(57)【要約】  式（Ｉ）の化合物、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能な塩、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能なエステルおよびこれらの組み合わせから構成される群から選択される、活性成分の有効量を含み、2015506963.tif 000047  Ａは、１または複数の不飽和結合を任意において有するＣ１−Ｃ５のアルキル基であり、−ＯＨ、＝ＯおよびＣ１−Ｃ３のアルキル基から構成される群から選択される１または複数の置換基によって任意において置換されており、  Ｘは、Ｈ、−ＯＨ、2015506963.tif 000048または2015506963.tif 000049であり、  Ｙは、ＯまたはＳであり、５員環を形成するように任意においてＡと結合し、  Ｒ１は、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ２０のアルキル基であり、Ｃ１−Ｃ２０のアルキル基の１または複数の−ＣＨ２−は、−ＮＨ−または−Ｏ−によって任意において置き換えられている、  運動ニューロンのオートファジーを阻害するための医薬組成物。【選択図】図２
2015506963.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物、前記式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能な塩、前記式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能なエステルおよびこれらの組み合わせから構成される群から選択される、活性成分の有効量を含み、
【化１】
2015506963.tif 000028
Ａは、１または複数の不飽和結合を任意において有するＣ１−Ｃ５のヒドロカルビル基であり、−ＯＨ、＝ＯおよびＣ１−Ｃ３のヒドロカルビル基から構成される群から選択される１または複数の置換基によって任意において置換されており、
Ｘは、Ｈ、−ＯＨ、
【化２】
2015506963.tif 000029
または
【化３】
2015506963.tif 000030
であり、
Ｙは、ＯまたはＳであり、５員環を形成するように任意においてＡと結合し、
Ｒ１は、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ２０のヒドロカルビル基であり、前記ヒドロカルビル基における１または複数の−ＣＨ２−は、−ＮＨ−または−Ｏ−によって任意において置き換えられている、
運動ニューロンのオートファジーを阻害するための医薬組成物。
【請求項２】
Ａは、−ＯＨ、＝ＯおよびＣ１−Ｃ３のアルキル基から構成される群から選択される１または複数の置換基によって任意において置換された、Ｃ１−Ｃ５のアルキル基またはアルケニル基であり、
Ｒ１は、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１０のヒドロカルビル基であり、前記ヒドロカルビル基における１または複数の−ＣＨ２−は、−ＮＨ−または−Ｏ−によって任意において置き換えられている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
Ａは、
【化４】
2015506963.tif 000031
【化５】
2015506963.tif 000032
【化６】
2015506963.tif 000033
【化７】
2015506963.tif 000034
【化８】
2015506963.tif 000035
【化９】
2015506963.tif 000036
【化１０】
2015506963.tif 000037
【化１１】
2015506963.tif 000038
または
【化１２】
2015506963.tif 000039
であり、
Ｒ１は、Ｈ、
【化１３】
2015506963.tif 000040
【化１４】
2015506963.tif 000041
または
【化１５】
2015506963.tif 000042
である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記式（Ｉ）の化合物は、以下の化合物から構成される群から選択される、１または複数の化合物である、請求項１に記載の医薬組成物。
【化１６】
2015506963.tif 000043
【請求項５】
前記式（Ｉ）の化合物は、式（１）の化合物である、請求項１に記載の医薬組成物。
【化１７】
2015506963.tif 000044
【請求項６】
前記式（Ｉ）の化合物は、以下のものである、請求項５に記載の医薬組成物。
【化１８】
2015506963.tif 000045
【請求項７】
脊髄運動神経細胞のオートファジーを阻害するためのものである、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
運動ニューロン変性疾患の発症を遅延させるため、および／または、運動ニューロン変性疾患の治療をするためのものである、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
筋萎縮性側索硬化症、重症筋無力症、筋無力症、筋萎縮、筋萎縮症、多発性硬化症、多系統萎縮症、脊髄性筋萎縮症およびこれらの組み合わせの治療をするため、および／または、発症を遅延させるためのものである、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
筋萎縮性側索硬化症の治療をするため、および／または、発症を遅延させるためのものである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
Ａ、Ｘ、ＹおよびＲ１は、請求項１ないし６のいずれか１項において定義されたものである、
【化１９】
2015506963.tif 000046
運動ニューロンのオートファジーを阻害するための薬剤の製造における、前記式（Ｉ）の化合物、または、その薬学的に許容可能な塩もしくはエステルの使用。
【請求項１２】
前記薬剤は、１日に、約３０ｍｇ（前記式（Ｉ）の化合物として）／ｋｇ−体重から、約２０００ｍｇ（前記式（Ｉ）の化合物として）／ｋｇ−体重の範囲の量において投与される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記薬剤は、１日に、約１００ｍｇ（前記式（Ｉ）の化合物として）／ｋｇ−体重から、約１０００ｍｇ（前記式（Ｉ）の化合物として）／ｋｇ−体重の範囲の量において投与される、請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、運動ニューロンのオートファジー（自食作用）を阻害するための医薬組成物およびその適用に関する。特に、運動ニューロン変性疾患の発症を遅延させるため、および／または、運動ニューロン変性疾患の治療をするためのものに関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞として知られているニューロンは、生物の神経系の構造的および機能的ユニットの１つである。ニューロンは、化学および電気信号によって、他の細胞にメッセージを伝えることができる。ニューロンは形状および大きさにおいて変化することができ、ニューロンの直径は約４μｍから約１００μｍの範囲となり得る。ニューロンの構造は、大きく３つの部分に分けることができ、当該部分は、細胞体、樹状突起および軸索である。樹状突起は細胞体の中へと信号を伝えることができ、軸索は細胞体から外へ信号を伝えることができる。
【０００３】
ニューロンは、それらの信号変換および機能の傾向によって、３つの種類に分類することができる。感覚ニューロン、運動ニューロンおよび介在ニューロンである。運動ニューロンは、生物の身体活動を制御している神経細胞である。一般的に、脳内における運動ニューロンは上位運動ニューロンとして知られており、一方、脳幹および脊髄における運動ニューロンは下位運動ニューロンとして知られている。運動ニューロンの変性によって引き起こされる機能的障害は、結果として、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、重症筋無力症、筋無力症、筋萎縮、筋萎縮症、多発性硬化症、多系統萎縮症および脊髄性筋萎縮症等のような、運動ニューロン変性疾患となり得る。前述の運動ニューロン変性疾患に罹患している患者は、徐々に、筋力低下、萎縮、震え、または痙攣のような症状が現れ、会話困難、嚥下困難および呼吸不全にも繋がり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
運動ニューロン変性疾患の本当の原因は、今日では、未だ不明である。しかし、当該疾患原因の可能性において、スーパーオキシドアニオンの蓄積、自己免疫異常、過度の神経興奮（例えば、過度のグルタミン酸の蓄積）、過度の酸化および遺伝性のもの等によって刺激され、過度のオートファジーによって引き起こされる神経細胞死を含むということが研究によって示されている。運動ニューロン変性疾患の治療をするために、臨床において現在使用されている薬剤は、リルゾールのようなグルタミン酸アンタゴニスト、ビタミンＥのような抗酸化剤、神経栄養因子および免疫変調成分等を含む。しかし、前述した薬剤は、通常、有意な治療効果を有していないか、または、３から６ヶ月の間において患者の寿命を長くすることができるのみである。そのため、運動ニューロン変性疾患の発症を遅延させるための、および／または、運動ニューロン変性疾患の治療をするための薬剤の必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、本発明の式（Ｉ）の化合物が、運動ニューロンのオートファジーを阻害し、運動ニューロンの細胞死を減少させるために使用できるということを見出した。それによって、運動ニューロン変性疾患の発症を遅延させ、および／または、運動ニューロン変性疾患の治療をする。
【０００６】
本発明の目的は、運動ニューロンのオートファジーを阻害するための医薬組成物を提供することである。当該医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能な塩、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能なエステルおよびこれらの組み合わせから構成される群から選択される、活性成分の投与有効量を含む。
【化１】
2015506963.tif 000003
【０００７】
Ａは、１または複数の不飽和結合を任意において有するＣ１−Ｃ５のヒドロカルビル基であり、−ＯＨ、＝ＯおよびＣ１−Ｃ３のヒドロカルビル基から構成される群から選択される１または複数の置換基によって任意において置換されており、
Ｘは、Ｈ、−ＯＨ、
【化２】
2015506963.tif 000004
または
【化３】
2015506963.tif 000005
であり、
Ｙは、ＯまたはＳであり、５員環を形成するように任意においてＡと結合し、
Ｒ１は、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ２０のヒドロカルビル基であり、当該ヒドロカルビル基における１または複数の−ＣＨ２−は、−ＮＨ−または−Ｏ−によって任意において置き換えられている。
【０００８】
本発明の別の目的は、運動ニューロンのオートファジーを阻害するための薬剤の製造において、前述の活性成分を使用することである。
【０００９】
本発明のさらに別の目的は、式（Ｉ）の化合物ならびに式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能な塩およびエステルから構成される活性成分の有効量を対象に対して投与することを含む、対象における運動ニューロンのオートファジーを阻害するための方法を提供することである。
【００１０】
詳細な技術および本発明のために実施された好ましい実施の形態は、この技術分野における当業者が特許請求の範囲に記載された発明の特徴をよく理解できるように、後の段落において記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析されたブチリデンフタリドおよびヒト肝ミクロソームの混合物の質量スペクトルの図である。
【図１Ｂ】生物内におけるブチリデンフタリドの第Ｉ相代謝を示す代謝プロファイルの図である。
【図１Ｃ】生物内におけるブチリデンフタリドの第ＩＩ相代謝を示す代謝プロファイルの図である。
【図２】ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの生存率の増加におけるブチリデンフタリドの効果を示す生存曲線図である。
【図３】ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの生存率の増加におけるリルゾールの効果を示す生存曲線図である。
【図４】ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスにおけるブチリデンフタリドの効果を示すＢＢＢスケール曲線の図である。
【図５Ａ】ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの脊髄運動神経細胞死の遅延または防止におけるブチリデンフタリドの効果を示す組織化学染色撮影図である。
【図５Ｂ】ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの脊髄運動神経細胞死の遅延または防止におけるブチリデンフタリドの効果を示す棒グラフの図である。
【図６】ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの腰椎でのＬＣ３−ＩＩタンパク質の発現レベルの減少におけるブチリデンフタリドの効果を示すウェスタンブロットの撮影図である。
【図７】ＮＳＣのオートファジーの阻害におけるブチリデンフタリドの効果を示すウェスタンブロットの撮影図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、詳細における本発明のいくつかの実施の形態について記載する。しかし、本発明の精神から逸脱することなく、本発明は種々の実施の形態において具体化され得るし、本明細書に記載される実施の形態に限定されるべきではない。さらに、本明細書において他に言及のない限り、本明細書において（特に、特許請求の範囲において）用いられる“１”、“当該”および同様の用語は、単数形式および複数形式の両方を包含するように理解されるべきである。さらに、本明細書において使用されている“有効量”という用語は、対象に投与された場合、被疑対象において治療されている状態を少なくとも部分的に緩和することができる化合物の量を示している。本明細書において使用されている“対象”という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む、哺乳動物を示している。
【００１３】
オートファジーは、細胞の細胞内リソソームを介した細胞自身の細胞小器官または他の物質の分解に関与する、細胞増殖、細胞ホメオスタシスおよび細胞死の調節のための重要なメカニズムである。しかし、上述したように、運動ニューロンの過剰なオートファジーは運動ニューロン変性疾患の原因の１つとなることが知られている。そのため、もし、運動ニューロンのオートファジーを阻害することができれば、運動ニューロン変性疾患の治療をするために、運動ニューロンの細胞死を軽減することができる。
【００１４】
本発明者らは、以下の化合物（１）が、運動ニューロンのオートファジーを有意に阻害することができ、従って、運動ニューロン変性疾患の発症を遅延させるため、および／または、運動ニューロン変性疾患の治療をするために使用することができるということを見出した。
【化４】
2015506963.tif 000006
【００１５】
ブチリデンフタリド（ＢＰ）としても知られている化合物（１）は、その天然型において、２つの異性体（Ｚ）−ブチリデンフタリド（ｃｉｓ−ブチリデンフタリド）および（Ｅ）−ブチリデンフタリド（ｔｒａｎｓ−ブチリデンフタリド）を含む。
【００１６】
生物の肝臓における第Ｉ相代謝または第ＩＩ相代謝によってブチリデンフタリドが代謝された後には、１または複数の以下の化合物（２）から（１４）が生成され得るということが確認された。
【化５】
2015506963.tif 000007
【００１７】
化合物（１０）におけるＣｙｓはシステインを示す。理論によって限定されることはなく、生物での運動ニューロンのオートファジーの阻害におけるブチリデンフタリドの効果は、上記化合物（２）から（１４）の化学構造の共通構造部分に由来するものであると考えられる。
【００１８】
従って、本発明は、式（Ｉ）の化合物、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能な塩、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能なエステルおよびこれらの組み合わせから構成される群から選択される、活性成分の投与有効量を含む、運動ニューロンのオートファジーを阻害するための医薬組成物を提供する。
【化６】
2015506963.tif 000008
【００１９】
Ａは、１または複数の不飽和結合を任意において有するＣ１−Ｃ５のヒドロカルビル基であり、−ＯＨ、＝ＯおよびＣ１−Ｃ３のヒドロカルビル基から構成される群から選択される１または複数の置換基によって任意において置換されており、
Ｘは、Ｈ、−ＯＨ、
【化７】
2015506963.tif 000009
または
【化８】
2015506963.tif 000010
であり、
Ｙは、ＯまたはＳであり、５員環を形成するように任意においてＡと結合し、
Ｒ１は、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ２０のヒドロカルビル基であり、当該ヒドロカルビル基における１または複数の−ＣＨ２−は、−ＮＨ−または−Ｏ−によって任意において置き換えられている。運動ニューロンは、脳における運動ニューロンのような上位運動ニューロン、ならびに脳幹および脊髄における運動ニューロンのような下位運動ニューロンを含む。
【００２０】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物において、
Ａは、−ＯＨ、＝ＯおよびＣ１−Ｃ３のアルキル基から構成される群から選択される１または複数の置換基によって任意において置換された、Ｃ１−Ｃ５のアルキル基またはアルケニル基であり、
Ｒ１は、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１０のヒドロカルビル基であり、当該ヒドロカルビル基における１または複数の−ＣＨ２−は、−ＮＨ−または−Ｏ−によって任意において置き換えられている。
【００２１】
より好ましくは、Ａは、
【化９】
2015506963.tif 000011
【化１０】
2015506963.tif 000012
【化１１】
2015506963.tif 000013
【化１２】
2015506963.tif 000014
【化１３】
2015506963.tif 000015
【化１４】
2015506963.tif 000016
【化１５】
2015506963.tif 000017
【化１６】
2015506963.tif 000018
または
【化１７】
2015506963.tif 000019
であり、
Ｒ１は、Ｈ、
【化１８】
2015506963.tif 000020
【化１９】
2015506963.tif 000021
または
【化２０】
2015506963.tif 000022
である。
【００２２】
本発明の医薬組成物の１つの実施の形態では、式（Ｉ）の化合物は、前述の化合物（１）−（１４）から構成される群から選択される。式（Ｉ）の化合物は、好ましくは化合物（１）（すなわち、ブチリデンフタリド）であり、より好ましくは以下の式の化合物（すなわち、（Ｚ）−ブチリデンフタリド）である。
【化２１】
2015506963.tif 000023
【００２３】
本発明の医薬組成物は、運動ニューロンのオートファジーを阻害することができ、ニューロンの細胞死を軽減させることができる。そのため、運動ニューロン変性疾患の発症を遅延させるために、および／または、運動ニューロン変性疾患の治療をするために使用することができる。運動ニューロン変性疾患は、運動ニューロンのオートファジーに関する任意の疾患を含む。当該疾患は、限定はされないが、筋萎縮性側索硬化症、重症筋無力症、筋無力症、筋萎縮、筋萎縮症、多発性硬化症、多系統萎縮症および脊髄性筋萎縮症等を含む。
【００２４】
１つの実施の形態では、本発明の医薬組成物は、筋萎縮性側索硬化症の治療のために使用される。筋萎縮性側索硬化症の患者は、徐々に筋萎縮の症状が現れ、通常、２から５年間において四股麻痺、嚥下困難、さらには呼吸不全を引き起こす。研究において、筋萎縮性側索硬化症は過剰な神経興奮（例えば、過度のグルタミン酸蓄積）に関連している可能性があるということが示されている。そのため、現時点では、リルゾールのようなグルタミン酸アンタゴニストが、患者の生存率を増加させるための運動ニューロン変性疾患の治療のために、通常臨床において使用されている。リルゾールと比較すると、本発明の医薬組成物は、運動ニューロンのオートファジーを阻害することによって、より効果的に、運動ニューロン変性疾患の発症を遅延させ、および／または、運動ニューロン変性疾患の治療をすることができる。それによって、筋萎縮性側索硬化症の患者の生存率を増加させることができる。
【００２５】
本発明の投与される医薬組成物は、投与のための任意の適切な形態の薬剤に製造することができる。例えば、限定はされないが、医薬組成物は、経口投与、皮下注射、鼻腔内投与または静脈注射のために、適切な形態を有する薬剤に製造することができる。経口投与用の薬剤は、患者が自分で定期的に摂取するために便利であるので、医薬組成物を経口投与用に適した形態における薬剤に製造することが好ましい。また、薬剤の形態および目的に応じて、医薬組成物は薬学的に許容可能なキャリアをさらに含むこともできる。
【００２６】
経口投与用に適した薬剤の製造には、医薬組成物は、その中に含まれている活性成分の活性において悪影響を与えない、薬学的に許容可能なキャリアを含むことができる。当該キャリアは、溶媒、油性溶媒、希釈剤、安定化剤、吸収遅延剤、崩壊剤、乳化剤、酸化防止剤、結合剤、潤滑剤および水分吸収剤等のようなものを含む。薬剤は、タブレット、カプセル、顆粒、粉末、流体抽出液、溶液、シロップ、懸濁液、乳剤およびチンキ剤等のような、経口投与用に適した形態とすることができる。
【００２７】
皮下または静脈注射用に適した薬剤では、医薬組成物は、等張液、生理食塩緩衝液（例えば、リン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液）、可溶化剤、乳化剤および他のキャリア等のような、１または複数の組成物を含んでもよい。これは、静脈注射剤、エマルジョン静脈注射剤、粉末注射剤、懸濁液注射剤および粉末懸濁液注射剤等としての薬剤を製造するためである。
【００２８】
上述のアジュバントに加えて、医薬組成物は、結果物としての薬剤の味および外観を向上させるために、香味剤、トナーおよび着色剤等のような他の添加物を含んでもよい。また、結果物としての薬剤の保存性を改善するために、医薬組成物は、適切な量の防腐剤、保存剤、消毒剤および抗菌剤等も含んでもよい。さらに、本発明の方法の効果を増大させる、または当該方法における適応柔軟性および順応性を高めるために、医薬組成物は、酸化防止剤（例えば、ビタミンＥ）、神経栄養因子または免疫調節因子等のような、１または複数の他の活性成分を含んでもよい。しかし、これは、当該他の活性成分が、式（Ｉ）の化合物またはその塩およびエステル誘導体における効果に悪影響を及ぼさない場合に限る。
【００２９】
本発明の医薬組成物は、対象の必要性に応じて、１日に１回、１日に数回または数日に１回等のように、様々な投与頻度において適用することができる。例えば、運動ニューロンのオートファジーを阻害するために人体に適用される場合、当該組成物の投薬量は、１日に、約３０ｍｇ（式（Ｉ）の化合物として）／ｋｇ−体重から、約２０００ｍｇ（式（Ｉ）の化合物として）／ｋｇ−体重である。好ましくは、１日に、約１００ｍｇ（式（Ｉ）の化合物として）／ｋｇ−体重から、約１０００ｍｇ（式（Ｉ）の化合物として）／ｋｇ−体重である。ここで、“ｍｇ／ｋｇ−体重”という用語は、ｋｇ体重毎において必要とされる投薬量を意味する。しかし、重篤な状態を有する患者には、実践的な要求に応じて、投薬量を数倍または数十倍に増加させることができる。筋萎縮性側索硬化症の治療をするための、本発明の医薬組成物を使用する１つの実施の形態では、活性成分は（Ｚ）−ブチリデンフタリドであり、その投薬量は約５００ｍｇ／ｋｇ−体重である。
【００３０】
本発明は、運動ニューロンのオートファジーを阻害するための薬剤の製造における、式（Ｉ）の化合物ならびに／またはその薬学的に許容可能な塩およびエステルの使用をも提供する。運動ニューロンのオートファジーを阻害することによって、薬剤は、筋萎縮性側索硬化症、重症筋無力症、筋無力症、筋萎縮、筋萎縮症、多発性硬化症、多系統萎縮症、脊髄性筋萎縮症およびこれらの組み合わせのような、運動ニューロン変性疾患の発症を遅延させるため、および／または、当該運動ニューロン変性疾患の治療をするために使用され得る。薬剤の形態および投薬量、ならびに任意においてその中に含まれている他の成分については、上記に沿った内容と同様である。
【００３１】
本発明は、対象における運動ニューロンのオートファジーを阻害するための方法をも提供する。当該方法は、式（Ｉ）の化合物、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能な塩、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能なエステルおよびこれらの組み合わせから構成される群から選択される、活性成分の有効量の対象への投与を含む。活性成分の形態および投薬量については、上記に沿った内容と同様である。
【００３２】
本発明は、さらに、以下の特定の実施例を用いて詳細に説明されるだろう。しかし、以下の実施例は、本発明を例示するためのみに提供されるものにすぎず、それにより本発明の範囲は限定されない。
【実施例】
【００３３】
（実施例１）ブチリデンフタリドの代謝産物の同定
生物の肝臓内における薬物の代謝経路は、主として、第Ｉ相および第ＩＩ相代謝に分けられることが知られている。第Ｉ相代謝は、主に、薬物の酸化還元反応または加水分解反応によって起こり、第ＩＩ相代謝は、主に、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）モノオキシゲナーゼ系によって起こる。本実施例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ブチリデンフタリドと、肝ミクロソームまたは凍結保存肝細胞とをそれぞれ混合することによって、生物の肝臓内において起こるブチリデンフタリドの第Ｉ相および第ＩＩ相代謝をシミュレートし、当該反応溶液における物質を、代謝産物および代謝プロファイルを同定するために、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって分析した。実験ステップは以下の通りであった。
【００３４】
（１）第Ｉ相代謝分析
ブチリデンフタリド（２ｍＭ）を、それぞれ、ヒト、ラットまたはイヌの肝ミクロソームを含む（０．５ｍｇ／ｍＬ）Ｋ３ＰＯ４緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）と混合した。混合物を３７℃において１０分間保ち、次いで、予め温めておいた補因子（ＮＡＤＰＨ（２ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（３ｍＭ））を添加し、当該混合物を３７℃において６０分間インキュベートした。その後、０．１％ギ酸含有アセトニトリルを３倍容量において加え、混合物の反応を停止させた。混合物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その後、上清を回収し、代謝産物を同定するためにＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【００３５】
（２）第ＩＩ相代謝分析
ヒト、ラットまたはイヌの解凍した肝細胞を５×１０５含むウイリアムＥ培地を、それぞれ１２ウェル培養皿の中へ添加し、当該細胞を６時間培養した。その後、０．５ｍＬのブチリデンフタリド（５０μＭ）を培養皿の中へ添加した。細胞を、３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２下において６時間インキュベートした後、２ｍＬのアセトニトリル（１００％）を加え、反応を停止させた。サンプルを回収し、十分に混合し、４５０００ｇ、４℃において１０分間遠心分離した。その後、上清を回収し、乾燥させ、代謝産物を同定するためにＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【００３６】
（３）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
（１）および（２）から得られたサンプルを、アセトニトリル／０．１％ギ酸含有の中に別々に溶解させ、４５０００ｇ、４℃において１０分間遠心分離した。その後、それぞれのサンプルのアリコート（２０μｌ）を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行うためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムのオートサンプラーバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）の中に注入した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムは、１２００ＳＬ  ＨＰＬＣシステムを有するＡＢＳＣＩＥＸ  ５５００  Ｑ  ＴＲＡＰ（商標）システム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）、ＨＰＬＣカラム（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標）  Ｃ１８、３．５μＭ、４．６×７５ｍｍ）、およびオートサンプラー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を含む。２つの溶媒系（溶媒Ａ：０．１％ギ酸；溶媒Ｂ：０．１％ギ酸含有メタノール）を使用し、０．８ｍＬ／分の流速において、ＨＰＬＣを実行した。ＨＰＬＣの勾配系は、次のように設計した。０から２分は１０％の溶媒Ｂにおいて保持され、２から７分は１０％から９５％の溶媒Ｂの勾配を有し、７から１２分は９５％の溶媒Ｂにおいて保持され、１２から１４分は９５％から１０％の溶媒Ｂの勾配を有し、１４から２０分は１０％の溶媒Ｂにおいて保持され、ＨＰＬＣ分析の保持時間は２０分間である。質量分析は、５．５ｋＶ、５５０℃における陽イオンのエレクトロスプレーイオン化法（＋ＥＳＩ）で行い、Ｎ２（窒素）を補助ガスとして使用した。そして、サンプルにおける代謝産物を決定して生物における生体内分解経路およびブチリデンフタリドの代謝プロファイルを同定するために、ブチリデンフタリドのスペクトルと比較したそれぞれのサンプルのＬＣ−ＭＳ／ＭＳスペクトルにおける強いピーク、および質量がシフトしたピークを、ＬｉｇｈｔＳｉｇｈｔ（商標）  Ｓｏｆｔｗａｒｅによって分析した。結果を、表１、表２、図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃにおいて示す。
【００３７】
図１Ａは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析された、ブチリデンフタリド（ｍ／ｚ  １８９．１）およびヒト肝ミクロソームの混合物の、フラグメント物質スペクトルを示している。図１Ａにおいて示す通り、１７１．２ａｍｕ、１５３．１ａｍｕ、１４３．０ａｍｕ、１２８．０ａｍｕ、および１１５．０ａｍｕに、非常に強いピーク（ｍ／ｚ）がある。
【００３８】
【表１】
2015506963.tif 000024
【００３９】
表１は、ブチリデンフタリドおよび肝ミクロソームの混合物の反応（すなわち、第Ｉ相代謝）から生成された種々の代謝産物と、ソフトウェア解析によって取得された生体内分解経路を示している。当該結果は、本発明の化合物（２）から（９）が、ブチリデンフタリドおよびラット、イヌまたはヒトの肝ミクロソームの混合物の反応によって生成され得ることを示しており、これは、異なる生物の肝臓において代謝された場合でも、ブチリデンフタリドは同一の代謝産物へと変換され得るということを示している。図１Ｂは、ブチリデンフタリドおよび肝ミクロソームの混合物の反応から得られる代謝プロファイル、ならびに化合物（２）から（９）の化学構造を示す。
【００４０】
【表２】
2015506963.tif 000025
【００４１】
表２は、ブチリデンフタリドおよび凍結保存肝細胞の混合物の反応（すなわち、第ＩＩ相代謝）から生成された種々の代謝産物と、ソフトウェア解析によって取得された生体内分解経路を示している。当該結果は、本発明の化合物（１１）から（１４）が、ブチリデンフタリドおよびラット、イヌまたはヒトの凍結保存肝細胞の混合物の反応によって生成され得ることを示しており、これは、異なる生物の肝臓において代謝された場合でも、ブチリデンフタリドは同様の代謝産物へと変換され得るということを示している。図１Ｃは、ブチリデンフタリドおよび凍結保存肝細胞の混合物の反応から得られる代謝プロファイル、ならびに化合物（１１）から（１４）の化学構造を示す。
【００４２】
（実施例２）ｉｎ  ｖｉｖｏ分析：ブチリデンフタリドによるトランスジェニックマウスの生存率の上昇
筋萎縮性側索硬化症患者の約２０％が、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジムスターゼ酵素（ＳＯＤ１）をコードする遺伝子内の変異に関連しており、Ｇ９３Ａが主要な変異部位であることが知られている。遺伝子導入技術によって、ヒトＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ変異を遺伝子導入されたマウス（以下、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスとして示される）を、筋萎縮性側索硬化症の臨床研究のための動物モデルとして使用した。これは、当該マウスがヒトと同様の疾患経過を示すためである。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスは、出生後約９０±５日以内において筋萎縮性側索硬化症の症状を示し、出生後約１２５±５日以内において死亡するだろう。
【００４３】
本実施例では、ｉｎ  ｖｉｖｏでの分析を実行するための研究の対象として、上記ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスを使用した。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス（６０日齢）に、１日１回、５００ｍｇ／ｋｇ−体重の投薬量において、経口投与によってブチリデンフタリド（ＥＣＨＯ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから購入）を処置した。ここで、“ｍｇ／ｋｇ−体重”という用語は、ｋｇ体重毎において必要とされる投薬量を意味する。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスを３０日間にわたり処置した後、ブチリデンフタリドはＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの寿命を延ばせるのかどうか（すなわち、１２５日より長くなるかどうか）を見るために、当該マウスを観察した。当該結果を、図２および表３において示す。
【００４４】
【表３】
2015506963.tif 000026
【００４５】
図２および表３において示すように、毎日、経口投与によってブチリデンフタリドで処置された実験グループの６０日齢ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスは、平均で約１４９±４．３９日間生存した。すなわち、実験グループのＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの寿命は、コントロールグループの未処置のＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス（約１２７±６．１１日間生存）と比較して、約２２±２日間延びていた。図３（文献“Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｒｉｌｕｚｏｌｅ  ａｎｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｍｉｃｅ．  Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  ２００９；１０：８５−９４”から得られ、その全てを参照によりここに組み込む）によると、従来の筋萎縮性側索硬化症の薬剤であるリルゾールが、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの治療のために使用された場合、当該マウスは１４０日間生存していた。上記の結果は、リルゾールと比較して、式（Ｉ）の化合物を使用する本発明は、より有意に筋萎縮性側索硬化症患者の生存率を高めることができるということを示している。
【００４６】
（実施例３）ｉｎ  ｖｉｖｏ分析：ブチリデンフタリドによる筋萎縮性側索硬化症の発症の遅延
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス（６０日齢）に、１日１回、５００ｍｇ／ｋｇ−体重の投薬量において、経口投与によってブチリデンフタリドを処置した。当該マウスを３０日間にわたり処置した後、マウスの後肢をＢＢＢスケール（Ｂａｓｓｏ，  Ｂｅａｔｔｉｅ，  ａｎｄ  Ｂｒｅｓｎａｈａｎ  （ＢＢＢ）  Ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ）によって調べた。正常マウスの後肢のＢＢＢスケールは２１ポイントであったが、一方、疾患が進行したＳＯＤ１−Ｇ９３ＡトランスジェニックマウスのＢＢＢスケールは２１から０ポイントへ減少していた。なお、より低いスケールは、マウスにおいて、より重篤な動作障害を表している。薬剤の効能を記録するために、ＢＢＢスケールは使用される。
【００４７】
図４において示すように、実験グループにおける６０日齢ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスは、毎日の経口投与によってブチリデンフタリドが処置された。当該マウスの後肢のＢＢＢスケールは、１２５から１３５日においてゆっくりと減少し（２１から１６ポイント）、１３５日後において急速に減少した（１６から０ポイント）。一方、コントロールグループにおける未処置のマウスの後肢のＢＢＢスケールは、１１０日後において急速に減少した（１９から０ポイント）。上記の結果は、ブチリデンフタリドが、実際に、筋萎縮性側索硬化症の発症を遅延させることができることを示している。
【００４８】
（実施例４）組織化学染色：ブチリデンフタリドによる脊髄運動神経細胞死の遅延および／または防止
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス（６０日齢）に、１日１回、５００ｍｇ／ｋｇ−体重の投薬量において、経口投与によってブチリデンフタリドを処置した。実験グループにおけるＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスを死の直前において屠殺し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を行うために、脊髄を回収した。脊髄における運動ニューロンの数を顕微鏡を用いて観察し、カウントした。当該データを、未処置のコントロールグループのものと比較した。
【００４９】
図５Ａ、図５Ｂおよび表４において示すように、毎日ブチリデンフタリドで処置をした実験グループにおける６０日齢ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの脊髄運動神経細胞数は、コントロールグループのものよりも有意に多かった（実験グループの数：２４；コントロールグループの数：３）。上記の結果は、ブチリデンフタリドが、脊髄運動神経細胞死を効果的に遅延および／または防止することができ、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの生存率を上昇させるということを示している。
【００５０】
【表４】
2015506963.tif 000027
【００５１】
（実施例５）ウェスタンブロット解析：ブチリデンフタリドによるオートファジーの阻害
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス（６０日齢）に、１日１回、５００ｍｇ／ｋｇ−体重の投薬量において、経口投与によってブチリデンフタリドを処置した。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスは、筋萎縮性側索硬化症の末期段階の間、オートファジーが顕著に増加するので、その脊髄運動神経細胞を失うことが研究によって示されている（これは、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ７：９、１−８；Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１１、において知ることが可能であり、その全てを参照によりここに組み込む）。そこで、本実施例では、実験グループにおけるＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスを、脊髄を回収するために死の直前において屠殺し、当該脊髄からタンパク質を抽出した。これは、ウェスタンブロットを行い、オートファジーのタンパク質バイオマーカーＬＣ３−ＩＩを解析するためである。当該ＬＣ３−ＩＩは、マウスの腰部脊髄運動神経細胞においてオートファジーが起こっているかどうかを確かめるために使用され、β−アクチンは内部コントロールとして使用した。
【００５２】
図６において示すように、コントロールグループにおける未処置のマウスと比較すると、実験グループにおけるマウスの頚部脊髄、胸髄および腰髄内のＬＣ３−ＩＩおよびｐＬＣ３−ＩＩのタンパク質発現レベルが有意に減少した。上記の結果は、ブチリデンフタリドが、生物における運動ニューロンのオートファジーを特異的に阻害することが可能であり、それによって、筋萎縮性側索硬化症の発症を遅延させ、当該マウスの生存日数を延ばし、筋萎縮性側索硬化症の治療の効果を達成するということを示している。
【００５３】
（実施例６）細胞実験：ブチリデンフタリドによるオートファジーの阻害
細胞実験は、マウスの運動ニューロンを模倣するために、マウスの運動ニューロンに分化することができるＮＳＣｓ（神経幹細胞）を使用することによって行った。
【００５４】
ＮＳＣｓを、培養皿（直径１０ｃｍ）においてインキュベートした。インキュベート後、６０％コンフルエントの密度まで増殖した際に、当該細胞をＰＢＳを用いて洗浄し、異なる濃度のブチリデンフタリドを用いて１２時間にわたって処置した。その後、細胞のオートファジーを刺激するために、当該細胞を、Ｈ２Ｏ２（２５００μＭ／ｍＬ）を用いて１２時間にわたり処置した。そして、細胞を収集し、タンパク質を抽出し、ＮＳＣにおけるＬＣ３−ＩＩのタンパク質発現レベルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって解析した。ウェスタンブロットの結果を、図７において示す。
【００５５】
図７において示すように、１０μｇ／ｍＬのブチリデンフタリドが、オートファジーを阻害することによって、Ｈ２Ｏ２の損傷からＮＳＣｓを保護し、防止することができていた（ＬＣ３−ＩＩのタンパク質発現レベルを減少させる）。
【００５６】
上述の実施例は、本発明の原理および有効性を説明するため、およびその発明の特徴を示すために使用されるものである。本技術分野における当業者であれば、記載されている本発明の開示および示唆に基づいて、技術的原理およびその精神から逸脱することなく、種々の変形および代替を用いて実施し得る。そのため、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲において規定されているものである。
【図１Ｂ】
2015506963.tif 000050
【図１Ｃ】
2015506963.tif 000051
【図２】
2015506963.tif 000052
【図３】
2015506963.tif 000053
【図４】
2015506963.tif 000054
【図５Ｂ】
2015506963.tif 000055
【図１Ａ】
2015506963.tif 000056
【図５Ａ】
2015506963.tif 000057
【図６】
2015506963.tif 000058
【図７】
2015506963.tif 000059
【手続補正書】
【提出日】平成26年8月12日(2014.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブチリデンフタリド（ＢＰ）、ブチリデンフタリド（ＢＰ）の薬学的に許容可能な塩およびこれらの組み合わせから構成される群から選択される、活性成分の有効量を含む、運動ニューロンのオートファジーを阻害するための医薬組成物。
【請求項２】
ブチリデンフタリド（ＢＰ）は、（Ｚ）−ブチリデンフタリド（ＢＰ）である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
脊髄運動神経細胞のオートファジーを阻害するためのものである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
運動ニューロン変性疾患の発症を遅延させるため、および／または、運動ニューロン変性疾患の治療をするためのものである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
筋萎縮性側索硬化症、重症筋無力症、筋無力症、筋萎縮、筋萎縮症、多発性硬化症、多系統萎縮症、脊髄性筋萎縮症およびこれらの組み合わせの治療をするため、および／または、発症を遅延させるためのものである、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
筋萎縮性側索硬化症の治療をするため、および／または、発症を遅延させるためのものである、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
１日に、３０ｍｇ（ＢＰとして）／ｋｇ−体重から、２０００ｍｇ（ＢＰとして）／ｋｇ−体重の範囲の量において投与されるように用いられる、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
１日に、１００ｍｇ（ＢＰとして）／ｋｇ−体重から、１０００ｍｇ（ＢＰとして）／ｋｇ−体重の範囲の量において投与されるように用いられる、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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