(57)【要約】  本発明は、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体を含む、ＴｒｋＡ受容体に対する抗体およびそれらの使用に関する。より具体的には、本発明は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域、および変化した交換特性を表すバリアントヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を含む、阻害特性が増強されたヒト化抗ＴｒｋＡ抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１〜５からなる群から選択される配列を含む重鎖可変ドメイン、および
ｂ）配列番号６〜１３からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含むヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片であって、
重鎖可変ドメインのＣＤＲ２が、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、かつ／または重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域が、３７、４２、および８９からなる群から選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、各群のメンバーのアミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項２】
重鎖可変ドメインのＣＤＲ２が、配列番号１５の配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項３】
重鎖可変ドメインが、配列番号１、３および５からなる群から選択される配列を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号６および８からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項４】
抗体が、配列番号１および配列番号６、配列番号３および配列番号６、配列番号３および配列番号８、配列番号５および配列番号６、ならびに配列番号５および配列番号８からなる群から選択される配列を含む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの組み合わせを含む、請求項１に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項５】
抗体が、配列番号５および配列番号６の配列を含む、または配列番号５および配列番号８の配列を含む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの組み合わせを含む、請求項１に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項６】
抗体が、配列番号５および配列番号６の配列を含む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの組み合わせを含む、請求項１に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項７】
重鎖可変ドメインのＣＤＲ２のアミノ酸置換が、５０、６０および６２からなる群から選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、各群のメンバーのアミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される、請求項１に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項８】
重鎖可変ドメインのＣＤＲ２のアミノ酸置換が、Ｙ５０Ａ、Ｐ６０Ａ、およびＴ６２Ｓからなる群から選択されるアミノ酸置換を含まず、各群のメンバーのアミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される、請求項１に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項９】
重鎖可変ドメインまたはその断片の非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換が、Ｖ３７Ａ、Ｇ４２Ｅ、およびＶ８９Ｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を含み、各群のメンバーのアミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される、請求項１に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項１０】
重鎖可変ドメインまたはその断片の非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換が、Ｖ３７Ａを含み、アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される、請求項１に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項１１】
抗体が、配列番号３および配列番号６の配列の配列を含む、または配列番号３および配列番号８の配列を含む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの組み合わせを含み、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換が、Ｖ３７Ａ、Ｔ４０Ａ、Ｇ４２Ｅ、Ｒ４４Ｇ、Ａ４９Ｓ、およびＶ８９Ｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を含み、各群のメンバーのアミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される、請求項１に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項１２】
重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換が、Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ、Ｇ４２Ｅ、Ａ４９Ｓ、Ｖ８９Ｌ、およびＲ９４Ｋからなる群から選択されるアミノ酸置換を含み、各群のメンバーのアミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される、請求項６に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項１３】
重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換が、アミノ酸置換Ｋ３ＱおよびＶ３７Ａを含み、アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される、請求項６に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項１４】
重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換が、アミノ酸置換Ｖ３７Ａを含み、アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される、請求項６に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項１５】
ａ）配列番号３１〜４９からなる群から選択される配列を含む重鎖可変ドメイン、および
ｂ）配列番号６〜１３からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項１６】
抗体が、
ａ）配列番号３２および３６からなる群から選択される配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに
ｂ）配列番号６の配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１５に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項１７】
重鎖および／または軽鎖定常領域をさらに含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項１８】
重鎖および／または軽鎖定常領域ならびにヒンジ領域をさらに含み、重鎖定常領域およびヒンジ領域がヒトＩＧＨＧ１アイソタイプまたはヒトＩＧＨＧ４アイソタイプである、請求項１から１６のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項１９】
重鎖および／または軽鎖定常領域ならびにヒンジ領域をさらに含み、重鎖定常領域およびヒンジ領域が、ヒトＩＧＨＧ４アイソタイプであり、ヒンジ領域が、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含み、アミノ酸位置が、ＥＵ番号付けシステムを利用して示される、請求項１から１６のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項２０】
ａ）配列番号５０〜７０からなる群から選択される配列を含む重鎖、ならびに
ｂ）配列番号２９および３０からなる群から選択される配列を含む軽鎖
を含む、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項２１】
抗体が、全長抗体である、請求項１から２０のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項２２】
抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'−ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ'）2、ｓｃＦｖ、２重特異性単鎖Ｆｖ二量体、ダイアボディ、トリアボディおよび同じまたは異なる抗体と遺伝子的に融合したｓｃＦｖからなる群から選択される抗体断片である、請求項１から１６のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項２３】
抗体が、親抗体のＦｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸改変を含むバリアントＦｃ領域を含み、一方でバリアントＦｃ領域を含む抗体が、親抗体と比較して変化したエフェクター機能を示す、請求項１から２１のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項２４】
ＴｒｋＡの機能的活性化を阻害する能力がある、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項２５】
ＴｒｋＡの１つまたは複数の生物活性を遮断または低減する能力がある、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項２６】
５００ｎＭ以下の親和性（ＫＤ）でヒトＴｒｋＡに結合する、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項２７】
ＴＦ−１細胞増殖アッセイにおいて少なくとも対応する親のマウス抗体以下のＩＣ５０を有する、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項２８】
ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体が、６５℃よりも高いＦＡＢ断片熱安定性温度を有する、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項２９】
ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体のＦＡＢ断片熱安定性温度が、親のマウス抗体のＦＡＢ断片熱安定性温度と同等である、請求項２８に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項３０】
請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片をコードする単離核酸。
【請求項３１】
配列番号７３〜１１６からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項３０に記載の単離核酸。
【請求項３２】
請求項３０または３１に記載の単離核酸を含むベクター。
【請求項３３】
請求項３０または３１に記載の単離核酸または請求項３２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３４】
核酸が発現され、抗体が産生されるように、請求項３３に記載の宿主細胞を培養することを含む、ヒトＴｒｋＡに結合するヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片を産生する方法。
【請求項３５】
固定化された形態の、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片。
【請求項３６】
請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項３７】
治療剤と連結した請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片を含むイムノコンジュゲート。
【請求項３８】
請求項３７に記載のイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項３９】
別の医薬活性薬剤をさらに含む、請求項３６または３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記別の医薬活性薬剤が、
ａ）鎮痛剤
ｂ）別の抗ＴｒｋＡ抗体
ｃ）ＮＧＦ
ｄ）抗癌剤
ｅ）抗ＮＧＦ抗体
の１つまたは複数である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
医学に使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、請求項３６、３８、３９、もしくは４０に記載の組成物、または請求項３７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４２】
疼痛の処置に使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、請求項３６、３８、３９、もしくは４０に記載の組成物、または請求項３７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４３】
慢性疼痛の処置に使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、請求項３６、３８、３９、もしくは４０に記載の組成物、または請求項３７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４４】
急性疼痛の処置に使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、請求項３６、３８、３９、もしくは４０に記載の組成物、または請求項３７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４５】
炎症性疼痛、手術後疼痛、術後疼痛（歯痛を含む）、神経障害性疼痛、末梢神経障害、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、骨折痛、痛風性関節痛、帯状疱疹後神経痛、癌性疼痛、変形性関節症または関節リウマチ疼痛、坐骨神経痛、鎌状赤血球クリーゼ関連疼痛、頭痛（例えば片頭痛、緊張性頭痛、群発頭痛）、月経困難症、子宮内膜症、子宮筋腫、筋骨格痛、慢性腰痛、線維筋痛、捻挫、内臓痛（ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｐａｉｎ）、卵巣嚢腫、前立腺炎、慢性骨盤痛症候群、膀胱炎、間質性膀胱炎、有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群、慢性無菌性前立腺炎関連痛、切開痛、片頭痛、三叉神経痛、熱傷および／または創傷からの疼痛、外傷に関連する疼痛、筋骨格疾患に関連する疼痛、強直性脊椎炎、関節周囲の病状、骨転移からの疼痛、ＨＩＶからの疼痛、皮膚紅痛症または膵炎もしくは腎結石によって起こる疼痛、悪性黒色腫、シェーグレン症候群、喘息（例えば重症気道反応亢進を有するコントロール不良の喘息）、難治性咳嗽、脱髄疾患、慢性アルコール依存症、脳卒中、視床痛症候群、毒素からの疼痛、化学療法からの疼痛、炎症性腸障害、過敏性腸症候群、炎症性眼障害、炎症性または不安定膀胱障害、乾癬、炎症成分による皮膚疾患、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症状態、炎症性疼痛ならびに関連する痛覚過敏および異痛、神経障害性疼痛および関連する痛覚過敏または異痛、糖尿病性神経障害痛、灼熱痛、交感神経依存性疼痛、求心路遮断症候群、上皮組織損傷または機能障害、呼吸器、尿生殖器、消化管、または血管領域での内臓運動障害、アレルギー性皮膚反応、掻痒症、白斑、汎胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動性またはアレルギー性鼻炎、気管支障害、消化不良、胃食道逆流、膵炎、内臓痛（ｖｉｓｃｅｒａｌｇｉａ）、ならびに線維性骨形成異常（ＦＤ）の１つまたは複数に関連する疼痛の処置に使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、請求項３６、３８、３９、もしくは４０に記載の組成物、または請求項３７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４６】
膵炎、腎結石、子宮内膜症、ＩＢＤ、クローン病、術後癒着、胆嚢結石、頭痛、月経困難症、筋骨格痛、捻挫、内臓痛、卵巣嚢腫、前立腺炎、膀胱炎、間質性膀胱炎、術後疼痛、片頭痛、三叉神経痛、熱傷および／または創傷からの疼痛、外傷に関連する疼痛、神経障害性疼痛、筋骨格疾患に関連する疼痛、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、関節周囲の病状、腫瘍性疼痛、骨転移からの疼痛、ＨＩＶ感染の１つまたは複数に関連する疼痛の処置に使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、請求項３６、３８、３９、もしくは４０に記載の組成物、または請求項３７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４７】
癌、ニューロン障害、アルツハイマー病、糖尿病、糖尿病性腎症、ウイルス障害、ＨＩＶ媒介障害、ハンセン病、または炎症障害の処置に使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、請求項３６、３８、３９、もしくは４０に記載の組成物、または請求項３７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４８】
痛覚過敏が、ＮＳＡＩＤと同じ程度まで効果的に反転する、急性炎症性疼痛の処置に使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、請求項３６、３８、３９、もしくは４０に記載の組成物、または請求項３７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４９】
痛覚過敏が、ＮＳＡＩＤと同じ程度まで効果的に反転する、慢性炎症性疼痛の処置に使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、請求項３６、３８、３９、もしくは４０に記載の組成物、または請求項３７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５０】
痛覚過敏が、プレガバリンおよびオピエートと同じ程度まで効果的に反転する、変形性関節症性疼痛の処置に使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、請求項３６、３８、３９、もしくは４０に記載の組成物、または請求項３７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５１】
痛覚過敏および異痛が、プレガバリンと同じ程度まで効果的に反転する、神経障害性疼痛の処置に使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、請求項３６、３８、３９、もしくは４０に記載の組成物、または請求項３７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５２】
診断または予後に使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、請求項３６、３８、３９、もしくは４０に記載の組成物、または請求項３７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５３】
ＴｒｋＡの異常発現を伴う状態またはＴｒｋＡを伴う異常活性の診断または予後に使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、請求項３６、３８、３９、もしくは４０に記載の組成物、または請求項３７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５４】
請求項４１から４７に記載の疾患または障害のいずれかの診断または予後に使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、請求項３６、３８、３９、もしくは４０に記載の組成物、または請求項３７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５５】
請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、請求項３６、３８、３９、もしくは４０に記載の組成物、または請求項３７に記載のイムノコンジュゲートを含む製品。
【請求項５６】
請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、請求項３６、３８、３９、もしくは４０に記載の組成物、または請求項３７に記載のイムノコンジュゲートを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年６月８日に出願された米国仮出願第６１／６５７，１８４号（この全ては本明細書に参照によりそれらの全体が組み込まれている）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、全般に、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体および抗ＴｒｋＡ抗体を用いた処置の方法を含む、ＴｒｋＡ受容体に対する抗体およびそれらの使用に関する。一態様では、本発明は、阻害特性が増強されたヒト化抗ＴｒｋＡ抗体に関する。
【０００３】
さらなる態様では、本発明は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域、および変化した交換特性を表すバリアントヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を含む、阻害特性が増強されたヒト化抗ＴｒｋＡ抗体に関する。
【背景技術】
【０００４】
ニューロトロフィンは、ファミリーＮＧＦの最初のメンバーと構造的に関係するペプチド成長因子（Ｂａｒｄｅ  ＹＡ（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２５（１１）：１３２９〜３３）のファミリーである（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ  Ｒ（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６（５）：１１４５〜５４）。ニューロトロフィンは、ニューロンの分化および生存、ならびに末梢ニューロンおよび中枢神経系の両方のシナプス伝達を調節する。さらにＮＧＦは、免疫細胞などの様々な非神経組織および細胞に作用する。ＮＧＦは、標的細胞に存在する２種の膜受容体、すなわち低親和性ｐ７５受容体およびチロシンキナーゼ活性を有する１４０ｋＤａ高親和性膜貫通糖タンパク質ＴｒｋＡ（Ｋａｐｌａｎ  ＤＲら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２（５００５）：５５４〜８；Ｋｌｅｉｎ  Ｒら、（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６５（１）：１８９〜９７）を介して作用する。ＴｒｋＡは、神経提ニューロン、交感神経ニューロン、ならびにＴｒｋＡがＮＧＦ活性の重大な媒介物質に相当する前脳基底部および線条体のコリン作動性ニューロンに発現される（Ｈｏｌｔｚｍａｎ  ＤＭら、（１９９２）Ｎｅｕｒｏｎ  ９（３）：４６５〜７８；Ｖｅｒｇｅ  ＶＭら、（１９９２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２（１０）：４０１１〜２２）。ＴｒｋＡは、Ｂリンパ球を含むいくつかの非神経組織および細胞にも発現される（Ｔｏｒｃｉａ  Ｍら、（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８５（３）：３４５〜５６）。
【０００５】
神経成長因子（ＮＧＦ）は、本来、発生途中の神経系において知覚神経および交感神経ニューロンに関する生存因子として同定された（Ｇｏｒｉｎ  ＰＤおよびＪｏｈｎｓｏｎ  ＥＭ（１９７９）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、７６（１０）：５３８２〜６）。ＮＧＦは、成体では生存に必要とされず、いくつかの急性および慢性疼痛状態での疼痛および痛覚過敏の発生に重大な役割を有する。ＮＧＦの発現は、傷害組織および炎症組織では高く、侵害受容ニューロン上でのｔｒｋＡの活性化は、複数のメカニズムによって疼痛シグナル伝達をトリガーおよび強化する。炎症関連疼痛は、動物モデルにおいて、ＮＧＦの生物活性を中和することによって有意に緩和することができ（Ｗｏｏｌｆ  ＣＪら、（１９９４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ６２（２）：３２７〜３１；ＭｃＭａｈｏｎ  ＳＢら、（１９９５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１（８）：７７４〜８０；Ｋｏｌｔｚｅｎｂｕｒｇ  Ｍら、（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１（５）：１６９８〜７０４）、このことは、このニューロトロフィンのレベル増大が完全痛覚過敏応答を発生するために必要であることを意味している。驚くことに、他のニューロトロフィンの阻害は、誘導された痛覚過敏の拮抗を生じず、このことは、この作用がＮＧＦに特異的であることを示唆しており（ＭｃＭａｈｏｎ  ＳＢら、（１９９５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１（８）：７７４〜８０）；加えて、ＮＧＦの阻害は種々の神経障害関連疼痛プロトコールで鎮痛を生じる（Ｋｏｌｔｚｅｎｂｕｒｇ  Ｍら、（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１（５）：１６９８〜７０４；Ｒｏ  ＬＳら、（１９９９）Ｐａｉｎ  ７９（２〜３）：２６５〜７４；Ｔｈｅｏｄｏｓｉｏｕ  Ｍら、（１９９９）Ｐａｉｎ、８１（３）：２４５〜５５；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＭＤおよびＨｕｌｓｅｂｏｓｃｈ  ＣＥ（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４７（２）：４６３〜７５）。疼痛の処置には、大きなまだ対処されていない医学的必要がある。最も優位なクラスの鎮痛薬である非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）およびオピエートは、それらの効力および認容性に制限がある（Ｈｅｆｔｉ  ＦＦら、（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２７（２）：８５〜９１）。現行の治療法で十分な緩和を得るのは、慢性疼痛を有する患者の３０％未満であり、特に長期投与で多くの有害作用がある（Ｋａｌｓｏ  Ｅら、（２００４）Ｐａｉｎ  １１２（３）：３７２〜８０）。成体においてＮＧＦが疼痛のメカニズムに中心的な役割を有するという認識は、全く新規なクラスの疼痛治療法を開発する機会を提供する。
【０００６】
ＮＧＦの代わりにＴｒｋＡをターゲティングすることは、より良い治療選択に相当し得る。それは、この受容体が、ニューロン発生に広い機能を有するｐ７５受容体によって媒介されるＮＧＦの機能を妨害しないからである。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、全般に、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体、それらの調製方法、および使用に関する。
【０００８】
一態様では、本開示は、
ａ）配列番号１〜５からなる群から選択される配列を含む重鎖可変ドメイン、および
ｂ）配列番号６〜１３からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含むヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片であって、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２が、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、かつ／または重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域が、３７、４２、および８９からなる群から選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、各群のメンバーのアミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示されるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片を提供する。
【０００９】
さらなる態様では、本開示は、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片をコードする単離核酸、単離核酸を含むベクター、および単離核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。本開示によって同様に提供されるのは、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片を産生する方法である。
【００１０】
さらなる態様では、本開示は、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片を含む組成物、および治療剤と連結したヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片を含むイムノコンジュゲートを提供する。さらなる態様では、本開示は、医学に使用するため、疼痛処置に使用するため、慢性疼痛の処置に使用するため、急性疼痛の処置に使用するため、膵炎、腎結石、子宮内膜症、ＩＢＤ、クローン病、術後癒着、胆嚢結石、頭痛、月経困難症、筋骨格痛、捻挫、内臓痛、卵巣嚢腫、前立腺炎、膀胱炎、間質性膀胱炎、術後疼痛、片頭痛、三叉神経痛、熱傷および／もしくは創傷からの疼痛、外傷に関連する疼痛、神経障害性疼痛、筋骨格疾患に関連する疼痛、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、関節周囲の病状、腫瘍性疼痛、骨転移からの疼痛、ＨＩＶ感染の１つまたは複数に関連する疼痛の処置に使用するため、癌、ニューロン障害、アルツハイマー病、糖尿病、糖尿病性腎症、ウイルス障害、ＨＩＶ媒介障害、ハンセン病、または炎症障害の処置に使用するため、ならびに診断または予後に使用するためのヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、組成物、またはイムノコンジュゲートを提供する。
【００１１】
さらなる態様では、本開示は、炎症性疼痛、変形性関節症性疼痛、および神経障害性疼痛を処置する方法を提供する。一態様では、急性炎症性痛覚過敏のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の投与は、用量０．０１ｍｇ／ｋｇで急性炎症性痛覚過敏の顕著な反転を生じた。別の態様では、慢性炎症性痛覚過敏のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の投与は、用量０．０１ｍｇ／ｋｇで慢性炎症性痛覚過敏の顕著で持続的な反転を生じた。別の態様では、慢性変形性関節症性痛覚過敏のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の投与は、用量０．０１ｍｇ／ｋｇで慢性変形性関節症性痛覚過敏の顕著で持続的な反転を生じた。さらなる態様では、神経障害性疼痛のｉｎ  ｖｉｖｏ慢性絞扼損傷モデルにおいて、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の投与は、用量１．０ｍｇ／ｋｇで神経障害性疼痛の顕著な反転を生じた。
【００１２】
さらなる態様では、本開示は、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、組成物、またはイムノコンジュゲートを含む製品を提供する。
【００１３】
さらなる態様では、本開示は、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体もしくはその断片、組成物、またはイムノコンジュゲートを含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】抗ＴｒｋＡ抗体の表面プラズモン共鳴測定。データは、時間（Ｘ軸）に対する応答値（略語ＲＵ；Ｙ軸）として表現する。（図１Ａ）ＭＮＡＣ１３抗体。（図１Ｂ）ＢＸｈＶＨ５ＶＬｌ抗体。（図１Ｃ）ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１抗体。（図１Ｄ）ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１抗体。
【図２】示差走査熱量測定を用いた抗ＴｒｋＡ抗体の熱安定性測定。データは、温度（Ｘ軸）に対する過剰モル熱容量（略語Ｃｐ［ｋｃａｌ／ｍｏｌ／℃］；Ｙ軸）として表現する。（図２Ａ）ＭＮＡＣ１３抗体（ＦＡＢ断片のＴｍは７４℃であるＴｍ１）。（図２Ｂ）ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１抗体（ＦＡＢ断片のＴｍは７６．５℃であるＴｍ３）。（図２Ｃ）ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１抗体（ＦＡＢ断片のＴｍは７３．６℃であるＴｍ１）。（図２Ｄ）ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１抗体（ＦＡＢ断片のＴｍは７３℃であるＴｍ１）。（図２Ｅ）図２Ｃと図２Ｄとの重ね合わせ。（図２Ｆ）図２Ｂと図２Ｄとの重ね合わせ。（図２Ｇ）図２Ａと図２Ｄとの重ね合わせ。
【図３】抗ＴｒｋＡ抗体の機能的生物活性。ＮＧＦ誘導型ＴＦ−１細胞増殖に及ぼすヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の作用；データは、抗体濃度（μｇ／ｍｌ；Ｘ軸）に対する増殖応答（Ｙ軸）の％として表現する。（図３Ａ）ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１、ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１対ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１。（図３Ｂ）ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１、ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１対ＭＮＡＣ１３。（図３Ｃ）ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１対ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐ。（図３Ｄ）ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ３、ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１対ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ３。（図３Ｅ）ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ１、ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１対ＧＢＲ  ＶＨ３（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１。
【図４】ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体が急性炎症性足痛を反転させる。足の急性炎症性痛覚過敏は、ＡＭＢ１マウスの後肢の片方にＣＦＡを足底内注射することによって誘導し、同側の（注射した）足への荷重と対側の（注射していない）足への荷重との間の％比として測定した。（％同側／対側、平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。荷重の読み取りは、ＣＦＡ注射の２３時間後（０時間）に行い、その後、ＣＦＡの２４時間後に０．０００１（白棒線）、０．００１（横線網かけ棒線）、０．０１（市松模様）、および０．１ｍｇ／ｋｇ（斜線網かけ棒線）の抗ＴｒｋＡ抗体または０．１ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体（黒棒線）を単回ｉ．ｐ．注射して処置を開始し、続いて投与の４、８、２４、４８、７２、９６、および１２０時間後に荷重を測定した。陽性対照として、マウスを１０ｍｇ／ｋｇインドメタシンでｐ．ｏ処置した（縦線網かけ棒線）。
【図５】ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体が慢性炎症性関節痛を反転させる。関節の慢性炎症性痛覚過敏は、ＡＭＢ１マウスの後肢膝関節の片方にＣＦＡを関節内注射することによって誘導し、同側の（注射した）肢への荷重と対側の（注射していない）肢への荷重との間の％比として測定した（％同側／対側、平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。荷重の読み取りは、ＣＦＡ注射の直前（未処置）ならびにＣＦＡの３、７、および１０日後に行い、その後ＣＦＡの１３日後に０．０１（白丸、点線）、１（黒三角）、および１０ｍｇ／ｋｇ（白丸）の抗ＴｒｋＡ抗体または１０ｍｇ／ｋｇアイソタイプ対照抗体（黒丸）を単回ｉ．ｐ．注射して処置を開始し、続いて投与の４、８、２４、４８、７２、および９６時間後に荷重を測定した（カッコ内）。陽性対照として、１３日目からマウスを６０ｍｇ／ｋｇセレコキシブで１日２回処置し（白菱形）、ＣＦＡの１３日後の投与の１および８時間後、ならびに次にＣＦＡの１４〜１７日後の投与の１時間後に荷重を測定した。
【図６】ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体が、慢性変形性関節症性疼痛を反転させる。慢性変形性関節症性痛覚過敏は、ＡＭＢ１マウスの後肢膝関節の片方にＭＩＡを関節内注射することによって誘導し、同側の（注射した）肢への荷重と対側の（注射していない）肢への荷重との間の％比として測定した（％同側／対側、平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。ベースライン（ＢＬ）の荷重の読み取りは、ＭＩＡ注射の直前ならびにＭＩＡの３、７および１０日後に行い、その後、ＭＩＡの１４日後に１（白三角）、１０（白菱形）、および１００μｇ／ｋｇ（黒丸、点線）の抗ＴｒｋＡ抗体、または１０ｍｇ／ｋｇアイソタイプ対照抗体（黒四角）を単回ｉ．ｐ．注射して処置を開始した（図６Ａ）。比較対照薬として、ＭＩＡの１４日後に動物を１０ｍｇ／ｋｇトラマドールまたは３０ｍｇ／ｋｇプレガバリンでｐ．ｏ．処置し、続いてＭＩＡの１６〜２２日後に３０ｍｇ／ｋｇトラマドールまたは１００ｍｇ／ｋｇプレガバリンで隔日処置した（図６Ｂ）。抗体処置群についてはＭＩＡの１４日後の投与の４、８、および２４時間後、ならびに続いて２４時間毎に、トラマドールおよびプレガバリン処置群については投与の１および２４時間後に、荷重を用いて全ての動物を判定した。
【図７】ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体が神経障害性疼痛を反転させる。慢性神経障害性痛覚過敏および異痛は、ＡＭＢ１マウスの坐骨神経の慢性絞扼損傷によって誘導し、それぞれ足挙上に必要な限界力（ｇ）および冷プレートから足を挙上する潜時（秒）として測定した。読み取りは、手術前および手術７日後の処置開始前日（０時間）に行った。次に、動物を１０００μｇ／ｋｇアイソタイプ対照抗体（黒三角）または１０（黒丸）、１００（黒四角）および１０００μｇ／ｋｇ（黒菱形）の抗ＴｒｋＡ抗体のいずれかの単回ｉ．ｐ．注射で処置した。プレガバリン（黒逆三角）（３０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｌ、ｐ．ｏ．）または食塩水（白丸）を投与後の７日間にわたり１日１回投与した。投与後の読出しは、投与後４時間、２４時間、および続いて７日まで隔日記録した。投与後読出しは、全ての日にプレガバリンまたは食塩水投与の１時間後に記録した。
【発明の詳細な説明】
【００１５】
本開示は、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片、それらの調製の方法、および使用に関する。
【００１６】
用語「ＴｒｋＡ」、「ヒトＴｒｋＡ」、「ＴｒｋＡ受容体」、または「ヒトＴｒｋＡ受容体」は、本明細書において同等に使用され、特に具体的に示さない限り「ヒトＴｒｋＡ」を意味する。本明細書で用いる場合、ヒトＴｒｋＡには、ヒトＴｒｋＡのバリアント、アイソフォーム、および種相同体が含まれる。したがって、本開示の抗体は、ある場合にヒト以外の種由来のＴｒｋＡと交差反応することがある。ある実施形態では、抗体は、１種または複数のヒトＴｒｋＡタンパク質に完全に特異的なことがあり、種交差反応性も他の種類の非ヒト交差反応性も示さないことがある。
【００１７】
ＴｒｋＡは、高親和性神経成長因子受容体または神経栄養性チロシンキナーゼ受容体１またはＴＲＫ１−形質転換チロシンキナーゼタンパク質またはトロポミオシン関連キナーゼＡまたはチロシンキナーゼ受容体またはチロシンキナーゼ受容体ＡまたはＴｒｋ−Ａまたはｇｐ１４０ｔｒｋまたはｐ１４０−ＴｒｋＡまたはＭＴＣまたはＴＲＫとしても公知である。ＴｒｋＡは、交感神経ニューロンおよび神経ニューロンの増殖、分化、および生存の調節により中枢神経系および末梢神経系の発生および成熟に関与する受容体型チロシンキナーゼである。ＴｒｋＡは、ＮＧＦに対する高親和性受容体であり、ＮＧＦはその主リガンドである。ＴｒｋＡは、また、ＮＴＦ３／ニューロトロフィン−３と結合し、それによって活性化することができる。
【００１８】
４種の公知のヒトＴｒｋＡアイソフォームの完全アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０４６２９（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＴＵ、（２０１２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４０（Ｄ１）：Ｄ７１〜Ｄ５）から見いだされる。４種のアイソフォームは、選択的スプライシングによって産生され、アイソフォームＴｒｋＡ−Ｉは、大部分の非神経組織から見いだされ（ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０４６２９−２）、一方でアイソフォームＴｒｋＡ−ＩＩは、主として神経細胞に発現され（ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０４６２９−１）、アイソフォームＴｒｋＡ−ＩＩＩは、特異的に多能性神経幹前駆細胞および神経提前駆細胞によって発現される（ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０４６２９−４）。残基１〜７１でアイソフォームＴｒｋＡ−ＩＩと異なり、残基３９３〜３９８を欠如する４番目のアイソフォームは、アイソフォーム３として公知である（ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０４６２９−３）。ＴｒｋＡ−ＩＩアイソフォームは、ＴｒｋＡの主要な公知のアイソフォームである。アイソフォームＴｒｋＡ−ＩがＮＴＦ３ニューロトロフィンに対して反応性の増強を有するのに対して、アイソフォームＴｒｋＡ−ＩＩＩは構成的に活性であり、ＮＧＦと結合しない。好ましい実施形態では、ＴｒｋＡアイソフォームは、本明細書で用いる場合、配列番号７２のＴｒｋＡ−ＩＩアイソフォームおよび配列番号２５の配列を含むその細胞外領域である。
【００１９】
本明細書で用いる場合、用語「抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片」または「ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片」には、５００ｎＭ以下、好ましくは３５０ｎＭ以下、より好ましくは１５０ｎＭ以下、いっそうより好ましくは１００ｎＭ以下、最も好ましくは５０ｎＭ以下、特に３０ｎＭ以下の親和性（ＫＤ）で、ヒトＴｒｋＡ、例えば単離された形態のヒトＴｒｋＡに結合する抗体またはその断片、具体的にはＴｒｋＡ−ＩＩアイソフォーム（配列番号７２）に結合する抗体またはその断片、より具体的にはＴｒｋＡ−ＩＩアイソフォームの一価形態のヒトＴｒｋＡ細胞外領域（配列番号２５）に結合する抗体またはその断片が含まれる。通常、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、ＴｒｋＡの機能的活性化を阻害する能力があり、かつ／またはその他の場合にＴｒｋＡへのＮＧＦの結合によって誘導されるであろう１つもしくは複数の生物活性を遮断もしくは低減する能力がある。
【００２０】
本明細書で用いる場合、「抗ＮＧＦ抗体」は、ＮＧＦに、好ましくはヒトＮＧＦに結合することができる抗体のことをいう。通常、抗ＮＧＦ抗体は、ＴｒｋＡの機能的活性化を阻害する能力があり、かつ／またはＴｒｋＡの１つもしくは複数の生物活性を遮断もしくは軽減する能力がある。ＮＧＦ（ｈＮＧＦなど）に対する抗ＮＧＦ抗体の結合親和性は、５００ｎＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下であり得る。通常、抗ＮＧＦ抗体は、以下のいずれか１つまたは複数の特徴を示すはずである：（ａ）ＮＧＦに結合し、ＮＧＦの生物活性および／またはＮＧＦシグナル伝達機能によって媒介される下流経路を阻害する；（ｂ）ＮＧＦ受容体の活性化を遮断または低下させる（ＴｒｋＡ受容体の二量体化および／または自己リン酸化を含む）；（ｃ）ＮＧＦの排除を増加させる；（ｄ）ＮＧＦの合成、産生または放出を阻害（低減）する。抗ＮＧＦ抗体は、当技術分野において公知であり、例えばＰＣＴ公報番号ＷＯ０１／７８６９８、ＷＯ０１／６４２４７、米国特許第５，８４４，０９２号、同第５，８７７，０１６号、および同第６，１５３，１８９号；Ｈｏｎｇｏら、（２０００）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９：２１５〜２２７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ３９６０８、Ｕ３９６０９、Ｌ１７０７８、またはＬ１７０７７を参照されたい。
【００２１】
用語「Ｔｒｋの機能的活性化を阻害する能力があるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片」は、本明細書で用いる場合、以下のいずれか１つまたは複数の特徴を示すヒト化抗ＴｒｋＡ抗体のことをいう：（ａ）ＴｒｋＡに結合し、ＴｒｋＡの生物活性および／またはＮＧＦの結合もしくはＮＴＦ３／ニューロトロフィン−３シグナル伝達機能によって媒介される下流経路を阻害する；（ｂ）疼痛の任意の態様を予防、改善、または治療する；（ｃ）ＴｒｋＡの活性化または二量体化および／もしくは自己リン酸化を遮断または減少させる；（ｄ）ＴｒｋＡの排除を増加させる；（ｅ）ＴｒｋＡの合成および／または細胞表面発現を阻害または低減する。
【００２２】
用語「ＴｒｋＡの１つまたは複数の生物活性を遮断または低減する能力があるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片」は、本明細書で用いる場合、ＴｒｋＡの生物活性を直接または間接的に低減、阻害、中和、または撤廃するヒト化抗ＴｒｋＡ抗体のことをいう。
【００２３】
用語「ＴｒｋＡの生物活性」または「ＴｒｋＡ生物活性」は、本明細書で用いる場合、限定することなく、以下のいずれか１つまたは複数のことをいう：ＮＧＦまたは他のニューロトロフィンに結合できること；ホモ二量体化もしくはヘテロ二量体化および／または自己リン酸化できること；ＮＧＦ誘導型シグナル伝達経路を活性化できること；細胞分化、増殖、生存、成長、遊走、ならびにニューロンの形態変化、シナプス形成、シナプス機能、神経伝達因子および／または神経ペプチドの放出（末梢ニューロンおよび中枢ニューロンを含むニューロンの場合）を含む細胞生理における他の変化、ならびに損傷後の再生を促進できること；ならびに骨転移に関連する疼痛および癌性疼痛を媒介できること。
【００２４】
用語「ＩＣ５０」は、本明細書で用いる場合、化合物が生物学的機能を阻害する有効性、例えばＮＧＦ誘導型ＴＦ−１細胞の増殖に対するヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の阻害の尺度である最大半値阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。
【００２５】
本明細書で言及する場合、用語「抗体」には、全長抗体およびその任意の抗原結合断片または単鎖が含まれる。抗体、具体的には天然抗体は、４本のポリペプチド鎖から構成されるＹの形をしたユニットの１つまたは複数のコピーとして存在する糖タンパク質である。各「Ｙ」形は、重（Ｈ）鎖の２つの同一のコピーおよび軽（Ｌ）鎖の２つの同一のコピーを含み、それらの鎖は、そのようにそれらの相対分子量により名付けられる。各軽鎖は重鎖と対形成し、各重鎖は別の重鎖と対形成する。共有結合性鎖内ジスルフィド結合および非共有結合性相互作用が鎖を相互に連結する。抗体、具体的には天然抗体は、抗原結合部位の２つのコピーである可変領域を含む。タンパク質分解酵素パパインは「Ｙ」形を３つの別々の分子に分割し、２つはいわゆる「Ｆａｂ」断片（Ｆａｂ＝抗原結合性断片）であり、１つはいわゆる「Ｆｃ」断片または「Ｆｃ領域」（Ｆｃ＝結晶化可能断片）である。Ｆａｂ断片は、軽鎖全体および重鎖の部分からなる。重鎖は、１つの可変ドメイン（重鎖可変ドメインまたはＶＨ）および３つまたは４つのいずれかの定常ドメイン（抗体のクラスまたはアイソタイプに応じてＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含む。ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域はヒンジ領域と呼ばれ、Ｙ形抗体分子の２つのＦａｂアームの間の柔軟性を可能にし、一定の距離で分離された２つの抗原決定基への結合と適応するようにそれらを開放および閉鎖する。ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの重鎖は、それぞれ４つのドメイン、すなわち１つの可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１〜３）を有する。ＩｇＥおよびＩｇＭは、重鎖上に１つの可変ドメインおよび４つの定常ドメイン（ＣＨ１〜４）を有する。抗体の定常領域は、多様な免疫系細胞（例えばエフェクター細胞）および補体系古典経路の補体第一成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または宿主因子への結合を媒介し得る。各軽鎖は、通常、１個の共有ジスルフィド結合で重鎖に連結している。各軽鎖は、１つの可変ドメイン（軽鎖可変ドメインまたはＶＬ）および１つの軽鎖定常ドメインを含む。軽鎖定常ドメインは、本明細書においてＩＧＫＣと呼ばれるκ軽鎖定常ドメインであるか、または本明細書においてＩＧＬＣと呼ばれるλ軽鎖定常ドメインである。ＩＧＫＣは、本明細書においてＣκまたはＣＫと同等に使用され、同じ意味を有する。ＩＧＬＣは、本明細書においてＣλまたはＣＬと同等に使用され、同じ意味を有する。用語「ＩＧＬＣドメイン」は、本明細書で用いる場合、全てのλ軽鎖定常ドメイン、例えばＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６、およびＩＧＬＣ７からなる群から選択される全てのλ軽鎖定常ドメインのことをいう。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられる超可変領域と、そこに分散する、より保存性の高いフレームワーク領域（ＦＲまたはＦＷまたは「非ＣＤＲ領域」）と呼ばれる領域とにさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端方向に以下の順序で配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
【００２６】
抗体は、定常領域により遺伝子的に決定される、アイソタイプともよばれるクラスに群分けされる。ヒト定常軽鎖は、カッパ（ＣΚ）およびラムダ（Ｃλ）軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）またはイプシロン（ε）として分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。よって、「アイソタイプ」は、本明細書で用いる場合、それらの定常領域の化学的および抗原的特徴により定義される免疫グロブリンのクラスおよび／またはサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）、ＩｇＧ２（ＩＧＨＧ２）、ＩｇＧ３（ＩＧＨＧ３）、ＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）、ＩｇＡ１（ＩＧＨＡ１）、ＩｇＡ２（ＩＧＨＡ２）、ＩｇＭ（ＩＧＨＭ）、ＩｇＤ（ＩＧＨＤ）およびＩｇＥ（ＩＧＨＥ）である。いわゆるヒト免疫グロブリン偽ガンマＩＧＨＧＰ遺伝子は、配列決定されているが、スイッチ領域の変更によりタンパク質をコードしないさらなるヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子を表す（Ｂｅｎｓｍａｎａ  Ｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６（７）：３１０８頁）。スイッチ領域が変更されているにもかかわらず、ヒト免疫グロブリン偽ガンマＩＧＨＧＰ遺伝子は、全ての重鎖定常ドメイン（ＣＨ１〜ＣＨ３）およびヒンジについてのオープンリーディングフレームを有する。その重鎖定常ドメインについての全てのオープンリーディングフレームは、予測される構造特徴を有する全てのヒト免疫グロブリン定常ドメインと良好に整列されるタンパク質ドメインをコードする。このさらなる偽ガンマアイソタイプは、本明細書において、ＩｇＧＰまたはＩＧＨＧＰという。ヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインイプシロンＰ１およびＰ２偽遺伝子（ＩＧＨＥＰ１およびＩＧＨＥＰ２）などの他の偽免疫グロブリン遺伝子が、報告されている。ＩｇＧクラスは、治療目的のために最も一般的に用いられている。ヒトにおいて、このクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。マウスにおいて、このクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３を含む。
【００２７】
用語「キメラ抗体」または「キメラ抗ＴｒｋＡ抗体」は、本明細書で用いる場合、可変領域配列がある種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を含む。
【００２８】
用語「ヒト化抗体」または「ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体」は、本明細書で用いる場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体を含む。さらなるフレームワーク領域改変を、ヒトフレームワーク配列内および別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列内で作製してよい。
【００２９】
用語「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」は、本明細書で用いる場合、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを含む。Ｆａｂは、単離されたこの領域または全長抗体もしくは抗体断片の関係におけるこの領域のことをいうことがある。
【００３０】
用語「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」は、本明細書で用いる場合、第１定常領域免疫グロブリンドメインを除外した抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。よって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインと、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインと、これらのドメインからＮ末端側にあるフレキシブルヒンジとのことをいう。ＩｇＡおよびＩｇＭについて、Ｆｃは、Ｊ鎖を含むことがある。ＩｇＧについて、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインであるＣγ２およびＣγ３と、ＣγｌとＣγ２との間のヒンジとを含む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、残基Ｃ２２６またはＰ２３０をそのカルボキシル末端に含むと通常定義される（番号付けはＥＵ番号付けシステムに従う）（Ｅｄｅｌｍａｎ  ＧＭら、（１９６９）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、６３（１）：７８〜８５頁）。ヒトＩｇＧ１について、Ｆｃ領域は、本明細書において、残基Ｐ２３２をそのカルボキシル末端に含むと定義される（番号付けはＥＵ番号付けシステムに従う）。Ｆｃは、単離されたこの領域またはＦｃポリペプチド、例えば抗体の関係におけるこの領域のことをいうことがある。
【００３１】
用語「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」は、本明細書において、抗体の第１定常ドメインと第２定常ドメインとの間のアミノ酸を含むフレキシブルポリペプチドを含む。「ヒンジ領域」は、本明細書で言及する場合、６〜６２アミノ酸長で、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧのみに存在し、２つの重鎖を橋かけするシステイン残基を包含する配列領域である。構造的には、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインは、ＥＵ位２２０にて終了し、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインは、ＥＵ位２３７の残基にて開始する。よって、ＩｇＧについて、抗体ヒンジは、本明細書において、２２１位（ＩｇＧ１におけるＤ２２１）〜２３１位（ＩｇＧ１におけるＡ２３１）を含むと定義される（番号付けはＥＵ番号付けシステムに従う）。
【００３２】
本明細書において同等に使用される用語「親抗体」、「親免疫グロブリン」、「親の抗体」、または「親の免疫グロブリン」には、バリアントを作製するために後で改変される未改変抗体が含まれる。前記親抗体は、天然抗体または天然抗体のバリアントもしくはその加工版であり得る。親抗体は、抗体自体、親抗体を含む組成物、または親抗体をコードするアミノ酸配列のことをいうことがある。「親のマウス抗体」または「対応する親のマウス抗体」は、本明細書で用いる場合、ヒトＴｒｋＡと結合する抗体または免疫グロブリンであって、バリアントを作製するために改変された抗体または免疫グロブリン、具体的にはＷＯ００／７３３４４に開示のマウス抗体ＭＮＡＣ１３を意味する。
【００３３】
用語「バリアント抗体」または「抗体バリアント」は、本明細書で用いる場合、親と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変により親抗体配列のものと異なる抗体配列を含む。バリアント抗体配列は、本明細書において、親抗体配列と好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。抗体バリアントは、抗体自体、抗体バリアントを含む組成物または抗体バリアントをコードするアミノ酸配列のことをいうことがある。
【００３４】
用語「アミノ酸改変」は、本明細書において、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含む。「アミノ酸置換」または「置換」は、本明細書において、親ポリペプチド配列中の特定の位置での別のアミノ酸へのアミノ酸の置き換えを意味する。例えば、置換Ｒ９４Ｋは、バリアントポリペプチド、この場合、９４位のアルギニンがリシンで置き換えられた重鎖可変フレームワーク領域バリアントのことをいう。前出の例について、９４Ｋは、９４位でのリシンへの置換を示す。本明細書における目的のために、複数の置換は、斜線により典型的に分けられる。例えば、Ｒ９４Ｋ／Ｌ７８Ｖは、置換Ｒ９４ＫおよびＬ７８Ｖを含む２重バリアントのことをいう。「アミノ酸挿入」または「挿入」は、本明細書で用いる場合、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、挿入−９４は、９４位での挿入を示す。「アミノ酸欠失」または「欠失」は、本明細書で用いる場合、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。例えば、Ｒ９４−は、９４位でのアルギニンの欠失を示す。
【００３５】
本明細書で用いる場合、用語「保存改変」または「保存配列改変」は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴に著しく影響しないかまたは前記特徴を著しく改変しないアミノ酸改変のことをいうことを意図する。このような保存改変は、アミノ酸置換、挿入および欠失を含む。改変は、本発明の抗体に、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野において知られる標準的な技術により導入できる。保存アミノ酸置換は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基でアミノ酸残基を置き換えるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。よって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内またはフレームワーク領域内の１または複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができ、変化した抗体（バリアント抗体）を、保持された機能について試験できる。
【００３６】
全てのヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインについて、番号付けは、「ＥＵ番号付けシステム」に従う（Ｅｄｅｌｍａｎ  ＧＭら、同著）。ヒトカッパ免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＩＧＫＣ）について、番号付けは、「ＥＵ番号付けシステム」に従う（Ｅｄｅｌｍａｎ  ＧＭら、同著）。ヒトラムダ免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６およびＩＧＬＣ７）について、番号付けは、Ｄａｒｉａｖａｃｈ  Ｐら、（１９８７）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８４（２４）：９０７４〜８頁およびＦｒａｎｇｉｏｎｅ  Ｂら、（１９８５）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８２（１０）：３４１５〜９頁により記載されるように、「Ｋａｂａｔ番号付けシステム」に従う（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第５版−ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ出版第９１−３２４２号）。
【００３７】
用語「可変ドメイン」は、抗原結合を媒介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義するドメインのことをいう。自然に存在する抗体では、抗原結合部位は、特異性を定義する２つの可変ドメイン（一方は本明細書において重鎖可変ドメイン（ＶＨ）という重鎖中にあり、他方は本明細書において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）という軽鎖中にある）からなる。いくつかの場合では、特異性は、ラクダにおいて見出される重鎖抗体からの単一ドメイン抗体のように、２つのドメインの一方のみにもっぱら帰することがある。Ｖ領域は、通常、約１１０アミノ酸長であり、７〜１７アミノ酸長の「超可変領域」とよばれる非常に可変性のより短い領域で分けられた、１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲまたは非ＣＤＲ領域）とよばれる比較的不変のアミノ酸配列の連続からなる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、ループを形成する３つの超可変領域により接続されたベータシート構造を全般的に採用する４つのＦＲを含む。各鎖中の超可変領域は、ＦＲにより接近して一緒にされ、他の鎖からの超可変領域と一緒に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、同著を参照されたい）。用語「超可変領域」は、本明細書で用いる場合、抗原結合を担う、抗体のアミノ酸残基のことをいう。超可変領域は、配列可変性が最高であり、かつ／または抗原認識に関与する「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を一般的に含む。全ての可変ドメインについて、番号付けは、Ｋａｂａｔに従う（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、同著）。
【００３８】
いくつかのＣＤＲ定義を本明細書において用い、包含する。Ｋａｂａｔ定義は、配列可変性に基づき、最も一般的に用いられる（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、同著）。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの場所に言及する（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁）。ＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ定義との間の折衷案であり、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより用いられている（Ｍａｒｔｉｎ  ＡＣＲら、（１９８９）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８６：９２６８〜９２７２頁；Ｍａｒｔｉｎ  ＡＣＲら、（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：１２１〜１５３頁；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ＪＴら、（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  １：１２６〜１３６頁；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  Ｍ．Ｊ．Ｅ．（編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１４１〜１７２頁中のＲｅｅｓ  ＡＲら、（１９９６））。接触による定義は最近導入され（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ＲＭら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２〜７４５頁）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋにおいて入手可能な、入手可能な複合体構造の分析に基づく。ＩＭＧＴ（登録商標）、すなわちｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）によるＣＤＲの定義は、全ての免疫グロブリンおよび全ての種のＴ細胞受容体Ｖ領域についてＩＭＧＴ番号付けに基づく（ＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰら、（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７（１）：２０９〜１２頁；Ｒｕｉｚ  Ｍら、（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（１）：２１９〜２１頁；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１）：２０７〜９頁；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１）：３０７〜１０頁；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰら、（２００５）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（３）：１８５〜２０３頁；Ｋａａｓ  Ｑら、（２００７）Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ＆Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、６（４）：２５３〜６４頁）。
【００３９】
本発明において言及される全ての相補性決定領域（ＣＤＲ）は、好ましくは以下のように定義される（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、既出による番号付け）：ＬＣＤＲ１：２４〜３４；ＬＣＤＲ２：５０〜５６；ＬＣＤＲ３：８９〜９８；ＨＣＤＲ１：２６〜３５；ＨＣＤＲ２：５０〜６５；およびＨＣＤＲ３：９５〜１０２。可変ドメインの「非ＣＤＲ領域」は、フレームワーク領域（ＦＲ）として公知である。ＶＬ領域の「非ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列１〜２３（ＦＲ１）、３５〜４９（ＦＲ２）、５７〜８８（ＦＲ３）、および９９〜１０７（ＦＲ４）を含む。ＶＨ領域の「非ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列１〜２５（ＦＲ１）、３６〜４９（ＦＲ２）、６６〜９４（ＦＲ３）、および１０３〜１１３（ＦＲ４）を含む。
【００４０】
用語「全長抗体」は、本明細書で用いる場合、可変および定常領域を含む抗体の自然の生物学的な形を構成する構造を含む。例えば、ヒトおよびマウスを含むほとんどの哺乳動物では、ＩｇＧクラスの全長抗体は、４量体であり、２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一の対からなり、各対は、１つの軽鎖および１つの重鎖を有し、各軽鎖は、免疫グロブリンドメインＶＬおよびＣＬを含み、各重鎖は、免疫グロブリンドメインＶＨ、ＣＨ１（Ｃγ１）、ＣＨ２（Ｃγ２）およびＣＨ３（Ｃγ３）を含む。いくつかの哺乳動物、例えばラクダおよびラマでは、ＩｇＧ抗体は、２つの重鎖のみからなることがあり、各重鎖は、Ｆｃ領域に付いた可変ドメインを含む。
【００４１】
抗体断片は、本明細書で用いる場合、抗原結合断片のことをいい、それらに限定されないが、（ｉ）Ｆａｂ'およびＦａｂ'−ＳＨを含む、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）単一可変ドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６頁）、（ｖ）２つの連結されたＦａｂ断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ'）２断片、（ｖｉ）ＶＨドメインとＶＬドメインとが、２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成できるようにするペプチドリンカーで連結された単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３〜４２６頁；Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３頁）、（ｖｉｉ）２重特異性単鎖Ｆｖ２量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、（ｖｉｉｉ）遺伝子融合により構築された多価または多重特異性断片である「ダイアボディ」または「トリアボディ」（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  Ｉら、（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１〜４７９頁；ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、（１９９３）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８頁）および（ｉｘ）同じまたは異なる抗体と遺伝子的に融合されたｓｃＦｖ（ＣｏｌｏｍａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１５９〜１６３頁）を含む。
【００４２】
用語「エフェクター機能」は、本明細書で用いる場合、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用に起因する生化学的事象を含む。エフェクター機能は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用）およびＡＤＣＰ（抗体依存性細胞媒介性食作用）などのＦｃγＲ媒介性エフェクター機能、ならびにＣＤＣ（補体依存性細胞傷害作用）などの補体媒介性エフェクター機能を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ受容体または補体成分などのエフェクター分子についての抗体の親和性を変更、すなわち増進または低減、好ましくは増進することにより変更できる。結合親和性は、エフェクター分子結合部位を改変することにより一般的に変動され、この場合、対象の部位を置き、前記部位の少なくとも一部を適切な方法で改変することが適当である。エフェクター分子についての抗体の結合部位における変更は、全体的な結合親和性を著しく変更する必要はないが、相互作用の幾何学的配置を変更して、非生産的結合におけるようにエフェクター機序を無効にすることも構想される。エフェクター分子結合に直接関与しないがエフェクター機能の性能に関与する部位を改変することにより、エフェクター機能を変更することもさらに構想される。抗体のエフェクター機能を変更することにより、免疫応答の様々な態様を制御すること、例えば免疫系の様々な反応を増進または抑制することが可能になり、診断および治療において有益な効果を有する可能性がある。
【００４３】
本明細書で用いる場合、用語「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。好ましくは、対象はヒトである。
【００４４】
本発明の抗体
第１の態様では、本発明は、
ａ）配列番号１〜５からなる群から選択される配列を含む重鎖可変ドメイン、および
ｂ）配列番号６〜１３からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含むヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片であって、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２が、少なくとも１個のアミノ酸置換を含み、かつ／または重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域が、３７、４２、および８９からなる群から選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、各群のメンバーのアミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示されるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片を提供する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域は、３７、４２、および８９からなる群から選択されるアミノ酸位置に保存的アミノ酸置換を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２は、配列番号１５の配列を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１、３、および５からなる群から選択される配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号６および８からなる群から選択される配列を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、配列番号１および配列番号６、配列番号３および配列番号６、配列番号３および配列番号８、配列番号５および配列番号６、ならびに配列番号５および配列番号８からなる群から選択される配列；好ましくは配列番号５および配列番号６の配列または配列番号５および配列番号８の配列；より好ましくは配列番号５および配列番号６の配列を含む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの組み合わせを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本開示によって提供されるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片の重鎖可変ドメインは、配列番号７１の配列を含まない。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本開示によって提供されるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片の重鎖可変ドメインは、位置８７にセリンを欠如し、各群のメンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本開示によって提供されるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片の重鎖可変ドメインは、位置８７にトレオニンを含み、各群のメンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される。
【００５３】
いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２のアミノ酸置換は、５０、６０、および６２からなる群から選択される、好ましくは６０および６２からなる群から選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、各群のメンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２のアミノ酸置換は、Ｙ５０Ａ、Ｐ６０Ａ、およびＴ６２Ｓからなる群から選択されるアミノ酸置換を含まず、各群のメンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域におけるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体または断片のアミノ酸置換がＡ４９Ｓである場合、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２におけるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体または断片のアミノ酸置換は、Ｙ５０Ａではない。
【００５６】
いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域におけるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体または断片のアミノ酸置換はＡ４９Ｓではなく、かつ／または重鎖可変ドメインのＣＤＲ２におけるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体または断片のアミノ酸置換はＹ５０Ａではない。
【００５７】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換は、Ｖ３７Ａ、Ｇ４２Ｅ、およびＶ８９Ｌからなる群から選択されるアミノ酸置換、好ましくはＶ３７Ａを含み、アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３の配列を含む重鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換は、Ｖ３７Ａ、Ｔ４０Ａ、Ｇ４２Ｅ、Ｒ４４Ｇ、Ａ４９Ｓ、およびＶ８９Ｌからなる群から選択される、好ましくはＶ３７Ａ、Ｔ４０Ａ、Ｇ４２Ｅ、Ｒ４４Ｇ、およびＶ８９Ｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を含み、各群のメンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される。
【００５９】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３および配列番号６の配列を含む、または配列番号３および配列番号８の配列を含む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの組み合わせを含み、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換は、Ｖ３７Ａ、Ｔ４０Ａ、Ｇ４２Ｅ、Ｒ４４Ｇ、Ａ４９Ｓ、およびＶ８９Ｌからなる群から選択される、好ましくはＶ３７Ａ、Ｔ４０Ａ、Ｇ４２Ｅ、Ｒ４４Ｇ、およびＶ８９Ｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を含み、各群のメンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換は、Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ、Ｇ４２Ｅ、Ａ４９Ｓ、Ｖ８９Ｌ、およびＲ９４Ｋからなる群から選択される、好ましくはＫ３Ｑ、Ｖ３７Ａ、Ｇ４２Ｅ、Ｖ８９Ｌ、およびＲ９４Ｋからなる群から選択されるアミノ酸置換を含み、より好ましくはアミノ酸置換Ｋ３ＱおよびＶ３７Ａを含み、最も好ましくはアミノ酸置換Ｖ３７Ａを含み、各群のメンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される。等しく最も好ましいのは、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換が、Ｖ３７ＡおよびＫ３Ｑ、Ｖ３７Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む実施形態であり、各群のメンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５の配列を含む重鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換は、Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ、Ｇ４２Ｅ、Ａ４９Ｓ、Ｖ８９Ｌ、およびＲ９４Ｋからなる群から選択される、好ましくはＫ３Ｑ、Ｖ３７Ａ、Ｇ４２Ｅ、Ｖ８９Ｌ、およびＲ９４Ｋからなる群から選択されるアミノ酸置換を含み、より好ましくはアミノ酸置換Ｋ３ＱおよびＶ３７Ａを含み、最も好ましくはアミノ酸置換Ｖ３７Ａを含み、各群のメンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される。等しく最も好ましくは、抗体が配列番号５の配列を含む重鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換が、Ｖ３７Ａ、およびＫ３Ｑ、Ｖ３７Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む実施形態であり、各群のメンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載される番号付けシステムを利用して示される。
【００６２】
さらなる態様では、本発明は、
ａ）配列番号３１〜４９からなる群から選択される配列を含む重鎖可変ドメイン、および
ｂ）配列番号６〜１３からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含むヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片を提供する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、
ａ）配列番号３２、３６、３９、４３、４８、および４９からなる群から選択される配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに
ｂ）配列番号６〜１３からなる群から選択される、または配列番号６および８からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、
ａ）配列番号３２、３６、４８、および４９からなる群から選択される配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに
ｂ）配列番号６または配列番号８の配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、
ａ）配列番号３２および３６からなる群から選択される配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに
ｂ）配列番号６の配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、
ａ）配列番号３６の配列を含む重鎖可変ドメイン、および
ｂ）配列番号６の配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体は、配列番号３２および配列番号６、配列番号３２および配列番号８、配列番号３６および配列番号６、配列番号４８および配列番号６、配列番号４９および配列番号６、ならびに配列番号４９および配列番号８の配列を含む群から選択される、好ましくは配列番号３２および配列番号６、配列番号３２および配列番号８、配列番号３６および配列番号６、配列番号４９および配列番号６、ならびに配列番号４９および配列番号８の配列を含む群から選択される、最も好ましくは配列番号３６および配列番号６の配列の組み合わせから選択される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの組み合わせを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、重鎖および／または軽鎖定常領域、好ましくは重鎖および／または軽鎖定常領域ならびにヒンジ領域をさらに含む。好ましくは、重鎖定常領域はヒト起源、例えばヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧｌ）、ＩｇＧ２（ＩＧＨＧ２）、ＩｇＧ３（ＩＧＨＧ３）、ＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）、ＩｇＡ１（ＩＧＨＡ１）、ＩｇＡ２（ＩＧＨＡ２）、ＩｇＭ（ＩＧＨＭ）、ＩｇＤ（ＩＧＨＤ）、またはＩｇＥ（ＩＧＨＥ）アイソタイプである。より好ましくは、重鎖定常領域は、ヒトＩＧＨＧ１アイソタイプまたはヒトＩＧＨＧ４アイソタイプである。好ましくは、軽鎖定常領域は、ヒト起源であり、ヒトκ（ＣＫ）またはヒトλ（Ｃλ）軽鎖定常ドメイン、好ましくはヒトκ軽鎖定常ドメインである。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、重鎖および／または軽鎖定常領域ならびにヒンジ領域をさらに含み、重鎖定常領域およびヒンジ領域は、ヒトＩＧＨＧ１アイソタイプまたはヒトＩＧＨＧ４アイソタイプである。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、重鎖および／または軽鎖定常領域ならびにヒンジ領域をさらに含み、重鎖定常領域およびヒンジ領域は、ヒトＩＧＨＧ４アイソタイプであり、ヒンジ領域は、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含み、アミノ酸位置は、ＥＵ番号付けシステムを利用して示される。
【００７１】
さらなる態様では、本発明は、
ａ）配列番号５０〜７０からなる群から選択される配列を含む重鎖、ならびに
ｂ）配列番号２９および３０からなる群から選択される配列を含む軽鎖
を含むヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片を提供する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、
ａ）配列番号５１、５２、５６、５７、６０、６４、６９、および７０からなる群から選択される配列を含む重鎖、ならびに
ｂ）配列番号２９および３０、好ましくは配列番号２９からなる群から選択される配列を含む軽鎖
を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、
ａ）配列番号５１、５２、５６、５７、６９、および７０からなる群から選択される配列を含む重鎖、ならびに
ｂ）配列番号２９および３０、好ましくは配列番号２９からなる群から選択される配列を含む軽鎖
を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、
ａ）配列番号５１、５２、５６、５７、および７０からなる群から選択される配列を含む重鎖、ならびに
ｂ）配列番号２９および３０、好ましくは配列番号２９からなる群から選択される配列を含む軽鎖
を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、
ａ）配列番号５１、５２、５６、および５７からなる群から選択される配列を含む重鎖、ならびに
ｂ）配列番号２９および３０、好ましくは配列番号２９からなる群から選択される配列を含む軽鎖
を含む。
【００７６】
好ましい実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、
ａ）配列番号５７の配列を含む重鎖、および
ｂ）配列番号２９の配列を含む軽鎖
を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、全長抗体である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'−ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ'）２、ｓｃＦｖ、２重特異性単鎖Ｆｖ二量体、ダイアボディ、トリアボディ、および同じまたは異なる抗体と遺伝子的に融合したｓｃＦｖからなる群から選択される抗体断片；好ましくはｓｃＦｖまたはＦａｂ；より好ましくはｓｃＦｖ二量体またはダイアボディまたはＦ（ａｂ'）2である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、親抗体のＦｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸改変を含むバリアントＦｃ領域を含み、バリアントＦｃ領域を含む抗体は、親抗体と比較して変化したエフェクター機能を示す。
【００８０】
Ｆｃ領域内のアミノ酸改変は、概して、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体もしくはリガンド結合に関係するエフェクター機能、および／または抗原依存性細胞性細胞傷害作用などの抗体の１つまたは複数の機能的特性を変化させる。下に概略を述べるようなＦｃ領域内の改変は、Ｆｃ領域中の残基のＥＵ番号付けによる。一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の番号が変化するように、例えば増加または減少するように改変される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらによって米国特許第５，６７７，４２５号にさらに説明されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば軽鎖および重鎖の集合を促進するように、または抗体の安定性を増大もしくは減少するように改変される。別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるように突然変異誘発される。より具体的には、抗体が天然Ｆｃ−ヒンジドメインのブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合性に比べてＳｐＡ結合性の障害を有するように、１つまたは複数のアミノ酸突然変異がＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入される。このアプローチは、Ｗａｒｄらによって米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に説明されている。別の実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を増大するように改変される。様々なアプローチが可能である。例えば、以下の突然変異の１つまたは複数を導入することができる：Ｗａｒｄの米国特許第６，２７７，３７５号に記載のＴ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、Ｐｒｅｓｔａらによって米国特許第５，８６９，０４６号および同第６，１２１，０２２号に記載されているように、生物学的半減期を増大するために、抗体をＣＨ１またはＣＬ領域内で変化させて、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採用されたサルベージ受容体結合エピトープを含ませることができる。さらなる実施形態では、抗体の（１つまたは複数の）エフェクター機能を変化させるために、Ｆｃ領域が、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置換することによって変化される。例えば、抗体がエフェクターリガンドに対して変化した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０、および３２２から選択される１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基に置換することができる。それに対する親和性が変化されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体Ｃ１成分であり得る。このアプローチは、米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号に、どちらもＷｉｎｔｅｒらによってさらに詳細に記載されている。別の例では、抗体がＣ１ｑ結合性の変化および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の低減もしくは消失を有するように、アミノ酸残基３２９、３３１、および３２２から選択される１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基に置換することができる。このアプローチは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによって米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。別の例では、ＣＨ２ドメインのＮ末端領域中のアミノ酸位置２３１〜２３８内の１つまたは複数のアミノ酸残基が変化され、それによって抗体が補体を結合させる能力が変化される。このアプローチは、さらにＢｏｄｍｅｒらによってＰＣＴ公報ＷＯ９４／２９３５１に記載されている。なお別の例では、抗体が抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を増大するように、および／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増大するように、以下の位置で１つまたは複数のアミノ酸を改変することによってＦｃ領域が改変される：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８、または４３９。このアプローチは、ＰｒｅｓｔａによってＰＣＴ公報ＷＯ００／４２０７２にさらに記載されている。さらに、本発明の抗体は、化学的に改変しても（例えば、１つまたは複数の化学的部分を抗体に結合させることができる）、またはそのグリコシル化を変化させるように改変してもよい。
【００８１】
本発明の抗体の特性
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、ＴｒｋＡの機能的活性化を阻害する能力がある。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体は、ＴｒｋＡの１つまたは複数の生物活性を遮断または低減する能力がある。
【００８３】
いくつかの実施形態では、例えばＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）または当技術分野において公知の同等の装置を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、分析物として組換え一価ヒトＴｒｋＡ細胞外ドメイン（配列番号２５）を使用して装置のセンサチップ上に抗体を捕捉することによって測定するとき、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、５００ｎＭ以下、好ましくは３５０ｎＭ以下、より好ましくは１５０ｎＭ以下、いっそうより好ましくは１００ｎＭ以下、最も好ましくは５０ｎＭ以下、特に３０ｎＭ以下の親和性（ＫD）でヒトＴｒｋＡに結合する。ＴｒｋＡ受容体を使用する親和性測定に関して「一価」は、本明細書で用いる場合、ヒトＴｒｋＡ受容体ドメインであって、例えばそのドメインのアミノ末端が免疫グロブリンＦｃ部分と融合すると受けるような人工的な二量体化も多量体化もされていない、または例えばそのドメインがその天然リガンドＮＧＦと結合すると受けるような自然二量体化がされていない、ヒトＴｒｋＡ細胞外ドメインのようなヒトＴｒｋＡ受容体ドメインのことをいう。
【００８４】
例えばＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー分析を含む、例えばヒトＴｒｋＡに対する抗体の結合能を評価するための標準アッセイは、当技術分野において公知である。適切なアッセイは、実施例に詳細に記載されている。抗体の結合動態（例えばＫDのような結合親和性）は、ＳｃａｔｃｈａｒｄまたはＢｉａｃｏｒｅ（商標）システム分析などによる、当技術分野において公知の標準アッセイによっても判定することができる。相対結合親和性Ｋiは、当技術分野において公知の標準競合アッセイによって判定することができる。加工抗ＴｒｋＡ抗体がＴｒｋＡの機能的活性化を阻害する能力について、その抗体をＴＦ−１細胞増殖アッセイでアッセイすることができる。化合物が生物学的機能を阻害する有効性の尺度である最大半値阻害濃度（ＩＣ５０）を、好ましい抗体を選択するために使用することができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、ＴＦ−１細胞増殖アッセイで、例えば、因子依存性ヒト赤白血病細胞系ＴＦ−１（Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔら、（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １４０（２）：３２３〜３４）を使用して抗体が細胞表面ＴｒｋＡ／β−ＮＧＦ媒介性細胞増殖を遮断する能力によって測定するとき、少なくとも対応する親のマウス抗体以下のＩＣ５０を有する。好ましくは、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、ＴＦ−１細胞増殖アッセイで１μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは０．７５μｇ／ｍｌ、いっそうより好ましくは０．５μｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは０．３μｇ／ｍｌ以下、特に０．１μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０を有する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片は、６５℃よりも高い、好ましくは７０℃よりも高いＦＡＢ断片熱安定性温度を有する。ＦＡＢ断片の熱安定性の分析のために、示差走査熱量測定が用いられ、一方で全長ＩｇＧの状況でＦＡＢ断片の中点融解温度が確認される。これらの種類の熱量測定は、当業者に公知であり、例えばＧａｒｂｅｒおよびＤｅｍａｒｅｓｔ（２００７）ＢＢＲＣ  ３５５：７５１〜７にしたがって実施することができる。驚くことに、本発明のヒト化抗体は、親のマウス抗体のＦＡＢ断片熱安定性温度と同等のＦＡＢ断片熱安定性温度を有するが、ＳＰＲによって測定したとき同等の親和性およびＴＦ−１細胞増殖アッセイによって測定したとき向上した効力を有することが見いだされた。したがって本開示は、また、親のマウス抗体のＦＡＢ断片熱安定性温度と同等のＦＡＢ断片熱安定性温度を有し、ヒトＴｒｋＡに対して同等の親和性および向上した阻害特性を有するヒト化抗ＴｒｋＡ抗体を提供する。
【００８７】
これに関連して本明細書で用いる場合、「親のマウス抗体のＦＡＢ断片熱安定性温度と同等の」は、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片が、親のマウス抗体のＦＡＢ断片熱安定性温度の±２０％の範囲内、好ましくは±１５％の範囲内、より好ましくは±１０％の範囲内、いっそうより好ましくは±５％の範囲内のＦＡＢ断片熱安定性温度を有することを意味する。好ましくは、本発明のヒト化抗体は、親のマウス抗体のＦＡＢ断片熱安定性温度からの低下が１５％以内のＦＡＢ断片熱安定性温度を有する。
【００８８】
これに関連して本明細書で用いる場合、「ヒトＴｒｋＡに対して同等の親和性」は、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片が、親のマウス抗体の±２０％の範囲内、好ましくは±１５％の範囲内、より好ましくは±１０％の範囲内の親和性を有することを意味する。好ましくは、本発明のヒト化抗体は、親のマウス抗体のＫDよりも少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％低いＫDを有する。
【００８９】
本発明は、また、疼痛を処置するために使用することができるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片を提供する。
【００９０】
ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の効果は、後足へのフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）の足底内注射によって誘導された急性炎症性痛覚過敏を患うマウスで試験された（実施例２参照）。０．０１ｍｇ／ｋｇ以上の用量のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の投与は、痛覚過敏の顕著な反転を生じ、それは、ＮＳＡＩＤであるインドメタシンで観察されたものに類似していた。
【００９１】
ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の効果は、膝関節へのＣＦＡの関節内注射によって誘導された慢性炎症性痛覚過敏を患うマウスで試験された（実施例３参照）。用量０．０１ｍｇ／ｋｇ以上のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の単回投与は、痛覚過敏の顕著な反転を生じ、それは、ＣＯＸ−２選択的ＮＳＡＩＤであるセレコキシブの反復投与で観察されたものに匹敵した。
【００９２】
ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の効果は、膝関節へのヨード酢酸一ナトリウム（ＭＩＡ）の関節内注射によって誘導された慢性変形性関節症性痛覚過敏を患うマウスで試験された（実施例４参照）。用量０．０１ｍｇ／ｋｇ以上のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の単回投与は、痛覚過敏の顕著な反転を生じ、それは、オピエートであるラマドールおよびプレガバリンの反復投与で観察されたものに匹敵した。
【００９３】
ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の効果は、坐骨神経の慢性絞扼によって誘導された神経障害性疼痛を患うマウスで試験された（ＣＣＩモデル；実施例５参照）。用量０．０１ｍｇ／ｋｇ以上のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の単回投与は、機械的痛覚過敏および寒冷異痛の顕著な反転を生じ、それは、試験した最高用量１ｍｇ／ｋｇにおいて、プレガバリンの反復投与で観察されたものに匹敵した。
【００９４】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、急性炎症性疼痛、慢性炎症性疼痛、変形性関節症性疼痛、および／または神経障害性疼痛を患う患者の処置のためのヒト化抗ＴｒｋＡ抗体を提供する。
【００９５】
核酸、ベクターおよび宿主細胞
本開示は、また、抗ＴｒｋＡ抗体およびその断片をコードする単離核酸、ベクター、ならびに核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。核酸は、細胞全体中に、細胞溶解物中に、または部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知のその他を含む標準技法によって他の細胞成分または他の混入物、例えば他の細胞性核酸またはタンパク質から精製されたときに、「単離」または「実質的に純粋に」されている。例えばＡｕｓｕｂｅｌ  Ｆら著（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇおよびＷｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。本発明の核酸は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの場合があり、イントロン配列を含んでも、または含まなくてもよい。好ましい実施形態では、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【００９６】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学的技法を用いて得ることができ、例えば抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡまたはＶＨおよびＶＬセグメントをコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技法によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えばファージディスプレイ技法を用いて）得られた抗体について、抗体をコードする１つまたは複数の核酸は、ライブラリーから回収することができる。宿主細胞に外因性核酸を導入する方法は、当技術分野において周知であり、使用される宿主細胞により様々である。技法には、非限定的に、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、塩化カルシウム処理、ポリエチレンイミン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルスまたはファージ感染、リポソーム中への（１種または複数の）ポリヌクレオチドの封入、および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが含まれる。哺乳動物細胞の場合、トランスフェクションは、一過性または安定的のいずれかであり得る。
【００９７】
いくつかの実施形態では、抗ＴｒｋＡ抗体およびその断片をコードする単離核酸は、配列番号７３〜１１６からなる群から選択される核酸配列を含み、通常、核酸分子は、配列番号１１３、１１４、１１５、および１１６からなる群から選択される軽鎖可変領域もしくは軽鎖、ならびに／または配列番号７３〜１１２からなる群から選択される重鎖可変領域もしくは重鎖をコードする。
【００９８】
本発明の好ましい核酸分子は、配列番号１１３および１１４からなる群から選択される軽鎖可変領域、ならびに／または配列番号７４、７８、８１、８５、９０、および９１からなる群から選択される重鎖可変領域をコードする核酸分子である。より好ましいのは、配列番号７４および７８からなる群から選択される重鎖可変領域をコードする、かつ／または配列番号１１３および１１４からなる群から選択される軽鎖可変領域をコードする核酸分子である。最も好ましいのは、配列番号７４もしくは７８の核酸配列を含む重鎖可変領域をコードする、かつ／または配列番号１１３の核酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸分子である。
【００９９】
本発明のさらに好ましい核酸分子は、配列番号１１５および１１６からなる群から選択される軽鎖、ならびに／または配列番号９３、９４、９８、９９、１０２、１０６、１１１、および１１２からなる群から選択される重鎖をコードする核酸分子である。より好ましいのは、配列番号９３、９４、９８、および９９の核酸配列を含む重鎖をコードする、かつ／または配列番号１１５および１１６からなる群から選択される軽鎖をコードする核酸分子である。最も好ましいのは、配列番号９３、９４、９８、および９９の核酸配列を含む重鎖をコードする、かつ／または配列番号１１５の核酸配列を含む軽鎖をコードする核酸分子である。
【０１００】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られた後、これらのＤＮＡ断片をさらに標準組換えＤＮＡ技法により操作して、例えば可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、上記断片に対応する断片遺伝子、例えばＦａｂ断片遺伝子などに、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域または可動性リンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結している。これに関連して使用される用語「作動可能に連結する」は、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がフレーム内であり続けるように、その２つのＤＮＡ断片が結合されることを意味することを意図する。ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において公知であり（例えばＫａｂａｔ、ＥＡら、既出参照）およびこれらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくはＩｇＧ４定常領域であり、好ましくはヒンジ領域がアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むヒトＩＧＨＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子について、ＤＮＡをコードするＶＨは、重鎖ＣＨ１定常領域だけをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することができる。ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において公知であり（例えばＫａｂａｔ  ＥＡら、既出参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅によって得ることができる。好ましい実施形態では、軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域、好ましくはκ定常領域であり得る。ｓｃＦｖ遺伝子を創出するために、ＶＨをコードするＤＮＡ断片およびＶＬをコードするＤＮＡ断片が、可動性リンカー、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結し、それにより、ＶＬおよびＶＨ領域が可動性リンカーによって結合された連続する単鎖タンパク質としてＶＨおよびＶＬ配列を発現することができる（例えば、Ｂｉｒｄら、既出；Ｈｕｓｔｏｎら、既出；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４参照）。抗体の抗体断片の産生のために様々な技法が開発されている。伝統的に、これらの断片は、無傷抗体のタンパク質分解消化を経て得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４：１０７〜１１７およびＢｒｅｎｎａｎら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１参照）。しかし、これらの断片は、今や組換え宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上述の抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ'−ＳＨ断片をＥ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的にカップリングさせてＦ（ａｂ'）2断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら、（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６３〜１６７）。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ'）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片の産生のための他の技法は、当業者に明らかであろう。他の実施形態では、えり抜きの抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。例えばＷ０９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号および同第５，５８７，４５８号を参照されたい。例えば、抗体断片は、米国特許第５，６４１，８７０号に記載の「線状抗体」でもあり得る。
【０１０１】
タンパク質を発現させるために、本発明の抗体をコードする核酸は、ベクター、好ましくは発現ベクターに組み込むことができる。多様な発現ベクターをタンパク質発現のために利用することができる。発現ベクターは、自己複製する染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターを含み得る。発現ベクターは、宿主細胞型と適合するように構築される。したがって、本発明に用途を見いだすベクター、好ましくは発現ベクターには、非限定的に、哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞、酵母、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ系でのタンパク質発現を可能にするベクターが含まれる。当技術分野において公知のように、商業的またはその他の方法で多様な発現ベクターが入手可能であり、それらのベクターは、抗体の発現のために本発明において用途を見いだすことができる。
【０１０２】
発現ベクターは、概して、制御もしくは調節配列、選択マーカー、任意の融合パートナー、および／または追加的なエレメントと作動可能に連結したタンパク質を含む。本明細書における「作動可能に連結した」は、核酸が別の核酸配列との機能的関係に置かれることを意味する。用語「調節配列」には、プロモーター、エンハンサー、および抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）が含まれることが意図される。そのような調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０））に記載されている。一般に、これらの発現ベクターは、抗体をコードする核酸に作動可能に連結した転写および翻訳調節核酸を含み、概してタンパク質を発現させるために使用される宿主細胞に適している。一般に、転写および翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が含まれ得る。同じく当技術分野において公知のように、発現ベクターは、概して発現ベクターを含有する形質転換宿主細胞の選択を可能にする選択遺伝子またはマーカーを含有する。選択遺伝子は、当技術分野において周知であり、使用される宿主細胞により様々である。例えば、概して選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞にメトトレキサート選択／増幅を行って使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が含まれる。
【０１０３】
本明細書におけるベクターでＤＮＡをクローニングまたは発現するために適切な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞、または高等真核細胞である。この目的に適切な原核生物には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物を含む真正細菌、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えばＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、およびＳｈｉｇｅｌｌａなどの腸内細菌科、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが含まれる。適切なＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＩ７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）が含まれる。
【０１０４】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物が、適切なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは一般的なパン酵母は、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用される。本発明の組換え抗体を発現するための宿主細胞は、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７７：４２１６〜４２２０に記載されたｄｈｆｒ-ＣＨＯ細胞など、例えばＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１〜６２１に記載のＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用される）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２細胞、およびＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞（ＡＴＣＣ（商標）カタログ番号ＣＲＬ−１０８５２）が含まれる哺乳動物宿主細胞である。特に、ＮＳ０骨髄腫細胞と共に使用するための別の好ましい発現系は、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６、およびＥＰ０３３８８４１に開示されたＧＳ遺伝子発現系である。
【０１０５】
抗体の構築および産生
ＴｒｋＡポリペプチドに対して作製された抗体は、周知で日常的なプロトコールを用いて、動物を免疫処置することによって、すなわち動物、好ましくは非ヒト動物にポリペプチドを投与することによって、得ることができる。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｅｉｒ  ＤＭ（著）、第４巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８６）を参照されたい。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ、またはブタなどの多数の温血動物を免疫処置することができる。しかし、マウス、ウサギ、ブタ、およびラット、特にマウスが、一般に最も適切である。同様に抗体は、当業者に公知の組換えＤＮＡ技法によって産生することができる。加えて抗体は、天然抗体の酵素的または化学的切断によって産生することができる。本発明のヒト化抗体は、非ヒト動物（例えばマウス）由来のＶＨおよび／またはＶＬ領域からヒトＶＨおよび／またはＶＬ領域由来の１つまたは複数のフレームワーク領域に１つまたは複数のＣＤＲまたはその部分を転移することによって構築することができる。好ましくは、本発明のヒト化抗体は、ＷＯ００／７３３４４に開示のマウスＭＮＡＣ１３抗体由来のＶＨおよび／またはＶＬ領域からヒトＶＨおよび／またはＶＬ領域由来の１つまたは複数のフレームワーク領域に１つまたは複数のＣＤＲまたはその部分を転移することによって構築される。場合によっては、必要なとき、または抗体の免疫原性を減少および／もしくは結合親和性を維持したいと望むとき、ＶＨおよび／またはＶＬ領域中に存在するヒトフレームワーク残基を対応する非ヒト（例えばマウス）残基によって置換することができる。場合により、ＣＤＲに存在する非ヒトアミノ酸残基を、ヒト残基と置換することができる。本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体は、上記のように調製された非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づき調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを、関心がもたれる非ヒトハイブリドーマから得て、標準的な分子生物学的技法を用いて非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を含むように加工することができる。例えば、キメラ抗体を創出するために、当技術分野で公知の方法を用いて、マウス可変領域をヒト定常領域に連結することができる（例えばＣａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号参照）。ヒト化抗体を創出するために、当技術分野において公知の方法を用いて、マウスＣＤＲ領域をヒトフレームワークに挿入することができる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号参照）。
【０１０６】
重鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子が、潜在的アクセプター分子可変領域とマウス抗体の重鎖可変領域との間の相同性の考慮に基づき選択される本発明のヒト化抗体を構築することができる。潜在的な免疫原性を低減するために、生殖細胞系候補ヒトアクセプター分子が好ましい。生殖細胞系データベースは、重鎖ＦＷ３領域の末端を通って部分的にＣＤＲ３配列まで読み取る抗体配列から構成されている。ＦＷ４領域の選択のために、選択された生殖細胞系分子から得られた成熟抗体配列のデータベースを検索することができ、またはヒトドナーから選択された生殖細胞系分子から得られた抗体配列を使用することができる。ヒトアクセプター分子は、好ましくはマウスドナー分子と同じ重鎖クラスから選択され、マウスドナー分子の可変領域の同じカノニカル構造クラスである。重鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子を選択するための二次的考慮には、マウスドナー分子とヒトアクセプター分子との間のＣＤＲ長における相同性が含まれる。ヒトアクセプター抗体分子は、好ましくはＶ−ＢＡＳＥデータベースへの相同性検索によって選択されるが、Ｋａｂａｔおよび公的ＮＣＢＩデータベースなどの他のデータベースも同様に使用することができる。
【０１０７】
軽鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子が、潜在的アクセプター分子可変領域とマウス抗体の軽鎖可変領域との間の相同性の考慮に基づき選択される、本発明のヒト化抗体を構築することができる。潜在的な免疫原性を低減するために、生殖細胞系候補ヒトアクセプター分子が好ましい。生殖細胞系データベースは、重鎖ＦＷ３領域の末端を通って部分的にＣＤＲ３配列まで読み取る抗体配列から構成されている。ＦＷ４領域の選択のために、選択された生殖細胞系分子から得られた成熟抗体配列のデータベースを検索することができ、またはヒトドナーから選択された生殖細胞系分子から得られた抗体配列を使用することができる。ヒトアクセプター分子は、好ましくはマウスドナー分子と同じ軽鎖クラスから選択され、マウスドナー分子の可変領域の同じカノニカル構造クラスである。軽鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子を選択するための二次的考慮には、マウスドナー分子とヒトアクセプター分子との間のＣＤＲ長における相同性が含まれる。ヒトアクセプター抗体分子は、好ましくはＶ−ＢＡＳＥデータベースへの相同性検索によって選択されるが、Ｋａｂａｔおよび公的ＮＣＢＩデータベースなどの他のデータベースも同様に使用することができる。
【０１０８】
抗体が、例えば哺乳動物宿主細胞に遺伝子を導入することによって組換え抗体として産生される場合、その抗体は、宿主細胞中での抗体の発現またはより好ましくは宿主細胞が成長される培養培地中への抗体の分泌を可能にするために十分な時間、宿主細胞を培養することによって産生される。ヒトＴｒｋＡに結合する抗体を産生するために有用な宿主細胞は、多様な培地中で培養することができる。ＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、最小必須培地（ＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ２９３、ＨＥＫ２９３無血清培地（Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）などの市販培地が宿主細胞の培養に適している。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培養培地から回収することができる。
【０１０９】
発現されたタンパク質のターゲティング、精製、スクリーニング、ディスプレイなどを可能にするために、抗体を融合パートナーと作動可能に連結してもよい。融合パートナーは、リンカー配列を介して抗体配列に連結してもよい。リンカー配列は、一般に、少数のアミノ酸、概して１０個未満を含むが、より長いリンカーも使用することができる。概して、リンカー配列は、可動性および分解抵抗性であるように選択される。当業者によって理解されるように、多種多様な配列のうち任意の配列をリンカーとして使用することができる。例えば、一般的リンカー配列は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳを含む。融合パートナーは、抗体および任意の関連する融合パートナーを所望の細胞位置または細胞外媒質に方向づけるターゲティング配列またはシグナル配列であり得る。当技術分野において公知のように、ある種のシグナル伝達配列は、タンパク質が成長培地中または細胞内膜と外膜の間に位置するペリプラズム間隙中のいずれかに分泌されるようにターゲティングすることができる。融合パートナーは、また、精製および／またはスクリーニングを可能にするペプチドまたはタンパク質をコードする配列であり得る。そのような融合パートナーには、非限定的に、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）（例えばＨ６およびＨ１０または固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）システム（例えばＮｉ2+アフィニティーカラム）で使用するための他のタグ）、ＧＳＴ融合体、ＭＢＰ融合体、Ｓｔｒｅｐタグ、細菌酵素ＢｉｒＡのＢＳＰビオチン化ターゲット配列、および抗体によってターゲティングされるエピトープタグ（例えばｃ−ｍｙｃタグ、ｆｌａｇタグなど）が含まれる。当業者によって理解されるように、そのようなタグは、精製、スクリーニング、またはその両方に有用であり得る。
【０１１０】
抗ＴｒｋＡ抗体の特徴づけおよび精製
抗体のスクリーニングは、ヒトＴｒｋＡへの結合性を測定するアッセイおよび／またはＴｒｋＡからそのリガンドＮＧＦへの結合を遮断する能力を測定するアッセイを用いて行うことができる。結合アッセイの一例はＥＬＩＳＡである。加えて、例えば実施例で用いられる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析は、抗体の結合動態についての結合速度定数および解離速度定数を測定するために適用することができる。ブロッキングアッセイの一例は、ＴｒｋＡへのＮＧＦ結合の遮断を測定するフローサイトメトリーに基づくアッセイである。抗ＴｒｋＡ抗体の機能的活性を評価するためのアッセイとして、例えば、抗体が細胞表面ＴｒｋＡ／β−ＮＧＦ媒介性細胞増殖を遮断する能力が因子依存性ヒト赤白血病細胞系ＴＦ−１を使用してアッセイされるＴＦ−１細胞増殖アッセイを用いることができる（Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔら、（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １４０（２）：３２３〜３４）。
【０１１１】
本発明の抗体は、当業者に公知の多様な方法で単離または精製することができる。標準的な精製方法には、大気圧で、またはＦＰＬＣおよびＨＰＬＣなどのシステムを用いて高圧で実施された、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティー、サイジングまたはゲル濾過、および逆相を含むクロマトグラフィー技法が含まれる。精製方法には、また、電気泳動、免疫学的、沈降、透析、および等電点電気泳動の技法が含まれる。タンパク質濃縮と共に限外濾過およびダイアフィルトレーション技法も有用である。ＴｒｋＡ抗体を精製するために、選択された宿主細胞を、例えばモノクローナル抗体精製用のスピナーフラスコ中で成長させることができる。上清をろ過し、濃縮した後に、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことができる。溶出された抗体をゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーによってチェックして、純度を確認することができる。このように、本発明の好ましい抗体は、ヒトＴｒｋＡに結合する単離および／または精製抗体である。
【０１１２】
イムノコンジュゲート
別の態様では、本発明は、ヒトＴｒｋＡに結合するＴｒｋＡ抗体またはその断片が細胞毒、薬物（例えば免疫抑制剤）または放射性毒素などの治療剤に連結したものを提供する。そのような複合体は、本明細書において「イムノコンジュゲート」と呼ばれる。１種または複数の細胞毒を含むイムノコンジュゲートは、「免疫毒素」と呼ばれる。細胞毒または細胞毒性剤には、細胞に有害な（例えば死滅させる）任意の薬剤が含まれる。例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにそれらのアナログまたはホモログが含まれる。治療剤には、例えば代謝拮抗薬（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロフォスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（旧名ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（旧名アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））および有糸分裂阻害薬（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）も含まれる。本発明の抗体と連結できる治療用細胞毒の他の例には、デュオカルマイシン、カリチアマイシン、マイタンシンおよびオーリスタチン、ならびにそれらの誘導体が含まれる。カリチアマイシン抗体複合体の一例は、市販されている（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｏｍｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）。細胞毒は、本発明の抗体と、当技術分野において利用可能なリンカー技法を用いて連結することができる。抗体に細胞毒をコンジュゲートするために用いられているリンカー型の例には、非限定的に、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド、およびペプチド含有リンカーが含まれる。例えばリソソーム区画内の低ｐＨによる切断に感受性またはカテプシン（例えばカテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）などの、腫瘍組織において優先的に発現されるプロテアーゼなどのプロテアーゼによる切断に感受性であるリンカーを選択することができる。細胞毒の型、リンカーおよび抗体に治療剤をコンジュゲートする方法のさらなる論考については、Ｓａｉｔｏ  Ｇら、（２００３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９〜２１５；Ｔｒａｉｌ  ＰＡら、（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８〜３３７；Ｐａｙｎｅ  Ｇ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７〜２１２；Ａｌｌｅｎ  ＴＭ（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅ���．Ｃａｎｃｅｒ  ２：７５０〜７６３；Ｐａｓｔａｎ  ＩおよびＫｒｅｉｔｍａｎ  ＲＪ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ、３：１０８９〜１０９１；Ｓｅｎｔｅｒ  ＰＤおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ  ＣＪ（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７〜２６４も参照されたい。本発明の抗体は、放射性同位体に連結して、ラジオイムノコンジュゲートとも呼ばれる細胞傷害性放射性医薬品を作製することもできる。診断または治療的に用いるために抗体にコンジュゲートできる放射性同位体の例には、非限定的に、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０、およびルテニウム１７７が含まれる。ラジオイムノコンジュゲートを調製する方法は、当技術分野において確立されている。ラジオイムノコンジュゲートの例は、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）（ＥＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒ（商標）（Ｃｏｒｉｘａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含めて市販されており、同様の方法を用いて、本発明の抗体を使用してラジオイムノコンジュゲートを調製することができる。本発明の抗体イムノコンジュゲートを用いて所定の生物学的応答を改変することができ、薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定して解釈されるべきでない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、もしくはジフテリア毒素などの酵素活性毒素またはその活性断片；腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン−γなどのタンパク質；または例えばリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、もしくは他の成長因子などの生物学的応答調節物質が含まれ得る。
【０１１３】
そのような治療剤を抗体に連結する技法は周知であり、例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３〜５６頁（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）中のＡｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３〜５３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）中のＨｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ'８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５〜５０６頁（１９８５）中のＴｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３〜１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）中の「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、およびＴｈｏｒｐｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９〜５８頁（１９８２）を参照されたい。
【０１１４】
別の態様では、本発明は、細胞毒、薬物（例えば免疫抑制剤）または放射性毒素などの治療剤と一緒に投与される、ヒトＴｒｋＡに結合する抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片を提供する。
【０１１５】
医薬組成物
別の態様では、本発明は、本発明の抗体またはその断片と薬学的に許容される担体とを含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。そのような組成物は、１種もしくは組み合わせの（例えば２種以上の異なる）抗体、および／または本発明のイムノコンジュゲート、および／または上記のような細胞毒、薬物（例えば免疫抑制剤）もしくは放射性毒素などの治療剤を含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補的な活性を有する抗体（またはイムノコンジュゲート）の組み合わせを含み得る。本発明の医薬組成物は、併用療法で投与することもでき、すなわち下記にさらに概要するように他の薬剤と組み合わせることができる。
【０１１６】
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」には、生理的に適合性の任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば注射または注入による）に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体またはイムノコンジュゲートを材料中に入れてコーティングして、化合物を不活性化するおそれのある酸および他の自然条件の作用からその化合物を保護することができる。薬学的に許容される担体には、無菌水溶液または分散液、および無菌注射液または分散液の即時調製用の無菌粉末が含まれる。医薬活性物質のためのそのような媒質および薬剤の使用は、当技術分野において公知である。任意の従来の媒質または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除き、本発明の医薬組成物におけるその使用が考えられる。補助的活性化合物も組成物中に組み入れることができる。
【０１１７】
別の態様では、本発明は、本発明のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体またはその断片と、別の医薬活性薬剤とを含む組成物を提供する。好ましくは、医薬活性薬剤は、下記にさらに概要するように、ａ）鎮痛剤、ｂ）別の抗ＴｒｋＡ抗体、ｃ）ＮＧＦ、ｄ）抗癌剤、ｅ）抗ＮＧＦ抗体の１つまたは複数である。
【０１１８】
別の態様では、本発明は、ヒトＴｒｋＡに結合する抗体またはその断片が治療剤に連結したものを含むイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。使用できるイムノコンジュゲートおよび治療剤は、上記の通りである。
【０１１９】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤も含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例には、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤が含まれる。本発明の医薬組成物に採用できる適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが含まれる。適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング材料の使用、分散物の場合に必要とされる粒子径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。これらの組成物は、また、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの佐剤を含有し得る。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順ならびに様々な抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有の両方によって確実にできる。糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含有させることが望ましいこともある。さらに、注射用医薬剤形の吸収の延長は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の含有によってもたらすことができる。
【０１２０】
治療的使用および他の使用
本発明の抗体は、医学において、下記の様々な項目で述べられるように、様々な障害／状態を処置するために使用することができる。
【０１２１】
本発明は、したがって、後述の状態の処置方法であって、それを必要とする対象、適切には哺乳動物対象、特にヒト対象に、本明細書記載の抗体または誘導体の治療有効量を投与することによりその状態が処置されることを含む方法を提供する。
【０１２２】
本発明は、また、後述の状態の処置用の医薬の製造における本明細書記載の抗体または誘導体の使用を提供する。
【０１２３】
本明細書の用語「処置」には、現存する障害／状態の治療的処置が含まれる。この用語には、また、予防的処置も含まれる。この用語には、たとえ患者の所定の障害／状態が治癒されなくても、１つまたは複数の有害症状が改善することがさらに含まれる。例えば、疼痛が緩和または軽減され得る。
【０１２４】
好ましい医学的使用は、疼痛の処置である。国際疼痛学会（「ＩＡＳＰ」）によると、疼痛は、一般に「実質的もしくは潜在的な組織損傷に関連する、またはそのような損傷により説明された、あるいはその両方である不快な感覚および情動体験」と定義されている。全ての形態の疼痛における必須の要素は、生物に潜在的な組織損傷を警告する専門の高閾値受容器および神経線維の活性化である。炎症細胞および炎症過程の関与は、多くの疼痛状態に共通の要素である。用語「急性疼痛」は、切傷、挫傷、熱傷などの傷害、または化学的刺激によってもたらされた、即時の、一般に高閾値の疼痛を意味する。用語「慢性疼痛」は、本明細書で用いる場合、炎症および神経障害起源の両方の、急性疼痛以外の疼痛を意味する。慢性疼痛は、多くの場合に比較的長期間、例えば数か月または数年であり、持続性または間欠性であり得ることが理解されている。本発明の抗体は、慢性疼痛または急性疼痛を処置するために使用することができる。慢性疼痛の処置が好ましい。
【０１２５】
疼痛は、例えば以下のいずれかであり得る、またはそれと関連し得る：
炎症性疼痛、手術後疼痛、術後疼痛（歯痛を含む）、神経障害性疼痛、末梢神経障害、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、骨折痛、痛風性関節痛、帯状疱疹後神経痛、癌性疼痛、変形性関節症性または関節リウマチ疼痛、坐骨神経痛、鎌状赤血球クリーゼ関連疼痛、頭痛（例えば片頭痛、緊張性頭痛、群発頭痛）、月経困難症、子宮内膜症、子宮筋腫、筋骨格痛、慢性腰痛、線維筋痛、捻挫、内臓痛（ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｐａｉｎ）、卵巣嚢腫、前立腺炎、慢性骨盤痛症候群、膀胱炎、間質性膀胱炎、有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群、慢性無菌性前立腺炎関連痛、切開痛、片頭痛、三叉神経痛、熱傷および／または創傷からの疼痛、外傷に関連する疼痛、筋骨格疾患に関連する疼痛、強直性脊椎炎、関節周囲の病状、骨転移からの疼痛、ＨＩＶからの疼痛、皮膚紅痛症または膵炎もしくは腎結石によって起こる疼痛、悪性黒色腫、シェーグレン症候群、喘息（例えば重症気道反応亢進を有するコントロール不良の喘息）、難治性咳嗽、脱髄疾患、慢性アルコール依存症、脳卒中、視床痛症候群、毒素からの疼痛、化学療法からの疼痛、炎症性腸障害、過敏性腸症候群、炎症性眼障害、炎症性または不安定膀胱障害、乾癬、炎症成分による皮膚愁訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症状態、炎症性疼痛ならびに関連する痛覚過敏および異痛、神経障害性疼痛および関連する痛覚過敏または異痛、糖尿病性神経障害痛、灼熱痛、交感神経依存性疼痛、求心路遮断症候群、上皮組織損傷または機能障害、呼吸器、尿生殖器、消化管、または血管領域での内臓運動障害、アレルギー性皮膚反応、掻痒症、白斑、汎胃腸障害（ｇｅｎｅｒａｌ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動性またはアレルギー性鼻炎、気管支障害、消化不良、胃食道逆流、膵炎、内臓痛（ｖｉｓｃｅｒａｌｇｉａ）および線維性骨形成異常（ＦＤ）。
【０１２６】
疼痛は、例えば以下のいずれかであり得る、またはそれと関連し得る：
膵炎、腎結石、子宮内膜症、ＩＢＤ、クローン病、術後癒着、胆嚢結石、頭痛、月経困難症、筋骨格痛、捻挫、内臓痛、卵巣嚢腫、前立腺炎、膀胱炎、間質性膀胱炎、術後疼痛、片頭痛、三叉神経痛、熱傷および／または創傷からの疼痛、外傷に関連する疼痛、神経障害性疼痛、筋骨格疾患に関連する疼痛、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、関節周囲の病状、腫瘍性疼痛、骨転移からの疼痛、ＨＩＶ感染。
【０１２７】
様々なモデルが疼痛を判定するために公知であり、抗体／その誘導体のスクリーニングに使用することができる。例えば、ＷＯ００／７３３４４に開示の痛覚ホットプレート試験を用いることができる。実験は、ＭｃＭａｈｏｎら、１９９５（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：７７４〜７８０）にしたがってイムノアドヘシンとして抗体／誘導体を使用して実施することができる。抗体／誘導体は、成ラットの後足に３週間皮下注入されるか、または浸透圧ミニポンプによって注入される。痛覚感受性は、炎症または神経の部分損傷後の痛覚過敏状況を模倣するホットプレート試験（ＥｄｄｙおよびＬｅｉｍｂａｃｈ（１９５３）Ｊ．Ｐｈａｒ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１０７：３８５〜３９３）を用いて間隔を空けて評価される。そのような場合、痛覚刺激は、単純反射よりも高く統合された協応と推定する応答（足をなめる、および／またはジャンプする）を誘導する。試験によると、動物は、ベースとして所望の温度、通常は５６℃に加熱されたプレートを有するペンに入れられる。対照動物（無関係の抗体で処置）および抗ＴｒｋＡ抗体／誘導体で処置された動物における任意の２種の応答（足をなめるおよびジャンプする）の潜時を測定する。
【０１２８】
ホットプレート試験の代替として、ホルマリンに対する痛覚応答を判定することができる。この試験は、ＰｏｒｒｏおよびＣａｖａｚｚｕｔｉ、１９９３（Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、４１：５６５−６０７）によって開示されており、ＷＯ０６／１３７１０６において用いられた。この試験は、試験前に所定の候補が投与されるときに、続いて起こる足をなめる行動の任意の低減を分析することによって、疼痛応答における低減を判定することを伴う。概して陰性対照として食塩水が使用される。
【０１２９】
痛覚過敏の判定は、体重支持法を用いて決定することができる。マウスは、普通、２本の肢の間で体重を等しく配分する。例えば後足（足底内）または膝関節（関節内）へのフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）またはヨード酢酸一ナトリウム（ＭＩＡ）の局所注射による肢への有痛刺激後に、注射された肢にかける体重を減少させ、注射されていない肢にかける体重を増大させるように体重が再配分される。荷重は、インキャパシタンステスターを用いて別々のセンサ上に置いた後足および両方の後肢によって及ぼされる平均力を記録して測定される。荷重を用いて、それぞれ実施例２、３、および４に詳述されるように、ＣＦＡの足底内注射に起因する急性炎症性痛覚過敏、ＣＦＡの関節内注射に起因する慢性炎症性痛覚過敏、またはＭＩＡの関節内注射に起因する慢性変形性関節症性痛覚過敏を判定することができる。
【０１３０】
機械的痛覚過敏の判定は、いくつかの方法、例えば、フォンフレイ式フィラメントまたはランダル−セリット式痛覚効果測定装置によって行うことができる。フォンフレイ式フィラメントにより後足底表面またはランダル−セリット式痛覚効果測定装置のくさび形プローブによる後足の背側表面に適用した漸増性圧刺激に応答する足の挙上閾値が測定される。後足挙上の潜時は、対照動物および抗ＴｒｋＡ抗体／誘導体で処置された動物で測定する。実施例５に詳述されるように、これらの方法を用いて、慢性絞扼損傷（ＣＣＩ）動物モデルに起因する機械的痛覚過敏を判定することができる。
【０１３１】
ＣＣＩモデルも、周知の動物モデルである。それは、坐骨神経の慢性絞扼を伴い、マウスまたはラットなどのげっ歯類における神経障害性の慢性疼痛を誘導するために用いられる。このモデルは、ＢｅｎｎｅｔｔおよびＸｉｅ、１９９８  Ｐａｉｎ  ３３：８７〜１０７に記載されている。このモデルは、例えばＷＯ０６／１３１５９２に用いられた。多くの神経障害性疼痛状態の主な特徴は、普通は非侵害性の寒冷刺激が疼痛を生じ始めることである。無痛刺激に対する応答増加は異痛と呼ばれる。したがって、実施例５に詳述するように、誘導された神経障害性疼痛状態の程度は、異痛についてコールドプレート試験を用いて測定することができる。動物は、−５℃〜１５℃の範囲内であり得る所望の温度に冷却されたプレートを有するペンに入れられる。後足挙上の潜時は、対照動物および抗ＴｒｋＡ抗体／誘導体で処置された動物で測定される。概して、挙上の潜時は、５℃以下の表面温度でベースラインと異なるようになる。
【０１３２】
抗体は、癌、ニューロン障害、アルツハイマー病、糖尿病、糖尿病性腎症、ウイルス障害、ＨＩＶ媒介障害、ハンセン病、または炎症障害の処置に使用することができる。加えて抗体は、例えば、エリテマトーデス、帯状疱疹、帯状疱疹後神経痛、および痛覚過敏を含む、ＮＧＦのレベル増加に関連し得る他の疾患の処置にも有用である。
【０１３３】
様々な癌がＴｒｋＡを発現する。ＴｒｋＡとＮＧＦとの相互作用は、（例えば前立腺癌および膵臓癌の）腫瘍発生に関与し得る。実際、ある形態の癌では、過剰のＮＧＦが神経線維の成長および浸潤を促進する場合がある。ＮＧＦの作用を遮断することによって、神経腫の形成を顕著に低減することが可能である。さらに、単に遮断効果を提供することの代替として、抗体を細胞毒性剤とカップリングすることができ、ＴｒｋＡを発現している癌細胞をターゲティングするために使用することができる。しかし、抗体を毒素とカップリングすることは必要ではない。ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害作用）は、抗体が、ターゲット細胞を被覆することによって、それらを系による（例えばＴ細胞、補体活性化などによる）攻撃に脆弱にすることができる免疫応答が原因で生じる。処置されるべき好ましい癌は、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、プロラクチノーマ、黒色腫、または骨転移に関連する癌性疼痛を含む骨癌性疼痛である。処置されるべき好ましい癌は、骨転移に関連する癌性疼痛を含む骨癌性疼痛である。
【０１３４】
抗体は、神経変性障害を含む様々なニューロン障害の処置にも使用することができ、例えば、抗体を使用して神経腫の形成を低減することができる。それらは、また、アルツハイマー病の処置または神経再生療法に使用することができる。本発明の抗体は、そのような処置においてＮＧＦの望まれないアゴニスト作用を低減するために有用であり得る（下記「併用療法」の項も参照されたい）。さらに、抗体は、上述のような神経障害性疼痛の処置に使用することができる。これは、神経系の病変または機能障害と関連し得る。ＮＧＦは、糖尿病およびハンセン病の処置に潜在的用途を有するが、疼痛感受性の増大を含む望まれないアゴニスト特性を有し、それは、本発明の抗体を使用することで回避することができよう。
【０１３５】
なおさらなる適用は、炎症障害の処置においてである。ＮＧＦは、マスト細胞、線維芽細胞、および炎症過程が起こる末梢部位内の他の細胞型によって放出される。特に、マスト細胞が基本的な役割を果たすように見える。マスト細胞はＮＧＦを産生し、同時にその表面に機能的ＴｒｋＡ受容体を発現する。ＮＧＦ／ＴｒｋＡ系は、発痛性炎症シグナルを局所増幅させる自己分泌ポジティブフィードバックメカニズムによりマスト細胞の活性化を媒介するように見える。処置され得る炎症障害の例には、尿路および骨盤部の炎症形態、変形性関節症、多発性硬化症、大腸炎、炎症性腸疾患、膀胱炎、湿疹、接触皮膚炎、慢性関節炎および関節リウマチを含む関節炎、クローン病、乾癬、ならびに喘息が挙げられる。
【０１３６】
本発明の抗体は、ＮＧＦの望まれないアゴニスト作用を低減するために上述のような処置に有用であり得る。
【０１３７】
本発明の抗体またはその誘導体は、併用療法において１種または複数の他の活性薬剤、例えば医薬活性薬剤と一緒に使用することができる。それらは、医学において同時、連続、または協調投与のために使用することができる。例えば、抗体または誘導体は、鎮痛性オピオイドまたは非オピオイド系鎮痛剤などの鎮痛剤と組み合わせることができる。ＷＯ０６／１３７１０６では、ＴｒｋＡの生物活性を遮断することができる少量の分子が、オピオイドの鎮痛効果を強化できることが開示されている。そのような鎮痛性オピオイドには、以下から選択される１種または複数の化合物が含まれる：モルヒネ、コデイン、ジヒドロコデイン、ジアセチルモルヒネ、ヒドロコドン、ヒドロモルホン、レボルファノール、オキシモルホン、アルフェンタニル、ブプレノルフィン、ブトルファノール、フェンタニル、スフェンタニル、メペリジン、メサドン、ナブメトン、プロポキシフェン、ペンタゾシン；およびそれらの薬学的に許容される誘導体（例えばそれらの薬学的に許容される塩）。適切な非オピオイド系鎮痛剤には、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）およびアセトアミノフェンなどの他の鎮痛剤が含まれる。急性炎症性疼痛を処置するために一般に入手可能なＮＳＡＩＤには、アスピリン、イブプロフェン、インドメタシン、ナプロキセン、およびケトプロフェンが含まれ、慢性炎症性疼痛を処置するためのＮＳＡＩＤには、セレコキシブおよびメロキシカムが含まれる。
【０１３８】
さらなる組み合わせは、１種または複数の他の抗体と一緒の１種または複数の本発明の抗体の組み合わせである。好ましい組み合わせは、１種または複数の他の抗ＴｒｋＡおよび／または抗ＮＧＦ抗体との組み合わせである。そのような組み合わせは、単一の抗体を用いた処置に比べて、本明細書に述べられた１つまたは複数の障害の処置における効力増大を提供し得る。例えば、本明細書で用いるアッセイ手順においてその中で最も有効であると見いだされた２種以上の抗体の組み合わせを使用することができる。
【０１３９】
さらなる組み合わせは、本発明の抗体のＮＧＦとの組み合わせである。上述のように、アルツハイマー病、糖尿病、ハンセン病などを含む多様な障害の処置へのＮＧＦの使用が提唱されてきたが、末梢標的に対するアゴニスト特性に起因する疼痛感受性増大が指摘されていた。改めて、本発明の抗体または誘導体を使用することによって、疼痛感受性を低減するができ、それによりＮＧＦに基づく治療をより魅力的にすることができる。
【０１４０】
さらなる組み合わせは、本発明の抗体と、例えばアルキル化剤、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、有糸分裂阻害薬、または白金誘導体などの抗癌剤との組み合わせである。
【０１４１】
本発明の抗体は、任意の適切な経路で投与することができる。これには、（非限定的に）腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、気管内、経口、経腸、非経口、鼻腔内、または皮膚投与が含まれる。
【０１４２】
抗体は、概して液体製剤の注射（腹腔内または頭蓋内、概して脳室内、または心膜内もしくは滑液包内）または固体製剤（丸剤、錠剤、カプセル剤の剤形）もしくは液体製剤（乳剤および液剤の剤形）の摂取による局所適用のために投与することができる。非経口投与用の組成物は、通例、適合性の、好ましくは水性の溶液に溶解された免疫グロブリンの溶液を含む。これらの製剤中の抗体／誘導体の濃度は、０．００５％未満から１５〜２０％ｗ／ｖに変動し得る。濃度は、主に液体の体積、粘度などに応じて、および所望の特定の投与様式に応じて選択される。あるいは、抗体は、固体剤形での投与用に調製することができる。抗体は、異なる不活性物質または賦形物質と組み合わせることができ、それらには、微結晶セルロース、ゼラチン、もしくはアラビアゴムなどのリガンド；乳糖もしくはデンプンなどの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはトウモロコシデンプンなどの薬剤；ステアリン酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素などの滑沢剤；サッカロースもしくはサッカリンなどの甘味料；またはミントおよびサリチル酸メチルなどの香料が含まれ得る。他の医薬投与システムには、ヒドロゲル、ヒドロキシメチルセルロース、リポソーム、マイクロカプセル、マイクロエマルション、マイクロスフェアなどが含まれる。
【０１４３】
障害が局所の場合、障害／それに近いものに冒された部位での直接の局所注射が、好ましい投与様式である。抗ＴｒｋＡ抗体は、適宜、全身投与される。全身投与は、注射、例えば連続静脈内注入、ボーラス静脈内注入、皮下または筋肉内注射によって行うことができる。
【０１４４】
あるいは、他の形態の投与（例えば経口、粘膜、吸入による、舌下など）も用いることができる。しかし、所望であれば、抗体／誘導体の送達は、患部組織近くへの局所投与（例えば関節内注射または皮下、筋肉内注射）によって行うことができる。
【０１４５】
抗ＴｒｋＡ抗体／誘導体は、適宜、目的の投与経路に適切な医薬組成物に製剤化される。注射液は、必要に応じて適切な緩衝剤およびモル濃度改変剤（例えばリン酸塩、食塩および／またはデキストロース）を含有する水性媒質（例えば注射用水）中に溶解または分散された抗体／誘導体を適宜含有する。
【０１４６】
処置方式（すなわち用量、タイミングおよび反復）は、選択された投与経路による製品の単回または反復投与（例えば注射）により表すことができる。用量投与の間隔は、臨床応答の程度および期間、ならびに特定の個体および個体の臨床歴に応じて改変されることがある。
【０１４７】
抗ＴｒｋＡ抗体／誘導体は、適宜、長い作用時間を有する。特に、投与後の抗体の臨床効果は、動物試験から決定したとき２１日という長さであり得る。さらに、抗ＴｒｋＡ抗体は、その投与後にその存在が血清または血漿などの関連する生体マトリックスから検出できる期間よりも長い期間、臨床的有用性を現し得る。
【０１４８】
目的の長い作用期間（すなわち適宜少なくとも１週間、または好ましくは少なくとも２週間、例えば少なくとも３週間または少なくとも４週間持続する効果）に照らして、抗体／誘導体は、適宜、１週間に１回以下、例えば２週間に１回以下または３週間に１回以下または４週間に１回以下の頻度で対象に投与することができる。
【０１４９】
抗ＴｒｋＡ抗体／誘導体の適切な１日用量は、概して、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。急性および慢性炎症性疼痛の処置に適切な抗ＴｒｋＡ抗体の用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ（実施例２および３参照）である。変形性関節症性疼痛の処置に適切な抗ＴｒｋＡ抗体の用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇである（実施例４参照）。神経障害性疼痛の処置に適切な抗ＴｒｋＡ抗体の用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ、および最も好ましくは１ｍｇ／ｋｇである（実施例５参照）。これらの用量は、マウスだけのｉｎ  ｖｉｖｏ状態に関係するものである。本発明は、急性炎症性疼痛の処置におけるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の使用であって、痛覚過敏がＮＳＡＩＤの投与で観察される程度と同じ程度まで効果的に反転する使用に関する。本発明は、また、慢性炎症性疼痛の処置におけるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の使用であって、痛覚過敏がＮＳＡＩＤの投与で観察される程度と同じ程度まで効果的に反転する使用に関する。本発明は、また、変形性関節症性疼痛の処置におけるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の使用であって、痛覚過敏がプレガバリンおよびオピエートの投与で観察される程度と同じ程度まで効果的に反転する使用に関する。本発明は、また、神経障害性疼痛の処置におけるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の使用であって、痛覚過敏がプレガバリンの投与で観察される程度と同じ程度まで効果的に反転する使用に関する。次に具体的に腫瘍に関する投与に目を転ずると、投与は、腫瘍または腫瘍部位近くの組織への直接および局所注射による場合がある。全身投与のために、用量は、１日０．０５ｍｇ／ｋｇから１日５００ｍｇ／ｋｇまで変動するが、その範囲のより低い領域にある投薬量が好ましい。それはその方が、投与が容易であるからである。例えば抗体／誘導体の特定の血漿中レベルを保証するために投薬量を較正し（約５〜３０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０から１５ｍｇ／ｍＬの間の範囲）、臨床結果が達成されるまでこのレベルを所定の期間維持することができる。
【０１５０】
膵臓または前立腺腫瘍の病期を測定または判定するための効果的な方法は、血中前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の測定、膵臓腫瘍については生存期間の測定、両方の腫瘍型の場合、転移についての拡散の減速または阻害の測定に基づく。
【０１５１】
腫瘍部位のレベルでの直接注射のために、投薬量は、多くの他の変数と共に、腫瘍の型、病期、および体積を含む異なる要因に依存する。
【０１５２】
腫瘍体積に応じて、典型的な治療用量は、０．０１ｍｇ／ｍＬおよび１０ｍｇ／ｍＬの注射から変動することがあり、それらの注射は、必要な頻度で施すことができる。
【０１５３】
治療の性質が何であろうと、ヒト化抗体は、非ヒト化抗体よりもずっとゆっくりと排出され、有効血漿中濃度を維持するために低い投薬量を必要とし得る。そのうえ、高親和性抗体を用いると、低親和性を有する抗体よりも頻度が低く、大きさが小さい場合がある。
【０１５４】
各抗体／誘導体の治療的に有効な投薬量は、熟練の開業医による処置の間に決定することができる。必要ならば、投薬量は、減少（例えば副作用を低減するため）または増大（治療効果を増大させるため）させることができる。
【０１５５】
投与前に、本発明の抗体調製物は、凍結または凍結乾燥することによって保存することができる。次に、それらを使用直前に適切な緩衝液に入れて再構成することができる。凍結乾燥および再構成は、活性喪失を招くおそれがあることを考えれば、この事実を埋め合わせるために抗体の投与レベルを較正することができる。（従来型免疫グロブリンについて、ＩｇＭ抗体は、ＩｇＧ抗体よりも大きく活性を喪失する傾向にある。）
【０１５６】
有効期間は、また、抗体がある保存期間を過ぎて使用されないように指定されることがある。
【０１５７】
本発明の抗体またはその誘導体は、医学的使用に関係して上述した疾患／状態のいずれかの診断または予後に使用することができる。例えば、それは、アルツハイマー病などの反乱の早発マーカーのようなＴｒｋＡ陽性腫瘍マーカーの検出を容易にするために使用することができる。
【０１５８】
それは、また、ＣＩＰＡ（「先天性無痛無汗症」）の診断に使用することができる。これは、再発するエピソード性の発熱、無汗症、痛覚刺激に対する反応不在、精神遅滞および自傷傾向によって特徴づけられる遺伝的劣性常染色体症候群である。それは、ＴｒｋＡ遺伝子の突然変異に起因する。実際、本発明の抗体または誘導体は、ＴｒｋＡの異常発現（健康個体もしくは健康組織試料中のＴｒｋＡの発現に比べて）を伴う広範囲の状態またはＴｒｋＡを伴う異常活性の診断または予後に使用することができる。したがって、本発明には、その範囲内で患者から得られた生物学的試料を得ること、およびその試料を本発明の抗体または誘導体と接触させることを含む方法が含まれる。所望であれば、抗体／誘導体を固定化してもよい。次に、その方法は、前記試料への抗体／誘導体の結合を定量的または定性的にアッセイすることを含み得る。所望であれば、この方法は、基準と共に、および／または陽性対照（健康な状態を示す）もしくは陰性対照（障害の存在／見込みを示す）に対して行うことができる。診断目的で、抗体は、両方とも検出可能なマーカーでマークすることができ、またはマークしなくてもよい。（本明細書において用語「マーカー」は、ラベルまたは任意の他の検出可能な部分／検出可能な変化をトリガーできる部分が含まれるように使用される。）
【０１５９】
製品およびキット
本開示の別の実施形態では、製品は、１つまたは複数の上述の疾患／状態の処置のための、本発明の抗体もしくはその断片、組成物、またはイムノコンジュゲートを含む。製品は、容器、および容器上のまたは容器に関連するラベルまたは添付文書を含み得る。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、またはシリンジが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成され得る。容器は、状態の処置に有効であり得る組成物を収容し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば容器は、皮下注射針で刺通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１種の活性薬剤が、本明細書記載の抗体であり得る。ラベルまたは添付文書は、選択された状態の処置に組成物を使用できることを示している場合がある。
【０１６０】
さらに、製品は、（ａ）本明細書における抗体を含む組成物がその中に入れられた第１の容器、および（ｂ）抗体以外の治療剤を含む組成物がその中に入れられた第２の容器を含み得る。本開示のこの実施形態における製品は、第１および第２の組成物を併用できることを示す添付文書をさらに含み得る。そのような治療剤は、前節で記載の任意の補助療法であり得る（例えば、血栓溶解剤、抗血小板剤、化学療法剤、抗血管新生剤、抗ホルモン化合物、心保護薬、および／またはサイトカインを含む哺乳動物における免疫機能の調節因子）。あるいは、または追加的に、製品は、さらに注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２（または第３）の容器を含み得る。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的観点およびユーザー観点から望ましい他の物質をさらに含み得る。
【０１６１】
本発明の抗体、組成物、またはイムノコンジュゲートと、使用説明書とを含むキットも本発明の範囲内に入る。キットは、免疫抑制試薬、細胞毒性剤、もしくは放射性毒性剤などの１種もしくは複数の追加的な試薬、または１種もしくは複数の追加的な本発明の抗体（例えばＴｒｋＡ抗原中のエピトープに結合する相補的活性を有する、第１の抗体と別個の抗体）をさらに含み得る。
【０１６２】
さらなる説明なしに、当業者は、前述の説明および以下の例示的な実施例を用いて本開示の薬剤を製造および利用し、請求された方法を実施することができると考えられている。以下の実施例は、本開示の実施を容易にするために提供されるものであり、どのような方法であれ本開示の残りを限定するものとして見なすべきではない。
【実施例】
【０１６３】
本明細書で記載したヒト化抗ＴｒｋＡ抗体は、抗ＴｒｋＡ抗体の新規サブグループであり、ＴｒｋＡの機能活性化の阻害に非常に効果的である。ＷＯ００／７３３４４で開示されたＭＮＡＣ１３として知られる抗ＴｒｋＡマウスモノクローナル抗体およびＷＯ０９／０９８２３８で開示されたそのヒト化バリアントは、特定の状況下、例えば、阻害レベルが高いと治療効果を増大することができる疼痛および癌関連疼痛の治療で望まれる同じ阻害レベルを実現することはできない。したがって、高度のＴｒｋＡの阻害を示すヒト化抗ＴｒｋＡ抗体を開発することが所望されている。
【０１６４】
ＴｒｋＡの機能的活性化の阻害を媒介する抗体の評価方法は、当業界ではよく知られており、細胞表面ＴｒｋＡ／ベータ−ＮＧＦ媒介細胞増殖を遮断する抗体の能力を因子依存性ヒト赤白血病細胞系ＴＦ−１を用いてアッセイするＴＦ−１細胞増殖アッセイが含まれる（Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔら、（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １４０（２）：３２３〜３４）。ＷＯ０９／０９８２３８で開示されたヒト化抗体は、ＴＦ−１増殖アッセイにおいて阻害活性を示し、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１候補は、ＭＮＡＣ１３マウス抗体のヒト化バリアントの中で最高度の阻害を有する。さらに、ＷＯ０９／０９８２３８で開示されたヒト化抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて、ＴｒｋＡの細胞外領域に直接結合することが示された。したがって、ヒトＴｒｋＡに対する結合親和性が改善された、さらに重要なことにはＴＦ−１細胞増殖アッセイにおいてＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ヒト化バリアントよりも阻害能力が改善されたマウスＭＮＡＣ１３抗体の新規ヒト化バリアントを設計するために、ＷＯ０９／０９８２３８で開示されたヒト化抗体から選択されたサブセットを操作の開始点として使用した。
【０１６５】
「ＢＸｈ」に続く文字は、ＶＨまたはＶＬまたはその両方である。ＶＨまたはＶＬはそれぞれ、特定の数字によって表された特定の重鎖可変ドメイン、例えば、ＢＸｈＶＨ５を備えたＩＧＨＧ１アイソタイプを有する重鎖または特定の数字によって表された特定の軽鎖可変ドメイン、例えば、ＢＸｈＶＬ１を備えたカッパアイソタイプを有する軽鎖を示す。特定の数字を有するＶＨならびに特定の数字を有するＶＬの両方を「ＢＸｈ」の後に表す場合、例えば、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１は、重鎖および軽鎖の特定の組み合わせからなる特定の抗体分子を示しており、例えば、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１抗体は、ＢＸｈＶＨ５重鎖およびＢＸｈＶＬ１軽鎖を有する抗体のことをいう。ＷＯ０９／０９８２３８で記載されたＶＨおよびＶＬ可変ドメインの選択されたサブセットに基づいて新たに操作されたヒト化バリアントは、「ＧＢＲ」抗体と称する。反対に、同じ命名法はＧＢＲ抗体に関しても有効である。本明細書で使用したように可変重鎖ドメイン内で行われる特定の置換はさらに括弧内に示す。ＧＢＲ抗体は全て、特に記載しない限り、カッパアイソタイプ軽鎖を備えたＩＧＨＧ１重鎖アイソタイプである。
【０１６６】
実施例１：抗体エンジニアリング
ＷＯ０９／０９８２３８で開示された４０種類の抗体のうち、５種類のヒト化抗体を操作するための投入抗体として選択した：重鎖可変ドメインＶＨ１（配列番号１）および軽鎖可変ドメインＶＬ１（配列番号６）を有するＢＸｈＶＨＩＶＬ１、重鎖可変ドメインＶＨ３（配列番号３）および軽鎖可変ドメインＶＬ１を有するＢＸｈＶＨ３ＶＬ１、重鎖可変ドメインＶＨ３および軽鎖可変ドメインＶＬ３（配列番号８）を有するＢＸｈＶＨ３ＶＬ３、重鎖可変ドメインＶＨ５（配列番号５）および軽鎖可変ドメインＶＬ１を有するＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ならびに重鎖可変ドメインＶＨ５および軽鎖可変ドメインＶＬ１を有するＢＸｈＶＨ５ＶＬ３。本明細書で使用したＭＮＡＣ１３マウス抗体は、配列番号２０の重鎖可変ドメインＭＮＡＣ１３ＶＨ、配列番号２１の重鎖および配列番号２２の軽鎖を有する。
【０１６７】
驚くべきことに、遺伝子操作した抗体は全て、重鎖可変ドメインの３７位（Ｋａｂａｔ番号付け（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、同著）のバリンからアラニンへの単純な変化（マウス逆突然変異）によって利益を得る。この置換は、ＳＰＲによって測定したところ、遺伝子操作した抗体全ての中でもヒトＴｒｋＡの親和性を大いに高める独特の特性を有していた。さらに重要なことに、同置換が、ＴＦ−１細胞増殖アッセイにおいてほとんどのバリアントに能力の増加をもたらし、予期せぬことに、ＶＬ１ドメインと組み合わせたＶＨ５ドメイン（ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１抗体）に導入すると、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ヒト化抗体と比較して増加は１０倍であった。特に、同ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１抗体はまた、ＴＦ−１細胞増殖アッセイにおいて、ＭＮＡＣ１３マウス抗体と比較したとき３倍の能力増加を示した。
【０１６８】
ヒト化抗体中のマウスに由来する残基数が増加すると、免疫原性の危険性が増加する可能性があるので（Ｈａｒｄｉｎｇ  ＦＡら、（２０１０）ＭＡｂｓ  ２（３）：２５６〜６５）、遺伝子操作した抗体におけるマウス残基の数を低下させるためにさらに研究を行った。ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１抗体において、３位のマウス残基リシンをグルタミンに変化させることによって、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ヒト化抗体と比較して同数のマウス残基を有するが、結合親和性が増加し、親マウスＭＮＡＣ１３抗体とＦＡＢ熱安定性が同等で、阻害能力が増加したＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１抗体が生じた。
【０１６９】
最後に、抗体が媒介するエフェクター機能は、ＴｒｋＡ遮断のみが必要な治療には有害になり得るので、免疫細胞によってＴｒｋＡ発現細胞の殺滅を媒介することなく、ＴｒｋＡを阻害する抗ＴｒｋＡ抗体を開発することが望ましい。ヒトＩＧＨＧ４アイソタイプは、ＡＤＣＣまたはＣＤＣなどのエフェクター機能を有さず、エフェクター機能が必要ないか、または治療に有害である場合、それ自体特に適した抗体形式である。しかし、天然に生じるヒトＩＧＨＧ４アイソタイプの１つの欠点は「ＦＡＢ交換」現象で、それによって天然に生じるヒトＩＧＨＧ４はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて重鎖を交換することが知られている（Ｌａｂｒｉｊｎ  ＡＦら、（２００９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（８）：７６７〜７１）。組換えＩＧＨＧ４と内在性ヒトＩＧＨＧ４と間の重鎖交換を遮断する方法は当業界では公知であり、交換はヒンジ領域に位置する２２８位のセリン残基をプロリン残基に置換することによって効率よく遮断され（ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ、Ｅｄｅｌｍａｎ  ＧＭら、同著）、それによってヒトＩＧＨＧ１アイソタイプに見いだされる立体的ヒンジ構造が再現されることが知られている（Ｌｅｗｉｓ  ＫＢら、（２００９）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６（１６）：３４８８〜９４）。ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１およびＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１はいずれも、前述の治療目的のためにＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐ免疫グロブリンとしてフォーマットされ、対応するＩＧＨＧ１アイソタイプと同等の能力を示し、それによってＴｒｋＡ遮断のみが必要とされるヒト治療に適したＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８ＰおよびＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐ抗体の両方が形成される。
【０１７０】
方法
操作したバリアントの設計
可変ドメインのＶＨ５−ＶＬ１の組み合わせの３Ｄモデルは、構造相同性モデリングサーバーＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ（Ａｒｎｏｌｄ  Ｋら、（２００６）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２２（２）：１９５〜２０１；ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）の自動モードに設定して計算した。検索されたモデル型は、実験的に解明されたＭＮＡＣ１３  ＦＡＢ  ３Ｄ構造（ＰＤＢコード１ＳＥＱ、ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ，Ｂｅｒｍａｎ  ＨＭら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（１）：２３５〜４２、Ｃｏｖａｃｅｕｓｚａｃｈ  Ｓら、（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ５８（３）：７１７〜２７）であった。ＭＮＡＣ１３ＶＨ、ＶＨ１、ＶＨ３、ＶＨ５および生殖系列ＶＨ３−０２３*０１（配列番号２３）ドメインの配列アラインメントは、３、５、１９、３７、４０、４２、４４、４９、５０、５２Ａ、５３、６０、６２、７４、８２Ａ、８３、８４、８９および９４位（Ｋａｂａｔ番号付け）の位置において異なるアミノ酸含量を示した。モデル分析によって、ＣＤＲ領域および／または重鎖−軽鎖可変ドメイン充填に対して予測される影響に基づいた位置のサブセットの選択が可能となった。この位置のサブセットは、３、３７、４０、４２、４４、４９、５０、６０、６２、８９および９４（Ｋａｂａｔ番号付け）から構成された。したがって、遺伝子操作した抗体は、前述の位置のサブセットから選択された前述の可変ドメイン配列（それぞれ配列番号１、３、５を有するＶＨ１、ＶＨ３およびＶＨ５）に１個または複数の位置の置換を包含する重鎖可変ドメインを有した。より具体的には、操作した抗体は、既に記載した２つの軽鎖可変ドメインＶＬ１またはＶＬ３（配列番号６および８）の１つと組み合わせた前述のような置換された重鎖可変ドメインから構成された。
【０１７１】
分子生物学
操作された重鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）は、ＷＯ０９／０９８２３８で記載されたＢＸｈＶＨ１、ＢＸｈＶＨ３およびＢＸｈＶＨ５のベクターＤＮＡをＰＣＲ鋳型として使用して、標準的突然変異誘発技法によって作出した。同様に、軽鎖可変ドメインｃＤＮＡは、ＷＯ０９／０９８２３８で記載されたＢＸｈＶＬ１およびＢＸｈＶＬ３のベクターＤＮＡから直接増幅した。可変ドメインｃＤＮＡは、ＰＣＲアセンブリ技術を用いて、それらのそれぞれの定常ドメインｃＤＮＡ配列（複数可）の上流でさらに組み立てた。最後に、完全重鎖および軽鎖ｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを有する改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）をベースにした独立ベクターにライゲーションした。軽鎖特異的ベクターは、ＢａｍＨＩおよびＢｓｉＷＩ制限酵素部位を用いて、カッパ軽鎖定常ドメインｃＤＮＡの前に対象の軽鎖可変ドメインｃＤＮＡを連結することによって、カッパアイソタイプ軽鎖の発現を可能にしたが、重鎖特異的ベクターは、ＢａｍＨＩおよびＳａｉＩ制限酵素部位を用いて、ＩＧＨＧ１  ＣＨ１、ＩＧＨＧ１ヒンジ領域、ＩＧＨＧ１  ＣＨ２およびＩＧＨＧ１  ＣＨ３定常ドメインをコードするｃＤＮＡ配列の前に対象の重鎖可変ドメインｃＤＮＡをライゲーションすることを可能にするように操作された。重鎖及び軽鎖両方の発現ベクターにおいて、分泌は、ＢａｍＨＩ部位を含有するマウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドにより、駆動した。ＢｓｉＷＩ制限酵素部位は、カッパ定常ドメイン中にあり、ＳａｉＩ制限酵素部位は、ＩＧＨＧ１  ＣＨ１ドメイン中で見いだされる。
【０１７２】
Ｓ２２８Ｐ置換を有するＩＧＨＧ４免疫グロブリンフォーマットは、前述の重鎖特異的ベクターにおいて、ＩＧＨＧ１  ＣＨＩ、ＩＧＨＧ１ヒンジ領域、ＩＧＨＧ１  ＣＨ２およびＩＧＨＧ１  ＣＨ３定常ドメインをコードするｃＤＮＡ配列をＩＧＨＧ４  ＣＨ１、Ｓ２２８Ｐ置換を有するＩＧＨＧ４ヒンジ領域、ＩＧＨＧ４  ＣＨ２およびＩＧＨＧ４  ＣＨ３定常ドメインをコードするｃＤＮＡ配列と置き換えることによって達成した。Ｓ２２８Ｐ置換は、標準的ＰＣＲ突然変異誘発技法によって、ヒトＩＧＨＧ４重鎖ｃＤＮＡ鋳型に導入された。
【０１７３】
抗体産生
抗体を一過的に発現するために、懸濁に適応したＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号：ＣＲＬ−１０８５２）にポリエチレンイミン（ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ  Ｃｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、等量の重鎖および軽鎖ベクターを同時にトランスフェクトした。通常、１ｍｌ当たり８〜１２０万個の細胞密度で懸濁した細胞１００ｍｌを、重鎖をコードする発現ベクター５０μｇおよび軽鎖をコードする発現ベクター５０μｇを含有するＤＮＡ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）混合物でトランスフェクトする。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを宿主細胞に導入する場合、抗体は、細胞をさらに４から５日間培養して、０．１％プルロニック酸、グルタミン４ｍＭおよびジェネテシン０．２５μｇ／ｍｌを補給した培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ２９３、ＨＥＫ２９３無血清培地：Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）へ分泌させて産生する。
【０１７４】
抗体は、組換えプロテインＡストリームライン媒体（ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ｍｅｄｉａ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて無細胞上清から精製し、アッセイ前にリン酸緩衝生理食塩水に緩衝液を交換した。
【０１７５】
示差走査熱量測定を使用した安定性試験
熱量測定を、ＶＰ−ＤＳＣ示差走査熱量計（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で行った。セル容量は０．１２８ｍｌであり、加熱速度は２００℃／ｈであり、過圧は６５ｐ．ｓ．ｉ．に維持した。全ての抗体を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１ｍｇ／ｍｌの濃度にて用いた。各タンパク質のモル熱容量は、タンパク質を除いた同一の緩衝液を含有する２連の試料との比較により見積もった。部分モル熱容量および融解曲線を、標準的方法を用いて分析した。サーモグラムをベースライン補正し、濃度で標準化した後に、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ｖ７．０，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で非２状態モデル（Ｎｏｎ−Ｔｗｏ  Ｓｔａｔｅ  ｍｏｄｅｌ）を用いてさらに分析した。
【０１７６】
ＳＰＲによる親和性の測定
ＳＰＲ分析を用いて、様々な抗体（マウスおよびヒト化抗体）の結合動態の結合および解離速度定数を測定した。マウス抗体およびヒト化バリアントの結合動態は、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で室温で測定し、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ｖ４．１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で分析した。
【０１７７】
抗体は２価の分子なので、抗体をセンサチップに固定することが最も良い。抗体を分析物として使用する場合、ＳＰＲ測定には、親和性に加えて、結合価成分も関与する。ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアは、結合価をモデル化し、親和性定数を求めることができるが、できる限り１価の分析物で操作することによってあらゆる結合価の影響を回避することが好ましい。この目的のために、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞中で作製した組換えヒトＴｒｋＡ−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号２４）を消化することによって、１価型のヒトＴｒｋＡ細胞外領域を生成した。融合タンパク質は、ＩＧＨＧ１  Ｆｃ領域に融合したヒトＴｒｋＡ細胞外領域（配列番号２５）から構成され、プロテアーゼ特異的切断配列（ＴＥＶ切断プロテアーゼアミノ酸配列：ＥＮＬＹＦＱＳ）が２個の領域の間に含まれている。プロテアーゼ切断後、Ｆｃ断片を除去するためにプロテインＡステップを含む標準的クロマトグラフィー技術を用いて、１価型のヒトＴｒｋＡ細胞外領域をさらに精製して均一にした。最後に、１価のヒトＴｒｋＡ細胞外領域タンパク質は、緩衝液をＰＢＳに交換してから、親和性測定のためにＢｉａｃｏｒｅランニング緩衝液で希釈した。試料精製度、均一性および分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除分析によって確認した。
【０１７８】
抗体は、センサチップ表面への正確な方向付けを可能にするために、Ｆｃ部分を捕捉することによって固定した。マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）モノクローナル抗体センサチップを用いて、アイソタイプに関わらずヒト化抗体全てを捕捉し（ヒト抗体捕捉キット、カタログ番号ＢＲ−１００８−３９、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）、ウサギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体センサチップを用いて、ＭＮＡＣ１３マウス抗体を捕捉した（マウス抗体捕捉キット、カタログ番号ＢＲ−１００８−３８、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）。
【０１７９】
データ（センサグラム：ｆｃ２−ｆｃｌ）は、物質移動試験では物質移動制限はほとんどないにもかかわらず、物質移動ありの１：１ラングミュアモデルにフィットした。それぞれの測定の開始時に捕捉抗体における実験的な変動を説明するために、Ｒｍａｘ値を全てのフィットにおいてローカルに設定した。解離時間は少なくとも３５０秒間であった。
【０１８０】
測定は、３回繰り返し実施し、参考のためにゼロ濃度試料を含めた。Ｃｈｉ２および残りの値の両方を用いて、実験データと個々の結合モデルとの間のフィットの質を評価した。
【０１８１】
ＴＦ−１細胞による増殖アッセイ
懸濁に適応したＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＲＬ−２００３）は、１０％  ＦＣＳおよびｒｈｕβＮＧＦ（組換えヒトベータ−ＮＧＦ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）５ｎｇ／ｍｌを含有する完全ＲＰＭＩ培地で成長させた。アッセイのために、ＴＦ−１細胞はヒトベータＮＧＦを含まない完全ＲＰＭＩ中で５時間インキュベートした。この飢餓段階の後、細胞を遠心分離し、様々な濃度の各抗体および固定濃度の組換えベータＮＧＦを含む平底９６ウェルプレートに播種した。ＴＦ−１細胞を７０００細胞／ウェルの密度で播種し、抗体−細胞混合物の全体積は２００μｌで、ヒトベータＮＧＦは５ｎｇ／ｍｌ（最終濃度）であった。この混合物を、ＣＯ2を補給して３７℃で４日間インキュベートした。３日目に、インキュベーション条件にはいかなる変更も行わずに、比色定量用色素アラマーブルー（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡｂＤ  ＧｍｂＨ、Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を各ウェルに添加した。４日目に、蛍光をＢｉｏ−Ｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）２分光光度計／マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ、Ｌｕｚｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で、励起波長５３０から５６０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍで読み取った。実験は、少なくとも２回実施し、各抗体濃度の測定は３連で行った。
【０１８２】
結果
ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１をベースにした新規ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体のエンジニアリング
可変ドメインのＶＨ５−ＶＬ１の組み合わせの３Ｄモデルをベースにして、様々な重鎖可変ドメイン（ＶＨ１、ＶＨ３およびＶＨ５）内の共通の３Ｄ位置のサブセットをマウスからヒトならびにヒトからマウスへの突然変異のために選択した；この群は３、３７、４０、４２、４４、４９、５０、６０、６２、８９および９４（Ｋａｂａｔ番号付け）の位置から構成された。本明細書で使用した置換の組み合わせに関する操作戦略は、ＣＤＲ領域および／または可変ドメイン充填および／または免疫原性に対して推定される影響に関する様々な置換の相補性に基づいている。
【０１８３】
最初のアプローチでは、マウスからヒトおよびヒトからマウスへの突然変異は、ＩＧＨＧ１アイソタイプ形式のＢＸｈＶＨ５ＶＬ１候補において操作した。実施したマウスからヒトへの突然変異には、以下の置換：Ｋ３Ｑ、Ｔ４０Ａ、Ｒ４４Ｇ、Ａ４９Ｓ、Ｙ５０Ａ、Ｐ６０Ａ、Ｔ６２ＳおよびＲ９４Ｋが含まれた。これら１個の置換または置換の組み合わせをベースにして操作した抗ＴｒｋＡ抗体のいくつかの生成収率および親和性はそれぞれ表１および２に示す。マウスからヒトへの突然変異のほとんどまたは全てを一緒にすると、生成収率は不十分になり、ＴｒｋＡに対する結合の完全な消失が引き起こされた。例えば、マウスからヒトへの置換Ａ４９ＳをＹ５０Ａと一緒にすると、結合の完全な抑止が誘導され、その他のマウスからヒトへの置換では復帰せず、マウスからヒトへの置換Ｋ３Ｑ、Ｔ４０Ａ、Ｒ４４ＧおよびＲ９４Ｋは、単独でも、またはその他のマウスからヒトへの置換と組み合わせても、親和性のいかなる改善も引き起こさなかった。
【０１８４】
実施したヒトからマウスへの突然変異には、以下の置換：Ｖ３７Ａ、Ｇ４２ＥおよびＶ８９Ｌが含まれた。ヒトからマウスへの置換Ｖ３７Ａは、最も正の影響をもたらし、親和性の少なくとも２倍の増加を引き起こし（ＫDは少なくとも２倍減少する）（表２および図１）、ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ１抗体では親和性の２．５倍の増加が記録された。この親和性の増加は、ヒトからマウスへの置換Ｖ３７Ａとマウスからヒトへの置換Ｐ６０ＡおよびＴ６２Ｓを一緒にすると抑止されるが、マウスからヒトへの置換Ｋ３Ｑおよび／またはＲ４４Ｇと組み合わせると維持された。これらの結果を一緒に考えると、結合を可能にするために４９位および５０位が重要であること、およびＢＸｈＶＨ５ＶＬ１の親和性を少なくとも２倍増強するのにヒトからマウスへの置換Ｖ３７Ａが特有の特性を有することが確認された。抗体媒介エフェクター機能は、ＴｒｋＡ遮断のみが必要な治療では有害になり得るので、ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１およびＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１はいずれも、Ｓ２２８Ｐ置換を有する前述のＩＧＨＧ４アイソタイプに再フォーマットした。操作した両抗体は、ＩＧＨＧ１アイソタイプ対応物に類似の親和性を示し、Ｖ３７Ａ置換によってもたらされた親和性の改善は、アイソタイプスイッチによっては影響を受けないことが示された。
【０１８５】
ＢＸｈＶＨＩＶＬ１、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ１およびＢＸｈＶＨ５ＶＬ３をベースにした新規ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体のエンジニアリング
第２のアプローチでは、Ｖ３７Ａ置換をＷＯ０９／０９８２３８から得られた他の選択候補に導入し、操作された抗ＴｒｋＡ抗体の親和性をＢＸｈＶＨ５ＶＬ１およびＭＮＡＣ１３抗体に対してＳＰＲによって評価した。表３および４はそれぞれ、Ｖ３７Ａを置換した抗体の生成収率および親和性を示す。操作した抗体は生成収率が異なるが、操作した抗体は全て、Ｖ３７Ａ置換を導入することによって親和性の増強を示した。親和性は、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ１では８％、ＢＸｈＶＨＩＶＬ１では２０％、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ３では３０％、およびＢＸｈＶＨ５ＶＬ３では５５％改善した。したがって、ヒトからマウスへの置換Ｖ３７Ａは、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１に導入した場合、親和性の増加を引き起こすだけではなく、最も驚くべきことに、全ヒト化バリアントに対する親和性の増加を引き起こした。特に、ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１またはＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１はいずれも、ＩＧＨＧ１またはＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐアイソタイプとして、ＭＮＡＣ１３マウス抗体で測定された親和性に匹敵する親和性を示し（表２および４）、いずれも、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１抗体と比較した場合、少なくとも２倍増加した（ＫDはそれぞれ、２．５から２．７倍に減少した）。
【０１８６】
表３および図２は、操作した抗体内で測定されたＦＡＢ部分の融解温度を含む。モノクローナル抗体融解プロファイルは、それらのアイソタイプの特徴であるが、ＦＡＢ断片の中間融解温度（Ｔｍ）は、全長免疫グロブリンの関係においても、容易に同定できる（Ｇａｒｂｅｒ  Ｅ  ａｎｄ  Ｄｅｍａｒｅｓｔ  ＳＪ（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３５５（３）：７５１〜７）。ＦＡＢ部分のこのような中間融解を用いて、操作候補の安定性をモニターした。ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１およびＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＦＡＢ断片はそれぞれ、７３．６および７３℃でそれぞれ１回移行を示し、密に折りたたまれたＦＡＢ断片について通常観察される協同的アンフォールディング（ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）と一貫するＦＡＢ転移の形状および振幅を示す同等の熱安定性を有し、この操作方法がＦＡＢ安定性のうまく保持したことを示した。これはさらに、ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１またはＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１のＦＡＢ  ＴｍをＭＮＡＣ１３  ＦＡＢ  Ｔｍ（７４℃）のＴｍと比較したとき、差は１℃以内であることを実証している。
【０１８７】
エンジニアされた抗ＴｒｋＡ抗体の機能試験
操作された抗ＴｒｋＡ抗体が、ＴＦ−１細胞増殖アッセイにおいて、ＴｒｋＡの機能的活性化を阻害する能力をアッセイした（図３）。生物学的機能を阻害する化合物の有効性の基準である最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を各曲線について計算し、結果を表５に挙げる。ＧＢＲ  ＶＨ１（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１は、ＳＲＰによる親和性が低いため、アッセイしなかったことに注意されたい。
【０１８８】
ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１が最も性能がよく、同一のＩＣ５０を有するＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１、ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８ＰおよびＧＢＲ  ＶＨ３（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１がその次であることが見いだされた。ＧＢＲ  ＶＨ３（Ｖ３７Ａ）ＶＬ３およびＧＢＲＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ３抗体は、わずかにＩＣ５０が高いが、試験した操作抗体は全て、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１よりも性能が良く、ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１は１０倍優れていた。特に、ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１抗体はまた、ＴＦ−１細胞増殖アッセイにおいて、ＭＮＡＣ１３マウス抗体と比較して３倍の能力増加を示した。Ｖ３７Ａバリアントは全て、マウス親抗体と比較した場合、ＩＣ５０は同等以上であった。
【０１８９】
【表１】
2015520182.tif 000002
【０１９０】
【表２】
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【０１９１】
【表３】
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【０１９２】
【表４】
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【０１９３】
【表５】
2015520182.tif 000006
【０１９４】
実施例２：ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体は、ＣＦＡの足蹠注射によって誘導された足の急性炎症性痛覚過敏を回復させる。
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）をマウスの後足に足蹠注射することによって、荷重法を用いて評価することができる急性炎症性痛覚過敏を引き起こす。ナイーブマウスは通常、体重を２本の後足に等分に分配する。しかし、ＣＦＡを注射した後足が炎症を起こして痛みがある場合、注射した足（同側）にかかる体重を少なくし、注射していない（反対側）の後足にかかる体重を増加させるように体重は再配分される。
【０１９５】
方法
各後肢にかかる荷重の測定は、インキャパシタンステスターを用いて測定した（Ｌｉｎｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）。マウスを両足圧力差痛覚測定機に置いて、後足を別々のセンサの上に載せ、両後肢によって生じる平均力を２秒間記録した。ナイーブＡＭＢ１マウスは、ホームケージの処置室に馴化させ、食べ物および水は自由に取らせた。ＡＭＢ１マウスは、マウスＴｒｋＡのエキソン１をヒトＴｒｋＡのエキソン１と置き換えることによって作製したもので、それ自体はもっぱらヒトＴｒｋＡタンパク質のみを発現する。両足圧力差痛覚測定機への慣化は、数日間かけて行った。基準となる荷重は、傷害を誘導する前に記録した。炎症性痛覚過敏は、ＣＦＡ（１．５ｍｇ／ｍｌ溶液２０μｌ）を左後足に足蹠注射することによって誘導した。処置前の荷重は、ＣＦＡの２３時間後の痛覚過敏を評価するために読み取った。次に、動物は、ラテン方格法のＣＦＡウインドウにしたがって順位付けし、無作為化した。ＣＦＡの２４時間後、動物をアイソタイプ対照０．１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．または抗体ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐ、０．０００１、０．００１、０．０１および０．１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．（１０ｍｌ／ｋｇ用量体積）の単回ｉ．ｐ．注射で処置した。非選択的ＮＳＡＩＤインドメタシンを陽性対照として１０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．（５ｍｌ／ｋｇ用量体積）で使用した。荷重は、抗体／薬物処理の４、８、２４、４８、７２、９６および１２０時間後に読み取った。
【０１９６】
行動評価はブラインドで行った。荷重（ｇ）は、同側および反対側後足両方で読み取り、％荷重差（％同側／反対側）で表した。データは、各時点で処理群をアイソタイプ対照群と比較することによって分析した。統計学的分析は、反復測定ＡＮＯＶＡに次いでＩｎＶｉｖｏＳｔａｔを使用した計画的比較試験として行った（ｐ＜０．０５は有意と見なした）。
【０１９７】
結果
ＣＦＡの足蹠注射によって、ＣＦＡの２３時間後に、同側から反対側後足へ荷重がシフトし、％同側／反対側比の下降が生じることによって検出されたように、著しい痛覚過敏が誘導された（図４）。ＣＦＡの２４時間後に開始したアイソタイプ対照による処置では、痛覚過敏に対する影響は示されなかった。痛覚過敏の著しい回復は、アイソタイプ対照と比較した場合、投与の４〜４８時間後に抗体ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐの０．０１および０．１ｍｇ／ｋｇで観察された。抗体ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐの０．００１ｍｇ／ｋｇ以下の用量は、痛覚過敏を回復させるのに効果がなかった。インドメタシン（１０ｍｇ／ｋｇ）は、試験した時点全てにおいて痛覚過敏の有意な回復を示した。結論として、抗体ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐは、インドメタシンと類似の足の急性炎症性痛覚過敏の有意な回復をもたらした。さらに、投与したＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐの有効用量（０．０１および０．１ｍｇ／ｋｇ）は、インドメタシンの有効用量（１０ｍｇ／ｋｇ）よりも何倍も少なく、抗ＴｒｋＡ抗体がこの症状に対する標準的治療よりもはるかに低い用量で投与できることを示している。
【０１９８】
実施例３：ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体は、ＣＦＡの関節内注射によって誘導された膝関節の慢性炎症性痛覚過敏を回復させる。
ＣＦＡをマウスの後肢膝関節の１つに関節内注射することによって、荷重法を用いて評価することができる慢性炎症性痛覚過敏が誘導する。ＣＦＡを注射した関節が炎症を起こして痛みがある場合、注射した（同側）関節の脚にかかる重量を少なくし、注射していない（反対側）関節の脚にかかる重量を増加させるように重量は再配分される。この動物モデルにおけるこれらの徴候の発症は、変形関節炎および関節リウマチなどの基礎症状に関連した慢性炎症性関節痛を呈する患者が示す症状を反映しているので、臨床的に関連があると考えられている。
【０１９９】
方法
ナイーブＡＭＢ１マウスは、ホームケージの処置室に馴化させ、食べ物および水は自由に取らせた。ＡＭＢ１マウスは、マウスＴｒｋＡのエキソン１をヒトＴｒｋＡのエキソン１と置き換えることによって作製したもので、それ自体はもっぱらヒトＴｒｋＡタンパク質のみを発現する。両足圧力差痛覚測定機への慣化を行った。基準となる荷重は、ＣＦＡ注射直前に読み取った。動物は、滅菌状態で３：１に混合したイソフルランおよび酸素を用いて麻酔した。膝領域を剪毛し、希釈したヒビスクラブ溶液で清潔にした。左膝に１０ｍｇ／ｍｌＣＦＡを１０μｌ注射した。動物は、ホームケージに戻す前に暖かい環境で回復させた。ＣＦＡの４、７および１０日後に、荷重法を用いて動物の炎症性痛覚過敏の発症を評価した。ＣＦＡの１０日後の測定に基づいて、動物を順位付けし、ＣＦＡウインドウにしたがって処置群に無作為化した。ＣＦＡの１３日後に、痛覚過敏が十分に確立されたら、動物は、アイソタイプ対照抗体１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．または抗体ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐ、０．０１、１および１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．のいずれかの単回注射で処置した。ＣＯＸ−２選択的ＮＳＡＩＤセレコキシブを陽性対照として６０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．で１日２回使用した。抗体処置群では、荷重は投与して４、８、２４および９６時間後に測定した。セレコキシブ処置群では、荷重はＣＦＡの１３日後の投与の１および８時間後、次いでＣＦＡの１４〜１７日後の投与の１時間後に測定した。行動評価はブラインドで行った。荷重（ｇ）は、同側および反対側後肢の両方で読み取り、％荷重差（％同側／反対側）として表した。データは、各時点で処理群をアイソタイプ対照群と比較することによって分析した。統計学的分析は、反復測定ＡＮＯＶＡ、次いでＩｎＶｉｖｏＳｔａｔを使用した計画的比較試験として行った（ｐ＜０．０５は有意と見なした）。
【０２００】
結果
ＣＦＡの膝関節への注射によって、同側から反対側後肢へ荷重がシフトし、％同側／反対側比の下降が生じることによって検出されたように、３日目以降から著しくて長期継続する痛覚過敏が引き起こされた（図５）。アイソタイプ対照抗体処置は、痛覚過敏に対する影響を有さなかった。治療経過中、投与して１時間後ではセレコキシブ（６０ｍｇ／ｋｇ）による痛覚過敏の有意な回復が見られた。痛覚過敏の有意な回復は、投与の４〜７２時間後に抗体ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐの０．０１、１および１０ｍｇ／ｋｇの単回注射で観察され、アイソタイプ対照と比較したとき、最も高い２用量のみが９６時間後に有意であった。結論として、抗体ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐの０．０１ｍｇ／ｋｇ以上の単回投与は、セレコキシブの複数回投与と類似の、膝関節の慢性炎症性痛覚過敏の有意で、持続した回復をもたらした。さらに、セレコキシブ６０ｍｇ／ｋｇの複数回投与に相当する効果を実現するために必要なのは、抗体ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐの０．０１ｍｇ／ｋｇの単回投与のみであり、抗体ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐは、現在の標準的治療法であるＮＳＡＩＤセレコキシブよりもずっと低い用量、少ない頻度で与えることができることを示している。
【０２０１】
実施例４：ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体は、ＭＩＡの関節内注射によって誘導された膝関節の慢性骨関節炎性痛覚過敏を回復させる。
ヨード酢酸１ナトリウム（ＭＩＡ）をマウス膝関節に間接内注射することによって、軟骨分解を伴った局所関節炎に付随する慢性痛覚過敏の発症を引き起こした。このように、ＭＩＡモデルで測定された痛覚過敏は、骨関節炎関連疼痛によく似ている。さらに、軟骨分解は、神経障害に類似した特性の慢性神経障害を招く。抗痙攣薬であるプレガバリンは、神経因性疼痛の治療に推奨される第１選択の薬物であるので、本明細書ではプレガバリンを比較化合物として使用する。弱いμオピオイド受容体アゴニストであるトラマドールは、ＮＳＡＩＤとは対照的に、消化管出血または腎臓の問題を生じず、関節軟骨にも影響を及ぼさないので、ＯＡの治療にますます使用されている。このため、トラマドールは、プレガバリンと並んで抗体ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐの比較物として使用した。
【０２０２】
方法
ナイーブＡＭＢ１マウスは、ホームケージの処置室に馴化させ、食べ物および水は自由に取らせた。ＡＭＢ１マウスは、マウスＴｒｋＡのエキソン１をヒトＴｒｋＡのエキソン１と置換することによって作製し、それ自体はもっぱらヒトＴｒｋＡタンパク質のみを発現する。両足圧力差痛覚測定機への慣化は、数日間かけて行った。基準となる荷重を読み取って測定した。動物は、滅菌状態で３：１に混合したイソフルランおよび酸素を用いて麻酔した。膝領域を剪毛し、希釈したヒビスクラブ溶液で清潔にした。ＭＩＡ  １００ｍｇ／ｍｌの５μｌ（５００μｇ）または生理食塩水（疑似処置）を左後肢の膝関節に注射した。動物は、ホームケージに戻す前に暖かい環境で回復させた。ＭＩＡの３〜２３日後に、膝関節痛覚過敏の発症のために荷重を用いて、定期的な間隔で動物を評価した。ＭＩＡの１４日後に、荷重測定を行い、動物はＭＩＡ応答ウインドウにしたがって順位付けし、処置群に無作為化して、次いで抗体ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐの１、１０、１００μｇ／ｋｇまたはアイソタイプ対照抗体１００μｇ／ｋｇの単回ｉ．ｐ．注射（５ｍｌ／ｋｇ用量体積）で処置した。比較対照として、動物をＭＩＡの１４日後にトラマドール１０ｍｇ／ｋｇまたはプレガバリン３０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．（５ｍｌ／ｋｇ用量体積）、次いで、ＭＩＡの１６〜２２日後に１日おきにトラマドール３０ｍｇ／ｋｇまたはプレガバリン１００ｍｇ／ｋｇ（５ｍｌ／ｋｇ用量体積）で処置した。動物は全て、ＭＩＡの１４日後の投与の４、８および２４時間後に、次いで、抗体処置群では２４時間毎、トラマドールおよびプレガバリン処置群では投与の１および２４時間後に荷重を用いて評価した。行動評価はブラインドで行った。荷重（ｇ）は、同側および反対側後肢の両方で読み取り、％荷重差（％同側／反対側）として表した。データは、各時点において（ＭＩＡの３〜１４日後）、痛覚過敏に対するＭＩＡの効果を、処置群と疑似処置群とを比較することによって分析した。投与後のデータは、各時点で処置群をアイソタイプ対照群と比較することによって分析した。統計学的分析は、反復測定ＡＮＯＶＡ、次いでＩｎＶｉｖｏＳｔａｔを使用した計画的比較試験によって行った（ｐ＜０．０５は有意と見なした）。
【０２０３】
結果
ＭＩＡ５００μｇを膝関節に注射することによって、同側から反対側後肢へ荷重がシフトし、％同側／反対側比の下降が生じることによって検出されたように、３日目以降から著しい痛覚過敏が引き起こされた。痛覚過敏の有意な回復は、各時点でアイソタイプ対照と比較した場合、投与して４時間〜７日後の抗体ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐ、１０および１００μｇ／ｋｇの単回注射によって見られた（図６Ａ）。抗体ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐは、１μｇ／ｋｇでは痛覚過敏に対して効果がなかった。トラマドール（１０ｍｇ／ｋｇ）およびプレガバリン（３０ｍｇ／ｋｇ）は、ＭＩＡの１４日後の投与の１時間後では効果がなかったが、投与の４時間後で痛覚過敏の有意な回復を示した（図６Ｂ）。ＭＩＡの１４日後の投与の１時間後では効果がないので、トラマドールを３０ｍｇ／ｋｇに増加させ、プレガバリンを１００ｍｇ／ｋｇに増加させると、いずれもＭＩＡの１６、１８および２０日後の投与の１時間後で痛覚過敏の有意な回復を示した。結論として、抗体ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐの１０μｇ／ｋｇ以上の単回投与は、トラマドールおよびプレガバリンの複数回投与と類似の膝関節の慢性骨関節炎性痛覚過敏の有意で、持続した回復をもたらした。さらに、より高い用量（それぞれ３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ）で使用した２種類の薬物、トラマドールおよびプレガバリンの複数回投与に相当する効果を実現するために必要なのは、抗体ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐ  １０μｇ／ｋｇの単回投与のみであった。したがって、抗ＴｒｋＡ抗体はプレガバリンおよびトラマドールよりもずっと低い用量、少ない投与頻度で投与することができる。
【０２０４】
実施例５：ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体は坐骨神経の慢性狭窄損傷によって誘導された末梢神経因性痛覚過敏およびアロディニアを回復させる。
末梢神経因性疼痛は、末梢神経系の損傷、機能障害または疾患から生じる慢性形態の疼痛である。通常、痛覚過敏（疼痛刺激に対する強い応答）ならびにアロディニア（無痛刺激に対する疼痛応答）が含まれる。神経因性疼痛は、末梢神経の実験的損傷によって動物に誘導することができ、これは通常、坐骨神経を軽い結紮による慢性狭窄損傷（ＣＣＩ）によって実現される（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＆  Ｘｉｅ（１９９８）Ｐａｉｎ、３３：８７〜１０７）。プレガバリンは、神経因性疼痛の治療に推奨される第１選択の薬物であるので、本明細書ではプレガバリンを比較化合物として使用する。
【０２０５】
方法
ＣＣＩ手術は、雌雄ＡＭＢ１マウスにケタミンキシラジン（１００および１０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｌ、ｉ．ｐ．）麻酔下で行った。ＡＭＢ１マウスは、マウスＴｒｋＡのエキソン１をヒトＴｒｋＡのエキソン１と置き換えることによって作製し、それ自体はもっぱらヒトＴｒｋＡタンパク質のみを発現する。毛をクリップで挟んだ後、麻酔して左坐骨神経を中大腿部まで露出させた。坐骨神経の周りを神経分岐前１〜２ｍｍで軽く３本（４−０黒い絹糸を用いて）で結紮した。手術部位は、皮膚縫合後、ベタディン溶液で処置した。動物は翌７日間、回復させた。実験１日前に、動物を測定装置（冷たいプレート）に馴化させ、投与前の足の逃避行動閾値を記録した（０時間）。次に、動物を６つの群に再度群分けした。翌日、動物をアイソタイプ対照抗体（１０００μｇ／ｋｇ／１０ｍｌ）または様々な用量の抗体ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐ（１０、１００＆１０００μｇ／ｋｇ／１０ｍｌ）の単回ｉ．ｐ．注射で処置した。プレガバリン（３０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｌ、ｐ．ｏ．）、または生理食塩水は、投与期間後７日間にわたって１日１回投与した。投与後の読出しは、４時間後、２４時間後に記録し、その後投与して７日後までは１日おきに記録した。投与後の読出しは、プレガバリンまたは生理食塩水を投与して１時間後に毎日記録した。投与後の読出しは、まず物理的痛覚過敏を記録し、５分後に冷却によるアロディニアを記録した。物理的痛覚過敏は、ダイナミックプランター触覚測定機（Ｐｌａｎｔａｒ  Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ；Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ  Ｓｒｉ、Ｉｔａｌｙ）を用いて、足の逃避行動を惹起するために必要な力の閾値（ｇ）として測定した。冷却によるアロディニアは、冷たいプレートから足を逃避させるまでの秒による時間として測定した（ＩＩＴＣ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）。
【０２０６】
結果
ＣＣＩ手術の７日後に、足の逃避行動閾値の鋭い低下および足の逃避行動反応時間それぞれによってわかるように、マウスは著しい物理的痛覚過敏（図７Ａ）および冷却によるアロディニア（図７Ｂ）を示した。抗体ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐの全用量で、足の逃避行動閾値の上昇（図７Ａ）にみられるような物理的痛覚過敏および足の逃避行動反応の増加に見られるような冷却によるアロディニア（図７Ｂ）の回復がもたらされた。この回復の程度および持続期間は、明らかに用量依存的で、いずれの読出しも最高用量１ｍｇ／ｋｇ（１０００μｇ／ｋｇ）のプレガバリンに相当した。抗体ＧＢＲ  ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐのこの用量１ｍｇ／ｋｇは、単回投与として投与する場合、プレガバリン３０ｍｇ／ｋｇの複数回投与と比較して有効で、標準的治療のプレガバリンと比較して抗ＴｒｋＡ抗体に、より低用量で、より投与頻度が少なく投与することができることを再度示した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
2015520182.tif 000011
【図２Ｂ】
2015520182.tif 000012
【図２Ｃ】
2015520182.tif 000013
【図２Ｄ】
2015520182.tif 000014
【図２Ｅ】
2015520182.tif 000015
【図２Ｆ】
2015520182.tif 000016
【図２Ｇ】
2015520182.tif 000017
【図３Ａ】
2015520182.tif 000018
【図３Ｂ】
2015520182.tif 000019
【図３Ｃ】
2015520182.tif 000020
【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
2015520182.tif 000024
【図６Ａ】
2015520182.tif 000025
【図６Ｂ】
2015520182.tif 000026
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
2015520182000001.app
【国際調査報告】
2015520182.tif 000029
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