(57)【要約】本発明は、ｃｃ−クリスタリン凝集の阻害剤と、例えば白内障を有しまたは白内障を発症するリスクがある被験体の白内障を処置または予防するのにｃｃ−クリスタリン凝集阻害剤を使用する方法とを提供する。本発明はさらに、タンパク質の熱安定性をモジュレートするための化合物をスクリーニングするハイスループット方法であって、タンパク質と、複数の試験化合物それぞれとを接触させるステップと；（ｂ）該複数の試験化合物それぞれの存在下で該タンパク質の融解転移点（Ｔｍ）を測定するステップとを含み、見掛けのＴｍを少なくとも２標準偏差低下または上昇させる化合物が薬理学的タンパク質シャペロンとして同定される、ハイスループット方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
白内障を処置または予防する方法であって、それを必要とする個体に、式Ｉの化合物：
【化９】
2015529646.tif 000021
（式中：
両方のＲ１はＨであり、または両方のＲ１はＭｅであり；
Ｒ２はＨまたはＯＨであり；
炭素５と６との間の破線は任意選択の二重結合を示し；
Ｒ３はＨまたはＭｅであり；
Ｒ４はＨまたはＭｅであり；
ｎは０または１であり；
（ａ）Ｒ６は
【化１０】
2015529646.tif 000022
であり、各Ｒ５は独立してＨもしくはＭｅであり、または（ｂ）Ｒ６および１個のＲ５は一緒になって、必要に応じて置換された６員環を形成し、他方のＲ５はＭｅであり；
炭素１２と１３との間の破線は任意選択の二重結合であり、但しＲ７は、炭素１２と１３との間の二重結合が存在する場合には存在せず、およびＲ７は、炭素１２と１３との間の二重結合が存在しない場合にはＨまたはＭｅであることを条件とし；
Ｒ８はＨまたはＯＨであり；
両方のＲ９は一緒になってオキソ（＝Ｏ）を形成し、または両方のＲ９は水素であり；
Ｒ１０は、ＣＯ２Ｈまたは直鎖状もしくは分枝状Ｃ１〜Ｃ６アルキルである）、
またはそのプロドラッグもしくは薬学的に許容される塩を含む組成物の有効量を投与するステップを含む、白内障を処置または予防する方法。
【請求項２】
前記式Ｉの化合物が、式ＩＡまたは式ＩＢの構造：
【化１１】
2015529646.tif 000023
（式中、各Ｒ１１は独立して、アルキル、ＣＯ２Ｈ、またはＣＯ２アルキルである）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、式ＩＩの構造：
【化１２】
2015529646.tif 000024
（式中、Ｒ１２はＨまたはＯＨであり、Ｒ１３はＨまたはＯＨである）
を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が５−コレスチン−３ｂ，２５−ジオールである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が、局所的、結膜下、眼球後部、眼周囲、網膜下、脈絡膜上、または眼内に投与される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記白内障が加齢性白内障または糖尿病性白内障である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記個体が、早発性白内障の遺伝形式を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記個体が、ｃｒｙＡＢにＲ１２０Ｇ変異および／またはＤ１０９Ｈ変異を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
薬学的に許容される眼科用キャリアと、式Ｉの化合物：
【化１３】
2015529646.tif 000025
（式中：
両方のＲ１はＨであり、または両方ともＭｅであり；
Ｒ２はＨまたはＯＨであり；
炭素５と６との間の破線は任意選択の二重結合を示し；
Ｒ３はＨまたはＭｅであり；
Ｒ４はＨまたはＭｅであり；
ｎは０または１であり；
（ａ）Ｒ６は
【化１４】
2015529646.tif 000026
であり、各Ｒ５は独立してＨもしくはＭｅであり、または（ｂ）Ｒ６および１個のＲ５は一緒になって、必要に応じて置換された６員環を形成し、他方のＲ５はＭｅであり；
炭素１２と１３との間の破線は任意選択の二重結合であり、但しＲ７は、炭素１２と１３との間の二重結合が存在する場合には存在せず、およびＲ７は、炭素１２と１３との間の二重結合が存在しない場合にはＨまたはＭｅであることを条件とし；
Ｒ８はＨまたはＯＨであり；
両方のＲ９は一緒になってオキソ（＝Ｏ）を形成し、または両方のＲ９は水素であり；
Ｒ１０は、ＣＯ２Ｈまたは直鎖状もしくは分枝状Ｃ１〜Ｃ６アルキルである）、
またはそのプロドラッグもしくは薬学的に許容される塩とを含む、眼科用医薬組成物。
【請求項１０】
前記式Ｉの化合物が、式ＩＡまたは式ＩＢの構造：
【化１５】
2015529646.tif 000027
（式中、各Ｒ１１は独立して、アルキル、ＣＯ２Ｈ、またはＣＯ２アルキルである）
を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記化合物が、式ＩＩの構造：
【化１６】
2015529646.tif 000028
（式中、Ｒ１２はＨまたはＯＨであり、Ｒ１３はＨまたはＯＨである）
を有する、請求項９または請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記化合物が５−コレスチン−３ｂ，２５−ジオールである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記薬学的に許容される眼科用キャリアがシクロデキストリンである、請求項９から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記シクロデキストリンが（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
タンパク質の熱安定性をモジュレートするための化合物をスクリーニングするハイスループット方法であって：
（ａ）タンパク質と、複数の試験化合物それぞれとを接触させるステップと；
（ｂ）該複数の試験化合物それぞれの存在下で該タンパク質の融解転移点（Ｔｍ）を測定するステップとを含み、見掛けのＴｍを少なくとも２標準偏差低下または上昇させる化合物が薬理学的タンパク質シャペロンである、ハイスループット方法。
【請求項１６】
前記タンパク質が、アミロイド形成タンパク質、または機能喪失疾患の基礎をなすタンパク質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アミロイド形成タンパク質が、Ｈｓｐ２７、αＡ−クリスタリン、αＢ−クリスタリン、βＢ２−クリスタリン、βＢ１−クリスタリン、γＤ−クリスタリン、Ｈｓｐ２２、Ｈｓｐ２０、タウ、α−シヌクレイン、ＩＡＰＰ、β−アミロイド、ＰｒＰ、ハンチンチン、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、アポリポタンパク質ＡＩ、血清アミロイドＡ、メディン、プロラクチン、トランスサイレチン、リゾチーム、β２ミクログロブリン、ゲルソリン、ケラトエピセリン、シスタチン、免疫グロブリン軽鎖ＡＬ、およびＳ−ＩＢＭからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
機能喪失疾患の基礎をなす前記タンパク質が、変異型β−グルコシダーゼ、嚢胞性線維症膜貫通受容体、ヘキソサミニダーゼＡ、ヘキソサミニダーゼＢ、β−ガラクトシダーゼ、およびα−グルコシダーゼからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｔｍが、ハイスループット示差走査蛍光定量デバイスを使用して決定される、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記測定するステップが：
（ｂ１）複数の試験化合物それぞれの存在下で、５０℃から８０℃に前記タンパク質を加熱するステップと、
（ｂ２）該タンパク質を２５℃に冷却するステップと、
（ｂ３）該タンパク質を２５℃で１０秒間維持するステップと、
（ｂ４）該タンパク質の蛍光を測定するステップと
を含む、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ１）〜（ｂ４）を２から３０回の間で繰り返すことをさらに含み、ステップ（ｂ１）のそれぞれの繰返しは、段階的に高くなる温度で行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記アミロイド形成タンパク質が、６５℃から８０℃まで１℃ずつ上昇させて加熱される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ｂ１）が、加熱後に前記アミロイド形成タンパク質と試験化合物とを６０から１８０秒の間平衡化させるステップをさらに含む、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記平衡化させるステップが１３０秒である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）アミロイド形成タンパク質と；
（ｂ）該アミロイド形成タンパク質の融解転移点（Ｔｍ）を測定することが可能なデバイスと；
（ｃ）複数の試験化合物と
を含む、ハイスループットスクリーニングシステム。
【請求項２６】
前記タンパク質が、Ｈｓｐ２７、αＡ−クリスタリン、αＢ−クリスタリン、βＢ２−クリスタリン、βＢ１−クリスタリン、γＤ−クリスタリン、Ｈｓｐ２２、Ｈｓｐ２０、タウ、α−シヌクレイン、ＩＡＰＰ、β−アミロイド、ＰｒＰ、ハンチンチン、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、アポリポタンパク質ＡＩ、血清アミロイドＡ、メディン、プロラクチン、トランスサイレチン、リゾチーム、β２ミクログロブリン、ゲルソリン、ケラトエピセリン、シスタチン、免疫グロブリン軽鎖ＡＬ、およびＳ−ＩＢＭからなる群から選択される、請求項２５に記載のスクリーニングシステム。
【請求項２７】
前記デバイスが、ハイスループット示差走査蛍光定量デバイスである、請求項２５または請求項２６に記載のスクリーニングシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、米国仮特許出願第６１／６７２，５６９号（２０１２年７月１７日出願）に対する優先権を主張する。この米国仮特許出願は、その全体が本明細書により参照により組み込まれる。
政府の利益に関する記載
本発明は、国立衛生研究所により与えられたＲＲ０２４９８６の下、政府の支援によって行われた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本開示は一般に、α−クリスタリン凝集の阻害剤、その使用、およびタンパク質凝集の治療上有効なモジュレーターをスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
白内障、または眼水晶体の混濁は、８０才以上の全成人の半数以上が罹患する状態であり、米国では約２５００万人の患者がその状態に苦しんでいる。さらに白内障は、全世界における失明の主な原因と考えられている。αＡ−クリスタリン（ｃｒｙＡＡ：αＡ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ）およびαＢ−クリスタリン（ｃｒｙＡＢ：αＢ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ）は、眼水晶体のタンパク質含量の３０パーセントを構成し、それらが水晶体の透明度の維持に関与する（Ｈａｓｌｂｅｃｋら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １２巻、８４２頁（２００５年））。ｃｒｙＡＡおよびｃｒｙＡＢは、保存されたクリスタリンドメインを含有する小型熱ショックタンパク質（ｓＨＳＰ：ｓｍａｌｌ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の種類に属する（Ｂｌｏｅｍｅｎｄａｌら、Ｐｒｏｇ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８６巻、４０７頁（２００４年）；Ｈａｓｌｂｅｃｋ、上掲）。ひとたび合成されると、これら水晶体のｓＨＳＰは分解されることがなく、したがっていかなる損傷も生涯にわたって蓄積され、最終的には加齢に関連した白内障をもたらす（Ｈａｓｌｂｅｃｋ、上掲；Ｐｅｒｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４巻、３３２３５頁（１９９９年）；Ｍｅｅｈａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９巻、３４１３頁（２００４年）；Ｍｅｅｈａｎら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３７２巻、４７０頁（２００７年））。同様に、Ｒ１２０ＧなどのｃｒｙＡＢにおける不安定化させる変異が、早発性白内障の遺伝形式をもたらす（Ｖｉｃａｒｔら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０巻、９２頁（１９９８年））。遺伝性白内障では、ｃｒｙＡＢが凝集しやすく、アミロイド様原線維がｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成される（Ａｎｄｌｅｙら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６巻、ｅ１７６７１頁（２０１１年））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｈａｓｌｂｅｃｋら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １２巻、８４２頁（２００５年）
【非特許文献２】Ｂｌｏｅｍｅｎｄａｌら、Ｐｒｏｇ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８６巻、４０７頁（２００４年）
【非特許文献３】Ｐｅｒｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４巻、３３２３５頁（１９９９年）
【非特許文献４】Ｍｅｅｈａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９巻、３４１３頁（２００４年）
【非特許文献５】Ｍｅｅｈａｎら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３７２巻、４７０頁（２００７年）
【非特許文献６】Ｖｉｃａｒｔら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０巻、９２頁（１９９８年）
【非特許文献７】Ａｎｄｌｅｙら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６巻、ｅ１７６７１頁（２０１１年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在、白内障の処置は、混濁した水晶体を切除して人工代替物を挿入する手術を含む。手術は費用がかかる可能性があり、全ての患者に適切であるわけではない。タンパク質凝集の基礎をなすメカニズムを標的とする療法は、これらの患者に利益をもたらすと考えられる。したがって当技術分野では、ｃｒｙＡＢなどの凝集傾向にあるタンパク質が病的な凝集体（例えば、白内障に関連した凝集体）を形成するのを阻止する、治療薬および治療薬のためのスクリーニング方法が、依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、白内障を処置または予防する方法であって、それを必要とする個体に、式Ｉの化合物：
【化１】
2015529646.tif 000002
（式中：
両方のＲ１はＨであり、または両方のＲ１はＭｅであり；
Ｒ２はＨまたはＯＨであり；
炭素５と６との間の破線は任意選択の二重結合を示し；
Ｒ３はＨまたはＭｅであり；
Ｒ４はＨまたはＭｅであり；
ｎは０または１であり；
（ａ）Ｒ６は
【化２】
2015529646.tif 000003
であり、各Ｒ５は独立してＨもしくはＭｅであり、または（ｂ）Ｒ６および１個のＲ５は一緒になって必要に応じて置換された６員環を形成し、他方のＲ５はＭｅであり；
炭素１２と１３との間の破線は任意選択の二重結合であり、但しＲ７は、炭素１２と１３との間の二重結合が存在する場合には存在せず、およびＲ７は、炭素１２と１３との間の二重結合が存在しない場合にはＨまたはＭｅであることを条件とし；
Ｒ８はＨまたはＯＨであり；
両方のＲ９は一緒になってオキソ（＝Ｏ）を形成し、または両方のＲ９は水素であり；
Ｒ１０は、ＣＯ２Ｈまたは直鎖状もしくは分枝状Ｃ１〜Ｃ６アルキルである）、
またはそのプロドラッグもしくは薬学的に許容される塩を含む組成物の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【０００７】
本発明は、薬学的に許容される眼科用キャリアおよび式Ｉの化合物を含む、眼科用医薬組成物も提供する。
【０００８】
方法および／または組成物の様々な態様では、式Ｉの化合物は、式ＩＡまたは式ＩＢの構造：
【化３】
2015529646.tif 000004
（式中、各Ｒ１１は独立して、アルキル、ＣＯ２Ｈ、またはＣＯ２アルキルである）を有する。
【０００９】
方法および／または組成物のより具体的な態様では、化合物は、式ＩＩの構造：
【化４】
2015529646.tif 000005
（式中、Ｒ１２はＨまたはＯＨであり、Ｒ１３はＨまたはＯＨである）
を有する。方法および／または組成物の一態様では、化合物は５−コレスチン（ｃｈｏｌｅｓｔｉｎ）−３ｂ，２５−ジオールである。
【００１０】
方法の様々な態様では、組成物は、局所的、結膜下、眼球後部、眼周囲、網膜下、脈絡膜上、または眼内に投与される。方法の様々な態様では、白内障は、加齢性白内障または糖尿病性白内障である。方法のいくつかの態様では、個体は、早発性白内障の遺伝形式を持つ。方法のより具体的な態様では、個体は、ｃｒｙＡＢにおけるＲ１２０Ｇ変異および／またはＤ１０９Ｈ変異を有する。
【００１１】
組成物のいくつかの態様では、薬学的に許容される眼科用キャリアはシクロデキストリンである。特定の態様では、シクロデキストリンは（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンである。
【００１２】
さらに本発明は、タンパク質の熱安定性をモジュレートするための化合物をスクリーニングするハイスループット方法であって：（ａ）タンパク質と、複数の試験化合物それぞれとを接触させるステップと；（ｂ）複数の試験化合物それぞれの存在下でタンパク質の融解転移点（Ｔｍ）を測定するステップとを含み、見掛けのＴｍを、少なくとも２標準偏差、低下または上昇させる化合物が薬理学的タンパク質シャペロンである、ハイスループット方法を包含する。
【００１３】
方法の様々な態様では、タンパク質は、アミロイド形成タンパク質または機能喪失疾患の基礎をなすタンパク質である。いくつかの態様では、アミロイド形成タンパク質は、Ｈｓｐ２７、αＡ−クリスタリン、αＢ−クリスタリン、βＢ２−クリスタリン、βＢ１−クリスタリン、γＤ−クリスタリン、Ｈｓｐ２２、Ｈｓｐ２０、タウ、α−シヌクレイン、ＩＡＰＰ、β−アミロイド、ＰｒＰ、ハンチンチン、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、アポリポタンパク質ＡＩ、血清アミロイドＡ、メディン、プロラクチン、トランスサイレチン、リゾチーム、β２ミクログロブリン、ゲルソリン、ケラトエピセリン、シスタチン、免疫グロブリン軽鎖ＡＬ、およびＳ−ＩＢＭからなる群から選択される。その他の態様では、機能喪失疾患の原因となるタンパク質は、変異型β−グルコシダーゼ、嚢胞性線維症膜貫通受容体、ヘキソサミニダーゼＡ、ヘキソサミニダーゼＢ、β−ガラクトシダーゼ、およびα−グルコシダーゼからなる群から選択される。
【００１４】
方法のいくつかの態様では、Ｔｍは、ハイスループット示差走査蛍光定量デバイスを使用して決定される。
【００１５】
方法の一態様では、測定ステップは：（ｂ１）複数の試験化合物それぞれの存在下で、５０℃から８０℃にタンパク質を加熱するステップと、（ｂ２）タンパク質を２５℃に冷却するステップと、（ｂ３）タンパク質を２５℃で１０秒間維持するステップと、（ｂ４）タンパク質の蛍光を測定するステップとを含む。
【００１６】
様々な態様では、方法は、ステップ（ｂ１）〜（ｂ４）を２から３０回の間で繰り返すことをさらに含み、ステップ（ｂ１）のそれぞれの繰返しは、段階的に高くなる温度で行われる。特定の態様では、アミロイド形成タンパク質は、６５℃から８０℃まで１℃ずつ上昇させて加熱する。その他の態様では、（ｂ１）は、加熱後にアミロイド形成タンパク質と試験化合物とを６０から１８０秒の間で平衡化させるステップをさらに含む。方法の様々な態様では、平衡化させるステップは１３０秒である。
【００１７】
さらに本発明は：（ａ）アミロイド形成タンパク質と；（ｂ）アミロイド形成タンパク質の融解転移点（Ｔｍ）を測定することが可能なデバイスと；（ｃ）複数の試験化合物とを含む、ハイスループットスクリーニングシステムを含む。
【００１８】
スクリーニングシステムの様々な態様では、タンパク質は、Ｈｓｐ２７、αＡ−クリスタリン、αＢ−クリスタリン、βＢ２−クリスタリン、βＢ１−クリスタリン、γＤ−クリスタリン、Ｈｓｐ２２、Ｈｓｐ２０、タウ、α−シヌクレイン、ＩＡＰＰ、β−アミロイド、ＰｒＰ、ハンチンチン、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、アポリポタンパク質ＡＩ、血清アミロイドＡ、メディン、プロラクチン、トランスサイレチン、リゾチーム、β２ミクログロブリン、ゲルソリン、ケラトエピセリン、シスタチン、免疫グロブリン軽鎖ＡＬ、およびＳ−ＩＢＭからなる群から選択される。
【００１９】
スクリーニングシステムのいくつかの態様では、デバイスは、ハイスループット示差走査蛍光定量デバイスである。
【００２０】
本明細書に開示される方法のいずれかにおける構造式Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、またはＩＩのいずれか１つの化合物の使用、または本明細書に開示される方法のいずれかにより投与するための医薬の調製が、特に企図される。この点に関し、本発明は、白内障を処置または予防する方法で使用される構造式Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、またはＩＩのいずれか１つの化合物を提供し、ここで、該方法は、白内障の処置または予防を必要とする個体に有効量の該化合物を投与するステップを含む。
【００２１】
本開示のその他の特徴および利点は、以下の詳細な記述から明らかになる。しかし、本開示の精神および範囲内の様々な変更および修正が、この詳細な記述から当業者に明らかにされるので、この詳細な記述および特定の例は、本開示の具体的な実施形態を示してはいるが単なる例として提供されることを理解すべきである。文書全体は、一つにまとめられた開示として関係付けられることを意図しており、特徴の組合せがこの文書の同じ文章または段落または章で一緒に見出されない場合であっても、本明細書に記述される特徴の全ての組合せが企図されることを理解すべきである。上記の内容に加え、本発明は、追加の態様として、特に上記にて述べられた変形例（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）よりも多少なりともその範囲が狭い、本発明の全ての実施形態を含む。例えば、本発明の態様が特徴を「含む」と記述される場合、実施形態は、特徴「からなる」または特徴「から本質的になる」ことも企図される。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、α−クリスタリン凝集の阻害剤と、例えば白内障を有しまたは白内障を発症するリスクがある被験体の白内障を処置または予防するのにα−クリスタリン凝集阻害剤を使用する方法とを提供する。本発明のα−クリスタリン凝集の阻害剤は、例えば、式Ｉ、式ＩＡ、式ＩＢ、および式ＩＩによって表されるステロールであり、薬学的に許容される眼科用キャリアを含む眼科用医薬組成物として製剤化されてもよい。白内障は、人口の極めて大部分（８０才以上の全成人の半数以上）が患い、主な処置は外科的介入であるので、本明細書に記述された発見は、白内障の処置に利用可能な非外科的方法の著しい前進を示す。さらに、現在使用されている多くの非外科的処置は、α−クリスタリンのさらなる凝集を阻害する傾向がある。注目すべきは、本発明の化合物が、α−クリスタリンの凝集を逆転させ、α−クリスタリンのさらなる凝集を阻害できることである。
【００２３】
本発明はさらに、タンパク質の熱安定性をモジュレートする化合物をスクリーニングするハイスループット方法であって、タンパク質と複数の試験化合物それぞれとを接触させるステップと；複数の試験化合物それぞれの存在下でタンパク質の融解転移点（Ｔｍ）を測定するステップとを含み、見掛けのＴｍを少なくとも２標準偏差低下または上昇させる化合物が薬理学的タンパク質シャペロンとして同定される、ハイスループット方法を提供する。
【００２４】
白内障を処置または予防する方法
いくつかの実施形態において、本発明は、白内障を処置または予防する方法であって、それを必要とする個体に、構造式Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、もしくはＩＩのいずれか１つの化合物または例えば表１の化合物を含む組成物の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、白内障は、加齢性白内障、糖尿病性白内障、手術に関連した白内障、放射線への曝露によってもたらされた白内障、遺伝性の病気によってもたらされた白内障、感染によってもたらされた白内障、または薬物処置によってもたらされた白内障である。いくつかの実施形態では、個体は、早発性白内障の遺伝形式を持つ。例えば、白内障の遺伝形式には、ｃｒｙＡＢにＲ１２０Ｇ変異および／またはＤ１０９Ｈ変異がある個体が含まれる。
【００２５】
本発明による処置「を必要とする」個体は、白内障に罹患した個体である。例えば、個体は、加齢性白内障または糖尿病であることによってもたらされた白内障を有していてもよい。同様に、本発明による処置「を必要とする」個体は、白内障を発症するリスクのある個体である。白内障を発症するリスクのある個体には、白内障を発症する家族歴がある個体、早発性白内障に関連する変異を有する個体、例えばｃｒｙＡＢにＲ１２０Ｇ変異および／またはＤ１０９Ｈ変異がある個体、放射線や糖尿病などに曝された個体が挙げられるが、これらに限定するものではない。例えば一態様では、個体が片眼に白内障があると診断されると、反対側の眼における白内障の形成を予防しまたは遅くするために化合物が投与される。
【００２６】
白内障の「処置」では、白内障を１００％消滅させる必要はない。同様に「予防」は、白内障の形成を１００％阻害する必要はない。混濁のいくらかの低下または白内障の進行の減速は、被験体において有益な生物学的効果を構成する、これに関し、本発明は、本発明の方法を用いない場合に観察されたレベルに比べて（例えば、本発明の方法の化合物に曝されていない、生物学的に適合した対照被験体または標本で）、白内障を例えば少なくとも約５％、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％低減させる。いくつかの実施形態では、白内障は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ超（約１００％）低減される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法による白内障の「処置」は、本発明の方法を用いない場合に観察されたレベルに比べて（例えば、本発明の方法の化合物に曝されていない、生物学的に適合した対照被験体または標本で）、白内障の形成を例えば少なくとも約５％、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％阻害する。いくつかの実施形態では、白内障の形成は、本発明の方法の化合物を用いない場合の白内障の形成に比べて、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ超（約１００％）阻害される。白内障は一般に、視力検査、眼底検査、細隙灯検査、角膜曲率測定、眼圧測定、造影検査、グレア感度、波面マッピングを含むがこれらに限定されない、いくつかの光学試験のいずれかを使用して検出される。
【００２８】
構造式Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、もしくはＩＩのいずれか１つの化合物または表１の化合物を含む組成物の「有効量」は、個体におけるｃｒｙＡＢなどのアミロイド形成タンパク質の凝集を阻害しまたは低減させる量である。凝集の阻害では、凝集を１００％阻害する必要はない。凝集のいくらかの阻害は、被験体において有益な生物学的効果を構成する。これに関し、本発明は、本発明の方法を用いない場合に観察されたレベルに比べて（例えば、本発明の方法の化合物に曝されていない、生物学的に適合した対照被験体または標本で）、アミロイド形成タンパク質の凝集を例えば少なくとも約５％、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％阻害する。いくつかの実施形態では、アミロイド凝集体の形成は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％阻害される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、本発明の方法の化合物を用いない場合のアミロイド形成に比べて、アミロイド形成を少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ超（約１００％）阻害する。
【００２９】
同様に、凝集を低減させるための「有効量」は、凝集を１００％消滅させる必要はない。凝集のいくらかの低減は、被験体において有益な生物学的効果を構成する。これに関し、本発明は、本発明の方法を用いない場合に観察されたレベルに比べて（例えば、本発明の方法の化合物に曝されていない、生物学的に適合した対照被験体または標本で）、アミロイド形成タンパク質の凝集を例えば少なくとも約５％、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％低減させる。いくつかの実施形態では、アミロイド凝集体は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％低減される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、本発明の方法の化合物を用いない場合のアミロイド凝集体に比べて、アミロイド凝集体を少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ超（約１００％）低減させる。
【００３０】
投与経路
当業者に理解されるように、被験体に化合物を投与する最も適切な方法は、いくつかの要因に左右される。様々な実施形態において、本発明による化合物は、眼に限局的に投与され、例えば局所的、結膜下、眼球後部、眼周囲、網膜下、脈絡膜上、または眼内に投与される。例えば、様々な実施形態では、組成物は、注射を介して眼に限局的に送達される。注射液は、微細な針を使用して、角膜、水晶体、および硝子体、またはそれらに隣接する組織に直接注射することができる。組成物は、眼内潅流液として投与することもできる。
【００３１】
さらに企図される投与経路としては：経口（例えば、錠剤、カプセル剤として、または摂取可能な溶液として）、粘膜（例えば、吸入用の鼻スプレーまたはエアロゾルとして）、鼻、非経口（例えば、注射可能な形態によって）、胃腸、脊髄内、腹腔内、筋肉内、静脈内、子宮内、皮内、頭蓋内、気管内、膣内、脳室内、脳内、皮下、経皮、直腸、口腔（ｂｕｃｃａｌ）、硬膜外、および舌下の１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定するものではない。
【００３２】
いくつかの実施形態では、眼に本発明の組成物を送達するための方式は、コンタクトレンズを介する。レンズは、所望の化合物で前処理されて提供されてもよい。あるいはレンズは、再形成するための凍結乾燥した粉末としてまたは濃縮された溶液もしくはすぐに使用可能な溶液として提供される、コーティングされたレンズを調製するための構成要素を備えたキットで提供される。組成物は、単回または複数回使用のためのキットとして提供することができる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、眼に本発明の組成物を送達するための方式は、点眼棒を介する（Ｇｗｏｎら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．１９８６年９月；９３巻（増補９）：８２〜５頁）。いくつかの実施形態では、眼に本発明の組成物を送達するための方式は、眼内レンズ−ヒドロゲルアセンブリを介する（Ｇａｒｔｙら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、２０１１年８月３日；５２巻（９号）：６１０９〜１６頁）。
【００３４】
用量
化合物を含む組成物は、医学的に許容されるレベルの毒性で所望の生物学的効果を実現する、治療上有効な量で提供される。組成物の投薬量は、投与経路および疾患の重症度に応じて変えてもよい。投薬量は、処置がなされる各患者の体重、年齢、性別、および／または症状の程度に応じて調節されてもよい。正確な用量および投与経路は、最終的には担当医師または獣医師の裁量に任せられる。患者の年齢および体重、ならびに処置される状態の重症度に応じて、投薬量には日常的な変化を付けることが必要となり得ることが理解されよう。投与頻度は、製剤および上記のパラメータに依存する。例えば、１日に少なくとも１回、１日に２、３、４、または５回も含めて、点眼剤を施用することが望ましい場合がある。
【００３５】
眼経路を介してヒト（体重約７０ｋｇ）に投与するための化合物の例示的な用量は、単位用量当たりの化合物が０．１ｍｇから１ｇ、例えば１ｍｇから５００ｍｇである。様々な実施形態では、用量は、約１μｇ／ｋｇ体重から１５ｍｇ／ｋｇ体重である。例えば、用量は、１μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２０μｇ／ｋｇ、１４０μｇ／ｋｇ、１６０μｇ／ｋｇ、１８０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇとすることができる。全身経路を介してヒト（体重約７０ｋｇ）に投与するための化合物の例示的な用量は、単位用量当たりの化合物が０．１ｍｇから５ｇ、例えば１ｍｇから２．５ｇである。
【００３６】
式Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、もしくはＩＩの化合物または表１に列挙された化合物の好ましい濃度は、約１μｇ／ｍｌから５００μｇ／ｍｌに及び、例えば約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約７０μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ、約９０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１２０μｇ／ｍｌ、約１４０μｇ／ｍｌ、約１６０μｇ／ｍｌ、約１８０μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ、約３００μｇ／ｍｌ、約３５０μｇ／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ、約４５０μｇ／ｍｌ、または約５００μｇ／ｍｌである。阻害剤は、その他の薬学的に活性な作用物質（ａｇｅｎｔ）を組み合わせて提供されてもよい。
【００３７】
本発明による組成物は、適切な希釈剤で使用前に希釈される濃縮物としてまたはすぐに使用可能な濃度で、容器に入れて提供される。好ましくは、単回投薬量は滅菌バイアルに入れて提供される。
【００３８】
白内障の処置または予防に有効な化合物
様々な実施形態において、本発明の方法または組成物の化合物は、式Ｉの化合物：
【化５】
2015529646.tif 000006
（式中：
両方のＲ１はＨであり、または両方のＲ１はＭｅであり；
Ｒ２はＨまたはＯＨであり；
炭素５と６との間の破線は任意選択の二重結合を示し；
Ｒ３はＨまたはＭｅであり；
Ｒ４はＨまたはＭｅであり；
ｎは０または１であり；
（ａ）Ｒ６は
【化６】
2015529646.tif 000007
であり、各Ｒ５は独立してＨもしくはＭｅであり、または（ｂ）Ｒ６および１個のＲ５は一緒になって必要に応じて置換された６員環を形成し、他方のＲ５はＭｅであり；
炭素１２と１３との間の破線は任意選択の二重結合であり、但しＲ７は、炭素１２と１３との間の二重結合が存在する場合には存在せず、およびＲ７は、炭素１２と１３との間の二重結合が存在しない場合にはＨまたはＭｅであることを条件とし；
Ｒ８はＨまたはＯＨであり；
両方のＲ９は一緒になってオキソ（＝Ｏ）を形成し、または両方のＲ９は水素であり；
Ｒ１０は、ＣＯ２Ｈまたは直鎖状もしくは分枝状Ｃ１〜Ｃ６アルキルである）
である。
【００３９】
例えば、本発明の方法または組成物の化合物は、式ＩＡまたは式ＩＢの化合物：
【化７】
2015529646.tif 000008
（式中、各Ｒ１１は独立して、アルキル、ＣＯ２Ｈ、またはＣＯ２アルキルである）
である。
【００４０】
様々な実施形態において、化合物は、式ＩＩの構造：
【化８】
2015529646.tif 000009
（式中、Ｒ１２はＨまたはＯＨであり、Ｒ１３はＨまたはＯＨである）
を有する。いくつかの実施形態では、化合物は５−コレスチン−３ｂ，２５−ジオールである。
【００４１】
あるいは、化合物は、表１に列挙された化合物である。
【００４２】
上記化合物の任意のプロドラッグまたは薬学的に許容される塩は、本発明の範囲内にあることが企図される。
【表１−１】
2015529646.tif 000010
【表１−２】
2015529646.tif 000011
【表１−３】
2015529646.tif 000012
【表１−４】
2015529646.tif 000013
【表１−５】
2015529646.tif 000014
【表１−６】
2015529646.tif 000015
【表１−７】
2015529646.tif 000016
【表１−８】
2015529646.tif 000017
【表１−９】
2015529646.tif 000018
【００４３】
医薬組成物
本発明はさらに、構造式Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、もしくはＩＩのいずれか１つの化合物または表１に列挙された化合物、および薬学的に許容される眼科用キャリア、例えば薬学的に許容される賦形剤、キャリア、結合剤、および／または希釈剤を含む組成物を含む。必要に応じて組成物は、構造式Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、もしくはＩＩのいずれか１つの化合物または表１に列挙された化合物の、遊離酸、遊離塩基、塩（例えば、酸または塩基付加塩）、水和物、またはプロドラッグを含む。プロドラッグは、キャリア部分に共有結合された、構造式Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、もしくはＩＩのいずれか１つの化合物または表１に列挙された化合物を含む材料である。キャリア部分は、構造式Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、もしくはＩＩのいずれか１つの化合物または表１に列挙された化合物が得られるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、構造式Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、もしくはＩＩのいずれか１つの化合物または表１に列挙された化合物から放出させることができる。プロドラッグの形態は、Ｓｌｏａｎ，  Ｋ．  Ｂ．、Ｐｒｏｄｒｕｇｓ、Ｍ．  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年；およびＴｅｓｔａ，  Ｂ．およびＭａｙｅｒ，  Ｊ．  Ｍ．、Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｚｕｒｉｃｈ、２００３年で具体化されるように、当技術分野で周知である。
【００４４】
様々な実施形態において、組成物は、点眼剤、注射液、または眼軟膏として製剤化された、構造式Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、もしくはＩＩのいずれか１つの化合物または表１に列挙された化合物を含む。これらの医薬組成物は、従来の方法に従って、必要に応じて賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、バッファ、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、および溶解助剤などの適切な医薬添加剤を用いて化合物を混合し、希釈し、または溶解し、剤形に応じて従来の手法で製剤化することによって、製剤化することができる。例えば点眼剤は、界面活性剤を溶解させた滅菌水に化合物を溶解し、必要に応じて保存剤、安定化剤、バッファ、抗酸化剤、および粘度向上剤などの適切な医薬添加剤を添加することによって、製剤化することができる。いくつかの実施形態では、組成物はシクロデキストリンを含む。特定の実施形態では、シクロデキストリンは（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンである。
【００４５】
生理学的に許容されるバッファには、リン酸バッファまたはＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよびＨＣｌを含む）が含まれるが、これらに限定するものではない。例えば、ｐＨ７．４のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファは、３ｇ／ｌのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび０．７６ｇ／ｌのＨＣｌを含む。さらに別の態様では、バッファは、１０×リン酸緩衝食塩液（「ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ」）または５×ＰＢＳ溶液である。
【００４６】
その他のバッファには、２５℃でｐＫａが７．５でありｐＨが約６．８〜８．２の範囲のＨＥＰＥＳ（Ｎ−｛２−ヒドロキシエチル｝ピペラジン（ｐｅｐｅｒａｚｉｎｅ）−Ｎ’−｛２−エタンスルホン酸｝）；２５℃でｐＫａが７．１でありｐＨが約６．４〜７．８の範囲のＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス｛２−ヒドロキシエチル｝２−アミノエタンスルホン酸）；２５℃でｐＫａが７．２でありｐＨが約６．５〜７．９の範囲のＭＯＰＳ（３−｛Ｎ−モルホリノ｝プロパンスルホン酸）；２５℃でｐＫａが７．４でありｐＨが約６．８〜８．２の範囲のＴＥＳ（Ｎ−トリス｛ヒドロキシメチル｝−メチル−２−アミノエタンスルホン酸）；２５℃でｐＫａが７．６でありｐＨが約６．９〜８．３の範囲のＭＯＢＳ（４−｛Ｎ−モルホリノ｝ブタンスルホン酸）；２５℃でｐＫａが７．５２でありｐＨが約７〜８．２の範囲のＤＩＰＳＯ（３−（Ｎ，Ｎ−ビス｛２−ヒドロキシエチル｝アミノ）−２−ヒドロキシプロパン））；２５℃でｐＫａが７．６１でありｐＨが約７〜８．２の範囲のＴＡＰＳＯ（２−ヒドロキシ−３｛トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ｝−１−プロパンスルホン酸））；２５℃でｐＫａが８．４でありｐＨが約７．７〜９．１の範囲のＴＡＰＳ（｛（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ｝−１−プロパンスルホン酸））；２５℃でｐＫａが８．９でありｐＨが約８．２〜９．６の範囲のＴＡＢＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸）；２５℃でｐＫａが９．０でありｐＨが約８．３〜９．７の範囲のＡＭＰＳＯ（Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））；２５℃でｐＫａが９．５でありｐＨが約８．６〜１０．０の範囲のＣＨＥＳ（２−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）；２５℃でｐＫａが９．６でありｐＨが約８．９〜１０．３の範囲のＣＡＰＳＯ（３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）；および２５℃でｐＫａが１０．４でありｐＨが約９．７〜１１．１の範囲のＣＡＰＳ（３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸）をベースにしたバッファが含まれるが、これらに限定するものではない。
【００４７】
活性剤を制御放出するためのいくつかの有効な方法が、利用可能である。例えば、参照によりその内容が本明細書に組み込まれる、Ｗａｇｈ  Ｖ．  Ｄ．、Ｉｎａｍｄａｒ  Ｂ．、Ｓａｍａｎｔａ  Ｍ．  Ｋ．、Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｏｃｕｌａｒ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ａｓｉａｎ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ２巻、２００８年、１２〜１７頁およびそこに引用された参考文献を、参照されたい。ポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ：ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）およびヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ：ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）などのセルロース誘導体、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ：ｐｏｌｙ（ａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリアクリレート、シクロデキストリン、および天然ゴム、ポリオルトエステル（ＰＯＥ：ｐｏｌｙｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ）、および粘膜付着性ポリマー）；ゲル、フィルム、およびその他の挿入物などの半固体；イオン交換樹脂などの樹脂；イオン泳動送達物；ならびにミクロスフィアおよびナノ粒子などのコロイド粒子の使用が、特に企図される。
【００４８】
本発明の化合物は、その他の治療剤と組み合わせて提供されてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、疼痛寛解剤、麻酔剤、人工涙液、酵素阻害剤、サイトカイン阻害剤、抗炎症剤、または抗生剤と共製剤化されてもよい。いくつかの実施形態では、抗生剤は、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原虫剤、またはこれらの組合せである。
【００４９】
様々な実施形態において、本発明の化合物は、Ａｃｕｌａｒ（ケトロラックトロメタミン点眼液）０．５％、Ａｃｕｖａｉｌ（ケトロラックトロメタミン）、ＡＫ−Ｃｏｎ−Ａ（ナファゾリン眼科用）、Ａｋｔｅｎ（塩酸リドカイン）、Ａｌａｍａｓｔ、Ａｌｐｈａｇａｎ（ブリモニジン）、Ａｌｒｅｘ、Ａｓｔｅｐｒｏ（塩酸アゼラスチン鼻スプレー）、ＡｚａＳｉｔｅ（アジスロマイシン）、Ｂｅｐｒｅｖｅ（ベシル酸ベポタスチン点眼液）、Ｂｅｓｉｖａｎｃｅ（ベシフロキサシン眼科用懸濁液）、Ｂｅｔａｘｏｎ、ＢＳＳ滅菌灌注溶液、Ｃｏｓｏｐｔ、Ｄｕｒｅｚｏｌ（ジフルプレドネート）、Ｅｙｌｅａ（アフリベルセプト）、Ｌｏｔｅｍａｘ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（ラニビズマブ）、Ｌｕｍｉｇａｎ（ビマトプロスト点眼液）、Ｍａｃｕｇｅｎ（ペガプタニブ）、Ｏｃｕｆｌｏｘ（オフロキサシン点眼液）０．３％、ＯｃｕＨｉｓｔ、Ｏｚｕｒｄｅｘ（デキサメタゾン）、Ｑｕｉｘｉｎ（レボフロキサシン）、Ｒｅｓｃｕｌａ（ウノプロストンイソプロピル点眼液）０．１５％、Ｒｅｓｔａｓｉｓ（シクロスポリン眼科用エマルジョン）、Ｓａｌａｇｅｎ錠、Ｔｒａｖａｔａｎ（トラボプロスト点眼液）、Ｖａｌｃｙｔｅ（バルガンシクロビルＨＣｌ）、Ｖｉｒｏｐｔｉｃ、Ｖｉｓｔｉｄｅ（シドフォビル）、Ｖｉｓｕｄｙｎｅ（注射用ベルテポルフィン）、Ｖｉｔｒａｓｅｒｔインプラント、Ｖｉｔｒａｖｅｎｅ注射剤、ＺＡＤＩＴＯＲ、Ｚｉｏｐｔａｎ（タフルプロスト点眼液）、Ｚｉｒｇａｎ（ガンシクロビル眼科用ゲル）、Ｚｙｍａｘｉｄ（ガチフロキサシン点眼液）、アトロピン、フルルビプロフェン、フィソスチミン（Ｐｈｙｓｏｓｔｉｍｉｎｅ）、エイゾプト、ゲンタマイシン、ピロカルピン、バシトラシン、ゴニオソル（Ｇｏｎｉｏｓｏｌ）、ポリミキシンＢ、ベタジン、グラミシジン、プレドニゾロン、ベタキソロール、フモルソル（Ｈｕｍｏｒｓｏｌ）、プロパラカイン、ベトプティック、ヒラルチン（Ｈｙｌａｒｔｉｎ）、プロピン（Ｐｒｏｐｉｎｅ）、ブリンゾラミド、高張ＮａＣｌ、ピュラルーブ、ＢＳＳ、インドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙｃａｎｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ）、ローズベンガル、カルバコール、イトラコナゾール、ヒアルロン酸ナトリウム、セファゾリン、ラタノプロスト、スプロフェン、セルビスク、マンニトール、テラマイシン、クロラムフェニコール、メタゾラミド、チモロール、シロキサン、ミコナゾール、トブラマイシン、シプロフロキサシン、ミオスタット（Ｍｉｏｓｔａｔ）、トリアムシノロン、コソプト、Ｍｕｒｏ  １２８、トリフルリジン、デメカリウム、ネオマイシン、トロピカミド、デキサメタゾン、ネプタザン、トルソプト、ジピベフリン、オキュフロックス、ビダラビン、ドルゾラミド、オフロキサシン、Ｖｉｒａ−Ａ、エピネフリン、オキシテトラサイクリン、ビロプティック、フルオレセイン、フェニレフリン、およびキサラタンからなる群から選択される眼科用治療薬と組み合わせて提供されてもよい。
【００５０】
スクリーニング方法およびシステム
様々な実施形態において、本発明は、タンパク質の熱安定性をモジュレートする化合物をスクリーニングするハイスループット方法を包含する。方法は、（ａ）タンパク質と、複数の試験化合物それぞれとを接触させるステップと；（ｂ）複数の試験化合物それぞれの存在下でタンパク質の融解転移点（Ｔｍ）を測定するステップとを含み、見掛けのＴｍを少なくとも２標準偏差低下または上昇させる化合物が、薬理学的タンパク質シャペロンである。様々な実施形態において、見掛けのＴｍを少なくとも３標準偏差低下または上昇させる化合物は、薬理学的タンパク質シャペロンである。
【００５１】
タンパク質の熱安定性をモジュレートする作用物質は、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）を使用して同定することができる。ＤＳＦでは、タンパク質標的の融解転移点（Ｔｍ）を、潜在的リガンドの存在下で測定する。ＤＳＦは、内在性トリプトファンまたは色素、例えば１，８−アニリノナフタレンスルホン酸（ａｎｉｌｉｎｏｎａｐｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ）（ビス−ＡＮＳ）またはＳｙｐｒｏオレンジの蛍光を介して標的タンパク質の熱によるアンフォールディングを測定する。リガンドの結合は、折畳み状態または重要な中間体に自由エネルギーを加え、それがアンフォールディングを制限し、見掛けのＴｍをシフトさせる。したがっていくつかの実施形態では、融解転移点は、ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ（登録商標）３８４−ウェルＤＳＦプラットフォームまたはリアルタイムＰＣＴサーモサイクラなどのハイスループット示差走査蛍光定量デバイスを使用して決定される。
【００５２】
スクリーニング方法の様々な実施形態において、融解転移点が測定されるステップは、下記のステップ：（ｂ１）複数の試験化合物それぞれの存在下で、タンパク質を、５０℃から８０℃に加熱するステップと、（ｂ２）タンパク質を２５℃に冷却するステップと、（ｂ３）タンパク質を２５℃で１０秒間維持するステップと、（ｂ４）タンパク質の蛍光を測定するステップとを含む。より具体的な実施形態では、方法は、ステップ（ｂ１）〜（ｂ４）を２から３０回の間で繰り返すことをさらに含み、ステップ（ｂ１）のそれぞれの繰返しは、段階的に高くなる温度で行われる。例えば、１回目の反復中、タンパク質は、試験化合物の存在下で６５℃に加熱され、２５℃に冷却されてその温度で約１０秒間維持した後に、タンパク質の蛍光を測定する。２回目の反復中、タンパク質を、試験化合物の存在下で６６℃に加熱し、２５℃に冷却してその温度で約１０秒間維持した後、タンパク質の蛍光を測定する。このプロセスを、タンパク質が加熱されるピーク温度を上昇させて、例えば１℃ずつ上昇させて、繰り返す（例えば、２から３０回の間）。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ１）中、タンパク質を、６０から１８０秒の間、ピーク温度で平衡化する。方法の特定の実施形態では、平衡化ステップが１３０秒である。
【００５３】
スクリーニング方法の様々な実施形態では、融解転移点が測定されるステップは、タンパク質の蛍光を連続的に測定しながら、複数の試験化合物それぞれの存在下でタンパク質を８０℃に徐々に加熱するステップを含む。
【００５４】
スクリーニング方法の様々な態様では、タンパク質はアミロイド形成タンパク質である。一般に、タンパク質がアミロイド形成タンパク質である場合、所望のモジュレーターは、タンパク質の融解転移点を低下させる。そのようなモジュレーターは、非アミロイド形態のタンパク質を安定化させる。いくつかの実施形態では、アミロイド形成タンパク質は、Ｈｓｐ２７、αＡ−クリスタリン（白内障）、αＢ−クリスタリン（白内障）、βＢ２−クリスタリン（白内障）、βＢ１−クリスタリン（白内障）、γＤ−クリスタリン（白内障）、Ｈｓｐ２２、Ｈｓｐ２０、タウ、α−シヌクレイン（パーキンソン病）、ＩＡＰＰ（糖尿病２型）、β−アミロイド（アルツハイマー病）、ＰｒＰ（伝達性海綿状脳症）、ハンチンチン（ハンチントン病）、カルシトニン（甲状腺の髄様癌）、心房性ナトリウム利尿因子（孤立性心房性アミロイドーシス）、アポリポタンパク質ＡＩ（アテローム性動脈硬化症）、血清アミロイドＡ（関節リウマチ）、メディン（大動脈中膜アミロイド）、プロラクチン（プロラクチノーマ）、トランスサイレチン（家族性アミロイド多発ニューロパシー）、リゾチーム（遺伝性非神経障害性全身性アミロイドーシス）、β２ミクログロブリン（透析関連のアミロイドーシス）、ゲルソリン（フィンランド型アミロイドーシス）、ケラトエピセリン（格子状角膜ジストロフィー）、シスタチン（脳アミロイド血管症：アイスランド型）、免疫グロブリン軽鎖ＡＬ（全身性ＡＬアミロイドーシス）、ミオシリン（緑内障）、およびＳ−ＩＢＭ（孤発性封入体筋炎）からなる群から選択される。
【００５５】
スクリーニング方法のいくつかの実施形態では、タンパク質は、機能喪失疾患の基礎をなすタンパク質である。一般に、タンパク質が機能喪失疾患の基礎をなすタンパク質である場合、所望のモジュレーターは、タンパク質の融解転移点を上昇させる。そのようなモジュレーターは、活性であり続けるように（すなわち、タンパク質の分解が低減される）タンパク質の変異型形態を安定化させる。機能喪失疾患の基礎をなすタンパク質は、例えば、変異型β−グルコシダーゼ、変異型グルコシルセラミダーゼ（ゴーシェ病）、変異型嚢胞性線維症膜貫通受容体（嚢胞性線維症）、変異型ヘキソサミニダーゼＡ（テイサックス病）、変異型ヘキソサミニダーゼＢ（サンドホフ病）、変異型β−ガラクトシダーゼ（モルキオ症候群）、および変異型α−グルコシダーゼ（すなわち、ポンペ病）とすることができる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明は：（ａ）アミロイド形成タンパク質と；（ｂ）アミロイド形成タンパク質の融解転移点（Ｔｍ）を測定することが可能なデバイスと；（ｃ）複数の試験化合物とを含む、ハイスループットスクリーニングシステムを含む。アミロイド形成タンパク質のＴｍを測定することが可能なデバイスは、当技術分野で公知の任意のデバイスとすることができる。上記のように、いくつかの実施形態では、デバイスは、ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ（登録商標）３８４−ウェルＤＳＦプラットフォームなどの示差走査蛍光定量デバイスである。スクリーニングシステムの様々な態様では、タンパク質は、Ｈｓｐ２７、αＡ−クリスタリン、αＢ−クリスタリン、βＢ２−クリスタリン、βＢ１−クリスタリン、γＤ−クリスタリン、Ｈｓｐ２２、Ｈｓｐ２０、タウ、α−シヌクレイン、ＩＡＰＰ、β−アミロイド、ＰｒＰ、ハンチンチン、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、アポリポタンパク質ＡＩ、血清アミロイドＡ、メディン、プロラクチン、トランスサイレチン、リゾチーム、β２ミクログロブリン、ゲルソリン、ケラトエピセリン、シスタチン、免疫グロブリン軽鎖ＡＬ、およびＳ−ＩＢＭからなる群から選択される。
【実施例】
【００５７】
下記は、本明細書に記述される方法の様々な態様の、非限定的な実施例である。実施例は、その多くの変形例が可能であるように、例示のためだけに与えられるものであり本開示を限定すると解釈するものではない。
【００５８】
（実施例１）
この実施例は、例示的な凝集傾向にあるタンパク質、Ｈｓｐ２７を安定化させる化合物をスクリーニングする、ハイスループット方法について記述する。
【００５９】
示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を利用して、ｃｒｙＡＢを安定化させる化合物を同定した。ＤＳＦ実験では、タンパク質標的の融解転移点（Ｔｍ）を、潜在的リガンドの存在下で測定する（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  １１巻、８５４頁（２００６年））。ＤＳＦは、内在性トリプトファンまたは（より一般的には）色素、例えば１，８−アニリノナフタレンスルホン酸（ビス−ＡＮＳ）もしくはＳｙｐｒｏオレンジの蛍光を介して、標的タンパク質の熱によるアンフォールディングを測定する。リガンドの結合は、折畳み状態または重要な中間体に自由エネルギーを加え、アンフォールディングを制限し、見掛けのＴｍをシフトさせる。これらの値を使用して、アンフォールディング転移を計算する。化合物が加熱前に標的に結合する場合、化合物はアンフォールディングに抗して安定化させ、ΔＴｍをシフトさせる。ｃｒｙＡＢおよびｃｒｙＡＢ  Ｒ１２０Ｇ変異体の場合、アミロイドはこのプラットフォームでより高い見掛けの安定性を典型的には有するので、見掛けのＴｍを低下させる化合物が求められた。例えば、野生型ｃｒｙＡＢのＴｍは６４．１±０．５℃であり、それに対して、よりアミロイド傾向のあるＲ１２０Ｇ  ｃｒｙＡＢ変異体は、６８．３±０．２℃（３）の見掛けのＴｍを有していた。この差は、Ｒ１２０Ｇの高いアミロイド傾向に相関していた。したがって、見掛けのＴｍを低下させるスクリーニング「ヒット」は凝集を抑制し得ると推論された。
【００６０】
小型化３８４−ウェルＤＳＦプラットフォーム（ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ（登録商標））を使用して、２，４４６種の化合物を、ｓＨＳＰの凝集を阻止するその能力に関してスクリーニングした。モデルとして、ＨＴＳのためにヒトＨｓｐ２７を使用したが、それはヒトＨｓｐ２７がアミロイドを容易に形成し、全てのｓＨＳＰに見出される高度に保存されたクリスタリンドメインを保持するからである。Ｈｓｐ２７は室温で可溶であったが、熱によりアンフォールディングし、加熱によって安定なアミロイドを急速に形成した。
【００６１】
スクリーニングは、７μＬの体積の、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．４、７００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＬｉＣｌ中の１０μＭ  Ｈｓｐ２７、および１００μＭ  ビス−ＡＮＳを用い、Ａｂｇｅｎｅブラック３８４−ウェルＰＣＲプレート中で行った。反応物をシリコーン（ｓｉｌｉｃｏｎ）油で覆い、蒸発を制限した。対照試験は、アッセイが最大４％ＤＭＳＯまで耐えたが、１％を最終濃度として使用したことを示唆した。プレートをアップ／ダウンモードで測定したが、これは、連続勾配モード（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｒａｍｐ  ｍｏｄｅ）よりも良好な信号対雑音比が得られるように経験的に決定されたものである。プレートを６５℃から８０℃まで１℃ずつ加熱し、各高温で１３０秒間平衡化し、２５℃に冷却し、２５℃で１０秒間保持した後、各温度の読取りごとに、１回１０秒の露出で撮像した。プレート均一性試験は、７２．３±０．１６℃でＨｓｐ２７のＴｍを測定した。Ｚ因子は約０．５９から０．７１の間で変化するように計算し、ＣＶは８％であった。変動のほとんどは、いくらかの「エッジ効果」から生ずるようであった。
【００６２】
各ウェルについて、一連の蛍光対温度の点を得、プロットし、当てはめて、Ｔｍを決定した。自動化方法がＭａｔＬａｂで開発されたが、これは個々の当てはめを行い、次いで３つの独立した当てはめ方法（Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ導関数、Ｓ字状曲線、および平行ベースライン（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂａｓｅｌｉｎｅ）Ｈｉｌｌ）がどの程度緊密に一致するかに基づいて、各試験ウェルをランク付けする。
【００６３】
１次スクリーニングから、３標準偏差よりも大きく（−３ＳＤ；約０．６℃）見掛けのＴｍを低下させる４５種の化合物を同定し、４５種の化合物は、Ｔｍを＋３ＳＤ上昇させた。これら化合物の９０種全てを用量依存性実験で調査して、それらの活性を確認し、それらの研究から、６４種は５０μＭよりも低い活性を有していた。見掛けのＴｍを３標準偏差よりも大きく低下させることが同定された４５種の化合物を、１２点用量依存アッセイで試験し、２０μＭ未満の濃度でΔＴｍを確認し、シフトさせた２８種が提供された。興味深いことに、これら２８種のうち１２種は、関連あるステロールの単一構造クラスの一部であった。この骨格は、さらなる調査のために選択した。
【００６４】
まとめると、これらの研究は、ｃｒｙＡＢなどのアミロイド形成タンパク質の薬理学的シャペロンを同定するための堅牢な手段として、ＨＴＳ法を検証する。実際に、研究は、高い（例えば、ポンペ病に関与するα−グルコシダーゼの変異形態などの機能喪失型タンパク質）または低い安定性（ハンチンチンなどの凝集傾向にあるタンパク質）が望まれる任意のタンパク質に関してＴｍをモジュレートする作用物質を見出すための、ＨＴＳ法を検証する。
【００６５】
（実施例２）
この実施例は、実施例１の１次スクリーニングで同定されたステロール骨格の構造活性関係（ＳＡＲ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）の研究について記述する。以下にさらに記述されるように、ＳＡＲは、アミロイド形成タンパク質、Ｒ１２０Ｇ  ｃｒｙＡＢのＴｍを少なくとも２℃低下させる化合物に関する一般的化学構造（式Ｉ）を明らかにした。
【００６６】
１７−ａ−ヒドロキシ−プロゲステロンに関係した化学構造を有する３２種のステロールを収集し、さらなる試験に供した（表２参照）。この注目される集団に対し、Ｒ１２０Ｇ  ｃｒｙＡＢを使用してＤＳＦ実験を行い、Ｔｍを少なくとも２℃低下させる２種の化合物：５ａ−コレスタン−３ｂ−オール−６−オンおよび５−コレステン−３ｂ，２５−ジオールが同定された。その他の密接に関係するステロールの多くは、コレステロールも含め、不活性であり、得られたＳＡＲは非常に特異的な分子相互作用を裏付けていた。
【表２】
2015529646.tif 000019
【００６７】
５ａ−コレスタン−３ｂ−オール−６−オン、５−コレステン−３ｂ，２５−ジオール、およびコレステロールによるさらなる用量依存性研究は、５ａ−コレスタン−３ｂ−オール−６−オンおよび５−コレステン−３ｂ，２５−ジオールが共に野生型Ｔｍを部分的に回復できることを示したが、これは、薬理学的シャペロンとしてそれらが有用であることを示していた。別個の実験プラットフォームでｃｒｙＡＢとの直接的な相互作用を確認するために、バイオレイヤー干渉法（実施例１に記述された）を使用して、５−コレステン−３ｂ，２５−ジオールが１０．１±４．４μＭのＫＤでＲ１２０Ｇ  ｃｒｙＡＢに結合することを決定した。バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ）により試験タンパク質の親和性を測定することによって、偽陽性の同定が可能になる。簡単に言うと、ビオチン化したｃｒｙＡＢを、ストレプトアビジンでコーティングしたピンに固定し、１００倍濃度範囲の全体にわたる平衡会合データを解析して見掛けのＫＤを生成する。非特異的結合を制御するために、ビオシチン遮断ピンの応答を、各センサーグラムから差し引く。
【００６８】
まとめると、上記の結果は、式Ｉの化合物が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲ１２０Ｇ  ｃｒｙＡＢの薬理学的シャペロンとして機能し、高親和性で結合することを実証する。さらに結果は、開示されたＤＳＦ法が、非酵素のための新規な薬理学的シャペロンを同定するための堅牢なハイスループットスクリーニングシステムであることを示す。
【００６９】
（実施例３）
この実施例は、実施例１で同定された化合物がアミロイド形成を抑制することを実証する。重要なことには、化合物は、アミロイド形成を逆転させることもできる。
【００７０】
ＤＳＦ研究は、ステロールがＲ１２０Ｇ  ｃｒｙＡＢアミロイド形成を抑制することを示唆した。この考えを試験するために、Ｒ１２０Ｇ  ｃｒｙＡＢ（１５μＭ）を５−コレステン−３ｂ，２５−ジオールまたはコレステロール（１００μＭ）で処理し、その凝集能力を電子顕微鏡法により測定した。これらの研究は、５−コレステン−３ｂ，２５−ジオールがアミロイド形成を劇的に抑制するが、コレステロールや溶媒対照はそうではないことを確認した。溶液の目視検査は、５−コレステン−３ｂ，２５−ジオールのみがＲ１２０Ｇ  ｃｒｙＡＢ混合物の不透明度を低減させたので、この結論を裏付けていた。さらに５−コレステン−３ｂ，２５−ジオールは、あらかじめ形成させたＲ１２０Ｇ  ｃｒｙＡＢアミロイドの凝集も逆転させたが、このことは、それが平衡を非アミロイド構造に向けてシフトさせることを示唆した。
【００７１】
５−コレステン−３ｂ，２５−ジオールの作用機序を調査するために、Ｒ１２０Ｇ  ｃｒｙＡＢ上の結合部位を１５Ｎ  ＨＳＱＣ  ＮＭＲによって調査し、得られた化学シフトの解析は、保存されたクリスタリンドメインの露出面にそれが結合することを示唆した。特に５−コレステン−３ｂ，２５−ジオールは、ｃｒｙＡＢダイマー界面の全体にわたる溝に結合し、Ｒ１２０およびＤ１０９付近の残基と接触する。
【００７２】
上記結果は、ステロールがｓＨＳＰを安定化しアミロイド形成を低減させるモデルを支持する。
【００７３】
（実施例４）
この実施例は、本明細書で同定された化合物が、ｉｎ  ｖｉｖｏで白内障表現型を逆転させることを実証する。
【００７４】
Ｒ１２０Ｇ  ｃｒｙＡＢノックインマウスは、加齢に関連した白内障および遺伝性白内障の、臨床上許容されるモデルである。動物モデルは、２０週以内で重度の白内障を発症する（Ａｎｄｌｅｙら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６巻、ｅ１７６７１頁（２０１１年））。これらのマウスから切除した眼を、５−コレステン−３ｂ，２５−ジオール（１００μＭ）または食塩液対照で処理した。５−コレステン−３ｂ，２５−ジオールでの処理は、ｃｒｙＡＢの凝集を有意に低減させ、ｃｒｙＡＢの溶解度を改善した。
【００７５】
次いで５−コレステン−３ｂ，２５−ジオールを、食塩液−シクロデキストリン溶液（５ｍＭシクロデキストラン；５ｍＭ  ５−コレステン−３ｂ，２５−ジオール）に製剤化し、生きている動物（ｎ＝１５）に、２週間にわたって１週間に３回、点眼器により送達した。ｃｒｙＡＢ溶解度および水晶体の透明度を、生きている動物でスリット水晶体イルミネーションを測定することによって、およびゲル浸透クロマトグラフィ／水晶体ホモジネートからの光散乱によって決定した。この処置は、ｃｒｙＡＢの溶解度を有意に改善し、水晶体の透明度を改善し、１０／１５の処置したＲ１２０Ｇ  ｃｒｙＡＢノックインマウスの白内障表現型を救った。このように、５−コレステン−３ｂ，２５−ジオール、より一般には式Ｉの化合物は、白内障の処置に関する有望な治療薬である。より広範には、これらの研究は、ＤＳＦをベースにしたＨＴＳキャンペーンを使用して、ｃｒｙＡＢなどの非酵素のための薬理学的シャペロンを同定することができることを示唆する。
【００７６】
（実施例５）
この実施例は、本明細書で同定された化合物が、眼内での可溶性α−クリスタリンのレベルを上昇させることを実証する。
【００７７】
食塩液−シクロデキストリン溶液（５ｍＭシクロデキストラン；５ｍＭ  ５−コレステン−３ｂ，２５−ジオール）に製剤化された５−コレステン−３ｂ，２５−ジオールを、生きているマウス（ｎ＝１５）に２週間にわたって、１週間に３回点眼器により送達した。α−クリスタリン溶解度のゲル濾過分析は、Ａｎｄｌｅｙら（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、６巻：３号、１〜１３頁（２０１１年））により既に記述されたように、サンプルを加工することによって実施した。簡単に言うと、α−クリスタリンの凝集の程度は、光散乱および屈折率（ＲＩ：ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）測定を伴うゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ：ｇｅｌ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を使用して決定した。全てのデータを、ＳＡＳバージョン９．３（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して解析した。動物間でのアッセイ感受性の差を制御するために、薬物で処置した眼におけるα−クリスタリンに関する曲線下面積を、もう片方の未処置の眼から生成した曲線下面積と比較し、分母に未処置の眼を使用して、面積の差の「パーセント」として表した。処置した眼と未処置の眼との間の差のパーセントを、差のない帰無仮説に関するＷｉｌｃｏｘｏｎ符号順位検定を使用して比較した。日齢と差のパーセントとの間の関連を、Ｓｐｅａｒｍａｎ順位相関係数を使用して計算した。ノンパラメトリック統計モデルを使用して、正規性からの逸脱を防いだ。
【００７８】
α−クリスタリンの曲線下面積は、薬物処置した眼において、もう片方の処置していない眼よりも統計的に有意に高いことがわかった（ｎ＝１７、差の平均パーセント＝３８１．２±９７４．６、メジアン＝６３．３、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ符号順位ｐ値＝０．００１）。老齢マウスでは、未処置の眼よりも処置した眼において、α−クリスタリンが高いパーセンテージで増加したことが実証された（Ｓｐｅａｒｍａｎ順位相関＝０．４４、ｐ＝０．０７５）。表１のデータは、日齢が２００日より大きい場合、差のメジアンパーセントに顕著な増加を示す。
【表１Ａ】
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【００７９】
データは、式Ｉの化合物、５−コレステン−３ｂ，２５−ジオールが、特に加齢被験体で、ｉｎ  ｖｉｖｏでα−クリスタリンの溶解度を有意に増加させ、それによって白内障形成の基礎をなすメカニズムが標的とされることを明らかにする。
【００８０】
任意の相互参照されたまたは関係ある特許または出願も含めた、本明細書に引用された全ての文書は、明らかに除外しない限りまたは他に限定しない限り、その全体を参照により本明細書に組み込む。任意の文書の引用は、本明細書において開示されまたは特許請求される任意の発明に関して従来技術であることを認めるものではなく、あるいは単独でまたは任意のその他の１つまたは複数の参考文献との任意の組合せによって、任意のそのような発明を教示し示唆しまたは開示することを認めるものではない。さらに、本文書の用語の任意の意味または定義が、参照により組み込まれた文書の同じ用語の任意の意味または定義と矛盾する範囲では、本文書の用語に割り当てられた意味または定義が支配するものとする。
【００８１】
開示された主題の特定の実施形態を例示し記述してきたが、特許請求される主題の精神および範囲から逸脱することなく、様々なその他の変更および修正を行うことができることが当業者に明らかにされよう。したがって、そのような変更および修正の全ては、添付される特許請求の範囲に包含されるものとする。
【国際調査報告】
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2015529646.tif 000031
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