(57)【要約】  本発明は、網膜の変性または機能障害を伴う眼疾患の治療における極小胚様（ＶＳＥＬ）幹細胞の使用に関する。本発明はまた、網膜の疾患もしくは障害または幹細胞置換療法による利益があると見込まれる他の疾患や網膜傷害に起因する、喪失視力の回復あるいは視力喪失の軽減または停止に使用しうるＶＳＥＬｓを用いて作成した医薬組成物も含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の網膜疾患を治療または改善する方法であって、哺乳動物の眼内に極小胚様幹細胞（ＶＳＥＬｓ）を含む組成物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項２】
ＶＳＥＬｓは、ＣＤ４５-／ｌｉｎ-／ＣＤ３４+、またはＣＤ４５-／ｌｉｎ-／ＣＤ１３３+、またはＣＤ４５-／ｌｉｎ-／ＣＤ３４+／ＣＤ１３３+を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＶＳＥＬｓは、ＳＳＥＡ−４、Ｏｃｔ−４、Ｒｅｖ−１、およびＮａｎｏｇの１つまたは複数を発現する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＸＣＲ４を発現させるためにＶＳＥＬｓをさらに濃縮する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
核色素により染色するためにＶＳＥＬｓをさらに濃縮する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
核色素はＤＲＡＱ５である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＶＳＥＬｓを網膜下に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＶＳＥＬｓを硝子体内に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＶＳＥＬｓを懸濁液またはマトリックスの形態で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
投与するＶＳＥＬの数は、２０〜２００個である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
投与するＶＳＥＬの数は、２００〜１，０００個である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
投与するＶＳＥＬの数は、１，０００〜５，０００個である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
投与するＶＳＥＬの数は、５，０００〜５０，０００個である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
網膜疾患は、黄斑変性または網膜色素変性症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物はヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＶＳＥＬｓは自家ＶＳＥＬｓである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＶＳＥＬｓは同種ＶＳＥＬｓである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ＶＳＥＬｓはヒトＶＳＥＬｓである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
投与する細胞の少なくとも一部は、生着し、神経または網膜分化のマーカーの１つまたは複数を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
神経または網膜分化のマーカーは、ネスチン、ＰＡＸ６、ロドプシン、リカバリン、β３チューブリン、およびＭＡＰ２である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＶＳＥＬｓから光受容体細胞への分化を刺激する物質を哺乳動物に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＶＳＥＬｓから神経細胞への分化を刺激する物質を哺乳動物に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
組成物は、少なくとも約５０％がＶＳＥＬｓである細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、網膜の変性または機能障害を伴う眼疾患の治療における極小胚様（ＶＳＥＬ）幹細胞の使用に関する。本発明はまた、網膜の疾患もしくは障害または幹細胞置換療法による利益があると見込まれる他の疾患や網膜傷害に起因する、喪失視力の回復あるいは視力喪失の軽減または停止に使用しうるＶＳＥＬｓを用いて作成した医薬組成物も含む。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年５月３１日に出願した米国特許出願第６１／６５４，００２号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は西欧諸国では不治の失明の主な原因の一つである。萎縮（乾燥）型ＡＭＤが、最も一般的なタイプで、症例の９０％を占める。萎縮（乾燥）型ＡＭＤは、神経網膜外側にある光感受性の光受容体を支持および保護している高度に特殊化した組織である網膜色素上皮（ＲＰＥ）下に堆積物が進行的に沈着することにより変性することを特徴とする。細胞移植（ＲＰＥ、光受容体前駆体または神経保護能を持つ細胞）を利用して、網膜下の構造を補完し、ＲＰＥと光受容体との間の機能的連携を再確立することにより、進行ＡＭＤによる視力の回復ができる可能性がある。
【０００４】
網膜色素変性症としては、光受容体およびＲＰＥが進行的に変性することを特徴とする遺伝性の網膜障害が挙げられる。現在、疾患の進行を停止または視力を回復する治療法は存在していない。他の遺伝性疾患であるシュタルガルト病は、主に６歳〜１２歳の子供に影響し、急速かつ深刻な中心視力の喪失をもたらす。
【０００５】
幹細胞に基づく療法が、網膜変性疾患の治療に向けて進められている。網膜幹細胞は、ヒトを含むいくつかの哺乳動物種から単離されている。しかし、宿主の網膜に移動して統合する細胞の能力に限界があるため、これらの細胞移植の成功率は低い。骨髄由来幹細胞で代替することができるものの、骨髄には、造血幹細胞、間葉系幹細胞、および間葉組織、そして場合により他の種類の組織、に分化する非造血細胞の異種集団といった何種類かの多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ／ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞が含まれる。また、骨髄には組織関連性の幹細胞が含まれることも報告されている。
【０００６】
極小胚様幹細胞（ＶＳＥＬｓ）は、ヒト骨髄および成人末梢血液中に見られる多能性細胞である。ＶＳＥＬｓは、サイズが小さいｌｉｎ-およびＣＤ４５-細胞であるが、ＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＣＸＣＲ４、そして、ＳＳＥＡ−４、Ｏｃｔ−４、Ｒｅｖ−１、およびＮａｎｏｇといった胚性幹細胞に特徴的な他の成分を発現する。
【発明の概要】
【０００７】
網膜におけるＶＳＥＬｓの再生能を実証するために、ＳＣＩＤマウスの網膜剥離モデルの硝子体腔に細胞を注入および網膜下に細胞を注入することの両方によって、ＰＫＨ２６で標識した濃縮ヒトＶＳＥＬｓをマウスの眼に移植した。ヒトＶＳＥＬｓがマウス網膜において生着し、生存し、網膜または神経外胚葉細胞に分化する能力を評価した。移植から２および４週間後に、網膜下および硝子体内に注入したヒトＶＳＥＬｓは、網膜内で生着、生存し、そして移動可能であった。さらに、免疫組織化学解析により、網膜下に移植した細胞が分化し、ネスチンおよびＰＡＸ６といった網膜幹細胞および発生段階の前駆細胞のマーカー、ＭＡＰ２およびβ３チューブリンといった神経外胚葉細胞のマーカー、および初期の光受容体マーカーであるリカバリンを発現することが明らかになった。これらの研究により、ヒトＶＳＥＬｓは、生着し、移動し、網膜系譜に従って分化できることが示される。
【０００８】
本発明は、眼組織の損傷または傷害を治療するための方法および組成物に関する。本発明によれば、有効量の極小胚様幹細胞（ＶＳＥＬｓ）を含む組成物を組織に投与し、そこでＶＳＥＬｓが網膜組織を修復または再生する。ＶＳＥＬｓを動員、収集、および精製する方法を記載する。
【０００９】
したがって、本発明は、哺乳動物の網膜疾患を治療または改善する方法であって、哺乳動物の眼内に極小胚様幹細胞（ＶＳＥＬｓ）を含む組成物の有効量を投与することを含み、当該眼内でＶＳＥＬｓが網膜系譜に従って移動および分化する方法を提供する。特定の実施形態では、ＶＳＥＬｓは、ＣＤ４５-／ｌｉｎ-／ＣＤ３４+、またはＣＤ４５-／ｌｉｎ-／ＣＤ１３３+、またはＣＤ４５-／ｌｉｎ-／ＣＤ３４+／ＣＤ１３３+を含み、そしてＳＳＥＡ−４、Ｏｃｔ−４、Ｒｅｖ−１、およびＮａｎｏｇの１つまたは複数を発現する。これについて、本明細書でさらに記載する。
【００１０】
本発明によれば、ＶＳＥＬｓを、哺乳動物の網膜下または硝子体内を含む眼に投与するが、これらに限定されない。
【００１１】
本発明によって治療する眼の損傷または傷害には、これらに限定されないが黄斑変性および網膜色素変性症などの網膜疾患が含まれる。
【００１２】
本発明によって投与するＶＳＥＬｓには、自家ＶＳＥＬｓおよび同種ＶＳＥＬｓが含まれる。ＶＳＥＬｓは、マウスなど任意の哺乳動物由来であり得る。好ましい実施形態では、ＶＳＥＬｓはヒトＶＳＥＬｓである。また、本発明は、ヒトＶＳＥＬｓをヒト眼疾患を有する動物モデルへ移植する異種移植も含む。
【００１３】
特定の実施形態では、投与するＶＳＥＬｓの少なくとも一部が生着し、そして、ネスチン、ＰＡＸ６、ロドプシン、リカバリン、β３チューブリン、およびＭＡＰ２などの神経または網膜分化のマーカーの１つまたは複数を発現する。
【００１４】
また、本発明は、ＶＳＥＬｓを投与する際に上記ＶＳＥＬｓの分化を刺激する薬剤を提供する。例えば、このような薬剤は、ＲＰＥｓ、光受容体細胞、又は神経細胞への分化を刺激することができる。
【００１５】
特定の実施形態では、ＶＳＥＬｓは、修復部位で分化する。特定の実施形態では、ＶＳＥＬｓは、所望の系譜に向かって分化するように処理または選択される。例えば、一実施形態では、ＶＳＥＬｓは、哺乳動物に投与する前に、ＲＰＥ細胞のマーカー、例えば、ＲＰＥ６５、ベストロフィン、ＣＲＡＬＢＰ、およびＰＥＤＦの１つまたは複数を発現する細胞に分化させる。
【００１６】
特定の実施形態では、ＶＳＥＬｓは、懸濁液の形態で投与されるか、あるいは生分解性であってもよいマトリックスまたは足場に取り込まれる。特定の実施形態では、マトリックスは、ＶＳＥＬｓから所望の組織型への分化を誘発するように選択される。特定の実施形態では、ＶＳＥＬｓは、所望の組織型への分化を促進する薬剤または成長因子とともに投与される。
【００１７】
使用する組成物におけるＶＳＥＬｓの数は、治療する眼の欠陥部の容積または表面積に関係し得る。本発明の一実施形態では、組成物は約５０〜約５０，０００個のＶＳＥＬｓを含む。別の実施形態では組成物は、約２００〜約１０，０００個のＶＳＥＬｓを含む。本発明の一実施形態では、組成物は約５００〜約５，０００個のＶＳＥＬｓを含む。別の実施形態では、組成物は２０〜２００個、または２００〜１０００個、または１０００〜５，０００個、または５０，０００〜５０，０００個のＶＳＥＬｓを含む。
【００１８】
特定の実施形態では、ＶＳＥＬｓは、他の有核細胞を含む組成物中に設けられる。ある実施形態では、組成物の細胞は、少なくとも約５０％がＶＳＥＬｓである。別の実施形態では、組成物の細胞の少なくとも約７０％がＶＳＥＬｓである。追加の実施形態では、組成物の細胞の少なくとも約９０％または少なくとも約９５％がＶＳＥＬｓである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】硝子体腔または網膜下腔内への細胞の注入。ＶＳＥＬの投与の例示的な方法を示す。光受容体層は、外顆粒層（ＯＮＬ）とも呼ばれる（Ｋ．Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２０１１；２５：４３９−４４３から複製）。
【００２０】
【図２Ａ】硝子体内への注入から４週間後のＰＫＨ２６+細胞のカウント。Ｃｙ３チャンネル（上）、ＦＩＴＣチャンネル（中央）、および統合（下）画像により、Ｃｙ３チャンネル内の陽性染色（矢印）はＰＫＨ２６で標識された細胞によるものであり、自家蛍光によるものでないことが示される。
【図２Ｂ】硝子体内への注入から４週間後のＰＫＨ２６+細胞のカウント。ＰＫＨ２６+細胞のカウントを示す代表的な凍結切片。
【図２Ｃ】硝子体内への注入から４週間後のＰＫＨ２６+細胞のカウント。Ｃｙ３チャンネル（上）およびＦＩＴＣチャンネル（神経線維層を染色するβＩＩＩチューブリン）を統合したＤＡＰＩ（中央）により、ＰＫＨ２６+細胞は内境界膜に沿って細胞核と共局在し、網膜内へ移動しない傾向にあることが示される。
【００２１】
【図３】網膜下へ注入した後のＰＫＨ２６+細胞の網膜への移動。ＧＣＬ：神経節細胞層、ＩＮＬ：内顆粒層、ＯＮＬ：外顆粒層、ＲＰＥ：網膜色素上皮。（Ａ）網膜下腔への注入から２週間後に網膜の外顆粒層内で同定されたＰＫＨ２６+細胞（矢印）。（Ｂ）網膜下腔、外顆粒層、および内顆粒層で同定されたＰＫＨ２６+細胞。
【００２２】
【図４Ａ−４Ｂ】移植細胞の一部は、網膜分化のマーカーを示す。ＧＣＬ：神経節細胞層、ＩＮＬ：内顆粒層、ＯＮＬ：外顆粒層、ＲＰＥ：網膜色素上皮。（Ａ）ヒトＳＲＰ１４に対する抗体で染色すると、ＰＫＨ２６+細胞（矢印）、およびＰＫＨ２６マーカーを失っている可能性のある別の細胞の2種類が染色される。ヒト核抗原（ＨｕＮ）に対する抗体は、この実験では染色しなかった。（Ｂ）抗ネスチン抗体により、ＰＨＫ２６+／ＳＲＰ１４+／ネスチン+細胞（矢印）が同定される。
【図４Ｃ−４Ｄ】移植細胞の一部は、網膜分化のマーカーを示す。ＧＣＬ：神経節細胞層、ＩＮＬ：内顆粒層、ＯＮＬ：外顆粒層、ＲＰＥ：網膜色素上皮。（Ｃ）抗ＰＡＸ６抗体により、数少ないＰＨＫ２６+／ＳＲＰ１４+／ＰＡＸ６+細胞（矢印）が同定される。（Ｄ）抗リカバリン抗体より、ＰＨＫ２６+／リカバリン+細胞（矢印）が同定される。
【図４Ｅ−４Ｆ】移植細胞の一部は、網膜分化のマーカーを示す。ＧＣＬ：神経節細胞層、ＩＮＬ：内顆粒層、ＯＮＬ：外顆粒層、ＲＰＥ：網膜色素上皮。（Ｅ）抗ｂ３チューブリン抗体より、数少ないＰＨＫ２６+／ＳＲＰ１４+／ｂ３チューブリン+細胞（矢印）が同定される。（Ｆ）抗ＭＡＰ２抗体より、ＰＨＫ２６+／ＳＲＰ１４+／ＭＡＰ２+細胞（矢印）が同定される。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、網膜変性を治療または改善するための治療組成物および方法を提供する。本発明によれば、極小胚様幹細胞（ＶＳＥＬｓ）を、網膜の組織および機能を維持または回復する方法において使用する。より具体的には、ＶＳＥＬｓを網膜組織内に導入し、そこでＶＳＥＬｓが移動して、例えば、これらに限定されないが、桿体および錐体といった網膜細胞、ならびにアマクリン細胞（網膜内の神経細胞）および網膜神経節細胞といった神経細胞などの眼細胞を回復させる。神経分化に特徴的なマーカーには、これらに限定されないが、ネスチンおよびＭＡＰ２（神経新生に不可欠なステップである微小管集合）などが挙げられる。光受容体のマーカーには、これらに限定されないが、リカバリン、ロドプシン、Ｃｒｘ、およびＮｒｌが挙げられる。
【００２４】
また、用語「極小胚様幹細胞」は、本明細書では「ＶＳＥＬ幹細胞」とも呼ばれ、多能性幹細胞のことを指す。いくつかの実施形態では、ＶＳＥＬ幹細胞（「ＶＳＥＬｓ」）は、ヒトＶＳＥＬｓであり、Ｌｉｎ-、ＣＤ４５-、およびＣＤ３４+という特徴を有してもよい。いくつかの実施形態では、ＶＳＥＬｓは、ヒトＶＳＥＬｓであり、Ｌｉｎ-、ＣＤ４５-、およびＣＤ１３３+という特徴を有してもよい。いくつかの実施形態では、ＶＳＥＬｓは、ヒトＶＳＥＬｓであり、Ｌｉｎ-、ＣＤ４５-、およびＣＸＣＲ４+という特徴を有してもよい。いくつかの実施形態では、ＶＳＥＬｓは、ヒトＶＳＥＬｓであり、Ｌｉｎ-、ＣＤ４５-、ＣＸＣＲ４+、ＣＤ１３３+、およびＣＤ３４+という特徴を有してもよい。いくつかの実施形態では、ＶＳＥＬｓは、ヒトＶＳＥＬｓであり、Ｌｉｎ-、ＣＤ４５-、ＣＤ１３３+、およびＣＤ３４+という特徴を有してもよい。いくつかの実施形態では、ヒトＶＳＥＬｓは、ＳＳＥＡ−４、Ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、およびＮａｎｏｇの少なくとも１つを発現する。幹細胞マーカーについて、マウスＶＳＥＬｓは、ＳＳＥＡ−１、Ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、およびＮａｎｏｇの少なくとも１つを発現する。また、ＶＳＥＬｓは、細胞質の細い縁に囲まれた大きな核を有し、胚型で組織化されていないクロマチンを含むという特徴を有してもよい。ＶＳＥＬｓは、高いテロメラーゼ活性も有する。いくつかの実施形態では、ＶＳＥＬｓは、ヒトＶＳＥＬｓであり、Ｌｉｎ-、ＣＤ４５-、ＣＸＣＲ４+、ＣＤ１３３+、Ｏｃｔ４+、ＳＳＥＡ４+、およびＣＤ３４+という特徴を有してもよい。いくつかの実施形態では、ヒトＶＳＥＬｓは、あまり原始的ではなく、Ｌｉｎ-、ＣＤ４５-、ＣＸＣＲ４+、ＣＤ１３３-、およびＣＤ３４+という特徴を有してもよい。いくつかの実施形態では、ヒトＶＳＥＬは、例えば、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇなどの多能性胚性転写因子について濃縮することができる。いくつかの実施形態では、ヒトＶＳＥＬｓは、直径が４〜５μｍ、４〜６μｍ、４〜７μｍ、５〜６μｍ、５〜８μｍ、６〜９μｍ、または７〜１０μｍであってもよい。本発明によって投与したＶＳＥＬｓは、収集、そして濃縮または精製してから直接使用してもよく、または使用まで冷凍してもよい。本発明によって自家または同種ＶＳＥＬｓを投与してもよい。さらに、ＶＳＥＬｓを操作してもよい。
【００２５】
似たような表面マーカーを有するＶＳＥＬ幹細胞および細胞外小胞は、種々の手順、例えば、それらのサイズ、密度、および染色特性（例えば、表面マーカー、核色素による染色の欠如）に基づいて取得、そして単離または精製できる。一実施形態では、ＶＳＥＬｓは、アフェレーシスによって末梢血液から得られる。本発明の一実施形態では、ＶＳＥＬｓは、動員後の末梢血液から得られる。別の実施形態では、ＶＳＥＬｓは臍帯血から得られる。別の実施形態では、ＶＳＥＬｓは骨髄から得られる。別の実施形態では、ＶＳＥＬｓは脾臓から得られる。別の実施形態では、ＶＳＥＬｓは脂肪組織から得られる。別の実施形態では、ＶＳＥＬｓ成体組織から得られる。いくつかの実施形態では、ＶＳＥＬｓは使用前にＣ２Ｃ１２フィーダー層と共培養する。いくつかの実施形態では、ＶＳＥＬｓは、胚様体のような球として伝播する。
【００２６】
ＷＯ／２０１１／０６９１１７には、サイズに基づいた分離により末梢血液から幹細胞集団を単離する方法が記載されている。アフェレーシスした新鮮な細胞を、１×ＢＤ  Ｐｈａｒｍ  Ｌｙｓｅバッファーにより約１：１０（体積／体積）の比率で溶解し、赤血球を除去する。洗浄後、細胞を計数し、２〜２．５×１０10個の有核細胞を全て、１×１０8細胞／ｍｌの濃度でＥＬＵＴＲＡ（登録商標）細胞分離システム（ＣａｒｉｄｉａｎＢＣＴ）に載せる。次いで、細胞を様々な流量で９００ｍｌのＰＢＳ＋０．５％ＨＳＡ培地を含む各袋に収集する。典型的には、６個の分画を、２４００ｒｐｍの遠心速度で収集する。最後に、すべての画分から細胞を試験管に移し、１５分間、６００×ｇでスピンダウンする。画分のサイズ特性は、ＳＳＣおよびＦＳＣを評価することによって確認する。開示されているように、特定の画分はＶＳＥＬｓについて高度に濃縮され、臨床用途のＶＳＥＬｓ集団を設けるのに使用できる。この手順は、他の機器に合わせることもできる。この集団を、さらにＦＡＣＳによって精製してもよい。
【００２７】
差動遠心分離、パーコール勾配遠心分離、対流遠心エルトリエーションなど、サイズまたは密度に基づき細胞を分離する方法を使用して、Ｌｉｎ-ＣＤ４５-ＣＤ３４／１３３+の事象が、異なる物理的特性を持つ２つの別集団に分類されることが観察された。対象の主要な集団（Ｌｉｎ-ＣＤ４５-ＣＤ３４／１３３+事象の約９８％）のほうは、サイズが非常に小さく（＜４μｍ）、重量が非常に軽く、核色素ＤＲＡＱ５による染色がネガティブであるかまたは薄い。主要でないほうの集団は、サイズが大きく（５〜１０μｍ）、重量が重く、ＤＲＡＱ５による染色が明るい。サイトスピンおよび迅速な差分染色の後で、２つの集団をＦＡＣＳにより分離したところ、主要でないほうの集団は小核細胞で構成され、一方、主要な集団は細胞核を持たない膜結合物質で構成されていたことが示された。光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡によると、これらの物質は、細胞外小胞の外観を有していた。大部分はおおよそ血小板サイズであるが、それらの形態学的な外観は、血小板とは全く異なる。Ｌｉｎ-ＣＤ４５-ＣＤ３４／１３３+事象の２つの集団は、臍帯血でも見られるが、その頻度が動員後の成人血液中におけるものとは異なる（ＤＲＡＱ５-の事象の９４％で、５個の造血前駆細胞あたり１個の頻度）。従って、ＶＳＥＬｓをフローサイトメトリーにより単離または精製する場合、ＶＳＥＬマーカーまたはＶＳＥＬ特性を有する他の細胞様物質の中から有核ＶＳＥＬｓを定量化するのに、ＤＲＡＱ５といった核マーカーが有用であり得る。ＤＲＡＱ５+である有核ＶＳＥＬｓと同様にＶＳＥＬｓのマーカーを発現する除核粒子を精製し、ヒト対象の損傷または傷害を受けた組織を修復する治療に使用してもよい。
【００２８】
本発明によれば、ＶＳＥＬの亜集団を、所望の組織型への分化を示すマーカーの発現について選択してもよい。また、ＶＳＥＬｓは、投与前に所望の組織型への分化を誘導するための処理および培養をしてもよい。
【００２９】
本発明は、網膜の疾患および機能障害に対する治療法を提供する。網膜の機能障害には、レシピエントの網膜に関する疾患や物理的もしくは化学的な傷害、または退行性もしくは病理学的なプロセスのいずれに起因するかにかかわらず正常な網膜機能の欠如または損失のいずれかが含まれる。ＶＳＥＬｓは、当技術分野で公知の技術に従って、網膜部位、網膜下腔、硝子体腔（硝子体腔の硝子体内への注入もしくは他の導入を含む）、または視神経に注入するか他の方法により配置できる。これには生分解性基材をＶＳＥＬｓの担体として使用することが含まれる。
【００３０】
特定の実施形態では、本発明は、自家幹細胞の投与を提供する。特定の実施形態では、本発明は、同種幹細胞の投与を提供する。この点で、硝子体腔、色素上皮、網膜、および網膜下腔を含む眼の特定の組織について、同種組織の移植が可能であるという免疫的な恩恵がある。このような実施形態では、ドナーから収集したＶＳＥＬｓをレシピエントに投与できる。さらに、組織移植片の免疫拒絶を最小化または防止するために、ドナーおよびレシピエントを一致させてもよく、および／または免疫抑制剤を投与してもよい。特定の実施形態では、本発明は、眼疾患の動物モデルを含むがこれらに限定されない異種移植片を提供する。
【００３１】
ここで使用する用語「再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」とは、損失または傷害を受けた部分の再生成（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）または再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を指す。
【００３２】
ここで使用する用語「修復（ｒｅｐａｉｒ）」とは、治癒過程の自然な方法または人工的な方法により、疾患または損傷した組織を回復すること指す。
【００３３】
ここで使用する用語「治療的に有効な」とは、対象に投与した後に治療的または有益な効果をもたらすヒト極小胚様幹細胞（ＶＳＥＬｓ）を含む自家幹細胞生成物の量を指す。治療的効果は、疾患または障害を治癒する、最小限に抑える、予防する、または改善すること、あるいは任意の他の有益な効果を有することであってもよい。物質の濃度は、その治療効果を発揮するように選択されるが、医師の健全な判断の範囲内で重篤な副作用を回避できるほど十分に低い。有効量の自家幹細胞生成物は、治療する生物対象の年齢および身体状態、状態の重症度、治療期間、併用療法の性質、注入のタイミング、使用する特定の化合物、組成物、または他の有効成分、利用する特定の担体、および同様の要因によって変化し得る。
【００３４】
当業者は、所定の強さの効果を誘発する投与単位（使用の単位を意味する）で用量を決定することにより、ヒト極小胚様幹細胞（ＶＳＥＬｓ）を含む自己幹細胞生成物の治療的有効量を決定することができる。以下、上記投与単位のことを「単位用量」と呼ぶ。用語「用量−強度間の関係」とは、如何に個々のレシピエントにおける効果の強さが用量に関係するかを指す。一般に採用される効果の強さは、最大強度の５０％である。対応する用量のことを、５０％有効量または個別ＥＤ50（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ＥＤ50）と呼ぶ。「個別（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」という用語の使用は、本明細書中で使用する効果の強さに基づくＥＤ50を、集団における応答データの頻度から決定され同じくＥＤ50と略される有効量の中央値から区別するものである。本明細書で使用する「効果」とは、所望の応答を達成するために使用する本発明の組成物の性質を指し、「最大効果」とは、達成可能な最大の効果を指す。特定の障害または状態の治療に有効であろう自己幹細胞生成物の量は、障害または状態の性質に依存するであろうし、標準的な臨床技術によって決定することができる。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれるＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  ＧｉｌｍａｎのＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，Ｊｏｅｌ  Ｇ．Ｈａｒｍａｎ，Ｌｅｅ  Ｅ．Ｌｉｍｂｉｒｄ，Ｅｄｓ．；ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１：ＴＨＥ  ＰＨＹＳＩＣＩＡＮ’Ｓ  ＤＥＳＫ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｏｒａｄｅｌｌ，Ｎ．Ｊ．，１９９５；およびＤＲＵＧ  ＦＡＣＴＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＡＲＩＳＯＮＳ，ＦＡＣＴＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＡＲＩＳＯＮＳ，ＩＮＣ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，１９９３参照。また、記載の本発明の製剤に使用する正確な用量は、投与経路および疾患または障害の重篤度に依存するであろうし、そして医師の判断および各対象の状況によって決定すべきである。
【００３５】
本明細書において使用する用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、交換可能に使用され、状態の進行を無効にし、実質的に阻害し、遅延し、または逆転し、状態の臨床的または美的な症状を実質的に改善し、状態の臨床的または美的な症状の出現を実質的に予防し、そして有害または不快な刺激から保護することを含む。さらに、治療は、次の項目の１つまたは複数を達成することを指す：（ａ）障害の重症度を低減する；（ｂ）治療する障害に特徴的な症状の発症を制限する；（ｃ）治療する障害に特徴的な症状の悪化を制限する；（ｄ）従前に障害を有していた患者の再発を制限する；ならびに、（ｅ）従前に障害に対し無症状であった患者の症状の再発を制限する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、網膜に機能障害が生じるのは、加齢黄斑変性、早期発症黄斑変性、アッシャー症候群、網膜色素変性症、先天性脈絡膜欠如、錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー、杆体錐体ジストロフィー、レーバー先天性黒内障、先天性定常夜盲症、スティックラー症候群、コロボーマ、硝子体網膜異形成、色覚異常、または視神経低形成の結果である。
【００３７】
本方法は、光受容体細胞の機能の欠如または低下に患っている哺乳動物レシピエントを治療するために用いることができる。本発明の成体網膜幹細胞株および方法によって治療できる網膜の機能障害の例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：光受容体の変性（例えば、遺伝性または後天性網膜色素変性症、錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィーおよび／または杆体錐体ジストロフィー、および加齢性および早期発症型黄斑変性を含む黄斑変性で起こる）；網膜剥離および網膜外傷；レーザーまたは日光によって引き起こされる透光層の病変；黄斑円孔；黄斑浮腫：夜盲症および色盲症；糖尿病又は血管閉塞によって引き起こされる虚血性網膜症；未熟児／早産に起因する網膜症；感染状態、例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）網膜炎、ヘルペスウイルス１型網膜炎、エプスタイン・バールウイルス網膜炎、トキソプラズマ症、風疹、およびポックスウイルス；炎症、例えば、ブドウ膜炎、多焦点脈絡膜炎、およびブドウ膜炎、散弾状網脈絡膜症、眼の後部に影響を与えるコラーゲン血管疾患、例えば、ウェゲナー肉芽腫症、全身性エリテマトーデスに関連したブドウ膜炎、結節性多発動脈炎に関連したブドウ膜炎、末梢または中間部ブドウ膜炎、慢性中心性漿液性脈絡網膜症、および近視脈絡膜新生血管膜症とその傷跡。炎症性障害には、以下が含まれる：ベーチェット症候群、中間部ブドウ膜炎（扁平部炎）、仮面症候群、末梢ブドウ膜炎、眼の梅毒、眼の結核、ウイルス関連の脈絡網膜炎（ＡＲ）症候群、ＨＩＶ−関連ブドウ膜炎、進行性の外側網膜壊死症候群、交感性眼炎、白点症候群、推定眼ヒストプラスマ症候群、急性黄斑視神経網膜症、広汎性片眼性亜急性視神経網膜炎、眼うじ病、匍行性脈絡膜症、全ブドウ膜炎、散弾状網脈絡膜症、および若年性関節リウマチ、川崎症候群、多発性硬化症、サルコイドーシス、トキソカラ症、トキソプラズマ症、フォークト−小柳−原田（ＶＫＨ）、およびＨＬＡ−Ｂ２７血清陽性の脊椎症症候群などの疾患に関連したブドウ膜炎。
【００３８】
他の障害としては、網膜芽細胞腫および眼黒色腫などの腫瘍が挙げられる。さらに、ＶＳＥＬｓは、緑内障、外傷性視神経症、変性性視神経症、虚血性視神経症、多発性硬化症による視神経症、放射線視神経症、および網膜症などの眼の神経障害に影響される内網膜神経細胞の置換に使用できる。
【００３９】
また、当該方法は、視神経疾患を治療するために使用できる。視神経疾患には、以下が挙げられる：視神経萎縮、虚血性視神経症、糖尿病誘発性視神経萎縮、視神経低形成、朝顔症候群、グレーブス眼、視神経炎、サイトメガロウイルスの神経炎、動脈炎性視神経症、圧縮神経障害、糖尿病性神経障害、巨細胞性動脈炎、浸潤性神経障害、栄養障害、虚血性神経障害、球後視神経炎、眼球後部の虚血性神経障害、毒性神経障害、外傷性神経障害；梅毒、ライム病、トキソプラズマ症、ネコ引っ掻き病、全身性エリテマトーデス、腫瘍随伴症候群、多発性硬化症、および自己免疫疾患などの原因から生じる視神経疾患；加齢黄斑変性症、早期発症黄斑変性症、アッシャー症候群、網膜色素変性症、錐体桿体ジストロフィー、および先天性脈絡膜欠如などの退行性視神経疾患；レーバー先天性黒内障、先天性定常夜盲症、および視神経低形成などの先天性光学疾患。
【００４０】
本発明によれば、ＶＳＥＬｓは、網膜部位、網膜下腔、視神経、または硝子体腔内へ、網膜疾患または機能障害を治療または改善するのに有効な量で導入される。ＶＳＥＬ組成物の量は、治療する疾患、およびＶＳＥＬｓの精製度に依存するであろう。上記の例として、サイズおよび表面マーカーに基づいて精製されるＶＳＥＬｓを含む組成物は、ＶＳＥＬｓに加えて除核細胞様小胞を含みうる。このような無傷の細胞に由来する小胞は、生物学的に活性な成分を含有しうるが、移動または分化ができないであろう。一方、サイズおよび密度に基づいて細胞を分離する水簸手順により、除核細胞様小胞を含まない濃縮ＶＳＥＬ組成物を設けることが期待される。
【００４１】
特定の実施形態では、ＶＳＥＬｓは、他の有核細胞を含む組成物中に設けられる。ある実施形態では、組成物の細胞は、少なくとも約５０％がＶＳＥＬｓである。別の実施形態では、組成物の細胞の少なくとも約７０％がＶＳＥＬｓである。追加の実施形態では、組成物の細胞の少なくとも約９０％または少なくとも約９５％がＶＳＥＬｓである。
【００４２】
ここで例示するように、マウスの硝子体内に注入するために、ＦＡＣＳで精製した約２，０００個のＶＳＥＬｓを硝子体腔に注入した。網膜下注入について研究するために、（純度が０．１％〜１１％の調製物中の）約１０，０００個の細胞を、網膜下腔に注入した。ＶＳＥＬｓは、注入部位の網膜下剥離を起こすのに十分な量であった。ＶＳＥＬｓを本発明に従って投与する際に、注入するＶＳＥＬｓの容積を減らすことによって、または複数の注入部位に注入しＶＳＥＬｓを分散させることによってこのような網膜の損傷は回避することができることが理解されるであろう。治療する網膜障害に応じて、細胞数、細胞の純度、細胞の容積、および注入技術を調整することは、当業者の裁量の範囲内である。
【００４３】
従って、本発明の一実施形態では、注入可能なＶＳＥＬ組成物は、約５０〜約５０，０００個のＶＳＥＬｓを含む。別の実施形態では、組成物は、約２００〜約１０，０００個のＶＳＥＬｓを含み得る。本発明のまた別の実施形態では、組成物は、約５００〜約５，０００個のＶＳＥＬｓを含み得る。
【００４４】
本発明のある実施形態では、投与するＶＳＥＬの数は、２０〜２００個である。本発明の別の実施形態では、投与するＶＳＥＬの数は、２００〜１，０００個である。本発明のまた別の実施形態では、投与するＶＳＥＬの数は、１，０００〜５，０００個である。本発明のさらに別の実施形態では、投与するＶＳＥＬの数は、５，０００〜５０，０００個である。
【００４５】
細胞または組成物の投与は、単回投与、あるいは治療過程を通じて連続的または断続的に行うことができる。投与の最も有効な手段および用量を決定する方法は、当業者によく知られており、治療に用いられる組成物、治療の目的、および治療対象に応じて変化する。単回投与または複数回投与は、治療する医師が選択する用量のレベルおよびパターンで行うことができる。適切な投与製剤および薬剤を投与する方法は、当該分野で公知である。さらなる態様において、本発明の細胞および組成物は、他の治療と組み合わせて投与できる。
【００４６】
網膜の機能障害を治療するためにＶＳＥＬｓを使用する際、レシピエントの眼にＶＳＥＬｓを導入することと併用して、光受容体細胞または他の網膜細胞型（例えば、双極細胞、神経節細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞）への分化を刺激する物質を投与してもよい。また、眼の神経機能障害を治療するためにＶＳＥＬｓを導入する際、幹細胞から神経細胞または星状細胞への分化を刺激する物質（または物質の組み合わせ）を利用してもよい。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本発明の治療方法は、ＶＳＥＬｓからＲＰＥ細胞への分化を刺激する物質をレシピエントに投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、本発明の治療方法は、ＶＳＥＬｓから光受容体細胞への分化を刺激する物質をレシピエントに投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、本発明の治療方法は、ＶＳＥＬｓから神経細胞への分化を刺激する物質を哺乳動物レシピエントに投与することを更に含む。
【００４８】
本発明はまた、様々な眼疾患、障害、および傷害、特に網膜および神経網膜組織に関する疾患、障害、および傷害の治療について研究および開発するための手段を提供する。
【００４９】
網膜の細胞の源は外胚葉性であり、その網膜前駆細胞は、最終的に２層を形成する。外層はＲＰＥｓになり、内層は神経網膜になる。また、本開示の主題は、目的の細胞型に向けてＶＳＥＬ幹細胞を分化するための方法を提供するものでもある。方法は、目的の細胞型が培養物内に出現するまで、ＶＳＥＬ幹細胞から目的の細胞型への分化を誘導する１つまたは複数の因子を、分化を誘導する量で含む培地中でＶＳＥＬｓを培養することを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、目的の細胞型は、星状細胞、グリア細胞、またはニューロンなどの神経系の細胞またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、神経系の細胞またはその誘導体は、ＧＦＡＰ、ネスチン、βＩＩＩチューブリン、Ｏｌｉｇｌ、およびＯｌｉｇ２の１つまたは複数を発現する。いくつかの実施形態では、ＶＳＥＬｓは、約１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＥＧＦ、約２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２、および約２０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを含む培養培地中で少なくとも約１０日間培養する。
【００５１】
精製、濃縮、もしくは富化された細胞は、生理学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬的または生理学的に許容される製剤または組成物として投与してもよく、ヒトおよび非ヒト動物を含む対象のレシピエント器官の組織に投与してもよい。幹細胞を含有する組成物は、滅菌生理食塩水または他の生理学的に許容される注入可能な水性液などの適切な液体または溶液中に細胞を再懸濁することによって調製できる。このような組成物に使用する成分の量は、当技術分野の当業者によって日常的に決定できる。
【００５２】
ＶＳＥＬｓまたはそれらの組成物は、吸収性または接着性の材料、すなわち、コラーゲンスポンジマトリックスに幹細胞懸濁液を載せることによって投与してもよいし、目的の部位の中または表面に、幹細胞を含む材料を挿入することによって投与してもよい。注入可能な投与のために、組成物を、滅菌溶液または懸濁液中に含んでもよいし、あるいは、保存剤、安定剤、および当該溶液または懸濁液をレシピエントの体液と等張にするための物質を含有し得る医薬的および生理学的に許容される水性または油性ビヒクル中に再懸濁してもよい。使用に適した賦形剤の非限定的な例としては、水、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４の０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液、デキストロース、グリセロール、希エタノール、およびそれらの混合物などが挙げられる。例示的な安定剤としては、ポリエチレングリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機酸および有機酸が挙げられ、それらはそれ自体で、又は混合物として使用することができる。量（ａｍｏｕｎｔｓまたはｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ）ならびに用いる投与経路は、個人ベースで決定し、当業者に公知の用途または適応と同種のもので使用する量に対応する。
【実施例】
【００５３】
得られた実験結果により、ヒトＶＳＥＬｓをマウス網膜に移植すると、生着し、生存し、網膜または神経外胚葉細胞に分化することが実証された。
【００５４】
Ｇ−ＣＳＦは、ヒト末梢血液単核細胞を動員した。
健康なヒトドナーに、４８０μｇのヒトＧ−ＣＳＦ（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）を３日間毎日皮下注射して動員した。動員後のドナーを、３〜４時間Ｃｏｂｅスペクトル血球分離装置にアフェレーシスして単核細胞を得た。
【００５５】
水簸によるサイズに基づくＶＳＥＬの濃縮。
２〜２．５×１０10個のアフェレーシスした新鮮な単核細胞を１×１０8個の細胞／ｍｌの濃度でＥｌｕｔｒａ（登録商標）細胞分離システム（Ｃａｒｉｄｉａｎ  ＢＣＴ）に載せた。次いで、９００ｍｌのＰＢＳ＋０．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）培地を含む袋に細胞を入れ、２４００ｒｐｍの回転数および３５ｍｌ／ｍｉｎ〜＞１１０ｍｌ／ｍｉｎの逆流速度で分離した。典型的には、５個の分画を収集した。５０〜７０ｍｌ／ｍｉｎの分画内でＶＳＥＬｓが小さい細胞とともに同時精製されていた。
【００５６】
免疫磁気選択によるＣＤ３４／１３３+ＶＳＥＬｓの濃縮。
ＶＳＥＬｓを含むＥｌｕｔｒａ画分をさらに免疫磁気ＣＤ３４及びＣＤ１３３ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して濃縮した。１×１０8個の細胞を、製造業者の指示に従い５０μｌのＣＤ１３３および１００μｌのＣＤ３４磁気ビーズで染色してから洗浄し、ＡｕｔｏＭＡＣＳ細胞分離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に載せ、ＣＤ１３３+／ＣＤ３４+ＶＳＥＬ集団を濃縮した。この段階では典型的に、１，０００個の細胞につきおよそ１個の細胞がＬｉｎ-ＣＤ４５-ＣＤ１３３／３４+ＶＳＥＬｓであった。
【００５７】
フローサイトメトリーによるＶＳＥＬｓの精製および分析。
細胞は、以下のＦＩＴＣ結合マウス抗ヒト抗体を用いて、系譜マーカーについて染色した：抗ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２３５ａ、およびＣＤ４１。また、細胞を、生細胞染色色素である７−ＡＡＤ、および抗ＣＤ４５−ＰＥ、およびＣＤ１３３−ＡＰＣとＣＤ３４−ＡＰＣの組み合わせでも染色した。ＶＳＥＬｓの分析および計数のために、核色素ＤＲＡＱ５も染色カクテルに加えた。染色は氷上で３０分間、０．５％ＨＳＡを含有するＰＢＳ中で行った。その後ＶＳＥＬｓをＧａｌｌｉｏｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析、またはＭｏＦｌｏ  ＸＤＰセルソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてＬｉｎ−ＣＤ４５−ＣＤ１３３／ＣＤ３４+の小さい細胞（５〜９μｍ）について分類することによって精製した。注入が必要になるまで、両方のＦＡＣＳ精製物またはＭＡＣＳ濃縮物を、５％ヒトアルブミンおよび５％ＤＭＳＯを含むＰＢＳ中で凍結した。
【００５８】
ＳＣＩＤマウス内へのＶＳＥＬの移植。
我々は、ＳＣＩＤマウスの２つの網膜疾患モデルについて調べた（図１）：１つのモデルでは緑内障にみられるように網膜神経節細胞が死滅しており（毒素注入後に硝子体内注入を行った）、もう１つのモデルでは、黄斑変性症、網膜色素変性症、および網膜剥離で見られるように光受容体が死滅していた（網膜剥離後に網膜下腔注入を行った）。硝子体内への注入について研究するために、ＦＡＣＳで精製したＶＳＥＬｓを赤色蛍光染料ＰＫＨ２６で標識し、網膜神経節細胞毒素ＮＭＤＡで前処理し麻酔したマウスの硝子体腔に注入した（マウスあたり約２，０００個のＶＳＥＬｓ）。網膜下への注入について研究するために、濃縮したＶＳＥＬｓ（調製物は０．１％〜１１％の純度）を赤色蛍光染料ＰＫＨ２６で標識し、網膜下腔に注入し（マウスあたり約１０，０００個の細胞）、注入部位に網膜剥離を引き起こした。
【００５９】
免疫蛍光顕微鏡による眼球切片の解析。
注入から４週間後、マウスを安楽死させて摘出を行った。眼を４％パラホルムアルデヒドで固定し、スクロースを含むリン酸緩衝液で凍結保護し、クライオスタット上で８μｍにスライスした。組織切片を、Ｋｉ６７、ネスチン、およびＰＡＸ６などの網膜幹細胞および発生段階の前駆細胞のマーカー、ＭＡＰ２およびβ３チューブリンなどの神経外胚葉細胞のマーカー、および初期の光受容体マーカーであるリカバリン、ならびに光受容体マーカーであるロドプシンについて免疫染色した。また、切片の一部は、ヒト核マーカーＳＲＰ１４について染色し、ＰＫＨ２６標識を欠くヒト細胞の存在を決定した。切片を従来の共焦点顕微鏡で観察した。
【００６０】
以下の細胞生存についての研究では、２種のＳＣＩＤマウス網膜疾患モデルについて調べた：１つは、網膜神経節細胞が死滅しており緑内障などの疾患をモデル化したもの（網膜毒素を注入後に硝子体内注入を行った）で、もう１つは、光受容体が死滅しており黄斑変性、網膜色素変性症、および網膜剥離などの状態をモデル化したもの（網膜剥離後に網膜下腔注入を行った）である。精製および濃縮したＬｉｎ-ＣＤ４５-ＣＤ３４／ＣＤ１３３+ヒトＶＳＥＬｓの集団は、ＰＨＫ２６で容易に標識でき、移植後蛍光顕微鏡により特異的にトレースできる。移植細胞は、ＳＣＩＤマウスにおいて４週間良い状態で生存した。硝子体内に移植した細胞は、内境界膜に付着する傾向があり網膜内には移動しなかった一方、網膜下腔に注入した細胞は、光受容体の外顆粒層まで移動した証拠が示された。網膜下腔に移植した細胞は、網膜系譜に従って分化するという証拠も示された。
【００６１】
ヒトＶＳＥＬｓは、硝子体内注入後のＳＣＩＤマウス眼球の微小環境で生存する。
凍結ＶＳＥＬｓを解凍し、ＰＫＨ２６で標識し、その後、網膜神経節細胞毒素であるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）で前処理したＳＣＩＤマウスの硝子体内に注入した。移植から４週間後、各眼を８０〜１００個の切片に切断して、合計約６００個の切片（図２）について共焦点蛍光顕微鏡により計数した。ＰＨＫ陽性細胞の平均数は切片あたり１３個で、推定生存率は３０％超であった。
【００６２】
網膜下腔に注入した濃縮ＶＳＥＬｓは、網膜内で生存し移動する。
凍結した濃縮ＶＳＥＬｓを解凍し、ＰＫＨ２６で標識し、その後、ＳＣＩＤマウスの網膜下腔内に注入し、注入部位に網膜剥離を引き起こした。移植から２および４週間後、眼をスライスし、ＰＫＨ２６+細胞の存在について調べた（図３）。ＰＫＨ２６+細胞は、網膜下腔および網膜内の両方で見られ、これらの細胞は移動し始めていたことが示された。
【００６３】
移植細胞の一部は、網膜分化のマーカーを示す。
切片を、網膜幹細胞および発生段階の前駆細胞のマーカー（中間径フィラメントタンパク質であるネスチンおよび転写因子ＰＡＸ６）、神経外胚葉細胞のマーカー（両者とも細胞骨格マーカーであるＭＡＰ２およびβ３チューブリン）、および初期の光受容体マーカーであるリカバリン（細胞質タンパク質）について染色することにより、移植細胞が網膜系譜に従って分化した証拠について検査した。また、切片を遍在性の核（ＨｕＮ）および細胞質（ＳＲＰ１４）タンパク質に対するヒト特異的抗体で染色し、ＰＫＨ２６マーカーを欠いているであろう移植細胞を同定した。図４Ａに見られるように、かなりの数の細胞で、ＰＫＨ２６およびＳＲＰ１４染色が共局在していることが示される。他の細胞で、ＳＲＰ１４の単一染色、つまりＰＫＨ２６染色されていないヒト細胞であることが示される。
【００６４】
移植細胞の一部は網膜分化のマーカーを示す。
切片を、網膜幹細胞および発生段階の前駆細胞のマーカー（中間径フィラメントタンパク質であるネスチンおよび転写因子ＰＡＸ６）、神経外胚葉細胞のマーカー（両者とも細胞骨格マーカーであるＭＡＰ２およびβ３チューブリン）、および初期の光受容体マーカーであるリカバリン（細胞質タンパク質）について染色することにより、移植細胞が網膜系譜に従って分化した証拠について検査した。また、切片を遍在性の核（ＨｕＮ）および細胞質（ＳＲＰ１４）タンパク質に対するヒト特異的抗体で染色し、ＰＫＨ２６マーカーを欠いているであろう移植細胞を同定した。図４Ａに見られるように、かなりの数の細胞で、ＰＫＨ２６およびＳＲＰ１４染色が共局在していることが示される。他の細胞で、ＳＲＰ１４の単一染色、つまりＰＫＨ２６染色されていないヒト細胞であることが示される。
【図２Ａ】
2015520174.tif 000003
【図２Ｂ】
2015520174.tif 000004
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2015520174.tif 000007
【図１】
2015520174.tif 000008
【図４Ａ−４Ｂ】
2015520174.tif 000009
【図４Ｃ−４Ｄ】
2015520174.tif 000010
【図４Ｅ−４Ｆ】
2015520174.tif 000011
【国際調査報告】
2015520174.tif 000012
2015520174.tif 000013