(57)【要約】  本発明は、天然又はペグ化されたタム・ホースフォール糖タンパク質および薬学的に許容され得る賦形剤を含む、腫瘍の発達を阻害するための医薬組成物、治療方法および使用に関する。
2015506973.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然又はペグ化されたタム・ホースフォール糖タンパク質および薬学的に許容され得る賦形剤を含む、腫瘍の発達を阻害するための医薬組成物。
【請求項２】
非経口的に哺乳動物に天然またはペグ化ヒトタム・ホースフォールタンパク質の有効量および薬理学的に許容される賦形剤を含む組成物を投与することを含む、哺乳動物における腫瘍の発達を阻害するための治療の治療方法。
【請求項３】
非経口的に哺乳動物に天然またはペグ化ヒトタム・ホースフォールタンパク質の有効量および薬理学的に許容される賦形剤を含む組成物を投与することを含む、哺乳動物における先天的免疫応答を増加させるための治療の治療方法。
【請求項４】
哺乳動物における腫瘍の発達を阻害するための組成物を調製するための、天然又はペグ化タム・ホースフォール糖タンパク質の使用。
【請求項５】
哺乳動物における先天的免疫応答を増加させるための組成物を調製するための、天然又はペグ化タム・ホースフォール糖タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、THP（ヒト尿中タム・ホースフォール糖タンパク質）（UniProtKB / Swiuss-Prot P07911）（THP）の使用およびタム・ホースフォール糖タンパク質を用いた腫瘍の発達を阻害するための治療方法に関する。
【０００２】
腫瘍および感染症に対する抵抗性を改善する能力は、本出願に報告されている。
【０００３】
高度に精製されたヒト尿タンパク質であって、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で均質なものが使用される。タンパク質の同定は、分子量決定、タンパク質画分のアミノ酸配列決定、および酵素結合したイムノアッセイによって行われる。
【０００４】
THPは、hCGまたはhMG生産の副生成物（THP-hCG、THP-hMG）として得られた。使用バイアルは凍結乾燥したタンパク質4,8mg、ラクトース200mg、およびトリスベース50mgを含む。
【０００５】
製品は、発熱物質を含まない白色の粉末である。タンパク質の分子量は約90kDaである。タンパク質のペグ化形態も試験した。
【０００６】
得られた医薬組成物（バイアル）は、非経口的に投与される。
【０００７】
THPの以前の治療上の使用は知られていない。
【背景技術】
【０００８】
タム・ホースフォール糖タンパク質（THP）はまたTHPとしても知られ、ヒトにおいてUMOD遺伝子によってコードされる糖タンパク質である。ＴＨＰは150mg/日まで尿中に排泄され、正常な尿における最も豊富なタンパク質になっている。
【０００９】
THPは、GPIアンカー型糖タンパク質である。これは、血漿に由来せず、哺乳動物の腎臓のヘンレ係蹄の太い上行脚によって産生される。単量体分子は、約90kDaのMWを有しているが、それは生理的には数百万Daのまでの大きな凝集体で尿中に存在している。このタンパク質は、低pHで濃縮されると、ゲルを形成する。タム・ホースフォールタンパク質は、哺乳動物の尿中に非常に豊富なタンパク質である。それは、尿細管細胞の分泌に由来する、尿のキャストのマトリックスである。
【００１０】
Weichhart, T., Zlabinger, GJ, および Saemann, M D., (The multiple functions of Tamm-Horsfall protein in human health and disease: A Mistery Clears Up, Wien Klin Wochenschr, 117, 316-322, 2005) および Tsai-Hung, W, Song-Chou, H, Chih-Yao, Y, Yi-Fang, L, Chang-Youh, T, Chia-Li, Y (Intact protein core structure is essential for protein binding, mononuclear cell proliferating, and neutrophil phagocytosis-enhancing activities of normal human Urinary Tamm-Horsfall glycoprotein, Intern. Immunopharmacology, 8, 90-99, 2008)の出版物は、タム・ホースフォールタンパク質の免疫賦活効果を示している。
【００１１】
米国特許4977244は、85キロダルトンの分子量を有する糖タンパク質、THPを製造する方法に関する。この粗尿から単離される糖タンパク質、ならびにその炭水化物誘導体は、免疫抑制剤または抗炎症剤として有用である。米国特許6110688は、タム・ホースフォール糖タンパク質またはTHPの精製方法、それらの精製物および両者の識別を行うための方法に言及している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許4977244
【特許文献２】米国特許6110688
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Weichhart, T., Zlabinger, GJ, および Saemann, M D., (The multiple functions of Tamm-Horsfall protein in human health and disease: A Mistery Clears Up, Wien Klin Wochenschr, 117, 316-322, 2005)
【非特許文献２】Tsai-Hung, W, Song-Chou, H, Chih-Yao, Y, Yi-Fang, L, Chang-Youh, T, Chia-Li, Y (Intact protein core structure is essential for protein binding, mononuclear cell proliferating, and neutrophil phagocytosis-enhancing activities of normal human Urinary Tamm-Horsfall glycoprotein, Intern. Immunopharmacology, 8, 90-99, 2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の一つの目的は、天然又はペグ化タム・ホースフォール糖タンパク質および薬理学的に許容される賦形剤を含む、腫瘍の発達を阻害するための医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の他の目的は、非経口的に哺乳動物に天然又はPEG化ヒトタム・ホースフォールタンパク質の有効量および薬理学的に許容される賦形剤を含む組成物を投与することを含む、哺乳動物における腫瘍の発達を阻害するための治療の治療方法を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、非経口的に哺乳動物に天然またはペグ化ヒトタム・ホースフォールタンパク質の有効量および薬理学的に許容される賦形剤を含む組成物を投与することを含む、哺乳動物における先天的免疫応答を増加させるための治療の治療方法を提供することである。
【００１７】
本発明の他の目的は、哺乳動物における腫瘍の発達を阻害するための組成物を調製するための、天然又はペグ化タム・ホースフォール糖タンパク質の使用を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、哺乳動物における先天的免疫応答を増加させるための組成物を調製するための、天然又はペグ化タム・ホースフォール糖タンパク質の使用を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1は、コントロール、THP-HMGおよびアッセイ1のTHP-HCGの、体重対日を示すグラフである。
【図２】図2は、アッセイ2の解剖した腫瘍を示している。
【図３】図3は、アッセイ3の解剖した腫瘍を示している。
【図４】図4は、コントロールおよびTHPの腫瘍重量対日を示すグラフであり、アッセイ5でのグループ2および3における腫瘍の平均重量を示す。
【図５】図5は、THPの抗腫瘍効果の報告書の4T1乳癌を有するマウスへのTHP投与の効果を示すグラフに相当する。
【図６】図6は、THPの抗腫瘍効果の報告書の4T1乳癌を有するマウスにおける血液学的インデックスに関するTHP投与の効果を示すグラフに相当する。
【図７】図7は、THPの抗腫瘍効果の報告書のTHPで処置したマウス由来の組織学的4T1腫瘍の分析と肝臓を示すグラフに相当する。
【図８】図8は、THPの抗腫瘍効果の報告書のCT26結腸癌を有するマウスでのTHP投与の効果を示すグラフに相当する。
【図９】図9は、THPの抗腫瘍効果の報告書のCT26結腸癌を有するマウスにおける血液学的インデックスのTHP投与の効果を示すグラフに相当する。
【図１０】図10は、THPの抗腫瘍効果の報告書のTHPで処置されたマウスからのCT26腫瘍の組織学的分析を示すグラフに相当する。
【図１１】図11は、THPの抗腫瘍効果の報告書のB16黒色腫を有するマウスでのTHP投与の効果を示すグラフに相当する。
【図１２】図12は、THPの抗腫瘍効果の報告書のB16黒色腫を有するマウスにおける血液学的インデックスに関するTHP投与の効果を示すグラフに相当する。
【図１３】図13は、THPの抗腫瘍効果の報告書のTHPで処置したマウス由来のB16腫瘍の組織学的分析を示すグラフに相当する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
免疫不全（または免疫不全）は、感染症と戦うための免疫系の能力が危険にさらされている状態、または完全に不在である状態である。免疫不全はまた、癌の免疫監視機構を減少させることができる。免疫不全のほとんどの症例は獲得されたもの（「二次」）であるが、一部の人たちは、その免疫系の欠陥、または原発性免疫不全を持って生まれている。過剰活性な免疫系を患っている何人かの患者がそうであるように、移植患者は、抗拒絶反応の処置として、それらの免疫系を抑制するために薬を服用する。いかなる種類でも、免疫不全のある人は、免疫無防備状態であると言われている。免疫無防備状態の人は皆に影響を与える可能性がある通常の感染症に加えて、日和見感染症に対して特に脆弱である可能性がある。
【００２１】
本出願で行われた研究は、天然またはペグ化THPを用いた治療は、哺乳動物での免疫生得的反応を増大させること、さらに、哺乳動物における腫瘍の発達を阻害することを実証するものである。
【００２２】
THPは、以下の方法に従って調製した。
【００２３】
論文、「"ヒトの尿からのタム・ホースフォール糖タンパク質（ウロモジュリン）の急速な分離」“Rapid isolation of Tamm-Horsfall glycoprotein (uromodulin) from human urine”：Franca Serafini-Cessi, Guivanni Bellabarba, Nadia Malagolini and Fabio Dall’Olio, Journal of Immonological methods, 120 (1989) page 185-189、に記載されている方法。
【００２４】
THPは、上記論文の著者によって詳述された手順に従って、ヒト尿（ヒト妊娠尿またはヒト閉経後尿）から単離した。
【００２５】
この方法は、一価および二価イオンの存在下でゲルを形成するというTHPの傾向と、正常なヒト尿中に存在する（T-H）糖タンパク質のほとんどを選択的に維持するケイソウ土の濾過能力、および脱イオン水によるフィルタからのその脱着に基づく。
【００２６】
エンドトキシンはゲルとしてDEAE-セファロース、移動相としてpH8.5の40 mMトリス/ ClH緩衝液を使用した陰イオン交換クロマトグラフィーにより、（TH）糖タンパク質から除去された。
【００２７】
タンパク質を、2ベッドボリュームの40mMのトリス/ ClH、pH8.5で溶出し、最終的に溶出した（TH）糖タンパク質は、滅菌溶液を得るために、0.22ミリポアフィルターで濾過してカラムから溶出した。
【００２８】
溶液を10ミリリットルのファルコンチューブに分注し、凍結乾燥した。
【００２９】
凍結乾燥した液の物理化学的特性評価：
【００３０】
各凍結乾燥したバイアルを適量の水に再懸濁し、1 mg / ml溶液を取得した。
【００３１】
タンパク質含量は、2つの方法により行われた：Lowry法、およびHPLCによるサイズ排除クロマトグラフィー、TSK-30 カラムおよび 50 mM Tris pH 7.5+ 10 mM EDTA +0.025% Tween 20を用いた。
【００３２】
分子量および単離された糖タンパク質の純度は、SDS-PAGE、クーマシー及び銀染色によって決定した。
【００３３】
簡単に説明すると、電気泳動分離には以下の機器や薬品を使用した：
LMWキャリブレーション混合液（Pharmacia Code No. 17-0446-01）
Phastgel SDS勾配 8-25% （Code No.17-0542-01）
Phastgel SDS バッファストリップ（Code No.17-0516-01）
SDS-page用のサンプルバッファ (10 mM tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0+2.5 % SDS + 5% Mercaptoethanol + 0.01 % ブロムフェノールブルー)
機器
電気泳動: Phast システム, Pharmacia
スキャナおよびソフトウェア: ImageMaster 1 D, Version 1.10, Sharp JX 325 
【００３４】
ジチオスレイトールでの還元条件下で、THPのSDS-PAGEは95キロダルトンの単一のバンドが得られ、このことはTHPが、鎖内ジスルフィド結合を有する単一のペプチドであることを示唆している。
【００３５】
特異性はTHP ELISA試験（MDBiosciences）によって測定した、得られた結果は、タンパク質1mgが1mgのTHPと同等であることを示した。
【００３６】
内因性タンパク質は、身体から迅速にクリアされ、経口的に摂取することができない。タンパク質によって有効な治療を行うためには、薬物の長期間の頻繁な注射がしばしば必要とされる。
【００３７】
治療用ペプチドまたはタンパク質薬剤の効率を高める方法は、天然分子の、PEG化として知られているポリエチレングリコール（PEG）による化学修飾によって達成される化学修飾に基づいている。
【００３８】
本出願に示したアッセイで使用されるペグ化THPは、次のプロトコルに従って調製した：
プロトコル1（PEG3,5モル/モルTHP）
14.4 mgのTHPを蒸留水10mlに溶解させた。 3.4％までNaCl適量を加えた。混合物を撹拌し、次いで2-8℃で2時間、立てて維持した。混合物を遠心分離し、沈殿を回収し、3.5％NaClで1回洗浄した。
【００３９】
得られた沈殿物を10mlの蒸留水に溶解した。
【００４０】
PEGのtresilate（Sigma-Aldrich社）2.88 mgを添加し、混合物を室温で2時間撹拌した。
【００４１】
3.5％までNaCl適量を加え、1時間立てて維持した。
【００４２】
混合物を遠心分離し、沈殿を-20℃で保存した。
【００４３】
プロトコル2（THP7モル/モルPEG）
THP 09022010（14.4mgTHP）の3バイアルを蒸留水7.2mlに溶解させた。
【００４４】
得られた混合物を、4℃の脱イオン水6 1に対して透析し、そして、それはバスを3回交換しながら、24時間の間攪拌した。
【００４５】
翌日、透析物を回収し、体積が（17.4ml）を決定した。
【００４６】
3.76mgのPEG tresilateを添加し、混合物を室温で2時間攪拌した。
【００４７】
0.58MのNaClを添加し、混合物を2〜8℃で2時間立てて維持した。
【００４８】
混合物を遠心分離し、沈殿を-20℃で保存した。
【００４９】
プロトコル1および2によって得られた沈殿物を蒸留水中に溶解して、1mg/mlを含む溶液を得て、非経口投与のためのペグ化ヒトタムホースフォールタンパク質の薬学的組成物を調製した。
【００５０】
本明細書に記載の天然またはペグ化THPを含有する医薬組成物は、罹患しているまたは腫瘍を患っていると考えられる哺乳動物に投与された。また、それは、それらの生来の免疫応答を高めるために、感染した重篤な患者に投与された。
【００５１】
腫瘍を治療するための治療用途において、組成物は、腫瘍の退縮を引き起こすか、または少なくとも部分的に腫瘍の増殖および転移を阻止するのに十分な量で哺乳動物に投与される。上記目的を達成するために十分な量は、「治療有効用量」と定義される。これらの用途のための有効量は、例えば、THP（比活性など）の性質、それを投与する方法、ステージおよび腫瘍の重症度、体重および一般的な健康状態、および処方する医師の判断に依存する。
【００５２】
THP組成物としてのペプチド組成物の単回投与または複数回投与は、治療する医師によって決定される投与計画によって行うことができる。いずれにせよ、医薬製剤としては、効果的に、哺乳動物を治療するのに十分なTHPの量が提供されるべきである。投与は、望ましくない細胞増殖の最初の兆候で、または診断直後から始め、症状が実質的に和らぎ、そしてその後の一定期間になるまで継続すべきである。腫瘍で十分に確立されたケースでは、負荷用量およびそれに続く維持用量が必要とされ得る。
【００５３】
治療的処置のための医薬組成物は、非経口、局所、経口または局所投与が意図されている。本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体に溶解または懸濁された抗腫瘍THPの溶液を含む非経口投与用組成物を提供する。多様な水性担体、例えば、水、緩衝水、0.4％生理食塩水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸などを用いることができる。これらの組成物は従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得るか、または滅菌濾過することができる。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装または凍結乾燥することができる、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌溶液と組み合わされる。組成物は、pH調整剤および緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムのようなる、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどの、生理的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質を含有することができる。
【００５４】
薬学的組成物を調製するための他の方法は当業者に知られているか、明らかであり、例えば、レミントンの製薬科学、第19版、マック・パブリッシング・カンパニー、イーストン、ペンシルバニア州（1990）に、より詳細に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５５】
実験的試験
実験結果の実質的な本体は、THPが、腫瘍および感染性疾患の発症を減少させることができることを示すためにここに提示される。実施した実験は、皮下経路によるTHPの投与が、T180肉腫細胞開発のマウス（CD1系統）を、サルモネラ腸炎によって生成された致死腹膜炎から保護することを示している。
【００５６】
THPは、48時間間隔で2回の注射で、皮下経路で、二つの異なる用量、15または30 mg / kg体重で注射した。ヒトタンパク抗原に対するマウスの迅速な免疫応答が結果に影響を与える可能性があるため、追加の用量は注射しなかった。
【００５７】
アッセイ1
腹水肉腫T180対THPアッセイ法
方法
6匹の成体雄マウス（すべての場合でCD1系統）の3グループを用いた：
１）  コントロールグループ
２）  THP（閉経後の尿）グループ
３）  THP（妊娠尿）グループ
【００５８】
アッセイは、以下のスキームに従って行った。
第１日
ａ）全ての動物について、体重を登録する。１ｍLの肉腫180（87×l0exp6  細胞/ mL）を腹腔内経路で注入する。
ｂ）1mg/mLのTHP-HCG水溶液（パイロットバッチ09062010）1mLの皮下注射。
ｃ）1mg/mLのTHP-HMG水溶液（パイロットバッチ09062010）1mLの皮下注射。
【００５９】
第３日および第４日
体重の制御を行った。
【００６０】
結果
結果は以下の表および図1にまとめた。
【００６１】
【表１】
2015506973.tif 000003
【００６２】
【表２】
2015506973.tif 000004
【００６３】
【表３】
2015506973.tif 000005
【００６４】
【表４】
2015506973.tif 000006
【００６５】
図1はそれぞれTHP-HCGおよびTHP-HMGで処理したグループ2）とグループ3)について、コントロールグループ1に対応した体重の増加を示している。
【００６６】
アッセイ1の結論：
理解できるように、THPで処理したグループ2）および3）で観察された体重値はコントロールグループ1）と比較して減少を示した。すなわち、それはグループ2）及び3）の動物は、THPによる腫瘍発達の阻害に関連しているであろう体重の減少を被ったと考えられる。
【００６７】
アッセイ2
アッセイ1で得られた結論を確認するために、以下のようにアッセイ2を行った。
ソリッドSarcoma-180対ＴＨＰ
方法：
それぞれ6匹の成体雄マウスの2つのグループを使用した：
グループ０１はSarcomaグループを含み、６匹にSarcoma-180を皮下注射した。
グループ０２はSarcomaプラスＴＨＰグループを含み、６匹にSarcoma-180およびTHP-HMGを皮下注射した。
【００６８】
アッセイは、以下のスキームに従って行った：
１日目
ａ）マウスを無作為にグループ間に分配した。
ｂ）Sarcoma-180細胞懸濁液０．５ｍｌ（19xl0exp6  細胞/ml）を動物の右側腹部に皮下注射した。
ｃ）グループ２への１ｍｌのTHP-HMGの注射：１ｍｌのTHP-HMG（パイロットバッチ09062010）を皮下経路で注射した。
【００６９】
３日目
グループ２は新たな用量のTHP-HMGを受けた。皮下経路で動物ごとに１ｍｇ。
【００７０】
５日目
全ての動物を体重測定し、殺戮した。腫瘍を解剖して秤量した。
【００７１】
結果
結果は、解剖した腫瘍に対応する以下の表および図2に要約する。
【００７２】
【表５】
2015506973.tif 000007
【００７３】
【表６】
2015506973.tif 000008
【００７４】
図2は、解剖した腫瘍の重量を示しており、グループ01（肉腫）からの動物の腫瘍の大きさが、グループ02（Sarcoma-THP）よりもかなり大きい。
【００７５】
アッセイ2の結論：
これからわかるように、THPで処理したグループ02で観察された腫瘍の重量は、グループ01からのものよりも小さい。したがって、それはグループ02ではTHPの投与により腫瘍の発生および増殖が阻害されたと考えられる。
【００７６】
アッセイ2により、アッセイ1で観察された体重の減少は、腫瘍の発達の阻害（ＴＨＰが適用されるとコントロールグループよりも腫瘍の重量は小さくなる）によるものであることが確認された。
【００７７】
アッセイ3
外来タンパク質自体の投与が、マウスにおいて腫瘍の発達を阻害し得るかどうかを評価するために、アッセイ3を行った：
【００７８】
Sarcoma-180対ＴＨＰおよびヒトγグロブリン
方法：
2つのグループで6匹のアルビノの成体雄マウスを使用した：
グループ１はSarcoma-ヒトγグロブリングループ（コントロールグループ）に相当する
グループ２はSarcoma-ＴＨＰグループに相当する。
【００７９】
アッセイは、以下のスキームに従って行った：
1日目
ａ）0.5mlのSarcoma-180細胞懸濁液（40xl0exp6  細胞/ml）を皮下経路により両グループにおいて注射した。
ｂ）１mgのヒトγグロブリンをグループ１の動物に注射した。１mg／mlのヒトγグロブリンの１mlの生理食塩水（グロブリン−A  5000mg）を皮下で。
ｃ）１mgのTHP-HMGをグループ２に注射した。１mg/mlのTHP-HMGを含む1mlの水性溶液（パイロットロット09062010）。
【００８０】
2日目
新たな用量のTHP-HMGおよびヒトγをそれぞれのグループに注射した。
（1日目と同じ）
【００８１】
5日目
全ての動物を体重測定し、殺戮した。腫瘍を解剖して秤量した。
【００８２】
結果
結果は、解剖した腫瘍に対応する以下の表および図3に要約する。
【００８３】
【表７】
2015506973.tif 000009
【００８４】
【表８】
2015506973.tif 000010
【００８５】
アッセイ3の結論：
これからわかるように、ヒトガンマグロブリンなどの外来タンパク質の投与は、THPを適用したグループから得られた値に比べて、体重と腫瘍重量の結果から分かるように、腫瘍の発生と成長を阻害しない。
【００８６】
アッセイ4
ペグ化THPとしてTHP誘導体の腫瘍増殖阻害の効果を評価するために、アッセイ4を行った。
【００８７】
ペグ化THPの抗腫瘍活性
方法
2つのグループでそれぞれ6匹の成体雄マウスを使用した：
グループ１はSarcomaグループに相当する。
グループ２はSarcoma-THP-PEGグループに相当する。
【００８８】
アッセイは、以下のスキームに従って行った：
1日目
ａ）0.5mlのSarcoma-180細胞懸濁液（40xl0exp6  細胞/ml）を両グループにおいて動物の右側腹部に注射した。
ｂ）１mgのTHP-PEGを溶解した１mlの水性溶液をグループ２の動物の左側腹部に注射した。
【００８９】
3日目
動物の体重を記録した。
2回目の用量（1日目ｂと同じ）のTHP-HMG-PEGをグループ２に投与した：動物の左側腹部に１mg/mlのTHP-HMG-PEGを含む1mlの水性溶液を皮下注射した。
【００９０】
6日目
全ての動物を体重測定し、殺戮した。腫瘍を解剖して秤量した。
【００９１】
結果
結果は、以下の表に要約する。
【００９２】
【表９】
2015506973.tif 000011
【００９３】
【表１０】
2015506973.tif 000012
【００９４】
アッセイ４の結論
これからわかるように、6日目に得られた腫瘍重量は、THP-PEGで処理されていない動物グループと比較して、THP-PEGで処置した動物のグループはかなり低く、これは、ネイティブTHPと同じように、THP-PEGが腫瘍の発生および増殖などの阻害をもたらすことを実証している。
【００９５】
アッセイ5
このアッセイは、以前に発生した腫瘍に対するTHPを用いた治療の有効性を評価するという目的を有する。
【００９６】
以前に発生した腫瘍に対するTHPの抗腫瘍活性
方法：
6成体雄マウスの3グループを使用した。
グループ１  Sarcoma（腫瘍発生3日目）
グループ２  Sarcoma（コントロールグループ）
グループ３  Sarcoma  THP
【００９７】
アッセイは、以下のスキームに従って行った：
1日目
ａ）0.5mlのSarcoma-180細胞懸濁液（40xl0exp6  細胞/ml）をそれぞれの動物の右側腹部に皮下注射した。
【００９８】
3日目
ｂ）グループ１の動物を殺戮し、腫瘍を解剖して秤量し、この段階での腫瘍の発育度合いを確立した。
グループ２にはTHP-HMGを1mg注射した：それぞれの動物の左側腹部に１mg/mlのTHPを含む1mlの水性溶液を皮下注射した。
【００９９】
5日目
グループ２にTHP-HMGを1mg投与した（3日目と同じ）
【０１００】
7日目
マウスを体重測定し、殺戮した。腫瘍を解剖して秤量した。
【０１０１】
結果
結果は、グループ２および３の腫瘍の平均重量に対応する以下の表および図4に要約する。
【０１０２】
【表１１】
2015506973.tif 000013
【０１０３】
統計：
スチューデントｔ検定  グループ１対グループ２：ｐ0.26
スチューデントｔ検定  グループ２対グループ３：ｐ0.0019
【０１０４】
【表１２】
2015506973.tif 000014
【０１０５】
図４は、グループ2および3における腫瘍の平均重量を表す。
グラフで分かるように、7日目において、THPが注射された動物の腫瘍の平均重量はTHPで処理されていない動物（コントロールグループ）の腫瘍の重量よりも相当低い。
【０１０６】
アッセイ5の結論
これからわかるように、あらかじめ腫瘍が発生したマウスをTHPで処理すると、処理されていない動物に比べて腫瘍の発達を阻害した。
【０１０７】
アッセイ６
このアッセイは、THPを用いた治療から得られた抗感染防御作用を示した
【０１０８】
THPによる抗感染防御
方法
Salmonella enteritidis +のヒツジヘモグロビンを接種したマウスの致死性腹膜炎をチャレンジとして用いた。
【０１０９】
アッセイは、以下のスキームに従って行った：
1日目：成体の雄のマウスのグループにTHP0.1mg、0.5mg、1mgおよび5mgを皮下注射した。コントロールグループには佐剤を注射した。
【０１１０】
2日目：全ての動物は腹腔内経路で1mlのSalmonella enteritidis 懸濁液（24時間ブロス）を等量の10g/100mlヒツジヘモグロビン溶液と混合したものを投与された。
【０１１１】
マウスでの腹膜炎に起因する死亡率は、以下の表に観察される：
【０１１２】
【表１３】
2015506973.tif 000015
【０１１３】
アッセイ6の結論
これからわかるように、1mgより多い用量でのTHP処置により、マウスにSalmonella enteritidisが接種された場合の腹膜炎による死亡率が減少した。THPは、Salmonella enteritidisに対するマウスでの防御障壁を増加させる。
【０１１４】
THPの抗腫瘍効果の報告
アッセイ1-6、特にアッセイ5の結論（予め発生した腫瘍に対するTHPの有効性）を確認し、マウスの異なる種の異なる腫瘍細胞株に対するTHPの抗腫瘍作用を評価するために、以下の論文を考慮しつつin vivo試験を実施した。
【０１１５】
1. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.Washington. Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences National Research Council.  1996. DC: National Academy Press. 
2.     Tao K, Fang M, Alroy J, Sahagian GG. Imagable 4T1 model for the study of late stage breast cancer. BMC Cancer 2008;8:228.
3.     Brattain MG, Strobel-Stevens J, Fine D, Webb M, Sarrif AM. Establishment of mouse colonic carcinoma cell lines with different metastatic properties. Cancer Res 1980;40:2142-46.
4.     Fidler IJ, Kripke ML. Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor. Science 1977;197:893-95.
5.     Leng HM, Albrecht CF, Kidson SH, Folb PI. Erythropoietin production in anemia associated with experimental cancer. Exp Hematol 1999;27:806-10.
【０１１６】
材料および方法
試薬：40ｍMのTRIS（pH=8）に溶解したヒトTamm-Horsfallタンパク質（THP, ロット：26062012；0.9mg/ml）を用いた。希釈は滅菌した発熱因子を含まない水中で行われた。
【０１１７】
細胞培養：細胞培養：4T1マウス乳房腫瘍細胞、CT26マウス結腸癌、およびB16黒色腫細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（マナッサス、VA）から入手した。4T1およびCT26はRPMI1640培地（Life Technologies社、ニューヨーク州グランドアイランド）で培養し、2 mMグルタミンおよび10％ウシ胎児血清（FCS、玄、ブエノスアイレス、アルゼンチン）を補充した。B16細胞を、RPMI 1640培地、高グルコース培養し、非必須アミノ酸、2mMグルタミン及び10％FCSを補充した。すべての細胞型は5％のCO2を含む加湿インキュベーター中で37℃にて培養した。
【０１１８】
in vivo研究：実験は、ブエノスアイレスの実験医学および生物学研究所（4T1およびCT26細胞株実験）で育てた処女雌BALB/cマウス（生後8-9週）、または（B16実験のために、ブエノスアイレス、アルゼンチン）ラプラタ国立大学から得られた処女雌C57BLマウス（生後8-9週）において、HEPAフィルターフードを使用して病原体を含まない条件下で行われた。マウスは、一定光周期の条件（12時間暗所に12時間光）でポリエステル繊維フィルターカバーで通気プラスチックケージ内で、4-5のグループで、食物および水を自由に摂取させてグループを飼育した。それぞれの動物は耳標を付し実験を通して個別に追跡した。すべての動物実験は、国立保健研究所の実験動物の管理と利用（1）のためのガイドに概説されている動物のケアの最高の基準に従って行われた。
【０１１９】
各マウスの右脇腹（皮下）に0.1mlの無血清培地中の1x105、 3x105、 2.5 x105 の細胞株4T1、CT26、およびB16のそれぞれを接種した。腫瘍が確立されるにつれ（平均開始腫瘍体積、〜100mm3）、マウスを無作為に異なるグループに分け（1日目）、150mlの異なる用量のTHPを左脇腹に皮下注射した。マウスは、1日目から始まり計3回投与され、1日おきに投与された。7日目に、マウスを屠殺した。
【０１２０】
4T1細胞
マウスは5つのグループ（ｎ＝１０）に無作為に分け、以下の処置を受けた：（ａ）コントロール（ＴＲＩＳ４ｍＭ、ｐＨ＝８）、（ｂ）187μg/kg体重/投与、（ｃ）375μg/kg体重/投与、（ｄ）750μg/kg体重/投与および（e）1500μg/kg体重/投与。
【０１２１】
CT26細胞
マウスは4つのグループに無作為に分け、以下の処置を受けた：（ａ）コントロール（ＴＲＩＳ４ｍＭ、ｐＨ＝８）、ｎ＝5（ｂ）375μg/kg体重/投与、ｎ＝4（ｃ）750μg/kg体重/投与、ｎ＝4および（ｄ）1500μg/kg体重/投与、ｎ＝4。
【０１２２】
B16細胞
マウスは4つのグループ（ｎ＝８）に無作為に分け、以下の処置を受けた：（ａ）コントロール（ＴＲＩＳ４ｍＭ、ｐＨ＝８）（ｂ）375μg/kg体重/投与（ｃ）750μg/kg体重/投与および（ｄ）1500μg/kg体重/投与。
【０１２３】
全ての実験において、腫瘍は、デジタルキャリパーを用いて週に三回測定し、その体積は、標準的な式を用いて計算した：（幅2x長さ）/ 2。腫瘍増殖率は、体積測定によって推定成長曲線の傾きとして決定した。体重を毎週測定した。腫瘍成長阻害のパーセンテージは、コントロールグループの平均腫瘍体積または重量により、THP-処置グループの平均腫瘍体積または重量を割り、1から得られた値を減算し、100を乗じて計算した。屠殺時に、肝臓、脾臓、肺および腎臓を除去し、腫瘍を採取し、秤量した。脾臓も秤量した。すべての器官および腫瘍組織を、10％ホルマリンで一晩固定し、70％エタノールに移した。四マイクロメートルの厚さのパラフィン包埋組織切片を標準的な手順によって、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。各マウスからの血液は、コールターカウンターを用いて、血液学的パラメーターを評価した。
【０１２４】
統計解析：動物の複数のグループ間の相対的な腫瘍重量の比較は、通常のANOVAに続けて、Tukey-Kramerによる複数の比較ポストANOVA分析を行った。確率値（P）が0.05未満を統計的有意とみなした。
【０１２５】
結果
THPのin vivo抗腫瘍効果を試験するため、異なった腫瘍モデルを用いた。
【０１２６】
4T1細胞
まず、4T1乳癌の成長（2）上でTHPの効果を研究した。確立された皮下4T1腫瘍（平均腫瘍体積、128.6 ±7.9mm3）を有するBALB/cマウスを一日おきに187、375、750、または1500マイクログラム/kgのTHPまたはベヒクルで7日間皮下処理した。図5Aに示されているように、187〜1500 mg/kgのTHPでのマウスの処理は4T1腫瘍増殖を7日目にビヒクル処置コントロール（それぞれP＜0.05およびP＜0.01）と比較してそれぞれ38％および40％阻害した（表1）。THPまたはビヒクル処理で得られた増殖曲線の傾きとして求められる腫瘍増殖率は、ビヒクルで処置した動物（表1）と比較して、全てTHP-処置グループで低かった。重要なことは、マウスは、ビヒクル処置のコントロールと比較して、体重が有意に変動せず、毒性の明白な徴候なしにTHPを用いた治療を許容したように見えたことである（図5B）。4T1腫瘍に由来する典型的なsplenomegalia（2）は、正常マウス（図5C）について全てのマウスにおいて観察された。既に報告されたように（2）、これは、白血球の増加を伴っていた（図6E）。THP投与は脾臓重量（図5（c））および白血球数（図6E）のいずれも変更しなかった。ヘマトクリットおよび赤血球中のわずかな減少は、すべての4T1保有マウス（それぞれ図6AおよびB）で観察された。平均赤血球容積（MCV）およびヘモグロビン濃度値で変化は発生しなかった（それぞれ、図6CおよびD）。血小板数の増加が、750マイクログラム/kgの用量で処置したマウスにおいて観察された（図6F）。
【０１２７】
組織病理学的特徴を研究するために、治療の7日目に切除した腫瘍をヘマトキシリン−エオシン（H＆E）染色によって評価した。図7A〜Fは、コントロールおよびTHP 1500mg/kg/日の用量実験グループからの腫瘍の代表的な切片を示している。広範な壊死領域が、（腫瘍塊の30〜50％）THPで処置したマウスにおいて増殖した腫瘍において見出された（図7B）。一方、コントロールマウスは、巣状壊死（5〜20％、図7A）を示した。有意な線維化面積がTHPで処置したマウスで観察された（15〜25％、図7D）、一方、線維はコントロールマウスではほとんど見られなかった（5％、図7C）。炎症細胞（リンパ球、形質細胞、肥満細胞およびいくつかの好中球）の腫瘍周囲浸潤が、THP-処理マウスと比較してコントロールではより豊富であった（それぞれ図7E、図7F）。コントロールおよびTHP−処置マウスで成長した4T1腫瘍は退形成（核等級= 3）、高分裂指数（有糸分裂グレード= 3）および貧しい分化（組織学的指数= 3）（図7A-F）を示した。肝臓の組織学的検査は、球状の外観と正弦波の空間における局所転移の存在を明らかにした（図7G、図7H）。THP-処置した動物は、コントロールよりも小さいサイズ（転移における腫瘍細胞の数が少ない）の転移（それぞれ図7H及び図7G）および正常組織学的特徴（図7J）を示した。一方、コントロール動物からの肝臓は重要な肝細胞毒性を示した（図7I）。腎の形態および構造は、THP処理下の動物では腎皮質尿細管上皮の軽度〜中程度の曇りの変性を示し、コントロール動物では、腎皮質尿細管上皮の中等度の曇りの変性を示した。髄外造血を伴う肺うっ血とうっ血性巨脾が、コントロールおよびTHP−処理マウスで観察された。
【０１２８】
腫瘍細胞株4T1の増殖に対するTHPの皮下投与の効果を、以下の表1に要約する。
【０１２９】
【表１４】
2015506973.tif 000016
【０１３０】
腫瘍が128.6±7.9mm3に達した時に、材料および方法に記載されているように、マウスを処置した。各グループは10匹のマウスを含む。1日目と実験終了の処置7日目の間の成長速度は、成長曲線の勾配として算出した。実験の最後に、ビヒクル処置した動物（コントロール）に対するTHP−処置したマウスからの腫瘍重量および腫瘍成長阻害のパーセンテージを材料および方法に記載のように計算した。
【０１３１】
CT26細胞：
第二に、CT26結腸癌の成長（3）におけるTHPの効果を研究した。確立された皮下CT26腫瘍を有するBALB/cマウス（平均腫瘍体積88.6±12.0mm3）を一日おきに、375、750、または1500マイクログラム/kgのTHPまたはベヒクルで7日間皮下処理した。図8Aに示されるように、1500mg/kgのTHPで処理したマウスは、ビヒクル処置コントロールに比べて、7日目に39％までCT26腫瘍増殖を阻害した（P <0.05）（表2）。THP処理グループの腫瘍増殖率は、ベヒクルで処置した動物と比較して750および1500mg/kgで低かった（表2）。重要なことは、マウスは、ベヒクル処置のコントロールを含めたすべてのグループで体重の大幅な増加を伴い（図8B）、および通常のマウスのCT26腫瘍を持つすべてのグループでうっ血性巨脾を伴い（図8C）、毒性の明白な徴候なしでTHPを用いた治療に耐えるように見えたことである。血液学的インデックスは、THPで処理されたか、またはされていないCT26保有マウスと比較して、正常動物におけるヘマトクリット、ヘモグロビン、白血球および血小板に変化は認められなかった（図9A、C、EおよびF）。しかし、750および1500マイクログラム/kgのTHPで処置したマウスにおいて赤血球の減少およびMCVの増加が観察された（それぞれ図9B及び9D）。
【０１３２】
組織病理学的特徴を研究するために、治療の7日目に切除した腫瘍をヘマトキシリン−エオシン（H＆E）染色によって評価した。図10A−Dは、コントロールからとTHP1500mg/kg/投与の用量実験グループからの腫瘍の代表的な切片を示している。壊死領域（腫瘍塊の15〜20％）はTHPで処置したマウスにおいて増殖した腫瘍において見出され（図10Bおよび図10D）、コントロールマウスは最小限の壊死領域（5〜10％、図IOCの）を示した。コントロールおよびTHP-処置マウスで成長したCT26腫瘍は、退形成（核等級= 3）、高分裂指数（有糸分裂グレード= 3）と貧しい分化（組織学的指数= 3）を示し、広範な腫瘍内の血管新生を示している（図10A-D）。腎の形態および構造は、THP処理下の動物では腎皮質尿細管上皮の軽度の曇りの変性を示し、コントロールの動物では腎皮質尿細管上皮の中程度の曇りの変性を示した。
【０１３３】
髄外造血を伴う肺うっ血とうっ血性巨脾が、コントロールおよびTHP−処理マウスで観察された。
腫瘍細胞株CT26の増殖に対するTHPの皮下投与の効果を、以下の表2に要約する。
【０１３４】
【表１５】
2015506973.tif 000017
【０１３５】
腫瘍が88.6±12.0mm3に達した時、マウスを材料および方法に記載の通り処置した。コントロールグループには5匹のマウスおよびTHP−処置グループには4匹のマウスが含まれた。1日目と実験終了の処置7日目の間の成長速度は、成長曲線の勾配として算出した。実験の最後に、ビヒクル処置した動物（コントロール）に対するTHP−処置したマウスからの腫瘍重量および腫瘍成長阻害のパーセンテージを材料および方法に記載のように計算した。
【０１３６】
B16細胞
最後に、我々はB16黒色腫成長に対するTHPの影響を研究した（4）。確立された皮下B16腫瘍を有するC57BLマウス（平均腫瘍体積180.4±13.2mm3）を一日おきに、375、750、または1500マイクログラム/kgのTHPまたはベヒクルで7日間皮下処理した。図11Aに示されるように、375mg/kgのTHPで処理したマウスは、ビヒクル処置コントロールに比べて、7日目に有意に24％までB16腫瘍増殖を阻害した（P <0.05）（表3）。375mg/kgのTHP処理グループの腫瘍増殖率は、ベヒクルで処置した動物と比較して低かった（表3）。明確にしておくべき重要なことは、マウスは、ベヒクル処置のコントロールを含めたすべてのグループで体重の大幅な増加を伴い（図11B）、およびコントロールおよび通常のグループに対してTHP−処置グループで相当のうっ血性巨脾を伴い（図11C）、毒性の明白な徴候なしでTHPを用いた治療に耐えるように見えたことである。
【０１３７】
既に（5）に記載されているように、赤血球産生指数の低下はB16腫瘍の増殖を伴う。ヘマトクリット、赤血球およびヘモグロビンの減少は、B16腫瘍を有する全てのマウスにおいて明らかであり、THP処理はこれらのパラメータを変更しなかった（それぞれ図12A、BおよびC）。MCVは、全てのグループにおいて正常であった。白血球は、B16腫瘍を有する、ビヒクルで処理した動物（コントロール）またはTHP 1500μｇ/kgで処置した動物において減少した。 THP 375および750μg/kgでの処理では、血球数は正常なマウスと同レベルに増加した（図12E）。血小板数の変化は、すべての試験グループ（図12F）で認められなかった。
【０１３８】
組織病理学的特徴を研究するために、治療の7日目に切除した腫瘍をヘマトキシリン−エオシン（H＆E）染色によって評価した。図13 A−DはコントロールおよびTHP 375ミリグラム/kg/投与実験グループからの腫瘍の代表的な切片を示している。広範な壊死領域（腫瘍塊の40から55%）は、THPで処置したマウスにおいて増殖した腫瘍で発見された（図13のBおよび図13D）。一方、コントロールマウスは、より低い壊死を示し（30〜35％、図13Aおよび図13C）およびTHP−処置した腫瘍（図13Bおよび図13D）と比較して無秩序を示した。有意な線維化面積はTHPで処置したマウスにおいて観察された（35％、図13B）一方で線維症はコントロールマウスではほとんど見られなかった（10％、図13A）。コントロールおよびTHP-処置マウスで成長したB16腫瘍は、退形成（核等級= 3）、高分裂指数（有糸分裂グレード= 3）と貧しい分化（組織学的指数= 3）を示し、広範な腫瘍内の血管新生を示している（図13A-D）。腎の形態および構造は、THP処理下の動物およびコントロールの動物の両方で腎皮質尿細管上皮の中程度の曇りの変性を示した。髄外造血を伴う肺うっ血と細気管支上皮過形成およびうっ血性巨脾は、コントロールおよびTHP-処理マウスで観察された。
【０１３９】
腫瘍細胞株B16の増殖に対するTHPの皮下投与の効果は、以下の表3に要約されている。
【０１４０】
【表１６】
2015506973.tif 000018
【０１４１】
腫瘍が180.4±13.2mm3に達した時、マウスを材料および方法に記載の通り処置した。コントロールグループには5匹のマウスおよびTHP−処置グループには4匹のマウスが含まれた。1日目と実験終了の処置7日目の間の成長速度は、成長曲線の勾配として算出した。実験の最後に、ビヒクル処置した動物（コントロール）に対するTHP−処置したマウスからの腫瘍重量および腫瘍成長阻害のパーセンテージを材料および方法に記載のように計算した。
【０１４２】
THPの抗腫瘍効果の報告書の結論：
表1に示す結果から分かるように、THPは187μg/kg以上の投与を受けたBALB/cマウスにおける4T1腫瘍増殖を阻害した。腫瘍増殖阻害率で得られた最高値は、187μｇ/ｋｇおよび1500μg/kｇの用量で達成された（最高値）。187μｇ/ｋｇおよび1500μg/kｇの中間の投与量は、少ない腫瘍増殖阻害率を示した。。明確にしておくべき重要なことは、マウスは、毒性の明白な徴候なしで、コントロールグループと比較して体重の変化なしにTHPを用いた治療を許容するように見えたことである。
【０１４３】
表2に示された結果に見られるように、THPは、750μg/kgより多い用量を受けたBALB/cマウスにおいてCT26腫瘍増殖を阻害する。腫瘍増殖阻害率で得られた最高値は、1500μg/kｇの用量で達成された（最高値）。明確にしておくべき重要なことは、マウスは、毒性の明白な徴候なしで、コントロールグループを含む全てのグループにおいて大幅な体重の増加を伴ってTHPを用いた治療を許容するように見えたことである。
【０１４４】
表3に示された結果に見られるように、THPは、375μg/kg（最高値）の用量を受けたC57BLマウスにおいてB16腫瘍増殖を阻害する。より高用量（750-1500μg/k g）は、腫瘍成長阻害率の増加をもたらさない。明確にしておくべき重要なことは、マウスは、毒性の明白な徴候なしで、コントロールグループを含む全てのグループにおいて大幅な体重の増加を伴ってTHPを用いた治療を許容するように見えたことである。
【０１４５】
上記の結論として、THPは、毒性の明白な徴候なしに、耐性を有する患者での異なる腫瘍細胞株の治療に使用することができた。
【０１４６】
最終的結論
アッセイ1-6は、ペグ化誘導体としてのTHPによる治療が腹水肉腫T180、ソリッド肉腫−180の成長を阻害し、哺乳動物における自然免疫応答を増加させる抗感染作用を生成することを実証した。同様の結果が4T1、CT26およびB16腫瘍成長の阻害に関するTHPの抗腫瘍効果の報告において得られ、SARCOMA−180における私たちの先の観察が確認された。使用した異なる腫瘍細胞株より、THPは効果的に腫瘍増殖を阻害するために治療的投与に用いることができると推察された。
【０１４７】
前述の説明および実施例は本発明の実施の例示であり、決して限定するものではないことは、当業者によって理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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