(57)【要約】本発明は、抗生物質耐性黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)および抗生物質感受性黄色ブドウ球菌から選択される細菌を目的とした、少なくとも部分的に該細菌を中和する、デルフィニジンまたはその塩の使用および対象をデルフィニジンまたはその塩で処置する方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗生物質耐性黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)および抗生物質感受性黄色ブドウ球菌からなる群から選択される細菌に汚染された、生きた動物ではない対象を、少なくとも部分的に中和するための、デルフィニジンまたはその塩の使用。
【請求項２】
該抗生物質が、以下からなる群から選択される、請求項１記載の使用：
−ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネムおよびモノバクタムを含むβ-ラクタム抗生物質、
−キノロン、
−テトラサイクリン、
−アミノグリコシド、
−エリスロマイシン、
−スルホンアミドおよび
−バンコマイシン。
【請求項３】
デルフィニジンまたはその塩が、水溶液または固体中に存在することを特徴とする、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
該水溶液または固体が、物質またはすすぎ液の添加であることを特徴とする、請求項３記載の使用。
【請求項５】
生きた動物ではない対象の処置方法であって：
a)
i)  デルフィニジンもしくはその塩またはデルフィニジンもしくはその塩を含む水溶液または固体および
ii)  抗生物質耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）および抗生物質感受性黄色ブドウ球菌からなる群から選択される細菌が混入した疑いのある無生物の対象
を提供し、
b)  該対象をデルフィニジンもしくはその塩または該水溶液もしくは固体で、対象に混入している疑いのある細菌を少なくとも部分的に中和するような条件下にて処置すること
を含む、処置方法。
【請求項６】
該対象が、動物の体またはその一部であることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
動物の体またはその一部が以下からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６記載の方法
-  ウシの体またはその一部
-  ブタの体またはその一部
-  家禽の体またはその一部
-  水棲動物の体またはその一部
【請求項８】
該対象が食物および／または餌であることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項９】
該対象が以下からなる群から選択される食品および／または飼料であることを特徴とする、請求項８記載の方法：
−  肉製品、
−  加工肉製品、
−  乳製品、
−  野菜およびその一部ならびに
−  果物およびその一部。
【請求項１０】
該対象が以下からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５記載の方法: 
a)
-  医療適用、
-  食品加工、
-  軍
のための器具および／または装置および／または設備および／または機器
b)  保護装置、
c)  家庭内の物品
d)  建築装置および
e)  建設工事。
【請求項１１】
抗生物質耐性または抗生物質感受性の、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)種の細菌の感染が疑われる対象の処置に用いるための、デルフィニジンもしくはその塩、またはデルフィニジンもしくはその塩を含む、水溶液または固体。
【請求項１２】
抗生物質耐性または抗生物質感受性の黄色ブドウ球(Staphylococcus aureus)菌種の細菌の感染が疑われるヒトまたは動物の処置または予防に用いるための、デルフィニジンもしくはその塩またはデルフィニジンもしくはその塩を含む水溶液または固体。
【請求項１３】
感染が以下からなる群から選択される症候を伴う疾患を引き起こすことを特徴とする、請求項１２記載の、デルフィニジンもしくはその塩、または水溶液または固体：
−  腫れものおよび吹き出ものを含む皮膚感染症、
−  化膿性筋炎
−  肺炎、
−  心内膜炎、
−  毒ショック症候群
−  敗血症および
−  乳腺炎。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗生物質耐性および抗生物質感受性の細菌を制御するための、アントシアニジンであるデルフィニジンまたはその塩の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アントシアニジンは、高等陸上植物の大部分に見られるザイモクローム(zymochrome)色素である。アントシアニジンは糖を含まず（アグリコン）、糖を含有するアントシアン（グリコシド）と近縁であって、これらはともに、一般的にアントシアンに分類される。アントシアニジンは色素であり、抗酸化性を示す。
【０００３】
抗生物質耐性および抗生物質感受性細菌は、抗生物質が連続的に用いられている場合、頻繁に発見される。黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)種の抗生物質耐性および抗生物質感受性細菌は、病院内で獲得される、すなわち院内感染する中で最も危険な病原体であり、皮膚および粘膜だけでなく、汚染した医療機器または食品によっても感染する。
【０００４】
具体的には、細菌感染性疾患の処置における、広域抗生物質の消費が増加しているため、多耐性細菌が増加しており、このことは、これらの細菌に感染した動物または患者の処置に利用可能である、有効な抗生物質がもはや存在しないことを意味する。ヒトおよび動物において、抗生物質耐性細菌は、深刻な全身性の感染症を引き起こし得る。これは、特に、免疫抑制患者においてそうである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細菌感染性疾患の予防および処置のために効果的な薬剤を提供することが、本発明の目的の一つである。
【０００６】
本発明のさらなる目的は、抗生物質耐性および抗生物質感受性の黄色ブドウ球菌種の細菌を制御するための効果的な薬剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これらの目的は、請求項１に記載する、デルフィニジンまたはその塩の使用、請求項５に記載の方法、請求項１１および１２に記載の使用により達成される。本発明の有利な態様は従属項に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】２つの独立した実験における、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)種および肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）種の様々な株ならびにまた、MRSAおよびMSSA株の、４８時間後のバイオフィルムの静的形成の結果を示す。
【図２】細菌を、pHインジケーターとしてフェノールレッドを含むRPMI−１６４０細胞培地中で、９６-ウェルポリスチレン細胞培養ディッシュに中で、デルフィニジンを添加し、３７℃にて４８時間インキュベートした視覚的な結果を示す。
【図３】緑膿菌(P. aeruginosa) ATCC9027)のスクレープを示す。
【図４】肺炎桿菌(K. pneumoniae) ATCC700603) のスクレープを示す。
【図５】MRSA2318のスクレープを示す。
【図６】MRSA2855のスクレープを示す。
【図７】MSSA1155のスクレープを示す。
【図８】４８時間インキュベーションした後のクリスタルバイオレット試験の全体的な結果を示す。
【図９】緑膿菌(P. aeruginosa) ATCC9027の吸光度を測定した後に、グラフ処理したものを示す。
【図１０】肺炎桿菌(K. pneumoniae) ATCC700603の吸光度を測定した後に、グラフ処理したものを示す。
【図１１】MRSA2318の吸光度を測定した後に、グラフ処理したものを示す。
【図１２】MRSA2855の吸光度を測定した後に、グラフ処理したものを示す。
【図１３】MSSA1155の吸光度を測定した後に、グラフ処理したものを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
先ず、本発明に用いる多数の用語を説明する。
【００１０】
「抗生物質」は、細菌感染性疾患を処置するための医薬である。該抗生物質の群には、特に、β−ラクタム抗生物質（ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネムおよびモノバクタムを含む）、キノロン、テトラサイクリン、アミノグリコシド、エリスロマイシン、スルホンアミド、およびバンコマイシンが含まれる。「抗生物質耐性細菌」および「抗生物質感受性細菌」は、該細菌が少なくとも一つの抗生物質に対して耐性であること、および／または少なくとも一つの抗生物質に対する感受性が低下していることを意味する。現在市販されている全てのβラクタム抗生物質に対して耐性を示し、殆どの場合、他のクラスの抗生物質、例えばキノロン、テトラサイクリン、アミノグリコシド、エリスロマイシンおよびスルホンアミドに対する耐性を有する、多耐性の黄色ブドウ球菌株は、当該分野において、まとめて、「ＭＲＳＡ」（多耐性黄色ブドウ球菌(multi-resistant Staphylococcus aureus)またはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)）と称される。ＭＲＳＡ患者の治療は、通常、予備的な抗生物質であるバンコマイシンを用いて行われるが、この抗生物質に対してすら耐性を示すものが既に普通になりつつあり(「VRSA」−バンコマイシン抵抗性黄色ブドウ球菌（vancomycin-resistant Staphylococcus aureus))、その結果として、細菌感染性疾患を処置するための、代替となる医薬が相当必要とされている。
【００１１】
本発明によれば、請求項１〜７のいずれかに記載する組成物または複合体または、請求項８記載の水溶液または固体は、抗生物質耐性黄色ブドウ球菌および抗生物質感受性黄色ブドウ球菌からなる群から選択される細菌で汚染されている疑いのある対象または個人の処置に用いられる。この処置の目的は該細菌を少なくとも部分的に中和することである。該中和は、任意の種類の中和、例えば、静菌性の中和、殺菌性の中和および静菌性と殺菌性の混合の中和を含む。用語「少なくとも一つのアントシアニジンを含む組成物または複合体」は、アントシアニジンを、そのものとして、さらなる構成成分を含まずに含む。
【００１２】
保健分野への適用については、請求項１〜７のいずれかに記載の本発明の組成物または複合体または請求項８記載の水溶液または固体は、抗生物質耐性または抗生物質感受性の黄色ブドウ球菌種の細菌に感染している疑いのあるヒトまたは動物の処置または予防のための使用に供される。該細菌感染は、特に、腫れものおよび吹き出ものを含む皮膚感染、化膿性筋炎、肺炎、心内膜炎、毒素性ショック症候群、敗血症および乳腺炎のような症候を伴う疾患を引き起こす。特に、免疫抑制患者においては、抗生物質耐性または抗生物質感受性の黄色ブドウ球菌種の細菌により、深刻な全身性の感染症が引き起こされうる。
【００１３】
食物、餌および消毒分野への適用に関して、「対象」という語は、生きていない動物、医療用の器具および／または装置および／または設備および／または機器、食品加工、軍、保護装置、家庭内の物品(domestic objects)、建築装置ならびに建設工事を含む。「生きていない動物」は、具体的には、殺した、屠殺した動物またはこれらの動物の一部、例えば、ウシの体またはその一部、ブタの体またはその一部、家禽の体またはその一部、および水棲動物またはその一部である。該「対象」は、具体的には、食品および／または飼料、例えば肉製品、加工した肉製品、乳製品、野菜およびその一部、ならびに果物およびその一部であってよい。
【００１４】
本発明において、「中和」は、病原の崩壊または分解（溶菌）または不活化（例えば、感染能の喪失）または増殖の停止または、病原体が介在するバイオフィルム、特に抗生物質耐性または抗生物質感受性の、黄色ブドウ球菌種のバイオフィルム形成の阻止を指す。本発明の組成物または本発明の複合体は、噴霧、粉体散布、注射、ジェル、ドレッシング剤、プラスター、パッチ等を用いる被覆により、感染していると疑われる領域に投与または適用しうる。ヒトまたは動物を処置する場合、病像によって、本発明の組成物または本発明の複合体は、全身または局所に投与してよい。製剤および投与についての相当する技術は、先行技術より公知である; 例えば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences”(Mack Publishing Co., Easton Pa.)を参照のこと。例えば、本発明の組成物および複合体は、薬学的に許容される媒体（例えば生理食塩水）を用いて対象に、静脈内投与し得る。注射用の適当な製剤は、水溶液中の製剤、好ましくは生理学的に許容される緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液または緩衝生理食塩水）中の製剤である。非経口投与、例えば静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内投与には、水性または油性の液剤または固体製剤等が考慮される。
【００１５】
「バイオフィルム」は、微生物が産生した細胞外の多糖マトリクスまたは蛋白質マトリクスに包埋された、表面上の該微生物（例えば細菌）の集合体である。バイオフィルム中の細菌組織化は、極めて広範な影響に対する該集団全体の耐性を有意に向上させる。歯、歯肉、尿路、消化管または医療機器、例えばカテーテルおよびプロテーシス上に、細菌により形成されるバイオフィルムは、しばしば、重症の感染症を引き起こす (Costerton et al., Annu Rev. Microbiol 1995; 49: 711-45)。
【００１６】
「塩」または「薬学的に許容される塩」は、投与後に薬学的に有効な成分またはその活性代謝物を放出することのできる本発明の化合物の、薬学的な見地から許容できる任意の塩を意味する。本発明の組成物および複合体の塩は、有機または無機の酸および塩基より生成されてよい。
【００１７】
該アントシアニジンは、「純粋な形態」または「精製」されて使用してよく、このことは、望まれない成分が除かれていることを意味する。
【００１８】
「アントシアニジン」は以下に表す基本構造を持つ。
【化１】
2015518466.tif 000003
【００１９】
この式中の置換基は、水素、ヒドロキシル基およびメトキシ基からなる群から選択される。
【００２０】
本発明によれば、アントシアニジンと複合体化させてもよい、シクロデキストリンは、α-１,４-グリコシド結合により結合する、グルコース分子の環状オリゴ配糖体である。β-シクロデキストリンは、７つのグルコースユニットを持つ。スルホアルキルエーテル−β−シクロデキストリンの場合、グルコースユニットのヒドロキシル基は、スルホアルキルアルコール中でエーテル化される。一般的に、本発明によれば、β-シクロデキストリンの２１のヒドロキシル基のうち、エーテル化されるのはいくつかのみである。スルホアルキルエーテル−シクロデキストリンの製造は、当業者にはよく知られたものであり、例えば、米国特許第５,１３４,１２７号または国際公開第２００９/１３４３４７号に記載されている。
【００２１】
先行技術におけるシクロデキストリンの場合、スルホアルキルエーテル基は、親水性または水溶性を上昇させるために用いられる。本発明は、スルホアルキルエーテル基が、アントシアニジンと同様に置換されたβ-シクロデキストリンとの複合体の安定性を特に向上させ、そのため、特に酸化に対して感受性であるアントシアニジンの保存安定性と製剤化しやすさを向上させることを見出した。本発明の複合体は、保存安定性の優れた水性液剤または固体として製剤してもよく、これについては以下で詳述する。
【００２２】
本発明によれば、特に好ましいのは、スルホブチル エーテル-β-シクロデキストリン (SEB−β−CD)と複合化させることである。発明の保護範囲を限定するものではないが、この説明における目的の一つは、負に荷電したスルホブチルユニットが、正に荷電したアントシアニジンと静電気的に相互作用し、アルキル基の中で、ブチル基が、該相互作用を可能にする最適な長さを立体的に有することである。
【００２３】
スルホアルキルエーテル基によるシクロデキストリンの置換の程度は、好ましくは３〜８、より好ましくは４〜８、より好ましくは５〜８、より好ましくは６〜７である。
【００２４】
６〜７の平均置換度を有する適当なスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンは、例えば、国際公開第２００９/１３４３４７号に記載されており、商品名Captisol（登録商標）として市販されている。置換度が４〜５、例えば４.２の、相当するシクロデキストリンも、同様に使用可能である。
【００２５】
本発明で用いる、純粋形態、塩形態または複合体形態のアントシアニジンは、オーランチニジン、シアニジン、デルフィニジン、ユーロピニジン、ルテオリニジン、ペラルゴニジン、マルビジン、ペオニジン、ペツニジンおよびロシニジンからなる群から選択されるのが好ましい。化学構造は、上述の式Ｉに相当し、以下のような置換パターンを示す。
【表１】
2015518466.tif 000004
【００２６】
本発明において特に好ましいのはデルフィニジンである。
【００２７】
本発明はさらに、本発明の組成物または本発明の複合体の水溶液を提供する。
【００２８】
本発明の複合体および対応する水溶液は以下の工程を含む：
a)  スルホアルキルエーテル-β-シクロデキストリンの水溶液を調製し、
b)  アントシアニジンを添加して、混合して該複合体を製造する。
【００２９】
工程a)において、好ましくは、使用するシクロデキストリンを５〜１０重量％含む水溶液が製造される。本発明において、アントシアニジン、好ましくはデルフィニジンの添加の間または後、好ましくは前に、該水溶液のｐＨは、７以下、好ましくは６以下、より好ましくは５以下、より好ましくは４〜５であることが特に好ましい。このｐＨでは、該複合体の水溶液中のより高い濃度が確立できることがわかった。
【００３０】
アントシアニジンの濃度は、塩化物として計算して、好ましくは、少なくとも０.５mg/ml、より好ましくは少なくとも１.０mg/ml、より好ましくは少なくとも１.５mg/ml、より好ましくは２.０mg/mlである。特に好ましい濃度範囲である、少なくとも２.０mg/mlの濃度は、特に好ましい態様において、４〜５のｐＨを有する水溶液中で、確立し得る。
【００３１】
本発明の製造において、水溶液の構成成分の混合は、撹拌によって行ってよく；好ましい混合時間は２〜２０時間である。光により誘導される酸化を防ぐため、暗所で操作するのが好ましい。
【００３２】
本発明はさらに、本発明によって、溶媒を本発明の水溶液から取り除くことにより得られる、本発明の複合体を含む固体を提供する。かかる除去は、好ましくは、凍結乾燥(freeze-drying)（凍結乾燥(lyophilization)）により達成し得る。本発明の水溶液および固体は、高い保存安定性を示す。
【００３３】
本発明は、以下の実施例において、添付の図についてさらに記載するが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
I.アントシアニジンであるデルフィニジンとシクロデキストリンの複合体の製造
１.使用する物質：
以下のシクロデキストリンを使用する：
【表２】
2015518466.tif 000005
塩化デフィニジンは、Extrasynthese社より得た。
【００３５】
２.デルフィニジン含有量の決定
塩化デルフィニジンの、デルフィニジン含有組成物中の含有量は、逆相ＨＰＬＣ技術を用いて決定した。ここでは、以下の試薬を用いた:
純水
クロマトグラフィー用のメタノール
ギ酸 (分析用)
容量分析用としての１M塩酸
【００３６】
使用したカラムは、Waters X BridgeTM C１８, ３５ μl, １５０ mm x ４.６ mmである。
【００３７】
移動相は以下の通りであった:
チャンネルA: 水９５０ml、メタノール５０ml、ギ酸１０ml
チャンネルB: 水５０ml、メタノール９５０ml、ギ酸１０ml
【００３８】
以下の勾配プログラムを用いた：
【表３】
2015518466.tif 000006
停止時間: ３５分
ポストタイム(Post-time): ８分
流速: １ml/分
注入量: ２０μl
カラム温度: ３０℃ ＋/− ２℃
UV-Vis検出器: アッセイについては５３０μm、不純物の検出については２７５μm
インテグレーター: 面積
【００３９】
溶液および試料の製造:
希釈液１:  メタノール１００mlと１M HCL ２.６mlの混合物
希釈液２:   ４０％濃度のメタノール１００mlと１M HCL ２.６mlの混合物
較正液:デルフィニジンの標準液は、塩化デルフィニジン１０mgを１０ml フラスコに量り入れ、希釈液１に溶解させることにより製造した。溶解の後、希釈液２で約１０倍に希釈し、濃度を約０.１mg/mlにした。
【００４０】
対照較正液を、同じ方法にて製造した。塩化デルフィニジンは溶液中で不安定であるため、較正液は、すぐにHPLCにより分析した。
【００４１】
試験溶液の製造
本発明にしたがって（製造については以下を参照）製造した固体のデルフィニジン含有量を決定するために、この組成物約５０mgを１０mlフラスコに量り入れた。次に、この量を希釈溶液２に溶解させ、同じ希釈溶液２でさらに希釈し、デルフィニジン濃度を約０.１mg/mlにした。
【００４２】
デルフィニジンの試料中の含有量の決定は、Agilent ChemStation softwareを用いて、記載する外部標準を用いて算出する。
【００４３】
実施例１: デルフィニジンのSBE-β-CDとの複合
この実施例において、様々なシクロデキストリンによるデルフィニジンの複合および該複合体の水溶液中の溶解度を調べる。
【００４４】
それぞれのシクロデキストリンを１０重量％含む、中性水溶液を製造した。β-CDの場合、溶解性不足のため、選択した濃度はわずか２重量%であった。
【００４５】
シクロデキストリン水溶液と純水をそれぞれ５ml、ガラスのフラスコに入れた。その後、過剰量の塩化デルフィニジンを添加した。必要な過剰量は、α−、β−およびγ-の溶液については１０mg、HPBCD (２-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン)およびSBE-β-CDについては１５mgであった。
【００４６】
該懸濁液を、暗所、３０℃にて２０時間撹拌した。この後に、０.２２μmの孔径のメンブレンフィルターに通して濾過を行った。
【００４７】
達成し得る溶解度を以下の表１にまとめる
【表４】
2015518466.tif 000007
【００４８】
SBE-β-CDについての複合および生じる溶解度の上昇は、他のシクロデキストリンよりもはるかに優れていることが示唆される。
【００４９】
実施例２: pHの影響
この実施例では、デルフィニジン-SBE-β-CDの水溶液中の溶解度へのｐＨの影響を調べた。実施例１の方法にしたがって、SBE-β-CDの水溶液を製造したが、これらの溶液は、１Ｍ HCLで、表２に特定する酸性ｐＨ値に調整した。その後、撹拌時間が２.５時間に限定されている以外は、実施例１の方法にしたがって、塩化デルフィニジンを添加し、操作を続けた。結果を以下の表２に表す：
【表５】
2015518466.tif 000008
【００５０】
４〜５のｐＨレベルにて、複合した塩化デルフィニジンの溶解度は、中性のｐＨと比較して約３倍上昇することがわかる。
【００５１】
実施例３: 本発明の固体の製造
この実施例にて、本発明の複合体を固体として製剤する。比較のために、デルフィニジン/HPBCD複合体と、デルフィニジン/デンプン製剤を固体として製造する。
【００５２】
実施例３.１: デルフィニジン/SBE-β-CD
SEB-β-CD ５gを蒸留水４０mlに溶解させ、透明な溶液を形成した。該溶液のpHを、１M HCLを用いて４.８に調整した。その後、塩化デルフィニジン０.１１gを添加し、該混合物を暗所、２７℃にて２時間撹拌した。かかる均一な液体を、孔径０.４５μmのニトロセルロースメンブレンフィルターに通して真空濾過した。該溶液を冷凍した後、約１０.３Pa (７７ mtorr)の圧力下にて、−４８℃で凍結乾燥させた。該凍結乾燥物を粉砕し、メッシュサイズ０.３mmのふるいに通してスクリーニングした。
【００５３】
実施例３.２: デルフィニジン/HPBCD
手法は実施例３.１と同じであるが、濾過時に、かなりの量の物質が残り、このことは、実施例３.１のようにSBE-β-CDを用いた場合に比べて溶解性がはるかに低いことを示唆する。
【００５４】
実施例３.３: デルフィニジン/デンプン製剤
デンプン５gを蒸留水４０mlに懸濁した。これにより、白色の懸濁液を得た。該溶液のpHを１M HCLを用いて４.６に調整した。その後、塩化デルフィニジン０.１１gを添加し、該混合物を暗所、２７℃にて２時間撹拌した。得られた均一な液体を、実施例３.１と同様に、凍結乾燥させ、粉砕し、篩過した。
【００５５】
実施例３.１は本発明の実施例であり; 実施例３.２および３.３は比較例である。
【００５６】
実施例４: 安定性試験
実施例３.１〜３.３の固体を、以下の条件にて保存した：
-  ねじの栓を有する褐色のガラス容器に、室温にて８日間;
-  続いて、酸素雰囲気下にて、ガラス容器中、暗所、室温にて２２日間。
【００５７】
上述の保存の最後の２２日間は、体積２０mlのガラスバイアル中で行った。その前に既に８日間保存した、該試料をそれぞれ２５０mg、これらのバイアルに入れ、これをゴム栓で密封した。該バイアルのヘッドスペースを、二つの注射針を用いて純粋な酸素でフラッシュした。続いて、該試料を暗所にて保存した。
【００５８】
該固体におけるデルフィニジンの含有量 (塩化デルフィニジンとして算出し、重量%にて報告する) を、上述のHPLC法により決定した。結果は以下の表３に表す。
【表６】
2015518466.tif 000009
【００５９】
かかる結果より、本発明によれば、純粋な酸素雰囲気下においても、高い安定性を示し、それ故に優れた保存性を示すデルフィニジン複合体を製造し得る。該複合体はさらに水溶液、特にわずかに酸性の溶液において、水易溶性を示し、デルフィニジンが、本発明によって様々な方法で製剤化されることが可能になっている。本発明の固体の安定性は、デンプンとの製剤（実施例３.３）と質的に同程度であるが、この比較例は水溶液中で製剤することができない。
【００６０】
実施例５: 水溶液中での安定性試験
デルフィニジンを含有する溶液中の塩化デルフィニジンの含有量を、すでに上述したものと同様の逆相HPLC技術を用いて決定した。ここでは以下の試薬を用いた：
純水
クロマトグラフィー用のメタノール
ギ酸 (分析用)
容積定量用の１M 塩酸
【００６１】
用いたカラムは、Waters X BridgeTM C18, 35μl、150 mm x 4.6 mmである。
【００６２】
移動相は以下の通りであった:
チャンネルA: 水 ７７０ml、メタノール ２３０ml、ギ酸 １０ml
チャンネルB: 水 ５０ml、メタノール ９５０ml、ギ酸 １０ml
【００６３】
以下の勾配プログラムを用いた
【表７】
2015518466.tif 000010
停止時間: ２５分
ポストタイム: ８分
流速: １ml/分
注入量: ２０μl
カラム温度: ３０℃+/− ２℃
UV-Vis検出器: 該アッセイ用には５３０μm、不純物の検出には２７５μm
インテグレーター: 面積
【００６４】
溶液および試料の製造:
希釈液１:  メタノール１００mlと１M HCL ２.６mlの混合物
希釈液２:  ５０%濃度のメタノール１００mlと１M HCL２.６mlの混合物
較正液:デルフィニジンの標準液は、塩化デルフィニジン１０mgを１０mlフラスコに量り入れ、希釈液１に溶解させることにより製造した。溶解の後、希釈液２で約１０倍に希釈し、濃度を約０.１mg/mlにした。
【００６５】
対照較正液を、同じ方法にて製造した。塩化デルフィニジンは溶液中で不安定であるため、較正液は、すぐにHPLCにより分析した。
【００６６】
試験溶液の製造
本発明の水溶液中の、デルフィニジン含有量を決定するために、実施例(３.１)のデルフィニジン/SBE-β-CD（本発明）およびデルフィニジン (比較例)を、０.９%濃度のNaCl溶液に、確立される出発濃度(デルフィニジンに基づく)が１.５８４mg/ml (本発明の実施例) または０.０２１６mg/ml (比較例)になるまで、溶解させた。該溶液を、室温にて製造した後、密封バイアル中にて、暗所、３７℃で保存した。
【００６７】
該デルフィニジン含有量は、１、２、３および４時間後に決定した。以下の表は、明らかになった含有量を上述の出発濃度のパーセンテージとして示す。
【表８】
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【００６８】
試料中のデルフィニジンの含有量は、Agilent ChemStation softwareを用いて、記載する外部標準を用いて算出した。
【００６９】
II.アントシアニジンであるデルフィニジンの細菌に対する影響
１. 試験株および実験のセットアップ
株は以下のように選択した；
−  緑膿菌 (Pseudomonas aeruginosa) ATCC9027、バイオフィルム陽性の、外耳感染からの臨床分離株(標準株); 
−  肺炎桿菌 (Klebsiella pneumoniae) ATCC700603、バイオフィルム陽性の、ESBL+ (基質特異性拡張型βラクタマーゼ；Extended Spectrum Beta-Lactamase) 病院患者の尿由来の臨床分離株 (標準株); 
−  黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus) MRSA2318、バイオフィルム陽性の、22.04.2009の気管分泌物由来の臨床分離株 (Wurzburg University Hospital, neurosurgical clinic and polyclinic I, intensive therapy unit); 
−  黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus) MRSA2855、バイオフィルム陽性の、22.04.2009の血液培養物からの臨床分離株 (Wurzburg University Hospital, medical clinic and polyclinic I, ITU); 
−  黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus） MSSA1155、バイオフィルム陽性の27.04.2004の腹腔スクレープ由来の臨床分離株 (Wurzburg University clinic, urology, unit B). 
【００７０】
上記の株は、はっきりとバイオフィルムを形成するため、本発明の組成物の細菌に対する効果を調べるのに特に適当であるとして選択したものであり、これは図１より明らかである。
【００７１】
図１は、２つの独立した実験における、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)種および肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）種の様々な株ならびにまた、MRSAおよびMSSA株の、４８時間後のバイオフィルムの静的形成の結果を示す。バイオフィルムの成長および解析は、Current ProtocolsのMicrobiology 1B.1.2−1B.1.4“MICROTITER PLATE BIOFILM ASSAY” [オンライン出版 August 2011 (Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com)) DOI: 10.1002/9780471729259.mc01b01s22]に記載のbasic protocol 1にしたがって、クリスタルバイオレットアッセイを用いて、静的モデルにて決定した。
【００７２】
２. 有効成分分析
デルフィニジンの細菌増殖および細菌のバイオフィルム形成に対する効果は、
a)  細菌増殖の視覚的評価(静的モデル)、
b)  バイタリティー試験 (血液寒天プレート上のスクレープ)
c)  セクション１に記載した、クリスタルバイオレットアッセイによる静的モデルにおけるバイオフィルムの分析
を用いて調べる。
【００７３】
最初に、細菌１ x １０６個/ウェルを、pHインジケーターとして（およびそれによる、細菌増殖の間接的なインジケーターとして）フェノールレッドを含むRPMI−１６４０細胞培地１００μl中で、９６-ウェルポリスチレン細胞培養ディッシュに入れた。使用した対照は、無菌のRPMI−１６４０である。その後、前もって作製した希釈系列から、RPMI溶液中のデルフィニジンを添加し、細胞培養ディッシュを３７℃にて４８時間インキュベートし、その視覚的な結果を図２に示す。（フェノール）レッドから黄色への色の変化は、細菌の増殖の程度と相関する。
【００７４】
培養ディッシュからの細菌のスクレープを図３ (緑膿菌(P. aeruginosa) ATCC9027)、４ (肺炎桿菌(K. pneumoniae) ATCC700603)、５ (MRSA2318)、６ (MRSA2855)および７ (MSSA1155)に示す。寒天プレート上のスクレープの「ST_26.1.11」および「ST_28.1.11」は、二つ組の実験のそれぞれのスクレープの日付である。
【００７５】
実験の設定を同じにして、セクション１にて上述した、クリスタルバイオレット試験を用いてバイオフィルムの解析を行い、４８時間インキュベーションした後に、クリスタルバイオレット試験を行い、その全体的な結果を図８に示し、図９〜１３には、個々の細菌株について、吸光度を測定した後に、それぞれのデルフィニジン濃度についてグラフ処理したものを示す(図９: 緑膿菌(P. aeruginosa) ATCC9027、図１０: 肺炎桿菌(K. pneumoniae) ATCC700603、図１１: MRSA2318、図１２: MRSA2855、図１３: MSSA1155)。
【００７６】
実験結果は以下のように要約し得る:
-  デルフィニジンは、グラム陽性細菌である緑膿菌(P. aeruginosa)および肺炎桿菌(K. pneumoniae)の増殖およびバイオフィルムの形成に対して全く阻害効果を持たない。実際のところ、肺炎桿菌の場合、バイオフィルムの形成はさらに刺激されているように見える。
-  対照的に、デルフィニジンは、黄色ブドウ球菌(S. aureus) (MSSAおよびMRSA両方)の増殖およびバイオフィルムの形成の両方に対して阻害能を有する。この効果は、用量依存的に減少する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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