(57)【要約】  本発明は、生理的に許容されるバッファとそれに溶解された膠質浸透圧剤を含む灌流用バッファのバイアルと、分画分子量が前記膠質浸透圧剤の分子量より少ない透析膜を備えた微小透析プローブと、を含む脳損傷または脳卒中の治療用キットを提供する。
2015534491.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理的に許容されるバッファとそれに溶解された膠質浸透圧剤を含む灌流用バッファのバイアルと、
分画分子量が前記膠質浸透圧剤の分子量より少ない透析膜を備えた微小透析プローブと、
を含むことを特徴とする、脳損傷または脳卒中の治療用キット。
【請求項２】
前記生理的に許容されるバッファが、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）、リンガー溶液、生理食塩水から構成される群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の脳損傷または脳卒中の治療用キット。
【請求項３】
前記膠質浸透圧剤が、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンであることを特徴とする、請求項１に記載の脳損傷または脳卒中の治療用キット。
【請求項４】
透析膜の分画分子量が６７ｋＤａ未満であることを特徴とする、請求項１に記載の脳損傷または脳卒中の治療用キット。
【請求項５】
脳虚血により引き起こされた脳卒中の治療用であることを特徴とする、請求項１に記載の脳損傷または脳卒中の治療用キット。
【請求項６】
さらに血栓溶解剤及び（または）神経保護剤のバイアルを含むことを特徴とする、請求項１に記載の脳損傷または脳卒中の治療用キット。
【請求項７】
前記神経保護剤が、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧF、ＮＴ３、ＮＴ４、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦβ、及びそれらの組み合わせで構成される群より選択されることを特徴とする、請求項６に記載の脳損傷または脳卒中の治療用キット。
【請求項８】
前記ａＣＳＦが、濃度１５０ｍＭのナトリウムイオン、濃度３ｍＭのカリウムイオン、濃度１．４ｍＭのカルシウムイオン、濃度０．８ｍＭのマグネシウムイオン、濃度１ｍＭのリンイオン、濃度１５５ｍＭの塩素イオンを含む。ことを特徴とする、請求項２に記載の脳損傷または脳卒中の治療用キット。
【請求項９】
さらに徐放性担体のバイアルを含むことを特徴とする、請求項６に記載の脳損傷または脳卒中の治療用キット。
【請求項１０】
前記徐放性担体がフィブリン接着剤であることを特徴とする、請求項９に記載の脳損傷または脳卒中の治療用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は脳損傷または脳卒中の治療方法または治療用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血性脳卒中は障害と死亡の主要な原因である。虚血性脳卒中の予防と効果的な治療は最重要課題である。虚血性脳損傷は重度の局所炎症性貯留、フリーラジカル、不可逆性神経細胞死を含む一連の病的反応を起こす。虚血性ペナンブラにおけるアポトーシスカスケードは可逆性である。ペナンブラの神経細胞はほとんどが機能不全となるが、早期に処置されれば回復の可能性がある。脳卒中防止または治療用のよい薬剤または薬物療法はない。
【０００３】
脳卒中は、脳に血流を送る血管の閉塞または血管からの大出血によって引き起こされ（Ｋｒｉｚ，Ｊ．ａｎｄ  Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔ，Ｍ．２００９．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．（Ｂｅｒｌ）．１１７、４９７〜５０９；Ｌａｋｈａｎ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７、９７．Ｒｅｖｉｅｗ）、世界で２番目に最も一般的な死因となっている（Ｄｏｎｎａｎ  ＧＡ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｓｔｒｏｋｅ  Ｌａｎｃｅｔ．１０；３７１（９６２４）：１６１２〜２３．Ｒｅｖｉｅｗ）。脳卒中患者の８０％以上が虚血性脳卒中である（Ｃａｎｄｅｌａｒｉｏ−Ｊａｌｉｌ，Ｅ．２００９．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ  １０、６４４〜６５４）。虚血損傷は、興奮毒性、活性酸素産生、炎症、アポトーシスなどの脳損傷につながる数々の分子現象を引き起こす（Ｌａｋｈａｎ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７、９７．Ｒｅｖｉｅｗ）。虚血性脳卒中後、脳内の２つの主要な損傷領域を残存する血液供給に基づいて定義することができる。損傷の中心部は血液供給が完全になくなり、ほぼ完全なエネルギー不全により壊死する。中心部周囲領域であるペナンブラは従来、閉塞期間中の脳血流が軽度から中等度減少する領域として定義される（Ｌｏ，Ｅ．Ｈ．２００８．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１４、４９７〜５００）。従って、臨床医は脳組織を救済し、脳卒中後の障害を減少するための標的としてペナンブラに介入する（Ｌａｋｈａｎ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７、９７．Ｒｅｖｉｅｗ）。神経保護作用を有する治療薬候補に重点を置いた数々の研究にも関わらず、毒性や生体内での薬効不足のため、臨床試験の全相に合格したものはない（Ｇｒｅｅｎ，Ａ．Ｒ．ａｎｄ  Ｓｈｕａｉｂ，Ａ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ．２００６  Ａｕｇ；１１（１５〜１６）、６８１〜９３．Ｒｅｖｉｅｗ）。特に、脳卒中後の劣化から脳を保護する治療法は著しく不足している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｒｉｚ，Ｊ．ａｎｄ  Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔ，Ｍ．２００９．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．（Ｂｅｒｌ）．１１７、４９７〜５０９
【非特許文献２】Ｌａｋｈａｎ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７、９７．Ｒｅｖｉｅｗ
【非特許文献３】Ｄｏｎｎａｎ  ＧＡ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｓｔｒｏｋｅ  Ｌａｎｃｅｔ．１０；３７１（９６２４）：１６１２〜２３．Ｒｅｖｉｅｗ
【非特許文献４】Ｃａｎｄｅｌａｒｉｏ−Ｊａｌｉｌ，Ｅ．２００９．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ  １０、６４４〜６５４．
【非特許文献５】Ｌｏ，Ｅ．Ｈ．２００８．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１４、４９７〜５００．
【非特許文献６】Ｇｒｅｅｎ，Ａ．Ｒ．ａｎｄ  Ｓｈｕａｉｂ，Ａ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ．２００６  Ａｕｇ；１１（１５〜１６）、６８１〜９３．Ｒｅｖｉｅｗ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、脳損傷または脳卒中の治療方法または治療用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、脳内の関心分析対象物質サンプリングのための従来の診断ツールである脳微小透析が、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ）により誘発された脳虚血ラットモデルにおいて、梗塞体積の減少と運動回復の促進に有効であったという予期せぬ発見に基づいている。一方で、神経系の神経保護及び神経再生因子である酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）も、ＭＣＡｏラットにおいて用量依存的に虚血により誘発される脳梗塞を減少し、機能回復を改善したことも発見された。
【０００７】
従って、一態様において、本発明は治療を必要とする患者において、脳損傷または脳卒中を治療する方法を提供する。前記方法は、患者の微小透析プローブ損傷または損傷中心に埋め込み、生理的に許容されるバッファ中に溶解された膠質浸透圧剤（ｏｎｃｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）で前記プローブを灌流する工程を含み、そのうち、前記微小透析プローブは分画分子量が前記膠質浸透圧剤の分子量よりも少ない透析膜を含む。
【０００８】
別の一態様において、前記方法はさらに、患者に血栓溶解剤及び（または）酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）などの神経保護剤を投与する工程を含むことができる。
【０００９】
さらに別の一態様において、本発明は、生理的に許容されるバッファとそれに溶解された膠質浸透圧剤を含む灌流用バッファのバイアルと、分画分子量が前記膠質浸透圧剤の分子量よりも少ない透析膜を含む微小透析プローブとを含む、脳損傷または脳卒中の治療用キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本発明の前述の概要及び以下の詳細な説明は、添付の図面を参照することでより理解されるであろう。
【図１】図１は図１（Ａ）と図１（Ｂ）よりなり、図１（Ａ）は脳虚血ラットモデルの損傷コアに配置された標準的な微小透析プローブの図である。図１（Ｂ）は虚血再灌流の２、４、６時間後の虚血脳における治療的微小透析プロトコルである。
【図２】図２は図２（Ａ）から図２（Ｃ）よりなり、脳虚血ラットにおける脳梗塞に対する治療的微小透析の時間域と期間の効果を示す図である。図２（Ａ）は虚血性脳組織のＴＴＣ染色（損傷４時間後に開始された微小透析治療ありまたはなし）の代表的画像であり、そのうち、陽性のＴＴＣ染色は生存（ｖｉａｂｌｅ）皮質組織を示す。図２（Ｂ）と図２（Ｃ）はそれぞれ虚血性ラット（各２ラット）の梗塞体積（ｍｍ３）と梗塞の大きさ／脳の大きさ（％）を示す。そのうち、虚血性ラットには損傷２時間後または４時間後に微小透析プローブが埋め込まれ、ａＣＳＦ±ＢＳＡの溶液ありまたはなしで３時間灌流された。ラットは微小透析実験の１日後に犠牲にされた。
【図３】図３は図３（Ａ）から図３（Ｃ）よりなり、損傷２時間後に開始された治療的微小透析が虚血誘発性脳梗塞を効果的に減少したことを示す図である。そのうち、図３（Ａ）は損傷１週間後のＭＣＡｏラットの脳切片を示す代表的なＴＴＣ染色画像であり、そのうち陰性ＴＴＣ染色領域は虚血性脳における梗塞領域を表す。図３（Ｂ）と図３（Ｃ）は再灌流１週間後の虚血性脳組織における梗塞体積（ｍｍ３）と梗塞の大きさ／脳の大きさ（％）をそれぞれ示す。そのうち、梗塞の大きさ／脳の大きさ（％）は、虚血性ラットの脳全部に対する損傷体積の割合を示す。データは平均±ＳＥＭで表された（ａ：Ｐ＜０．００１、Ｓｈａｍ対ａＣＳＦ／ＢＳＡ；ｂ：Ｐ＜０．００１、ａＣＳＦ対ａＣＳＦ−ＢＳＡ、一元配置分散分析とボンフェローニｔ検定による）。
【図４】図４は図４（Ａ）から図４（Ｃ）よりなり、透析液へのグルタミン酸塩と乳酸塩の放出と損傷１週間後のＭＣＡｏラットにおける脳タンパク質発現に対する微小透析の効果を示す図である。図４（Ａ）は損傷２〜５時間後の間のＭＣＡｏラットの微小透析液中グルタミン酸塩レベルを示し、そのうち、微小透析液は３時間にわたり１５分間隔で収集された。図４（Ｂ）は損傷２〜５時間後の間のＭＣＡｏラットの微小透析液に放出された乳酸塩のレベルを示す。図４（Ｃ）は損傷１週間後のラット脳切片のウェスタンブロット分析の結果を示し、そのうち、ＭＡＰ−２（微小管結合タンパク質２の省略形）は神経細胞マーカーであり、ＥＤ１（ＣＤ６８）は活性化された小膠細胞／マクロファージを示し、ＧＡＰ４３（ニューロモジュリンとも呼ばれる）は新たに合成された神経突起を示し、ＧＦＡＰ（グリア細胞繊維性酸性タンパク質の省略形）はアストロサイトのマーカーであり、ＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質の省略形）はミエリン形成オリゴデンドロサイトのマーカーである。＊＊：Ｐ＜０．０１、同間隔のａＣＳＦ対ａＣＳＦ−ＢＳＡ、一元配置分散分析及びボンフェローニｔ検定による。
【図５】図５は図５（Ａ）と図５（Ｂ）よりなり、治療的微小透析による治療がＭＣＡｏラットにおける機能回復を改善したことを示す図である。図５（Ａ）は、脳虚血後１週間生存したラットにおける、５点形式のスコア試験を使用した神経学的重症度試験で評価した神経障害スコアである。図５（Ｂ）はＭＣＡｏラットの右前肢（健側）及び左前肢（脳卒中患側）握力試験により評価された、ＭＣＡｏラットの握力を示す。データは平均±ＳＥＭで示された（ｎ：各群のラットの数；ａ：Ｐ＜０．０５、Ｓｈａｍ対ａＣＳＦ／ＢＳＡ；ｂ：Ｐ＜０．０５、ａＣＳＦ対ａＣＳＦ／ＢＳＡ、一元配置分散分析とボンフェローニｔ検定による）。
【図６】図６は図６（Ａ）から図６（Ｄ）よりなり、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）がＭＣＡｏラットにおいて治療的微小透析用の膠質浸透圧剤としてＢＳＡと同様に有効に作用したことを示す図である。そのうち図６（Ａ）と図６（Ｂ）は、再灌流１週間後の虚血性脳組織における梗塞体積（ｍｍ３）と梗塞体積／脳（％）をそれぞれ示しており、そのうち、梗塞体積／脳（％）は、ＭＣＡｏ＋Ｓｈａｍを１００％として用いた損傷体積の全脳に対する割合を示す。図６（Ｃ）は神経障害スコアである。図６（Ｄ）はＭＣＡｏラットの右前肢（健側）と左前肢（脳卒中患側）の握力試験により評価された握力を示す。データは平均±ＳＥＭで示された（ｎ：各群のラットの数；ａ：Ｐ＜０．０５、Ｓｈａｍ対ａＣＳＦ−ＢＳＡ；ｂ：Ｐ＜０．０５、ａＣＳＦ対ａＣＳＦ−ＢＳＡ、一元配置分散分析とボンフェローニｔ検定による）。
【図７】図７は図７（Ａ）から図７（Ｈ）よりなり、虚血境界領域（中間梗塞領域；ｍｉｄ−ｉｎｆａｒｃｔ  ｒｅｇｉｏｎ）を示した観察皮質領域の画像である。ＮｅｕＮ免疫反応（ＩＲ）細胞は神経細胞を示し、ＥＤ−１は活性化された小膠細胞／マクロファージのマーカーである。図７（Ａ）-（Ｄ）虚血中心領域周囲の抗ＮｅｕＮで免疫染色された脳切片を示す図である。図７（Ａ）はＭＣＡｏ＋Ｓｈａｍ群からの脳切片である。図７（Ｂ）はＭＣＡｏ＋ａＣＳＦ群からの脳切片である。図７（Ｃ）はＭＣＡｏ＋ａＣＳＦ−ＢＳＡ群からの脳切片である。図７（Ｄ）はＭＣＡｏ＋ａＣＳＦ−ＨＳＡ群からの脳切片である。図７（Ｅ）から（Ｈ）は抗ＥＤ１で免疫染色された脳切片の図である。図７（Ｅ）はＭＣＡｏ＋Ｓｈａｍ群からの脳切片である。図７（Ｆ）はＭＣＡｏ＋ａＣＳＦ群からの脳切片である。図７（Ｇ）はＭＣＡｏ＋ａＣＳＦ−ＢＳＡ群からの脳切片である。図７（Ｈ）はＭＣＡｏ＋ａＣＳＦ−ＨＳＡ群からの脳切片である。
【図８】図８は図８（Ａ）から図８（Ｄ）よりなり、損傷６時間後の治療的微小透析インターベンションの適用が虚血誘発性脳梗塞を効果的に減少したことを示す図である。図８（Ａ）は再灌流の１週間後に虚血性脳組織で評価された梗塞体積を示す。図８（Ｂ）はＭＣＡｏ＋Ｓｈａｍを１００％として用いた損傷体積の全脳に対する割合を表す梗塞体積／脳の大きさ（％）を示す。図８（Ｃ）は神経障害スコアを示す。図８（Ｄ）は虚血性ラットにおける握力を示す図である。握力はＭＣＡｏラットの右前肢（健側）と左前肢（脳卒中患側）の握力試験により評価される。データは≧１１ラット／群からの平均±ＳＥＭで示された。＊＊：Ｐ＜０．０１、ＭＣＡｏラットと比較;ａ：Ｐ＜０．０５、ＭＣＡｏ＋ａＣＳＦと比較、一元配置分散分析及びボンフェローニｔ検定による。
【図９】図９は図９（Ａ）から図９（Ｄ）よりなり、徐放ａＦＧＦの局所投与が虚血誘発性脳損傷を保護したことを示す図である。図９（Ａ）は虚血性脳組織のＴＴＣ染色の代表的画像である（ＭＣＡｏラットにおいてＭＣＡ閉塞の１時間後と再灌流の１週間後に生体ＴＴＣ染色により評価された梗塞体積）。図９（Ｂ）と図９（Ｃ）は再灌流の１週間後のラット虚血性脳組織の梗塞体積（ｍｍ３）と梗塞体積／脳（％）をそれぞれ示す（接着剤のみ、またはａＦＧＦと混合された接着剤（１または２μｇ）がＭＣＡ閉塞の１時間後にすぐにラットの皮質表面に適用された。梗塞体積／脳（％）はＭＣＡｏ＋接着剤を１００％として用いた損傷体積の全脳に対する割合を示す）。図９（Ｄ）はＭＣＡｏラットにおける神経障害スコアを示す（神経障害の度合いが５点形式のスコア試験を使用して評価された）。データはｎラットからの平均±ＳＥＭとして表された。＊、＊＊：それぞれＰ＜０．０５、０．０１、ＭＣＡｏ＋ａＦＧＦ対ＭＣＡｏ＋接着剤、一元配置分散分析及びボンフェローニｔ検定による。
【図１０】図１０は図１０（Ａ）から図１０（Ｉ）よりなり、虚血境界領域（中間梗塞領域；ｍｉｄ−ｉｎｆａｒｃｔ  ｒｅｇｉｏｎ）を示した観察皮質領域の画像である。図１０（Ａ）、（Ｄ）、（Ｇ）はＭＣＡｏ＋接着剤の群である。図１０（Ｂ）、（Ｅ）、（Ｈ）はＭＣＡｏ＋接着剤ａＦＧＦ１μｇの群である。図１０（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）はＭＣＡｏ＋接着剤−ａＦＧＦ２μｇの群である。そのうち、図１０（Ａ）から図１０（Ｃ）は虚血中心領域周囲の抗ＮｅｕＮで免疫染色された脳切片を示す図である。図１０（Ｄ）から図１０（Ｆ）はダブルコルチンに対して染色された脳切片の図である。図１０（Ｇ）から図１０（Ｉ）はＥＤ１に対して染色された脳切片の図である。
【図１１】図１１は図１１（Ａ）から図１１（Ｈ）よりなり、損傷１週間後のＭＣＡｏラットにおいて、徐放性ａＦＧＦの局所投与が海馬細胞損失から保護したことを示す図である。図１１（Ａ）から図１１（Ｆ）は観察された虚血側の海馬領域を示す図であり、そのうち図１１（Ａ）と図１１（Ｄ）は、それぞれＮｅｕＮとダブルコルチンに対して染色されたＭＣＡｏ＋接着剤のみの群の画像である。図１１（Ｂ）と図１１（Ｅ）は、それぞれＮｅｕＮとダブルコルチンに対して染色されたＭＣＡｏ＋接着剤−ａＦＧＦ  １μｇの群の画像である。図１１（Ｃ）と図１１（Ｆ）は、それぞれＮｅｕＮとダブルコルチンに対して染色されたＭＣＡｏ＋接着剤−ａＦＧＦ  ２μｇの群の画像である。図１１（Ｇ）は、ａＦＧＦ  ２μｇで治療された右海馬中のＮｅｕＮ−ＩＲ細胞を示す。図１１（Ｈ）はａＦＧＦ  ２μｇで治療された右海馬中のダブルコルチン−ＩＲ細胞を示す。接着剤のみ、または接着剤とａＦＧＦ（１または２μｇ）の混合がＭＣＡ閉塞の１時間後ラットの皮質表面にすぐに（０時間）適用された。免疫組織化学染色が虚血中心領域近くの２ｍｍの脳切片１つで実施された。ＮｅｕＮ−免疫反応（ＩＲ）細胞は神経細胞を示す。ダブルコルチン−ＩＲ細胞は神経前駆細胞を示す。
【図１２】図１２は図１２（Ａ）から図１２（Ｄ）よりなり、皮質表面への徐放性ａＦＧＦの遅延投与が虚血誘発性脳梗塞を減少し、機能回復を改善したことを示す図である。図１２（Ａ）は虚血性脳組織のＴＴＣ染色の代表画像である。図１２（Ｂ）と図１２（Ｃ）は、それぞれ再灌流の１週間後の生体ＴＴＣ染色による虚血性脳組織の梗塞体積（ｍｍ３）と梗塞体積／脳（％）を示す（梗塞体積／脳（％）はＭＣＡｏ＋接着剤を１００％として用いた全脳に対する損傷体積の割合を示す）。図１２（Ｄ）は治療後のＭＣＡｏラットにおける神経障害スコアである。神経障害の度合いが５点形式のスコア試験を使用して評価された。データは平均±ＳＥＭとしてとして表された。＊、＊＊：それぞれＰ＜０．０５、０．０１、一元配置分散分析及びボンフェローニｔ検定によりＭＣＡｏ＋接着剤のみと比較。
【図１３】図１３は図１３（Ａ）から図１３（Ｆ）よりなり、損傷の１週間後のＭＣＡｏラットにおいて徐放ａＦＧＦの遅延局所投与が皮質細胞損失から保護したことを示す図である。図１３（Ａ）と図１３（Ｄ）は、ＭＣＡｏ＋接着剤の群の免疫組織化学染色画像である。図１３（Ｂ）と図１３（Ｅ）は、ＭＣＡｏ＋接着剤−ａＦＧＦ２μｇの群の免疫組織化学染色画像である。図１３（Ｃ）と図１３（Ｆ）：ＭＣＡｏ＋接着剤−ａＦＧＦ４μｇ。図１３（Ａ）から図１３（Ｃ）：抗ＮｅｕＮで免疫染色された虚血中心領域周囲の脳切片。図１３（Ｄ）から図１３（Ｆ）：ＥＤ１に対して染色された脳切片。ＮｅｕＮ−免疫反応（ＩＲ）細胞は神経細胞を示す。ＥＤ−１は活性化された小膠細胞／マクロファージのマーカーである。
【図１４】図１４は図１４（Ａ）から図１４（Ｄ）よりなり、ＭＣＡｏラットにおける脳虚血後の治療的微小透析及び（または）ａＦＧＦ徐放放出治療の保護効果を示す図である。図１４（Ａ）と図１４（Ｂ）は、それぞれ再灌流の１週間後の生体ＴＴＣ染色による虚血性脳組織の梗塞体積（ｍｍ３）と梗塞体積／脳（％）を示す（梗塞体積／脳（％）はＭＣＡｏを１００％として用いた全脳に対する損傷体積の割合を示す）。図１４（Ｃ）は治療後のＭＣＡｏラットにおける神経障害スコアを示す。神経障害の度合いが５点形式のスコア試験を使用して評価された。図１４（Ｄ）は虚血性ラットにおける握力を示す図である。握力はＭＣＡｏラットの右前肢（健側）と左前肢（脳卒中患側）の握力試験により評価される。データは平均±ＳＥＭとしてとして表された。＊、＊＊：Ｐ＜０．０５、０．０１、ＭＣＡｏと比較；ａ、ｂ：Ｐ＜０．０５、０．０１、ＭＣＡｏ＋ａＦＧＦと比較、それぞれ一元配置分散分析とボンフェローニｔ検定による。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
例外が特筆されない限り、ここで使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術における通常の技能で一般的に理解されているものと同じ意味を持つ。
【００１２】
本明細書で使用されている「１つ」、「ある」、「その」などの単数形は、文脈上例外が明記されていない限り、複数形の意味を含む。したがって、例えば、「（１つの）試料」には複数のそのような試料及び当業者の知る等価物が含まれる。
【００１３】
本発明によれば、膠質浸透圧剤での微小透析インターベンションの適用が、脳損傷または脳卒中の治療において有効であることが予期せず発見された。
【００１４】
したがって、一態様において、本発明は、微小透析プローブを患者の損傷または損傷コアに埋め込む工程と、生理的に許容されるバッファに溶解された膠質浸透圧剤でプローブを灌流する工程を含み、そのうち、前記微小透析プローブが、分画分子量が前記膠質浸透圧剤の分子量より少ない透析膜を含むことを特徴とする、必要とする患者対する脳損傷または脳卒中の治療方法を提供する。
【００１５】
虚血性脳卒中からの損傷は、脳のある領域への栄養血流が中断された後すぐに発生する複雑な一連の細胞代謝性事象の結果である。期間、重症度、局所脳虚血の場所によって、脳機能の度合いが決まり、したがって脳卒中の重症度が決まる。本明細書で使用される用語「損傷（ｉｎｊｕｒｙ）または損傷コア（ｉｎｓｕｌｔ ｃｏｒｅ）」は、重症の虚血（血流が約１０％〜２５％を下回る）領域であるコア虚血領域を指す。コア領域において酸素とグルコースが失われることでエネルギー貯蔵が急速に減少する。重症の虚血は、神経細胞及び重症の虚血領域内の支持細胞成分（グリア細胞）の壊死につながることがある。
【００１６】
透析プローブは、ヒトや動物の体内に挿入し、血流から廃物を濾過して除去するための管状透析膜を備えたプローブである。血液透析と腹膜透析が２つの主な種類である。透析は毒物や過剰な薬物の除去に用い、重篤な電解質及び酸ベースの平衡障害を修正したり、慢性末期腎不全において尿素、尿酸、クレアチニンを除去したりすることができる。
【００１７】
一般に患者の組織内に挿入するために用いられる微小透析プローブは、半透膜から成る微小な管である。半透膜には分子が通過できる微小な「穴」が複数ある。微小透析は溶液（「透析液」）をゆっくりポンプして微小透析プローブを通過させることで作用する。透析液がプローブからポンプされるのに伴い、組織内の分子が透析液中に拡散される。その後、前記透析液が収集され、細胞外液中の分子とその濃度を同定するために分析される。前記プローブは通常周辺組織液の（イオン）組成に緊密に類似した溶解液（灌流液）で連続的に約０．１〜１０μＬ／分の低流速で灌流される。市販されている微小透析プローブの分画分子量は約６〜１００ｋＤａの広範囲を網羅している。
【００１８】
膠質浸透圧は血管の血漿（血液／液）中タンパク質により発揮される浸透圧の一形態で、通常は循環系内に水を引き込む傾向がある。本発明によれば、前記膠質浸透圧剤は浸透作用のある任意の非毒性物質とすることができる。例えば、前記膠質浸透圧剤には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、血漿タンパクの混合物、テトラスターチ、及び高分子量のヒドロキシエチルデンプンまたは低分子量のヒドロキシエチルデンプンなどの水溶性多糖類が含まれるがこれらに限らない。本発明の一実施態様において、前記膠質浸透圧剤はウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンである。
【００１９】
本発明によれば、前記透析膜は分画分子量が６７ｋＤａ（ＢＳＡまたはＨＳＡの分子量は約６７ｋＤａである）未満の範囲であり、好ましくは６ｋＤａ〜６０ｋＤａの範囲である。
【００２０】
本発明によれば、前記生理的に許容されるバッファは体液に対する等張液であり、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）、リンガー溶液、生理食塩水が含まれるがこれらに限らない。
【００２１】
本明細書で用いられる用語「人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）」は、脳脊髄液の電解質濃度に非常に近い溶液を指す。一般に、ａＣＳＦは濃度１４０〜１９０ｍＭのナトリウムイオン、濃度２．５〜４．５ｍＭのカリウムイオン、濃度１〜１．５ｍＭのカルシウムイオン、濃度０.５〜１．５ｍＭのマグネシウムイオン、濃度０．５〜１．５ｍＭのリンイオン、濃度１００〜２００ｍＭの塩素イオンを含む。一実施例において、前記ａＣＳＦは濃度１５０ｍＭのナトリウムイオン、濃度３ｍＭのカリウムイオン、濃度１．４ｍＭのカルシウムイオン、濃度０．８ｍＭのマグネシウムイオン、濃度１ｍＭのリンイオン、濃度１５５ｍＭの塩素イオンを含む。
【００２２】
リンガー溶液は一般に、濃度１４７ｍＭのナトリウムイオン、濃度１５６ｍＭの塩素イオン、濃度４ｍＭのカリウムイオン、濃度２.２ｍＭのカルシウムイオンを含む。
【００２３】
本発明によれば、ラットに対する灌流は０.１〜１０μＬ／分の速度で実施することができる。本発明の一実施例において、ラットに対する前記灌流速度は５μＬ／分である。５μＬ／分のラットに対する灌流速度は７．２ｍｌ／日に相当する。本発明によれば、ヒトに対する灌流速度は２７５〜３５０μＬ／分の速度で実施することができる。
【００２４】
本発明において、前記方法はさらに、成長因子などの神経保護剤、及び（または）組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡまたはＰＬＡＴと省略される）などの任意の既知の血栓溶解剤の投与を含むことができる。
【００２５】
前記成長因子は、グリア細胞由来神経栄養因子、形質転換増殖因子β、線維芽細胞増殖因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、血管内皮増殖因子、神経栄養因子を含む群より選択することができる。本発明によれば、前記成長因子は酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、ＰＡＣＡＰ、及びそれらの組み合わせから構成される群より選択することができる。好ましくは、前記成長因子は線維芽細胞増殖因子である。
【００２６】
また、本発明ではａＦＧＦの直接投与が虚血性脳の梗塞体積を大幅に減少した（図９（Ａ）〜図９（Ｄ）〜図１４（Ａ）から図１４（Ｄ））ことも確認された。したがって、本発明は、（a）微小透析プローブを患者の損傷または損傷コアに埋め込み、生理的に許容されるバッファに溶解された膠質浸透圧剤で前記プローブを灌流し、そのうち前記微小透析プローブが、分画分子量が前記膠質浸透圧剤の分子量より少ない透析膜を備えた工程と、（b）治療有効量の神経保護剤を局所的に投与する工程を含む、必要とする患者において脳損傷または脳卒中を治療する方法を提供する。
【００２７】
本発明によれば、前記工程（a）は前記工程（b）と同時、またはその前あるいは後に実施することができる。
【００２８】
一実施態様において、前記ａＦＧＦは損傷領域に局部的に適用される前にフィブリン接着剤などの徐放性担体と混合される。
【００２９】
本明細書で用いられる用語「ａＦＧＦ」は、ネイティブヒトａＦＧＦまたはネイティブヒトａＦＧＦからの任意の改変ペプチドを指す。前記改変ペプチドはネイティブヒトａＦＧＦにおける1以上の欠失、挿入、置換、またはそれらの組み合わせなどにより取得される。本発明の一実施態様において、改変ヒトａＦＧＦは、ネイティブヒトａＦＧＦのＮ末端から最初の２０個のアミノ酸を欠失し、続いて短化されたネイティブａＦＧＦのＮ末端にアラニンを付加したペプチドである。例えば、ａＦＧＦは米国特許第１２／４８２０４１号に開示されたペプチドとすることができ、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。
【００３０】
本明細書で用いられる用語「治療有効量」とは、外傷性脳損傷または脳卒中の防止または治療に有効な量を指し、この量は年齢、体重、症状、治療効果、投与経路、治療時間などを含む、投与モードと治療対象の条件によって異なる。
【００３１】
別の一側面において、本発明は生理的に許容されるバッファとそれに溶解された膠質浸透圧剤を含む灌流用バッファのバイアルと、分画分子量が前記膠質浸透圧剤の分子量より少ない透析膜を備えた微小透析プローブと、を含む脳損傷または脳卒中の治療用キットを提供する。
【００３２】
本発明によれば、前記膠質浸透圧剤は浸透作用のある任意の非毒性物質とすることができる。例えば、前記膠質浸透圧剤には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、血漿タンパクの混合物、テトラスターチ、及び高分子量のヒドロキシエチルデンプンまたは低分子量のヒドロキシエチルデンプンなどの水溶性多糖類が含まれるがこれらに限らない。本発明の一実施態様において、前記膠質浸透圧剤はウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンである。
【００３３】
本発明によれば、前記透析膜は分画分子量が６７ｋＤａ（ＢＳＡまたはＨＳＡの分子量は約６７ｋＤａである）未満の範囲であり、好ましくは６ｋＤａ〜６０ｋＤａの範囲である。
【００３４】
本発明によれば、前記生理的に許容されるバッファは体液に対する等張液であり、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）、リンガー溶液、生理食塩水が含まれるがこれらに限らない。
【００３５】
一般に、ａＣＳＦは濃度１４０〜１９０ｍＭのナトリウムイオン、濃度２．５〜４．５ｍＭのカリウムイオン、濃度１〜１．５ｍＭのカルシウムイオン、濃度０.５〜１．５ｍＭのマグネシウムイオン、濃度０．５〜１．５ｍＭのリンイオン、濃度１００〜２００ｍＭの塩素イオンを含む。一実施例において、前記ａＣＳＦは濃度１５０ｍＭのナトリウムイオン、濃度３ｍＭのカリウムイオン、濃度１．４ｍＭのカルシウムイオン、濃度０．８ｍＭのマグネシウムイオン、濃度１ｍＭのリンイオン、濃度１５５ｍＭの塩素イオンを含む。
【００３６】
リンガー溶液は一般に、濃度１４７ｍＭのナトリウムイオン、濃度１５６ｍＭの塩素イオン、濃度４ｍＭのカリウムイオン、濃度２.２ｍＭのカルシウムイオンを含む。
【００３７】
以下、本発明について実施例を挙げて詳細に説明するが、それらは本発明を限定するためではなく、例示を目的として示される。
【００３８】
本発明の一部実施態様において、前記キットはさらに、成長因子などの神経保護剤、及び（または）組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡまたはＰＬＡＴと省略される）などの任意の既知の血栓溶解剤のバイアルを含むことができる。好ましくは、前記キットはさらに徐放性担体のバイアルを含む。
【００３９】
前記成長因子は、グリア細胞由来神経栄養因子、形質転換増殖因子β、線維芽細胞増殖因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、血管内皮増殖因子、神経栄養因子を含む群より選択することができる。本発明によれば、前記成長因子は酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、ＰＡＣＡＰ、及びそれらの組み合わせから構成される群より選択することができる。好ましくは、前記成長因子は線維芽細胞増殖因子である。
【００４０】
一実施態様において、前記徐放性担体はフィブリン接着剤である。
【実施例１】
【００４１】
Ｉ.材料及び方法
【００４２】
１、材料
試薬は、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ；Ｈａｒｖａｒｄ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ５９−７３１６）、微小透析プローブ（ＣＭＡ  １２  ＭＤ  Ｅｌｉｔｅプローブ４ｍｍ、米国マサチューセッツ州）、グルタミン酸塩アッセイキット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｋ６２９−１００）、乳酸塩アッセイキット（Ｅｔｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ.）、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ、Ｓｉｇｍａ）、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ）、フィブリン接着剤（Ｂｅｒｉｐｌａｓｔ  Ｐ、ドイツ）を含め、市販されていた。本発明で使用するａＦＧＦはネイティブヒトａＦＧＦからの改変ペプチドであり、米国特許第１２／４８２０４１号で説明されている。
【００４３】
２、外科的手順の実施
体重２５０〜３５０ｇのオス成熟ロングエバンス（ＬＥ）ラット（台湾台北市のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒで飼育）が使用された。ラットは抱水クロラールで麻酔された（０．４ｇ／ｋｇ、腹腔内注射）。局所的虚血性梗塞が先に説明されたように右大脳皮質の中大脳動脈（ＭＣＡ）の領域に誘発された（Ｃｈｅｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １０３３、２８〜３３；Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．４６、３４６〜３５３）。右側ＭＣＡが１０−０モノフィラメントナイロン縫合糸で結紮された。両総頸動脈が１時間にわたり微細動脈瘤クリップで閉塞された。流れの再灌流が傷口を閉じる前に手術中目視で確認された。
【００４４】
３、徐放性担体キャストの調製とラット皮質表面への適用
徐放性担体とＣＮＳ組織中の接着剤、フィブリン接着剤（Ｂｅｒｉｐｌａｓｔ  Ｐ、ドイツ）が使用前に新たに調製された。簡単に説明すると、フィブリノーゲンのストック溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）とアプロチニン液（２００ＫＩＵ／ｍｌ）が調製され、ＨＢＳＳ中に溶解された。組み換えａＦＧＦ（１μｇ、２μｇまたは４μｇ）またはＨＢＳＳがフィブリノーゲン／アプロチニン（８０／２０；ｖ／ｖ）溶液２０μｌに添加された。その後、得られた溶液が皮質領域に局所的に適用され、さらに塩化カルシウム（２０μl；８ｍＭ）がすぐに適用された。ａＦＧＦを含む徐放性キャストが形成された。虚血−再灌流後すぐに（直後）または３時間後（遅延）、フィブリン接着剤のみ、またはフィブリン混合ａＦＧＦ（１〜４μｇ／ラット）が局所的にＭＣＡｏラットに適用された。動物は皮膚の傷を閉じて麻酔から回復された。実験ラットの神経機能と把持タスクを含む運動評価が損傷１日、３日、５日、７日後または犠牲前に実施された。虚血と治療の１週間後、形態学的分析のためラットは犠牲にされた。
【００４５】
４、ラット脳内への微小透析プローブの外科的移植
微小透析実験に使用するラットとして、成熟したオスのＬＥラットがイソフルラン麻酔下で定位固定装置上に配置された。虚血−再灌流の２、４または６時間後、２０ｋＤａカットオフ膜を備えた微小透析プローブが、ラット脳アトラスに従い、ブレグマからＡＰ  ０ｍｍ、Ｌ＋５．５ｍｍ、ＤＶ＋４．０ｍｍ（硬膜表面下）の座標で、虚血コアに挿入された。ａＣＳＦで平衡化済みの前記プローブは、シリンジポンプ（ＣＭＡ；マサチューセッツ州ノース・チェルムズフォード）に接続された１ｍＬのガラス製マイクロシリンジ（ＣＭＡ）を使用して、ａＣＳＦまたはａＣＳＦとウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの膠質浸透圧剤で連続的に灌流された。ａＣＳＦの終イオン濃度（ｍＭ）は、Ｎａ  １５０；Ｋ  ３．０；Ｃａ  １．４；Ｍｇ  ０．８；Ｐ  １．０；Ｃｌ  １５５であった。灌流速度は５μＬ／分に設定された。微小透析プローブからの流出が合計３時間にわたり１５分間隔で収集された。動物は微小透析と皮膚の傷を閉じたあと麻酔から回復された。虚血の２４時間または１週間後、動物は梗塞体積分析と免疫組織化学染色のために犠牲にされた。実験ラットの神経機能と把持タスクを含む運動評価が損傷１日、３日、５日、７日後または犠牲前に実施された。
【００４６】
５、梗塞体積の分析
ラットは指定の期間後に犠牲にされた。ラットの脳が速やかに除去され、脳切片器（Ｚｉｖｉｃ  ｍｉｌｌｅｒ）に配置された。脳は２ｍｍの冠状切片にスライスされた。その後、作製されたスライスは２％２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（省略してＴＴＣ、Ｓｉｇｍａ）で３０分間染色され、１０％緩衝ホルマリン液中でオーバーナイト固定された。生存（ｖｉａｂｌｅ）組織を示すＴＴＣ染色を使用して、成功した脳卒中と治療が検証された。ＴＴＣ染色後、虚血領域の色は白く、非虚血領域は赤くなった。梗塞体積（陰性ＴＴＣ染色領域）が画像システムソフトウェア（Ｃｈｉａｍｕｌｅｒａ，Ｃ  ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ６０６、２５１〜２５８；Ｃｏｌｅ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．１９９０．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  ８０、１５２〜１５５）を使用して分析された。特に、各脳切片は、両側生存組織（赤色部分）と死亡組織（白色部分）のデルタの形式（ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｄｅｌｔａ  ｏｆ  ｂｉｌａｔｅｒａｌ  ｖｉａｂｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ（ｒｅｄ  ｐｏｒｔｉｏｎ）ｗｉｔｈ  ｄｙｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ（ｗｈｉｔｅ  ｐｏｒｔｉｏｎ））で計算された。
【００４７】
６、握力試験
脳卒中の影響を受けた脳のダメージに起因するラット前肢の対側（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）運動障害が握力試験を使用して評価された（Ｃｈｅｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １０３３、２８〜３３；Ｂｅｒｔｅｌｌｉ  ＪＡ  ａｎｄ  Ｍｉｒａ  ＪＣ．１９９５．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５８、１５１〜１５５）。ラットにおける把持タスクが損傷の１、３、５、７日後または犠牲にされる前に市販のラット用握力検査計（Ｇｒｉｐ−ｓｔｒｅｎｇｔｈ−ｍｅｔｅｒ  ３０３５００、ＴＳＥ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐ）を使用して試験された。簡単に説明すると、ラットは三角バー前のＰｅｒｓｐｅｘプレート上に配置された。ラットの尾を引っ張ることで、不随意の後ろへの移動を止めるために、ＬＥラットが何か（この場合は三角バー）に本能的に捕まろうとするようにさせた。引っ張る力がラットの握力より強まると、ラットは三角バーから前肢を離すが、握力検査計のピーク前置増幅器がピーク引張り力を示し、これが試験肢の握力を表すものとして用いられた。精度を確約するため、各握力試験でラット１匹あたり１０回以上試験を行い、各ケースで３つの最高把持力が記録された。
【００４８】
７、神経障害スコア（ＮＳＤ）試験
神経障害スコア試験は全体的な観察による運動機能の評価である（Ｍｅｎｚｉｅｓ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ３１、１００〜１０６；Ｈｕａｎｇ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｓｅｐ  ２３；２６５（５１８０）、１８８３〜５）。各試験が０〜５の個々の値で採点される。値が高いほど運動障害が重度であり、低いほど軽度であることを示す。ＮＤＳの５点評価が使用された。０、標準の運動機能または明らかな障害がない；１、対側（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）前肢屈曲；２、尾が引っ張られたときの対側前肢握力低下；３、全方向の不随意運動、尾を引っ張ると対側に回転；４、不随意の対側回転；５、不随意の運動なしまたは死亡、の５つのカテゴリで採点された。ＭＣＡｏ手順前とＭＣＡｏ手術の１、３、５、７日後に各ラットに値が付与された。
【００４９】
８、虚血性損傷コアにおける治療的微小透析の確立
微小透析プローブは灌流と試料収集用の導入管と排出管をそれぞれ備えた管状透析膜を含む。コアでの一般的なプローブ配置を図１（Ａ）に示す。脳微小透析は拡散により脳の細胞外空間と相互作用する移植されたプローブを使用する。これら分子を含む灌流液を収集して分析に用いることができる。微小透析実験中、膜の内部が液体で灌流され、膜の外側が虚血中心領域に直接接触される。長さ４ｍｍの微小透析プローブ（型番ＩＢＲ−４；ＢＡＳ）を２０ｋＤａ分画分子量ＰＡＥＳ膜で使用した。前記プローブは灌流液で数分間予め平衡化され（流速は２μＬ／分に設定）、使用前に膜内部の漏れや気泡をチェックした。灌流液の流速は治療的微小透析中５μＬ／分に設定された。微小透析プローブの移植前に、ラットはイソフルランで麻酔され、定位固定装置上に配置された。頭蓋骨右側に穿頭孔がブレグマから後部０ｍｍ、横５．５ｍｍの座標で形成された。灌流用バッファ（または治療薬追加）で平衡化済みの微小透析プローブが穿頭孔から虚血コアに移植された（硬膜表面４ｍｍ下）。この標的の脳領域、虚血コアは、ラット脳アトラス（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ＢＪＫ  ａｎｄ  Ｇ．Ｐａｘｉｎｏｓ．１９９７．Ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  ｉｎ  ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ．ＩＳＢＮ０１２２６６０７０６）と、発明者の脳虚血の研究における経験を用いて決定された。その後輸液ポンプが灌流バッファ（または治療薬追加）に連続して３時間または６時間にわたり流速５μＬ／分で駆動された。虚血性または正常ラットはプローブ移植後と３時間または６時間の間の微小透析後も生存した。微小透析液が連続して１５分ごとに収集され、生化学アッセイ用に保存された。
【００５０】
ＩＩ．結果
【００５１】
１、治療的微小透析が虚血誘発性脳梗塞を効果的に減少した
微小透析は、脳の局部領域の神経化学的環境をサンプリングする手法であり、これが脳虚血損傷後のラットの脳に用いられた。図１（Ｂ）に示すように灌流用バッファで平衡化された微小透析プローブがコア領域の梗塞に移植された。まず、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）を脳微小透析用灌流用バッファとして脳微小透析の時間域が評価された。人工ＣＳＦはＣＳＦの電解質濃度に非常に近いため、脳細胞間液からのサンプリング時に一般的に使用される。血流を通じた高浸透圧療法が重症の頭部損傷患者向けの治療インターベンションで適用されているため、本発明でも脳虚血向け微小透析バッファに添加された膠質浸透圧剤、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の効果が調べられた。ＬＥラットは、第（１）群と第（２）群：再灌流２時間後と４時間後の虚血性ラットとプローブ移植（微小透析なし）；第（３）群と第（４）群：再灌流２時間後と４時間後の虚血性ラットとａＣＳＦでの微小透析灌流；第（５）群と第（６）群：再灌流２時間後と４時間後の虚血性ラットとaＣＳＦと１０％ＢＳＡでの微小透析灌流の６群に分けられた。図１（Ｂ）にグループ分けと脳虚血後の治療時間域を示す。３時間の脳微小透析またはプローブ移植後、実験ラットの切開が閉じられ、縫合された。各ラットはケージに戻され、２４時間生存可能とされた。その後ラットは高速断頭により犠牲にされ、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）染色を使用した梗塞体積分析のため脳が除去された。図２に示すように、ａＣＳＦでの微小透析灌流は、ｓｈａｍ虚血性ラットとの比較で虚血性ラットにおいて脳梗塞を若干減少した、または影響がなかった。興味深いことに、梗塞（ＴＴＣ陰性染色）の体積は、損傷の２時間または４時間後にＢＳＡ＋ａＣＳＦでの微小透析で治療された虚血性ラットにおいて効果的に減少された。これらの結果は損傷２時間後の微小透析治療後１週間生存可能とされた虚血性ラットにおいても観察された。図３（Ｃ）に示すように、ＳｈａｍＭＣＡｏラットまたは損傷２時間後に開始されたａＣＳＦでの微小透析治療ＭＣＡｏラットはそれぞれ２９５±４７ｍｍ３または２５０±５１ｍｍ３の体積の脳梗塞を産生した。ａＣＳＦ−ＢＳＡでの微小透析は、ｓｈａｍまたはａＣＳＦでの微小透析と比較して、ＭＣＡｏラットにおいて脳梗塞の体積を有意に減少した（１０９±７ｍｍ３）（Ｐ＜０．０１）。同時に、ＭＣＡｏラットにおける梗塞体積／全脳サイズの割合もａＣＳＦ−ＢＳＡ微小透析治療によって有意に減少した（Ｐ＜０．０１、図３（Ｂ））。さらに、ａＣＳＦ治療ＭＣＡｏラットとａＣＳＦ−ＢＳＡ治療ＭＣＡｏラット両方の微小透析液における興奮性アミノ酸であるグルタミン酸塩と乳酸塩のレベルも分析した。ａＣＳＦ−ＢＳＡ治療ＭＣＡｏラットにおける少ない脳損傷と一貫して、図４（Ａ）に示すように、ａＣＳＦ−ＢＳＡ治療ラットの微小透析液中で有意に多くのグルタミン酸塩が回収（または除去）された（Ｐ＜０．０５）。
【００５２】
エネルギー代謝の状態も微小透析液中の乳酸塩レベルによって判定された。３時間の微小透析中の累積的乳酸塩放出はａＣＳＦ−ＢＳＡ治療ＭＣＡｏラットにおいて有意に減少し（Ｐ＜０．０５）、エネルギー障害の度合いが少ないことが示唆された（図４（Ｂ））。さらに、実験ラットにおける虚血中心領域を含む虚血性脳切片（同側サイト）において損傷の１週間後にウェスタンブロット分析を実施した。図４（Ｃ）に示すように、活性化された小膠細胞／マクロファージのマーカーであるＥＤ−１のレベルが脳虚血損傷後増加した。ａＣＳＦ−ＢＳＡでの微小透析がＥＤ−１レベルの虚血誘発的増加を緩和する。神経細胞マーカーであるＭＡＰ−２と、新たに形成される神経突起のマーカーであるＧＡＰ４３（ニューロモジュリン）のレベルは、Ｓｈａｍ群またはａＣＳＦ治療群と比較してａＣＳＦ−ＢＳＡ治療群でより保たれた。一貫して、生存シグナルであるリン酸化ＡＫＴ（ｐ−ＡＫＴ）のレベルは、Ｓｈａｍ群またはａＣＳＦ治療群と比較してａＣＳＦ−ＢＳＡ群でより高かった。しかし、アストロサイトマーカーであるグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）と、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のレベルは治療間で類似した。
【００５３】
２、治療的微小透析がＭＣＡｏラットにおける運動機能障害を減少した
治療的微小透析でのＭＣＡｏラット治療後の効果的な梗塞の大きさの縮小、乳酸塩放出の減少、より多くのグルタミン酸塩の除去がこの研究で実証された。しかし、脳卒中後の主な障害は、患側大脳半球から対側（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）脊椎運動ニューロンへの神経細胞信号の中断（つまり、皮質脊髄路の障害）による片側不全まひである（Ｆｒｏｍｍ  Ｃ  ａｎｄ  Ｅｖａｒｔｓ  ＥＶ．１９８２．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ａｐｒ  ２２；２３８（１）：１８６〜９１）。このため、ＭＣＡｏラットにおいてａＣＳＦ−ＢＳＡ微小透析のインターベンションが運動機能障害を減少できるか否かを評価した。ＭＣＡｏラットの神経障害スコア試験と握力試験を含む運動試験が虚血と治療の１、３、５、７日後に盲検で実施された。全体試験では損傷の３、５、７日後における機能回復に有意な群間差が示された（Ｐ＜０．０５；図５）。神経障害スコア（ＮＤＳ）（図５（Ａ））と握力（図５（Ｂ））試験で、ＢＳＡ含有ａＣＳＦでの微小透析は、ａＣＳＦでの微小透析治療ＭＣＡｏラットと比較して、機能回復を有意に改善した（Ｐ＜０．０５）。ａＣＳＦ−ＢＳＡ微小透析治療ラットのＮＤＳは、Ｓｈａｍ−ＭＣＡｏラットのそれと比較して、ＭＣＡｏ３、５、７日後に有意に改善された（Ｐ＜０．０５）。対側（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）前肢（左前肢）の握力試験により調べられた把持強度は、右前肢のそれと比較して、ＭＣＡｏ１、３、５、７日後、ａＣＳＦ−ＢＳＡ微小透析治療ラットで大きく改善された（Ｐ＜０．０５）。これらの結果はＳｈａｍ群とａＣＳＦ治療群では観察されなかった。これらのデータは、ＭＣＡｏラットにおいてａＣＳＦ−ＢＳＡ微小透析でのインターベンションが運動機能回復を効果的に改善できることを示唆した。
【００５４】
３、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）はＭＣＡｏラットにおける治療的微小透析用の膠質浸透圧剤としての作用がＢＳＡ同様に有効であった
さらに、ＭＣＡｏラットでの梗塞体積の減少においてａＣＳＦ含有ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）がＢＳＡ−ａＣＳＦと同様に有効であるか試験を実施した。図６に示すように、損傷２時間後のａＣＳＦ−ＨＳＡまたはａＣＳＦ−ＢＳＡいずれかでの微小透析は、虚血誘発性梗塞（図６（Ａ）及び図６（Ｂ））と機能障害（図６（Ｃ）と図６（Ｄ））を有意に減少した。ａＣＳＦ-ＨＳＡとａＣＳＦ−ＢＳＡの効果の間に差はなかった。治療的インターベンションが損傷６時間後に実施されたときも類似の結果が観察された。
【００５５】
４、治療的微小透析が虚血性ラット皮質における神経細胞脱落と小膠細胞活性化／浸潤の両方を減少した
虚血再灌流の２時間後、ＭＣＡｏラットはプローブ（Ｓｈａｍ）、ａＣＳＦでの微小透析（ａＣＳＦ）、またはＢＳＡでの微小透析（ａＣＳＦ−ＢＳＡ）、またはＨＳＡでの微小透析（ａＣＳＦ−ＨＳＡ）で３時間治療された。ラットは治療の１週間後犠牲にされた。ＭＣＡｏラットの虚血コア周囲のラット脳切片が、神経細胞（ＮｅｕＮ）と活性化小膠細胞（ＥＤ−１）のマーカーに対する免疫組織化学（ＩＨＣ）染色向けに処理された。図７にラット皮質領域（右損傷側）のＩＨＣの結果を示す。虚血後、ＢＢＢは破壊され、血液由来細胞（ｂｌｏｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌ）と血清分子の溢出が起こった。脳自体内で小膠細胞は活性化される。これらの細胞は活性化され、大きな形態的及び代謝的変換と、急速かつ大規模な遺伝子上方制御を経る。脳卒中後の炎症反応には、周辺の小膠細胞集団の病変への急速な拡張と血中免疫細胞の動員が含まれる。虚血後の炎症は、常在小膠細胞の急速な活性化と損傷した実質での好中球及びマクロファージの浸潤によって特徴付けられる。炎症カスケードは即時相として特徴付けられ、これは脳卒中の数時間後に始まり、損傷への遅延組織反応として数日間及び数週間持続することがある。虚血の４〜６時間後、星状膠細胞が肥大し、続いて小膠細胞が活性化され、拡大した細胞体と短縮された細胞過程のアメボイド型に進化する。局所虚血の２４時間後、強いミクログリア反応が虚血性組織、特にペナンブラで形成され、数日内にほとんどの小膠細胞が食細胞になる。小膠細胞の活性化は炎症過程を強め、組織損傷の一因となる。活性化された小膠細胞とマクロファージのマーカーであるＥＤ１、及びＮｅｕＮ（神経細胞マーカー）に対して蛍光免疫組織化学法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）がＭＣＡｏの７日後に実施された。免疫染色結果は、ＭＣＡｏの７日後Ｓｈａｍ  ＭＣＡｏ群またはａＣＳＦ治療ＭＣＡｏ群（図７（Ｅ）と図７（Ｆ））には多数のＥＤ１陽性細胞が脳卒中罹患皮質の虚血境界領域上にあることが示された。対照的に、ａＣＳＦ−ＢＳＡまたはａＣＳＦ−ＨＳＡ治療を受けた群（虚血２時間後）では虚血性皮質にわずかのＥＤ１陽性細胞が観察されたのみであった（図７（Ｇ）と図７（Ｈ））。これらの結果と一貫して、ＮｅｕＮ陽性神経細胞は、ＳｈａｍまたはａＣＳＦ治療ＭＣＡｏラット皮質（図７（Ａ）と図７（Ｂ））と比較して、ａＣＳＦ−ＢＳＡまたはａＣＳＦ−ＨＳＡ治療群（図７（Ｃ）と図７（Ｄ））でより保たれた。
【００５６】
５、損傷６時間後の治療的微小透析インターベンション適用が虚血誘発性脳梗塞を効果的に減少した
損傷後より長時間での治療効果を試験するため、治療的インターベンションの同じ治療を損傷６時間後に実施した。興味深いことに、（ａＣＳＦ−ＨＳＡでの）治療的微小透析のＭＣＡｏラットに対する損傷６時間後の適用でも、ＭＣＡｏラットにおける脳梗塞体積が有意に減少した（図８（Ａ）と図８（Ｂ））。図８（Ｃ）に示すこれら実験ラットの運動試験は、ＭＣＡｏ、ＭＣＡｏ＋ＳｈａｍまたはＭＣＡｏ＋ａＣＳＦラットと比較して、ａＣＳＦ−ＨＳＡでの治療的微小透析が損傷１日後にＭＣＡｏラットで神経障害を減少する傾向があることを示している。
【００５７】
６、徐放性ａＦＧＦの局所投与が虚血誘発性脳損傷から保護した
脳卒中誘発性脳損傷は、局所的な重度の炎症と不可逆性の神経細胞死につながることがある。虚血コア周囲のペナンブラは、更なる損傷を受けやすく、治療的インターベンションに適している。酸性ＦＧＦは脳全体に広く分布し、神経系に対して神経保護性及び神経再生性の両方を備える。フィブリン接着剤とａＦＧＦの混合（接着剤＋ａＦＧＦ  １μｇまたは２μｇ）またはフィブリン接着剤単独（接着剤）の虚血性脳卒中に対する効果を調べた。図９（Ａ）から図９（Ｄ）に、損傷後１週間目に示された用量のａＦＧＦで治療された虚血性ラットの脳梗塞体積と運動試験を示す。図９（Ａ）に虚血性脳組織のＴＴＣ染色の代表的画像を示す。ＭＣＡ閉塞の１時間後と生体ＴＴＣ染色による再灌流の１週間後ＭＣＡｏラットにおいて梗塞体積画評価された。両方の接着剤＋ａＦＧＦ群における梗塞体積と虚血損傷の割合は、フィブリン接着剤群のそれと比較して有意に減少された（図９（Ｂ）と図９（Ｃ））。さらに、図９（Ｄ）の運動試験は、１μｇと２μｇのａＦＧＦが、ＭＣＡｏラットにおいて損傷５日後と７日後に神経障害を有意に減少したことを示している（それぞれ、Ｐ＜０．０５及びＰ＜０．０１）。
【００５８】
７、徐放性ａＦＧＦの局所投与がＭＣＡｏラットにおける皮質細胞損失から保護した
ＭＣＡｏラットの虚血コア周囲の脳切片が神経細胞（ＮｅｕＮ）、神経前駆細胞（ダブルコルチン）、活性化された小膠細胞（ＥＤ−１）のマーカーについて免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のため処理された。図１０にラット皮質領域（右損傷側）のＩＨＣの結果を示す。接着剤のみ、または接着剤とａＦＧＦ（１または２μｇ）の混合が１時間のＭＣＡ閉塞後すぐに（０時間）ラット皮質表面に適用された。免疫組織化学染色が虚血中心領域近くの２ｍｍの脳切片１つで実施された。ＮｅｕＮ−免疫反応（ＩＲ）細胞は神経細胞を表す；ダブルコルチン−ＩＲ細胞は神経前駆細胞を表す；ＥＤ−１は活性化された小膠細胞／マクロファージマーカーである。直後に１または２μｇのａＦＧＦで治療された脳虚血ラットはＮｅｕＮとダブルコルチンに免疫活性（ＩＲ）をより保ち、ａＦＧＦの神経保護効果を示唆している。加えて、ａＦＧＦ治療は小膠細胞活性化または浸潤を減少した。同様に、接着剤混合ａＦＧＦの局所投与は、ＭＣＡｏラットの海馬においてＮｅｕＮ−ＩＲとダブルコルチン−ＩＲ細胞消失を保護した（図１１）。これらの結果は、脳虚血ラットにおいて徐放性担体に混合されたａＦＧＦが虚血誘発性脳梗塞を有意に減少し、機能回復を改善したことを示唆している。次に、損傷３時間後の治療的インターベンションで接着剤−ａＦＧＦ治療が実施された。接着剤のみ、または接着剤とａＦＧＦ（２または４μｇ）の混合が１時間のＭＣＡ閉塞の３時間後にラット皮質表面に適用された。図１２（Ａ）から図１２（Ｄ）は、神経障害スコアにより示されるように、接着剤−２μｇと４μｇのａＦＧＦの局所投与が脳梗塞体積を有意に減少し、両用量のａＦＧＦでの治療が機能回復を有意に改善したことを示している。さらに、免疫染色結果は、ａＦＧＦ治療ＭＣＡｏラットの脳でより多くのＮｅｕＮ陽性神経細胞が保たれたことを示している（図１３（Ａ）から図１３（Ｃ））。対照的に、ａＦＧＦ治療を受けた群の虚血性皮質にはわずかのＥＤ１陽性細胞のみが観察された（図１３（Ｄ）から図１３（Ｆ））。接着剤のみ、または接着剤とａＦＧＦ（２または４μｇ）の混合が、１時間のＭＣＡ閉塞の３時間後ラット皮質表面に適用された。免疫組織化学染色が虚血中心領域近くの２ｍｍの脳切片１つで実施された。
【００５９】
８、脳虚血後のＭＣＡｏラットにおける治療的微小透析及び（または）徐放性ａＦＧＦ治療の保護効果
虚血性病理学的事象の複雑さのため、虚血性脳卒中に対する可能な戦略として併用療法を考慮できる。次に、接着剤−ａＦＧＦ（４μｇ）と治療的微小透析の併用療法が損傷６時間後に脳虚血ラットにおいて実施された。結果を図１４に示す。図８と図１２の結果と一貫して、治療的微小透析または徐放性ａＦＧＦでの単独療法は梗塞体積を効果的に減少した。しかし、接着剤含有ａＦＧＦと微小透析の併用療法は虚血性脳損傷に対する各治療の有益な効果をさらに増進することはなかった（図１４（Ａ）と図１４（Ｂ））。興味深いことに、ａＣＳＦ−ＨＳＡで治療されたＭＣＡｏラットは、ａＦＧＦ治療ＭＣＡｏラットと比較して、虚血誘発性運動障害が効果的に減少した（図１４（Ｃ））。ａＣＳＦ−ＨＳＡとａＦＧＦの併用療法は、ＭＣＡｏまたはａＦＧＦ治療ＭＣＡｏラットと比較して、虚血誘発性神経障害をさらに減少した（図１４（Ｃ））。
【００６０】
図１４（Ａ）と図１４（Ｂ）は再灌流１週間後の虚血性脳組織で評価された梗塞体積である。梗塞の大きさ／脳の大きさ（％）は、ＭＣＡｏを１００％として用いた全脳に対する損傷体積の割合を示す。接着剤とａＦＧＦ（４μｇ）の混合がラット皮質表面に１時間のＭＣＡ閉塞の６時間後に適用され、治療的微小透析が虚血性ラットで１時間のＭＣＡ閉塞の６〜９時間後に適用された。図１４（Ｃ）はＭＣＡｏラットの神経障害スコアである。神経障害の度合いが５点形式のスコア試験を使用して評価された。図１４（Ｄ）は握力で、ＭＣＡｏラットの右前肢（健側）と左前肢（脳卒中患側）の握力試験により評価された。データは平均±ＳＥＭとしてとして表された。＊、＊＊：Ｐ＜０．０５、０．０１、ＭＣＡｏと比較；ａ、ｂ：Ｐ＜０．０５、０．０１、ＭＣＡｏ＋ａＦＧＦと比較、それぞれ一元配置分散分析とボンフェローニｔ検定による。
【００６１】
微小透析は健康体及び疾病における脳神経化学の研究において強力なツールであるが、微小透析手順の脳損傷へのインターベンションは初めての適用である。虚血性損傷コアにおける治療的微小透析の適用は、細胞損傷及び細胞死のメディエーターを排除する実行可能かつ非常に効果的な方法であることが分かった。また、ＭＣＡｏの急性期及び亜急性期において神経保護剤と組み合わせ、梗塞の進行を軽減することができる。さらに、幹細胞などその他試薬投与のための治療可能時間域を拡大し、それにより脳損傷または脳卒中の予後を改善することができる。
【００６２】
本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者が、更なる例示を必要とせずにここに記載された説明に基づき本発明をその最大の範囲で利用することが可能であろう。したがって、本発明の明細書及び請求の範囲は本発明の範囲をいかなるようにも限定するのではなく、例示を目的としたものであると理解されるべきである。
【図２】
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【図３】
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【図４（Ａ）（Ｂ）】
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【図４（Ｃ）】
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【図５】
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【図６（Ａ）（Ｂ）】
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【図６（Ｃ）（Ｄ）】
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【図７】
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【図８（Ａ）（Ｂ）】
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【図８（Ｃ）（Ｄ）】
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【図９（Ａ）（Ｂ）】
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【図９（Ｃ）（Ｄ）】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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