(57)【要約】組織標的化部分と、４つのＨＯＰＯ部分を含む八座ヒドロキシピリジノン含有配位子と、アルファ放射性トリウム放射性核種のイオンとを含み、４つのＨＯＰＯ部分のうちの少なくとも１つが、Ｎ位においてヒドロキシアルキル可溶化基で置換されている、組織標的化錯体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織標的化部分と、４つのＨＯＰＯ部分を含む八座ヒドロキシピリジノン含有配位子と、アルファ放射性トリウム放射性核種のイオンとを含む組織標的化錯体であって、前記４つのＨＯＰＯ部分のうちの少なくとも１つが、Ｎ位においてヒドロキシアルキル可溶化基で置換されている、組織標的化錯体。
【請求項２】
少なくとも１つの３，２−ＨＯＰＯ部分を含む、請求項１に記載の錯体。
【請求項３】
４つのＨＯＰＯ部分がすべてＮ位にヒドロキシアルキル可溶化部分を含む、請求項１または２に記載の錯体。
【請求項４】
式Ｉ
【化１】
2015517483.tif 000034
の４つのキレート部分に含む八座配位子を含み、式中、
Ｒ1が、前記式Ｉの４つの部分のうちの少なくとも１つに存在する任意選択のＮ置換基可溶化基であり；
基Ｒ2〜Ｒ6がそれぞれ独立してＨ、ＯＨ、＝Ｏ、短いヒドロカルビル基、リンカー部分および／またはカップリング部分から選択され、Ｒ2〜Ｒ6のうちの１つがＯＨであり、Ｒ2〜Ｒ6のうちの１つが＝Ｏである、
請求項１または２に記載の錯体。
【請求項５】
基Ｒ1〜Ｒ6のうちの少なくとも１つがリンカー部分である、請求項４に記載の錯体。
【請求項６】
４つの３，２−ヒドロキシピリジノン部分を含む、請求項４〜５のいずれかに記載の錯体。
【請求項７】
前記４つのＨＯＰＯ基のそれぞれの前記Ｎ置換基がそれぞれ独立してＨＯ−、ＨＯＣＨ2−、ＨＯＣＨ2ＣＨ2−、ＨＯ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、ＨＯ−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2−、ＨＯ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、ＨＯ−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2−、ＨＯ−ＣＨ（ＣＨ2ＣＨ3）ＣＨ2−、ＨＯ−Ｃ（ＣＨ3）2ＣＨ2−、ＨＯ−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ（ＣＨ3）−およびＨＯＣＨ2ＣＨ（ＣＨ2ＣＨ3）−から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の錯体。
【請求項８】
前記アルファ放射性トリウム放射性核種のイオンが、227Ｔｈなどのアルファ放射性トリウム放射性核種の４＋イオンである、請求項１〜７のいずれかに記載の錯体。
【請求項９】
式ＶＩ：
【化２】
2015517483.tif 000035
ＶＩ
の配位子部分を含み、式中、ＲLが任意の適切なリンカー部分である、請求項１〜８のいずれかに記載の錯体。
【請求項１０】
前記組織標的化部分がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖ）、またはこのような抗体および／またはフラグメントの構築物あるいは抗体模倣物である、請求項１〜９のいずれかに記載の錯体。
【請求項１１】
過形成性疾患または腫瘍性疾患の治療のための薬物の製造における、組織標的化部分と、４つのＨＯＰＯ部分を含む八座ヒドロキシピリジノン含有配位子と、アルファ放射性トリウム放射性核種のイオンとを含む組織標的化錯体の使用であって、前記４つのＨＯＰＯ部分のうちの少なくとも１つがＮ位においてヒドロキシアルキル可溶化基で置換されている、使用。
【請求項１２】
前記組織標的化錯体が、請求項１〜１０のいずれかに記載の錯体である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記疾患が癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫または混合型癌である、請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
ヒトまたは非ヒト動物（特に、治療を必要とするもの）を治療する方法であって、組織標的化部分と、４つのＨＯＰＯ部分を含む八座ヒドロキシピリジノン含有配位子と、アルファ放射性トリウム放射性核種のイオンとを含む少なくとも１つの組織標的化錯体の投与を含み、前記４つのＨＯＰＯ部分のうちの少なくとも１つが、Ｎ位においてヒドロキシアルキル可溶化基で置換されている、方法。
【請求項１５】
前記組織標的化錯体が、請求項１〜１０のいずれかに記載の錯体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫または混合型癌などの過形成性疾患または腫瘍性疾患を治療する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
治療に使用する、請求項１〜１０のいずれかに記載の組織標的化錯体。
【請求項１８】
癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫または混合型癌などの過形成性疾患および／または腫瘍性疾患の治療に使用する、請求項１７に記載の組織標的化錯体。
【請求項１９】
医薬組成物であって、組織標的化部分と、４つのＨＯＰＯ部分を含む八座ヒドロキシピリジノン含有配位子と、アルファ放射性トリウム放射性核種のイオンとを含む組織標的化錯体を少なくとも１つの医薬担体または添加剤とともに含み、前記４つのＨＯＰＯ部分のうちの少なくとも１つが、Ｎ位においてヒドロキシアルキル可溶化基で置換されている、医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１０のいずれかに記載の錯体である組織標的化錯体を含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法に使用するキットであって、
４つのＨＯＰＯ部分を含む八座ヒドロキシピリジノン含有配位子とコンジュゲートしているかコンジュゲート可能な組織標的化部分を含み、前記４つのＨＯＰＯ部分のうちの少なくとも１つが、Ｎ位においてヒドロキシアルキル可溶化基で置換されており、
任意選択で、また好ましくは、227Ｔｈなどのアルファ放射性トリウム放射性核種を含む、
キット。
【請求項２２】
組織標的化錯体を形成する方法であって、
水溶液中で組織標的化部分と八座ヒドロキシピリジノン含有配位子とをカップリングさせることを含み、
前記錯体が、４つのＨＯＰＯ部分とアルファ放射性トリウム放射性核種のイオンとを含み、
前記４つのＨＯＰＯ部分のうちの少なくとも１つが、Ｎ位においてヒドロキシアルキル可溶化基で置換されている、
方法。
【請求項２３】
第一の八座ヒドロキシピリジノン含有配位子の水溶液および第二の前記組織標的化部分の水溶液を調製することと、前記第一の水溶液と前記第二の水溶液とを接触させることとを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２４】
前記接触を４０℃未満で実施する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記接触を、いかなる有機溶媒も実質的に存在しない状態で実施する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記カップリングにより、前記配位子部分と前記標的化部分との間にアミド結合、エステル結合、エーテル結合またはアミン結合が生じる、請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記アミド結合またはエステル結合が、少なくとも１つの活性エステル基によって形成される、例えば、Ｎ−ヒドロキシマレイミドカップリング試薬、カルボジイミドカップリング試薬またはアゾジカルボキシラートカップリング試薬によって形成される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリウム同位体の錯体、具体的には、標的化部分とコンジュゲートしたある特定の八座配位子を有するトリウム−２２７の錯体に関する。本発明はこのほか、このような錯体の投与を含む、疾患、具体的には腫瘍性疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物対象の様々な疾患の治療に成功するのに特異的な殺細胞作用が不可欠となる場合がある。この典型的な例は肉腫および癌腫などの悪性疾患の治療にみられる。しかし、ある特定の細胞型の選択的除去はその他の疾患、特に過形成性疾患および腫瘍性疾患の治療にも重要な役割を果たし得る。
【０００３】
現在最もよく用いられている選択的治療の方法が外科手術、化学療法および遠隔照射である。しかし、標的化した放射性核種療法は、望ましくない細胞型に細胞毒性の高い放射線を送達できる可能性を秘めた有望で発展しつつある分野である。現時点でヒトでの使用が承認され最もよく用いられている形態の放射性医薬品は、ベータ線放射性核種および／またはガンマ線放射性核種を用いるものである。しかし、アルファ線放射性核種にはさらに特異性の高い殺細胞作用がある可能性が秘められていることから、これを治療に使用することに一部関心が向けられている。
【０００４】
生理的環境での典型的なアルファ放射体の放射範囲は一般に１００マイクロメートル未満であり、この値は細胞の直径わずか数個分に相当するものである。このことから、腫瘍内の隣接する細胞に到達する放射範囲を有するものの、十分に標的化すれば放射されたエネルギーがほとんど標的細胞を通り抜けることがないため、このような放射線源は微小転移を含めた腫瘍の治療によく適している。したがって、すべての細胞を標的化する必要はなく、しかも周囲の健常組織の損傷を最小限に抑えることが可能である（Ｆｅｉｎｅｎｄｅｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｄｉａｔ  Ｒｅｓ  １４８：１９５−２０１（１９９７）を参照されたい）。これに対して、ベータ粒子の範囲は水中で１ｍｍ以上である（Ｗｉｌｂｕｒ，Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ  ４：８５−９６（１９９１）を参照されたい）。
【０００５】
アルファ粒子の放射エネルギーはベータ粒子、ガンマ線およびＸ線のものに比べて高く、通常５〜８ＭｅＶ、すなわちベータ粒子のものの５〜１０倍、ガンマ線のエネルギーの２０倍以上である。したがって、このようにきわめて近距離に大量のエネルギーが蓄積することから、アルファ放射線はガンマ放射線およびベータ放射線に比べて線エネルギー付与（ＬＥＴ）がきわめて高くなり、生物学的効果比（ＲＢＥ）が高くなり、酸素効果比（ＯＥＲ）が低くなる（Ｈａｌｌ，“Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｄｉｏｌｏｇ
ｉｓｔ”，第５版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋ
ｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡ，ＵＳＡ，２０００を参照されたい）。このことにより、アルファ放射性核種のきわめて高い細胞毒性が説明されるとともに、このような同位体の生物学的標的化ならびに許容されない副作用を回避するのに必要なアルファ放射性核種の分布の管理および研究のレベルに対して厳しい要求が生じる。
【０００６】
下の表１は、これまでに治療効果があると考えられるものとして文献で広く提案されているアルファ放射体の物理学的崩壊特性を示す。
【０００７】
【表１】
2015517483.tif 000002
【０００８】
これまで放射免疫療法への応用に関しては、主として211Ａｔ、213Ｂｉおよび225Ａｃが注目を集めており、この３つの核種が臨床免疫療法試験で検討されてきた。
【０００９】
これまでに提案された放射性核種のいくつかは短寿命である、すなわち半減期が１２時間未満である。半減期がこのように短いと、これらの放射性核種をベースとする放射性医薬品を商業的に製造および流通するのが難しくなる。ほかにも、短寿命核種を投与すると、標的部位に到達する前に体内で放射される放射線量の割合が増大する。
【００１０】
アルファ放射による反跳エネルギーは多くの場合、親核種の崩壊の位置からの娘核種の放出を引き起こす。この反跳エネルギーは、親核種を保持していた可能性のある化学環境、例えば、親核種がキレート剤などの配位子と錯体を形成していた環境から多数の娘核を崩壊させるのに十分なものである。この現象は、娘核が同じ配位子と化学的に適合性がある、すなわち錯体を形成し得る場合にも生じる。同様に、娘核種が気体、具体的にはラドンのような希ガスである場合または配位子と化学的に適合性がない場合、この放出効果はさらに大きいものとなる。娘核種の半減期が数秒以上である場合、親核種を保持していた錯体形成物質による拘束を受けずに血液系中に拡散し得る。次いで、これらの遊離の放射性娘核は望ましくない全身毒性を引き起こし得る。
【００１１】
223Ｒａ娘同位体のコントロールが維持された条件下でのトリウム−２２７（Ｔ1/2＝１８．７日）の使用が数年前に提案された（国際公開第０１／６０４１７号および同第０２／０５８５９号を参照されたい）。これは閉環境によって娘核種を保持することができる担体系を用いた場合であった。１つの場合は、放射性核種をリポソーム内に配置し、（反跳距離に比べて）リポソームの相当な大きさが助けとなり娘核種をリポソーム内に保持するものである。２つ目の場合は、骨基質内に組み込まれる骨親和性の放射性核種錯体を用いることにより娘核種の放出を制限するものである。これらはきわめて有利な方法であると考えられるが、リポソームの投与が望ましくない場合があり、また娘同位体を保持するのに放射性核種を石灰化基質で囲むことができない軟部組織の疾患も多数存在する。
【００１２】
ごく最近では、哺乳動物の体には、227Ｔｈの崩壊時に放出される223Ｒａ娘核の毒性に対して同等の核に関する以前の試験から予測されるよりもはるかに高い耐容性があることが確認されている。ラジウムの毒性に関して公開されている情報から、上述のトリウム−２２７のラジウム娘核を保持する特定の手段を用いない場合、トリウム−２２７崩壊から治療効果を得るのに必要な投与量では、ラジウム娘核の崩壊から毒性が高く、致死の可能性がある量の放射線が生じるであろう、すなわち治療域が存在しないことから、トリウム−２２７を治療剤として使用することは不可能であることが明らかであった。
【００１３】
国際公開第０４／０９１６６８号には、許容されない骨髄毒性を引き起こす量のラジウム−２２３を発生させずに治療有効量の標的化トリウム−２２７放射性核種を対象（通常、哺乳動物）に投与することができる治療域が確かに存在するという予想外の発見が記載されている。したがって、これを骨組織部位および軟部組織部位両方のあらゆるタイプの疾患の治療および予防に用いることができる。
【００１４】
上に述べた進歩を考えると、生成した223Ｒａによる致死的な骨髄毒性を引き起こさずにアルファ放射性トリウム−２２７核を内部放射性核種療法に用いることが可能である。しかし、その治療域は比較的狭いままであり、いずれの場合にも絶対に必要な量以上のアルファ放射性同位体を対象に投与しないことが望ましい。したがって、アルファ放射性トリウム−２２７核を錯体化し、高い信頼度で標的化すれば、この新たな治療域の有効活用が大いに促進されるであろう。
【００１５】
放射性核種は常時崩壊しているため、単離し対象に投与する間に材料を取り扱うのに費やす時間が重要である。また、迅速かつ簡便に調製でき、好ましくは必要な段階が少なく、インキュベーション時間が短い形態で、かつ／または標的化実体の特性に不可逆的な影響を及ぼさない温度でアルファ放射性トリウム核を錯体化、標的化および／または投与することができれば相当有用なものとなろう。さらに、投与前に除去する必要のない溶媒中で（実質的には水溶液中で）実施可能な工程には、溶媒蒸発または透析段階を回避するという大きな利点がある。これにより、汚染物質の娘生成物に常時崩壊する放射性医薬品の作製に重要な鍵となる調製の時間および複雑性の低減がもたらされる。
【００１６】
治療において細胞毒性薬を送達するのに選択性が必要であることを考えれば、アルファ放射性核種錯体の標的化が必要であるのは明らかである。しかし、適切なキレート剤と小さい標的化ペプチドまたは小さいタンパク質とのコンジュゲートは、小さい生体分子が不溶性のキレートを溶液中に保つことができないため、水溶液系における溶解度が低くなる傾向を示す。溶解度が低いと凝集または沈殿が生じる。凝集物があればヒト対象に投与する薬物製剤には許容されず、沈殿があれば組成物は使用できなくなることは明らかである。
【００１７】
さらに、モノクローナル抗体などのより大きい標的化ペプチド／タンパク質を用いても、キレート剤がコンジュゲートの表面に疎水性の「スポット」として露出する。場合によってはこれが微小凝集の問題をもたらす。
【００１８】
ヒト患者などの生体系では一般に、疎水性により肝臓での望ましくない取込みが生じる。これはアルファ放射体などの細胞毒性の高い薬剤において典型的な薬物化合物よりもはるかに重大な問題となる。キレート剤の疎水性はほかにも、疎水性が宿主の免疫系によって産生される抗体の結合を強化するため、免疫応答のリスクが増大する。これも同じくアルファ放射体の細胞毒性がきわめて高いことに起因する懸念である。したがって、上に述べた１つまたは複数の問題に対処するため、親水性、具体的には配位子部分の親水性が増大したコンジュゲートによってアルファ放射性トリウム放射性核種を選択的に送達する方法の必要性が相当高いことは明らかである。
【００１９】
のちに標的化部分と結合させるにはヒドロキシピリジノン基を含む八座キレート剤がアルファ放射体トリウム−２７７の配位に適していることがこれまでに示されている（国際公開第２０１１０９８６１１号）。リンカー基によってアミン系足場と結合した４つの３，２−ヒドロキシピリジノン基を含み、標的化分子とのコンジュゲーションに用いられる別の反応基を有する八座配位子キレート剤が記載された。上に挙げた発明の好ましい構造は、複素環の１位にメチル置換窒素を有する３，２−ヒドロキシピリジノン基を含み、４位にギ酸が結合するアミン結合によってアミン系足場と結合し、化合物ＡＬＧ−ＤＤ−ＮＣＳ、ＡＬＧ１００５−３８、Ｂｂ−１−ＨＯＰＯ−１−ＤＥＢＮとして示されるものであった。上に挙げたヒドロキシピリジノン含有分子のうちの１つを腫瘍標的化抗体とコンジュゲートする実験では、分子を水性緩衝液に溶かすことができなかったため、これを有機溶媒ＤＭＳＯに溶かした。
【００２０】
現在、細胞毒性療法（癌の化学療法または内部放射性核種療法など）に特異的標的化部分を使用することは十分に確立された方法であり、多数の標的および潜在的な標的が知られている。これらは通常、疾患細胞もしくは疾患細胞に関連する細胞またはその周辺の基質にある程度優先的に発現する細胞表面または基質マーカー（受容体など）である。特異的結合部分が細胞毒性要素（化学的毒素または放射性核種など）を望ましくない細胞型（例えば、腫瘍細胞）の近傍に標的化し、運搬し、かつ／または結合させる役割を果たすことによって、細胞毒性薬がもたらす殺細胞作用の選択性を向上させ得る。このような特異的結合性を利用するには、結合部分が細胞毒性薬（錯体化放射性核種など）とコンジュゲートしているかコンジュゲート可能なものでなければならない。葉酸結合受容体、ＣＤ２２、ＣＤ３３、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体などをはじめとする多数の受容体を含め、細胞表面および基質標的が多数知られている。通常、このような細胞表面マーカーに対する特異性を有する抗体、抗体フラグメントまたはより小さい結合分子（「アフィボディ」など）を作製し、細胞毒性薬とコンジュゲートさせる。ここに挙げた既知の方法およびマーカーはいずれも、放射性核種薬剤とともに使用可能であると考えられる。しかし、調製の簡便性および時間が重要であり、またより小さい結合物質では、投与するのにコンジュゲート全体が溶解する必要があるため、溶解度が重要なものとなり得る。
【００２１】
本発明者らは予想外にも、少なくとも１つが適切な可溶化部分で置換された４つのＨＯＰＯ部分を含む八座配位子ヒドロキシピリジノン（ＨＯＰＯ）型配位子によって錯体化した４＋トリウム−２２７イオンの使用により錯体の溶解度および対応する特性を劇的に向上させ得るということを確認した。
【発明の概要】
【００２２】
したがって、第一の態様から見て、本発明は、組織標的化部分と、４つのＨＯＰＯ部分を含む八座ヒドロキシピリジノン含有配位子と、アルファ放射性トリウム放射性核種のイオンとを含み、少なくとも４つのＨＯＰＯ部分のうちの１つがＮ位（１位）においてヒドロキシアルキル可溶化基で置換されている、組織標的化錯体を提供する。一実施形態では、このような錯体は純水に可溶性である。
【００２３】
好ましい実施形態では、八座配位子は少なくとも１つの３，２−ＨＯＰＯ部分、好ましくは２つ、３つまたは４つの３，２−ＨＯＰＯ部分を含む。さらなる好ましい実施形態では、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは全４つのＨＯＰＯ部分がＮ位にヒドロキシアルキル可溶化部分を含む。
【００２４】
好ましい標的化部分としては、ポリクローナル、具体的にはモノクローナル抗体およびそのフラグメントが挙げられる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’２および一本鎖特異的結合抗体などの特異的結合フラグメントが典型的なフラグメントである。
【００２５】
このような錯体（および好ましくは、本発明の全態様）では、一般にトリウムイオンを八座ヒドロキシピリジノン含有配位子によって錯体化し、次いで、これを任意の適切な手段によって組織標的化部分と結合させる。このような手段としては、直接的な共有結合または任意の適切な特異的結合対（例えば、ビオチン／アビジン型結合対）の手段による結合が挙げられる。任意の適切な結合を用いることができるが、直接的な共有結合または共有もしくは結合対リンカー部分の使用が典型的な方法であろう。共有エステル結合または共有アミド結合が好ましい方法である。
【００２６】
さらなる態様から見て、本発明は、組織標的化部分と、４つのＨＯＰＯ部分を含む八座ヒドロキシピリジノン含有配位子と、アルファ放射性トリウム放射性核種のイオンとを含み、４つのＨＯＰＯ部分のうちの少なくとも１つがＮ位においてヒドロキシアルキル可溶化基で置換されている組織標的化錯体（本明細書に記載される任意のこのような錯体を含む）の、本明細書に記載される任意のものを含めた過形成性疾患または腫瘍性疾患を治療するための薬物の製造における使用を提供する。
【００２７】
対応する態様では、本発明は、ヒトまたは非ヒト動物（具体的には治療を必要とするもの）を治療する方法を提供し、この方法は、組織標的化部分と、４つのＨＯＰＯ部分を含む八座ヒドロキシピリジノン含有配位子と、アルファ放射性トリウム放射性核種のイオンとを含み、４つのＨＯＰＯ部分のうちの少なくとも１つがＮ位においてヒドロキシアルキル可溶化基で置換されている組織標的化錯体（本明細書に記載される任意のこのような錯体を含む）を少なくとも１つ投与することを含む。このような方法は、好ましくは、本明細書に記載される任意のものを含めた過形成性疾患または腫瘍性疾患の治療のためのものである。このような方法は通常、それを必要とするヒトまたは非ヒト哺乳動物対象などのヒトまたは非ヒト哺乳動物対象に対して実施する。
【００２８】
さらなる対応する実施形態では、本発明は、治療に使用するための、特に本明細書に記載される任意の疾患および方法を含めた過形成性疾患および／または腫瘍性疾患の治療に使用するための、組織標的化部分と、４つのＨＯＰＯ部分を含む八座ヒドロキシピリジノン含有配位子と、アルファ放射性トリウム放射性核種のイオンとを含み、４つのＨＯＰＯ部分のうちの少なくとも１つがＮ位においてヒドロキシアルキル可溶化基で置換されている組織標的化錯体（本明細書に開示されるこのような錯体をすべて含む）を提供する。
【００２９】
さらなる態様から見て、本発明は、組織標的化部分と、４つのＨＯＰＯ部分を含む八座ヒドロキシピリジノン含有配位子と、アルファ放射性トリウム放射性核種のイオンとを含み、４つのＨＯＰＯ部分のうちの少なくとも１つがＮ位においてヒドロキシアルキル可溶化基で置換されている組織標的化錯体（本明細書に記載される任意のこのような錯体を含む）を少なくとも１つの医薬担体または添加剤とともに含む、医薬組成物を提供する。
【００３０】
天然に最も多く存在するトリウム同位体、すなわちトリウム−２３２（半減期が１０10年であり、事実上非放射性である）のトリウム錯体と区別するため、本明細書で特許請求されるトリウム錯体およびその組成物は、アルファ放射性トリウム放射性同位体（すなわち、半減期が１０3年未満の少なくとも１つのトリウム同位体、例えばトリウム−２２７）を天然の相対存在量よりも多く、例えば、少なくとも２０％多く含むことを理解するべきである。このことは、治療有効量のトリウム−２２７などの放射性トリウムを明示的に必要とする本発明の方法の定義に影響を及ぼす必要はないが、好ましくは全態様に当てはまる。
【００３１】
本発明の全態様において、アルファ放射性トリウムイオンはトリウム−２２７のイオンであることが好ましい。トリウムの４＋イオンは、本発明の錯体に使用するのに好ましいイオンである。それに応じて、トリウム−２２７の４＋はきわめて好ましい。
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、組織標的化錯体を形成する方法をさらに提供し、当該方法は、組織標的化部分と八座ヒドロキシピリジノン含有配位子とを水溶液中でカップリングさせることを含み、錯体は４つのＨＯＰＯ部分とアルファ放射性トリウム放射性核種のイオンとを含み、４つのＨＯＰＯ部分のうちの少なくとも１つがＮ位においてヒドロキシアルキル可溶化基で置換されている。このような方法は、いかなる有機溶媒も実質的に存在しない状態で実施し得る。
【００３３】
またさらにさらなる態様から見て、本発明はほかにも、本発明による方法に使用するキットを提供し、当該キットは、４つのＨＯＰＯ部分を含む八座ヒドロキシピリジノン含有配位子とコンジュゲートしているかコンジュゲート可能な組織標的化部分を含み、４つのＨＯＰＯ部分のうちの少なくとも１つがＮ位（１位）においてヒドロキシアルキル可溶化基で置換されている。結合部分および配位子はすべて、本明細書に記載されるものであるのが好ましい。このようなキットは、任意選択で、また好ましくは、227Ｔｈなどのアルファ放射性トリウム放射性核種を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】それぞれ非コンジュゲートｍＡｂおよび１つまたは２つのキレート剤とコンジュゲートしたｍＡｂの分布を示す質量スペクトルＡＧＣ０７１５（上）である。平均キレート剤−抗体比（ＣＡＲ）は約０．３である。
【図２Ａ−Ｂ】フローサイトメトリーにより分析したＣＤ３３陽性ＨＬ−６０細胞に対するＡＧＣ０７００およびＡＧＣ０７１５の結合を示す図である。ヤギ抗ヒトＦｃ、Ａｌｅｘａ４８８とコンジュゲートした二次抗体を用いて抗体を検出し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を一次抗体の濃度μｇ／ｍｌに対してプロットした。ＡＣ０１０３（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）をアイソタイプ様対照として用いた。様々なキレート剤−抗体（ＣＡＲ）比のＡＧＣ０７１５を非コンジュゲートＡＧＣ７００と比較した（Ａ）。対照実験では、ＡＧＣ７００と参照マウス抗ヒトＣＤ３３抗体とを５０：５０の混合比で混合した（Ｂ）。
【図３】ＡＧＣ０７１５−Ｔｈ−２２７（黒四角）、ＡＧＣ０７０３−Ｔｈ−２２７（白四角）および陰性対照トラスツズマブ−ＡＣ００１５−Ｔｈ−２２７（三角）の内部移行を示す図である。
【図４Ａ−Ｂ】Ｔｈ−２２７標識ＡＧＣ００１５とコンジュゲートしたＣＤ３３結合ｍＡｂ  ＡＧＣ０７１５（黒丸）、Ｔｈ−２２７標識ＡＧＣ００１５とコンジュゲートした対照ｍＡｂトラスツズマブ（黒四角）または培地（黒菱形）とともにインキュベートしたＨＬ−６０リンパ腫細胞を示す図である。両ｍＡｂとも同じ比活性になるようＴｈ−２２７で標識し、３ｎＭ（Ａ）または０．３ｎＭ（Ｂ）で使用した。
【図５】ＨＬ−６０腫瘍を有するヌードマウスにおける227Ｔｈ−ＡＧＣ０７１５の生体内分布を示す図である。データは、注射７日後に腫瘍内への取込みが高くなることを示している（２３±１０．７％ＩＤ／ｇ）。
【図６】ＡＧＣ１１１５の２８０ｎｍ（Ａ）および３３５ｎｍ（Ｂ）におけるＳＥＣ−ＵＶクロマトグラムである。平均キレート剤−抗体比（ＣＡＲ）は約０．９である。
【図７】フローサイトメトリーにより分析したＣＤ２２陽性Ｒａｊｉ細胞に対するＡＧＣ１１００およびＡＧＣ１１１５の結合を示す図である。マウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ、ＰＥとコンジュゲートした二次抗体を用いて検出を実施し、蛍光強度（ＭＦＩ）中央値を一次抗体の対数濃度ｎＭに対してプロットした。トラスツズマブをアイソタイプ対照として使用した。
【図８】：Ｔｈ−２２７標識ＡＧＣ００１５とコンジュゲートしたＣ２２結合ｍＡｂ  ＡＧＣ１１１５（黒丸）、Ｔｈ−２２７標識ＡＧＣ００１５とコンジュゲートした対照ｍＡｂトラスツズマブ（黒四角）または培地（黒菱形）とインキュベートしたＲａｍｏｓ細胞を示す図である。両ｍＡｂとも同じ比活性（４４ｋＢｑ／μｇ）になるようＴｈ−２２７で標識し、３ｎＭで使用した（Ａ）。
【図９】実施例１８の生成物１５のＨＰＬＣ分析を示す図である。出発物質１１が６．０４１分、所望のアミド生成物１５が７．６１６分、ジアシル化された副生成物が８．１５７分に示されている。
【図１０】ＡＧＣ０２０３（図１０Ａ）およびＡＧＣ０２１５（図１０Ｂ）のＦＰＬＣ−ＳＥＣクロマトグラムである。２８０ｎｍにおいて吸光度をモニターした。ピーク下の総面積を求めたところ、それぞれ１６６ｍＡＵ*ｍＬおよび４０９ｍＡＵ*ｍＬであった。
【図１１】サイズ排除クロマトグラフィーによって分離された主要なタンパク質画分、ＡＧＣ０２００、ＡＧＣ０２０３およびＡＧＣ０２１５のダイオードアレイ分光光度分析を示す図である。コンジュゲート中のキレート剤は約３３５ｎｍで吸収し、タンパク質は約２８０ｎｍで吸収する。
【図１２】ＡＧＣ０２００（１２Ａ）、ＡＧＣ０２０３（１２Ｂ）およびＡＧＣ０２１５（１２Ｃ）の調製物のＭＳスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の文脈において、「組織標的化」は本明細書で、問題の物質（具体的には、本明細書に記載される組織標的化錯体の形態である場合）が、その存在（例えば、放射性崩壊を送達するため）が望まれる少なくとも１つの組織部位にそれ自体を優先的に局在させる役割（および具体的には、任意のコンジュゲートしたトリウム錯体を局在させる役割）を果たすことを表すのに使用される。したがって、組織標的化基または部分は、対象に投与した後に対象の体の少なくとも１つの所望の部位に平均よりも多く局在させる役割を果たす。標的化部分は、例えば、罹患細胞上に存在する細胞表面マーカー（例えば、受容体、輸送タンパク質、細胞接着分子など）と結合し得る。同様に、組織標的化部分は、罹患細胞近傍の細胞上に存在する細胞表面マーカー（例えば、受容体、輸送タンパク質、細胞接着分子など）と結合し得る。このような細胞表面マーカーには、疾患細胞表面に健常細胞表面よりも多く発現するタンパク質または成長期もしくは複製期に休止期よりも多く細胞表面に発現するタンパク質が含まれる。このほか、標的細胞もしくは組織またはそれに関連する細胞もしくは組織の近傍に存在する成分を本発明の任意の態様による治療法の標的に利用し得る。例えば、標的細胞または標的組織周囲の基質中に存在するか放出される成分であれば、その存在、形態または濃度によってその領域が健常組織と区別される場合にそれを標的として使用し得る。このような例には、脳腫瘍に関連するが細胞間の基質中に発現するテネイシンなどの基質抗原がある。このような基質抗原は、本明細書で述べられる単一または複合標的化部分によって標的化することができる。
【００３６】
組織標的化部分はほかにも、総体としてトリウム錯体を所望の組織（１つまたは複数）に標的化する作用を有する２つ以上の成分を含み得る。これは例えば、最初に１つの成分が投与されて特定の組織、腫瘍または細胞型と結合し（組織結合物質）、同時にまたは好ましくはその後に第二のおよび／またはさらなる成分（連結物質）が投与され、これがｉｎ  ｖｉｖｏで組織結合物質と結合する場合であり得る。連結物質が錯体化アルファ放射性トリウムと直接的または間接的にコンジュゲートし、これにより組織結合物質と連結物質が総体として組織標的化部分を形成し得る。互いに親和性のある組織結合物質と連結物質を得るのに適した適切な特異的結合対は当該技術分野で周知である（例えば、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン）。
【００３７】
本明細書に記載される本発明の様々な態様は、具体的には患部組織を選択的に標的とする疾患の治療に関するほか、このような方法に有用な錯体、コンジュゲート、薬物、製剤、キットなどに関する。全態様において、患部組織は体の単一の部位に存在するもの（例えば、局在する固形腫瘍の場合）であっても、複数の部位に存在するもの（例えば、関節炎で複数の関節が冒されている場合または癌性疾患が分散もしくは転移している場合）であってもよい。
【００３８】
標的とする患部組織は軟部組織部位にあっても、石灰化組織部位にあっても、すべて軟部組織中にあり得る、すべて石灰化組織中にあり得る、あるいは少なくとも１つの軟部組織部位および／または少なくとも１つの石灰化組織部位を含み得る複数の部位であってもよい。一実施形態では、少なくとも１つの軟部組織部位を標的とする。標的化部位と疾患発生部位は同じ部位であり得るが、異なる部位（転移部位を特異的に標的とする場合など）であってもよい。２つ以上の部位に及ぶ場合、これは発生部位を含むものであっても、複数の二次部位であってもよい。
【００３９】
本明細書では、「軟部組織」という用語は、「硬い」石灰化基質のない組織を表すのに使用される。特に本明細書で使用される軟部組織は、骨格組織ではない任意の組織であり得る。これに対応して、本明細書で使用される「軟部組織疾患」は、本明細書で使用される「軟部組織」に発生する疾患を表す。本発明は具体的には癌および「軟部組織疾患」の治療に適するものであるため、任意の「軟部」（すなわち、非石灰化）組織に発生する癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫および混合型癌のほかにも、このような組織の他の非癌性疾患を包含する。癌性「軟部組織疾患」には軟部組織に発生する固形腫瘍のほか、転移腫瘍および微小転移腫瘍が含まれる。実際、軟部組織疾患は、同じ患者の軟部組織の原発固形腫瘍と軟部組織の少なくとも１つの転移腫瘍とを含み得る。あるいは、「軟部組織疾患」は、原発腫瘍のみまたは原発腫瘍が骨格疾患である転移腫瘍のみからなるものであり得る。
【００４０】
ある特定のアルファ放射性トリウム同位体（例えば、227Ｔｈ）を治療的に有効でかつ許容されない骨髄毒性を引き起こさない量で投与し得るというのは近年発見された重要な事実である。本明細書で使用される「許容できる非骨髄毒性」という用語は、最も重要なことであるが、投与したトリウム−２２７放射性同位体の崩壊によって生じるラジウム−２２３の量が、一般に対象に直接致命的にならない程度であることを表すのに使用される。しかし、このような治療の許容される副作用となる骨髄損傷（および致命的反応の確率）の量が治療する疾患の種類、治療法の目的および対象の予後によって大幅に異なることは当業者には明らかであろう。本発明の好ましい対象はヒトであるが、その他の哺乳動物、具体的にはイヌでも本発明の使用による利益を受け、許容される骨髄損傷のレベルも対象の種を反映したものになり得る。許容される骨髄損傷のレベルは一般に、悪性疾患の治療の方が非悪性疾患の治療よりも高くなる。よく知られている骨髄毒性のレベルの尺度の１つが好中球細胞数であり、本発明では、許容される223Ｒａの非骨髄毒性量は通常、最低点（最下点）における好中球画分が治療前の細胞数の１０％以上になるようコントロールされた量となる。好ましくは、許容される223Ｒａの非骨髄毒性量は、好中球細胞画分が最下点において少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％になる量となる。最下点の好中球細胞画分が少なくとも４０％であるのが最も好ましい。
【００４１】
さらに、幹細胞支持またはこれと同等の回復法を含める場合、通常であれば生成したラジウム（例えば、223Ｒａ）の骨髄毒性が不耐容性である高用量レジメンに放射性トリウム（例えば、227Ｔｈ）含有化合物を使用し得る。このような場合、適切な注意を払い、のちに幹細胞支持を実施する限り、最下点における好中球細胞数が１０％未満まで減少してもよく、例外的には５％まで、必要に応じて５％未満まで減少する。このような技術は当該技術分野で周知である。
【００４２】
本発明で特に関心がもたれるトリウム同位体がトリウム−２２７であり、文脈上可能であれば、本明細書でトリウムに言及する場合はいずれもトリウム−２２７が好ましい同位体である。トリウム−２２７は作製が比較的容易で、中性子を照射した226Ｒａから間接的に調製することが可能であり、これには227Ｔｈの母核種、すなわち227Ａｃ（Ｔ1/2＝２２年）が含有される。アクチニウム−２２７は226Ｒａ標的から分離するのがきわめて容易であり、227Ｔｈの発生源として使用することができる。この工程は必要に応じて工業規模に拡大することが可能であり、したがって、分子標的化放射線療法の候補に考えられている他のアルファ放射体のほとんどにみられる供給の問題が回避され得る。
【００４３】
トリウム−２２７はラジウム−２２３を経て崩壊する。この場合、主要な娘核種の半減期は１１．４日である。最初の数日間は、純粋な227Ｔｈ入手源から中程度の量のラジウムしか生成しない。しかし、223Ｒａからアルファ粒子が放射されて数分以内に短寿命の娘核種からアルファ粒子がさらに３種類放射されるため、223Ｒａの潜在的な毒性は227Ｔｈよりも高い（トリウム−２２７の崩壊系列を記載した下の表２を参照されたい）。
【００４４】
【表２】
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【００４５】
トリウム−２２７（Ｔ1/2＝１８．７日）は有害な崩壊生成物を生じることを一部の理由に、アルファ粒子療法に広く考慮されることはなかった。
【００４６】
トリウム−２２７は、不耐容性の骨髄抑制を引き起こす量のラジウム−２２３を生じることなく望ましい治療効果が得られる量で投与し得る。娘同位体の崩壊からなおも治療効果が得られるよう娘同位体を標的となる領域内に維持するのが望ましい。しかし、許容されない骨髄毒性を誘発せずに有用な治療効果を得るのにトリウム崩壊生成物の制御を維持する必要はない。
【００４７】
殺腫瘍細胞作用が主としてトリウム−２２７によるものであり、その娘核種によるものではないことを想定すると、他のアルファ放射体との比較によってこの同位体の予想される治療量を確立することができる。例えば、アスタチン−２１１では、動物における治療量は通常、２〜１０ＭＢｑ／ｋｇとされてきた。半減期およびエネルギーを補正すれば、対応するトリウム−２２７の投与量は体重１ｋｇ当たり少なくとも３６〜２００ｋＢｑになる。これにより、治療効果を期待して有効に投与し得る227Ｔｈの量の下限が設定される。この計算は、アスタチンとトリウムが同程度滞留すると仮定したものである。しかし、トリウムの１８．７日という半減期により、この同位体の方が崩壊前に多く排出される可能性が高いことは明らかである。したがって、この算出された投与量は通常、最小の有効量と見なすべきである。227Ｔｈが完全に保持される（すなわち、227Ｔｈが体から排出されない）と考えて治療量を表せば、通常少なくとも１８または２５ｋＢｑ／ｋｇ、好ましくは少なくとも３６ｋＢｑ／ｋｇ、より好ましくは少なくとも７５ｋＢｑ／ｋｇ、例えば１００ｋＢｑ／ｋｇ以上となる。トリウムの量をこれより多くすればさらに高い治療効果が期待されるが、不耐容性の副作用が生じる場合は多くすることはできない。これと同様に、トリウムを生物学的半減期（すなわち、依然としてトリウムを保持している体から排出される前の半減期）が短い形態で投与する場合、多量のトリウムが崩壊前に排出されるため、治療効果を得るには放射性同位体の量を多くする必要がある。しかし、これに対応して、生成するラジウム−２２３の量は減少することになる。上に述べた同位体が完全に保持される場合に投与するトリウム−２２７の量と、生物学的半減期の短い同等の投与量との関係は容易に求めることができる。このような計算は当該技術分野で周知であり、国際公開第０４／０９１６６８号（例えば、実施例１および２の本文）に記載されている。
【００４８】
放射標識化合物が娘核種を放出する場合、該当すれば放射性娘核種（１つまたは複数）の運命を知ることが重要である。227Ｔｈであれば、主要な娘生成物は223Ｒａであり、この生成物は骨親和性があるため臨床評価段階にある。ラジウム−２２３は血液からきわめて迅速に排出され、骨格内に濃縮されるか、腸および腎臓経路を介して排泄される（Ｌａｒｓｅｎ，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４３（５，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）：１６０Ｐ（２００２）を参照されたい）。したがって、227Ｔｈからｉｎ  ｖｉｔｒｏで放出されたラジウム−２２３は、健常軟部組織にあまり影響を及ぼさないと考えられる。Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｂｉｏｌ．２０：２３３−２４３（１９７１）に記載されているＭｕｌｌｅｒによる溶解したクエン酸塩としての227Ｔｈの分布に関する研究では、軟部組織内の227Ｔｈから生成した223Ｒａが容易に骨に再分布するか排泄されることが明らかにされている。したがって、知られているアルファ放射性ラジウムの毒性、具体的には骨髄に対する毒性はトリウム投与量の問題である。
【００４９】
実際、投与量が少なくとも２００ｋＢｑ／ｋｇの223Ｒａをヒト対象に投与しても耐容性が認められることが、国際公開第０４／０９１６６８号で初めて確認されている。このデータは上記公開特許に示されている。したがって、全く予想外ではあるが、治療有効量（３６ｋＢｑ／ｋｇ以上など）の227Ｔｈを哺乳動物対象に、このような対象に許容されない重篤な、場合によっては致命的な骨髄毒性のリスクが発生することを予想せずに、投与することが可能な治療域量が実際に存在することがわかった。しかし、この治療域を最大限に活用することがきわめて重要であり、したがって、投与量のうち最大限の割合の量が標的部位に送達されるよう放射性トリウムを迅速かつ効率的に錯体化し、親和性がきわめて高くなるよう保持することが不可欠である。
【００５０】
227Ｔｈ医薬品から生成する223Ｒａの量は、放射標識化合物の生物学的半減期に左右される。理想的な状況は、腫瘍細胞へ内部移行し、腫瘍内に強固に滞留し、正常組織内での生物学的半減期が短いことを含め迅速に腫瘍内に取り込まれる錯体を用いることであると考えられる。しかし、生物学的半減期が理想値に達しない錯体であっても、223Ｒａの投与量が耐容レベル内に維持される限り有用である。ｉｎ  ｖｉｖｏで生じるラジウム−２２３の量は、トリウム投与量とトリウム錯体の生物学的滞留時間の因子となる。任意の特定の場合に生じるラジウム−２２３の量は、当業者であれば容易に算出することができる。投与可能な227Ｔｈの最大量はｉｎ  ｖｉｖｏで生じるラジウムの量によって決まり、不耐容レベルの副作用、具体的には骨髄毒性が生じる量未満でなければならない。この量は一般に、３００ｋＢｑ／ｋｇ未満、具体的には２００ｋＢｑ／ｋｇ未満、より好ましくは１７０ｋＢｑ／ｋｇ未満（例えば、１３０ｋＢｑ／ｋｇ未満）である。最小有効量はトリウムの細胞毒性、生じるアルファ放射線に対する患部組織の感受性およびトリウムがどの程度標的化錯体（この場合、配位子と標的化部分の組合せ）と効果的に結合し、これに保持され送達されるかによって決まる。
【００５１】
本発明の方法では、トリウム錯体を望ましくは１８〜４００ｋＢｑ／ｋｇ体重、好ましくは３６〜２００ｋＢｑ／ｋｇ（５０〜２００ｋＢｑ／ｋｇなど）、より好ましくは７５〜１７０ｋＢｑ／ｋｇ、特に１００〜１３０ｋＢｑ／ｋｇのトリウム−２２７投与量で投与する。これに対応して、１回の投与量は、ここに挙げたいずれかの範囲に３０〜１５０Ｋｇ、好ましくは４０〜１００Ｋｇなどの適切な体重を乗じた数値前後（例えば、１投与当たり５４０ｋＢｑ〜４０００ＫＢｑの範囲など）を含み得る。トリウム投与量、錯化剤および投与経路はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じるラジウム−２２３量が３００ｋＢｑ／ｋｇ未満、より好ましくは２００ｋＢｑ／ｋｇ未満、さらにより好ましくは１５０ｋＢｑ／ｋｇ未満、特に１００ｋＢｑ／ｋｇ未満になるものが望ましい。もう一度述べると、これにより、示されるいずれかの体重を上に挙げた範囲に乗じることによって示される223Ｒａへの曝露が得られる。上記投与量レベルは227Ｔｈが完全に保持される投与量であるのが好ましいが、崩壊前に一部の227Ｔｈが崩壊前に体から排出されることを考慮に入れた投与量であってもよい。
【００５２】
227Ｔｈ錯体の生物学的半減期が物理的半減期に比べて短い（例えば、７日未満、特に３日未満）場合、同等の投与量を保持するのに相当多い投与量を必要とする場合がある。したがって、例えば、完全に保持される投与量１５０ｋＢｑ／ｋｇは、半減期が５日の錯体を７１１ｋＢｑ／ｋｇの投与量で投与する場合と等しくなる。任意のしかるべき保持投与量に等しい投与量は、当該技術分野で周知の方法を用いて錯体の生物学的クリアランス速度から算出することができる。
【００５３】
227Ｔｈ核が１個崩壊すると223Ｒａ原子が１個生じるため、227Ｔｈの保持および治療活性は、患者が受ける223Ｒａ投与量と直接関係がある。任意の特定の状況で生じる223Ｒａの量は周知の方法を用いて算出することができる。
【００５４】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は哺乳動物対象（本明細書に記載される）の疾患の治療のための方法を提供し、当該方法は、当該対象に組織標的化部分と、八座配位子（特に本明細書に記載されるいずれかのもの）と、放射性トリウム同位体（例えば、トリウム−２２７）を含むコンジュゲートを治療有効量投与することを含む。
【００５５】
223Ｒａ娘同位体の特性を有効に用いない限り、対象の223Ｒａ娘同位体への曝露を最小限に抑えることが望ましいのは明らかである。具体的には、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じるラジウム−２２３は通常、４０ｋＢｑ／ｋｇ超、例えば６０ｋＢｑ／Ｋｇ超となる。場合によっては、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じる223Ｒａが８０ｋＢｑ／ｋｇ超、例えば１００または１１５ｋＢｑ／ｋｇ超となる必要がある。
【００５６】
しかるべき担体溶液中のトリウム−２２７標識コンジュゲートを単回適用または分割適用レジメンとして静脈内に、腔内に（例えば、腹腔内に）、皮下に、経口的にまたは局所的に投与し得る。好ましくは、標的化部分とコンジュゲートした錯体を溶液として非経口（例えば、経皮）経路によって、特に静脈内にまたは腔内経路によって投与する。好ましくは、本発明の組成物を非経口投与用に無菌溶液に製剤化する。
【００５７】
本発明の方法および製品におけるトリウム−２２７は単独で使用しても、または外科手術、遠隔照射療法、化学療法、他の放射性核種または組織温度調節などを含めた他の治療法式と併用してもよい。これは本発明の方法のさらなる好ましい実施形態を形成するものであり、それに対応して、製剤／薬物は別の放射性薬剤または化学療法剤などの追加の治療活性薬剤を少なくとも１つ含み得る。
【００５８】
１つの特に好ましい実施形態では、ほかにも対象に幹細胞治療および／またはその他の支持療法を実施して、ラジウム−２２３による骨髄毒性の作用を低減する。
【００５９】
本発明に従って、227Ｔｈを標的化錯化剤によって錯体化し得る。通常、標的化部分は分子量が１００ｇ／ｍｏｌ〜数百万ｇ／ｍｏｌ（具体的には１００ｇ／ｍｏｌ〜１００万ｇ／ｍｏｌ）であり、好ましくは疾患関連受容体に対して直接親和性があり、かつ／または227Ｔｈの投与前に疾患に対して標的化された分子と結合した予め投与する適切な結合物質（例えば、ビオチンまたはアビジン）を含む。適切な標的化部分としては、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡフラグメント、アプタマーなど、好ましくはタンパク質、例えば、アビジン、ストレパタビジン（ｓｔｒｅｐａｔａｖｉｄｉｎ）、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体（ＩｇＧおよびＩｇＭ型抗体を含む）あるいはタンパク質またはタンパク質のフラグメントもしくは構築物の混合物が挙げられる。抗体、抗体構築物、抗体のフラグメント（例えば、ＦＡＢフラグメントまたは抗原結合領域を少なくとも１つ含む任意のフラグメント）、フラグメントの構築物（例えば、一本鎖抗体）またはその混合物が特に好ましい。適切なフラグメントとしては、特にＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’および／またはｓｃＦｖが挙げられる。抗体構築物は本明細書に示される任意の抗体またはフラグメントのものであり得る。
【００６０】
一実施形態では、標的化部分はＣＤ２２、ＣＤ３３、葉酸受容体、エストロゲンおよび／またはプロゲステロン受容体あるいは腫瘍性細胞型に付随する任意の細胞表面受容体などの細胞表面受容体に対する特異性を有し得る。
【００６１】
別の実施形態では、標的化部分はＣＤ２２またはＣＤ３３に対して特異性を有さない。一実施形態では、標的化部分は受容体ＣＤ２２と結合せず、かつ／または受容体ＣＤ３３と結合しない。結合しないことは、インスリン受容体などの対照受容体との結合以下の程度で結合することと考えられ得る。
【００６２】
さらなる実施形態では、特異的結合部分は、抗体のものと類似した特異的結合領域を少なくとも１つ有し分子質量が約１０ｋＤ未満（例えば、０．５〜７ｋＤなどの８ｋＤ以下）のペプチド結合物質などの「抗体模倣物」であり得る。このような特異的結合剤物質は、例えば、２０〜１００個のアミノ酸、好ましくは３５〜８０個のアミノ酸（例えば、約４５〜約７０個のアミノ酸）からなるペプチドであり得る。この種の特異的結合物質で周知のものとしては、約５５〜６０個のアミノ酸からなり分子量が約５〜７ｋＤのアフィボディ分子が挙げられる。本明細書ではアフィボディ含有融合タンパク質を例として挙げる。このような結合物質は１つの好ましい実施形態を形成するものである。比較のために挙げると、典型的な抗体の質量が約１５０ｋＤａであり、単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）の質量が約１２〜１５ｋＤａである。
【００６３】
このほか、本発明での使用に適したものには、錯体化227Ｔｈと、ペプチド、アミノ酸、ステロイドホルモンまたは非ステロイドホルモン、葉酸、エストロゲン、テストステロン、ビオチンをはじめとする分子量が通常１００００ｇ／ｍｏｌ未満の特異的結合化合物との治療用コンジュゲートがある。
【００６４】
一般に、八座配位子を標的化部分と直接的または間接的に（例えば、リンカー部分を介して）コンジュゲートさせる。このタイプ、すなわち、活性な（例えば、治療的にまたは診断的に活性な）金属−錯体化部分−任意選択のリンカー部分−標的化部分のタイプの一般的な構築物は標的化放射性医薬品および標的化造影剤の分野で周知である。しかし、様々な配位子についてトリウム４＋イオンに特異的に使用するのに適するかどうかを評価した研究はほとんどまたは全くない。この点に関しては、例えば、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ”，Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５が参照されよう。
【００６５】
ヒドロキシピリジノン配位子を有するトリウムイオンに関するこれまでの研究で最も適切なものが国際公開第２０１１／０９８６１１号として公開されており、これには八座ＨＯＰＯ含有配位子と錯体化したトルイム（ｔｈｏｒｕｉｍ）イオンの比較的容易な作製が開示されている。
【００６６】
これまでに知られているトリウムのキレート剤としてはほかにも、主鎖の窒素部分に酸性（例えば、カルボキシアルキル）基が結合した直鎖状、環状または分岐状のポリアザアルカン主鎖を含むポリアミノポリ酸キレート剤が挙げられる。このようなキレート剤の例としては、ｐ−イソチオシアナトベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＯＴＡ）などのＤＯＴＡ誘導体およびｐ−イソチオシアナトベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ）などのＤＴＰＡ誘導体が挙げられ、前者は環状キレート剤、後者は直鎖状キレート剤である。
【００６７】
これまでに１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸の誘導体が例として挙げられているが、ＤＯＴＡ誘導体でトリウムをキレートするのに標準的な方法を容易に用いることはできない。ＤＯＴＡ誘導体と金属とともに加熱すると効率的にキレートされるが、収率が低くなる場合が多い。少なくとも一部の配位子が処理中に不可逆的に変性する傾向がある。さらに、標的化部分は不可逆的変性に対する感受性が比較的高いため、一般に加熱段階がすべて完了するまで標的化部分の結合を避ける必要がある。これにより、アルファ放射性トリウム同位体の崩壊寿命の間に実施しなければならない余分な化学的段階（すべての必要なワークアップおよび分離とともに）が加わる。アルファ放射性物質をこのように取り扱ったり、これに伴う無駄を必要以上に生じさせたりすることは好ましくないのは明らかである。さらに、コンジュゲートの調製に費やす時間はすべて、この調製時間中に崩壊する分のトリウムを浪費するものである。
【００６８】
本発明の全態様においてアルファ放射性トリウムと八座配位子の錯体は、６０℃超に加熱せずに（例えば、５０℃超に加熱せずに）、好ましくは３８℃超に加熱せずに、最も好ましくは２５℃超に加熱せずに形成されるか形成可能であるのが好ましい。
【００６９】
さらに、アルファ放射性トリウム同位体（例えば、227Ｔｈ4+イオン）を加える前に標的化部分と八座配位子とのコンジュゲートを調製するのが好ましい。したがって、本発明の生成物は、八座配位子と組織標的化部分とのコンジュゲートによるアルファ放射性トリウム同位体（例えば、227Ｔｈ4+イオン）の錯体化によって形成されるか形成可能であるのが好ましい。
【００７０】
キレート剤は非ホスホン酸分子であり得、本発明の一実施形態では、227Ｔｈはホスホン酸をはじめとする骨標的化基と結合させることも、このような物質とともに投与することもない。
【００７１】
本発明者らは、４つのＨＯＰＯ部分を含む八座ヒドロキシピリジノン含有配位子と、アルファ放射性トリウム放射性核種のイオンとを含む錯体が、室温および／または生理的温度（例えば、２０℃または３７℃）での作製にきわめて適していることを確認している。このような錯体は迅速に作製され得るものであり、さらには作製温度が比較的低いため、配位子部分が組織標的化部分と結合または別の方法でコンジュゲートした後にトリウム成分の錯体化が起こり得ることから、放射性同位体の添加後に必要な段階数が少なくなる。
【００７２】
上記のことに加えて、少なくとも１つのＨＯＰＯ部分がヒドロキシアルキル可溶化基を含む４つのＨＯＰＯ部分を含む八座ヒドロキシピリジノン含有配位子の水溶性が高いことが、完全なコンジュゲートの製造の簡便さをさらに向上させるのに役立つ。具体的には、コンジュゲートを製造するとき、既に知られている八座配位子などの疎水性キレート剤であればＤＭＳＯまたはＤＭＡなどの有機溶媒に溶かす必要がある。コンジュゲーション後、有機溶媒を完全に除去する必要があるが、このような不揮発性の極性有機溶媒の除去は困難であり、完全に除去されたことを分析的に示すのは難しい。アルファ放射体が既に組み込まれている場合、分析に時間を費やすのは、放射性核種が崩壊し続け、コンジュゲートの効力が時間とともに減少することから明らかに望ましくない。
【００７３】
有機溶媒を必要とすることから、疎水性キレート剤は、タンパク質性標的化分子のみならず、表面にＰＥＧまたはデキストランを有するナノ粒子を含めたより親水性の高い別の標的化分子とはなおさら、組み合わせるのが困難である。
【００７４】
半減期が長いまたは免疫応答を軽減するなどの生物学的な理由から、ＰＥＧまたは別の親水性で水溶性の高いスペーサーが望まれ得る。タンパク質とのコンジュゲーション前にキレート剤−ＰＥＧ単位を製造することも、この２つの部分の溶解性の違いから困難なものとなる。ＰＥＧまたはこれと同様のスペーサーがあると、分子のキレート部分と担体タンパク質との間により高い親水性がもたらされる。しかし、これはキレート剤を担体タンパク質からさらに離れた位置に移動させるだけで、キレート剤の疎水性は影響を受けない。したがって、疎水性キレート剤は依然として（ペグ化）標的化分子の表面に疎水性スポットとして認められ、本明細書で上に述べた通り望ましくない反応を起こし得る。
【００７５】
八座配位子キレート剤（本明細書に記載されるカップリング部分を含む）を介してトリウム（例えば、トリウム−２２７）と連結し得る様々なタイプの標的化化合物。標的化部分は既知の標的化基から選択することができ、このような標的化基としては、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、増殖因子、ペプチド、ホルモンおよびホルモン類似体、葉酸塩および葉酸塩誘導体、ボチン（ｂｏｔｉｎ）、アビジンおよびストレプトアビジンまたその類似体が挙げられる。ほかにも考えられる標的化基としては、ＲＮＡ、ＤＮＡもしくはそのフラグメント（アプタマーなど）、オリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質またはタンパク質を含めてもしくは含めずにこのような基を組み合わせることによって作製した化合物などが挙げられる。前述の通りＰＥＧ部分を加えて、例えば生物学的滞留時間を増大させ、かつ／または免疫刺激を低減してもよい。
【００７６】
一実施形態では、組織標的化部分として、骨親和性物質、リポソームおよび葉酸とコンジュゲートした抗体または抗体フラグメントを除外し得る。あるいは、このような部分が含まれ得る。
【００７７】
本発明のトリウム（例えば、トリウム−２２７）標識分子は、疾患関連受容体を標的とすることによって癌性または非癌性疾患の治療に使用され得る。通常、このような227Ｔｈの医学的使用は、キレート剤によって227Ｔｈと抗体、抗体フラグメントまたは抗体もしくは抗体フラグメントの構築物とを連結することに基づく、癌性または非癌性疾患の治療のための放射免疫療法によるものとなる。本発明による方法および医薬品における227Ｔｈの使用は具体的には、癌腫、肉腫、リンパ腫および白血病を含めた任意の形態の癌、特に肺癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、脳癌、卵巣癌、子宮癌、口腔癌、結腸直腸癌、黒色腫、多発性骨髄腫および非ホジキンリンパ腫の治療に適している。
【００７８】
227Ｔｈを運搬する分子のｉｎ  ｖｉｖｏでの生物学的保持半減期が短い場合、227Ｔｈの大部分が223Ｒａに崩壊する前に放射性核種がほとんど除去されるため、放出される223Ｒａの量が減少し得る。しかし、本発明によれば、治療効果を維持するために227Ｔｈの量を増加させる必要がある。227Ｔｈが標的細胞の内部に送達されるよう錯化剤を選択した場合、娘同位体が腫瘍部位に少なくとも一部保持されるため、これにより特異的細胞毒性がさらに増大し、放射性娘核種の全身毒性効果が低減される。これらの特徴はともに227Ｔｈの治療域を広げるため、本発明の好ましい実施形態を形成する。
【００７９】
本発明のさらなる実施形態では、軟部組織および骨格の疾患をともに有する患者を227Ｔｈおよび投与したトリウムによりｉｎ  ｖｉｖｏで生じる223Ｒａの両方で治療し得る。この特に有利な態様では、骨格疾患に標的化することにより、許容される非骨髄毒性量の223Ｒａから治療に追加の治療要素が得られる。この治療方法では通常、227Ｔｈを用いて、軟部組織の原発性および／または転移性癌をそれに対する適切な標的化により治療し、227Ｔｈ崩壊から生じた223Ｒａを用いて、同じ対象の関連する骨格疾患を治療する。この骨格疾患は原発性軟部組織癌に起因する骨格への転移であっても、軟部組織の治療で転移性癌を抑制する原発疾患であってもよい。軟部組織疾患と骨格疾患との間に関連がない場合もあり得る（例えば、リウマチ性の軟部組織疾患を有する患者の骨格疾患に対する追加の治療）。
【００８０】
本発明のあらゆる点において重要な態様は、八座配位子、具体的には４つのＨＯＰＯ部分を含む八座ヒドロキシピリジノン含有配位子の使用である。このような配位子は通常、それぞれが独立して以下に挙げる置換ピリジン構造（Ｉ）を有する少なくとも４つのキレート基を含み：
【化１】
2015517483.tif 000004
式中、Ｒ1は、式Ｉの４つの部分のうちの少なくとも１つに存在し、２つ、３つまたは全４つのこのような部分に存在し得る、任意選択のＮ置換基可溶化基である。したがって、Ｒ1は存在していなくても、ＯＨおよびヒドロキシアルキル部分から選択されるものであってもよい。適切なヒドロキシアルキル部分は少なくとも１つのＯＨ基を含むが、任意選択で２つ、３つまたは４つなど２つ以上のＯＨ基を含み得る。ヒドロキシアルキル部分に１つまたは２つのＯＨ基があるのが最も好ましい。
【００８１】
ＨＯＰＯ部分（特に３，２−ＨＯＰＯおよび２，３−ＨＯＰＯ）のピリジノン環上にある窒素は、環の特性に大きな影響を及ぼさずに親水性置換基を導入するのに適した位置であり、重要なことに、分子と担体タンパク質または他の標的化分子とコンジュゲートした後に外側を向く位置である。本発明者らはこれまでに、この位置にメチル基を有するピリミドン環をベースとしたキレート剤がトリウムイオンのキレート化に適していることを示した。新規なキレート剤には、Ｎ位のヒドロキシエチルを含めた別の基が導入されている。驚くべきことに、メチルからヒドロキシルエチルにわずかに変化させただけで、純水に完全に溶解するキレート剤が得られた。この分子およびこれに関連するいくつかの例を以下に示す。
【００８２】
本明細書で使用されるヒドロカルビル部分はすべて、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アルケニルまたはアルキニル基を含めたＣ１〜Ｃ８ヒドロカルビルなどの短いヒドロカルビル基から独立して選択される。これに対応して、アルキル基は通常、メチル、エチル、ｎ−またはイソ−プロピ（ｐｒｏｐｙ）、ｎ−、イソ−またはｓｅｃ−ブチルなどの直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ８アルキル基となる。
【００８３】
非常に好ましいＲ1基としては、アルキル鎖の炭素原子に結合したヒドロキシ基を１つ、２つまたはそれ以上有する直鎖または分岐鎖アルキル基（上に示したものなど）が挙げられる。いくつかの非常に好ましいヒドロキシアルキル基としては、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシｎ−プロピル、ヒドロキシイソ−プロピル、ジ−ヒドロキシｎ−プロピル（例えば、１，２−、２，３−または１，３−ジ−ヒドロキシプロピル）、ヒドロキシｎ−ブチル、ジ−ヒドロキシｎ−ブチルおよびトリ−ヒドロキシｎ−ブチルが挙げられ、ヒドロキシエチルが最も非常に好ましい。一実施形態では、八座配位子の４つのＨＯＰＯ部分がそれぞれＲ1位にヒドロキシルアキル（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｋｙｌ）（ヒドロキシエチルなど）基を含む。さらなる実施形態では、４つのＨＯＰＯ部分がすべて同じヒドロキシアルキル基を含む（例えば、４つのＨＯＰＯ基がすべてヒドロキシエチルでＮ置換されているか、４つともジ−ヒドロキシプロピルで置換されている）。
【００８４】
非常に好ましい実施形態では、４つのＨＯＰＯ基がすべて、３，２ＨＯＰＯ基および２，３ＨＯＰＯ基から選択される同じＨＯＰＯ基である。さらなる非常に好ましい実施形態（任意選択で前の実施形態と組み合わせてもよい）では、４つのＨＯＰＯ基がすべて、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、ヒドロキシブチル、ジヒドロキシプロピルおよびジヒドロキシブチルから選択される同じヒドロキシアルクリ（ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋｌｙ）基でＮ置換されている。このリストのうち、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルおよびジヒドロキシプロピルが最も好ましい。
【００８５】
式Ｉにおいて、基Ｒ2〜Ｒ6はそれぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、短いヒドロカルビル（本明細書に記載される）、リンカー部分（本明細書に記載される）および／またはカップリング部分（本明細書に記載される）から選択され得る。一般に、基Ｒ2〜Ｒ6のうちの少なくとも１つがＯＨである。一般に、基Ｒ2〜Ｒ6のうちの少なくとも１つが＝Ｏである。一般に、基Ｒ2〜Ｒ6のうちの少なくとも１つがリンカー部分（本明細書に記載される）。好ましくは、基Ｒ2〜Ｒ6のうちのちょうど１つが＝Ｏである。好ましくは、基Ｒ2〜Ｒ6のうちのちょうど１つがＯＨである。好ましくは、基Ｒ2〜Ｒ6のうちのちょうど１つがリンカー部分（本明細書に記載される）である。残りの基Ｒ2〜Ｒ6は本明細書に示される部分のいずれであってもよいが、好ましくはＨである。リンカー部分またはリンカー部分に結合した任意の追加のリンカー、鋳型またはキレート基がカップリング部分を含まない場合、基Ｒ1〜Ｒ6のうちの１つがカップリング部分（本明細書に記載される）であるのが好ましい。
【００８６】
好ましい実施形態では、基Ｒ2〜Ｒ6のうちの１つがＯＨであり、Ｒ2〜Ｒ6のうちの１つが＝Ｏであり、ＯＨ基と＝Ｏ基が環の隣接する原子上にある。したがって、好ましい実施形態では、ＯＨと＝Ｏはそれぞれ原子２，３；３，２；３，４；または４，３（予想される窒素からの番号付け）である。少なくとも１つのキレート部分を有し、ＯＨ基と＝Ｏ基がそれぞれ３位および２位にある八座配位子が非常に好ましい。八座配位子はこのようなキレート基を２つ、３つまたは４つ有し得るが、この場合、このような基は２つまたは４つであるのが非常に好ましい。Ｎ置換３，２−ＨＯＰＯ部分は、八座配位子の全４つの錯体化部分として非常に好ましい。
【００８７】
適切なキレート部分は、米国特許第５，６２４，９０１号（例えば、実施例１および２）および国際公開第２００８／０６３７２１号（ともに参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を含めた当該技術分野で公知の方法によって形成し得る。
【００８８】
本明細書で使用される「リンカー部分」（式ＩＩではＲL）という用語は、本発明の様々な態様の重要な構成要素を形成する八座配位子内の少なくとも２つのキレート基を連結する役割を果たす化学物質を表すのに使用される。通常、各キレート基（例えば、上の式Ｉおよび／または下の式ＩＩのキレート基）は二座であるため、少なくとも１つが式Ｉのものである４つのキレート基は通常、配位子内に存在する。このようなキレート基は、そのリンカー部分によって互いに連結している。したがって、リンカー部分（例えば、下の基ＲL）は、式Ｉおよび／またはＩＩの２つ以上のキレート基の間で共有され得る。リンカー部分はほかにも、八座配位子の錯体化部分と標的化部分との間の結合点としての役割を果たし得る。このような場合、少なくとも１つのリンカー部分がカップリング部分（ＲC）と連結する。適切なリンカー部分としては、あらゆるトポロジーのメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよび／またはヘキシル基を含むＣ１〜Ｃ１２アルキル、アルケニルまたはアルキニル基を含めたＣ１〜Ｃ１２ヒドロカルビルなどの短いヒドロカルビル基が挙げられる。
【００８９】
リンカー部分はほかにも、エステル、エーテル、アミンおよび／またはアミド基を含めた他の任意の適度に堅固な化学結合であるか、これを含み得る。２つのキレート部分を連結する原子の総数（２つ以上の経路が存在する場合、最も短い経路で数えたもの）は一般に、キレート部分を錯体形成に適した配置に拘束するために制限される。したがって、通常、キレート部分の間の原子が１５個以下、好ましくは１〜１２個、およびより好ましくは１〜１０個になるようリンカー部分を選択する。リンカー部分が２つのキレート部分を直接連結する場合、リンカーは通常、長さが１〜１２原子、好ましくは２〜１０原子（例えばエチル、プロピル、ｎ−ブチルなど）である。リンカー部分が中心の鋳型と連結する場合（下を参照されたい）、各リンカーはこれより短いものであり得、２つの別々のリンカーがキレート部分を連結する。この場合、リンカーの長さは１〜８原子、好ましくは１〜６原子であるのが好ましい（メチル、エチルおよびプロピルのほか、一端または両端にエステル、エーテルまたはアミド結合を有する基が適している）。
【００９０】
主として八座配位子の様々なキレート基を互いにおよび／または中心の鋳型と結合する役割を果たすリンカー部分に加えて、八座は、「カップリング部分」（ＲC）をさらに含むのが好ましい。カップリング部分の機能は八座配位子と標的化部分とを結合することである。これは共有結合または非共有結合のいずれによっても（例えば、ビオチン／アビジン（ストレプトアビジン）などの特異的結合対によって）達成し得る。上記リンカー部分は、可能なカップリング部分を形成する。好ましくは、カップリング部分は、キレート基のうちの一方と直接共有結合することによって、またはより典型的には、リンカー部分もしくは鋳型と結合することによってキレート基と共有結合している。カップリング部分を２つ以上用いる場合、それぞれが任意の鋳型、リンカーまたはキレート基などにある利用可能な部分のいずれと結合していてもよい。
【００９１】
一実施形態では、カップリング部分は構造：
【化２】
2015517483.tif 000005
を有し、式中、Ｒ7は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択されるメンバーである架橋部分であり；Ｘは標的化部分または反応性官能基である。好ましい架橋部分としては、本明細書に適切なリンカー部分として示される基すべてが挙げられる。好ましい標的化部分としては、本明細書に記載される標的化部分すべてが挙げられ、好ましい反応性Ｘ基としては、例えばＣＯＯＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨＲおよびＣＯＨ基を含めた、標的化部分と共有結合を形成することが可能な任意の基が挙げられ、ＮＨＲのＲはＨであっても本明細書に記載されるいずれかの短いヒドロカルビル基であってもよい。標的化部分への結合に非常に好ましい基としては、リジン残基のイプシロン−アミンおよびシステイン残基のチオール基が挙げられる。適切な反応性Ｘ基の非限定的な例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシミジルエステル、イミドエステル、ハロゲン化アシル、Ｎ−マレイミド、アルファ−ハロアセチルおよびイソチオシアナートが挙げられ、後ろの３つはチオール基との反応に適している。
【００９２】
カップリング部分は、得られるカップリングした八座配位子が安定な金属イオン錯体の形成を受けられるよう結合するのが好ましい。したがって、カップリング部分はリンカー、鋳型またはキレート部分と錯体化を著しく阻害しない部位で結合するのが好ましい。このような部位は、好ましくはリンカーまたは鋳型上の、より好ましくは標的と結合する表面から離れた位置にある。
【００９３】
好ましいキレート基としては、下式ＩＩ：
【化３】
2015517483.tif 000006
のキレート基が挙げられる。上式ＩＩにおいて、＝Ｏ部分はピリジン環の任意の炭素と結合したケト基を表し、−ＯＨはピリジン環の任意の炭素と結合したヒドロキシ部分を表し、−ＲLは、ヒドロキシピリジノン部分と他の錯体化部分とを結合して八座配位子全体を形成するリンカー部分を表す。本明細書に記載されるリンカー部分はいずれも、あらゆるトポロジーのメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよび／またはヘキシル基を含むＣ１〜Ｃ８アルキル、アルケニルまたはアルキニル基を含めたＣ１〜Ｃ８ヒドロカルビルなどの短いヒドロカルビル基を含め、ＲLとして適している。ＲLは式ＩＩの環とピリジン環の任意の炭素において連結し得る。次にＲL基は、別のキレート部分、別のリンカー基および／または環もしくは他の鋳型（本明細書に記載される）などの中心の原子もしくは基と直接結合し得る。リンカー、キレート基および任意選選択の鋳型部分は、しかるべき八座配位子を形成するよう選択される。
【００９４】
好ましい一実施形態では、式ＩＩの−ＯＨ部分と＝Ｏ部分がピリジン環の隣接する原子上に存在し、したがって、２，３−；３，２−；４，３−；および３，４−ヒドロキシピリジノン誘導体はすべて非常に適している。
【００９５】
部分ＲLはピリジン環の窒素上に存在する。八座配位子内に式ＩＩの２つ以上の異なる基が存在する場合、式ＩＩの一部の基には基ＲNが存在しなくてもよい。しかし、各八座配位子内の少なくとも１つのＲN基は、本明細書に示されるヒドロキシアルキル基である。
【００９６】
好ましい一実施形態では、八座配位子構造内に３，２−ヒドロキシピリジノン部分が少なくとも１つ存在する。これは本明細書に示される様々な置換基部分のいずれかによって置換されていてよいのは明らかである。
【００９７】
式ＩＩの部分にはそれぞれ、錯体化する可能性のある酸素が２つあるため、本発明の１つの実施形態は、独立して選択された式ＩＩの部分を少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、および最も好ましくは４つ含む八座配位子を提供する。式ＩＩの部分はそれぞれ、独立した置換パターンを有し得るが、好ましい一実施形態では、少なくとも１つの部分が３，２−ヒドロキシピリジノン部分である。配位子は２つ、３つまたは４つの３，２−ヒドロキシピリジノン部分（本明細書に記載される通り、必要に応じて置換されている）を含み得る。
【００９８】
八座配位子内の式ＩまたはＩＩの部分はそれぞれ、本明細書に記載される任意のしかるべきリンカー基によって、任意のしかるべきトポロジーで残りの配位子と連結し得る。例えば、式Ｉの４つの基がそのリンカー基により主鎖と連結して直鎖状の配位子を形成し得るか、リンカー基により架橋されて、直鎖状または環状であり得る「オリゴマー」型構造を形成し得る。あるいは、式Ｉおよび／またはＩＩの配位子部分が、それぞれリンカー（例えば、「ＲL」部分）によって中心の原子または基と「十字型」または「星型」形状で連結し得る。リンカー（ＲL）部分は炭素間結合のみを介して連結し得るか、アミン、アミド、エステル、エーテル、チオ−エーテルまたはジスルフィド結合を含む任意の適度に堅固な官能基によって、互いに結合するか、他のキレート基、主鎖、鋳型、カップリング部分または他のリンカーと結合し得る。
【００９９】
「星型」配置は下式ＩＩＩ：
【化４】
2015517483.tif 000007
で示される。上式中、基および位置はすべて前述の通りであり、加えて「Ｔ」は中心の原子または鋳型基、例えば炭素原子、ヒロドカルビィ（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｙ）鎖（本明細書で上に記載されるもののいずれかなど）、脂肪族もしくは芳香環（複素環を含む）または融合環系などである。最も基本的な鋳型は単一の炭素であり、これが連結基によって各キレート部分と結合し得る。同じようにエチルやプロピルなどのより長い鎖でも可能であり、鋳型の各末端に２つのキレート部分が結合する。鋳型とリンカー部分とを連結するのに炭素間結合、エステル、エーテル、アミン、アミド、チオ−エーテルまたはジスルフィド結合を含めた任意の適度に堅固な結合を用い得ることは明らかである。
【０１００】
式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＩＶｂの構造において、特に置換されていない（例えば、リンカーまたはカップリング部分によって）ピリジン環（１つまたは複数）の位置が、必要に応じて式ＩのＲ1〜Ｒ5について記載されている置換基を有し得ることは明らかである。特に、メチル、エチルまたはプロピル基などの小さいアルキル置換基はいずれの位置にも存在し得る。
【０１０１】
八座配位子は一般に、上記のようなカップリング部分を少なくとも１つさらに含む。これは本明細書に示される構造のいずれかを含む任意の適切な構造であってよく、終端が標的化部分、特異的結合物質またはこのような標的化部分もしくは特異的結合物質と結合することが可能な官能基になる。
【０１０２】
カップリング部分はリンカー、鋳型またはキレート部分の任意の適切な位置、例えば式ＩＩＩに示される位置ａ）、ｂ）および／またはｃ）などに結合し得る。カップリング部分の結合は炭素間結合、エステル、エーテル、アミン、アミド、チオ−エーテルまたはジスルフィド結合などの任意の適度に堅固な結合であり得る。同様に、標的化部分と任意のこのような結合を形成することが可能な基はカップリング部分の官能性末端に適しており、その部分が標的化部分と結合すると、終端がこのような基になる。
【０１０３】
別の「主鎖」型構造を式ＩＶで下に示す。
【化５】
2015517483.tif 000008
上式中、基および位置はすべて前述の通りであり、加えて「ＲB」は主鎖部分であり、この部分は通常、本明細書に示されるリンカー部分のいずれかとほぼ同じ構造および機能を有するため、文脈上可能であれば、リンカー部分のいずれの定義も主鎖部分に当てはめることができる。適切な主鎖部分は、キレート部分がそのリンカー基によって結合する足場を形成する。通常、主鎖部分が３つまたは４つ必要である。通常、直鎖状の主鎖であれば３つ、環状の主鎖であれば４つになる。特に好ましい主鎖部分としては、任意選択で一端または両端にヘテロ原子または官能性部分を有する短い炭化水素鎖（本明細書に記載されるものなど）が挙げられる。この点ではアミンおよびアミド基が特に適している。
【０１０４】
カップリング部分はリンカー、主鎖またはキレート部分の任意の適切な位置、例えば式ＩＶに示される位置ａ）、ｂ）および／またはｃ’）などに結合し得る。カップリング部分の結合は炭素間結合、エステル、エーテル、アミン、アミド、チオ−エーテルまたはジスルフィド結合などの任意の適度に堅固な結合であり得る。同様に、標的化部分と任意のこのような結合を形成することが可能な基はカップリング部分の官能性末端に適しており、その部分が標的化部分と結合すると、終端がこのような基になる。
【０１０５】
アミドリンカー基によって主鎖と結合した４つの３，２−ＨＯＰＯキレート部分（それぞれヒドロキシエチル可溶化基を有する）を有する「主鎖」型八座配位子は以下のような式Ｖ：
【化６】
2015517483.tif 000009
になる。この分子上の任意の適切な位置、例えば第二級アミン基のうちの１つまたは主鎖アルキル基のいずれかの分岐点にリンカー基ＲLを加え得ることは明らかである。主鎖プロピレンまたはｎ置換エチレン基などの小さいアルキル基はすべて、他の小さいアルキレン、例えば本明細書に記載されるアルキレンのいずれか（特にメチレン、エチレン、プロピレンおよびブチレンが非常に適している）などで置換され得る。
【０１０６】
エチルアミド基によってそれぞれエチルジアミンおよびプロピルジアミンと結合した４つの３，２−ＨＯＰＯキレート部分をそれぞれ有する例示的な「鋳型」八座配位子は以下のような式ＶＩ：
【化７】
2015517483.tif 000010
になる。式ＶＩにエチレン部分として示されるアルキレン基はいずれも、独立してメチレン、プロピレンまたはｎ−ブチレンなどの他の小さいアルキレン基で置換され得ることは明らかである。分子にある程度の対称性が保持されるのが好ましいため、例えば、中心のエチレン基がプロピレンで置換されていれば、他のエチレン基はそのままであるか、ＨＯＰＯ部分と中心の第三級アミンの一方または両方とを結合している２つのエチレンがメチレンまたはプロピレンに置き換わり得る。同様に、本明細書で述べる通り、Ｎ置換基は、本明細書全体を通して記載される他の任意のヒドロキシアルキル基と置き換わり得る。
【０１０７】
前述の通り、八座配位子は通常、任意の位置にある残りの配位子と連結し得るカップリング部分を含む。リンカーの結合に適する位置を以下に式ＶＩで示す：
【化８】
2015517483.tif 000011
上式中、ＲLは、具体的には組織標的化基と結合するための、任意の適切な結合部分である。終端がアミンなどの活性基であるＣ１〜Ｃ８環状、分岐または直鎖芳香族または脂肪族基などの短いヒドロカルビル基が、式ＶＩおよび本明細書全体の基ＲLとして非常に適している。
【０１０８】
配位子の結合に適した部位を示す非常に好ましい八座配位子としては、以下の式ＶＩＩおよびＶＩＩＩのものが挙げられる：
【化９】
2015517483.tif 000012
上式ＶＩＩおよびＶＩＩＩ中、ＲLは、本明細書に記載される任意の適切なリンカー基または反応性部分であり得る。通常、ＲLが配位子と標的化部分との結合点を形成するため、直接または別のリンカーを用いて任意の適切な反応基をこの結合に用いることができる。式ＶＩＩおよびＶＩＩＩのＲLに適した反応性部分としては、ＮＨ2およびＮＣＳ基が挙げられる。
【０１０９】
この実施形態による、カップリング部分の終端となる官能性部分を有する例示的な化合物が下の構造ＩＸである（リンカーのフェニルアミン基は、必要に応じて本明細書に示される他の任意のＲL基で置換され得ることは明らかである）：
【化１０】
2015517483.tif 000013
化合物ＩＸの合成は本明細書でのちに記載され、以下の合成経路を経る：
【化１１】
2015517483.tif 000014
【０１１０】
本明細書に引用される文献はいずれも参照により組み込まれ、以下のものがこれに含まれる：Ｇｏｒｄｏｎ  ＡＥＶ  ｅｔ  ａｌ，Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｍ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ａｃｔｉｎｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００３，１０３，４２０７−４２８２、ＰＣＴ特許出願国際公開第２００８／０６３７２１号（Ａ２）およびＴ．Ｎ．Ｌａｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４３（２００２）７３７９−７３８３。
【０１１１】
本発明の錯体を形成する方法では、水溶液中で反応を実施するのが好ましい。これには利点がいくつかある。第一に、製造者が許容されるレベルになるまで溶媒をすべて除去し、その除去を証明する負担が取り除かれる。第二に、分離または除去段階を回避することによって、無駄が削減され、最も重要なことに生産スピードが上がる。本発明の放射性医薬品との関連においては、放射性同位体は常に崩壊し、調製に費やす時間は貴重な原料を浪費し、汚染物の娘同位体を生じるため、できる限り迅速に合成を実施することが重要である。
【０１１２】
一実施形態では、この方法は、第一の八座ヒドロキシピリジノン含有配位子（本明細書全体を通して記載される）の水溶液および第二の組織標的化部分（本明細書全体を通して記載される）の水溶液を形成することと、当該第一の水溶液と当該第二の水溶液とを接触させることとを含む。
【０１１３】
関連する実施形態では、本発明の形成方法をいかなる有機溶媒も実質的に存在しない状態で実施する。この文脈において、「有機溶媒」は、室温またはその前後で液体であり、炭素を少なくとも１つ含む物質という本来の意味を表す。このような有機溶媒は通常、炭化水素、アルコール、エステル、アミド、エステルおよび／またはハロゲン化部分を含み、このような溶媒は本明細書で言及される水溶液中に１重量％以下（例えば、０．０００１〜１重量％）、好ましくは０．５重量％以下、および最も好ましくは０．２重量％以下で存在するのが好ましい。誤解を避けるために述べると、本明細書で言及される標的化部分および配位子は用語「有機溶媒」には包含されない。有機酸、アミンおよびその塩などのある特定の有機物質がいくぶん高濃度で水性溶媒中に存在し、ｐＨ緩衝剤として作用し得る。このような有機物質が存在する場合、通常、１０重量％以下（例えば、０．００１〜１０重量％）、好ましくは５重量％以下、より好ましくは１重量％以下の濃度である。これらの化合物は一般に、室温または周囲温度で液体ではないため、有機溶媒ではない。
【０１１４】
適切なカップリング部分については上で詳細に述べられており、本明細書でカップリング基および／または連結基として述べられる基および部分はすべて、標的化部分と配位子とをカップリングするのに適宜使用し得るものである。いくつかの好ましいカップリング基としては、アミド、エステル、エーテルおよびアミンカップリング基が挙げられる。エステルおよびアミドは、カルボン酸から活性エステル基を生成することによって形成するのが好都合である。このようなカルボン酸は標的化部分、カップリング部分および／または配位子部分に存在し得るものであり、通常、アルコールまたはアミンと反応してエステルまたはアミドを形成する。このような方法は当該技術分野では非常によく知られており、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＤＥＡＤ、ＤＩＡＤなどのＮ−ヒドロキシマレイミド、カルボジイミドおよび／またはアゾジカルボキシラート活性化試薬を含めた周知の活性化試薬を用いるものである。
【０１１５】
実施例
これより以下の非限定的な実施例によって本発明を説明する。実施例に例示される化合物はいずれも本発明の好ましい実施形態を形成し（好ましい中間体および前駆物質を含む）、文脈上可能であれば任意の態様で個々にも任意に組み合わせても使用し得るものである。したがって、例えば、実施例２の化合物２〜４、実施例３の化合物１０、実施例４の化合物７のそれぞれおよびすべてが、その様々なタイプの好ましい実施形態を形成する。
【０１１６】
実施例では、以下に挙げる配位子、抗体および抗体コンジュゲートに言及する：
ＡＧ０００３−比較用配位子（下の構造１３）
ＡＧ００１５−本発明の高溶解性配位子。
ＡＧ０７００−実施例５で作製される抗ＣＤ３３抗体
ＡＧ０７１５−高溶解性配位子（１２）とコンジュゲートしたＡＧ０７００
ＡＧＣ１１００−実施例（１３）で作製される抗ＤＣ２２抗体
ＡＧＣ１１１５−高溶解性配位子（１２）とコンジュゲートしたＡＧＣ１１００
【実施例１】
【０１１７】
純粋なトリウム−２２７の単離
アクチニウム−２２７カウからトリウム−２２７を単離する。ラジウム−２２６の熱中性子照射、次いでラジウム−２２７（ｔ１／２＝４２．２ｍ）からアクチニウム−２２７への崩壊によりアクチニウム−２２７が生成した。陰イオン交換クロマトグラフィーにより、アクチニウム−２２７崩壊混合物の８Ｍ  ＨＮＯ3溶液からトリウム−２２７を選択的に保持した。ＡＧ（登録商標）１−Ｘ８樹脂（２００〜４００メッシュ、硝酸形態）７０ｍｇを詰めた内径２ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラムを使用した。アクチニウム−２２７、ラジウム−２２３および娘核種をカラムから溶出した後、１２Ｍ  ＨＣｌでトリウム−２２７をカラムから抽出した。トリウム−２２７を含有する溶出液を蒸発乾固させ、残渣を０．０１Ｍ  ＨＣｌに再懸濁させた。
【実施例２】
【０１１８】
化合物ＩＸの合成
段階１
【化１２】
2015517483.tif 000015
２−ベンジルオキシエチルアミン（３１ｇ、２０７ｍｍｏｌ）およびグリコロニトリル（１６ｍＬ、７０％水溶液、２０７ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（無水）３００ｍＬに溶かし、４時間還流した。減圧下で揮発性物質を除去した。粗生成物（２４．７ｇ、１３０ｍｍｏｌ）をこれ以上精製せずに次の段階に用いた。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）：２．９２（ｍ，２Ｈ），３．５８−３．６２（ｍ，４Ｈ），４．５１（ｓ，２Ｈ），７．２５−７．３７（ｍ，５Ｈ）
【０１１９】
段階２
【化１３】
2015517483.tif 000016
１（２４．７ｇ、１３０ｍｍｏｌ）を乾燥エーテルに溶かした。この溶液にＨＣｌ（ｇ）を３０分間吹き込んだ。沈殿物をろ過除去し、減圧下で乾燥させ、所望生成物を得た（２７．８ｇ、１２２．６ｍｍｏｌ）。この生成物をこれ以上精製も分析も行わずに次の段階に用いた。
【０１２０】
段階３
【化１４】
2015517483.tif 000017
２（２７．８ｇ、１２２．６ｍｍｏｌ）をクロロベンゼン２３０ｍＬに室温で溶かした。クロロベンゼン１００ｍＬに溶かした塩化オキサリル（４５ｍＬ、５３０ｍｍｏｌ）を室温で３０分間にわたって滴加した。反応混合物を室温で４５時間攪拌した。水１００ｍＬを滴下して慎重に反応を停止させた。相を分離し、ＤＣＭ３×１００ｍＬで水相を抽出した。有機相を合わせ、ブライン１００ｍＬで洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で揮発性物質を除去した。ＤＣＭ中のＭｅＯＨ勾配（０〜２％）を用いたＳｉＯ2での乾燥フラッシュクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、所望生成物を得た（２１．２ｇ、７０．８ｍｍｏｌ）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）：３．７１−３．７６（ｍ，２Ｈ），４．０６−４．１２（ｍ，２Ｈ），４．４７（ｓ，２Ｈ），７．２１７−７．２２（ｍ，２Ｈ），７．２６−７．３６（ｍ，４Ｈ）
ＭＳ（ＥＳＩ−ｐｏｓ，ｍ／ｚ，）：３２１．０
【０１２１】
段階４
【化１５】
2015517483.tif 000018
水素化ナトリウム（６０％分散液、３．６０ｇ、９０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ５０ｍＬ中、０℃で攪拌し、ベンジルアルコール（８．３ｍＬ、８０ｍｍｏｌ）を１０分間にわたって滴加した。反応混合物を０℃で３０分間攪拌した後、ＴＨＦ１００ｍＬに溶かした３（２１．２ｇ、７０．８ｍｍｏｌ）を０℃で滴加した。反応混合物を暗所にて室温で一晩攪拌した。ＨＣｌのジオキサン溶液（４Ｍ）５０ｍＬを滴加した後、反応混合物を真空下で還元した。ＤＣＭ５００ｍＬ、次いで水２００ｍＬを加えた。相を分離し、ＤＣＭ２００ｍＬで水相を抽出した。有機相を合わせ、ブライン１００ｍＬで洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で揮発性物質を除去した。ＤＣＭ中のＭｅＯＨ勾配（０〜６％）を用いたＳｉＯ2での乾燥フラッシュクロマトグラフィーにより、所望生成物を得た（２５．６ｇ、６９ｍｍｏｌ）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ）：３．６９−３．７５（ｍ，２Ｈ），４．０１−４．０７（ｍ，２Ｈ），４．４６（ｓ，２Ｈ），５．３７（ｓ，２Ｈ），６．９７（ｓ，１Ｈ），７．１９−７．３９（ｍ，８Ｈ），７．４４−７．５１（ｍ，２Ｈ）
ＭＳ（ＥＳＩ−ｐｏｓ，ｍ／ｚ）：３７１．１，７６３．２
【０１２２】
段階５
【化１６】
2015517483.tif 000019
４（２５．６ｇ、６９ｍｍｏｌ）およびプロピオール酸エチル（４１ｍＬ、０．４ｍｏｌ）を１４０℃で５時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、ＳｉＯ2での乾燥フラッシュクロマトグラフィーにより反応混合物を精製した。ＤＣＭ中のＭｅＯＨ勾配（０〜１０％）により、所望生成物が分離不可能な所望の４−異性体と５−異性体との混合物として得られた。この混合物（２８．６ｇ、約６５ｍｍｏｌ）をこれ以上精製せずに次の段階に直接用いた。
【０１２３】
段階６
【化１７】
2015517483.tif 000020
前段階で得られた５（２８．６ｇ，約６５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ３００ｍＬに０℃で溶かした。ＫＯＨ（１Ｍ、水溶液）１００ｍＬを加え、反応混合物を室温で４０時間攪拌した。ＨＣＬ（１Ｍ、水溶液）をｐＨ約２になるまで加え（１２５ｍＬ）、ＣＨＣｌ3３×２５０ｍＬで水相を抽出した。有機相を合わせ、ブライン１００ｍＬで洗浄し、ろ過し、真空下で揮発性物質を除去した。得られた物質（２５．９ｇ、約６５ｍｍｏｌ）をこれ以上精製も分析も行わずに次の段階に用いた。
【０１２４】
段階７
【化１８】
2015517483.tif 000021
前段階で得られた６（２５．９ｇ、約６４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ４００ｍＬに一部溶かした。２−チアゾリン−２−チオール（８．９４ｇ、７５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．８６ｇ、７ｍｍｏｌ）、次いでＤＣＣ（１５．４８ｇ、７５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物をセライトパッドでろ過し、このセライトパッドをＤＣＭ１００ｍＬで洗浄した。真空下で揮発性物質を除去した。最初にヘプタン中のＤＣＭ勾配（５０〜１００％）、次にＤＣＭ中のＴＨＦ勾配（０〜１５％）を用いたＳｉＯ2での乾燥フラッシュクロマトグラフィーにより、生成物の混合物を精製した。しかるべき画分を真空下で還元し、生成物の混合物を得た。ヘプタン中のＥｔＯＡｃ勾配（２５〜７５％）を用いたＳｉＯ2でのフラッシュクロマトグラフィーにより、この不純物の入った混合物を精製した。しかるべき画分を真空下で還元し、生成物の混合物を得た。最後に、所望生成物を得るため、水中のＭｅＣＮ勾配（２５〜７５％）を用いたＲＰ１８−シリカでの乾燥フラッシュクロマトグラフィーにより生成物の混合物を精製した。これにより所望生成物が得られた（８．６５ｇ、１８ｍｍｏｌ）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ）：２．９０（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），３．７７−３．８４（ｍ，２Ｈ），４．１８−４．２３（ｍ，２Ｈ），４．３５（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），４．５１（ｓ，２Ｈ），５．３３（ｓ，２Ｈ），６．１１（ｄ，７．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２１−７．４８（ｍ，１１Ｈ）
ＭＳ（ＥＳＩ−ｐｏｓ，ｍ／ｚ）：５０３．１
【０１２５】
段階８
【化１９】
2015517483.tif 000022
７（５．７７ｇ、１２ｍｍｏｌ）および８（１．４４ｇ、２．４ｍｍｏｌ）をＤＭＰＵ４０ｍＬに一部溶かした。ＤＢＵ（２．７ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）を滴加した。反応物を室温で４日間攪拌した。ＥｔＯＡｃ中のＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配を用いたＳｉＯ2での乾燥フラッシュクロマトグラフィーにより精製し、所望生成物を得た（３．９３ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）：２．２０−２．３２（ｍ，１０Ｈ），２．４４−２．５０（ｍ，２Ｈ），３．０５−３．２０（ｍ，１０Ｈ），３．２３−３．２７（ｍ，１Ｈ），３．６９−３．７７（ｍ，８Ｈ），４．０６−４．１５（ｍ，８Ｈ），４．４３（ｓ，８Ｈ），５．２４（ｓ，８Ｈ），６．６２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），７．１６−７．３８（ｍ，４２Ｈ），７．８２−７．９３（ｍ，６Ｈ）
【０１２６】
段階９
【化２０】
2015517483.tif 000023
９（３．９３ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ３００ｍＬに室温で溶かした。水６０ｍＬ、次いでＮＨ4Ｃｌ（５．９４ｇ、３２．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を６０℃にした後、鉄粉（１．８０ｇ、３２．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を６０℃で１時間攪拌した。反応混合物を室温まで冷却し、ＤＣＭ４００ｍＬおよび水１００ｍＬを加えた。反応混合物をろ過し、有機相を水１００ｍＬおよびブライン１００ｍＬで洗浄した。水相を合わせ、ＤＣＭ３×１００ｍＬで逆抽出した有機相を合わせ、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で揮発性物質を除去した。ＤＣＭ中のＭｅＯＨ勾配（０〜７％）を用いたＳｉＯ２での乾燥フラッシュクロマトグラフィーにより生成物の混合物を精製し、所望生成物を得た（３．５２ｇ、１．９６ｍｍｏｌ）。
ＭＳ（ＥＳＩ−ｐｏｓ，ｍ／ｚ）：８９９．２
【０１２７】
段階１０
【化２１】
2015517483.tif 000024
１０（１．００ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＨ）2／Ｃ（パールマン触媒、１．００ｇ）およびＡｃＯＨ１０ｍＬを圧力反応器に入れた。水流吸引器により反応器を真空にし、Ｈ2を導入した（７ｂａｒ）。反応混合物を１時間攪拌した後、圧力を解除し、ＨＣｌ（６Ｍ、水溶液）５ｍＬを反応混合物に加えた。反応器を前の場合と同様にして真空にし、再びＨ2を導入した（７ｂａｒ）。７日間攪拌した後、ＨＰＬＣにより完全な変換が示された。反応混合物をろ過し、減圧下で揮発性物質を除去した。残基をＭｅＯＨ／ＭｅＣＮ（１：１）に溶かし、Ｅｔ2Ｏの添加により生成物を沈殿させた。遠心分離および上清の傾捨により固体を収集した後、真空下で生成物を乾燥させた（４８４ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）。
1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ，４００ＭＨｚ）：２．７０−２．９５（ｍ，２Ｈ），３．００−３．１０（ｍ，２Ｈ），３．１５−３．６５（ｍ，１９Ｈ），３．７５−４．２３（ｍ，１６Ｈ），６．２５（ｂｓ，４Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，４Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ）
ＭＳ（ＥＳＩ−ｐｏｓ，ｍ／ｚ）：１０７６．４
【０１２８】
段階１１
【化２２】
2015517483.tif 000025
化合物１１（２０ｍｇ、１８μｍｏｌ）をＭｅＣＮ３ｍＬおよび水３ｍＬに溶かした。チオホスゲン２０μＬを加えた。反応混合物を１時間厳しく攪拌した。減圧下で揮発性物質を除去し、残基をＭｅＣＮ４ｍＬに溶かした。アセトントリル（ａｃｅｔｏｎｔｒｉｌｅ）相をＥｔ2Ｏ４０ｍＬに加えることにより生成物を沈殿させた。遠心分離および上清の傾捨により固体を収集した後、真空下で生成物を乾燥させた（１０ｍｇ、９μｍｏｌ）。
ＭＳ（ＥＳＩ−ｐｏｓ，ｍ／ｚ）：１１１８．４
【実施例３】
【０１２９】
コンジュゲーション
０．９％ＮａＣｌ溶液１．０ｍＬに溶かしてろ過したトラスツズマブ（９．５ｍｇ／ｍＬ）および金属不含水５〜３５μＬに溶かした新規なキレート剤（式ＩＸ）（１０ｍｇ／ｍＬ）を無菌ろ過したホウ砂緩衝液（７０ｍＭ、ｐＨ９）１．０ｍＬに加えた。反応混合物を３７℃で一晩、緩やかに攪拌し、得られたコンジュゲートを０．９％ＮａＣｌ溶液中、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４（３０ｋ  ＭＷＣＯ）遠心ろ過ユニットを用いて精製し濃縮した。ＬＣ／ＭＳ分析によりコンジュゲーションの成功を確認した。
【実施例４】
【０１３０】
キレート化
０．９％ＮａＣｌ５０μＬに溶かした実施例３のコンジュゲート（５μｇ／μＬ）に酢酸ナトリウム緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ５．５）１００μＬ、次いで227Ｔｈ溶液（０．０５Ｍ  ＨＣｌ１〜４μＬ中、約０．５〜１ＭＢｑ）を加えた。３７℃で１時間または室温（約２０℃）で１５分間、緩やかにかき混ぜながら反応を実施し、得られた生成物を溶出緩衝液として酢酸ナトリウム緩衝液を用いたＮＡＰ−５カラムで精製した。保持された遊離の放射性金属を含む使用済みカラムおよび標識タンパク質を含有する溶出画分をＨＰＧｅ検出器ＧＥＭ（１５）で測定して、反応収率および生成物の比活性を求めた（表１）。
【０１３１】
【表３】
2015517483.tif 000026
【実施例５】
【０１３２】
抗ＣＤ３３モノクローナル抗体（ＡＧＣ０７００）の作製。
（１）に記載され（２）に公開されているモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＨｕＭ１９５の配列をＡＧＣ０７００作製の鋳型として用いた。ＩｇＧ１重鎖遺伝子からＣ末端リジン（Ｌｙｓ）をコードするコドンを削除した。得られるタンパク質は、完全長遺伝子から生成したときに抗体中に存在する３つの変異体のうちの１つであり、他の２つの変異体ではそれぞれ、重鎖の一方または両方にリジンが結合している。このＬｙｓ残基を除去することにより、実施例６に概説される通り、コンジュゲートと抗体の比（ＣＡＲ）をより正確に決定することが可能になることが期待される。ＡＧＣ０７００の完全なアミノ酸配列の概要を表２に示す。
【０１３３】
標準的な分子生物学手法を用いて、ＡＧＣ０７００をコードする遺伝子を作製した。簡潔に述べると、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）ソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて、各鎖のアミノ酸配列をＤＮＡ配列に逆翻訳した。最適化されたＤＮＡ配列をＧｅｎｅＡｒｔ（ＧｅｎｅＡｒｔ／Ｌｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）により哺乳動物での発現にコドン最適化して合成した。Ｃｏｂｒａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社（Ｓｏｄｅｒｔａｌｊｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）により、ＶＨドメインおよびＶＬドメインをエンドヌクレアーゼ制限消化により発現ベクターにサブクローニングした。チャイニーズハムスター卵巣浮遊（ＣＨＯ−Ｓ）細胞にＡＧＣ０７００のＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするプラスミドを安定にトランスフェクトし、ピューロマイシン（１２．５ｍｇ／ｌ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した標準的なＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の存在下で増殖させた。２５世代にわたる限界希釈により、ＡＧＣ０７００を発現する安定なクローンを選択した。上清のタンパク質の力価を測定することによりクローンの安定性を評価した。最も安定なクローンの細胞バンクを確立し、凍結保存した。使い捨てのバイオリアクター中、３７℃で約１４日間、ｍＡｂを発現させた。上清をろ過した後、モノクローナル抗体を回収した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、Ａｔｏｌｌ、Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ）、次いでイオン交換段階によってＡＧＣ０７００をさらに精製する。静電性および疎水性に基づく３つ目の精製段階を用いて、生成物から凝集体および不純物をさらに除去する。等電点電気泳動およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりＡＧＣ０７００の同一性を確認する。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により試料の純度をさらに分析する。
【０１３４】
【表４】
2015517483.tif 000027
【実施例６】
【０１３５】
ＡＧＣ０７００とキレート剤ＡＧＣ００１５とのコンジュゲーション。
裸の抗体ＡＧＣ０７００を水溶性キレート剤ＡＧＣ００１５（１２）とコンジュゲート（カップリング）させた。ＡＧＣ００１５を金属不含溶液で調製した。キレート剤（１２）を下に示す：
【化２３】
2015517483.tif 000028
【０１３６】
ｐＨ８．５の７０ｍＭホウ酸塩緩衝液と混合したＰＢＳの１：１（ｖ／ｖ）混合物中で反応を実施した。キレート剤と抗体を名目モル比１．３：１で使用し、反応物を２１℃で２０時間インキュベートした。反応時間の終了時、ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６００  ＰＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；パーツ番号２９−９８９３−３５）およびｐＨ６．０の５０ｍＭヒスチジン緩衝液を移動相として用いて、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、抗体を遊離のキレート剤から分離した。精製したコンジュゲートの最終的なキレート剤−抗体比（ＣＡＲ）をサイズ排除クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＳＥＣ−ＭＳ）分析により決定した。ＬＣ−ＭＳ分析の前に、組換えＥｎｄｏＳ（ＩｇＧＺＥＲＯ、Ｇｅｎｏｖｉｓ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて試料を酵素的に脱グリコシル化した。簡潔に述べると、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）でクロマトグラフィーを実施し、カラムは２．０×３００ｍｍ、４μｍ粒子のＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ３０００（パーツ番号２１４８５）とし室温で維持した。移動相は、５０％アセトニトリル水溶液、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（定組成溶離）とした。注入体積は最大１５μＬとし、ＬＣ流速は、インタクトのコンジュゲートおよび還元コンジュゲートに対してそれぞれ７５μＬ／分または５０μｌ／分とした。ＳＥＣ実行時間は計１６分であった。Ｘｅｖｏ  ＱＴＯＦ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ）はエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源が装備された。イオン源はポジティブイオンモードで稼働させ、スキャン範囲は２０００〜４０００Ｄａとした。Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｅｎｔｒｏｐｙソフトウェアを用いて、多価イオンを一価種に変換した。質量分析計は予めヨウ化ナトリウムにより所与の質量範囲に校正した。インタクトのコンジュゲートでは、全コンジュゲート種（キレート剤０〜ｎ）が含まれるＳＥＣ−ＭＳクロマトグラムに１つのピークが見られる。ＣＡＲ決定の代表的な結果を図１に示す。裸のｍＡｂ（キレート剤なし）、キレート剤を１つ含むコンジュゲートおよびキレート剤を２つ含むコンジュゲートに対応するｍ／ｚシグナルを同定した。還元され脱グリコシル化したコンジュゲートでは、キレート剤が結合していない、１つ結合したまたは２つ結合した重鎖および軽鎖に対応するピークに分かれた。
【実施例７】
【０１３７】
Ｔｈ−２２７による抗体−キレート剤コンジュゲートＡＧＣ０７１５のキレート化。
アクチニウム−２２７発生器システムからトリウム−２２７を４＋イオンとして単離した。簡潔に述べると、陰イオン交換クロマトグラフィーにより、８Ｍ  ＨＮＯ３中のＡｃ−２２７崩壊混合物からＴｈ−２２７を選択的に保持した（227Ｔｈ４＋と負荷電硝酸錯体を形成した）。Ａｃ−２２７、Ｒａ−２２３および娘核種をカラムから洗浄した後、１２Ｍ  ＨＣｌを用いてＴｈ−２２７を溶出した。Ｔｈ−２２７溶出液を蒸発乾固させ、残基を０．５Ｍ  ＨＣｌに溶かした。
【０１３８】
抗体コンジュゲートＡＧＣ０７１５をｐＨ６．０のヒスチジン緩衝液中、抗体０．５ｍｇ当たり１ＭＢｑのＴｈ−２２７の存在下、３７℃で１時間インキュベートした。ＮＡＰ−５  ＤＮＡ  Ｇｒａｄｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより、放射標識抗体コンジュゲートを含有する高分子画分を遊離のＴｈ−２２７および娘核種から分離した。標識効率は通常、ＮＡＰ−５脱塩段階で起こり得る損失を含めて９６〜９８％であった。
【実施例８】
【０１３９】
フローサイトメトリーによるＡＧＣ０７００およびＡＧＣ０７１５とＣＤ３３陽性細胞との結合試験。
ＣＤ３３陽性ＨＬ−６０細胞との結合をフローサイトメトリーにより試験した。プロットした曲線に基づいてＥＣ50を求めることにより、親和性の近似値がわかる。親和性の評価には市販のマウス抗ヒトＣＤ３３（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；＃５５５４５０、１ｍｇ／ｍＬ）を参照抗体とし、分析するｍＡｂとの５０：５０混合物の設定を含めて用いた。このアッセイを用いてほかにも、標的結合親和性がキレート剤とのコンジュゲーションによる悪影響を受けないことを確認した。
【０１４０】
ＨＬ−６０細胞をイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；＃１２４４０−０４６）中、２０％のウシ胎仔血清およびペニシリン／ストレプトマイシンの存在下で増殖させた。４℃、３００ｇで５分間の遠心分離により細胞培養物約２０ｍＬを回収した。１％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＰＢＳ１０ｍＬに細胞を再懸濁させ、４℃、３００ｇで５分間の遠心分離によりペレット化した。次いで、再懸濁させた細胞の調製物２０μＬをＣｏｕｌｔｅｒ  Ｉｓｏｔｏｎ  ＩＩ  Ｄｉｌｕｅｎｔで１：５００に希釈し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ２機器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ；ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて計数した。調製物を細胞密度３〜４×１０6細胞／ｍＬに調整し、１００μＬを丸底またはＶ字底の９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ／Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ＮＨ、ＵＳＡ）の各ウェルに移した。細胞を遠沈し、傾捨後に再懸濁させて、１ウェル当たり体積約５０μＬの細胞懸濁液を得た。
【０１４１】
保存用緩衝液をＰＢＳに変えることにより、分析するｍＡｂまたはコンジュゲートを凍結ストックから新たに調製し、４℃で保管し、調製後数日以内に使用した。ヒトｍＡｂを検出する二次抗体試薬としてＦ（ａｂ）2’Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；＃１０９−５４６−１７０）を用いた。二次抗体試薬を０．１％ＢＳＡを添加したＰＢＳ中０．０１５ｍｇ／ｍＬに調製した。ｍＡｂストックを５ｍｇ／ｍＬから開始する１０倍希釈段階で希釈した。アイソタイプ対照ｍＡｂ（トラスツズマブ）をこれに準じて調製した。ＨＬ−６０細胞を含むウェルに各希釈段階の抗ヒトＣＤ３３  ｍＡｂを２０μＬ加えた。４℃で１時間インキュベートした後、細胞を遠沈し、０．１％ＢＳＡを添加した冷ＰＢＳ２００μｌで３回洗浄した。４％ヤギ血清を含有する溶液をブロッキング剤として加え、１５分間インキュベートした。次いで、二次抗体試薬から各ウェルに２０μｌを加えた後、暗所にて４℃で３０分間インキュベートした。
【０１４２】
細胞を上記の通りに２回洗浄し、０．１％ＢＳＡを添加したＰＢＳ２００μＬに再懸濁させた。全試料を９６ウェルの丸底または円錐底プレートで分析した。Ｂｅｃｋｈａｍ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  ｌａｂ  Ｑｕａｎｔ  ＳＣフローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ；ＣＡ、ＵＳＡ）で蛍光シグナルを記録した。中央値をＥｘｃｅｌグラフシートにエクスポートし、濃度に対してプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＰｒｉｓｍＳｏｆｔｗａｒｅ；ＣＡ、ＵＳＡ）に「一部位特異的」結合モデルを用いてデータをフィットした（図２Ａ〜２Ｂ）。
【０１４３】
二次抗体を加え一次抗体を加えない陰性対照はバックグラウンドの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の値が約５（高い陽性値の１〜２％）という低い値を示した。
【０１４４】
コンジュゲートＡＧＣ０７１５の結合親和性は非コンジュゲートＡＧＣ０７００と同程度であった。したがって、コンジュゲーションは結合親和性の低下をもたらさなかった（図２Ａ）。市販のマウス抗ヒトＣＤ３３参照ｍＡｂは、２つの抗体の５０：５０混合物中でＡＧＣ０７００よりも低い親和性で結合し、抗体結合が約０．７倍低かった（図２Ｂ）。
【実施例９】
【０１４５】
ＡＧＣ０７１５の内部移行。
放射性免疫錯体が外側細胞膜に結合した後の内部移行の程度は、殺細胞作用の効力を決定する１つの因子である。放射性免疫錯体ＡＧＣ０７１５−Ｔｈ−２２７および陰性対照トラスツズマブ−ＡＣ００１５−Ｔｈ−２２７のＨＬ−６０細胞への内部移行を試験した。
【０１４６】
実施例５に記載される方法に従って、コンジュゲートしたｍＡｂを比活性が約２０Ｂｑ／μｇになるよう同時に標識した。培地（２０％のウシ胎仔血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；＃１２４４０−０４６））５００μＬに２０００００個の細胞を含むウェルに１２ｋＢｑに相当する等量の放射性免疫錯体を加えた。
【０１４７】
３７℃、５％ＣＯ2で０分間、３０分間、６０分間、１２０分間および２４０分間インキュベートした後、細胞の試料を回収した。回収後、ｐＨ２．５のグリシン、０．９％ＮａＣｌで細胞を洗浄して、膜に結合した抗体コンジュゲートを除去した。フローサイトメトリーによる分析から、酸で２〜４分間洗浄した後、膜に結合した抗体が残らないことが明らかになった。細胞ペレットでの内部移行をガンマカウンター（Ｗｉｚａｒｄ）により６０秒間測定し、測定した１分当たりのカウント数を時間に対してプロットした（図３）。
【実施例１０】
【０１４８】
ＡＧＣ０７１５−Ｔｈ−２２７によるＴｈ−２２７誘導細胞毒性。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞毒性をＣＤ３３陽性ＨＬ−６０細胞で調査した。ＡＧＣ０７１５および対照トラスツズマブとコンジュゲートしたＡＧＣ００１５を用いて、比活性が４４ｋＢｑ／μｇになるようＴｈ−２２７をキレートした。ＨＬ−６０細胞を３７℃、５％ＣＯ2で増殖させ、週３回、１：５に分割した。アッセイ前日、培地（２０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ））を新しい培地と交換し、１ｍＬ当たりの細胞数が４０００００個になるよう体積を調整した。
【０１４９】
６ウェルプレートの各ウェルに約１６０００００個の細胞（４ｍＬ）を加えた。標識ｍＡｂまたは培地を加えるために翌日までプレートをインキュベートした。標識ｍＡｂまたは培地を加えた後、プレートをさらに４時間インキュベートした。１つの実験では、ＡＧＣ０７１５またはトラスツズマブ−ＡＧＣ００１５を最終濃度が３ｎＭになるよう各ウェルに加えた。別の実験では最終濃度を０．３ｎＭとした。
【０１５０】
インキュベーション後、細胞を培地中で２回洗浄し、上清およびペレット中のＡＴＰを測定した。次いで、細胞を１：２に分割し、培地中、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。２日目、４日目および７日目に洗浄を１回にして同じ方法を繰り返した。ＡＴＰの定量化を様々な試料採取時間における細胞生存能の尺度として用いて（Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存能アッセイ）、図４Ａおよび４Ｂに示される増殖曲線が得られた。
【０１５１】
ＨＬ−６０腫瘍細胞と結合するＡＧＣ０７１５−Ｔｈ−２２７では、ＨＬ６０細胞と結合しないトラスツズマブ構築物とは対照的に細胞毒性がみられた。培地対照における４日〜７日目の生存能の低下は、培地交換の間隔が長すぎたことによるものと考えられる。
【実施例１１】
【０１５２】
ヒト異種移植モデルにおけるＡＧＣ０７１５による効果的な腫瘍標的化。
雌ＮＭＲＩヌードマウスにヒトＨＬ−６０腫瘍細胞系の細胞を異種移植した。ＨＬ−６０細胞は急性前骨髄球性白血病の患者に由来し、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら（３）によればＣＤ３３を発現する。この細胞系をヌードマウスの皮下に接種すると腫瘍原性を示すことが明らかにされている（４）。この試験には雌ＮＭＲＩヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｅｕｒｏｐｅ）５４匹を用いた。
【０１５３】
マウスには試験に用いる前に少なくとも５日間の馴化期間が設けられ、腫瘍接種前の時点で４週齢であった。試験開始時、マウスの体重は約２０グラムであった。マウスは空気をＨＥＰＡフィルターに通す換気されたケージ（ＩＶＣ、Ｓｃａｎｂｕｒ）で個体ごとに飼育し、「Ｒａｔ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｎｒ．３  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ」餌料（Ｓｃａｎｂｕｒ  ＢＫ）およびモル濃度が１ｍＭ（ｐＨ３．０）になるまでＨＣｌを加えて酸性化した水を自由摂取させた。ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ／Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ；カタログ番号ＣＣＬ−２４０）をＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；＃１２４４０−０４６）中、２０％ＦＣＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンの存在下で増殖させ、皮下接種用に調製した。継代数４（Ｐ４）の時点でストックを作製し、保存するため、５％ＤＭＳＯを含有する培地中、３×１０７細胞／バイアルにて液体窒素で凍結させた。
【０１５４】
接種当日、細胞を３７℃の水浴で急速に解凍し（約２分）、２％ＦＣＳを添加したＰＢＳで洗浄し再懸濁させた（１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した）。投薬シリンジに吸引する前に細胞同士を毎回十分にかき混ぜた。マウスが軽いガス麻酔下（Ｎ2Ｏ）にある間に、内径の小さい針（２５Ｇ）を用いて体積０．１ｍＬの細胞懸濁液を背中に皮下注射した。マウスをケージに戻し、腫瘍を１５日間成長させた。被験試料（０．１ｍＬ）を尾静脈から静脈内ボーラス投与した。
【０１５５】
２１日間の腫瘍成長の後、マウスを無作為化により３つのグループ（ｎ＝６）に割り付け、被験化合物227Ｔｈ−ＡＧＣ０７１５を１５ｋＢｑ／マウスの用量で投与した。注射後の所定の時点でマウスを安楽死させ、血液、筋肉、大腿骨、腎臓、肺、肝臓、胃、小腸、大腸および腫瘍を採取した。組織および血液試料の重量を測定し、ガンマ分光測定法（ＨＰＧｅ１５ｐまたはＨＰＧｅ５０ｐゲルマニウム検出器）を用いて各試料の放射活性を測定した。
【０１５６】
測定した放射活性（Ｂｑ）と１０％注射標準試料で測定した放射活性とを関連させ、Ｔｈ−２２７およびＲａ−２２３の百分率を計算し、％ＩＤまたは組織１グラム当たりの％ＩＤで表した。２匹のマウスにはグループの他のマウスよりも大きい腫瘍がみられ、後ろ向き解析により腫瘍取込みと腫瘍サイズとの間に逆相関関係が示されている（データ不掲載）ことから、分析から除外した。データは腫瘍によるＡＧＣ０７１５−Ｔｈ−２２７の特異的取込みを裏付けるものである。これまでの試験では、血管漏出により腫瘍内に非特異的に滞留したｍＡｂが時間とともに洗い流され、７日目には数％ＩＤ／ｇ以下になることが示されている（データ不掲載）。
【０１５７】
生体内分布試験の結果を図５に示す。このデータは予想された腫瘍標的化を示している。腫瘍には放射活性の増大がみられるが、正常組織にはみられない。
【実施例１２】
【０１５８】
異種移植マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏのＡＧＣ０７１５−Ｔｈ−２２７の有効性。
細胞調製および雌ＮＭＲＩヌードマウスの異種移植を実施例９に記載される通りに実施する。マウスには試験に用いる前に少なくとも５日間の馴化期間を設け、腫瘍接種前の時点で４週齢である。試験開始時、マウスの体重は約２０グラムである。マウスは空気をＨＥＰＡフィルターに通す換気されたケージ（ＩＶＣ、Ｓｃａｎｂｕｒ）で個体ごとに飼育し、「Ｒａｔ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｎｒ．３  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ」餌料（Ｓｃａｎｂｕｒ  ＢＫ）およびモル濃度が１ｍＭ（ｐＨ３．０）になるまでＨＣｌを加えて酸性化した水を自由摂取させる。マウスの腫瘍の平均サイズが７５〜１５０ｍｍ３の範囲内に収まるようにするため、投与の約１０日前に腫瘍細胞をマウスに接種する。マウスを無作為化により４つの治療群および３つの対照群に割り付ける（ｎ＝１０／グループ）。治療群のマウスにはＡＧＣ０７１５−Ｔｈ−２２７を７５ｋＢｑ／ｍＬ、１５０ｋＢｑ／ｍＬ、２２５ｋＢｑ／ｍＬまたは３００ｋＢｑ／ｍＬ含有する１００μＬを尾静脈内に注射して２５０、５００、７５０または１０００ｋＢｑ／ｋｇ体重（ｂ．ｗ．）とする。対照群のマウスには溶媒のみ（緩衝液）、非放射性抗体（ＡＧＣ０７１５）または比活性が５００ｋＢｑ／ｋｇになるよう標識したトラスツズマブ−Ｔｈ−２２７（アイソタイプ対照）のいずれかを投与する。
【０１５９】
腫瘍の出現を注意深くモニターし、週３回、以下に挙げるスキームに従って腫瘍をスコア化（測定できない大きさである場合）または測定する。
【０１６０】
【表５】
2015517483.tif 000029
【０１６１】
デジタル式ノギスを用いて腫瘍径を２次元で測定し、式：Ｌ×Ｗ×1／2Ｗ（長さ×幅×1／2幅）によって体積を推定する。０日目、すなわち接種当日に測定／観察を開始する。腫瘍体積の測定を月曜日、水曜日および金曜日の週３回実施する。体重を週１回記録する。データを図で表し、記述統計を実施する。
【０１６２】
腫瘍サイズが最大値の直径１５ｍｍに達した後、マウスを屠殺する。この直径は、球形であると仮定した場合の体積１６８８ｍｍ3に相当する。この試験では有害な臨床徴候は予想されない。有害な臨床徴候が観察された場合、注記としてファイルに記録する。
【０１６３】
試験後、異なる治療群をカプラン・マイヤー生存曲線により比較する。このほか、治療による腫瘍成長をプロットし、平均の成長対時間の非線形回帰に従って成長遅延を計算し、スチューデントT検定を用いて比較する。
【０１６４】
この有効性試験のデータは、既に公開されている、トリウム−２２７で標識したモノクローナル抗体トラスツズマブおよびリツキシマブの投与後に得られた有効性データとほぼ同じものになると予想される。
【実施例１３】
【０１６５】
抗ＣＤ２２モノクローナル抗体（ＡＧＣ１１００）の作製。
エプラツズマブとも呼ばれ、ここではＡＧＣ１１００と称するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ｈＬＬ２の配列を（１）に記載されている通りに構築した。本実施例に使用されるｍＡｂはＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ社（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）によって作製されたものである。このｍＡｂの作製は、例えば、軽鎖および重鎖をコードする遺伝子をコードするプラスミドをトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣浮遊（ＣＨＯ−Ｓ）細胞で実施することができる。標準的な方法を用いて最初の安定なクローンを選択する。使い捨てのバイオリアクターに入れて約１４日後、上清をろ過した後にモノクローナル抗体が回収され得る。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、Ａｔｏｌｌ、Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ）、次いでイオン交換段階によってＡＧＣ１１００をさらに精製する。静電性および疎水性に基づく３つ目の精製段階を用いて、生成物から凝集体および残存している可能性のある不純物をさらに除去し得る。等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、Ｎ末端配列決定およびＬＣ／ＭＳ分析によりＡＧＣ１１００の同一性を確認する。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により試料の純度をさらに分析する。
【０１６６】
既知のＣＤ２２結合抗体（マウス抗体およびヒト化抗体）の配列としては以下のものが挙げられる（配列中、ＣＤＲを太字で表し、ＣＤＲ外側の予測される接触領域に下線を施す）：
2015517483.tif 000030
【０１６７】
参考文献：
（１）      Ｌｅｕｎｇ，Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｄｉｏｎ，Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ，Ｓｈｅｖｉｔｚ，ＳｈｉｈおよびＨａｎｓｅｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３２：１４１３−２７，１９９５。
【実施例１４】
【０１６８】
ＡＧＣ１１００とキレート剤ＡＧＣ００１５とのコンジュゲーション。
抗体ＡＧＣ１１００を水溶性キレート剤ＡＧＣ００１５（１２）とコンジュゲートさせた。コンジュゲーション反応は、ｐＨ８．５の７０ｍＭホウ酸緩衝液と混合したＰＢＳの１：１（ｖ／ｖ）混合物中で実施した。キレート剤、ＡＧＣ００１５を下に示す：
【化２４】
2015517483.tif 000031
【０１６９】
キレート剤、ＡＧＣ００１５（上記１２）を金属不含水に溶かした後、コンジュゲーション反応物に加えた。キレート剤と抗体を名目モル比１．３：１で使用し、反応物を２１℃で２２時間インキュベートした。反応時間の終了時、ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６００  ＰＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；コード番号２８−９８９３−３５）およびｐＨ５．５の０．９％ＮａＣｌ  １００ｍＭクエン酸緩衝液を移動相として用いて、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、抗体画分を遊離のキレート剤から分離した。精製したコンジュゲートの最終的なキレート剤−抗体比（ＣＡＲ）をＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー−ＵＶ（ＳＥＣ−ＵＶ）分析により決定した。ＣＡＲの決定は、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、室温で維持した４．６×３００ｍｍ、４μｍ粒子のカラムＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、パーツ番号１８６７５）およびｐＨ６．８の３００ｍＭ  ＮａＣｌ  ２００ｍＭ酢酸アンモニウム（定組成溶離）の移動相を使用し、計１５分の実行時間で実施した。注入体積は５μｌとし、ＬＣ流速は０．３５ｍｌ／分とした。それぞれｍＡｂおよびキレート剤の最大吸収に対応する２８０ｎｍおよび３３５ｎｍでＵＶシグナルをモニターした。ＣＡＲ決定の代表的な結果を図６に示す。
【実施例１５】
【０１７０】
Ｔｈ−２２７による抗体／キレート剤コンジュゲートＡＧＣ１１１５のキレート化
アクチニウム−２２７（227Ａｃ）発生器システムからトリウム−２２７（227Ｔｈ）を４＋イオンとして単離した。陰イオン交換クロマトグラフィーにより、８Ｍ  ＨＮＯ3中の227Ａｃ崩壊混合物から227Ｔｈを選択的に保持し、227Ｔｈ4+と負荷電硝酸錯体を形成した。227Ａｃおよび娘核種をカラムから洗浄し、１２Ｍ  ＨＣｌで227Ｔｈを溶出した。227Ｔｈ溶出液を蒸発乾固させ、残渣を０．５Ｍ  ＨＣｌに溶かした。
【０１７１】
キレート化反応では、抗体コンジュゲートＡＧＣ１１１５をｐＨ５．５の０．９％ＮａＣｌ  １００ｍＭクエン酸緩衝液中、抗体コンジュゲート０．５ｍｇ当たり１ＭＢｑの227Ｔｈの存在下、２１℃／室温で１５分間インキュベートした。ＮＡＰ−５  ＤＮＡ  Ｇｒａｄｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより、放射標識抗体コンジュゲートを含有する高分子画分を遊離の227Ｔｈおよび娘核種から分離した。標識効率は通常、ＮＡＰ−５脱塩段階で起こり得る損失を含めて９６〜９８％であった。
【実施例１６】
【０１７２】
フローサイトメトリーによるＡＧＣ１１１５およびＡＧＣ１１００とＣＤ２２陽性Ｒａｊｉ細胞との結合分析。
ＡＧＣ１１１５およびＡＧＣ１１００（抗ヒトＣＤ２２、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ；ｈＬＬ２、＃１００３１６４、１０ｍｇ／ｍｌ）とＣＤ２２陽性Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ、＃ＣＣＬ−８６）との結合をフローサイトメトリーにより分析した。近似曲線から求めたＥＣ50値を抗体と抗体コンジュゲートの結合能の比較に用いた。この分析を用いて、抗体コンジュゲートのＣＤ２２との結合能がコンジュゲーション法による影響を受けないことを確認した。
【０１７３】
Ｒａｊｉ細胞をＲＰＭＩ１６４０（ＰＡＡ；＃Ｅ１５−８４０）中、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンの存在下で増殖させた。フローサイトメトリー分析には、４℃、３４０×ｇで５分間の遠心分離により細胞培養物５０ｍＬを回収した。１％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＰＢＳ１０ｍＬに細胞を再懸濁させて２回洗浄し、４℃、３００×ｇで５分間の遠心分離によりペレット化した。次いで、再懸濁させた細胞の調製物２０μＬをＣｏｕｌｔｅｒ  Ｉｓｏｔｏｎ  ＩＩ  Ｄｉｌｕｅｎｔで１：５００に希釈し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ２機器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ；ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて計数した。調製物を細胞密度１×１０6細胞／ｍｌに調整し、１００μＬをＶ字底の９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ／Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ＮＨ、ＵＳＡ）の各ウェルに移した。細胞を遠沈し、傾捨後に再懸濁させて、１ウェル当たり体積約５０μＬの細胞懸濁液を得た。
【０１７４】
ＡＧＣ１１１５およびＡＧＣ１１００を３倍希釈段階で５０μｇ／ｍｌに希釈し、１２段階で漸増させた。アイソタイプ対照抗体（トラスツズマブ）をこれに準じて調製した。Ｒａｊｉ細胞を含むウェルに各抗体希釈物から１００μｌを加えた。４℃で１．５時間インキュベートした後、細胞を遠沈し、１％ＦＢＳを添加した冷ＰＢＳ２００μｌで２回洗浄した。ヒトｍＡｂを検出する二次抗体試薬としてＰＥコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；＃４０９３０４）を使用した。二次抗体試薬を１％ＦＢＳを添加したＰＢＳで１μｇ／ｍｌに調製した。次いで、二次抗体試薬から１００μｌを各ウェルに加えた後、暗所にて４℃で１時間インキュベートした。細胞を上記の通りに２回洗浄し、１％ＦＢＳを添加したＰＢＳ２００μｌに再懸濁させた。全試料をＶ字底の９６ウェルプレートで分析した。Ｂｅｃｋｈａｍ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌａｂ  Ｑｕａｎｔａ  ＳＣ  ＭＰＬフローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ；ＣＡ、ＵＳＡ）で蛍光シグナルを記録した。中央値（ＭＦＩ）をＥｘｃｅｌシートにエクスポートし、濃度（［ｎＭ］）に対してプロットした。
【０１７５】
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＰｒｉｓｍＳｏｆｔｗａｒｅ；ＣＡ、ＵＳＡ）に「ｌｏｇ（アゴニスト）対反応−変数勾配（４つのパラメータ）」結合モデルを用いてデータをフィットし、そのフィットからＥＣ50値を計算した（図７）。Ｒａｊｉ細胞を二次抗体で直接染色したところ、バックグラウンドのＭＦＩ値が約１（ＡＧＣ１１１５のＭＦＩ値の０．５〜１％）という低い値を示した。
【０１７６】
フィットしたＡＧＣ１１００およびＡＧＣ１１１５の滴定曲線の算出されたＥＣ50値はそれぞれ９ｎＭおよび６ｎＭであり、コンジュゲートＡＧＣ１１１５の結合能がＡＧＣ１１００と同程度であることを示していた。
【実施例１７】
【０１７７】
ＡＧＣ１１１５−Ｔｈ−２２７によるＴｈ−２２７誘導細胞毒性。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞毒性をＣＤ２２陽性Ｒａｍｏｓ細胞で調査した（実施例６を参照されたい）。ＡＧＣ１１１５およびＡＧＣ００１５とコンジュゲートした対照トラスツズマブを用いて、比活性が４４ｋＢｑ／μｇになるようＴｈ−２２７をキレートした。
【０１７８】
Ｒａｍｏｓ細胞を３７℃、５％ＣＯ2で増殖させ、週３回、１：５に分割した。アッセイ前日、培地（２０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ））を新しい培地と交換し、１ｍＬ当たりの細胞数が４０００００個になるよう体積を調整した。６ウェルプレートの各ウェルに約１６０００００個の細胞（４ｍＬ）を加えた。標識ｍＡｂまたは培地を加えるために翌日までプレートをインキュベートした。
【０１７９】
標識ｍＡｂまたは培地を加えた後、プレートをさらに４時間インキュベートした。この実験では、ＡＧＣ１１１５またはトラスツズマブ−ＡＧＣ００１５を最終濃度が３ｎＭになるよう各ウェルに加えた。インキュベーション後、細胞を培地中で２回洗浄し、上清およびペレット中のＡＴＰを測定した。次いで、細胞を１：２に分割し、培地中、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。３日目、５日目および７日目に洗浄を１回のみにして同じ方法を繰り返した。
【０１８０】
ＡＴＰの定量化を様々な試料採取時間における細胞生存能の尺度として用いて（Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存能アッセイ）、図８に示される曲線が得られた。Ｒａｍｏｓ細胞と結合するＡＧＣ１１１５−Ｔｈ−２２７では、Ｒａｍｏｓ細胞と結合しないＴｈ−２２７で標識した対照構築物とは対照的に細胞毒性がみられた。
【実施例１８】
【０１８１】
酸誘導体
別のカップリング化学反応を可能にする水溶性キレート剤の酸誘導体の作製。
この実施例では成功した酸誘導体の合成を示す。このキレート剤の誘導体により、例えば、腫瘍標的化タンパク質のイプシロンアミンとのアミド結合形成が可能になる。
【０１８２】
本実施例は可溶性キレート剤の合成を示し、物質１１（実施例２）から出発するものである。４３ｍｇ（約０．０４ｍｍｏｌ）の物質１１をＤＭＳＯ４ｍＬ、アセトニトリル４ｍＬおよびＮＥｔ3３０μＬに溶かした。無水コハク酸６ｍｇを加えた（０．０６ｍｍｏｌ）。室温で２２時間反応させた後の反応混合物のＬＣ／ＭＳ分析により、物質１５が形成されたことが示された。不純物のジアシル化された副生成物がいくらか形成された。無水物を一部ずつ加えればエステル形成が最小限に抑えられ、生成物１４のモル収率が向上するはずである。得られた反応混合物のＨＰＬＣ分析を図９に示す。
【化２５】
2015517483.tif 000032
【実施例１９】
【０１８３】
ＡＧＣ０００３およびＡＧＣ００１５と小分子量タンパク質とのコンジュゲーション
リジンカップリングを用いることになっていたため、キレート剤とのコンジュゲーションの前にアフィボディ融合タンパク質の遊離のシステインを化学的にブロックした。基本的にＴｏｌｍａｃｈｅｖら（１）により記載されている通りに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で作製したアフィボディ融合タンパク質ＰＥＰ９２３７（配列番号１０）を、２ｍＭトリス（２−クロロエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含有するＰＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌ１８２５；０．９％ＮａＣｌ、リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）に１．３２ｍｇ／ｍｌになるよう溶かし、ジスルフィド形成を阻害した。アフィボディ融合タンパク質溶液１ｍｌを０．１４Ｍホウ酸緩衝液０．９８５ｍｌと混合し、ｐＨが約８．４であることを確認した。ヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ  １１４９−５ｇ）の１ｍｇ／ｍｌ溶液１５μＬを加え、反応混合物を室温で１時間インキュベートした。
【０１８４】
コンジュゲーション前、スルフィドリルをブロックしたアフィボディ融合タンパク質を含有する溶液４ｍｌをＡｍｉｃｏｎスピンフィルターを用いて０．５ｍＬに濃縮し、ホウ酸緩衝液で平衡化したＮＡＰ５脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ロット番号８３８９２６２４）で余分な反応物を除去した。溶出した高分子量画分１ｍＬをＡＧＣ０００３またはＡＧＣ００１５のいずれかと反応させるべく２部に分けた。
【０１８５】
スルフィドリルをブロックしたアフィボディ融合タンパク質０．５ｍＬを含むバイアルにキレート剤ＡＧＣ０００３（ＤＭＦ（Ｓｉｇｍａ  ２２７０５６、ロット番号ＳＴＢＢ４６６８）８．３μＬ−下の１３−１０ｍｇ／ｍｌ含有）を加えた。スルフィドリルをブロックしたアフィボディ融合タンパク質０．５ｍＬを含む別のバイアルにキレート剤ＡＧＣ００１５（１０ｍｇ／ｍｌを含有するＨ2Ｏ  ９．３μＬ）を加えた。キレート剤タンパク質反応混合物を含む両バイアルを３０℃で一晩インキュベートした。得られた透明な溶液にＮＡＰ５カラムを用いてＰＢＳへの緩衝液交換を行った。
【０１８６】
配列番号１０：
ＡＥＡＫＹＡＫＥＭＲＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＳＧＳＧＳＬＡＥＡＫＥＡＡＮＡＥＬＤＣＹＧＶＳＤＦＹＫＲＬＩＤＫＡＫＴＶＥＧＶＥＡＬＫＤＡＩＬＡＡＬＰＧ
【０１８７】
【化２６】
2015517483.tif 000033
【実施例２０】
【０１８８】
ＡＧＣ０００３およびＡＧＣ００１５との小分子量タンパク質コンジュゲートの溶解度分析
実施例１９で作製した２種類のアフィボディ融合タンパク質キレート剤コンジュゲートの透明なＰＢＳ溶液を−２０℃で凍結させた後、解凍した。ＡＧＣ０００３コンジュゲートを含有する溶液には明らかな乳白色の沈殿物が見られたが、ＡＧＣ００１５コンジュゲートの溶液には見られなかった。この沈殿は氷上で冷却すると一層明瞭に見えるようになった。
【０１８９】
両反応から得られた透明な溶液をＦＰＬＣ−ＳＥＣによって分析し、凝集体の可能性を調査した（図１０）。ＡＧＣ０００３コンジュゲートでは５０％超が凝集状態にあることが明らかになったのに対して、ＡＧＣ００１５コンジュゲートではごく一部（クロマトグラムの肩として現れている）が凝集状態にあった。総合した曲線下面積から、ＡＧＣ０２０３（ＡＧＣ０００３コンジュゲート）の方がＡＧＣ０２１５よりも回収された総タンパク質がはるかに少ないことがわかった（ＡＵＣはそれぞれ：１６６ｍＡＵ*ｍＬおよび４０９ｍＡＵ*ｍＬ）。
【０１９０】
次に、タンパク質とキレート剤の比をＬＣ／ＭＳ分析により調査した。非コンジュゲートアフィボディ融合タンパク質（ＡＧＣ２００）を対照として含めた。ＬＣでは２８０ｎｍおよび３３５ｎｍ（キレート剤は約３３５ｎｍで吸収する）で吸収をモニターし、キレート剤が２種類のコンジュゲート溶液中には存在するが、ＡＧＣ２００調製物中には存在しないことがわかった（図１１）。ＡＧＣ０００３コンジュゲート（ＡＧＣ０２０３）では、ＭＳ分析により非コンジュゲート融合タンパク質およびキレート剤を１つ有するタンパク質コンジュゲートがともに示されたのに対して、ＡＧＣ００１５コンジュゲート（ＡＧＣ０２１５）では、ＭＳ分析により非コンジュゲート融合タンパク質ならびにキレート剤を１つおよび２つ有するタンパク質コンジュゲートが示された（図１２）。このことは、キレート剤を２つ以上有するＡＧＣ０２０３が沈殿したことを示している。
【０１９１】
参考文献
Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ，Ｏｒｌｏｖａ，Ｐｅｈｒｓｏｎ，Ｇａｌｌｉ，Ｂａａｓｔｒｕｐ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ，Ｒｏｓｉｋ，Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｌｕｎｄｑｖｉｓｔ，Ｗｅｎｎｂｏｒｇ，Ｎｉｌｓｓｏｎ．Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ＨＥＲ２−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｉｃｒｏｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  １７７Ｌｕ−Ｌａｂｅｌｅｄ  ＨＥＲ２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７：２７７３−８２，２００７。
【配列表フリーテキスト】
【０１９２】
配列番号１；ＨｕＭ１９５モノクローナル抗体を逆翻訳し、最適化してチャイニーズハムスター卵巣浮遊細胞にサブクローニングした。
配列番号２；ＨｕＭ１９５モノクローナル抗体を逆翻訳し、最適化してチャイニーズハムスター卵巣浮遊細胞にサブクローニングした。
配列番号３；ＨｕＭ１９５モノクローナル抗体を逆翻訳し、最適化してチャイニーズハムスター卵巣浮遊細胞にサブクローニングした。
配列番号４；ＨｕＭ１９５モノクローナル抗体を逆翻訳し、最適化してチャイニーズハムスター卵巣浮遊細胞にサブクローニングした。
配列番号５；マウス由来モノクローナル抗体
配列番号６；ヒト化マウス由来モノクローナル抗体
配列番号７；マウス由来モノクローナル抗体
配列番号８；ヒト化マウス由来モノクローナル抗体
配列番号９；ヒト化マウス抗ＣＤ２２モノクローナル抗体
配列番号１０；大腸菌に発現させたアフィボディ融合タンパク質
【図１】
2015517483.tif 000036
【図２ａ】
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【図２ｂ】
2015517483.tif 000038
【図３】
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【図４】
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【図５】
2015517483.tif 000041
【図６ａ】
2015517483.tif 000042
【図６ｂ】
2015517483.tif 000043
【図７】
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【図８】
2015517483.tif 000045
【図９】
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【図１０】
2015517483.tif 000047
【図１１】
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【図１２ａ】
2015517483.tif 000049
【図１２ｂ】
2015517483.tif 000050
【図１２ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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