(57)【要約】  発明は、抗ＬＲＰ５抗体及びそれを作成し及び使用する方法を提供する。
2015511119.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体がノリン活性及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達を増強する、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）に結合する単離された抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ＬＲＰ５に結合する抗体断片である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＹＹＲＹＡＰＹＲＳＬＧＭＤＶ（配列番号２３）又はＷＩＰＱＳＹＰＦＸ１ＳＹＫＳＧＦＤＹ（ここでＸ１はＡ又はＲである）（配列番号２４）を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｂ）アミノ酸配列ＱＱＹＹＸ１ＹＰＦＴ（ここでＸ１はＬ又はＳである）（配列番号２５）を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び（ｃ）アミノ酸配列ＧＸ１ＩＳＸ２Ｘ３ＧＸ４ＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（ここでＸ１はＡ又はＧ、Ｘ２はＡ又はＳ、Ｘ３はＰ又はＳ、Ｘ４はＳ又はＷである）（配列番号２６）、又はＳＲＩＳＳＮＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２７）を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＸ１（ここでＸ１はＨ又はＳである）（配列番号２８）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）アミノ酸配列ＧＸ１ＩＳＸ２Ｘ３ＧＸ４ＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（ここでＸ１はＡ又はＧ、Ｘ２はＡ又はＳ、Ｘ３はＰ又はＳ、Ｘ４はＳ又はＷである）（配列番号２６）、又はＳＲＩＳＳＮＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２７）を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｃ）アミノ酸配列ＹＹＲＹＡＰＹＲＳＬＧＭＤＶ（配列番号２３）又はＷＩＰＱＳＹＰＦＸ１ＳＹＫＳＧＦＤＹ（ここでＸ１はＡ又はＲである）（配列番号２４）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
（ａ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号２９）又はＲＡＳＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＹＬＡ（ここでＸ１はＡ、Ｇ、Ｓ又はＶ、Ｘ２はＩ又はＭ、Ｘ３はＦ、Ｇ、Ｓ又はＹ、及びＸ４はＧ、Ｓ又はＹである）（配列番号３０）を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号３１）又はＤＡＳＸ１Ｘ２ＥＳ（ここでＸ１はＳ又はＴ及びＸ２はＬ又はＲである）（配列番号３２）を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＹＹＸ１ＹＰＦＴ（ここでＸ１はＬ又はＳである）（配列番号３３）を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
（ａ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号２９）又はＲＡＳＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＹＬＡ（ここでＸ１はＡ、Ｇ、Ｓ又はＶ、Ｘ２はＩ又はＭ、Ｘ３はＧ、Ｆ、Ｙ又はＳ、及びＸ４はＧ、Ｙ又はＳである）（配列番号３０）を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号３１）又はＤＡＳＸ１Ｘ２ＥＳ（ここでＸ１はＳ又はＴ及びＸ２はＬ又はＲである）（配列番号３２）を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＹＹＸ１ＹＰＦＴ（ここでＸ１はＬ又はＳである）（配列番号３３）を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号３４−３７からなる群から選択される一以上の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を更に含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項１０】
（ａ）配列番号１から１１のうちの一のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号１２から２２のうちの一のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号１から１１のうちの一のＶＨ配列を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号１２から２２のうちの一のＶＬ配列を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１３】
配列番号１から１１のうちの一のＶＨ配列、及び配列番号１２から２２のうちの一のＶＬ配列を含む抗体。
【請求項１４】
完全長ＩｇＧ１抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
請求項１に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１６に記載の宿主細胞を抗体が産生されるように培養することを含む、抗体を産生する方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の抗体及び細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲート。
【請求項１９】
請求項１に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤。
【請求項２０】
医薬としての使用のための、請求項１に記載の抗体。
【請求項２１】
増殖性糖尿病性網膜症、ＣＮＶ、ＡＭＤ、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、ＤＭＥ、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ、ＢＲＶＯ、角膜血管新生、網膜血管新生、ＲＯＰ、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ（骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群）、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症の治療において使用のための、請求項１に記載の抗体。
【請求項２２】
ノリン活性及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達の増強において使用のための、請求項１に記載の抗体。
【請求項２３】
医薬の製造における、請求項１に記載の抗体の使用。
【請求項２４】
医薬は、増殖性糖尿病性網膜症、ＣＮＶ、ＡＭＤ、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、ＤＭＥ、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ、ＢＲＶＯ、角膜血管新生、網膜血管新生、ＲＯＰ、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ（骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群）、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症の治療のためである、請求項２３の使用。
【請求項２５】
医薬は、ノリン活性及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達を増強するためである、請求項２３の使用。
【請求項２６】
請求項１に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、増殖性糖尿病性網膜症、ＣＮＶ、ＡＭＤ、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、ＤＭＥ、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ、ＢＲＶＯ、角膜血管新生、網膜血管新生、ＲＯＰ、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ（骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群）、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症を有する個体を治療する方法。
【請求項２７】
ノリン活性及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達を増強するための請求項１に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、個体におけるノリン活性及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達を増強する方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の抗体を投与することを含む、ノリン及び／又はＦｚｄ４における変異により生じる、個体中のシグナル伝達欠損をレスキューする方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１２年１月１８日に出願された米国仮出願番号６１／５８８，１００の３５ ＵＳＣ １１９（ｅ）に基づく利益を主張し、その内容は参照により本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００２】
発明の分野
本発明は、抗ＬＲＰ５抗体及びそれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
現在では、血管新生は、様々な障害の病因に対する重要な寄与因子であることが十分に確立されている。これらには、固形腫瘍及び転移、網膜症などの眼内新生血管疾患、例えば、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、滲出型加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植角膜組織及び他の組織の免疫拒絶、関節リウマチが含まれる。Duda et al. J. Clin. Oncology 25(26): 4033-42 (2007); Kesisis et al. Curr. Pharm. Des. 13: 2795-809 (2007); Zhang & Ma Prog. Ret. & Eye Res. 26: 1-37 (2007)。
【０００４】
網膜は、網膜の内側の部分に供給する網膜血管、及び外側部分に供給する脈絡膜血管から血液の供給を受ける。網膜血管に対する損傷は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、及び網膜中心静脈閉塞症及び網膜静脈分枝閉塞症（虚血性網膜症）を含むいくつかの疾患プロセスで発生する。この損傷からの網膜虚血は好ましくない新生血管を生じる。脈絡膜血管新生は、ＡＭＤを含む数多くの他の疾患プロセスで起こる。これに対して、網膜の不完全な血管新生は、特定の遺伝子疾患、例えば家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、コーツ病、及びＷｎｔ受容Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４（ＦＺＤ４）、共受容体ＬＲＰ５又は分泌リガンドノリン（Ｎｏｒｒｉｎ）の突然変異によって引き起こされるノリエ病に罹患した患者において顕著である(Berger et al. Nature Genet. 1:199-203 (1992); Chen et al. Nature Genet. 1:204-208 (1992); Robitaille et al. Nature Genet. 32:326-30 (2002); Toomes et al. Am. J. Hum. Genet. 74:721-30 (2004))。更なるタンパク質、ＴＳＰＡＮ１２は、ノリンのシグナル伝達に関与していることが示されている(Junge et al. Cell 139:299-311 (2009)及び国際公開第２０１０／０３０８１３号）。またＴｓｐａｎ１２遺伝子の変異は、ＦＥＶＲの原因となると報告されている(Poulter et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 14;53(6):2873-9 (2012); Yang et al. Molecular Vision 17:1128-1135 (2011); Poulter et al. The American Journal of Human Genetics 86, 248-253 (2010))。これらの遺伝子疾患のモデルは、対応する相同遺伝子についてノックアウトしたマウスで利用可能である。
【０００５】
眼の血管新生の分野における多くの進歩にもかかわらず、標的を同定し、既存の治療法の有効性を補うか又は増強することができる手段を開発する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００６】
概要
本発明は、特に血管新生に関連する状態および疾患の治療において、抗ＬＲＰ５抗体とその作製及び使用方法を提供する。
【０００７】
一態様において、本発明は、抗体がノリン活性及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達を増強する、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）に結合する単離された抗体を提供する。幾つかの実施態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。幾つかの実施態様において、抗体はヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である。幾つかの実施態様において、抗体はＬＲＰ５に結合する抗体断片である。
【０００８】
幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＹＹＲＹＡＰＹＲＳＬＧＭＤＶ（配列番号２３）又はＷＩＰＱＳＹＰＦＸ１ＳＹＫＳＧＦＤＹ（ここでＸ１はＡ又はＲである）（配列番号２４）を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｂ）アミノ酸配列ＱＱＹＹＸ１ＹＰＦＴ（ここでＸ１はＬ又はＳである）（配列番号２５）を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び（ｃ）アミノ酸配列ＧＸ１ＩＳＸ２Ｘ３ＧＸ４ＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（ここでＸ１はＡ又はＧ、Ｘ２はＡ又はＳ、Ｘ３はＰ又はＳ、Ｘ４はＳ又はＷである）（配列番号２６）、又はＳＲＩＳＳＮＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２７）を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＸ１（ここでＸ１はＨ又はＳである）（配列番号２８）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）アミノ酸配列ＧＸ１ＩＳＸ２Ｘ３ＧＸ４ＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（ここでＸ１はＡ又はＧ、Ｘ２はＡ又はＳ、Ｘ３はＰ又はＳ、Ｘ４はＳ又はＷである）（配列番号２６）、又はＳＲＩＳＳＮＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２７）を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｃ）アミノ酸配列ＹＹＲＹＡＰＹＲＳＬＧＭＤＶ（配列番号２３）又はＷＩＰＱＳＹＰＦＸ１ＳＹＫＳＧＦＤＹ（ここでＸ１はＡ又はＲである）（配列番号２４）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。幾つかの実施態様において、抗体は更に、（ａ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号２９）又はＲＡＳＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＹＬＡ（ここでＸ１はＡ、Ｇ、Ｓ又はＶ、Ｘ２はＩ又はＭ、Ｘ３はＦ、Ｇ、Ｓ又はＹ、及びＸ４はＧ、Ｓ又はＹである）（配列番号３０）を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号３１）又はＤＡＳＸ１Ｘ２ＥＳ（ここでＸ１はＳ又はＴ及びＸ２はＬ又はＲである）（配列番号３２）を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＹＹＸ１ＹＰＦＴ（ここでＸ１はＬ又はＳである）（配列番号３３）を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号２９）又はＲＡＳＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＹＬＡ（ここでＸ１はＡ、Ｇ、Ｓ又はＶ、Ｘ２はＩ又はＭ、Ｘ３はＧ、Ｆ、Ｙ又はＳ、及びＸ４はＧ、Ｙ又はＳである）（配列番号３０）を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号３１）又はＤＡＳＸ１Ｘ２ＥＳ（ここでＸ１はＳ又はＴ及びＸ２はＬ又はＲである）（配列番号３２）を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＹＹＸ１ＹＰＦＴ（ここでＸ１はＬ又はＳである）（配列番号３３）を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号３４−３７からなる群から選択される一以上の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１から１１のうちの一のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号１２から２２のうちの一のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号１から１１のうちの一のＶＨ配列を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号１２から２２のうちの一のＶＬ配列を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号１から１１のうちの一のＶＨ配列、及び配列番号１２から２２のうちの一のＶＬ配列を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、図４及び５に示される抗体のＶＨ配列及びＶＬ配列を含む。幾つかの実施態様において、抗体は完全長ＩｇＧ１抗体である。
【０００９】
別の態様において、本発明は、本発明の抗体をコードする単離された核酸を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、本発明の核酸を含む宿主細胞を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、抗体が産生されるように、本発明の宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法を提供する。幾つかの実施態様において、本方法は宿主細胞から抗体を回収することを更に含む。
【００１０】
幾つかの実施態様において、本発明は、本発明の抗体及び細胞傷害性薬物含むイムノコンジュゲートを提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、本発明の抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤を提供する。幾つかの実施態様において、薬学的製剤は、付加的治療薬、例えば、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗体断片、例えばラニビズマブ；可溶性ＶＥＧＦ受容体、例えばアフリベルセプト；又はアプタマー、例えば、ペガプタニブを含む）、ＴＳＰＡＮ１２アゴニスト、プラスミン、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＴＮＦ−α阻害剤、及び／又はステロイド、例えばトリアムシノロン又はデキサメタゾンを含む。
【００１１】
幾つかの実施態様において、本発明は、医薬として使用するための本発明の抗体を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、増殖性糖尿病性網膜症、ＣＮＶ、ＡＭＤ、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、ＤＭＥ、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ、ＢＲＶＯ、角膜血管新生、網膜血管新生、ＲＯＰ、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ（骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群）、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症の治療において使用のための本発明の抗体を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、ノリン活性及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達の増強に使用のための本発明の抗体を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、医薬の製造に使用のための本発明の抗体を提供する。幾つかの実施態様において、医薬は、増殖性糖尿病性網膜症、ＣＮＶ、ＡＭＤ、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、ＤＭＥ、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ、ＢＲＶＯ、角膜血管新生、網膜血管新生、ＲＯＰ、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ（骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群）、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症の治療のためである。幾つかの実施態様において、医薬は、ノリン活性及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達を増強するためである。
【００１２】
幾つかの実施態様において、本発明は、本発明の抗体の有効量を個体に投与することを含む、増殖性糖尿病性網膜症、ＣＮＶ、ＡＭＤ、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、ＤＭＥ、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ、ＢＲＶＯ、角膜血管新生、網膜血管新生、ＲＯＰ、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ（骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群）、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症を有する個体を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様において、本方法は、付加的治療薬、例えば、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗体断片、例えばラニビズマブ；可溶性ＶＥＧＦ受容体、例えばアフリベルセプト；又はアプタマー、例えば、ペガプタニブを含む）、組換えノリンタンパク質、ＴＳＰＡＮ１２アゴニスト、プラスミン、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＴＮＦ−α阻害剤、及び／又はステロイド、例えばトリアムシノロン又はデキサメタゾンの有効量を個体に投与することを更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は、ノリン活性及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達を増強するための本発明の抗体の有効量を個体に投与することを含む、個体におけるノリン活性及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達を増強する方法を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、請求項１に記載の抗体を投与することを含む、ノリン及び／又はＦｚｄ４における変異により生じる、個体中のシグナル伝達欠損をレスキューする方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ−１Ｂ】図１Ａ及び１Ｂは、抗ＬＲＰ５抗体が、ノリン／Ｆｚｄ４媒介性シグナル伝達を増強し、Ｆｚｄ４Ｍ１５７Ｖ変異をレスキューすることを示す。この図においては接頭辞「Ｐ６Ｃ」が用いられるが、一方本特許明細書中の他の場所では「ＹＷ６２９」が同義的に用いられる。
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂは、抗ＬＲＰ５抗体が、ヒト網膜内皮微小血管細胞において、ノリン活性を増強し、Ｔｓｐａｎ１２の損失をレスキューすることを示す。この図においては接頭辞「Ｐ６Ｃ」が用いられるが、一方本特許明細書中の他の場所では「ＹＷ６２９」が同義的に用いられる。
【図３Ａ−３Ｂ】図３Ａ及び３Ｂは、抗ＬＲＰ５抗体がＴｓｐａｎ１２ノックアウトマウスにおいて血管障害を部分的にレスキューすることを示す。この図においては接頭辞「Ｐ６Ｃ」が用いられるが、一方本特許明細書中の他の場所では「ＹＷ６２９」が同義的に用いられる。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂは、囲まれたＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を持つ様々な抗ＬＲＰ５抗体の重鎖可変領域配列を示す。これらの配列に対応する配列番号は次の通りである：ＹＷ６２９．４２（配列番号１）、ＹＷ６２９．４２．５７（配列番号２）、ＹＷ６２９．４２．５８（配列番号３）、ＹＷ６２９．４２．６５（配列番号４）、ＹＷ６２９．５１（配列番号５）、ＹＷ６２９．５１．１３（配列番号６）、ＹＷ６２９．５１．６１（配列番号７）、ＹＷ６２９．５１．６３（配列番号８）、ＹＷ６２９．５１．７７（配列番号９）、ＹＷ６２９．５１．７８（配列番号１０）、及びＹＷ６２９．５１．８０（配列番号１１）。
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ及び５Ｂは、囲まれたＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を持つ様々な抗ＬＲＰ５抗体の軽鎖可変領域配列を示す。これらの配列に対応する配列番号は次の通りである：ＹＷ６２９．４２（配列番号１２）、ＹＷ６２９．４２．５７（配列番号１３）、ＹＷ６２９．４２．５８（配列番号１４）、ＹＷ６２９．４２．６５（配列番号１５）、ＹＷ６２９．５１（配列番号１６）、ＹＷ６２９．５１．１３（配列番号１７）、ＹＷ６２９．５１．６１（配列番号１８）、ＹＷ６２９．５１．６３（配列番号１９）、ＹＷ６２９．５１．７７（配列番号２０）、ＹＷ６２９．５１．７８（配列番号２１）、及びＹＷ６２９．５１．８０（配列番号２２）。
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ及び６Ｂは、抗ＬＲＰ５抗体がＴｓｐａｎ１２ノックアウトに関連した網膜血管障害を部分的にレスキューすることを示す。
【図７Ａ−７Ｃ】図７Ａ−７Ｃは、抗ＬＲＰ５抗体は、血管網膜疾患の酸素誘導性網膜症モデルにおいて、血管再生を促進し、病的な血管新生を低減することを示す。
【図８Ａ−８Ｃ】図８Ａ−８Ｃは、抗ＬＲＰ５抗体は、ノリン及びＷｎｔ７ｂシグナル伝達を増強するが、Ｗｎｔ３ａをシグナル伝達に拮抗することを示す。
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａ及び９Ｂは、抗ＬＲＰ５抗体は、受容体のクラスター形成を減らす受容体成分又はリガンド中の変異のシグナル伝達障害をレスキューすることを示す。
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ及び図１０Ｂは、抗体の二価性は、Ｗｎｔ３ａシグナル伝達でなく、ノリンシグナル伝達の抗ＬＲＰ５抗体媒介性増強のために必要である。
【００１４】
本発明の実施態様の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の改変を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、Ｖはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
【００１５】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって典型的な実施態様は、以下で説明される。
【００１６】
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）において一又は複数の改変を持つ抗体を指す。
【００１７】
用語「抗ＬＲＰ５抗体」及び「ＬＲＰ５に特異的に結合する抗体」は、抗体がＬＲＰ５を標的とし、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように十分な親和性でＬＲＰ５に結合することができる抗体を指す。一実施態様において、抗ＬＲＰ５抗体の無関係な、非ＬＲＰ５タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＬＲＰ５への結合の約１０％未満である。ある実施態様において、ＬＲＰ５へ結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）を有する。所定の実施態様において、抗ＬＲＰ５抗体は、異なる種由来のＬＲＰ５間で保存されているＬＲＰ５のエピトープに結合する。
【００１８】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００１９】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’；Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００２０】
参照抗体として「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体、逆に競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合をブロックするその参照抗体を指す。典型的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
【００２１】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００２２】
本明細書で用いられる「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死又は破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）：化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）、成長阻害剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など、抗生物質、小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）、及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。
【００２３】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞の活性化を含む。
【００２４】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
【００２５】
用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991。
【００２６】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００２７】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００２８】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。
【００２９】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００３０】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
【００３１】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、全てまたは実質的にＦＲの全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。
【００３２】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４本鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる。(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２で生じる。(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、略称(abbreviated-)ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２で生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照のこと）。特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。
【００３３】
「イムノコンジュゲート」は、一以上の異種分子にコンジュゲートした抗体であり、限定されないが、細胞傷害性薬物を含む。
【００３４】
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。所定の実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
【００３５】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上または９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００３６】
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００３７】
「抗ＬＲＰ５抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
【００３８】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、即ち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００３９】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
【００４０】
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【００４１】
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
【００４２】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００４３】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍。
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。
【００４４】
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
【００４５】
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
【００４６】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５」又は「ＬＲＰ５」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＬＲＰ５を指す。その用語は、細胞内でのプロセシングから生じた「完全長」、未処理ＬＲＰ５並びにＬＲＰ５の任意の形態を含む。その用語はまた、天然に存在するＬＲＰ５の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。典型的なヒトＬＲＰ５のアミノ酸配列は以下の通りである：
ＭＥＡＡＰＰＧＰＰＷＰＬＬＬＬＬＬＬＬＬＡＬＣＧＣＰＡＰＡＡＡＳＰＬＬＬＦＡＮＲＲＤＶＲＬＶＤＡＧＧＶＫＬＥＳＴＩＶＶＳＧＬＥＤＡＡＡＶＤＦＱＦＳＫＧＡＶＹＷＴＤＶＳＥＥＡＩＫＱＴＹＬＮＱＴＧＡＡＶＱＮＶＶＩＳＧＬＶＳＰＤＧＬＡＣＤＷＶＧＫＫＬＹＷＴＤＳＥＴＮＲＩＥＶＡＮＬＮＧＴＳＲＫＶＬＦＷＱＤＬＤＱＰＲＡＩＡＬＤＰＡＨＧＹＭＹＷＴＤＷＧＥＴＰＲＩＥＲＡＧＭＤＧＳＴＲＫＩＩＶＤＳＤＩＹＷＰＮＧＬＴＩＤＬＥＥＱＫＬＹＷＡＤＡＫＬＳＦＩＨＲＡＮＬＤＧＳＦＲＱＫＶＶＥＧＳＬＴＨＰＦＡＬＴＬＳＧＤＴＬＹＷＴＤＷＱＴＲＳＩＨＡＣＮＫＲＴＧＧＫＲＫＥＩＬＳＡＬＹＳＰＭＤＩＱＶＬＳＱＥＲＱＰＦＦＨＴＲＣＥＥＤＮＧＧＣＳＨＬＣＬＬＳＰＳＥＰＦＹＴＣＡＣＰＴＧＶＱＬＱＤＮＧＲＴＣＫＡＧＡＥＥＶＬＬＬＡＲＲＴＤＬＲＲＩＳＬＤＴＰＤＦＴＤＩＶＬＱＶＤＤＩＲＨＡＩＡＩＤＹＤＰＬＥＧＹＶＹＷＴＤＤＥＶＲＡＩＲＲＡＹＬＤＧＳＧＡＱＴＬＶＮＴＥＩＮＤＰＤＧＩＡＶＤＷＶＡＲＮＬＹＷＴＤＴＧＴＤＲＩＥＶＴＲＬＮＧＴＳＲＫＩＬＶＳＥＤＬＤＥＰＲＡＩＡＬＨＰＶＭＧＬＭＹＷＴＤＷＧＥＮＰＫＩＥＣＡＮＬＤＧＱＥＲＲＶＬＶＮＡＳＬＧＷＰＮＧＬＡＬＤＬＱＥＧＫＬＹＷＧＤＡＫＴＤＫＩＥＶＩＮＶＤＧＴＫＲＲＴＬＬＥＤＫＬＰＨＩＦＧＦＴＬＬＧＤＦＩＹＷＴＤＷＱＲＲＳＩＥＲＶＨＫＶＫＡＳＲＤＶＩＩＤＱＬＰＤＬＭＧＬＫＡＶＮＶＡＫＶＶＧＴＮＰＣＡＤＲＮＧＧＣＳＨＬＣＦＦＴＰＨＡＴＲＣＧＣＰＩＧＬＥＬＬＳＤＭＫＴＣＩＶＰＥＡＦＬＶＦＴＳＲＡＡＩＨＲＩＳＬＥＴＮＮＮＤＶＡＩＰＬＴＧＶＫＥＡＳＡＬＤＦＤＶＳＮＮＨＩＹＷＴＤＶＳＬＫＴＩＳＲＡＦＭＮＧＳＳＶＥＨＶＶＥＦＧＬＤＹＰＥＧＭＡＶＤＷＭＧＫＮＬＹＷＡＤＴＧＴＮＲＩＥＶＡＲＬＤＧＱＦＲＱＶＬＶＷＲＤＬＤＮＰＲＳＬＡＬＤＰＴＫＧＹＩＹＷＴＥＷＧＧＫＰＲＩＶＲＡＦＭＤＧＴＮＣＭＴＬＶＤＫＶＧＲＡＮＤＬＴＩＤＹＡＤＱＲＬＹＷＴＤＬＤＴＮＭＩＥＳＳＮＭＬＧＱＥＲＶＶＩＡＤＤＬＰＨＰＦＧＬＴＱＹＳＤＹＩＹＷＴＤＷＮＬＨＳＩＥＲＡＤＫＴＳＧＲＮＲＴＬＩＱＧＨＬＤＦＶＭＤＩＬＶＦＨＳＳＲＱＤＧＬＮＤＣＭＨＮＮＧＱＣＧＱＬＣＬＡＩＰＧＧＨＲＣＧＣＡＳＨＹＴＬＤＰＳＳＲＮＣＳＰＰＴＴＦＬＬＦＳＱＫＳＡＩＳＲＭＩＰＤＤＱＨＳＰＤＬＩＬＰＬＨＧＬＲＮＶＫＡＩＤＹＤＰＬＤＫＦＩＹＷＶＤＧＲＱＮＩＫＲＡＫＤＤＧＴＱＰＦＶＬＴＳＬＳＱＧＱＮＰＤＲＱＰＨＤＬＳＩＤＩＹＳＲＴＬＦＷＴＣＥＡＴＮＴＩＮＶＨＲＬＳＧＥＡＭＧＶＶＬＲＧＤＲＤＫＰＲＡＩＶＶＮＡＥＲＧＹＬＹＦＴＮＭＱＤＲＡＡＫＩＥＲＡＡＬＤＧＴＥＲＥＶＬＦＴＴＧＬＩＲＰＶＡＬＶＶＤＮＴＬＧＫＬＦＷＶＤＡＤＬＫＲＩＥＳＣＤＬＳＧＡＮＲＬＴＬＥＤＡＮＩＶＱＰＬＧＬＴＩＬＧＫＨＬＹＷＩＤＲＱＱＱＭＩＥＲＶＥＫＴＴＧＤＫＲＴＲＩＱＧＲＶＡＨＬＴＧＩＨＡＶＥＥＶＳＬＥＥＦＳＡＨＰＣＡＲＤＮＧＧＣＳＨＩＣＩＡＫＧＤＧＴＰＲＣＳＣＰＶＨＬＶＬＬＱＮＬＬＴＣＧＥＰＰＴＣＳＰＤＱＦＡＣＡＴＧＥＩＤＣＩＰＧＡＷＲＣＤＧＦＰＥＣＤＤＱＳＤＥＥＧＣＰＶＣＳＡＡＱＦＰＣＡＲＧＱＣＶＤＬＲＬＲＣＤＧＥＡＤＣＱＤＲＳＤＥＡＤＣＤＡＩＣＬＰＮＱＦＲＣＡＳＧＱＣＶＬＩＫＱＱＣＤＳＦＰＤＣＩＤＧＳＤＥＬＭＣＥＩＴＫＰＰＳＤＤＳＰＡＨＳＳＡＩＧＰＶＩＧＩＩＬＳＬＦＶＭＧＧＶＹＦＶＣＱＲＶＶＣＱＲＹＡＧＡＮＧＰＦＰＨＥＹＶＳＧＴＰＨＶＰＬＮＦＩＡＰＧＧＳＱＨＧＰＦＴＧＩＡＣＧＫＳＭＭＳＳＶＳＬＭＧＧＲＧＧＶＰＬＹＤＲＮＨＶＴＧＡＳＳＳＳＳＳＳＴＫＡＴＬＹＰＰＩＬＮＰＰＰＳＰＡＴＤＰＳＬＹＮＭＤＭＦＹＳＳＮＩＰＡＴＡＲＰＹＲＰＹＩＩＲＧＭＡＰＰＴＴＰＣＳＴＤＶＣＤＳＤＹＳＡＳＲＷＫＡＳＫＹＹＬＤＬＮＳＤＳＤＰＹＰＰＰＰＴＰＨＳＱＹＬＳＡＥＤＳＣＰＰＳＰＡＴＥＲＳＹＦＨＬＦＰＰＰＰＳＰＣＴＤＳＳ
（配列番号４２）。
【００４７】
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する(treat)」または「治療している(treating)」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【００４８】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
【００４９】
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【００５０】
ＩＩ．組成物及び方法
一態様において、本発明は、ノリン及び／又はノリン／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４シグナル伝達を増強する抗体の発見に部分的に基づいている。所定の実施態様において、ＬＲＰ５に結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、増殖性糖尿病性網膜症、ＣＮＶ、ＡＭＤ、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、ＤＭＥ、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ、ＢＲＶＯ、角膜血管新生、網膜血管新生、ＲＯＰ、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ（骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群）、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症の診断又は治療のために有用である。
【００５１】
Ａ．典型的な抗ＬＲＰ５抗体
一態様において、本発明は、ＬＲＰ５に結合する単離された抗体を提供する。幾つかの実施態様において、抗ＬＲＰ５抗体は、ノリン活性及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達を増強する。
【００５２】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２６又は２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２３又は２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２９又は３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３１又は３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＰＲＯ抗体を提供する。
【００５３】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２６又は２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号２３又は２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、配列番号２３又は２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。別の実施態様において、抗体は、配列番号２３又は２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号２３又は２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号２６又は２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２６又は２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号２３又は２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００５４】
その他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号２９又は３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号３１又は３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号２９又は３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号３１又は３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００５５】
その他の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６又は２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３又は２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号２９又は３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３１又は３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【００５６】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２６又は２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２３又は２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２９又は３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３１又は３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【００５７】
上記実施態様の何れかにおいて、抗ＬＲＰ５抗体はヒト化することができる。一実施態様において、抗ＬＲＰ５抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。別の実施態様において、抗ＬＲＰ５抗体は、上記実施態様の何れかにあるようなＨＶＲを含み、更に、ＦＲ配列が以下の通りであるＦＲ配列を含むＶＨ又はＶＬを含む。重鎖について、ＦＲ１は、配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号３４）を含み、ＦＲ２は、配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号３５）を含み、ＦＲ３は、配列ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３６）を含み、ＦＲ４は配列ＷＧＱ（配列番号３７）を含む。軽鎖について、ＦＲ１は、配列ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号３８）を含み、ＦＲ２は、配列ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号３９）を含み、ＦＲ３は、配列ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号４０）を含み、ＦＲ４は配列ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号４１）を含む。
【００５８】
その他の態様において、抗ＬＲＰ５抗体は、配列番号１−１１の何れか一のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＬＲＰ５抗体はＬＲＰ５へ結合する能力を保持する。所定の実施態様において、配列番号１−１１の何れか一において合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＬＲＰ５抗体は、配列番号１−１１の何れか一のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２６又は２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２３又は２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＨ３から選択される一、二、又は三のＨＶＲを含む。
【００５９】
別の態様において、配列番号１２−２２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗ＬＲＰ５抗体が提供される。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＰＲＯ抗体はＰＲＯへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号１２−２２において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＬＲＰ５抗体は、配列番号１２−２２のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号２９又は３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号３１又は３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＬ３から選択される一、二、又は三のＨＶＲを含む。
【００６０】
その他の態様において、抗ＬＲＰ５抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。一実施態様において、抗体は、配列番号１−１１及び配列番号１２−２２の何れか一にＶＨ配列及びＶＬ配列をそれぞれ含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、以下のようなＶＨ配列及びＶＬ配列を含む：配列番号１及び配列番号１２、配列番号２及び配列番号１３、配列番号３及び配列番号１４、配列番号４及び配列番号１５、配列番号５及び配列番号１６、配列番号６及び配列番号１７、配列番号７及び配列番号１８、配列番号８及び配列番号１９、配列番号９及び配列番号２０、配列番号１０及び配列番号２１、又は配列番号１１及び配列番号２２。
【００６１】
更なる態様において、本発明は、本明細書に与えられた抗ＬＲＰ５抗体と同一エピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ある実施態様において、配列番号１のＶＨ配列及び配列番号１２のＶＬ配列を含むか又は配列番号５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含む抗ＬＲＰ５抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。
【００６２】
本発明の更なる態様では、上記実施態様のいずれかに記載の抗ＬＲＰ５抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗ＬＲＰ５抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施態様において、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、又は本明細書において定義された他の抗体クラス又はアイソタイプである。
【００６３】
更なる態様にて、以下のセクション１−７で説明されるように、上記実施態様のいずれかに記載の抗ＬＲＰ５抗体は、単独または組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる。
【００６４】
１．抗体親和性
所定の実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）。
【００６５】
一実施態様において、以下のアッセイにより説明されるように、Ｋｄは、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。非標識抗原の滴定系列の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体被覆プレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例えば、Chen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照）。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート(Thermo Scientific)を、５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc #269620）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する（例えば、Presta等, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。ついで目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間（例えばおよそ６５時間）かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ＴＭ；Packard）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭγ計測器(Packard)にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下を与える各Ｆａｂの濃度が、競合結合測定における使用のために選択される。
【００６６】
他の実施態様に従って、〜１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫｄを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５, BIAcore Inc.）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度(kon)と解離速度(koff)を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、 Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【００６７】
２．抗体断片
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ，及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、 Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【００６８】
ダイアボディは２価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
【００６９】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。所定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である(Domantis, Inc., Waltham, MA;例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照）。
【００７０】
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【００７１】
３．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【００７２】
所定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、例えば抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている
【００７３】
ヒト化抗体およびそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、 Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989);米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号及び第７，０８７，４０９号； Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (SDR (a-CDR)グラフティングを記述）； Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述）； Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
【００７４】
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993))；軽鎖または重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）；及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及びRosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照）を含む。
【００７５】
４．ヒト抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
【００７６】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している、米国特許第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）も参照のこと。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。
【００７７】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) （ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
【００７８】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に説明される。
【００７９】
５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性または活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
【００８０】
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングして、Griffiths等,EMBO J, 12: 725-734(1993)に記載のように如何なる免疫化を伴うことなく、幅広い非自己抗原及び自己抗原に対する抗体の単一源を提供することが可能である。最終的には、ナイーブライブラリーは、また、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを利用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードせしめ、インビトロでの再配列を達成させることによって合成的に作製することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０を含む。
【００８１】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書でヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
【００８２】
６．多重特異性抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つはＬＲＰ５に対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。ある実施態様において、他の結合特異性は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対してである。ある実施態様において、二重特異性抗体は、ＬＲＰ５の２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまたＬＲＰ５を発現する細胞に細胞傷害性薬物を局所化するために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【００８３】
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照）及び「ノブ−イン−ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」エンジニアリング（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号Ａ１）；２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４，６７６，９８０号；及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）、二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照）；二重特異性抗体フラグメントを作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）；及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【００８４】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号Ａ１を参照）。
【００８５】
本明細書中の抗体又は断片はまた、ＬＲＰ５並びにその他の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用(Dual Acting) ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。
【００８６】
７．抗体変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
【００８７】
ａ）置換、挿入、および欠失変異体
ある実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表１の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
【００８８】
2015511119.tif 000003
【００８９】
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００９０】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【００９１】
置換された変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【００９２】
変更（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008）を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲを標的としたアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、またはモデリングを用いて、特異的に同定され得る。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【００９３】
ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で生じる可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個または３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
【００９４】
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基またはグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【００９５】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【００９６】
ｂ）グリコシル化変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成または削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
【００９７】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、一定の改善された特性を有する抗体変異体を作成するために行われ得る。
【００９８】
一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、または２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着しているすべての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流または下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号 (Presta, L.)；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「非フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。非フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８ Ａ１号、Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２号Ａ１、Adamsら、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
【００９９】
抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を更に備えている。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairettら）；米国特許第６，６０２，６８４号（Umanaら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umanaら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patelら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）に記載されている。
【０１００】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある実施態様において、１つまたは複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つまたは複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
【０１０１】
ある実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体およびＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の464ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照）及びHellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；第５，８２１，３３７号(Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照）に説明される。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞毒性アッセイ (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ(Promega, Madison, WI)を参照。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定はまた、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照）。
【０１０２】
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０１０３】
ＦｃＲへの改善又は減少させた結合を持つ特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照）。
【０１０４】
所定の実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。
【０１０５】
幾つかの実施態様において、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に説明されるように、改変された（即ち改善されたか又は減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされる。
【０１０６】
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号Ａ１(Hinton et al.)に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一つまたは複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基の１以上の置換を有するものが含まれる：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０１０７】
Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び、Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０１０８】
ｄ）システイン操作抗体変異体
ある実施態様において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ（複数）」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換される残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分またはリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０１０９】
ｅ）抗体誘導体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手される追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む検討事項に基づいて決定することができる。
【０１１０】
別の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体と非タンパク質部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
【０１１１】
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号で説明したように、組換えの方法および組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗ＬＲＰ５抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗ＥＴＢＲ抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、および必要に応じて、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【０１１２】
抗ＬＲＰ５抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【０１１３】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で産生することができる。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号及び第５，８４０，５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照。）発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。
【０１１４】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
【０１１５】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
【０１１６】
植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
【０１１７】
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株 (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。
【０１１８】
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗ＬＲＰ５抗体は、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、または特徴づけることができる。
【０１１９】
１．結合アッセイとその他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
【０１２０】
その他の態様において、競合アッセイを、ＬＲＰ５への結合についてＹＷ６２９．４２又はＹＷ６２９．５１と競合する抗体を同定するために用いることができる。ある実施態様において、このような競合する抗体は、ＹＷ６２９．４２又はＹＷ６２９．５１により結合される同一のエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。
【０１２１】
典型的な競合アッセイにおいて、固定化ＬＲＰ５は、ＬＲＰ５に結合する第一の標識された抗体（例えば、ＹＷ６２９．４２又はＹＷ６２９．５１）、及びＬＲＰ５へ結合について第一の抗体と競合する能力について試験された第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化ＬＲＰ５が、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。ＬＲＰ５への第一の抗体の結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化されたＬＲＰ５に結合した標識の量が測定される。もし、固定化ＬＲＰ５に結合した標識の量が、対照サンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体がＬＲＰ５への結合に対して、第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【０１２２】
２．活性のアッセイ
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するその抗ＬＲＰ５抗体を同定するために与えられる。生物学的活性は、例えば、ＬＲＰ５との結合、ノリン活性の増強、又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達の増強を含み得る。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
【０１２３】
ある実施態様において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。例示的ななＷｎｔ／ノリン活性化アッセイにおいて、ＬＲＰ５及びＦｚｄ４タンパク質、又は関連する変異体（即ち、Ｆｚｄ４Ｍ１５７Ｖ）は、２９３Ｔ細胞においてＴｏｐｆｌａｓｈルシフェラーゼレポータープラスミドで一過性に発現される。これらのタンパク質を発現する細胞は、ノリン又はＷｎｔリガンドに曝露され、３７℃で１６時間インキュベーションした後、活性化のレベルは、ルシフェラーゼからの発光の量を測定することによって確認される。発光量がＬＲＰ５抗体の存在下でのリガンドの添加によって実質的に増えた場合、それは抗体がＦｚｄ４／ノリンシグナル伝達を増強することを示している。ノリンの存在下でシグナル伝達を減少させるＦｚｄ４Ｍ１５７Ｖを使用する場合、ＬＲＰ５抗体の存在下での発光の増加は、Ｆｚｄ４シグナル伝達における欠損をレスキューすると考えられる。
【０１２４】
更なるＷｎｔ／ノリン活性化アッセイにおいて、培養されたヒト網膜内皮細胞は、ＬＲＰ５抗体又は対照抗体の存在下で２４時間ノリンリガンド又はＷｎｔリガンドに曝露することができ、そして既知のＷｎｔレポーター遺伝子（即ち、Ａｘｉｎ−２又はＰＶ−１）のレベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定することができる。対照抗体の状況において、ノリンリガンド及びＷｎｔリガンドの添加後、Ａｘｉｎ−２ ＲＮＡの量は増加するが、一方ＰＶ−１ ＲＮＡの量は、リガンド添加無しに比較して減少するであろう。もしＬＲＰ５抗体が存在する場合、ノリンシグナル伝達の増強は、Ａｘｉｎ−２の更なる増加と、逆にＰＶ−１の減少を生じるであろう。このアッセイは、Ｔｓｐａｎ１２の発現を減少させるｓｉＲＮＡで処置した細胞で行うこともできる。Ｔｓｐａｎ１２の発現が減少した細胞では、ノリンの存在下ではＡｘｉｎ−２に変化はない。Ｔｓｐａｎ１２の発現欠損下にて、対照抗体でなくＬＲＰ５抗体がＡｘｉｎ−２の増加を引き起こすことができる場合、この抗体はＴｓｐａｎ１２の減少から生じるＦｚｄ４／ノリンシグナル伝達の異常をレスキューすると考えられる。
【０１２５】
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、１つ以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中の抗ＬＲＰ５抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０１２６】
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、そこでは抗体は、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許ＥＰ０ ４２５２３５ Ｂ１を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び第５７８０５８８号及び第７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、第５７１４５８６号、第５７３９１１６号、第５７６７２８５号、第５７７０７０１号、第５７７０７１０号、第５７７３００１号、及び第５８７７２９６号を参照；Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998))；ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン (Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；及びＣＣ１０６５を含む一以上の薬物とコンジュゲートしている。
【０１２７】
その他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした、本明細書に記載の抗体を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。
【０１２８】
その他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生産のために入手可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。検出のために放射性複合体を使用するとき、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
【０１２９】
抗体と細胞傷害性薬物の複合体は、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）など、を使って作成され得る。Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、例えば、リシンイムノトキシンを調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。
【０１３０】
本明細書において、イムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販の（例えばPierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に意図する。
【０１３１】
Ｅ．診断及び検出のための方法および組成物
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗ＬＲＰ５抗体の何れかは、生物学的サンプル中のＬＲＰ５の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。所定の実施態様において、生物学的サンプルは、網膜組織を含む眼組織などの細胞又は組織を含む。
【０１３２】
一実施態様において、診断又は検出の方法に使用される抗ＬＲＰ５抗体が提供される。更なる態様において、生物学的サンプル中のＬＲＰ５の存在を検出する方法が提供される。所定の実施態様において、本方法は、抗ＬＲＰ５抗体のＬＲＰ５への結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように抗ＬＲＰ５抗体と生物学的サンプルを接触させること、及び複合体が抗ＬＲＰ５抗体とＬＲＰ５との間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボでの方法であり得る。一実施態様において、例えばＬＲＰ５が患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗ＬＲＰ５抗体が抗ＬＲＰ５抗体による治療にふさわしい被検体を選択するために使用される。
【０１３３】
本発明の抗体を用いて診断され得る典型的な障害は、増殖性糖尿病性網膜症、ＣＮＶ、ＡＭＤ、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、ＤＭＥ、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ、ＢＲＶＯ、角膜血管新生、網膜血管新生、ＲＯＰ、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ（骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群）、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症を含む。
【０１３４】
ある実施態様において、標識された抗ＬＲＰ５抗体が提供される。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。典型的な標識は、限定されないが、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体を酸化する過酸化水素を利用する酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼと共役したもの、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどが含まれる。
【０１３５】
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載の抗ＬＲＰ５抗体の薬学的処方物は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980)）とを、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Baxter International, Inc.）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つまたは複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
【０１３６】
典型的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０１３７】
本明細書の製剤はまた、治療を受けている特定の徴候のために必要な一以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものが含まれる場合がある。例えば、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗体断片、例えばラニビズマブ；可溶性ＶＥＧＦ受容体又はその断片、例えばアフリベルセプト；又はアプタマー、例えば、ペガプタニブを含む）、ＴＳＰＡＮ１２アゴニスト、プラスミン、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子、トリアムシノロン、ＴＮＦ−α阻害剤、及び／又はデキサメタゾンを更に提供することが望まれる。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
【０１３８】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート（methylmethacylate））マイクロカプセルによって、コロイド薬物送達系で（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロ・エマルジョンで調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０１３９】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形をしている。
【０１４０】
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。
【０１４１】
Ｇ．治療的方法及び組成物
本明細書で提供される抗ＬＲＰ５抗体のいずれかを、治療方法で使用することができる。
【０１４２】
一態様では、医薬として使用するための抗ＬＲＰ５抗体が提供される。更なる態様において、増殖性糖尿病性網膜症、ＣＮＶ、ＡＭＤ、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、ＤＭＥ、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ、ＢＲＶＯ、角膜血管新生、網膜血管新生、ＲＯＰ、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ（骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群）、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症の治療において使用のための抗ＬＲＰ５抗体が提供される。所定の実施態様において、治療の方法に使用される抗ＬＲＰ５抗体が提供される。ある実施態様において、本発明は、抗ＬＲＰ５抗体の有効量を個体に投与することを含む、増殖性糖尿病性網膜症、ＣＮＶ、ＡＭＤ、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、ＤＭＥ、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ、ＢＲＶＯ、角膜血管新生、網膜血管新生、ＲＯＰ、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ（骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群）、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症を有する個体を治療する方法において使用のための抗ＬＲＰ５抗体を提供する。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも一の追加の治療薬の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本発明は、ノリン活性及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達の増強に使用のための抗ＬＲＰ５抗体を提供する。ある実施態様において、本発明は、ノリン活性を増強及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達を増強するため抗ＬＲＰ５抗体の有効量を個体に投与することを含む、個体においてノリン活性を増強及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達を増強する方法において使用のための抗ＬＲＰ５抗体を提供する。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。
【０１４３】
更なる態様にて、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ＬＲＰ５抗体の使用を提供する。一実施態様において、医薬は、増殖性糖尿病性網膜症、ＣＮＶ、ＡＭＤ、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、ＤＭＥ、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ、ＢＲＶＯ、角膜血管新生、網膜血管新生、ＲＯＰ、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ（骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群）、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症の治療のためである。更なる実施態様において、医薬は、増殖性糖尿病性網膜症、ＣＮＶ、ＡＭＤ、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、ＤＭＥ、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ、ＢＲＶＯ、角膜血管新生、網膜血管新生、ＲＯＰ、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ（骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群）、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症を有する個体に医薬の有効量を投与することを含む、増殖性糖尿病性網膜症、ＣＮＶ、ＡＭＤ、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、ＤＭＥ、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ、ＢＲＶＯ、角膜血管新生、網膜血管新生、ＲＯＰ、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ（骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群）、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症を治療する方法において使用のためである。
【０１４４】
一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも一の追加の治療薬の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、医薬は、ノリン活性を増強及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達を増強するためである。更なる実施態様において、医薬は、ノリン活性を増強及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達を増強するための医薬の有効量を個体に投与することを含む、個体においてノリン活性を増強及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達を増強する方法において使用のためである。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０１４５】
更なる態様において、本発明は、増殖性糖尿病性網膜症、ＣＮＶ、ＡＭＤ、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、ＤＭＥ、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ、ＢＲＶＯ、角膜血管新生、網膜血管新生、ＲＯＰ、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ（骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群）、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症の治療のための方法を提供する。一実施態様において、本方法は、増殖性糖尿病性網膜症、ＣＮＶ、ＡＭＤ、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、ＤＭＥ、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ、ＢＲＶＯ、角膜血管新生、網膜血管新生、ＲＯＰ、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ（骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群）、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症を有する個体に、抗ＬＲＰ５抗体の有効量を投与することを含む。一つのそのような実施態様において、本方法は、後述するように、少なくとも１つの付加的治療薬の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０１４６】
更なる態様において、本発明は個体においてノリン活性を増強及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達を増強するための方法を提供する。一実施態様において、本方法は、ノリン活性を増強及び／又はノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達を増強するための抗ＬＲＰ５抗体の有効量を個体に投与することを含む。一実施態様において、「個体」はヒトである。
【０１４７】
更なる態様において、本発明は、例えば、上記の治療法のいずれかに使用のための、本明細書で提供される抗ＬＲＰ５抗体のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＬＲＰ５抗体のいずれかと及び薬学的に許容される担体とを含む。その他の実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＬＲＰ５抗体のいずれかと、少なくとも１つの付加的治療薬とを、例えば後述するように含む。
【０１４８】
本発明の抗体は、治療において、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は少なくとも一の付加的治療薬と同時投与され得る。ある実施態様において、付加的治療薬は、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗体断片、例えばラニビズマブ；可溶性ＶＥＧＦ受容体又はその断片、例えばアフリベルセプト；又はアプタマー、例えば、ペガプタニブを含む）、ＴＳＰＡＮ１２アゴニスト、プラスミン、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子、トリアムシノロン、ＴＮＦ−α阻害剤、及び／又はデキサメタゾンである。
【０１４９】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一または別々の製剤に含まれている）、及び、本発明の抗体の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。
【０１５０】
本発明の抗体（および任意の付加的治療薬）は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、および鼻腔内、及び局所治療が所望される場合、眼内投与（例えば硝子体内投与）が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、硝子体内などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一または複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。
【０１５１】
本発明の抗体は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。抗体は、必要ではないが任意で、問題となる障害の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０１５２】
疾患の予防又は治療のためには、本発明の抗体の適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び抗体に対する応答性、及び担当医の判断に依存する。抗体は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば抗体の約６投与量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷用量の後、１つ以上の低用量を投与してよい。しかしながら、他の投与量レジメンも有益であり得る。この治療法の進行は従来の手法及び試験により容易にモニタリングされる。
【０１５３】
上記の製剤または治療方法のいずれかが、抗ＬＲＰ５抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて行うことができることが理解される。
【０１５４】
Ｈ．製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベルまたは容器上にある又は容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器；および（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。別法として、または加えて、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二（または第三）の容器をさらに含んでもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザーの立場から望まれる他の物質をさらに含んでもよい。
【０１５５】
上記の製造品のいずれかは、抗ＬＲＰ５抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解される。
【実施例】
【０１５６】
ＩＩＩ．実施例
以下は本発明の方法および組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０１５７】
実施例１：抗ＬＲＰ５抗体の生成
抗ＬＲＰ５−Ｅ３／Ｅ４抗体を同定するためのライブラリ選別とスクリーニング
我々は、細胞外ドメインの全領域、４つの全βプロペラドメインＥ１−４、各βプロペラドメイン単独、及びＥ３−Ｅ４をコードするものを含む複数のＬＲＰ５発現構築物を生成し、Ｅ３−Ｅ４ドメインをコードするクローンのみが有意な量の可用性発現タンパク質を生産することを見いだした。従って、我々は、社内で生成されたビオチン化ＬＲＰ５ドメインＥ３−Ｅ４（配列番号４２のＥ６４４−Ｑ１２６３）をライブラリ選別のための抗原として用いた。Ｎｕｎｃ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）はイムノプレートはニュートラアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）（登録商標） (Fisher Scientific, #89890, １０μｇ／ｍｌ）又はストレプトアビジン（Fisher Scientific, #21125, １０μｇ／ｍｌ）と４℃で一晩コーティングし、ファージブロッキング緩衝液ＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０）により室温にて１時間ブロックした。ビオチン化ＬＲＰ５−Ｅ３／Ｅ４（１０μｇ／ｍｌ）は、次いで、ニュートラアビジン（登録商標）／ストレプトアビジンによって室温で１時間プレート上に捕捉した。ヒト抗体の合成ファージライブラリ（例えばLee et al., J. Immunol. Meth. 284:119-132, 2004, Liang et al., J. Molec. Biol. 366: 815-829, 2007を参照）を別々抗原プレートに添加し、室温で一晩インキュベートした。翌日、抗原被覆プレートをＰＢＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で１０回洗浄し、結合したファージを３０分間５０ｍＭのＨＣｌ及び５００ｍＭのＮａＣｌで溶出させ、同容量の１Ｍのトリス塩基（ｐＨ７．５）で中和した。回収されたファージを、大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞中で増幅した。続く選択ラウンドの間、抗原がコーティングされたプレートとの抗体ファージのインキュベーションを２ー３時間に減らし、プレート洗浄のストリンジェンシーは徐々に増加させた。
【０１５８】
６ラウンドのパンニング(panning)の後、有意な濃縮が観察された。９６個のクローンは、それらがヒトＬＲＰ５Ｅ３／Ｅ４に特異的に結合するかどうかを決定するために、ライブラリトラックからそれぞれ選び取った。これらのクローンの可変領域は、固有のシーケンスクローンを同定するためにＰＣＲ配列決定された。
【０１５９】
ファージ上清を１００μｌの総体積中でＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ）で１：５に希釈し、標的タンパク質をコーティングしたプレート（直接一晩コーティングした１μｇ／ｍｌのＬＲＰ５Ｅ３／Ｅ４）又はニュートラアビジン／ストレプトアビジンをコーティングしたプレート（各タンパク質の５μｇ／ｍｌ）に移した。プレートを穏やかに１時間振とうし、ファージがタンパク質をコーティングしたプレートに結合することができるようにした。プレートをＰＢＳ−０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０で１０回洗浄した。結合は、ＥＬＩＳＡ緩衝液（１：５０００）中で西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗Ｍ１３抗体を添加し、室温で３０分間インキュベートすることにより定量した。プレートをＰＢＳ−０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０で１０回洗浄した。次に、３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ基質及びペルオキシダーゼ溶液Ｂ（Ｈ２Ｏ２） (Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD)) の１：１の比の１００μｌ／ウェルをウェルに添加し、室温で５分間インキュベートした。反応を各ウェルに１００μｌの０．１Ｍリン酸（Ｈ３ＰＯ４）を添加することによって停止させ、室温で５分間インキュベートさせた。各ウェルにおける黄色のＯ．Ｄ．（光学密度）を４５０ｎｍで標準ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて測定した。ＯＤの減少（％）を次式により算出した。
【０１６０】
ＯＤ４５０ｎｍ減少（％）＝［（競争相手を含むウェルのＯＤ４５０ｎｍ）／（競争相手を含まないウェルのＯＤ４５０ｎｍ）］＊１００
【０１６１】
ＬＲＰ５Ｅ３／Ｅ４に対してバックグランドよりも少なくとも５倍高いＯＤ４５０ｎｍを有するクローンを選別し、個々のクローンのＶＬ領域及びＶＨ領域をＬＰＧ３とＬＰＧ４ベクターそれぞれにクローニングすることにより、完全長ヒトＩｇＧ１に再フォーマットした。次いでこれらのクローンを哺乳動物ＣＨＯ細胞で一過性に発現し、プロテインＡカラムを用いて精製した。
【０１６２】
合成ファージライブラリに由来するクローンの親和性向上のためのライブラリー構築及びパニングストラテジー
有望な細胞ベースのアッセイの活性を示した各クローン、ＹＷ６２９．４２とＹＷ６２９．５１について、ＣＤＲ Ｌ３４停止コドン（ＴＡＡ）を含有し、Ｍ１３バクテリオファージの表面上に一価のＦａｂを呈するファージミドを生成した。これらのファージミドは親和性成熟ライブラリーの構築のためのクンケル変異誘発のための鋳型としての役割を果たした。親和性成熟については、変異原性ＤＮＡが、選択された位置に約５０％の変異率を得るために野生型ヌクレオチドを好む塩基の７０−１０−１０−１０混合物を用いて合成されるソフトランダム化戦略を使用した（Gallop et al., Journal of Medicinal Chemistry 37:1233-1251 (1994)）。ＣＤＲループ、Ｈ１／Ｌ３、Ｈ２／Ｌ３、Ｈ３／Ｌ３、及びＬ１／Ｌ２／Ｌ３の４つの異なる組み合わせをランダム化のために選択した。
【０１６３】
親和性改善の選択のために、社内で生成したＬＲＰ５Ｅ３／Ｅ４は、限定試薬条件下で最初にビオチン化した。ファージライブラリーは、ストリンジェンシーを増加させた５ラウンドの溶液選別を受けた。溶液選別の最初のラウンドにおいて、１％のＢＳＡ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０のファージインプットの３Ｏ．Ｄ．／ｍｌが、ＬＲＰ５Ｅ３／Ｅ４で予め被覆されたプレートに対して３時間インキュベートされた。ウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で１０回洗浄した。結合ファージを５０ｍＭのＨＣｌ、５００ｍＭのＫＣｌを１５０μｌ／ウェルで溶出し、続いて１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）の５０ｕｌ／ウェルにより中和し、滴定し、次のラウンドのために増殖された。続くラウンドにおいて、ファージライブラリーのパニングが溶液ファージ中で行われ、ここではファージライブラリーは、室温で２時間、１００μｌのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ緩衝液(Pierce Biotechnology)中で初期濃度１００ｎＭのビオチン化標的タンパク質（濃度は親クローンファージのＩＣ５０値に基づく）とインキュベートされた。混合物は１％のスーパーブロックで１０Ｘに更に希釈され、１００μｌ／ウェルをニュートラアビジンでコーティングされたウェル（１０μｇ／ｍｌ）に室温で３０分間穏やかに振盪しながら適用した。バックグラウンド結合を決定するために、ファージを含むコントロールウェルをニュートラアビジンでコーティングされたプレート上に捕獲した。その後、結合したファージは、洗浄し、溶出し、最初のラウンドのために説明したように増殖させた。溶液選別の更なる４回のラウンドが、選別ストリンジェンシーの増加とともに実行された。その最初の２ラウンドは、ビオチン化標的タンパク質濃度を１００ｎＭから１ｎＭに減少させることによる会合速度(on-rate)選択のためであり、その最後の２回のラウンドは、室温で弱い結合剤を競合するため、過剰量の非ビオチン化標的タンパク質（３００から１０００倍以上）を加えることによる解離速度(off-rate)選択のためのものであった。
【０１６４】
ハイスループット親和性スクリーニングＥＬＩＳＡ（単一スポットコンペティション）
コロニーがスクリーニングのために第６ラウンドのパニングから採取された。コロニーを９６ウェルプレート（Falcon）中で５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンと１ｘ１０１０／ｍｌのＭ１３ＫＯ７を含む２ＹＴ培地の１５０μｌ／ウェル中で、３７℃で一晩増殖させた。同じプレートから、ＸＬ−１に感染した親のファージのコロニーをコントロールとして取り上げた。９６ウェルＮｕｎｃマキシソープ（登録商標）プレートを一晩４℃で、ＰＢＳ中のＬＲＰ５Ｅ３／Ｅ４（０．５μｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ウェルでコーティングした。プレートは１時間、ＰＢＳ中に０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び１％のＢＳＡを含む１５０μｌでブロックした。
【０１６５】
３５μｌのファージ上清が、５ｎＭのＬＲＰ５Ｅ３／４の有無によらず、７５μｌのＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ）で希釈され、Ｆプレート（ＮＵＮＣ）中で室温で１時間インキュベートさせた。混合物の９５μｌを抗原でコーティングしたプレートへ並べて移した。プレートを穏やかに１５分間振とうし、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で１０回洗浄した。結合は、ＥＬＩＳＡ緩衝液（１：２５００）中で西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗Ｍ１３抗体を添加し、室温で３０分間インキュベートすることにより定量した。ウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で１０回洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ基質の１００μｌ／ウェルをウェルに加え、室温で５分間インキュベートした。反応を各ウェルに１００μｌの０．１Ｍリン酸（Ｈ３ＰＯ４）を添加することによって停止させ、室温で５分間インキュベートさせた。各ウェルのＯ．Ｄ．（光学密度）を４５０ｎｍで標準的ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて測定した。親ファージのウェル（１００％）のＯＤ４５０ｎｍ減少（％）と比較して、５０％未満のＯＤ４５０ｎｍ減少（％）を有するクローンが配列解析用に選択された。親のクローンとの比較により標的抗原ＬＲＰ５Ｅ３／Ｅ４に対する結合親和性（ファージＩＣ５０）を決定するファージ調製のためにユニークなクローンが選択された。親和性の向上を最も示したクローンは、抗体産生及び更なるビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）ＴＭ結合動態解析及び他のインビトロ又はインビボアッセイのためヒトＩｇＧ１に再フォーマットされた。この方法により同定された所定の抗体の可変ドメイン配列は図４及び５に示される。本特許明細書において、接頭辞「ＹＷ６２９」及び「Ｐ６Ｃ」は同義的に用いられ得る。従って、例えば、ＹＷ６２９．５１．６１として記載される抗体は、Ｐ６Ｃ．５１．６１と同一である。
【０１６６】
抗ＬＲＰ５抗体の特性評価（ビアコア）
抗ＬＲＰ５Ｅ３／Ｅ４ ＩｇＧの結合親和性は、ビアコアＴＭ−Ｔ１００装置を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）によって測定した。抗ＬＲＰ５Ｅ３／Ｅ４ヒトＩｇＧは、ＣＭ５バイオセンサーチップ上にコーティングされたマウス抗ヒトＦｃ抗体（GE Healthcareカタログ# BR-1008-39）によって捕捉され、約２００応答単位（ＲＵ）を達成した。速度論測定のため、ヒトＬＲＰ５Ｅ３／Ｅ４（ＧＮＥ）の２倍連続希釈（５００ｎＭから０．２４５ｎＭ）が２５℃で流速３０μｌ／分でＨＢＳ−Ｐ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）に注入された。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は単純な一対一のラングミュア結合モデルを用いて計算した（ＢＩＡｃｏｒｅ評価用ソフトウェアのバージョン２．０．２）。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として算出した。図４及び５の抗体についてこの解析の結果は以下の表２に示される。
【０１６７】
2015511119.tif 000004
【０１６８】
実施例２：ノリン経路を増強する活性を有する抗体の同定
ノリンは、ＬＲＰ５、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４（ＦＺＤ４）及びテトラスパニン１２（ＴＳＰＡＮ１２）を含む膜複合体を介してシグナル伝達する。シグナル伝達の欠陥を示す、ノリン（例えばノリン−Ｃ９５Ｒ）、ＦＺＤ４（例えば、ＦＺＤ４−Ｍ１５７Ｖ）及びＴＳＰＡＮ１２（例えば、ＴＳＰＡＮ１２−Ｇ１８８Ｒ）の各々において変異体が同定されている。私たちは、ノリン媒介性シグナル伝達に影響を与える様々なＬＲＰ５抗体の能力を試験した。
【０１６９】
２４ウェルプレートにおいて、１．６ｘ１０５細胞／ウェルが、βカテニンレポーター混合物（ＴＯＰＦｌａｓｈ、ｐＲＬ−ＣＭＶ、及びｐＣａｎ−ｍｙｃ−ｌｅｆ−１）、ＬＲＰ５、及びＦｚｄ４又はＦｚｄ４−Ｍ１５７Ｖを含むＤＮＡ混合物でトランスフェクトされた。トランスフェクション後２４時間で、指定される量の各ＬＲＰ５抗体が添加された。１時間後、１２５ｎｇ／ｍｇの組換えノリンが、示されるようにウェルに添加された。３７℃で更に１６時間インキュベーション後、細胞を溶解し、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼの発現がプロメガＤｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を使用して測定された。ホタルルシフェラーゼの値は、ウミシイタケの発現に対して正規化した。ノリンは、リガンド無しに比較して、レポーター遺伝子の発現を〜５倍活性化する。抗体の量の増やして添加すると、試験された全抗体において０．１−１μｇ／ｍｌでノリンの活性を〜１０倍まで増強する（図１Ａ）。Ｆｚｄ４−Ｍ１５７Ｖが、トランスフェクションでＦｚｄ４と置換される場合、ノリンの活性化は、わずか２倍に低減される。ＬＲＰ５抗体の添加は、不完全なシグナル伝達を、野生型Ｆｄｚ４を反映するレベルまでレスキューする（図１Ｂ）。これらのデータは、抗ＬＲＰ５抗体がノリン／Ｆｚｄ４シグナル伝達を増強し、Ｆｚｄ４−Ｍ１５７Ｖ変異をレスキューすることを示唆している。
【０１７０】
３×１０５ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＥＭＶＣ）を、６ウェルディッシュに播種した。翌日、指示された抗体の１０μｇ／ｍｌを添加し、その１時間後に１．２５μｇ／ｍｌのノリンを加えた。更に２４時間経過後、ノリン標的遺伝子のＰＶ−１（ノロンにより下方制御される）及びＡｘｉｎ−２（ノリンにより上方制御される）のＱ−ＰＣＲ解析のために単離された。ノリンの添加は、リガンド無しと比較して、約１．６倍Ａｘｉｎ−２発現を上方制御し、約０．７倍ＰＶ−１を下方制御する。示されたＬＲＰ５抗体の添加は、Ａｘｉｎ−２を約２倍まで上方制御し、ＰＶ−１を約０．５倍まで下方制御する（図２Ａ）。３×１０５のＨＲＥＭＶＣを６ウェルディッシュに播種した。細胞が付着されると（約４時間）、それらは、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）トランスフェクション試薬を用いて１００ｎＭの対照物又はＴｓｐａｎ１２ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした。翌日、細胞を、２４ウェルプレートに播種し、示された抗体及びリガンド（上記）で処理した。Ａｘｉｎ−２の遺伝子発現を測定することによって示されるように、Ｔｓｐａｎ１２のノックダウンは、ノリンによる活性化を妨げる。示されたＬＲＰ−５抗体の１０μｇ／ｍｌの添加は、部分的に、この不完全なノリンシグナル伝達をレスキューする（図２Ｂ）。これらのデータは、ＬＲＰ５抗体がノリン活性を増強し、Ｔｓｐａｎ１２の損失をレスキューすることを示唆している。
【０１７１】
次に我々は、抗ＬＲＰ５抗体の活性をインビボで試験する。Ｔｓｐａｎ１２ノックアウト（ＫＯ）及び野生型同腹子を、Ｐ３−Ｐ１４から毎日２５ｍｇ／ｋｇの抗ｇＤ（陰性対照抗体）又は抗ＬＲＰ５抗体（ＹＷ６２９．４２）により処置した。Ｐ１５に、眼を摘出し、網膜をビオチン化イソレクチンＢ４による血管の染色のために回収した。網膜を、ストレプトアビジン−ＡＦ４８８で染色し、全組織を標本化し、共焦点顕微鏡を用いて画像化した。ＸＹ及びＺ投影は各網膜の厚みを貫通して捕捉した１．６ミクロンのスタックから作成された。予測されるように、Ｔｓｐａｎ１２ ＫＯ網膜の血管は、表在性血管叢で停止し、ちょうど神経節細胞層の下にある小さな病理学的血管クラスターを形成する。対照抗体の抗ｇＤでなく、Ｐ６Ｃ．４２による処置は、深層血管新生を促進し、異常血管のクラスター形成を減少させることにより、Ｔｓｐａｎ１２ ＫＯ血管障害を部分的にレスキューする（図３Ａ）。Ｐ１５において、Ｔｓｐａｎ１２ ＫＯマウスは、野生型マウスに典型的である内網状（ＩＰＬ）血管床を形成できない。ＹＷ６２９．４２による処置は、同様な抗ｇＤ処置マウスと比較して、ＩＰＬ血管系を部分的に修復する。（ｎ＝３匹の動物／処置群；図３Ｂ）これらのデータは、抗ＬＲＰ５抗体は、インビボでＴｓｐａｎ１２ノックアウトマウスにおける血管障害を部分的にレスキューすることを示す。
【０１７２】
Ｔｓｐａｎ１２ ＫＯ及びヘテロ接合同腹仔も２５ｍｇ／ｋｇの抗ｇＤ又は抗ＬＲＰ５抗体（Ｐ６Ｃ．５１．６１）で処理した。図６Ａに示されるデータについては、マウスはＰ６−Ｐ１５から毎日処置され、Ｐ１６に屠殺された（６匹のマウス／処置群）。眼を摘出し、網膜をビオチン化イソレクチンＢ４による血管の染色のために回収した。網膜を、ストレプトアビジン−ＡＦ４８８で染色し、全組織を標本化し、共焦点顕微鏡を用いて画像化した。ＸＹ及びＺ投影は各網膜の厚みを貫通して捕捉した１．６ミクロンのスタックから作成された。Ｔｓｐａｎ１２＋／−マウスは、３つの異なる血管層からなる正常な網膜血管系を示す（図６Ａ、左、スケールバーは１００μｍ）。予想されるように、対照抗体抗ｇＤで処理されたＴｓｐａｎ１２−／−マウスからの網膜血管は、表在性血管叢で停止し、神経節細胞層の下にある小さな病理学的血管クラスターを形成する（図６Ａ、中央）。Ｐ６Ｃ．５１．６１による処置は、深層血管新生を促進し、異常血管のクラスター形成を減少させることにより、Ｔｓｐａｎ１２ ＫＯ血管障害を部分的にレスキューする（図６Ａ、右）。図６Ｂに示されるデータについては、マウスはＰ３−Ｐ１５から毎日処置され、続いてＰ１５−Ｐ３０から一日おきに処置された（８匹のマウス／処置群）。Ｐ３１において、眼を摘出し、網膜を回収し、上述のように処置した。内網状層（ＩＰＬ）の血管は共焦点顕微鏡で画像化した。Ｔｓｐａｎ１２の＋／−マウスのＩＰＬは典型的な健常なる毛細血管網を含むが（図６Ｂ、左、スケールバーは５０μｍ）、一方抗ｇＤ対照抗体で処置されたＴｓｐａｎ１２−／−は毛細血管網を形成することができず、ＩＰＬに異常な血管の断片を発達させる（図６Ｂ、中央）。Ｐ６Ｃ．５１．６１による処置は、ＩＰＬにおいて毛細血管網の形成を部分的に回復する（図６Ｂ、右）。
【０１７３】
次に我々は、キャピラリードロップアウト及び網膜静脈閉塞症及び糖尿病性網膜症における病理学的な血管新生などの成人の網膜血管障害の特定の病理学的特徴を再現する酸素誘発性網膜症（ＯＩＲ）モデルにおいて抗ＬＲＰ５抗体を試験した。モデルは２つのフェーズ：中心網膜内で血管閉塞(vasoobliteration)を生じる、生後７〜１２日（Ｐ７−Ｐ１２）からの高酸素フェーズ、及び病的な血管新生につながるＰ１２−Ｐ１７からの相対的低酸素フェーズからなる。簡潔には、フェーズ１の間、Ｐ７新生仔マウスを、５日間、７５％の酸素からなる高酸素チャンバー内に配置する。このフェーズの間、既存の網膜血管系は退縮し、中心の視神経乳頭周辺で血管閉塞(vasoobliteration)を生じる。第二フェーズの間、Ｐ１２マウスは２０％の酸素からなる室内空気中で飼育される。中央の血管閉塞(vasoobliteration)は病的な血管新生を引き起こす低酸素応答につながる。図７Ａに示すデータにおいて、Ｃ５７Ｂｌ６／Ｎマウスは、上記の通りにＯＩＲの処置を受けた。マウスを、を２５ｍｇ／ｋｇの抗ｇＤ（陰性対照抗体）又は抗ＬＲＰ５抗体（ＰＣ６．５１．６１）でＰ１２−Ｐ１７から毎日処置した。Ｐ１７に、前述したように、目は摘出され、網膜を回収し、イソレクチンＢ４によって染色された網膜の全領域、血管閉塞領域（中央に輪郭で描かれる）、及び病理学的血管系を富士イメージングソフトウェアを用いて測定した。図７Ｂは、データの分析を示し、治療群間で網膜の全領域に有意差がなかったという事実にもかかわらず、Ｐ６Ｃ．５１．６１で処置したマウスは、抗ｇＤで処置した同腹子よりも血管閉塞領域内において有意に大きな血管再成長を有していた。図７Ｃは、Ｐ６Ｃ．５１．６１で処置した動物において強化された血管再成長は、抗ｇＤで処置されたコホート、ｎ＝５匹／治療群と比較して、病理学的血管形成の減少に向かう傾向を伴っていたことを示している。
【０１７４】
実施例３：抗ＬＲＰ５抗体のノリン経路増強活性の解析
我々は抗ＬＲＰ５抗体がノリン経路及びその他の構成要素に作用するメカニズムを理解するために実験を行った。２４ウェルプレート中で、１．６ｘ１０５細胞／ウェルを、ＴＯＰＦｌａｓｈ、ｐＲＬ−ＣＭＶ、及びｐＣａｎ−ｍｙｃ−ｌｅｆ−１、ＬＲＰ５、ＦＺＤ−４を含むＤＮＡ、及び指定されたリガンド（ノリン、又はＷｎｔ７ｂ、又はＷｎｔ３ａ）をコードするｃＤＮＡの混合物でトランスフェクトした。トランスフェクションの１６時間後に、Ｐ６Ｃ．６１．５１抗体が１０μｇ／ｍｌ加えられた。３７℃で更に１６時間インキュベーション後、細胞を溶解し、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼの発現がプロメガＤｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を使用して測定された。ホタルルシフェラーゼの値は、ウミシイタケの発現に対して正規化した。図８Ａは、ノリンは、リガンド無しに比較してレポーター遺伝子発現を約６倍活性化し、かつＰ６Ｃ．５１．６１を１０μｇ／ｍｌ添加するとノリン単独に比較して約３倍ノリンの活性を増強することを示している。図７Ｂは、Ｗｎｔ７ｂは、抗体が無い場合に約２０倍ルシフェラーゼ発現を活性化すること、及びＰ６Ｃ．５１．６１によるＷｎｔ７ｂを超える２倍の増強を実証する実験を示す。図７Ｃは、Ｗｎｔ３ａの存在は抗体の非存在下でルシフェラーゼ活性を約４０倍活性化するが、この活性はＰ６Ｃ．５１．６１の存在下で著しく拮抗されることを示す。まとめると、これらのデータは、Ｐ６Ｃ．５１．６１はノリン及びＷｎｔ７ｂシグナル伝達を増強するが、Ｗｎｔ３ａシグナル伝達に拮抗することを示している。
【０１７５】
Ｆｚｄ４Ｍ１５７Ｖ及びノリンＣ９５Ｒは家族性滲出性硝子体網膜症スペクトラム障害の患者で起きる変異であり、これらの変異はＦｚｄ４／ＬＲＰ５／ノリン受容体複合体においてクラスタ化の減少につながる（Junge et al. Cell 139:299-311 (2009)）。Jungeらは、ＴＳＰＡＮ１２の過剰発現はＦｚｄ４Ｍ１５７Ｖ及びノリンＣ９５Ｒに関連したクラスタル化の欠陥をレスキューし、野生型レベルにまでシグナル伝達を回復することができることを実証している。我々は、Ｐ６Ｃ．５１．６１が受容体複合体をクラスタ化し、同様にこれらの変異をレスキューすることができるかどうかを試験した。２４ウェルプレート中で、１．６ｘ１０５細胞／ウェルを、ＴＯＰＦｌａｓｈ、ｐＲＬ−ＣＭＶ、ｐＣａｎ−ｍｙｃ−ｌｅｆ−１、ＬＲＰ５、Ｆｚｄ４又はＦＺＤ４Ｍ１５７Ｖ、及びノリン又はノリンＣ９５Ｒを含むＤＮＡの混合物でトランスフェクトした。トランスフェクションの１６時間後に、Ｐ６Ｃ．６１．５１抗体を１０μｇ／ｍｌ、示すように添加した。３７℃で更に１６時間インキュベーション後、細胞を溶解し、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼの発現がプロメガＤｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を使用して測定された。ホタルルシフェラーゼの値は、ウミシイタケの発現に対して正規化した。図８Ａは、ノリンは、野生型Ｆｚｄ４の存在下で、リガンド無しに比較して約６倍レポーター遺伝子発現を活性化することを示している。これらの条件下で、Ｐ６Ｃ．５１．６１の１０μｇ／ｍｌの添加は、ノリン単独に比較して約３倍ノリンの活性を増強する。Ｆｚｄ４Ｍ１５７Ｖが、トランスフェクションでＦｚｄ４と置換される場合、ノリンの活性化は、リガンド無しに比較して約２倍まで減少する。Ｐ６Ｃ．５１．６１の添加は、野生型Ｆｄｚ４を反映するレベルまで不完全なＦｚｄ４Ｍ１５７Ｖシグナル伝達を低減する（点線）。図８Ｂは、ノリンをノリンＣ９５Ｒと置換すると、抗体の欠損下で経路の活性化の著しい減少をもたらすが、Ｐ６Ｃ．５１．６１の存在下では、ノリンＣ９５Ｒの活性は野生型ノリンと関連するレベルまで回復されることを示している（点線）。これらの結果は、Ｐ６Ｃ．５１．６１は、受容体のクラスタ化を減らす受容体成分において変異をレスキューすることを実証している。
【０１７６】
我々は次に、活性に関する抗体価の影響力を試験した。我々は、二価結合は、Ｗｎｔ３ａシグナル伝達の阻害ではなく、ノリンシグナル伝達の抗ＬＲＰ５増強のために必要であることを見いだした。２４ウェルプレートにおいて、１．６ｘ１０５細胞／ウェルが、ＴＯＰＦｌａｓｈ、ｐＲＬ−ＣＭＶ、及びｐＣａｎ−ｍｙｃ−ｌｅｆ−１、ＬＲＰ５、及びＦＺＤ−４を含むＤＮＡ混合物でトランスフェクトされた。トランスフェクション後２４時間で、指定される量の各ＬＲＰ５抗体が添加された。１時間後、１２５ｎｇ／ｍｌの組換えノリン又は２００ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａを添加した。３７℃で更に１６時間インキュベーション後、細胞を溶解し、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼの発現がプロメガＤｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を使用して測定された。ホタルルシフェラーゼの値は、ウミシイタケの発現に対して正規化した。図１０Ａは、ノリンはレポーター遺伝子の発現を、リガンドの無い対照と比較して約８倍活性化することを示している。二価ＬＲＰ５抗体（Ｐ６Ｃ．５１）１０μｇ／ｍｌを添加すると、ノリンの活性を＞２倍増強するが、一価（Ｆａｂ）ＬＲＰ５抗体１０μｇ／ｍｌの添加ではノリンシグナル伝達を増強することができない。図１０Ｂは、二価または一価のどちらかのＬＲＰ５の１０μｇ／ｍｌの存在下で抗ＬＲＰ５抗体はＷｎｔ３ａシグナル伝達に拮抗することを示している。これらのデータは、抗ＬＲＰ５ ＭＡｂの二価の性質は、ノリンのシグナル伝達に必要であることが知られている受容体複合体のクラスタ化に必要とされることを示唆している。
【０１７７】
前述の発明は、理解を明確にするために説明と実施例によって少し詳細に説明してきたが記述及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照することによりその全体が援用される。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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