(57)【要約】  本発明は、オリゴヌクレオチド類を含む脂質ナノ粒子を形成するために、他の脂質成分、たとえばコレステロールやＰＥＧ−脂質等と組み合わせて使用することができる、式Ａの新規なカチオン性脂質を提供する。本発明の目的は、肝臓での低脂質レベルの結果としての低肝臓毒性に加えて、強化された有効性を示すカチオン性脂質足場を提供することである。本発明は、ｓｉＲＮＡのインビボ送達の効率および耐容性を高めるために、加水分解性官能基を脂質鎖に包含することに加えて、１つの短い脂質鎖を有する低分子量カチオン性脂質を使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａ：
【化１】
2015520733.tif 000052
のカチオン性脂質
（ここで：
Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ヘテロシクリル、およびポリアミンからなる群からそれぞれ独立に選択され、ここで前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、１〜３個のＲ’で置換されていてもよく；
またはＲ１とＲ２は、それらが結合している窒素と一緒になって、前記窒素に加えて、場合によりＮ、ＯおよびＳから選択される１個または２個の追加的ヘテロ原子を含む、４〜７員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は、１〜３個のＲ’で置換されていてもよく；
Ｒ３は、（Ｃ４〜Ｃ２０）アルキルおよび（Ｃ４〜Ｃ２０）アルケニルからなる群から選択され、前記アルキルまたはアルケニルは、１〜３個のＲ’で置換されていてもよく；
Ｒ４は、（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキルおよび（Ｃ２〜Ｃ１６）アルケニルからなる群から選択され、前記アルキルまたはアルケニルは、１〜３個のＲ’で置換されていてもよく；
Ｒ５は、（Ｃ４〜Ｃ８）アルキルおよび（Ｃ４〜Ｃ８）アルケニルからなる群から選択され、前記アルキルまたはアルケニルは、１〜３個のＲ’で置換されていてもよく；
Ｒ６は、（Ｃ１〜Ｃ２）アルキルであって、１〜３個のＲ’で置換されていてもよく；
Ｑ１およびＱ２は、それぞれ独立に、結合、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｒ’’）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ’’）−、−Ｃ（Ｒ’’）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ’’）−、−Ｃ（Ｏ）（ＮＲ’’）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｓ）（ＮＲ’’）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、ＯＳｉ（Ｒ’’）２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ’’２）Ｃ（Ｏ）Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ’’２）Ｃ（Ｏ）−）からなる群から選択され、但し、Ｑ１またはＱ２のいずれかが結合であるとき、他方は結合ではなく；
Ｘは、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｒ’’）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ’’）−、−Ｃ（Ｒ’’）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ’’）−、−Ｃ（Ｏ）（ＮＲ’’）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｓ）（ＮＲ’’）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、ＯＳｉ（Ｒ’’）２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ’’２）Ｃ（Ｏ）Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ’’２）Ｃ（Ｏ）−）からなる群から選択され、
Ｒ’の各出現は、ハロゲン、Ｒ’’、ＯＲ’’、ＳＲ’’、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ’’およびＣＯＮ（Ｒ’’）２からなる群から独立に選択され；
Ｒ’’の各出現は、Ｈおよび（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルからなる群から独立に選択され、ここで前記アルキルは、ハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよく；そして
ｎは１、２、３、４または５である）、
またはそれらの薬学的に許容される塩または立体異性体。
【請求項２】
請求項１に記載の式Ａのカチオン性脂質、
（ここで：
Ｒ１およびＲ２は、それぞれメチルであり；
ｎは、３であり；
Ｒ３は、（Ｃ４〜Ｃ２０）アルキルおよび（Ｃ４〜Ｃ２０）アルケニルから選択され、前記アルキルまたはアルケニルは、１〜３個のＲ’で置換されていてもよく；
Ｒ４は、（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキルおよび（Ｃ２〜Ｃ１６）アルケニルから選択され、前記アルキルまたはアルケニルは、１〜３個のＲ’で置換されていてもよく；
Ｒ５は、（Ｃ４〜Ｃ８）アルキルおよび（Ｃ４〜Ｃ８）アルケニルから選択され、前記アルキルまたはアルケニルは、１〜３個のＲ’で置換されていてもよく；
Ｒ６は、（Ｃ１〜Ｃ２）アルキルであり、１〜３個のＲ’で置換されていてもよく；
Ｑ１およびＱ２は、それぞれ独立に、結合または−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり、但しＱ１またはＱ２のいずれかが結合であるとき、他方は結合ではなく；そして
Ｘは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である）、
またはそれらの薬学的に許容される塩または立体異性体。
【請求項３】
メチル（９Ｚ）−１９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタコス−９−エノアート（化合物１）；
メチル８−［２−（９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタデシル）シクロプロピル］オクタノアート（化合物２）；
メチル（９Ｚ）−１９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘプタコス−９−エノアート（化合物３）；
メチル（９Ｚ）−１９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘキサコス−９−エノアート（化合物４）；
メチル（９Ｚ）−１９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ペンタコス−９−エノアート（化合物５）；
メチル（９Ｚ）−２１−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝トリアコント−９−エノアート（化合物６）；
メチル（９Ｚ）−２１−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ノナコス−９−エノアート（化合物７）；
メチル（９Ｚ）−２１−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタコス−９−エノアート（化合物８）；
メチル（９Ｚ）−２１−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘプタコス−９−エノアート（化合物９）；
メチル（１１Ｚ）−１９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタコス−１１−エノアート（化合物１０）；
メチル（７Ｚ）−１９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタコス−７−エノアート（化合物１１）；
メチル８−［２−（９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘプタデシル）シクロプロピル］オクタノアート（化合物１２）；
メチル８−［２−（９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘキサデシル）シクロプロピル］オクタノアート（化合物１３）；
メチル８−［２−（９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ペンタデシル）シクロプロピル］オクタノアート（化合物１４）；
メチル８−［２−（１１−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝イコシル）シクロプロピル］オクタノアート（化合物１５）；
メチル８−［２−（１１−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ノナデシル）シクロプロピル］オクタノアート（化合物１６）；
メチル８−｛２−［１１−（ジメチルアミノ）オクタデシル］シクロプロピル｝オクタノアート（化合物１７）；
メチル８−［２−（１１−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタデシル）シクロプロピル］オクタノアート（化合物１８）；
メチル１０−［２−（７−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘキサデシル）シクロプロピル］デカノアート（化合物１９）；
メチル６−［２−（１１−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝イコシル）シクロプロピル］ヘキサノアート（化合物２０）；
エチル（７Ｚ）−１７−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘキサコス−７−エノアート（化合物２１）；
エチル６−［２−（９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタデシル）シクロプロピル］ヘキサノアート（化合物２２）；
（２Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル  １０−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ノナデカノアート（化合物２３）；
（２−ヘキシルシクロプロピル）メチル  １０−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ノナデカノアート（化合物２４）；
（２Ｚ）−ウンデク−２−エン−１−イル  ８−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘプタデカノアート（化合物２５）；
（２Ｚ）−ヘプト−２−エン−１−イル  １２−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘニコサノアート（化合物２６）；
（２−オクチルシクロプロピル）メチル  ８−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘプタデカノアート（化合物２７）；
（２−ブチルシクロプロピル）メチル  １２−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘニコサノアート（化合物２８）；
メチル（１９Ｚ，２２Ｚ）−９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタコサ−１９，２２−ジエノアート（化合物２９）；
エチル（１８Ｚ，２１Ｚ）−８−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘプタコサ−１８，２１−ジエノアート（化合物３０）；
メチル９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝−１６−（２−オクチルシクロプロピル）ヘキサデカノアート（化合物３１）；
エチル８−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝−１５−（２−オクチルシクロプロピル）ペンタデカノアート（化合物３２）；
ジメチル（９Ｚ）−１９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘプタコス−９−エンジオアート（化合物３３）；および
１−メチル１８−［（２Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル］９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタデカンジオアート（化合物３４）；
から選択されるカチオン性脂質：
またはそれらの薬学的に許容される塩または立体異性体。
【請求項４】
請求項１に記載の式Ａのカチオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣおよびＰＥＧ−ＤＭＧを含むＬＮＰ組成物。
【請求項５】
脂質ナノ粒子の調製のための、請求項１に記載のカチオン性脂質の使用。
【請求項６】
オリゴヌクレオチド類の送達のための脂質ナノ粒子中の構成成分としての、請求項１に記載のカチオン性脂質の使用。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を形成するため、細胞性取り込みおよびエンドソーム脱出を促進するため、およびインビトロとインビボの両方で標的ｍＲＮＡをノックダウンするために、他の脂質成分、たとえばコレステロールやＰＥＧ脂質等と組み合わせて使用することができる、新規なジエステルおよびトリエステルカチオン性脂質に関する。
【０００２】
カチオン性脂質およびオリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子におけるカチオン性脂質の使用は、以前に開示されている。脂質ナノ粒子および、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを送達するための、脂質ナノ粒子の使用は、以前に開示されている。オリゴヌクレオチド類（ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含む）およびオリゴヌクレオチド類の合成は、以前に開示されている。（米国特許出願公開第２００６／００８３７８０号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２４０５５４号明細書、米国特許出願公開第２００８／００２００５８号明細書、米国特許出願公開第２００９／０２６３４０７号明細書および米国特許出願公開第２００９／０２８５８８１号明細書、ならびにＰＣＴ特許公開：国際公開第２００９／０８６５５８号パンフレット、国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット、国際公開第２００９／１３２１３１号パンフレット、国際公開第２０１０／０４２８７７号パンフレット、国際公開第２０１０／０５４３８４号パンフレット、国際公開第２０１０／０５４４０１号パンフレット、国際公開第２０１０／０５４４０５号パンフレット、国際公開第２０１０／０５４４０６号パンフレットおよび国際公開第２０１１／１５３４９３号パンフレット参照）。Ｓｅｍｐｌｅ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，２８，１７２−１７６も参照されたい。
【０００３】
他のカチオン性脂質は、以下の特許出願に開示されている：米国特許出願公開第２００９／０２６３４０７号明細書、米国特許出願公開第２００９／０２８５８８１号明細書、米国特許出願公開第２０１０／００５５１６８号明細書、米国特許出願公開第２０１０／００５５１６９号明細書、米国特許出願公開第２０１０／００６３１３５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／００７６０５５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／００９９７３８号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１０４６２９号明細書、国際公開第２０１０／０８８５３７号パンフレット、国際公開第２０１０／１４４７４０号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書、米国特許第８，０３４，３７６号明細書、国際公開第２０１１／１４３２３０号パンフレット、国際公開第２０１１／０００１０６号パンフレット、米国特許出願公開第２０１１／０１１７１２５号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０２５６１７５号明細書、国際公開第２０１１／１４１７０３号パンフレット、国際公開第２０１１／１４１７０４号パンフレットおよび国際公開第２０１１／１４１７０５号パンフレット。
【０００４】
従来のカチオン性脂質、たとえばＣＬｉｎＤＭＡやＤＬｉｎＤＭＡ等が、肝臓へのｓｉＲＮＡ送達に使用されてきたが、高用量での肝毒性に加えて非最適送達効率に悩まされてきた。本発明の目的は、肝臓での低脂質レベルの結果としての低肝臓毒性に加えて、強化された有効性を示すカチオン性脂質足場を提供することである。本発明は、ｓｉＲＮＡのインビボ送達の効率および耐容性を高めるために、加水分解性官能基を脂質鎖に包含することに加えて、１つの短い脂質鎖を有する低分子量カチオン性脂質を使用する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、オリゴヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を形成するために、他の脂質成分、たとえばコレステロールやＰＥＧ−脂質等と組み合わせて使用することができる、式Ａの新規なカチオン性脂質を提供する。本発明の目的は、肝臓における低脂質濃度の結果としての低肝臓毒性に加えて、強化された有効性を示すカチオン性脂質足場を提供することである。本発明は、ｓｉＲＮＡのインビボ送達の効率および耐容性を高めるために、加水分解性官能基を脂質鎖に包含することに加えて、１つの短い脂質鎖を有する低分子量カチオン性脂質を使用する。
【０００６】
本発明の様々な態様および実施態様は、オリゴヌクレオチド類、特に、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを、標的遺伝子に送達するための脂質ナノ粒子に有用な新規なカチオン性脂質を対象とする。（米国特許出願公開第２００６／００８３７８０号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２４０５５４号明細書、米国特許出願公開第２００８／００２００５８号明細書、米国特許出願公開第２００９／０２６３４０７号明細書および米国特許出願公開第２００９／０２８５８８１号明細書ならびにＰＣＴ特許出願：国際公開第２００９／０８６５５８号パンフレット、国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット、国際公開第２００９／１３２１３１号パンフレット、国際公開第２０１０／０４２８７７号パンフレット、国際公開第２０１０／０５４３８４号パンフレット、国際公開第２０１０／０５４４０１号パンフレット、国際公開第２０１０／０５４４０５号パンフレット、国際公開第２０１０／０５４４０６号パンフレットおよび国際公開第２０１１／１５３４９３号パンフレット参照）。Ｓｅｍｐｌｅ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，２８，１７２−１７６も参照されたい。
【０００７】
本発明のカチオン性脂質は、オリゴヌクレオチド類、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを送達するための、脂質ナノ粒子の有用成分である。
【０００８】
本発明の第１の実施態様で、カチオン性脂質は式Ａ：
【化１】
2015520733.tif 000002
（ここで：
Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ヘテロシクリル、およびポリアミンからなる群からそれぞれ独立に選択され、ここで前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、１〜３個のＲ’で任意選択的に置換されている；か、またはＲ１とＲ２は、それらが付いている窒素と統合して、窒素に加えて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または２個の追加的ヘテロ原子を任意選択的に含む４〜７員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は１〜３個のＲ’で任意選択的に置換されている；
Ｒ３は、（Ｃ４〜Ｃ２０）アルキルおよび（Ｃ４〜Ｃ２０）アルケニルからなる群から選択され、前記アルキルまたはアルケニルは１〜３個のＲ’で任意選択的に置換されている；
Ｒ４は、（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキルおよび（Ｃ２〜Ｃ１６）アルケニルからなる群から選択され、前記アルキルまたはアルケニルは１〜３個のＲ’で任意選択的に置換されている；
Ｒ５は、（Ｃ４〜Ｃ８）アルキルおよび（Ｃ４〜Ｃ８）アルケニルからなる群から選択され、前記アルキルまたはアルケニルは、１〜３個のＲ’で任意選択的に置換されている；
Ｒ６は（Ｃ１〜Ｃ２）アルキルであり、前記アルキルは１〜３個のＲ’で任意選択的に置換されている；
Ｑ１およびＱ２はそれぞれ、独立に、結合、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｒ’’）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ’’）−、−Ｃ（Ｒ’’）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ’’）−、−Ｃ（Ｏ）（ＮＲ’’）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｓ）（ＮＲ’’）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、ＯＳｉ（Ｒ’’）２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ’’２）Ｃ（Ｏ）Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ’’２）Ｃ（Ｏ）−）からなる群から選択されるが、但し、Ｑ１またはＱ２のいずれかが結合であるとき、他方は結合ではない；
Ｘは、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｒ’’）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ’’）−、−Ｃ（Ｒ’’）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ’’）−、−Ｃ（Ｏ）（ＮＲ’’）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｓ）（ＮＲ’’）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、ＯＳｉ（Ｒ’’）２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ’’２）Ｃ（Ｏ）Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ’’２）Ｃ（Ｏ）−）からなる群から選択され、
Ｒ’の各出現は、ハロゲン、Ｒ’’、ＯＲ’’、ＳＲ’’、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ’’およびＣＯＮ（Ｒ’’）２からなる群から独立に選択される；
Ｒ’’の各出現は、Ｈおよび（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルからなる群から独立に選択され、ここで前記アルキルはハロゲンおよびＯＨで任意選択的に置換されており；また
ｎは１、２、３、４または５である；）
で示されるか、またはそれらの薬学的に許容される塩または立体異性体である。
【０００９】
第２の実施態様で、本発明は上述の式Ａを有する化合物：
（ここで
Ｒ１およびＲ２はそれぞれメチルであり；
ｎは３であり；
Ｒ３は（Ｃ４〜Ｃ２０）アルキルおよび（Ｃ４〜Ｃ２０）アルケニルから選択され、前記アルキルまたはアルケニルは１〜３個のＲ’で任意選択的に置換されている；
Ｒ４は（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキルおよび（Ｃ２〜Ｃ１６）アルケニルから選択され、前記アルキルまたはアルケニルは、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で任意選択的に置換されている；
Ｒ５は、（Ｃ４〜Ｃ８）アルキルおよび（Ｃ４〜Ｃ８）アルケニルから選択され、前記アルキルまたはアルケニルは１〜３個のＲ’で任意選択的に置換されている；
Ｒ６は（Ｃ１〜Ｃ２）アルキルであり、前記アルキルは１〜３個のＲ’で任意選択的に置換されている；
Ｑ１およびＱ２はそれぞれ、独立に、結合または−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であるが、但しＱ１またはＱ２の何れかが結合であるとき、他方は結合ではない；
Ｘは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり；そして
Ｒ’は上述の通りである；）
またはその薬学的に許容される塩または立体異性体
を特徴とする。
【００１０】
ここで開示されるカチオン性脂質の具体的な実施態様は：
メチル（９Ｚ）−１９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタコス−９−エノアート（化合物１）；
メチル８−［２−（９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタデシル）シクロプロピル］オクタノアート（化合物２）；
メチル（９Ｚ）−１９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘプタコス−９−エノアート（化合物３）；
メチル（９Ｚ）−１９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘキサコス−９−エノアート（化合物４）；
メチル（９Ｚ）−１９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ペンタコス−９−エノアート（化合物５）；
メチル（９Ｚ）−２１−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝トリアコント−９−エノアート（化合物６）；
メチル（９Ｚ）−２１−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ノナコス−９−エノアート（化合物７）；
メチル（９Ｚ）−２１−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタコス−９−エノアート（化合物８）；
メチル（９Ｚ）−２１−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘプタコス−９−エノアート（化合物９）；
メチル（１１Ｚ）−１９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタコス−１１−エノアート（化合物１０）；
メチル（７Ｚ）−１９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタコス−７−エノアート（化合物１１）；
メチル８−［２−（９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘプタデシル）シクロプロピル］オクタノアート（化合物１２）；
メチル８−［２−（９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘキサデシル）シクロプロピル］オクタノアート（化合物１３）；
メチル８−［２−（９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ペンタデシル）シクロプロピル］オクタノアート（化合物１４）；
メチル８−［２−（１１−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝イコシル）シクロプロピル］オクタノアート（化合物１５）；
メチル８−［２−（１１−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ノナデシル）シクロプロピル］オクタノアート（化合物１６）；
メチル８−｛２−［１１−（ジメチルアミノ）オクタデシル］シクロプロピル｝オクタノアート（化合物１７）；
メチル８−［２−（１１−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタデシル）シクロプロピル］オクタノアート（化合物１８）；
メチル１０−［２−（７−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘキサデシル）シクロプロピル］デカノアート（化合物１９）；
メチル６−［２−（１１−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝イコシル）シクロプロピル］ヘキサノアート（化合物２０）；
エチル（７Ｚ）−１７−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘキサコス−７−エノアート（化合物２１）；
エチル６−［２−（９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタデシル）シクロプロピル］ヘキサノアート（化合物２２）；
（２Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル１０−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ノナデカノアート（化合物２３）；
（２−ヘキシルシクロプロピル）メチル１０−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ノナデカノアート（化合物２４）；
（２Ｚ）−ウンデク−２−エン−１−イル８−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘプタデカノアート（化合物２５）；
（２Ｚ）−ヘプト−２−エン−１−イル１２−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘニコサノアート（化合物２６）；
（２−オクチルシクロプロピル）メチル８−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘプタデカノアート（化合物２７）；
（２−ブチルシクロプロピル）メチル１２−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘニコサノアート（化合物２８）；
メチル（１９Ｚ，２２Ｚ）−９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタコサ−１９，２２−ジエノアート（化合物２９）；
エチル（１８Ｚ，２１Ｚ）−８−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘプタコサ−１８，２１−ジエノアート（化合物３０）；
メチル９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝−１６−（２−オクチルシクロプロピル）ヘキサデカノアート（化合物３１）；
エチル８−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝−１５−（２−オクチルシクロプロピル）ペンタデカノアート（化合物３２）；
ジメチル（９Ｚ）−１９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘプタコス−９−エンジオアート（化合物３３）；および
１−メチル１８−［（２Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル］９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタデカンジオアート（化合物３４）；
またはそれらの薬学的に許容される塩または立体異性体である。
【００１１】
別の実施態様で、開示されるカチオン性脂質は、脂質ナノ粒子の調製で有用である。
【００１２】
別の実施態様で、開示されるカチオン性脂質は、オリゴヌクレオチドを送達するための脂質ナノ粒子の有用成分である。
【００１３】
別の実施態様で、開示されるカチオン性脂質は、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子の有用成分である。
【００１４】
別の実施態様で、開示されるカチオン性脂質は、ｓｉＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子の有用成分である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のカチオン性脂質は、不斉中心、キラル軸、およびキラル平面を有してもよく（Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４，１１１９−１１９０に記述されている）、またラセミ化合物、ラセミ混合物として、また個々のジアステレオマーとして、存在してもよく、光学異性体を含む、それらの全ての可能な異性体および混合物が、本発明に含まれる。加えて、ここで開示されるカチオン性脂質は、互変異性体として存在する可能性があり、１つの互変異性体構造だけが表されていても、両方の互変異性体形がともに本発明の範囲に含まれることを意図する。
【００１６】
化学的に安定であり、かつ容易に入手できる出発材料から、当技術分野で知られている技術、ならびに後述の方法で、容易に合成することができるカチオン性脂質を提供するために、当業者は本発明のカチオン性脂質上の置換基および置換パターンを選択できると理解される。置換基が、それ自体２つ以上の基で置換されている場合、安定した構造が結果として生じる限り、これらの複数の基は、同一炭素上であっても異なる炭素上であってもよいと理解される。
【００１７】
化学的に安定であり、かつ容易に入手できる出発材料から当技術分野で知られている技術で容易に合成することができるカチオン性脂質を提供するために、当業者は、１つまたは複数のＳｉ原子を本発明のカチオン性脂質に組み入れることができると理解される。
【００１８】
式Ａの化合物で、原子は、それらの自然の同位体存在度を示してもよく、原子の１つまたは複数は、同一原子番号を有するが、自然界で主にみられる原子質量または質量数と異なる原子質量または質量数を有する、ある特定の同位体が人工的に富化されていてもよい。本発明は、式Ａの化合物のあらゆる好適な同位体異形を含むことを意味する。たとえば、水素（Ｈ）の異なる同位体形は、軽水素（１Ｈ）および重水素（２Ｈ）を含む。軽水素は自然界でみられる主な水素同位体である。重水素富化は、ある種の治療上の利点、たとえばインビボ半減期の増加または必要用量の減少等を与えたり、また生体試料を特性化するための標準として有用な化合物を提供したりすることが可能である。必要以上の実験をせずに、当業者に周知の従来技術で、または本明細書に記載のスキームおよび実施例に記述されているものに似たプロセスで、適切な同位体富化試薬同位体富化した試薬および／または中間体を使用して、式Ａ内の同位体富化化合物を調製することができる。
【００１９】
本明細書で使用されるとき、「アルキル」は、指定数の炭素原子を有する、直鎖状、環状または分枝状の飽和脂肪族炭化水素を意味する。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、「アルケニル」は、ジエン、トリエンおよびテトラエン不飽和脂肪族炭化水素を含むがその限りではない、指定数の炭素原子を有する直鎖状、環状または分枝状の不飽和脂肪族炭化水素を意味する。
【００２１】
環状「アルキル」または「アルケニル」の例としては下記のものなどがある。
【化２】
2015520733.tif 000003
【００２２】
本明細書で使用されるとき、「ヘテロシクリル」または「複素環」は、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子を含む４〜１０員の芳香族または非芳香族複素環を意味し、また二環式基を含む。従って、「ヘテロシクリル」は下記のものを含む。ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンズオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ナフトピリジニル（ｎａｐｈｔｈｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサゾリン、イソキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、テトラヒドロピラニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンズオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチエニル、並びにこれらのＮ−酸化物（全て、Ｒ’’から選択される１〜３個の置換基で任意選択的に置換されている）。
【００２３】
本明細書で使用されるとき、「ポリアミン」は、２個以上のアミノ基を有する化合物を意味する。例としては、プトレッシン、カダベリン、スペルミジン、およびスペルミンなどがある。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、「ハロゲン」は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを意味する。
【００２５】
式Ａの実施態様で、Ｒ１およびＲ２は、Ｈおよび（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルからそれぞれ独立に選択され、ここで前記アルキルは１〜３個のＲ’で任意選択的に置換されている；またはＲ１とＲ２は、それらが付いている窒素と統合して、窒素に加えて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または２個の追加的ヘテロ原子を任意選択的に含む４〜７員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は１〜３個のＲ’で任意選択的に置換されている。
【００２６】
式Ａの実施態様で、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立にＨ、メチル、エチルおよびプロピルから選択され、ここで前記メチル、エチルおよびプロピルは、１〜３個のＲ’で任意選択的に置換されている；またはＲ１とＲ２は、それらが付いている窒素と統合して、窒素に加えて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または２個の追加的ヘテロ原子を任意選択的に含む４〜７員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環はＲ’から選択される１〜３個の置換基で任意選択的に置換されている。
【００２７】
式Ａの一実施態様で、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから選択される。
【００２８】
式Ａの一実施態様で、Ｒ１およびＲ２はそれぞれメチルである。
【００２９】
式Ａの一実施態様で、Ｒ３は（Ｃ４〜Ｃ２０）アルキルおよび（Ｃ４〜Ｃ２０）アルケニルから選択される。
【００３０】
式Ａの一実施態様で、Ｒ３は（Ｃ１４〜Ｃ１８）アルケニルである。
【００３１】
式Ａの一実施態様で、Ｒ３はＣ１６アルケニルである。
【００３２】
式Ａの一実施態様で、Ｒ３はＣ１４アルケニルである。
【００３３】
式Ａの一実施態様で、Ｒ３は（Ｃ６〜Ｃ９）アルキルである。
【００３４】
式Ａの一実施態様で、Ｒ３はＣ７アルキルである。
【００３５】
式Ａの一実施態様で、Ｒ４は（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ１６）アルケニルである。
【００３６】
式Ａの一実施態様で、Ｒ４は（Ｃ４〜Ｃ１０）アルケニルである。
【００３７】
式Ａの一実施態様で、Ｒ４はＣ９アルケニルである。
【００３８】
式Ａの一実施態様で、Ｒ４は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルである。
【００３９】
式Ａの一実施態様で、Ｒ４は（Ｃ１〜Ｃ２）アルキルである。
【００４０】
式Ａの一実施態様で、Ｒ４はエチルである。
【００４１】
式Ａの一実施態様で、Ｒ４はメチルである。
【００４２】
式Ａの一実施態様で、Ｒ３はＣ７アルキルでありＲ４はＣ９アルケニルである。
【００４３】
式Ａの一実施態様で、Ｒ３はＣ１４アルケニルでありＲ４はエチルである。
【００４４】
式Ａの一実施態様で、Ｒ３はＣ１６アルケニルであり、Ｒ４はメチルである。
【００４５】
式Ａの一実施態様で、Ｒ５は（Ｃ４〜Ｃ８）アルキルまたは（Ｃ４〜Ｃ８）アルケニルである。
【００４６】
式Ａの一実施態様で、Ｒ５は（Ｃ４〜Ｃ８）アルキルである。
【００４７】
式Ａの一実施態様で、Ｒ５は（Ｃ６〜Ｃ８）アルキルである。
【００４８】
式Ａの一実施態様で、Ｒ５はＣ８アルキルである。
【００４９】
式Ａの一実施態様で、Ｒ６はメチルまたはエチルである。
【００５０】
式Ａの一実施態様で、Ｒ６はエチルである。
【００５１】
式Ａの一実施態様で、Ｒ６はメチルである。
【００５２】
式Ａの一実施態様で、Ｒ５はＣ８アルキルでありＲ４はエチルである。
【００５３】
式Ａの一実施態様で、Ｒ５はＣ８アルキルでありＲ４はメチルである。
【００５４】
式Ａの一実施態様で、Ｒ５はＣ７アルキルでありＲ４はエチルである。
【００５５】
式Ａの一実施態様で、Ｒ５はＣ７アルキルでありＲ４はメチルである。
【００５６】
式Ａの一実施態様で、Ｑ１およびＱ２はそれぞれ、結合、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｒ’’）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ’’）−、−Ｃ（Ｒ’’）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ’’）−、−Ｃ（Ｏ）（ＮＲ’’）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｓ）（ＮＲ’’）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、ＯＳｉ（Ｒ’’）２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ’’２）Ｃ（Ｏ）Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ’’２）Ｃ（Ｏ）−から独立に選択されるが、但しＱ１またはＱ２の何れかが結合であるとき、他方は結合ではない。
【００５７】
式Ａの一実施態様で、Ｑ１およびＱ２はそれぞれ、独立に、結合または−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であるが、但しＱ１またはＱ２の何れかが結合であるとき、他方は結合ではない。
【００５８】
式Ａの一実施態様で、Ｘは−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｒ’’）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ’’）−、−Ｃ（Ｒ’’）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ’’）−、−Ｃ（Ｏ）（ＮＲ’’）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｓ）（ＮＲ’’）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、ＯＳｉ（Ｒ’’）２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ’’２）Ｃ（Ｏ）Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ’’２）Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択される。
【００５９】
式Ａの一実施態様で、Ｘは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。
【００６０】
式Ａの一実施態様で、Ｒ’はＲ’’である。
【００６１】
式Ａの一実施態様で、Ｒ’’は独立にＨ、メチル、エチルおよびプロピルから選択され、ここで前記メチル、エチルおよびプロピルは１つまたは複数のハロゲンおよびＯＨで任意選択的に置換されている。
【００６２】
式Ａの一実施態様で、Ｒ’’は独立に、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから選択される。
【００６３】
式Ａの一実施態様で、ｎは１、２、３、４または５である。
【００６４】
式Ａの一実施態様で、ｎは３である。
【００６５】
式Ａの一実施態様で、「ヘテロシクリル」はピロリジン、ピペリジン、モルホリン、イミダゾールまたはピペラジンである。
【００６６】
式Ａの一実施態様で、「単環式ヘテロシクリル」はピロリジン、ピペリジン、モルホリン、イミダゾールまたはピペラジンである。
【００６７】
式Ａの一実施態様で、「ポリアミン」はプトレッシン、カダベリン、スペルミジンまたはスペルミンである。
【００６８】
一実施態様で、「アルキル」は指定数の炭素原子を有する直鎖状飽和脂肪族炭化水素である。
【００６９】
一実施態様で、「アルケニル」は指定数の炭素原子を有する直鎖不飽和脂肪族炭化水素である。
【００７０】
式Ａのカチオン性脂質の遊離形、ならびにそれらの薬学的に許容される塩類および立体異性体は、発明に含まれる。本明細書に例示されている分離された具体的なカチオン性脂質の一部は、アミンカチオン性脂質のプロトン化塩類である。用語「遊離形」は、非塩形のアミンカチオン性脂質を指す。包含される薬学的に許容される塩類は、本明細書に記載されている具体的なカチオン性脂質に関して例示されている分離された塩類を含むばかりでなく、式Ａのカチオン性脂質の遊離形の全ての代表的な薬学的に許容される塩類を含む。記述されている特定の塩カチオン性脂質の遊離形は、当技術分野で知られている技術を使用して分離することが可能である。たとえば、遊離形は、その塩を好適な希塩基性水溶液、たとえば希ＮａＯＨ水、希炭酸カリウム水、希アンモニア水および希炭酸水素ナトリウム水で処理することによって再生することができる。遊離形は、ある種の物理的特性、たとえば極性溶媒中での溶解度等が、それぞれの塩形と幾分異なる可能性があるが、本発明の目的上、酸塩および塩基塩は、その他の点ではそれぞれの遊離形と薬学的に同等である。
【００７１】
本発明のカチオン性脂質の薬学的に許容される塩類は、塩基性部分または酸性部分を含む本発明のカチオン性脂質から、従来の化学的方法で合成することができる。一般に、塩基性カチオン性脂質の塩類は、イオン交換クロマトグラフィーによるか、または好適な溶媒または溶媒の様々な組合せの中で、遊離塩基を、化学量論量または過剰の望ましい塩形成性無機酸または有機酸と反応させることのいずれかによって調製される。同様に、酸性化合物の塩類は、適切な無機塩基または有機塩基との反応によって形成される。
【００７２】
このように、本発明のカチオン性脂質の薬学的に許容される塩類は、塩基性の本カチオン性脂質を無機酸または有機酸と反応させることによって形成される、本発明のカチオン性脂質の従来型非毒性塩を含む。たとえば、従来型非毒性塩は、塩化水素、臭化水素、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等々の無機酸から誘導されるもの、ならびに有機酸、たとえば酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ−安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）等から調製される塩類を含む。
【００７３】
本発明のカチオン性脂質が酸性であるとき、好適な「薬学的に許容される塩類」は、無機塩基および有機塩基を含む薬学的に許容される非毒性の塩基から調製される塩類を指す。無機塩基から誘導される塩類としては、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第２鉄、第１鉄、リチウム、マグネシウム、第２マンガン塩、第１マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛等々がある。アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩およびナトリウム塩が特に好ましい。薬学的に許容される有機非毒性塩基から誘導される塩類としては、一級アミン、二級アミン、三級アミン、天然の置換アミン類を含む置換アミン類、環状アミン類および塩基性イオン交換樹脂、たとえばアルギニン、ベタインカフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ１−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン類、チオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン  トリプロピルアミン、トロメタミン等々の塩類などがある。
【００７４】
上述の薬学的に許容される塩類の調製および他の代表的な薬学的に許容される塩類は、Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７：６６：１−１９にさらに十分に記述されている。
【００７５】
生理的条件で、化合物の脱プロトン化酸性部分、たとえばカルボキシル基等は、アニオン性である可能性があり、この電子電荷は次には、プロトン化またはアルキル化した塩基性部分、たとえば四級窒素原子のカチオン電荷に対してバランスを失うことがあり得るので、本発明のカチオン性脂質は、潜在的内部塩または両性イオンであることにも注目されるであろう。
【実施例】
【００７６】
提供する実施例は、本発明のさらなる理解を助けることを目的とする。使用される個々の材料、種および条件は、本発明をさらに説明するためであって、その合理的な範囲を限定するためではない。カチオン性脂質の合成に使用される試薬は、市販されているかまたは当業者によって容易に調製されるかのいずれかである。
【００７７】
新規なカチオン性脂質の合成は、脂質アルデヒド（ｉ）から出発するリニアプロセスである。脂質ベースのグリニャール試薬を添加することにより、第二級アルコール（ｉｉ）を生成することができる。このアルコールは、そのシリルエーテル（ｉｉｉ）として保護され、オレフィンは四酸化オスミウムでジヒドロキシ化されてジオール（ｉｖ）を生じる。ジオールは、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化的に開裂されてアルデヒド（ｖ）を提供する。アルデヒドは、ウィッティヒオレフィン化によってオレフィンを含むカルボン酸（ｖｉ）に変換される。酸は、インサイチュでエステル（ｖｉｉ）に変換され、続いてシリルエーテル脱保護によりアルコール（ｖｉｉｉ）を生じる。次いで、アルコールをカップリングして最終化合物ｉｘを生じる。次いで、シクロプロパン化してさらなる脂質ｘを提供する。
【００７８】
一般的図式１
【化３】
2015520733.tif 000004
脂質を含有するエステル（ｘｉｉｉ）の合成は、アルデヒドｖのカルボン酸ｘｉへの酸化、続くエステル形成によって達成される。ｘｉｉｉへの変換は、一般的図式１に記述されているものと類似した方法で完了する。
【００７９】
一般的図式２
【化４】
2015520733.tif 000005
脂質を含むエステルｘｘｉの合成は、カルボン酸ｘｉｖで始まるリニアシーケンスである。酸はワインレブアミド（Ｗｅｉｎｒｅｂ  ａｍｉｄｅ）ｘｖに変換され、続くグリニャール添加によりケトンｘｖｉを生じる。アルコールを脱保護し、酸化およびエステル化してエステルｘｉｘを生じる。ケトンｘｉｘは、還元およびエステルカップリングによって最終化合物ｘｘｉに転換される。
【００８０】
一般的図式３
【化５】
2015520733.tif 000006
ジエステルアミン類の合成は、一般的図式４に略述されている通りに遂行される。アルケンｘｘｉｉはジヒドロキシル化され、酸化開裂してアルデヒドｘｘｉｖを生じる。アルデヒドは、ウィッティヒオレフィン化によってアルケンを含むカルボン酸に転換される。結果として生じる酸ｘｘｖは、インサイチュで、その対応するエステルに転換される。シリルエーテルは脱保護され、アルコール酸化されてカルボン酸ｘｘｖｉｉを生じる。これは、エステル化されてケトン中間体ｘｘｖｉｉｉを生じる。このケトンは、上記一般的図式１および３に略述されている通り、最終化合物ｘｘｉｘまで続行される。
【００８１】
一般的図式４
【化６】
2015520733.tif 000007
ビス・エステル化合物（ｘｘｘｉｉ）の合成は、アルデヒド（ｘｘｉｖ）の酸化に続くエステル化によりエステルｘｘｘｉを生じることによって達成される。最終化合物への転換は、一般的図式１〜４に記述されているものと類似した方法で達成される。
【００８２】
一般的図式５
【化７】
2015520733.tif 000008
【００８３】
メチル（９Ｚ）−１９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタコス−９−エノアート（化合物１）
【化８】
2015520733.tif 000009
ＴＨＦ中のオレイルアルデヒド（ａ）を０℃に冷却し、ノニルマグネシウムブロミドで処理する。反応混合物を室温まで温め、完了次第、重炭酸水溶液でクエンチする。反応混合物を、水とヘキサンの間で分配し、有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗アルコール（ｂ）を生じさせる。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。
【００８４】
【化９】
2015520733.tif 000010
アルコール（ｂ）をジクロロメタンに溶解し、トリエチルアミンおよびＤＭＡＰで処理する。この溶液に、周囲温度で、ＴＢＤＰＳＣｌを一度に加える。完了次第、反応を重炭酸水溶液でクエンチする。反応混合物を、水とヘキサンの間で分配し有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗シリルエーテル（ｃ）を生じさせる。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。
【００８５】
【化１０】
2015520733.tif 000011
シリルエーテル（ｃ）を、ｔｅｒｔ−ブタノール、ＴＨＦおよび水の混合物に溶解し、四酸化オスミウムおよびＮＭＯで処理する。完了次第、反応を重炭酸水溶液でクエンチする。反応混合物を、水とヘキサンの間で分配し、有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗ジオール（ｄ）を生じさせる。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。
【００８６】
【化１１】
2015520733.tif 000012
ジオール（ｄ）を、ＴＨＦ、ジクロロメタン、メタノールおよび水の混合物に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウムで処理する。完了次第、反応を重炭酸水溶液でクエンチする。反応混合物を、水とヘキサンの間で分配し、有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗アルデヒド（ｅ）を生じさせる。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。
【００８７】
【化１２】
2015520733.tif 000013
イリド前駆体トリフェニルホスフィニウムブロミドをＴＨＦに溶解し、ＨＭＰＡおよびリチウムヘキサメチルジシラジドで処理して、イリドを生成する。この溶液にアルデヒド（ｅ）を加える。反応が完了したら、この溶液を炭酸水素ナトリウムおよびジメチル硫酸で処理する。完了次第、反応を重炭酸水溶液でクエンチする。反応混合物を、水とヘキサンの間で分配し、有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗エステル（ｆ）を生じさせる。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。
【００８８】
【化１３】
2015520733.tif 000014
エステル（ｆ）をＴＨＦに溶解し、ＴＢＡＦで処理する。完了次第、反応を重炭酸水溶液でクエンチする。反応混合物を、水とヘキサンの間で分配し、有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗アルコール（ｇ）を生じさせる。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。
【００８９】
【化１４】
2015520733.tif 000015
アルコール（ｇ）および４−（ジメチルアミノ）ブタン酸を、周囲温度でジクロロメタンに溶解し、ＥＤＣ、ＤＭＡＰおよびＤＩＥＡで処理する。完了次第、反応を重炭酸水溶液でクエンチする。反応混合物を、水とヘキサンの間で分配し、有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗化合物１を生じさせる。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。
【００９０】
メチル８−［２−（９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタデシル）シクロプロピル］オクタノアート（化合物２）
【化１５】
2015520733.tif 000016
ジクロロメタンに溶解したジエチル亜鉛の溶液を−１℃に冷却し、ＴＦＡで滴状処理する。３０分後、ジヨードメタンを加え、結果として生じた溶液を、氷浴中で３０分間ねかす。この溶液にオレフィン化合物１を加え、結果として生じた溶液を周囲温度まで徐々に温める。完了次第、反応を重炭酸水溶液でクエンチする。反応混合物を、水とヘキサンの間で分配し、有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗シクロプロパン化合物２を生じさせる。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。
【００９１】
化合物３〜２２は、新規なカチオン性脂質であり、上記一般的図式１に従って調製される。
【００９２】
【表１】
2015520733.tif 000017
【００９３】
【表２】
2015520733.tif 000018
【００９４】
【表３】
2015520733.tif 000019
【００９５】
（２Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル  １０−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ノナデカノアート（化合物２３）
【化１６】
2015520733.tif 000020
ＤＭＦに溶解したアルデヒド（ｅ）の溶液を、周囲温度にて、オキソンで処理する。反応を塩化アンモニウム溶液でクエンチし、完了次第、ヘキサンと水の間で分配する。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗酸（ｈ）を生じさせる。この物質をフラッシュクロマトグラフィーで精製する。
【００９６】
【化１７】
2015520733.tif 000021
ＤＭＦに溶解した酸（ｈ）とＣ９−アルコールの溶液を、ＥＤＣＩおよびジイソプロピルエチルアミンで処理する。反応を塩化アンモニウム溶液でクエンチし、完了次第、ヘキサンと水の間で分配する。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗酸（ｉ）を生じさせる。この物質をフラッシュクロマトグラフィーで精製する。
【００９７】
【化１８】
2015520733.tif 000022
シリルエーテル（ｉ）の化合物２３への転換は、上記化合物１について記述されているものと類似した方法で実施される。
【００９８】
（２−ヘキシルシクロプロピル）メチル  １０−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ノナデカノアート（化合物２４）
【化１９】
2015520733.tif 000023
化合物２４は、上記化合物２について記述されているシクロプロパン化化学を使用して、化合物２３について上述されているものと類似した方法で調製される。
【００９９】
化合物２５〜２８は、新規なカチオン性脂質であり、上記一般的図式１〜２に従って調製される。
【０１００】
【表４】
2015520733.tif 000024
【０１０１】
メチル（１９Ｚ，２２Ｚ）−９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタコサ−１９，２２−ジエノアート（化合物２９）
【化２０】
2015520733.tif 000025
１１，１４−エイコサジエン酸、（１１Ｚ，１４Ｚ）−（５０ｇ、１６２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（３１．６ｇ、３２４ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（４４．１ｇ、３２４ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（４５．２ｍＬ、３２４ｍｍｏｌ）、およびＥＤＣ（６２．１ｇ、３２４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（８１０ｍＬ）中で混合し、周囲温度で一晩撹拌した。次に反応を、５×７００ｍＬの水で、次いで１×６００ｍＬの１Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、セライトで濾過し、蒸発させて５３．０６ｇ（９３％）の１１，１４−エイコサジエンアミド、Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−、（１１Ｚ，１４Ｚ）を清澄な金色の油として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．３５（ｍ，４Ｈ）、３．６８（ｓ，３Ｈ）、３．１８（ｓ，３Ｈ）、２．７７（ｍ，２Ｈ）、２．４１（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ）、２．０５（ｍ，４Ｈ）、１．６３（ｍ，２Ｈ）、１．４０〜１．２６（ｍ，１８Ｈ）、０．８９（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ）。
【０１０２】
【化２１】
2015520733.tif 000026
ＴＨＦに溶解した臭化アルキルの溶液を、マグネシウム削り状で処理して、グリニャール試薬を生成する。別の、ＴＨＦに溶解したワインレブアミド（ｌ）の溶液を、この結果として得られたグリニャール溶液で、周囲温度にて処理する。反応を塩化アンモニウム溶液でクエンチし、完了次第、ヘキサンと水の間で分配する。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗ケトン（ｍ）を生じさせる。この物質をフラッシュクロマトグラフィーで精製する。
【０１０３】
【化２２】
2015520733.tif 000027
ＴＨＦに溶解したシリルエーテル（ｍ）の溶液をＴＢＡＦで処理する。反応を塩化アンモニウム溶液でクエンチし、完了次第、ヘキサンと水の間で分配する。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗アルコール（ｎ）を生じさせる。この物質をフラッシュクロマトグラフィーで精製する。
【０１０４】
【化２３】
2015520733.tif 000028
ＤＭＦに溶解したアルコール（ｎ）の溶液を、０℃で、ピリジニウムジクロマートで処理する。溶液を周囲温度まで温める。反応を水でクエンチし、完了次第、ヘキサンと水の間で分配する。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗酸（ｏ）を生じさせる。この物質をフラッシュクロマトグラフィーで精製する。
【０１０５】
【化２４】
2015520733.tif 000029
ＴＨＦに溶解した酸（ｏ）の溶液を、炭酸水素ナトリウムおよびジメチル硫酸で処理する。溶液を周囲温度まで温める。反応を炭酸水素ナトリウム溶液でクエンチし、完了次第、ヘキサンと水の間で分配する。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗ケトエステル（ｐ）を生じさせる。この物質をフラッシュクロマトグラフィーで精製する。
【０１０６】
【化２５】
2015520733.tif 000030
ケトン（ｐ）をメタノールに溶解し、水素化ホウ素ナトリウムで処理する。反応を炭酸水素ナトリウム溶液でクエンチし、水／ヘキサン間で分配する。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗アルコール（ｑ）を生じさせる。これをフラッシュクロマトグラフィーで精製する。
【０１０７】
【化２６】
2015520733.tif 000031
アルコール（ｑ）および４−（ジメチルアミノ）ブタン酸をジクロロメタンに溶解し、周囲温度にて、ＥＤＣ、ＤＭＡＰおよびＤＩＥＡで処理する。完了次第、反応を重炭酸水溶液でクエンチする。反応混合物を、水とヘキサンの間で分配し、有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗脂質化合物２９を生じさせる。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。
【０１０８】
化合物３０〜３２は新規なカチオン性脂質であり、上記一般的図式１〜３に従って調製される。
【０１０９】
【表５】
2015520733.tif 000032
【０１１０】
ジメチル  （９Ｚ）−１９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ヘプタコス−９−エンジオアート（化合物３３）
【化２７】
2015520733.tif 000033
ＴＨＦに溶解した臭化アルキルの溶液をマグネシウム削り状で処理してねかせ、グリニャール試薬を生成する。別の、ワインレブアミドの溶液をグリニャール試薬で処理する。反応を炭酸水素ナトリウム溶液でクエンチし、完了次第、ヘキサンと水の間で分配する。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗ケトン（ｒ）を生じさせる。この物質をフラッシュクロマトグラフィーで精製する。
【０１１１】
【化２８】
2015520733.tif 000034
ＴＨＦ、ｔｅｒｔ−ブタノールおよび水に溶解したケトンの溶液を、四酸化オスミウムおよびＮＭＯで処理する。反応を炭酸水素ナトリウム溶液でクエンチし、完了次第、ヘキサンと水の間で分配する。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗ジオール（ｓ）を生じさせる。この物質をフラッシュクロマトグラフィーで精製する。
【０１１２】
【化２９】
2015520733.tif 000035
ジオール（ｓ）の溶液を、ＴＨＦ、ジクロロメタン、メタノールおよび水に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウムで処理する。反応を炭酸水素ナトリウム溶液でクエンチし、完了次第、ヘキサンと水の間で分配する。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗アルデヒド（ｔ）を生じさせる。この物質をフラッシュクロマトグラフィーで精製する。
【０１１３】
【化３０】
2015520733.tif 000036
イリド前駆体トリフェニルホスフィニウムブロミドをＴＨＦに溶解し、ＨＭＰＡおよびリチウムヘキサメチルジシラジドで処理して、イリドを生成する。この溶液にアルデヒド（ｔ）を加える。反応が完了次第、この溶液を炭酸水素ナトリウムおよびジメチル硫酸で処理する。完了次第、反応を重炭酸水溶液でクエンチする。反応混合物を、水とヘキサンの間で分配し、有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗エステル（ｕ）を生じさせる。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。
【０１１４】
【化３１】
2015520733.tif 000037
ＴＨＦに溶解したシリルエーテル（ｕ）の溶液を、ＴＢＡＦで処理する。完了次第、反応を重炭酸水溶液でクエンチする。反応混合物を、水とヘキサンの間で分配し、有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗アルコールを生じさせる。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。
ＤＭＦに溶解したアルコールの溶液をピリジニウムジクロマートで処理する。完了次第、反応を水でクエンチする。反応混合物を、水とヘキサンの間で分配し、有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗酸（ｖ）を生じさせる。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。
【０１１５】
【化３２】
2015520733.tif 000038
ＴＨＦに溶解した酸（ｖ）の溶液を、炭酸水素ナトリウムおよびジメチル硫酸で処理する。完了次第、反応を重炭酸水溶液でクエンチする。反応混合物を、水とヘキサンの間で分配し、有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗ジエステル（ｗ）を生じさせる。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。
【０１１６】
【化３３】
2015520733.tif 000039
ケトン（ｗ）を、化合物２９について記述されているものと類似した方法でアミン化合物３３に転換する。
【０１１７】
構造への変更、すなわち、脂質鎖長、メチルエステルおよびエチルエステル、シルコプロパンの包含、不飽和またはシクロプロパン組み入れの位置変更、および上記の全ての可能な組合せの変更が上表に略述されているものに似た、化合物３３に類似したジエステル類が調製される。
【０１１８】
１−メチル  １８−［（２Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル］  ９−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝オクタデカンジオアート（化合物３４）
【化３４】
2015520733.tif 000040
ＤＭＦに溶解したアルデヒド（ｔ）の溶液をピリジニウムジクロマートで処理する。完了次第、反応を重炭酸水溶液でクエンチする。反応混合物を、水とヘキサンの間で分配し、有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗酸（ｘ）を生じさせる。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。
【０１１９】
【化３５】
2015520733.tif 000041
ジクロロメタンに溶解した酸（ｘ）の溶液を、Ｃ９アルコールおよびＥＤＣＩおよびジイソプロピルエチルアミンで処理する。完了次第、反応を重炭酸水溶液でクエンチする。反応混合物を、水とヘキサンの間で分配し、有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗ケトエステル（ｙ）を生じさせる。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。
【０１２０】
【化３６】
2015520733.tif 000042
ケトン（ｙ）は、上記化合物３３について記述されているものと類似した方法でアミン化合物３４に転換される。
【０１２１】
構造への変更、すなわち、脂質鎖長、メチルエステルおよびエチルエステル、シルコプロパンの包含、不飽和またはシクロプロパン組み入れの位置変更、および上記の全ての可能な組合せの変更が、上表に略述されているものに似た、化合物３４に類似したジエステル類が調製される。
【０１２２】
ＬＮＰ組成物
下記の本発明の脂質ナノ粒子組成物（ＬＮＰ）は、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達に有用である：
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ５６．６／３８／５．４；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６０／３８／２；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６７．３／２９／３．７；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ４９．３／４７／３．７；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ５０．３／４４．３／５．４；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０；および
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ５８／３０／２／１０。
【０１２３】
ＬＮＰプロセス説明：
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、衝突ジェットプロセスで調製される。粒子は、アルコールに溶解した脂質を、クエン酸バッファに溶解したｓｉＲＮＡと混合することによって形成される。脂質のｓｉＲＮＡに対する混合比は、脂質４５〜５５％とｓｉＲＮＡ６５〜４５％を目標とする。脂質溶液は、本発明の新規なカチオン性脂質、ヘルパー脂質（コレステロール）、ＰＥＧ（たとえばＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ）脂質、およびＤＳＰＣを、アルコール（たとえばエタノール）中に、９〜１２ｍｇ／ｍＬを目途に５〜１５ｍｇ／ｍＬの濃度で含むことができる。脂質の比率は、カチオン性脂質については３５〜６５を目途に２５〜９８モルパーセントの範囲を有することができ、ヘルパー脂質は３０〜５０を目途に０〜７５モルパーセントの範囲を有することができ、ＰＥＧ脂質は１〜６を目途に１〜１５モルパーセントの範囲を有することができ、ＤＳＰＣは０〜１２を目途に０〜１５モルパーセントの範囲を有することができる。ｓｉＲＮＡ溶液は、３．５〜５の範囲のｐＨを有するクエン酸ナトリウム緩衝塩溶液中に、０．３〜０．９ｍｇ／ｍＬを目途に０．３〜１．０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ配列を含むことができる。これらの２つの液体を、１５〜４０℃（目標３０〜４０℃）の範囲の温度まで加温し、次いで、衝突ジェットミキサー内で混合して直ちにＬＮＰを形成する。ティー内径（ｔｅｅＩＤ）は、０．２５〜１．０ｍｍの範囲および１０〜６００ｍＬ／分の全流量を有することができる。流量と管内径組合せは、ＬＮＰの粒径を３０〜２００ｎｍに制御する効果がある。次いで、溶液を、より高いｐＨの緩衝化溶液と、１：１〜１：３容量：容量（１：２容量：容量を目途）の範囲の混合比で混合することができる。この緩衝化溶液は、１５〜４０℃の範囲（３０〜４０℃を目途）の温度である。混合されたＬＮＰを、陰イオン交換濾過ステップの前に、３０分〜２時間保持する。インキュベーション中の温度は、１５〜４０℃の範囲（目標３０〜４０℃）である。インキュベーション後、溶液を、陰イオン交換分離ステップを含む、０．８μｍフィルターを通して濾過する。このプロセスは、１ｍｍ  ＩＤ〜５ｍｍ  ＩＤの範囲の管内径および１０〜２０００ｍＬ／分の流量を使用することができる。ＬＮＰを濃縮し、限外濾過法（アルコールが除去され、クエン酸バッファが、たとえばリン酸緩衝食塩水等の、最終バッファ溶液に交換される）によって血液透析濾過する。限外濾過法は、タンジェント流濾過方式（ＴＦＦ）を使用することができる。このプロセスは、３０〜５００ＫＤの範囲の膜公称分画分子量を使用することができる。膜方式は、中空糸かまたはフラトシートカセットである。適切な分画分子量を用いたＴＦＦプロセスは、ＬＮＰをリテンテート（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）中に保持することができ、濾液または透過水はアルコール；クエン酸バッファ；最終バッファ廃棄物を含む。ＴＦＦプロセスは、ｓｉＲＮＡ濃縮までの初期濃度が１〜３ｍｇ／ｍＬの多段プロセスである。濃縮後、アルコールを除去し、バッファ交換を実施するために、ＬＮＰ溶液を、１０〜２０容量の最終バッファに対して血液透析濾過する。材料を、さらに１〜３倍濃縮することができる。ＬＮＰプロセスの最終ステップは、濃縮ＬＮＰ溶液を除菌濾過して生成物を瓶に入れることである。
【０１２４】
分析手順：
１）ｓｉＲＮＡ濃度
ｓｉＲＮＡ二本鎖濃度は、２９９６ＰＤＡ検出器を具備するＷａｔｅｒｓ  ２６９５  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）を使用して、強陰イオン交換高速液体クロマトグラフィ（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）により測定する。ＬＮＰ（別名ＲＮＡｉ送達媒体（ＲＤＶ）と呼ばれる）を、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理し、全ｓｉＲＮＡを遊離させ、Ｄｉｏｎｅｘ  ＢｉｏＬＣ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ２００（４×２５０ｍｍ）カラムを使用し、２５４ｎｍでＵＶ検出して、ＳＡＸ分離により分析する。移動相は、Ａ：２５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０％ＥｔＯＨ、ｐＨ７．０およびＢ：２５０ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０％ＥｔＯＨ、ｐＨ７．０で構成され、０〜１５分の線形勾配および流量１ｍｌ／分である。ｓｉＲＮＡ量は、ｓｉＲＮＡ標準曲線と比較することにより決定される。
【０１２５】
２）封入率
蛍光試薬ＳＹＢＲ  ＧｏｌｄをＲＮＡ定量化に使用して、ＲＤＶの封入率をモニターする。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む、または含まない、ＲＤＶを使用して、遊離ｓｉＲＮＡ量および全ｓｉＲＮＡ量を決定する。このアッセイは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）製のＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５ｅマイクロプレート分光光度計を使用して実施される。試料を４８５ｎｍで励起し、蛍光発光を５３０ｎｍで測定する。ｓｉＲＮＡ量は、ｓｉＲＮＡ標準曲線と比較することにより決定される。
封入率＝（１−遊離ｓｉＲＮＡ／全ｓｉＲＮＡ）×１００％
【０１２６】
３）粒径および多分散性
１μｇのｓｉＲＮＡを含有するＲＤＶを、１×ＰＢＳで希釈して最終体積３ｍｌにする。試料の粒径および多分散性は、ＺｅｔａＰＡＬＳ計器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用して、動的光散乱法により測定する。散乱強度は、２５℃、散乱角９０°で、Ｈｅ−Ｎｅレーザを用いて測定する。
【０１２７】
４）ゼータ電位分析
１μｇのｓｉＲＮＡを含むＲＤＶを、１ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファ（ｐＨ７．４）で希釈して最終体積２ｍｌにする。試料の電気泳動移動度は、電極および光源としてＨｅ−Ｎｅレーザを具備するＺｅｔａＰＡＬＳ計器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用して決定する。スモルフスキー極限は、ゼータ電位の計算において仮定される。
【０１２８】
５）脂質分析
個々の脂質濃度は、コロナ荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）（ＥＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＭＡ）を具備するＷａｔｅｒｓ  ２６９５  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）を使用して、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で決定される。ＲＤＶ中の個々の脂質は、６０℃で、ＣＡＤを具備するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ，粒径１．８μｍ）カラムを使用して分析する。移動相は、Ａ：Ｈ２Ｏ中０．１％ＴＦＡおよびＢ：ＩＰＡ中０．１％ＴＦＡで構成される。勾配は、流量１ｍｌ／分で、０時における移動相Ａ６０％および移動相Ｂ４０％から１．００分における移動相Ａ４０％および移動相Ｂ６０％に；１．００〜５．００分における移動相Ａ４０％および移動相Ｂ６０％；５．００分における移動相Ａ４０％および移動相Ｂ６０％から１０．００分における移動相Ａ２５％および移動相Ｂ７５％に；１０．００分における移動相Ａ２５％および移動相Ｂ７５％から１５．００分における移動相Ａ５％および移動相Ｂ９５％に；そして１５．００における移動相Ａ５％および移動相Ｂ９５％から２０．００分における移動相Ａ６０％および移動相Ｂ４０％に、変えることができる。個々の脂質濃度は、二次曲線当てはめにより、ＲＤＶ中の全脂質成分を含む標準曲線と比較することによって決定される。各脂質のモルパーセンテージは、その分子量に基づいて計算される。
【０１２９】
上述のＬＮＰプロセスを用いて、下記の比率を有する具体的なＬＮＰが同定される。
【０１３０】
組成式：
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６０／３８／２
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ５８／３０／２／１０
【０１３１】
Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ
【化３７】
2015520733.tif 000043
【０１３２】
組成式
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６０／３８／２
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ５８／３０／２／１０
【０１３３】
ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡ
【化３８】
2015520733.tif 000044
【０１３４】
β−カテニンｓｉＲＮＡ
【化３９】
2015520733.tif 000045
【０１３５】
オリゴヌクレオチド合成は当該技術分野で周知である。（米国特許出願第２００６／００８３７８０号明細書、米国特許出願第２００６／０２４０５５４号明細書、米国特許出願第２００８／００２００５８号明細書、米国特許出願第２００９／０２６３４０７号明細書および米国特許出願第２００９／０２８５８８１号明細書ならびにＰＣＴ特許出願：国際公開第２００９／０８６５５８号パンフレット、国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット、国際公開第２００９／１３２１３１号パンフレット、国際公開第２０１０／０４２８７７号パンフレット、国際公開第２０１０／０５４３８４号パンフレット、国際公開第２０１０／０５４４０１号パンフレット、国際公開第２０１０／０５４４０５号パンフレットおよび国際公開第２０１０／０５４４０６号パンフレット参照）。開示され、実施例で使用さているｓｉＲＮＡは、標準固相手順で合成される。
【０１３６】
実施例１
有効性のマウス・インビボ評価
すぐ上に記述した組成式において、化合物１〜３４を使用したＬＮＰを、インビボ有効性について評価する。ｓｉＲＮＡは、ホタル（フォチナス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ））ルシフェラーゼ遺伝子（寄託番号Ｍ１５０７７）のｍＲＮＡ転写物をターゲットすることができる。ルシフェラーゼｓｉＲＮＡの一次配列および化学修飾パターンは上に表示されている。インビボ  ルシフェラーゼモデルは、ホタル  ルシフェラーゼコード配列が全細胞に存在するトランスジェニックマウスを使用する。Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからライセンスを受けたＲＯＳＡ２６−ＬｏｘＰ−Ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−Ｌｕｃ（ＬＳＬ−Ｌｕｃ）トランスジェニックマウスを、先ず組み換えＡｄ−Ｃｒｅウイルス（ＶｅｃｔｏｒＢｉｏｌａｂｓ）を用いてＬＳＬ配列を除去することにより、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するように誘導する。ウイルスの向臓器性のため、尾静脈注射により送達されるとき、発現は肝臓に限定される。肝臓におけるルシフェラーゼ発現レベルは、ルシフェリン基質（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の投与後に、ＩＶＩＳイメージャ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して光出力を測定することにより定量化する。投与前発光レベルは、ＲＤＶの投与前に測定する。ＰＢＳ中のルシフェリン（１５ｍｇ／ｍＬ）を、１５０μＬの量で腹腔内（ＩＰ）注射する。４分間インキュベートした後、マウスをイソフルランで麻酔し、ＩＶＩＳイメージャに入れる。ＰＢＳ媒体中のＲＤＶ（ｓｉＲＮＡを含有）を、０．２ｍＬの量で尾静脈注射する。最終投与レベルは、０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡであり得る。コントロールとして、ＰＢＳ媒体のみを投与する。投与後４８時間に、上述の方法を使用してマウスを撮像する。ルシフェリン光出力の変化は、ルシフェラーゼｍＲＮＡレベルと直接的に相関があり、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ活性の間接的尺度を表す。インビボ有効性の結果は、投与前発光レベルと比較した、発光の％阻害として表される。
【０１３７】
実施例２
インビトロＡｐｏＥ結合アッセイ
ＬＮＰを、９０％アカゲザル血清中、最終ＬＮＰ濃度４μｇ／ｍＬで、３７℃でインキュベートする。インキュベーションは、軌道回転で、２０分間である。インキュベーション後、試料をＰＢＳで１：２０希釈し、各希釈試料１００μＬを、抗−ＰＥＧ抗体被覆９６−ウェルプレート（Ｌｉｆｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓカタログ番号Ｐ−０００１ＰＬ）のウェルに分取する。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ  ３００μＬで５回洗浄する。洗浄後、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ５０μＬを各ウェルに加え、プレートを３７℃で１０分間インキュベートし、続いて、７５０ｒｐｍのプレートシェーカー上で１分間振盪する。試料のＡｐｏＥ  ＥＬＩＳＡおよびステム・ループＰＣＲ分析を実施する前に、試料を凍結する。
【０１３８】
アカゲザル血清中でインキュベートした後、ＬＮＰに結合したＡｐｏＥを定量化するために、ＡｐｏＥ  ＥＬＩＳＡアッセイを実施する。抗−ＡｐｏＥ抗体（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＡＢ９４７）をＰＢＳで１：１０００希釈し、希釈抗体１００μＬを、ポリスチレン高結合プレートの各ウェルに加える。抗体が入っているプレートを４℃で一晩インキュベートし、その後プレートをＰＢＳ  ２００μＬで２回洗浄する。次に、ＰＢＳ中に１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するバッファ（インキュベーションバッファ）２００μＬを各ウェルに加え、続いて室温で１時間インキュベートする。プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで５回洗浄する。凍結したトリトン溶解検査試料を解凍して、インキュベーションバッファで１：６希釈し、検査試料１００μＬをＡｐｏＥ抗体プレートのウェルに分取する。インキュベーションは室温で１時間であり、続いて０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで５回洗浄する。洗浄後、インキュベーションバッファで１：５００希釈した、ビオチン化抗ＡｐｏＥ抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ、カタログＡ番号Ｅ８８７−ビオチン）１００μＬを、各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗浄する。次いで、ウェル当たり１００μＬのストレプトアビジンーＨＰＲ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＰＲ）（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号ＴＳ−１２５−ＨＲ）を加え、室温で１時間インキュベートする。ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗浄した後、１００μＬのＴＭＢ基質（ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号３４０２８）を各ウェルに加え、続いて暗所にて室温で２０分間インキュベートする。比色反応を、１００μＬのＴＭＢ停止液（ＴＭＢ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＫＰＬ、カタログ番号５０−８５−０４）で停止し、４５０ｎｍで吸光度を測定する。０．０３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むインキュベーションバッファでアカゲザル組み換えＡｐｏＥを希釈して、１００ｎｇ／ｍＬ〜０．７８ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で、ＡｐｏＥ標準曲線を作成する。ＡｐｏＥ標準を、検査試料と並行して、ＥＬＩＳＡで評価する。アカゲザル血清のみ（無ＬＮＰ）コントロールを使用して、ＥＬＩＳＡにおける無ＬＮＰ依存的ＡｐｏＥシグナルのバックグラウンド除去を得る。
【０１３９】
ステム・ループＲＴ−ＰＣＲプロトコール
抗−ＰＥＧ抗体プレートに結合したＬＮＰの量に結合したＡｐｏＥに正規化するために、抗−ＰＥＧ抗体ウェルに保持されているｓｉＲＮＡの量を、ステム・ループＰＣＲで定量し、ＬＮＰ当たりの封入されたｓｉＲＮＡ数と関連させ、結合した全ＬＮＰ粒子のウェル当たりの近似測定値を与える。
【０１４０】
標準添加曲線試料の調製：
コピー数を計算するために、ｓｉＲＮＡの分子量（ＡｐｏＢ  １７０６３では１３６９３ｇ／ｍｏｌ）を使用して、標準曲線を作成する。高標準は、３μｌ当たり１０１１コピーを含まなくてはならない。最低標準が３μｌ当たり１０２コピーを含むまで、アッセイプレートの一列全体に、１０倍段階希釈を実施する。０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を水で１：８０希釈し、希釈したＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ２０μＬを、９６ウェルプレートの１０ウェルにピペットで移す。３０μＬの段階希釈標準曲線およびミックスをプレートの各ウェルに加える。１０μＬの標準添加曲線を、逆転写反応で使用する。
【０１４１】
ステム・ループＲＴ−ＰＣＲ−検査試料および標準曲線：
ＰＥＧ抗体プレート捕獲からのトリトン溶解物を無ヌクレアーゼ水で１：２０００希釈する。１０μＬの「ＲＴ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ」（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔカタログ番号４３６６５９６）を９６−ウェルＭｉｃｒｏ−ＡｍｐＱＰＣＲプレート（ＡＢＩカタログ番号Ｎ８０１−０５６０）の各ウェルに加える。
【０１４２】
【表６】
2015520733.tif 000046
【０１４３】
【化４０】
2015520733.tif 000047
【０１４４】
１０μＬの各検査試料（１：２０００希釈）または標準添加曲線（上記）を９６−ウェルプレートに分取する。プレートをマット（ＡＢＩカタログ番号Ｎ８０１−０５５０）で覆い、蒸発を最小限に抑える。プレートを、８００ｒｐｍで１分間、手短に遠心分離する。次に、下記のサイクリングパラメータを使用して、サーモサイクラでプレートを管理する。
【０１４５】
【表７】
2015520733.tif 000048
【０１４６】
次に、１０μＬの「ＲＴ  Ｍｉｘ」を各ウェル（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔカタログ番号４３６６５９６）に加える。
【０１４７】
【表８】
2015520733.tif 000049
【０１４８】
ＲＴサイクリング反応は、検査試料１０μＬ、ＲＴプライマーミックス１０μＬおよびＲＴ  Ｍｉｘ成分１０μＬ、総体積３０μＬで構成される。全ＲＴミックス計３０μＬ中のＲＴ−プライマーの最終濃度は２００ｎＭである。次に、プレートを同じプレートマットで密封し、８００ｒｐｍで１分間、手短に遠心分離し、次いで下記のサイクリングパラメータを使用して、サーモサイクラでプレートを管理する。
【０１４９】
【表９】
2015520733.tif 000050
【０１５０】
次に、１５μＬのＦａｓｔ  Ｅｎｚｙｍｅ／プライマー−プローブミックスを新しいＦａｓｔ９６−ウェルプレートの各ウェルに加える（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、カタログ番号４３５２０４２）。
【０１５１】
【表１０】
2015520733.tif 000051
【０１５２】
ＡｐｏＢプライマーおよびプローブ配列：
１７０６３ＤＣ  Ｆ３  ＧＧＣＧＣＧＡＡＡＴＴＴＣＡＧＧＡＡＴＴＧＴ（配列番号：１２）
１７０６３ＤＣ  Ｐｒ２  ＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡ（配列番号：１３）
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｒ２  ＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧ（配列番号：１４）
【０１５３】
５μＬの各ＲＴ反応を、Ｆａｓｔ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘプレートに加える。プレートを１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、Ｆａｓｔ  Ｂｌｏｃｋを具備するＡＢＩ７９００でＱＰＣＲ分析を実施する。サイクリングパラメータは以下の通りである：１サイクル−９５℃で２０秒間、続いて４０サイクル−９５℃で１秒間、６０℃で２０秒間。
【０１５４】
ＱＰＣＲ結果を使用して、ＰＥＧ抗体捕獲板トリトン溶解物中のｓｉＲＮＡ濃度を計算する。ＬＮＰ粒子当たり５００ｓｉＲＮＡという推定に基づいて、抗−ＰＥＧ抗体プレートの各ウェルに保持されるＬＮＰ数を計算することができる。ＡｐｏＥ  ＥＬＩＳＡおよびウェル当たりのＬＮＰ粒子数によって決定される、ウェル当たりのＡｐｏＥ濃度を使用して、ＬＮＰ粒子当たりの結合したおおよそのＡｐｏＥ分子を計算することができる。
【０１５５】
実施例３
ヘパリンセファロースＨＩ−ＴＲＡＰ（商標）結合アッセイ
中立表面電荷をもつ脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、泳動バッファとしての１Ｘ  ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）リン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）と共にヘパリンセファロースに注入された後、保持されないが、カラム空隙容積中に溶離する。血清アポリポ蛋白質Ｅ（ＡｐｏＥ）はヘパリン硫酸と高親和性結合を示し、また精製されたおよび／または組み換え型のヒトＡｐｏＥまたは血清試料とのインキュベーション後、ＬＮＰは、ＡｐｏＥを結合するそれらの固有の能力に応じて（脂質ナノ粒子組成とＡｐｏＥ濃度の両方によって）ある程度、ヘパリンセファロースに結合することを示すことができる。高い親和性でヘパリンセファロースに結合する表面結合したＡｐｏＥが付いた脂質ナノ粒子は、高塩（１Ｍ  ＮａＣｌ）でのみ溶離され得る。
【０１５６】
ヘパリンセファロースに対してＡｐｏＥ−ＬＮＰ複合体が示す高親和性相互作用に基づいて脂質ナノ粒子への血清ＡｐｏＥの結合を評価するための、ヘパリンセファロース結合アッセイが開発されている。
【０１５７】
インキュベーション
最終ｓｉＲＮＡ濃度５０μｇ／ｍＬ、３７℃で２０分間、脂質ナノ粒子を、１Ｘダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中の様々な濃度の精製されたまたは組み換え型のヒトアポリポ蛋白質Ｅかまたは０．１〜５０％のラット／マウス／アカゲザル／ヒト血清のいずれかと共にインキュベートする。ＡｐｏＥまたは血清ＬＮＰとインキュベートした後、試料を、１Ｘ  ＤＰＢＳを使用して１０倍希釈し、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーで分析する。ＡｐｏＥ／血清とのインキュベーション後に高親和性ヘパリン相互作用にシフトするＬＮＰのパーセンテージを決定するために、保持されたＬＮＰのピーク面積（適切なブランクシグナルの減算後）を、ＡｐｏＥおよび／または血清インキュベーションのないＬＮＰコントロールの全ピーク面積と比較する。
【０１５８】
ヘパリンセファロースＨＩ−ＴＲＡＰ（商標）クロマトグラフ条件
ヘパリンセファロースＨＩ−ＴＲＡＰ（商標）クロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；１ｍＬカラム床体積）を、１Ｘまたは２Ｘ  ダルベッコのＰＢＳのいずれかと平衡化させる；より高い２Ｘ塩濃度が、ヘパリンセファロースでの固有保持がより高いＬＮＰに使用される（多分、より高い表面正電荷による）。
移動相Ａ：１Ｘまたは２Ｘ  ＤＰＢＳ
移動相Ｂ：１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．０中、１Ｍ  ＮａＣｌ
１００％Ａが均一濃度で１０分間送達され、続いて１００％Ｂまで段階的勾配；さらに１０分間保持；１００％Ａに戻るまで段階的勾配および次の試料を注入する前にさらに１０分間再平衡化
流量：１ｍＬ／分
試料注入量：５０μＬ
検出：ＵＶ＠２６０ｎｍ
【０１５９】
実施例４
有効性および毒性のラットインビボ評価
上述の組成式の化合物を使用したＬＮＰを、インビボ有効性およびアラニンアミノトランスフェラーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの増加について、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）メスラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）で評価する。ｓｉＲＮＡは、ＡｐｏＢ遺伝子（寄託番号ＮＭ０１９２８７）のｍＲＮＡ転写物をターゲットする。ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡの一次配列および化学修飾パターンは上に表示されている。ＰＢＳ媒体中のＲＤＶ（ｓｉＲＮＡを含有）を、１〜１．５ｍＬの量で尾静脈注射する。注入速度はおよそ３ｍｌ／分である。各投与群でラット５匹を使用した。ＬＮＰ投与後、ラットを標準的な食餌および水のあるケージに入れる。投与後６時間に、飼料をケージから除去する。ＬＮＰ投与の２４時間後に動物の剖検を実施する。ラットをイソフルラン下で５分間麻酔し、次いで瀉血が完了するまで、イソフルランの送達を継続しながらラットをノーズコーンに入れることによって麻酔下で維持する。２３ゲージ蝶形静脈穿刺セットを使用して血液を大静脈から採取し、血清化学分析のために、血清分離器バキュテナーに分取する。切除した肝葉のパンチを採取し、ｍＲＮＡ分析のためにＲＮＡＬａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）に入れる。保存された肝組織をホモジナイズし、製造業者の取扱説明書に従って、ＱｉａｇｅｎビーズミルおよびＱｉａｇｅｎ  ｍｉＲＮＡ−Ｅａｓｙ  ＲＮＡ単離キットを使用して、総ＲＮＡを単離する。肝ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定する。ラットＡｐｏＢ市販プローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＲＮ０１４９９０５４＿ｍ１）を使用して、精製ＲＮＡからメッセージを増幅する。ＰＣＲ反応は、９６−ウェルＦａｓｔ  Ｂｌｏｃｋを具備するＡＢＩ  ７５００計器で実施する。ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピングＰＰＩＢ（ＮＭ  ０１１１４９）ｍＲＮＡに正規化する。ＰＰＩＢ  ｍＲＮＡレベルは、市販のプローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓカタログ番号Ｍｍ００４７８２９５＿ｍ１）を使用してＲＴ−ＰＣＲで決定する。結果は、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ／ＰＰＩＢ  ｍＲＮＡの比率として表示される。全てのｍＲＮＡデータは、ＰＢＳコントロール用量と比較して表示される。血清ＡＬＴおよびＡＳＴ分析は、Ｓｉｅｍｅｎｓアラニンアミノトランスフェラーゼ（カタログ番号０３０３９６３１）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（カタログ番号０３０３９６３１）試薬を使用して、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ａｄｖｉａ  １８００  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒで実施する。
【０１６０】
実施例５
ラット／サル肝臓におけるカチオン性脂質の測定
肝組織を２０ｍｌバイアル内に秤量し、９ｖ／ｗの水中で、ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ  ２０００（ＯＰＳ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、１６００ストローク／分、５分）を使用してホモジナイズする。各組織ホモジネートのアリコート５０μＬを抽出／蛋白質沈降溶媒（５００ｎＭ内部標準を含有する５０／５０アセトニトリル／メタノール）３００μＬと混合し、プレートを遠心分離して、沈降した蛋白質を沈殿させる。次いで、各上澄２００μＬを、９６−ウェルプレートの別のウェルに移し、試料１０μＬをＬＣ／ＭＳ−ＭＳで直接分析する。
【０１６１】
化合物のメタノール貯蔵液の既知量を、未処理のラット肝ホモジネート（９容量の水／肝重量）に添加することによって、標準を調製する。各標準／肝ホモジネートのアリコート（５０μＬ）を、抽出／蛋白質沈降溶媒（５００ｎＭ内部標準を含有する５０／５０アセトニトリル／メタノール）３００μＬと混合し、プレートを遠心分離して、沈降した蛋白質を沈殿させる。各上澄２００μＬを、９６−ウェルプレートの別のウェルに移し、各標準１０μＬをＬＣ／ＭＳ−ＭＳで直接分析する。
【０１６２】
絶対定量対肝ホモジネートから調製され抽出された標準は、ＡＰＩ  ４０００三重四極質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に連結されたＡｒｉａ  ＬＸ−２  ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施される。各泳動のために、計１０μＬの試料が、周囲温度にて、ＢＤＳ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｃ８  ＨＰＬＣカラム（Ｔｈｅｒｍｏ、５０×２ｍｍ、３μｍ）に注入される。
【０１６３】
移動相Ａ：９５％Ｈ２Ｏ／５％メタノール／１０ｍＭギ酸アンモニウム／０．１％ギ酸  移動相Ｂ：４０％メタノール／６０％ｎ−プロパノール／１０ｍＭギ酸アンモニウム／０．１％ギ酸  流量は０．５ｍＬ／分であり、勾配溶離プロフィールは以下の通りである：８０％Ａで０．２５分間保持、１．６分にわたって１００％Ｂまで直線ランプ、１００％Ｂで２．５分間保持、次いで戻って８０％Ａで１．７５分間保持。全泳動時間は５．８分である。ＡＰＩ  ４０００ソースパラメータは、ＣＡＤ：４、ＣＵＲ：１５、ＧＳ１：６５、ＧＳ２：３５、ＩＳ：４０００、ＴＥＭ：５５０、ＣＸＰ：１５、ＤＰ：６０、ＥＰ：１０である。
【０１６４】
実施例６
ＡｐｏＢ有効性のアカゲザルインビボ評価
上述の組成式の化合物を使用したＬＮＰを、オスまたはメスのマカカ・ムラタ（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）（アカゲザル）でインビボ有効性について評価する。ｓｉＲＮＡは、ＡｐｏＢ遺伝子（寄託番号ＸＭ  ００１０９７４０４）のｍＲＮＡ転写物をターゲットする。ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡの一次配列および化学修飾パターンは上に表示されている。ＰＢＳ媒体中のＲＤＶ（ｓｉＲＮＡを含有）は、注入速度２０ｍＬ／分、投与レベル０．２５ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡで、伏在静脈における静脈注射により投与される。注入量は、１．９〜２．１ｍＬ／ｋｇであり、サルは体重２．５〜４．５ｋｇの範囲であってもよい。ＲＤＶまたはＰＢＳコントロールを、サル３匹に投与する。投与後複数日に、血清化学分析用に血液試料１ｍＬを大腿動脈から採取する。サルを、採血前に一晩絶食させる。有効性の尺度として、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ減少の下流代理マーカーとしてのＬＤＬ−Ｃをモニターする。
【０１６５】
実施例７
β−カテニン有効性のアカゲザルインビボ評価
試験−７日目に、腹腔鏡下外科的切除術（サル１匹について、ランダムに選択された１肝葉の外縁から、１生検試料の切除）によって、投与前肝生検試料（約０．５〜１ｇ／試料）をオス・アカゲザルから採取する。各投与前生検から３つの隣接していない約５０ｍｇ試料をサンプリングするために、５ｍｍ組織パンチを使用する。後のＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡ分析のために、試料をＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）中で保存する。
【０１６６】
試験０日目に、リン酸緩衝食塩水中の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）被験物質の懸濁液（０．０５〜０．１ｍｇ  ｓｉＲＮＡ／ｍＬ）を、目標用量０．６７、１．３４または３．３４ｍｇ  ｓｉＲＮＡ／ｍ２で、単回投与静脈内ボーラス注入により、サルに投与する。投薬のために、体表面積（ｍ２）を、以下に示す（１）確立した非比例的スケーリング関係に従って体重から推定する：
ＢＳＡ（ｍ２）＝０．１１＊体重（ｋｇで）０．６５
試験２日目および７日目に、ＬＮＰ投与後４８時間および１６８時間に、肝生検試料（約０．５〜１ｇ／試料）を、腹腔鏡下外科的切除術によりサルから採取する（サル１匹につき２つの別々の、ランダムに選択された肝葉が切除される）。４８時間および１６８時間外科的生検試料のそれぞれについて、３つの隣接していない約５０ｍｇ試料をサンプリングするために、５ｍｍ組織パンチを使用する。後のＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡ分析のために、試料をＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）中で保存する。
【０１６７】
ＣＴＮＮＢ１ｍＲＮＡレベルは、ＣＴＮＮＢ１のために確立されたプライマー／プローブセットを使用して相対的定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定され、ペプチジルプロリルイソメラーゼＢ（ＰＰＩＢまたはシクロフィリンＢとしても知られる）のｍＲＮＡレベルおよび１８ＳリボソームＲＮＡ（１８Ｓ  ｒＲＮＡ）のＲＮＡレベルに対して正規化される。ＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡ肝発現の変化は、投与後試料と各対応するサルの投与前肝試料との間のＰＣＲ閾値サイクル数（ΔΔＣｔ）の差として測定される。
【０１６８】
ＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡノックダウンの計算（前処置レベルに関して）は、以下の関係を使用してΔΔＣｔから計算される。
ｍＲＮＡ（％ノックダウン）＝１００−（１００／２−ΔΔＣｔ）
【０１６９】
（１）ＦＤＡ指針書：「企業用指針：健常な成人ボランティアにおける治療のための初回臨床治験で安全な最大開始用量を推定する」２００５年７月、米国保健社会福祉省、品医薬品局−医薬品評価センター（ＣＤＥＲ）
【０１７０】
実施例８
ＡＬＴ上昇のアカゲザルインビボ評価
遠心分離後、凝固したサル全血から採取される血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を測定する。Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍ自動化学アナライザーは、国際臨床化学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）標準手順および試薬を使用することにより、血清中のＡＬＴの酵素活性を測定する。アナライザーのコンピュータは、標準曲線と比較して試料中のＡＬＴ活性を計算するために、吸光度測定値を使用する。ＡＬＴ活性は、リットル当たりの国際単位（ＩＵ／Ｌ）で報告される。
【配列表】
2015520733000001.app
【国際調査報告】
2015520733.tif 000053