(57)【要約】  本開示は、カンナビノイド受容体活性の変化と関連している、膠芽腫、肝細胞癌腫、肝臓癌、結腸癌及び／又は肺癌などの障害又は疾患の治療を含めた、カンナビノイド（ＣＢ）受容体活性関連障害及び疾患、例えば、調節不全のＣＢ受容体を調節するための、フェノテロール類似体の使用の発見に関する。一例では、本方法は、ＣＢ受容体活性によって調節される障害若しくは疾患を有するか、又はそれを発症する危険性がある対象に、ＣＢ受容体活性によって調節される障害又は疾患と関連している１種又は複数の症状を低減するのに有効な量のフェノテロール類似体を投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンナビノイド（ＣＢ）受容体活性によって調節される障害又は疾患を治療する方法であって、
ＣＢ受容体活性によって調節される障害若しくは疾患を有するか、又はそれを発症する危険性がある対象に、ＣＢ受容体活性によって調節される障害又は疾患と関連している１種又は複数の症状を低減するのに有効な量の化合物を投与し、それによって、ＣＢ受容体活性によって調節される対象における障害又は疾患と関連している１種又は複数の症状を低減することを含み、前記化合物は、式
【化１】
2015519347.tif 000037
［式中、Ｒ１〜Ｒ３は独立に、水素、アシル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル（カルバモイル）又はそれらの組合せであり、
Ｒ４は、Ｈ又は低級アルキルであり、
Ｒ５は、
【化２】
2015519347.tif 000038
（式中、Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は独立に、水素、低級−ＯＲ６及び−ＮＲ７Ｒ８であり、
Ｒ６は、Ｈ又は低級アルキルであり、
Ｒ７及びＲ８は独立に、水素、低級アルキル、アルコキシカルボニル、アシル又はアミノカルボニルである）である］
を有し、前記化合物は光学活性である、上記方法。
【請求項２】
投与することが、治療上有効な量の化合物を投与することを含み、前記化合物内のＲ４が、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
投与することが、治療上有効な量の化合物を投与することを含み、前記化合物内のＲ４が、メチル基である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
投与することが、治療上有効な量の化合物を投与することを含み、前記化合物内のＲ６が、メチル基である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
投与することが、治療上有効な量の化合物を投与することを含み、前記化合物内のＲ５が、以下の構造：
【化３】
2015519347.tif 000039
のうち１種である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
投与することが、治療上有効な量の化合物を投与することを含み、前記化合物内のＲ１、Ｒ２及びＲ３が、水素である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
投与することが、治療上有効な量の（Ｒ，Ｒ’）−４’−メトキシ−１−ナフチルフェノテロール（ＭＮＦ）、（Ｒ，Ｓ’）−ＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−ナフチルフェノテロール（ＮＦ）、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＮＦ、（Ｒ，Ｓ’）−ＮＦ及び（Ｒ，Ｒ’）−４’−アミノ−１−ナフチルフェノテロール（アミノＮＦ）、（Ｒ，Ｒ’）−４’−ヒドロキシ−１−ナフチルフェノテロール（ヒドロキシＮＦ）又はそれらの組合せを投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
投与することが、治療上有効な量のＭＮＦ、ＮＦ又はそれらの組合せを投与することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
投与することが、治療上有効な量のＭＮＦを投与することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
治療上有効な量の化合物を投与する前に、ＣＢ受容体活性によって調節される障害若しくは疾患を有するか、又はそれを発症する危険性がある対象を選択することをさらに含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＢ受容体活性によって調節される障害若しくは疾患を有するか、又はそれを発症する危険性がある対象を選択することが、対象から得られたサンプルにおいて、ＣＢ受容体活性又は発現（又は両方）を測定することを含み、ＣＢ受容体活性又は発現（又は両方）の存在が、対象が、ＣＢ受容体活性によって調節される障害若しくは疾患を有するか、又はそれを発症する危険性があることを示す、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＢ活性によって調節される障害若しくは疾患を有するか、又はそれを発症する危険性がある対象を選択することが、治療上有効な量の化合物を投与する前に、β２−ＡＲ活性を標的とする治療に応答しない障害又は疾患を有する対象を選択することを含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＢ受容体を発現する腫瘍の治療において使用される、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
障害又は疾患が、ＣＢ受容体を発現する原発性脳腫瘍、ＣＢ受容体を発現する星状細胞腫、ＣＢ受容体を発現する膠芽腫、ＣＢ受容体を発現する肝細胞癌腫、結腸癌、肝臓癌及び肺癌からなる群から選択される、請求項１から１２までに記載の方法。
【請求項１５】
疾患又は障害と関連している１種又は複数の徴候又は症状を阻害することが、腫瘍若しくは癌細胞成長（又は両方）などの細胞成長、腫瘍体積又はそれらの組合せを阻害することを含む、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＣＢ受容体が、ＧＰＲ５５である、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
化合物の投与の前に、それと一緒に、又はその後などに、さらなる治療薬を投与することをさらに含む、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記さらなる治療薬が化学療法薬である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
治療上有効な量の化合物を投与することが、治療上有効な量の前記化合物を医薬上許容される担体とともに投与することを含む、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象がヒトである、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１２年５月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／６５１，９６１号及び２０１３年３月１５日に出願された第６１／７８９，６２９号の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、カンナビノイド受容体の分野、特に、特定のフェノテロール類似体の投与によって、カンナビノイド受容体活性の変化と関連している、膠芽腫、肝細胞癌腫、肝臓癌、結腸癌及び／又は肺癌などの障害又は疾患を治療することを含めた、カンナビノイド（ＣＢ）受容体活性関連障害及び疾患を調節する方法、例えば、ＣＢ受容体を活性化する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌は、米国では、冠動脈疾患に次いでヒトの死亡の２番目に多い原因である。世界中で、毎年、何百万人もの人が癌によって死亡している。アメリカ癌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）によって報告されたように、米国単独で、癌は、毎年５０万人をはるかに超える死亡を引き起こし、年に１２０万人を超える新規症例が診断されている。心疾患による死亡は、大幅に減少しているのに対し、癌に起因するものは、全体的に増加傾向にある。癌は、間もなく第１位の死因となると予測されている。脳癌及び肝臓癌を含めた多数の種類の癌に、有効な臨床治療がない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、特定のフェノテロール類似体は、カンナビノイド（ＣＢ）受容体モジュレーターであり、それだけには限らないが、ＣＢ受容体活性又は発現（又は両方）の変化、例えば、ＧＰＲ５５カンナビノイド受容体の発現又は活性（又は両方）の変化と関連している膠芽腫又は肝細胞癌腫を含めた腫瘍などの障害又は疾患を治療するために使用され得るという発見に関する。本発明者らは、特定のフェノテロール類似体の投与は、ＣＢ受容体を発現する腫瘍と関連している１種又は複数の徴候又は症状（腫瘍成長など）を阻害することを発見した。本発明者らは、この発見を使用して、ＣＢ受容体を発現する腫瘍、例えば、ＣＢ受容体を発現する膠芽腫又は肝細胞癌腫の治療を含めた、ＣＢ受容体によってモジュレートされる障害又は疾患を治療する、開示されている方法を開発した。
【０００５】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＢ受容体活性によって調節される障害若しくは疾患を有するか、又はそれを発症する危険性がある対象に、ＣＢ受容体活性によって調節される障害又は疾患と関連している１種又は複数の症状を低減するのに有効な量の化合物を投与し、それによって、ＣＢ受容体活性によって調節される対象における障害又は疾患と関連している１種又は複数の症状を低減することを含み、化合物は、式
【化１】
2015519347.tif 000002
【０００６】
［式中、Ｒ１〜Ｒ３は独立に、水素、アシル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル（カルバモイル）又はそれらの組合せであり、Ｒ４は、Ｈ又は低級アルキルであり、Ｒ５は、
【化２】
2015519347.tif 000003
（Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は独立に、水素、ハロゲン、ＳＨ、スルホキシド、スルホン、スルファンアミドを含めた硫黄含有部分並びに関連アルキル及び芳香族置換部分、低級−ＯＲ６及び−ＮＲ７Ｒ８であり、Ｒ６は、Ｈ又は低級アルキルであり、Ｒ７及びＲ８は独立に、水素、低級アルキル、アルコキシカルボニル、アシル又はアミノカルボニルである）である］を有し、化合物は光学活性である。
【０００７】
いくつかの実施形態では、投与することは、治療上有効な量の化合物を投与することを含み、化合物内のＲ４が、メチル、エチル、ｎ−プロピル及びイソプロピルから選択される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、投与することは、治療上有効な量の化合物を投与することを含み、化合物内のＲ４が、メチルである。
【０００９】
いくつかの実施形態では、投与することは、治療上有効な量の化合物を投与することを含み、化合物内のＲ６が、メチルである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、投与することは、治療上有効な量の化合物を投与することを含み、化合物内のＲ５が、
【化３】
2015519347.tif 000004
のうち１種である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、投与することは、治療上有効な量の化合物を投与することを含み、化合物内のＲ１〜Ｒ３が、水素である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、投与することは、治療上有効な量の（Ｒ，Ｒ’）−４’−メトキシ−１−ナフチルフェノテロール（ＭＮＦ）、（Ｒ，Ｓ’）−ＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−ナフチルフェノテロール（ＮＦ）、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＮＦ、（Ｒ，Ｓ’）−ＮＦ及び（Ｒ，Ｒ’）−４’−アミノ−１−ナフチルフェノテロール（アミノＮＦ）、（Ｒ，Ｒ’）−４’−ヒドロキシ−１−ナフチルフェノテロール（ヒドロキシＮＦ）又はそれらの組合せを投与することを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、投与することは、治療上有効な量のＭＮＦ、ＮＦ又はそれらの組合せを投与することを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、投与することは、治療上有効な量のＭＮＦを投与することを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＧＰＲ５５を発現する膠芽腫又は肝細胞癌腫などのＣＢ受容体によって調節される障害又は疾患を治療するための、ＣＢ受容体関連障害又は疾患を調節できる、開示されているフェノテロール類似体のいずれかと、医薬上許容される担体とを含有する治療上有効な量の医薬組成物を投与することを含む。例えば、開示されている（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ、（Ｒ，Ｓ’）−ＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−ＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＮＦ、（Ｒ，Ｓ’）−ＮＦ及び（Ｒ，Ｒ’）−アミノＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−ヒドロキシＮＦ又はそれらの組合せは、ＣＢ受容体を発現する膠芽腫又は肝細胞癌腫、例えば、ＧＰＲ５５を発現する膠芽腫又は肝細胞癌腫の治療において有効である。いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＢ受容体によって調節される障害若しくは疾患を有するか、又はそれを発症する危険性がある対象を選択することをさらに含む。例えば、対象が、ＧＰＲ５５発現などのＣＢ受容体発現と関連している障害又は腫瘍を決定することによって治療のために選択される。１つの特定の例では、本方法は、β２−ＡＲ機能の変化と関連していない障害及び／又は疾患を有する対象を選択することをさらに含む。例えば、障害又は疾患は、β２−ＡＲ活性を標的とする治療に応答しない。さらなる例では、本方法は、フェノテロール類似体又はその組合せに加えて１種又は複数の治療薬を投与することを含む。本方法は、例えば、フェノテロール類似体又はその組合せと組み合わされた組成物中で、１種又は複数の治療薬を個別、逐次又は同時に投与することを含み得る。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＢ受容体を発現する腫瘍の治療において使用するためのものである。例えば、障害又は疾患は、ＣＢ受容体を発現する原発性脳腫瘍、ＣＢ受容体を発現する膠芽腫、ＣＢ受容体を発現する肝細胞癌腫、結腸癌、肝臓癌及び肺癌からなる群から選択される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、疾患又は障害と関連している１種又は複数の徴候又は症状を阻害することは、腫瘍及び／若しくは癌細胞成長などの細胞成長、腫瘍体積又はそれらの組合せを阻害することを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＧＰＲ５５であるＣＢ受容体によって調節される障害又は疾患、例えば、糖尿病を治療するために使用される。
【００１９】
本開示の前記のもの並びにその他の特徴及び利点は、添付の図面を参照して進む、以下の詳細な説明から、より明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】β−アゴニスト刺激に曝露したＨｅｐＧ２細胞の応答を例示する図である。図１Ａは、完全培地で維持された、ＨｅｐＧ２（レーン１）及び１３２１Ｎ１（レーン２）細胞から調製され、ウエスタンブロット解析に付された可溶性抽出物のデジタル画像である。β２−アドレナリン受容体（β２−ＡＲ）及びβ−アクチンにおける細胞含量は、特異的一次抗体を使用して測定した。
【図１Ｂ】β−アゴニスト刺激に曝露したＨｅｐＧ２細胞の応答を例示する図である。図１Ｂは、フォルスコリンでのＨｅｐＧ２細胞におけるｃＡＭＰ蓄積の増大を例示し、（Ｒ）−イソプロテレノール（Ｉｓｏ）又は（Ｒ，Ｒ’）−フェノテロール（Ｆｅｎ）では増大しないことを例示する棒グラフである。示されるデータは、４連で実施された単回の研究から得られている。エラーバーは、単回の研究から得られた平均±Ｓ．Ｄ．を示す。図１Ｂにおいて示される研究は、２回反復し、匹敵する結果を得た。
【図１Ｃ】β−アゴニスト刺激に曝露したＨｅｐＧ２細胞の応答を例示する図である。図１Ｃは、免疫ブロットのデジタル画像である。血清を欠乏させたＨｅｐＧ２細胞を、（Ｒ）−イソプロテレノール（Ｉｓｏ；１μＭ）又は（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ（１μＭ）の存在下で５、１０及び３０分間インキュベートした。細胞溶解物を、リン酸化（Ｓｅｒ４７３）及び総Ａｋｔ並びにリン酸化ＥＲＫ１／２及び総ＥＲＫ２に対する抗体を用いて免疫ブロットした。図１Ｃにおいて示される研究は、２回反復し、匹敵する結果を得た。分子量マーカーの泳動（キロダルトンでの値）が、免疫ブロットの左に示されている。
【００２１】
【図２Ａ】細胞成長に対する（Ｒ）−イソプロテレノール、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ及び誘導体の効果が、細胞型特異的であることを例示する図である。血清を欠乏させたＨｅｐＧ２細胞を、媒体又は示された濃度の（Ｒ）−イソプロテレノール（Ｉｓｏ）、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ、（Ｒ，Ｒ’）−アミノＦｅｎ（ＮＨ２−ｆｅｎ）若しくは（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦとともに２４時間インキュベートし、［３Ｈ］−チミジン取り込みのレベルを測定した。代表的な用量反応曲線が、図２Ａに示されている。
【図２Ｂ】細胞成長に対する（Ｒ）−イソプロテレノール、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ及び誘導体の効果が、細胞型特異的であることを例示する図である。血清を欠乏させたＨｅｐＧ２細胞を、媒体又は示された濃度の（Ｒ）−イソプロテレノール（Ｉｓｏ）、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ、（Ｒ，Ｒ’）−アミノＦｅｎ（ＮＨ２−ｆｅｎ）若しくは（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦとともに２４時間インキュベートし、［３Ｈ］−チミジン取り込みのレベルを測定した。代表的な用量反応曲線が、図２Ｂに示されている。
【図２Ｃ】細胞成長に対する（Ｒ）−イソプロテレノール、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ及び誘導体の効果が、細胞型特異的であることを例示する図である。血清を欠乏させたＨｅｐＧ２細胞を、媒体又は示された濃度の（Ｒ）−イソプロテレノール（Ｉｓｏ）、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ、（Ｒ，Ｒ’）−アミノＦｅｎ（ＮＨ２−ｆｅｎ）若しくは（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦとともに２４時間インキュベートし、［３Ｈ］−チミジン取り込みのレベルを測定した。血清が枯渇した培地中のＨｅｐＧ２細胞及び完全培地中の１３２１Ｎ１細胞を、１μＭの化合物を用いて２４時間処置し、それらの結果が図２Ｃに示されている。
【図２Ｄ】細胞成長に対する（Ｒ）−イソプロテレノール、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ及び誘導体の効果が、細胞型特異的であることを例示する図である。血清を欠乏させたＨｅｐＧ２細胞を、媒体又は示された濃度の（Ｒ）−イソプロテレノール（Ｉｓｏ）、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ、（Ｒ，Ｒ’）−アミノＦｅｎ（ＮＨ２−ｆｅｎ）若しくは（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦとともに２４時間インキュベートし、［３Ｈ］−チミジン取り込みのレベルを測定した。図２Ｄは、ＨｅｐＧ２及び１３２１Ｎ１細胞を、示された濃度のＩｓｏ又は（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ（ｆｅｎ）の存在下で、血清を伴わずに（ＳＦＭ）、又は血清とともに（ＣＭ）インキュベートした場合の知見を例示する図である。対照に対する［３Ｈ］−チミジン取り込みの変化パーセントの定量化が、平均±ＳＥとして表されており、各々３連のディッシュで実施された２〜６つの独立した研究から得られた結果を表す。ほとんどの場合、エラーバーは記号よりも小さい。
【００２２】
【図３Ａ】β２−ＡＲアンタゴニストは、ＨｅｐＧ２細胞において（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの抗増殖作用を阻害しないということを実証する図である。血清が枯渇したＨｅｐＧ２細胞を、示された濃度のβ２−ＡＲアンタゴニスト、ＩＣＩ−１１８，５５１（ＩＣＩ）とともに、１時間インキュベートし、続いて、媒体を２４時間添加し、［３Ｈ］−チミジン取り込みのレベルを測定した。
【図３Ｂ】β２−ＡＲアンタゴニストは、ＨｅｐＧ２細胞において（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの抗増殖作用を阻害しないということを実証する図である。血清が枯渇したＨｅｐＧ２細胞を、示された濃度のβ２−ＡＲアンタゴニスト、ＩＣＩ−１１８，５５１（ＩＣＩ）とともに、１時間インキュベートし、続いて、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ（左のパネル）又は（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ（右のパネル）を２４時間添加し、［３Ｈ］−チミジン取り込みのレベルを測定した。（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ及び（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの代表的な用量反応曲線は、図３Ｂに示されている。
【図３Ｃ】β２−ＡＲアンタゴニストは、ＨｅｐＧ２細胞において（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの抗増殖作用を阻害しないということを実証する図である。図３Ｃは、平均±ＳＥとして対照に対する［３Ｈ］−チミジン取り込みの変化パーセントの定量化を例示する棒グラフであり、各々３連で実施された３つの独立した研究から得られた結果を表す。
【図３Ｄ】β２−ＡＲアンタゴニストは、ＨｅｐＧ２細胞において（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの抗増殖作用を阻害しないということを実証する図である。図３Ｄは、平均±ＳＥとして対照に対する［３Ｈ］−チミジン取り込みの変化パーセントの定量化を例示する棒グラフであり、各々３連で実施された３つの独立した研究から得られた結果を表す。
【００２３】
【図４】（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦが、ＨｅｐＧ２細胞においてサブ−Ｇ１事象の数を増加させることを例示する図である。血清が枯渇したＨｅｐＧ２細胞を、媒体、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ（１μＭ）又は（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ（１μＭ）を用いて６時間、１２時間又は２４時間処置した後に回収した。細胞を固定し、染色し、フローサイトメトリーを使用してＤＮＡ含量について分析した。媒体、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ又は（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦを用いて２４時間処置した後の、細胞周期の種々の相における代表的なＤＮＡ含量分析が示されている。死滅細胞又は後期アポトーシスにある細胞を表すサブ−Ｇ１事象の数を、各々２連で実施された２つの独立した研究から得られた結果を使用して処置期間の関数として定量化した（右下のパネル）。データは、平均±ＳＥとして表されている（ｎ＝４）。
【００２４】
【図５】（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦが、ＨｅｐＧ２細胞においてアポトーシスを誘導したフローサイトメトリー研究の結果を例示する図である。血清が枯渇したＨｅｐＧ２細胞を、媒体、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ（１μＭ）又は（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ（１μＭ）を用いて２４時間処置し、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて染色し、次いで、フローサイトメトリーによって分析した。代表的なプロフィールが示されている。アポトーシスであったアネキシンＶ陽性ＨｅｐＧ２細胞の割合を、各々２連で実施された２つの独立した研究から得られた結果を使用して定量化した（右下のパネル）。データは、平均±ＳＥとして表されている（ｎ＝４）。
【００２５】
【図６Ａ】ＨｅｐＧ２細胞における（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの抗増殖作用におけるカンナビノイド受容体活性化の役割を例示する図である。ＨｅｐＧ２、１３２１Ｎ１及びＵ８７ＭＧ細胞から全ＲＮＡを抽出し、次いで、ＰＣＲによって半定量的に分析した。非鋳型対照（ＮＴＣ）が含まれている（レーン１）。
【図６Ｂ】ＨｅｐＧ２細胞における（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの抗増殖作用におけるカンナビノイド受容体活性化の役割を例示する図である。血清が枯渇したＨｅｐＧ２細胞を、カンナビノイド受容体アゴニスト、ＷＩＮ５５，２１２−２（Ｗｉｎ；１μＭ）とともに１時間インキュベートし、続いて、媒体、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ（０．５μＭ）又は（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ（０．２５μＭ）を２４時間添加した。対照に対する［３Ｈ］−チミジン取り込みの変化パーセントの定量化が、平均±ＳＤとして表されており、各々３連のディッシュで実施された３つの独立した研究から得られた結果を表す。
【図６Ｃ】ＨｅｐＧ２細胞における（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの抗増殖作用におけるカンナビノイド受容体活性化の役割を例示する図である。血清が枯渇したＨｅｐＧ２細胞を、カンナビノイド受容体アンタゴニスト、ＡＭ２５１（１−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−ヨードフェニル）−４−メチル−Ｎ−１−ピペリジニル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド；１μＭ）又はＡＭ６３０（６−ヨード−２−メチル−１−［２−（４−モルホリニル）エチル］−１Ｈ−インドール−３−イル］（４−メトキシフェニル）メタノン、０．５μＭ）とともに１時間インキュベートし、続いて、媒体、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ（０．５μＭ）又は（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ（０．２５μＭ）を２４時間添加した。対照に対する［３Ｈ］−チミジン取り込みの変化パーセントの定量化が、平均±ＳＤとして表されており、各々３連のディッシュで実施された３つの独立した研究から得られた結果を表す。
【００２６】
【図７】β２−ＡＲアンタゴニスト、ＩＣＩ−１１８，５５１による（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ媒介性細胞増殖制御の選択的阻害を例示する一連のグラフである。ＨｅｐＧ２、１３２１Ｎ１及びＵ８７ＭＧ細胞を、β２−ＡＲアンタゴニスト、ＩＣＩ−１１８，５５１（ＩＣＩ、１μＭ）とともに１時間インキュベートし、続いて、媒体、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ（０．５μＭ）又は（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ（０．２５μＭ）を２４時間添加し、［３Ｈ］−チミジン取り込みのレベルを測定した。対照に対する［３Ｈ］−チミジン取り込みの変化パーセントの定量化が、平均±ＳＤとして表されており、各々３連のディッシュで実施された３つの独立した研究の結果を表す。
【００２７】
【図８Ａ】カンナビノイド受容体が、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎによる細胞増殖制御において役割を果たさないことを例示する棒グラフである。１３２１Ｎ１細胞を、カンナビノイド受容体アゴニスト、ＷＩＮ５５，２１２−２（Ｗｉｎ；０．５〜１μＭ）とともに１時間インキュベートし、続いて、媒体、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ（０．５μＭ）又は（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ（０．２５μＭ）を２４時間添加した。対照に対する［３Ｈ］−チミジン取り込みの変化パーセントの定量化は、平均±ＳＤとして表されており、各々３連で実施された、３つの独立した研究から得られた結果を表す。
【図８Ｂ】カンナビノイド受容体が、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎによる細胞増殖制御において役割を果たさないことを例示する棒グラフである。１３２１Ｎ１細胞を、カンナビノイド受容体アンタゴニスト、ＡＭ２５１（０．５〜１μＭ）又はＡＭ６３０（０．２５〜０．５μＭ）とともに１時間インキュベートし、続いて、媒体、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ（０．５μＭ）又は（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ（０．２５μＭ）を２４時間添加した。対照に対する［３Ｈ］−チミジン取り込みの変化パーセントの定量化は、平均±ＳＤとして表されており、各々３連で実施された、３つの独立した研究から得られた結果を表す。
【図８Ｃ】カンナビノイド受容体が、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎによる細胞増殖制御において役割を果たさないことを例示する棒グラフである。Ｕ８７ＭＧ細胞を、カンナビノイド受容体アゴニスト、ＷＩＮ５５，２１２−２（Ｗｉｎ；０．５〜１μＭ）とともに１時間インキュベートし、続いて、媒体、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ（０．５μＭ）又は（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ（０．２５μＭ）を２４時間添加した。対照に対する［３Ｈ］−チミジン取り込みの変化パーセントの定量化は、平均±ＳＤとして表されており、各々３連で実施された、３つの独立した研究から得られた結果を表す。
【図８Ｄ】カンナビノイド受容体が、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎによる細胞増殖制御において役割を果たさないことを例示する棒グラフである。Ｕ８７ＭＧ細胞を、カンナビノイド受容体アンタゴニスト、ＡＭ２５１（０．５〜１μＭ）又はＡＭ６３０（０．２５〜０．５μＭ）とともに１時間インキュベートし、続いて、媒体、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ（０．５μＭ）又は（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ（０．２５μＭ）を２４時間添加した。対照に対する［３Ｈ］−チミジン取り込みの変化パーセントの定量化は、平均±ＳＤとして表されており、各々３連で実施された、３つの独立した研究から得られた結果を表す。
【００２８】
【図９】ＨｅｐＧ２細胞におけるＴｏｃｒｉＦｌｕｏｒ１１１７（Ｔ１１１７）、蛍光性ＡＭ２５１類似体の細胞性取り込みを例示する図である。細胞を、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ（１μＭ）、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ（１μＭ）又はＡＭ２５１（１０μＭ）を用いて１時間処置し、続いて、Ｔ１１１７（０．１μＭ）を添加した。細胞を共焦点顕微鏡に取り付け、ＣＯ２を用いて３７℃で維持した。１時間まで３０秒毎に画像を撮った。
【００２９】
【図１０】ヒト及びラット肝臓ミクロソームでの（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの代謝的安定性を例示するグラフである。
【００３０】
【図１１】（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦによるシトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）阻害を例示する棒グラフである。ヒト肝臓ミクロソームを、８種の異なるＣＹＰ基質及び１又は１０μＭ  ＭＮＦとともにインキュベートした。１０μＭのＭＮＦは、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ３Ａ４を阻害すると決定した。一次代謝産物は、Ｏ−脱メチル化ＭＮＦであると決定した。
【００３１】
【図１２】（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの血漿及び脳組織濃度を例示するトレーシング図である。図１２は、１０ｍｇ／ｋｇ  ＭＮＦのＩＶ投与後３０分に得られた血漿サンプルの分析を例示する。ＭＮＦ及び図１２の挿入図中のＧｌｕｃ−ＭＮＦは、対照血漿マトリックス中に存在する干渉ピークを伴わずに示されている。
【図１３】（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの血漿及び脳組織濃度を例示するトレーシング図である。図１３は、１０ｍｇ／ｋｇ  ＭＮＦのＩＶ投与後３０分に得られた脳組織の分析を例示する。６．３９分のピークは、対照脳マトリックス中に存在する同定されていない化合物である（図１３の挿入図を参照のこと）。
【００３２】
【図１４】１０ｍｇ／ｋｇ  ＭＮＦ  ＩＶのＩＶ投与後の雄のスプラーグ−ドーリーラットの血漿及び脳におけるＭＮＦ濃度の時間経過であり、これでは、１時点あたり（血漿における１０分〜２４時間及び脳における１０〜６０分）ｎ＝３匹のラットである。脳組織におけるＭＮＦ濃度は、投与後１０分で２００ｎｇ／組織１ｍｇであり、３０分で８００ｎｇ／組織１ｍｇのピークに達した。血液（ｎｇ／ｍｌとして測定される）及び脳組織（ｎｇ／組織１ｍｇとして測定される）中のＭＮＦの濃度の間の相対分布は、中枢及び末梢身体区画の両方の間の同等の分布を反映して、１０分で０．２、３０分及び６０分で１．０であった。
【００３３】
【図１５】ＭＮＦが、テトラヒドロカンナビノールによってもたらされる効果（図１６中に示される）と比較して、中枢神経系に大幅な負の効果をもたらさないことを例示する一連の棒グラフである。
【００３４】
【図１６】中枢神経系機能に対するテトラヒドロカンナビノールの効果を例示する一連の棒グラフである。
【００３５】
【図１７】Ｈｅｐ３Ｂ細胞、ＰＣ３細胞又はＬＮ２２９細胞を含む９６ウェル培養プレートにおける［３Ｈ］−チミジン取り込みを例示する一連のグラフである。
【００３６】
【図１８Ａ】ＭＮＦが、ラットＣ６神経膠腫細胞系の増殖を低減することを例示する図である。細胞増殖アッセイを、漸増濃度のＭＮＦを用いて２４時間処置し、続いて、［３Ｈ］−チミジンを１６時間添加したラットＣ６神経膠腫細胞において実施した。
【図１８Ｂ】ＭＮＦが、ラットＣ６神経膠腫細胞系の増殖を低減することを例示する図である。細胞を選択的β２−ＡＲ遮断薬、ＩＣＩ−１１８，５５１（３ｎＭ）を伴わずに、又はそれとともに３０分間プレインキュベートし、続いて、媒体又は２０ｎＭのＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ若しくはイソプロテレノール（ＩＳＯ）を２４時間添加した。１６時間インキュベートした後［３Ｈ］−チミジンを測定した。バーは、３連のウェルで実施された単一実験の平均±ＳＤを表す。２〜３つの独立した実験において、同様の結果が得られた。
【図１８Ｃ】ＭＮＦが、ラットＣ６神経膠腫細胞系の増殖を低減することを例示する図である。Ｃ６神経膠腫細胞を、カンナビノイド受容体インバースアゴニスト、ＡＭ２５１（０．５及び１μＭ）及びＡＭ６３０（０．５μＭ）の存在下又は不在下で３０分間前処置し、続いて、媒体又は２０ｎＭ  ＭＮＦを２４時間添加した。１６時間インキュベートした後［３Ｈ］−チミジンを測定した。バーは、３連のウェルで実施された単一実験の平均±ＳＤを表す。２〜３つの独立した実験において、同様の結果が得られた。
【図１８Ｄ】２０ｎＭ  ＭＮＦを用いて４８時間インキュベートしたＣ６細胞について、細胞形態の変化を観察した。
【００３７】
【図１９Ａ】ＭＮＦが、ラットＣ６神経膠腫異種移殖片モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍成長を低減することを例示するグラフである。Ｃ６腫瘍を保有する雌のヌードマウスを、媒体又はＭＮＦ群のいずれかに無作為に割り当てた。ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｋｇ  ＭＮＦ又はシトラートのいずれかを、１週間につき５日、１９日間注射することによって処置を行った。腫瘍体積を毎日モニタリングし、最後の処置の翌日、マウスを屠殺した。媒体処置された、腫瘍を保有するマウスと比較した、ＭＮＦ処置動物の経時的な腫瘍体積が示されている（平均±ＳＥＭ；ｎ＝９〜１０）。
【図１９Ｂ】ＭＮＦが、ラットＣ６神経膠腫異種移殖片モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍成長を低減することを例示するグラフである。Ｃ６腫瘍を保有する雌のヌードマウスを、媒体又はＭＮＦ群のいずれかに無作為に割り当てた。ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｋｇ  ＭＮＦ又はシトラートのいずれかを、１週間につき５日、１９日間注射することによって処置を行った。腫瘍体積を毎日モニタリングし、最後の処置の翌日、マウスを屠殺した。２つのコホートの動物から得られた個々の結果が、血漿薬物濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）として表されている。媒体群の平均ＡＵＣ±ＳＥＭは、５４５０±５１８（ｎ＝１７）であり、ＭＮＦ：３２１７±２６５（ｎ＝１９）であった。示されるＰ値は、両側検定のものである。
【００３８】
【図２０Ａ】ＭＮＦ処置された、Ｃ６腫瘍を保有するマウスにおける遺伝子発現プロファイリングを例示する図である。ラットＣ６異種移植片における遺伝子クラスタリング：ＭＮＦ対媒体対照で処置したラットＣ６神経膠腫異種移殖片の主成分分析（ＰＣＡ）。ＰＣＡを、６種の独立したサンプル（３種のＭＮＦ、３種の対照）に適用し、番号は、個々のサンプル表示を指す。分析は、サンプルの処置群へのクラスタリングを示す。
【図２０Ｂ】ＭＮＦ処置された、Ｃ６腫瘍を保有するマウスにおける遺伝子発現プロファイリングを例示する図である。コホート番号１、コホート番号２及び組み合わされたコホート（１＋２）における、対照群と比較された、ＭＮＦ処置によって変化した１００種の遺伝子セットのクラスター分析を示す。
【図２０Ｃ】ＭＮＦ処置された、Ｃ６腫瘍を保有するマウスにおける遺伝子発現プロファイリングを例示する図である。対象の選択された遺伝子のＺ比が表されており、ＭＮＦ及び媒体処置群間の対比較後の上方制御又は下方制御された発現のいずれかを示す。
【図２０Ｄ】ＭＮＦ処置された、Ｃ６腫瘍を保有するマウスにおける遺伝子発現プロファイリングを例示する図である。ＭＮＦ及び媒体処置マウスに由来するＣ６異種移殖片腫瘍から全ＲＮＡを抽出し、定量的リアルタイムＰＣＲによって、Ｓｏｘ４、Ｏｌｉｇ１、Ｇａｌｎｔ３、Ｃｄｋｎ３、Ｃｃｎａ２及びＢｕｂ１ｂ  ｍＲＮＡレベルについて分析した（平均±ＳＤ；ｎ＝５〜６）。値は、ＧＡＰＤＨに対して標準化した。
【００３９】
【図２０Ｅ】Ｃ６腫瘍異種移植片におけるサイクリン発現に対するＭＮＦの負の影響を実証する図である。腫瘍サンプルから得られた溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ウエスタンブロッティングは、サイクリンＡ及びサイクリンＤに対して作製した一次抗体で実施した。膜を、ローディングコントロールとして働いたＨｓｐ９０に対して再検出した。上のパネル、代表的免疫ブロット；下のパネル、媒体及びＭＮＦ処置マウスから得られた異種移殖片腫瘍間のサイクリンＡ及びサイクリンＤ１発現における有意差を示すデータの散布図。両側スチューデントのｔ検定を使用して＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【図２０Ｆ】Ｃ６神経膠腫細胞を、２０ｎＭ  ＭＮＦとともに６及び２４時間インキュベートし、その後、溶解物を調製し、サイクリンＡ及びサイクリンＤ１について免疫ブロットした。膜を、ローディングコントロールとして働いたβ−アクチンについて再検出した。上のパネル、代表的なブロット；下のパネル、バーは、媒体処置した細胞における値を１．０に設定した、各ブロットの濃度測定による定量化を表す。バーは、３つの独立した研究から得られた平均±ＳＥＭを表す。ａ、ｂ：Ｐ＜０．０１の群間の有意差。
【００４０】
【図２１Ａ】ＨｅｐＧ２細胞におけるＴ１１１７の迅速な、飽和性取り込みを例示する図である。Ｔ１１１７の細胞侵入を、生細胞イメージングのための温度調節性チャンバーシステムを有するＺｅｉｓｓ７１０共焦点顕微鏡で測定した。血清が枯渇したＨｅｐＧ２細胞を、漸増濃度のＴ１１１７（２．５〜１００ｎＭ）の存在下でインキュベートした。規定の対象領域（ＲＯＩ）から、時間に対するシグナル強度のプロットを作製した。結果は、２〜３つの独立した研究から得られたものである。
【図２１Ｂ】ＨｅｐＧ２細胞におけるＴ１１１７の迅速な、飽和性取り込みを例示する図である。Ｔ１１１７の細胞侵入を、生細胞イメージングのための温度調節性チャンバーシステムを有するＺｅｉｓｓ７１０共焦点顕微鏡で測定した。Ｔ１１１７濃度に対する相対ＡＵＣデータが示されており、Ｔ１１１７−１００ｎＭ値を１に設定した。
【図２１Ｃ】ＨｅｐＧ２細胞におけるＴ１１１７の迅速な、飽和性取り込みを例示する図である。Ｔ１１１７の細胞侵入を、生細胞イメージングのための温度調節性チャンバーシステムを有するＺｅｉｓｓ７１０共焦点顕微鏡で測定した。Ｔ１１１７（１００ｎＭ）の細胞取り込みを、１００×モル過剰の非標識ＡＭ２５１の存在下で実施した。エラーバーは、２回反復し、匹敵する結果が得られた単一の研究から得られた平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３つのＲＯＩ）を示す。
【図２１Ｄ】ＨｅｐＧ２細胞におけるＴ１１１７の迅速な、飽和性取り込みを例示する図である。Ｔ１１１７の細胞侵入を、生細胞イメージングのための温度調節性チャンバーシステムを有するＺｅｉｓｓ７１０共焦点顕微鏡で測定した。ｔ＝１５分での代表的なイメージが示されている。バー、３０μｍ。
【００４１】
【図２２Ａ】Ｔ１１１７の細胞取り込みにおけるＧＰＲ５５の役割を例示する図である。ＨｅｐＧ２細胞を、ＣＢ１Ｒ、ＣＢ２Ｒ若しくはＧＰＲ５５のいずれかに対するｓｉＲＮＡオリゴ又は非サイレンシングｓｉＲＮＡ対照を用いて４８時間トランスフェクトした。細胞を、血清不含培地で３時間維持し、続いて、Ｔ１１１７を添加した。規定のＲＯＩから、シグナル強度対時間のプロットを作製した。エラーバーは、各々、３〜４つのＲＯＩを用いて実施した２つの独立した研究の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
【図２２Ｂ】Ｔ１１１７の細胞取り込みにおけるＧＰＲ５５の役割を例示する図である。相対ＡＵＣデータ、対照ｓｉＲＮＡ値を１に設定した。
【図２２Ｃ】Ｔ１１１７の細胞取り込みにおけるＧＰＲ５５の役割を例示する図である。血清が枯渇したＨｅｐＧ２細胞を、媒体（０．０１％ＤＭＳＯ）、ＡＭ６３０（１μＭ）又はＷＩＮ５５，２１２−２（１μＭ）で１時間処置し、続いて、Ｔ１１１７を添加した。エラーバーは、２回反復し、匹敵する結果が得られた単一の研究から得られた平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３つのＲＯＩ）を示す。
【図２２Ｄ】Ｔ１１１７の細胞取り込みにおけるＧＰＲ５５の役割を例示する図である。血清が枯渇したＨｅｐＧ２細胞を、媒体（０．０１％ＤＭＳＯ）、ＣＰ５５，９４０（０．２５μＭ）又はＯ−１６０２（［５−メチル−４−［（１Ｒ，６Ｒ）−３−メチル−６−（１−メチルエテニル）−２−シクロヘキセン−１−イル］−１，３−ベンゼンジオール；０．２５μＭ）を用いて３０分間処置し、続いて、１０ｎＭ  Ｔ１１１７を添加した。エラーバーは、２回反復し、匹敵する結果が得られた単一の研究から得られた平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３つのＲＯＩ）を示す。
【００４２】
【図２３Ａ】Ｔ１１１７の細胞性取り込みに対するＭＮＦの効果を例示する図である。血清が枯渇したＨｅｐＧ２細胞を、ＭＮＦ（１μＭ）若しくはＡＭ２５１（１０μＭ）を用いて、又は用いずに３０分間前処置し、続いて、媒体（０．１％ＤＭＳＯ）、ＡＭ２５１又はＭＮＦをさらに３０分間添加した。次いで、細胞を１０ｎＭ  Ｔ１１１７とともにインキュベートした。図２３Ａ：規定のＲＯＩから、シグナル強度対時間のプロットを作製した。エラーバーは、各々３〜４つのＲＯＩを用いて実施した、２つの独立した研究の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
【図２３Ｂ】Ｔ１１１７の細胞性取り込みに対するＭＮＦの効果を例示する図である。血清が枯渇したＨｅｐＧ２細胞を、ＭＮＦ（１μＭ）若しくはＡＭ２５１（１０μＭ）を用いて、又は用いずに３０分間前処置し、続いて、媒体（０．１％ＤＭＳＯ）、ＡＭ２５１又はＭＮＦをさらに３０分間添加した。次いで、細胞を１０ｎＭ  Ｔ１１１７とともにインキュベートした。図２３Ｂ：相対ＡＵＣデータ、ＤＭＳＯ値を１に設定した。
【図２３Ｃ】Ｔ１１１７の細胞性取り込みに対するＭＮＦの効果を例示する図である。血清が枯渇したＰＡＮＣ−１細胞を、ＭＮＦ（１μＭ）若しくはＡＭ２５１（１０μＭ）を用いて、又は用いずに３０分間前処置し、続いて、媒体（０．１％ＤＭＳＯ）、ＡＭ２５１又はＭＮＦをさらに３０分間添加した。次いで、細胞を１０ｎＭ  Ｔ１１１７とともにインキュベートした。図２３Ｃ：規定のＲＯＩから、シグナル強度対時間のプロットを作製した。エラーバーは、各々３〜４つのＲＯＩを用いて実施した、２つの独立した研究の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
【図２３Ｄ】Ｔ１１１７の細胞性取り込みに対するＭＮＦの効果を例示する図である。血清が枯渇したＰＡＮＣ−１細胞を、ＭＮＦ（１μＭ）若しくはＡＭ２５１（１０μＭ）を用いて、又は用いずに３０分間前処置し、続いて、媒体（０．１％ＤＭＳＯ）、ＡＭ２５１又はＭＮＦをさらに３０分間添加した。次いで、細胞を１０ｎＭ  Ｔ１１１７とともにインキュベートした。図２３Ｄ：相対ＡＵＣデータ、ＤＭＳＯ値を１に設定した。
【００４３】
【図２４Ａ】ＭＮＦが、ＧＰＲ５５のリガンド誘導性内部移行を損なうことを示す図である。３ｘＨＡタグが付けられたｈＧＰＲ５５ベクターで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、血清を欠乏させ、次いで、ＭＮＦ（１μＭ）の不在下又は存在下、３７℃で４５分間、抗ＨＡ抗体とともにインキュベートした。十分に洗浄した後、Ｏ−１６０２（５μＭ）を、３７℃で２０分間細胞に添加して、ＧＰＲ５５内部移行を促進した。無傷の細胞を固定し、次いで、抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８抗体とともにインキュベートして、細胞表面ＧＰＲ５５を標識した。透過処理ステップの後、抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８抗体を添加して、細胞内ＧＰＲ５５を検出した。ＤＡＰＩを用いて核を対比染色した。スケールバー＝２０μｍ。
【図２４Ｂ】ＭＮＦが、ＧＰＲ５５のリガンド誘導性内部移行を損なうことを示す図である。３ｘＨＡタグが付けられたｈＧＰＲ５５ベクターで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、血清を欠乏させ、次いで、ＭＮＦ（１μＭ）の不在下又は存在下、３７℃で４５分間、抗ＨＡ抗体とともにインキュベートした。十分に洗浄した後、Ｏ−１６０２（５μＭ）を、３７℃で２０分間細胞に添加して、ＧＰＲ５５内部移行を促進した。無傷の細胞を固定し、次いで、抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８抗体とともにインキュベートして、細胞表面ＧＰＲ５５を標識した。透過処理ステップの後、抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８抗体を添加して、細胞内ＧＰＲ５５を検出した。ＤＡＰＩを用いて核を対比染色した。スケールバー＝２０μｍ。
【００４４】
【図２５Ａ】ＭＮＦによるＧＰＲ５５下流シグナル伝達における障害を例示する図である。血清が枯渇したＨｅｐＧ２細胞を、ＭＮＦ（１μＭ）の存在下で１０分間前処置し又は処置せず、続いて、媒体、Ｏ−１６０２（２．５及び１０μＭ）又は１０％ＦＢＳをさらに１０分間添加した。細胞溶解物を調製し、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分離し、総ＥＲＫ及びＥＲＫのホスホ活性（ｐｈｏｓｐｈｏａｃｔｉｖｅ）型について免疫ブロットした。図２５Ａ：代表的免疫ブロット。分子量マーカーの泳動（キロダルトンでの値）が、免疫ブロットの左に示されている。
【図２５Ｂ】ＭＮＦによるＧＰＲ５５下流シグナル伝達における障害を例示する図である。血清が枯渇したＨｅｐＧ２細胞を、ＭＮＦ（１μＭ）の存在下で１０分間前処置し又は処置せず、続いて、媒体、Ｏ−１６０２（２．５及び１０μＭ）又は１０％ＦＢＳをさらに１０分間添加した。細胞溶解物を調製し、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分離し、総ＥＲＫ及びＥＲＫのホスホ活性型について免疫ブロットした。図２５Ｂ：ホスホ−ＥＲＫ１／２バンドは、総ＥＲＫ２に対して標準化し、Ｏ−１６０２−１０μＭ値を１に設定した。データは、２つの独立したディッシュの平均±範囲である。
【図２５Ｃ】ＭＮＦによるＧＰＲ５５下流シグナル伝達における障害を例示する図である。血清が枯渇したＰＡＮＣ−１細胞を、ＭＮＦ（１μＭ）の存在下で１０分間前処置し又は処置せず、続いて、媒体、Ｏ−１６０２（２．５及び１０μＭ）又は１０％ＦＢＳをさらに１０分間添加した。細胞溶解物を調製し、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分離し、総ＥＲＫ及びＥＲＫのホスホ活性型について免疫ブロットした。図２５Ｃ：代表的免疫ブロット。分子量マーカーの泳動（キロダルトンでの値）が、免疫ブロットの左に示されている。
【図２５Ｄ】ＭＮＦによるＧＰＲ５５下流シグナル伝達における障害を例示する図である。血清が枯渇したＰＡＮＣ−１細胞を、ＭＮＦ（１μＭ）の存在下で１０分間前処置し又は処置せず、続いて、媒体、Ｏ−１６０２（２．５及び１０μＭ）又は１０％ＦＢＳをさらに１０分間添加した。細胞溶解物を調製し、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分離し、総ＥＲＫ及びＥＲＫのホスホ活性型について免疫ブロットした。図２５Ｄ：ホスホ−ＥＲＫ１／２バンドは、総ＥＲＫ２に対して標準化し、Ｏ−１６０２−１０μＭ値を１に設定した。データは、２つの独立したディッシュの平均±範囲である。
【００４５】
【図２６Ａ】ＭＮＦが、細胞形態及びＥＧＦＲの発現の誘導可能な変化を干渉することを示す図である。血清を欠乏させたＨｅｐＧ２細胞を、ＤＭＳＯ（０．１％）又はＭＮＦ（１μＭ）の存在下で３０分間プレインキュベートし、続いて、ＡＭ２５１（５μＭ）又はＯ−１６０２（５μＭ）を１６時間添加した。未刺激のＰＡＮＣ−１細胞は、ＭＮＦを用いた場合も用いない場合も立方状の形態を示した。白色矢印は、糸状仮足を有する個々の細胞を示す。
【図２６Ｂ】ＭＮＦが、細胞形態及びＥＧＦＲの発現の誘導可能な変化を干渉することを示す図である。血清を欠乏させたＰＡＮＣ−１細胞を、ＤＭＳＯ（０．１％）又はＭＮＦ（１μＭ）の存在下で３０分間プレインキュベートし、続いて、ＡＭ２５１（５μＭ）又はＯ−１６０２（５μＭ）を１６時間添加した。未刺激のＰＡＮＣ−１細胞は、ＭＮＦを用いた場合も用いない場合も立方状の形態を示した。白色矢印は、糸状仮足を有する個々の細胞を示す。
【図２６Ｃ】ＭＮＦが、細胞形態及びＥＧＦＲの発現の誘導可能な変化を干渉することを示す図である。同様の研究から細胞溶解物を調製し、ＥＧＦＲについて免疫ブロットした。膜をローディングコントロールとして働いたＨｓｐ９０について再検出した。
【００４６】
【図２７Ａ】ＭＮＦが、創傷治癒アッセイにおいて、ＨｅｐＧ２及びＰＡＮＣ−１細胞のリガンド誘導性運動性を阻害することを示す図である。コンフルエントなＨｅｐＧ２細胞を、掻創に付した。細胞を、ＤＭＳＯ（０．１％）又はＧＰＲ５５アゴニストＡＭ２５１（１μＭ）の存在下で３０分間インキュベートし、続いて、示される場合にＭＮＦ（１μＭ）を添加した。種々の時点で画像を撮った。図２７Ａ：相対創傷表面積を、経時的に測定し、プロットし、時間０での値を１に設定した。
【図２７Ｂ】ＭＮＦが、創傷治癒アッセイにおいて、ＨｅｐＧ２及びＰＡＮＣ−１細胞のリガンド誘導性運動性を阻害することを示す図である。コンフルエントなＨｅｐＧ２細胞を、掻創に付した。細胞を、ＤＭＳＯ（０．１％）又はＧＰＲ５５アゴニストＡＭ２５１（１μＭ）の存在下で３０分間インキュベートし、続いて、示される場合にＭＮＦ（１μＭ）を添加した。種々の時点で画像を撮った。図２７Ｂ：２４時間の時点での４つの独立した観察の相対創傷表面積がプロットされている。＊Ｐ＜０．０５。
【図２７Ｃ】ＭＮＦが、創傷治癒アッセイにおいて、ＨｅｐＧ２及びＰＡＮＣ−１細胞のリガンド誘導性運動性を阻害することを示す図である。コンフルエントなＰＡＮＣ−１細胞を、掻創に付した。細胞を、ＤＭＳＯ（０．１％）又はＧＰＲ５５アゴニストＡＭ２５１（１μＭ）の存在下で３０分間インキュベートし、続いて、示される場合にＭＮＦ（１μＭ）を添加した。種々の時点で画像を撮った。図２７Ｃ：相対創傷表面積を、経時的に測定し、プロットし、時間０での値を１に設定した。
【図２７Ｄ】ＭＮＦが、創傷治癒アッセイにおいて、ＨｅｐＧ２及びＰＡＮＣ−１細胞のリガンド誘導性運動性を阻害することを示す図である。コンフルエントなＰＡＮＣ−１細胞を、掻創に付した。細胞を、ＤＭＳＯ（０．１％）又はＧＰＲ５５アゴニストＡＭ２５１（１μＭ）の存在下で３０分間インキュベートし、続いて、示される場合にＭＮＦ（１μＭ）を添加した。種々の時点で画像を撮った。図２７Ｄ：２４時間の時点での４つの独立した観察の相対創傷表面積がプロットされている。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００４７】
【図２８Ａ】５’−ＴＡＭＲＡ−３−フェニルプロパン−１−アミン（ＴＡＭＲＡ−ＰＰＡ）及びＴ１１１７の構造を提供する図である。
【００４８】
【図２８Ｂ】ＴＡＭＰＲＡ−ＰＰＡイオンの質量スペクトルを提供する図であり、ｍ／ｚは、５４８．０に相当する。
【００４９】
【図２８Ｃ】血清が枯渇したＨｅｐＧ２細胞におけるＴ１１１７（１０ｎＭ）対ＴＡＭＲＡ−ＰＰＡ（２０ｎＭ）の細胞蓄積の比較を提供する図である。細胞におけるＴＡＭＲＡ−ＰＰＡ取り込みがないことに留意されたい。
【００５０】
【図２９Ａ】代表的な創傷治癒アッセイの取り込み画像である。コンフルエントなＨｅｐＧ２細胞を、掻創に付し、図２７Ａ〜２７Ｄについて上記のように処置した。４つの独立したアッセイにおいて同様のプロフィールが得られた。
【図２９Ｂ】代表的な創傷治癒アッセイの取り込み画像である。コンフルエントなＰＡＮＣ−１細胞を、掻創に付し、図２７Ａ〜２７Ｄについて上記のように処置した。４つの独立したアッセイにおいて同様のプロフィールが得られた。
【図２９Ｃ】代表的な創傷治癒アッセイの取り込み画像である。コンフルエントなＨｅｐＧ２及びＰＡＮＣ−１細胞を、掻創に付した。細胞を非定型カンナビノイドＯ−１６０２（１μＭ）の存在下で３０分間インキュベートし、続いて、媒体（ＤＭＳＯ、０．１％）又はＭＮＦ（１μＭ）を添加した。種々の時点で画像を撮った。２４時間の時点での相対創傷表面積がプロットされている。＊＊Ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
Ｉ．導入
【００５２】
ＭＮＦなどの特定のフェノテロール類似体が、膠芽腫腫瘍細胞、肝細胞癌腫細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞及び肝臓癌細胞を含めた種々の種類の腫瘍細胞の成長を阻害するという知見が本明細書において開示されている。特に、本発明者らは、フェノテロール類似体を特性決定し、その可能性ある治療活性を決定するための一連の研究を実施した。ＭＮＦは、ヒト由来肝細胞癌腫細胞（ＨｅｐＧ２）並びにヒト（Ｕ８７ＭＧ）及びラット（Ｃ６）由来膠芽腫細胞の成長を阻害することが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションを使用して、及びヌードマウス中の側腹部に移植されたＣ６異種移殖片においてｉｎ  ｖｉｖｏで観察された。これらの結果は、ＭＮＦがβ２−ＡＲアゴニストであり、このクラスの化合物は、ＨｅｐＧ２細胞において細胞成長を増大することがわかっていたので、予期しないものであった。結合及び機能的研究を実施し、これらによって、ＭＮＦが、ＧＰＲ５５カンナビノイド受容体の阻害剤として作用し、したがって、この標的に向けられる第１の可能性ある薬物の１種に相当するということが示された。最初のｐＫ研究によって、この化合物が血液脳関門を通過することが実証され、最初の毒性研究によって、この薬物が、的外れの効果をほとんど有さないことが示された。β２−ＡＲアゴニスト特性は陽性指標であり、ＭＮＦが心保護効果を有し得ることを示唆する。ＭＮＦはまた、それだけには限らないが、結腸癌細胞、肺癌細胞及び肝臓癌細胞を含めたさらなる種類の腫瘍細胞成長を大幅に阻害できるとわかった。さらに、（Ｒ，Ｒ’）−１−ナフチルフェノテロール（ＮＦ）などのさらなるフェノテロール化合物が、肝細胞癌腫細胞成長を阻害することがわかった。したがって、発見の本質は、ＣＢ受容体関連障害及び疾患、特に、現在有効な治療がない脳癌及び肝臓癌を含めたＧＲＰ５５関連障害及び疾患を治療するために使用され得る新規クラスの化合物の同定である。これらの知見に基づいて、ＣＢ受容体活性を調節し、ＧＲＰ５５活性又は発現（又は両方）などのＣＢ受容体活性又は発現（又は両方）によってモジュレートされる障害及び疾患を治療する方法が開示されている。
【００５３】
ＩＩ．略語及び用語
【００５４】
略語
ＡＫＡＰ：Ａ−キナーゼアンカリングタンパク質
ＡＭ２５１：１−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−ヨードフェニル）−４−メチル−Ｎ−（１−ピペリジル）ピラゾール−３−カルボキサミド
ＡＭ６３０：１−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−２−メチル−３−（４−メトキシベンゾイル）−６−ヨードインドール
ＡＲ：アドレナリン受容体
ＢＢＢ：血液脳関門
β２−ＡＲ：β２−アドレナリン受容体
ＣＢ：カンナビノイド
ＥＲＫ：細胞外調節性キナーゼ
Ｆｅｎ：フェノテロール
ＧＰＲ５５：Ｇタンパク質共役型受容体５５
ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質共役型受容体
ＨＰＬＣ：高性能液体クロマトグラフィー
ＩＡＭ−ＰＣ：固定化人工膜クロマトグラフィー支持体
ＩＣＩ１１８，５５１：３−（イソプロピルアミノ）−１−［（７−メチル−４−インダニル）オキシ］ブタン−２−オール
ＩＣＹＰ：［１２５Ｉ］シアノピンドロール
ＩＰ：腹膜内
ＩＶ：静脈内
ＭＮＦ：４−メトキシ−１−ナフチルフェノテロール
ＮＦ：ナフチルフェノテロール
ＯＧＴＴ：経口糖負荷試験
ＵＶ：紫外
【００５５】
用語
【００５６】
別に説明のない限り、本明細書において使用されたすべての技術用語及び科学用語は、開示されている主題が属する分野において当業者によって一般的に理解されているものと同一の意味を有する。化学における一般用語の定義は、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ、１９８５年及びＴｈｅ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、１９８１年に見出すことができる。
【００５７】
別に記載される場合を除いて、任意の定量的値は、単語「約」又は「およそ」などが記載されていようとそうでなかろうと、近似である。本明細書に記載される材料、方法及び実施例は、単に例示であって、制限であるよう意図されない。任意の分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）又は分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ）の値は、近似であり、単に説明のために提供される。別に記載される場合を除いて、本発明の方法及び技術は、当技術分野で周知であり、本明細書を通じて引用され、論じられる種々の一般的な参考文献及びより特定の参考文献に記載されるような従来法に従って一般に実施される。例えば、Ｌｏｕｄｏｎ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００２年、３６０〜３６１頁、１０８４〜１０８５頁；Ｓｍｉｔｈ及びＭａｒｃｈ、Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ、ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第５版、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年；又はＶｏｇｅｌ、Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、第４版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｌｏｎｇｍａｎ、１９７８年を参照のこと。
【００５８】
本明細書において開示されている種々の実施形態の再検討を容易にするために、以下の特定の用語の説明を提供する：
【００５９】
アシル：式ＲＣ（Ｏ）−（式中、Ｒは、有機基である）の基。
【００６０】
アシルオキシ：構造−ＯＣ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは、所望により置換されていてもよいアルキル又は所望により置換されていてもよいアリールであり得る）を有する基。「低級アシルオキシ」基とは、Ｒが、１〜１０個（例えば、１〜６個）の炭素原子を含有するものである。
【００６１】
投与：対象に、任意の有効な経路によって１種又は複数のフェノテロール類似体を含む医薬組成物などの組成物を提供又は与えること。例示的投与経路として、それだけには限らないが、注射（皮下、筋肉内、皮内、腹膜内（ＩＰ）及び静脈内（ＩＶ）など）、経口、舌下、直腸、経皮、鼻腔内、経膣及び吸入経路が挙げられる。
【００６２】
アルコキシ：構造−Ｏ−Ｒ（式中、Ｒは、置換又は非置換アルキルである）を有するラジカル（又は置換基）。メトキシ（−ＯＣＨ３）は、例示的アルコキシ基である。置換アルコキシでは、Ｒは、非干渉置換基で置換されたアルキルである。「チオアルコキシ」とは、−Ｓ−Ｒ（式中、Ｒは、置換又は非置換アルキルである）を指す。「ハロアルキルオキシ」とは、ラジカル−ＯＲ（式中、Ｒは、ハロアルキルである）を意味する。
【００６３】
アルコキシカルボニル：式−Ｃ（Ｏ）ＯＲ（式中、Ｒは、所望により置換されていてもよいアルキル又は所望により置換されていてもよいアリールであり得る）の基。「低級アルコキシカルボニル」基とは、Ｒが、１〜１０個（例えば、１〜６個）の炭素原子を含有するものである。
【００６４】
アルキル：別に明確に記載されない限り、１〜１５個の炭素原子；例えば、１〜１０個、１〜６個又は１〜４個の炭素原子を含有する、非環式、飽和、分岐又は直鎖炭化水素基。この用語は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル又はドデシルなどの基を含む。用語「低級アルキル」とは、１〜１０個の炭素原子を含有するアルキル基を指す。「非置換アルキル」と明確に呼ばれない限り、アルキル基は、非置換である場合も、置換されている場合もある。アルキル基は、１個又は複数の置換基（例えば、アルキル鎖中の各メチレン炭素について最大２個の置換基）で置換されてもよい。例示的アルキル置換基として、例えば、アミノ基、アミド、スルホンアミド、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、ヒドロキシ、メルカプト、トリフルオロメチル、アルキル、アルコキシ（メトキシなど）、アルキルチオ、チオアルコキシ、アリールアルキル、ヘテロアリール、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルファノ、ケト又はその他の官能基が挙げられる。
【００６５】
アミノカルボニル（カルバモイル）：式Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）Ｒ’（式中、Ｒ及びＲ’は互いに独立に、水素又は低級アルキル基である）の基。
【００６６】
抗糖尿病薬：それだけには限らないが、２型糖尿病と関連している症状を軽減する薬剤又は２型糖尿病の進行若しくは発症を減速する薬剤を含めた糖尿病を治療できる化学的又は医薬上の抗高血糖性薬剤又は薬物。抗糖尿病薬は、一般に６つのクラスに分類される：ビグアナイド；チアゾリジンジオン；スルホニル尿素；炭水化物吸収の阻害剤；脂肪酸オキシダーゼ阻害剤及び抗脂肪分解性薬物；並びに体重減少剤。抗糖尿病薬として、参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、２２（４）：６２３〜６３４（１９９９年）に開示されている薬剤が挙げられる。抗糖尿病薬の１つの一般定なクラスとして、スルホニル尿素があり、これは、インスリンの分泌を増大し、肝臓の糖新生を低減し、インスリン受容体感受性を増大すると考えられている。別のクラスの抗糖尿病薬として、ビグアナイド抗高血糖症薬があり、これは、高インスリン血症を誘導せずに、肝臓のグルコース産生及び腸管吸収を低減し、末梢のグルコース取り込み及び利用を増大する。いくつかの例では、抗糖尿病薬は、ＧＰＲ５５活性などのＣＢ受容体活性をモジュレートできる、開示されているフェノテロール類似体である。
【００６７】
星状細胞腫：星状細胞から起こる脳の腫瘍。星状細胞腫は、原発腫瘍の一例である。星状細胞腫は、最も一般的な神経膠腫であり、脳のほとんどの部分で、時には、脊髄において起こり得る。しかし、星状細胞腫は、大脳において最もよく見られる。一例では、星状細胞腫は、対象に、治療上有効な量のフェノテロール、フェノテロール類似体又はそれらの組合せを投与し、それによって、星状細胞腫成長を阻害することによって阻害される。
【００６８】
β２−アドレナリン受容体（β２−ＡＲ）：Ｇ−タンパク質共役型受容体ファミリーのメンバーであるアドレナリン受容体のサブタイプ。β２−ＡＲサブタイプは、呼吸器疾患、心血管疾患、早産及び本明細書において開示されているように、腫瘍発達に関与している。β２−ＡＲの発現の増大は、治療標的として働き得る。現在、いくつかの薬物、例えば、アルブテロール、フォルモテロール、イソプロテレノール又はサルメテロールが、β２−ＡＲアゴニスト活性を有する。本明細書において開示されているように、フェノテロール及びフェノテロール類似体は、β２−ＡＲアゴニストである。
【００６９】
血液脳関門（ＢＢＢ）：脳及び中枢神経系に供給する毛細血管において上皮細胞によって形成される障壁。この障壁は、水、酸素、二酸化炭素並びにグルコース、アルコール及び全身麻酔薬などの非イオン性溶質の侵入を選択的に可能にし、その他の物質の侵入を遮断する。アミノ酸などのいくつかの小分子は、特異的輸送機構によって障壁を越えて取り込まれる。一例では、フェノテロール又は開示されているフェノテロール類似体は、障壁を通過できる。
【００７０】
肥満度指数（ＢＭＩ）：ヒトにおいて体重を測定するための数式、ケトレー指数と呼ばれることもある。ＢＭＩは、体重（ｋｇで）を身長２（メートル２で）で除すことによって算出される。「正常」と認められる男性及び女性両方の現在の標準は、２０〜２４．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩである。一実施形態では、２５ｋｇ／ｍ２を超えるＢＭＩが、肥満対象を同定するために使用され得る。グレードＩ肥満症は、２５〜２９．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩに相当する。グレードＩＩ肥満症は、３０〜４０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩに相当する。グレードＩＩＩ肥満症は、４０ｋｇ／ｍ２を超えるＢＭＩに相当する（Ｊｅｑｕｉｅｒ、Ａｍ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、４５：１０３５〜４７、１９８７年）。理想的な体重は、身長、体質、骨の構造及び性別に基づいて個人毎に変わる。
【００７１】
カンナビノイド受容体：Ｇタンパク質共役型受容体スーパーファミリー下の細胞膜受容体のクラス。カンナビノイド受容体は、７回膜貫通ドメインを含有する。カンナビノイド受容体は、３つの主要な群のリガンド、内因性カンナビノイド（哺乳動物の身体によって産生される）、植物カンナビノイド（大麻植物によって産生されるＴＨＣなど）及び合成カンナビノイド（ＨＵ−２１０など）によって活性化される。内因性カンナビノイド及び植物カンナビノイドのすべては、親油性、すなわち、脂溶性化合物である。カンナビノイド受容体の２つのサブタイプとして、ＣＢ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３３１８１  ｍＲＮＡ及びＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２１５５４を参照のこと、その各々は、２０１２年５月２３日現在で参照により本明細書に組み込まれる）及びＣＢ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１８４１  ｍＲＮＡ及びＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ３４９７２を参照のこと、その各々は、２０１２年５月２３日現在で参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＢ１受容体は、脳（中枢神経系、ＣＮＳ）において主に発現されるが、肺、肝臓及び腎臓においても発現される。ＣＢ２受容体は、免疫系において、及び造血細胞において主に発現される。さらなる非ＣＢ１及び非ＣＢ２として、ＧＰＲ５５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５６８３．３又はＮＰ＿００５６７４．２タンパク質、その各々は、２０１２年５月２３日現在で参照により本明細書に組み込まれる）、ＧＰＲ１１９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７８４７１．２又はＮＰ＿８４８５６６．１タンパク質、その各々は、２０１２年５月２３日現在で参照により本明細書に組み込まれる）及びＧＰＲ１８（Ｎ−アラキドニルグリシン受容体としても知られ、ミクログリア遊走に関与している、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０９８２００  ｍＲＮＡ、ＮＰ＿００１０９１６７０．１、その各々は、２０１２年５月２３日現在で参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
【００７２】
ＣＢ１及びＣＢ２受容体のタンパク質配列は、約４４％が類似している。受容体の膜貫通領域のみが考慮される場合には、２種の受容体サブタイプ間のアミノ酸類似性は、およそ６８％である。さらに、各受容体におけるわずかな変動が同定されている。カンナビノイドは、カンナビノイド受容体と、可逆性に、立体選択的に結合する。個々のカンナビノイドの各受容体に対する親和性が、そのカンナビノイドの効果を左右する。特定の受容体とより選択的に結合するカンナビノイドは、医学的利用にとってより望ましいものである。ＧＰＲ５５は、Ｇ−タンパク質Ｇ１３及び／又はＧ１１に共役され、受容体の活性化が、ｒｈｏＡ、ｃｄｃ４２及びｒａｃ１の刺激につながる。ＧＰＲ５５は、植物カンナビノイドΔ９−ＴＨＣ及びカンナビジオール、並びに内因性カンナビノイドであるアナンダミド、２−ＡＧ、ノラジンエーテルによって、低いナノモル範囲で活性化される。対照的に、ＣＢ１及びＣＢ２受容体は、阻害性Ｇタンパク質と共役される。これは、両種の受容体が異なる読み取り値を有するということを示す。例えば、ＣＢ１の活性化は、アポトーシスを引き起こすのに対して、ＧＰＲ５５活性の増大は、発癌性である。ＣＢ１受容体アンタゴニスト（「インバースアゴニスト」とも呼ばれる）化合物、ＡＭ２５１は、実際、ＧＰＲ５５のアゴニストである。ＧＰＲ５５と結合し、直ちに内部移行される。これは、これら２種のＧＰＣＲの反対の挙動を示す。ＭＮＦは、ＣＢ１受容体アゴニスト（ＷＩＮ５５，２１２−２と類似）であるが、ＧＰＲ５５の阻害剤、ひいては、選択された癌細胞におけるＭＮＦのアポトーシス促進性挙動として作用すると本明細書において示される。
【００７３】
本明細書において開示されているように、ＭＮＦ及びＮＦなどの特定のフェノテロール類似体は、ＧＰＲ５５の調節因子などのカンナビノイド受容体調節因子である。一例では、フェノテロール類似体が、単独又はその他の薬剤と組み合わせて、カンナビノイド受容体（ＧＰＲ５５など）によってモジュレートされる、障害（例えば、代謝性、炎症性、疼痛性などの障害）又は疾患（例えば、肝細胞癌腫、膠芽腫、肝臓癌、肺癌、結腸癌、脳癌、糖尿病又は炎症性疾患）と関連している１種又は複数の症状又は徴候を低減又は阻害するために対象に投与される。
【００７４】
カルバマート：式−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−（式中、Ｒは、Ｈ又は低級アルキル基若しくはアラルキル基などの脂肪族基である）の基。
【００７５】
化学療法；化学療法薬：本明細書において、異常な細胞成長を特徴とする疾患の治療において治療上の有用性を有する任意の化学剤。このような疾患として、腫瘍、新生物及び癌並びに過形成性成長を特徴とする疾患が挙げられる。一実施形態では、化学療法薬は、ＣＢ受容体活性及び／又は発現と関連している腫瘍を含めた、固形腫瘍などの新生物の治療において使用するための薬剤である。一実施形態では、化学療法薬は、放射活性分子である。いくつかの実施形態では、１種又は複数のフェノテロール類似体又はそれらの組合せなどのＣＢ受容体調節因子は、化学療法薬である。一例では、化学療法薬は、カルムスチン、ロムスチン、プロカルバジン、ストレプトゾシン又はそれらの組合せである。当業者ならば、役立つ化学療法薬を容易に同定できる（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１４版中、Ｓｌａｐａｋ及びＫｕｆｅ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第８６章；Ａｂｅｌｏｆｆ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ第２版、（Ｃ）２０００  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｉｎｃ中、Ｐｅｒｒｙら、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、第１７章；Ｂａｌｔｚｅｒ  Ｌ．、Ｂｅｒｋｅｒｙ  Ｒ．（編）：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、第２版Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ、１９９５年；Ｆｉｓｃｈｅｒ  ＤＳ、Ｋｎｏｂｆ  ＭＦ、Ｄｕｒｉｖａｇｅ  ＨＪ（編）：Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第４版Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ、１９９３年を参照のこと）。
【００７６】
対照又は参照値。「対照」とは、試験サンプルとの比較のために使用されるサンプル又は標準を指す。いくつかの実施形態では、対照は、健常対象から得られたサンプル又はβ２−アゴニストを用いる治療に応答しなかった腫瘍などの障害又は疾患を有すると診断された患者から得られた組織サンプルである。いくつかの実施形態では、対照は、歴史的対照又は標準参照値又は値の範囲である（これまでに試験された対照サンプルなど、ＣＢ受容体を発現する腫瘍を有さない対象の群又はベースライン若しくは正常値を表すサンプルの群など、フェノテロール、フェノテロール類似体又はそれらの組合せを用いる治療に応答しない腫瘍組織におけるＣＢ受容体のレベルなど）。
【００７７】
真性糖尿病：真性糖尿病は、尿崩症と混同されてはならないが、「糖尿病」に一般的に簡易化される、制御されない炭水化物代謝につながるインスリンの相対的又は絶対的欠乏によって引き起こされる疾患。本明細書において、「糖尿病」とは、特に断りのない限り、真性糖尿病を指す。「糖尿病状態」は、糖尿病前症及び糖尿病を含む。Ｉ型糖尿病（「インスリン依存性糖尿病」又は「若年発症糖尿病」と呼ばれることもある）は、インスリンの完全な欠乏又はほぼ完全な欠乏につながる膵臓β細胞の破壊を特徴とする自己免疫疾患である。２型糖尿病（「非インスリン依存性糖尿病」又は「成人発症糖尿病」と呼ばれることもある）では、身体は、インスリンは存在するが、それに応答しない。
【００７８】
糖尿病の症状として、過度の口渇（多飲症）；頻繁な排尿（多尿症）；過度の空腹感又は持続する摂食（過食症）；説明のつかない体重減少；尿中のグルコースの存在（糖尿）；疲労（ｔｉｒｅｄｎｅｓｓ）又は疲労（ｆａｔｉｇｕｅ）；視覚の変化；四肢（手、足）におけるしびれ又は刺痛；回復が遅い創傷又は痛むところ；及び異常に高頻度の感染が挙げられる。糖尿病は、７．０ｍｍｏｌ／Ｌ（１２６ｍｇ／ｄＬ）以上の空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）濃度又は７５ｇの負荷を用いる経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）の約２時間後の１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ（２００ｍｇ／ｄＬ）以上の血漿グルコース濃度によって臨床的に診断され得る。糖尿病のより詳細な説明は、Ｃｅｃｉｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｊ．Ｂ．Ｗｙｎｇａａｒｄｅｎら編（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９２年、第１９版）に見出すことができる。
【００７９】
以下の危険因子のうち１種又は複数を示す対象は、２型糖尿病を発症する大きな又は相当な危険を有すると考えられる：
１．約３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩなどの肥満症；
２．高い空腹時血糖（ＦＰＧ）レベル；
３．耐糖能異常（ＩＧＴ）；
４．非白人民族性；
５．高インスリン血症；
６．高トリグリセリド血症；
７．糖尿病の家族歴；
８．妊娠糖尿病の病歴；
９．セデンタリーライフスタイル；及び
１０．ヒトでは、中年又は高齢者の状態（すなわち、４０歳以上）。
【００８０】
「非糖尿病」又は「正常」対象は、１型糖尿病、２型糖尿病又は糖尿病前症などのいずれの形態の糖尿病も有さない。
【００８１】
誘導体：別の化学物質とは、１個又は複数の官能基によって異なる化学物質。誘導体（フェノテロール類似体など）は、それが導かれた分子の生物活性（ＣＢ受容体活性化）を保持することが好ましい（ＣＢ受容体、例えば、ＧＰＲ５５を調節できるフェノテロール類似体など）。
【００８２】
有効量：状態又は疾患と関連している１種又は複数の徴候又は症状の低減又は阻害などの、所望の反応をもたらすのに十分である薬剤の量。対象に投与されると、標的組織濃度を達成する投与量が、一般に使用される。いくつかの例では、「有効量」は、障害又は疾患のいずれかの１種又は複数の症状及び／又は根底にある原因を治療するものである。いくつかの例では、「有効量」とは、薬剤単独が、さらなる治療薬（単数又は複数）（例えば、化学療法薬）とともに、腫瘍の治療などの所望の反応を誘導する「治療上有効な量」である。一例では、所望の反応は、療法が施される対象において腫瘍の大きさ又は転移を低減することである。組成物が有効であるには、腫瘍転移が完全に排除される必要はない。例えば、組成物は、組成物の不在下での転移と比較して、転移を所望の量、例えば、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はさらに少なくとも１００％（腫瘍の排除）低減し得る。
【００８３】
特定の例では、投与される対象、例えば、１種又は複数の癌腫を有する対象においてなど、いくつかの癌腫細胞を低減するのに有効な薬剤の量である。組成物が有効であるには、癌細胞は、完全に排除される必要はない。例えば、組成物は、組成物の不在下での癌細胞数と比較して、癌細胞の数を所望の量、例えば、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はさらに少なくとも１００％（検出可能な癌細胞の排除）低減し得る。
【００８４】
いくつかの例では、有効量は、ＣＢ受容体、例えば、ＧＰＲ５５発現及び／又は活性と関連している障害又は疾患の低減、阻害及び／又は治療において有用な（Ｒ，Ｒ’）−又は（Ｒ，Ｓ’）−フェノテロール類似体（単数又は複数）の量である。理想的には、薬剤の治療上有効な量は、対象において細胞傷害効果を引き起こさずに、対象において障害を低減、阻害及び／又は治療するのに十分な量である。
【００８５】
対象において障害を低減、阻害及び／又は治療するのに有用な組成物の有効量は、治療されている対象、障害の重篤度及び治療用組成物の投与方法に応じて変わる。治療薬の有効量は、脳腫瘍などの腫瘍を有する対象の腫瘍の大きさの低減又は生理学的状態の改善についてアッセイすることなど、多数の異なる方法で決定され得る。有効量はまた、種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｓｉｔｕアッセイによって決定され得る。
【００８６】
膠芽腫：原発性脳腫瘍の一般的な、悪性形態。膠芽腫は、グレードＩＶ星状細胞腫であり、普通、脳において迅速に広がる。一例では、膠芽腫は、治療上有効な量のフェノテロール類似体を、対象にＣＢ受容体、例えば、ＧＰＲ５５を調節できるその他の薬剤とともに投与し、それによって、膠芽腫と関連している１種又は複数の症状を阻害することによって阻害される。
【００８７】
炎症：組織への損傷が起こると、損傷に対する身体の反応は、普通、炎症である。損傷は、外傷、血液供給の欠如、出血、自己免疫発作、移植された外因性組織又は感染によるものであり得る。この身体による全身性反応は、多数の免疫系の成分（例えば、ＩＬ−１及びＴＮＦ）の放出、損傷部位への細胞の誘引、流体の放出及びその他のプロセスによる組織の膨潤を含む。いくつかの例では、炎症と関連している１種又は複数の徴候又は症状を、治療、例えば、低減又は阻害するために、ＣＢ受容体活性を調節できる開示されているフェノテロール類似体が使用される。
【００８８】
異性体：同一分子式を有するが、性質又はその原子の結合の配列又は空間におけるその原子の配置が異なる化合物は、「異性体」と呼ばれる。空間におけるその原子の配置が異なる異性体は、「立体異性体」と呼ばれる。２つ以上のキラル中心を含有し、互いに鏡像ではない立体異性体は、「ジアステレオマー」と呼ばれる。互いに重ね合わせることができない鏡像である立体異性体（Ｓｔｅｒｏｉｓｏｍｅｒｓ）は、「エナンチオマー」と呼ばれる。化合物が不斉中心を有する場合には、例えば、炭素原子が、４種の異なる基と結合している場合には、１対のエナンチオマーがあり得る。エナンチオマーは、その不斉中心の絶対配置を特徴とし得、Ｃａｈｎ及びＰｒｅｌｏｇのＲ−及びＳ−配列決定ルールによって、又は分子が偏光面を回転する方法によって記載され、右旋性又は左旋性と（すなわち、それぞれ、（＋）又は（−）異性体と）表される。キラル化合物は、個々のエナンチオマー又はそれらの混合物として存在し得る。等割合のエナンチオマーを含有する混合物は、「ラセミ混合物」と呼ばれる。
【００８９】
本明細書において記載される化合物は、１つ又は複数の不斉中心を有し得；したがって、このような化合物は、個々の（Ｒ）、（Ｓ）、（Ｒ，Ｒ’）、（Ｒ，Ｓ’）−立体異性体として、又はそれらの混合物として製造され得る。特に断りのない限り、本明細書及び特許請求の範囲において特定の化合物の説明又は名称は、個々のエナンチオマー及びそのラセミ又は別の混合物の両方を含むものとする。立体化学を決定する方法及び立体異性体を分離する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９２年、第４章を参照のこと）。
【００９０】
肥満症：過剰の体脂肪がヒトを健康上危険な状態にさらし得る状態（Ｂａｒｌｏｗ及びＤｉｅｔｚ、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ１０２：Ｅ２９、１９９８年；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ，Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （ＮＨＬＢＩ）、Ｏｂｅｓ．Ｒｅｓ．６（付録２）：５１Ｓ〜２０９Ｓ、１９９８年を参照のこと）。過剰の体脂肪は、エネルギー摂取及びエネルギー消費の不均衡の結果である。一実施形態では、ヒトにおいて、肥満症を評価するために肥満度指数（ＢＭＩ）が使用される。一実施形態では、２５．０ｋｇ／ｍ２〜２９．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩは、過体重であり、３０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩは、肥満である。
【００９１】
別の実施形態では、ヒトにおいて、肥満症を評価するためにウエスト周囲が使用される。この実施形態では、男性において、１０２ｃｍ以上のウエスト周囲が肥満と考えられ、女性においては、８９ｃｍ以上のウエスト周囲が肥満と考えられる。強力な証拠によって、肥満症が、個体の罹病率及び死亡率の両方に影響を及ぼすことが示されている。例えば、肥満個体は、中でも、心疾患、非インスリン依存性（２型）糖尿病、高血圧症、卒中、癌（例えば、子宮内膜癌、乳癌、前立腺癌及び結腸癌）、脂質異常症、胆嚢疾患、睡眠時無呼吸、受精能の低下及び変形性関節症の危険が増大している（Ｌｙｚｎｉｃｋｉら、Ａｍ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓ．６３：２１８５、２００１年を参照のこと）。
【００９２】
任意選択の：「任意選択の」又は「所望により」とは、その後に記載される事象又は状況が起こり得るが必ずしもそうではないこと並びに記載が、前記事象又は状況が起こる場合及びそれが起こらない場合を含むということを意味する。
【００９３】
経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）：糖尿病の診断試験。一晩絶食した後、対象に、普通、５０〜１００グラムのグルコースを含有する、飲むための濃縮糖溶液が提供される。血糖レベルを経時的に調べるために、対象の血液が、その後２、３〜数時間にわたって周期的にサンプリングされる。非糖尿病対象では、血糖濃度は、わずかな上方シフトを示し、２〜３時間以内に正常に戻る。糖尿病対象では、血糖濃度は、絶食後正常よりも全般的に高く、対象が、グルコース溶液を飲んだ後はより上がり、正常に戻るのに数時間かかる場合もある。１４０ｍｇ／ｄｌ以上及び２００ｍｇ／ｄｌ未満のＯＧＴＴは、対象が糖尿病前症を有することを示す。２００ｍｇ／ｄｌ以上のＯＧＴＴは、対象が明らかな糖尿病を有することを示し、１４０ｍｇ／ｄｌ未満のＯＧＴＴは、対象が正常（健常）であり、糖尿病前症又は糖尿病を有さないことを示す。
【００９４】
過体重：理想体重よりも重い個体。過体重個体は肥満であり得るが、必ずしも肥満ではない。一実施形態では、過体重ヒト個体は、その体重を減らしたいと思っている任意の個体である。別の実施形態では、過体重ヒト個体は、２５．０ｋｇ／ｍ２〜２９．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する個体である。
【００９５】
医薬上許容される担体：この開示において有用な医薬上許容される担体（媒体）は、従来のものである。Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、第１９版（１９９５年）には、１種又は複数の治療用化合物又は分子、例えば、１種又は複数の核酸分子、タンパク質又はこれらのタンパク質と結合する抗体及びさらなる医薬品の医薬送達に適した組成物及び製剤が記載されている。
【００９６】
一般に、担体の性質は、使用されている特定の投与様式に応じて変わる。例えば、非経口製剤は、普通、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどといった医薬上及び生理学上許容される流体を、媒体として含む注射用流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤又はカプセル剤形態）用には、従来の非毒性固体担体として、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン又はステアリン酸マグネシウムが挙げられる。投与されるべき医薬組成物は、生物学的に中性の担体に加えて、微量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、保存料及びｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウラートを含有し得る。
【００９７】
フェニル：フェニル基は、非置換であるか、又は１、２若しくは３個の置換基で置換されていてもよく、置換基（単数又は複数）は、アルキル、ヘテロアルキル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、チオアルコキシ、ハロ、ハロアルキル（−ＣＦ３など）、ニトロ、シアノ、−ＯＲ（式中、Ｒは、水素又はアルキルである）、−Ｎ（Ｒ）Ｒ’（式中、Ｒ及びＲ’は互いに独立に、水素又はアルキルである）、−ＣＯＯＲ（式中、Ｒは、水素又はアルキルである）又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）Ｒ”（式中、Ｒ’及びＲ”は独立に、水素又はアルキルから選択される）から独立に選択される。
【００９８】
精製された：用語「精製された」は、完全に純粋であることを必要とせず、むしろ、相対的な用語として意図される。したがって、例えば、精製された調製物とは、フェノテロールの（Ｒ，Ｒ’）−エナンチオマーなどの所望の成分が、（±）−フェノテロール混合物中などの前の環境においてよりも濃縮されているものである。フェノテロールの（Ｒ，Ｒ’）−エナンチオマーなどの所望の成分は、例えば、サンプルの少なくとも約７０重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９２重量％、９５重量％、９７重量％、９８重量％又は９９重量％が、所望の成分からなる場合に、精製されたと考えられる。化合物の純度は、例えば、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又はその他の従来法によって決定され得る。一例では、特定のフェノテロール類似体エナンチオマーは、精製された調製物中に存在するその他のエナンチオマーの９０％超、多くの場合は、９５％超に相当するよう精製される。その他の場合には、精製された調製物は、本質的に均一であり、これでは、その他の立体異性体は１％未満である。
【００９９】
本明細書に記載される化合物は、シリカゲル及び／又はアルミナクロマトグラフィーを含めた当技術分野で公知の手段のいずれかによって、精製された形態で得られ得るか、又は精製され得る。例えば、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、第２版、Ｓｎｙｄｅｒ及びＫｉｒｋｌａｎｄ編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９７９年；並びにＴｈｉｎ  Ｌａｙｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ｓｔａｈｌ編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、１９６９年を参照のこと。一例では、化合物は、その他の混入物に対してサンプルの、少なくとも約７０重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９２重量％、９５重量％、９７重量％、９８重量％又は９９重量％の純度を有する、精製されたフェノテロール又はフェノテロール類似体を含む。さらなる例では、化合物は、各々、その他の混入物に対してサンプルの、少なくとも約７０重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９２重量％、９５重量％、９７重量％、９８重量％又は９９重量％の純度を有する、少なくとも２種の精製された立体異性体を含む。例えば、化合物は、実質的に精製された（Ｒ，Ｒ’）−フェノテロール類似体及び実質的に精製された（Ｒ，Ｓ’）−フェノテロール類似体を含み得る。
【０１００】
対象：用語「対象」は、ヒト及び獣医学対象の両方、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウス及びウシを含む。同様に、哺乳動物という用語は、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む。
【０１０１】
組織：複数の機能的に関連している細胞。組織は、懸濁液、半固体又は固体であり得る。組織は、脳又はその一部などの対象から収集された細胞を含む。
【０１０２】
腫瘍：悪性であろうが、良性であろうが、すべての新生細胞成長及び増殖並びにすべての前癌性及び癌性細胞及び組織。原発腫瘍とは、腫瘍進行が始まり、この量を生成するよう進行した解剖学的部位で成長している腫瘍である。原発性脳腫瘍（神経膠腫とも呼ばれる）は、脳を起源とする腫瘍である。例示的原発性脳腫瘍として、星状細胞腫、膠芽腫、上衣腫、乏突起神経膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｏｍａｓ）及び混合膠腫が挙げられる。いくつかの例では、原発性脳腫瘍は、ＣＢ受容体を発現する、例えば、ＣＢ受容体発現と関連している膠芽腫。
【０１０３】
〜に十分な条件下で：所望の活性を可能にする任意の環境を説明するために使用される語句。一例では、〜に十分な条件下は、１種又は複数のフェノテロール類似体、フェノテロール又はそれらの組合せを、所望の活性を可能にするのに十分な濃度で、対象に投与することを含む。いくつかの例では、所望の活性は、原発性脳腫瘍、肝細胞癌腫、肝臓癌、結腸癌又は肺癌などの障害又は疾患と関連している徴候又は症状を低減又は阻害することであり、例えば、感受性対象における腫瘍の臨床症状の発症の遅延、腫瘍の臨床症状の一部若しくはすべての重篤度の低減、腫瘍の遅い進行（例えば、腫瘍を有する対象の生命の延長によって）、腫瘍再発数の低減、対象の全体的な健康若しくは幸福の改善によって、又は特定の疾患にとって特異的である当技術分野で周知のその他のパラメータによって証明され得る。１つの特定の例では、所望の活性は、星状細胞腫、膠芽腫又は肝細胞癌腫成長などの腫瘍成長を防止又は阻害することである。治療が有効と考えられるために、腫瘍成長が、完全に阻害されることを必要としない。例えば、少なくとも約１０％の低減などの成長の部分的な低減又は減速、例えば、少なくとも２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％又はそれより多くが有効であると考えられる。
【０１０４】
ＩＩＩ．（Ｒ，Ｒ’）−フェノテロール及びフェノテロール類似体
【０１０５】
Ａ．化学構造
【０１０６】
本明細書において開示されているいくつかの例示的フェノテロール類似体は、式：
【化４】
2015519347.tif 000005
［式中、Ｒ１〜Ｒ３は独立に、水素、アシル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル又はそれらの組合せであり、
Ｒ４は、Ｈ又は低級アルキルであり、
Ｒ５は、低級アルキル、
【化５】
2015519347.tif 000006
（式中、Ｘ及びＹは独立に、水素、低級−ＯＲ６及び−ＮＲ７Ｒ８から選択され、
Ｒ６は、低級アルキル又はアシルであり、
Ｒ７及びＲ８は独立に、水素、低級アルキル、アルコキシカルボニル、アシル又はアミノカルボニルである）である］
を有する。
【０１０７】
上記のフェノテロール類似体の一般式に、引き続き関して、Ｙは、−ＯＨであり得る。
【０１０８】
一実施形態では、Ｒ５は、所望により、１、２又は３個の置換基を有する、１−又は２−ナフチル誘導体である。このようなＲ５基の例は、式
【化６】
2015519347.tif 000007
［式中、Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は独立に、水素、ハロゲン、ＳＨ、スルホキシド、スルホン、スルファンアミドを含めた硫黄含有部分並びに関連アルキル及び芳香族置換部分、低級−ＯＲ６及び−ＮＲ７Ｒ８であり、Ｒ６は、各出現について独立に、低級アルキル及びアシルから選択され、Ｒ７及びＲ８は独立に、水素、低級アルキル、アルコキシカルボニル、アシル又はアミノカルボニル（カルバモイル）である］
によって表される。特定の化合物では、Ｙ１、Ｙ２及びＹ３のうち少なくとも１つは、−ＯＣＨ３である。
【０１０９】
特定のＲ５基は、式
【化７】
2015519347.tif 000008
［式中、Ｒ６は、メチル、エチル、プロピル若しくはイソプロピル又はアセチルなどのアシルなどの低級アルキルである］
によって表されるものを含む。
【０１１０】
例示的Ｒ５基として、
【化８】
2015519347.tif 000009
が挙げられる。
【０１１１】
一例では、Ｒ４は、低級アルキルであり、Ｒ５は、
【化９】
2015519347.tif 000010
［式中、Ｘ及びＹは独立に、Ｈ、低級アルキル−ＯＲ６及び−ＮＲ７Ｒ８から選択され、Ｒ６は、低級アルキルであり、Ｒ７及びＲ８は独立に、水素又は低級アルキルである］
である。
【０１１２】
さらなる例では、Ｒ４は、エチル、ｎ−プロピル及びイソプロピルから選択され、Ｒ５は、式
【化１０】
2015519347.tif 000011
［式中、ＸはＨ、−ＯＲ６又は−ＮＲ７Ｒ８である］
を有する。例えば、Ｒ６は、メチルであり得、又はＲ７及びＲ８は、水素である。
【０１１３】
さらなる例では、Ｒ５は、式
【化１１】
2015519347.tif 000012
を有する。
【０１１４】
さらなる実施形態では、Ｒ４は、メチル、エチル、ｎ−プロピル及びイソプロピルから選択され、Ｒ５は、
【化１２】
2015519347.tif 000013
を表す。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、Ｒ１〜Ｒ３は独立に、水素であり、Ｒ４は、低級アルキル（ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３など）であり、Ｒ５は、低級アルキル、
【化１３】
2015519347.tif 000014
［式中、Ｘ、Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は独立に、水素、−ＯＲ６及び−ＮＲ７Ｒ８であり、Ｒ６は独立に、水素、低級アルキル、アシル、アルコキシカルボニル又はアミノカルボニルであり、Ｒ７及びＲ８は独立に、水素、低級アルキル、アルコキシカルボニル、アシル又はアミノカルボニルである］
であり、化合物は、光学活性である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、Ｒ１〜Ｒ３は独立に、水素であり、Ｒ４は、メチル又はエチルであり、Ｒ５は、
【化１４】
2015519347.tif 000015
［式中、Ｘは、−ＯＨ又は−ＯＣＨ３である］
である。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、Ｒ１〜Ｒ３は独立に、水素であり、Ｒ４は、メチル又はエチルであり、Ｒ５は、
【化１５】
2015519347.tif 000016
である。
【０１１８】
例示的化合物として、それだけには限らないが、（Ｒ，Ｒ’）−４’−メトキシ−１−ナフチルフェノテロール（ＭＮＦ）、（Ｒ，Ｓ’）−ＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−ナフチルフェノテロール（ＮＦ）、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＮＦ、（Ｒ，Ｓ’）−ＮＦ及び（Ｒ，Ｒ’）−４’−アミノ−１−ナフチルフェノテロール（アミノＮＦ）又は（Ｒ，Ｒ’）−４’−ヒドロキシ−１−ナフチルフェノテロール（ヒドロキシＮＦ）が挙げられる。
【０１１９】
ｉｎ  ｖｉｖｏで切断されてヒドロキシ基を提供し得るＲ１〜Ｒ３の適した基の例として、制限するものではないが、アシル、アシルオキシ及びアルコキシカルボニル基が挙げられる。このような切断可能な基を有する化合物は、「プロドラッグ」と呼ばれる。用語「プロドラッグ」とは、本明細書において、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒドロキシル基に変換可能である（例えば、加水分解によって）置換基を含む化合物を意味する。例えば、Ｂｕｎｄｇａａｒｄ（編）、Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８５年）；Ｗｉｄｄｅｒら（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第４巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５年）；Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎら（編）、Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第５章、１１３  １９１（１９９１年）；Ｂｕｎｄｇａａｒｄら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、８：１  ３８（１９９２年）；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、７７：２８５以下参照（１９８８年）；並びにＨｉｇｕｃｈｉ及びＳｔｅｌｌａ（編）Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（１９７５年）に論じられるように、種々の形態のプロドラッグが当技術分野で公知である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、投与することは、治療上有効な量のＭＮＦ、ＮＦ又はそれらの組合せを投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与することは、治療上有効な量のＭＮＦを投与することを含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、方法は、ＧＰＲ５５を発現する膠芽腫又は肝細胞癌腫などのＣＢ受容体によって調節される障害又は疾患を治療するために、ＣＢ受容体障害又は疾患を調節できる開示されているフェノテロール類似体のいずれかと、医薬上許容される担体とを含有する治療上有効な量の医薬組成物を投与することを含む。例えば、開示されている（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ、（Ｒ，Ｓ’）−ＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−ＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＮＦ、（Ｒ，Ｓ’）−ＮＦ及び（Ｒ，Ｒ’）−アミノＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−ヒドロキシＮＦ又はそれらの組合せ。
【０１２２】
例示的（Ｒ，Ｒ’）−化合物は、
【化１６】
2015519347.tif 000017
［Ｘ及びＲ１〜Ｒ３は、上記のとおりである］
の化学構造を有する。
【０１２３】
さらなる例示的（Ｒ，Ｒ’）−化合物は、化学構造：
【化１７】
2015519347.tif 000018
を有する。
【０１２４】
例示的（Ｒ，Ｓ’）−化合物は、化学構造：
【化１８】
2015519347.tif 000019
［式中、Ｘ及びＲ１〜Ｒ３は、上記のとおりである］
を有する。
【０１２５】
さらなる例示的（Ｒ，Ｓ’）−化合物は、化学構造：
【化１９】
2015519347.tif 000020
を有する。
【０１２６】
例示的（Ｓ，Ｒ’）−化合物は、化学構造：
【化２０】
2015519347.tif 000021
［式中、Ｘ及びＲ１〜Ｒ３は、上記のとおりである］
を有する。
【０１２７】
例示的（Ｓ，Ｓ’）−化合物は、化学構造：
【化２１】
2015519347.tif 000022
［式中、Ｘ及びＲ１〜Ｒ３は、上記のとおりである］
を有する。
【０１２８】
フェノテロールの種々の立体異性体を例示する化学構造の例は、以下に提供される。
【化２２】
2015519347.tif 000023
【０１２９】
特定の方法実施形態は、（Ｒ，Ｒ’）−フェノテロール又は本明細書において記載されるフェノテロール類似体のいずれかの溶媒和物（水和物など）、医薬上許容される塩及び／又は種々の物理的形態の使用を考慮する。
【０１３０】
１．溶媒和物、塩及び物理的形態
【０１３１】
「溶媒和物」とは、化合物の、１種又は複数の溶媒分子との物理的会合を意味する。この物理的会合は、種々の程度のイオン結合及び共有結合を含み、例として、共有結合付加物及び水素結合された溶媒和物を含む。特定の場合には、溶媒和物は、例えば、結晶固体の結晶格子中に１つ又は複数の溶媒分子が組み込まれる場合には単離できる。「溶媒和物」は、溶液相の溶媒和物及び単離可能な溶媒和物の両方を包含する。代表的な溶媒和物として、エタノール会合化合物、メタノール会合化合物などが挙げられる。「水和物」は、溶媒分子（単数又は複数）がＨ２Ｏである溶媒和物である。
【０１３２】
開示されている化合物はまた、いくつかの塩形成基が存在する場合には、混合塩及び／又は内部塩を含む塩を包含する。塩は、一般に、非毒性である医薬上許容される塩である。塩は、任意の種類（有機及び無機の両方）のもの、例えば、フマル酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩及びリン酸塩であり得る。一例では、塩は、元素周期表においてＶＩＩ族を形成する非金属（例えば、ハロゲン）を含む。例えば、化合物は、臭化水素酸塩として提供され得る。
【０１３３】
塩形成基のさらなる例として、それだけには限らないが、適した塩基と塩を形成し得る、カルボキシル基、ホスホン酸基又はボロン酸基が挙げられる。これらの塩として、例えば、元素周期表のＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ及びＩＩＢ族の金属に由来する非毒性金属カチオンを挙げることができる。一実施形態では、リチウム、ナトリウム若しくはカリウムイオンなどのアルカリ金属カチオン又はマグネシウム若しくはカルシウムイオンなどのアルカリ土類金属が使用され得る。塩はまた、亜鉛又はアンモニウムカチオンであり得る。塩はまた、非置換又はヒドロキシル置換モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミン、特に、モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミンなどの適した有機アミンで、或いは第四級アンモニウム化合物で、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、モノ−、ビス−若しくはトリス−（２−ヒドロキシ−低級アルキル）アミン、例えば、モノ−、ビス−若しくはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、２−ヒドロキシ−ｔｅｒｔ−ブチルアミン又はトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−Ｎ−（ヒドロキシ−低級アルキル）アミン、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミン若しくはトリ−（２−ヒドロキシエチル）アミン又はＮ−メチル−Ｄ−グルカミン、又はテトラブチルアンモニウム塩などの第四級アンモニウム化合物で形成され得る。
【０１３４】
本明細書において開示されている例示的化合物は、無機酸との酸塩基塩を形成し得る少なくとも１個の塩基性基を有する。塩基性基の例として、それだけには限らないが、アミノ基又はイミノ基が挙げられる。このような塩基性基と塩を形成し得る無機酸の例として、それだけには限らないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸又はリン酸などの鉱酸が挙げられる。塩基性基はまた、有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ酸又はホスホ酸又はＮ−置換スルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン酸、ニコチン酸又はイソニコチン酸と塩を形成し得、さらに、アミノ酸と、例えば、α−アミノ酸と、またメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシメタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンジスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、２−若しくは３−ホスホグリセラート、グルコース−６−ホスファート又はＮ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラマートの形成を伴って）と、或いはその他の酸性有機化合物、例えば、アスコルビン酸と塩を形成し得る。現在好ましい実施形態では、フェノテロールは、臭化水素酸塩として提供され、例示的フェノテロール類似体は、そのフマル酸塩として提供される。
【０１３５】
医薬上許容される塩を形成するためのさらなる対イオンは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５年に見出される。一態様では、医薬上許容される塩を使用することはまた、組成物の浸透圧を調整するよう働き得る。
【０１３６】
特定の実施形態では、本方法において使用される化合物は、多形性で提供される。したがって、化合物は、異なる結晶形態、結晶、液晶又は非晶質（アモルファス）形態などの２種以上の物理的形態で提供され得る。
【０１３７】
２．医薬の製造のための使用
【０１３８】
上記の化合物のいずれか（例えば、（Ｒ，Ｒ’）及び／若しくは（Ｒ，Ｓ’）フェノテロール類似体又はその水和物若しくは医薬上許容される塩）又はそれらの組合せは、カンナビノイド受容体（例えば、ＧＰＲ５５）によってモジュレートされる、ＣＢ受容体調節性障害（例えば、代謝性、炎症性、疼痛性などの障害）若しくは疾患（例えば、肝細胞癌腫、膠芽腫、肝臓癌、肺癌、結腸癌、脳癌、糖尿病又は炎症性疾患）を発症する危険性があるか、又は有する対象において、ＧＰＲ５５などのＣＢ受容体を調節するための医薬の製造において使用するために意図される。
【０１３９】
このような医薬に適した製剤、それから恩恵を受け得る対象及びその他の関連する特徴は、本明細書において別の場所に記載されている。
【０１４０】
Ｂ．合成方法
【０１４１】
開示されているフェノテロール類似体は、各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２００９年２月９日に出願された米国特許出願第１２／３７６，９４５号、２０１１年１２月２１日に出願された米国特許出願第１３／３３３，８６６号及び２０１１年３月１０日に出願されたＷＯ２０１１／１１２８６７に記載されたものを含めた当技術分野で公知の任意の方法によって合成され得る。開示されている化合物を合成するのに有用な一般的に知られている化学合成スキーム及び条件を提供する多数の一般的な参考文献が利用可能である（例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＭａｒｃｈ、Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第５版、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年；又はＶｏｇｅｌ、Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、第４版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｌｏｎｇｍａｎ、１９７８年を参照のこと）。
【０１４２】
本明細書において記載されるような化合物は、ＨＰＬＣ、分取薄層クロマトグラフィー、フラッシュカラムクロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー手段を含めた当技術分野で公知の手段のいずれかによって精製され得る。正常相及び逆相並びにイオン樹脂を含めた任意の適した固定相が使用され得る。最も通常は、開示されている化合物は、オープンカラムクロマトグラフィー又は分取クロマトグラフィーによって精製される。
【０１４３】
フェノテロール類似体の適した例示的合成を以下に提供する：
【０１４４】
スキームＩ：（Ｒ）−又は（Ｓ）−３’，５’−ジベンジルオキシフェニルブロモヒドリンのいずれかから形成されたエポキシドの、適当なベンジル保護２−アミノ−３−ベンジルプロパン（１−５）の（Ｒ）−若しくは（Ｓ）−エナンチオマー又はＮ−ベンジル−２−アミノヘプタン（６）の（Ｒ）若しくは（Ｓ）−エナンチオマーとのカップリングを含む、１−６の４種の立体異性体の例示的合成。
【化２３】
2015519347.tif 000024
【０１４５】
スキームＩＩ：２−フェネチルアミンを使用する（Ｒ）−７及び（Ｓ）−７の例示的合成。得られた化合物は、Ｐｄ／Ｃでの水素化によって脱保護され、フマル酸塩として精製されてもよい。
【化２４】
2015519347.tif 000025
【０１４６】
スキームＩＩＩは、スキームＩＩにおいて使用されるキラル構成要素の例示的合成を記載する。（Ｒ）−及び（Ｓ）−３’，５’−ジベンジルオキシフェニル−ブロモヒドリンエナンチオマーは、ホウ素−メチルスルフィド複合体（ＢＨ３ＳＣＨ３）と、（１Ｒ，２Ｓ）−又は（１Ｓ，２Ｒ）−シス−１−アミノ−２−インダノールのいずれかを使用する３，５−ジベンジルオキシ−α−ブロモアセトフェノンのエナンチオ特異的還元によって得た。必要な（Ｒ）−及び（Ｓ）−２−ベンジルアミノプロパンは、対イオンとして（Ｒ）−又は（Ｓ）−マンデル酸のいずれかを使用するｒａｃ−２−ベンジルアミノプロパンのエナンチオ選択的結晶化によって調製した。
【化２５】
2015519347.tif 000026
【０１４７】
ＩＶ．医薬組成物
【０１４８】
開示されているフェノテロール類似体は、少なくとも、カンナビノイド受容体（ＧＰＲ５５など）によってモジュレートされる、障害（例えば、代謝性、炎症性、疼痛性などの障害）又は疾患（例えば、肝細胞癌腫、膠芽腫、肝臓癌、肺癌、結腸癌、脳癌、糖尿病又は炎症性疾患）と関連している１種又は複数の症状又は徴候を低減又は阻害するために有用であり得る。したがって、少なくとも１種の開示されているフェノテロール類似体を含む医薬組成物も、本明細書において記載される。
【０１４９】
医薬組成物のための製剤は、当技術分野で周知である。例えば、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、第１９版、１９９５年に、（Ｒ，Ｒ’）−フェノテロール及び開示されているフェノテロール類似体の医薬送達に適した例示的製剤（及びその成分）が記載されている。これらの化合物のうちの少なくとも１種を含む医薬組成物は、ヒト又は獣医学医学において使用するために製剤され得る。開示されている医薬組成物の特定の製剤は、例えば、投与様式（例えば、経口又は非経口）及び／又は治療されるべき障害（例えば、ＧＰＲ５５受容体などのＣＢ受容体、活性又は発現と関連している腫瘍）に応じて変わり得る。いくつかの実施形態では、製剤は、フェノテロール化合物などの少なくとも１種の有効成分に加えて、医薬上許容される担体を含む。
【０１５０】
開示されている方法及び組成物にとって有用な医薬上許容される担体は、当技術分野で従来のものである。医薬担体の性質は、使用されている特定の投与様式に応じて変わる。例えば、非経口製剤は、普通、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどといった医薬上及び生理学上許容される流体を、媒体として含む注射用流体を含む。散剤、丸剤、錠剤又はカプセル剤形態などの固体組成物用には、従来の非毒性固体担体として、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン又はステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。投与されるべき医薬組成物は、生物学的に中性の担体に加えて、所望により、微量の非毒性補助物質又は賦形剤、例えば、湿潤剤又は乳化剤、保存料及びｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウラートを含有し得る。その他の限定されない賦形剤として、クレモフォールなどの非イオン性可溶化剤又はヒト血清アルブミン若しくは血漿調製物などのタンパク質が挙げられる。
【０１５１】
開示されている医薬組成物は、医薬上許容される塩として製剤され得る。医薬上許容される塩は、遊離塩基の所望の薬理活性を有する化合物の遊離塩基形態の非毒性塩である。これらの塩は、無機又は有機酸に由来し得る。適した無機酸の限定されない例として、塩酸、硝酸、臭化水素酸、硫酸、ヨウ化水素酸及びリン酸がある。適した有機酸の限定されない例として、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メチルスルホン酸、サリチル酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、アスパラギン酸（ａｓｐａｒａｇｉｃ  ａｃｉｄ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などがある。その他の適した医薬上許容される塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５年に見出される。医薬上許容される塩はまた、組成物の浸透圧を調整するよう働き得る。
【０１５２】
開示されている医薬組成物の剤形は、選択された投与様式によって決定される。例えば、注射用流体に加えて、経口剤形が使用され得る。経口製剤は、シロップ、溶液若しくは懸濁液などの液体又は散剤、丸剤、錠剤若しくはカプセル剤などの固体であり得る。このような剤形を調製する方法は、当業者に公知であり、明らかとなる。
【０１５３】
開示されている化合物を含む医薬組成物の特定の実施形態は、正確な投与量の個々の投与に適した単位剤形で製剤され得る。投与される（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ又はＮＦなどの有効成分の量は、治療されている対象、障害の重篤度及び投与方法に応じて変わり、当業者に公知である。これらの範囲内で、投与されるべき製剤は、治療されている対象において所望の効果を達成するのに有効な量で、本明細書において開示されている抽出物又は化合物の量を含有する。
【０１５４】
特定の例では、経口投与用に、組成物は、治療されている対象に対する投与量の対症調節のために、約１．０〜約５０ｍｇの有効成分、特に、約２．０ｍｇ、約２．５ｍｇ、５ｍｇ、約１０ｍｇ又は約５０ｍｇの有効成分を含有する錠剤の形態で提供される。１つの例示的経口投与計画では、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ（例えば、約２ｍｇ〜約１０ｍｇ）の有効成分を含有する錠剤が、１日に２〜４回、例えば、２回、３回又は４回投与される。
【０１５５】
その他の例では、非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）投与に適した用量は、１キログラムあたり約１ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇの用量であり、そのように、非経口的に投与される約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ又は約１００ｍｇ／ｋｇを含む。しかし、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇを含めた、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ、例えば、約０．１〜約５００ｍｇ／ｋｇなどのその他のより高い又は低い投与量も使用され得る。
【０１５６】
１種又は複数の開示されている組成物を含む組成物の単回又は複数回投与は、治療医師によって選択されている用量レベル及びパターンを用いて実施され得る。一般に、複数回用量が投与される。特定の例では、組成物は、１日に１回非経口的に投与される。しかし、組成物は、１日２回、１日３回、１日４回、１日６回、１日おき、週に２回、週１回又は月１回投与され得る。治療は、通常、少なくとも１カ月間、より多くの場合は、２又は３カ月間、時には、６カ月又は１年間継続し、不確定に、すなわち、慢性的にさらに継続する場合もある。治療の反復過程もまた、あり得る。
【０１５７】
一実施形態では、医薬組成物は、ＣＢ受容体、例えば、ＧＰＲ５５を発現する腫瘍の治療のために、第２の薬剤の同時投与を伴わずに投与される。１つの特定の限定されない例では、開示されている組成物のうち１種又は複数が、その他の薬剤の同時投与を伴わずに、例えば、腫瘍を標的とすると同じくわかっているさらなる薬剤の同時投与を伴わずに投与される。その他の特定の限定されない例では、治療上有効な量の開示されている医薬組成物は、さらなる療法（例えば、それだけには限らないが、化学療法薬、さらなるＣＢ受容体調節因子（ＧＰＲ５５の調節因子など）、抗炎症薬、抗酸化物質又は当業者に公知のその他の薬剤）を含めた、さらなる薬剤と同時に投与される。例えば、開示されている化合物は、化学療法薬、抗酸化物質、抗炎症薬又はそれらの組合せと組み合わせて投与される。
【０１５８】
その他の例では、開示されている医薬組成物は、アジュバント療法で投与される。例えば、開示されている化合物のうち１種又は複数を含有する医薬組成物は、腫瘍成長を防止又は遅延するために対象に毎日経口投与される。１つの特定の例では、２種以上の開示されている化合物の同等の分量を含有する組成物が、対象に提供される。一例では、２種以上の開示されている化合物の不均等な分量を含有する組成物が、対象に提供される。例えば、組成物は、（Ｒ，Ｒ’）−フェノテロール誘導体及び（Ｓ，Ｒ’）−フェノテロール誘導体及び／又は（Ｒ，Ｓ’）−誘導体の不均等な分量を含有する。１つの特定の例では、組成物は、より多量の（Ｓ，Ｒ’）−又は（Ｒ，Ｓ’）−フェノテロール誘導体を含む。このような療法は、腫瘍再発を阻害、防止又は低減するために、不確定な期間、対象に与えられ得る。
【０１５９】
Ｖ．使用方法
【０１６０】
本開示は、カンナビノイド受容体（ＧＰＲ５５など）によってモジュレートされる、障害（例えば、代謝性、炎症性、疼痛性などの障害）又は疾患（例えば、肝細胞癌腫、膠芽腫、肝臓癌、肺癌、結腸癌、脳癌、糖尿病又は炎症性疾患）と関連している１種又は複数徴候の又は症状を低減又は阻害することを含む、障害を治療する方法を含む。
【０１６１】
いくつかの例では、腫瘍は、ＣＢ受容体、例えば、ＧＰＲ５５を発現するか、それによって調節される原発性脳腫瘍などの原発腫瘍である。いくつかの例では、腫瘍は、ＣＢ受容体、例えば、ＧＰＲ５５を発現する膠芽腫又は肝細胞癌腫である。いくつかの例では、腫瘍は、ＣＢ受容体、例えば、ＧＰＲ５５を発現するが、β２−ＡＲは発現しない膠芽腫又は肝細胞癌腫である。いくつかの例では、腫瘍は、ＣＢ受容体、例えば、ＧＰＲ５５及びβ２−ＡＲの両方を発現する膠芽腫又は肝細胞癌腫である。フェノテロール類似体及び／又はフェノテロール、例えば、（Ｒ，Ｒ’）フェノテロール自体が、腫瘍受容体集団に応じて投与される。例えば、ＣＢ受容体、例えば、ＧＰＲ５５を発現するか、それによって調節される腫瘍は、ＣＢ受容体モジュレート活性を有する１種又は複数の開示されているフェノテロール類似体、例えば、（Ｒ，Ｒ’）−４’−メトキシ−１−ナフチルフェノテロール（ＭＮＦ）、（Ｒ，Ｓ’）−ＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−ナフチルフェノテロール（ＮＦ）、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＮＦ、（Ｒ，Ｓ’）−ＮＦ及び（Ｒ，Ｒ’）−４’−アミノ−１−ナフチルフェノテロール（アミノＮＦ）、（Ｒ，Ｒ’）−４’−ヒドロキシ−１−ナフチルフェノテロール（ヒドロキシＮＦ）又はそれらの組合せを投与することによって治療される。いくつかの例では、ＣＢ受容体、例えば、ＧＰＲ５５及びβ２−ＡＲを発現するか、又はそれによって調節される腫瘍は、ＣＢ受容体調節活性を有する１種又は複数の開示されているフェノテロール類似体、例えば、（Ｒ，Ｒ’）−４’−メトキシ−１−ナフチルフェノテロール（ＭＮＦ）、（Ｒ，Ｓ’）−ＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−ナフチルフェノテロール（ＮＦ）、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＮＦ、（Ｒ，Ｓ’）−ＮＦ及び（Ｒ，Ｒ’）−４’−アミノ−１−ナフチルフェノテロール（アミノＮＦ）、（Ｒ，Ｒ’）−４’−ヒドロキシ−１−ナフチルフェノテロール（ヒドロキシＮＦ）及びβ２−ＡＲ刺激活性を有する１種又は複数のフェノテロール類似体又はフェノテロール自体を組み合わせて投与することによって治療される。
【０１６２】
開示されている方法は、医薬上許容される担体中で、β２−ＡＲ、ＣＢ受容体又はそれらの組合せを発現する腫瘍、例えば、原発腫瘍を治療するのに有効な量で、対象に、腫瘍の受容体集団に応じて、フェノテロール、例えば、（Ｒ，Ｒ’）−フェノテロール、開示されているフェノテロール類似体又はそれらの組合せ（及び、所望により、１種又は複数のその他の医薬品）を投与することを含む。腫瘍の治療は、このような腫瘍の存在と関連している徴候又は症状を防止又は低減すること（例えば、腫瘍の大きさ若しくは体積又はその転移を低減することによって）を含む。このような成長の低減は、いくつかの例では、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％又は９５％の低減を含めた、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％又は少なくとも７５％、例えば、１０％〜９０％、２０％〜８０％、３０％〜７０％、４０％〜６０％の間で、腫瘍の転移を低減若しくは減速又は腫瘍の大きさ若しくは体積を低減し得る。別の例では、治療は、例えば、腫瘍が転移する能力を低減することによって、対象において腫瘍の浸潤活性を低減することを含む。いくつかの例では、本明細書において開示されている方法を使用する治療が、対象の生存時間を延長する。
【０１６３】
開示されている方法において有用な投与経路として、それだけには限らないが、経口及び非経口経路、例えば、上記で詳細に記載されるような静脈内（ＩＶ）、腹膜内（ＩＰ）、直腸、局所、経眼、経鼻及び経皮が挙げられる。
【０１６４】
フェノテロール、例えば、（Ｒ，Ｒ’）−フェノテロール若しくは開示されているフェノテロール類似体又はそれらの組合せの有効量は、少なくとも、特定の使用方法、治療されている対象、腫瘍の重篤度及び治療用組成物の投与方法に応じて変わる。組成物の「治療上有効な量」は、治療されている対象において所望の効果を達成するのに十分な指定の化合物の量である。例えば、これは、対象において腫瘍成長及び／又は腫瘍と関連している１種若しくは複数の症状を防止又は阻害するのに必要な、（Ｒ，Ｒ’）−フェノテロール、開示されているフェノテロール類似体又はそれらの組合せの量であり得る。理想的には、（Ｒ，’Ｒ）−フェノテロール又は開示されているフェノテロール類似体の治療上有効な量は、宿主細胞に対して実質的な細胞傷害性効果を引き起こさずに、対象において、腫瘍、例えば、脳腫瘍若しくは肝臓腫瘍成長及び／又は腫瘍と関連している１種若しくは複数の症状を防止又は阻害するのに十分な量である。
【０１６５】
開示されているフェノテロール化合物又は医薬組成物の治療上有効な用量は、少なくとも、本明細書における実施例において開示されている適用可能な化合物のＩＣ５０と同程度に高い濃度を達成することを目的に、当業者によって決定され得る。投与量範囲の例は、単回又は分割用量で、経口で、約０．００１〜約１０ｍｇ／体重１ｋｇである。特定の例では、投与量範囲は、単回又は分割用量で、経口で、約０．００５〜約５ｍｇ／体重１ｋｇである（およそ７０ｋｇの平均体重を仮定して；多かれ少なかれ平均より体重のある人に従って調整された値）。経口投与用には、組成物は、例えば、治療されている対象に対する投与量の対症調節のために、約１．０〜約５０ｍｇの有効成分、特に、約２．５ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ又は約５０ｍｇの有効成分を含有する錠剤の形態で提供される。１つの例示的経口投与計画では、約１ｍｇ〜約５０ｍｇの有効成分を含有する錠剤が、１日に２〜４回、例えば、２回、３回又は４回投与される。
【０１６６】
その他の例では、非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）投与に適した用量とは、１キログラムあたり約１ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇの用量であり、そのように、非経口的に投与される約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ又は約１００ｍｇ／ｋｇを含む。しかし、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇを含めた、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ、例えば、約０．１〜約５００ｍｇ／ｋｇなどのその他のより高い又は低い投与量も使用され得る。
【０１６７】
１種又は複数の開示されている組成物を含む組成物の単回又は複数回投与は、治療医師によって選択されている用量レベル及びパターンを用いて実施され得る。一般に、複数回用量が投与される。特定の例では、組成物は、１日に１回非経口的に投与される。しかし、組成物は、１日２回、１日３回、１日４回、１日６回、１日おき、週に２回、週１回又は月１回投与され得る。治療は、通常、少なくとも１カ月間、より多くの場合は、２又は３カ月間、時には、６カ月又は１年間継続し、不確定に、すなわち、慢性的にさらに継続する場合もある。治療の反復過程もまた、あり得る。
【０１６８】
任意の特定の対象のための特定の用量レベル及び投与量の頻度は、変わり得、特定の化合物の活性、代謝的安定性及びその化合物の作用の長さ、対象の年齢、体重、全身の健康、性別及び食事、投与様式及び投与時間、排泄速度、薬物組合せ並びに療法を受けている対象の状態の重篤度を含めた種々の因子に応じて変わる。
【０１６９】
対象を選択すること
【０１７０】
対象は、例えば、ＣＢ受容体活性若しくは発現を必要とする対象又はそれによって調節される障害若しくは疾患を発症する危険性がある対象を選択するために、開示されている療法を開始する前にスクリーニングされ得る。手短には、本方法は、対象をスクリーニングして、ＧＰＲ５５によって調節される障害若しくは疾患を有するか、又はそれを発症する危険性があるかどうか、例えば、対象が、腫瘍阻害を必要とするかどうかを決定することを含み得る。ＣＢ受容体、例えば、ＧＰＲ５５を発現する腫瘍若しくはＣＢ受容体活性によって調節される腫瘍、例えば、膠芽腫などの原発性脳腫瘍を含めた原発腫瘍、肝細胞癌腫、肝臓癌、肺癌若しくは結腸癌を有する対象又はこのような腫瘍を発症する危険性がある対象が選択される。一例では、対象は、臨床徴候、検査室検査又は両方によって腫瘍を有すると診断される。例えば、原発性脳腫瘍などの腫瘍は、頭痛、嘔吐、発作、めまい、体重減少及び種々の関連する訴えなどの特徴的な臨床徴候によって診断され得る。診断は、一般に、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によってなどの画像解析によってであり、組織診断によって確認される。いくつかの例では、脳内出血などの出血障害を有さない対象が、選択される。
【０１７１】
一例では、開示されている療法を必要とする対象は、ＣＢ受容体（例えば、ＧＰＲ５５）を発現するか、その活性によって調節される腫瘍を有するか、有する疑いのある、又は獲得する危険性があると同定された対象から得られたサンプルにおいてＣＢ受容体活性又は発現を検出することなどによって、このような腫瘍を検出することによって選択される。例えば、原発腫瘍の不在下でのＣＢ発現又は活性と比較される、ＣＢ発現又は活性における、１０％〜９０％、２０％〜８０％、３０％〜７０％、４０％〜６０％を含めた少なくとも１０％の変化、例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％の変化又はそれ以上の変化の検出は、腫瘍が、ＣＢ受容体調節因子である本明細書において提供されるフェノテロール組成物及び方法を使用して治療され得ることを示す。その他の例では、対象は、対象においてＭＲＩ又は陽電子放射型断層撮影（ＰＥＴ）によって星状細胞腫又は膠芽腫などの原発性脳腫瘍を検出することによって選択される。
【０１７２】
いくつかの例では、対象は、β２−ＡＲ刺激に応答しない腫瘍及び／又は癌などの障害若しくは疾患を有するか、又はそれを発症する危険性があることを決定することによって選択される。
【０１７３】
本明細書において開示されている治療薬（フェノテロール、フェノテロール類似体又はそれらの組合せを含むものなど）の投与に先立って、プレスクリーニングは必要ではない。
【０１７４】
例示的腫瘍
【０１７５】
例示的腫瘍として、ＣＢ受容体、例えば、ＧＰＲ５５を発現するか、又はこのようなものによって調節される腫瘍、例えば、原発性脳腫瘍などの原発腫瘍が挙げられる。原発性脳腫瘍として、星状細胞腫、膠芽腫、上衣腫、乏突起神経膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｏｍａｓ）及び混合膠腫が挙げられる。ＣＢ受容体活性又は発現と関連している腫瘍のさらなる可能性ある種類として、急性白血病（１１ｑ２３陽性急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病並びに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球）白血病、慢性骨髄性白血病及び慢性リンパ性白血病など）を含めた白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度及び高悪性度形態）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高グロブリン血症、重鎖疾患、骨髄異形成症候群、ヘアリーセル白血病及び脊髄形成異常症などの血液腫瘍が挙げられる。
【０１７６】
ＣＢ受容体を発現し得るか、ＣＢ受容体活性によって調節され得る可能性ある固形腫瘍の例として、肉腫及び癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫及びその他の肉腫、滑膜腫、食道、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、リンパ系腫瘍、膵臓癌、乳癌（基底乳癌腫、乳管癌腫及び小葉癌腫を含む）、肺癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌腫、扁平上皮癌腫、基底細胞癌腫、腺癌、汗腺癌腫、甲状腺髄様癌腫、甲状腺乳頭癌腫、クロム親和性細胞腫  皮脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭状腺癌、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫、肝細胞腫、胆管癌腫、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌腫並びにＣＮＳ腫瘍（神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｒｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫及び網膜芽細胞腫など）が挙げられる。いくつかの例では、腫瘍は、ＣＢ受容体、例えば、ＧＰＲ５５を発現する脳癌、肝臓癌又は肺癌である。ＣＢ受容体、例えば、ＧＰＲ５５を発現する腫瘍は、ＣＢ受容体、例えば、ＧＰＲ５５を検出できる抗体を用いる、ウエスタンブロット及び組織学的研究を含めた、当業者に公知の日常的な方法によって同定され得る。
【０１７７】
評価
【０１７８】
１種又は複数の療法を施した後、ＣＢ受容体活性によって調節される障害又は疾患、例えば、ＧＰＲ５５を発現する腫瘍（例えば、原発腫瘍）を有する対象は、腫瘍成長、腫瘍体積の低減又は腫瘍と関連している１種若しくは複数の臨床症状の低減についてモニタリングされ得る。特定の例では、対象は、治療の７日後に出発して１回又は複数回分析される。対象は、画像解析を含めた本明細書において記載されるものを含めた、当技術分野で公知の任意の方法を使用してモニタリングされ得る。
【０１７９】
さらなる治療及びさらなる治療薬
【０１８０】
特定の例では、対象が、治療に対して、安定であるか、又は微量の、混合した、若しくは部分的な応答を有する場合には、対象は、再評価後に、同一スケジュール及びこれまでに投与された薬剤の調製物を用いて、所望の時間量の間、例えば、対象の寿命の期間、再治療されてもよい。部分的応答は、腫瘍の大きさ又は体積を含めた、障害又は疾患、例えば、ＣＢ受容体活性によって調節される腫瘍と関連している１種又は複数の徴候又は症状の、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％又は少なくとも７０％の低減などの低減である。
【０１８１】
いくつかの例では、本方法は、治療上有効な量のフェノテロール、フェノテロール類似体又はそれらの組合せを、さらなる治療的治療とともに投与することをさらに含む。特定の例では、ＣＢ受容体活性によって調節される腫瘍を防止又は阻害する薬剤の治療量の投与の前、投与の間、投与の後に、対象は、１種又は複数のその他の療法を施され得る。一例では、対象は、フェノテロール、フェノテロール類似体又はそれらの組合せを含む組成物の治療量の投与の前に、腫瘍を除去又は低減するための１種又は複数の治療を施される。
【０１８２】
このような療法の例として、それだけには限らないが、腫瘍を除去又は低減するための外科的治療（外科的切除、寒冷療法又は化学塞栓療法など）並びに放射治療薬、抗新生物化学療法薬、抗生物質、アルキル化剤及び抗酸化物質、キナーゼ阻害剤並びにその他の薬剤を含み得る抗腫瘍薬剤治療が挙げられる。使用され得るさらなる治療薬の特定の例として、微小管結合剤、ＤＮＡ介入物又は架橋剤、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤並びに遺伝子調節因子が挙げられる。これらの薬剤（治療上有効な量で投与される）及び治療は、単独又は組み合わせて使用され得る。方法及びこのような薬剤の治療的投与量は、当業者に公知であり、熟練した臨床医によって決定され得る。
【０１８３】
「微小管結合剤」とは、チューブリンと相互作用して、微小管形成を安定化又は不安定化し、それによって、細胞分裂を阻害する薬剤を指す。開示されている療法とともに使用され得る微小管結合剤の例として、制限するものではないが、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン（ナベルビン）、エポチロン、コルヒチン、ドラスタチン１５、ノコダゾール、ポドフィロトキシン及びリゾキシンが挙げられる。このような化合物の類似体及び誘導体もまた、使用され得、当業者に公知である。例えば、適したエポチロン及びエポチロン類似体は、国際公開ＷＯ２００４／０１８４７８に記載されている。パクリタキセル及びドセタキセル並びに米国特許第６，６１０，８６０号；同第５，５３０，０２０号及び同第５，９１２，２６４号によって教示されるパクリタキセルの類似体などのタキソイドが使用され得る。
【０１８４】
以下のクラスの化合物が、本明細書において開示されている方法において有用である：制限するものではないが、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、ドキソルビシン並びにそれらの誘導体及び類似体を含めた、適したＤＮＡ及び／又はＲＮＡ転写調節因子も、開示されている療法と組み合わせて使用するのに適している。対象に投与され得るＤＮＡ介入物及び架橋剤として、制限するものではないが、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシＣなどのマイトマイシン、ブレオマイシン、クロラムブシル、シクロホスファミド並びにそれらの誘導体及び類似体が挙げられる。治療薬として使用するのに適したＤＮＡ合成阻害剤として、制限するものではないが、メトトレキサート、５−フルオロ−５’−デオキシウリジン、５−フルオロウラシル及びそれらの類似体が挙げられる。適した酵素阻害剤の例として、制限するものではないが、カンプトテシン、エトポシド、ホルメスタン、トリコスタチン並びにそれらの誘導体及び類似体が挙げられる。アルキル化剤の例として、カルムスチン又はロムスチンが挙げられる。遺伝子調節に影響を及ぼす適した化合物として、ラロキシフェン、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、タモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ミフェプリストン並びにそれらの誘導体及び類似体などの、１種又は複数の遺伝子の発現の増大又は減少をもたらす薬剤が挙げられる。キナーゼ阻害剤として、増殖因子のリン酸化及び活性化を防ぐ、Ｇｌｅｅｖａｃ、Ｉｒｅｓｓａ及びＴａｒｃｅｖａが挙げられる。
【０１８５】
上記の分類の１種又は複数下に入る場合も入らない場合もあるその他の治療薬、例えば、抗腫瘍剤も、開示されている療法と組み合わせた投与に適している。例として、このような薬剤として、アドリアマイシン、アピゲニン、ラパマイシン、ゼブラリン、シメチジン並びにそれらの誘導体及び類似体が挙げられる。
【０１８６】
一例では、開示されている療法を施す（フェノテロール、フェノテロール類似体又はそれらの組合せの投与など）前に、腫瘍（原発性脳腫瘍など）の少なくとも一部が、外科的に除去され（例えば、寒冷療法によって）、照射され、化学的に処置される（例えば、化学塞栓療法によって）又はそれらの組合せである。例えば、ＣＢ受容体活性と関連している原発性脳腫瘍を有する対象は、開示されている療法を施す前に外科的に切除される腫瘍の少なくとも一部を有し得る。一例では、フェノテロール、フェノテロール類似体又はそれらの組合せを含む組成物での治療後に、１種又は複数の化学療法薬が投与される。別の特定の例では、対象は原発性脳腫瘍を有し、開示されている療法を施すのと同時に、放射線療法、化学塞栓療法治療又は両方が施される。
【０１８７】
さらなる障害及び疾患
【０１８８】
上記で論じられるように、ＣＢ受容体によって調節される腫瘍を治療する方法に加えて、ＣＢ受容体調節と関連しているその他の状態、例えば、代謝性障害及び疾患（例えば、肥満症及び糖尿病）又は炎症性及び神経因性疼痛性障害、アルツハイマー病、骨量減少、筋消耗（筋肉減少症）、変形性関節症及び食欲不振などの加齢と関連している疾患、鬱病及び不安神経症などの中枢神経系状態並びにＣＢ受容体調節と関連しているその他の疾患及び障害を治療するために、ＣＢ受容体モジュレート活性を有する開示されているフェノテロール類似体、例えば、ＧＰＲ５５活性のモジュレーターが使用され得るということが考慮される。
【０１８９】
これらの知見に基づいて、代謝性障害／疾患（肥満症、食欲不振及び／又は糖尿病など）、骨及び／又は筋肉障害又は疾患（骨量減少、筋消耗、変形性関節症など）、中枢神経系状態（鬱病及び不安神経症など）並びに炎症及び／又は加齢と関連している炎症、神経因性疼痛障害及び疾患（アルツハイマー病、変形性関節症など）などの炎症性障害／疾患を治療する方法が開示されている。例えば、肥満症、糖尿病及び関連障害を防止及び治療する方法が、本明細書に開示されている。
【０１９０】
一例では、肥満症又は肥満症と関連している状態と関連している１種又は複数の徴候又は症状を低減又は阻害するために、対象に、有効量の少なくとも１種の、ＣＢ受容体モジュレート活性、例えば、ＧＰＲ５５活性を有するフェノテロール類似体（例えば、（Ｒ，Ｒ’）−４’−メトキシ−１−ナフチルフェノテロール（ＭＮＦ）、（Ｒ，Ｓ’）−ＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−ナフチルフェノテロール（ＮＦ）、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＮＦ、（Ｒ，Ｓ’）−ＮＦ及び（Ｒ，Ｒ’）−４’−アミノ−１−ナフチルフェノテロール（アミノＮＦ）、（Ｒ，Ｒ’）−４’−ヒドロキシ−１−ナフチルフェノテロール（ヒドロキシＮＦ）又はそれらの組合せなどの開示されているナフチルフェノテロール類似体）を投与することを含む、対象において肥満症又は肥満症と関連している状態、例えば、糖尿病を治療する方法が開示されている。いくつかの例では、炎症性障害／疾患又は炎症性障害／疾患と関連している状態と関連している１種又は複数の徴候又は症状を低減又は阻害するために、対象に、有効量の少なくとも１種の、ＣＢ受容体モジュレート活性、例えば、ＧＰＲ５５活性を有するフェノテロール類似体（例えば、（Ｒ，Ｒ’）−４’−メトキシ−１−ナフチルフェノテロール（ＭＮＦ）、（Ｒ，Ｓ’）−ＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＭＮＦ、（Ｒ，Ｒ’）−ナフチルフェノテロール（ＮＦ）、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＮＦ、（Ｒ，Ｓ’）−ＮＦ及び（Ｒ，Ｒ’）−４’−アミノ−１−ナフチルフェノテロール（アミノＮＦ）、（Ｒ，Ｒ’）−４’−ヒドロキシ−１−ナフチルフェノテロール（ヒドロキシＮＦ）又はそれらの組合せなどの開示されているナフチルフェノテロール類似体）を投与することを含む、炎症性障害及び／又は疾患と関連している１種又は複数の徴候又は症状を治療する方法が開示されている。
【０１９１】
開示されている方法は、医薬上許容される担体中で、ＣＢ受容体活性、例えば、ＧＰＲ５５活性によって調節される障害又は疾患を治療するのに有効な量で、対象にＣＢ受容体モジュレート活性を有する開示されているフェノテロール類似体（及び所望により、１種又は複数のその他の医薬品）を投与することを含む。障害又は疾患の治療は、特定の障害又は疾患と関連している徴候又は症状を防止又は低減することを含む。特定の障害又は疾患と関連している徴候及び症状は、当業者には公知であり、本明細書において開示されているアッセイ並びに当業者に公知のものによって測定され得る。いくつかの例では、本明細書において開示されている方法を使用する治療は、対象の生存時間を延長する。
【０１９２】
開示されている方法において有用な投与経路として、それだけには限らないが、上記で詳細に記載されるような、経口及び非経口経路、例えば、静脈内（ＩＶ）、腹膜内（ＩＰ）、直腸、局所、経眼、経鼻及び経皮が挙げられる。
【０１９３】
開示されているフェノテロール類似体又はそれらの組合せの有効量は、少なくとも、特定の使用方法、治療されている対象、障害／疾患の重篤度及び治療用組成物の投与方法に応じて変わる。組成物の「治療上有効な量」は、治療されている対象において所望の効果を達成するのに十分な指定の化合物の量である。理想的には、開示されているフェノテロール類似体の治療上有効な量は、宿主細胞に対して実質的な細胞傷害性効果を引き起こさずに、対象において、特定の障害／疾患と関連している１種又は複数の症状を防止又は阻害するのに十分な量である。
【０１９４】
開示されているフェノテロール化合物又は医薬組成物の治療上有効な用量は、少なくとも、本明細書における実施例において開示されている適用可能な化合物のＩＣ５０と同程度に高い濃度を達成することを目的に、当業者によって決定され得る。投与量範囲の例は、単回又は分割用量で、経口で、約０．００１〜約１０ｍｇ／体重１ｋｇである。特定の例では、投与量範囲は、単回又は分割用量で、経口で、約０．００５〜約５ｍｇ／体重１ｋｇである（およそ７０ｋｇの平均体重を仮定して；多かれ少なかれ平均より体重のある人に従って調整された値）。経口投与用には、組成物は、例えば、治療されている対象に対する投与量の対症調節のために、約１．０〜約５０ｍｇの有効成分、特に、約２．５ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ又は約５０ｍｇの有効成分を含有する錠剤の形態で提供される。１つの例示的経口投与計画では、約１ｍｇ〜約５０ｍｇの有効成分を含有する錠剤が、１日に１〜４回、例えば、１回、２回、３回又は４回投与される。
【０１９５】
その他の例では、非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）投与に適した用量とは、１キログラムあたり約１ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇの用量であり、そのように、非経口的に投与される約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ又は約１００ｍｇ／ｋｇを含む。しかし、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇを含めた、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ、例えば、約０．１〜約５００ｍｇ／ｋｇなどのその他のより高い又は低い投与量も使用され得る。
【０１９６】
１種又は複数の開示されている組成物を含む組成物の単回又は複数回投与は、治療医師によって選択されている用量レベル及びパターンを用いて実施され得る。一般に、複数回用量が投与される。特定の例では、組成物は、１日に１回非経口的に投与される。しかし、組成物は、１日２回、１日３回、１日４回、１日６回、１日おき、週に２回、週１回又は月１回投与され得る。治療は、通常、少なくとも１カ月間、より多くの場合は、２又は３カ月間、時には、６カ月又は１年間継続し、不確定に、すなわち、慢性的にさらに継続する場合もある。治療の反復過程もまた、あり得る。
【０１９７】
任意の特定の対象のための特定の用量レベル及び投与量の頻度は、変わり得、特定の化合物の活性、代謝的安定性及びその化合物の作用の長さ、対象の年齢、体重、全身の健康、性別及び食事、投与様式及び投与時間、排泄速度、薬物組合せ並びに療法を受けている対象の状態の重篤度を含めた種々の因子に応じて変わる。いくつかの例では、加齢障害若しくは疾患（アルツハイマー病、筋肉減少症、骨量減少又はそれらの組合せなど）又は中枢神経系障害若しくは疾患（不安神経症又は鬱病など）と関連している１種又は複数の症状を治療するために、１種又は複数の、ＣＢ受容体活性を有する開示されているフェノテロール類似体が、対象に、毎日経口投与される。
【０１９８】
対象は、例えば、ＣＢ受容体活性若しくは発現を必要とする対象又はそれによって調節される障害若しくは疾患を発症する危険性がある対象を選択するために、開示されている療法を開始する前にスクリーニングされ得る。手短には、本方法は、対象をスクリーニングして、ＧＰＲ５５によって調節される障害若しくは疾患を有するか、又はそれを発症する危険性があるかどうか決定することを含み得る。ＣＢ受容体、例えば、ＧＰＲ５５を発現するか、又はＣＢ受容体活性によって調節される障害又は疾患を有する対象が選択される。一例では、対象は、当業者に公知の、又は本明細書において開示されている（又は両方）、臨床徴候、検査室検査又は両方によって診断される。
【０１９９】
本明細書において開示されている治療薬（フェノテロール、フェノテロール類似体又はそれらの組合せを含むものなど）の投与に先立って、プレスクリーニングは必要ではない。
【０２００】
特定の例では、対象が、治療に対して、安定であるか、又は微量の、混合した、若しくは部分的な応答を有する場合には、対象は、再評価後に、同一スケジュール及びこれまでに投与された薬剤の調製物を用いて、所望の時間量の間、例えば、対象の寿命の期間、再治療されてもよい。部分的応答は、障害又は疾患と関連している１種又は複数の徴候又は症状の、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％又は少なくとも７０％の低減などの低減である。
【０２０１】
いくつかの例では、本方法は、治療上有効な量の１種又は複数のフェノテロール類似体を、さらなる治療的治療とともに投与することをさらに含む。特定の例では、ＣＢ受容体活性によって調節される腫瘍を防止又は阻害する薬剤の治療量の投与の前、投与の間、投与の後に、対象は、１種又は複数のその他の療法を施され得る。一例では、対象は、１種又は複数のフェノテロール類似体を含む組成物の治療量の投与の前に、ＣＢ受容体によって調節される障害／疾患と関連している１種又は複数の徴候又は症状を除去又は低減するための１種又は複数の治療を施される。
【０２０２】
特定の例では、肥満症又は肥満症と関連している状態の１種又は複数の徴候又は症状を低減又は阻害する、開示されているフェノテロール類似体組成物の治療量の投与前、投与の間又は投与後に、対象は、１種又は複数のその他の療法を施され得る。一例では、対象は、肥満症と関連している１種又は複数の状態、例えば、糖尿病を除去又は低減するために、１種又は複数の治療を施される。
【０２０３】
このような療法の例として、それだけには限らないが、抗糖尿病薬、インスリン増感剤、インスリン分泌促進物質、β−細胞量を保存及び／又は増大する薬剤、グルコース刺激性インスリン分泌及びインスリン作用の末梢臓器（骨格筋、肝臓、脂肪組織）におけるグルコース取り込みを増強する薬剤、内因性グルコース産生を抑制する薬剤並びに抗肥満症剤が挙げられる。例えば、開示されている療法は、ビグアナイドなどの抗糖尿病薬とともに投与され得る。特定の実施形態では、ビグアナイド抗糖尿病薬は、メトホルミンである。メトホルミンは、そのアクロニムＬＩＰＨＡ  ＳＡによっても知られる、Ｌｙｏｎｎａｉｓｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｌｌｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｑｕｅ  ＳＡ（Ｌｙｏｎｓ、Ｆｒａｎｃｅ）によって製造され、ＧＬＵＣＯＰＨＡＧＥ（登録商標）ＸＲとして、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）によって塩酸塩として米国において商業的に流通されている。さらに、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂは、メトホルミン及びグリブリドの組合せを有する医薬をＧＬＵＣＯＶＡＮＣＥ（登録商標）として流通させている。
【０２０４】
ビグアナイド以外の抗糖尿病薬も、同定された対象に投与され得る。例えば、代替実施形態では、抗糖尿病薬は、トログリタゾンなどのチアゾリンジンジオンである。いくつかの例では、抗糖尿病薬は、インクレチン又はジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤であるが、抗糖尿病薬は、対象の任意の薬剤であり得る。
【０２０５】
治療上有効な量の抗糖尿病薬は、単回用量で、又は数回用量で、例えば、毎日、治療の過程の間、投与され得る。治療の過程は、糖尿病前症と診断された対象においてＩＩ型糖尿病の発症を阻害する、又は２型糖尿病若しくは糖尿病前症と診断された対象を正常な糖耐性に誘導するなどの治療効果が観察される限り、任意の時間の長さの間、例えば、１日若しくは数日、１週間若しくは数週間、１カ月若しくは数カ月、又は１年若しくは数年持続し得る。対象は、治療プロトコールの有効性を評価するために、本明細書において記載される方法を使用する治療を受けながらモニタリングされ得る。このようにして、本明細書において開示されている方法を使用して得られた結果に基づいて、対象に与えられる時間の長さ又は量が改変され得る。
【０２０６】
治療上有効な量は、使用されている抗糖尿病薬、治療されている対象の特徴（例えば、年齢、ＢＭＩ、生理学的状態など）、苦痛の重篤度及び種類並びに薬剤の投与方法に応じて変わる。治療上有効な用量は、経験的な用量反応曲線を作製すること、定量的構造活性関係（ＱＳＡＲ）法又は分子モデリングを使用することによって効力及び有効性を予測すること並びに薬学において使用されるその他の方法を含めた種々の方法によって決定され得る。特定の、限定されない例では、メトホルミン（又は関連ビグアナイド類似体若しくは同族体）の治療上有効な量は、１日あたり少なくとも約１０００ｍｇ、例えば、１日あたり少なくとも約１５００ｍｇ又はさらに１日あたり少なくとも約１７００ｍｇである。特定のその他の限定されない例では、メトホルミンの総量は、１日あたり２又は３用量、例えば、８５０ｍｇを１日あたり２回（ｂ．ｉ．ｄ．）又は５００ｍｇを１日あたり３回（ｔ．ｉ．ｄ．）などのより小さい用量に分割される。代替の限定されない例では、メトホルミンの総量は、１日あたり約５００ｍｇ以下である。対象は、対象とする対象にとって治療上有効な量を決定するために、本明細書において記載されるアッセイを使用して異なる用量の薬剤でモニタリングされ得る。
【０２０７】
動物に投与するために、精製された治療上活性な薬剤は、一般に、医薬上許容される担体と組み合わされる。医薬調整物は、１種類のみの抗糖尿病薬を含有し得るか、２種以上の抗糖尿病薬の組合せなどの数種類の抗糖尿病薬の組合せからなり得る。
【０２０８】
一般に、担体の性質は、使用されている特定の投与様式に応じて変わる。例えば、非経口製剤は、普通、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどといった医薬上及び生理学上許容される流体を、媒体として含む注射用流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤又はカプセル剤形態）用には、従来の非毒性固体担体として、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン又はステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。投与されるべき医薬組成物は、生物学的に中性の担体に加えて、微量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、保存料及びｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウラートを含み得る。
【０２０９】
抗糖尿病薬は、その意図される目的を達成する任意の手段によって投与され得る。例えば、抗糖尿病薬は、対象に、静脈内、腹膜内、病巣内、坐剤又は経口投与などの全身投与によって投与され得る。
【０２１０】
抗糖尿病薬は、単独で、又は別の抗糖尿病薬と組み合わせて投与され得る。特定の実施形態では、抗糖尿病薬は、任意のその他の抗糖尿病薬の投与の不在下で投与される。
【０２１１】
疾患を発症する高い危険性がある対象においてＩＩ型糖尿病の発症を阻害又は遅延するために、その他の手段が取られてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、対象は、抗糖尿病性ライフスタイル改変を取り入れるよう指導されるか、訓練されるか、又は誘導される。例えば、対象は、カロリー摂取を低減するか、運動するよう助言され得る。本明細書に開示されている方法は、これらの代替手段の有効性をモニタリングして、薬剤介入が対象とする対象にとって正当化されるかどうかを決定するために使用され得る。
【０２１２】
本開示の主題は、以下の限定されない実施例によってさらに例示される。
【実施例】
【０２１３】
（例１）
材料及び方法
この実施例は、例２〜４に使用される材料及び方法を記載する。
【０２１４】
材料。（Ｒ，Ｒ’）−、（Ｒ，Ｓ’）−、（Ｓ，Ｒ’）−及び（Ｓ，Ｓ’）−フェノテロール及びフェノテロール類似体、（Ｒ，Ｒ’）−エチルフェノテロール、（Ｒ，Ｒ’）−４’−アミノフェノテロール、（Ｒ，Ｒ’）−１−ナフチルフェノテロール並びに（Ｒ，Ｒ’）−及び（Ｒ，Ｓ’）−４−メトキシ−１−ナフチルフェノテロールを、これまでに記載されたように合成した（各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｏｚｗｉａｋら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ５０：２９０３〜２９１５、２００７年；Ｊｏｚｗｉａｋら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ１８：７２８〜７３６、２０１０年）。［３Ｈ］−チミジン（７０〜９０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入した。イーグル最小必須培地（Ｅ−ＭＥＭ）、トリプシン溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ピルビン酸ナトリウムの１００×溶液（１００ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００ユニット／ｍｌペニシリン及び１０，０００μｇ／ｍｌストレプトマイシンの混合物）は、Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から入手した。ＷＩＮ５５，２１２−２、ＡＭ２５１及びＡＭ６３０は、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）から購入した。ＩＣＩ１１８，５５１ヒドロクロリド及び（Ｒ）−イソプロテレノールは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。
【０２１５】
細胞系の維持及び処置。ヒトＨｅｐＧ２肝細胞癌腫細胞及びヒトＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）は、１％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を補給したＥＭＥＭ培地で維持した。ヒト１３２１Ｎ１星状細胞腫細胞（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを補給したダルベッコ改変イーグル培地で培養した。すべての細胞系は、５％ＣＯ２中、３７℃で培養し、培地は２〜３日毎に置き換えた。
【０２１６】
特に断りのない限り、７０〜８０％コンフルエンスの細胞を、３時間血清を枯渇させ、続いて、ＩＣＩ１１８５５１、ＡＭ２５１、ＡＭ６３０又はＷＩＮ５５−２１２，２を１時間添加し、その後、媒体、示された濃度のフェノテロール又はフェノテロール誘導体を用いて処置した。
【０２１７】
［３Ｈ］−チミジン取り込みアッセイ。細胞をおよそ５０，０００個／ウェルで１２ウェルプレートに播種し、３７℃でインキュベートした。２４時間後、ウェルをＰＢＳですすぎ、適当な濃度の試験化合物を含有する血清不含培地で置き換えた。３７℃でさらに２４時間インキュベーションした後、各ウェルに１μＣｉの［３Ｈ］−チミジンを添加し、３７℃で１６時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、６００μＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨ中で振盪しながら３０分間溶解した後、ＤＮＡへの［３Ｈ］−チミジン取り込みをモニタリングした。溶解物を、３ｍＬの液体シンチレーションカクテル（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｂｒｅａ、ＣＡ）と混合し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ６０００ＩＣ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒを使用する液体シンチレーション測定によって放射能を測定した。データは、対照細胞と比較した、取り込まれたＣＰＭとして示されている。
【０２１８】
ｃＡＭＰ蓄積。ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルプレートに播種し、コンフルエンシーに成長させた。細胞をＫｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４ですすぎ、バッファーを用いて１０分間プレインキュベートし、次いで、１０μＭ  （Ｒ）−イソプロテレノール又は（Ｒ，Ｒ’）−フェノテロールを添加し、続いて、さらに１０分間インキュベーションを行った。細胞中に蓄積されたｃＡＭＰのレベルを決定し、１ウェルあたりのタンパク質の量に対して正規化した。
【０２１９】
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成及びＲＴ−ＰＣＲ分析。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してＨｅｐＧ２、１３２１Ｎ１及びＵ８７ＭＧ細胞から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ調製は、ＤＮアーゼ消化ステップを含んでいた。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用してＲＮＡ濃度及び質を測定した。ｃＤＮＡを得るために、１μｇの全ＲＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して逆転写した。ＧＡＰＤＨを内部対照として使用するＰＣＲ反応を実施して、ＣＢ１Ｒ、ＣＢ２Ｒ及びβ２−ＡＲ  ｍＲＮＡの発現を決定した。ＰＣＲプライマー及び条件は、補助表１に見られる。
【０２２０】
細胞周期分析。ＮＩＭ技術によって調製したヨウ化プロピジウム染色した核でのフローサイトメトリーによって細胞周期分布を実施した。Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で獲得した少なくとも１０，０００個の細胞のＤＮＡヒストグラムを、細胞周期のＧ０／１、Ｓ及びＧ２＋Ｍ相にある細胞のパーセンテージの推定値を求めて、Ｍｕｌｔｉｃｙｃｌｅプログラム（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｆｌｏｗ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してデコンボリューションした。ソフトウェアアルゴリズムによって分析からデブリ及びダブレットを除去した。
【０２２１】
アポトーシスアッセイ。薬物治療によって誘導されたアポトーシスの程度を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８アネキシンＶ／死細胞アポトーシスキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の標準プロトコールに従って使用してフローサイトメトリーによってアッセイした。手短には、ＨｅｐＧ２細胞（５×１０５）を、１００ｍｍディッシュ上で２４時間成長させ、続いて、すべて血清不含培地中の、媒体、（Ｒ，Ｒ’）−フェノテロール又は（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦを用いて処置した。続いて、２４時間インキュベーションを行った後に細胞を回収し、冷ＰＢＳで洗浄し、１００μＬの１Ｘアネキシン結合バッファーに再懸濁して、約１×１０６個／ｍＬの密度を維持し、その後、５μＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８アネキシンＶ及び１μＬの１００μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウムを、細胞懸濁液に添加した。次いで、細胞を室温で１５分間インキュベートし、４００μＬの１Ｘアネキシン結合バッファーを添加し、続いて穏やかに混合した。染色された細胞を、ＢＤＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターで分析した。
【０２２２】
ウエスタンブロッティング。ＥＧＴＡ及びＥＤＴＡを含有するＲＩＰＡバッファー（Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ）を用いて細胞を溶解した。溶解バッファーを、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合した。タンパク質濃度を、ビシンコニン酸試薬（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して測定した。タンパク質（２０μｇ／ウェル）を、還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して４〜１２％プレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で分離し、ポリビニリデンフルオリドメンブレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に電気泳動的にトランスファーした。標準法に従ってウエスタンブロットを実施した。ＥＣＬ  Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＮＪ）を使用して免疫反応バンドの可視化を実施し、その定量化をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して容量デンシトメトリーによって実施し、β−アクチンに対して正規化した。β２−ＡＲの一次抗体は、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から入手し（カタログ番号ＡＤＩ−９０５−７４２−１００、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）；ウサギ抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ−４７３）、ホスホ−ＥＲＫ１／２、総Ａｋｔ及び総ＥＲＫ２は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から入手し、抗β−アクチンはＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から入手した。抗体は、製造業者によって推奨される希釈で使用した。
【０２２３】
統計解析。結果は、対照値に対して表した。研究は、少なくとも２〜３種の異なる培養調製物で実施し、各調製物において各試験条件について２〜３つのディッシュをプレーティングした。結果は、平均±Ｓ．Ｅ．として表されている。群間の統計比較を行うために、スチューデントのｔ検定を使用した。解析は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェア（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ，２００３（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐ．、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）を使用して実施し、ｐ値≦０．０５を有意と考えた。
【０２２４】
（例２）
カンナビノイド受容体活性に対するフェノテロール及びフェノテロール類似体の特性決定
この実施例は、フェノテロール及び開示されているフェノテロール類似体の、カンナビノイド受容体活性をモジュレートする能力を特性決定するために実施された一連の研究を記載する。
【０２２５】
（Ｒ，Ｒ’）−フェノテロール、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎは、β２−アドレナリン受容体（β２−ＡＲ）の強力な、選択的アゴニストであり、β１−ＡＲと比較してβ２−ＡＲに対して４３倍高い親和性及びヒトβ２−ＡＲを発現するＨＥＫ細胞においてｃＡＭＰ蓄積の刺激に対して０．３ｎＭというＥＣ５０ｃＡＭＰ値を有する。本発明者らは、さまざまなβ２−ＡＲ選択性及び効力を有するいくつかの（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ類似体及び立体異性体（例えば、各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許公報ＷＯ２００８／０２２０３８及びＷＯ２０１１／１１２８６７を参照のこと）の合成及び特性決定を開示した。これらの類似体のうち１種、（Ｒ，Ｒ’）−４−メトキシ−１−ナフチルフェノテロール（ＭＮＦ）は、５７３のβ２−ＡＲ選択性を有し、３．９０ｎＭのＥＣ５０ｃＡＭＰである。
【０２２６】
β２−ＡＲは、ヘテロ三量体Ｇタンパク質（例えば、ＧＳ、Ｇｉ）、イオンチャンネル及びβ−アレスチンを含めた細胞質スキャフォールドタンパク質と会合して、種々のシグナル伝達経路を開始し、アデニルシクラーゼ及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）などの細胞内エフェクターの活性をモジュレートする。β２−ＡＲアゴニストによるＧタンパク質及びβ−アレスチンシグナル伝達の相違は、リガンド特異的ＧＰＣＲコンホメーション及び機能選択性との相互作用に起因しており、これは、β２−ＡＲが、不活性の（Ｒ）状態及び１種又は複数のリガンド特異的活性コンホメーション（Ｒ＊ｎ）で存在するという仮定に基づいている。薬理学的結果のリガンド特異的相違の基礎は、アゴニストの分子構造と受容体の細胞環境間の相互関係にある。第１の例では、本発明者らは、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎが心筋細胞収縮性モデルにおいてＧＳシグナル伝達を優先的に活性化したのに対し、（Ｓ，Ｒ’）−Ｆｅｎ及び（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦは、ＧＳ及びＧｉタンパク質の両方を活性化したので、ＦｅｎのＧｓ／Ｇｉ選択性が、分子構造及び立体化学の関数であることを示した。後の例では、本発明者らは、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ及びイソプロテレノールなどのβ２−ＡＲアゴニストは、具体的には、ｃＡＭＰ依存性経路によって、ヒト由来１３２１Ｎ１星状細胞腫細胞系において抗増殖効果を発揮することを実証したが、Ｙｕａｎ及び同僚ら（Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ２３：１５１〜１５７、２０１０年）は、イソプロテレノールがヒト由来ＨｅｐＧ２肝細胞癌腫細胞系の成長を用量依存的に誘導したことを報告した。
【０２２７】
この実施例は、ＨｅｐＧ２細胞における［３Ｈ］−チミジン取り込みに対するβ２−ＡＲアゴニストの分子構造及び立体化学の効果を記載し、これらの結果を、１３２１Ｎ１及びヒト由来Ｕ８７ＭＧ膠芽腫細胞系を使用して実施された同様の研究に対して比較する。最初のデータは、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ及びイソプロテレノールは、ＨｅｐＧ２細胞において［３Ｈ］−チミジン取り込みを誘導し、１３２１Ｎ１細胞において増殖を低減し、Ｕ８７ＭＧ細胞に対して効果を有さなかったということ並びにＨｅｐＧ２及び１３２１Ｎ１細胞における効果は、β２−ＡＲアンタゴニストＩＣＩ１１８５５１によって減弱され得るということを実証した。（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦが研究において利用された場合には、化合物が、ＨｅｐＧ２細胞における［３Ｈ］−チミジン取り込みを阻害し、１３２１Ｎ１細胞に対して有意な効果を有していなかったので、反対の結果が得られた。ＨｅｐＧ２細胞における（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの阻害効果は、ＩＣＩ１１８５５１の添加によって影響を受けず、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦはまた、β２−ＡＲ欠損Ｕ８７ＭＧ細胞系において［３Ｈ］−チミジン取り込みを減弱した。これらの結果は、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦは、完全β２−ＡＲアゴニストであるが、この化合物の抗増殖効果は、この活性によるものではないということを示す。さらなる研究によって、ＡＭ２５１及びＡＭ６３０、それぞれ、ＣＢ１及びＣＢ２カンナビノイド受容体のインバースアゴニストは、ＨｅｐＧ２及びＵ８７ＭＧ細胞系において（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ有糸分裂促進性反応を遮断したということ並びにＷＩＮ５５，２１２−２、合成ＣＢ１及びＣＢ２受容体アゴニストは、これらの細胞系において成長阻害をもたらしたということが示された。これらの結果は、カンナビノイド受容体活性化は、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの細胞型依存性抗増殖効果及びアポトーシス促進効果と関連しているということを示唆する。
【０２２８】
選択されたヒト癌細胞系におけるβ２−ＡＲの発現。ＨｅｐＧ２肝細胞癌腫細胞、１３２１Ｎ１星状細胞腫細胞及びＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞の総抽出物におけるウエスタンブロット解析によって、β２−ＡＲのタンパク質レベルを決定した（図１Ａ）。β２−ＡＲタンパク質レベルは、ＨｅｐＧ２細胞と比較した場合に１３２１Ｎ１細胞において最高であった。Ｕ８７ＭＧ細胞は、細胞表面でβ２−ＡＲを欠いていると本発明者らによってこれまでに見出された。
【０２２９】
ＨｅｐＧ２細胞におけるｃＡＭＰ蓄積並びにＡｋｔ及びＥＲＫ１／２のリン酸化に対するβ−ＡＲアゴニストの効果。（Ｒ）−イソプロテレノールも（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎも、１０μＭでは、ＨｅｐＧ２細胞においてｃＡＭＰ産生の増大を誘発しなかったが、アデニル酸シクラーゼアクチベーター、フォルスコリンを用いる細胞処置は、ｃＡＭＰの大幅な蓄積を誘導した（図１Ｂ）。研究は、β２−ＡＲは、機能的アデニル酸シクラーゼカップリングとは独立に、マイトジェン活性化プロテインキナーゼＥＲＫ１及びＥＲＫ２にシグナル伝達し得るということを実証した。Ａｋｔ及びＥＲＫ１／２活性化に対するイソプロテレノール及び（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎの効果を、Ａｋｔ及びＥＲＫ１／２の活性形態に相当するリン酸化ペプチドに対する選択的抗体を使用する免疫ブロッティング（ｉｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）によって評価した。ＨｅｐＧ２細胞の、これらのβ−アゴニストを用いる処置は、Ａｋｔ及びＥＲＫ活性化の時間依存性増大を誘導した（図１Ｃ）。これらの結果は、β２−ＡＲによって刺激されるアデニリルシクラーゼ活性は、少ない受容体数のために、この細胞系では検出可能レベル未満であり得るということを示す。
【０２３０】
ＨｅｐＧ２細胞の増殖に対する（Ｒ）−イソプロテレノール及びＦｅｎ類似体の効果。ＨｅｐＧ２細胞において、細胞増殖に対する（Ｒ）−イソプロテレノール、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ及び選択されたＦｅｎ類似体の効果を決定した。（Ｒ）−イソプロテレノール及び（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎの両方とも、［３Ｈ］−チミジン取り込みによって評価されるように細胞増殖の大幅な増大をもたらし、それぞれ、０．４０±０．０８μＭ及び１．１７±０．３７μＭのＥＤ５０を有していた（表１；図２Ａ）。Ｆｅｎは、２つのキラル中心を有し、４種の可能性ある立体異性体形態、（Ｒ，Ｒ’）、（Ｒ，Ｓ’）、（Ｓ，Ｒ’）及び（Ｓ，Ｓ’）を有する。１μＭの濃度の各異性体を使用してＦｅｎの増殖効果に対する立体化学の効果を決定した。データは、異性体のすべてが、［３Ｈ］−チミジン取り込みの増大を誘導したこと及び立体化学は、このプロセスに対して定量的効果のみを有し、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎが最大の増大をもたらし（５１．３％）、（Ｓ，Ｓ’）−Ｆｅｎが最低の増大をもたらした（９．７％）（表１）ことを示す。この結果は、１３２１Ｎ１細胞における有糸分裂誘発に対する、これまでに報告されたＦｅｎ立体異性体の阻害効果と一致し、これでは、阻害効力は、（Ｒ，Ｒ’）＞（Ｒ，Ｓ’）≒（Ｓ，Ｒ’）＞＞（Ｓ，Ｓ’）であった（以下の表１を参照のこと）。Ｎ−アルキルメチル基のエチル部分｛（Ｒ，Ｒ’）−エチルＦｅｎ｝への変化及び４’−アミノ基の４’−ヒドロキシル基｛（Ｒ，Ｒ’）−アミノＦｅｎ｝との置換の効果も調べた。いずれの変更も［３Ｈ］−チミジン取り込みに対する効果の方向性を変化させ、（Ｒ，Ｒ’）−アミノＦｅｎは、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎよりも３倍活性であり、ＥＣ５０＝０．４７±０．０９μＭであると思われた（表１；図２Ａ）。
【０２３１】
本発明者らは、Ｆｅｎ分子へのナフチル部分の組込みが、得られた化合物の効力を低減したが、１３２１Ｎ１細胞における有糸分裂誘発に対する阻害効果を低減しなかったと決定した。さらに、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ及び１−ナフチルＦｅｎが、［３Ｈ］−チミジン取り込みを阻害し、それぞれ、０．３９±０．０９μＭ及び０．２１±０．０７μＭのＩＣ５０値を有していたので、反対の効果が観察された（表１；図２Ｂ）。（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ及び（Ｒ，Ｓ’）−ＭＮＦの１μＭ濃度が、［３Ｈ］−チミジン取り込みにおいてそれぞれ、−５９．４％及び−６８．１％という同等の低減をもたらしたので、ＭＮＦ分子のＮ−アルキル部分でのキラル中心の立体化学の変化は、抗増殖反応に対して効果がなかった（表１）。
【０２３２】
【表１】
2015519347.tif 000027
【０２３３】
（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦは、β２−ＡＲを用いて安定にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞及び１３２１Ｎ１細胞におけるｃＡＭＰ発現の刺激に関して完全な、強力なβ２−ＡＲアゴニストであり、ＨＥＫ細胞及び１３２１Ｎ１細胞は、それぞれ、３．９ｎＭ及び６８．９ｎＭのＥＣ５０を有する。ＨｅｐＧ２細胞は、［３Ｈ］−チミジン取り込みに関して、（Ｒ，Ｒ’）−アミノＦｅｎ（ＥＣ５０＝０．４７±０．０９μＭ）及び（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ（ＩＣ５０＝０．３９±０．０９μＭ）に対して相当な感受性を示したので、２種の化合物に対する１３２１Ｎ１細胞の反応性を決定し、著しく低いとわかった（図２Ｃ）。ＨｅｐＧ２及び１３２１Ｎ１細胞における（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ及び（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦに対する観察されたβ２−ＡＲ反応の特異性を、これまでに活性β２−ＡＲの発現を欠くとわかっているＵ８７ＭＧ細胞を使用して試験した。この細胞系では、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦは、細胞増殖の強力な阻害をもたらしたが、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎは効果がなかった（図７）。
【０２３４】
１３２１Ｎ１細胞における有糸分裂誘発に対する（Ｒ）−イソプロテレノール及び（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎの効果のこれまでの研究では、研究は、完全培地を使用して実施された。血清の存在又は不在が、（Ｒ）−イソプロテレノール及び（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎに応じた有糸分裂誘発の程度に大幅に影響を及ぼしたかどうかを決定するために、両プロトコールを使用して研究を反復した。結果は、ＨｅｐＧ２細胞は、血清が枯渇した培地においてより良好な感受性を示したが、感受性は完全培地で維持された１３２１Ｎ１細胞においてより高かったことを示した（図２Ｄ）。これらのデータは、ＨｅｐＧ２及び１３２１Ｎ１細胞においてβ２−ＡＲアゴニストに対する対照的な有糸分裂促進性反応があることを示唆する。
【０２３５】
β２−ＡＲ拮抗作用は、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの抗増殖作用を阻害しないが、ＨｅｐＧ２細胞において（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎの成長促進効果を妨げる。（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ及び（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦによって媒介される多岐にわたる作用は、細胞増殖に対して反対の効果を有する個々のシグナル伝達経路の活性化と一致する。これを評価するために、ＨｅｐＧ２細胞を、β２受容体アンタゴニスト、ＩＣＩ１１８，５５１を用いて前処置し、続いて、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ又は（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの存在下で２４時間インキュベーションを行った。ＩＣＩ１１８，５５１単独では細胞増殖に対して効果を示さなかった（図３Ａ）が、その添加は、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎによって刺激される有糸分裂誘発を大幅に遮断した（図３Ｂ及び３Ｃ）。しかし、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの抗増殖効果は、ＩＣＩ１１８，５５１前処置に対して不応性であった（図３Ｂ及び３Ｄ）。
【０２３６】
ＭＮＦの同時添加によって（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎの作用を妨害する能力を決定した。結果は、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ及び（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ単独の中間である、ＨｅｐＧ２細胞における有糸分裂促進性反応を明確に示し、ＩＣＩ１１８，５５１を用いる前処置は、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの抗増殖効果を部分的に回復した（図７、上のパネル）。しかし、１３２１Ｎ１細胞において（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎによって、及びＵ８７ＭＧ細胞において（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦによって誘発される細胞増殖プロフィールの特徴は、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ及び（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦを用いる同時処置によって維持された（図７、中央及び下のパネル）。ＩＣＩ１１８，５５１を用いる前処置は、Ｕ８７ＭＧ細胞において（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの抗増殖作用に対して不活性でありながら、１３２１Ｎ１細胞において（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎシグナル伝達を遮断した（図７）。これらの結果は、細胞増殖に対する（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ及び（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの効果が、細胞型特異的であり、個々の受容体の活性化を必要とし得ることを示す。
【０２３７】
（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦは、ＨｅｐＧ２細胞においてアポトーシスを誘導する。ＨｅｐＧ２細胞の増殖は、ヨウ化プロピジウム染色を使用するフローサイトメトリー分析によって評価して、細胞周期を調べた。（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎは、細胞周期の有意な変化をもたらさなかったが、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦは、１μＭの（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦで処置されたＨｅｐＧ２細胞において、Ｇ２／Ｍ及びＳ相細胞集団の一時的な減少を引き起こした（対照におけるＧ２／Ｍ：１３．８±１．１％対６時間後に１０．２±０．９％、１２時間後に１４．６±１．８％及び２４時間後に８．９±１．６％；Ｓ：対照における３４．７±０．３％対６時間後に３４．１±０．９％、１２時間後に１３．７±１．２％及び２４時間後に２４．６±４．２％）（図４）。（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦを用いる処置はまた、サブＧ１事象の数の時間依存性増大をもたらし、１２時間までに２１．５±０．７％の最大に達した（図４、下、右のパネル）。細胞が（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ（１μＭ）を用いて処置された場合には、最大２４時間でサブＧ１事象の有意でない増大が観察された。
【０２３８】
サブＧ１事象は、細胞がアポトーシスの後期段階に進行したか、すでに死滅しているときに起こる。アポトーシスを直接測定するために、ＨｅｐＧ２細胞においてアネキシンＶ／ＰＩ染色を用いるフローサイトメトリー分析を実施した。（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ（１μＭ）を用いる２４時間処置によって誘導されたアポトーシス細胞のパーセンテージは、対照と比較して５．７倍増大した（Ｐ＜０．０１）。しかし、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ処置は、対照の未処置細胞と比較してアポトーシスを著しく低減した（図５）。
【０２３９】
（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ及び（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎの細胞増殖の対照におけるカンナビノイド受容体の役割。（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ及び（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦに応じた有糸分裂誘発の調節が、カンナビノイド受容体シグナル伝達機構によって起こるかどうかを調べた。ＣＢ１Ｒ及びＣＢ２ＲのｍＲＮＡレベルを、ＨｅｐＧ２、１３２１Ｎ１及びＵ８７ＭＧ細胞においてＲＴ−ＰＣＲによって決定した（図６Ａ、表２中に以下に提供されるプライマー）。結果は、ＨｅｐＧ２及びＵ８７ＭＧ細胞が、ＣＢ１Ｒ及びＣＢ２Ｒを発現したが、１３２１Ｎ１細胞は検出可能なレベルのＣＢＲ  ｍＲＮＡを有さなかったことを示した。（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ及び（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦで処置された細胞において、対照と比較して、合成カンナビノイド化合物の強力な調節効果が観察された。（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦと同様に、カンナビノイド受容体アゴニスト、ＷＩＮ５５，２１２−２（１μＭ）を用いたＨｅｐＧ２細胞の処置は、細胞増殖を低減し、フェノテロールの成長促進作用を相殺した（図６Ｂ）。ＡＭ２５１及びＡＭ６３０は、それぞれ、ＣＢ１Ｒ及びＣＢ２Ｒの合成インバースアゴニストである。ＡＭ２５１又はＡＭ６３０を用いる細胞前処置は、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎの有糸分裂促進性反応に対して影響がなく（図６Ｃ）、これら２種のカンナビノイド受容体の基礎レベル活性は、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎの増殖作用において主要な役割を果たさないことを示す。しかし、ＡＭ２５１又はＡＭ６３０を用いるプレインキュベーションは、ＨｅｐＧ２細胞における（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの抗増殖効果を完全に阻害し（図６Ｃ）、これは、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦシグナル伝達におけるカンナビノイド受容体の関与と一致する。この仮説を支持して、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ非応答性である１３２１Ｎ１細胞は、単独又は（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎと組み合わせて添加された場合に、カンナビノイド受容体リガンドに対して不応性であった（図８Ａ及び８Ｂ）。しかし、ＭＮＦの抗増殖効果は、β２−ＡＲ欠損、ＭＮＦ反応性Ｕ８７ＭＧ細胞において、ＡＭ２５１及びＡＭ６３０によって部分的に遮断された（図８Ｃ及び８Ｄ）。
【０２４０】
【表２】
2015519347.tif 000028
【０２４１】
本実施例は、ＨｅｐＧ２細胞の（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎを用いる処置が、細胞増殖の増大につながったことを実証する。ＩＣＩ１１８，５５１は、この効果を遮断し、これは、β２−ＡＲの関与を示す。しかし、フォルスコリンを用いる処置は、細胞が機能的アデニル酸シクラーゼを発現したことを実証したが、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎもイソプロテレノールも、ＨｅｐＧ２細胞におけるｃＡＭＰの形成を誘導しなかった（図１）。これらの結果は、ｃＡＭＰ蓄積に対するβ２−ＡＲアゴニストの効果の欠如を説明するための２つの可能性を支持する：β２−ＡＲが、ｃＡＭＰを大幅に増大しないほど十分に低いレベルにあるか、又はＨｅｐＧ２細胞系中のβ２−ＡＲが刺激性Ｇαタンパク質と不十分にしか共役せず、細胞成長を促進するその他のシグナル伝達中間体との可能性ある相互作用を示唆するか、のいずれか。本結果は、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ又はイソプロテレノールを用いるＨｅｐＧ２細胞の処置が、ＰＩ３−キナーゼ／Ａｋｔ及びＥＲＫ経路を活性化したことを実証する。
【０２４２】
１３２１Ｎ１細胞におけるｃＡＭＰ蓄積及び有糸分裂誘発の阻害のβ２−ＡＲ関連刺激に対するＦｅｎの立体化学の効果に関するこれまでの研究は、分子の２つのキラル中心での空間配置の変化が、これらの特性の定量的変化のみをもたらすことをということを実証した。Ｆｅｎ立体異性体のすべてが、［３Ｈ］−チミジン取り込みの増大をもたらしたように（変化％として報告される）、ＨｅｐＧ２細胞において立体化学の同様の効果が観察され、（Ｒ，Ｒ’）＞＞（Ｓ，Ｒ’）≒（Ｒ，Ｓ’）＞＞（Ｓ，Ｓ’）であった（表１）。分子、（Ｒ，Ｒ’）−エチルＦｅｎのＮ−アルキル部分でのキラル中心での立体容積を増大することによって、また４’−置換基、（Ｒ，Ｒ’）−アミノＦｅｎの水素結合特性を変化させることによって、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎ分子の構造変化の効果を調べた。両類似体とも、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎと同程度に、ＨｅｐＧ２細胞における［３Ｈ］−チミジン取り込みを増大し（表１及び図２Ａ）、これは、Ｆｅｎ分子が、４’−置換フェニル環を含有する場合に、化合物が、ＨｅｐＧ２細胞において［３Ｈ］−チミジン取り込みを刺激すること及び分子の立体化学が、この効果に影響を及ぼすが、質的には変化させないことを示唆する。全構造−活性関係研究を開始しており、結果は別の場所で報告する。
【０２４３】
本発明者らは、Ｎ−アルキル部分でのフェニル環のナフチル部分の置換によって製造されたＦｅｎのナフチルフェノテロール（ＮＦ）類似体が、β２−ＡＲを用いて安定にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞（ＨＥＫ−β２−ＡＲ）におけるｃＡＭＰ発現の刺激に関して完全な、強力なβ２−ＡＲアゴニストであることを実証した；例えば、（Ｒ，Ｒ’）−１−ＮＦ及び（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦのＥＣ５０ｃＡＭＰは、それぞれ、１２．５及び３．９ｎＭであった。（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎを用いて観察されたように、（Ｒ，Ｒ’）−１−ＮＦ及び（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦも、１３２１Ｎ１細胞において有糸分裂誘発を阻害したが、ＩＣ５０値は、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎよりも≧１０倍高かった（Ｔｏｌｌら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ３３６：５２４〜３２、２０１１年）。ＨｅｐＧ２細胞が（Ｒ，Ｒ’）−１−ＮＦ及び（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦとともにインキュベートされた場合には、同様の定量的効果、すなわち、［３Ｈ］−チミジン取り込みの弱い刺激が期待された。しかし、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ及び（Ｒ，Ｒ’）−１−ＮＦが、［３Ｈ］−チミジン取り込みを阻害し、０．３９±０．０９μＭ及び０．２１±０．０７μＭのＩＣ５０値をそれぞれ有していたので、質的に異なる効果が観察された（表１及び図２Ｂ）。さらに、Ｆｅｎとは異なり、ＭＮＦ分子のＮ−アルキル部分でのキラル中心の立体化学の変化は、抗増殖反応に対して効果がなかった（表１）。
【０２４４】
この研究に使用されたＦｅｎ及びＮＦ類似体は、β２−ＡＲアゴニストであるので、ナフチル環のフェニル環との置換によって生じた効果の可能性ある説明として、「リガンドによって向けられるシグナル伝達」又は「偏ったアゴニズム」がある。β２−ＡＲは、複数のコンホメーションでリガンドと結合すること及び異なる受容体コンホメーションとの結合が、シグナル伝達の相違につながり得るということが実証されている。Ｆｅｎ及びＮＦ分子に関して、Ｆｅｎ類似体のβ２−ＡＲとの相互作用の最初の比較分子場解析（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｉｅｌｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＣｏＭＦＡ）研究によって、ＮＦ分子のナフチル置換基が、Ｆｅｎ分子上のフェニル部分には利用できない一連のπ−π及びπ−水素結合相互作用によってβ２−ＡＲと相互作用し得ることが示された。しかし、ＮＦ類似体の結合及び［３Ｈ］−チミジン取り込みの低減の直接的関連は、選択的薬理学的β２−ＡＲアンタゴニスト、ＩＣＩ１１８，５５１が、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの抗増殖作用を遮断できず（図３）、β２−ＡＲ陰性Ｕ８７ＭＧ細胞の（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦを用いる処置が、細胞成長の著しい低減を引き起こすが、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎは効果を有さなかった（図７）ので疑わしいと思われる。このデータは、ＮＦがＨｅｐＧ２細胞において発現されたβ２−ＡＲと結合し、（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎによって安定化されるコンホメーションとは異なるそのコンホメーションを安定化する可能性を排除しないが、これが起こる場合には、細胞成長をもたらす下流シグナル伝達カスケードの開始をもたらさないということを示唆する。
【０２４５】
本明細書において開示されている薬理学的証拠は、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦが、ＣＢ受容体の活性化によってその抗増殖効果を媒介することを示す。一方では、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦのこの作用は、ＨｅｐＧ２及びＵ８７ＭＧ細胞においてＷＩＮ５５，２１２−２によって再現され、組合せ（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ及びＷＩＮ５５，２１２−２は、相加効果の欠如を示した。他方、ＣＢ１及びＣＢ２受容体の選択的阻害は、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦシグナル伝達の抑制を示した。１３２１Ｎ１細胞における細胞成長に対するＷＩＮ５５，２１２−２によって媒介される作用の効果の欠如という知見は、１３２１Ｎ１細胞においてよりもＨｅｐＧ２及びＵ８７ＭＧ細胞系において実質的により多くのＣＢＲ発現があることによって説明され得る。さらに、本結果は、ＨｅｐＧ２細胞増殖における（Ｒ，Ｒ’）−Ｆｅｎによって媒介される増大は、ＷＩＮ５５，２１２−２によって中和されることを実証し、場合によっては、ＷＩＮ５５，２１２−２に応じたＧｉが連結しているＣＢＲの刺激が、主にＰＩ３−キナーゼ／Ａｋｔ及び／又はＥＲＫ経路を負にターゲッティングすることによって細胞成長を阻害することを示す。まとめると、これらの知見は、β２−ＡＲ活性化を必要としない機序による、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの抗有糸分裂促進性、アポトーシス促進性活性におけるＣＢ受容体の複雑な細胞型特異的関与を示す。
【０２４６】
（例３）
カンナビノイド受容体モジュレーションの特性決定
この実施例は、フェノテロール及び開示されているフェノテロール類似体のカンナビノイド受容体活性をモジュレートする能力をさらに特性決定するために実施された一連の研究を記載する。
【０２４７】
（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ誘導性反応を媒介するＣＢ受容体の種類を同定するために、ＨｅｐＧ２細胞におけるＴｏｃｒｉＦｌｕｏｒ１１１７（Ｔ１１１７、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）取り込みに対するＭＮＦの効果を評価した。Ｔ１１１７は、カンナビノイドＣＢ１受容体インバースアゴニストＡＭ２５１の蛍光性形態であり、これは、ＧＰＲ５５と高親和性で結合するが、ＣＢ１受容体との中程度の結合を有し、ＣＢ２受容体と相互作用しない。ＨｅｐＧ２細胞を、フェノテロール（１μＭ）、ＭＮＦ（１μＭ）又はＡＭ２５１（１０μＭ）とともに１時間インキュベートし、続いて、Ｔ１１１７（０．１μＭ）を添加した。図９に例示されるように、媒体又はフェノテロールのいずれかと比較して、Ｔ１１１７に先立ってＭＮＦ又はＡＭ２５１で処置した細胞において、Ｔ１１１７取り込みは著しく低減した。これらの研究は、ＭＮＦはＧＰＲ５５をモジュレートできることを示す。
【０２４８】
（例４）
ＭＮＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏ代謝的安定性
この実施例は、ヒト及びラット肝臓ミクロソームでのＭＮＦの代謝的安定性を記載する。
【０２４９】
図１０は、ＭＮＦを、活性な、熱不活化したヒト（ＨＬＭ）及びラット（ＲＬＭ）肝臓ミクロソーム及び補助因子とともに３７℃でインキュベートした（２連で）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ代謝的安定性研究から得られたデータを示す。アリコートを０、１５、３０及び６０分で取り出し、各時点で残存する試験化合物（ＭＮＦ）の量をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定した。結果は、熱不活化ミクロソーム対照の濃度の低下に基づいて、ＭＮＦが、インキュベーション条件下で幾分か不安定であることを示したが、結果は、ラット及びヒト肝臓ミクロソームとともにインキュベートした場合にＭＮＦレベルの大きな低下を示す。
【０２５０】
図１１は、３７℃で２０分間の、ＭＮＦ、１又は１０μＭの、モデルＣＹＰ基質のカクテルとの、ヒト肝臓ミクロソーム及びＣＹＰ補助因子の同時インキュベーションから得られた結果を実証する。既知ＣＹＰ阻害剤を含有するインキュベーションも陽性対照として含めた。モデル基質の代謝産物の形成を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定し、対照インキュベーション（基質の、ミクロソーム及び補助因子との、試験品又は阻害剤を伴わないインキュベーション）と比較した。対照の７０％未満であった、試験化合物（ＭＮＦ）の存在下でＣＹＰ活性を、有意と考えた。ＭＮＦ（１０μＭ）は、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ３Ａ４を対照の７０％未満に阻害した。さらに、一次代謝産物をＯ−脱メチル化−ＭＮＦであると決定した。これらの研究は、ＭＮＦが、１０μＭ以上で血漿又は肝臓中に存在する場合に、ＣＹＰ２Ｄ６及び／又はＣＹＰ３Ａ４アイソフォームの基質であるその他の薬物又は内因性化合物の代謝を変化させることを示す。
【０２５１】
（例５）
ＩＶ投与後のｉｎ  ｖｉｖｏ分布及びクリアランス
ＭＮＦの血漿及び脳組織濃度を決定するために、１０ｍｇ／ｋｇのＭＮＦの単回ＩＶ用量の投与後に、雄のスプラーグ−ドーリーラットから得られた血漿及び脳組織サンプル中のＭＮＦ及びその代謝産物の濃度を決定した。アッセイは、Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８ガードカラム（４．６ｍｍ×１２．５ｍｍ）及びＡｔｌａｎｔｉｓ  ＨＩＬＩＣカラム（１５０×２．１ｍｍ  ＩＤ、５ｍｍ）を使用して実施した。移動相は、成分Ａとして０．１％ギ酸及び成分Ｂとしてアセトニトリルを含有する水からなっていた。直線勾配は以下の通りに流した：１．０ｍｌ／分の流速で、０分間９５％Ｂ；５分間６０％Ｂ；６分間８０％Ｂ；１０分間９５％Ｂ。総実施時間は、１サンプルあたり１５分とした。分析物の同定及び定量化は、ポジティブエレクトロスプレーイオン化モードにおいてＡＰＩ−４０００  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して達成し、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）及び以下のＭＲＭトランジション：ＭＮＦ（３６９−２００）；ＭＮＦ−Ｇｌｕｃ（５４５−２００）を使用してデータを獲得した。
【０２５２】
図１２は、１０ｍｇ／ｋｇ  ＭＮＦのＩＶ投与後３０分で得られた血漿サンプルの分析を例示する。図１２の挿入図中、ＭＮＦ及びＧｌｕｃ−ＭＮＦは、対照血漿マトリックス中に存在する干渉ピークを伴わずに示されている。図１３は、１０ｍｇ／ｋｇ  ＭＮＦのＩＶ投与後３０分に得られた脳組織の分析を例示する。６．３９分のピークは、対照脳マトリックス中に存在する同定されていない化合物である（図１３の挿入図を参照のこと）。図１４は、スプラーグ−ドーリー雄ラットの血漿及び脳におけるＭＮＦの時間経過であり、算出された薬物動態パラメータが以下の表３中に示されている。
【表３】
2015519347.tif 000029
【０２５３】
１０ｍｇ／ｋｇ  ＭＮＦを、雄のスプラーグ−ドーリーラットにＩＶ投与し、投与後１０分間から２４時間の間、ＭＮＦの血漿中濃度を決定し、レベルは１時点あたり３匹の動物において測定した。同一研究において、１時点あたり３匹の動物を用いて、投与後１０〜６０分間の間で脳組織におけるＭＮＦの濃度を測定した。投与後１０分で脳組織におけるＭＮＦ濃度は、２００ｎｇ／組織１ｍｇであり、３０分で、８００ｎｇ／組織１ｍｇのピークに達した。血液（ｎｇ／ｍｌとして測定された）及び脳組織（ｎｇ／組織１ｍｇとして測定された）中のＭＮＦの濃度間の相対分布は、中枢及び末梢身体区画の両方の間の同等の分布を反映して、１０分で０．２、３０分及び６０分で１．０であった。この分析は、薬物の相当なレベルが、投与後１０分で脳組織において定量され得ること並びに投薬後３０分で濃度がピークに達し、その時点で血漿中濃度は同等であり、６０分で脳組織濃度は血漿中濃度と同等であり続けることを示す。さらに、見かけの分布容積（Ｖ）は高く、これは広範な組織分布を示す。
【０２５４】
これらの研究は、ＭＮＦが血液脳関門を通過できること並びにこのような化合物並びにおそらくはその他の関連フェノテロール類似体及び／又はフェノテロールのＩＶによる投与は、これらの化合物を、例えば、ＣＢ受容体活性によって調節される脳腫瘍を治療するために脳に送達する有効な手段であることを実証する。
【０２５５】
（例６）
ＭＮＦは、中枢神経系機能に対して有意な負の効果を有さない
この実施例は、ＭＮＦが、中枢神経系機能に対して有意な負の効果を有さないことを実証する。
【０２５６】
単回用量増大研究を実施して、スプラーグ−ドーリーラットにおけるＩＶ投与を用いる７日反復用量研究のために、用量レベルを選択した。用量レベルは、０、５、１０及び２５ｍｇ／ｋｇとした。毒性効果はこの研究において最小であった（以下の表４及び５を参照のこと）。
【０２５７】
【表４】
2015519347.tif 000030
【表５】
2015519347.tif 000031
【０２５８】
中枢神経系機能に対するＭＮＦの効果をさらに評価するさらなる研究を実施した。これらの研究において、ＭＮＦは、テトラヒドロカンナビノールと比較して（図１６）、中枢神経系に有意な負の効果を全く有さないことがわかった（図１５）。
【０２５９】
（例７）
（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ及び（Ｒ，Ｒ’）−４−メトキシフェノテロール（ＭＦ）は、肝臓、結腸及び肺癌細胞成長の強力な阻害剤である
この実施例は、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ及び（Ｒ，Ｒ’）−４−メトキシフェノテロール（ＭＦ）が、肝臓、結腸及び肺癌細胞成長の強力な阻害剤であることを実証する。
【０２６０】
種々の腫瘍細胞の成長に対する（Ｒ，Ｒ’）−ＭＦ及び（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦの効果を評価した。３０μＭ未満のＩＣ５０値は、腫瘍細胞成長の有効な阻害剤であると考えられたのに対し、５０μＭ未満のＩＣ５０値は、潜在的な活性を示す。以下の表６及び７に例示されるように、ＭＮＦは、肝臓癌細胞成長、肺癌細胞成長、結腸癌細胞成長、前立腺癌細胞成長、ＣＮＳ癌細胞成長及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の強力な阻害剤であった。
【０２６１】
これらの研究は、ＭＮＦ及びＭＦが、肝臓、肺及び結腸癌を含めたさらなる種類の癌成長を阻害できることを示す。当業者ならば、それらはまた、ヒトを含めたさらなる対象において、肝臓、肺及び結腸癌などの癌を治療することを含め、腫瘍成長を低減するために、その他のフェノテロール類似体（その他のナフチルフェノテロール類似体など）を使用するための支持体を提供することを理解するであろう。
【表６】
2015519347.tif 000032
【表７】
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【０２６２】
（例８）
マウスにおけるラットＣ６神経膠腫異種移殖片モデルにおける（Ｒ，Ｒ’）−４−メトキシ−１−ナフチルフェノテロールの抗腫瘍活性
この実施例は、マウスにおけるラットＣ６神経膠腫異種移殖片モデルにおけるＭＮＦの抗腫瘍活性を実証する。
【０２６３】
（Ｒ，Ｒ’）−４−メトキシ−１−ナフチルフェノテロール（ＭＮＦ）は、いくつかの種類の癌細胞系のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を阻害する。この実施例では、ＭＮＦのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を、５週齢ＮＭＲＩ／ヌード雌スイスマウスの下部側腹部に皮下移植したラットＣ６神経膠腫細胞を使用して評価した。接種の３日後、マウスを、１週間に５日で２週間の生理食塩水又はＭＮＦ（２ｍｇ／ｋｇ）の腹膜内注射に付した。腫瘍体積をノギスを使用して毎日測定した。研究の最後に、動物を屠殺し、ｃＤＮＡマイクロアレイ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ及び免疫ブロット分析のために腫瘍を採取した。生理食塩水処置群と比較して、ＭＮＦを投与されたマウスでは、平均腫瘍体積の大幅な低減が観察された（ｐ＜０．００１、ｎ＝１７〜１９）。細胞増殖に関与する遺伝子の発現のクラスター並びに生理食塩水が注射された対照と比較して、ＭＮＦ処置マウスの腫瘍において大幅に下方制御された膠芽腫の分子マーカーを同定した。ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＣ６神経膠腫細胞増殖に対するＭＮＦの有効性は、細胞周期調節因子タンパク質の発現の著しい低減を伴った。この研究は、膠芽腫異種移殖片モデルにおけるＭＮＦ依存性化学予防の最初の実証であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその抗癌作用の機序を提供する。
【０２６４】
材料及び方法
【０２６５】
材料。（Ｒ，Ｒ’）−４−メトキシ−１−ナフチルフェノテロール（ＭＮＦ）は、本明細書に、及びこれまでに記載されたように合成した（各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｏｚｗｉａｋら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ５０：２９０３〜２９１５、２００７年；Ｊｏｚｗｉａｋら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ１８：７２８〜７３６、２０１０年）。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、トリプシン溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミンの１００×溶液（２００ｍＭ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００ユニット／ｍｌペニシリン及び１０，０００μｇ／ｍｌストレプトマイシンの混合物）は、Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）から入手した。
【０２６６】
細胞培養。ラット由来Ｃ６神経膠腫細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。細胞は、３７℃の加湿ＣＯ２インキュベーター中、Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液及び１０％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭで日常的に維持した。
【０２６７】
３Ｈ−チミジン取り込み。Ｃ６神経膠腫細胞を、約５×１０４個／ウェルで１２ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートし、続いて、種々の濃度のＭＮＦとともに２回目の２４時間インキュベーションを行った。放射標識チミジン（１０Ｃｉ／ｍｍｏｌ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を、１ウェルあたり１μＣｉで１６時間添加し、次いで、ＤＮＡへのその取り込みを測定した。各処置群を３連で実施し、３つの独立した研究を実施した。
【０２６８】
マウスにおけるＣ６腫瘍異種移殖片。ＭＮＦの、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長の退縮を誘導する能力を評価するために、ラットＣ６神経膠腫細胞を、コンフルエンシーでトリプシンで回収し、腫瘍異種移植片を作製するために使用した。胸腺欠損雌ヌードマウス（ＳＷＩＳＳ  ｎｕ＋／ｎｕ＋）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手し、病原体不含条件下、１２時間明／１２時間暗周期で維持した。動物に標準飼料（供給物）を自由に給餌させた。胸腺欠損ヌードマウスに、０．５×１０６個のＣ６神経膠腫細胞を含有する１００μｌの培養培地を左側腹部に皮下に接種し、次いで、各１０匹の動物の２群に無作為に分割した。細胞接種の３日後に出発して、マウスに毎日、媒体又は生理食塩水中の１００μＭアスコルビン酸（媒体）中のＭＮＦ（２ｍｇ．ｋｇ−１）の腹膜内注射（１０μｌ．ｇ−１体重）を１週間に５日で１９日間投与した。動物生存を毎日モニタリングし、長さ（ａ）及び幅（ｂ）を測定して、４／３π×ｒｌ２×ｒ２（式中、ｒｌは短い方の半径であり、ｒ２は長い方の半径である）として推定するためにノギスを使用して腫瘍の大きさを決定した。マウスを、ＭＮＦ注射後最大１９日モニタリングし、又は腫瘍の大きさが２ｃｍ３を超えた場合若しくはマウスが嗜眠性、病的になり、給餌することができず、このため体重が初期体重の２０％未満に低下した場合には、より早く安楽死させた。マウスは、頸部伸長によって安楽死させ、腫瘍塊を採取し、秤量し、冷ＰＢＳで洗浄し、その後、液体窒素中で瞬間凍結した。両群において８〜９匹の動物を用いる第２セットの研究を反復した。
【０２６９】
Ｃ６神経膠腫腫瘍におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＮＦ蓄積の評価。胸腺欠損マウスにおけるＣ６腫瘍異種移植片におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＮＦの蓄積を、媒体処置腫瘍を保有する動物との比較で評価した。凍結腫瘍サンプルを解凍し、次いで、ホモジナイズした。ＭＮＦ及びその代謝産物の濃度を、ＨＰＬＣと、それに続くＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定した。手短には、アッセイをＥｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８ガードカラム（４．６ｍｍ×１２．５ｍｍ）及びＡｔｌａｎｔｉｓ  ＨＩＬＩＣカラム（１５０×２．１ｍｍ  ＩＤ、５ｍｍ）を使用して実施した。移動相は、成分Ａとして０．１％ギ酸及び成分Ｂとしてアセトニトリルを含有する水からなっていた。直線勾配は以下の通りに流した：１．０ｍｌ／分の流速で、０分間９５％Ｂ；５分間６０％Ｂ；６分間８０％Ｂ；１０分間９５％Ｂ。総実施時間は、１サンプルあたり１５分とした。分析物の同定及び定量化は、ポジティブエレクトロスプレーイオン化モードにおいてＡＰＩ−４０００  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して達成し、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）及び以下のＭＲＭトランジション：ＭＮＦ（３６９−２００）；ＭＮＦ−Ｇｌｕｃ（５４５−２００）を使用してデータを獲得した。媒体が注射されたマウスから得られた腫瘍組織を対照として使用した。
【０２７０】
ラットＣ６神経膠腫異種移植片における遺伝子発現の分析。媒体及びＭＮＦ処置マウス（ｎ＝１群あたり３、コホート１）から回収したラットＣ６神経膠腫異種移植片から全ＲＮＡを単離した。この分析を、動物の第２のコホート（ｎ＝１群あたり３、コホート２）で反復した。総細胞ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙプラスミニキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して抽出し、ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｃｈｉｐｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用するＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用してその質を評価した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｅｎｔｒｉｘ  ＢｅａｄＣｈｉｐｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して転写プロファイリングを決定した。全ＲＮＡを使用し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｏｔａｌＰｒｅｐ  ＲＮＡ増幅キットを用いてビオチン標識したｃＲＮＡを作製した。手短には、０．５μｇの全ＲＮＡを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含有するオリゴｄＴプライマーを使用し、逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡにまず変換し、次いで、コピーして、二本鎖ｃＤＮＡ分子を製造した。供給されたカラムで二本鎖ｃＤＮＡを清浄にし、濃縮し、ビオチン−１６−ＵＴＰを組み込む一本鎖ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）が作製される一晩ｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写反応において使用した。合計０．７５μｇのビオチン標識ｃＲＮＡを、ＩｌｌｕｍｉｎａのＳｅｎｔｒｉｘ  Ｒａｔ  Ｒｅｆ−１２  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＢｅａｄＣｈｉｐと５８℃で１６時間ハイブリダイズした。各ＢｅａｄＣｈｉｐは、およそ３０倍の重複性を有する、約２２，０００ウェルの注釈のついたＲｅｆＳｅｑ転写物を有する。アレイを洗浄し、ブロッキングし、ストレプトアビジン−Ｃｙ３を用いて染色することによって標識されたｃＲＮＡを検出した。ハイブリダイズされたアレイを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＳｔａｔｉｏｎ  ５００Ｘ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓスキャナーを使用してスキャンし、ＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏソフトウェア、バージョン１．６．１を使用して画像データを抽出した。統計分析のために、発現データを、各チップで一貫したシグナル及びＩｌｌｕｍｉｎａ検出ｐ値＜０．０２を有するプローブのみを含むようフィルターにかけた。
【０２７１】
相関分析、サンプルクラスタリング分析及び主成分分析を実施して、任意の可能性ある異常値を同定／排除した。得られたデータセットを、次いで、０．０５未満のＺスコア信頼度及び０より大きい平均バックグラウンド補正シグナル強度の値統計を使用するＤＩＡＮＥ６．０、スプレッドシートベースのマイクロアレイ分析プログラムを用いて分析した。
【０２７２】
遺伝子セット濃縮分析は、マイクロアレイ中のすべての遺伝子の遺伝子発現値又は遺伝子発現変化値を使用する。遺伝子セット分析のためのＷＥＢ−ＰＡＧＥ  ＧＳＡツールを使用する遺伝子セット濃縮のパラメトリック分析（ＰＡＧＥ）を使用した。遺伝子セットは、ＭＳＩＧデータベース、遺伝子オントロジーデータベース、ＧＡＤヒト疾患及びマウス表現型遺伝子セットを含み、これらを使用して機能的レベル変化を調査した。ＩＮＧＥＮＵＩＴＹ（登録商標）Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）システム（ＩＮＧＥＮＵＩＴＹ（登録商標）  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、遺伝子−遺伝子相互作用も分析した。
【０２７３】
全ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成及びｑＲＴ−ＰＣＲ分析。全ＲＮＡ（ＤＮアーゼ処置ステップを含む）を、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して凍結腫瘍組織から単離した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用してＲＮＡ濃度及び質を測定した。続いて、ｑＳＣＲＩＰＴ（商標）ｃＤＮＡ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して、２μｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）反応を実施して、マイクロアレイ分析から選択された６種の遺伝子の発現を確認した。Ｓｏｘ４、Ｏｌｉｇ１、Ｇａｌｎｔ３、Ｃｄｋｎ３、Ｃｃｎａ２及びＢｕｂ１ｂの市販の標的プローブ（ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ  ｑＰＣＲ  Ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  Ｐｒｉｍｅｒｓ、ＩＤＴ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）を使用する、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７３００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックスを用いて反応を実施した。内部対照として、Ｇａｐｄｈ及び媒体処置腫瘍を用い、２−ΔΔＣｔ法を使用してデータを分析した。ｃＤＮＡを含まない反応混合物からなる対照は、すべての実施において陰性とした。
【０２７４】
ウエスタンブロット分析。凍結腫瘍組織を、ホスファターゼ阻害剤カクテル（ＥＭＢ−Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補給した、ＥＧＴＡ及びＥＤＴＡを含有する放射免疫沈澱バッファー（Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ）を用い、標準プロトコールに従って溶解した。清澄化した溶解物から得られた等量のタンパク質を、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ｉＢｌｏｔシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してポリビニリデンジフルオリドメンブレンに電気的に転写した。ウエスタンブロットを標準法に従って実施し、これは、５％脱脂乳でのメンブレンのブロッキングと、それに続く、対象の一次抗体及び酵素西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしている二次抗体を用いる逐次インキュベーション法を含んでいた。ＥＣＬ  Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用する化学発光によって免疫反応性バンドの検出を実施した。タンパク質バンドの定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用する容量デンシトメトリーによって行った。この研究において使用される一次抗体は、サイクリンＡ（ｓｃ−７５１、１：５００希釈；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）、サイクリンＤ１（ｓｃ−８３９６；１：５００希釈；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）及びβ−アクチン（マウス；１：１００００希釈；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）に対して作製した。モノクローナル抗体（１：１０００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を用いるＨｓｐ９０の検出を実施して、同等タンパク質ローディングを制御した。
【０２７５】
統計分析。腫瘍組織の両セットから得られたウエスタンブロットデータを一緒に分析した。シャピロ・ウィルク検定を使用して、値（タンパク質発現レベル）がガウス分布に従ったかどうかを評価した。異常値は、集団が正規性検定を通ることを妨げるので、さらなる分析から除去した。培養物でのラットＣ６細胞から得られた結果を、スチューデントｔ検定を使用して分析した。反復二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、時間の関数として変化の誘導を比較した。データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表されており、ｐ値が０．０５未満である場合に有意と考えた。
【０２７６】
結果
【０２７７】
ＭＮＦは、腫瘍細胞増殖を低減する。細胞増殖アッセイをラットＣ６神経膠腫細胞系を使用して実施した場合に、ＭＮＦに応じて強力な成長阻害が観察され、約１．０ｎＭのＩＣ５０を有していた（図１８Ａ）。細胞増殖に対するβ−ＡＲアゴニスト、イソプロテレノール及びＦｅｎの効果を、選択的β２−ＡＲ遮断薬、ＩＣＩ−１１８，５５１の不在下及び存在下でのＭＮＦのものと比較した（図１８Ｂ）。イソプロテレノール及びＦｅｎの両方とも、２０ｎＭで使用した場合に、Ｃ６細胞成長の弱い１０〜１５％阻害を誘発し、同一濃度のＭＮＦは、有糸分裂誘発の大幅な５４．３±１．２％の低減を引き起こした（ｎ＝４、Ｐ＜０．００１）。ＩＣＩ−１１８，５５１の添加は、イソプロテレノール及びＦｅｎシグナル伝達を妨害しながらＭＮＦの抗増殖効果を遮断しなかった（図１８Ｂ）。Ｃ６神経膠腫細胞は、β２−ＡＲ及びＣＢ受容体の両方を発現し、ＭＮＦの細胞作用は、ＣＢ受容体活性と関係すると先に報告されている。ＣＢ１受容体インバースアゴニストＡＭ２５１とのプレインキュベーションは、Ｃ６細胞をＭＮＦの成長阻害効果に対して不応性にしたのに対し、ＣＢ２受容体のＡＭ６３０を用いる阻害は、ＭＮＦシグナル伝達に対して最小の効果を有していた（図１８Ｃ）。これらの結果は、ＭＮＦの抗増殖作用がＣＢ１受容体シグナル伝達によって起こることを示す。ＭＮＦ処置Ｃ６神経膠腫細胞において、細胞形態学及び核縮合における同時発生的変化が観察され、アポトーシスと一致した（図１８Ｄ）。
【０２７８】
ＭＮＦは、ラットＣ６神経膠腫異種移殖片モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍成長を低減する。ＭＮＦが、ｉｎ  ｖｉｖｏで治療効果を有し得るかどうかを決定するために、免疫欠損マウスにおいてラットＣ６神経膠腫異種移植片モデルを開発した。腫瘍を保有する雌のヌードマウスをＭＮＦを用いて毎日腹膜内に１９日間処置した。ＭＮＦ処置動物において、媒体処置群と比較して腫瘍体積の大幅な低減が観察された（Ｐ＜０．００８；図１９Ａ）。これらの研究は、マウスの第２の独立コホートにおいて実施し、同様の結果を示した（組み合わされた結果について図１９Ｂを参照のこと）。処置の最終日の後に腫瘍を切除し、その後の分析のために液体窒素中で瞬間凍結した。
【０２７９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＮＦレベルの決定。研究の完了時に、ＭＮＦ処置動物から得られた腫瘍をＭＮＦの組織濃度についてアッセイした。結果は、相当な濃度のＭＮＦが腫瘍組織において蓄積したことを示し、１４１．０±５２．５ｎｇ／ｍｌ／組織１ｇ（コホート１、ｎ＝９）及び２１４．４±６５．５ｎｇ／ｍｌ／組織１ｇ（コホート２、ｎ＝７）、これは、全身投与されたＭＮＦは、提案された治療標的に達することを実証した。
【０２８０】
ＭＮＦは、Ｃ６神経膠腫異種移植片における遺伝子発現プロフィールを変化させる。マイクロアレイ分析によるグローバル遺伝子発現プロファイリングを実施して、腫瘍を保有する媒体処置マウスと比較して、Ｃ６神経膠腫異種移植片において、発現がＭＮＦ処置の際に変化した遺伝子の群を同定した。各群において２つの動物のコホートから得られた６つの独立した生物学的サンプルを使用した。マイクロアレイデータを正規化し、処理した後に、遺伝子が、ＭＮＦ及び媒体間で１．５以上の絶対ｚ比を示し、調整されたＰ値＜０．０５及び偽発見率＜０．３が割り当てられた場合に、遺伝子は異なって発現されると考えられた。主成分分析（ＰＣＡ）は、ＭＮＦ及び媒体群間で大幅に変化した遺伝子発現の識別パターンを示した（図２０Ａ）。この研究に由来するデータセットのコンピュータによる解析は、いくつかの細胞周期と関連するＧＯ期間、例えば、ＭＮＦ処置の間の腫瘍成長の制御に関与している可能性が高い「ＤＮＡ複製」、「細胞周期」、「有糸分裂」及び「細胞分裂」の同定につながった（表８）。異種移殖片トランスクリプトームにおけるＭＮＦ処置の際の大きな比率を占めるＧＯ期間の分析は、核酸の代謝の制御に関与するものと一緒に、細胞分裂と関連する遺伝子の大幅な負の調節を示した。遺伝子セット濃縮のパラメータ化分析（ＰＡＧＥ）を使用して、ＭＮＦによって影響を受ける、調節されたシグナル伝達経路及び生物学的プロセスに関してさらなる洞察が提供された。３０８種を超える遺伝子セットの収集物から、ＭＮＦによって発現レベルが大幅に変化した５５種の遺伝子セットがあり、遺伝子セットの大部分（４８／５５）は下方制御された（表１０）。
【表８】
2015519347.tif 000034
【０２８１】
２つの動物のコホートから得られたこのシグネチャーの強度が、図２０Ｂに表されており、ＭＮＦ処置によって最も影響を受けた１０種の遺伝子セットの部分リストが表９に表されている。対象の遺伝子の中で、ＭＮＦ群では、媒体対照と比較して、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−１１及び１４を含めた多くのものが下方制御された（図２０Ｃ）。ＭＮＦを用いる処置はまた、Ｇａｌｎｔ３並びにその他の細胞周期調節因子、例えば、Ｃｃｎａ２、Ｃｄｋｎ３及びＢｕｂ１ｂ（図２０Ｃ）の下方制御による成長停止に対してＣ６神経膠腫腫瘍異種移殖片を感作させた。さらに、ＭＮＦ処置の際にグリア脳腫瘍の分子マーカーの発現の大幅な低減があった。他方、Ｃａｓｐ１、Ｃａｓｐ１１及びＣａｓｐ１２などのアポトーシス関連転写物は、ＭＮＦによって上方制御された（図２０Ｃ）。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によって、ＭＮＦは、対照と比較して、Ｂｕｂ１ｂ、Ｃｄｋｎ３  Ｃｃｎａ２、Ｏｌｉｇ１、Ｓｏｘ４及びＧａｌｎｔ３の発現を低減したことが確認され（図２０Ｄ）、したがって、マイクロアレイデータが確認された。全体的に、これらの結果は、ＭＮＦが神経膠腫成長及び進行に負に影響を及ぼし得る経路を示す。また、これらの結果は、ＭＮＦ処置の効率並びに全般的に神経膠腫成長及び進行を決定するために使用され得るバイオマーカーを示す。したがって、これらの研究は、開示されているバイオマーカーを指標として使用することによって、全般的に腫瘍成長及び進行のＭＮＦ並びにその他の処置の効率を診断、予後診断及び決定する方法を開示する。
【０２８２】
乏突起膠細胞転写因子１（Ｏｌｉｇ１）は、新規膠芽腫マーカーとして同定されており、診断及び予後診断値を有する。さらに、ＳＲＹ−ボックス４（Ｓｏｘ４）は、細胞運命の決定に、及び腫瘍発生に関与している転写因子である。対照群と比較して、ＭＮＦ処置Ｃ６神経膠腫腫瘍ではＯｌｉｇ１及びＳｏｘ４  ｍＲＮＡレベルが低下したという事実は、神経膠腫発生につながる分子経路の活性化の低減と一致する。神経膠腫発生におけるＣｄｋｎ３、Ｂｕｂ１ｂ及びＯｌｉｇ−１の関与は確立される。ここで、ＭＮＦに応じたラットＣ６神経膠腫腫瘍異種移植片におけるこれらの遺伝子の発現レベルの下方制御の証拠が提供され、これは、ＭＮＦ及び関連類似体が、高悪性度神経膠腫の治療における治療戦略に相当することを示す。ＭＮＦは、血液脳関門を通って容易に輸送され、ラット脳中に蓄積し得る。
【表９】
2015519347.tif 000035
【表１０】
2015519347.tif 000036
【０２８３】
この実施例は、マウスにおける膠芽腫異種移殖片モデルにおけるＭＮＦ依存性化学予防を実証し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその抗癌薬作用の機序を提供する。また、診断マーカー及び腫瘍治療の効率を決定する方法が示された。
【０２８４】
（例９）
ＭＮＦは、ＧＰＲ５５媒介性リガンド内部移行を標的とし、癌細胞運動を損なう
この実施例は、ＭＮＦが、ＧＰＲ５５媒介性リガンド内部移行を標的とし、癌細胞運動を損なうことを実証する。
【０２８５】
（Ｒ，Ｒ’）−４’−メトキシ−１−ナフチルフェノテロール（ＭＮＦ）は、カンナビノイド受容体（ＣＢＲ）活性化によって、ヒトＨｅｐＧ２肝細胞癌腫細胞の成長阻害及びアポトーシスを促進する。合成ＣＢ１Ｒインバースアゴニスト、ＡＭ２５１は、これらの細胞におけるＭＮＦの抗有糸分裂促進性効果を遮断するとわかった。しかし、ＡＭ２５１はまた、最近オーファンでなくなった脂質検出受容体である、その上方制御は発癌に寄与するＧＰＲ５５のアゴニストである。ここで、培養物でのヒトＨｅｐＧ２及びＰＡＮＣ−１癌細胞系におけるＭＮＦシグナル伝達におけるＧＰＲ５５の役割を、蛍光性リガンドＴｏｃｒｉｆｌｕｏｒ１１１７（Ｔ１１１７）の内部移行、アクチン細胞骨格の再組織化及び引っ掻きアッセイによって測定される細胞運動に焦点をあてて調べた。結果は、ＲＮＡ干渉によるＧＰＲ５５ノックダウンは、Ｔ１１１７の細胞取り込み、ＭＮＦ阻害に対して感受性であったプロセスを著しく低減したことを示した。非定型カンナビノイドＯ−１６０２によって媒介されるＧＰＲ５５内部移行は、ＧＰＲ５５を発現するＨＥＫ２９３細胞ではＭＮＦによって遮断された。ＨｅｐＧ２及びＰＡＮＣ−１細胞の、ＭＮＦを用いる前処置は、ＡＭ２５１、Ｏ−１６０２及び生理活性脂質を含有するとわかっているウシ胎児血清に応じたＥＲＫ１／２リン酸化の誘導を大幅に抑制した。さらに、ＭＮＦは、掻創治癒アッセイを使用する細胞形態学及び遊走の変化を含めた、ＡＭ２５１及びＯ−１６０２誘導性プロセスの協調した負の調節を発揮した。この研究は、ＭＮＦが、ＧＰＲ５５媒介性シグナル伝達を損ない、ＧＰＲ５５に関する将来の調査を促進することによって、癌の管理において治療的可能性を有することを示す。
【０２８６】
β２−アドレナリン受容体（β２−ＡＲ）アゴニストによるｃＡＭＰの蓄積は、培養物での癌細胞系の有糸分裂促進性反応の低減及び増大の両方と関連している。β２−ＡＲ媒介性抗腫瘍活性の細胞型特異性を決定する機序は、あまり理解されておらず、それによって、アゴニストの分子構造及び立体化学並びに受容体の細胞環境が、β２−ＡＲの１種又は複数のリガンド特異的活性コンホメーションを安定化する、β２−ＡＲの可能性ある偏ったアゴニズムについて疑問が生じる。β２−ＡＲ［及びその他のＧタンパク質共役型受容体］での偏ったアゴニズムの主な結果は、生物学的結果の著しい相違につながり得る、複数のＧ−タンパク質アイソフォームの活性化及び種々の下流シグナル伝達経路のモジュレーションである。
【０２８７】
（Ｒ，Ｒ’）−４’−メトキシ−１−ナフチルフェノテロール（ＭＮＦ）は、フェノテロールの類似体であり、β２−アドレナリン受容体（β２−ＡＲ）についてβ１−ＡＲよりも５７３倍大きい選択性を有する。ｃＡＭＰ蓄積を増強し、ヒトβ２−ＡＲ過剰発現細胞において３．９０ｎＭのＥＣ５０値を有し、１３２１Ｎ１星状細胞腫細胞の増殖を減弱し、３．９８ｎＭのＩＣ５０値を有する。（Ｒ，Ｒ’）−フェノテロールとは対照的に、ＭＮＦは、Ｇαｓ及びＧαｉタンパク質の両方を活性化し、心筋細胞収縮性を強力に刺激し、β２−ＡＲアゴニストとしての役割と一致する。しかし、ヒト由来ＨｅｐＧ２肝細胞癌腫細胞系のＭＮＦ処置が、β２−ＡＲ独立経路によって成長停止及びアポトーシスを引き起こすことが本明細書において開示されている。ＭＮＦ反応は、β２−ＡＲアンタゴニストＩＣＩ１１８，５５１に対して非感受性であるとわかり、β２−ＡＲ結合活性を欠くＵ８７ＭＧ細胞は、ＭＮＦの抗有糸分裂促進性効果に対して反応性であった。ＭＮＦ中のナフチル部分の存在のために、その他のリガンドと構造類似性を共有し、そのため、独特の親和性及び選択性プロフィールを有する二重作用性化合物として挙動し得ると推測した。
【０２８８】
カンナビノイド受容体（ＣＢＲ）は、多数の組織及び種々の細胞種ではβ２−ＡＲと同時発現されることが多く、そのヘテロ二量体化する傾向は、２種の受容体間のクロストークの可能性を実証する。実際、ＣＢＲは、β２−ＡＲ活性をモジュレートし得る。内因性及び合成カンナビノイドリガンドによるＣＢＲの関与は、ＨｅｐＧ２細胞を含めた癌細胞の増殖及びアポトーシスの調節をもたらす。ＣＢＲの選択的薬理学的インバースアゴニストを用いる処置は、ＨｅｐＧ２細胞におけるＭＮＦの抗増殖性作用を遮断し、ＭＮＦシグナル伝達におけるＣＢＲの可能性ある役割と一致するということは興味深い。ＡＭ２５１及びその臨床類似体、リモナバン（ＳＲ１４１７１６Ａ；Ｎ−（ピペリジン−１−イル）−５−（４−クロロフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミドヒドロクロリド）が、インバースアゴニストとしてＣＢ１Ｒと相互作用しても、それらが最近オーファンでなくなったＧＰＲ５５のアゴニストとして作用することを示唆する証拠が増えている。ＧＰＲ５５は、脂質検出特性を有するＧタンパク質共役型受容体であり、その上方制御は、種々の癌の種類の攻撃行動に寄与する。ミクログリア活性化の際のＥＲＫ／ＭＡＰキナーゼシグナル伝達の役割及びＧＰＲ５５による癌細胞増殖の促進が提案されている。ＡＭ２５１はまた、ＧＰＲ５５アゴニストとして作用することによって、好中球走化作用を促進する。したがって、ＣＢ１Ｒによって媒介されていると広く解釈されているＡＭ２５１及びリモナバンの作用は、実際、このクラスの化合物によるＧＰＲ５５の的外れの効果を含み得る。
【０２８９】
この実施例は、培養物の２種のヒト癌細胞系、ＨｅｐＧ２及びＰＡＮＣ−１細胞におけるＭＮＦ作用におけるＧＰＲ５５の寄与を調べるよう設計された。Ｔｏｃｒｉｆｌｕｏｒ１１１７（Ｔ１１１７）、内因性ＧＰＲ５５と結合し、ＣＢ１Ｒに対して低親和性を有する蛍光性リガンドを使用して、薬力学的研究を実施し、データは、ＭＮＦが、ＧＰＲ５５の内部移行／再利用における障害によって、Ｔ１１１７取り込みを大幅に遅延することを示す。ＭＮＦを用いる処置はまた、腫瘍細胞系及び創傷治癒アッセイを使用してその細胞遊走の両方において、下流ＧＰＲ５５シグナル伝達経路の損なわれたリガンド媒介性活性化をもたらした。本データは、ＭＮＦに対する細胞曝露がＧＰＲ５５シグナル伝達の障害につながることを示す。
【０２９０】
材料及び方法
【０２９１】
材料。（Ｒ，Ｒ’）−４’−メトキシ−１−ナフチルフェノテロール（ＭＮＦ）を、これまでに記載されたように合成した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｏｚｗｉａｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１８：７２８、７３６、２００７年）。イーグル最小必須培地、トリプシン溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ピルビン酸ナトリウムの１００×溶液（１００ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００ユニット／ｍｌペニシリン及び１０，０００μｇ／ｍｌストレプトマイシンの混合物）は、Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）から入手した。ＷＩＮ５５，２１２−２、ＡＭ２５１及びＡＭ６３０は、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）から購入したのに対し、ＣＰ５５，９４０、Ｏ−１６０２及びＴｏｃｒｉｆｌｕｏｒ  Ｔ１１１７は、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。
【０２９２】
細胞系の維持及び処置。ヒトＨｅｐＧ２肝細胞癌腫細胞及びヒトＰＡＮＣ−１細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入した。ＨｅｐＧ２細胞は、１％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）を補給したイーグル最小必須培地で維持した。ＰＡＮＣ−１細胞は、４．５ｇ／Ｌグルコース及び１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムを、グルタミン、ピルバート、ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％ＦＢＳと一緒に補給したフェノールレッド不含ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＨＡタグが付けられたヒトＧＰＲ５５（ｈＧＰＲ５５−ＨＥＫ２９３）を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞は、Ｍａｒｉａ  Ｗａｌｄｈｏｅｒ（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｒａｚ、Ｇｒａｚ、Ａｕｓｔｒｉａ）から提供された（Ｈｅｎｓｔｒｉｄｇｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１６０：６０４〜６１４、２０１０年）。細胞は、１０％ＦＢＳ、０．２ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８及びペニシリン／ストレプトマイシンを補給した４．５ｇ／Ｌグルコースを有するＤＭＥＭで維持した。すべての細胞系は、５％ＣＯ２中、３７℃で培養物で維持し、培地を２〜３日毎に置き換えた。
【０２９３】
ＴｏｃｒｉＦｌｕｏｒ  Ｔ１１１７、蛍光標識されたＧＰＲ５５アゴニストの細胞取り込み。細胞を、３５ｍｍガラス底培養ディッシュ（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）中で約７０％コンフルエンスに達するまで４８時間成長させた。血清が枯渇した細胞を、ＤＭＳＯ（媒体、０．１％）、ＭＮＦ（１μＭ）又は合成カンナビノイド化合物（ＡＭ６３０、ＡＭ２５１、Ｏ−１６０２、ＣＰ５５，９４０）のいずれかとともに３０分間インキュベートし、次いで、新規蛍光性ジアリールピラゾールカンナビノイドリガンド、Ｔｏｃｒｉｆｌｕｏｒ  Ｔ１１１７（１０〜１００ｎＭ）を添加した。細胞を、温度制御、加湿ＣＯ２チャンバー及び限定的な焦点システムを備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡を用いて撮像した。５−ＴＡＭＲＡコンジュゲートの励起には５６１ｎｍ  ＤＰＳＳレーザーを使用した。Ｚｅｉｓｓ  Ｚｅｎソフトウェアの時系列関数を使用し、４０×１．３ＮＡ対物レンズを用いて、１時間まで３０秒毎に画像を集め、すべての共焦点設定は研究を通じて同一のままにした。静止画像、動画及び蛍光性強度定量化は、Ｚｅｉｓｓ  Ｚｅｎソフトウェアを使用してこれらの一連のものから得た。研究は、少なくとも２〜３回反復した。
【０２９４】
遺伝子サイレンシング。ＨｅｐＧ２細胞を、ＣＢ１Ｒ、ＣＢ２Ｒ若しくはＧＰＲ５５に対するｓｉＲＮＡオリゴ（１．２５μｇ）又は非サイレンシングｓｉＲＮＡ対照（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を用い、１０μｌのｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用し、製造業者のプロトコールに従って４８時間トランスフェクトした。ｓｉＲＮＡは、最小の的外れの効果しか伴わずに、効率的なノックダウンを実施すると確認されている。４８時間のｓｉＲＮＡ処置の後、細胞をＰＢＳで洗浄し、血清不含培地中で維持し、その後、Ｔ１１１７を添加した。
【０２９５】
ＧＰＲ５５内部移行アッセイ。わずかな改変を加えたこれまでに記載されたプロトコールに従って（Ｈｅｎｓｔｒｉｄｇｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１６０：６０４〜６１４、２０１０年）、ＧＰＲ５５のエンドサイトーシスを観察した。手短には、ｈＧＰＲ５５−ＨＥＫ２９３細胞を、標準培地中、Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩ  ＣＣ２チャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）上で４８時間成長させ、次いで、１時間血清を欠乏させた。血清不含培地中、媒体（０．１％ＤＭＳＯ）又は１μＭ  ＭＮＦの存在下で、１：１０００ウサギＨＡ抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ、ＭＤ）とのプレインキュベーションを、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４５分間実施した。次いで、細胞をＰＢＳで十分に洗浄し、血清不含培地中、５μＭのＯ１６０２を用いて、ＣＯ２インキュベーター中３７℃で２０分間処置した。続いて、細胞を３回洗浄し、新鮮な、ＰＢＳ中３．７％パラホルムアルデヒド中で固定し（１０分）、抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ；１：１０００、３０分間）とともにインキュベートした。２回目のために、細胞を洗浄し、固定し、その後、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて透過処理した（５分間）。抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；１：１０００、３０分間）とのインキュベーションを実施して、内部移行されたＧＰＲ５５−ＨＡ抗体複合体の程度を決定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ抗退色マウント培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加したＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を用いて核対比染色を実施し、室温、暗所で２４時間硬化した。画像を、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭソフトウェアを使用してＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡（Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）を用いて獲得した。
【０２９６】
引っ掻きアッセイ。これらのアッセイは、本質的にこれまでに記載されたように実施した（Ｆｉｏｒｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１５０：２５５１〜２５６０、２００９年）。手短には、細胞を、平底の１２ウェル未処理ポリスチレン細胞培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、Ｍｏｎｒｏｅ、ＮＣ）に播種した。細胞がコンフルエントになったら、ピペットチップを用いて掻創を作製し、直ちに画像を撮った（時間０）。細胞を、媒体（ＤＭＳＯ、０．１％）又は合成ＧＰＲ５５リガンドＡＭ２５１（１μＭ）若しくはＯ−１６０２（１μＭ）のいずれかを用いて３０分間前処置し、続いて、示された場合にはＭＮＦ（１μＭ）を添加した。それぞれ、ＨｅｐＧ２及びＰＡＮＣ−１細胞について、引っ掻き後、１２、２４、３６、４８時間及び１２、１８、２４、４８時間で細胞遊走を調べた。３時間毎に同一視野の画像を撮り、細胞遊走率を決定した。画像は、ＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲｃデジタルカメラ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を取り付けたＡｘｉｏｖｅｒｔ２００倒立顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）で撮り、ＩｍａｇｅＪ１．４６ｓソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を用いて引っ掻き領域の測定を実施した。各研究は２連のディッシュで実施し、少なくとも２回反復した。
【０２９７】
５’−ＴＡＭＲＡ−３−フェニルプロパン−１−アミンの合成。１０ｎｍｏｌｅの、５’−ＴＡＭＲＡのＮＨＳエステル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、１ｍｌの０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ８．０中、２０ｎｍｏｌｅの３−フェニルプロパン−１−アミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに４時間インキュベートした。溶液は、窒素下で流れ乾燥させ、５００μｌの、エタノール中、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の１：１溶液で再構成した。５’−ＴＡＭＲＡ−３−フェニルプロパン−１−アミン（ＴＡＭＲＡ−ＰＰＡ、図２８Ａに示された構造）の形成及び５’−ＴＡＭＲＡのＮＨＳエステルの不在を質量分析によって確認した（図２８Ｂ、２８Ｃ）。１０ｍＭのＴＡＭＲＡ−ＰＰＡの保存溶液を調製し、分注し、−２０で保存した。
【０２９８】
ウエスタンブロット解析。細胞内シグナル伝達タンパク質の検出のために、細胞を、ＥＧＴＡ及びＥＤＴＡ（Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ）を含有する放射性免疫沈降法バッファーに溶解した。溶解バッファーは、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含有していた。等量のタンパク質（それぞれ、ＰＡＮＣ−１及びＨｅｐＧ２細胞について１４及び５４μｇ／ウェル）を、還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して４〜１２％プレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で分離し、次いで、ポリビニリデンフルオリドメンブレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に電気泳動的にトランスファーした。ウエスタンブロットを標準法に従って実施し、これは、５％脱脂乳中のブロッキングを含み、対象の一次抗体とともにインキュベートし、それに続く、酵素西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしている二次抗体とともにインキュベーションを行った。ＥＣＬ  Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用する化学発光によって、免疫反応性バンドの検出を実施した。バンドの定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用する容量デンシトメトリーによって行った。ＥＧＦＲに対するウサギポリクローナル抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から入手し、モノクローナル抗Ｈｓｐ９０は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から購入した。
【０２９９】
細胞シグナル伝達におけるＯ−１６０２媒介性増大に対するＭＮＦの効果。血清を欠乏させた細胞を、１μＭ  ＭＮＦの不在下又は存在下で１０分間前処置し、続いて、０、２．５及び１０μＭ  Ｏ−１６０２又は１０％ＦＢＳとともに、１０分間インキュベーションを行い、その後、総ＥＲＫ２及びＥＲＫ１／２のリン酸化形態のレベル（ｐＥｒｋ１／２、Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）を、ウエスタンブロッティング技術によって決定した。すべての一次抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入し、製造業者によって推奨された希釈で使用した。
【０３００】
統計分析。パーソナルコンピュータで実行するＰｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して、すべての統計データ分析を実施した。
【０３０１】
結果
【０３０２】
Ｔ１１１７の細胞取り込みにおけるオーファンでなくなったＧＰＲ５５の役割。蛍光標識されたＡＭ２５１類似体、Ｔ１１１７は、ＣＢ１Ｒに対して低親和性を有するＧＰＲ５５のリガンドとして作用する。Ｔ１１１７取り込みの感受性及び特異性の問題に対応するために、血清が枯渇した細胞を、温度制御、加湿ＣＯ２チャンバーを備えた共焦点顕微鏡ステージで維持した。３７℃でヒトＨｅｐＧ２及びＰＡＮＣ−１細胞におけるＴ１１１７取り込みの特徴を本明細書において研究した。細胞Ｔ１１１７レベルの量は、用量依存的に増大し、１００ｎＭで最大取り込みを有し、およそ８ｎＭで半最大効果を有した（図２１Ａ、２１Ｂ）。１００×モル過剰の非標識ＡＭ２５１の同時添加は、Ｔ１１１７の細胞蓄積の大幅な１８分の遅れを引き起こした（図２１Ｃ、２１Ｄ）。同様に温度を１０℃に低下させることによって、Ｔ１１１７取り込み速度が低下した。Ｔ１１１７の細胞取り込みが、ＡＭ２５１部分の存在を必要としたかどうかを確立するために、ＨｅｐＧ２細胞を、等モル量のＴ１１１７（５’−ＴＡＭＲＡ−（３−フェニルプロパン−１−アミン）標識されたＡＭ２５１）又は５’−ＴＡＭＲＡ−３−フェニルプロパン−１−アミン（ＴＡＭＲＡ−ＰＰＡ）のいずれかとともに最大１時間インキュベートした。これらの条件下で、ＴＡＭＲＡ−ＰＰＡとの細胞インキュベーション時に蛍光の大幅な取り込みはなかった（図２９Ｃ）。これらの結果は、Ｔ１１１７の細胞蓄積が迅速で、飽和性であり、細胞表面受容体との競合結合によって開始したことを実証する。
【０３０３】
Ｔ１１１７の細胞取り込みにおけるＧＰＲ５５の役割を確認するために、ＨｅｐＧ２細胞を、ＣＢ１Ｒ、ＣＢ２Ｒ又はＧＰＲ５５に対するｓｉＲＮＡオリゴ及び非サイレンシングｓｉＲＮＡ対照とともに４８時間インキュベートし、その後、Ｔ１１１７取り込みをモニタリングした（図２４Ａ、２４Ｂ）。研究は、示された標的に対するｓｉＲＮＡ二本鎖を使用した場合に遺伝子発現の選択的低減を示した。対照ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞では、Ｔ１１１７の侵入が観察され、半最大取り込みは、約１５分であった（図２２Ａ）。ＧＰＲ５５のサイレンシングは、Ｔ１１１７取り込みを６倍超遮断したのに対し、ＣＢ１Ｒサイレンシングの際には大幅な１０〜１２分の遅延が起こり、最終的に、細胞Ｔ１１１７レベルの４０％の低減をもたらした（図２２Ｂ）。しかし、ＣＢ２Ｒ  ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞では、Ｔ１１１７取り込みのプロフィールは、非サイレンシングｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞のものに匹敵していた。これらの結果は、ＧＰＲ５５が、Ｔ１１１７の細胞侵入において主な役割を果たすこと及び構成性ＣＢ１Ｒ活性が、このＧＰＲ５５機能に関与している可能性があることを示す。
【０３０４】
これらの観察結果を独立に確認するために、ＨｅｐＧ２細胞を、ＣＢ１Ｒ及びＣＢ２Ｒの選択的インバースアゴニスト／アンタゴニストを用いて前処置し、その後、Ｔ１１１７を添加した。ＣＢ２Ｒインバースアゴニスト、ＡＭ６３０は大きく不活性であったが、ＣＢＲアゴニスト、ＷＩＮ５５，２１２−２を用いる前処置は、Ｔ１１１７蓄積の速度を増大した（図２２Ｃ）。強力な合成カンナビノイドアゴニストＣＰ５５，９４０は、異種発現系においてＧＰＲ５５内部移行を遮断すると報告されている。ここで、ＣＰ５５，９４０（０．２５μＭ）を用いる３０分の前処置は、ＨｅｐＧ２細胞において、Ｔ１１１７取り込みを２．５倍明確に低減した（図２４Ｄ）。同様に、非定型カンナビノイドＯ−１６０２（０．２５μＭ）を用いる細胞処置は、Ｔ１１１７の細胞蓄積の１２．５分の遅延を引き起こし、取り込まれたＴ１１１７の量の４７％の低減をもたらした（図２２Ｄ）。
【０３０５】
ＭＮＦは、Ｔ１１１７の細胞取り込みを阻害する。ＧＰＲ５５依存性活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとしてＴ１１１７の取り込みを使用して、ＧＰＲ５５シグナル伝達に対するＭＮＦの効果を最初に調べた。ＨｅｐＧ２細胞の、１μＭ  ＡＭ２５１を用いる３０分の前処置は、構成的Ｔ１１１７取り込みを阻害せず、増強もせず、これは、負の又は正のアロステリックモジュレーションがないことを示唆する（図２３Ａ、２３Ｂ）。これは、対照的に、Ｔ１１１７との１００×過剰のＡＭ２５１の同時添加の効果であり、おそらくは蛍光性マーカーの低い特異的活性のために、同一アッセイ条件下で細胞性Ｔ１１１７蓄積を大幅に低減した（図２３Ｃ）。この研究を、ＭＮＦ単独の存在下で実施した場合には、約７０％の低減が観察された（図２３Ａ、２３Ｂ）。さらに、ＭＮＦを用いる３０分の処置の前又は後のいずれかでのＡＭ２５１の添加は、Ｔ１１１７取り込みのさらなる低下を引き起こし、媒体処置細胞と比較して約６．８倍低下した。
【０３０６】
化合物の効果が、ＨｅｐＧ２細胞に対して独特であったかどうかを調べるために、同様の研究を、培養物のＰＡＮＣ−１細胞において実施した。半定量的ＰＣＲ分析は、これらの細胞におけるＣＢ１Ｒ、ＣＢ２Ｒ及びＧＰＲ５５の存在を示した。結果は、ＭＮＦは、ＰＡＮＣ−１細胞におけるＴ１１１７取り込みの強力な阻害剤であったということを示した（図２３Ｃ及び２３Ｄ）。したがって、ＭＮＦが、ＧＰＲ５５リガンドのエンドサイトーシスを遮断したことは明らかであろう。
【０３０７】
ＧＰＲ５５内部移行及び下流シグナル伝達に対するＭＮＦの効果。ＨＡタグが付けられたＧＰＲ５５を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞において、リガンド誘導性ＧＰＲ５５内部移行に対するＭＮＦの効果を実施した。共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して、ＧＰＲ５５が、刺激されていない細胞の細胞膜に大部分局在することを見出した（図２４Ａ）。２０分間のＯ−１６０２の添加は、ＨＡタグが付けられたＧＰＲ５５の著しいエンドサイトーシスにつながり、これは、ＭＮＦを用いる前処置によって遮断された（図２４Ｂ）。
【０３０８】
細胞表面からエンドソーム区画へのリガンドが結合した受容体の再分布が、種々のシグナル伝達経路及びその関連する生物学的結果を異なって調節するので、ＧＰＲ５５内部移行の下流のさらなる事象が、ＭＮＦを用いる細胞処置によって損なわれ得る。実際、細胞外シグナルによって調節されるキナーゼ（ＥＲＫ）−ＭＡＰキナーゼの空間的−時間的活性化は、複雑な細胞機能の動的制御において役割を果たす。ここで、ＨｅｐＧ２細胞のＯ−１６０２に対する曝露は、ＥＲＫリン酸化を用量依存的に増大し、ＭＮＦ前処置は、Ｏ−１６０２反応性を抑制した（図２５Ａ及び２５Ｂ）。ＰＡＮＣ−１細胞は、ＨｅｐＧ２細胞と同一挙動を示し、Ｏ−１６０２媒介性ＥＲＫリン酸化に関してＭＮＦに対して精巧な感受性を示した（図２５Ｃ及び２５Ｄ）。ＭＮＦ前処置を伴うか伴わないＡＭ２５１を用いる細胞刺激後に同様の知見が観察された。
【０３０９】
内因性カンナビノイドの生物活性濃度は、ウシ胎児血清中に存在し（２５０〜７００ｎＭの２−アラキドノイルグリセロール）、これは、単球／マクロファージ反応に強力に影響を及ぼす。図２６Ａ〜２６Ｄに示されるように、ＭＮＦを用いる前処置は、両細胞系において血清誘導性ＥＲＫリン酸化を強力に阻害した。
【０３１０】
腫瘍細胞の形態学及び運動性におけるＭＮＦの役割。ＨｅｐＧ２及びＰＡＮＣ−１細胞生物学におけるＭＮＦ及びＧＰＲ５５活性化の役割をさらに研究するために、形態学における可能性ある変化を調べた。ＡＭ２５１及びＯ−１６０２刺激に応じて、不規則な外観並びに長い糸状仮足（ｆｉｌｉｐｏｄｉａ）及び葉状仮足を有する細胞が観察された（図２６Ａ及び２６Ｂ、白色矢印）。ＭＮＦを用いる前処置は、細胞を、両腫瘍細胞系においてＡＭ２５１及びＯ−１６０２によって誘導される形態学の変化に対して不応性にした。図２６Ｃに示されるように、Ｏ−１６０２を用いるＨｅｐＧ２及びＰＡＮＣ−１細胞の処置は、媒体処置細胞と比較して、高いＥＧＦＲレベルにつながり、ＭＮＦは、この効果（図２６Ｃ、レーン４対３）及びＡＭ２５１のものを遮断した。これらの知見は、ＭＮＦが、ＧＰＲ５５シグナル伝達に対する不応性を付与したという考えと一致する。
【０３１１】
次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで創傷−治癒アッセイを実施して、細胞運動に対するＭＮＦの効果を調べた。図２７Ａ及び２９Ａに示されるように、ＭＮＦは単独で、研究を通じて使用した濃度（１μＭ）でＨｅｐＧ２細胞の運動性に対して効果がなかった。しかし、これは、細胞運動のＡＭ２５１媒介性増大に向けられたその大幅な阻害効果と対照的である（図２７Ａ、２９Ａ）。各条件を用いてＨｅｐＧ２細胞を２４時間処置した後の相対創傷表面積が図２７Ｂに表されている。ＨｅｐＧ２細胞におけるその効果と同様に、ＭＮＦはまた、ＰＡＮＣ−１細胞のＡＭ２５１誘導性運動性において大幅な低減をもたらしたが、裂け目充填の構成速度を変化させなかった（図２７Ｃ、２７Ｄ及び２９Ｂ）。Ｏ−１６０２に対して試験した場合には、ＭＮＦの存在下で細胞型選択的効果が観察された。特に、ＰＡＮＣ−１細胞においてＯ−１６０２によって惹起されたＭＮＦの創傷閉鎖を阻害する能力は、ＨｅｐＧ２細胞では存在せず（図２９Ｃ）、これは複雑な様式の拮抗作用を示す。
【０３１２】
「カンナビノイド様受容体」ＧＰＲ５５の関与が、細胞増殖、遊走、生存及び発癌を促進するいくつかのシグナル伝達カスケードを誘発する。ＭＮＦは、１）蛍光性ＧＰＲ５５リガンドの細胞侵入の遅延、２）リガンドによって占有されたＧＰＲ５５の内部移行の阻害及び３）いくつかの生物学的読み取り値に関するＧＰＲ５５アゴニスト有効性の大幅な低減を含めた、ＧＰＲ５５シグナル伝達の選択的減弱と関連しているいくつかの特徴を示す。
【０３１３】
細胞アッセイでは、フルオロフォア単独（５’−ＴＡＭＲＡ−ＰＰＡ）の低レベルの非特異的取り込みが、Ｔ１１１７（５’−ＴＡＭＲＡ−ＰＰＡがコンジュゲートしているＡＭ２５１）を、ＧＰＲ５５の占有率及び内部移行を評価することを目的としたｉｎ  ｖｉｖｏイメージングアプローチに適したものにする。化合物Ｔ１１１７は、小さいマウス動脈においてＧＰＲ５５の分布を測定するためにこれまでに示されている。ここで、ｓｉＲＮＡベースの遺伝子サイレンシング法を使用して、ＧＰＲ５５が、無傷の細胞へのＴ１１１７侵入に関与する主な分子であると決定した。ヒトＨｅｐＧ２細胞では、ＰＣＲ及び機能アッセイによって、ＧＰＲ５５及び古典的なＣＢ１Ｒの存在が証明された。両受容体とも、内皮細胞において個別のシグナル伝達経路を誘発し、したがって、本発明者らの研究において、ｓｉＲＮＡによるＣＢ１Ｒのサイレンシングは、ＧＰＲ５５によって媒介される反応を制限したが、ＣＢ１Ｒのアゴニスト（ＷＩＮ５５，２１２−２）を用いる細胞刺激は、ＧＰＲ５５構成的活性の増大をもたらしたということを観察することは驚くべきことではなかった。ＧＰＲ５５は、好中球の炎症反応に影響を及ぼすようＣＢ２Ｒと協調的に相互作用するが、薬理学的阻害及びｓｉＲＮＡによるＣＢ２Ｒのサイレンシングは、ＨｅｐＧ２細胞においてＴ１１１７取り込みに影響を及ぼすことができなかった。したがって、ＣＢ１Ｒによって誘発される機序は、構成的なＧＰＲ５５によって媒介されるＴ１１１７取り込みに、ある程度寄与すると思われる。ＣＢ１Ｒの、種々のＧＰＣＲと機能的ヘテロ二量体を形成する傾向によって、ＧＰＲ５５の細胞型特異的生理反応の一部が説明される。
【０３１４】
データの分析によって、ＭＮＦが、内因性レベルのＧＰＲ５５を発現する血清が枯渇した細胞において、Ｔ１１１７の細胞蓄積を大幅に遅延したことが示され、これは、Ｔ１１１７のＧＰＲ５５に対する結合親和性の低下並びに／又は構成的細胞表面ＧＰＲ５５内部移行及び再利用経路の障害を示す。ＡＭ２５１を用いる３０分の前処置は、ＭＮＦの効果を増強し、負の蓄積事象と一致した。このモデルでは、ＡＭ２５１が結合しているＧＰＲ５５複合体は、内部移行し、任意の残存する細胞表面ＧＰＲ５５受容体が、ＭＮＦによって標的とされ、このＧＰＣＲを効率的なＴ１１１７結合及び／又は内部移行のために接近できないものにした。或いは、ＡＭ２５１によるＣＢ１Ｒの阻害がまた、ＭＮＦシグナル伝達における観察された効力に寄与した可能性がある。ＣＰ５５，９４０の、Ｔ１１１７の細胞侵入を遮断する能力は、ＧＰＲ５５アンタゴニストとしての役割と一致した。
【０３１５】
ＧＰＲ５５を発現するＨＥＫ２９３細胞の、非定型カンナビノイドＯ−１６０２を用いる刺激は、ＭＮＦ阻害可能な機序によるＧＰＲ５５の迅速な内部移行を誘発し、これは、現在のアッセイ条件下では、ＭＮＦの効力が過剰発現の条件によって目に見えて影響を受けなかったことを示す。ＧＰＣＲ脱感作及び内部移行は、活性化受容体へのβ−アレスチン転位の関与を必要とする。一時的トランスフェクション形式でのβ−アレスチン転位アッセイを使用して、ＡＭ２５１及びその臨床類似体リモナバンは、ＧＰＲ５５アゴニストとして強力な活性を示すのに対し、ＣＰ５５，９４０は、β−アレスチン／ＧＰＲ５５複合体の形成を遮断する。ＭＮＦが、β−アレスチンのＧＰＲ５５への補充を妨げ、それによって、アゴニスト曝露後のこのＧＰＣＲの内部移行及び再利用に負の影響をもたらすという可能性が存在する。β−アレスチンは、ＧＰＣＲ内部移行の促進におけるその役割に加えて、下流シグナル伝達の活性化（例えば、ＥＲＫ活性化）にとって必要である、ＧＰＲ５５は、主にＧ−タンパク質Ｇ１３と結合し、そこで、内皮細胞におけるＲｈｏ依存性シグナル伝達を促進すると考えられる。ＧＰＲ５５の下流のさらなる事象として、ＥＲＫの活性化及び内部貯蔵からのＣａ２＋放出が挙げられる。ここで、ＡＭ２５１又はＯ−１６０２に対するＨｅｐＧ２及びＰＡＮＣ−１細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ曝露は、ＥＲＫリン酸化、ＭＮＦを用いる細胞前処置によって阻害されたプロセスの迅速な増大をもたらした。ＭＮＦに応じた、ＥＲＫリン酸化のアゴニストによって刺激された増大の大幅な低減の説明は、オピオイド媒介性ＥＲＫ活性化が、κ−オピオイド受容体内部移行に依存しないことを示すＬｉ及び同僚らによる早期の研究（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１２０８７〜１２０９４、１９９９年）とは対照的に、リガンドが結合しているＧＰＲ５５は、受容体が内部移行されるとＥＲＫ活性を刺激するというものである。或いは、ＭＮＦは、ＧＰＲ５５上の推定アロステリック結合部位と相互作用し、ＧＰＲ５５アゴニストの負のアロステリックモジュレーションを誘発し得る。ＣＢ１Ｒでアロステリック結合部位が報告されていることは注目に値する。ＭＮＦは、ＧＰＲ５５の下流のシグナル伝達を阻害して、Ｔ１１１７の結合、受容体内部移行及びＥＲＫ活性化につながるシグナル伝達カスケードの誘導を撹乱し得る。
【０３１６】
開示されている研究から得られた別の目立った観察結果として、基礎及びアゴニスト誘導性ＥＲＫリン酸化に対するＭＮＦの効果並びにＧＰＲ５５依存性細胞形態学及び細胞運動を含めた生物学的読み取り値に対するＭＮＦの効果の間の類似性がある。ＥＲＫは、ＷＡＶＥ２調節複合体のリン酸化によって葉状仮足前縁運動を促進することによって細胞遊走を協同し、調節するとわかっている。ここで、ＨｅｐＧ２及びＰＡＮＣ−１細胞の、ＡＭ２５１又はＯ−１６０２を用いる処置が、糸状仮足（ｆｉｌｌｉｐｏｄｉａ）伸長につながり、これは、ＭＮＦ前処置によって遮断された。さらに、ＭＮＦは、掻創−治癒アッセイを使用してＨｅｐＧ２及びＰＡＮＣ−１細胞においてＧＰＲ５５アゴニストの創傷閉鎖の速度の大幅な低減を誘発した。
【０３１７】
この実施例は、ＭＮＦが、ヒトＨｅｐＧ２肝細胞癌腫細胞及び培養物のＰＡＮＣ−１膵臓癌細胞系において増殖を低減し、アポトーシスを増大したことを示す。ＨｅｐＧ２及びＰＡＮＣ−１細胞におけるＭＮＦシグナル伝達におけるＧＰＲ５５の役割を、蛍光性リガンド、Ｔｏｃｒｉｆｌｕｏｒ１１１７（Ｔ１１１７）の内部移行、アクチン細胞骨格の再組織化及び引っ掻きアッセイによって測定される細胞運動に焦点をあてて調べた。結果は、ＲＮＡ干渉によるＧＰＲ５５ノックダウンは、Ｔ１１１７の細胞取り込み、ＭＮＦ阻害に対して感受性であったプロセスを著しく低減したことを示した。非定型カンナビノイドＯ−１６０２によって媒介されるＧＰＲ５５内部移行は、ＧＰＲ５５を発現するＨＥＫ２９３細胞ではＭＮＦによって遮断された。ＨｅｐＧ２及びＰＡＮＣ−１細胞の、ＭＮＦを用いる前処置は、ＡＭ２５１、Ｏ−１６０２及び生理活性脂質を含有するとわかっているウシ胎児血清に応じたＥＲＫ１／２リン酸化の誘導を大幅に抑制した。さらに、ＭＮＦは、掻創治癒アッセイを使用する細胞形態学及び遊走の変化を含めた、ＡＭ２５１及びＯ−１６０２誘導性プロセスの協調した負の調節を発揮した。したがって、これらの研究は、ＭＮＦが、ＧＰＲ５５媒介性シグナル伝達を損ない、癌の管理において治療的使用を有することを初めて示す。
【０３１８】
（例１０）
ＣＢ受容体活性によって調節される腫瘍の治療
この実施例は、フェノテロール、フェノテロール類似体又はそれらの組合せを、膠芽腫又は肝細胞癌腫などの腫瘍と関連している１種又は複数の徴候又は症状を低減又は阻害するのに治療上有効な量で含む組成物を投与することによって、ヒト対象において腫瘍を治療するために使用され得る方法を記載する。特定の方法、投与量及び投与様式が提供されるが、当業者ならば、治療に実質的に影響を及ぼさずに、変法を行ってもよいということは理解するであろう。
【０３１９】
膠芽腫又は肝細胞癌腫を有する対象を、臨床症状に基づいて選択する。生物学的サンプルを、対象から単離し、ＧＰＲ５５を含めたＣＢ受容体発現及びβ２−ＡＲ発現を、マイクロアレイ、ウエスタンブロッティング又は組織学的研究によって決定する。陽性結果は、腫瘍が、フェノテロール、開示されているフェノテロール類似体又はそれらの組合せの投与によって治療され得ることを示す。１つの特定の例では、組織生検を、原発性脳腫瘍を有する対象から得る。サンプルにおいてβ２−ＡＲ及びＧＰＲ５５の発現を決定する。サンプルにおいてβ２−ＡＲがないこと及びＧＰＲ５５があることが、原発性脳腫瘍が、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦを含む組成物の投与によって治療され得ることを示す。β２−ＡＲがあること及びＧＰＲ５５があることは、腫瘍が、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ若しくはフェノテロール（又は両方）又はβ２−ＡＲ活性を刺激すると知られているその他のフェノテロール類似体（単数又は複数）によって治療され得ることを示す。所望の化合物を含む組成物を、３０ｍｇ／ｋｇ／日の濃度で、最初の１０日間、５０ｍｇ／ｋｇ／日の濃度で、残りの３２日間、対象に腹膜内に投与する。次いで、治療後７日、１４日、２１日、３０日及び４２日に腫瘍成長を評価する。一例では、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）及び特に、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）などの非浸潤性、高解像度様式を含めたイメージング法によって治療の有効性を決定する。例えば、造影剤取り込みをモニタリングして、治療の有効性を決定する。参照値又は治療前に測定されたものと比較した、造影剤の取り込みの少なくとも２０パーセント（２０％）の低減によって示される血液脳関門への透過性の低下は、治療が有効であることを示す。また、治療前の腫瘍の大きさと比較した、腫瘍の大きさの２０パーセント（２０％）の低減は、有効な治療であると考えられる。一例では、治療的有効性は、本明細書においてＭＮＦによって調節されると実証される１種又は複数の分子の発現又は活性を測定することによって決定される（例えば、表１０を参照のこと）。いくつかの例では、対象は、ｃＧＭＰによって製造された（Ｒ，Ｒ’）−４−メトキシナフチルフェノテロール（例えば、ｃＧＭＰによって製造された（Ｒ，Ｒ’）−４−メトキシナフチルフェノテロール２Ｋｇ製剤）とともに使用されるＭＮＦの静脈内製剤を投与される。いくつかの例では、対象は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度のＭＮＦの静脈内製剤を単独薬剤として４日間、又はその他のフェノテロール類似体若しくは癌化学療法において使用される標準薬剤と組み合わせて、２週間にわたって、連続療法として、又はパルス療法として投与される。いくつかの例では、対象は、単独薬剤として又は（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ及びその他のＭＮＦ立体異性体若しくはフェノテロール立体異性体の組合せとして製剤された２５ｍｇ／ｋｇ用量のＭＮＦを、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月などの特定の期間と、腫瘍の退縮又は腫瘍成長の阻害に基づいて必要に応じてそれに続くさらなる期間、毎日経口投与される。
【０３２０】
（例１１）
（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ又は（Ｒ，Ｒ’）−ＮＦ（又は両方）を含む開示されている組成物の、アジュバント療法としての使用
この実施例は、悪性星状細胞腫について治療されているヒト対象において腫瘍成長を低減、防止又は遅延するために使用され得る方法を記載する。
【０３２１】
星状細胞腫を有する対象を、臨床症状に基づいて選択し、ＣＢ受容体を発現する星状細胞腫を有することを決定する。悪性星状細胞腫の治療の第一形態は、観血的手術である。手術候補ではない対象には、放射線照射又は化学療法のいずれかが、最初の治療として使用される。最初の治療後、対象に、（Ｒ，Ｒ’）−ＭＮＦ及び／又は（Ｒ，Ｒ’）−ＮＦを含有する医薬組成物を、毎日、不確定な期間経口投与する。ＣＴ及びＭＲＩなどの非浸潤性の、高解像度様式を含めたイメージング法によって、腫瘍成長の再発をモニタリングする。
【０３２２】
開示されている本発明の原則が適用され得る多数の可能性ある実施形態を考慮して、例示された実施形態は、単に本発明の好ましい実施例であって、本発明の範囲を制限するととられてはならないということは認識されなければならない。そうではなく、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって規定される。したがって、本発明者らは、本発明者らの発明として、これらの特許請求の範囲及び趣旨内に入るすべてを特許請求する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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