(57)【要約】  本発明は、CNS内の標的に選択的に結合する抗体部分、およびアプロチニン由来ポリペプチドを含有する、タンパク質コンジュゲートに関するが、このアプロチニン由来ポリペプチドは血液脳関門を越えるコンジュゲートの輸送を促進する。タンパク質コンジュゲートは、さらに、リンカーの含有；それぞれの抗体部分にコンジュゲートされたポリペプチドの数；抗体部分とポリペプチドがコンジュゲートしている位置；ならびにコンジュゲートの大規模な立体配置（すべてのポリペプチドは抗体部分とのみ結合している）によって、特徴付けられる。修飾されたアプロチニン由来ポリペプチド、リンカーと結合した抗体部分、医薬組成物、キット、およびタンパク質コンジュゲートを作製して使用する方法も、本発明の特徴をなす。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体部分、およびアミノ酸配列Thr1- Phe2- Phe3- Tyr4- Gly5- Gly6- Cys7/Ser7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19（配列番号117）を含有するポリペプチド、または生物活性のあるそのアナログもしくは断片を含んでなるタンパク質コンジュゲートであって、該抗体部分が該ポリペプチド上の次の位置：N末端アミノ酸残基；C末端アミノ酸残基；またはN末端とC末端の間のリジン残基、のうち1カ所または数カ所で該ポリペプチドとコンジュゲートしている、前記タンパク質コンジュゲート。
【請求項２】
抗体部分とポリペプチドの間にリンカーをさらに有する、請求項１に記載のタンパク質コンジュゲート。
【請求項３】
リンカーが第1級アミンと反応する基を含有する、請求項２に記載のタンパク質コンジュゲート。
【請求項４】
リンカーがモノフルオロシクロオクチン（MFCO）、ビシクロ[6.1.0]ノニン（BCN）、S-アセチルチオ酢酸N-スクシンイミジル（SATA）、S-アセチルチオプロピオン酸N-スクシンイミジル（SATP）、マレイミド、またはジベンゾシクロオクチン（DBCO）である、請求項２に記載のタンパク質コンジュゲート。
【請求項５】
ポリペプチドがアミノ酸配列Thr1- Phe2- Phe3- Tyr4- Gly5- Gly6- Cys7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19（配列番号67）を含有する、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
ポリペプチドがアミノ酸配列Thr1- Phe2- Phe3- Tyr4- Gly5- Gly6- Ser7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19（配列番号97）を含有する、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
コンジュゲートが配列番号117のアナログを含有する、請求項1に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
配列番号117のアナログが、配列番号117と比べて変化していない少なくとも13個のアミノ酸残基を含有する、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
配列番号117のアナログが、Lys10および/またはLys15が不変のままである配列を含有する、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
配列番号117のアナログにおいて、Asn12がGlnで置換され、Asn13がGlnで置換され、ならびに/またはPhe14がTyrもしくはTrpで置換されている、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
配列番号117のアナログが、配列Phe3- Tyr4- Gly5- Gly6- Cys7/Ser7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19- Cys（配列番号118）；Gly5- Gly6- Ser7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19- Cys（配列番号119）；Ser7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19- Cys（配列番号120）；Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19- Cys（配列番号121）；またはLys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Tyr19- Cys（配列番号122）を含んでいる、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
ポリペプチドが配列番号117の断片を含有する、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
断片が配列番号117の少なくとも6個のアミノ酸残基を含有する、請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
断片がLys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15（配列番号123）である、請求項１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
断片が配列番号117の6〜18個の連続したアミノ酸残基を含有する、請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
ポリペプチドが、D型、L型、または両方の型のアミノ酸残基を含有する、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
コンジュゲートが1〜10個のポリペプチド、および1つの抗体部分を含有する、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
コンジュゲートが2〜6個のポリペプチド、および1つの抗体部分を含有する、請求項１７に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
各ポリペプチドは、リンカーを介して抗体部分に連結されており、いずれのポリペプチドも、リンカーを介していようがいまいが、別のポリペプチドとは結合していない、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
抗体部分が四量体抗体であるか、または生物活性のあるそのバリアントである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
抗体部分が、一本鎖抗体（scFv）、Fabフラグメント、またはF(ab')2フラグメントである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
抗体部分が、ヒト抗体、キメラ抗体、もしくはヒト化抗体部分、または生物活性のあるそれらのバリアントを含んでいる、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項２３】
抗体部分が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
四量体抗体、生物活性のあるそのバリアント、scFv、Fabフラグメント、もしくはF(ab')2フラグメントが、増殖因子受容体またはインターロイキン受容体に特異的に結合する、請求項２０または２１に記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
増殖因子受容体が、上皮増殖因子受容体（EGFR）ファミリーのメンバーである、請求項２４に記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
抗体部分が、トラスツズマブ、セツキシマブ、もしくはパニツムマブ、または生物活性のあるそれらのバリアントである、請求項２５に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
増殖因子受容体が、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）である、請求項２４に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
抗体部分が、ベバシズマブもしくはラニビズマブ、または生物活性のあるそれらのバリアントである、請求項２７に記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
インターロイキン受容体がIL-2受容体である、請求項２４に記載のコンジュゲート。
【請求項３０】
抗体部分がバシリキシマブもしくはダクリズマブ、または生物活性のあるそれらのバリアントである、請求項２９に記載のコンジュゲート。
【請求項３１】
インターロイキン受容体がIL-6受容体である、請求項２４に記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
抗体部分が、トシリズマブ、または生物活性のあるそのバリアントである、請求項３１に記載のコンジュゲート。
【請求項３３】
増殖因子受容体がTNFα受容体である、請求項２４に記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
抗体部分が、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、もしくはインフリキシマブである、請求項３３に記載のコンジュゲート。
【請求項３５】
抗体部分が化学療法薬である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３６】
抗体部分が抗炎症薬である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３７】
請求項1に記載のコンジュゲート、および製薬上許容される基剤を含有する医薬組成物。
【請求項３８】
組成物が静脈内投与用に製剤される、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
中枢神経系のがんに罹っている患者を治療する方法であって、治療を必要とする患者を識別すること；ならびに請求項３７に記載の医薬組成物を治療上有効な量、患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項４０】
患者がヒト患者である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
がんが脳腫瘍または脳転移である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
アミノ酸配列Thr1- Phe2- Phe3- Tyr4- Gly5- Gly6- Cys7/Ser7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19（配列番号117）、または生物活性のあるそのアナログもしくは断片を含むポリペプチドに、抗体部分をコンジュゲートする方法であって、
(a) リンカーと結合した抗体部分を提供すること；
(b) 修飾型ポリペプチドを提供すること；ならびに
(c) 抗体部分、リンカー、およびポリペプチドを含むタンパク質コンジュゲートを生じる条件下で、修飾型ポリペプチドに、リンカーと結合した抗体部分を暴露すること、
を含む前記方法。
【請求項４３】
リンカーと結合した抗体部分の作製が、
(a) 抗体部分を提供すること；ならびに
(b) リンカーと結合した抗体部分を生じる条件下で、抗体部分をリンカーに暴露すること
を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
修飾型ポリペプチドの作製が、
(a) ポリペプチドを提供すること；ならびに
(b) 修飾型ポリペプチドを生じる条件下で、そのポリペプチドを、リンカーと反応する化学物質に暴露すること
を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
リンカーが環状オクチンを含む、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４６】
リンカーと反応する化学基がアジド基を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
リンカーが、モノフルオロシクロオクチン（MFCO）、ビシクロ[6.1.0]ノニン（BCN）、S-アセチルチオ酢酸N-スクシンイミジル（SATA）、S-アセチルチオプロピオン酸N-スクシンイミジル（SATP）、マレイミド、またはジベンゾシクロオクチン（DBCO）である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
リンカーと結合した抗体部分の、修飾型ポリペプチドへの暴露が、室温にて約8〜24時間、光を制限した環境で行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
ステップ(e)：コンジュゲートをカラムクロマトグラフィーにより精製することを追加して含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
カラムクロマトグラフィーによるコンジュゲートの精製が、コンジュゲートをプロテインAカラムに通して約pH 3.0のクエン酸バッファーで溶出することを含む、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2012年11月12日出願の米国仮出願第61/625,365号の優先日の利益を主張する。これによって、先に出願されたこの仮出願の内容は、参考としてその全体を本明細書に含めるものとする。
【０００２】
本発明は、1つもしくは複数のKunitz型プロテアーゼインヒビター（たとえば、アプロチニン）、またはその誘導体（たとえばアプロチニン由来ポリペプチド）が本明細書に記載の方法で抗体部分にコンジュゲートした、タンパク質コンジュゲート；医薬用または診断用（たとえば造影剤として使用するため）にコンジュゲートを合成する方法；それらを含む生理学的に許容される組成物；ならびに、たとえばがんおよび神経障害の、診断および治療のためにコンジュゲートを患者に投与する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
血液脳関門（BBB）は、有害物質（たとえば、誤って摂取された毒物）から中枢神経系（CNS）を守る一方で、治療用のタンパク質が脳脊髄にアクセスできないようにもしており、したがって、CNSの疾患を治療する上で大きな障害をもたらす。原則として、約500ダルトンより小さい親油性分子だけがBBBを超える。CNS疾患の動物実験において有望な結果を示す多くの薬物はそれよりもかなり大きく、そうした大きさと複雑さを有する薬物を通す脳毛細血管の内皮壁の透過性は無視できるほど小さいため、タンパク質治療物質は通常CNSから完全に排除される。
【０００４】
タンパク質治療物質のCNSへのデリバリーを高めるために目下追求されている戦略は、3つのカテゴリーに分けられる。第1のカテゴリーは、薬物の脳室内直接投与、ならびに一時的にBBBを破壊する高張液の頸動脈内注入といった、侵襲的な処置を含む。第2のカテゴリーは、BBBを通過するタンパク質の脂溶性を高めることを目的とする、薬理学に基づく戦略を含む。第3のカテゴリーに含まれるのは、BBBに対してベクターまたは受容体標的デリバリー担体として機能するタンパク質に治療薬が結合しているようなデリバリー法である。このアプローチは、特異性が高く効果的である点、結果として生じる悪影響が最小限である点、ならびに広く適用できる点で有利である。
【発明の概要】
【０００５】
第1の態様において、本発明は、抗体部分、ならびに1つもしくは複数のKunitz型プロテアーゼインヒビター（たとえば、アプロチニン）またはその誘導体（たとえば、アプロチニン由来ポリペプチド）を含有する、タンパク質コンジュゲートを特徴とする。抗体部分、およびBBBを超えてコンジュゲートを輸送するポリペプチドはいずれも、以下で詳細に検討される。タンパク質コンジュゲートはさらに、リンカーを含有すること；それぞれの抗体部分にコンジュゲートしたポリペプチドの数；および/または、抗体部分とポリペプチドがコンジュゲートした位置によって、特徴付けることができる。さらに、所与のコンジュゲート内に2つ以上のポリペプチドが含まれている場合、それぞれのポリペプチドは、抗体部分にのみ結合している。言い換えると、リンカーを介していようがいまいが、いかなるポリペプチドもコンジュゲート内の別のポリペプチドと結合していない。
【０００６】
ある実施形態において、タンパク質コンジュゲートは、抗体部分およびポリペプチドを含有しており、そのポリペプチドは、Thr1- Phe2- Phe3- Tyr4- Gly5- Gly6- Cys7/Ser7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19（配列番号117）、または生物活性のある配列番号117のアナログもしくは断片を含む。「Cys7/Ser7」が示すように、7位のアミノ酸残基は、システインもしくはセリンである。前記ポリペプチド（配列番号117）または本明細書に記載の他の任意のポリペプチドを含有するタンパク質コンジュゲートにおいて、抗体部分は、そのポリペプチド上の次の位置のうち1カ所または数カ所でポリペプチドにコンジュゲートすることができる：N末端アミノ酸残基（たとえば、ポリペプチドが配列番号117からなる場合Thr1）；C末端アミノ酸残基（たとえば、ポリペプチドが配列番号117からなる場合Tyr19）；またはN末端とC末端の間のリジン残基（たとえば、配列番号117のLys10もしくはLys15）。
【０００７】
本発明者らは、分子として連結された部分から形成された、アミノ酸を基本とする化合物のことを言うために「タンパク質コンジュゲート」という用語を使用する。本発明において、部分は、抗体部分、および（たとえばリンカーを介して）それに結合した（1つもしくは複数の）ポリペプチドを含む。「アミノ酸を基本とする化合物」とは、主としてアミノ酸残基を含むが、必ずしもそれだけを含むわけではない化合物（すなわち、（通常の融合タンパク質にみられるように）アミノ酸残基のみを含む化合物、またはアミノ酸残基および他の成分を含む化合物）である。上記のように、タンパク質コンジュゲートは、リンカーを含有することができるが、リンカーは化学物質とすることができる。このようなコンジュゲートが主としてアミノ酸残基を含むがそれだけを含むわけではないと考えられるのは、抗体部分およびポリペプチドはアミノ酸でできているがリンカーは化学物質であるからである。また、タンパク質コンジュゲートは、検出試薬（たとえば、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、色素など）を含んでいてもよい。検出薬はアミノ酸残基を含まないかもしれないが、その場合、本発明者らはやはり、そうした検出薬を含有するタンパク質コンジュゲートを、アミノ酸を基本とする化合物と呼ぶことができる。本発明は、画像診断を含めて、診断法において検出可能なコンジュゲートを使用する方法を含む。
【０００８】
さらに明確にするために、本発明者らは、抗体部分およびポリペプチド（1つもしくは複数）が互いに異なる（すなわち、互いに同一ではない）ことを指摘する。しかしながら、タンパク質コンジュゲートはいずれも、2つ以上のポリペプチドを含有することがあり、その2、3、4、または5つ以上のポリペプチドが同じであってもよい（すなわち同一のアミノ酸配列を有してもよい）が、互いに異なっていてもよい（すなわち、抗体部分にコンジュゲートしたポリペプチドは異なるアミノ酸配列を有してもよい）。本発明の組成物および方法に関して、本発明者らは、「include」（含む）という用語を「comprising」（含んでなる）を意味するために使用する。たとえば、上記の実施形態において、タンパク質コンジュゲートは抗体およびポリペプチドを含んでなるが、そのポリペプチドはまた配列番号117で表されるアミノ酸配列を含んでなる。いかなる場合も、文脈上特に別段の指示がない限り、本発明の組成物、その構成部分（たとえば抗体部分およびポリペプチド）、ならびに本発明の方法は、記載された要素もしくはステップを含んでなるか、またはそれらから構成されることが可能である。たとえば、所与のポリペプチドは、記載された配列（たとえば、配列番号117）を含んでなるか、またはそれらから構成されることが可能である。
【０００９】
上記のように、本発明のタンパク質コンジュゲートは、本明細書に記載のポリペプチド、またはその生物活性のあるアナログもしくは断片を含有することができる。本発明者らが、タンパク質コンジュゲートのポリペプチド部分に関して「生物活性のある」という用語を使用するのは、基準となるポリペプチドのアナログもしくは断片が、生理的環境において、有効となるのに十分な活性を保持していることを示すためである。タンパク質コンジュゲートのポリペプチド部分は、そのポリペプチドが結合しているコンジュゲートおよび/または抗体部分を、BBBを超えて輸送する役割を担っているので、基準となるポリペプチドのアナログもしくは断片は、それが結合しているコンジュゲートおよび/または抗体部分を、BBBを超えて輸送する能力を有するならば、生物活性がある。この性質は、in vivoまたはin vitroモデルで調べることができるが、基準となるポリペプチドの、生物活性のあるアナログもしくは断片は、この輸送に関してその基準ポリペプチドより効果が高いこともあれば低いこともある。具体的には、断片もしくはアナログの有効性は、それが望ましい結果を達成するのに十分なほど高水準を保持している限り（たとえば、それを含むコンジュゲートが臨床的に有利な結果を達成する限り）、基準ポリペプチドより低いこともある。
【００１０】
基準となるポリペプチドの「断片」は、基準となるポリペプチドの連続した一部分、言い換えると途切れのない一部分である（たとえば、10アミノ酸長のポリペプチドからの断片は、当該ポリペプチド内の任意の2-9個の連続した残基とすることができる）。基準となるポリペプチドの「アナログ」は、基準のポリペプチドもしくはその一部分の配列と、類似しているが同一ではない配列を有する、任意のポリペプチドである。したがって、1つもしくは複数のアミノ酸置換、付加、またはアミノ酸残基の欠失（またはそれらの任意の組み合わせ）を含むポリペプチドが、基準となる配列のアナログである。本発明のタンパク質コンジュゲートに含めるのに適したポリペプチドの断片およびアナログは、以下にさらに説明する。
【００１１】
記載されるとおり、本発明のタンパク質コンジュゲートはいずれも、コンジュゲートの抗体部分とポリペプチド（1つもしくは複数）の間にリンカーを含有することができる。コンジュゲートは、当技術分野で「クリックケミストリー」として知られる方法によって構築することができる。おそらく、クリック反応のもっとも顕著な例は、銅触媒を用いたアジド-アルキン付加環化反応（CuAAC）であるが、このような反応を用いて、本発明のコンジュゲートを作製することができる。こうした反応がin vivoで有用であるのは、アジドも末端アルキン官能基も自然の系には通常存在しないからである。CuAACに基づくクリックケミストリーの魅力的な特徴にもかかわらず、銅は、生きた細胞または完全な生物体において生体直交型コンジュゲーションを妨害する可能性があり、本発明の方法はまた、銅を含まないクリックケミストリーによって実施することができる（すなわち、本発明のコンジュゲートは、銅を含まないクリックケミストリーで構築することができる）。
【００１２】
ある実施形態において、リンカーは、第一級アミンと反応する基を含む化学物質である。したがって、リンカーはモノフッ素化シクロオクチン（MFCO）、ビシクロ[6.1.0]ノニン（BCN）、S-アセチルチオ酢酸N-スクシンイミジル（SATA）、S-アセチルチオプロピオン酸N-スクシンイミジル（SATP）、マレイミド、またはジベンゾシクロオクチン（DBCO）とすることができる。適当なリンカー、ならびにそれを本発明のコンジュゲートに組み入れる方法は、以下にさらに説明する。
【００１３】
配列番号117で表されるポリペプチドにおいて、7位の残基はシステイン残基かセリン残基とすることができるが、この置換は、本明細書に記載のポリペプチドのいずれにおいても起こりうる。したがって、有用なポリペプチドは、アミノ酸配列Thr1- Phe2- Phe3- Tyr4- Gly5- Gly6- Cys7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19（配列番号67）、アミノ酸配列Thr1- Phe2- Phe3- Tyr4- Gly5- Gly6- Ser7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19（配列番号97）、または配列番号67もしくは配列番号97で表されるポリペプチドの、生物活性のある断片もしくはアナログを含むことができる。読みやすさのために、本発明者らは、「またはその生物活性のある断片もしくはアナログ」という表現を、必ずしも起こりうるすべての場合に繰り返さないことにする。当然のことながら、基準のポリペプチドが有効である場合、その生物活性のある断片もしくはアナログも有効である。
【００１４】
タンパク質コンジュゲートが配列番号117のアナログを含有する場合、そのアナログは、配列番号117に対して変化のない、少なくとも13アミノ酸残基（たとえば、13〜19アミノ酸残基、包括的）を含んでなることがある。アナログは追加のアミノ酸残基を含んでいてもよいので、アナログは配列番号の19アミノ酸残基より長い可能性がある。長さ、または１つもしくは複数の相違の正確な性質にかかわらず、類似性の程度は、アナログの配列と、基準となるポリペプチドの配列（ここでは配列番号117）との間の「パーセント同一性」として表すことができる。このようにして特徴付けられたアナログを以下にさらに説明する。ポリペプチドが配列番号117のアナログである場合はいかなる場合も、10位のリジン残基および/または15位のリジン残基は、不変のままであるとすることができる。すなわち、アナログは10位および/または15位にリジン残基を含有することができる。当業者には当然のことであるが、所与の残基の絶対的な位置は、場合によって変動する可能性がある。たとえば、今述べたリジン残基は、アナログが配列番号117の最初の9アミノ酸残基より多くの残基を、または少ない残基を含んでいれば、10位および/または15位に相当する位置に存在することになる。たとえば、N末端に追加のアミノ酸残基を1つ含有するアナログにおいて、基準配列の10および15位にあるリジン残基は、アナログの11および16位にあるように見える。
【００１５】
配列番号117の他のアナログにおいて、Asn12をGlnで置換することができ、Asn13をGlnで、ならびに/またはPhe14をTyrもしくはTrpで置換することができる。配列番号117の他の有用なアナログにおいて、システイン残基がポリペプチドのアミノ末端および/またはカルボキシ末端に付加される。システイン残基は、末端の位置が配列番号117の1位にあるスレオニン残基であれ、配列番号117の19位にあるチロシン残基であれ、ポリペプチドのアミノ末端および/またはカルボキシ末端から1つもしくは複数の残基を欠失させることにより生じたいずれか一方の内側にある残基であれ、その末端の位置に付加することができる。言葉を換えると、Nおよび/またはC末端システイン残基は、全長ポリペプチド、またはその断片もしくはアナログに付加することができる。有用なアナログには、下記の配列を含めることができる：Phe3- Tyr4- Gly5- Gly6- Cys7/Ser7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19- Cys（配列番号118）；Gly5- Gly6- Ser7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19- Cys（配列番号119）；Ser7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19- Cys（配列番号120）；Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19- Cys（配列番号121）；またはLys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Tyr19- Cys（配列番号122）。本発明者らは、アナログが配列番号117とどのように関連づけられるかをより明白にするために、このようにアミノ酸残基に番号付けをした。たとえば、Phe3は配列番号117の3番目のアミノ酸残基であるが、配列番号118で表される配列番号117のアナログでは、明らかに1番目のアミノ酸残基である。
【００１６】
タンパク質コンジュゲートが配列番号117の断片を含有する場合、その断片には、配列番号117の少なくとも6つの（たとえば6〜18個の、包括的）連続したアミノ酸残基を含めることができる。たとえば、断片は、Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15（配列番号123）の配列を含んでいてもよく、またはその配列から構成されていてもよい。
【００１７】
任意の実施形態において、ポリペプチドは、D型、L型、または両方の型のアミノ酸残基を含有することができる。たとえば、1つもしくは複数の（および最大ですべての）残基が、L型かD型とすることができる。
【００１８】
タンパク質コンジュゲートの立体配置に関して、コンジュゲートは１つの抗体部分、および、それに結合して、さまざまな数のポリペプチドを含有することができる。ポリペプチドの数は、抗体部分にある適当な結合ポイントの数によって左右されることになる。本明細書に記載のリンカーは、第1級アミン基と反応することができるので、リンカーが、抗体部分の中にある1つもしくは複数のリジン残基において、ポリペプチドを抗体部分に結合させることができる。あるいはまた、リンカーは、抗体部分にあるチオール基もしくは糖鎖とも反応する（したがって結合する）ことができる。リンカーは、わずかに1〜10個のリジン残基において存在することができる（すなわち、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個のポリペプチドが、抗体部分の中にある個別のリジン残基にコンジュゲートすることができる）。特別な実施形態において、約15（たとえば14〜16）、約30、約40、約50、約60、約70、約80、または約90個のリジン残基が使用されることもある。コンジュゲート内のポリペプチドの数は、コンジュゲーションのために利用できる抗体部分内の残基数に対するパーセンテージとして表すこともできる。より詳細には、リジン残基の約10％から最大100％までを、ポリペプチドとコンジュゲートさせることができる。
【００１９】
任意の実施形態において、抗体部分はIgGクラスに属するものとすることができる。任意の実施形態において、抗体部分は、四量体抗体、一本鎖抗体（scFv）、四量体抗体のフラグメント（たとえば、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント）、またはこれらの抗体部分の任意の生物活性のあるバリアントとすることができる。本発明者らが、タンパク質コンジュゲートの抗体部分に関して、「生物活性のある」という用語を使用するのは、抗体のバリアントが、生理的環境において有効となるのに十分な活性を保持していることを示すためである。タンパク質コンジュゲートの抗体部分は、生物学的標的に選択的に結合するので、基準となる抗体部分のバリアントは、それが、有用なレベルまで選択的に当該標的と結合する能力を有するならば、生物活性がある。抗体部分の生物活性のあるバリアントは、たとえば、生物学的標的（たとえば細胞受容体）に対して、規準となる抗体部分とは異なる親和性を有する可能性がある。その親和性は、それが望ましい結果を達成するのに十分なほどの高水準を保持している限り（たとえば、それを含むコンジュゲートが臨床的に有利な結果を達成する限り）、基準となる抗体部分より低いこともある。
【００２０】
抗体部分は、ヒト抗体、キメラ抗体、もしくはヒト化抗体部分、またはその生物活性のあるバリアントとすることができる。読みやすくするために、本発明者らは、「またはその生物活性のあるバリアント」という表現を、必ずしもすべての場合に繰り返さないことにする。当然のことながら、抗体部分が本発明の文脈において有効である場合、その生物活性のあるバリアントも有効である。抗体部分は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体から構築された一本鎖抗体であっても、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体のフラグメント（たとえば、FabもしくはF(ab')2フラグメント）であってもよい。
【００２１】
標的に関して、抗体部分（たとえば、四量体抗体、その生物活性のあるバリアント、scFv、Fabフラグメント、もしくはF(ab')2フラグメント、またはその生物活性のあるバリアントであって、クラス（すなわちIgGクラスであるか別のクラスであるか）を問わず、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体であるかを問わず、本明細書に記載の何か他の特質もしくは特徴を有するかを問わない）は、増殖因子受容体またはサイトカイン受容体（たとえば、インターロイキン受容体）と特異的に結合することができる。増殖因子受容体は、上皮増殖因子（EGF）ファミリーのメンバーが結合する受容体とすることができる。EGFファミリーのタンパク質に対する受容体の例には、EGF受容体（EGFR）、ヘパリン結合性EGF様増殖因子受容体（HB-EGFR）、アンフィレギュリン受容体（AR）、エピレギュリン受容体（EPR）、エピジェン受容体、ベータセルリン受容体、およびニューレグリンに対する受容体（たとえば、ニューレグリン1、ニューレグリン2、ニューレグリン3、またはニューレグリン4に対する受容体）がある。本発明はさほど限定されないが、EGFRが標的とされる場合は、抗体部分は、トラスツズマブ、セツキシマブ、もしくはパニツムマブとすることができ、トラスツズマブ、セツキシマブ、もしくはパニツムマブの重鎖および軽鎖の可変領域を含むscFv、または、これらの四量体抗体もしくは一本鎖抗体の生物活性のあるバリアントとすることもできる。たとえば、トラスツズマブ、セツキシマブ、もしくはパニツムマブのFabもしくはF(ab')2フラグメント。本発明者らは、トラスツズマブと約99％相同な配列を有する抗体を用いて研究を実施した。他の実施形態において、増殖因子受容体は、血管内皮増殖因子（VEGF）ファミリーのメンバーが結合する受容体とすることができる。VEGFファミリーのタンパク質に対する受容体標的の例としては、VEGF受容体（VEGFR；たとえばVEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、もしくはVEGF-Dの受容体）、または胎盤増殖因子に対する受容体（PGFR）が挙げられる。
【００２２】
VEGFRが標的とされる場合は、抗体部分は、ベバシズマブもしくはラニビズマブとすることができ、ベバシズマブもしくはラニビズマブの重鎖および軽鎖の可変領域を含むscFv、または、これらの四量体抗体もしくは一本鎖抗体の生物活性のあるバリアントとすることもできるが、本発明はそのように限定されるものではない。たとえば、抗体部分は、ベバシズマブもしくはラニビズマブのFabもしくはF(ab')2フラグメントとすることができる。記載されたように、本発明のタンパク質コンジュゲート中の抗体部分に適した他の標的は、サイトカイン受容体であって、これには腫瘍壊死因子（TNF）ファミリーのメンバーに対する受容体を含む。これらの受容体には、TNF（TNF-αもしくはカケクチンとしても知られる）、リンホトキシンα（LT-α）、T細胞抗原gp39（CD40L）、FASL、4-1BBL、OX40L、およびTNF関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）が結合する受容体が含まれる。本発明はさほど限定されないが、TNF受容体が標的とされる場合は、抗体部分は、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、もしくはインフリキシマブとすることができ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、もしくはインフリキシマブの重鎖および軽鎖の可変領域を含むscFv、または、これらの四量体抗体もしくは一本鎖抗体の生物活性のあるバリアントとすることもできる。たとえば、抗体部分は、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、もしくはインフリキシマブのFabもしくはF(ab')2フラグメントとすることができる。標的とされる受容体がインターロイキン受容体である場合、抗体部分は、インターロイキン2（IL-2）またはインターロイキン6（IL-6）受容体と特異的に結合することができる。本発明はさほど限定されないが、抗体部分がIL-2に対する受容体を標的とする場合は、その抗体部分は、バシリキシマブもしくはダクリズマブとすることができ、バシリキシマブもしくはダクリズマブの重鎖および軽鎖の可変領域を含むscFv、または、四量体抗体もしくは一本鎖抗体の生物活性のあるバリアントとすることもできる。たとえば、抗体部分はバシリキシマブもしくはダクリズマブのFabもしくはF(ab')2フラグメントとすることができる。同様に、抗体部分がIL-6の受容体を標的とする場合は、その抗体部分は、トシリズマブ、トシリズマブの重鎖および軽鎖の可変領域を含むscFv、または、この四量体抗体もしくは一本鎖抗体（たとえばトシリズマブのFabもしくはF(ab')2フラグメント）の生物活性のあるバリアントとすることができる。機能については、抗体部分は、化学療法薬または抗炎症薬とすることができる。
【００２３】
第2の態様において、本発明は、本明細書に記載のタンパク質コンジュゲートおよび製薬上許容される基剤を含む医薬組成物を特徴とする。同様に本発明の範囲に含まれる関連組成物には、こうした医薬組成物の前段階の組成物、たとえば濃縮された原液、凍結乾燥標品、凍結した状態で保存された組成物（たとえば凍結防止剤とともに）、または患者に投与する前に何らかの操作（たとえば、希釈、再懸濁、精製、および/または滅菌）を必要とする他の組成物がある。これらの組成物、ならびにそれが含有することができる製薬上許容される基剤は、以下にさらに説明する。組成物は、経口もしくは非経口（たとえば、静脈内もしくは経粘膜）投与用を含めて、さまざまに製剤することができる。
【００２４】
第3の態様において、本発明は、中枢神経系のがん、またはCNSに関わる神経障害（たとえば炎症を伴う障害）に罹っている患者を治療する方法を特徴とする。その方法には、本明細書に記載のタンパク質コンジュゲートを含有する医薬組成物を治療上有効な量、患者に投与するステップを含めることができる。いずれの方法においても、医薬組成物を投与するのに先立って、治療を必要とする患者を識別するステップも実施することができる。たとえば、1つもしくは複数の診断テスト、たとえば画像診断などを実施することにより、CNSのがんに罹っている患者を識別することができる。同様に、神経障害を診断するために適した検査を行うことができる。本発明はあまり限定されないが、本発明者らは明らかにヒト患者の治療を企図している。動物への使用（たとえば、飼い慣らされたペットなどの、非ヒト哺乳類を治療する）は確かに可能ではあるが、ただし、少なくとも近い将来は、コストが法外に高い状態が続きそうである。本発明者らは「患者」という用語を使用する傾向があるが、ヒト用か動物用かの文脈にかかわらず、意味のある相違なしに、「個体」または「被験体」と言うこともある。本発明者らは、「disorder(障害・疾患)」という用語を、患者に影響を及ぼす何らかの臨床的に望ましくない状態を表すために使用する。たとえば、状態によっては明確に病気（disease）（たとえば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）と称することがあるが、こうした状態は、臨床的に望ましくなく、本明細書で使用される「disorder（障害・疾患）」である。したがって、CNSに関わる神経障害は、一般に、障害（disorder）、疾病（disease）、疾患（condition）、症候群などと称されるような状態であるとすることができる。医薬組成物の「治療上有効な量」は、プラスの臨床的結果をもたらすのに十分な量であって、その結果が障害の根絶であるか否かを問わない。したがって、患者を「治療する」ことは、問題となっている「障害」の兆候もしくは症状を改善すること、または障害がより重い状態に進行するのを阻止し、もしくは遅らせることによって、成し遂げられる。投与されるタンパク質コンジュゲートの量は、「等価用量」とすることができるが、その場合、タンパク質コンジュゲートに内在して投与される抗体部分の量は、BBBによって保護されていない組織を効果的に治療するために投与されている抗体部分の量と同じか、ほぼ同じ（たとえば、±10-20％）である。障害がCNSに影響を及ぼすがんである場合、がんは、CNSの内部に生じるものであるか、またはCNSに転移したものである可能性がある。
【００２５】
第4の態様において、本発明は、本明細書に記載のタンパク質コンジュゲートを作製する方法を特徴とする。その方法は、抗体部分を、リンカーを介してポリペプチドにコンジュゲートすることによって実施される。ある実施形態において、方法は、アミノ酸配列Thr1- Phe2- Phe3- Tyr4- Gly5- Gly6- Cys7/Ser7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19（配列番号117）、またはその生物活性のあるアナログもしくは断片を含むポリペプチドに、抗体部分をコンジュゲートする。他の実施形態において、本明細書に記載の他のポリペプチドのいずれかを組み入れることができる。方法には、次のステップを含めることができる：(a) リンカーと結合した抗体部分を提供するステップ；(b) 修飾型ポリペプチドを提供するステップ；ならびに(c) 抗体部分、リンカー、およびポリペプチドを含むタンパク質コンジュゲートを生じる条件下で、リンカーと結合した抗体部分を、修飾型ポリペプチドに暴露するステップ。ポリペプチドは、リンカーと反応する化学基（たとえば第1級アミン（たとえばN3））を含んでいれば、修飾型である。リンカーと結合した抗体部分は、次のステップを実施することによって作製することができる：(a) 抗体部分を提供するステップ；ならびに(b) リンカーと結合した抗体部分を生じる条件下で、抗体部分をリンカーに暴露するステップ。修飾型ポリペプチドは、次のステップを実施することによって作製することができる：(a) ポリペプチドを提供するステップ；ならびに(b) 修飾型ポリペプチドを生じる条件下で、そのポリペプチドを、リンカーと反応する化学物質に暴露するステップ。
【００２６】
別のコンジュゲーションスキームにおいて、リンカーが最初にポリペプチドに結合し、その修飾された中間体（リンカー結合ポリペプチド）が次に、抗体部分にコンジュゲートされる。コンジュゲーションにアジド-アルキン付加環化反応が関与する場合、所与のリンカー内のアルキンがコンジュゲーションパートナー上のアジドと反応する。たとえば、ポリペプチドがアルキンを含むリンカーと結合した場合、抗体部分を、アジドを含むように修飾することができる（リンカーと結合したポリペプチド、およびアジドを有する抗体はコンジュゲーションパートナーである）。アルキンとアシド基が反応して安定なトリアゾールを生じる。たとえば、アルキン含有ジベンゾシクロオクチン（DBCOリンカー）と結合することによって修飾されたポリペプチドは、アジドを有する抗体部分と反応して安定なトリアゾールを生じることができるが、これは銅(I)（Cu(I)）フリーのクリック反応、または環歪みに促進されるクリック反応とも呼ばれることがある。Baskin et. ah, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(43): 16793-16797, 2007; Ning et al. Anweg. Chem. Int. Ed., 47:2253-5; and Jewett et ah, J. Am. Chem. Soc,132(ll):3688-3690, 2010を参照されたい。
【００２７】
当業者がコンジュゲーションの方法および機構についてさらにこれ以上の情報を求めるならば、Jewett and Bertozzi ("Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology," Chemical Society Reviews 39: 1272-1279, 2010)、WO 2012/134925、ならびに米国出願公開番号2005-0222427および2009-004753を閲覧することができるが、これらは参考としてその全体を本明細書に含めるものとする。
【００２８】
リンカーに関わる方法において、リンカーは環状オクチン、言い換えると、歪んだシクロオクチンを含有することができる。リンカーと反応するポリペプチド上の化学基は、アジド基を含むことができる。コンジュゲーションを生じさせるために、修飾ポリペプチド上のアジド基は、図1に示すようにリンカー上のオクチンと反応する。図1において、例示されるリンカーはMFCO-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルである。より一般的には、使用されるリンカーはモノフルオロシクロオクチン（MFCO）、ビシクロ[6.1.0]ノニン（BCN）、S-アセチルチオ酢酸N-スクシンイミジル（SATA）、S-アセチルチオプロピオン酸N-スクシンイミジル（SATP）、マレイミド、またはジベンゾシクロオクチン（DBCO）とすることができる。タンパク質コンジュゲートを作製するための条件は、下記にさらに十分に説明されるが、ここで本発明者らが注目するのは、リンカーと結合した抗体部分を、室温にて約8-24時間にわたって、光の制限された環境で、修飾されたポリペプチドに暴露することができることである。コンジュゲーションは、たとえば、液体クロマトグラフィー質量分析法（LCMS）によって、修飾されたポリペプチドの消費を測定することによってモニターすることができる。コンジュゲーション後、タンパク質コンジュゲートを、たとえばカラムクロマトグラフィーで、精製することができる。たとえば、コンジュゲートをプロテインAカラムに通し、約pH 3.0のクエン酸バッファーで溶出することができる。
【００２９】
本明細書に記載の、リンカーと結合した抗体部分、および修飾されたポリペプチド（これもリンカーと結合していてもよい）も本発明の組成物であって、本発明のキットの中に含めることができる。したがって、第5の態様において、本発明はキットを特色とする。ある実施形態において、キットには、医薬組成物、またはその前段階となるものが含まれ、使用説明書とともにパッケージされているが、さらに適宜、投与の準備および/または組成物の投与において組成物を取り扱うのに役立つ、任意のデバイスを含んでいてもよい。たとえば、本発明のキットは、希釈剤、手袋、バイアルもしくは他の容器、ピペット、ニードル、シリンジ、チューブ類、スタンド、スパーテル、滅菌クロスもしくはドレープ、陽性および/または陰性対照などのうち1つもしくはいくつかを含むことができる。別の実施形態において、本発明のキットは、タンパク質コンジュゲートの作製に有用な組成物および試薬を含む。たとえば、キットは、抗体部分、リンカー、リンカーと結合した抗体部分、ポリペプチド、リンカーと反応する化学物質、および/または修飾されたポリペプチドのうち1つもしくはいくつかを含むことができる。たとえば、ある実施形態において、キットは、抗体部分、リンカー、リンカーと反応する化学物質、およびポリペプチドを含んでいてもよい。他の実施形態において、キットは、リンカーと結合した抗体部分、および修飾されたポリペプチドを含むことができる。組成物を投与するのに有用なキットと同様に、組成物を作製するのに有用なキットは、希釈剤、手袋、バイアルもしくは他の容器、ピペット、ニードル、シリンジ、チューブ類、スタンド、スパーテル、滅菌クロスもしくはドレープ、陽性および/または陰性対照などの、いずれか1つもしくは複数を含むことができる。リンカーと抗体部分とを結合し、ポリペプチドを修飾し、リンカーと結合した抗体部分を修飾されたポリペプチドとコンジュゲートし、またはタンパク質コンジュゲートを精製して検査するのに役立つ、任意の試薬も含めることができる。記載のように、リンカーの結合した抗体部分、および修飾されたポリペプチドは本発明の主要な特徴となる組成物である。
【００３０】
第6の態様において、本発明は、生体組織、たとえば中枢神経系の中にある組織、を画像化する方法を特徴とする。その方法は、検出可能な造影剤を含有するように作製された、本明細書に記載のコンジュゲートを提供することによって実行される。この造影剤はさまざまであり、画像化に使用される、現在利用可能な標識およびタグのいずれかから選択することができる。たとえば、造影剤は、蛍光色素もしくはラジオアイソトープであるか、またはそれを含有することができる。造影剤は（たとえば、通常の化学反応によって）本発明のコンジュゲートに組み入れられ、その後被験体に投与される。たとえば、検出可能な標識もしくはタグを含有するコンジュゲートは、静脈内に投与可能であって、その後、コンジュゲートに組み込まれた特定の造影剤を検出することができるように設定されたデバイスを用いて、被験体を検査することができる。
【００３１】
BBB透過性に加えて、本発明のタンパク質コンジュゲートは、以下の利点の1つもしくは複数を有する可能性がある：投与する濃度でほとんど、もしくはまったく沈殿しないこと；凍結融解安定性；ならびに溶解性（溶液中で、たとえあったとしてもわずかしか凝集物を生じない）。抗体部分はまた、その標的に対して（非コンジュゲート型での親和性と比べて）高い親和性を保持することができる。たとえば、抗体部分は、その標的に対して、コンジュゲートしていない抗体部分の親和性の約3倍以内の、親和性を有する可能性がある。タンパク質コンジュゲートH43についての実験で、非コンジュゲート型抗体部分の親和性が1.3 nMである場合に、2.2 nMの親和性が観察された。本発明の組成物および方法の、他の特徴および利点は以下の説明、図面、および特許請求の範囲で説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図1aおよび1bは、銅なしの「クリックケミストリー」技術を用いて抗体部分をポリペプチドに結合する方法を説明する図式である。パネルa)は一般的な反応スキームを、パネルb)はより具体的なコンジュゲーションプロセスを表す。
【図２−１】図2は、本明細書に記載され、引用されたポリペプチド配列を記載した表である。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図２−３】図２−２の続きである。
【図３】図3は、本発明のタンパク質コンジュゲートに関する、検討して特徴付けることができる特定のパラメーター（たとえば、BBB透過性および結合親和性）、これらのパラメーターを調べるために実施することができる実験、ならびに典型例となるタンパク質コンジュゲート（H43、Angiopep-2ポリペプチドおよびトラスツズマブを含む）について得られた結果をまとめたチャートである。
【図４】図4は、H1、H2、およびH3と命名されたタンパク質コンジュゲートに関する灌流実験の結果を示す棒グラフである。脳、毛細血管、および実質において、各コンジュゲートならびにトラスツズマブ（抗HER2）に関するVd（ml/100 g/2分）を示す。
【図５】図5は、H40およびH41（左側のグラフ）、ならびにH42、H43、およびH44（右側のグラフ）と命名されたタンパク質コンジュゲートについて、非コンジュゲート型トラスツズマブ（αHer-2）と比較した、結合実験の結果を示す2つ1組の折れ線グラフである。
【図６】図6は、H40、H41、H42、H43、およびH44と命名されたタンパク質コンジュゲートに関する灌流実験の結果を示す棒グラフである。脳、毛細血管、および実質において、各コンジュゲートならびにトラスツズマブ（抗HER2）に関するVd（ml/100 g/2分）を示す。
【図７】図7は、静脈注射後のさまざまな時点での、マウス脳組織におけるトラスツズマブの量、ならびにトラスツズマブおよびAn2を含む本発明のタンパク質コンジュゲートの量（脳対血液比(%)）を示す棒グラフである。
【図８】図8は、マウスにBT-474腫瘍細胞を注入した後、溶媒/対照溶液、トラスツズマブ、または本発明のタンパク質コンジュゲート（H43）で治療したin vivo実験の結果を示す棒グラフである。
【図９】図9は、組織分布に関するin vivo実験の結果を示す一連の棒グラフである。非コンジュゲート型抗HER2抗体およびコンジュゲートされた構築物H43の分布は、% [脳]/[血漿]として（左側の図）、ならびに% 注入量/組織g（中央のグラフ）として表される。血漿中濃度は右側の図で示される。それぞれのグラフにおいて、非コンジュゲート型抗HER2抗体について得られたデータは、黒っぽい、それぞれ2つひと組になったうちの左端の棒グラフで表され、H43について得られたデータは、色が薄い方の右端の棒グラフで表される。
【図１０】図10は、ヒトアプロチニンおよびAngioPep-2のアラインメントである。
【図１１−１】図11は、本発明のコンジュゲートに使用され、本発明のキットに含められる、リンカーの例を収載する、一連の4つの表である。第1表は、アミン-アミンリンカーを記載し、これはNHSエステル、イミドエステル、などを含む；第2表は、スルフヒドリル-スルフヒドリルリンカー、たとえば、マレイミドおよびピリジルジチオールなどを記載する；
【図１１−２】第3表は、アミン-スルフヒドリルリンカーを記載するが、これはNHSエステル/マレイミド化合物を含む。これらの化合物の例が下の表で与えられる。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
CNSの治療に役立つ可能性のある薬物の大部分はBBBを通過しないが、この積年の問題にほとんど力が傾注されてこなかったのは驚きである。世界的に見て、CNS薬開発の99％以上が創薬それ自体に向けられており、その労力の1％未満しかデリバリーの改善に向けられていないと推測される。パーキンソン病、アルツハイマー病、および脳腫瘍を含む、数多くの、重篤な、損失の大きい、そして消耗性のCNS疾患のための、確実に有効な治療は存在しない。したがって、有効な薬剤を発見するのみならず、そうした薬剤の脳脊髄へのデリバリーも成功させる必要性が大いにあるが、未だ満たされていない。
【００３４】
治療用抗体は、CNSを冒す疾患を含めて、多くのタイプの疾患のための、もっとも有望な新規治療法の1つである。治療用抗体は、その大きさのせいで、CNSへのデリバリーがもっとも困難な薬剤の1つでもある。本発明の文脈において、抗体部分は、本明細書に記載のポリペプチド（たとえばアプロチニン由来ポリペプチド）にコンジュゲートされると、同じ抗体部分が単独で血液脳関門を越える（すなわちコンジュゲートされない場合）よりも大規模に血液脳関門を越える。輸送の相違は、BBBのex vivoモデルでも観察することができる。したがって、本発明のコンジュゲート中のポリペプチドは、個体の血液脳関門を越えて抗体部分を輸送するのに有用であり、その結果もたらされる改善されたCNSへのアクセスは、抗体部分が、以前には不可能な仕方で、がんおよび神経疾患の治療および診断に利用されることを可能にする。
【００３５】
本発明は、一つには、生理学に基づいたドラッグデリバリー戦略による本発明者らの研究に基づいており、このドラッグデリバリーにおいて、治療薬（本発明では抗体部分）は、BBBに対する媒介物、すなわち、受容体標的化デリバリー媒体、として機能するポリペプチド（たとえばアプロチニン由来ポリペプチド）と、特定の方法でコンジュゲートしている。
【００３６】
BBBに存在するトランスポーターおよび受容体は、BBBの完全性、ならびに恒常性の維持に重要である。1つの受容体ファミリーである、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（LRP）は、LRP1およびLRP2（メガリンとしても知られる）を含んでいるが、BBBの内皮細胞を越えてリガンドを輸送することに関与する（Shibata et al., 2000; Ito et al., 2006; Bell et al., 2007）。さらに具体的には、LRP2は、上皮細胞の細胞膜においてマルチリガンド結合受容体として機能し、トランスサイトーシスをもたらすリガンドのエンドサイトーシスに関与する。たとえば、LRP1およびLRP2はいずれも、分泌型アミロイド前駆体タンパク質（APP）のエンドサイトーシスに関与する（Kounnas et al., 1995; Cam and Bu, Mol. Neurodegen. 1:8, 2006）。興味深いことに、APPはKunitz型プロテアーゼインヒビター（KPI）ドメインを欠いており、LRPにとって不十分な基質/リガンドである。このことは、このドメインがLRPによるAPPの認識、内部移行、およびクリアランスのために重要であることを示唆する（Kounnas et al., 1995）。
【００３７】
アプロチニンは、Kunitz型プロテアーゼインヒビターであって（すなわちKPIドメインを含有する）、LRP1およびLRP2のリガンドである。アプロチニンは、ウシ肺組織に由来する、生物活性のある単量体ポリペプチドであって、複雑な手術中の出血を抑えるために使用される。アプロチニンは58個のアミノ酸残基からなり、正電荷を有するリジンおよびアルギニン残基は10個であるが、負電荷を有するアスパラギン酸およびグルタミン酸残基は4個だけである。アプロチニンは、タンパク質内部の6つのシステイン残基を結合させた3つのジスルフィド結合を含んでいるため安定である。それはまた、ねじれたβヘアピンおよびC末端αヘリックスを含有する。in vitro実験から、アプロチニンが哺乳類BBBを模した細胞層を越えることが示されているので、したがってアプロチニンは、必要性のある個体のBBBを越えて薬剤を輸送するための、媒介物として機能する。
【００３８】
したがって、本発明のコンジュゲートにおいて有用なポリペプチドは、アプロチニンポリペプチドもしくは別のKPIドメインポリペプチドの、特徴の1つもしくは複数を有することができる。すなわち、本発明のコンジュゲートに組み入れられるポリペプチドは、アプロチニン配列に対してある程度の相同性もしくは同一性（たとえば、70−100％相同性もしくは同一性）を示す約58個のアミノ酸残基（たとえば56−60個のアミノ酸残基、包括的）を含むか、またはそれらからなる、とすることができる；約10個の、リジンおよび/もしくはアルギニン残基を含むことができる；負電荷を有する残基をわずか約4個だけ（たとえばアスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基をわずか約4個だけ）含有することができる；約3個（たとえば2〜4個、包括的）の分子内（たとえばジスルフィド）結合を含むことができる；ならびに/または、ねじれたβヘアピンおよび/もしくはC末端αヘリックスを含むことができる。本発明者らは、アプロチニンポリペプチドとは異なるが、ある程度の類似性を保持している、ポリペプチドファミリーを同定した。これらのアプロチニン由来ポリペプチドは、新たに構成されたタンパク質コンジュゲートとの関連において、本明細書に記載され、そのコンジュゲートの一部となりうる。したがって、本発明のコンジュゲートは、本明細書に記載のアプロチニン配列を含有することができる（たとえば、配列番号98もしくは配列番号126からなる配列を有するポリペプチド（Siekmann et al., Biol. Chem. 369(3):157-163, 1988も参照されたい））。トランスサイトーシスの正確な分子機構は明らかではないが、また、本発明は、いかなる特定の分子機構によって機能するタンパク質コンジュゲートにも限定されないが、アプロチニンおよびアプロチニン由来ポリペプチドを含めて、本明細書に記載のポリペプチドは、LRPファミリーの受容体と相互作用すると考えられる。
【００３９】
ポリペプチド：本発明のコンジュゲートとの関連で有用なポリペプチドとしては、Kunitz型ドメインを有するポリペプチドがあるが、これは当技術分野ではタンパク質分解酵素を阻害するとされる。本発明のコンジュゲートに組み入れられるポリペプチドは、その機能を保持していても、保持いていなくてもよい。そのドメインは典型的には約50〜60個のアミノ酸残基の長さであって、典型的には約6 kDaの分子量を有するので、本発明のコンジュゲートのポリペプチド部分はこうした同じ特性を有することができる。より具体的には、ポリペプチドはアプロチニン、アルツハイマーのアミロイド前駆体タンパク質（APP）、または組織因子経路インヒビター（TFPI）とすることができる。これらのタンパク質は免疫原性である可能性があるので、本発明は、コンジュゲートした抗体部分を伴って血液脳関門を越える、より免疫原性の低い、上記タンパク質の断片を包含する。APPもしくはその生物活性のある断片は、KPIドメインを欠くにもかかわらず本発明のコンジュゲートに使用することができる。
【００４０】
ある実施形態において、本発明のタンパク質コンジュゲートに組み入れられるポリペプチド（1つもしくは複数）は：アプロチニン（たとえば配列番号98）；アプロチニンの生物活性のある断片もしくはアナログである（この断片は、上記のKunitzドメインの特徴の1つもしくはいくつかを含むことができる）。ある実施形態において、ポリペプチドは配列番号117で表されるか、または配列番号117の生物活性のある断片もしくはアナログ（たとえば、図2の表に示される断片もしくはアナログ）である。
【００４１】
ポリペプチドの中のアミノ酸残基は、標準的なαアミノ酸型とすることができるが、さらにD型、L型、もしくはこれら2つの鏡像異性体型の混合物とすることができる。当技術分野で知られているように、グリシンを除くすべてのαアミノ酸は、2つの鏡像異性体型のいずれか一方として存在しうるが、2つの型の一方もしくは両方を、本発明のポリペプチド中に、ならびにタンパク質コンジュゲートの抗体部分の中にも、組み入れることができる。やはり当技術分野で知られているとおり、DもしくはL型を有するとアミノ酸残基を称する場合の慣例は、アミノ酸残基それ自体の光学活性を規準とするのではなくて、グリセルアルデヒドからそのアミノ酸が理論的に合成されるとして、そのグリセルアルデヒドの異性体の光学活性の方を規準とする（D-グリセルアルデヒドは右旋性であり、L-グリセルアルデヒドは左旋性である）。D型アミノ酸残基をL型アミノ酸残基の代わりにすると、より安定なポリペプチドが生じる可能性がある。たとえば、10位および/または15位（または、アプロチニン由来ポリペプチドのアナログにおける同等の位置）にあるL-リジンの代わりにD-リジンを用いると、アプロチニン由来ポリペプチドの安定性を高めることができる。同様に、そうしたポリペプチドのN末端および/またはC末端においてD型アミノ酸を用いると、in vivo安定性が増すはずであるが、それはペプチダーゼがDアミノ酸を基質として利用できないからである（Powell et al., Pharm. Res. 10:1268-1273, 1993）。ポリペプチドはまた、逆向きのDポリペプチドとして設計することもできるが、これはL型アミノ酸を含有するポリペプチドに対して逆順で配置されたD型アミノ酸残基を含有する；Lアミノ酸ポリペプチドのC末端残基がDアミノ酸ポリペプチドについてはN末端となり、その逆も同様である。逆向きDポリペプチドは、同じ三次構造を保持しているので、対応するLアミノ酸ポリペプチドと同じ活性を保持するが、その安定性の増加は、より大きな治療効果をもたらすことができる（Brady and Dodson, Nature 368:692-693, 1994 and Jameson et al., Nature 368:744-746, 1994）。ポリペプチドはまた、たとえば、ジスルフィド橋を形成するシステイン残基の付加によって「束縛」されていてもよい（see Rizo et al., Ann. Rev. Biochem. 61:387-418, 1992）。任意の実施形態において、ポリペプチドは、環状ポリペプチドであってもよい（たとえば、ジスルフィド結合を形成する末端システイン残基を含有することにより環化される）。
【００４２】
それらの調製に関して、タンパク質コンジュゲートに有用なポリペプチドは、当技術分野で知られている任意の方法で作製することができるが、その方法は合成法、ならびに核酸からタンパク質を作製するために日常的に使用される組換え技術を含む。その結果得られたポリペプチドは、未精製の形で、または単離もしくは実質的に精製された形で、将来使用するまで保存することができる。たとえば、ポリペプチドは、本発明のタンパク質コンジュゲートを作製するために下記の方法で使用されるまで、保存することができる。化学合成は、たとえば、固相合成によって成し遂げることができるが、組換え技術は、生体細胞（たとえば原核もしくは真核細胞）におけるベクター構築物からの発現を含めることができる。個別のアミノ酸残基をコードするコドンは当技術分野でよく知られており（たとえば、“Biochemistry,” 3rd Ed., 1988, Lubert Stryer, Stanford University, W.H. Freeman and Company, New-Yorkを参照されたい）、コドン最適化のための方法も同様に周知である。アプロチニンアナログをコードするヌクレオチド配列の例を配列番号106に示すが、これはGenBankの受入番号X04666に見いだすことができる。この配列は、配列番号98に見られるバリンの代わりに、（配列番号106によってコードされるアミノ酸配列を基準として）16位にリジンを有するアプロチニンアナログをコードする。配列番号106のヌクレオチド配列における変異は、当技術分野で公知の方法によって導入され、16位にバリンを有する配列番号98のペプチドを作製することができる。
【００４３】
タンパク質コンジュゲート中に組み入れるための本明細書に記載のポリペプチドは、ポリペプチドが発現される細胞内で翻訳後に修飾されてもよいが、化学的修飾によってex vivoで修飾されてもよい。たとえば、本明細書に記載のポリペプチドは、ペグ化、アセチル化、アシル化、アミド化、酸化、環化および/またはスルホン化することができる。
【００４４】
長々と記載したように、コンジュゲート中のポリペプチドは、本明細書に具体的に記載された配列（たとえば、配列番号67もしくは97で表される配列、または図2の表に示す任意の他のアプロチニン由来ポリペプチド）を有することができるが、それらは上記の規準となる配列のうちいずれかの、生物活性のある断片もしくはアナログであってもよい。断片は、数の少ない連続したアミノ酸残基を有する（NもしくはC末端から1つもしくは複数のアミノ酸が欠失している）ために基準配列と異なるが、アナログは、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基、もしくは少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでいるために基準配列と異なる。追加のアミノ酸残基（1つもしくは複数）は、N末端、C末端、基準ポリペプチド（たとえば、配列番号117）のN末端からC末端までの間の位置、またはこれらの位置を任意に組み合わせた位置に、付加することができる。アナログは基準配列より短くてもよい（すなわち、1つもしくは複数のアミノ酸残基の欠失を含んでいてもよい）が、しかしながら、本発明者らは「アナログ」という用語を、N末端および/またはC末端アミノ酸残基（単数もしくは複数）のただの単純な欠失以外の、なんらかの形で基準配列とは異なるバリアントを意味するために使用する。アナログがアミノ酸残基の置換を含んでいる場合、その置換は、保存的と見なされることも、非保存的と見なされることもある。保存的置換は、以下のグループ内の置換である：Ser、Thr、およびCys；Leu、Ile、およびVal；GluおよびAsp；LysおよびArg；Phe、Tyr、およびTrp；ならびにGln、Asn、Glu、Asp、およびHis。たとえば、セリン残基をスレオニンまたはシステインで置き換えることは、保存的アミノ酸置換と見なされるだろう；ロイシンをイソロイシンまたはバリンで置き換えることは、保存的アミノ酸置換と見なされるだろう；等々。
【００４５】
保存的置換は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）アルゴリズム、BLOSUM置換行列（たとえば、BLOSUM 62行列）、またはPAM置換:P行列（たとえばPAM 250行列）によって規定することもできる。
【００４６】
基準配列が19アミノ酸残基を有する場合、その生物活性のある断片は、6〜18個の連続した残基を有する可能性がある（包括的）。基準配列が19アミノ酸残基を有する場合、その生物活性のあるアナログは、1〜13個のアミノ酸置換；1つもしくは複数のアミノ酸付加（たとえば、最大約50アミノ酸残基まで基準ポリペプチドの長さを伸ばす、Nおよび/またはC末端における残基の付加）；またはそうした置換および付加を組み合わせて有する可能性がある；記載のように、アナログについて言えば（断片とは対照的に）、少なくとも1つの置換、および/または少なくとも1つの付加がある場合、少なくとも1つの欠失も存在する可能性がある。
【００４７】
アプロチニン由来ポリペプチドの、生物活性のある断片もしくはアナログと、基準リペプチドとの間の類似性の程度は、同等の位置において同一である残基のパーセンテージとしても表すことができる。アプロチニン由来ポリペプチドの、生物活性のある断片もしくはアナログは、基準配列に対して、少なくとも35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、もしくは98％同一であるとすることができる（たとえば、本明細書において配列識別子を割り当てられるアプロチニン由来ポリペプチド）。
【００４８】
組み込まれるアミノ酸残基の鏡像体型がポリペプチドの安定性を変化させることができるのとまったく同様に、ポリペプチド（たとえば、アプロチニン由来ポリペプチド）の長さおよび内容を変更して、電荷もしくは極性、親水性もしくは疎水性、バイオアベイラビリティ、およびコンジュゲーション特性などの性質を最適化することができる。たとえば、塩基性でない/正電荷を持たないか、または正電荷の少ない（たとえばpKaで測定される）、1つもしくは複数のアミノ酸（たとえば、1から約3個のアミノ酸残基）を欠失させることによって、正電荷を強めることができる。あるいはまた、またはそれに加えて、塩基性である/正電荷を有するか、または置き換えられる残基より正電荷が強い（たとえばpKaで測定される）、1つもしくは複数のアミノ酸（たとえば、1から約3個のアミノ酸残基）を付加することによって、正電荷を強めることができる。当業者には当然のことながら、天然に存在する残基は、それらの側鎖の性質におもに起因する特性を認識し共有している。以下の情報を使用して、望む通りに、アプロチニン由来ポリペプチドの性質を変更することができる。疎水性を高めるために、ノルロイシン、メチオニン（Met）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、ヒスチジン（His）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、およびフェニルアラニン（Phe）を組み入れることができる；ニュートラリティもしくは親水性を高めるために、システイン（Cys）、セリン（Ser）、およびスレオニン（Thr）を組み入れることができる；酸性度もしくは負電荷を強めるために、アスパラギン酸（Asp）もしくはグルタミン酸（Glu）を組み入れることができる；塩基性を強めるために、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、ヒスチジン（His）、リジン（Lys）、およびアルギニン（Arg）を組み入れることができる。鎖配向に影響を及ぼす残基にはグリシン（Gly）およびプロリン（Pro）がある。芳香族側鎖を有する残基には、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、フェニルアラニン（Phe）、およびヒスチジン（His）がある。
【００４９】
本明細書で与えられる基準配列では、アミノ酸残基は天然に存在するものである。しかしながら、こうした配列の、生物活性のあるアナログは、1つもしくは複数の天然に存在しない残基を含有することがある。たとえば、そうしたアナログは、セレノシステイン（たとえば、セレノ-L-システイン）を、任意の位置に、たとえば7位のシステインの代わりに、含有することができる。多くの他の「非天然」アミノ酸代替物が、当技術分野で知られており、Sigma Aldrich chemical companyなどの商業的供給源から入手することができる。天然に存在しないアミノ酸の例としては、ほとんどの場合D-アミノ酸であるが、システインの硫黄原子に結合したアセチルアミノメチル基を有するアミノ酸残基、ペグ化アミノ酸、ならびに式NH2(CH2)nCOOH（nは2〜6）のωアミノ酸、中性、非極性アミノ酸、たとえばサルコシン、t-ブチルアラニン、t-ブチルグリシン、N-メチルイソロイシン、およびノルロイシンが挙げられる。フェニルグリシンはTrp、Tyr、もしくはPheと置換することができる；シトルリンおよびメチオニンスルホキシドは中性、非極性であり、システイン酸は酸性、オルニチンは塩基性である。プロリンはヒドロキシプロリンで置換することができるが、プロリンの特性を与える立体構造を保持する。本発明のタンパク質コンジュゲートは、そうした残基を含有する、ポリペプチドおよび抗体部分を包含する。当然のことながら、さまざまな鏡像異性体を含むこと、翻訳後修飾、または「非天然」残基を含むこと、といった改変もしくは特徴のことを言う場合、そうした改変もしくは特徴は、アプロチニン由来ポリペプチドのような本明細書に記載のコンジュゲートの一部分、抗体部分のような本明細書に記載のコンジュゲートの一部分、またはコンジュゲートの任意の他のアミノ酸含有部分の中に（たとえば検出可能な標識の中に）、存在する可能性がある。
【００５０】
基準とするポリペプチドの、生物活性のある断片もしくはアナログの、正確な配列または性質にかかわらず、そのバリアントは、基準の配列の能力と比べて、BBBを越えて抗体部分を輸送する能力が低いことも、高いこともある。もちろん、基準の配列、および生物活性のあるその断片もしくはアナログは、やはり、BBB輸送に関してほぼ同じ能力を有する可能性がある。たとえば、ポリペプチドが、基準ポリペプチド（たとえば、配列番号67、97、または117）の生物活性のあるバリアントである場合、コンジュゲートした抗体部分を輸送するバリアントの能力は、基準ポリペプチドと比べて、少なくとも、もしくはおよそ、5％だけ（たとえば、少なくとも、もしくはおよそ、5％、10％、20％、25％、35％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、もしくは95％だけ）低下している可能性がある。ポリペプチドが、基準ポリペプチド（たとえば、配列番号67、97、または117）の生物活性のあるバリアントである場合、コンジュゲートした抗体部分を輸送するバリアントの能力は、基準ポリペプチドと比べて、少なくとも、もしくはおよそ、5％だけ（たとえば、少なくとも、もしくはおよそ、5％、10％、25％、50％、100％、200％、500％、もしくは1000％だけ）向上している可能性がある。上記のように、活性は変動する可能性があるが、基準ポリペプチドの、生物活性のある断片もしくはアナログは、有益な結果（たとえば、それが投与される患者において、または患者群において平均して、臨床的に有益な結果）を達成するのに十分な活性がある、断片もしくはアナログである。有益な結果とは、有益な治療もしくは診断法であるといえる。
【００５１】
特定の実施形態において、ポリペプチドは配列：Thr1- Phe2- Phe3- Tyr4- Gly5- Gly6- Cys7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19（配列番号67）、またはThr1- Phe2- Phe3- Tyr4- Gly5- Gly6- Ser7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19（配列番号97）を有することができる。上記のように、ポリペプチドは、配列番号117の19個のアミノ酸残基のうち少なくとも13個が不変のまま保持されている、配列番号117の断片もしくはアナログとすることができる。具体的には、配列番号117のアナログは、K10 および/またはK15 が不変のままである配列を含有することができる。一部の実施形態において、Asn12は、別のアミノ酸残基（たとえばGln）で置換されている；Asn13は、別のアミノ酸残基（たとえばGln）で置換されている；ならびに/またはPhe14は、別のアミノ酸残基（たとえばTyrもしくはTrp）で置換されている。ポリペプチドは、配列：Phe3- Tyr4- Gly5- Gly6- Cys7/Ser7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19- Cys（配列番号118）；Gly5- Gly6- Ser7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19- Cys（配列番号119）；Ser7- Arg8- Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19- Cys（配列番号120）；Gly9- Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Thr16- Glu17- Glu18- Tyr19- Cys（配列番号121）；またはLys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15- Tyr19- Cys（配列番号122）を含有することができる。
【００５２】
ポリペプチドが配列番号117の断片である場合、またはポリペプチドが、配列番号117の断片を含む、配列番号117のアナログである場合、その断片は、配列番号117の6-18個の連続したアミノ酸残基と同一である、少なくとも6個のアミノ酸残基（たとえば、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16，17、もしくは18個のアミノ酸残基）の長さを有する可能性がある。本発明によれば、断片はLys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15（配列番号123）とすることができる。生物活性のある、配列番号117のアナログは、10位および15位にあるリジン残基が不変である配列、または10位および15位にあるリジン残基、ならびに16位にあるアルギニン残基が不変である配列を、有する（その配列からなる）か、またはその配列を含む（含んでなる）可能性がある。後者の場合、生物活性のあるアナログは、式Lys-Arg-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Lys（式I；配列番号106）に従う配列を有するか、または含んでいると考えられる。Xaa3はAsnもしくはGlnとすることができる；Xaa4はAsnもしくはGlnとすることができる；ならびにXaa5はPhe、Tyr、もしくはTrpとすることができる。上記の配列、Lys10- Arg11- Asn12- Asn13- Phe14- Lys15（配列番号123）は式Iに従う。Xaa3、Xaa4、およびXaa5が選択される場合、それらは保存的置換とすることができる（すなわち、連続するAsn残基は、Gln、Glu、Asp、もしくはHisによって独立して置き換えることが可能であり、PheはTyrもしくはTrpで置き換えることができる）。Xaa3、Xaa4、およびXaa5はまた、鏡像体型によって異なっていてもよく、天然に存在しないアミノ酸残基であってもよく、本明細書に記載の別の特徴もしくは性質に基づいて選択することもできる。
【００５３】
特定の実施形態において、アプロチニン由来ポリペプチドは、配列番号1〜配列番号123と称される、図2の表に示す配列を有する（配列からなる）か、またはその配列を含む（含んでなる）。
【００５４】
修飾型ポリペプチド：本発明のタンパク質コンジュゲート中に組み入れられるポリペプチドはいずれも、以下にこれから記載するように、リンカー（たとえば抗体部分と結合したリンカー）と化学的に相互作用するよう修飾することができる。これらの修飾型ポリペプチドは、本発明の範囲内に含まれており、リンカー結合抗体部分とのコンジュゲーションのプロセスを完了するための説明書とともに、キットの構成要素としてパッケージすることができる。たとえば、ポリペプチドは、N3アジド基を含有するように修飾することができるが、それが、抗体部分と結合したリンカー中のアルキンと反応することになる（逆の場合も同じで；ポリペプチドは、アルキンを含有するリンカーと結合することができるが、それが、抗体部分から伸びているアジド基と反応することになる）。
【００５５】
抗体部分：ポリペプチド（たとえば、アプロチニン由来ポリペプチド）に加えて、本発明のタンパク質コンジュゲートは、1つの抗体部分、またはその生物活性のあるバリアントを含有する。上記のように、抗体部分は、天然に発現された抗体（たとえば、四量体抗体）、またはその生物活性のあるバリアントとすることができる。抗体部分はまた、天然に存在しない抗体（たとえば、一本鎖抗体）もしくはその生物活性のあるバリアントとすることもできる。バリアントには、天然に存在する抗体の断片（たとえば四量体抗体の、たとえば、FabフラグメントもしくはF(ab')2フラグメント）、scFvの断片、または四量体抗体、scFv、もしくはそれらの断片のバリアント（1つもしくは複数のアミノ酸残基の付加および/または置換によって相違がある）が含まれるが、限定はしない。
【００５６】
当業者によく知られているように、ある種の抗体フラグメントは、「全長」抗体の酵素処理によって作製することができる。酵素パパインによる消化は、それぞれ1つの抗原結合部位を有する2つの同一のFabフラグメント、および残りのFcフラグメントを生じる。Fabフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖のCH1ドメインを含有する。それとは対照的に、酵素ペプシンによる消化は、F(ab')2フラグメントを生じるが、これは2つの抗原結合部位を有しており、依然として抗原と架橋結合する能力を有するものである。本発明のコンジュゲートに組み入れられる抗体部分は、これらの酵素による消化によって生成されるが、他の方法によって作製してもよい。
【００５７】
Fab'フラグメントも組み入れることができるが、これは、CH1ドメインのC末端に、抗体のヒンジ領域に由来する1つもしくは複数のシステイン残基を含めて、追加の残基を含んでいるという点で、Fabフラグメントとは異なる。定常ドメインのシステイン残基は、遊離のチオール基を有しており、それが本明細書に記載のコンジュゲーション反応に関与しうる。F(ab')2抗体フラグメントは、ヒンジ領域にあるシステイン残基で連結されたFab'フラグメントのペアである。抗体フラグメントの他の化学的結合も、当技術分野で知られている。
【００５８】
Fv領域は、1つの重鎖可変ドメインおよび1つの軽鎖可変ドメインからなる、完全な抗原認識結合部位を含有する最小のフラグメントである。それぞれの可変ドメインの3つのCDRが、相互に作用して、VH-VL二量体の表面上に抗原結合部位を限定する。全体として、6つのCDRが抗体に抗原結合特異性を与える。当業者に知られているように、「一本鎖」抗体、もしくは「scFv」フラグメントは、抗原を認識して結合する一本鎖Fvバリアントであって、抗体のVHおよびVLドメインが、1つのポリペプチド鎖に含まれているときに形成される。典型的には、一本鎖抗体は、VHおよびVLドメインの間にポリペプチドリンカーを含んでいるが、このリンカーは、scFvが抗原結合のために望ましい3次元構造を形成することを可能にするものである（たとえば、Pluckthun, In The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, 113:269-315, 1994を参照されたい）。
【００５９】
他の実施形態において、抗体はダイアボディとすることができる。ダイアボディは、2つの抗原結合部位を有する小型の抗体フラグメントである。各フラグメントはVLドメインに連結されたVHドメインを含有する。しかしながら、同一鎖上のドメイン間で対合させるにはドメイン間のリンカーが短すぎるため、連結されたVH-VLドメインはもう一方の鎖の相補的ドメインと対合せざるを得ず、2つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、たとえば、EP 404,097; WO 93/11161; および Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993に、より詳細に説明されている。
【００６０】
他の実施形態において、抗体部分は直鎖状抗体とすることができる。この場合、抗体部分は、1対の抗原結合領域を形成する1対のタンデムFdセグメント（VH-CH1-VH-CH1）から形成される。直鎖状抗体は、たとえば、Zapata et al. 1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062, 1995に記載のように、二重特異性または単一特異性とすることができる。
【００６１】
標的に関して、抗体部分（たとえば、四量体抗体、生物活性のあるそのバリアント、scFv、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、もしくはF(ab')2フラグメント、または生物活性のあるそのバリアントであって、クラスを問わず（すなわちIgGクラスであれ、他のクラスであれ）、また、ヒト、ヒト化、キメラ、ポリクローナル、モノクローナルであるか、本明細書に記載の何か他の特質もしくは性質を有するかを問わない）は、増殖因子受容体またはサイトカイン受容体（たとえば、インターロイキン受容体）と特異的に結合することができる。増殖因子受容体は、上皮増殖因子（EGF）ファミリーのメンバーが結合する受容体とすることができる。EGFファミリータンパク質の受容体の例としては、EGF受容体（EGFR）、ヘパリン結合EGF様増殖因子受容体（HB-EGFR）、アンフィレギュリン受容体（AR）、エピレギュリン受容体（EPR）、エピジェン受容体、ベータセルリン受容体、およびニューレギュリン受容体（たとえば、ニューレギュリン1、ニューレギュリン2、ニューレギュリン3、またはニューレギュリン4の受容体）が挙げられる。本発明はそれほど限定されないが、EGFRを標的とする場合、抗体部分は、トラスツズマブ、セツキシマブ、もしくはパニツムマブ；トラスツズマブ、セツキシマブ、もしくはパニツムマブの重鎖および軽鎖の可変領域を含むscFv；またはこれらの四量体もしくは一本鎖抗体の、生物活性のあるバリアントとすることができる。たとえば、トラスツズマブ、セツキシマブ、もしくはパニツムマブのFabまたはF(ab')2フラグメントである。他の実施形態において、増殖因子受容体は、血管内皮増殖因子（VEGF）ファミリーのメンバーが結合する受容体とすることができる。VEGFファミリータンパク質の受容体標的の例としては、VEGF受容体（VEGFR；たとえば、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、もしくはVEGF-Dの受容体)、または胎盤増殖因子の受容体（PGFR）がある。本発明はそれほど限定されないが、VEGFRを標的とする場合、抗体部分は、ベバシズマブもしくはラニビズマブ、ベバシズマブもしくはラニビズマブの重鎖および軽鎖の可変領域を含むscFv、またはこれらの四量体もしくは一本鎖抗体の、生物活性のあるバリアントとすることができる。たとえば、抗体部分は、ベバシズマブもしくはラニビズマブのFabまたはF(ab')2フラグメントとすることができる。記載のように、本発明のタンパク質コンジュゲート中の抗体部分にふさわしい他の標的は、腫瘍壊死因子（TNF）ファミリーメンバーの受容体を含めた、サイトカイン受容体である。こうした受容体には、TNF（TNFαとしても知られる）、リンホトキシンα（LTα）、T細胞抗原gp39（CD40L）、FASL、4-1BBL、OX40L、およびTNF関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）が結合する受容体が含まれる。本発明はそれほど限定されないが、TNF受容体を標的とする場合、抗体部分は、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、もしくはインフリキシマブ；アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、もしくはインフリキシマブの重鎖および軽鎖の可変領域を含むscFv；またはこれらの四量体もしくは一本鎖抗体の、生物活性のあるバリアントとすることができる。たとえば、抗体部分は、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、もしくはインフリキシマブのFabまたはF(ab')2フラグメ���トとすることができる。標的とされる受容体がインターロイキン受容体である場合、抗体部分は、インターロイキン2（IL-2）またはインターロイキン6（IL-6）受容体と特異的に結合することができる。本発明はそれほど限定されないが、抗体部分がインターロイキン2の受容体を標的とする場合、抗体部分は、バシリキシマブもしくはダクリズマブ；バシリキシマブもしくはダクリズマブの重鎖および軽鎖の可変領域を含むscFv；または四量体もしくは一本鎖抗体の、生物活性のあるバリアントとすることができる。たとえば、抗体部分は、バシリキシマブもしくはダクリズマブのFabまたはF(ab')2フラグメントとすることができる。同様に、抗体部分がIL-6の受容体を標的とする場合、抗体部分は、トシリズマブ、トシリズマブの重鎖および軽鎖の可変領域を含むscFv；またはこの四量体もしくは一本鎖抗体の、生物活性のあるバリアントとすることができる（たとえば、トシリズマブのFabまたはF(ab')2フラグメント）。機能に関して、抗体部分は、化学療法薬もしくは抗炎症薬とすることができる。
【００６２】
これまでの本発明者らの実験のいくつかは、下記の実施例に記載の実験の一部を含めて、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））を用いて実施されたが、このトラスツズマブは、高い親和性を以て、ヒト上皮増殖因子2（HER2）/neu受容体と結合する、マウスからヒト化されたモノクローナル抗体である。トラスツズマブは乳がん治療用としてFDAに承認されている。HER2/neu受容体は、リガンド不明のオーファン受容体であると考えられている。しかしながら、この受容体は、腫瘍細胞表面に発現され、細胞周期進行、細胞生存、細胞増殖、および細胞運動性といった重大な細胞過程を制御する。トラスツズマブ、もしくは任意の、HER2と選択的に結合する抗体部分は、特定の腫瘍型にとって臨床的に意義のあるバイオマーカーとなりうる。治療的には、トラスツズマブがHER受容体に結合すると、それは、細胞が増殖および分裂する能力を阻害するだけでなく、宿主免疫系による破壊のために細胞を指し示す。
【００６３】
リンカー：さまざまなリンカーを使用して、本発明のコンジュゲートを作製することができる。たとえば、抗体部分、もしくは生物活性のあるそのバリアントを、修飾された遊離アミンと反応するリンカーに結合することができるが、このアミンはポリペプチドの中にあるリジン残基、またはポリペプチドのアミノ末端に存在する。したがって、本発明のコンジュゲートに有用なリンカーは、ポリペプチド上の、または抗体部分とコンジュゲートするように修飾されたポリペプチド上の、第1級アミンと反応する基を含有することができる。もっと具体的に言うと、リンカーは、モノフルオロシクロオクチン（MFCO）、ビシクロ[6.1.0]ノニン（BCN）、S-アセチルチオ酢酸N-スクシンイミジル（SATA）、S-アセチルチオプロピオン酸N-スクシンイミジル（SATP）、マレイミド、およびジベンゾシクロオクチンエステル（DBCOエステル）からなる1群から選択することができる。
【００６４】
本発明のコンジュゲートに有用な、ホモ二官能性、およびヘテロ二官能性クロスリンカー（コンジュゲーション剤）は、多くの商業的供給源から入手することができる。当技術分野では知られていることであるが、ホモ二官能性クロスリンカー中の反応基は同一のものであって、クロスリンカーのスペーサーアームの両端にあることを簡単に指摘しておく。そうしたクロスリンカーは、反応を1段階化学架橋で完了させることができるので、それを使って作業するのに都合がよく、それらを構築して、必要ならば、二量体およびポリマーを形成することができる。商業的に入手可能なホモ二官能性クロスリンカーには、次のものがある：BSOCOES（ビス(2-[スクシンイミドオキシカルボニルオキシ]エチル)スルホン）；DPDPB（1,4-ジ-(3'-[2ピリジルジチオ]-プロピオンアミド)ブタン）；DSS（スベリン酸ジスクシンイミジル）；DST（酒石酸ジスクシンイミジル）；Sulfo-DST （酒石酸スルホジスクシンイミジル）；DSP（ジチオビス(プロピオン酸スクシンイミジル)）；DTSSP（3,3’-ジチオビス(プロピオン酸スルホスクシンイミジル)）；EGS（エチレングリコール ビス(こはく酸スクシンイミジル)）；およびBASED（ビス(β-[4-アジドサリチルアミド]-エチル)ジスルフィド・ヨウ素化可）。
【００６５】
ホモもしくはヘテロ二官能性クロスリンカーによる架橋に利用できる領域は、本発明のポリペプチド上に見いだすことができる。クロスリンカー（もしくはリンカー、その用語のほうが本明細書でよく使用される）は、柔軟なアーム、たとえば、短いアーム（＜2炭素鎖）、中型アーム（2〜5炭素鎖）、または長いアーム（3〜6炭素鎖）を含有することができる。有用なクロスリンカーには、BS3（スベリン酸ビス(スルホスクシンイミジル)）があるが、これは、アクセス可能な第1級アミンを標的とする、ホモ二官能性N-ヒドロキシスクシンイミドエステルである。もう1つの有用なリンカーはNHS/EDCである（N-ヒドロキシ-スクシンイミドおよびN-エチル-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、これらは第1級アミン基とカルボキシル基とのコンジュゲーションを可能にする）。別の有用なリンカーはスルホ-EMCSである（[N-ε-マレイミド-カプロン酸]ヒドラジド、これは、スルフヒドリル基およびアミノ基に対して反応性であるヘテロ二官能性反応基（マレイミドおよびNHSエステル）を含んでいる）。また別の有用なリンカーはヒドラジドである。ほとんどのタンパク質は、露出した糖を含有しており、ヒドラジドはカルボキシル基を第1級アミンに連結するために有用な試薬である。もう1つの有用なリンカーはSATA（S-アセチルチオ酢酸N-スクシンイミジル）である。SATAは、アミンに対して反応性であり、保護されたスルフヒドリル基を付加する。使用する方法に関して、抗体部分をポリペプチドにコンジュゲートするプロセスは、抗体部分の重要な特性、たとえばその免疫特異性もしくは免疫反応性を、部分的にも全面的にも変化させないことが好ましい。ホモ二官能性アミン特異的クロスリンカーは、NHSエステルおよびイミドエステル反応基によって、第1級アミンと選択的にコンジュゲートすることができるが、切断可能であってもよい。ヘテロ二官能性クロスリンカーは、二つの異なる基を有し、これらはコンジュゲーションが2段階反応として進行することを可能にする。こうしたリンカーも、さまざまなタイプのスペーサーアームを有する、さまざまな長さのものが、商業的に入手可能である。コンジュゲーションは、（たとえば、リジン残基上の）第1級アミン基と（たとえば、システイン残基上の）スルフヒドリル基の間で進行すると考えられる。有用なリンカーを図11の表に記載する。
【００６６】
タンパク質コンジュゲートおよび作製方法：所定のコンジュゲート中の抗体部分、リンカー、およびポリペプチドは、独立して選択することができる。すなわち、本明細書に記載のリンカーはいずれも、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかを、本明細書に記載の抗体部分のいずれかとコンジュゲートするために使用することができる。次にそのコンジュゲートを用いて、本明細書に記載のいかなる抗体部分も、治療上の理由でCNSに送達することができる。検出可能なマーカーを含めて、本発明のコンジュゲートは、造影剤としても使用することができ、CNSにおいて抗体部分が結合する抗原の分布地図を作製する手段を提供する。
【００６７】
本発明のコンジュゲートは、1つもしくは複数のポリペプチド部分を1つの抗体部分に結合すること（すなわちコンジュゲートすること）によって無制限に作製することができる。
【００６８】
好ましいコンジュゲーション技術は、クロスリンカーSATA、およびクリックケミストリーの応用を含む。SATAは、2つの分子をつなぐ（すなわち、抗体部分をポリペプチド部分につなぐ）共有結合の形成を促進する、ヘテロ二官能性クロスリンカーである。スクシンイミジルエステルは第1級アミンと反応して、分子内にチオール基を導入し、次にアセチル基を除去することによって、スルフヒドリルを生じる。チオール基は、ジスルフィド結合によって2つの分子をつなぎ合わせることができるターゲットを提供する。SATA反応を適用する利点の1つは、スルフヒドリル基を保護された形で付加することができるので、修飾された分子が、後のコンジュゲーション反応のために長期間保存できることである。
【００６９】
記載されるように、銅を含まないクリックケミストリーの技術を用いて、本明細書に記載のコンジュゲートを作製することができる。クリックケミストリーは一般に、適用できる範囲が広く、立体特異的であって、マイルドな条件（たとえば、生理的条件）下で高収率の産物を生成することができる、モジュール式の反応として理解されている。クリックケミストリーは、4クラスの化学変換を含んでいるとされてきた。第1は、非アルドール型カルボニル化学反応であって、たとえば、尿素、チオ尿素、オキシムエーテル、ヒドラゾン、アミド、および芳香族複素環を形成する反応である。第2の変換は、歪みのある複素環求電子試薬（たとえば、エポキシド、アジリジン、およびアジリジニウムイオン）の環が開裂する、求核置換反応である。第3では、C-C多重結合への付加反応、たとえば、マイケル付加、エポキシ化、アジリジン化、およびジヒドロキシル化が起こり、第4では、付加環化反応、たとえば、1,3-双極子付加環化反応およびディールス・アルダー反応である。5員環トリアゾールを形成する、アルキンとアジドの1,3-双極子付加環化（1,3-ヒュスゲン反応）は、クリック反応の具体例である。Guddehalli Parameswarappy, Sharavathi, “Bifunctional cyclooctynes in copper-free click chemistry for applications in radionuclide chemistry nd 4-Alkylpyridine derivatives in intramolecular dearomatization and heterocycle synethsis”, Dissertation, University of Iowa, 2011.  http://ir.uiowa.edu/etd/2710を参照されたい。クリックケミストリーの方法は、高収率をもたらす製造方法において、毒性の高い触媒である銅を利用することがある。しかしながら、予備的なコンジュゲーション反応は、本発明のコンジュゲートにおけるポリペプチドの組込みが、全体として、きわめて低い（6％）ことを示した。コンジュゲートはまた、不安定であり、生成物の沈殿が観察された。したがって、クリックケミストリーを用いたコンジュゲーションステップを最適化して、銅の使用を排除した。簡単に述べると、第1のステップは、コンジュゲーションのための活性化基、ならびに中間体の精製および透析に関与する。このステップのために、第1の成分（たとえば、抗体、もしくは抗体フラグメント）は、リンカーと反応して、第1の成分-リンカー中間体（たとえば、抗体-もしくは抗体フラグメント-リンカー中間体）を生成する。次に、コンジュゲーションのための活性化基（すなわちアルキン）を有するリンカー、および第2の成分（たとえば、アジドを有するポリペプチド）が反応して、望ましいコンジュゲートを形成し、これをさらに精製することができる。この第2ステップは、関係する基（アルキンとアジド部分）の間の反応が、室温で24時間以内に、タンパク質を変性させることなく行われるので、効率的である。この手順のステップはいずれも、生成される分子の生物活性を妨げない。
【００７０】
あるいはまた、ポリペプチド部分は、酸化プロセスによって、抗体分子の糖鎖部分に付ける、もしくはコンジュゲートすることができる。糖鎖を酸化する方法は、化学的でも酵素的でもよい。糖鎖部分は、抗体のFc領域、Fab、またはFab'フラグメントにある可能性がある。抗体部分のFc領域の酸化は、アルデヒドを生成する既知の方法を用いて、行うことができる。酸化剤は、過ヨウ素酸、パラ過ヨウ素酸、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、およびメタ過ヨウ素酸カリウムからなる一群から選択することができる。このステップの次は、アミン基との反応であって、アミン基は、第1級アミン、第2級アミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、セミカルバジド、もしくはチオセミカルバジドなどのアンモニア誘導体からなる一群から選択される。酵素的方法は、抗体分子の糖鎖部分を、酸素の存在下でガラクトース酸化酵素のような酵素と反応させて、アルデヒドを形成させることを含む。
【００７１】
本発明のタンパク質コンジュゲートは、いくつもの方法を用いて評価することができる。たとえば、タンパク質コンジュゲートは、BBB透過性を評価することができる（in situ脳灌流によって、またはU.S. Patent No. 7,557,182に記載のモデルのような、BBBのex vivoモデルで検査することによって）；標的に対する抗体部分の親和性を評価することができる；細胞毒性を評価することができる（たとえば、BT-474 [3H]-チミジン取り込みによって）；in vitroでの溶解性および/または安定性を評価することができる；純度を評価することができる（たとえば、低レベルの非コンジュゲート抗体部分および低レベルのタンパク質凝集物をゲル分離およびウェスタンブロッティングによって確認することができる）；ならびに、in vivoでの安定性および組織分布を評価することができる（たとえば、血漿中濃度を経時的に測定し、画像検査によって組織分布を測定することによって）。
【００７２】
医薬組成物：本発明はまた、治療上有効な量の本発明のタンパク質コンジュゲートを含有する、医薬組成物を特徴とする。組成物は、さまざまな投与経路のいずれかによって投与するために調剤することができ、1つもしくは複数の生理学上許容される添加剤を含有することができるが、それは投与経路によってさまざまに異なっていてもよい。本発明者らは、広く任意の化合物もしくは物質を意味する「添加剤」という用語を使用するが、それには「基剤」もしくは「賦形剤」とも呼ばれるようなものが含まれる。製薬上および生理学上許容される組成物の調製は、一般に、当技術分野において通常の操作とみなされており、当業者は、手引きを求めて多数の典籍を調べることができる。たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed., 1985を参照することができる。ドラッグデリバリーの方法に関する短い総説としては、たとえば、Langer (Science 249:1527-1533, 1990)を参照されたい。
【００７３】
本発明の医薬組成物は、経口もしくは非経口投与用に調製することができるが、ただし、本発明者らは経口投与が好ましいと予想している（利便性のためではなくて、活性のある診断活性物質もしくは医薬活性物質（ここでは抗体部分）のデリバリーを最適化するために）。非経口投与用に調製された医薬組成物には、静脈内（もしくは動脈内）、筋肉内、皮下、腹腔内、経粘膜（たとえば、鼻内、膣内、もしくは直腸）、または経皮（たとえば、局所）投与用に調製された組成物を含む。これらの経路は、診断もしくは治療処置のいずれにも利用することができる。エアロゾル吸入も検討される。したがって、本発明は、タンパク質コンジュゲートを、許容される基剤中に溶解または懸濁して含有する、非経口投与用の組成物を提供するが、この基剤は好ましくは、水性基剤、たとえば水、緩衝水、生理食塩水、緩衝生理食塩水（たとえば、PBS）などである。含まれている添加剤のうち1つ、またはいくつかは、生理的状態に近づけるのに役立つ可能性があり、それはたとえば、pH調整および緩衝剤、張性調整剤、湿潤剤、界面活性剤などである。組成物が固体成分を含んでいる場合（組成物が経口投与用であるかもしれないので）、添加剤の1つ、もしくはいくつかは、結合剤もしくは賦形剤としての役割を果たすことがある（たとえば、錠剤、カプセル剤などの製剤のために）。組成物が、皮膚または粘膜表面への塗布用に製剤される場合、添加剤の1つ、もしくはいくつかは、クリーム、軟膏などを製剤するための溶媒もしくは乳化剤とすることができる。
【００７４】
医薬組成物は無菌とすることができる；医薬組成物は従来の滅菌技術で滅菌されるか、または無菌濾過することができる。水溶液は、使用するために、そのまま、または凍結乾燥してパッケージされてもよく、凍結乾燥された標品は、本発明に含まれており、投与に先立って無菌水性基剤と配合される。医薬組成物のpHは、典型的には、3から11の間（たとえば約5から9の間）、または6から8の間（たとえば約7から8の間）となる。一部の実施形態において、医薬組成物のpHは、約7.0から7.5の間である。その結果得られた固形状の組成物は、複数の1回投与量単位にパッケージすることができるが、それぞれが一定量の上記活性物質を1つもしくは複数、たとえば錠剤もしくはカプセル剤の密封されたパッケージの中に含有する。固形状の組成物は、量を自由に変更できるように、容器内にパッケージすることもできるが、その容器はたとえば、局所適用可能なクリームもしくは軟膏用にデザインされた絞りチューブである。
【００７５】
治療および使用の方法：上記の医薬組成物は、診断に有用な、または治療に有効な量のタンパク質コンジュゲートを含有するように製剤することができる。治療的投与は予防的適用を含み、本明細書に記載の治療法はいずれも、タンパク質コンジュゲートの「使用」という言い方で表すことができる（たとえば、がんの治療において、またはがん治療に有用な薬剤の調製において）。遺伝子検査および他の予後診断法に基づいて、医師は、患者が臨床的に確実な素因を有するか、または、CNS障害を伴うCNSがんまたは神経疾患に対する感受性が増加した（場合によっては、感受性が大いに増加した）場合、患者と相談して、予防的投与を選択することができる。本発明の医薬組成物は、臨床疾患の発病を遅らせ、減少させ、または好ましくは妨げるのに十分な量を、被験体（たとえば、ヒト患者）に投与することができる。治療への応用において、組成物は、CNS障害を伴うCNSがんまたは神経疾患にすでに罹患している被験体（たとえば、ヒト患者）に、兆候もしくは症状を少なくともある程度は改善するのに十分な量、または病気の症状、その合併症、および結果の進行を抑制する（そして好ましくは止める）のに十分な量が投与される。この目的を達成するのに十分な量を、「治療上有効な量」と定義する。たとえば、神経疾患（たとえば、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはハンチントン病）の治療において、この疾患のなんらかの症状を低減、予防、遅延、抑制、または阻止する薬剤もしくは化合物は、治療上有効であるといえる。治療上有効な量の医薬組成物は、治癒を達成する量であってもよいが、その転帰は、達成可能ないくつかの転帰のうちの1つにすぎない。記載されるように、治療上有効な量は、疾患の発症もしくは進行を遅らせ、妨げ、もしくは予防する治療、または疾患もしくは疾患の症状を改善する治療をもたらす量を含む。症状のうち1つもしくはいくつかは、それほど深刻でないこともある。治療を受けた個体では、回復が早まる可能性がある。
【００７６】
こうした用途に有効な量は、CNSがんもしくは神経疾患の重症度、ならびに被験体の体重および全身状態に応じて決定することができるが、一般に、被験体あたりの用量につき、約0.05μgから約1000μgまでの範囲（たとえば、0.5〜100μg）のタンパク質コンジュゲートの相当量とすることができる。初回投与および追加投与に適した投与計画は、初回投与後に、1ないし数時間、1ないし数日、1ないし数週間、もしくは1ないし数ヶ月間隔で次の投与により反復投与するという特徴を示す。たとえば、被験体は、タンパク質コンジュゲートを、1週あたり1回ないし数回（たとえば、1週あたり2、3、4、5、6、もしくは7回、または8回以上）、用量あたり、非コンジュゲート型の抗体部分に照らして、約0.05から1,000μgに相当する用量の範囲内で、受け取ることができる。たとえば、被験体は、1週間につき0.1から2,500μg（たとえば、2,000、1,500、1,000、500、100、10、1、0.5、または0.1μg）の投与量を受け取ることができる。被験体は、本発明のコンジュゲートを、2もしくは3週間ごとに1回、用量あたり0.1から3,000μgの範囲内で受け取ることもできる。被験体はまた、毎週2mg/kgを受け取ることができる（コンジュゲートもしくは抗体部分の重量に基づいて算出された重量による）。
【００７７】
本発明の医薬組成物中の、タンパク質コンジュゲートの有効量のすべてを、1回分として、急速静注か、または比較的短時間の点滴により、哺乳類に投与することができるが、複数回の用量をもっと長期間にわたって投与する分割治療プロトコールを用いて投与することもできる（たとえば、4〜6、8〜12、14〜16、もしくは18〜24時間ごと、または2〜4日、1〜2週間ごとに1回投与、または月1回の投与）。あるいはまた、治療上有効な血中濃度を維持するのに十分な持続点滴静注も考えられる。
【００７８】
本発明の組成物中に存在する1つもしくは複数の活性物質であって、哺乳類（たとえばヒト）に適用される本発明の方法で使用される前記活性物質の、治療上有効な量は、年齢、体重、およびその他の全身状態（上記のような）の個体差を考慮しつつ、当業者により決定される。本発明のタンパク質コンジュゲートは、BBBを越える能力の向上を示すので、抗体部分の投与量は、コンジュゲートされない場合の抗体部分の有効用量より少なくすることができる。たとえば、抗体部分の投与量は、同じ、または相当する非コンジュゲート型活性物質による治療効果のために必要とされる用量の、約90%、75%、50%、40%、30%、20%、15%、12%、10%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、もしくは0.1%であるか、またはそれより少なくすることができる。
【００７９】
治療上有効な量は、当業者が経験的に決定することもできる。たとえば、本発明の医薬組成物の1回投与もしくは複数回投与は、治療する医師が、投与量レベルならびに投与のタイミングおよびパターンを選択することで、実施することができる。投与量および投与スケジュールは、被験体の病気の重さや体調に基づいて、決定し、調整することができるが、臨床医もしくはその他の熟練した医療従事者によって通常行われる方法にしたがって、治療期間を通じて、それをモニターすることができる。
【００８０】
キット：本発明のキットは、上記の組成物および適当な使用説明書（書面であれ、録音資料、視覚資料、もしくは視聴覚資料としての提供であれ、またその両方であれ）を任意に組み合わせて含めることができる。ある実施形態において、キットには、医薬組成物、またはその前段階となるものが含まれ、使用説明書とともにパッケージされているが、さらに適宜、投与の準備および/または組成物の投与において組成物を取り扱うのに役立つ、任意のデバイスを含んでいてもよい。たとえば、本発明のキットは、希釈剤、手袋、バイアルもしくは他の容器、ピペット、ニードル、シリンジ、チューブ類、スタンド、スパーテル、滅菌クロスもしくはドレープ、陽性および/または陰性対照などのうち1つもしくはいくつかを含むことができる。別の実施形態において、本発明のキットは、タンパク質コンジュゲートの作製に有用な組成物および試薬を含む。たとえば、キットは、抗体部分、リンカー、リンカーと結合した抗体部分、ポリペプチド、リンカーと反応する化学物質、および/または修飾されたポリペプチドのうち1つもしくはいくつかを含むことができる。たとえば、ある実施形態において、キットは、抗体部分、リンカー、リンカーと反応する化学物質、およびポリペプチドを含んでいてもよい。他の実施形態において、キットは、リンカーと結合した抗体部分、および修飾されたポリペプチドを含むことができる。組成物を投与するのに有用なキットと同様に、組成物を作製するのに有用なキットは、希釈剤、手袋、バイアルもしくは他の容器、ピペット、ニードル、シリンジ、チューブ類、スタンド、スパーテル、滅菌クロスもしくはドレープ、陽性および/または陰性対照などの、いずれか1つもしくはいくつかを含むことができる。リンカーと抗体部分もしくはポリペプチドとを結合し、ポリペプチドを修飾し、リンカー結合抗体部分を修飾されたポリペプチドとコンジュゲートし（もしくは逆に、抗体部分をリンカー結合ポリペプチドとコンジュゲートし）、またはタンパク質コンジュゲートを精製して調べるのに役立つ、任意の試薬も含めることができる。記載のように、リンカーの結合した抗体部分、および修飾されたポリペプチドは本発明の主要な特徴となる組成物である。
（実施例）
【実施例１】
【００８１】
さまざまなコンジュゲーション法による予備検討（H1、H2、およびH3）
タンパク質コンジュゲートを調製する条件の最適化を目的とする一連の実験において、トラスツズマブを（抗体部分として）、配列番号97で表されるポリペプチド（Angiopep-2 (An2)）と反応させた。2つの異なるコンジュゲーション化学反応を用いたが、その一方はリンカーSATAを使用した。このコンジュゲーションにおいて、リンカーSATAの中にあるスクシンイミジルエステルは、ポリペプチドの第1級アミンと化学的に反応する。一般に、銅を含まないクリックケミストリーについては、2つのアプローチを用いることができる。1つのアプローチでは、抗体部分は、第1級アミンのところでアジド基により修飾されるが、ポリペプチドはアルキンで修飾される。もう1つのアプローチでは、抗体部分はアルキン（たとえば、MFCOまたはBCN）で修飾されるが、ポリペプチドは第1級アミンのところでアジド基により修飾される。抗体部分のポリペプチドに対する比率も、1:8から1:32まで変化させた。反応は5 mgの理論的スケールで行った。
【００８２】
【表１】
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1当量未満のAngiopep-2が組み込まれたので、トラスツズマブが大過剰に存在しており、さらに精製してトラスツズマブを除去するために、抗Angiopep-2アフィニティカラムを使用した。これはわずかな収率をもたらした（5〜10％の間）。銅触媒を使用する従来のクリックケミストリーにも問題があり、銅触媒は微量残存し、コンジュゲートの不安定さの一因となる可能性があった。
【００８３】
脳灌流を調べるように計画された実験において、in situでH1、H2、およびH3をテストした。その結果は、トラスツズマブ（αHER2）単独より高い、脳内のH1およびH3レベルを示した（図4）。
【実施例２】
【００８４】
最適化された銅なしのクリックケミストリーを用いた第2シリーズのコンジュゲートの作製および試験
銅なしのクリックケミストリー技術は、毒性の高い触媒を必要としない、早くて簡単で再現性のある技術なので、それを用いた。通常、アルキンとアジド部分との間の反応は、記載のように室温で24時間以内に行われ、触媒Cu(I)を必要としない。反応条件はマイルドなので、タンパク質の変性を引き起こさず、反応部分は、生体分子の官能基と相互作用しない。さらに、ポリペプチド部分におけるコンジュゲーション部位の位置は、コントロールすることができるので、結果として生じるコンジュゲートは安定しており、生物活性を有する。
【００８５】
本発明者らの作製方法において、「ステップ1」は「活性化、精製、および透析」とした。このステップは、リンカーと結合した抗体部分を生成する。ある実施形態において、ステップ1を実施するために、MFCO-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルの原液200μlを抗HER2モノクローナル抗体51 mgに添加した。リンカーの原液では、MFCO-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル7.6 mgを無水DMSO1000μl中に溶解した。反応は、ときどき振盪しながら室温で5時間放置された。リンカーと結合した抗体部分は、脱塩カラムによるゲル濾過によって、過剰な試薬から精製した。カラムから35mlが採取され、リンカーと結合した抗体部分は、1.3 mg/mLの濃度で存在した。リガンド結合抗体部分は、リン酸/クエン酸バッファー（pH〜5）に対して、4℃で一晩透析した。45 mg（収率88％）の活性オクチンが回収されたが、これをアジドAn2とともにステップ2に使用した。リンカーと結合した抗体部分（抗体部分-オクチン）の形成は、MALDI-TOF分析によって確認された。
【００８６】
ステップ2において、リンカーと結合した抗体部分に、未修飾ポリペプチド（An2）および修飾されたポリペプチド（N3を含む化学物質と結合しているAn2）を両方とも添加した。リンカーと結合した抗体部分42.8 mg、未修飾ポリペプチドの原液2,156μl（8当量；An2 13 mgをH2O 4,060μlに溶解した）、および修飾型ポリペプチドの原液901μl（An2N310 mgを無水DMSO 1,230μlに溶解した）を使用した。混合物を、ボルテックスすることによって撹拌し、アルミホイルに包んで、室温にて一晩放置した。コンジュゲーションは、LC-MSで、An2N3（修飾型ポリペプチド）の消費によってモニターした。An2の濃度は経時変化しないので、そのポリペプチドは内部標準としての役割を果たした。その結果生じたタンパク質コンジュゲートは、結合バッファーとしてリン酸/クエン酸バッファーpH 5.0を用い、溶出バッファーとしてクエン酸バッファーpH 3.0を用いて、プロテインAカラムで精製した。タンパク質コンジュゲートは単離され、さらにリン酸一水素塩バッファーにより中和してpH 5.0とした。溶液を遠心分離し、デカントして精製タンパク質コンジュゲートを得た。An2の組込みはMALDI-TOF分析により確認した。
【００８７】
H40-H44と称される5つのタンパク質コンジュゲートを作製したが、これらは抗体部分としてトラスツズマブを含み、さらに配列番号97で表されるポリペプチド（Angiopep-2すなわちAn2）を含むものである。コンジュゲートは、5 mgスケールで作製され、抗体部分のポリペプチドに対する比率およびリンカーの長さはさまざまであった。
【００８８】
【表２】
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図5に示すように、タンパク質コンジュゲートH40、H41、H42、H43、およびH44はすべて、類似した、トラスツズマブに対する結合パラメーターを示した。トラスツズマブおよびAn2-トラスツズマブコンジュゲートとBT-474細胞との結合は次のように行った。コンフルエントなBT-474細胞を、最初に、非酵素的解離用PBS-クエン酸バッファーを用いてフラスコから剥離した。浮遊状態の細胞を氷冷した結合バッファー（BB: Hepes 10 mM、NaCl 150 mM、CaCl2 2.5 mM、pH: 7.3）で洗浄し、計数して、別々のエッペンドルフに分割した（チューブあたり106個のBT-474細胞）。トラスツズマブおよびAn2-トラスツズマブコンジュゲートの結合は、4℃にて30分間、氷冷BB中で行い、生成物の濃度は上昇した。次に細胞を洗浄し、4℃にて30分間、氷冷BB中で、αヒトAlexaFluor488二次抗体とともにインキュベートした。細胞を大量の氷冷BBで洗浄し、フローサイトメトリーで分析した（条件ごとに10,000 ゲート化イベント）。
【００８９】
in situ脳灌流実験は、H1、H2、およびH3について上記のように行われ、銅なしのクリックケミストリーで作製された5つのタンパク質コンジュゲートのうち、H43がもっとも高い脳実質浸透を示すことを明らかにした（図6）。H43が注入時（0時間）から4時間後までの間、時間経過につれて直線的に取り込まれることも観察された。
【００９０】
下記の表に、タンパク質コンジュゲート（H43）のさまざまな性質を要約し、第1バッチと第2バッチを比較する。
【００９１】
【表３】
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消費されたAn2ポリペプチドの数は、LC-MS（液体クロマトグラフィー-質量分析法）で測定した。組み込まれたAn2ポリペプチドの数、およびコンジュゲートの分子量は、MALDI-TOFで測定した。トラスツズマブの分子量は約148,000である。
【００９２】
H43に関するこれまでの研究は、脳実質浸透の増加を示しており、さらに抗体部分がHer2と結合する能力を保持していることを示している（1回の凍結融解サイクルの後、Her2に対する結合親和性は同じであった）。作製された組成物は、コンジュゲート濃度の低下なしに、0.2μmフィルターを通して濾過することができる。タンパク質コンジュゲートも安定であるように思われる。14日間4℃で保存した後、沈殿は見られず、コンジュゲートの濃度は遠心後も依然としてほとんど何も変わっておらず、ポリペプチド（An2）は、10日後にウェスタンブロットで、まだ検出することができた。
【００９３】
組織分布を調べるために、CD-1マウスの静脈内に、放射性標識トラスツズマブ（125I-トラスツズマブ）か125I-H43のいずれか一方を、10 mg/kgの相当用量で注入した。血液サンプルは、30分、1時間、4時間、7時間、24時間、48時間、および72時間後に採取した。次にマウスを屠殺して、〜8分間、冷たいリン酸緩衝生理食塩水で灌流した。さまざまな組織を回収し、放射能を測定して組織分布を評価した。その結果を図7に示す。30分後に、H43の脳内分布はトラスツズマブより3.5倍に高まり；60分後に、その分布は2.5倍の高さであり；さらに72時間後に、分布は2.3倍の高さであることが判明した。Her2発現脳腫瘍がない場合、新生児型Fc（FcRn）受容体によって脳から流出する可能性があり、この受容体はBBBの基底外側において発現されると報告されているが、BBBを越えるリバーストランスサイトーシスに関与することも知られている。タンパク質コンジュゲートの分布は、脳内で、非コンジュゲート型抗体より高かったが、タンパク質コンジュゲートおよび非コンジュゲート型抗体の分布はともに、（筋肉、心臓、肝臓、腎臓、および肺を含めて）調べた他のどの組織よりも脳内で低かった。
【００９４】
図9において、本発明者らは、上記のように処理されたマウスから集められた追加データを示す。非コンジュゲート型抗HER2抗体（125I-トラスツズマブ）およびコンジュゲート型構築物H43（125I-H43）の分布は、％[脳]/[血漿]（左側のグラフを参照されたい）として、ならびに％注入投与量/組織のグラム数（中央のグラフを参照されたい）として表される。血漿中濃度は、右皮のグラフで示される。
【実施例３】
【００９５】
マウスの同所性脳腫瘍実験
タンパク質コンジュゲートが脳腫瘍を抑制する能力を調べるため、BT-474細胞をマウス18匹の脳内に注入した（その注入が第0日となる）。タンパク質コンジュゲートが脳腫瘍を抑制する能力を調べるため、BT-474細胞をマウス18匹の脳内に注入した（その注入が第0日となる）。第12日に、マウスを、対照溶液（静脈注射により提供される溶媒のみの溶液）、トラスツズマブ14 mg/kg、またはH32 15 mg/kgのいずれかで治療した。第33日に、それぞれの治療計画にしたがって治療された2匹のマウス（対照2匹；トラスツズマブ2匹；タンパク質コンジュゲート2匹）を屠殺した。脳組織を切開してトリパンブルーで染色した。この時点では腫瘍ははっきりとしない。第47日に、各治療計画により治療されたマウスをさらに2匹屠殺した。この時点で、対照群のマウスは体重が減少し、健康状態が悪いように見えた。調べてみると大きな脳腫瘍が視認できた。トラスツズマブで治療したマウスの脳には、見るからにそれより小さい腫瘍が存在し、タンパク質コンジュゲートで治療したマウスの脳には、小さい腫瘍が見られるか、または腫瘍はまったく見られなかった。残りのマウスで治療を継続し、続いて全マウスにCyto720 H43を静脈内投与した。近赤外（NiR）in vivoイメージング実験のために、ANG4043 (H43)および抗Her2抗体をNiR反応色素Cyto750-NHSエステル（Cytodiagnostics, Burlington, ON）で、メーカーのプロトコールにしたがって標識した。簡単に述べると、DMSOに溶解したCyto750-NHSエステルを、H43またはハーセプチンとともに、pH=9で、色素対タンパク質のモル比を1:2としてインキュベートした。室温にて1時間のインキュベーション後、Cyto750標識タンパク質をゲル濾過（Pierceデキストラン脱塩カラム）によって、未反応の色素から分離したが、最初に流出した着色バンドがCyto750標識タンパク質である。マウスにcyto750-抗Her2抗体、またはcyto750-H43のいずれかを5 mg/kg注入した。動物のイメージングは、Carestream製のin vivo Xtremeイメージングシステムを用いて、注入の24時間後に実施した。
【００９６】
その翌日（第48日）、それぞれの治療計画で治療したマウスをさらに2匹ずつ屠殺した。その結果は第47日に報告された結果と同様であった。腫瘍量の指標として脳の重量を測定し、その結果を図8に示す。対照溶液による治療を受けたマウスの脳、およびトラスツズマブによる治療を受けたマウスの脳は、BT-474細胞注入後に、健康なマウスの脳より重くなったが、BT-474細胞注入後にタンパク質コンジュゲートによる治療を受けたマウスの脳は、健康なマウスの脳と比べてまったく重くはなかった。
【実施例４】
【００９７】
BT-474脳内腫瘍の進行に及ぼすANG4043の影響；NiRイメージング実験
近赤外親油性蛍光プローブDiRをBT-474乳腺腫瘍細胞膜に取り込ませた。このプローブは、本発明のコンジュゲートいずれにも含有させるのに適している。次にBT-464-DiR腫瘍細胞をヌードマウスの脳に移植した。移植の12日後、マウスを溶媒、または上記でH43と呼ばれたものと同じコンジュゲートであるANG4043で治療し（15 mg/kg、IV、週2回）、NiR in vivoイメージングに供した。腫瘍の進行をモニターするために、2回治療後、および5回治療後に画像を撮影した。5回治療後、腫瘍に伴う蛍光は、ANG4043治療群で大いに減少したが、対照群では依然として高く検出される状態であった。こうした結果は、腫瘍増殖に及ぼすANG4043治療の効果の可能性を示す。
【００９８】
関連実験において、抗HER2抗体をAngiopepポリペプチド（An2）にコンジュゲートすることは、その抗体のBT-474乳腺腫瘍細胞膜に対する結合親和性に影響を与えないことが判明した。さらに、ANG4043または非コンジュゲート型抗HER2抗体で処理したBT-474細胞の増殖も検討した（5日間処理した後、定量用のチミジンに4時間暴露）。取り込みは、低濃度（0.0001-0.1 nM）では同等であったが、ANG4043処理細胞の増殖は、100 nMでは少なかった。IC50 (nM)は、抗HER2抗体については4.99 ± 0.76であり（n=2）、タンパク質コンジュゲートについては3.16 ± 0.97であった（n=3）。
【００９９】
ANG4043に関する予備的なPKパラメーター（WinNonlinコンパートメント解析）を以下の表に示す：
【０１００】
【表４】
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齧歯類におけるin vivo実験において、HER2陽性腫瘍の大きさがANG4043により減少することが判明した。BT-474腫瘍細胞は、マウスの脳内に移植する前に、蛍光色素DiRによる前処理でそれを取り込んだ（第1日）。マウスは、第12日から始めて週2回、抗HER2およびANG4043、20 mg/kgで治療した。NiRイメージングは、第16日に実施し、その時点では2回の治療が投与済みであったが、7回治療後の第33日にも実施した。蛍光イメージングによって、ANG4043がBT-474細胞において細胞表面HER2ととも共局在化し、ハーセプチンより大幅に内在化されることが判明した。ANG4043による治療を受けた脳は、腫瘍増殖が低下した（たとえば、NiRイメージングにより観察されるように）。生存に関して：
【０１０１】
【表５】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【国際調査報告】
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