧＡ（配列番号２）と比較してＬ４１７Ｖ−Ｔ４３０Ａ−Ｑ５１１Ｈ−Ａ５３９Ｒ−Ｎ５６３Ｉを含む配列番号１３に示される成熟タンパク質配列を有する親トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ変異体ＣＳ４配列を指す。
【００８８】
語句「変異体、タンパク質またはポリペプチドの成熟形態」は、変異体、タンパク質またはポリペプチドの最終機能形態を指す。例えば、グルコアミラーゼの成熟形態は、シグナルペプチドを欠き得る。例示するため、ＴｒＧＡ／−ＣＳ４の成熟形態は、配列番号２／１３のアミノ酸配列を有する触媒ドメイン、リンカー領域およびデンプン結合ドメインを含む。
【００８９】
本明細書において使用される用語「グルコアミラーゼ変異体」および「変異体」は、親グルコアミラーゼ配列に対してある程度のアミノ酸配列同一性を有するグルコアミラーゼに関して使用される。変異体は、親配列に類似するが、その配列を親グルコアミラーゼと異なるものとする、そのアミノ酸配列中の少なくとも１つの置換、欠失または挿入を有する。一部の場合、変異体は、その配列を親と異なるものとする、そのアミノ酸配列中の少なくとも１つの置換、欠失または挿入を含むように操作および／または遺伝子操作されている。さらに、グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼの機能的な特徴を保持し得、例えば親グルコアミラーゼのグルコアミラーゼ活性の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％または約９０％であるグルコアミラーゼ活性を維持する。それが選択されたものである場合、１００％よりも高い活性も有し得る。
【００９０】
「変異体」は、比較のために最適にアライメントされた場合、親ポリペプチド配列に対して少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約８８％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約９９．５％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態において、グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼの触媒ドメインに対して少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約８８％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約９９．５％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態において、グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼのデンプン結合ドメインに対して少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約８８％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約９９．５％の配列同一性を有し得る。配列同一性は、親または変異体配列の全長にわたり計測することができる。
【００９１】
本明細書において使用される核酸またはポリペプチド配列に関する「相同配列」および「配列同一性」は、比較のために最適にアラインメントされた場合、核酸配列またはポリペプチド配列に対して少なくとも約１００％、少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、少なくとも約９０％、少なくとも約８８％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％または少なくとも約４５％の配列同一性を有し、候補核酸配列またはポリペプチド配列の機能が、候補相同配列が比較されている核酸配列またはポリペプチド配列と本質的に同一であることを意味する。一部の実施形態において、相同配列は、少なくとも約８５％〜１００％の配列同一性を有する一方、他の実施形態において、約９０％〜１００％の配列同一性が存在し、他の実施形態において、少なくとも約９５％〜１００％の配列同一性が存在する。
【００９２】
同一性の程度
２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメータ「同一性」により記載される。
【００９３】
一実施形態において、問い合わせ配列と参照配列との間の配列同一性の程度は、１）２つの配列を任意の好適なアラインメントプログラムによりデフォルトスコアリング行列およびデフォルトギャップペナルティを使用してアラインメントし、２）アラインメントプログラムがアラインメントにおける所与の位置上の２つのアラインメントされた配列中の同一アミノ酸またはヌクレオチドを同定した完全一致の数を同定し、３）完全一致の数を参照配列の長さにより除することにより決定される。
【００９４】
一実施形態において、問い合わせ配列と参照配列との間の配列同一性の程度は、１）２つの配列を任意の好適なアラインメントプログラムによりデフォルトスコアリング行列およびデフォルトギャップペナルティを使用してアラインメントし、２）アラインメントプログラムがアラインメントにおける所与の位置上の２つのアラインメントされた配列中の同一アミノ酸またはヌクレオチドを同定した完全一致の数を同定し、３）完全一致の数を２つの配列の長い方の長さにより除することにより決定される。
【００９５】
別の実施形態において、問い合わせ配列と参照配列との間の配列同一性の程度は、１）２つの配列を任意の好適なアラインメントプログラムによりデフォルトスコアリング行列およびデフォルトギャップペナルティを使用してアラインメントし、２）アラインメントプログラムがアラインメントにおける所与の位置上の２つのアラインメントされた配列中の同一アミノ酸またはヌクレオチドを同定した完全一致の数を同定し、３）完全一致の数を、配列のギャップおよび突出部分を含む全アラインメントの長さである「アラインメント長」により除することにより決定される。
【００９６】
配列同一性比較は、肉眼により、またはより通常、容易に利用可能な配列比較プログラムを用いて実施することができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、複雑な比較アルゴリズムを使用して２つ以上の配列間の差異をもたらし得る進化イベントを最良に反映する２つ以上の配列をアラインメントする。したがって、これらのアルゴリズムは、同一または類似アミノ酸のアラインメントを加算し、ギャップの挿入、ギャップ伸長および非類似アミノ酸のアラインメントを減算するスコアリングシステムにより作動する。比較アルゴリズムのスコアリングシステムは、
ｉ）ギャップが挿入されるごとのペナルティスコアの割り当て（ギャップペナルティスコア）、
ｉｉ）既存ギャップが追加位置とともに伸長されるごとのペナルティスコアの割り当て（伸長ペナルティスコア）、
ｉｉｉ）同一アミノ酸のアラインメント時の高スコアの割り当ておよび
ｉｖ）非同一アミノ酸のアラインメント時の変数スコアの割り当て
を含む。
【００９７】
ほとんどアラインメントプログラムは、ギャップペナルティの改変を可能とする。しかしながら、このようなソフトウェアを配列比較に使用する場合にはデフォルト値を使用することが好ましい。
【００９８】
非同一アミノ酸のアラインメントに付与されるスコアは、置換行列とも呼ばれるスコアリング行列に従って割り当てられる。このような置換行列において提供されるスコアは、あるアミノ酸が別のアミノ酸により進化の間に置換される確率が変動し、置換され得るアミノ酸の物理的／化学的性質に依存するという事実を反映している。例えば、極性アミノ酸が別の極性アミノ酸により置換される確率は、疎水性アミノ酸により置換される場合と比較して高い。したがって、スコアリング行列は、同一アミノ酸に最大スコアを、非同一であるが類似のアミノ酸により低いスコアを、非同一で非類似のアミノ酸にさらにより低いスコアを割り当てる。最も高頻度に使用されるスコアリング行列は、ＰＡＭ行列（Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２））、ＢＬＯＳＵＭ行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２））およびＧｏｎｎｅｔ行列（Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２））である。
【００９９】
このようなアラインメントを実施するための好適なコンピュータプログラムとしては、限定されるものではないが、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）ならびにＣｌｕｓｔａｌＶ、ＣｌｕｓｔａｌＷおよびＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ＆Ｓｈａｒｐ  ＰＭ（１９８８）、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、Ｌａｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）が挙げられる。様々なアラインメントツールの選択は、ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇにおけるＥｘＰＡＳｙ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓサーバから入手可能である。配列アラインメントを実施し得るソフトウェアの別の例はＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）であり、それは現在ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／において見出すことができるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブページから入手可能であり、最初にＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５；４０３−４１０により記載された。
【０１００】
本発明の一実施形態において、アラインメントプログラムは、アラインメントを配列の全長にわたり最適化するグローバルアラインメントプログラムを実施している。さらなる実施形態において、グローバルアラインメントプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓａｕｌ  Ｂ．；ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｄ．（１９７０）．“Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４８（３）：４４３−５３）に基づく。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用してグローバルアラインメントを実施する現在のプログラムの例は、ＥＭＢＯＳＳ  ＮｅｅｄｌｅおよびＥＭＢＯＳＳ  Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒプログラムであり、それらは両方ともｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／において入手可能である。
【０１０１】
ＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅは、Ｎｅｅｄｌｅ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメントアルゴリズムを使用して最適なグローバル配列アラインメントを実施して２つの配列のそれらの全長に沿った最適なアラインメント（ギャップを含む）を見出す。
【０１０２】
ＥＭＢＯＳＳ  Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒは、より長い配列のグローバルアラインメントを可能とするＮｅｅｄｌｅ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムの改変版を使用する。
【０１０３】
一実施形態において、配列は、グローバルアラインメントプログラムによりアラインメントされ、配列同一性は、そのプログラムにより同定された完全一致の数を同定し、配列のギャップおよび突出部分を含む全アラインメントの長さである「アラインメント長」により除することにより算出される。さらなる実施形態において、グローバルアラインメントプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用し、配列同一性は、そのプログラムにより同定された完全一致の数を同定し、配列のギャップおよび突出部分を含む全アラインメントの長さである「アラインメント長」により除することにより算出される。
【０１０４】
いっそうさらなる実施形態において、グローバルアラインメントプログラムは、ＥＭＢＯＳＳ  ＮｅｅｄｌｅおよびＥＭＢＯＳＳ  ｓｔｒｅｔｃｈｅｒからなる群から選択され、配列同一性は、そのプログラムにより同定された完全一致の数を同定し、配列のギャップおよび突出部分を含む全アラインメントの長さである「アラインメント長」により除することにより算出される。
【０１０５】
ソフトウェアがアラインメントを生成すると、類似性％および配列同一性％を算出することが可能である。ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部としてこれを行い、数値結果を生成する。
【０１０６】
一実施形態において、配列アラインメントの実施にＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアを使用することが好ましい。好ましくは、ＣｌｕｓｔａｌＷによるアラインメントは、ペアワイズアラインメントのための以下のパラメータにより実施される。
【０１０７】
【表２】
2015526090.tif 000004
【０１０８】
ＣｌｕｓｔａｌＷ２は、例えばＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅによりＥＭＢＬ−ＥＢＩウェブページｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋにおいて、ツール−配列分析−ＣｌｕｓｔａｌＷ２のもとインターネット上で入手可能となっている。現在、ＣｌｕｓｔａｌＷ２ツールの正確なアドレスはｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２である。
【０１０９】
別の実施形態において、配列アラインメントの実施にＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるプログラムＡｌｉｇｎ  Ｘを使用することが好ましい。一実施形態において、Ｅｘｐ１０をデフォルト設定で使用することができる。
ギャップ開始ペナルティ：１０
ギャップ伸長ペナルティ：０．０５
ギャップ分離ペナルティ範囲：８
【０１１０】
別の実施形態において、あるアミノ酸配列の、別のアミノ酸配列とのまたはそれに対するアラインメントは、スコア行列：ｂｌｏｓｕｍ６２ｍｔ２およびＶｅｃｔｏｒＮＴＩペアワイズアラインメント設定の使用により決定される。
【０１１１】
【表３】
2015526090.tif 000005
【０１１２】
好ましい実施形態において、あるアミノ酸配列の、別のアミノ酸配列とのまたはそれに対する同一性の割合は、タンパク質−タンパク質Ｂｌａｓｔ検索（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、デフォルト設定：スコア行列：ワードサイズ３、ｂｌｏｓｕｍ６２置換行列、非冗長タンパク質配列データベースおよびｂｌａｓｔアルゴリズムの使用により決定される。
【０１１３】
【表４】
2015526090.tif 000006
【０１１４】
用語「最適なアライメント」は、最大の同一性パーセントスコアを与えるアライメントを指す。
【０１１５】
相同性は、当技術分野において公知の標準的技術を使用して決定される（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）；プログラム、例えばＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＨＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ；ならびにＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｌ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２：３８７−３９５（１９８４）を参照のこと）。
【０１１６】
相同配列は、公知の配列アラインメント法により決定される。「配列同一性」は、配列アライメント法により本明細書において決定される。一般に使用されるアラインメント法は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．により記載されるＢＬＡＳＴである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；およびＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３））。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０−４８０（１９９６）を参照のこと）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメータを使用するが、それらのほとんどはデフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは、以下の値を用いて設定される：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ  ＳおよびＨＳＰ  Ｓ２パラメータは、動的値であり、特定の配列の組成および関心対象の配列が検索される特定のデータベースの組成に応じてプログラム自体により確立される。しかしながら、値は、感度を増加させるように調整することができる。
【０１１７】
配列のアラインメントには他の方法が使用される。有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、累進ペアワイズアラインメントを使用して関連配列の群から多重配列アラインメントを作出する。これは、アラインメントを作出するために使用されるクラスタ関係を示す系統樹もプロットし得る。ＰＩＬＥＵＰは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅの累進アラインメント法の簡略版を使用する（Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７））。本方法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３（１９８９））により記載のものと類似する。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、デフォルトギャップウエイト３．００、デフォルトギャップ長さウエイト０．１０および加重終了ギャップを含む。
【０１１８】
本明細書において使用される用語「グルコアミラーゼ変異体」または「変異体」は、親グルコアミラーゼ配列と類似するが、それらの配列を親グルコアミラーゼと異なるものとする、それらのアミノ酸配列中の少なくとも１つの置換、欠失または挿入を有するグルコアミラーゼに関して使用される。一部の場合、これらは、それらの配列を親グルコアミラーゼと異なるものとする、それらのアミノ酸配列中の少なくとも１つの置換、欠失または挿入を含むように操作および／または遺伝子操作されている。
【０１１９】
本明細書において使用される用語「触媒ドメイン」は、基質加水分解の触媒のための活性部位を含有するポリペプチドの構造領域を指し、例えば以下のＴｒＧＡの規定領域を参照のこと。
【０１２０】
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からのグルコアミラーゼ中の触媒コアドメインとデンプン結合ドメインとの間の界面領域は、巨大分子タンパク質界面の調査のためのＰＤＢｅＰＩＳＡ相互作用ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｍｓｄ−ｓｒｖ／ｐｒｏｔ＿ｉｎｔ／ｐｉｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌ）の使用により、データベース検索およびＰＤＢエントリーパラメータ：２ＶＮ４（Ｒ．Ｂｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７：５７４６−５７５４）を使用し、分子内界面分析のために鎖のアイデンティティを鎖Ａ、残基１〜４５３；触媒コアドメインおよび鎖Ｂ、残基４９１〜５９９により改変して決定された。界面検索は、界面分析のためのデフォルト設定で実施した。
【０１２１】
【表５】
2015526090.tif 000007
【０１２２】
検索は、２つのドメイン間の連結表面区域における以下のアミノ酸残基をもたらし、それらは配列番号２の２４、２６、２７、２９、３０、４０、４２、４３、４４、４６、４８、４９、１１０、１１１、１１２、１１４、１１６、１１７、１１８、１１９、５００、５０２、５０４、５３４、５３６、５３７、５３９、５４１、５４２、５４３、５４４、５４６、５４７、５４８、５８０、５８３、５８５、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９４および５９６位に対応し、Ｐｙｍｏｌ（Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．２ｒ３ｐｒｅ，Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ．）を使用して手作業による調査により評価した。
【０１２３】
本文脈において、用語「１〜４８４位におけるデンプン結合ドメインと直接接触していない残基」は、デンプン結合ドメイン中のアミノ酸残基との直接的な静電相互作用も、極性相互作用も、疎水性相互作用も有さない配列番号２の１〜４８４位におけるアミノ酸残基を意味する。１〜４８４位における大多数の残基は、ＴｒＧＡ（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＶＮ４）の構造から把握されるとおり、直接接触していない。相互作用および関与残基のアイデンティティは、ＰＩＳＡ  ｅＰＤＢサーバにより定義することができ、疎水性相互作用（ファンデルワールス）、水素結合、側鎖または主鎖原子間の双極性または他の直接的な静電相互作用からなっていてよい。したがって、一態様において、配列番号２の１から４８４の全ての残基は、配列番号２の残基２４、２６、２７、２９、３０、４０、４２、４３、４４、４６、４８、４９、１１０、１１１、１１２、１１４、１１６、１１７、１１８および１１９を除き、デンプン結合ドメインと直接接触していない。
【０１２４】
用語「リンカー」は、デンプン結合ドメインを含むアミノ酸配列を、触媒ドメインを含むアミノ酸配列と共有結合させる、３〜４０アミノ酸残基を一般に有する短いアミノ酸配列を指す。
【０１２５】
用語「デンプン結合ドメイン」（ＳＢＤ）は、デンプン基質に優先的に結合するアミノ酸配列を指す。ＳＢＤをいかに同定するかは当業者に周知であり、ＳＢＤは、炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）の一例であり、ＣＢＭは、配列ベースの分類体系（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ−Ｍｏｄｕｌｅｓ．ｈｔｍｌ）を使用してＣＢＭファミリーに分類されている。さらに、生デンプンまたはベータ−シクロデキストリン親和性クロマトグラフィーを使用して例えばＳＢＤを含有する材料を単離することは当業者に周知である（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６  ｐ５６１−５６７）。一態様において、ＳＢＤのドメイン定義は、Ｐｆａｍデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／またはｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｐｆａｍ．ｈｔｍｌ）から採用され、それらのタンパク質ドメインファミリーのデータベースは配列類似性から生成される。したがって、一態様において、ＳＢＤは、Ｐｆａｍデータベースにおける炭水化物結合モジュール２０ファミリーにより定義されるとおりである。
【０１２６】
本明細書において使用される用語「断片」は、例えば配列番号２のポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端から１つ以上（いくつか）のアミノ酸が欠失しており、グルコアミラーゼ活性を有する変異体として定義される。一態様において、断片は、配列番号２または１３のアミノおよび／またはカルボキシ末端から１つ以上（いくつか）のアミノ酸が欠失している。
【０１２７】
本明細書において使用される用語「トランケート」は、親グルコアミラーゼ（または別の変異体）と比較して完全翻訳長さを達成せず、したがって親グルコアミラーゼ中に存在するアミノ酸の一部を欠くポリペプチドを指す。トランケーションは、通常、早期終結突然変異により行われるが、別の機序、例えば翻訳後修飾またはプロテアーゼ開裂により引き起こすことができる。
【０１２８】
本明細書において使用される用語「突然変異配列」および「突然変異遺伝子」は、同義に使用され、宿主細胞の親配列中で生じる少なくとも１つのコドンにおける変更を有するポリヌクレオチド配列を指す。突然変異配列の発現産物は、親グルコアミラーゼに対して変更されたアミノ酸配列を有する変異体タンパク質である。発現産物は、変更された機能的能力（例えば向上した酵素活性または低減した熱安定性）を有し得る。
【０１２９】
本明細書において使用されるポリペプチドに関する用語「特性」またはその文法上の等価物は、選択または検出することができるポリペプチドの任意の特徴または属性を指す。これらの特性としては、限定されるものではないが、酸化安定性、基質特異性、触媒活性、熱安定性、ｐＨ活性プロファイル、タンパク分解に対する耐性、ＫＭ、ＫＣＡＴ、ＫＣＡＴ／ＫＭ比、タンパク質フォールディング、基質結合能および分泌能が挙げられる。
【０１３０】
本明細書において使用される核酸の文脈における用語「特性」またはその文法上の等価物は、選択または検出することができる核酸の任意の特徴または属性を指す。これらの特性としては、限定されるものではないが、遺伝子転写に影響を与える特性（例えばプロモーター強度またはプロモーター認識）、ＲＮＡプロセシングに影響を与える特性（例えばＲＮＡスプライシングおよびＲＮＡ安定性）、翻訳に影響を与える特性（例えば調節、リボソームタンパク質へのｍＲＮＡの結合）が挙げられる。
【０１３１】
用語「熱的に安定」および「熱安定」は、デンプン基質の加水分解の間に適用される条件下での所与の期間にわたるある温度に対する曝露後、例えば変更される温度に曝露されながらも、規定量の酵素活性を保持する本開示のグルコアミラーゼ変異体を指す。
【０１３２】
特性、例えば熱安定性に関する用語「向上した安定性」は、親グルコアミラーゼと比較してどのように計測されても経時的に高度に保持される触媒活性またはデンプン加水分解活性を指す。
【０１３３】
用語「熱不安定グルコアミラーゼ」は、所与の期間にわたるある温度への曝露後に検出可能な加水分解酵素活性を損失する本開示のグルコアミラーゼを指す。一態様において、用語「熱不安定グルコアミラーゼ」は、醸造プロセスの生産物の低温殺菌の間に適用される条件下での所与の期間にわたるある温度への曝露後に検出可能な加水分解酵素活性を損失する本開示のグルコアミラーゼを指す。低温殺菌の正確な条件（例えば低温殺菌単位）は、醸造プロセスにより生産されるビールの種類に依存する。低温殺菌されるビール中の熱不安定グルコアミラーゼの検出可能な加水分解活性の損失は、本明細書に記載のグルコアミラーゼ酵素アッセイを使用して検出し、そのアッセイにより計測される活性の損失により定義することができる。一態様において、「減少した熱安定性」は、親グルコアミラーゼと比較した場合、「より熱不安定」と同義に使用される。
【０１３４】
用語「比活性」は、グルコアミラーゼタンパク質１ｍｇ当たりの活性と定義される。一部の実施形態において、グルコアミラーゼについての活性は、ｐＮＰ−β−マルトシド基質を用いる特異的比色グルコアミラーゼアッセイにより決定され、定義されるアッセイ条件下で１分当たりでその基質から生産されるｐ−ニトロフェノールの量として表現される。一部の実施形態において、タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイを使用して測定することができる。
【０１３５】
用語「活性」および「生物学的に活性」は、特定のタンパク質と関連する生物学的活性を指す。所与のタンパク質の生物学的活性は、当業者によりそのタンパク質に典型的に帰属される任意の生物学的活性を指すことになる。例えば、グルコアミラーゼと関連する酵素活性は加水分解であり、したがって活性グルコアミラーゼは加水分解活性を有する。
【０１３６】
本明細書において使用される用語「グルコアミラーゼ活性」は、デンプンならびに関連オリゴおよび多糖の非還元末端からのＤ−グルコースの放出を触媒する酵素の活性を指す。特に、グルコアミラーゼ活性は、３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法によりアッセイすることができる（Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：４９−５４（１９９４）を参照のこと）。
【０１３７】
本明細書において同義に使用される用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらの用語は、限定されるものではないが、一、二もしくは三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドまたはプリンおよびピリミジン塩基もしくは他の天然、化学的、生化学的修飾、非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。
【０１３８】
本明細書において使用される用語「ＤＮＡ構築物」、「形質転換ＤＮＡ」および「発現ベクター」は、宿主細胞または生物中に配列を導入するために使用されるＤＮＡを指すために同義に使用される。ＤＮＡは、ＰＣＲまたは当業者に公知の任意の他の好適な技術によりインビトロで生成することができる。ＤＮＡ構築物、形質転換ＤＮＡまたは組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルスまたは核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクター、ＤＮＡ構築物または形質転換ＤＮＡの組換え発現カセット部分は、他の配列の中でも、転写されるべき核酸配列およびプロモーターを含む。一部の実施形態において、発現ベクターは、異種ＤＮＡ断片を取り込み、宿主細胞中で発現する能力を有する。
【０１３９】
本明細書において使用される用語「ベクター」は、１つ以上の細胞型中に核酸を導入するために設計されたポリヌクレオチド構築物を指す。ベクターとしては、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、カセットなどが挙げられる。
【０１４０】
細胞中への核酸配列の導入に関して本明細書において使用される用語「導入される」は、核酸配列を細胞中に移行させるために好適な任意の方法を指す。このような導入方法としては、限定されるものではないが、プロトプラスト融合、形質移入、形質転換、コンジュゲーションおよび形質導入が挙げられる。
【０１４１】
本明細書において使用される用語「形質転換された」および「安定的に形質転換された」は、ゲノム中に組み込まれ、またはエピソームプラスミドとして少なくとも２世代維持される非天然（異種）ポリヌクレオチド配列を有する細胞を指す。
【０１４２】
本明細書において使用される用語「選択可能マーカー」および「選択マーカー」は、ベクターを含有する宿主の選択を容易とする宿主細胞中で発現し得る核酸（例えば遺伝子）を指す。典型的には、選択可能マーカーは、宿主細胞に対して抗菌耐性または代謝的利点を付与して外因性ＤＮＡを含有する細胞が形質転換の間にいかなる外因性配列も受容しなかった細胞と区別されるのを可能とする遺伝子である。
【０１４３】
本明細書において使用される用語「プロモーター」は、下流の遺伝子の転写を指向するように機能する核酸配列を指す。プロモーターは、他の転写および翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも称される）と一緒に、所与の遺伝子を発現させるために必要である。一般に、転写および翻訳調節配列としては、限定されるものではないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が挙げられる。
【０１４４】
核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、「作動可能に結合している」。例えば分泌リーダー（すなわちシグナルペプチド）をコードするＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドについてのＤＮＡに作動可能に結合し得る。一般に、「作動可能に結合している」は、結合しているＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合、連続しており、リーディングフェーズ（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）中に存在することを意味する。
【０１４５】
本明細書において使用される用語「遺伝子」は、ポリペプチドをコードし、コード領域に先行および後続する領域ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含むポリヌクレオチド（例えばＤＮＡセグメント）を指す。
【０１４６】
本明細書において使用される用語「ハイブリダイゼーション」は、当技術分野において公知の、核酸の鎖が塩基対形成を通して相補鎖と結合するプロセスを指す。
【０１４７】
核酸配列は、２つの配列が中程度から高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で互いに特異的にハイブリダイズする場合、参照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」とみなされる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づく。例えば、「最高のストリンジェンシー」は、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの５℃下）で生じ、「高ストリンジェンシー」は、Ｔｍの約５〜１０℃下で生じ、「中ストリンジェンシー」は、プローブのＴｍの約１０〜２０℃下で生じ、「低ストリンジェンシー」は、Ｔｍの約２０〜２５℃下で生じる。実用的には、最高のストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性またはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために使用することができる一方、中または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチド配列相同体を同定または検出するために使用することができる。
【０１４８】
中程度および高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、当技術分野において周知である。高ストリンジェンシー条件の例は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％のＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌの変性担体ＤＮＡ中での約４２℃におけるハイブリダイゼーションと、それに続く２×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳ中での室温における２回の洗浄ならびに０．１×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳ中での４２℃における追加の２回の洗浄を含む。中程度ストリンジェント条件の例は、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストランおよび２０ｍｇ／ｍｌの変性煎断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での３７℃における一晩のインキュベーションと、それに続く１×ＳＳＣ中での約３７〜５０℃におけるフィルターの洗浄を含む。当業者は、因子、例えばプローブ長などを順応させるために必要に応じて温度、イオン強度などを調整する方法を理解している。
【０１４９】
本明細書において使用される「組換え」は、異種もしくは同種核酸配列の導入により改変された細胞もしくはベクター、またはそのように改変された細胞に由来する細胞に対する言及を含む。したがって、例えば組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態内で同一の形態で見出されない遺伝子を発現し、または計画的なヒトの介入の結果として他の場合には異常発現され、低発現され、もしくは全く発現されない天然遺伝子を発現する。
【０１５０】
一実施形態において、突然変異ＤＮＡ配列は、少なくとも１つのコドンおよび／またはヌクレオチドにおける部位飽和突然変異誘発により生成される。別の実施形態において、部位飽和突然変異誘発は、２つ以上のコドンについて実施される。さらなる実施形態において、突然変異ＤＮＡ配列は、グルコアミラーゼＤＮＡ配列と約５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超または９８％超の同一性を有する。代替の実施形態において、突然変異ＤＮＡは、任意の公知の突然変異誘発手順、例えば放射線照射、ニトロソグアニジンなどを使用してインビボで生成することができる。次いで、所望のＤＮＡ配列を単離し、本明細書において提供される方法において使用することができる。
【０１５１】
本明細書において使用される「異種タンパク質」は、宿主細胞中で天然に存在しないタンパク質またはポリペプチドを指す。
【０１５２】
酵素が対応する野生型細胞中で発現されるレベルよりも高いレベルにおいて宿主細胞中で発現される場合、その酵素は宿主細胞中で「過剰発現される」。
【０１５３】
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において同義に使用される。本開示および特許請求の範囲において、アミノ酸残基についての慣用の一文字および三文字コードが使用される。三文字コードは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に準拠して定義されるアミノ酸をコードする。ポリペプチドが遺伝子コードの縮重に起因して２つ以上のヌクレオチド配列によりコードされ得ることも理解される。
【０１５４】
本開示の変異体は、以下の命名法により記載される：［元のアミノ酸残基／位置／置換アミノ酸残基］。置換に好適な位置が本明細書において規定のアミノ酸を示唆せずに同定される場合、任意のアミノ酸残基がその位置に存在するアミノ酸残基に代えて置換されてよいことを理解されたい。
【０１５５】
「プロ配列」は、タンパク質の分泌に必要な、シグナル配列と成熟タンパク質との間のアミノ酸配列である。プロ配列の開裂は、成熟活性タンパク質をもたらす。
【０１５６】
用語「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、タンパク質の成熟または前駆体形態の分泌に関与し得るヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の任意の配列を指す。シグナル配列のこの定義は、機能的な定義であり、タンパク質の分泌の達成に関与するタンパク質遺伝子のＮ末端部分によりコードされる全てのアミノ酸配列を含むことを意味する。これらは、普遍的ではないが、タンパク質のＮ末端部分に、または前駆体タンパク質のＮ末端部分に結合していることが多い。シグナル配列は、内因性でも外因性でもよい。シグナル配列は、タンパク質（例えばグルコアミラーゼ）と通常関連するものであり得、または別の分泌タンパク質をコードする遺伝子からのものであり得る。
【０１５７】
タンパク質またはペプチドの用語「前駆体」形態は、タンパク質のアミノまたはカルボニル末端に作動可能に結合しているプロ配列を有するタンパク質の成熟形態を指す。前駆体は、プロ配列のアミノ末端に作動可能に結合している「シグナル」配列も有し得る。前駆体は、翻訳後活性に関与する追加のポリヌクレオチド（例えばそれから開裂され、タンパク質またはペプチドの成熟形態を残すポリヌクレオチド）も有し得る。
【０１５８】
「宿主株」または「宿主細胞」は、本開示によるＤＮＡを含む発現ベクターに好適な宿主を指す。
【０１５９】
用語「に由来する」および「から得られる」は、当該生物の株により生産され、または生産可能なグルコアミラーゼだけでなく、そのような株から単離されたＤＮＡ配列によりコードされ、そのようなＤＮＡ配列を含有する宿主生物中で生産されるグルコアミラーゼも指す。さらにこの用語は、合成のおよび／またはｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によりコードされ、当該グルコアミラーゼの同定特徴を有するグルコアミラーゼを指す。
【０１６０】
この定義の範囲内の「誘導体」は、一般に、誘導体が野生型、天然または親形態と類似する目的に有用である程度まで、グルコアミラーゼにおいて観察される特徴的な加水分解活性を保持する。グルコアミラーゼの機能誘導体は、本開示のグルコアミラーゼの一般的な特徴を有し、天然存在、合成または組換え生産ペプチドまたはペプチド断片を包含する。
【０１６１】
用語「単離された」は、それが天然に存在する場合、天然環境から取り出された材料を指す。「精製」タンパク質は、少なくとも部分的に均一に精製されたタンパク質を指す。一部の実施形態において、精製タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定して約１０％超純粋、任意選択で約２０％超純粋、任意選択で約３０％超純粋であり得る。本開示のさらなる態様は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定して高度に精製された形態（すなわち約４０％超純粋、約６０％超純粋、約８０％超純粋、約９０％超純粋、約９５％超純粋、約９７％超純粋、さらには約９９％超純粋）のタンパク質を包含する。
【０１６２】
本明細書において使用される用語、「コンビナトリアル突然変異誘発」は、出発配列の変異体のライブラリーを生成する方法を指す。これらのライブラリーにおいて、変異体は、突然変異の所定のセットから選択される１つまたはいくつかの突然変異を含有する。さらに、本方法は、突然変異の所定のセットのメンバーでなかったランダム突然変異を導入するための手段を提供する。一部の実施形態において、本方法は、参照により本明細書に援用される米国特許第６，５８２，９１４号明細書に記載のものを含む。代替の実施形態において、コンビナトリアル突然変異誘発法は、市販のキットを包含する（例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。
【０１６３】
本明細書において使用される用語「突然変異体のライブラリー」は、ゲノムのほとんどが同一であるが、１つ以上の遺伝子の異なる相同体を含む細胞の集団を指す。このようなライブラリーは、例えば改善された形質を有する遺伝子またはオペロンを同定するために使用することができる。
【０１６４】
本明細書において使用される用語「乾燥固体含有率（ＤＳまたはｄｓ）」は、乾燥重量基準の％でのスラリーの総固体を指す。
【０１６５】
本明細書において使用される用語「イニシャルヒット（ｉｎｉｔｉａｌ  ｈｉｔ）」は、コンビナトリアルコンセンサス突然変異誘発ライブラリーをスクリーニングすることにより同定された変異体を指す。一部の実施形態において、イニシャルヒットは、出発遺伝子と比較して改善された性能特徴を有する。
【０１６６】
本明細書において使用される用語「改善されたヒット（ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｈｉｔ）」は、向上したコンビナトリアルコンセンサス突然変異誘発ライブラリーをスクリーニングすることにより同定された変異体を指す。
【０１６７】
本明細書において使用される用語「標的特性」は、変更すべき出発遺伝子の特性を指す。本開示は、いかなる特定の標的特性にも限定されるものではない。しかしながら、一部の実施形態において、標的特性は、遺伝子産物の安定性（例えば変性、タンパク質分解または他の分解性因子に対する耐性）である一方、他の実施形態において、生産宿主における生産のレベルが変更される。実際に、出発遺伝子のあらゆる特性が本開示において使用されることが企図される。用語の他の定義は、本明細書の全体にわたり記載され得る。
【０１６８】
本明細書において使用される用語「組成物」は、例えば本発明により調製される飲料、食料または飼料成分の形態の調製物に関し、使用および／または適用方式および／または施与方式に応じて溶液の形態で、または固体として存在し得る。固体形態は、乾燥酵素粉末または粒状酵素のいずれかとして存在し得る。組成物は、本発明による変異体、酵素担体ならびに任意選択で安定剤および／または保存剤を含み得る。酵素担体は、グリセロールまたは水からなる群から選択することができる。調製物は、安定剤および含み得る。安定剤は、無機塩、ポリオール、糖およびそれらの組合せからなる群から選択することができる。さらに、安定剤は、無機塩、例えば塩化カリウムであり得る。別の態様において、ポリオールは、グリセロール、プロピレングリコールまたはソルビトールである。糖は、小分子炭水化物、特にいくつかの甘味小分子炭水化物のいずれか、例えばグルコース、フルクトースおよびサッカロースである。いっそうさらなる態様において、調製物は、保存剤を含み得る。一態様において、保存剤は、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンゾエート、ソルベートもしくは他の食料承認保存剤またはそれらの混合物である。
【０１６９】
本文脈において、用語「発酵」は、微生物を培養物中で生育させることにより組成物、例えば発酵飲料および／または物質を提供することを指す。酵素（例えばグルコアミラーゼ）生産に関して、用語「発酵」は、微生物培養プロセスにおける酵素の生産を含むプロセスを指す。醸造に関して、用語「発酵」は、醸造酵母中の酵素による麦汁中の糖のエタノールおよび二酸化炭素への転換と他の発酵副生物の形成を指す。
【０１７０】
本明細書において使用される「発酵飲料を生産する方法」、例えばビールを生産する方法は、一般に、例えばグリストをベースとするマッシュを調製し、マッシュをろ過して麦汁および使用済み穀物を得、麦汁を発酵させて発酵飲料を得る工程を含む。
【０１７１】
本明細書において使用される用語「デンプンおよび／または糖含有植物材料」は、任意の植物および植物部分、例として塊茎、根、茎、葉および種子に由来し得るデンプンおよび／または糖含有植物材料を指す。「デンプンおよび／または糖含有植物材料」は、例えば１つ以上の穀類、例えばオオムギ、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、ソルガム、キビまたはイネおよびそれらの任意の組合せであり得る。デンプンおよび／または糖含有植物材料は、加工、例えば製粉、麦芽化、部分麦芽化することができ、または非麦芽化であってよい。非麦芽化穀類は、「生穀物」とも呼ばれる。非穀類デンプン含有植物材料の例は、例えば塊茎を含む。
【０１７２】
本明細書において使用される用語「グリスト」は、マッシングに好適な任意の加工デンプンおよび／または糖含有植物材料を指す。本明細書において企図される用語「グリスト」は、任意の植物および植物部分、例として塊茎、根、茎、葉および種子に由来し得る任意のデンプンおよび／または糖含有植物材料を含み得る。加工の例は、製粉および／または摩砕を含み、通常、粉ではなく粗い材料を提供する。本文脈に関して、グリストは、穀物、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、オートムギ、コーン（トウモロコシ）、イネ、ミロ、キビおよびソルガムからの穀物からの加工材料を含み得、より好ましくは、麦汁のグリストの少なくとも１０％またはより好ましくは、少なくとも１５％、いっそうより好ましくは、少なくとも２５％または最も好ましくは、少なくとも３５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％またはさらには１００％（ｗ／ｗ）が穀物に由来する。一部の実施形態において、グリストは、キャッサバ［Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ］の根から得られるデンプンおよび／または糖含有植物材料を含み得る。グリストは、麦芽化穀物、例えばオオムギ麦芽を含み得る。好ましくは、麦汁のグリストの少なくとも１０％またはより好ましくは、少なくとも１５％、いっそうより好ましくは、少なくとも２５％または最も好ましくは、少なくとも３５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％またはさらには１００％（ｗ／ｗ）が麦芽化穀物に由来する。
【０１７３】
本明細書において使用される用語「麦芽」は、任意の麦芽化穀物粒、例えば麦芽化オオムギまたはコムギとして理解される。
【０１７４】
一態様において、ビールの生産に関して選択されたオオムギの品種から主として生産された麦芽を使用する場合、麦芽は、ビールの全体の特徴および品質に対して最大の効果を有する。第１に、麦芽は、ビールにおける主要な香味料である。第２に、麦芽は、発酵性糖の大部分を提供する。第３に、麦芽は、ビールの本体および発泡特徴に寄与するタンパク質を提供する。第４に、麦芽は、任意選択で外因性酵素の添加により補完されるマッシングの間の酵素活性を提供する。第５に、麦芽使用済み穀物は、典型的には、ロータリングまたはマッシュろ過によるマッシング後の麦汁の分離のためのろ過媒体を提供する。
【０１７５】
本明細書において使用される用語「副原料」は、オオムギ麦芽でない任意のデンプンおよび／または糖含有植物材料を指す。副原料の例として、一般的なコーン（トウモロコシ）グリッツ、精製コーン（トウモロコシ）グリッツ、醸造製粉酵母、イネ、ソルガム、精製コーン（トウモロコシ）デンプン、オオムギ、オオムギデンプン、穀皮除去（ｄｅｈｕｓｋｅｄ）オオムギ、コムギ、コムギデンプン、半炭化穀類、穀類フレーク、ライムギ、オートムギ、ジャガイモ、タピオカおよびシロップ、例えばコーン（トウモロコシ）シロップ、サトウキビシロップ、転化糖シロップ、オオムギおよび／またはコムギシロップなどのような材料を挙げることができ、デンプンの供給源として使用することができる。デンプンは、最終的にはデキストリンおよび発酵性糖に変換される。一態様において、「副原料」は、キャッサバ［Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ］の根から得られるデンプンおよび／または糖含有植物材料を含む。
【０１７６】
本明細書において使用される用語「マッシュ」は、任意のデンプンおよび／または糖含有植物材料、例えばグリスト、例えば後に麦汁および使用済み穀物に分離すべき水と混合している破砕オオムギ麦芽、破砕オオムギおよび／もしくは他の副原料またはそれらの組合せを含むグリストの水性スラリーを指す。
【０１７７】
本明細書において使用される用語「麦汁」は、マッシングの間にグリストを抽出した後の未発酵汁の流出液を指す。
【０１７８】
本明細書において使用される用語「使用済み穀物」は、グリストが抽出され、麦汁がマッシュから分離されたときに残留する排出固体を指す。「使用済み穀物」は、例えば飼料として使用することができる。
【０１７９】
本明細書において使用される麦汁における用語「抽出物回収率」は、乾物に基づく割合で表現される、グリスト（麦芽および／または副原料）から抽出される可溶性物質の合計を指す。
【０１８０】
本明細書において使用される用語「ホップ」は、ビール品質、例として香味付けへの顕著な寄与におけるその使用を指す。特に、ホップ（またはホップ構成要素）は、所望の苦味物質をビールに添加する。さらに、ホップはタンパク質沈殿剤として作用、保存剤として定着し、泡形成および安定化を促進し得る。
【０１８１】
本明細書において使用される用語「飲料」および「飲料生産物」は、ビール、例えばフルモルトビール（ｆｕｌｌ  ｍａｌｔｅｄ  ｂｅｅｒ）、「ビール純粋令」のもと醸造されたビール、エール、ＩＰＡ、ラガー、ビター、発泡酒（第２のビール）、第３のビール、ドライビール、ニアビール、ライトビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボックビール、スタウト、モルトリカー、ノンアルコールビール、ノンアルコールモルトリカーなどを含む。用語「飲料」または「飲料生産物」は、代替穀類および麦芽飲料、例えば果実風味の麦芽飲料、例えば柑橘風味、例えばレモン、オレンジ、ライムもしくはベリー風味の麦芽飲料、リカー風味の麦芽飲料、例えばウォッカ、ラムもしくはテキーラ風味のモルトリカーまたはコーヒー風味の麦芽飲料、例えばカフェイン風味のモルトリカーなども含む。さらなる態様において、飲料または飲料生産物は、アルコールまたはノンアルコール飲料、例えば穀類または麦芽ベース飲料、例えばビールまたはウイスキー、例えばワイン、シードル、酢、日本酒、醤油またはジュースである。
【０１８２】
本明細書において使用される用語「麦芽飲料」は、フルモルトビール、エール、ＩＰＡ、ラガー、ビター、発泡酒（第２のビール）、第３のビール、ドライビール、ニアビール、ライトビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボックビール、スタウト、モルトリカー、ノンアルコールモルトリカーなどのような麦芽飲料を含む。用語「麦芽飲料」は、代替麦芽飲料、例えば果実風味の麦芽飲料、例えば柑橘風味、例えばレモン、オレンジ、ライムもしくはベリー風味の麦芽飲料、リカー風味の麦芽飲料、例えばウォッカ、ラムもしくはテキーラ風味のモルトリカーまたはコーヒー風味の麦芽飲料、例えばカフェイン風味のモルトリカーなども含む。
【０１８３】
本発明に関して、用語「ビール」は、デンプン含有植物材料の発酵／醸造により生産される任意の発酵麦汁を含むことを意味し、したがって特にもっぱら麦芽もしくは副原料または麦芽および副原料の任意の組合せから生産されるビールも意味する。
【０１８４】
ビールは、種々のデンプンおよび／または糖含有植物材料（穀物粒および／または麦芽であることが多い）から本質的に同一のプロセスにより作製することができる。穀物デンプンは、グルコース残基がアルファ−１，４−またはアルファ−１，６−結合により連結しており、前者が優勢なグルコースホモポリマーであると考えられる。
【０１８５】
本明細書において使用される用語「ピルスナービール」は、通常、通常（例えばヘレス）のペールラガーよりも顕著なホップ特徴を有するペール下面発酵ラガー（ピルスナー麦芽から作製）を指す。
【０１８６】
本明細書において使用される用語「ライトビール、低減カロリービールまたは低カロリービール」は、近年、特に米国市場において広く普及してきた醸造飲料を指す。米国において定義されるとおり、これらの高希薄化ビールは、製造業者の「通常の」ビール」よりも約３０％少ないカロリーを有する。
【０１８７】
本明細書において使用される用語「ノンアルコールビール」または「低アルコールビール」は、体積基準で最大０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％のアルコールを含有するビールを指す。ノンアルコールビールは、特別なアルコールを生産しない「酵母」を用いる特別な方法（発酵停止）により醸造することができ、または慣習的な方法によるが、醸造プロセスの仕上げ段階の間にアルコールを例えば水およびアルコールの異なる沸点を利用することにより真空蒸発により除去して醸造することができる。
【０１８８】
本明細書において使用される用語「低カロリービール」または「低炭水化物含有量（ローカーボ）を有するビール」は、０．７５ｇ／１００ｇ以下の炭水化物含有量を有し、約９０〜９２％の発酵度を有するビールと定義される。
【０１８９】
本明細書において使用される用語「低温殺菌」は、加熱による水溶液中の微生物の殺滅を意味する。醸造プロセスにおける低温殺菌の実行は、典型的には、フラッシュ低温殺菌器またはトンネル低温殺菌器（ｔｕｎｎｅｌ  ｐａｓｔｅｕｒｉｓｅｒ）の使用を通してのものである。本明細書において使用される用語「低温殺菌単位（ｐａｓｔｅｕｒｉｓａｔｉｏｎ  ｕｎｉｔ）またはＰＵ」は、低温殺菌の量的尺度を指す。ビールについての１低温殺菌単位（１ＰＵ）は、摂氏６０度における１分間の熱保持として定義される。以下のとおり計算する。
ＰＵ＝ｔ×１．３９３∧（Ｔ−６０）
ｔ＝低温殺菌器中の低温殺菌温度における時間（分）
Ｔ＝低温殺菌器中の温度（摂氏度）
［∧（Ｔ−６０）は、（Ｔ−６０）の指数を表す］
【０１９０】
ビールの種類、原料および微生物汚染、醸造業者ならびにビールの風味に対する知覚効果に応じて様々な最小ＰＵを使用することができる。典型的には、ビールの低温殺菌に１４〜１５ＰＵが要求される。低温殺菌設備に応じて、低温殺菌温度は典型的には６４〜７２摂氏度の範囲であり、低温殺菌時間はそれに応じて算出される。さらなる情報は、“Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｌｔｉｎｇ”ｂｙ  Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｋｕｎｚｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅａｃｈｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（ＶＬＢ），３ｒｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００４，ＩＳＢＮ  ３−９２１６９０−４９−８に見出すことができる。
【０１９１】
値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別記しない限り、その範囲の上限値および下限値の間の、下限値の単位の１０分の１までのそれぞれの介在値も具体的に開示されることが理解される。任意の指定値または指定範囲における介在値および任意の他の指定値またはその指定範囲における介在値の間のそれぞれのより小さな範囲が、本開示内に包含される。これらのより小さな範囲の上限値および下限値は、その範囲中で独立して含まれても除外されてもよく、指定範囲における任意の具体的に除外された限界次第で、より小さな範囲においていずれかの限界が含まれ、いずれも含まれず、または両方とも含まれるそれぞれの範囲も本開示内に包含される。指定範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
【０１９２】
例示的な実施形態がより詳細に記載される前に、本開示は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって無論変動し得ることが理解されたい。本明細書に記載のものと類似のまたは等価な任意の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、目下、例示的な方法および材料が記載される。
【０１９３】
本明細書においておよび添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別記しない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば「遺伝子」への言及は、複数のそのような候補作用物質を含み、「細胞」への言及は、当業者に公知の１つ以上の細胞およびその均等物への言及を含む、などである。
【０１９４】
本明細書において考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示について提供されるにすぎない。本明細書において、本開示が先行発明によりそのような刊行物に先行する権利がないことが認められると解釈されるものは存在しない。
【０１９５】
【表６】
2015526090.tif 000008
【０１９６】
３．グルコアミラーゼポリペプチド
親グルコアミラーゼ
一部の実施形態において、本開示は、グルコアミラーゼ変異体を提供する。グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼの変異体であり、それは触媒ドメインおよびデンプン結合ドメインの両方を含み得る。一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号１、２、３、５、６、７、８、９もしくは１３において示されるアミノ酸配列を有し、または配列番号１、２、３、５、６、７、８、９もしくは１３において示されるアミノ酸配列の１つ以上と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％もしくは約９９．５％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する触媒ドメインを含む。さらに他の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号１、２または３のアミノ酸配列の１つを有するグルコアミラーゼの触媒ドメインをコードするＤＮＡと中程度、高度またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされる触媒ドメインを含む。
【０１９７】
一態様において、本明細書に記載の変異体は、多くとも４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９５、５００、５０５、５０７、５１５、５２５、５３５、５４５、５５５、５６５または５７３アミノ酸残基を有する。
【０１９８】
一態様において、本明細書に記載の変異体は、多くとも１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１のアミノ酸残基置換を有する。
【０１９９】
一態様において、本明細書に記載の変異体は、多くとも２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸残基の長さが欠失している。
【０２００】
一態様において、本明細書に記載の変異体は、多くとも２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸残基の長さの挿入を有する。
【０２０１】
一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号１、２、１１、２４、２５、２６、２７、２８もしくは２９において示されるアミノ酸配列を有し、または配列番号１、２、１１、２４、２５、２６、２７、２８もしくは２９において示されるアミノ酸配列の１つ以上と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％もしくは約９９．５％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するデンプン結合ドメインを含む。さらに他の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号１、２または１１のアミノ酸配列の１つを有するグルコアミラーゼのデンプン結合ドメインをコードするＤＮＡと中程度、高度またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされるデンプン結合ドメインを含む。
【０２０２】
グルコアミラーゼの予測構造および既知配列は、真菌種の中で保存されている（Ｃｏｕｔｉｎｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，７：３９３−４００およびＣｏｕｔｉｎｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，７：７４９−７６０）。一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、糸状菌グルコアミラーゼである。一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株（例えばＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、Ｔ．ロンギブラキアタム（Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、Ｔ．ストリクチピリス（Ｔ．ｓｔｒｉｃｔｉｐｉｌｉｓ）、Ｔ．アスペレルム（Ｔ．ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ）、Ｔ．コニラングブラ（Ｔ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）およびＴ．ハジアヌム（Ｔ．ｈａｚｉａｎｕｍ））、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株（例えばクロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、カワチコウジカビ（Ａ．ｋａｗａｃｈｉ）、アワモリコウジカビ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）およびＡ．オルジアエ（Ａ．ｏｒｚｙａｅ））、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）株（例えばＴ．エメルソニイ（Ｔ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、Ｔ．サーモフィラス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびＴ．デュポンティ（Ｔ．ｄｕｐｏｎｔｉ））、ヒポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）株（例えばＨ．ゲラチノサ（Ｈ．ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）、Ｈ．オリエンタリス（Ｈ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、Ｈ．ビノサ（Ｈ．ｖｉｎｏｓａ）およびＨ．シトリナ（Ｈ．ｃｉｔｒｉｎａ））、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株（例えばＦ．オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、Ｆ．ロゼウム（Ｆ．ｒｏｓｅｕｍ）およびＦ．ベネナタム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ））、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）株（例えばアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ））ならびにフミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）株（例えばＨ．グリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａ）、Ｈ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）およびＨ．ラヌギノス（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ））、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）株（例えばＰ．ノタタム（Ｐ．ｎｏｔａｔｕｍ）またはアオカビ（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））またはサッカロミコプシス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）株（例えばＳ．フィブリゲラ（Ｓ．ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ））から得られる。
【０２０３】
一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは細菌グルコアミラーゼであり得る。例えば、ポリペプチドは、グラム陽性細菌株、例えばバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株（例えばＢ．アルカロフィラス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ））またはストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株（例えばＳ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ））から得ることができる。
【０２０４】
一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号３のＴｒＧＡアミノ酸配列の触媒ドメインと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９３％、約９５％、約９７％、約９８％または約９９％の配列同一性を有する触媒ドメインを含む。
【０２０５】
他の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号５または配列番号６のアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）親グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも約９０％、約９３％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の配列同一性を有する触媒ドメインを含む。
【０２０６】
さらに他の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号８のフミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）（ＨｇＧＡ）親グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも約９０％、約９５％、約９７％または約９９％の配列同一性を有する触媒ドメインを含む。
【０２０７】
一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号１、２または１１のＴｒＧＡアミノ酸配列のデンプン結合ドメインと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％または約９８％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含む。
【０２０８】
他の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号２４のフミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）（ＨｇＧＡ）グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも約９０％、約９５％、約９７％または約９９％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含む。
【０２０９】
他の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号２９のチエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）（ＴｔＧＡ）グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも約９０％、約９５％、約９７％または約９９％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含み、図１０Ｄおよび１０Ｅにおけるアラインメントも参照のこと。
【０２１０】
他の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号２５のサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（ＴｈＧＡ）グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも約９０％、約９５％、約９７％または約９９％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含む（図１０Ｄおよび１０Ｅ）。
【０２１１】
他の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号２６のタラロミセス・エメルソニイト（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉｔ）（ＴｅＧＡ）グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも約９０％、約９５％、約９７％または約９９％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含む。
【０２１２】
さらに他の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号２７または配列番号２８のアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）親グルコアミラーゼのデンプン結合ドメインと少なくとも約９０％、約９３％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含む。
【０２１３】
一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号１または２のＴｒＧＡアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約８８％、約９０％、約９３％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の配列同一性を有する。
【０２１４】
さらなる実施形態において、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株またはヒポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）株から得られる。一部の典型的なトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体は、米国特許第７，４１３，８８７号明細書に記載されており、具体的にはこの参考文献の配列番号１７〜２２および４３〜４７に記載のアミノ酸配列が参照される。
【０２１５】
一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を含むＴｒＧＡまたはＴｒＧＡ配列（配列番号２）に対して少なくとも約８０％、約８５％、約８８％、約９０％、約９３％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％の配列同一性を有するトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体である。
【０２１６】
親グルコアミラーゼは、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して単離および／または同定することができる。当業者に公知の任意の標準的技術を使用することができる。例えば、グルコアミラーゼの保存領域に特異的なプローブおよび／またはプライマーを使用して細菌または真菌細胞中の相同体（触媒ドメイン、活性部位など）を同定することができる。あるいは、縮重ＰＣＲを使用して細菌または真菌細胞中の相同体を同定することができる。一部の場合、例えばデータベース中の既知配列を、既知グルコアミラーゼ、例として配列番号２または既知デンプン結合ドメイン、例として配列番号１１の１つに対する配列および／または構造的同一性について分析することができる。機能アッセイを使用して細菌または真菌細胞中のグルコアミラーゼ活性を同定することもできる。グルコアミラーゼ活性を有するタンパク質を単離および逆配列決定（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）して対応するＤＮＡ配列を単離することができる。このような方法は、当業者に公知である。
【０２１７】
グルコアミラーゼ構造的相同性
分子生物学のセントラルドグマは、特定の酵素についての遺伝子をコードするＤＮＡの配列がタンパク質のアミノ酸配列を決定し、この配列は次に酵素の三次元フォールディングを決定する、というものである。このフォールディングにより、触媒中心および基質結合表面を作出する異なる残基が集められ、これにより当該酵素の高い特異性および活性がもたらされる。
【０２１８】
グルコアミラーゼは、３つもの区別される構造ドメイン、全てのグルコアミラーゼにおいて構造的に保存される約４５０残基の触媒ドメイン、一般に、それに続く約１００残基のデンプン結合ドメインに連結している３０〜８０残基からなるリンカー領域からなる。インタクトな３つ全ての領域を有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの構造は、本明細書において１．８オングストロームの分解能まで決定された（参照により本明細書に援用される国際公開第２００９／０６７２１８号パンフレット（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）９４〜２１６ページの表２０および参照により本明細書に援用される国際公開第２００９／０６７２１８号パンフレット（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）８９〜９３ページの実施例１１を参照のこと）。座標（参照により本明細書に援用される国際公開第２００９／０６７２１８号パンフレット（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）９４〜２１６ページの表２０を参照のこと）を使用して、構造を既に決定されたアワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）株Ｘ１００からのグルコアミラーゼの触媒ドメインの座標（Ａｌｅｓｈｉｎ，Ａ．Ｅ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｃ．，Ｆｉｒｓｏｖ，Ｌ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｈｏｎｚａｔｋｏ，Ｒ．Ｂ．Ｒｅｆｉｎｅｄ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ  ｖａｒ．Ｘ１００．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３８：５７５−５９１（１９９４））とアライメントした。アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）結晶構造は、触媒ドメインのみを含んだ。図６Ａおよび７において把握されるとおり、触媒ドメインの構造は、極めて密接に重複し、この構造的な重ね合せに基づき等価残基を同定することが可能である。全てのグルコアミラーゼは図６Ａおよび７に示される基本構造を共有すると考えられる。
【０２１９】
したがって、ＴｒＧＡの触媒ドメインは、約４５０残基、例えばＴｒＧＡ配列番号２の残基１〜４５３を有し、１２ヘリックス二重バレルドメインである。触媒ドメインのヘリックスおよびループは、それらを形成する配列番号２を有するＴｒＧＡの残基に関して定義することができる。
【０２２０】
【表７】
2015526090.tif 000009
【０２２１】
リンカードメインは、３０〜８０残基、例えば配列番号２を有するＴｒＧＡの残基４５４〜４９０を有する。
【０２２２】
ＴｒＧＡのデンプン結合ドメインは、約１００残基、例えば２つのねじれ三本鎖シートから構成されるベータサンドイッチからなる配列番号２を有するＴｒＧＡの残基４９６〜５９６を有する。デンプン結合ドメインのシート、ヘリックスおよびループは、それらを形成する配列番号２を有するＴｒＧＡの残基に関して定義することができる。
【０２２３】
【表８】
2015526090.tif 000010
【０２２４】
デンプン結合ドメインの表面に対するＴｒＧＡ中の触媒ドメインの位置決めは、２つのドメイン間における界面領域を残す。この連結表面区域は、ＴｒＧＡ（配列番号２）中の以下の位置に対応する：２４、２６、２７、２９、３０、４０、４２、４３、４４、４６、４８、４９、１１０、１１１、１１２、１１４、１１６、１１７、１１８、１１９、５００、５０２、５０４、５３４、５３６、５３７、５３９、５４１、５４２、５４３、５４４、５４６、５４７、５４８、５８０、５８３、５８５、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９４および５９６。ＴｒＧＡの三次元構造中のこれらの残基の位置を図６Ｂに示す。
【０２２５】
以下にさらに詳細に記載されるとおり、他のグルコアミラーゼ中の構造的な重ね合せに基づき等価残基を同定することが可能である。
【０２２６】
図６Ａは、側面から見た配列番号２のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（黒色）およびアスペルギルス・アワモリイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉｉ）グルコアミラーゼ（灰色）の三次元構造の比較である。この見方において、触媒ドメインとリンカー領域とデンプン結合ドメインとの間の関係を把握することができる。
【０２２７】
図６Ｂは、側面から見たトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（黒色）（配列番号２）の三次元構造を示し、触媒ドメインとデンプン結合ドメインとの間で界面領域を形成する残基を強調する（暗灰色の触媒ドメインからの残基および淡灰色のデンプン結合ドメインからの残基）。
【０２２８】
図７は、上面から見た配列番号２のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（黒色）およびアスペルギルス・アワモリイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉｉ）グルコアミラーゼ（灰色）の三次元構造の比較である。本明細書に示されるグルコアミラーゼおよび実際、現在までに公知の全てのグルコアミラーゼは、この構造的相同性を共有する。構造の保存は、全てのグルコアミラーゼについての活性の保存および作用機序の保存と相関する。この高い相同性を考慮すると、変更された機能をもたらすトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼの部位特異的変異体から生じる変化は、他のグルコアミラーゼにおいて類似する構造的な、したがって機能的な結果も有する。したがって、変異体が所望の利益をもたらす本教示は、他のグルコアミラーゼに適用することができる。
【０２２９】
さらなる結晶構造は、デンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）について、参照により本明細書に援用される国際公開第２００９／０６７２１８号パンフレット（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）９４〜２１６ページの表２０中の座標を使用して生成した。ＴｒＧＡについてのＳＢＤを、クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）についてのＳＢＤとアライメントした。図８に示されるとおり、クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびＴｒＧＡのＳＢＤの構造は、極めて密接に重複する。全てのデンプン結合ドメインは、図８に示される基本構造の少なくとも一部を共有する一方、一部のＳＢＤは、他のものよりも構造的に類似していると考えられる。例えば、ＴｒＧＡ  ＳＢＤは、ＣＡＺＹデータベース（ｃａｚｙ．ｏｒｇ）内の炭水化物結合モジュール２０ファミリー内として分類することができる。ＣＡＺＹデータベースは、グリコシド結合を分解、改変または作出する酵素の構造的に関連する触媒および炭水化物結合モジュール（または機能ドメイン）のファミリーを記載している。高い構造的相同性を考慮すると、変更された機能をもたらすＴｒＧＡ  ＳＢＤの部位特異的変異体は、ＴｒＧＡ  ＳＢＤ、特に炭水化物結合モジュール２０ファミリー内に分類されるものと類似する構造を有するＳＢＤを有する他のグルコアミラーゼにおいて類似する構造的な、したがって機能的な結果も有する。したがって、変異体が所望の利益をもたらす本教示は、構造的類似性を有する他のＳＢＤに適用することができる。
【０２３０】
したがって、本明細書において考察されるアミノ酸位置番号は、配列番号２を有する成熟トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ配列に割り当てられるものを指す。しかしながら、本開示は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼの変異体に限定されるものではなく、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（配列番号２）中の特定の同定残基と「等価な」位置においてアミノ酸残基を含有するグルコアミラーゼまで及ぶ。本開示の一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）ＧＡであり、置換は、本明細書に記載のもののとおり、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）グルコアミラーゼ（例えば配列番号２３を参照のこと）中の等価アミノ酸残基位置においてなされる。他の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１および２２を含む。
【０２３１】
「構造的同一性」は、アミノ酸残基が等価かどうかを決定する。２つの構造（三次元およびアミノ酸構造）がアライメントされる場合、構造的同一性は、相関的なトポロジー的等価性である。グルコアミラーゼのある残基（アミノ酸）位置は、それが（化学的に結合し、反応し、相互作用する同一または類似の機能的能力を有する）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ中の特異的残基またはその残基の一部と相同（すなわち一次または三次構造のいずれかにおける位置において対応する）または相似である場合、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの残基と「等価である」。
【０２３２】
一次構造に対する同一性を確立するため、グルコアミラーゼのアミノ酸配列は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ一次配列と、特に、配列が既知グルコアミラーゼ中で不変であることが既知の残基のセットと直接比較することができる。例えば、本明細書における図１０Ａおよび１０Ｂは、グルコアミラーゼ間の保存残基を示す。図１０Ｄおよび１０Ｅは、種々のグルコアミラーゼからのデンプン結合ドメインのアライメントを示す。保存残基をアライメントし、アライメントを維持するために必要な挿入および欠失を考慮に入れた（すなわち、任意の欠失および挿入を通して保存残基の排除を回避した）後、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの一次配列中の特定のアミノ酸と等価な残基が定義される。保存残基のアライメントは、典型的には、そのような残基の１００％を保存するはずである。しかしながら、保存残基の約７５％超または約５０％ほどのアライメントも、等価残基を定義するために適切である。さらに、構造的同一性を配列同一性との組合せで使用して等価残基を同定することができる。
【０２３３】
例えば、図１０Ａおよび１０Ｂにおいて、６種の生物からのグルコアミラーゼの触媒ドメインをアラインメントしてアミノ酸配列間の相同性の最大値を提供する。これらの配列の比較は、アスタリスクにより示されるとおり、それぞれの配列中に含有される多くの保存残基が存在することを示す。したがって、これらの保存残基を使用して他のグルコアミラーゼ、例えばクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）からのグルコアミラーゼ中の、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの対応する等価アミノ酸残基を定義することができる。同様に、図１０Ｄおよび１０Ｅは、等価残基を同定するためにアライメントされた７種の生物からのグルコアミラーゼのデンプン結合ドメインを示す。
【０２３４】
構造的同一性は、２つの構造間の等価残基の同定を含む。「等価残基」は、三次構造がＸ線結晶解析により決定された酵素について、三次構造のレベルにおける相同性（構造的同一性）を決定することにより定義することができる。等価残基は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの特定のアミノ酸残基の主鎖原子の２つ以上の原子座標（Ｎ対Ｎ、ＣＡ対ＣＡ、Ｃ対ＣおよびＯ対Ｏ）が、アライメント後に０．１３ｎｍ、任意選択で０．１ｎｍ以内に存在するものとして定義される。一態様において、少なくとも４つの考えられる主鎖原子の２または３つが、アライメント後に０．１ｎｍ以内に存在する。アライメントは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼに対して当該グルコアミラーゼの非水素タンパク質原子の原子座標の最大重複を与えるように最良のモデルが配向および位置決めされた後に達成される。最良のモデルは、利用可能な最大分解能における実験回折データについて最小のＲファクターを与える結晶学的モデルである。
【数１】
2015526090.tif 000011
【０２３５】
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの特異的残基と機能的に相似する等価残基は、それらがトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの特異的残基に対して定義され、それに帰属される様式で、タンパク質構造、基質結合または触媒作用を変更、改変またはそれに寄与するように立体配座を採り得る酵素のアミノ酸として定義される。さらに、それらは、所与の残基の主鎖原子が相似位置の占有に基づく等価性の基準を満たさなくてもよいが、残基の側鎖原子の少なくとも２つの原子座標が、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの対応する側鎖原子から０．１３ｎｍに存在する程度まで相似位置を占有する（三次構造がＸ線結晶解析により得られた）酵素の残基である。トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの三次元構造の座標は、参照により本明細書に援用される国際公開第２００９／０６７２１８号パンフレット（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）９４〜２１６ページの表２０に記載されており、上記概説のとおり使用して三次構造のレベルでの等価残基を決定することができる。
【０２３６】
置換のために同定された残基の一部は保存残基である一方、他のものはそうではない。保存されていない残基の場合、１つ以上のアミノ酸の置換は、天然で見出されるものに対応しないアミノ酸配列を有する変異体を生産する置換に限定される。保存残基の場合、このような置換は、天然存在の配列をもたらさないはずである。
【０２３７】
グルコアミラーゼ変異体
本開示による変異体は、変異体の配列を親グルコアミラーゼと異なるものとする、親グルコアミラーゼのアミノ酸配列中の少なくとも１つの置換、欠失または挿入を含む。一部の実施形態において、本開示の変異体は、ＴｒＧＡ（配列番号２）、ＴｒＧＡ（配列番号２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する親グルコアミラーゼのグルコアミラーゼ活性の少なくとも約２０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％または約１００％のグルコアミラーゼ活性を有する。一部の実施形態において、本開示による変異体は、親ＴｒＧＡ（配列番号２）の少なくとも１つのアミノ酸位置における、またはＴｒＧＡ配列（配列番号２）に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％もしくは約９９％の配列同一性を有する別の親グルコアミラーゼの配列中の等価位置における置換、欠失または挿入を含む。
【０２３８】
他の実施形態において、本開示による変異体は、ＴｒＧＡ配列の触媒ドメイン（配列番号３）を含む親ＴｒＧＡの断片の少なくとも１つのアミノ酸位置における、または配列番号３、５、６、７、８もしくは９の触媒ドメイン含有断片に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％もしくは約９９％の配列同一性を有する親グルコアミラーゼの触媒ドメインを含む断片中の等価位置における置換、欠失または挿入を含む。一部の実施形態において、断片は、ＴｒＧＡ触媒ドメイン（配列番号３）の少なくとも約４００、約４２５、約４５０または約５００アミノ酸残基を含む。
【０２３９】
他の実施形態において、本開示による変異体は、ＴｒＧＡ配列のデンプン結合ドメイン（配列番号１１）を含む親ＴｒＧＡの断片の少なくとも１つのアミノ酸位置における、または配列番号１１、２４、２５、２６、２７、２８および／もしくは２９のデンプン結合ドメイン含有断片に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％もしくは約９９％の配列同一性を有する親グルコアミラーゼのデンプン結合ドメインを含む断片中の等価位置における置換、欠失または挿入を含む。一部の実施形態において、断片は、ＴｒＧＡデンプン結合ドメイン（配列番号１１）の少なくとも約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００または約１０９アミノ酸残基を含む。
【０２４０】
一部の実施形態において、親グルコアミラーゼが触媒ドメイン、リンカー領域およびデンプン結合ドメインを含む場合、変異体は、リンカー領域の一部を含む断片の少なくとも１つのアミノ酸位置における置換、欠失または挿入を含む。一部の実施形態において、変異体は、ＴｒＧＡ配列（配列番号２）の断片のアミノ酸配列における置換、欠失または挿入を含む。
【０２４１】
アミノ酸置換に関する構造的同一性は、相同グルコアミラーゼまたは親グルコアミラーゼ中の等価アミノ酸位置において置換が生じることを意味する。等価位置という用語は、ＴｒＧＡ参照グルコアミラーゼアミノ酸配列および三次元配列との、当該親グルコアミラーゼのアミノ酸配列のアライメントおよび当該親グルコアミラーゼの三次元構造のアライメントに基づく２つの親配列に共通する位置を意味する。例えば、図１０Ａに関して、ＴｒＧＡ（配列番号２または３）中の２４位はＤ２４であり、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（配列番号６）についての等価位置はＤ２５位であり、アスペルギルス・オリゼア（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚｅａ）（配列番号７）についての等価位置はＤ２６位である。三次元配列の例示的なアライメントについては、図６Ａおよび７参照のこと。
【０２４２】
したがって、一態様において、結晶形態である場合、主鎖原子の原子座標が等価主鎖原子のアライメントに従ってＴｒＧＡの等価主鎖原子の原子座標（国際公開第２００９／０６７２１８号パンフレットにおける表２０に定義）から０．１３ｎｍ未満の平均二乗偏差を有し、リンカー領域、デンプン結合ドメインおよび触媒ドメインを有する結晶構造を有するグルコアミラーゼ変異体であって、デンプン結合ドメインの相互連結ループ２’ならびに／または触媒ドメインのループ１および／もしくはヘリックス２および／もしくはループ１１および／もしくはヘリックス１２における親グルコアミラーゼのアミノ酸配列に対する２つ以上のアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼ変異体が記載される。さらなる態様において、ＴｒＧＡの等価主鎖原子の原子座標（国際公開第２００９／０６７２１８号パンフレットにおける表２０に定義）からの平均二乗偏差は、０．１２ｎｍ未満、例えば０．１１未満または例えば０．１０未満である。
【０２４３】
さらなる態様において、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、１１、１３、２４、２５、２６、２７、２８または２９のデンプン結合ドメインと少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを有する。さらなる態様において、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、３、５、６、７、８、９または１３の触媒ドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性を有する触媒ドメインを有する。
【０２４４】
さらなる態様において、親グルコアミラーゼは、真菌グルコアミラーゼである。
【０２４５】
さらなる態様において、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、フミコラ属種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｓｐｐ．）、アオカビ属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、タラロミセセ属種（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｅ  ｓｐｐ．）またはシゾサッカルミセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）から得られるグルコアミラーゼから選択される。
【０２４６】
さらなる態様において、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）またはアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）から得られる。
【０２４７】
さらなる態様において、グルコアミラーゼは精製されている。本開示のグルコアミラーゼは、当技術分野において公知の種々の手順、例として遠心分離、ろ過、抽出、沈殿などにより培養培地から回収または精製することができる。
【０２４８】
一部の実施形態において、グルコアミラーゼ変異体は、親のアミノ酸配列中の少なくとも２つの置換を含む。一部の実施形態において、グルコアミラーゼ変異体は、親、例えば配列番号２または１３のアミノ酸配列中の少なくとも２、３または４つの置換を含む。一部の実施形態において、グルコアミラーゼ変異体は、親、例えば配列番号２または１３のアミノ酸配列中の多くとも２、３または４つの置換を含む。さらなる実施形態において、変異体は、３つ以上の置換を有し得る。例えば、変異体は、対応する親グルコアミラーゼと比較して２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５のアミノ酸の置換、欠失または挿入を有し得る。
【０２４９】
一部の実施形態において、グルコアミラーゼ変異体は、図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｄおよび１０Ｅに説明されるとおり、非保存アミノ酸の領域に対応する位置における少なくとも１つのアミノ酸位置（例えば図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｄおよび１０Ｅにおいて「＊」により示されない位置に対応するアミノ酸位置）における置換、欠失または挿入、典型的には置換を含む。
【０２５０】
一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号２または配列番号１３と少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の配列同一性を有する。他の実施形態において、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体である。一部の実施形態において、変異体は、変更された特性を有する。一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号２または配列番号１３のグルコアミラーゼと構造的同一性を有する。
【０２５１】
一部の実施形態において、グルコアミラーゼ変異体は、規定の位置においてのみ親グルコアミラーゼと異なっていてよい。
【０２５２】
親グルコアミラーゼは、配列番号１、２、１１、１３、２４、２５、２６、２７、２８または２９と少なくとも９５％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含み得る。親グルコアミラーゼは、配列番号１または２と少なくとも８０％の配列同一性を有し得；例えばそれは配列番号１または２を含み得る。任意選択で、親グルコアミラーゼは、配列番号１、２または１３からなっていてよい。
【０２５３】
本開示のグルコアミラーゼ変異体は、例えばあるグルコアミラーゼからのデンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）ならびに別のグルコアミラーゼからの触媒ドメインおよびリンカーを有するキメラまたはハイブリッドグルコアミラーゼも含み得る。例えば、ハイブリッドグルコアミラーゼは、ＡｎＧＡ（配列番号６）からのＳＢＤをＴｒＧＡ（配列番号２）からのＳＢＤとスワップすることにより作製し、ＡｎＧＡのＳＢＤならびにＴｒＧＡの触媒ドメインおよびリンカーを有するハイブリッドを作製することができる。あるいは、ＡｎＧＡからのＳＢＤおよびリンカーをＴｒＧＡのＳＢＤおよびリンカーに代えてスワップすることができる。
【０２５４】
一部の態様において、変異体グルコアミラーゼは、親グルコアミラーゼと比較して変更された熱安定性を示す。一部の態様において、変更された熱安定性は、親グルコアミラーゼと比較して減少した熱安定性であり得る。一部の実施形態において、変更された特性は、親グルコアミラーゼと比較して変更された比活性である。一部の実施形態において、比活性は、親グルコアミラーゼと比較して類似のまたは増加したものであり得る。一部の実施形態において、変更された特性は、親グルコアミラーゼと比較して低い温度において減少した熱安定性である。一部の実施形態において、変更された特性は、親グルコアミラーゼと比較して類似のまたは増加した比活性および減少した熱安定性の両方である。
【０２５５】
多数の親グルコアミラーゼをＴｒＧＡのアミノ酸配列とアライメントした。図１０Ａおよび１０Ｂは、以下の親グルコアミラーゼ、アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）（ＡａＧＡ）（配列番号５）；クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（ＡｎＧＡ）（配列番号６）；アスペルギルス・オルジアエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｚｙａｅ）（ＡｏＧＡ）（配列番号７）；フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）（ＨｇＧＡ）（配列番号８）；およびヒポクレア・ビノサ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｖｉｎｏｓａ）（ＨｖＧＡ）（配列番号９）の触媒ドメインを含む。触媒ドメインの同一性％を以下の表Ａに表す。
【０２５６】
【表９】
2015526090.tif 000012
【０２５７】
一部の実施形態において、例えば変異体グルコアミラーゼは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）グルコアミラーゼ、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）グルコアミラーゼまたはヒポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）グルコアミラーゼである親グルコアミラーゼに由来する。
【０２５８】
一態様において、本明細書において企図される変異体は、宿主細胞中での組換え発現により得られる。
【０２５９】
一態様において、本明細書に記載の変異体は、少なくとも０．０５ＧＡＵ／ｍｇ、０．１ＧＡＵ／ｍｇ、０．２ＧＡＵ／ｍｇ、０．３ＧＡＵ／ｍｇ、０．４ＧＡＵ／ｍｇ、０．５ＧＡＵ／ｍｇ、０．６ＧＡＵ／ｍｇ、０．７ＧＡＵ／ｍｇ、０．８ＧＡＵ／ｍｇ、０．９ＧＡＵ／ｍｇ、１ＧＡＵ／ｍｇ、２ＧＡＵ／ｍｇ、３ＧＡＵ／ｍｇ、５ＧＡＵ／ｍｇまたは１０ＧＡＵ／ｍｇのグルコアミラーゼ活性（ＧＡＵ）を有する。
【０２６０】
別の態様において、本明細書に記載の変異体は、０．０５〜１０ＧＡＵ／ｍｇ、例えば０．１〜５ＧＡＵ／ｍｇ、例えば０．５〜４ＧＡＵ／ｍｇ、例えば０．７〜４ＧＡＵ／ｍｇ、例えば２〜４ＧＡＵ／ｍｇのグルコアミラーゼ活性（ＧＡＵ）を有する。
【０２６１】
いっそうさらなる態様において、本明細書に記載のグルコアミラーゼ変異体は、配列番号１４、１５または１６の変異体を含み、またはそれからなる。
【０２６２】
変異体グルコアミラーゼの特徴付け
本開示はまた、親グルコアミラーゼ、特にＴｒＧＡと比較して少なくとも１つの変更された特性（例えば改善された特性）を有するグルコアミラーゼ変異体を提供する。一部の実施形態において、少なくとも１つの変更された特性（例えば改善された特性）は、ＧＡＵ活性、真正発酵度、発現レベル、熱安定性および比活性からなる群から選択される。典型的には、変更された特性は、低減した熱安定性、向上した真正発酵度および／または増加した比活性である。低減した熱安定性は、典型的には、より高い温度におけるものである。
【０２６３】
本開示のグルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼと比較して低い基質濃度におけるより高い速度のデンプン加水分解も提供し得る。変異体は、同一条件下で試験された場合、親グルコアミラーゼよりも高いＶｍａｘまたは低いＫｍを有し得る。例えば、変異体グルコアミラーゼは、約２５℃〜約４０℃（例えば約２５℃〜約３５℃；約３０℃〜約３５℃）の温度範囲におけるより高いＶｍａｘを有し得る。ミカエリス−メンテン定数、ＫｍおよびＶｍａｘ値は、標準的な公知の手順を使用して容易に決定することができる。別の態様において、グルコアミラーゼは、親グルコアミラーゼ、例えばＴｒＧＡまたはＴ
ｒＧＡ  ＣＳ４と比較して５％以下、１０％以下または１５％以下低減したデンプン加水分解活性の低減も示し得る。
【０２６４】
変更された熱安定性を有する変異体グルコアミラーゼ
一部の態様において、本開示は、親（野生型）と比較して変更された熱安定性を有する変異体グルコアミラーゼに関する。変更された熱安定性は、増加した温度または減少した温度におけるものであり得る。熱安定性は、ＮａＡｃ緩衝液ｐＨ４．５またはレギュラーピルスナービール中７２℃における最大１００秒間のインキュベーション後の残留活性％として計測され、ＴｒＧＡはこれらの条件におけるインキュベーション前の初期活性と比較して２４％の残留活性を有する。これらの条件下でのＴｒＧＡの残留活性は、インキュベーション前の初期活性と比較して約１５％の残留活性を残す、ＮａＡｃ緩衝液ｐＨ４．５中６４℃における１時間の酵素のインキュベーションと同等である。したがって、一部の実施形態において、減少した熱安定性（すなわちより熱不安定）を有する変異体は、インキュベーション前の初期活性と比較して親よりも少なくとも約５０％〜少なくとも約１００％低い残留活性（レギュラーピルスナービールｐＨ４．５中７２℃における１００秒間のインキュベーション後）、例として約５１％、約５２％  約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％および約１００％低い残留活性を有する。例えば、親の残留活性が２４％である場合、減少した熱安定性を有する変異体は、約２％〜約３％の残留活性を有し得る。一部の実施形態において、グルコアミラーゼ変異体は、例えば７２℃における少なくとも約５０秒間、約６０秒間、約７０秒間、約１００秒間または約１５０秒間の所与の期間にわたる変更温度への曝露後に、少なくとも約０％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％または約２０％の酵素活性を保持する減少した熱安定性を有する。一部の実施形態において、変異体は、約４０℃〜約８０℃の範囲の選択温度において、さらには約５０℃〜約７５℃の範囲において、および約６０℃〜約７０℃の範囲においてならびに約４．０〜約６．０のｐＨ範囲において、親グルコアミラーゼと比較して減少した熱安定性を有する。一部の実施形態において、熱安定性は、アッセイおよび方法に記載のとおり決定される。その方法は、他の温度における熱安定性を計測するために適切となるように適合させることができる。あるいは、熱安定性は、そこに記載のとおり６４℃において決定することができる。一部の実施形態において、変異体は、約２０℃〜約５０℃の範囲、例として約３５℃〜約４５℃および約３０℃〜約４０℃における選択温度において親グルコアミラーゼと比較して低い温度における減少した熱安定性を有する。
【０２６５】
一部の実施形態において、減少した熱安定性を有する変異体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列中の以下の位置における１つ以上の欠失、置換または挿入、特に置換を含む：配列番号２の残基２９、４３、４８、１１６および５０２または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号２の残基９７、９８、１４７、１７５、４８３および４８４または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換。一部の実施形態において、減少した熱安定性を有する変異体は、配列番号２または１３に記載のアミノ酸配列中の以下の位置における１つ以上の欠失、置換または挿入、特に置換を含む：配列番号２または１３の残基２９、４３、４８、１１６および５０２からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号２または１３の残基９７、９８、１４７、１７５、４８３および４８４からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換。一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体であり、さらなる実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号２または１３に対して少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９８％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号２に対して構造的同一性も有する。一部の実施形態において、減少した熱安定性を有する変異体は、配列番号２または１３の以下の置換：Ｆ２９Ｖ、Ｆ２９Ｑ、Ｉ４３Ｑ、Ｙ４８Ｖ、Ｆ１１６Ｍ、Ｈ５０２Ｓ、Ｈ５０２ＥまたはＨ５０２Ｗの１つまたは２つを有し、以下の置換：Ｓ９７Ｍ、Ｌ９８Ｅ  Ｙ１４７Ｒ、Ｆ１７５Ｖ、Ｆ１７５Ｌ、Ｆ１７５Ｉ、Ｇ４８３ＳまたはＴ４８４Ｗの１つ、２つまたは３つを有する。一部の実施形態において、減少した熱安定性を有する変異体は、配列番号２または１３の以下の置換：Ｆ２９Ｖ、Ｉ４３Ｑ、Ｙ４８Ｖ、Ｆ１１６Ｍ、Ｈ５０２ＳまたはＨ５０２Ｅの１つまたは２つを有し、以下の置換Ｓ９７Ｍ、Ｌ９８Ｅ  Ｙ１４７Ｒ、Ｆ１７５Ｖ、Ｆ１７５Ｌ、Ｆ１７５Ｉ、Ｇ４８３ＳまたはＴ４８４Ｗの１つ、２つまたは３つを有する。
【０２６６】
変更された比活性を有する変異体グルコアミラーゼ
本明細書において使用される比活性は、タンパク質１ｍｇ当たりのグルコアミラーゼの活性である。活性は、比色ｐＮＰ−β−マルトシド基質を使用するグルコアミラーゼアッセイを使用して決定した。スクリーニングは、親ＴｒＧＡのＰＩと比較して性能指数（ＰＩ）＞１．０または（ＰＩ）＝１．０を有する変異体を同定した。ＰＩは、野生型（ＷＴ）および変異体酵素の比活性（酵素１ｍｇ当たりの活性）から算出される。それは、指数「変異体比活性／ＷＴ比活性」であり、変異体の比活性の増加尺度であり得る。約２のＰＩは、ＷＴよりも約２倍良好であるはずである。一部の態様において、本開示は、親または野生型グルコアミラーゼと比較して変更された比活性を有する変異体グルコアミラーゼに関する。一部の実施形態において、変更された比活性は、増加した比活性である。増加した比活性は、１を超える、例として約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９および約２以上の増加した性能指数として定義することができる。一部の実施形態において、増加した比活性は、約１．０〜約５．０、例として約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８および約４．９である。一部の実施形態において、変異体は、親グルコアミラーゼよりも少なくとも約１．０倍高い、例として少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２．０倍、約２．２倍、約２．５倍、約２．７倍、約２．９倍、約３．０倍、約４．０倍および約５．０倍高い比活性を有する。一部の実施形態において、比活性は、親と類似または同等である。したがって、類似の比活性は、親の１．０よりも０．１大きい、それと同等またはそれよりも０．１小さい性能指数、例として１．０よりも約０．０２大きく、または小さい、例として１．０よりも約０．０４大きく、または小さい、例として１．０よりも約０．０６大きく、または小さい、例として１．０よりも約０．０８大きく、または小さい、および例として１．０よりも約０．１大きく、または小さい性能指数として定義することができる。
【０２６７】
一部の実施形態において、比活性の改善を有する変異体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列中の以下の位置における１つ以上の欠失、置換または挿入、特に置換を含む：配列番号２の残基２９、４３、４８、１１６および５０２または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号２の残基９７、９８、１４７、１７５、４８３および４８４または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換。一部の実施形態において、比活性の改善を有する変異体は、配列番号２または１３に記載のアミノ酸配列中の以下の位置における１つ以上の欠失、置換または挿入、特に置換を含む：配列番号２または１３の残基２９、４３、４８、１１６および５０２からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号２または１３の残基９７、９８、１４７、１７５、４８３および４８４からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換。一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体であり、さらなる実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号２または１３に対して少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９８％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号２に対して構造的同一性も有する。一部の実施形態において、比活性の改善を有する変異体は、配列番号２または１３の以下の置換：Ｆ２９Ｖ、Ｆ２９Ｑ、Ｉ４３Ｑ、Ｙ４８Ｖ、Ｆ１１６Ｍ、Ｈ５０２Ｓ、Ｈ５０２ＥまたはＨ５０２Ｗの１つまたは２つを有し、以下の置換：Ｓ９７Ｍ、Ｌ９８Ｅ  Ｙ１４７Ｒ、Ｆ１７５Ｖ、Ｆ１７５Ｌ、Ｆ１７５Ｉ、Ｇ４８３ＳまたはＴ４８４Ｗの１つ、２つまたは３つを有する。
【０２６８】
一部の実施形態において、変異体と比較した親の比活性は、アッセイおよび方法に記載のとおり決定される。
【０２６９】
変更された糖化性能を有する変異体グルコアミラーゼ
本明細書において使用される、発酵容器（ＦＶ）中のデンプン糖化を容易にするグルコアミラーゼの性能は、真正発酵度により間接的に決定した。真正発酵度は、麦芽−副原料醸造実験において、ＧＡＵ活性または定義された条件セットのもとでのタンパク質のいずれかに基づき投入されるグルコアミラーゼ変異体を用いて決定した。真正発酵度（ＲＤＦ、割合の形態で表現される真正希薄度）は、最終発酵麦汁（ビール）について発酵前、その間およびその後の麦汁の比重として算出し、比重計またはＡｎｔｏｎ−Ｐａａｒ密度計（例えばＤＭＡ４１００Ｍ）を使用して計測した。真正希薄度は、Ｅｎｓｍｉｎｇｅｒにより列記された式に従ってＲＤＦとして割合の形態として算出および表現した（ｈｔｔｐ：／／ｈｂｄ．ｏｒｇ／ｅｎｓｍｉｎｇｒ／“Ｂｅｅｒ  ｄａｔａ：Ａｌｃｏｈｏｌ，Ｃａｌｏｒｉｅ，ａｎｄ  Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｂｅｅｒ”を参照のこと）。
【０２７０】
一部の態様において、本開示は、親または野生型グルコアミラーゼと比較して変更されたＲＤＦ性能を有する変異体グルコアミラーゼに関する。一部の実施形態において、変更されたＲＤＦ性能は、親と類似し、または等しい。ＴｒＧＡは、麦汁１ｍｌ当たり０．０５８ｍｇのＧＡで投入した場合、７５．０４％のＲＤＦ性能を有する。したがって、類似のＲＤＦ性能は、記載の条件セットおよび麦汁１ｍｌ当たり０．０５８ｍｇのＧＡの投入のもとで得られる、７５．０４％よりも０．５％大きく、それと等しく、またはそれよりも０．５％小さいＲＤＦ値、例として７５．０４％よりも約０．１％大きく、もしくは小さい、７５．０４％よりも約０．２％大きく、もしくは小さい、７５．０４％よりも約０．３％大きく、もしくは小さい、７５．０４％よりも約０．４％大きく、もしくは小さいまたは７５．０４％よりも約０．５％大きく、もしくは小さいＲＤＦ値と定義することができる。
【０２７１】
一部の実施形態において、親グルコアミラーゼ、例えばＴｒＧＡと比較して類似の真正発酵度を有する変異体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列中の以下の位置における１つ以上の欠失、置換または挿入、特に置換を含む：配列番号２の残基２９、４３、４８、１１６および５０２または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号２の残基９７、９８、１４７、１７５、４８３および４８４または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換。一部の実施形態において、改善されたＲＤＦ性能を有する本開示の変異体は、配列番号２または１３に記載のアミノ酸配列中の以下の位置における１つ以上の欠失、置換または挿入、特に置換を含む：配列番号２または１３の残基２９、４３、４８、１１６および５０２からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号２または１３の残基９７、９８、１４７、１７５、４８３および４８４からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換。一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体であり、さらなる実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号２または１３に対して少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９８％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号２に対して構造的同一性も有する。一部の実施形態において、改善されたＲＤＦ性能を有する本開示の変異体は、配列番号２または１３の以下の置換：Ｆ２９Ｖ、Ｆ２９Ｑ、Ｉ４３Ｑ、Ｙ４８Ｖ、Ｆ１１６Ｍ、Ｈ５０２Ｓ、Ｈ５０２ＥまたはＨ５０２Ｗの１つまたは２つを有し、以下の置換：Ｓ９７Ｍ、Ｌ９８Ｅ  Ｙ１４７Ｒ、Ｆ１７５Ｖ、Ｆ１７５Ｌ、Ｆ１７５Ｉ、Ｇ４８３ＳまたはＴ４８４Ｗの１つ、２つまたは３つを有する。
【０２７２】
一部の実施形態において、変異体と比較した親のＲＤＦ性能は、アッセイおよび方法に記載のとおり決定される。
【０２７３】
親グルコアミラーゼと比較して減少した熱安定性および類似の糖化性能を有する変異体グルコアミラーゼ
一部の態様において、本開示は、親（例えば野生型）と比較して変更された熱安定性および類似の糖化（ＲＤＦ）性能を有する変異体グルコアミラーゼに関する。一部の実施形態において、変更された熱安定性は、減少した熱安定性、例えばより熱不安定な変異体である。一部の実施形態において、ＲＤＦ性能は、親グルコアミラーゼと比較して類似のＲＤＦ性能である。
【０２７４】
一部の実施形態において、減少した熱安定性および類似のＲＤＦ性能を有する変異体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列中の以下の位置における１つ以上の欠失、置換または挿入、特に置換を含む：配列番号２の残基２９、４３、４８、１１６および５０２または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号２の残基９７、９８、１４７、１７５、４８３および４８４または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換。一部の実施形態において、減少した熱安定性および類似のＲＤＦ性能を有する変異体は、配列番号２または１３に記載のアミノ酸配列中の以下の位置における１つ以上の欠失、置換または挿入、特に置換を含む：配列番号２または１３の残基２９、４３、４８、１１６および５０２からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号２または１３の残基９７、９８、１４７、１７５、４８３および４８４からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換。一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体であり、さらなる実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号２または１３に対して少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９８％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、配列番号２に対して構造的な同一性も有する。一部の実施形態において、減少した熱安定性および類似のＲＤＦ性能を有する変異体は、配列番号２または１３の以下の置換：Ｆ２９Ｖ、Ｆ２９Ｑ、Ｉ４３Ｑ、Ｙ４８Ｖ、Ｆ１１６Ｍ、Ｈ５０２Ｓ、Ｈ５０２ＥまたはＨ５０２Ｗの１つまたは２つを有し、以下の置換：Ｓ９７Ｍ、Ｌ９８Ｅ  Ｙ１４７Ｒ、Ｆ１７５Ｖ、Ｆ１７５Ｌ、Ｆ１７５Ｉ、Ｇ４８３ＳまたはＴ４８４Ｗの１つ、２つまたは３つを有する。
【０２７５】
発酵性糖を生産する変異体グルコアミラーゼ
さらなる態様において、グルコアミラーゼは、親グルコアミラーゼ、例えばＴｒＧＡと比較して向上した発酵性糖の生産を示す。さらなる態様において、グルコアミラーゼは、親グルコアミラーゼ、例えばＴｒＧＡと比較して向上した醸造プロセスのマッシング工程における発酵性糖の生産を示す。さらなる態様において、グルコアミラーゼは、親グルコアミラーゼ、例えばＴｒＧＡと比較して向上した醸造プロセスの発酵工程における発酵性糖の生産を示す。さらなる態様において、発酵性糖は、グルコースである。当業者は、例えばＨＰＬＣ技術により発酵性糖の生産を測定することができる。
【０２７６】
４．グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチド
本開示はまた、変異体グルコアミラーゼをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の確立された技術により調製することができる。ポリヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成装置により合成により調製することができる。ＤＮＡ配列は、断片を一緒にライゲートすることにより調製された混合ゲノム（またはｃＤＮＡ）および合成起源のものであり得る。ポリヌクレオチドは、特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製することもできる。一般に、Ｍｉｎｓｈｕｌｌ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２（４）：４１６−４２７（２００４）が参照される。ＤＮＡは、多数の営利会社、例えばＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙにより合成することもできる。
【０２７７】
本開示はまた、（ｉ）配列番号４に対して少なくとも約５０％、例として少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％および約９９％の同一性を有し、または（ｉｉ）中から高ストリンジェンシーの条件下で、配列番号４に記載のヌクレオチド配列に由来するプローブにハイブリダイズし得、または（ｉｉｉ）配列番号４に記載の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。本開示による有用なプローブは、少なくとも約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００以上の配列番号４の連続ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、コードされる変異体は、配列番号２に対して構造的同一性も有する。
【０２７８】
本開示は、配列番号２または配列番号１３に対して少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９３％、約９５％、約９７％、約９８％または約９９％のアミノ酸配列同一性を含むアミノ酸配列を含む変異体グルコアミラーゼをコードする単離ポリヌクレオチドをさらに提供する。さらに、本開示は、上記に提供されるポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクターを提供する。本開示はまた、本明細書において提供される変異体グルコアミラーゼをコードするＤＮＡの断片（すなわち一部）を提供する。これらの断片は、糸状菌細胞（例えばトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）およびフミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ））からの本明細書に記載の成熟グルコアミラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドまたはグルコアミラーゼ活性を有するそのセグメントを単離または同定するために使用され得る部分長のＤＮＡ断片を得るのに使用される。一部の実施形態において、ＤＮＡの断片は、少なくとも約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００以上の連続ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、配列番号４において提供されるＤＮＡの部分を使用して他の種、例えばグルコアミラーゼをコードする糸状菌から親グルコアミラーゼ、特にトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体を得ることができる。
【０２７９】
５．グルコアミラーゼの生産
ＤＮＡ構築物およびベクター
本開示の一実施形態によれば、本開示により包含される変異体グルコアミラーゼをコードし、プロモーター配列に作動可能に結合している上記のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物をアセンブルして宿主細胞中に移行させる。一態様において、本明細書に開示のグルコアミラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【０２８０】
ＤＮＡ構築物は、ベクターを使用して宿主細胞中に導入することができる。一態様において、本明細書に開示のポリヌクレオチドを含み、または本明細書に開示のグルコアミラーゼ変異体を発現し得るベクターが提供される。ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、安定的に導入される任意のベクターであり得る。一部の実施形態において、ベクターは、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、複製される。ベクターとしては、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセットなどが挙げられる。一部の実施形態において、ベクターは、グルコアミラーゼコード配列に作動可能に結合している調節配列を含む発現ベクターである。
【０２８１】
好適な発現および／または組込みベクターの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）前掲およびＡｕｓｕｂｅｌ（１９８７）前掲およびｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ｉｎ  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ（Ｅｄｓ．）Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．３９６−４２８ならびに米国特許第５，８７４，２７６号明細書に提供されている。ベクターの列記については、Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ（ＦＧＳＣ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｇｓｃ．ｎｅｔ）も参照される。特に有用なベクターとしては、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＰｒｏｍｅｇａから入手されるベクターが挙げられる。
【０２８２】
細菌細胞における使用に好適なプラスミドとしては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での複製を可能とするｐＢＲ３２２およびｐＵＣ１９ならびに例えばバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）中での複製を可能とするｐＥ１９４が挙げられる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞における使用に好適な他の特異的ベクターとしては、ｐＦＢ６、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１００、ｐＤＯＮＲ（商標）２０１、１０ｐＤＯＮＲ（商標）２２１、ｐＥＮＴＲ（商標）、ｐＧＥＭ（登録商標）３ＺおよびｐＧＥＭ（登録商標）４Ｚのようなベクターが挙げられる。
【０２８３】
真菌細胞における使用に好適な特異的ベクターとしてはｐＲＡＸが挙げられ、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）において有用な汎用性発現ベクターである、ｇｌａＡプロモーターを有するｐＲＡＸ、ヒポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）／トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）においてはｃｂｈ１プロモーターを有するｐＴｒｅｘ３ｇが挙げられる。
【０２８４】
一部の実施形態において、細菌または真菌宿主細胞中で転写活性を示すプロモーターは、宿主細胞に対して同種または異種のいずれかであるタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る。プロモーターは、突然変異、トランケートおよび／またはハイブリッドプロモーターであり得る。上記プロモーターは、当技術分野において公知である。真菌細胞、特に糸状菌細胞、例えばトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞において有用な好適なプロモーターの例としては、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）プロモーターｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇ５、ｘｌｎ１およびｘｌｎ２のような例示的なプロモーターが挙げられる。有用なプロモーターの他の例としては、アワモリコウジカビ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）およびクロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）からのプロモーター（Ｎｕｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：２３０６−２３１５（１９８４）およびＢｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１５８１−１５８５（１９８４）を参照のこと）、ニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼプロモーター、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）プロモーター、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ遺伝子およびリゾムコル・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ遺伝子からのプロモーターが挙げられる。細菌細胞において有用な好適なプロモーターの例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン；バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＳ）；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、ベータ−ラクタマーゼ遺伝子から得られるものならびにｔａｃプロモーターが挙げられる。一部の実施形態において、プロモーターは、宿主細胞由来のものである。例えば、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）が宿主である場合、プロモーターは、天然Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）プロモーターである。他の実施形態において、プロモーターは、真菌宿主細胞に対して異種のものである。一部の実施形態において、プロモーターは、親グルコアミラーゼのプロモーター（例えばＴｒＧＡプロモーター）である。
【０２８５】
一部の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、シグナル配列、すなわちコードされるポリペプチドを細胞の分泌経路に指向するポリペプチドのアミノ末端に結合しているアミノ酸配列をコードする核酸を含む。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるグルコアミラーゼをコードするグルコアミラーゼコード配列のセグメントと翻訳リーディングフレーム中で天然に結合しているシグナルペプチドコード領域を天然で含み得、または核酸配列のコード配列の５’末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドを含み得る。一部の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、変異体グルコアミラーゼが得られた親グルコアミラーゼ遺伝子と天然に関連するシグナル配列を含む。一部の実施形態において、シグナル配列は、配列番号１において示される配列またはそれに対して少なくとも約９０％、約９４もしくは約９８％の配列同一性を有する配列である。有効なシグナル配列としては、他の糸状菌酵素、例えばトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ、セロビオヒドロラーゼＩ、セロビオヒドロラーゼＩＩ、エンドグルカナーゼＩ、エンドグルカナーゼＩＩ、エンドグルカナーゼＩＩまたは分泌プロテイナーゼ、例えばアスパラギン酸プロテイナーゼ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（Ｈ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セロビオヒドロラーゼもしくはエンドグルカナーゼまたはＨ．グリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａ）グルコアミラーゼ）またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼおよびニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ）からのものから得られるシグナル配列を挙げることができる。
【０２８６】
追加の実施形態において、宿主細胞中に導入すべきシグナル配列およびプロモーター配列を含むＤＮＡ構築物またはベクターは、同一供給源に由来する。一部の実施形態において、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体の天然グルコアミラーゼシグナル配列、例えばヒポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）株からのシグナル配列を使用することができる。
【０２８７】
一部の実施形態において、発現ベクターは終結配列も含む。宿主細胞中で機能的な任意の終結配列を、本開示において使用することができる。一部の実施形態において、終結配列およびプロモーター配列は、同一供給源に由来する。別の実施形態において、終結配列は、宿主細胞に対して同種である。有用な終止配列としては、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｌ１；クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）もしくはアワモリコウジカビ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（Ｎｕｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）前掲およびＢｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）前掲）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼまたはＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣ（Ｐｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ５６：１１７−１２４（１９８７））の遺伝子から得られる終止配列が挙げられる。
【０２８８】
一部の実施形態において、発現ベクターは、選択可能マーカーを含む。選択可能マーカーの例としては、抗菌耐性を付与するもの（例えばハイグロマイシンおよびフレオマイシン）が挙げられる。栄養選択マーカー、例として当技術分野において公知のマーカー、例えばａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）およびｐｙｒＧ（オロチジン−５’リン酸デカルボキシラーゼ）も本開示において使用される。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の形質転換のためのベクター系において有用なマーカーが、当技術分野において公知である（例えばＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ６  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ，Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｄｓ．Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｋｉｎｇｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ，Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｂｅｒｇｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｅａｕ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３５９−３６５（１９９１）；およびｖａｎ  Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０６：７１−７５（１９８７）を参照のこと）。一部の実施形態において、選択マーカーは、酵素アセトアミダーゼをコードし、形質転換細胞が窒素源としてのアセトアミド上で生育することを可能とするａｍｄＳ遺伝子である。選択マーカーとしてのＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ遺伝子の使用は、Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：４７５−４７９（１９８５）およびＰｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６１：１５５−１６４（１９８７）に記載されている。
【０２８９】
変異体グルコアミラーゼ、プロモーター、終結および他の配列をコードする核酸配列を含むＤＮＡ構築物をライゲートし、好適なベクター中にそれらを挿入するために使用される方法は、当技術分野において周知である。結合は、一般に簡便な制限部位におけるライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドリンカーが慣用の実施に従って使用される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）前掲およびＢｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ，Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９１）ｐｐ７０−７６を参照のこと）。さらに、ベクターは、公知の組換え技術（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｔｅｗａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して構築することができる。
【０２９０】
宿主細胞および宿主細胞の形質転換
本開示はまた、本開示の変異体グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。一部の実施形態において、宿主細胞は、細菌、真菌、植物および酵母細胞から選択される。宿主細胞という用語は、本開示による変異体グルコアミラーゼを生産するために使用される細胞、その細胞の子孫およびその細胞から作出されるプロトプラストの両方を含む。一態様において、ベクターを含み、好ましくはベクターにより形質転換されている宿主細胞が開示される。さらなる態様において、グルコアミラーゼ変異体を発現し得る細胞が提供される。さらなる態様において、宿主細胞は、プロテアーゼ欠損および／またはキシラナーゼ欠損および／またはグルカナーゼ欠損宿主細胞である。プロテアーゼ欠損および／またはキシラナーゼ欠損および／または天然グルカナーゼ欠損宿主細胞は、上記酵素をコードする遺伝子を欠失またはサイレンシングさせることにより得ることができる。結果として、ＧＡ変異体を含有する宿主細胞は、上記酵素を発現しない。
【０２９１】
一部の実施形態において、宿主細胞は真菌細胞であり、所望により糸状菌宿主細胞である。用語「糸状菌」は、ユーミコティナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門の全ての糸状性形態を指す（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９６２），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。これらの真菌は、キチン、セルロースおよび他の複合多糖から構成される細胞壁を有する栄養菌糸により特徴付けられる。本開示の糸状菌は、酵母とは形態学的に、生理学的におよび遺伝学的に区別される。糸状菌による栄養生育は、菌糸伸長によるものであり、炭素異化は絶対好気性である。本開示において、糸状菌親細胞は、限定されるものではないが、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例えばトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、以前にＴ．ロンギブラキアタム（Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）として分類されたヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）の無性的なモルフ、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ））（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６−５３（１９８４）；ＡＴＣＣ番号５６７６５およびＡＴＣＣ番号２６９２１）、ペニシリウルン属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｒｎ  ｓｐ．）、フミコラ属種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｓｐ．）（例えばＨ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、Ｈ．ラヌギノサ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）およびＨ．グリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａ））、クリソスポリウム属種（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）（例えばＣ．ルックノウエンス（Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ））、グリオクラジウム属種（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）（例えばニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、ショウユコウジカビ（Ａ  ｓｏｊａｅ）、Ａ．ジャポニクス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびアワモリコウジカビ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ））（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８−７４３（１９９３）およびＧｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．４１：８９−９８（２００２））、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）（例えばＦ．ロゼウム（Ｆ．ｒｏｓｅｕｍ）、Ｆ．グラミナム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｕｍ）、Ｆ．セレアリス（Ｆ．ｃｅｒｅａｌｉｓ）、Ｆ．オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）およびＦ．ベネナタム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ））、ニューロスポラ属種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）（アカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ））、ヒポクレア属種（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｓｐ．）、ケカビ属種（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．）（Ｍ．ミーヘイ（Ｍ．ｍｉｅｈｅｉ））、クモノスカビ属種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．）ならびにエメリセラ属種（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｓ���．）（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：２１−２６（１９８５）も参照のこと）の種の細胞であり得る。用語「トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）」または「トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）」または「トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）」は、以前にまたは現在トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）として分類されている任意の真菌属を指す。
【０２９２】
一部の実施形態において、宿主細胞はグラム陽性細菌細胞である。非限定的な例としては、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）（例えばＳ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｓ．コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）およびＳ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ））ならびにバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の株が挙げられる。本明細書において使用される「バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」としては、当業者に公知の「バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」内の全ての種、例として、限定されるものではないが、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィラス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウタス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）およびＢ．チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が挙げられる。バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）が分類学的な再編成を受け続けることが認識される。したがって、この属としては、再分類された種、例として、限定されるものではないが、目下「ゲオバシラス・テアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と命名されているＢ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のような生物が挙げられることが意図される。
【０２９３】
一部の実施形態において、宿主細胞はグラム陰性細菌株、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはシュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）である。他の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、例えばサッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、シゾサッカロミセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）またはカンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）であり得る。他の実施形態において、宿主細胞は、天然遺伝子が例えば細菌または真菌細胞における欠失により不活化された遺伝子操作宿主細胞である。１つ以上の不活化遺伝子を有する真菌宿主細胞を得ることが望ましい場合、公知の方法を使用することができる（例えば米国特許第５，２４６，８５３号明細書、米国特許第５，４７５，１０１号明細書および国際公開第９２／０６２０９号パンフレットに開示の方法）。遺伝子不活化は、完全もしくは部分欠失により、挿入不活化により、または遺伝子をその意図される目的のために非機能性とする任意の他の手段により達成することができる（遺伝子の機能タンパク質の発現が妨害されるように）。一部の実施形態において、宿主細胞がトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞、特にＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞である場合、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１およびｅｇｌ２遺伝子が不活化および／または欠失される。四重欠失タンパク質を有する例示的なトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞は、米国特許第５，８４７，２７６号明細書および国際公開第０５／００１０３６号パンフレットに記載および説明されている。他の実施形態において、宿主細胞は、プロテアーゼ欠損株またはプロテアーゼマイナス株である。
【０２９４】
宿主細胞の中へのＤＮＡ構築物またはベクターの導入としては、形質転換；エレクトロポレーション；核マイクロインジェクション；形質導入；形質移入（例えばリポフェクション媒介性およびＤＥＡＥ−デキストリン媒介性形質移入）；リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物を用いるインキュベーション；ＤＮＡコートマイクロプロジェクティルを用いる高速ボンバードメント（ｈｉｇｈ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ−ｃｏａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ）；およびプロトプラスト融合のような技術が挙げられる。一般的な形質転換技術は、当技術分野において公知である（例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）前掲、ｃｈａｐｔｅｒ  ９；およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）前掲およびＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６（１９８９）を参照のこと）。
【０２９５】
バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）についての形質転換法は、多数の参考文献、例としてＡｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ  Ｃ．ａｎｄ  Ｊ．Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：７４１−７４６（１９６１）および国際公開第０２／１４４９０号パンフレットに開示されている。
【０２９６】
アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）についての形質転換法は、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４（１９８４）；Ｂｅｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）ｉｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ）；Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．９：９９１−１００１（２０００）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６（１９８９）および欧州特許第２３８０２３号明細書に記載されている。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）中での異種タンパク質の発現は、米国特許第６，０２２，７２５号明細書；米国特許第６，２６８，３２８号明細書；Ｈａｒｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：２２７−２３３（１９９１）；Ｈａｒｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．７：５９６−６０３（１９８９）；欧州特許第２４４，２３４号明細書；欧州特許第２１５，５９４号明細書；およびＮｅｖａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ”，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｌｅｏｎｇ  ａｎｄ  Ｂｅｒｋａ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９２）ｐｐ．１２９−１４８）に記載されている。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株の形質転換については国際公開第９６／００７８７号パンフレットおよびＢａｊａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８２０２−８２１２（１９９１）も参照される。
【０２９７】
１つの具体的な実施形態において、形質転換のためのトリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）の調製は、真菌菌糸からのプロトプラストの調製を含む（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６（１９８９）；Ｐｅｎｔｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６１：１５５−１６４（１９８７）を参照のこと）。糸状菌の根頭癌腫病菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介性の形質転換が公知である（ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：８３９−８４２（１９９８）を参照のこと）。糸状菌宿主を用いて使用される形質転換手順については、米国特許第６，０２２，７２５号明細書および米国特許第６，２６８，３２８号明細書も参照される。
【０２９８】
一部の実施形態において、遺伝的に安定した形質転換体は、ベクター系を用いて構築され、それにより変異体グルコアミラーゼをコードする核酸は、宿主株染色体中に安定的に組み込まれる。次いで、形質転換体は、公知技術により精製される。
【０２９９】
一部のさらなる実施形態において、宿主細胞は、植物細胞、例えば単子葉植物（例えばコーン（トウモロコシ）、コムギおよびソルガム）からの細胞または双子葉植物（例えばダイズ）からの細胞である。植物の形質転換において有用なＤＮＡ構築物を作製する方法および植物形質転換の方法は、公知である。これらの方法の一部としては、根頭癌腫病菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介性の遺伝子移行；マイクロプロジェクティルボンバードメント、プロトプラストのＰＥＧ媒介性形質転換、エレクトロポレーションなどが挙げられる。米国特許第６，８０３，４９９号明細書、米国特許第６，７７７，５８９号明細書；Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．８：８３３−８３９（１９９０）；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１６９−１７７（１９８５）が参照される。
【０３００】
グルコアミラーゼの生産
本開示はさらに、変異体グルコアミラーゼを生産する方法であって、本開示による変異体グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより宿主細胞を形質転換すること、変異体グルコアミラーゼの発現および生産に好適な条件下で宿主細胞を培養することならびに任意選択で変異体グルコアミラーゼを回収することを含む方法に関する。一態様において、本開示による変異体グルコアミラーゼを発現させる方法であって、本明細書に開示の宿主細胞または細胞を得ること、細胞または宿主細胞からグルコアミラーゼ変異体を発現させることおよび任意選択でグルコアミラーゼ変異体を精製することを含む方法が提供される。一態様において、グルコアミラーゼ変異体を精製する。
【０３０１】
本開示の発現および生産の方法において、宿主細胞は、生理学的塩および栄養素を含有する好適な培地を有する実験または工業用発酵槽中で、振とうフラスコ培養、スモールスケールまたはラージスケール発酵（連続、回分および流加発酵を含む）において好適な条件下で培養する（例えばＰｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ａｕｂｅｒｔ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．７１−８６，１９８８およびＩｌｍｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８−１３０６（１９９７）を参照のこと）。一般的な商業的に調製された培地（例えば酵母麦芽エキス（ＹＭ）ブロス、ルリアベルターニ（ＬＢ）ブロスおよびサブローデキストロース（ＳＤ）ブロス）を、本開示において使用する。細菌および糸状菌細胞についての培養条件は、当技術分野において公知であり、科学文献においておよび／または真菌の供給源、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎおよびＦｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒから見出すことができる。グルコアミラーゼコード配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合、誘導剤（例えば糖、金属塩または抗菌薬）を、グルコアミラーゼ発現を誘導するために有効な濃度において培地に添加する。
【０３０２】
一部の実施形態において、本開示は、植物宿主中で変異体グルコアミラーゼを生産する方法であって、本開示によるグルコアミラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより植物細胞を形質転換することならびに変異体の発現および生産に好適な条件下で植物細胞を生育させることを含む方法に関する。
【０３０３】
一部の実施形態において、本開示により包含される変異体グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドにより形質転換された細胞系による変異体グルコアミラーゼの発現を評価するためにアッセイを実施する。アッセイは、タンパク質レベルにおいて、ＲＮＡレベルにおいて、ならびに／またはグルコアミラーゼ活性および／もしくは生産に固有の機能バイオアッセイの使用により実施することができる。これらのアッセイの一部としては、ノザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、適切に標識されたプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション（核酸コード配列に基づく）および慣用のサザンブロッティングならびにオートラジオグラフィーが挙げられる。
【０３０４】
さらに、変異体グルコアミラーゼの生産および／または発現は、例えば培養培地中の還元糖、例えばグルコースを直接計測するアッセイにより、ならびにグルコアミラーゼ活性、発現および／または生産を測定するためのアッセイにより、試料中で直接計測することができる。特に、グルコアミラーゼ活性は、３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法によりアッセイすることができる（Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：４９−５４（１９９４）を参照のこと）。追加の実施形態において、タンパク質発現は、免疫学的方法、例えば細胞、組織切片の免疫組織化学染色または組織培養培地のイムノアッセイ（例えばウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによる）により評価する。このようなイムノアッセイを使用してグルコアミラーゼの発現を定性および定量的に評価することができる。このような方法の詳細は当業者に公知であり、そのような方法を実施するための多くの試薬が市販されている。
【０３０５】
本開示のグルコアミラーゼは、当技術分野において公知の種々の手順、例として遠心分離、ろ過、抽出、沈殿などにより培養培地から回収または精製することができる。
【０３０６】
一部の実施形態において、グルコアミラーゼ変異体は、２つ以上のアミノ酸置換を有する。例えば、変異体は、親グルコアミラーゼと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５のアミノ酸置換、欠失または挿入を有し得る。一部の実施形態において、グルコアミラーゼ変異体は、非保存アミノ酸の領域に対応する位置における少なくとも１つのアミノ酸位置における置換、欠失または挿入を含む。本明細書において企図されるグルコアミラーゼ変異体は、成熟タンパク質配列中の任意の位置における置換、欠失または挿入を有し得る。
【０３０７】
本明細書において企図される、グルコアミラーゼまたはグルコアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列は、典型的には、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルをコードする制御配列および任意選択で抑制遺伝子または種々のアクチベーター遺伝子を含む発現ベクターを使用して酵素形態で発現させることができる。本明細書において企図されるグルコアミラーゼをコードするＤＮＡ配列を担持する組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に簡便に供することができる任意のベクターであり得る。ベクターは、親グルコアミラーゼ中に導入される場合、ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであり得る。例えば、真菌細胞は、グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ構築物により形質転換することができ、ＤＮＡ構築物は１つ以上のコピーで宿主染色体中で組み込まれる。この組込みは、ＤＮＡ配列が安定的に維持される可能性がより高いため、一般に有利であるとみなされる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体中への組込みは、慣用の方法に従って、例えば相同または非相同組換えにより実施することができる。
【０３０８】
ベクターの使用を取り込む一実施形態において、ＤＮＡ配列は、好適なプロモーター配列に作動可能に連結すべきである。プロモーターは、親グルコアミラーゼ中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり得、親グルコアミラーゼに対して同種または異種のいずれかであるタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る。グルコアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列の転写を指向する好適なプロモーターの例は、非限定的な例にすぎないが、ニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、リゾムコル・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酸安定α−アミラーゼ、クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、リゾムコル・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、ニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼまたはＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＡをコードする遺伝子に由来するものである。企図される任意の発現ベクターは、グルコアミラーゼまたは変異体をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結している好適な転写ターミネーターおよびポリアデニル化配列も含み得る。終結およびポリアデニル化配列は、好適にはプロモーターと同一の供給源に由来し得る。ベクターは、真菌宿主中でのベクターの複製を可能とし、またはもたらす任意のＤＮＡ配列をさらに含み得る。ベクターは、産物が真菌宿主中の欠損を補完し得る追加の遺伝子も含み得る。例えば、選択可能マーカーを取り込んで薬物耐性を提供することができる。本明細書において企図される、グルコアミラーゼ、プロモーター、ターミネーターおよび他のエレメントをそれぞれコードするＤＮＡ構築物をライゲートするため、ならびに複製に必要な情報を含有する好適なベクター中にそれらを挿入するために使用される全ての手順は、当業者により理解され得るものである。
【０３０９】
一態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドの異種発現を有する宿主細胞、例えば真菌細胞、例えばトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、例えばトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）に関する。別の態様において、真菌細胞は、ヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）種のものである。
【０３１０】
一態様において、宿主細胞は、プラスミドまたは発現ベクターを含み、または好ましくは、それにより形質転換されており、したがって本明細書において企図されるポリペプチドを発現し得る。一態様において、発現ベクターは核酸を含み、本明細書において企図される発現ベクターまたはプラスミドは、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に由来するプロモーター、例えばＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩ由来プロモーターならびに／またはトリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に由来するターミネーター、例えばＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩ由来ターミネーターならびに／または１つ以上の選択マーカー、例えばアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳおよびｐｙｒＧならびに／または宿主細胞中での非染色体プラスミド維持を可能とする１つ以上のテロメア領域を含み得る。
【０３１１】
６．組成物および使用
本明細書において企図されるグルコアミラーゼは、組成物、例として、限定されるものではないが、例えばデンプン加水分解組成物およびデンプン糖化組成物、清浄組成物および界面活性剤組成物（例えば洗濯用界面活性剤、食器洗浄用界面活性剤および硬表面清浄組成物）、アルコール発酵組成物において、ならびに動物飼料組成物において使用することができる。さらに、これらのグルコアミラーゼは、ベーキング用途、例えばパンおよびケーキ製造、醸造、ヘルスケア、織物、環境廃棄物変換プロセス、バイオパルプ加工ならびにバイオマス変換用途において使用することができる。
【０３１２】
一部の実施形態において、本明細書において企図されるグルコアミラーゼを含む組成物は、任意選択で以下の酵素−アルファアミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、ペプチダーゼ（プロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ）、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エンドグルカナーゼおよび関連ベータ−グルカン加水分解アクセサリー酵素、キシラナーゼおよびキシラナーゼアクセサリー酵素、アセトラクテートデカルボキシラーゼ、シクロデキストリングリコトランスフェラーゼ、リパーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、粒状デンプン加水分解酵素ならびに他のグルコアミラーゼのいずれか１つまたは任意の組合せとの組合せで使用される。
【０３１３】
一部の実施形態において、組成物は、１つ以上のさらなる酵素を含む。一部の実施形態において、組成物は、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、ペプチダーゼ（例えばプロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ）、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼおよび関連ベータ−グルカン加水分解アクセサリー酵素、キシラナーゼおよびキシラナーゼアクセサリー酵素（例えばアラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ）、アセトラクテートデカルボキシラーゼならびにグルコアミラーゼ（それらの任意の組合せを含む）の中から選択される１つ以上のさらなる酵素を含む。
【０３１４】
別の実施形態において、本明細書において企図される変異体および／または１つ以上のさらなる酵素は、低温殺菌により、例えば５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６または１５低温殺菌単位（ＰＵ）未満を使用することによりビール、例えばピルスナービール中で不活化される。
【０３１５】
一部の実施形態において、組成物は、アルファアミラーゼ、例えば真菌アルファアミラーゼ（例えばアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．））または細菌アルファアミラーゼ（例えばバシラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、例えばＢ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、（ゲオバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）およびＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））ならびにそれらの変異体およびハイブリッドを含む。一部の実施形態において、アルファアミラーゼは、酸安定アルファアミラーゼである。一部の実施形態において、アルファアミラーゼは、カワチコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉ）アルファアミラーゼ（ＡｋＡＡ）であり、米国特許第７，０３７，７０４号明細書を参照のこと。本開示の組成物における使用に企図される市販のアルファアミラーゼが公知であり、ＧＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９９７、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤ、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＸＴＲＡ（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ，Ｉｎｃ，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）１２０−ＬおよびＳＵＰＲＡ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．）が挙げられる。
【０３１６】
一部の実施形態において、組成物は、酸性真菌プロテアーゼを含む。さらなる実施形態において、組成物は、２００７年９月１３日公開の国際公開第２００７／１０１８８８号パンフレットに開示のプロリン残基のカルボキシル部位においてペプチドを加水分解する微生物クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の変異体を供給源とするエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．２６）を含む。さらなる実施形態において、酸性真菌プロテアーゼは、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ）に由来し、参照により本明細書に援用される２００６年７月１３日公開の米国特許出願公開第２００６／０１５４３５３号明細書に開示のプロテアーゼのいずれか１つであり得る。さらなる実施形態において、組成物は、ブチアウキシエラ属種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）からのフィターゼを含む（例えばＢＰ−１７、ＰＣＴ特許出願公開の国際公開第２００６／０４３１７８号パンフレットに開示の変異体も参照のこと）。さらなる実施形態において、組成物は、例えばバシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からのまたは１９８６年１０月１４日公開の米国特許第４，６１７，２７３号明細書に開示の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の改変株中で発現されるバシラス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）のＡＬＤＣ遺伝子からのアセトラクテートデカルボキシラーゼ（ＡＬＤＣ）ＥＣ４．１．１．５を含む。
【０３１７】
他の実施形態において、本明細書において企図されるグルコアミラーゼは、他のそのようなグルコアミラーゼと組み合わせることができる。一部の実施形態において、そのようなグルコアミラーゼは、他の種々の株またはモナスカス・カオリアング（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｋａｏｌｉａｎｇ）の変種またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の株もしくはその変種、例えばニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、カワチコウジカビ（Ａ．ｋａｗａｃｈｉ）およびアワモリコウジカビ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）に由来する１つ以上のグルコアミラーゼ；フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）の株もしくはその変種に由来するグルコアミラーゼ；タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）の株もしくはその変種、例えばＴ．エメルソニイ（Ｔ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）に由来するグルコアミラーゼ；アセリア属（Ａｔｈｅｌｉａ）の株もしくはその変種、例えばＡ．ロルフシイ（Ａ．ｒｏｌｆｓｉｉ）に由来するグルコアミラーゼ；またはアオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の株、例えばアオカビ（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）に由来するグルコアミラーゼなどと組み合わせられる。
【０３１８】
特に、本明細書において企図されるグルコアミラーゼは、デンプン変換プロセスに、特にフルクトースシロップ、特殊糖用のデキストロースの生産ならびにデンプン含有基質の発酵からのアルコールおよび他の最終生産物（例えば有機酸、アスコルビン酸およびアミノ酸）の生産において使用することができる（Ｇ．Ｍ．Ａ．ｖａｎ  Ｂｅｙｎｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．（１９８５）ＳＴＡＲＣＨ  ＣＯＮＶＥＲＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．ＮＹ）。本開示の変異体グルコアミラーゼ組成物を使用して生産されるデキストリンは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％および少なくとも９５％のグルコース収率をもたらし得る。本明細書において企図されるグルコアミラーゼを使用するデンプン基質の発酵からのアルコールの生産は、アルコール燃料または飲用アルコールの生産を含み得る。一部の実施形態において、変異体グルコアミラーゼが親または野生型グルコアミラーゼと同一条件下で使用される場合、アルコールの生産は、より大きくなる。一部の実施形態において、アルコールの生産は、親または野生型グルコアミラーゼよりも約０．５％〜２．５％良好であり、例として、限定されるものではないが、アルコールが０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％および２．４％多い。
【０３１９】
一部の実施形態において、本明細書において企図されるグルコアミラーゼは、アルコール生産に使用される種々の植物ベースの基質、通常デンプンおよび／または糖含有植物材料からのデンプンの加水分解において使用される。一部の実施形態において、植物ベースの基質としては、コーン（トウモロコシ）、コムギ、オオムギ、ライムギ、ミロ、イネ、サトウキビ、ジャガイモ、キャッサバおよびそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態において、植物ベースの基質は、分別された植物材料、例えば繊維、胚、タンパク質およびデンプン（内胚乳）のような構成成分に分別された例えば穀物粒、例えばコーン（トウモロコシ）である（米国特許第６，２５４，９１４号明細書および米国特許第６，８９９，９１０号明細書）。アルコール発酵の方法は、ＴＨＥ  ＡＬＣＯＨＯＬ  ＴＥＸＴＢＯＯＫ，Ａ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＢＥＶＥＲＡＧＥ，ＦＵＥＬ  ＡＮＤ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＡＬＣＯＨＯＬ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｅｄｓ  Ｋ．Ａ．Ｊａｃｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＵＫに記載されている。ある実施形態において、アルコールは、エタノールである。特に、アルコール発酵生産プロセスは、湿式製粉プロセスまたは乾式製粉プロセスとして特徴付けられる。一部の実施形態において、グルコアミラーゼは、湿式製粉発酵プロセスにおいて使用され、他の実施形態において、グルコアミラーゼは、乾式製粉プロセスにおいて使用される。
【０３２０】
乾式穀物製粉は、多数の基本的な工程を含み、それらは一般にアルコールおよび他の副生物を生産するための摩砕、クッキング、液化、糖化、発酵ならびに液体および固体の分離を含む。植物材料、特に穀物粒全体、例えばコーン（トウモロコシ）、コムギまたはライムギが摩砕される。一部の場合、穀物は、最初に構成成分の部分に分別することができる。摩砕された植物材料を製粉して粗または微粒子を得ることができる。摩砕された植物材料は、スラリータンク中で液体（例えば水および／またはシンスティレージ）と混合することができる。スラリーは、液化酵素（例えばアルファアミラーゼ）とともにジェットクッカー中で高温（例えば約９０℃〜約１０５℃以上）に供して穀物中のデンプンを可溶化し、デキストリンに加水分解する。混合物を冷却し、さらに糖化酵素、例えば本開示により包含されるグルコアミラーゼにより処理してグルコースを生産することができる。次いで、グルコースを含有するマッシュは、発酵微生物、例えばエタノール生産微生物、特に酵母（サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．））の存在下で約２４〜１２０時間発酵させることができる。マッシュ中の固体を液相から分離し、アルコール、例えばエタノールおよび有用な副生物、例えばジスチラーズグレインを得る。
【０３２１】
一部の実施形態において、糖化工程および発酵工程は組み合わせられ、そのプロセスは並行複発酵または同時糖化、酵母増殖および発酵と称される。一態様において、本明細書に開示のグルコアミラーゼ変異体は、セルロース分解酵素および発酵用微生物を組み合わせる、セルロース系バイオマスをアルコールに変換する一工程プロセスにおいて使用される。このプロセスにおいて、酵素作用により放出される糖を微生物発酵によりアルコールに同時に変換することができる。
【０３２２】
他の実施形態において、これらのグルコアミラーゼは、デンプン加水分解のためのプロセスにおいて使用することができ、そのプロセスの温度は２５℃〜５０℃であり、一部の実施形態において３０℃〜４０℃である。一部の実施形態において、グルコアミラーゼは、約３．０〜約６．５のｐＨにおけるデンプン加水分解のためのプロセスにおいて使用することができる。一部の実施形態における発酵プロセスは、穀物粒または分別された穀物を製粉し、摩砕された穀物粒と液体とを組み合わせてスラリーを形成し、次いでそれを単一容器中で本開示によるグルコアミラーゼならびに任意選択で他の酵素、例えば、限定されるものではないが、アルファアミラーゼ、他のグルコアミラーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼまたは粒状デンプン加水分解活性を有する他の酵素ならびに酵母と混合してエタノールおよび他の副生物を生産することを含む（例えば米国特許第４，５１４，４９６号明細書、国際公開第０４／０８１１９３号パンフレットおよび国際公開第０４／０８０９２３号パンフレットを参照のこと）。
【０３２３】
一部の実施形態において、本開示は、液体デンプン溶液を糖化する方法であって、本明細書において企図される１つ以上のグルコアミラーゼを使用する酵素糖化工程を含む方法に関する。
【０３２４】
一部の実施形態において、本開示は、醸造において使用すべきゼラチン化および液化（典型的には）グリストデンプンを加水分解および糖化する方法であって、本明細書において企図される１つ以上のグルコアミラーゼを含む組成物を使用してデンプンから得られる醸造酵母発酵性糖の量を向上させる方法に関する。醸造プロセスは、飲用生産物、ビールを生産するために使用され、発酵性糖は、醸造酵母を用いる発酵によりエタノールおよびＣＯ２に変換される。発酵性糖は、従来より、穀物粒中のデンプンに由来し、任意選択で発酵性糖供給源、例えばグルコースおよびマルトースシロップおよび甘蔗糖が補給される。手短に述べると、当技術分野において周知のビール生産は、典型的には、麦芽化、マッシングおよび発酵の工程を含む。
【０３２５】
歴史的に、ビール生産における第１の工程は、穀物粒（例えばオオムギ）の麦芽化−浸漬、発芽および乾燥である。麦芽化の間、酵素が発芽穀類（例えばオオムギ）の穀物粒中で生産され、その化学構成要素のある変化（溶けとして公知）、例としてデンプン、タンパク質およびベータ−グルカンのいくらかの分解が存在する。
【０３２６】
麦芽化穀類を製粉してグリストを生じさせ、それを製粉された副原料（例えば非発芽穀物粒）と混合して混合グリストを生じさせる。グリストは、主として副原料またはそれのみからなっていてもよい。グリストを水と混合し、マッシングに供し；既にクッキングされた（ゼラチン化および液化された）副原料（「副原料クッキング」の結果）をマッシュに添加することができる。マッシングプロセスを、種々の温度においてある期間にわたり実施して穀類タンパク質を加水分解し、ベータ−グルカンを分解し、デンプンを可溶化および加水分解する。従来のマッシングにおける麦芽および副原料中のグリストデンプンの加水分解は、麦芽化オオムギに対して内因性の２つの主な酵素により触媒されると考えられる。アルファ−アミラーゼは、デンプン分子の内部におけるアルファ−１，４結合をランダムに開裂させ、それらをより小さいデキストリンに断片化する。ベータ−アミラーゼは、それらのデキストリンの非還元末端からアルファ−１，４結合を連続的に開裂させ、主にマルトースを生産する。アルファ−およびベータ−アミラーゼの両方は、デンプン分子中でデンプン鎖の分枝点を形成するアルファ−１，６結合を加水分解し得ず、それはマッシュ中での限界デキストリンの蓄積をもたらす。麦芽は、酵素の限界デキストリナーゼを含有し、それはアルファ−１，６結合の加水分解を触媒するが、その熱不安定性に起因してマッシング温度において弱い活性を示すにすぎない。マッシング後、液体抽出物（麦汁）は、使用済み穀物固体（すなわちグリストの一部を形成する不溶性穀物および殻材料）から分離される。麦汁分離の目的としては、・良好な抽出物回収率を得ること、・良好なろ過性を得ること、および・澄明な麦汁を生産することが挙げられる。麦汁の抽出物回収率およびろ過性は、醸造プロセスの経済性において重要である。
【０３２７】
麦汁の組成は、原料、マッシングプロセスおよびプロファイルならびに他の可変要素に依存する。典型的な麦汁は、６５〜８０％の発酵性糖（グルコース、マルトースおよびマルトトリオースならびに２０〜３５％の非発酵性限界デキストリン（マルトトリオースよりも高い重合度を有する糖）を含む。高レベルの副原料非麦芽化穀類グリストとともに醸造する場合、マッシングの間のデンプン加水分解酵素が不十分であり得る。したがって、マッシングプロセスの間に発酵性糖を生産し得る外因性酵素の供給源が必要とされる。さらに、そのような外因性酵素は、麦汁中の非発酵性糖のレベルを低減させ、それに対応して発酵性糖を増加させて低炭水化物含有量を有する高希薄化ビールを醸造するためにも必要である。マッシュに添加し、または醸造プロセスのマッシングプロセスにおいて使用してデンプングリスト中のアルファ−１，４結合および／またはアルファ−１，６結合を開裂させ、それにより麦汁の発酵性糖の含有量を増加させ、完成ビール中の非発酵性糖の残留物を低減させることができる、本明細書において企図される少なくとも１つのグルコアミラーゼを含むデンプンの加水分解のための酵素組成物が本明細書において開示される。さらに、そのように生産された麦汁を乾燥（例えば噴霧乾燥により）または濃縮（例えば煮沸および蒸発）させてシロップまたは粉末を提供することができる。
【０３２８】
本明細書において企図されるグリストは、上記のとおり任意の植物ならびに植物部分、例として、例えば塊茎、根、茎、葉および種子に由来し得る任意のデンプンおよび／または糖含有植物材料を含み得る。好ましくは、グリストは、穀物、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、カラスムギ、コーン（トウモロコシ）、イネ、ミロ、キビおよびソルガムからの穀物を含み、より好ましくは、麦汁のグリストの少なくとも１０％もしくはより好ましくは少なくとも１５％、いっそうより好ましくは少なくとも２５％または最も好ましくは少なくとも３５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％またはさらに１００％（ｗ／ｗ）は、穀物に由来する。最も好ましくは、グリストは、麦芽化穀物、例えばオオムギ麦芽を含む。麦汁のグリストの好ましくは少なくとも１０％またはより好ましくは少なくとも１５％、いっそうより好ましくは少なくとも２５％または最も好ましくは少なくとも３５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％またはさらには１００％（ｗ／ｗ）は、麦芽化穀物に由来する。好ましくは、グリストは、副原料、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、カラスムギ、コーン（トウモロコシ）、イネ、ミロ、キビおよびソルガムからの非麦芽化穀物を含み、麦汁のグリストのより好ましくは少なくとも１０％またはより好ましくは少なくとも１５％、いっそうより好ましくは少なくとも２５％または最も好ましくは少なくとも３５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％またはさらには１００％（ｗ／ｗ）は、非麦芽化穀物または他の副原料に由来する。即時発酵性の炭水化物、例えば糖またはシロップを含む副原料は、本発明のマッシングプロセスの前、その間またはその後に麦芽マッシュに添加することができるが、好ましくは、マッシングプロセス後に添加される。副原料の一部は、マッシュに添加される前にアルファ−アミラーゼおよび／もしくはエンドペプチダーゼ（プロテアーゼ）および／もしくはエンドグルカナーゼにより処理ならびに／または熱処理することができる。本明細書において企図されるデンプンの加水分解のための酵素組成物は、追加の酵素、好ましくは、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、ペプチダーゼ（プロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ）、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼおよび関連ベータ−グルカン加水分解アクセサリー酵素、キシラナーゼおよびキシラナーゼアクセサリー酵素（例えばアラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ）、アセトラクテートデカルボキシラーゼならびにグルコアミラーゼ（それらの任意の組合せを含む）の中から選択される酵素を含み得る。マッシングプロセスの間、グリストから抽出されるデンプンは、発酵性糖およびより小さいデキストリンに徐々に加水分解される。好ましくは、マッシュは、麦汁分離前のヨウ素試験に対して陰性のデンプンである。
【０３２９】
マッシング後、麦汁（液体抽出麦汁）は、使用済み穀物固体からロータリングまたはマッシュろ過のプロセスにより分離される。麦芽ろ過の目的としては、良好な抽出物回収率；良好なろ過性および澄明な麦汁が挙げられる（さらなる情報は、“Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｌｔｉｎｇ”ｂｙ  Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｋｕｎｚｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅａｃｈｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（ＶＬＢ），３ｒｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００４，ＩＳＢＮ  ３−９２１６９０−４９−８に見出すことができる）。
【０３３０】
醸造プロセスの第３の工程である発酵前、麦汁を典型的には醸造釜に移し、５０〜６０分間激しく煮沸する。多数の重要なプロセス、例として内因性の麦芽酵素およびマッシュまたは副原料に添加される任意の外因性酵素の不活化を麦汁煮沸の間に行う（さらなる情報は、“Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｌｔｉｎｇ”ｂｙ  Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｋｕｎｚｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅａｃｈｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（ＶＬＢ），３ｒｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００４，ＩＳＢＮ  ３−９２１６９０−４９−８に見出すことができる）。次いで、煮沸された麦汁を冷却し、醸造酵母をピッチングし、８〜１６℃の範囲の温度において発酵させて発酵性糖をエタノールに変換する。低アルコールビールは、アルコールを選択的に除去するように機能する真空蒸発のプロセスにより最終ビールから生産することができる。さらに、ホップを麦汁に添加することができる。
【０３３１】
一態様において、本発明は、発酵における本明細書において企図されるグルコアミラーゼ変異体または組成物の使用であって、前記変異体または組成物を発酵工程前またはその間に添加する使用に関する。さらなる態様において、前記発酵工程に、低温殺菌工程が続く。一態様において、前記発酵飲料を、ビール、例えば低アルコールビールまたは低カロリービールからなる群から選択する。別の態様において、前記変異体または前記組成物を、例えばアルファ−アミラーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼおよびグルコアミラーゼ（それらの任意の組合せを含む）の中から選択される１つ以上のさらなる酵素との組合せで添加する。いっそうさらなる態様において、変異体または１つ以上のさらなる酵素を、低温殺菌工程において不活化する。
【０３３２】
一態様において、本明細書において企図される変異体を、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．０１〜５０ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．０５〜２５ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．１〜１５ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．２〜１０ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり１〜５ｍｇの量で添加する。
【０３３３】
一態様において、本明細書において企図される変異体を、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり少なくとも０．００１、０．０１、０．０５、０．１０、０．２００、０．３００、０．５００、０．８００、０．１００、０．５００または１．０００ｍｇの量で添加する。
【０３３４】
一態様において、本明細書において企図される変異体を、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．０１〜２０ＧＡＵ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．０２〜１０ＧＡＵ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．０５〜５ＧＡＵ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．０８〜２ＧＡＵ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．１〜１ＧＡＵの量で添加する。
【０３３５】
一態様において、本明細書において企図される変異体を、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり少なくとも０．０１０、０．０５０、０．１００、０．１５０、０．３００、０．５００、０．８００、１．００、５．００または１０．０ＧＡＵの量で添加する。
【０３３６】
代替の実施形態において、本発明は、例えば発酵を発酵飲料を作製する方法に含める方法において、例えば発酵工程または任意選択のビールろ過工程後に低温殺菌工程を含む方法において本明細書に記載の変異体または組成物を発酵工程前またはその間に添加することを含む方法に関する。
【０３３７】
一態様において、本発明は、発酵飲料を生産する方法であって、以下の工程：
ａ）例えばグリストから得られるマッシュを調製する工程（前記グリストは、例えば麦芽化および／もしくは非麦芽化穀物または別の作物からのデンプンベース材料の１つ以上を含み、この工程は、任意選択で前記マッシュを１つ以上のさらなる酵素と接触させることをさらに含む）、
ｂ）マッシュをろ過して麦汁を得ることおよび
ｃ）麦汁を発酵させて発酵飲料を得ること
ならびに任意選択で低温殺菌工程（ｄ）
を含み、
本明細書に記載の変異体または組成物を
ｉ．工程（ａ）のマッシュおよび／または
ｉｉ．工程（ｂ）の麦汁および／または
ｉｉｉ．工程（ｃ）の麦汁
に添加する方法に関する。
【０３３８】
一態様において、工程において任意選択で添加される１つ以上の酵素は、デンプン枝切り酵素、Ｒ酵素、限界デキストリナーゼ、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、ペプチダーゼ（プロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ）、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼおよび関連ベータ−グルカン加水分解アクセサリー酵素、キシラナーゼおよびキシラナーゼアクセサリー酵素（例えばアラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ）、アセトラクテートデカルボキシラーゼおよびグルコアミラーゼ（それらの任意の組合せを含む）の中から選択することができる。別の態様において、１つ以上の酵素は、工程（ｂ）または（ｃ）の麦汁を１つ以上のさらなる酵素と接触させることにより添加することもでき、酵素を、デンプン枝切り酵素、イソアミラーゼおよび限界デキストリナーゼ（それらの任意の組合せを含む）の中から選択する。
【０３３９】
代替の実施形態において、本開示は、本明細書において企図される１つ以上のグルコアミラーゼ（例えば熱不安定グルコアミラーゼ）を含む組成物を使用して麦汁中の発酵性糖の量を向上させる方法であって、１つ以上のグルコアミラーゼが発酵工程の間に活性になるように麦汁を煮沸した後に組成物を麦汁に添加する方法に関する。組成物は、麦汁に醸造酵母をピッチングする前、それと同時に、またはその後に、煮沸された麦汁に添加することができる。発酵および熟成工程の終了時、ビールを任意選択で真空蒸発に供して低アルコールビールを生産することができ、次いで任意選択でろ過および／または低温殺菌する。この方法の固有の利点は、約６〜１５日間である（ピッチング率、発酵、温度などに応じて）発酵プロセスの期間にあり、これにより、短いマッシング工程（２〜４時間の期間）と比較して非発酵性糖の酵素的開裂に、より多くの時間が与えられる。この方法のさらなる利点は、非発酵性糖の所望の減少（および発酵性糖の増加）を達成するために必要とされる組成物の量にあり、それは類似の非発酵性糖の減少を達成するためにマッシュに添加される必要があるものよりも顕著に低い数の酵素活性の単位（例えばグルコアミラーゼ活性の単位）に対応する。さらに、これにより高い投入率のグルコアミラーゼがマッシュ中に添加される場合、特にロータリングによる麦汁分離の間に見られることが多い困難性が除去される。グルコアミラーゼ酵素の代替供給源と対照的に、驚くべきことに、本明細書において企図されるグルコアミラーゼは十分に温度感受性であること、完成ビールの最終熱処理工程（標準的な低温殺菌条件）がその触媒活性の不活化に十分であることが見出された。したがって、本明細書において企図される１つ以上のグルコアミラーゼを含む組成物の重要な利点は、それを使用して醸造の発酵工程の間に麦汁中の非発酵性糖の量を低減させ、低炭水化物含有量を有する高希薄化ビールを醸造することができ、組成物の触媒活性は、ビール低温殺菌の間の熱処理により不活化を受けやすく、それにより固定化酵素反応器の出費または遺伝子操作醸造酵母の使用が回避されることである。
【０３４０】
本開示はまた、食料、飼料または飲料生産物、例えばアルコールまたはノンアルコール飲料、例えば穀類または麦芽ベース飲料、例えばビールまたはウイスキー、例えばワイン、シードル、酢、日本酒、醤油またはジュースを生産する方法であって、デンプンおよび／または糖含有植物材料を本明細書に記載の変異体または組成物により処理する工程を含む方法を提供する。別の態様において、本発明はまた、本明細書において企図される変異体または組成物；および前記変異体または組成物の使用指示書を含むキットに関する。本発明はまた、本明細書に記載の方法により生産される発酵飲料に関する。
【０３４１】
本開示はまた、本明細書において企図される少なくとも１つのグルコアミラーゼを含む動物飼料組成物または配合物を提供する。デンプンを含む飼料の生産においてグルコアミラーゼ酵素を使用する方法は、例えば国際公開第０３／０４９５５０号パンフレット（参照により全体として本明細書に援用される）に提供されている。手短に述べると、グルコアミラーゼを、デンプンを含む飼料と混合する。グルコアミラーゼは、動物による使用のために抵抗性デンプンを分解し得る。
【０３４２】
本開示の他の目的および利点は、本明細書から明らかである。
【０３４３】
６．本発明によるさらなる実施形態番号：
実施形態１
配列番号２の残基２９、４３、４８、１１６および５０２または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号２の残基９７、９８、１４７、１７５、４８３および４８４または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼ変異体。
【０３４４】
実施形態２
ａ）配列番号２の５０２位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換ならびに任意選択で配列番号２の残基２９、４３、４８および１１６または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる界面アミノ酸の群から選択されるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号２の９８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換ならびに任意選択で配列番号２の残基９７、１４７、１７５、４８３および４８４または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる触媒コアアミノ酸残基の群から選択される１つまたは２つのアミノ酸置換
を含み；
少なくとも前記界面アミノ酸の群または前記触媒コアアミノ酸残基の群から選択される１つのアミノ酸置換を有し；
配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも８０％の配列同一性を有するグルコアミラーゼ変異体。
【０３４５】
実施形態３
ａ）配列番号２の５０２位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号２の９８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換；および
ｃ）配列番号２の４８位もしくは親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換または配列番号２の１４７位もしくは親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換
を含み；
配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも８０％の配列同一性を有するグルコアミラーゼ変異体。
【０３４６】
実施形態４
ａ）配列番号２の５０２位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号２の９８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換；および
ｃ）配列番号２の１４７位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換
を含み；
配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも８０％の配列同一性を有するグルコアミラーゼ変異体。
【０３４７】
実施形態５
ａ）配列番号２の５０２位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号２の９８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換；および
ｃ）配列番号２の４８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換
を含み；
配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも８０％の配列同一性を有するグルコアミラーゼ変異体。
【０３４８】
実施形態６
配列番号２または１３のアミノ酸置換Ｈ５０２Ｓ；配列番号２または１３のアミノ酸置換Ｌ９８Ｅ；および配列番号２もしくは１３のアミノ酸置換Ｙ４８Ｖまたは配列番号２もしくは１３のアミノ酸置換Ｙ１４７Ｒを含み；配列番号２または１３と少なくとも８０％の配列同一性を有するグルコアミラーゼ変異体。
【０３４９】
実施形態７
前記親グルコアミラーゼが、配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２である、実施形態１〜５のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３５０】
実施形態８
前記親グルコアミラーゼが、配列番号２または１３である、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３５１】
実施形態９
配列番号２の残基２４、２６、２７、２９、３０、４０、４２、４３、４４、４６、４８、４９、１１０、１１１、１１２、１１４、１１６、１１７、１１８、１１９、５００、５０２、５０４、５３４、５３６、５３７、５３９、５４１、５４２、５４３、５４４、５４６、５４７、５４８、５８０、５８３、５８５、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９４および５９６または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換を含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３５２】
実施形態１０
配列番号２の１〜４８４位（２４、２６、２７、２９、３０、４０、４２、４３、４４、４６、４８、４９、１１０、１１１、１１２、１１４、１１６、１１７、１１８および１１９位を除く）におけるデンプン結合ドメインと直接接触しない残基または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる触媒コアアミノ酸の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３５３】
実施形態１１
少なくとも７４．５％のＲＤＦを有する、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３５４】
実施形態１２
配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも８０％の配列同一性を有する、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３５５】
実施形態１３
配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも８５％の配列同一性を有する、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３５６】
実施形態１４
配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３５７】
実施形態１５
配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３５８】
実施形態１６
配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２と少なくとも９９．５％の配列同一性を有する、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３５９】
実施形態１７
配列番号２または１３と少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性を有する、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３６０】
実施形態１８
配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１または２２のアミノ酸の親配列からなり、アミノ酸の配列が、配列番号２の残基Ｆ２９、Ｉ４３、Ｙ４８、Ｆ１１６およびＨ５０２（Ｉ４３における置換はＩ４３Ｑであり、Ｙ４８における置換はＹ４８Ｖである）または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号２の残基Ｓ９７、Ｌ９８、Ｙ１４７、Ｆ１７５、Ｇ４８３およびＴ４８４（Ｓ９７における置換はＳ９７Ｍであり、Ｇ４８３における置換はＧ４８３Ｓであり、Ｔ４８４における置換はＴ４８４Ｗである）または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を有する、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３６１】
実施形態１９
配列番号２のアミノ酸の配列からなり、アミノ酸の配列が、配列番号２の残基Ｆ２９、Ｉ４３、Ｙ４８、Ｆ１１６およびＨ５０２（Ｉ４３における置換はＩ４３Ｑであり、Ｙ４８における置換はＹ４８Ｖである）からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号２の残基Ｓ９７、Ｌ９８、Ｙ１４７、Ｆ１７５、Ｇ４８３およびＴ４８４（Ｓ９７における置換はＳ９７Ｍであり、Ｇ４８３における置換はＧ４８３Ｓであり、Ｔ４８４における置換はＴ４８４Ｗである）からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を有する、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３６２】
実施形態２０
配列番号１３のアミノ酸の配列からなり、アミノ酸の配列が、配列番号１３の残基Ｆ２９、Ｉ４３、Ｙ４８、Ｆ１１６およびＨ５０２（Ｉ４３における置換はＩ４３Ｑであり、Ｙ４８における置換はＹ４８Ｖである）からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号１３の残基Ｓ９７、Ｌ９８、Ｙ１４７、Ｆ１７５、Ｇ４８３およびＴ４８４（Ｓ９７における置換はＳ９７Ｍであり、Ｇ４８３における置換はＧ４８３Ｓであり、Ｔ４８４における置換はＴ４８４Ｗである配列番号１３）からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を有する、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３６３】
実施形態２１
前記親グルコアミラーゼと比較して減少した熱安定性を示す、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３６４】
実施形態２２
低温殺菌により、例えば１６．８、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４低温殺菌単位（ＰＵ）未満を使用してビール中で不活化される、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３６５】
実施形態２３
結晶形態である場合、主鎖原子の原子座標が等価主鎖原子のアラインメントに従ってＴｒＧＡの等価主鎖原子の原子座標（国際公開第２００９／０６７２１８号パンフレットの表２０に定義）から０．１３ｎｍ未満の平均二乗偏差を有し、リンカー領域、デンプン結合ドメインおよび触媒ドメインを有する結晶構造を有する、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３６６】
実施形態２４
配列番号２の残基Ｆ２９、Ｉ４３、Ｙ４８、Ｆ１１６およびＨ５０２（Ｉ４３における置換はＩ４３Ｑであり、Ｙ４８における置換はＹ４８Ｖである）または前記親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる界面アミノ酸の群における１つまたは２つのアミノ酸置換；ならびに配列番号２の残基Ｓ９７、Ｌ９８、Ｙ１４７、Ｆ１７５、Ｇ４８３およびＴ４８４（Ｓ９７における置換はＳ９７Ｍであり、Ｇ４８３における置換はＧ４８３Ｓであり、Ｔ４８４における置換はＴ４８４Ｗである）または前記親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる触媒コアアミノ酸残基の群における１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を含む、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３６７】
実施形態２５
配列番号２のＦ２９位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３６８】
実施形態２６
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｆ２９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｓ／Ｔ／Ｑ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｖまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３６９】
実施形態２７
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｆ２９Ｖまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３７０】
実施形態２８
配列番号２のＩ４３位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３７１】
実施形態２９
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｉ４３Ｑまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３７２】
実施形態３０
配列番号２のＹ４８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む、実施形態１〜２９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３７３】
実施形態３１
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｙ４８Ｖまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３７４】
実施形態３２
配列番号２のＦ１１６位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３７５】
実施形態３３
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｆ１１６Ｍまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３７６】
実施形態３４
配列番号２のＨ５０２位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む、実施形態１〜３３のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３７７】
実施形態３５
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｈ５０２Ａ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｓ／Ｔ／Ｑ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｖ／Ｗ／Ｙまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、実施形態１〜３４のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３７８】
実施形態３６
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｈ５０２Ｓ／Ｅまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、実施形態１〜３５のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３７９】
実施形態３７
配列番号２のＳ９７位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む、実施形態１〜３６のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３８０】
実施形態３８
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｓ９７Ｍまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、実施形態１〜３７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３８１】
実施形態３９
配列番号２のＬ９８位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む、実施形態１〜３８のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３８２】
実施形態４０
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｌ９８Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｓ／Ｔ／Ｑ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｖ／Ｙまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、実施形態１〜３９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３８３】
実施形態４１
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｌ９８Ｅまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、実施形態１〜４０のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３８４】
実施形態４２
配列番号２のＹ１４７位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む、実施形態１〜４１のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３８５】
実施形態４３
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｙ１４７Ｒまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、実施形態１〜４２のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３８６】
実施形態４４
配列番号２のＦ１７５位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む、実施形態１〜４３のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３８７】
実施形態４５
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｆ１７５Ｖ／Ｉ／Ｌまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、実施形態１〜４４のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３８８】
実施形態４６
配列番号２のＧ４８３位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む、実施形態１〜４５のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３８９】
実施形態４７
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｇ４８３Ｓまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、実施形態１〜４６のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３９０】
実施形態４８
配列番号２のＴ４８４位または親グルコアミラーゼ中の等価位置に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む、実施形態１〜４７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３９１】
実施形態４９
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｔ４８４Ｗまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、実施形態１〜４８のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３９２】
実施形態５０
（１）配列番号２の残基２４、２６、２７、２９、３０、４０、４２、４３、４４、４６、４８、４９、１１０、１１１、１１２、１１４、１１６、１１７、１１８、１１９、５００、５０２、５０４、５３４、５３６、５３７、５３９、５４１、５４２、５４３、５４４、５４６、５４７、５４８、５８０、５８３、５８５、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９４および５９６または親グルコアミラーゼ中の等価位置からなる界面アミノ酸残基の群におけるアミノ酸置換；ならびに
（２）配列番号２の１〜４８４位（２４、２６、２７、２９、３０、４０、４２、４３、４４、４６、４８、４９、１１０、１１１、１１２、１１４、１１６、１１７、１１８および１１９位を除く）または親グルコアミラーゼ中の等価位置におけるデンプン結合ドメインと直接接触しない残基からなる触媒コアアミノ酸の群におけるアミノ酸置換の総数が、２、３または４つである、実施形態１〜４９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３９３】
実施形態５１
配列番号２の以下のアミノ酸置換Ｆ２９Ｖ−Ｇ４８３Ｓ、Ｙ４８Ｖ−Ｌ９８Ｅ−Ｈ５０２Ｓ、Ｆ１１６Ｍ−Ｆ１７５Ｖ、Ｆ１７５Ｖ−Ｈ５０２Ｅ、Ｉ４３Ｑ−Ｆ１７５Ｉ−Ｈ５０２Ｓ、Ｉ４３Ｑ−Ｆ１７５Ｉ、Ｆ２９Ｖ−Ｓ９７Ｍ−Ｇ４８３Ｓ−Ｔ４８４ＷまたはＬ９８Ｅ−Ｙ１４７Ｒ−Ｈ５０２Ｓまたは親グルコアミラーゼ中の等価位置の置換を含む、実施形態１〜５０のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３９４】
実施形態５２
以下のアミノ酸置換Ｌ４１７Ｖ、Ｔ４３０Ａ、Ｑ５１１Ｈ、Ａ５３９ＲおよびＮ５６３Ｉをさらに含む、実施形態１〜５１のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３９５】
実施形態５３
配列番号１４からなる、実施形態１〜５２のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３９６】
実施形態５４
配列番号１５からなる、実施形態１〜５２のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３９７】
実施形態５５
配列番号１６からなる、実施形態１〜５２のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３９８】
実施形態５６
配列番号１７からなる、実施形態１〜５２のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０３９９】
実施形態５７
前記親グルコアミラーゼが、配列番号１、２、１３、１８、１９、２０、２１および／または２２と少なくとも８０％の配列同一性を有する触媒ドメインを有する、実施形態１〜５６のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０４００】
実施形態５８
前記親グルコアミラーゼが、配列番号１１、２４、２５、２６、２７、２８および／または２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを有する、実施形態１〜５７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０４０１】
実施形態５９
前記親グルコアミラーゼが、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、フミコラ属種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｓｐｐ．）、アオカビ属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、タラロミセス属種（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）またはシゾサッカルミセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）から得られるグルコアミラーゼから選択される、実施形態１〜５８のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０４０２】
実施形態６０
前記親グルコアミラーゼが、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）またはアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）から得られる、実施形態５９に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０４０３】
実施形態６１
前記親グルコアミラーゼと比較して変更された熱安定性を示す、実施形態１〜６０のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０４０４】
実施形態６２
前記変更された熱安定性が、減少した熱安定性である、実施形態６１に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０４０５】
実施形態６３
前記親グルコアミラーゼと比較して変更された比活性を示す、実施形態１〜６２のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０４０６】
実施形態６４
前記変更された比活性が、類似のまたは増加した比活性である、実施形態６３に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０４０７】
実施形態６５
前記親グルコアミラーゼと比較して減少した熱安定性および類似のまたは増加した比活性の両方を示す、実施形態１〜６４のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０４０８】
実施形態６６
あるアミノ酸配列の、別のアミノ酸配列とのまたはそれに対する同一性の割合が、タンパク質−タンパク質Ｂｌａｓｔ検索（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、デフォルト設定：スコア行列：ｂｌｏｓｕｍ６２、非冗長タンパク質配列データベースおよびｂｌａｓｔアルゴリズムの使用により決定される、実施形態１〜６５のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０４０９】
【表１０】
2015526090.tif 000013
【０４１０】
実施形態６７
低温殺菌により、例えば１６．８、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４低温殺菌単位（ＰＵ）未満を使用してビール中で不活化される、実施形態１〜６６のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０４１１】
実施形態６８
０．０５〜１０ＧＡＵ／ｍｇ、例えば０．１〜５ＧＡＵ／ｍｇ、例えば０．５〜４ＧＡＵ／ｍｇ、例えば０．７〜４ＧＡＵ／ｍｇまたは例えば２〜４ＧＡＵ／ｍｇのグルコアミラーゼ活性（ＧＡＵ）を有する、実施形態１〜６７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０４１２】
実施形態６９
宿主細胞中での組換え発現により得られる、実施形態１〜６８のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
【０４１３】
実施形態７０
実施形態１〜６９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体をコードし得る核酸。
【０４１４】
実施形態７１
実施形態７０に記載の核酸を含み、または実施形態１〜６９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体を発現し得る発現ベクターまたはプラスミド。
【０４１５】
実施形態７２
トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に由来するプロモーター、例えばＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩ由来プロモーターを含む、実施形態７１に記載の発現ベクターまたはプラスミド。
【０４１６】
実施形態７３
トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に由来するターミネーター、例えばＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩ由来ターミネーターを含む、実施形態７１〜７２のいずれか１つに記載の発現ベクターまたはプラスミド。
【０４１７】
実施形態７４
１つ以上の選択マーカー、例えばアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳおよびｐｙｒＧを含む、実施形態７１〜７３のいずれか１つに記載の発現ベクターまたはプラスミド。
【０４１８】
実施形態７５
宿主細胞中での非染色体プラスミド維持を可能とする１つ以上のテロメア領域を含む、実施形態７１〜７４のいずれか１つに記載の発現ベクターまたはプラスミド。
【０４１９】
実施形態７６
実施形態１〜６９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の異種発現を有する宿主細胞。
【０４２０】
実施形態７７
真菌細胞である、実施形態７６に記載の宿主細胞。
【０４２１】
実施形態７８
前記真菌細胞が、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）のものである、実施形態７７に記載の宿主細胞。
【０４２２】
実施形態７９
前記真菌細胞が、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）種のものである、実施形態７８に記載の宿主細胞。
【０４２３】
実施形態８０
前記真菌細胞が、ヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）種のものである、実施形態７７に記載の宿主細胞。
【０４２４】
実施形態８１
実施形態７１〜７５のいずれか１つに記載のプラスミドまたは発現ベクターを含み、好ましくは、それにより形質転換されている宿主細胞。
【０４２５】
実施形態８２
実施形態１〜６９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体を単離する方法であって、前記グルコアミラーゼ変異体の異種発現を有する実施形態７６〜８１のいずれか１つに記載の宿主細胞中での前記グルコアミラーゼ変異体の合成を誘導する工程および前記宿主細胞により分泌された細胞外タンパク質を回収する工程および任意選択で前記グルコアミラーゼ変異体を精製する工程を含む方法。
【０４２６】
実施形態８３
実施形態１〜６９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体を生産する方法であって、前記グルコアミラーゼ変異体の異種発現を有する実施形態７６〜８１のいずれか１つに記載の宿主細胞中での前記グルコアミラーゼ変異体の合成を誘導する工程および任意選択で前記グルコアミラーゼ変異体を精製する工程を含む方法。
【０４２７】
実施形態８４
実施形態１〜６９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体を発現させる方法であって、実施形態７６〜８１のいずれか１つに記載の宿主細胞を得ることおよび前記宿主細胞から前記グルコアミラーゼ変異体を発現させることおよび任意選択で前記グルコアミラーゼ変異体を精製することを含む方法。
【０４２８】
実施形態８５
実施形態１〜６９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体は、優勢分泌タンパク質である、実施形態８２〜８４のいずれか１つに記載の方法。
【０４２９】
実施形態８６
実施形態１〜６９のいずれか１つに記載の１つ以上のグルコアミラーゼ変異体を含む組成物。
【０４３０】
実施形態８７
デンプン加水分解組成物、糖化組成物、洗浄組成物、アルコール発酵酵素組成物および動物飼料動物飼料組成物の中から選択される、実施形態８６に記載の組成物。
【０４３１】
実施形態８８
１つ以上のさらなる酵素を含む、実施形態８６〜８７のいずれか１つに記載の組成物。
【０４３２】
実施形態８９
前記１つ以上のさらなる酵素が、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、ペプチダーゼ（例えばプロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ）、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼおよび関連ベータ−グルカン加水分解アクセサリー酵素、キシラナーゼおよびキシラナーゼアクセサリー酵素（例えばアラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ）、アセトラクテートデカルボキシラーゼならびにグルコアミラーゼ（それらの任意の組合せを含む）の中から選択される、実施形態８８に記載の組成物。
【０４３３】
実施形態９０
グルコアミラーゼ変異体および／または１つ以上のさらなる酵素が、低温殺菌により不活化される、実施形態８６〜８９のいずれか１つに記載の組成物。
【０４３４】
実施形態９１
前記グルコアミラーゼ変異体および／または前記１つ以上のさらなる酵素が、低温殺菌により、例えば５０、４５、４０、３５、３０、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６または１５低温殺菌単位（ＰＵ）未満を使用することによりビール中で不活化される、実施形態９０に記載の組成物。
【０４３５】
実施形態９２
発酵における実施形態１〜６９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体または実施形態８６〜９１のいずれか１つに記載の組成物の使用であって、前記グルコアミラーゼ変異体または組成物を、発酵工程前またはその間に添加する使用。
【０４３６】
実施形態９３
前記発酵工程および任意選択のビールろ過工程に、低温殺菌工程が続く、実施形態９２に記載の使用。
【０４３７】
実施形態９４
前記発酵を、発酵飲料を作製する方法に含める、実施形態９２〜９３のいずれか１つに記載の使用。
【０４３８】
実施形態９５
前記発酵飲料を、ビール、例えば低アルコールビールまたは低カロリービールからなる群から選択する、実施形態９２〜９４のいずれか１つに記載の使用。
【０４３９】
実施形態９６
前記グルコアミラーゼ変異体または前記組成物を、１つ以上のさらなる酵素との組合せで添加する、実施形態９２〜９５のいずれか１つに記載の使用。
【０４４０】
実施形態９７
前記１つ以上のさらなる酵素を、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、ペプチダーゼ（例えばプロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ）、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼおよび関連ベータ−グルカン加水分解アクセサリー酵素、キシラナーゼおよびキシラナーゼアクセサリー酵素（例えばアラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ）、アセトラクテートデカルボキシラーゼならびにグルコアミラーゼ（それらの任意の組合せを含む）の中から選択する、実施形態９６に記載の使用。
【０４４１】
実施形態９８
前記グルコアミラーゼ変異体または前記１つ以上のさらなる酵素を、低温殺菌工程において不活化する、実施形態９２〜９７のいずれか１つに記載の使用。
【０４４２】
実施形態９９
前記グルコアミラーゼ変異体を、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．０１〜５０ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．０５〜２５ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．１〜１５ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．２〜１０ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり１〜５ｍｇの量で添加する、実施形態９２〜９８のいずれか１つに記載の使用。
【０４４３】
実施形態１００
醸造プロセスの発酵工程における発酵性糖の生産を向上させるための熱不安定グルコアミラーゼ変異体の使用であって、前記グルコアミラーゼ変異体が、実施形態１〜６９のいずれか１つに記載のものである使用。
【０４４４】
実施形態１０１
実施形態１〜６９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体または実施形態８６〜９１のいずれか１つに記載の組成物を、発酵工程、例えば酵母を用いる発酵工程前またはその間に添加することを含む方法。
【０４４５】
実施形態１０２
前記発酵工程または任意選択のビールろ過工程後に低温殺菌工程を含む、実施形態１０１に記載の方法。
【０４４６】
実施形態１０３
前記発酵を、発酵飲料を作製する方法に含める、実施形態１０１〜１０２のいずれか１つに記載の方法。
【０４４７】
実施形態１０４
前記発酵飲料を、ビール、例えば低アルコールビール、低カロリービールからなる群から選択する、実施形態１０１〜１０３のいずれか１つに記載の方法。
【０４４８】
実施形態１０５
前記グルコアミラーゼ変異体または前記組成物を、１つ以上のさらなる酵素との組合せで添加する、実施形態１０１〜１０４のいずれか１つに記載の方法。
【０４４９】
実施形態１０６
前記１つ以上のさらなる酵素を、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、ペプチダーゼ（例えばプロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ）、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼおよび関連ベータ−グルカン加水分解アクセサリー酵素、キシラナーゼおよびキシラナーゼアクセサリー酵素（例えばアラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ）、アセトラクテートデカルボキシラーゼならびにグルコアミラーゼ（それらの任意の組合せを含む）の中から選択する、実施形態１０５に記載の方法。
【０４５０】
実施形態１０７
前記グルコアミラーゼ変異体および／または前記１つ以上のさらなる酵素を、前記低温殺菌工程において不活化する、実施形態１０１〜１０６のいずれか１つに記載の方法。
【０４５１】
実施形態１０８
前記グルコアミラーゼ変異体を、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．０１〜５０ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．０５〜２５ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．１〜１５ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり０．２〜１０ｍｇ、例えば発酵麦汁１ｍｌ当たり１〜５ｍｇの量で添加する、実施形態１０１〜１０７のいずれか１つに記載の方法。
【０４５２】
実施形態１０９
以下の工程：
ａ）マッシュを調製すること、
ｂ）前記マッシュをろ過して麦汁を得ることおよび
ｃ）前記麦汁を発酵させて発酵飲料を得ること
を含む、発酵飲料の生産のための、実施形態１０１〜１０８のいずれか１つに記載の方法。
【０４５３】
実施形態１１０
実施形態１〜６９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体または実施形態８６〜９１のいずれか１つに記載の組成物を、
工程（ａ）の前記マッシュおよび／または
工程（ｂ）の前記麦汁および／または
工程（ｃ）の前記麦汁
に添加する、実施形態１０９に記載の方法。
【０４５４】
実施形態１１１
前記発酵飲料を低温殺菌工程（ｄ）に供する、実施形態１０９または１１０に記載の方法。
【０４５５】
実施形態１１２
工程（ａ）における前記マッシュを、グリストから得る、実施形態１０９〜１１１のいずれか１つに記載の方法。
【０４５６】
実施形態１１３
前記グリストが、麦芽化および／もしくは非麦芽化穀物または別の作物からのデンプンベース材料の１つ以上を含む、実施形態１１２に記載の方法。
【０４５７】
実施形態１１４
工程（ａ）の前記マッシュを、１つ以上のさらなる酵素と接触させることをさらに含む、実施形態１０９〜１１３のいずれか１つに記載の方法。
【０４５８】
実施形態１１５
前記酵素を、デンプン枝切り酵素、Ｒ酵素、限界デキストリナーゼ、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、ペプチダーゼ（例えばプロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ）、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼおよび関連ベータ−グルカン加水分解アクセサリー酵素、キシラナーゼおよびキシラナーゼアクセサリー酵素（例えばアラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ）、アセトラクテートデカルボキシラーゼならびにグルコアミラーゼ（それらの任意の組合せを含む）の中から選択する、実施形態１１４に記載の方法。
【０４５９】
実施形態１１６
工程（ｂ）または（ｃ）の前記麦汁を１つ以上のさらなる酵素と接触させることをさらに含み、前記酵素を、デンプン枝切り酵素、イソアミラーゼおよび限界デキストリナーゼ（それらの任意の組合せを含む）の中から選択する、実施形態１０９〜１１５のいずれか１つに記載の方法。
【０４６０】
実施形態１１７
実施形態１０９〜１１６のいずれか１つに記載の方法により生産される発酵飲料。
【０４６１】
実施形態１１８
ビール、例えば低アルコールビールまたは低カロリービールである、実施形態１１７に記載の発酵飲料。
【０４６２】
実施形態１１９
食料、飼料または飲料生産物、例えばアルコールまたはノンアルコール飲料、例えば穀類または麦芽ベース飲料、例えばビールまたはウイスキー、例えばワイン、シードル、酢、日本酒、醤油またはジュースを生産する方法であって、デンプンおよび／または糖含有植物材料を実施形態１〜６９に記載のグルコアミラーゼ変異体または実施形態８６〜９１のいずれか１つに記載の組成物により処理する工程を含む方法。
【０４６３】
実施形態１２０
実施形態１〜６９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体または実施形態８６〜９１のいずれか１つに記載の組成物；および前記グルコアミラーゼ変異体または組成物の使用指示書を含むキット。
【０４６４】
実施形態１２１
第１または第２世代バイオ燃料、例えばバイオエタノールおよび／またはバイオブタノールの生産における、実施形態１〜６９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体または実施形態８６〜９１および１１７〜１１８のいずれか１つに記載の組成物の使用。
【０４６５】
実施形態１２２
バイオケミカル、例えばバイオベースドイソプレンの生産における、実施形態１〜６９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体または実施形態８６〜９１および１１７〜１１８のいずれか１つに記載の組成物の使用。
【０４６６】
実施形態１２３
第１または第２世代バイオ燃料、例えばバイオエタノールおよび／またはバイオブタノールを生産する方法であって、デンプンを含む材料を実施形態１〜６９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体または実施形態８６〜９１および１１７〜１１８のいずれか１つに記載の組成物により処理する工程を含む方法。
【０４６７】
実施形態１２４
バイオケミカル、例えばバイオベースドイソプレンを生産する方法であって、デンプンを含む材料を実施形態１〜６９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体または実施形態８６〜９１および１１７〜１１８のいずれか１つに記載の組成物により処理する工程を含む方法。
【０４６８】
実施形態１２５
実施形態８２〜８５のいずれか１つに記載の方法により得られるグルコアミラーゼ変異体。
【０４６９】
実施形態１２６
例えば０．１〜９９．９％の範囲である、実施形態１２５に記載の生産物を含む組成物。
【０４７０】
以下の実施例を提供し、考察される実施形態の趣旨から逸脱せずに種々の改変をなすことができることを理解されたい。
【実施例】
【０４７１】
アッセイおよび方法
以下のアッセイおよび方法を、以下に提供される実施例において使用する。変異体を提供するために使用される方法を以下に記載する。しかしながら、親酵素の変異体を提供するために様々な方法を使用することができ、本発明は、実施例において使用される方法に限定されないことに留意されたい。変異体の作製および変異体の選択のための任意の好適な手段を使用することができることが意図される。
【０４７２】
発酵によるＧＡの生産
４００×微量元素溶液：１０００ｍｌの脱塩水中で希釈する：無水クエン酸（１７５ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２００ｇ）、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１６ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（３．２ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（１．４ｇ）、Ｈ３ＢＯ３（０．８ｇ）。これを酸性化して全ての構成成分を溶液で得ることが有益であり得る。溶液をろ過および滅菌した。
【０４７３】
ＬＤ培地：約８００ｍｌの脱塩水に添加する：カザミノ酸（９ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（５ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（４．５ｇ）、ＣａＣｌ２＊
２Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ピペラジン−１，４−ビス−プロパンスルホン酸（ＰＩＰＰＳ）緩衝液（３３ｇ）、４００×Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量元素（２．５ｍｌ）、ＮａＯＨ  ４ＮによりｐＨを５．５に調整する。最終容量を９２０ｍｌに調整する。
【０４７４】
２×ＡｍｄＳ基礎培地寒天（１リットル）：ＫＨ２ＰＯ４（３０ｇ）、１Ｍのアセトアミド（２０ｍｌ）、１ＭのＣｓＣｌ（２０ｍｌ）、２０％のＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（６ｍｌ）、２０％のＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ（６ｍｌ）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）胞子元素４００×（２ｍｌ）、５０％のグルコース．Ｈ２Ｏ（８０ｍｌ）を混合する。４ＮのＮａＯＨによりｐＨを４．５に調整する。１Ｌにメークアップし、フィルター滅菌する。４℃において貯蔵する。
【０４７５】
初期培養：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株を、ＡｍｄＳ基礎培地寒天プレート上で生育させた。寒天プレートを生産するため、最小培地寒天を煮沸し、約５０℃に冷却した後、それを２×ＡｍｄＳ基礎培地により１：１に希釈し、ペトリ皿上に注いだ。胞子形成後（約６〜７日）、プレートを２ｍｌの生理食塩水、０．０１５％のＴｗｅｅｎ８０によりスクレーピングした。約１ｍｌを、５００〜６００μｌの３５％グリセロールを含有するグリセロールチューブに添加し、−８０℃において貯蔵した。前培養発酵をこの胞子懸濁液から直接開始させた。
【０４７６】
前培養：２．５％のグルコースをＬＤ培地に添加し、続いて１Ｌにメークアップすることにより培地を作製する。バイオマスを生産するため、５０μｌの胞子懸濁液を１００ｍｌの培地（５００ｍｌの振とうフラスコ中で滅菌）に添加する。フラスコをロータリーシェーカー上で３０℃、１８０ｒｐｍにおいて２日間インキュベートし、次いで１０ｍｌの懸濁液を使用して新たなバッフル付振とうフラスコに接種し、それを類似の条件下で１日間インキュベートする。このフラスコの含有物を使用して発酵槽に接種する。あるいは、前培養の発酵は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）を有する新たなＰＤＡプレートの一片（約１ｃｍ２）単位で開始させた。
【０４７７】
主培養：１Ｌの培地を作製するため、４０ｍｌのグルコース／ソホロース混合物（Ｄａｎｉｓｃｏ，Ｊａｍｓａ，Ｆｉｎｌａｎｄ）をＬＤ培地に添加し、１Ｌにメークアップした。４Ｌの培地を含有する６Ｌの発酵槽に前培養物を接種し、ＣＥＲ／ＯＵＲ（二酸化炭素排出速度／酸素利用速度（Ｃａｒｂｏｎｄｉｏｘｉｄｅ  Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  Ｒａｔｅ／Ｏｘｙｇｅｎ  Ｕｐｔａｋｅ  Ｒａｔｅ））が降下し始めるまでｐＨ３．５において３４℃において約１６時間生育させた。次いで、温度を２８℃に低下させ、ｐＨを５．５に上昇させ、発酵を約８０時間継続させた。細胞培養物を収集し、培地を遠心分離（２５分間における４０００ｒｐｍ）およびろ過（ＶａｃｕＣａｐ  ９０、０．２μｍ）により澄明化した。次いで、発酵体を濃縮し、−２０℃において貯蔵した。
【０４７８】
ＴｒＧＡ変異体の精製
発現したＴｒＧＡ変異体の培養上清を、ＢｉｏＲＡＤ  ＤＵＯ−Ｆｌｏｗ  ＦＰＬＣシステム（ＢｉｏＲＡＤ，Ｕ．Ｓ．）を使用する親和性クロマトグラフィーにより一工程で精製した。クロマトグラフィーは、手動によりＢｉｏＲＡＤ  ＦＰＬＣシステム上で実施した。β−シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；ＣＡＳ番号：６８１６８−２３−０）をエポキシ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｄｉｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ；ロット：１００２１９８７）上で固定化することにより１５ｍｌのβ−シクロデキストリンカラムを作製した。このβ−ＣＤカラムを緩衝液Ａにより２ｍｌ／分の流速において平衡化した。この流速を精製全体にわたり維持した。５００ＧＡＵ単位を含有する試料を注入チューブに通してカラム上にロードし、１０ｍｌの分画を精製全体にわたり回収した。フロースルーを廃棄し、緩衝液Ａによる広域の洗浄によるベースラインの安定化後に緩衝液を１００％の緩衝液Ｂ（２５ｍＭの酢酸Ｎａ  ｐＨ４．３中１０ｍＭのα−シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ，２８７０５））に切り替えた。結合したＴｒＧＡ変異体をカラムから溶出させ、全てのタンパク質を溶出させた後に緩衝液を最終的に緩衝液Ａに切り替えて戻した。溶出したタンパク質を脱塩してα−シクロデキストリンを除去し、グルコアミラーゼ活性について、およびドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。
【０４７９】
精製ＴｒＧＡ変異体のタンパク質定量
総タンパク質定量には、ブラッドフォードアッセイを使用した。試薬溶液はブラッドフォードＱｕｉｋｓｔａｒｔ作業溶液（ＢｉｏＲａｄカタログ番号５００−０２０５）であった。１００μｌの上清を新たな９６ウェル平底プレート中に装入した。それぞれのウェルに２００ＵＩの試薬を添加し、室温において５分間インキュベートした。吸光度をＭＴＰリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  １９０）中で５９５ｎｍにおいて計測した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（０〜５０Ｕｇ／ｍｌ）標準曲線に従って算出した。
【０４８０】
ゲル電気泳動分析
全てのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％ビストリスゲル１．０ｍｍ、１２ウェル（カタログ番号ＮＰ０３２１ｂｏｘ）、Ｎｏｖｅｘ  Ｓｅｅ−Ｂｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２プレステインドスタンダード（カタログ番号ＬＣ５９２５）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（カタログ番号ＬＣ６０６０）およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ  ＳＤＳランニング緩衝液（カタログ番号ＮＰ０００２）を用いて、製造業者のプロトコルに従って実行した。
【０４８１】
９６ウェルマイクロタイタープレートについてのｐＮＰＧグルコアミラーゼ活性アッセイ
試薬溶液は、ＮａＡｃ緩衝液：２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５；基質：ＮａＡｃ緩衝液中５０ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ  Ｎ−１３７７）（０．３ｇ／２０ｍｌ）および停止溶液：８００ｍＭのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ１０であった。３０μｌのろ過上清を新たな９６ウェル平底マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中に装入した。それぞれのウェルに５０μｌのＮａＡｃ緩衝液および１２０μｌの基質を添加し、５０℃において３０分間インキュベートした（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉＥＭＳインキュベーター／シェーカーＨＴ）。反応を１００μｌの停止溶液の添加により終結させた。吸光度をＭＴＰリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ３８４  ｐｌｕｓ）中で４０５ｎｍにおいて計測し、０．０１１μＭ／ｃｍのモル吸光係数を使用して活性を算出した。
【０４８２】
９６ウェルマイクロタイタープレート中のＧＡＵ活性の測定
ｐＮＰ−β−マルトシド基質を用い、ｐ−ニトロフェノールの量として表現される特異的比色グルコアミラーゼアッセイが、定義されるアッセイ条件下でその基質から生産される。特異的基質ｐ−ニトロフェニル−β−マルトシドはα−アミラーゼ、α−グルコシダーゼおよびトランスグルコシダーゼにより加水分解されず、それは市販のグルコアミラーゼ調製物中で汚染物質として出現し得る。
基質：ｐ−ニトロフェニル−β−マルトシド（４ｍＭ）と熱安定β−グルコシダーゼ（５Ｕ／ｍｌ）（アッセイＲ−ＡＭＧＲ３  ０５／０４から；Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を新たに調製した。
緩衝液：２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）。
【０４８３】
酵素試料は、酢酸ナトリウム緩衝液中で少なくとも１０倍だけ希釈した。９６ウェルプレート中で：２０μＬの基質を２０μＬの酵素溶液と混合し、撹拌しながら４０℃において１０分間インキュベートした。３００μＬの２％Ｔｒｉｚｍａ塩基を添加して反応を終結させ、発色させた。４００ｎｍにおける吸光度を、試薬ブランクに対して計測した。
【０４８４】
ブランクは、３００μＬのＴｒｉｚｍａ塩基溶液（２％）を２０μＬの基質に激しく撹拌しながら添加し、次いで酵素溶液（２０μＬ）を添加することにより調製した。活性は、以下のとおり算出した：
【数２】
2015526090.tif 000014
ＧＡＵ＝酵素活性の国際単位。１単位は、定義されるｐＨおよび温度において毎分、基質から１μモルのｐ−ニトロフェノールを放出する酵素の量である。ΔＡ４００＝吸光度（反応）−吸光度（ブランク）。１０＝インキュベーション時間（分）。３４０＝最終反応容量（μＬ）。２０＝アッセイされた酵素の容量（μＬ）。１８．１＝４００ｎｍにおける２％ｔｒｉｚｍａ塩基（ｐＨ約８．５）中のｐ−ニトロフェノールのＥｍＭ（単位：μＭ−１＊ｃｍ−１）。０．８８＝光路（ｃｍ）。
【０４８５】
熱安定性アッセイ
グルコアミラーゼ活性の相対損失を、実験室スケールの低温殺菌アッセイにおいてガス抜きビールまたは酢酸Ｎａ緩衝液ｐＨ４．５中で測定した。試料をビールまたは緩衝液中で１：１０に希釈し、薄型ガラスキュベットに移し、７２℃における水浴中に装入し、時間および温度を計測した。試料を経時的に（０〜１００秒）抜き取り、氷上で保持してから残留ＧＡＵ活性を測定した。希釈および混合をＢｉｏｍｅｋ  ３０００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）上で９６ウェルＥＬＩＳＡプレート中で実施した。本実験において使用される条件下で酵素熱安定性を計測するため、ＧＡＵ活性を酵素のインキュベーション前後に測定した。グルコアミラーゼを有さないビールまたは緩衝液をブランクとして使用した。蓄積エネルギー投入量を、エネルギー等価指数の低温殺菌単位（ＰＵ）に下記の式により変換した。
【０４８６】
低温殺菌単位またはＰＵは、低温殺菌の定量的尺度を指す。ビールについての１低温殺菌単位（１ＰＵ）は、６０摂氏度における１分間の熱保持と定義する。以下のとおり計算する。
ＰＵ＝ｔ×１．３９３∧（Ｔ−６０）：
ｔ＝低温殺菌器中の低温殺菌温度における時間（分）
Ｔ＝低温殺菌器中の温度（摂氏度）
［∧（Ｔ−６０）は、（Ｔ−６０）の指数を表す］
【０４８７】
熱安定性は、ＴｒＧＡ変異体についてレギュラーガス抜きピルスナー（Ｒｏｙａｌ  Ｅｘｐｏｒｔ  Ｐｉｌｓｎｅｒ）ｐＨ（４．５）中で測定した。データを以下のとおり相対活性％として算出する。
【数３】
2015526090.tif 000015
【０４８８】
真正発酵度（ＲＤＦ）の測定を有する醸造分析
純粋麦芽醸造分析
３４０ｇのＭｕｎｔｏｎ’ｓ麦芽エキスを１５００ｍｌの熱水中で溶解させた。このスラリーに５つのペレットのＨｏｐｆｅｎｖｅｒｅｄｌｕｎｇ，Ｓｔ．Ｊｏｈａｎｎ製のビターホップ（１６．０％のアルファ含有率（ＥＢＣ７．７０規定のＨＰＬＣ分析）、Ｈ２ＳＯ４によりｐＨを５．２に調整）を添加し、１時間煮沸してから１２１℃において１５分間オートクレーブ処理していかなる残留グルコアミラーゼ活性および微生物汚染も破壊した。マッシングの終了時、マッシュを冷却し、３５０ｇにメークアップし、ろ過した。濾液用量を３０分後に計測し、ろ過された麦汁を比重測定のために試料採取した。最終麦汁は、１０５８．６の初期比重（すなわち１４．４１°Ｐｌａｔｏ）を有していた。６０ｍｌの麦汁をそれぞれの１００ｍｌフラスコ（発酵容器；ＦＶ）に添加し、次いで１８℃に冷却した。酵素を類似量のタンパク質（麦汁１ｍＬ当たり０．０５８ｍｇのＧＡ）または類似のβ−Ｄ−マルトシド活性（麦汁１ｍＬ当たり０．１６ＧＡＵ）に基づき投入した。
【０４８９】
以下の添加をフラスコに行った：
−  陰性対照フラスコは２ｍｌの滅菌水を受容した；
−  陽性対照フラスコは、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌにより供給される２ｍｌの希釈ＤＩＡＺＹＭＥ（登録商標）Ｘ４（クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の株に由来する濃縮グルコアミラーゼ）；トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｒｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（ＴｒＧＡ  ｗｔ）ろ過発酵ブロスからの２ｍｌの希釈野生型グルコアミラーゼ；およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｒｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（ＴｒＧＡ  ＣＳ４）ろ過発酵ブロスからの２ｍｌの希釈ＣＳ４グルコアミラーゼ変異体を受容した。
−  試験フラスコは、２ｍｌの３．５ｍｇ→２ｍｌの熱不安定グルコアミラーゼ変異体の希釈物を受容し、それはピッチング麦汁１ｈｌ当たりで添加されるグルコアミラーゼの量（ｍｇ）に関して陽性対照においてＤＩＡＺＹＭＥ（登録商標）Ｘ４について使用されるものと同一の添加率に相当した。
【０４９０】
それぞれのコニカルフラスコに新たに生産された酵母Ｗ３４／７０（Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ）を麦汁１００ｍＬ当たり０．６ｇの投入率において投入し、発酵を標準化実験室試験条件下で進行させた（１８．５℃の上昇温度、１５０ｒｐｍの穏やかな撹拌、オービタルインキュベーター中、最大８８時間）。それぞれのフラスコを重量損失および比重に関して計画的な間隔において分析した一方、真正発酵度（ＲＤＦ、これは割合の形態で表現される真正希薄度）を最終発酵麦汁（ビール）について算出した。発酵前、その間およびその後の麦汁の比重は、比重計またはＡｎｔｏｎ−Ｐａａｒ密度計（例えばＤＭＡ４１００Ｍ）を使用して計測し、真正希薄度はＥｎｓｍｉｎｇｅｒにより列記された式に従ってＲＤＦとして割合の形態で算出および表現した（ｈｔｔｐ：／／ｈｂｄ．ｏｒｇ／ｅｎｓｍｉｎｇｒ／“Ｂｅｅｒ  ｄａｔａ：Ａｌｃｏｈｏｌ，Ｃａｌｏｒｉｅ，ａｎｄ  Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｂｅｅｒ”を参照のこと）。発酵の間の重量損失のモニタリングは、ＣＯ２進化およびしたがってエタノール形成の間接的尺度を提供する。
【０４９１】
残留活性は、発酵前後で計測した。エタノールの生産は、発酵物の重量損失により間接的に計測した。アルコールはＡｎｔｏｎ−Ｐａａｒ上で計測した。
【０４９２】
麦芽−副原料醸造分析
副原料としてコーン（トウモロコシ）グリストを使用する改変デコクションマッシングを用いた。醸造プロトコルは、米国特許出願公開第２００９０１４２４７号明細書から改変した。麦芽の４０％を、１２．６％の含水率を有するコーン（トウモロコシ）グリスト（Ｂｅｎｎｔａｇ  Ｎｏｒｄｉｃ；Ｎｏｒｄｇｅｔｒｅｉｄｅ  ＧｍＢＨ  Ｌｕｅｂｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により置換した。全てのコーン（トウモロコシ）グリストを、５４％の水および５％の麦芽（溶けが十分なピルスナー麦芽；Ｆｕｇｌｓａｎｇ  Ｄｅｎｍａｒｋ）と一緒に１００℃に２℃／分において加熱した。５分間のレストを７２℃および８０℃において保持し、１０分間のレストを１００℃において保持した。その後、副原料を６４℃に冷却し、同様に６４℃において主マッシュと合わせた。この段階において酵素を添加し、６４℃のレストを２５０分間に拡張した。発酵後、ＲＤＦ値を決定した。
【０４９３】
真正発酵度（ＲＤＦ）値は、以下の式に従って算出することができる：
【数４】
2015526090.tif 000016
ＲＥ＝真正エキス＝（０．１８０８×°Ｐ初期）＋（０．８１９２×°Ｐ最終）、°Ｐ初期は発酵前の標準化麦汁の比重であり、°Ｐ最終は発酵麦汁の比重であり、ｐｌａｔｏ度で表現する。
【０４９４】
本文脈に関して、真正発酵度（ＲＤＦ）は、比重およびアルコール濃度から決定した。
【０４９５】
比重およびアルコール濃度は、発酵物に対してＢｅｅｒ  Ａｌｃｏｌｙｚｅｒ  ＰｌｕｓおよびＤＭＡ  ５０００密度計（両方ともＡｎｔｏｎ  Ｐａａｒ，Ｇｒａｔｚ，Ａｕｓｔｒｉａ製）を使用して測定した。これらの計測値に基づき、真正発酵度（ＲＤＦ）値を以下の式に従って算出した：
【数５】
2015526090.tif 000017
Ｅ（ｒ）は、Ｐｌａｔｏ度（°Ｐ）での真正エキスであり、ＯＥは、°Ｐでの原麦汁エキスである。
【０４９６】
実施例１
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）中での発現のためのｐＴＴＴベクター中でのＴｒＧＡ変異体の構築
（米国特許出願公開第２０１１００２０８９９号明細書、米国特許出願公開第２０１１００１４６８１号明細書）に記載のとおり、ＴｒＧＡ  ｗｔおよびＴｒＧＡ  ＣＳ４変異体（配列番号２および配列番号１３）をコードするヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）（アナモルフはトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ））最適化ｃＤＮＡ配列（配列番号３０および配列番号３１）を、ｐＤＯＮＲ（商標）２０１中にＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＢＰ組換え反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を介してクローニングし、エントリーベクターｐＥｎｔｒｙ−ＣＳ４およびｐＥｎｔｒｙ−ＧＡ（図１）をもたらした。Ｈ．ジェコリナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）中でのタンパク質の発現を可能とするため、ＴｒＧＡ  ＣＳ４／ＧＡ  ｗｔコード配列をＧａｔｅｗａｙ適合性デスティネーションベクターｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３またはｐＴＴＴ−ｐｙｒ２中にＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ組換え反応を介してクローニングした。
【０４９７】
ｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３ベクターは、国際公開第２０１０１４１７７９Ａ１号パンフレットに記載された。このベクターは、関心対象の遺伝子の強力な誘導性発現を可能とするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩ由来プロモーターおよびターミネーター領域、ウリジン不存在下で唯一の窒素源としてのアセトアミド上での形質転換体の生育を付与するアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳおよびｐｙｒＧ選択マーカーならびに真菌細胞中での非染色体プラスミド維持を可能とするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）テロメア領域を含有する。ｃｂｈＩプロモーターおよびターミネーター領域は、バクテリオファージラムダに基づく特異的組換え部位ａｔｔＲ１、ａｔｔＲ２によりフランキングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子ＣｍＲおよび致死性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ｃｃｄＢにより離隔されている。このような構成は、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ組換え反応を介して右向きにおけるｃｂｈＩ調節エレメントの制御下でＴｒＧＡ遺伝子を含有する組換え体の直接的な選択を可能とする。ｐＴＴＴ−ｐｙｒ２デスティネーションベクターは、ｐｙｒＧがＨ．ウリジンの不存在下で生育するジェコリナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ウリジン栄養要求能を付与するＨ．ジェコリナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ｐｒｙ２遺伝子により置き換えられたｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３の誘導体である。最終発現ベクターｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−ＧＡＣＳ４およびｐＴＴＴｐｙｒ２−ＧＡＣＳ４を図２に示す。
【０４９８】
ｐＥｎｔｒｙ−ＣＳ４およびｐＥｎｔｒｙ−ＧＡ  ｗｔプラスミドを、ＢＡＳＥＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により構築された組換え突然変異誘発のためのテンプレートとして使用した。成熟ＴｒＧＡ  ｗｔ（配列番号２）および成熟ＴｒＧＡ  ＣＳ４変異体（配列番号１３）における特異的単一およびコンビナトリアル変異体の生成のため、表１に示されるとおり販売会社に要求した。ＴｒＧＡ−ＣＳ４変異体は、ＴｒＧＡ（ｗｔ）と比較して以下の突然変異Ｌ４１７Ｖ−Ｔ４３０Ａ−Ｑ５１１Ｈ−Ａ５３９Ｒ−Ｎ５６３Ｉを含む。
【０４９９】
【表１１】
2015526090.tif 000018
【０５００】
実施例２
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）中へのＴｒＧＡ変異体の形質転換
ＰＥＧプロトプラスト法を使用してＴｒＧＡ変異体をＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中に形質転換した。配列分析により確認されたプラスミドＤＮＡをＢＡＳＥＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により提供し、以下の改変を有するＰＥＧ−プロトプラスト法（Ｐｅｎｔｔｉｌａｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅ  ６１：１５５−１６４）を使用して４つの遺伝子欠失（Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｅｇｌ１、Δｅｇｌ２、すなわち「四重欠失」；米国特許第５，８４７，２７６号明細書、国際公開第９２／０６１８４号パンフレットおよび国際公開第０５／００１０３６号パンフレットを参照のこと）を担持するＲＬ−Ｐ３７に由来するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主株中に個々に形質転換した。
【０５０１】
プロトプラスト調製のため、胞子をトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）最小培地（ＭＭ）（２０ｇ／Ｌのグルコース、１５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．５、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．６ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．６ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｍｌの１０００×Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量元素溶液｛５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、３．７ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ｝）中で１５０ｒｐｍにおいて振とうさせながら２４℃において１６〜２４時間生育させた。発芽胞子を遠心分離により収集し、１５ｍｇ／ｍｌのβ−Ｄ−グルカナーゼ−Ｇ（Ｉｎｔｅｒｓｐｅｘ−商品番号０４３９−１）溶液により処理して真菌細胞壁を溶解させた。プロトプラストのさらなる調製は、Ｐｅｎｔｔｉｌａｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７前掲）により記載される標準的方法により実施した。
【０５０２】
形質転換法は、１０分の１にスケールダウンさせた。一般に、２５μｌの総容量で最大６００ｎｇのＤＮＡおよび１〜５×１０５個のプロトプラストを含有する形質転換混合物は、２００ｍｌの２５％ＰＥＧ溶液により処理し、２容量の１．２Ｍソルビトール溶液により希釈し、アセトアミドを有する３％選択的上層アガロースＭＭと混合し（上記と同一の最小培地であるが、（ＮＨ４）２ＳＯ４を２０ｍＭのアセトアミドと置換した）、２４ウェルマイクロタイタープレートまたは４８ウェルに分割された２０×２０ｃｍのＱ−ｔｒａｙ中でアセトアミドを有する２％選択アガロース上に注いだ。プレートを２８℃において５〜８日間インキュベートした。それぞれの個々のウェル上で再生成された形質転換体の全集団からの胞子は、０．８５％のＮａＣｌ、０．０１５％のＴｗｅｅｎ  ８０の溶液を使用してプレートから収集した。胞子懸濁液を使用して９６ウェルＭＴＰ中で発酵物に接種した。２４ウェルＭＴＰの場合、選択アセトアミドＭＭを有する新たな２４ウェルＭＴＰ上での追加の平板培養工程を導入して胞子数を高めた。
【０５０３】
実施例３
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からのグルコアミラーゼ変異体（ＴｒＧＡ）の発酵ブロス中の酵素活性の分析
アッセイおよび方法の部に上記のとおり形質転換体を発酵させ、発現した変異体ＴｒＧＡタンパク質を含有する上清を種々の特性について試験した。
【０５０４】
手短に述べると、菌糸体を培養試料から遠心分離により除去し、アッセイおよび方法の部に上記のとおり上清を総タンパク質含有率（ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２３２２５）およびＧＡ活性について分析した。
【０５０５】
全ブロス試料のタンパク質プロファイルは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動）により決定した。培養上清の試料を、還元剤を有する等容量の５×試料ローディング緩衝液と混合し、１０分間煮沸し、ＮＵＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％ビストリスゲル上でＭＥＳ  ＳＤＳランニング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて分離した。ポリペプチドバンドをＳＤＳゲル中でＳＩＭＰＬＹＢＬＵＥ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて製造業者のプロトコルに従って可視化した。図３、４および５に示されるとおり、ＴｒＧＡ（ｗｔ）およびＴｒＧＡ−ＣＳ４骨格（ＣＳ４はＴｒＧＡ（ｗｔ）野生型と比較してＬ４１７Ｖ−Ｔ４３０Ａ−Ｑ５１１Ｈ−Ａ５３９Ｒ−Ｎ５６３Ｉを含む）の両方からのトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）変異体の発酵ブロスを分析した。トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｒｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）変異体の発酵ブロスのグルコアミラーゼ活性を計測し、表２に示す。
【０５０６】
【表１２】
2015526090.tif 000019
【０５０７】
ほとんどのトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）変異体の発酵ブロスは、ＴｒＧＡ（ｗｔ）グルコアミラーゼのサイズ（６４ｋＤａ）において濃いタンパク質バンドを示した。しかしながら、様々な変異体の発現レベルおよびさらには計測されたＧＡＵ活性の大きい変動が発酵ブロス間で見られた。発酵ブロスの総ＧＡＵ活性と、総タンパク質含有率とを比較すると、見かけの比活性は、最大の比活性を有する変異体から最小の比活性を有する変異体まで５２倍変動することがわかった。したがって、ある部位を含む突然変異のいくつかの組合せは、発現性またはＧＡＵ活性のいずれかに関して破壊的であり、醸造分析を除外した。
【０５０８】
一工程β−シクロデキストリンクロマトグラフィーからの精製Ｒ＿Ｃ＿１およびＲ＿Ｃ＿２変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図５に示す。全ての精製変異体を、２５ｍＭの酢酸Ｎａ  ｐＨ４．３（Ｓｉｇｍａ，２８７０５）により平衡化されたＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７−０８５１−０１）上で脱塩して残留α−シクロデキストリンのいかなる阻害も回避した。
【０５０９】
実施例４
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からのグルコアミラーゼ変異体（ＴｒＧＡ）の熱安定性アッセイ
熱安定性は、上記アッセイ「熱安定性アッセイ」に従って計測した。
【０５１０】
熱安定性アッセイの結果を、ラージスケールの発現および発酵についての初期スクリーンから選択された変異体：ＣＰＳ３−Ｂ０１、ＣＰＳ２−Ｆ０７、ＣＰＳ２−Ａ１２、ＣＰＳ２−Ｆ０５、ＣＰＳ２−Ｄ１１、ＣＰＳ２−Ｆ０９、ＣＰＳ２−Ｅ０８、Ｒ＿Ａ＿１、Ｒ＿Ａ＿２、Ｒ＿Ａ＿６、Ｒ＿Ａ＿７、Ｒ＿Ｃ＿１、Ｒ＿Ｃ＿２、Ｒ＿Ｃ＿５、Ｒ＿Ｃ＿７、Ｒ＿Ｃ＿１２、Ｒ＿Ｃ＿１３、Ｒ＿Ｃ＿２２、Ｒ＿Ｄ＿２、Ｒ＿Ｄ＿３およびＲ＿Ｄ＿５についての残留活性により表３に示す。親分子（ＴｒＧＡ−ｗｔおよびＴｒＧＡ−ＣＳ４）は、記載の条件下で１００秒間の低温殺菌後にそれぞれ２４および３８％の残留活性を示した。クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）からのグルコアミラーゼＤＩＡＺＹＭＥ（登録商標）Ｘ４をベンチマークのために含め、それは１００秒間のインキュベーション後に４５％の残留活性を示した。使用材料は、精製脱塩タンパク質であった（２５ｍＭの酢酸Ｎａ  ｐＨ４．３）。残留活性は、７２℃におけるレギュラーガス抜きピルスナー（Ｒｏｙａｌ  Ｅｘｐｏｒｔ  Ｐｉｌｓｎｅｒ）ｐＨ（４．５）中での増加（最大１００秒間）インキュベーション前後のＧＡＵ活性（ｐＮＰ−β−マルトシド基質）に基づき算出した。残留活性をインキュベーション時間：０、１０、２０、３０、４０、５０、７０および１００秒間および対応する低温殺菌単位：０．０、０．０、０．０、０．２、１．６、４．０、１６．８および４２．６ＰＵの関数として示す。ＦＶ適用のための関連変異体の選択は、１６．８ＰＵにより完全に不活化された変異体のセットと定義した。これは以下の関心対象の１４種の変異体を残した：ＣＰＳ３−Ｂ０１、ＣＰＳ２−Ｆ０７、ＣＰＳ２−Ａ１２、ＣＰＳ２−Ｆ０５、ＣＰＳ２−Ｄ１１、Ｒ＿Ａ＿１、Ｒ＿Ａ＿６、Ｒ＿Ｃ＿１、Ｒ＿Ｃ＿２、Ｒ＿Ｃ＿５、Ｒ＿Ｃ＿７、Ｒ＿Ｃ＿１３およびＲ＿Ｃ＿２２。
【０５１１】
ビールの種類、原料および微生物汚染、醸造業者およびビール風味に対する知覚効果に応じて様々な最小ＰＵを使用することができる。典型的には、ビール低温殺菌に１４〜１６ＰＵが要求される。低温殺菌装置に応じて、低温殺菌温度は典型的には６４〜７２摂氏度の範囲であり、低温殺菌時間はそれに応じて算出される。さらなる情報は、“Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｌｔｉｎｇ“ｂｙ  Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｋｕｎｚｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅａｃｈｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（ＶＬＢ），３ｒｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００４，ＩＳＢＮ  ３−９２１６９０−４９−８に見出すことができる。
【０５１２】
比較において、熱安定性を、上記のとおりレギュラーガス抜きピルスナー（Ｒｏｙａｌ  Ｅｘｐｏｒｔ  Ｐｉｌｓｎｅｒ）ｐＨ（４．５）中でＭｋＧＡ  Ｉ、ＭｋＧＡ  ＩＩ、ＤＩＡＺＹＭＥ（登録商標）Ｘ４（ＡｎＧＡ）、ＴｒＧＡ（ｗｔ）およびＴｒＧＡ−ＣＳ４について決定した。ＳＤＢを欠くトランケートグルコアミラーゼＭｋＧＡ  Ｉは、２６低温殺菌単位（ＰＵ）未満により７２℃の低温殺菌温度を使用して完全に不活化され（欧州特許第１２１５１２８５．９号明細書に既に記載）、ＭｋＧＡ  ＩＩは不活化に１００ＰＵを要求し、ＡｎＧＡおよびＴｒＧＡは２００ＰＵ超を必要とした。
【０５１３】
【表１３】
2015526090.tif 000020
【０５１４】
【表１４】
2015526090.tif 000021
【０５１５】
実施例５
醸造の発酵工程における発酵ブロスからのトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ変異体の使用
醸造分析：
麦汁炭水化物を糖化し、エタノール発酵を支持するためのＭ．カオリアング（Ｍ．ｋａｏｌｉａｎｇ）グルコアミラーゼの使用を、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）からのグルコアミラーゼ（ＡｎＧＡ）を含むＤＩＡＺＹＭＥ（登録商標）Ｘ４、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｒｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からの野生型グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ  ｗｔ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｒｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からのＣＳ４グルコアミラーゼ変異体（ＴｒＧＡ  ＣＳ４）および醸造における適用について既に調査されたモナスカス・カオリング（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｋａｏｌｉｎｇ）からの２つのグルコアミラーゼ（ＭｋＧＡＩおよびＭｋＧＡＩＩ）（欧州特許第１２１５１２８５．９号明細書）と比較した。発酵試験は、アッセイおよび方法の部に記載のとおりＭｕｎｔｏ’ｓ麦芽エキスから調製された麦汁を使用して実施した。発酵前、その間およびその後の麦汁の比重を、比重計またはＡｎｔｏｎ−Ｐａａｒ密度計（例えばＤＭＡ４１００Ｍ）を使用して計測し、真正希薄度をＥｎｓｍｉｎｇｅｒにより列記された式に従ってＲＤＦとして割合の形態で算出および表現した（ｈｔｔｐ：／／ｈｂｄ．ｏｒｇ／ｅｎｓｍｉｎｇｒ／“Ｂｅｅｒ  ｄａｔａ：Ａｌｃｏｈｏｌ，Ｃａｌｏｒｉｅ，ａｎｄ  Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｂｅｅｒ”を参照のこと）。酵素をタンパク質１ｍｇに基づき投入した場合（麦汁１ｍｌ当たり０．０５８ｍｇのＧＡ）に得られたＲＤＦ値を表４に示す。
【０５１６】
【表１５】
2015526090.tif 000022
【０５１７】
いくつかの変異体は、参照（ＴｒＧＡ（ｗｔ）、ＴｒＧＡ（ＣＳ４）およびＤｉａｘｙｍｅ（登録商標）Ｘ４）と標準誤差内で類似の性能を示したが、コンビナトリアル変異体の一部については有意差も見られた。特に、多数のコンビナトリアル変異体は、顕著に減少した性能（減少したＲＤＦ％）を示し、それらの性能はＧＡＵ活性に基づき投入された場合にも低下したため、それは基質特異性の変化に従い得る（ＣＰＳ３  Ｂ０１、ＣＰＳ２  Ｅ０８、ＣＰＳ２  Ｆ０９、Ｒ＿Ａ＿２、Ｒ＿Ａ＿７、Ｒ＿Ｃ＿２、Ｒ＿Ｃ＿５、Ｒ＿Ｃ＿７およびＲ＿Ｃ＿１２）。残りの９種のＧＡ（ＣＰＳ２−Ａ１２、ＣＰＳ２−Ｆ０５、ＣＰＳ２−Ｄ１１、ＣＰＳ２−Ｆ０７、Ｒ＿Ａ＿１、Ｒ＿Ａ＿６、Ｒ＿Ｃ＿１、Ｒ＿Ｃ＿１３およびＲ＿Ｃ＿２２）は、参照（ＴｒＧＡ  ｗｔ、ＴｒＧＡ  ＣＳ４およびＤｉａｘｙｍｅ（登録商標）Ｘ４）により得られたものと同等／類似のＲＤＦ値を生産した。試験されたコンビナトリアル変異体のいずれも、参照（ＴｒＧＡ（ｗｔ）、ＴｒＧＡ−ＣＳ４およびＤｉａｘｙｍｅ（登録商標）Ｘ４）およびさらにはモナスカス・カオリアング（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｋａｏｌｉａｎｇ）からのグルコアミラーゼ（ＭｋＧＡＩおよびＭｋＧＡＩＩ）により得られたＲＤＦと比較してＲＤＦ値を顕著に増加させなかった。ＦＶ適用のための関連変異体の選択は、麦汁１ｍｌ当たり０．０５８ｍｇのＧＡにおいて投入された場合に最小でも７４．５のＲＤＦ値を生産する変異体のセットと定義した。これは、以下の９種の関心対象の変異体を残す：ＣＰＳ２−Ａ１２、ＣＰＳ２−Ｆ０５、ＣＰＳ２−Ｄ１１、ＣＰＳ２−Ｆ０７、Ｒ＿Ａ＿１、Ｒ＿Ａ＿６、Ｒ＿Ｃ＿１、Ｒ＿Ｃ＿１３およびＲ＿Ｃ＿２２。
【０５１８】
ＦＶ中で機能的であるこの９種の変異体のセットは、それら全てが上記の「熱安定性アッセイ」による熱不安定性に関して興味深いものであった。それぞれの変異体は、１６．８ＰＵにより完全に不活化することができ、所与の条件セット下でＦＶ中で麦汁１ｍｌ当たり０．０５８ｍｇのＧＡにおいて投入された場合に最小でも７４．５のＲＤＦ値を生産する。
【０５１９】
これらの９種の変異体は、熱不安定性および糖化性能の両方のスクリーニングにおけるいわゆるウイナーヒット（ｗｉｎｎｅｒ  ｈｉｔ）であった。
【０５２０】
配列
参照により全体として本明細書に援用される配列を以下に示す。
【０５２１】
配列番号１：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ、全長；シグナルペプチドを有する
【化１】
2015526090.tif 000023
【０５２２】
【化２】
2015526090.tif 000024
【０５２３】
配列番号２：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ、成熟タンパク質；シグナルペプチドを有さない
【化３】
2015526090.tif 000025
【０５２４】
【化４】
2015526090.tif 000026
【０５２５】
【化５】
2015526090.tif 000027
【０５２６】
配列番号３：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ触媒ドメイン、成熟ＴｒＧＡの１−４５３、ＣＤ
【化６】
2015526090.tif 000028
【０５２７】
配列番号４：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼｃＤＮＡ
【化７】
2015526090.tif 000029
【０５２８】
配列番号５：アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）ＧＡ（ＡａＧＡ）；ＣＤ
【化８】
2015526090.tif 000030
【０５２９】
配列番号６：クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（ＡｎＧＡ）、ＣＤ
【化９】
2015526090.tif 000031
【０５３０】
配列番号７：ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（ＡｏＧＡ）、ＣＤ
【化１０】
2015526090.tif 000032
【０５３１】
配列番号８：フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）グルコアミラーゼ（ＨｇＧＡ）；ＣＤ
【化１１】
2015526090.tif 000033
【０５３２】
配列番号９：ヒポクレア・ビノサ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｖｉｎｏｓａ）グルコアミラーゼ（ＨｖＧＡ）；ＣＤ
【化１２】
2015526090.tif 000034
【０５３３】
配列番号１０：ＴｒＧＡ、リンカー領域
【化１３】
2015526090.tif 000035
【０５３４】
配列番号１１：ＴｒＧＡ、ＳＢＤ
【化１４】
2015526090.tif 000036
【０５３５】
配列番号１２    ＳＶＤＤＦＩ：ＴｒＧＡ成熟タンパク質の開始点
【化１５】
2015526090.tif 000037
【０５３６】
配列番号１３：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼＣＳ４変異体、成熟タンパク質；シグナルペプチドを有さない
【化１６】
2015526090.tif 000038
【０５３７】
配列番号１４：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼＲ＿Ａ＿１変異体、成熟タンパク質；シグナルペプチドを有さない
【化１７】
2015526090.tif 000039
【０５３８】
配列番号１５：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼＲ＿Ｃ＿１変異体、成熟タンパク質；シグナルペプチドを有さない
【化１８】
2015526090.tif 000040
【０５３９】
配列番号１６：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼＲ＿Ａ＿６変異体、成熟タンパク質；シグナルペプチドを有さない
【化１９】
2015526090.tif 000041
【０５４０】
配列番号１７：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼＲ＿Ｃ＿１３変異体、成熟タンパク質；シグナルペプチドを有さない
【化２０】
2015526090.tif 000042
【０５４１】
配列番号１８：アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ＡａＧＡ）、成熟全長、シグナルペプチドを有さない
【化２１】
2015526090.tif 000043
【０５４２】
配列番号１９：クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ（ＡｎＧＡ）、成熟全長、シグナルペプチドを有さない
【化２２】
2015526090.tif 000044
【０５４３】
配列番号２０：ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼ（ＡｏＧＡ）、成熟全長、シグナルペプチドを有さない
【化２３】
2015526090.tif 000045
【０５４４】
配列番号２１：フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）グルコアミラーゼ（ＨｇＧＡ）、成熟全長、シグナルペプチドを有さない
【化２４】
2015526090.tif 000046
【０５４５】
配列番号２２：ヒポクレア・ビノサ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｖｉｎｏｓａ）グルコアミラー
ゼ（ＨｖＧＡ）、成熟全長、シグナルペプチドを有さない
【化２５】
2015526090.tif 000047
【０５４６】
配列番号２３：タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）ＧＡ、成熟タンパク質
【化２６】
2015526090.tif 000048
【０５４７】
【化２７】
2015526090.tif 000049
【０５４８】
配列番号２４：フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）ＧＡ、ＳＢＤ
【化２８】
2015526090.tif 000050
【０５４９】
配列番号２５：サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）ＧＡ、ＳＢＤ
【化２９】
2015526090.tif 000051
【０５５０】
配列番号２６：タラロミセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）ＧＡ、ＳＢＤ
【化３０】
2015526090.tif 000052
【０５５１】
配列番号２７：クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＡ、ＳＢＤ
【化３１】
2015526090.tif 000053
【０５５２】
配列番号２８：アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）ＧＡ、ＳＢＤ
【化３２】
2015526090.tif 000054
【０５５３】
配列番号２９：チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）ＧＡ、ＳＢＤ
【化３３】
2015526090.tif 000055
【０５５４】
配列番号３０：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｗｔグルコアミラーゼ最適化ｃＤＮＡ（２５３５ｂｐ−４４３３ｂｐ、ダイレクト）１８９９ｂｐ（ｐＥｎｔｒｙ−ＧＡ  ＷＴ）
【化３４】
2015526090.tif 000056
【０５５５】
配列番号３１：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＣＳ４変異体グルコアミラーゼ最適化ｃＤＮＡ（２５３５ｂｐ−４４３３ｂｐ、ダイレクト）１８９９ｂｐ（ｐＥｎｔｒｙ−ＧＡ  ＣＳ４）
【化３５】
2015526090.tif 000057
【０５５６】
上記の出願およびそこで引用されまたはその審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）ならびに出願引用文献に引用または参照される全ての文献ならびに本明細書において引用または参照される全ての文献（「本明細書引用文献」）ならびに本明細書引用文献において引用または参照される全ての文献は、本明細書または参照により本明細書に援用される任意の文献において挙げられる任意の生産物についての任意の製造業者の指示書、説明書、生産物明細および生産物シートと一緒に、参照により本明細書に援用され、本発明の実施において用いることができる。
【０５５７】
記載される実施形態の種々の改変形態および変形形態は、それらの実施形態の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者に明らかである。特許請求される主題は、そのような具体的な実施形態に不当に限定されるべきでないことが理解されたい。実際、当業者に明白な実施形態を実施するために記載される方式の種々の改変形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図１０Ａ−１】
2015526090.tif 000058
【図１０Ａ−２】
2015526090.tif 000059
【図１０Ａ−３】
2015526090.tif 000060
【図１０Ｂ−１】
2015526090.tif 000061
【図１０Ｂ−２】
2015526090.tif 000062
【図１０Ｃ】
2015526090.tif 000063
【図１０Ｄ−１】
2015526090.tif 000064
【図１０Ｄ−２】
2015526090.tif 000065
【図１０Ｅ−１】
2015526090.tif 000066
【図１０Ｅ−２】
2015526090.tif 000067
【図１−１】
2015526090.tif 000068
【図１−２】
2015526090.tif 000069
【図２】
2015526090.tif 000070
【図３】
2015526090.tif 000071
【図４】
2015526090.tif 000072
【図５】
2015526090.tif 000073
【図６Ａ】
2015526090.tif 000074
【図６Ｂ】
2015526090.tif 000075
【図７】
2015526090.tif 000076
【図８】
2015526090.tif 000077
【図９】
2015526090.tif 000078
【配列表】
2015526090000001.app
【国際調査報告】
2015526090.tif 000079
2015526090.tif 000080
2015526090.tif 000081
2015526090.tif 000082
2015526090.tif 000083
2015526090.tif 000084
2015526090.tif 000085