(57)【要約】  本発明は、式Ｉ：【化１】2015518853.tif 000020（式中、Ｒ９は、本明細書に定義した意味を有する）の化合物（その任意の可能な立体異性体を含む）、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物に関する。本発明また、前記化合物の製造方法、それらを含有する医薬組成物、及び、単独での又は他のＨＣＶ阻害剤との組み合わせてのＨＣＶの処置におけるそれらの使用に関する。
2015518853.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その任意の可能な立体異性体を含む、式Ｉ：
【化１】
2015518853.tif 000015
（式中：
Ｒ９は、各々独立してフェニル、ナフチル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、ヒドロキシ又はＣ１〜Ｃ６アルコキシから選択される１、２又は３個の置換基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル又はＣ１〜Ｃ３アルキルである；）
の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物。
【請求項２】
式Ｉａ：
【化２】
2015518853.tif 000016
のものである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ９が、フェニルＣ１〜Ｃ２アルコキシ又はＣ３〜Ｃ６シクロアルキルで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル又はＣ１〜Ｃ２アルキルである、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ９がＣ２〜Ｃ４アルキルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ９がｉ−プロピルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
式Ｉｂ：
【化３】
2015518853.tif 000017
のものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
その薬学的に許容され得る塩又は溶媒和物を含む、式Ｖ：
【化４】
2015518853.tif 000018
の化合物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物の合成における、化合物（Ｖ）の使用。
【請求項９】
その任意の立体化学的形態及び／又は薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含む、式ＶＩ：
【化５】
2015518853.tif 000019
の化合物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物と、薬学的に許容され得る担体とを含有する医薬組成物。
【請求項１１】
医薬としての使用のための請求項１〜６若しくは９のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
哺乳動物におけるＨＣＶ感染の予防又は処置における使用のための、請求項１〜６若しくは９のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＨＣＶ感染の処置における同時の、別個の、又は連続した使用のための組み合わせ製剤としての、（ａ）請求項１〜６又は９のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物及び（ｂ）他のＨＣＶ阻害剤を含む製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スピロオキセタンヌクレオシド、及び肝炎Ｃウィルス（ＨＣＶ）の阻害剤であるヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶは、ヘパシウィルス属のフラビウィルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ウィルスファミリーに属する一本鎖のプラスセンスＲＮＡウィルスである。ＲＮＡポリジーンのＮＳ５Ｂ領域は、ウィルス複製に必須のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）をコードする。初期の急性感染後、感染した大部分の個人は、ＨＣＶが肝細胞内で優先的に複製するが直接細胞壊死性ではないため、慢性肝炎に罹患する。詳細には、活発なＴ−リンパ球応答の欠如、及びウィルスが突然変異する高い傾向により、高い率の慢性感染が促進されると思われる。慢性肝炎は肝線維症に進行して、硬変、末期肝疾患、及びＨＣＣ（肝細胞癌腫）をもたらす可能性があり、肝臓移植の主要な原因となっている。地理的に異なって分布する６つの主なＨＣＶ遺伝子型及び５０を超えるサブタイプが存在する。ＨＣＶ遺伝子型１は、欧州及び米国内で優勢な遺伝子型である。ＨＣＶの広範な遺伝子異質性は、重要な診断的及び臨床的意味を有し、おそらくワクチン開発における困難さ、及び現在の治療法に対する応答の欠如を説明するものである。
【０００３】
ＨＣＶの伝播は、汚染された血液又は血液製品との接触、例えば輸血後又は静脈内薬物使用を介して生じ得る。血液スクリーニングに用いられる診断試験の導入により、輸血後ＨＣＶ発生率の下方傾向がもたらされている。しかしながら、末期肝疾患への遅い進行を考慮すると、存在する感染症は、重大な医学的及び経済的負担を数十年間もたらし続けるであろう。
【０００４】
現在のＨＣＶ療法は、リバビリンと組み合わせた（ペグ化）インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）に基づいている。この組み合わせ療法は、遺伝子型１  ＨＣＶにより感染された患者の４０％超、並びに遺伝子型２及び３により感染された患者の約８０％に持続的なウィルス学的応答を生じている。この組み合わせ療法は、ＨＣＶ遺伝子型１に対する限定された効力に加えて、有意な副作用を有し、多くの患者において耐性が乏しい。主な副作用は、インフルエンザ様症状、血液学的異常及び精神神経症状を含む。それ故、より有効な、より簡便な、またより耐性の高い処置が必要とされている。
【０００５】
近年、治療の可能性は、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤（例えば、テラプレビル又はボセプレビル）及び（ペグ化）インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）／リバビリンの組み合わせの方向に拡大している。
【０００６】
ＨＩＶ薬物、特にＨＩＶプロテアーゼ阻害剤による経験によって、準最適な薬物動態及び複雑な投与体制（ｒｅｇｉｍｅ）は、不注意による服薬率の不足を急速にもたらすことが教示された。このことは、ＨＩＶ治療計画における各薬物の２４時間トラフ濃度（最低血漿濃度）が、一日のうちの大部分にて、ＩＣ９０又はＥＤ９０閾値を頻繁に下回ることを意味する。少なくともＩＣ５０、及びより現実的にはＩＣ９０又はＥＤ９０の２４時間トラフレベルが、薬物回避変異体（ｄｒｕｇ  ｅｓｃａｐｅ  ｍｕｔａｎｔｓ）の発生を遅延させるのに不可欠であることが考えられる。そのようなトラフレベルを可能にするのに必要な薬物動態及び薬物代謝を達成することは、薬物設計に厳しい挑戦を提供する。
【０００７】
ＮＳ５Ｂ  ＲｄＲｐは、一本鎖のプラスセンスＨＣＶ  ＲＮＡゲノムの複製に必須である。この酵素は、医薬品化学者の間で相当な興味を引き出している。ＮＳ５Ｂのヌクレオシド及び非ヌクレオシド阻害剤の両方は既知である。ヌクレオシド阻害剤は、連鎖停止剤若しくは競合阻害剤、又はそれらの両方として作用し得る。活性となるためには、ヌクレオシド阻害剤は、細胞に吸収され、インビボで三リン酸エステルに変換される必要がある。この三リン酸エステルへの変換は通常、細胞キナーゼにより仲介され、このことは潜在的なヌクレオシドポリメラーゼ阻害剤に対して追加の構造的要求を付与する。加えて、このことはインサイチューリン酸化が可能な細胞ベースのアッセイに対する、ＨＣＶ複製の阻害剤としてのヌクレオシドの直接的な評価を制限する。
【０００８】
ＨＣＶ  ＲｄＲｐの阻害剤としてのヌクレオシドを開発するいくつかの試みが為されており、少数の化合物が臨床開発に進んでいるが、いずれも登録に進んでいない。今日までＨＣＶ−標的ヌクレオシドが遭遇した問題には、毒性、変異原性、選択性の不足、乏しい効力、乏しいバイオアベイラビリティ、準最適な投与計画、及び結果として生じる高い丸剤負荷量、並びに製品の費用がある。
【０００９】
ＣＡＳ−１３７５０７４−５２−４を含む、スピロオキセタンヌクレオシド、特に１−（８−ヒドロキシ−７−（ヒドロキシ−メチル）−１，６−ジオキサスピロ［３．４］オクタン−５−イル）ピリミジン−２，４−ジオン誘導体、及びＨＣＶ阻害剤としてのそれらの使用は、国際公開第２０１０／１３０７２６号パンフレット及び国際公開第２０１２／０６２８６９号パンフレットにより既知である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
例えば副作用、限定された効力、耐性の出現、及び服薬率の不足等の現在のＨＣＶ療法の欠点の少なくとも１つを克服し又は持続的なウィルス応答を改善するＨＣＶ阻害剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下のパラメーター、すなわち、以下の遺伝子型、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３、４及び６の少なくとも１つに対する抗ウィルス効力、耐性の発生の好ましいプロファイル、殆ど存在しない毒性及び遺伝毒性、好ましい薬物動態及び薬力学、並びに処方及び投与の容易さ、の１つ以上に関して有用な特性を有するＨＣＶ−阻害ウラシルスピロオキセタン誘導体の群に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一態様において、本発明は、その任意の可能な立体異性体を含む、式Ｉ：
【化１】
2015518853.tif 000003
（式中：
Ｒ９は、各々独立してフェニル、ナフチル（ｎａｐｈｔｙｌ）、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、ヒドロキシ又はＣ１〜Ｃ６アルコキシから選択される１、２又は３個の置換基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル又はＣ１〜Ｃ３アルキルである；）
で表すことができる化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を提供する。
【００１３】
式Ｉの化合物、又は式Ｉａ：
【化２】
2015518853.tif 000004
に従った構造を有する、本明細書に定義したそのサブグループが特に興味深い。
【００１４】
本発明の一実施形態では、Ｒ９は、フェニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、ヒドロキシ又はＣ１〜Ｃ６アルコキシから選択される１つの置換基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル又はＣ１〜Ｃ３アルキルである。本発明の別の実施形態では、式Ｉ又はＩａにおけるＲ９は、フェニル  Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ又はＣ３〜Ｃ６シクロアルキルで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル又はＣ１〜Ｃ２アルキルである。より好ましい実施形態では、Ｒ９はＣ２〜Ｃ４アルキルであり、最も好ましい実施形態では、Ｒ９は、ｉ−プロピルである。
【００１５】
本発明による好ましい実施形態は、その任意の薬学的に許容され得る塩又は溶媒和物を含む、式Ｉｂ：
【化３】
2015518853.tif 000005
に従った化合物と、式Ｉ、Ｉａ又はＩｂに従った化合物の合成における化合物（Ｖ）の使用である。
【００１６】
本発明は更に、その任意の薬学的に許容され得る塩又は溶媒和物を含む、式Ｖ：
【化４】
2015518853.tif 000006
の化合物と、式Ｉ、Ｉａ又はＩｂに従った化合物の合成における化合物（Ｖ）の使用に関する。
【００１７】
加えて、本発明は、その任意の立体化学的形態及び／又は薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含む、式ＶＩ：
【化５】
2015518853.tif 000007
の化合物に関する。
【００１８】
加えて、本発明は、式Ｉ、Ｉａ又はＩｂに従った化合物と、薬学的に許容され得る担体とを含有する医薬組成物に関する。本発明はまた、ＨＣＶ感染の処置における同時の、別個の、又は連続した使用のための組み合わせ製剤としての、（ａ）式Ｉ、Ｉａ又はＩｂａの化合物、及び（ｂ）他のＨＣＶ阻害剤を含む製品に関する。
【００１９】
本発明の更なる別の態様は、医薬としての使用のための、好ましくは哺乳動物におけるＨＣＶ感染の予防又は処置における使用のための、式Ｉ、Ｉａ又はＩｂに従った化合物、又は本発明による医薬組成物に関する。
【００２０】
更なる態様において、本発明は、ＨＣＶ感染の処置若しくは予防（又は、処置若しくは予防のための医薬の製造）における使用のための、式ＩＩａ又はＩｂの化合物、又はその薬学的に許容され得る塩、水和物、若しくは溶媒和物を提供する。本発明による処置又は予防との関連における代表的なＨＣＶ遺伝子型は、遺伝子型１ｂ（欧州で流行）又は１ａ（北米で流行）を含む。本発明はまた、特に遺伝子型１ａ又は１ｂのＨＣＶ感染の処置又は予防のための方法を提供する。
【００２１】
「実施例」セクションにて言及する化合物８ａ、及びこの化合物の薬学的に許容され得る酸付加塩が特に興味深い。
【００２２】
式Ｉの化合物は、数個のキラリティーの中心を有し、特に炭素原子１’、２’、３’及び４’において有する。これらの炭素原子における立体化学は固定されているが、化合物は、各キラル中心において、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９０％、例えば９５％又は９８％過剰のエナンチオマー純度を示し得る。
【００２３】
リン中心は、ＲＰ若しくはＳＰ、又は、ラセミ体を含むそれらの立体異性体の混合物として示されてもよい。キラルリン中心及びキラル炭素原子から生じるジアステレオ異性体も存在し得る。
【００２４】
式Ｉの化合物は、リン原子における立体異性を除いて、明確な立体異性体として示される。それらの化合物の絶対立体配置は、例えばＸ線回折若しくはＮＭＲ、及び／又は既知の立体化学を有する出発物質からの推定等の、当技術分野にて既知の方法を用いて決定することができる。本発明による医薬組成物は、特定の式Ｉの化合物の、示される立体異性体の立体異性体的に純粋な形態を含有することが好ましいであろう。
【００２５】
本明細書に言及する化合物及び中間体の純粋な立体異性体は、前記化合物又は中間体の同一の基本分子構造の他のエナンチオマー又はジアステレオマー形態を実質的に含まない異性体として定義される。特に、用語「立体異性体的に純粋な」は、少なくとも８０％の立体異性体過剰（即ち、最小９０％の１つの異性体及び最大１０％の他の可能な異性体）から１００％迄の立体異性体過剰（即ち、１００％の１つの異性体及び他の異性体なし）、更に、特に９０％超〜最大１００％の立体異性体過剰を有する化合物又は中間体、尚更に、特に９４超〜最大１００％の立体異性体過剰、最も特には９７％超〜最大１００％、又は９８％超〜最大１００％の立体異性体過剰を有する化合物又は中間体に関する。用語「エナンチオマー的に純粋な」及び「ジアステレオマー的に純粋な」は、同様の方法で理解するべきであるが、それぞれ、問題となっている混合物のエナンチオマー的過剰、ジアステレオマー的過剰が考慮される。
【００２６】
本発明の化合物及び中間体の純粋な立体異性体は、当技術分野にて既知の手順を適用することにより得ることができる。例えば、エナンチオマーは、光学活性酸又は塩基を用いたそれらのジアステレオマー塩の選択的結晶化によって、互いに分離することができる。光学活性酸の例は、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸及びカンファースルホン酸である。代替的に、エナンチオマーは、キラル固定層を用いたクロマトグラフィー法によって分離することができる。前記純粋な立体化学的異性体は、反応が立体特異的に起こることを条件として、適切な出発物質の対応する純粋な立体化学的異性体から誘導することもできる。特定の立体異性体が所望される場合、前記化合物は立体特異的な製剤方法によって合成されることが好ましい。それらの方法は、エナンチオマー的に純粋な出発物質を有利に使用するであろう。
【００２７】
式Ｉの化合物のジアステレオマーラセミ体は、従来の方法によって別々に得ることができる。有利に使用され得る適切な物理的分離方法は、例えば、選択的結晶化及びクロマトグラフィー、例えばカラムクロマトグラフィーである。
【００２８】
薬学的に許容され得る付加塩は、式Ｉの化合物の治療的に有効な無毒酸及び塩基付加塩形態を含む。式Ｉの化合物、又は本明細書に特定した式Ｉの化合物のサブグループの遊離形態、即ち非塩形態が興味深い。
【００２９】
薬学的に許容され得る酸付加塩は、塩基形態をそれらの適切な酸で処理することにより都合よく得ることができる。適切な酸は、例えば、ハロゲン化水素酸、例えば塩酸又は臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、及び同様の酸等の無機酸；又は例えば、酢酸、プロピオン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸（即ちエタン二酸）、マロン酸、コハク酸（即ちブタン二酸）、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸（即ちヒドロキシルブタン二酸）、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、パルモ（ｐａｌｍｏｉｃ）酸、及び同様の酸等の有機酸を含む。逆に、前記塩形態は、適切な塩基で処理することにより遊離塩基形態に変換され得る。
【００３０】
酸性プロトンを含む式Ｉの化合物はまた、適切な有機及び無機塩基を用いた処理によって、それらの非毒性金属又はアミン付加塩形態に変換されてもよい。適切な塩基塩形態は、例えば、アンモニウム塩、アルカリ及びアルカリ土類金属塩、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム塩等、有機塩基との塩、例えばベンザチン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ヒドラバミン塩、並びにアルギニン、リシン等のアミノ酸との塩を含む。
【００３１】
用語「溶媒和物」は、式Ｉの化合物、及びその塩が形成することができる、薬学的に許容され得る任意の溶媒和物を包含する。そのような溶媒和物は、例えば水和物、アルコラート、例えばエタノラート、プロパノラート等である。
【００３２】
式Ｉの化合物のいくつかは、それらの互変異性形態でも存在し得る。例えば、アミド（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）基の互変異性形態は、イミノアルコール（−Ｃ（ＯＨ）＝Ｎ−）であり、これは芳香族性を有する環内で安定な状態となり得る。ウリジン塩基は、そのような形態の一例である。そのような形態は、本明細書で表される構造式には明白に示されないが、本発明の範囲内に含まれることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヒト化肝細胞マウスモデルにて決定された、インビボでの化合物８ａ及びＣＡＳ−１３７５０７４−５２−４の効力。
【００３４】
定義
本明細書で使用されるように、基又は基の一部としての「Ｃ１〜Ｃｎアルキル」は、１〜ｎ個の炭素原子を有する飽和の直鎖又は分岐鎖の炭化水素基を定義する。従って、基又は基の一部としての「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」は、例えばメチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、１−ブチル、２−ブチル、２−メチル−１−プロピル、２−メチル−２−プロピル等の、１〜４個の炭素原子を有する飽和の直鎖又は分岐鎖の炭化水素基を定義する。「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」は、例えば、１−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、２−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ペンチル、２−エチル−１−ブチル、３−メチル−２−ペンチル等の、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基、及び５又は６個の炭素原子を有するそのより高次の同族体を包含する。Ｃ１〜Ｃ６アルキルの中でも、Ｃ１〜Ｃ４アルキルが興味深い。
【００３５】
「Ｃ１〜Ｃｎアルコキシ」は、基−Ｏ−Ｃ１〜Ｃｎアルキルを意味し、ここでＣ１〜Ｃｎアルキルは、上記に定義した通りである。従って、「Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ」は、基−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アルキルを意味し、ここでＣ１〜Ｃ６アルキルは、上記に定義した通りである。Ｃ１〜Ｃ６アルコキシの例は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ又はイソプロポキシである。メトキシ及びエトキシを包含する「Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ」が興味深い。
【００３６】
「Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル」は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルを含む。
【００３７】
一実施形態において、用語「フェニル−Ｃ１〜Ｃ６アルキル」は、ベンジルである。
【００３８】
本明細書で使用されるように、用語「（＝Ｏ）」又は「オキソ」は、炭素原子に結合された場合、カルボニル部分を形成する。原子は、その原子の結合価が可能な場合のみに、オキソ基で置換され得ることに留意するべきである。
【００３９】
用語「一リン酸、二リン酸又は三リン酸エステル」は、基：
【化６】
2015518853.tif 000008
を指す。
【００４０】
分子部分上の基（例えばフェニル上の置換基）の位置が特定されない場合、又は浮遊結合（ｆｌｏａｔｉｎｇ  ｂｏｎｄ）によって表される場合、それらの基は、得られる構造が化学的に安定である限り、それらの分子部分の任意の原子上に位置することができる。任意の可変物（ｖａｒｉａｂｌｅ）が分子内に２回以上存在する場合、各々の定義は独立している。
【００４１】
本明細書で用語「式Ｉの化合物」若しくは「本化合物」、又は同様の用語が使用される場合は常に、式Ｉ、Ｉａ及びＩｂの化合物（その可能な立体化学的異性体形態を含む）、並びにそれらの薬学的に許容され得る塩及び溶媒和物を含むことを意味する。
【００４２】
本発明はまた、原子の１つ以上が、一般に天然に見出されるものとは異なる同位体で置き換えられている、同位体で標識された式Ｉ又は式Ｉの任意のサブグループの化合物も含む。そのような同位体の例としては、２Ｈ及び３Ｈ等の水素の同位体；１１Ｃ、１３Ｃ及び１４Ｃ等の炭素の同位体；１３Ｎ及び１５Ｎ等の窒素の同位体；１５Ｏ、１７Ｏ及び１８Ｏ等の酸素の同位体；３１Ｐ及び３２Ｐ等のリンの同位体、３５Ｓ等の硫黄の同位体；１８Ｆ等のフッ素の同位体；３６Ｃｌ等の塩素の同位体；７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ及び８２Ｂｒ等の臭素の同位体；並びに１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ及び１３１Ｉ等のヨウ素の同位体が挙げられる。本発明の同位体標識化合物は、適切な同位体標識試薬若しくは出発物質を使用することにより、本明細書に記載したものと類似したプロセスによって、又は当技術分野にて既知の技術を用いることによって調製することができる。同位体標識化合物に含まれる同位体の選択は、化合物の特定の用途に依存する。例えば、基質組織分布アッセイの場合、３Ｈ又は１４Ｃ等の放射性同位体が組み込まれる。無線画像形成用途では、１１Ｃ、１８Ｆ、１３Ｎ又は１５Ｏ等の陽電子放出同位体が有用であろう。重水素を組み込むことによってより高い代謝的安定性が提供され、例えばインビボでの化合物の半減期の増大又は投与必要量の低減がもたらされ得る。
【００４３】
一般的合成手順
以下のスキームは、例示のみを意味し、範囲を限定するものでは決してない。
【００４４】
出発物質１−［（４Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ）−８−ヒドロキシ−７−（ヒドロキシメチル）−１，６−ジオキサスピロ［３．４］オクタン−５−イル］ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（１）は、国際公開第２０１０／１３０７２６号パンフレットに例示されているように調製することができる。以下のスキーム１に例示するように、ｐ−メトキシベンジル保護誘導体（４）を経由して、化合物（１）を本発明の化合物に変換する。
【００４５】
スキーム１
【化７】
2015518853.tif 000009
スキーム１において、Ｒ９は、各々独立してフェニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、ヒドロキシ又はＣ１〜Ｃ６アルコキシから選択される１、２又は３個の置換基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、ナフチル（ｎａｐｈｔｙｌ）、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル又はＣ１〜Ｃ３アルキルであってもよく、好ましくはＲ９は、フェニル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ又はＣ３〜Ｃ６シクロアルキルで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル又はＣ１〜Ｃ２アルキルであり、更により好ましくはＲ９は、Ｃ２〜Ｃ４アルキルであり、最も好ましくはＲ９は、ｉ−プロピルである。
【００４６】
更なる態様において、本発明は、治療的有効量の、本明細書に特定した式Ｉの化合物と、薬学的に許容され得る担体とを含有する医薬組成物に関する。前記組成物は、１％〜５０％、又は１０％〜４０％の式Ｉの化合物を含有してもよく、組成物の残りは前記担体である。これとの関連における治療的有効量は、感染した対象、又は感染した状態となる危険性を有する対象において、ＨＣＶ感染に対して予防的に作用し、ＨＣＶを阻害し、ＨＣＶ感染を安定化又は低減するのに十分な量である。尚更なる態様では、本発明は、薬学的に許容され得る担体を、治療的有効量の、本明細書に特定した式Ｉの化合物と密に混合することを含む、本明細書に特定した医薬組成物の調製プロセスに関する。
【００４７】
式Ｉの化合物又はその任意のサブグループの化合物は、投与目的のために様々な医薬形態に処方され得る。適切な組成物としては、薬物の全身投与のために通常使用される全組成物が引用され得る。本発明の医薬組成物を調製するために、活性成分としての特定の化合物、任意選択で付加塩形態又は金属複合体の有効な量を、薬学的に許容され得る担体と混合して密な混合物とし、この担体は、投与に所望される製剤の形態に応じて、非常に様々な形態をとり得る。これらの医薬組成物は、特に経口、直腸内、経皮投与、又は非経口注射による投与に好適な単位剤形が望ましい。例えば、組成物を経口剤形に調製する際、縣濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、乳剤及び液剤等の経口液体製剤の場合、例えば、水、グリコール、油、アルコール等の任意の通常の医薬媒体を使用することができ；又は、散剤、丸剤、カプセル剤及び錠剤の場合、澱粉、糖、カオリン、滑沢剤、結合剤、錠剤崩壊剤等の固体担体を使用することができる。投与の容易さにより、錠剤及びカプセル剤は最も有利な経口投与単位剤形となり、その場合、固体医薬担体が明らかに使用される。非経口組成物の場合、担体は、通常、少なくとも大部分が無菌水を含むが、例えば溶解性を補助する他の成分を含む場合があるであろう。例えば、担体が生理食塩水溶液、又はブドウ糖溶液、又は生理食塩水とブドウ糖溶液との混合物を含む注射用溶液が調製され得る。注射用縣濁液も調製され得、その場合、適切な液体担体、懸濁剤等が使用され得る。使用直前に液体剤形製剤に変換されることが意図される固体剤形製剤も含まれる。経皮投与に好適な組成物では、担体は任意選択で、浸透促進剤及び／又は好適な湿潤剤を含み、これらは任意選択で少ない割合の任意の性質の好適な添加剤と組み合わされ、これらの添加剤は、有意な有害効果を皮膚に導入しない。本発明の化合物は、当技術分野にて既知の任意の送達システムを使用して、溶液、縣濁液又は乾燥粉末の形態で、経口吸入又は通気を介して投与することもできる。
【００４８】
前述した医薬組成物を、投与の容易さ、投与量の均一性のために、単位剤形に処方することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、単位投与量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と共同して所望の治療効果を生じるよう計算された所定の量の活性成分を含む。そのような単位剤形の例は、錠剤（分割錠剤又は被覆錠剤を含む）、カプセル剤、丸剤、坐薬、粉末小包、オブラート剤（ｗａｆｅｒｓ）、注射用溶液又は縣濁液等、及び分離されたそれらの集まりである。
【００４９】
式Ｉの化合物は、ＨＣＶに対する活性を示し、ＨＣＶ感染又はＨＣＶに関連した疾病の処置及び／又は予防にて使用することができる。後者には、硬変に繋がる進行性肝線維症、炎症及び壊死、末期肝疾患、並びにＨＣＣが挙げられる。本発明の化合物は、更に、ＨＣＶの変異型株に対して活性であると考えられ、容認可能な半減期、ＡＵＣ（曲線下面積）及びピーク値、並びに不十分に急速な開始及び組織滞留等の好ましくない現象を有さないことを含む、好ましい薬物動態プロファイルを示し、バイオアベイラビリティの観点から魅力的な特性を有する。
【００５０】
ＨＣＶに対する式Ｉの化合物のインビトロでの抗ウィルス活性は、Ｌｏｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１１０−１１３に基づき、Ｋｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５：４６１４−４６２４（参照により本明細書に組み込まれる）により記載されている更なる変更を有する細胞ＨＣＶレプリコン系にて試験することができ、これは実施例セクションにて更に例示される。
【００５１】
式Ｉの化合物（任意の可能な立体異性体を含む）、その薬学的に許容され得る付加塩又は溶媒和物は、それらの抗ＨＣＶ特性に起因して、ＨＣＶに感染した恒温動物、特にヒトにおける処置、及びＨＣＶ感染の予防に有用である。従って、本発明の化合物は、医薬、特に抗ＨＣＶ医薬、又はＨＣＶ−阻害医薬として使用されてもよい。本発明はまた、ＨＣＶ感染の処置又は予防のための医薬の製造における本化合物の使用に関する。更なる態様では、本発明は、ＨＣＶに感染した、又はＨＣＶに感染した状態となる危険性を有する恒温動物、特にヒトの処置方法に関し、前記方法は、抗−ＨＣＶ有効量の、本明細書に特定した式Ｉの化合物を投与することを含む。前記医薬としての使用又は処置方法は、ＨＣＶ感染対象又はＨＣＶ感染に罹りやすい対象に、ＨＣＶ感染に関連した病状と闘うのに有効な量を全身投与することを含む。
【００５２】
一般に、有効な抗ウィルス一日量は、約１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、又は約２〜約２５ｍｇ／ｋｇ、又は約５〜約１５ｍｇ／ｋｇ、又は約８〜約１２ｍｇ／ｋｇ体重であろうと想定される。平均一日用量は、これらの一日量を約７０で乗算することにより得ることができる。必要な用量を２、３、４又はそれを超えるサブ用量として、一日において適切な間隔で投与することが適切であり得る。前記サブ用量は、例えば単位剤形当たり約１〜約２０００ｍｇ、又は約５０〜約１５００ｍｇ、又は約１００〜約１０００ｍｇ、又は約１５０〜約６００ｍｇ、又は約１００〜約４００ｍｇの活性成分を含む単位剤形として処方されてもよい。
【００５３】
本明細書で使用されるように、用語「約」は、当業者に既知の意味を有する。所定の実施形態では、用語「約」は脱落されている場合があり、正確な量が意味される。別の実施形態では、用語「約」は、用語「約」に続く数字が、前記数値の±１５％、又は±１０％、又は±５％、又は±１％の範囲内であることを意味する。
【実施例】
【００５４】
スキーム２
化合物（８ａ）の合成
【化８】
2015518853.tif 000010
【００５５】
化合物（２）の合成
化合物（２）は、化合物（１）をピリジンに溶解し、１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサンを加えることにより調製することができる。反応物を、反応が完了するまで室温で撹拌する。溶媒を除去し、生成物をＣＨ２Ｃｌ２に再溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄する。ＭｇＳＯ４上で乾燥し、溶媒を除去して、化合物（２）を与える。
【００５６】
化合物（３）の合成
化合物（３）は、化合物（２）を、ＣＨ３ＣＮ中で、塩基としてのＤＢＵの存在下、ｐ−メトキシベンジルクロリドと反応させることにより調製される。
【００５７】
化合物（４）の合成
化合物（４）は、フッ化物源としてのＴＢＡＦを使用して、化合物（３）のビス−シリル保護基を切断することにより調製される。
【００５８】
化合物（６ａ）の合成
イソプロピルアルコール（３．８６ｍＬ、０．０５ｍｏｌ）及びトリエチルアミン（６．９８３ｍＬ、０．０５ｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍＬ）溶液を、撹拌しているＰＯＣｌ３（５）（５．０ｍＬ、０．０５５１ｍｏｌ）のＤＣＭ（５０ｍＬ）溶液に−５℃で２５分間滴加した。混合物を１時間撹拌した後、溶媒を蒸発させ、残留物をエーテル（１００ｍＬ）中に懸濁させた。トリエチルアミン塩酸塩を濾過し、エーテル（２０ｍＬ）で洗浄した。濾液を濃縮し、残留物を蒸溜して、（６）を無色液体（６．１ｇ、収率６９％）として与えた。
【００５９】
化合物（７ａ）の合成
撹拌している（４）（２．０ｇ、５．１３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍＬ）中の懸濁液に、室温でトリエチルアミン（２．０７ｇ、２０．４６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を−２０℃に冷却した後、（６ａ）（１．２ｇ、６．７８ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴加した。混合物をこの温度で１５分間撹拌した後、ＮＭＩ（０．８４ｇ、１０．２３ｍｍｏｌ）を１５分間かけて一滴ずつ加えた。混合物を−１５℃で１時間撹拌した後、２０時間でゆっくり室温まで暖めた。溶媒を蒸発させ、混合物を濃縮し、石油エーテル／ＥｔＯＡｃ（勾配として１０：１〜５：１）を使用したカラムクロマトグラフィーにより精製して、（７ａ）を白色固体（０．８ｇ、収率３２％）として与えた。
【００６０】
化合物（８ａ）の合成
（７ａ）のＣＨ３ＣＮ（３０ｍＬ）及びＨ２Ｏ（７ｍＬ）溶液に、ＣＡＮを２０℃未満で一部ずつ加えた。この混合物をＮ２下にて１５〜２０℃で５時間撹拌した。反応混合物にＮａ２ＳＯ３（３７０ｍＬ）を１５℃未満で滴加した後、Ｎａ２ＣＯ３（３７０ｍＬ）を加えた。混合物を濾過し、濾液をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ＊３）で抽出した。有機層を乾燥し、濃縮して残留物を与えた。この残留物をカラムクロマトグラフィーにより精製して、標的化合物（８ａ）を白色固体（収率：５５％）として与えた。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）δ  ｐｐｍ  １．４５（ｄｄ、Ｊ＝７．５３、６．２７Ｈｚ、６Ｈ）、２．６５〜２．８４（ｍ、２Ｈ）、３．９８（ｔｄ、Ｊ＝１０．２９、４．７７Ｈｚ、１Ｈ）、４．２７（ｔ、Ｊ＝９．６６Ｈｚ、１Ｈ）、４．４３（ｄｄｄ、Ｊ＝８．９１、５．７７、５．６５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４９〜４．６１（ｍ、１Ｈ）、４．６５（ｔｄ、Ｊ＝７．７８、５．７７Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄ、Ｊ＝７．７８Ｈｚ、１Ｈ）、４．８７（ｄｑ、Ｊ＝１２．７４、６．３０Ｈｚ、１Ｈ）、５．５５（ｂｒ．ｓ．、１Ｈ）、５．８２（ｄ、Ｊ＝８．０３Ｈｚ、１Ｈ）、７．２０（ｄ、Ｊ＝８．０３Ｈｚ、１Ｈ）、８．７８（ｂｒ．ｓ．、１Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（クロロホルム−ｄ）δ  ｐｐｍ−７．１３；ＬＣ−ＭＳ：３７５（Ｍ＋１）＋
【００６１】
スキーム３
化合物（ＶＩ）の合成
【化９】
2015518853.tif 000011
【００６２】
ステップ１：化合物（９）の合成
化合物（１）、ＣＡＳ  １２５５８６０−３３−３（１２００ｍｇ、４．３３ｍｍｏｌ）及び１，８−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン（３７０７ｍｇ、１７．３ｍｍｏｌ）を２４．３ｍＬのリン酸トリメチルに溶解した。溶液を０℃に冷却した。化合物（５）（１．２１ｍＬ、１２．９８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を、温度を０℃に適切に維持して５時間撹拌した。１２０ｍＬの臭化テトラエチルアンモニウム溶液（１Ｍ）を加えることにより反応をクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２（２ｘ８０ｍＬ）で抽出した。精製を分取ＨＰＬＣ（固定相：ＲＰ  ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤ−１０μｍ、３０ｘ１５０ｍｍ、移動相：０．２５％ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液、ＣＨ３ＣＮ）により行って、２つの画分を得た。最も高純度の画分を水（１５ｍＬ）に溶解し、水で溶出することにより、手作業で充填したＤｏｗｅｘ（Ｈ＋）カラムに通した。溶出の終点は、溶出画分のＵＶ吸収を確認することにより決定した。組み合わせた画分を−７８℃で凍結させ、凍結乾燥した。化合物（９）をふわふわした白色固体（３０３ｍｇ、（０．８６ｍｍｏｌ、収率２０％）として得、これを直ちに以下の反応に使用した。
【００６３】
ステップ２：化合物（ＶＩ）の調製
化合物（９）（３０３ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）を８ｍＬの水に溶解し、この溶液に、ピリジン（８．４ｍＬ）に溶解したＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−４−モルホリンカルボキサミジン（２５３．８ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５分間保った後、乾燥するまで蒸発させ、真空下にて３７℃で一晩乾燥した。残留物（ｒｅｓｉｄｕ）をピリジン（８０ｍＬ）に溶解した。この溶液を、激しく撹拌しているピリジン（８０ｍＬ）中のＤＣＣ（８９２．６ｍｇ、４．３２６ｍｍｏｌ）に還流温度で滴加した。溶液を１．５時間還流状態に保ち、その間、溶液中に幾分かの濁りが観察された。反応混合物を冷却し、乾燥するまで蒸発させた。固体残留物（ｒｅｓｉｄｕ）にジエチルエーテル（５０ｍＬ）及び水（５０ｍＬ）を加えた。Ｎ’Ｎ−ジシクロヘキシルウレアを濾去し、水性画分を分取ＨＰＬＣ（固定相：ＲＰ  ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤ−１０μｍ、３０ｘ１５０ｍｍ、移動相：０．２５％ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液、ＣＨ３ＣＮ）により精製して、白色固体を得、これを真空下にて３８℃で一晩乾燥した。（１８５ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ、収率６５％）。ＬＣ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）＋：３３３。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）ｄ  ｐｐｍ  ２．４４〜２．５９（ｍ、２Ｈ）シグナルはＤＭＳＯシグナルの影響を受ける、３．５１（ｔｄ、Ｊ＝９．９０、５．５０Ｈｚ、１Ｈ）、３．９５〜４．１１（ｍ、２Ｈ）、４．１６（ｄ、Ｊ＝１０．３４Ｈｚ、１Ｈ）、４．２５〜４．４０（ｍ、２Ｈ）、５．６５（ｄ、Ｊ＝８．１４Ｈｚ、１Ｈ）、５．９３（ｂｒ．ｓ．、１Ｈ）、７．４６（ｄ、Ｊ＝７．９２Ｈｚ、１Ｈ）、２Ｈ’は認められない。
【００６４】
生物学的実施例
レプリコンアッセイ
式Ｉの化合物を、細胞アッセイにて、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製の阻害における活性に関して試験した。このアッセイを用いて、式Ｉの化合物が、ＨＣＶレプリコンとしても既知のＨＣＶ機能性細胞複製細胞ラインを阻害することを示した。細胞アッセイは、多標的スクリーニング戦略における、Ｋｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５：４６１４−４６２４により記載された変更を有する、Ｌｏｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ．２８５ｐｐ．１１０−１１３により記載されているようなバイシストロニックな発現コンストラクトに基づいていた。
【００６５】
レプリコンアッセイ（Ａ）
基本的に、方法は以下の通りであった。アッセイは安定にトランスフェクトされた細胞ラインＨｕｈ−７  ｌｕｃ／ｎｅｏ（以下、Ｈｕｈ−Ｌｕｃと称する）を使用した。この細胞ラインは、脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）からの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）から翻訳されたＨＣＶタイプ１ｂの野生型ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ領域、先行するレポーター部分（ＦｆＬ−ルシフェラーゼ）、及び選択可能なマーカー部分（ｎｅｏＲ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）を含むバイシストロニックな発現コンストラクトをコードするＲＮＡを有する。このコンストラクトは、ＨＣＶ遺伝子型１ｂからの５’及び３’ＮＴＲｓ（非翻訳領域）が隣接する。Ｇ４１８（ｎｅｏＲ）の存在下でのレプリコン細胞の連続培養は、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製に依存する。とりわけルシフェラーゼをコードする、ＨＣＶ  ＲＮＡを自律的にかつ高いレベルで複製する、安定にトランスフェクトされたレプリコン細胞を、抗ウィルス化合物のスクリーニングに使用した。
【００６６】
このレプリコン細胞を、様々な濃度で添加された試験及び対照化合物の存在下、３８４ウェルプレート内に蒔いた。３日間のインキュベーション後、ルシフェラーゼ活性をアッセイすることにより（標準的なルシフェラーゼアッセイ基質及び試薬、並びにＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＶｉｅｗＬｕｘ（商標）ｕｌｔｒａＨＴＳマイクロプレートイメージャを使用して）ＨＣＶ複製を測定した。対照培養物中のレプリコン細胞は、任意の阻害剤の不在下で高いルシフェラーゼ発現を有した。ルシフェラーゼ活性に対する化合物の阻害活性を、Ｈｕｈ−Ｌｕｃ細胞上で監視し、各試験化合物に関する用量応答曲線を可能にした。次いで、ＥＣ５０値を計算し、この値は、ルシフェラーゼ活性のレベルを５０％低下させるのに必要な、又はより詳細には、遺伝的に関係があるＨＣＶレプリコンＲＮＡが複製する能力を低下させるのに必要な、化合物の量を表す。
【００６７】
結果（Ａ）
表１は、上記に与えた実施例の化合物に関して得られたレプリコン結果（ＥＣ５０、レプリコン）及び細胞毒性結果（ＣＣ５０（μＭ）（Ｈｕｈ−７））を示す。
【００６８】
【表１】
2015518853.tif 000012
【００６９】
レプリコンアッセイ（Ｂ）
化合物８ａを用いて更なるレプリコンアッセイを行った。このアッセイのプロトコル及び結果を以下に開示する。
【００７０】
アッセイ１
化合物８ａの抗ＨＣＶ活性を、Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ研究室からの試薬（ＨＣＶ  １ｂバイシストロニックサブゲノムルシフェラーゼレポーターレプリコンクローンＥＴ）を使用して生成されたレプリコン細胞を用いて細胞培養物中で試験した。プロトコルは、化合物の９段階の１：４希釈系列における、３８４ウェルフォーマット内での２５００個のレプリコン細胞の３日間のインキュベーションを含んでいた。用量応答曲線をホタルルシフェラーゼ読み取りに基づいて生成した。このアッセイの変形物では、９段階の希釈系列における、９６ウェルフォーマット内での３０００個の細胞の３日間のインキュベーションに次いで、ＨＣＶゲノムのｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｔａｑｍａｎ検出、及び、細胞転写の化合物阻害に関する対照としての細胞転写産物、ＲＰＬ１３（リボソームサブユニットＲＰＬ１３遺伝子の）に対する正規化を行った。
【００７１】
アッセイ２
化合物８ａの抗ＨＣＶ活性を、Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ研究室からの試薬（ＨＣＶ  １ｂバイシストロニックサブゲノムルシフェラーゼレポーターレプリコンクローンＥＴ又はＨｕｈ−Ｌｕｃ−Ｎｅｏ）を使用して生成されたレプリコン細胞を用いて細胞培養物中で試験した。プロトコルは、化合物の６段階の１：５希釈系列における、９６ウェルフォーマット内での２ｘ１０４個のレプリコン細胞の３日間のインキュベーションを含んでいた。用量応答曲線をルシフェラーゼ読み取りに基づいて生成した。
【００７２】
アッセイ３
化合物８ａの抗ＨＣＶ活性を、Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ研究室からの試薬（ＨＣＶ  １ｂバイシストロニックサブゲノムルシフェラーゼレポーターレプリコンクローンＥＴ又はＨｕｈ−Ｌｕｃ−Ｎｅｏ）を使用して生成されたレプリコン細胞を用いて細胞培養物中で試験した。プロトコルは、化合物の８段階の１：５希釈系列における、９６ウェルフォーマット内での８ｘ１０３個の細胞又は２ｘ１０４個の細胞の３日間のインキュベーションを含んでいた。用量応答曲線をルシフェラーゼ読み取りに基づいて生成した。
【００７３】
結果
表２は、上記に与えたアッセイ後、化合物８ａに関して得られた平均レプリコン結果（ＥＣ５０、レプリコン）を示す。
【００７４】
【表２】
2015518853.tif 000013
【００７５】
一次ヒト肝細胞のインビトロアッセイ
化合物８ａの抗ＨＣＶ活性を、一次ヒト肝細胞のインビトロアッセイにて決定した。プロトコル及び結果を以下に開示する。
【００７６】
プロトコル
肝細胞単離及び培養
転移又は良性腫瘍に関する部分肝切除術を受けている患者から、一次ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を調製した。新鮮なヒト肝細胞を、２ステップのコラゲナーゼ消化方法の変更物を用いて、被包肝臓断片から単離した。手短には、被包肝臓組織を特注の灌流装置内に配置し、肝臓血管に、マルチチャネルマニフォールドに取り付けられた管を有するカニューレを挿入した。肝臓断片を最初に、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）で補充した予熱した（３７℃）無カルシウム緩衝液で２０分間灌流した後、カルシウム（ＣａＣｌ２、Ｈ２Ｏ２）及びコラゲナーゼ０．０５％を含む予熱した（３７℃）緩衝液で１０分間灌流した。次いで、肝臓断片を穏やかに振とうして、肝細胞を肝細胞洗浄培地中で解いた。細胞縣濁液を、ガーゼで内側を覆った漏斗を通して濾過した。細胞を低速遠心分離法で遠心分離した。損傷又は死肝細胞を含む上清、非実質性細胞及びデブリを除去し、ペレット状肝細胞を肝細胞洗浄培地中に再懸濁した。生存率及び細胞濃度をトリパンブルー排除試験により決定した。
【００７７】
１００ＩＵ／Ｌインスリン（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，フランス）、及び１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ，フランス）で補充されたウィリアム培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる完全肝細胞培地中に細胞を再懸濁し、仔ウシ皮膚からのＩ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，フランス）で予備被覆した６ウェルプレート上に１，８ｘ１０６生存細胞の密度で播種した。１６〜２０時間後に、培地をヒドロコルチゾンヘミスクシネート（ＳＥＲＢ，パリ，フランス）で補充した新鮮な完全肝細胞培地で置き換え、細胞をＨＣＶ接種までこの培地中に残した。培養物を加湿５％ＣＯ２雰囲気内にて３７℃で維持した。
【００７８】
播種から３日後にＰＨＨｓを接種した。ＪＦＨ１−ＨＣＶｃｃストックを使用して、０．１ｆｆｕ／細胞の感染効率（ＭＯＩ）で、ＰＨＨｓを１２時間接種した。３７℃で１２時間のインキュベーション後、接種材料を除去し、単層をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、担体対照として０．１％ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｆｏｘｉｄｅ）、負の対照として１００ＩＵ／ｍｌのＩＦＮαを含む、それ以外は化合物８ａの濃度を上昇させた、完全肝細胞培地中でインキュベートした。次いで、培養物を３日間維持した。
【００７９】
ＨＣＶ  ＲＮＡの定量化
製造業者の推奨に従って、各々ＲＮｅａｓｙ又はＱｉａｍｐウィルスＲＮＡミニキット（ＱｉａｇｅｎＳＡ，コートアボフ（Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ），フランス）を使用して、培養細胞又は濾過した培養上清から総ＲＮＡを調製した。ＨＣＶ  ＲＮＡを、以前記載された（Ｃａｒｒｉｅｒｅ  Ｍらｌ  ２００７）鎖−特異的逆リアルタイムＰＣＲ技術を用いて、細胞及び培養上清中で定量化した。
【００８０】
ＨＣＶゲノムの５０ＮＣＲ領域内に位置する、以前記載されたプライマー、各々マイナス鎖及びプラス鎖用のｔａｇ−ＲＣ１（５’−ＧＧＣＣＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＡＡＴＡＡＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡ−３’）及びＲＣ２１（５’−ＣＴＣＣＣＧＧＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣ−３’）を使用して逆転写を行った。７０℃で８分間行った変性ステップの後、ＲＮＡ鋳型を、２００ｎｇのｔａｇ−ＲＣ１プライマー及び１．２５ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，シャルボニエール（Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ），フランス）の存在下、総容積１２μｌで４℃で５分間インキュベートした。
【００８１】
製造業者により推奨される緩衝液中で、２０Ｕ  ＲＮａｓｅＯｕｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，セルジ・ポントワーズ（Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ），フランス）及び７．５Ｕ  Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下、逆転写を６０℃で６０分間行った。１μｌ（２Ｕ）のＲＮａｓｅＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３７℃で２０分間加えることにより、追加の処理を適用した。
【００８２】
ネステッドＰＣＲの第一巡は、３Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、及びプラス鎖増幅用の０．５μＭ  ＲＣ１（５’−ＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡ−３’）及びＲＣ２１プライマー、又はマイナス鎖増幅用のＴａｇ（５’−ＧＧＣＣＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＡＡＴＡＡ−３’）及びＲＣ２１プライマーを含む、総容積５０μｌ中で得られた２μｌのｃＤＮＡを用いて行った。ＰＣＲプロトコルは、変性（９４℃で１分間）、アニーリング（５５℃で４５秒間）、及び伸長（７２℃で２分間）の１８サイクルからなっていた。得られたｃＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ製のキットを使用して、製造業者の説明書に従って精製した。
【００８３】
次いで精製した産物をリアルタイムＰＣＲに供した。反応は、ＬＣ４８０機器及び技術（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を有するＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ（２ｘ  ｃｏｎ）キット（Ｒｏｃｈｅ，グルノーブル，フランス）を使用して行った。５μｌのＳｙｂｒｇｒｅｅｎ    ＩＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２ｘ）、並びに２５ｎｇの１９７Ｒ（５’−ＣＴＴＴＣＧＣＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣＴＡＣ−３’）及び１０４（５’−ＡＧＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧ−３’）プライマーを含む総容積１０μｌでＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲプロトコルは、９４℃で１０分間の初期変性の一ステップ、続く変性（９５℃で１５秒間）、アニーリング（５７℃で５秒間）、及び伸長（７２℃で８秒間）の４０サイクルからなっていた。
【００８４】
特異的ＲＴ−ＰＣＲによる２８Ｓｒ  ＲＮＡの定量化を内部基準として使用して、総肝細胞ＲＮＡのＨＣＶプラス鎖又はマイナス鎖／μｇの結果を表した。２８Ｓｒ  ＲＮＡに関する特異的プライマー、５’−ＴＴＧＡＡＡＡＴＣＣＧＧＧＧＧＡＧＡＧ−３’（ｎｔ２７１７〜２７３５）及び５０−ＡＣＡＴＴＧＴＴＣＣＡＡＣＡＴＧＣＣＡＧ−３０（ｎｔ２８１６〜２７９７）を、Ｏｌｉｇｏ６ソフトウエアを使用して設計した。ＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して逆転写を行い、ＰＣＲプロトコルは、９５℃で８分間の初期変性の一ステップ、続く変性（９５℃で１５秒間）、アニーリング（５４℃で５秒間）、及び伸長（７２℃で５秒間）の４０サイクルからなっていた。
【００８５】
結果
表３は、上述したインビトロでの一次ヒト肝細胞アッセイにて決定した、化合物８ａの抗ＨＣＶ活性を示す。数は、総ＲＮＡの１０６ＨＣＶ  ＲＮＡコピー／μｇとして表される。２つの独立した実験（Ｅｘｐ１及びＥｘｐ２）の結果を示す。実験毎のデータは、２つの測定値の平均である。
【００８６】
【表３】
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【００８７】
インビボでの効力アッセイ
化合物８ａ及びＣＡＳ−１３７５０７４−５２−４のインビボでの効力を、ヒト化肝細胞マウスモデル（ＰＢＸ−マウス）内で、以下の詳細を有するＩｎｏｕｅら（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００７Ａｐｒ；４５（４）：９２１−８）及びＴｅｎａｔｏら（Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００４；１６５−９０１−９１２）にて以前に記載されているように決定した：試験動物：ＨＣＶ  Ｇ１ａ−感染ＰＸＢ−マウス、雄又は雌、ヒト肝細胞の＞７０％置換指数。投与は、下記に示す用量にて、ｐ．ｏで７日間行い、ここでＱＤは１日１用量を表し、ＢＩＤは１日２用量を表す。
【００８８】
化合物８ａの効力をＣＡＳ−１３７５０７４−５２−４と比較した。結果を図１に示す。この図は、７日間の投与後の、ＨＣＶウィルスＲＮＡのｌｏｇ低下を示している。
【００８９】
図１は、ＣＡＳ  １３７５０７４−５２−４の１００ｍｇ／ｋｇ  ＱＤ（＊で示される、ｎ＝４）の投与が、ＨＣＶウィルスＲＮＡの有意なｌｏｇ低下をもたらさないことを明白に示す。化合物８ａに関して示された各投与計画との強いコントラストが明白であるｌｏｇ低下は、１００ｍｇ／ｋｇ  ＱＤ（◆で示される、ｎ＝３）、２００ｍｇ／ｋｇ  ＱＤ（●で示される、ｎ＝４）、５０ｍｇ／ｋｇＢＩＤ（■で示される、ｎ＝４）にて観察される。ウィルスＲＮＡの最も顕著なｌｏｇ低下の効果は、１００ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ（▲で示される、ｎ＝４）での化合物８ａの投与から７日後に観察される。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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