(57)【要約】  本発明は、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物を、混合物から少なくとも不純物の一部を除去するために、イオン交換クロマトグラフィー膜に供することを含み、これにより、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供する、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物を、イオン交換クロマトグラフィー膜に供して、前記混合物から少なくとも前記不純物の一部を除去することを含み、これにより、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供する、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための方法。
【請求項２】
前記方法が、連続的に２、３、または４回繰り返される、請求項１の方法。
【請求項３】
請求項１の方法であって、前記方法が、
（ａ）細胞結合剤を細胞毒性剤と接触させて、前記細胞結合剤および前記細胞毒性剤を含む第１の混合物を形成し、その後、約４から約９のｐＨを有する溶液において、前記第１の混合物をリンカーを含む二官能性架橋剤と接触させて、前記細胞毒性剤に対して前記リンカーにより化学的に結合された前記細胞結合剤を含む前記細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む第２の混合物を提供することと、
（ｂ）前記第２の混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供して、前記混合物から少なくとも前記不純物の一部を除去し、これにより、前記細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートの精製された第２の混合物を提供することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）後の前記精製された第２の混合物を、タンジェント流濾過、選択的析出、非吸着クロマトグラフィー、吸着濾過、吸着クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせに供して、前記不純物から前記細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートをさらに精製し、これにより、前記細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートの精製された第３の混合物を調製することとを含み、
前記精製された第３の混合物が、前記精製された第２の混合物と比較して低減された量の前記不純物を含む、方法。
【請求項４】
ステップ（ｃ）の前に、ステップ（ｂ）が、連続的に２、３、または４回繰り返される、請求項３の方法。
【請求項５】
吸着クロマトグラフィーが、ステップ（ｃ）で利用される、請求項３または４の方法。
【請求項６】
前記吸着クロマトグラフィーが、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードイオン交換クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、色素リガンドクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３〜５のいずれかの方法。
【請求項７】
前記吸着クロマトグラフィーが、イオン交換クロマトグラフィーである、請求項６の方法。
【請求項８】
前記イオン交換クロマトグラフィーが、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィーである、請求項７の方法。
【請求項９】
タンジェント流濾過が、ステップ（ｃ）で利用される、請求項３または４の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）における前記接触が、反応器に前記細胞結合剤を提供することと、前記反応器に前記細胞毒性剤を添加して、前記細胞結合剤および前記細胞毒性剤を含む前記第１の混合物を形成することと、その後、前記二官能性架橋剤を前記第１の混合物に添加することとにより、達成される、請求項３〜９のいずれかの方法。
【請求項１１】
ステップａからｂまたはステップｂからｃ間で前記混合物を保持して、前記細胞結合剤から前記不安定な結合リンカーを放出することをさらに含む、請求項３〜１０のいずれかの方法。
【請求項１２】
前記混合物が、約２℃から約８℃の温度で約２０時間保持される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）から（ｂ）の間に前記第２の混合物を急冷して、あらゆる未反応の細胞毒性剤および／または未反応の二官能性架橋剤を急冷することをさらに含む、請求項３〜１２のいずれかの方法。
【請求項１４】
前記第２の混合物を、前記遊離細胞毒性剤と反応する急冷試薬と接触させることにより、前記混合物が急冷される、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記急冷試薬が、４‐マレイミド酪酸、３‐マレイミドプロピオン酸、Ｎ‐エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、およびヨードアセトアミドプロピオン酸（ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群から選択される、請求項１４の方法。
【請求項１６】
請求項３〜１５のいずれかの方法であって、前記方法が、
（ａ）細胞結合剤を細胞毒性剤と接触させて、前記細胞結合剤および前記細胞毒性剤を含む第１の混合物を形成し、その後、約４から約９のｐＨを有する溶液において、前記第１の混合物をリンカーを含む二官能性架橋剤と接触させて、前記細胞毒性剤に対して前記リンカーにより化学的に結合された前記細胞結合剤を含む前記細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む第２の混合物を提供することと、
（ｂ）前記第２の混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供して、前記混合物から少なくとも前記不純物の一部を除去し、これにより、前記細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートの精製された第２の混合物を提供することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）後の前記精製された第２の混合物を急冷して、あらゆる未反応の細胞毒性剤および／または未反応の二官能性架橋剤を急冷することと、
（ｄ）イオン交換クロマトグラフィー膜に、ステップ（ｃ）後の前記急冷された混合物を供して、前記混合物から少なくとも前記不純物の一部を除去し、これにより、前記細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートの精製された第３の混合物を提供することと、
（ｅ）前記精製された第３の混合物を保持して、前記細胞結合剤からの前記不安定な結合リンカーを放出することと、
（ｆ）イオン交換クロマトグラフィー膜に、ステップ（ｃ）後の前記精製された第３の混合物を供して、前記混合物から少なくとも前記不純物の一部を除去し、これにより、前記細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートの精製された第４の混合物を提供することと、
（ｇ）タンジェント流濾過、選択的析出、非吸着クロマトグラフィー、吸着濾過、吸着クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせに、ステップ（ｆ）後の前記精製された第４の混合物を供して、前記不純物から前記細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートをさらに精製し、これにより、前記細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートの精製された第３の混合物を調製することとを含み、
前記精製された第３の混合物が、前記精製された第２の混合物と比較して、低減された量の前記不純物を含む、方法。
【請求項１７】
タンジェント流濾過が、ステップ（ｇ）で利用される、請求項１６の方法。
【請求項１８】
請求項１の方法であって、前記方法が、
（ａ）細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させて、リンカーを前記細胞結合剤に共有結合的に付着させ、これにより、結合されたリンカーを有する細胞結合剤を含む第１の混合物を調製することと、
（ｂ）タンジェント流濾過、選択的析出、非吸着クロマトグラフィー、吸着濾過、吸着クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせに、前記第１の混合物を供し、これにより、結合されたリンカーを有する細胞結合剤の精製された第１の混合物を調製することと、
（ｃ）約４から約９のｐＨを有する溶液において、細胞毒性剤と、結合されたリンカーを有する前記細胞結合剤を反応させることにより、前記精製された第１の混合物において、細胞毒性剤を、結合されたリンカーを有する前記細胞結合剤に結合させて、前記リンカーにより前記細胞毒性剤に化学的に結合された前記細胞結合剤を含む前記細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む第２の混合物を調製することと、
（ｄ）前記第２の混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供して、少なくとも前記不純物の一部を除去し、これにより、前記細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートの精製された第２の混合物を提供することと、
（ｅ）タンジェント流濾過、選択的析出、非吸着クロマトグラフィー、吸着濾過、吸着クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせに、ステップ（ｄ）後の前記精製された第２の混合物を供して、前記不純物から前記細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートをさらに精製し、これにより、前記細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートの精製された第３の混合物を調製することとを含み、
前記精製された第３の混合物が、前記精製された第２の混合物と比較して低減された量の前記不純物を含む、方法。
【請求項１９】
ステップ（ｅ）の前に、ステップ（ｄ）が、連続的に２、３、または４回繰り返される、請求項１８の方法。
【請求項２０】
吸着クロマトグラフィーが、ステップ（ｂ）および（ｄ）において利用される、請求項１８または１９の方法。
【請求項２１】
タンジェント流濾過が、ステップ（ｂ）において利用され、吸着クロマトグラフィーが、ステップ（ｄ）において利用される、請求項１８または１９の方法。
【請求項２２】
吸着クロマトグラフィーが、ステップ（ｂ）において利用され、タンジェント流濾過が、ステップ（ｄ）において利用される、請求項１８または１９の方法。
【請求項２３】
前記吸着クロマトグラフィーが、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードイオン交換クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、色素リガンドクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１８〜２２のいずれかの方法。
【請求項２４】
前記吸着クロマトグラフィーが、イオン交換クロマトグラフィーである、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記イオン交換クロマトグラフィーが、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィーである、請求項２４の方法。
【請求項２６】
タンジェント流濾過が、ステップ（ｂ）および（ｄ）において利用される、請求項１８または１９の方法。
【請求項２７】
非吸着クロマトグラフィーが、ステップ（ｂ）および（ｄ）において利用される、請求項１８または１９の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｃ）における前記溶液が、スクロースを含む、請求項１８〜２７のいずれかの方法。
【請求項２９】
ステップ（ｃ）における前記溶液が、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、およびリン酸緩衝液からなる群から選択される緩衝剤を含む、請求項１８〜２８のいずれかの方法。
【請求項３０】
ステップ（ｃ）における前記溶液が、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ‐（２‐ヒドロキシエチル）ピペラジン‐Ｎ’‐（２‐ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン‐１，４‐ビス‐（２‐ヒドロキシ‐プロパン‐スルホン酸）無水物）、ＨＥＰＥＳ（４‐（２‐ヒドロキシエチル）ピペラジン‐１‐エタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳ（ＥＰＰＳ）（４‐（２‐ヒドロキシエチル）ピペラジン‐１‐プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ‐［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］‐２‐アミノエタンスルホン酸）、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される緩衝剤を含む、請求項１８〜２８のいずれかの方法。
【請求項３１】
（ｆ）ステップａからｂ、ステップｂからｃ、ステップｃからｄ、およびステップｄからｅの少なくとも１つの間、前記混合物を保持して、前記細胞結合剤から前記不安定な結合リンカーを放出することをさらに含む、請求項１８〜３０のいずれかの方法。
【請求項３２】
請求項１の方法であって、前記方法が、
（ａ）細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させて、リンカーを前記細胞結合剤に共有結合的に付着させ、これにより、結合されたリンカーを有する細胞結合剤を含む第１の混合物を調製することと、
（ｂ）細胞毒性剤と、結合されたリンカーを有する前記細胞結合剤を反応させることにより、前記第１の混合物において、細胞毒性剤を、結合されたリンカーを有する前記細胞結合剤に結合させて、前記リンカーにより前記細胞毒性剤に化学的に結合された前記細胞結合剤を含む前記細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む第２の混合物を調製することと、
（ｃ）イオン交換クロマトグラフィー膜に前記第２の混合物を供して、少なくとも前記不純物の一部を除去し、これにより、前記細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートの精製された第２の混合物を提供することと、
（ｄ）ステップ（ｃ）後の前記精製された第２の混合物を、タンジェント流濾過、選択的析出、非吸着クロマトグラフィー、吸着濾過、吸着クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせに供して、前記不純物から前記細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートをさらに精製し、これにより、前記細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートの精製された第３の混合物を調製することとを含み、
前記精製された第３の混合物が、前記精製された第２の混合物と比較して、低減された量の前記不純物を含む、方法。
【請求項３３】
前記第１の混合物が、ステップ（ａ）および（ｂ）間で精製に供されない、請求項３２の方法。
【請求項３４】
ステップ（ｄ）の前に、ステップ（ｃ）が、連続的に２、３、または４回繰り返される、請求項３２または３３の方法。
【請求項３５】
吸着クロマトグラフィーが、ステップ（ｄ）において利用される、請求項３２〜３４のいずれかの方法。
【請求項３６】
前記吸着クロマトグラフィーが、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードイオン交換クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、色素リガンドクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３５の方法。
【請求項３７】
前記吸着クロマトグラフィーが、イオン交換クロマトグラフィーである、請求項３６の方法。
【請求項３８】
前記イオン交換クロマトグラフィーが、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィーである、請求項３７の方法。
【請求項３９】
タンジェント流濾過が、ステップ（ｄ）において利用される、請求項３２〜３４のいずれかの方法。
【請求項４０】
非吸着クロマトグラフィーが、ステップ（ｄ）において利用される、請求項３２〜３４のいずれかの方法。
【請求項４１】
ステップ（ｂ）における前記溶液が、スクロースを含む、請求項３２〜３４のいずれかの方法。
【請求項４２】
ステップ（ｂ）における前記溶液が、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、およびリン酸緩衝液からなる群から選択される緩衝剤を含む、請求項３２〜４１のいずれかの方法。
【請求項４３】
ステップ（ｂ）における前記溶液が、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ‐（２‐ヒドロキシエチル）ピペラジン‐Ｎ’‐（２‐ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン‐１，４‐ビス‐（２‐ヒドロキシ‐プロパン‐スルホン酸）無水物）、ＨＥＰＥＳ（４‐（２‐ヒドロキシエチル）ピペラジン‐１‐エタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳ（ＥＰＰＳ）（４‐（２‐ヒドロキシエチル）ピペラジン‐１‐プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ‐［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］‐２‐アミノエタンスルホン酸）、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される緩衝剤を含む、請求項３２〜４１のいずれかの方法。
【請求項４４】
（ｅ）ステップａからｂ、ステップｂからｃ、およびステップｃからｄの少なくとも１つの間、前記混合物を保持して、前記細胞結合剤から前記不安定な結合リンカーを放出することをさらに含む、請求項３２〜４３のいずれかの方法。
【請求項４５】
前記１つまたはそれ以上の不純物が、細胞毒性剤ダイマー、前記細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートの凝集体、遊離細胞毒性剤、非コンジュゲートリンカー、およびこれらの混合物の群から選択される、請求項１〜４４のいずれか一項の方法。
【請求項４６】
前記混合物が、不純物として細胞毒性剤ダイマーを含み、いくらかの前記細胞毒性剤ダイマーが前記混合物から除去されて、前記精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供する、請求項４５の方法。
【請求項４７】
前記細胞毒性剤ダイマーが、ＤＭ１‐ＤＭ１を含む、請求項４６の方法。
【請求項４８】
前記細胞毒性剤ダイマーが、ＤＭ１‐ＭＣＣ‐ＤＭ１を含む、請求項４６の方法。
【請求項４９】
前記細胞毒性剤ダイマーが、ＤＭ１‐ＤＭ１およびＤＭ１‐ＭＣＣ‐ＤＭ１を含む、請求項４６の方法。
【請求項５０】
前記混合物が、不純物として前記細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートの凝集体を含み、前記細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートのいくらかの前記凝集体が前記混合物から除去されて、前記精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供する、請求項４５の方法。
【請求項５１】
前記混合物が、不純物として遊離細胞毒性剤を含み、いくらかの前記遊離細胞毒性剤が前記混合物から除去されて、前記精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供する、請求項４５の方法。
【請求項５２】
前記混合物が、不純物として非コンジュゲートリンカーを含み、いくらかの前記非コンジュゲートリンカーが前記混合物から除去されて、前記精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供する、請求項４５の方法。
【請求項５３】
前記イオン交換クロマトグラフィー膜に供される前記混合物の前記ｐＨが、約４から約９である、請求項１〜５２のいずれかの方法。
【請求項５４】
前記混合物の前記ｐＨが、約７から約８である、請求項５３の方法。
【請求項５５】
前記混合物の前記ｐＨが、約７．３から約７．７である、請求項５４の方法。
【請求項５６】
前記混合物の前記ｐＨが約７．５である、請求項５５の方法。
【請求項５７】
前記混合物の前記ｐＨが、約４．５から約５．５である、請求項５３の方法。
【請求項５８】
前記混合物の前記ｐＨが、約４．８または約５である、請求項５７の方法。
【請求項５９】
前記１つまたはそれ以上の不純物の少なくとも５０％が、前記混合物から除去される、請求項１〜５８のいずれかの方法。
【請求項６０】
前記１つまたはそれ以上の不純物の少なくとも７５％が、前記混合物から除去される、請求項１〜５８のいずれかの方法。
【請求項６１】
前記１つまたはそれ以上の不純物の少なくとも９０％が、前記混合物から除去される、請求項１〜５８のいずれかの方法。
【請求項６２】
前記イオン交換クロマトグラフィー膜が、陰イオン交換膜である、請求項１〜６１のいずれかの方法。
【請求項６３】
前記陰イオン交換膜がＱ膜である、請求項６２の方法。
【請求項６４】
前記イオン交換クロマトグラフィー膜が、陽イオン交換膜である、請求項１〜６１のいずれかの方法。
【請求項６５】
前記陽イオン交換膜が、Ｓ膜である、請求項６４の方法。
【請求項６６】
前記イオン交換クロマトグラフィー膜が、エンドトキシン除去交換膜である、請求項１〜６１のいずれかの方法。
【請求項６７】
ステップ（ａ）における前記接触が、約７から約９のｐＨを有する溶液で生じる、請求項３〜６６のいずれかの方法。
【請求項６８】
ステップ（ａ）における前記溶液が、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、およびリン酸緩衝液からなる群から選択される緩衝剤を含む、請求項３〜６６のいずれか一項の方法。
【請求項６９】
ステップ（ａ）における前記溶液が、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ‐（２‐ヒドロキシエチル）ピペラジン‐Ｎ’‐（２‐ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン‐１，４‐ビス‐（２‐ヒドロキシ‐プロパン‐スルホン酸）無水物）、ＨＥＰＥＳ（４‐（２‐ヒドロキシエチル）ピペラジン‐１‐エタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳ（ＥＰＰＳ）（４‐（２‐ヒドロキシエチル）ピペラジン‐１‐プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ‐［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］‐２‐アミノエタンスルホン酸）、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される緩衝剤を含む、請求項３〜６６のいずれか一項の方法。
【請求項７０】
ステップ（ａ）における前記接触が、約１６℃から約２４℃の温度で生じる、請求項３〜６９のいずれかの方法。
【請求項７１】
ステップ（ａ）における前記接触が、約０℃から約１５℃の温度で生じる、請求項３〜６９のいずれかの方法。
【請求項７２】
前記二官能性架橋剤が、酸不安定性リンカー、ジスルフィド含有リンカー、感光性リンカー、ペプチダーゼ不安定性リンカー、またはエステラーゼ不安定性リンカーである、請求項３〜７１のいずれかの方法。
【請求項７３】
前記二官能性架橋剤が、ジスルフィド含有の切断可能なリンカーである、請求項３〜７１のいずれかの方法。
【請求項７４】
前記二官能性架橋剤が、非切断可能リンカーである、請求項３〜７１のいずれかの方法。
【請求項７５】
前記二官能性架橋剤が、Ｎ‐スクシンイミジルエステル部分、Ｎ‐スルホスクシンイミジルエステル部分、マレイミド系の部分、またはハロアセチル系の部分を含む、請求項３〜７１のいずれかの方法。
【請求項７６】
前記二官能性架橋剤が、Ｎ‐スクシンイミジル３‐（２‐ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、Ｎ‐スクシンイミジル４‐（２‐ピリジルジチオ）ブタン酸（ＳＰＤＢ）、Ｎ‐スクシンイミジル４‐（２‐ピリジルジチオ）ペンタン酸（ＳＰＰ）、およびＮ‐スクシンイミジル‐４‐（２‐ピリジルジチオ）２‐スルホブタン酸（スルホ‐ＳＰＤＢ）からなる群から選択される、請求項７３の方法。
【請求項７７】
前記二官能性架橋剤が、Ｎ‐スクシンイミジル４‐（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ‐スクシンイミジル‐４‐（Ｎ‐マレイミドメチル）‐シクロヘキサン‐１‐カルボキシ‐（６‐アミドカプロン酸エステル）（ＬＣ‐ＳＭＣＣ）、κ‐マレイミドウンデカン酸Ｎ‐スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ‐マレイミド酪酸Ｎ‐スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、β‐マレイミドプロピルオキシ‐スクシンイミジルエステル（ＢＭＰＳ）、ε‐マレイミドカプロン酸Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ‐マレイミドベンゾイル‐Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ‐（α‐マレイミドアセトキシ）‐スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル‐６‐（β‐マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ‐スクシンイミジル４‐（ｐ‐マレイミドフェニル）‐ブチラート（ＳＭＰＢ）、およびＮ‐（ｐ‐マレイミドフェニル）イソシアナート（ＰＭＰＩ）、スルホ‐Ｍａｌ、ＰＥＧ４‐Ｍａｌ、およびＣＸ１‐１からなる群から選択される、請求項７４の方法。
【請求項７８】
前記細胞結合剤が、抗体、インターフェロン、インターロイキン２（ＩＬ‐２）、インターロイキン３（ＩＬ‐３）、インターロイキン４（ＩＬ‐４）、インターロイキン６（ＩＬ‐６）、インスリン、ＥＧＦ、ＴＧＦ‐α、ＦＧＦ、Ｇ‐ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＭＣＳＦ、ＧＭ‐ＣＳＦ、およびトランスフェリンからなる群から選択される、請求項１〜７７のいずれかの方法。
【請求項７９】
前記細胞結合剤が、抗体である、請求項７８の方法。
【請求項８０】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項７９の方法。
【請求項８１】
前記抗体が、ヒト化モノクローナル抗体である、請求項８０の方法。
【請求項８２】
前記細胞結合剤が、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、トラスツズマブ、ビバツズマブ、シブロツズマブ、ｈｕＤＳ６、リツキシマブ、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２７Ｌ抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、抗ＣＤ１３８抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、インテグリン標的抗体、抗ＣＤ３７抗体、抗葉酸レセプター抗体、抗Ｈｅｒ３抗体、Ｂ‐Ｂ４抗体、および抗ＩＧＦＩＲ抗体からなる群から選択される抗体である、請求項７８の方法。
【請求項８３】
前記細胞毒性剤が、マイタンシノイド、タキサン、およびＣＣ１０６５からなる群から選択される、請求項１〜８２のいずれかの方法。
【請求項８４】
前記細胞毒性剤が、マイタンシノイドである、請求項８３の方法。
【請求項８５】
前記マイタンシノイドが、チオール基を含む、請求項８４の方法。
【請求項８６】
前記マイタンシノイドが、Ｎ２’‐デアセチル‐Ｎ２’‐（３‐メルカプト‐１‐オキソプロピル）‐マイタンシン（ＤＭ１）、またはＮ２’‐デアセチル‐Ｎ２’‐（４‐メチル‐４‐メルカプト‐１‐オキソペンチル）‐マイタンシン（ＤＭ４）である、請求項８５の方法。
【請求項８７】
前記細胞毒性剤がＤＭ１であり、前記二官能性架橋剤がＳＭＣＣであり、および前記細胞結合剤がｈｕＣＤ３７‐３抗体である、請求項１〜７１のいずれかの方法。
【請求項８８】
前記細胞毒性剤がＤＭ１であり、前記二官能性架橋剤がＳＭＣＣであり、および前記細胞結合剤がＥＧＦＲ‐７Ｒ抗体である、請求項１〜７１のいずれかの方法。
【請求項８９】
前記細胞毒性剤がＤＭ１であり、前記二官能性架橋剤がＳＭＣＣであり、および前記細胞結合剤が抗ＥＦＧＲｖＩＩＩ抗体である、請求項１〜７１のいずれかの方法。
【請求項９０】
前記細胞毒性剤がＤＭ１であり、前記二官能性架橋剤がＳＭＣＣであり、および前記細胞結合剤が抗ＣＤ２７Ｌ抗体である、請求項１〜７１のいずれかの方法。
【請求項９１】
前記細胞毒性剤がＤＭ１であり、前記二官能性架橋剤がＳＭＣＣであり、および前記細胞結合剤がトラスツズマブである、請求項１〜７１のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、参照により組み込まれる、２０１２年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６１／７０９，８７１号の利益を主張する。
【０００２】
電子的に提出されるデータの参照による援用
本明細書にその全体において参照により援用されるのは、これにより同時に提出されたコンピュータ読取可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表であり、以下のように識別される：２０１３年１０月３日に作成されたファイル名「７１４２８８ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ＴＸＴ，」の１つの８，２７９バイトＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル
【背景技術】
【０００３】
癌および他の疾病の治療のために有用である抗体‐薬物コンジュゲートは、通常、３つの別個の要素：細胞結合剤、リンカー、および細胞毒性剤からなる。通常使用される製造方法の１つは、反応基を有するリンカーに共有結合的に付着された細胞結合剤を形成するための、細胞結合剤を二官能性リンカーと反応させる修飾ステップと、修飾された抗体が修飾反応の他の成分から精製される精製ステップと、リンカーから（反応基を用いて）細胞毒性剤へと共有結合性の化学結合を形成するための、修飾された細胞結合剤を細胞毒性剤と反応させる結合ステップと、コンジュゲートが結合反応の他の成分から精製される第２の精製ステップとを含む。
【０００４】
近年の臨床試験は、多くの異なるタイプの癌の治療における、抗体‐薬物コンジュゲートについての有望な役割を示してきた。よって、患者を治療するために使用され得る高純度および高安定性のコンジュゲートを産生する必要性がある。抗体‐薬物コンジュゲートを調製することにおける前進にも関わらず、現在の方法は、いくつかの因子により制限される。例えば、これらの方法により産生されるコンジュゲートは、遊離細胞毒性剤（例えば、細胞毒性剤ダイマーに関連する種）および／または高分子量の種（例えば、ダイマーおよび他の高次の凝集体）を含む、増加した量の不純物を含む。タンジェント流濾過および吸着クロマトグラフィーのような、当該技術分野で採用される、現在の精製方法は、収率を著しく減少させることなくこれらの不純物を効率的に除去せず、および／またはラージスケールの製造方法にとって煩雑である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
よって、現在の方法により産生された抗体‐薬物コンジュゲートよりも高い純度であり、より安定している、抗体‐薬物コンジュゲートを調製する向上された方法の必要性が残る。本発明は、このような方法を提供する。本発明のこれらおよび他の利点、並びに、さらなる発明の特徴は、本明細書で提供される発明の記載から明らかであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、混合物から少なくとも不純物の一部を除去するために、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供することを含み、これにより、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供する、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための方法を提供する。また、本発明は、本明細書に記載された方法に従って調製された、細胞毒性剤に化学的に結合された細胞結合剤を含む、コンジュゲートを含む。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
当業者は、細胞毒性剤に化学的に結合された、抗体のような細胞結合剤を含むコンジュゲート（「抗体‐細胞毒性剤コンジュゲート」）が、典型的には、低ｐＨ（つまり、ｐＨ７．０またはそれ以下）で、二官能性架橋剤により抗体を修飾することと、結合されたリンカーを有する抗体を精製することと、結合されたリンカーを有する抗体に細胞毒性剤を結合させることと、抗体‐細胞毒性剤コンジュゲートを精製することとにより、調製されることを理解するであろう。近年、方法は、細胞結合剤に安定して結合されたリンカーの量を最大化し、かつ不安定性へとコンジュゲートを導く望ましくない副反応を最小化することにより増加した安定性のコンジュゲートを産生するために開発されてきた。安定して結合されたリンカーを有する細胞結合剤の所望の種のレベルを増加させ、かつ望ましくない反応産物（例えば、不安定に結合されたリンカーを有する細胞結合剤）のレベルを低減させるために、例えば、コンジュゲートを作成する方法が１つのステップで（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０２５３０２１号に記載された方法を参照）および／または高いｐＨ（例えば、ｐＨ７またはそれ以上）で（例えば、国際出願公開第２０１２／１３５５２２号に記載された方法を参照）行われる方法が、開発された。このような方法は、安定性の増加したコンジュゲートを産生するが、これらの方法は、遊離細胞毒性剤（例えば、細胞毒性剤ダイマーに関連する種）および／または高分子量の種（例えば、ダイマーおよび他の高次の凝集体）のような、増加したレベルの不純物を有するコンジュゲートをもたらすことが発見されている。タンジェント流濾過および吸着クロマトグラフィーのような、当該技術分野で採用される現在の精製方法は、収率を著しく減少させることなくこれらの不純物を効率的に除去せず、および／またはラージスケールの製造方法にとって煩雑である。
【０００８】
イオン交換クロマトグラフィー膜が、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを含む混合物から、少なくとも不純物の一部を除去するために使用され得る、という驚くべき発見がされた。特に、遊離細胞毒性剤（例えば、細胞毒性剤ダイマーに関連する種）が、イオン交換クロマトグラフィー膜に混合物を供することにより、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを含む混合物から効果的におよび効率的に除去され得ることが予想外に発見された。従って、本発明は、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供することを含む、増加した純度および安定性の細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートの製造のための方法を提供する。
【０００９】
本発明は、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物を、イオン交換クロマトグラフィー膜に供して、混合物から少なくとも不純物の一部を除去することを含み、これにより、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供する、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための方法を提供する。イオン交換クロマトグラフィー膜は、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを含む混合物で一般的にみられる種々の不純物を除去するために使用され得る。例えば、イオン交換クロマトグラフィー膜は、細胞毒性剤ダイマー、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートの凝集体、遊離細胞毒性剤、非コンジュゲートリンカー、およびこれらの混合物の群から選択される、１つまたはそれ以上の不純物を除去するために使用され得る。
【００１０】
一実施形態では、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを含む混合物が、不純物として細胞毒性剤ダイマーを含み、イオン交換クロマトグラフィー膜が、混合物からいくらかの細胞毒性剤ダイマーを除去して、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供する。別の実施形態では、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを含む混合物が、不純物として細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートの凝集体を含み、イオン交換クロマトグラフィー膜が、混合物からいくらかの細胞結合剤細胞毒性剤の凝集体を除去して、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供する。別の実施形態では、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを含む混合物が、不純物として遊離細胞毒性剤を含み、イオン交換クロマトグラフィー膜が、混合物からいくらかの遊離細胞毒性剤を除去して、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供する。別の実施形態では、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲート含む混合物が、不純物として非コンジュゲートリンカーを含み、イオン交換クロマトグラフィー膜が、混合物からいくらかの非コンジュゲートリンカーを除去して、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供する。
【００１１】
好ましい実施形態では、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを含む混合物が、不純物として、リンカーにより互いに化学的に結合された細胞毒性剤ダイマー（例えば、ＤＭ１‐ＭＣＣ‐ＤＭ１；ＤＭ１‐ＳＰＰ‐ＤＭ１；またはＤＭ１‐ＣＸ１‐１‐ＤＭ１）を含み、イオン交換クロマトグラフィー膜が、混合物から、リンカーにより互いに化学的に結合されたいくらかの細胞毒性剤ダイマー（例えば、ＤＭ１‐ＭＣＣ‐ＤＭ１；ＤＭ１‐ＳＰＰ‐ＤＭ１；またはＤＭ１‐ＣＸ１‐１‐ＤＭ１）を除去して、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供する。別の好ましい実施形態では、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを含む混合物が、不純物として、リンカーにより互いに化学的に結合されない細胞毒性剤ダイマー（例えば、ＤＭ１‐ＤＭ１）を含み、イオン交換クロマトグラフィー膜が、混合物から、リンカーにより互いに化学的に結合されないいくらかの細胞毒性剤ダイマー（例えば、ＤＭ１‐ＤＭ１）を除去して、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供する。
【００１２】
細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物が、イオン交換クロマトグラフィー膜に供される場合、得られる精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートは、混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供する前の混合物における１つまたはそれ以上の不純物のレベルと比較して、低減されたレベルの少なくとも１つまたはそれ以上の不純物を含む。例えば、イオン交換クロマトグラフィー膜は、混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供する前の混合物における１つまたはそれ以上の不純物のレベルと比較して、混合物における少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％もの１つまたはそれ以上の不純物を除去する。
【００１３】
一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー膜が、混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供する前の混合物における１つまたはそれ以上の不純物のレベルと比較して、混合物における約１０％から約１００％、約１０％から約９０％、約２０％から約１００％、約２０％から約９０％、約２０％から約８０％、約３０％から約１００％、約３０％から約９０％、約３０％から約８０％、約４０％から約８０％、約４０％から約９０％、約４０％から約１００％、約５０％から約８０％、約５０％から約９０％、約５０％から約１００％（例えば、約６０％から約９０％、約７０％から約９０％）、約６０％から約１００％、約７０％から約１００％、約８０％から約１００％、約９０％から約１００％、または約９５％から約１００％（例えば、約９６％から約１００％、約９７％から約１００％、約９８％から約１００％、約９９％から約１００％、約９５％から約９６％、約９５％から約９７％、約９５％から約９８％、または約９５％から約９９％）の１つまたはそれ以上の不純物を除去する。
【００１４】
一実施形態では、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物のｐＨは、混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供する前に調節される。細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物のｐＨは、好ましくは、約４から約９（例えば、約４．５から約８．５、約５から約８、約５．５から約７．５、約６から約７、約６．５から約７．５、約７から約８、約８から約９、約４．５から約６、または約４．５から約５のｐＨ）である。いくつかの実施形態では、混合物のｐＨは、約６から約６．５（例えば、５．５から７のｐＨ、５．７から６．８のｐＨ、５．８から６．７のｐＨ、５．９から６．６のｐＨ、または６から６．５のｐＨ）、約６もしくはそれ以下のｐＨ（例えば、約４から６、約４から約５．５、約４から約４．５、約４から約５、約５から６のｐＨ）、または約６．５もしくはそれ以上のｐＨ（例えば、６．５から約９、約６．５から約７、約７から約９、約７．５から約９、または６．５から約８のｐＨ）である。一実施形態では、混合物のｐＨは、７．５超である（例えば、７．６から約９、７．７から約９、約７．８から約９、約７．９から約９、７．６から約８．５、７．６から約８、７．７から約８．５、７．７から約８、約７．８から約８．４、約７．８から約８．２、約８から約９、または約８から約８．５のｐＨ）。例えば、混合物のｐＨは、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９のｐＨであり得る。別の実施形態では、混合物のｐＨは、約４．８（例えば、約４．５から約５、約４．６から約５、または約４．７から約４．９）である。
【００１５】
種々のイオン交換クロマトグラフィー膜が、当該技術分野で知られ、本明細書に記載された発明に従って使用され得る。一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー膜は、Ｑ膜のような陰イオン交換膜である。別の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー膜は、Ｓ膜のような陽イオン交換膜である。一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー膜は、エンドトキシン除去交換膜である。Ｑ、Ｓ、およびエンドトキシン（Ｅ）膜は、例えば、Ｐａｌｌ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈから市販されている。
【００１６】
好ましい実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー膜は、陰イオン交換膜である（例えば、Ｑ膜）。陰イオン交換膜は、正帯電の微孔性膜である。一実施形態では、正帯電の陰イオン交換部分は、第四アンモニウム基である。一実施形態では、正帯電の微孔性膜は、ペンダントカチオン基を有する架橋コーティングおよび多孔性基材を含む（例えば、米国特許第６，７８０，３２７号、米国特許第６，８５１，５６１号、米国特許第７，０９４，３４７号、米国特許第７，２２３，３４１号、米国特許第７，３９６，４６５号に記載されるものを参照）。一実施形態では、多孔性基材は、親水性である（例えば、ポリエーテルスルホンまたは架橋セルロースマトリックス）。別の実施形態では、カチオン基は、第四アンモニウム基である。別の実施形態では、陰イオン交換膜は、多孔性のポリエーテルスルホン基質およびペンダント第四アンモニウム基を有する架橋コーティングを含む正帯電の微孔性膜である。
【００１７】
細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための多くの方法が、記載される（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０２５３０２１号、国際特許出願公開第２０１２／１３５５２２号、米国特許第５，２０８，０２０号、米国特許第６，４４１，１６３号、米国特許第７，８１１，５７２号、米国特許出願公開第２００６／０１８２７５０号、米国特許出願公開第２００８／０１４５３７４号、および米国特許出願公開第２０１１／０００３９６９号を参照）。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、細胞毒性剤に化学的に結合された細胞結合剤を含むコンジュゲートを調製するための方法を提供し、修飾反応および結合反応が単一のステップ内で組み合わされ、その後、精製ステップが続き（つまり、米国特許出願公開第２０１２／０２５３０２１号に記載されるワンステップ方法）、方法は、精製ステップの前または後のいずれかに、イオン交換クロマトグラフィー膜に細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物を供することを含む。ワンステップ方法は、細胞結合剤（例えば、抗体）を、細胞毒性剤と接触させて、細胞結合剤および細胞毒性剤を含む第１の混合物を形成することと、その後、約４から約９のｐＨを有する溶液において、細胞結合剤および細胞毒性剤を含む第１の混合物を、リンカーを含む二官能性架橋剤と接触させて、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物（例えば、遊離細胞毒性剤および反応副生成物）を含む第２の混合物を提供することとを含み、細胞結合剤は、細胞毒性剤に、リンカーにより化学的に結合される。第２の混合物は、その後、精製に供されて、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供する。細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む第２の混合物は、精製ステップ前、精製ステップ後、または両方で、イオン交換クロマトグラフィー膜に供される。
【００１９】
ワンステップ反応は、好ましくは、約４から約ｐＨ９のｐＨ（例えば、約４．５から約８．５、約５から約８、約５．５から約７．５、約６から約７、約６から約８、約６から約９、または約６．５から約７．５のｐＨ）で実行される。いくつかの実施形態では、反応は、約６から約８のｐＨ（例えば、約６、約６．５、約７、約７．５、または約８のｐＨ）で実行される。
【００２０】
一実施形態では、反応は、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、または約９のｐＨで実行される。別の実施形態では、反応は、約７．５から約９、約７．５から約８．５、約７．５から約８、約７．８から約９、約７．８から約８．５、約７．８から約８、約８から約９、約８から約８．５、または約８．５から約９のｐＨで実行される。別の実施形態では、反応は、約７．８のｐＨ（例えば、７．６から８．０のｐＨまたは７．７から７．９のｐＨ）で実行される。別の実施形態では、修飾反応は、約８のｐＨ（例えば、７．８から８．２のｐＨまたは７．９から８．１のｐＨ）で実行される。
【００２１】
別の実施形態では、反応は、７．５超であるｐＨで実行される（例えば、７．６から約９、７．７から約９、約７．８から約９、約７．９から約９、７．６から約８．５、７．６から約８、７．７から約８．５、７．７から約８、約７．８から約８．４、約７．８から約８．２、約８から約９、または約８から約８．５のｐＨ）。
【００２２】
一実施形態では、細胞結合剤を提供し、その後、細胞結合剤を細胞毒性剤と接触させて、細胞結合剤および細胞毒性剤を含む第１の混合物を形成し、その後、細胞結合剤および細胞毒性剤を含む第１の混合物を二官能性架橋剤と接触させることにより、接触は達成される。例えば、一実施形態では、細胞結合剤が反応器で提供され、細胞毒性剤が反応器に添加され（これにより、細胞結合剤と接触させる）、その後、二官能性架橋剤が、細胞結合剤および細胞毒性剤を含む混合物に添加される（これにより、細胞結合剤および細胞毒性剤を含む混合物を接触させる）。一実施形態では、細胞結合剤は反応器で提供され、容器に細胞結合剤を提供したすぐ後に、細胞毒性剤が反応器に添加される。別の実施形態では、細胞結合剤が反応器に提供され、容器へ細胞結合剤を提供することに続いて所定の時間間隔後に細胞毒性剤が反応器に添加される（例えば、スペースに細胞結合剤を提供した後、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約１日またはそれより長い）。細胞毒性剤は、急速に（つまり、約５分、約１０分のような短い時間間隔内）またはゆっくりと（例えば、ポンプを用いることにより）添加され得る。
【００２３】
細胞結合剤および細胞毒性剤を含む混合物は、その後、細胞結合剤を細胞毒性剤と接触させたすぐ後、または細胞結合剤を細胞毒性剤と接触させた後の少し後の時点（例えば、約５分から約８時間またはそれ以上）のいずれかで、二官能性架橋剤と接触され得る。例えば、一実施形態では、二官能性架橋剤が、細胞結合剤を含む反応器への細胞毒性剤の添加後すぐの、細胞結合剤および細胞毒性剤を含む混合物に添加される。代替的には、細胞結合剤および細胞毒性剤を含む混合物を、細胞毒性剤と細胞結合剤を接触させた後に、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、またはそれ以上長く、二官能性架橋剤と接触させ得る。
【００２４】
別の実施形態では、細胞毒性剤および二官能性剤は、複数のサイクル（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上のサイクル）により添加される。例えば、本発明は、ａ）細胞結合剤を細胞毒性剤と接触させて、細胞結合剤および細胞毒性剤を含む第１の混合物を形成し、その後、約４から約９のｐＨを有する溶液において、第１の混合物をリンカーを含む二官能性架橋剤と接触させて、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物（例えば、遊離細胞毒性剤および反応副生成物）を含む第２の混合物を提供し、細胞結合剤が細胞毒性剤にリンカーにより化学的に結合され、ｂ）第２の混合物を細胞毒性剤と接触させて、第３の混合物を形成し、その後、約４から約９のｐＨで、第３の混合物を二官能性架橋剤と接触させて、第４の混合物を提供し、ｃ）第４の混合物を精製して、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）に続いて所定の時間間隔後（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、またはそれ以上長く）に行われる。別の実施形態では、ステップｂ）は、ステップｃ）が行われる前に数回（例えば、１、２、３、４、またはそれ以上の回数）繰り返され得る。追加のステップｂ）が、最初のステップｂ）に続いて所定の時間間隔（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、またはそれ以上長く）後に行われ得る。
【００２５】
別の実施形態では、細胞毒性剤の全部の添加の前に、二官能性架橋剤が添加される。例えば、一実施形態では、細胞毒性剤が、所定の時間間隔にわたって（例えば、約５分、約１０分、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、またはそれ以上長期にわたって）連続的に細胞結合剤に添加されて、細胞結合剤および細胞毒性剤を含む混合物を形成する。細胞毒性剤の添加が完了する前に、二官能性架橋剤が、細胞結合剤および細胞毒性剤を含む混合物に添加され、ただし、いつでも、細胞毒性剤は、二官能性架橋剤のものを超えるモル濃度であることが条件である。一実施形態では、二官能性架橋剤は、所定の時間間隔にわたって（例えば約５分、約１０分、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、またはそれ以上長期にわたって）、連続的に添加される。
【００２６】
細胞結合剤および細胞毒性剤を含む混合物を二官能性架橋剤と接触させた後に、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、またはそれ以上長く（例えば、約３０時間、約３５時間、約４０時間、約４５時間、または約４８時間）の間、反応を進めることができる。
【００２７】
よって、一実施形態では、本発明は、細胞結合剤を細胞毒性剤と接触させて、細胞結合剤および細胞毒性剤を含む第１の混合物を形成し、その後、約４から約９のｐＨを有する溶液において、第１の混合物を、リンカーを含む二官能性架橋剤と接触させて、細胞毒性剤とリンカーにより化学的に結合された細胞結合剤を含む細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む第２の混合物を提供することと、（ｂ）イオン交換クロマトグラフィー膜に第２の混合物を供して、少なくとも不純物の一部を除去し、これにより、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートの精製された第２の混合物を提供することと、（ｃ）タンジェント流濾過、選択的析出、非吸着クロマトグラフィー、吸着濾過、吸着クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせに、ステップ（ｂ）の後の精製された第２の混合物を供して、不純物から細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートをさらに精製し、これにより、細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートの精製された第３の混合物を調製することとを含み、精製された第３の混合物が、精製された第２の混合物と比較して、低減された量の不純物を含む、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための方法を提供する。本明細書に記載されるあらゆる精製方法が、本発明の方法で使用され得る。好ましい実施形態では、タンジェント流濾過、吸着クロマトグラフィー、または非吸着クロマトグラフィーが、精製ステップとして利用される。
【００２８】
本発明の一実施形態では、細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させることが（つまり、修飾反応）、結合されたリンカーを有する細胞結合剤および１つまたはそれ以上の不純物（例えば、反応物および他の副産物）を含む第１の混合物を産生する。本発明のいくつかの実施形態では、第１の混合物は、安定におよび不安定に結合されたリンカーを有する細胞結合剤および１つまたはそれ以上の不純物（例えば、反応物および他の副産物）を含む。リンカーと細胞結合剤間の共有結合性の結合が、数カ月から数年の範囲であり得る、一定期間にわたる通常の保存条件下で、実質的に弱められずまたは切断されない場合に、リンカーが細胞結合剤に「安定」に結合される。対照的に、リンカーと細胞結合剤間の共有結合性の結合が、数カ月から数年の範囲であり得る、一定期間にわたる通常の保存条件下で、実質的に弱められまたは切断される場合に、リンカーが「不安定」に細胞結合剤に結合される。
【００２９】
修飾反応は、好ましくは、約４から約ｐＨ９のｐＨ（例えば、約４．５から約８．５、約５から約８、約５．５から約７．５、約６から約７、約６から約８、約６から約９、または約６．５から約７．５のｐＨ）で実行される。いくつかの実施形態では、修飾反応が、約６から約８のｐＨ（例えば、約６、約６．５、約７、約７．５、または約８のｐＨ）で実行される。
【００３０】
一実施形態では、修飾反応は、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、または約９のｐＨで実行される。別の実施形態では、修飾反応が、約７．５から約９、約７．５から約８．５、約７．５から約８、約７．８から約９、約７．８から約８．５、約７．８から約８、約８から約９、約８から約８．５、または約８．５から約９のｐＨで実行される。別の実施形態では、修飾反応が、約７．８のｐＨ（例えば、７．６から８．０のｐＨまたは７．７から７．９のｐＨ）で実行される。別の実施形態では、修飾反応は、約８のｐＨで実行される（例えば、７．８から８．２のｐＨまたは７．９から８．１のｐＨ）。
【００３１】
別の実施形態では、修飾反応が、７．５より高いｐＨ（例えば、７．６から約９、７．７から約９、約７．８から約９、約７．９から約９、７．６から約８．５、７．６から約８、７．７から約８．５、７．７から約８、約７．８から約８．４、約７．８から約８．２、約８から約９、または約８から約８．５のｐＨ）で実行される。例えば、発明の方法が、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９のｐＨを有する溶液における、細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させることを含む。
【００３２】
本発明の一実施形態では、修飾反応（例えば、反応物および副産物）中に産生された不純物からの修飾された細胞結合剤の精製は、修飾反応により産生される混合物（つまり、第１の混合物）を、精製方法に供することにより行われる。この点については、第１の混合物は、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）、例えば、膜によるタンジェント流濾過方法、非吸着クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、吸着濾過、もしくは選択的析出、またはあらゆる他の適切な精製方法、並びにこれらの組み合わせを用いて精製され得る。この第１の精製ステップは、精製された第１の混合物、つまり、本発明により、精製前の第１の混合物と比較して、結合されたリンカーを有する増加した濃度の細胞結合剤および減少した量の非結合性の二官能性架橋剤を提供する。好ましくは、第１の混合物は、タンジェント流濾過または吸着クロマトグラフィー（例えば、セラミックハイドロキシアパタイトのようなイオン交換クロマトグラフィー）を用いて精製される。
【００３３】
結合されたリンカーを有する細胞結合剤の精製された第１の混合物を得るための第１の混合物の精製後に、第２の混合物を形成するために、約４から約９のｐＨを有する溶液において、結合されたリンカーを有する細胞結合剤を細胞毒性剤と反応させることにより、第１の精製された混合物における、細胞毒性剤が、結合されたリンカーを有する細胞結合剤に結合され、細胞毒性剤にリンカーにより化学的に結合された細胞結合剤および１つまたはそれ以上の不純物（例えば、遊離細胞毒性剤および反応副生成物）を含む第２の混合物が産生される。
【００３４】
任意に、修飾された細胞結合剤の精製は、省略されることとしてもよい。よって、本発明の一実施形態では、結合されたリンカーを有する細胞結合剤並びに反応物および他の副産物を含む第１の混合物は、精製方法に供されない。そのような状況で、細胞毒性剤は、架橋剤と同時に、または少し後の時点、例えば、細胞結合剤への架橋剤の添加後１、２、３、またはそれ以上の時間で添加されることとしてもよい。修飾された細胞結合剤は、約４から約９のｐＨを有する溶液において、修飾された細胞結合剤を細胞毒性剤と反応させることにより、細胞毒性剤（例えば、マイタンシノイド）に結合され、結合ステップは、安定な細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲート、不安定な細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲート、非結合細胞毒性剤（つまり、「遊離」細胞毒性剤）、反応物、および副産物の混合物の形成をもたらす。
【００３５】
結合反応は、好ましくは、約４から約ｐＨ９のｐＨ（例えば、約４．５から約８．５、約５から約８、約５．５から約７．５、約６．０から約７、または約６．５から約７．５のｐＨ）で実行される。いくつかの実施形態では、結合反応は、約６から約６．５のｐＨ（例えば、５．５から７のｐＨ、５．７から６．８のｐＨ、５．８から６．７のｐＨ、５．９から６．６のｐＨ、または６から６．５のｐＨ）、約６もしくはそれ以下のｐＨ（例えば、約４から６、約４から約５．５、約５から６のｐＨ）または約６．５もしくはそれ以上のｐＨ（例えば、６．５から約９、約６．５から約７、約７から約９、約７．５から約９、または６．５から約８のｐＨ）で実行される。一実施形態では、結合反応は、約４のｐＨから６未満のｐＨまたは６．５超から９までのｐＨで実行される。結合ステップが、約６．５またはそれ以上のｐＨで実行される場合、いくつかのスルフヒドリル含有細胞毒性剤は、ジスルフィド結合形成によりダイマー化しやすい可能性がある。一実施形態では、反応混合物からの微量金属および／もしくは酸素の除去、並びに抗酸化剤の任意の添加もしくはより多くの反応性脱離基を有するリンカーの使用、または１超のアリコートにおける細胞毒性剤の添加は、そのような状況で、効率的な反応を可能にするために必要とされる可能性がある。
【００３６】
結合ステップに続いて、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物は、精製ステップに供される。この点については、結合混合物は、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）、例えば、膜によるタンジェント流濾過方法、非吸着クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、吸着濾過、もしくは選択的析出、またはあらゆる他の適切な精製方法、並びにこれらの組み合わせを用いて精製され得る。当業者は、結合ステップ後の精製が、細胞毒性剤に化学的に結合された細胞結合剤を含む精製されたコンジュゲートの単離を可能にし、精製ステップ前のコンジュゲートと比較して、コンジュゲートが低減された量の不純物を有することを理解するであろう。一実施形態では、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物が、精製前に、混合物から少なくとも不純物の一部を除去するために、結合ステップ後および精製ステップ前にイオン交換クロマトグラフィー膜に供される。別の実施形態では、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物が、精製の混合物に残る少なくとも不純物の一部を除去するために、精製ステップ後にイオン交換クロマトグラフィー膜に供される。
【００３７】
よって、一実施形態では、本発明は、細胞毒性剤に化学的に結合された細胞結合剤を含む、コンジュゲートを調製するための方法を提供し、当該方法は、修飾ステップ後の第１の精製ステップおよび結合ステップ後の第２の精製ステップを含み、方法が、第２の精製ステップの前または後のいずれかで、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供して、混合物から少なくとも不純物の一部を除去することを含む。一実施形態では、本発明は、細胞結合剤を二官能性架橋剤に接触させて、細胞結合剤にリンカーを共有結合的に付着させ、これにより、結合されたリンカーを有する細胞結合剤を含む第１の混合物を調製することと、（ｂ）タンジェント流濾過、選択的析出、非吸着クロマトグラフィー、吸着濾過、吸着クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせに第１の混合物を供して、これにより、結合されたリンカーを有する細胞結合剤の精製された第１の混合物を調製することと、（ｃ）約４から約９のｐＨを有する溶液において、細胞毒性剤と、結合されたリンカーを有する細胞結合剤を反応させることにより、精製された第１の混合物における結合されたリンカーを有する細胞結合剤に細胞毒性剤を結合させて、リンカーにより、細胞毒性剤に化学的に結合された細胞結合剤を含む細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む第２の混合物を調製することと、（ｄ）第２の混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供して、少なくとも不純物の一部を除去し、これにより、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートの精製された第２の混合物を提供することと、（ｅ）ステップ（ｄ）後の精製された第２の混合物を、タンジェント流濾過、選択的析出、非吸着クロマトグラフィー、吸着濾過、吸着クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせに供して、不純物から細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートをさらに精製し、これにより、細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートの精製された第３の混合物を調製し、精製された第３の混合物が、精製された第２の混合物と比較して低減された量の不純物を含む、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための方法を提供する。
【００３８】
本明細書に記載されるあらゆる精製方法が、本発明の方法で使用され得る。本発明の一実施形態では、タンジェント流濾過（ＴＦＦ、クロスフロー濾過、限外濾過、および透析濾過としても知られる）および／または吸着クロマトグラフィー樹脂が、精製ステップで利用される。例えば、本発明の方法は、修飾ステップ後のＴＦＦを用いる第１の精製ステップおよび結合ステップ後のＴＦＦを用いる第２の精製ステップを含み得る。代替的には、本発明の方法は、修飾ステップ後の吸着クロマトグラフィーを用いる第１の精製ステップおよび結合ステップ後の吸着クロマトグラフィーを用いる第２の精製ステップを含み得る。また、本発明の方法は、修飾ステップ後の吸着クロマトグラフィーを用いる第１の精製ステップおよび結合ステップ後のＴＦＦを用いる第２の精製ステップ、または修飾ステップ後のＴＦＦを用いる第１の精製ステップおよび結合ステップ後の吸着クロマトグラフィーを用いる第２の精製ステップを含み得る。
【００３９】
本発明の一実施形態では、非吸着クロマトグラフィーが、精製ステップとして利用される。例えば、本発明の方法が、修飾ステップ後の非吸着クロマトグラフィーを用いる第１の精製ステップおよび結合ステップ後の非吸着クロマトグラフィーを用いる第２の精製ステップを含み得る。
【００４０】
別の実施形態では、本発明は、細胞毒性剤に化学的に結合された細胞結合剤を含むコンジュゲートを調製するための方法を提供し、結合されたリンカーを有する細胞結合剤を含む第１の混合物が、修飾反応に続いておよび結合反応前に、精製に供されず、方法が、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供することを含む。修飾された細胞結合剤の精製が省略される場合、本発明は、細胞毒性剤に化学的に結合された細胞結合剤を含むコンジュゲートを調製するための方法を提供し、当該方法が、修飾ステップ、結合ステップ、および結合ステップ後の第１の精製ステップを含み、方法が、第１の精製ステップ前または後のいずれかで、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供して、混合物から少なくとも不純物の一部を除去することを含む。一実施形態では、本発明は、細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させて、リンカーを細胞結合剤に共有結合的に付着させ、これにより、結合されたリンカーを有する細胞結合剤を含む第１の混合物を調製することと、（ｂ）結合されたリンカーを有する細胞結合剤を細胞毒性剤と反応させることにより、第１の混合物における結合されたリンカーを有する細胞結合剤に細胞毒性剤を結合させて、細胞毒性剤とリンカーにより化学的に結合された細胞結合剤を含む細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む第２の混合物を調製することと、（ｃ）第２の混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供して、少なくとも不純物の一部を除去し、これにより、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートの精製された第２の混合物を提供することと、（ｄ）ステップ（ｃ）後の精製された第２の混合物を、タンジェント流濾過、選択的析出、非吸着クロマトグラフィー、吸着濾過、吸着クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせに供して、不純物から細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートをさらに精製し、これにより、細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートの精製された第３の混合物を調製することを含み、精製された第３の混合物は、精製された第２の混合物と比較して低減された量の不純物を含み、ステップ（ａ）で調製される、結合されたリンカーを有する細胞結合剤（並びに、反応物および他の副産物）を含む第１の混合物は、ステップ（ｂ）の前に精製方法に供されない、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための方法を提供する。本明細書に記載されるあらゆる精製方法が、結合反応に続く精製ステップとして使用され得る。好ましい実施形態では、タンジェント流濾過、吸着クロマトグラフィー、または非吸着クロマトグラフィーが、結合反応に続く精製ステップとして利用される。
【００４１】
一実施形態では、本発明は、細胞毒性剤に化学的に結合された細胞結合剤を含むコンジュゲートを調製するための方法を提供し、方法は、米国特許第６，４４１，１６３号並びに米国特許出願公開第２０１１／０００３９６９号および同第２００８／０１４５３７４号に記載されるように、予備形成された細胞毒性剤‐リンカー化合物を細胞結合剤と結合させることを含み、その後精製ステップが続き、方法は、精製ステップの前または後のいずれかで、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物を、イオン交換クロマトグラフィー膜に供することを含む。本明細書に記載されるあらゆる精製方法が、本発明の方法で使用され得る。好ましい実施形態では、タンジェント流濾過、吸着クロマトグラフィー、または非吸着クロマトグラフィーが、精製ステップとして利用される。
【００４２】
一実施形態では、細胞毒性剤‐リンカー化合物が、細胞毒性剤を、リンカーを含む二官能性架橋剤と接触させて、細胞毒性剤をリンカーに共有結合的に付着させることにより調製される。細胞毒性剤‐リンカー化合物は、任意に、細胞毒性剤‐リンカー化合物を細胞結合剤と接触させる前に、精製に供される。
【００４３】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載される本発明の方法は（例えば、ワンステップ方法）、結合ステップに続く、２つの別個の精製ステップを含む。本発明の方法が結合ステップに続く２つの別個の精製ステップを含む場合、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物が、精製ステップの両方またはいずれかの前に、または精製ステップに続いて、イオン交換クロマトグラフィー膜に供され得て、混合物から少なくとも不純物の一部を除去する。本明細書に記載されるあらゆる精製方法が、結合反応に続く精製ステップとして使用され得る。好ましい実施形態では、タンジェント流濾過、吸着クロマトグラフィー、非吸着クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせが、結合反応に続く精製ステップとして利用される。
【００４４】
一実施形態では、混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜（例えば、Ｑ膜またはＳ膜）に供する前に、混合物が精製に供される。一実施形態では、混合物を精製に供する前に、混合物がイオン交換クロマトグラフィー膜に供される。さらに別の実施形態では、混合物を精製に供する前および後に、混合物がイオン交換クロマトグラフィー膜に供される。別の実施形態では、混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供する前および後に、混合物が精製膜に供される。
【００４５】
ペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）タイプシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）、ザルトコンカセット（Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，  Ｅｄｇｅｗｏｏｄ，  ＮＹ）、およびセントラセット（Ｃｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ）タイプシステム（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，  Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，  ＮＹ）を含む、あらゆる適切なＴＦＦシステムが、精製のために利用されることとしてもよい。
【００４６】
あらゆる適切な吸着クロマトグラフィー樹脂が、精製のために利用されることとしてもよい。好ましい吸着クロマトグラフィー樹脂は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードイオン交換クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、色素リガンドクロマトグラフィー（ｄｙｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびこれらの組み合わせを含む。適切なハイドロキシアパタイト樹脂の例は、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ  Ｉ型およびＩＩ型、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）、ＨＡ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌハイドロキシアパタイト（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，  Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，  ＮＹ）、およびセラミックフルオロアパタイト（ＣＦＴ  Ｉ型およびＩＩ型、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を含む。適切なＨＣＩＣ樹脂の例は、ＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ樹脂（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，  Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，  ＮＹ）である。適切なＨＩＣ樹脂の例は、ブチル‐セファロース、ヘキシル‐セファロース（Ｈｅｘｙｌ−Ｓｅｐａｈａｒｏｓｅ）、フェニル‐セファロース、およびオクチル‐セファロース樹脂（すべて、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪより）、並びに、Ｍａｃｒｏ‐ｐｒｅｐメチルおよびＭａｃｒｏ‐Ｐｒｅｐ  ｔ‐ブチル樹脂（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を含む。適切なイオン交換樹脂の例は、ＳＰ‐セファロース、ＣＭ‐セファロース、およびＱ‐セファロース樹脂（すべて、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪより）、およびＵｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を含む。適切な混合モードイオン交換の例は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢｘ樹脂（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ  ＮＪ）を含む。適切なＩＭＡＣ樹脂の例は、キレート化セファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）およびＰｒｏｆｉｎｉｔｙ  ＩＭＡＣ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を含む。適切な色素リガンド樹脂の例は、ブルーセファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）およびＡｆｆｉ‐ｇｅｌ  Ｂｌｕｅ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を含む。適切なアフィニティ樹脂の例は、プロテインＡセファロース樹脂（例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ，  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を含み、細胞結合剤は抗体、およびレクチンアフィニティ樹脂、例えば、レンチル（Ｌｅｎｔｉｌ）レクチンセファロース樹脂であり（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）、細胞結合剤が、適切なレクチン結合部位を有する。代替的には、細胞結合剤に対して特異的な抗体��使用されることとしてもよい。このような抗体が、例えば、セファロース４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）に固定化され得る。適切な逆相樹脂の例は、Ｃ４、Ｃ８、およびＣ１８樹脂（Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ，  Ｈｅｓｐｅｒｉａ，  ＣＡ）を含む。
【００４７】
あらゆる適切な非吸着クロマトグラフィー樹脂が、精製のために利用されることとしてもよい。適切な非吸着クロマトグラフィー樹脂の例は、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ‐２５、Ｇ‐５０、Ｇ‐１００、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）樹脂（例えば、Ｓ‐２００およびＳ‐３００）、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）樹脂（例えば、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）７５およびＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００）、ＢＩＯ‐ＧＥＬ（登録商標）樹脂（例えば、Ｐ‐６、Ｐ‐１０、Ｐ‐３０、Ｐ‐６０、およびＰ‐１００）、および当業者に知られる他のものを含むが、これらに限定されない。
【００４８】
本発明の方法は、当該技術分野で知られるあらゆる適切な温度で本明細書に記載される反応（例えば、修飾反応、結合反応、またはワンステップ反応）を実行することを含む。例えば、反応は、約２０℃またはそれ以下（例えば、約−１０℃（ただし、例えば、細胞毒性剤および二官能性架橋剤を溶解するために使用される有機溶媒の存在により、溶液が凍結することを防止することが条件である）から約２０℃、約０℃から約１８℃、約４℃から約１６℃）、室温（例えば、約２０℃から約３０℃または約２０℃から約２５℃）、または高い温度（例えば、約３０℃から約３７℃）で生じ得る。一実施形態では、反応は、約１６℃から約２４℃（例えば、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、または約２５℃）の温度で生じる。
【００４９】
一実施形態では、本明細書に記載される本発明の方法は、あらゆる未反応の細胞毒性剤および／または未反応の二官能性架橋剤を急冷するための急冷ステップをさらに含む。急冷ステップが、細胞結合剤細胞毒性剤の精製前に実行される。代替的には、急冷ステップが、細胞結合剤（ｃｅｌｌ−ｂｉｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）細胞毒性剤の精製の後に実行される。一実施形態では、本発明の方法が、（ａ）細胞結合剤を細胞毒性剤と接触させて、細胞結合剤および細胞毒性剤を含む混合物を形成し、その後、約４から約９のｐＨを有する溶液において、リンカーを含む二官能性架橋剤と細胞結合剤および細胞毒性剤を含む混合物を接触させて、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび不純物（例えば、遊離細胞毒性剤および反応副生成物）を含む混合物を提供し、細胞結合剤が、細胞毒性剤に、リンカーにより化学的に結合されることと、（ｂ）細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供することと、（ｃ）ステップ（ｂ）後に混合物を急冷して、あらゆる未反応の細胞毒性剤および／または未反応の二官能性架橋剤を急冷することと、（ｄ）急冷した混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供することと、（ｅ）任意に、混合物を保持することと、（ｆ）任意に、混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供することと、（ｇ）混合物を精製して、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供することとを含む。別の実施形態では、本発明の方法は、（ａ）細胞結合剤を細胞毒性剤と接触させて、細胞結合剤および細胞毒性剤を含む混合物を形成し、その後、約４から約９のｐＨを有する溶液において、リンカーを含む二官能性架橋剤と細胞結合剤および細胞毒性剤を含む混合物を接触させて、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび不純物（例えば、遊離細胞毒性剤および反応副生成物）を含む混合物を提供し、細胞結合剤が細胞毒性剤とリンカーにより化学的に結合されることと、（ｂ）細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供することと、（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）後の混合物を急冷して、あらゆる未反応の細胞毒性剤および／または未反応の二官能性架橋剤を急冷することと、（ｄ）任意に、急冷した混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供することと、（ｅ）混合物を保持することと、（ｆ）混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供することと、（ｇ）混合物を精製して、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供することとを含む。
【００５０】
一実施形態では、急冷試薬と混合物を接触させることにより、混合物が急冷される。本明細書で使用されるように、「急冷試薬」は、遊離細胞毒性剤および／または二官能性架橋剤と反応する試薬を指す。
【００５１】
一実施形態では、４‐マレイミド酪酸、３‐マレイミドプロピオン酸、Ｎ‐エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、またはヨードアセトアミドプロピオン酸のようなマレイミドまたはハロアセトアミド急冷試薬が、細胞毒性剤におけるあらゆる未反応基（例えば、チオール）が急冷されることを確実にするために使用され得る。急冷ステップが、細胞毒性剤、特に未反応のチオール基を有する細胞毒性剤（例えば、ＤＭ１）のダイマー化の防止を補助し得る。ダイマー化した細胞毒性剤は、除去することが難しくなり得る。また、急冷ステップが、天然の抗体のジスルフィド基とのあらゆる望ましくないチオール‐ジスルフィド相互変換反応を最小化することとしてもよい。極性の帯電したチオール急冷試薬（例えば、４‐マレイミド酪酸または３‐マレイミドプロピオン酸）で急冷する際に、精製ステップ中に共有結合的に結合されたコンジュゲートから容易に分離され得る、極性の帯電した水溶性の付加体に、過剰な未反応の細胞毒性剤が、転換される。また、非極性の天然チオール急冷試薬により急冷することが使用され得る。
【００５２】
一実施形態では、混合物が、未反応の二官能性架橋剤と反応する急冷試薬と、混合物を接触させることにより急冷される。例えば、求核剤が、あらゆる未反応の二官能性架橋剤を急冷するために、混合物に添加され得る。求核剤は、好ましくは、リジン、タウリン、およびヒドロキシルアミンのような、求核剤を含むアミノ基である。
【００５３】
代替的には、混合物が、約５．０（例えば、４．８、４．９、５．０、５．１、または５．２）に混合物のｐＨを下げることにより急冷される。別の実施形態では、混合物が、６．０未満、５．５未満、５．０未満、４．８未満、４．６未満、４．４未満、４．２未満、４．０未満にｐＨを下げることにより急冷される。代替的には、ｐＨは、約４．０（例えば、３．８、３．９、４．０、４．１、または４．２）から約６．０（例えば、５．８、５．９、６．０、６．１、または６．２）、約４．０から約５．０、約４．５（例えば、４．３、４．４、４．５、４．６、または４．７）から約５．０に下げられる。一実施形態では、混合物は、混合物のｐＨを４．８に下げることにより急冷される。
【００５４】
好ましい実施形態では、急冷試薬と混合物を接触させる前に、反応（例えば、修飾ステップ、結合ステップ、またはワンステップ反応）を完了へと進めることが可能である。この点については、細胞結合剤および細胞毒性剤を含む混合物を二官能性架橋剤と接触させた後、約１時間から約４８時間（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、または約２５時間から約４８時間）で急冷試薬が混合物に添加される。
【００５５】
本発明の方法は、任意に、細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートの溶解性および回収率を増加させるために、反応ステップ（例えば、修飾ステップ、結合ステップ、またはワンステップ反応）にスクロースの添加を含むこととしてもよい。望ましくは、スクロースが、約０．１％（ｗ／ｖ）から約２０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）、１５％（ｗ／ｖ）、または２０％（ｗ／ｖ））の濃度で添加される。好ましくは、スクロースが、約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．５％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、約４％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）、約６％（ｗ／ｖ）、約７％（ｗ／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）、約９％（ｗ／ｖ）、約１０％）（ｗ／ｖ）、または約１１％（ｗ／ｖ））の濃度で添加される。また、反応ステップが、緩衝剤の添加も含み得る。当該技術分野で知られるあらゆる適切な緩衝剤が使用され得る。適切な緩衝剤は、例えば、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、およびリン酸緩衝液を含む。一実施形態では、緩衝剤は、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ‐（２‐ヒドロキシエチル）ピペラジン‐Ｎ’‐（２‐ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン‐１，４‐ビス‐（２‐ヒドロキシ‐プロパン‐スルホン酸）無水物）、ＨＥＰＥＳ（４‐（２‐ヒドロキシエチル）ピペラジン‐１‐エタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳ（ＥＰＰＳ）（４‐（２‐ヒドロキシエチル）ピペラジン‐１‐プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ‐［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］‐２‐アミノエタンスルホン酸）、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００５６】
一実施形態では、本発明の方法は、さらに、細胞結合剤から不安定な結合リンカーを放出するための、１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、または３の）保持ステップを含む。保持ステップは、結合されたリンカーを有する細胞結合剤への細胞毒性剤の結合後、および／または精製ステップ後に、二官能性架橋剤による細胞結合剤の修飾後の混合物を保持することを含む。保持ステップが、結合されたリンカーを有する細胞結合剤への細胞毒性剤の結合後、および／または結合ステップに続く精製ステップ後の混合物を保持することを含む場合、混合物は、保持ステップ前もしくは後、または両方で、イオン交換クロマトグラフィー膜に供され得る。一実施形態では、方法は、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物を、結合ステップ後の保持ステップに供することを含み、混合物は、保持ステップ後および精製ステップ前に、イオン交換クロマトグラフィー膜に供される。別の実施形態では、方法は、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物を、結合ステップ後の保持ステップに供することを含み、混合物は、保持ステップ後の精製ステップに供され、その後、混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供する。混合物は、任意に、混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供する前に、第２の保持ステップに供されることとしてもよい。
【００５７】
保持ステップは、細胞結合剤から安定な結合リンカーを実質的に放出せず、一方、細胞結合剤から不安定な結合リンカーを放出するために、適切な期間（例えば、約１時間から約１週間）、適切な温度（例えば、約２℃から約３７℃）で、溶液を維持することを含む。一実施形態では、保持ステップは、溶液を、低い温度（例えば、約２℃から約１０℃、または約４℃）で、室温で（例えば、約２０℃から約３０℃、または約２０℃から約２５℃）、または高い温度で（例えば、約３０℃から約３７℃）維持することを含む。
【００５８】
保持ステップの持続期間は、保持ステップが実行される温度による。例えば、保持ステップの持続期間は、高い温度で、保持ステップを実行することにより、実質的に低減し得、最大の温度は、細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートの安定性により限定される。保持ステップは、約１時間から約１日の間（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、または約２４時間）、約５時間から約１週間、約１２時間から約１週間（例えば、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、または約７日）、約１２時間から約１週間の間（例えば、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、または約７日）、または約１日から約１週間、溶液を維持することを含み得る。
【００５９】
一実施形態では、保持ステップは、少なくとも約１２時間から１日までの期間、約２℃から約８℃の温度で、溶液を維持することを含む。
【００６０】
保持ステップのｐＨの値は、好ましくは、約４から約９（例えば、約４．５から約８．５、または約５から約８）である。一実施形態では、保持ステップのｐＨの値は、約５から約７．５（例えば、約５．５から約７．５、約６から約７．５、約６．５から約７．５、約７から約７．５、約５から約７、約５から約６．５、約５から約５．５、約５．５から約７、約６から約６．５、または約６から約７）の範囲である。例えば、保持ステップのｐＨの値は、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、または約９であり得る。
【００６１】
保持ステップは、細胞結合剤を細胞毒性剤に結合する前または後に実行され得る。一実施形態では、保持ステップが、細胞結合剤を二官能性架橋剤で修飾後すぐに実行される。例えば、本発明の方法は、二官能性架橋剤による細胞結合剤の修飾後および結合前の、保持ステップを含む。細胞結合剤の修飾後に、精製ステップは、保持ステップ前および／または保持ステップ後であるが、結合ステップ前に、実行されることとしてもよい。別の実施形態では、保持ステップが、結合されたリンカーを有する細胞結合剤への細胞毒性剤の結合後すぐにおよび精製ステップ前に実行される。別の実施形態では、保持ステップが、結合および精製ステップ後に実行され、追加の精製ステップが続く。
【００６２】
具体的な実施形態では、保持ステップが、約２℃から約室温で、約１時間から約１週間の間、約５から７．５または約６．５から７．５のｐＨで、混合物をインキュベートすることを含み得る。
【００６３】
一実施形態では、本発明は、細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための方法を提供し、当該方法は、外因性のＮＨＳの添加を含む。本明細書で使用される「外因性のＮＨＳ」は、外部ソースから方法中に添加されるＮＨＳを指すが、二官能性リンカーの加水分解／アミノ分解の結果として、修飾反応中に生成されるＮＨＳを指さない。
【００６４】
一実施形態では、本発明は、細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲート調製するための方法を提供し、当該方法は、約０．１ｍＭから約３００ｍＭの外因性のＮＨＳの添加を含む。例えば、本発明の方法は、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．１ｍＭ、約１．３ｍＭ、約１．５ｍＭ、約１．７ｍＭ、約１．９ｍＭ、約２．０ｍＭ、約２．１ｍＭ、約２．３ｍＭ、約２．５ｍＭ、約２．７ｍＭ、約２．９ｍＭ、約３．０ｍＭ、約３．１ｍＭ、約３．３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約３．７ｍＭ、約３．９ｍＭ、約４．０ｍＭ、約４．１ｍＭ、約４．３ｍＭ、約４．５ｍＭ、約４．７ｍＭ、約４．９ｍＭ、約５．０ｍＭ、約５．１ｍＭ、約５．３ｍＭ、約５．５ｍＭ、約５．７ｍＭ、約５．９ｍＭ、約６．０ｍＭ、約６．１ｍＭ、約６．３ｍＭ、約６．５ｍＭ、約６．７ｍＭ、約６．９ｍＭ、約７．０ｍＭ、約７．１ｍＭ、約７．３ｍＭ、約７．５ｍＭ、約７．７ｍＭ、約７．９ｍＭ、約８．０ｍＭ、約８．１ｍＭ、約８．３ｍＭ、約８．５ｍＭ、約８．７ｍＭ、約８．９ｍＭ、約９．０ｍＭ、約９．１ｍＭ、約９．３ｍＭ、約９．５ｍＭ、約９．７ｍＭ、約９．９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２１０ｍＭ、約２２０ｍＭ、約２３０ｍＭ、約２４０ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２６０ｍＭ、約２７０ｍＭ、約２８０ｍＭ、約２９０ｍＭ、または約３００ｍＭの外因性のＮＨＳの添加を含む。一実施形態では、本発明の方法は、約０．１ｍＭから約５ｍＭ、約０．１ｍＭから約１０ｍＭ、約１．０ｍＭから約５ｍＭ、約１．０ｍＭから約１０ｍＭ、約５．０ｍＭから約１０ｍＭ、約１０ｍＭから約２０ｍＭ、約２０ｍＭから約３０ｍＭ、約３０ｍＭから約４０ｍＭ、約４０ｍＭから約５０ｍＭ、約５０ｍＭから約６０ｍＭ、約６０ｍＭから約７０ｍＭ、約７０ｍＭから約８０ｍＭ、約８０ｍＭから約９０ｍＭ、約９０ｍＭから約１００ｍＭ、約１００ｍＭから約１１０ｍＭ、約１１０ｍＭから約１２０ｍＭ、約１２０ｍＭから約１３０ｍＭ、約１３０ｍＭから約１４０ｍＭ、約１４０ｍＭから約１５０ｍＭ、約１５０ｍＭから約１６０ｍＭ、約１６０ｍＭから約１７０ｍＭ、約１７０ｍＭから約１８０ｍＭ、約１８０ｍＭから約１９０ｍＭ、約１９０ｍＭから約２００ｍＭ、約２００ｍＭから約２２０ｍＭ、約２２０ｍＭから約２４０ｍＭ、約２４０ｍＭから約２６０ｍＭ、約２６０ｍＭから約２８０ｍＭ、または約２８０ｍＭから約３００ｍＭの外因性のＮＨＳの添加を含む。別の実施形態では、本発明の方法は、約１０ｍＭから約２００ｍＭ、約２０から約１５０ｍＭ、約５０から約１５０ｍＭ、または約２０から約１００ｍＭの外因性のＮＨＳの添加を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、二官能性リンカーの加水分解／アミノ分解の結果として、修飾反応中に生成されたＮＨＳの量に対する、ある分子比の外因性のＮＨＳの添加を含む。当業者は、生成されたＮＨＳの量が、使用される二官能性リンカーの量と本質的に同じであるため、特定の修飾中に生成されたＮＨＳの量を測定し得る。当業者は、その後、修飾反応中に生成されたＮＨＳの量に対して、反応混合物に、ある分子比の外因性のＮＨＳを追加し得る。一実施形態では、修飾反応中に生成されたＮＨＳの量に対して、約２から約２００倍の外因性のＮＨＳが添加される。例えば、本発明の方法は、修飾反応中に生成されたＮＨＳの量に対して、約２、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約１００、または約２００倍の外因性のＮＨＳを添加することを含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、二官能性リンカーの量に対して、ある分子比の外因性のＮＨＳの添加を含む。一実施形態では、二官能性架橋剤に対する外因性のＮＨＳの分子比は、約０．５から約１０００（例えば、約１から約９００、約５から約７５０、約５０から約５００、約１００から約５００、約０．５から約５００、または約１００から約１０００）である。例えば、本発明の方法は、二官能性リンカーの量に対して、約０．５、約１、約２、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、または約１０００倍のＮＨＳを含む。
【００６７】
本発明の方法は、細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートを調製する方法中の任意の時点で、外因性のＮＨＳの添加を含む。例えば、本発明の方法は、修飾ステップへの（つまり、細胞結合剤を二官能性リンカーと反応させるステップ）、結合ステップへの（つまり、修飾された細胞結合剤を細胞毒性剤と反応させるステップ）、精製ステップへの、またはあらゆる前述のステップ間の保持ステップへの外因性のＮＨＳの添加を含む。一実施形態では、本発明の方法は、修飾ステップへの（つまり、ＮＨＳが修飾反応に添加される）、修飾ステップと精製ステップ間の保持ステップへの、修飾ステップと結合ステップ間の保持ステップへの、精製ステップへの、結合ステップへの、結合ステップと精製ステップ間の保持ステップへの、および／または２つの精製ステップ間の保持ステップへの、外因性のＮＨＳの添加を含む。
【００６８】
一実施形態では、本発明は、結合されたリンカーを有する細胞結合剤を調製するための方法を提供し、当該方法は、外因性のＮＨＳの存在下で、細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させて、細胞結合剤にリンカーを共有結合的に付着させ、これにより、結合されたリンカーを有する細胞結合剤を含む混合物を調製することを含む。
【００６９】
本発明は、細胞毒性剤に化学的に結合された細胞結合剤を含む安定したコンジュゲートの組成物を調製するための方法を提供し、組成物は、実質的に、不安定なコンジュゲートを含まない。この点で、本発明は、実質的に高純度かつ安定な細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための方法を提供する。このような組成物は、高純度かつ安定なコンジュゲートにより疾病を治療するために使用され得る。マイタンシノイドのような細胞毒性剤に化学的に結合された、抗体のような細胞結合剤を含む組成物が、例えば、米国特許第７，３７４，７６２号に記載される。本発明の一態様では、実質的に高純度の細胞結合剤‐細胞毒性剤コンジュゲートが、１つまたはそれ以上の以下の特徴を有する：（ａ）９０％超（例えば、約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％以上）、好ましくは約９５％超のコンジュゲートの種がモノマーであり、（ｂ）コンジュゲートの調製物または精製されたコンジュゲートにおける非コンジュゲートリンカーのレベルが約１０％未満（例えば、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０％以下）（総リンカーに対して）である、（ｃ）コンジュゲートの種の１０％未満が架橋され（例えば、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０％以下）、（ｄ）コンジュゲートの調製物または精製されたコンジュゲートにおける遊離細胞毒性剤のレベルが、約５％未満、約３％未満、約２％未満（例えば、約１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、または０％以下）（総細胞毒性剤に対して）である、（ｆ）コンジュゲートの調製物または精製されたコンジュゲートにおける細胞毒性ダイマー種のレベルが、約５％未満、約３％未満、約２％未満（例えば、約１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、または０％以下）（総細胞毒性剤に対して）および／または（ｅ）保存の際の遊離細胞毒性剤のレベルにおける実質的な増加がない（例えば、約１週間、約２週間、約３週間、約１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約１年、約２年、または約５年後に）。遊離細胞毒性剤のレベルにおける「実質的な増加」は、所定の保存時間後に、遊離細胞毒性剤のレベルにおける増加が、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、約２．２％、約２．５％、約２．７％、約３．０％、約３．２％、約３．５％、約３．７％、約４．０％未満であることを意味する。
【００７０】
本明細書で使用されるように、「非コンジュゲートリンカー」は、二官能性架橋剤と共有結合的に結合された細胞結合剤であって、細胞結合剤が、二官能性架橋剤のリンカーにより、細胞毒性剤と共有結合的に結合されていないものを指す（つまり、「非コンジュゲートリンカー」は、ＣＢＡ‐Ｌにより示され得、ＣＢＡは細胞結合剤を示し、Ｌは二官能性架橋剤を示す。対照的に、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートは、ＣＢＡ‐Ｌ‐Ｄにより示され得、Ｄは細胞毒性剤を示す）。
【００７１】
本明細書で使用されるように、用語「細胞毒性剤ダイマー」は、遊離細胞毒性剤を含むダイマーであって、細胞毒性剤が、リンカーにより細胞結合剤に化学的に結合されていないものを指す。一実施形態では、細胞毒性剤ダイマーが、リンカーにより互いに化学的に結合される（つまり、「細胞毒性剤ダイマー」は、Ｄ‐Ｌ‐Ｄにより示され得、Ｄは細胞毒性剤を示し、Ｌは二官能性架橋剤を示す。対照的に、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートは、ＣＢＡ‐Ｌ‐Ｄにより示され得、ＣＢＡは細胞結合剤を示す。）。別の実施形態では、細胞毒性剤ダイマーは、リンカーにより互いに化学的に結合されない（つまり、「細胞毒性剤ダイマー」が、Ｄ‐Ｄにより示され得、Ｄは細胞毒性剤を示す。対照的に、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートは、ＣＢＡ‐Ｌ‐Ｄにより示され得、ＣＢＡは細胞結合剤を示し、Ｌは二官能性架橋剤を示す。）。一実施形態では、いくつかの細胞毒性剤ダイマーは、リンカーにより互いに化学的に結合され、いくつかの細胞毒性剤ダイマーは、リンカーにより互いに化学的に結合されない（つまり、「細胞毒性剤ダイマー」は、Ｄ‐Ｌ‐ＤおよびＤ‐Ｄにより示され得、Ｄは細胞毒性剤を示し、Ｌは二官能性架橋剤を示す。）。
【００７２】
一実施形態では、細胞毒性剤ダイマーは、リンカーがＳＭＣＣであり、細胞毒性剤がＤＭ１である場合に、ＤＭ１‐ＤＭ１ダイマーおよびＤＭ１‐ＭＣＣ‐ＤＭ１ダイマーである。
【００７３】
【化１】
2015535215.tif 000002
【００７４】
別の実施形態では、細胞毒性剤ダイマーは、リンカーがＳＰＰであり、細胞毒性剤がＤＭ１である場合に、ＤＭ１‐ＤＭ１ダイマーおよびＤＭ１‐ＳＰＰ‐ＤＭ１ダイマーである。
【００７５】
【化２】
2015535215.tif 000003
【００７６】
別の実施形態では、細胞毒性剤ダイマーは、リンカーがＣＸ１‐１であり、細胞毒性剤がＤＭ１である場合に、ＤＭ１‐ＤＭ１ダイマーおよびＤＭ１‐ＣＸ１‐１‐ＤＭ１ダイマーである。
【００７７】
【化３】
2015535215.tif 000004
【００７８】
本明細書で使用されるように、用語「遊離細胞毒性剤」は、リンカーにより細胞結合剤に化学的に結合されない、あらゆる形態の細胞毒性剤を指す（つまり、「遊離細胞毒性剤」は、上述される、Ｄにより示される細胞毒性剤単体、Ｄ‐Ｌにより示されるリンカーまたはリンカーの誘導体（例えば、加水分解された誘導体）と結合された細胞毒性剤、およびＤ‐ＤおよびＤ‐Ｌ‐Ｄにより示される細胞毒性剤ダイマーを含み得るが、これらに限定されない。）。
【００７９】
一実施形態では、遊離細胞毒性剤は、ＤＭ１、ＭＣＣ‐ＤＭ１、ハイドロ‐ＳＭＣＣ‐ＤＭ１、ＳＭＣＣ‐ＤＭ１、ＤＭ１‐ＳＰＰ、ＤＭ１‐ＴＰＡ、ＤＭ１‐ＤＭ１、ＤＭ１‐ＭＣＣ‐ＤＭ１、およびＤＭ１‐ＳＰＰ‐ＤＭ１を含む。
【００８０】
【化４】
2015535215.tif 000005
【００８１】
【化５】
2015535215.tif 000006
【００８２】
【化６】
2015535215.tif 000007
【００８３】
別の実施形態では、遊離細胞毒性剤は、ＤＭ４、ＤＭ４‐スルホ‐ＳＰＤＢ、加水分解されたＤＭ４‐スルホ‐ＳＰＤＢ、ＤＭ４‐ＳＰＹ、およびＤＭ４‐スルホ‐ＴＢＡを含む。
【００８４】
【化７】
2015535215.tif 000008
【００８５】
【化８】
2015535215.tif 000009
【００８６】
本明細書で使用されるように、用語「細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートの凝集体」は、互いに共有結合的にまたは非共有結合的に結合された２つまたはそれ以上の細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを指す（例えば、リンカーにより共有結合的に結合された２つまたはそれ以上の細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲート）。
【００８７】
一実施形態では、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートにおける、細胞結合剤に対する細胞毒性剤の平均分子比は、約１から約１０、約２から約７、約３から約５、約２．５から約４．５（例えば、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５）、約３．０から約４．０、約３．２から約４．２、約４．５から５．５（例えば、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５）である。
【００８８】
細胞結合剤は、細胞、典型的におよび好ましくは動物細胞（例えば、ヒト細胞）に結合する、あらゆる適切な薬剤であり得る。好ましくは、細胞結合剤は、ペプチドまたはポリペプチドまたはグリコトープ（ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ）である。適切な細胞結合剤は、例えば、抗体（例えば、モノクローナル抗体およびそのフラグメント）、インターフェロン（例えば、アルファ、ベータ、ガンマ）、リンホカイン（例えば、インターロイキン２（ＩＬ‐２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ‐４）、インターロイキン６（ＩＬ‐６）、ホルモン（例えば、インスリン、ＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）、ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）、ステロイドホルモン、例えば、アンドロゲンおよびエストロゲン）、増殖因子およびコロニー刺激因子、例えば、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ‐アルファ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｇ‐ＣＳＦ、Ｍ‐ＣＳＦおよびＧＭ‐ＣＳＦ（Ｂｕｒｇｅｓｓ，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ５：  １５５−１５８  （１９８４））、栄養輸送分子（例えば、トランスフェリン）、ビタミン（例えば、葉酸）、並びに、あらゆる他の薬剤または細胞の表面で標的分子に特異的に結合する分子を含む。
【００８９】
細胞結合剤が抗体である場合、それは、ポリペプチドである抗原に結合し、膜貫通分子（例えば、レセプター）または増殖因子のようなリガンドであることとしてもよい。例示的な抗原は、レニンのような分子；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポプロテイン；アルファ‐１‐アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、ｖｍｃ因子（ｆａｃｔｏｒ  ｖｍｃ）、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、およびフォンヴィルブランド因子；抗凝固因子、例えば、プロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性物質；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型のプラスミノーゲン活性化因子（ｔ‐ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血性の増殖因子；腫瘍壊死因子‐アルファおよび‐ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化で調節され通常はＴ細胞で発現され分泌される）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ‐１‐アルファ）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質（Ｍｕｅｌｌｅｒｉａｎ‐ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン（ｐｒｏｒｅｌａｘｉｎ）；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、ベータ‐ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ‐４；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子についてのレセプター；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン‐３、‐４、‐５、もしくは‐６（ＮＴ‐３、ＮＴ４、ＮＴ‐５、またはＮＴ‐６）、または神経成長因子、例えば、ＮＧＦ‐β；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、例えば、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；線維芽細胞増殖因子レセプター、例えば、ＦＧＦＲ２／４およびＦＧＦＲ３、表皮増殖因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ‐アルファおよびＴＧＦ‐β１、ＴＧＦ‐β２、ＴＧＦ‐β３、ＴＧＦ‐β４、またはＴＧＦ‐β５を含むＴＧＦ‐ベータ；インスリン様増殖因子‐Ｉおよび‐ＩＩ（ＩＧＦ‐ＩおよびＩＧＦ‐ＩＩ）；ｄｅｓ（１‐３）‐ＩＧＦ‐Ｉ（脳ＩＧＦ‐Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ３、ＦＬＴ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＳＴＥＡＰ、ＣＥＡ、ＴＥＮＢ２、ＥｐｈＡレセプター、ＥｐｈＢレセプター、葉酸レセプター、ＦＯＬＲ１、メソテリン、クリプト（ｃｒｉｐｔｏ）、アルファｖベータ６、インテグリン、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、トランスフェリンレセプター、ＩＲＴＡ１、ＩＲＴＡ２、ＩＲＴＡ３、ＩＲＴＡ４、ＩＲＴＡ５；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２８、ＣＤ３０、Ｃ��３３、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１５２、または米国特許出願公開第２００８／０１７１０４０号または米国特許出願公開第２００８／０３０５０４４号に開示され、参照によりそれらの全体において組み込まれる１つまたはそれ以上の腫瘍関連の抗原または細胞表面レセプターに結合する抗体；エリスロポエチン；骨誘導因子（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ）；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロン‐アルファ、‐ベータ、および‐ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ‐ＣＳＦ、ＧＭ‐ＣＳＦ、およびＧ‐ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ‐１からＩＬ‐１０；スーパオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面の膜タンパク質；崩壊促進因子；例えば、ＨＩＶエンベロープの一部のようなウイルス性の抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ‐４、およびＶＣＡＭ；腫瘍関連の抗原、例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４レセプター；エンドグリン、ｃ‐Ｍｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、前立腺抗原、例えば、ＰＣＡ３、ＰＳＡ、ＰＳＧＲ、ＮＧＥＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＴＭＥＦＦ２、およびＳＴＥＡＰ１；ＬＧＲ５、Ｂ７Ｈ４、並びに上記に挙げられたあらゆるポリペプチドのフラグメントを含む。
【００９０】
さらに、骨髄系細胞に結合するＧＭ‐ＣＳＦは、急性骨髄性白血病由来の患部の細胞への細胞結合剤として使用され得る。活性化されたＴ細胞に結合するＩＬ‐２は、移植片対宿主病の予防および治療のための移植片拒絶の予防のために、並びに急性Ｔ細胞白血病の治療のために使用され得る。メラノサイトに結合するＭＳＨは、メラノーマに向けられる抗体が使用され得るように、メラノーマの治療のために使用され得る。葉酸は、卵巣および他の腫瘍で発現される葉酸レセプターを標的とするために使用され得る。表皮増殖因子は、肺および頭頸部のような扁平上皮の癌を標的にするために使用され得る。ソマトスタチンは、神経芽細胞腫および他の腫瘍タイプを標的とするために使用され得る。
【００９１】
胸部と精巣の癌が、成功的に、細胞結合剤としてのエストロゲン（またはエストロゲン類似体）またはアンドロゲン（またはアンドロゲン類似体）によりそれぞれ標的とされ得る。
【００９２】
本明細書で使用される、用語「抗体」は、あらゆる免疫グロブリン、あらゆる免疫グロブリンフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ、ｓＦｖ、低分子化抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、二重特異性抗体、三重特異性抗体（ｔｒｉｂｏｄｙ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）（Ｐａｒｈａｍ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３１  ：  ２８９５‐２９０２  （１９８３）；  Ｓｐｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１３：  ４７０−４７８  （１９７４）；  Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ８９：  ２３０‐２４４  （１９６０），  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，  ７：  ２４８６‐２４９７  （２００８），  Ｃａｒｔｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｓ．，  ６：  ３４３−３５７  （２００６））、または（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む）細胞の表面で抗原に結合し得る、免疫グロブリンキメラを指す。あらゆる適切な抗体が、細胞結合剤として使用され得る。当業者は、適切な抗体の選択は、標的とされる細胞群によることを理解するであろう。この点については、特定の細胞群（典型的におよび好ましくは患部の細胞群）で選択的に発現される細胞表面分子（つまり、抗原）のタイプおよび数が、本発明の組成物における使用についての適切な抗体の選択を決定するであろう。細胞表面発現のプロファイルは、腫瘍細胞タイプを含む、多種多様な細胞タイプについて知られており、または未知である場合には、通常の分子生物学および組織化学技術を用いて確定され得る。
【００９３】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得るが、最も好ましくはモノクローナル抗体である。本明細書で使用されるように、「ポリクローナル」抗体は、抗体分子の異種の群を指し、典型的には、免疫動物の血清に含まれる。「モノクローナル」抗体は、特定の抗原に特異的である抗体分子の同種の群を指す。モノクローナル抗体は、典型的には、Ｂリンパ球（「Ｂ細胞」）の単一クローンにより産生される。モノクローナル抗体は、スタンダードなハイブリドーマ技術を含む、当業者に知られる種々の技術を用いて得られることとしてもよい（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ５：  ５１１−５１９  （１９７６），  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （ｅｄｓ．），  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８８），  ａｎｄ  Ｃ．Ａ．  Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  （２００１）を参照）。簡潔には、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ方法は、典型的には、あらゆる適切な動物、典型的におよび好ましくはマウスに、抗原（つまり、「免疫原」）を注入することを含む。動物は、その後、殺処分され、脾臓から単離されたＢ細胞が、ヒト骨髄腫細胞により融合される。インビトロで、所望の特異性を有する高い力価の抗体を連続的に分泌し、かつ無期限に増殖する、ハイブリッド細胞が産生される（つまり、「ハイブリドーマ」）。当該技術分野で知られるあらゆる適切な方法が、所望の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を識別するために使用され得る。このような方法は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット分析、およびラジオイムノアッセイを含む。ハイブリドーマの個体群は、選別されて、個々のクローンに単離され、それぞれが、抗原に対する単一の抗体種を分泌する。それぞれのハイブリドーマは、単一のＢ細胞との融合由来のクローンであるため、それが産生する全ての抗体分子が、それらの抗原結合部位およびアイソタイプを含む構造において同じである。また、モノクローナル抗体は、ＥＢＶ‐ハイブリドーマ技術（例えば、Ｈａｓｋａｒｄ  ａｎｄ  Ａｒｃｈｅｒ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ７４（２）：  ３６１−６７  （１９８４）、およびＲｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １２１：  １４０−６７  （１９８６）を参照）、バクテリオファージベクター発現システム（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４６：  １２７５−８１  （１９８９）を参照）、またはＦａｂおよびｓｃＦｖ（単鎖可変領域）のような抗体フラグメントを含むファージディスプレイライブラリ（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号、および同第５，９６９，１０８号、並びに国際特許出願公開第９２／０１０４７号、および同第９９／０６５８７号を参照）を含む、他の適切な技術を用いて生成されることとしてもよい。
【００９４】
モノクローナル抗体は、あらゆる適切な動物から産生され、または単離され得るが、好ましくは哺乳類で、より好ましくはウスまたはヒト、および最も好ましくはヒトで産生される。マウスで抗体を産生するための方法は、当業者によく知られ、かつ本明細書に記載される。ヒト抗体に関しては、当業者は、ポリクローナル抗体が、適切な抗原で免疫されたまたはワクチン接種されたヒト対象の血清から単離され得ることを理解するであろう。代替的には、ヒト抗体が、マウスのような非ヒト動物においてヒト抗体を産生するための公知の技術を適合させることにより生成され得る（例えば、米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、および第５，７１４，３５２号、並びに米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６  Ａ１号を参照）。
【００９５】
ヒトにおける治療適用の理想的な選択であるが、ヒト抗体、特にヒトモノクローナル抗体は、典型的には、マウスモノクローナル抗体よりも生成することがより難しい。マウスモノクローナル抗体は、しかしながら、ヒトに投与される場合に、急速な宿主抗体反応を誘導し、これは、抗体‐細胞毒性剤コンジュゲートの治療上のまたは診断上の潜在能力を低減し得る。これらの厄介な問題を回避するために、好ましくは、モノクローナル抗体は、ヒト免疫システムにより「外来性」と認識されない。
【００９６】
この目的を達成するために、ファージディスプレイが、抗体を生成するために使用され得る。この点については、抗体の抗原結合可変（Ｖ）ドメインをコードするファージライブラリが、スタンダードな分子生物学および組換えＤＮＡ技術を用いて生成され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）を参照）。所望の特異性で可変領域をコードするファージが、所望の抗原に対する特異的な結合のために選択され、完全なヒト抗体が、選択された可変ドメインを含んで再構成される。再構成された抗体をコードする核酸配列が、モノクローナル抗体の特性を有するヒト抗体が細胞により分泌されるように、ハイブリドーマ産生のために使用される骨髄腫細胞のような適切な細胞株に導入される（例えば、上記Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．、上記Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、および米国特許第６，２６５，１５０号を参照）。代替的には、モノクローナル抗体が、特定のヒト重および軽鎖免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックであるマウスから生成され得る。このような方法は、当該技術分野で知られ、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号および同第５，５６９，８２５号、並びに上記Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．に記載される。
【００９７】
最も好ましくは、抗体はヒト化抗体である。本明細書で用いられるように、「ヒト化」抗体は、抗体の抗原結合ループ（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｏｏｐ）を形成するマウスモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ヒト抗体分子のフレームワークに移植されるものである。ヒトとマウス抗体のフレームワークの類似性のために、このアプローチが、ヒト抗体と抗原的に同一であるが、ＣＤＲ配列が由来するマウスモノクローナル抗体と同じ抗原に結合する、モノクローナル抗体を産生することが当該技術分野で一般的に受け入れられている。ヒト化抗体を生成するための方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、上記Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号、および同第５，６９３，７６１号、欧州特許第０２３９４００  Ｂ１号、並びにイギリス特許第２１８８６３８号に詳細に記載される。ヒト化抗体は、また、米国特許第５，６３９，６４１号、およびＰｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，  ２３５：  ９５９−９７３  （１９９４）に記載される、抗体リサーフェイシング技術を用いて生成され得る。本発明の組成物のコンジュゲートに採用される抗体は、最も好ましくは、ヒト化モノクローナル抗体であり、上記のようなヒトモノクローナル抗体およびマウスモノクローナル抗体もまた、本発明の範囲内である。
【００９８】
少なくとも１つの抗原結合部位を有し、よって、標的細胞の表面に存在する少なくとも１つの抗原またはレセプターを認識および結合する抗体フラグメントもまた、本発明の範囲内である。この点で、インタクトな抗体分子のタンパク質分解性の切断は、抗原を認識して結合するための性能を保持する、種々の抗体フラグメントを産生し得る。例えば、プロテアーゼのパパインによる抗体分子の限定消化は、典型的には、３つのフラグメントを産生し、そのうち２つが、同一であり、それらが親抗体分子の抗原結合性能を保持するので、Ｆａｂフラグメントとして言及される。酵素のペプシンによる抗体分子の切断は、通常、２つの抗体フラグメントを産生し、そのうち１つが、抗体分子の両方の抗原結合アームを保持し、よって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントとして言及される。ジチオスレイトールまたはメルカプトエチルアミンによるＦ（ａｂ’）２フラグメントの縮小は、Ｆａｂ’フラグメントとして言及される、フラグメントを産生する。合成ペプチドを介して軽抗体鎖のＶドメインに結合された抗体重鎖の可変（Ｖ）ドメインを含む、切断されたＦａｂフラグメントからなる単鎖可変領域フラグメント（ｓＦｖ）抗体フラグメントは、ルーチン的な組換えＤＮＡテクノロジー技術を用いて生成され得る（例えば、上記Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．を参照）。同様に、ジスルフィド安定化可変領域フラグメント（ｄｓＦｖ）が、組換えＤＮＡテクノロジーにより調製され得る（例えば、Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ７：  ６９７−７０４  （１９９４）を参照）。しかしながら、本発明に関連する抗体フラグメントは、これらの代表的なタイプの抗体フラグメントに限定されない。所望の細胞表面レセプターまたは抗原を認識しかつ結合する、あらゆる適切なフラグメントが採用され得る。抗体フラグメントは、さらに、例えば、Ｐａｒｈａｍ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １３１  ：  ２８９５‐２９０２  （１９８３）、Ｓｐｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １１３：  ４７０−４７８  （１９７４）、およびＮｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，  ８９：  ２３０‐２４４  （１９６０）に記載される。抗体‐抗原結合が、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降、および競合阻害アッセイ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）のような、当該技術分野で知られるあらゆる適切な方法を用いて分析され得る（例えば、上記Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．、および米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６  Ａ１号を参照）。
【００９９】
また、抗体は、キメラ抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。「キメラ」とは、抗体が、少なくとも２つの異なる種（例えば、マウス免疫グロブリン可変領域と組み合わされたヒト免疫グロブリン定常領域のような、２つの異なる免疫グロブリン）から得られまたは由来する、少なくとも２つの免疫グロブリンまたはそのフラグメントを含むことを意味する。また、抗体は、例えば、ラクダ類の抗体（例えば、Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ，  ３：  ７５２，  （１９９６）を参照）、または例えば新抗原レセプター（ＩｇＮＡＲ）のようなサメ類抗体のような、ドメイン抗体（ｄＡｂ）またはその抗原結合フラグメントであり得る（例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３７４：  １６８  （１９９５）、およびＳｔａｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３０５：  １７７０−１７７３  （２００４）を参照）。
【０１００】
あらゆる適切な抗体は、本発明に関連して使用され得る。例えば、モノクローナル抗体Ｊ５は、急性リンパ芽球性白血病共通抗原（ＣＡＬＬＡ）について特異的であるマウスＩｇＧ２ａ抗体であり（Ｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２８３：  ５８３−５８５  （１９８０））、ＣＡＬＬＡ（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）細胞を発現する標的細胞に使用され得る。モノクローナル抗体ＭＹ９は、ＣＤ３３抗原に特異的に結合するマウスＩｇＧｌ抗体であり（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓ．，  ８：  ５２１  （１９８４））、ＣＤ３３を発現する標的細胞（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞）に使用され得る。同様に、モノクローナル抗体の抗Ｂ４（Ｂ４としても言及される）は、Ｂ細胞上でＣＤ１９抗原と結合するマウスＩｇＧｌ抗体であり（Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３１  ：  ２４４‐２５０  （１９８３））、ＣＤ１９を発現するＢ細胞または患部の細胞（例えば、非ホジキンリンパ腫細胞および慢性リンパ芽球性白血病細胞）を標的とするのに使用され得る。Ｎ９０１は、薬物が神経内分泌の起源の細胞を標的とするようコンジュゲートにおいて使用され得る、肺小細胞腫瘍を含む、神経内分泌の起源の細胞にみられるＣＤ５６（神経細胞接着分子）抗原に結合するマウスモノクローナル抗体である。Ｊ５、ＭＹ９、およびＢ４抗体は、好ましくは、コンジュゲートの一部としてのそれらの使用の前に、リサーフェイス（ｒｅｓｕｒｆａｃｅ）されるまたはヒト化される。抗体のリサーフェイスまたはヒト化は、例えば、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９１  ：  ９６９−７３  （１９９４）に記載される。一実施形態では、抗Ｂ４抗体はｈｕＢ４である。別の実施形態では、抗Ｂ４抗体は、重鎖および軽鎖を含み、重鎖は以下の配列を有し、
ＱＶＱＬＶＱＰＧＡＥ  ＶＶＫＰＧＡＳＶＫＬ  ＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴ  ＳＮＷＭＨＷＶＫＱＡ  ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥ  ＩＤＰＳＤＳＹＴＮＹ  ＮＱＮＦＱＧＫＡＫＬ  ＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹ  ＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳ  ＮＰＹＹＹＡＭＤＹＷ  ＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ  ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ  ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ  ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰ  ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ  ＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ  ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰ  ＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰ  ＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳ  ＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ  ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡ  ＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ  ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴ  ＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ  ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡ  ＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳ  ＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱ  ＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ  ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣ  ＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩ  ＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰ  ＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ  ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹ  ＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ  ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶ  ＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴ  ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ  （配列番号１）
および軽鎖は以下の配列を有する
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＩ  ＭＳＡＳＰＧＥＲＶＴ  ＭＴＣＳＡＳＳＧＶＮ  ＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧ  ＴＳＰＲＲＷＩＹＤＴ  ＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲ  ＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹ  ＳＬＴＩＳＳＭＥＰＥ  ＤＡＡＴＹＹＣＨＱＲ  ＧＳＹＴＦＧＧＧＴＫ  ＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰ  ＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥ  ＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶ  ＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥ  ＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡ  ＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶ  ＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹ  ＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫ  ＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡ  ＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳ  ＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥ  Ｃ  （配列番号２）。
【０１０１】
また、モノクローナル抗体Ｃ２４２は、ＣａｎＡｇ抗原に結合し（例えば、米国特許第５，５５２，２９３号）、コンジュゲートが、結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、および胃癌のような、ＣａｎＡｇ発現腫瘍を標的とするために使用され得る。ＨｕＣ２４２は、モノクローナル抗体Ｃ２４２のヒト化形態である（例えば、米国特許第５，５５２，２９３号を参照）。ＨｕＣ２４２が産生されるハイブリドーマは、ＥＣＡＣＣ識別番号９００１２６０１で寄託されている。ＨｕＣ２４２は、ＣＤＲ‐移植方法論（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、および同第５，６９３，７６２号を参照）またはリサーフェイシング技術（例えば、米国特許第５，６３９，６４１号を参照）を用いて調製され得る。ＨｕＣ２４２は、コンジュゲートが、例えば、結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、および胃癌の細胞のような、ＣａｎＡｇ抗原を発現する腫瘍細胞を標的とするために使用され得る。
【０１０２】
卵巣癌および前立腺癌細胞を標的とするために、抗ＭＵＣ１抗体が、コンジュゲートにおける細胞結合剤として使用され得る。抗ＭＵＣ１抗体は、例えば、抗ＨＭＦＧ‐２（例えば、Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ２８：  １７‐２１  （１９８１）を参照）、ｈＣＴＭ０ｌ（例えば、ｖａｎ  Ｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５６：  ５１７９−５１８５  （１９９６）を参照）、およびＤＳ６を含む。前立腺癌細胞は、また、Ｊ５９１のような細胞結合剤として抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を用いることによりコンジュゲートで標的とされ得る（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５７：  ３６２９−３６３４  （１９９７）を参照）。さらに、乳癌、前立腺癌、および卵巣癌のようなＨｅｒ２抗原を発現する癌細胞が、細胞結合剤として、例えばトラスツズマブのような抗ＨＥＲ２抗体を使用することによりコンジュゲートで標的とされ得る。タイプＩＩＩ欠失突然変異体、ＥＧＦＰｖｖＩＩＩのような、表皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）およびその変異体を発現する細胞は、抗ＥＧＦＲ抗体を用いてコンジュゲートで標的とされ得る。抗ＥＧＦＲ抗体は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０５８３８５号および同第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０５８３７８号に記載される。抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、米国特許第７，７３６，６４４号および同第７，６２８，９８６号、並びに米国特許出願公開第２０１０／０１１１９７９号；同第２００９／０２４００３８号；同第２００９／０１７５８８７号；同第２００９／０１５６７９０号；および同第２００９／０１５５２８２号に記載される。米国特許第７，９８２，０２４号に記載されるもののような、インスリン様増殖因子レセプターに結合する抗ＩＧＦ‐ＩＲ抗体は、また、コンジュゲートで使用され得る。ＣＤ２７Ｌ、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＥｐｈＡ２、インテグリン、ＣＤ３７、葉酸、ＣＤ２０、ＰＳＧＲ、ＮＧＥＰ、ＰＳＣＡ、ＴＭＥＦＦ２、ＳＴＥＡＰ１、エンドグリン、およびＨｅｒ３に結合する抗体もまた、コンジュゲートで使用され得る。
【０１０３】
一実施形態では、抗体が、ｈｕＮ９０１、抗ＣＤ３３抗体（例えば、ｈｕＭｙ９‐６）、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ）、ビバツズマブ（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、リツキシマブ、ｈｕＤＳ６、（ＭＦ‐Ｔのような）国際特許出願公開第２０１０／１２４７９７号に記載される抗メソテリン抗体、（ｈｕＢ３Ｆ６のような）米国特許出願公開第２０１０／００９３９８０号に記載される抗クリプト（ｃｒｉｐｔｏ）抗体、（Ｂ‐Ｂ４またはヒト化Ｂ‐Ｂ４またはｎＢＴ０６２のような）米国特許出願公開第２００７／０１８３９７１号に記載される抗ＣＤ１３８抗体、（ＥＧＦＲ‐７のような）国際特許出願公開第２０１２／０５８５９２号および同第２０１２／０５８５８８号に記載される抗ＥＧＦＲ抗体、米国特許第７，７３６，６４４号、および同第７，６２８，９８６号、並びに米国特許出願公開第２０１０／０１１１９７９号、同第２００９／０２４００３８号、同第２００９／０１７５８８７号、同第２００９／０１５６７９０号、および同第２００９／０１５５２８２号に記載される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、（２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４のような）国際特許出願公開第２０１１／０３９７２１号、および同第２０１１／０３９７２４号に記載されるヒト化ＥｐｈＡ２抗体、（ｈｕ３８ＳＢ１９のような）国際特許出願公開第２００８／０４７２４２号に記載される抗ＣＤ３８抗体、国際特許出願公開第２０１１／１０６５２８号および米国特許出願公開第２０１２／０００９１８１号に記載される抗葉酸レセプター抗体（例えば、ｈｕＭｏｖｌ９バージョン１．０または１．６）、米国特許第５，９５８，８７２号、同第６，５９６，７４３号、および同第７，９８２，０２４号に記載される抗ＩＧＦ１Ｒ抗体、米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５３号に記載される抗ＣＤ３７抗体（例えば、ｈｕＣＤ３７‐３バージョン１．０）、米国特許出願公開第２００６／０１２７４０７号に記載される抗インテグリンανβ６抗体（例えば、ＣＮＴＯ９５）、および国際特許出願公開第２０１２／０１９０２４号に記載される抗Ｈｅｒ３抗体からなる群から選択される。本発明の一実施形態では、抗体はｈｕＮ９０１またはＣＮＴＯ９５ではない。一実施形態では、抗ＣＤ３７抗体はｈｕＣＤ３７‐３であり、抗体は可変重鎖および可変軽鎖を含み、可変重鎖は、以下の配列を有し、
ＱＶＱＶＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＴＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＴＳＧＶＳＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＤＧＳＴＮＹＨＰＳＬＫＳＲＬＳＩＫＫＤＨＳＫＳＱＶＦＬＫＬＮＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＹＣＡＫＧＧＹＳＬＡＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ  （配列番号３）
および、可変軽鎖は、以下の配列を有する
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＶＳＶＧＥＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＲＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＶＮＶＡＴＮＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＫＩＮＳＬＱＰＥＤＦＧＴＹＹＣＱＨＹＷＧＴＴＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ  （配列番号４）。
【０１０４】
細胞結合剤は、好ましくは抗体であるが、細胞結合剤は、また、非抗体分子であり得る。適切な非抗体分子は、例えば、インターフェロン（例えば、アルファ、ベータ、またはガンマインターフェロン）、リンホカイン（例えば、インターロイキン２（ＩＬ‐２）、ＩＬ‐３、ＩＬ‐４、またはＩＬ‐６）、ホルモン（例えば、インスリン）、増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ‐アルファ、ＦＧＦ、およびＶＥＧＦ）、コロニー刺激因子（例えば、Ｇ‐ＣＳＦ、Ｍ‐ＣＳＦ、およびＧＭ‐ＣＳＦ（例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，  ５：  １５５−１５８  （１９８４）を参照）、ソマトスタチン、およびトランスフェリン（例えば、Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６０：  ９３２‐９３７  （１９８５）を参照）を含む。例えば、骨髄系細胞に結合するＧＭ‐ＣＳＦは、急性骨髄性白血病細胞を標的とするための細胞結合剤として使用され得る。また、活性化されたＴ細胞に結合するＩＬ‐２は、移植片拒絶の防止のため、移植片対宿主病の防止および療法のため、急性Ｔ細胞白血病の治療のために使用され得る。表皮増殖因子（ＥＧＦ）が、肺癌および頭頸部癌のような扁平上皮の癌を標的とするために使用され得る。ソマトスタチンが、神経芽細胞腫の細胞および他の腫瘍の細胞タイプを標的とするために使用され得る。
【０１０５】
コンジュゲートは、あらゆる適切な細胞毒性剤を含み得る。本明細書で使用される「細胞毒性剤」は、細胞の死をもたらす、細胞死を誘導する、または細胞生存率を減少させる、あらゆる化合物を指す。適切な細胞毒性剤は、例えば、マイタンシノイドおよびマイタンシノイド類似体、タキソイド、ＣＣ‐１０６５およびＣＣ‐１０６５類似体、並びにドラスタチンおよびドラスタチン類似体を含む。本発明の好ましい実施形態では、細胞毒性剤は、マイタンシノールおよびマイタンシノール類似体を含む、マイタンシノイドである。マイタンシノイドは、微小管形成を阻害する化合物であり、哺乳類細胞に対して非常に毒性がある。適切なマイタンシノール類似体の例は、修飾された芳香環を有するもの、および他の位置での修飾を有するものを含む。このようなマイタンシノイドは、例えば、米国特許第４，２５６，７４６号、同第４，２９４，７５７号、同第４，３０７，０１６号、同第４，３１３，９４６号、同第４，３１５，９２９号、同第４，３２２，３４８号、同第４，３３１，５９８号、同第４，３６１，６５０号、同第４，３６２，６６３号、同第４，３６４，８６６号、同第４，４２４，２１９号、同第４，３７１，５３３号、同第４，４５０，２５４号、同第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号、および同第６，３３３，４１０号に記載される。
【０１０６】
修飾された芳香環を有するマイタンシノール類似体の例は、（１）Ｃ‐１９‐デクロロ（ｄｅｃｈｌｏｒｏ）（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサマイトシン（ａｎｓａｍｙｔｏｃｉｎ）Ｐ２のＬＡＨ縮小により調製される）、（２）Ｃ‐２０‐ヒドロキシ（またはＣ‐２０‐デメチル）＋／−Ｃ‐１９‐デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号および同第４，３０７，０１６号）（ストレプトマイセスまたはアクチノミセスを用いて脱メチル化、またはＬＡＨを用いる脱塩素反応により調製される）、並びに（３）Ｃ‐２０‐デメトキシ、Ｃ‐２０‐アシルオキシ（‐ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを用いてアシル化により調製される）を含む。
【０１０７】
芳香環以外の位置の修飾を有するマイタンシノール類似体の例は、（１）Ｃ‐９‐ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（Ｈ２ＳまたはＰ２Ｓ５とのマイタンシノールの反応により調製される）、（２）Ｃ‐１４‐アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）、（３）Ｃ‐１４‐ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（ノカルジアから調製される）、（４）Ｃ‐１５‐ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトマイセスによるマイタンシノールの変換により調製される）、（５）Ｃ‐１５‐メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号および同第４，３１５，９２９号）（トレウィアヌディフローラ（Ｔｒｅｗｉａ  ｎｕｄｉｆｌｏｒａ）から単離される）、（６）Ｃ‐１８‐Ｎ‐デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号および同第４，３２２，３４８号）（ストレプトマイセスによるマイタンシノールの脱メチル化により調製される）、および（７）４，５‐デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（マイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ縮小により調製される）を含む。
【０１０８】
本発明の好ましい実施形態では、コンジュゲートが、細胞毒性剤として、Ｎ２’‐デアセチル‐Ｎ２’‐（３‐メルカプト‐１‐オキソプロピル）‐マイタンシンとしても知られる、チオール含有マイタンシノイドＤＭ１を利用する。ＤＭ１の構造は、式（Ｉ）により表される。
【０１０９】
【化９】
2015535215.tif 000010
【０１１０】
本発明の別の好ましい実施形態では、コンジュゲートは、細胞毒性剤として、Ｎ２’‐デアセチル‐Ｎ２’‐（４‐メチル‐４‐メルカプト‐１‐オキソペンチル（ｏｘｏｐｅｎｔｙｌ））‐マイタンシンとしても知られるチオール含有マイタンシノイドＤＭ４を利用する。ＤＭ４の構造は、式（ＩＩ）により表される。
【０１１１】
【化１０】
2015535215.tif 000011
【０１１２】
他のマイタンシンが、例えば、硫黄原子を持つ炭素原子でモノまたはジ‐アルキル置換を持つジスルフィドおよびチオール含有のマイタンシノイドを含み、本発明に関連して使用されることとしてもよい。特に好ましいのは、Ｃ‐３位置に（ａ）Ｃ‐１４ヒドロキシメチル、Ｃ‐１５ヒドロキシ、またはＣ‐２０デスメチルの官能性、および（ｂ）ヒンダードスルフヒドリル基を持つアシル基を有するアシル化されたアミノ酸側鎖を有するマイタンシノイドであって、チオールの官能性を持つアシル基の炭素原子が、１つまたは２つの置換基を有し、前記の置換基は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０の炭素原子を有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキルもしくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであって、さらに、置換基の１つがＨであり得、アシル基が、カルボニル官能性と硫黄原子間で、少なくとも３つの炭素原子の直鎖長さを有する。
【０１１３】
本発明に関連する使用のための追加のマイタンシンは、式（ＩＩＩ）により表される化合物を含み、
【０１１４】
【化１１】
2015535215.tif 000012
【０１１５】
式中、Ｙ’は、
（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡｏ（ＣＲ５Ｒ６）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれが独立してＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０の炭素原子を有する直鎖状のアルキルもしくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝鎖状もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、Ｒ２はまたＨであり得、
Ａ、Ｂ、Ｄは３から１０の炭素原子を有するシクロアルケニルまたはシクロアルキル、単純なもしくは置換されたアリール、または複素環芳香族、またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２は、それぞれが独立してＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０の炭素原子を有する直鎖状のアルキルもしくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝鎖状もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニルもしくは複素環芳香族、またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、およびｔは、それぞれが独立して、１から５の整数またはゼロであり、ただし、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、およびｔの少なくとも２つが常にゼロではないことが条件であり、ＺはＨ、ＳＲ、またはＣＯＲであり、Ｒは１から１０の炭素原子を有する直鎖状のアルキルもしくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝鎖状もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、または単純なもしくは置換されたアリールもしくは複素環芳香族、またはヘテロシクロアルキルラジカルである。
【０１１６】
式（ＩＩＩ）の好ましい実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物を含み、式中、（ａ）Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、およびＺがＨであり、（ｂ）Ｒ１およびＲ２がメチルであり、並びにＺがＨであり、（ｃ）Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、およびＺが‐ＳＣＨ３であり、並びに（ｄ）Ｒ１およびＲ２がメチルであり、並びにＺが‐ＳＣＨ３である。
【０１１７】
また、このような追加のマイタンシンが、式（ＩＶ‐Ｌ）、（ＩＶ‐Ｄ）、または（ＩＶ‐Ｄ，Ｌ）で表される化合物を含む。
【０１１８】
【化１２】
2015535215.tif 000013
【０１１９】
式中、Ｙは、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれが独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０の炭素原子を有する直鎖状のアルキル、もしくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝鎖状もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、または複素環芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
Ｒ２はまたＨであり得、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、それぞれが独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０の炭素原子を有する直鎖状のアルキルもしくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝鎖状もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、または複素環芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ｌ、ｍ、およびｎは、それぞれが独立して、１から５の整数であり、さらに、ｎはゼロであり得、
ＺはＨ、ＳＲ、またはＣＯＲであり、Ｒは、１から１０の炭素原子を有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキルもしくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する環状のアルキルもしくはアルケニル、または単純なもしくは置換されたアリールもしくは複素環芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
Ｍａｙは、Ｃ‐３、Ｃ‐１４、ヒドロキシメチル、Ｃ‐１５ヒドロキシ、またはＣ‐２０デスメチルで、側鎖を持つマイタンシノイドを表す。
【０１２０】
式（ＩＶ‐Ｌ）、（ＩＶ‐Ｄ）、および（ＩＶ‐Ｄ，Ｌ）の好ましい実施形態は、式（ＩＶ‐Ｌ）、（ＩＶ‐Ｄ）、および（ＩＶ‐Ｄ，Ｌ）の化合物を含み、式中、（ａ）Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、並びにＺがＨであり、（ｂ）Ｒ１およびＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍが１であり、ｎが０であり、並びにＺがＨであり、（ｃ）Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、およびＺが‐ＳＣＨ３であり、または（ｄ）Ｒ１およびＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍが１であり、ｎが０であり、並びにＺが‐ＳＣＨ３である。
【０１２１】
好ましくは、細胞毒性剤が式（ＩＶ‐Ｌ）により表される。
【０１２２】
追加の好ましいマイタンシンは、また、式（Ｖ）により表される化合物を含み、
【０１２３】
【化１３】
2015535215.tif 000014
【０１２４】
式中、Ｙは、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれが独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０の炭素原子を有する直鎖状のアルキル、もしくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝鎖状もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
Ｒ２はまたＨであり得、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、それぞれが独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０の炭素原子を有する直鎖状のアルキルもしくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝鎖状もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、または複素環芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ｌ、ｍ、およびｎは、それぞれが独立して、１から５の整数であり、さらに、ｎはゼロであり得、
ＺはＨ、ＳＲ、またはＣＯＲであり、Ｒは、１から１０の炭素原子を有する直鎖状のアルキルもしくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝鎖状もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、または単純なもしくは置換されたアリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルである。
【０１２５】
式（Ｖ）の好ましい実施形態は、式（Ｖ）の化合物を含み、式中、（ａ）Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、並びにＺがＨであり、（ｂ）Ｒ１およびＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍが１であり、ｎが０であり、並びにＺがＨであり、（ｃ）Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、およびＺが‐ＳＣＨ３であり、または（ｄ）Ｒ１およびＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍが１であり、ｎが０であり、並びにＺが‐ＳＣＨ３である。
【０１２６】
またさらに好ましいマイタンシンは、式（ＶＩ‐Ｌ）、（ＶＩ‐Ｄ）、または（ＶＩ‐Ｄ，Ｌ）で表される化合物を含む。
【０１２７】
【化１４】
2015535215.tif 000015
【０１２８】
式中、Ｙ２は、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれが独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０の炭素原子を有する直鎖状のアルキルもしくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝鎖状もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、Ｒ２はまたＨであり得、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、それぞれが独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０の炭素原子を有する直鎖状  環状のアルキルもしくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝鎖状もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニルまたは複素環芳香族、またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ｌ、ｍ、およびｎは、それぞれが独立して、１から５の整数であり、さらに、ｎはゼロであり得、
Ｚ２はＳＲまたはＣＯＲであり、Ｒは、１から１０の炭素原子を有する直鎖状のアルキルもしくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝鎖状もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、または単純なもしくは置換されたアリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
Ｍａｙはマイタンシノイドである。
【０１２９】
追加の好ましいマイタンシンは、式（ＶＩＩ）により表される化合物を含み、
【０１３０】
【化１５】
2015535215.tif 000016
【０１３１】
式中、Ｙ２’は、
（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡｏ（ＣＲ５Ｒ６）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれが独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０の炭素原子を有する直鎖状  分枝鎖状のアルキルもしくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、また、Ｒ２はＨであり得、
Ａ、Ｂ、およびＤは、それぞれが独立して３から１０の炭素原子を有するシクロアルケニルまたはシクロアルキル、単純なもしくは置換されたアリール、または複素環芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２は、それぞれが独立してＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０の炭素原子を有する直鎖状のアルキルもしくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝鎖状もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、およびｔは、それぞれが独立して、１から５の整数またはゼロであり、ただし、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、およびｔの少なくとも２つが常にゼロではないことが条件であり、Ｚ２はＳＲまたは‐ＣＯＲであり、Ｒは１から１０の炭素原子を有する直鎖状のアルキルもしくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝鎖状もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、または単純なもしくは置換されたアリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルである。
【０１３２】
式（ＶＩＩ）の好ましい実施形態は、式（ＶＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ１はＨであり、Ｒ２はメチルである。
【０１３３】
マイタンシノイドに加えて、コンジュゲートにおいて使用される細胞毒性剤は、タキサンまたはその誘導体であり得る。タキサンは、ともに癌の治療に広く使用される、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））（細胞毒性自然産物）、およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））（半合成の誘導体）を含む化合物のファミリーである。タキサンは、チューブリンの脱重合を阻害し、細胞死をもたらす紡錘体阻害剤である。ドセタキセルおよびパクリタキセルは、癌の治療において有用な薬剤であるが、それらの抗腫瘍活性は、正常な細胞への非特異的な毒性のため制限される。さらに、パクリタキセルおよびドセタキセルのような化合物は、それら自体、細胞結合剤のコンジュゲートにおいて使用されるのに十分な効能がない。
【０１３４】
細胞毒性コンジュゲートの調製における使用のための好ましいタキサンは、式（ＶＩＩＩ）のタキサンである。
【０１３５】
【化１６】
2015535215.tif 000017
【０１３６】
抗体のような細胞結合剤にタキサンを結合するための方法に加えて、本発明に関連して使用され得るタキサンを合成するための方法は、米国特許第５，４１６，０６４号、同第５，４７５，０９２号、同第６，３４０，７０１号、同第６，３７２，７３８号、同第６，４３６，９３１号、同第６，５９６，７５７号、同第６，７０６，７０８号、同第６，７１６，８２１号、および同第７，３９０，８９８号に、詳細に記載される。
【０１３７】
細胞毒性剤は、また、ＣＣ‐１０６５またはその誘導体であり得る。ＣＣ‐１０６５は、ストレプトマイセスゼレンシスの培養液から単離された効能のある抗腫瘍抗生物質である。ＣＣ‐１０６５は、インビトロで、ドキソルビシン、メトトレキサート、およびビンクリスチンのような一般的に使用される抗癌剤よりも約１０００倍効能がある（Ｂｈｕｙａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ４２：  ３５３２‐３５３７  （１９８２））。ＣＣ‐１０６５およびその類似体は、米国特許第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号、同第６，３４０，７０１号、および同第６，３７２，７３８号に開示されている。ＣＣ‐１０６５の細胞毒性効力は、そのアルキル化活性およびそのＤＮＡ結合またはＤＮＡインターカレート活性と関連している。これらの２つの活性は、分子の別個の部分に帰する。この点で、アルキル化活性が、シクロプロパピロロインドール（ＣＰＩ）サブユニットに含まれ、ＤＮＡ結合活性は、ＣＣ‐１０６５の２つのピロロインドールサブユニットに帰する。
【０１３８】
いくつかのＣＣ‐１０６５類似体が当該技術分野で知られ、また、コンジュゲートにおける細胞毒性剤として使用され得る（例えば、Ｗａｒｐｅｈｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ３１：  ５９０−６０３  （１９８８）を参照。）。一連のＣＣ‐１０６５類似体が開発され、ＣＰＩ部分がシクロプロパベンズインドール（ＣＢＩ）部分により置換される（Ｂｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ５５：  ５８２３−５８３３  （１９９０）、およびＢｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １：  １１５−１２０  （１９９１））。これらのＣＣ‐１０６５類似体は、マウスにおける遅延毒性を生じさせることなく、親薬物の高いインビトロ効能を維持する。ＣＣ‐１０６５のように、これらの化合物は、ＤＮＡの副溝に共有結合的に結合して細胞死を生じさせる、アルキル化薬剤である。
【０１３９】
ＣＣ‐１０６５類似体の治療上の有効性は、非標的化組織へのより低い毒性、したがって、より低い全身毒性をもたらす、腫瘍部位への標的化された送達によってインビボでの分布を変化させることにより大幅に向上され得る。この目的を達成するために、腫瘍細胞を特異的に標的とする細胞結合剤を有するＣＣ‐１０６５の類似体および誘導体のコンジュゲートが生成された（例えば、米国特許第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、および同第５，８４６，５４５号を参照。）。これらのコンジュゲートは、典型的には、インビトロでの高い標的特異性の細胞毒性、およびマウスにおけるヒト腫瘍異種移植モデルにおける抗腫瘍活性を示す（例えば、Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５５：  ４０７９−４０８４  （１９９５）を参照）。
【０１４０】
ＣＣ‐１０６５類似体を合成するための方法は、米国特許第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号、同第６，５３４，６６０号、同第６，５８６，６１８号、同第６，７５６，３９７号、および同第７，３２９，７６０号に詳細に記載される。
【０１４１】
また、メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、カリケアマイシン、チューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）およびチューブリシン類似体、デュオカルマイシンおよびデュオカルマイシン類似体、ドラスタチンおよびドラスタチン類似体のような薬物が、本発明の細胞毒性剤として使用され得る。ドキソルビシン（ｄｏｘａｒｕｂｉｃｉｎ）およびダウノルビシン化合物（例えば、米国特許第６，６３０，５７９号を参照）が、また、細胞毒性剤として使用され得る。
【０１４２】
細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートは、インビトロでの方法により調製されることとしてもよい。細胞毒性剤を抗体に連結するために、連結基が使用される。適切な連結基は、当該技術分野でよく知られ、ジスルフィド基、酸不安定性基、感光性基（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ  ｇｒｏｕｐ）、ペプチダーゼ不安定性基（ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｌａｂｉｌｅ  ｇｒｏｕｐ）、およびエステラーゼ不安定性基（ｅｓｔｅｒａｓｅ  ｌａｂｉｌｅ  ｇｒｏｕｐ）、並びに切断不可能な連結基（ｎｏｎｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｌｉｎｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）を含む。
【０１４３】
本発明によれば、細胞結合剤は、二官能性架橋剤を細胞結合剤と反応させることにより修飾され、これにより、細胞結合剤へのリンカー分子の共有結合性付着をもたらす。本明細書で使用されるように、「二官能性架橋剤」は、２つの反応基を持つ試薬を指し、そのうち１つは細胞結合剤との反応を可能にし、一方、他の１つは、細胞毒性剤との反応を可能にして、細胞結合剤を細胞毒性剤と連結させ、これにより、コンジュゲートを形成する。
【０１４４】
リンカー試薬が、許容可能な毒性プロファイルを提供しながら、それぞれ、細胞毒性剤および細胞結合剤の治療特性、例えば、細胞毒性、並びに標的特性を提供する限り、あらゆる適切な二官能性架橋剤が本発明に関連して使用され得る。好ましくは、リンカー分子は、化学的結合により（上記のような）、細胞毒性剤を細胞結合剤と結合させて、細胞毒性剤と細胞結合剤が互いに化学的に結合される（例えば、共有結合的に結合される）。
【０１４５】
一実施形態では、細胞結合薬剤は、ジスルフィド結合、酸不安定性結合、感光性結合、ペプチダーゼ不安定性結合、およびエステラーゼ不安定性結合からなる群から選択される化学結合を介して細胞毒性剤に化学的に結合される。
【０１４６】
一実施形態では、二官能性架橋剤は、切断不可能なリンカーを含む。切断不可能なリンカーは、マイタンシノイド、タキサン、またはＣＣ‐１０６５類似体のような、細胞毒性剤を、安定な共有結合性の方法で、細胞結合剤に連結することを可能にする、あらゆる化学的部分である。よって、切断不可能なリンカーは、実質的に、細胞毒性剤または細胞結合剤が活性を保持する条件下で、酸誘導切断（ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ）、光誘導切断（ｌｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ）、ペプチダーゼ誘導切断（ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ）、エステラーゼ誘導切断（ｅｓｔｅｒａｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ）、およびジスルフィド結合切断に耐性がある。
【０１４７】
細胞毒性剤および細胞結合剤間に切断不可能なリンカーを形成する適切な架橋剤は、当該技術分野でよく知られている。一実施形態では、細胞毒性剤は、チオエーテル結合により細胞結合剤に化学的に結合される。別の実施形態では、細胞毒性剤は、アミド結合により細胞結合剤に連結される。切断不可能なリンカーの例は、細胞毒性剤との反応のためのマレイミド系の部分またはハロアセチル系の部分を有するリンカーを含む。このような二官能性架橋剤は、当該技術分野でよく知られており（米国特許出願公開第２０１０／０１２９３１４号、同第２００９／０２７４７１３号、同第２００８／００５０３１０号、同第２００５／０１６９９３３号、およびＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．  Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  １１７，  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，  ＩＬ  ６１１０５，  ＵＳＡを参照。）、Ｎ‐スクシンイミジル４‐（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣの「長鎖」類似体であるＮ‐スクシンイミジル‐４‐（Ｎ‐マレイミドメチル）‐シクロヘキサン‐１‐カルボキシ‐（６‐アミドカプロン酸エステル（ａｍｉｄｏｃａｐｒｏａｔｅ））（ＬＣ‐ＳＭＣＣ）、κ‐マレイミドウンデカン酸Ｎ‐スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ‐マレイミド酪酸Ｎ‐スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε‐マレイミドカプロン酸Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ‐マレイミドベンゾイル‐Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ‐（α‐マレイミドアセトキシ）‐スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル‐６‐（β‐マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ‐スクシンイミジル４‐（ｐ‐マレイミドフェニル）‐ブチラート（ＳＭＰＢ）、およびＮ‐（ｐ‐マレイミドフェニル）イソシアナート（ＰＭＰＩ）を含むがこれらに限定されない。ハロアセチル系の部分を含む架橋試薬は、Ｎ‐スクシンイミジル‐４‐（ヨードアセチル）‐アミノ安息香酸エステル（ＳＩＡＢ）、Ｎ‐スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ‐スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）、Ｎ‐スクシンイミジル３‐（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、ビス‐マレイミドポリエチレングリコール（ＢＭＰＥＯ）、ＢＭ（ＰＥＯ）２、ＢＭ（ＰＥＯ）３、Ｎ‐（β‐マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、５‐マレイミド吉草酸ＮＨＳ、ＨＢＶＳ、４‐（４‐Ｎ‐マレイミドフェニル）‐酪酸ヒドラジド・ＨＣｌ（ＭＰＢＨ）、スクシンイミジル‐（４‐ビニルスルホニル）安息香酸エステル（ＳＶＳＢ）、ジチオビス‐マレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、１，４‐ビス‐マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４ビスマレイミジル‐２，３‐ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ビス‐マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビス‐マレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、スルホスクシンイミジル４‐（Ｎ‐マレイミド‐メチル）シクロヘキサン‐１‐カルボキシレート（スルホ‐ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル（４‐ヨード‐アセチル）アミノ安息香酸エステル（スルホ‐ＳＩＡＢ）、ｍ‐マレイミドベンゾイル‐Ｎ‐ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ‐ＭＢＳ）、Ｎ‐（ｙ‐マレイミドブチルオキシ（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｒｙｌｏｘｙ））スルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｄｅ）エステル（スルホ‐ＧＭＢＳ）、Ν‐（ε‐マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｍｉｄｏ）エステル（スルホ‐ＥＭＣＳ）、Ν‐（κ‐マレイミドウンデカノイルオキシ（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｕｎｄｅｃａｎｏｙｌｏｘｙ））スルホスクシンイミドエステル（スルホ‐ＫＭＵＳ）、スルホスクシンイミジル４‐（ｐ‐マレイミドフェニル）ブチラート（スルホ‐ＳＭＰＢ）、ＣＸ１‐１、スルホ‐Ｍａｌ、およびＰＥＧｎ‐Ｍａｌを含む。好ましくは、二官能性架橋剤は、ＳＭＣＣである。
【０１４８】
【化１７】
2015535215.tif 000018
【０１４９】
【化１８】
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【０１５０】
【化１９】
2015535215.tif 000020
【０１５１】
一実施形態では、連結試薬は、切断可能なリンカーである。適切な切断可能なリンカーの例は、ジスルフィド含有リンカー、酸不安定性リンカー、感光性リンカー、ペプチダーゼ不安定性リンカー、およびエステラーゼ不安定性リンカーを含む。ジスルフィド含有リンカーは、生理的条件下で生じ得る、ジスルフィド交換により切断可能なリンカーである。酸不安定性リンカーは、酸性のｐＨで切断可能なリンカーである。例えば、エンドソームおよびリソソームのような、所定の細胞内区画は、酸性のｐＨ（ｐＨ４から５）を有し、酸不安定性リンカーを切断するために適切な条件を提供する。感光性のリンカーは、光が到達可能である多くの体腔で、および体表面で有用である。さらに、赤外光は組織を貫通し得る。ペプチダーゼ不安定性リンカーは、細胞内または細胞外の所定のペプチドを切断するために使用され得る。（例えば、Ｔｒｏｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７９：  ６２６−６２９  （１９８２）、およびＵｍｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ４３：  ６７７−６８４  （１９８９）を参照。）一実施形態では、切断可能なリンカーは、緩やかな条件下で、つまり、細胞毒性剤の活性が影響を受けない細胞内の条件で切断される。
【０１５２】
一実施形態では、細胞毒性剤は、ジスルフィド結合により細胞結合剤に連結される。リンカー分子は、細胞結合剤と反応し得る反応化学基を含む。一実施形態では、二官能性架橋剤は、細胞結合剤のリジン残査によりアミド結合を形成し得る反応性部分を含む。細胞結合剤のリジン残査によりアミド結合を形成し得る反応性部分の例は、カルボン酸部分および反応性エステル部分、例えば、Ｎ‐スクシンイミジルエステル、Ｎ‐スルホスクシンイミジルエステル、ニトロフェニル（例えば、２または４‐ニトロフェニル）エステル、ジニトロフェニル（例えば、２，４‐ジニトロフェニル）エステル、スルホ‐テトラフルオロフェニル（ｔｅｔｒａｆｌｕｒｏｐｈｅｎｙｌ）（例えば、４‐スルホ‐２，３，５，６‐テトラフルオロフェニル）エステル、およびペンタフルオロフェニルエステルを含む。
【０１５３】
細胞結合剤との反応のための好ましい反応化学基は、Ｎ‐スクシンイミジルエステルおよびＮ‐スルホスクシンイミジルエステルである。また、リンカー分子は、細胞毒性剤と反応して、ジスルフィド結合を形成し得る、反応化学基、好ましくは、ジチオピリジル基を含む。ジスルフィド結合を介して、細胞毒性剤と細胞結合剤の連結を可能にする二官能性架橋剤は、当該技術分野で知られ、例えば、Ｎ‐スクシンイミジル３‐（２‐ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）（例えば、Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ，  １７３：  ７２３−７３７  （１９７８）を参照）、Ｎ‐スクシンイミジル４‐（２‐ピリジルジチオ）ブタン酸（ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号を参照）、Ｎ‐スクシンイミジル４‐（２‐ピリジルジチオ）ペンタン酸（ＳＰＰ）（例えば、ＣＡＳ登録番号３４１４９８‐０８‐６を参照）、およびＮ‐スクシンイミジル‐４‐（２‐ピリジルジチオ）２‐スルホブタン酸（スルホ‐ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許出願公開第２００９／０２７４７１３号を参照）を含む。ジスルフィド基を導入するために使用され得る他の二官能性架橋剤が、当該技術分野で知られ、その全てが参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９１３，７４８号および同第６，７１６，８２１号、並びに米国特許出願公開第２００９／０２７４７１３号および同第２０１０／０１２９３１４号に記載される。
【０１５４】
【化２０】
2015535215.tif 000021
【０１５５】
切断不可能なリンカーを形成する硫黄原子を欠く他の架橋剤は、また、本発明の方法に使用され得る。このようなリンカーは、ジカルボン酸系部分由来であり得る。適切なジカルボン酸系部分は、一般式（ＩＸ）のα，ω‐ジカルボン酸を含むが、これに限定されず、
ＨＯＯＣ‐Ｘｌ‐Ｙｎ‐Ｚｍ‐ＣＯＯＨ
（ＩＸ）、
式中、Ｘは、２から２０の炭素原子を有する直鎖状または分枝鎖状のアルキル、アルケニル、またはアルキニル基であり、Ｙは、３から１０の炭素原子を持つシクロアルキルまたはシクロアルケニル基であり、Ｚは、６から１０の炭素原子を持つ置換されたもしくは置換されていない芳香族基、または置換されたもしくは置換されていないヘテロ環状基であり、ヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択され、ｌ、ｍ、およびｎがそれぞれ０または１であり、ただし、ｌ、ｍ、およびｎは全て同時にゼロではないことが条件である。
【０１５６】
本明細書に記載される多くの切断不可能なリンカーが、米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３  Ａ１号に詳細が記載される。
【０１５７】
本発明の方法により産生された、最終的に精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートは、細胞毒性剤、二官能性架橋剤、および細胞結合剤を含む。本発明の好ましい実施形態では、細胞毒性剤はＤＭ１であり、二官能性架橋剤はＳＭＣＣであり、細胞結合剤はｈｕＣＤ３７‐３抗体である。本発明の別の好ましい実施形態では、細胞毒性剤はＤＭ１であり、二官能性架橋剤はＳＭＣＣであり、細胞結合剤はＥＧＦＲ‐７Ｒ抗体である。本発明の好ましい実施形態では、細胞毒性剤はＤＭ１であり、二官能性架橋剤はＳＭＣＣであり、および細胞結合剤は抗ＥＦＧＲｖＩＩＩ抗体である。本発明の好ましい実施形態では、細胞毒性剤はＤＭ１であり、二官能性架橋剤はＳＭＣＣであり、および細胞結合剤は抗ＣＤ２７Ｌ抗体である。本発明の好ましい実施形態では、細胞毒性剤はＤＭ１であり、二官能性架橋剤はＳＭＣＣであり、および細胞結合剤はトラスツズマブである。
【０１５８】
以下の実施例は、さらに、本発明を説明するが、もちろん、多少なりともその範囲を限定するとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１５９】
実施例１
本実施例は、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供して、混合物から少なくとも不純物の一部を除去し、これにより、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供することを含む、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための方法を論証する。
【０１６０】
抗体（Ａｂ）が、ｐＨ７．５で、５０ｍＭのＫＰｉ、２ｍＭのＥＤＴＡで緩衝された。緩衝されたＡｂは、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＡ、Ａｂのモルあたり８．６モル当量のＳＭＣＣおよびリンカー（ＳＭＣＣ）に対して１．１モル濃度過剰なＤＭ１と混合された。反応は、２４時間１５℃で進行した。その後、反応混合物の半分が、Ｓａｒｔｏｂｉｄ  ＩＥＸ  ＳｉｎｇｌｅＳｅｐ（Ｑ膜）に通され、他の半分は対照として使用された。混合物（Ｑ膜の前後）が分析された。結果は、以下の表１に示される。
【０１６１】
【表１】
2015535215.tif 000022
【０１６２】
表１に示されるように、Ｑ膜を通って濾過されたコンジュゲートは、より低レベルの高分子量の種（高次凝集体とコンジュゲートダイマーの両方）およびより高いレベルのコンジュゲートモノマーを有する。また、ＤＭ１‐ＤＭ１ダイマーおよびＤＭ１‐ＭＣＣ‐ＤＭ１ダイマーは、効率的にＱ膜により除去される。
【０１６３】
本実施例において反映された実験の結果は、イオン交換クロマトグラフィー膜、特にＱ膜が、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを含む混合物から、少なくとも不純物の一部を除去するために使用され得ることを論証する。特に、Ｑ膜は、細胞毒性剤ダイマーＤＭ１‐ＤＭ１およびＤＭ１‐ＭＣＣ‐ＤＭ１を細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物から効率的に除去した。
【０１６４】
実施例２
本実施例は、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供して、混合物から少なくとも不純物の一部を除去し、これにより、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供することを含む、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための方法を論証する。
【０１６５】
抗体‐ＣＸ１‐１‐ＤＭ１コンジュゲートが、実施例１に記載されるように調製された。混合物（Ｑ膜の前後）が分析された。結果が以下の表２に示される。
【０１６６】
【表２】
2015535215.tif 000023
【０１６７】
表２に示されるように、Ｑ膜を通って濾過されたコンジュゲートは、より低いレベルの高分子量の種（高次凝集体およびコンジュゲートダイマーの両方）およびより高いレベルのコンジュゲートモノマーを有する。
【０１６８】
本実施例において反映された実験の結果は、イオン交換クロマトグラフィー膜、特にＱ膜が、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを含む混合物から、少なくとも不純物の一部を除去するために使用され得ることを論証する。特に、Ｑ膜は、高分子量の種（例えば、コンジュゲートの凝集体）を細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物から効率的に除去した。
【０１６９】
実施例３
本実施例は、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物をイオン交換クロマトグラフィー膜に供して、混合物から少なくとも不純物の一部を除去し、これにより、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供することを含む、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための方法を論証する。
【０１７０】
抗体（Ａｂ）が、ｐＨ７．６の１５ｍＭのＫＰｉ、２ｍＭのＥＤＴＡにバッファ交換された。バッファ交換されたＡｂは、８％（ｖ／ｖ）ＤＭＡでＡｂのモルあたり４．４モル濃度のスルホ‐ＳＰＤＢおよび５．３モル濃度のＤＭ４と混合された。反応は、２０時間２０℃で進行した。結合混合物は、抗体コンジュゲートのバッファ交換および精製のためにタンジェント流濾過に供された。１グラムの精製されたＡｂ‐スルホ‐ＳＰＤＢ‐ＤＭ４コンジュゲートは、 Ｐａｌｌ’ｓ  Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ  Ｃｏｉｎ  （Ｐａｌｌカタログ番号ＭＳＴＡ１８Ｑ１６）に通された。遊離マイタンシノイド種について、分画が収集されて分析された。結果が以下の表３に示される。
【０１７１】
【表３】
2015535215.tif 000024
【０１７２】
表３に示されるように、Ｑ膜を通って濾過された抗体コンジュゲートは、Ｑ膜により濾過されなかった抗体コンジュゲートと比較して、より低いレベルの各識別された遊離マイタンシノイド種を有する。
【０１７３】
本実施例において反映された実験の結果は、イオン交換クロマトグラフィー膜、特にＱ膜が、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを含む混合物から、遊離細胞毒性剤の不純物を除去するために使用され得ることを論証する。特に、Ｑ膜は、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートおよび１つまたはそれ以上の不純物を含む混合物における、ＤＭ４‐加水分解スルホ‐ＳＰＤＢ、ＤＭ４、ＤＭ４‐ＳＰｙ、およびＤＭ４‐スルホ‐ＴＢＡのレベルを低減させた。
【０１７４】
本明細書で挙げられた刊行物、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、個々におよび具体的に、本明細書でその全体において述べられ、および参照により組み込まれることが示されたのと同じ範囲に対して参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７５】
本発明の記載に関連して（特に、以下の請求の範囲に関連して）、用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」および類似の指示対象の使用は、本明細書で別途記載されない限り、または文脈によって明らかに矛盾していない限り、単数形および複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、別途の注記がない限り、制約のない用語（つまり、「含むがこれらに限定されない」）と解釈されるべきである。本明細書での数値の範囲の列挙は、本明細書に別途示されない限り、単に、範囲内の各別個の値に個々に言及する省略表現法として機能し、それぞれの別個の値が、本明細書に個々に挙げられているかのように、明細書内に組み込まれることを意図されている。本明細書に記載される全ての方法が、本明細書に別途示されない限り、または文脈により明らかに別途矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行され得る。あらゆるおよび全ての実施例、または本明細書で提供される代表的な言語（例えば、「のような（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、単に、本発明をよりよく明らかにすることが意図され、別途請求されない限り、本発明の範囲に限定を課さない。本明細書におけるいかなる言語も、本発明の実施に必須として、あらゆるクレームされていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【０１７６】
本発明の好ましい実施形態は、本発明を行うための、発明者に知られる最良の形態を含み、本明細書に記載される。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、前述の記載を読むと、当業者にとって明らかとなるであろう。発明者は、当業者がこのようなバリエーションを適切なように採用することを予期し、発明者は、本明細書に具体的に記載されるよりも別の方法で本発明が実施されることを意図する。従って、本発明は、準拠法により許容されるような、ここに添付された請求の範囲に挙げられた主題の全ての変更および均等物を含む。さらに、上記記載の要素の、その全ての可能なバリエーションでのあらゆる組み合わせが、別途本明細書で示されない限り、または別途文脈により明確に矛盾しない限り、本発明により包含される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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