(57)【要約】 【課題】ミチノクフクジュソウ抽出物またはその有効物質を用いた抗癌剤組成物を提供すること。【解決手段】細胞実験および動物実験において抗癌活性を示すミチノクフクジュソウ抽出物またはその有効物質を用いた抗癌剤組成物を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミチノクフクジュソウ抽出物、下記［化学式１］の化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、抗癌剤組成物。
［化学式１］
2015503551.tif 000009
【請求項２】
前記ミチノクフクジュソウ抽出物は、ミチノクフクジュソウを水、エタノール、または水とエタノールの混合溶媒に浸漬させて得られた抽出物であることを特徴とする、請求項１に記載の抗癌剤組成物。
【請求項３】
前記ミチノクフクジュソウ抽出物は、ミチノクフクジュソウを水、エタノール、または水とエタノールの混合溶媒に浸漬させて得られた抽出物を水に懸濁させ、ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチルおよびブタノールで順次分画したときに得られるジクロロメタン層の分画抽出物、酢酸エチル層の分画抽出物またはブタノール層の分画抽出物であることを特徴とする、請求項１に記載の抗癌剤組成物。
【請求項４】
前記ミチノクフクジュソウ抽出物は、ミチノクフクジュソウを水、エタノール、および水とエタノールの混合溶媒に浸漬させて得られた抽出物を水に懸濁させ、ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチルおよびブタノールで順次分画したときに得られる酢酸エチル層の分画抽出物であることを特徴とする、請求項１に記載の抗癌剤組成物。
【請求項５】
前記抗癌活性は肺癌、胃癌、大腸癌、乳癌または肝癌に対する抗癌活性であることを特徴とする、請求項１に記載の抗癌剤組成物。
【請求項６】
前記抗癌活性は肝癌に対する抗癌活性であることを特徴とうる、請求項１に記載の抗癌剤組成物。
【請求項７】
前記組成物は薬学的組成物であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗癌剤組成物。
【請求項８】
前記組成物は食品組成物であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗癌剤組成物。
【請求項９】
下記［化学式１］の化合物またはその薬学的に許容される塩。
［化学式１］
2015503551.tif 000010
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミチノクフクジュソウ抽出物またはその有効物質を用いた抗癌剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌とは、一般に人体組織の細胞の周期に異常がおきて、細胞が正常に分化せず成長を調節することができなくなり大きくなったものの中でも、悪性を示すもののことをいう。
癌は、開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）、促進（ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ）および進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）の３つの段階を経て発生するが、環境または飲食物中に含まれた発癌物質により細胞に突然変異が起こり、これらの細胞が発癌物質の継続的な刺激を受けながら異常に増殖し続けて癌組織を形成するものと知られている。
癌を治療するための抗癌剤の研究方法には、癌細胞に対する直接的な細胞毒性物質を探索する方法や、生体の免疫能力を調節する物質を探索する方法、癌細胞の転移を抑制する物質を探索する方法、最近注目されている血管新生を抑制する物質を探索する方法などがある。
【０００３】
現在使用されている抗癌剤は、酵素製剤やワクチンなどの生物学的製剤、化学合成医薬品、天然物由来の医薬品などに大別されるが、この中でも、酵素やワクチンなどの生物学的製剤は実用段階にある状態ではない。化学合成医薬品は、癌の種類によって薬理作用が様々であり（Ｇｉｌｌｍａｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｘｗｅｌｌ  Ｍａｃｍｉｌｌａｎ．  １８，  ｐｐ１２０２，  １９８６）、毒性による副作用が様々であるため、癌治療の際に問題点として指摘されている（Ｃｈｕｎｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｗｏｎｋｗａｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉ．  ，  ３  ，  ｐｐ  １３−３４，  １９８７）。
このような化学合成抗癌剤の副作用を最小化し且つ治療効果を高めるために、植物抽出物を用いた抗癌剤の開発が持続的に行われている。
抗癌活性を有する植物抽出物が多く報告されている（Ｐｕｊｏｌ  Ｍ，  Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  Ｊ，  Ａｙａｌａ  Ｍ，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｍ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ＥＭ，  Ｐｅｒｅｚ  Ｌ．  ２００７  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５（１０）：４５５−４５９）。例えば、トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｇｉｇａｓ）抽出物は、結腸癌（ＫａｎＷＬ，  Ｃｈｏ  ＣＨ，  Ｒｕｄｄ  ＪＡ，  Ｌｉｎ  Ｇ．  ２００８．  １２０（１）：  ３６−４３）、大腸癌（Ｌｕ  Ｊ．  Ｋｉｍ  ＳＨ  Ｊｉａｎｇ  Ｃ，  Ｌｅｅ  Ｈ  Ｇｕｏ  Ｊ．  ２００７．  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ．  ２８（９）：１３６５−１３７２）、脳癌（Ｔａｓｉ  ＮＭ，  Ｃｈｅｎ  ＹＬ，  Ｌｅｅ  ＣＣ，  Ｌｉｎ  ＰＣ，  Ｃｈｅｎｇ  ＹＬ，  Ｃｈａｎｇ  ＷＬ，  ＬＩｎ  ＳＺ，  Ｈａｍ  ＨＪ．  ２００６．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ９９（４）：１２５１−１２６２）などの各種癌に対して抗癌効果を有することが報告されており、また、例えばカンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａ）の根抽出物が前立腺癌  （Ｋａｎａｚａｗａ  Ｍ，  Ｓａｔｏｍｉ  Ｙ，  Ｍｉｚｕｔａｎｉ  Ｙ，  Ｕｋｉｍｕｒａ  Ｏ，  Ｋａｗａｕｃｈｉ  Ａ，  Ｓａｋａｉ  Ｔ，  Ｂａｂａ  Ｍ，  Ｏｋｕｙａｍａ  Ｔ，  Ｎｉｓｈｉｎｏ  Ｈ，  Ｍｉｋｉ  Ｔ．  ２００３．  Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ  ４３（５）  ：５８０−５８６）または乳癌（Ｊｏ  ＥＨ，  Ｌｉｍ  ＳＨ，  Ｒａ  ＪＣ，  Ｋｉｍ  ＳＲ，  Ｃｈｏ  ＳＤ，  Ｊｕｎｇ  ＪＷ，  Ｙａｎｇ  ＳＲ，  Ｐａｒｋ  ＪＳ，  Ｈｗａｎｇ  ＪＷ，  Ａｒｕｏｍａ  ＯＩ，  Ｋｉｍ  ＴＹ，  Ｌｅｅ  ＹＳ，  Ｋａｎｇ  Ｋｓ．  ２００５．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  ２３０（２）：  ２３９−２４７）に対して抗癌効果を有することが知られている。
【０００４】
本発明は、細胞実験および／または動物実験によってミチノクフクジュソウ抽出物およびその有効物質の抗癌活性を確認することにより完成したものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、抗癌剤組成物を提供することにある。
本発明の他の目的や具体的な目的は、以下に提示される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、下記の実施例および実験例から確認されるように、ミチノクフクジュソウ８０％エタノール抽出物を製造するとともに、その８０％エタノール抽出物を蒸留水に懸濁させ、ヘキサン（ｎ−ｈｅｘａｎｅ）、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）およびブタノール（ＢｕＯＨ）で順次分画してミチノクフクジュソウ分画抽出物を製造した後、その８０％エタノール抽出物と各分画抽出物の抗癌活性を一次的に細胞実験によって考察した結果、実験に使用した癌細胞株たる肺癌細胞株Ａ５４９、胃癌細胞株ＡＧＳ、大腸癌細胞株ＨＣＴ−１５、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１および肝癌細胞株ＳＫ−Ｈｅｐ１のいずれに対しても細胞増殖抑制活性を示すことを確認した。この中でも、最も活性に優れた酢酸エチル分画抽出物を用いて動物実験を行った結果、肺癌細胞株Ａ５４９、胃癌細胞株ＡＧＳまたは肝癌細胞株ＳＫ−Ｈｅｐ１を用いたＨＦ（Ｈｏｌｌｏｗ  ｆｉｂｅｒ）アッセイモデル実験より、酢酸エチル画分は実験で使用した全ての癌細胞株で濃度依存的に抗癌活性を示すことを確認した。特に、肝癌細胞株たるＳＫ−Ｈｅｐ−１またはＨｅｐ−２を移植したヌードマウス動物実験モデルにおいても、大体に濃度依存的に抗癌活性を示すことを確認した。
本発明者は、前記酢酸エチル画分から有効物質を分離し、その物質を同定した結果、下記化学式１の化合物であって、新規化合物であることを確認した。
【０００７】
［化学式１］
2015503551.tif 000002
【０００８】
本発明は、このような実験結果に基づいて提供されるものであって、ある観点によれば、前記［化学式１］の化合物またはその薬学的に許容される塩と把握することができ、他の観点によれば、ミチノクフクジュソウ抽出物、前記［化学式１］の化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む抗癌剤組成物と把握することができる。
本明細書において、「抗癌」とは、癌細胞の死滅、癌細胞の増殖抑制、癌細胞の転移抑制、癌が有する病理的症状の改善・治療、またはその病理的症状の発病抑制／遅延を含む意味である。
また、本明細書において、「有効成分」とは、単独で目的する活性を示し、或いはそれ自体は活性のない担体と共に活性を示すことが可能な成分を意味する。
また、本明細書において、「ミチノクフクジュソウ抽出物」は、抽出方法を問わず、抽出対象であるアドニス・ムレチフローラの全草、葉、茎、花、根またはこれらの組み合わせをメタノール、エタノール、ブタノールなどの炭素数１〜４の低級アルコール、アセトン、ヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、水またはこれらの混合溶媒で抽出して得られた抽出物と、その抽出物を前記列挙された溶媒の少なくとも一つで分画して得られた抽出物とを含む意味として理解される。抽出方法を問わないので、抽出対象であるアドニス・ムレチフローラの葉、茎、花、根またはこれらの組み合わせを抽出溶媒に浸漬させる段階によって抽出される限り、抽出方法は冷浸、還流、加温、超音波放射などの任意の方式がいずれも適用できるものと理解されるべきである。それにも拘らず、前記「ミチノクフクジュソウ抽出物」は、好ましくは、抽出対象たるアドニス・ムレチフローラの葉、茎、花、根またはこれらの組み合わせを水、エタノールまたはこれらの混合溶媒で抽出して得られたものであって、抽出溶媒が除去された濃縮液状の抽出物または固形状の抽出物、その固形状の抽出物を水とヘキサン、水とジクロロメタン、水と酢酸エチル、または水とブタノールで分画して得られたいずれか一つの分画溶媒層の抽出物、またはその固形状の抽出物を水に懸濁した後、ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチルおよびブタノールを用いて順次分画して得られた抽出物を意味する。ここで、「順次分画する」とは、水層の画分を分画した後にも使用し続けて、前記列挙された順序の溶媒で分画することを意味する。
【０００９】
本発明の［化学式１］の化合物は、薬学的に許容される塩の形で使用でき、その塩としては、薬学的に許容される遊離酸（ｆｒｅｅ  ａｃｉｄ）によって形成された酸付加塩が使用できる。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜硝酸または亜リン酸などの無機酸類、脂肪族モノおよびジカルボキシレート、フェニル置換されたアルカノエート、ヒドロキシアルカノエートおよびアルカンジオエート、芳香族酸類、脂肪族および芳香族スルホン酸類などの無毒性有機酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、酒石酸、フマル酸などの有機酸から得る。このような薬学的に無毒な塩類としては、スルファート、ピロスルファート、バイスルファート、スルフィット、バイスルフィット、ニトラート、ホスファート、モノハイドロゲンホスファート、ジハイドロゲンホスファート、メタホスファート、ピロホスファートクロライド、ブロマイド、アイオダイド、フルオライド、アセテート、プロピオネート、デカノエート、カプリレート、アクリレート、ホルマート、イソブチレート、カプレート、ヘプタノエート、プロピオラート、オキサレート、マロネート、スクシネート、スベラート、セバカート、フマラート、マレアート、ブチン−１，４−ジオエート、ヘキサン−１，６−ジオエート、ベンゾエート、クロロベンゾエート、メチルベンゾエート、ジニトロベンゾエート、ヒドロキシベンゾエート、メトキシベンゾエート、フタラート、テレフタラート、ベンゼンスルホナート、トルエンスルホナート、クロロベンゼンスルホナート、キシレンスルホナート、フェニルアセテート、フェニルプロピオネート、フェニルブチレート、シトレート、ラクテート、β−ヒドロキシブチレート、グリコラート、マラート、タルトラート、メタンスルホナート、プロパンスルホナート、ナフタレン−１−スルホナート、ナフタレン−２−スルホナートまたはマンデルレートを含むが、これに限定されるものではない。本発明における酸付加塩は、通常の方法、例えば、［化学式１］の化合物を有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトン、塩化メチレン、アセトニトリルなどに溶かし、有機酸または無機酸を加えて生成した沈殿物を濾過、乾燥させて製造するか、或いは溶媒と過量の酸を減圧蒸留した後、乾燥させて製造するか、或いは有機溶媒の下で結晶化させて製造することができる。
また、本発明の［化学式１］の化合物は、塩基を用いて、薬学的に許容される金属塩を作ることができる。アルカリ金属またはアルカリ土金属塩は、例えば、化合物を過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土金属水酸化物溶液中に溶解し、非溶解化合物塩を濾過し、濾液を蒸発、乾燥させて得る。この際、金属塩としては、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を製造することが製薬上適する。また、これに対応する銀塩は、アルカリ金属またはアルカリ土金属塩を適切な銀塩（例えば、硝酸銀）と反応させて得る。
また、本発明の前記［化学式１］の化合物は、その薬学的に許容される塩だけでなく、これから製造できる溶媒和物、水和物、立体異性体などの形でも使用できる。
【００１０】
本発明の抗癌剤組成物において、下記実験例の癌細胞増殖抑制実験結果を参照するとき、抗癌活性は肺癌または肝癌に対する抗癌活性であることが好ましく、その有効成分は塩化メチレン分画抽出物、酢酸エチル分画抽出物またはブタノール抽出物であることが好ましい。特に、有効成分は、塩化メチレン分画抽出物または酢酸エチル分画抽出物であることが好ましい。下記実験例の動物実験結果をも考慮すると、最も好ましくは、抗癌活性は肝癌に対する抗癌活性であり、その有効成分は酢酸エチル分画抽出物である。
本発明の抗癌剤組成物は、その有効成分を剤形、配合目的などによって、意図する抗癌活性を示しうる限り、任意の量（有効量）で含むことができるが、通常の有効量は、組成物の全体重量に対して０．００１重量％〜１５重量％の範囲内で決定される。ここで、「有効量」とは、その適用対象である哺乳動物、好ましくはヒトに対して、癌細胞の死滅、癌細胞の増殖抑制、癌細胞の転移抑制、癌が有する病理的症状の改善・治療、またはその病理的症状の発病抑制／遅延を誘導することが可能な有効成分の量をいう。このような有効量は当業者における通常の能力範囲内で実験的に決定できる。本発明の抗癌剤組成物が適用（処方）できる対象は、哺乳動物およびヒトであり、特にヒトの場合が好ましい。
本発明の抗癌剤組成物は、具体的な様態においては薬学的組成物として利用できる。
本発明の薬学的組成物は、有効物質以外に、薬学的に許容される担体、賦形剤などを含んで、経口用剤形（錠剤、懸濁剤、顆粒、エマルジョン、カプセル、シロップなど）、非経口用剤形（滅菌注射用水性または油性懸濁液）、局所用剤形（溶液、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、パッチ）などに製造できる。
上記において、「薬学的に許容される」とは、有効成分の活性を抑制することなく適用（処方）対象が適応可能な以上の毒性（十分に低い毒性）を有しないことを意味する。
薬学的に許容される担体の例としては、ラクトース、グルコース、スクロース、澱粉（例えば、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉など）、セルロース、その誘導体（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースなど）、麦芽、ゼラチン、タルク、固体潤滑剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなど）、硫酸カルシウム、植物性油（例えば、ピーナッツ油、綿実油、胡麻油、オリーブ油など）、ポリオール（例えば、プロピレングリコール、グリセリンなど）、アルギン酸、乳化剤（例えば、ＴＷＥＥＮＳ）、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、着色剤、風味剤、錠剤化剤、安定化剤、抗酸化剤、保存剤、水、食塩水、リン酸塩緩衝溶液などを挙げることができる。このような担体は、本発明の薬学的組成物の剤形に応じて適したものを少なくとも１種選択して使用することができる。
賦形剤も、本発明の薬学的組成物の剤形に応じて適したものを選択して使用することができるが、例えば、本発明の薬学的組成物が水性懸濁剤に製造される場合、適切な賦形剤としては、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどの懸濁剤や分散剤などを挙げることができる。注射液に製造される場合、適切な賦形剤としてはリンガー液、等張塩化ナトリウムなどを挙げることができる。
【００１１】
本発明の薬学的組成物は、経口または非経口で投与でき、場合によっては局所的に投与できる。
本発明の薬学的組成物は、その１日投与量が通常０．００１〜１５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、１回または数回に分けて投与することができる。ところが、本発明の薬学的組成物の投与量は投与経路、患者の年齢、性別、体重、患者の重症度などの様々な関連因子に鑑みて決定されるものなので、前記投与量はいずれの観点でも、本発明の範囲を制限するものと理解されてはならない。
他の具体的な様態において、本発明は食品組成物と把握できる。
本発明の食品組成物には、その有効成分以外に、甘味剤、風味剤、生理活性成分、ミネラルなどが含まれ得る。
甘味剤は、食品に適当な甘みをつける量で使用でき、天然のものでも合成のものでもよい。好ましくは天然甘味剤を使用する。天然甘味剤としては、トウモロコシシロップ固形物、蜂蜜、スクロース、フルクトース、ラクトース、マルトースなどの糖甘味剤を挙げることができる。
風味剤は、味または香を良くするために使用できるが、天然のものでも合成のものでもよい。好ましくは天然のものを使用する。天然のものを使用する場合、風味の他にも、栄養強化の目的も併行することができる。天然風味剤としては、リンゴ、レモン、ミカン、ブドウ、イチゴ、モモなどから得られたものであってもよく、緑茶の葉、アマドコロ、竹の葉、桂皮、菊の葉、ジャスミンなどから得られたものであってもよい。また、高麗人参（紅参）、タケノコ、アロエベラ、イチョウなどから得られたものを使用することができる。天然風味剤は液状の濃縮液または固形状の抽出物である。場合によっては合成風味剤が使用できるが、合成風味剤はエステル、アルコール、アルデヒド、テルペンなどが使用できる。
生理活性物質としては、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキンなどのカテキン類や、レチノール、アスコルビン酸、トコフェロール、カルシフェロール、チアミン、リボフラビンなどのビタミン類などが使用できる。
ミネラルとしては、カルシウム、マグネシウム、クロム、コバルト、銅、フッ素化物、ゲルマニウム、ヨード、鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、セレニウム、ケイ素、ナトリウム、硫黄、バナジウム、亜鉛などが使用できる。
【００１２】
また、本発明の食品組成物は、前記甘味剤などの他にも、必要に応じて保存剤、乳化剤、酸味料、粘増剤などを含むことができる。
このような保存剤や乳化剤などは、それが添加される用途を達成することができる限りは、極微量で添加されて使用されることが好ましい。極微量とは、数値的に表現するとき、食品組成物の全体重量に対して０．０００５重量％〜約０．５重量％の範囲を意味する。
使用できる保存剤としては、ナトリウムソルビン酸カルシウム、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸カルシウム、安息香酸ナトリウム、安息香酸カリウム、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）などを挙げることができる。
使用できる乳化剤としては、アカシアガム、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、ペクチンなどを挙げることができる。
使用できる酸味料としては、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アジピン酸、リン酸、グルコン酸、酒石酸、アスコルビン酸、酢酸、リン酸などを挙げることができる。このような酸味料は、味を増進させる目的の他にも、微生物の増殖を抑制する目的で、食品組成物が適正の酸度となるように添加できる。
使用できる粘増剤としては、懸濁化剤、沈降剤、ゲル形成剤、膨化剤などを挙げることができる。
また、香味または嗜好性を向上させ、他の機能性（例えば、骨粗しょう症の予防など）を加えるために、様々な漢方薬材が本発明の食品組成物に追加できるが、追加できる漢方薬材としては、杜仲（トチュウ）抽出物、続断（ゾクダン）抽出物、鹿茸抽出物、紅花の種抽出物、菟絲子（トシシ）抽出物、熟地黄（ジュクジオウ）抽出物、鼈甲（ベッコウ）抽出物、山茱萸（サンシュユ）抽出物、枸杞子（クコシ）抽出物、甘草抽出物、当帰（トウキ）抽出物、葛根抽出物、降真香抽出物、合歓皮（ゴウカンヒ）抽出物、山豆根（サンズコン）抽出物、槐（エンジュ）の花抽出物  、苦参（クララ）抽出物などが例示できる。
【発明の効果】
【００１３】
前述したように、本発明に係るミチノクフクジュソウ抽出物またはその有効物質を有効成分とする抗癌剤組成物を提供することができる。本発明の抗癌剤組成物は、特に、肺癌、胃癌、大腸癌、乳癌、肝癌などに対して適応症を有し、薬学的組成物または食品組成物に製品化されて使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ミチノクフクジュソウから分離した有効物質の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図２】ミチノクフクジュソウから分離した有効物質の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルである。
【図３】ミチノクフクジュソウから分離した有効物質の１Ｈ  ＮＭＲと１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルデータをまとめた図である。
【図４】ミチノクフクジュソウから分離した有効物質のＤＥＰＴ  ＮＭＲスペクトルである。
【図５】ミチノクフクジュソウから分離した有効物質のＨ−Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルである。
【図６】ミチノクフクジュソウから分離した有効物質のＨＳＱＣスペクトルである。
【図７】ミチノクフクジュソウから分離した有効物質のＨＭＢＣスペクトルである。
【図８】ヌードマウスに移植されたＳＫ−Ｈｅｐ−１に対する抗癌活性実験期間中の実験動物の体重変化を示すグラフである。
【図９】ヌードマウスに移植されたＳＫ−Ｈｅｐ−１に対する抗癌活性実験期間中の腫瘍容積の変化を示すグラフである。
【図１０】ヌードマウスに移植されたＳＫ−Ｈｅｐ−１に対する抗癌活性実験期間中の腫瘍容積の変化を示すグラフである。
【図１１】ヌードマウスに移植されたＳＫ−Ｈｅｐ−１に対する抗癌活性実験期間中の腫瘍重量の変化を示すグラフである
【図１２】ヌードマウスに移植されたＨｅｐＧ−２に対する抗癌活性実験期間中の実験動物の体重変化を示すグラフである。
【図１３】ヌードマウスに移植されたＨｅｐＧ−２に対する抗癌活性実験期間中の腫瘍容積の変化を示すグラフである。
【図１４】ヌードマウスに移植されたＨｅｐＧ２−に対する抗癌活性実験期間中の腫瘍重量の変化を示すグラフである。
【図１５】ミチノクフクジュソウから分離した有効物質のＳＫ−Ｈｅｐ−１に対する増殖抑制活性をＭＴＴ方法によって測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜実施例１＞ミチノクフクジュソウ抽出物および画分の製造
細切りしたミチノクフクジュソウ（全草）１ｋｇを８０％エタノールに入れ、４８時間浸漬させて３回繰り返し抽出した後、濾過して得られた抽出液を減圧濃縮し、溶媒を除去した後、凍結乾燥させて粉末状の抽出物を得た。
得られたエタノール抽出物を１０重量の蒸留水に懸濁および溶解させた後、ヘキサン（ｎｎ−ｈｅｘａｎｅ）、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）およびブタノール（ＢｕＯＨ）で順次分画し、ヘキサン層、ジクロロメタン層、酢酸エチル層、ブタノール層および残余物層の画分を順次得た。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を実施例および実験例を参照して説明する。しかし、本発明の範囲はこれらの実施例および実験例に限定されるものではない。
＜実施例＞ミチノクフクジュソウ抽出物および画分の製造とその有効物質の分離
＜実施例１＞ミチノクフクジュソウ抽出物および画分の製造
細切りしたミチノクフクジュソウ（全草）１ｋｇを８０％エタノールに入れ、４８時間浸漬させて３回繰り返し抽出した後、濾過して得られた抽出液を減圧濃縮して溶媒を除去し、凍結乾燥させて粉末状の抽出物を得た。
得られたエタノール抽出物を１０重量の蒸留水に懸濁および溶解させた後、ヘキサン、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）およびブタノール（ＢｕＯＨ）で順次分画し、ヘキサン層、ジクロロメタン層、酢酸エチル層、ブタノール層および残余物層の画分を順次得た。
【００１７】
＜実施例２＞有効物質の分離および同定
前記酢酸エチル画分８ｇを採取してセライト５４５と混合し、減圧濃縮して混合物を作った後、オープンカラムクロマトグラフィーを行った。ｎ−Ｈｅｘ．、ＭＣ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＤＥ（Ｄｉｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ＥＡ（Ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）、メタノール（ＭｅＯＨ）を移動相として用いて総５個の小画分を得た。その中でもＤＥ（８００ｍｇ）画分に対してシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行った。クロロホルム／ＭｅＯＨ（９／２）を移動相として、分当たり２．５ｍＬの流速で流して総１８個の小画分を得た。その中で、１４番（ＤＥ−１４）画分に対して簡単な精製を行って単一化合物（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ１）を確保した。
分離された物質の構造を分析するために、単一化合物１０ｍｇをメタノール−ｄに溶かしてＮＭＲスペクトルを測定した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（図１および図３）から３つのメチル基を確認したが、この３つのメチル基はいずれも、シングルレットであって、４次炭素と結合していると予想したとともに、４ｐｐｍシグナルからみて１つ以上のベンゼン環があると予想した。さらに、３．７〜３．３ｐｐｍ付近の複雑なシグナルからみて、１つ以上の糖が結合していると予想した。１３Ｃ  ＮＭＲ（図２および図３）およびＤＥＰＴ  ＮＭＲ（図４）スペクトルから、総２１個以上の炭素が在ることを予測したとともに、１０５．８ｐｐｍでアノマー炭素を確認した。
【００１８】
Ｈ−Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル（図５）からは、ベンゼン環のプロトン（Ｈ−１１、δ６．４０）とメチル基のプロトン（Ｈ−１５、δ２．２）とがカップリングされていることを確認した。よって、Ｈ−１５メチル基はベンゼン環に結合しており、ＨＳＱＣスペクトル（図６）およびＨＭＢＣスペクトル（図７）の分析結果、アノマー水素（Ｈ−１’、δ１０５）とベンゼン環炭素（Ｃ−９、δ１４６）とのカップリングを確認した。そして、ベンゼン環に連結されたメチル基は、Ｃ−９（δ１４６）、Ｃ−１０（δ１２９）、Ｃ−１１（δ１１６）とカップリングしているから、Ｃ−１０と結合していることを予想した。また、ベンゼン環の水素（Ｈ−１１、δ６．４）がそれぞれＣ−９、Ｃ−１２、Ｃ−７とカップリングしているから、Ｃ−９、Ｃ−７に対してオルト位にあり、Ｃ−１２に対してメタ位にあり、Ｃ−８に対してパラ位にあることを確認した。メチル基水素（Ｈ−１４、δ１．７）は、ベンゼン環炭素（Ｃ−７、δ１２５）、４次炭素（Ｃ−６、δ７４．４）、Ｃ−５（δ３７）とカップリングされているから、４次炭素と結合していることを予測したとともに、他のメチル基水素（Ｈ−１３、δ１．２）は、４次炭素（Ｃ−２、δ７４．５）、Ｃ−１（δ２９．６）とカップリングしているから、Ｃ−２と結合していることを確認した。また、Ｈ−１（δ２．３）はＣ−３（δ７５．５）、Ｃ−７（δ１２５）とカップリングしており、Ｈ−４（δ１．１６）はＣ−６（δ７４．４）、Ｈ−５（δ２．０２）はＣ−３（δ７５．５）とカップリングしているから、Ｃ−１〜Ｃ−８は巨大環を形成していることを予想した。また、Ｃ−２とＣ−６は、単一結合形態の４次炭素であるにも拘らず、ケミカルシフトが低磁場へ移動したことからみて、電気陰性度の大きい元素が結合していることを予想した。よって、ＮＭＲスペクトルを分析した結果、分離された化合物は１つのβ−グルコース、ベンゼン環および八角形の多環から構成されていることを確認したとともに、予想構造を文献検索した結果、これまでに報告されていない新規物質であることを確認して［化学式１］の新規物質たる「Ｍｕｌｔｉｏｓｉｄｅ」と命名した。
【００１９】
分離された物質の分子量を測定するために、ＨＲ−ＦＡＢＭＳ分析を行った。新規物質は、４２６．４６の分子量を有し、ＨＲ−ＦＡＢＭＳ分析の結果、ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ）が結合した形態たる４４９．１７９１（Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２１Ｈ３０Ｏ９Ｎａ：４４９．１７８８）と分析された。よって、予想した分子構造が正確であることを確認した。
【００２０】
＜実験例＞ミチノクフクジュソウ抽出物および画分の抗癌活性実験
＜実験例１＞ＭＴＴ方法による癌細胞増殖抑制活性実験
＜１＞実験方法
５種の癌細胞（肺癌：Ａ５４９、胃癌：ＡＧＳ、大腸癌：ＨＣＴ−１５、乳癌：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、肝癌：ＳＫ−Ｈｅｐ１）に対する実施例のミチノクフクジュソウ８０％エタノール抽出物と各画分の細胞増殖抑制効果は、ＭＴＴ方法を用いて評価した。このために、癌細胞別に３〜５×１０４／ｍＬの濃度に細胞数を調整して９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、２４時間付着させた。２４時間後に試料を処理して３日間培養した後、ＭＴＴ試薬を添加して４時間さらに培養した。プレートを１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、注意深く培地を除去した後、ＤＭＳＯを加え、５４０ｎｍで吸光度を測定した。
＜２＞実験結果
実験結果を図８、表１および表２に示す。
Ａ５４９、ＡＧＳ、ＨＣＴ−１５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＫ−Ｈｅｐ１を用いた癌細胞増殖抑制効果を確認した結果、図１から分かるように、１００μｇ／ｍＬのミチノクフクジュソウ８０％エタノール抽出物はＡ５４９とＳＫ−Ｈｅｐ１に対して８０％以上の抑制効果を示した。前記Ａ５４９とＳＫ−Ｈｅｐ１に対してミチノクフクジュソウ抽出物の各画分を濃度別に処理したとき、表１および表２から分かるように、Ａ５４９およびＳＫ−Ｈｅｐ１に対して濃度依存的に細胞増殖抑制効果を示した。
このような実験結果に基づいて、最も優れた効果を示すＥｔＯＡｃ画分（ＡＡＭ−ＥＡ）を用いて動物実験を行った。
【００２１】
【表１】
2015503551.tif 000003
【００２２】
【表２】
2015503551.tif 000004
【００２３】
＜実験例２＞ＡＡＭ−ＥＡのＨＦ（Ｈｏｌｌｏｗ  ｆｉｂｅｒ）アッセイモデルにおける抗癌活性実験
＜１＞実験方法
＜１−１＞投与方法および投与回数
試験物質は、経口胃ゾンデを取り付けた使い捨て注射器を用いて、１ＨＦ移植の後、日１回ずつ７日間胃内強制投与した。
＜１−２＞群構成および投与用量
＜１−２−１＞群構成
群構成は、下記表３のとおりである。
【００２４】
【表３】
2015503551.tif 000005
【００２５】
＜１−２−２＞投与用量の設定
試験物質の投与用量は２５、５０および１００ｍｇ／ｋｇと設定し、陰性対照群は賦形剤たる注射用水を投与した。陰性対照群および試験物質投与群の投与液量は１０ｍＬ／ｋｇと設定し、個体別投与液量は最近週１回測定された体重を基準として算出した。
＜１−３＞観察および体重測定
＜１−３−１＞一般症状の観察
投与全期間にわたって１日１回投与直後の一般症状を観察した。一般症状の観察は死亡有無、症状の種類および程度、発現日を個体別に記録した。
＜１−３−２＞体重測定
全動物に対して受入時、群分け時、投与開始時、および投与期間中毎週１回測定した。
＜１−４＞ＨＦアッセイ
＜１−４−１＞細胞培養
試験物質を用いて５種の細胞株に対する細胞毒性試験を施した後（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄａｔａ）、選別してＨＦアッセイに使用されたヒト由来癌細胞株は、次のとおりである；Ａ５４９（肺癌）、ＡＧＳ（胃癌）、ＳＫ−Ｈｅｐ１（肝癌）。
Ａ５４９とＡＧＳはＲＰＭＩ１６４０培地に、ＳＫ−Ｈｅｐ１はＤＭＥＭ培地に重炭酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）、Ｌ−グルタミン（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を添加した後、最終濃度が１０％となるようにＦＢＳを添加してｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ  ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒで培養した。十分成長した細胞株をトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）で分離し、ＨＦ（Ｃｅｌｌｍａｘ  ｉｍｐｌａｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）で１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度でロードした後、ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ  ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒで２４時間培養した。
＜１−４−２＞移植（Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）
ヌードマウスをゾレチル（ｚｏｌｅｔｉｌ）とロンパン（ｒｏｍｐｕｎ）を用いて麻酔した後、腹壁を若干切開し、２４時間培養したＨＦを移植し、移植３日後から試験物質の投与を開始した。
＜１−４−３＞ＨＦ摘出および癌細胞増殖抑制程度の測定
試験終了後、マウスを頚椎脱骨で犠牲させた後、移植していたｆｉｂｅｒを摘出して表面の異物を除去し、しかる後に、予め３７℃に温めておいた培地に入れて３０分ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ  ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒで安定化させた後、ＭＴＴ（ｆｉｎａｌ  ｃｏｎｃ．１ｍｇ／ｍＬ）を処理し、４時間培養した。
培養終了後、２．５％硫酸プロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ）で洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）し、新しい２．５％硫酸プロタミンにｆｉｂｅｒを浸漬した後、４℃でＯ／Ｎした。さらに新しい２．５％硫酸プロタミンを入れた、４時間反応させた後、ｆｉｂｅｒを縦に切ってＯ／Ｎ乾燥させた。ｆｉｂｅｒが完全に乾燥したことを確認し、ＤＭＳＯを入れて室温で４時間振とう（ｓｈａｋｉｎｇ）しながらホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）塩を溶解させた後、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて吸光度を測定した。
＜１−５＞資料の統計処理
得た資料に対する賦形剤対照群と試験物質投与群間の比較は、一般にＳｔｕｄｅｎｔ−ｔテストを用いて検定した。浮腫率と抑制率の表記は一般に百分率で表した。統計方法は、商用として広く使われている統計パッケージたるＳＰＳＳ１２．１Ｋプログラムを利用した。
＜実験結果＞
結果を表４に示した。
表４から分かるように、Ａ５４９、ＡＧＳおよびＳＫ−Ｈｅｐ１を用いたＨＦアッセイの結果、全投与群で有意な細胞増殖抑制効果を示し、特にＳＫ−Ｈｅｐ１の場合は最も高い水準の癌細胞増殖抑制を示した。
【００２６】
【表４】
2015503551.tif 000006
【００２７】
＜実験例３＞ＡＡＭ−ＥＡのヌードマウスに移植されたＳＫ−Ｈｅｐ−１に対する抗癌活性実験
＜１＞実験方法
＜１−１＞投与方法および投与回数
試験物質は、経口胃ゾンデを取り付けた使い捨て注射器を用いて１日１回、４週間、総２８回胃内に強制投与した。
陽性対照物質は、使い捨て注射器（２６Ｇ、１ｍＬ、Ｄｏｏｗｏｎ  ｍｅｄｉｔｅｃ．Ｃｏｒｐ．、韓国）を用いて週２回、４週間、総８回腹腔に投与した。
＜１−２＞群構成および投与用量
＜１−２−１＞群構成
群構成は下記表５のとおりである。
【００２８】
【表５】
2015503551.tif 000007
【００２９】
＜１−２−２＞投与用量の設定
試験物質の投与用量は５０、２００および５００ｍｇ／ｋｇに設定し、陽性対照物質（Ｃｉｓ−Ｄｉａｍｉｎｅ  ｐｌａｔｉｎｕｍ（II）  ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）の投与用量は２ｍｇ／ｋｇに設定した。陰性対照群は賦形剤たる注射用水を投与した。陰性対照群、試験物質投与群および陽性対照群の投与液量は１０ｍＬ／ｋｇに設定し、個体別投与液量は投与日近くに測定された体重を基準として算出した。
＜１−３＞観察および体重測定
＜１−３−１＞一般症状の観察
観察期間中に毎日１回外観、行動および排泄物などの一般症状を観察し、死亡動物を確認した。
＜１−３−２＞体重測定
体重は投与開始日から週２回（火曜日、金曜日）、投与前に測定した。
＜１−４＞腫瘍の移植
「Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ．  Ｓｕｃｃｅｅｄｉｎｇ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ（（株）バイオトクステック）、Ｓｔｕｄｙ  Ｎｏ．：Ｂ１０９９９」で形成された腫瘍塊を約３×３×３ｍｍ３の切片に作った。動物をイソフルラン（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）で吸入麻酔させた後、動物の左側後肢の前側方部位を約４ｍｍ程度切開し、套管針（ｔｒｏｃａｒ）の先端に腫瘍切片をのせた後、套管針を左側後肢の切開部位に貫通させて左側前肢近くの背部位まで押し込んだ。その後、套管針を速く３６０°回転させながら抜き出し、皮膚表面を観察して腫瘍の位置を確認した後、動物の左側後肢の切開部位を約１週間ポビドンヨード液（Ｌｏｔ  Ｎｏ．：  １００５，  Ｄｏｎｇｉｎ−ｄａｎｇ  Ｐｈａｒｍ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．，  Ｋｏｒｅａ）で消毒した。
＜１−５＞腫瘍の成長抑制評価
＜１−５−１＞腫瘍容積の測定
観察期間中に週２回（火曜日、金曜日）、カリパス（ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて腫瘍の長軸（ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｅｎｇｔｈ、Ｌ）と短軸（ｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ  ｗｉｄｔｈ、Ｗ）を測定し、次の計算式に代入して腫瘍容積（ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ、ＴＶ）を計算した。
ＴＶ（ｍｍ３）＝Ｌ（ｍｍ）×Ｗ２（ｍｍ２）×１／２
各個体の投与前の腫瘍の容積は群分けの際に測定された値に設定した。
＜１−５−２＞腫瘍の摘出および重量測定
観察期間終了日に動物をイソフルラン（ＡＳＪ９ＡＥ、Ｃｈｏｏｎｇｗａｅ  Ｐｈａｒｍａ  Ｃｏｒｐ．、韓国）で吸入麻酔させた後、個体別に腫瘍を摘出して腫瘍を測定した。
＜１−６＞資料の統計処理
実験で得られた体重、腫瘍容積、腫瘍重量はＳＡＳ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．２、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、米国）を用いて検定した。
バートレット検定（Ｂａｒｔｌｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔ）によって等分散性を検定した（有意水準：０．０５）。等分散性の場合には、ＡＮＯＶＡ（Ｏｎｅ−ｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ）を行い（有意水準：０．０５）、有意性が観察されると、陰性対照群に対する各試験群の有意性を確認するためにＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔの多重検定を行い（有意水準：短軸０．０５および０．０１）、等分散性が棄却された場合には、Ｋｒｕｓｋａｌ−ｗａｌｌｉｓ  ｔｅｓｔを行い（有意水準：０．０５）、有意性が観察されると、陰性対照群に対する各試験群の有意性を確認するためにＳｔｅｅｌ’ｓ  ｔｅｓｔの多重検定を行った。
【００３０】
＜２＞実験結果
結果を図９〜図１１に示した。
体重測定の結果、５０ｍｇ／ｋｇ用量の試験物質投与群は、陰性対照群と比較して統計学的に有意な差が示されなかった。２００および５００ｍｇ／ｋｇ用量の試験物質投与群は、投与後２８日目に陰性対照群と比較して統計学的に有意に増加した。２ｍｇ／ｋｇ用量の陽性対照群は、陰性対照群と比較して統計学的に有意な差は示されなかったが、減少する傾向を示した。
腫瘍容積の測定結果、５０、２００および５００ｍｇ／ｋｇ用量の試験物質投与群および２ｍｇ／ｋｇ用量の陽性対照群は、投与後７〜２８日目に陰性対照群と比較して統計学的に有意に抑制された。
腫瘍重量の測定結果、５０、２００および５００ｍｇ／ｋｇ用量の試験物質投与群および２ｍｇ／ｋｇ用量の陽性対照群は、陰性対照群と比較して有意に小さく示された。
組織病理学的検査の結果において、５０、２００および５００ｍｇ／ｋｇ用量の試験物質投与群は、腫瘍が生着している個体の腫瘍の壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）程度が陰性対照群と比較して類似することが観察されたが、大部分の個体で腫瘍が消失してしまい、全体的な評価は行うことができなかった。アポトーシスも、腫瘍が大部分消失してしまったうえ、摘出された腫瘍においても壊死が発生してしまい、陰性対照群と比較評価することができなかった。
結論的にヌードマウスに移植された人体由来の肝癌細胞株たるＳＫ−ＨＥＰ−１に対する抗癌試験において、試験物質ＡＡＭ−ＥＡは５０、２００および５００ｍｇ／ｋｇ用量で腫瘍の成長を抑制する効果が明らかであると判断される。
【００３１】
＜実験例４＞ＡＡＭ−ＥＡのヌードマウスに移植されたＨｅｐＧ−２に対する抗癌活性実験
＜１＞実験方法
＜１−１＞投与方法および投与回数
試験物質は、経口胃ゾンデを取り付けた使い捨て注射器を用いて１日１回、４週間、総２８回胃内に強制投与した。
陽性対照物質は、使い捨て注射器（２６Ｇ、１ｍＬ、Ｄｏｏｗｏｎ  ｍｅｄｉｔｅｃ．Ｃｏｒｐ．、韓国）を用いて週２回、４週間、総８回腹腔に投与した。
＜１−２＞群構成および投与用量
群構成は、下記表６のとおりである。
【００３２】
【表６】
2015503551.tif 000008
【００３３】
＜１−２−２＞投与用量の設定
試験物質の投与用量は２０、８０および２００ｍｇ／ｋｇに設定し、陽性対照物質の投与用量は２ｍｇ／ｋｇに設定した。陰性対照群は賦形剤たる注射用水を投与した。陰性対照群、試験物質投与群および陽性対照群の投与液量は１０ｍＬ／ｋｇに設定し、個体別投与液量は投与日近くに測定された体重を基準として算出した。
＜１−３＞観察および体重測定
＜１−３−１＞一般症状の観察
観察期間中に毎日１回外観、行動および排泄物などの一般症状を観察し、死亡動物を確認した。
＜１−３−２＞体重測定
体重は、投与開始日から週２回（火曜日、金曜日）、投与前に測定した。
＜１−４＞腫瘍の移植
「Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ．  Ｓｕｃｃｅｅｄｉｎｇ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ（（株）バイオトクステック）、Ｓｔｕｄｙ  Ｎｏ．：Ｂ１０９９９」で形成された腫瘍塊を約３×３×３ｍｍ３の切片に作った。動物をイソフルランで吸入麻酔させた後、動物の左側後肢の前側方部位を約４ｍｍ程度切開し、套管針（ｔｒｏｃａｒ）の先端に腫瘍切片をのせた後、套管針  を左側後肢の切開部位に貫通させて左側前肢近くの背部位まで押し込んだ。その後、套管針を速く３６０°回転させながら抜き出し、皮膚表面を観察して腫瘍の位置を確認した後、動物の左側後肢の切開部位を約１週間ポビドンヨード液（Ｌｏｔ  Ｎｏ．：  １００５，  Ｄｏｎｇｉｎ−ｄａｎｇ  Ｐｈａｒｍ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．，  Ｋｏｒｅａ）で消毒した。
＜１−５＞腫瘍の成長抑制評価
＜１−５−１＞腫瘍容積の測定
観察期間中に週２回（火曜日、金曜日）、カリパス（ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて腫瘍の長軸（ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｅｎｇｔｈ、Ｌ）と短軸（ｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ  ｗｉｄｔｈ、Ｗ）を測定し、次の計算式に代入して腫瘍容積（ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ、ＴＶ）を計算した。
ＴＶ（ｍｍ３）＝Ｌ（ｍｍ）×Ｗ２（ｍｍ２）×１／２
各個体の投与前の腫瘍の容積は群分けの際に測定された値に設定した。
＜１−５−２＞腫瘍の摘出および重量測定
観察期間終了日に動物をイソフルラン（ＡＳＪ９ＡＥ、Ｃｈｏｏｎｇｗａｅ  Ｐｈａｒｍａ  Ｃｏｒｐ．、韓国）で吸入麻酔させた後、個体別に腫瘍を摘出して腫瘍を測定した。
＜１−６＞資料の統計処理
実験で得られた体重、腫瘍容積、腫瘍重量はＳＡＳ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．２、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、米国）を用いて検定した。
バートレット検定（Ｂａｒｔｌｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔ）を行って等分散性を検定した（有意水準：０．０５）。等分散性の場合には、ＡＮＯＶＡ（Ｏｎｅ−ｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ）を行い（有意水準：０．０５）、有意性が観察されると、陰性対照群に対する各試験群の有意性を確認するためにＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔの多重検定を行い（有意水準：短軸０．０５および０．０１）、等分散性が棄却された場合には、Ｋｒｕｓｋａｌ−ｗａｌｌｉｓ  ｔｅｓｔを行い（有意水準：０．０５）、有意性が観察されると、陰性対照群に対する各試験群の有意性を確認するためにＳｔｅｅｌ’ｓ  ｔｅｓｔの多重検定を行った。
＜２＞実験結果
結果を図１２〜図１４に示した。
体重測定の結果、２０および８０ｍｇ／ｋｇ用量の試験物質投与群は、陰性対照群と比較して有意な差が示されなかった。２００ｍｇ／ｋｇ用量の試験物質投与群は、投与群１４〜２１日目に陰性対照群と比較して有意に増加した。２ｍｇ／ｋｇ用量の陽性対照群は、投与後１８〜２８日目に陰性対照群と比較して有意に減少した。
腫瘍容積の測定結果、２０ｍｇ／ｋｇ用量の試験物質投与群は投与後１１および１８〜２５日目に、８０および２００ｍｇ／ｋｇ用量の試験物質投与群および２ｍｇ／ｋｇ用量の陽性対照群は投与後１１〜２８日目に陰性対照群と比較して有意に抑制された。
腫瘍重量の測定結果、２０ｍｇ／ｋｇ用量の試験物質投与群は陰性対照群と比較して有意な差が示されなかったが、８０および２００ｍｇ／ｋｇ用量の試験物質投与群および２ｍｇ／ｋｇ用量の陽性対照群は陰性対照群と比較して有意に小さく示された。
組織病理学的検査の結果において、２０、８０および２００ｍｇ／ｋｇ用量の試験物質投与群および２ｍｇ／ｋｇ用量の陽性対照群は、腫瘍の壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）、アポトシース（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の程度、およびアポトーシスを計数した結果が陰性対照群と比較して類似する傾向を示した。
結論的にヌードマウスに移植された人体由来の肝癌細胞株たるＨｅｐＧ２に対する抗癌試験において、試験物質ＡＡＭ−ＥＡは８０および２００ｍｇ／ｋｇ用量で腫瘍の成長を抑制する効果が明らかであると判断される。
【００３４】
＜実験例５＞ミチノクフクジュソウから分離した有効物質のＭＴＴ方法によるＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞増殖抑制活性実験
前記＜実験例１＞と同様の方法で、ミチノクフクジュソウから分離した有効物質のＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞に対する増殖抑制活性を評価した。
実験結果を図１５に示したが、ミチノクフクジュソウから分離した有効物質は濃度依存的にＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞の増殖を抑制することを示す。
【図８】
2015503551.tif 000011
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１】
2015503551.tif 000019
【図２】
2015503551.tif 000020
【図３】
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【図４】
2015503551.tif 000022
【図５】
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【図６】
2015503551.tif 000024
【図７】
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【国際調査報告】
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2015503551.tif 000028
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