(57)【要約】  本発明は、毒性を実質的に低減又は排除する、天然毒素配列に対して特に定められた突然変異を含む組換えクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ（ＴｃｄＡ）及び毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）及び二成分毒素Ａ（ＣＤＴａ）タンパク質に関する。本発明はまた、クロストリジウム・ディフィシレ感染及び／又はその影響に対する防御をもたらしうる、これらの組換え毒素及びこれらの毒素と二成分毒素Ｂ（ＣＤＴｂ）との組合せを含むワクチン及び免疫原性組成物に関する。本発明はまた、本明細書に記載のワクチン及び免疫原性組成物を患者に投与することを含む、クロストリジウム・ディフィシレに対する免疫応答の誘導方法に関する。本発明は、組換え発現系における組換えクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａ及び毒素Ｂ及びＣＤＴａ突然変異体及びＣＤＴｂの発現方法も含む。典型的実施形態においては、毒性を実質的に低減又は排除するのに十分な突然変異を含むＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ及びＣＤＴａ突然変異毒素をバキュロウイルス／昆虫細胞発現系内で発現させる。
2015506948.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｄ２８５Ａ、Ｓ５１７Ａ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａからなる群から選択される少なくとも４つの突然変異を含む組換えクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ（ＴｃｄＡ）タンパク質。
【請求項２】
該タンパク質が、（ａ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＷ５１９Ａ；（ｂ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＤ２８５Ａ；（ｃ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＳ５１７Ａ；（ｄ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７ＡおよびＥ５１４Ｑ；ならびに（ｅ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａからなる群から選択される一組の突然変異を含む、請求項１記載のＴｃｄＡタンパク質。
【請求項３】
該タンパク質が、Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａ突然変異を含む、請求項２記載のＴｃｄＡタンパク質。
【請求項４】
該ＴｃｄＡタンパク質が、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＮＡＰ１参考株またはＶＰＩ  １０４６３参考株から誘導されたアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載のＴｃｄＡタンパク質。
【請求項５】
該タンパク質が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６および配列番号３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のＴｃｄＡタンパク質。
【請求項６】
該タンパク質が実質的に精製されている、請求項１〜５のいずれか１項記載のＴｃｄＡタンパク質。
【請求項７】
Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｄ２８６Ａ、Ｓ５１８Ａ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａからなる群から選択される少なくとも３つの突然変異を含む単離された組換えクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）タンパク質。
【請求項８】
該タンパク質が、（ａ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８ＡおよびＥ５１５Ｑ；（ｂ）Ｗ１０２、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＷ５２０Ａ；（ｃ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＤ２８６Ａ；（ｄ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＳ５１８Ａ；ならびに（ｅ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａからなる群から選択される一組の突然変異を含む、請求項７記載の単離されたＴｃｄＢタンパク質。
【請求項９】
該タンパク質が、Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａ突然変異を含む、請求項８記載の単離されたＴｃｄＢタンパク質。
【請求項１０】
該ＴｃｄＢタンパク質が、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＮＡＰ１参考株またはＶＰＩ  １０４６３参考株から誘導されたアミノ酸配列を含む、請求項７〜９のいずれか１項記載の単離されたＴｃｄＢタンパク質。
【請求項１１】
該タンパク質が、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８または配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７記載の単離されたＴｃｄＢタンパク質。
【請求項１２】
該タンパク質が実質的に精製されている、請求項７〜１１のいずれか１項記載の単離されたＴｃｄＢタンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項記載のＴｃｄＡタンパク質および医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物。
【請求項１４】
請求項７〜１２のいずれか１項記載のＴｃｄＢタンパク質および医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項記載のＴｃｄＡタンパク質および請求項７〜１２のいずれか１項記載のＴｃｄＢタンパク質および医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物。
【請求項１６】
アジュバントを更に含む、請求項１３〜１５のいずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
該アジュバントが、アルミニウムアジュバント、Ｉｓｃｏｍ型アジュバント、またはアルミニウムアジュバントとＩｓｃｏｍ型アジュバントとの組合せである、請求項１６記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
昆虫細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、請求項１〜５のいずれか１項記載のＴｃｄＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むバキュロウイルスベクターで形質転換してＴｃｄＡタンパク質を産生させることを含む、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡタンパク質の製造方法。
【請求項１９】
昆虫細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、請求項７〜１１のいずれか１項記載のＴｃｄＢタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むバキュロウイルスベクターで形質転換してＴｃｄＢタンパク質を産生させることを含む、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢタンパク質の製造方法。
【請求項２０】
Ｃ２Ａ、Ｙ６７Ａ、Ｙ６９Ａ、Ｙ２５３Ａ、Ｒ２５５Ａ、Ｙ２５８Ａ、Ｒ３０２Ａ、Ｑ３０７Ｅ、Ｎ３４２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｆ３５６Ａ、Ｒ３５９Ａ、Ｙ３８２Ａ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７ＱおよびＥ３８７Ｄから選択される少なくとも２つの突然変異を含む組換え二成分毒素タンパク質Ａ（ＣＤＴａ）。
【請求項２１】
該タンパク質がシグナルペプチドを欠いている、請求項２０記載のＣＤＴａタンパク質。
【請求項２２】
該ＣＤＴａタンパク質が、
（ａ）Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；
（ｂ）Ｒ３０２Ａ、Ｅ３８５ＡおよびＥ３８７Ｄ；
（ｃ）Ｃ２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；
（ｄ）Ｒ３０２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；
（ｅ）Ｙ６７Ａ、Ｙ６９ＡおよびＲ２５５Ａ；
（ｆ）Ｒ３５９Ａ、Ｙ６７ＡおよびＱ３０７Ｅ；
（ｇ）Ｙ２５８Ａ、Ｆ３５６Ａ、Ｓ３４５Ｆ；ならびに
（ｈ）Ｎ３４２Ａ、Ｙ２５３ＡおよびＹ３８２Ａ
からなる群から選択される一組の突然変異を含む、請求項２０または請求項２１記載のＣＤＴａタンパク質。
【請求項２３】
該タンパク質が、配列番号４０、配列番号４２または配列番号６７に記載されているアミノ酸配列を含む、請求項２０または請求項２１記載のＣＤＴａタンパク質。
【請求項２４】
該タンパク質が、Ｃ２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ突然変異を含む、請求項２２記載のＣＤＴａタンパク質。
【請求項２５】
該タンパク質が実質的に精製されている、請求項２０〜２４のいずれか１項記載のＣＤＴａタンパク質。
【請求項２６】
請求項２０〜２５のいずれか１項記載のＣＤＴａタンパク質およびクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）からの二成分毒素タンパク質Ｂ（ＣＤＴｂ）および医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物。
【請求項２７】
該ＣＤＴｂタンパク質がシグナルペプチドを欠いている、請求項２６記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
該ＣＤＴｂタンパク質が活性化ドメインを欠いている、請求項２７記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
アジュバントを更に含む、請求項２６〜２８のいずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
該アジュバントがアルミニウムアジュバントまたはＩＳＣＯＭ型アジュバントまたはそれらの組合せである、請求項２９記載の免疫原性組成物。
【請求項３１】
請求項２０〜２４のいずれか１項記載のＣＤＴａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項３２】
請求項３１記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３３】
バキュロウイルスベクターである、請求項３２記載のベクター。
【請求項３４】
請求項３２または請求項３３記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３５】
該細胞が昆虫細胞である、請求項３４記載の宿主細胞。
【請求項３６】
細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、請求項３２記載のベクターで形質転換してＣＤＴａタンパク質を産生させることを含む、ＣＤＴａタンパク質の製造方法。
【請求項３７】
昆虫細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、ＣＤＴｂタンパク質をコードする核酸を含むバキュロウイルスベクターで形質転換してＣＤＴｂタンパク質を産生させることを含む、ＣＤＴｂタンパク質の製造方法。
【請求項３８】
請求項１３〜１７、２６〜３０または４０〜４３のいずれか１項記載の免疫原性組成物の有効量を患者に投与することを含む、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の治療または予防方法。
【請求項３９】
クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に関連した疾患の治療または予防用の医薬の製造における、（ａ）請求項１〜６のいずれか１項記載のＴｃｄＡタンパク質、（ｂ）請求項７〜１２のいずれか１項記載のＴｃｄＢタンパク質、（ｃ）請求項２０〜２５のいずれか１項記載のＣＤＴａタンパク質、または（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せの使用。
【請求項４０】
請求項１〜６のいずれか１項記載の組換えＴｃｄＡタンパク質および請求項７〜１２のいずれか１項記載の組換えＴｃｄＢタンパク質を更に含む、請求項２６〜２８のいずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項４１】
ＴｃｄＡタンパク質が突然変異Ｗ１０１、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａを含み、ＴｃｄＢタンパク質が突然変異Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａを含み、ＣＤＴａタンパク質がシグナルペプチドを欠いており、ＣＤＴａタンパク質が突然変異Ｃ２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑを含み、そして、ＣＤＴｂタンパク質がシグナルペプチドを欠いている、請求項４０記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
該組成物がアルミニウムアジュバントを更に含む、請求項４１記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
該組成物がＩＳＣＯＭ型アジュバントを更に含む、請求項４０〜４２のいずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項４４】
クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に関連した疾患の治療または予防のための、請求項１３〜１７、２６〜３０または４０〜４３のいずれか１項記載の免疫原性組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）からの毒素Ａ（ＴｃｄＡ）、毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）および二成分毒素（ＣＤＴａおよびＣＤＴｂ）タンパク質から選択される少なくとも１つの組換え毒素タンパク質ならびに追加的な免疫原との組合せを使用するクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する免疫応答の誘導方法に関する。本発明はまた、防御免疫応答を誘導しうる、ＣＤＴａおよび／またはＣＤＴｂタンパク質を、単独で又は１以上の追加的な免疫原、例えばＴｃｄＡおよびＴｃｄＢと組み合わせて含む免疫原性組成物、特に、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンに関する。
【０００２】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１２年１月２７日付け出願の米国仮特許出願第６１／５９１，６３１号、２０１２年２月８日付け出願の米国仮特許出願第６１／５９６，４１９号、および２０１２年９月２０日付け出願の米国仮特許出願第６１／７０３，７５４号（それらの全内容を参照により本明細書に組み入れることとする）の利益を主張するものである。
【０００３】
電子的に提出された配列表に対する言及
本出願の配列表は、２０１３年１月２５日付け作成のファイル名「２３１９２−ＰＣＴ−ＳＥＱＬＩＳＴ−２５ＪＡＮ２０１３．ＴＸＴ」および６３２ＫＢのサイズを有するＡＳＣＩＩファーマット化配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂから電子的に提出されている。ＥＦＳ−Ｗｅｂから提出されたこの配列表は本明細書の一部であり、その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
【背景技術】
【０００４】
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）は、土壌中の有機物および哺乳動物の胃腸管の嫌気性区画中の分解および崩壊に関与する嫌気性グラム陽性芽胞形成細菌の属である。多数のクロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）は、それらの機能に影響を及ぼすために、生物の種々の成分を標的化する分解酵素をコードし、発現する。これらの酵素の幾つかは非常に強力な毒素および細胞毒へと進化している。これらの毒素の発現は、幾つかのクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属種を、それぞれ破傷風、ボツリヌス中毒、ガス壊疽および抗生物質関連大腸炎を引き起こすクロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を含む日和見病原体へと変化させうる。
【０００５】
クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染（ＣＤＩ）は先進国における最も一般的な院内感染の１つであり、抗生物質により引き起こされる正常なコロニーフローラの破壊により、抗生物質療法を受けている入院患者に広がることが多い。米国では毎年、推定５００，０００のＣＤＩの症例が見られる（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｈｏｓｐ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，３０（６）：５２６−３３（２００９）；Ｒｕｐｎｉｋら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，７：５２７−３６（２００９））。米国で報告されているクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の症例数は、ＣＤＩ排出物診断での入院の比率が２００１年から２００５年までに９２％増加していることにより認められるとおり、増加している。クリンダマイシン、セファロスポリン、ペニシリンおよびフルオロキノロンを含むほとんど全ての抗生物質は、毒素産生性クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）により引き起こされる症候性疾患に関連づけられている（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｇ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．４６（１０）：１４８９−９２（２００８）；Ｇｏｒｂａｃｈ，Ｓ．Ｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３４１（２２）：１６９０−１（１９９９）；Ｋｅｌｌｙら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３０（４）：２５７−６２（１９９４））。クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患（ＣＤＡＤ）は、抗生物質関連下痢、大腸炎および偽膜性大腸炎を含み、場合によっては、中毒性巨大結腸症、敗血症および死亡へと進行しうる。この理由により、ＣＤＩは重大な医療問題である。ＣＤＡＤに罹患している幾人かの患者は抗生物質療法の中断に応答するが、ほとんどはメトロニダゾールまたはバンコマイシンのような更なる薬剤での治療を要する（ＤｕＰｏｎｔら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２１：５００−５０７（２００８）に概説されている）。既存療法は、しばしば、ＣＤＡＤを排除できずあるいは再発性疾患につながり、したがって、予防または治療の新規方法が必要とされている。
【０００６】
過去１０年にわたり、重篤または致死的な感染症の増加、標準的な治療の失敗、よりビルレントな流行性株（ＮＡＰ１／０２７／ＢＩ）の出現、益々増加している市中感染および回帰発症の頻度（〜１５から２５％と見積もられている）が、ＣＤＩに対する治療的および／または予防的治療の必要性の増大をもたらしている（Ａｓｌａｍら，Ｌａｎｃｅｔ，３６５（９４６９）：１４６４（２００５）；Ｌｏｏら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３６５（１８）：１６９３−７０３（２００６）；ＭｃＤｏｎａｌｄら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３５３（２３）：２４３３−４１（２００５）；Ｍｕｔｏ，Ｃ．Ａ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｈｏｓｐ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，２６（１）：１０−２（２００５）；Ｐｅｐｉｎら，Ｃｍａｊ，．１７１（５）：４６６−７２（２００４）；Ｚａｒら，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，４５（３）：３０２−７．（２００７））。幾つかの研究は最近、市中感染ＣＤＩの頻度が増加していることを示唆している（ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ，５７（１３）：３４０−３（２００８）；Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎら，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，．１６９（１）：１２７−３３（１９９４）；Ｋａｒｌｓｔｒｏｍら，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２６（１）：１４１−５（１９９８）；Ｋｙｎｅら，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ，３６（３）：２８７−８（１９９８）；Ｌａｍｂｅｒｔら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｈｏｓｐ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，３０（１０）：９４５−５１（２００９）；Ｎｏｒｅｎら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４２（８）：ｐ．３６３５−４３（２００４）；Ｐａｌｔａｎｓｉｎｇら，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ，１３（１１）：１０５８−６４（２００７））。
【０００７】
クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素産生性分離体は、通常、毒素Ａおよび毒素Ｂ（「ＴｃｄＡ」および「ＴｃｄＢ」）と称される２つの大きなクロストリジウム毒素をコードしており、それらは、それらの特異な大分子量（＞２５０ｋＤａ）および作用メカニズムゆえに、大クロストリジウム毒素（ＬＣＴ）と称される、より大きな毒素ファミリーの一部である（ＳｃｈｉｒｍｅｒおよびＡｋｔｏｒｉｅｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １６７３：６６−７４（２００４））。他の毒素産生株は毒素Ｂのみを発現し、毒素Ａを発現しない。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢはＣＤＩの唯一の原因因子であることが示されている。クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株の一部は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トランスフェラーゼまたはＣＤＴと称されるアクチン−ＡＤＰ−リボシル化毒素をも産生する。二成分毒素と一般に称されるこの毒素は、特に、非常にビルレントな流行性株、例えばＮＡＰ１／０２７／ＢＩに関連しており、２つのタンパク質ＣＤＴａおよびＣＤＴｂからなる。
【０００８】
ＣＤＴｂサブユニットは、酵素的に活性なＣＤＴａタンパク質の細胞質内進入を可能にする七量体環状構造を形成する。ＣＤＴａタンパク質はアルギニン１７７におけるＧ−アクチンのＡＤＰ−リボシル化を触媒し、アクチン重合を妨げる（Ｂａｒｔｈ，Ｈ．ら，Ｂｉｎａｒｙ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｏｘｉｎｓ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｎｄ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ，６８（３）：３７３−４０２（２００４））。クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）疾患の病理発生における二成分毒素の厳密な役割は十分には解明されていないが、これらの毒素は腸管毒として機能し（Ｇｅｒｉｃ，Ｂ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １９３（８）：１１４３−１１５０（２００６））、微小管の形成を誘導し、それによりクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の定着を増進することが示されており（Ｓｃｈｗａｎ，Ｃら，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ，５（１０）：ｅｌ０００６２６（２００９））、より最近になって、非二成分毒素含有株と比較して増加した死亡率に関連づけられている（Ｂａｃｃｉら，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７（６）：９７６−８２（２０１１）；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ＳＤ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，６２：３５５−６２（２０１１））。
【０００９】
クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素中和性ポリクローナル血清での受動免疫（Ｔｈｏｍａｓら，ＷＯ  ９９／２０３０４およびＷＯ  ２００５／０５８３５３を参照されたい）、毒素断片で免疫化（Ｗａｒｄら，ＷＯ  ９８／５９０５３；Ｌｙｅｒｌｙら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２１：２９−３２（１９９０）；ＷＯ  ００／／０６１７６１）およびホルマリン不活化完全天然毒素での免疫化（Ｔｏｒｒｅｓら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６３（１２）：４６１９−４６２７（１９９５）；Ｋｉｍら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５５（１２）：２９８４−２９９２（１９８７））；Ｆｅｒｎｉｅら，Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ  ５３：３２５−３２（１９８３）；Ｌｉｂｂｙら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ３６：８２２−９（１９８２）；Ｇｈｏｓｅら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７５（６）：２８２６−２８３２）を含む、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの開発に対する幾つかのアプローチが文献に記載されている。また、二成分毒素（Ｊ．Ｅ．Ｇａｌｅｎ，ＷＯ  ２０１１／０６０４３１）を含む毒素断片をコードするＤＮＡに基づくワクチンも記載されている（Ｇａｒｄｉｎｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７：３５９８−３６０４（２００９））。Ｅｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈらは、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの受容体結合ドメインを含む組換え融合タンパク質を開示している（ＷＯ２０１２／０２８７４１）。
【００１０】
また、毒性に関与する特定部位が突然変異している、組換え毒素に基づくワクチンも記載されている。ＢａｌｌａｒｄおよびＳｐｙｒｅｓは、３９５位のシステインが別のアミノ酸により置換された組換えＴｃｄＢワクチンを記載している（米国特許第７，２２６，５９７号）。酵素活性にとって重要だと記載されている他の部位は、ＴｃｄＢの１０２位のトリプトファン残基（Ｗ１０２）、およびＬＣＴが含まれるグリコシルトランスフェラーゼＡファミリーのシグネチャーモチーフである触媒性三つ組モチーフＤＸＤである（Ｂｕｓｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（１８）：１３２２８−２３４（２０００））。Ｆｅｎｇらは、毒性を排除するための単一、二重または三重突然変異を有するＴｃｄＡ毒素、および二重突然変異を有するＴｃｄＢ毒素を記載している（ＷＯ２０１１／０６８９５３）。
【発明の概要】
【００１１】
本明細書に記載されている本発明は、Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｄ２８５Ａ、Ｓ５１７Ａ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａからなる群から選択される少なくとも３つの突然変異を含む又はそれらからなる組換えクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ（ＴｃｄＡ）タンパク質に関する。本発明の好ましい実施形態においては、組換えＴｃｄＡタンパク質は、（ａ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７ＡおよびＥ５１４Ｑ；（ｂ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＷ５１９Ａ；（ｃ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＤ２８５Ａ；（ｄ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＳ５１７Ａ；ならびに（ｅ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａからなる群から選択される一組の突然変異を含む又はそれらからなる。追加的な実施形態においては、ＴｃｄＡタンパク質は実質的に精製されている。
【００１２】
本発明は更に、Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｄ２８６Ａ、Ｓ５１８Ａ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａからなる群から選択される少なくとも３つの突然変異を含む又はそれらからなる組換えクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）タンパク質に関する。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、精製ＴｃｄＢタンパク質は、（ａ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８ＡおよびＥ５１５Ｑ；（ｂ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＷ５２０Ａ；（ｃ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＤ２８６Ａ；（ｄ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＳ５１８Ａ；ならびに（ｅ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａからなる群から選択される一組の突然変異を含む又はそれらからなる。追加的な実施形態においては、ＴｃｄＢタンパク質は実質的に精製されている。
【００１３】
本発明はまた、本明細書に記載されているＴｃｄＡおよび／またはＴｃｄＢ突然変異毒素を医薬上許容される担体と共に含むワクチンおよび免疫原性組成物に関する。好ましい実施形態においては、組成物およびワクチンは、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異タンパク質を含む。組成物およびワクチンは、アジュバント、例えばアルミニウムアジュバントおよび／またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を更に含みうる。
【００１４】
本発明は更に、ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、細胞培養において発現させて組換え突然変異タンパク質を得ることによる、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異タンパク質の製造に関するものであり、組換え突然変異タンパク質は単離および／または精製されうる。本発明の特定の実施形態においては、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異毒素タンパク質は、昆虫細胞培養においてバキュロウイルス発現系を使用して製造される。
【００１５】
本発明はまた、Ｃ２Ａ、Ｙ６７Ａ、Ｙ６９Ａ、Ｙ２５３Ａ、Ｒ２５５Ａ、Ｙ２５８Ａ、Ｒ３０２Ａ、Ｑ３０７Ｅ、Ｎ３４２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｆ３５６Ａ、Ｒ３５９Ａ、Ｙ３８２Ａ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７ＱおよびＥ３８７Ｄから選択される少なくとも２つの突然変異を含む組換え二成分毒素タンパク質Ａ（ＣＤＴａ）に関する。幾つかの実施形態においては、ＣＤＴａ突然変異は、Ｃ２Ａ、Ｒ３０２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７ＱおよびＥ３８７Ｄから選択される。本発明のこの態様の実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質は、（ａ）Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；（ｂ）Ｒ３０２Ａ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７Ｄ；（ｃ）Ｃ２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；（ｄ）Ｒ３０２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；（ｅ）Ｙ６７Ａ、Ｙ６９ＡおよびＲ２５５Ａ；（ｆ）Ｒ３５９Ａ、Ｙ６７ＡおよびＱ３０７Ｅ；（ｇ）Ｙ２５８Ａ、Ｆ３５６Ａ、Ｓ３４５Ｆ；ならびに（ｈ）Ｎ３４２Ａ、Ｙ２５３ＡおよびＹ３８２Ａからなる群から選択される一組の突然変異を含む。本発明の好ましい実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質は、シグナルペプチドを欠いている。本発明の追加的実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質は実質的に精製されている。
【００１６】
本発明は更に、本明細書に記載されているＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよびＣＤＴｂタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。幾つかの実施形態においては、ヌクレオチド配列は、選択された宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはバシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）における最適な発現のためにコドン最適化されている。更に、本発明のヌクレオチド配列を含むベクターおよび宿主細胞を本発明において提供する。
【００１７】
また、本明細書に記載されているＴｃｄＡ、ＴｃｄＢおよび／またはＣＤＴａタンパク質およびクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）からの二成分毒素タンパク質Ｂ（ＣＤＴｂ）と医薬上許容される担体とを含む免疫原性組成物を本発明において提供する。本発明の好ましい実施形態においては、ＣＤＴｂタンパク質はシグナルペプチドを欠いている。追加的実施形態においては、ＣＤＴｂタンパク質は更に、活性化ドメインを欠いている。好ましい実施形態においては、組成物はＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよびＣＤＴｂタンパク質を医薬上許容される担体と共に含む。本発明の幾つかの実施形態においては、免疫原性組成物はアジュバントを更に含む。
【００１８】
本発明はまた、対応ヌクレオチドの配列の発現を可能にする条件下、ＣＤＴａまたはＣＤＴｂタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターで細胞を形質転換してＣＤＴａまたはＣＤＴｂタンパク質を産生させることを含む、ＣＤＴａまたはＣＤＴｂタンパク質の製造方法に関する。
【００１９】
また、本発明の免疫原性組成物またはワクチンの有効量を患者に投与することを含む、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の治療および／または予防方法を本発明において提供する。
【００２０】
本明細書の全体および添付の特許請求の範囲において用いる単数形“ａ”、“ａｎ”、及び“ｔｈｅ”は、文脈に明らかに矛盾しない限り、複数形を含む。
【００２１】
本出願の全体にわたり、「含む」なる語は非限定的であり、他の要素、例えば突然変異の追加を許容する。１つの実施形態においては、本出願の全体における「含む」なる語は、「からなる」または「から実質的になる」でありうる。幾つかの場合には、「からなる」なる語は、「からなる」なる語を伴う実施形態の可能性を強調するために用いられている。
【００２２】
ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢのいずれにも具体的には言及されていない、本明細書の全体にわたる毒素突然変異の全般的考察においては、アミノ酸残基の番号づけは、特に示されていない限りＴｃｄＢに関する適切な番号づけを意味する（ＴｃｄＡに特に向けられているテキストはＴｃｄＡに関する適切な番号づけを示し、ＴｃｄＢに特に向けられているテキストはＴｃｄＢに関する適切な番号づけを示す）。残基番号１３の後のＴｃｄＡにおける単一アミノ酸欠失のため（ＴｃｄＢに対して；ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢのアライメントは図１６を参照されたい）、毒素Ａの突然変異に関する残基番号づけは毒素Ａに関しては毒素Ｂに対して１単位だけずれる（すなわち、ＴｃｄＡでは、本明細書に記載されている突然変異に関する残基番号づけはＴｃｄＢに対してｎ−１である；例えば、ＴｃｄＢにおけるＷ１０２はＴｃｄＡにおけるＷ１０１である）。例外はＴｃｄＡにおけるシステイン突然変異Ｃ７００Ａであり、ＴｃｄＡのシステインプロテアーゼドメイン内の追加的な３つの残基の存在のため、これはＴｃｄＢにおいてはＣ６９８Ａである（図１６を参照されたい）。
【００２３】
本明細書および添付の特許請求の範囲の全体においては、以下の定義および略語が用いられる。
【００２４】
「ＴｃｄＡ」および「ＴｃｄＢ」は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素産生性分離体からの大きなクロストリジウム毒素であるそれぞれ毒素Ａおよび毒素Ｂ、ならびに本明細書に記載されているそれらの突然変異体および誘導体を意味する。「ＴｃｄＡ」および／または「ＴｃｄＢ」に対する言及は、発現系としてクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を使用してタンパク質が産生されることを必要とするものではなく、すなわち、本明細書に記載されているとおり、異なる発現系が使用されうる。
【００２５】
「ＣＤＴａ」および「ＣＤＴｂ」は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トランスフェラーゼまたはＣＤＴと称され二成分毒素としても公知であるアクチン−ＡＤＰ−リボシル化毒素からのそれぞれサブユニットタンパク質ＡおよびＢである。本明細書において定義されているとおり、「ＣＤＴａ」および「ＣＤＴｂ」は、本明細書に記載されている天然または野生型ＣＤＴａおよびＣＤＴｂの突然変異体および誘導体を含む。「ＣＤＴａ」および／または「ＣＤＴｂ」に対する言及は、発現系としてクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を使用してタンパク質が産生されることを必要とするものではなく、すなわち、本明細書に記載されているとおり、異なる発現系が使用されうる。
【００２６】
突然変異体は、本明細書においては一般に以下のとおりに称される：３個の点突然変異を有する毒素Ａ（３ｍＴｃｄＡ）、３個の点突然変異を有する毒素Ｂ（３ｍＴｃｄＢ）、４個の点突然変異を有する毒素Ａ（４ｍＴｃｄＡ）、４個の点突然変異を有する毒素Ｂ（４ｍＴｃｄＢ）、５個の点突然変異を有する毒素Ａ（５ｍＴｃｄＡ）および５個の点突然変異を有する毒素Ｂ（５ｍＴｃｄＢ）。
【００２７】
二成分毒素Ａの具体的な突然変異体は、以下のとおりに称される。３ｍＣＤＴａ１は、突然変異Ｒ３０２Ａ、Ｅ３８５ＡおよびＥ３８７Ｄを有する、シグナルペプチドを伴わないＣＤＴａを意味する。３ｍＣＤＴａ２は、突然変異Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑを有する、シグナルペプチドを伴わないＣＤＴａを意味する。４ｍＣＤＴａ３は、突然変異Ｒ３０２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑを有する、シグナルペプチドを伴わないＣＤＴａを意味する。３ｍＣＤＴａ４は、突然変異Ｙ６２Ａ、Ｙ６９ＡおよびＲ２５５Ａを有する、シグナルペプチドを伴わないＣＤＴａを意味する。３ｍＣＤＴａ５は、突然変異Ｒ３５９Ａ、Ｙ６２ＡおよびＱ３０７Ｅを有する、シグナルペプチドを伴わないＣＤＴａを意味する。３ｍＣＤＴａ６は、突然変異Ｙ２５８Ａ、Ｆ３５６ＡおよびＳ３４５Ｆを有する、シグナルペプチドを伴わないＣＤＴａを意味する。３ｍＣＤＴａ７は、突然変異Ｎ３４２Ａ、Ｙ２５３ＡおよびＹ３８２Ａを有する、シグナルペプチドを伴わないＣＤＴａを意味する。４ｍＣＤＴａ８は、突然変異Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ３８７ＱおよびＣ２Ａを有する、シグナルペプチドを伴わないＣＤＴａを意味する。シグナルペプチドを伴わないＣＤＴａ（すなわち、突然変異無し）、３ｍＣＤＴａ１および３ｍＣＤＴａ２に関する、ＮＡＰ１株Ｒ２０２９から得られた参照配列は、それぞれ、配列番号３８、配列番号４０および配列番号４２として示されている（図１３を参照されたい）。Ｎａｐ株から誘導された４ｍＣＤＴａ８の参照配列は、配列番号６７として示されている。本明細書に記載されている研究に用いたＣＤＴａおよびＣＤＴａの突然変異体の実際のアミノ酸配列は、配列番号３８、４０、４２および６７に示されている配列と比較すると、追加的なＮ末端メチオニンを含有していた。本発明のＣＤＴａ配列を得るのに有用な参照配列に関しては、当業者は、二成分毒素を発現する他の株からのＣＤＴａ配列も３ｍＣＤＴａ１、３ｍＣＤＴａ２または４ｍＣＤＴａ８のバックボーン配列を提供することが可能であり、そのような配列は、与えられたＮＡＰ１参考株配列からの小さな変異を有しうると認識するであろう。ＣＤＴａの残基番号づけは、天然ＣＴＤａアミノ酸配列からシグナルペプチドが除去された後のＮ末端残基（ＮＡＰ１参考株においてはバリン）から始まる（図１５を参照されたい）。
【００２８】
本明細書中で用いる他の略語には以下のものが含まれる：ｂｍ＝バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）発現系；ｂｖ＝バキュロウイルス発現系；ｃｄ＝クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）発現系；ｅｃ＝大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現系；ＮＡＰ＝ＮＡＰ１／０２７／ＢＩ１７株；ＶＰＩ＝ＶＰＩ１０４６３株。
【００２９】
「有効量」は、所望の効果を得るために、例えば、患者におけるクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する免疫応答を誘導するためにまたはクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を予防するために、十分なワクチンまたは免疫原性組成物が患者に導入されることを意味する。当業者は、このレベルは変動しうるものと認識する。
【００３０】
「ＭＡＡ」は無定形アルミニウムヒドロキシホスファートスルファートアジュバントを意味する。
【００３１】
本明細書中で用いる「ＩＳＣＯＭ型アジュバント」は、その機能に寄与する特有の球状籠状構造を有する特徴的な籠状粒子を一緒になって形成する、サポニン、コレステロールおよびリン脂質から構成される免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）を含むアジュバントである（総説としては、ＢａｒｒおよびＭｉｔｃｈｅｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７４：８−２５（１９９６）を参照されたい）。この語は、抗原を使用して製造されたＩＳＣＯＭ粒子内に抗原を含むＩＳＣＯＭアジュバント、および抗原を使用しないで製造されたＩＳＣＯＭ型アジュバントを中空にしたＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントの両方を含む。
【００３２】
本明細書中で用いる「単離（された）」なる語は、天然で見出されるものとは異なる形態を示す。タンパク質（ポリペプチド）または核酸の異なる形態は、例えば、天然で見出されるものとは異なる純度でありうる。１つの実施形態においては、この語は、文脈に応じて、天然状態で通常付随する成分を実質的または本質的に含有しないタンパク質または核酸に関するものである。
【００３３】
本明細書中で用いる「誘導体」なる語は、参照配列（例えば、本明細書に記載されているＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａまたはＣＤＴｂ配列）と比較した場合のアミノ酸配列における変化（アミノ酸残基の付加および欠失を含む）および／または化学修飾でありうる１以上の改変を有するポリペプチドを意味する。好ましい実施形態においては、誘導体は改変前の元の参照配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一である。一般に、誘導体は参照配列の活性（例えば、免疫応答の誘導）を保有する。本明細書中で用いる「誘導体」なる語は野生型または天然参照配列の誘導体に限定されず、参照配列としての突然変異体配列の誘導体を含む。好ましい実施形態においては、いずれかの特定の参照配列の突然変異が維持されているが、誘導体配列においては、参照配列の特定の突然変異以外のアミノ酸残基における突然変異参照配列に対する改変／修飾が含まれる。本明細書中で用いる「誘導体」なる語は、参照ヌクレオチド配列に対する１以上の改変を有するポリヌクレオチドをも含む。
【００３４】
１つの実施形態においては、誘導体は、それが由来する塩基配列とは１以上のアミノ酸置換により異なっているアミノ酸配列であるポリペプチドである。アミノ酸置換は、「保存的」［すなわち、該アミノは、アミノ酸の同一クラス（無極性、極性／中性、酸性および塩基性）からの異なるアミノ酸、概ね類似した特性または類似構造（脂肪族、ヒドロキシルまたは硫黄含有、環状、芳香族、塩基性および酸性）を有するアミノ酸で置換されている］または「非保存的」（すなわち、該アミノ酸は、異なるタイプのアミノ酸で置換されている）でありうる。大まかに言えば、ポリペプチドの生物活性を改変することなく、より少数の非保存的置換が可能であろう。本発明の幾つかの実施形態は、２５アミノ酸以下の残基、２０アミノ酸以下の残基、１５アミノ酸以下の残基、１２アミノ酸以下の残基、１１アミノ酸以下の残基、１０アミノ酸以下の残基、９アミノ酸以下の残基、８アミノ酸以下の残基、７アミノ酸以下の残基、６アミノ酸以下の残基、５アミノ酸以下の残基、４アミノ酸以下の残基、３アミノ酸以下の残基、２アミノ酸以下の残基または１アミノ酸の残基が参照配列に対して置換されている誘導体を含む。
【００３５】
もう１つの実施形態においては、誘導体は、それが由来する塩基配列とは、任意の組合せでの１以上のアミノ酸の欠失および／または付加を有することにより異なっているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。欠失または付加アミノ酸は連続的又は個別の残基でありうる。幾つかの実施形態においては、２５アミノ酸以下の残基、２０アミノ酸以下の残基、１５アミノ酸以下の残基、１２アミノ酸以下の残基、１０アミノ酸以下の残基、８アミノ酸以下の残基、７アミノ酸以下の残基、６アミノ酸以下の残基、５アミノ酸以下の残基、４アミノ酸以下の残基、３アミノ酸以下の残基、２アミノ酸以下の残基または１アミノ酸の残基が参照配列に対して欠失または付加している。
【００３６】
もう１つの実施形態においては、誘導体は、それが由来する塩基配列とは、タンパク質の化学修飾の１以上を有することにより異なっているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。化学修飾には、官能基の修飾（例えば、アルキル化、ヒドロキシル化、リン酸化、チオール化、カルボキシル化など）、タンパク質合成中の非天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体の組込み、ならびにポリペプチドにコンホメーション拘束を課す架橋剤および他の方法の使用が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
参照配列（例えば、配列番号４４または６７）と誘導体との相違の度合を決定するためには、当技術分野で公知の任意の方法が用いられうる。１つの実施形態においては、関連性を決定するために配列同一性が用いられる。本発明の誘導体は参照配列（例えば、配列番号４４）に対して少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一である。同一性（％）は、同一残基の数を残基の総数で割り算し１００を掛けたものとして定義される。アライメントにおける配列が（ギャップまたは伸長により）異なる長さのものである場合、最長配列の長さが計算において用いられ、全体の長さの値を表す。有利には、参照配列に対する配列の関連性は、例えば、ＧＡＰコンピュータプログラム・バージョン６．０（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能）のような配列解析ソフトウェアを使用して配列情報を比較することにより決定されうる。ＧＡＰプログラムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１）により修正されたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）アライメント法を用いる。
【００３８】
追加的実施形態においては、関連性を決定するためにハイブリダイゼーションが用いられる。本発明の誘導体をコードする核酸は、高ストリンジェント条件下で参照配列をコードする核酸にハイブリダイズするであろう。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは当業者により容易に決定され、一般に、プローブ長、洗浄温度および塩濃度に左右される経験的計算である。
【００３９】
「医薬上許容される担体」は、投与を促進する物質を意味する。具体例には、液体充填剤、希釈剤、または全身投与に安全に使用されうる他の物質が含まれる。特定の投与経路に応じて、当技術分野でよく知られている種々の医薬上許容される担体が使用されうる。これらの担体は、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水、乳化剤、等張生理食塩水および発熱物質非含有水を含む群から選択されうる。特に、医薬上許容される担体は、バッファー、注射用無菌水、正常生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水、スクロース、ヒスチジン、塩およびポリソルベートのような種々の成分を含有しうる。「生理的に許容される」、「希釈剤」または「賦形剤」のような語は互換的に用いられうる。
【００４０】
「ＰＤ」は「投与後」を意味し、「ＰＤ１」、「ＰＤ２」、「ＰＤ３」などは「用量１の投与後」、「用量２の投与後」、「用量３の投与後」などを意味する。
【００４１】
発明の詳細な説明
本発明は、毒素酵素活性を有意に低減または排除しハムスターチャレンジモデルにおける原型クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からのクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子でのチャレンジに対する防御の付与に有効である特異的突然変異を含む組換えＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異毒素、ならびに該毒素を含むワクチンおよび免疫原性組成物を含む。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢはＣＤＩの唯一の原因因子であるため、これらの毒素はこの疾患の予防および／または治療のための望ましい標的である。これらの毒素での対象のワクチン接種は、該対象におけるこれらの分子の毒性作用を中和する防御抗体の産生を潜在的に誘導しうるであろう。しかし、これらの毒素でのワクチン接種は、タンパク質に関連した毒性が排除され又は劇的に低減されない限り、ヒトにとって安全ではない。本出願人は、毒性を有意に低減し、そして好ましくは排除する突然変異およびそれらの組合せを特定し、同時に、これらの突然変異を含有する毒素は、免疫原性を誘導する能力を保有することを特定した。
【００４２】
本発明はまた、組換えＣＤＴａおよびＣＤＴｂ毒素タンパク質、ならびに突然変異ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢと該毒素を組み合わせて含むワクチンおよび免疫原性組成物を含み、ここで、該ＣＤＴａ毒素タンパク質は、毒素酵素活性を有意に低減または排除する特異的突然変異を含む。本明細書に記載されているＣＤＴａおよびＣＤＴｂ毒素タンパク質を含むワクチンおよび組成物は、ハムスターチャレンジモデルにおける流行性クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からのクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子でのチャレンジに対する防御をもたらすのに有効である（実施例１１を参照されたい）。
【００４３】
構造的には、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢは、Ｎ末端の酵素ドメイン（ＥＤ）、システインプロテアーゼドメイン（ＣＰＤ）、トランスロケーションドメイン（ＴＤ）およびＣ末端の結合ドメイン（ＢＤ）から構成される（図１を参照されたい）。ＥＤは小Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼを不活性化して、細胞性細胞骨格の劇的な不可逆的変化をもたらし、最終的にはアポトーシスにより罹患細胞の死を招く（Ｇｅｒｈａｒｄら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５７：７６５−７７０（２００８）；Ｓｐｙｒｅｓら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７１（６）：３２９４−３３０１（２００３）；Ｂｕｓｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（３１）：１９５６６−１９５７２（１９９８））。ＣＰＤは、ＥＤの自己触媒的切断をもたらす。ＴＤは細胞質内へのＥＤのトランスロケーション、およびそれに続く細胞表面へのＢＤの結合を引き起こす。トランスロケーションはエンドサイトーシス経路によるものであり、それにより、ＴＤは後期エンドソームの酸性化の際にそのコンホメーションを変化させ、細胞質内へのＥＤの進入を可能にする孔を形成すると考えられている。ＢＤは、クロストリジウム反復性オリゴペプチド（ＣＲＯＰ）から構成される多価反復性受容体結合ドメインである。ＣＲＯＰＳは表面炭水化物（例えば、ルイスＸおよびルイスＹ）に結合し、毒素の結合およびエンドサイトーシスを引き起こす。これらの反復は高度に免疫原性であり、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対するワクチンの標的となっている。
【００４４】
ＬＣＴファミリーは、現在、以下の５つのメンバーを含む：ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ（クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））、ＴｃｎＡ（クロストリジウム・ノビイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉ））、ＴｃｓＬ（クロストリジウム・ソルデリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ））およびＴｐｅＬ（クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））。これらの毒素は類似した有機体、基質（ＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼ）、補基質（ＵＰＤ−グルコース、ＵＤＰ−ＮＡｃグルコサミン）および補因子（ＭｎＩＩ）を共有する。それらの相互配列同一性は２９〜７６％の範囲であるが、触媒残基および酵素ドメインの活性部位に沿って並ぶ残基は、ほぼ１００％保存され（図２を参照されたい）、機械学的に統一体である。ＴｃｓＬ、ＴｃｎＡおよびＴｃｄＢの酵素ドメインは結晶化されており（Ｒｅｉｎｅｒｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５１：９７３−８１（２００）；Ｚｉｅｇｌｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７７：１３４６−５６（２００７））、それらの構造はほぼ同一である。また、ＴｃｄＡの酵素ドメインの結晶構造が最近公開された（Ｐｒｕｉｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：８０１３−８０２０（２０１２））。ＴｃｄＡは、他のＬＣＴファミリーメンバーに類似した構造を実際に有することが示された。特に、毒素のコアの構造（ＵＤＰ結合および触媒活性）はＴｃｄＡに比べて保存されているが、表面は多岐にわたる。
【００４５】
一般に、毒素の突然変異誘発は既に記載されている。特に、幾つかの研究は、１０２位のトリプトファン残基（Ｗ１０２）、およびＬＣＴが含まれるグリコシルトランスフェラーゼＡファミリーのシグネチャーモチーフである三つ組触媒基モチーフＤＸＤに関連した研究を記載している。Ｗ１０２Ａ突然変異の最初の記載はＢｕｓｃｈら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（１８）：１３２２８−２３４（２０００））によるものであり、これはＴｃｓＬ触媒ドメインに焦点を合わせていた。その研究において、野生型断片と比較してＷ１０２Ａはグリコシル化活性を約１，０００倍低減し、Ｗ１０２Ｙは活性を１００倍低減することが観察され、このことは、ウラシル環の芳香性スタッキングがこの残基の考えられうる機能であることを示唆している。Ｂｕｓｃｈらは、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ｒＴｃｄＢ  Ｗ１０２Ａ断片がグリコシル化アッセイにおいて野生型断片より遥かに低い活性を有することが判明した、と簡潔に記載している。該著者は、酵素活性におけるこの低減が補基質に対する結合アフィニティの低減によるものだと結論づけている。Ｔｅｉｃｈｅｒｔら（Ｉｎｆｅｃｔ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ．７４：６００６−６０１０（２００６））は、組換え完全長ＴｃｄＡにおけるＷ１０１Ａ突然変異がインビトロ系（ＲｈｏＡ−グルコシル化；後記を参照されたい）においてグルコシルトランスフェラーゼ活性を３８０倍低減し、Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３繊維芽細胞上で細胞変性活性を５０倍低減することを開示している。突然変異毒素の濃度の５０倍の増加は完全な細胞毒性を回復させた。最後に、Ｇｅｒｈａｒｄら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５７，７６５−７７０（２００８））は完全長Ｗ１０１Ａ  ＴｃｄＡ突然変異体のアポトーシス作用を調べた。野生型ＴｃｄＡは１ｎＭの濃度でアポトーシスを誘導しうるが、Ｗ１０１Ａ突然変異体で処理された細胞はアポトーシスの最小限度の徴候を示すに過ぎない。しかし、ＴｃｄＡ  Ｗ１０１Ａ突然変異体の濃度を５０倍増加させると、細胞は野生型に類似したレベルのアポトーシスを示した。毒素Ｂの突然変異誘発はＪａｎｋら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（４８）：３５２２２−３５２３１（２００７））およびＢａｒｒｏｓｏら（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  １６：２９７−３０３（１９９４））によっても記載されている。また、特定の突然変異毒素がＳｉｄｈｕらにより記載されている（米国特許出願公開第２０１２／０２６９８４１号）。
【００４６】
ＤＸＤモチーフは、ＭｎＩＩ、ＵＤＰおよびグルコースの結合、配向および分極に関与するため、酵素活性に必須である。Ｄ２８８残基は、ＭｎＩＩに直接結合する。Ｄ２８６は、一般塩基（例えば、補基質を加水分解する水分子）、ＵＤＰおよびグルコースと相互作用する。Ｂｕｓｃｈらは、ＴｃｓＬの触媒ドメイン断片内のこの部位に対する突然変異を記載している（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３：１８５６６−１９５７２（１９９８））。２８６または２８８位のアスパラギン酸をアラニンまたはアスパラギンで置換すると、グルコシル化活性がインビトロアッセイにおいて約５，０００倍低減することが判明した（Ｂｕｓｃｈら，１９９８，前掲）。Ｄ２８６Ａ／Ｄ２８８Ａ二重突然変異体では酵素活性は観察されなかった。ＤＸＤモチーフ内のアスパラギン酸残基がアラニンに変化された場合、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ断片に関する類似した抑制が観察された。また、高濃度のＭｎＩＩの存在下、ＴｃｓＬ  Ｄ２８８Ａ酵素の活性が約２０倍増加して、活性における数百倍の低減を尚ももたらしたことが開示された（Ｂｕｓｃｈら，１９９８，前掲）。高いＭｎＩＩ濃度は二重突然変異体の活性をモジュレーションしなかった。Ｔｅｉｃｈｅｒｔら（２００６）は、完全長Ｄ２８５／２８７Ｎ二重突然変異体で、野生型ＴｃｄＡと比較して、インビトロ活性における比較しうる６，９００倍の増加を観察した。最後に、Ｇｅｒｈａｒｄらは、ＴｃｄＡ  Ｄ２８５Ａ／Ｄ２８７Ａ二重突然変異体がアポトーシスを誘導し得ないことを示した（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５７：７６５−７７０（２００８））。
【００４７】
理論により束縛されることを望むものではないが、ＬＣＴの活性部位の精査に基づいて、本発明者らは、１０２位における大きな芳香環の除去（Ｗ１０２Ａ）が、（芳香的スタッキングによる）補基質のＵＤＰ環に関する結合エネルギーの正味の喪失をもたらし、より低い触媒ターンオーバーを有する酵素を与えると仮定した。これは、アラニンをその位置でチロシンに置換することによっては部分的にしか回復しない。なぜなら、チロシンのフェノール環はトリプトファンのインドール二重環より遥かに小さく、したがって、より低い結合エネルギーを与えるからである。ＤＸＤモチーフ内のアスパラギン酸残基の一方または両方の突然変異はＬＣＴの酵素活性に顕著な効果を及ぼした。なぜなら、活性部位は、ＭｎＩＩ補因子の結合および分極、そして最終的にはＵＤＰ−グルコース内のＯ−グリコシド結合の加水分解に関与する決定的に重要な残基を欠いているからである。したがって、Ｗ１０２／１０１ポケットおよびＤＸＤモチーフ内の突然変異を組み合わせることにより、補基質に結合しそれを分極させるそれらの能力が著しく損なわれるため、野生型の活性の一部しか示さない酵素が得られると推論された。
【００４８】
完全長の遺伝的に不活性なＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ、ならびにバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）におけるそれらの発現は、ＷＯ  ２０１１／０６８９５３に記載されている。特に、ＷＯ  ２０１１／０６８９５３は、突然変異Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７ＮおよびＷ５１９Ａを含む突然変異ＴｃｄＡ、ならびに突然変異Ｗ１０２ＡおよびＤ２８８Ｎを含む突然変異ＴｃｄＢを記載している。これらの毒素はマウスにおいて評価されたが、ワクチン接種後の有害事象に関して動物が評価されたかどうかは不明である。
【００４９】
本発明者らは、３つの突然変異（３ｍＴｃｄＡ；Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ）および（３ｍＴｃｄＢ；Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ）をそれぞれが含有するＴｃｄＡおよびＴｃｄＢからなるワクチンは、このワクチンがホルムアルデヒドで更に不活化されなければハムスターおよびサルにおいて許容できない毒性（局所炎症および腫脹）を引き起こすことを見出した。毒性を更に低下させるために、本明細書に記載され図３Ａおよび３Ｂに示されているとおり、３つの追加的突然変異を株ＶＰＩ１０４６３からのＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの触媒ドメイン内に別々に導入した。特に、Ｅ５１４／５１５（ＴｃｄＡ／ＴｃｄＢ）の部位ＭｎＩＩへの立体的等価結合に対する突然変異、ならびにＯ−グリコシド結合の分極に影響を及ぼすＳ５１７／５１８位およびＷ５１９／５２０位（ＴｃｄＡ／ＴｃｄＢ）における突然変異を試験した。また、単一アミノ酸欠失突然変異体も構築し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させた。
【００５０】
本出願における図５および実施例２に示されているとおり、４ｍＴｃｄＢに関しては、ＲｈｏＡ  グルコシル化アッセイを用いて分析された場合、残留酵素活性がないことは明らかであった。この第４突然変異の付加にもかかわらず、動物の免疫化の後、残留毒素が尚も観察された。したがって、トランスロケーションドメインからの触媒ドメインの切断をもたらして細胞質内へのその遊離を可能にするシステインプロテアーゼの鍵残基である第５突然変異Ｃ７００Ａ／６９８Ａを導入した。この突然変異の導入はＴｃｄＢの毒性における更に１０倍の低減を招く。
【００５１】
突然変異ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢトキソイド
前記のとおり、本明細書に記載されている実験は、３、４または５個の突然変異を含むクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）突然変異毒素が種々のレベルでタンパク質の毒性の低減を示すことを示している。その目的のために、本発明は、部分的には、タンパク質の毒性を排除するように意図された少なくとも３つの突然変異を含む単離および／または精製された組換えＴｃｄＡタンパク質に関する。本発明は更に、タンパク質の毒性を排除するように意図された少なくとも３つの突然変異を含む単離および／または精製された組換えＴｃｄＢタンパク質に関する。本発明の好ましい実施形態においては、本発明の組換えＴｃｄＡおよびＴｃｄＢタンパク質は、毒性を排除するように意図された少なくとも４つの突然変異または少なくとも５つの突然変異を含む。少なくとも３つの突然変異を含むＴｃｄタンパク質は更に、化学的手段、例えばホルムアルデヒド不活化により解毒されうる。
【００５２】
本発明の幾つかの実施形態においては、ＴｃｄＡ突然変異体は、Ｗ１０１、Ｄ２８７、Ｅ５１４、Ｄ２８５、Ｓ５１７、Ｗ５１９およびＣ７００からなる群から選択されるアミノ酸残基における少なくとも３つ、少なくとも４つ又は少なくとも５つの突然変異を含む又はそれらからなるクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａタンパク質（ＴｃｄＡ）を含む。追加的な実施形態において、ＴｃｄＡ突然変異体は、Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｄ２８５Ａ、Ｓ５１７Ａ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａ置換ならびにＷ１０１欠失からなる群から選択される少なくとも３つ、少なくとも４つ又は少なくとも５つの突然変異を含む又はそれらからなる。
【００５３】
突然変異の導入のための基礎となる天然クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａタンパク質配列は、任意のクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株、例えばＮＡＰ１／０２７／ＢＩ（「ＮＡＰ」）またはＶＰＩ  １０４６３に由来するものでありうる。本発明の好ましい実施形態においては、該ＴｃｄＡ突然変異体は、ＶＰＩ  １０４６３株から得られたアミノ酸配列を含む。本発明におけるＴｃｄＡ突然変異体配列のバックボーンを形成しうる典型的なＴｃｄＡアミノ酸配列（すなわち、本明細書において特定されている突然変異は、特定されている位置において参照「バックボーン」配列に対して施されうる）には、配列番号９４（ＶＰＩ１０４６３株、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ６３５６４）、配列番号９５（株６３０（毒型（ｔｏｘｉｎｏｔｙｐｅ）０、リボタイプ０１２））、配列番号９６（ＳＥ８４４（毒型ＩＩＩａ、リボタイプ０８０））、配列番号９７（Ｒ１２０８７（ＮＡＰ１））、配列番号９８（Ｋ１４（毒型０、リボタイプ０５３））、配列番号９９（ＢＩ６（ＮＡＰ１））、配列番号１００（ＢＩ１７（ＮＡＰ１））、配列番号１０１（ＣＨ６２３０（毒素ＩＩＩｃ））および配列番号１０２（ＳＥ８８１（毒型Ｖ、リボタイプ０６６））に記載されているアミノ酸配列が含まれる。また、突然変異参照配列の突然変異を保有する突然変異ＴｃｄＡタンパク質の誘導体が、本発明の範囲内に含まれる。例えば、Ｗ１０１Ａ置換を含む又はそれからなるＶＰＩ参考株から誘導された突然変異ＴｃｄＡタンパク質の誘導体はＷ１０１Ａ置換を維持するが、他の位置におけるＶＰＩアミノ酸参照配列に対する改変／修飾を含みうる。
【００５４】
本発明の特定の実施形態は、アミノ酸置換Ｗ１０１、Ｄ２８７ＡおよびＥ５１４Ｑを含む又はそれらからなるＴｃｄＡタンパク質を提供する。もう１つの実施形態は、アミノ酸置換Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＷ５１９Ａを含む又はそれらからなるＴｃｄＡタンパク質を含む。本発明のもう１つの特定の実施形態は、アミノ酸置換Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａを含む又はそれらからなるＴｃｄＡタンパク質である。
【００５５】
本明細書に記載されている本発明の別の実施形態においては、ＴｃｄＡタンパク質は突然変異Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＤ２８５Ａを含む又はそれらからなる。もう１つの別の実施形態は、突然変異Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＳ５１７Ａを含む又はそれらからなるＴｃｄＡタンパク質を提供する。これらの別の実施形態のいずれか又は本明細書に記載されているいずれかの他の実施形態においては、もう１つの突然変異、例えばＣ７００Ａ突然変異がＴｃｄＡタンパク質に付加されうる。本発明の追加的実施形態においては、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個までの更なる突然変異が、本明細書に記載されているＴｃｄＡ実施形態のいずれかに付加されうる。
【００５６】
本発明の特定の実施形態においては、突然変異ＴｃｄＡタンパク質は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２５または配列番号３５に記載されているアミノ酸配列を含む、それらからなる、またはそれらから実質的になる。
【００５７】
本発明の別の実施形態においては、ＴｃｄＡタンパク質は、本明細書に記載されているいずれかのアミノ酸残基位置（すなわち、Ｗ１０１、Ｄ２８７、Ｅ５１４、Ｄ２８５、Ｓ５１７、Ｗ５１９およびＣ７００）に突然変異を含む、それらからなるまたはそれらから実質的になり、ここで、特定されたアミノ酸残基は、天然配列内に存在しないいずれかの他のアミノ酸残基で置換され、例えば、１０１位のトリプトファンはトリプトファン以外のいずれかの残基で置換され、２８７位のアスパラギン酸はアスパラギン酸以外のいずれかのアミノ酸残基で置換される。例えば、本発明の別の実施形態は、Ｗ１０１、Ｄ２８７、Ｅ５１４、Ｗ５１９およびＣ７００位に突然変異を含む又はそれらからなる配列番号２６（５ｍＴｃｄＡ：Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９Ａ、Ｃ７００Ａ）により定められるＴｃｄＡ配列の変異体を含み、ここで、配列番号７０に記載されているとおり、Ｗ１０１はトリプトファン以外のいずれかのアミノ酸で置換され、Ｄ２８７はアスパラギン酸以外のいずれかのアミノ酸で置換され、Ｅ５１４はグルタミン酸以外のいずれかのアミノ酸で置換され、Ｗ５１９はトリプトファン以外のいずれかのアミノ酸で置換され、Ｃ７００はシステイン以外のいずれかのアミノ酸で置換される。
【００５８】
好ましい実施形態においては、記載されているアミノ酸残基（Ｗ１０１、Ｄ２８７、Ｅ５１４、Ｄ２８５、Ｓ５１７、Ｗ５１９およびＣ７００）は、Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｄ２８５Ａ、Ｓ５１７Ａ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａにより定められる突然変異と同じクラス内の又は構造において類似しているアミノ酸残基で置換される。例えば、好ましい実施形態においては、１０１位のトリプトファンは、アラニンと類似した構造を有する又は同じクラス内のアミノ酸で置換される。
【００５９】
本発明の追加的実施形態においては、突然変異ＴｃｄＡタンパク質は、以下に示すアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから実質的になる。
【化１】
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【００６０】
追加的実施形態においては、突然変異ＴｃｄＡタンパク質は、本明細書に記載されているＴｃｄＡタンパク質の誘導体、例えば、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３５または配列番号７０に記載されているアミノ酸配列を含むＴｃｄＡタンパク質の誘導体である。そのような誘導体は、元の参照配列（例えば、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３５または配列番号７０）に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。更なる実施形態においては、本発明は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３５または配列番号７０に対する１２アミノ酸以下の残基、１１アミノ酸以下の残基、１０アミノ酸以下の残基、９アミノ酸以下の残基、８アミノ酸以下の残基、７アミノ酸以下の残基、６アミノ酸以下の残基、５アミノ酸以下の残基、４アミノ酸以下の残基、３アミノ酸以下の残基、２アミノ酸以下の残基または１アミノ酸の残基に対する修飾／改変（例えば、置換）を含むＴｃｄＡタンパク質誘導体を含む。
【００６１】
本発明はまた、Ｗ１０２、Ｄ２８８、Ｅ５１５、Ｄ２８６、Ｓ５１８、Ｗ５２０およびＣ６９８からなる群から選択されるアミノ酸残基における少なくとも３つ、少なくとも４つ又は少なくとも５つの突然変異を含む又はそれらからなるクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂタンパク質を含むＴｃｄＢ突然変異体に関する。本発明の実施形態においては、ＴｃｄＢ突然変異タンパク質は、Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｄ２８６Ａ、Ｓ５１８Ａ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａ置換ならびにＷ１０２欠失からなる群から選択される少なくとも３つ、少なくとも４つ又は少なくとも５つの突然変異を含む又はそれらからなる。
【００６２】
突然変異の導入のための基礎となる天然クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂタンパク質配列は、任意のクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株、例えばＮＡＰ１／０２７／ＢＩ（「ＮＡＰ」）またはＶＰＩ  １０４６３に由来するものでありうる。本発明におけるＴｃｄＢ突然変異体配列のバックボーンを形成しうる典型的なＴｃｄＢアミノ酸配列（すなわち、本明細書において特定されている突然変異は、特定されている位置において参照「バックボーン」配列に対して施されうる）には、配列番号８６（ＱＣＤ−６３ｑ４２（リボタイプ００１，ＮＡＰ２）、ＮＣＢＩ参照配列：ＺＰ ０５３２８７４４．１０）；配列番号８７（ＮＡＰ８，ＮＣＢＩ参照配列：ＺＰ ０６８９１２２８．１）、配列番号８８（ＱＣＤ−２３ｍ６３（リボタイプ０７８、毒型Ｖ）、ＮＣＢＩ参照配列：ＺＰ ０５４００１１３．１）、配列番号８９（ＣＤ１９６（ＮＡＰ１，０２７，毒型ＩＩＩ）、ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ ００３２１３６３９．１）；配列番号９０（１４７０（リボタイプ０１７、毒型ＶＩＩＩ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＡＡ８０８１５．１）、配列番号９１（８８６４（リボタイプ０３６、毒型Ｘ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＡＣ１９８９１．１）、配列番号９２（５３４０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＧ１８０１１．１）および配列番号９３（ＶＰＩ１０４６３（リボタイプ０８７、毒型０）、ＮＣＢＩ参照配列：ＺＰ ０５３４９８２４．１）に記載されている配列が含まれる。当業者は、いずれかのクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株において、特定された位置に所望の突然変異を導入しうるであろう。
【００６３】
本発明の１つの実施形態においては、ＴｃｄＢ突然変異タンパク質は、ＮＡＰ１株から得られるアミノ酸配列（例えば、配列番号２８に記載されているアミノ酸配列を含む、それらからなる又はそれらから実質的になるＴｃｄＢ突然変異タンパク質５ｍＴｃｄＢ）を含む。別の実施形態においては、ＴｃｄＢ突然変異タンパク質は、ＶＰＩ株から得られるアミノ酸配列（例えば、配列番号５８に記載されているアミノ酸配列を含む、それらからなる又はそれらから実質的になるＴｃｄＢ突然変異タンパク質５ｍＴｃｄＢ）を含む。また、突然変異参照配列の突然変異を保有する突然変異ＴｃｄＢタンパク質の誘導体も本発明の範囲内に含まれる。例えば、Ｗ１０２Ａ置換を含む又はそれらからなるＮＡＰ１参考株から誘導された突然変異ＴｃｄＢタンパク質の誘導体はＷ１０２Ａ置換を維持するが、他の位置におけるＮＡＰ１アミノ酸参照配列に対する改変／修飾を含みうる。
【００６４】
本発明の特定の実施形態は、アミノ酸置換Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８８ＡおよびＥ５１５Ｑを含む又はそれらからなるＴｃｄＢタンパク質を提供する。もう１つの実施形態は、アミノ酸置換Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＷ５２０Ａを含む又はそれらからなるＴｃｄＢタンパク質を提供する。本発明のもう１つの特定の実施形態は、アミノ酸置換Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａを含む又はそれらからなるＴｃｄＢタンパク質である。
【００６５】
本明細書に記載されている本発明の別の実施形態においては、ＴｃｄＢタンパク質は、突然変異Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＤ２８６Ａを含む又はそれらからなる。もう１つの別の実施形態は、突然変異Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＳ５１８Ａを含む又はそれらからなるＴｃｄＢタンパク質を提供する。これらの別の実施形態のいずれか又は本明細書に記載されているＴｃｄＢいずれかの他の実施形態においては、もう１つの突然変異、例えばＣ６９８Ａ突然変異がＴｃｄＢタンパク質に付加されうる。本発明の追加的実施形態においては、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個までの更なる突然変異が、本明細書に記載されているＴｃｄＢ実施形態のいずれかに付加されうる。
【００６６】
本発明の特定の実施形態においては、突然変異ＴｃｄＢタンパク質は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８または配列番号５８に記載されているアミノ酸配列を含む、それらからなるまたはそれらから実質的になる。
【００６７】
本発明の追加的実施形態においては、突然変異ＴｃｄＢタンパク質は、以下に示すアミノ酸配列を含む、それからなるまたはそれから実質的になる。
【化２】
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【００６８】
本発明の別の実施形態においては、ＴｃｄＢタンパク質は、本明細書に記載されているいずれかのアミノ酸残基位置（すなわち、Ｗ１０２、Ｄ２８８、Ｅ５１５、Ｄ２８６、Ｓ５１８、Ｗ５２０およびＣ６９８）に突然変異を含む、それらからなるまたはそれらから実質的になり、ここで、特定されたアミノ酸残基は、天然配列内に存在しないいずれかの他のアミノ酸残基で置換され、例えば、１０２位のトリプトファンはトリプトファン以外のいずれかの残基で置換され、２８８位のアスパラギン酸はアスパラギン酸以外のいずれかのアミノ酸残基で置換される。例えば、本発明の別の実施形態は、Ｗ１０２、Ｄ２８８、Ｅ５１５、Ｗ５２０およびＣ６９８位に突然変異を含む又はそれらからなる配列番号２８（５ｍＴｃｄＢ：Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０Ａ、Ｃ６９８Ａ）により定められるＴｃｄＢ配列の変異体を含み、ここで、配列番号７１に記載されているとおり、Ｗ１０２はトリプトファン以外のいずれかのアミノ酸で置換され、Ｄ２８８はアスパラギン酸以外のいずれかのアミノ酸で置換され、Ｅ５１５はグルタミン酸以外のいずれかのアミノ酸で置換され、Ｗ５２０はトリプトファン以外のいずれかのアミノ酸で置換され、Ｃ６９８はシステイン以外のいずれかのアミノ酸で置換される。
【００６９】
好ましい実施形態においては、記載されているアミノ酸残基（Ｗ１０２、Ｄ２８８、Ｅ５１５、Ｄ２８６、Ｓ５１８、Ｗ５２０およびＣ６９８）は、Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｄ２８６Ａ、Ｓ５１８Ａ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａにより定められる突然変異と同じクラス内の又は構造において類似しているアミノ酸残基で置換される。例えば、Ｗ１０２突然変異を含む好ましい実施形態においては、１０２位のトリプトファンは、アラニンと類似した構造を有する又は同じクラス内のアミノ酸で置換される。
【００７０】
追加の実施形態においては、突然変異ＴｃｄＢタンパク質は、本明細書に記載されているＴｃｄＢタンパク質の誘導体、例えば、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５８、配列番号７１に記載されているアミノ酸配列を含むＴｃｄＢタンパク質の誘導体である。そのような誘導体は、元の参照配列（例えば、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５８または配列番号７１）に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。異なる実施形態においては、本発明は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５８および配列番号７１に対する１２アミノ酸以下の残基、１１アミノ酸以下の残基、１０アミノ酸以下の残基、９アミノ酸以下の残基、８アミノ酸以下の残基、７アミノ酸以下の残基、６アミノ酸以下の残基、５アミノ酸以下の残基、４アミノ酸以下の残基、３アミノ酸以下の残基、２アミノ酸以下の残基または１アミノ酸の残基に対する修飾／改変（例えば、置換）を含むＴｃｄＡタンパク質誘導体を含む。
【００７１】
本明細書に記載されているＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異毒素の任意の組合せが、後記により完全に記載されているとおり、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染またはＣＤＡＤの予防および／または治療のための免疫原性組成物およびワクチンにおいて有用であり、本発明に含まれる。
【００７２】
本発明はまた、本明細書に記載されているＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異体をコードするヌクレオチド配列に関する。該ヌクレオチド配列は、所望の突然変異を含むタンパク質をコードするように、または所望の発現系、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の高発現遺伝子のコドン使用頻度により厳密に合致したコドンを利用することを意図したコドン最適化ヌクレオチド配列をコードするように天然ヌクレオチド配列に施された変化を伴う天然配列でありうる。また、発現または安定性を増強するために、コード化タンパク質を改変することなく、ヌクレオチド配列に他の変化を施すことが可能であり、例えば、ヌクレオチド配列のＧＣ含量を修飾することが可能であり、クローニング目的、精製タグ（例えば、ＨｉｓタグまたはＧＳＴタグ）の付加、制限部位の付加などのために追加的ヌクレオチドを付加することが可能である。また、組換えを低減するためにＣＲＯＰ領域の反復性を低減するために、ヌクレオチド配列に変化が施されうる。
【００７３】
したがって、本発明は、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異タンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列に関する。ＴｃｄＡをコードする本発明の典型的なヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１に記載されているヌクレオチド配列を含む、それらからなる又はそれらから実質的になる。ＴｃｄＢをコードする典型的なヌクレオチド配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４および配列番号５７に記載されているヌクレオチド配列を含む、それらからなる又はそれらから実質的になる。本発明の追加の実施形態は、本明細書に開示されているヌクレオチド配列の誘導体、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４および配列番号５７に記載されているヌクレオチド配列を含む又はそれらからなる核酸分子に高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
【００７４】
本発明はまた、本発明の核酸および誘導体のいずれかを含むベクター、ならびに本発明のベクターのいずれかを含む宿主細胞に関する。
【００７５】
二成分毒素からのＣＤＴａおよびＣＤＴｂタンパク質
本明細書に記載されている実験は、大クロストリジウム毒素ＴｃｄＡおよびＴｃｄｂと二成分毒素（ＣＤＴａおよびＣＤＴｂ）との両方を含有するワクチンでのハムスターの免疫化が、流行性ＮＡＰ１／０２７／ＢＩ株でのチャレンジに対してＴｃｄＡおよびＴｃｄＢのみを含むワクチンより有意に高いレベルの防御を誘導することを実証している。その目的において、本発明は、前記の突然変異ＴｃｄＡおよび／またはＴｃｄＢタンパク質をＣＤＴａおよび／またはＣＤＴｂと組み合わせて含むワクチンおよび免疫原性組成物に関する。好ましい実施形態においては、本発明のワクチンおよび免疫原性組成物は、ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよびＣＤＴｂタンパク質を含む。
【００７６】
二成分毒素が活性毒素であるので、ワクチンまたは免疫原性組成物において使用するために、毒素タンパク質の遺伝的に不活性化（不活化）された形態を作製することが望ましかった。したがって、毒素ＣＤＴａの酵素成分を遺伝的不活性化の標的とした。ＣＤＴａを遺伝的に不活性化するために、以下の６つのＣＤＴａ三重突然変異体および２つのＣＤＴａ四重突然変異体を設計した：３ｍＣＤＴａ１（Ｒ３０２Ａ，Ｅ３８５Ａ，Ｅ３８７Ｄ）；３ｍＣＤＴａ２（Ｓ３４５Ｆ，Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ）；４ｍＣＤＴａ３（Ｒ３０２Ａ，Ｓ３４５Ｆ，Ｅ３８５Ｑ，Ｅ３８７Ｑ）；３ｍＣＤＴａ４（Ｙ６２Ａ，Ｙ６９Ａ，Ｒ２５５Ａ）；３ｍＣＤＴａ５（Ｒ３５９Ａ，Ｙ６２Ａ，Ｑ３０７Ｅ）；３ｍＣＤＴａ６（Ｙ２５８Ａ，Ｆ３５６Ａ，Ｓ３４５Ｆ）；３ｍＣＤＴａ７（Ｎ３４２Ａ，Ｙ２５３Ａ，Ｙ３８２Ａ）；および４ｍＣＤＴａ８（Ｓ３４５Ｆ，Ｅ３８５Ｑ，Ｅ３８７Ｑ，Ｃ２Ａ）。
【００７７】
３ｍＣＤＴａ１（Ｒ３０２Ａ，Ｅ３８５Ａ，Ｅ３８７Ｄ）の場合、突然変異は、ＣＤＴａ、およびＣＤＴａに対して〜８４．３％の配列同一性を有するＩｏｔａ毒素（Ｉａ）について行われている、公開された突然変異誘発／毒性研究に基づいて選択された。ＩｏＴａ毒素（Ｉａ）の触媒活性に必須である活性部位残基は、ＣＤＴａにおいて高度に保存されている（Ｐｅｒｅｌｌｅら，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｂｉｎａｒｙ  ｔｏｘｉｎ  ａｃｔｉｎ  −ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｂｙ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＣＤ  １９６．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５（４）：１４０２−１４０７（１９９７）；およびＳｕｎｄｒｉｙａｌら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｔｏｘｉｎ  ＣＤＴａ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８４（４２）２８７１３−２８７１９（２００９）；Ｐｅｒｅｌｌｅら，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  Ａｒｇ−２９５，Ｇｌｕ−３７８  ａｎｄ  Ｇｌｕ−３８０  ａｒｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｉｏｔａ  ｔｏｘｉｎ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３９５：１９１−１９４．（１９９６）；Ｎａｇａｈａｍａら，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  Ｉｏｔａ  ｔｏｘｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８２（８）２０９６−２１０３（２０００），およびＴｓｕｇｅら，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  Ｉｏｔａ  ｔｏｘｉｎ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ３２５：４７１−４８３．（２００３））。したがって、本発明者らの仮定は、ＣＤＴａ内の等価残基も触媒活性に必須であるはずだというものであった。
【００７８】
３ｍＣＤＴａ２の場合、突然変異（Ｓ３４５Ｆ，Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ）は、ＣＤＴａの突然変異誘発を記載している報告（Ｎａｇａｈａｍａら；Ｔｓｕｇｅら；Ｐｅｒｅｌｌｅら；前掲；Ｓｕｎｄｒｉｙａｌら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｔｏｘｉｎ  ＣＤＴａ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８４（４２）：２８７１３−２８７１９（２００９）；およびＧｕｌｋｅら．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｔｏｘｉｎ  ＣＤＴａ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６９（１０）：６００４−６０１１（２００１））に基づいて選択された。また、ＳｕｎｄｒｉｙａｌらはＣＤＴａの結晶構造を記載しており、突然変異Ｓ３４５Ｆが立体障害により基質結合を妨げると予測した。Ｓ３３８Ａ（Ｓ３４５のＩａ等価体）では活性における〜２０倍の低減が観察されたが、Ｓ３３８Ｆ突然変異体では活性は全く観察されなかった（Ｎａｇａｈａｍａら）。Ｇｕｌｋｅらは、Ｉａでの観察と同様に、ＣＤＴａにおけるＳ３４５Ａからは活性の僅かな低減しか生じないことを報告した。
【００７９】
４ｍＣＤＴａ３（Ｒ３０２Ａ，Ｓ３４５Ｆ，Ｅ３８５Ｑ，Ｅ３８７Ｑ）は、３ｍＣＤＴａ１および３ｍＣＤＴａ２における突然変異を組み合わせるように設計された。Ｅ３８５ＡおよびＥ３８７Ｄに対して突然変異Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑが選択されたのは、これらの置換残基が、グルタミン酸により類似しているからである。
【００８０】
３ｍＣＤＴａ４（Ｙ６７Ａ，Ｙ６９Ａ，Ｒ２５５Ａ）の場合、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のｉｏｔａ毒素におけるアクチン認識およびＡＤＰ−リボシル化残基の突然変異が細胞毒性および酵素活性の低減を引き起こすことを示した過去の報告（Ｔｓｕｇｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：７３９９−７４０４．（２００８））に基づいて、アクチン結合に関与する残基に突然変異が施された。
【００８１】
３ｍＣＤＴａ５（Ｒ３５９Ａ，Ｙ６７Ａ，Ｑ３０７Ｅ）の場合、Ｙ６７Ａ突然変異は、ＮＡＤと相互作用する２つの残基（Ｒ３５９およびＳ３０７）に対する突然変異と組み合わされた。ＣＤＴａにおけるＲ３５９の等価残基である、ｉｏｔａ毒素におけるＲ３５２は、ＮＡＤアーゼ活性に必須であることが示された（Ｔｓｕｇｅら，（２００３），前掲）。また、ＣＤＴａの結晶構造に基づいて、ＮＡＤはＲ３５９およびＱ３０７と相互作用すると予測された（Ｓｕｎｄｒｉｙａｌら，（２００９））。３ｍＣＤＴａ６（Ｙ２５８Ａ，Ｆ３５６Ａ，Ｓ３４５Ｆ）の場合、ＡＲＴアーゼおよびＮＡＤアーゼ活性に影響を及ぼす等価ｉｏｔａ毒素残基の能力に基づいて（Ｔｓｕｇｅら，（２００３））、またはＣＤＴａ結晶構造に基づいて（Ｓｕｎｄｒｉｙａｌら，（２００９））、追加的突然変異が選択された。
【００８２】
３ｍＣＤＴａ７（Ｎ３４２Ａ，Ｙ２５３Ａ，Ｙ３８２Ａ）の場合、Ｉｏｔａ毒素におけるリガンド結合、ＮＡＤアーゼ活性および／またはＡＲＴアーゼ活性に関与すると考えられる残基に突然変異が施された（Ｓｕｎｄｒｉｙａｌら，（２００９）；Ｔｓｕｇｅら，（２００３））。また、Ｙ３８２が選択されたのは、それが、アクチン特異的ＡＤＰ−リボシル化毒素に重要であることが公知の保存された決定的に重要な芳香族残基だからである。
【００８３】
４ｍＣＤＴａ８の場合、野生型組換えＣＤＴａおよび組換え突然変異ＣＤＴａが二量体化する傾向を有していたという本発明者らの観察に基づいて、突然変異Ｃ２Ａが３ｍＣＤＴａ２突然変異体における突然変異に加えられた。ＣＤＴａの配列を調べることにより、本発明者らは単一のシステイン残基を見出し、ＣＤＴａの二量体化を低減または排除することを試みるためにシステイン残基を変異させた。分析的解析は、このシステインの変異が突然変異ＣＤＴａのオリゴマー化を劇的に低減することを示した。実施例１３および図２０Ｃを参照されたい。
【００８４】
したがって、本発明は、Ｃ２、Ｙ６７、Ｙ６９、Ｙ２５３、Ｒ２５５、Ｙ２５８、Ｒ３０２、Ｑ３０７、Ｎ３４２、Ｓ３４５、Ｆ３５６、Ｒ３５９、Ｙ３８２、Ｅ３８５、Ｅ３８５、Ｅ３８７およびＥ３８７からなる群から選択されるアミノ酸位置に少なくとも２つの突然変異を含む、それらからからなる又はそれらから実質的になる組換え二成分毒素タンパク質Ａ（ＣＤＴａ）に関する。本発明の特定の実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質は、Ｃ２Ａ、Ｙ６７Ａ、Ｙ６９Ａ、Ｙ２５３Ａ、Ｒ２５５Ａ、Ｙ２５８Ａ、Ｒ３０２Ａ、Ｑ３０７Ｅ、Ｎ３４２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｆ３５６Ａ、Ｒ３５９Ａ、Ｙ３８２Ａ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７ＱおよびＥ３８７Ｄからなる群から選択される２個まで、３個まで、４個まで、５個まで、６個まで、７個まで、８個まで、９個まで、１０個まで、１１個まで、１２個まで、１３個まで、１４個まで、１５個まで、１６個まで、または１７個までの突然変異を含む又はそれらからなる。幾つかの実施形態においては、ＣＤＴａ突然変異は、Ｃ２Ａ、Ｒ３０２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７ＱおよびＥ３８７Ｄから選択される。本発明の幾つかの実施形態においては、組換えＣＤＴａタンパク質は、（ａ）Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；（ｂ）Ｒ３０２Ａ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７Ｄ；（ｃ）Ｃ２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；（ｄ）Ｒ３０２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；（ｅ）Ｙ６７Ａ、Ｙ６９ＡおよびＲ２５５Ａ；（ｆ）Ｒ３５９Ａ、Ｙ６７ＡおよびＱ３０７Ｅ；（ｇ）Ｙ２５８Ａ、Ｆ３５６Ａ、Ｓ３４５Ｆ；ならびに（ｈ）Ｎ３４２Ａ、Ｙ２５３ＡおよびＹ３８２Ａからなる群から選択される一組の突然変異を含む又はそれらからなる。本発明の好ましい実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質はシグナルペプチドを欠いている（すなわち、天然ＣＤＴのシグナルペプチドが欠失している）。
【００８５】
本発明の追加の実施形態においては、本明細書に記載されているＣＤＴａ突然変異タンパク質は、天然配列に対する１つの更なる突然変異を含む（例えば、突然変異Ｃ２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ｑおよびＥ３８７ＱからなるＣＤＴａタンパク質に対して、１つの追加的突然変異を加える）。本発明の追加的実施形態においては、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個までの更なる突然変異が本明細書におけるいずれかの実施形態に記載されているＣＤＴａタンパク質のいずれかに付加されうる。
【００８６】
本発明の典型的実施形態においては、前記のＣＤＴａタンパク質は、配列番号４０、配列番号４２または配列番号６７に記載されているアミノ酸配列を含む、それらからなる又はそれらから実質的になる。本発明の追加の実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質は、追加的なＮ末端メチオニンを伴う配列番号４０、配列番号４２または配列番号６７を含む、それらからなる又はそれらから実質的になる。
【００８７】
本発明の別の実施形態においては、ＣＤＴａ突然変異タンパク質は、本明細書に記載されているいずれかのアミノ酸残基（すなわち、Ｃ２、Ｙ６７、Ｙ６９、Ｙ２５３、Ｒ２５５、Ｙ２５８、Ｒ３０２、Ｑ３０７、Ｎ３４２、Ｓ３４５、Ｆ３５６、Ｒ３５９、Ｙ３８２、Ｅ３８５、Ｅ３８５、Ｅ３８７およびＥ３８７）に突然変異を含む、それらからなる又はそれらから実質的になり、ここで、特定されているアミノ酸残基は、天然配列内に存在しないいずれかの他のアミノ酸残基で置換され、例えば、２位のシステインはシステイン以外のいずれかの残基で置換され、６７位のＹはチロシン以外のいずれかの残基で置換される。例えば、本発明の別の実施形態は、Ｃ２、Ｓ３４５、Ｅ３８５およびＥ３８７位に突然変異を含む又はそれらからなる配列番号６７に記載されているＣＤＴａ配列の変異体（４ｍＣｄｔＡ８：Ｃ２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ）を含み、ここで、配列番号７２に記載されているとおり、Ｃ２はシステイン以外のいずれかのアミノ酸で置換され、Ｓ３４５はセリン以外のいずれかのアミノ酸で置換され、Ｅ３８５はグルタミン酸以外のいずれかのアミノ酸残基で置換され、Ｅ３８７はグルタミン酸以外のいずれかのアミノ酸で置換される。
【００８８】
好ましい実施形態においては、記載されているアミノ酸残基（すなわち、Ｃ２、Ｙ６７、Ｙ６９、Ｙ２５３、Ｒ２５５、Ｙ２５８、Ｒ３０２、Ｑ３０７、Ｎ３４２、Ｓ３４５、Ｆ３５６、Ｒ３５９、Ｙ３８２、Ｅ３８５、Ｅ３８５、Ｅ３８７およびＥ３８７）は、Ｃ２Ａ、Ｙ６７Ａ、Ｙ６９Ａ、Ｙ２５３Ａ、Ｒ２５５Ａ、Ｙ２５８Ａ、Ｒ３０２Ａ、Ｑ３０７Ｅ、Ｎ３４２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｆ３５６Ａ、Ｒ３５９Ａ、Ｙ３８２Ａ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７ＱおよびＥ３８７Ｄにより定められる突然変異と同じクラス内の又は構造において類似しているアミノ酸残基で置換される。
【００８９】
別の実施形態においては、本発明は、前記の突然変異のいずれか又はそれらの組合せを含む突然変異ＣＤＴａタンパク質を提供する。突然変異の導入のための基礎となる天然ＣＤＴａタンパク質配列は、任意のクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株、例えばＮＡＰ１／０２７／ＢＩ（「ＮＡＰ」）株またはＶＰＩ  １０４６３株に由来するものでありうる（すなわち、前記突然変異は、いずれかのＣＤＴａ参照配列、例えば、配列番号３８に示されているＣＤＴａ配列、または異なる株からのＣＤＴａ配列内に組込まれうる）。本発明におけるＣＤＴａ突然変異体配列のバックボーンを形成しうる追加的な典型的ＣＤＴａアミノ酸配列（すなわち、本明細書において特定されている突然変異は、特定されている位置において参照「バックボーン」配列に対して施されうる）には、配列番号７３（株ＡＭ４７８（毒素型ＩＶ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＣ１１５７５．１）、配列番号７４（株ＣＤ９８（リボタイプ０７８、ＮＡＰ７、毒素型Ｖ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＣ１１５６９．１）、配列番号７５（株ＡＥ１６（リボタイプ０２７、ＮＡＰ１、毒素型ＩＩＩ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＣ１１５６０．１）、配列番号７６（株ＣＤ１９６（ＮＡＰ１、毒素型ＩＩＩ、０２７）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ６７３０４．２）、および配列番号７７（株Ａ７６５（毒素型ＩＸ、ＮＡＰ１）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＣ１１５７８．１）が含まれる。本発明の追加の実施形態においては、本発明の組換えＣＤＴａタンパク質のいずれかは実質的に精製されている。
【００９０】
追加の実施形態においては、突然変異ＣＤＴａタンパク質は、本明細書に記載されているＣＤＴａタンパク質の誘導体、例えば、配列番号４０、配列番号４２、配列番号６７または配列番号７２に記載されているアミノ酸配列を含むＣＤＴａタンパク質の誘導体である。そのような誘導体は、元の参照配列（例えば、配列番号４０、配列番号４２、配列番号６７または配列番号７２）に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。更なる実施形態においては、本発明は、配列番号４０、配列番号４２、配列番号６７または配列番号７２に対して１２アミノ酸以下の残基、１１アミノ酸以下の残基、１０アミノ酸以下の残基、９アミノ酸以下の残基、８アミノ酸以下の残基、７アミノ酸以下の残基、６アミノ酸以下の残基、５アミノ酸以下の残基、４アミノ酸以下の残基、３アミノ酸以下の残基、２アミノ酸以下の残基または１アミノ酸の残基に対する修飾／改変（例えば置換）を含むＣＤＴａタンパク質誘導体を含む。本発明の追加の実施形態は、追加的なＮ末端メチオニンを伴う本明細書に記載されているＣＤＴａタンパク質（例えば、配列番号４０、配列番号４２、配列番号６７または配列番号７２）のいずれかの誘導体を含む。
【００９１】
また、本発明は、単離および／または精製された組換え二成分毒素タンパク質Ｂ（ＣＤＴｂ）を提供し、ここで、ＣＤＴｂタンパク質はシグナルペプチドを欠いている（本明細書においては「プロＣＤＴｂ」と称される）。本発明の単離されたプロＣＤＴｂタンパク質は、二成分毒素を発現する任意のクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株に由来しうる。本明細書に記載されている組成物およびワクチンにおいて使用されうる典型的なＣＤＴｂ配列には、配列番号７８（株ＣＤ９８（リボタイプ０７８、ＮＡＰ７、毒素型Ｖ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＣ１１５７０．１）、配列番号７９（株Ｋ７４４（リボタイプ０７８、ＮＡＰ８、毒素型Ｖ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＣ１１５８５．１）、配列番号８０（株ＡＭ４７８（毒素型ＩＶ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＣ１１５７６．１）、配列番号８１（株ＡＤ６６７（毒素型ＩＩＩ、ＮＡＰ１）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＣ１１５５８．１）、配列番号８２（株Ｃ４２１（毒素型ＩＸ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＣ１１５６４．１）、配列番号８３（株Ａ７６５（毒素型ＩＸ、ＮＡＰ１）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＣ１１５７９．１）、配列番号８４（株ＣＤ１９６（ＮＡＰ１、毒素型ＩＩＩ、０２７）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ６７３０５．１）、および配列番号８５（株ＡＥ１６（リボタイプ０２７、ＮＡＰ１、毒素型ＩＩＩ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＣ１１５６０．１）に記載されているアミノ酸配列が含まれる。
【００９２】
米国および欧州におけるＣＤＩの確定臨床例に関して株型決定が行われた大規模多国臨床試験および／または疫学的研究においては、主要な二成分毒素を発現するリボタイプは０２７および０７８であった。これらの研究においては、０２７および０７８の有病率は１１％〜４０％の範囲であった（Ｂａｕｅｒら，Ｌａｎｃｅｔ  ３７７（９７５９）：６３−７３（２０１１）；Ｇｅｒｄｉｎｇら，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．８（２）：６７−８（２０１１））。本発明のこの態様の幾つかの実施形態においては、プロＣＤＴｂアミノ酸配列はＮＡＰ１株に由来する。
【００９３】
特定の実施形態においては、プロＣＤＴｂタンパク質は、以下に示すアミノ酸配列を含む、それらからなる又はそれらから実質的になる。
【化３】
2015506948.tif 000005
【００９４】
本発明の追加の実施形態においては、単離された組換えＣＤＴｂタンパク質は更に欠失している（すなわち、シグナルペプチドの欠失を含有し、ＣＤＴｂのＮ末端活性化ドメインの更なる欠失を含有する（Ｂａｒｔｈら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６８（３）：３７３−４０２（２００４）を参照されたい））。本発明のＣＤＴｂタンパク質は、二成分毒素を含む任意のクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株に由来しうる。本発明のこの態様の幾つかの実施形態においては、ＣＤＴｂタンパク質配列はＮＡＰ１株に由来する。特定の典型的な実施形態においては、ＣＤＴｂタンパク質は、配列番号４６に記載されているアミノ酸配列からなる、実質的になるまたはそれを含む。追加の実施形態においては、ＣＤＴｂタンパク質は、配列番号４６に記載されているＣＤＴｂタンパク質の誘導体、例えば、配列番号４６に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＴｂタンパク質である。もう１つの実施形態においては、本発明は、配列番号４６に対する１２アミノ酸以下の残基、１１アミノ酸以下の残基、１０アミノ酸以下の残基、９アミノ酸以下の残基、８アミノ酸以下の残基、７アミノ酸以下の残基、６アミノ酸以下の残基、５アミノ酸以下の残基、４アミノ酸以下の残基、３アミノ酸以下の残基、２アミノ酸以下の残基または１アミノ酸の残基に対する修飾／改変（例えば置換）を含むＣＤＴｂタンパク質誘導体を含む。
【００９５】
本発明はまた、本明細書に記載されているＣＤＴａおよびＣＤＴｂ突然変異体をコードするヌクレオチド配列に関する。該ヌクレオチド配列は、所望の突然変異を含むタンパク質をコードするように、または所望の発現系、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）または昆虫細胞の高発現遺伝子のコドン使用頻度により厳密に合致したコドンを利用することを意図したコドン最適化ヌクレオチド配列をコードするように、天然ヌクレオチド配列に施された変化を伴う天然配列でありうる。また、発現または安定性を増強するために、コード化タンパク質を改変することなく、ヌクレオチド配列に他の変化を施すことが可能であり、例えば、ヌクレオチド配列のＧＣ含量を修飾することが可能であり、クローニング目的、精製タグ（例えば、ＨｉｓタグまたはＧＳＴタグ）の付加、制限部位の付加などのために追加的ヌクレオチドを付加することが可能である。
【００９６】
したがって、本発明は、本発明のＣＤＴａ突然変異タンパク質をコードする単離された核酸に関する。突然変異ＣＤＴａタンパク質をコードする典型的なヌクレオチド配列は、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号６７および配列番号６８に記載されているヌクレオチド配列を含む、それらからなる又はそれらから実質的になる。本発明の幾つかの実施形態においては、核酸は実質的に精製されている。本発明の追加的実施形態は、本明細書に開示されているＣＤＴａヌクレオチド配列の誘導体であるヌクレオチド配列、例えば、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号６７および配列番号６８に記載されているヌクレオチド配列を含む又はそれらからなる核酸分子に高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
【００９７】
本発明はまた、前記のＣＤＴｂおよびプロＣＤＴｂタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列に関する。ＣＤＴｂをコードする典型的なヌクレオチド配列は、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６に記載されているヌクレオチド配列を含む、それらからなる又はそれらから実質的になる。本発明の幾つかの実施形態においては、該核酸は実質的に精製されている。本発明の追加の実施形態は、本明細書に開示されているＣＤＴａヌクレオチド配列の誘導体であるヌクレオチド配列、例えば、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６に記載されているヌクレオチド配列を含む又はそれらからなる核酸分子に高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
【００９８】
本発明はまた、本発明の核酸のいずれかを含むベクター、および本発明のベクターのいずれかを含む宿主細胞に関する。
【００９９】
使用方法
本発明の実施形態はまた、（ａ）療法（例えば、人体）、（ｂ）医薬、（ｃ）クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の複製の抑制、（ｄ）クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）による感染の治療または予防、（ｅ）クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発の予防、（ｆ）クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に関連した病的症状の進行、開始もしくは重症度の低減、および／またはクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の可能性の低減、あるいは（ｇ）下痢、大腸炎および偽膜性大腸炎（これらに限定されるものではない）を含むクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の治療、予防、または該関連疾患の開始、重症化もしくは進行の遅延における；（ｉ）使用のための、（ｉｉ）医薬または組成物としての使用のための、あるいは（ｉｉｉ）医薬の製造における使用のための、突然変異ＴｃｄＡ、突然変異ＴｃｄＢ、突然変異ＣＤＴａおよびＣＤＴｂ毒素の１以上、又は本明細書に記載されている毒素を含む組成物、または突然変異毒素もしくは組成物を含む若しくはそれらからなるワクチンを含む。これらの使用においては、突然変異毒素、その組成物、および／または突然変異毒素もしくは組成物を含むもしくはそれらからなるワクチンは、場合により１以上の抗細菌剤（例えば、後記の抗細菌化合物、モノクローナル抗体または組合せワクチン）と組み合わせて使用されうる。
【０１００】
したがって、本発明は、本発明の毒素の１以上、または本発明の毒素の１以上を含む免疫原性組成物もしくはワクチンを、治療を要する患者に投与することを含む、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染またはクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の予防的および／または治療的治療のための方法を提供する。本発明のこの態様の幾つかの好ましい実施形態においては、患者には、ＴｃｄＡタンパク質、ＴｃｄＢタンパク質、ＣＤＴａタンパク質およびＣＤＴｂ毒素タンパク質、またはＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよびＣＤＴｂを含むワクチンもしくは免疫原性組成物が投与される。
【０１０１】
「患者」（あるいは本明細書においては「対象」と称される）は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に感染している哺乳動物を意味する。好ましい実施形態においては、患者はヒトである。患者は予防的または治療的に処置されうる。予防的処置は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染またはその効果（すなわち、ＣＤＡＤ）の可能性または重症度を低減するのに十分な防御免疫をもたらす。治療的処置は、重症度を低減するために、またはクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染もしくはＣＤＡＤの再発を予防するために行われうる。
【０１０２】
予防的処置は、本明細書に記載されている突然変異または単離毒素の１以上を含有する医薬組成物を使用して行われうる。医薬組成物は、集団全体に、またはクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染のリスクの増大を示す個体に投与されうる。
【０１０３】
本発明の組成物は、追加的物質を含む治療計画の一部として患者に投与されうる。例えば、本発明は、ＣＤＡＤの治療またはＣＤＡＤの重症度もしくは進行の低減に有効である抗生物質［例えば、メトロニダゾール（ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ）、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）およびフィダキソマイシン（ｆｉｄａｘｏｍｙｃｉｎ）］と組み合わされた免疫原性組成物の使用を想定している。また、本発明においては、本明細書に記載されている免疫原性組成物が、ＣＤＡＤの治療またはＣＤＡＤの重症度もしくは進行の低減に有効である他の医薬または物質［例えば、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、毒素Ａまたは毒素Ｂを標的化するモノクローナル抗体、例えば、米国特許第７，６２５，５５９号にＡｍｂｒｏｓｉｎｏにより記載されているモノクローナル抗体］での治療を受けている患者に投与される治療計画も提供される。そのような場合、本明細書に記載されているワクチンおよび組成物は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発の予防に有用である可能性があり、あるいは、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に既に感染している又はクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に感染する高いリスクを有する患者において、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の重症度またはクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の発現または進行またはその効果（例えば、ＣＤＡＤ）を低減しうる。
【０１０４】
「治療を要する」者は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を既に有する者、および感染を有する傾向にある者、または感染の可能性の低減が望まれる任意の者を含む。クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染のリスクの増大を示す者は、抗生物質治療、例えば、あるクリンダマイシン、セファロスポリンおよびフルオロキノロンでの治療を受けている者、ならびに高齢（６５歳以上）の者、免疫抑制患者、医療従事者である患者、および長期入院患者を含む。
【０１０５】
前記のとおり、本発明の特徴は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を有する又は該感染に感受性である患者を治療するための組成物、好ましくは免疫原性組成物またはワクチンにおける、本明細書に記載されている突然変異または単離毒素の１以上を、単独又は１以上の追加的抗原と組み合わされた使用である。適切には、該組成物は、ＣＤＴｂタンパク質および医薬上許容される担体と共に、本明細書に記載されている突然変異毒素タンパク質（ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢおよびＣＤＴａ）の１以上の有効量を含む。前記の本発明の好ましい実施形態においては、医薬組成物はヒト患者において使用される。別の実施形態においては、医薬組成物は非ヒト患者において使用される。
【０１０６】
本発明の組成物は、アジュバント、例えばＩＳＣＯＭ型アジュバントまたはアルミニウムアジュバントを更に含みうる。アジュバントの含有は、長く続く防御免疫を誘導するために、患者へのワクチン抗原（すなわち、ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよび／またはＣＤＴｂ）の投与により惹起される免疫応答を増強しうる。免疫応答を増強することに加えて、所望の免疫応答を惹起するのに必要な抗原の量を減少させるために、あるいは持続的な免疫応答を誘導し、疾患に対する防御を付与し、および／またはクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染により引き起こされる疾患の退縮を誘導するための臨床計画において必要な注射の回数を減少させるために、アジュバントが使用されうる。
【０１０７】
本発明の突然変異および／または天然毒素タンパク質と共に使用されうるアジュバントには、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含有するアジュバント、またはＴＬＲ４およびＴＬＲ９のようなトール様受容体（総説としては、Ｄａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９（１）：４５−５２（２００７）；Ｄｕｔｈｉｅら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２３９（１）：１７８−１９６（２０１１）；Ｈｅｄａｙａｔら，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３２（２）：２９４−３２５（２０１２）を参照されたい）に作用する他の分子、例えば、リポ多糖、モノホスホリルリピドＡおよびアミノアルキルグルコサミニド４−ホスファートが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の組成物において有用な追加的なアジュバントには、免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ；例えば、Ｕ．Ｓ．７，７１３，５３５およびＵ．Ｓ．７，４７０，６７４を参照されたい）；Ｔヘルパーエピトープ、リピドＡおよびその誘導体または変異体、リポソーム、リン酸カルシウム、サイトカイン（例えば、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、Ｆｌｔ−３Ｌ）、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＣＤ７０、ＩＬ−１２、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）９０、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７、ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴ、非イオン性ブロック共重合体、不完全フロイントアジュバント、ケモカイン、コレラ毒素；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシン；百日咳毒素；ムラミルジペプチド、ムラミルペプチド類似体、ＭＦ５９、ＳＡＦ、免疫刺激性複合体、生分解性ミクロスフェア、ポリホスファゼン；合成ポリヌクレオチドが含まれる。
【０１０８】
本明細書に記載されている組成物と共に使用される追加的なアジュバントとしては、サポニン（例えば、ＱＳ２１）を単独で又はコレステロールおよびリン脂質をＩＳＣＯＭ（「免疫刺激性複合体」；総説としては、ＢａｒｒおよびＭｉｔｃｈｅｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７４：８−２５（１９９６）；ならびにＳｋｅｎｅおよびＳｕｔｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４０：５３−５９（２００６）を参照されたい）の特徴的な形態において組み合わせて含むアジュバントが挙げられる。本発明で提供される組成物および方法の特定の実施形態においては、突然変異毒素および／または毒素タンパク質は、ＩＳＣＯＭ型アジュバントまたは「ＩＳＣＯＭ」［これは、抗原の非存在下で製造されるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（本明細書においては「ＩＭＸ」とも称される）のようなＩＳＣＯＭマトリックス粒子アジュバントである］（ＩＳＣＯＭ（登録商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）はＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａの登録商標である）と組み合わされる。
【０１０９】
また、アルミニウムに基づく化合物、例えば水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）、アルミニウムヒドロキシホスファート（ＡｌＰＯ４）、無定形アルミニウムヒドロキシホスファートスルファート（ＡＡＨＳ）、またはいわゆる「ミョウバン」（ＫＡｌ（ＳＯ４）・１２Ｈ２Ｏ）（Ｋｌｅｉｎら，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｂｙ  Ａｌ  ＭＡＳ  ＮＭＲ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８９（３）：３１１−２１（２０００）を参照されたい）が、本発明で提供される組成物と組み合わされうる。本発明で提供される本発明の典型的実施形態においては、アルミニウムアジュバントはアルミニウムヒドロキシホスファートまたはＡＡＨＳ（あるいは「ＭＡＡ」と称される）である。
【０１１０】
前記組成物は、治療用または予防用ワクチンとして使用されうる。したがって、本発明は、本発明の突然変異もしくは単離毒素（「免疫原性物質」）またはそれらの誘導体の１以上を有効成分として含有するワクチンの製造に拡張される。そのようなワクチンを製造するためには、任意の適当な方法が想定される。典型的な方法は、例えば、Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（１９９７，Ｌｅｖｉｎｅら，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｅｌ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ）（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているものを含む。
【０１１１】
誘導体毒素を含む本発明の突然変異毒素、または該突然変異毒素もしくは誘導体もしくは天然毒素、例えばＣＤＴｂを（単独で又は１以上の免疫原と共に）含む組成物もしくはワクチンは、当技術分野でよく知られた技術を用いて製剤化され、患者に投与されうる。医薬投与の全般に関する指針は、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ編，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９９；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００；ならびにＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に記載されている。
【０１１２】
したがって、本発明は、本明細書に記載されているワクチンまたは医薬組成物のいずれかの免疫学的有効量を患者に投与する工程を含む、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に対する患者における防御免疫応答を誘導するための方法を提供する。
【０１１３】
また、本明細書に記載されているワクチンまたは医薬組成物のいずれかの免疫学的有効量を患者に投与する工程を含む、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を治療するためのまたはクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に関連したいずれかの病態を治療するための方法が本発明により提供される。
【０１１４】
ワクチンおよび／または組成物は、皮下、筋肉内、静脈内、粘膜、非経口または皮内のような種々の経路により投与されうる。皮下および筋肉内投与は、例えば、無針またはジェット式注射器を使用して行われうる。本発明の好ましい実施形態においては、ワクチンおよび組成物は筋肉内注射により投与される。
【０１１５】
本明細書に記載されている組成物は、剤形に適合した方法で、そしてクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を治療し、および／または感染の可能性を低減するのに免疫学的に有効な量で投与されうる。本発明の場合における患者に投与される用量は、患者における有益な応答（例えば、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のレベルの低下）に経時的に影響を及ぼすのにまたはクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）による感染の可能性を低減するのに十分なものであるべきである。投与されるべき免疫原性物質の量は、治療されるべき対象（その年齢、性別、体重および全身健康状態を含む）に依存しうる。これに関して、投与される必要のある免疫原性物質の厳密な量は実施者の判断によるであろう。クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に対する治療または予防において投与される免疫原性物質の有効量の決定の際には、医師が、循環血漿レベル、疾患の進行および抗クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗体の産生を評価しうる。いずれの場合にも、本発明の免疫原性物質の適当な投与量は当業者により容易に決定されうる。そのような投与量は、本発明の免疫原性物質のナノグラムからミリグラムのオーダーでありうる。
【０１１６】
適当な投与計画は、好ましくは、患者の年齢、体重、性別および医学的症状；投与経路；所望の効果；ならびに使用される個々の化合物を含む当技術分野で公知の要因を考慮して決定される。該ワクチン組成物は多用量形態で使用されうる。
【０１１７】
投与の時期は、当技術分野でよく知られた要因に左右される。初期投与後、抗体価を維持および／または増強するために、１以上の追加的な用量が投与されうる。
【０１１８】
組合せワクチン接種の場合、突然変異毒素のそれぞれは、１つの組成物中で一緒にあるいは異なる組成物中で別々に投与されうる。本明細書に記載されている本発明の突然変異または単離ＴｃｄまたはＣＤＴ毒素は、１以上の所望の追加的免疫原と共に投与されうる。「共に」なる語は、複数の治療用物質が厳密に同時に投与されることには限定されず、それは、本明細書に記載されている突然変異または単離ＴｃｄおよびＣＤＴ毒素とその他の所望の免疫原とが、それらが一緒になってそれ以外の様態で投与される場合と比較して大きな利益をもたらすように作用しうるような順序および時間間隔で対象に投与されることを意味する。例えば、各治療用物質は、同時にまたは異なる時点で任意の順序で連続的に投与されうるが、同時に投与されない場合には、それらは、所望の治療効果が得られるように時間的に十分に近くなるように投与されるべきである。各治療用物質は任意の適切な形態および任意の適切な経路で別々に投与されうる。
【０１１９】
前記の本発明の態様においては、Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｄ２８５Ａ、Ｓ５１７Ａ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａからなる群から選択される少なくとも３つの突然変異を含む組換えクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ（ＴｃｄＡ）タンパク質及び医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物を提供する。本発明のこの態様の幾つかの実施形態においては、ＴｃｄＡタンパク質は、（ａ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ；（ｂ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＷ５１９Ａ；（ｃ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＤ２８５Ａ；ならびに（ｄ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＳ５１７Ａからなる群から選択される一組の突然変異を含む。更に詳細な実施形態においては、ＴｃｄＡタンパク質は更に、Ｃ７００Ａ突然変異、例えば、以下の一組の突然変異（ｅ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａを含む。追加的な実施形態においては、ＴｃｄＡタンパク質は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＮＡＰ株またはＶＰＩ  １０４６３株から得られたアミノ酸配列を含む。更に詳細な実施形態においては、ＴｃｄＡタンパク質は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６および配列番号３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１２０】
本発明はまた、Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｄ２８６Ａ、Ｓ５１８Ａ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａからなる群から選択される少なくとも３つの突然変異を含む組換えクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）タンパク質及び医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物を提供する。本発明のこの態様の追加的実施形態においては、ＴｃｄＢタンパク質は、（ａ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８ＡおよびＥ５１５Ｑ；（ｂ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＷ５２０Ａ；（ｃ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＤ２８６Ａ；ならびに（ｄ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＳ５１８Ａからなる群から選択される一組の突然変異を含む。更に詳細な実施形態においては、ＴｃｄＢタンパク質は更に、Ｃ６９８Ａ突然変異、例えば、以下の一組の突然変異（ｅ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａを含む。更に詳細な実施形態においては、ＴｃｄＢタンパク質は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＮＡＰ株またはＶＰＩ  １０４６３株から得られたアミノ酸配列を含む。本発明のこの態様の特定の実施形態においては、ＴｃｄＢタンパク質は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８および配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明の追加的実施形態においては、前記の突然変異ＴｃｄＢ毒素タンパク質はいずれも、本明細書の全体において開示されているいずれかの他の突然変異毒素タンパク質、例えば、前記の突然変異ＴｃｄＡタンパク質と組み合わされうる。
【０１２１】
したがって、本発明の１つの実施形態は、突然変異ＴｃｄＡタンパク質、突然変異ＴｃｄＢタンパク質および医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物である。本発明のこの態様の幾つかの実施形態においては、ＴｃｄＡタンパク質は、Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｄ２８５Ａ、Ｓ５１７Ａ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａからなる群から選択される少なくとも３つの突然変異を含み、ＴｃｄＢタンパク質は、Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｄ２８６Ａ、Ｓ５１８Ａ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａからなる群から選択される少なくとも３つの突然変異を含む。更に詳細な実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、本明細書に記載されている突然変異ＴｃｄＡ、本明細書に記載されている突然変異ＴｃｄＢタンパク質、突然変異ＣＤＴａタンパク質およびＣＤＴｂタンパク質を含み、ここで、突然変異ＴｃｄＡタンパク質は、Ｃ２Ａ、Ｙ６７Ａ、Ｙ６９Ａ、Ｙ２５３Ａ、Ｒ２５５Ａ、Ｙ２５８Ａ、Ｒ３０２Ａ、Ｑ３０７Ｅ、Ｎ３４２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｆ３５６Ａ、Ｒ３５９Ａ、Ｙ３８２Ａ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７ＱおよびＥ３８７Ｄから選択される少なくとも２つの突然変異を含む。本発明のこの態様の幾つかの実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質およびＣＤＴｂタンパク質は、シグナルペプチドを欠いている。追加の実施形態においては、本明細書に記載されている免疫原性組成物はいずれも、アジュバントを更に含みうる。更に詳細な実施形態においては、アジュバントはＩＳＣＯＭ型アジュバント、例えばＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ＣＳＬ，ＬＴｄ．）および／またはアルミニウムアジュバント、例えばＭＡＡである。
【０１２２】
本発明はまた、Ｃ２Ａ、Ｙ６７Ａ、Ｙ６９Ａ、Ｙ２５３Ａ、Ｒ２５５Ａ、Ｙ２５８Ａ、Ｒ３０２Ａ、Ｑ３０７Ｅ、Ｎ３４２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｆ３５６Ａ、Ｒ３５９Ａ、Ｙ３８２Ａ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７ＱおよびＥ３８７Ｄから選択される少なくとも２つの突然変異を含む組換え二成分毒素タンパク質Ａ（ＣＤＴａ）、およびクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）からの二成分毒素タンパク質Ｂ（ＣＤＴｂ）、および医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物に関する。追加の実施形態においては、免疫原性組成物は、Ｃ２Ａ、Ｙ６７Ａ、Ｙ６９Ａ、Ｙ２５３Ａ、Ｒ２５５Ａ、Ｙ２５８Ａ、Ｒ３０２Ａ、Ｑ３０７Ｅ、Ｎ３４２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｆ３５６Ａ、Ｒ３５９Ａ、Ｙ３８２Ａ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７ＱおよびＥ３８７Ｄからなる群から選択される２個まで、３個まで、４個まで、５個まで、６個まで、７個まで、８個まで、９個まで、１０個まで、１１個まで、１２個まで、１３個まで、１４個まで、１５個まで、１６個まで、または１７個までの突然変異からなるＣＤＴａタンパク質を含む。本発明の幾つかの実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質は、（ａ）Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；（ｂ）Ｒ３０２Ａ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７Ｄ；（ｃ）Ｃ２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；（ｄ）Ｒ３０２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；（ｅ）Ｙ６７Ａ、Ｙ６９ＡおよびＲ２５５Ａ；（ｆ）Ｒ３５９Ａ、Ｙ６７ＡおよびＱ３０７Ｅ；（ｇ）Ｙ２５８Ａ、Ｆ３５６Ａ、Ｓ３４５Ｆ；ならびに（ｈ）Ｎ３４２Ａ、Ｙ２５３ＡおよびＹ３８２Ａからなる群から選択される一組の突然変異を含む又はそれらからなる。更に詳細な実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質は、配列番号４０または配列番号４２に記載されているアミノ酸配列を含む又はそれらからなる。
【０１２３】
更に詳細な実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質は、以下に示す配列を含む又はそれからなる。
【化４】
2015506948.tif 000006
【０１２４】
別の実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質は、追加的なＮ末端メチオニンを伴う配列番号６７を含む又はそれからなる。追加の実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質は、追加的なＮ末端メチオニンを伴う配列番号４０または配列番号４２を含む又はそれからなる。
【０１２５】
追加の実施形態においては、免疫原性組成物は、本明細書に記載されている任意のＣＤＴａタンパク質、およびシグナルペプチドを欠く（すなわち、シグナルペプチドが欠失している）ＣＤＴｂタンパク質を含む。更に詳細な実施形態においては、組成物は、本明細書に記載されている任意のＣＤＴａタンパク質、ならびにシグナルペプチドおよび活性化ドメインの両方を欠く（すなわち、シグナルペプチドおよび活性化ドメインが欠失している）ＣＤＴｂタンパク質を含む。
【０１２６】
また、本明細書に記載されている任意の組換え突然変異ＴｃｄＡタンパク質、本明細書に記載されている任意の組換え突然変異ＴｃｄＢタンパク質、本明細書に記載されている任意の組換え突然変異ＣＤＴａタンパク質、およびシグナルペプチドを欠くＣＤＴｂタンパク質、ならびに医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物が本発明により提供される。追加的実施形態においては、記載されている組成物はアジュバントを更に含む。更に詳細な実施形態においては、アジュバントはアルミニウムアジュバントおよび／またはＩＳＣＯＭ型アジュバントである。
【０１２７】
本発明の組成物の別の実施形態においては、本明細書に記載されている突然変異ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢおよび／またはＣＤＴａタンパク質は、天然ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢおよび／またはＣＤＴａタンパク質（例えば、同じ株の天然ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢタンパク質に対するいずれの突然変異をも含まないが、解毒されている、または化学的手段により例えばホルムアルデヒドの使用により毒性が実質的に低減しているトキソイドタンパク質）と組み合わされうる。そのような組成物はＣＤＴｂをも含みうる。追加的な別の実施形態においては、本明細書に記載されている突然変異ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢおよび／または突然変異ＣＤＴａタンパク質はまた、残留毒性を更に低減または排除するためにホルムアルデヒドで処理されうる。
【０１２８】
本発明はまた、（ａ）突然変異Ｗ１０１、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９Ａを含む若しくはそれらからなるＴｃｄＡタンパク質、突然変異Ｗ１０１、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＷ５１９ＡおよびＣ７００Ａを含む若しくはそれらからなるＴｃｄＡタンパク質；（ｂ）突然変異Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａを含む若しくはそれらからなるＴｃｄＢタンパク質、または突然変異Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＷ５２０Ａを含む若しくはそれらからなるＴｃｄＢタンパク質；（ｃ）シグナルペプチドを欠き、突然変異Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ３８７ＱおよびＣ２Ａを含む又はそれらからなるＣＤＴａタンパク質；ならびに（ｄ）シグナルペプチドを欠くＣＤＴｂタンパク質、を含む免疫原性組成物に関する。別の実施形態においては、ＣＤＴｂタンパク質はシグナルペプチドおよび活性化ドメインを欠く。更に詳細な実施形態においては、組成物はアルミニウムアジュバントまたはＩＳＣＯＭ型アジュバント、例えばＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を更に含む。更に詳細な実施形態においては、本明細書に記載されている組成物はアルミニウムアジュバントおよびＩＳＣＯＭ型アジュバントを含む。
【０１２９】
組換え毒素の発現
本発明の方法において使用される本明細書に記載されている毒素タンパク質またはその誘導体は、組換え製造され、必要に応じて、例えばホルムアルデヒドで化学修飾される。本発明の好ましい実施形態においては、組換え毒素は、選択された宿主細胞発現系における組換え発現の後は、化学的手段、例えばホルムアルデヒド不活化によりそれ以上は不活性化されない。ポリペプチドの組換え発現は、関心のあるポリペプチド（すなわち、本明細書に記載されているＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａもしくはＣＤＴｂポリペプチドまたはそれらの誘導体）をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を要する。関心のあるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが得られたら、関心のあるポリペプチドの産生のためのベクターが当技術分野でよく知られた技術を用いる組換えＤＮＡ技術により製造されうる。したがって、関心のあるポリペプチドコードするポリヌクレオチドを発現させることにより、ポリペプチドを製造するための方法が本明細書に記載されている。
【０１３０】
関心のあるポリペプチドのコード配列ならびに適当な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するためには、当業者によく知られた方法が用いられうる。これらの方法は、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ遺伝的組換えを含む。したがって、本発明は、プロモーターに機能的に連結された関心のあるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。
【０１３１】
発現ベクターを通常の技術により宿主細胞に導入し、ついでトランスフェクト化細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、通常の技術により培養して関心のあるポリペプチドを産生させる。したがって、本発明は、異種プロモーターに機能的に連結された関心のあるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。本明細書中で定義される「宿主細胞」なる語は、トランスジェニックヒトの体、トランスジェニックヒト胎児またはトランスジェニックヒト胚における宿主細胞を含むものとは意図されない。
【０１３２】
ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａ、ＣＤＴｂまたはそれらの突然変異体もしくは誘導体形態をコードする組換えヌクレオチド配列の宿主細胞内での発現の後、毒素タンパク質を回収して、本明細書に記載されている免疫原性ワクチンおよび組成物において使用される実質的に精製されたタンパク質を得ることが可能である。幾つかのタンパク質精製方法が利用可能であり、使用に適している。組換え毒素タンパク質は、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーの種々の組合せ又は個々の適用により、細胞ライセートおよび抽出物から精製されうる。また、組換えタンパク質は、毒素タンパク質またはその誘導体もしくは断片に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用して作製された免疫アフィニティカラムを使用して、他の細胞タンパク質から分離されうる。
【０１３３】
関心のあるポリペプチドを発現させるためには、種々の宿主−発現ベクター系が使用されうる。そのような宿主−発現系は、関心のあるコード配列が産生され、ついで精製されうるビヒクルを表し、そして、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされると関心のあるポリペプチドをｉｎ  ｓｉｔｕで発現する細胞をも表す。これらには、関心のあるコード配列（すなわち、本明細書に記載されている突然変異ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよびＣＤＴｂタンパク質をコードする配列）を含有するＤＮＡ発現ベクターで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のような微生物、および関心のあるコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１３４】
商業的ワクチン製造のための十分な量のクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を得るためには、低い生産収率、および培養内で増殖したクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌からの天然毒素の単離に伴う安全性の問題を克服する、組換え発現系において組換えＴｃｄＡおよび／またはＴｃｄＢを発現させるための方法を開発することが有益であろう。クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は嫌気性胞子形成生物であるため、培養におけるＴｃｄ毒素の製造は非常に少量しか得られず、したがって高い経費を要する。また、毒素の化学的不活化は困難なことがあり、汚染を招く可能性があり、このため、商業的ワクチン製造の場合には安全性の問題が生じる。その目的において、本発明の好ましい実施形態は、大量の毒素Ａおよび毒素Ｂの両方を与える、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよびＣＤＴｂタンパク質（例えば、前記のＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよびＣＤＴｂタンパク質またはそれらの誘導体）を、後記のバキュロウイルス／昆虫細胞発現系において組換え発現させるための方法に関する。
【０１３５】
本明細書に記載されているとおり、組換えＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの発現において遭遇する難題を克服するために、幾つかの発現プラットフォームを評価した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、この系を使用しても３ｍＴｃｄＡが発現され得なかったため、最適な発現プラットフォームではないことを結果は示した。また、３ｍＴｃｄＢは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で成功裏に発現されたが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）系における発現から生じた発現産物は、他の発現系において産生される組換え毒素より大量の分解物を含有していた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で４ｍＴｃｄＡ／Ｂが発現される能力をも評価した。３ｍＴｃｄＡで得られた結果に合致して、４ｍＴｃｄＡはこの宿主系においては発現されなかったが、４ｍＴｃｄＢは高レベル（〜１．６ｇ／Ｌ）で産生された。バシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）発現系も評価し、これは少量ないし中等度の量の５ｍＴｃｄＡ（〜７５ｍｇ／Ｌ）および５ｍＴｃｄＢ（〜２００から７００ｍｇ／Ｌ）を成功裏に産生した。
【０１３６】
前記の最適に準じる結果は、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異体の両方に関して一貫していたわけではなく、したがって商業的発現プラットフォームのための良好な候補とはならなかったため、昆虫細胞／バキュロウイルス産生プラットフォームを評価した。昆虫細胞／バキュロウイルス系の前に別の発現系を評価した。というのも、突然変異毒素が残留活性を完全に欠いていなければ、これらの毒素の発現は、Ｒｈｏタンパク質に対する毒素の作用により、昆虫細胞宿主に致死的となると考えられるからである。昆虫細胞を含む全ての真核細胞はＲｈｏタンパク質を産生し、これは細胞増殖および遺伝子発現における役割を有し、アクチン細胞骨格の体制を制御する。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの両方の作用方式はＲｈｏ  ＧＴＰアーゼを不活性化して細胞円形化および細胞死を招くものであるため、いかなる残留毒性も細胞を死亡させうるであろう。したがって、毒素発現の成功の可能性を増大させ、そして、この系を使用して無傷抗原の収量を増加させるために、本発明者らは５ｍＴｃｄＡおよび５ｍＴｃｄＢを試験した。本明細書に記載されている結果は、５ｍＴｃｄＡ／Ｂ毒素が共に、この系において成功裏に発現されることを示した。また、この系において産生された解毒されたＴｃｄＡを使用して行った安定性試験は、培地内で２７℃で６週間貯蔵された場合に、検出可能な分解を示さなかった。
【０１３７】
したがって、本発明は、細胞培養内のバキュロウイルス発現系における、少なくとも４個または少なくとも５個の突然変異を含むＴｃｄタンパク質をコードするヌクレオチド配列の組換え発現による、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ＡおよびＢの製造方法に関する。本発明の好ましい実施形態においては、宿主細胞は昆虫細胞である。前記方法の好ましい実施形態においては、突然変異Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａを含むＴｃｄＡをバキュロウイルス発現系において発現させる。追加的な好ましい実施形態においては、突然変異Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａを含むＴｃｄＢタンパク質をバキュロウイルス発現系において発現させる。
【０１３８】
したがって、本発明は、宿主細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、少なくとも３個、少なくとも４個または少なくとも５個の突然変異を含む本明細書に記載されているＴｃｄＡ突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換してＴｃｄＡタンパク質を産生させることを含む、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡタンパク質の製造方法を提供する。本発明の或る実施形態においては、宿主細胞は昆虫細胞であり、ベクターはバキュロウイルスベクターである。
【０１３９】
本発明は更に、宿主細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、少なくとも３個、少なくとも４個または少なくとも５個の突然変異を含む本明細書に記載されているＴｃｄＢ突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換して、ＴｃｄＢタンパク質を産生させることを含む、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡタンパク質の製造方法を提供する。本発明の或る実施形態においては、宿主細胞は昆虫細胞であり、ベクターはバキュロウイルスベクターである。
【０１４０】
本発明は更に、本明細書の全体にわたって記載されているＣＤＴａタンパク質またはＣＤＴｂタンパク質をコードするヌクレオチド配列の組換え発現による、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）からの二成分毒素Ａおよび二成分Ｂの製造方法に関する。
【０１４１】
したがって、本発明は、宿主細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、少なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも４個の突然変異を含む本明細書に記載されているＣＤＴａ突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換して、ＣＤＴａタンパク質を産生させることを含む、ＣＤＴａタンパク質の製造方法を提供する。本発明の或る実施形態においては、宿主細胞は昆虫細胞であり、ベクターはバキュロウイルスベクターである。
【０１４２】
本発明は、宿主細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、少なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも４個の突然変異を含む本明細書に記載されているＣＤＴｂタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換して、ＣＤＴｂタンパク質を産生させることを含む、ＣＤＴｂタンパク質の製造方法を提供する。本発明の或る実施形態においては、宿主細胞は昆虫細胞であり、ベクターはバキュロウイルスベクターである。
【０１４３】
本明細書に挙げられている全ての刊行物を、本発明に関して使用されうる方法および材料を記載し開示する目的で参照により本明細書に組み入れることとする。本明細書におけるいずれのものも、本発明が先行発明に基づいてそのような開示に先行する権利を有しないと自認するものと解釈されるべきではない。
【０１４４】
添付図面の参照により本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されているが、本発明はそれらそのとおりの実施形態には限定されず、添付の特許請求の範囲において定められる本発明の範囲または精神から逸脱することなく、種々の変更および修飾が当業者により施されうると理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１はクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ＡおよびＢ（ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ）からの大クロストリジウム毒素の構造を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、種々のクロストリジウム属種からのＬＣＴの多重配列アライメントを示し、活性部位に沿って並ぶ高度に保存された残基が太字で示されている。
【図２Ｂ】図２Ｂは、種々のクロストリジウム属種からのＬＣＴの多重配列アライメントを示し、活性部位に沿って並ぶ高度に保存された残基が太字で示されている。
【図３Ａ】図３Ａは、本明細書中の実施例に記載されている組換えＴｃｄＡ（図３Ａ）およびＴｃｄＢ（図３Ｂ）突然変異体（完全長および酵素ドメイン）の突然変異の種類を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本明細書中の実施例に記載されている組換えＴｃｄＡ（図３Ａ）およびＴｃｄＢ（図３Ｂ）突然変異体（完全長および酵素ドメイン）の突然変異の種類を示す。
【図４】図４は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＴｃｄ突然変異酵素ドメイン（触媒ドメイン、ＴｃｄＢ突然変異体、上；ＴｃｄＡ突然変異体、下）の発現を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびそれに続くクーマシーブルー染色による精製ヘキサヒスチジンタグ付き酵素ドメインの分析が示されている（左パネル）。該タンパク質の同一性および完全性は、抗Ｈｉｓ  ＭＡｂを使用するウエスタンブロット分析（右パネル）により確認された。
【図５】図５は、実施例２に記載されている、ＴｃｄＢおよび突然変異体組換え酵素ドメインに関するＲｈｏＡグルコシル化アッセイからの結果を示す。データは、１００％活性を有するＶＰＩ１０４６３  ＴｃｄＢに対して標準化された。データは、天然完全長ＴｃｄＢ毒素（ＴｃｄＢ）、およびバシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）において発現された完全長３ｍＴｃｄＢ（ｍＴｃｄＢ）に関して示されている。また、以下の触媒ドメイン断片に関するデータも示されている：Ｗ１０２欠失（Ｄｅｌｔａ）、野生型ＶＰＩ１０４６３  ＴｃｄＢ（ＶＰＩ）、野生型ＴｃｄＢ（ＮＡＰ１）、三重突然変異体Ｗ１０２Ａ，Ｄ２８８Ａ，Ｅ５１５Ｑ（Ｔｒｉ）、四重突然変異体Ｗ１０２Ａ，Ｄ２８８Ａ，Ｅ５１５Ｑ，Ｓ５１８Ａ（ＱｕａｄＳ）、四重突然変異体Ｗ１０２Ａ，Ｄ２８６Ａ，Ｄ２８８Ａ，Ｅ５１５Ｑ（ＱｕａｄＤ）ならびに四重突然変異体Ｗ１０２Ａ，Ｄ２８８Ａ，Ｅ５１５Ｑ，Ｗ５２０Ａ（Ｑｕａｄ  Ｗ）。全ての突然変異体断片はＶＰＩ１−４６３株から誘導された。
【図６】図６は、細胞に基づくアッセイにおける、種々のＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ構築物に関連した残留毒性を示す。３、４または５個の突然変異を含有するＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの両方の種々の突然変異形態（毒素Ａ突然変異体：ｎａｐ ３ｍＴｃｄＡ ｂｍ、ｖｐｉ ４ｍＴｃｄＡ ｂｖ、ｖｐｉ ５ｍＴｃｄＡ ｂｖならびに毒素Ｂ突然変異体：ｎａｐ ３ｍＴｃｄＢ ｂｍ、ｎａｐ ４ｍＴｃｄＢ ｅｃおよびｎａｐ ５ｍＴｃｄＢ ｂｖ）を、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（ｖｐｉ ＴｃｄＡ ｃｄ、ｎａｐ ＴｃｄＡ ｃｄ、ｖｐｉ ＴｃｄＢ ｃｄおよびｎａｐ ＴｃｄＢ ｃｄ）から精製された天然毒素、またはホルムアルデヒド不活化天然毒素（ｖｐｉ ＴｏｘＡ ｃｄおよびｖｐｉ ＴｏｘＢ ｃｄ）、またはホルムアルデヒド不活化突然変異毒素（ｖｐｉ ５ｍＴｏｘＡ ｂｖおよびｎａｐ ５ｍＴｏｘＢ ｂｍ）と比較した。ＴＣ５０の増加は毒素活性の減少を示す。下の破線は、提示されている安全性閾値を示す。
【図７】図７は、実施例６に記載されているとおり、ＴｃｄＡ ＶＰＩ ４Ｍバキュロウイルス感染Ｓｆ９昆虫細胞の上清および全ブロスサンプルの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を示す。また、陰性対照として働いた、インサートを含有しないバキュロウイルス（Ｂａｃｍｉｎ）も示されている。
【図８】図８はハムスターチャレンジモデルにおける防御の分析を示す。種々の発現系において組換え製造された上部に一覧されている種々の突然変異ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ毒素がクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子での致死的チャレンジからハムスターを防御する能力の評価が示されている。実施例７に記載されているとおり、ＶＰＩ株でハムスターをチャレンジした。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異体の起源が示されている（ｖｐｉまたはｎａｐ）。各突然変異体に関して使用した発現系も示されている（ｃｄ（クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））、ｂｖ（バキュロウイルス）、ｂｍ（バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ））およびｅｃ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）））。
【図９】図９は、突然変異Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａを有するＶＰＩ ５ｍＴｃｄＡのアミノ酸配列（配列番号２６）を示す。
【図１０】図１０は、突然変異Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａを有するＮＡＰ ５ｍＴｃｄＢのアミノ酸配列（配列番号２８）を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、実施例１１に記載されているハムスターチャレンジモデルにおいて行った研究に関する生存曲線（時間に対する生存率）を示す。ｎａｐ ４ｍＴｃｄＡとｎａｐ ４ｍＴｃｄＢとの組合せ（黒三角）、またはホルムアルデヒド不活化トキソイドＡとトキソイドＢとの組合せ（白丸）（共にＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントの存在下でＭＡＡ上で製剤化されたもの）のいずれかでハムスターをワクチン接種した。また、アジュバントのみの対照（黒丸）も示されている。２４１  ＣＦＵの原型株ＶＰＩ１０４６３（パネルＡ）または４５７  ＣＦＵの流行性株ＮＡＰ１／０２７／ＢＩ１７（パネルＢ）で動物をチャレンジした。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、実施例１１に記載されているハムスターチャレンジモデルにおいて行った研究に関する生存曲線（時間に対する生存率）を示す。ｎａｐ ４ｍＴｃｄＡとｎａｐ ４ｍＴｃｄＢとの組合せ（黒三角）、またはホルムアルデヒド不活化トキソイドＡとトキソイドＢとの組合せ（白丸）（共にＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントの存在下でＭＡＡ上で製剤化されたもの）のいずれかでハムスターをワクチン接種した。また、アジュバントのみの対照（黒丸）も示されている。２４１  ＣＦＵの原型株ＶＰＩ１０４６３（パネルＡ）または４５７  ＣＦＵの流行性株ＮＡＰ１／０２７／ＢＩ１７（パネルＢ）で動物をチャレンジした。
【図１２】図１２はハムスターチャレンジモデルにおけるＮＡＰ１／０２７／ＢＩ１７株でのチャレンジの後のクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの防御効力に対するＣＤＴａおよびＣＤＴｂの関連関与を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、前記に記載されている、天然ＣＤＴａタンパク質からのシグナルペプチドを伴わないＣＤＴａ（パネルＡ、配列番号３８）、３ｍＣＤＴａ１（パネルＢ、配列番号４０）および３ｍＣＤＴａ２（パネルＣ、配列番号４２）のアミノ酸配列を示す。３ｍＣＤＴａ１および３ｍＣＤＴａ２における突然変異残基が示されている。示されているＣＤＴａ配列はＮＡＰ１株Ｒ２０２９１からのものである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、前記に記載されている、天然ＣＤＴａタンパク質からのシグナルペプチドを伴わないＣＤＴａ（パネルＡ、配列番号３８）、３ｍＣＤＴａ１（パネルＢ、配列番号４０）および３ｍＣＤＴａ２（パネルＣ、配列番号４２）のアミノ酸配列を示す。３ｍＣＤＴａ１および３ｍＣＤＴａ２における突然変異残基が示されている。示されているＣＤＴａ配列はＮＡＰ１株Ｒ２０２９１からのものである。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、前記に記載されている、天然ＣＤＴａタンパク質からのシグナルペプチドを伴わないＣＤＴａ（パネルＡ、配列番号３８）、３ｍＣＤＴａ１（パネルＢ、配列番号４０）および３ｍＣＤＴａ２（パネルＣ、配列番号４２）のアミノ酸配列を示す。３ｍＣＤＴａ１および３ｍＣＤＴａ２における突然変異残基が示されている。示されているＣＤＴａ配列はＮＡＰ１株Ｒ２０２９１からのものである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、天然ＣＤＴｂタンパク質からのＣＤＴｂシグナルペプチドを欠くｐｒｏＣＤＴｂ（パネルＡ、配列番号４４）、および天然ＣＤＴｂタンパク質からのシグナルペプチドと活性化ドメインとの両方を欠くＣＤＴｂ（パネルＢ、配列番号４６）のアミノ酸配列を示す。示されているＣＤＴｂ配列はＮＡＰ株Ｒ２０２９１からのものである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、天然ＣＤＴｂタンパク質からのＣＤＴｂシグナルペプチドを欠くｐｒｏＣＤＴｂ（パネルＡ、配列番号４４）、および天然ＣＤＴｂタンパク質からのシグナルペプチドと活性化ドメインとの両方を欠くＣＤＴｂ（パネルＢ、配列番号４６）のアミノ酸配列を示す。示されているＣＤＴｂ配列はＮＡＰ株Ｒ２０２９１からのものである。
【図１５】図１５はＲ２０２９１参考株からのＣＤＴａの天然アミノ酸配列（配列番号５９）を示す。天然ＣＤＴａのシグナルペプチドが下線で示されている。本明細書においてＣＤＴａ突然変異を番号づけするための残基番号１の位置が示されている。残基番号１はシグナルペプチドの後の最初のアミノ酸から始まる。
【図１６】図１６はクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＶＰＩ１０４６３株からの天然ＴｃｄＡ（配列番号６０）および天然ＴｃｄＢ（配列番号６１）のＮ末端部分の残基１から残基７１９（ＴｃｄＡ）および７１７（ＴｃｄＢ）までのアライメントを示す。本明細書に開示されている突然変異の位置が下線で示されているが、示されている残基は天然配列からのものである。
【図１７】図１７はアカゲザル「研究番号１１」（実施例１２を参照されたい）に関するプロトコールの概要を示す。示されている投与計画で各群にｖｐｉ ５ｍＴｃｄＡ ｂｖ、ｎａｐ ５ｍＴｃｄＢ ｂｖ、３ｍ ＣｄｔＡ２ ｂｖおよびｐｒｏＣｄｔＢ ｂｖを筋肉内投与した。毒素ワクチン成分に加えて、示されている量のアジュバントまたはアジュバントの組合せ（ＩＭＯ＝ＩＭＯ２１７０、ＭＡＡ＝アルミニウムヒドロキシホスファートスルファートおよびＩＭＸ＝ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＣＳＬ  Ｌｔｄ．））を、示されている量でまたはアジュバント無しで、各群に投与した。示されているとおり、幾つかのワクチン組成物をホルムアルデヒドで処理した。
【図１８Ａ】図１８Ａは、３用量計画（図１８Ａ）または４用量計画（図１８Ｂ）で、示されている種々のアジュバントと組み合わされた４つの成分のそれぞれを含むワクチン組成物を投与した種々のサル群（研究番号１１）に関するＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよびＣＤＴｂに対するＩｇＧ価のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、３用量計画（図１８Ａ）または４用量計画（図１８Ｂ）で、示されている種々のアジュバントと組み合わされた４つの成分のそれぞれを含むワクチン組成物を投与した種々のサル群（研究番号１１）に関するＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよびＣＤＴｂに対するＩｇＧ価のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａ〜Ｃは、それぞれ、ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢおよび二成分毒素に関する中和アッセイデータを示す。図ＡおよびＢでは、各用量に関して示されている棒線は、左から右へ、群１〜１１に対応する。天然ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢによるＶｅｒｏ細胞の殺細胞を抑制する抗血清の能力を測定するために、Ｎａｂアッセイを用いた。研究１１における群では、第０日、第７／１０日、第３０日および第４５日における（図ＡおよびＢ）、そして二成分毒素に関しては第４５日における（図Ｃ）、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢに対する中和抗体価が示されている。
【図１９Ｂ】図１９Ａ〜１９Ｃは、それぞれ、ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢおよび二成分毒素に関する中和アッセイデータを示す。図ＡおよびＢでは、各用量に関して示されている棒線は、左から右へ、群１〜１１に対応する。天然ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢによるＶｅｒｏ細胞の殺細胞を抑制する抗血清の能力を測定するために、Ｎａｂアッセイを用いた。研究１１における群では、第０日、第７／１０日、第３０日および第４５日における（図ＡおよびＢ）、そして二成分毒素に関しては第４５日における（図Ｃ）、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢに対する中和抗体価が示されている。
【図１９Ｃ】図１９Ａ〜１９Ｃは、それぞれ、ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢおよび二成分毒素に関する中和アッセイデータを示す。図ＡおよびＢでは、各用量に関して示されている棒線は、左から右へ、群１〜１１に対応する。天然ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢによるＶｅｒｏ細胞の殺細胞を抑制する抗血清の能力を測定するために、Ｎａｂアッセイを用いた。研究１１における群では、第０日、第７／１０日、第３０日および第４５日における（図ＡおよびＢ）、そして二成分毒素に関しては第４５日における（図Ｃ）、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢに対する中和抗体価が示されている。
【図２０Ａ】図２０Ａは還元および非還元条件下のＣＤＴａ（レーン１および２）および３ｍＣＤＴａ １（レーン３および４）のウエスタンブロット分析の結果を示す。また、サイズマーカー（レーン１の左）ならびにタンパク質単量体および二量体バンドの位置も示されている。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは経時的な３ｍＣＤＴａ１のＳＥＣ−ＵＶ分析の結果を示す。凝集物、二量体および単量体のピークが示されている。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは４ｍＣＤＴａ８のＳＥＣ  ＭＡＬＳ分析の結果を示す。記載されている結果は経時的なモル質量を示す。４ｍＣＤＴａ８では単一単量体ピークが視認可能である。
【図２１】図２１は、３ｍＣＤＴａ２または４ｍＣＤＴａ８で免疫化されたＳｙｒｉａｎハムスターの防御の比較を示す。アジュバントのみの対照と比較された経時的な生存率が示されている。
【図２２】図２２は、実施例９に記載されているとおり、天然ＣＤＴａと比較された場合の、Ｖｅｒｏ細胞に対するキモトリプシン活性化プロＣＤＴｂと混合されたＣＤＴａの種々の突然変異形態の細胞毒性アッセイの結果を示す。
【０１４６】
実施例１
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異体の発現
Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ（登録商標）ＸＬ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、ＶＰＩ１０４６３株に由来するクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）天然毒素Ａおよび毒素Ｂをコードするヌクレオチド配列に対して突然変異誘発を行った。種々の組合せの突然変異を有する幾つかの突然変異毒素を、図３に示されているとおりに製造した。突然変異体を発現させ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製した。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系のためにコドン最適化されたヌクレオチド配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手した。図３に示されている突然変異体のうち、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化三重突然変異ＴｃｄＢ（Ｗ１０２Ａ，Ｄ２８８Ａ，Ｅ５１５Ｑ）だけが完全長形態で発現された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現された酵素ドメインだけからなる追加的構築物を試験した。
【０１４７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における構築物の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。図４に示されているとおり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＴｃｄ突然変異酵素ドメイン（触媒ドメイン）の発現の分析は、一般に、分解産物の可変性プロファイルを有する〜６０ｋＤａの１つの主要組換え体バンドを示した。タンパク質の同一性および完全性を、抗Ｈｉｓ  ＭＡｂを使用するウエスタンブロット分析により確認した（図４）。
【０１４８】
実施例２
ＲｈｏＡグルコシル化アッセイによるＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ酵素活性の決定
ＲｈｏＡグルコシル化活性アッセイを用いて、組換えＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ酵素ドメインの毒性をインビトロで比較した。簡潔に説明すると、タンパク質を、２つの異なる濃度レベル（１および１０μｇ／ｍＬ）で、基質（組換えＲｈｏＡ−ＧＴＰアーゼ）、補因子（ＭｎＩＩ）および放射能標識補基質（ＵＤＰ−１４Ｃ−グルコース）を含有する反応バッファーと混合した。反応を３７℃で９０分間インキュベートし、タンパク質を、取り込まれた１４Ｃと共に、氷冷１０％トリクロロ酢酸で沈殿させた。沈殿物を濾過により回収し、フィルターを液体シンチレーションカウンターで定量した。
【０１４９】
ＴｃｄＢに関するアッセイの結果を図５に示す。三重突然変異体Ｗ１０２Ａ，Ｄ２８８Ａ，Ｅ５１５Ｑ触媒ドメインは天然触媒ドメインのグルコシル化活性の約１０％を保有しているようであり、これはＷ１０２欠失突然変異体と匹敵しうる活性であった。ＱｕａｄＳ（Ｗ１０２Ａ，Ｄ２８８Ａ，Ｅ５１５Ｑ，Ｓ５１８Ａ）、ＱｕａｄＷ（Ｗ１０２Ａ，Ｄ２８８Ａ，Ｅ５１５Ｑ，Ｗ５２０Ａ）およびデルタＷ１０２は、検出可能な酵素活性を示さなかった。完全長毒素の場合、３ｍＴｃｄＢは完全長毒素の活性の〜０．５％を保有していた。３ｍＴｃｄＢ触媒ドメイン断片と完全長３ｍＴｃｄＢとの間の毒性の相違はフォールディングまたは純度の相違によるものでありうる。ＴｃｄＡに関して、類似した結果が観察された。
【０１５０】
このデータに基づいて、完全長突然変異毒素（Ｗ１０２Ａ，Ｄ２８８Ａ，Ｅ５１５Ｑ，Ｗ５２０Ａ）内に第４の突然変異を導入した。昆虫細胞（バキュロウイルス発現系）およびバシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）において、４ｍＴｃｄＡおよび４ｍＴｃｄＢ構築物を発現させた。この第４突然変異の付加にもかかわらず、動物の免疫化後に残留毒性が尚も観察された。したがって、第５の突然変異であるＣ６９８Ａを導入した。Ｃ６９８Ａは、トランスロケーションドメインから触媒ドメインを切断して細胞質内へのその遊離を可能にするシステインプロテアーゼの鍵残基である。この突然変異の導入はＴｃｄＢの毒性における更に１０倍の減少を引き起こした（図６）。
【０１５１】
実施例３
バキュロウイルス発現系におけるＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの発現
組換えＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの発現において遭遇する難題を克服するために、幾つかの発現プラットフォームを評価した。まず、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を試験したが、この系を使用して３ｍＴｃｄＡを発現させることはできなかった。３ｍＴｃｄＢは成功裏に発現されたが、それは部分的に分解した。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における４ｍＴｃｄＡ／Ｂの発現も評価したが、この場合もまた、４ｍＴｃｄＡはこの宿主系において成功裏に産生されなかったが、４ｍＴｃｄＢは高レベル（〜１．６ｇ／Ｌ）で産生された。また、バシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）発現系も評価し、それは少量ないし中等度の量の５ｍＴｃｄＡ（〜７５ｍｇ／Ｌ）および５ｍＴｃｄＢ（〜２００から７００ｍｇ／Ｌ）を成功裏に産生した。
【０１５２】
バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）を、この生物における完全長ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの発現の過去の例（Ｂｕｒｇｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０７（３）：５８４−８（２００３）；Ｙａｎｇら，ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：１９２（２００８））に基づいて、発現宿主として評価した。この発現宿主は３ｍＴｃｄＡおよび３ｍＴｃｄＢの産生の増加を示したが（起源配列ＮＡＰ１株）、これらの分子でのハムスターおよびサルの免疫化は、これらの調製物が、ホルムアルデヒド不活化の非存在下では許容し得ないほどに高レベルの残留毒性を含有することを示した。
【０１５３】
つぎに、無傷抗原の収量を増加させるために、５ｍＴｃｄＡおよび５ｍＴｃｄＢについて昆虫細胞／バキュロウイルス産生プラットフォームの使用を評価した。昆虫細胞におけるバキュロウイルス媒介性発現のために、Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９Ａ突然変異またはＷ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａ突然変異のいずれかで修飾されたクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株ＶＰＩ１０４６３からのＴｃｄＡ配列（以下、それぞれ、ＴｃｄＡ ＶＰＩ ４ＭまたはＴｃｄＡ ＶＰＩ ５Ｍと称する）を使用した。また、突然変異Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａで修飾されたクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株ＮＡＰ１／０２７／ＢＩからのＴｃｄＢ配列（以下、ＴｃｄＢ ＮＡＰ ５Ｍ）を使用した。
【０１５４】
組換えバキュロウイルスは、ＴｃｄＡ変異体に関して後記でより詳細に記載されているとおり、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して作製した。ＤＮＡ配列を遺伝子合成により作製し、ｐＦａｓｔＢａｃ（商標）導入ベクター内のＮｏｔＩ／ＳｐｈＩ制限部位内にクローニングした。ＴｃｄＡ突然変異体のクローニングのために、プラスミドＶＰＩＡ ＢＭ ｐＵＣ５７における、ＴｃｄＡコード配列の上流のＢｓｒＧＩ制限部位にＮｏｔＩ制限部位を導入した。構築物は、ｐＵＣ５７内にクローニングされたバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）最適化クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ配列（ＴｃｄＡ ＢＭ）を含有していた。ＮｏｔＩの挿入のために使用したオリゴヌクレオチドは以下のとおりであった：ＢｓｒＧＩ−ＮｏｔＩ  Ｆ−５’  Ｇ  Ｔ  Ａ  Ｃ  Ａ  Ｇ  Ｃ  Ｇ  Ｇ  Ｃ  Ｃ  Ｇ  Ｃ  Ｔ  ３’（配列番号３６）およびＢｓｒＧＩ−ＮｏｔＩ  Ｒ−５’  Ｔ  Ｃ  Ｇ  Ｃ  Ｃ  Ｇ  Ｇ  Ｃ  Ｇ  Ａ  Ｃ  Ａ  Ｔ  Ｇ  ３’（配列番号３７）。得られたＶＰＩＡ ＢＭ ｐＵＣ５７ ＮｏｔＩをＮｏｔＩおよびＳｐｈＩで消化してＴｃｄＡ ＢＭ遺伝子を得、ついでこれは、ＮｏｔＩ／ＳｐｈＩで消化されたｐＦａｓｔｂａｃ１ベクター内にクローニングすることが可能であった。これは導入プラスミドｐＦｂＴｃｄＡ ＢＭを与えた。
【０１５５】
ついでｐＦａｓｔＢａｃ（商標）を、親バクミド（ｂａｃｍｉｄ）を含有するコンピテントＤＨ１０Ｂａｃ（商標）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）内に形質転換し、ここで、それは組換えバクミド（Ｂａｃｍｉｄ）を与えるように再結合した。ＴｃｄＡ突然変異体の場合、２つのタイプの細菌コンピテント細胞において形質転換を行った。１つ目は、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系を備えた標準的なＤＨ１０Ｂａｃ（商標）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であり、２つ目はＢａｃｄＣＣＤＨ１０細胞（Ｍ  ｖａｎ  Ｏｅｒｓ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，ＮＬ，  Ｓ．Ｋａｂａら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２２（２００４）１１３−１１８）であった。ＢａｃｄＣＣ細胞においてバクミドとしてクローニングされたバキュロウイルスゲノムは、クロラムフェニコール耐性遺伝子により置換されたｖ−カテプシンおよびキチナーゼ遺伝子の欠失を含有する。Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ発現系と共に提供されたマニュアルに従い、形質転換を行った。ＢａｃｄＣＣ  ＤＨ１０細胞との組換え体の選択のために、２５μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールをＬＢ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）寒天プレートに加えた。再ストリーク後に白色にとどまるコロニーから培養を成長させ、バクミドＤＮＡを単離し、トランスフェクションに使用した。
【０１５６】
ついで組換えバクミドを抽出し、使用して、Ｓｆ９およびＳｆ２１昆虫細胞をトランスフェクトし、ここで、バキュロウイルスを作製し、１〜２回継代して、実験のための十分な組換えバキュロウイルスを得た。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃマニュアルに従い、トランスフェクションを行った。ＴＣＩＤ５０アッセイまたは市販のバキュロウイルス力価測定キット（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＬＬＣ，Ｗｏｏｄｌａｎｄ，ＣＡ）を使用して、バキュロウイルスを力価測定した。精製プロセス条件における若干の相違以外は、それらの２つのＴｃｄＡ変異体およびＴｃｄＢ変異体は同様に処理された。
【０１５７】
実施例４
昆虫細胞の増殖および誘導のための方法
ＳＦ９（ＡＴＣＣ）、ＳＦ２１細胞（Ｋｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ＳＦ２１ＣＢ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）およびＥｘｐｒｅｓＳＦ＋（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）を、無血清Ｓｆ９００−ＩＩまたはＳｆ９００−ＩＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、振とうフラスコ（培養体積＝フラスコ体積の１／５〜１／２）内で２７℃で培養し、１−２’’行程の振とう器を使用して５０〜１５０ＲＰＭで撹拌した。細胞を分割し、０．５×１０６〜５×１０６  生細胞／ｍｌで維持した。発現研究のために、１〜２×１０６  細胞／ｍｌの生細胞濃度の昆虫細胞を０．１単位／生細胞以上の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。感染後第２〜６日から、細胞ペレット、上清および全ブロスサンプルにおいて産物レベルをモニターした。サンプルを調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［この場合、ＴｃｄＡ（〜３００ｋＤａ）およびＴｃｄＢ（〜２７０ｋＤａ）はほとんどの他のタンパク質から良く分離される］により分析した。精製のための回収を、典型的には感染後第４〜５日に行った。
【０１５８】
実施例５
昆虫細胞からのＴｃｄＡおよびＴｃｄＢタンパク質の回収および精製
回収時の全ブロスサンプルにおけるＴｃｄＡレベルは、（実験的変動および昆虫細胞型の相違により）１００〜２００ｍｇ／ｌで変動し、ＴｃｄＢレベルは２００〜５００ｍｇ／ｌで変動した。初期の試みは、清澄化上清から産物を回収することを目的とした。しかし、組換えタンパク質は上清および細胞ペレットの両方に存在し、流動物または合せた全ブロスのいずれからも回収されうる。細胞内画分は昆虫細胞の型によって様々であった。細胞ペレットまたは全ブロスからのタンパク質の効率的抽出は、細胞溶解の誘発に典型的な濃度の非イオン界面活性剤（例えば、０．１〜１．０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の使用を要した。精製では、硫酸アンモニウム沈殿、およびそれに続く、強アニオン交換樹脂を使用するイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）の組合せを用いて、完全長産物ＴｃｄＡは、清澄化上清から、低収率で７０％を超える純度まで回収可能であった。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢは共に、強アニオン交換樹脂を使用するＩＥＸクロマトグラフィーおよびそれに続くヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーの組合せを用い、流動物のいずれからも２０％を超える収率で９０％を超える純度まで回収可能であった。
【０１５９】
実施例６
組換えＴｃｄＡおよびＴｃｄＢタンパク質の特徴づけ
ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢタンパク質産物（完全長であった産物関連バンドの画分）の完全性は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＴｃｄＢの場合）およびバシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）における細胞内発現と比較して、バキュロウイルス／昆虫細胞系において最も良く維持された。また、宿主不純物に対する所望の産物の比率は（より低いバイオマスおよび細胞当たりの良好な生産性ゆえに）バキュロウイルス／昆虫細胞系の場合に最高であり、それにより、より容易な下流処理が可能となった。これを例示するために、図７に示されているとおり、上清、およびＴｃｄＡ ＶＰＩ ４Ｍバキュロウイルス感染Ｓｆ９（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）昆虫細胞培養の全ブロスサンプルを、サンプルバッファーとしての４×ＬＤＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル）により分析した。陰性対照として、インサート（Ｂａｃｍｉｎ）を含有しないバキュロウイルスを使用した。細胞に０．１  ＴＣＩＤ５０  単位／細胞のＭＯＩで感染させ、それを感染の５日後に回収した。
【０１６０】
結果は、バキュロウイルス系により産生された突然変異毒素物質が、その他の系において産生されたタンパク質より高い質を有することを示した。それは遥かに低い分解を示し、より容易に精製された。
【０１６１】
実施例７
ハムスターチャレンジモデルにおけるＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異タンパク質の免疫原性の評価
ハムスターモデルを以下のとおりに行った。ゴールデンハムスターを３週間間隔でワクチンで筋肉内に４回免疫化した。ついで、１５日間の休息期間の後、動物にクリンダマイシン（クレオシン（Ｃｌｅｏｃｉｎ））を経口ガバージュにより投与した。この処理はコロニー性微生物叢を破壊し、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）による定着に対する感受性のウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ）を与えることが判明した。クレオシン処理の５日後、動物を致死量のクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子でチャレンジした。動物を１日２回、１４日間にわたって評価した。種々のＴｃｄＡおよびＴｃｄｂタンパク質での免疫化のこのモデルにおける防御の結果を図８に示す。
【０１６２】
組換え突然変異毒素（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびバキュロウイルス／昆虫細胞）は、天然毒素に対する血清ＩｇＧを測定するＥＬＩＳＡ及び細胞に基づく中和抗体アッセイにおいて、お互いに対しておよび天然毒素のホルムアルデヒド不活化により得られたトキソイドワクチンに対して、ハムスター致死チャレンジモデルにおいて免疫学的に類似していることも示された（データ非表示）。
【０１６３】
実施例８
ＣＤＴａおよびＣＤＴｂの発現
全ての二成分毒素構築物は、鋳型としてＮＡＰ１／０２７／ＢＩ配列を使用して作製した。ＣＤＴａおよびＣＤＴｂ配列は、これまで調べた全株にわたって＞９７％保存されているため、ＮＡＰ１株に基づく選択された構築物は、全ての二成分毒素発現株に対して防御するのに十分な抗体応答を生成するはずである。
【０１６４】
ＣＤＴａをコードするヌクレオチド配列（シグナルペプチドとして作用する最初の４２個のＮ末端アミノ酸をコードするコドンを欠く）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における最適発現のためにＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によりコドン最適化され（配列番号４７）、フランキングＮｄｅＩおよびＸｈｏＩクローニング部位を含有し、終止コドンを含有していなかった。配列は、指示上の誤りのため、Ｎ末端に余分なメチオニンを含有していた。遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＥＴ３０ａ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位内にクローニングし、Ｃ末端の６×ヒスチジンタグと共に発現させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現宿主ＢＬＲ（ＤＥ３）（ＥＭＤ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して発現研究を行った。ＣＤＴａは高度に発現され、可溶性であった。
【０１６５】
最初に、ＣＤＴｂの成熟形態（シグナルペプチドおよび活性化ドメインを欠く）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で６×ヒスチジンタブを伴って発現させるための試みを行った。ＣＤＴｂは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での発現に関してコドン最適化され、フランキングＮｄｅＩ／ＸｈｏＩクローニング部位を含有し、終止コドンを含有していなかった（配列番号５３）。遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＥＴ３０ａのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位内にクローニングし、Ｃ末端の６×ヒスチジンタグと共に発現させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現宿主ＢＬＲ（ＤＥ３）を使用して発現研究を行った。残念ながら、この構築物は不安定であり、不溶性であることが判明した。ＣＤＴｂタンパク質の＞９０％は〜４０ｋＤの分解産物中で見出された。
【０１６６】
ベクターｐＧＥＸ  ６Ｐ−１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するＧＳＴ融合タンパク質としてのＣＤＴｂの安定発現は、Ｓｕｎｄｒｉｙａｌら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ７４：４２−４８（２０１０））により既に記載されている。この研究に基づき、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより最適化された前記ＣＤＴｂを、Ｎ末端クローニング部位をＮｄｅＩからＢａｍＨＩへと変化させ終止コドンを導入するように設計されたプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。ついで、Ｓｕｎｄｒｉｙａｌにより記載されているとおり、ＣＤＴｂを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＧＥＸ６Ｐ−１内にＮ末端ＧＳＴタグとインフレームでクローニングした（配列番号５４）。ＢＬＲ（ＤＥ３）を使用してＣＤＴｂを発現させた。融合タンパク質は安定であり、高度に発現され、可溶性であった。しかし、ＧＳＴタグを除去するためのタンパク質分解は、タンパク質の可溶性の著しい低下を引き起こした。
【０１６７】
ＣＤＴｂの可溶性を増加させることを試みるために、ＣＤＴｂの第２形態を構築した。プロＣＤＴｂと称されるこの構築物は、元のＣＤＴｂ構築物には含まれていない活性化ドメインを含んでいたが、シグナルペプチドを尚も欠いていた。プロＣＤＴｂは、フランキングＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩクローニング部位および終止コドンを伴うように、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での発現に関してコドン最適化された（配列番号５６）。前記のとおりに、プロＣＤＴｂを発現ベクターｐＧＥＸ  ６Ｐ−１内にクローニングした。発現宿主ＢＬＲ（ＤＥ３）を使用して、発現研究を行った。融合タンパク質は安定であり、高度に発現され、可溶性であった。この場合もまた、ＧＳＴタグを除去するためのタンパク質分解は、タンパク質の可溶性の著しい低下を引き起こした。
【０１６８】
二成分毒素成分の安全性を評価するために、ハムスター研究を行った。ハムスターを、以下の形態のＣＤＴａの１つと組み合わされたＣＤＴｂで免疫化した：（１）ホルムアルデヒド不活化組換え天然（非突然変異）ＣＤＴａ、（２）ホルムアルデヒド不活化３ｍＣＤＴａ１／３ｍＣＤＴａ２、または（３）組換え３ｍＣＤＴａ１／３ｍＣＤＴａ２（ホルムアルデヒド未不活化体）。全身性の及び注射部位の両方の有害事象（ＡＥ）に関して、免疫化後の数日間にわたって動物を観察した。１つの研究においては、ホルムアルデヒド不活化野生型配列ＣＤＴａを含有する全ての腕において有意なＡＥが観察され、ホルムアルデヒド不活化３ｍＣＤＴａ１および３ｍＣＤＴａ２を含有する腕においては、少数の軽度なＡＥが観察された。第２の研究においては、ホルムアルデヒド不活化野生型配列ＣＤＴａの投与を受けた腕の半分（２／４）で有意なＡＥが観察され、この場合もまた、ホルムアルデヒド不活化３ｍＣＤＴａおよび３ｍＣＤＴａ２ならびに組換え３ｍＣＤＴａ１／３ｍＣＤＴａ２（ホルムアルデヒド未不活化体）を含有する腕において少数の軽度なＡＥが観察された。研究の結果は、二成分毒素を完全に不活化するにはホルムアルデヒド不活化法だけでは不十分であったことを示している。また、ＡＥは大部分がＣＤＴａ成分によるものであろう。なぜなら、それらの２つの成分の免疫化は僅かなＣＤＴｂ関連ＡＥを別個に示したに過ぎないからである。
【０１６９】
実施例９
遺伝的に不活化されたＣＤＴａタンパク質の発現
二成分毒素は活性毒素であるため、遺伝的に不活化（不活性化）された形態の毒素タンパク質を作製することも望ましかった。したがって、毒素の酵素成分ＣＤＴａを遺伝的不活化のための標的とした。まず、ＣＤＴａを遺伝的に不活化することを試みるために、ＣＤＴａの以下の２つの三重突然変異体を設計した：３ｍＣＤＴａ１（Ｒ３０２Ａ，Ｅ３８５Ａ，Ｅ３８７Ｄ）および３ｍＣＤＴａ２（Ｓ３４５Ｆ，Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ）。この場合もまた、遺伝子は、余分のメチオニンを伴わないこと以外はＣＤＴａ（前記）と同様にして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における最適発現のためにＧｅｎｓｃｒｉｐｔによりコドン最適化された。また、ＣＤＴａに関して前記されているとおりに、３ｍＣＤＴａ１および３ｍＣＤＴａ２をクローニングし、発現させた。３ｍＣＤＴａ１および３ｍＣＤＴａ２は高度に発現され、可溶性であった。
【０１７０】
ＣＤＴａを遺伝的に不活化するために、以下の３つの追加的なＣＤＴａ三重突然変異体および２つのＣＤＴａ四重変異体を設計した：４ｍＣＤＴａ３（Ｒ３０２Ａ，Ｓ３４５Ｆ，Ｅ３８５Ｑ，Ｅ３８７Ｑ）；３ｍＣＤＴａ４（Ｙ６２Ａ，Ｙ６９Ａ，Ｒ２５５Ａ）；３ｍＣＤＴａ５（Ｒ３５９Ａ，Ｙ６２Ａ，Ｑ３０７Ｅ）；３ｍＣＤＴａ６（Ｙ２５８Ａ，Ｆ３５６Ａ，Ｓ３４５Ｆ）；３ｍＣＤＴａ７（Ｎ３４２Ａ，Ｙ２５３Ａ，Ｙ３８２Ａ）；および４ｍＣＤＴａ８（Ｓ３４５Ｆ，Ｅ３８５Ｑ，Ｅ３８７Ｑ，Ｃ２Ａ）。突然変異体構築物の毒性を天然抗原と比較するために、細胞毒性研究を行った。毒性力価測定アッセイにおいて、ＣＤＴａ（天然体または突然変異体）および活性化ＣＤＴｂを、１：７のＣＤＴａ：ＣＤＴｂ  モル比で一緒にした。毒素混合物を完全ＭＥＭ培地内で系列希釈した。ついで、希釈された毒素を、３８４ウェルプレート内で増殖させたベロ（Ｖｅｒｏ）細胞に適用し、加湿ＣＯ２インキュベータ内で３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を固定し、透過性亢進させ、Ａｌｅｘａ  ４８８ファロイジンで染色し、走査サイトメータ（ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｖｅｌｏｓ）を使用して単層のイメージを得た。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、力価測定曲線をグラフ化した。結果は、全ての突然変異ＣＤＴａタンパク質において、天然ＣＤＴａより低い毒性が観察されたことを示している（図２２を参照されたい）。
【０１７１】
実施例１０
ＣＤＴａ／ＣＤＴｂの精製
動物研究において使用するための精製された二成分毒素タンパク質を得るために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からアフィニティタグ付き抗原としてＣＤＴａおよびＣＤＴｂを精製した。アフィニティカラムを使用する精製方法を、動物研究のための十分な収率および純度を確保するように最適化した。表１は、各構築物の精製に使用したアフィニティタグ、ならびに得られた収率および純度を示す。幾つかの場合には、更なる研究のための十分な純度を得るためにアフィニティクロマトグラフィー以降の追加的な精製工程を用いた。
【表１】
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【０１７２】
また、タグ無し二成分毒素タンパク質を、バキュロウイルスベクターを使用して、昆虫細胞においておよびバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）において発現させた。各系からの発現力価をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した。３ｍＣＤＴａの発現力価（全ライセート／培養ブロスから測定）はバシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）に関しては＞１ｇ／Ｌであり、バキュロウイルス系に関しては約０．３ｇ／Ｌであった。ＣＤＴｂの発現力価はバシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）に関しては０．０２ｇ／Ｌであり、バキュロウイルスに関しては０．２ｇ／Ｌであった。プロＣＤＴｂの場合、発現力価はバキュロウイルスにおいて＞０．５ｇ／Ｌであった。
【０１７３】
実施例１１
ワクチン組成物の効力
二成分毒素を含むワクチン組成物の効力を、実施例７に記載されているハムスターモデルにおいて評価した。１つの研究においては、（ａ）アルミニウムヒドロキシホスファートアジュバント（「メルクアルミニウムアジュバント（Ｍｅｒｃｋ  Ａｌｕｍｉｎｕｍ  Ａｄｊｕｖａｎｔ」または「ＭＡＡ」）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントと共に製剤化された組換えＴｃｄＡ［バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）発現系を使用して産生されたＮａｐ ３ｍＴｃｄＡ］およびＴｃｄＢ［バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）発現系を使用して産生されたＮａｐ ３ｍＴｃｄＢ］、（ｂ）ＭＡＡおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）と共に製剤化されたホルムアルデヒド不活化ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ）、または（ｃ）アジュバントのみの対照を含むワクチンでハムスターを免疫化した。結果は、組換えワクチンが投与された動物が原型ＶＰＩ１０４６３株からの胞子（純度９５％）の２４１  ＣＦＵ／用量の致死的チャレンジに対して完全に防御されたことを示している（図１１、パネルＡ）。
【０１７４】
しかし、これらの動物がＶＰＩ株でのチャレンジの後に生存したにもかかわらず、全ての試験群の動物において、相当な体重減少、下痢および罹患が生じた。また、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌および毒素は、便および盲腸含有物の両方において検出可能であった。更に、前記の同じ３つの試験群（（ａ）〜（ｃ））でワクチン接種を比較する別の研究において、組換えＴｃｄＡ＋ＴｃｄＢワクチンは、高毒性ＮＡＰ１／０２７／ＢＩ１７株からの胞子（純度９５％）の４５７  ＣＦＵ用量の致死的チャレンジでチャレンジされたハムスターの生存を実質的に増加させることができなかった（図１１、パネルＢ）。
【０１７５】
したがって、ワクチンの防御効力を増強し、疾患に関連した罹患率を低下させるために、他の抗原が該ワクチンに加えられうるかどうかを決定するために、追加的なワクチン成分を評価した。この目的のために、ワクチン中のＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ毒素に加えられうる９個の追加的抗原を特定するために、文献およびプロテオーム評価を行い、そのような追加的抗原をＴｃｄＡおよびＴｃｄＢと組み合わせてハムスターモデルにおいて評価した。この評価から、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢを含有するワクチンへの二成分毒素（ＣＤＴａおよびＣＤＴｂ）の添加は、ＮＡＰ１／０２７／ＢＩチャレンジ後のハムスターにおけるこのワクチンの防御効力を一貫して増強した。
【０１７６】
本発明者らはまた、二成分毒素（ＣＤＴａおよびＣＤＴｂ）の両成分が、この分子によりもたらされる防御に必要なのかどうかまたは一方のタンパク質で十分なのかどうかを、ハムスターチャレンジ研究において調べた。この研究においては、（ａ）組換えＴｃｄＡ（バキュロウイルス発現系を使用して産生された５ｍＴｃｄＡ）、組換えＴｃｄＢ（バキュロウイルス発現系を使用して産生された５ｍＴｃｄＢ）、およびＣＤＴａ；（ｂ）組換えＴｃｄＡ（バキュロウイルス発現系を使用して産生された５ｍＴｃｄＡ）、組換えＴｃｄＢ（バキュロウイルス発現系を使用して産生された５ｍＴｃｄＢ）、およびＣＤＴｂ；または（ｃ）組換えＴｃｄＡ（バキュロウイルス発現系を使用して産生された５ｍＴｃｄＡ）、組換えＴｃｄＢ（バキュロウイルス発現系を使用して産生された５ｍＴｃｄＢ）、ＣＤＴａおよびＣＤＴｂ、のいずれかでハムスターをワクチン接種した。（ａ）〜（ｃ）の全群をＭＡＡおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバント共に製剤化し、アジュバントのみが投与された第４群（ｄ）と比較した。結果は、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢと組み合わされたＣＤＴａまたはＣＤＴｂがＮＡＰ１／０２７／ＢＩ１７株（４７０  ＣＦＵ／動物）による致死的チャレンジに対する防御を誘導しうることを示唆しているが、この防御は不完全であった。これとは対照的に、両方の二成分毒素タンパク質（ＣＤＴａおよびＣＤＴｂ）とＴｃｄＡおよびＴｃｄＢとの組合せは、この組合せを用いて過去の研究において観察された防御を完全に復元した（図１２）。
【０１７７】
実施例１２
非ヒト霊長類におけるワクチン組成物の免疫原性
４〜１０歳のアカゲザルの１１群（ｎ＝３／群）を、２０μｇのｖｐｉ ５ｍＴｃｄＡ ｂｖ、２０μｇのｎａｐ ５ｍＴｃｄＢ ｂｖ、５μｇの３ｍ ＣｄｔＡ２  ｂｖおよび５μｇのプロＣｄｔＢ（「研究１１」）を含む種々のワクチン組成物で筋肉内に免疫化した。１０群に投与した試験組成物は、図１７に示されているとおり、ＩＭＸ、ＭＡＡ、ＩＭＯ２１７０またはこれらのアジュバントの組合せから選択されるアジュバントをも含んでいた。ＩＭＯ２１７０は、Ｉｄｅｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から得られるトール様受容体アゴニストである。
【０１７８】
研究の全体にわたって有害事象に関して動物をモニターした。覚醒中の動物に対して、研究の全体にわたり並びに用量１の投与後（ＰＤ１）、ＰＤ２、ＰＤ３およびＰＤ４の４時間の時点で、トランスポンダーにより体温を測定した。投与後４時間の時点で、および少なくとも７日間にわたって毎日、注射部位を観察した。研究の全体にわたって、ほとんどのサルに関して体温は正常範囲内であった。いずれの動物に関しても、いずれの時点でも有害事象は観察されなかった。
【０１７９】
示されている時点で動物から採血し、全４個の抗原に対する免疫応答を、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。アカゲザルにおいてワクチン接種により誘導された血清抗毒素ＩｇＧの濃度を各ワクチン成分に関して測定した。抗原を９６ウェルプレート上にコートした（ＴｃｄＡは１μｇ／ｍｌ、ＴｃｄＢは０．５μｇ／ｍｌ、ＣＤＴａは５μｇ／ｍｌおよびＣＤＴｂは５μｇ／ｍｌ）。洗浄およびブロッキング工程ならびにＨＲＰヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃｇ二次抗体および現像用基質を含む一般的なＥＬＩＳＡ法に従った。
【０１８０】
ＴｃｄＡ  ＥＬＩＳＡアッセイの結果は、３用量計画の投与を受けた群ではＰＤ−１の抗体価（抗体力価）は１：１００未満であったことを示している。ＰＤ−２およびＰＤ−３の力価は、群１〜４および６〜７において非常に類似していた。４用量計画の投与を受けた群では、抗体価は、用量２の投与後、ＩＭＸ−ＭＡＡにおけるワクチンが投与された群（群１１、１：１８６３の力価）において観察されたに過ぎなかった。ＰＤ−３およびＰＤ−４の力価は群９〜１０において類似していた。また、群１１のＰＤ−４に関して、力価の低下が観察された。
【０１８１】
３用量計画の投与を受けた群では、ＴｃｄＢ  ＥＬＩＳＡアッセイの結果は、ＰＤ−１抗体価が１：１００未満であったことを示している。ＰＤ−２およびＰＤ−３の力価は、群２、４および７において非常に類似していた。群１、３、５および６において、第３用量の投与後に力価の上昇（＞５×）が観察された。４用量計画の投与を受けた群では、抗体価は、ＰＤ−２において、ＩＭＸ−ＭＡＡにおけるワクチンが投与された群（群１１、１：８１４４）において観察されたに過ぎなかった。ＰＤ−３およびＰＤ−４において、力価は群９〜１０において類似していた。用量４の投与後、群１（〜８×）で力価の上昇が観察され、群１１で力価の低下（２．５×）が観察された。
【０１８２】
二成分毒素成分の場合、ＣＤＴｂでは、全体的にＣＤＴａの場合より高い力価が観察された。３用量計画の投与を受けた群では、ＣＤＴａに関するＰＤ−１抗体価は１：１００未満であった。用量２の投与後、ＣＤＴａ力価は群５において観察されたに過ぎなかった（１：１０８５０）。ＰＤ−３では全群で力価が観察され、群５（ＩＭＸ−ＭＡＡ−ＮｏＦ）において１：２６，０００の最大力価が観察された。群６（ＩＭＯ−ＭＡＡ−Ｆ）および群７（アジュバント無し）では、１：２０００未満の力価が観察された。４用量計画の投与を受けた全群で、ＣＤＴａ力価は用量２の投与後までは検出不能であった。用量３の投与後、群８〜１０においては力価の上昇が観察され、群１１においては力価の低下が観察された。
【０１８３】
ＣＤＴｂの場合、３用量計画の投与を受けた全群でＰＤ−１抗体価は１：１００未満であった。ＰＤ−２およびＰＤ−３における抗体価は、３用量計画の投与を受けた全群で高かった。興味深いことに、アジュバントを伴わずにワクチンが投与された群（群７）において、力価の上昇（５×）が認められた。４用量計画の投与を受けた群では、ＰＤ−２において、３用量計画の群からのＰＤ−２力価と比較して低い抗体価が観察された。しかし、ＰＤ−３およびＰＤ−４における力価は全群において非常に類似していた。最終的なＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ力価（第４７日）を、３用量計画の投与を受けた群に関しては図１８Ａに、４用量計画の投与を受けた群に関しては図１８Ｂに示す。
【０１８４】
また、Ｎａｂアッセイを用いて中和抗体を測定した。このアッセイにおいては、天然ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢによるベロ細胞の殺細胞を抑制する抗血清の能力を評価した。毒素のインキュベーションおよびベロ細胞での抗血清の希釈の後、細胞を固定し、Ｆ−アクチンに特異的な蛍光プローブで染色した。染色されたＦ−アクチンの量およびそれに続いて細胞面積を、細胞走査サイトメータを使用して決定した。結果は、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢに対する中和抗体が、３０日後（ＰＤ−３）および４５日後（群に応じてＰＤ−３またはＰＤ−４）、全群で観察されたことを示している。３用量計画の場合、第４５日に、群４（ＩＭＸ／ＭＡＡ−Ｆ）はＴｃｄＡおよび二成分毒素の両方に対する最高の中和抗体価を示し、群１（ＩＭＸ−Ｆ）はＴｃｄＢに対する最高の中和力価を示した。４用量計画からの第４５日の結果は、群８および１１（ＩＭＸ−ＦおよびＩＭＸ／ＭＡＡ−Ｆ）が、全３個の中和アッセイにおいて、ＭＡＡアジュバント化体（群９および１０）より高い力価を有することを示している。一般に、ＩＭＸまたはＩＭＸ／ＭＡＡでアジュバント化された４成分ワクチンで免疫化されたサルは最高の中和力価を示した。該Ｎａｂアッセイの結果を図１９Ａ〜１９Ｃに示す。
【０１８５】
実施例１３
ＣＤＴａ突然変異４ｍＣＤＴａ８の分析用および免疫原性分析
組換え突然変異体３ｍＣＤＴａ２および組換え野生型ＣＤＴａのウエスタンブロット分析により、本発明者らは、これらのＣＤＴａタンパク質が二量体化する傾向を有することを観察した。８〜１６％  Ｔｒｉｓ−グリシンゲルを５μｇまたは２μｇ／ウェルでローディングし、還元および非還元条件下で泳動させた。図２０Ａを参照されたい。結果は、還元条件下、ＣＤＴａおよび３ｍＣＤＴａ２タンパク質の両方の大部分が単量体（＞９７％）として存在することを示した。しかし、非還元条件下では、ＣＤＴａの約３５〜３８％および３ｍＣＤＴａ２の約６０〜６３％は二量体として存在した。
【０１８６】
ＣＤＴａの配列を調べることにより、単一のシステイン残基（Ｃ２）を見出した。システインはジスルフィド結合によりタンパク質をオリゴマー化させうるため、ＣＤＴａの二量体化を低減または排除することを試み、システイン残基を突然変異させた。このようにして、３ｍＣＤＴａ２における突然変異に突然変異Ｃ２Ａを付加した４ｍＣＤＴａ８を作製した。システイン突然変異が実際に二量体化を低減していたかどうかを確認するために、ＳＥＣ分析を行った。３ｍＣＤＴａ１のＳＥＣ−ＵＶ分析では、移動相は２５ｍＭ  ＮａＰｉ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ｗ／ｖ  アジ化ナトリウム（ｐＨ６．８）であり、分析は、０．２ｍｌ／分の流速でＴＳＫｇｅｌスーパーＳＷ３０００（Ｔｓｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｌ  ８６７５）を使用して行った。４ｍＣＤＴａ８のＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析では、サンプルを、ガードカラムを伴うＷｙａｔｔ  ０１０Ｓ５分析装置上に注入した。カラムを平衡化し、０．５ｍｌ／分でＰＢＳ中で作動させた。サンプルは、配列推定単量体分子量より約１３％高い約５６．９ｋＤａの計算分子量を有する単一の十分に明瞭なピークとして溶出した。
【０１８７】
３ｍＣＤＴａ１のＳＥＣ−ＵＶ分析は、物質が、二量体／より高次の凝集物として、単量体より高い比率で存在することを証明した（図２０Ｂを参照されたい）。これとは対照的に、４ｍＣＤＴａ８のＳＥＣ−ＭＡＬｓ分析は、タンパク質物質のほぼ全てが単量体として存在することを示しており（図２０Ｃ）、このことは、システイン突然変異がＣＤＴａのオリゴマー化を実際に劇的に低減したことを証明している。
【０１８８】
Ｃ２Ａ突然変異がＣＤＴａタンパク質成分の免疫原性またはＮＡＰ１チャレンジ後の防御能に影響を及ぼしたかどうかを判定するために、他のワクチン成分（突然変異ＴｃｄＡ／Ｂ、プロＣＤＴｂ）と組み合わされた３ｍＣＤＴａ２および４ｍＣＤＴａ８の免疫原性の比較を含むハムスター研究を行った。生存曲線は、両方の群において、ハムスターの８０％がＮＡＰ１チャレンジを生き延びたことを示しており、このことは、システイン突然変異の付加が３ｍＣＤＴａ２（両抗原は免疫学的に類似している）の免疫原性に悪影響を及ぼさなかったことを示している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年10月6日(2014.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｄ２８５Ａ、Ｓ５１７Ａ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａからなる群から選択される少なくとも４つの突然変異を含む組換えクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ（ＴｃｄＡ）タンパク質。
【請求項２】
該タンパク質が、（ａ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＷ５１９Ａ；（ｂ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＤ２８５Ａ；（ｃ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＳ５１７Ａ；（ｄ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７ＡおよびＥ５１４Ｑ；ならびに（ｅ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａからなる群から選択される一組の突然変異を含む、請求項１記載のＴｃｄＡタンパク質。
【請求項３】
該タンパク質が、Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａ突然変異を含む、請求項２記載のＴｃｄＡタンパク質。
【請求項４】
該ＴｃｄＡタンパク質が、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＮＡＰ１参考株またはＶＰＩ  １０４６３参考株から誘導されたアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載のＴｃｄＡタンパク質。
【請求項５】
該タンパク質が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６および配列番号３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のＴｃｄＡタンパク質。
【請求項６】
Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｄ２８６Ａ、Ｓ５１８Ａ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａからなる群から選択される少なくとも３つの突然変異を含む単離された組換えクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）タンパク質。
【請求項７】
該タンパク質が、（ａ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８ＡおよびＥ５１５Ｑ；（ｂ）Ｗ１０２、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＷ５２０Ａ；（ｃ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＤ２８６Ａ；（ｄ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＳ５１８Ａ；ならびに（ｅ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａからなる群から選択される一組の突然変異を含む、請求項６記載の単離されたＴｃｄＢタンパク質。
【請求項８】
該タンパク質が、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８または配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６記載の単離されたＴｃｄＢタンパク質。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項記載のＴｃｄＡタンパク質および請求項６〜８のいずれか１項記載のＴｃｄＢタンパク質および医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物。
【請求項１０】
アジュバントを更に含む、請求項９記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
昆虫細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、請求項１〜５のいずれか１項記載のＴｃｄＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むバキュロウイルスベクターで形質転換してＴｃｄＡタンパク質を産生させることを含む、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡタンパク質の製造方法。
【請求項１２】
昆虫細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、請求項６〜８のいずれか１項記載のＴｃｄＢタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むバキュロウイルスベクターで形質転換してＴｃｄＢタンパク質を産生させることを含む、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢタンパク質の製造方法。
【請求項１３】
Ｃ２Ａ、Ｙ６７Ａ、Ｙ６９Ａ、Ｙ２５３Ａ、Ｒ２５５Ａ、Ｙ２５８Ａ、Ｒ３０２Ａ、Ｑ３０７Ｅ、Ｎ３４２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｆ３５６Ａ、Ｒ３５９Ａ、Ｙ３８２Ａ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７ＱおよびＥ３８７Ｄから選択される少なくとも２つの突然変異を含む組換え二成分毒素タンパク質Ａ（ＣＤＴａ）。
【請求項１４】
該ＣＤＴａタンパク質が、
（ａ）Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；
（ｂ）Ｒ３０２Ａ、Ｅ３８５ＡおよびＥ３８７Ｄ；
（ｃ）Ｃ２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；
（ｄ）Ｒ３０２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；
（ｅ）Ｙ６７Ａ、Ｙ６９ＡおよびＲ２５５Ａ；
（ｆ）Ｒ３５９Ａ、Ｙ６７ＡおよびＱ３０７Ｅ；
（ｇ）Ｙ２５８Ａ、Ｆ３５６Ａ、Ｓ３４５Ｆ；ならびに
（ｈ）Ｎ３４２Ａ、Ｙ２５３ＡおよびＹ３８２Ａ
からなる群から選択される一組の突然変異を含む、請求項１３記載のＣＤＴａタンパク質。
【請求項１５】
該タンパク質が、配列番号４０、配列番号４２または配列番号６７に記載されているアミノ酸配列を含む、請求項１３記載のＣＤＴａタンパク質。
【請求項１６】
請求項１３−１５のいずれか１項記載のＣＤＴａタンパク質およびクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）からの二成分毒素タンパク質Ｂ（ＣＤＴｂ）および医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物。
【請求項１７】
アジュバントを更に含む、請求項１６記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
請求項９〜１０、または１６〜１７のいずれか１項記載の免疫原性組成物を含む、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の治療薬または予防薬。
【請求項１９】
クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に関連した疾患の治療または予防用の医薬の製造における、（ａ）請求項１〜５のいずれか１項記載のＴｃｄＡタンパク質、（ｂ）請求項６〜８のいずれか１項記載のＴｃｄＢタンパク質、（ｃ）請求項１３〜１５のいずれか１項記載のＣＤＴａタンパク質、または（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せの使用。
【請求項２０】
請求項１〜５のいずれか１項記載の組換えＴｃｄＡタンパク質および請求項６〜８のいずれか１項記載の組換えＴｃｄＢタンパク質を更に含む、請求項１６記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
ＴｃｄＡタンパク質が突然変異Ｗ１０１、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａを含み、ＴｃｄＢタンパク質が突然変異Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａを含み、ＣＤＴａタンパク質がシグナルペプチドを欠いており、ＣＤＴａタンパク質が突然変異Ｃ２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑを含み、ＣＤＴｂタンパク質がシグナルペプチドを欠いている、請求項２０記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に関連した疾患の治療または予防のための、請求項９〜１０、１６〜１７または２０〜２１のいずれか１項記載の免疫原性組成物の使用。
【国際調査報告】
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