(57)【要約】  良性前立腺肥大症の治療のための、α1A、α1Dアドレナリン受容体及び5-HT1A受容体のアンタゴニストであるN-フェニルピペラジン誘導体、同様のものを含む医薬組成物【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α1A及びα1Dアドレナリン受容体並びに5-HT1A受容体と高い親和性を有する2-アルコキシフェニルピペラジン誘導体であって、
- これらの受容体のTM3におけるアスパラギン酸残基(Asp)のカルボキシレート基とのイオン相互作用のための塩基性窒素原子と、
- TM2、4、6及び7における相補的な残基との疎水的及び静電気的相互作用のための少なくても1つの芳香族環と、
- N-フェニルピペラジンサブユニット、水素結合アクセプター、例えばアルコキシド及び同配体の窒素の位置2(オルト)に負電荷密度を有する基と、を有する、2-アルコキシフェニルピペラジン誘導体。
【請求項２】
以下の
【化４】
2015506358.tif 000027
【化５】
2015506358.tif 000028
【化６】
2015506358.tif 000029
を含む群から選択される、請求項1に記載のN-フェニルピペラジン誘導体。
【請求項３】
α1A/Dアドレナリン受容体及び5-HT1A受容体リガンドであって、
- これらの受容体のTM3のアスパラギン酸残基(Asp)のカルボキシレート基とのイオン相互作用のための塩基性窒素原子と、
- TM2、4、6及び7の相補的残基との疎水的且つ静電気的相互作用のための少なくとも一つの芳香族環と、を有する、α1A/Dアドレナリン受容体及び5-HT1A受容体リガンド。
【請求項４】
以下の
【化７】
2015506358.tif 000030
【化８】
2015506358.tif 000031
【化９】
2015506358.tif 000032
を含む群から選択される、請求項3に記載のリガンド。
【請求項５】
良性前立腺肥大症及び下部尿路症状の治療、加えて前立腺抗増殖効果のための医薬組成物であって、
医薬的に許容可能な担体と、α1A/Dアドレナリン受容体及び5-HT1A受容体に高い親和性を有する少なくとも一つのN-フェニルピペラジン誘導体と、を有し、
前記N-フェニルピペラジン誘導体は、
- これらの受容体のTM3のアスパラギン酸残基(Asp)のカルボキシラート基とのイオン相互作用のための塩基性窒素原子と、
- TM2、4、6及び7の相補的残基との疎水的且つ静電気的相互作用のための少なくとも一つの芳香族環と、を有する、医薬組成物。
【請求項６】
以下の
【化１０】
2015506358.tif 000033
【化１１】
2015506358.tif 000034
【化１２】
2015506358.tif 000035
を含む群から選択される、請求項5に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬製品及び製造方法の技術分野に関する。より具体的には、本発明は、α1Aアドレナリン受容体、α1Dアドレナリン受容体及びセロトニン5-HT1A受容体のリガンド及び/又は多重アンタゴニストとしてのN-フェニルピペラジン誘導体を提供する。かかる物質は、良性前立腺肥大症及び下部尿路症状の治療のためのプロトタイプの候補であり、医薬組成物に好適に用いることができる。
【０００２】
発明の背景
受容体(GPCR)が結合したGタンパク質
ヘテロトリマーのGタンパク質に結合した受容体は、7つの膜貫通ドメインを有しており、「Gタンパク質結合受容体」(GPCR)としても知られている(Oldham & HA MM, Nature 9:60-71, 2008)。
【０００３】
国際薬理学連合(IUPHAR)の受容体データベースによれば、ヒトにおいて、これらの受容体はロドプシンファミリー(R)を含むクラスに分類されている(Fredriksson et al Mol. Pharmacol. 63:1256-1272, 003.)。
【０００４】
OVERINGTON及び共同研究者(Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12) :993-996, 2006)によれば、このGPCRのファミリーを薬理学的ターゲットとして臨床的に使用されている薬は、世界の製薬市場の約4分の1に相当している。これは、これらの受容体の主な役割が、様々な内因性及び外因性リガンドであって細胞外のもの、とりわけ、ホルモン、タンパク質、脂質、神経伝達物質を認識する(そして、様々な生理的及び病態生理学的機構に関与している)ことである点から説明されている(BJARNADOTTIR RN et al, Genomics 88:263-273, 2006: OLDHAM & HAMM, Nature 9:60-71, 2008)。例えば、男性の泌尿性器系におけるGPCRの活性化は、筋収縮から細胞増殖及び分化まで調節する(AVELLAR et al., An. Acad. Bras. Cienc. 81 (3): 321-344, 2009)。これらの受容体に作用するリガンドは、著しい構造的な多様性を示す(WESS Pharmacol. Ther. 80 (3) :231-264, 1998)。
【０００５】
GPCRのRファミリーには、これらの受容体の特定の領域、特にリガンド認識の疎水膜貫通領域におけるアミノ酸配列に大きな類似性が見られる。これは、例えば、リガンドのプロトン化された窒素含有基との相互作用に関与しているTM3領域のAsp残基及び水素結合を介したリガンド認識に重要なTM5領域のSer及びTyr残基を有するα1Aアドレナリン受容体及び5-HT1A受容体において確認することができる。これらの2つの受容体を考慮すると、これらのリガンド認識領域は、互いに45%のホモロジーを有する(OLDHAM & HAMM, Nature 9:60-71, 2008において説明されている)。更に、芳香族領域に更にプロトン化が可能な基を含んでいる窒素分子と対応するこれらの受容体のリガンド間に、構造的な関係が存在している(FREDRIKSSON et al. Mol Pharmacol 63: 1256-1272, 2003)。
【０００６】
アドレナリン受容体
ヒトにおいて、α1A、α1B及びα1Dアドレナリン受容体は互いに異なる遺伝子によってエンコードされ(HIEBLE et al. Pharmacol Rev 45:267-270, 1995; MICHEL et al, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 352 (1): 1 -10, 995)、その主な構造的特徴はアミノ酸配列における高い類似性からなり、それらのドメインにおいて約65-73%の類似性が示される(LANGER, Eur. J. Urol 36:. 2-6, 1999; VARMA & DENG, Can. J. Physiol. Pharmacol. 78:267-292, 2000; ZHONG & MINNEMAN, Eur. J. Pharmacol. 375: 261-276, 1999; HUH et al., Genes Genet. Syst. 85 (l):65-73, 2010)。3つのサブタイプは、広く組織に分布しており、特定のサブタイプが優性であってもよい。これは、SCOFIELD外によって行われたラット組織を用いたmRNA研究(J. Pharmacol. Exp. Ther. 275: 1035-1042, 1995)にて示している通りである。この研究において、我々は、ラットの前立腺及び膀胱においてはα1Aサブタイプが、肝臓においてはα1Bが、そして大動脈においてはα1Dが優性であることを観察することができた。
【０００７】
自律神経系において、α1アドレナリン受容体は、非血管性及び血管性平滑筋収縮の変調の原因となるため脈管緊張の制御に非常に重要であることから、血圧の制御に非常に重要である(HIEBLE, Pharm. Acta. Helv. 74 (2-3): 163-171, 2000; MICHELOTTI et al., Pharmacol. Ther. 88:281-309, 2000)。
【０００８】
男性の泌尿性器系におけるそれらの作用に注目することは、重要である。いくつかの研究から、下部尿路、特にヒト前立腺組織及び膀胱排尿筋におけるこれらの受容体の存在が特徴づけられている(FORRAY et al, Mol. Pharmacol. 45 (4):703-708, 1994; HATANO et al , Br. J. harmacol. 113 (3): 723-728, 1994; MARSHALL et al, J. Pharmacol. 115 (5): 781-786, 1995; HIEBLE & RUFFOLO, Expert Opin Investig Drugs. 6(4): 367-387, 1997; MALLOY et al, J. Urol. Sep; 160 (3 Pt 1) :937-943, 1998; MURAMATSU et al. Br J. Urol. 74 (5):572-578, 1994; HIEBLE et al., Pharmacol. Rev. 45:267-270, 1995; MICHELOTTI et al, Pharmacol. Ther. 88:281-309, 2000)。この系において、複数のα1アドレナリン受容体は、それぞれ、主にα1Aアドレナリン受容体及びα1Dアドレナリン受容体を介して膀胱の収縮に関与している(Chen et al., J. Urol. 174: 370-374, 2005)。
【０００９】
α1アドレナリン受容体アンタゴニストは、良性前立腺肥大症(BPH) (男性集団における割合増に影響を与え、前立腺のサイズが大きくなることにより尿流量の妨害を引き起こす臨床状態)の治療に広く用いられてきた(MCNEAL, Urol. Clin. North Am., 17, 477-486, 1990)。従って、BPHの有病率は年齢と共に増加し、60歳の男性で約50%に急増し、80歳の男性で80%に達する(COCKETT et al. Prog. Urol. 1 (6 ): 957-72, 1991)。
【００１０】
α1Aサブタイプアドレナリン受容体がmRNA(Price et al, Mol Pharmacol 46:221-226, 1994; TSENG-CRANK et al, J. Pharmacol. 115: 1475-1485, 1995)及びタンパク質(LEPOR et al, J. Urol 149:640-642, 1993; MICHEL et al, J. Auton Pharmacol 16:21-28, 1996)レベルでヒト前立腺において優位であることが判明した。最近の調査から、α1Dサブタイプが前立腺にも有意な程度で存在していることが示されている(KOJIMA et al., Prostate 66:761-767, 2006)。従って、α1Aアドレナリン受容体及びα1Dアドレナリン受容体に対するより高い親和性プロファイルを有する薬の使用は、BPHの治療において効果的であり、非選択的α1アドレナリン受容体アンタゴニストよりも副作用を回避出来るためより許容可能である(CHAPPLE, Br J Uro1 76 (l) :47-56, 1995)。
【００１１】
α1アドレナリン受容体結合
多くの化学物質のクラスは、α1アドレナリン受容体が認識し得る。3つのα1A、α1B及びα1D受容体サブタイプに対して高い親和性を有する薬の中で、高血圧症治療において使用されるキナゾリン誘導体であるプラゾシンアンタゴニストが発見された(SHIBATA et al., Mol. Pharmacol. 48:250-258, 1995)。
【００１２】
他の重要な化学物質のクラスとして、ナノモルの範囲の親和性を有し且つ薬理学的ツールとして使用されている、α1Dアドレナリン受容体アンタゴニストであるフェニルピペラジン誘導体(例えばBMY 7378)が挙げられる(GOETZ et al, Eur. J. Pharmacol. 272 (2-3): R5-6, 1995)。更に、BMY 7378は、セロトニン5-HT1A受容体の部分的アゴニストである(CHAPUT & MONTIGNI J. harmacol. Ther. 246 (l): 359-370, 1988)。
【００１３】
セロトニン受容体(5-HT)
哺乳動物において、計14個の構造的及び薬理的に互いに異なる5-HT受容体のサブタイプに関係する、7つのファミリーの5-HT受容体(5-HT1-7)が知られている((HOYER et al, Pharmacol Rev 46:157-203, 1994; HOYER & MARTIN, Neuropharmacology 36:419-428, 1997; SAXENA et al, Trends Pharmacol Sci 19:311-316, 1998; VILLALON et al, Drug Discov Today 2:294-300, 1997; VILLALON & CENTURION, Naunyn. Schmiedebergs Arch Pharmacol 376 (1-2) :45-63 2007)。一次構造を考慮すると、5-HT代謝調節型受容体は、アドレナリン及びドーパミン受容体と高い類似性を有する(FREDRIKSSON et al. Mol Pharmacol.:1256-1272 63, 2003)。
【００１４】
代謝調節型サブタイプ5-HT1A及び5-HT2Aは、α1アドレナリン受容体と約45%の高い類似性を示し(TRUMPP-KALLMEYER et al. J. Med. 35(19):3448-3462. 1992)、それらの間で適度なホモロジー(35%)を示す(BARNES & SHARP Neuropharmacology 38:1083-1152, 1999)。
【００１５】
5-HT1A受容体
5-HT1A受容体は、遺伝子がクローニングされた、このファミリーでの最初の受容体の1つであった(KOBILKA et al Nature 329:75-79, 1987; Fargin et al Nature 335 (6188) :358-360, 1988)。受容体5-HT1AのmRNAの研究から、脳での発現が示され、大脳皮質に高密度で存在している。しかしながら、それらは、CNSの外(例えば脾臓、腎臓(新生児のもの)、腸(PUCADYIL & CHATTOPADHYAY, Progr. Lipid Res. 45:295-333, 2006)、そして、前立腺(ABDUL et al. Anticancer Res 14 (3A): 1215-1220, 1994; DIZEYI et al Prostate 59 (3) :328-336, 2004)においても見られる。
【００１６】
前立腺神経内分泌細胞は、5-HTを含むニューロペプチド及び成長因子を合成し、保存し、そして放出し(ABRAHAMSSON et al. 1986)、これらの組織に5-HTに特異的な受容体が存在していること(HOOSEIN et al. 1993)が知られている。従って、5-HT1Aアンタゴニストの潜在的な用途は、それらが腫瘍前立腺細胞の抗増殖効果を有し且つアンドロゲン非依存性腫瘍の成長の制御に有効であることから、BPHの治療であることが明らかになった(ABDUL and cols. Anticancer Res 14 (3A):1215-1220, 1994; DIZEYI et al Prostate 59 (3) :328-336, 2004)。以下に示す化学構造は、5-HT1Aに親和性を有する化学物質のクラスのいくつかの例である(構造は、IUPHAR受容体データベースから取得):
【００１７】
分子認識の仮説モデル
GPCRの結晶構造の決定は、一般的に、7つの膜貫通ドメインを有するこれらの受容体の天然高次構造の結晶モデル中で再現することが困難であるため妨げられている。例えば、最近、ヒトβ2-アドレナリン受容体においてGPCRの最初の結晶構造解析結果が得られ、その後A2aアデノシン受容体でも得られた(TATE and SCHERTLER, Curr Opin Struct Biol 19 (4): 386 - 395 2009;. KOBILKA and SCHERTLER, Trends Pharmacol Sci 29 (2) :79-83, 2008において説明されている)。従って、予想モデル構造及び公知のリガンドとの相互作用の研究は、これらの重要な薬理学的ターゲットに関する新しい知識を得るのに重要である(THIEL, Nat Biotechnol 22:513-519, 2004)。
【００１８】
突然変異生成の研究から、αアドレナリン受容体リガンド(例えばフェニルピペラジン誘導体)のプロトン化された窒素がTM3のアスパラギン酸残基(正イオン型のアミノ基であり、主な活性基と考えられているもの)とイオン相互作用することが示された(PEREZ, Biochem Pharmacol 73 (8): 1051 -1062, 2007)。一方では、芳香族環は、TM2、4、6及び7の相補的残基との疎水的及び静電気的に相互作用する(WAUGH et al J. Biol Chem 276 (27): 25366-2537, 2001)。これらの重要な結合に加え、メタ及びパラ位置における水素結合のアクセプター基を含む芳香族環の存在は、TM5のセリン残基と相互作用するリンカー-受容体複合体の安定化に関連している(LOPEZ-RODRIGUEZ et al. J. Med . Chem 40, 2653-2656, 1997; PEREZ Biochem Pharmacol 73 (8): 1051-1062, 2007)。
【００１９】
α1アドレナリン受容体及び5-HT1A受容体は、リガンド認識膜貫通領域に高い類似性を示す(TRUMPP-KALLMEYER et al. J. Med. 35 (19) : 3448-3462, 1992)。α1A-アドレナリン受容体アンタゴニストと5-HT1A受容体の結合に重要なサイトはTM3のAsp残基であり、リガンドのプロトン化されたアミノ基と相互作用するという証拠がある(LI et al. J. Mol. Model l4 (10) :957-966, 2008; LOPEZ-RODRIGUEZ et al Mol Pharmacol 62 (1): 15-21, 2002)。いくつかの戦略が薬の分子設計で利用可能である。これらの中で、最も重要なものは生理的手法である。これは、所望の薬理作用のメカニズムに基づくものであり(KUBINYI. Pharmazie 50; 647-662 1995)、治療標的の選択に依存し、関係する病態生理学的プロセスの知識に依存するものである。慢性疾患は、1種以上の受容体の細胞シグナル伝達の変化に関係している可能性があるため、種々の受容体に作用する標的薬は治療的に有効であってもよい(HUBER et al Biochemistry 47 (42): 11013-1 1023, 2008)。
【００２０】
いくつかの研究から、尿路中、特にヒト前立腺組織及び膀胱排尿筋にα1アドレナリン受容体の存在が示されており、BPHにおいてそれらの発現が増加している(FORRAY et al. Pharmacol. 45 (4) :703-708, 1994 ; HATANO et al J. Pharmacol 113 (3) :723-728, 1994; Marshall et al Br J Pharmacol 115 (5): l-786 78, 1995; HIEBLE & RUFFOLO Expert Opin Investig Drugs 6 (4) :367-387, 1997;. MALLOY et al Urol, J. et al Sep. l60 (3 Pt l) :937-943, 1998; MURAMATSU et al Br J Urol. 74 (5) :572-578, 1994; HIEBLE et al Pharmacol Rev. 45:267-270, 1995; HIEBLE Pharma Helv Acta 74 (2-3): 163-171, 2000; MTCHELOTTI et al. Pharmacol. Ther. 88:281-309, 2000)。これらの受容体に加えて、5-HT1A受容体は、ヒト前立腺組織においても発現しており、そこで増殖作用を及ぼしている(ABDUL et al, Anticancer Res 14 (3A): 1215-1220, 1994; DIZEYL et al Prostate 59 (3) :328-336, 2004)。この観点から、α1A/D及び5-HT1Aアドレナリン受容体の阻害に関心があるため、BPHの治療のための二重アンタゴニストに関する新薬を開発する分野において大きな関心がある。
【００２１】
科学論文の検索からは、本発明に記載されている下部尿路症状及び良性前立腺肥大症の治療のためのプロトタイプに対する新たな候補としてのα1Aアドレナリン受容体、α1Dアドレナリン受容体及び5-HT1Aセロトニン受容体の多重アンタゴニストとしての、N-フェニルピペラジン誘導体に関する関連文献は見つからなかった。
【００２２】
そして、調査した論文からは、本発明を示唆する文献、予想する文献又は教示する文献は発見されなかったことから、本願明細書において提唱される解決策は従来技術に対して新規性及び進歩性を有することが明らかである。
【００２３】
発明の要約
本発明の目的は、N-フェニルピペラジン誘導体、リガンド、それらを含む医薬組成物である。
【００２４】
本発明のN-フェニルピペラジン誘導体は、特にインビトロプロセスでの結合物質として有効であり、また、特に良性前立腺肥大症及び/又は下部尿路症状の治療、加えて抗増殖効果(アンドロゲン-非依存性腫瘍前立腺起源の細胞増殖を含む)のための医薬組成物においても有効である。α1アドレナリン受容体及び5-HT1A受容体を考慮すると、本発明のN-フェニルピペラジンは、これらの受容体に結合するために必要な構造的要件(例えば、これらの受容体(アドレナリン受容体α1及び5-HT1A受容体)のTM3のアスパラギン酸残基(Asp)のカルボキシレート基とのイオン相互作用のための塩基性窒素原子と、加えて、TM2、4、6及び7の相補的残基との疎水的且つ静電気的相互作用のための芳香族環)を有している。
【００２５】
本発明の他の目的は、アルキル鎖に多様性を有するN-フェニルピペラジンを得る製造方法である。
【００２６】
本発明に係るこれら及び他の目的は、当業者によって、及び、上記セグメントに関心をもつ会社によって直ちに理解されるだろう。そして、これは、下記の記述を再現できるように十分詳細に記載されているだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図1は、LDTの希釈に使用した担体の存在(□)又は非存在下(■)でのラット大動脈におけるフェニレフリン(PE)の濃度-反応曲線を示している。データは、平均±EPM(n = 5)として表記している。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、N-フェニルピペラジン誘導体、リガンド、それらを含む医薬組成物を提供する。
【００２９】
本発明のN-フェニルピペラジン誘導体は、特にインビトロプロセスでの結合物質として有効であり、また、特に良性前立腺肥大症及び/又は下部尿路症状の治療、加えて抗増殖効果(アンドロゲン-非依存性腫瘍前立腺起源の細胞増殖を含む)のための医薬組成物においても有効である。特に、本発明の2-アルコキシフェニルピペラジン誘導体は、α1A及びα1Dアドレナリン受容体並びに5-HT1A受容体と高い親和性を有し、且つ、
- これらの受容体のTM3におけるアスパラギン酸残基(Asp)のカルボキシレート基とのイオン相互作用のための塩基性窒素原子と、
- TM2、4、6及び7における相補的残基との疎水的及び静電気的相互作用のための少なくても1つの芳香族環と、
- N-フェニルピペラジンサブユニット、水素結合アクセプター、例えばアルコキシド及び同配体の窒素の位置2(オルト)に負電荷密度を有する基と、を有する。
【００３０】
いくつかの化合物は、N-フェニルピペラジン活性基と共に合成される。LDT2-6、LDT8、LDT 62-69、LDT 39、70及びLDT 245の化合物の化学構造のリストは、以下で一覧にしている。
【化１】
2015506358.tif 000002
【化２】
2015506358.tif 000003
【化３】
2015506358.tif 000004
【００３１】
α1アドレナリン受容体及び5-HT1A受容体に対するN-フェニルピペラジン誘導体の研究には、２つの研究が存在する。1つはRatouis外(J. Med. 8:271-273, 1965)が研究し、もう1つはLeopold外(J Pharm. Pharmacol . 56 (2) :247-255, 2003)が研究し、とりわけ、最初の研究では時にLDT5と呼ばれるフェニルピペラジンが研究され、次の研究ではLDT3、LDT4、LDT5が研究された。加えて、5-HT1A及び5-HT2に関する結合物質としてLDT62-68を特徴づけている2つの他の参考文献もあり(MOKROSZ et al, Arch Pharm 328: 143-148, 1995)、単なるα1アドレナリン受容体リガンドとしてのLDT66及びLDT68に関する参考文献もある(MOKROSZ et al, J Med Chem 39: 1125-1129, 1996)。しかしながら、これらの参考文献は、5-HT2A受容体並びにα1及びα2アドレナリン受容体の選択性に関する理由に対する、内因活性の決定及び系統分析を共に示していない。LDT2-6-LDT8及びLDT62-68の全ては、α1-アドレナリン受容体α1 A/D及び5-HT1Aに関して二重親和性を有するアンタゴニストの調査状況から、一連のものが潜在的な候補であることを示している。
【００３２】
新規のN-フェニルピペラジンの取得
本発明においてLDTと呼ぶ全ての誘導体は、従来型又はマイクロ波加熱下にて還流によりアミン塩基又は炭酸塩の存在下でアセトニトリル中でのN-フェニルピペラジンとSN２反応を用いて、第一級アルコールから商業的又は事前に合成された対応ハロゲン化アルキルから、収率86から97%の範囲で合成して、モノ塩酸塩の形態で利用可能な状態として、その後、超純水中で10mMの濃度で可溶化して-20℃で保管した。
【００３３】
赤外スペクトルは、パーキンエルマー分光器(Spectrum BX)でフーリエ変換(FT-IR)して記録し、スペクトルIH-NMR(300及び500MHz CDC13)及び13 C-NMR(75及び125MHz CDC13)は、Varian Plus(7.05T)及びBruker Avance DRX300及びDRX500分光器において記録し、そして、マススペクトルは分光器Shimadzu LCMS IT-TOFにて記録した。極性及び無極性の溶媒(エタノール/クロロホルム)の混合物によって溶出される薄層クロマトグラフィ(TLC)のプレートから、各サンプルにおいて1つの化合物だけの存在を明示する単一の点が示された。これは、分光分析によって確認した。毎日の実験において、当該実験を実行するのに必要な濃度については、少量アリコートの保存溶液から希釈した。
【００３４】
一連のLDT2-6、LDT8及びLDT62-68 LTD-45を用いた全ての実験は、化合物の分解の可能性を避けるために低圧ナトリウムランプ下で実行した。
【００３５】
取得する臓器
全てのプロトコールは、UFRJの倫理委員会の承認を事前に受けた(CEUA; protocol: DFBCICB011)。
【００３６】
2.5から3月齢の雄ウィスターラットを、飽和チャンバー中のエーテルによって麻酔をかけた後に断頭によって安楽死させた。雄アルビノラビット(2.5〜3kg)を、静脈内ペントバルビタール(40mg/kg)によって麻酔した後に全採血によって安楽死させた。
【００３７】
放射性リガンド及び薬
放射性リガンド[3H]-プラゾシン(比放射能85Ci/mmol)[3H]-ケタンセリン(比放射能67Ci/mmol)、[3H]-8-OH-DPAT(比放射能170.2Ci/mmol)、[3H] mPPF、[3H]-QNB、[3H]-YM09151-2及び[3H] RX821002は、PerkinElmer (米国)から購入し、[3H]RX821002(比放射能60Ci/mmol)はAmersham(英国)から購入した。塩酸プラゾシン、酒石酸水素アドレナリン、塩酸パルギリン、５-ヒドロキシトリプタミン塩酸塩、アセチルコリン塩酸塩、(R)-(-)-塩酸フェニレフリン、(±)-塩酸プロプラノロール、及び、BMY7378二塩化水素化物及びケタンセリン酒石酸塩は、SIGMA (米国)から購入した。
【００３８】
機能的アッセイ
等尺性収縮アッセイは、上記の通りに安楽死させた2.5-3月齢の雄ウィスターラットを使用して行った。胸部大動脈(機能的なα1Dアドレナリン受容体が豊富な組織)を取り出して、隣接する結合及び脂肪組織を除いて、3mmのセグメントに切り取った。そして、各リング状組織を、張力変換器(Grass FT-03)に固定して、炭素混合物(95%のO2及び5%のCO2)を有する一定のエアレーション下で37℃に維持した9mL生理食塩水(122mMのNaCl、5mMのKCl、1.25mMのCaCl2、1.25mMのMgCl2、1,25mMのKH2PO、15mMのNaHCO3、11.5mMのグルコース)を含むバット中に浸した。そして、大動脈セグメントに対して60分当たり20mNの前負荷をかけた。静止状態で1時間維持した組織の回復後、1μΜのフェニレフリン(PE)(α1アドレナリン受容体選択的アゴニスト)によって誘導される収縮を実行した。この安定水準に達した収縮において、酵素である内皮一酸化窒素合成酵素(eNOS)の活性化による内皮依存的な緩和を促進させるため、およびその後の一酸化窒素(NO)の解放を促進させるために、1μΜのアセチルコリンを加えた。少なくとも80%緩和されたリング状組織を正常な内皮とみなして使用した。
【００３９】
そして、組織を回復させるために、試料を洗浄して1時間静置させた。そして、10又は50nMのLDTを1時間インキュベーションした前後で、1μΜのプロプラノロール(β-アドレナリン受容体遮断薬)の存在下でフェニレフリン(10-9〜10-5M)に関する積算曲線を演算した。平行して、時間的制御を行い、測定した収縮に対する任意の人為的要因を取り除いた。その際、試験物質の代わりに担体(超純水Milli Q(登録商標))だけを加えた。厳密に言えば、同じプロトコールを他のタンクで実行し、そこでは、LDTを加えた。
【００４０】
データは、等尺性張力変換器GrassFT-03に接続しているMacLab 8Sシステムにてスキャンし、分析全体にわたって生じたミリニュートン(mN)の電圧変化を記録した。そして、デジタル化されたデータを、Chart 3.4/sソフトウエアプログラム(MacLab社、米国)によって分析した。薬理学的スクリーニングプロセスにおいて、使用したLDTの初期濃度は50nMであり、それをカットオフ濃度とみなしている。即ち、この濃度で効果がない物質は、この試験において調査しなかった。そして、対照的に効果があった物質は、より低い濃度(10又は2nM)で試験した(表2)。従って、アンタゴニストの存在及び非存在下においてアゴニストPEに対する濃度-反応曲線を構築することによって、最大有効パラメーター(Emax)と、Emaxの50%(EC50)を促進する濃度を決定することができる。これらの2つの条件(LDT有無)におけるEC50値の比率は、「濃度比率」(または、RC)と呼ばれる第3のパラメーターに合致する。一旦、これらのパラメーターが決定すると、シルト方程式(方程式1)を使用して、インビトロで競合的拮抗薬(KB)の見かけの親和性を算出することが可能になる(KENAKIN, Raven Press, New York. Pp :278-322, 1993)。
【００４１】
(方程式1)
【数１】
2015506358.tif 000005
CR =濃度比(EC'50/EC50)；[B] = 'B'アンタゴニスト濃度；KB =アンタゴニスト'B'の平衡解離定数。
【００４２】
データ分析及び統計処理
張力データを非線形回帰によって分析して、GraphPad Prismソフトウェア(バージョン4(米国))を使用して最大有効パラメーター(Emax)及びEmaxの50%(EC50)を促進する濃度を算出した。LDTを用いた治療の前後で得られた測定値間に有意な差があったか否か決定するために、5%のアルファリスク(P < 0.05の場合、差は有意であるとみなした)を考慮して、単一因子ANOVA試験を実施して、ニューマン-クールズ試験を行った。
【００４３】
前立腺に対する機能試験
等尺性収縮アッセイは、上記の通りに安楽死させた2.5-3月齢の雄ウィスターラットを使用して実行した。雄ラット腹側前立腺を、10mmのセグメントに切開して除去した。そして、各セグメントを、張力変換器(GRASS FT-03)に固定して、炭素混合物(95%のO2及び5%のCO2)を有する一定のエアレーション下で37℃に維持した9ml生理食塩水溶液を含むバット中に浸した。そして、セグメントに対して60分当たり10mNの前負荷をかけた。1μΜのフェニレフリン(PE)誘導収縮(α1アドレナリン受容体選択的アゴニスト)を実行した。そして、組織を回復させるために、試料を洗浄して1時間静置させた。3、10、50又は100nMのLDTを1時間インキュベーションした前後で、1μΜのプロプラノロール(β-アドレナリン受容体遮断薬)の存在下でフェニレフリン(10-8〜10-3M)に関する積算曲線を演算した。並行して、時間的制御を実行した。
【００４４】
データは、等尺性張力変換器GrassFT-03に接続しているMacLab 8Sシステムにてデジタル化して、分析全体にわたって生じたミリニュートン(mN)の電圧変化を記録した。そして、デジタル化されたデータを、Chart 3.4/sソフトウエアプログラム(MacLab社、米国)を用いて分析した。従って、アンタゴニストの存在及び非存在下においてアゴニストであるフェニレフリンに対する濃度-反応曲線を構築することによって、最大有効パラメーター(Emax)と、Emaxの50%(EC50)を促進する濃度を決定することができる。これらの2つの条件(LDT有無)におけるEC50値の比率は、「濃度比率」(または、RC)と呼ばれる第3のパラメーターである。このパラメーターが決定された後、シルト方程式を使用して、インビトロで競合的拮抗薬(KB)の見かけの親和性を算出することが可能であった(KENAKIN, Raven Press, New York. Pp :278-322, 1993)。
【００４５】
統計分析
測定値間に有意な差があったか否かを決定するために、5%のアルファリスク(P < 0.05の場合、差は有意であるとみなした)を考慮すると、ANOVA単一要因試験を実施して、ニューマン-クールズ試験を行った。
【００４６】
結合アッセイ(結合)
α1Aアドレナリン受容体
膜試料
以前の論文に記載されているプロトコールに従って、ラビット肝臓ホモジェネートから膜試料を得た。かかる膜試料は、アドレナリン受容体サブタイプα1Aが豊富である。上記の通りに取得した組織(〜30g)を、氷点下で解凍溶液(0.25Mのスクロース、1mMのEGTA及び5mMのトリス(pH 7.4))に浸漬して、自然解凍させた。そして、組織を、氷点下で肝臓をホモジナイズするための溶液(2mMのEDTA、100mMのNaCl及び50mMのトリス(pH 7.4))を含む、氷上のシャーレに移した。そして、最も繊維質な部分を外すように肝臓を慎重に切り取った。
【００４７】
そして、試料をビーカーに移して、Ultra-Turraxホモジナイザー(速度24,000回転数/分)を用いて、上記組織を、試料1部に対して溶液6部の割合で同じ緩衝溶液と共にホモジナイズした。試料を20秒間3回ホモジナイズして、合間では、溶液を1分間氷上に置いた。その後、ホモジナイズしたものを4℃で10分間、10,000×gで遠心して上清を取得し、そして4℃で40分間、80,000×gで超遠心してペレットを取得した。このペレットは、NaClを含まない緩衝溶液(1mMのEDTA及び50mMのトリス(pH 7.4))に再懸濁して、前と同じ条件で超遠心を行った。このステップで得られたペレットは、手動タイプのダウンス型ホモジナイザーを用いて、保存溶液(0.25Mのスクロース、1mMのEGTA及び5mMのトリス(pH 7.4))に再懸濁して、300μLのアリコートにして液体窒素で保存した。膜試料に関する全てのプロトコールにおいて、タンパク質用量は、LOWRY外(J. Biol. Chem. 193 (l) :265-275, 1951)の方法に従って行った。
【００４８】
α1Aアドレナリン受容体に対する[3H]-プラゾシンの結合
アッセイの標準化を論文の記載通りに行った。飽和試験にて、ネイティブα1A-アドレナリン受容体に対する[3H]-プラゾシンの結合を、種々の濃度の非放射性プラゾシン(10-10-10-7M)の存在及び非存在下で測定した。競合アッセイのために、350μLの中間溶液(0.16nMの[3H]-プラゾシン、1.6mMのEDTA、50mMのトリス(250℃でpH 7.4))を含む試験管に、種々の濃度の50μLのLDT(最終濃度10-9-10-4M)又は50μLの水(LDTの希釈のための溶媒で、総結合を決定するためのもの)又は10μΜの50μL非放射性プラゾシン(非特異的結合を決定するためのもので、最終濃度は1μΜ)と、50μL懸濁液に含まれる200μgのラビット肝臓の膜試料(α1A)を加え、最終量を500μLとした。アッセイは、同じものを３つ実行した。
【００４９】
両アッセイにおいて、膜試料を45分間0℃でインキュベートした。インキュベーション期間後、4mLの氷冷洗浄緩衝液(50mMのトリス-HCl、pH 7.4)を加えて反応を止めて、次にガラス繊維フィルター(GMF 3 Filtrak (登録商標))上で急速吸引濾過を行った。フィルターを真空下で4回、4mlの同じ溶液によって洗浄して、全ての遊離放射性リガンドを取り除いた。そして、フィルターを乾燥させて、5mlのシンチレーション流体(4%のPPO、トルエン中で0.1%のPOPOP w/v)が入っているバイアルに入れた。そして、フィルターに保持される放射活性は、液体シンチレーション計数器(Packard Tri-Carb 1600 TR)にて決定した。
【００５０】
α1Aアドレナリン受容体に対する[3H]-プラゾシンの特異的結合は、総結合と非特異的結合間の差として規定した。飽和実験によって得られたデータから、我々は、パラメーターKd(解離定数)(これは、受容体サイトが50%を占めるのに必要な放射性リガンドの濃度)及びBmax(結合サイトの最大密度であり、線形回帰によって計算した)を得ることができた。アイソトープ希釈として知られている製造方法において、結合値の増加は、非放射性リガンド(例えば、プラゾシン)を加えることにより得られた放射性リガンド(例えば[3H]-プラゾシン)の希釈係数(DF)を掛けて、結合放射性リガンド(fmol/mgタンパク質)の濃度に対して得られた値によって間接的に算出した。この手法は、放射性物質及び生物物質の消費量を少なくしつつも飽和曲線を得ることを目的とする。競合アッセイにより、我々は、放射性リガンドの特異的結合に関する阻害曲線を構築することが可能になった。LDT研究において競合薬剤の濃度を高く使用すればするほど、特定の受容体に対する競合が放射性リガンド-受容体複合体の形成をより減少させる。これは、液体シンチレーション計数器によって検出される、フィルターに保持された放射活性の漸進的な減少によって確認することができる。
【００５１】
これらの曲線から、50%の放射性リガンド結合(IC50)を阻害するLDTの濃度値を算出することが可能になった。これらの値は、Cheng-Prusoff方程式(方程式2)を使用して、Ki値(平衡時の競合解離定数又は阻害定数)に変換した。
【００５２】
(方程式2)
【数２】
2015506358.tif 000006
Ki =阻害定数；IC50 = 50%の放射性リガンド結合を阻害する濃度；[L] =  放射性リガンドの濃度；Kd =
(飽和アッセイにおいて測定された)リガンドの平衡解離定数。
【００５３】
α1Bアドレナリン受容体
膜試料
以前の論文に記載されているプロトコールに従って、ラット肝臓ホモジェネートから膜試料を得た。かかる膜試料は、アドレナリン受容体サブタイプα1Bが豊富である。上記の通りに取得した組織(4つのラット肝臓、〜30gに対応)は、ラビット肝臓に対するのと同じように解凍してホモジナイズし、穿孔した。得られたホモジナイズしたものを、4層のガーゼを通してろ過し、4℃で20分間、5,000×gで遠心して上清を取得し、そして4℃で60分間、100,000のx gで超遠心してペレットを取得した。このペレットは、、NaClを含まない緩衝液に再懸濁して、同じ条件下で更なる限外ろ過を行った。このステップで得られたペレットは、手動タイプのダウンス型ホモジナイザーを用いて、保存溶液(0.25Mのスクロース、1mMのEGTA TIIM及び5mMのトリス(pH 7.4))に再懸濁して、300μLのアリコートにして液体窒素で保存した。
【００５４】
α1Bアドレナリン受容体に対する[3H]-プラゾシンの結合
結合アッセイは、論文により、α1Aに対するアドレナリン受容体結合アッセイと同一方法でα1Bアドレナリン受容体に対して標準化した。即ち、飽和及び競合アッセイは、ラット肝臓からの膜試料に対して行った。このケースでは、様々な濃度のLDT(10-9-10-6M)を加え、50Μlの懸濁液を含む試験管当たり150gのタンパク質を使用した。
【００５５】
α2アドレナリン受容体及びムスカリン受容体
膜試料
以前の論文の記載の通り、ラット皮質の膜試料に対して行った。臓器は、試料1部に対して50mMのトリスHCl(4℃、pH 7.4)20部の割合で、各回30秒間を3回、合間では、溶液を1分間氷上に置くことで、モーターユニット(Fisatom)及びテフロンピストンを用いたポッターにてホモジナイズした。
【００５６】
そして、それを、4℃で10分、900x gで遠心してペレットを取得し、上記ペレットを氷冷50mMのトリス-HCl溶液(pH 7.4)に再懸濁して、同じ手法をもう一度行った。上清を、4℃で10分間、48,000x gで遠心してペレットを取得し、上記ペレットを試料1部に対して20部の50mMのトリスHCl(4℃、pH 7.4)の割合で再懸濁し、37℃で10分間インキュベートして、内因性神経伝達物質を取り除いた。最後に、4℃で10分間、48,000x gの遠心を2回行い、そして、最終ペレットを50mMのトリス-HCl(pH 7.4)溶液に再懸濁した。
【００５７】
α2及び5-HT2Aアドレナリン受容体
膜試料
以前の論文の記載の通り、ラット皮質の膜試料に対して行った。臓器は、1断片の試料に対して50mMのトリスHCl(4℃、pH 7.4)20部の割合で、各回30秒間を3回(合間では、溶液を1分間氷上に置くことが可能)、モーターユニット(Fisatom)及びテフロンピストンを用いたポッターにてホモジナイズした。
【００５８】
そして、それを、4℃で10分、900x gで遠心した。得られたペレットを、50mMのトリス-HCl(pH 7.4)冷溶液に再懸濁した。同じ手法をもう一度行った。上清を、4℃で10分間、48,000x gで遠心してペレットを取得し、上記ペレットを試料1部に対して20部の50mMのトリスHCl(4℃、pH 7.4)の割合で再懸濁し、内因性神経伝達物質を取り除くために37℃で10分間インキュベートした。最後に、4℃で10分間、48,000x gの遠心を2回以上行い、そして、最終ペレットを50mMのトリス-HCl(pH 7.4)溶液に再懸濁した。
【００５９】
α2アドレナリン受容体に対する[3H]RX821002の結合
α2A受容体に対する結合アッセイを以前の論文に記載されている通りに行い、飽和実験による実験にて予め標準化した。Kd及びBmaxの値は、それぞれ、2.05±0.28nM及び124±7fmol/mgタンパク質(n = 1)であった。50μLの50mM トリス-HCl中に含まれるラット皮質の150膜試料を、400μLの中間溶液(1.25nMの[3H] RX821002、50mMのトリス(37℃、pH 7.4))及び種々の濃度の50μLのLDT(LDT65-68について10-7-3x10-5Mの最終濃度)又は50μLの50mMのトリス-HCl(37℃、pH7.4)(LDTの希釈のための溶媒で、総結合を決定するためのもの)又は50μLの100μΜ非放射性酒石酸水素アドレナリン(非特異的結合を決定するためのもの)を含む試験管にて懸濁し(最終量500μL)、30℃、60分間インキュベートした。アッセイは、同じものを３つ実行した。
【００６０】
インキュベーション期間後、5mMのトリス(pH 7.4)を含む氷冷溶液4mLを加えて反応を止めて、次に0.5%ポリエチレンイミン溶液によって予め浸漬しておいたガラス繊維フィルター(GMF 3、Filtrak (登録商標))上で真空濾過を行った。フィルターを真空下で3回、5mMのトリス(pH 7.4)を含む4mLの氷冷溶液によって洗浄して、全ての遊離放射性リガンドを取り除いた。そして、フィルターを乾燥させて、5mlのシンチレーション流体(組成：4%のPPO、トルエン中で0.1%のPOPOP w/v)が入っているバイアルに入れた。そして、フィルターに保持される放射活性は、液体シンチレーション計数器(Packard Tri-Carb 1600 TR)にて決定した。α2Aアドレナリン受容体に対する[3H]RX821002の特異的結合は、総結合と非特異的結合間の差として規定した。これらの受容体に対して、IC50及びKiパラメーターを決定した。
【００６１】
ムスカリン受容体に対する[3H]-QNBの結合
ムスカリン受容体に関する結合アッセイは、論文に記載されている通りに行った(RICHARDS J Pharmacol 99, 753-761, 1990; CASTOLDI and cols., Life Sci. 78: 1915-1924, 2006)。150gのラット皮質の膜試料を、25℃で60分間、LTD誘導体(0.1-100μΜ)の存在及び非存在下において、50mMのトリス-HC1(4℃、pH 7.4)を含む媒体中に、0.1nMの放射性リガンド[3H]-QNBと共にインキュベートした。非特異的結合は、1μΜ硫酸アトロピンの存在下で決定した。アッセイは、同じものを３つ実行した。そして、フィルターに保持される放射活性は、液体シンチレーション計数器(Packard Tri-Carb 1600 TR)にて決定した。これらの受容体に対して、IC50及びKiパラメーターを決定した。
【００６２】
5-HT1A受容体
膜試料
ラット海馬の膜試料は、以前にHALL外(1985)及びPEROUTKA(1986)によって記載したものに従って行った。ホモジナイズ及び遠心ステップは、受容体α2A及び5-HT2A受容体について上述したものと同じように行った。
【００６３】
5-HT1A受容体に対する[3H]-8-OH-DPAT又は[3H]p-MPPFの結合
5-HT1A受容体に対する結合アッセイを以前の論文に記載されている通りに行い、飽和実験による実験にて予め標準化した。Kd及びBmaxの値は、それぞれ、0.7±0.1nM及び125±42fmol/mgタンパク質であった(Neves et al., Bioorg Med. Chem. 18 (5): 1925-1935, 2010)。50μLの50mM トリス-HClに含まれる50mgのラット海馬の膜試料を、400μlの中間溶液(1.25mMの[3H]-8-OH-DPAT、1.25mMのCaC12、1.25mMのMnC12、10μΜパージリン(モノアミンオキシダーゼ酵素(MAO)による放射性リガンドの分解の可能性を阻止するためのもの)、50mMのトリス(37℃でpH 7、4))と、更に、種々の濃度の50μL LDT(最終濃度は、LDT 2-6については10-10-10-6M、LDT 8については10-12-10-6M、そしてLTD 62-70及びLDT 39については10-9-10-4M)又は50μLの50mMトリス-HCL(37℃でpH 7.4)(LDTの希釈のための溶媒で、総結合を決定するためのもの)又は50μLの10μΜ非放射性セロトニン(非特異的結合を決定するためのもの)を含む試験管にて懸濁して(最終量500μL)、37℃、15分間インキュベートした。アッセイは、同じものを３つ実行した。あるいは、50μLの50mMトリス-HClに含まれる50μgのラット海馬の膜試料を、400Μlの中間溶液(0.625nMの[3H]p-MPPF、1.25のGTP及び50mMのトリス(37℃でpH 7.4))と、更に、種々の濃度の50μl LTD(最終濃度は、LDT 65-68については10-9-3×10-7M)又は50μLの50mMトリス-HCl(37℃でpH7.4)(LDTの希釈のための溶媒で、総結合を決定するためのもの)、そして[3H]8-OH-DPATの結合と同じように、50μLの10μM非放射性セロトニン(非特異的結合を決定するためのもの)を含む試験管にて懸濁して(最終量500μL)、37℃で45分間インキュベートした。アッセイは、同じものを３つ実行した。
【００６４】
インキュベーション期間後、5mMのトリス(pH 7.4)を含む4mLの氷冷溶液を加えて反応を止めて、次に0.5%ポリエチレンイミン溶液によって予め浸漬しておいたガラス繊維フィルター(GMF3、Filtrak(登録商標))上で真空濾過を行った。フィルターを真空下で3回、5mMのトリス(pH 7.4)を含む4mLの氷冷溶液によって洗浄し、全ての遊離放射性リガンドを取り除いた。そして、フィルターを乾燥させて、5mlのシンチレーション流体(組成：4%のPPO、トルエン中で0.1%のPOPOP w/p)が入っているバイアルに入れた。そして、フィルターに保持される放射活性は、液体シンチレーション計数器(Packard Tri-Carb 1600 TR)にて決定した。5-HT1A受容体に対する[3H]-8-OH-DPATの特異的結合は、総結合と非特異的結合間の差として規定した。これらの受容体に対して、IC50及びKiパラメーターを決定した。
【００６５】
天然5-HT1A受容体の内因活性
GTP存在は、GPCRを低親和性状態にさせる(Lahti et al, 1992)。物質の内因活性は、高親和性及び低親和性受容体の状態における物質の親和性を規定するのに適切なGPCRアゴニストまたはアンタゴニスト放射性リガンドを使用して、それぞれ、評価することができる。従って、5HT1A受容体におけるより有力な誘導体の内因活性を決定するために、高濃度GTP存在下における放射性リガンド([3H] p-MPPF)としてのアンタゴニスト(低Ki)、または、GTPの非存在下におけるアゴニスト([3H]8-OH-DPAT)(高Ki)を用いて、解離定数(Ki)を算出した。Ki比率(低Ki/高Ki)が1より著しく大きい値は作動作用を示す一方で、1に近い値は拮抗作用を示し、マイナスの値は逆作動作用を示す。
【００６６】
5-HT2A受容体に対する[3H]-ケタンセリン結合
5-HT2A受容体に関する結合アッセイは、論文で説明されている通りに実行した。以前の実験において得られたKd及びBmaxの値は、それぞれ、1.77±0.07nM及び348±51fmol/mgタンパク質であった。50μLのラット皮質の膜試料(150g)を400μL中間溶液(1.25nMの[3H]-ケタンセリン、125nMのプラゾシン、50mMのトリスHCl(37でpH 7.4)と、更に、種々の濃度の50μL LDT(最終濃度は、LDT2-4については10-10-10-4M、LDT5-8については10-8-10-4)又は50μLの50mMトリス-HCl(37℃でpH 7.4)(LDTの希釈のための溶媒で、総結合を決定するためのもの)又は50μLの10μΜ非放射性ケタンセリン(非特異的結合を決定するためのもの)を含む試験管にて懸濁して(最終量500μL)、37℃で15分間インキュベートした。アッセイは、同じものを３つ実行した。
【００６７】
インキュベーション期間後、5mMのトリス(pH 7.4)を含む氷冷溶液4mLを加えて反応を止めて、次に0.5%ポリエチレンイミン溶液によって予め浸漬しておいたガラス繊維フィルター(GMF 3、Filtrak (登録商標))上で真空濾過を行った。フィルターを真空下で3回、5mMのトリス(pH 7.4)を含む4mLの氷冷溶液によって洗浄して、全ての遊離放射性リガンドを取り除いた。そして、フィルターを乾燥させて、5mlのシンチレーション流体(組成：4%のPPO、トルエン中で0.1%のPOPOP w/v)が入っているバイアルに入れた。そして、フィルターに保持される放射活性は、液体シンチレーション計数器(Packard Tri-Carb 1600 TR)にて決定した。5-HT2A受容体に対する[3H]-ケタンセリンの特異的結合は、総結合と非特異的結合間の差として規定した。これらの受容体に対して、IC50及びKiパラメーターも決定した。
【００６８】
D2様受容体
膜試料
ラット線条体の膜試料(ドーパミン受容体の受容体D2-"様"-サブタイプ: D2、D3及びD4)は、論文の記述に従って行った(Niznik et al, Naunyn-Schmiedebergs Arch.. Pharmacol 329:333-343, 1985; Terai et al. Eur J Pharmacol 173:177, 1989; HAMDI et al, Life Sci 50, 1529-1534, 1992)。簡潔にいえば、臓器を、50mMのトリス-HCl、8mMのMgCl2、5mMのEDTA(4℃でpH 7.4)中でFisatomにて3回30秒間ホモジナイズして、そして48,000x gav(20分4℃)で遠心した。ペレットを、50mMのトリス-HCl、8mMのMgCl2、5mMのEDTA(37℃でpH 7.4)に再懸濁して、37℃で10分間インキュベートして、2回以上遠心した。最終ペレットは、1.5mL/g組織の濃度となるように同じ緩衝液にて再懸濁した。
【００６９】
D2様受容体結合アッセイ
D2様受容体結合アッセイは、我々のグループが記述した通りに行った(Neves et al., Bioorg. Med. 18 (5), 1925-1935, 2010)。50μgのラット線条体膜を、LTD(0,003-30μΜ)の存在又は非存在下において0.1nMのアンタゴニスト放射性リガンド[3H]-YM 09151-2、120mMのNaCl、5mmのKCl、5mMのMgC12、1.5mMのCaC12、lmMのEDTA及び50mMのトリス-HCl(25℃でpH 7.2)を含む媒体中で、37℃で60分間インキュベートした。非特異的結合は、30μΜのスルピリド存在下で測定した。アッセイは、同じものを３つ実行した。
【００７０】
そして、フィルターに保持される放射活性は、液体シンチレーション計数器(Packard Tri-Carb 1600 TR)にて決定した。これらの受容体に対して、IC50及びKiパラメーターも決定した。
【００７１】
タンパク質用量
サンプルのタンパク量の用量は、論文に従って行い、マイクロタイタープレート(96ウエルプレート)比色法の改良版を企画した。検量線を構築するために、タンパク質ウシ血清アルブミン(BSA)を50、100、200、250、350μg/mLの濃度で使用した。試験下では50μLのタンパク質パターン又は50μLの薄いタンパク質サンプルを、50μLの水、0.1NのNaOH、1%の硫酸第二銅及び2%の酒石酸カリウムナトリウムを含有する250μLの2%炭酸二ナトリウムを含む各ウェルに加えた(白)。最後に、15μLのフォリンを各ウェルに加えて、マルチチャネルピペットを用いて混合した。プレートを、最初のウェルのホモジナイズから、室温で45分間インキュベートした。吸光度の値は、700nmに等しい波長でのプレート分光光度計にて取得した。実験は、2つの異なる希釈係数を使用して、同じものを３つ実行した。サンプルのタンパク量の算出は、吸光度対タンパク質濃度の検量線の値を使用して内挿法によって行った。これは、GraphPad Prism 4.0プログラムを用いた直線回帰によって解析した。値は、mgタンパク質/mlホモジネートと表現する。
【００７２】
データ分析及び統計処理
結合アッセイにおいて得られたデータは、競合曲線のパラメーター、IC50及び飽和曲線(例えばKd及びBmax)を算出するためにGraphPad Prismソフトウェア(米国)を使用して非線形回帰によって分析した。特に、α1A及びα1Bアドレナリン受容体の飽和実験については、1又は2つの結合部位を、F検定を通じて最適なもの1つ選択することによってテストした(DE LEAN et al., Mol Pharmacol. 21 (l) :5 it, 1982)。従って、サイトモデル関して2つの対向サイトモデルを前提とすることによって誤差の平方和が非常に下がる場合、第一モデルを用いてプラゾシンのKd値の評価が得られる。一方では、第二サイトを加えたときに向上が有意でない場合、単一のKd値が得られた。
【００７３】
実験群間の差を、単一因子分散分析(一元配置ANOVA)によって分析し、次にニューマン-クールズのポストホックテスト(3以上のグループ)をP < 0.05の両方のケースで考慮した。
【００７４】
細胞増殖のインビトロ試験
ヒト前立腺の癌細胞(DU-145)を、重なるまで培地(RPMI 1640)で培養した。そして、細胞を解離させて、プレートに蒔いて(5×103細胞/ウェル)、ウシ胎児血清フリーの培地に24時間維持した。そして、細胞を、LTD(5、50又は500nM)の存在又は非存在下において、48時間、5-HT(1μΜ)又はフェニレフリン(3μΜ)と共に維持して処理した。細胞増殖は、MTT技術を用いて評価した(MOSMANN, T. Immunol Methods. 16;65 (1 -2 ) :55-63, 1983)。
【００７５】
急性毒性試験
スイスマウス(雌、25-30g、条件当たり6匹の動物)に、腹腔を介して100μg/kgのLTDをLDT処置して、記載の方法による行動枠組み内で14日間観察した(LORKE, D., Arch Toxicol, 54 (4):. 275 - 87, 1983を改良)。温度は、記載の処置の前後30分と60分に直腸プローブで測定した。
【００７６】
ラット大動脈におけるフェニレフリン誘導収縮阻害
SCOFIELD外(J. Pharmacol Exp Ther 275:. 1035-1042, 1995)及びTESTA外(Life Sci 57 (13). P1159-63, 1995)によれば、ラット胸部大動脈は、主にα1D-アドレナリン受容体を発現している組織に対応し、加えて、セロトニン受容体サブタイプ5-HT2Aが豊富である(Banes et al, J. Pharmacol Exp Ther 291:.. 1179-1187, 1999)。このことに鑑み、単離した臓器モデルにおける収縮の機能試験は、これらの組織を使用して行った。インキュベーションバスに加えても、等尺性張力のベースラインを変えるLDT(50mM)は1つもなかった。従って、この濃度においては、血管収縮作用を伴う、受容体に対する支配的アゴニスト効果(例えばα1-アドレナリン受容体とセロトニン(5-HT2A))の可能性が排除された。測定された収縮に対する任意の人為的要因を排除することを目的とするために、時間制御を行い、他のバットにLDTに加えたのと同じプロトコールに厳密に従って担体(超高純度のミリQ(登録商標)水)だけを被験物質がある場所に加えた（図１）。
【００７７】
我々は、50nMのBMY7378 (ポジティブコントロールとして使用するα1Dアドレナリン受容体アンタゴニスト)を用いたの実験を行い、KB=2.95nMの値を得た。これは論文(CARROLL et al, Bioorg Med Chem Lett, 11:1119 - 1121, 2001)と一致している。一連のLDT2-6及び8内において、LDT6以外の全ての物質は、FEによって誘導される収縮を低下させ、また、FEに対する濃度-反応曲線の右へのシフトを誘導し、CE50(CR)の割合によって定量化された。従って、データから、LDT6を除く試験した全ての誘導体に対して1α1Dアドレナリン作用性アンタゴニスト効果を示している。その後、アンタゴニストの見かけの親和性を算出した(表1)。第二実験条件(10nMのLDT)は、LDT5及び8又は2nM(LDT 245)に関してのみ行ない、シルト方程式から算出される親和性(KB)を決定した。LDT6を除く完全な一連のLDT2-8は、α1Dアドレナリン受容体に対して大きな親和性を示した。BMY7378(KB=2.95 nM)と比較すると、この受容体の親和性は、LDT誘導体5及び8よりも大きい(それぞれ、KB=0.57及び0.16、* P < 0.05)。
【００７８】
他の誘導体LDT62-70及び39に関して、フェニレフリンに対する全ての濃度-反応曲線は、LDTの存在下で、標準曲線と比較して標準的な右シフトを受け、EC50(CR)の割合で定量化した(表4)。このように、競合的アンタゴニストとして作用した。アンタゴニストであるN-フェニルピペラジンの中で、位置R1(LDT63-68)に結合したアルキル鎖を変化させて、LDT62誘導体とそれらを比較すると、LDT66及びLDT67誘導体に対するα1D-アドレナリン受容体による相対的親和性(KB)が有意に増加した(表2)。アルキル鎖は、それぞれ、6から7つの炭素の範囲があり、疎水性相互作用がアドレナリン受容体のこのサブタイプにおいて分子認識にとって重要であることを示している。これは、αアドレナリン受容体に対するN-フェニルピペラジン又はオルト-メトキシフェニルピペラジンの親和性を決定する際の疎水力の重要な役割を記載する論文と一致している。
【００７９】
LDT69での疎水性の増加は、エトキシ基によるR2(R2は、メトキシル)置換によるものと仮定すると、LDT62と比較してα1D-アドレナリン受容体に対する親和性を変化させなかった。更に、親水基の包含、水素結合のドナー及びアクセプター又はLDT70及びLDT39について観察されるR2欠損の置換基は、それぞれ、α1D-アドレナリン受容体による親和性を低下させる。α1Dアドレナリン受容体に対するLDT66-68の親和性の範囲は、他のアンタゴニスト(例えばN-フェニルピペラジンBMY7378及びナフトピジル)に関して報告された親和性に等しい
【００８０】
表1:α1Dアドレナリン受容体によるLDT(2-6、8、245)及びBMY7378の親和性
【表１】
2015506358.tif 000007
2015506358.tif 000008
KB値は、50nM、b 10nM又はc 2nMでのLDT又はBMY7378の存在下における機能的実験から個々に算出して取得した。
CR(LDTの存在及び非存在下におけるEC50間の割合)は、非線形回帰分析法で得られたEC50から算出されたCRの平均値である。
*P < 0.05  BMY7378との比較による(単一因子ANOVAに続くニューマン-クールズ試験)。
【００８１】
表2：α1Dアドレナリン受容体によるLTD(62-70及び39)の親和性
【表２】
2015506358.tif 000009
KB値は、50nMのLTD(LTD62-69)又は10μMのLTD(LTD70及び39)の存在下において機能的試験から個々に算出して取得した。
CR(LTDの存在及び非存在下におけるEC50間の割合)は、非線形回帰分析法によって得られたEC50から算出されたCRの中央値である。
a P < 0.001及びb P < 0.01  LTD62との比較による(単一因子ANOVAに続くニューマン-クールズ試験)。
【００８２】
結合アッセイ(結合)
アドレナリン受容体α1A及びα1B  -  [3H]-プラゾシン結合のパーセンテージ
最初に、ラビット及びラット肝臓試料の飽和アッセイを行って[3H]-プラゾシンの結合パラメーターを決定した。分析後アドレナリン受容体α1Aに関して、1又は2の特異的結合部位に対する放射性リガンドの結合を検討し、2-サイトモデルを考慮して最もフィットする曲線を取得した。この場合、α1Lタイプに対応する高親和性サイトと第二低親和性サイトを有する。α1Lの存在、性質及び機能は論文中で議論されている。一方、α1Bアドレナリン受容体に関しては、一つの結合サイトモデルが最もフィットする。非放射性プラゾシンを競合薬剤として用いることによって、0.1nMの[3H]-プラゾシンに対する競合曲線を標準化した。従って、競合曲線は、ラビット肝臓試料において二相性であり、0.1nMの[3H]-プラゾシンによってレベルされたサイトの2/3がプラゾシンに対して高い親和性サイト(CI50 = 0.16nM)であり、1/3は低親和性サイト(CI50 1nM)であった。
【００８３】
α1Aアドレナリン受容体に対する[3H]-プラゾシンのKd値は、高親和性及び低親和性を有するサイトに対して、それぞれ0.46nM及び56.5nMであり(n=3)、α1Bアドレナリン受容体に関して、Kd値は、0,34nMであり(n=3)、論文(SHIBATA and cols., Mol. Pharmacol., 48:250-258, 1995)と一致していた。LDTに関して、試験した一連のものの全ては、競合アッセイにおいて[3H]-プラゾシンの特異的結合を阻害することができた。
【００８４】
LTDのKiの算出のために、Cheng-Prusoff方程式を用いた。プラゾシン(PZS)に関して、Kd値は、α1Aアドレナリン受容体に対する高親和性及び低親和性サイトに関して、それぞれ0.46nM及び56.5nMであり、α1B-アドレナリン受容体についてはKd =0.34nMを用いた。得られたKi値は、下記の表3〜5にまとめている。
【００８５】
表3：α1A-アドレナリン受容体のLDT(2-6及び8)の薬理学的パラメーター
【表３】
2015506358.tif 000010
a CI50値を、GraphPad Prismソフトウェア(米国)を用いた非線形回帰によって算出して平均±EPMとして表した。
b Ki値は、Cheng-Prusoff方程式を使用して算出した。
P < 0.05  PZSとの比較による(単一因子ANOVAに続くニューマン-クールズ試験)。
【００８６】
表4：LDT(2-6、8)α1Bアドレナリン受容体の薬理学的パラメーター
【表４】
2015506358.tif 000011
a CI50値を、GraphPad Prismソフトウェア(米国)を用いた非線形回帰によって算出して、平均±EPMとして表した。
b Ki値は、Cheng-Prusoff方程式を使用して算出した。
【００８７】
表5：α1A及びα1Bアドレナリン受容体におけるLDT(62-70及び39)の薬理学的パラメーター
【表５】
2015506358.tif 000012
a CI50値を、GraphPad Prismソフトウェア(米国)を用いた非線形回帰によって算出して、平均±EPMとして表した。
b Ki値は、Cheng-Prusoff方程式を用いて算出した。
P < 0.01  LTD62との比較による(単一因子ANOVAに続くニューマン-クールズ試験)。
【００８８】
全てのLDT2-8グループは、2つの結合部位を識別する能力の他に、プラゾシンで観察されたものと類似の高親和性成分(α1A)に対してナノモル範囲のKi値を示した(表3)。α1Aアドレナリン受容体に対する誘導体LDT65からLDT69の親和性は、LDT62と比較して増加していた。LDT66、LDT68及びLDT69誘導体(それぞれ、43、38及び33nMに等しいKi)は、LDT62(Ki=261nM)よりも6〜8倍高い親和性(P < 0.01)を示した(表5)。LDT65及びLDT67は、LDT62と比較して3から4倍小さいKi値(それぞれ、67及び81nM)を有するが、この親和性の増加は有意ではなかった(P = 0.06(LDT65)及び0.1(LDT67))。LDT62及びLDT63誘導体間に親和性の差はなかった。LDT64、LDT39及びLDT70。アドレナリン受容体α1Bに関しては、同様に、他のもの、特にナノモル範囲のLDT8と比較すると、LDT6に関する親和性プロファイルがμΜ範囲で低かったが、差は有意ではなかった。従って、我々は、LDT6において観察されるオウクスフォリック(auxophoric)置換がα1 B/Dアドレナリン受容体サブタイプに関する見かけの親和性の向上に関与しないということを明らかにした。
【００８９】
LDT62-70及びLDT39誘導体は、α1A及びα1D受容体との関係でα1B-アドレナリン受容体に対する親和性が低い。いずれの構造的変化でも親和性を著しく変化させることがなかったが、LDT65誘導体からのアルキル鎖の増加に関連して親和性が増加するようである。更に、R2フェニルピペラジンサブユニット位置におけるエトキシ基がLDT69に存在すると(LDT8にも観察される)、同じ標準的親和性である受容体α1Aを用いてLDT62のメトキシルと比較すると、相互作用はより大きくなるが程度は小さい。Mokrosz外(1997)は、LDT66及び68だけがα1-アドレナリン受容体のリガンドであることを発見したが、それらの親和性は決定されなかった。従って、我々は、LDTがどのようなα1-アドレナリン受容体サブタイプと特異的に結合するか、そしてこれらのサブタイプにおける内因活性が何であるかを評価する。α1Dアドレナリン受容体に関しては、良好なサイズのアルキル鎖との疎水性相互作用が受容体α1Aの分子認識の重要な要件のようである。理由は、親和性(表6)がLDT66及びLDT68誘導体(それぞれ、6つ及び8つの炭素を有するアルキル鎖を有する)に対して著しく高かったためである。
【００９０】
アルキル鎖のサイズが増加したLTD、より具体的にはLDT65-68誘導体、最も強力であるLDT66及び68は、臨床用途の大部分の薬に示される親和性の範囲内にあり、それらにBPHの症状の緩和だけでなくα1Aアドレナリン受容体拮抗作用を経た前立腺組織の増殖阻害にも有効な可能性がある新規な潜在的二重α1アドレナリン受容体アンタゴニスト(α1A及びα1d)である。
【００９１】
Α2A受容体  -  [3H]RX821002の結合パーセンテージ
以前、我々のグループは、ラット皮質の飽和アッセイを行い、α2Α受容体に対する[3H] RX821002の結合パラメーター(Kd=2.05±0.28nM及びBmax=124±7fmolタンパク質/mg)を決定した。このKd値を使用し、Cheng-Prusoff方程式を用いてLDTのKiを算出した。
【００９２】
競合アッセイ間、LDT65-68では、α2Aアドレナリン受容体に対する[3H] RX821002の特異的結合を阻害することが可能であったが、親和性はより低いものであり(μΜ範囲、表5)、α1Α/1Dアドレナリン受容体に関するアドレナリン受容体α-1Bも同様であった。これらの物質がこの受容体に対して親和性が低いという事実は、α2Aアドレナリン受容体サブタイプ間のホモロジーが高いということに重要である。従って、試験したLDTは、中枢神経、心血管及び雄の泌尿生殖系を、これらの系でのカテコールアミンの解放を阻害することによって調整することに関与するこのα2Aアドレナリン受容体に対して僅かな遮断作用を示しそうである。
【００９３】
表6：α2A受容体に対するLDT(65-68)の薬理学的パラメーター。
【表６】
2015506358.tif 000013
IC50値を、GraphPad Prismソフトウェア(米国)を用いて非線形回帰によって算出して、個々の実験の平均±EPMとして表した。
Ki値は、Cheng-Prusoff方程式を用いて算出した。
【００９４】
5-HT1A受容体-[3H]-8-OH-DPATの結合パーセンテージ
5-HT1A受容体が豊富な組織である海馬ラットの飽和研究を行って、[3H]-8-OH-DPATの結合パラメーター(Kd=0.7nM±0.1nM及びBmax=125±42fmol/mgタンパク質、n=3)を決定した。これは、論文(Neves et al, Bioorg Med Chem 18 (5): 1925-1935, 2010)と一致している。このKd値を使用してCheng-Prusoff方程式を用いてLDTのKiを算出した。得られたKi値は、以下の表7及び8にまとめた。競合アッセイにおいて、全ての試験範囲は、[3H]-8-OH-DPATの特異的結合を阻害することが可能であった。この受容体において、最も顕著な誘導体がLDT8であった。これは、その他のものと比較して非常に高い親和性(Ki=23.7pM)を示した。その範囲にある他の全ての成分は、全てナノモル範囲の高い親和性を有していたが、顕著に低い親和性であった。
【００９５】
LDT62(Ki=147nM)と比較して、LTD65-68は、8-29倍親和性が高い(それぞれ、Ki(nM) 18、5、18及び9、 P < 0.05)。一方で、LDT63、LDT64、LDT69、LDT70及びLDT39には、類似の親和性があり、Kiの値とLDT62の値と間の統計的に有意な差がない(P > 0.05)(表8)。
【００９６】
表7：5-HT1A受容体に対するLDT(2-6、8、245)の薬理学的パラメーター。
【表７】
2015506358.tif 000014
a IC50値を、GraphPad Prismソフトウェア(米国)を用いて非線形回帰によって算出して、平均±EPMとして表した。
b Ki値は、Cheng-Prusoff方程式を用いて算出した。
* P < 0.01及び** P < 0.001  LDT8との比較による(単一因子ANOVAに続くニューマン-クールズ試験)。
【００９７】
表8：5-HT1Aに対するLDT(62-70、39)薬理学的パラメーター。
【表８】
2015506358.tif 000015
IC50値を、GraphPad Prismソフトウェア(米国)を用いて非線形回帰によって算出して、平均±EPMとして表した。
Ki値は、Cheng-Prusoff方程式を用いて算出した。
a P < 0.001、b P <0.01及びc p < 0.05  LDT62との比較による(単一因子ANOVAに続くニューマン-クールズ試験)。
【００９８】
5-HT1A受容体に対する別の競合アッセイにおいて、LDT65-68は、nM範囲の親和性を有するアンタゴニスト[3H]p-MPPFと、アゴニスト[3H]-8-OH-DPATとの特異的結合が可能であった。低親和性及び高親和性の受容体状態に対するKi値の比率(それぞれ、アゴニストとアンタゴニストによる)は、ほぼ1を示す(表9)ことから、これらの4つの誘導体は5-HT1A受容体のアンタゴニストとして作用することを示唆しており、BPHで生じる前立腺組織の増殖阻害に有効となり得る。
【００９９】
表9：5-HT1A受容体におけるLDT 65-68の内因活性評価
【表９】
2015506358.tif 000016
Ki値は、ラット海馬膜試料において、GTP存在下におけるアンタゴニスト放射性リガンド[3H] p-MPPF(低Ki)及びアゴニスト放射性リガンド[3H] 8-OH-DPAT(高Ki)との競合実験を用いて算出した。
低親和性及び高親和性の受容体状態に対するKiの比率は、内因活性の評価である。
【０１００】
5-HT2A-[3H]-ケタンセリンの結合パーセンテージ
以前、我々のグループは、5-HT2A受容体が豊富な組織であるラット皮質での飽和アッセイを行った(Neves et al., Bioorg. Med. Chem. 18 (5): 1925-1935, 2010)。決定した[3H]-ケタンセリンの結合パラメーター：Kd=1.77±0.07nM及びBmax=348±51fmol/mgタンパク質、n=2。
【０１０１】
このKd値は、Cheng-Prusoff方程式(Cheng & Prusoff, Biochem. Pharmacol. 22:3099-3108, 1973)を用いたLDTのKi算出のために使用した。得られたKi値は、以下の表10及び11にまとめている。試験された全ての範囲での競合アッセイでは、[3H]-ケタンセリンの特異的結合を阻害することが可能であった。
【０１０２】
表10：LDT(2-6及び8)と5-HT2A受容体との薬理学的パラメーター
【表１０】
2015506358.tif 000017
a IC50値を、GraphPad Prismソフトウェア(米国)を用いた非線形回帰によって算出して、平均±EPMとして表した。
b Ki値は、Cheng-Prusoff方程式を用いて算出した。
【０１０３】
表11：5-HT2A受容体に対するLDT(62-70、39)の薬理学的パラメーター
【表１１】
2015506358.tif 000018
CI50値を、GraphPad Prismソフトウェア(米国)を用いた非線形回帰によって算出して、平均±EPMとして表した。
Ki値は、Cheng-Prusoff方程式を用いて算出した。
a P < 0.001、b P <0.05  LDT62との比較による(単一因子ANOVAに続くニューマン-クールズ)。
【０１０４】
5-HT1A受容体に対して観察されたのと違って、LDT62(P < 0.05)より6倍低い低親和性を有する非常に低い親和性のLDT70以外は、大部分のLDT間の親和性に殆ど差がない(差は、Ki値間で20倍を超えない)。一般に、全ての試験受容体に対するLDT2-6及び8、LTD62-70及びLDT39の親和性と比較すると、5-HT2A受容体に対して観察される親和性は、α2Aアドレナリン受容体と関係するLDT65誘導体で生じるのが最も小さい。
【０１０５】
α2A受容体  -  [3H]RX821002の結合パーセンテージ
競合アッセイにおいて、LDTはα2Aアドレナリン受容体に対する[3H]-RX821002の特異的結合を阻害することが可能であるが、親和性はより低いものであった(μΜ範囲、表12)。これらの物質がこの受容体に対して親和性が低いという事実は、α2Aアドレナリン受容体サブタイプ間のホモロジーが高いということに重要である。従って、試験したLDTは、中枢神経、心血管及び雄の泌尿生殖系を、これらの系でのカテコールアミンの解放を阻害することによって調整することに関与するこのα2Aアドレナリン受容体に対して僅かな遮断作用を示しそうであるため、副作用の可能性が低下する。
【０１０６】
表12：α2A受容体に対するLDTの薬理学的パラメーター
【表１２】
2015506358.tif 000019
CI50値を、GraphPad Prismソフトウェア(米国)を用いた非線形回帰によって算出して、個々の実験の平均±EPMとして表した。
Ki値は、Cheng-Prusoff方程式を用いて算出した。
【０１０７】
5-HT1A受容体-内因活性
低親和性及び高親和性の受容体状態に対するKi値の比率(それぞれ、アンタゴニストとアゴニストによる)は、LDT3及び8に関してほぼ1を示す(表13)ことから、これらの誘導体は、5-HT1Aアンタゴニスト受容体であることを示唆している。従って、これらは、BPHで生じる前立腺組織の増殖阻害に有効となり得る。
【０１０８】
表13：5-HT1A受容体に対するLDTの内因活性評価
【表１３】
2015506358.tif 000020
Ki値は、ラット海馬膜試料において、GTP存在下におけるアンタゴニスト放射性リガンド[3H] p-MPPF(低Ki)及びアゴニスト放射性リガンド[3H] 8-OH-DPAT(高Ki)との競合実験を用いて算出した。
CI =信頼区間。
5-HTは、ポジティブコントロールとして使用。
* 1.0からの差(P < 0.05、スチューデントt検定)
【０１０９】
BPH治療における他の非受容体標的
受容体を結合させたGタンパク質は、選択的リガンドを得るのが困難な構造的な類似点を有する(Oldham & Hamm, Nature 9:60-71, 2008を見直した)。加えて、当該疾患に関して対象外の受容体を遮断することは、副作用の可能性を高めることに関わる。従って、α2アドレナリン受容体(本テキストで既に表している(表12))に加えて、我々は、ムスカリン及びドーパミンD2受容体に対するLDTの作用に関する調査も行った。全てのLDTは、これらの受容体に対して低い親和性を示し、特に、標的受容体(即ち、α1A、α1Dアドレナリン受容体及び5-HTIA受容体)に関してマイクロモル範囲のKiを有するLDT3及びLDT5に対して低い親和性を示した(表14及び15)。従って、これらのLDTは、副作用の傾向がほとんどない。
【０１１０】
表14：ムスカリン受容体に対するLDTの薬理学的パラメーター
【表１４】
2015506358.tif 000021
IC50値を、GraphPad Prismソフトウェア(米国)を用いた非線形回帰によって算出して、個々の実験の平均±EPMとして表した。
Ki値は、Cheng-Prusoff方程式を用いて算出した。
【０１１１】
表15：D2ドーパミン受容体に対するLDTの薬理学的パラメーター
【表１５】
2015506358.tif 000022
IC50値を、GraphPad Prismソフトウェア(米国)を用いた非線形回帰によって算出して、個々の実験の平均±EPMとして表した。
Ki値は、Cheng-Prusoff方程式を用いて算出した。
【０１１２】
インビトロでのヒト前立腺細胞を用いた増殖アッセイ
論文データは、α1Aアドレナリン受容体、α1Dアドレナリン受容体及び5HT1A受容体を発現している前立腺細胞を示しており、α1Dアドレナリン受容体及び5HT1A受容体は細胞増殖に関係がある(DIZEYI et al Prostate 59 (3):328-336, 2004; KOJIMA and cols., Prostate 66:761-767, 2006)。これらのモデルにおいて、タムスロシンは細胞増殖を阻害しない(DIZEYI et al. Prostate 59 (3) :328-336, 2004)。
【０１１３】
我々のデータ分析からは、インビトロでナノモル濃度の範囲で使用したLDTが腫瘍発生ヒト前立腺細胞の刺激を阻害することが示されている。特に、LDT3(50nM)及びLDT66(20nM)は、α1D受容体及び5-HT1A受容体刺激に逆らって効果を阻害した(表16)。
【０１１４】
表16：ヒト前立腺細胞のインビトロ増殖に対するLDTの効果
【表１６】
2015506358.tif 000023
5-HT(1μΜ)及びフェニレフリン(3μΜ)を、α1D受容体及び5-HT1A受容体を刺激するのに用いた。
BMY7378(50nM)及びp-MMPF(50nM)は、α1D受容体及び5-HT1A受容体の選択的アンタゴニストであり、ポジティブコントロールとして使用した。
実験は、5回行った。N=3。
a フェニレフリンに関する条件；b 5-HTに関する条件。
a,b P <0.05は、それぞれ、フェニレフリン及び5-HTに対する。ND=未決定。
【０１１５】
急性毒性研究に関するテスト
使用される用量(100mg/kgのip)において、この種の研究の常用量よりも10倍高いが、動物は死なずまた温度変化もなかった(n=6動物/条件)(表17)。
【０１１６】
表17：体温に対するLDTの影響評価
【表１７】
2015506358.tif 000024
中央レベルでの受容体遮断は、表8にて説明したように、症状を引き起こす可能性があった。表8に記載されているパラメーターを考慮すると、LDT(100mg/kgのip)のいずれも14日目に影響を及ぼさなかったことから、急性毒性は無視し得る。重要な点は、非標的受容体(表2、4及び5)によるLDTの親和性低下は、副作用が観察されないことに寄与している(表9)。
【０１１７】
表18：受容体が結合したGタンパク質の中心遮断から生じる副作用
【表１８】
2015506358.tif 000025
【０１１８】
表19：LDTでの治療後の14日間に評価した行動パラメーター
【表１９】
2015506358.tif 000026
【図１】
2015506358.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成26年9月8日(2014.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の分子式：
【化４】
2015506358.tif 000037
【化５】
2015506358.tif 000038
【化６】
2015506358.tif 000039
を有する、α1Aアドレナリン受容体及びα1Dアドレナリン受容体並びに5-HT1A受容体と高い親和性を有する2-アルコキシフェニルピペラジン誘導体。
【請求項２】
以下の分子式：
【化７】
2015506358.tif 000040
【化８】
2015506358.tif 000041
【化９】
2015506358.tif 000042
を含む、α1Aアドレナリン受容体、α1Dアドレナリン受容体及び5-HT1A受容体リガンド。
【請求項３】
良性前立腺肥大症及び下部尿路症状の治療、加えて前立腺抗増殖効果のための医薬組成物であって、
医薬的に許容可能な担体と、α1A/Dアドレナリン受容体及び5-HT1A受容体に高い親和性を有する少なくとも一つのN-フェニルピペラジン誘導体と、を有する、医薬組成物。
【請求項４】
α1A/Dアドレナリン受容体及び5-HT1A受容体に高い親和性を有する前記N-フェニルピペラジン誘導体は、以下の
【化１０】
2015506358.tif 000043
【化１１】
2015506358.tif 000044
【化１２】
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を含む群から選択される、請求項3に記載の組成物。
【国際調査報告】
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2015506358.tif 000048
2015506358.tif 000049
2015506358.tif 000050
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