(57)【要約】本発明は、高グリコシル化されて体内持続性が高められた持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質及びその製造方法に関し、具体的には、体内持続性を増加させる高グリコシル化α１−アンチトリプシン変異体とヒト成長ホルモンが融合された持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質の特定のアイソフォーム及びその製造方法に関する。また、持続型ヒト成長ホルモンの製造方法は、ＮｅｘＰ−ｈＧＨの高純度精製方法に関し、具体的には、（ａ）ヒト成長ホルモン及びα１−アンチトリプシン変異体が融合された持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液を陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーにかけるステップと、（ｂ）前記ＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液、又はステップ（ａ）で生成された溶出液を疎水性樹脂クロマトグラフィーにかけるステップと、（ｃ）前記持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液、ステップ（ａ）で生成された溶出液、又はステップ（ｂ）で生成された溶出液を抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィーにかけるステップとを含む。
2015518882.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞から製造された、α１−アンチトリプシン変異体（ＮｅｘＰ）及びヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）が融合されたタンパク質であって、５．２以下の等電点（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｏｉｎｔ，ｐＩ）を有する持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質。
【請求項２】
前記α１−アンチトリプシン変異体（ＮｅｘＰ）は、野生型α１−アンチトリプシンタンパク質の９番目のグルタミンのアスパラギンへの変異、２３２番目のアミノ酸のシステインのセリンへの変異、３５７番目のアミノ酸のプロリンのアスパラギンへの変異、及び３５９番目のアミノ酸のセリンのスレオニンへの変異からなる群から選択される少なくとも１種の変異を含む、請求項１に記載の持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質。
【請求項３】
（ａ）α１−アンチトリプシン変異体（ＮｅｘＰ）及びヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）が融合された持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質を含む生物学的乳液を抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィーにかけるステップと、
（ｂ）等電点の差により等電点（ｐＩ）５．２以下の持続型成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質を分離するステップとを含む、持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質の製造方法。
【請求項４】
前記ステップ（ｂ）は、０〜１０００ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液で溶出させるステップを含む、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記トリス緩衝液は２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記ステップ（ａ）は、持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質を含む試料を陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー又は疎水性樹脂クロマトグラフィーにかけて生成された溶出液を、抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィーにかけるステップである、請求項３に記載の製造方法。
【請求項７】
前記ステップ（ａ）は、持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質を含む試料を順に陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー及び疎水性樹脂クロマトグラフィーにかけて生成された溶出液を、抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィーにかけるステップである、請求項３に記載の製造方法。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法で製造された持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質。
【請求項９】
（ａ）ヒト成長ホルモン及びα１−アンチトリプシン変異体が融合された持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液を陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーにかけるステップと、
（ｂ）前記ＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液、又はステップ（ａ）で生成された溶出液を疎水性樹脂クロマトグラフィーにかけるステップと、
（ｃ）前記持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液、ステップ（ａ）で生成された溶出液、又はステップ（ｂ）で生成された溶出液を抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィーにかけるステップとを含む、持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨの精製方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ａ）は、平衡化した陰イオン交換樹脂に持続型ヒト成長ホルモンを含む培養液、又は前記培養液をｐＨ６〜９の０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有緩衝液でダイアフィルトレーションした培養液を加えて吸着させ、その後ｐＨ６〜９の０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有緩衝液で洗浄し、その後ｐＨ６〜９の１００〜１０００ｍＭ  ＮａＣｌ含有緩衝液で持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含有する分画を溶出するステップである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ（ｂ）は、平衡化した疎水性樹脂に持続型ヒト成長ホルモンを含む培養液、又は前記陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーステップで回収された溶液を加えて吸着させ、その後ｐＨ６〜８の１〜３Ｍ  ＮａＣｌ含有緩衝液で洗浄し、その後ｐＨ６〜８の０〜１Ｍ  ＮａＣｌ含有緩衝液で持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含有する分画を溶出するステップである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ（ｃ）は、平衡化した抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂に持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含有する培養液、或いは、前記ステップ（ａ）の溶出液、又は前記ステップ（ｂ）の溶出液を加えて吸着させ、その後ｐＨ６．５〜８．５の０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌ含有トリス緩衝液で洗浄し、その後ｐＨ６．５〜８．５の０〜１Ｍ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液で持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含有する分画を溶出するステップである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
（ｄ）抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィー精製ステップに、０〜１０００ｍＭ  ＭｇＣｌ２で持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨの糖鎖パターン及び等電点が異なる構造的な亜型（ｉｓｏｆｏｒｍ）を分離溶出するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＭｇＣｌ２の代わりに０〜２０００ｍＭ  ＮａＣｌで持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨの糖鎖パターン及び等電点が異なる構造的な亜型を分離溶出するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記洗浄及び溶出ステップで用いる緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、又はトリス緩衝液である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物学的乳液は動物細胞培養液である、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記陰イオン交換樹脂の官能基は、Ｑ（第四級アミン）、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）、及びＱＡＥ（第４級アミノエチル）からなる群から選択されるいずれかである、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
疎水性樹脂クロマトグラフィーの官能基は、フェニル、オクチル、イソプロピル、ブチル、及びエチルからなる群から選択されるいずれかである、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高グリコシル化されて体内持続性が高められた持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質及びその製造方法に関し、具体的には、体内持続性を増加させる高グリコシル化α１−アンチトリプシン変異体とヒト成長ホルモンが融合された持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質の特定のアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）及びその製造方法に関する。
【０００２】
持続型ヒト成長ホルモンの製造方法は、ＮｅｘＰ−ｈＧＨの高純度精製方法に関し、具体的には、（ａ）ヒト成長ホルモン及びα１−アンチトリプシン変異体が融合された持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液を陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーにかけるステップと、（ｂ）前記ＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液、又はステップ（ａ）で生成された溶出液を疎水性樹脂クロマトグラフィーにかけるステップと、（ｃ）前記持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液、ステップ（ａ）で生成された溶出液、又はステップ（ｂ）で生成された溶出液を抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィーにかけるステップとを含む。
【背景技術】
【０００３】
一般に、天然ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ，ｈＧＨ）とは、１９１個のアミノ酸から構成されており、約２１，５００ダルトンの分子量を有するホルモンである。ヒト成長ホルモンは、脳下垂体前葉から分泌され、体内で骨、軟骨などの成長を促進する。この成長ホルモンが欠乏すると、低身長症、心血管疾患のリスク増加、筋肉及び骨密度の減少などを誘発することがある。
【０００４】
成長ホルモン欠乏症を治療するために、１９５０年代後半からはヒトの脳下垂体に由来するか又は遺伝工学技術により生産された成長ホルモンが用いられるようになり、２００９年には、ヒト成長ホルモンは世界的に約３兆ウォンの市場規模となった。ただし、成長ホルモンにおいては、毎日皮下注射で投与しなければならない不便さがあるので、患者の利便性の向上が求められている。このような要求に応えるべく持続型ヒト成長ホルモンが開発されており、持続性を向上させる方法として、徐放性製剤、タンパク質又は糖の融合、糖鎖工学などが用いられている。例えば、徐放性製品としてジェネンテック社がニュートロピンデポ（ｎｕｔｒｏｐｉｎ  ｄｅｐｏｔ）を最初に発売し、韓国内ではＬＧ生命科学がディクラーゼを２００７年から発売している（特許文献１及び２）。しかし、徐放性治療剤は、人体に好ましくない免疫反応を引き起こし、大きな注射器を用いるので痛みを伴い、低い収率のため経済性に問題があった。特に、ニュートロピンデポは、第１世代製品と比べても有効性が低いため、市場から撤収された。
【０００５】
徐放性製剤以外にも、タンパク質の持続性を向上させる方法として、高分子の糖であるポリエチレングリコールとの融合（非特許文献１）、糖鎖工学（Ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，特許文献３）、他のタンパク質との融合（特許文献４）などの方法を用いて、体内の吸収、代謝、排泄を行わせることもある。しかし、前記方法は、低い収率により経済性に欠け、長期間にわたって使用すると免疫反応を引き起こし、結合過程で用いられる化学物質が毒性を有するなど、様々な理由により汎用的な半減期延長方法としては用いることができない。よって、このような欠点を最小限に抑えて持続性を増大させる方法を用いた持続型ヒト成長ホルモンの開発が求められており、特許文献５には、体内タンパク質であるα１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の変異体とヒト成長ホルモンの結合体形態の持続型ヒト成長ホルモンタンパク質を開発し、タンパク質のサイズ増加による半減期の延長を試みた内容が開示されている。それに加えて、α１−アンチトリプシンに少なくとも１つの遺伝子変異によりＮ糖鎖を付加して体内半減期の延長をさらに試みた（特許文献６）。
【０００６】
本発明者らにより用いられたα１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）変異体は、タンパク質分解酵素抑制剤としてのα１−アンチトリプシン固有の体内活性をなくして半減期を延長させるために、所定のアミノ酸を突然変異させたものである。タンパク質分解酵素としての固有の活性をなくしたα１−アンチトリプシンのタンパク質配列、製造方法などは特許文献７に開示されている。
【０００７】
持続型ヒト成長ホルモンは、このようなα１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の変異体をヒト成長ホルモンのＮ末端又はＣ末端に遺伝子組換えで融合したタンパク質であって、第１世代ヒト成長ホルモンに比べて体内半減期が改善された物質である。大多数の第１世代ヒト成長ホルモン医薬品が大腸菌から製造されるのに対して、持続型ヒト成長ホルモンはＣＨＯ細胞において発現してグリコシル化するように製造されている。
【０００８】
従来のα１−アンチトリプシンの精製は、ポリグリコールとｐＨで不純物のみ沈殿させる方法（特許文献８）、陽イオン交換樹脂（特許文献９及び１０）により行われていた。また、第１世代ヒト成長ホルモンは、一般に大腸菌から封入体の形態で過剰発現させ、その後リフォールディングしてそれを陰イオン交換樹脂で精製する方法により得られていた（特許文献１１及び非特許文献２）。
【０００９】
一方、持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨは、分子量約７０〜９０ｋＤａ、等電点約（ｐＩ）３．０〜６．０であるので、第１世代ヒト成長ホルモン又はα１−アンチトリプシンと分子量、等電点及び糖鎖パターンなどの物理化学的性質が異なる新規物質であり、第１世代ヒト成長ホルモン又はα１−アンチトリプシンと同一／類似した精製方法では高純度の持続型ヒト成長ホルモンを得ることができなかった。また、現在まで、論文や特許において持続型ヒト成長ホルモンの精製方法は開示されていない。
【００１０】
このような背景から、本発明者らは、従来の方法では高純度の精製が難しかった持続型ヒト成長ホルモンの効率的な精製方法を見出すために鋭意努力した結果、陰イオン交換樹脂、疎水性樹脂、抗体断片が付着した樹脂などを用いて高純度の持続型ヒト成長ホルモンを精製できることを見出した。
【００１１】
また、体内に存在するタンパク質は、タンパク質の種類によってグリコシル化の程度が半減期及び有効性に影響を及ぼす程度が異なる。その例として、汎用的に多く用いられるタンパク質医薬品であるエリスロポエチンとＧＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）が挙げられる。体内に存在するタンパク質であるエリスロポエチン（非特許文献３）は、シアル酸の含有量によって体内有効性が異なる。具体的には、エリスロポエチンはシアル酸含有量と体内有効性の相関関係が高く、適切な有効性を示すためには、特定の比率以上のシアル酸を含む高グリコシル化糖鎖が必ず必要である。それに対して、ＧＣＳＦは、糖鎖の有無によってｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験での有効性は２５％まで差が出るが、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性では差が出ないことが知られている（非特許文献４）。
【００１２】
よって、本発明者らは、免疫原性の可能性が低く、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で高い持続性及び薬理活性を示すヒト成長ホルモンを開発するために鋭意努力した結果、動物細胞から製造された前記タンパク質のうち、特定のｐＩを有するＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質のアイソフォームが優れた体内持続性及び成長効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−０２３６７７１号
【特許文献２】韓国登録特許第１０−０３２９３３６号
【特許文献３】米国特許第７２１７６８９号
【特許文献４】国際公開第９３／１５１９９号
【特許文献５】韓国登録特許第１０−１１８３２６２号
【特許文献６】韓国公開特許第１０−２０１３−００２９７１３号
【特許文献７】韓国公開特許第１０−２０１０−０１１６５５８号
【特許文献８】欧州特許第００９７２７４号
【特許文献９】欧州特許第９６９２９４３０号
【特許文献１０】欧州特許第９５１１２６３０号
【特許文献１１】韓国登録特許第１９９８−０００３７５２号
【特許文献１２】韓国特許出願第１０−２０１０−００３７４９６号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，Ｓａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７１，１３７−１３９，１９９１
【非特許文献２】Ｐａｔｒａ  ＡＫ，Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  Ｒ，Ｍｕｋｈｉｊａ  Ｒ，Ｋｒｉｓｈｎａｎ  Ａ，Ｇａｒｇ  ＬＣ，Ｐａｎｄａ  ＡＫ．（２０００）１８，１８２−１９２，２０００；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．
【非特許文献３】ＪＣ  Ｅｇｒｉｅ  ａｎｄ  ＪＫ  Ｂｒｏｗｎｅ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，８４，３−１０，２００１
【非特許文献４】Ｈ  Ｂｏｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２８，２５９−２６４，２００１
【非特許文献５】Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ  ２７５，４１９−４２５，１９９８
【非特許文献６】Ｓｔｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，３６５，２２２５−２２３６，２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、動物細胞から製造された、α１−アンチトリプシン変異体（ＮｅｘＰ）及びヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）が融合されたタンパク質であって、５．２以下の等電点を有する持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質を提供することを目的とする。
【００１６】
また、本発明は、（ａ）α１−アンチトリプシン変異体（ＮｅｘＰ）及びヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）が融合された持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質を含む生物学的乳液を抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィーにかけるステップと、（ｂ）等電点の差により等電点（ｐＩ）５．２以下の持続型成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質を分離するステップとを含む、持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【００１７】
さらに、本発明は、高純度の持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨの精製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の一実施態様は、動物細胞から製造された、α１−アンチトリプシン変異体（ＮｅｘＰ）及びヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）が融合されたタンパク質であって、５．２以下の等電点を有する持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、（ａ）ヒト成長ホルモン及びα１−アンチトリプシン変異体が融合された持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液を陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーにかけるステップと、（ｂ）前記ＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液、又はステップ（ａ）で生成された溶出液を疎水性樹脂クロマトグラフィーにかけるステップと、（ｃ）前記持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液、ステップ（ａ）で生成された溶出液、又はステップ（ｂ）で生成された溶出液を抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィーにかけるステップとを含む、持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨの精製方法を提供する。
【００２０】
本発明における用語「ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ，ｈＧＨ）」とは、ペプチドホルモンであって、ヒトの成長、細胞生産又は再生をもたらすホルモンを意味する。前記ヒト成長ホルモンは、体内で骨端軟骨板の細胞分化を刺激して成長を促進するタンパク質であればいかなるものも含まれる。前記ヒト成長ホルモンには、自然に生産された成長ホルモンと遺伝工学技術を用いて生産された成長ホルモンの両方が含まれ、遺伝工学技術を用いて生産された成長ホルモンであることが好ましいが、これに限定されるものではない。また、前記ヒト成長ホルモンに関する情報は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋなどの公知のデータベースから得ることができ、例えば、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ（受託番号）がＡＡＡ９８６１８であるヒト成長ホルモンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
ヒト成長ホルモンは、体内で骨端軟骨板の細胞分化を刺激することにより成長を促進することができるので、体内合成又は分泌に問題のある個体において治療用タンパク質として重要視されている。しかし、患者に対する投与の利便性及び治療効果の面から、従来の成長ホルモンに比べて半減期が延長された持続型ヒト成長ホルモンの開発が求められているので、本発明者らは、α１−アンチトリプシン変異体を開発し、それをヒト成長ホルモンに融合させ、次いで動物細胞において発現させることにより、高グリコシル化されたヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨを開発した。前記高グリコシル化されたヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨは、動物細胞から生産され、等電点（ｐＩ）５．２以下のタンパク質であり、等電点５．２を超えるものに比べてグリコシル化の程度が高いので、体内持続性や薬効が高い。
【００２２】
本発明における「持続型ヒト成長ホルモン」とは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びα１−アンチトリプシン変異体（ＮｅｘＰ）が融合された形態のタンパク質であり、本発明においては「ＮｅｘＰ−ｈＧＨ」と混用される。前記ＮｅｘＰは、本発明者らにより開発された、体内持続性を維持することにより体内半減期が延長された体内タンパク質であるα１−アンチトリプシン（ａｌｐｈａ  １−Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ，Ａ１ＡＴ）の変異体であり、本発明者らにより命名された用語である。タンパク質分解酵素抑制剤の活性をなくしたα１−アンチトリプシン変異体タンパク質の配列、製造方法などは特許文献５又は６に開示されており、特許文献５及び６の明細書全体は本発明の参考文献として含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
前記α１−アンチトリプシンは、約５０，０００Ｄａの分子量を有する、哺乳類の血液中に存在するタンパク質の１つであり、α１−プロテアーゼインヒビター（ａｌｐｈａ−１  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）とも呼ばれる。血液中から抽出したα１−アンチトリプシンは、ＦＤＡの許可を得てプロラスチン（Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ）という商品名で肺気腫治療剤として販売されている。プロラスチンは、通常６０ｍｇ／ｋｇの用量で１週間毎に静脈注射により人体に投与されるが、人体における安全性が立証されているタンパク質である。また、α１−アンチトリプシンのプロテアーゼインヒビターとしての役割や構造などは既によく知られている（非特許文献５）。また、前記α１−アンチトリプシンは、自然界に１００種以上の対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）が存在し、表現型は等電点電気泳動（ＩＥＦ、ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ）のタイプによってＡからＺに分けられる（非特許文献６）。そのうち最も多いＭ対立遺伝子が野生型であり、アミノ酸配列変異によりＭ１（Ｖａｌ２１３）、Ｍ２、Ｍ３のように多くの亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）に分けられる。よって、本発明に用いられるα１−アンチトリプシンは、自然界に存在する特定の亜型であり、他の亜型においても同じ効果を得ることができる。前記α１−アンチトリプシンタンパク質に関する情報は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋなどの公知のデータベースから得ることができ、例えば、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ（受託番号）がＡＡＨ１１９９１である野生型α１−アンチトリプシンタンパク質が挙げられるが、これに限定されるものではない。前記野生型α１−アンチトリプシンタンパク質の配列を配列番号１に示す。
【００２４】
このようなα１−アンチトリプシンは、特定部位の突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法を用いて、少なくとも１つのアミノ酸残基を変形させて固有の体内活性をなくすことにより、半減期を延長させることができる。前記アミノ酸残基の変形により、Ｎ−グリコシル化部位を生成してα１−アンチトリプシンのプロテアーゼインヒビターの活性を中和すると共に、体内注入時にアミノ酸置換による免疫原性の可能性を最小限に抑えることができ、遊離システイン残基による二重体形成などを排除することができる。ここで、少なくとも１つのアミノ酸の変異は、Ｐ２位置である配列番号１のα１−アンチトリプシンタンパク質の３５７番目のアミノ酸のプロリン（Ｐ）を変異させたことを特徴とし、より具体的には、これをアスパラギン（Ｎ）に変異させたことを特徴とする。また、α１−アンチトリプシン変異体は、配列番号１のα１−アンチトリプシンタンパク質の９番目のアミノ酸のグルタミン（Ｑ）のアスパラギンへの変異、２３２番目のアミノ酸のシステイン（Ｃ）のセリン（Ｓ）への変異、又は３５９番目のセリン（Ｓ）のスレオニン（Ｔ）への変異を含んでもよく、ここで、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸のプロリンがアスパラギンに変異し、前記変異の少なくとも１つをさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない。
【００２５】
前記持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨは、このようなα１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の変異体をヒト成長ホルモンのＮ末端又はＣ末端に遺伝子組換えで融合したタンパク質である。特に、前記持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨは、ヒト成長ホルモンのＮ末端に、９番目のアミノ酸のグルタミン及び３５７番目のアミノ酸のプロリンの両方がアスパラギンに変異したα１−アンチトリプシンタンパク質が融合されたタンパク質（ｈＧＨ−Ａ１ＡＴ（Ｑ９Ｎ，Ｐ３５７Ｎ））であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００２６】
本発明における用語「高グリコシル化された持続型ヒト成長ホルモン」とは、α１−アンチトリプシン変異体とヒト成長ホルモンとを含む形態のタンパク質であって、自然に見られる野生型タンパク質よりグリコシル化の程度が高く、等電点が５．２以下となるようにグリコシル化された持続型ヒト成長ホルモンを意味する。
【００２７】
本発明においては、前記持続型ヒト成長ホルモンのグリコシル化の程度が高くなるほど体内持続性が高くなることを確認し、とりわけ持続型ヒト成長ホルモンの等電点が５．２以下であるとｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で著しく高い体内持続性及び薬物活性を示すことを解明した。
【００２８】
前記高グリコシル化された持続型ヒト成長ホルモンは、等電点が５．２以下、好ましくは３．５〜５．２であるが、これらに限定されるものではない。
ここで、グリコシル化部位とは、糖鎖構造の付加などのグリコシル化が起こり得るポリペプチド内のアミノ酸残基又は部位を意味し、このような部位としてはＮ−グリコシル化部位、又はＯ−グリコシル化部位などが代表的である。保存的なＮ−グリコシル化部位としては、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒやＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒが挙げられ、ここでＸは任意のアミノ酸であるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
前記高グリコシル化された持続型ヒト成長ホルモンは、前記持続型ヒト成長ホルモンをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された動物細胞を培養することにより生産することができる。
【００３０】
本発明における「動物細胞」とは、本発明の持続型ヒト成長ホルモンを発現させることのできる細胞であって、グリコシル化をもたらす細胞であればその種類が特に限定されるものではなく、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞及び３Ｔ３細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
本発明の一実施例においては、９番目及び３５７番目のアミノ酸がどちらもアスパラギンに置換されたα１−アンチトリプシンが融合されたヒト成長ホルモンタンパク質を作製し、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターをＣＨＯ細胞に導入することにより安定細胞株を作製した（実施例１）。また、陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、及び抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィーを順に行うことにより、等電点の差によってＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質を得た結果、アイソフォーム１〜３のうちｐＩの低いアイソフォーム１がアイソフォーム２及び３に比べてグリコシル化の程度が高く、アイソフォーム３に比べてｐＩの低いアイソフォーム２がアイソフォーム３に比べてグリコシル化の程度が高いことが確認された（図１及び図２）。さらに、ヒト成長ホルモンの薬力学を確認した結果、グリコシル化の程度が高くなるほど本発明の持続型ヒト成長ホルモンの薬力学が良好になり、特に陽性対照群と対等又はより良好になった（図３）。さらに、アイソフォーム１及びアイソフォーム２は、陽性対照群に比べて試験動物の体長を著しく増加させることが確認された（図４）。すなわち、本発明の高グリコシル化された持続型ヒト成長ホルモンは、陽性対照群に比べて有効性が著しく高かった。
【００３２】
本発明の他の態様は、（ａ）α１−アンチトリプシン変異体（ＮｅｘＰ）及びヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）が融合された持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質を含む生物学的乳液を抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィーにかけるステップと、（ｂ）等電点の差により等電点（ｐＩ）５．２以下の持続型成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質を分離するステップとを含む、持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質の製造方法を提供する。
【００３３】
前記α１−アンチトリプシン変異体、ヒト成長ホルモン及び持続型ヒト成長ホルモンについては前述した通りである。
以下、前記製造方法の各ステップについて具体的に説明する。
【００３４】
前記ステップ（ａ）は、持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液を抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィーにかけるステップである。
【００３５】
前記ステップは、ＮｅｘＰと抗体断片の親和性によりＮｅｘＰ−ｈＧＨをカラムに付着させるためのステップである。
本発明における用語「持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液」とは、持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質を生産する細胞の培養上清、前記細胞の破砕物又はこれらを部分精製した形態を意味するが、これらに限定されるものではない。特に、前記生物学的乳液は、前記持続型ヒト成長ホルモンをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された動物細胞を培養することにより得られた培養上清又は前記細胞の破砕物であることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
本発明における「部分精製（ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、クロマトグラフィーなどの分画方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を少なくとも１つ行ったものの、目的とするｐＩ値を有するＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質以外の他のタンパク質も存在する状態を意味する。前記部分精製過程は、特にその種類が限定されるものではなく、例えば、疎水性クロマトグラフィー又は陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記部分精製は、疎水性クロマトグラフィー及び陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーからなる群から選択される少なくとも１つの方法を用いて精製することができ、持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質を生産する細胞の培養上清又は／及び前記細胞の破砕物を陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー又は疎水性樹脂クロマトグラフィーにかけて溶出液を生成させることが好ましく、順に陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー及び疎水性樹脂クロマトグラフィーにかけて溶出液を生成させることがより好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
前記ステップ（ｂ）は、ｐＩの差により等電点（ｐＩ）５．２以下の持続型成長ホルモンを分離するステップである。
前記抗体断片が付着した樹脂から分離するステップにおいて、持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨの糖鎖パターン及び等電点が異なる構造的な亜型（ｉｓｏｆｏｒｍ）は、ＭｇＣｌ２の濃度によって分離溶出することができる。
【００３８】
よって、前記ステップ（ｂ）は、等電点（ｐＩ）５．２以下の持続型成長ホルモンを分離溶出するために、０〜１０００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、好ましくは０〜３００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、より好ましくは０〜２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、さらに好ましくは２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むトリス緩衝液を用いることにより、等電点（ｐＩ）５．２以下の持続型成長ホルモンを分離溶出することができるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
分離溶出のためのトリス緩衝液において、ＭｇＣｌ２は選択的に添加してもよく、添加しなくてもよい。
本発明のさらに他の実施態様は、持続型ヒト成長ホルモンの製造方法を提供する。
【００４０】
本発明の具体的な実施例においては、ヒト成長ホルモン／α１−アンチトリプシン変異体が形質転換されたＣＨＯ細胞を培養し、培養液の上清を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で限外濾過システムによりダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）した。前記特許文献１２の明細書全体は本発明の参考文献として含まれる。
【００４１】
以下、製造方法について具体的に説明する。
ステップ（ａ）は、ヒト成長ホルモン及びα１−アンチトリプシン変異体が融合された持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液を陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーにかけるステップであり、平衡化した陰イオン交換樹脂に持続型ヒト成長ホルモンを含む培養液、又は前記培養液をｐＨ６〜９の０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有緩衝液でダイアフィルトレーションした培養液を加えて吸着させ、その後ｐＨ６〜９の０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有緩衝液で洗浄し、その後ｐＨ６〜９の１００〜１０００ｍＭ  ＮａＣｌ含有緩衝液で持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含有する分画を溶出するステップであることが好ましい。このような陰イオン交換樹脂を用いることにより、培養液中の染料、ＤＮＡ／ＲＮＡなどの核酸などを除去することができ、生物学的乳液中の持続型ヒト成長ホルモンを濃縮することができる。
【００４２】
本発明における用語「陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー」とは、陽性に荷電した支持体に陰性に荷電した（又は酸性）分子を結合させることにより、分子をこれらの電荷に応じて分離する技法であり、分子の同族体（酸性、塩基性及び中性）はこの技法により容易に分離することができる。本発明の陰イオン交換クロマトグラフィーに用いることのできる樹脂としては、強陰イオン交換樹脂と弱陰イオン交換樹脂を制限なく用いることができ、例えば、セファデックス、セファロース、ソース、モノ、ミニ（商品名，ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）などが挙げられ、これらに限定されるものではないが、前記樹脂の官能基がＱ（第四級アミン）、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）、ＱＡＥ（第４級アミノエチル）などである樹脂を用いることができる。前記樹脂の官能基がＱ又はＤＥＡＥであるものが好ましく、強陰イオン交換樹脂であるＱ−セファロースを用いることが最も好ましい。
【００４３】
陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーは、カラムクロマトグラフィーで行うこともでき、バッチモード（ｂａｔｃｈ  ｍｏｄｅ）で行うこともできる。商業的な製造においてはバッチモードを用いることが好ましい。陰イオン交換樹脂を洗浄し、段階的な塩勾配（ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｓａｌｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）又は連続的な塩勾配（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｓａｌｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）で溶出させる。段階的な塩勾配又は連続的な塩勾配は、不純物と持続型ヒト成長ホルモンを分離できるものであればいかなるものであってもよい。
【００４４】
また、本発明の陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーに用いられる陰イオン交換樹脂は、培養液を吸着させる前に水性緩衝液で平衡化してもよい。陰イオン交換樹脂に培養液を吸着させる前に、ｐＨ６〜９の０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有緩衝液で培養液を希釈するか、又は濃縮及び透析を行うと、精製収率を一層向上させることができる。これは、限外濾過法を用いたダイアフィルトレーションを行うことにより得ることができる。前記ダイアフィルトレーションは、培養液中の３０，０００分画分子量（ＭＷＣＯ、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ  ｏｆｆ）以下の低分子物質（例えば、界面活性剤、染料、低分子ペプチド、糖成分など）の除去及び陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー平衡緩衝液への緩衝液交換によりカラム吸着効率を向上させることができる。
【００４５】
一方、限外濾過法は、液体中に溶解又は分散した物質を粒径により分画する方法であり、通常は分子量が数千〜数十万程度の分子又はコロイド粒子を対象に分離、濃縮、精製することができる。限外濾過膜の性能は分画分子量（ＭＷＣＯ）で表わすが、その膜の分画分子量以上の物質は排除されることになる。通常、ＭＷＣＯは、９０％以上排除できる球状タンパク質の分子量で表わす。このような限外濾過膜の主な機能は、ダイアフィルトレーション、精製及び濃縮である。
【００４６】
前記各洗浄及び溶出ステップで用いる緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、又はトリス緩衝液であることが好ましい。
本発明の具体的な実施例においては、ＣＨＯ細胞から持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを発現させて得た培養液を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で限外濾過システムによりダイアフィルトレーションし、その後前記試料を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱ−セファロース樹脂が充填されたＸＫ−５０カラムに２０ｍｌ／ｍｉｎの流速で負荷して結合させ、その後３カラム容量の１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で２０ｍｌ／ｍｉｎの流速にて不純タンパク質を除去する洗浄を行い、その後２００ｍＭ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で２０ｍｌ／ｍｉｎの流速、３カラム容量の溶出溶媒により持続型ヒト成長ホルモンを溶出した。その結果、純度は約８５％であった（図５）。
【００４７】
ステップ（ｂ）は、前記持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む培養液、又はステップ（ａ）で生成された溶出液を疎水性樹脂クロマトグラフィーにかけるステップであり、平衡化した疎水性樹脂に前記陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーステップで回収された溶液を加えて吸着させ、その後ｐＨ６〜８の１〜３Ｍ  ＮａＣｌ含有緩衝液で洗浄し、その後ｐＨ６〜８の０〜１Ｍ  ＮａＣｌ含有緩衝液で持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含有する分画を溶出するステップであることが好ましい。疎水性樹脂は、陰イオン交換樹脂で精製できない細胞由来不純物をさらに除去することができる。これらの結果は、図５の陰イオン交換樹脂の純度が約８０％であり、図６の疎水性樹脂の純度が約９０％以上であることを比較しても分かる。
【００４８】
このように、ステップ（ａ）の後にステップ（ｂ）を行うことを構成的特徴とする本発明における精製方法が従来の精製方法と異なる理由は次の通りである。（１）陰イオン交換樹脂（約１０〜２０ｍｇ  ＮｅｘＰ−ｈＧＨ／ｒｅｓｉｎ  １ｍｌ）はＮｅｘＰ−ｈＧＨに対する結合容量（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）において疎水性樹脂（約６ｍｇ  ＮｅｘＰ−ｈＧＨ／ｒｅｓｉｎ  １ｍｌ）より優れるので、培養液中のＮｅｘＰ−ｈＧＨキャプチャ（ｃａｐｔｕｒｅ）を目的とする１次カラムには陰イオン交換樹脂が適することを見出し、（２）工程の効率性においても、陰イオン交換樹脂工程の後に陰イオン交換樹脂溶出液に対する濃透析を行うことなく疎水性樹脂工程を直ちに行うことができるというカラムの特性を見出し、それらから導かれたクロマトグラフィーの組み合わせであるという特徴がある。もし、疎水性樹脂を用いるステップであるステップ（ｂ）を先に行うと、疎水性樹脂溶出液が陰イオン交換樹脂平衡緩衝液で濃透析された後に陰イオン交換樹脂工程を行わなければならないなど、濃透析過程が追加されるという欠点がある。また、（３）培養液由来染料及びＤＮＡの除去に陰イオン交換樹脂が効果的であるので、それを１次カラムに用いる本発明の方法が従来の精製方法より優れた結果をもたらすことができる。
【００４９】
本発明における用語「疎水性樹脂クロマトグラフィー」とは、市販されている各種マトリクスに結合した疎水性、好ましくは芳香族又は脂肪族の電荷を帯びていないリガンドを有するゲルで行われる任意のクロマトグラフィーであり、前記ゲルとして用いることのできる樹脂は、高い解像度を維持するために比較的小さなビーズサイズ（ｂｅａｄ  ｓｉｚｅ）を有することが好ましい。例えば、ソース（Ｓｏｕｒｃｅ，ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、リソース（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）などの樹脂を用いることができるが、これらに限定されるものではない。リガンドとして作用する前記樹脂の官能基としては、フェニル、オクチル、イソプロピル、ブチル、エチル基などが好ましい。フェニル樹脂であることが好ましい。
【００５０】
本発明の疎水性クロマトグラフィーに用いることのできる溶出液の種類は限定されないが、ｐＨ６〜８の０〜１Ｍ  ＮａＣｌ含有緩衝液を溶出液として用いることが好ましい。
本発明において、陰イオン交換樹脂溶出液を疎水性樹脂に吸着させる前に、ｐＨ６〜８の３〜４Ｍ  ＮａＣｌ含有緩衝液で希釈するか、又はｐＨ６〜８の１〜３Ｍ  ＮａＣｌ含有緩衝液で濃縮及び透析を行って陰イオン交換樹脂溶出液中のＮａＣｌ濃度を２Ｍ以上に高めると、精製収率を向上させることができる。
【００５１】
前記各洗浄及び溶出ステップで用いる緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、又はトリス緩衝液であることが好ましい。
また、前記緩衝液を用いて陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー溶出液を疎水性樹脂クロマトグラフィーカラムに負荷し、その後クロマトグラフィー樹脂に結合された持続型ヒト成長ホルモンを前記緩衝液により直線濃度勾配で溶出することが好ましい。
【００５２】
本発明の具体的な一実施例においては、Ｑ−セファロースカラム溶出液に４Ｍ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して２．５Ｍ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）となるようにしてフェニル−セファロースローディング液を準備し、その後２．５Ｍ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニル−セファロースが充填されたＸＫ−５０カラムに前記ローディング液を２０ｍｌ／ｍｉｎの流速で流し、その後３カラム容量の２．５Ｍ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を流して洗浄し、その後４カラム容量の０．５Ｍ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を流して持続型ヒト成長ホルモンを溶出した。その結果、純度は約９６％であった（図６）。
【００５３】
ステップ（ｃ）は、前記持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液、ステップ（ａ）で生成された溶出液、又はステップ（ｂ）で生成された溶出液を抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィーにかけるステップであり、平衡化した抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂に持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含有する培養液、前記ステップ（ａ）の溶出液、又は前記ステップ（ｂ）の溶出液を加えて吸着させ、その後ｐＨ６．５〜８．５の０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌ含有トリス緩衝液で洗浄し、その後ｐＨ６．５〜８．５の０〜１Ｍ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液で持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含有する分画を溶出するステップであることが好ましい。
【００５４】
高純度及び高収率の精製が行える本発明の精製方法は、このように抗体断片が付着した樹脂工程を行うステップ（ｃ）を最後のステップとして行うことに特徴がある。ステップ（ｃ）を最初の工程として用いて、ダイアフィルトレーションされた培養液中に残存する洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、染料、その他不純物などが多量に含まれる培養液を直接ローディングしたとしても、純度９０％以上の持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを得ることができるが、結合容量や収率が低下するという欠点を本発明者らが初めて解明した。
【００５５】
最初の工程として、洗浄剤、染料、その他不純物などが存在したとしても、持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨに対する結合容量が高い（１０ｍｇ／ｍｌ以上）ステップ（ａ）を行うことにより不純物を一部除去し、その後ステップ（ｂ）及び（ｃ）を順に行うことが、９８％以上の純度及び２５％以上の収率を実現する精製工程であることを見出し、本発明の完成に至った。
【００５６】
前記陰イオン交換樹脂及び疎水性樹脂工程で９０〜９５％の純度の持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを得ることができ、９９％以上の高純度の持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを得るために、抗体断片が付着した樹脂を追加してもよい。また、抗体断片が付着した樹脂のみを用いて培養液を精製すると、収率は前記工程に比べて約２０％低下するが、約９０〜９５％の純度の持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨが得られることが確認された。
【００５７】
前記疎水性樹脂から得られた持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含有する溶出液をｐＨ７〜９の０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有トリス緩衝液で濃縮及び透析するか、又は溶液中のＮａＣｌ濃度が２００ｍＭ以下となるように希釈することが好ましい。濃縮及び透析した溶液、又は希釈した溶液を抗体断片が付着した樹脂、具体的には抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂に加えて吸着させ、ｐＨ６．５〜８．５の０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌ含有トリス緩衝液で洗浄し、その後ｐＨ６．５〜８．５の０〜１Ｍ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液で持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含有する分画を溶出する。
【００５８】
前記各洗浄及び溶出ステップで用いる緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、又はトリス緩衝液であることが好ましい。
本発明の具体的な一実施例においては、前記ステップ（ｂ）で得られた持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む溶液を１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で限外濾過システムによりダイアフィルトレーションした。抗α１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）抗体断片が付着した樹脂（以下、「ＡＩＡＴ」ともいう）をＸＫ−５０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に充填し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）を十分に流してカラムを平衡化し、その後前記ダイアフィルトレーション液を２０ｍｌ／ｍｉｎの流速で前記カラムに流し、その後再び約３カラム容量の１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）を流してカラムを洗浄した。次いで、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）でカラムを洗浄し、その後１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）を順に流して持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む分画を溶出した。持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含有する溶出液は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４５）緩衝液で限外濾過システム（分子量カットオフ３０，０００）によりダイアフィルトレーションした。回収した溶出液の純度を確認した結果、約９９％であった（図７）。
【００５９】
前記方法は、（ｄ）抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィー精製ステップに、０〜１０００ｍＭ  ＭｇＣｌ２で持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨの糖鎖パターン及び等電点が異なる構造的な亜型（ｉｓｏｆｏｒｍ）を分離溶出するステップをさらに含むことが好ましい。このようなステップ（ｄ）は、ＭｇＣｌ２ではなく、ＮａＣｌを用いることができ、ここで、ＭｇＣｌ２の代わりに０〜２０００ｍＭ  ＮａＣｌで持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨの糖鎖パターン及び等電点が異なる構造的な亜型を分離溶出するステップであることが好ましい。
【００６０】
前記抗体断片が付着した樹脂から分離ステップにおいて、持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨの糖鎖パターン及び等電点が異なる構造的な亜型は、ＭｇＣｌ２の濃度によって分離溶出することができる。例えば、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２緩衝液は、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２緩衝液より、糖鎖が多く、等電点が低い構造的な亜型を選択的に溶出することができる（図８）。
【００６１】
抗体断片が付着した樹脂から得られた溶出液であって、持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含有する溶出液は、さらなる緩衝液交換工程を行ってもよい。緩衝液交換工程は、ゲル濾過や、濃縮及びダイアフィルトレーションなどにより行うことができる。
【００６２】
本発明のさらに他の実施態様は、前記方法で製造された持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質を提供する。
前記方法及び持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質については前述した通りである。
【発明の効果】
【００６３】
本発明の高グリコシル化持続型ヒト成長ホルモン及びその製造方法は、従来のヒト成長ホルモンに比べてグリコシル化が著しく増加し、市販されているディクラーゼなどのヒト成長ホルモンに比べて持続性に著しく優れるだけでなく、その薬効も優れるので、ヒト成長ホルモンが必要な分野に有用である。
【００６４】
また、本発明の方法は、陰イオン交換樹脂、疎水性樹脂、抗体断片が付着した樹脂を用いて、細胞培養液から９９％以上の高純度の組換え持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを得ることができる。本発明が提供する高純度の精製方法は、生産工程に適用すると、大量に高純度の持続型ヒト成長ホルモンを精製することができるので、タンパク質治療剤の製造に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ｐＩの差による持続型ヒト成長ホルモンの分画を示す図である。
【図２】ｐＩの差による持続型ヒト成長ホルモンの分画を示す図である。
【図３】本発明の高グリコシル化持続型ヒト成長ホルモンアイソフォーム１〜３の体重に及ぼす影響を確認した図である。
【図４】本発明の高グリコシル化持続型ヒト成長ホルモンアイソフォーム１〜３における体長を測定した結果を示す図である。
【図５】陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いて分離した持続型ヒト成長ホルモンの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣ４  ＨＰＬＣ分析クロマトグラフィーで測定した結果を示す図である。
【図６】疎水性樹脂クロマトグラフィーを用いて分離した持続型ヒト成長ホルモンの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣ４  ＨＰＬＣ分析クロマトグラフィーで測定した結果を示す図である。
【図７】抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィーを用いて分離した持続型ヒト成長ホルモンの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣ４  ＨＰＬＣ分析クロマトグラフィーで測定した結果を示す図である。
【図８】ＭｇＣｌ２濃度によって分離溶出した持続型ヒト成長ホルモンの糖鎖パターン及び等電点の差を示す図である。左図のレーン１は疎水性樹脂溶出液であり、レーン２は１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２／トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨであり、レーン３は２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２／トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨであり、レーン４は３００ｍＭ  ＭｇＣｌ２／トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨである。右図のレーン１は５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２／トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨであり、レーン２は１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２／トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨであり、レーン３は２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２／トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨであり、レーン４は３００ｍＭ  ＭｇＣｌ２／トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨである。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。当該分野における通常の知識を有する者であれば、与えられた状況に応じて通常用いられるベクターや培養条件などを適宜選択することができる。
【実施例】
【００６７】
実施例１：ヒト成長ホルモン／α１−アンチトリプシン融合体の作製及び融合体発現細胞株の作製
ｐＳＧＨＶ０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ２８５１８３）からｓｈＧＨ、Ｈｉｓ  ｔａｇ、ＴＥＶ  ｓｉｔｅを除去した改良ベクターｐＡＶ１を用いてヒト成長ホルモン／α１−アンチトリプシン融合体をクローニングし、タンパク質固有のシグナル配列を用いて細胞外に分泌されるようにした。
【００６８】
また、前記融合体を持続的に発現する細胞株（ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）の構築のための選択マーカーとしてＤＨＦＲシステムを導入し、このためにＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ遺伝子をｐＡＶ１ベクターに挿入した。発現量増加のために、シグナル配列にコザック配列をさらに挿入した。標的タンパク質であるｈＧＨ−Ａ１ＡＴ（Ｑ９Ｎ，Ｐ３５７Ｎ）は、Ａ１ＡＴのＮ末端にｈＧＨを融合する方法で導入した。
【００６９】
次に、このように作製されたクローンをＣＨＯ  ＤＧ４４細胞株に遺伝子導入し、メトトレキサート（ＭＴＸ）を５０ｎＭから２倍ずつ増やして４μＭまで用いて選別を行うことにより、安定細胞株を確保した。
【００７０】
ただし、当該分野における通常の知識を有する者であれば、与えられた状況に応じて通常用いられるベクター及び細胞株を適宜選択して適用することができる。
実験例１：持続型ヒト成長ホルモン／α１−アンチトリプシン融合体発現細胞株の培養及び融合体の生産
前述したように得られた細胞株から高グリコシル化された成長ホルモン／α１−アンチトリプシン融合体を高収率で得るために、本発明の持続型成長ホルモンである成長ホルモン／α１−アンチトリプシン融合体を通常の細胞培養条件で発現させた。ただし、当該分野における通常の知識を有する者であれば、与えられた状況に応じて通常用いられる培養条件などを適宜選択して適用することができる。
【００７１】
実験例２：ヒト成長ホルモン／α１−アンチトリプシン融合体の各ｐＩの分画
上記実施例で得られた発現細胞株を懸濁培養して得られた細胞培養液に分泌された本発明の新規な持続型成長ホルモンを精製した。
【００７２】
具体的には、培養液を濾過して細胞を除去し、その後上清のみを採取し、平衡緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ８．０）で限外濾過システム（分子量カットオフ３０，０００）によりダイアフィルトレーションした。次に、これをＱ−セファロース（Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社，米国）カラムに注入し、平衡緩衝液と５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で不純タンパク質を除去し、次いで１９０ｍＭ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を流し、持続型成長ホルモンを含む溶液を回収した。
【００７３】
Ｑ−セファロースカラム溶出液に４Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を添加して約２．５Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）とすることにより、フェニル−セファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社，米国）ローディング液を準備した。次に、これをフェニル−セファロースカラムにローディングし、２．５Ｍ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でカラムを洗浄した。次に、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で持続型ヒト成長ホルモンを含む溶液を回収した。
【００７４】
フェニルセファロースカラム溶出液を１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で限外濾過システム（分子量カットオフ３０，０００）によりダイアフィルトレーションした。次に、これを抗α１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）抗体断片が付着した樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社，以下「Ａ１ＡＴ」ともいう）にローディングしてカラムに結合させ、その後５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。その後、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）を順に流し、ｐＩの差による本発明の持続型成長ホルモンを分画して溶出した。
【００７５】
ここで、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２／トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した本発明の持続型成長ホルモンをアイソフォーム１といい、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２／トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した本発明の持続型成長ホルモンをアイソフォーム２といい、３００ｍＭ  ＭｇＣｌ２／トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した本発明の持続型成長ホルモンをアイソフォーム３という（図１及び図２）。
【００７６】
前記方法以外にも、当該分野における通常の知識を有する者であれば、等電点によってタンパク質を分離する通常の方法を適宜選択して適用することができる。
実験例３：ヒト成長ホルモン／α１−アンチトリプシン融合体の薬力学実験
本発明による持続型成長ホルモン分画の薬力学を確認するために、次の実験を行った。
【００７７】
脳下垂体除去ラットに前記アイソフォーム１〜３を０．６ｍｇ／ｋｇの濃度で皮下（Ｓ．Ｃ．）投与して１４日目まで体重の変化及び体長を測定した。その結果をそれぞれ図３及び図４に示す。
【００７８】
その結果、図３に示すように、陰性対照群であるＰＢＳ投与群では体重変化がなかったが、アイソフォーム１〜３及び陽性対照群であるユートロピン（Ｅｕｔｒｏｐｉｎ）及びディクラーゼ（Ｄｅｃｌａｇｅ）投与群では著しい体重増加が見られた。特に、アイソフォーム１及び２は陽性対照群より体重増加率が１０日目の時点で大きく、アイソフォーム３は陽性対照群よりやや低調な増加率であった。
【００７９】
また、体長を測定した結果、アイソフォーム１及び２は陽性対照群であるディクラーゼより体長の増加率が大きかったが、アイソフォーム３はやや小さかった（図４）。
これらの結果は、同種の持続型成長ホルモンであっても、グリコシル化の程度により効能の程度に差異があることを示すものであり、特に本発明の方法で製造された、５．２以下のｐＩを有するＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質が高グリコシル化タンパク質であり、体内持続性及び高い成長効果を有することを示唆するものである。
【００８０】
実施例２：持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨの陰イオン交換樹脂及び疎水性樹脂クロマトグラフィーを用いた精製方法
形質転換されたＣＨＯ細胞から実施例１で作製した持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨを発現させて得た約２ｌの培養液を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で限外濾過システム（分子量カットオフ３０，０００）によりダイアフィルトレーションした。
【００８１】
約２５０ｍｌのＱ−セファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）樹脂をＸＫ−５０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に充填し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を十分に流してカラムを平衡化した。準備したＱ−セファロールカラムに約１ｌの前記ダイアフィルトレーション液を２０ｍｌ／ｍｉｎの流速で流し、その後再び約３ＣＶ（カラム体積）の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を流してカラムを洗浄した。
【００８２】
約３ＣＶの１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を２０ｍｌ／ｍｉｎの流速で流して不純タンパク質を除去し、その後約３ＣＶの２００ｍＭ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を２０ｍｌ／ｍｉｎの流速で流して持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む溶液を回収した。
【００８３】
回収した溶出液の純度をＣ４  ＨＰＬＣ分析クロマトグラフィーで測定した結果を図５に示す。その結果、持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨの純度が約８５％であることが確認された。
【００８４】
Ｑ−セファロールカラム溶出液に４Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して約２．５Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）とすることにより、フェニル−セファロース（Ｐｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ローディング液を準備した。
【００８５】
約２５０ｍｌのフェニル−セファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）樹脂をＸＫ−５０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に充填し、２．５Ｍ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を十分に流してカラムを平衡化した。準備したフェニル−セファロースカラムに約１．２ｌの前記フェニル−セファロースローディング液を２０ｍｌ／ｍｉｎの流速で流し、その後再び約３ＣＶの２．５Ｍ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を流してカラムを洗浄した。
【００８６】
約４ＣＶの０．５Ｍ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を２０ｍｌ／ｍｉｎの流速で流して持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む溶液を回収した。
【００８７】
回収した溶出液の純度をＣ４  ＨＰＬＣ分析クロマトグラフィーで測定した結果を図６に示す。持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨの純度が約９６％であることが確認された。
【００８８】
実施例３：抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂の精製方法
実施例２で得られた持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む約１ｌの溶液を１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で限外濾過システム（分子量カットオフ３０，０００）によりダイアフィルトレーションした。
【００８９】
約２５０ｍｌの抗α１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）抗体断片が付着した樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社，以下「ＡＩＡＴ」ともいう）をＸＫ−５０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に充填し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）を十分に流してカラムを平衡化した。
【００９０】
準備したＡ１ＡＴカラムに約１ｌのダイアフィルトレーション液を２０ｍｌ／ｍｉｎの流速で流し、その後再び約３ＣＶの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）を流してカラムを洗浄した。その後、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）でカラムを洗浄し、その後１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）を順に流して持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む分画を溶出した。
【００９１】
持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨを含有する溶出液は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４５）緩衝液で限外濾過システム（分子量カットオフ３０，０００）によりダイアフィルトレーションした。
【００９２】
回収した溶出液の純度をＣ４  ＨＰＬＣ分析クロマトグラフィーで測定した結果を図７に示す。持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨの純度が約９９％であることが確認された。
【００９３】
実施例４：持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨの糖鎖パターン及び等電点による分離
実施例３において、持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨの糖鎖パターン及び等電点が異なる構造的な亜型（ｉｓｏｆｏｒｍ）は、ＭｇＣｌ２濃度によって分離溶出することができる。１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で分離溶出した持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨの糖鎖パターン及び等電点の差を図８に示す。
【００９４】
これらの結果は、本発明の陰イオン交換樹脂、疎水性樹脂、抗体断片が付着した樹脂が充填されたカラムを順に用いると、本発明の持続型ヒト成長ホルモンを９９％以上の高純度で分離精製できることを裏付けるものであり、グリコシル化の程度の差によって所望のグリコシル化された持続型ヒト成長ホルモンを分離精製できることを示唆するものである。
【００９５】
以上の説明から、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年1月16日(2015.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞から製造された、α１−アンチトリプシン変異体（ＮｅｘＰ）及びヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）が融合されたタンパク質であって、５．２以下の等電点（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｏｉｎｔ，ｐＩ）を有する持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質。
【請求項２】
前記α１−アンチトリプシン変異体（ＮｅｘＰ）は、野生型α１−アンチトリプシンタンパク質の９番目のグルタミンのアスパラギンへの変異、２３２番目のアミノ酸のシステインのセリンへの変異、３５７番目のアミノ酸のプロリンのアスパラギンへの変異、及び３５９番目のアミノ酸のセリンのスレオニンへの変異からなる群から選択される少なくとも１種の変異を含む、請求項１に記載の持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質。
【請求項３】
（ａ）α１−アンチトリプシン変異体（ＮｅｘＰ）及びヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）が融合された持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質を含む生物学的乳液を抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィーにかけるステップと、
（ｂ）等電点の差により等電点（ｐＩ）５．２以下の持続型成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質を分離するステップとを含む、持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質の製造方法。
【請求項４】
前記ステップ（ｂ）は、０〜１０００ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液で溶出させるステップを含む、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記トリス緩衝液は２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記ステップ（ａ）は、
（ｉ）持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質を含む試料を陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー又は疎水性樹脂クロマトグラフィーにかけて生成された溶出液を、抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィーにかけるステップ、又は、
（ｉｉ）持続型ヒト成長ホルモンＮｅｘＰ−ｈＧＨタンパク質を含む試料を順に陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー及び疎水性樹脂クロマトグラフィーにかけて生成された溶出液を、抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィーにかけるステップ
である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項７】
（ａ）ヒト成長ホルモン及びα１−アンチトリプシン変異体が融合された持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液を陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーにかけるステップと、
（ｂ）前記ＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液、又はステップ（ａ）で生成された溶出液を疎水性樹脂クロマトグラフィーにかけるステップと、
（ｃ）前記持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含む生物学的乳液、ステップ（ａ）で生成された溶出液、又はステップ（ｂ）で生成された溶出液を抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィーにかけるステップとを含む、持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨの精製方法。
【請求項８】
前記ステップ（ａ）は、平衡化した陰イオン交換樹脂に持続型ヒト成長ホルモンを含む培養液、又は前記培養液をｐＨ６〜９の０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有緩衝液でダイアフィルトレーションした培養液を加えて吸着させ、その後ｐＨ６〜９の０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有緩衝液で洗浄し、その後ｐＨ６〜９の１００〜１０００ｍＭ  ＮａＣｌ含有緩衝液で持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含有する分画を溶出するステップである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ（ｂ）は、平衡化した疎水性樹脂に持続型ヒト成長ホルモンを含む培養液、又は前記陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーステップで回収された溶液を加えて吸着させ、その後ｐＨ６〜８の１〜３Ｍ  ＮａＣｌ含有緩衝液で洗浄し、その後ｐＨ６〜８の０〜１Ｍ  ＮａＣｌ含有緩衝液で持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含有する分画を溶出するステップである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｃ）は、平衡化した抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂に持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含有する培養液、或いは、前記ステップ（ａ）の溶出液、又は前記ステップ（ｂ）の溶出液を加えて吸着させ、その後ｐＨ６．５〜８．５の０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌ含有トリス緩衝液で洗浄し、その後ｐＨ６．５〜８．５の０〜１Ｍ  ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液で持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨを含有する分画を溶出するステップである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
（ｄ）抗α１−アンチトリプシン抗体断片が付着した樹脂で充填されたアフィニティークロマトグラフィー精製ステップに、０〜１０００ｍＭ  ＭｇＣｌ２で持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨの糖鎖パターン及び等電点が異なる構造的な亜型（ｉｓｏｆｏｒｍ）を分離溶出するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭｇＣｌ２の代わりに０〜２０００ｍＭ  ＮａＣｌで持続型ヒト成長ホルモンであるＮｅｘＰ−ｈＧＨの糖鎖パターン及び等電点が異なる構造的な亜型を分離溶出するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）前記陰イオン交換樹脂の官能基は、Ｑ（第四級アミン）、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）、及びＱＡＥ（第４級アミノエチル）からなる群から選択されるいずれか、又は、
（ｉｉ）疎水性樹脂クロマトグラフィーの官能基は、フェニル、オクチル、イソプロピル、ブチル、及びエチルからなる群から選択されるいずれか
である、請求項７に記載の方法。
【国際調査報告】
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