(57)【要約】  本発明は、１つまたは複数の金属、金属合金、金属酸化物、もしくはその組み合わせを有する生体適合インプラントであって、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせからなる群から選択される化合物が、上記生体適合インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面の少なくとも一部に共有結合している生体適合インプラントに関する。ＩＰと、金属、金属合金、または金属酸化物表面との共有結合は、結合剤を使用することによってさらに促すことができる。本発明に係るインプラントは、共有結合されたフィチン酸塩を有するコーティングの効力によって、哺乳類の体などの体内に埋め込まれた時に、オッセオインテグレーション効果の調整、および／または改善をもたらす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の金属、金属合金、金属酸化物、もしくはその組み合わせを有する生体適合インプラントであって、イノシトールリン酸（ＩＰ）、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせからなる群から選択される化合物が、上記生体適合インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面の少なくとも一部にリンカーを介してまたは介さずに共有結合している生体適合インプラント。
【請求項２】
上記ＩＰは、イノシトール六リン酸（ＩＰ６）などの、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のリン酸基を有する請求項１に記載の生体適合インプラント。
【請求項３】
結合剤が、上記金属、金属合金、または金属酸化物表面と、上記ＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせとに結合している請求項１または２に記載の生体適合インプラント。
【請求項４】
上記結合剤は、無水物、アルコール、酸、アミン、エポキシ、イソシアネート、シラン、ハロゲン化基、そして重合化基からなる群から選択され、好ましくは３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）である請求項３に記載の生体適合インプラント。
【請求項５】
上記金属、金属合金、金属酸化物は、チタン、その合金または酸化物、ジルコニウム、その合金または酸化物、タンタル、その合金または酸化物、ハフニウム、その合金または酸化物、ニオブ、その合金または酸化物、クロム−バナジウム合金、およびステンレス鋼からなる群、から選択され、好ましくは、チタン、その合金または酸化物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体適合インプラント。
【請求項６】
上記インプラントは、外科インプラント、整形外科インプラント、歯科インプラント、整形外科固定具、整形外科人工関節、背骨固定用人工椎間板、およびグラフト剤からなる群から選択され、好ましくはチタン酸化物を含有する金属酸化物足場材であるインプラント請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体適合インプラント。
【請求項７】
上記インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面上に他の生体分子が存在し、上記生体分子は、生体接着剤、細胞接着因子、生重合体、血漿タンパク質、酵素、細胞外基質タンパク質、細胞外基質および生体分子、成長因子および成長ホルモン、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、受容体、合成生体分子、ビタミン、薬物、ビスホスホネート、生物活性イオン、フッ化物、およびマーカー生体分子の、天然生体分子、合成生体分子、および組み換え生体分子からなる群から選択される請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体適合インプラント。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体適合インプラントを製造する方法であって、ＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせを上記生体適合インプラントの表面に接触させて反応させる工程を有する方法。
【請求項９】
ａ）インプラントの表面を化学的に前処理する工程と、
ｂ）ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせを上記化学的に前処理された表面に接触させて反応させる工程とを有する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｂ）の前に、工程ａ）において得られた上記化学的に前処理された表面に結合剤を接触させて反応させる工程を行い、工程ｂ）においてＩＰと上記結合剤とを反応させる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程ａ）は、不動態化処理、ピラニア処理、または１種類もしくは複数種類のアルカリ溶液を用いた処理によって行われる請求項９または１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
上記ＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせは、工程ｂ）において上記表面に添加される前に活性化されている請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
上記活性化は、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）などのカルボジイミド架橋剤を、上記ＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせに添加することによって請求項１２に記載の方法
【請求項１４】
オッセオインテグレーションの調整および／または改善のために使用される請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体適合インプラント。
【請求項１５】
好ましくは、脊椎動物、人などの特に哺乳動物における骨組織を置換するおよび／または身体機能を復元するために、再生医療において使用される請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体適合インプラント。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、生体適合インプラントの分野に関し、特に、チタン、ジルコニウム、タンタル、ハフニウム、ニオブ、クロム−バナジウム合金、およびステンレス鋼などの少なくとも１つの金属、またはその合金を有する生体適合インプラントに関する。より具体的には、本発明は、生体適合インプラントが哺乳類の体に埋め込まれた時に、上記生体適合インプラントのオッセオインテグレーションを調整するおよび／または改善するコーティングを有する金属、金属合金、および／または金属酸化物表面を有する生体適合インプラントに関する。
【０００２】
（背景技術）
歯科インプラント、整形外科インプラント、人工器官、および脈管ステントなどの医療インプラントは、一般的にチタンおよび／またはチタン合金から作られる。チタンは、低密度、機械的強度、体液に対する耐薬品性などの優れた物理的および生物的特性を有しているため、骨内のインプラントとして最もよく利用される物質である。チタンは公知の生体適合性を有する物質であり、人工器官および歯科インプラントを製造するために大いに利用されている。チタン表面の化学的性質および構造は、骨結合を左右する最も重要な要素である。
【０００３】
歯科インプラントは、１本または複数の歯を失った患者の歯の修復処置に利用される。歯科インプラントは、取替人工歯根として用いられる歯科用フィクスチャを備えている。したがって歯科用フィクスチャは、新しい歯の歯根として機能する。概して、歯科用フィクスチャは組織の接触面積を広げるために凹凸のある表面を有するチタン製ネジである。チタン製ネジは外科的に顎の骨に埋め込まれ、その後骨の組織が上記ネジの周りに成長する。骨芽細胞が埋め込まれたネジの凹凸のある表面上およびその中に成長するため、このプロセスはオッセオインテグレーションと呼ばれる。オッセオインテグレーションによって、ネジの取付けが固定される。
【０００４】
チタン製ネジが顎骨にしっかり固定されると、取付け部を接続してチタン製ネジからの延伸を行うことができる。取付け部はネジと同様に、チタンまたはチタン合金から作られ得る。使用される取付け部の形および大きさは、ネジに取り付けられた後、正確に歯肉内に伸びるよう調整される。その後、歯冠、ブリッジまたは義歯などの歯科用修復物を取付け部に取付け得る。あるいは、チタン製ネジは、埋め込まれた後に歯肉内に伸びる形および大きさを有しているため、歯冠、ブリッジまたは義歯などの歯科用修復物を、取付け部を用いずにネジに直接取り付けてもよい。
【０００５】
整形外科インプラントは、特に関節および骨の筋骨格系の機能の維持および修復のために用いられ、これらの組織における痛みの軽減もその用途に含まれる。脈管ステントは、局所的な血流の狭窄を防ぐかまたは軽減するために、血管内に導入されるよう構成された管状のインプラントであり、すなわち脈管ステントは著しく狭くなった血管の直径に対処するものである。
【０００６】
上述したように、チタン（Ｔｉ）は、歯科用、整形外科用、および脈管ステントによく利用される。Ｔｉ表面に容易に生成される安定した酸化物は、チタンの優れた生体適合性に寄与すると報告されている。しかしインプラント表面に対する骨の反応は、Ｔｉ表面の化学的および物理的特性に左右され、それがインプラントの成否に影響を与えるとも報告されている。そのため、Ｔｉインプラントの表面の調製が注目されている。
【０００７】
チタン表面およびその合金は生体不活性であるため、それらがオッセオインテグレーションに用いられる時、周囲の環境からインプラントを包み込み、隔離する調整可能な厚みの繊維組織が生成され得る。このオッセオインテグレーションの欠如には、生体活性コーティングを結合させてインプラントの表面を改質することによって対処する。インプラント表面の改質についての現在の研究は、実質的に生体不活性な物質を生体活性に変えること、またはむしろインプラント後すぐに表面に吸収されるタンパク質の種類に影響を及ぼすことに、焦点を当てている。表面改質の種類は、炭化物、フッ素、カルシウム、ヒドロキシアパタイト、またはリン酸カルシウムなどの非生物コーティングから、脂質単層または脂質二重層、成長因子、タンパク質および／またはペプチドを用いた生物環境を模倣するコーティングに亘る。
【０００８】
例えば、チタン製の人工器官の金属表面上の人工器官の表面に、様々な活性生体分子を結合または組み合わせることによって、人工器官またはインプラントの生体適合性を向上させることが、提案されている。この方法によって作成されるインプラントの目標は、適合性が改善し；組織の厚みの増加および組織の生体適合性の向上を示し；細胞の成長、分化、および成熟の増加のための生物活性表面を有し；免疫反応の低下を示し；抗菌活性を示し；生体石灰化力の向上を示し；結果的に外傷および／または骨の治癒が向上し；骨密度が改善し；「所要時間」が減りかつ炎症を減らすことによってある。
【０００９】
機械に掛けること、または研磨すること、酸性またはアルカリ性処理、陽極酸化、化学蒸着法、シラン化による生化学的改質、物理蒸着法、イオン注入、およびグロー放電プラズマ処理を含む、様々な機械的、化学的、および物理的表面改質方法が、チタン合金に利用されている。周波数グロー放電（ＲＦＧＤ）を用いたプラズマ処理が、他の重合体や生体分子の共有結合のための活性官能基を蓄積させるために用いてもよいため、生物学的用途として特に適している。同様に、末端官能基とのシランカップリング剤が、無機シリカならびに金属物質の表面改質に利用されている。他にも、優れた安定性を有する有機膜を生成するためのアルキルシランによるチタン表面の改質、さらに有機官能性トリアルコシシランなどのカップリング剤が、無機分子と有機分子の間（または一部）の耐久性のある化学結合を形成するために利用されていることが報告されている（Liu, Chu et al.2004）。
【００１０】
しかしながら、イノシトールリン酸（ＩＰ）が、直接にまたは結合剤を介して金属表面に共有結合されることは全く報告されていない。
【００１１】
（塩形態の時に）フィチン酸またはフィチン酸塩としても知られるミオ−イノシトール−１、２、３、４、５、６−六リン酸（ＩＰ６）は、野菜の種および豆に豊富に存在する分子である。ＩＰ６は、主に食物の摂取である外部からの摂取によって、すべての哺乳類の生体液（尿、血漿等）にも自然に存在している。この化合物のヒトの健康への潜在的な有益な効果が最近いくつか実証されている。特に、ＩＰ６は、骨粗しょう症の動物モデルにおける骨の吸収の阻害剤として機能する。ＩＰ６は、骨の無機質成分であるヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）の表面に吸着し、骨量の進行性損失を低減し、ヒドロキシアパタイトの溶解に対する強力な阻害剤として機能する。
【００１２】
ＩＰの構造およびそのカルシウムイオンへの親和性によって、ＩＰは結晶化阻害剤としての特性および骨吸収抑制特性を備えている（Grases, Sanchis et al. 2010）。
【００１３】
フィチン酸塩は、陽極処理によって生成された金属酸化物を含有するリンのコーティングを有する生体適合インプラントを開示する例えばＷＯ２００４／０２４２０２において、生体適合性を有する医療インプラントに関連して記載されている。コーティングはインプラントに加えられ、上記インプラントの骨組織への結合が改善される。
【００１４】
さらに、ＷＯ２００４／０２４２０２と同様に、ＵＳ５，４７８，２３７でも、陽極処理によってインプラントが製造される。本文献に記述されたインプラント上のコーティングは、上記文献に記載の生体適合インプラントの骨の成長を向上させるためのＣａイオンおよびＰイオンをさらに有する。
【００１５】
しかし、陽極処理は生体分子の共有結合を作り出さないが、酸素および生体分子（例えば、ＣａおよびＰを有する）を含有する吸着膜層を金属表面に生成することを含む。
【００１６】
現在の技術において生体適合インプラントが利用可能であるにも関わらず、哺乳類の体内に導入した時のインプラントのオッセオインテグレーションをさらに改善し得る別の生体適合インプラントを特定することが未だに求められている。したがって、本発明の目的は、生体活性分子をインプラント表面に永続的に結合する際の困難性に主に関わる、先行技術のインプラントに関連するいくつかの問題を克服することによってある。さらに、利用可能な技術の多くには、インプラント表面へのこれらの化合物の物理的吸収（不安定な結合）に関して制約がある。
【００１７】
（発明の概要）
上述した目的は、１つまたは複数の金属、金属合金、金属酸化物、もしくはその組み合わせを有する生体適合インプラントであって、イノシトールリン酸（ＩＰ）、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせからなる群から選択される化合物が、上記インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面の少なくとも一部に共有結合している生体適合インプラントによって、今では少なくともある程度達成されている。本発明はまた、チタンおよび／またはチタン合金を有する生体適合インプラントであって、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせからなる群から選択される化合物が、上記生体適合インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面の少なくとも一部に共有結合している生体適合インプラントにも関する。
【００１８】
したがって、本願の発明者らは、驚くべきことに、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、および／もしくはその組み合わせを、生体適合性を有すインプラントのチタンおよび／またはチタン合金表面などの金属、金属合金、または金属酸化物表面に共有結合させることによって、インプラントのオッセオインテグレーションの特性が著しく改善され得ることを今回発見している。そのような生体適合インプラントはこれまで公知ではなく、この分野で示されたこともない。
【００１９】
本発明はさらに、シリコン結合剤などの結合剤が、インプラントの表面と、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせとの間に共有結合を形成することに用いられる生体適合インプラントに関する。そのような態様では、上記結合剤の一部が上記表面に結合し、上記結合剤の他方の部分が、上記ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせに結合し、それによって上記ＩＰと上記表面との間に共有結合が形成される。上記結合剤と、上記表面と、上記ＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせとの間の結合は、上記結合剤と、上記ＩＰとの間に発生する化学反応によって起こり、その結果、上記表面と、上記ＩＰおよび／またはＩＰのエステルとの間の共有結合が安定する。そのような事実が例えば図１または図２に示されている。
【００２０】
本発明はまた、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、またその組み合わせを、生体適合インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面に加える工程を有する生体適合インプラントを製造する方法であって、ＩＰ、フィチン酸塩のエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせを、化学的に前処理したインプラントに加える前に、上記生体適合インプラントを化学的に前処理する工程を任意に有し得る方法にも関する。上記方法は、上記インプラントの化学的前処理後、および上記ＩＰを上記生体適合インプラントに加える前に、シリコン結合剤などの結合剤を加える工程をも有することができる。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書において定義された方法によって得ることができる生体適合インプラント、および生体適合インプラントを必要とする患者に上記インプラントを導入する方法にも関する。
【００２２】
また、本発明の態様／実施形態は、下記の各項にも見出すことができる。
【００２３】
第１項．１つまたは複数の金属、金属合金、金属酸化物、もしくはその組み合わせを有する生体適合インプラントであって、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせからなる群から選択される化合物が、上記生体適合インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面の少なくとも一部に、リンカーを介してまたは介さずに共有結合している生体適合インプラント。
【００２４】
第２項．上記ＩＰは、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のリン酸基を有する、例えばイノシトール六リン酸（ＩＰ６）である第１項に記載の生体適合インプラント。
【００２５】
第３項．前記生体適合インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面に存在するＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、および／もしくはその組み合わせの少なくとも５０重量％が上記表面に共有結合している第１項に記載の生体適合インプラント。
【００２６】
第４項．上記生体適合インプラントの上記金属、金属合金、または金属酸化物表面に存在する上記ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせの少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％、または少なくとも８０重量％が上記表面に共有結合している第１〜第３項のいずれか１項に記載の生体適合インプラント。
【００２７】
第５項．結合剤が、上記金属、金属合金、または金属酸化物表面と、上記ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせとに結合している第１項〜第４項のいずれか１項に記載の生体適合インプラント。
【００２８】
第６項．上記結合剤は、無水物、アルコール、酸、アミン、エポキシ、イソシアネート、シラン、ハロゲン化基、そして重合化基からなる群から選択され、好ましくは３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）である第５項に記載の生体適合インプラント。
【００２９】
第７項．上記金属、金属合金、金属酸化物、もしくはその組み合わせは、チタン、その合金または酸化物、ジルコニウム、その合金または酸化物、タンタル、その合金または酸化物、ハフニウム、その合金または酸化物、ニオブ、その合金または酸化物、クロム−バナジウム合金、および／または複合酸化物、およびステンレス鋼からなる群から選択され、好ましくは、チタン、チタン酸化物、またはその合金である第１項〜第６項のいずれか１項に記載の生体適合インプラント。
【００３０】
第８項．外科インプラント、整形外科インプラント、歯科インプラント、整形外科固定具、整形外科人工関節 、背骨固定用人工椎間板、および金属からなる群から選択されるインプラントである第１項〜第７項のいずれか１項に記載の生体適合インプラント。上記インプラントは、グラフト剤、好ましくはチタン酸化物を含有する金属酸化物足場材であり得る。
【００３１】
第９項．他の生体分子が上記インプラントの金属、および／または金属合金からなる表面上に存在し、上記生体分子は、天然生体分子、合成生体分子、および組み換え生体分子の生体接着剤、細胞接着因子、生重合体、血漿タンパク質、酵素、細胞外基質タンパク質、細胞外基質生体分子、成長因子、成長ホルモン、核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）、受容体、合成生体分子、ビタミン、薬物、ビスホスホネート、生物活性イオン、フッ化物、およびマーカー生体分子からなる群から選択される第１項〜第８項のいずれか１項に記載の生体適合インプラント。
【００３２】
第１０項．第１項〜第９項のいずれか１項に記載の生体適合インプラントを製造する方法であって、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせを、上記生体適合インプラントの上記表面に接触させて反応させる工程を有する方法。
【００３３】
第１１項．
ａ）インプラントの上記表面を化学的に前処理する工程と、
ｂ）ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせを、上記化学的に前処理されたインプラントの表面に接触させて反応させる工程とを有する第１０項に記載の方法。
【００３４】
第１２項．工程ｂ）の前に、結合剤と、工程ａ）において得られた上記化学的に前処理された表面とを接触させて反応させる工程を行い、工程ｂ）においてＩＰと結合剤とを反応させる第１１項に記載の方法。
【００３５】
第１３項．工程ａ）は、不動態化処理、ピラニア処理、もしくは１種類または複数種類のアルカリ溶液を用いた処理によって行われる第１０項または第１１項に記載の方法。
【００３６】
第１４項．上記ＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせは、工程ｂ）において上記表面に添加する前に活性化されている第１１項〜第１３項のいずれか１項に記載の方法。
【００３７】
第１５項．上記活性化は、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）などのカルボジイミド架橋剤を上記ＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせに添加することによって行われる第１４項に記載の方法。
【００３８】
第１６項．上記活性化はリン化アミドの生成を含む第１４項または第１５項に記載の方法。
【００３９】
第１７項．上記リン化アミドの生成は、
ａ）活性エステルを生成するために、１−エチル−３−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩を、上記イノシトールリン酸フィチン酸塩、イノシトールリン酸フィチン酸塩のエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせに添加する工程と、その後、
ｂ）活性リン化アミドを生成するために、上記活性エステルにイミダゾールを添加する工程とを有する第１６項に記載の方法。
【００４０】
第１８項．第１０項〜第１７項のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる生体適合インプラント。
【００４１】
第１９項．オッセオインテグレーションの調整および／または改善のための、第１項〜第９項および第１８項のいずれか１項に記載の生体適合インプラント、の使用。
【００４２】
第２０項．好ましくは、脊椎動物、人などの特に哺乳動物における骨組織を置換するおよび/または身体機能を復元するために、再生医療において使用される第１項〜第９項および第１８項のいずれか１項に記載の生体適合インプラント。
【００４３】
第２１項．生体適合インプラントを必要とする患者に生体適合インプラントを導入する方法であって、
ａ）第１項〜第９項のいずれか１項、または第１８項に定義されたインプラントを準備する工程と、
ｂ）上記インプラントを外科的処置によって上記導入に導入する工程とを有する方法。
【００４４】
（図面の簡単な説明）
図１：結合剤を介した（ａ）、または結合剤を介さない（ｂ）、金属表面への生体分子の添加を示す概略図。
【００４５】
図２．（ａ）ＡＰＴＥＳを用いたＴｉＯ２表面の反応。（ｂ）カルボシドイミド架橋剤ＥＤＳおよびイミダゾールを用いたＩＰ６の活性化、およびそれに続く生体分子のチタン表面への結合（注：１個のリン酸基の活性化のみを示している）。
【００４６】
図３．結合剤を用いたＩＰ６の共有結合後のＴｉ表面のＥＤＳ分析。
【００４７】
図４．ＩＰ６の物理的吸着後のＴｉ表面の性質（ａ）洗浄していない試料のＥＤＳ分析。（ｂ）洗浄した試料のＥＤＳ分析。
【００４８】
図５．（ａ）化学的前処理が未実施、（ｂ）不動態化前処理後、（ｃ）ピラニア前処理後、（ｄ）アルカリ前処理後、の結合剤を用いたＩＰ６の共有結合後のＴｉ表面のＥＤＳ分析。
【００４９】
図６．砕骨細胞前駆細胞の細胞生存力および細胞増殖へのＩＰの影響。（Ａ）２４時間に亘って異なる量のＩＰ６を細胞に投与する処理後に収集した培養液を測定したＬＤＨ活性。正の対照である高毒性側標準（ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｒｏｌ）（１００％）は１％のトリトンＸ−１００で培養した細胞の培養液であった。負の対照である低毒性側標準（ｌｏｗ  ｃｏｎｔｒｏｌ）（０％）は対照細胞の培養液であった。値は平均±ＳＥＭを表している。マン−ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）検定によって有意差が評価され、＊はｐ≦０．０５対未処理細胞である。（Ｂ）２４時間に亘って異なる量のＩＰ６を投与され、６時間に亘ってＢｒｄＵをラベルされたＲＡＷ２６４．７細胞の増殖。対照細胞を１００％とした割合で値が示されている。値は平均±ＳＥＭを表している。スチューデントｔ検定によって有意差が評価された。
【００５０】
図７．ＩＰ６はＲＡＮＫＬに誘発された砕骨細胞の生成を直接的に抑制する。（Ａ）多核ＴＲＡＰ陽性細胞（ＯＣＬ）の発生におけるＩＰ６の処理効果。左側は、ＲＡＮＫＬの刺激を与えずに５日間培養したＲＡＷ２６４．７細胞を示す。中央は、５日間に亘って１００ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬが投与されたＲＡＷ２６４．７を示す。右側は、５日間に亘って１００ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬが投与され、１μＭのＩＰ６が処理されたＲＡＷ２６４．７細胞を示す。例を示す画像が示されている。（Ｂ）ＩＰ６が処理されたＲＡＷ２６４．７から生成された多核ＴＲＡＰ陽性細胞（ＯＣＬ）の数。ＲＡＮＫＬが投与されＩＰ６が未処理の細胞を１００とした割合で値が示されている。
【００５１】
図８．ＩＰ６はＲＡＮＫＬに誘発された砕骨細胞の生成を直接的に抑制する。（Ａ）ＴＲＡＰｍＲＮＡ量、（Ｃ）ＣＦＭＳ  ｍＲＮＡ量、（Ｂ）ＩＰ６の処理を行った、ＲＡＮＫＬ刺激細胞のＣＦＭＳ  ｍＲＮＡ量。データは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡおよび１８ｓ  ｒＲＮＡによって標準化された目標遺伝子の倍率変化を示しており、ＲＡＮＫＬが投与されＩＰ６が未処理の細胞を１００％とした割合で示した。値は平均±ＳＥＭを表している。スチューデントｔ検定によって有意差が評価され、＊はｐ≦０．０５対対照細胞であり、♯はｐ≦０．０５対ＲＡＮＫＬ処理細胞である。
【００５２】
図９．ＩＰ６はＲＡＮＫＬに誘発された破骨細胞の骨吸収力を直接抑制する。ＲＡＷ２６４．７細胞は、５日間に亘って、ＯＣＬおよびＩＰ６を生成するためにＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）処理され、破骨細胞機能マーカー（Ｃａｒ−２（Ａ）、Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ（Ｂ）、ＣｔｓＫ（Ｃ）、およびＭＭＰ−９（Ｄ））の遺伝子表現が定量された。データは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡおよび１８ｓ  ｒＲＮＡによって標準化された目標遺伝子の倍率変化を示しており、ＲＡＮＫＬが投与されＩＰ６が未処理の細胞を１００％とした割合で示した。値は平均±ＳＥＭを表している。スチューデントｔ検定によって有意差が評価され、＊はｐ≦０．０５対対照細胞であり、♯はｐ≦０．０５対ＲＡＮＫＬ処理細胞である。
【００５３】
図１０．ＩＰ６はＲＡＮＫＬに誘発された破骨細胞の骨吸収力を直接抑制する。（Ａ）破骨細胞形成の間、１μＭのＩＰ６が処理されたＲＡＷ２６４．７細胞の骨吸収能力を、象牙質ディスクの吸収ピットアッセイ（ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｐｉｔ  ａｓｓａｙ）によって評価した（ｎ＝３）。データは破骨細胞によって吸収された領域の割合を表している。値は平均±ＳＥＭを表している。スチューデントｔ検定によって有意差が評価され、＊はｐ≦０．０５対対照細胞であり、♯はｐ≦０．０５対ＲＡＮＫＬ処理細胞である。（Ｂ）２４時間に亘って１μＭのＩＰ６を処理された発達した破骨細胞のアクチンリング形成を共焦点顕微鏡を用いて評価した。アクチンはＦＩＴＣ−ファロイジン（Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）（緑）によって、核はＤＡＰＩ（青）によって染色された。典型的な画像が示されている。
【００５４】
図１１．ＩＰ６はｈＵＣ−ＭＳＣの骨芽細胞の分化を誘発する。ｈＵＣ−ＭＳＣ細胞に１９日間に亘って４μＭのＩＰで処理され、骨芽細胞のマーカーであるＲｕｎｘ−２（Ａ）、Ｃｏｌ１Ａ（Ｂ）、ＡＬＰ（Ｃ）、およびＯＣ（Ｄ）の遺伝子表現が定量された。データは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡおよびβアクチンｍＲＮＡで標準化された目標遺伝子の倍率変化を表しており、対照細胞を１００％とした割合で示されている。値は平均±ＳＥＭを表している。スチューデントｔ検定によって有意差が評価された。
【００５５】
図１２．各表面についてのＬＤＨ値によって計測された、対照の未処理のチタンインプラント（０％の毒性）および０．１％のトリトンＸ−１００（１００％の毒性）に対する表面改質の毒性。３種類のチタンコイン：対照チタンコイン；前処理（不導体化）して、ＡＰＴＥＳと結合させたチタンコイン；前処理（不導体化）して、ＡＰＴＥＳおよびＩＰ６と結合させたチタンコインがテストされた。値は平均±ＳＥＭを表している。スチューデントｔ検定によって有意差が評価され、＊はｐ≦０．０５対対照Ｔｉである。
【００５６】
図１３．チタンインプラントに共有結合したフィチン酸はＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞内でのオステオカルシン遺伝子表現を誘発する。データは、標準化されたオステオカルシンの倍率変化を表しており、対照Ｔｉインプラントに培養された細胞を１００％とした割合で示している。値は平均±ＳＥＭを表している。スチューデントｔ検定によって有意差が評価された。
【００５７】
発明の詳細な説明
したがって、本発明は、ＩＰが結合された金属、金属合金、金属酸化物、または上記金属、金属合金、金属酸化物、もしくはその組み合わせの表面層の物理的性質によって、オッセオインテグレートの特性を調整、好ましくは改善するための生体適合インプラントに関する。そのような有利な表面層は、上記インプラントのチタン、チタン合金、またはチタン酸化物からなる表面などの、金属、金属合金、または金属酸化物表面にＩＰを共有結合することによって作成され、それによってオッセオインテグレーションに適した表面が得られた。
【００５８】
したがって、一態様において、１つまたは複数の金属、金属合金、および／もしくは金属酸化物を有する生体適合インプラントであって、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせからなる群から選択される化合物が、上記生体適合インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面の少なくとも一部に共有結合している生体適合インプラントが提供される。本発明は、チタン、チタン合金、および／またはチタン酸化物を有する生体適合インプラントであって、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせからなる群から選択される化合物が、上記生体適合インプラントの上記チタン、チタン合金、またはチタン酸化物からなる表面の少なくとも一部に共有結合している生体適合インプラントをも含む。
【００５９】
以前からイノシトール六リン酸はインプラントに利用されているが、その結合方法は、不安定な相互作用である物理化学的な吸収に主に焦点が当てられていた。これらは洗浄するだけで簡単に解離してしまう（例えば図４を参照）。これらの問題は、共有結合したＩＰを有するインプラントの製造に成功した本発明者らによって今は克服されている。
【００６０】
チタン、チタン合金、またはチタン酸化物からなるインプラント表面などの、本発明に係るインプラントの金属、金属合金、および／または金属酸化物表面と、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせとの間において、共有結合が起こる。そのような共有結合は、例えば、ＡＰＴＥＳ（（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン）などのシリコン結合剤等である結合剤を用いることによって発生させることが可能であり、上記結合剤が、上記金属、金属合金、または金属酸化物表面と、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせとの間に配置されることによって、上記金属、金属合金および／または金属酸化物と、結合剤と、ＩＰとの間に三成分複合体が生成される（図２参照）。
【００６１】
したがって、上記ＩＰ、エステル、または薬剤的に許容されるその塩、および任意の上記結合剤が、その後、生体適合インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面上に共有結合コーティングを形成し得る。それゆえ、１つまたは複数の金属、金属合金、および／もしくは金属酸化物を有する生体適合インプラントであって、上記生体適合インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面の少なくとも一部が、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせからなる群から選択される化合物のコーティングと、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）などのシリコン結合剤等である結合剤とを有する生体適合インプラントもまた本明細書に開示される。
【００６２】
（例えばオリゴヌクレオチドからの）有機リン酸基を、架橋剤としてＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）を用いて１級アミンに共役させることもできる。したがって、アミノシロキサンチタン表面への共有結合を改善し得る反応性ホスホリルイミダゾリド中間体を介した１級アミンへの共役によって、リン酸基を介して、ＩＰを得ることもできる。
【００６３】
金属、金属合金、または金属酸化物表面に化合物を共有結合するために、Ｔｉに反応性基を発生させ、１つの工程のみで表面に塗布される分子内の反応性結合部位を発生させる高エネルギーのＵＶ光が用いられ得る（Petzold, Iyngstadaas et at. 2008）。高エネルギーのＵＶ光は、分子内の原子間の結合部位に影響を与える。周囲環境では、エネルギーが分子に移され、その後上記分子は、非常に励起されやすい酸素分子とさらに反応する。このプロセスは光酸化と呼ばれる。ＴｉＯ２は周知の光触媒であり（Nakamura, Sirghi et al. 2002; Wu, Wang et al. 2006）、ＵＶ光が照射されると、電子−正孔対が形成され、反応性酸素化合物が放出され、水分子が解離して表面に吸着する（Mills and LeHunte 1997; Wang, Hashimoto et al. 1998; Miyauchi, Kieda et al. 2002）。同時に、生体分子はＵＶ光によって酸化されることによってその反応性が増し、光酸化されたＴｉＯ２表面との共有結合の形成が可能となる。
【００６４】
本明細書で用いられる場合、「インプラント」は、生体器官の一部と置換するため、または生体組織と密接に接触して機能するために用いられる合成または天然素材として記載することができる。したがって、「生体適合インプラント」は、免疫システムへのいかなる重大な反応などの、哺乳動物の体に導入された時のいかなる重大な体への副作用を起こさないインプラントとして記載することができる。それゆえ上記インプラントは、哺乳動物の体と相互作用し、その導入を促すように形成される。
【００６５】
本明細書で用いられる場合、「オッセオインテグレーション」は、骨とインプラントとの境界における、または境界上における、生体の骨と、繊維組織が成長しないインプラントの表面との間の直接的な構造および機能の結合について言及する本発明に係るインプラントの性質を指す。インプラントと新しい骨との間の直接的な結合が存在しない場合、インプラントの周囲の骨の成長を向上させるだけでは十分ではない。したがって、インプラントのオッセオインテグレーションの特性を調整することなく骨の成長を向上させることは可能であり、これによって、機械的な損壊を阻止する強固な骨とインプラントとの境界が作られる結果とはならず、しかし、境界上のインプラントに移動によって上記境界に骨の代わりに軟組織が形成されることになる。本発明の生体適合インプラントはオッセオインテグレーションの調整を可能とする。これは、特定のインプラントは一時的なものであってもよく、それゆえ上記インプラントが骨に結合されることは望ましくないが、その一方で他のインプラントは永久的なものであってもよく、その場合はオッセオインテグレーションの改善が求められる、という利点を意味する。
【００６６】
例として、骨とインプラントとの境界が、下記のいくつかの特徴：（１）プルアウト検査などの生体力学的検査によって検査される優れた機械安定性、（２）炎症反応および組織壊死の欠如、（３）インプラント周辺の骨が、マイクロコンピュータ分析によって高度に石灰化した骨基質を有すると判断され、タンパク質の含有が少ない、（４）いくつかの分子マーカーの遺伝子表現に基づく骨芽細胞系の細胞によるインプラント表面の定着、を有する場合、インプラントは「オッセオインテグレート」されている。
【００６７】
反対に帯電したイオン間の引力によって原子が互いに結合するイオン結合に対して、「共有」結合は原子間の電子対の共有によって特徴づけられる化学結合の形態である。共有結合の強度は、多原子分子内の原子間の角度関係に左右される。本発明は、金属の酸化表面の酸素原子と、活性生体分子との間の１つの共有結合、および／または金属の酸化表面の酸素原子と、結合剤との間の１つの共有結合、それに加えて上記結合剤と上記活性生体分子との間の１つの共有結合に主に焦点を当てているが、これに限定されるわけではない。結合の中心原子の混成はｓｐ３であってもよい（原子価結合法に基づく定義）。共有結合のエネルギーは概して、約３０ｋＪ／ｍｏｌよりも高く、好ましくは、約１００ｋＪ／ｍｏｌよりも高く、より好ましくは約１５０ｋＪ／ｍｏｌよりも高くすることができる。
【００６８】
本明細書における「インプラント」は、その範囲として、脊椎動物、特にヒトなどの哺乳動物の体に埋め込まれることが意図された任意の装置を含む。そのような装置は、体の構造の置換、または身体機能の復元のための医療装置であり、限定しない例として下記のものが挙げられる。大腿股関節；大腿骨頭；寛骨臼カップ；脈管ステント；ステム、ウェッジ、関節用インサートを含むヒジ；大腿骨用および脛骨用部品、ステム、ウェッジ、関節用インサート、または膝蓋骨用部品を含むヒザ；ステムおよびヘッドを含む肩；手首；足首；手；指；つま先；脊椎；椎間板；人工関節；歯科インプラント；耳小骨形成インプラント；砧骨、槌骨、鐙骨、砧骨−鐙骨、槌骨−砧骨、槌骨−砧骨−鐙骨を含む中耳インプラント；人工耳；クギ、ネジ、股釘、板などの整形外科固定具；心臓弁；ペースメーカー；カテーテル；血管；空間充填インプラント；補聴器固定用インプラント；外部固定用インプラント；背骨固定用人工椎間板；子宮内避妊器具（ＩＵＤ）、および人工内耳または頭蓋内電子機器などの生体電子機器等。外科インプラントも例に含まれる。
【００６９】
医療インプラントは医療用人工器官またはインプラントとして記載されてもよい。概して、医療インプラントは１つまたはいくつかのインプラント部品からなる。したがって、本発明は、１つまたは複数の金属、金属合金、および／もしくは金属酸化物を有する１つまたは複数の生体適合インプラント要素または部品にも関する。
【００７０】
本明細書における「整形外科インプラント」は、その範囲として、脊椎動物、特にヒトなどの哺乳動物の体に埋め込まれることが意図された、特に関節および骨の筋骨格系の機能の維持および復元、ならびにこれらの組織における痛みの緩和のための任意の装置を含む。本明細書においては、整形外科固定具および整形外科人工関節も想定される。
【００７１】
本明細書における「歯科インプラント」は、その範囲として、歯牙修復処置において、脊椎動物、特にヒトなどの哺乳動物の口腔に埋め込まれることが意図された任意の装置を含む。歯科インプラントは歯科用補綴具として記載されてもよい。概して、歯科インプラントは１つまたはいくつかのインプラントの部品からなる。例えば、歯科インプラントは、通常、取付け部、および／または歯冠、ブリッジ、または義歯などの歯科用修復物などの二次的なインプラントの部品に連結した歯科用フィクスチャを備えている。しかし、インプラント用の歯科用フィクスチャなどのいずれの部材も、他の部品が上記部材に連結している場合でも、その部材のみでインプラントとして記載される。
【００７２】
本発明における「インプラント」、「医療インプラント」、「グラフト剤」、「装置」および「医療装置」は本発明において同じ意味で用いられてもよい。本発明のすべての態様において、「生体適合インプラント」または「インプラント」と記載される場合は常に、本明細書に記載されるいずれかのインプラントを含み、および／または本発明の目的に適合するような当業者に公知であることが理解されるべきである。
【００７３】
骨は、石灰化基質の構造骨格からなり、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、内皮細胞、単核細胞、大食細胞、リンパ細胞、および造血細胞という種々の細胞の集まりを含有する多機能器官である。骨の成長は、異なる細胞間と細胞外のプレーヤーの間の複雑な相互作用に左右される。概して、石灰化組織は、脊椎動物における多くの特徴的な適応性表現型にとって不可欠である。硬組織、および／または石灰化組織は、石灰化した自然発生の種々の異なる組織のタイプ、および／または安定した細胞間物質を有する組織を示している。
【００７４】
１つまたは複数の金属、金属合金、および／もしくは金属酸化物を有する生体適合インプラントについて述べられる時は、合成またはプラスチック素材などの１つまたは複数のさらなる生体適合性を有する素材を有するインプラントについても言及することができる。あるいは、生体適合インプラントは、ほぼすべて、または完全に、チタン、チタン合金、および／またはチタン酸化物などの金属、金属合金、および／または金属酸化物からなることも可能である。ある態様では、上記インプラントは、金属、金属合金、および／または金属酸化物の表面を有し、その中心が本発明の目的に適うその他の適切な物質を有する構成としてもよい。金属、金属合金、および／または金属酸化物表面は、インプラントそれ自体が他の物質から作られる、またはインプラントの一部が金属、金属合金、および／または金属酸化物から作られる時に、上記インプラントに加えてもよい。これらすべてのインプラントが、金属、金属合金、および／または金属酸化物を有するインプラントと呼ばれる。
【００７５】
上記生体適合インプラントは、ジルコニウム、その合金および／または酸化物、タンタル、その合金および／または酸化物、ハフニウム、その合金および／または酸化物、ニオブ、その合金および／または酸化物、クロム−バナジウム合金、および／または複合酸化物、およびステンレス鋼などの他の金属、金属合金、および／または金属酸化物と組み合わされた、チタン、チタン合金および／またはチタン酸化物などの１つまたは複数の金属、金属合金、および／もしくは金属酸化物を含んでもよい。上記インプラントは、チタン酸化物を有する金属酸化物足場材であることが好ましいグラフト剤とすることも可能である。
【００７６】
本発明のある態様では、本発明に係る生体適合インプラントは、ＩＰの塗布前、塗布と同時、および／または塗布後に紫外線にさらすことが可能である。例えば、ＴｉＯ２は公知の光触媒である(Nakamura, Sirghi et al. 2002）。表面に紫外線を当てた場合、電子−正孔対が形成され、反応性酸素化合物が放出され、水分子が解離して上記表面に吸着する。そのような水酸基によって上記表面の親水性が増加する。
【００７７】
本発明のいずれの態様または実施形態においてＩＰと記載される場合も、明確に言及されていなくても、またはＩＰのみが言及されている場合でも、常に、ＩＰがイノシトールリン酸、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせを含むことが理解されるべきである。
【００７８】
上記ＩＰは１個、２個、３個、４個、５個または６個のリン酸基を有することが可能である。ＩＰの例は、本明細書においてフィチン酸塩、ＩＰ６、またはＩＰ６（ミオ−イノシトール−１、２、３、４、５、６−六リン酸、図２参照）と同じ意味で記載される６リン酸基を有するＩＰである。
【００７９】
本発明において、結合剤が記載された場合は、常に、上記結合剤は、上記ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせを、生体適合インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面に結合し、フィチン酸塩と、上記金属、金属合金、および／または金属酸化物との間に共有結合を形成するために用いられる化学物質を指している。上記結合剤の一部が、金属、金属合金、または金属酸化物表面と反応して結合する。上記結合剤の他の部分が、上記ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせと反応して結合し、そして上記ＩＰと、上記金属、金属合金、または金属酸化物表面との間に共有結合が形成される。これによって、特にオッセオインテグレーションを能動的に調整し、好ましくは改善する上記生体適合インプラントの表面が供されることがある。本発明において使用してもよい結合剤の例として、無水物、アルコール、酸、アミン、エポキシ、イソシアネート、シラン、ハロゲン化基、そして重合化基からなる群から選択される結合剤が挙げられる。シランの群から選択される上記結合剤は（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）であってもよい。
【００８０】
本明細書に記載されるように、１つまたは複数の金属、金属合金、および／もしくは金属酸化物を有する生体適合インプラントでは、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせからなる群から選択される化合物が、上記生体適合インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面の少なくとも一部に共有結合しなければならない。さらに、これは、金属、金属合金、または金属酸化物表面上に共有結合されたＩＰのコーティングを有するインプラントとも呼ばれ得る。
【００８１】
１つまたは複数の金属、金属合金、および／もしくは金属酸化物を有する生体適合インプラントであって、ＩＰの組み合わせが、上記生体適合インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面の少なくとも一部に共有結合し、上記結合が、ＩＰ６と、ＩＰ５などのイノシトール三リン酸〜イノシトール五リン酸（ＩＰ３〜ＩＰ５）などのその他のより低い少なくとも１つのＩＰを有する生体適合インプラントも本発明に含まれる。
【００８２】
本発明に含まれるＩＰのエステルの例として、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９またはＣ１０アルキルエステルなど、Ｃ１〜Ｃ６アルキルエステルなど、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルエステルなどのＣ１〜Ｃ２０アルキルエステルが挙げられる。
【００８３】
「金属、金属合金、または金属酸化物表面の少なくとも一部」と記載される場合、これは、インプラントの金属、金属合金、金属酸化物、またはその組み合わせの表面は、共有結合されたＩＰによって完全に覆われる必要はなく、金属、金属合金、および／または金属酸化物表面のある一部がＩＰコーティングを欠き、より少ないＩＰを含有してもよく、および／または、金属、金属合金、および／または金属酸化物表面のある一部が、例えば、表面にＩＰを付着させるための表面処理後に残ったＩＰの場合のように、共有結合されたＩＰに加えて、物理的に結合されたＩＰを含んでもよい。さらに、本発明に係るインプラントの表面のある一部は、金属、金属合金、および／または金属酸化物を有する必要がなく、その代りに、他の物質もしくはその組み合わせを有し得る。
【００８４】
ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせが、金属、金属合金、またはその金属酸化物表面に共有結合し、上記金属、金属合金、または金属酸化物表面上に、ＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせの総重量の少なくとも約５０重量％を有する生体適合インプラントが本明細書に開示される。他の態様では、ＩＰの総重量の少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９重量％が、上記インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面に共有結合される。
【００８５】
共有結合されたＩＰ化合物を有するコーティングは、上記インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面上に、天然生体分子（つまり、天然物由来の自然に発生する分子）、合成生体分子（つまり、合成的に調製された自然発生生体分子、または合成的に調製された非自然発生分子または分子形態）、または（組み換え技術を使用して調製された）組み換え生体分子などの、ただしこれらに限定されるわけではない他の活性生体分子をさらに有することができる。関係する生体分子の例は、生体接着剤、細胞接着因子、生重合体、血漿タンパク質、酵素、細胞外基質タンパク質、細胞外基質生体分子、成長因子、成長ホルモン、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、受容体、合成生体分子、ビタミン、ビスホスホネートなどの薬物、フッ化物などの生物活性イオン、マーカー生体分子などを含むが、生体分子に限定されるわけではない。
【００８６】
上記ＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせが、上記生体適合インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面に共有結合する時、これは、共有結合されたＩＰのコーティングを含み、ＡＰＴＥＳなどの結合剤を選択的に有する生体適合インプラントのことも指している。したがって、本明細書における、コーティング、塗布される、結合する、覆う、覆われるは、本明細書のインプラントの表面についての記載において、同じ意味で用いることができる。
【００８７】
ここで、ＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせの、金属、金属合金、または金属酸化物表面への共有結合は、少なくとも１つの結合剤を介して発生させることが可能である。したがって、上記結合剤の一部と、金属、金属合金、または金属酸化物表面との間に化学反応を発生させることによって、上記結合剤の一部を、上記金属、金属合金、または金属酸化物表面と結合させることができる。上記結合剤の一部と上記ＩＰとの間に化学反応を発生させることによって、上記結合剤のその他の部分を、上記ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせに結合させることができる。それによって、上記結合剤を介して、金属、金属合金、または金属酸化物表面と、上記ＩＰとの間に共有結合が形成されるようにしてもよい。したがって、本発明において結合剤が用いられる時、上記結合剤は、上記ＩＰと金属表面との間で共有結合を形成してもよい。上記ＩＰ、および上記金属、金属合金、または金属酸化物表面への結合剤の結合は、本目的に適した結合剤の任意の部分、つまり、ＩＰ、または上記金属、金属合金、または金属酸化物表面と化学的に反応することが可能な結合剤の一部とすることができる。したがって、化学反応基の効力によって、結合剤の各部と、上記ＩＰと、上記金属、金属合金、または金属酸化物表面との間に化学反応が起きる。このような事実の例が図１および２に示されている。
【００８８】
上記結合剤は、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）などのケイ素を含有する結合剤とすることができる。そのような結合剤は、シラン群から選択されるものとして記載することもできる。そのような結合剤は本発明の全態様に適応できる。したがって、本発明は、本明細書で例示されるように、１つまたは複数の金属、金属合金、および／もしくは金属酸化物を有する生体適合インプラントであって、上記金属、金属合金、および／または金属酸化物が上記生体適合インプラントの表面に存在し、結合剤、およびＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせが、上記生体適合インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面の少なくとも一部にコーティングを形成し、上記コーティングが、上記金属、金属合金、または金属酸化物表面に主に共有結合されるＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせを有する生体適合インプラントにも関する。
【００８９】
本発明の全態様において、金属、金属合金、および／または金属酸化物は、チタン、その合金および／または酸化物、ジルコニウム、その合金および／または酸化物、タンタル、その合金および／または酸化物、ハフニウム、その合金および／または酸化物、ニオブ、その合金および／または酸化物、クロム−バナジウム合金、および／または複合酸化物、およびステンレス鋼からなる群から選択することができる。本発明によると、そのような金属は、チタン、チタン合金、および／またはチタン酸化物とすることができる。上記インプラントは、チタン酸化物を有する金属酸化物足場材であることが好ましいグラフト剤とすることも可能である。
【００９０】
本明細書において上述したように、生体適合インプラントは、外科インプラント、整形外科インプラント、歯科インプラント、または、整形外科固定具とすることができる。本発明に係る生体適合インプラントは、整形外科人工関節、または背骨固定用人工椎間板から選択される装置とすることもできる。
【００９１】
本発明は、本明細書に例示されるように、チタン、チタン合金、および／またはチタン酸化物などの１つまたは複数の金属、金属合金、および／もしくは金属酸化物を有する生体適合インプラントであって、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせからなる群から選択される化合物が、上記生体適合インプラントの金属、金属合金、および／または金属酸化物表面の少なくとも一部に共有結合するインプラントを製造する方法にも関する。方法は、上記生体適合インプラントの金属、金属合金、および／または金属酸化物表面に、ＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせを、加えかつ反応させる工程を有する方法であってもよい。
【００９２】
生体適合インプラントを製造する方法は、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせと、生体適合インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面を接触させ、および／または反応させる前に、上記インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面を化学的に前処理する工程をさらに有することができる。その後、上記ＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせの少なくとも一部が、上記インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面に添加されると、共有結合が形成される。上記ＩＰが、金属、金属合金、または金属酸化物表面と接触する前に、化学的に前処理された金属、金属合金、または金属酸化物表面に結合剤を接触、反応、および結合させる工程をも有する方法としてもよい。その後、上記ＩＰを、上記結合剤がすでに結合された上記金属、金属合金、または金属酸化物表面と接触させ、これらと反応させる。このような別の方法を用いることによって、結合剤を介して上記ＩＰと、上記金属、金属合金、または金属酸化物表面との間に共有結合を発生させてもよい。したがって、結合剤が用いられる場合、結合剤を介して共有結合を確立することもできる。しかし、本発明はこれに限定されず、インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面と直接共有結合を形成するＩＰも本発明に含まれる。結合剤およびＩＰを、金属、金属合金、または金属酸化物表面に接着する上述の工程を交互に行ってもよい。
【００９３】
本明細書に記載されるように、上記結合剤はケイ素を有することができ、上記ケイ素を有する結合剤は、本明細書に開示された方法によって用いられる、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）とすることができる。上記インプラントの化学的に前処理された表面に、ＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせを加えた後に、洗浄工程を有する方法とすることもできる。本明細書に記載されるように、本明細書の方法に用いられる生体適合インプラントは、チタン、その合金および／または酸化物、ジルコニウム、その合金および／または酸化物、タンタル、その合金および／または酸化物、ハフニウム、その合金および／または酸化物、ニオブ、その合金および／または酸化物、クロム−バナジウム合金、および／または複合酸化物、およびステンレス鋼からなる群、から選択される金属、金属合金、および／または金属酸化物を有することができる。
【００９４】
本発明に係る前処理は、例えば、不動態化処理、ピラニア処理、または１種または複数種類のアルカリ溶液によって行うことが可能である。そのような前処理の限定されない例が、実験欄にさらに記載されている。さらに、方法の各工程において、本明細書に記載されるように、ＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせが、上記生体適合インプラントの選択的な化学的前処理をされた金属、金属合金、または金属酸化物表面に加えられる前に、上記ＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせが活性化される。
【００９５】
そのような活性化は、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）などのカルボジイミド架橋剤を上記ＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせに加えることによって行うことができる。そのような活性化は、上記活性化の間にリン化アミドの生成を含むこともできる。
【００９６】
図２にさらに示されているリン化アミドの生成は、活性エステルの生成のために、１−エチル−３−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩をＩＰに加える工程と、その後、活性リン化アミドの生成のために、イミダゾールを加える工程とを有する。ＩＰを有する活性リン化アミドは、その後、インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面に加えられる。
【００９７】
したがって、本発明は、リン化アミドの生成を有する方法にも関連しており、この方法は、活性エステルの生成のために、１−エチル−３−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩を上記ＩＰ、ＩＰのエステル、薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせに加える工程と、その後、活性リン化アミドの生成のために、イミダゾールを上記活性エステルに加える工程とを有する。この反応の目的は、適切な離脱基を有する本発明に係るＩＰを生成することによってあるため、その他の適切な反応物もそのような反応を行うために用いてもよい。
【００９８】
したがって、ＡＰＴＥＳなどの結合剤が、まず化学的に前処理されたインプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面と反応し、ＩＰが活性化され、その後、上記金属、金属合金、または金属酸化物表面に結合した結合剤と反応して、上記金属、金属合金、または金属酸化物表面と上記ＩＰとの間の安定した共有結合が形成される方法が本明細書に記載されている。
【００９９】
本発明は、本明細書に記載の任意の方法によって得られる生体適合インプラントにも関する。
【０１００】
別の態様では、本発明は、１つまたは複数の金属、金属合金、および／もしくは金属酸化物を有する生体適合インプラントであって、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、および／もしくはその組み合わせからなる群から選択される化合物が、上記生体適合インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面の少なくとも一部に共有結合する生体適合インプラントを提供する工程と、その後、上記インプラントを外科的処置によって上記患者に導入する工程とを有する、本明細書において定義された生体適合インプラントを、それを必要とする患者に導入する方法にも関する。本発明のインプラントは、オッセオインテグレーションの特性を調整、好ましくは改善する必要であり、かつ股関節部または膝などの体の部位の置換が必要な患者に導入され得る。
【０１０１】
本発明は、１つまたは複数の金属、金属合金、および／もしくは金属酸化物を有する生体適合インプラントであって、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、および／もしくはその組み合わせからなる群から選択される化合物が、上記インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面の少なくとも一部に共有結合されるインプラントの、オッセオインテグレーションの調整、好ましくは改善時における使用にも関する。本発明は、オッセオインテグレーションの調整、好ましくは改善時の、金属、金属合金、または金属酸化物表面に共有結合されるＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせの使用にも関する。
【０１０２】
別の態様では、１つまたは複数の金属、金属合金、および／もしくは金属酸化物を有する生体適合インプラントであって、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせが、上記インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面の少なくとも一部に共有結合され、上記金属、金属合金、または金属酸化物表面に共有結合されたＩＰの組み合わせの効力によって、オッセオインテグレーション効果が得られ、上記共有結合は、ＡＰＴＥＳなどの少なくとも１つの結合剤を介して選択的に行われる、オッセオインテグレーションの調整、好ましくは改善のために使用するための生体適合インプラントが記載されている。したがって本発明は、オッセオインテグレーションの調整、好ましくは改善のために使用される医療装置の製造時における、１つまたは複数の金属、金属合金、および／もしくは金属酸化物を有する生体適合インプラントであって、ＩＰ、ＩＰのエステル、および／または薬剤的に許容されるその塩、もしくはその組み合わせが、上記生体適合インプラントの金属、金属合金、または金属酸化物表面の少なくとも一部に共有結合される生体適合インプラントの使用にも関する。
【０１０３】
本発明はさらに下記の限定しない例によって示される。
【０１０４】
実験欄
略語および頭字語
ＡＬＰ：アルカリホスファターゼ
ＡＰＴＥＳ：（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン
ΔＨ：エンタルピー
ＢｒｄＵ：ブロモデオキシウリジン
ＣａｌｃＲ：カルシトニン受容体
Ｃａｒ２：ＩＩ型炭酸脱水酵素
ＣＥＩＣ−ＩＢ：バレアレス諸島の倫理委員会
ＣＦＭＳ：コロニー刺激因子受容体
Ｃｏｌ１Ａ：Ｉ型コラーゲン
ＣｔｓＫ：カテプシンＫ
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＭＥＭ−ＬＧ：低グルコースおよびグルタマックスのダルベッコ改変イーグル培地
ＥＤＣ：Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド
ＥＤＳ：エネルギー分散Ｘ線分光法
ＦＢＳ：ウシ胎仔血清
ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素
Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ：液胞型Ｈ＋ＡＴＰａｓｅ
ｈＵＣ−ＭＳＣ：ヒト臍帯由来間充織幹細胞
ＩＣＰ−ＡＥＳ：プラズマ原子発光分光法
ＩＰ６：ミオ−イノシトール−１、２、３、４、５、６−六リン酸、フィチン酸、フィチン酸塩
ＬＤＨ：乳酸脱水素酵素
ＭＭＰ−９：メタロプロテイナーゼ−９
ＯＣ：オステオカルシン
ＯＣＬｓ：破骨細胞
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ｐＮＰＰ：ｐ−ニトロフェニルリン酸
ＲＡＮＫＬ：ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド
ｒＲＮＡ：リボソームＲＮＡ
Ｒｕｎｘ２：Ｒｕｎｔ関連転写因子２
ＳＥＭ：走査型電子顕微鏡
Ｔｉ：チタン
ＴＲＡＰ：酒石酸耐性酸ホスファターゼ
ＵＶ：紫外線
実験試薬
ＡＰＴＥＳ、トルエン、ＥＤＣ、イミダゾール、硫酸、イソプロピルアルコール、アセトン、エタノール、水酸化ナトリウム、ＴＲＡＰ染色キット、ＦＩＴＣファロイジン、ＤＡＰＩ含有Ｆｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄ  、アスコルビン酸、β−グリセロリン酸、ヒドロコルチゾン、ＩＡ型コラゲナーゼ、およびｐ−ニトロフェニルリン酸をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，アメリカ）から得た。ＴｉＯ２粉末（Ｋｒｏｎｏｓ  １１７１）をＫｒｏｎｏｓ  Ｔｉｔａｎ  ＧｍｂＨ（Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，ドイツ）から得た。形質転換されたマウス単球細胞株ＲＡＷ  ２６４．７をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ，アメリカ）から得た。マウス骨芽細胞細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１をＤＳＭＺ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，ドイツ）から得た。ＤＭＥＭ、ウシ胎仔血清、ペニシリン、およびストレプトマイシンをＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ（Ｐａｓｃｈｉｎｇ，オーストリア）から得た。α−最少必須培養液およびＤＭＥＭ−ＬＧをＧＩＢＣＯ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，アメリカ）から得た。ＦＢＳをＨｙＣｌｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｌｏｇａｎ，アメリカ）から購入した。細胞毒性検出キット（ＬＤＨ）、細胞増殖ＥＬＩＳＡキット、トリピュア試薬、ライトサイクラーファストスタートＤＮＡマスターＰＬＵＳ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  ＭａｓｔｅｒＰＬＵＳ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ）、ミダゾラム（Ｄｏｒｍｉｃｕｍ（登録商標））をＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）から得た。ＲＡＮＫＬをＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，  ＮＪ，アメリカ）から得た。Ｔｈｅ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡ  ｋｉｔをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，アメリカ）から得た。象牙質片をＩｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｂｏｌｄｏｎ，イギリス）で購入した。アルカリホスファターゼをＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，アメリカ）から得た。ＢＣＡタンパク質アッセイキットをＰｉｅｒｃｅ  （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ，アメリカ）から購入した。リドカイン／アドレナリン（キシロカイン／アドレナリン（登録商標））をＡｓｔｒａＴｅｃｈ  ＡＢ（Ｍｏｌｎｄａｌ，スウェーデン）から購入した。クロルヘキシジングルコン酸塩（クロルヘキシジンン）をＧａｌｄｅｒｍａ（Ｎｏｒｄｉｃ  ＡＢ，スウェーデン）から得た。ブプレノルフィン（Ｔｅｍｇｅｓｉｃ（登録商標））をＲｅｃｋｉｔｔ  ＆  Ｃｏｌｍａｎ（Ｈｕｌｌ，イギリス）から得た。フルアニソン／フェンタニル（Ｈｙｐｎｏｒｍ（登録商標））をＪａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ（Ｂｅｅｒｓｅ，ベルギー）から購入した。ペントバルビタール（Ｍｅｂｕｍａｌ（登録商標）をＲｉｋｓｈｏｓｐｉｔａｌｅｔｓ  Ａｐｏｔｅｋ（Ｏｓｌｏ，ノルウェー）から得た。
【０１０５】
その他の日常的に利用される化学物質はＰａｎｒｅａｃ  （Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，スペイン）およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  （Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，アメリカ）から得た。
【０１０６】
実施例１：結合剤を介したフィチン酸のチタンインプラントへの共有結合
シリコン結合剤を使ってＩＰ６をＴｉディスクに共有結合させた。具体的には、ＴｉＯ２表面の水酸基をＡＰＴＥＳ上のアルコキシ基と反応させて共有結合のＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を形成することによって、アミノシロキサン部位をＴｉＯ２表面に固定化させた。一方、カルボジイミド架橋剤ＥＤＣとイミダゾールを使用してＩＰ６のリン酸基を誘導体化すると、アミノシロキサンチタン表面への共有結合を改善するのではと仮説が立てられた（図２参照）。
【０１０７】
材料と方法
１．シラン化
Ｔｉコインを室温のＡＰＴＥＳ１０％のトルエン溶液中に２４時間浸けてシラン化処理し、一晩真空中にて乾燥させた。
【０１０８】
２．ＩＰ６の共有結合
シラン化されたＴｉコインをＥＤＣの水溶液に浸し、直後にＩＰ６．３ｍＬのイミダゾール溶液６０００ｍｇ／Ｌを添加した。得られた混合物を室温で超音波処理した。未反応のＥＤＣ、ＩＰ６と副生成物を、水で静かに洗浄して除去した。最後にＴｉコインを一晩真空中にて乾燥させた。
【０１０９】
３．走査型電子顕微鏡とエネルギー分散Ｘ線分光器による改質表面の分析
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｓ−３４００Ｎを使用して、表面改質されたＴｉコインの表面を分析した。マイクロ分析システムＲ−Ｘ  ＥＤＳ、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ  ＸＦｌａｓｈ４０１０を使用して、定性分析と半定量分析を行った。
【０１１０】
４．固定化されたリンの定量分析
表面改質されたＴｉコインを２Ｎの硝酸で処理し、５０℃で３０分加熱した。総リン含有量を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｏｐｔｉｍａ５３００分光器を使用して誘導結合プラズマ原子発光分析（ＩＣＰ−ＡＥＳ）を行って測定した。
【０１１１】
結果
表面改質したＴｉコインをＳＥＭ−ＥＤＳとＩＣＰ−ＡＥＳを使って分析し、ＳｉとＰのピークがＴｉ表面上で検出されたことを確認した（図３）。また、表面改質Ｔｉコインのリリース試験後、Ｐが溶液中にて検出され、ＩＰ６がＴｉ表面に付着しているという事実と一致した。Ｐ信号と、Ｔｉコイン上に堆積したＩＰ６量の相関関係から、結合したＩＰ６の量は、１．６４μｇ／Ｔｉコインであることが分かった。
【０１１２】
実施例２：フィチン酸のチタンインプラントへの物理的吸着と共有結合との比較
共有結合の代替方法として、ＩＰ６をチタン表面に物理的に吸着することも可能である。ＩＰ６分子に含まれる、負に帯電したリン酸基は、金属酸化物表面に対して強い親和性を示すので、チタン表面に対して直接作用することができる。この付着（物理吸着と呼ぶ）は、低い結合エネルギー（△Ｈ＜５０ｋｊ  ｍｏｌ−１）分子間力、所謂ファンデルワールス力によって得られるものである。結合力が弱いので、このタイプの吸着は単に洗浄しただけで可逆になり、オッセオインテグレーションの特性の調整という観点から医療機器を使用できないものとしてしまう。本実施例では、物理的吸着にてＩＰ６をＴｉ表面に塗布したものと、共有結合とを比較した。
【０１１３】
材料と方法
１．物理的吸着
加圧滅菌処理済みの水を用いてＴｉコインを洗浄した後、エタノールで洗浄した。そして、加圧滅菌処理済みの水中にてコインを超音波で５分間処理した。その後、純粋で洗浄した。ＩＰ６溶液（濃度：エタノール７０％中にそれぞれ０．１ｍｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌ）をろ過で消毒した。１０μｌのそれぞれのＩＰ６溶液をコインの表面に置き、３７℃で２４時間培養した。
【０１１４】
２．共有結合
実施例１の実験手順を採用した。
【０１１５】
３．走査型電子顕微鏡とエネルギー分散Ｘ線分光器による改質表面の分析
実施例１の実験手順を採用した。
【０１１６】
４．固定化されたリンの定量分析
実施例１の実験手順を採用した。
【０１１７】
結果
物理的吸着を行った後、試料の一部を加圧滅菌処理済みの水で洗浄し、未結合のＩＰ６を取り除いた。その他の部分をＳＥＭ−ＥＤＳとＩＣＰ−ＡＥＳにて直接分析した。ＥＤＳ分析によれば、物理的吸着処理済みのＴｉ表面において洗浄前ではＮａとＰのピークが見られるが（図４ａ）、これらの信号は、試料を加圧滅菌処理済みの水で洗浄すると消滅した（図４ｂ）。ＥＤＳの結果をＩＣＰ−ＡＥＳ分析の観察により確認した（データは省略する）。
【０１１８】
ＩＰ６のＴｉ表面への物理的吸着では、コインを水で５秒洗うと殆どすべてのＩＰ６が除かれてしまい、非常に弱い相互作用しか得られないということが分かった。よって、ＴｉコインにＩＰ６を直接物理的に吸着させるという方法は、この分子をＴｉコインに結合させ生体活性を有するコーティングを形成するには実現可能な方法ではない。
【０１１９】
実施例３：化学的前処理（アルカリ処理、不動態化処理、およびピラニア処理）と、結合剤を使ったフィチン酸のチタンインプラントへの共有結合
共有結合を利用したシリコン化合物のチタン表面への付着は、シラノール基本来の性質である、活性化された表面上の酸化層上に存在する水酸基と反応するという性質に基づくものである。このため、Ｔｉ表面に対する様々な化学的前処理（不導体化処理、ピラニア処理、アルカリ溶液による処理）を、Ｔｉ表面上の水酸基の数を増加させて、引き続いて行われるＡＰＴＥＳとの反応を向上させることができるかと言う点について検討した。結果、アミノシロキサン反応基の数が増えると、ＩＰ６の共有結合を改善させるのではという仮説が導かれた。化学的前処理後、実施例１の実験欄にて説明した反応条件でＴｉコインを処理し、ＥＤＣを架橋剤として使用してＩＰ６の固定化を行った。
【０１２０】
材料と方法
１．不動態化前処理
Ｔｉコインをアセトン（７０体積％）、無水エタノール、そして水の順でこれらの化学物質中に置きながらそれぞれ１０分間超音波処理した。水中での超音波後、上記コインを硝酸溶液（硝酸：水＝３：７（ｖ／ｖ））中に室温で３０分間放置した。この処理の後、上記試料を水で洗浄し、カバーで覆われた水槽に２４時間放置した。最後にＴｉコインを乾燥させてから包装し、その後使用するまで７０％エタノールの中にて４℃で暗中保管した。
【０１２１】
２．ピラニア前処理
Ｔｉコインをまず７０％イソプロピルアルコール中にて３０分間超音波処理した。超音波処理後、濃硫酸をビーカーに入れ、３５％過酸化水素を、最終的に硫酸と過酸化水素の割合が７：３（ｖ／ｖ）になるまでゆっくりと添加した。その後、得られた混合液を静かに撹拌した。この溶液にコインを１０分間浸してから取り出し、その後、２番目の新しいピラニア溶液（濃硫酸／３５％過酸化水素＝７：３（ｖ／ｖ））に５分間浸した。この期間の後、上記Ｔｉコインを水で２回洗浄し、その後水槽に２４時間放置した。最後にＴｉコインを乾燥させてから包装し、その後使用するまで７０％エタノールの中にて４℃で暗中保管した。
【０１２２】
３．アルカリ前処理
Ｔｉコインを水、アセトン、そしてエタノール中でそれぞれ２０分間超音波洗浄し、最後にまた水中で１０分間超音波洗浄した。続いて、６０℃のＮａＯＨ（５Ｍ）中に上記Ｔｉコインを２４時間浸けた。２４時間後、上記基板プレートを静かに水で洗浄した。最後にＴｉコインを乾燥させてから包装し、その後使用するまで７０％エタノールの中にて４℃で暗中保管した。
【０１２３】
４．共有結合
実施例１の実験手順を採用した。
【０１２４】
５．走査型電子顕微鏡とエネルギー分散Ｘ線分光器による改質表面の分析
実施例１の実験手順を採用した。
【０１２５】
６．固定化されたリンの定量分析
実施例１の実験手順を採用した。
【０１２６】
結果
異なる化学的前処理（不動態化処理、ピラニア処理、アルカリ溶液による処理）をテストし、Ｔｉ表面の酸化層上に存在する水酸基の数が増加すると上記表面に共有結合するＩＰ６の量が増加するかどうかを調べた。化学的な前処理を行わない表面については本実験の対象外とした。得られた表面改質されたＴｉコインをＳＥＭ−ＥＤＳとＩＣＰ−ＡＥＳにて分析した。
【０１２７】
ＳＥＭ−ＥＤＳ分析（図５）に示されているように、アルカリ前処理を除く他の表面改質を行ったＴｉコインはＳｉとＰのピークを有しており、ＩＰ６をＴｉ表面上に固定化できていることを示した。
【０１２８】
表面改質済みのＴｉコインのリリース試験と、それに続いて行われたＩＣＰ−ＡＥＳによる総Ｐ含有量の測定により、ＳＥＭ−ＥＤＳによるその前の観察結果を再確認した。他の処理と比較して、不動態化を行う化学前処理をＩＰ６の固定化の前に行う場合、ＩＰ６の堆積をより増加させることができる（３６．６６μｇ／Ｔｉコイン）。
【０１２９】
実施例４：結合剤を使用したフィチン酸のセラミック二酸化チタン（ＴｉＯ２）足場材への共有結合
実施例１の手順をＴｉＯ２足場材に採用することが可能である。
【０１３０】
１．ＴｉＯ２足場材の作成
ポリマースポンジ法とＴｉＯ２粉末を使用することにより足場材を作成することが可能である。ＴｉＯ２足場材は、実験の前に、１２１℃で２０分間加圧滅菌を行うことにより消毒することができる。
【０１３１】
２．ＩＰ６の共有結合
実施例１の実験手順を採用した。
【０１３２】
３．走査型電子顕微鏡とエネルギー分散Ｘ線分光器による改質表面の分析
実施例１の実験手順を採用した。
【０１３３】
４．固定化されたリンの定量分析
実施例１の実験手順を採用した。
【０１３４】
実施例１〜４の結果と考察
実施例１〜４により、インプラント表面にＩＰ６を恒久的に結合させるのが困難であるという問題を克服することが可能であることが実証されている。以前からＩＰ６はインプラントに使用されているが、その結合方法は不安定な相互作用である物理化学的な吸収に
主に焦点が当てられている。実施例２に示すように、これは洗浄するだけで簡単に解離してしまうものなので、インプラントの表面に物理的吸収（不安定な結合）をさせたＩＰ６の使用には制限があることが分かる。ＩＰ６を金属表面に共有結合させるために、固液境界での有機反応させる方法を開発して最適化し、共有結合したＩＰを有するインプラントの作成に成功している。また、化学的前処理をするとＴｉコインはより多量のＩＰ６が結合できるものとなり、特に不動態化処理によれば、より多くのＩＰ６の堆積量を得ることができることが実証されている。
【０１３５】
実施例５：フィチン酸の体外破骨細胞形成への影響
ＩＰ６が、ＲＡＷ２６４．７単球−マクロファージ系マウス細胞株の細胞生存、増殖、そして分化破骨細胞への分化にどのように影響するかを調べた。未分化の破骨細胞をＩＰ６で処理したものを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびＴＲＡＰ染色法を使って、所定の分化と機能マーカーについて調べた。破骨細胞の活動も、象牙質ディスクの骨吸収と、アクチンリングの形成によって判定した。
【０１３６】
材料と方法
１．細胞培養
形質変換したネズミの単球細胞株であるＲＡＷ２６４．７を、１０％のウシ胎仔血清と抗生物質（ペニシリン５０ＩＵ/ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ）を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用し、３７℃で５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。
【０１３７】
２．細胞毒性分析
ＲＡＷ細胞２６４．７を２００００個／ｃｍ２の量で２４ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。細胞を接着させた後、培養液を入れ替え、異なる量のＩＰ６を添加した。細胞をさらに２４時間培養した後、培養液を採取し細胞毒性を検査した（ＬＤＨ活性）。ＬＤＨ細胞毒性分析は、細胞毒性検知キットを製造元の指示に基づいて使用して行われた。この比色分析は、ダメージを受けた細胞のシトソルから上澄みに放出されたＬＤＨの活性を定量するので、細胞死の指標として利用できる。
【０１３８】
細胞毒性（％）は、対照試料とした細胞（低毒性側対照、細胞死０％）の培養液中のＬＤＨ活性と比較したもの、および１％のトリトンＸ−１００で処理された細胞（高毒性側対照、細胞死１００％）の培養液中のＬＤＨ活性と比較したものとして、式：細胞毒性（％）＝（実験値−低毒性側対照）/（高毒性側対照−低毒性側対照）×１００から算出した。
【０１３９】
３．細胞増殖分析
ＲＡＷ細胞２６４．７を２５００個／ウェルの量で９６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。細胞を接着させた後、培養液を入れ替え、異なる量のＩＰ６を添加した。細胞をさらに２４時間培養した。最後の６時間は、ＢｒｄＵも添加して培養を行った。ＢＲｄＵが取り込まれたかどうかを細胞増殖ＥＬＩＳＡキットを製造元の指示に基づいて使用して検査した。
【０１４０】
４．破骨細胞の形成
破骨細胞様の細胞をＲＡＷ２６４．７細胞を培養したものから形成した。２００００個／ｃｍ２の量で２４ウェルプレートに播種し、ＣＯ２培養器に一晩入れて細胞を表面に接着させた。２４時間後、培養液を、ＲＡＮＫＬを１００ｎｇ／ｍＬ含有する培養液と入れ替えた。ＲＡＮＫＬを５日間、４８時間ごとに追加して破骨細胞を形成することに成功した。多核化した破骨細胞様の細胞が形成したかを確認するため、ＴＲＡＰ染色キットを製造元の指示に従って使用して培養細胞を染色し、ＴＲＡＰ酵素の有無を調べた。ＴＲＡＰは、２０年以上破骨細胞機能のマーカーとして使用されている酵素である。ＴＲＡＰポジティブの多核破骨細胞は光学顕微鏡で可視化することができ、写真に撮ることができる。各破骨細胞形成分析を少なくともそれぞれ３回行った。
【０１４１】
５．ＩＰ６の破骨細胞形成への影響
ＩＰ６の破骨細胞形成への影響を調べるため、２００００個／ｃｍ２の量を２４ウェルプレートに播種し、２４時間後、培養液を、ＲＡＮＫＬを１００ｎｇ／ｍＬ、ＩＰ６をそれぞれ異なる量（０．１、１、１０、１００μＭ）含んだ培養液と入れ替えた。培養液の入れ替えを行った後、５日間の期間中トリートメントを４８時間ごとに添加した。ＩＰ６の破骨細胞形成への影響を分析するため、ＴＲＡＰポジティブ細胞の数、破骨細胞と機能マーカーの遺伝子表現量、象牙質ディスクの骨吸収活動と、アクチンリングの形成を調べた。
【０１４２】
６．ＲＮＡの単離とＲＴ−ＰＣＲ分析
上記のように処理した細胞から、製造元の指示書に従ってトリピュアを有する全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡの定量分析を、２６０ｎｍに設定した分光計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ、アメリカ）を使用して行った。
【０１４３】
各試料から同じ量の全ＲＮＡ（１ｍｇ）をｃＤＮＡに逆転写した。逆転写は３７℃で６０分間、最終的な量が２０ｍｌになるように、大容量逆転写キット（Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、アメリカ）を使用して行われた。各ｃＤＮＡは１／５に希釈し、各分割した試料を、凍結と凍解のサイクルが繰り返されるのを避けて、ＰＣＲ反応を行うまで−２０°で保管した。
【０１４４】
リアルタイムＰＣＲを、２種類のハウスキーピング遺伝子：１８ＳｒＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ、３種類の破骨細胞遺伝子マーカー：ＴＲＡＰ、ＣａｌｃＲ、ＣＦＭＳと、４種類の破骨細胞機能マーカー：ＣｔｓＫ、ＭＭＰ−９、Ｃａｒ２、Ｈ±ＡＴＰａｓｅについて行った。
【０１４５】
リアルタイムＰＣＲを、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０（登録商標）（ＲＯＣＨＥ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を使用してＳＹＢＲ緑色検知を用いて行った。各反応液は、７μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  ＭａｓｔｅｒＰＬＵＳ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（ファストスタートＴａｑポリメラーゼ、反応バッファ、ｄＮＴＰミックス、ＳＹＢＲグリーンＩ染料、ＭｇＣｌ２を含有）、センスプライマーとアンチセンスプライマーを０．５μＭずつ（表１）、３μｌの上記ｃＤＮＡ希釈液を最終量が１０μｌになるように含んだものである。増幅プログラムは、テンプレートｃＤＮＡの変性を行う前加熱工程 （９５℃で５分）、続いて変性工程（９５℃で１０秒）、アニーリング工程（６０℃で１０秒）、そして伸長工程（７２℃で１０秒）からなるサイクルを４５サイクル行った。各サイクル終了後、蛍光を７２℃で測定した。ｃＤＮＡテンプレートを除いたネガティブ対照試料も各分析に掛けた。
【０１４６】
ＰＣＲ後の相対定量を行うため、標準曲線をターゲット遺伝子とハウスキーピング遺伝子それぞれの標準反応から得た。第２誘導最大化法（Ｓｅｃｏｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｍｅｔｈｏｄ）により、未知の試料のそれぞれの結果の交点からそのターゲットやハウスキーピングが標準曲線に対応する量を算出した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０分析ソフトバージョン１．５（ＲＯＣＨＥ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）によるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄを使用して、同じ試料中のターゲット遺伝子の相対的な濃度の比率として相対的なｍＲＮＡ量を算出した。
【０１４７】
【表１】
2015503378.tif 000002
【０１４８】
７．骨吸収ピット分析
ＲＡＷ２６４．７細胞を象牙質スライスに、２００００個/ｃｍ２の量で播種した。破骨細胞形成へのＩＰ６の影響を調べるため、実験全体を通じて１００ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬとＩＰ６（１μＭ）を含む培養液を使用して細胞を培養した。成熟した破骨細胞様細胞へのＩＰ６の影響を調べるため、ＲＡＷ２６４．７細胞にＲＡＮＫＬを６日間投与し、その後ＩＰ６（１μＭ）で４日間処理して破骨細胞を形成した。
【０１４９】
上記培養期間終了後、０．１ＮのＮａＯＨ中で２分間超音波処理して細胞を象牙質スライスから取り除き、ヘマトキシリンで４０秒処理して染色し、蒸留水で洗浄した。各象牙質スライスの表面を光学顕微鏡で観察してラクナ吸収の有無を調べ、骨吸収領域の量的分析をＩｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅ１．４４ｐ（ＮＩＨ、アメリカ）を使って行った。
【０１５０】
８．アクチンリング染色
ＲＡＷ２６４．７細胞をカバースリップに２００００個／ｃｍ２の量で播種し、上記の処理を行った。その後、カバースリップを固定し、０．１％のトリトンＸ−１００で１０分間処理して透過化し、５０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−ファロイジンで３０分間染色した。カバースリップをＰＢＳで洗浄した後、ＤＡＰＩ含有のフルオロシールドで核を染色した。アクチンリングを共焦点顕微鏡で観察し、アクチンリングを有する破骨細胞の総数の割合を、事情を知らされていない試験者により、影響なし（７５％〜１００％）、影響あり（２５％〜５０％）、アクチンリング無（０〜２５％）として、算出した。
【０１５１】
結果
ＩＰ６が、ＲＡＮＫＬに誘発されたＲＡＷ２５４．７細胞中の破骨細胞形成を、細胞増殖や細胞生存に影響を与えずに、低下させることが分かった（図６）。ＴＲＡＰポジティブの細胞の数と、ＴＲＡＰ、カルシトニン受容体、カテプシンＫ、ＭＭＰ−９などの破骨細胞マーカーのｍＲＮＡ量は、ＲＡＮＫＬ処理された細胞をＩＰ６で処理することによって低下した（図７〜１０）。よって、ＩＰ６は細胞の生存能力や分化能力を損なわずに、成熟した破骨細胞の形成の低下をもたらすことが実証された。
【０１５２】
実施例６：フィチン酸のヒト臍帯間充織幹細胞（ｈＵＣ−ＭＳＣ）の骨芽細胞への分化に対する影響に関する体外分析
ＩＰ６が骨形成条件下のヒト臍帯間充織幹細胞（ｈＵＣ−ＭＳＣ）の骨芽細胞への分化に対してどのように影響するかを調べた。間充織幹細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞、骨細胞、含脂肪細胞、軟骨細胞、初期神経前駆細胞などの複数の系統に分化できる細胞である。ｈＵＣ−ＭＳＣをＩＰ６で１９日間処理し、骨芽細胞マーカーの有無をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて調べた。
【０１５３】
材料と方法
１．ｈＵＣ−ＭＳＣの単離
コンコルディアコード献血プログラムの下で提供されたヒト臍帯血を処理して得られた臍帯からヒト臍帯間充織幹細胞（ｈＵＣＭＳＣ）を単離した。上記試料は、提供者に対し事情を説明し、ＣＥＩＣ−ＩＢの承認を得た上で使用されたものである。
【０１５４】
ｈＵＣ−ＭＳＣを単離するため、臍帯を無菌食塩水で数回洗浄し、臍帯血を除いて、凝血塊を容器から取り除いた。次に臍帯を小さく切り分け、０．０７５％のコラゲナーゼ系ＩＡで２時間培養した。その後、０．１２５％のトリプシンを３７℃で静かに撹拌しながら３０分掛けて添加した。消化の結果得られた混合物を１００μｍフィルタに通して、細胞懸濁液を得た。細胞ペレットをＮＨ４Ｃｌ系の赤血球溶解バッファに再懸濁し、室温にて１０分間培養した後、ＰＢＳで洗浄した。最後に細胞をＤＭＥＭ−ＬＧと２０％ＦＢＳの溶液に再懸濁し、コーティングされていない２５ｃｍ２細胞培養フラスコに接種した。培養物はＣＯ２が５％、温度が３７℃の状態下の湿気のある雰囲気化に放置された。培養の３日目に、培養液を入れ替え、接着していない細胞を取り除いた。その後週一回の頻度で２回培養液の入れ替えを行った。８０％コンフルエントな状態になった時に、接着した細胞を１×１０４個/ｃｍ２の量で再播種した。
【０１５５】
２．細胞培養
２人のドナーから得たｈＵＣ−ＭＳＣを２４ウェルプレートに播種し（ｎ＝１２）、ペニシリン（５０ＩＵ/ｍｌ）、ストレプトマイシン（ストレプトマイシン５０μｇ/ｍｌ）、および２０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ−ＬＧからなる成長培養液でコンフルエントな状態になるまで培養した。細胞は、ＣＯ２が５％の湿気のある雰囲気下３７℃で培養された。コンフルエントな状態になった時点（０日目とする）で、細胞を分化培養液（ヒドロコルチゾン（２００ｎＭ）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）およびβ―グリセロリン酸（１０ｍＭ）が添加された成長培養液からなる培養液）で培養した。細胞培養液を、ＩＰ６を添加した培養液または、添加していない培養液と週に２回の頻度で入れ替えながら１９日間培養した。
【０１５６】
３．ＲＮＡ単離とＲＴ−ＰＣＲ分析
実施例５の実験手順を採用した。本実施例においては、リアルタイムＰＣＲを２種類のハウスキーピング遺伝子：ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ、ＧＡＰＤＨと、４種類の骨芽細胞マーカー：Ｒｕｎｘ２、Ｃｏｌ１Ａ、ＡＬＰ およびＯＣについて行った。
【０１５７】
【表２】
2015503378.tif 000003
【０１５８】
結果
対照試料と比較して、ＩＰ６処理によりＲｕｎｘ−２、ＡＬＰ、およびＯＣ中のｍＲＮＡ量が高くなることが実証されている。一方Ｃｏｌ１Ａに関しては、ｍＲＮＡ量は対照試料と比較してＩＰ６で処理された細胞では低いものとなった（図１１）。Ｃｏｌ１Ａは増殖に関するマーカーであり、その量は骨芽細胞への分化が始まると減少することが知られている。これらの結果により、ＩＰ６処理によりｈＵＣ−ＭＳＣの骨芽細胞への分化を向上させることが分かった。
【０１５９】
実施例７：フィチン酸コーティングされたチタンインプラント（結合剤を介した共有結合をし、化学的に前処理されたインプラント）の破骨細胞の生物学的反応への影響についての体外分析
実施例５と同じ手順を（実施例１および４の方法で準備した）チタンプラントに共有結合しているフィチン酸に行うことが可能である。
【０１６０】
実施例８：フィチン酸コーティングされたチタンインプラント（結合剤を介した共有結合をし、化学的に前処理されたインプラント）の骨芽細胞の生物学的反応への影響についての体外分析
チタンインプラントに共有結合したフィチン酸が、骨芽細胞様の細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）の細胞生存能力と骨芽細胞マーカーの表現に対してどのように影響するかを調べた。
【０１６１】
材料と方法
１．ＩＰ６の共有結合
実施例１および４にて示したように、フィチン酸はチタンインプラントに共有結合することができる。実施例１および４に説明した同様の方法で準備した３種類のチタンコインをテストした。すなわち、チタンコイン、前処理（不動態化）しＡＰＴＥＳと結合したチタンコイン、そして前処理（不動態化）しＡＰＴＥＳおよびＩＰ６と結合したチタンコインである。
【０１６２】
２．細胞培養
マウスの骨芽細胞株であるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を、ウシ胎仔血清１０％、ペニシリン−ストレプトマイシン１％を添加したα−最少必須培養液にて、ＣＯ２が５％の湿気のある雰囲気下において３７℃の状態で維持した。チタンインプラントの異なる表面改質をテストするため、コインを９６ウェルプレートに置き、各コイン当り１０４個の細胞を播種した。
【０１６３】
３．細胞毒性分析
実施例５と同様にしてＬＤＨ細胞毒性分析を行った。細胞毒性（％）は、対照試料としたチタンインプラントにて培養された細胞（低毒性側対照、細胞死０％）の培養液中のＬＤＨ活性と比較したもの、および１％のトリトンＸ−１００で処理された細胞（高毒性側対照、細胞死１００％）の培養液中のＬＤＨ活性と比較したものとして、式：細胞毒性（％）＝（実験値−低毒性側対照）/（高毒性側対照−低毒性側対照）×１００から算出した。
【０１６４】
４．ＲＮＡ単離とＲＴ−ＰＣＲ分析
実施例５の実験手順を採用した。本実施例では、リアルタイムＰＣＲを、２種類のハウスキーピング遺伝子：ＧＡＰＤＨ（配列番号１および２）、骨芽細胞マーカーであるオステオカルシン（Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＣＧＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＡＧＣＴＴＡ−３’（配列番号３１）、Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＡＧＡＴＧＣＧＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＣ−３’（配列番号３２）について行った。
【０１６５】
結果
チタンインプラントに共有結合したフィチン酸は細胞に対して毒性を有さないことが実証された（図１２）。また、対照試料であるチタンインプラントや、不動態化しＡＰＴＥＳと結合した（しかしＩＰ６とは結合していない）チタンインプラントと比較し、チタンインプラントに共有結合したＩＰ６よってオステオカルシンのｍＲＮＡ量が増加していた（図１２）。これらは、チタンインプラントに共有結合したＩＰ６により骨芽細胞への分化が改善されることを示している。
【０１６６】
実施例９：フィチン酸コーティングされたチタンインプラント（結合剤を介した共有結合をし、化学的に前処理されたインプラント）の生物学的反応への影響についての生体内分析
チタンインプラントに共有結合したフィチン酸の影響を動物モデルで生体内実験することができる。選択されるモデルは、ニュージーランドホワイトラビットの脛骨近位端のプルアウトモデルであった。皮質骨に当接させる、被試験側のみを表面改質したコイン形のインプラントをモデルに使用した。反対側では、ネジ穴に、上記穴に合ったプルアウト治具を取り付けることができるようになっている。治具からインプラントの試験表面に対して垂直に力が掛けられることによって、摩擦や機械的な連結の影響を受けずに骨の付着の記録を取ることができる。
【０１６７】
材料と方法
１．ＩＰ６の共有結合
実施例１と４にて説明したように準備可能な３種類のチタンコインをテストすることができる。すなわち、前処理済み（不動態化）チタンコイン、前処理し（不動態化）ＡＰＴＥＳと結合させたチタンコイン、前処理し（不動態化）ＡＰＴＥＳおよびＩＰ６と結合させたチタンコインである。
【０１６８】
２．動物と外科手順
６匹のメスのニュージーランドホワイトラビット（生後６ヶ月、３．０〜３．５ｋｇ）を本実施例にて使用可能である（ＥＳＦ  Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ  Ｅｓｔｕｎａ  ＡＢ、Ｎｏｒｒｔａｉｊｅ、スウェーデン）。実験期間中、上記個体をケージの中で飼育してもよい。室温は１９±１℃に調整することができ、湿度は５５±１０％であった。
【０１６９】
本実験は、ノルウェー動物実験委員会（Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）により承認され、上記委員会により登録された後に実施することができる。よって、上記手順は１９７４年１２月２０の動物保護法、Ｎｏ．７３、第６章、２０〜２２条と、１９９６年１月１５日の動物実験に関する規則に則して行われなければならない。ケージから出す１０分前に、上記ウサギにフルアニソン／フェンタニル（Ｈｙｐｎｏｒｍ,  Ｊａｎｓｓｅｎ、ベルギー）を０．０５〜０．１ｍｌ／ｋｇ皮膚注射（ｓ.ｃ.）し、ミダゾラムを体重あたり２ｍｇ／ｋｇ静脈注射（ｉ.ｖ.）した。眠りから覚める兆候が見られたら、希釈したヒプノーム（登録商標）を静かに静脈注射し、適当な効果が表れるまで待つ。その後リドカイン／アドレナリンを１．８ｍｌ、手術個所に局所的に投与するようにしてもよい。手術の前に手術個所の毛を除き、液体せっけんで洗浄するようにしてもよい。手術台上に個体を仰向けに載せ、消毒済みの布を被せるようにしてもよく、手術個所を５ｍｇ／ｍｌのクロルヘキシジングルコン酸塩で消毒するようにしてもよい。すべての軟組織の層を突き抜けるように前脛骨近位を切開してもよい。骨膜を持ち上げ、自留開創器により保持するようにしてもよい。統一的に正確に位置決めするためドリルガイドを使用しながらツイストドリル（Ｍｅｄｉｃｏｎ（登録商標）  ＣＭＳ、Ｔｕｔｔｌｉｎｇｅｎ、ドイツ）を使ってガイドホールを４つ形成するようにしてもよい。特注のステンレスドリル先（ｂｕｒ：直径６．２５ｍｍ）を低速歯科用インプラントドリルを使用してチタンインプラントにプラットフォームを形成してもよい。チタンコイン（実施例１、４参照）を下記のような無作為試験に用いるようにしてもよい。骨の研磨は、多量の生理食塩水で洗浄しながら行うようにしてもよい。チタンコインをテフロン（登録商標）キャップで覆い、成形済みチタン顎顔面骨プレート（Ｍｅｄｉｃｏｎ  ＣＭＳ、Ｔｕｔｔｌｉｎｇｅｎ、ドイツ）を２本のチタンネジ（Ｍｅｄｉｃｏｎ  ＣＭＳ、  Ｔｕｔｔｌｉｎｇｅｎ、ドイツ）で皮質骨にネジ止めしたものを安定具として用いてもよい。軟組織を元の場所に戻し、Ｄｅｘｏｎ（登録商標）ｌｌ（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ−Ｄａｖｉｓ＆Ｇｅｅｋ、イギリス）で縫合した。手術後、各個体に、体温まで温められたＮａＣｌを２０ｍｌ皮下注射し、ブプレノルフィンを０．０２〜０．０５ｍｇ／ｋｇ皮下注射するようにしてもよい。初回または前回のテムゲシック注射の少なくとも３時間後に第２回目のテムゲシック注射を、同じく０．０５ｍｇ／ｋｇ皮下注射するようにしてもよい。実験の期間中健康状態を観察し、傷が回復するまで手術個所を毎日注意深く検査するようにしてもよい。
３．引張試験と分子分析
手術から８週間後、引張試験にてインプラントの評価を行うようにしてもよい。８週間の回復期間後、フルアニソン／フェンタニルを１．０ｍｌ静脈注射し、その後、体重あたり１ｍｌ／ｋｇの量のペントバルビタールをウサギに静脈注射して安楽死させた。安楽死直後に、脛骨上の軟組織を貫くように切開するようにしてもよい。インプラントを覆っているチタンプレートを露出させて取り除くようにしてもよい。中空針でテフロンキャップの真ん中に穴を開け、加圧空気を供給することによってキャップを取り除きチタンインプラント裏側を露出するようにしてもよい。
【０１７０】
引張試験は、１００Ｎの調整負荷を備えたロイズＬＲＸ材料試験機（Ｌｌｏｙｄｓ  ＬＲＸ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅ；Ｌｌｏｙｄｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ、Ｓｅｇｅｎｓ−Ｗｏｒｔｈ、イギリス）を使用して行ってもよい。クロスヘッド速度範囲を１．０ｍｍ/分に設定するようにしてもよい。インプラントが外れるまで負荷を掛け、負荷と時間の関係をプロットして記録するようにしてもよい。
【０１７１】
インプラントが外れた後、傷からの体液をインプラントがあった場所から採取し、乳酸脱水素酵素活性分析を行うようにしてもよい。インプラントの周囲の骨組織の組成を総タンパク質と、体積当たりの骨ミネラル濃度（ｖＢＭＤ）に基づいて評価してもよい。骨形成、骨吸収、炎症に関する分子マーカーの遺伝子表現についても同様に評価してもよい。
【０１７２】
実施例１０：結合剤を用いたチタンインプラントへのフィチン酸の共有結合−工程最適化
均一にＩＰ６がコーティングされたチタン表面をより再生可能な方法で得るようにして、共有結合によりＩＰ６が結合したチタン表面の機能性を最適化するために次のような工程を行ってもよい。
【０１７３】
上記作業手順は以下の通りである。
−チタン表面活性化：実施例３にて説明されている実験手順のそれぞれを使って行われた。処理後、各インプラントを単層形成直前まで窒素流中で乾燥させた。
−シラン化：本工程は、実施例１の実験手順を使って行われたが、ＡＰＴＥＳ自己組織化単分子膜の形成は、乾燥窒素の雰囲気下、グローブボックス中にて２％（ｖ／ｖ）のＡＰＴＥＳ溶液（溶剤：無水トルエン）を使用して行われた。各インプラントにはそれぞれ別の容器を使用した（３ｍｌ／インプラント）。室温で２４時間放置して反応させた。その後、トルエンを掛けて洗浄し（Ｎ２雰囲気下）、余分なシランを取り除き、重合を防いだ。そしてグローブボックスの外で、アセトンとエタノールで洗浄し、物理吸着している物質を取り除いた。最後に７０℃で乾燥させた。
−ＩＰ６の共有結合：本工程は実施例１の実験手順を使って行われ、下記の手順に従い、最適化された。
【０１７４】
１）シラン化したインプラントを、各バイアル瓶中の、ＥＤＣを６ｍｇ／ｍｌとＩＰ６を１ｍｇ／ｍｌ含有する水溶液に浸した（各インプラント当り３ｍｌ）。１ｍｇのＩＰ６は、１．４２３ｍｇのＩＰ６Ｎａ６である。
【０１７５】
２）直後に、３ｍｌのイミダゾール溶液（６ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ＝６）を各バイアル瓶に添加した。
【０１７６】
３）室温にて２時間超音波処理を行った。
【０１７７】
４）静かに水で洗浄し、未反応の物質を取り除いた。
【０１７８】
５）Ｎ２を用いて乾燥させた。
【０１７９】
６）乾燥させ、品質を維持した状態で保存した（Ｎ２雰囲気下、−２０℃）。
【０１８０】
文献
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Mills, A. and S. LeHunte (1997). "An overview of semiconductor photocatalysis." Journal of Photochemistry and Photobiology a-Chemistry 108(1): 1-35.
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Petzold, C., S. P. Lyngstadaas, et al. (2008). "UV-induced chemical coating of titanium surfaces with eicosapentaenoic acid." Journal of Materials Chemistry 18(45): 5502-5510.
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【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１ａ】結合剤を介した金属表面への生体分子の添加を示す概略図。
【図１ｂ】結合剤を介さない金属表面への生体分子の添加を示す概略図。
【図２】（ａ）ＡＰＴＥＳを用いたＴｉＯ２表面の反応。（ｂ）カルボシドイミド架橋剤ＥＤＳおよびイミダゾールを用いたＩＰ６の活性化、およびそれに続く生体分子のチタン表面への結合（注：１個のリン酸基の活性化のみを示している）。
【図３】結合剤を用いたＩＰ６の共有結合後のＴｉ表面のＥＤＳ分析。
【図４】ＩＰ６の物理的吸着後のＴｉ表面の性質（ａ）洗浄していない試料のＥＤＳ分析。（ｂ）洗浄した試料のＥＤＳ分析。
【図５】（ａ）化学的前処理が未実施、（ｂ）不動態化前処理後、（ｃ）ピラニア前処理後、（ｄ）アルカリ前処理後、の結合剤を用いたＩＰ６の共有結合後のＴｉ表面のＥＤＳ分析。
【図６】砕骨細胞前駆細胞の細胞生存力および細胞増殖へのＩＰの影響。（Ａ）２４時間に亘って異なる量のＩＰ６を細胞に投与する処理後に収集した培養液を測定したＬＤＨ活性。正の対照である高毒性側標準（ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｒｏｌ）（１００％）は１％のトリトンＸ−１００で培養した細胞の培養液であった。負の対照である低毒性側標準（ｌｏｗ  ｃｏｎｔｒｏｌ）（０％）は対照細胞の培養液であった。値は平均±ＳＥＭを表している。マン−ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）検定によって有意差が評価され、＊はｐ≦０．０５対未処理細胞である。（Ｂ）２４時間に亘って異なる量のＩＰ６を投与され、６時間に亘ってＢｒｄＵをラベルされたＲＡＷ２６４．７細胞の増殖。対照細胞を１００％とした割合で値が示されている。値は平均±ＳＥＭを表している。スチューデントｔ検定によって有意差が評価された。
【図７】ＩＰ６はＲＡＮＫＬに誘発された砕骨細胞の生成を直接的に抑制する。（Ａ）多核ＴＲＡＰ陽性細胞（ＯＣＬ）の発生におけるＩＰ６の処理効果。左側は、ＲＡＮＫＬの刺激を与えずに５日間培養したＲＡＷ２６４．７細胞を示す。中央は、５日間に亘って１００ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬが投与されたＲＡＷ２６４．７を示す。右側は、５日間に亘って１００ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬが投与され、１μＭのＩＰ６が処理されたＲＡＷ２６４．７細胞を示す。例を示す画像が示されている。（Ｂ）ＩＰ６が処理されたＲＡＷ２６４．７から生成された多核ＴＲＡＰ陽性細胞（ＯＣＬ）の数。ＲＡＮＫＬが投与されＩＰ６が未処理の細胞を１００とした割合で値が示されている。
【図８】ＩＰ６はＲＡＮＫＬに誘発された砕骨細胞の生成を直接的に抑制する。（Ａ）ＴＲＡＰｍＲＮＡ量、（Ｃ）ＣＦＭＳ  ｍＲＮＡ量、（Ｂ）ＩＰ６の処理を行った、ＲＡＮＫＬ刺激細胞のＣＦＭＳ  ｍＲＮＡ量。データは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡおよび１８ｓ  ｒＲＮＡによって標準化された目標遺伝子の倍率変化を示しており、ＲＡＮＫＬが投与されＩＰ６が未処理の細胞を１００％とした割合で示した。値は平均±ＳＥＭを表している。スチューデントｔ検定によって有意差が評価され、＊はｐ≦０．０５対対照細胞であり、♯はｐ≦０．０５対ＲＡＮＫＬ処理細胞である。
【図９】ＩＰ６はＲＡＮＫＬに誘発された破骨細胞の骨吸収力を直接抑制する。ＲＡＷ２６４．７細胞は、５日間に亘って、ＯＣＬおよびＩＰ６を生成するためにＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）処理され、破骨細胞機能マーカー（Ｃａｒ−２（Ａ）、Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ（Ｂ）、ＣｔｓＫ（Ｃ）、およびＭＭＰ−９（Ｄ））の遺伝子表現が定量された。データは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡおよび１８ｓ  ｒＲＮＡによって標準化された目標遺伝子の倍率変化を示しており、ＲＡＮＫＬが投与されＩＰ６が未処理の細胞を１００％とした割合で示した。値は平均±ＳＥＭを表している。スチューデントｔ検定によって有意差が評価され、＊はｐ≦０．０５対対照細胞であり、♯はｐ≦０．０５対ＲＡＮＫＬ処理細胞である。
【図１０】ＩＰ６はＲＡＮＫＬに誘発された破骨細胞の骨吸収力を直接抑制する。（Ａ）破骨細胞形成の間、１μＭのＩＰ６が処理されたＲＡＷ２６４．７細胞の骨吸収能力を、象牙質ディスクの吸収ピットアッセイ（ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｐｉｔ  ａｓｓａｙ）によって評価した（ｎ＝３）。データは破骨細胞によって吸収された領域の割合を表している。値は平均±ＳＥＭを表している。スチューデントｔ検定によって有意差が評価され、＊はｐ≦０．０５対対照細胞であり、♯はｐ≦０．０５対ＲＡＮＫＬ処理細胞である。（Ｂ）２４時間に亘って１μＭのＩＰ６を処理された発達した破骨細胞のアクチンリング形成を共焦点顕微鏡を用いて評価した。アクチンはＦＩＴＣ−ファロイジン（Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）（緑）によって、核はＤＡＰＩ（青）によって染色された。典型的な画像が示されている。
【図１１】ＩＰ６はｈＵＣ−ＭＳＣの骨芽細胞の分化を誘発する。ｈＵＣ−ＭＳＣ細胞に１９日間に亘って４μＭのＩＰで処理され、骨芽細胞のマーカーであるＲｕｎｘ−２（Ａ）、Ｃｏｌ１Ａ（Ｂ）、ＡＬＰ（Ｃ）、およびＯＣ（Ｄ）の遺伝子表現が定量された。データは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡおよびβアクチンｍＲＮＡで標準化された目標遺伝子の倍率変化を表しており、対照細胞を１００％とした割合で示されている。値は平均±ＳＥＭを表している。スチューデントｔ検定によって有意差が評価された。
【図１２】各表面についてのＬＤＨ値によって計測された、対照の未処理のチタンインプラント（０％の毒性）および０．１％のトリトンＸ−１００（１００％の毒性）に対する表面改質の毒性。３種類のチタンコイン：対照チタンコイン；前処理（不導体化）して、ＡＰＴＥＳと結合させたチタンコイン；前処理（不導体化）して、ＡＰＴＥＳおよびＩＰ６と結合させたチタンコインがテストされた。値は平均±ＳＥＭを表している。スチューデントｔ検定によって有意差が評価され、＊はｐ≦０．０５対対照Ｔｉである。
【図１３】チタンインプラントに共有結合したフィチン酸はＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞内でのオステオカルシン遺伝子表現を誘発する。データは、標準化されたオステオカルシンの倍率変化を表しており、対照Ｔｉインプラントに培養された細胞を１００％とした割合で示している。値は平均±ＳＥＭを表している。スチューデントｔ検定によって有意差が評価された。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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