(57)【要約】  本発明は、発酵工程の増殖期と生産期における差次的遺伝子発現のための、様々な候補プロモーターを評価するための適切なスクリーニングストラテジーに関する。本発明はまた、同定されたプロモーター核酸配列を含んでなる組換え宿主細胞と、当該宿主細胞を用いて発酵産物を生産する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ）ｉ）プロモーター核酸配列；および
ｉｉ）生体触媒ポリペプチドをコードする核酸配列
を含んでなる異種ポリヌクレオチドを含んでなる組換え宿主細胞を、第１の条件の組の下で炭素基質と接触させるステップと；
Ｂ）前記組換え宿主細胞を、第２の条件の組の下で炭素基質と接触させるステップと
を含んでなる、ブタノールまたは２−ブタノンを生産する方法であって、
前記第１の条件の組および前記第２の条件の組が異なり、生体触媒ポリペプチドをコードする前記核酸配列が、前記第１の条件の組および前記第２の条件の組の下で差次的に発現し；
前記宿主細胞が少なくとも前記第１または前記第２の条件の組の一方の下で、ブタノールまたは２−ブタノンを生成する、方法。
【請求項２】
前記第１の条件の組および前記第２の条件の組が、炭素基質源、溶存酸素濃度、温度、ｐＨ、グルコース濃度、またはブタノールまたは２−ブタノン濃度の少なくとも１つの点で異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶存酸素濃度が、前記第２の条件の組よりも前記第１の条件の組においてより高い、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の条件の組が嫌気的である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記平均グルコース濃度が、前記第２の条件の組よりも前記第１の条件の組においてより低い、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記平均グルコース濃度が、前記第２の条件の組よりも前記第１の条件の組において、少なくとも約５倍低い、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記平均グルコース濃度が、前記第２の条件の組よりも前記第１の条件の組において、少なくとも約５０倍低い、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記平均グルコース濃度が、前記第２の条件の組よりも前記第１の条件の組において、少なくとも約１００倍低い、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ブタノール生成速度が、前記第２の条件の組よりも前記第１の条件の組の下でより低い、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体触媒ポリペプチドが、ピルビン酸からアセト乳酸への基質から産物への変換を触媒する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体触媒ポリペプチドが、ピルビン酸からアセト乳酸への基質から産物への変換を触媒し、配列番号１またはその活性断片と、少なくとも約８５％同一性である配列を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロモーター核酸配列が、配列番号１７０、１７１、１７２、１７５、１７６、１７７、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、または２５８またはその活性断片と、少なくとも約９０％同一性の配列を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロモーター核酸配列が、配列番号２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、または３８３またはその活性断片と、少なくとも約９０％同一性の配列を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロモーター核酸配列が、配列番号７７５、７７６、７７７、または７７８またはその活性断片と、少なくとも約９０％同一性の配列を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロモーター核酸配列が、配列番号７７９またはその活性断片と、少なくとも約９０％同一性の配列を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記プロモーター核酸配列が、配列番号６８６と、少なくとも約９０％同一性の配列を含んでなる、請求項１２または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロモーター核酸配列が、配列番号３８４、３６０、３８６、または３３１またはその活性断片と、少なくとも約９０％同一性の配列を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロモーター核酸配列が、配列番号７７２または７７３またはその活性断片と、少なくとも約９０％同一性の配列を含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記プロモーター核酸配列が、配列番号７７９またはその活性断片と、少なくとも約９０％同一性の配列を含んでなる、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記プロモーター核酸配列が、配列番号１６８、１６９、３８８、または１７３またはその活性断片と、少なくとも約９０％同一性の配列を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記プロモーター核酸配列が、配列番号７６８または７６９と、少なくとも約９０％同一性の配列を含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記プロモーター核酸配列が、配列番号７７９またはその活性断片と、少なくとも約９０％同一性の配列を含んでなる、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記プロモーター核酸配列が、配列番号７１１またはその活性断片と、少なくとも約９０％同一性の配列を含んでなる、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロモーター核酸配列が、配列番号１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、または１５１またはその断片と、少なくとも約９０％同一性の配列を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の条件の組の前記炭素基質源が前記第２の条件の組と異なる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の条件の組の前記炭素基質源が糖蜜である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２の条件の組の前記炭素基質源がコーンマッシュである、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）プロモーター核酸配列；および
（ｂ）生体触媒ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチドであって、
（ｂ）の核酸配列が、発酵工程の生産期および増殖期において前記生体触媒ポリペプチドが差次的に発現するように、（ａ）の核酸配列と共役される、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２９】
前記生体触媒ポリペプチドの発現が、発酵の増殖期よりも生産期においてより高い、請求項２８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３０】
前記生体触媒ポリペプチドの発現が、発酵の生産期よりも増殖期においてより高い、請求項２８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３１】
前記生体触媒ポリペプチドが、生合成経路ポリペプチドまたは細胞完全性ポリペプチドである、請求項２８または２９に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３２】
前記生体触媒ポリペプチドが、ブタノールまたは２−ブタノン生合成経路中で基質から産物への変換を触媒する、請求項２８または２９に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３３】
前記生体触媒ポリペプチドが、ＥＣ  ２．２．１．６、ＥＣ  １．１．１．８６、ＥＣ  ４．２．１．９、ＥＣ  ４．１．１．７２、ＥＣ  １．１．１．１、ＥＣ  １．１．１．２６５、ＥＣ  １．１．１．２、ＥＣ  １．２．４．４、ＥＣ  １．３．９９．２、ＥＣ  １．２．１．５７、ＥＣ  １．２．１．１０、ＥＣ  ２．６．１．６６、ＥＣ  ２．６．１．４２、ＥＣ  １．４．１．９、ＥＣ  １．４．１．８、ＥＣ  ４．１．１．１４、ＥＣ  ２．６．１．１８、ＥＣ  ２．３．１．９、ＥＣ  ２．３．１．１６、ＥＣ  １．１．１３０、ＥＣ  １．１．１．３５、ＥＣ  １．１．１．１５７、ＥＣ  １．１．１３６、ＥＣ  ４．２．１．１７、ＥＣ  ４．２．１．５５、ＥＣ  １．３．１．４４、ＥＣ  １．３．１．３８、ＥＣ  １．３．１．４４、ＥＣ  １．３．１．３８、ＥＣ  ５．４．９９．１３、ＥＣ  ４．１．１．５、ＥＣ  １．１．１．１、２．７．１．２９、１．１．１．７６、１．２．１．５７、および４．２．１．２８の酵素番号を有する一群の酵素から選択される、請求項２８、２９、または３２に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３４】
前記生体触媒ポリペプチドが、イソブタノール生合成経路中の基質から産物への変換を触媒する、請求項２８、２９、３２または３３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３５】
前記生体触媒ポリペプチドが、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、バリンデヒドロゲナーゼ、バリンデカルボキシラーゼ、ωトランスアミナーゼ、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、イソブチリル−ＣｏＡムターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、アセトニンアミナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセトインキナーゼ、アセトインリン酸アミナーゼ、アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼ、アミノブタノールキナーゼ、ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、またはブタンジオールデヒドラターゼである、請求項２８、２９、３２または３３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３６】
前記生体触媒ポリペプチドが、酸耐性に関与するＧＰＩアンカー細胞壁タンパク質である、請求項２８、２９、または３１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記生体触媒ポリペプチドが、配列番号３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０７、４０９、４１１、４１３、４１５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、または４３５と、少なくとも９０％同一性の配列を含んでなる、請求項２８、２９、３１、または３６に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記プロモーター核酸配列が、配列番号１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、または１５１またはその断片と、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一性の配列を含んでなる、請求項２８、２９または３１〜３７のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３９】
前記プロモーター核酸配列が、配列番号１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、または１７７またはその断片と、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一性の配列を含んでなる、請求項２８、２９または３１〜３７のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４０】
前記プロモーター核酸配列が、配列番号１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、または１７７またはその断片と、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一性の配列を含んでなり、前記生体触媒ポリペプチドがアセト乳酸シンターゼである、請求項２９に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４１】
前記アセト乳酸シンターゼが、配列番号１と、少なくとも約９０％の同一性を有する、請求項４０に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４２】
前記生体触媒ポリペプチドが、増殖ポリペプチド、イソブタノール経路副産物ポリペプチド、グリセロール生合成経路、またはＮＡＤＰＨ生成経路のポリペプチドである、請求項２８または請求項３０に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４３】
前記生体触媒ポリペプチドが、ホスホケトラーゼである、請求項２８、２９、または４２に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４４】
前記ホスホケトラーゼが、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に由来する、請求項４３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４５】
前記生体触媒ポリペプチドが、ホスホトランスアセチラーゼである、請求項２８、２９、または４２に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４６】
前記ホスホトランスアセチラーゼが、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に由来する、請求項４５に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４７】
前記生体触媒ポリペプチドが、アセト乳酸還元酵素である、請求項２８、３０、または４２に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４８】
前記アセト乳酸還元酵素が、ＹＭＲ２２６Ｃである、請求項４７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４９】
前記生体触媒ポリペプチドが、アルデヒドデヒドロゲナーゼである、請求項２８、３０、または４２に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５０】
前記生体触媒ポリペプチドが、ＡＬＤ６である、請求項４９に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５１】
前記生体触媒ポリペプチドが、酸化ペントースリン酸経路の酵素である、請求項２８、３０、または４２に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５２】
前記生体触媒ポリペプチドが、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、または６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼである、請求項２８、３０、４２または５１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５３】
前記生体触媒ポリペプチドが、グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼである、請求項２８、３０、または４２に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５４】
前記プロモーター核酸配列が、配列番号１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、または１６３またはその断片と、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一性の配列を含んでなる、請求項２８、３０、４２〜５３のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５５】
（ｂ）の核酸配列が、特定の宿主細胞中の発現のためにコドン最適化される、請求項２８〜５４のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５６】
請求項２８〜５５のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドを含んでなる、組換え微生物宿主細胞。
【請求項５７】
前記宿主細胞が、細菌、ラン藻、糸状菌、または酵母細胞である、請求項５６に記載の組換え微生物宿主細胞。
【請求項５８】
前記宿主細胞が細菌またはラン藻細胞である、請求項５７に記載の宿主細胞。
【請求項５９】
前記宿主細胞の属が、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、またはキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）である、請求項５８に記載の宿主細胞。
【請求項６０】
前記宿主細胞が糸状菌または酵母細胞である、請求項５７に記載の宿主細胞。
【請求項６１】
前記宿主細胞の属が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、パキソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、チゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｙｏｍｙｃｅｓ）、ウィリオプシス属（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）、デッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、メチニコビア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）またはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）である、請求項６０に記載の宿主細胞。
【請求項６２】
前記宿主細胞がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項５７に記載の宿主細胞。
【請求項６３】
前記宿主細胞が、内在性ピルビン酸デカルボキシラーゼ発現の低下または排除を含んでなる、請求項５６〜６２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６４】
前記デカルボキシラーゼ発現の低下または排除が、遺伝子欠失、妨害、または変異によって引き起こされる、請求項６３に記載の宿主細胞。
【請求項６５】
前記妨害されまたは欠失する遺伝子が、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、またはそれらの組み合わせである、請求項６４に記載の宿主細胞。
【請求項６６】
前記宿主細胞が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、アセト乳酸還元酵素活性を有する内在性酵素発現の、またはＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチド発現の、低下または排除を含んでなる、請求項５６〜６５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６７】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、アセト乳酸還元酵素活性を有する内在性酵素発現の、またはＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチド発現の、前記低下または排除が、遺伝子欠失、中断、または変異によって引き起こされる、請求項６６に記載の宿主細胞。
【請求項６８】
（ａ）請求項５６〜６７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を提供するステップと；
（ｂ）発酵産物が生成される条件下で、前記宿主細胞を発酵培地中の発酵性炭素基質と接触させるステップと；
（ｃ）前記発酵産物を回収するステップと
を含んでなる、発酵産物を生産する方法。
【請求項６９】
宿主細胞が増殖する条件下で、（ｂ）の接触させるステップに先立って、前記宿主細胞を増殖させるステップをさらに含んでなる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記発酵産物が生成される条件が嫌気的である、請求項６８または４１に記載の方法。
【請求項７１】
前記発酵産物が生成される条件が微好気的である、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記発酵産物が、ブタノール、２−ブタノン、プロパノール、イソプロパノール、およびエタノールからなる群から選択される、請求項６８〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記発酵産物がブタノールまたは２−ブタノンである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記発酵産物がイソブタノールである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記発酵産物がイソブタノールであり、前記単離ポリヌクレオチドが配列番号１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、または１７７またはその断片と、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％の同一性を含んでなるプロモーター核酸配列を含んでなり、前記生体触媒ポリペプチドがアセト乳酸シンターゼまたはケトール酸レダクトイソメラーゼである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記発酵産物がイソブタノールであり、前記単離ポリヌクレオチドが配列番号１７０、１７１、１７２、１７５、１７６、１７７、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３６０、３８６、３３１、１６８、１６９、３８８、または１７３またはその断片と、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一性の配列を含んでなるプロモーター核酸配列を含んでなる、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記発酵産物がイソブタノールであり、前記単離ポリヌクレオチドが配列番号６８６または７１１と、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一性の配列を含んでなるプロモーター核酸配列を含んでなる、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記発酵産物がイソブタノールであり、前記単離ポリヌクレオチドが配列番号７１１と、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一性の配列を含んでなるプロモーター核酸配列を含んでなり、前記生体触媒ポリペプチドがアセト乳酸シンターゼである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
（ａ）増殖条件下で微生物を培養するステップと；
（ｂ）（ａ）で培養された前記微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｃ）生産条件下で微生物を培養するステップと；
（ｄ）（ｃ）で培養された前記微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｅ）（ｂ）の対応する単離リボ核酸分子より高いレベルで発現される（ｄ）の単離リボ核酸分子のみを選択するステップと；
（ｆ）（ｅ）で選択された前記リボ核酸分子の発現に関連するプロモーターのポリヌクレオチド配列を判定するステップと
を含んでなる、発酵の生産期において優先的に発現される候補プロモーター配列をスクリーニングする方法。
【請求項８０】
（ａ）増殖条件下で微生物を培養するステップと；
（ｂ）（ａ）で培養された前記微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｃ）生産条件下で微生物を培養するステップと；
（ｄ）（ｃ）で培養された前記微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｅ）（ｂ）の対応する単離リボ核酸分子より低いレベルで発現される（ｄ）の単離リボ核酸分子のみを選択するステップと；
（ｆ）（ｅ）で選択されたリボ核酸分子の発現に関連するプロモーターのポリヌクレオチド配列を判定するステップと
を含んでなる、発酵の生産期において優先的に抑制される候補プロモーター配列をスクリーニングする方法。
【請求項８１】
（ａ）増殖条件下で微生物を培養するステップと；
（ｂ）（ａ）で培養された前記微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｃ）生産条件下で微生物を培養するステップと；
（ｄ）（ｃ）で培養された前記微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｅ）（ｂ）の対応する単離リボ核酸分子より高いレベルで発現される（ｄ）の単離リボ核酸分子のみを選択するステップと；
（ｆ）（ｅ）で選択されたリボ核酸分子の発現に関連するプロモーターのポリヌクレオチド配列を判定するステップと
を含んでなる、発酵の増殖期において優先的に抑制される候補プロモーター配列をスクリーニングする方法。
【請求項８２】
（ａ）増殖条件下で微生物を培養するステップと；
（ｂ）（ａ）で培養された前記微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｃ）生産条件下で微生物を培養するステップと；
（ｄ）（ｃ）で培養された前記微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｅ）（ｂ）の対応する単離リボ核酸分子より低いレベルで発現される（ｄ）の単離リボ核酸分子のみを選択するステップと；
（ｆ）（ｅ）で選択されたリボ核酸分子の発現に関連するプロモーターのポリヌクレオチド配列を判定するステップと
を含んでなる、発酵の増殖期において優先的に発現される候補プロモーター配列をスクリーニングする方法。
【請求項８３】
（ｂ）および（ｄ）で単離されたリボ核酸分子が、レポーターコンストラクトに導入される、請求項７９〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
（ｂ）および（ｄ）で単離されたリボ核酸分子が、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドと作動的に連結する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記増殖条件が、一定濃度の発酵性炭素基質を含んでなる発酵培地中で、前記微生物を培養するステップを含んでなり、前記生産条件が、より高濃度の同一発酵性炭素基質を含んでなる発酵培地中で、前記微生物を培養するステップを含んでなる、請求項７９〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記発酵性炭素基質が、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記増殖条件が、一定濃度の溶存酸素を含んでなる発酵培地中で、前記微生物を培養するステップを含んでなり、生産条件が、より低い濃度の溶存酸素を含んでなる発酵培地中で、前記微生物を培養するステップを含んでなる、請求項７９〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記溶存酸素のより低い濃度が約３％未満である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
イソブタノール生合成経路と、少なくとも１つの修飾発現コンストラクトとを含んでなる組換え酵母宿主細胞であって、前記修飾発現コンストラクトが、イソブタノール生成よりもバイオマス増殖が支持される条件下で差次的にポリペプチドを発現し、同一条件下における前記修飾発現コンストラクトのない宿主細胞と比較して、前記条件下でのイソブタノール生成が実質的に低下する、組換え酵母宿主細胞。
【請求項９０】
前記修飾発現コンストラクトが配列番号７１１を含んでなる、請求項８９に記載の組換え宿主酵母細胞。
【請求項９１】
前記修飾発現コンストラクトが、ピルビン酸からアセト乳酸への基質から産物への変換を触媒できるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、請求項８９または９０に記載の組換え宿主酵母細胞。
【請求項９２】
ピルビン酸からアセト乳酸への基質から産物への変換を触媒できるポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２と、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または１００％の同一性を含んでなる、請求項８９〜９１のいずれか一項に記載の組換え宿主酵母細胞。
【請求項９３】
ピルビン酸からアセト乳酸への基質から産物への変換を触媒できる前記ポリペプチドが、配列番号１と、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または１００％の同一性を含んでなる、請求項８９〜９２のいずれか一項に記載の組換え宿主酵母細胞。
【請求項９４】
前記修飾発現コンストラクトが、配列番号７９０と、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または１００％の同一性の配列を含んでなる、請求項８９〜９３のいずれか一項に記載の組換え宿主酵母細胞。
【請求項９５】
前記宿主酵母細胞がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項８９〜９４のいずれか一項に記載の組換え宿主酵母細胞。
【請求項９６】
（ａ）請求項８９〜９５のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を提供するステップと；
（ｂ）発酵産物が生成される条件下で、前記宿主細胞を発酵培地中の発酵性炭素基質と接触させるステップと；
（ｃ）前記発酵産物を回収するステップと
を含んでなる、発酵産物を生産する方法。
【請求項９７】
前記発酵産物が生成される条件が、嫌気的または微好気的である、請求項９６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、工業微生物学およびアルコール生産分野に関する。本発明の実施形態は、微生物中の改変経路を通じて低級アルキルアルコール生産を達成するための、増殖期と生産期における遺伝子発現の差異的調節で使用するのに適した、プロモーターの同定に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米２０１１年１２月３０日に出願された、米国仮特許出願第６１／５８１，８８８号明細書の優先権を主張する。
【０００３】
Ｅｆｓ−Ｗｅｂによって電子的に提出された配列表への言及
添付する電子的に提出された配列表（名称：２０１２１２２８＿ＣＬ５１９２ＵＳＮＰ＿ＳＥＱＬＩＳＴ＿ｆｉｎａｌ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：１，８８２，７９６バイト；作成日２０１２年１２月２８日）の内容は、その全体を参照によって本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００４】
ブタノールは重要な工業化学物質であり、燃料添加剤として、プラスチック工業における原材料化学物質として、そして食物および香料工業における食物等級抽出剤として有用である。毎年、１００〜１２０億ポンドのブタノールが石油化学的手段によって生産され、この汎用化学物質に対する需要は増大すると思われる。
【０００５】
オキソ合成、一酸化炭素の接触水素化（非特許文献１）およびメタノールとｎ−プロパノールのゲルベ縮合（非特許文献２）などのイソブタノールの化学合成法が知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨＶｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．７１６−７１９
【非特許文献２】Ｃａｒｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｔａｌ．Ａ：Ｃｈｅｍ．２２０：２１５−２２０，２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらの方法は、石油化学物質に由来する出発原料を使用し、一般に高価で環境を損なう。植物由来原料からのイソブタノール生産は、温室効果ガス排出を最小化して技術分野における進歩に相当する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書で提供されるのは、発酵産物を生産する方法である。実施形態では、方法は、Ａ）ｉ）プロモーター核酸配列；およびｉｉ）生体触媒ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる異種ポリヌクレオチドを含んでなる組換え宿主細胞を、第１の条件の組の下で炭素基質と接触させるステップと；Ｂ）組換え宿主細胞を、第２の条件の組の下で炭素基質と接触させるステップとを含んでなり；第１の条件の組および第２の条件の組が異なり、生体触媒ポリペプチドをコードする核酸配列が、第１の条件の組および第２の条件の組の下で差次的に発現する。実施形態では、宿主細胞は、第１または第２の条件の組の少なくとも１つの下で、ブタノールまたは２−ブタノンなどの発酵産物を生成する。
【０００９】
実施形態では、第１の条件の組と第２の条件の組は、炭素基質源、溶存酸素濃度、温度、ｐＨ、グルコース濃度、またはブタノールまたは２−ブタノンなどの発酵産物濃度の少なくとも１つの点で異なる。実施形態では、溶存酸素濃度は、第２の条件の組よりも第１の条件の組においてより大きい。実施形態では、条件の１つの組は嫌気的である。実施形態では、第２の条件の組は嫌気的である。実施形態では、平均グルコース濃度は、第２の条件の組よりも第１の条件の組においてより低い。実施形態では、平均グルコース濃度は、第２の条件の組よりも第１の条件の組において少なくとも約５倍低く、第２の条件の組よりも第１の条件の組において少なくとも約５０倍低く、第２の条件の組よりも第１の条件の組において少なくとも約１００倍低く、または第２の条件の組よりも第１の条件の組において少なくとも約１０００倍低い。実施形態では、ブタノール生成速度は、第２の条件の組よりも第１の条件の組においてより低い。
【００１０】
実施形態では、第１の条件の組の炭素基質源は、第２の条件の組と異なる。実施形態では、第１の条件の組の炭素基質源は糖蜜である。実施形態では、第２の条件の組の炭素基質源はコーンマッシュである。
【００１１】
したがって、ｉ）プロモーター核酸配列と；ｉｉ）生体触媒ポリペプチドをコードする核酸配列とを含んでなる異種ポリヌクレオチドが本明細書で提供され、開示される方法で用いられてもよい。
【００１２】
実施形態では、本明細書で提供される単離ポリヌクレオチドは、（ａ）プロモーター核酸配列と；（ｂ）生体触媒ポリペプチドをコードする核酸配列とを含んでなり、（ｂ）の核酸配列は、発酵工程の生産期および増殖期において生体触媒ポリペプチドが差次的に発現するように、（ａ）の核酸配列と作動的に結合する。実施形態では、生体触媒ポリペプチドの発現は、発酵の増殖期よりも生産期でより高い。実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、ブタノールまたは２−ブタノン生合成経路内で、基質から産物への変換を触媒する。実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、以下の酵素番号を有する一群の酵素から選択される：ＥＣ  ２．２．１．６、ＥＣ  １．１．１．８６、ＥＣ  ４．２．１．９、ＥＣ  ４．１．１．７２、ＥＣ  １．１．１．１、ＥＣ  １．１．１．２６５、ＥＣ  １．１．１．２、ＥＣ  １．２．４．４、ＥＣ  １．３．９９．２、ＥＣ  １．２．１．５７、ＥＣ  １．２．１．１０、ＥＣ  ２．６．１．６６、ＥＣ  ２．６．１．４２、ＥＣ  １．４．１．９、ＥＣ  １．４．１．８、ＥＣ  ４．１．１．１４、ＥＣ  ２．６．１．１８、ＥＣ  ２．３．１．９、ＥＣ  ２．３．１．１６、ＥＣ  １．１．１３０、ＥＣ  １．１．１．３５、ＥＣ  １．１．１．１５７、ＥＣ  １．１．１３６、ＥＣ  ４．２．１．１７、ＥＣ  ４．２．１．５５、ＥＣ  １．３．１．４４、ＥＣ  １．３．１．３８、ＥＣ  １．３．１．４４、ＥＣ  １．３．１．３８、ＥＣ  ５．４．９９．１３、ＥＣ
４．１．１．５、ＥＣ  １．１．１．１、２．７．１．２９、１．１．１．７６、１．２．１．５７、および４．２．１．２８。実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、イソブタノール生合成経路内で、基質から産物への変換を触媒する。実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、バリンデヒドロゲナーゼ、バリンデカルボキシラーゼ、ωトランスアミナーゼ、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、イソブチリル−ＣｏＡムターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、アセトニンアミナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセトインキナーゼ、アセトインホスフェートアミナーゼ、アミノブタノールホスフェートホスホリラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｙａｓｅ）、アミノブタノールキナーゼ、ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、またはブタンジオールデヒドラターゼである。実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、酸耐性に関与するＧＰＩアンカー細胞壁タンパク質である。実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、Ｓｅｄ１タンパク質またはＳｐｉ１タンパク質またはその相同体である。生体触媒ポリペプチドが、酸耐性に関与するＧＰＩアンカー細胞壁タンパク質である、請求項２８、２９、または３１に記載の単離ポリヌクレオチド。実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、配列番号３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０７、４０９、４１１、４１３、４１５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、または４３５との少なくとも９０％の同一性を含んでなる。
【００１３】
実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、生合成経路ポリペプチド、細胞保全ポリペプチド、増殖ポリペプチド、グリセロール生合成経路ポリペプチド、副産物生成ポリペプチド、またはＮＡＤＰＨ生成ポリペプチドであってもよい。実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、ピルビン酸からアセト乳酸への基質から産物への変換を触媒する。実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、ピルビン酸からアセト乳酸への基質から産物への変換を触媒して、配列番号１またはその変異体または活性断片と、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％の同一性を含んでなる。
【００１４】
実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号１７０、１７１、１７２、１７５、１７６、１７７、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、または２５８またはその活性断片と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、または３８３またはその活性断片と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号７７５、７７６、７７７、または７７８またはその活性断片と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号７７９またはその活性断片と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号６８６と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を含んでなる。実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号３８４、３６０、３８６、または３３１またはその活性断片と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号７７２または７７３またはその活性断片と、少なくとも���９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号７７９またはその活性断片と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号１６８、１６９、３８８、または１７３またはその活性断片と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号７６８または７６９と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号７７９またはその活性断片と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号７１１またはその活性断片と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、または１５１またはその断片と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を含んでなる。
【００１５】
実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、または１５１またはその断片と、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％の同一性を含んでなる。実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、または１７７またはその断片と、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を含んでなる。
【００１６】
実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、または１７７またはその断片と、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％を含んでなり、生体触媒ポリペプチドは、アセト乳酸シンターゼまたはケトール酸レダクトイソメラーゼである。実施形態では、アセト乳酸シンターゼは、配列番号１またはその変異体または活性断片と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を有する。実施形態では、アセト乳酸シンターゼは、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｌｓＳまたはその変異体または活性断片である。
【００１７】
実施形態では、生体触媒ポリペプチドの発現は、発酵の生産期よりも増殖期においてより高い。実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、生合成経路ポリペプチドまたは細胞完全性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、増殖ポリペプチド、イソブタノール経路副産物ポリペプチド、グリセロール生合成経路、またはＮＡＤＰＨ生成経路ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、ホスホケトラーゼである。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼは、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に由来する。いくつかの実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、ホスホトランスアセチラーゼである。いくつかの実施形態では、ホスホトランスアセチラーゼは、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に由来する。いくつかの実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、アセト乳酸還元酵素である。いくつかの実施形態では、アセト乳酸還元酵素は、ＹＭＲ２２６Ｃである。いくつかの実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼである。いくつかの実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、ＡＬＤ６である。いくつかの実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、酸化ペントースリン酸経路の酵素である。いくつかの実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ）、または６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼである。実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼである。実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、または１６３、またはその断片と、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％の同一性を含んでなる。
【００１８】
実施形態では、核酸配列をコードする生体触媒ポリペプチドは、特定の宿主細胞中の発現のためにコドン最適化される。
【００１９】
本明細書では、開示される単離ポリヌクレオチドを含んでなる組換え宿主細胞もまた、開示される。実施形態では、宿主細胞は、細菌、ラン藻、糸状菌、または酵母細胞である。実施形態では、宿主細胞は、細菌またはラン藻細胞である。実施形態では、前記宿主細胞の属は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、またはキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）である。実施形態では、宿主細胞は、糸状菌または酵母細胞である。実施形態では、前記宿主細胞の属は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、パキソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、チゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｙｏｍｙｃｅｓ）、ウィリオプシス属（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）、デッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、メチニコビア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）またはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）である。実施形態では、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。実施形態では、宿主細胞は、内在性ピルビン酸デカルボキシラーゼ発現の低下または排除を含んでなる。実施形態では、デカルボキシラーゼ発現の低下または排除は、遺伝子欠失、中断、または変異によって引き起こされる。実施形態では、中断されまたは欠失する遺伝子は、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、アセト乳酸還元酵素活性を有する内在性酵素の、またはＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチド発現の低下または排除を含んでなる。いくつかの実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナー���活性、アセト乳酸還元酵素活性を有する内在性酵素の、またはＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチド発現の低下または排除は、遺伝子欠失、中断、または変異によって引き起こされる。
【００２０】
提供されるのは、イソブタノール生合成経路と、少なくとも１つの修飾発現コンストラクトとを含んでなる組換え酵母宿主細胞であり、上記修飾発現コンストラクトは、イソブタノール生成よりもバイオマス増殖が支持される条件下で差次的にポリペプチドを発現し、同一条件下における前記修飾発現コンストラクトのない宿主細胞と比較して、前記条件下でのイソブタノール生成が実質的に低下する。実施形態では、修飾発現コンストラクトは、配列番号７１１を含んでなる。実施形態では、修飾発現コンストラクトは、ピルビン酸からアセト乳酸への基質から産物への変換を触媒できるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる。実施形態では、ピルビン酸からアセト乳酸への基質から産物への変換を触媒できるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２と、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、ピルビン酸からアセト乳酸への基質から産物への変換を触媒できるポリペプチドは、配列番号１と、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、修飾発現コンストラクトは、配列番号７９０と、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、宿主酵母細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００２１】
本明細書では、（ａ）開示される組換え宿主細胞を提供するステップと；（ｂ）発酵産物が生成される条件下で、前記宿主細胞を発酵培地中の発酵性炭素基質と接触させるステップと；（ｃ）任意選択的に、前記発酵産物を回収するステップとを含んでなる、発酵産物を生産する方法もまた開示される。
【００２２】
実施形態では、方法は、（ｂ）の接触させるステップに先だって、宿主細胞が増殖する条件下で、前記宿主細胞を増殖させるステップをさらに含んでなる。実施形態では、発酵産物が生成される条件は、嫌気的である。実施形態では、発酵産物が生成される条件は、微好気的である。実施形態では、発酵産物は、ブタノール、２−ブタノン、プロパノール、イソプロパノール、およびエタノールからなる群から選択される。実施形態では、発酵産物は、ブタノールまたは２−ブタノンである。実施形態では、発酵産物は、イソブタノールである。実施形態では、発酵産物はイソブタノールであり、単離ポリヌクレオチドは配列番号１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、または１７７またはその断片と、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％の同一性を含んでなるプロモーター核酸配列を含んでなり、生体触媒ポリペプチドはアセト乳酸シンターゼまたはケトール酸レダクトイソメラーゼである。
【００２３】
本明細書では、
（ａ）増殖条件下で微生物を培養するステップと；
（ｂ）（ａ）で培養された微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｃ）生産条件下で微生物を培養するステップと；
（ｄ）（ｃ）で培養された微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｅ）（ｂ）の対応する単離リボ核酸分子より高いレベルで発現される（ｄ）の単離リボ核酸分子のみを選択するステップと；
（ｆ）（ｅ）で選択されたリボ核酸分子の発現に関連するプロモーターのポリヌクレオチド配列を判定するステップと
を含んでなる、発酵の生産期において優先的に発現される候補プロモーター配列をスクリーニングする方法もまた開示される。
【００２４】
本明細書では、
（ａ）増殖条件下で微生物を培養するステップと；
（ｂ）（ａ）で培養された微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｃ）生産条件下で微生物を培養するステップと；
（ｄ）（ｃ）で培養された微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｅ）（ｂ）の対応する単離リボ核酸分子より低いレベルで発現される（ｄ）の単離リボ核酸分子のみを選択するステップと；
（ｆ）（ｅ）で選択されたリボ核酸分子の発現に関連するプロモーターのポリヌクレオチド配列を判定するステップと
を含んでなる、発酵の生産期において優先的に抑制される候補プロモーター配列をスクリーニングする方法もまた開示される。
【００２５】
本明細書では、
（ａ）増殖条件下で微生物を培養するステップと；
（ｂ）（ａ）で培養された微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｃ）生産条件下で微生物を培養するステップと；
（ｄ）（ｃ）で培養された微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｅ）（ｂ）の対応する単離リボ核酸分子より高いレベルで発現される（ｄ）の単離リボ核酸分子のみを選択するステップと；
（ｆ）（ｅ）で選択されたリボ核酸分子の発現に関連するプロモーターのポリヌクレオチド配列を判定するステップと
を含んでなる、発酵の増殖期において優先的に抑制される候補プロモーター配列をスクリーニングする方法もまた開示される。
【００２６】
実施形態では、（ｂ）および（ｄ）で単離されるリボ核酸分子は、標識される。実施形態では、（ｂ）および（ｄ）で単離されるリボ核酸分子は、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドと作動可能に結合する。実施形態では、増殖条件は、一定濃度の発酵性炭素基質を含んでなる発酵培地中で、微生物を培養するステップを含んでなり、生産条件は、より高濃度の同一発酵性炭素基質を含んでなる発酵培地中で、微生物を培養するステップを含んでなる。実施形態では、発酵性炭素基質は、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、およびそれらの混合物からなる群から選択される。実施形態では、増殖条件は、一定濃度の溶存酸素を含んでなる発酵培地中で、微生物を培養するステップを含んでなり、生産条件は、より低い濃度の溶存酸素を含んでなる発酵培地中で、微生物を培養するステップを含んでなる。実施形態では、溶存酸素のより低い濃度は約３％未満である。
【００２７】
別の実施形態では、成長と生成の乖離は、必ずしも差次的発現からでなく、別成分の添加または削除による、条件または細胞経路、タンパク質、またはその他の成分活性の変更から生じる。前記その他の成分の添加、欠失または作用は、差次的発現と組み合わされてもよく、または差次的発現から独立した、成長および／または生成の制御をもたらしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】増殖タンク内における、細胞成長およびグルコース消費量を描写する。ＯＤ（バイオマス）は、発酵時間の関数として示される。
【図２】イソブタノールが２６および３７時間目に合成されて、細胞培養の５０時間目には、イソブタノール蓄積が止むことを描写する。
【図３】発酵時間に対して、イソブタノール生成速度をｇ／Ｌ／時間で描写する。
【図４】発酵時間に対して、二酸化炭素放出速度を描写する。
【図５】発酵時間に対して、酸素消費量を描写する。
【図６】ａｌｓＳの発現を駆動するＦＢＡ１プロモーターと、すぐ上流のＰＤＣ１ターミネーターとを示す、ＰＮＹ１５５６株の染色体ＸＩＩ中の遺伝要素のマップを描写する。
【図７】酵母中における発現のための制御配列がある、ＫＡＲＩおよびＤＨＡＤのための導入遺伝子を保有する、酵母−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターである、プラスミドｐＢＰ２０９２を描写する。
【図８】異なるイソブタノール生合成経路を描写する。「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」、「ｆ」、「ｇ」、「ｈ」、「ｉ」、「ｊ」、および「ｋ」と標識されるステップは、下述の基質から産物への変換に対応する。「ａ」は、例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい。「ｂ」は、例えばアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼによって触媒されてもよい。「ｃ」は、例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されてもよい。「ｄ」は、例えば分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒されてもよい。「ｅ」は、例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい。「ｆ」は、例えば分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい。「ｇ」は、例えばアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい。「ｈ」は、例えばトランスアミナーゼまたはバリンデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい。「ｉ」は、例えばバリンデカルボキシラーゼによって触媒されてもよい。「ｊ」は、例えばωトランスアミナーゼによって触媒されてもよい。
【図９】Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ２２８９株における、グルコースによるａｌｓＳ転写物の誘導を示す。
【図１０−１】実施例９に記載されるプロモーターとＧＦＰの融合に対する、３％グルコースの添加の効果を示す。図１０ＡはＰＮＹ１６３１株における効果を示す。図１０ＢはＰＮＹ１６３２株における効果を示す。図１０ＣはＰＮＹ１６３３株における効果を示す。
【図１０−２】実施例９に記載されるプロモーターとＧＦＰの融合に対する、３％グルコースの添加の効果を示す。図１０ＤはＰＮＹ１６３４株における効果を示す。図１０ＥはＰＮＹ１６３５株における効果を示す。図１０ＦはＰＮＹ１６３６株における効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、工程の増殖期対生産期において差次的発現を提供するプロモーター配列を含んでなり、発酵産物を生成する組換え宿主細胞、ならびに該宿主細胞を使用する方法を対象とする。
【００３０】
酵母による工業的発酵プロセスは、発酵段階が、所望の収率と生成速度を有するのに十分な生体触媒を提供するために、バイオマス生産段階を用いてもよい。例えば典型的に流加技術を使用して、エタノール産生菌であるＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を増殖させ、その中では、低い糖濃度と非制限的曝気が、約０．５ｇバイオマス／ｇグルコースのＹｘｓなどの高いバイオマス収量での呼吸代謝を支援する。流加法中の低い糖濃度の維持は、その中で全体的代謝に対する呼吸代謝画分が、細胞外グルコース濃度の増大と負の相関関係にある、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のようなクラブトリー陽性酵母にとって、特に重要なこともある。低い糖濃度のために、比グルコース取り込み速度は限定的であり、呼吸能力は、炭水化物基質のＣＯ２への異化作用中に成形されるピルビン酸を完全に代謝するのに十分である。無酸素の発酵条件下では、またはクラブトリー効果が作用するより高いグルコース濃度の好気的条件下では、例えばＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のようなエタノール産生酵母は、エタノールを生成し、例えば約０．１５ｇバイオマス／ｇグルコースのＹｘｓなどの低いバイオマス収率のみが達成される。
【００３１】
ブタノール生成生体触媒などの、低級アルキルアルコールを生成する生体触媒増殖のための考察としては、（ｉ）ブタノールまたは２−ブタノンなどの毒性産物の悪影響、（ｉｉ）阻害性経路副産物または中間体の蓄積、および（ｉｉｉ）生体触媒および発酵産物形成のより低い収率をもたらす、発酵副産物形成による基質の損失が挙げられる。例えばブタノール生成経路が、酵母中で構成的に機能する場合、生成したブタノールが、生産工程の増殖期における成長を阻害することもあり、インフラと生体触媒生産期操作のいずれかまたは双方において、コストと非効率性を増大させることもある。調節、特にバイオマス形成期におけるブタノール生成の低下または排除は、当該技術分野における進歩に相当する。
【００３２】
出願人らは、異なる条件下で対象遺伝子の差次的発現を提供する、様々なプロモーター核酸配列を同定し、したがって生体触媒増殖期および発酵産物生産期における差次的発現のためのストラテジーを提供することで、既述の問題を解決した。本明細書では、候補核酸配列を同定して評価し、生体触媒増殖期および発酵産物生産期において、対象遺伝子の差次的発現を制御する、適切なスクリーニングストラテジーもまた提供される。さらに、２つ以上のプロモーター領域に由来する核酸配列を含んでなるハイブリッド配列が提供される。本明細書に記載される核酸配列は、増殖および／または生産に妥当な様々なポリペプチドを発現させるためのプロモーターとして用いられてもよく、以下で時折「遺伝的スイッチ」と称される。したがって本明細書で開示される配列および方法は、以下を可能にする。（ｉ）ブタノールまたは２−ブタノン生合成経路などの生合成経路の基質から産物への変換を触媒するポリペプチドなどの生体触媒ポリペプチドを、発酵の生産期において優先的に発現させ、（ｉｉ）細胞完全性に有益な生体触媒ポリペプチドを、発酵の生産期において優先的に発現させ、（ｉｉｉ）増殖ポリペプチドなどの生体触媒ポリペプチドを、生体触媒増殖期において優先的に発現させ、（ｉｖ）ＮＡＤＰＨ生成経路の一部である生体触媒ポリペプチドを、増殖期において優先的に発現させ、または（ｖ）ブタノール以外のＮＡＤＨ消費生成物経路の一部であるポリペプチド発現を、発酵産物生産期において優先的に低下させること、またはそれらの組み合わせ。出願人らは、同定されたプロモーターを含んでなる組換えポリヌクレオチド配列を利用して、組換え宿主細胞を提供し、該宿主細胞を使用して発酵産物を生産する方法もまた提供した。
【００３３】
実施形態では、本明細書に記載される組換え宿主細胞は、植物由来炭素源から、ブタノールまたは２−ブタノンを生成する。したがって本明細書では、発酵工程の増殖期と生産期において、関連遺伝子の発現を差次的に調節するプロモーター核酸配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチドを含んでなる、組換え宿主細胞を使用して、ブタノールまたは２−ブタノンを生産する方法が提供される。一実施形態では、ブタノール生合成経路で最初のステップを触媒するポリペプチドを、生産期において優先的に発現させ得る。一実施形態では、イソブタノール生合成経路で基質から産物への変換を触媒するポリペプチドを、生産期において優先的に発現させ得る。一実施形態では、アセト乳酸シンターゼを、生産期において優先的に発現させ得る。一実施形態では、ケトール酸レダクトイソメラーゼを、生産期において優先的に発現させ得る。一実施形態では、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼを、生産期において優先的に発現させ得る。
【００３４】
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めて本出願が優先される。また文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語には複数形が含まれるものとし、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。本明細書で参照される全ての刊行物、特許、およびその他の参考文献は、あらゆる目的のために、その内容全体を参照によって援用する。
【００３５】
本明細書の用法では、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、または任意のその他のバリエーションは、記述される整数または整数群の包含を暗示するが、任意のその他の整数または整数群の排除を暗示しないものと理解される。例えば明確に列挙されることもこれらの要素に固有でもない要素の一覧を含んでなる組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、これらの構成要件のみに限定されず、明示的に列挙されることもこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有でもないその他の要素を含み得る。さらに特に断りのない限り、「ｏｒ」は排他的ｏｒでなく包括的ｏｒを指す。例えば条件ＡまたはＢは、以下のいずれかによって満たされる：Ａが真で（または存在し）Ｂが偽であり（または存在せず）、Ａが偽で（または存在せず）Ｂが真であり（または存在する）、ＡおよびＢの双方が真である（または存在する）。
【００３６】
さらに本発明の構成要件または構成要素に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、構成要件または構成要素の事例数（すなわち発生）に関して非制限的であることが意図される。したがって「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈すべきであり、構成要件または構成要素の単数語形は、数が単数であることを明らかに意味する場合を除いて、複数もまた含む。
【００３７】
「発明」または「本発明」という用語は、本明細書の用法では非限定的用語であり、特定の発明のいずれかの単一実施形態を指すことは意図されず、本出願に記載される全ての可能な実施形態を包含する。
【００３８】
本明細書の用法では、本発明で用いられる成分または反応物質の量を修飾する「約」という用語は、例えば実際の濃縮物または調製溶液の作成で使用される、典型的な測定および液体取り扱い手順を通じて；これらの手順における不注意による誤りを通じて；組成物作成または方法実施で用いられる成分の、生産、供給元または純度の差異などを通じて、生じ得る数量の変動を指す。「約」という用語はまた、特定の最初の混合物から生じる組成物の異なる平衡条件のために、異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されるか否かを問わず、特許請求の範囲には量の同等物が含まれる。一実施形態では、「約」という用語は、報告される数値の１０％以内、代案としては報告される数値の５％以内を意味する。
【００３９】
「成長期」または「増殖期」という用語は、その間に酵母バイオマスが生成して、種菌蓄積が起こる工程段階を指す。
【００４０】
「生産期」という用語は、ブタノール、イソブタノール、１−ブタノール、２−ブタノールおよび／または２−ブタノンをはじめとするが、これに限定されるものではない、所望の発酵産物が生じる、発酵工程段階を指す。
【００４１】
場合によっては、「バイオマス」は、本明細書の用法では、典型的に単位ｇ／Ｌ乾燥細胞重量（ｄｃｗ）で提供される、発酵産物産生微生物の細胞バイオマスを指す。
【００４２】
「発酵産物」という用語は、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、イソブチレートなどをはじめとするが、これに限定されるものではない、低級アルキルアルコールをはじめとする、あらゆる所望の対象産物を含む。
【００４３】
「低級アルキルアルコール」という用語は、１〜１０個の炭素原子がある、あらゆる直鎖または分枝、飽和または不飽和アルコール分子を指す。
【００４４】
「ブタノール」という用語は、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、またはその混合物を指す。イソブタノールは、２−メチル−１−プロパノールとしてもまた知られている。
【００４５】
「ブタノール生合成経路」という用語は、本明細書の用法では、１−ブタノール、２−ブタノール、またはイソブタノールを生成する酵素経路を指す。例えばイソブタノール生合成経路は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，８５１，１８８号明細書で開示される。経路の構成要素は、経路中の全ての基質、補助因子、副産物、中間体、最終産物、および酵素からなる。
【００４６】
「２−ブタノン生合成経路」という用語は、本明細書の用法では、２−ブタノンを生成するための酵素経路を指す。
【００４７】
「増殖ポリペプチド」という用語は、バイオマス生産に関係するポリペプチドと、バイオマス生産に関係する酵素能力に関係するポリペプチドとを含む。
【００４８】
「生体触媒ポリペプチド」という用語は、例えばブタノールまたは２−ブタノン生合成経路などの、示される生合成経路の基質から産物への変換と関係するポリペプチドと、細胞完全性ポリペプチドおよび増殖ポリペプチドをはじめとするが、これに限定されるものではない、示される生合成経路に関連する生体触媒の増殖または能力に関係するポリペプチドとを含む。例えばＮＡＤＰＨ生成経路の一部であるポリペプチド、または非ブタノールＮＡＤＨ消費生成物経路の一部であるポリペプチドが、生体触媒ポリペプチドであってもよい。
【００４９】
「生合成経路ポリペプチド」という用語は、列挙された生合成経路の基質から産物への変換を触媒するポリペプチドを含む。
【００５０】
「細胞完全性ポリペプチド」という用語は、細胞構造を構成するのに必要なポリペプチドをはじめとする、細胞完全性に関与するポリペプチドを含む。
【００５１】
「組換え微生物宿主細胞」は、遺伝子操作されている宿主細胞と定義される。実施形態では、組換え微生物宿主細胞は遺伝子操作されており、生合成生成経路を発現し、その中で宿主細胞は、未改質宿主細胞と比較してより多量に生合成産物を生成し、または通常は未改変宿主細胞によって生成されない生合成産物を生成する。
【００５２】
「発酵性炭素基質」という用語は、本明細書で開示されるものなどの、微生物によって代謝されることができる炭素源を指す。適切な発酵性炭素基質としては、グルコースまたはフルクトースなどの単糖類；乳糖またはスクロースなどの二糖類；オリゴ糖類；デンプン、セルロース、またはリグノセルロース、ヘミセルロースなどの多糖類；１炭素基質、脂肪酸；およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５３】
「発酵培地」は、本明細書の用法では、水、糖類（発酵性炭素基質）、溶解固形分、発酵産物を生成する微生物、発酵産物、および発酵容器内に保持される材料の全てのその他の構成物の混合物を意味し、発酵容器内では、存在する微生物によって、発酵性炭素基質から発酵産物、水、および二酸化炭素（ＣＯ２）への反応によって、発酵産物が生成される。時折、本明細書の用法では、「発酵ブロス」および「発酵混合物」という用語は、「発酵培地」の同意語として使用され得る。
【００５４】
「好気的条件」という用語は、本明細書の用法では、酸素存在下の条件を意味する。
【００５５】
「微好気的条件」という用語は、本明細書の用法では、低い溶存酸素レベルの条件を意味する例えば酸素レベルは、空気飽和の約１％未満であってもよい。
【００５６】
「嫌気的条件」という用語は、本明細書の用法では、酸素不在下の条件を意味する。多数の発酵工程では、工程開始時には初期酸素量が存在するが、このような酸素は、工程の大部分が検出可能な酸素不在下で起こるように、発酵過程中に枯渇するものと理解される。
【００５７】
本明細書の用法では、「収率」という用語は、ｇ／ｇでの炭素源あたりの生成物量を指す。収率は、グルコースを炭素源として、例示されてもよい。特に断りのない限り、収率は、理論的収率の百分率として表されるものと理解される微生物または代謝経路に関して、「理論的収率」は、生成物を生成するのに使用される代謝経路の化学量によって決まる、総基質量あたりで生じ得る最大生成物量と定義される。例えばグルコースからイソプロパノールへの典型的な変換の理論的収率は、０．３３ｇ／ｇである。したがって２９．７ｇ／ｇのグルコースからのイソプロパノールの収率は、理論値の９０％または理論的収率の９０％として表される。本開示では、収率はグルコースを炭素源として例示される一方で、本発明はその他の炭素源に応用し得て、使用される炭素源に応じて収率が変動してもよいものと理解される。当業者は、様々な炭素源について収率を計算し得る。
【００５８】
「アセトヒドロキシ酸シンターゼ」、「アセト乳酸シンターゼ」、および「アセト乳酸シンセターゼ」（本明細書で「ＡＬＳ」、「ＡｌｓＳ」、「ａｌｓＳ」および／または「ＡＨＡＳ」と略記される）という用語は、本明細書において同義的に使用されて、ピルビン酸からアセト乳酸およびＣＯ２への変換を触媒する酵素を指す。アセト乳酸シンターゼの例は、ＥＣ番号２．２．１．６で知られている（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。これらの酵素は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ０７８０２．１（配列番号１）、Ｚ９９１２２（配列番号２）、それぞれＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）アミノ酸配列、ＮＣＢＩヌクレオチド配列）、ＣＡＢ１５６１８（配列番号７８９）、クレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５０７９（配列番号３）、Ｍ７３８４２（配列番号４））、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５１６１（配列番号５）、Ｌ１６９７５（配列番号６））をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの起源から入手できる。
【００５９】
「ケトール酸レダクトイソメラーゼ」（「ＫＡＲＩ」）および「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ」という用語は同義的に使用されて、（Ｓ）−アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への反応を触媒できる酵素を指す。例証的ＫＡＲＩ酵素は、ＥＣ番号ＥＣ  １．１．１．８６（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）に分類されてもよく、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１８２２２（配列番号７）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号８））、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１３４５９（配列番号９）、ＮＣ＿００１１４４（配列番号１０））、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＦ３０２１０（配列番号１１）、ＢＸ９５７２２０（配列番号１２））、およびバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４７８９（配列番号１３）、Ｚ９９１１８（配列番号１４））をはじめとするが、これに限定されるものではない、無数の微生物から入手できる。ＫＡＲＩとしては、アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）ＫＡＲＩ変異体「Ｋ９Ｇ９」、「Ｋ９Ｄ３」、および「Ｋ９ＪＢ４Ｐ」（それぞれ配列番号：１６７、１６６、および７９１）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＫＡＲＩはＮＡＤＨを利用する。いくつかの実施形態では、ＫＡＲＩはＮＡＤＰＨを利用する。
【００６０】
「アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ」および「ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ」（「ＤＨＡＤ」）という用語は、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸のα−ケトイソ吉草酸への変換を触媒する酵素を指す。例証的アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼは、ＥＣ番号４．２．１．９で知られている。このような酵素は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿０２６２４８（配列番号１５）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号１６））、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１２５５０（配列番号１７）、ＮＣ００１１４２（配列番号１８））、Ｍ．マリパルディス（Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＦ２９８７４（配列番号１９）、ＢＸ９５７２１９（配列番号２０））、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４１０５（配列番号２１）、Ｚ９９１１５（配列番号２２））、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、アカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）、およびＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）をはじめとするが、これに限定されるものではない、無数の微生物から入手できる。ＤＨＡＤは、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）変異体「Ｉ２Ｖ５」（配列番号７９２）を含む。
【００６１】
「分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ」または「α−ケト酸デカルボキシラーゼ」または「α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ」または「２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ」（「ＫＩＶＤ」）という用語は、α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドおよびＣＯ２への変換を触媒する酵素を指す。例証的分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼはＥＣ番号４．１．１．７２で知られており、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＳ４９１６６（配列番号２３）、ＡＹ５４８７６０（配列番号２４）；ＣＡＧ３４２２６（配列番号２５）、ＡＪ７４６３６４（配列番号２６）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４６１３４６（配列番号２７）、ＮＣ＿００３１９７（配列番号２８））、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿１４９１８９（配列番号２９）、ＮＣ＿００１９８８（配列番号３０））、Ｍ．カセオリティカス（Ｍ．ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（配列番号１６５）、およびＬ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）（配列番号１６４）をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの起源から入手できる。
【００６２】
「分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ」（「ＡＤＨ」）という用語は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒する酵素を指す。例証的分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼはＥＣ番号１．１．１．２６５で知られているが、その他のアルコールデヒドロゲナーゼ（具体的にはＥＣ  １．１．１．１または１．１．１．２）にもまた分類されてもよい。アルコールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＰＨ依存性またはＮＡＤＨ依存性であってもよい。このような酵素は、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１０６５６（配列番号３１）、ＮＣ＿００１１３６（配列番号３２）；ＮＰ＿０１４０５１（配列番号３３）ＮＣ＿００１１４５（配列番号３４））、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１７４８４（配列番号３５）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号３６））、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９８９２（配列番号３７）、ＮＣ＿００３０３０（配列番号３８）；ＮＰ＿３４９８９１（配列番号３９）、ＮＣ＿００３０３０（配列番号４０））、Ａ．キシロソキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）、およびＢ．インディカ（Ｂ．ｉｎｄｉｃａ）をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの起源から入手できる。
【００６３】
「ブタノールデヒドロゲナーゼ」という用語は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換、または２−ブタノンおよび２−ブタノールの変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。ブタノールデヒドロゲナーゼは、幅広いアルコールデヒドロゲナーゼファミリーのサブセットである。ブタノールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ依存性であってもよい。ＮＡＤ依存性酵素はＥＣ  １．１．１．１として知られており、例えばロドコッカス・ルーバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＤ３６４７５、ＡＪ４９１３０７）から入手できる。ＮＡＤＰ依存性酵素はＥＣ  １．１．１．２として知られており、例えばピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ２５５５６、ＡＦ０１３１６９）から入手できる。さらにブタノールデヒドロゲナーゼは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ４１７４８４、ＮＣ＿０００９１３）から入手でき、シクロヘキサノールデヒドロゲナーゼはアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）種（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＧ１００２６、ＡＦ２８２２４０）から入手できる。「ブタノールデヒドロゲナーゼ」という用語は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかを補助因子として使用して、ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの変換を触媒する酵素も指す。ブタノールデヒドロゲナーゼは、例えばＣ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿１４９３２５、ＮＣ＿００１９８８；注記：この酵素はアルデヒドおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性の双方を持つ）；ＮＰ＿３４９８９１、ＮＣ＿００３０３０；およびＮＰ＿３４９８９２、ＮＣ＿００３０３０）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１７４８４、ＮＣ＿０００９１３）から入手できる。
【００６４】
「分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ」という用語は、典型的にＮＡＤ＋  （ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を電子受容体として使用して、α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡ（イソブチリル−補酵素Ａ）への変換を触媒する酵素を指す。例証的分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．４．４で知られている。このような分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼは４つのサブユニットを含んでなり、全てのサブユニットの配列は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４３３６（配列番号４１）、Ｚ９９１１６（配列番号４２）；ＣＡＢ１４３３５（配列番号４３）、Ｚ９９１１６（配列番号４４）；ＣＡＢ１４３３４（配列番号４５）、Ｚ９９１１６（配列番号４６）；およびＣＡＢ１４３３７（配列番号４７）、Ｚ９９１１６（配列番号４８））およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ６５６１４（配列番号４９）、Ｍ５７６１３（配列番号５０）；ＡＡＡ６５６１５（配列番号５１）、Ｍ５７６１３（配列番号５２）；ＡＡＡ６５６１７（配列番号５３）、Ｍ５７６１３（配列番号５４）；およびＡＡＡ６５６１８（配列番号５５）、Ｍ５７６１３（配列番号５６））をはじめとするが、これに限定されるものではない、無数の微生物から入手できる。
【００６５】
「アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ」という用語は、典型的にＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかを電子供与体として使用して、イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素を指す。例証的アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１．１０および１．２．１．５７で知られている。このような酵素は、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＤ３１８４１（配列番号５７）、ＡＦ１５７３０６（配列番号５８））、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿１４９３２５（配列番号５９）、ＮＣ＿００１９８８（配列番号６０）；ＮＰ＿１４９１９９（配列番号６１）、ＮＣ＿００１９８８（配列番号６２））、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ８９１０６（配列番号６３）、Ｕ１３２３２（配列番号６４））、およびサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿１４５４８６（配列番号６５）、ＮＣ＿００６４６１（配列番号６６））をはじめとするが、これに限定されるものではない、複数起源から入手できる。
【００６６】
「トランスアミナーゼ」という用語はアラニンまたはグルタミン酸のいずれかをアミン供与体として使用して、α−ケトイソ吉草酸からＬ−バリンへの変換を触媒する酵素を指す。例証的トランスアミナーゼは、ＥＣ番号２．６．１．４２および２．６．１．６６で知られている。このような酵素は、いくつかの起源から入手できる。アラニン依存性酵素の起源の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿０２６２３１（配列番号６７）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号６８））およびバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿０９３７４３（配列番号６９）、ＮＣ＿００６３２２（配列番号７０））が挙げられるが、これに限定されるものではない。グルタミン酸依存性酵素の起源の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿０２６２４７（配列番号７１）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号７２））、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１２６８２（配列番号７３）、ＮＣ＿００１１４２（配列番号７４））およびメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿２７６５４６（配列番号７５）、ＮＣ＿０００９１６（配列番号７６））が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６７】
「バリンデヒドロゲナーゼ」という用語は、典型的にＮＡＤ（Ｐ）Ｈを電子供与体として、アンモニアをアミン供与体として使用し、α−ケトイソ吉草酸からＬ−バリンへの変換を触媒する酵素を指す。例証的バリンデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．４．１．８および１．４．１．９で知られており、このような酵素は、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿６２８２７０（配列番号７７）、ＮＣ＿００３８８８（配列番号７８））およびＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４３３９（配列番号７９）、Ｚ９９１１６（配列番号８０））をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの起源から入手できる。
【００６８】
「バリンデカルボキシラーゼ」という用語は、Ｌ−バリンからイソブチルアミンおよびＣＯ２への変換を触媒する酵素を指す。例証的バリンデカルボキシラーゼは、ＥＣ番号４．１．１．１４で知られている。このような酵素は、例えばストレプトミセス・ビリディファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＮ１０２４２（配列番号８１）、ＡＹ１１６６４４（配列番号８２））などのストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に見られる。
【００６９】
「ωトランスアミナーゼ」という用語は、適切なアミノ酸をアミン供与体として使用して、イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素を指す。例証的ωトランスアミナーゼはＥＣ番号２．６．１．１８で知られており、アルカリゲネス・デニトリフィカンス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）（ＡＡＰ９２６７２（配列番号８３）、ＡＹ３３０２２０（配列番号８４））、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿２９４４７４（配列番号８５）、ＮＣ＿００７３４７（配列番号８６））、シューワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿７１９０４６（配列番号８７）、ＮＣ＿００４３４７（配列番号８８））、およびＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＮ６６２２３（配列番号８９）、ＡＥ０１６７７６（配列番号９０））をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの起源から入手できる。
【００７０】
「アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ」という用語は、２分子のアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡおよび補酵素Ａ（ＣｏＡ）への変換を触媒する酵素を指す。例証的アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼは、短鎖アシルＣｏＡとアセチル−ＣｏＡに対する基質選択性（順方向での反応）がある、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼであり、Ｅ．Ｃ．２．３．１．９に分類される［Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ］；しかしより広い基質範囲の酵素（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１６）も同様に機能性である。アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼは、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１６７２８（配列番号９１）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号９２）；ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）アミノ酸配列、ＮＣＢＩヌクレオチド配列）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９４７６．１（配列番号９３）、ＮＣ＿００３０３０（配列番号９４）；ＮＰ＿１４９２４２（配列番号９５）、ＮＣ＿００１９８８（配列番号９６）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３９０２９７（配列番号９７）、ＮＣ＿０００９６４（配列番号９８））、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１５２９７（配列番号９９）、ＮＣ＿００１１４８（配列番号１００））などのいくつかの起源から入手できる。
【００７１】
「３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」という用語は、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素を指す。例証的３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（３−Ｅｘａｍｐｌｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ）は、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）−依存性であってもよく、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対する基質選択性がある。例証的酵素は、それぞれＥ．Ｃ．１．１．１．３５およびＥ．Ｃ．１．１．１．３０に分類されてもよい。さらに、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）依存性であってもよく、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対する基質選択性があり、それぞれＥ．Ｃ．１．１．１．１５７およびＥ．Ｃ．１．１．１．３６に分類される。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、例えば、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９３１４（配列番号１０１）、ＮＣ＿００３０３０（配列番号１０２））、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＢ０９６１４（配列番号１０３）、Ｕ２９０８４（配列番号１０４））、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿２９４４８１（配列番号１０５）、ＮＣ＿００７３４７（配列番号１０６））、およびアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２１９７３（配列番号１０７）、Ｊ０４９８７（配列番号１０８））などのいくつかの起源から入手できる。
【００７２】
「クロトナーゼ」という用語は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡおよびＨ２Ｏへの変換を触媒する酵素を指す。例証的クロトナーゼは、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対する基質選択性を有してもよく、それぞれＥ．Ｃ．４．２．１．１７およびＥ．Ｃ．４．２．１．５５に分類されてもよい。クロトナーゼは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ番号：ＮＰ＿４１５９１１（配列番号１０９）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号１１０））、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９３１８（配列番号１１１）、ＮＣ＿００３０３０（配列番号１１２））、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１３７０５（配列番号１１３）、Ｚ９９１１３（配列番号１１４））、およびアエロモナス・カビアエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＢＡＡ２１８１６（配列番号１１５）、Ｄ８８８２５（配列番号１１６））などのいくつかの起源から入手できる。
【００７３】
「ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」という用語は、クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素を指す。例証的ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨ依存性、ＮＡＤＰＨ依存性、またはフラビン依存性であってもよく、それぞれＥ．Ｃ．１．３．１．４４、Ｅ．Ｃ．１．３．１．３８、およびＥ．Ｃ．１．３．９９．２に分類されてもよい。ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、例えば、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４７１０２（配列番号１１７）、ＮＣ＿００３０３０（配列番号１１８）））、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：Ｑ５ＥＵ９０配列番号１１９）、ＡＹ７４１５８２配列番号１２０））、ストレプトミセス・コリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｌｌｉｎｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ９２８９０（配列番号１２１）、Ｕ３７１３５（配列番号１２２））、およびストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＡ２２７２１（配列番号１２３）、ＡＬ９３９１２７（配列番号１２４））などのいくつかの起源から入手できる。
【００７４】
「イソブチリル−ＣｏＡムターゼ」という用語は、ブチリル−ＣｏＡからイソブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素を指す。この酵素は、補酵素Ｂ１２を補助因子として使用する。例証的イソブチリル−ＣｏＡムターゼは、ＥＣ番号５．４．９９．１３で知られている。これらの酵素は、ストレプトミセス・シンナモネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ０８７１３（配列番号１２５）、Ｕ６７６１２（配列番号１２６）；ＣＡＢ５９６３３（配列番号１２７）、ＡＪ２４６００５（配列番号１２８））、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ７０６４５（配列番号１２９）、ＡＬ９３９１２３（配列番号１３０）；ＣＡＢ９２６６３（配列番号１３１）、ＡＬ９３９１２１（配列番号１３２））、およびストレプトミセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿８２４００８（配列番号１３３）、ＮＣ＿００３１５５（配列番号１３４）；ＮＰ＿８２４６３７（配列番号１３５）、ＮＣ＿００３１５５（配列番号１３６））をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかのストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に見られる。
【００７５】
「ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ」という用語は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補助因子として使用して、ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素を指す。ＮＡＤＨに対する選択性があるブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、Ｅ．Ｃ．１．２．１．５７として知られており、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＤ３１８４１、ＡＦ１５７３０６）およびＣ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿１４９３２５、ＮＣ＿００１９８８）から入手できる。
【００７６】
「アセト乳酸デカルボキシラーゼ」という用語は、α−アセト乳酸からアセトインへの変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。例証的アセト乳酸デカルボキシラーゼはＥＣ  ４．１．１．５として知られており、例えば、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２２２２３、Ｌ０４４７０）、クレブシエラ・テリゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５０５４、Ｌ０４５０７）およびクレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＵ４３７７４、ＡＹ７２２０５６）から入手できる。
【００７７】
「アセトインアミナーゼ」または「アセトイントランスアミナーゼ」という用語は、アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド）を指す。アセトインアミナーゼは、補助因子ピリドキサール５’−リン酸またはＮＡＤＨ（還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）またはＮＡＤＰＨ（還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を利用してもよい。得られた生成物は、３位に（Ｒ）または（Ｓ）立体配置を有してもよい。ピリドキサールリン酸依存性酵素は、アラニンまたはグルタミン酸などのアミノ酸をアミノ供与体として使用してもよい。ＮＡＤＨ依存性酵素およびＮＡＤＰＨ依存性酵素は、アンモニアを第２の基質として使用してもよい。アミノアルコールデヒドロゲナーゼとしてもまた知られている、ＮＡＤＨ依存性アセトインアミナーゼの適切な例は、Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，４３２，６８８号明細書）によって記載される。ピリドキサール依存性アセトインアミナーゼの一例は、Ｓｈｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｍ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：２８４８−２８５３（２００２））によって記載されるアミン：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（アミン：ピルビン酸トランスアミナーゼとも称される）である。
【００７８】
「アセトインキナーゼ」という用語は、アセトインからホスホアセトインへの変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。アセトインキナーゼは、反応中で、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）またはホスホエノールピルビン酸をリン酸供与体として利用してもよい。例えば同様の基質ジヒドロキシアセトン上で類似反応を触媒する酵素としては、ＥＣ  ２．７．１．２９で知られている酵素が挙げられる（Ｇａｒｃｉａ−Ａｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１３０３７−１３０４６）。「アセトインリン酸アミナーゼ」という用語は、ホスホアセトインから３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸への変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。アセトインリン酸アミナーゼは、補助因子ピリドキサール５’−リン酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用してもよい。得られた生成物は、３位に（Ｒ）または（Ｓ）立体配置を有してもよい。ピリドキサールリン酸依存性酵素は、アラニンまたはグルタミン酸などのアミノ酸を使用してもよい。ＮＡＤＨ依存性酵素およびＮＡＤＰＨ依存性酵素は、アンモニアを第２の基質として使用してもよい。ホスホアセトインに対するこの反応を触媒する酵素の報告はないが、同様の基質セリノールリン酸に対して類似反応を起こすと提案される、ピリドキサールリン酸依存性酵素がある（Ｙａｓｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．６７：４９９９−５００９。「アミノアルコールＯ−リン酸リアーゼ」とも称される「アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼ」という用語は、３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸から２−ブタノンへの変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。アミノブタノールリン酸ホスホ−リアーゼは、補助因子ピリドキサール５’−リン酸を利用してもよい。同様の基質１−アミノ−２−プロパノールリン酸上での類似反応を触媒する酵素の報告がある（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１３４：１６７−１８２）。米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０号明細書は、生物エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）からのアミノブタノールリン酸ホスホリアーゼを記載する。
【００７９】
「アミノブタノールキナーゼ」という用語は、３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２ブタノールＯ−リン酸への変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。アミノブタノールキナーゼは、ＡＴＰをリン酸供与体として利用してもよい。３−アミノ−２−ブタノール上で、この反応を触媒する酵素の報告はないが、同様の基質エタノールアミンおよび１−アミノ−２−プロパノール上で類似反応を触媒する酵素の報告がある（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，前出）。米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書は、実施例１４において、エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）亜株アトロセプチカ（Ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）のアミノアルコールキナーゼを記載する。
【００８０】
「アセトイン還元酵素」としてもまた知られている「ブタンジオールデヒドロゲナーゼ」という用語は、アセトインから２，３−ブタンジオールへの変換を触媒する酵素活性を有する、ポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。ブタンジオール（Ｂｕｔａｎｅｄｉａｌ）デヒドロゲナーゼは、幅広いアルコールデヒドロゲナーゼファミリーのサブセットである。ブタンジオールデヒドロゲナーゼ酵素は、アルコール生成物中の（Ｒ）または（Ｓ）立体配置の生成に対する特異性を有してもよい。（Ｓ）特異的ブタンジオールデヒドロゲナーゼはＥＣ  １．１．１．７６として知られており、例えばクレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＢＢＡ１３０８５、Ｄ８６４１２）から入手できる。（Ｒ）特異的ブタンジオールデヒドロゲナーゼはＥＣ  １．１．１．４として知られており、例えばバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号．ＮＰ８３０４８１、ＮＣ＿００４７２２；ＡＡＰ０７６８２、ＡＥ０１７０００）、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＫ０４９９５、ＡＥ００６３２３）から入手できる。
【００８１】
「ジアールデヒドラターゼ」または「プロパンジオールデヒドラターゼ」としてもまた知られている「ブタンジオールデヒドラターゼ」という用語は、２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（またはポリペプチド群）を指す。ブタンジオールデヒドラターゼは、補助因子アデノシルコバラミンを利用してもよい（補酵素ＢｗまたはビタミンＢ１２としてもまた知られている；しかしビタミンＢ１２は、補酵素Ｂ１２でないコバラミンのその他の形態もまた指してもよい）。アデノシルコバラミン依存性酵素はＥＣ  ４．２．１．２８として知られており、例えば、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡ０８０９９（αサブユニット）、Ｄ４５０７１；ＢＡＡ０８１００（βサブユニット）、Ｄ４５０７１；およびＢＢＡ０８１０１（γサブユニット）、Ｄ４５０７１（全ての３つのサブユニットが活性に必要であることに留意されたい）］、およびクレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ９８３８４（αサブユニット）、ＡＦ１０２０６４；ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ９８３８５（βサブユニット）、ＡＦ１０２０６４、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ９８３８６（γサブユニット）、ＡＦ１０２０６４）から入手できる。その他の適切なジアールデヒドラターゼとしては、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＢ８４１０２（大型サブユニット）、ＡＦ０２６２７０；ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＢ８４１０３（中型サブユニット）、ＡＦ０２６２７０；ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＢ８４１０４（小型サブユニット）、ＡＦ０２６２７０）；およびラクトバチルス・コリノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＣ８２５４１（大型サブユニット）、ＡＪ２９７７２３；ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＣ８２５４２（中型サブユニット）；ＡＪ２９７７２３；ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＤ０１０９１（小型サブユニット）、ＡＪ２９７７２３）から入手できるＢ１２依存性ジアールデヒドラターゼ；およびラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）からの酵素（特にＣＮＲＺ７３４株およびＣＮＲＺ７３５株、Ｓｐｅｒａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．（１９９７）４５：３４７６−３４８０）、および対応する酵素をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。ジアールデヒドラターゼ遺伝子を単離する方法は、当該技術分野で周知である（例えば米国特許第５，６８６，２７６号明細書）。
【００８２】
「ピルビン酸デカルボキシラーゼ」という用語は、ピルビン酸からアセトアルデヒドおよび二酸化炭素への脱炭酸を触媒する酵素を指す。ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号４．１．１．１で知られている。これらの酵素は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＡ９７５７５（配列番号１３７）、ＣＡＡ９７７０５（配列番号１３８）、ＣＡＡ９７０９１（配列番号１３９））をはじめとするいくつかの酵母に見られる。
【００８３】
「ホスホケトラーゼ」という用語は、キシルロース（ｘｙｕｌｏｓｅ）５−リン酸からグリセルアルデヒド−３−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒する酵素を指す。例証的ホスホケトラーゼは、ＥＣ番号４．１．２．９で知られている。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼは、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）からのｘｐｋである（核酸配列番号１８０；アミノ酸配列番号１８１）。
【００８４】
「ホスホトランスアセチラーゼ」という用語は、アセチル−ＣｏＡおよびリン酸からＣｏＡおよびアセチルリン酸への変換を触媒する酵素を指す。例証的ホスホトランスアセチラーゼは、ＥＣ番号２．３．１．８で知られている。いくつかの実施形態では、ホスホトランスアセチラーゼは、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）からのｅｕｔＤ（核酸配列番号１７８；アミノ酸配列番号１７９）である。
【００８５】
本明細書の用法では、「ポリペプチド」という用語は、単数形「ポリペプチド」ならびに複数形「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としてもまた知られている）によって直線的に連結するモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸のあらゆる鎖または鎖群を指し、生成物の特定長を指さない。したがって２つ以上のアミノ酸の鎖または鎖群を指すために使用されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、またはあらゆるその他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはそれと同義的に使用されてもよい。「ポリペプチド」という用語は、制限なしに、既知の保護／ブロッキング基、タンパク質分解的切断、または非天然アミノ酸による修飾による、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化をはじめとする、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すこともまた意図される。実施形態では、生合成経路ポリペプチド、細胞完全性ポリペプチド、増殖ポリペプチド、およびその他の酵素をはじめとするが、これに限定されるものではない、本明細書で提供されるポリペプチドは、完全長ポリペプチドおよびその活性断片を含んでなる。
【００８６】
「単離」ポリペプチドまたはその断片、変種、または誘導体とは、その天然環境にないポリペプチドが意図される。特定レベルの精製は、必要ない。例えば単離ポリペプチドは、その固有のまたは天然環境から取り出され得る。宿主細胞中で発現される、組換え的に生成されたポリペプチドおよびタンパク質は、本発明の目的で単離されていると見なされ、任意の適切な技術によって分離、分画、または部分的または実質的に精製された天然または組換えポリペプチドについても同様である。
【００８７】
本発明のポリペプチドは、約１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、または２，０００以上のアミノ酸のサイズであってもよい。ポリペプチドは、規定の三次元構造を有してもよいが、それらは必ずしもこのような構造を有しない。規定の三次元構造があるポリペプチドは折り畳まれたと称され、規定の三次元構造を持たず、むしろ多数の異なる立体構造を取り得るポリペプチドは、折り畳まれていないと称される。
【００８８】
前述のポリペプチド誘導体、類似体、または変異体、およびそれらのあらゆる組み合わせもまた、本発明のポリペプチドに含まれる。「活性変異体」、「活性断片」、「積極的誘導体」、および「類似体」という用語は、本発明のポリペプチドを指し、示される基質から産物への変換を触媒できる、任意選択のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの変異体としては、アミノ酸置換、欠失、および／または挿入が原因で改変されたアミノ酸配列がある、ポリペプチドが挙げられる。変異体は、天然または非天然であってもよい。非天然変異体は、技術分野で既知の変異誘発技術を使用して、作り出されてもよい。変種ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失および／または付加を含んでなってもよい。本発明のポリペプチドの誘導体は、天然ポリペプチドには見られない、追加的な特性を示すように改変されているポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。変種ポリペプチドはまた、本明細書で「ポリペプチド類似体」と称されてもよい。本明細書の用法では、ポリペプチドの「誘導体」は、機能性側鎖基の反応によって化学的に誘導体化された、１つまたは複数の残基を有する対象ポリペプチドを指す。「誘導体」には、２０個の標準アミノ酸の天然アミノ酸誘導体の１つまたは複数を含有するペプチドもまた含まれる。例えば、プロリンを４−ヒドロキシプロリンで置換してもよく；リジンを５−ヒドロキシリジンで置換してもよく；ヒスチジンを３−メチルヒスチジンで置換してもよく；セリンをホモセリンで置換してもよく；リジンをオルニチンで置換してもよい。
【００８９】
「断片」は、親完全長配列と配列は同一であるが、長さがより短い、本発明で使用されるポリペプチドのユニークな部分である。断片は、最高で、アミノ酸残基を１個除いた、規定配列の全長を含んでなってもよい。例えば、断片は、５〜１０００個の連続アミノ酸残基を含んでなってもよい。断片は、少なくとも５、１０、１５、１６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０または少なくとも５００個の連続アミノ酸残基長であってもよい。断片は、分子の特定領域から優先的に選択されてもよい。例えばポリペプチド断片は、一定の規定配列に示されるように、ポリペプチドの最初の１００または２００個のアミノ酸から選択される、一定長さの連続アミノ酸を含んでなってもよい。明らかにこれらの長さは例示的であり、配列表、表、および数値をはじめとする規格によって支持される任意選択の長さが、本実施形態に包含されてもよい。同様に、「活性断片」は、ポリペプチドに関して使用される場合、対象ポリペプチドの機能性を保つが、ポリペプチドの配列全体未満を含んでなるポリペプチドの部分である。
【００９０】
代案としては、遺伝コード中の「重複」を利用することで、これらの同一または類似ポリペプチドをコードする組換え変異体を合成し、または選択し得る。様々な制限酵素認識部位を生じるサイレント変化などの様々なコドン置換を導入して、プラスミドまたはウイルスベクターへのクローニング、または宿主細胞系内での発現を最適化してもよい。
【００９１】
好ましくは、アミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸を、同様の構造および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置換する、すなわち保存的アミノ酸置換の結果であり、またはそれらは、１つのアミノ酸を、異なる構造および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置換する、すなわち非保存的アミノ酸置換の結果である。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて実施してもよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ；極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ；正に帯電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられ；負に帯電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。代案としては、これらのいずれかのアミノ酸の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、または両親媒性の相違を選択することで、「非保存的」アミノ酸置換を実施し得る。「挿入」または「欠失」は、好ましくは約１〜約２０個のアミノ酸、より好ましくは１〜１０個のアミノ酸の範囲である。許容される変動は、組換えＤＮＡ技術を使用して、ポリペプチド分子中に体系的に、アミノ酸の挿入、欠失、または置換を施し、得られた組換え変異体を活性についてアッセイすることで、実験的に判定してもよい。
【００９２】
本発明で使用するのに適したポリペプチドとその断片は、ポリヌクレオチドによってコードされる。「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸ならびに複数の核酸を包含することが意図され、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）などの単離核酸分子またはコンストラクトを指す。ポリヌクレオチドは、従来型リン酸ジエステル結合または非従来型結合（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）などに見られるアミド結合）を含んでなってもよい。「核酸」という用語は、例えば、ポリヌクレオチド中に存在する、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片などの任意選択の１つまたは複数の核酸断片を指す。本発明によるポリヌクレオチドは、さらに合成的に生成された分子を含む。本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞に天然であっても、または異種であってもよい。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節因子であってもよく、またはそれを含んでもよい。
【００９３】
ポリヌクレオチド配列は「単離された」と称し得て、その中ではそれはその天然環境から取り出されている。例えば、酵素活性（例えば基質をキシルロースに変換する能力）を有するポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードして、ベクター中に含有される異種ポリヌクレオチドは、本発明の目的では、単離されていると見なされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液中の（部分的または実質的）精製ポリヌクレオチドが挙げられる。本発明に従った単離ポリヌクレオチドまたは核酸としては、合成的に生成された分子がさらに挙げられる。ＤＮＡポリマーの形態の単離ポリヌクレオチド断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数の部分を含んでなり得る。
【００９４】
「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質として発現されることができ、任意選択的に、コード配列に先行する（５’非コード配列）および後続する（３’非コード配列）制御配列を含む、核酸断片を指す。
【００９５】
本明細書の用法では、「コード領域」または「ＯＲＦ」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる、核酸の部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、コード領域が存在する場合、その一部と見なされてもよいが、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’および３’非翻訳領域などのあらゆる側面に位置する配列などは、コード領域の一部でない。「適切な制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列中、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または結合コード配列の翻訳に影響を及ぼす、ヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造を含み得る。
【００９６】
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列は、プロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、または合成ＤＮＡ断片を含んでなってさえよい。当業者は、異なる組織または細胞タイプ中で、または異なる発達段階で、または異なる環境的または生理的な条件に答えて、異なるプロモーターが、遺伝子発現を誘導してもよいことを理解する。ほとんどの場合にほとんどの細胞型で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が、同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。
【００９７】
表１、２、７、および８内のものをはじめとする、本明細書で開示されるいくつかのプロモーター核酸配列は、自由裁量で、各遺伝子の開始コドンの５’の１０００ｂｐとした。しかし配列は、Ｙｅａｓｔｒａｃｔデータベース、ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｒａｃｔ．ｃｏｍ（２０１２年１２月２１日閲覧）またはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ゲノムデータベース、ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ（２０１２年１２月２１日閲覧）などの公的に利用可能なデータベースから取得されてもよい。遺伝子名（利用できる場合）および系統名（利用できる場合サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ゲノムデータベースを参照）が示される。上述したように、提供される配列の異なる長さの断片が同一プロモーター活性を有してもよいことが、当業者によって理解され、したがって例えば「ＨＥＭ１３プロモーター」への言及は、本明細書で提供される配列を包含し、または標的ポリペプチドの発現または示される生成物の生成に対して同一プロモーター活性または実質的に同様の効果を有するＨＥＭ１３遺伝子のプロモーター領域のあらゆる断片を包含するものと理解される。したがって、開示される核酸配列は、提供される配列のみに限定されると解釈すべきではない。
【００９８】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合、常態ではポリペプチドをコードする核酸を含んでなるポリヌクレオチドは、１つまたは複数のコード領域と作動可能に結合する、プロモーターおよび／またはその他の転写または翻訳制御要素を含んでもよい。作動可能な結合では、遺伝子産物発現が制御配列の影響または制御下に置かれるように、例えばポリペプチドである遺伝子産物のコード領域が、１つまたは複数の制御配列と結合する。（ポリペプチドコード領域とそれに結合するプロモーターなどの）２つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘発が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらし、２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物発現を誘導する発現制御配列の能力に干渉せず、またはＤＮＡテンプレートが転写される能力に干渉しなければ、「作動的に結合」または「作動可能に連結」または「共役」される。したがってプロモーターが核酸の転写をもたらすことができれば、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に結合する。プロモーターに加えて、例えばエンハンサー、オペレーター、抑制因子、および転写終結シグナルなどのその他の転写制御要素が、ポリヌクレオチドと作動可能に結合し得る。適切なプロモーターおよびその他の転写制御領域が、本明細書で開示される。「発現コンストラクト」は、本明細書の用法では、ポリペプチドのコード領域と作動可能に連結するプロモーター核酸配列と、任意選択的にターミネーター核酸配列とを含んでなる。
【００９９】
多様な翻訳制御要素が、当業者に知られている。これらとしては、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、およびウイルス系由来要素（特に配列内リボソーム進入部位、またはＩＲＥＳ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であってもよい。
【０１００】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド分泌を誘導する、分泌型またはシグナルペプチドをコードする、追加的なコード領域と結合していてもよい。
【０１０１】
ここでの用法では「形質転換」は、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物のゲノムへの核酸断片の転移を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「組換え」または「形質転換」生物と称される。
【０１０２】
「発現」および「発現された」と言う用語は、ここでの用法では、発明の核酸断片から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもよい。「差次的に発現される」は、宿主細胞の環境に応じて、遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、または遺伝子によってコードされるタンパク質生成物の差次的生成を指す。差次的に発現される遺伝子は、その他の条件下の発現レベルと比較して、過剰発現または過小発現されてもよい。一態様では、それは、参照環境で検出される発現レベルよりも、１、２、３、４、５、１０、または２０倍高いまたは低い差分を指す。「差次的に発現される」という用語はまた、サイレントの場合に発現される、または対照環境内では発現されず、または対照細胞中で発現させると発現されない、細胞中のヌクレオチド配列も指す。
【０１０３】
「プラスミド」、「ベクター」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる起源に由来する、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、直鎖または環状の、自己複製配列、ゲノム一体化配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、その中では、いくつかのヌクレオチド配列が独自構造に連結されまたは組換えされており、それは適切な３’非翻訳配列と共に、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞に導入できる。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する、特定のベクターを指す。「発現カセット」は、遺伝子を含み、遺伝子に加えて、その遺伝子の発現を可能にする要素を有する、特定のコンストラクトを指す。
【０１０４】
本明細書の用法では、「天然」は、存在する場合、それ自身の制御配列と共に、天然に見られるポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドの形態を指す。
【０１０５】
本明細書の用法では、「内在性」は、生物または生物ゲノム中のその自然な位置にある、ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドの天然形態を指す。「内在性ポリヌクレオチド」は、生物ゲノム中のその自然な位置にある天然ポリヌクレオチドを含む。「内在性遺伝子」は、生物のゲノム中のその自然な位置にある天然遺伝子を含む。「内在性ポリペプチド」は、生物中のその自然な位置にある天然ポリペプチドを含む。
【０１０６】
本明細書の用法では、「異種」は、常態では宿主生物に見られないが、宿主生物に導入された、ポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドを指す。「異種ポリヌクレオチド」は、対応する天然ポリヌクレオチドと異なる形態で、生物源に再導入された未変性コーディング領域、またはその一部を含んでもよい。「異種遺伝子」は、対応する天然遺伝子と異なる形態で、生物源に再導入された未変性コーディング領域、またはその一部を含む。例えば異種遺伝子は、天然宿主に再導入された非天然調節領域をはじめとするキメラ遺伝子の一部である、未変性コーディング領域を含み得る。「異種ポリペプチド」は、対応する天然ポリペプチドと異なる形態で、生物源に再導入された天然ポリペプチドを含む。
【０１０７】
本発明の参照ヌクレオチド配列と、例えば少なくとも９５％「同一」のヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００個のヌクレオチドあたり、最高５つの点変異を含んでもよいこと以外は、参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中の最高５％のヌクレオチドが、欠失されまたは別のヌクレオチドで置換されてもよく、または参照配列中の全ヌクレオチドの最高５％までのいくつかのヌクレオチドが、参照配列中に挿入されてもよい。
【０１０８】
実際に、任意選択の特定の核酸分子またはポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、公知のコンピュータプログラムを使用して慣習的に特定し得る。大域的配列アラインメントとも称される、クエリー配列（本発明の配列）と対象配列間の最良の全体的一致を判定する好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して判定され得る。配列アラインメントでは、クエリーおよび対象配列は、どちらもＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することで比較し得る。前記大域的配列アラインメントの結果が、％同一性である。％同一性を計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントで使用される好ましいパラメータは、Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ−３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列長のどちらか短い方である。
【０１０９】
内部欠失のためではなく５’または３’欠失のために、対象配列がクエリー配列より短い場合、結果に手動補正を施すべきである。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが％同一性を計算する際に、対象配列の５’および３’トランケーションを考慮しないためである。クエリー配列と比較して、５’または３’末端でトランケートされた対象配列では、クエリー配列の全塩基の百分率として、整合／整列しない対象配列の５’および３’のクエリー配列の塩基数を計算することで、％同一性が補正される。ヌクレオチドが整合／整列するかどうかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって判定される。次に、規定のパラメータを使用して上のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された％同一性から、この百分率を差し引き、最終％同一性スコアを得る。本発明の目的で使用されるのは、この補正スコアである。ＦＡＳＴＤＢアラインメントで示されるように、クエリー配列と整合／整列しない、対象配列の５’および３’塩基の外部の塩基のみが、％同一性スコアを手動調節する目的で計算される。
【０１１０】
例えば９０塩基の対象配列を１００塩基のクエリー配列と配列比較して、％同一性を判定する。欠失は対象配列の５’末端に存在し、したがってＦＡＳＴＤＢアラインメントは、５’末端の最初の１０塩基の整合／整列を示さない。１０個の不対塩基は、配列の１０％（５’および３’末端の不整合塩基数／クエリー配列中の塩基総数）に相当するので、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される％同一性スコアから１０％が差し引かれる。残りの９０個の塩基が完全に整合するならば、最終％同一性は９０％になる。別の例では、９０個の塩基の対象配列を１００個の塩基のクエリー配列と比較する。この例では、欠失は内部欠失であるので、クエリーと整合／整列しない塩基は、対象配列の５’または３’にはない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算される％同一性は、手動で補正されない。再度、クエリーと整合／整列しない対象配列の５’および３’塩基のみが、手動補正される。本発明の目的では、その他の手動補正は行われない。
【０１１１】
本発明で使用されるポリペプチドは、その活性変異体、断片または誘導体をはじめとする、明細書の他の箇所に記載されるヌクレオチド配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列によってコードされる。
【０１１２】
「活性変異体」、「活性断片」、「活性誘導体」、および「類似体」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを指し、それぞれの酵素機能または構造を維持する、本発明で使用される生体触媒ポリペプチドをコードする、あらゆるポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドの変異体としては、塩基対の置換、欠失、および／または挿入に起因する改変ヌクレオチド配列がある、ポリヌクレオチドが挙げられる。変異体は、天然または非天然であってもよい。非天然変異体は、技術分野で既知の変異誘発技術を使用して、作り出されてもよい。本発明のポリヌクレオチドの誘導体は、それらがコードするポリペプチドが、天然ポリペプチドには見られない追加的な特性を示すように改変されているポリヌクレオチドである。例としては、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。変異ポリヌクレオチドはまた、本明細書で「ポリヌクレオチド類似体」と称されることもある。本明細書の用法では、ポリヌクレオチドの「誘導体」は、機能性側鎖基の反応によって化学的に誘導体化された、１つまたは複数のヌクレオチドを有する対象ポリヌクレオチドを指す。「誘導体」にはまた、１つまたは複数の天然のヌクレオチド誘導体を含有するポリヌクレオチドも含まれる。例えば、３−メチルシチジンでシトシンを置換してもよく；リボチミジンでチミジンを置換してもよく；Ｎ４−アセチルシチジンでシトシンを置換してもよい。
【０１１３】
「断片」は、プロモーター配列に関して使用される場合、親核酸配列と配列は同一であるが、長さがより短い、本発明で使用される生体触媒ポリペプチドをコードする、プロモーター核酸配列または核酸配列のユニークな部分である。例えば断片は、５〜１０００個の連続ヌクレオチドを含んでなってもよい。プローブ、プライマーとして、またはその他の目的で使用される断片は、少なくとも５、１０、１５、１６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０または少なくとも５００個の連続ヌクレオチドであってもよい。断片は、最高で、ヌクレオチドまたはアミノ酸を１個除いた、規定配列の全長を含んでなってもよい。断片は、分子の特定領域から優先的に選択されてもよい。例えば、ポリヌクレオチド断片は、一定の規定配列に示されるように、ポリヌクレオチドの最初の１００または２００個のヌクレオチドから選択される、一定長さの連続ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。明らかにこれらの長さは例示的であり、配列表、表、および数値をはじめとする規格によって支持される任意選択の長さが、本実施形態に包含されてもよい。
【０１１４】
本明細書の用法では、「コドン縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド配列の多様性を可能にする、遺伝子コードの性質を指す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドン使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」について良く知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【０１１５】
本明細書の用法では「コドン最適化コード領域」という用語は、少なくとも１つ、または２つ以上、またはかなりの数のコドンを、その生物の遺伝子でより頻繁に使用される１つまたは複数のコドンによって置換することで、所与の生物細胞中の発現に適応させた核酸コード領域を意味する。
【０１１６】
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含んでなるヌクレオチド配列の偏向は、遺伝子をコードする配列の多様性を可能にする。各コドンは３個のヌクレオチドからなり、ＤＮＡを構成するヌクレオチドは４つの特定塩基に限定されるので、ヌクレオチドの６４個の可能な組み合わせがあり、その内６１個がアミノ酸をコードする（残りの３個のコドンは、翻訳終了シグナルをコードする）。いずれのコドンがいずれのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝コード」は、本明細書で表Ａとして再現される。その結果、多数のアミノ酸が、２個以上のコドンによって指定される。例えばアミノ酸、アラニンおよびプロリンは４個の三つ組み、セリンおよびアルギニンは６個の三つ組みによってコードされるのに対し、トリプトファンおよびメチオニンは１個の三つ組みのみによってコードされる。この縮重が、ＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、広範囲にわたるＤＮＡ塩基組成の変動を可能にする。
【０１１７】
【表１】
2015503351.tif 000002
【０１１８】
多数の生物は、成長するペプチド鎖への特定アミノ酸挿入をコードする、特定のコドン使用についてバイアスを示す。生物間のコドン選択、またはコドンバイアス、コドン使用頻度の差は、遺伝コードの縮重によって提供され、文献で多数の生物において十分に立証されている。コドンバイアスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、それは次に、特に翻訳されるコドンの特性、および特定の移転ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の可用性に左右されると思われる。細胞における選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般にペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適遺伝子発現のために調整し得る。
【０１１９】
多種多様な動物、植物、および微生物種で利用できる多数の遺伝子配列を所与として、コドン使用頻度の相対的頻度を計算することが可能である。コドン使用頻度表は、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／の「コドン使用頻度データベース」（２００８年３月２０日閲覧）で容易に入手でき、これらの表はいくつかの方法で応用し得る。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。ＧｅｎＢａｎｋリリース１２８．０［２００２年２月１５日］から計算された酵母のコドン使用頻度表は、下で表Ｂとして再現される。この表はｍＲＮＡ命名法を使用し、表は、ＤＮＡに見られるチミン（Ｔ）の代わりに、ＲＮＡに見られるウラシル（Ｕ）を使用する。表では、頻度が、全ての６４個のコドンでなく、各アミノ酸について計算されるように適応されている。
【０１２０】
【表２】
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【０１２１】
【表３】
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【０１２２】
この表または同様の表を利用することで、当業者は、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用して、ポリペプチドをコードするが、所与の種に最適のコドンを使用する、コ
ドン最適化コード領域の核酸断片を生成し得る。
【０１２３】
所与のポリペプチド配列をコードする最適化頻度で、コドンを無作為に割り当てることは、各アミノ酸についてコドン頻度を計算し、次にコドンをポリペプチド配列に無作為に割り当てることにより、手動で成し得る。それに加えて、当業者は、様々なアルゴリズム、およびコンピュータソフトウェアプログラムを容易に利用できる。例えばＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手できるＬａｓｅｒｇｅｎｅパッケージの「ＥｄｉｔＳｅｑ」機能、ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから入手できるＶｅｃｔｏｒＮＴＩスイートのｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ機能、およびＡｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手できるＧＣＧ−Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージの「ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｅ」機能。これに加えて、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｐｈｐ？ｌａｎｇ＝ｅｎｇで利用できる「ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」機能（２００８年４月１５日閲覧）およびｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｐｂｉ．ｎｒｃ．ｃａ：８０９０／ＥＭＢＯＳＳ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで利用できる「ｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ」機能（２００２年７月９日閲覧）などのコドン最適化コード領域配列の様々な資源が公的に入手可能である。初歩的アルゴリズムを構築し、所与の頻度に基づいてコドンを割り当てることもまた、当業者によって、基本的数学機能により容易に達成され得る。
【０１２４】
コドン最適化コード領域は、「合成遺伝子デザイナー」などのソフトウェアパッケージをはじめとする、当業者に知られている様々な方法によって、デザインされ得る（ｕｓｅｒｐａｇｅｓ．ｕｍｂｃ．ｅｄｕ／〜ｖｙｕｇ１／ｃｏｄｏｎ／ｓｇｄ／、２０１２年３月１９日に閲覧）。）。
【０１２５】
プロモーター核酸配列−「遺伝的スイッチ」
いくつかの実施形態では、プロモーター活性は、発酵の増殖段階と生産段階の間の１つまたは複数の生理化学的違いに対して感受性である。実施形態では、プロモーター活性は、溶存酸素濃度に対して感受性である。実施形態では、プロモーター活性は、グルコース濃度に対して感受性である。いくつかの実施形態では、プロモーター活性は、発酵性炭素基質源に対して感受性である。なおもさらなる実施形態では、プロモーター活性は、発酵培地中のブタノール濃度に対して感受性である。なおもさらなる実施形態では、プロモーター活性は、発酵培地のｐＨに対して感受性である。なおもさらなる実施形態では、プロモーター活性は、発酵培地の温度に対して感受性である。実施形態では、プロモーター活性は、発酵の増殖段階と生産段階において差次的発現を提供する。
【０１２６】
生産および増殖
本発明で有用なプロモーター核酸配列としては、発酵培地中の酸素、ブタノール、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、酢酸、または発酵性炭素基質の濃度などの発酵条件に対する感受性を与えまたは増大させる、変異体、断片または誘導体を含めた、配列番号１４１〜１６３のヌクレオチド配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を含んでなるものをはじめとする、本明細書で記載され例示される「プロモーター探査」を使用して同定されたものが挙げられる。これらの適切なプロモーター核酸配列の一部は、下の表１および２に記載される。
【０１２７】
【表４】
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【０１２８】
【表５】
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【０１２９】
本発明の実施形態では、プロモーター核酸配列は、発酵培地中の発酵性炭素基質濃度に対して感受性である。なおもさらなる実施形態では、プロモーター核酸配列は、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、脂肪酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される発酵性炭素基質濃度に対して感受性である。
【０１３０】
本発明の実施形態では、本発明で使用するのに適するプロモーター核酸配列は、配列番号１４０［ＩＭＡ１／ＹＧＲ２８７］、［ＨＸＫ１］、配列番号１４１［ＨＸＫ２］、配列番号１４２［ＳＬＴ２］、配列番号１４３［ＹＨＲ２１０ｃ］、配列番号１４４［ＹＪＬ１７１ｃ］、配列番号１４５［ＰＵＮ１］、配列番号１４６［ＰＲＥ８］、配列番号１４７［ＣＯＳ３］、配列番号１４８［ＤＩＡ１］、配列番号１４９［ＹＮＲ０６２Ｃ］、配列番号１５０［ＰＲＥ１０］、配列番号１５１［ＡＩＭ４５］、配列番号１５２［ＺＲＴ１］、配列番号１５３［ＺＲＴ２］、配列番号１５４［ＰＨＯ８４］、配列番号１５５［ＰＣＬ１］、配列番号１５６［ＡＲＧ１］、配列番号１５７［ＺＰＳ１］、配列番号１５８［ＦＩＴ２］、配列番号１５９［ＦＩＴ３］、配列番号１６０［ＦＲＥ５］、配列番号１６１［ＣＳＭ４］、配列番号１６０［ＳＡＭ３］、配列番号１６３［ＦＤＨ２］またはその変異体、断片または誘導体からなる群から選択される配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含んでなる。
【０１３１】
実施形態では、本発明で使用するのに適するプロモーター核酸配列は、配列番号１４０［ＩＭＡ１／ＹＧＲ２８７］、［ＨＸＫ１］、配列番号１４１［ＨＸＫ２］、配列番号１４２［ＳＬＴ２］、配列番号１４３［ＹＨＲ２１０ｃ］、配列番号１４４［ＹＪＬ１７１ｃ］、配列番号１４５［ＰＵＮ１］、配列番号１４６［ＰＲＥ８］、配列番号１４７［ＣＯＳ３］、配列番号１４８［ＤＩＡ１］、配列番号１４９［ＹＮＲ０６２Ｃ］、配列番号１５０［ＰＲＥ１０］、配列番号１５１［ＡＩＭ４５］、配列番号１５２［ＺＲＴ１］、配列番号１５３［ＺＲＴ２］、配列番号１５４［ＰＨＯ８４］、配列番号１５５［ＰＣＬ１］、配列番号１５６［ＡＲＧ０］、配列番号１５７［ＺＰＳ１］、配列番号１５８［ＦＩＴ２］、配列番号１５９［ＦＩＴ３］、配列番号１６０［ＦＲＥ５］、配列番号１６１［ＣＳＭ４］、配列番号１６２［ＳＡＭ３］、配列番号１６３［ＦＤＨ２］またはその変異体、断片または誘導体からなる群から選択される。
【０１３２】
酸素
実施形態では、プロモーター核酸配列は、発酵培地中の酸素濃度に対して感受性である。
【０１３３】
実施形態では、増殖段階と生産段階間の識別特性は、増殖期の大部分における高い（例えば約５％を超える）溶存酸素濃度と、生産期の大部分における低い（例えば約５％未満または約３％未満）、しばしば嫌気的条件にさえ至る溶存酸素濃度の存在である。その結果、実施形態では、「高い」対「低い」溶存酸素濃度は、工程の増殖段階対生産段階における、対象生体触媒ポリペプチド発現の増大または低下をもたらす。このような生体触媒ポリペプチドの例としては、本明細書の他の箇所に記載される、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＺＷＦ１）、ホスホケトラーゼ（ＸＰＫ）、およびグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１３４】
実施形態では、示される遺伝子プロモーターは、嫌気的条件下よりも好気的条件下で、所望の生体触媒ポリペプチドのより低い発現、結果的に遺伝子産物（生体触媒ポリペプチド）のより低い発現を可能にする。このような生体触媒ポリペプチドは、ブタノール生合成経路のアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）を被限定的に含んでなる。好気的または嫌気的条件によって影響される、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）プロモーター核酸配列は、表３に示される。実施形態では、プロモーターは、ＨＥＭ１３（配列番号１７６）プロモーターまたはその活性断片である。実施形態では、プロモーターは、ＨＥＳ１（配列番号１７７）プロモーターまたはその活性断片である。実施形態では、プロモーター核酸配列は、増殖期において、生合成経路ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのより低い発現を提供し、生産期においては、例えばアセトヒドロキシ酸シンターゼの発現増大を提供する。適切なプロモーター核酸配列は、本明細書で提供され、および／または当該技術分野で入手できる（Ｂｏｌｅｓ，Ｅ．，Ｗ．Ｌｅｈｎｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＡＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｎ  ｒｅｓｔｏｒｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｎ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｍｕｔａｎｔ．”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１７（１）：４６９−７７．Ｈｅｕｘ，Ｓ．，Ａ．Ｃａｄｉｅｒｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｌａｃｋｉｎｇ  ＰＧＩ１  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｔｒａｎｓｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｎｔｏｓｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ａｍｏｎｇ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｔｒａｉｎｓ．”ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．８（２）：２１７−２４．Ｋｒｅｓｎｏｗａｔｉ，Ｍ．Ｔ．，Ｗ．Ａ．ｖａｎ  Ｗｉｎｄｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）“Ｗｈｅｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｍｅｅｔｓ  ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ：ｆａｓｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｔｏ  ｓｕｄｄｅｎ  ｒｅｌｉｅｆ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ．”Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  ２：４９．Ｋｕｎｄａｊｅ，Ａ．，Ｘ．Ｘｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ａｎｄ  ｈｅｍｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．”ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．４（１１）：ｅ１０００２２４．Ｌａｉ，Ｌ．Ｃ．，Ａ．Ｌ．Ｋｏｓｏｒｕｋｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）“Ｄｙｎａｍｉｃａｌ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｍｓｎ２  ａｎｄ／ｏｒ  Ｍｓｎ４  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ａｎｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｅｄｉａ．”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２５（１０）：４０７５−９１．ｔｅｒ  Ｌｉｎｄｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｈ．Ｌｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｅｒｏｂｉｃ  ａｎｄ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｃｈｅｍｏｓｔａｔ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．”Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ．ｌ  １８１（２４）：７４０９−１３．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ，Ｊ．，Ｐ．Ｄａｒａｎ−Ｌａｐｕｊａｄｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｗｉｔｃｈ：ｄｙｎａｍｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａｎａｅｒｏｂｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｅｘｃｅｓｓ．”ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ９：１００．Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｍ．Ｐｉｅｒｃｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）“Ｒａｓ  ａｎｄ  Ｇｐａ２  ｍｅｄｉａｔｅ  ｏｎｅ  ｂｒａｎｃｈ  ｏｆ  ａ  ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．”ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ２（５）：Ｅ１２８）。本発明で有用なプロモーター核酸配列としては、酸素濃度感受性を与えまたは増大させる、本明細書で提供される配列を含んでなるもの、および変異体、断片または誘導体を含めた、表３で示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含んでなるものが挙げられる。実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号７７５［ＡＮＢ１］、７７６［ＴＩＲ１］、７７７［ＨＥＭ１３］、または７７８［ＨＥＳ１］またはその変異体、断片、または誘導体と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｌｓＳ（配列番号１）またはその活性断片と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を含んでなる。
【０１３５】
【表６】
2015503351.tif 000007
【０１３６】
【表７】
2015503351.tif 000008
【０１３７】
別の実施形態では、プロモーター核酸配列は、嫌気的条件下よりも好気的条件下で、所望のポリヌクレオチドのより低い発現、結果的にコードされた生成物のより低い発現を可能にする。このようなポリヌクレオチドは、イソ酪酸またはＤＨＭＢなどのブタノール生合成経路副産物を生成してもよいポリペプチドを、被限定的に含んでなる。列このような条件によって影響されるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）プロモーター核酸配は、表４に示される。実施形態では、プロモーター核酸配列は、増殖期において、副産物生成ポリペプチドをコードする遺伝子のより低い発現を提供し、生産期において、例えばＹＭＲ２２６Ｃ、またはＡＬＤ６をはじめとするが、これに限定されるものではない、アルデヒドデヒドロゲナーゼなどのより低い発現を提供する。本発明で有用なプロモーター核酸配列は、酸素濃度感受性を与えまたは増大させる、本明細書で提供されるもの、および変異体、断片または誘導体を含めた、表４のヌクレオチド配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含んでなるものを含んでなる。
【０１３８】
【表８】
2015503351.tif 000009
【０１３９】
【表９】
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【０１４０】
【表１０】
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【０１４１】
グルコース
実施形態では、増殖期と生産期の間の識別条件は、増殖期における低いグルコース濃度の存在と、生産期における過剰なグルコースの存在である。その結果「高い」対「低い」グルコース濃度を使用して、増殖期対生産期における生体触媒ポリペプチド発現を発現／抑制し得る。それらの発現が差次的に制御される、このような対象生体触媒ポリペプチドの例としては、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＺＷＦ１）、ホスホケトラーゼ（ＸＰＫ）、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１４２】
Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のヘキソース輸送体遺伝子ファミリーは、糖輸送体遺伝子ＨＸＴ１〜ＨＸＴ１７、ＧＡＬ２、およびグルコースセンサー遺伝子ＳＮＦ３およびＲＧＴ２を含有する。ＨＸＴ１〜ＨＸＴ４およびＨＸＴ６〜ＨＸＴ７によってコードされるタンパク質は、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の主なヘキソース輸送体と見なされる。ＨＸＴグルコース輸送体遺伝子の大部分の発現は、グルコース濃度に依存することが知られている（Ｏｚｃａｎ，Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９９９）。“Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｈｅｘｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ．”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６３（３）：５５４−６９）。その結果、「高い」または「低い」グルコース濃度下における遺伝子の差次的発現のために、それらのプロモーターが本明細書で提供される。
【０１４３】
実施形態では、グルコース制限条件下でのより高い発現、およびグルコース過剰条件下でのおよびより低い発現のために、ＨＸＴ２（配列番号３８４）、ＨＸＴ５（配列番号３６０）、ＨＸＴ６（配列番号３８６）、またはＨＸＴ７（配列番号３３１）のプロモーター領域からの配列を含んでなる、プロモーター核酸配列が用いられる。ＨＸＴ５、ＨＸＴ６およびＨＸＴ７はまた、ＨＸＴ２とは対照的に、エタノール上での成長時に強力な発現を示す（Ｄｉｄｅｒｉｃｈ，Ｊ．Ａ．，Ｓｃｈｅｐｐｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）。“Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＸＴ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｏｓｔａｔ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２２）：１５３５０−９。異なる酸素条件下では、ＨＸＴ５およびＨＸＴ６発現が変動性を示したことが報告されている（Ｒｉｎｔａｌａ，Ｅ．，Ｍ．Ｇ．Ｗｉｅｂｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）。“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｘｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｉｓ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｏｘｙｇｅｎ  ｐｒｏｖｉｓｉｏｎ．”ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．ｌ  ８：５３）が、本開示の知識を持つ当業者は、所望の生産工程に適切な条件下で、このようなプロモーターコンストラクトを容易に作成して試験できる。本発明で有用なプロモーター核酸配列は、酸素濃度感受性を与えまたは増大させる、本明細書で提供されるもの、および変異体、断片または誘導体を含めた、ＨＸＴ２（配列番号３８４）、ＨＸＴ５（配列番号３６０）、ＨＸＴ６（配列番号３８６）、またはＨＸＴ７（配列番号３３１）のヌクレオチド配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を含んでなるものを含んでなる。実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号７７２［ＨＸＴ５］または７７３［ＨＸＴ７］または断片またはその誘導体と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｌｓＳ（配列番号１）またはその活性断片と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を含んでなる。
【０１４４】
実施形態では、ＨＸＴ１は、グルコースベースの遺伝子発現制御のためのプロモーターであり、高グルコース条件下で高度発現を提供する。ＨＸＴ３は、有望なプロモーター強度を有してもよいが、非常に低いグルコース濃度下でいくらかの低い発現もまた示してもよい（Ｂｒａｕｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｃ．Ｈｕｔｔｅｎｈｏｗｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）。“Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅ，ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ，ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．”Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １９（１）：３５２−６７）。本開示の知識を持つ当業者は、所望の生産工程に適切な条件下で、プロモーターコンストラクトを作成して適切さを試験できる。したがって本発明で有用なプロモーター核酸配列は、酸素濃度感受性を与えまたは増大させる、本明細書で提供されるもの、および変異体、断片または誘導体を含めた、ＨＸＴ１（配列番号１６８）、ＨＸＴ３（配列番号１６９）、ＨＸＴ４（配列番号３８８）、またはＥＮＯ２（配列番号１７３）のヌクレオチド配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を含んでなるものを含んでなる。実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号７６８［ＨＸＴ３］、７６９［ＨＸＴ１］、または７１１［ＨＸＴ１プロモーター核酸配列を含んでなる雑種プロモーター］またはその断片または誘導体と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｌｓＳ（配列番号１）またはその活性断片と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を含んでなる。
【０１４５】
ｐＨ
本明細書で開示されるように、いくつかの実施形態では、増殖期と生産期の間の識別条件はｐＨである。実施形態では、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＫＬ０９６Ｗ−Ａ（ＣＷＰ２）プロモーター（配列番号３８９）またはＹＥＲ１５０Ｗ（ＳＰＩ１）プロモーター（配列番号１９０）からのプロモーター核酸配列を用いて、異なる時期においてｐＨが異なる工程の差次的発現を制御した。本開示の知識を持つ当業者は、所望の生産工程に適切な条件下で、プロモーターコンストラクトを作成して適切さを試験できる。したがって本発明で有用なプロモーター核酸配列としては、ｐＨ感受性を与えまたは増大させる、本明細書で提供されるもの、および変異体、断片または誘導体を含めた、配列番号３８９または配列番号１９０）のヌクレオチド配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるものが挙げられる。
【０１４６】
温度
本明細書で開示されるように、いくつかの実施形態では、増殖期と生産期の間の識別条件は温度である。実施形態では、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＹＢＲ０２７Ｗプロモーター（ＨＳＰ２６）（配列番号３９１）からの、またはＹＬＬ０２６Ｗ（ＨＳＰ１０４）プロモーター（配列番号３９２）からのプロモーター核酸配列を用いて、異なる時期において温度が異なる工程の差次的発現を制御した。温度感受性プロモーターおよび候補温度感受性プロモーターは、当該技術分野でもまた入手できる（Ｂｅｃｅｒｒａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐ  Ｆｕｎｃ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２００３）４（４）：３６６−７５  ａｎｄ  Ａｌ−Ｆａｇｅｅｈ，ＭＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ（２００６）３９７（２）：２４７−５９，ｂｏｔｈ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）。本開示の知識を持つ当業者は、所望の生産工程に適切な条件下で、プロモーターコンストラクトを作成して適切さを試験できる。したがって本発明で有用なプロモーター核酸配列としては、温度感受性を与えまたは増大させる、本明細書で提供されるもの、および変異体、断片または誘導体を含めた、配列番号３９１または配列番号３９２のヌクレオチド配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一
であるものが挙げられる。
【０１４７】
ブタノール
本明細書で開示されるように、いくつかの実施形態では、増殖期と生産期の間の識別条件は、ブタノールまたは２−ブタノンなどの発酵産物の濃度である。実施形態では、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＯＬ１５１Ｗ（ＧＲＥ２）プロモーター（配列番号３９３）からの、またはＹＯＲ１５３Ｗ（ＰＤＲ５）プロモーター（配列番号３９４）からのプロモーター核酸配列を用いて、異なる時期においてブタノールのレベルが異なる工程の差次的発現を制御した。本開示の知識を持つ当業者は、所望の生産工程に適切な条件下で、プロモーターコンストラクトを作成して適切さを試験できる。したがって本発明で有用なプロモーター核酸配列としては、ブタノール濃度感受性を与えまたは増大させる、本明細書で提供されるもの、および変異体、断片または誘導体を含めた、配列番号３９３または配列番号３９４のヌクレオチド配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるものが挙げられる。
【０１４８】
雑種プロモーター
２つ以上のプロモーター領域からの核酸配列を含んでなる「雑種プロモーター」を構築して、本明細書の実施形態では用い得ることが理解されるであろう。
【０１４９】
例えば培地中の溶存酸素レベルを通じて、追加的な陰性対照トリガーを追加するために、Ｒｏｘ１結合部位（例えば「ＡＴＴＧＴ」）またはＲｏｘ１結合部位を含んでなる配列（例えば配列番号３９５）（Ｂａｄｉｓ，Ｇ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ（２００８）３２（６）：８７８−８７；Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９９３）１３９１０）６０７１−８）を、対象遺伝子の調節配列（例えばプロモーター）またはコード配列のいずれかに付加し得る。Ｒｏｘ１結合部位は、生物情報学分析（ＭａｃＩｓａａｃ，Ｋ．Ｄ．，Ｔ．Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．“Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍａｐ  ｏｆ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．”ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ７：１１３）に基づいて、ＨＸＴ１プロモーターに既に存在してもよく、Ｒｏｘ１およびその他の転写モチーフは、例えばＢａｄｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ（２００８）３２（６）：８７８−８７に記載される。転写因子モチーフはまた、ＴＲＡＮＳＦＡＣデータベース（Ｍａｔｙｓ  Ｖ，  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００３）３１（１）：３７４−８）にも見られる。
【０１５０】
雑種プロモーター核酸配列は、ＦＢＡ１プロモーター配列（配列番号７７９）またはその変異体、断片または誘導体を含んでなってもよい。一実施形態では、雑種プロモーター核酸配列は、ＦＢＡ１（配列番号７７９または配列番号７７０）またはその変異体、断片または誘導体と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含んでなる。一実施形態では、雑種プロモーター核酸配列は、ＨＸＴ１（配列番号１６８）またはＤＡＮ１（配列番号１８６）プロモーターまたはその変異体、断片または誘導体と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含んでなる。実施形態では、プロモーター核酸配列は、Ｐ［ＦＢＡ１：：ＤＡＮ１＿ＡＲ３１４）（配列番号６８６）またはその変異体、断片または誘導体と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、プロモーター核酸配列は、Ｐ［ＦＢＡ１：：ＨＸＴ１＿３３１］（配列番号７１１）またはその変異体、断片または誘導体と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を含ん
でなる。
【０１５１】
実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｌｓＳ（配列番号１）またはその活性断片と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を含んでなる。
【０１５２】
実施形態では、発現コンストラクトは、配列番号７１１を含んでなり、または配列番号１と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなり、または双方を含んでなる。実施形態では、発現コンストラクトは、配列番号７９０と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を含んでなる。実施形態では、組換え宿主細胞は、このような発現コンストラクトを含んでなり、イソブタノール生合成経路をさらに含んでなってもよい。実施形態では、このような組換え宿主細胞は、イソブタノールが生成されて任意選択的に回収される条件下で、それを炭素基質と接触させる方法で用いてもよい。
【０１５３】
追加的な適切な遺伝的スイッチの同定および単離：「プロモーター探査」
本明細書で提供されるのは、細胞環境変化に対して感受性である、すなわち特定条件下で優先的に遺伝子発現を増大または低下させる、プロモーター核酸配列を同定する方法である。本明細書で開示されるいくつかの実施形態では、プロモーターの選択過程は、選択増殖条件下で成長した微生物細胞と、選択生産条件下で成長した微生物細胞の間のＲＮＡ転写物の比較を伴う。生産期との比較で、増殖期において、上方制御または下方制御されるＲＮＡ転写物と関連付けられているプロモーターが、本発明で使用するのに適する。増殖期との比較で、生産期において、上方制御または下方制御されるＲＮＡ転写物と関連付けられているプロモーターもまた、本発明で使用するのに適する。
【０１５４】
本発明の別の実施形態は、
（ａ）増殖条件下で微生物を培養するステップと；
（ｂ）（ａ）で培養された微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｃ）生産条件下で微生物を培養するステップと；
（ｄ）（ｃ）で培養された微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｅ）（ｂ）の対応する単離リボ核酸分子より高いレベルで発現される（ｄ）の単離リボ核酸分子のみを選択するステップと；
（ｆ）（ｅ）で選択されたリボ核酸分子の発現に関連するプロモーターのポリヌクレオチド配列を判定するステップと
を含んでなる、発酵の生産期において優先的に発現される候補プロモーター配列をスクリーニングする方法を対象とする。
【０１５５】
本発明の別の実施形態は、
（ａ）増殖条件下で微生物を培養するステップと；
（ｂ）（ａ）で培養された微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｃ）生産条件下で微生物を培養するステップと；
（ｄ）（ｃ）で培養された微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｅ）（ｂ）の対応する単離リボ核酸分子より低いレベルで発現される（ｄ）の単離リボ核酸分子のみを選択するステップと；
（ｆ）（ｅ）で選択されたリボ核酸分子の発現に関連するプロモーターのポリヌクレオチド配列を判定するステップと
を含んでなる、発酵の生産期において優先的により少なく転写される候補プロモーター配列をスクリーニングする方法を対象とする。
【０１５６】
本発明の別の実施形態は、
（ａ）増殖条件下で微生物を培養するステップと；
（ｂ）（ａ）で培養された微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｃ）生産条件下で微生物を培養するステップと；
（ｄ）（ｃ）で培養された微生物からリボ核酸分子を単離するステップと；
（ｅ）（ｂ）の対応する単離リボ核酸分子より高いレベルで発現される（ｄ）の単離リボ核酸分子のみを選択するステップと；
（ｆ）（ｅ）で選択されたリボ核酸分子の発現に関連するプロモーターのポリヌクレオチド配列を判定するステップと
を含んでなる、バイオマス増殖期において優先的に抑制される候補プロモーター配列をスクリーニングする方法を対象とする。
【０１５７】
一実施形態では、（ｂ）および（ｄ）で単離されるリボ核酸分子は、レポーターコンストラクトに導入される。特定の実施形態では、（ｂ）および（ｄ）で単離されるリボ核酸分子は、蛍光レポーターコンストラクトに導入される。一実施形態では、蛍光レポーターコンストラクトは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する。別の実施形態では、増殖条件は、低濃度の発酵性炭素基質を含んでなる発酵培地中で、微生物を培養するステップを含んでなり、生産条件は、高濃度の同一発酵性炭素基質を含んでなる発酵培地中で、微生物を培養するステップを含んでなる。特定の実施形態では、発酵性炭素基質は、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、脂肪酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される。実施形態では、増殖条件は、高濃度の溶存酸素を含んでなる発酵培地中で、微生物を培養するステップを含んでなり、生産条件は、低濃度の溶存酸素を含んでなる発酵培地中で、微生物を培養するステップを含んでなる。
【０１５８】
別の実施形態では、本発明で使用するためのプロモーター核酸配列を同定する方法は、候補核酸配列の文献検索を実施するステップをさらに含んでなる。例えばＬｉＢ．−Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：４３−５５（２０１０）などの文献参照は、流加発酵において、いずれの遺伝子が発現されるかに関する情報を提供する。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．は、工業的エタノール発酵から採取した酵母の転写プロファイルを調べた（８０％コーンマッシュおよび２０％穀物マッシュを原材料として使用する、連続法および流加法の双方）。彼らは、種培養段階、初期「主」発酵、および後期主発酵において、試料を採取した。彼らは、貯留性炭水化物の代謝とタンパク質折り畳み（折り畳まれていないタンパク質の応答）とに関与する遺伝子の強力な上方制御を発見した。彼らは、残留グルコースが高くても（連続およびバッチプロセスにおいて、それぞれ１５および２３ｇ／Ｌ）、グルコース抑制遺伝子（例えば別のヘキソキナーゼイソ酵素をコードするＨＸＫ１およびＧＬＫ１；糖新生遺伝子；高親和性グルコース輸送体）の抑制と、ＨＸＫ２の下方制御とを検出した。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．によって観察されたＨＸＫ２応答は、下で考察される実施例における、プロモーター探査実験で観察されたものと異なる。
【０１５９】
好気的条件から嫌気的条件への移行に対して、酵母がいかに迅速に応答するかという遺伝的側面を理解することは、いずれの酸素感受性プロモーター核酸配列が、本発明で潜在的に適切であり得るかという、いくらかの指標を提供してもよい。全ゲノムレベルでは、発酵機能が誘導され、呼吸発酵代謝、細胞周期、および翻訳における活性が下方制御される。関与する主な５つの転写調節ネットワークとしては、Ｍｓｎ２／４、Ｈａｐ１、Ｒｏｘ１、Ｈａｐ２／３／４／５、およびＵｐｃ２ネットワークが挙げられる。一研究では、嫌気的生活と引き続く再酸素化に対するゲノム規模応答には、グルコース培養細胞中の１，６０３個の遺伝子が関与する。Ｋｗａｓｔ  Ｋ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２０１：１１７７−１１９５（１９９８）；Ｋｗａｓｔ  Ｋ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２５０−２５６（２００２）；およびＬａｉ  Ｌ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５：４０７５−４０９１（２００５）を参照されたい。
【０１６０】
いくつかのバイオマス生産では、一定規模の工程を好気的でなく微好気的と説明してもよく、これは完全嫌気的条件に対する転写応答の帯域を狭めてもよい。しかしこの範囲内では、少数の研究のみが実施されている。一研究では、十分なおよび制限レベルのＯ２を提供して、恒成分培養槽内で、（大部分が炭素代謝に関与する）６０個の遺伝子パネルの転写物レベルがモニターされ；酸素可用性の低下と共に、全転写物存在量が減少したことが分かった。微好気的条件との比較で、嫌気培養中では、ＰＹＣ１（をコードするピルビン酸カルボキシラーゼ）およびＧＰＰ１（をコードするグリセロールリン酸ホスファターゼ）転写物のみが増大した。（微）好気的条件を嫌気的条件に切り替えた際、ペントースリン酸経路からの３つの遺伝子（ＴＫＬ１、ＴＡＬ１、およびＹＧＲ０３２Ｃ）、呼吸遺伝子ＣＯＸ５ｂ、および糖新生遺伝子ＭＤＨ２およびＰＣＫ１をはじめとする、少数の遺伝子の発現は有意に増大した。Ｗｉｅｂｅ  Ｍ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．８：１４０−１５４（２００８）を参照されたい。同等の培養物に対する全ゲノムマイクロアレイ試験は、実施されていない。
【０１６１】
嫌気的から好気的条件への、その他のネットワーク応答については記載されており、Ｙａｐ１ネットワークの活性化（ａｃｔｉｖｉａｔｉｏｎ）およびヘム調節ネットワークの活性化が挙げられる（Ｌａｉ  ＬＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｃｅｌｌ．２００６  Ｓｅｐ；５（９）：１４６８−８９）。
【０１６２】
実施形態では、本発明で使用するのに適するプロモーター核酸配列は、［ＭＳＮ２］、［ＭＳＮ４］、［ＨＡＰ１］、［ＲＯＸ１］、［ＨＡＰ２］、［ＨＡＰ３］、［ＨＡＰ４］、［ＨＡＰ５］、［ＵＰＣ２］、［ＰＹＣ１］、［ＧＰＰ１］、［ＴＫＬ１］、［ＴＡＬ１］、［ＹＧＲ０３２Ｃ］、［ＣＯＸ５ｂ］、［ＭＤＨ２］、［ＹＨＲ２１０］、および［ＰＣＫ１］からなる群から選択される配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含んでなる。実施形態では、本発明で使用するのに適するプロモーター核酸配列は、［ＭＳＮ２］、［ＭＳＮ４］、［ＨＡＰ１］、［ＲＯＸ１］、［ＨＡＰ２］、［ＨＡＰ３］、［ＨＡＰ４］、［ＨＡＰ５］、［ＵＰＣ２］、［ＰＹＣ１］、［ＧＰＰ１］、［ＴＫＬ１］、［ＴＡＬ１］、［ＹＧＲ０３２Ｃ］、［ＣＯＸ５ｂ］、［ＭＤＨ２］、［ＹＨＲ２１０］、および［ＰＣＫ１］またはその変異体、断片または誘導体からなる群から選択され得る。
【０１６３】
本開示の知識を持つ当業者は、このような微生物の増殖および生産に適切な条件を使用して、本明細書の他の箇所で開示される組換え宿主細胞などのあらゆる微生物に、本明細書に記載されるスクリーニング法を実施できる。実施形態では、微生物は酵母微生物である。
【０１６４】
例えばその株のために、および使用される発酵槽規模のために、開発された発酵工程を使用した、イソブタノール生産のために、当該技術分野で公知のまたは本明細書で開示されるイソブタノール産生菌酵母株を使用してもよい。工程は、（ｉ）炭素源原材料（例えば甜菜糖蜜）上でバイオマスが高収率で形成されるバイオマス生産期、および（ｉｉ）炭素源原材料（例えばコーンマッシュ）がイソブタノールに発酵される発酵期を含んでもよい。工程全体にわたり間隔を置いて発酵槽から採取された培養ブロスが、生産期および発酵期双方の初期、中期、および後期の時点を含むサンプルを提供する。採取された細胞は、迅速に冷却され、遠心分離によってブロスから回収され得る。次に当該技術分野で公知の方法によって（例えばＴｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ  ＮＹを使用して）、ＲＮＡを細胞ペレットから抽出し得て、標準法を使用する（例えばＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ２１００；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＣＡを用いる）ＲＮＡ分析がそれに続き、１．８以上のｒＲＮＡピーク比が判定される。
【０１６５】
次に例えばＲＮＡ−Ｓｅｑなどの当業者に知られている方法を使用して、全トランスクリプトーム分析（全トランスクリプトームショットガン配列決定としてもまた知られている）を実施し得る。各時点からのＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）技術を使用してｍＲＮＡから濃縮し得る。次に濃縮プールをｃＤＮＡに逆転写し、次にそれを配列法で使用するのに適切な長さに断片化する。次に配列決定のために断片化ｃＤＮＡを作成し（例えば増幅してライブラリーを作成する）、次に断片のＤＮＡ配列を判定する。得られた生データセットは、多数の（典型的に数百万の）各時点の短い配列読み取りから構成されてもよい。次に生物情報学分析を実施して（ｅｒｆｏｒｍｅｄ）例えば当該技術分野で入手できる参照ゲノム配列の使用によって、これらの配列を整列させる。次に適切な配列カバー度で、発酵工程全体にわたる各サンプル時点について、ゲノム中の全ての遺伝子の読み取り深度を判定する。当該技術分野で公知の生物情報学法を使用して、これらを遺伝子発現レベルの数値的記述に変換する。特定の発現パターンがある遺伝子は、基準点と比較して、様々な時点における、転写物群の変化倍数を報告する、クラスター分析などの方法によって確認される（例えば基準は、生産期の最終時点であり得る）。例えばバイオマス生産期全体にわたり低含量で、発酵期中（または少なくとも発酵期の特定期間中）に高存在量のものなどの、可能な効用特性がある遺伝子が同定される。次にこれらの遺伝子のプロモーターに対応する核酸配列を、発酵工程における異種遺伝子の調節される予測可能発現候補として試験し得る。それらはさらに改変し得て；例えばそれらの中の調節因子をその他のプロモーター（例えば強力な解糖作用プロモーター）に移して、それらに同定された遺伝子の調節特性を与え得る。
【０１６６】
生体触媒ポリペプチド
本明細書で開示されるポリヌクレオチド、組換え宿主細胞、および方法の１つの望ましい特徴は、成長期中のブタノール生成経路酵素を通じた流動に起因する、阻害性副産物の蓄積を回避し得ることである。イソブタノール生合成経路酵素によって生成される阻害性副産物の非限定的例は、イソ酪酸である。イソブタノール生合成経路酵素によって生成される阻害性副産物の別の非限定的例は、イソブチルアルデヒドである。イソブタノール生合成経路酵素によって生成される阻害性副産物のさらに別の非限定的例は、酢酸である。いくつかのアセト乳酸シンターゼ酵素は、顕著なオキシゲナーゼ副反応を示し、その中では、分子酸素が高度に反応性のカルバニオン／エナミンを求電子的に攻撃して、ＴｈＤＰおよび過酢酸を分解するペルオキシ付加物が形成される。Ｔｓｅ，Ｍ．Ｔ．ａｎｄ  Ｓｃｈｌｏｓｓ，Ｊ．Ｖ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１０３９８−１０４０３（１９９３）を参照されたい。過酢酸は、ピルビン酸とさらに反応して、２モルの酢酸エステルを形成し得る。成長阻害効果、および副産物の存在によって生じるストレスを撃退するための代謝エネルギー損失に加えて、副産物のために失われる炭素は、用いられる炭素基質上の生体触媒のより低い収率に寄与する。
【０１６７】
いくつかの実施形態の別の望ましい特徴は、酸素供給がある場合、ピルビン酸に至る代謝経路で生成する還元当量が、ブタノール生合成経路などの生合成経路でなく呼吸系によって、より高い割合に酸化され得ることである。ピルビン酸のより高い割合は、ミトコンドリア膜を移行して、ピルビン酸デヒドロゲナーゼおよびトリカルボン酸回路によってさらに代謝され得る。いくつかの実施形態の別の望ましい特徴は、酸素供給がない場合、ピルビン酸に至る代謝経路で生成する還元当量がブタノール生成経路によって酸化され、より低い割合がグリセロール生成経路によって酸化されてもよいことである。このようにして、グリセロールのより低い収率と、ブタノールのより高い収率が達成されてもよい。
【０１６８】
いくつかの実施形態のさらに別の望ましい特徴は、過剰なピルビン酸が生成した場合、ピルビン酸が培地中に排出され得ることである。ｖａｎ  Ｍａｒｉｓ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｉｏｂｉｏｌ．７０：１５９−１６６（２００４）を参照されたい。しかしピルビン酸は、非常に高い濃度でさえも、成長を阻害しない。
【０１６９】
このような望ましい（ｄｅｓｉｒｅａｂｌｅ）特徴は、本明細書で提供される組成物および方法を使用して、達成し得る。例えば実施例に示されるように、本明細書の組成物および方法は、生産期において、イソブタノール生産経路のアセト乳酸シンターゼの優先的な発現を提供する。
【０１７０】
一実施形態では、本発明の単離ポリヌクレオチドによってコードされる生体触媒ポリペプチドは、宿主細胞に発酵産物耐性を与える。別の実施形態では、本発明の単離ポリヌクレオチドによってコードされる生体触媒ポリペプチドは、宿主細胞に発酵副産物耐性を与える。一実施形態では、単離ポリヌクレオチドによってコードされる生体触媒ポリペプチドは、宿主細胞にブタノール耐性を与える。別の実施形態では、単離ポリヌクレオチドによってコードされる生体触媒ポリペプチドは、宿主細胞にイソブチルアルデヒド耐性を与える。別の実施形態では、単離ポリヌクレオチドによってコードされる生体触媒ポリペプチドは、宿主細胞にイソ酪酸耐性を与える。別の実施形態では、単離ポリヌクレオチドによってコードされる生体触媒ポリペプチドは、宿主細胞に酢酸耐性を与える。
【０１７１】
生合成経路
使用されてもよいイソブタノール生産のための生合成経路としては、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，８５１，１８８号明細書に記載されるものが挙げられる。一実施形態では、イソブタノール生合成経路は、
−ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からアセト乳酸への；
−ｂ）例えばアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼによって触媒されてもよい、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への；
−ｃ）例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されてもよい２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への；
−ｄ）例えば分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒されてもよい、α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換；および
−ｅ）例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなる。
【０１７２】
別の実施形態では、イソブタノール生合成経路は、
−ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からアセト乳酸への；
−ｂ）例えばケトール酸レダクトイソメラーゼによって触媒されてもよい、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への；
−ｃ）例えばジヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されてもよい、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への；
−ｄ）例えばトランスアミナーゼまたはバリンデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、α−ケトイソ吉草酸からバリンへの；
−ｅ）例えばバリンデカルボキシラーゼによって触媒されてもよい、バリンからイソブチルアミンへの；
−ｆ）例えばω−トランスアミナーゼによって触媒されてもよい、イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの；および
−ｇ）例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなる。
【０１７３】
別の実施形態では、イソブタノール生合成経路は、
−ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からアセト乳酸への；
−ｂ）例えばアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼによって触媒されてもよい、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への；
−ｃ）例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されてもよい、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への；
−ｄ）例えば分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡへの；
−ｅ）例えばアシル化（ａｃｅｌｙｌａｔｉｎｇ）アルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの；および
−ｆ）例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなる。
【０１７４】
別の実施形態では、イソブタノール生合成経路は、図２でステップｋ、ｇ、およびｅとして示される、基質から生成物への変換を含んでなる。
【０１７５】
使用されてもよい１−ブタノール生産のための生合成経路としては、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８号明細書に記載されるものが挙げられる。一実施形態では、１−ブタノール生合成経路は、
−ａ）例えばアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによって触媒されてもよい、アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへの；
−ｂ）例えば３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの；
−ｃ）例えばクロトナーゼによって触媒されてもよい、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへの；
−ｄ）例えばブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへの；
−ｅ）例えばブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへの；および
−ｆ）例えばブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなる。
【０１７６】
使用されてもよい２−ブタノール生産のための生合成経路としては、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０号明細書および米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書に記載されるものが挙げられる。一実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、
−ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からα−アセト乳酸への；
−ｂ）例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されてもよい、α−アセト乳酸からアセトインへの；
−ｃ）例えばアセトニン（ａｃｅｔｏｎｉｎ）アミナーゼによって触媒されてもよい、アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの；
−ｄ）例えばアミノブタノールキナーゼによって触媒されてもよい、３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールホスフェートへの；
−ｅ）例えばアミノブタノールホスフェートホスホリラーゼによって触媒されてもよい、３−アミノ−２−ブタノールホスフェートから２−ブタノンへの；および
−ｆ）例えばブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、２−ブタノンから２−ブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなる。
【０１７７】
別の実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、
−ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からα−アセト乳酸への；
−ｂ）例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されてもよい、α−アセト乳酸からアセトインへの；
−ｃ）例えばブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、アセトインから２，３−ブタンジオールへの；
−ｄ）例えばダイアル（ｄｉａｌ）デヒドラターゼによって触媒されてもよい、２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの；および
−ｅ）例えばブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、２−ブタノンから２−ブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなる。
【０１７８】
使用されてもよい２−ブタノンの生成のための生合成経路としては、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０号明細書および米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書に記載されるものが挙げられる。一実施形態では、２−ブタノン生合成経路は、
−ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からα−アセト乳酸への；
−ｂ）例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されてもよい、α−アセト乳酸からアセトインへの；
−ｃ）例えばアセトニンアミナーゼによって触媒されてもよい、アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの；
−ｄ）例えばアミノブタノールキナーゼによって触媒されてもよい、３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールホスフェートへの；および
−ｅ）例えばアミノブタノールホスフェートホスホリラーゼによって触媒されてもよい、３−アミノ−２−ブタノールホスフェートから２−ブタノンへの
基質から生成物への変換を含んでなる。
【０１７９】
別の実施形態では、２−ブタノン生合成経路は、
−ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からα−アセト乳酸への；
−ｂ）例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されてもよい、α−アセト乳酸からアセトインへの；
−ｃ）例えばブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、アセトインから２，３−ブタンジオールへの；
−ｄ）例えばジオールデヒドラターゼによって触媒されてもよい、２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの
基質から生成物への変換を含んでなる。
【０１８０】
本発明の一実施形態は、
（ａ）プロモーター核酸配列；および
（ｂ）生体触媒ポリペプチドをコードする核酸配列
を含んでなる、単離ポリヌクレオチドを対象とし；（ｂ）の核酸配列は、発酵の生産期において、生体触媒ポリペプチドが優先的に発現されるように、（ａ）の核酸配列と共役される。一実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、ブタノールまたは２−ブタノン生合成経路において、基質から産物への変換を触媒する。
【０１８１】
本発明の別の実施形態は、
（ａ）プロモーター核酸配列；および
（ｂ）生体触媒ポリペプチドをコードする核酸配列
を含んでなる、単離ポリヌクレオチドを対象とし；（ｂ）の核酸配列は、増殖期において、生体触媒ポリペプチドが優先的に抑制されるように、（ａ）の核酸配列と共役される。
【０１８２】
別の実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、以下の酵素番号を有する酵素群を含んでなり、またはそれから選択される：ＥＣ  ２．２．１．６、ＥＣ  １．１．１．８６、ＥＣ  ４．２．１．９、ＥＣ  ４．１．１．７２、ＥＣ  １．１．１．１、ＥＣ  １．１．１．２６５、ＥＣ  １．１．１．２、ＥＣ  １．２．４．４、ＥＣ  １．３．９９．２、ＥＣ  １．２．１．５７、ＥＣ  １．２．１．１０、ＥＣ  ２．６．１．６６、ＥＣ  ２．６．１．４２、ＥＣ  １．４．１．９、ＥＣ  １．４．１．８、ＥＣ  ４．１．１．１４、ＥＣ  ２．６．１．１８、ＥＣ  ２．３．１．９、ＥＣ  ２．３．１．１６、ＥＣ  １．１．１３０、ＥＣ  １．１．１．３５、ＥＣ  １．１．１．１５７、ＥＣ  １．１．１３６、ＥＣ  ４．２．１．１７、ＥＣ  ４．２．１．５５、ＥＣ  １．３．１．４４、ＥＣ  １．３．１．３８、ＥＣ  １．３．１．４４、ＥＣ  １．３．１．３８、ＥＣ  ５．４．９９．１３、ＥＣ  ４．１．１．５、ＥＣ  １．１．１．１、２．７．１．２９、１．１．１．７６、および４．２．１．２８、または酵素アセトニンアミナーゼ、アセトインリン酸アミナーゼ、アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼ、およびアミノブタノールキナーゼ。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への基質から産物への変換を触媒する生体触媒ポリペプチド、および／またはイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドは、補助因子としてＮＡＤＨを利用する。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、生合成経路からの酵素は細胞質ゾルに局在化する。いくつかの実施形態では、通常はミトコンドリアに局在化する生合成経路からの酵素が、細胞質ゾルに局在化する。いくつかの実施形態では、ミトコンドリア標的配列を除去することで、生合成経路からの酵素が細胞質ゾルに局在化する。いくつかの実施形態では、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，８５１，１８８号明細書に記載される新しい開始コドンを作成することで、ミトコンドリア標的が除去される。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、生体触媒ポリペプチドはＫＡＲＩである。いくつかの実施形態では、ＫＡＲＩは、補助因子としてＮＡＤＨを優先的に利用する。いくつかの実施形態では、生体触媒ポリペプチドはＡＤＨである。いくつかの実施形態では、ＡＤＨは、補助因子としてＮＡＤＨを優先的に利用する。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、生体触媒ポリペプチドはＫＩＶＤであり、いくつかの実施形態では（ｉｓ  ｓｏｍｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）、生体触媒ポリペプチドはＤＨＡＤである。いくつかの実施形態では、生体触媒ポリペプチドはＡＬＳである。
【０１８７】
上述の基質から産物への変換のために、ならびに追加的なイソブタノール経路のために、使用し得る遺伝子およびポリペプチドは、本明細書で記載され、例えば全て参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書、国際公開第２０１１／０１９８９４号パンフレット、および国際公開第２０１２／１２９５５５号パンフレットなど、当該技術分野で記載される。米国特許出願公開第２０１１／０１９８９４号明細書、米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書、米国特許出願公開第２０１０００８１１５４号明細書は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（配列番号７９４）およびストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）（配列番号７９３）および例えばＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）Ｉ２Ｖ５（配列番号７９２）などのその変異体からのものをはじめとする、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼを記載する。ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼとしては、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（配列番号７９５）、マクロコッカス・カセオリティカス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（配列番号７９７）およびリステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）（配列番号７９６）に由来するものが挙げられる。参照によって援用する、米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書および米国特許出願公開第２０１１０２６９１９９号明細書は、アルコールデヒドロゲナーゼについて記載する。アルコールデヒドロゲナーゼとしては、参照によって本明細書に援用する米国特許第８，１８８，２５０号明細書で開示されるアクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）（配列番号７９８）からのＳａｄＢが挙げられる。さらにアルコールデヒドロゲナーゼとしては、ウマ肝臓ＡＤＨ（配列番号７９９）およびベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨ（配列番号８００）、および補助因子としてＮＡＤＨを利用するものが挙げられる。ＫＡＲＩ酵素は、例えばそれらの全てを参照によって援用する、米国特許第７，９１０、３４２号明細書および米国特許第８，１２９，１６２号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０１９７５１９号明細書；国際公開第２０１２／１２９５５５号パンフレットに記載される。ＫＡＲＩとしては、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＫＡＲＩ（配列番号８０１）およびその変異体およびアナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）ＫＡＲＩ（配列番号８０２）およびその変異体（例えば「Ｋ９Ｇ９」、「Ｋ９Ｄ３」、および「Ｋ９ＪＢ４Ｐ」；それぞれ配列番号１６７、１６６、および７９１）が挙げられる。一実施形態では、ブタノール生合成経路は、ａ）ＮＡＤＨに対して、約３００μＭ未満、約１００μＭ未満、約５０μＭ未満、約２０μＭ未満または約１０μＭ未満のＫＭを有する、ケトール酸レダクトイソメラーゼ；ｂ）補助因子としてＮＡＤＨを利用するアルコールデヒドロゲナーゼ；または��）ａ）およびｂ）の双方を含んでなる。
【０１８８】
細胞完全性ポリペプチド
本発明の別の実施形態は、（ａ）プロモーター核酸配列；および（ｂ）細胞完全性のための生体触媒ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチドを対象とする。実施形態では、（ｂ）の核酸配列は、発酵の生産期において、細胞完全性に必要なポリペプチドが優先的に発現されるように、（ａ）の核酸配列と共役される。
【０１８９】
一実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、酸耐性に関与するＧＰＩアンカー細胞壁タンパク質である。一実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、ＹＥＲ１５０Ｗ（ＳＰＩ１）（核酸配列番号１９０；アミノ酸配列番号３９７）、またはその相同体である。別の実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、表５に列挙されるポリペプチドまたはその相同体などのＲｌｍ１によって活性化される、細胞壁保全遺伝子によってコードされる。
【０１９０】
【表１１】
2015503351.tif 000012
【０１９１】
実施形態では、生産期において、細胞完全性ポリペプチドが優先的に発現される。理論による拘束は望まないが、このようなポリペプチドの発現は、発酵産物（例えばブタノール）に対する宿主細胞の改善された耐性に寄与し、ひいては生産を改善してもよいと考えられる。
【０１９２】
増殖ポリペプチド
本発明の別の実施形態は、
（ａ）プロモーター核酸配列；および
（ｂ）細胞増殖に必要な生体触媒ポリペプチドをコードする核酸配列
を含んでなる、単離ポリヌクレオチドを対象とし；（ｂ）の核酸配列は、増殖ポリペプチドの発現が、発酵の生産期でなく増殖期においてより高くなるように、（ａ）の核酸配列と共役される。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、増殖ポリペプチドは、ホスホケトラーゼである。いくつかの実施形態では、増殖ポリペプチドは、ホスホトランスアセチラーゼである。例証的ホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼは、参照によって本明細書に援用する、国際公開第２０１１／１５９８５３号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１２０１５６７３５Ａ１号明細書に記載される。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼは、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）からのｘｐｋである（核酸配列番号１８０；アミノ酸配列番号１８１）。いくつかの実施形態では、ホスホトランスアセチラーゼは、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）からのｅｕｔＤ（核酸配列番号１７８；アミノ酸配列番号１７９）である。
【０１９４】
実施形態では、細胞増殖のための生体触媒ポリペプチドをコードするこのような核酸配列を含んでなる宿主細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が、低下または排除されている。
【０１９５】
生合成経路副産物生成ポリペプチド
ＤＨＭＢは、宿主細胞が、例えばアセト乳酸の生成に関与する生合成経路である、生合成経路を含むように遺伝子操作されている場合に起こる、副反応の結果として生じ得る。ＤＨＭＢの存在は、経路基質の一部が所望の産物に変換されていないことを示唆する。したがって、収率が低下することもある。さらに発酵培地中に存在するＤＨＭＢは、生産量に対する抑制効果を有することもある。例えばＤＨＭＢは、生合成経路中の酵素活性を低下させ得て、または発酵中の細胞成長および／または生産性に対するその他の抑制効果を有する。したがって本明細書に記載されるのは、発酵の増殖期よりも生産期において、ＤＨＭＢのより低い発現をもたらす、単離ポリヌクレオチドである。アセト乳酸をＤＨＭＢに変換する宿主細胞の能力は、例えばアセト乳酸還元酵素活性を有するポリペプチドの発現を低下させることで、低下または排除され得る。いくつかの実施形態では、アセト乳酸還元酵素活性を有するポリペプチドは、ＹＭＲ２２６Ｃ（核酸配列番号１８２、アミノ酸配列番号１８３）またはその相同体である。
【０１９６】
ピルビン酸利用生合成経路によるイソブタノールの生合成の最後のステップは、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換である（図８）。この経路中の副反応は、イソブチルアルデヒドからイソ酪酸への変換であり、それはイソブタノールへの変換に利用できるイソブチルアルデヒド量の低下と、イソブタノール収率の低下をもたらす。イソブチルアルデヒドからイソ酪酸への変換の低下または排除は、イソブタノールへの変換のために利用できるイソブチルアルデヒド量の増大をもたらしてもよい。イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換は、例えばアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現を低下させることで、低下または排除され得る。したがって本明細書で提供されるのは、発酵の増殖期よりも生産期においてアルデヒドデヒドロゲナーゼのより低い発現をもたらす、単離ポリヌクレオチドである。実施形態では、本発明の組換え宿主細胞は、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり得て、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、ＡＬＤ２（核酸配列番号４３６；アミノ酸配列番号４３７）、ＡＬＤ３（核酸配列番号４３８；アミノ酸配列番号４３９）、ＡＬＤ４（核酸配列番号４４０；アミノ酸配列番号４４１）、ＡＬＤ５（核酸配列番号４４２；アミノ酸配列番号４４３）、ＡＬＤ６（核酸配列番号１８４；アミノ酸配列番号１８５）、またはそれらの組み合わせであり得る。別の実施形態では、組換え宿主細胞は、クリベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）であり得て、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、ＫＬＬＡ０Ｆ００４４０、ＫＬＬＡ０Ｅ２３０５７、ＫＬＬＡ０Ｄ１００２１、ＫＬＬＡ０Ｄ０９９９９Ｇ、またはそれらの組み合わせであり得る。別の実施形態では、組換え宿主細胞は、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）であり得て、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ４、ＡＬＤ５、ＡＬＤ７、またはそれらの組み合わせであり得る。別の実施形態では、組換え宿主細胞は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）であり得て、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、ＡｌｄＨであり得る。別の実施形態では、組換え宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり得て、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、ａｌｄＡ、ａｌｄＢ、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１９７】
グリセロール生合成経路ポリペプチド
内在性ＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼは、グリセロール合成中の重要な酵素であり、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）をグリセロール−３−リン酸に変換して、ＮＡＤＨの細胞酸化で役割を果たしている。酵母株は、ＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）をコードする１つまたは複数の遺伝子を有してもよい。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、およびＰ．スティピティス（Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ）などのいくつかの酵母では、ＧＰＤ１およびＧＰＤ２は、ＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼについて、機能的同族体である。本明細書で提供されるのは、増殖期よりも発酵生産期中に、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性のより低い発現をもたらす単離ポリヌクレオチドである。一実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、ＧＰＤ１（核酸配列番号４４４；アミノ酸配列番号４４５）またはＧＰＤ２（核酸配列番号４４６；アミノ酸配列番号４４７）、またはその相同体である。
【０１９８】
ＮＡＤＰＨ生成経路のポリペプチド
いくつかの実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、酸化ペントースリン酸経路の酵素である。いくつかの実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＺＷＦ１、核酸配列番号４４８；アミノ酸配列番号４４９）、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ）（ＳＯＬ３：核酸配列番号４５０；アミノ酸配列番号４５１；またはＳＯＬ４：配列番号４５２；アミノ酸配列番号４５３）、または６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ核酸（ＧＮＤ１：核酸配列番号４５４；アミノ酸配列番号４５５；ＧＮＤ２：核酸配列番号４５６；アミノ酸配列番号４５７）である。例えば一実施形態では、ＺＷＦ１が増殖中に優先的に発現される。いくつかの実施形態では、解糖中に生成する還元当量（ＮＡＤＨなど）が、生産期において生合成生成経路によって利用される。例えば本明細書に記載されるイソブタノール生合成経路では、生成する１分子のイソブタノールあたり、解糖中に生成する２分子のＮＡＤＨが消費される。理論による拘束は望まないが、このような生産工程におけるＺＷＦ１の発現低下は、過剰なＮＡＤＰＨ生成の低下、結果的に副産物生成の低下をもたらしてもよいと考えられる。
【０１９９】
組換え微生物宿主細胞
標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に記載される。追加的な方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ  Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にある。分子ツールおよび技術は当該技術分野で公知であり、重複延長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるスプライシング（Ｙｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．４１：９７３−９８１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＵＲＡ３遺伝子座における変異に対する正の選択（Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９７、３４５−３４６；ＭＡＲｏｍａｎｏｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９１  Ｊａｎｕａｒｙ  １１；１９（１）：１８７）、ｃｒｅ−ｌｏｘ部位特異的組換え系ならびに変異ｌｏｘ部位およびＦＬＰ基質変異（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．（１９８７）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：２０８７−２０９６；Ｓｅｎｅｃｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１，Ｉｓｓｕｅ  ２，Ｐａｇｅｓ  ４０５−４２１；Ａｌｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ．Ｖｏｌｕｍｅ  ７，Ｉｓｓｕｅ  ４，ｐａｇｅｓ  ６４９−６５９）、「継ぎ目のない」遺伝子欠失（Ａｋａｄａ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｙｅａｓｔ；２３（５）：３９９−４０５）、およびｇａｐ修復手順（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５８：２０１−２１６；１９８１）が挙げられる。
【０２００】
本明細書で開示される組換え宿主細胞の遺伝子操作は、標準遺伝子技術およびスクリーニングを使用して実施し得て、遺伝子操作に適するあらゆる宿主細胞中で実施し得る（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）。
【０２０１】
本発明で使用するための宿主細胞の非限定的例としては、細菌、ラン藻、糸状菌および酵母が挙げられる。
【０２０２】
一実施形態では、本発明の組換え宿主細胞は、細菌またはラン藻細胞である。別の実施形態では、組換え宿主細胞は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）からなる群を含んでなり、またはそれから選択される。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、またはＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）である。
【０２０３】
別の実施形態では、本発明の組換え宿主細胞は、糸状菌または酵母細胞である。別の実施形態では、組換え宿主細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、パキソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、チゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ガラクトミセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｙｏｍｙｃｅｓ）、ウィリオプシス属（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）、デッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、メチニコビア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、およびカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）からなる群を含んでなり、またはそれから選択される。別の実施形態では、宿主細胞は、酵素番号ＥＣ  ４．１．１．１を有する酵素を発現せず、または発現が低下している。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、酵母はクラブトリー陽性である。クラブトリー陽性酵母細胞は、好気的培地中に高濃度のグルコースが存在する場合に細胞呼吸が抑制される現象である、クラブトリー効果を示す。適切なクラブトリー陽性酵母は、培養中で生存能力があり、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびイサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切な種としてはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クリベロミセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２０５】
クラブトリー陽性酵母細胞は、当該技術分野で公知のように、高い曝気と低いグルコース濃度で培養して、ブタノール生産でなく、呼吸および細胞量生産を最大化してもよい。典型的にグルコース濃度は、約０．２ｇ／Ｌ未満に維持される。通気培養物は高い細胞密度に増殖し得て、次に、本発明の生産培養物として使用される。代案としては、ブタノールを生成できる酵母細胞を培養し、濃縮して、高細胞密度培養物を生成してもよい。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、酵母はクラブトリー陰性である。クラブトリー陰性酵母細胞は、好気的培地に高濃度グルコースが添加された場合にクラブトリー効果を示さず、したがってクラブトリー陰性酵母細胞中では、過剰なグルコースが添加された後に、アルコール性発酵が不在である。適切なクラブトリー陰性酵母属は培養中で生存能力があり、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切な種としては、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、ハンゼヌラ・ノンファーメンタンス（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、クリベロミセス・マルキシアナス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クリベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２０７】
適切な微生物宿主としては、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏ
ｍｙｃｅｓ）、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のメンバーが挙げられるが、これに限定されるものではない。適切な宿主としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母は当該技術分野で公知であり、米国微生物系統保存機関（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、オランダ微生物株保存センター（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、ＬｅＳａｆｆｒｅ、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＡＢ、Ｆｅｒｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｍａｒｔｒｅｘ、およびＬａｌｌｅｍａｎｄをはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な供給元から入手できる。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）としては、ＢＹ４７４１、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ、Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）酵母、Ｆｅｒｍ  Ｐｒｏ（商標）酵母、Ｂｉｏ−Ｆｅｒｍ（登録商標）ＸＲ酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｉｇｅ  Ｂａｔｃｈ  Ｔｕｒｂｏアルコール酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｏｔ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｔｕｒｂｏ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｒｅｅｎ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｏｌｄ酵母、Ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）酵母、ＢＧ−１、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、およびＣＢＳ７９６１が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２０８】
発酵性炭素基質を所望の産物（例えばブタノール）に変換する酵素経路をコードする必要な遺伝子を含有する組換え微生物は、当該技術分野で周知の技術を使用して構築し得る。例えば、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ、および分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼなどの、例えば本発明のイソブタノール生合成経路の１つの酵素をコードする遺伝子は、上述したような様々な起源から得られ得る。
【０２０９】
ゲノムから所望の遺伝子を得る方法は、分子生物学技術分野で一般的であり周知である。例えば遺伝子の配列が既知であれば、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なゲノムライブラリーを作成し得て、所望の遺伝子配列と相補的なプローブでスクリーニングし得る。ひとたび配列が単離されたら、ポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）などの標準プライマー誘導増幅法を使用してＤＮＡを増幅し、適切なベクターを使用した形質転換に適する量のＤＮＡが得られ得る。異種宿主中の発現のためのコドン最適化ツールは、容易に入手できる（本明細書の他の箇所に記載される）。
【０２１０】
ひとたび妥当な経路遺伝子を同定して単離したら、当該技術分野で周知の手段によって、それらを適切な発現宿主に形質転換し得る。多様な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、一般的であり、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）などの会社から市販される。典型的に、ベクターまたはカセットは、妥当な遺伝子の転写と翻訳を誘導する配列、選択可能なマーカー、および自律複製または染色体の組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始の制御がある遺伝子の５’領域と、転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域とを含んでなる。どちらの制御領域も形質転換宿主細胞に相同的な遺伝子に由来し得るが、このような制御領域はまた、産生宿主として選択された特定の種に天然でない遺伝子にも由来し得るものと理解される。
【０２１１】
所望の宿主細胞中で、妥当な経路コード領域の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者に良く知られている。ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）中の発現に有用）；ＡＯＸ１（ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）中の発現に有用）；およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）中の発現に有用）、ならびにバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、およびパエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）中の発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーター、および様々なファージプロモーターをはじめとするが、これに限定されるものではない、実施例で使用されるものをはじめとする、これらの遺伝要素を駆動できる実質的にあらゆるプロモーターが、本発明に適する。酵母組換え宿主細胞では、酵母：ＦＢＡ１、ＴＤＨ３（ＧＰＤ）、ＡＤＨ１、ＩＬＶ５、およびＧＰＭ１中で使用するのに適した構成的プロモーター；および酵母：ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＯＬＥ１、およびＣＵＰ１中で使用するのに適した誘導性プロモーターをはじめとするが、これに限定されるものではない、遺伝子の発現カセットを構築するためのいくつかのプロモーターを使用し得る。その他の酵母プロモーターとしては、雑種プロモーターＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ、ＵＡＳ（ＦＢＡ１）−ＰＤＣ１ｐ、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＤＣ１ｐ、およびＵＡＳ（ＰＧＫ）−ＯＬＥ１ｐが挙げられる。
【０２１２】
プロモーター、転写ターミネーター、およびコード領域は、酵母２−ｍｉｃｒｏｎプラスミドにクローンして、酵母細胞に形質転換し得る（Ｌｕｄｗｉｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ，１３２：３３−４０，１９９３；米国特許出願公開第２００８０２６１８６１Ａ１号明細書）。
【０２１３】
所与の宿主中の遺伝子発現量を調節することは、天然または人工プロモーターの選択などを通じて、転写レベルを変動させることで、達成されてもよい。さらに所望レベルの遺伝子転写を達成するためのプロモーターライブラリーの使用などの技術が、当該技術分野で周知である。このようなライブラリーは、例えば遺伝子カセットの前のランダムｃＤＮＡ断片のクローニング（Ｇｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＡＥＭ  ９９，１７０２５）、プロモーター中に存在する制御配列の調節（Ｌｉｇｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７２，２１１３）、または既知プロモーター配列の変異誘発（Ａｌｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＰＮＡＳ，１２６７８；Ｎｅｖｏｉｇｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＡＥＭ  ７２，５２６６）などの当該技術分野で公知の技術を使用して、作成し得る。
【０２１４】
終結制御領域はまた、宿主に天然の様々な遺伝子に由来し得る。任意選択的に、終結部位は、不要であることも、（ｕｎｎｅｃｅｓｓａｒｙｏｒ）包含されることもできる。
【０２１５】
特定のベクターは、広範な宿主細菌中で自己複製でき、接合によって転移され得る。ｐＲＫ４０４および３つの関連ベクターｐＲＫ４３７、ｐＲＫ４４２、およびｐＲＫ４４２（Ｈ）の完全なアノテートされた配列が入手できる。これらの誘導体は、グラム陰性細菌における遺伝子操作の有益なツールであることが判明している（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，５０：７４−７９，２００３）。広宿主範囲Ｉｎｃ  Ｐ４プラスミドＲＳＦ１０１０のいくつかのプラスミド誘導体もまた、ある範囲のグラム陰性細菌内で機能し得るプロモーターと共に利用できる。プラスミドｐＡＹＣ３６およびｐＡＹＣ３７は、複数クローニング部位と共に活性プロモーターを有して、グラム陰性細菌中の異種遺伝子発現を可能にする。
【０２１６】
染色体の遺伝子置換ツールもまた、一般的に利用可能である。例えば広宿主範囲レプリコンｐＷＶ１０１の熱感受性変異体が修飾されて、プラスミドｐＶＥ６００２が構築されており、これはある範囲のグラム陽性細菌中の遺伝子置換をもたらすために利用し得る。（Ｍａｇｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４：５６３３−５６３８，１９９２）。さらに、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）などの商業的供給元からの多様なゲノム中でランダム変異を作成するために、生体外トランスポソームが使用できる。
【０２１７】
様々な微生物宿主中の生合成経路の発現は、本明細書の実施例および当該技術分野において、より詳細に記載される。米国特許第７，８５１，１８８号明細書および国際公開第２０１２／１２９５５５号パンフレットは、どちらも参照によって援用され、イソブタノール生産のための組換え微生物の遺伝子操作を開示する。参照によって援用される米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８Ａ１号明細書は、１−ブタノールの生産のための組換え微生物の遺伝子操作を開示する。米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０Ａ１号明細書および米国特許出願公開第２００７／０２９２９２７Ａ１号明細書は、どちらも参照によって援用され、２−ブタノール生産のための組換え微生物の遺伝子操作を開示する。イソブタノールおよび２−ブタノールの生合成のために、複数経路が記載される。これらの公開で開示される方法を利用して、本発明の組換え宿主細胞を遺伝子操作し得る。これらの公開で提示される情報は、その内容全体を参照によって援用する。
【０２１８】
修飾
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるような生合成経路を含んでなる宿主細胞は、１つまたは複数の追加的な修飾をさらに含んでなってもよい。米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書（参照によって本明細書に援用される）は、細胞質ゾル局在化アセト乳酸シンターゼの発現と、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の実質的排除とのために、酵母を遺伝子操作することで、増大されたピルビン酸からアセト乳酸への変換を開示する。米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書（参照によって本明細書に援用される）に記載される、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる修飾、および／またはピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子の妨害、またはピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子発現を制御する調節因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の妨害；米国特許出願公開第２０１０／０１２０１０５号明細書（参照によって本明細書に援用される）に記載される、エントナー・ドウドロフ経路または還元当量均衡を通じた炭素流増大を提供する宿主細胞の修飾。その他の修飾としては、ピルビン酸利用生合成経路の一段階を触媒するポリペプチドをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチドの組み込みが挙げられる。その他の修飾は、参照によって本明細書に援用する、国際公開第２０１２／１２９５５５号パンフレットに記載される。修飾は、アセト乳酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチド中の少なくとも１つの欠失、変異、および／または置換を含む。実施形態では、アセト乳酸還元酵素活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）のＹＭＲ２２６Ｃまたはその相同体である。追加的な修飾としては、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよび／またはアルデヒドオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチド中の欠失、変異、および／または置換が挙げられる。実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＡＬＤ６またはその相同体である。酵母産生宿主細胞がｐｄｃ−である、グルコース抑制低下効果を有する遺伝子修飾については、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１１／０１２４０６０号明細書に記載される。いくつかの実施形態では、欠失されまたは下方制御されるピルビン酸デカルボキシラーゼは、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、グリセルアルデヒド−３−リン酸からグリセリン酸塩１，３、ビスホスフェートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドの欠失または下方制御を含有する。いくつかの実施形態では、この反応を触媒する酵素は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼである。
【０２１９】
組換え宿主細胞は、（ａ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド；および（ｂ）（ｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドをコードする、内在性遺伝子中の少なくとも１つの欠失、変異、および／または置換；および／または（ｉｉ）参照によって本明細書に援用する国際公開第２０１１／１０３３００号パンフレットに記載される、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすにポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドをさらに含んでなってもよい。実施形態では、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドは、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、またはＣＣＣ１によってコードされる。実施形態では、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドは、構成的変異体ＡＦＴ１  Ｌ９９Ａ、ＡＦＴ１  Ｌ１０２Ａ、ＡＦＴ１  Ｃ２９１Ｆ、またはＡＦＴ１  Ｃ２９３Ｆである。
【０２２０】
差次的発現
実施例で実証されるように、プロモーター核酸配列を含んでなる組換え宿主細胞を、増殖期対生産期に対応する条件などの異なる条件に曝露してもよく、標的ポリヌクレオチドまたはそれがコードするポリペプチドの差次的発現は、当該技術分野で公知のおよび／または本明細書で提供される方法を使用して確認してもよい。生体触媒ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド差次的発現は、当該技術分野で公知のおよび／または本明細書で例示される方法を使用して、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）またはリアルタイムＰＣＲを使用して、異なる条件下で転写物レベルを比較することで確認し得る。いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーと組み合わせて、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのレポーターを使用して、異なる条件下の発現に影響を及ぼすプロモーター核酸配列の能力を確認し得る。さらに実施例で実証されるように、生体触媒ポリペプチドの活性を異なる条件下で判定して、ポリペプチドの差次的発現を確認してもよい。例えばＡＬＳが生体触媒ポリペプチドである場合、（例えば本明細書の実施例に記載されるように修正して、Ｗ．Ｗ．Ｗｅｓｔｅｒｆｅｌｄ（１９４５），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１６１：４９５−５０２に記載される方法を使用して）異なる条件に曝露された宿主細胞中に存在する、ＡＬＳの活性を判定してもよい。ＡＬＳ活性の差を利用して、ＡＬＳの差次的発現を確認し得る。下流産物または副産物測定によって、生体触媒ポリペプチドの差次的発現を間接的に確認し得ることもまた、想定される。例えばイソブチルアルデヒドの生成低下は、差次的ＡＬＳ発現を示唆してもよい。
【０２２１】
差次的発現を確認するその他の有用な方法としては、異なる条件下における、バイオマス測定および／または生合成経路産物測定が挙げられることが理解されるであろう。例えば光学濃度（Ｏ．Ｄ．）の分光光度測定を、バイオマスの指標として使用し得る。ブタノール濃度、ＤＨＭＢ濃度、またはイソ酪酸をはじめとするが、これに限定されるものではない、経路産物または副産物測定は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；例えば参照によって本明細書に援用する国際公開第２０１２／１２９５５５号パンフレットを参照されたい）などの、当該技術分野で公知のおよび／または本明細書で提供される方法を使用して実施し得る。同様に、バイオマス速度、グルコース消費速度、またはブタノール生成速度の増大は、例えば示される方法を使用することで判定し得る。バイオマス収率および産物（例えばブタノール）収率も、当該技術分野でおよび／または本明細書で開示される方法を使用して、同様に判定し得る。
【０２２２】
発酵産物を生産する方法
本発明の別の実施形態は、低級アルキルアルコールをはじめとするが、これに限定されるものではない、様々な発酵産物を生産する方法を対象とする。これらの方法は、本発明の組換え宿主細胞を用いる。一実施形態では、本発明の方法は、上で考察したような組換え宿主細胞を提供するステップと、発酵産物が生成される発酵培地条件下で、組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップと、任意選択的に発酵産物を回収するステップとを含んでなる。
【０２２３】
発酵産物を生産する方法は、複数の時期を含んでなってもよいことが理解されるであろう。例えば、工程は、第１のバイオマス生産期、第２のバイオマス生産期、発酵生産期、および任意選択の回収期を含んでなってもよい。実施形態では、本明細書で提供される工程は、２つ以上の、２つを超える、または３つを超える時期を含んでなるプロセス条件は、時期毎に変動してもよいことが理解されるであろう。例えば工程の１つの時期が実質的に好気的であってもよいのに対し、次の時期は実質的に嫌気的であってもよい。時期間のその他の違いとしては、炭素基質源（例えば発酵性炭素がそれに由来する原材料）、炭素基質（例えばグルコース）濃度、溶存酸素、ｐＨ、温度、または発酵産物（例えばブタノール）の濃度が挙げられるが、これに限定されるものではない。生体触媒ポリペプチドをコードする、プロモーター核酸配列および核酸配列、およびこのようなプロモーター核酸配列を含んでなる組換え宿主細胞をこのような工程で用いてもよい。実施形態では、生体触媒ポリペプチドは、少なくとも１つの時期において優先的に発現される。
【０２２４】
増殖期は、バイオマスが増大する少なくとも１つの工程を、一般に含んでなる。実施形態では、増殖期の温度は、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約３５、または少なくとも約４０℃であってもよい。実施形態では、増殖期におけるｐＨは、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約５．５、少なくとも約６、または少なくとも約６．５であってもよい。実施形態では、増殖期は、バイオマス濃度が、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約７０、または少なくとも約１００ｇ／Ｌに達するまで継続する。実施形態では、平均グルコースまたは糖濃度は、約２ｇ／Ｌ以下、約１ｇ／Ｌ以下、約０．５ｇ／Ｌ以下、または約０．１ｇ／Ｌ以下である。実施形態では、溶存酸素濃度（ｃｏｎｃｅｔｒａｔｉｏｎ）の平均は、検出不能、または少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％であってもよい。
【０２２５】
非限定的な一例では、増殖期の段階は、約３０〜約３５℃の温度と約４〜約５．５のｐＨで、バイオマス濃度が約２０〜約１００ｇ／Ｌの範囲になるまで、組換え宿主酵母細胞を少なくとも１つの炭素基質と接触させるステップを含んでなる。接触工程にわたって溶存酸素レベルは、平均で約２０〜４０％（０．８〜３．２ｐｐｍ）であってもよい。炭素基質源は、グルコースまたは糖濃度が、接触工程にわたって約０〜約１ｇ／Ｌであり、または約０〜約０．１ｇ／Ｌであるような、糖蜜またはコーンマッシュ、または純粋なグルコースまたはその他の糖であってもよい。増殖期に続いて起こるまたはその代わりの段階で、組換え宿主酵母細胞をさらなる工程の対象としてもよく、約２５〜約３５℃の温度と約４〜約５．５のｐＨで、バイオマス濃度が約５〜約１５ｇ／Ｌの範囲になるまで、約０．１ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌの濃度の組換え酵母を少なくとも１つの炭素基質と接触させる。接触工程にわたって溶存酸素レベルは、平均で、検出不能から約３０％（０〜２．４ｐｐｍ）であってもよい。炭素基質源は、グルコース濃度の平均が接触工程にわたって約２〜約３０ｇ／Ｌであるような、コーンマッシュであってもよい。
【０２２６】
増殖期は、１、２、３、４、またはそれを超える数の段階を含んでなってもよく、上の段階の非限定的例は、任意の順にまたは組み合わせて実施されてもよいものと理解される。
【０２２７】
生産期は、典型的に、生成物が生成される少なくとも１つの工程を含んでなる。実施形態では、生産期における平均グルコース濃度は、少なくとも約０．１、少なくとも約１、少なくとも約５、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、または少なくとも約１００ｇ／Ｌである。実施形態では、生産期の温度は、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約３５、または少なくとも約４０℃であってもよい。実施形態では、生産期のｐＨは、少なくとも約４、少なくとも約５、または少なくとも約５．５であってもよい。実施形態では、生産期は、生成物力価が、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約２５ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約３５ｇ／Ｌまたは少なくとも約４０ｇ／Ｌに達するまで継続する。実施形態では、溶存酸素濃度（ｃｏｎｃｅｔｒａｔｉｏｎ）は、平均で約５％未満、約１％未満、または条件が実質的に嫌気的であるように微少量であってもよい。
【０２２８】
生産期の非限定的な一例では、約２５〜約３０℃の温度と約４〜約５．５のｐＨで、約０．１〜約６ｇ／Ｌの濃度の組換え酵母細胞を、約５〜約１００ｇ／Ｌの濃度の少なくとも１つの炭素基質と接触させる。接触工程にわたって溶存酸素レベルは、実質的に嫌気的条件下で接触が起こるように、平均して微少量であってもよい。炭素基質源は、グルコース濃度が、それが実質的に完全に消費されるまで、接触工程にわたって平均で約１０〜約１００ｇ／Ｌであるように、コーンマッシュなどのようにマッシュしてもよい（ｍａｙ  ｍａｓｈ）。
【０２２９】
実施形態では、グルコース濃度は、増殖期よりも生産期で、約１００倍〜約１０００倍高い。実施形態では、生産中のグルコース濃度は、増殖中よりも、少なくとも約５×、少なくとも約１０×、少なくとも約５０×、少なくとも約１００×、または少なくとも約５００×高い。実施形態では、増殖期の温度は、増殖期より生産期で約５〜約１０℃低い。実施形態では、平均溶存酸素濃度は生産期において嫌気的であり、増殖期において微好気的から好気的である。
【０２３０】
当業者は、宿主細胞を増殖させおよび／または宿主細胞を利用して発酵産物を生産する条件が、利用される宿主細胞によって異なることを理解するであろう。一実施形態では、発酵産物を生産する方法は、嫌気的条件下で実施される。一実施形態では、発酵産物を生産する方法は、微好気的条件下で実施される。
【０２３１】
さらに、ひとたび適切な遺伝的スイッチを含んでなる組換え宿主細胞が同定されたら、工程をさらに精緻化して、それによってもたらされる差次的発現を活用してもよいことが想定される。例えば遺伝的スイッチが、高グルコース条件における優先的な発現を提供する場合、当業者は、最小の発現を維持するのに必要なグルコースレベルを容易に判定できる。このように、その下で最小の発現が所望される工程の時期におけるグルコース濃度は、最小の発現を維持するように制御され得る。非限定的な一例では、ポリマーベースの徐放供給ビーズ（例えばＫｕｈｎｅｒ  Ｓｈａｋｅｒ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手できる）を使用して、低グルコース条件を維持してもよい。同様のストラテジーを用いて、本明細書で提供される組成物および方法を使用して、差次的発現に妥当な増殖または生産期条件を精緻化し得る。
【０２３２】
炭素基質としては、単糖類（フルクトース、グルコース、マンノース、ラムノース、キシロースまたはガラクトースなど）；オリゴ糖類（乳糖、マルトース、またはスクロースなど）；デンプン、マルトデキストリン、またはセルロースなどの多糖類；脂肪酸；またはその混合物；およびコーンマッシュ、乳清透過液、コーンスティープリーカー、甜菜糖蜜、および大麦麦芽などの再生可能な原材料からの未精製混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。その他の炭素基質としては、エタノール、乳酸、コハク酸、またはグリセロールが挙げられる。
【０２３３】
さらに、炭素基質は、主要生化学的中間体への代謝的変換が実証されている、二酸化炭素、またはメタノールなどの一炭素基質であってもよい。一および二炭素基質に加えて、メチロトローフ生物は、代謝活性のために、メチルアミン、グルコサミン、および多様なアミノ酸などの、いくつかのその他の炭素含有化合物を利用することもまた知られている。例えばメチロトローフ酵母は、メチルアミンからの炭素を利用して、トレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］，７ｔｈ（１９９３），４１５  ３２，Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：  Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ  Ｐ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の様々な種が、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５−４８９（１９９０））。したがって本発明で用いられる炭素源は、多種多様な炭素含有基質を包含してもよく、生物体の選択によってのみ制限されることが考察される。
【０２３４】
前述の炭素基質およびそれらの混合物の全てが、本発明で適切であってもよいことが検討されるが、Ｃ５糖類を利用するように修飾された酵母細胞にとって、好ましい炭素基質は、グルコース、フルクトース、およびスクロース、またはこれらと、キシロースおよび／またはアラビノースなどのＣ５糖類との混合物である。スクロースは、サトウキビ、甜菜、キャッサバ、サトウモロコシ、およびそれらの混合物などの再生可能な糖原料に由来してもよい。グルコースおよびデキストロースは、コーン、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、およびそれらの混合物などの穀物をはじめとする、デンプンベースの原材料の糖化を通じて、再生可能な穀物原料から得られてもよい。さらに例えば参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２００７／００３１９１８Ａ１号明細書に記載されるように、発酵性糖類は、前処理および糖化工程による再生可能なセルロース系またはリグノセルロース系バイオマスに由来してもよい。炭素源に関してバイオマスは、あらゆるセルロース系またはリグノセルロース系材料を指し、セルロースを含んでなり、任意選択的にヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および／または単糖類をさらに含んでなる材料を含む。バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質などの追加的な成分を含んでなってもよい。バイオマスは単一起源に由来してもよく、またはバイオマスは２つ以上の起源に由来する混合物を含んでなり得る；例えばバイオマスは、トウモロコシ穂軸とトウモロコシ茎葉の混合物、または草と葉の混合物を含んでなってもよい。バイオマスとしては、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙業汚泥、庭ごみ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これに限定されるものではない。バイオマスの例としては、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉などの作物残渣、トウモロコシ茎葉、草本、小麦、麦藁、大麦、大麦藁、乾草、稲藁、スイッチグラス、古紙、糖サトウキビバガス、モロコシ、大豆、穀物製粉から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木片、おがくず、灌木および低木、野菜、果物、花卉、家畜糞尿、およびそれらの混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２３５】
炭素基質は、宿主細胞の成長と繁殖に適した、あらゆる培地中に提供されてもよい。利用し得る培地の非限定的例としては、Ｍ１２２Ｃ、ＭＯＰＳ、ＳＯＢ、ＴＳＹ、ＹＭＧ、ＹＰＤ、２ＸＹＴ、ＬＢ、Ｍ１７、またはＭ９最少培地が挙げられる。利用し得る培地その他の例としては、リン酸カリウムおよび／またはリン酸ナトリウムを含有する溶液が挙げられる。適切な培地には、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補給し得る。
【０２３６】
一実施形態では、発酵産物を生成する方法は、少なくとも約２０ｇ／Ｌの発酵産物の力価をもたらす。別の実施形態では、発酵産物を生成する方法は、少なくとも約３０ｇ／Ｌの発酵産物の力価をもたらす。別の実施形態では、発酵産物を生成する方法は、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌまたは４０ｇ／Ｌの発酵産物の力価をもたらす。
【０２３７】
実施形態では、発酵産物の生産速度が増大する。実施形態では、バイオマス生産の速度が増大する。実施形態では、発酵産物の収率が増大する。実施形態では、バイオマスの収率が増大する。このような改善は、遺伝的スイッチのない対照組換え宿主細胞を使用して得られたものと比較することで、観察されてもよい。
【０２３８】
本発明の方法によって生成されてもよい低級アルキルアルコールの非限定的例としては、ブタノール（例えばイソブタノール）、プロパノール、イソプロパノール、およびエタノールが挙げられる。一実施形態では、イソブタノールが生成される。
【０２３９】
一実施形態では、本発明の組換え宿主細胞は、理論値の約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％を超える収率で、発酵産物を生成する。一実施形態では、本発明の組換え宿主細胞は、理論値の約２５％を超える収率で、発酵産物を生成する。別の実施形態では、本発明の組換え宿主細胞は、理論値の約４０％を超える収率で、発酵産物を生成する。別の実施形態では、本発明の組換え宿主細胞は、理論値の約５０％を超える収率で、発酵産物を生成する。別の実施形態では、本発明の組換え宿主細胞は、理論値の約７５％を超える収率で、発酵産物を生成する。
【０２４０】
本発明の組換え宿主細胞によって生産される低級アルキルアルコールの非限定的例としては、ブタノール、イソブタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびエタノールが挙げられる。一実施形態では、本発明の組換え宿主細胞は、イソブタノールを生成する。別の実施形態では、本発明の組換え宿主細胞は、エタノールを生成しない。
【０２４１】
発酵培地からのイソブタノール単離法
当該技術分野で公知のＡＢＥ発酵法を使用して、生物生産されたイソブタノールを発酵培地から単離してもよい（例えばＤｕｒｒｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９−６４８（１９９８）、Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１−７５（１９９２）およびその中の参考文献を参照されたい）。例えば遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって、発酵培地から固形物を除去してもよい。次に蒸留、共沸性蒸留、液−液抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、浸透気化法などの方法を使用して、ブタノールを発酵培地から単離してもよい。
【０２４２】
ブタノールは水と低沸点の共沸混合物を形成するので、蒸留を使用して、混合物がその共沸性組成物になるまで分離し得る。蒸留を別の分離方法と組み合わせて使用して、共沸混合物周辺での分離を得てもよい。ブタノールを単離して精製するために組み合わせて使用してもよい方法としては、デカンテーション、液体−液体抽出、吸着、および膜ベースの技術が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらにブタノールは、共留剤を使用した共沸蒸留を使用して単離してもよい（例えばＤｏｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｍａｌｏｎｅ，Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１を参照されたい）。
【０２４３】
ブタノール−水混合物は不均一共沸混合物を形成するので、蒸留をデカンテーションと組み合わせて使用して、ブタノールを単離し精製してもよい。この方法では、ブタノール含有発酵ブロスを共沸組成物近くまで蒸留する。次に共沸性混合物を濃縮し、デカンテーションによってブタノールを発酵培地から分離する。デカントされた水相を還流として第１の蒸留カラムに戻してもよい。第２の蒸留カラム中での蒸留によって、ブタノールに富む有機相をさらに精製してもよい。
【０２４４】
ブタノールはまた、蒸留と組み合わせた液体−液体抽出を使用して、発酵培地から単離し得る。この方法では、適切な溶剤での液体−液体抽出を使用して、ブタノールが発酵ブロスから抽出される。次にブタノール含有有機相を蒸留して、ブタノールを溶剤から分離する。
【０２４５】
吸着と組み合わせた蒸留もまた使用して、ブタノールを発酵培地から単離し得る。この方法では、ブタノール含有発酵ブロスを共沸組成物近くに蒸留し、次に分子ふるいなどの吸着材の使用によって残留水を除去する（Ａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ｔｏ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｓｉｇｎ
ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｌｕｔｅ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｎ  Ｓｔｏｖｅｒ，Ｒｅｐｏｒｔ  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−３２４３８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊｕｎｅ  ２００２）。
【０２４６】
さらに浸透気化法と組み合わせた蒸留を使用して、発酵培地からブタノールを単離し精製してもよい。この方法では、ブタノール含有発酵ブロスを共沸性組成物近くまで蒸留して、次に親水性膜を通じた浸透気化法によって水を除去する（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．２４５，１９９−２１０（２００４））。
【０２４７】
原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）（抽出発酵とも称される）を使用して、ブタノール（またはその他の発酵性アルコール）が生成されるに従って、それを発酵容器から除去し得て、それによって微生物がブタノールを高収率で生成できるようにする。当該技術分野で記載される発酵性アルコールを除去するためのＩＳＰＲの一方法は、液−液抽出である。一般に例えばブタノール発酵に関しては、ブタノール濃度が毒性レベルに達する前に、微生物を含む発酵培地を有機抽出剤と接触させる。有機抽出剤と発酵培地は、二相混合物を形成する。ブタノールは有機抽出剤相に分配され、微生物を含有する水相中の濃度が低下し、それによって阻害性ブタノールに対する微生物の曝露が制限される。
【０２４８】
液−液抽出は、例えばその開示全体を本明細書に組み込んだ、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書に記載される方法に従って実施し得る。米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書は、液−液抽出を使用して発酵ブロスからブタノールを生産して回収する方法について記載し、方法は、発酵ブロスに水不混和性抽出剤を接触させて、水相と有機相を含んでなる二相混合物を形成するステップを含んでなる。典型的に抽出剤は、飽和、一価不飽和、多不飽和（およびそれらの混合物）Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸エステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であり得る。ＩＳＰＲの抽出剤は、非アルコール抽出剤であり得る。ＩＳＰＲ抽出剤は、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルア
ルコール、ステアリルアルコール、１−ウンデカノール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ウンデカナール、ラウリンアルデヒド、２０−メチルウンデカナール、およびそれらの混合物などの外来性有機抽出剤であり得る。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、発酵培地中のアルコールを、有機酸（例えば脂肪酸）とアルコールを有機酸でエステル化（ｅｓｔｅｒｆｉｙｉｎｇ）できる触媒とに接触させることで、アルコールが形成され得る。このような実施形態では、有機酸は、その中にアルコールエステルが分配される、ＩＳＰＲ抽出剤の役割を果たし得る。有機酸は、発酵容器に提供され得て、および／または発酵容器に供給される発酵性炭素を提供するバイオマスに由来する。原材料中に存在する脂質は、触媒的に有機酸に加水分解され得て、同一触媒（例えば酵素）が有機酸をアルコールでエステル化し得る。触媒は、発酵前に原材料に提供され得て、または原材料供給の前またはそれと同時に発酵容器に提供され得る。触媒を発酵容器に提供する場合、脂質の有機酸への加水分解と、発酵容器内に存在するブタノールによる実質的に同時の有機酸のエステル化によって、アルコールエステルが得られ得る。原材料に由来しない有機酸および／または天然油もまた、発酵容器に供給され得て、天然油が有機酸に加水分解される。アルコールでエステル化されないあらゆる有機酸が、ＩＳＰＲ抽出剤の役割の一部を果たし得る。アルコールエステルを含有する抽出剤を発酵培地から分離し得て、アルコールを抽出剤から回収し得る。抽出剤は、発酵容器内に再循環させ得る。したがってブタノール生成の場合、例えばブタノールからエステルへの変換は、発酵培地中の遊離ブタノール濃度を低下させ、ブタノール濃度増大の毒性効果から微生物を遮蔽する。これに加えて、脂質は触媒的に有機酸に加水分解され得て、それによってＩＳＰＲ抽出剤中の脂質の蓄積速度が低下するので、未分画穀物をその中の脂質を分離させることなく原材料として使用し得る。
【０２５０】
原位置生成物除去は、バッチ様式または連続様式で実施し得る。原位置生成物除去の連続様式では、生成物は反応装置から絶えず取り出される。バッチ式の原位置生成物除去では、一定容積の有機抽出剤が発酵容器に添加され、抽出剤は工程中に取り出されない。原位置生成物除去では、有機抽出剤発を、酵開始時に発酵培地と接触させて、二相性発酵培地を形成させ得る。代案としては、有機抽出剤は、微生物が、培養物の光学濃度測定によって判定し得る所望の成長量を達成した後に、発酵培地と接触させ得る。さらに有機抽出剤は、発酵培地中の生成物アルコールレベルが事前選択されたレベルに達した時点で、発酵培地と接触させ得る。本発明のいくつかの実施形態によるブタノール生産の場合、ブタノールを有機酸でエステル化してブタノールエステルを生成させ、結果的に発酵容器内のブタノール濃度を低下させるように、ブタノール濃度が毒性レベルに達する前の時点で、有機酸抽出剤を発酵培地と接触させ得る。エステル含有有機相は、ブタノールエステルの所望の有効力価が達成された後に、発酵容器から取り出し得る（そして水相を構成する発酵ブロスから分離し得る）。いくつかの実施形態では、エステル含有有機相は、発酵容器内の利用可能発酵性糖の発酵が実質的に完了した後に、水相から分離される。
【０２５１】
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めて本出願が優先される。また文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語には複数形が含まれるものとし、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。本明細書で言及される全ての刊行物、特許、およびその他の参考文献は、あらゆる目的のために、その内容全体を参照によって援用する。
【実施例】
【０２５２】
本発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は、本発明の実施形態を示しながら、例証としてのみ提供されるものと理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を見極め得て、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明に様々な変更と修正を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。
【０２５３】
一般方法
実施例で使用される標準組換えＤＮＡ、分子クローニング技術および形質転換プロトコルは当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９，本明細書ではＭａｎｉａｔｉｓと称される）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ
ａｌ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂ．ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７）、およびＡｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ（Ａｍｂｅｒｇ，Ｄ．Ｃ．，Ｂｕｒｋｅ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ
Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｎ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，２００５）に記載される。細菌培養の維持および成長に適した材料および方法もまた、技術分野で周知である。以下の実施例で使用するのに適した技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．，１９９４）または  Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ（Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）に記載される。細菌細胞の増殖および維持のために使用される、全ての試薬、制限酵素および材料は、特に断りのない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＨｉＭｅｄｉａ（Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ）、ＳＤ  Ｆｉｎｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａ）、またはタカラバイオ株式会社（日本、滋賀県）から得られた。
【０２５４】
略称の意味は、次の通りである。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「ｍｇ／ｍＬ」はミリリットルあたりミリグラムを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し，「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｋｇ」はキログラムを意味し、「Ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味して「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学濃度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍの波長で測定された光学濃度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は重力定数もまた意味し得て、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「％」はパーセントを意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／容積パーセントを意味し、「％ｖ／ｖ」は容積／容積パーセントを意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ｇ／Ｌ」は１リットルあたりグラムを意味し、「μｇ／Ｌ」は１リットルあたりマイクログラムを意味し、「ｎｇ／μＬ」はマイクロリットルあたりナノグラムを意味し、「ｐｍｏｌ／μＬ」はマイクロリットルあたりピコモルを意味し「ＲＰＭ」は毎分回転数を意味し、「μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ」はミリグラムあたり毎分マイクロモルを意味し、「ｗ／ｖ」は容積あたり重量を意味し、「ｖ／ｖ」は容積あたり容積を意味する。
【０２５５】
実施例１
株構築
【表１２】
2015503351.tif 000013
【０２５６】
【表１３】
2015503351.tif 000014
【０２５７】
【表１４】
2015503351.tif 000015
【０２５８】
ＰＮＹ１５５６株の構築
ＰＮＹ１５００の構築
ＢＰ８５７株（「ＰＮＹ１５００」）は、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＣＢＳ  ８３４０；オランダ微生物株保存センター（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に由来して、遺伝子ＵＲＡ３およびＨＩＳ３の欠失を含有する。
【０２５９】
ＵＲＡ３欠失
内在性ＵＲＡ３コード領域を欠失させるために、ｕｒａ３：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットをｐＬＡ５４テンプレートＤＮＡ（配列番号４６５）からＰＣＲ増幅した。ｐＬＡ５４は、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターおよびｋａｎＭＸマーカーを含有し、ｌｏｘＰ部位で挟まれて、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えおよびマーカー除去を可能にする。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、およびプライマーＢＫ５０５およびＢＫ５０６（配列番号４６６および４６７）を使用して実施した。各プライマーのＵＲＡ３部分は、ＵＲＡ３プロモーター上流の５’領域およびコード領域下流の３’領域に由来し、ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰマーカーの組み込みは、ＵＲＡ３コード領域の置換をもたらした。ＰＣＲ産物は、標準遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を使用してＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄに形質転換され、形質転換体は、３０℃でＧ４１８（１００μｇ／ｍｌ）含有ＹＰＤ上で選択された。プライマーＬＡ４６８およびＬＡ４９２（配列番号４６８および４６９）を使用して、ＰＣＲにより形質転換体をスクリーニングして正しい組み込みを確認し、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｋａｎＭＸと命名した。
【０２６０】
ＨＩＳ３欠失
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）と、テンプレートとしてＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）により調製されたＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡとを使用して、無瘢痕ＨＩＳ３欠失のためのＰＣＲカセットのための４つの断片を増幅した。ＨＩＳ３断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号４７０）およびプライマーｏＢＰ４５３（配列番号４７１）によって、ＨＩＳ３断片Ａを増幅した。ＨＩＳ３断片Ａの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５４（配列番号４７２）と、ＨＩＳ３断片Ｕの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５５（配列番号４７３）とによって、ＨＩＳ３断片Ｂを増幅した。ＨＩＳ３断片Ｂの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５６（配列番号４７４）と、ＨＩＳ３断片Ｃの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５７（配列番号４７５）とによって、ＨＩＳ３断片Ｕを増幅した。ＨＩＳ３断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５８（配列番号４７４）と、プライマーｏＢＰ４５９（配列番号４７７）とによって、ＨＩＳ３断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＨＩＳ３断片ＡＢは、ＨＩＳ３断片ＡとＨＩＳ３断片Ｂとを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号４７０）およびｏＢＰ４５５（配列番号４７３）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。ＨＩＳ３断片ＵＣは、ＨＩＳ３断片ＵとＨＩＳ３断片Ｃとを混合し、プライマーｏＢＰ４５６（配列番号４７４）およびｏＢＰ４５９（配列番号４７７）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）がそれに続いた。ＨＩＳ３  ＡＢＵＣカセットは、ＨＩＳ３断片ＡＢとＨＩＳ３断片ＵＣとを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号４７０）およびｏＢＰ４５９（配列番号４７７）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【０２６１】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸのコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＨＩＳ３  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上に、３０℃で播種した。Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ４６０（配列番号４７８）およびｏＢＰ４６１（配列番号４７９）を用いたＰＣＲによって、ｈｉｓ３ノックアウトがある形質転換体をスクリーニングした。正しい形質転換体をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸ  Δｈｉｓ３：：ＵＲＡ３株として選択した。
【０２６２】
Δｕｒａ３部位からのＫａｎＭＸマーカー除去およびΔｈｉｓ３部位からのＵＲＡ３マーカー除去
Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸ  Δｈｉｓ３：：ＵＲＡ３をｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号４８０）で形質転換し、ヒスチジン欠損ウラシル添加２％グルコース合成完全培地上に３０℃で播種して、ＫａｎＭＸマーカーを除去した。形質転換体をＹＰ添加１％ガラクトース中で約６時間３０℃で培養して、ＣｒｅリコンビナーゼおよびＫａｎＭＸマーカー切除を誘発し、回収のために、ＹＰＤ（２％グルコース）プレート上に３０℃で播種した。単離株をＹＰＤ中で一晩培養し、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した単離株を選択した。ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドを除去するために、５−ＦＯＡ耐性単離株をＹＰＤ中で培養して、その上に播種した。ＹＰＤ＋Ｇ４１８プレート、ウラシル欠損合成完全培地プレート、およびヒスチジン欠損合成完全培地プレート上の増殖をアッセイすることで、ＫａｎＭＸマーカー、ＵＲＡ３マーカー、およびｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの喪失について、単離株をチェックした。Ｇ４１８感受性でウラシルおよびヒスチジン栄養要求性である、正しい単離株をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３株として選択し、ＢＰ８５７と命名した。欠失およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用した、Δｕｒａ３ではプライマーｏＢＰ４５０（配列番号４８１）およびｏＢＰ４５１（配列番号４８２）による、Δｈｉｓ３ではプライマーｏＢＰ４６０（配列番号４７８）およびｏＢＰ４６１（配列番号４７９）による、ＰＣＲおよび配列決定によって確認された。
【０２６３】
ＰＮＹ２２０５株の構築
ＰＤＣ６欠失
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）と、テンプレートとしてＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡとを使用して、無瘢痕ＰＤＣ６欠失のためのＰＣＲカセットのための４つの断片を増幅した。ＰＤＣ６断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号４５８）およびプライマーｏＢＰ４４１（配列番号４５９９）によって、ＰＤＣ６断片Ａを増幅した。ＰＤＣ６断片Ａの３”末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４２（配列番号４６０）と、ＰＤＣ６断片Ｕの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４３（配列番号４６１）とによって、ＰＤＣ６断片Ｂを増幅した。ＰＤＣ６断片Ｂの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４４（配列番号４６２）と、ＰＤＣ６断片Ｃの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４５（配列番号４６３）とによって、ＰＤＣ６断片Ｕを増幅した。ＰＤＣ６断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４６（配列番号４６４）と、プライマーｏＢＰ４４７（配列番号４８３）とによって、ＰＤＣ６断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＰＤＣ６断片ＡＢは、ＰＤＣ６断片ＡとＰＤＣ６断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号４５８）およびｏＢＰ４４３（配列番号４７１）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＤＣ６断片ＵＣは、ＰＤＣ６断片ＵとＰＤＣ６断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ４４４（配列番号４６２）およびｏＢＰ４４７（配列番号４８３）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）がそれに続いた。ＰＤＣ６  ＡＢＵＣカセットは、ＰＤＣ６断片ＡＢとＰＤＣ６断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号４５８）およびｏＢＰ４４７（配列番号４８３）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【０２６４】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３のコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ＰＤＣ６  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物は、ウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上に、３０℃で播種した。Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号４８４）およびｏＢＰ４４９（配列番号４８５）を用いたＰＣＲによって、ｐｄｃ６ノックアウトがある形質転換体をスクリーニングした。正しい形質転換体をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３株として選択した。
【０２６５】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３をＹＰＤ中で一晩培養し、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した単離株を選択した。欠失およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号４８４）およびｏＢＰ４４９（配列番号４８５）による、ＰＣＲおよび配列決定によって確認された。単離株中のＰＤＣ６遺伝子の不在は、ＰＤＣ６、ｏＢＰ５５４（配列番号４８６）、およびｏＢＰ５５５（配列番号４８７）のコード配列に対して特異的なプライマーを使用した、陰性ＰＣＲ結果によって実証された。正しい単離株をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６株として選択し、ＢＰ８９１と命名した。
【０２６６】
ＰＤＣ１欠失ｉｌｖＤＳｍ組み込み
ＰＤＣ１遺伝子を欠失させて、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ＃７００６１０からのｉｌｖＤコード領域で置換した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）と、テンプレートとしてＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたＮＹＬＡ８３ゲノムＤＮＡとを使用して、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組み込みのためのＰＣＲカセットのための、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）からのｉｌｖＤコード領域がそれに続くＡ断片を増幅した。ＮＹＬＡ８３は、（その内容全体を参照によって本明細書に援用する）米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書に記載される、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組み込みを有する株である（構築はその内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１１０１２４０６０号明細書に記載される）。ＰＤＣ１断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号４８８）およびプライマーｏＢＰ５１５（配列番号４８９）によって、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍを増幅した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）と、テンプレートとしてＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡとを使用して、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組み込みのためのＰＣＲカセットのためのＢ、Ｕ、およびＣ断片を増幅した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５１６（配列番号４９０）と、ＰＤＣ１断片Ｕの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５１７（配列番号４９１）とによって、ＰＤＣ１断片Ｂを増幅した。ＰＤＣ１断片Ｂの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５１８（配列番号４９２）と、ＰＤＣ１断片Ｃの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５１９（配列番号４９３）とによって、ＰＤＣ１断片Ｕを増幅した。ＰＤＣ１断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５２０（配列番号４９４）と、プライマーｏＢＰ５２１（配列番号４９５）とによって、ＰＤＣ１断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−Ｂは、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ（配列番号５２５）とＰＤＣ１断片Ｂを混合して、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号４８８）およびｏＢＰ５１７（配列番号４９１）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＤＣ１断片ＵＣは、ＰＤＣ１断片ＵとＰＤＣ１断片Ｃとを混合し、プライマーｏＢＰ５１８（配列番号５２６）およびｏＢＰ５２１（配列番号４９５）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）がそれに続いた。ＰＤＣ１  Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣカセット（配列番号５２６）は、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢとＰＤＣ１断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号４８８）およびｏＢＰ５２１（配列番号４９５）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【０２６７】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６のコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ＰＤＣ１  Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上に、３０℃で播種した。Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号４６９）およびｏＢＰ５１２（配列番号４９７）を用いたＰＣＲによって、ｐｄｃ１ノックアウトがある形質転換体をスクリーニングした。単離株中のＰＤＣ１遺伝子の不在は、ＰＤＣ１、ｏＢＰ５５０（配列番号４９８）、およびｏＢＰ５５１（配列番号４９９）のコード配列に対して特異的なプライマーを使用した、陰性ＰＣＲ結果によって実証された。正しい形質転換体をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３株として選択した。
【０２６８】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３をＹＰＤ中で一晩培養し、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した単離株を選択した。ＰＤＣ１欠失およびｉｌｖＤＳｍ組み込みは、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号４９９）およびｏＢＰ５１２（配列番号４９７）による、ＰＣＲおよび配列決定によって確認された。正しい単離株をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ株として選択し、ＢＰ９０７と命名した。
【０２６９】
ＰＤＣ５欠失ｓａｄＢ組み込み
ＰＤＣ５遺伝子を欠失させて、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）からのｓａｄＢコード領域で置換した（ｓａｄＢ遺伝子は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書に記載される）。最初に、ＰＤＣ５欠失−ｓａｄＢ組み込みのためのＰＣＲカセット断片をプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化した。
【０２７０】
ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳは、ｐＵＣ１９（配列番号５２１）ベースであり、多重クローニング部位（ＭＣＳ）に位置するＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＵＲＡ３遺伝子の配列を含有する。ｐＵＣ１９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中における複製と選択のための、ｐＭＢ１レプリコンおよびβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を含有する。ＵＲＡ３のためのコード配列の他に、酵母中のＵＲＡ３遺伝子発現のために、この遺伝子の上流および下流からの配列が含まれた。クローニング目的でベクターを使用し得て、酵母組み込みベクターとして使用し得る。
【０２７１】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して、ＢａｍＨＩ、ＡｓｃＩ、ＰｍｅＩ、およびＦｓｅＩ制限酵素認識部位を含有するプライマーｏＢＰ４３８（配列番号５１６）と、ＸｂａＩ、ＰａｃＩ、およびＮｏｔＩ制限酵素認識部位を含有するプライマーｏＢＰ４３９（配列番号５１７）とによって、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡからのＵＲＡ３コード領域の上流２５０ｂｐおよび下流１５０ｂｐと共に、ＵＲＡ３コード領域を包含するＤＮＡを増幅した。ゲノムＤＮＡは、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製した。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによる消化後に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによってＰＣＲ産物およびｐＵＣ１９をライゲートして、ベクターｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳを作成した。ベクターをＰＣＲによって確認し、プライマーｏＢＰ２６４（配列番号５１７）およびｏＢＰ２６５（配列番号５１９）によって配列決定した。
【０２７２】
ｓａｄＢおよびＰＤＣ５断片Ｂのコード配列をｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化して、ＰＤＣ５Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣ  ＰＣＲカセットのｓａｄＢ−ＢＵ部分を作成した。ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５３０（配列番号５０１）と、ＰＤＣ５断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５３１（配列番号５００）とによって、テンプレートとしてｐＬＨ４６８−ｓａｄＢ（配列番号５２０）を使用して、ｓａｄＢのコード配列を増幅した。ｓａｄＢの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５３２（配列番号５０２）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５３３（配列番号５０３）とによって、ＰＤＣ５断片Ｂを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ｓａｄＢ−ＰＤＣ５断片Ｂは、ｓａｄＢとＰＤＣ５断片Ｂ  ＰＣＲ産物を混合し、プライマーｏＢＰ５３０（配列番号５００）およびｏＢＰ５３３（配列番号５０３）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、適切な酵素による消化後に、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。得られたプラスミドは、ＰＤＣ５断片Ｃの５’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ５３６（配列番号５０４）およびｏＢＰ５４６（配列番号５０５）を使用した、ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ増幅のためのテンプレートとして使用した。ＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５４７（配列番号５０６）と、プライマーｏＢＰ５３９（配列番号５０７）とによって、ＰＤＣ５断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃは、ＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片ＵとＰＤＣ５断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ５３６（配列番号５０４）およびｏＢＰ５３９（配列番号５０７）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）がそれに続いた。天然ＰＤＣ５コード配列のすぐ上流の５０ヌクレオチドとの相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５４２（配列番号５０８）と、ｏＢＰ５３９（配列番号５０７）とによる、ＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃの増幅によって、ＰＤＣ５Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣカセット（配列番号５２７）を作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【０２７３】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍのコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ＰＤＣ５  Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損１％エタノール添加（グルコース無添加）合成完全培地上に、３０℃で播種した。Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号５０９）およびｏＢＰ５４１（配列番号５１０）を用いたＰＣＲによって、ｐｄｃ５ノックアウトｓａｄＢ組み込みがある形質転換体をスクリーニングした。単離株中のＰＤＣ５遺伝子の不在は、ＰＤＣ５、ｏＢＰ５５２（配列番号５１１）、およびｏＢＰ５５３（配列番号５１２）のコード配列に対して特異的なプライマーを使用した、陰性ＰＣＲ結果によって実証された。正しい形質転換体をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３株として選択した。
【０２７４】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３をＹＰＥ（１％エタノール）中で一晩培養し、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有エタノール添加（グルコース無添加）合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した単離株を選択した。ＰＤＣ５欠失、ｓａｄＢ組み込み、およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号５０９）およびｏＢＰ５４１（配列番号５１０）を用いたＰＣＲによって確認された。正しい単離株をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ株として選択し、ＢＰ９１３と命名した。
【０２７５】
ＧＰＤ２欠失
内在性ＧＰＤ２コード領域を欠失させるために、テンプレートＤＮＡとしてｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ  ＰＣＲを使用して、ｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセット（配列番号１７４）をＰＣＲ増幅した。ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ（配列番号５２４）は、ｌｏｘＰリコンビナーゼ部位で挟まれる、ｐＲＳ４２６からのＵＲＡ３マーカーを含有する。Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼとプライマーＬＡ５１２（配列番号５２２）およびＬＡ５１３（配列番号５２３）とを使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＧＰＤ２部分は、ＧＰＤ２コード領域上流の５’領域およびコード領域下流の３’領域に由来し、ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰマーカーの組み込みは、ＧＰＤ２コード領域の置換をもたらした。ＰＣＲ産物をＢＰ９１３に形質転換し、形質転換体をウラシル欠損１％エタノール添加（グルコース無添加）合成完全培地上で選択した。プライマーｏＢＰ５８２（配列番号５１３）およびＡＡ２７０（配列番号５１４）を使用したＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。
【０２７６】
ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅによって形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。１％エタノール添加５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に、形質転換体を画線塗抹して３０℃で培養し、ＵＲＡ３マーカーを喪失した単離株を選択した。ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミド除去のために、ＹＰＥ（１％エタノール）中で５−ＦＯＡ耐性単離株を培養した。欠失およびマーカー除去は、プライマーｏＢＰ５８２（配列番号５１３）およびｏＢＰ５９１（配列番号５１５）を用いたＰＣＲによって確認された。正しい単離株をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ  Δｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ株として選択し、ＢＰ１０６４（ＰＮＹ１５０３）命名した。
【０２７７】
ＦＲＡ２欠失
ＦＲＡ２欠失をデザインして、コード配列の３’末端から２５０ヌクレオチドを欠失させ、ＦＲＡ２コード配列の最初の１１３ヌクレオチドは無処理のままにした。インフレームの停止コドンは、欠失から７ヌクレオチド下流に存在する。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）と、テンプレートとしてＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡとを使用して、無瘢痕ＦＲＡ２欠失のためのＰＣＲカセットのための４つの断片を増幅した。ＦＲＡ２断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号５２９）およびプライマーｏＢＰ５９５（配列番号５３０）によって、ＦＲＡ２断片Ａを増幅した。ＦＲＡ２断片Ａの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５９６（配列番号５３１）と、ＦＲＡ２断片Ｕの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５９７（配列番号５３２）とによって、ＦＲＡ２断片Ｂを増幅した。ＦＲＡ２断片Ｂの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５９８（配列番号５３３）と、ＦＲＡ２断片Ｃの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５９９（配列番号５３４）とによって、ＦＲＡ２断片Ｕを増幅した。ＦＲＡ２断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ６００（配列番号５３５）と、プライマーｏＢＰ６０１（配列番号５３６）とによって、ＦＲＡ２断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＦＲＡ２断片ＡＢは、ＦＲＡ２断片ＡとＦＲＡ２断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号５２６）およびｏＢＰ５９７（配列番号５３２）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。ＦＲＡ２断片ＵＣは、ＦＲＡ２断片ＵとＦＲＡ２断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ５９８（配列番号５３３）およびｏＢＰ６０１（配列番号５３６）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）がそれに続いた。ＦＲＡ２  ＡＢＵＣカセットは、ＦＲＡ２断片ＡＢとＦＲＡ２断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号５２９）およびｏＢＰ６０１（配列番号５３６）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【０２７８】
ＰＮＹ１５０３のコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ＦＲＡ２  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、３０℃で播種した。Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ６０２（配列番号５３７）およびｏＢＰ６０３（配列番号５３８）を用いたＰＣＲによって、ｆｒａ２ノックアウトがある形質転換体をスクリーニングした。正しい形質転換体をＹＰＥ（酵母抽出物、ペプトン、１％エタノール）中で培養し、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した単離株を選択した。欠失およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ６０２（配列番号５３７）およびｏＢＰ６０３（配列番号５３８）を用いたＰＣＲによって確認された。単離株中のＦＲＡ２遺伝子の不在は、ＦＲＡ２、ｏＢＰ６０５（配列番号５３９）、およびｏＢＰ６０６（配列番号５４０）の欠失したコード配列に対して特異的なプライマーを使用した、陰性ＰＣＲ結果によって実証された。正しい単離株をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ  ｆｒａ２Δ株として選択し、ＰＮＹ１５０５（ＢＰ１１３５）と命名した。
【０２７９】
ＡＤＨ１欠失およびｋｉｖＤＬｌ（ｙ）組み込み
ＡＤＨ１遺伝子を欠失させ、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の発現のためにコドン最適化したラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのｋｉｖＤコード領域で置換した。ＡＤＨ１欠失−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）組み込みのための無瘢痕カセットを最初にプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化した。
【０２８０】
ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５６２（配列番号５４１）と、ＡＤＨ１断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５６３（配列番号５４２）とによって、テンプレートとしてｐＬＨ４６８（配列番号５５３）を使用して、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の発現のためにコドン最適化されたラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのｋｉｖＤコード領域を増幅した。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５６４（配列番号５４３）と、ＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５６５（配列番号５４４）とによって、上のように調製されたゲノムＤＮＡから、ＡＤＨ１断片Ｂを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂは、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）およびＡＤＨ１断片Ｂ  ＰＣＲ産物を混合し、プライマーｏＢＰ５６２（配列番号５４１）およびｏＢＰ５６５（配列番号５４４）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩおよびＦｓｅＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、適切な酵素による消化後に、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。ＳａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０５（配列番号５４５）と、ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０６（配列番号５４６）とによって、ゲノムＤＮＡからＡＤＨ１断片Ｃを増幅した。ＡＤＨ１断片Ａ  ＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＡｓｃＩで消化して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂ含有プラスミドの対応する部位にライゲートした。ＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０７（配列番号５４７）と、ＳａｌＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０８（配列番号５４８）とによって、ゲノムＤＮＡからＡＤＨ１断片Ａを増幅した。ＡＤＨ１断片Ｃ  ＰＣＲ産物をＰａｃＩおよびＳａｌＩで消化して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでＡＤＨ１断片Ａ−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂ含有プラスミドの対応する部位にライゲートした。ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６７４（配列番号５４９）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６７５（配列番号５５０）とによって、ベクターｐＲＳ３１６−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１−ＧＵＳ（配列番号５５４）から、ハイブリッドプロモーターＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１を増幅した。ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１ＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩで消化して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片ＡＢＣを含有するプラスミドの対応する部位にライゲートした。プライマーｏＢＰ５０５（配列番号５４５）およびｏＢＰ５０８（配列番号５４８）によって、得られたプラスミドから組み込みカセット全体を増幅し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【０２８１】
ＰＮＹ１５０５のコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、上で構築したＡＤＨ１−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、３０℃で播種した。形質転換体をＹＰＥ（１％エタノール）中で培養し、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーが欠失した単離株を選択した。ＡＤＨ１欠失およびｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）組み込みは、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、外部プライマーｏＢＰ４９５（配列番号５５１）およびｏＢＰ４９６（配列番号５５２）を用いた、およびｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）特異的プライマーｏＢＰ５６２（配列番号５４１）および外部プライマーｏＢＰ４９６（配列番号５５２）を用いた、ＰＣＲによって確認された。正しい単離株をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ  ｆｒａ２Δ  ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ株として選択し、ＰＮＹ１５０７（ＢＰ１２０１）と命名した。
【０２８２】
ＰＮＹ２２１１株の構築
以下の段落で記載されるように、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ１５０７株から、数段階でＰＮＹ２２１１を構築した。最初に、ホスホケトラーゼ遺伝子を含有するように、株を改変した。次にホスホケトラーゼ遺伝子に隣接する配列を標的とする組み込みベクターを使用して、アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ａｌｓＳ）を株に入れた。最後に、相同的組換えを使用して、ホスホケトラーゼ遺伝子と組み込みベクター配列を除去し、染色体ＸＩＩのｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤと天然ＴＲＸ１遺伝子の遺伝子間領域に、ａｌｓＳの無瘢痕挿入をもたらした。得られたＰＮＹ２２１１の遺伝子型は、ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜  ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ  ｆｒａ２Δ  ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔである。
【０２８３】
相同的組換えによって、ホスホケトラーゼ遺伝子カセットをＰＮＹ１５０７に導入した。組み込みコンストラクトを次のように作成した。プラスミドｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ｂｕｄＡ（その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書で以前記載されている）をＮｏｔＩおよびＸｍａＩで消化して、１．８ｋｂのＦＢＡ−ｂｕｄＡ配列を除去し、ベクターをクレノウ断片での処理後に再度ライゲートした。次にＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）のＤＮＡ合成およびベクター構築サービスにより、ＣＵＰ１プロモーターをＴＥＦ１プロモーター変種（その内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ｎｅｖｏｉｇｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２：５２６６−５２７３（２００６）によって以前記載されているＭ４変種）で置換した。得られたプラスミドｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ａｌｓＳをＳｔｕＩおよびＭｌｕＩで切断し（ａｌｓＳ遺伝子とＣＹＣ１ターミンター（ｔｅｒｍｉｎｔｏｒ）の部分を含有する１．６ｋｂ部分を除去する）、プライマーＮ１１７６（配列番号５６９）およびＮ１１７７（配列番号５７０）によって、ｐＲＳ４２６：：ＧＰＤ−ｘｐｋ１＋ＡＤＨ−ｅｕｔＤ（配列番号５７５）から作成された４ｋｂのＰＣＲ産物、およびプライマーＮ８２２（配列番号５６５）およびＮ１１７８（配列番号５７１）によって酵母ゲノムＤＮＡ（ＥＮＯ１プロモーター領域）から作成された０．８ｋｂのＰＣＲ産物ＤＮＡと組み合わせて、ギャップ修復クローニング手順を使用して、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４１株（ＡＴＣＣ＃２０１３８８）に形質転換した；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ５８：２０１−２１６（１９８７）を参照されたい。形質転換体は、細胞をヒスチジン非含有合成完全培地上に播種して得られた。予想されたプラスミド（ｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ１（Ｍ４）−ｘｐｋ１＋ＥＮＯ１−ｅｕｔＤ、配列番号５６１）の適切なアセンブリーは、ＰＣＲプライマーＮ８２１およびおよびＮ１１１５（それぞれ配列番号５６４および５６８）によって、および制限消化（ＢｇｌＩ）によって確認された。２つのクローンを引き続いて配列決定した。３．１ｋｂのＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１遺伝子をＳａｃＩおよびＮｏｔＩで消化して単離し、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３：：ｉｌｖＤ−ＴＲＸ１ベクター（クローンＡ、ＡｆｌＩＩで切断）にクローン化した。クローン化断片をクレノウ断片で処置して、ライゲーションのための平滑末端を作成した。連結反応を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ３細胞に形質転換して、アンピシリン耐性について選択した。ＴＥＦ１（Ｍ４）−ｘｐｋ１の挿入は、ＰＣＲ（プライマーＮ１１１０（配列番号５５８）およびＮ１１１４（配列番号５６７））によって確認された。ベクターをＡｆｌＩＩで直線化し、クレノウ断片で処理した。（参照によって本明細書に援用する）国際公開第２０１１１５９８５３Ａ１号パンフレットに記載される１．８ｋｂのＫｐｎＩ−ＨｉｎｃＩＩジェネテシン耐性カセットをクレノウ断片処理後に、ライゲーションによってクローン化した。連結反応を大腸菌（Ｅ．ｃｏ��ｉ）Ｓｔｂｌ３細胞に形質転換して、アンピシリン耐性について選択した。ジェネテシンカセットの挿入は、ＰＣＲ（プライマーＮ１６０ＳｅｑＦ５（配列番号５５９）およびＢＫ４６８（配列番号５５７））によって確認された。プラスミド配列（ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３：：ｐｄｃ１：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１：：ｋａｎ、配列番号５６２）が、本明細書で提供される。
【０２８４】
得られた組み込みカセット（ｐｄｃ１：：ＴＥＦ１（Ｍ４）−ｘｐｋ１：：ＫａｎＭＸ：：ＴＲＸ１）を単離して（ＡｓｃＩおよびＮａｅＩ消化は５．３ｋｂのバンドを生成し、それをゲル精製した）、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎキット（カタログ番号Ｔ２００１）を使用して、ＰＮＹ１５０７に形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍｌのＧ４１８添加ＹＰＥ上に播種して選択した。予想された位置の組み込みは、ＰＣＲ（それぞれプライマーＮ８８６およびＮ１２１４、配列番号５６６および５７２）によって確認された。次にＣｒｅリコンビナーゼをコードするプラスミドｐＲＳ４２３：：ＧＡＬ１ｐ−Ｃｒｅ（配列番号５７４）を使用して、ｌｏｘＰに挟まれるＫａｎＭＸカセットを除去した。カセットの適切な除去は、ＰＣＲ（プライマーｏＢＰ５１２およびＮ１６０ＳｅｑＦ５（それぞれ配列番号５７３および５５９））によって確認された。最後に、ａｌｓＳ組み込みプラスミド（配列番号５６０；ｐＵＣ１９−ｋａｎ：：ｐｄｃ１：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ：：ＴＲＸ１、クローンＡ）をこの株に形質転換した。２つの組み込み体は、プラスミドｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳ（配列番号５５５）およびｐＢＰ９１５（配列番号５５６）による形質転換によって、アセト乳酸シンターゼ活性について試験され、Ａｍｂｅｒｇ，Ｂｕｒｋｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”（２００５）のプロトコル＃２を使用して形質転換されて、グルコース含有培地中の増殖およびイソブタノール生成の評価（増殖およびイソブタノール測定の方法は、次のとおりである：全ての株は、ヒスチジンおよびウラシル非含有で炭素源として０．３％グルコースおよび０．３％エタノールを含有する、合成完全培地中で培養した（１２５ｍＬ通気式エルレンマイアーフラスコ（ＶＷＲカタログ番号８９０９５−２６０内の１０ｍＬの培地）。一晩の培養後（３０℃、Ｉｎｎｏｖａ（登録商標）４０  Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｈａｋｅｒ内で２５０ｒｐｍ）、培養物を２％グルコースおよび０．０５％エタノール含有合成完全培地で希釈して、０．２のＯＤ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ測定）に戻した（１２５ｍＬのきつく栓をしたエルレンマイアーフラスコ（ＶＷＲカタログ番号８９０９５−２６０）内の２０ｍｌの培地）。４８時間の培養後（３０℃、Ｉｎｎｏｖａ（登録商標）４０  Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｈａｋｅｒ内で２５０ｒｐｍ）、培養物上清（Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管濾過ユニット、Ｃｏｓｔａｒカタログ番号８１６９を使用して収集した）を米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書に記載される方法に従って、ＨＰＬＣによって分析した）。２つのクローンの１つは陽性であり、ＰＮＹ２２１８と命名された。
【０２８５】
ＰＮＹ２２１８をＣｒｅリコンビナーゼで処理して、ＰＣＲによってｘｐｋ１遺伝子およびｐＵＣ１９組み込みベクター配列の喪失について、得られたクローンをスクリーニングした（プライマーＮ８８６およびＮ１６０ＳｅｑＲ５；それぞれ配列番号５６６および５６３）。これによって、組み込みベクター挿入中に導入されたｘｐｋ１上流のＤＮＡと相同ＤＮＡの組換え後に、ｐｄｃ１−ＴＲＸ１遺伝子間領域に組み込まれたａｌｓＳ遺伝子のみが残った（ベクター、マーカー遺伝子、およびｌｏｘＰ配列が喪失するため「無瘢痕」挿入）。この組換えは任意の時点で発生し得たが、ベクター組み込みはジェネテシン選択がなくても安定しているようであり、組換え事象は、Ｃｒｅリコンビナーゼ導入後にのみ観察された。１つのクローンをＰＮＹ２２１１と命名した。
【０２８６】
ＰＮＹ１５５６の構築
ＰＮＹ１５２８の構築（ＰＮＹ２２１１へのｈＡＤＨ組み込み）
標的範囲の上流および下流の相同領域と、形質転換体の選択のためのＵＲＡ３遺伝子とを含有するＰＣＲ産物を使用して、相同的組換えによって欠失／組み込みを作成した。相同的組換えによってＵＲＡ３遺伝子を除去して、無瘢痕欠失／組み込みを作成した。
【０２８７】
無瘢痕欠失／組み込み手順は、Ａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，２３：３９９（２００６）から適応された。欠失／組み込み手順のためにＰＣＲによってカセット全体を増幅するのに先だって、個々の断片をプラスミドにクローニングして、４つの断片Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃと組み込まれる遺伝子とを組み合わせることで、各欠失／組み込みのためのＰＣＲカセットを作成した。組み込まれる遺伝子は、断片ＡおよびＢの間のカセットに含まれた。ＰＣＲカセットは、プロモーター（ＵＲＡ３遺伝子の２５０ｂｐ上流）およびターミネーター（ＵＲＡ３遺伝子の１５０ｂｐ下流）領域と共に、天然ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  ＵＲＡ３遺伝子からなる、選択可能／逆選択可能マーカーであるＵＲＡ３（断片Ｕ）を含有した。断片ＡおよびＣ（それぞれおよそ１００〜５００ｂｐ長さ）は、標的範囲のすぐ上流の配列（断片Ａ）、および標的範囲の３’配列（断片Ｃ）に相当した。相同的組換えによる、染色体へのカセット組み込みのために、断片ＡおよびＣを使用した。断片Ｂ（５００ｂｐ長さ）は、標的範囲のすぐ下流の５００ｂｐに相当し、断片Ｂに相当する直列反復配列が、カセットの染色体への組み込み時に生じる際に、相同的組換えによって、染色体からＵＲＡ３マーカーおよび断片Ｃを切除するために使用された。
【０２８８】
ＹＰＲＣΔ１５欠失およびウマ肝臓ａｄｈ組み込み
ＹＰＲＣΔ１５遺伝子座を欠失させて、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＰＤＣ５プロモーター範囲（５３８ｂｐ）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＡＤＨ１ターミネーター範囲（３１６ｂｐ）と共に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現のためにコドン最適化されたウマ肝臓ａｄｈ遺伝子で置換した。ＹＰＲＣΔ１５欠失−Ｐ［ＰＤＣ５］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ組み込みのための無瘢痕カセットは、最初にプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化した。
【０２８９】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と、テンプレートとしてＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製されたＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡとを使用して、断片Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃを増幅した。ＫｐｎＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６２２（配列番号７４５）と、ＹＰＲＣΔ１５断片Ｂの５’末端相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ６２３（配列番号７４６）とによって、ゲノムＤＮＡからＹＰＲＣΔ１５断片Ａを増幅した。ＹＰＲＣΔ１５断片Ａの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ６２４（配列番号７４７）と、ＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６２５（配列番号７４８）とによって、ゲノムＤＮＡからＹＰＲＣΔ１５断片Ｂを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＹＰＲＣΔ１５断片ＡとＹＰＲＣΔ１５断片Ｂ  ＰＣＲ産物とを混合し、オーバーラップＰＣＲによってＹＰＲＣΔ１５断片Ａ−ＹＰＲＣΔ１５断片Ｂを作成し、プライマーｏＢＰ６２２（配列番号７４５）およびｏＢＰ６２５（配列番号７４８）で増幅した。得られたＰＣＲ産物をＫｐｎＩおよびＦｓｅＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、適切な酵素による消化後に、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。ＮｏｔＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６２６（配列番号７４９）と、ＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６２７（配列番号１９１）によって、ゲノムＤＮＡからＹＰＲＣΔ１５断片Ｃを増幅した。ＹＰＲＣΔ１５断片Ｃ  ＰＣＲ産物をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、ＹＰＲＣΔ１５断片ＡＢを含有するプラスミドの対応する部位にライゲートした。ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーＨＹ２１（配列番号７５１）と、ａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）の５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーＨＹ２４（配列番号７５２）とによって、ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡから、ＰＤＣ５プロモーター範囲を増幅した。Ｐ［ＰＤＣ５］の３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーＨＹ２５（配列番号７５３）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーＨＹ４（配列番号７５４）とによって、ｐＢＰ９１５（配列番号５５６）からａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。Ｐ［ＰＤＣ５］とａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ  ＰＣＲ産物とを混合して、オーバーラップＰＣＲによって、Ｐ［ＰＤＣ５］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔを作成し、プライマーＨＹ２１（配列番号７５１）およびプライマーＨＹ４（配列番号７５４）によって増幅した。得られたＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、ＹＰＲＣΔ１５断片ＡＢＣを含有するプラスミドの対応する部位にライゲートした。プライマーｏＢＰ６２２（配列番号７４５）およびｏＢＰ６２７（配列番号７５０）によって、組み込みカセット全体を得られたプラスミドから��幅した。
【０２９０】
Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＮＹ２２１１のコンピテント細胞を作成し、ＹＰＲＣΔ１５欠失−Ｐ［ＰＤＣ５］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ組み込みカセットＰＣＲ産物で形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、３０Ｃで播種した。プライマーＵＲＡ３−ｅｎｄ  Ｆ（配列番号７５５）およびｏＢＰ６３７（配列番号７５６）を用いて、ＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングした。正しい形質転換体をＹＰＥ（１％エタノール）中で培養し、１％ＥｔＯＨ添加、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０Ｃで播種して、ＵＲＡ３マーカーが欠失した単離株を選択した。ＹＰＲＣΔ１５の欠失およびＰ［ＰＤＣ５］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔの組み込みは、ＹｅａＳｔａｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で調製されたゲノムＤＮＡを使用して、外部プライマーｏＢＰ６３６（配列番号７５７）およびｏＢＰ６３７（配列番号７５６）を用いたＰＣＲによって確認された。以下の遺伝子型の正しい単離株をさらなる改変のために選択した：ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ  ｆｒａ２Δ  ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ  ｙｐｒｃΔ１５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ａｄｈ＿Ｈｌ−ＡＤＨ１ｔ。
【０２９１】
ｆｒａ２Δにおけるウマ肝臓ａｄｈ組み込み
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＰＤＣ１プロモーター範囲（８７０ｂｐ）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＡＤＨ１ターミネーター範囲（３１６ｂｐ）と共に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現のためにコドン最適化されたウマ肝臓ａｄｈ遺伝子をｆｒａ２欠失部位に組み込んだ。ｆｒａ２Δ−Ｐ［ＰＤＣ１］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ組み込みのための無瘢痕カセットは、最初にプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化した。
【０２９２】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と、テンプレートとしてＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製されたＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡとを使用して、断片Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃを増幅した。ＮｏｔＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６９５（配列番号７５８）と、ＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６９６（配列番号７４４）によって、ゲノムＤＮＡからｆｒａ２Δ断片Ｃを増幅した。ｆｒａ２Δ断片ＣＰＣＲ産物をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６９３（配列番号７６０）と、ＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６９４（配列番号７６１）によって、ゲノムＤＮＡからｆｒａ２Δ断片Ｂを増幅した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩおよびＦｓｅＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、適切な酵素による消化後に、ｆｒａ２Δ断片Ｃ含有プラスミドの対応する部位にライゲートした。ＢａｍＨＩおよびＡｓｉＳＩ制限酵素認識部位を含有するプライマーｏＢＰ６９１（配列番号７４３）と、ＡｓｃＩおよびＳｗａＩ制限酵素認識部位を含有するプライマーｏＢＰ６９２（配列番号７６３）とによって、ゲノムＤＮＡからｆｒａ２Δ断片Ａを増幅した。ｆｒａ２Δ断片Ａ  ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＡｓｃＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、適切な酵素による消化後に、ｆｒａ２Δ断片ＢＣ含有プラスミドの対応する部位にライゲートした。ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーＨＹ１６（配列番号７６６）と、ａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）の５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーＨＹ１９（配列番号７６７）とによって、ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡから、ＰＤＣ１プロモーター範囲を増幅した。Ｐ［ＰＤＣ１］の３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーＨＹ２０（配列番号７６２）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーＨＹ４（配列番号７５４）とによって、ｐＢＰ９１５からａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。Ｐ［ＰＤＣ１］とａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ  ＰＣＲ産物とを混合して、オーバーラップＰＣＲによって、Ｐ［ＰＤＣ１］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔを作成し、プライマーＨＹ１６（配列番号７６６）およびＨＹ４（配列番号７５４）によって増幅した。得られたＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、ｆｒａ２Δ断片ＡＢＣを含有するプラスミドの対応する部位にライゲートした。プライマーｏＢＰ６９１（配列番号７４３）およびｏＢＰ６９６（配列番号７４４）によって、組み込みカセット全体を得られたプラスミドから増幅した。
【０２９３】
Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ＹＰＲＣΔ１５にａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）が組み込まれたＰＮＹ２２１１変異体のコンピテント細胞を作成し、ｆｒａ２Δ−Ｐ［ＰＤＣ１］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ組み込みカセットＰＣＲ産物で形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、３０℃で播種した。プライマーＵＲＡ３−ｅｎｄ  Ｆ（配列番号７５５）およびｏＢＰ７３１（配列番号７６５）を用いて、ＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングした。正しい形質転換体をＹＰＥ（１％エタノール）中で培養し、１％ＥｔＯＨ添加、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーが欠失した単離株を選択した。Ｐ［ＰＤＣ１］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔの組み込みは、ＹｅａＳｔａｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で調製されたゲノムＤＮＡを使用して、内部プライマーＨＹ３１（配列番号７５９）および外部プライマーｏＢＰ７３１（配列番号７６５）を用いたコロニーＰＣＲと、外部プライマーｏＢＰ７３０（配列番号７６４）およびｏＢＰ７３１（配列番号７６５）によるＰＣＲとによって確認された。以下の遺伝子型の正しい単離株をＰＮＹ１５２８と命名した：ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＤＨ｜ａｄｈ＿Ｈｌ−ＡＤＨ１ｔ  ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ  ｙｐｒｃΔ１５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ａｄｈ＿Ｈｌ−ＡＤＨ１ｔ。
【０２９４】
ＰＮＹ１５２８からのＰＮＹ１５５６の構築
以下には、ＰＮＹ１５２８中のａｄｈ１Δ位置において、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の染色体コピーをｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）またはｋｉｖＤ＿Ｍｃ（ｙ）で置換するのに使用されるコンストラクトのアセンブリーと、ｋｉｖＤ遺伝子を発現するＰＮＹ１５５６株の構築とが記載される。
【０２９５】
前項に記載されるように、標的範囲の上流および下流の相同領域と、形質転換体の選択のためのＵＲＡ３遺伝子とを含有するＰＣＲ産物を使用して、相同的組換えによって欠失／組み込みを作成した。
【０２９６】
ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を組み込むためのプラスミドは、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）をサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＤＨ１位置に組み込むために構築されたプラスミドに由来する。ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）をＡＤＨ１位置に組み込むのに使用されるプラスミドの構築については、下述される。プラスミドは、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳ中で構築した。
【０２９７】
ＡＤＨ１欠失／ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）組み込みプラスミドの構築
ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５６２（配列番号５４１）と、ＡＤＨ１断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５６３（配列番号１１４）とによって、テンプレートとしてｐＬＨ４６８（配列番号５５３）を使用して、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の発現のためにコドン最適化されたラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのｋｉｖＤコード領域、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）を増幅した。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５６４（配列番号５４３）と、ＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５６５（配列番号５４４）とによって、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡから、ＡＤＨ１断片Ｂを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で精製した。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂは、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）およびＡＤＨ１断片Ｂ  ＰＣＲ産物を混合し、プライマーｏＢＰ５６２（配列番号５４１）およびｏＢＰ５６５（配列番号５４４）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩおよびＦｓｅＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、適切な酵素による消化後に、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。ＳａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０５（配列番号５４５）と、ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０６（配列番号５４６）とによって、ゲノムＤＮＡからＡＤＨ１断片Ａを増幅した。ＡＤＨ１断片Ａ  ＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＡｓｃＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂ含有プラスミドの対応する部位にライゲートした。ＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０７（配列番号５４７）と、ＳａｌＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０８（配列番号５４８）とによって、ゲノムＤＮＡからＡＤＨ１断片Ｃを増幅した。ＡＤＨ１断片Ｃ  ＰＣＲ産物をＰａｃＩおよびＳａｌＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでＡＤＨ１断片Ａ−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂ含有プラスミドの対応する部位にライゲートした。ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６７４（配列番号５４９）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６７５（配列番号５５０）とによって、ベクターｐＲＳ３１６−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１−ＧＵＳ（配列番号５５４）から、ハイブリッドプロモーターＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１を増幅した。ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１  ＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片ＡＢＣを含有するプラスミドの対応する部位にライゲートして、ｐＢＰ１１８１を作成した。
【０２９８】
ＡＤＨ１欠失／ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）組み込みプラスミドｐＢＰ１１８１から、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）を除去した。プラスミドをＰｍｅＩおよびＦｓｅＩで消化し、大型ＤＮＡ断片をアガロースゲルと、それに続くゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ８２１（配列番号５６４）と、ＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ４８４（配列番号５７８）とによって、ｐＢＰ１１８１からＡＤＨ１断片Ｂを増幅した。ＡＤＨ１断片Ｂ  ＰＣＲ産物をＰｍｅＩおよびＦｓｅＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、ゲル精製した大型ＤＮＡ断片の対応する部位にライゲートした。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）ＰＮＹ１５２８のｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の標的化欠失のために、３’  ５００ｂｐのｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）に対応するＰＣＲ断片を得られたベクターにクローン化した。ＮｏｔＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ８２２（配列番号５７９）と、ＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ８２３（配列番号５８０）とによって、ｐＢＰ１１８１から断片を増幅した。断片をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、適切な制限酵素による消化後に、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）欠失がある上記プラスミドのＵＲＡ３下流の対応する部位にライゲートした。得られたプラスミドをｐＢＰ１７１６と命名した。
【０２９９】
ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）によって、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現のためにコドン最適化された、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）からのｋｉｖＤコード領域（配列番号５８１）であるｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を合成した。ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ８２８（配列番号５８２）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ８２９（配列番号５８３）とで、ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、適切な酵素による消化後に、ｐＢＰ１７１６の対応する部位にライゲートした。プライマーＦＢＡｐ−Ｆ（配列番号５７６）およびｏＢＰ８２９（配列番号５８３）を用いたＰＣＲによって、クローン遺伝子の配向をチェックした。正しい方向のｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）がある単離株をｐＢＰ１７１９と命名した。
【０３００】
プライマーｏＢＰ５０５（配列番号５４５）およびｏＢＰ８２３（配列番号５８０）によって、ｐＢＰ１７１９からｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）欠失／ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）組み込みカセットを増幅した。Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＮＹ１５２８のコンピテント細胞を作成して、ＰＣＲ産物に形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、３０℃で播種した。形質転換体をＹＰＥ（１％エタノール）中で培養し、１％ＥｔＯＨ添加、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーが欠失した単離株を選択した。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の欠失とｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）の組み込みは、ＹｅａＳｔａｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ６７４（配列番号４５９）およびｏＢＰ８３０（配列番号５８４）を用いたＰＣＲによって確認された。正しい単離株は、ＰＮＹ１５２８中のｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）と同一位置にｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を含有して、同一プロモーターから発現され、ＰＮＹ１５５６と命名された。
【０３０１】
ＰＮＹ２０５６株の構築
ＰＮＹ２０５６を構築するさらなる遺伝子操作のための宿主細胞として、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ０８２７株が使用される。ＰＮＹ０８２７は、米国微生物系統保存機関Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９において、２０１１年９月２２日にブダペスト条約の下にＡＴＣＣに寄託されて、特許寄託名ＰＴＡ−１２１０５を有する、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来株を指す。
【０３０２】
ＵＲＡ３の欠失および半数体胞子形成
内在性ＵＲＡ３コード領域を欠失させるために、ｌｏｘＰ部位で挟まれたＰＴＥＦ１−ｋａｎＭＸ４−ＴＥＦ１ｔカセットを含有するｐＬＡ５４（配列番号４６５）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅し、生体内で相同的組換して、引き続いてＫＡＮＭＸ４マーカーを除去した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびプライマーＢＫ５０５（配列番号４６６）およびＢＫ５０６（配列番号４６７）を使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＵＲＡ３部分は、ｋａｎＭＸ４カセットの組み込みがＵＲＡ３コード領域の置換をもたらすように、ＵＲＡ３  ＡＴＧの１８０ｂｐ上流の５’領域およびコード領域の７８ｂｐ下流の３’領域から誘導された。標準遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を使用して、ＰＣＲ産物をＰＮＹ０８２７に形質転換し、３０℃で２％グルコースおよび１００μｇ／ｍＬのジェネテシンを添加したＹＥＰ培地上で形質転換体を選択した。プライマーＬＡ４６８（配列番号４６８）およびＬＡ４９２（配列番号４６９）を用いたコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、組み込みカセットの存在を確認した。遺伝子型ＭＡＴａ／α  ＵＲＡ３／ｕｒａ３：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰを有する異型接合二倍体、ＮＹＬＡ９８が得られた。半数体を得るために、標準法を使用してＮＹＬＡ９８に胞子形成させた（Ｃｏｄｏｎ  ＡＣ，Ｇａｓｅｎｔ−Ｒａｍｉｒｅｚ  ＪＭ，Ｂｅｎｉｔｅｚ  Ｔ．Ｆａｃｔｏｒｓ  ｗｈｉｃｈ  ａｆｆｅｃｔ  ｔｈｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｂａｋｅｒ’ｓ  ｙｅａｓｔ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９５  ＰＭＩＤ：７５７４６０１）。極微操作装置を使用して四分子を解体し、２％グルコースを添加した富化ＹＰＥ培地上で培養した。ウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上に、４個の生存能力がある胞子を含有する四分子をパッチに植えて、プライマーＡＫ１０９−１（配列番号５８５）、ＡＫ１０９−２（配列番号５８６）、およびＡＫ１０９−３（配列番号５８７）を使用する多重コロニーＰＣＲによって、交雑型を確認した。得られた同定された（ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）半数体株は、ＮＹＬＡ１０３と称されて遺伝子型ＭＡＴα  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰを有し、ＮＹＬＡ１０６と称されて遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰを有する。
【０３０３】
Ｈｉｓ３の欠失
内在性ＨＩＳ３コード領域を欠失させるために、無瘢痕欠失カセットを使用した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用してと、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製されたＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡをテンプレートとして、無瘢痕ＨＩＳ３欠失のためのＰＣＲカセットのための４つの断片を増幅した。ＨＩＳ３断片Ａは、ＨＩＳ３断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号４７０）とプライマーｏＢＰ４５３（配列番号４７１）によって増幅した。ＨＩＳ３断片Ｂは、ＨＩＳ３断片Ａの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５４（配列番号４７２）、およびＨＩＳ３断片Ｕの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５５（配列番号４７３）によって増幅した。ＨＩＳ３断片Ｕは、ＨＩＳ３断片Ｂの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５６（配列番号４７４）、およびＨＩＳ３断片Ｃの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５７（配列番号４７５）によって増幅した。ＨＩＳ３断片Ｃは、ＨＩＳ３断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ４５８（配列番号４７６）とプライマーｏＢＰ４５９（配列番号４７７）によって増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＨＩＳ３断片ＡとＨＩＳ３断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号４７０）およびｏＢＰ４５５（配列番号４７３）で増幅することで、ＨＩＳ３断片ＡＢをオーバーラップＰＣＲによって作成した。ＨＩＳ３断片ＵとＨＩＳ３断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ４５６（配列番号４７４）およびｏＢＰ４５９（配列番号４７７）で増幅することで、ＨＩＳ３断片ＵＣをオーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）がそれに続いた。ＨＩＳ３断片ＡＢとＨＩＳ３断片ＵＣとを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号４７０）およびｏＢＰ４５９（配列番号４７７）で増幅することで、ＨＩＳ３  ＡＢＵＣカセットをオーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＮＹＬＡ１０６のコンピテント細胞をＨＩＳ３  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換して、ウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上に３０℃で播種した。ヒスチジン欠損２％グルコース添加合成完全培地上における３０℃での形質転換体のレプリカ平板法によって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。ゲノムＤＮＡプレップを作成し、５’末端のためのプライマーｏＢＰ４６０（配列番号４７８）およびＬＡ１３５（配列番号５９０）、および３’末端のためのプライマーｏＢＰ４６１（配列番号４７９）およびＬＡ９２（配列番号５９０）を使用したＰＣＲによって、組み込みを確認した。標準プロトコルに従って、２％グルコースおよび５−ＦＯＡを添加し���合成完全培地上における３０℃での平板培養によって、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。マーカー除去は、５−ＦＯＡプレートからのコロニーをＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチで植えて、成長不在を立証することで確認した。ＰＮＹ２００３と称される得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δを有する。
【０３０４】
ＰＤＣ１の欠失
内在性ＰＤＣ１コード領域を欠失させるために、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを含有するｐＬＡ５９（配列番号５９１）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅し、生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびプライマーＬＡ６７８（配列番号５９２）およびＬＡ６７９（配列番号５９３）を使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＰＤＣ１部分は、ＵＲＡ３カセット組み込みが、ＰＤＣ１コード領域の置換をもたらすが、コード領域の最初の５０ｂｐおよび最後の５０ｂｐは残すように、ＰＤＣ１開始コドンの５０ｂｐ下流の５’領域および停止コドンの５０ｂｐ上流の３’領域から誘導された。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２００３に形質転換し、ウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。５’コード領域外部のプライマーＬＡ３３７（配列番号５９７）およびＵＲＡ３内部のプライマーＬＡ１３５（配列番号５８８）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。次に、ＰＤＣ１コード領域内部のプライマーＬＡ６９２（配列番号５９５）およびＬＡ６９３（配列番号５９６）を使用したコロニーＰＣＲによって、正の形質転換体をスクリーニングした。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４（配列番号５９７）で形質転換し、ヒスチジン欠損２％グルコース添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を０．５％ガラクトース添加富栄養培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２００８と称される得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０３０５】
ＰＤＣ５の欠失
内在性ＰＤＣ５コード領域を欠失させるために、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを含有するｐＬＡ５９（配列番号５９１）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅し、生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびプライマーＬＡ７２２（配列番号５９８）およびＬＡ７３３（配列番号５９９）を使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＰＤＣ５部分は、ＵＲＡ３カセット組み込みが、ＰＤＣ５コード領域全体の置換をもたらすように、ＰＤＣ５開始コドンの５０ｂｐ上流の５’領域および停止コドンの５０ｂｐ下流の３’領域から誘導された。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２００８に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。５’コード領域外部のプライマーＬＡ４５３（配列番号６００）およびＵＲＡ３内部のプライマーＬＡ１３５（配列番号５８８）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。次に、ＰＤＣ５コード領域内部のプライマーＬＡ６９４（配列番号６０１）およびＬＡ６９５（配列番号６０２）を使用したコロニーＰＣＲによって、正の形質転換体をスクリーニングした。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４（配列番号５９７）で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノールおよび０．５％ガラクトース添加富化ＹＥＰ培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２００９と称される得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０３０６】
ＦＲＡ２の欠失
ＦＲＡ２欠失をデザインして、コード配列の３’末端から２５０ヌクレオチドを欠失させ、ＦＲＡ２コード配列の最初の１１３ヌクレオチドは無処理のままにした。インフレームの停止コドンは、欠失から７ヌクレオチド下流に存在する。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製されたＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡをテンプレートとして、無瘢痕ＦＲＡ２欠失のためのＰＣＲカセットのための４つの断片を増幅した。ＦＲＡ２断片Ａは、ＦＲＡ２断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号５２９）とプライマーｏＢＰ５９５（配列番号５３０）によって増幅した。ＦＲＡ２断片Ｂは、ＦＲＡ２断片Ａの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５９６（配列番号５３１）、およびＦＲＡ２断片Ｕの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５９７（配列番号５３２）によって増幅した。ＦＲＡ２断片Ｕは、ＦＲＡ２断片Ｂの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５９８（配列番号５３３）、およびＦＲＡ２断片Ｃの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５９９（配列番号５３４）によって増幅した。ＦＲＡ２断片Ｃは、ＦＲＡ２断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ６００（配列番号５３５）、およびプライマーｏＢＰ６０１（配列番号５３６）によって増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＦＲＡ２断片ＡとＦＲＡ２断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号５２９）およびｏＢＰ５９７（配列番号５３２）で増幅することで、ＦＲＡ２断片ＡＢをオーバーラップＰＣＲによって作成した。ＦＲＡ２断片ＵとＦＲＡ２断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ５９８（配列番号５３３）およびｏＢＰ６０１（配列番号５３６）で増幅することで、ＦＲＡ２断片ＵＣをオーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）がそれに続いた。ＦＲＡ２断片ＡＢとＦＲＡ２断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号５２９）およびｏＢＰ６０１（配列番号５３６）で増幅することで、ＦＲＡ２  ＡＢＵＣカセットをオーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【０３０７】
内在性ＦＲＡ２コード領域を欠失させるために、標準的な技術を使用して、上で得られた無瘢痕欠失カセットをＰＮＹ２００９に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に播種した。ゲノムＤＮＡプレップを作成し、５’末端のためのプライマーｏＢＰ６０２（配列番号５３７）およびＬＡ１３５（配列番号５８８）、およびプライマーｏＢＰ６０２（配列番号５３７）およびｏＢＰ６０３（配列番号５３８）を使用したＰＣＲによって全遺伝子座を増幅し、組み込みを確認した。標準プロトコルに従って、１％エタノールおよび５−ＦＯＡ（５−フルオロオロト酸）を添加した合成完全培地上における３０℃での平板培養によって、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、５−ＦＯＡプレートからのコロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２０３７と称される得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δを有する。
【０３０８】
天然２−ｍｉｃｒｏｎプラスミドの添加
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、ｐＬＡ５９（配列番号５９１）から、ｌｏｘＰ７１−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ６６マーカーをＰＣＲ増幅し、ＬＡ８１１ｘ８１７（配列番号６０３、６０４）およびＬＡ８１２ｘ８１８（配列番号６０５、６０６）２−ｍｉｃｒｏｎプラスミド断片（ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄからの天然２−ｍｉｃｒｏｎプラスミドから増幅された；オランダ微生物株保存センター（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ）と共に、ＳＥ−ＵＲＡプレート上でＰＮＹ２０３７株に３０℃で形質転換した。得られたＰＮＹ２０３７  ２μ：：ｌｏｘＰ７１−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ６６株を、ｐＬＡ３４（ｐＲＳ４２３：：ｃｒｅ）（ｐＬＡ３４とも称される）（配列番号５９７）で形質転換し、ＳＥ−ＨＩＳ−ＵＲＡプレート上において３０℃で選択した。形質転換体をＹＰ−１％ガラクトースプレート上にパッチに植えて、４８時間３０℃で成長させてＣｒｅリコンビナーゼ発現を誘導した。次に個々のコロニーをＳＥ−ＵＲＡ、ＳＥ−ＨＩＳ、およびＹＰＥプレート上にパッチに植えて、ＵＲＡ３マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２０５０と称される得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ，ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎを有する。
【０３０９】
ＰＮＹ２０５０からのＰＮＹ２０６８構築
ＰＮＹ２０６８［ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｇｐｄ２Δ  ｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＰＦＢＡ１−ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｌｄ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−ＰＦＢＡ１−ｋｉｖＤ＿Ｌｇ−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：ＰＩＬＶ５−ＡＤＨ＿Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ１Δ：：ＰＰＤＣ１−ＡＤＨ＿Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６］は、ＰＮＹ２０５０から以下のように構築した。
【０３１０】
ＧＰＤ２の欠失
内在性ＧＰＤ２コード領域を欠失させるために、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを含有するｐＬＡ５９（配列番号５９１）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅し、生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびプライマーＬＡ５１２（配列番号５２２）およびＬＡ５１３（配列番号５２３）を使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＧＰＤ２部分は、ＵＲＡ３カセット組み込みが、ＧＰＤ２コード領域全体の置換をもたらすように、ＧＰＤ２開始コドンの５０ｂｐ上流の５’領域および停止コドンの５０ｂｐ下流の３’領域から誘導された。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２０５０に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。５’コード領域外部のプライマーＬＡ５１６（配列番号６０７）およびＵＲＡ３内部のプライマーＬＡ１３５（配列番号５８８）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。次に、ＧＰＤ２コード領域内部のプライマーＬＡ５１４（配列番号６０８）およびＬＡ５１５（配列番号６０９）を使用したコロニーＰＣＲによって、正の形質転換体をスクリーニングした。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４（配列番号５９７）で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノールおよび０．５％ガラクトース添加富栄養培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２０５６と称される得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｇｐｄ２Δを有する。
【０３１１】
ＰＮＹ１５５８株の構築
ＰＮＹ１５５８は、ＰＮＹ２０５６中のｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ遺伝子座における、ホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼ発現カセットの組み込みによってＰＮＹ２０５６から誘導され、Ｃ２非依存性株が作成された。ホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼ発現カセットＰ［ＴＥＦ（Ｍ４）］−ｘｐｋ１＋Ｐ［ＥＮＯ１］−ｅｕｔＤ（配列番号６１０）は、ｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１＋ＥＮＯ１−ｅｕｔＤ（配列番号５６１；参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１２０２３７９８８号明細書）からのもので、それは酵母ＴＥＦ１変異４プロモーターから発現されるラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）からのｘｐｋ１遺伝子を有して（Ｎｅｖｏｉｇｔ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖ７２  ｐ５２６６）、ホスホケトラーゼ発現のためのＣＹＣ１ターミネーター、および酵母ＥＮＯ１プロモーターから発現されるラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）からのｅｕｔＤ遺伝子がそれに続き、ホスホトランスアセチラーゼ発現のためのＡＤＨ１ターミネーターがそれに続く。ホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼ発現カセットは、それぞれＥｃｏＲＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ９６２（配列番号６１１）およびｏＢＰ９６３（配列番号６１２）を使用して、ｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１＋ＥＮＯ１−ｅｕｔＤから増幅された。ＥｃｏＲＩでの消化後に、得られたＰＣＲ産物およびｐＬＡ５９（配列番号５９１）を共にライゲートした。ｐＬＡ５９は、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを含有する。得られたプラスミドからのＵＲＡ３−ｘｐｋ−ｅｕｔＤ組み込みカセットは、ＰＤＣ５の上流配列との相同性がある５’テールを含有するｏＢＰ９８８（配列番号６１３）、およびＰＤＣ５の下流配列との相同性がある５’テールを含有するｏＢＰ９８９（配列番号６１４）によって増幅した。得られたＰＣＲ産物でＰＮＹ２０５６を形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上における３０Ｃでの成長について、形質転換体を選択した。正しい部位への組み込みをＰＣＲによって確認し、ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＪＴ２５４（配列番号６１５）での形質転換によってＵＲＡ３マーカーを除去し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種した。ＰＣＲによってＵＲＡ３マーカーの除去を確認した後、ＹＰＥ（１％エタノール）中で株を培養して、ＣＲＥプラスミドを除去した。ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ遺伝子座にホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼ発現カセットが正しく組み込まれ、ＵＲＡ３マーカーおよびＣＲＥプラスミドが除去された株をＰＮＹ１５５８と命名した。
【０３１２】
プロモーターａｌｓＳ組み込みプラスミドｐＢＰ２６４０、ｐＢＰ２６４１、ｐＢＰ２６６２、ｐＢＰ２６６６、ｐＢＰ２７２８、ｐＢＰ２７３０、およびｐＢＰ２７３２の構築
ｐＢＰ２２３４は、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳから誘導された。ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳはｐＵＣ１９−ベースであり、多重クローニング部位（ＭＣＳ）内に位置する、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＵＲＡ３遺伝子の配列を含有する。ｐＵＣ１９は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中における複製と選択のための、ｐＭＢ１レプリコンおよびβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を含有する。ＵＲＡ３のためのコード配列の他に、酵母中のＵＲＡ３遺伝子発現のために、この遺伝子の上流および下流からの配列を含めた。ベクターをクローニング目的で使用し得て、酵母組み込みベクターとして使用し得る。ｐＢＰ２２３４は、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳからＵＲＡ３マーカーを除去し、ｐＬＡ５９（配列番号５９１）からの縮重ｌｏｘＰ部位とプライマー結合部位とで挟まれたＵＲＡ３マーカーで、それを置換することによって構築された。ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳをＮｏｔＩおよびＦｓｅＩで消化して、得られた大型断片をゲル精製した。ｐＬＡ５９中の縮重ｌｏｘＰ部位とプライマー結合部位とで挟まれたＵＲＡ３マーカーを、ＦｓｅＩ制限部位を含有するｏＢＰ８８０（配列番号６１６）、およびＮｏｔＩ制限部位を含有するｏＢＰ８８１（配列番号６１７）で増幅した。得られたＰＣＲ産物をＦｓｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、次にｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳからのゲル精製した大型断片と共にライゲートした。得られたプラスミドは、ｐＢＰ２２３４（配列番号６１８）と命名された。
【０３１３】
組み込みプラスミドを、ＰＮＹ１５５８のｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ遺伝子座へのプロモーターａｌｓＳコンストラクト組み込みのために作成した。ＰＤＣ１コード配列上流の配列７５１から１０００ｂｐに及ぶ最初の２５０ｂｐのＤＮＡを、ｐＢＰ２２３４にクローン化した。この配列は、相同組換えによる組み込みに必要な相同性を作り出し、そうすることでＰＤＣ１プロモーターの欠失もまたもたらした。ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ１１６７（配列番号６１９）、およびＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ１１６８（配列番号６２０）を使用して、ＰＮＹ０８２７ゲノムＤＮＡから、２５０ｂｐの上流相同性領域を増幅した。適切な酵素による消化後に、得られたＰＣＲ産物をｐＢＰ２２３４にライゲートして、プラスミドｐＢＰ２６３８を作成した。ＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ１１６９（配列番号６２２）、およびＳａｌＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ１１７０（配列番号６２３）を使用して、プラスミドｐＹＺ０９０（配列番号６２１）から、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｌｓＳ遺伝子を増幅した。ＮｏｔＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ１１６５（配列番号６２４）、およびＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ１１６６（配列番号６２５）を使用して、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡから、ＨＸＴ３プロモーター領域を増幅した。適切な酵素による消化後に、ＨＸＴ３プロモーター領域のＰＣＲ産物とａｌｓＳをｐＢＰ２６３８にライゲートして、プラスミドｐＢＰ２６４０（配列番号６２６）を作成した。ＮｏｔＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ１１６３（配列番号６２７）、およびＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ１１６４（配列番号６２８）を使用して、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡから、ＨＸＴ１プロモーター領域を増幅した。適切な酵素による消化後に、ＨＸＴ１プロモーター領域のＰＣＲ産物およびａｌｓＳをｐＢＰ２６３８にライゲートして、プラスミドｐＢＰ２６４１（配列番号６２９）を作成した。
【０３１４】
ＰＤＣ１停止コドン後の１番目のｂｐに始まるＰＤＣ１下流の２６１ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＢＰ２６４０にクローン化した。ＸｈｏＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ１２０５（配列番号６３０）、およびＳａｌＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ１２０６（配列番号６３１）を使用して、ＰＮＹ０８２７ゲノムＤＮＡから、２６１ｂｐの領域を増幅した。ＸｈｏＩおよびＳａｌＩによるＰＣＲ産物の消化後、およびＳａｌＩによるｐＢＰ２６４０の消化後に、得られたＰＣＲ産物をｐＢＰ２６４０にライゲートして、プラスミドｐＢＰ２６６２（配列番号６３２）を作成した。
【０３１５】
ｐＢＰ２６４０をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化して、大型断片をゲル精製してＨＸＴ３プロモーターを除去した。ＮｏｔＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ１２１１（配列番号６３３）、およびＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ１２１２（配列番号６３４）を使用して、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡから、ＡＮＢ１プロモーター領域を増幅した。ＡＮＢ１プロモーター領域のＰＣＲ産物を適切な酵素で消化して、消化ｐＢＰ２６４０大型断片と共にライゲートして、プラスミドｐＢＰ２６６６（配列番号６３５）を作成した。ＮｏｔＩ制限部位を含有するプライマーＨＹ１８３（配列番号６３６）、およびＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーＨＹ１８４（配列番号６３７）を使用して、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡから、ＴＩＲ１プロモーター領域を増幅した。ＴＩＲ１プロモーター領域のＰＣＲ産物を適切な酵素で消化して、消化ｐＢＰ２６４０大型断片と共にライゲートして、プラスミドｐＢＰ２７２８（配列番号６３８）を作成した。ＮｏｔＩ制限部位を含有するプライマーＨＹ１８５（配列番号６３９）、およびＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーＨＹ１８６（配列番号６４０）を使用して、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡから、ＨＥＭ１３プロモーター領域を増幅した。ＨＥＭ１３プロモーター領域のＰＣＲ産物を適切な酵素で消化して、消化ｐＢＰ２６４０大型断片と共にライゲートして、プラスミドｐＢＰ２７３０（配列番号６４１）を作成した。ＮｏｔＩ制限部位を含有するプライマーＨＹ１８７（配列番号６４２）、およびＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーＨＹ１８８（配列番号６４３）を使用して、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡから、ＨＥＳ１プロモーター領域を増幅した。ＨＥＳ１プロモーター領域のＰＣＲ産物を適切な酵素で消化して、消化ｐＢＰ２６４０大型断片と共にライゲートして、プラスミドｐＢＰ２７３２（配列番号６４４）を作成した。
【０３１６】
ＰＮＹ１５５９、ＰＮＹ１５６０、ＰＮＹ１５６１、ＰＮＹ１５６２、ＰＮＹ１６２３、ＰＮＹ１６２４、ＰＮＹ１６２５、ＰＮＹ１６２６、およびＰＮＹ１６２７株の構築
株を構築して、染色体上の単コピー組み込みからａｌｓＳ遺伝子を発現した。イソブタノール経路の最後の４つの酵素は、多コピープラスミド上に保有された。ｐＨＲ８１−ＩＬＶ５ｐ−Ｋ９ＪＢを構築して、酵母ＩＬＶ５プロモーター（ｎｔ  ８４２０〜９６１３）から発現されたアナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）からのＫ９ＪＢ４Ｐ変異体ｉｌｖＣ遺伝子のコード領域（ｎｔ  ８〜１０３６）と、それに続くＫＡＲＩ発現のためのＩＬＶ５ターミネーター（ｎｔ  １０６５〜１６８７）を有する、キメラ遺伝子を包めた。ｐＬＡ８４を構築して、酵母ＦＢＡ１プロモーター（ｎｔ  ５２７７〜５８６６）から発現されたストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）からのｉｌｖＤ遺伝子（ｎｔ位置５８７６〜７５８８）のコード領域と、それに続くＤＨＡＤ発現のためのＦＢＡ１ターミネーター（ｎｔ  ７６２１〜７９３３）を有するキメラ遺伝子；酵母ＧＰＭ１プロモーター（ｎｔ  １０１０７〜９３５１）から発現されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の発現のためにコドン最適化されたベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ）からの遺伝子コード領域（ｎｔ  ９３３９〜８２９６）と、それに続くＡＤＨ発現のためのＡＤＨ１ターミネーター（ｎｔ  ８２８７〜７９７２）を有するキメラ遺伝子；および酵母ＴＤＨ３プロモーター（ｎｔ  １３０１７〜１２３５４）から発現されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の発現のためにコドン最適化されたリステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）からのｋｉｖＤ遺伝子のコード領域（ｎｔ  １２３５３〜１０７０７）と、それに続くＡＤＨ発現のためのＴＤＨ３ターミネーター（ｎｔ  １０７０６〜１０１１４）を有するキメラ遺伝子を含めた。
【０３１７】
ＰＮＹ１５５８をプラスミドｐＨＲ８１−ＩＬＶ５ｐ−Ｋ９ＪＢ（配列番号６４５）およびｐＬＡ８４（配列番号６４６）で形質転換し、ウラシルおよびヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上における３０℃での成長について、形質転換体を選択した。形質転換体はＰＮＹ１５５９と命名され；ａｌｓＳを含まない対照株であった。
【０３１８】
ＵＲＡ３−Ｐ［ＨＸＴ３］−ａｌｓＳ組み込みカセットは、ＰＤＣ１下流配列との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ１１６７（配列番号６１９）とプライマーｏＢＰ１２０４（配列番号６４７）によって、ｐＢＰ２６４０から増幅した。得られたＰＣＲ産物でＰＮＹ１５５８を形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上における３０℃での成長について、形質転換体を選択した。正しい部位への組み込みをＰＣＲによって確認し、ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＪＴ２５４（配列番号６１５）での形質転換によってＵＲＡ３マーカーを除去し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種した。ＰＣＲによってＵＲＡ３マーカーの除去を確認した後、ＹＰＥ（１％エタノール）中で株を培養して、ＣＲＥプラスミドを除去した。ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ遺伝子座に正しく組み込まれたＰ［ＨＸＴ３］−ａｌｓＳ発現カセットを有し、ＰＤＣ１プロモーター欠失があり、ＵＲＡ３マーカーおよびＣＲＥプラスミドが除去された単離株を、プラスミドｐＨＲ８１−ＩＬＶ５ｐ−Ｋ９ＪＢおよびｐＬＡ８４で形質転換し、ウラシルおよびヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上における３０℃での成長について、形質転換体を選択した。形質転換体は、ＰＮＹ１５６０と命名した。
【０３１９】
ＵＲＡ３−Ｐ［ＨＸＴ１］−ａｌｓＳ組み込みカセットは、ＰＤＣ１下流配列との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ１１６７（配列番号６１９）とプライマーｏＢＰ１２０４（配列番号６４７）によって、ｐＢＰ２６４１から増幅した。得られたＰＣＲ産物でＰＮＹ１５５８を形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上における３０℃での成長について、形質転換体を選択した。正しい部位への組み込みをＰＣＲによって確認し、ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＪＴ２５４（配列番号６１５）での形質転換によってＵＲＡ３マーカーを除去し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種した。ＰＣＲによってＵＲＡ３マーカーの除去を確認した後、ＹＰＥ（１％エタノール）中で株を培養して、ＣＲＥプラスミドを除去した。ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ遺伝子座に正しく組み込まれたＰ［ＨＸＴ１］−ａｌｓＳ発現カセットを有し、ＰＤＣ１プロモーター欠失があり、ＵＲＡ３マーカーおよびＣＲＥプラスミドが除去された単離株を、プラスミドｐＨＲ８１−ＩＬＶ５ｐ−Ｋ９ＪＢおよびｐＬＡ８４で形質転換し、ウラシルおよびヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上における３０℃での成長について、形質転換体を選択した。形質転換体は、ＰＮＹ１５６１と命名した。
【０３２０】
縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３があるａｌｓＳ−ＣＹＣ１ｔ−ＵＲＡ３カセットは、ＰＤＣ１コード配列のすぐ上流の６０ｂｐとの相同性がある５’テールを含有するプライマー８９５（配列番号６５０）、およびＰＤＣ１（ヌクレオチド１５９０−１６３９ｏｆＰＤＣ１）の３’末端に対する相同性がある５’テールを含有するプライマー６７９（配列番号６５１）によって、ｐＬＡ７１（配列番号６４９）から増幅した。得られたＰＣＲ産物でＰＮＹ１５５８を形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上における３０℃での成長について、形質転換体を選択した。正しい部位への組み込みをＰＣＲによって確認し、ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＪＴ２５４（配列番号６１５）での形質転換によってＵＲＡ３マーカーを除去し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種した。ＰＣＲによってＵＲＡ３マーカーの除去を確認した後、ＹＰＥ（１％エタノール）中で株を培養して、ＣＲＥプラスミドを除去した。ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ遺伝子座に正しく組み込まれたａｌｓＳ−ＣＹＣ１ｔ発現カセットを有し、ＰＤＣ１プロモーターによるａｌｓＳ発現があり、ＵＲＡ３マーカーおよびＣＲＥプラスミドが除去された単離株を、プラスミドｐＨＲ８１−ＩＬＶ５ｐ−Ｋ９ＪＢおよびｐＬＡ８４で形質転換し、ウラシルおよびヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上における３０℃での成長について、形質転換体を選択した。形質転換体は、ＰＮＹ１５６２と命名した。
【０３２１】
プラスミドをＳａｌＩおよびＰｍｅＩで消化して、ＵＲＡ３−Ｐ［ＡＮＢ１］−ａｌｓＳ組み込みカセットをｐＢＰ２６６６から遊離した。得られた消化プラスミドでＰＮＹ１５５８を形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上における３０℃での成長について、形質転換体を選択した。正しい部位への組み込みをＰＣＲによって確認し、ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＪＴ２５４（配列番号６１５）での形質転換によってＵＲＡ３マーカーを除去し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種した。ＰＣＲによってＵＲＡ３マーカーの除去を確認した後、ＹＰＥ（１％エタノール）中で株を培養して、ＣＲＥプラスミドを除去した。ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ遺伝子座に正しく組み込まれたＰ［ＡＮＢ１］−ａｌｓＳ発現カセットを有し、ＰＤＣ１プロモーター欠失があり、ＵＲＡ３マーカーおよびＣＲＥプラスミドが除去された単離株を、プラスミドｐＨＲ８１−ＩＬＶ５ｐ−Ｋ９ＪＢおよびｐＬＡ８４で形質転換し、ウラシルおよびヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上における３０℃での成長について、形質転換体を選択した。形質転換体は、ＰＮＹ１６２３と命名した。
【０３２２】
プラスミドをＳａｌＩおよびＰｍｅＩで消化して、ＵＲＡ３−Ｐ［ＴＩＲ１］−ａｌｓＳ組み込みカセットをｐＢＰ２７２８から遊離した。得られた消化プラスミドでＰＮＹ１５５８を形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上における３０℃での成長について、形質転換体を選択した。２つの独立した形質転換体について、正しい部位への組み込みをＰＣＲによって確認し、ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＪＴ２５４（配列番号６１５）での形質転換によってＵＲＡ３マーカーを除去し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種した。ＰＣＲによってＵＲＡ３マーカーの除去を確認した後、ＹＰＥ（１％エタノール）中で株を培養して、ＣＲＥプラスミドを除去した。ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ遺伝子座に正しく組み込まれたＰ［ＴＩＲ１］−ａｌｓＳ発現カセットを有し、ＰＤＣ１プロモーター欠失があり、ＵＲＡ３マーカーおよびＣＲＥプラスミドが除去された２つの独立した単離株を、プラスミドｐＨＲ８１−ＩＬＶ５ｐ−Ｋ９ＪＢおよびｐＬＡ８４で形質転換し、ウラシルおよびヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上における３０℃での成長について、形質転換体を選択した。各独立した組み込み体からの形質転換体を選択し、ＰＮＹ１６２４およびＰＮＹ１６２５と命名した。
【０３２３】
プラスミドをＳａｌＩおよびＰｍｅＩで消化して、ＵＲＡ３−Ｐ［ＨＥＭ１３］−ａｌｓＳ組み込みカセットをｐＢＰ２７３０から遊離した。得られた消化プラスミドでＰＮＹ１５５８を形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上における３０℃での成長について、形質転換体を選択した。正しい部位への組み込みをＰＣＲによって確認し、ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＪＴ２５４（配列番号６１５）での形質転換によってＵＲＡ３マーカーを除去し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種した。ＰＣＲによってＵＲＡ３マーカーの除去を確認した後、ＹＰＥ（１％エタノール）中で株を培養して、ＣＲＥプラスミドを除去した。ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ遺伝子座に正しく組み込まれたＰ［ＨＥＭ１３］−ａｌｓＳ発現カセットを有し、ＰＤＣ１プロモーター欠失があり、ＵＲＡ３マーカーおよびＣＲＥプラスミドが除去された単離株を、プラスミドｐＨＲ８１−ＩＬＶ５ｐ−Ｋ９ＪＢおよびｐＬＡ８４で形質転換し、ウラシルおよびヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上における３０℃での成長について、形質転換体を選択した。形質転換体は、ＰＮＹ１６２６と命名した。
【０３２４】
プラスミドをＳａｌＩおよびＰｍｅＩで消化して、ＵＲＡ３−Ｐ［ＨＥＳ１］−ａｌｓＳ組み込みカセットをｐＢＰ２７３２から遊離した。得られた消化プラスミドでＰＮＹ１５５８を形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上における３０℃での成長について、形質転換体を選択した。正しい部位への組み込みをＰＣＲによって確認し、ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＪＴ２５４（配列番号６１５）での形質転換によってＵＲＡ３マーカーを除去し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種した。ＰＣＲによってＵＲＡ３マーカーの除去を確認した後、ＹＰＥ（１％エタノール）中で株を培養して、ＣＲＥプラスミドを除去した。ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ遺伝子座に正しく組み込まれたＰ［ＨＥＳ１］−ａｌｓＳ発現カセットを有し、ＰＤＣ１プロモーター欠失があり、ＵＲＡ３マーカーおよびＣＲＥプラスミドが除去された単離株を、プラスミドｐＨＲ８１−ＩＬＶ５ｐ−Ｋ９ＪＢおよびｐＬＡ８４で形質転換し、ウラシルおよびヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上における３０℃での成長について、形質転換体を選択した。形質転換体は、ＰＮＹ１６２７と命名した。
【０３２５】
ＰＮＹ２１１５からのＰＮＹ２１４５の作成
ｐｄｃ５Δ遺伝子座へのホスホケトラーゼ遺伝子カセットの追加的な組み込みと、ＣＥＮ．ＰＫからのオルソログのコドン最適化バージョン（ｖｅｒｉｓｏｎ）による天然ＡＭＮ１遺伝子の置換によって、ＰＮＹ２１１５からＰＮＹ２１４５を構築した。組み込みコンストラクトを以下でさらに詳しく説明する。
【０３２６】
ｐｄｃ５Δ：：ＦＢＡ（Ｌ８）−ｘｐｋ１−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
プライマーＮ１３４１およびＮ１３３８（配列番号６５２および６５３）を使用して、ｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１＋ＥＮＯ１−ｅｕｔＤ（配列番号５６１）からのＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１−ＣＹＣ１ｔ遺伝子をＰＣＲ増幅して、３．１ｋｂの生成物を作成した。プライマーＮ１０３３ｃおよびＮ１３４２（配列番号６５４および６５５）によって、ｌｏｘＰが側面に位置するｐＬＡ５９（配列番号５９１）からのＵＲＡ３遺伝子カセットを増幅し、１．６ｋｂの生成物を作成した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した追加的な１０サイクルのＰＣＲのために、ｘｐｋ１およびＵＲＡ３ＰＣＲ産物を組み合わせることで、プライマーなしにそれらを融合した。次に得られた反応混合物を、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉおよびプライマーＮ１３４２およびＮ１３６４（配列番号６５５および６５６）によるＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。電気泳動アガロースゲル（Ｚｙｍｏキット）からの精製によって、４．２ｋｂのＰＣＲ産物を回収した。プライマーＮ１３６６およびＮ１３６８（配列番号６５８および６５９）を使用して、ＦＢＡプロモーター変異体Ｌ８（配列番号６５７）を増幅した。ｘｐｋ１：：ＵＲＡ３ＰＣＲ産物は、ＰＣＲの追加的な反復によって、ＦＢＡプロモーターと組み合わせた。得られた生成物をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、ＥｃｏＲＶで消化され仔ウシ腸管ホスファターゼで処理されたｐＢＲ３２２にライゲートした。連結反応を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＳｔｂｌ３コンピテント細胞）に形質転換した。組み込みカセットは、配列決定によって確認した。組み込みのためのＤＮＡを調製するために、Ｋａｐａ  ＨｉＦｉおよびプライマーＮ１３７１およびＮ１３７２（配列番号６６０および６６１）によるＰＣＲ反応中で、プラスミドをテンプレートとして使用した。フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって、ＰＣＲ産物を単離した（標準法を使用して；例えばＭａｎｉａｔａｓ，ｅｔ  ａｌ．）。５マイクログラムのＤＮＡを使用して、ＰＮＹ２１１５株を形質転換した。形質転換体をウラシル欠損培地（ウラシル除去合成完全培地、炭素源として１％エタノール添加）上で選択した。プライマーＢＫ９３およびＮ１１１４（配列番号６６２および５６７）によるＰＣＲ（ＪｕｍｐＳｔａｒｔ）を使用して、コロニーを組み込み事象についてスクリーニングした。２つのクローンを選択して、次の段階で使用した。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＪＴ２５４（配列番号６１５）で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノール添加富栄養培地中で培養して、リコンビナーゼを抑制解除した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、パッチで植えて成長不在を立証することで、単一コロニー単離物についてマーカー除去を確認した。リコンビナーゼプラスミドｐＪＴ２５４の喪失は、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えることで確認した。適切なマーカー除去は、ＰＣＲ（プライマーＮ１６０ＳｅｑＦ���（配列番号５５９）およびＢＫ３８０によって確認した。得られた１つのクローンは、ＰＮＹ２２９３と命名された。
【０３２７】
ａｍｎ１Δ：：ＡＭＮ１（ｙ）−ｌｏｘＰ７１／６６
ＣＥＮ．ＰＫ２からのＡＭＮ１遺伝子のコドン最適化バージョンで、ＡＭＮ１の内在性コピーを置換するために、ＣＥＮ．ＰＫ  ＡＭＮ１プロモーターと、ＡＭＮ１（ｙ）遺伝子（核酸配列番号６６６；アミノ酸配列番号６６４）と、ＣＥＮ．ＰＫＡＭＮ１ターミネーターとを含有する組み込みカセットをＳＯＥ  ＰＣＲによって組み立て、シャトルベクターｐＬＡ５９にサブクローニングした。ＡＭＮ１（ｙ）遺伝子は、ＤＮＡ２．０から注文され、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のためにコドン最適化された。完成したｐＬＡ６７プラスミド（配列番号６６７）は、１）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含有するｐＵＣ１９ベクター主鎖配列；２）ｌｏｘＰ７１およびｌｏｘＰ６６部位で挟まれたＵＲＡ３選択マーカー；および３）ＰＡＭＮ１（ＣＥＮ．ＰＫ）−ＡＭＮ１（ｙ）−ｔｅｒｍＡＭＮ１（ＣＥＮ．ＰＫ）発現カセットを含有した。
【０３２８】
Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡからのＫＡＰＡ  ＨｉＦｉおよびプライマーＬＡ７１２（配列番号６６８）およびＬＡ７４６（配列番号６６９）を使用することで、ＡＭＮ１（ｙ）−ｌｏｘＰ７１−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ６６カセットのＰＣＲ増幅を実施した。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２２９３に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。対照（ＰＮＹ２２９３）と比較した凝集表現型の不在について、形質転換体を拡大観察した。上述したようにｐＪＴ２５４Ｃｒｅリコンビナーゼプラスミドを使用して、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。マーカー再循環後、クローンを再度拡大観察して、凝集表現型不在を確認した。得られた同定株ＰＮＹ２１４５は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＦＢＡ（Ｌ８）］−ＸＰＫ｜ｘｐｋ１＿Ｌｐ−ＣＹＣｔ−ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｐｌａｓｍｉｄ（ＣＥＮ．ＰＫ２）ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ａｍｎ１Δ：：ＡＭＮ１（ｙ）を有する。
【０３２９】
ＰＮＹ１６３１、ＰＮＹ１６３２、ＰＮＹ１６３３、ＰＮＹ１６３４、ＰＮＹ１６３５、およびＰＮＹ１６３６株の構築
プロモーター−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）融合も含有するイソブタノール生成株を構築した。プロモーター−ＧＦＰ融合を含有するプラスミドは、動原体シャトルベクターであるｐＲＳ４１３（ＡＴＣＣ＃８７５１８）をベースとした。ｐＲＳ４１３中の異なるプロモーターの下流で、ＧＦＰタンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）の遺伝子をクローン化した。
【０３３０】
ＰＮＹ２０５０からのＰＮＹ２１１５構築
ＰＮＹ２０５０からのＰＮＹ２１１５［ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎプラスミド（ＣＥＮ．ＰＫ２）ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６］の構築は、次のようであった。
【０３３１】
ａ．ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
内在性ＰＤＣ１プロモーターを使用して、ａｌｓＳをＰＮＹ２０５０のｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ６６／７１遺伝子座に組み込むために、ＦＢＡ１プロモーターとＣＹＣ１ターミネーターがあるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種からの遺伝子アセト乳酸シンターゼを含有するｐＬＡ７１（配列番号８１０）から、組み込みカセットをＰＣＲ増幅し、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ（商標）ＰＣＲキット（Ｋａｐａｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）およびプライマー８９５（配列番号８１３）および６７９（配列番号８１４）を使用することで、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＰＤＣ１部分は、コード配列上流の６０ヌクレオチドおよび停止コドンの５３ヌクレオチド上流の５０ヌクレオチドから誘導された。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２０５０に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。３’コード領域外部のプライマー６８１（配列番号８１５）およびＵＲＡ３遺伝子内部のプライマー９２（配列番号８１６）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。次に陽性形質転換体をゲノムＤＮＡのためにプレップして、プライマーＮ２４５（配列番号８１７）およびＮ２４６（配列番号８１８）を使用したＰＣＲによって、スクリーニングした。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４（配列番号８０４）で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノールおよび０．５％ガラクトース添加富栄養培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２０９０と称される得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ，ｈｉｓ３Δ，ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６，ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｐｄ
ｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０３３２】
ｂ．ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
内在性ＰＤＣ６コード領域を欠失させるために、雑種ＦＢＡ１プロモーターおよびＴＤＨ３ターミネーターがあるリステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）種からのｋｉｖＤ遺伝子を含有するｐＬＡ７８（配列番号８１１）から組み込みカセットをＰＣＲ増幅し、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ（商標）ＰＣＲキット（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）およびプライマー８９６（配列番号８１９）および８９７（配列番号８２０）を使用することで、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＰＤＣ６部分は、コード配列の６０ヌクレオチド上流およびコード領域の５９ヌクレオチド下流から誘導された。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２０９０に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。ＰＤＣ６遺伝子の内部プライマーである、プライマー３６５（配列番号８２１）および３６６（配列番号８２２）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。次に、遺伝子の５’末端外部のコロニーＰＣＲＮ６３８（配列番号８２３）、およびＦＢＡ１プロモーター内部の７４０（配列番号８２４）によって、生成物不在の形質転換体をスクリーニングした。ゲノムＤＮＡを陽性形質転換体から調製し、ＰＤＣ６コード配列に対する２つの外部プライマーを使用したＰＣＲによって、スクリーニングした。陽性組み込み体は、４７２０ヌクレオチド長の生成物を生じる一方で、ＰＤＣ６野性型形質転換体は２１３０ヌクレオチド長の生成物を生じる。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノールおよび０．５％ガラクトース添加富栄養培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。得られた同定株はＰＮＹ２０９３と称され、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０３３３】
ｃ．ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
内在性ＡＤＨ１プロモーターを使用して、内在性ＡＤＨ１コード領域欠失させ、ＢｉＡＤＨを組み込むために、ＩＬＶ５プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーターがあるベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ｉｎｄｉｃａ）種からのアルコールデヒドロゲナーゼを含有するｐＬＡ６５（配列番号８１２）から、組み込みカセットをＰＣＲ増幅し、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ（商標）ＰＣＲキット（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）およびプライマー８５６（配列番号８２５）および８５７（配列番号８２６）を使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＡＤＨ１部分は、ＡＤＨ１開始コドンの５０ヌクレオチド上流の５’領域およびコード領域の最後の５０ヌクレオチドから誘導された。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２０９３に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。５’コード領域外部のプライマーＢＫ４１５（配列番号８２７）およびＢｉＡＤＨ遺伝子内部のプライマーＮ１０９２（配列番号８２８）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。次に３’コード領域外部のプライマー４１３（配列番号８２９）、およびＵＲＡ３マーカー内部のプライマー９２（配列番号８１６）を使用したコロニーＰＣＲによって、陽性形質転換体をスクリーニングした。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４（配列番号８０４）で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノールおよび０．５％ガラクトース添加富栄養培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２１０１と称される得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０３３４】
ｄ．ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
ＰＮＹ２１０１のｆｒａ２Δ遺伝子座にＢｉＡＤＨを組み込むために、ＩＬＶ５プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーターがあるベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ｉｎｄｉｃａ）種からのアルコールデヒドロゲナーゼを含有するｐＬＡ６５（配列番号８１２）から、組み込みカセットをＰＣＲ増幅し、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ（商標）ＰＣＲキット（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）およびプライマー９０６（配列番号８３１）および９０７（配列番号８３２）を使用することで、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＦＲＡ２部分は、ＡＴＧに開始するコード配列の最初の６０ヌクレオチドおよび停止コドンの５６ヌクレオチド下流から誘導された。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２１０１に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。５’コード領域外部のプライマー６６７（配列番号８１７）およびＩＬＶ５プロモーター内部のプライマー７４９（配列番号８３３）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４（配列番号８０４）で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノールおよび０．５％ガラクトース添加富栄養培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２１１０と称される得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ６６／７１  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０３３５】
ｅ．ＧＰＤ２欠失
内在性ＧＰＤ２コード領域を欠失させるために、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを含有するｐＬＡ５９（配列番号８３４）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅し、生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ（商標）ＰＣＲキット（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）およびプライマー５１２（配列番号８０５）および５１３（配列番号８０６）を使用することで、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＧＰＤ２部分は、ＵＲＡ３カセット組み込みが、ＧＰＤ２コード領域全体の置換をもたらすように、ＧＰＤ２開始コドンの５０ヌクレオチド上流の５’領域および停止コドンの５０ヌクレオチド下流の３’領域から誘導された。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２１１０に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。５’コード領域外部のプライマーＬＡ５１６（配列番号８０７）およびＵＲＡ３内部のプライマーＬＡ１３５（配列番号８０３）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。次に、ＧＰＤ２コード領域内部のプライマーＬＡ５１４（配列番号８０８）およびＬＡ５１５（配列番号８０９）を使用したコロニーＰＣＲによって、正の形質転換体をスクリーニングした。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４（配列番号８０４）で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノールおよび０．５％ガラクトース添加富栄養培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２１１５と称される得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０３３６】
ｐＢＰ３８３６（配列番号６７０）を構築して、酵母ＦＢＡ１プロモーター（ｎｔ  ２１０３〜２７０３）から発現されたＺｓＧｒｅｅｎコード領域（ｎｔ  ２７１６〜３４１１）と、それに続くＦＢＡ１ターミネーター（ｎｔ  ３４２０〜４４１９）を含めた。ｐＢＰ３８４０（配列番号６７１）を構築して、改変プロモーターＦＢＡ１：：ＨＸＴ１＿３３１（本明細書に記載される；ｎｔ  ２１０３〜２８７８）から発現されたＺｓＧｒｅｅｎコード領域（ｎｔ  ２８９１〜３５８６）と、それに続くＦＢＡ１ターミネーター（ｎｔ  ３５９５〜４５９４）を含めた。ｐＢＰ３９３３（配列番号６７２）を構築して、酵母ＡＤＨ２プロモーター（ｎｔ  ２１０３〜２７５１）から発現されたＺｓＧｒｅｅｎコード領域（ｎｔ  ２７６４〜３４５９）と、それに続くＦＢＡ１ターミネーター（ｎｔ  ３４６８〜４４６７）を含めた。ｐＢＰ３９３５（配列番号６７３）を構築して、酵母ＨＸＴ５プロモーター（ｎｔ  ２１０３〜３０４０）から発現されたＺｓＧｒｅｅｎコード領域（ｎｔ  ３０５３〜３７４８）と、それに続くＦＢＡ１ターミネーター（ｎｔ  ３７５７〜４７５６）を含めた。ｐＢＰ３９３７（配列番号６７４）を構築して、酵母ＨＸＴ７プロモーター（ｎｔ  ２１０３〜３１０２）から発現されたＺｓＧｒｅｅｎコード領域（ｎｔ  ３１１５〜３８１０）と、それに続くＦＢＡ１ターミネーター（ｎｔ  ３８１９〜４８１８）を含めた。ｐＢＰ３９４０（配列番号６７５）を構築して、酵母ＰＤＣ１プロモーター（ｎｔ  ２１０３〜３０５２）から発現されたＺｓＧｒｅｅｎコード領域（ｎｔ  ３０６５〜３７６０）と、それに続くＦＢＡ１ターミネーター（ｎｔ  ３７６９〜４７６８）を含めた。
【０３３７】
ｐＬＨ６８９：：Ｉ２Ｖ５（配列番号６７６）を構築して、酵母ＩＬＶ５プロモーター（ｎｔ  ４２７〜１６２０）から発現されたアナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｐｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃａｅ）からのＫ９ＪＢ４Ｐ変異体ｉｌｖＣ遺伝子のコード領域（ｎｔ  １６２８〜２６５９）と、それに続くＫＡＲＩ発現のためのＩＬＶ５ターミネーター（ｎｔ  ２６８５〜３３０７）を有するキメラ遺伝子；およびストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）（ヌクレオチド５３７７〜３６４１）から発現された酵母ＴＥＦ１変異７プロモーターからのＩ２Ｖ５変異体ｉｌｖＤ遺伝子のコード領域（ｎｔ  ５７８７〜５３８７；Ｎｅｖｏｉｇｔ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖ７２  ｐ５２６６）と、それに続くＤＨＡＤ発現のためのＦＢＡ１ターミネーター（ｎｔ  ３６３２〜３３２０）を有するキメラ遺伝子を含めた。
【０３３８】
プラスミドｐＬＨ６８９：：Ｉ２Ｖ５と、プロモーター−ＧＦＰ融合の１つを含有するプラスミドで、ＰＮＹ２１４５を形質転換した。ウラシルおよびヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上における３０℃での成長について、形質転換体を選択した。ＰＮＹ２１４５をプラスミドｐＬＨ６８９：：Ｉ２Ｖ５およびｐＢＰ３８３６で形質転換して、形質転換体をＰＮＹ１６３１と命名した。ＰＮＹ２１４５をプラスミドｐＬＨ６８９：：Ｉ２Ｖ５およびｐＢＰ３８４０で形質転換して、形質転換体をＰＮＹ１６３２と命名した。ＰＮＹ２１４５をプラスミドｐＬＨ６８９：：Ｉ２Ｖ５およびｐＢＰ３９３３で形質転換して、形質転換体をＰＮＹ１６３３と命名した。ＰＮＹ２１４５をプラスミドｐＬＨ６８９：：Ｉ２Ｖ５およびｐＢＰ３９３５で形質転換して、形質転換体をＰＮＹ１６３４と命名した。ＰＮＹ２１４５をプラスミドｐＬＨ６８９：：Ｉ２Ｖ５およびｐＢＰ３９３５で形質転換して、形質転換体をＰＮＹ１６３４と命名した。ＰＮＹ２１４５をプラスミドｐＬＨ６８９：：Ｉ２Ｖ５およびｐＢＰ３９４０で形質転換して、形質転換体をＰＮＹ１６３４と命名した。
【０３３９】
ＰＮＹ２３３２およびＰＮＹ２２８９株の構築
ＰＮＹ２３３２
Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＢＡ１プロモーターに、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＡＮ１プロモーターからの９５塩基対の好気的リプレッサー配列をクローニングして、酸素によって制御される雑種プロモーターを構築した。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子をレポーターとして使用する最初の雑種プロモーター試験のための１つ目のコンストラクト、そしてＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ１５５８株のΔｐｄｃ１：：ｌｏｘＰ７１／６６遺伝子座へのＵＲＡ３：：Ｐ［ＦＢＡ１：：ＤＡＮ１＿３１４］−ａｌｓＳカセットの組み込みのための２つ目のコンストラクトの２つのコンストラクトを構築した。
【０３４０】
１１９塩基対のＰＣＲ産物をもたらす５’改変ＢｌｐＩ制限部位をそれぞれ含有する、順方向および逆方向プライマーＮ１３８７（配列番号６７７）およびＮ１３８８（配列番号６７８）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｓ２８８ｃ配列、ＡＴＣＣ＃２０４５０８に基づく）を使用して、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４３株（米国微生物系統保存機関，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，＃２０１３９０から入手できる）から調製されたゲノムＤＮＡテンプレートから、ＤＡＮ１プロモーターからの好気的リプレッサー配列をＰＣＲ増幅した。増幅は、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して実施した。得られたＰＣＲ産物をＢｌｐＩで制限消化し、標準連結プロトコルを使用して、ＢｌｐＩであらかじめ直線化したプラスミドｐＲＳ３１６−ＦＢＡ１ｐ−ＧＵＳ中のＦＢＡ１プロモーター配列のＢｌｐＩ部位に、双方向性にクローン化した（それぞれ参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１２０２３７９８８号明細書および国際公開第２０１２／１２９５５５号パンフレットに記載される）。連結ＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞に形質転換して、選択培地上に播種した。順方向および逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅｒ）チェックプライマーＮ１３８９（配列番号６８０）およびＮ１４１１（配列番号６８１）をそれぞれ使用して、いくつかの形質転換体をＰＣＲコロニースクリーニングして、新しいコンストラクトを含有するクローンを単離した。プライマーＧＵＳ７２９Ｒ（配列番号６８２）、Ｎ１３１０（配列番号６８３）、およびＮ１３１１（配列番号６８４）を使用して、いくつかのクローンから調製されたプラスミドを配列決定し、好気的リプレッサー挿入の所望の方向および配列を確認した。新しいコンストラクトは、ｐＪＴ３１４と命名された。雑種ＦＢＡ１プロモーターは、Ｐ［ＦＢＡ１：：ＤＡＮ１＿ＡＲ３１４）（配列番号６８６）と命名された。
【０３４１】
Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）ＰＮＹ１５５８株中のΔｐｄｃ１遺伝子座からのＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｌｓＳ遺伝子発現のために、Ｐ［ＦＢＡ１：：ＤＡＮ１＿ＡＲ３１４］組み込みカセットを構築した。改変ＮｏｔＩおよびＰａｃＩ制限酵素認識部位をそれぞれ含有する、プライマーＮ１４４３（配列番号６８７）およびＮ１４４４（配列番号６８８）を使用して、プラスミドｐＪＴ３１４から、Ｐ［ＦＢＡ１：：ＤＡＮ１＿ＡＲ３１４］をＰＣＲ増幅した。増幅は、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して実施した。製造会社の使用説明書（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼキット（通常濃度）を使用して、７２６塩基対のＰＣＲ産物をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで制限消化し、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩであらかじめ制限消化された組み込みベクターｐＢＰ２６６２（配列番号６３２）に、一方向性にクローン化した。連結ＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞に形質転換して、選択培地上に播種した。順方向および逆方向チェックプライマーＮ１４５２（配列番号６９０）およびＮ１４５７（配列番号６９１）をそれぞれ使用して、いくつかの形質転換体をＰＣＲコロニースクリーニングして、新しいコンストラクトを含有するクローンを単離した。プライマーＮ１４４５（配列番号６９２）、Ｎ１４４６（配列番号６９３）、Ｎ１４４７（配列番号６９４）、Ｎ１４４８（配列番号６９５）、Ｎ１４５２およびＮ１４５９（配列番号６９０および６９６）を使用して、いくつかのクローンから調製されたプラスミドを配列決定して、雑種プロモーター挿入配列を確認した。新しいコンストラクトは、ｐＪＴ３３６（配列番号６９７）と命名された。
【０３４２】
プラスミドｐＪＴ３３６をＰｍｅＩおよびＳａｌＩで制限消化して、ＵＲＡ３マーカーと、Δｐｄｃ１：：ｌｏｘＰ７１／６６遺伝子座に相同的な上流および下流配列で挟まれたＰ［ＦＢＡ１：：ＤＡＮ１＿ＡＲ３１４］−ａｌｓＳ発現カセットとを含有する、４，７１５塩基対の直鎖組み込みカセットを遊離させた。標準酵母変換プロトコルを使用した相同組換え組み込みのために、線状化組み込みカセットをＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ１５５８株に形質転換した。Δｐｄｃ１：：ｌｏｘＰ７１−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ６６：：Ｐ［ＦＢＡ１：：ＤＡＮ１＿ＡＲ３１４］−ａｌｓＳ組み込み体の選択のために、形質転換細胞をウラシル除去ＳＥ１．０％培地上に播種した。プライマーＮ１４６３（配列番号６９８）、Ｎ１４６４（配列番号６９９）、Ｎ１４６５（配列番号７００）およびＮ１４６６（配列番号７０１）を使用して、組み込み部位の５’および３’末端をＰＣＲコロニースクリーニングすることで、推定組み込み体を確認した。プラスミドｐＪＴ２５４からｃｒｅ−リコンビナーゼの発現により、ｌｏｘＰ部位を切断することで、ＵＲＡ３マーカーを組み込み部位から除去した。ウラシル欠損培地上の陰性成長表現型がマーカー除去の証拠である、選択および非選択培地上に播種することで、ＵＲＡ３マーカー除去をいくつかのクローン中で確認した。プライマーＮ１４６３（配列番号６９８）およびＮ１４６７（配列番号７０２）、Ｎ１４６５、およびＮ１４６６をそれぞれ使用した、組み込み遺伝子座の５’および３’末端のＰＣＲコロニースクリーニングで、ＵＲＡ３マーカーの欠損、およびΔｐｄｃ１：：ｌｏｘＰ７１／６６：：Ｐ［ＦＢＡ１−ＤＡＮ１＿ＡＲ３１４］−ａｌｓＳ遺伝子座の完全性をさらに確認した。得られた株は、ＰＮＹ２３３２である。
【０３４３】
ＰＮＹ２２８９
Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＢＡ１プロモーターに、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＸＴ１プロモーターからの１６８塩基対のグルコースリプレッサー配列をクローニングして、グルコースによって制御される雑種プロモーターを構築した。緑色蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；Ｍａｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１７：９６９；Ｌｕｋｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ，］ＢＣ（２０００）２７５（３４）：２５８７９）遺伝子をレポーターとして使用する最初の雑種プロモーター試験のための１つ目のコンストラクト、そしてＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓ，ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ１５５８株のΔｐｄｃ１：：ｌｏｘＰ７１／６６遺伝子座へのＵＲＡ３：：Ｐ［ＦＢＡ１：：ＨＸＴ１−３３１］−ａｌｓＳカセット組み込みのための２つ目のコンストラクトの２つのコンストラクトを構築した。
【０３４４】
改変５’制限酵素認識部位ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩがそれぞれある、プライマーＮ１３１６（配列番号７０３）およびＮ１３１７（配列番号７０４）を使用して、プラスミドｐＺｓＧｒｅｅｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から、ＺｓＧｒｅｅｎの遺伝子をＰＣＲ増幅して、７２３塩基対の生成物をもたらした。ＺｓＧｒｅｅｎＰＣＲ産物をＳｐｅＩおよびＮｏｔＩで制限消化して、ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩであらかじめ消化されたプラスミドｐＲＳ３１６−ＦＢＡ１−ＧＵＳに、一方向性にクローン化し（どちらも参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１２０２３７９８８号明細書および国際公開第２０１２／１２９５５５号パンフレットに記載される）、ＧＵＳ遺伝子を置換して、プラスミドｐＪＴ２５７（配列番号７０５）をもたらした。それぞれ５’改変ＢｌｐＩ制限部位を含有する、プライマーＮ１４２４（配列番号７０６）およびＮ１４２５（配列番号７０７）（Ｓ２８８ｃゲノム配列；ＡＴＣＣ＃２０４５０８に基づく）を使用して、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４３株から調製されたゲノムＤＮＡテンプレートから、ＨＸＴ１プロモーターからのグルコースリプレッサー配列をＰＣＲ増幅し、１９０塩基対のＰＣＲ産物をもたらした。増幅は、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して実施した。得られたＰＣＲ産物をＢｌｐＩで制限消化して、ＢｌｐＩであらかじめ線状化されたプラスミドｐＪＴ２５７中に存在するＦＢＡ１プロモーター配列のＢｌｐＩ部位に、双方向性にクローン化した。連結ＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞に形質転換して、選択培地上に播種した。いくつかの形質転換体からのプラスミドＤＮＡを単離して、ＨＸＴ１グルコースリプレッサー挿入の存在および方向を、プライマーＮ１３１４（配列番号７０８）およびＮ１３２３（配列番号７０９）を使用した配列決定によってスクリーニングした。新しいコンストラクトは、ｐＪＴ３３１（配列番号７１０）と命名された。雑種ＦＢＡ１プロモーターは、Ｐ［ＦＢＡ１：：ＨＸＴ１＿３３１］（配列番号７１１）と命名された。
【０３４５】
Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）コーンＰＮＹ１５５８株中のΔｐｄｃ１遺伝子座からのＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｌｓＳ遺伝子発現のために、Ｐ［ＦＢＡ１：：ＨＸＴ１＿３３１］組み込みカセットを構築した。改変ＮｏｔＩおよびＰａｃＩ制限酵素認識部位をそれぞれ含有する、プライマーＮ１４５３（ＥＱＩＤＮＯ７１２）およびＮ１４５４（配列番号７１３）を使用して、プラスミドｐＪＴ３３１から、Ｐ［ＦＢＡ１：：ＨＸＴ１＿３３１］をＰＣＲ増幅した。増幅は、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して実施した。７９８塩基対のＰＣＲ産物をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで制限消化し、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩであらかじめ制限消化された組み込みベクターｐＢＰ２６６２（配列番号６３２）に、一方向性にクローン化した。連結ＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞に形質転換して、選択培地上に播種した。順方向および逆方向チェックプライマーＮ１４３４（配列番号７１５）およびＮ１４４６をそれぞれ使用して、いくつかの形質転換体をＰＣＲコロニースクリーニングし、新しいコンストラクトを含有するクローンを単離した。プライマーＮ１４３４、Ｎ１４４５、Ｎ１４４６、およびＮ１４５９を使用して、いくつかのクローンから調製されたプラスミドを配列決定して、プロモーター配列挿入を確認した。新しいコンストラクトは、ｐＪＴ３３７（配列番号７１６）と命名された。
【０３４６】
プラスミドｐＪＴ３３７をＰｍｅＩおよびＳａｌＩで制限消化して、ＵＲＡ３マーカーと、Δｐｄｃ１：：ｌｏｘＰ７１／６６遺伝子座に相同的な上流および下流配列で挟まれたＰ［ＦＢＡ１：：ＨＸＴ１＿３３１］−ａｌｓＳ発現カセットとを含有する、４，５９５塩基対の直鎖組み込みカセットを遊離させた。標準酵母変換プロトコルを使用した相同組換え組み込みのために、線状化組み込みカセットをＳ．セレヴィシエ（Ｓ，ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ１５５８株に形質転換した。Δｐｄｃ１：：ｌｏｘＰ７１−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ６６：：Ｐ［ＦＢＡ１：：ＨＸＴ１＿３３１］ａｌｓＳ組み込み体の選択のために、形質転換細胞をウラシル除去ＳＥ１．０％培地上に播種した。プライマーＮ１４６３、Ｎ１４６４、Ｎ１４３４およびＮ１４４６を使用して、組み込み部位の５’および３’末端をＰＣＲコロニースクリーニングすることで、推定組み込み体を確認した。プラスミドｐＪＴ２５４からのｃｒｅ−リコンビナーゼの発現により、ｌｏｘＰ部位を切断することで、ＵＲＡマーカーを組み込み部位から除去した。ウラシル欠損培地上の陰性成長表現型がマーカー除去の証拠である、選択および非選択培地上に播種することで、ＵＲＡ３マーカー除去をいくつかのクローン中で確認した。プライマーＮ１４６３およびＮ１４６８（配列番号７１７）、Ｎ１４３４、およびＮ１４４６をそれぞれ使用した、組み込み遺伝子座の５’および３’末端のＰＣＲコロニースクリーニングを使用して、ＵＲＡ３マーカーの欠損、およびΔｐｄｃ１：：ｌｏｘＰ７１／６６：：Ｐ［ＦＢＡ１−ＨＸＴ１＿３３１］−ａｌｓＳ遺伝子座の完全性をさらに確認した。得られた株は、ＰＮＹ２２８９と命名された。
【０３４７】
実施例２
プロモーター探査の概要
「プロモーター探査」実験は下記のように実施され、増殖からイソブタノール生産への移行に起因するイソブタノール産生菌中の遺伝子発現パターンを調べた。増殖培養終了時、および生産培養中における３つの時点で、ＲＮＡを抽出した。マイクロアレイ分析は、上方制御され（最高２００倍）、生産中の１つまたは複数の時点で高度に発現されるが、増殖サンプル中ではそうでない、いくつかの遺伝子を同定した。これらの内１２個をさらなる試験のために選択し；それらのプロモーターを発現レポーターとしての緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合させ、発酵中に、それらの転写活性をモニターした（同時糖化発酵の縮小モデルを含む）。１２個の遺伝子を表１に示す。それらは、イソマルターゼをコードするＩＭＡ１（α−アミラーゼが触媒するデンプン加水分解によって生じる残留糖類の発酵に関与する）、細胞壁損傷によって誘導される遺伝子、（イソブタノールによって誘発されることが知られている）仮性菌糸性成長における熱耐性および耐塩性に関与する遺伝子、およびプロテアソームのサブユニットをコードする遺伝子（プロテアソームは特定の種類のストレス下で増加する、誤って折り畳まれたタンパク質を分解する）を含む。
【０３４８】
プロモーター探査を通じて同定されたプロモーターは、必ずしも合理的な先験的アプローチに基づいて選択されてはいない。イソブタノール生成株と方法の発達につれて、周期的にプロモーター探査実験を繰り返すことが必要なこともある。またこのプロモーター探査実験において動的発現プロファイルを示した遺伝子のプロモーターは、２回目の試験における効用についてもまたスクリーニングしてもよい。
【０３４９】
プロモーター探査実験において観察されるＩＭＡ１遺伝子の誘導は、コーンマッシュ中に存在するマルトリンに応答してもよい。酵母は、コーンオイル脂肪酸画分、特にオレイン酸に対する活性転写応答を有して、ペルオキシソームのバイオジェネシスおよび機能に関与する遺伝子の活性化をもたらす。この応答は、グルコース抑制によって無効化される。
【０３５０】
イソブタノール挑戦に対する転写応答試験では、ＧＲＥ２（３−メチルブタナール還元酵素をコードする）、ＰＤＲ５（薬剤排出ポンプをコードする）、および熱ショック遺伝子をはじめとするいくつかの遺伝子が、誘導されることが観察された。ＧＦＰをコードする遺伝子へのＧＲＥ２プロモーターの融合に際して、ＧＦＰ発現がイソブタノールチャレンジによって確かに活性化されると断定された。
【０３５１】
プロモーター探査実験
この実験の目的は、引き続く利用のために応答性プロモーターを同定し得るように、コーンマッシュのイソブタノール発酵をシミュレートすることであった。過剰なグルコースがある好気的増殖タンクには、コーンマッシュの同時糖化発酵によって供給グルコースが制限される、無酸素生産タンクが続いた。生産期において、遺伝子発現の変化数は控えめである。候補プロモーターの組が同定され、これらの候補を試験する手段が開発された。「転写物オフ変化」もまた表にされて、最も劇的な差は少なくとも１０倍のオフであった。ＦｅおよびＺｎ遺伝子のシャットオフは、培地が過剰な二価の金属イオンを有することを示唆することもあるのに対し、ＭＡＬ１遺伝子の誘導は、グルコース制限およびマルトース可用性の双方を示す。
【０３５２】
発酵
全ての段階で、生物学的三重反復試験培養を実施した。ＡＣＥＮ．ＰＫｇｐｄ２−ｐｄｃ−酵母株（ＰＮＹ１５０４、参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１２０２３７９８８号明細書に記載される）は、３ｇ／Ｌのグルコース＋３ｇ／Ｌのエタノール塩培地中で約２４時間培養した。ＯＤ２．０〜２．５で、各２５０ｍＬ培養物の１３〜１５ｍＬを、２Ｌ調節板付き通気フラスコ内の約２７０ｍＬの培地に移した。各増殖タンクあたり、４個の２Ｌフラスコで開始した。２Ｌフラスコへの接種の２４時間後。引き続いて、３０ｍＬのＹＥＰ原液（２００ｇ／Ｌのペプトン、１００ｇ／Ｌの酵母抽出物）を各フラスコに添加し、次に３００ｍＬの無菌バージン９０〜９５％Ｃｏｇｎｉｓオレイルアルコールを添加して、フラスコを振盪機に約２０時間戻した。水性相およびオレイルアルコール相を、約５分間沈降させた。１２個の全フラスコから水性相を合わせて貯留し、約１．２Ｌを３個の圧力缶に分配し、それを使用して各増殖タンクに接種した。培地中のグルコース濃度を接種時の約１〜２ｇ／Ｌから＜０．５ｇ／Ｌに低下させ、約ｍ＝０．１７の速度でＯＤ＞２５まで、５０％ｗ／ｗのグルコース供給を開始した。その後、溶存酸素濃度を３０％に維持した。次におよそ１．１Ｌの増殖タンク培養物を、その対応する生産タンクに移した。グルコアミラーゼ（β−アミラーゼ）を使用して同時糖化発酵（ＳＳＦ）を実施し、生産段階全体にわたって、過剰なグルコースと低い溶存酸素濃度（３％）を維持した。三重反復試験培養物は、次のように命名された。
ＧＬＮＯＲ７１４ＰＲＯＰ→ＧＬＮＯＲ７１５ＦＥＲＭ
ＧＬＮＯＲ７１６ＰＲＯＰ→ＧＬＮＯＲ７１７ＦＥＲＭ
ＧＬＮＯＲ７１８ＰＲＯＰ→ＧＬＮＯＲ７１９ＦＥＲＭ
【０３５３】
分子生物学
標準法によって、ＲＮＡを増殖タンクおよび生産タンクから単離した。標準法によって、Ａｇｉｌｅｎｔアレイを使用してＲＮＡ種を定量化した。データを平均化して、統計学的分析を実施した。多数のＲＮＡ転写物を生理機能について解釈した。したがって最初に、増殖タンクについて妥当な生理学的データを要約する。
【０３５４】
生理機能
発酵タンク内では、２６および３７時間目に、イソブタノールが合成されたことが観察された。しかし５０時間目までには、イソブタノールの蓄積が止んだ。図２を参照されたい。しかし培養の約４０時間目までは触媒が最適に機能しておらず、累積速度データ（生成イソブタノール容積が／ＥＦＴ）は、誤解を招くものであることに留意されたい。図３を参照されたい。これはどちらも３０時間後に急激に低下して、５０時間目にゼロに近くなる二酸化炭素放出と酸素消費速度を調べることで確認された。図４および５を参照されたい。したがってこのプロモーター探査実験の目的では、選択された２６、３７、および５０時間転写物の測定が最も妥当である。
【０３５５】
生産タンク内で有意に上方または下方制御される全てのプロモーター要素は、以下の表に要約される。
【０３５６】
【表１５】
2015503351.tif 000016
【０３５７】
したがって比較的わずかな転写物が、増殖段階および生産段階の間で測定できる程に変化したが、多数の候補プロモーター（ｃａｎｄｉｄａｔｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）がある。
【０３５８】
これらの実験では、目的は、発酵タンクの無酸素条件によって調節されるＲＮＡを同定することであった。このようなＲＮＡのプロモーターは、顕著な基底レベルから発現を上昇させる、有用なスイッチ（例えばオフからオンへの）または増幅器モジュール（例えば低から高への）であり得る。「スイッチ」および「増幅器」プロモーターの双方の要素が、望ましい。
【０３５９】
２６時間目に２つのＯＲＦ（ＹＪＬ１７１ＣおよびＹＧＲ２８７Ｃ）が転写され、上昇した発現レベルを維持した一方で、ＤＩＡ１は３７時間目に転写されて、５０時間目に依然として高度に発現された。２６時間（ＩＭＤ２）、３７時間（ＣＨＡ１およびＹＪＬ１９５Ｃ）、および５０時間目（ＰＲＭ６）にもまた、スイッチを入れる選択肢があった。
【０３６０】
最初に、上位４５個の転写物を下の表の４つの各条件の下に分類した。
【０３６１】
【表１６】
2015503351.tif 000017
【０３６２】
増殖タンクから、上位４５個の転写物の内３７個が、列挙したカテゴリーに分類される。生産タンク内では、割合は、２６、３７および５０時間のＥＦＴで、それぞれ４０／４５、３８／４５、および３５／４５である。予測されたように、翻訳は対数成長（２６時間／生産）において重要であるが、定常期により類似したその他の３条件（１５時間、３７時間、および５０時間）では重要でない。
【０３６３】
実施例３（予測的）
遺伝的スイッチを使用してイソブタノール生成酵母中でａｌｓＳ（アセト乳酸シンターゼをコードする）の発現を制御する
遺伝的スイッチとして評価するために、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＭＡ１遺伝子（ＹＧＲ２８７Ｃ）のプロモーターを選択する。ＩＭＡ１開始コドンの１０００個の塩基対の５’である、このプロモーターを含んでなるＤＮＡを、それらの５’末端に、制限酵素ＸｂａＩおよびＳａｌＩの認識部位をそれぞれ含む、プライマーＡＫ１１−６２およびＡＫ１１−６３（表１０）を使用して、増幅する。テンプレートＤＮＡは、精製された酵母株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤのゲノムＤＮＡである（ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ  ＪＰ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）“Ａｎ  ｉｎｔｅｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｔｒａｉｎｓ”Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２６：７０６−７１４）。併行して、（それらの５’末端に、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩのための認識部位をそれぞれ含む）プライマーＡＫ１１−６０およびＡＫ１１−６１を使用して、ジェネテシン耐性のための選択可能なマーカーを含み、ｃｒｅ部位特異的リコンビナーゼの標的であるｌｏｘＰ配列で挟まれた、ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットを、プラスミドｐＵＣ１９にクローン化されたカセットをテンプレートとして使用して、増幅する。ＰＣＲ反応は、アガロースゲル電気泳動（図示せず）で実証されるように、予測された１．０および１．８ｋｂＤＮＡ生成物を生じ、生成物は精製される。
【０３６４】
【表１７】
2015503351.tif 000018
【０３６５】
ＩＭＡ１プロモーターＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化し、ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰ  ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し；併行してプラスミドｐＵＣ１９  ＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化する。消化ＤＮＡを組み合わせてライゲートし、次に化学的コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌの寒天）上に播種する。その中でｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットが、ＩＭＡ１プロモーター上流にライゲートされているコンストラクトの制限酵素マッピングによって、個々のコロニーをチェックする。このようなコンストラクトの１つは、ｐＮＡＫ２１と命名される。これは、プライマーＡＫ１１−５２およびＡＫ１１−５５を用いたＰＣＲ反応中で、テンプレートとして使用される。これらのプライマーは、ａｌｓＳ読み取り枠のＰＤＣ１ターミネーター配列と、５’末端配列との相同性領域をそれぞれ含む（そしてＡＫ１１−５５プライマーはまた、ａｌｓＳ開始コドンに先行する塩基をＴＧＡＧＧからＡＡＡＴＡに変化させる）。ＰＮＹ１５５６株中のａｌｓＳ導入遺伝子周囲の領域の遺伝子地図は、図６に示される。
【０３６６】
ＰＣＲ反応を実施し、２．８ｋｂの生成物を精製して、細胞をＹＰＥ培地（５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／Ｌのペプトン、２０ｍＬ／Ｌの９５％エタノール）中で培養したこと以外は、本質的に、記載された（“Ｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＬｉＡｃ／ＳＳ  Ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ／ＰＥＧ  ｍｅｔｈｏｄ”Ｇｉｅｔｚ  ＲＤ  ＆  Ｗｏｏｄｓ  ＲＡ（２００６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３１３：１０７−１２０）ようにして、酵母ＰＮＹ１５５６株（遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＤＨ｜ａｄｈ＿Ｈｌ−ＡＤＨ１ｔ  ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ  ｙｐｒｃΔ１５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ａｄｈ＿Ｈｌ−ＡＤＨ１ｔ）に形質転換する。形質転換細胞を２００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を含有するＹＰＥ寒天培地上に播種する。コロニーを同一培地上に再度画線塗抹し、１つの反応の組ではプライマーＡＫ１１−５６およびＡＫ１１−５７を使用したＰＣＲによって、別の反応の組ではプライマーＡＫ１１−５８およびＡＫ１１−５９を使用したＰＣＲによって、ａｌｓＳ導入遺伝子の前のＩＭＡ１プロモーターによる、ＦＢＡ１プロモーターの置換について試験する。ＰＣＲ反応は、テンプレートとしてコロニー溶解産物を用いて実施される（ｈｔｔｐ：／／ｏｐｅｎｗｅｔｗａｒｅ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ：Ｙｅａｓｔ＿Ｃｏｌｏｎｙ＿ＰＣＲ＿ｖ２．０  ２０１１年１１月１７日）。２つのプライマー対によって、５１０ｂｐおよび５５０ｂｐのＰＣＲ産物をそれぞれ生成する、ＰＮＹ９４２と命名された１つの単離株が、さらなる利用のために選択される。
【０３６７】
ガラクトース誘導性プロモーター（“Ａ  ｎｅｗ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｆｏｒ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｂｕｄｄｉｎｇ  ｙｅａｓｔ”Ｇｕｌｄｅｎｅｒ  Ｕ，Ｈｅｃｋ  Ｓ，Ｆｉｅｌｄｅｒ  Ｔ，Ｂｅｉｎｈａｕｅｒ  Ｊ，＆  Ｈｅｇｅｍａｎｎ  ＪＨ（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４：２５１９−２５２４）制御下のｃｒｅリコンビナーゼＯＲＦ有するプラスミドｐＳＨ４７で、ＰＮＹ９４２を形質転換して、ウラシル原栄養性について選択する。ＳＣＧ培地（６．７ｇ／Ｌのアミノ酸非含有酵母窒素原礎培地（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．）、ウラシル除去酵母アミノ酸ドロップアウト混合物（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ  ＤＳＣＫ１０２）、および２０ｇ／Ｌのガラクトース）中で、単離株をおよそ６時間培養し、次に希釈してＹＰＤプレート上に塗り広げ、３０℃で３日間培養する。２００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有するＹＰＤプレート上に、コロニーをレプリカ播種し；成長しない単離株は、ｋａｎＭＸマーカーが欠失している。
【０３６８】
これらのＰＮＹ９４２のＧ４１８感受性誘導体の内３つを、ＫＡＲＩおよびＤＨＡＤ導入遺伝子を含有するプラスミドｐＢＰ２０９２で、形質転換する（図７）。
【０３６９】
ＳＣＥ寒天培地（６．７ｇ／Ｌのアミノ酸非含有酵母窒素原礎培地、ヒスチジンおよびウラシル除去酵母アミノ酸ドロップアウト混合物（ＦｏｒｍｅｄｉｕｍＤＳＣＫ１６２）、２０ｍＬ／Ｌの９５％エタノール、２０ｇ／Ｌの寒天）上に形質転換体を播種して、３０℃で３日間培養する。ＳＣＤＥプレート（６．７ｇ／Ｌのアミノ酸非含有酵母窒素原礎培地、ヒスチジンおよびウラシル除去酵母アミノ酸ドロップアウト混合物（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ  ＤＳＣＫ１６２）、３ｇ／Ｌのグルコース、３ｍＬ／Ｌの９５％エタノール、２０ｇ／Ｌの寒天）上に、１２個のコロニーを再度画線塗抹する。
【０３７０】
３つの典型的な単離株を２ｍＬの液体ＳＣＤＥ培養中に接種する（第０段階）。培養物を成長させて、バイオマスおよび細胞外代謝産物測定のためにサンプルを取り出す。各培養物の残りを遠心分離して、（栓をした）１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬコーンマッシュ培地に再懸濁する。同時糖化発酵のためのコーンマッシュは、本質的に記載されるようにして（Ｗａｎｇ  ＦＱ，Ｇａｏ  ＣＪ，Ｙａｎｇ  ＣＹ，＆  Ｘｕ  Ｐ（２００７）“Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ  ｉｎ  ｖｅｒｙ  ｈｉｇｈ  ｇｒａｖｉｔｙ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．２９：２３３−２３６）調製され、遠心分離によって清澄にされる。オレイルアルコール（２５ｍＬ）を各フラスコに添加して、フラスコを２５０ｒｐｍおよび３０℃で７２時間培養する（第２段階）。バイオマスおよび細胞外代謝産物の測定のために、サンプルを取り出す。対照として、非改変ＰＮＹ１５５６株（ｐＢＰ２０９２で形質転換された）を並行して培養する。
【０３７１】
Ｇｅｎｅｓｙｓ  １０ｕｖ分光光度計（テルモ）内で、適切に希釈された懸濁液の光学濃度（ＯＤ６００）として、サンプル中のバイオマス濃度を求める。０．１ＮＨ２ＳＯ４を移動相（５０℃、流速０．５ｍＬ／分）として、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｒｅｚｅｘ  ＲＯＡ−Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈ＋（８％）カラムを用いて、Ｗａｔｅｒｓ  ２４１４屈折率検出器による検体検出がある、Ｗａｔｅｒｓ  ２６９５  ＨＰＬＣを使用して、細胞外代謝産物（グルコース、イソブタノール、およびグリセロール）を測定する。
【０３７２】
この実験の予測的結果は、表１０に示される。ＰＮＹ９４２株は、第１段階において、ＰＮＹ１５５６株よりもはるかにより多くのバイオマスと、より少ないイソブタノールを生成する。第２段階では、コーンマッシュ中のオリゴ糖類によってＩＭＡ１プロモーターが誘導される場合、イソブタノール経路が完全に発現され、ＰＮＹ９４２株は、ＰＮＹ１５５６株によって生産されるのと同等の量のイソブタノールを生成できる。２つの株のグルコース消費能力もまた同様であり（どちらも第１段階または第２段階培地中に、残留グルコースを残さない）；ＰＮＹ９４２株では、グルコース−含有培地にＩＭＡ１プロモーターが導入されていないので、グルコースは、主に第１段階のバイオマスに向けられる。
【０３７３】
【表１８】
2015503351.tif 000019
【０３７４】
実施例４（予測的）
異種遺伝的スイッチを使用してイソブタノール生成酵母中でａｌｓＳ（アセト乳酸シンターゼをコードする）の発現を制御する
テトラサイクリンによって、ａｌｓＳ発現を被抑制にするために、宿主株はｔＴＡ活性化タンパク質を発現する必要があり、ａｌｓＳ  ＯＲＦがｔｅｔＯプロモーター制御下に置かれる必要がある（Ｂｅｌｌｉ  Ｇ，Ｇａｒｉ  Ｅ，Ａｌｄｅａ  Ｍ，＆  Ｈｅｒｒｅｒｏ  Ｅ（１９９８）“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ  ｄｕａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ”Ｙｅａｓｔ  １４：１１２７−１１３８）。
【０３７５】
ミニ遺伝子の両端にＮｏｔＩ部位を導入する、プライマーｏｔＴＡ１およびｏｔＴＡ２を使用して、ｔＴＡミニ遺伝子（ＣＭＶプロモーターを含む）と、ｐＵＧ６−ｔＴＡ（Ｙｅｎ  Ｋ，Ｇｉｔｓｈａｍ  Ｐ，Ｗｉｓｈａｒｔ  Ｊ，Ｏｌｉｖｅｒ  ＳＧ，＆  Ｚｈａｎｇ  Ｎ（２００３）“Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｅｔＯ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｓ”Ｙｅａｓｔ  ２０：１２５５−１２６２）からのｋａｎＭＸ選択可能なマーカー（ｌｏｘＰ部位で挟まれた）とを含んでなるカセットを増幅して；増幅が実施される。３．５ｋｂのＰＣＲ産物をユニークなＮｏｔＩ部位でｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋にクローン化して、プラスミドｐＢＳ−ｔＴＡをもたらす。ＢａｍＨＩ部位の両端にカセットを導入する、プライマーｏＴｅｔＯ１およびｏＴｅｔＯ２を使用して、プラスミドｐＣＭ３２５（同書）から、ｋａｎＭＸ４−ＴｅｔＯ７プロモーターカセットが増幅される。２．２ｋｂのＰＣＲ産物をユニークなＢａｍＨＩ部位でｐＵＣ１９にクローン化して、プラスミドｐＵＣ−ＴｅｔＯをもたらす。
【０３７６】
【表１９】
2015503351.tif 000020
【０３７７】
ｐＢＳ−ｔＴＡ中のｔＴＡミニ遺伝子は、ＵＲＡ３遺伝子座における組換えのための側面に位置する相同性領域を含む、ｏｔＴＡ３およびｏｔＴＡ４プライマーによって増幅される。ＰＣＲ産物を使用してＰＮＹ１５５６株を形質転換し、Ｇ４１８耐性について選択する。ガラクトース−誘導性プロモーター制御下のｃｒｅリコンビナーゼＯＲＦを有するプラスミドｐＳＨ４７（Ｇｕｌｄｅｎｅｒ  Ｕ，Ｈｅｃｋ  Ｓ，Ｆｉｅｌｄｅｒ  Ｔ，Ｂｅｉｎｈａｕｅｒ  Ｊ，＆  Ｈｅｇｅｍａｎｎ  ＪＨ（１９９６）“Ａ  ｎｅｗ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｆｏｒ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｂｕｄｄｉｎｇ  ｙｅａｓｔ”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４：２５１９−２５２４）で、抗生物質耐性分離株を形質転換し、ウラシル原栄養性について選択する。ＳＣＧ培地（６．７ｇ／Ｌのアミノ酸非含有酵母窒素原礎培地、ウラシル除去酵母アミノ酸ドロップアウト混合物（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ  ＤＳＣＫ１０２）、および２０ｇ／Ｌのガラクトース）中で単離株を培養し、次に希釈してＹＰＤプレート上に塗り広げる。２００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有するＹＰＤプレート上に、コロニーをレプリカ播種し；成長しない単離株は、ｋａｎＭＸマーカーが欠失している。
【０３７８】
ａｌｓＳ読み取り枠のＰＤＣ１ターミネーター配列と、５’末端との相同性領域をそれぞれ含むプライマーｏＴｅｔＯ３およびｏＴｅｔＯ４（そしてｏＴｅｔＯ４プライマーはまた、ａｌｓＳ開始コドンに先行する塩基をＴＧＡＧＧからＡＡＡＴＡに変化させる）によって、ｐＵＣ−ＴｅｔＯ中のｋａｎＭＸ４−ＴｅｔＯ７カセットを増幅する。ＰＣＲ反応を実施して；生成物をＰＣＲ精製キットを使用して精製し；ＹＰＥ（５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／Ｌのペプトン、２０ｍＬ／Ｌの９５％エタノール）中で細胞を培養すること以外は、記載される（Ｇｉｅｔｚ  ＲＤ  ＆  Ｗｏｏｄｓ  ＲＡ（２００６）“Ｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＬｉＡｃ／ＳＳ  Ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ／ＰＥＧ  ｍｅｔｈｏｄ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３：１０７−１２０）ようにして、酵母株ＰＮＹ１５５６に形質転換する。２００μｇ／ｍｌのＧ４１８および１０μｇ／ｍＬのドキシサイクリン（ＴｅｔＯ７プロモーターを抑制状態に保つため）を含有するＹＰＥ寒天培地上に、形質転換細胞を播種する。コロニーを同一培地上に再度画線塗抹し、プライマーＡＫ１１−５９およびｏＴｅｔＯ５を使用したＰＣＲによって、ａｌｓＳ導入遺伝子の前における、ＴｅｔＯ７プロモーターによるＦＢＡ１プロモーターの置換について試験する。ＰＣＲ反応は、テンプレートとしてコロニー溶解産物を用いて実施される（ｏｐｅｎｗｅｔｗａｒｅ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ：Ｙｅａｓｔ＿Ｃｏｌｏｎｙ＿ＰＣＲ＿ｖ２．０  ２０１１年１１月１７日）。４２０ｂｐのＰＣＲ産物を生成する、ＰＮＹ９４３と命名された１つの単離株が、さらなる利用のために選択される。
【０３７９】
実施例５に記載されるプラスミドｐＢＰ２０９２で、ＰＮＹ９４３を形質転換する。形質転換体をＳＣＥ寒天培地＋１０μｇ／ｍＬのドキシサイクリン上に播種する。１２個のコロニーをＳＣＤＥプレート＋１０μｇ／ｍＬのドキシサイクリン上に再度画線塗抹する。
【０３８０】
プレート上で３日間の成長後、典型的な単離株を２ｍＬ液体ＳＣＤＥ培養物＋１０μｇ／ｍＬのドキシサイクリン中に接種する（第０段階）。これらを成長させ、２５ｍＬｏｆＳＣＤＥ培地＋１０μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを含有する振盪フラスコに入れる。培養物を３０℃で２４時間成長させ（第１段階）、バイオマスおよび細胞外代謝産物の測定のために、サンプルを取り出す。各培養の残りをＦ１５−８ｘ５０ｃＦｉｂｅｒｌｉｔｅローター（ＰｉｒａｍｏｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内で１８６４ｇで遠心分離し、（栓をした）１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬコーンマッシュ培地に再懸濁する。オレイルアルコール（２５ｍＬ）を各フラスコに添加して、フラスコを２５０ｒｐｍおよび３０℃で７２時間培養する（第２段階）。実施例Ａに記載されるように、バイオマスおよび細胞外代謝産物の測定のために、サンプルを取り出す。対照として、非改変ＰＮＹ１５５６株（ｐＢＰ２０９２で形質転換された）を並行して培養する。
【０３８１】
この実験の予測的結果は、表１２に示される。株ＰＮＹ９４３は、ドキシサイクリンによる活性発現の抑制のために、第１段階において、ＰＮＹ１５５６株よりもはるかにより多くのバイオマスと、より少ないイソブタノールを生成する。第２段階では、細胞がドキシサイクリン不在下においてコーンマッシュ中で培養される場合、イソブタノール経路がｓ完全に発現れ、ＰＮＹ９４３株は、ＰＮＹ１５５６株によって生産されるのと同等の量のイソブタノールを生成できる。２つの株のグルコース消費量能力もまた同様である（どちらも第１段階または第２段階培地中に、残留グルコースを残さない）。
【０３８２】
【表２０】
2015503351.tif 000021
【０３８３】
実施例５
グルコースありまたはなしのＰＮＹ１５６０、ＰＮＹ１５６１、およびＰＮＹ１５６２中におけるＡＬＳ発現
本実施例は、グルコース存在または不在下における、グルコース応答性株ＰＮＹ１５６０およびＰＮＹ１５６１、および対照株ＰＮＹ１５６２中のＡＬＳ発現のレベルを実証する。グルコース不在下における成長のための炭素源として、酢酸エステル使用した。ｍＲＮＡレベルおよびＡＬＳ酵素活性の双方をアッセイした。
【０３８４】
ｍＲＮＡレベルの測定のために、株を最初に、７６ｍｇ／Ｌのトリプトファン、３８０ｍｇ／Ｌのロイシン、１００ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ５．５、０．３％グルコース、および０．１％酢酸ナトリウムが添加された、合成培地（アミノ酸非含有酵母窒素原礎培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびウラシル、ヒスチジン、ロイシン、およびトリプトファン非含有酵母合成ドロップアウト培地補給剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））中で培養した。一晩培養物は、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４振盪機内において、２５０ｍＬ通気エルレンマイアーフラスコ内の３４ｍＬの培地中で、３０℃および２５０ＲＰＭで培養した。次に一晩培養物を、酢酸合成培地（７６ｍｇ／Ｌのトリプトファン、３８０ｍｇ／Ｌのロイシン、１００ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ５．５、および０．５％酢酸ナトリウムが添加された、アミノ酸非含有酵母窒素原礎培地およびウラシル、ヒスチジン、ロイシン、およびトリプトファン非含有酵母合成ドロップアウト培地補給剤）およびグルコース合成培地（７６ｍｇ／Ｌのトリプトファン、３８０ｍｇ／Ｌのロイシン、１００ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ５．５、および３％グルコースが添加された、アミノ酸非含有酵母窒素原礎培地およびウラシル、ヒスチジン、ロイシン、およびトリプトファン非含有酵母合成ドロップアウト培地補給剤）中で、１２５ｍｌ通気エルレンマイアーフラスコ内の２０ｍｌの培地中の初期ＯＤ６００が０．１になるまで、二次培養した。酢酸培養物は、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４内で、３０℃および２５０ＲＰＭで６．５時間培養し、２０ｍｌの同一培地内で、ＯＤ６００が０．１に戻るまで二次培養し、同一条件下で１６時間培養した。次に酢酸培養物を、２０ｍｌの同一培地内で、ＯＤ６００が０．５に戻るまで二次培養し、細胞を収集するのに先だって、同一条件下で４時間培養した。グルコース培養物は、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４内で、３０℃および２５０ＲＰＭで６．５時間培養し、２０ｍｌの同一培地内で、ＯＤ６００が０．２に戻るまで二次培養し、同一条件下で１６時間培養した。グルコース培養物を室温において４，０００×ｇで５分間遠心分離し、新鮮グルコース培地に０．２５のＯＤ６００で再懸濁した。好気的条件にするために、２０ｍｌの培養物を１２５ｍｌ通気エルレンマイアーフラスコに移し、微好気的条件にするために、１０ｍｌの培養物を４０ｍｌ血清バイアル（Ｋｉｍｂｌｅ  Ｃｈａｓｅ，Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮＪ）に移して密封した。次に細胞を収集するのに先だって、グルコース培養物を同一条件下で２４時間培養した。
【０３８５】
細胞成長後、培養物を収集してＲＮＡを抽出した。細胞収集のために、１０ｍｌの培養物を氷冷１５ｍｌ円錐管に入れて、４℃および４，０００×ｇで４分間遠心分離した。ペレットを即座に１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に再懸濁して、ドライアイス上で凍結させ、次にＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。ＲＮＡ抽出では、サンプルを氷上で解凍して、Ｌｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂ  ０．１ｍｍシリカ球（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）を含有する２ｍｌねじ蓋管に移す。サンプルを２回にわたり、最大速度で１分間、ビーズビーターにかけた。２００μｌのクロロホルムを添加して、サンプルをボルテックスした。サンプルを４℃および１３，０００×ｇで１５分間遠心分離した。６００μｌの水性相を６５０μｌの７０％エタノールに添加して、混合した。サンプルをＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）カラムに適用して、製造会社のプロトコルに従った。５０μｌのＲＮａｓｅ非含有水によって、ＲＮＡをカラムから溶出した。リアルタイム逆転写ＰＣＲ分析まで、ＲＮＡサンプルを−８０℃で保存した。
【０３８６】
プライマーデザインおよび検証：
発現解析に先だって、ＡＢＩ／Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｖ．２．０をデフォルト条件下で使用して、リアルタイムＰＣＲプライマーおよびプローブをデザインした。プライマーは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，Ｔｅｘａｓ，７７３８０から購入された。プライマーは、ＢＬＡＳＴ分析を使用して特異性について検証し、標的ＤＮＡの連続希釈にわたりＰＣＲ効率を分析することで定量化した。プライマー効率は、９０％〜１１０％の効率と検証された。プライマー配列は、下の表に示される。
【０３８７】
【表２１】
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【０３８８】
リアルタイム逆転写ＰＣＲ：
デオキシリボヌクレアーゼ（Ｑｉａｇｅｎ  ＰＮ７９２５４）によって、２μｇの精製全ＲＮＡを室温で１５分間処理し、０．１ｍＭのＥＤＴＡ存在下における７５℃で５分間にわたる不活性化がそれに続いた。次に１μｇの処理されたＲＮＡを使用して、二段階ＲＴ−ＰＣＲを実施した。第１段階では、ＡＢＩ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＰＮ  ４３６８８１３）からの高容量ｃＤＮＡ逆転写キットを使用して、製造会社の推奨プロトコルに従って、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。手順の第２段階は、ｑＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲであった。これは、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ  ＳＤＳ装置上で実施された。各２０μｌのｑＰＣＲ反応は、１ｎｇのｃＤＮＡ、０．２μｌの１００μＭ順方向および逆方向プライマー、０．０５μｌのＴａｑＭａｎプローブ、１０μｌのＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＮ  ４３２６６１４）および８．５５μｌの水を含有した。蛍光データを収集しながら、９５℃で１０分間と、それに続く９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクルで熱サイクルを実施した。１８Ｓ  ｒＲＮＡプライマーセットを用いて、各サンプルの（−）逆転写酵素ＲＮＡ対照を試験してゲノムＤＮＡの不在を確認した。全ての反応は、三重反復試験で実施した。
【０３８９】
相対的発現計算：
サンプル中の標的遺伝子ａｌｓＳの相対的定量化は、ΔΔＣｔ法を使用して計算された（ＡＢＩ  Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２“Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”を参照されたい）。１８ＳｒＲＮＡを使用して、各反応に添加された全ＲＮＡ量の差について、標的遺伝子の定量化を正規化した。相対的定量化（ＲＱ）値は、発現レベル１．０を有する較正物質サンプルと比較した、各サンプル中の標的遺伝子発現の差の倍数である。
【０３９０】
ＰＮＹ１５６２酢酸培養物からのａｌｓＳ転写物の量は、１．０と設定された。酢酸培養した培養物からのＰＮＹ１５６０およびＰＮＹ１５６１  ａｌｓＳ転写物レベルは、酢酸培養された培養物からのＰＮＹ１５６２  ａｌｓＳ転写物レベルよりも、それぞれ１６７倍および５００倍低かった。ＰＮＹ１５６２  ａｌｓＳ転写物レベルは、ＰＮＹ１５６２の酢酸培養された培養物と比較して、グルコース培養された培養物中でより高くはなかった。ＰＮＹ１５６０  ａｌｓＳ転写物レベルは、ＰＮＹ１５６０の酢酸培養された培養物と比較して、グルコース培養された培養物中で１２〜３４倍高かった。ＰＮＹ１５６１  ａｌｓＳ転写物レベルは、ＰＮＹ１５６１の酢酸培養された培養物と比較して、グルコース培養された培養物中で１０〜１９倍高かった。
【０３９１】
【表２２】
2015503351.tif 000023
【０３９２】
ＡＬＳ酵素アッセイ実験１では、株を最初に、７６ｍｇ／Ｌのトリプトファン、３８０ｍｇ／Ｌのロイシン、１００ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ５．５、０．３％グルコース、および０．１％酢酸ナトリウムが添加された、合成培地（アミノ酸非含有酵母窒素原礎培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびウラシル、ヒスチジン、ロイシン、およびトリプトファン非含有酵母合成ドロップアウト培地補給剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））中で培養した。Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４振盪機内において、２５０ｍＬ通気エルレンマイアーフラスコ内の４０ｍＬの培地中で、一晩培養物を３０℃および２５０ＲＰＭで培養した。次に一晩培養物を、酢酸合成培地（７６ｍｇ／Ｌのトリプトファン、３８０ｍｇ／Ｌのロイシン、１００ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ５．５、および０．５％酢酸ナトリウムが添加された、アミノ酸非含有酵母窒素原礎培地およびウラシル、ヒスチジン、ロイシン、およびトリプトファン非含有酵母合成ドロップアウト培地補給剤）およびグルコース合成培地（７６ｍｇ／Ｌのトリプトファン、３８０ｍｇ／Ｌのロイシン、１００ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ５．５、および３％グルコースが添加された、アミノ酸非含有酵母窒素原礎培地およびウラシル、ヒスチジン、ロイシン、およびトリプトファン非含有酵母合成ドロップアウト培地補給剤）中で、２５０ｍｌ通気エルレンマイアーフラスコ内の４０ｍｌの培地中で、初期ＯＤ６００が０．１になるまで、二次培養した。培養物は、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４内で、３０℃および２５０ＲＰＭで７時間培養し、４０ｍｌの同一培地内で、ＯＤ６００が０．２に戻るまで二次培養し、同一条件下で１５時間培養した。次に酢酸培養物を、４０ｍｌの同一培地内で、ＯＤ６００が１．０に戻るまで二次培養し、細胞を収集するのに先だって、同一条件下で７時間培養した。グルコース培養物を室温において４，０００×ｇで５分間遠心分離し、新鮮グルコース培地に０．５のＯＤ６００で再懸濁した。微好気的条件にするために、６０ｍｌの培養物を１２０ｍｌ血清バイアル（Ｋｉｍｂｌｅ  Ｃｈａｓｅ，Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮＪ）に移して密封した。次に細胞を収集するのに先だって、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４振盪機内で、グルコース培養物を３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間培養した。細胞を収集するために、培養物を４℃および４，０００×ｇで５分間遠心分離した。ペレットを２０ｍｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ６．８で洗浄し、次に４℃および４，０００×ｇで５分間遠心分離した。ペレットをドライアイス上で凍結させ、次にＡＬＳ活性についてアッセイするまで−８０℃で保存した。
【０３９３】
ＡＬＳ酵素アッセイ実験２では、３番目の成長条件を使用した。一晩培養では、株を上記のように培養して、同一酢酸およびグルコース培地中で二次培養した。培養物は、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４内で、３０℃および２５０ＲＰＭで７時間培養し、４０ｍｌの同一培地内で、ＯＤ６００が０．１に戻るまで二次培養し、同一条件下で１６時間培養した。次に酢酸培養物を、４０ｍｌの同一培地内で、ＯＤ６００が１．０に戻るまで二次培養し、細胞を収穫するのに先だって、同一条件下で４．５時間培養した。１６時間の成長後、グルコース培養物を室温において４，０００×ｇで５分間遠心分離し、新鮮グルコース培地に０．５のＯＤ６００で再懸濁した。好気的条件にするために、４０ｍｌの培養物を２５０ｍｌ通気エルレンマイアーフラスコに移し、微好気的条件にするために、６０ｍｌの培養物を１２０ｍｌ血清バイアル（Ｋｉｍｂｌｅ  Ｃｈａｓｅ，Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮＪ）に移して密封した。次に細胞を収集するのに先だって、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４振盪機内で、グルコース培養物を３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間培養した。細胞を収集するために、培養物を４℃および４，０００×ｇで５分間遠心分離した。ペレットを２０ｍｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ６．８で洗浄し、次に４℃および４，０００×ｇで５分間遠心分離した。ペレットをドライアイス上で凍結させ、次にＡＬＳ活性についてアッセイするまで−８０℃で保存した。
【０３９４】
凍結酵母細胞を解凍して、１０ｍＭのＭｇＣｌ２とプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１８７３５８０００１）とを含有する１．５ｍＬの０．１Ｍ  Ｋ−Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ６．８に再懸濁し、次に０．５ｍｍガラスビーズと共に、ビーズビーターにかけて破壊した。破壊細胞を遠心分離して細胞残骸を除去し、酵母粗抽出物を作成した。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイ（カタログ番号２３２３６、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって、抽出物のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）を測定した。Ｗ  Ｗ  Ｗｅｓｔｅｒｆｅｌｄ（１９４５），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１６１，４９５−５０２に記載される方法に修正を加えて使用して、エンドポイントアッセイ中で、ＬＳ酵素活性を分光光度法で測定した。
【０３９５】
アッセイ緩衝液は、０．１ＭのＫ−Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ６．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．５ｍＭのＴＰＰを含有した。アッセイ中の最終濃度が５０ｍＭになるように、十分なピルビン酸ナトリウムをアッセイ緩衝液に添加した。各アッセイでは、最終容積が５００μｌになるように、酵素含有溶液と基質含有緩衝液を混合した。アッセイ混合物を３０℃で、４５分間インキュベートした。１５分間隔で、各反応の１００μｌアリコートと１０μｌのＨ２Ｏ中の６Ｎ硫酸とを混合した。６０℃で１５分間のインキュベーションに続いて、５００μｌのＨ２Ｏの０．２％クレアチンと、５００μｌの２．５Ｎ  ＮａＯＨ中の１．５％α−ナフトールとを添加した。短時間の混合後、サンプルを６０℃で１５分間加熱し、短時間冷却して、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ３８４  Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、混合物の吸光度を５３０ｎｍで読み取った。０〜０．６３ｍＭのアセトインに対する標準曲線の勾配、反応速度（ＯＤ／ｍｉｎ）、およびタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）を使用して、各サンプルのＡＬＳ比活性（Ｕ／ｍｇ）を計算した。
【０３９６】
ＰＮＹ１５６０およびＰＮＹ１５６１からのＡＬＳ酵素活性は、酢酸培地中で培養された細胞と比較して、グルコース培地中で培養された細胞でより高かった（表１５および１６）。
【０３９７】
【表２３】
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【０３９８】
【表２４】
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【０３９９】
実施例６
ＰＮＹ２２８９ａｌｓＳ転写物のグルコース誘導
本実施例は、低グルコース条件下で培養された細胞について、グルコース応答性株ＰＮＹ２２８９中における３％（最終濃度）へのグルコースの添加によるａｌｓＳ転写物の誘導を実証する。低グルコース条件のためには、ポリマーベースの徐放供給ビーズ（Ｋｕｈｎｅｒ  Ｓｈａｋｅｒ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。
【０４００】
ＰＮＹ２２８９を最初に、７６ｍｇ／Ｌのトリプトファン、３８０ｍｇ／Ｌのロイシン、１００ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ５．５、および０．５％エタノールが添加された、合成培地（アミノ酸非含有酵母窒素原礎培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびウラシル、ヒスチジン、ロイシン、およびトリプトファン非含有酵母合成ドロップアウト培地補給剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））中で培養した。Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４振盪機内において、２５０ｍＬ通気エルレンマイアーフラスコ内の５０ｍＬの培地中で、一晩培養物を３０℃および２５０ＲＰＭで培養した。一晩培養物を室温において４，０００×ｇで５分間遠心分離して、エタノール非含有の上記培地で洗浄し、再度遠心分離した。細胞ペレットをエタノール非含有の上記培地に再懸濁した。エタノール非含有の上記培地を含有する２本の５００ｍｌ通気式フラスコに、０．１３のＯＤ６００で接種し、最終容積は８０ｍｌであった。１枚の１２ｍｍ径Ｋｕｈｎｅｒ  Ｓｈａｋｅｒ  ＦｅｅｄＢｅａｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅディスクを各フラスコに入れて、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４振盪機内で、培養物を３０℃および２５０ＲＰＭで培養した。接種後６および１０時間目に、第２のおよび第３の供給ビーズを添加した後、培養をさらに１５時間継続した。１５時間の成長後、ＹＳＩ  ７１００ＭＢＳグルコース分析器（ＹＳＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＯＨ）によって測定されたグルコース濃度は、０．１ｇ／Ｌ未満であった。次に培養物を、５００ｍｌ通気エルレンマイアーフラスコ内の８０ｍｌのエタノール非含有の上記培地中で、ＯＤ６００が０．５に戻るまで二次培養した。５０％グルコースを３％の最終濃度に添加して、３０℃および２５０ＲＰＭで培養を継続した。グルコースの添加直前に細胞を収集し、グルコース添加後の２、４、６、８、および２４時間目にＲＮＡを抽出した。
【０４０１】
各時点で、細胞収穫のために、１０ｍｌの培養物を氷冷１５ｍｌ円錐管に入れて、４℃および４，０００×ｇで４分間遠心分離した。ペレットを即座に１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に再懸濁して、ドライアイス上で凍結させ、次にＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。ＲＮＡ抽出では、サンプルを氷上で解凍して、Ｌｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂ  ０．１ｍｍシリカ球（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）を含有する２ｍｌねじ蓋管に移す。サンプルを２回にわたり、最大速度で１分間、ビーズビーターにかけた。２００μｌのクロロホルムを添加して、サンプルをボルテックスした。サンプルを４℃および１３，０００×ｇで１５分間遠心分離した。６００μｌの水性相を６５０μｌの７０％エタノールに添加して、混合した。サンプルをＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）カラムに適用して、製造会社のプロトコルに従った。５０μｌのＲＮａｓｅ非含有水によって、ＲＮＡをカラムから溶出した。ＲＴ−ＰＣＲ分析まで、ＲＮＡサンプルを−８０℃で保存した。
【０４０２】
上記の実施例５のように、リアルタイム逆転写ＰＣＲ分析を実施した。１８Ｓ  ＲＮＡ転写物を使用して、サンプル間でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲデータを正規化した。追加のグルコースの添加に先だって存在する転写物量に対する、２つの培養物の平均ａｌｓＳ転写物レベルは図９に示される。グルコースが０．１ｇ／Ｌ未満の培地中で培養した後、細胞にグルコースをボーラス投与して、グルコース濃度を最高３０ｇ／Ｌにすると、ＰＮＹ２２８９中のａｌｓＳ転写物レベルはおよそ５０倍に誘導された。
【０４０３】
実施例７
過剰なグルコースのパルス投与ありまたはなしで低グルコース条件で培養されたＰＮＹ２２８９およびＰＮＹ１５６２中のイソブタノールおよびイソ酪酸生成
本実施例は、過剰なグルコースをパルス投与した後に、またはしなかった後に、低グルコース条件下で培養された細胞について、グルコース応答性株ＰＮＹ２２８９および対照株ＰＮＹ１５６２中のイソブタノールおよびイソ酪酸プロファイルを実証する。イソブタノール経路の最後から２番目の代謝産物であるイソブチルアルデヒドは、イソブタノールに還元されてもよく、またはイソ酪酸に酸化されてもよい。イソブタノールおよびイソ酪酸の双方を測定して、経路の最初のステップであるＡＬＳを含む、イソブタノール経路を通る流量を判定した。低グルコース条件のためには、ポリマーベースの徐放供給ビーズ（Ｋｕｈｎｅｒ  Ｓｈａｋｅｒ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。
【０４０４】
ＰＮＹ２２８９およびＰＮＹ１５６２を最初に、７６ｍｇ／Ｌのトリプトファン、３８０ｍｇ／Ｌのロイシン、１００ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ５．５、および０．５％エタノールが添加された、合成培地（アミノ酸非含有酵母窒素原礎培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびウラシル、ヒスチジン、ロイシン、およびトリプトファン非含有酵母合成ドロップアウト培地補給剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））中で培養した。Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４振盪機内において、２５０ｍＬ通気エルレンマイアーフラスコ内の４０ｍＬの培地中で、一晩培養物を３０℃および２５０ＲＰＭで培養した。一晩培養物を室温において４，０００×ｇで５分間遠心分離して、エタノール非含有の上記培地で洗浄し、再度遠心分離した。細胞ペレットをエタノール非含有の上記培地に再懸濁した。各株について、エタノール非含有の上記培地を含有する複製の５００ｍｌ通気式フラスコに、０．０５のＯＤ６００で接種し、最終容積は８０ｍｌであった。１枚の１２ｍｍ径Ｋｕｈｎｅｒ  Ｓｈａｋｅｒ  ＦｅｅｄＢｅａｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅディスクを各フラスコに入れて、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４振盪機内で、培養物を３０℃および２５０ＲＰＭで培養した。接種後３時間目に、第２の供給ビーズを添加した後、培養をさらに２１時間継続した。次に、２１時間後に、エタノールなしの新鮮培地で、０．３の同一ＯＤ６００に培養物を調節した。１組のフラスコに、グルコースを最終濃度３．４％に添加した。フラスコのもう一方の組には、等体積の水を添加した。Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４内において、フラスコを３０℃および２５０ＲＰＭで５分間培養した。５分後、培養物を室温において４，０００×ｇで５分間遠心分離し、エタノール非含有の７０ｍｌの上記培地に再懸濁した。培養物を５００ｍｌ通気エルレンマイアーフラスコに入れて、２つのグルコース供給ビーズを各フラスコに添加した。ＰＮＹ１５６２培養物のＯＤ６００は、およそ０．２４であり、ＰＮＹ２２８９培養物のＯＤ６００は、およそ０．３１であった。Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４内において、培養物を３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間培養した。
【０４０５】
低グルコース条件下での２４時間の成長に続いて、培養物に３．４％グルコースまたは単に水のいずれかの５分間のパルス投与をした後、ＯＤ６００、イソブタノール、およびイソ酪酸のために培養物から試料採取した。培養上清（Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルターユニットＣｏｓｔａｒカタログ番号８１６９を使用して収集された）をＨＰＬＣ（参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書に記載される方法）によって分析し、イソブタノールおよびイソ酪酸濃度を測定した。ＯＤ６００およびイソブタノールおよびイソ酪酸濃度は、表１７に提示される。水を投与された培養物では、ＰＮＹ１５６２でイソ酪酸が蓄積したが、ＰＮＹ２２８９ではイソ酪酸は検出されなかった。５分間の３．４％グルコースパルス投与を受け、次に低グルコース条件下で２４時間培養された培養物では、ＰＮＹ１５６２はＰＮＹ２２８９よりも多くのイソ酪酸を蓄積した。
【０４０６】
【表２５】
2015503351.tif 000026
【０４０７】
実施例８
グルコース過剰条件で培養されたＰＮＹ２２８９およびＰＮＹ１５６２中のイソブタノー
ル生成
本実施例は、最終濃度３％のグルコース過剰条件で培養された細胞について、グルコース応答性株ＰＮＹ２２８９および対照株ＰＮＹ１５６２中のイソブタノールプロファイルを実証する。
【０４０８】
ＰＮＹ２２８９およびＰＮＹ１５６２を最初に、７６ｍｇ／Ｌのトリプトファン、３８０ｍｇ／Ｌのロイシン、１００ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ５．５、および０．５％エタノールが添加された、合成培地（アミノ酸非含有酵母窒素原礎培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびウラシル、ヒスチジン、ロイシン、およびトリプトファン非含有酵母合成ドロップアウト培地補給剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））中で培養した。Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４振盪機内において、２５０ｍＬ通気エルレンマイアーフラスコ内の３０ｍＬの培地中で、一晩培養物を３０℃および２５０ＲＰＭで培養した。一晩培養物を室温において４，０００×ｇで５分間遠心分離して、上記培地で洗浄し、再度懸濁した。各株について、エタノール非含有の上記培地を含有する３本の２５０ｍｌ通気式フラスコに、０．０５のＯＤ６００で培養を接種し、最終容積は３０ｍｌであった。１枚の１２ｍｍ径Ｋｕｈｎｅｒ  Ｓｈａｋｅｒ  ＦｅｅｄＢｅａｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅディスクを各フラスコに入れて、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４振盪機内で、培養物を３０℃および２５０ＲＰＭで１８時間培養した。次に培養物を新鮮培地で、０．２５のＯＤ６００に希釈して、５０％グルコースを３％の最終濃度に添加した。１３ｍｌの培養物を新しい１２５ｍｌ通気エルレンマイアーフラスコに移して、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４振盪機内で、３０℃および２５０ＲＰＭで４時間培養した。４時間後、培養物を２０ｍｌ血清バイアル（Ｋｉｍｂｌｅ  Ｃｈａｓｅ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ）に移して密封し、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４振盪機内で３０℃および２５０ＲＰＭで６５時間培養した。
【０４０９】
６５時間後、ＯＤ６００およびイソブタノールのために培養物を試料採取した。培養上清（Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルターユニットＣｏｓｔａｒカタログ番号８１６９を使用して収集された）をＨＰＬＣ（参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書に記載される方法）によって分析し、イソブタノール濃度を測定した。ＯＤ６００およびイソブタノール濃度は、グルコース過剰条件（最終濃度３％）下で培養された各株毎に、３つの培養物の平均として表１８に示される。イソブタノールは、ＰＮＹ１５６２およびＰＮＹ２２８９の双方によって生成された。
【０４１０】
【表２６】
2015503351.tif 000027
【０４１１】
実施例９
ＰＮＹ１６３１、ＰＮＹ１６３２、ＰＮＹ１６３３、ＰＮＹ１６３４、ＰＮＹ１６３５、およびＰＮＹ１６３６中のプロモーターＧＦＰ融合に対するグルコースの影響
本実施例は、細胞を低グルコース条件下で培養した後の３％（最終濃度）へのグルコース添加に対する、イソブタノール生成株中における選択されたプロモーターの応答を実証する。低グルコース条件のためには、ポリマーベースの徐放供給ビーズ（Ｋｕｈｎｅｒ  Ｓｈａｋｅｒ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。
【０４１２】
ＰＮＹ１６３１、ＰＮＹ１６３２、ＰＮＹ１６３３、ＰＮＹ１６３４、ＰＮＹ１６３５、およびＰＮＹ１６３６を最初に、７６ｍｇ／Ｌのトリプトファン、３８０ｍｇ／Ｌのロイシン、１００ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ５．５、および０．５％エタノールが添加された、合成培地（アミノ酸非含有酵母窒素原礎培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびウラシル、ヒスチジン、ロイシン、およびトリプトファン非含有酵母合成ドロップアウト培地補給剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））中で培養した。Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４振盪機内において、１２５ｍＬ通気エルレンマイアーフラスコ内の２０ｍＬの培地中で、一晩培養物を３０℃および２５０ＲＰＭで培養した。一晩培養物を室温において４，０００×ｇで５分間遠心分離して、上記培地で洗浄し、再度懸濁した。各株について、エタノール非含有の上記培地を含有する複製の２５０ｍｌ通気式フラスコに、０．０５のＯＤ６００で接種し、最終容積は３５ｍｌであった。１枚の１２ｍｍ径Ｋｕｈｎｅｒ  Ｓｈａｋｅｒ  ＦｅｅｄＢｅａｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅディスクを各フラスコに入れて、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４振盪機内で、培養物を３０℃および２５０ＲＰＭで２３時間培養した。２３時間後に、各株について複製フラスコの１つにグルコースを３％の最終濃度に添加する一方で、もう一方の複製フラスコは維持した。Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉ２４振盪機内で、成長を３０℃および２５０ＲＰＭで３０時間継続させた。グルコース添加に先だって、そして３０時間の期間全体にわたり周期的に、サンプルを採取してＯＤ６００を測定し、フローサイトメーターを使用した蛍光量による測定で、プロモーター活性をモニターした。
【０４１３】
蛍光は、Ｃ６フローサイトメーター（Ａｃｃｕｒｉ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）上で測定した。蛍光は、波長４８８ｎｍでの励起および波長５３０ｎｍでの発光検出を用いて、ＦＬ１チャネル上で測定した。フローサイトメーターは、中程度の流速（３５μｌ／分）で１０，０００回の事象を測定するように設定した。フローサイトメーター上にサンプルを装填するのに先だって、それをおよそ０．１のＯＤ６００に培地で希釈して、事象速度を毎秒１０００回よりも低く保ち、単一細胞の計数を確実にした。
【０４１４】
表１９は、３％へのグルコース添加ありまたはなしの培養物について、０時間および３０時間目における、株の細胞成長を示す。図１０は、３％へのグルコース添加ありまたはなしの各株について、各時点で測定された１０，０００回の事象について平均蛍光を示す。（図１０Ａ＝ＰＮＹ１６３１、図１０Ｂ＝ＰＮＹ１６３２、図１０Ｃ＝ＰＮＹ１６３３、図１０Ｄ＝ＰＮＹ１６３４、図１０Ｅ＝ＰＮＹ１６３５、および図１０Ｆ＝ＰＮＹ１６３６）天然低親和性ＨＸＴ１プロモーターと同様にグルコースによって調節されるように改変されているＦＢＡ１：：ＨＸＴ１＿３３１プロモーターとの、プロモーターＧＦＰ融合を含有する、イソブタノール生成株ＰＮＹ１６３２は、グルコースの添加後、最大で１１．２倍増大する蛍光レベルを有した。ＦＢＡ１プロモーターＧＦＰ融合があるＰＮＹ１６３１は、平均蛍光に３．２倍の増大を示す一方で、ＰＤＣ１プロモーターＧＦＰ株であるＰＮＹ１６３６は、３８％のみの蛍光レベル増大を有した。グルコース抑制されるプロモーターＡＤＨ２、ＨＸＴ５、およびＨＸＴ７と融合する、プロモーター−ＧＦＰを含有する、３つのイソブタノール生成株ＰＮＹ１６３３、ＰＮＹ１６３４、およびＰＮＹ１６３５は、３％へのグルコースの添加後、平均蛍光にそれぞれ４．５倍、２．６、および６倍の低下を有した。
【０４１５】
【表２７】
2015503351.tif 000028
【０４１６】
実施例１０
ＰＮＹ１５５９、ＰＮＹ１５６０、およびＰＮＹ１５６２のグルコース制限成長
本実施例は、好気的グルコース制限条件下における、ＰＮＹ１５５９、ＰＮＹ１５６０、およびＰＮＹ１５６２株の成長を実証する。１０ｍｌの種培養培地で充填された１２５ｍｌ振盪フラスコに、試験管１本分の解凍グリセロール保存培養物（およそ１ｍｌ）を接種した。２４時間後、１００ｍｌのＳＴＡＧＥ１培地で充填された５００ｍｌ振盪フラスコに、それぞれ３．５１ｍｌ、３．６５ｍｌ、および３．８１のＰＮＹ１５５９、ＰＮＹ１５６０、およびＰＮＹ１５６２株を移し入れた。種培地は、５０％酵母合成培地（２×）、１０％ヒスチジンおよびウラシル非含有Ｄｏｕｂｌｅ  Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ＣＳＭ）（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ，ＤＳＣＫ１６２，Ｈｕｎｓｔａｎｔｏｎ，ＵＫ）、０．６３％エタノール、および３９．３７％水から構成された。酵母合成培地（２×）は、１３．４ｇ／Ｌのアミノ酸非含有酵母窒素原礎培地（Ｄｉｆｃｏ  ０９１９−１５−３）、４０ｍｇ／ｌのチアミン、４０ｍｇ／ｌのナイアシン、および２００ｍｌ／ｌの１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ＝５．５から構成された。ＳＴＡＧＥ１培地は、５０％酵母合成培地（２×）、１０％ヒスチジンおよびウラシル非含有Ｄｏｕｂｌｅ  Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ＣＳＭ）（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ，ＤＳＣＫ１６２，Ｈｕｎｓｔａｎｔｏｎ，ＵＫ）、および４０％水から構成された。培養物を引き続いて、Ｉｎｎｏｖａ実験室振盪機（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）内で、３０℃および２５０ｒｐｍで培養した。工程の２時間、８時間、１７．５時間、および２５時間目に、毎回１個の大型グルコース供給物ビーズ（Ｄ＝１２ｍｍ，Ｋｕｈｎｅｒ  Ｓｈａｋｅｒ，Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ，ＣＨ）を各培養に添加した。サンプルを取り出して、成長および産物形成をモニターした。ＨＰＬＣ分析を適用して、培地中で、グルコース、イソ酪酸ｃ（ｉａｃ）、およびイソブタノールｃ（ｉｓｏ）の濃度を測定した。培養物のバイオマス濃度は、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３０００分光光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって、λ＝６００ｎｍでモニターした。グルコースは、ＥＰＴ＝４時間およびＥＰＴ＝１７．１７時間で取り出したサンプルを除いて、全ての培養物の上清中に検出されなかった。それでもなお、これらの２つのサンプル時には、全ての培養物中の検出グルコース濃度は０．１ｍＭ（１８ｍｇ／Ｌ）未満であり、全ての培養物がグルコース制限条件下で成長したことが示された。観察されたバイオマス、イソ酪酸およびイソブタノール濃度は、表２０に示される。ＰＮＹ１５５９およびＰＮＹ１５６０株は、放出グルコースについて、同等のバイオマス濃度を達成した。ＰＮＹ１５５９およびＰＮＹ１５６０株は、ＰＮＹ１５６２株よりも、放出グルコースの顕著により高いバイオマス濃度を達成した。全ての培養物
において、顕著なイソブタノール生成は検出されなかった。ＰＮＹ１５５９およびＰＮＹ１５６０株の培養物中で、顕著なイソ酪酸生成は検出されなかった。ＰＮＹ１５６２株では、イソ酪酸生成が検出された。
【０４１７】
【表２８】
2015503351.tif 000029
【０４１８】
実施例１１
ＰＮＹ１５６２と比較したＰＮＹ１５５９およびＰＮＹ１５６０のグルコース制限成長におけるバイオマス収率増大
本実施例は、好気的グルコース制限成長下における、ＰＮＹ１５６２株と比較した、ＰＮＹ１５５９およびＰＮＹ１５６０株のグルコース上の顕著により高いバイオマス収率を実証する。実験は、実施例１０に記載されるようにして実施した。全ての放出グルコースおよび形成バイオマスは、均衡が取れていた。大型供給ビーズ（Ｄ＝１２ｍｍ，Ｋｕｈｎｅｒ  ｓｈａｋｅｒ，Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ，ＣＨ）では、ｍ（ｇｌｃ）＝２．０６ｍｇ／ｈ０．６３×ＥＰＴ０．６３に従ったグルコース放出動態が想定された。放出グルコースの完全な消費を計算に使用した。放出グルコースｍ（ｇｌｃ）ならびに全形成バイオマスｍ（ｃｄｗ）は、ＥＰＴ＝８、１７、２０、２５および４１ｈの時点で判定した。選択された培養物では、グルコース以外の炭素源（例えばエタノール）が上清中に見られたので、先行する時点は廃棄した。全形成バイオマスｍ（ｃｄｗ）は、λ＝６００ｎｍに設定されたｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３０００分光光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって、光学濃度（ＯＤ）を測定し、０．３３ｇ（ｃｄｗ）／ＯＤの変換を適用することで判定された。実験中に取り出されたサンプル容積、ならび０．０４２ｍｌ／ｈの速度のブロスからの水の蒸発を考慮に入れて、質量平衡が誘導された（表２２）。
【０４１９】
【表２９】
2015503351.tif 000030
【０４２０】
【表３０】
2015503351.tif 000031
【０４２１】
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３  ＳＰ３（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）による、放出グルコースをｘ軸、形成バイオマスをｙ軸とした直線回帰は、３つの培養物のバイオマス収率係数［ｇ／ｇ］を勾配として明らかにした。全ての３つの培養物の適合線の相関係数Ｒ２は、＞０．９９であった。所与の実験条件でのグルコース上のバイオマス収率は、ＰＮＹ１５５９では０．８５ｇ／ｇ、ＰＮＹ１５６０では０．８３ｇ／ｇ、およびＰＮＹ１５６２では０．５３ｇ／ｇと判定された。グルコース上のＰＮＹ１５５９およびＰＮＹ１５６０のバイオマス収率は、ＰＮＹ１５６２よりも顕著に高いことを認め得る。
【０４２２】
実施例１２
最初に好気的グルコース制限条件、後に好気的グルコース過剰条件でのグルコース添加における、ＰＮＹ１５５９、ＰＮＹ１５６０、およびＰＮＹ１５６２中のＡＬＳ発現
本実施例は、好気的グルコース制限条件下における、ＰＮＹ１５５９、ＰＮＹ１５６０、およびＰＮＹ１５６２株の成長を実証する。１０ｍｌの種培地で充填された１２５ｍｌ振盪フラスコに、試験管１本分の解凍グリセロール保存培養物（およそ１ｍｌ）を接種した。２４時間後、１００ｍｌのＳＴＡＧＥ１培地で充填された５００ｍｌ振盪フラスコに、それぞれ３．５１ｍｌ、３．６５ｍｌ、および３．８１ｍｌのＰＮＹ１５５９、ＰＮＹ１５６０、およびＰＮＹ１５６２株を移し入れた。種培地は、５０％酵母合成培地（２×）、１０％ヒスチジンおよびウラシル非含有Ｄｏｕｂｌｅ  Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ＣＳＭ）（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ，ＤＳＣＫ１６２，Ｈｕｎｓｔａｎｔｏｎ，ＵＫ）、０．６３％エタノール、および３９．３７％水から構成された。酵母合成培地（２×）は、１３．４ｇ／Ｌのアミノ酸非含有酵母窒素原礎培地（Ｄｉｆｃｏ  ０９１９−１５−３）、４０ｍｇ／ｌのチアミン、４０ｍｇ／ｌのナイアシン、および２００ｍｌ／ｌの１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ＝５．５から構成された。ＳＴＡＧＥ１培地は、５０％酵母合成培地（２×）、１０％ヒスチジンおよびウラシル非含有Ｄｏｕｂｌｅ  Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ＣＳＭ）（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ，ＤＳＣＫ１６２，Ｈｕｎｓｔａｎｔｏｎ，ＵＫ）、および４０％水から構成された。培養物を引き続いて、Ｉｎｎｏｖａ実験室振盪機（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）内で、３０℃および２５０ｒｐｍで培養した。工程の２時間、８時間、１７．５時間、および２５時間目に、毎回１個の大型グルコース供給物ビーズ（Ｄ＝１２ｍｍ，Ｋｕｈｎｅｒ  Ｓｈａｋｅｒ，Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ，ＣＨ）を各培養に添加した。ＥＰＴ＝４１．３３ｈにおいて、５０％グルコース溶液のグルコースの５ｍｌボーラスを培養物に添加した。ＡＬＳ  ｍＲＮＡレベルを判定するためのサンプルは、過剰なグルコースの添加前（ＥＰＴ＝２４．８３ｈおよび４１．１７ｈ）、および添加後（ＥＰＴ＝４２．８３ｈ、４４．０８ｈ、４６．０８ｈ、４８．３３ｈ、および６５．３３ｈ）に取り出した。ＡＬＳ酵素比活性のためのサンプルは、グルコースボーラス前（ＥＰＴ＝４１．１７ｈ）および後（ＥＰＴ＝４８．３３ｈおよびＥＰＴ＝６５．３３ｈ）に取り出した。
【０４２３】
ＡＬＳ転写物の分析では、培養サンプル（表２３）を取り出して、４ｍｌの氷冷水を含有する氷冷１５ｍｌ円錐管に入れて、４℃および４，０００×ｇで４分間遠心分離した。ペレットを即座に１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に再懸濁して、ドライアイス上で凍結させ、次にＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。ＲＮＡ抽出では、サンプルを氷上で解凍して、Ｌｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂ  ０．１ｍｍシリカ球（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）を含有する２ｍｌねじ蓋管に移す。サンプルを２回にわたり、最大速度で１分間、ビーズビーターにかけた。２００μｌのクロロホルムを添加して、サンプルをボルテックスした。サンプルを４℃および１３，０００×ｇで１５分間遠心分離した。６００μｌの水性相を６５０μｌの７０％エタノールに添加して、混合した。サンプルをＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）カラムに適用して、製造会社のプロトコルに従った。５０μｌのＲＮａｓｅ非含有水によって、ＲＮＡをカラムから溶出した。リアルタイム逆転写ＰＣＲ分析まで、ＲＮＡサンプルを−８０℃で保存した。１８Ｓ転写物を内標準として使用した。引き続いて培養物中の倍数発現レベルを、ＥＰＴ＝４１．１７ｈにおけるＰＮＹ１５６０株の発現レベルについて正規化し、［ＡＵ］（任意の単位）で表した。
【０４２４】
【表３１】
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【０４２５】
ＡＬＳ酵素比活性の判定のために、培養サンプルを５０ｍｌ遠心管（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）に移し入れて、エッペンドルフ５８０４Ｒ遠心分離機（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内で、５０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離した。ペレットを引き続いてドライアイス上で凍結させ、次にＡＬＳ活性についてアッセイするまで−８０℃で保存した。凍結ペレットを解凍して、１０ｍＭのＭｇＣｌ２とプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１８７３５８０００１）とを含有する１．５ｍＬの０．１Ｍ  Ｋ−Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ６．８に再懸濁し、次に０．５ｍｍガラスビーズと共に、ビーズビーターにかけて破壊した。破壊細胞を遠心分離して細胞残骸を除去し、酵母粗抽出物を作成した。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイ（カタログ番号２３２３６、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって、抽出物のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）を測定した。Ｗ  Ｗ  Ｗｅｓｔｅｒｆｅｌｄ（１９４５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１６１，４９５−５０２に記載される方法に修正を加えて使用して、エンドポイントアッセイ中で、ＡＬＳ酵素活性を分光光度法で測定した。アッセイ緩衝液は、０．１ＭのＫ−Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ６．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．５ｍＭのＴＰＰを含有した。アッセイ中の最終濃度が５０ｍＭになるように、十分なピルビン酸ナトリウムをアッセイ緩衝液に添加した。各アッセイでは、最終容積が５００μｌになるように、酵素含有溶液と基質含有緩衝液を混合した。アッセイ混合物を３０℃で、４５分間インキュベートした。１５分間隔で、各反応の１００μｌアリコートと１０μｌのＨ２Ｏ中の６Ｎ硫酸とを混合した。６０℃で１５分間のインキュベーションに続いて、５００μｌのＨ２Ｏの０．２％クレアチンと、５００μｌの２．５Ｎ  ＮａＯＨ中の１．５％α−ナフトールとを添加した。短時間の混合後、サンプルを６０℃で１５分間加熱し、短時間冷却して、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ３８４  Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、混合物の吸光度をλ＝５３０ｎｍで読み取った。０〜０．６３ｍＭのアセトインに対する標準曲線の勾配、反応速度（ＯＤ／ｍｉｎ）、およびタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）を使用して、各サンプルのＡＬＳ酵素比活性（Ｕ／ｍｇ）を計算した。
【０４２６】
【表３２】
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【０４２７】
Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３０００分光光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いてλ＝６００ｎｍで測定されたＯＤによって、培養物のバイオマス濃度をモニターした。細胞乾燥重量濃度は、０．３３ｇ（ＤＷ）／ＯＤのＯＤ−ＤＷ相関を仮定して、ＯＤ読み取りから推測（ｄｅｆｅｒｒｅｄ）された。上清中の細胞外化合物分析は、ＨＰＬＣによって達成された。Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５分離モジュール（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）上で、ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを０．０１Ｎ硫酸を溶出剤とする均一溶媒法で使用した。流速は０．６０ｍｌ／分、カラム温度は４０℃、注入容積は１０μｌで、稼働時間は５８分間であった。検出は、４０℃で操作される屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ  ２４１４  ＲＩ）と、２１０ｎｍのＵＶ検出器（Ｗａｔｅｒｓ  ２９９６  ＰＤＡ）とを用いて実施した。
【０４２８】
ＰＮＹ１５５９株中では、好気的グルコース制限中、ならびに好気的グルコース過剰培養中に、一貫して低いＡＬＳ  ｍＲＮＡレベルが検出された（全ての７つのサンプルの平均：０．０２±０．０４ＡＵ）。ＰＮＹ１５６２では、双方の工程条件において、一貫して高いＡＬＳ  ｍＲＮＡレベルが見られた（全ての７つのサンプルの平均：１９３．０２±４５．０４ＡＵ）。対照的に、ＰＮＹ１５６０では、好気的グルコース制限成長中に低いＡＬＳ  ｍＲＮＡレベルが見られたが（２つのサンプルの平均：０．７５±０．３５ＡＵ）、好気的グルコース過剰成長中には高いｍＲＮＡレベルが見られた（５つのサンプルの平均：１６．８３±１１．７０ＡＵ）。グルコースボーラス添加後のＰＮＹ１５６０中のＡＬＳ  ｍＲＮＡレベルは、ボーラス前の１．００ＡＵおよびボーラス直後の７．３７ＡＵから、ＥＰＴ＝６５．３３ｈにおける実験終了時の３５．２２ＡＵに、実験時間と共に絶えず増大したことも分かる。ＰＮＹ１５６０株中の増大するＡＬＳ  ｍＲＮＡレベルは、ＨＸＴ３プロモーターによって媒介されるＡＬＳ遺伝子の転写が、低グルコース濃度では低いが、高いグルコース濃度では、有意に増大することを示唆する。
【０４２９】
ＰＮＹ１５５９株中では、好気的グルコース制限中、ならびに好気的グルコース過剰培養中に、一貫して低いＡＬＳ酵素比活性が検出された（全ての３つのサンプルの平均：０．０１±０．００  Ｕ）。ＰＮＹ１５６２では、双方の工程条件において、一貫して高いＡＬＳ酵素比活性が見られた（全ての３つのサンプルの平均：１．０３±０．０８ＡＵ）。対照的に、ＰＮＹ１５６０では、好気的グルコース制限成長では低いＡＬＳ酵素比活性が見られたが（０．０１Ｕ）、好気的グルコース制限成長中には着実に増大する酵素活性が見られた（ＥＰＴ＝４８．３３ｈでは０．０８Ｕであり、ＥＰＴ＝６５．３３ｈでは０．１１Ｕ）。これらの知見は、ＨＸＴ３プロモーターによって媒介されるＡＬＳ遺伝子の発現増大が、低い細胞外グルコース濃度と比較して、高い細胞外グルコース濃度でＡＬＳ酵素比活性の増大をもたらすことを例証する。
【０４３０】
【表３３】
2015503351.tif 000034
【０４３１】
ＰＮＹ１５５９株中では、好気的グルコース制限または好気的グルコース過剰条件のどちらにおいても、イソブタノール生成は観察されなかった。ＰＮＹ１５６２株中では、イソブタノール生成は、好気的グルコース制限条件では観察されなかったが、好気的グルコース過剰条件では観察された（ｗａｉｓ）。ＰＮＹ１５６０株では、好気的グルコース制限条件では、イソブタノール生成が観察されなかったが、好気的グルコース過剰条件では、イソブタノール生成が観察された。ＰＮＹ１５５９株中では、好気的グルコース制限または好気的グルコース過剰条件のどちらにおいても、イソ酪酸生成は観察されなかった。ＰＮＹ１５６２株では、好気的グルコース制限条件ならびに好気的グルコース過剰条件で、イソ酪酸生成が観察された。ＰＮＹ１５６０株では、好気的グルコース制限条件では、イソ酪酸生成が観察されなかったが、好気的グルコース過剰条件では、イソ酪酸生成が観察された。ＰＮＹ１５６０株中の、好気的グルコース制限条件におけるイソ酪酸およびイソブタノールの非形成、しかし好気的グルコース過剰条件におけるイソ酪酸およびイソブタノール形成の観察は、発現がＨＸＴ３プロモーターによって媒介されるＡＬＳを通じた、ＰＮＹ１５６０株のグルコースからイソブチルアルデヒドへの炭素流を示唆し、それは細胞外グルコース濃度に左右されて、高いグルコース濃度では炭素流が高く、低いグルコース濃度では炭素流は低い／検出不能である。
【０４３２】
【表３４】
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【０４３３】
【表３５】
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【０４３４】
【表３６】
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【０４３５】
実施例１３
好気的グルコース過剰から嫌気的グルコース過剰条件への移行中のＰＮＹ１５６０およびＰＮＹ１５６２中のイソブタノール生成
本実施例は、好気的グルコース過剰から嫌気的グルコース過剰条件への移行における、ＰＮＹ１５６０中のイソブタノールの生成を実証する。実施例１０〜１２に記載される実験の終わりに、ＰＮＹ１５６０およびＰＮＹ１５６２からの３．３ｍｌおよび６．７ｍｌの培養物をそれぞれ５０ｍＬの無菌遠心管に移し、９５００ｒｐｍで２０分間遠心沈殿させた。ペレットを引き続いて１２ｍｌの生産培地に再懸濁し、２５ｍｌのＢａｌｃｈ管に移し入れた。生産培地は、５０％酵母合成培地（２×）、１０％ヒスチジンおよびウラシル非含有Ｄｏｕｂｌｅ  Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ＣＳＭ）（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ，ＤＳＣＫ１６２，Ｈｕｎｓｔａｎｔｏｎ，ＵＫ）、１６％２５０ｇ／Ｌのグルコース溶液、および２４％水から構成された。酵母合成培地（２×）は、１３．４ｇ／Ｌのアミノ酸非含有酵母窒素原礎培地（Ｄｉｆｃｏ  ０９１９−１５−３）、４０ｍｇ／ｌのチアミン、４０ｍｇ／ｌのナイアシン、および２００ｍｌ／ｌの１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ＝５．５から構成された。各Ｂａｌｃｈ管はブチルゴム隔膜を装着して、シリンジでサンプルを抜き取れるようにする円形開口部がある、金属シートで管にクランプ止めした。サンプル抜き取りのためには、１ｍｌシリンジ（２５Ｇ  ５／８（０．５ｍｍ×１６ｍｍ）Ｓａｆｅｔｙ−Ｌｏｋ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いた。Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３０００分光光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、λ＝６００ｎｍで測定されたＯＤの助けによって、培養物の成長をモニターした。細胞乾燥重量濃度は、０．３３ｇ（ＤＷ）／ＯＤのＯＤ−ＤＷ相関を仮定して、ＯＤ読み取りから推測（ｄｅｆｅｒｒｅｄ）された。上清中の細胞外化合物分析は、ＨＰＬＣによって達成された。Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５分離モジュール（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）上で、ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを０．０１Ｎ硫酸を溶出剤とする均一溶媒法で使用した。流速は０．６０ｍｌ／分、カラム温度は４０℃、注入容積は１０μｌで、稼働時間は５８分間であった。検出は、４０℃で操作される屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ  ２４１４  ＲＩ）と、２１０ｎｍのＵＶ検出器（Ｗａｔｅｒｓ  ２９９６  ＰＤＡ）とを用いて実施した。
【０４３６】
適用条件下では、ＰＮＹ１５６０がイソブタノールを生成することを認め得る。イソブタノール生成の平均比速度は、ＰＮＹ１５６０では０．０１ｇ／ｇ（ＤＷ）ｈ、ＰＮＹ１５６２では０．０６ｇ／ｇ（ＤＷ）ｈと判定された。イソブタノール生成の平均比速度は、実験中に形成されたイソブタノール濃度を平均バイオマス濃度で除算して計算した。平均バイオマス濃度は、生体触媒の指数関数的成長と引き続く線形成長を仮定して、実験時間を積分し、結果を実験の全時間で除算して計算した。
【０４３７】
【表３７】
2015503351.tif 000038
【０４３８】
実施例１４
ＰＮＹ１６２３、ＰＮＹ１６２４、ＰＮＹ１６２５、ＰＮＹ１６２６、およびＰＮＹ１６２７中のイソブタノール生成
本実施例は、酸素供給低下条件下における、ＰＮＹ１６２３、ＰＮＹ１６２４、ＰＮＹ１６２５、ＰＮＹ１６２６、およびＰＮＹ１６２７中の、イソブタノールおよびイソブタノール経路中間体の生成を実証する。この目的で各株、すなわちＰＮＹ１５５９、ＰＮＹ１５６２、ＰＮＹ１６２３、ＰＮＹ１６２７、ＰＮＹ１６２５、ＰＮＹ１６２６の３本のバイアル、およびＰＮＹ１６２４の２本のバイアルの凍結グリセロール保存株を５００ｍｌ振盪フラスコ内の１００ｍｌの種培地に接種した。各凍結グリセロール保存株バイアルは、およそ１ｍｌの凍結保存培養物を含有した。種培地は、５０％酵母合成培地（２×）、３０％ヒスチジンおよびウラシル非含有ＤｏｕｂｌｅＤｒｏｐ−Ｏｕｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ＣＳＭ）（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ，ＤＳＣＫ１６２，Ｈｕｎｓｔａｎｔｏｎ，ＵＫ）、および２０％水から構成された。酵母合成培地（２×）は、１３．４ｇ／Ｌのアミノ酸非含有酵母窒素原礎培地（Ｄｉｆｃｏ  ０９１９−１５−３）、４０ｍｇ／ｌのチアミン、４０ｍｇ／ｌのナイアシン、および２００ｍｌ／ｌの１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ＝５．５から構成された。接種直後に、３個の小型供給ビーズ（Ｄ＝６ｍｍ，Ｋｕｈｎｅｒ  Ｓｈａｋｅｒ，Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ，ＣＨ）を各振盪フラスコに添加した。培養物をＩｎｎｏｖａ実験室振盪機（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）内で、３０℃および２５０ｒｐｍで培養した。ＥＰＴ＝４ｈおよびＥＰＴ＝２０．５ｈにおいて、３個の大型供給ビーズを各培養に添加した。ＥＰＴ＝２５．８３ｈにおいて、培養物を供給ビーズと共に５００ｍｌから１２５ｍｌ振盪フラスコに移して、酸素供給を低下させた。しかし培養物は、グルコース制限下において２５０ｒｐｍで振盪して培養を継続した。ＥＰＴ＝７５．００ｈにおいて、２０ｍｌの２５０ｇ／Ｌのグルコース溶液を培養物のそれぞれに添加して、グルコース過剰条件を作り出した。得られた培養物の容積は、ＰＮＹ１６２３、ＰＮＹ１６２４、ＰＮＹ１６２５、ＰＮＹ１６２６、ＰＮＹ１６２７、ＰＮＹ１５５９、およびＰＮＹ１５６２株の培養物について、それぞれ９５ｍｌ、１０１ｍｌ、１０１ｍｌ、９５ｍｌ、１０５ｍｌ、９９ｍｌ、および１０２ｍｌであった。さらに撹拌機速度を１６０ｒｐｍに低下させ、酸素供給を低下させ、イソブタノール増殖および生産タンクに匹敵する環境を模倣した。
【０４３９】
光学濃度をλ＝６００ｎｍでＵｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３０００分光光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって、細胞外代謝産物濃度をＨＰＬＣによって、酵素分析法によって酵素活性を測定するためのサンプルを実験中に取り出した（ｗｈｅｒｅ）。ＨＰＬＣ分析では、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５分離モジュール（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）上で、ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを０．０１Ｎ硫酸を溶出剤とする均一溶媒法で使用した。流速は０．６０ｍｌ／分、カラム温度は４０℃、注入容積は１０μｌで、稼働時間は５８分間であった。検出は、４０℃で操作される屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ  ２４１４  ＲＩ）と、２１０ｎｍのＵＶ検出器（Ｗａｔｅｒｓ  ２９９６  ＰＤＡ）とを用いて実施した。
【０４４０】
ＡＬＳ酵素比活性の判定のために、培養サンプルを５０ｍｌ遠心管（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）に移し入れて、エッペンドルフ５８０４Ｒ遠心分離機（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内で、５０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離した。ペレットを引き続いて解凍して、１０ｍＭのＭｇＣｌ２と、０．５ｍＭのＴＰＰと、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１８７３５８０００１）とを含有する１．５ｍＬの０．１Ｍ  Ｋ−Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ６．８に再懸濁し、次に０．５ｍｍガラスビーズと共に、ビーズビーターにかけて破壊した。破壊細胞を遠心分離して細胞残骸を除去し、酵母粗抽出物を作成した。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイ（カタログ番号２３２３６、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって、抽出物のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）を測定した。Ｗ  Ｗ  Ｗｅｓｔｅｒｆｅｌｄ（１９４５液−液Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１６１，４９５−５０２に記載される方法に修正を加えて使用して、エンドポイントアッセイ中で、ＬＳ酵素活性を分光光度法で測定した。通常は活性を４時点でアッセイした。１０μｌの６Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を必要なだけのウェルに供給した。さらに０〜５０ｎｍｏｌのアセト乳酸の標準曲線を作成した。反応ライブラリー管内で、抽出および希釈緩衝液を合わせて４００μｌにした。アッセイ緩衝液は、０．１ＭのＫ−Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ６．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．５ｍＭのＴＰＰからなった。希釈緩衝液は、アッセイ緩衝液および０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡからなった。反応ライブラリー管と、アッセイ緩衝液中の０．２５Ｍのピルビン酸のライブラリーストリップとを水浴中で予備加温した。一定時間間隔で各反応管に１００μｌのピルビン酸溶液を添加することで反応を開始させ、混合は、ピペットによって上下させることで達成した。５、１０、１５、および２０分目に、ウェル内に硫酸と共に１００μｌのサンプルを収集して、ピペットによって上下させて、再度混合した。全てのサンプルを収集した後、１００μｌのアセト乳酸標準物質を硫酸を含有するウェルに添加した。プレートを短時間震盪して、蓋をして、オーブン内において５０℃で３０分間インキュベートした。引き続いて、１００μｌのクレアチンナフトール（ｎａｐｔｈｏｌ）溶液を各ウェルに添加した。１．７５ｍｇ／ウェルに相当する１−ナフトール（ｎａｐｔｈｏｌ）を秤量して、クレアチン−ナフトール（ｎａｐｔｈｏｌ）溶液を調製した。６ｍｇ／ｍｌのクレアチン溶液を添加して、３５ｍｇ／ｍＬのナフトール（ｎａｐｔｈｏｌ）懸濁液を作成した。使用直前に、等容積の２．５Ｎ  ＮａＯＨを添加して、溶液が透明になるまでボルテックスした。オーブン内においてプレートを５０℃で３０分間培養して、Ｍａｘ３８４  Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて５３０ｎｍで読み取った。
【０４４１】
ＰＮＹ１６２３、ＰＮＹ１６２４、ＰＮＹ１６２５、ＰＮＹ１６２６、ＰＮＹ１６２７、ＰＮＹ１５５９、およびＰＮＹ１５６２株の上清中のＯＤおよび選択代謝産物濃度の経時変化は、表３０〜３６にある。  ＰＮＹ１５６２の陽性対照を除いて、その他の株は、酸素可用性が高いグルコース制限条件下で、イソブタノールを生成することを認め得る。しかしグルコースボーラスの添加、および振盪フラスコ内の高い液体容積と、顕著により低い振盪機速度とに起因する、顕著に低下した酸素供給後に、ＰＮＹ１６２４株を除く全ての培養物中で、イソブタノールの生成が観察された（表３０〜表３６）。
【０４４２】
イソブタノール生成平均比速度は、高い酸素供給があるグルコース制限条件と、引き続いて、酸素供給をわずかに低下させた、ＥＰＴ＝０ｈからＥＰＴ＝１００．５０ｈの範囲の実験の第１段階成長期、およびグルコース過剰条件で酸素供給を低下させた、ＥＰＴ＝１００．５０ｈから１４８．５ｈの範囲の実験の第２段階生産期において測定した。平均バイオマス濃度は、ＥＰＴ＝０ｈからＥＰＴ＝１００．５０ｈの第１段階における全てのＯＤ時点の関数を積分し、それらの間の線形接続を仮定して、引き続いて、結果を実験の全時間間隔（１００．５０ｈ）で除算して判定した。さらに、測定されたＯＤについて、０．３３ｇ／Ｌ（ｃｄｗ）の細胞乾燥重量対ＯＤ（ｃｄｗ）相関が仮定された。第１段階ではいずれの株もイソブタノールを生成しないが、第２段階ではＰＮＹ１６２４株を除く全ての株がイソブタノールｉを生成することを認め得る（表３０〜表３６）。
【０４４３】
ＫＩＶ、ＤＨＸ、イソ酪酸およびイソブタノールを含んでなる、イソブタノール生成経路における選択経路産物（ＰＰ）の濃度変化は、表３８に示される。アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）によって触媒される、イソブタノール生合成経路の入口反応。実験第１段階（Δ２６ｈ、ＥＰＴ＝０〜２５．８３ｈ）は、高い酸素供給があるグルコース制限条件によって特徴付けられる。第２段階（Δ７５ｈ、ＥＰＴ＝２５．８３〜１００．５０ｈ）は、酸素供給をわずかに低下させたグルコース制限条件によって特徴付けられる。第１および２期を合わせると、実験の第１相とも称される。実験の第２相（Δ２４ｈ、ＥＰＴ＝１００．５０〜１２５ｈ、ＥＰＴ＝１０１ｈおよびＥＰＴ＝１２５ｈでの測定）は、酸素供給を低下させたグルコース過剰条件を示した。全ての培養物中で、第１段階よりも第２段階でより多くの経路産物が、および第１期よりも第２期で有意により多くの経路産物が、生成されることが分かった（表３７）。第２期条件下において、ＰＮＹ１６２３、ＰＮＹ１６２５、ＰＮＹ１６２６、およびＰＮＹ１６２７株では、ＡＬＳを通じた流動が増大すると結論付け得る。
【０４４４】
実験において、酵素アッセイを実施して、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の酵素活性を評価した。結果は、表３９に示される。
【０４４５】
【表３８】
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【０４４６】
【表３９】
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【０４４７】
【表４０】
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【０４４８】
【表４１】
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【０４４９】
【表４２】
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【０４５０】
【表４３】
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【０４５１】
【表４４】
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【０４５２】
【表４５】
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【０４５３】
【表４６】
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【０４５４】
【表４７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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