(57)【要約】  本発明は、分子生理学の分野に関する。具体的には、本発明は、呼吸器の急性炎症、特に急性肺損傷（ＡＬＩ）または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の予防および／または治療に関する。そのような状態を患っている患者およびそのような状態の動物モデルにおいては、ＣＣＬ７レベルが増加することが示されている。ＣＣＬ７および／またはＰＡＲ１−ＣＣＬ７系の他のメンバー、またはＣＣＬ２のアンタゴニストを用いてこれらの状態を予防および／または治療することができる。
2015511625.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器における好中球の蓄積と関連する急性炎症の治療または予防での使用のための、
（ａ）ＣＣＬ７、ＰＡＲ１またはＰＡＲ１−ＣＣＬ７系の別のメンバー；または
（ｂ）ＣＣＬ２；の、
アンタゴニスト。
【請求項２】
請求項１に記載のアンタゴニストであって、
前記のＰＡＲ１−ＣＣＬ７系の他のメンバーが、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２またはＣＣＲ３であることを特徴とする、
アンタゴニスト。
【請求項３】
請求項１または２に記載のアンタゴニストであって、
肺空間内、気管支内、気管支壁内または間質空間内での好中球の急性炎症の治療または予防での使用のためのものであることを特徴とする、
アンタゴニスト。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載のアンタゴニストであって、
急性肺損傷（ＡＬＩ）または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の治療または予防での使用のためのものであることを特徴とする、
アンタゴニスト。
【請求項５】
請求項４に記載のアンタゴニストであって、
直接的または間接的な原因により生じるＡＬＩまたはＡＲＤＳの治療または予防での使用のためのものであることを特徴とする、
アンタゴニスト。
【請求項６】
請求項５に記載のアンタゴニストであって、
肺への外傷、細菌またはウイルスの感染、または別の呼吸器疾患から選択される直接的な原因から；または、敗血症、膵炎および肺遠位の組織外傷から選択される間接的な原因から生じる、ＡＬＩまたはＡＲＤＳの治療または予防での使用のためのものであることを特徴とする、
アンタゴニスト。
【請求項７】
請求項６に記載のアンタゴニストであって、
前記の他の呼吸器疾患が、新生児呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）、気管支拡張症または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）であることを特徴とする、
アンタゴニスト。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載のアンタゴニストであって、
前記アンタゴニストが、
（ａ）ＣＣＬ７およびＣＣＲ１；
（ｂ）ＣＣＬ７およびＣＣＲ２；
（ｃ）ＣＣＬ７およびＣＣＲ３
（ｄ）ＣＣＬ２およびＣＣＲ１；
（ｅ）ＣＣＬ２およびＣＣＲ２；または
（ｆ）ＣＣＬ２およびＣＣＲ３
の間の相互作用をブロックすることを特徴とする、
アンタゴニスト。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載のアンタゴニストであって、
そのターゲットの機能をブロックする、抗体、二本鎖ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、または、ペプチドまたはペプチド模倣物を含み、
ここで、前記ターゲットが、ＰＡＲ１−ＣＣＬ７系のメンバーまたはＣＣＬ２であることを特徴とする、
アンタゴニスト。
【請求項１０】
請求項９に記載のアンタゴニスト抗体であって、
モノクローナル抗体であることを特徴とする、
アンタゴニスト抗体。
【請求項１１】
請求項１０に記載のアンタゴニストモノクローナル抗体であって、
ＣＣＬ７またはＣＣＬ２に対する抗体であることを特徴とする、
アンタゴニストモノクローナル抗体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の抗体であって、
ＣＣＬ７に対する抗体であり、
そのエピトープは、ＣＣＬ７のＮ末領域内に、ＣＣＬ７のＮループ内に、ＣＣＬ７の３０ｓループ内に、ＣＣＬ７内のジスルフィド結合に隣接して、ＣＣＬ７のαへリックス領域内に、位置することを特徴とする、
抗体。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のアンタゴニストであって、
好中球動員および／または好中球蓄積を下方制御することにより、呼吸器における好中球の蓄積と関連する急性炎症の治療または予防で使用するためのものであることを特徴とする、
アンタゴニスト。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のアンタゴニストであって、
前記のアンタゴニストの効果が、好中球遊走を阻害することによる効果であることを特徴とする、
アンタゴニスト。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載のアンタゴニストであって、
鼻腔内投与または吸入投与のためのものであることを特徴とする、
アンタゴニスト。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項に記載のアンタゴニストであって、
呼吸器における好中球の蓄積と関連する急性炎症の治療および／または予防のための１つまたは複数のさらなる薬剤と組み合わせて使用するためのものであることを特徴とする、
アンタゴニスト。
【請求項１７】
請求項１６による使用のためのアンタゴニストであって、
前記のさらなる薬剤が、ＣＸＣＬ８のアンタゴニストであることを特徴とする、
アンタゴニスト。
【請求項１８】
請求項１７による使用のためのアンタゴニストであって、
前記のさらなる薬剤が、抗−ＣＸＣＬ８抗体であることを特徴とする、
アンタゴニスト。
【請求項１９】
呼吸器における好中球の蓄積と関連する急性炎症の治療または予防のための薬剤の製造における、ＣＣＬ７、ＰＡＲ１、ＰＡＲ１−ＣＣＬ７系の別のメンバー、またはＣＣＬ２、のアンタゴニストの使用。
【請求項２０】
呼吸器における好中球の蓄積と関連する急性炎症を治療または予防する方法であって、
ＣＣＬ７、ＰＡＲ１、ＰＡＲ１−ＣＣＬ７系の別のメンバー、またはＣＣＬ２、のアンタゴニストの有効量を、それらを必要とする患者に投与するステップを含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生理学の分野に属し、呼吸器における好中球の蓄積と関連する急性炎症、特に、急性肺損傷（ＡＬＩ）および急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の治療および予防に使用するための、ＣＣＬ７、ＰＡＲ１、ＣＣＬ７−ＰＡＲ１系（ａｘｉｓ）の他のメンバー、またはＣＣＬ２のアンタゴニストの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性肺損傷（ＡＬＩ）およびその最も重症型である急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）は、肺炎、外傷、および敗血症（これらは全て急性呼吸不全を引き起こす可能性がある）を含む、様々な局所および全身性の損傷に起因する。ＡＬＩ／ＡＲＤＳは、一般的な、命にかかわる状態であり、英国において毎年７９／１００，０００人が３０〜６０％の死亡率で冒されている（Ｍｏｎｃｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５８，１０７６−１０８１（１９９８））。ＡＬＩおよびＡＲＤＳの初期は、負傷した組織への好中球の流入と関連する（Ａｂｒａｈａｍ，Ｅ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．３１，Ｓ１９５−Ｓ１９９（２００３））。好中球性の炎症に加えて、これらの状態は、びまん性肺胞障害、肺胞毛管バリアの崩壊、および、肺水腫により特徴付けられる。迅速な先天性の免疫応答が、感染性微生物に対する即時の宿主保護を提供するが、過剰な好中球蓄積は、過剰増殖性の炎症および重度の組織損傷（Ｇｒｏｍｍｅｓ，Ｊ．&  Ｓｏｅｈｎｌｅｉｎ，Ｏ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１７，２９３−３０７（２０１１））を引き起こす可能性がある。肺保護ベンチレーターのストラテジーを用いたいくらかの改善にもかかわらず、呼吸の崩壊および多臓器不全がＡＬＩ／ＡＲＤＳを有する患者の４０％に至るまで生じるので、罹患率および死亡率の両方とも高いままである（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１６２，１７８３−１７８８（２０００））。
【０００３】
プロテイナーゼ活性化受容体１（ＰＡＲ１）は、テザーリガンドのタンパク質分解性アンマスキングにより活性化される、７つの膜貫通Ｇタンパク質結合受容体のファミリーに属する（Ｖｕ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ６４，１０５７−１０６８（１９９１））。生化学的試験およびＰＡＲ１ノックアウトマウスにより得られた証拠は、肺疾患における凝固と炎症との間の複雑な相互作用を仲介する、主要な高親和性トロンビン受容体ＰＡＲ１の重要な役割を示唆する。（Ｈｏｗｅｌｌ，Ｄ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６６，１３５３−１３６５（２００５）；Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １１６，１６０６−１６１４（２００６）；Ｓｃｏｔｔｏｎ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １１９，２５５０−２５６３（２００９）、および、Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｒ．Ｃ．Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５３  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ３６７−Ｓ３７８（２００８））。
【０００４】
上皮細胞、単球／マクロファージ、および血管内皮細胞上のＰＡＲ１の活性化は、様々な炎症促進性メディエーターの放出をもたらし、内皮バリア機能に対して差次的で濃度依存性の効果を及ぼす。ＰＡＲ１活性化に応答した内皮上の細胞接着分子の上方制御および上昇したケモカインレベルは、循環から肺内への炎症性細胞の動員を促進する（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｒ．Ｃ．Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．Ｓｕｐｐｌ  ４４，３３ｓ−３５ｓ（２００３））。しかしながら、ＰＡＲ１が仲介する炎症促進性のサイトカインおよびケモカインの放出が、ＡＬＩ／ＡＲＤＳにおける好中球性炎症にどの程度まで寄与するのか不明である。
【０００５】
したがって、単独で、または既存の治療と組み合わせて、ＡＬＩ／ＡＲＤＳの治療のための、より効果的かつ、より低いオフターゲット効果を有し得る、代替の治療ターゲットおよび新規の薬を同定する必要性がある。
【発明の概要】
【０００６】
我々は、ＣＣＬ７（ＣＣＬ７遺伝子識別名称：ＨＧＮＣ：１０６３４；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１０８６８８（ＥｎｓｅｍｂｌバージョンＥＮＳＧ０００００１０８６８８．７）；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ（バージョン１２５）：Ｐ８００９８）を、ＡＬＩ／ＡＲＤＳの治療および／または予防のための新薬開発可能なターゲットとして同定した。
【０００７】
ＣＣＬ７（単球走化性タンパク質−３、ＭＣＰ−３）は、成熟タンパク質のアミノ末端の２つの隣り合ったシステイン残基により特徴付けられる、ＣＣ−ケモカインファミリー（β−ケモカイン）のメンバーである。一般に、ＣＣ−ケモカインは、およそ８〜１２ｋＤａの低分子であり、免疫応答の編成の間、様々な重要な機能を果たす。それらは、様々な白血球を産生部位の方に引き寄せる走化性勾配を形成することができ、特定の細胞種の活性化に寄与することができ、様々なエフェクター機能、例えば、脱顆粒、遺伝子発現、および細胞運動に関与する。ほとんどのケモカインと同様に、ＣＣ−ケモカインは、組織および細胞源、および、他のケモカインおよびサイトカインの環境の中でそれらが発現される状況に応じた、多面的な機能を有する。ＣＣＬ７は、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、および上皮細胞を含む様々な細胞種により発現されるという点において決して例外ではない。かつてはマクロファージ特有の化学誘引物質であると考えられていたが、現在では、ＣＣＬ７が、単球、マクロファージ、ＤＣ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、およびマスト細胞に対して効果を及ぼし、全てのＣＣ−ケモカインのうち最も無差別的になり、そうすることで、様々な重要な疾患（例えばＣＸＣＬ１０を伴う喘息）の病因に影響を及ぼすことが明らかとなっている（ＭｉｃｈａｌｅｃＬ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８，８４６−８５２（２００２）。
【０００８】
しかしながら、これまでに、ＣＣＬ７は、ＡＬＩ／ＡＲＤＳに関係があるとはされていなかった。その代わりに、ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）および齧歯類ホモログＣＸＣＬ１（ＫＣ）およびＣＸＣＬ２（ＭＩＰ−２）が、ＡＬＩの間に肺内へ好中球を動員する中心であると考えられている。臨床ＡＬＩサンプルにおいて、ＩＬ−８の増加と空間内への好中球遊走との間の重要な相関が（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，２４，１４４８−１４５４（１９９６））、死亡率について作成されている（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ，１４６，４２７−４３２（１９９２））。さらに、ＩＬ−８のみが、一貫して、好中球の数および疾患の重症度と相関し（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ，１４，５２３−５３５（２００３）、および、Ｖｉｌｌａｒｄ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１５２，１５４９−１５５４（１９９５））、したがって、ＡＬＩ／ＡＲＤＳにおける主な好中球化学誘引物質であると考えられる。
【０００９】
しかしながら、本発明者らは、ＰＡＲ１シグナリングがＣＣＬ７発現を仲介すること、急性好中球性炎症がＣＣＬ７依存性であること、および、ＡＬＩの間、ＣＣＬ７がヒト好中球の化学走性を制御することを示した。また、本発明者らは、ＬＰＳチャレンジされたマウスの肺由来の好中球はＣＣＲ１およびＣＣＲ２の発現が増加するが、ＣＸＣＲ２分子の発現は減少することを示した。したがって、本発明者らは、好中球がＣＣケモカインに応答することができることを示した。
【００１０】
本発明者らは、ＰＡＲ１シグナリングが、関連するケモカインＣＣＬ２（ＭＣＰ−１としても知られる）の発現を仲介すること、および、急性好中球性炎症がＣＣＬ２に依存することを、さらに示した。本発明者らは、ＬＰＳチャレンジされたマウスの肺由来の好中球が、ＣＣＬ２受容体ＣＣＲ２を発現する[0]ことを示した。
【００１１】
こうして、本発明者らは、ＣＣＬ２（ＣＣＬ２遺伝子識別名称：ＨＧＮＣ：１０６１８；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１０８６９１（ＥｎｓｅｍｂｌバージョンＥＮＳＧ０００００１０８６９１．４）；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ（バージョン１６７）：Ｐ１３５００）を、ＡＬＩ／ＡＲＤＳの治療および／または予防のための新薬開発可能なターゲットとして同定した。
【００１２】
したがって、本発明者らは、ここで、特にＡＬＩ／ＡＲＤＳにおける、呼吸器における好中球の蓄積と関連する急性炎症の治療および／または予防のための新薬開発可能なターゲットとして、ＣＣＬ７およびＣＣＬ２を同定した。ＰＡＲ１およびＣＣＬ７に関する知見は、ＰＡＲ１および／または同一目的のためのＰＡＲ１−ＣＣＬ７系の他のメンバーのターゲッティングの可能性を上げる。
【００１３】
したがって、本発明は、呼吸器における好中球の蓄積と関連する急性炎症の治療または予防での使用のための、ＣＣＬ７、ＰＡＲ１、ＰＡＲ１−ＣＣＬ７系の別のメンバー、またはＣＣＬ２のアンタゴニストを提供する。
【００１４】
また、本発明は、呼吸器における好中球の蓄積と関連する急性炎症の治療または予防のための薬剤の製造での、ＣＣＬ７、ＰＡＲ１、ＰＡＲ１−ＣＣＬ７系の別のメンバー、またはＣＣＬ２のアンタゴニストの使用を提供する。
【００１５】
また、本発明は、呼吸器における好中球の蓄積と関連する急性炎症を治療または予防する方法であって、有効量のＣＣＬ７、ＰＡＲ１、ＰＡＲ１−ＣＣＬ７系の別のメンバー、またはＣＣＬ２のアンタゴニストを、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】３０分後にＰＡＲ１アンタゴニストＲＷＪ−５８２５９（５ｍｇ／ｋｇ）を治療的に投与して（ｉ．ｐ（腹腔内投与））、および投与せずに、ＬＰＳ（１２５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））または生理食塩水のチャレンジの３時間後にマウスを屠殺した。肺を洗浄（合計１．５ｍｌのＰＢＳ）または除去し、ＦＡＣＳ分析のためにホモジナイズした。合計（Ａ）、および差次的なＢＡＬ液の好中球（Ｂ）を、サイトスピンの血球計算器の数により定量化した。肺ホモジネート中の好中球ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を、ＥＬＩＳＡにより評価した（Ｃ）。ＢＡＬ液から（Ｄ）、または肺ホモジネートから（Ｅ）、分離したＧｒ−１＋好中球（Ｇｒ−１ｈｉｇｈＦ４／８０ｎｅｇ）を、フローサイトメトリーでさらに評価した。ＢＡＬＦマクロファージを、サイトスピン分析により評価した（Ｅ）。肺胞リークを、ＢＡＬＦから回収された血清アルブミンレベルにより測定した（Ｆ）。パネルは、３回の独立の実験によるｎ＝５／群に関する平均値を示す。データを、Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  Ｐｏｓｔ  Ｈｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した：＊＊＊ｐ<０．０００１、＊＊ｐ<０．０１、＊ｐ<０．０５。
【図２】ＬＰＳチャレンジの直後に、特異的なＰＡＲ１アンタゴニストＳＣＨ５３０３４８（１０ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ（腹腔内投与）で治療的に投与して、および投与せずに、ＬＰＳ（１２５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））のチャレンジの３時間後にマウスを屠殺した。肺を洗浄し、全細胞（Ａ）および好中球（Ｂ）を、血球計算器およびサイトスピン装置を用いてカウントした。肺全体を取り出してホモジナイズした。ケモカインＣＸＣＬ１（ＫＣ）およびＣＣＬ７を、ＥＬＩＳＡにより測定した（ＣおよびＤ）。データを、Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  Ｐｏｓｔ  Ｈｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した：＊ｐ<０．０５。
【図３】３０分後にＰＡＲ１アンタゴニストＲＷＪ−５８２５９（５ｍｇ／ｋｇ）を治療的に投与して（ｉ．ｐ（腹腔内投与））、および投与せずに、ＬＰＳ（１２５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））または生理食塩水のチャレンジの６時間または２４時間後にマウスを屠殺した。肺を洗浄した（合計１．５ｍｌのＰＢＳ）。データを、Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  Ｐｏｓｔ  Ｈｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した。
【図４】３０分後にＰＡＲ１アンタゴニストＲＷＪ−５８２５９（５ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ（腹腔内投与）で治療的に投与して、および投与せずに、肺炎連鎖球菌の接種（血清型１９、  ５０μｌ／マウス、５×１０６ＣＦＵ／マウス  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））の３時間後にマウスを屠殺した。肺を洗浄し（合計１．５ｍｌのＰＢＳ）、ＢＡＬ液の全白血球（ａ）および好中球（ｂ）を定量化した。肺炎連鎖球菌を肺ホモジネートから回収し、それぞれのコロニーをカウントした（ｃ）。パネルは、２回の独立した実験によるｎ＝５／群に関する平均値を示す。データを、Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  Ｐｏｓｔ  Ｈｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した：＊＊＊ｐ<０．０００１、＊ｐ<０．０５。
【図５】３０分後にＰＡＲ１アンタゴニストＲＷＪ−５８２５９（５ｍｇ／ｋｇ）を治療的に投与して（ｉ．ｐ（腹腔内投与））、および投与せずに、肺炎連鎖球菌の接種（血清型２、臨床株Ｄ３９、  ５０μｌ／マウス、５×１０６ＣＦＵ／マウス  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））の３時間後にマウスを屠殺した。肺を洗浄し（合計１．５ｍｌのＰＢＳ）、ＢＡＬ液の全白血球（Ａ）、マクロファージ（Ｂ）および好中球（Ｃ）を定量化した。気管支肺胞洗浄液を回収し、トロンビン−抗−トロンビン（ＴＡＴ）および血清アルブミンのレベルをＥＬＩＳＡにより定量化した（ＤおよびＥ）。パネルは、２回の独立した実験によるｎ＝５／群に関する平均値を示す。データを、Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  Ｐｏｓｔ  Ｈｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した：＊＊＊ｐ<０．０００１、＊ｐ<０．０５。
【図６】３０分後にＰＡＲ１アンタゴニストＲＷＪ−５８２５９（５ｍｇ／ｋｇ）を治療的に投与して（ｉ．ｐ（腹腔内投与））、および投与せずに、肺炎連鎖球菌の接種（血清型２、臨床株Ｄ３９、  ５０μｌ／マウス、５×１０６ＣＦＵ／マウス  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））の３時間後にマウスを屠殺した。肺を洗浄し（合計１．５ｍｌのＰＢＳ）、細菌コロニー形成単位（ｃｆｕ）を３時間後（Ａ）および２４時間後（Ｂ）にカウントした。２４時間後の肺（Ｃ）および脾臓（Ｄ）におけるｃｆｕにより、細菌性浸潤性疾患を測定した。データを、Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  Ｐｏｓｔ  Ｈｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した：ｎ．ｓ．有意差なし。
【図７】３０分後に高選択性のＰＡＲ１アンタゴニストＲＷＪ−５８２５９（５ｍｇ／ｋｇ）を治療的に投与して（ｉ．ｐ（腹腔内投与））、または投与しないで、ＬＰＳ（１２５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））または生理食塩水のチャレンジの３時間後にマウスを屠殺した。ＲＮＡを分離して１５１個の炎症性マーカーからなる低密度の遺伝子アレイを行なう前に、肺を取り出し、液体窒素下で凍らせて切断してホモジナイズした（Ａ）。ＬＰＳ処理後の遺伝子発現は、５１個のマーカーが差次的に制御されることが明らかとなった（Ｂ）。さらに２５個のマーカーが、ＰＡＲ１拮抗作用の後に減少した発現を示した（Ｃ）。ケモカインＣＣＬ２およびＣＣＬ７に加えて、これらの遺伝子のうち、炎症促進性サイトカインＴＮＦおよびＩＬ−６、および、好中球化学誘引物質ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ２をさらに示す（Ｄ）。データを、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  Ｐｏｓｔ  Ｈｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した：＊＊ｐ<０．０１、＊ｐ<０．０５。
【図８】３０分後にＰＡＲ１アンタゴニストＲＷＪ−５８２５９（５ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ（腹腔内投与）で投与して、または投与せずに、ＬＰＳ（１２５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））または生理食塩水のチャレンジの３時間後にマウスを屠殺した。肺を取り出し、ホモジナイズした。肺ホモジネート中の、ＴＮＦ（Ａ）、ＩＬ−６（Ｂ）ＣＸＣＬ１（Ｃ）、およびＣＸＣＬ２（Ｄ）のタンパク質レベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズアレイを用いて測定した。ＣＣＬ２（Ｈ）およびＣＣＬ７（Ｉ）のタンパク質レベルを、肺ホモジネートを用いてＥＬＩＳＡにより測定した。ｎ＝５／群の平均および標準誤差の値を示す。データを、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  Ｐｏｓｔ  Ｈｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した：＊＊＊ｐ<０．００１、＊＊ｐ<０．０１、＊ｐ<０．０５。
【図９】３０分後にＰＡＲ１アンタゴニストＲＷＪ−５８２５９（５ｍｇ／ｋｇ）を治療的に投与し（ｉ．ｐ（腹腔内投与））、および投与せずに、ＬＰＳ（１２５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））または生理食塩水のチャレンジの６時間または２４時間後にマウスを屠殺した。肺を取り出し、ホモジナイズした。表は、肺ホモジネートの低密度アレイを用いて解析した１５１個の炎症性メディエーターのプロファイルを示す。
【図１０】ＬＰＳ（１２５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））または生理食塩水のチャレンジの３時間後にマウスを屠殺した。マウスに、ＣＣＬ７中和抗体（１０μｇ／マウス）を経鼻チャレンジ量の範囲内で投与した。肺を洗浄し（合計１．５ｍｌのＰＢＳ）、抗−ＣＣＬ７の投与後に差次的なＢＡＬ液の好中球を定量化した（ａ）。肺ホモジネート中のＣＣＬ７（ｂ）ケモカインレベルを、処置したマウスを用いてＥＬＩＳＡにより測定した。２回の独立した実験に関するｎ＝５／群の平均および標準誤差の値を、各処置について示す。データを、Ｎｅｕｍａｎ  Ｋｅｕｌｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した：＊＊＊ｐ<０．０００１、＊＊ｐ<０．０１、＊ｐ<０．０５。ＬＰＳ（１２５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））または生理食塩水のチャレンジの１２時間前に、ＣＣＲ２に特異的な阻害抗体（抗−ＣＣＲ２；ＭＣ２１）またはアイソタイプコントロール（ＭＣ６７）（１０μｇ／マウス  ｉ．ｐ（腹腔内投与））でマウスを処置した。肺を洗浄し（合計１．５ｍｌのＰＢＳ）、差次的なＢＡＬ液の好中球を定量化した（ｃ）。血中のＧｒ−１＋／ＣＤ１１ｂ＋単球を、ＦＡＣＳにより定量化した（ｄ、丸で囲った）。ＬＰＳまたは生理食塩水のチャレンジの１２時間前に、マウスをさらにＣＣＲ１／ＣＣＲ２アンタゴニストで処置した（ｅ）。ｎ＝６／群の平均および標準誤差の値を示す。データを、Ｎｅｕｍａｎ  Ｋｅｕｌｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した：＊＊＊ｐ<０．０００１、＊＊ｐ<０．０１。
【図１１】ＣＣ−ケモカインは、ＬＰＳチャレンジに応答して初期の白血球蓄積に影響を与える。ＬＰＳ（１２５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））または生理食塩水のチャレンジの３時間後にマウスを屠殺した。マウスに、抗−ＣＣＬ２または抗−ＣＣＬ７中和抗体（１０μｇ／マウス）、またはコントロールＩｇＧを、経鼻チャレンジ量の範囲内で投与した。肺を取り出し、ホモジナイズし、そして、抗−ＣＣＬ２抗体の処理後に、ＣＣＬ２レベルをＥＬＩＳＡにより測定した（Ａ）。肺を洗浄し、ＢＡＬ液の全細胞（Ｂ）および好中球（Ｃ）を、抗−ＣＣＬ２の投与の後に定量化した。さらに、肺を取り出し、ホモジナイズし、そして、抗−ＣＣＬ７抗体の処理後に、ＣＣＬ７レベルをＥＬＩＳＡにより測定した（Ｄ）。肺を洗浄し、ＢＡＬ液の全細胞（Ｅ）および好中球（Ｆ）を定量化した。２回の独立した実験に関する少なくともｎ＝５／群の平均および標準誤差の値を、各処置について示す。データを、Ｎｅｗｍａｎ−ＫｅｕｌｓＰｏｓｔＨｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した：＊＊ｐ<０．０１、＊ｐ<０．０５；ｎ．ｓ．有意差なし。
【図１２】ＬＰＳ（１２５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））チャレンジの３時間後にマウスを屠殺した。ＣＸＣＬ１０、ＣＸ３ＣＲ１またはＣＣＬ１２中和抗体（１０μｇ／マウス）を、経鼻チャレンジ量の範囲内でマウスに投与した。肺を洗浄し（合計１．５ｍｌのＰＢＳ）、抗−ＣＸＣＬ１０、抗−ＣＸ３ＣＲ１または抗−ＣＣＬ１２中和抗体の投与の後に、差次的なＢＡＬ液の好中球を定量化した。治療したマウス由来の肺ホモジネート中の、ＣＸＣＬ１０（ａ）、ＣＸ３ＣＲ１（ｂ）またはＣＣＬ１２（ｃ）のケモカインのレベルを、ＥＬＩＳＡにより測定した。データを、Ｎｅｕｍａｎ  Ｋｅｕｌｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した。
【図１３】ＣＣＬ７に対する特異的な中和抗体（チャレンジ量の範囲内、１０μｇ／マウス  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））と共に、およびなしに、肺炎連鎖球菌（血清型２、臨床株Ｄ３９、  ５０μｌ／マウス、５×１０６ＣＦＵ／マウス  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））を接種した３時間後にマウスを屠殺した。肺を洗浄し（合計１．５ｍｌのＰＢＳ）、ＢＡＬ液の全白血球（Ａ）、および好中球（Ｂ）を定量化した。ＢＡＬＦから回収した細菌（ｃｆｕ）もカウントした（Ｃ）。データを、Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  Ｐｏｓｔ  Ｈｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した：＊＊ｐ<０．００１、＊ｐ<０．０５。
【図１４】ＰＡＲ１アンタゴニストと共に、またはなしに、ＬＰＳ（１２５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））をチャレンジした３時間後にマウスを屠殺した。ＣＸＣＬ１０（Ａ）およびＣＸ３ＣＬ１（Ｂ）のｍＲＮＡのレベルのＬＤＡ分析（１８ｓハウスキーピング遺伝子にノーマライズした）。マウスに、ＣＸＣＬ１０またはＣＸ３ＣＬ１中和抗体（１０μｇ／マウス）をＬＰＳ経鼻チャレンジ量の範囲内で投与した。肺を洗浄し（合計１．５ｍｌのＰＢＳ）、抗−ＣＸＣＬ１０（Ｃ）または抗−ＣＸ３ＣＬ１（Ｄ）中和抗体の投与後に、差次的なＢＡＬ液の好中球を定量化した。データを、Ｎｅｕｍａｎ  Ｋｅｕｌｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した：＊＊ｐ<０．０１。
【図１５】ナイーブマウスに、ｒＣＣＬ２またはｒＣＣＬ７（５００ｎｇ／マウス、ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））のいずれかを投与し、３時間後にＢＡＬ液を回収した。ＢＡＬ液の全細胞数（Ａ）および全好中球（Ｂ）を、サイトスピン調製物について行なわれた差次的な細胞のカウントから計算した。ＢＡＬ液中の好中球のパーセンテージも計算した（Ｃ）。差次的な細胞のカウントは、生理食塩水（Ｄ）、ｒＣＣＬ２（Ｅ）またはｒＣＣＬ７（Ｆ）の投与後に、サイトスピン調製物について行なった。データを、Ｎｅｗｍａｎ−ＫｅｕｌｓＰｏｓｔＨｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した：＊ｐ<０．０５、＊＊ｐ<０．０１、＊＊＊ｐ<０．００１。矢印は：Ｎ、好中球；Ｍ、単球／マクロファージを示す。
【図１６】マウスに１２５μｇ／ｋｇのＬＰＳ（ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））をチャレンジし、肺全体を膨張させ、３時間後に固定した。生理食塩水で処置したコントロールと、３０分後にＰＡＲ１アンタゴニストＲＷＪ−５８２５９（５ｍｇ／ｋｇ）を治療的に投与して処置してまたは処置せずにＬＰＳをチャレンジしたマウスとの間で、ＣＣＬ７（ａ、ｂおよびｃ）またはＧｒ−１（ｄ、ｅおよびｆ）の免疫組織化学染色を比較した［ＡＥＷ］。内皮−上皮バリアの崩壊を、３０分後にＰＡＲ１アンタゴニストＲＷＪ−５８２５９（５ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ（腹腔内投与）で治療的に投与して、および投与せずに、ＬＰＳ（１２５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））チャレンジ（ｇ）または肺炎連鎖球菌チャレンジ（ｈ）の３時間後のマウス由来のＢＡＬ液中の血清アルブミンの量として、ＥＬＩＳＡにより測定した。
【図１７】健康なヒトボランティアを、０．９％生理食塩水を噴霧で、または滅菌生理食塩水中にチャレンジし（最終ＬＰＳ投与量は５０μｇであった）、６時間後にＢＡＬ液を回収した。生理食塩水で処置した、またはＬＰＳをチャレンジした、ヒトボランティア由来のＢＡＬ液中のＣＣＬ７タンパク質レベルを、ＥＬＩＳＡにより測定した（ａ）。組み換えヒト（ｒｈ）ＣＸＣＬ８またはｒｈＣＣＬ７に応答したヒト好中球の化学走性を、５μｍメンブレン（ＣｈｅｍｏＴＸ，ＮｅｕｒｏＰｒｏｂｅ）を通して測定した（ｂ）。ＬＰＳで処置したヒトＢＡＬ液へ向かう好中球の化学走性を、中和抗−ＣＸＣＬ８または抗−ＣＣＬ７抗体（ｃ）の存在下で測定した。集中治療室でＡＬＩを患っている患者から、ＢＡＬ液を回収した。ＡＬＩ  ＢＡＬ液中の、ＣＣＬ７タンパク質（ｄ）およびＣＣＬ２タンパク質（ｆ）を、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＡＬＩを有する患者から得られたＢＡＬ液へ向かう好中球の化学走性を、中和抗−ＣＸＣＬ８および抗−ＣＣＬ７抗体の存在下で測定した（ｅ）。統計分析を、ＡＮＯＶＡ＊＊（ａ）および対応のあるスチューデントｔ検定（ｂ、ｃ、ｅ、ｆ）を用いて行なった。
【図１８】血液および肺から分離した好中球のＣＣ−ケモカイン受容体発現。マウスに、ＬＰＳ（１２５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））を投与し、または投与せずに（ナイーブ）、血液および肺を分離し、単細胞懸濁液を調製した。細胞をＬｙ６Ｇに関して染色し、好中球の集団を特異的にゲートした（ＦＳｃに対してＬｙ６Ｇｈｉｇｈ）。好中球上のＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３およびＣＸＣＲ２の発現を計算し、ドットプロットとして表した。血液（Ａ）、ナイーブの肺（Ｂ）およびＬＰＳで処理した肺（Ｃ）から分離した好中球を分析し、ケモカイン受容体ポジティブ細胞のパーセンテージを計算した（Ｄ）。データを、Ｎｅｗｍａｎ−ＫｅｕｌｓＰｏｓｔＨｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した：＊ｐ<０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ＣＣＬ７のブロッキング
本発明のＣＣＬ７アンタゴニストは、ＣＣＬ７の機能をブロックする。ＣＣＬ７のブロッキングは、その活性または機能における、ＡＬＩ／ＡＲＤＳの治療および／または予防に有利な効果をもたらす任意の減少を含む。
【００１８】
典型的に、ＣＣＬ７のブロッキングは、好中球増加の低減、好中球浸潤の低減、好中球蓄積の低減、および／または、肺内の、特に肺胞スペース内の、好中球の合計数の低減をもたらす。好ましくは、この低減は、好中球の遊走または好中球の化学走性を低減させるＣＣＬ７の阻害により仲介される。好中球の遊走は、Ｌｙ６Ｇ＋好中球の数を定量化する分析により測定され得る。また、ＣＣＬ７のブロッキングは、好中球がＣＸＣＬ８などの古典的な化学誘引物質に応答する能力も低減し得る。
【００１９】
ブロッキングは、ＣＣＬ７の活性または機能の全体的および部分的の両方の低減を含み、例えば、ＣＣＬ７／ＣＣＲ１、ＣＣＬ７／ＣＣＲ２、ＣＣＬ７／ＣＣＲ３の相互作用の全体的または部分的な予防を含む。例えば、本発明のブロッキングアンタゴニストは、ＣＣＬ７の活性を１０〜５０％、少なくとも５０％、または少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％低減し得る。
【００２０】
ＣＣＬ７活性または機能のブロッキングは、任意の適切な方法で測定することができる。例えば、ＣＣＬ７／ＣＣＲ１、ＣＣＬ７／ＣＣＲ２、ＣＣＬ７／ＣＣＲ３の相互作用の阻害は、ＣＣＲのリン酸化、それらの関連するＧ結合タンパク質のリン酸化、または、ＥＲＫ１またはＥＲＫ２のリン酸化に対する効果を測定することにより判定することができる。ＣＣＲ活性化もまた、Ｃａ２＋動員により測定することができる。好中球の活性化もまた、例えば、好中球活性化の尺度としてのミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性、エラスターゼ、または、好中球活性化の尺度としてのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ、例えばＭＭＰ１〜９のいずれか）の放出、形状変化アッセイ、または、好中球活性化の尺度としての活性酸素種（ＲＯＳ）の放出により測定することができる。
【００２１】
また、ＣＣＬ７のブロッキングは、遊走または化学走性を測定する分析、例えば、Ｂｏｗｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒアッセイまたはＣｈｅｍｏＴＸアッセイなどの、好中球の化学走性の分析を介して測定することができる。
【００２２】
また、ＣＣＬ７のブロッキングは、肺胞毛管バリアに対するＣＣＬ７の効果を測定する分析、例えば、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の血清アルブミンのレベルを測定する分析を介して測定することができる。好ましくは、ＣＣＬ７のブロッキングは、肺胞毛管バリアの崩壊を低減し、したがって、ＢＡＬ液中の血清アルブミンのレベルを低下させる。
【００２３】
ブロッキングは、例えば、用いられるアンタゴニストの特性（以下参照）、例えば、ＣＣＬ７／ＣＣＲ１、ＣＣＬ７／ＣＣＲ２、ＣＣＬ７／ＣＣＲ３の相互作用の直接的または間接的のいずれでの立体障害、またはＣＣＬ７発現のノックダウンに依存して、任意の適切なメカニズムを介して行われ得る。
【００２４】
ＰＡＲ１および／またはＰＡＲ１−ＣＣＬ７系の他のメンバーのブロッキング
ＰＡＲ１および／またはＰＡＲ１−ＣＣＬ７系の他のメンバーもまた、ＣＣＬ７に関して上述した様式でブロックすることができる。適切なＰＡＲ１−ＣＣＬ７系メンバーのターゲットは、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２およびＣＣＲ３を含む。
【００２５】
ＰＡＲ１のブロッキングは、好ましくは、特定のサイトカインまたはケモカインの存在またはレベルを測定する分析を介して測定することもできる。典型的に、ＰＡＲ１のブロッキングは、ＣＣＬ７（タンパク質またはｍＲＮＡ）の発現を低減させるが、ＣＸＣＬ１発現に対して影響を及ぼさない。ＣＸＣＬ１０またはＣＸＣ３ＣＬ１のいずれのブロッキングも好中球の遊走に影響を及ぼさないが、ＰＡＲ１のブロッキングは、ＣＸＣＬ１０および／またはＣＸＣ３ＣＬ１発現における低減によって測定してもよい。
【００２６】
また、ＰＡＲ１のブロッキングは、マクロファージの数を測定する分析によって測定してもよい。典型的に、ＰＡＲ１のブロッキングは、組織へのマクロファージの流入を減少させる。
【００２７】
また、ＰＡＲ１のブロッキングは、トロンビン−抗−トロンビン（ＴＡＴ）の存在またはレベルを測定する分析によって測定してもよい。
【００２８】
ＣＣＬ２のブロッキング
ＣＣＬ２もまた、ＣＣＬ７に関して上述した様式でブロックすることができる。ＣＣＬ２のブロッキングは、その活性または機能における、ＡＬＩ／ＡＲＤＳの治療および／または予防に有利な効果をもたらす任意の低減を含む。
【００２９】
典型的に、ＣＣＬ２のブロッキングは、好中球増加の低減、好中球浸潤の低減、好中球蓄積の低減、および／または、肺内、特に肺胞スペース内の好中球の合計数の低減をもたらす。好ましくは、この低減は、好中球の遊走または好中球の化学走性を低減させるＣＣＬ２のブロッキングにより仲介される。
【００３０】
ＣＣＬ２のブロッキングの測定は、本明細書中でＣＣＬ７拮抗作用に関して記載される任意の技術を用いて達成され得る。任意の適切なＣＣＬ２アンタゴニストを用いてよい。ＣＣＬ２アンタゴニストは、本明細書中に記載の任意のタイプであってよい。例えば、本発明のＣＣＬ２アンタゴニストは、ペプチドおよびペプチド模倣物；抗体；低分子阻害剤；二本鎖ＲＮＡ；アンチセンスＲＮＡ；アプタマー；およびリボザイムから選択してよい。好ましいアンタゴニストは、抗体を含む。
【００３１】
アンタゴニスト
任意の適切なアンタゴニスト、例えば、ペプチドおよびペプチド模倣物；抗体；低分子阻害剤；二本鎖ＲＮＡ；アンチセンスＲＮＡ；アプタマー；およびリボザイムを、本発明に従って用いてよい。好ましいアンタゴニストは、ＣＣＬ７、他のＰＡＲ１−ＣＣＬ７系メンバーのターゲット（ＰＡＲ１、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２およびＣＣＲ３および／またはＣＣＬ２など）のペプチドフラグメント；アンチセンスＲＮＡ、アプタマーおよび抗体を含む。
【００３２】
ペプチド
ＣＣＬ７のペプチドアンタゴニストは、典型的に、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２および／またはＣＣＲ３に対する結合に関してＣＣＬ７全長と競合し、したがってＣＣＬ７に拮抗する、ＣＣＬ７のフラグメントである。同様に、ＣＣＬ２のペプチドアンタゴニストは、典型的に、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２および／またはＣＣＲ３を含むその受容体に対する結合に関してＣＣＬ２全長と競合し、したがってＣＣＬ２に拮抗する、ＣＣＬ２のフラグメントである。そのようなペプチドは、線状または環状であってよい。ペプチドアンタゴニストは、典型的に、５〜５０、好ましくは１０〜４０、１０〜３０または１５〜２５のアミノ酸長であり、通常、ＣＣＬ７またはＣＣＬ２内からの連続する配列と同一であるが、ＣＣＬ７ブロッキングまたはＣＣＬ２ブロッキングの特性を保持する限り、１００％未満、例えば９５％以上、９０％以上、または８０％以上の同一性を有してよい。ブロッキングペプチドは、任意の適切な様式で、例えば、ＣＣＬ７またはＣＣＬ２配列のスパニング部分または全体の、連続またはオーバーラップするペプチドの体系的なスクリーニングにより、決定することができる。また、ペプチド模倣物は、そのようなブロッキングペプチドを模倣するように設計され得る。ＰＡＲ１および他のＰＡＲ１−ＣＣＬ７系メンバーのターゲットに関するブロッキングペプチドおよびペプチド模倣物もまた同様に設計することができる。
【００３３】
二本鎖ＲＮＡ
公知技術を用い、ＣＣＬ７、別のＰＡＲ１−ＣＣＬ７系メンバーのターゲット、またはＣＣＬ２の配列の知識に基づき、ターゲットに拮抗するように、そのＲＮＡのシーケンスホモロジーに基づくターゲッティングにより、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を設計することができる。そのようなｄｓＲＮＡは、典型的に、通常はステムループ（「ヘアピン」）立体配置での低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または、ミクロ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。そのようなｄｓＲＮＡの配列は、ターゲットをコードするｍＲＮＡの部分の配列に一致する部分を含む。この部分は、通常、ターゲットｍＲＮＡ内のターゲット部分に１００％相補であるが、より低いレベルの相補性（例えば９０％以上、または９５％以上）もまた用いてよい。
【００３４】
アンチセンスＲＮＡ
公知技術を用い、ターゲットの配列の知識に基づき、ターゲットに拮抗するように、それらのＲＮＡのシーケンスホモロジーに基づくターゲッティングにより、一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子を設計することができる。そのようなアンチセンスの配列は、ターゲットをコードするｍＲＮＡの部分の配列に一致する部分を含む。この部分は、通常、ターゲットｍＲＮＡ内のターゲット部分に１００％相補であるが、より低いレベルの相補性（例えば９０％以上、または９５％以上）もまた用いてよい。
【００３５】
アプタマー
アプタマーは、一般に、特異的なターゲット分子に結合する核酸分子である。アプタマーは、インビトロで完全に改変することができ、化学合成により容易に製造され、望ましい保管特性を有し、治療的適用において免疫原性をほとんど誘発しないか、または全く誘発しない。これらの特徴は、それらを調剤用途および治療用途において特に有用にする。
【００３６】
本明細書において用いられる「アプタマー」は、一般に、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチド、またはそのようなオリゴヌクレオチドの混合物を指し、ここで、オリゴヌクレオチドまたは混合物は、ターゲットに対して特異的に結合することが可能である。オリゴヌクレオチドアプタマーについて本明細書に記載するが、これを読む当業者は、ペプチドアプタマーなどの、同等の結合特性を有する他のアプタマーもまた用いることができることを理解するであろう。
【００３７】
一般に、アプタマーは、少なくとも５、少なくとも１０、または少なくとも１５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含んでよい。アプタマーは、最大で４０の、最大で６０の、または最大で１００以上のヌクレオチドの長さの配列を含んでよい。例えば、アプタマーは、５〜１００のヌクレオチド、１０〜４０のヌクレオチド、または１５〜４０のヌクレオチドの長さであってよい。可能であれば、より短い長さのアプタマーは、大抵他の分子または物質によるより低い干渉をもたらすので、好ましい。
【００３８】
無改変のアプタマーは、主にヌクレアーゼ分解および腎臓による体からの除去により、数分から数時間の半減期で血流から急速に除去される。そのような無改変のアプタマーは、一過的な状態の処置において、例えば血液凝固の刺激において、有用である。あるいは、アプタマーは、それらの半減期を改善するために改変をしてよい。２’フッ素置換ピリミジン類の付加またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合など、様々なそのような改変が利用可能である。
【００３９】
アプタマーは、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）の方法のような、常法を用いて製造してよい。ＳＥＬＥＸは、ターゲット分子に対して特異的結合が高い核酸分子のインビトロ展開のための方法である。例えば、ＵＳ５，６５４，１５１、ＵＳ５，５０３，９７８、ＵＳ５，５６７，５８８、およびＷＯ９６／３８５７９に記載されている。
【００４０】
ＳＥＬＥＸ法は、オリゴヌクレオチドのコレクションからの、核酸アプタマーおよび特に所望のターゲットに結合することが可能な一本鎖核酸の選択を含む。一本鎖核酸のコレクション（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの変異体）は、結合に好ましい条件下でターゲットと接触させられ、混合物中のターゲットに結合したこれらの核酸は、結合しないものから分離され、核酸−ターゲットの複合体が分離され、ターゲットに対して結合を有したこれらの核酸が増幅され、所望の結合活性を有する核酸が濃縮されたコレクションまたはライブラリーを生じ、それから、この一連のステップが必要に応じて繰り返されて、関連のあるターゲットに特異的な結合親和性を有する核酸（アプタマー）のライブラリーが製造される。
【００４１】
抗体
本明細書で言及する用語「抗体」は、抗体全体および任意の抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部位」）またはそれらの単鎖を含む。抗体は、ジスルフィド結合により内部結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖、またはそれらの抗原結合部位を含む、糖タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中でＶＨと省略される）および重鎖定常領域からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと省略される）および軽鎖定常領域からなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）が散在する相補性決定領域領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。
【００４２】
抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第一構成要素（Ｃｌｑ）を含む、宿主の組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を仲介し得る。
【００４３】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってよく、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の抗体は、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ナノボディ、ヒト抗体またはヒト化抗体、または、それらのいずれかの抗原結合部位であってよい。モノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方の製造に関して、実験動物は、典型的に非ヒトの哺乳類、例えばヤギ、ウサギ、ラットまたはマウスであるが、ラクダ科などの他の種が挙げられてもよい。
【００４４】
ポリクローナル抗体は、目的の抗原を用いた適切な動物の免疫化などの常法により製造してよい。続いて動物から血液を採取してＩｇＧ画分を精製してよい。
【００４５】
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術のような従来のモノクローナル抗体の方法を含む、様々な技術により製造することができる。ハイブリドーマを製造する好ましい動物系はミューリン系である。マウスでのハイブリドーマ製造は非常によく実証された方法であり、当技術分野でよく知られている技術を用いて達成することができる。
【００４６】
本発明による抗体は、ＣＣＬ７、別のＰＡＲ１−ＣＣＬ７系メンバーのターゲット、またはＣＣＬ２の全長、ＣＣＬ７、別のＰＡＲ１−ＣＣＬ７系メンバーのターゲット、またはＣＣＬ２のペプチドフラグメント、または、ＣＣＬ７内、別のＰＡＲ１−ＣＣＬ７系メンバーのターゲット内、またはＣＣＬ２内のエピトープを含む免疫原を用いて、非ヒトの哺乳類を免疫化するステップ；前記哺乳類から調製された抗体を取得するステップ；および、そこから、前記エピトープを特異的に認識するモノクローナル抗体を得るステップを含む方法により製造してよい。
【００４７】
抗体の「抗原結合部位」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、抗体全長のフラグメントにより発揮することができることが示されている。抗体の「抗原結合部位」という用語の範囲に包含される結合フラグメントの例は、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、および分離された相補性決定領域領域（ＣＤＲ）を含む。ｓｃＦｖ抗体などの単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部位」という用語の範囲に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて得てよく、そのフラグメントは、完全な抗体と同じ様式で有用性に関してスクリーニングしてよい。
【００４８】
本発明の抗体は、（ａ）目的の免疫グロブリン遺伝子についてのトランスジェニックまたはトランスクロモソームの動物（例えばマウス）から分離した抗体、または、それから調製されたハイブリドーマ、（ｂ）目的の抗体を発現するために形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから、分離された抗体、（ｃ）組み換え、組み合わせ抗体ライブラリーから分離した抗体、および、（ｄ）他のＤＮＡ配列への免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段により、調製され、発現され、作製され、または、分離された抗体など、組み換え手段により調製され、発現され、作製され、または分離されてよい。
【００４９】
本発明の抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であってよい。本明細書において用いられる用語「ヒト抗体」は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方ともがヒト生殖細胞系の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図される。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もまた、ヒト生殖細胞系の免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系の免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ランダムまたは部位特異的なインビトロでの突然変異誘発により、または、インビボでの体細胞突然変異により、導入された変異）を含んでよい。しかしながら、本明細書において用いられる用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳類の種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に融合された抗体を含むことを意図しない。
【００５０】
そのようなヒト抗体は、ヒトモノクローナル抗体であってよい。そのようなヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖トランスジーンおよび軽鎖トランスジーンを含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物（例えばトランスジェニックマウス）から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマにより生産され得る。
【００５１】
ヒト抗体は、ヒトリンパ球のインビトロでの免疫化の後に、エプスタイン・バーウイルスを用いてリンパ球を形質転換することにより、製造され得る。
【００５２】
用語「ヒト抗体誘導体」は、ヒト抗体の任意の改変体、例えば、抗体と別の因子または抗体とのコンジュゲートを指す。
【００５３】
用語「ヒト化抗体」は、マウスなど別の哺乳類の種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に融合された抗体を指すことが意図される。さらなるフレームワーク領域の改変が、ヒトフレームワーク配列内にされてよい。
【００５４】
本明細書中に記載されるスクリーニング方法を用いて、ＣＣＬ７、別のＰＡＲ１−ＣＣＬ７系メンバーのターゲット、またはＣＣＬ２に結合することが可能な適切な抗体を同定してよい。したがって、本明細書中に記載のスクリーニング方法は、目的の抗体を試験化合物として用いて実施してよい。
【００５５】
本発明の抗体は、例えば、標準的なＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティングにより、ＣＣＬ７、別のＰＡＲ１−ＣＣＬ７系メンバーのターゲット、またはＣＣＬ２に対する結合について試験することができる。また、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ターゲットタンパク質とポジティブの反応性を示すハイブリドーマをスクリーニングすることもできる。また、抗体の結合特異性は、例えばフローサイトメトリーによって、ターゲットタンパク質を発現している細胞に対する抗体の結合をモニターすることにより判定してよい。したがって、本発明のスクリーニング方法は、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットを行なうことにより、またはフローサイトメトリーにより、ＣＣＬ７または別のＰＡＲ１−ＣＣＬ７系メンバーのターゲットに結合することが可能な抗体を同定するステップを含んでよい。それから、さらに上述されるように、必要とされる結合特性を有する抗体をさらに試験して、ＣＣＬ７、別のＰＡＲ１−ＣＣＬ７系メンバーのターゲット、またはＣＣＬ２の活性に対するそれらの効果を判定してよい。
【００５６】
本発明の抗−ＣＣＬ７抗体は、上述したように、ＣＣＬ７拮抗（ブロッキング）特性を有する。一実施態様では、モノクローナル抗体は、ＣＣＬ７内のエピトープを特異的に認識して、ＣＣＬ７の活性をブロックする。一実施態様では、モノクローナル抗体は、ＣＣＬ７内のエピトープを特異的に認識して、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２および／またはＣＣＲ３およびＣＣｌ７との間の相互作用をブロックする。
【００５７】
本発明の抗−ＣＣＬ２抗体は、上述したように、ＣＣＬ２拮抗（ブロッキング）特性を有する。一実施態様では、モノクローナル抗体は、ＣＣＬ２内のエピトープを特異的に認識して、ＣＣＬ２の活性をブロックする。一実施態様では、モノクローナル抗体は、ＣＣＬ２内のエピトープを特異的に認識して、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２および／またはＣＣＲ３およびＣＣｌ７との間の相互作用をブロックする。
【００５８】
本発明の抗体は、ＣＣＬ７、別のＰＡＲ１−ＣＣＬ７系メンバーのターゲット、またはＣＣＬ２を、すなわち、ＣＣＬ７内または別のＰＡＲ１−ＣＣＬ７系メンバーのターゲット内またはＣＣＬ２内のエピトープを、特異的に認識する。抗体または他の化合物は、選択的または高親和力でタンパク質に結合し、そのタンパク質には特異的であるが、他のタンパク質には実質的に結合しないか低親和力で結合する場合に、タンパク質に「特異的に結合」または「特異的に認識」する。ターゲットタンパク質に関する本発明の抗体の特異性は、上述の他の関係あるタンパク質に抗体が結合するか否か、または、それらの間で区別されるかを判定することにより、さらに試験してよい。例えば、本発明の抗−ＣＣＬ７抗体は、ヒトＣＣＬ７に結合し得るが、マウスまたは他の哺乳類のＣＣＬ７には結合しない。
【００５９】
本発明の抗体は、ＣＣＬ７、別のＰＡＲ１−ＣＣＬ７系メンバーのターゲット、またはＣＣＬ２に、高親和力で、好ましくはピコモル範囲で、例えば、表面プラズモン共鳴または任意の他の適切な技術により測定して、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下、または１００ｐＭ以下の親和定数（ＫＤ）で、好適に結合する。
【００６０】
適切な抗体を同定および選択したら、抗体のアミノ酸配列を、当技術分野で知られている方法により同定してよい。抗体をコードする遺伝子は、縮重プライマーを用いてクローン化することができる。抗体は、常法により組み換えで製造してよい。
【００６１】
ＣＣＬ７内、他のＰＡＲ１−ＣＣＬ７系メンバーのターゲット内、およびＣＣＬ２内のエピトープは、当技術分野で知られていて本明細書中に述べられる方法により、とりわけ、「ＰＥＰＳＣＡＮ」法を介した連続またはオーバーラップするペプチドの体系的なスクリーニングにより、または、ＣＣＬ７を阻害することが示されたペプチドフラグメント（上記参照）に対する抗体を形成することにより、同定することができる。エピトープ含有ペプチドは、抗体産生のための免疫原として用いることができる。抗体を生じさせるために好ましいエピトープは、ＣＣＬ７がその受容体に結合する際に介するものを含む。ＣＣＬ受容体の結合のための推定配列は、パラロガスＣＣ−ケモカインの受容体結合に基づく。したがって、好ましいエピトープは、Ｎ末領域に、Ｎループ内に、３０ｓループ内に、および、ジスルフィド結合に隣接して、およびαへリックス領域内に、位置することを予想することができる。
【００６２】
ＰＡＲ１のアンタゴニスト
本発明により用いることのできる公知のＰＡＲ１アンタゴニストは、ｖｏｒｏｐａｘａｒおよびａｔｏｐａｘａｒを含む。他の公知のＰＡＲ１アンタゴニストもまた、用いることができる。
【００６３】
ＣＣＬ２のアンタゴニスト
本発明により用いることのできる公知のＣＣＬ２アンタゴニストは、改変されたケモカインＭＣＰ−１（９−７６）（ＪＥＭ  ｖｏｌ．１８６  ｎｏ．１  １３１−１３７）およびＳＲ１６９５１（ＣＣＬ２の低分子アンタゴニストである（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００９，１８２，５０．１３））を含む。他の公知のＣＣＬ２アンタゴニストは、Ｃ２４３（これも低分子アンタゴニストである）、およびｍＮＯＸ−Ｅ３６を含む（Ｇｕｔ．２０１２  Ｍａｒ；６１（３）：４１６−２６）。抗−ＣＣＬ２中和抗体は市販もされている。他の公知のＣＣＬ２アンタゴニストもまた、用いることができる。
【００６４】
また、ＣＣＬ２の活性は、ＣＣＲ２阻害剤を用いて阻害され得る。公知のＣＣＲ２阻害剤を、以下の表に挙げる。
【表１】
2015511625.tif 000003
表１  ＣＣＲ２阻害剤の実験および臨床の状態の概要（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．２０１１  Ｊｕｎ；２０（６）：７４５−５６）
【００６５】
治療適応症
本発明のアンタゴニストは、特に、急性肺損傷（ＡＬＩ）および急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）として知られる状態における、呼吸器における好中球の蓄積と関連する急性炎症を治療および／または予防するために用いてよい。
【００６６】
ＡＬＩは、肺に悪影響を及ぼすが、必ずしも気道には悪影響を及ぼさない、急性疾患である。ＡＬＩは、肺胞上皮および毛管内皮における崩壊により特徴付けられ、まとめて毛管−肺胞バリアと呼ばれる。ＡＬＩの２つの主な特徴は、肺胞空間における流体の蓄積および好中球の遊走である。ＡＬＩは、ＩＬ−１βおよびＴＮＦなどの炎症促進性サイトカインおよびトロンビンなどの凝固系の構成要素の放出を含む、急速な疾患の発症と関連する。ＡＬＩは、適応免疫よりむしろ先天性免疫の構成要素の活性化を伴うと考えられる。ＡＲＤＳは、より重度の形態のＡＬＩである。
【００６７】
臨床状況では、ＡＬＩ／ＡＲＤＳは、低酸素血症、肺水腫および放射線学的異常により特徴付けられ、公知の臨床的損傷に続き、または、新規の／悪化する呼吸性症状に続き、急速な発症を有する。ＡＬＩ／ＡＲＤＳの最新の推奨される定義は以下のとおりである：低酸素血測定のＰａＯ２／ＦｉＯ２が２０１〜３００（軽度）、２００以下（中度）、１００以下（重度）；心不全または水分過負荷により説明されない呼吸不全を有し；放射線学的異常があり；および、重症のさらなる生理学的障害がある。この定義は、米国胸部学会からの情報提供により２０１２年のＥＳＩＣＭ年次会議で提案された。しかしながら、１９９６年の合意定義が、おそらく今でもなお、最も広く用いられていて、それは以下のとおりである：肺動脈楔入圧が１８ｍｍＨｇ未満；心不全の臨床的証拠がなく；および、低酸素血測定がＡＬＩではＰａＯ２／ＦｉＯ２<３００であり、ＡＲＤＳでは<２００である。これらのいずれかを用いて、本発明の目的に関してＡＬＩ／ＡＲＤＳを定義してよい。
【００６８】
好ましくは、本発明のアンタゴニストは、免疫機能を完全に消滅させることなく、過剰な好中球蓄積を減少させる。さらに好ましくは、ＣＣＬ７、別のＰＡＲ１−ＣＣＬ７系メンバーのターゲット、またはＣＣＬ２の阻害は、過剰な好中球増加により生じるバイスタンダー組織の損傷を低減させ、同時に、宿主防御のための十分な免疫を保持し、内皮−上皮バリアの完全性を維持し、それにより、不要な組織損傷の減少と防御免疫応答の維持との間のバランスを達成する。
【００６９】
したがって、本発明は、呼吸器における好中球の蓄積と関連する急性炎症の治療および／または予防に関する。そのような急性炎症は、肺空間、気管支、気管支壁または間質空間に見られ得る。
【００７０】
また、本発明は、任意の原因から生じるＡＬＩ／ＡＲＤＳの治療および／または予防に関する。これらは、間接的および直接的の両方の原因を含む。間接的な原因は、敗血症（敗血症、内毒血症）、膵炎および肺遠位の組織外傷を含む。直接的な原因は、肺への外傷、細菌感染（市中肺炎が最も一般的であり、肺炎連鎖球菌がその最も一般的な病原学的因子であるが、ＡＬＩ／ＡＲＤＳは、インフルエンザ菌または肺炎クラミジアなどの他の細菌による感染に起因し得る）、ウイルス感染（最も一般的な病原学的因子は、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、例えば重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、およびサイトメガロウイルスであり、免疫不全に特有の問題である）、および、他の呼吸性疾患、例えば、新生児呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）、気管支拡張症（その根底にある原因、例えば、スタフィロコッカス種、クレブシエラ種、および百日咳菌による感染を含む）、特に急性憎悪に関連する慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む。
【００７１】
医薬組成物、用量および投与計画
本発明のアンタゴニストは、典型的に、薬学的に許容できる担体とともに、医薬組成物に製剤化される。
本明細書において用いられる「薬学的に許容できる担体」は、任意かつ全ての、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤など、生理的に適合するものを含む。担体は、非経口投与、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、眼球内投与または硝子体内投与（例えば、注射または注入による）に適切である。好ましくは、担体は、鼻腔内投与または吸入投与に適切である。投与経路に応じて、化合物を不活性化し得る酸および他の自然条件の作用から化合物を保護するために、物質内にモジュレーターをコーティングしてよい。
【００７２】
本発明の医薬化合物は、１つまたは複数の薬学的に許容できる塩を含んでよい。「薬学的に許容できる塩」は、元の化合物の所望の生物学的活性を保ち、いかなる望ましくない毒性作用も与えない塩を指す。そのような塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。
【００７３】
好ましい薬学的に許容できる担体は、水性担体または希釈剤を含む。本発明の医薬組成物に用いられ得る適切な水性担体の例は、水、緩衝水、および生理食塩水を含む。他の担体の例は、エタノール、ポリオール類（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、および、それらの適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、および、注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルを含む。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール類、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを、組成物中に含むことが好ましい。
【００７４】
治療組成物は、典型的に、滅菌され、製造および保管の条件下で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または、高濃度の薬に適切な他の秩序構造として、製剤化することができる。
【００７５】
本発明の医薬組成物は、本明細書中に述べられる、さらなる活性成分を含んでよい。
【００７６】
本発明のアンタゴニストおよび使用のための説明書を含むキットもまた、本発明の範囲内である。キットは、１つまたは複数のさらなる試薬、例えば、上述のさらなる治療的または予防的薬剤をさらに含んでよい。
【００７７】
本発明のアンタゴニストおよび組成物は、予防的および／または治療的な処置のために投与してよい。
【００７８】
治療用途では、モジュレーターまたは組成物は、上述の障害または状態を既に患っている対象に、状態または１つまたは複数のその症状を、治療する、緩和する、または部分的に抑止するのに十分な量で投与される。そのような治療的処置は、疾患症状の重症度の低下、または、症状のない期間の頻度または持続時間の増加をもたらし得る。これを達成するのに十分な量を、「治療的有効量」と定義する。
【００７９】
予防用途では、製剤は、上述の障害または状態のリスクがある対象に、状態または１つまたは複数のその症状の、その後の影響を予防または減少させるのに十分な量で投与される。これを達成するのに十分な量を、「予防的有効量」と定義する。それぞれの目的のための有効量は、疾患または損傷の重症度、および、対象の体重および全身状態に依存する。
【００８０】
本発明のアンタゴニストの投与のための対象は、ヒトまたは非ヒト動物であってよい。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。ヒトへの投与が好ましい。
【００８１】
本発明のアンタゴニストは、当技術分野で知られている様々な方法のうちの１つまたは複数を用いて、１つまたは複数の投与経路を介して投与してよい。熟練した技術者に理解されるように、投与経路および／または投与方法は、要求される結果に応じて変化する。本発明のモジュレーターのための投与経路は、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、眼球内投与、腹腔内投与、皮下投与、脊椎投与、または、他の非経口投与の経路、例えば、注入または点滴による投与を含む。本明細書において用いられる語句「非経口投与」は、通常は注入による、腸内および局所投与以外の投与方法を意味する。あるいは、本発明のアンタゴニストは、非経口でない経路、例えば、局所投与、上皮投与または粘膜投与の経路を介して投与することができる。好ましくは、本発明のアンタゴニストは、鼻腔内または吸入の経路により投与される。
【００８２】
本発明のモジュレーターの適切な用量は、熟練医師により決定され得る。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、特定の患者に対して所望の治療応答を達成するのに効果的な活性成分の量、組成物、および投与方法を、患者に対して毒性にならずに得るように変更し得る。選択される用量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排泄率、治療の持続時間、用いられる特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬剤、化合物および／または物質を含む様々な薬物動態因子、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、健康全般および以前の病歴、および、医療分野においてよく知られる同様の因子に依存する。
【００８３】
適切な用量は、例えば、治療される患者の約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であってよい。例えば、適切な用量は、１日あたり約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、または、１日あたり約１０ｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。
【００８４】
投与計画は、最適な所望の応答（例えば治療応答）を提供するように調節してよい。例えば、単回量を投与してよく、数回の分割量を時間をかけて投与してよく、または、治療状況の緊急性に示されるとおりに投与量を比例的に減少または増加させてよい。本明細書において用いられる投与単位の形態は、治療される対象のための、単位としての投与として適した物理的に不連続の単位を指し；各単位は、必要とされる調剤担体を伴って所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。
【００８５】
投与は、単回または多数回での投与量であってよい。多数回の投与量は、同一または異なる経路を介して、同一または異なる部位に投与してよい。あるいは、投与は、徐放性製剤を介することができ、その場合、必要とされる投与頻度がより少ない。投与量および頻度は、患者におけるアンタゴニストの半減期および要求される治療の持続時間に応じて変化し得る。
【００８６】
上述のように、本発明のモジュレーターは、１または他のより多くの他の治療薬とともに投与してよい。例えば、他の薬剤は、鎮痛剤、麻酔薬、免疫抑制剤、または抗炎症性剤であってよい。
【００８７】
２以上の薬剤を組み合わせた投与が、多くの異なる方法で達成され得る。両方を単一の組成物で一緒に投与してよく、または、それらを別々の組成物で併用療法の一部として投与してよい。例えば片方をもう片方の前に、後に、または同時に、投与してよい。
【００８８】
併用療法
上記のように、本発明のアンタゴニストは、任意の他の適切な活性化合物と組み合わせて投与してよい。
【００８９】
特に、ＰＡＲ１−ＣＣＬ７系の異なるメンバーのアンタゴニストを組み合わせて投与してよく、例えば、ＣＣＬ７のアンタゴニストは、ＰＡＲ１および／またはＣＣＲ１、および／またはＣＣＲ２および／またはＣＣＲ３のアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。同様に、ＰＡＲ１のアンタゴニストは、ＣＣＬ７および／またはＣＣＲ１、および／またはＣＣＲ２および／またはＣＣＲ３のアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。ＣＣＲ１のアンタゴニストは、ＣＣＬ７および／またはＰＡＲ１、および／またはＣＣＲ２および／またはＣＣＲ３のアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。ＣＣＲ２のアンタゴニストは、ＣＣＬ７および／またはＰＡＲ１、および／またはＣＣＲ１および／またはＣＣＲ３のアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。ＣＣＲ３のアンタゴニストは、ＣＣＬ７および／またはＰＡＲ１、および／またはＣＣＲ２および／またはＣＣＲ１のアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。
【００９０】
ＣＣＬ７アンタゴニスト、ＰＡＲ１アンタゴニストおよび／またはＰＡＲ１−ＣＣＬ７系の他のアンタゴニストは、本発明のＣＣＬ２アンタゴニストと組み合わせて用いてよい。例えば、ＣＣＬ２のアンタゴニストは、ＣＣＬ７、ＰＡＲ１および／またはＣＣＲ１、および／またはＣＣＲ２および／またはＣＣＲ３のアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。
【００９１】
また、本発明のアンタゴニストは、炎症促進性ケモカインＣＸＣＬ８（インターロイキン−８；ＩＬ−８）のアンタゴニストと組み合わせて投与してよい。また、本発明のアンタゴニストは、ＩＬ−８受容体、ＣＸＣＲ１（インターロイキン８受容体α、ＩＬ８ＲＡ、ＣＤ１８１としても知られる）に関するアンタゴニストと組み合わせて投与してよい。ＣＸＣＬ８は、内皮および上皮表面を通じて好中球を溢出するのための公知の化学誘引物質である（Ｇｒｏｍｍｅｓ，Ｊ．&  Ｓｏｅｈｎｌｅｉｎ，Ｏ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１７，２９３−３０７（２０１１））。ＣＸＣＬ８またはＣＸＣＲ１アンタゴニストは、例えば、ＣＣＬ７、他のＰＡＲ１−ＣＣＬ７系メンバーのターゲットおよびＣＣＬ２に関して本明細書中で述べた、ペプチドおよびペプチド模倣物；抗体、好ましくはモノクローナル抗体；低分子阻害剤；二本鎖ＲＮＡ；アンチセンスＲＮＡ；アプタマーおよびリボザイムから選択してよい。ＣＣＬ７およびＣＸＣＬ８および／またはＣＸＣＲ１のアンタゴニストの組み合わせの使用による、ＣＣＬ７およびＣＸＣＬ８および／またはＣＸＣＲ１の阻害の、例えば好中球の遊走または化学走性などに対する効果は、ＣＣＬ７およびＣＸＣＬ８および／またはＣＸＣＲ１の単独の阻害の効果と比較して、相加的または相乗的であり得る。同様に、ＣＸＣＬ８および／またはＣＸＣＲ１のアンタゴニストは、本発明のＣＣＬ２アンタゴニストと、同じようにして組み合わせて用いてよい。
【００９２】
以下の実施例により本発明は説明される。
【実施例】
【００９３】
１．ＰＡＲ１は急性肺炎に寄与する。
ＰＡＲ１は、凝固因子トロンビンの主な受容体であり、凝固と炎症との間の相互作用を編成するのに必須である（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｒ．Ｃ．Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５３  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ３６７−Ｓ３７８（２００８））。また、ＰＡＲ１活性化は、肺への好中球動員を仲介する様々な炎症促進性遺伝子の上方制御を導く（Ｍｅｒｃｅｒ，Ｐ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９６，８６−８８（２００７））。
【００９４】
急性肺炎におけるＰＡＲ１の役割を同定するために、ＬＰＳ（１２５μｇ／ｋｇ）による鼻腔内チャレンジの後に、特異的なＰＡＲ１アンタゴニスト（５ｍｇ／ｋｇ、米国Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  &  ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔのＣｌａｕｄｉａ  Ｄｅｒｉａｎからの寄贈品）でマウスを処置した。実験は、英国内務省に従った現地の倫理承認の下で行なった。ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（６〜８週；英国Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を麻酔し（５％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ））、滅菌生理食塩水中のＬＰＳでチャレンジした（１２５μｇ／ｋｇ、５０μｌ  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ０１２７：Ｂ８；Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）。ＬＰＳは、肺胞空間への、全細胞および好中球の動員の有意な増加を引き起こした（図１ａ、図１ｂ）。それらは初期の急性炎症を示す事象である（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１，３１８−３２４（２０１０））。全体的および差次的な数を、サイトスピンの後に定量化した。
【００９５】
マウスに、ＬＰＳ投与の３０分後に、ＰＡＲ１アンタゴニストＲＷＪ−５８２５９をｉ．ｐ（腹腔内）注入した。急性肺炎の発症直後のＰＡＲ１の拮抗作用は、空間における全細胞および好中球の数を有意に減少させ（図１ｂ）、急性肺炎の誘導においてＰＡＲ１が中心的な役割を果たすことを示した。空間の好中球増加の低減がフローサイトメトリーにより確認され、ＢＡＬ液から回収された、および全肺調製物中の、Ｇｒ−１＋（Ｆ４／８０−）好中球の減少を示した（図１ｄ）。肺ホモジネートにおいて検出されるように、ＰＡＲ１拮抗作用はＬＰＳが誘導する好中球ミエロペルオキシダーゼ活性を減少させた（図１ｃ）。
【００９６】
ＢＡＬ液中のマクロファージの数は、全ての処置群において変化しないままであり、ＰＡＲ１拮抗作用がＢＡＬ液への初期のマクロファージ動員に影響を及ぼさないことを示した（図１ｅ）。ＬＰＳにより誘導される肺胞−毛管バリアの崩壊に対するＰＡＲ１拮抗作用の効果を試験するために、生理食塩水およびＬＰＳでチャレンジされたマウスから回収したＢＡＬ液における血清アルブミンレベルを測定した。血清アルブミンレベルは、ＬＰＳでチャレンジしたマウスのＢＡＬ液において増加し、ＰＡＲ１拮抗作用の後に有意に（ｐ＝０．００４）減少した（図１ｆ）。したがって、これらのデータは、ＰＡＲ１シグナリングが、急性肺炎モデルにおいて、初期の好中球性炎症および肺胞−毛管バリアの崩壊に影響を及ぼすことを示す。
【００９７】
同様の結果が、異なるＰＡＲ１であるＳＣＨ５３０３４８を用いた場合に見られた。ＬＰＳチャレンジの直後に特異的なＰＡＲ１アンタゴニストＳＣＨ５３０３４８（１０ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ（腹腔内投与）で治療的に投与して、および、投与せずに、ＬＰＳ（１２５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））のチャレンジの３時間後にマウスを屠殺した。肺を洗浄し、血球計算器およびサイトスピン装置を用いて、全細胞および好中球をカウントした。データを、Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  Ｐｏｓｔ  Ｈｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した：＊ｐ<０．０５。再び、急性肺炎の発症直後のＰＡＲ１の拮抗作用は、空間における全細胞（図２Ａ）および好中球（図２Ｂ）の数を有意に減少させた。
【００９８】
さらにまた、ＲＷＪ−５８２５９によるＰＡＲ１拮抗作用は、ＬＰＳチャレンジの６時間後および２４時間後に、好中球の動員を減少させた（図３）。
【００９９】
細菌により誘導されるＡＬＩのモデルにおける、宿主防御の間のＰＡＲ１の影響を試験するために、マウスを、ＡＬＩの原因となる最も一般的な感染因子である肺炎連鎖球菌でチャレンジした（５×１０６ＣＦＵ／マウス、ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））。マウスに、５０μｌの肺炎連鎖球菌（血清型１９、５×１０６ＣＦＵ／マウス  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））を接種した。３時間後、動物を屠殺し（ウレタン  ｉ．ｐ（腹腔内投与）２０ｇ／ｋｇ）、気管内にカニューレ挿入し、気管支肺胞洗浄を行なった（１．５ｍｌ、ＰＢＳ）。サイトスピンの後に全体的および差次的な数を定量化し、アルブミンレベルをＥＬＩＳＡにより測定した（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ，ＵＳＡ）。
【０１００】
肺炎連鎖球菌による感染は、全白血球の増加および空間内における好中球の蓄積を引き起こした。それらは全て、初期の肺の細菌感染および細菌により誘導されるＡＬＩの特徴である。ＰＡＲ１アンタゴニストで処置されたマウスでは、全細胞の浸潤および好中球の蓄積が減少した（図４ａ、図４ｂ）。そのような、好中球増加の有意な低減は、特に、ＡＬＩの間に同時に起きることの多い細菌感染に対して、宿主防御に関する有害な結果を有するということもあり得る。しかしながら、肺全体から回収された肺炎連鎖球菌のコロニー数はＰＡＲ１アンタゴニストの治療により影響を受けなかったので（図４ｃ）、ＰＡＲ１拮抗作用は宿主防御を損なわなかった。
【０１０１】
同様の結果が、３０分後にＰＡＲ１アンタゴニストＲＷＪ−５８２５９（５ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ（腹腔内投与）で治療的に投与して、および投与せずに、異なる株の肺炎連鎖球菌（血清型２、臨床株Ｄ３９、５０μｌ／マウス、５×１０６ＣＦＵ／マウス  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））を用いて観察された（図５ａ、図５ｃ）。また、ＰＡＲ１拮抗作用は、ＢＡＬのマクロファージの数を減少させることが見いだされた（図５ｂ）。気管支肺胞洗浄液を回収し、トロンビン−抗−トロンビン（ＴＡＴ）および血清アルブミンのレベルをＥＬＩＳＡにより定量化した（図４ｄ、図４ｅ）。ＰＡＲ１拮抗作用は、ＰＡＲ１により仲介される肺胞−毛管バリアの崩壊を減少させることが見いだされた。パネルは、２回の独立した実験によるｎ＝５／群に関する平均値を示す。データを、Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  Ｐｏｓｔ  Ｈｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した：＊＊＊ｐ<０．０００１、＊ｐ<０．０５。
【０１０２】
３時間後（図６ａ）および２４時間後（図６ｂ）に得られた、ＢＡＬＦから回収した肺炎連鎖球菌のコロニー数がＰＡＲ１アンタゴニストの治療により影響を受けなかったので、この２つ目の肺炎連鎖球菌株を用いて得られた結果もまた、ＰＡＲ１拮抗作用が宿主防御を損なわないことを示した。細菌性浸潤性疾患を、２４時間後の肺（図６ｃ）および脾臓（図６ｄ）におけるｃｆｕにより測定した。データを、Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  Ｐｏｓｔ  Ｈｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した：ｎ．ｓ．有意差なし。再び、ＰＡＲ１アンタゴニストの処置によりカウントは影響を受けず、ＰＡＲ１拮抗作用は、肺炎連鎖球菌感染に対する免疫応答に悪影響を及ぼさないことが示された。
【０１０３】
２．ＰＡＲ１シグナリングは、ＣＣＬ７発現を仲介する。
ＰＡＲ１シグナリングが急性肺炎に影響を及ぼすメカニズムを調べるために、ＬＰＳチャレンジの効果およびその後の肺ホモジネートにおける好中球に特異的なケモカインのレベルに対するＰＡＲ１拮抗作用を調べた。ＣＸＣＲ２リガンド、ＣＸＣＬ１（ケラチノサイト由来のケモカイン、ＫＣ）およびＣＸＣＬ２／ＣＸＣＬ３（マクロファージ炎症性タンパク質−２、ＭＩＰ−２α／β）は、ヒトＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）およびＣＸＣＬ２／ＣＸＣＬ３（増殖関連がん遺伝子ＧＲＯ−β／ＧＲＯ−γ）の機能性ホモログであり、炎症組織への好中球の動員の一次メディエーターとして関与している。
【０１０４】
本研究では、ＬＰＳチャレンジは、以前に示されるように（Ｈｕｂｅｒ，Ａ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，９９−１０２（１９９１））、これらのケモカインのレベルを有意に増加させた。しかしながら、ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ２のレベルはＰＡＲ１拮抗作用により影響を受けず（図７ａ、図７ｂ）、これらのケモカインはＰＡＲ１により制御されていないことが示された。同様に、ＰＡＲ１拮抗作用は、炎症促進性サイトカインであるＴＮＦおよびＩＬ−６（図７ｃ、図７ｄ）の発現を減少させなかった（これは特質上、急性炎症と関連する）。サイトカインおよびケモカインのレベルは、ＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１０５】
これらのデータにより、我々は、ＰＡＲ１が仲介する急性炎症性応答は、古典的な好中球化学誘引物質または炎症促進性サイトカインの誘導とは関連しないと結論付けた。
【０１０６】
ＬＰＳが誘導するＡＬＩに関与する、ＰＡＲ１が制御するサイトカイン／ケモカインの潜在的な候補を同定するために、１５１個の炎症性メディエーターをプロファイルするように設計した低密度アレイ（ＬＤＡ）を用いた（図７ａ、図９）。粉状化された冷凍粉状肺から、ＴＲＩｚｏｌを用いて（メーカーのプロトコル参照（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））全ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡフリーキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＤＮａｓｅ処理し、そして、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、サンプルあたり１μｇのＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。公知の炎症性メディエーターの発現レベルを、Ｔａｑｍａｎ低密度アレイｑＰＣＲチップを用いてｃＤＮＡにおいて分析し、１８ｓにノーマライズした。Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  Ｓｕｉｔｅ（Ｇｅｎｅｓｉｓ）Ｓｏｆｔｗｅｒｅ５１を用いて転写データを解析し、ｌｏｇ２変換およびノーマライズの後に、データをヒートマップとして表した。キャリブレーター参照として、発現における相対的な倍差（ｆｏｌｄ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を、ΔΔＴ方法を用いて生理食塩水の処置群で計算した。ＬＰＳでのチャレンジ後、５１個の遺伝子が肺組織において差次的に発現されることが見いだされた（図７ｂ、図９）。ＬＰＳチャレンジ後、３２個の遺伝子が有意に上方制御されることが示された（図７ｂ、図９）（様々なケモカインが含まれる）。差次的な遺伝子発現プロファイルは、ＴＮＦ、インターロイキン、ＣＸＣケモカイン、および、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ７、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３およびＣＸ３ＣＬ１を含むＣＣケモカインなど、炎症性応答を生じさせるために重要であることが知られる様々な遺伝子の上方制御を含んだ。さらなる分析により、ＰＡＲ１拮抗作用の後に、２５個の遺伝子の発現が減少することが明らかとなった（図７ｃ）。
【０１０７】
以前のタンパク質データと合致して、ＬＰＳ損傷後に、好中球に特異的なケモカインであるＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ２、および、サイトカインであるＴＮＦおよびＩＬ−６の発現が増加したが、ＰＡＲ１拮抗作用による影響は受けず（図７ｄ）、ＬＰＳにより誘導される肺炎症の本モデルにおいて、これらのサイトカイン／ケモカインがＰＡＲ１シグナリングの下流により制御されないことが示された。ＬＰＳによるチャレンジ後に上方制御されることが分かった３２個の遺伝子について、ＰＡＲ１拮抗作用は、好中球動員と従来関連しない２つの密接に関連するＣＣ−ケモカインＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）およびＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）の発現を減少させた（図７ｄ）。その代わり、これらのケモカインは、骨髄からの単球放出を誘導し、炎症組織内に単球／マクロファージを動員することが知られる。
【０１０８】
ｍＲＮＡ発現のＬＤＡ分析を確認するために、肺ホモジネートにおけるタンパク質レベルを測定した。ＬＰＳによる処理は、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ２の発現を有意に増大させた（図８ａ、図８ｂ、図８ｃ、図８ｄ）。これはＬＤＡ分析後の知見と一致するが、これらのタンパク質発現はＰＡＲ１アンタゴニストの処置により影響を受けなかった。同様に、ＬＰＳチャレンジは、ＣＣＬ２およびＣＣＬ７の発現を増加させ（図８ｅ、図８ｆ）、そしてまた、ＬＤＡ分析で見られたように、ＰＡＲ１アンタゴニストの処置は、これらのケモカインの発現をタンパク質レベルで減少させた。これらのデータは、ＰＡＲ１シグナリングが、ＬＰＳにより誘導される肺炎症の後にＣＣＬ２およびＣＣＬ７発現を制御するのに重要な役割を果たすということ、および、これらのケモカインが好中球の遊走に直接的に影響を及ぼし得るということに対し、強い支持を与える。
【０１０９】
３．急性好中球性炎症は、ＣＣＬ７依存性である。
ＬＰＳにより誘導される肺炎症における、ＣＣＬ２およびＣＣＬ７の潜在的な役割を調べるために、我々は、これらのケモカインを阻害する特異的な中和抗体を用いた。中和抗体をＬＰＳチャレンジ量の範囲内で投与し、３時間後に肺ホモジネートを分析した。ＣＣＬ２またはＣＣＬ７の中和抗体による処理は、それぞれのケモカインを基礎レベルまで減少させ（図１０Ｂ、図１１Ａ、図１１Ｄ）、したがって、効果的なターゲットの結合が確認された。抗−ＣＣＬ２抗体の投与は、ＬＰＳでのチャレンジ後にＢＡＬ液から分離される全細胞の数および好中球の数の両方を有意に減少させた（図１０Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ）。同様に、抗−ＣＣＬ７抗体の投与もまた、全細胞および好中球の空間内への蓄積を有意に減少させた（図１１Ｅ、１１Ｆ）。まとめると、これらのデータにより、我々は、ＣＣＬ２およびＣＣＬ７の両方が、炎症を起こした肺内への、全白血球および好中球の初期の蓄積に影響を及ぼすと結論付けた。
【０１１０】
ＬＰＳにより誘導されるケモカインＣＸＣＬ１０およびＣＸ３ＣＬ１がＰＡＲ１アンタゴニストによる処置に応答性であり得ることをＬＤＡ分析が示したので、インビボでの中和実験もまた、ＣＸＣＬ１０またはＣＸ３ＣＬ１に対する抗体を用いて行なった。ＣＸＣＬ１０またはＣＸ３ＣＬ１の中和の後に、好中球蓄積の減少は見られず（図１２）、これらのケモカインは、ＬＰＳにより炎症を起こした肺内への好中球遊走に直接関与しないことが示された。
【０１１１】
ＬＰＳチャレンジによるよりもむしろ、肺炎連鎖球菌（血清型２、臨床株Ｄ３９、５０μｌ／マウス、５×１０６ＣＦＵ／マウス  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））による感染により炎症が引き起こされた場合に、同様の結果が得られた。ＣＣＬ７に対する特異的な中和抗体をと共に（チャレンジ量の範囲内で、１０μｇ／マウス  ｉ．ｎ．（鼻腔内投与））、およびなしに、肺炎連鎖球菌をマウスに接種した。肺を洗浄し（合計１．５ｍｌのＰＢＳ）、ＢＡＬ液の全白血球（Ａ）、および好中球（Ｂ）を定量化した。ＢＡＬＦから回収した細菌（ｃｆｕ）もカウントした（Ｃ）。データを、Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  Ｐｏｓｔ  Ｈｏｃ検定での一方向ＡＮＯＶＡにより解析した：＊＊ｐ<０．００１、＊ｐ<０．０５。ＣＣＬ７中和抗体による処置は、全細胞および空間内への好中球蓄積を有意に減少させ（図１３ａ、図１３ｂ）、肺内への好中球の動員において、ＣＣＬ７が重要な役割を果たすことが示された。ｃｆｕ数はＣＣＬ７中和抗体で処置されたマウスと無処置のマウスとの間で有意な差が無かったので、ＰＡＲ１拮抗作用と同様に、ＣＣＬ７中和抗体は、肺炎連鎖球菌感染に対する試験マウスの免疫応答に悪影響を及ぼさなかった。
【０１１２】
ＬＤＡ分析により、ＬＰＳが誘導するケモカインＣＸＣＬ１０およびＣＸ３ＣＬ１もまたＰＡＲ１アンタゴニストによる処置に応答性であり得ることが示されたので、インビボでの中和実験もまた、ＣＸＣＬ１０またはＣＸ３ＣＲ１に対する抗体を用いて行なった。ＣＸＣＬ１０、ＣＸ３ＣＲ１、または関連するＣＣ−ケモカインＣＣＬ１２（図１４および図１３）の中和の後に、好中球蓄積の減少は見られなかった。このことは、これらのケモカインが、炎症を起こした肺内への好中球遊走に直接関与しないことを強く示唆する。
【０１１３】
ＣＣＲ２の役割をさらに除外するために、マウスをＣＣＬ２受容体ＣＣＲ２に対するブロッキング抗体も用いて処置した（Ｂｒｕｈｌ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５６，２９７５−２９８５（２００７））。この抗体によるマウスの処置は、ＬＰＳにより誘導される好中球蓄積に対して効果がなかった（図１０Ｃ）。このことは、ＣＣＲ２が、好中球の動員に必須ではないことをさらに示唆する。効果的なターゲットの結合は、ＣＣＲ２を発現することが知られる全身性の循環中のＧｒ−１＋／ＣＤ１１ｂ＋単球（Ｂｒｕｈｌ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５６，２９７５−２９８５（２００７））が、好適に使い尽くされることを示すことにより確認された（図１０ｄ）。したがって、これらのデータは、好中球の動員が、ＣＣＲ２または循環する単球の存在に依存しないことを示す。
【０１１４】
ＣＣＬ２およびＣＣＬ７が白血球を肺内に直接的に動員することが可能であるか否かを決定するために、組み換えＣＣＬ２または組み換えＣＣＬ７を、ナイーブマウスの肺内へ投与し、３時間後にＢＡＬ液をサンプリングした。ｒＣＣＬ２またはｒＣＣＬ７のいずれかの直接的な点滴は、生理食塩水で処置したコントロールと比較して、ＢＡＬ液から回収された全細胞数を増加させた（図１５Ａ）。ｒＣＣＬ２の投与は、ｒＣＣＬ７と比較して、より多い数の白血球の動員を誘導した（図１５Ａ）。さらに、ｒＣＣＬ２またはｒＣＣＬ７の投与は、肺空間内への好中球の動員ももたらした（図１５Ｂ）。ＢＡＬ液から回収した全細胞のパーセンテージとして表すと、ｒＣＣＬ７は、ｒＣＣＬ２と比較して、合計の好中球の数は同程度だが、好中球の選択的な蓄積を促進することがデータから明らかであった（図１５Ｃ）。生理食塩水（図１５Ｄ）、ｒＣＣＬ２（図１５Ｅ）、またはｒＣＣＬ７（図１５Ｆ）の投与後に、サイトスピン装置で、差次的な細胞のカウントを行なった。これらのデータは、ＣＣＬ２およびＣＣＬ７の両方が、いかなる根底となる炎症も存在せずに、肺内へ好中球を引き寄せることが可能であることを明らかにする。
【０１１５】
ＣＣ−ケモカイン受容体ＣＣＲ１が、ＣＣＬ７依存性の好中球性の肺炎を仲介するか否か評価するために、ＬＰＳチャレンジの後に、ＣＣＲ１に対するアンタゴニストでマウスを処置した（図１０ｅ）。ＣＣＲ１処置後に、空間における好中球増加の低減が見られた。
【０１１６】
まとめると、これらのデータは、ＣＣＬ７は、急性肺炎の間の、空間内への好中球の遊走のための重要なケモカインであること、さらに、好中球遊走は、少なくとも部分的に、ＣＣＲ１に依存することを示す。
【０１１７】
４．ＣＣＬ７は、気管支上皮細胞から放出される。
ＰＡＲ１活性化の下流の好中球遊走が、非古典的な好中球ケモカインＣＣＬ７により仲介されるという知見は、予想に反した。ＣＣＬ７の細胞源を決定するために、生理食塩水で処置した、および、ＬＰＳをチャレンジしたマウス由来の、一連の肺断面における、ＣＣＬ７およびＧｒ−１＋好中球の免疫的局在性を調べた。生理食塩水で処置したコントロールの肺では、主に気管支上皮に限定された弱いＣＣＬ７染色が見られた（図１６ａ）。ＬＰＳ損傷に応答してＣＣＬ７免疫染色は著しく増加し、また、主に気管支上皮と関連した（図１６ｂ）。肺胞上皮では、弱い免疫的局在性のみ検出された。とりわけ、ＬＰＳで誘導したＣＣＬ７の免疫反応性は、ＰＡＲ１アンタゴニストで処置したマウスにおいて減少した（図１６ｃ）。次に、一連の肺断面において好中球を検出するために、Ｇｒ−１特異的な免疫染色を行なった。生理食塩水で処置したコントロールでは、Ｇｒ−１染色は検出することはできなかった（図１６ｄ）。ＬＰＳによるチャレンジの後に、Ｇｒ−１＋細胞は、特に、強いＣＣＬ７免疫反応性を示す領域において増加した（図１６ｅ）。予想どおり、ＰＡＲ１拮抗作用は、ＬＰＳをチャレンジしたマウスの肺において、Ｇｒ−１免疫反応性を減少させた（図１６ｆ）。
【０１１８】
まとめると、これらの試験は、炎症を起こした肺内への好中球蓄積をＬＰＳ損傷が促進するのに続いて、ＣＣＬ７が気管支上皮により産生および放出されるという知見を強く支持する。ＰＡＲ１アンタゴニストで処置されたマウスにおける、ＣＣＬ７およびＧｒ−１陽性の減衰は、炎症を起こした肺内への好中球動員の制御において重要な役割を果たすＰＡＲ１−ＣＣＬ７系とも合致する。
【０１１９】
ＬＰＳにより誘導される上皮−内皮バリアの崩壊に対する、ＰＡＲ１拮抗作用の効果を調べるために、ＬＰＳをチャレンジしたマウスから回収したＢＡＬ液中の血清アルブミンを測定した。血清アルブミンは通常、肺血管系および全身性循環においてのみ検出され、健康な空間内には検出されない。ＬＰＳは、チャレンジしたマウスのＢＡＬ液中の血清アルブミンの増加を誘導した（バリア破壊を示す）。しかしながら、ＰＡＲ１拮抗作用は、ＢＡＬ液の血清アルブミンを有意に減少させ（ｐ＝＊＊＊）、したがって、上皮−内皮崩壊を減少させた（図１６ｇ）。
【０１２０】
上皮／内皮バリアの完全性に対してＰＡＲ１が与える影響をさらに評価するために、肺炎連鎖球菌チャレンジの後に、ＢＡＬ液中の血清アルブミンレベルを測定した（図１６ｈ）。ＰＡＲ１アンタゴニストによる処置は、肺炎連鎖球菌によるチャレンジの後のＢＡＬ液の血清アルブミンを減少させ、ＰＡＲ１が、細菌により誘導される肺胞−毛管バリアの崩壊の重要なメディエーターであることを示した。
【０１２１】
まとめると、これらのデータは、ＰＡＲ１シグナリングが、直接的な肺損傷の後の炎症性応答に寄与すること、および、この受容体の拮抗作用が、宿主防御を損なわずに過剰な炎症および組織損傷を低減させることの、説得力のある証拠を提供する。
【０１２２】
５．ＣＣＬ７は、ＡＬＩの間のヒト好中球の化学走性を制御する。
ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）がヒト好中球性肺疾患における重要なケモカインであるということは広く認められているが（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ  Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１４６，４２７−４３２（１９９２））、他のケモカインが疾患病因と関連するか否かは確かでない。ヒト疾患に対するこれらの知見の潜在的意義を調べるために、次に、ＬＰＳにより誘導されるＡＬＩのヒトモデルにおいて、ＣＣＬ７が増加するか否か調べた。これらの試験のために、前述のとおり、ＬＰＳ（５０μｇ）をチャレンジしてから６時間の健常なボランティア由来のＢＡＬ液中のＣＣＬ７を、ＥＬＩＳＡにより測定した（Ｓｈｙａｍｓｕｎｄａｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１７９，１１０７−１１１４（２００９））。ＬＰＳをチャレンジした個体の肺では、コントロールの生理食塩水を与えられたボランティアと比較して、ＣＣＬ７レベルが有意に増加する（ｐ＝０．０１）ことが分かった（図１７ａ）。ＣＣＬ７は直接的な好中球化学誘引物質であるとは考えられていないが（Ｇｏｕｗｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７６，１８５−１９４（２００４））、古典的な化学誘引物質に応答してＣＣＬ７がヒト好中球の遊走を促進する可能性を調べた。この目的を達成するために、ヒトボランティアの末梢血から単離されたばかりの好中球を用いて、広範囲の化学走性試験を行なった。ヒト好中球は、健常なボランティアの血液から分離した（英国Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｃｔの下で同意書を得た）。好中球を、二重のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １１１９，Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０８８，Ｓｉｇｍａ）により精製した。細胞の数および純度を、顕微鏡により評価した。ウェルあたり５×１０４の好中球をＣｈｅｍｏＴＸプレート（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ）にわたって（９６ウェルプレート中、３μｍのポア）用いた。組み換えヒトＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）およびＣＣＬ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、５０ｎｇ／ｍｌで用いた。好中球を５％ＣＯ２中で３７℃でインキュベートし、下のチャンバー内に遊走した細胞を、血球計算器を用いて４５分後にカウントした。予想どおり、これらの実験により、ＣＸＣＬ８（５０ｎｇ／ｍｌ）は、培地単独と比較して、好中球の遊走を増加させる（ｐ＝０．０２４）ことが明らかとなった。対照的に、ＣＣＬ７（５０ｎｇ／ｍｌ）単独では、好中球の遊走に影響を及ぼさなかった（図１７ｂ）。しかしながら、好中球遊走は、ＣＸＣＬ８単独と比較して、ＣＸＣＬ８およびＣＣＬ７の両方に応答して有意に増加し（ｐ＝０．００１）、これらの２つのケモカインは、相乗的に好中球の化学走性を高めることを示唆した。
【０１２３】
ケモカイン特異的な中和抗体を用いて、ＬＰＳで処置したボランティアから得られたＢＡＬ液の好中球の化学走性活性に対するこれらのケモカインの寄与を調べた。この洗浄液は、単離されたばかりのヒト好中球に関して非常に化学走性であった。また、分離されたヒト好中球の化学走性を、１０μｇ／ｍｌの抗−ヒトＣＣＬ７中和抗体（抗−ヒトＣＣＬ７  ＡＦ−２８２−ＮＡ，Ｒ７Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）または１０μｇ／ｍｌの抗−ヒトＩＬ−８中和抗体（抗−ヒトＩＬ−８  ＡＢ−２０８−ＮＡ，Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む、または含まない、ヒトＢＡＬ液（上述）に応答させて測定した。ウェルあたり５×１０４の好中球を添加する前に、ＢＡＬ液を各中和抗体とともに１０分間インキュベートした。特異的な抗体によるＣＸＣＬ８の中和は、ＬＰＳでチャレンジしたボランティアから得られた洗浄液に応答する好中球の化学走性を減少させた（図１７ｃ）。重要なことに、ＣＣＬ７の中和もまた、好中球の化学走性を有意に減少させ（ｐ＝０．０３６）、ＣＸＣＬ８の中和よりも、好中球の化学走性を防止するのに効果的であった（ｐ＝０．０１７）。ＣＸＣＬ８およびＣＣＬ７に対する中和抗体の組み合わせは、ＣＣＬ７単独と同程度まで好中球の化学走性を有意に減少させ（ｐ＝０．０１５）、したがって、ＣＣＬ７の機能性重要性が示された。
【０１２４】
それから、集中治療室環境内で確実にＡＬＩと診断された患者から得られたＢＡＬ液中のＣＣＬ７およびＣＣＬ２のレベルを測定した。ＡＬＩを有する患者から得られたＢＡＬ液中のＣＣＬ７およびＣＣＬ２のレベルは、それぞれ、健常者と比較して有意に増加し（図１７ｄおよび図１７ｆ）、ＣＣＬ７およびＣＣＬ２が、ＡＬＩ／ＡＲＤＳの間に重要な役割を果たし得ることを示した。ＣＣＬ７のレベルは、ＬＰＳをチャレンジしたボランティア由来のＢＡＬＦ中のレベル（８．６＋／−２．１ｐｇ／ｍｌ）と比較して、ＡＬＩ患者のＢＡＬ液中では１０倍高く（８７．７＋／−１７．７ｐｇ／ｍｌ）、ＣＣＬ７のレベルが疾患の重症度と関連し得ることを示した。ＬＰＳをチャレンジしたボランティアから得られたＢＡＬ液で見られたように、ＡＬＩ患者由来のＢＡＬ液は、好中球に関して非常に化学走性であった。驚くことに、ＣＸＣＬ８単独の中和は、全てのＡＬＩのＢＡＬ液に応答した好中球の化学走性を有意に減少させず（ｐ＝０．０９）（図１７ｅ）、他の好中球化学走性メディエーターがＢＡＬＦ中に存在し得ることを示した。しかしながら、ＣＣＬ７の中和は、このＢＡＬ液に応答したヒト好中球の化学走性を有意に減少させ（ｐ＝０．００７）、一方で、ＣＸＣＬ８およびＣＣＬ７の両方の中和は、化学走性をさらに減少させた（ｐ＝０．０００７）。まとめると、これらのデータにより、ＡＬＩの状況でのヒト好中球の化学走性の調節におけるＣＣＬ７およびＣＣＬ２の機能性の重要性が確証され、および、ＣＸＣＬ８のみの阻害は、この疾患の状況において好中球の動員を阻害するのに不十分であり得ることが示唆される。
【０１２５】
６．好中球は、炎症を起こした肺において、ＣＣ−ケモカイン受容体を発現する。
ＣＣ−ケモカインに応答する好中球の能力を評価するために、血液、ナイーブ肺およびＬＰＳチャレンジした肺から分離した好中球上の、公知のＣＣ−ケモカイン受容体であるＣＣＲ１、ＣＣＲ２およびＣＣＲ３の発現を評価し、フローサイトメトリーにより、主な好中球化学誘引物質ＣＸＣＬ１（ＫＣ）受容体ＣＸＣＲ２と比較した。血液から分離した好中球上のＣＣＲ１またはＣＣＲ２の発現が最少であることが観察され（図１８Ａ）、一方で、ごく少ないパーセンテージの血液の好中球がＣＣＲ３を発現した（ＬＰＳチャレンジは血液の好中球上のＣＲＲ発現に影響を及ぼさなかったので、明確にする目的のために、ＬＰＳチャレンジした動物由来の血液のフローサイトメトリープロットのみ示す）。比較すると、血液から分離されたほとんど全ての好中球が、ＣＸＣＲ２を発現した（図１８Ａ、図１８Ｄ）。ナイーブ肺から分離された好中球は、９５％よりも多くがＣＸＣＲ２を発現したのに対し（図１８Ｂ、図１８Ｄ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２およびＣＣＲ３を発現した好中球のパーセンテージは低かった（図１８Ｂ）。しかしながら、ＬＰＳチャレンジの後に肺組織から分離された好中球は、有意により高いパーセンテージがＣＣＲ１を発現し、特にＣＣＲ２を発現した（図１８Ｃ、図１８Ｄ）。ＣＣＲ２を発現する好中球のパーセンテージは、ＬＰＳチャレンジの後は３５％よりも高いのに比較して、ナイーブ肺では約１０％だけであった（図１８Ｄ）。炎症を起こした肺組織から分離されたＣＣＲ３を発現する好中球は、パーセンテージが増加しなかった（図１８Ｄ）。興味深いことに、炎症を起こした肺組織から分離されたＣＸＣＲ２を発現する好中球のパーセンテージ（>９５％）は、ＬＰＳによるチャレンジの後、ナイーブ肺と比較して減少し（<６０％）（図１８Ｄ）、炎症性応答中に肺組織内へ遊走するときに、好中球は新規のケモカイン受容体を獲得することを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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