(57)【要約】本発明は、pH可変式高活性化型多色蛍光ナノプラットフォームに関連し、かつ基本的な細胞生理的プロセス、例えば、エンドサイトーシス小胞中のpH調節、エンドソーム／リソソーム成熟、受容体サイクリングおよび細胞内オルガネラの輸送に対するpHの効果の研究を含むがこれらに限定されない様々な適用において、該ナノプラットフォームを使用する方法に関連する。2015518145.tif 000056
2015518145.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1ナノ粒子の集団と第2ナノ粒子の集団とを含む、pH応答性システムであって、
第1ナノ粒子が、(i)親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含む第1ブロックコポリマーおよび(ii)第1蛍光色素を含み、さらに、第1ナノ粒子が、第1pH転移点および第1発光スペクトルを有し；かつ
第2ナノ粒子が、(i)親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含む第2ブロックコポリマーおよび(ii)第2蛍光色素を含み、さらに、第2ナノ粒子が、第1ナノ粒子の第1pH転移点と異なる第2pH転移点および第1ナノ粒子の第1発光スペクトルと異なる第2発光スペクトルを有する、
pH応答性システム。
【請求項２】
少なくとも第3ナノ粒子の集団をさらに含むpH応答性システムであって、第3ナノ粒子が、(i)親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含む第3ブロックコポリマーおよび(ii)第3蛍光色素を含み、さらに、第3ナノ粒子が、第1および第2ナノ粒子のpH転移点と異なる第3pH転移点ならびに第1および第2ナノ粒子の発光スペクトルと異なる第3発光スペクトルを有する、請求項1に記載のpH応答性システム。
【請求項３】
少なくとも第4ナノ粒子の集団をさらに含むpH応答性システムであって、第4ナノ粒子が、(i)親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含む第4ブロックコポリマーおよび(ii)第4蛍光色素を含み、さらに、第4ナノ粒子が、第1、第2、および第3ナノ粒子のpH転移点と異なる第4pH転移点ならびに第1、第2、および第3ナノ粒子の発光スペクトルと異なる第4発光スペクトルを有する、請求項2に記載のpH応答性システム。
【請求項４】
親水性ポリマーセグメントが、ポリ(エチレンオキシド)（PEO）、ポリ(メタクリレートホスファチジルコリン)（MPC）、およびポリビニルピロリドン（PVP）からなる群より選択される、請求項1に記載のpH応答性システム。
【請求項５】
疎水性ポリマーセグメントが、ポリ(2-(ジイソプロピルアミノ)エチルメタクリレート)（PDPA）、ポリ(2-(ジブチルアミノ)エチルメタクリレート)（PDBA）、ポリ(2-(ヘキサメチレンイミノ)エチルメタクリレート)（PC7A）、およびポリ(2-(ペンタメチレンイミノ)エチルメタクリレート)（PC6A）からなる群より選択される、請求項1に記載のpH応答性システム。
【請求項６】
第1および第2ナノ粒子が、PEO114-b-P(DPA75-co-AMA6)、MAL-PEO114-b-PDPA88、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA6)、PEO114-b-P(DPA74-co-AMA1)、PEO114-b-P(DPA77-co-AMA3)、PEO114-b-P(DPA80-co-AMA6)、PEO114-b-P(DBA65-co-AMA3)、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA3)、およびPEO114-b-P(C6A81-co-AMA3)からなる群より選択される前駆体コポリマーから合成される、請求項1に記載のpH応答性システム。
【請求項７】
第1または第2ナノ粒子の少なくとも一方のブロックコポリマーが、異なる疎水性を有する少なくとも2種のモノマーを含む、請求項1に記載のpH応答性システム。
【請求項８】
第1および第2ナノ粒子のブロックコポリマーが、異なる疎水性を有する異なるモル分率の少なくとも2種のモノマーを含む、請求項1に記載のpH応答性システム。
【請求項９】
第1および第2蛍光色素がpH非感受性蛍光色素である、請求項1に記載のpH応答性システム。
【請求項１０】
第1および第2蛍光色素がΔλ＜40 nmのストークスシフトを有する、請求項1に記載のpH応答性システム。
【請求項１１】
第1および第2蛍光色素が、ローダミン、BODIPY、クマリン、およびシアニン色素からなる群より選択される、請求項1に記載のpH応答性システム。
【請求項１２】
第1および第2ナノ粒子が、PDBA-BDY、PDPA-TMR、PDPA-C55、PC7A-C55、PC6A-C75、およびPDPA-CMNからなる群より選択される、請求項1に記載のpH応答性システム。
【請求項１３】
第1、第2、第3、および第4ナノ粒子が、PDBA-BDY、PDPA-TMR、PC7A-C55、およびPC6A-C75である、請求項3に記載のpH応答性システム。
【請求項１４】
第1および第2ナノ粒子のpH転移点がpH 5.0〜pH 8.0である、請求項1に記載のpH応答性システム。
【請求項１５】
第1および第2ナノ粒子のpH転移点がpH 5.7〜pH 6.9である、請求項1に記載のpH応答性システム。
【請求項１６】
第1および第2ナノ粒子のpH転移点が、pH 5.2、6.4、6.9、および7.2からなる群より選択される、請求項14に記載のpH応答性システム。
【請求項１７】
第1および第2ナノ粒子のpH転移点が、pH 6.42、6.18、5.94、および5.7からなる群より選択される、請求項14に記載のpH応答性システム。
【請求項１８】
第1ナノ粒子の集団が約pH 6.21のpH転移点を有し、かつ第2ナノ粒子の集団が約pH 6.9のpH転移点を有する、請求項14に記載のpH応答性システム。
【請求項１９】
第1および第2ナノ粒子の発光スペクトルが500〜820 nmである、請求項1に記載のpH応答性システム。
【請求項２０】
第1および第2ナノ粒子のpH応答（ΔpH10-90%）が1 pH単位未満である、請求項1に記載のpH応答性システム。
【請求項２１】
第1および第2ナノ粒子のpH応答（ΔpH10-90%）が0.25 pH単位未満である、請求項1に記載のpH応答性システム。
【請求項２２】
第1および第2ナノ粒子の少なくとも一方が標的指向部分をさらに含む、請求項1に記載のpH応答性システム。
【請求項２３】
標的指向部分が抗体または抗体断片である、請求項22に記載のpH応答性システム。
【請求項２４】
抗体がセツキシマブである、請求項23に記載のpH応答性システム。
【請求項２５】
抗体断片がセツキシマブのFab'断片である、請求項23に記載のpH応答性システム。
【請求項２６】
標的指向部分が細胞表面受容体に結合する、請求項22に記載のpH応答性システム。
【請求項２７】
標的指向部分がシグナルペプチドである、請求項22に記載のpH応答性システム。
【請求項２８】
シグナルペプチドが環状アルギニン-グリシン-アスパラギン酸ペプチド（cRGD）ペプチドである、請求項27に記載のpH応答性システム。
【請求項２９】
シグナルペプチドが、ナノ粒子を核、ミトコンドリア、小胞体、葉緑体、アポプラスト、またはペルオキシソームへと方向付ける、請求項27に記載のpH応答性システム。
【請求項３０】
標的指向部分が小分子である、請求項22に記載のpH応答性システム。
【請求項３１】
小分子が葉酸である、請求項30に記載のpH応答性システム。
【請求項３２】
ブロックコポリマーと蛍光色素とを有する単一のナノ粒子を含むpH応答性システムであって、さらに、該ナノ粒子の集団がpH転移点および発光スペクトルを示す、pH応答性システム。
【請求項３３】
標的指向部分をさらに含む、請求項32に記載のpH応答性システム。
【請求項３４】
少なくとも2つまたは3つのナノ粒子集団のシリーズを含む組成物であって、各ナノ粒子集団がpH転移点および発光スペクトルを有し、該シリーズ中の各ナノ粒子集団のpH転移点および発光スペクトルが、該シリーズ中の他のナノ粒子集団のpH転移点および発光スペクトルと異なる、組成物。
【請求項３５】
少なくとも2つまたは3つのナノ粒子集団が、
a)式
2015518145.tif 000046
に記載のポリマー；
b)式A1に記載のモノマー；および
c)式A2に記載のモノマー
を含むコポリマー、またはその薬学的に許容される塩；ならびにその立体異性体、同位体変種および互変異性体から合成され；
各A1およびA2は、独立して、
2015518145.tif 000047
より選択され、
各R1aは、独立して、H、置換もしくは非置換アルキル、または
2015518145.tif 000048
であり；
各R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R4c、R4d、およびR5は、独立して、Hまたは置換もしくは非置換アルキルであり；
各R6aおよびR6bは、独立して、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであるか；またはR6aおよびR6bは、それらが結合しているN原子と一緒になってヘテロ環を形成し；
R7は色素を含む部分であり；
下付き文字nは10〜200の整数であり；
かつ該コポリマーがランダムコポリマーである、
請求項34に記載の組成物。
【請求項３６】
A1が式
2015518145.tif 000049
を有する、請求項35に記載の組成物。
【請求項３７】
A2が式
2015518145.tif 000050
を有する、請求項35に記載の組成物。
【請求項３８】
少なくとも2つまたは3つのナノ粒子集団が、PEO114-b-P(DPA75-co-AMA6)、MAL-PEO114-b-PDPA88、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA6)、PEO114-b-P(DPA74-co-AMA1)、PEO114-b-P(DPA77-co-AMA3)、PEO114-b-P(DPA80-co-AMA6)、PEO114-b-P(DBA65-co-AMA3)、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA3)、およびPEO114-b-P(C6A81-co-AMA3)からなる群より選択される前駆体コポリマーから合成される、請求項34に記載の組成物。
【請求項３９】
少なくとも2つまたは3つのナノ粒子集団が、異なる疎水性を有する異なるモル分率の少なくとも2種のモノマーを含むブロックコポリマーを含む、請求項34に記載の組成物。
【請求項４０】
ナノ粒子集団がマレイミド含有コポリマーを約10%含有する、請求項34に記載の組成物。
【請求項４１】
少なくとも2つまたは3つのナノ粒子集団が、Δλ＜40 nmのストークスシフトを有するpH非感受性蛍光色素を含む、請求項34に記載の組成物。
【請求項４２】
少なくとも2つまたは3つのナノ粒子集団が、PDBA-BDY、PDPA-TMR、PDPA-C55、PC7A-C55、PC6A-C75、またはPDPA-CMNを含む、請求項34に記載の組成物。
【請求項４３】
PDBA-BDYナノ粒子集団、PDPA-TMRナノ粒子集団、およびPC7A-C55ナノ粒子集団を含む、請求項34に記載の組成物。
【請求項４４】
前記シリーズのpH転移点がpH 5.0〜pH 8.0である、請求項34に記載の組成物。
【請求項４５】
前記シリーズのpH転移点がpH 5.7〜pH 6.9である、請求項34に記載の組成物。
【請求項４６】
第1ナノ粒子集団が約pH 5.2のpH転移点を有し、第2ナノ粒子集団が約pH 6.4のpH転移点を有し、かつ第3ナノ粒子集団が約pH 6.9のpH転移点を有する、請求項34に記載の組成物。
【請求項４７】
第1ナノ粒子集団が約pH 5.7のpH転移点を有し、第2ナノ粒子集団が約pH 5.94のpH転移点を有し、第3ナノ粒子集団が約pH 6.18のpH転移点を有し、かつ第4ナノ粒子集団が約6.42のpH転移点を有する、請求項34に記載の組成物。
【請求項４８】
第1ナノ粒子集団が約pH 6.21のpH転移点を有し、かつ第2ナノ粒子集団が約pH 6.9のpH転移点を有する、請求項34に記載の組成物。
【請求項４９】
前記シリーズの発光スペクトルが500〜820 nmである、請求項34に記載の組成物。
【請求項５０】
前記シリーズのpH応答（ΔpH10-90%）が1 pH単位未満である、請求項34に記載の組成物。
【請求項５１】
前記シリーズのpH応答（ΔpH10-90%）が0.25 pH単位未満である、請求項34に記載の組成物。
【請求項５２】
ナノ粒子のうちの少なくとも1種が標的指向部分をさらに含む、請求項34に記載の組成物。
【請求項５３】
標的指向部分が抗体または抗体断片である、請求項52に記載の組成物。
【請求項５４】
抗体がセツキシマブである、請求項53に記載の組成物。
【請求項５５】
抗体断片がセツキシマブのFab'断片である、請求項53に記載の組成物。
【請求項５６】
標的指向部分が細胞表面受容体に結合する、請求項52に記載の組成物。
【請求項５７】
標的指向部分がシグナルペプチドである、請求項52に記載の組成物。
【請求項５８】
シグナルペプチドがcRGDペプチドである、請求項57に記載の組成物。
【請求項５９】
シグナルペプチドが、ナノ粒子を核、ミトコンドリア、小胞体、葉緑体、アポプラスト、またはペルオキシソームへと方向付ける、請求項57に記載の組成物。
【請求項６０】
標的指向部分が小分子である、請求項52に記載の組成物。
【請求項６１】
小分子が葉酸である、請求項60に記載の組成物。
【請求項６２】
コポリマーと蛍光色素とを有する単一のナノ粒子をさらに含む組成物であって、さらに、該ナノ粒子の集団がpH転移点および発光スペクトルを示す、組成物。
【請求項６３】
標的指向部分をさらに含む、請求項62に記載の組成物。
【請求項６４】
少なくとも2つまたは3つのミセル集団を含む組成物であって、各ミセルがブロックコポリマーおよび蛍光色素を含み、さらに、各ミセル集団が、他のミセル集団のpH転移点および発光スペクトルと異なるpH転移点および発光スペクトルを有する、組成物。
【請求項６５】
少なくとも2つまたは3つのミセル集団が、
a)式
2015518145.tif 000051
に記載のポリマー；
b)式A1に記載のモノマー；および
c)式A2に記載のモノマー
を含むコポリマー、またはその薬学的に許容される塩；ならびにその立体異性体、同位体変種および互変異性体から合成され；
各A1およびA2は、独立して、
2015518145.tif 000052
より選択され、
各R1aは、独立して、H、置換もしくは非置換アルキル、または
2015518145.tif 000053
であり；
各R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R4c、R4d、およびR5は、独立して、Hまたは置換もしくは非置換アルキルであり；
各R6aおよびR6bは、独立して、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであるか；またはR6aおよびR6bは、それらが結合しているN原子と一緒になってヘテロ環を形成し；
R7は色素を含む部分であり；
下付き文字nは10〜200の整数であり；
かつ該コポリマーがランダムコポリマーである、
請求項64に記載の組成物。
【請求項６６】
A1が式
2015518145.tif 000054
を有する、請求項65に記載の組成物。
【請求項６７】
A2が式
2015518145.tif 000055
を有する、請求項65に記載の組成物。
【請求項６８】
少なくとも2つまたは3つのミセル集団が、PEO114-b-P(DPA75-co-AMA6)、MAL-PEO114-b-PDPA88、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA6)、PEO114-b-P(DPA74-co-AMA1)、PEO114-b-P(DPA77-co-AMA3)、PEO114-b-P(DPA80-co-AMA6)、PEO114-b-P(DBA65-co-AMA3)、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA3)、およびPEO114-b-P(C6A81-co-AMA3)からなる群より選択される前駆体コポリマーから合成される、請求項64に記載の組成物。
【請求項６９】
少なくとも2つまたは3つのミセル集団のうちの少なくとも1集団のブロックコポリマーが、異なる疎水性を有する少なくとも2種のモノマーを含む、請求項64に記載の組成物。
【請求項７０】
少なくとも2つまたは3つのミセル集団のブロックコポリマーが、異なる疎水性を有する異なるモル分率の少なくとも2種のモノマーを含む、請求項64に記載の組成物。
【請求項７１】
ナノ粒子集団がマレイミド含有コポリマーを約10%含有する、請求項64に記載の組成物。
【請求項７２】
蛍光色素が、Δλ＜40 nmのストークスシフトを有するpH非感受性蛍光色素である、請求項64に記載の組成物。
【請求項７３】
蛍光色素がΔλ＜40 nmのストークスシフトを有する、請求項64に記載の組成物。
【請求項７４】
少なくとも2つまたは3つのミセル集団が、PDBA-BDY、PDPA-TMR、PDPA-C55、PC7A-C55、PC6A-C75、またはPDPA-CMNを含む、請求項64に記載の組成物。
【請求項７５】
PDBA-BDYミセル集団、PDPA-TMRミセル集団、およびPC7A-C55ミセル集団を含む、請求項64に記載の組成物。
【請求項７６】
少なくとも2つまたは3つのミセル集団のpH転移点がpH 5.0〜pH 8.0である、請求項64に記載の組成物。
【請求項７７】
少なくとも2つまたは3つのミセル集団のpH転移点がpH 5.7〜pH 6.9である、請求項64に記載の組成物。
【請求項７８】
第1ミセル集団が約pH 5.2のpH転移点を有し、第2ミセル集団が約pH 6.4のpH転移点を有し、かつ第3ミセル集団が約pH 6.9のpH転移点を有する、請求項64に記載の組成物。
【請求項７９】
第1ミセル集団が約pH 5.7のpH転移点を有し、第2ミセル集団が約pH 5.94のpH転移点を有し、第3ミセル集団が約pH 6.18のpH転移点を有し、かつ第4ミセル集団が約pH 6.42のpH転移点を有する、請求項64に記載の組成物。
【請求項８０】
第1ミセル集団が約pH 6.21のpH転移点を有し、かつ第2ミセル集団が約pH 6.9のpH転移点を有する、請求項64に記載の組成物。
【請求項８１】
少なくとも2つまたは3つのミセル集団の発光スペクトルが500〜820 nmである、請求項64に記載の組成物。
【請求項８２】
少なくとも2つまたは3つのミセル集団のpH応答（ΔpH10-90%）が1 pH単位未満である、請求項64に記載の組成物。
【請求項８３】
少なくとも2つまたは3つのミセル集団のpH応答（ΔpH10-90%）が0.25 pH単位未満である、請求項64に記載の組成物。
【請求項８４】
ミセル集団のうちの少なくとも1集団のミセルが標的指向部分をさらに含む、請求項64に記載の組成物。
【請求項８５】
標的指向部分が抗体または抗体断片である、請求項84に記載の組成物。
【請求項８６】
抗体がセツキシマブである、請求項85に記載の組成物。
【請求項８７】
抗体断片がセツキシマブのFab'断片である、請求項85に記載の組成物。
【請求項８８】
標的指向部分が細胞表面受容体に結合する、請求項84に記載の組成物。
【請求項８９】
標的指向部分がシグナルペプチドである、請求項84に記載の組成物。
【請求項９０】
シグナルペプチドがcRGDペプチドである、請求項89に記載の組成物。
【請求項９１】
シグナルペプチドが、ナノ粒子を核、ミトコンドリア、小胞体、葉緑体、アポプラスト、またはペルオキシソームへと方向付ける、請求項89に記載の組成物。
【請求項９２】
標的指向部分が小分子である、請求項84に記載の組成物。
【請求項９３】
小分子が葉酸である、請求項92に記載の組成物。
【請求項９４】
ハイブリッドミセル集団をさらに含む組成物であって、該ミセルが2種以上のブロックコポリマーおよび2種以上の蛍光色素を含み、さらに、該ミセル集団が、2つ以上のpH転移点と、各pH転移点につき異なる発光スペクトルとを示す、請求項64に記載の組成物。
【請求項９５】
コポリマーと蛍光色素とを有する単一のミセルを含む組成物であって、さらに、該ミセルの集団がpH転移点および発光スペクトルを有する、組成物。
【請求項９６】
標的指向部分をさらに含む、請求項95に記載の組成物。
【請求項９７】
以下の工程を含む、細胞内pHをモニターする方法：
(a)細胞と、請求項64〜94のいずれか一項に記載の組成物とを接触させる工程；および
(b)細胞中の1種または複数種の蛍光シグナルを検出する工程であって、蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程。
【請求項９８】
細胞中の蛍光シグナルの分布を測定する工程をさらに含む、請求項97に記載の方法。
【請求項９９】
蛍光シグナルの分布が経時的に測定される、請求項98に記載の方法。
【請求項１００】
蛍光シグナルの分布が、少なくとも1時間から最大で12時間までの時間にわたって測定される、請求項99に記載の方法。
【請求項１０１】
検出する工程が少なくとも2回繰り返される、請求項97に記載の方法。
【請求項１０２】
検出する工程が少なくとも5回繰り返される、請求項97に記載の方法。
【請求項１０３】
蛍光シグナルが500〜820 nmの発光波長を有する、請求項97に記載の方法。
【請求項１０４】
細胞が、癌細胞であるか、リソソーム蓄積に欠陥のある細胞であるか、または欠陥のある神経細胞である、請求項97に記載の方法。
【請求項１０５】
(a)細胞と、関心対象の化合物とを接触させる工程；
(b)細胞中の1種または複数種の蛍光シグナルを検出する工程；および
(c)細胞と関心対象の化合物との接触に続いて細胞中の1種または複数種の蛍光シグナルに変化が生じたかどうかを判定する工程
をさらに含む、請求項97に記載の方法。
【請求項１０６】
関心対象の化合物が薬物である、請求項105に記載の方法。
【請求項１０７】
関心対象の化合物が、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、または小分子である、請求項105に記載の方法。
【請求項１０８】
以下の工程を含む、小胞輸送をモニターする方法：
(a)細胞と、少なくとも第1、第2、および第3ミセル集団を含む組成物とを、細胞がエンドサイトーシスによって組成物を取り込む条件下で接触させる工程であって、各ミセルがブロックコポリマーおよび蛍光色素を含み、さらに、第1ミセル集団が、約pH 6.3〜7.4のpH転移点および第1蛍光発光スペクトルを有し、第2ミセル集団が、約pH 5.9〜6.2のpH転移点および第2蛍光発光スペクトルを有し、かつ第3ミセル集団が、約pH 5.0〜5.8のpH転移点および第3蛍光発光スペクトルを有する、工程；
(b)第1、第2、および第3蛍光発光スペクトルに対応する第1、第2、および第3蛍光シグナルを細胞中において検出する工程であって、第1、第2、および第3蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程；ならびに
(c)第1蛍光シグナルが検出された場合、小胞は初期エンドソームであると判定し、第2蛍光シグナルが検出された場合、小胞は後期エンドソーム／リソソームであると判定し、かつ第3蛍光シグナルが検出された場合、小胞はリソソームであると判定する工程。
【請求項１０９】
細胞中の第1、第2、および第3蛍光シグナルの分布を測定する工程をさらに含む、請求項108に記載の方法。
【請求項１１０】
第1、第2、および第3蛍光シグナルの分布が、少なくとも1時間から最大で12時間までの時間にわたって測定される、請求項108に記載の方法。
【請求項１１１】
検出する工程が少なくとも2回繰り返される、請求項108に記載の方法。
【請求項１１２】
検出する工程が少なくとも5回繰り返される、請求項108に記載の方法。
【請求項１１３】
第1、第2、および第3蛍光シグナルが500〜820 nmの発光波長を有する、請求項108に記載の方法。
【請求項１１４】
以下の工程を含む、細胞受容体サイクリングをモニターする方法：
(a)細胞と、少なくとも第1および第2ミセル集団を含む組成物とを接触させる工程であって、各ミセルが、ブロックコポリマー、蛍光色素、および受容体結合部分を含み、さらに、第1ミセル集団が第1pH転移点および第1蛍光発光スペクトルを有し、かつ第2ミセル集団が、第1pH転移点および第1発光スペクトルと異なる第2pH転移点および第2蛍光発光スペクトルを有する、工程；
(b)少なくとも第1および第2蛍光発光スペクトルに対応する少なくとも第1および第2蛍光シグナルを細胞中またはその表面上において検出する工程であって、第1および第2蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程；ならびに
(c)細胞中または細胞表面上の少なくとも第1および第2蛍光シグナルの分布を測定する工程。
【請求項１１５】
組成物が、第1および第2pH転移点ならびに第1および第2発光スペクトルと異なる第3pH転移点および第3蛍光発光スペクトルを有する少なくとも第3ミセル集団を含む、請求項114に記載の方法。
【請求項１１６】
少なくとも第1および第2蛍光シグナルの分布が、少なくとも1時間から最大で12時間までの時間にわたって測定される、請求項114に記載の方法。
【請求項１１７】
検出する工程が少なくとも2回繰り返される、請求項114に記載の方法。
【請求項１１８】
検出する工程が少なくとも5回繰り返される、請求項114に記載の方法。
【請求項１１９】
少なくとも第1および第2蛍光シグナルが500〜820 nmの発光波長を有する、請求項114に記載の方法。
【請求項１２０】
以下の工程を含む、エンドソームpHをモニターする方法：
(a)エンドソームと、少なくとも第1および第2ミセル集団を含む組成物とを、エンドソームが組成物を取り込む条件下で接触させる工程であって、各ミセルがブロックコポリマーおよび蛍光色素を含み、さらに、第1ミセル集団が約pH 5.7〜6.3のpH転移点および第1蛍光発光スペクトルを有し、第2ミセル集団が約pH 5.7〜6.3のpH転移点および第2蛍光発光スペクトルを有し、第1ミセル集団と第2ミセル集団は、異なるpH転移点および異なる蛍光発光スペクトルを有する、工程；
(b)第1および第2蛍光発光スペクトルに対応する第1および第2蛍光シグナルの少なくとも一方をエンドソーム中において検出する工程であって、第1および／または第2蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程；ならびに
(c)エンドソームのpHまたはpH範囲を決定する工程。
【請求項１２１】
第1および第2蛍光シグナルの分布が、少なくとも1時間から最大で12時間までの時間にわたって測定される、請求項120に記載の方法。
【請求項１２２】
検出する工程が少なくとも2回繰り返される、請求項120に記載の方法。
【請求項１２３】
検出する工程が少なくとも5回繰り返される、請求項120に記載の方法。
【請求項１２４】
第1および第2蛍光シグナルが500〜820 nmの発光波長を有する、請求項120に記載の方法。
【請求項１２５】
エンドソームと、少なくとも第3および第4ミセル集団とを接触させる工程をさらに含む、請求項120に記載の方法。
【請求項１２６】
第1ミセル集団が約pH 5.7のpH転移点を有し、第2ミセル集団が約pH 5.94のpH転移点を有し、第3ミセル集団が約pH 6.18のpH転移点を有し、かつ第4ミセル集団が約pH 6.42のpH転移点を有する、請求項125に記載の方法。
【請求項１２７】
以下の工程を含む、細胞外pHを測定する方法：
(a)細胞の集合体またはそれらの細胞外環境と、請求項64〜87.01のいずれか一項に記載のpH応答性システムまたは組成物とを接触させる工程；および
(b)細胞の集合体中の蛍光シグナルを検出する工程であって、蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程。
【請求項１２８】
細胞の集合体またはそれらの細胞外環境中の蛍光シグナルの分布を測定する工程をさらに含む、請求項127に記載の方法。
【請求項１２９】
蛍光シグナルの分布が経時的に測定される、請求項128に記載の方法。
【請求項１３０】
蛍光シグナルの分布が、少なくとも1時間から最大で12時間までの時間にわたって測定される、請求項129に記載の方法。
【請求項１３１】
検出する工程が少なくとも2回繰り返される、請求項127に記載の方法。
【請求項１３２】
検出する工程が少なくとも5回繰り返される、請求項127に記載の方法。
【請求項１３３】
蛍光シグナルが500〜820 nmの発光波長を有する、請求項127に記載の方法。
【請求項１３４】
細胞もしくは細胞の集合体またはそれらの細胞外環境が、癌細胞もしくは癌細胞の集合体またはそれらの細胞外環境、リソソーム蓄積に欠陥のある細胞もしくは細胞の集合体またはそれらの細胞外環境、欠陥のある神経細胞もしくは神経細胞の集合体またはそれらの細胞外環境、炎症と関連する細胞もしくは細胞の集合体またはそれらの細胞外環境、感染と関連する細胞もしくは細胞の集合体またはそれらの細胞外環境、創傷治癒と関連する細胞もしくは細胞の集合体またはそれらの細胞外環境、低酸素と関連する細胞もしくは細胞の集合体またはそれらの細胞外環境、放射線損傷と関連する細胞もしくは細胞の集合体またはそれらの細胞外環境、外傷と関連する細胞もしくは細胞の集合体またはそれらの細胞外環境、または低酸素血と関連する細胞もしくは細胞の集合体またはそれらの細胞外環境である、請求項127に記載の方法。
【請求項１３５】
(a)1個もしくは複数個の細胞またはそれらの細胞外環境と、関心対象の化合物とを接触させる工程；
(b)細胞中または細胞周囲の1種または複数種の蛍光シグナルを検出する工程；ならびに
(c)細胞と関心対象の化合物との接触に続いて細胞中または細胞周囲の1種または複数種の蛍光シグナルに変化が生じたかどうかを判定する工程
をさらに含む、請求項127に記載の方法。
【請求項１３６】
関心対象の化合物が薬物である、請求項135に記載の方法。
【請求項１３７】
関心対象の化合物が、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、または小分子である、請求項135に記載の方法。
【請求項１３８】
以下の工程を含む、血管新生腫瘍血管系を画像化する方法：
(a)腫瘍血管系と、請求項64〜94のいずれか一項に記載の少なくとも2つのミセル集団を含む組成物とを接触させる工程であって、各ミセルがブロックコポリマーおよび蛍光色素を含み、さらに、第1ミセル集団が約pH 6.5〜7.4のpH転移点および第1蛍光発光スペクトルを有し、第2ミセル集団が約pH 5.9〜6.4のpH転移点および第2蛍光発光スペクトルを有する、工程；ならびに
(b)第1および第2蛍光発光スペクトルに対応する第1および第2蛍光シグナルを腫瘍血管系中において検出する工程であって、第1および第2蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程。
【請求項１３９】
腫瘍血管系中の第1および第2蛍光シグナルの分布を測定する工程をさらに含む、請求項138に記載の方法。
【請求項１４０】
標的指向部分を有するミセルをさらに含む、請求項138に記載の方法。
【請求項１４１】
標的指向部分がcRGDペプチドである、請求項140に記載の方法。
【請求項１４２】
第1および第2蛍光シグナルの分布が、少なくとも1時間から最大で12時間までの時間にわたって測定される、請求項138に記載の方法。
【請求項１４３】
検出する工程が少なくとも2回繰り返される、請求項138に記載の方法。
【請求項１４４】
検出する工程が少なくとも5回繰り返される、請求項138に記載の方法。
【請求項１４５】
第1および第2蛍光シグナルが500〜820 nmの発光波長を有する、請求項138に記載の方法。
【請求項１４６】
以下の工程を含む、循環腫瘍細胞を画像化する方法：
(a)リンパ管中または血流中の循環腫瘍細胞と、請求項64〜94のいずれか一項に記載のpH応答性システムを含む組成物とを接触させる工程であって、ミセルが、ブロックコポリマーおよび蛍光色素を含み、かつ約pH 5.9〜6.4のpH転移点を有する、工程；ならびに
(b)循環腫瘍細胞の蛍光シグナルを検出する工程であって、蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程。
【請求項１４７】
リンパ系中または血流中の循環腫瘍細胞の第1および第2蛍光シグナルの分布を測定する工程をさらに含む、請求項146に記載の方法。
【請求項１４８】
標的指向部分を有するミセルをさらに含む、請求項146に記載の方法。
【請求項１４９】
標的指向部分が抗体断片である、請求項148に記載の方法。
【請求項１５０】
抗体断片がセツキシマブの断片である、請求項149に記載の方法。
【請求項１５１】
第1および第2蛍光シグナルの分布が、少なくとも1時間から最大で12時間までの時間にわたって測定される、請求項146に記載の方法。
【請求項１５２】
検出する工程が少なくとも2回繰り返される、請求項146に記載の方法。
【請求項１５３】
検出する工程が少なくとも5回繰り返される、請求項146に記載の方法。
【請求項１５４】
第1および第2蛍光シグナルが500〜820 nmの発光波長を有する、請求項146に記載の方法。
【請求項１５５】
以下の工程を含む、腫瘍を画像化する方法：
(a)腫瘍と、請求項64〜94のいずれか一項に記載の少なくとも2つのミセル集団を含む組成物とを接触させる工程であって、各ミセルがブロックコポリマーおよび蛍光色素を含み、さらに、第1ミセル集団が約pH 6.5〜7.4のpH転移点および第1蛍光発光スペクトルを有し、第2ミセル集団が約pH 5.9〜6.4のpH転移点および第2蛍光発光スペクトルを有する、工程；ならびに
(b)第1および第2蛍光発光スペクトルに対応する第1および第2蛍光シグナルを腫瘍中において検出する工程であって、第1および第2蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程。
【請求項１５６】
腫瘍中の第1および第2蛍光シグナルの分布を測定する工程をさらに含む、請求項155に記載の方法。
【請求項１５７】
標的指向部分を有するミセルをさらに含む、請求項155に記載の方法。
【請求項１５８】
標的指向部分が抗体断片である、請求項157に記載の方法。
【請求項１５９】
抗体断片がセツキシマブのものである、請求項158に記載の方法。
【請求項１６０】
標的指向部分が小分子である、請求項157に記載の方法。
【請求項１６１】
小分子が葉酸である、請求項160に記載の方法。
【請求項１６２】
第1および第2蛍光シグナルの分布が、少なくとも1時間から最大で12時間までの時間にわたって測定される、請求項155に記載の方法。
【請求項１６３】
検出する工程が少なくとも2回繰り返される、請求項155に記載の方法。
【請求項１６４】
検出する工程が少なくとも5回繰り返される、請求項155に記載の方法。
【請求項１６５】
第1および第2蛍光シグナルが500〜820 nmの発光波長を有する、請求項155に記載の方法。
【請求項１６６】
以下の工程を含む、原発腫瘍の所属領域内のリンパ節へと転移した腫瘍を画像化する方法：
(a)腫瘍と、請求項64〜94のいずれか一項に記載の少なくとも2つのミセル集団を含む組成物とを接触させる工程であって、各ミセルがブロックコポリマーおよび蛍光色素を含み、さらに、第1ミセル集団が約pH 6.5〜7.4のpH転移点および第1蛍光発光スペクトルを有し、第2ミセル集団が約pH 5.9〜6.4のpH転移点および第2蛍光発光スペクトルを有する、工程；ならびに
(b)第1および第2蛍光発光スペクトルに対応する第1および第2蛍光シグナルを腫瘍中において検出する工程であって、第1および第2蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程。
【請求項１６７】
腫瘍中の第1および第2蛍光シグナルの分布を測定する工程をさらに含む、請求項166に記載の方法。
【請求項１６８】
標的指向部分を有するミセルをさらに含む、請求項166に記載の方法。
【請求項１６９】
標的指向部分が抗体断片である、請求項168に記載の方法。
【請求項１７０】
抗体断片がセツキシマブのものである、請求項169に記載の方法。
【請求項１７１】
標的指向部分が小分子である、請求項168に記載の方法。
【請求項１７２】
小分子が葉酸である、請求項171に記載の方法。
【請求項１７３】
第1および第2蛍光シグナルの分布が、少なくとも1時間から最大で12時間までの時間にわたって測定される、請求項166に記載の方法。
【請求項１７４】
検出する工程が少なくとも2回繰り返される、請求項166に記載の方法。
【請求項１７５】
検出する工程が少なくとも5回繰り返される、請求項166に記載の方法。
【請求項１７６】
第1および第2蛍光シグナルが500〜820 nmの発光波長を有する、請求項166に記載の方法。
【請求項１７７】
以下の工程を含む、腫瘍のセンチネルリンパ節を画像化する方法：
(a)腫瘍と、請求項64〜94のいずれか一項に記載の少なくとも2つのミセル集団を含む組成物とを接触させる工程であって、各ミセルがブロックコポリマーおよび蛍光色素を含み、さらに、第1ミセル集団が約pH 6.5〜7.4のpH転移点および第1蛍光発光スペクトルを有し、第2ミセル集団が約pH 5.9〜6.4のpH転移点および第2蛍光発光スペクトルを有する、工程；ならびに
(b)第1および第2蛍光発光スペクトルに対応する第1および第2蛍光シグナルを腫瘍中において検出する工程であって、第1および第2蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程
(c)蛍光シグナルを含むミセルの解離部分を、腫瘍を排出するリンパ管系へ入り込ませて、かつリンパ管系に沿ったリンパ節へとリンパ管系を通って移動させる工程
(d)第1および第2蛍光発光スペクトルに対応する第1および第2蛍光シグナルを、リンパ管系中およびリンパ管系に沿ったリンパ節中において検出する工程であって、第1および第2蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルが原発腫瘍中においてそのpH転移点に達しかつ解離しかつリンパ管系およびリンパ管系に沿ったリンパ節へと移動したことを示す、工程。
【請求項１７８】
腫瘍中の第1および第2蛍光シグナルの分布を測定する工程をさらに含む、請求項177に記載の方法。
【請求項１７９】
標的指向部分を有するミセルをさらに含む、請求項177に記載の方法。
【請求項１８０】
標的指向部分が抗体断片である、請求項179に記載の方法。
【請求項１８１】
抗体断片がセツキシマブのものである、請求項180に記載の方法。
【請求項１８２】
標的指向部分が小分子である、請求項179に記載の方法。
【請求項１８３】
小分子が葉酸である、請求項182に記載の方法。
【請求項１８４】
第1および第2蛍光シグナルの分布が、少なくとも1時間から最大で12時間までの時間にわたって測定される、請求項177に記載の方法。
【請求項１８５】
検出する工程が少なくとも2回繰り返される、請求項177に記載の方法。
【請求項１８６】
検出する工程が少なくとも5回繰り返される、請求項177に記載の方法。
【請求項１８７】
第1および第2蛍光シグナルが500〜820 nmの発光波長を有する、請求項177に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2012年4月5日提出の米国特許仮出願第61/620,774号および2013年3月14日提出の米国特許非仮出願第13/827,197号の恩典を主張し、これらの内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号RO1EB013149の下で政府支援によって行った。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
1．発明の分野
本発明は、一般に、分子および細胞生物学、ナノテクノロジー、ならびに蛍光センサーの分野に関する。より詳しくは、本発明は、pH変化の検出のためのナノプラットフォームに関する。
【背景技術】
【０００４】
2．関連技術の説明
蛍光イメージングは、マイクロスコピック、メゾスコピックおよびマクロスコピックレベルで時空間情報を提供するその能力のために、生細胞中の生体分子、経路およびプロセスの研究において重要なツールとなった（例えば、Tsien, R. Y. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4, SS16; Weissleder, R., Nature 2008, 452, 580; Fernandez-Suarez, M., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2008, 9, 929を参照のこと）。蛍光レポーター分子は、大きく2つのカテゴリーに分類することができる：内因的に発現される蛍光タンパク質（例えば、GFP）または外部から投与される蛍光プローブ（例えば、合成色素）。蛍光タンパク質レポーターは、標的タンパク質の特異的標識化およびタンパク質機能の生細胞イメージングによって基礎生物科学の研究に大いに影響を与えた（例えば、Giepmans, B. N. G. Science 2006, 312, 217; Gross, S., Cancer Cell 2005, 7, 5を参照のこと）。外部イメージングプローブは様々な細胞および動物イメージング研究において広く使用されている。
【０００５】
最近、イオンおよび酸化還元電位、酵素発現、ならびにpHなどの生理的刺激に応答性である、活性化型イメージングプローブが、細胞生理的プロセスを調べるために相当な注目を集めている（例えば、de Silva, A. P., Chem. Rev. 1997, 97, 1515; Zhang, J., Nat. Rev. Mol Cell Biol. 2002, 3, 906; Lee, S., Chem. Commun. 2008, 4250; Kobayashi, H.; Chem. Res. 2010, 44, 83; Lovell, J. F., Chem. Rev. 2010, 110, 2839; Ueno, T., Nat. Methods 2011, 8, 642を参照のこと）。これらの刺激の中でも、pHは、細胞内（pHi）環境および細胞外（pHe）環境の両方において重要な役割を果たす重要な生理的パラメータとして頭角を現している（Alberts, B., Molecular Biology of the Cell; 5th ed.; Garland Science: New York, 2008）。例えば、真核細胞中の細胞内区画（例えば、エンドサイトーシス小胞）のpHは、注意深く制御されており、膜輸送、受容体サイクリング、リソソーム分解、および細胞中へのウイルス侵入などの多くのプロセスに直接影響を与える（Maxfield, F. R., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004, 5, 121; Izumi, H., Cancer Treat. Rev. 2003, 29, 541; Nishi, T., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002, 3, 94）。最近、調節不全のpHが癌の別の特徴として記載され、何故ならば、癌細胞は、細胞外pH（pHe）よりも高い、構成的に増加した細胞質pHを伴う「逆転」pH勾配を示すためである（Webb, B. A., Nat. Rev. Cancer 2011, 11, 671）。
【０００６】
様々なpH感受性蛍光プローブが報告されたが（Kobayashi, H., Chem. Rev. 2010, 110, 2620; Han, J. Y., Chem. Rev. 2010, 110, 2709）、それらのpH感受性は、フルオロフォアへのpH依存性光誘起電子移動（PeT）特性を有するイオン化可能な残基に主に起因する。これらの蛍光剤についての一つの潜在的な欠点は、Henderson-Hasselbalch式によって規定されるそれらのブロードなpH応答（ΔpH約2）である（Atkins, P., Physical Chemistry; Oxford University Press, 2009）。この鋭敏なpH応答の欠如のために、酸性細胞内オルガネラ間の（例えば、初期エンドソームとリソソームとの間の＜1 pH差）（Maxfield, F. R., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004, 5, 121; Casey, J. R., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010, 11, 50）または正常組織環境（7.4）に対する固形腫瘍中のpHe（6.5〜6.9）（Webb, B. A., Nat. Rev. Cancer 2011, 11, 671; Zhang, X., J. Nucl. Med. 2010, 51, 1167.）の僅かなpH差を検出することが困難である。さらに、pH転移点および発光波長（特に、近IR範囲内）の同時制御は小分子色素について困難である。pH感受性蛍光ナノ粒子を開発しようとする最近の試みは、小分子pH感受性色素とコンジュゲートしたポリマー（Srikun, D., J. Chem. Sci. 2011, 2, 1156; Benjaminsen, R. V., ACS Nano 2011, 5, 5864; Albertazzi, L., J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 18158; Urano, Y., Nat. Med. 2009, 15, 104）またはpH非感受性色素をコンジュゲートするためのpH感受性リンカーの使用（Li, C., Adv. Funct. Mater. 2010, 20, 2222; Almutairi, A., J. Am. Chem. Soc. 2007, 130, 444）を主に用いる。これらのナノプローブ設計も、ブロードなpH応答をもたらし、pH転移点を微調整する能力を欠いている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の様々な態様は、pH可変式高活性化型多色蛍光ナノプラットフォームを提供し、かつ基本的な細胞生理的プロセス、例えば、エンドサイトーシス小胞中のpH調節、エンドソーム／リソソーム成熟、ならびに受容体サイクリングおよび細胞内オルガネラの輸送に対するpHの効果の研究を含むがこれらに限定されない様々な適用において、該ナノプラットフォームを使用する方法を提供する。
【０００８】
一態様において、本発明は、第1ナノ粒子の集団を含むpH応答性システムを提供し、ここで、第1ナノ粒子は、(i)親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含む第1ブロックコポリマーおよび(ii)第1蛍光色素を含み、さらにここで、第1ナノ粒子は、第1pH転移点および第1発光スペクトルを有する。いくつかの態様において、pH応答性システムは、第2ナノ粒子の集団をさらに含み、ここで、第2ナノ粒子は、(i)親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含む第2ブロックコポリマーおよび(ii)第2蛍光色素を含み、さらにここで、第2ナノ粒子は、第1ナノ粒子の第1pH転移点と異なる第2pH転移点および第1ナノ粒子の第1発光スペクトルと異なる第2発光スペクトルを有する。本発明のある局面において、pH応答性システムは、少なくとも第3ナノ粒子の集団をさらに含み、ここで、第3ナノ粒子は、(i)親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含む第3ブロックコポリマーおよび(ii)第3蛍光色素を含み、さらにここで、第3ナノ粒子は、第1および第2ナノ粒子のpH転移点と異なる第3pH転移点ならびに第1および第2ナノ粒子の発光スペクトルと異なる第3発光スペクトルを有する。いくつかの態様において、pH応答性システムは、少なくとも第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10またはそれ以上のナノ粒子の集団をさらに含む。これらの第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10またはそれ以上のナノ粒子の各々は、システム中の他のナノ粒子の集団のpH転移点と異なるpH転移点ならびにシステム中の他のナノ粒子の集団の発光スペクトルと異なる発光スペクトルを有する。
【０００９】
ブロックコポリマーの親水性ポリマーセグメントは、任意の適切な親水性ポリマーであり得る。そのような親水性ポリマーの例としては、ポリ(エチレンオキシド)（PEO）、ポリ(メタクリレートホスファチジルコリン)（MPC）、およびポリビニルピロリドン（PVP）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１０】
ブロックコポリマーの疎水性ポリマーセグメントは、任意の適切な疎水性ポリマーであり得る。そのような疎水性ポリマーの例としては、ポリ(2-(ジイソプロピルアミノ)エチルメタクリレート)（PDPA）、ポリ(2-(ジブチルアミノ)エチルメタクリレート)（PDBA）、ポリ(2-(ヘキサメチレンイミノ)エチルメタクリレート)（PC7A）、ポリ(2-(ペンタメチレンイミノ)エチルメタクリレート)（PC6A）、およびPCT/US2011/00148またはPCT/US2011/047497に開示される親水性ポリマーが挙げられる。
【００１１】
上述したように、ナノ粒子はブロックコポリマーおよび蛍光色素を含む。本発明のある局面において、ナノ粒子は、疎水性モノマー（例えば、DPA、DBA、C7A、C6A）とメタクリル酸2-アミノエチル（AMA）などの第1級アミノ基を含有するモノマーとを有する前駆体コポリマーを反応させることによって合成される。前駆体コポリマーの例としては、PEO114-b-P(DPA75-co-AMA6)、MAL-PEO114-b-PDPA88、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA6)、PEO114-b-P(DPA74-co-AMA1)、PEO114-b-P(DPA77-co-AMA3)、PEO114-b-P(DPA80-co-AMA6)、PEO114-b-P(DBA65-co-AMA3)、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA3)、およびPEO114-b-P(C6A81-co-AMA3)が挙げられるが、これらに限定されない。ある態様において、AMA上の遊離アミノ基は蛍光色素分子にコンジュゲートされていてもよい。
【００１２】
本明細書において用いられるブロックコポリマーは、ホモポリマーであってもヘテロポリマーであってもよい。ホモポリマーは、1種類のモノマーサブユニットの重合によって作製され得る。ヘテロポリマーは、少なくとも2種の異なるモノマーサブユニットの重合によって作製され得る。下記に実証されるように、異なる疎水性を有する様々な比率の2種以上のモノマーを共重合することによって、本明細書に開示されるシステム、ナノ粒子、およびミセルのpH応答をさらに微調整することが可能となる。
【００１３】
蛍光色素の非限定的な例としては、ローダミン、BODIPY（登録商標）、クマリン、およびシアニン色素が挙げられる。蛍光色素の他の非限定的な例としては、赤色蛍光スクアリン（squarine）色素、例えば、2,4-ビス[1,3,3-トリメチル-2-インドリニリデンメチル]シクロブテンジイリウム-1,3-ジオキソレート、赤外色素、例えば、2,4ビス[3,3-ジメチル-2-(1H-ベンズ[e]インドリニリデンメチル)]シクロブテンジイリウム-1,3-ジオキソレート、または橙色蛍光スクアリン色素、例えば、2,4-ビス[3,5-ジメチル-2-ピロリル]シクロブテンジイリウム-1,3-ジオロレート、量子ドット、Alexa Fluor（登録商標）色素、AMCA、BODIPY（登録商標）630/650、BODIPY（登録商標）650/665、BODIPY（登録商標）-FL、BODIPY（登録商標）-R6G、BODIPY（登録商標）-TMR、BODIPY（登録商標）-TRX、Cascade Blue（登録商標）、限定されないがCy2（商標）、Cy3（商標）、およびCy5（商標）を含むCyDye（商標）、6-FAM（商標）、フルオレセイン、HEX（商標）、6-JOE、Oregon Green（登録商標）488、Oregon Green（登録商標）500、Oregon Green（登録商標）514、Pacific Blue（商標）、REG、限定されないがフィコエリトリンおよびアロフィコシアニンを含むフィコビリタンパク質、ローダミングリーン（Rhodamine Green）（商標）、ローダミンレッド（Rhodamine Red）（商標）、ROX（商標）、TAMRA（商標）、TET（商標）、テトラメチルローダミン、またはTexas Red（登録商標）が挙げられる。
【００１４】
本発明のある局面において、蛍光色素はpH非感受性蛍光色素である。いくつかの態様において、蛍光色素は小さなストークスシフトを有する。特定の態様において、ストークスシフトはΔλ＜40 nmである。
【００１５】
いくつかの態様において、ナノ粒子は、PDBA-BDY、PDPA-TMR、PDPA-C55、PC7A-C55、PC6A-C75、およびPDPA-CMNからなる群より選択される。下記により詳細に議論するように、「BDY」はBODIPY（登録商標）色素を指し、「TMR」はローダミン色素を指し、「C55」および「C75」はシアニン色素を指し、「CMN」はクマリン色素を指す。具体的な態様において、pH応答性システムは、PDBA-BDY、PDPA-TMR、PC7A-C55、PC6A-C75、およびPDPA-CMNのうちの少なくとも2、3、または4種全てを含む。下記において詳細に議論するように、ナノ粒子は、それらの環境のpHに応じてモノマー型であってもミセル型であってもよい。
【００１６】
pH応答性システムは、任意の所望のpH範囲にわたるpH転移点を有するナノ粒子を含んでもよい。特定の態様において、システムは、2つまたはそれ以上のナノ粒子集団を含み、ここで、各ナノ粒子集団は、pH 2.0〜pH 11.0、pH 4.0〜pH 9.0、pH 4.8〜pH 8.4、pH 5.0〜pH 8.0、pH 5.0〜pH 7.4、pH 5.2〜pH 7.2、pH 5.7〜pH 6.9、pH 5.7〜pH 6.5、またはpH 6.4〜pH 8.4であるpH転移点を有する。一態様において、システムは、約pH 5.2、6.4、6.9、および7.2のpH転移点を有する少なくとも4つのナノ粒子集団を含む。別の態様において、システムは、約pH 5.7、5.94、6.18、および6.42のpH転移点を有する少なくとも4つのナノ粒子集団を含む。他の態様において、システムは、約pH 6.21およびpH 6.9のpH転移点を有する少なくとも2つのナノ粒子集団を含む。
【００１７】
pH応答性システムは高活性化型である。本発明のある局面において、システム中のナノ粒子のpH応答（ΔpH10-90%）は、2 pH単位未満、1.5 pH単位未満、1 pH単位未満、0.75 pH単位未満、0.5 pH単位未満、または0.25 pH単位未満である。
【００１８】
pH応答性システムは、任意の所望の範囲にわたる蛍光発光スペクトルを有するナノ粒子を含んでもよい。本発明のある局面において、ナノ粒子の蛍光発光スペクトルは、400〜850 nm、500〜820 nm、または506〜808 nmである。一態様において、システムは、506 nm、580 nm、707 nm、および808 nmの発光スペクトルを有する少なくとも4つのナノ粒子集団を含む。
【００１９】
いくつかの態様において、ナノ粒子は標的指向部分をさらに含む。いくつかの態様において、標的指向部分は抗体または抗体断片である。いくつかの態様において、抗体はセツキシマブである。他の態様において、抗体断片はセツキシマブのFab'断片である。他の態様において、標的指向部分は細胞表面受容体に結合する。他の態様において、標的指向部分はシグナルペプチドである。いくつかの態様において、シグナルペプチドは環状アルギニン-グリシン-アスパラギン酸ペプチド（cRGD）ペプチドである。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、ナノ粒子を核、ミトコンドリア、小胞体、葉緑体、アポプラスト、またはペルオキシソームへと方向付ける。他の態様において、標的指向部分は小分子である。いくつかの態様において、小分子は葉酸である。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、ブロックコポリマーと蛍光色素とを有する単一のナノ粒子を含むpH応答性システムであって、さらにここで、該ナノ粒子の集団が上述のpH転移点および発光スペクトルを有する、pH応答性システムを含む。いくつかの態様において、単一のナノ粒子は標的指向部分をさらに含む。
【００２１】
ある態様において、ナノプラットフォームは、生理的範囲（pH 5.0〜7.4）内の可変pH転移を有する超pH応答性テトラメチルローダミン（TMR）系ナノ粒子を利用する。pH応答性蛍光ナノ粒子を提供するために、pH応答性ナノ粒子のpH誘発ミセル化を蛍光消光と共に使用してもよい。例えば、一態様において、発光波長（500〜820 nm）およびpH転移点（5.0〜7.4）の独立制御を有する、pH活性化型多色蛍光ナノ粒子のシリーズを提供する。特定の態様において、異なる発光波長を有するナノ粒子は、鋭敏なpH応答（オン／オフ状態間でΔpH＜0.25）を有する。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、各ナノ粒子集団がpH転移点および発光スペクトルを有する、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上のナノ粒子集団のシリーズを含む組成物であって、ここで、シリーズ中の各ナノ粒子集団のpH転移点および発光スペクトルが、シリーズ中の他のナノ粒子集団のpH転移点および発光スペクトルと異なる、組成物を提供する。ナノ粒子はブロックコポリマーおよび蛍光色素を含む。一態様において、シリーズ中のナノ粒子集団のうちの少なくとも1集団は、PDBA-BDY、PDPA-TMR、PDPA-C55、PC7A-C55、PC6A-C75、またはPDPA-CMNを含む。別の態様において、シリーズは、PDBA-BDYナノ粒子集団、PDPA-TMRナノ粒子集団、およびPC7A-C55ナノ粒子集団を含む。いくつかの態様において、ナノ粒子集団はマレイミド含有コポリマーを約10%含有する。下記において詳細に議論するように、ナノ粒子は、それらの環境のpHに応じてモノマー型であってもミセル型であってもよい。
【００２３】
シリーズ中のナノ粒子は、ブロックコポリマーおよび蛍光色素を含む。本発明のある局面において、ナノ粒子は、前駆体コポリマーと蛍光色素含有化合物とを反応させることによって合成される。前駆体コポリマーの例としては、PEO114-b-P(DPA75-co-AMA6)、MAL-PEO114-b-PDPA88、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA6)、PEO114-b-P(DPA74-co-AMA1)、PEO114-b-P(DPA77-co-AMA3)、PEO114-b-P(DPA80-co-AMA6)、PEO114-b-P(DBA65-co-AMA3)、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA3)、およびPEO114-b-P(C6A81-co-AMA3)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
いくつかの態様において、ナノ粒子は、
a)式
2015518145.tif 000003
に記載のポリマー；
b)式A1に記載のモノマー；および
c)式A2に記載のモノマー
を含むコポリマー、またはその薬学的に許容される塩；ならびにその立体異性体、同位体変種および互変異性体から合成され；
ここで、
各A1およびA2は、独立して、
2015518145.tif 000004
より選択され、
各R1aは、独立して、H、置換もしくは非置換アルキル、または
2015518145.tif 000005
であり；
各R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R4c、R4d、およびR5は、独立して、Hまたは置換もしくは非置換アルキルであり；
各R6aおよびR6bは、独立して、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであるか；またはR6aおよびR6bは、それらが結合しているN原子と一緒になってヘテロ環を形成し；
R7は色素を含む部分であり；
下付き文字nは10〜200の整数であり；
かつここで、コポリマーはランダムコポリマーである。
【００２５】
いくつかの態様において、A1は式
2015518145.tif 000006
を有する。いくつかの態様において、A2は式
2015518145.tif 000007
を有する。
【００２６】
本発明のある局面において、蛍光色素はpH非感受性蛍光色素である。いくつかの態様において、蛍光色素は小さなストークスシフトを有する。特定の態様において、ストークスシフトはΔλ＜40 nmである。
【００２７】
ナノ粒子集団のシリーズは、任意の所望のpH範囲にわたるpH転移点を有するナノ粒子を含んでもよい。特定の態様において、シリーズは、2つまたはそれ以上のナノ粒子集団を含み、ここで、各ナノ粒子集団は、pH 2.0〜pH 11.0、pH 4.0〜pH 9.0、pH 4.8〜pH 8.4、pH 5.0〜pH 8.0、pH 5.0〜pH 7.4、pH 5.2〜pH 7.2、pH 5.7〜pH 6.9、pH 5.7〜pH 6.5、またはpH 6.4〜pH 8.4であるpH転移点を有する。一態様において、組成物は、約pH 5.2、6.4、6.9、および7.2のpH転移点を有する少なくとも4つのナノ粒子集団を含む。別の態様において、組成物は、約pH 5.7、5.94、6.18、および6.42のpH転移点を有する少なくとも4つのナノ粒子集団を含む。別の態様において、組成物は、約pH 6.21およびpH 6.9のpH転移点を有する少なくとも2つのナノ粒子集団を含む。
【００２８】
本発明のある局面において、シリーズ中のナノ粒子のpH応答（ΔpH10-90%）は、2 pH単位未満、1.5 pH単位未満、1 pH単位未満、0.75 pH単位未満、0.5 pH単位未満、または0.25 pH単位未満である。
【００２９】
ナノ粒子集団のシリーズは、任意の所望の範囲にわたる蛍光発光スペクトルを有するナノ粒子を含んでもよい。本発明のある局面において、ナノ粒子の蛍光発光スペクトルは、400〜850 nm、500〜820 nm、または506〜808 nmである。一態様において、システムは、506 nm、580 nm、707 nm、および808 nmの発光スペクトルを有する少なくとも4つのナノ粒子集団を含む。
【００３０】
本発明の別の局面において、コポリマーと蛍光色素とを有する単一のナノ粒子をさらに含む組成物であって、さらにここで、該ナノ粒子の集団がpH転移点および発光スペクトルを有する、組成物が存在する。いくつかの態様において、単一のナノ粒子は標的指向部分をさらに含む。
【００３１】
別の態様は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上のミセル集団を含む組成物であって、ここで、各ミセルがブロックコポリマーおよび蛍光色素を含み、さらにここで、各ミセル集団が、他のミセル集団のpH転移点および蛍光色素と異なるpH転移点および蛍光色素を有する、組成物を提供する。下記において詳細に議論するように、蛍光色素はミセルによって消光される。したがって、ミセルの解離は蛍光強度を増加させる。本発明のある局面において、蛍光色素はpH非感受性蛍光色素である。いくつかの態様において、蛍光色素は小さなストークスシフトを有する。特定の態様において、ストークスシフトはΔλ＜40 nmである。一態様において、ミセル集団のうちの少なくとも1集団は、PDBA-BDY、PDPA-TMR、PDPA-C55、PC7A-C55、PC6A-C75、またはPDPA-CMNを含む。別の態様において、組成物は、PDBA-BDYミセル集団、PDPA-TMRミセル集団、およびPC7A-C55ミセル集団を含む。本発明のある局面において、ミセル集団は、PEO114-b-P(DPA75-co-AMA6)、MAL-PEO114-b-PDPA88、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA6)、PEO114-b-P(DPA74-co-AMA1)、PEO114-b-P(DPA77-co-AMA3)、PEO114-b-P(DPA80-co-AMA6)、PEO114-b-P(DBA65-co-AMA3)、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA3)、およびPEO114-b-P(C6A81-co-AMA3)からなる群より選択される前駆体コポリマーより合成される。
【００３２】
ミセル集団は、任意の所望のpH範囲にわたるpH転移点を有してもよい。特定の態様において、組成物は、2つまたはそれ以上のミセル集団を含み、ここで、各ミセル集団は、pH 2.0〜pH 11.0、pH 4.0〜pH 9.0、pH 4.8〜pH 8.4、pH 5.0〜pH 8.0、pH 5.0〜pH 7.4、pH 5.2〜pH 7.2、pH 5.7〜pH 6.9、pH 5.7〜pH 6.5、またはpH 6.4〜pH 8.4であるpH転移点を有する。一態様において、組成物は、約pH 5.2、6.4、6.9、および7.2のpH転移点を有する少なくとも4つのミセル集団を含む。別の態様において、組成物は、約pH 5.7、5.94、6.18、および6.42のpH転移点を有する少なくとも4つのミセル集団を含む。本発明のある局面において、組成物中のミセルのpH応答（ΔpH10-90%）は、2 pH単位未満、1.5 pH単位未満、1 pH単位未満、0.75 pH単位未満、0.5 pH単位未満、または0.25 pH単位未満である。
【００３３】
本明細書に開示されるナノ粒子またはミセルのいずれも、標的指向部分をさらに含んでもよい。標的指向部分は、ナノ粒子またはミセルを、例えば、特定の細胞表面受容体（例えば、αvβ3インテグリン、EGFR、Her2/neu）またはオルガネラ（例えば、核、ミトコンドリア、小胞体、葉緑体、アポプラスト、またはペルオキシソーム）へ標的指向または結合させるために使用してもよい。標的指向部分は、例えば、抗体もしくは抗体断片、タンパク質、ペプチド（例えば、シグナルペプチド）、ペプチド模倣リガンド、炭水化物、アプタマー、または小分子であってもよい。いくつかの態様において、抗体はセツキシマブである。いくつかの態様において、抗体断片はセツキシマブのFab'断片である。いくつかの態様において、シグナルペプチドはcRGDペプチドである。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、ナノ粒子を核、ミトコンドリア、小胞体、葉緑体、アポプラスト、またはペルオキシソームへと方向付ける。いくつかの態様において、小分子は葉酸である。
【００３４】
いくつかの態様において、ミセル集団は、ハイブリッドミセル集団をさらに含み、ここで、該ミセルは2種以上のブロックコポリマーおよび2種以上の蛍光色素を含み、さらにここで、該ミセル集団は、2つ以上のpH転移点と、各pH転移点につき異なる発光スペクトルとを有する。
【００３５】
いくつかの局面において、本発明は、コポリマーと蛍光色素とを有する単一のミセルであって、さらにここで、該ミセルの集団がpH転移点および発光スペクトルを有する、単一のミセルを提供する。いくつかの態様において、単一のミセルは標的指向部分をさらに含む。
【００３６】
一態様において、本発明は、以下の工程を含む、細胞内pHをモニターする方法を提供する：(a)細胞と、上述のpH応答性システムまたは組成物とを接触させる工程；および(b)細胞中の1種または複数種の蛍光シグナルを検出する工程であって、ここで、蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程。いくつかの態様において、方法は、(c)細胞と、関心対象の化合物とを接触させる工程；(d)細胞中の1種または複数種の蛍光シグナルを検出する工程；および(e)細胞と関心対象の化合物との接触に続いて細胞中の1種または複数種の蛍光シグナルに変化が生じたかどうかを判定する工程をさらに含む。関心対象の化合物は、細胞のpHに影響を与えるその能力に関して興味深い場合がある、任意の化合物であり得る。関心対象の化合物は、例えば、薬物、ペプチド、タンパク質、核酸、または小分子であってもよい。
【００３７】
別の態様は、以下の工程を含む、小胞輸送をモニターする方法を提供する：(a)細胞と、少なくとも第1および第2ミセル集団を含む組成物とを、細胞がエンドサイトーシスによって組成物を取り込む条件下で接触させる工程であって、ここで、第1ミセル集団が第1pH転移点および第1蛍光色素を有し、かつ第2ミセル集団が第2pH転移点および第2蛍光色素を有し、さらにここで、第1および第2pH転移点が同一ではなく、かつ第1および第2蛍光色素が同一ではない、工程；(b)第1および／または第2蛍光色素の蛍光発光スペクトルに対応する第1および／または第2蛍光シグナルを細胞中において検出する工程であって、ここで、第1蛍光シグナルの検出が、第1ミセル集団がそのpH転移点に達しかつ解離したことを示し、かつ第2蛍光シグナルの検出が、第2ミセル集団がそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程；ならびに(c)エンドサイトーシスされたミセル集団が、それが解離した時にどの区画中にあったかをミセルのpH転移点に基づいて判定する工程。ある態様において、方法は、細胞中の蛍光シグナルの分布を測定する工程をさらに含む。
【００３８】
さらなる態様は、以下の工程を含む、小胞輸送をモニターする方法を提供する：(a)細胞と、少なくとも第1、第2、および第3ミセル集団を含む組成物とを、細胞がエンドサイトーシスによって組成物を取り込む条件下で接触させる工程であって、ここで、各ミセルがブロックコポリマーおよび蛍光色素を含み、さらにここで、第1ミセル集団は、約pH 6.3〜7.4のpH転移点および第1蛍光発光スペクトルを有し、第2ミセル集団は、約pH 5.9〜6.2のpH転移点および第2蛍光発光スペクトルを有し、かつ第3ミセル集団は、約pH 5.0〜5.8のpH転移点および第3蛍光発光スペクトルを有する、工程；(b)第1、第2、および第3蛍光発光スペクトルに対応する第1、第2、および第3蛍光シグナルを細胞中において検出する工程であって、ここで、第1、第2、および第3蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程；ならびに(c)第1蛍光シグナルが検出された場合、小胞は初期エンドソームであると判定し、第2蛍光シグナルが検出された場合、小胞は後期エンドソーム／リソソームであると判定し、かつ第3蛍光シグナルが検出された場合、小胞はリソソームであると判定する工程。ある態様において、方法は、細胞中の蛍光シグナルの空間的分布を測定する工程をさらに含む。
【００３９】
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、細胞受容体サイクリングをモニターする方法を提供する：(a)細胞と、少なくとも第1および第2ミセル集団を含む組成物とを接触させる工程であって、ここで、各ミセルが、ブロックコポリマー、蛍光色素、および受容体結合部分を含み、さらにここで、第1ミセル集団は第1pH転移点および第1蛍光発光スペクトルを有し、かつ第2ミセル集団は、第1pH転移点および第1発光スペクトルと異なる第2pH転移点および第2蛍光発光スペクトルを有する、工程；(b)少なくとも第1および／または第2蛍光発光スペクトルに対応する少なくとも第1および／または第2蛍光シグナルを細胞中またはその表面上において検出する工程であって、ここで、第1および／または第2蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程；ならびに(c)細胞中または細胞表面上の少なくとも第1および／または第2蛍光シグナルの分布を測定する工程。いくつかの態様において、方法は、第1および第2pH転移点および発光スペクトルと異なる第3pH転移点および第3蛍光発光スペクトルを有する第3ミセル集団をさらに含む。
【００４０】
別の態様は、以下の工程を含む、エンドソームpHをモニターする方法を提供する：(a)エンドソームと、少なくとも第1および第2ミセル集団を含む組成物とを、エンドソームが組成物を取り込む条件下で接触させる工程であって、ここで、各ミセルがブロックコポリマーおよび蛍光色素を含み、さらにここで、第1ミセル集団が約pH 5.7〜6.3のpH転移点および第1蛍光発光スペクトルを有し、第2ミセル集団が約pH 5.7〜6.3のpH転移点および第2蛍光発光スペクトルを有し、ここで、第1ミセル集団と第2ミセル集団は、異なるpH転移点および異なる蛍光発光スペクトルを有する、工程；(b)第1および第2蛍光発光スペクトルに対応する第1および第2蛍光シグナルの少なくとも一方をエンドソーム中において検出する工程であって、ここで、第1および／または第2蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程；ならびに(c)エンドソームのpHまたはpH範囲を決定する工程。いくつかの態様において、方法は、エンドソームと、少なくとも第3および第4ミセル集団とを接触させる工程をさらに含む。特定の局面において、第1ミセル集団は約pH 5.7のpH転移点を有し、第2ミセル集団は約pH 5.94のpH転移点を有し、第3ミセル集団は約pH 6.18のpH転移点を有し、かつ第4ミセル集団は約pH 6.42のpH転移点を有する。
【００４１】
別の態様は、以下の工程を含む、細胞外pHを測定する方法を提供する：(a)細胞の集合体またはそれらの細胞外環境と、上述のpH応答性システムまたは組成物とを接触させる工程；および(b)細胞の集合体中の蛍光シグナルを検出する工程であって、ここで、蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程。いくつかの態様において、方法は、細胞の集合体またはそれらの細胞外環境中の蛍光シグナルの空間的配向を検出する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、(a)1個もしくは複数個の細胞またはそれらの細胞外環境と、関心対象の化合物とを接触させる工程；(b)細胞中または細胞周囲の1種または複数種の蛍光シグナルを検出する工程；ならびに(c)細胞と関心対象の化合物との接触に続いて細胞中または細胞周囲の1種または複数種の蛍光シグナルに変化が生じたかどうかを判定する工程をさらに含む。いくつかの態様において、関心対象の化合物は薬物である。他の態様において、関心対象の化合物は、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、または小分子である。いくつかの態様において、細胞もしくは細胞の集合体またはそれらの細胞外環境は、癌細胞もしくは癌細胞の集合体またはそれらの細胞外環境、リソソーム蓄積に欠陥のある細胞もしくは細胞の集合体またはそれらの細胞外環境、欠陥のある神経細胞もしくは神経細胞の集合体またはそれらの細胞外環境、炎症と関連する細胞もしくは細胞の集合体またはそれらの細胞外環境、感染と関連する細胞もしくは細胞の集合体またはそれらの細胞外環境、創傷治癒と関連する細胞もしくは細胞の集合体またはそれらの細胞外環境、低酸素と関連する細胞もしくは細胞の集合体またはそれらの細胞外環境、放射線損傷と関連する細胞もしくは細胞の集合体またはそれらの細胞外環境、外傷と関連する細胞もしくは細胞の集合体またはそれらの細胞外環境、または低酸素血と関連する細胞もしくは細胞の集合体またはそれらの細胞外環境である。
【００４２】
別の態様は、以下の工程を含む、血管新生腫瘍血管系を画像化する方法を提供する：(a)腫瘍血管系と、上述の少なくとも2つのミセル集団を含む上述の組成物とを接触させる工程であって、ここで、各ミセルがブロックコポリマーおよび蛍光色素を含み、さらにここで、第1ミセル集団が約pH 6.5〜7.4のpH転移点および第1蛍光発光スペクトルを有し、第2ミセル集団が約pH 5.9〜6.4のpH転移点および第2蛍光発光スペクトルを有する、工程；ならびに(b)第1および第2蛍光発光スペクトルに対応する第1および第2蛍光シグナルを腫瘍血管系中において検出する工程であって、ここで、第1および第2蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程。いくつかの態様において、方法は、腫瘍血管系中の蛍光シグナルの空間的配向および分布を測定する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、標的指向部分を有するミセルをさらに含む。いくつかの態様において、標的指向部分はcRGDペプチドである。
【００４３】
別の態様は、以下の工程を含む、循環腫瘍細胞を画像化する方法である：(a)リンパ管中または血流中の循環腫瘍細胞と、上述の組成物またはpH応答性システムを含む組成物とを接触させる工程であって、ここで、ミセルが、ブロックコポリマーおよび蛍光色素を含み、かつ約pH 5.9〜6.4のpH転移点を有する、工程；ならびに(b)循環腫瘍細胞の蛍光シグナルを検出する工程であって、ここで、蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程。いくつかの態様において、方法は、リンパ系中または血流中の循環腫瘍細胞の蛍光シグナルの空間的配向および分布を測定する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、標的指向部分を有するミセルをさらに含む。いくつかの態様において、標的指向部分は抗体断片である。いくつかの態様において、抗体断片はセツキシマブの断片である。
【００４４】
別の態様は、以下の工程を含む、腫瘍を画像化する方法を提供する：(a)腫瘍と、少なくとも2つのミセル集団を含む上述の組成物とを接触させる工程であって、ここで、各ミセルがブロックコポリマーおよび蛍光色素を含み、さらにここで、第1ミセル集団が約pH 6.5〜7.4のpH転移点および第1蛍光発光スペクトルを有し、第2ミセル集団が約pH 5.9〜6.4のpH転移点および第2蛍光発光スペクトルを有する、工程；ならびに(b)第1および第2蛍光発光スペクトルに対応する第1および第2蛍光シグナルを腫瘍中において検出する工程であって、ここで、第1および第2蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程。いくつかの態様において、方法は、腫瘍中の蛍光シグナルの空間的配向および分布を測定する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、標的指向部分を有するミセルをさらに含む。いくつかの態様において、標的指向部分は抗体断片である。いくつかの態様において、抗体断片はセツキシマブの断片である。他の態様において、標的指向部分は小分子である。いくつかの態様において、小分子は葉酸である。
【００４５】
別の態様は、以下の工程を含む、原発腫瘍の所属領域内のリンパ節へと転移した腫瘍を画像化する方法を提供する：(a)腫瘍と、少なくとも2つのミセル集団を含む上述の組成物とを接触させる工程であって、ここで、各ミセルがブロックコポリマーおよび蛍光色素を含み、さらにここで、第1ミセル集団が約pH 6.5〜7.4のpH転移点および第1蛍光発光スペクトルを有し、第2ミセル集団が約pH 5.9〜6.4のpH転移点および第2蛍光発光スペクトルを有する、工程；ならびに(b)第1および第2蛍光発光スペクトルに対応する第1および第2蛍光シグナルを腫瘍中において検出する工程であって、ここで、第1および第2蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程。いくつかの態様において、方法は、腫瘍中の蛍光シグナルの空間的配向および分布を測定する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、標的指向部分を有するミセルをさらに含む。いくつかの態様において、標的指向部分は抗体断片である。いくつかの態様において、抗体断片はセツキシマブの断片である。他の態様において、標的指向部分は小分子である。いくつかの態様において、小分子は葉酸である。
【００４６】
別の態様は、以下の工程を含む、腫瘍のセンチネルリンパ節を画像化する方法を提供する：(a)腫瘍と、少なくとも2つのミセル集団を含む上述の組成物とを接触させる工程であって、ここで、各ミセルがブロックコポリマーおよび蛍光色素を含み、さらにここで、第1ミセル集団が約pH 6.5〜7.4のpH転移点および第1蛍光発光スペクトルを有し、第2ミセル集団が約pH 5.9〜6.4のpH転移点および第2蛍光発光スペクトルを有する、工程；ならびに(b)第1および第2蛍光発光スペクトルに対応する第1および第2蛍光シグナルを腫瘍中において検出する工程であって、ここで、第1および第2蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルがそのpH転移点に達しかつ解離したことを示す、工程、(c)蛍光シグナルを含むミセルの解離部分を、腫瘍を排出するリンパ管系へ入り込ませて、かつリンパ管系に沿ったリンパ節へとリンパ管系を通って移動させる工程、(d)第1および第2蛍光発光スペクトルに対応する第1および第2蛍光シグナルを、リンパ管系中およびリンパ管系に沿ったリンパ節中において検出する工程であって、ここで、第1および第2蛍光シグナルの検出が、対応する蛍光色素を含むミセルが原発腫瘍中においてそのpH転移点に達しかつ解離しかつリンパ管系およびリンパ管系に沿ったリンパ節へと移動したことを示す、工程。いくつかの態様において、方法は、腫瘍中の蛍光シグナルの空間的配向および分布を測定する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、標的指向部分を有するミセルをさらに含む。いくつかの態様において、標的指向部分は抗体断片である。いくつかの態様において、抗体断片はセツキシマブの断片である。他の態様において、標的指向部分は小分子である。いくつかの態様において、小分子は葉酸である。
【００４７】
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、蛍光シグナルをある期間にわたって1回または2回以上検出してもよい。さらに、蛍光シグナルの分布をある期間にわたって1回または2回以上測定してもよい。期間は数分間、数時間、または数日間にわたってもよい。いくつかの態様において、蛍光シグナルを、0〜12時間の期間にわたって、または1〜12時間の期間にわたって検出する。いくつかの態様において、蛍光シグナルの分布を、0〜12時間の期間にわたって、または1〜12時間の期間にわたって測定する。蛍光シグナルの検出は、連続的であっても断続的であってもよい。
【００４８】
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、1種または複数種の蛍光シグナルを検出する工程を2回またはそれ以上繰り返してもよい。本発明のある局面において、検出する工程は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20回またはそれ以上繰り返される。
【００４９】
細胞内またはオルガネラ内pHのモニタリングに加えて、本明細書に開示される方法および組成物はまた、細胞外pHまたは体液中のpHを検出および／またはモニターするために使用してもよい。例えば、腫瘍は、正常組織中の細胞外環境よりもより酸性である細胞外環境を有することが公知である。したがって、本明細書に開示される方法および組成物は、例えば、病理学、診断、または画像誘導手術適用について腫瘍境界を確認するために、使用してもよい。ある局面において、標的指向部分の追加は、関連する細胞または組織の標識化をさらに増強することができる。さらに、pH応答性ミセルのシリーズを使用して、正常組織と病変組織との間でより大きなコントラストを達成することができ、何故ならば、pH応答性ミセルのシリーズは、pHおよび／または標的指向部分に依存してこれらの組織を差次的に標識するためである。また、pH応答性ミセルのシリーズは、薬物などの種々の化合物を正常および病変組織へ送達するために使用してもよく、何故ならば、pH応答性ミセルのシリーズは、pHおよび／または標的指向部分に依存して正常組織対病変組織中で差次的に解離するためである。したがって、例えば、ミセルのシリーズは、正常細胞へレスキュー薬物を送達すると同時に、癌細胞へ化学療法薬または放射線増感剤を送達するために使用することができる。ミセルのシリーズの蛍光標識化は、薬物がミセル内から放出された時間および場所を示すために使用してもよい。
【００５０】
別の態様において、本発明は、
a)式
2015518145.tif 000008
に記載のポリマー；
b)式A1に記載のモノマー；および
c)式A2に記載のモノマー
を含むコポリマー、またはその薬学的に許容される塩；ならびにその立体異性体、同位体変種および互変異性体を提供し；
ここで、
各A1およびA2は、独立して、
2015518145.tif 000009
より選択され、
各R1aは、独立して、H、置換もしくは非置換アルキル、または
2015518145.tif 000010
であり；
各R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R4c、R4d、およびR5は、独立して、Hまたは置換もしくは非置換アルキルであり；
各R6aおよびR6bは、独立して、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであるか；またはR6aおよびR6bは、それらが結合しているN原子と一緒になってヘテロ環を形成し；
R7は色素を含む部分であり；
下付き文字nは10〜200の整数であり；
かつここで、コポリマーはランダムコポリマーであり、但し、Zhou, K., Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 6109-6114、PCT/US2011/00148、およびPCT/US2011/047497に開示されるコポリマーは明示的に除外される。
【００５１】
別の態様において、本発明は、式I
2015518145.tif 000011
に記載のコポリマーまたはその薬学的に許容される塩；ならびにその立体異性体、同位体変種および互変異性体を提供し；
ここで、
各A1およびA2は、独立して、
2015518145.tif 000012
より選択され、
但し、A1およびA2の両方は同時には異なるものであり；
各R1aは、独立して、H、置換もしくは非置換アルキル、または
2015518145.tif 000013
であり；
各R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R4c、R4d、およびR5は、独立して、Hまたは置換もしくは非置換アルキルであり；
R1bは、H、置換もしくは非置換アルキル、Br、またはS-Rであり；
各R6aおよびR6bは、独立して、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであるか；またはR6aおよびR6bは、それらが結合しているN原子と一緒になってヘテロ環を形成し；
R7は色素を含む部分であり；
下付き文字nは10〜200の整数であり；下付き文字xは1〜200の整数であり；かつ下付き文字yは1〜200の整数であり；
かつここで、rは、コポリマーがランダムコポリマーの形態であることを示し、但し、Zhou, K., Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 6109-6114、PCT/US2011/00148、およびPCT/US2011/047497に開示されるコポリマーは明示的に除外される。
【００５２】
本明細書に開示される方法は、関心対象の任意の細胞と共に使用してもよい。ある態様において、細胞は、癌細胞であるか、リソソーム蓄積に欠陥のある細胞であるか、または欠陥のある神経細胞である。いくつかの態様において、細胞は組織試料中の細胞であってもよい。例えば、ナノプラットフォームは、画像誘導外科切除および／または外科切除後の腫瘍境界の分析について腫瘍および正常組織境界を定めるために使用してもよい。いくつかの態様において、標的指向部分は、ミセルを腫瘍細胞または正常細胞のいずれかへと方向付けるために使用してもよい。あるいは、細胞内または細胞外基質中のいずれかでの、pHの差は、本明細書に記載のpH応答性ナノプラットフォームを使用して、腫瘍組織と正常組織とを識別するために使用してもよい。
【００５３】
本発明のいくつかの態様において、pH応答性システム、組成物、または方法は、記載される2種以上のナノ粒子またはミセルではなく、想定されるナノ粒子またはミセルのうちの1種のみを使用して達成され得ることが想定される。いくつかの態様において、ナノ粒子またはミセルの各々は、実施例に記載されるように、ハイブリッドナノ粒子またはハイブリッドミセルとして使用され得ることも想定される。いくつかの態様において、ナノ粒子の各々が連続的であり得ることも想定される。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「pH応答性ミセル」、「pH感受性ミセル」、「pH活性化型ミセル」および「pH活性化型ミセル（pHAM）ナノ粒子」は、1種または複数種のブロックコポリマーを含むミセルを指すように本明細書において交換可能に用いられ、pHに応じて（例えば、特定のpHよりも上または下で）解離する。非限定的な例として、特定のpHで、ブロックコポリマーは実質的にミセル型である。pHが変化する（例えば、低下する）につれて、ミセルは解離し始め、pHがさらに変化する（例えば、さらに低下する）につれて、ブロックコポリマーは実質的に解離（非ミセル）型で存在する。
【００５５】
本明細書において使用される場合、「pH転移範囲」は、ミセルが解離するpH範囲を指す。
【００５６】
本明細書において使用される場合、「pH転移値」（pHt）は、ミセルの半分が解離するpHを指す。
【００５７】
本明細書に記載される任意の方法または組成物が、本明細書に記載される任意の他の方法または組成物に関して実施され得ることが意図される。
【００５８】
用語「含む（comprise）」（および含むの任意の形態、例えば「含む（comprises）」および「含むこと（comprising）」）、「有する（have）」（および有するの任意の形態、例えば「有する（has）」および「有すること（having）」）、「含有する（contain）」（および含有するの任意の形態、例えば「含有する（contains）」および「containing」）、ならびに「包含する（include）（および包含するの任意の形態、例えば「包含する（includes）」および「包含すること（including）」）は、オープンエンドの連結動詞である。結果として、1つまたは複数の記載の工程または要素を「含む」、「有する」、「含有する」、または「包含する」方法、組成物、キット、またはシステムは、それらの記載の工程または要素を有するが、それらの工程または要素のみを有することに限定されず；それは、記載されていない要素または工程を有してもよい（即ち、カバーしてもよい）。同様に、1つまたは複数の記載の特徴を「含む」、「有する」、「含有する」、または「包含する」方法、組成物、キット、またはシステムの要素は、それらの特徴を有するが、それらの特徴のみを有することに限定されず；それは、記載されていない特徴を有してもよい。
【００５９】
本発明の方法、組成物、キット、およびシステムのいずれかの任意の態様が、記載の工程および／または特徴を含む／包含する／含有する／有するのではなく、記載の工程および／または特徴からなるまたはそれらから本質的になる場合がある。したがって、請求項のいずれかにおいて、用語「からなる」または「から本質的になる」は、そうでなければオープンエンドの連結動詞を使用していたものから所定の請求項の範囲を変更するために、上記に記載のオープンエンドの連結動詞のいずれかの代わりに用いてもよい。
【００６０】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すようにまたは選択肢が相互に排他的であることが明示的に示されない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は選択肢のみならびに「および／または」を指す定義を支持する。
【００６１】
本出願全体にわたって、用語「約」は、値が、値を決定するために用いられる装置または方法についての誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。
【００６２】
長年の特許法に従って、単語「1つの（a）」および「1つの（an）」は、特許請求の範囲または明細書において単語「含む」と共に使用される場合、特に断りのない限り、1つまたは複数を意味する。
【００６３】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明および具体例は、本発明の具体的な態様を示しているが、例示のためのみに与えられることが理解されるべきであり、何故ならば、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修飾がこの詳細な説明から当業者に明らかになるためである。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明のある局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に示される具体的な態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面のうちの1つまたは複数を参照することによってよりよく理解され得る。
【図１】pH活性化型ナノ粒子の開発のための3つの可能性のある光化学機構の略図：Hダイマー形成、ホモフェルスター共鳴エネルギー移動（ホモFRET）、および光誘起電子移動（PeT）。
【図２】（図2A）PDPA-TMRナノプローブ（200μg/mL）の超pH応答特性、ここで、蛍光活性化は6.2〜6.6のpH範囲内で観察される。試料を545 nmで励起し、発光スペクトルを550〜750 nmで収集した。（図2B）PDPA-TMRについてのpHの関数としての正規化蛍光強度。pH 5.5および7.4でのPDPA-TMR水溶液（100μg/mL）の挿入蛍光画像を、Maestro機器において撮影した。数加重（number-weighted）流体力学的半径＜Rh＞のpH依存性を、0.02 M NaOH水溶液を使用したPDPA-TMRのpH滴定によって得た。（図2C）pHの関数としてのPDPA-TMR中の第3級アミノ基のモル分率。図2Bからの蛍光転移点（pHt）およびPDPA-TMRコポリマーの見かけのpKaを示す。（図2D）異なるポリマー濃度でのpH 7.4に対する異なるpHでのPDPA-TMR試料の蛍光強度比。
【図３】PDPA-TMR1、PDPA-TMR3、PDPA-TMR6、PDPA-CMN、PDPA-BDY、PDPA-PPOの化学構造およびそれらの対応する蛍光特性。
【図４】（図4A）pH 7.4に対する異なるpHでのPDPA-TMR1、PDPA-TMR3およびPDPA-TMR6水溶液の蛍光強度比のpH依存性。コポリマー濃度は200μg/mLであり、最大発光強度580 nmで測定された。（図4B）pH 7.4および5.5での水溶液中のPDPA-TMR1、PDPA-TMR3およびPDPA-TMR6のモノマーピーク強度に対する正規化を伴う、UV-Vis吸収スペクトル。コポリマー濃度は200μg/mLであり、遊離TMR色素濃度は1.0μg/mLであった。（図4C）PDPA-TMR1、PDPA-TMR3およびPDPA-TMR6の、それらの色素フリー前駆体（PDPA-AMAn=1,3,6）それぞれに対する重量パーセンテージの関数としての、pH 5.5対7.4の蛍光強度比。（図4D）pH 7.4でのPDPA-CMN、PDPA-BDY、および1:1重量比を有するそれらの分子混合物の蛍光発光スペクトル。試料をCMN波長（λex＝408 nm）で励起した。各コポリマー濃度を200μg/mLに制御した。
【図５】（図5A）PDPA-PPOコポリマー溶液（濃度＝500μg/mL）についてのpH 7.4に対する異なるpHでの蛍光強度比。（図5B）PDPA-PPOとその色素フリー合成前駆体との分子混合物中のPDPA-PPOの重量パーセンテージの関数としてのpH 5.5対7.4での蛍光強度比。
【図６】PBDA-BDY、PDPA-TMR、PC7A-C55、およびPC6A-C75の化学構造ならびにそれらの対応する蛍光データ。同一のポリマー濃度（100μg/mL）しかし異なるpH値でのそれらの水溶液の代表的な蛍光画像を示した。
【図７】PBDA-BDY、PDPA-TMR、PC7A-C55、およびPC6A-C75についてのpHの関数としての正規化蛍光強度。各ナノ粒子についての励起および発光条件を図6に示す。
【図８】異なるpH転移を有する多色ナノ粒子の経時的な連続活性化。定量的データを共焦点画像から解析した。各細胞内部の蛍光強度を12時間でのそれに対して正規化した。最大強度比率の半分を達成するための時間（t1/2）を、各ナノ粒子について評価した。
【図９】（図9A）0.02 M NaOH水溶液でのPEO-(PDPA-TMR)のpH滴定曲線。（図9B）滴定実験の間のpH 5.8および6.8でのPEO-(PDPA-TMR)水溶液の数加重流体力学的半径分布。
【図１０】PEO114-b-(PDPA77-co-AMA3)コポリマーの臨界ミセル濃度（CMC）の測定。ピレンのI1/I3蛍光比率が、PEO114-b-(PDPA77-co-AMA3)濃度の関数としてプロットされている。CMCを0.9μg/mLでの破線によって示す。
【図１１】pH 7.4および5.5での水溶液中の遊離TMR色素およびPEO-(PDPA-TMR)の蛍光強度減衰。
【図１２】pH 5.5（ユニマー状態）でのPDPA-CMN、PDPA-BDY、およびそれらの分子混合物の蛍光発光スペクトル。各ポリマー濃度を200μg/mLに制御する。試料を408 nmで励起し、発光スペクトルを420〜700 nmで収集した。
【図１３】（図13A）pH 7.4でのPDPA-BDY、PDPA-TMR、および1:1重量比を有するそれらの分子混合物の蛍光発光スペクトル。各個々のポリマー濃度は200μg/mLである。試料を498 nmで励起し、発光スペクトルを505〜750 nmで収集した。（図13B）pH 5.5でのこれらの溶液の蛍光発光スペクトル。
【図１４】pH 7.4および5.5での遊離クマリン水溶液（クマリン濃度は1μg/mLである）の（図14A）蛍光および（図14B）UV-Vis吸収スペクトル。pH 7.4および5.5でのPDPA-CMN水溶液の（図14C）蛍光発光および（図14D）UV-Vis吸収スペクトルであり、ここでポリマー濃度は200μg/mLである。（図14E）PDPA-CMNとその対応する合成前駆体との分子混合物中のPDPA-CMNの重量パーセンテージの関数としてのpH 5.5対7.4での蛍光強度比の変化（総ポリマー濃度は200μg/mLである）。蛍光発光の測定のために、試料を408 nmで励起し、発光スペクトルを420〜700 nmで収集した。
【図１５】（図15A）pH 7.4および5.5での水溶液中の遊離PPO色素の蛍光発光スペクトル（PPO濃度は15μg/mLである）。（図15B）コポリマー濃度が500μg/mLである、水溶液中のPEO-(PDPA-PPO)コポリマーのpH依存性蛍光発光スペクトル。蛍光発光実験について、試料を408 nmで励起した。
【図１６】（図16A）pH依存性蛍光発光スペクトルおよび（図16B）水溶液（コポリマー濃度は200μg/mLである）中のpHの関数としてのPC7A-C55の蛍光強度比。試料を690 nmで励起し、発光スペクトルを700〜780 nmで収集した。（図16C）pH 7.6および6.2での水溶液中のPC7A-C55のモノマーピーク強度に対する正規化を伴う、吸収スペクトル。（図16D）PC7A-C55とその対応する色素フリー合成前駆体との分子混合物中のPC7A-C55の重量パーセンテージの関数としての蛍光強度比の変化。
【図１７】（図17A）pH依存性蛍光発光スペクトルおよび（図17B）水溶液（コポリマー濃度は200μg/mLである）中のpHの関数としてのPC6A-C75の蛍光強度比。試料を790 nmで励起し、発光スペクトルを800〜900 nmで収集した。（図17C）pH 8.0および6.4での水溶液中のPC6A-C75のモノマーピーク強度に対する正規化を伴う、吸収スペクトル。（図17D）PC6A-C75とその対応する色素フリー合成前駆体との分子混合物中のPC6A-C75の重量パーセンテージの関数としての蛍光強度比の変化。
【図１８】（図18A）pH依存性蛍光発光スペクトルおよび（図18B）水溶液中のPDBA-BDYの蛍光最大強度比（コポリマー濃度は200μg/mLである）。試料を498 nmで励起し、発光スペクトルを505〜650 nmで収集した。（図18C）pH 6.2および4.2での水溶液中のPDBA-BDYのモノマーピーク強度に対する正規化を伴う、吸収スペクトル。（図18D）PDBA-BDYとその対応する色素フリー合成前駆体との分子混合物中のPDBA-BDYの重量パーセンテージの関数としての蛍光最大強度比の変化。
【図１９】異なる用量でのナノ粒子組成物に対する、H2009細胞中のナノ粒子細胞毒性の依存性。37℃で1時間、漸増濃度のPEG-PDBA、PEG-PDPAまたはPEG-PC7Aナノ粒子溶液と共に、H2009細胞をインキュベートした。それらの細胞毒性を細胞培養培地中において12時間後にMTT生存度アッセイで評価した。エラーバーは、6つのリプリケート試料の標準偏差を示す。
【図２０】PEO-(PR-色素)ブロックコポリマーの合成についてのスキーム。
【図２１】（図21A）pH活性化型ミセルナノプローブの合成。（図21B）異なるナノプローブについてのpHの関数としての正規化蛍光強度。ナノプローブ濃度は200μg/mLであり、Fmax/Fminは63倍までである。（図21C）コポリマーの成分中のPDBAのパーセンテージの関数としてのpH転移値。
【図２２】超pH感受性（UPS）ナノプローブによる腫瘍微小環境のイメージングの概略図。UPSナノプローブは血液循環の間pH 7.4で「オフ」のままである。腫瘍に到達した後、UPSナノプローブは、腫瘍環境中の酸性細胞外pHe（6.5〜6.8）、または受容体介在エンドサイトーシス後の腫瘍内皮細胞中のエンドサイトーシスオルガネラ（pHi、5.0〜6.0）によって、オンになる。
【図２３】UPSナノプローブの合成および特徴決定。23A：それぞれ6.9および6.2でpH転移を有する、2種類のナノプローブ、UPSeおよびUPSiの構造組成。UPSeは、酸性腫瘍細胞外液（pHe＝6.5〜6.8）で活性化するように特別に設計されている。UPSiは、酸性エンドサイトーシスオルガネラ内部（例えば、pHi＝5.0〜6.0）で活性化され得る。Cy5.5を大半の動物研究においてNIRフルオロフォアとして使用する。23B：UPSeおよびUPSiナノプローブについてのpHの関数としての正規化蛍光強度。高pH（例えば7.4）で、プローブは両方ともサイレントのままである。それらの転移（即ち6.9および6.2）未満のpHで、ナノプローブはミセル解離の結果として活性化され得る。破線は、Henderson-Hasselbach式に基づくpKa 6.9を有する小分子pHセンサーのpH応答をシミュレートする。ナノプローブについて、pH応答（ΔpH10-90%）は非常に鋭敏であり（オン／オフ状態間で＜0.25 pH単位）、＞100倍のシグナル増幅を伴う。対照的に、小分子pHセンサーは、匹敵するシグナル変化のためには3 pH単位を必要とする。23C：異なるpH緩衝液中のUPSe-Cy5.5ナノプローブ溶液の蛍光画像（λex＝675 nm、λem＝710 nm）。23D：pH 7.4および6.7での透過型電子顕微鏡写真（ポリマー濃度＝1 mg/mL、スケールバー＝100 nm）。23E：UPSeナノプローブは37℃で24時間にわたって新鮮なマウス血清中において安定のままである。
【図２４】cRGD-UPSiナノプローブの特徴決定。24A：cRGD-UPSiナノプローブのpH依存性蛍光スペクトル。各試料を675 nmで励起し、発光スペクトルを690〜780 nmで収集する。ポリマー濃度は0.1 mg/mLであった。24B：cRGD-UPSiナノプローブについてのpHの関数としての蛍光比率。PH応答（ΔpH10-90%）は0.21 pH単位であり、シグナル増幅は128倍である。24C：pHの関数としてのcRGD-UPSiナノプローブの蛍光シグナル増幅。蛍光画像を、「オレンジ色」フィルター（640〜820 nm）を使用してMaestroインビボイメージングシステム（CRI）においてキャプチャーした。24D：ポリマー濃度1 mg/mLでのpH 7.4および6.0緩衝液中のcRGD-UPSiナノプローブの透過型電子顕微鏡。スケールバーは100 nmである。24E：cRGD-UPSiナノプローブは、37℃で24時間にわたって新鮮なマウス血清中において安定のままである。
【図２５】UPSeナノプローブは酸性腫瘍pHeを特異的に画像化することができる。25A：癌細胞によるグルコースの好気性解糖および乳酸産生。2-DGおよびCHCは、それぞれ、グルコース取り込みおよび乳酸分泌についての代謝阻害剤である。25B：A549細胞におけるグルコース取り込みおよび乳酸分泌の速度に対する2-DGまたはCHCの効果。25C：24時間インキュベーション後の2-DGまたはCHCの存在下でのA549細胞培養培地の酸性化。25D：UPSeナノプローブ（10 mg/kg）の注射後24時間でのA549腫瘍担持マウスの重ね合わせた蛍光画像。対照群において、2-DG（250 mg/kg）またはCHC（250 mg/kg）をUPSeナノプローブ投与の12時間前に注射した。Cy5.5（灰色）および自己蛍光（淡灰色）が合成画像に別々に示される。25E：UPSe注射後の時間の関数としての腫瘍および正常組織間のNIR蛍光強度比（T/N比率）。データを平均値±s.d.として示す(n＝4)。25F：UPSeの注射後24時間での蛍光強度の器官対筋肉比率。データを平均値±s.d.として示す(n＝4)。**P＜0.01, 他の器官と比較。25G：低酸素バンドはA549腫瘍異種移植片中のUPSeの活性化パターンと相関する。低酸素（淡灰色）および腫瘍血管（CD31、淡灰色）について染色された腫瘍スライスのホールマウント画像。全ての画像を隣接している切片から×200倍率で得た。スケールバーは2 mmである。
【図２６】注射後24時間で犠牲にしたA549腫瘍担持マウスの切開した腫瘍および器官の代表的なエクスビボ蛍光画像。A549腫瘍担持マウスに10 mg/kgの用量でUPSeナノプローブを静脈内投与し、24時間後、器官をNIRイメージングのために収集した。対照群において、2-DG（250 mg/kg）またはCHC（250 mg/kg）をUPSeナノプローブ投与の12時間前に注射した。
【図２７】UPSeナノプローブ画像と組織学的に染色したホールマウント凍結切片との代表的な相関。上部（左から右へ）、27A：UPSeナノプローブシグナル、27B：低酸素染色についてのピモニダゾール、27C：CD31抗体で染色された腫瘍血管系、27D：細胞増殖染色についてのKi-67。下部、マージ画像（左から右へ）、27E：UPSeナノプローブ（灰色）およびピモニダゾール（淡灰色）；27F：UPSeナノプローブ（灰色）およびCD31（淡灰色）；27G：UPSeナノプローブ（灰色）およびKi-67（淡灰色）。全ての画像を隣接している切片から×200倍率で得た。スケールバーは2 mmである。
【図２８】cRGD-UPSiナノプローブは血管新生腫瘍血管系を特異的に画像化することができる。28A：cRGD-UPSiナノプローブの設計。28B：腫瘍内皮細胞中のαvβ3介在エンドサイトーシス後のcRGD-UPSiナノプローブのインターナリゼーションおよび活性化の概略図。ナノプローブはエンドソームまたはリソソーム中に蓄積され、ここで、酸性pHがナノプローブを活性化する。28C：cRGD-UPSiまたはUPSiナノプローブ（10 mg/kg）の注射後6時間でのA549腫瘍担持マウスの重ね合わせた蛍光画像。拮抗群において、ブロッキング用量のcRGDペプチド（25 mg/kg）をcRGD-UPSi投与の30分前に注射した。Cy5.5（灰色）および自己蛍光（淡灰色）が合成画像に別々に示される。28D：時間の関数としてのナノプローブの注射後のT/N比率。データを平均値±s.d.として示す（n＝4）。28E：ナノプローブの注射後6時間での蛍光強度の器官対筋肉比率。データを平均値±s.d.として示す（n＝4）。**P＜0.01, UPSiまたはcRGDブロッキング群で処置した腫瘍と比較。28F：ナノプローブの注射後6時間でのエクスビボ腫瘍、筋肉、および血液の代表的な画像。28G：cRGD-UPSiおよびUPSiナノプローブについての血漿濃度対時間曲線（n＝4）。28H：静脈内注射の6時間後のcRGD-UPSiおよびUPSiナノプローブの生体内分布プロファイル（n＝4）。28I：ナノプローブ活性化と腫瘍血管系（抗CD31）との相関。ナノプローブと腫瘍血管系との同時局在をマージ画像において白色によって示す（淡灰色：血管；灰色：ナノプローブ；暗灰色：核。スケールバー＝100μm）。
【図２９】HUVEC細胞中のcRGD-UPSiナノプローブの蛍光活性化。29A：HUVEC細胞中の「活性化された」cRGD-UPSiナノプローブの代表的な共焦点画像。UPSiおよび遊離cRGDブロックを対照として使用した。29B：異なるナノプローブ（各群についてN＞100）および細胞培養培地で処理したHUVEC細胞の蛍光強度。29C：UPSiおよび遊離cRGD＋cRGD-UPSi対照と比べてのcRGD-UPSiで処理されたHUVEC細胞のコントラスト・ノイズ比（CNR）。**P＜0.01, 他の2つの群と比較。
【図３０】HUVEC中のcRGD-UPSiナノプローブの細胞内活性化および分布。HUVECを3時間cRGD-UPSiの存在下でインキュベートした。30A：LysoTracker DND-26（淡灰色）または30B：MitoTracker Green FM（淡灰色）のいずれかで染色された細胞の共焦点画像をキャプチャーし、写真を重ね合わせた。灰色はナノプローブシグナルを示す。白色はナノプローブとリソソームとの同時局在の表示である。
【図３１】インビボでのA549腫瘍イメージングについてのcRGD-UPSiナノプローブの特異的シグナル増幅。A549腫瘍を担持する無胸腺(nu/nu)マウスに、10 mg/kgの投薬量のナノプローブを注射し、選択時点でのNIR蛍光画像をキャプチャーした。マウス自己蛍光を淡灰色にカラーコード化し、一方、純粋な（unmixed）ナノプローブシグナルを灰色にコード化する。
【図３２】注射後6時間で犠牲にしたA549腫瘍担持マウスの切開した腫瘍および器官の代表的なエクスビボ蛍光画像。A549腫瘍担持マウスに10 mg/kgの用量でcRGD-UPSiまたはUPSiを静脈内注射し、6時間後、腫瘍および器官をNIRイメージングのために収集した。拮抗群において、ブロッキング用量のcRGDfKペプチド（25 mg/kg）をcRGD-UPSiナノプローブ投与の30分前に注射した。
【図３３】インビボおよびエクスビボでのA549腫瘍イメージングについてのIRDye（登録商標）800CW-cRGD Optical Probe。33A：A549腫瘍を担持する無胸腺(nu/nu)マウスに、2 nmol/マウスの投薬量のIRDye（登録商標）800CW RGDプローブを注射し、選択時点でのNIR蛍光画像をキャプチャーした。マウス自己蛍光を淡灰色にカラーコード化し、一方、純粋なプローブシグナルを灰色にコード化する。33B：プローブ注射後の腫瘍および正常組織間のインビボ時間依存性平均蛍光強度比。33C：注射後24時間でマウスを犠牲にし、収集した器官を可視化した。33D：A549腫瘍担持マウス中のIRDye（登録商標）800CW RGDプローブについての器官対筋肉比率。器官の蛍光シグナルを筋肉中の蛍光シグナルに対して正規化した。データを平均値±s.d.として示す（n＝3）。
【図３４】腫瘍血管系中のcRGD-UPSiナノプローブホーミング（homing）および活性化の組織病理分析。UPSi群およびcRGD-UPSi群（6時間）の腫瘍組織切片をCD31染色へ供した。腫瘍血管系染色（抗CD31）を淡灰色で示す。ナノプローブシグナルを灰色で示す。細胞核を暗灰色で示す。スケールバーは100μmである。
【図３５】A549腫瘍担持マウス中の3H標識UPSナノプローブのインビボ薬物動態研究。UPSe、cRGD-UPSi、およびUPSiナノプローブ（1群当たりn＝4〜5）の血漿濃度対時間曲線を得た。
【図３６】iUPSナノプローブ（10 mg/kg）またはPBSを静脈内投与した無胸腺ヌードマウスについての血液検査パラメータ。結果は、処置後7日間にわたって肝機能および腎機能の異常を示さない。データを平均値±s.d.として示す（n＝5）。略語：ALT、アスパラギン酸トランスアミナーゼ；GOT、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ；BUN、血液尿素窒素；CRE、クレアチニン。
【図３７】iUPSナノプローブは、ブロードな腫瘍特異性で酸性pHeおよび腫瘍血管系の両方を標的とする。37A：生体内蛍光画像は、それぞれ、腫瘍血管系および実質内部のcRGD-UPSi-RhoG（10 mg/kg, 淡灰色）およびUPSe-TMR（10 mg/kg, 灰色）の空間的活性化の補完的パターンを示す。デュアルナノプローブを静脈内に同時注射し、画像を注射後6時間で撮影した。37B：iUPSナノプローブは、異なる癌タイプ（乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、肺癌、脳腫瘍、および膵臓癌）および器官部位の10個の異なる腫瘍モデルにおけるブロードな腫瘍イメージング特異性および効果を示す。各モデルにおいて、高いT/N比率が観察され、ブロードな腫瘍特異性を達成するためのユニバーサルな戦略として腫瘍微小環境シグナルを標的とすることの成功を実証している。
【図３８Ａ】iUPSナノプローブは最小限のバックグラウンドシグナルで多病巣性MMTV-PyMTトランスジェニック乳房腫瘍を明確に光らせることができる。38Aa：多発性乳房腫瘍を担持するMMTV-PyMTトランスジェニックマウスに、10 mg/kgの投薬量のiUPSナノプローブを注射し、Maestro CRIイメージングシステムを使用して24時間でのNIR蛍光画像をキャプチャーした。マウス自己蛍光を淡灰色にカラーコード化し、一方、純粋なナノプローブシグナルを暗灰色にコード化する。38Ab：注射後24時間でマウスを犠牲にし、収集した器官を可視化した。38Ac：多発性乳房腫瘍小結節の蛍光イメージング。38Ad：ナノプローブの注射後24時間での蛍光強度の器官対筋肉比率。器官の蛍光シグナルを筋肉中の蛍光シグナルに対して正規化した。データを平均値±s.d.として示す(n＝4)。**P＜0.01, 肝臓以外の他の器官と比較。
【図３８Ｂ】iUPSナノプローブは高いT/N比率でMDA-MB-231腫瘍異種移植片を光らせる。38Ba：ヒトMDA-MB-231腫瘍異種移植片を担持するヌードマウスに、10 mg/kgの投薬量のiUPSナノプローブを注射し、Maestro CRIイメージングシステムを使用して24時間でのNIR蛍光画像をキャプチャーした。マウス自己蛍光を淡灰色にカラーコード化し、一方、純粋なナノプローブシグナルを暗灰色にコード化する。38Bb：注射後24時間でマウスを犠牲にし、収集した器官を可視化した。38Bc：ナノプローブの注射後24時間での蛍光強度の器官対筋肉比率。器官の蛍光シグナルを筋肉中の蛍光シグナルに対して正規化した。データを平均値±s.d.として示す(n＝4)。**P＜0.01, 肝臓以外の他の器官と比較。
【図３８Ｃ】iUPSナノプローブは高いT/Nコントラストで同所性PC-3前立腺癌を光らせる。38Ca：同所性PC-3前立腺腫瘍を担持するヌードマウスに、10 mg/kgの投薬量のiUPSナノプローブを注射し、Maestro CRIイメージングシステムを使用して24時間でのNIR蛍光画像をキャプチャーした。マウス自己蛍光を淡灰色にカラーコード化し、一方、純粋なナノプローブシグナルを灰色にコード化する。38Cb：注射後24時間でマウスを犠牲にし、収集した器官を可視化した。38Cc：ナノプローブの注射後24時間での蛍光強度の器官対筋肉比率。器官の蛍光シグナルを筋肉中の蛍光シグナルに対して正規化した。データを平均値±s.d.として示す(n＝4)。**P＜0.01, 肝臓以外の他の器官と比較。
【図３８Ｄ】iUPSナノプローブは高いイメージングコントラストで同所性HCC4034頭頸部腫瘍を光らせる。38Da：同所性HCC4034頭頸部腫瘍を担持するヌードマウスに、10 mg/kgの投薬量のiUPSナノプローブを注射し、Maestro CRIイメージングシステムを使用して24時間でのNIR蛍光画像をキャプチャーした。マウス自己蛍光を淡灰色にカラーコード化し、一方、純粋なナノプローブシグナルを暗灰色にコード化する。38Db：注射後24時間でマウスを犠牲にし、収集した器官を可視化した。38Dc：ナノプローブの注射後24時間での蛍光強度の器官対筋肉比率。器官の蛍光シグナルを筋肉中の蛍光シグナルに対して正規化した。データを平均値±s.d.として示す(n＝4)。**P＜0.01, 肝臓以外の他の器官と比較。
【図３８Ｅ】iUPSナノプローブは高いイメージングコントラストで同所性HN5頭頸部腫瘍を光らせる。38Ea：同所性HN5頭頸部癌を担持するヌードマウスに、10 mg/kgの投薬量のiUPSナノプローブを注射し、Maestro CRIイメージングシステムを使用して24時間でのNIR蛍光画像をキャプチャーした。マウス自己蛍光を淡灰色にカラーコード化し、一方、純粋なナノプローブシグナルを暗灰色にコード化する。38Eb：注射後24時間でマウスを犠牲にし、収集した器官を可視化した。38Ec：ナノプローブの注射後24時間での蛍光強度の器官対筋肉比率。器官の蛍光シグナルを筋肉中の蛍光シグナルに対して正規化した。データを平均値±s.d.として示す（n＝4）。**P＜0.01, 肝臓以外の他の器官と比較。
【図３８Ｆ】iUPSナノプローブは最小限のバックグラウンドシグナルで多くの3LL Lewis肺癌病巣を光らせる。同所性3LL Lewis肺癌を担持するヌードマウスに、10 mg/kgの投薬量のcRGD-UPSeナノプローブを注射し、Maestro CRIイメージングシステムを使用して、24時間での切除した肺のNIR蛍光画像をキャプチャーした。自己蛍光を淡灰色にカラーコード化し、一方、純粋なナノプローブシグナルを灰色にコード化する。スケールバーは5 mmである。多数の腫瘍小結節（約1 mm）の高解像度NIR画像を可視化した。
【図３８Ｇ】iUPSナノプローブは高いイメージングコントラストでA549肺癌異種移植片を光らせる。38Ga：ヒトA549肺腫瘍を担持するヌードマウスに、10 mg/kgの投薬量のiUPSナノプローブを注射し、Maestro CRIイメージングシステムを使用して24時間でのNIR蛍光画像をキャプチャーした。マウス自己蛍光を淡灰色にカラーコード化し、一方、純粋なナノプローブシグナルを暗灰色にコード化する。38Gb：注射後24時間でマウスを犠牲にし、収集した器官を可視化した。38Gc：ナノプローブの注射後24時間での蛍光強度の器官対筋肉比率。器官の蛍光シグナルを筋肉中の蛍光シグナルに対して正規化した。データを平均値±s.d.として示す（n＝4）。**P＜0.01, 肝臓以外の他の器官と比較。
【図３８Ｈ】iUPSナノプローブは高いイメージングコントラストでSF-188脳腫瘍異種移植片を光らせる。38Ha：ヒトSF-188神経膠腫を担持するヌードマウスに、10 mg/kgの投薬量のiUPSナノプローブを注射し、Maestro CRIイメージングシステムを使用して24時間でのNIR蛍光画像をキャプチャーした。マウス自己蛍光を淡灰色にカラーコード化し、一方、純粋なナノプローブシグナルを灰色にコード化する。38Hb：注射後24時間でマウスを犠牲にし、収集した器官を可視化した。38Hc：ナノプローブの注射後24時間での蛍光強度の器官対筋肉比率。器官の蛍光シグナルを筋肉中の蛍光シグナルに対して正規化した。データを平均値±s.d.として示す（n＝4）。**P＜0.01, 肝臓以外の他の器官と比較。
【図３８Ｉ】iUPSナノプローブは高いイメージングコントラストでLN-229脳腫瘍異種移植片を光らせる。38Ia：ヒトLN-229神経膠腫を担持するヌードマウスに、10 mg/kgの投薬量のiUPSナノプローブを注射し、Maestro CRIイメージングシステムを使用して24時間でのNIR蛍光画像をキャプチャーした。マウス自己蛍光を淡灰色にカラーコード化し、一方、純粋なナノプローブシグナルを暗灰色にコード化する。38Ib：注射後24時間でマウスを犠牲にし、収集した器官を可視化した。38Ic：ナノプローブの注射後24時間での蛍光強度の器官対筋肉比率。器官の蛍光シグナルを筋肉中の蛍光シグナルに対して正規化した。データを平均値±s.d.として示す（n＝4）。**P＜0.01, 肝臓以外の他の器官と比較。
【図３８Ｊ】iUPSナノプローブは高いイメージングコントラストでMiaPaca-2膵臓癌異種移植片を光らせる。38Ja：ヒトMiaPaca-2膵臓腫瘍を担持するヌードマウスに、10 mg/kgの投薬量のiUPSナノプローブを注射し、Maestro CRIイメージングシステムを使用して24時間でのNIR蛍光画像をキャプチャーした。マウス自己蛍光を淡灰色にカラーコード化し、一方、純粋なナノプローブシグナルを暗灰色にコード化する。38Jb：注射後24時間でマウスを犠牲にし、収集した器官を可視化した。38Jc：ナノプローブの注射後24時間での蛍光強度の器官対筋肉比率。器官の蛍光シグナルを筋肉中の蛍光シグナルに対して正規化した。データを平均値±s.d.として示す（n＝4）。**P＜0.01, 肝臓以外の他の器官と比較。
【図３９】頭頸部同所性腫瘍におけるiUPSナノプローブ活性化の、葉酸-FITCコンジュゲートとの比較。39A：同所性HN5頭頸部癌を担持するヌードマウスに、第I相臨床試験における小分子プローブである葉酸-FITCおよびiUPSナノプローブを静脈内に同時注射した。注射後24時間で、腫瘍を腫瘍血管系および酸性腫瘍環境の蛍光術中イメージングのために外科的に露出させた。39B：注射後24時間でマウスを犠牲にし、切除した腫瘍およびリンパ節を可視化した。ナノプローブは、葉酸-FITCよりも、腫瘍全体およびリンパ節を画像化するのにより効果的である。マウス自己蛍光を黒色にカラーコード化し、一方、純粋な葉酸-FITCおよびナノプローブシグナルを、それぞれ、淡灰色および灰色にコード化する。
【図４０】Fab'-UPSi-TMRナノプローブを使用して全血中の稀な循環腫瘍細胞を検出するためのエクスビボ実験。40A：血清の600×倍率での顕微鏡画像。40B：血清の2400×倍率での顕微鏡画像。
【図４１】循環腫瘍細胞を示すヒトHNC患者の600×倍率での顕微鏡画像。
【図４２】Fab'含有ナノプローブへの曝露後30、60、90および120分でのA549細胞の染色。上の行は、Fab'断片がコンジュゲートされていないナノプローブへの細胞曝露を示し、中央の行は、コンジュゲートされたFab'断片を含有するナノプローブへの細胞曝露を示す。下の行は、Erbitux抗体とFab'断片を含有するナノプローブとの混合物への細胞曝露を示す。
【図４３】Fab'含有ナノプローブへの曝露後30、60、90および120分でのH2009細胞の染色。上の行は、Fab'断片がコンジュゲートされていないナノプローブへの細胞曝露を示し、中央の行は、コンジュゲートされたFab'断片を含有するナノプローブへの細胞曝露を示す。下の行は、Erbitux抗体とFab'断片を含有するナノプローブとの混合物への細胞曝露を示す。
【図４４】Fab'含有ナノプローブへの曝露後30、60、90および120分でのHCT116細胞の染色。上の行は、Fab'断片がコンジュゲートされていないナノプローブへの細胞曝露を示し、中央の行は、コンジュゲートされたFab'断片を含有するナノプローブへの細胞曝露を示す。下の行は、Erbitux抗体とFab'断片を含有するナノプローブとの混合物への細胞曝露を示す。
【図４５】Fab'含有ナノプローブへの曝露後30、60、90および120分でのHN5細胞の染色。上の行は、Fab'断片がコンジュゲートされていないナノプローブへの細胞曝露を示し、中央の行は、コンジュゲートされたFab'断片を含有するナノプローブへの細胞曝露を示す。下の行は、Erbitux抗体とFab'断片を含有するナノプローブとの混合物への細胞曝露を示す。
【図４６】Fab'含有ナノプローブへの曝露後30、60、90および120分でのFaDu細胞の染色。上の行は、Fab'断片がコンジュゲートされていないナノプローブへの細胞曝露を示し、中央の行は、コンジュゲートされたFab'断片を含有するナノプローブへの細胞曝露を示す。下の行は、Erbitux抗体とFab'断片を含有するナノプローブとの混合物への細胞曝露を示す。
【図４７】Fab'含有ナノプローブへの曝露後30、60、90および120分でのHCC4034細胞の染色。上の行は、Fab'断片がコンジュゲートされていないナノプローブへの細胞曝露を示し、中央の行は、コンジュゲートされたFab'断片を含有するナノプローブへの細胞曝露を示す。下の行は、Erbitux抗体とFab'断片を含有するナノプローブとの混合物への細胞曝露を示す。
【図４８】Fab'含有ナノプローブへの曝露後30、60、90および120分でのHSC3細胞の染色。上の行は、Fab'断片がコンジュゲートされていないナノプローブへの細胞曝露を示し、中央の行は、コンジュゲートされたFab'断片を含有するナノプローブへの細胞曝露を示す。下の行は、Erbitux抗体とFab'断片を含有するナノプローブとの混合物への細胞曝露を示す。
【図４９】3つの異なるフルオロフォアを含有するナノプローブでのHN5細胞の染色。左の列は、ローダミングリーンで合成されたプローブを含有し、中央の列は、TMRで合成されたプローブを含有し、右の列は、Cy5で合成されたプローブを含有する。上の行は、単にPDPAへ曝露された細胞を示し、中央の行は、Fab'断片を含有するナノプローブを示し、下の行は、Erbitux抗体とFab'断片を含有するナノプローブとの混合物への細胞曝露を示す。
【図５０】プローブが優先的に腫瘍を選択的に強調することを示している、HN5腫瘍担持マウス中のPDPA-TMR-Fab'ナノプローブのインビボイメージング。
【図５１】FA含有ナノプローブへの曝露後30、60、および120分でのA549細胞の染色。上の2行は2つの異なるイメージングを示し、上のものは、微分干渉コントラストチャネルであり、中央の行は、PDPA-TMR-FAチャネルを示す。下の行は、両方のチャネルの組み合わせ画像である。
【図５２】プローブが優先的に腫瘍を選択的に強調することを示している、HN5腫瘍担持マウス中のPDPA-TMR-FAナノプローブのインビボイメージング。
【図５３】多色ハイブリッドナノプローブの連続活性化。53a：pHの関数としてプロットしたハイブリッドナノプローブの平均計数率（kcps）。53b：490 nmで励起されたpH 7.4でのハイブリッドナノプローブ（100μg/mL）の蛍光スペクトル。53c：異なるpH値でのハイブリッドナノプローブ（100μg/mL）の代表的な蛍光画像。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
例示的な態様の説明
本発明の様々な態様は、蛍光色素を使用する、pH可変式高活性化型多色蛍光ナノ粒子を提供する。ある態様において、この多色ナノプラットフォームは、生理的範囲（5.0〜7.4）内の可変pH転移を有する超pH応答性テトラメチルローダミン（TMR）系ナノ粒子を利用する。Zhou, K., Chem. Int. Ed. 2011, 50, 6109; PCT/US2011/00148、およびPCT/US2011/047497に記載のテトラメチルローダミン（TMR）系ナノ粒子の製造方法。pH応答性ナノ粒子のpH誘発ミセル化は、蛍光消光と共に使用され、pH応答性蛍光ナノ粒子を提供する（図1を参照のこと）。例えば、一態様において、発光波長（500〜820 nm）およびpH転移点（5.0〜7.4）の独立制御を伴う、pH活性化型多色蛍光ナノ粒子のシリーズを提供する。異なる発光波長を有するナノ粒子は、鋭敏なpH応答（オン／オフ状態間でΔpH＜0.25）を達成した。いくつかの多色ナノ粒子の混合物と癌細胞とのインキュベーションは、それらのpH転移値と直接相関した連続活性化のパターンを示した。多色ナノプラットフォームは、エンドサイトーシス小胞中のpH調節、エンドソーム／リソソーム成熟、ならびに受容体サイクリングおよび細胞内オルガネラの輸送に対するpHの効果などの基本的な細胞生理的プロセスを調べるための有用なナノテクノロジーツールセットを提供する。様々な態様は多数の異なるナノ粒子またはミセルを使用することを説明しているが、単一のナノ粒子のみを使用して同様の結果が得られ得ることが想定される。
【００６６】
A．ブロックコポリマーおよび蛍光色素
本明細書に開示されるpH応答性ミセルおよびナノ粒子は、ブロックコポリマーおよび蛍光色素を含む。ブロックコポリマーは、親水性ポリマーセグメントおよび疎水性ポリマーセグメントを含む。疎水性ポリマーセグメントはpH感受性である。例えば、疎水性ポリマーセグメントは、pH感受性を与えるためにイオン化可能アミン基を含んでもよい。ブロックコポリマーは、これらのイオン化可能ブロックコポリマーの超分子自己集合に基づき、pH活性化型ミセル（pHAM）ナノ粒子を形成する。高pHでは、ブロックコポリマーが集合してミセルとなるが、低pHでは、疎水性ポリマーセグメントのアミン基のイオン化がミセルの解離を引き起こす。イオン化可能な基は、異なるpH値において、可変の親水性／疎水性ブロックとして作用し得、これはミセルの動的自己集合に直接影響しうる。
【００６７】
診断またはpHモニター適用のために、標識部分をブロックコポリマーにコンジュゲートしてもよい。いくつかの態様において、pHがミセル形成に有利である場合、標識（例えば、蛍光標識）はミセル内に隔離される。ミセル内の隔離によって標識シグナルの低下が起こる（例えば、蛍光消光により）。特定のpH条件は、ユニマーへのミセルの急速なプロトン化および解離を引き起こして、それにより標識を曝露し、標識シグナルを増大（例えば、蛍光発光を増大）させ得る。本発明のミセルは、診断適用において以下などの1つまたは複数の利点を提供しうる：（1）以前のミセル組成物での数時間または数日間に対し、特定のpH環境（例えば、酸性環境）下での短時間以内（例えば、数分以内）のミセルの解離（および標識シグナルの迅速な増大）；（2）イメージングペイロードの増大；（3）所望の部位（例えば、腫瘍または特定のエンドサイトーシス区画）への標識の選択的標的指向；（4）長い血液循環時間；（5）特定の狭いpH範囲内での応答性（例えば、特定のオルガネラの標的指向のため）；および（6）高いコントラスト感度および特異性。例えば、ミセルは正常な生理的条件（例えば、血液循環、細胞培養条件）下ではサイレント（またはオフ状態）のままで、バックグラウンドシグナルは最小限であるが、ミセルがそれらの所期の分子標的（例えば、細胞外腫瘍環境または細胞オルガネラ）に到達した場合には、イメージングシグナルは大幅に増幅されうる。
【００６８】
多数の蛍光色素が当技術分野において公知である。本発明のある局面において、蛍光色素はpH非感受性蛍光色素である。いくつかの態様において、蛍光色素は小さなストークスシフトを有する。特定の態様において、ストークスシフトはΔλ＜40 nmである。蛍光色素を、コポリマーに、直接またはリンカー部分を通じてコンジュゲートしてもよい。当技術分野において公知の方法を用いて、蛍光色素を、例えば、疎水性ポリマーにコンジュゲートしてもよい。
【００６９】
ブロックコポリマーの例および蛍光色素とコンジュゲートしたブロックコポリマーの例としては以下が挙げられる。
a)式
2015518145.tif 000014
に記載のポリマー；
b)式A1に記載のモノマー；および
c)式A2に記載のモノマー；
を含むコポリマー、またはその薬学的に許容される塩；ならびにその立体異性体、同位体変種および互変異性体；
ここで、
各A1およびA2は、独立して、
2015518145.tif 000015
より選択され、
各R1aは、独立して、H、置換もしくは非置換アルキル、または
2015518145.tif 000016
であり；
各R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R4c、R4d、およびR5は、独立して、Hまたは置換もしくは非置換アルキルであり；
各R6aおよびR6bは、独立して、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであるか；またはR6aおよびR6bは、それらが結合しているN原子と一緒になってヘテロ環を形成し；
R7は色素を含む部分であり；
下付き文字nは10〜200の整数であり；
かつここで、コポリマーはランダムコポリマーである。
【００７０】
式I
2015518145.tif 000017
に記載のコポリマーまたはその薬学的に許容される塩；ならびにその立体異性体、同位体変種および互変異性体；
ここで、
各A1およびA2は、独立して、
2015518145.tif 000018
より選択され、
但し、A1およびA2の両方は同時には異なるものであり；
各R1aは、独立して、H、置換もしくは非置換アルキル、または
2015518145.tif 000019
であり；
各R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R4c、R4d、およびR5は、独立して、Hまたは置換もしくは非置換アルキルであり；
R1bは、H、置換もしくは非置換アルキル、Br、またはS-Rであり；
各R6aおよびR6bは、独立して、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであるか；またはR6aおよびR6bは、それらが結合しているN原子と一緒になってヘテロ環を形成し；
R7は色素を含む部分であり；
下付き文字nは10〜200の整数であり；下付き文字xは1〜200の整数であり；かつ下付き文字yは1〜200の整数であり；
かつここで、rは、コポリマーがランダムコポリマーの形態であることを示す。
【００７１】
式II
2015518145.tif 000020
に記載のコポリマーまたはその薬学的に許容される塩；ならびにその立体異性体、同位体変種および互変異性体、但し、構造の右末端のMeはMeまたはBrであり得；
ここで、A1、A2、n、x、およびyは請求項1に記載される通りであり；
かつここで、rは、コポリマーがランダムコポリマーの形態であることを示す。
【００７２】
式III
2015518145.tif 000021
に記載のコポリマーまたはその薬学的に許容される塩；ならびにその立体異性体、同位体変種および互変異性体、但し、構造の右末端のMeはMeまたはBrであり得；
ここで、
各R3a、R3b、R4a、R4b、R4c、R4d、およびR5は、独立して、Hまたは置換もしくは非置換アルキルであり；
各R6aおよびR6bは、独立して、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであるか；またはR6aおよびR6bは、それらが結合しているN原子と一緒になってヘテロ環を形成し；
R7は色素を含む部分であり；
下付き文字nは10〜200の整数であり；下付き文字xは1〜200の整数であり；下付き文字yは1〜200の整数であり；
かつここで、rは、コポリマーがランダムコポリマーの形態であることを示す。
【００７３】
式IV
2015518145.tif 000022
に記載のコポリマーまたはその薬学的に許容される塩；ならびにその立体異性体、同位体変種および互変異性体、但し、構造の右末端のMeはMeまたはBrであり得；
ここで、
各R6aおよびR6bは、独立して、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであるか；またはR6aおよびR6bは、それらが結合しているN原子と一緒になってヘテロ環を形成し；
R7は色素を含む部分であり；
下付き文字nは10〜200の整数であり；下付き文字xは1〜200の整数であり；下付き文字yは1〜200の整数であり；
かつここで、rは、コポリマーがランダムコポリマーの形態であることを示す。
【００７４】
ある態様において、R7は、クマリン（またはCMN）、DODPY（またはBDY）、PyPMO（またはPPO）、TMR、Cy5,5、およびCy7,5より選択され；クマリン（またはCMN）、DODPY（またはBDY）、PyPMO（またはPPO）、TMR、Cy5,5、およびCy7,5は以下の式の通りである：
2015518145.tif 000023
。
【００７５】
しかし、クマリン（CMN）は本明細書に記載の研究において蛍光活性化をもたらさず、したがって、その有用性は陰性対照としてであってもよく、またはいくつかの態様において、それはR7の定義から明示的に除外されてもよいことが、注意される。
【００７６】
ある態様において、下付き文字nは、80〜200、100〜140、または110〜120の整数である。いくつかの態様において、下付き文字nは114である。
【００７７】
ある態様において、下付き文字xは、10〜110、40〜80、50〜80、60〜80、または70〜80の整数である。いくつかの態様において、下付き文字xは71、72、77、または80である。
【００７８】
ある態様において、下付き文字yは、1〜20、1〜15、または1〜10の整数である。いくつかの態様において、下付き文字yは1、3、5、または6である。
【００７９】
式V
2015518145.tif 000024
に記載のコポリマーまたはその薬学的に許容される塩；ならびにその立体異性体、同位体変種および互変異性体、但し、構造の右末端のMeはMeまたはBrであり得；
ここで、
R7は、CMN、BDY、PPO、TMR、C55、またはC75
2015518145.tif 000025
であり；
下付き文字nは110〜120の整数であり；下付き文字xは70〜81の整数であり；下付き文字yは1〜10の整数であり；
かつここで、rは、コポリマーがランダムコポリマーの形態であることを示す。
【００８０】
式Vに記載のコポリマー；ここで、
R7はTMRであり；
下付き文字nは114であり；
下付き文字xは71であり；かつ
下付き文字yは1である。
【００８１】
式Vに記載のコポリマー；ここで、
R7はTMRであり；
下付き文字nは114であり；
下付き文字xは77であり；かつ 
下付き文字yは3である。
【００８２】
式Vに記載のコポリマー；ここで、
R7はTMRであり；
下付き文字nは114であり；
下付き文字xは80であり；かつ
下付き文字yは6である。
【００８３】
式Vに記載のコポリマー；ここで、
R7はCMNであり；
下付き文字nは114であり；
下付き文字xは77であり；かつ
下付き文字yは3である。
【００８４】
式Vに記載のコポリマー；ここで、
R7はBDYであり；
下付き文字nは114であり；
下付き文字xは77であり；かつ
下付き文字yは3である。
【００８５】
式Vに記載のコポリマー；ここで、
R7はPPOであり；
下付き文字nは114であり；
下付き文字xは77であり；かつ
下付き文字yは3である。
【００８６】
式VI
2015518145.tif 000026
に記載のコポリマーまたはその薬学的に許容される塩；ならびにその立体異性体、同位体変種および互変異性体、但し、構造の右末端のMeはMeまたはBrであり得；
ここで、
R7は、CMN、BDY、PPO、TMR、C55、またはC75
2015518145.tif 000027
であり；
下付き文字nは110〜120の整数であり；下付き文字xは70〜81の整数であり；下付き文字yは1〜10の整数であり；
かつここで、rは、コポリマーがランダムコポリマーの形態であることを示す。
【００８７】
式VIに記載のコポリマー；ここで、
R7はC75であり；
下付き文字nは114であり；
下付き文字xは81であり；かつ
下付き文字yは3である。
【００８８】
式VIに記載のコポリマー；ここで、
R7はC55であり；
下付き文字nは114であり；
下付き文字xは65であり；かつ
下付き文字yは3である。
【００８９】
式VII
2015518145.tif 000028
に記載のコポリマーまたはその薬学的に許容される塩；ならびにその立体異性体、同位体変種および互変異性体、但し、構造の右末端のMeはMeまたはBrであり得；
ここで、
R7は、CMN、BDY、PPO、TMR、C55、またはC75
2015518145.tif 000029
であり；
下付き文字nは110〜120の整数であり；下付き文字xは70〜81の整数であり；下付き文字yは1〜10の整数であり；
かつここで、rは、コポリマーがランダムコポリマーの形態であることを示す。
【００９０】
式VIIに記載のコポリマー；ここで、
R7はC75であり；
下付き文字nは114であり；
下付き文字xは81であり；かつ
下付き文字yは3である。
【００９１】
式VIIに記載のコポリマー；ここで、
R7はC55であり；
下付き文字nは114であり；
下付き文字xは65であり；かつ
下付き文字yは3である。
【００９２】
式VIII
2015518145.tif 000030
に記載のコポリマーまたはその薬学的に許容される塩；ならびにその立体異性体、同位体変種および互変異性体；
ここで、
R7は、CMN、BDY、PPO、TMR、C55、またはC75
2015518145.tif 000031
であり；
下付き文字nは110〜120の整数であり；下付き文字xは70〜81の整数であり；下付き文字yは1〜10の整数であり；
かつここで、rは、コポリマーがランダムコポリマーの形態であることを示す。
【００９３】
請求項1〜68のいずれか一項記載のコポリマー、ここで、コポリマーはPDBA-BDYである。
【００９４】
式VIIIに記載のコポリマー；ここで、
R7はBDYであり；
下付き文字nは114であり；
下付き文字xは77であり；かつ
下付き文字yは3である。
【００９５】
ブロックコポリマーのさらなる例は、Zhou, K., Chem. Int. Ed. 2011, 50, 6109；PCT/US2011/00148、およびPCT/US2011/047497に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に組み入れられる。
【００９６】
B．ミセルシステムおよび組成物
本明細書に開示されるシステムおよび組成物は、異なるpHレベルへと調整された単一のミセルまたはミセルのシリーズのいずれかを利用する。さらに、ミセルは狭いpH転移範囲を有する。いくつかの態様において、ミセルは約1 pH単位未満のpH転移範囲を有する。様々な態様において、ミセルは、約0.9未満、約0.8未満、約0.7未満、約0.6未満、約0.5未満、約0.4未満、約0.3未満、約0.25未満、約0.2未満、または約0.1 pH単位未満のpH転移範囲を有する。狭いpH転移範囲は、より鋭敏なpH応答を有利に提供し、このため、pHの僅かな変化でフルオロフォアを完全にオンにすることができる。
【００９７】
したがって、pH誘発ミセル化とミセルコア中のフルオロフォアの消光とを有する単一のまたはシリーズの、pH可変式多色蛍光ナノ粒子は、pH転移（ポリマーによる）および蛍光発光（小さなストークシフトを有する色素）の独立制御のための機構を提供する。蛍光波長は、例えば、緑色から近IR発光範囲（500〜820 nm）まで、微調整することができる。それらの蛍光オン／オフ活性化は、小分子pHセンサーと比較して遥かにより狭い、0.25 pH単位以内で達成することができる。このpH可変式かつpH活性化型の多色蛍光ナノプラットフォームは、癌、リソソーム蓄積症、および神経障害に関連する、エンドサイトーシスオルガネラ中のpH調節、受容体サイクリング、およびエンドサイトーシス輸送などの基本的な細胞生理的プロセスを調べるための価値のあるツールを提供する。
【００９８】
ミセルのサイズは、典型的にナノメートルスケール（即ち、直径約1 nm〜1μm）である。いくつかの態様において、ミセルは約10〜約200 nmのサイズを有する。いくつかの態様において、ミセルは約20〜約100 nmのサイズを有する。いくつかの態様において、ミセルは約30〜約50 nmのサイズを有する。
【００９９】
C．標的指向部分
ミセルおよびナノ粒子は標的指向部分をさらに含んでもよい。標的指向部分は、ナノ粒子またはミセルを、例えば、特定の細胞表面受容体、細胞表面マーカー、またはオルガネラ（例えば、核、ミトコンドリア、小胞体、葉緑体、アポプラスト、またはペルオキシソーム）へ標的指向させるために使用してもよい。そのような標的指向部分は、受容体リサイクリング、マーカーリサイクリング、細胞内pH調節、エンドサイトーシス輸送の研究において有利である。
【０１００】
標的指向部分は、例えば、抗体または抗体断片（例えば、Fab'断片）、タンパク質、ペプチド（例えば、シグナルペプチド）、アプタマー、または小分子（例えば、葉酸）であってもよい。当技術分野において公知の方法を用いて、標的指向部分を、ブロックコポリマーにコンジュゲートしてもよい（例えば、親水性ポリマーセグメントにコンジュゲートしてもよい）。標的指向部分の選択は特定の標的に依存する。例えば、抗体、抗体断片、小分子、または結合パートナーが、細胞表面受容体および細胞表面マーカーを標的とするためにより適切であり得るが、ペプチド、特にシグナルペプチドが、オルガネラを標的とするためにより適切であり得る。
【０１０１】
D．蛍光検出
本発明の様々な局面は、蛍光シグナルの増大を検出することによるミセル解離の直接的または間接的な検出に関する。蛍光色素からの蛍光シグナルを検出するための技術は当業者に公知である。例えば、下記の実施例に記載される蛍光共焦点顕微鏡法はそのような技術の一つである。
【０１０２】
例えば、フローサイトメトリーは、蛍光シグナルを検出するために使用することができる別の技術である。フローサイトメトリーは、液体試料中の、細胞または他の粒子、例えばマイクロスフェアの分離を含む。フローサイトメトリーの基本的工程は、液体流がセンシング領域を通過するように、装置によって流体試料を方向付けることを含む。粒子は、センサーのそばを一つずつ通過し、サイズ、屈折、光散乱、不透明性、粗さ、形状、蛍光などに基づいて分類され得る。
【０１０３】
本明細書に記載の測定は、1つまたは複数の細胞画像を分析し、複数の検出波長でのおよび／または複数の時点での蛍光発光の大きさを示す数値などの1つまたは複数の細胞の特徴を決定するための、画像処理を含み得る。
【０１０４】
E．キット
本発明はさらにキットを提供する。本明細書に開示される成分のいずれかをキット中に組み合わせてもよい。ある態様において、キットは、上述のpH応答性システムまたは組成物を含む。
【０１０５】
キットは、成分が入れられ得る、好ましくは、適切に等分され得る、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器または他の容器を一般的に含む。キット中に2種以上の成分が存在する場合、キットはまた、追加の成分が別に入れられ得る、第2、第3または他の追加の容器を一般的に含有する。しかし、成分の様々な組み合わせが1つの容器中に含まれてもよい。いくつかの態様において、シリーズ中のミセル集団の全部が単一の容器中に含まれる。他の態様において、シリーズ中のミセル集団の一部または全部が別々の容器中に提供される。
【０１０６】
本発明のキットはまた、委託販売のため厳重に密封した様々な容器を含有するための包装を典型的に含む。そのような包装は、所望の容器が保持される、ボール紙または射出もしくはブロー成形プラスチック包装を含み得る。キットはまた、キット成分を使用するための説明書を含んでもよい。説明書は、実施され得るバリエーションを含んでもよい。
【実施例】
【０１０７】
F．実施例
以下の実施例は本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって明らかにされた技術を示し、したがって、その実施のための好ましいモードを構成すると考えられ得ることが、当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者であれば、本開示に照らし、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、開示される具体的な態様において多くの変更を行いかつ類似または同様の結果を依然として得ることができることを理解するべきである。
【０１０８】
1．pH誘発ミセル化と蛍光活性化との関係
ブロックコポリマー、ポリ(エチレンオキシド)-bポリ[2-(ジイソプロピルアミノ)エチルメタクリレート-co-2-アミノエチルメタクリレート塩酸塩]、PEO-b-P(DPA-co-AMA)（PDPA-AMA、表1）を、原子移動ラジカル重合法を使用して合成した。
【０１０９】
（表１）PEO-b-(PR-co-AMA)ジブロックコポリマーの特徴決定
2015518145.tif 000032
ａ1H NMRによって測定した数平均分子量(Mn)。ｂ溶離剤としてTHFを用いたGPCによって測定した数平均分子量(Mn)、重量平均分子量(Mw)、および多分散指数（PDI＝Mw/Mn）。
【０１１０】
5-カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステルを使用し、色素を第1級アミノ基にコンジュゲートし、PDPA-TMRコポリマーを得た（Zhou, K., Chem. Int. Ed. 2011, 50, 6109）。PDPA-TMR水溶液のpH依存性蛍光特性を図2Aに示す。pH応答特性を定量的に評価するために、正規化蛍光強度（NFI＝[F-Fmin]/[Fmax-Fmin]）をpHの関数としてプロットし、ここで、Fは任意の所与のpHでのナノ粒子の蛍光強度であり、FmaxおよびFminはそれぞれオン／オフ状態での最大および最小蛍光強度である。pH応答の鋭敏度を定量するために、ΔpH10-90%、NFI値が10％から90％まで変動するpH範囲を評価した。PDPA-TMR（図2B）について、ΔpH10-90%は0.20 pH単位であり、これはプロトン濃度（[H+]）の＜2倍の変化を表す。pH感受性小分子色素（Urano, Y., Nat. Med. 2009, 15, 104）について、ΔpH10-90%は典型的に2 pH単位であり、これは[H+]の100倍の変化に対応する（Atkins, P., Physical Chemistry; Oxford University Press, 2009）。
【０１１１】
pH感受性を与えるために、アミノ基がイオン化可能な基としてポリマー中に以前導入された（Dai, S., Soft Matter 2008, 4, 435; Gil, E. S., Prog. Polym. Sci. 2004, 29, 1173）。ナノ粒子設計（図3）において、疎水性成分を有する第3級アミンをイオン化可能な疎水性ブロックとして、ポリ(エチレングリコール)を親水性ブロックとして導入した。このシステムにおいて、ミセル形成は、2つの微妙なバランスによって熱力学的に駆動される：第1のものは、正電荷の第3級アンモニウム基（即ち、-NHR2+）と中性疎水性第3級アミン（-NR2）とのpH依存性イオン化平衡であり；第2のものは、第3級アミンセグメントにおいて疎水性の臨界閾値に達した後の、ミセル自己集合プロセスである（Zhou, K., Macromolecules 2008, 41, 8927; Riess, G., Prog. Polym. Sci. 2003, 28, 1107; Lee, E. S., Controlled Release 2003, 90, 363）。
【０１１２】
pH依存性蛍光活性化とpH誘発ミセル化との相関を機構的に理解するために、蛍光活性化曲線を、動的光散乱（DLS）実験からのミセル形成と比較した。流体力学的半径＜Rh＞を、ユニマー（3 nm）からミセル（24 nm）への転移を示すための主要パラメータとして使用した（図2B、図9B）。図2Bは、ミセル化pHが蛍光活性化pHと一致していることを示しており、ここで、両方の曲線が50%ポイントにてpH 6.36で交わっている。興味深いことには、蛍光pH転移値は、PDPA-TMRコポリマーの見かけのpKa（6.64、ここで、アンモニウム基の50%が脱プロトン化される）の前に生じる（図2C）。これらのデータは、蛍光消光がpH滴定の初期段階で生じることを示しており、ここで、比較的小さな部分（約10 mol%）のアンモニウム基が脱プロトン化され、ミセル形成のためのPDPAセグメントの十分な疎水性に達した時に、ミセルが形成される。これは、透過型電子顕微鏡解析によってさらに支持され、これは、pH 5.8でユニマー状態およびpH 6.8でミセルの形成を示した。
【０１１３】
第3級アミンのイオン化状態を10%から90%まで変化させるために、およそ0.5 pH単位（pH 6.4〜6.9）が必要であり、このことは、小さなイオン化可能な分子と比較してミセル誘発協同的脱プロトン化プロセスを示唆している。同様の協同的応答が、カルボン酸でコーティングされたAuナノ粒子を用いてNieおよび共同研究者によって観察された。（Kairdolf, B. A., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 7268）。ミセル誘発蛍光活性化機構をさらに確証するために、臨界ミセル濃度（CMC）よりも上および下のコポリマー濃度でのpH依存性蛍光強度を調べた（Ananthapadmanabhan, K. P., Langmuir 1985, 1, 352; Ruckenstein, E., J. Phys. Chem. 1975, 79, 2622を参照のこと）。この研究において、PDPATMRの代わりにPDPAAMA合成前駆体をCMC測定のために使用し、TMR色素の可能性のある干渉を回避した。データによって、CMCは0.2 Mリン酸緩衝液中pH 7.4でおよそ0.9μg/mLであることが示された（図10）。図2D中の結果は、より低いコポリマー濃度で蛍光活性化の程度が減少することを示した。コポリマー濃度が0.2μg/mL（即ち、＜CMC）である場合、pH応答がほとんど観察されない（遊離TMR色素もこのpH範囲においてpH非感受性である）。これらのデータは、これらの蛍光ナノ粒子の超pH応答（ΔpH10-90%＜0.25 pH単位）が、独特のナノスケール現象であることを示唆しており、ここで、pH誘発ミセル化が、観察された蛍光活性化の直接の原因である。イメージング適用に加えて、これらの超pH応答性ナノ粒子はまた、ナノスケール「プロトンスポンジ」として使用することができ、これは、より有効な薬物送達のためにsiRNAまたはDNA分子のエンドソームエスケープの助けとなることができる（Yezhelyev, M. V., J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 9006; Yu, H., J. ACS Nano 2011, 5, 9246を参照のこと）。
【０１１４】
2．ミセル誘発蛍光消光についての光化学機構の研究
3つの一般的な光化学機構がミセルナノ環境中の観察される蛍光消光に寄与し得る（図1）：(1)ミセルコア中の色素分子間でのH型ダイマー（Hダイマー）の形成、(2)高速減衰を伴う部位中のフルオロフォアへの励起子のより急速な拡散によって蛍光減衰を促進する、色素分子間のフェルスター共鳴エネルギー移動（ホモFRET）、および(3)ミセルコア（例えば電子供与性第3級アミン）およびフルオロフォア間の光誘起電子移動（PeT）（de Silva, A.P., Chem. Rev. 1997, 97, 1515; Kobayashi, H., Acc. Chem. Res. 2010, 44, 83; Kobayashi, H., Chem. Rev. 2010, 110, 2620; Valeur, B., Molecular fluorescence: principles and applications, Wiley-VCH, 2002; Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy; 3rd ed., Springer: New York City, 2006; Demchenko, A. P., Introduction to Fluorescence Sensing, Springer Science: New York, 2008; Lee, S., Curr. Top. Med. Chem. 2010, 10, 1135）。これらの機構が、活性化型蛍光分子色素の設計において検討された（de Silva, A.P., Chem. Rev. 1997, 97, 1515; Kobayashi, H., Chem. Rev. 2010, 110, 2620）。小分子pH感受性色素について、PeTが優勢な機構であり、ここで、2 pH単位のウィンドウがオン／オフ活性化について報告されている。
【０１１５】
上記の3つの機構からの相対的寄与を調べるために、異なる密度およびタイプの色素分子を有する一連のジブロックコポリマーを系統的に合成した（図3）。ローダミン、BODIPYおよびシアニン誘導体などの、いくつかのタイプのフルオロフォアは、消光された蛍光シグナルを伴って、比較的高い局所濃度でH型ダイマーを容易に形成することができる（West, W., Phys. Chem. 1965, 69, 1894; Lopez Arbeloa, I., Chem. Phys. Lett. 1982, 87, 556; Valdes-Aguilera, 0., Acc. Chem. Res. 1989, 22, 171; Packard, B. Z., Phys. Chem. B 1997, 101, 5070; Ogawa, M., ACS chem. biol. 2009, 4, 535）。Hダイマーは、2つの色素分子がサンドイッチ型配置にある基底状態複合体である（Valeur, B., Molecular fluorescence: principles and applications, Wiley-VCH, 2002; Johansson, M. K., Chem. Eur. J. 2003, 9, 3466; Scheibe, G. Z., Angew. Chem. 1936, 49, 563; Jelley, E. E. Nature 1936, 138, 1009）。H型ダイマーにおいて、より低いエネルギー励起状態への転移は禁じられ、このため、青色シフトしたその吸収およびモノマーに対して低下した蛍光へ至る（West, W., Phys. Chem. 1965, 69, 1894; Jelley, E. E. Nature 1936, 138, 1009）。
【０１１６】
まず、PDPA-TMRコポリマーのpH活性化型蛍光へのHダイマー形成の寄与を測定した。ポリマー鎖当たりのTMR分子数を1から3、6へ増加させた、一連のPDPA-TMRコポリマーを合成した（表1）。TMR数の増加は、それぞれ、10から28、40倍へ、蛍光活性化比率、RF（RF＝Fmax/Fmin）を増加させた（図4A）。3つ全てのコポリマーのUV-Visスペクトルの試験によって、より高いパーセンテージのHダイマーは、520 nmでの吸収ピークのより高い強度によって示されるように、より高いpH（即ちpH＝7.4、ミセル状態）でのものよりもより低いpH（即ち、pH＝5.5、ユニマー状態）で形成されたことが示された（図4B）。この結果は、Hダイマー形成が、ミセル状態で蛍光消光を引き起こす優勢な機構ではないことを示している。pH 5.5でのHダイマーの僅かな増加は、ユニマー状態でのポリマー鎖の運動性の増加の結果であり得、これはTMR二量化を促進する。H型ダイマーは基底状態複合体であるので、それらの形成は蛍光寿命に影響を与えない（Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy; 3rd ed., Springer: New York City, 2006; Berezin, M. Y., Chem. Rev. 2010, 110, 2641）。遊離色素（τ約2 ns、図11）と比較してのpH 7.4でのPDPA-TMR3の短い蛍光寿命（τ約0.4 ns）は、Hダイマー形成がミセル状態での蛍光消光についての主な原因ではないことをさらに支持している。
【０１１７】
次に、ミセル誘発蛍光消光へのPeTおよびホモFRET機構の寄与を調べた。電子供与体（例えば、ミセルコアセグメント由来の第3級アミン）のHOMOエネルギーレベルが蛍光アクセプターのLUMOおよびHOMOエネルギーレベルの間にあり、かつそれらが極めて接近している場合、PeTが生じる（de Silva, A.P., Chem. Rev. 1997, 97, 1515; Weller, A. Pure Appl. Chem. 1968, 16, 115; Wasielewski, M. R. Chem. Rev. 1992, 92, 435）。FRETが生じるためには、3つの特定の条件が満たされなければならない（Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy; 3rd ed., Springer: New York City, 2006; Vogel, S. S., Sci. STKE 2006, 2006, re2.）：(i)ドナーフルオロフォアの発光スペクトルはアクセプターの吸収スペクトルと重ならなければならない（ホモFRETでは、ドナーおよびアクセプター同一であり、したがって、色素は小さなストークスシフトを有さなければならない）；(ii)ドナーおよびアクセプターは適切な物理的配向になければならない；(iii)色素対は互いに接近していなければならない。FRET効率は、蛍光イメージング研究におけるその実行において最も頻繁に操作されるパラメータである分離距離に、6乗依存する。ホモFRET自体はフルオロフォアの非放射減衰を直接生じさせないことが、注意されるべきである。しかし、プロセスは色素分子間での励起子の拡散を増加することができる。フルオロフォアのごく一部が高速減衰環境中に捕えられると、ホモFRETは、交換プロセスによってフルオロフォアの集団全体の蛍光減衰を促進することができる。
【０１１８】
アミノ基はPeT機構によってフルオロフォアを消光することが公知である（de Silva, A. P., Chem. Commun. 1996, 2399; Dale, T. J., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 4500; Diaz-Fernandez, Y., Chem. Eur. J. 2006, 12, 921; Tal, S., Chem. Eur. J. 2006, 12, 4858; Petsalakis, I. D., J. Mol. Struct.: THEOCHEM 2008 , 867, 64）。より高いpHでのPDPA-TMR溶液において、その弱い蛍光シグナルは、PeT機構によりPDPA-TMRコポリマー中のこれらの電子豊富な第3級アミン基によって引き起こされ得る。蛍光消光におけるPeTおよびホモFRETの相対的寄与を識別するために、コアナノ環境を一定に維持したまま、TMR色素間の距離（またはミセルコア中のTMR密度）を系統的に変化させた。より具体的には、PDPA-TMRn=1,3,6コポリマーを、異なる重量分率で、それらの色素フリー前駆体コポリマー（PDPA-AMAn=1,3,6）とブレンドした。本発明者らは、重量分率の関数として、pH 7.4および5.5での蛍光強度の比率マイナス1をプロットした（RF-1）。PeT優勢機構では、(RF-1)は混合パーセンテージに依存しないことが予想され、Y切片はPeT消光効率を反映する。ホモFRET優勢機構では、(RF-1)は混合パーセンテージに依存することが予想され、Y切片は0に接近する。図4Cは、PDPAブロック中のTMR数にかかわらず、混合重量パーセンテージが0へ減少するにつれて、(RF-1)が0に接近することを明確に示している。ミセルコア中のTMR濃度の増加（1ポリマー鎖当たりのTMRの増加、またはTMRコンジュゲートコポリマーのより高いモル分率のいずれかによる）は、蛍光消光を著しく増加させる（即ち、より高いRF値）。これらの結果は、ホモFRETがPDPA-TMRシステムにおける蛍光消光についての優勢な機構であり、PeTからの寄与は無視できることを示している。
【０１１９】
ホモFRET機構をさらに検証するために、2セットの確立されたヘテロFRET色素：(a) PDPA-CMNおよびPDPA-BDY、(b) PDPA-BDYおよびPDPA-TMR（図3中のそれらの構造および蛍光特性を参照のこと）を用いて、コポリマーからの蛍光移動効果を調べた。コポリマーの各対をそれらの適した溶媒、THF中に溶解し、それらを分子的に混合させ、次いで、水中へ滴下し、ミセルの分子混合物を作製した。PDPA-CMNおよびPDPABDYの対において、クマリン色素の蛍光スペクトルは、ヘテロFRET効果についてBODIPY色素の吸収スペクトルと重なる。PDPA-CMN単独のミセル溶液と比較して、混合ミセル溶液中のクマリン発光波長（即ち468 nm）での蛍光強度は、8倍以上減少した（図4D）。さらに、BODIPY発光（506 nm）での蛍光強度は、PDPA-BDY単独のミセル溶液と比べて混合ミセル溶液について53倍以上増加した。これらの結果は、pH 7.4でPDPA-CMNおよびPDPA-BDYの混合ミセル中においてクマリンからBODIPY色素への強力な蛍光エネルギー移動が存在することを明確に実証している。pH 5.5ではそれらの間で蛍光エネルギー移動は観察されない（図12）。同様の観察がPDPA-BDYおよびPDPA-TMRの対においてあった（図13）。
【０１２０】
上述したように、ホモFRETのみが小さなストークスシフトを有する2つの同一の色素間で生じる。大きなストークスシフトを有する色素分子をPDPA-AMAコポリマー中へ導入する場合、それらの吸収スペクトルは発光スペクトルと重ならないので、ホモFRET効果は観察されない。図14に示されるように、PDPA-CMNについてpH応答性蛍光挙動はほとんど存在せず、ここで、λex＝408 nm, λem＝468 nmおよびΔλ＝60 nmであった。PDPA-PPO（λex＝415 nm、λem＝570 nmおよびΔλ＝155 nm）について、RF応答の14倍の増加が観察される（図5A）。さらなる試験（図5B）によって、(RF-1)は、色素濃度、したがってミセルコア中の距離と無関係であることが示された。これらのデータは、ホモFRETはPDPA-PPOのpH誘発蛍光応答に寄与しないことを実証している。代わりに、ミセル状態での蛍光消光は、大きなY切片（RF＝14）によって示されるように、PeT機構にほとんど起因する。
【０１２１】
3．pH可変式多色蛍光ナノプラットフォームの開発
PeT機構はPDPA-PPOにおいて示されるようにナノ粒子のpH応答性活性化をもたらすことができるが、PeT効率は、電子供与性アミノ基のHOMOとフルオロフォアのLUMOとのマッチングに大きく依存する。この相互依存は、色素分子ならびに異なる第3級アミンを有するポリマーの選択を限定し得、このため、ナノ粒子の発光波長およびそれらのpH転移を独立して制御することが困難となる。最後に、アミノ基のプロトン化／脱プロトン化状態は、PeT効率にも影響を与え（Dale, T. J., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 4500; Tal, S., Chem. Eur. J. 2006, 12, 4858; Petsalakis, I. D., J. Mol. Struct.: THEOCHEM 2008, 867, 64）、PDPA-PPOナノ粒子によって実証されたようなブロードなpH応答をもたらす（図5A）。
【０１２２】
上記の理由に起因して、pH可変式多色蛍光ナノプラットフォームの作製についてのより容易かつロバストな戦略を提供するために、pH誘発ミセル化と組み合わされたホモFRETを提案した。小さなストークスシフト（Δλ＜40 nm）を有するフルオロフォアは、広範囲の発光を有する様々な一般に入手可能な色素分子より選択することができる。この戦略は、ポリマーおよびフルオロフォア間の直接的なエネルギー／電子移動を伴わない、pH感受性および発光波長の独立制御というさらなる利点を有する。この原理に基づいて、緑色から近IRの範囲の発光波長を有する一連のpH可変式ナノ粒子を確立した。図6は、各ナノ粒子についての鋭敏な蛍光転移を説明する、異なるpHでの一連の多色ナノ粒子溶液の蛍光画像を示す。定量的データ解析は、PDBA-BDY、PDPATMR、PC7A-C55およびPC6A-C75それぞれについて、ΔpH10-90%値が0.22、0.20、0.23および0.24であり、それらのpH転移点が5.2、6.4、6.9および7.2であることを示している（図7）。PDPA-TMR、PC7A-C55、およびPC6A-C75（図4C；図16D；図17D）について、ホモFRETのみが蛍光消光機構に寄与した。PC7A-C55およびPC6AC75について、それぞれ、33および34倍の蛍光活性化比率が達成された。PDBA-BDYについて、PeTは2.5倍の蛍光活性化に寄与し、ホモFRETは5.2倍に寄与した（図18D）。
【０１２３】
提案される戦略は、発光波長の微調整のためのBODIPY、ローダミン、およびシアニン誘導体ファミリーを含む、いくつかのクラスの一般に入手可能なフルオロフォアに適用される。この戦略は、生物学的研究のための所望の色およびpH転移点を有するナノ粒子を作製するために、pH感受性ポリマーセグメントを有する異なるフルオロフォアをミックスマッチングするというさらなる利点を有する。さらに、MTTアッセイによる細胞毒性研究は、これらのナノ粒子組成物が200μg/mLでイメージング研究について安全であることを示した（細胞生存度＞90%、図19）。
【０１２４】
4．エンドサイトーシス小胞内部での、異なるpH転移を有する多色ナノ粒子の連続活性化
小胞輸送は、細胞内区画間の可溶性カーゴまたは膜タンパク質の送達のための真核細胞における必須のプロセスである（Maxfield, F. R., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004, 5, 121）。小胞pHは、膜リサイクリング、エンド／リソソーム成熟、およびエンドサイトーシス小胞の細胞内輸送に直接影響を与える重要なパラメータである（Izumi, H., Cancer Treat. Rev. 2003, 29, 541; Casey, J.R., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010, 11, 50）。小胞pHは、液胞型(H+)-ATPアーゼ、Na+/H+交換体、およびCI-チャネルなどの様々な膜ポンプまたは輸送体によって正確に調節される（Nishi, T., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002, 3, 94.; Ohgaki, R., Biochemistry 2010, 50, 443,）。
【０１２５】
この研究において、異なるpH転移を有する多色ナノ粒子を同時に適用し、ヒトH2009肺癌細胞内部でのそれらの活性化の時空間パターンを調べた。ナノ粒子セットは、PDBA-BDY（pHt＝5.2）、PDPA-TMR（pHt＝6.4）、およびPC7A-C55（pHt＝6.9）の混合ナノ粒子溶液からなった。各ナノ粒子を同一の培養培地中において同一の濃度（200μg/mL）に制御し、3つの発光波長を使用して共焦点レーザー走査顕微鏡検査によって生細胞イメージングを行った。1時間のインキュベーション後、混合ナノ粒子溶液を取り出し、新鮮な培地で置き換えた。各ナノ粒子はpH 7.4での外部細胞培養培地中では「サイレント」であったので、H2009細胞内部でのナノ粒子取り込みおよび活性化の動力学を共焦点顕微鏡法によって経時的にモニターすることができた。PC7A-C55（pHt＝6.9）ナノ粒子が最初に活性化され、それらの蛍光強度は増加し、プラトーに達し、これは、PDPA-TMR（pHt＝6.4）蛍光が最初の1時間で現れ始めた後であり、これは、3時間の期間にわたって徐々に増加した。PDPA-TMR（pHt＝6.4）について観察された斑点状の蛍光ドットの大部分が、PC7A-C55（pHt＝6.9）蛍光ドットのサブセットと同時局在した。最終的に、PDBA-BDY（pHt＝5.2）ナノ粒子が最後に活性化された。PDBA-BDY（pHt＝5.2）からの僅かな蛍光がインキュベーションの最初の3時間において観察され、しかし5時間後には、PDBA-BDY（pHt＝5.2）の活性化された蛍光が完全に目に見え、興味深いことには、蛍光の位置は、PDPA-TMR蛍光の位置のさらなるサブセットであった。これらのナノ粒子の細胞内活性化の時間経過をさらに定量化するために、経時的な各ナノ粒子についての蛍光強度を12時間でのものに対して正規化し（図8）、この時点で、本発明者らは全てのナノ粒子の完全な活性化を予想した。PC7A-C55、PDPA-TMR、およびPDBA-BDYについての蛍光活性化のハーフタイムは、それぞれ、0.6、1および4時間であると決定し、これはこれらのナノ粒子の連続活性化を示している。
【０１２６】
多色ナノ粒子の連続活性化パターンはそれらのpH転移に直接相関し、ここで、より高いpH転移を有するナノ粒子は、より低いpH転移を有するものよりもより早く活性化された。このデータは、エンドサイトーシス輸送経路に沿ってのpH値変化の傾向と一致しており、ここで、小胞pHは、pH 7.4（細胞周辺）から5.9〜6.2（初期エンドソーム）へ、次いで5.0〜5.5（後期エンドソーム／リソソーム）へ徐々に減少する（Maxfield, F. R., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004, 5, 121; Casey, J.R., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010, 11, 50; Modi, S., Nat. Nanotech. 2009, 4, 325）。さらに、PDBA-BDY（リソソーム中での特異的な活性化についてのpHt＝5.2）のナノ粒子活性化の細胞内位置は（Zhou, K., Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 6109）、リソソームの核周辺分布と一致している。これらのデータは、異なるエンドサイトーシスオルガネラ間の小さなpH差を検出する超pH応答性の多色ナノプラットフォームの強い可能性を実証している。
【０１２７】
要約すると、一般に入手可能なpH非感受性色素の使用によって、pH可変式多色蛍光ナノ粒子のシリーズを作製するためのロバストかつ一般的なシステムを開発した。pH誘発ミセル化およびミセルコア中のフルオロフォアのホモFRET消光は、pH転移（ポリマーによる）および蛍光発光（小さなストークシフトを有する色素）の独立制御についての機構を提供する。蛍光波長は、例えば、緑色発光から近IR発光範囲（500〜820 nm）まで、微調整することができる。それらの蛍光オン／オフ活性化は、小分子pHセンサーと比較して遥かにより狭い、0.25 pH単位内で達成することができる。このpH可変式かつpH活性化型の多色蛍光ナノプラットフォームは、癌、リソソーム蓄積症、および神経障害に関連する、エンドサイトーシスオルガネラ中のpH調節、受容体サイクリング、およびエンドサイトーシス輸送などの基本的な細胞生理的プロセスを調べるための価値のあるツールを提供する。
【０１２８】
5．材料および方法
2-(ペンタメチレンイミノ)エタノール（C6A）およびN,N,N',N'',N''-ペンタメチルジエチレントリアミン（PMDETA）をSigma-Aldrichから購入した。2-(ヘキサメチレンイミノ)エタノール（C7A）および2-(ジブチルアミノ)エタノール（DBA）を、それぞれ、Alfa Aesar社およびTCI America Inc.から購入した。4,4-ジフルオロ-1,3,5,7-テトラメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-8-プロピオン酸、スクシンイミジルエステル（BDIPY-NHS）、7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボン酸スクシンイミジルエステル（クマリン-NHS）、1-(3-(スクシンイミジルオキシカルボニル)ベンジル)-4-(5-(4-メトキシフェニル)オキサゾール-2-イル)ピリジニウムブロミド（PyPMO-NHS）およびテトラメチルローダミンNHSエステル（NHS-TMR）をInvitrogen社から購入した。Cy5.5およびCy7.5 NHSエステルをLumiprobe社から購入した。2-(ジイソプロピルアミノ)エチルメタクリレート（DPA）およびメタクリル酸2-アミノエチル（AMA）をPolyscience社から購入した。AMAをイソプロパノールおよび酢酸エチル（3:7）で2回再結晶した。2-(ジブチルアミノ)エチルメタクリレート（DBA）、2-(ヘキサメチレンイミノ)エチルメタクリレート（C7A）、2-(ペンタメチレンイミノ)エチルメタクリレート（C6A）のモノマー、およびPEG高分子開始剤（MeO-PEG114-Br）を、文献中の手順に従って作製した（Zhou, K., Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 6109-6114）。他の溶媒および試薬をSigma-AldrichまたはFisher Scientific Inc.から受け取ったままで使用した。
【０１２９】
PEO-(PR-色素)ブロックコポリマーの合成。PEO-b-(PR-co-AMA)コポリマー（図20中のスキーム1）を原子移動ラジカル重合（ATRP）法によってまず合成した。開始剤に対するAMAモノマーの供給比率（比率＝1、3、または6）を制御することによって、第1級アミノ基を各ポリマー鎖中へ導入した。色素フリーコポリマーをポリマーの特徴決定において使用した（表1）。手順を説明するための例としてPEO-b-P(DPA-co-AMA)を使用した。まず、DPA (1.7 g, 8 mmol)、AMA (51 mg, 0.31 mmol)、PMDETA (25μL, 0.12 mmol)、およびMeO-PEG114-Br (500 mg, 0.1 mmol)を重合管中へ加えた。次いで、2-プロパノール(2 mL)およびDMF(2 mL)の混合物を添加し、モノマーおよび開始剤を溶解した。酸素を除去するための凍結-ポンプ-解凍（freeze-pump-thaw）の3サイクル後、CuBr (16 mg, 0.11 mmol)を窒素雰囲気下で反応管中へ添加し、管を真空下で密封した。重合を50℃で8時間行った。重合後、反応混合物を10 mL THFで希釈し、Al2O3カラムを通過させ、触媒を除去した。THF溶媒をロトバップ（rotovap）によって除去した。残渣を蒸留水中にて透析し、凍結乾燥し、白色粉末を得た。得られたPEO-b-PRコポリマーを500 MHz 1H NMR、ゲル浸透クロマトグラフィー（Viscotech GPCmax, PLgel 5μm MIXED-Dカラム  Polymer Labs製、1 mL/分で溶離剤としてTHF）によって特徴決定した。表1は、各コポリマーの分子量（MnおよびMw）および多分散指数（PDI）を列挙する。
【０１３０】
色素コンジュゲートコポリマーの合成は、下記の代表的な手順に従った。TMRコンジュゲーションについて、PEO-b-(PR-co-AMA) (50 mg)をまず2 mL DMF中に溶解した。次いで、NHS-TMRエステル（第1級アミノ基のモル量に対して1.5当量）を添加した。反応混合物を室温で2日間撹拌した。コポリマーを分取ゲル浸透クロマトグラフィー（PLgel Prep 10μm 10E3Å 300×25mmカラム  Varian製、5 mL/分で溶離剤としてTHF）によって精製し、遊離色素分子を除去した。生成されたPEO-(PR-TMR)コポリマーを凍結乾燥し、保存のために-20℃で維持した。
【０１３１】
ミセルナノ粒子の作製。以前に公表された溶媒蒸発法に従ってミセルを作製した（Nasongkla, N., Nano. Lett. 2006, 6, 2427-24）。PDPA-TMRミセル溶液の例において、10 mgのコポリマーをまずTHF 0.5 mLに溶解し、次いで蒸留水4mLに超音波処理下で滴加した。数回の(100 kD)膜での限外濾過によってTHFを除去した。次いで、蒸留水を加え、ストック溶液としてポリマー濃度を5または10 mg/mLに調節した。ミセル形成後、ナノ粒子を透過電子顕微鏡検査（TEM、JEOL 1200 EXモデル）によりミセルのサイズおよび形態について、動的光散乱（DLS、Malvern MicroVモデル、He-Neレーザー、λ＝632nm）により流体力学的半径（Rh）について特徴決定した。
【０１３２】
分子的に混合されたミセルの作製のために、1：1重量比を有するPDPA-TMRおよびPEO-b-P(DPA-co-AMA)の混合物を例として使用した。PDPA-TMRコポリマー(5 mg)およびPEO-b-P(DPA-co-AMA) (5 mg)をまずTHF 0.5 mL中に溶解し、次いで超音波処理下で蒸留水4 mL中へ滴下した。数回の(100 kD)膜での限外濾過によってTHFを除去した。次いで、蒸留水を添加し、後の研究のためのストック溶液としてポリマー濃度を5または10 mg/mLへ調節した。
【０１３３】
PEO-(PDPA-AMA)のCMC測定。PEO-(PDPA-AMA)コポリマーの臨界ミセル濃度（CMC）を0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液中、pH7.4で測定した。まず、コポリマーストック溶液（5 mg/mL）を同じ緩衝液で異なる濃度に希釈した。各溶液において、5μLのピレンのTHF溶液（2×10-4mol/L）を2mLのポリマー溶液に加えて、5×10-7mol/Lの最終ピレン濃度を得た。蛍光スペクトルをHitachi蛍光光度計（F-7500モデル）で、励起波長339 nmならびに励起および発光スリットそれぞれ10.0 nmおよび1.0 nmを用いて記録した。I1およびI3値を、それぞれ約372および382nmでの最大発光強度として測定した。I1/I3比を異なるpH値でのポリマー濃度の関数としてプロットした。I1/I3比はピレン環境の極性を反映し、ここで疎水性ミセルコアへのピレンの分配はI1/I3値の低下につながる3,4。CMC値を、溶液中でミセルが形成される閾値ポリマー濃度として測定した（Kalyanasundaram, K., J. Am. Chem. Soc. 1977, 99, 2039-2044; Winnik, F. M., Chem. Rev. 1993, 93, 587-614）。TMR干渉を避けるために、TMRがコンジュゲートされていないPEO-b-PRコポリマーをこれらの研究で用いた。
【０１３４】
PDPA-TMRのpH滴定。PDPA-TMRコポリマー(80 mg)をまず0.1 M HCl 5mL中に溶解し、DI水で2 mg/mLへ希釈した。少量（0.05〜0.1 mL増加）の0.02 M NaOH溶液を撹拌下で添加することによって、pH滴定を行った。2〜11の範囲内のpH増加を、NaOHの総添加体積（VNaOH）の関数としてモニターした。pH値を、微小電極を備えたMettler Toledo pH計を用いて測定した。滴定実験の間、一連のpH点の溶液約1 mLを取り、0.45μmナイロンフィルターで濾過した。次いで、その流体力学的半径をDLSによって測定した。pH 5.8および6.8で、溶液をTEMによって特徴決定した。
【０１３５】
蛍光およびUV-Vis特徴決定。蛍光発光スペクトルを、Hitachi蛍光光度計（F-7500モデル）で得た。UV-Vis分光学研究をShimadzu UV-Vis分光光度計（UV-1800モデル）において行った。各コポリマーについて、試料をはじめにMilliQ水中、6mg/mLの濃度で調製した。次いで、ストック溶液を異なるpH値を有する0.2Mクエン酸-リン酸緩衝液で希釈した。最終ポリマー濃度を0.2または0.5 mg/mLに制御した。蛍光寿命測定のために、0.1 mg /mLのPDPA-TMRの蛍光減衰を、リン酸ナトリウム／クエン酸緩衝液中、pH＝7.4および5.5（それぞれpHtよりも上および下）で測定した。遊離TMR色素(5μg/mL)の蛍光減衰もpH＝7.4および5.5で測定した。これらの研究は、色素レーザー（GL 302）におよびストロボスコープ検出器に接続した窒素レーザー（GL-3300）からなるLaserStrobe蛍光寿命測定器（Photon Technology International, Inc., Birmingham, NJ）で実施した。C-540A（Exciton, Inc., Dayton, OH）色素溶液を用いて540 nmの励起波長を生じた。減衰曲線を580 nmの波長で分析した。発光モノクロメータースリットは4 nmであった。すべての測定を室温で行った。IRF（機器の応答関数）を、グリコーゲンの溶液からの散乱光を測定することにより求めた。蛍光強度減衰データを、PTI機器と共に供給されたソフトウェアを用いて解析した。
【０１３６】
異なるpH値でのPDBA-BDY、PDPA-TMR、C7A-C55およびC6A-C75溶液の蛍光画像について（各試料について100μg/mL）、機器マニュアルに従って適切なバンドパス励起フィルターおよび適切なロングパス発光フィルターを選択することによって、Maestroイメージングシステム（CRI, Inc., Woburn, MA）を使用した。
【０１３７】
細胞培養およびミセル取り込みの共焦点イメージング研究。ヒト肺癌H2009細胞を、5％ウシ胎仔血清（FBS）、100 IU/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを補ったRPMI 1640培地（Invitrogen、CA）中、37℃、5％CO2雰囲気下で培養した。
【０１３８】
共焦点イメージング研究の前に、H2009細胞を2mLの完全RPMI培地中でガラス底細胞培養皿（MatTek、MA）に播種し、PDBA-BDY、PDPA-TMRおよびC7A-C55の混合ナノ粒子と共にインキュベートし、ここで、各ナノ粒子濃度は、フェノールを含まないRPMI 1640培地中0.2 mg/mLであった。培地を1時間インキュベーション後に変えた。共焦点画像を異なる時点でキャプチャーした。画像をImage-Jソフトウェアによって同一条件下で処理および解析した。5回の独立した測定値を解析し、平均±標準偏差として平均した。画像を指定の時点で、100×対物レンズを備えたNikon ECLIPSE TE2000-E共焦点顕微鏡によりキャプチャーした。PDBA-BDY、PDPA-TMRおよびC7A-C55を、それぞれ、488、543および623 nmで励起した。FITC、TRITCおよびCy5フィルターを、それぞれ、PDBA-BDY、PDPA-TMRおよびC7A-C55イメージングのために使用した。
【０１３９】
ミセルナノ粒子のインビトロ細胞毒性評価。H2009細胞（実験の12時間前に播種された96ウェルプレート中において10,000細胞/ウェル）を、5% FBSを補った完全RPMI 1640培地中の20μg/mL、0.2 mg/mLまたは2 mg/mLの異なるミセルナノ粒子と共に1時間インキュベートすることによって、異なるミセルナノ粒子（PEG-PDBA、PEG-PDPA、PEG-PC7A）の細胞毒性を評価した。細胞外粒子を除去するために培地で洗浄した後、細胞を完全培地中で12時間さらに培養した。終了時点で、MTTストック溶液を次いで各ウェルへ添加し、さらに4時間について最終濃度0.5mg/mLを与えた。DMSO 100μLでの細胞処理後、マイクロプレートリーダーを使用して490 nmでの吸光度を測定した。未処理対照と比べての処理細胞についてのUV吸光度の比率として細胞生存度を測定した。標準偏差を6つのリプリケート試料から計算した。
【０１４０】
6．エンドソームpHの小分子モジュレータのハイスループットスクリーニングにおける適用のための微調整超pH応答性ナノ粒子
pHは、エンドサイトーシス輸送および細胞表面受容体（例えばLDL受容体）のリサイクリングにおいて重要な役割を有し、これらは、様々なヒト疾患および代謝障害と非常に関係がある。細胞内オルガネラ内部のpHを調節することができる小分子は、エンドソーム機能の欠損を改善する有望な薬物候補である。ハイスループットスクリーニング（HTS）は、化合物ライブラリーからリード分子を同定するための強力な方法である。HTSが機能するためには、有効な細胞ベースのアッセイが必須である。この研究は、一連の微調整超pH応答性ナノ粒子の合成を報告し、それらの蛍光シグナルは、初期エンドソーム範囲（pH 5.7〜6.3）内のpHの僅かな変化で「オン」および「オフ」になることができる。データは、共焦点レーザー走査顕微鏡法によって初期エンドソームpHの変化を検出することにおけるこれらのナノ粒子の実行可能性を実証している。これらの結果はまた、エンドソームpHを調節することができる小分子のHTSにおける適用についてのこれらのナノ粒子の実行可能性を実証している。
【０１４１】
方法：異なるpH転移を有するコポリマーのシリーズを、原子移動ラジカル重合によってポリ(エチレンオキシド)（PEO）および第3級アミン含有モノマーから合成した。2-(ジイソプロピルアミノ)エチルメタクリレート（DPA）に対する2-(ジブチルアミノ)エチルメタクリレート（DBA）の比率を制御することによって、コポリマーのpH転移を微調整した。テトラメチルローダミン（TMR）をフルオロフォアとして使用し、コポリマーにコンジュゲートした。分取ゲル浸透クロマトグラフィー（PLgel Prep 10μm 10E3Å 300×25mmカラム  Varian製、5 mL/分で溶離剤としてTHF）を使用し、ポリマー試料を精製した。ポリマーの1H NMRスペクトルをVarian 1H 500 MHz NMRで得た。蛍光強度をHitachi蛍光光度計（F7000モデル）で得た。
【０１４２】
結果：鋭敏なpH転移（オン／オフ状態間でΔpH＜0.25）を有する超pH応答性ナノ粒子のシリーズを合成した（ナノプローブ1〜4）。合成スキームを図21Aに示す。DBAおよびDPAのモノマー比率を変えることによって、pH転移点をpH 6.42（1）、6.18（2）、5.94（3）および5.70（4）に細かく制御した（図21B；表2）。これらの僅かな差は、コポリマーの成分中のDBAのパーセンテージとpH転移点との直線関係を明らかにし、これは、出発材料の比率を変えることによって特定の値へpH転移を微調整するために使用され得る（図21C）。ナノプローブおよびエンドソームpHの小分子モジュレータ（例えばナイジェリシン）とHeLa細胞株とのインキュベーションは、共焦点レーザー走査顕微鏡法によって、これらの小分子モジュレータを含まないものと比較してより早い活性化時間を示した。5.94のpH転移を有するナノプローブ(3)は、他のナノプローブと比較して、小分子pHモジュレータの存在下でのエンドソームpHの検出についてより特異的な活性化を示した。これらのデータは、エンドソームpHを調節することができる小分子をハイスループットスクリーニングすることにおける、ナノ粒子の実行可能性を示した。
【０１４３】
（表２）様々なモノマー比率を使用することによる、ナノプローブのpH転移点
2015518145.tif 000033
【０１４４】
要約すると、初期エンドソーム中の小さなpH変化の検出に関して微調整超pH応答性ナノ粒子を使用することの実行可能性が、実証された。異なる疎水性を有する2種のモノマーのモル分率の変更によって、pH転移点を微調整することができる。異なる活性化時間ウィンドウを異なるナノプローブによって確立し、これは、エンドサイトーシスオルガネラの酸性化または酸性化の阻害を伴う分子をスクリーニングするためにさらに使用することができる。
【０１４５】
7．特異的pHeおよびpHiイメージングのためのUPSナノプローブ
腫瘍微小環境が、従来の癌細胞中心の戦略と比べて、癌診断および治療介入についての新しいパラダイムとして台頭しつつある（Hanahan & Weinberg, 2011）。腫瘍微小環境は、分子、細胞、および組織レベルで驚くべき複雑性および多様性を有する（Gatenby & Gillies, 2008、Swartz, et. al., 2012、Joyce, 2005）。多くの微小環境シグナルの中で、2つの認識された特徴、腫瘍血管新生（Weis & Cheresh, 2011、Folkman, 2007）および低い細胞外pH（pHe）（Webb, et. al., 2011）が、癌のタイプにかかわらず、固形腫瘍に遍在する。この研究において、酸性腫瘍pHeおよび血管新生血管系を標的とするナノプローブは腫瘍検出の特異性を広げるためロバストな戦略をもたらすことができるという仮説をテストした（図22）。
【０１４６】
酸性腫瘍pHe（6.5〜6.8）（Webb, et. al., 2011）と血液（7.4）との小さなpH差を識別するために、このpHスパンにおいて蛍光シグナルを最大限にオンすることができる超pH応答性ナノプローブを確立することが必須である。この目的のために、UPSeナノプローブをポリ(エチレングリコール)-b-ポリ(2-(ヘキサメチレンイミノ)エチルメタクリレート)コポリマー（図23a、表3）から合成した。近赤外色素、Cy5.5（λex＝675 nm、λem＝710 nm）を、コポリマーのイオン化可能なブロックにコンジュゲートした。
【０１４７】
（表３）ジブロックコポリマーの特徴決定
2015518145.tif 000034
ａ数平均分子量(Mn)、重量平均分子量(Mw)、および多分散指数（PDI＝Mw/Mn）を、溶離剤としてTHFを用いたGPCによって測定した；ｂ1H NMRによって測定した。
【０１４８】
UPSeナノプローブは、非常に鋭敏なpH応答（ΔpH10-90%、10%蛍光活性化と90%蛍光活性化とのpH差は0.23であった）を伴って6.9でpH転移を有した。蛍光活性化比率は、pH 6.7および7.4間でUPSeナノプローブについて102倍であった。対照的に、小分子pHセンサー（pKa＝6.9）についてのHenderson-Hasselbach式に基づく理論計算は、このpH範囲において2.6倍の蛍光増大しかもたらさなかった（図23b）。血液pHで、UPSeナノプローブは、直径25.3±1.5 nmおよび球状形態を有する自己集合ミセルとして存在した（図23d、左パネル）。ホモFRET誘発蛍光消光は、ミセル状態（図23c）でのフルオロフォアの完全なサイレンスの原因である（Zhou, et. al., 2012）。酸性pHeでのミセル解離（図23d、右パネル）は、蛍光シグナルの劇的な増大をもたらした（図23c, e）。
【０１４９】
細胞中の酸性エンドサイトーシスオルガネラ（例えばエンドソームおよびリソソーム、pHi＝5.0〜6.0）において特異的な活性化を達成するために、UPSiナノプローブをポリ(エチレングリコール)-b-ポリ(2-(ジイソプロピルアミノ)エチルメタクリレート)コポリマー（図23a）から作製した。UPSiナノプローブは、0.21のΔpH10-90%値を伴って6.2でpH転移を有した。蛍光オン／オフ活性化比率は128倍であった（図24bおよび表4）。
【０１５０】
（表４）UPSナノプローブの特徴決定
2015518145.tif 000035
ａTEMから測定した, 平均値±s.d.；ｂCy5.5蛍光発光強度によって決定した。
【０１５１】
αvβ3発現血管新生腫瘍内皮細胞のイメージングのために、下記スキームに示すように、UPSi表面を、チオール-マレイミド結合によって10% cRGDfK（cRGD）ペプチドで官能化した。
2015518145.tif 000036
【０１５２】
cRGDコード化UPSiナノプローブ（24.5±1.1 nm）は血液pHおよび酸性腫瘍pHeで安定であったが、受容体介在エンドサイトーシスで腫瘍内皮細胞のリソソーム内部にて選択的に活性化され得る（下記のデータを参照のこと）。UPSeおよびUPSiナノプローブは両方とも、24時間のインキュベーションにわたる蛍光強度の無視できる変化によって示されたように、新たに調製されたマウス血清中で安定であった（図23eおよび24e）。
【０１５３】
a．UPSeナノプローブによる腫瘍担持マウス中の酸性pHeイメージング
pHeイメージングについてのUPSeナノプローブの特異性を調べるために、腫瘍解糖の2種の阻害剤を調べ、細胞培養中の細胞外pHに対するそれらの効果を評価した。第1剤、2-デオキシ-D-グルコース（2-DG）は、細胞表面グルコース輸送体（GLUT）によるグルコース取り込みおよびその後のヘキソキナーゼによるリン酸化を拮抗的に阻害し；第2剤、α-シアノ-4-ヒドロキシシンナメート（CHC）は、癌細胞からの乳酸の分泌を妨げる、モノカルボン酸輸送体（MCT）の自殺型阻害剤である（図25a）（Sonveaux, et. al., 2008）。インビトロ細胞培養実験は、両方の薬剤がA549肺癌細胞においてグルコース取り込みおよび乳酸分泌を著しく減少させたことを示している（図25b）。さらに、2-DGおよびCHC処置は、細胞培養培地の酸性化を遅らせた（ΔpHは、2-DGについて0.15対0.10、CHCについて0.19対0.10である、図25c）。
【０１５４】
インビボ腫瘍イメージング研究のために、UPSeナノプローブ（10 mg/kg）を、皮下A549肺癌異種移植片を担持するマウスに静脈内注射した（各群についてn＝4）。対照群について、2-DG (250 mg/kg)またはCHC (250 mg/kg)をUPSe投与の12時間前に注射した。腫瘍担持マウスの近IRイメージング（λex＝675 nm、λem＝710 nm）は、正常組織におけるバックグラウンドサプレッションを伴って、UPSe注射後の24時間にわたる腫瘍中の蛍光シグナルの着実な増大を示した（図25d, e）。腫瘍中のNIR蛍光強度は、5分から24時間まで10.9±1.7倍増大した（図25d, e）。対照的に、代謝阻害剤での前処置は、UPSe単独と比較して腫瘍中の有意なシグナル減少をもたらした（例えば、2-DGについて2.3±0.7倍(P＝0.004)、およびCHCについて3.2±0.6倍(P＝0.007)）。
【０１５５】
24時間後、マウスを犠牲にし、切除した器官を画像化した。エクスビボ画像の定量化は、UPSe単独のT/N比率（正常筋肉に対する腫瘍の蛍光強度）が12.9であったことを示した（図25f）。脳、心臓、皮膚、筋肉、脂肪、および膵臓における蛍光強度は筋肉に匹敵した。2-DGおよびCHC対照群はエクスビボ器官において同様の低い蛍光強度を示し（図26）、一方、腫瘍強度は、インビボイメージング結果と一致して、それぞれ、UPSe注射単独でのマウスからのそれよりも4および3倍低かった（図25e）。これらのデータは、UPSeナノプローブは酸性腫瘍pHeを特異的に検出でき、このプローブは治療開始後24時間以内の代謝性変化を感知できるという仮説を強く支持している。
【０１５６】
ホールマウント腫瘍切片の免疫染色（図25g）は、ナノプローブシグナル（灰色）とピモニダゾールによる低酸素染色との十分な相関を示し、これは、腫瘍の低酸素領域はより酸性であるという以前の報告（Gatenby & Gillies, 2004）と一致している。興味深いことには、ナノプローブ活性化プロファイルは、腫瘍の周辺で高い腫瘍血管密度（CD31染色）と相関しなかった（図27）。さらに、ナノプローブ活性化マップは、恐らくは低pH、特に＜6.8が癌細胞へのピモニダゾール結合を著しく減少させるために（Kleiter, et. al., 2006）、ピモニダゾールによって検出された低酸素の領域を越えて拡張していた。
【０１５７】
b．cRGD-UPSiナノプローブによる血管新生腫瘍血管系の特異的イメージング
cRGDコード化UPSiナノプローブ（cRGD-UPSi、図28a）を構築し、腫瘍内皮細胞の確立された血管新生バイオマーカーであるαvβ3インテグリンの非線形シグナル増幅によって血管新生腫瘍血管系を特異的に画像化した。cRGDペプチドはαvβ3インテグリンへ結合し、蛍光活性化のために酸性エンドサイトーシスオルガネラ中へのcRGD-UPSiの受容体介在エンドサイトーシスをもたらす（図28b）。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）をcRGD-UPSi、cRGDフリーのUPSi（UPSi）、および50倍モル過剰の遊離cRGDペプチド、続いてcRGD-UPSiナノプローブで処理し、概念実証を示した。ナノプローブは細胞培養培地中において「サイレント」であったので、培地を除去することなく、ナノプローブインターナリゼーションおよび活性化の動力学の直接測定が可能であった。cRGD-UPSiインキュベーションの30分後に、斑点状の蛍光活性化がHUVEC細胞内部で観察された。3時間で、UPSiおよび遊離cRGD対照群と比べて、cRGD-UPSi群において11倍の蛍光増大が観察された（図29）。cRGD-UPSiで処置された細胞中のほぼ全ての蛍光斑点が、LysoTracker色素と同時局在し（図30）、これは、cRGD-UPSiナノプローブが後期エンドソームおよびリソソーム中において活性化されたことを実証している。
【０１５８】
インビボ腫瘍イメージング研究のために、cRGD-UPSiまたはUPSi（10 mg/kg）を、A549腫瘍担持マウスに静脈内注射した（各群についてn＝4）。対照として、ブロッキング用量のcRGDペプチド（25 mg/kg）をcRGD-UPSiナノプローブ投与の30分前に注射した。注射後30分で、cRGD-UPSi群は、2つの対照群と比べて腫瘍中において有意に高い蛍光シグナルを生じさせた。腫瘍中のNIR蛍光強度は、注射後5分から6時間までに12.3±1.8倍増大した（図28c）。cRGD-UPSiと比較して、UPSiおよび遊離cRGD前処置対照は、6時間の期間にわたって腫瘍中において最小限の蛍光増大を有した（それぞれ、1.4±0.2倍, P＝0.002および1.8±0.4倍, P＝0.003）。図28dは、正常組織に対する腫瘍中のナノプローブの蛍光活性化のインビボ動力学を示す。cRGD-UPSiのT/N比率は着実に増加し、6時間でピーク値13.8±1.4に達し（図31）、一方、UPSiは3時間でそのピーク値1.4 ± 0.2に達した。エクスビボイメージングは、cRGD-UPSiのT/N比率が16.1であり、一方、匹敵する腫瘍蓄積パーセンテージ（例えば、注射後6時間で、それぞれ、2.49±0.44%対2.11±0.59% ID/g、図28h）にもかかわらず、UPSi対照は＜2倍のシグナル増強をもたらしたことを示した（図28e, fおよび図32）。血管新生腫瘍血管系中のcRGD-UPSiナノプローブによるシグナル増幅戦略は、市販の「常にオンの（always ON）」cRGD-NIR Dye 800CWコンジュゲートと比較した場合、より顕著に示され、ここでは、最大で2倍のT/N比率が、強いバックグラウンド蛍光シグナルを伴って24時間の期間内にわたって観察された（図33）。
【０１５９】
腫瘍切片の免疫染色（図28iおよび図34）を行い、cRGD-UPSi活性化の位置を確認した。腫瘍血管をAlexa 488標識抗CD31で染色した。cRGD-UPSiについて、ナノプローブ活性化の大部分が腫瘍血管系と同時局在することがわかった（図28i中の明色）。対照的に、低レベルのナノプローブ活性化が、UPSiおよび遊離cRGDブロッキング対照群において観察された。これらの腫瘍切片において、ナノプローブ活性化の散発的なスポットが腫瘍血管系の外部で見られ、これは、非血管細胞もανβ3独立経路によってごく一部のナノプローブを捕え得ることを示唆している。
【０１６０】
c．UPSeおよびUPSiナノプローブの薬物動態、生体内分布、および安全性の評価
UPSe/UPSiナノプローブの薬物動態および生体内分布を特徴決定するために、対応するコポリマー（表4）中の遊離アミノ基のアセチル化（-COCT3）によって、3H標識ナノプローブを合成した。3Hで標識されたUPSe、cRGD-UPSi、およびUPSiナノプローブをイメージング研究のために同一用量（10 mg/kg、または2.0 mCi/kg）で注射した（各群についてn＝5）。3つ全ての組成物について、血漿濃度-時間曲線は24時間にわたって二相挙動を示した（図28gおよび図35）。α相半減期（t1/2,α）は、UPSe、cRGD-UPSi、およびUPSiについて、それぞれ、1.0±0.2、2.3±0.5、および4.3±0.7時間であった。β相半減期（t1/2,β）は、UPSe、cRGD-UPSi、およびUPSiについて、それぞれ、7.5±0.3、17.0±1.8、および19.6±2.1時間であった。UPSiについて、cRGD表面官能化は、他のcRGDコード化ナノ粒子システム（Huang, et. al., 2010）と一致して、血中半減期の減少をもたらした。
【０１６１】
生体内分布研究は、UPSe/UPSiナノ粒子の腫瘍取り込み（2〜3% ID/g組織）が大抵の正常組織（心臓、肺、腎臓、および筋肉、図28hおよび表5〜7）よりも高かったことを示している。3つのナノプローブ組成物の中で、腫瘍分布の統計的有意差は観察されなかった（例えば、それぞれ、注射後24時間でUPSe、cRGD-UPSi、およびUPSiについて2.4±0.7%、3.4±1.1%、3.0±1.3% ID/g。各一対比較についてP＞0.05）。RES系（即ち、肝臓および脾臓）は、ナノプローブの大部分の取り込みの原因であった（20〜50% ID/g）。腫瘍および血液NIR蛍光強度を3H標識実験からのUPS濃度に対して正規化した場合、UPSeおよびcRGD-UPSiナノプローブにおいて腫瘍および血液間で300倍を超える差が見られた（表5〜7）。
【０１６２】
（表５）24時間でのUPSeナノプローブの生体内分布および組織蛍光（n＝4）
2015518145.tif 000037
ａ腫瘍および器官NIRFシグナル/(%ID/g)比率を血液に対して正規化した。
【０１６３】
（表６）6時間および24時間でのUPSiナノプローブの生体内分布および組織蛍光（n＝4）
2015518145.tif 000038
ａ腫瘍および器官NIRFシグナル/(%ID/g)比率を6時間での血液に対して正規化した。
【０１６４】
（表７）6時間および24時間でのcRGD-UPSiナノプローブの生体内分布および組織蛍光（n＝4）
2015518145.tif 000039
ａ腫瘍および器官NIRFシグナル/(%ID/g)比率を6時間での血液に対して正規化した。
【０１６５】
ナノプローブ毒性を評価するために、動物体重、肝機能および腎機能の変化、ならびにナノプローブ注射（10 mg/kg）後の24時間および7日でのRESの組織学を系統的に調べた。結果は、体重減少を示さず、肝機能および腎機能（例えば、アスパラギン酸トランスアミナーゼおよびグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、図36）の統計的に有意でない変化、ならびに正常なRES組織学（データを示さず）を示し、これらのナノ粒子の安全性を実証している。
【０１６６】
d．組み合わせた酸性pHeおよび腫瘍血管系イメージングについての統合（integrated）ナノプローブ（iUPS）
UPSeおよびcRGD-UPSi活性化の機構を確立した後、腫瘍微小環境中のUPSeおよびcRGD-UPSi活性化の空間的パターンを調べた。生体顕微鏡検査およびマウス中の皮下A549肺腫瘍異種移植片を本発明者らのモデルシステムとして利用した。2つのナノプローブを区別するために、テトラメチルローダミン（TMR、λex/λem＝550/580 nm）およびローダミンG（RhoG、λex/λem＝502/527 nm）を使用し、それぞれ、UPSeおよびcRGD-UPSiを標識した。デュアルナノプローブを静脈内に同時注射し、経時的に画像化した。図37aは、注射後6時間での補完的な空間的活性化パターンを示している：cRGD-UPSi-RhoG活性化は腫瘍血管へ大部分が限定され、一方、UPSe-TMRは腫瘍実質中の間質腔において光った。いずれのナノプローブも腫瘍血管系の内部では観察可能な蛍光を示さず、このことはそれらが血液中では「サイレント」のままであることを実証している。
【０１６７】
pHeおよび腫瘍血管系活性化の相乗効果を利用するために、統合cRGD-UPSe-Cy5.5ナノプローブ（iUPS）を構築し、10個の異なる腫瘍モデルにおけるその腫瘍イメージング効果を調べた。これらのモデルは、トランスジェニックMMTV-PyMT乳癌、いくつかの同所性癌（肺、頭頸部、前立腺）および様々な皮下癌モデル（脳腫瘍、膵臓癌）を含む。10個の腫瘍モデルの全てにおいて、周囲の正常組織／器官に対する腫瘍微小環境中のユニバーサルなナノプローブ活性化（図37bおよび図38a-j）を観察した。多くのモデルにおいて、より高いT/N比率（約20）が、pHeおよび腫瘍血管系シグナルの両方を組み合わせる相加効果に起因して得られた。
【０１６８】
最後に、同所性HN5頭頸部癌を担持するマウスにおけるiUPSナノプローブのイメージング効果を小分子葉酸-FITCコンジュゲート（folate-FITC conjugate）（第I相臨床試験）と比較した。iUPSナノプローブおよび葉酸-FITCを、腫瘍担持マウス中へ静脈内に同時注射した。注射後24時間で、同所性HN5腫瘍の小さな領域のみが葉酸-FITCによって可視化され、一方、iUPSナノプローブは、腫瘍全体ならびに局所的リンパ節転移を光らせた（図39）。葉酸-FITC結果は、多くの頭頸部癌細胞が葉酸受容体を発現しないという事実と一致している。これらのデータは、ブロードな腫瘍特異性を達成するためのよりロバストかつユニバーサルな戦略として腫瘍微小環境を標的とすることの成功を強調する。
【０１６９】
e．材料および方法
材料。環状RGDfK（cRGDfK）ペプチドをPeptides International Inc. (Kentucky, USA)から購入した。LysoTracker（登録商標）Green、MitoTracker（登録商標）Green、Hoechest 33342、ウシ胎仔血清、ペニシリン  ストレプトマイシン、および細胞培養培地をInvitrogen Inc. (OR, USA)から得た。Amicon ultra-15遠心濾過機チューブ(MWCO＝100 K)はMillipore製であった。Cy5.5 NHSエステルはLumiprobe社から得た。モノマー、2-(ジイソプロピルアミノ)エチルメタクリレート（DPA-MA）、メタクリル酸2-アミノエチル（AMA）はPolyscience社製であった。2-(ヘキサメチレンイミノ)エチルメタクリレート（C7A-MA）およびPEG高分子開始剤（MeO-PEG5k-Br）は、参照により本明細書に組み入れられる、Zhou et. al., 2011に記載の方法に従って作製した。他の有機溶媒は、Sigma-AldrichまたはFisher Scientific Inc製の分析等級であった。
【０１７０】
色素コンジュゲートブロックコポリマーの合成。2つの異なるブロックコポリマー（即ち、PEG-b-(PR-co-AMA)）（下記スキームに示す）を、原子移動ラジカル重合（ATRP）法によって合成した。色素フリーコポリマーをポリマーの特徴決定において使用した（表8）。近赤外蛍光色素（Cy5.5）またはトリチウム（3HもしくはT）標識のコンジュゲーションのために、メタクリル酸アミノエチル（AMA）をコポリマー合成において使用した。開始剤に対するAMAモノマーの供給比（モル比＝6）を制御することによって、6つの第1級アミノ基を各ポリマー鎖中へ導入した。
2015518145.tif 000040
【０１７１】
手順を説明するための例としてPEG-b-P(DPA-co-AMA)を使用した。まず、ジイソプロピルアミノエチルメタクリレート（DPA, 1.71 g, 8 mmol）、AMA (100 mg, 0.6 mmol)、PMDETA (21μL, 0.1 mmol)、およびMeO-PEG114-Br (0.5 g, 0.1 mmol)を重合管中へ加えた。次いで、2-プロパノール(2 mL)およびDMF (2 mL)の混合物を添加し、モノマーおよび開始剤を溶解した。酸素を除去するための凍結-ポンプ-解凍の3サイクル後、CuBr (14.4 mg, 0.1 mmol)を窒素雰囲気下で反応管中へ添加し、管を真空下で密封した。重合を40℃で12時間行った。重合後、反応混合物をTHF 10 mLで希釈し、Al2O3カラムを通過させ、触媒を除去した。THF溶媒をロトバップによって除去した。残渣を蒸留水中にて透析し、凍結乾燥し、白色粉末を得た。得られたPEG-b-P(DPA-co-AMA)コポリマーを1H 500 MHz NMR、ゲル浸透クロマトグラフィー（Viscotech GPCmax, PLgel 5μm MIXED-Dカラム  Polymer Labs製, 1 mL/分で溶離剤としてTHF）によって特徴決定した。
【０１７２】
（表８）ジブロックコポリマーの特徴決定
2015518145.tif 000041
ａ数平均分子量(Mn)、重量平均分子量(Mw)、および多分散指数（PDI＝Mw/Mn）を、溶離剤としてTHFを用いたGPCによって測定した；ｂ1H NMRによって測定した。
【０１７３】
表8は、各コポリマーの収率、分子量（MnおよびMw）および多分散指数（PDI）を列挙する。
【０１７４】
Cy5.5コンジュゲーションについて、50 mgのPEG-b-P(DPA-co-AMA6)またはPEG-b-(PC7A-co-AMA6)をまず2 mLの無水DMF中に溶解した。次いで、Cy5.5 NHSエステル（第1級アミノ基のモル量に対して1.5当量）を添加した。反応混合物を室温で2日間撹拌した。ポリマーコンジュゲートを分取ゲル浸透クロマトグラフィー（PLgel Prep 10μm 10E3Å, 300×25mmカラム  Varian製、5 mL/分で溶離剤としてTHF）によって精製し、遊離色素分子を除去した。得られたポリマーコンジュゲートを凍結乾燥し、-20℃で保存した。
【０１７５】
マレイミド末端ポリ(エチレングリコール)-b-ポリ(2-(ジイソプロピルアミノ)エチルメタクリレート)（MAL-PEG-b-PDPA）の合成。まず、N-マレオイル-β-アラニン1 (250 mg, 1.5 mmol)およびフラン(2.2 mL, 30 mmol)をベンゼン10 mL中に溶解した。溶液を一晩還流した。反応後、溶液を濃縮し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、化合物2を得た。1H NMR (TMS, CDCl3, ppm): 6.52 (2H, =CHCH(O-))-), 5.28 (2H, =CHCH(O-))-), 3.66 (2H, -NCH2CH2-), 2.87 (2H, -(-O)CHCH(CH)-), 2.55 (2H, -NCH2CH2-)。収率：65%。次いで、化合物2 (48 mg, 0.20 mmol)およびN-ヒドロキシマレイミド(25 mg, 0.22 mmol)を5 mLジクロロメタン（DCM）中に溶解した。N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(50 mg, 0.24 mmol)を上記溶液へ添加した。溶液を室温で2時間撹拌した後、HO-PEG5K-NH2(500 mg, 0.1 mmol)を添加し、反応溶液を一晩連続的に撹拌した。反応溶液を濾過し、濾液を冷ジエチルエーテル50 mL中へ注いだ。沈殿物を次の反応のために収集し、乾燥した。上記の生成物を、トリエチルアミン(70μL, 0.5 mmol)の添加と共に、DCM 5 mL中に溶解した。次いで、α-ブロモイソブチリルブロミド(65μL, 0.5 mmol)を添加し、溶液を一晩撹拌した。反応溶液を冷ジエチルエーテル50 mL中へ注ぎ、沈殿物を収集した。生成物を2回の溶解-および-沈殿サイクルによってさらに精製し、次いで乾燥した。1H NMR (TMS, CDCl3, ppm): 6.52 (2H, =CHCH(O-))-), 5.26 (2H, =CHCH(O-))-), 4.33 (2H, -CH2OC(O)2-), 3.93〜3.30 (460H, -NCH2CH2O(CH2CH2O)114-), 2.87 (2H, -(-O)CHCH(CH)-), 2.55 (2H, -NCH2CH2-), 1.92 (6H, -C(O)C(CH3)2Br)。収率：59%。DPA (479 mg, 2.24 mmol)、PMDETA (7.0μL, 0.034 mmol)、およびproMAL-PEG114-Br (150 mg, 0.028 mmol)を重合管中へ加えた。次いで、2-プロパノール(0.50 mL)およびDMF(0.50 mL)の混合物を添加し、モノマーおよび開始剤を溶解した。酸素を除去するための凍結-ポンプ-解凍の3サイクル後、CuBr (4.5 mg, 0.031 mmol)を窒素雰囲気下で反応管中へ添加し、管を真空下で密封した。重合を50℃で8時間行った。重合後、反応混合物をTHF 10 mLで希釈し、Al2O3カラムを通過させ、触媒を除去した。THF溶媒をロトバップによって除去した。残渣を蒸留水中にて透析し、凍結乾燥し、白色粉末を収率65%で得た。proMAL-PEG-b-PDPAコポリマーを1H NMR (500 MHz)、ゲル浸透クロマトグラフィー（Viscotech GPCmax, PLgel 5μm MIXED-Dカラム  Polymer Labs製, 1 mL/分で溶離剤としてTHF）によって特徴決定した。コポリマーの分子量（MnおよびMw）および多分散指数（PDI）を表8に示した。最後に、proMAL-PEG-b-PDPAコポリマー200 mgをトルエン10 mL中に溶解した。反応溶液を一晩還流した。トルエンを除去した。残渣を蒸留水中にて透析し、凍結乾燥し、白色粉末を収率95%で得た。
【０１７６】
UPSナノプローブの合成および特徴決定。色素とコンジュゲートしたMeO-PEG-b-PDPAおよびMeO-PEG-b-PC7A、ならびにマレイミド末端ブロックコポリマーを原子移動ラジカル重合（ATRP）法（上記に説明）によって合成した。cRGD-UPSiナノプローブを以前に公表された手順（Nasongkla, et. al., 2006、これは参照により本明細書に組み入れられる）に従って作製した。典型的な手順において、2 mgのMAL-PEG-b-PDPAおよび18 mgのMeO-PEG-b-PDPA-Cy5.5をTHF 1 mL中に溶解した。次いで、混合物を超音波処理下でMilli-Q水4 mL中へ徐々に添加した。マイクロ限外濾過システムを使用して、混合物を4回濾過し、THFを除去した。ミセル形成後、過剰量のcRGDfKおよび0.05 M HEPES/0.01 M EDTA水溶液中の0.05 Mヒドロキシルアミンをミセル溶液中へ添加した。コンジュゲーションを4時間生じさせ、続いて濾過し、ミセル溶液中のあらゆる沈殿物を除去した。cRGD-UPSiナノプローブを6回濾過し、遊離cRGDfKペプチドを除去した。UPSiまたはUPSeナノプローブを作製するために、20 mgのMeO-PEG-b-PDPA-Cy5.5またはMeO-PEG-b-PC7A-Cy5.5をTHF 1 mL中に溶解した。溶液をMilli-Q水4 mL中へ徐々に添加した。次いで、混合物を4回濾過し、THFを除去し、続いて濾過し、溶液中の沈殿物を除去した。1H-NMRを使用し、コア-シェル構造の形成およびミセル表面へのcRGDペプチドのコンジュゲーションを確認した。ミセルの表面上でのcRGDの成功したコンジュゲーションは、7.4 ppmでのcRGDのフェニルプロトンの出現によって確認された。透過型電子顕微鏡法を1%リンタングステン酸陰性染色で行い、JEOL 1200EX電子顕微鏡(JEOL 1200EX)において可視化した。
【０１７７】
UPSナノプローブの蛍光活性化。異なるpH緩衝溶液中のUPSナノプローブの蛍光発光スペクトルをHitachi蛍光光度計（F-7500モデル）において得た。各UPSナノプローブについて、試料（5 mg/mL）をMilli-Q水中において調製した。次いで、溶液を、異なるpH値を有する50 mMリン酸緩衝食塩水（PBS）中に希釈した。最終ポリマー濃度を0.1 mg/mLに制御した。ナノプローブを675 nmで励起し、発光スペクトルを690〜770 nmで収集した。710 nmでの発光強度を使用し、UPSナノプローブについてのシグナル増幅を定量化した。異なるpHでのUPSiおよびUPSeナノプローブ溶液（0.1 mg/mL）の蛍光画像を、「オレンジ色」フィルター（645〜820 nm）を使用してMaestroインビボイメージングシステム（CRI. Inc. Woburn, MA）においてキャプチャーした。
【０１７８】
インビトロ血清安定性。新鮮なマウス血清を収集し、0.22μmシリンジフィルターによって濾過した。次いで、0.2 mLのcRGD-UPSiまたはUPSeナノプローブ（2 mg/mL）を2 mLの血清中へ添加した。混合物を加湿チャンバ中において37℃でインキュベートした。各指定の時点で、100μLアリコートの血清混合物を収集し、同一のセッティング下でMaestroインビボイメージングシステムによって直ちに画像化し、蛍光強度を定量化した。
【０１７９】
細胞培養。インビボ移植のために使用される腫瘍細胞株には、A549肺癌、MDA-MB-231乳癌、HN5およびHCC4034頭頸部癌、SF-188神経膠腫、LN-229神経膠腫、3LL肺癌、Mia Paca-2膵臓癌ならびにPC-3前立腺癌細胞が含まれる。細胞を、10%ウシ胎仔血清および抗生物質を含むDMEM中で培養した。
【０１８０】
動物モデル。雌性無胸腺nu/nuマウス（18〜22 g）をCharles River (Wilmington, MA)から購入した。A549細胞（5×106/マウス）をマウスの右側腹部にs.c.接種した。移植の3〜4週間後、200〜300 mm3の腫瘍サイズを有する動物を薬物動態、生体内分布、およびイメージング研究のために使用した。統合ナノプローブのユニバーサルなイメージング適用を実証するために、HN5およびHCC4034頭頸部癌、PC-3前立腺癌ならびに3LL Lewis肺癌を含む、同所性腫瘍モデルを作製した。多病巣性乳房腫瘍を担持するMMTV-PyMTトランスジェニックマウスはDeBerardinis博士の研究室によって確立された。MDA-MB-231乳癌、SF-188神経膠腫、LN-229神経膠腫、およびMia Paca-2膵臓癌を含む皮下腫瘍モデルを確立した。
【０１８１】
薬物動態および生体内分布研究。3H標識cRGD-UPSiを、90% MeO-PEG-b-PDPA-C(O)CT3および10% MAL-PEG-b-PDPAから作製した。UPSiおよびUPSeを、それぞれ、MeO-PEG-b-PDPA-C(O)CT3およびMeO-PEG-b-PC7A-C(O)CT3から作製した。薬物動態実験のために、A549腫瘍を担持するマウスを、cRGD-UPSi、UPSi、およびUPSeについての3つの群（各群についてn＝4〜5）に無作為に分けた。マウスにミセル溶液を静脈内注射した。血液を注射後2分、30分、1、3、6、12、および24時間で収集した。血漿（20μL）を10分間5,000 gでの遠心分離によって単離した。血漿を、その後、室温で12時間、組織溶解剤溶液（1 mL, BTS-450; Beckman）と混合し、続いて、24時間、液体シンチレーション混合物（10 mL, Ready Organic, Beckman）を添加した。放射性同位体の量を液体シンチレーションカウンター（Beckman LS 6000 IC）によって測定した。腫瘍および他の器官中のcRGD-UPSi、UPSiおよびUPSeナノプローブの生体内分布をA549腫瘍担持マウスの別の群（各群についてn＝4）において行った。マウスを事前指定の時点（6および24時間）においてPBS緩衝液（30 mL）で灌流した。切開した器官を量り、ホモジナイズし、シンチレーション混合物で処理した。種々の器官／組織中のナノプローブ分布を、組織1グラム当たりの注射用量のパーセンテージ（% ID/g）として計算した。
【０１８２】
インビボおよびエクスビボNIR蛍光イメージング。腫瘍血管系イメージングのために、cRGD-UPSiまたはUPSi（10 mg/kg）をA549腫瘍担持マウス中へ静脈内投与した（各群についてn＝4）。時間経過蛍光画像を、「オレンジ色」フィルターを使用してMaestroインビボイメージングシステムにおいてキャプチャーした。αvβ3介在エンドサイトーシスの役割を解明するために、一群のマウスにcRGD-UPSi注射の30分前にcRGDfK（25 mg/kg）を注射した。
【０１８３】
pHeイメージングのために、UPSe（10 mg/kg）をA549腫瘍担持マウス中へ注射した（各群についてn＝4）。経時的NIR画像を、「オレンジ色」フィルターを使用してMaestroシステムにおいてキャプチャーした。対照として、2-DG（250 mg/kg）またはCHC（250 mg/kg）をUPSeナノプローブ投与の12時間前に注射した。次いで、マウスを事前指定の時点でモニターした。
【０１８４】
上述の10個の腫瘍モデルを使用し、腫瘍微小環境イメージングにおけるcRGD-UPSe-Cy5.5統合ナノプローブのユニバーサルな適用を実証した。統合ナノプローブ（10 mg/kg）を腫瘍担持マウス中へ静脈内投与した（各腫瘍モデルについてn＝4）。蛍光画像を、注射後24時間で、「オレンジ色」フィルターを使用してMaestroシステムにおいてキャプチャーした。
【０１８５】
腫瘍／正常組織（T/N）比率を、腫瘍および腫瘍部位以外の全身における平均蛍光強度を比較することによって決定した。イメージングの終わりに、マウスを犠牲にした。腫瘍および選択した器官を切除し、Maestroシステムによって画像化した。エクスビボ腫瘍の蛍光強度を、定量化し、筋肉および血液の値に対して正規化した。
【０１８６】
生体内イメージング。A549腫瘍を担持するマウスをイソフルランで麻酔し、2チャネル法でNikon ECLIPSE生体顕微鏡（Nikon, Japan）下で固定し、ここで、一方のチャネルは、腫瘍血管系中のcRGD-UPSiナノプローブの活性化を画像化するために使用し、他方のチャネルは、酸性腫瘍微小環境中のUPSeナノプローブのシグナル増幅をプローブするために使用した。cRGD-UPSi-RhoG（10 mg/kg、緑色）とUPSe-TMR（10 mg/kg、赤色）との混合物を腫瘍担持マウス（n＝4）へ静脈内注射した。10× Nikon対物レンズ（objective）を用いて1024×768ピクセルの解像度で画像をキャプチャーした。
【０１８７】
免疫蛍光染色。腫瘍血管系イメージング研究において、マウスを注射後6時間で犠牲にした。腫瘍をスナップ凍結し、8μm切片に切断した。スライスを冷アセトン中に固定し、PBSで3回リンスし、室温で1時間10% BSAでブロックした。その後、スライスをラット抗マウスCD31抗体（1：50, BD Biosciences）と共に4℃で一晩インキュベートした。次いで、Alexa Flour（登録商標）488色素コンジュゲート二次抗体（1：100）を添加し、スライスを染色した。スライドにDAPI含有媒体を載せた。画像を蛍光顕微鏡（Nikon ECLIPSE TE2000-E, Japan）においてキャプチャーした。
【０１８８】
pHeイメージング研究において、腫瘍担持マウスにUPSe（10 mg/kg）を静脈内注射した。注射後5時間で、動物にピモニダゾール（60 mg/kg）を注射した。1時間後、腫瘍を収集し、凍結し、8μm切片に切断した。隣接している腫瘍切片を、ブロッキング溶液中に希釈された一次抗体へ、室温で1時間曝露した。使用した一次抗体は以下の通りであった：1:50に希釈されたFITCコンジュゲートマウス抗ピモニダゾールモノクローナル抗体（HPI Inc.）；1:50に希釈されたラット抗マウスCD31抗体；およびウサギ抗マウスKi-67抗体（Millipore）。切片をPBSで3回洗浄し、適切な二次抗体と共に1時間インキュベートした。CD31をAlexa Flour（登録商標）488コンジュゲート二次抗体（1:100）で検出した。Ki-67をCy2コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体（1:100）で検出した。デジタルカメラを備えたコンピューター制御モーター駆動ステージを使用するNikon蛍光顕微鏡からなる画像解析システムにおいて、切片をスキャンした。全ての画像を×200倍率でスキャンした。切片の合成画像を個々の顕微鏡画像からソフトウェアによって作製した。
【０１８９】
統計解析。データを平均値±s.d.として表した。対応のある両側スチューデントt検定を使用して群間差を評価した。*P＜0.05を有意と見なし、**P＜0.01を高度に有意と見なした。
【０１９０】
インビトロ代謝研究。それぞれDMSOおよびPBS緩衝液中に溶解されたα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸（CHC、1 M）および2-デオキシグルコース（2-DG、1 M）のストック溶液を使用した。代謝研究を、僅かに変更して、以前に記載された通りに行った2。簡潔には、A549細胞（1.2×106/ウェル）を6ウェルプレートに播種し、阻害研究前に24時間インキュベートした。培地を除去し、実験の開始時に、阻害剤またはビヒクル対照を含有する培地で置き換えた。培養培地中のグルコースおよび乳酸の濃度を、その後、自動電気化学分析器（BioProfile Basic-4アナライザー, NOVA）で測定した。タンパク質濃度を、Pierce BCAタンパク質アッセイキットを使用して細胞ペレットから分析した。代謝アッセイを阻害剤添加の6時間後に行った。培地のpHを、阻害剤添加後の24時間で、pH計（Mettler-Toledo International Inc., Columbus, OH）で測定した。
【０１９１】
UPSiナノプローブの蛍光活性化およびHUVEC細胞中のその局在化。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）をLonzaから得、EGM singlequotsを含むEBM中に維持した。HUVECを指数増殖期において使用し、全ての実験を継代＜6で行った。共焦点走査顕微鏡法を使用し、HUVEC中のcRGD-UPSiナノプローブの細胞取り込みおよび細胞内分布を調べた。このために、細胞を完全培地2 mL中でガラス底皿（MatTek, MA）に平板培養し、pH 7.4にてポリマー濃度0.2 mg/mLでcRGD-UPSiまたはUPSiと共にインキュベートした。共焦点画像をミセルの添加後3時間でキャプチャーした。拮抗実験において、HUVECを20倍モル過剰のcRGDfKで前処理し、その後、cRGD-UPSiを細胞と共に3時間インキュベートした。画像をImage-Jソフトウェアを用いて解析した。5回の独立した測定値を平均値±標準偏差として提示した。同時局在実験のために、細胞を、取り込み研究の終わりに15分間、それぞれ、リソソームおよびミトコンドリア標識のために、LysoTracker（登録商標）Green（50 nM）またはMitoTracker（登録商標）Green（100 nM）と共にインキュベートした。次いで、細胞をPBSで3回洗浄した。各共焦点研究について同一のセッティングでNikon ECLIPSE TE2000-E共焦点顕微鏡によって細胞を画像化した。
【０１９２】
急性毒性。15匹の無胸腺ヌードマウス（20〜24 g, 6〜8週齢）を2つの群に無作為に分けた。対照群は5匹のマウスを含有し、実験群は10匹のマウスを含有する。iUPS統合ナノプローブ（10 mg/kg）を、尾静脈を介して実験群のマウスへ静脈内投与した。曝露に続いて、各群のマウスのバイタルサインおよび死を記録した。実験群のマウスの半分を第1日に犠牲にし、残りの半分を第7日に犠牲にした。血液試料（約0.8〜1 mL/マウス）を5,000 gで10分間遠心分離し、血清を分離した。肝機能をアラニントランスアミナーゼ（ALT）およびグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）の血清レベルに基づいて評価した。腎毒性を血液尿素窒素（BUN）およびクレアチニン（Cr）によって測定した。心臓、肝臓、脾臓、肺、および腎臓の組織を収集し、組織病理学検査のために10%ホルマリン中に直ちに固定した。
【０１９３】
8．超pH感受性ナノプローブを使用した、リンパ管中および血流中の腫瘍細胞輸送のリアルタイムイメージング
腫瘍転移は、新たな転移性腫瘍の形成または転移をしばしばもたらす、身体のある部分から身体の別の部分への癌細胞の移動をもたらす。癌患者の主な（principle）原因は腫瘍転移である。腫瘍が身体の他の部分または別の器官へ移動および拡張し得る3つの主な様式がある：血行性として公知の、循環（血液）系によるもの、リンパ系によるもの、および体腔内性（transcoelomic）として公知の、体壁から腹腔および胸腔へのもの。リンパ性移動および循環性移動は両方とも、優勢な移動様式であるようであり、一方、体腔内性は比較的稀である。循環系は、肉腫などの骨および軟組織腫瘍についての一般的なモデルであることが多く、一方、リンパ系は、黒色腫、乳房、肺および胃腸腫瘍についての一般的な輸送法である。腫瘍の転移（metathesis）は癌の臨床的進行において非常に重要であるので、UPSナノプローブは、血流中およびリンパ管中の腫瘍細胞輸送のリアルタイム蛍光イメージングにおいて有用であり得る。
【０１９４】
この目的に向けてUPSナノプローブの使用を研究するために、異なる濃度で全血中へスパイクされたA549細胞（EGFR++）を使用して、エクスビボ研究を行った。稀な循環腫瘍細胞がマウス血液中において確認できた場合、研究は骨の折れるもの（trying）であった。血液中の細胞の異なる濃度（10、100、および1000 CTC/mL血液）を、200μg/mLのナノプローブ濃度にてFratio≧100でFab'-UPSi-TMRナノプローブを使用して試験した。スパイクされた全血をナノプローブと共に3時間インキュベートし、Nikon共焦点顕微鏡を使用して細胞を可視化した。
【０１９５】
600×および2,400×倍率の両方で、癌細胞は全血で目に見えた（図40）。ヒトHNC患者での同様の研究は、600×倍率で細胞の可視化を可能にした（図41）。
【０１９６】
9．官能化PDPA-TMR-Fab'およびPDPA-TMR-FAナノプローブを使用した、種々の癌細胞株のインビトロ、インビボ、およびインイントロ（in intro）イメージング
さらに、上記セクション7に記載のナノプローブは、異なる細胞タイプについてのプローブの選択性を調節する異なる標的指向部分を使用して、官能化することができる。2つの異なる官能化ナノプローブをさらに合成し、異なる細胞タイプをより特異的に標的とするのを助けた。Erbituxモノクローナル抗体を使用して、Fab'ナノ粒子を合成した。Erbitux抗体をペプシンの酸性溶液中で切断した。反応を37℃で1時間加熱し、次いで、溶液のpHがpH 6に達するまで1M Trisの添加によってクエンチし、これに続いて、FPLCを使用して精製し、精製されたF(ab')2を得た。F(ab')2を10 mM EDTAおよび8当量の1 mg/mL水性DTTへ添加した。反応を37℃で4時間加熱し、次いで、PD-10カラムを使用して精製し、精製されたFab'抗体断片を得た。断片を、10% PEG-PDPA-マレイミドを含有する溶液へ添加し、一晩撹拌した。反応混合物を、マイクロ限外濾過によって5 mg/mLへ精製および濃縮した。
【０１９７】
追加の標的指向部分を付加する効果を確認するために、ナノプローブを、pH 7.4にてポリマー濃度0.1 mg/mLで、7種の異なる細胞株と共にインキュベートした。次いで、共焦点顕微鏡法を使用して、細胞をモニターした。図42〜48に示されるように、Fab'断片を含有するナノプローブは、非官能化ナノプローブと比べて標的細胞の可視化の増大を示した。PDPA-TMRは細胞の可視化をほとんどまたは全く示さず、一方、90〜120分後、7種の細胞株の全てが細胞のうちのいくつか内でいくらかの蛍光を示し、細胞株H2009およびHN5（図42および44）は120分後に最も明るい蛍光を示した。さらに、Erbitux抗体を使用して拮抗実験を行った。20倍モル過剰のErbituxおよびPDPA-TMR-Fab'を、細胞と共に2時間インキュベートした。拮抗実験において、ナノプローブは、もはや細胞のいかなる可視化も示さず、何故ならば、抗体が、試験した全ての細胞株について細胞からナノプローブを追放したためであった（図42〜48）。
【０１９８】
PDPA-Fab'プローブ上において異なるフルオロフォアを使用しても、抗体断片を有さないナノプローブと比べて選択的な細胞の可視化が依然として可能であった（図49）。さらに、プローブはインビボで機能し、腫瘍担持マウス中のHN5腫瘍のイメージングを可能にする。PDPA-TMR-Fab'をマウスへ静脈内投与した。図50に示す画像は、Maestroインビボイメージングシステムにおいて、注射の12時間後に撮影したものである。
【０１９９】
Fab'ナノプローブと同様に、チオール含有葉酸誘導体の10当量を、10% PEG-PC7A-マレイミドを含有するミセルおよび1 mM EDTAと共に溶解することによって、葉酸を含有するナノプローブを合成した。反応を一晩撹拌し、次いで、マイクロ限外濾過によって5 mg/mLへ精製および濃縮した。PDPA-TMR-Fab'ナノプローブについて記載したのと同一の細胞培養およびインビボ条件を使用して、PDPF-TMR-FAナノプローブをHSC3細胞へ曝露した。図51に示されるように、葉酸誘導体化プローブへ曝露された場合において、細胞は明らかに蛍光を発する。さらに、研究マウス中に存在した腫瘍は、インビボにてプローブの付加で明確に視認できた（図52）。
【０２００】
10．pH測定のためのハイブリッドミセルの使用
a．方法：
色素コンジュゲーション：色素コンジュゲーションについて、50 mgのPEG-b-P(DPA-co-AMA3)またはPEG-b-(PC7A-co-AMA3)をまず2 mLの無水DMF中に溶解した。次いで、RhoG-NHSまたはTMR-NHSエステル（第1級アミノ基のモル量に対して1.5当量）を添加した。反応混合物を室温で2日間撹拌した。ポリマーコンジュゲートを分取ゲル浸透クロマトグラフィー（PLgel Prep 10μm 10E3Å, 300×25mmカラム  Varian製、5 mL/分で溶離剤としてTHF）によって精製し、遊離色素分子を除去した。得られたポリマーコンジュゲートを凍結乾燥し、-20℃で保存した。
【０２０１】
ナノプローブ作製：10ミリグラムのPEG-b-PC7A-RhoGおよび10 mgのPEG-b-PDPA-TMRをTHF 1 mL中に溶解した。次いで、混合物を超音波処理下でmilli-Q水4 mL中へ添加した。マイクロ限外濾過システムを使用して、混合物を4回濾過し、THFを除去した。
【０２０２】
ハイブリッドナノプローブの特徴決定：異なるpH緩衝溶液中のハイブリッドナノプローブの平均計数率（kcps）を、動的光散乱解析によって得た。最終ポリマー濃度を1 mg/mLに制御した。ハイブリッドナノプローブの蛍光スペクトルをHitachi蛍光光度計（F-7500モデル）によって評価した。ナノプローブを50 mM PBS 緩衝液（pH 7.4）中に希釈し、490 nmで励起し、発光スペクトルを500〜650 nmで収集した。異なるpHでのハイブリッドナノプローブ溶液（0.1 mg/mL）の蛍光画像を、「青色」および「緑色」フィルターを使用してMaestroイメージングシステム（CRI Inc）においてキャプチャーした。
【０２０３】
b．結果：
pHの関数としてプロットしたハイブリッドナノプローブの平均計数率を図53aに示した。ハイブリッドナノプローブは、異なるpHで連続解離を示す。ハイブリッドナノプローブは、pH 6.8およびpH 6.2で2つの鋭敏なpH転移点を示す。図53bに示されるように、スペクトルは、ローダミングリーン色素とTMR色素とのFRET効果を示し、これはハイブリッドナノプローブの形成を示す。図53cの蛍光画像は、色素コンジュゲートポリマーが、異なるpH値で連続して活性化され得ることを実証しており、これは、各コポリマーがそれ自体のpH活性化プロファイルを依然として維持していたことを示している。
【０２０４】
本明細書において開示および特許請求される組成物および方法は全て、本開示を考慮して過度の実験なしに作製および実施することができる。本発明の組成物および方法を特定の態様によって説明したが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、組成物および方法に対して、ならびに本明細書に記載の方法の工程または工程の順序において、変更が適用され得ることが当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的の両方に関連するある薬剤を本明細書に記載の薬剤の代わりに用いてもよく、同一または同様の結果が達成されることが明らかであろう。当業者に明らかなこのような同様の置換および改変は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念内にあるとみなされる。
【０２０５】
参考文献
下記の参考文献は、本明細書に記載のものを補う例示的な手順または他の詳細をそれらが提供する程度まで、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３８Ｅ】
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【図３８Ｆ】
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【図３８Ｇ】
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【図３８Ｈ】
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【図３８Ｉ】
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【図３８Ｊ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【国際調査報告】
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