(57)【要約】  本発明は、腸球菌細胞壁高分子並びに細菌感染の予防及び療法におけるその使用に関する。  下記β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−リビトール構造：    【化１】2015511610.tif 000009（式中、Ｒ１はβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ又はα−Ｌ−Ｒｈａｐから選択され、Ｒ２はＨ又はα−Ｄ−Ｇｌｃｐから選択される）、並びにその誘導体及びその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される腸球菌細胞壁成分。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−リビトール構造：
【化１】
2015511610.tif 000008
（式中、Ｒ１はβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ又はα−Ｌ−Ｒｈａｐから選択され、
Ｒ２はＨ又はα−Ｄ−Ｇｌｃｐから選択される）、
並びにその誘導体及びその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される腸球菌細胞壁成分。
【請求項２】
請求項１に記載の腸球菌細胞壁成分を特異的に認識する抗体、又はモノクローナル抗体又はその抗原断片。
【請求項３】
少なくとも１つの請求項１に記載の腸球菌細胞壁成分及び／又は少なくとも１つの請求項２に記載の抗体を、薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤とともに含む医薬組成物。
【請求項４】
式Ｉによる細胞壁成分を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ワクチンとして配合される、請求項３又は４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記式Ｉによる細胞壁成分が複合糖質ワクチン中に存在する、請求項３〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
疾患の治療に使用される、請求項１に記載の腸球菌細胞壁成分、請求項２に記載の抗体又は請求項３〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の腸球菌細胞壁成分を作製する方法であって、該腸球菌細胞壁成分を細菌画分から単離することを含むか、又は該腸球菌細胞壁成分からなる抗原を少なくとも部分的に化学合成によって合成することを含む、方法。
【請求項９】
請求項２に記載の抗体を作製する方法であって、哺乳動物、又はウサギを請求項１に記載の腸球菌細胞壁成分、又は請求項３〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は請求項５又は６に記載のワクチンで免疫化することを含む、方法。
【請求項１０】
請求項２に記載の抗体を作製する方法であって、該抗体をモノクローナル抗体として産生するハイブリドーマ細胞を生成することを含むか、又は前記抗体を宿主細胞において組換え産生することを含む、方法。
【請求項１１】
院内感染菌血症、心内膜炎、尿路感染、手術創感染及び異物感染で代表される細菌感染、又は腸球菌感染の治療への請求項１に記載の腸球菌細胞壁成分、請求項２に記載の抗体、又は請求項３〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１２】
脊椎動物における少なくとも１つの腸球菌株に対する免疫応答を誘導する方法であって、前記脊椎動物に免疫学的に有効な量の請求項１に記載の腸球菌細胞壁成分、請求項２に記載の抗体又は請求項３〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１３】
脊椎動物における細菌感染を治療又は予防する方法であって、該脊椎動物に治療的に有効な量の請求項１に記載の腸球菌細胞壁成分、請求項２に記載の抗体又は請求項３〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１４】
前記細菌感染が院内感染菌血症感染、心内膜炎、尿路感染、手術創感染及び異物感染等の腸球菌感染であり、ＶＲＥ株、又はエンテロコッカス・フェカリスで代表される抗生物質耐性腸球菌に起因する、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸球菌細胞壁高分子並びに細菌感染の予防及び療法におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）は重要な院内病原菌であり、重症患者においてよく見られる感染原因である（非特許文献１）。原因となる悪性腫瘍、好中球減少症、腫瘍に対する化学療法及び免疫抑制薬治療は、腸球菌による侵襲的感染のよく特徴付けられた危険因子であり（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）、この患者集団における侵襲的腸球菌感染の臨床転帰は悪いことが多い（非特許文献５）。腸球菌感染に対する高リスク群の感受性の増大に寄与し得る危険因子としては、胃腸管の高密度コロニー形成（非特許文献６）、胃腸粘膜関門の損傷、中心静脈カテーテル等の留置器具及び免疫調節異常（非特許文献４）が挙げられる。
【０００３】
補体系は侵襲的感染に対する防御の重要な最前線であり、適応免疫不全の免疫不全宿主において重大な役割を果たす。補体系はヒト血清中、細胞表面上及び組織液中で検出可能な３０種を超えるタンパク質を含む。古典的経路、代替的経路及びレクチン経路は全て、補体系の主要なエフェクター分子であるＣ３ｂを形成するＣ３の切断に収束する。好中球の補体受容体３は細菌エンベロープ上に沈着した（deposited：堆積した）Ｃ３ｂに結合し、取り込んだ細菌の食作用及び死滅をもたらす。Ｃ３欠損マウスの研究から、Ｃ３が感染器官からの腸球菌のオプソニン食作用（opsonophagocytosis）及び排除にも不可欠であることが実証されている（非特許文献７）。加えて、多数の疫学研究から、最もよく記載されているレクチン経路の因子であるマンノース結合レクチンの欠乏が新生児、好中球減少症患者及び同種幹細胞又は固形臓器移植後の患者の重症感染及び菌血症の素因となることが示されている（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）。
【０００４】
進化の過程で、グラム陽性細菌は補体系による認識及び標的化を逃れるための多数の戦略を発達させた。補体因子の結合を回避する病原体の柔軟性は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）で目覚ましく示されている（非特許文献１２）。対照的に、エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）と補体系との相互作用についてはほとんど知られていない。
【０００５】
非特許文献１３及び非特許文献１４は、β−Ｄ−ＧａｌｐＮａｃ−リビトール構造からなる基を含む化合物を記載している。しかしながら、Ｒ１がβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ又はα−Ｌ−Ｒｈａｐから選択され、Ｒ２がβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ又はＨから選択される構造は開示されていない。
【０００６】
特許文献１は、腸球菌細胞壁成分並びに細菌感染の予防及び療法におけるその使用について記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０８８８４３号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Vincent JL, et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 2009 Dec 2; 302(21): 2323-9
【非特許文献２】Ghanem G, et al. Outcomes for and risk factors associated with vancomycin-resistant Enterococcus faecalis and vancomycin-resistant Enterococcus faecium bacteremia in cancer patients. Infect Control Hosp Epidemiol. 2007 Sep;28(9): 1054-9
【非特許文献３】DiazGranados CA, Jernigan JA. Impact of vancomycin resistance on mortality among patients with neutropenia and enterococcal bloodstream infection. J Infect Dis. 2005 Feb 15;191(4):588-95
【非特許文献４】Peel T, et al. Differing risk factors for vancomycin-resistant and vancomycin-sensitive enterococcal bacteraemia. Clin Microbiol Infect. 2012 Apr;18(4):388-94. Epub 2011 Aug 16
【非特許文献５】Theilacker C, Jonas D, Huebner J, Bertz H, Kern W. Outcomes of Invasive Infection due to Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium during a Recent Outbreak. Infection. 2009 Dec;37(6):540-3
【非特許文献６】Ubeda C, et al. Vancomycin-resistant Enterococcus domination of intestinal microbiota is enabled by antibiotic treatment in mice and precedes bloodstream invasion in humans. J Clin Invest. 2010 Dec 1; 120(12): 4332-41
【非特許文献７】Leendertse M, et al. The complement system facilitates clearance of Enterococcus faecium during murine peritonitis. J Infect Dis. 2010 Feb 15; 201(4): 544-52
【非特許文献８】Vekemans M, et al. Low mannose-binding lectin concentration is associated with severe infection in patients with hematological cancer who are undergoing chemotherapy. Clin Infect Dis. 2007 Jun 15; 44(12): 1593-601
【非特許文献９】Schlapbach LJ, et al. Differential role of the lectin pathway of complement activation in susceptibility to neonatal sepsis. Clin Infect Dis. 2010 Jul 15; 51(2): 153-62
【非特許文献１０】Worthley DL, et al. Donor mannose-binding lectin deficiency increases the likelihood of clinically significant infection after liver transplantation. Clin Infect Dis. 2009 Feb 15;48(4):410-7
【非特許文献１１】Mullighan CG, et al. Mannose-binding lectin status is associated with risk of major infection following myeloablative sibling allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 2008 Sep 1; 112(5): 2120-8
【非特許文献１２】Serruto D, Rappuoli R, Scarselli M, Gros P, van Strijp JA. Molecular mechanisms of complement evasion: learning from staphylococci and meningococci. Nat Rev Microbiol. 2010 Jun; 8(6): 393-9
【非特許文献１３】Toivanen P et al.: "Complement-fixing antibodies to adenovirus in rabbits and guinea-pigs treated with 6-mercaptopurine or epsilon-aminocaproic acid", 1965, Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica 1965, Vol. 63, pages 221 - 227
【非特許文献１４】T Behr, et al. "The structure of pneumococcal lipoteichoic acid. Improved preparation, chemical and mass spectrometric studies" FEBS J 207(3):1063-75 (1992)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
少なくとも部分的に腸球菌に起因する脊椎動物における感染を効果的に治療及び／又は予防するより効率的な戦略を提供するために、新たな改善されたワクチン接種戦略、並びにそれぞれのワクチンの開発及び作製に用いられ得る新たな抗原性細菌標的が必要とされている。
【００１０】
糖脂質、テイコ酸（ＴＡ）及び壁テイコ酸（ＷＴＡ）は、グラム陽性細菌感染の治療用の新たな薬物の潜在的標的となり得る。細胞壁多糖はグラム陽性細菌の細胞壁の主成分でもあるが、この種の成分に由来する任意の潜在的抗原についてはほとんど知られていない。
【００１１】
腸球菌感染に対抗する炭水化物補体耐性因子の研究及び複合糖質ワクチン等の代替的治療の開発の一環として、本発明は腸球菌の細胞壁から単離された新たな莢膜多糖類を提供することによってこれらの必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
このためその第１の態様における本発明の目的は、下記β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−リビトール構造：
【化１】
2015511610.tif 000002
（式中、Ｒ１はβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ又はα−Ｌ−Ｒｈａｐから選択され、
Ｒ２はＨ又はα−Ｄ−Ｇｌｃｐから選択される）、
並びにその誘導体及びその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される腸球菌細胞壁成分によって解決される。ここでＲｈａｐは６−デオキシ−マンノピラノース（ラムノース）であり、ＧａｌｐＮＡｃは２−アセトアミド−２−デオキシ−ガラクトピラノース（Ｎ−アセチル−ガラクトサミン）であり、Ｇｌｃｐはグルコピラノースである。
【００１３】
好ましくは、Ｒ１は以下の式ＩＩによるβ−Ｄ−Ｇｌｃｐから選択される。
【化２】
2015511610.tif 000003
【００１４】
好ましくは、Ｒ１は以下の式ＩＩＩによるα−Ｌ−Ｒｈａｐから選択される。
【化３】
2015511610.tif 000004
【００１５】
好ましくは、Ｒ２は以下の式ＩＶによるα−Ｄ−Ｇｌｃｐから選択される。
【化４】
2015511610.tif 000005
ここで、ＩＩ〜ＩＶにおける破線は上記のβ−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−リビトール構造への結合を示す。
【００１６】
図４に示される構造ＯＳ  Ｉ及び／又はＯＳ  ＩＩが最も好ましい。
【００１７】
本発明においては、エンテロコッカス・フェカリスの炭水化物細胞表面構造とヒト補体系との相互作用を調査した。以前には、推定表面又はストレス応答因子に関与する遺伝子の１７７個の標的化挿入突然変異体のライブラリーがエンテロコッカス・フェカリスＶ５８３株において構築され、突然変異体ライブラリーがオプソニン食作用（opsonophagocytic）死滅に対する感度についてスクリーニングされ、ＷＴＡ生合成に推定的に関与する遺伝子の３つの突然変異体が特異的Ａｂの非存在下で補体及び好中球によって容易に死滅した（Rigottier-Gois L, et al. Large-Scale Screening of a Targeted Enterococcus faecalis Mutant Library Identifies Envelope Fitness Factors. PLoS ONE. 2011 Dec 15; 6(12): e29023）。対照的に、野生型エンテロコッカス・フェカリスは補体及び好中球単独による死滅に耐性を示す。本発明は、補体媒介オプソニン食作用に対する感受性の増大の機構、並びに野生型及び突然変異体の細胞壁補助炭水化物高分子の構造差の特性化に基づく。
【００１８】
エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３株において壁テイコ酸（ＷＴＡ）合成遺伝子ｔａｇＡ、ｔａｇＢ及びｔａｇＯの３つの挿入突然変異体が同定され、これらは好中球による補体媒介オプソニン食作用に対する感受性の増大を示した。更なる研究から、エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２のＣａ２＋依存性、Ａｂ非依存性オプソニン食作用におけるＬ−フィコリン／マンノース結合レクチン関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）複合体の役割が明らかとなった。エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２によるレクチン経路活性化の機構を理解するために、本発明者らは、ペプチドグリカンの酵素消化により得られたエンテロコッカス・フェカリス野生型及びＶ５８３Δ１１７２の細胞壁断片を構造的に特性化した。Ｖ５８３Δ１１７２の細胞壁断片は、構造α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→３）−β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−（１→１）−リビトール及びα−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−［β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）−］β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−（１→１）−リビトールを有する本発明による２つのオリゴ糖を欠いており、突然変異体におけるＷＴＡの非存在が示唆された。
【００１９】
このため、腸球菌細胞壁成分（以下、「腸球菌抗原」とも表される）は、少なくとも部分的に腸球菌に起因する脊椎動物における感染を効果的に治療及び／又は予防するより効率的な戦略の開発のための新たな抗原性標的をもたらし、ワクチン接種戦略を改善し、複合糖質ワクチン等のそれぞれのワクチンの開発及び作製を可能にする。
【００２０】
本発明によると、「修飾誘導体」という用語（単数又は複数）は、上記の式Ｉによる化学的又は酵素的に修飾された腸球菌抗原を含むものとし、該修飾誘導体は腸球菌抗原決定基としての機能を維持し、及び／又は式Ｉによる腸球菌抗原としての機能を同じ若しくは実質的に同じ程度維持する。上記修飾誘導体は非修飾腸球菌抗原と比較して量的に増大した免疫学的反応を示すのが好ましい。かかる免疫学的反応の増大は、当該技術分野で既知の免疫アッセイを用いて検出することができる。
【００２１】
修飾誘導体の例は、好ましくは他の化学物質に連結又はコンジュゲートするリンカー基を含むように修飾された式Ｉの化合物である。これらのリンカー基は現行の技術水準で既知であり、通常は免疫学的に不活性であり、すなわち腸球菌抗原の免疫学的特性を実質的に妨げない。他の修飾としては、キレート基又は酵素基等の検出可能な標識を有する腸球菌抗原の化学部分の付加が挙げられる。さらに、診断アッセイにおける腸球菌抗原の精製及び／又は使用を可能にするペプチド（例えばＨｉｓ）又は他の「標識」若しくは「タグ」を付加させることができる。
【００２２】
最後に、腸球菌抗原は、例えば腸球菌抗原の糖成分の環に化学修飾を含むことができ、抗原は既存の側基をＨ、非置換、一置換又は多置換のＣ１〜Ｃ１８アルキルに置き換えるように修飾することができ、ここで該アルキルは直鎖、分岐又は環状アルケニル、非置換、一置換又は多置換のアリール又はヘテロアリール残基、非置換、一置換又は多置換のベンゼン基、アシル基、例えばホルミル、アセチル、トリクロロアセチル、フマリル、マレイル、スクシニル、ベンゾイル、又は分岐若しくはヘテロ原子若しくはアリール置換アシル基、アルコキシ置換基、例えば−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、−ＯｎＰｒ、−ｉＰｒ、−ＯｎＢｕ、−ＯｉＢｕ、−ＯｓｅｃＢｕ、−ＯｔＢｕ（これらのアルキル基は分岐、直鎖又は環状とすることができる）、硫黄原子を介して結合したアルキル基、例えば−ＳＭｅ、−ＳＥｔ又はスルホニル基、例えば−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２Ｍｅ、−ＳＯ２ＣＦ３、−ＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３若しくはＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ２Ｂｒ、又は窒素置換基、例えばＮＨ２、ＮＨＲ、−ＮＲＲ'（Ｒ、Ｒ'＝上記のアルキル、アルケニル又はアリール）、ＮＣ若しくは−ＮＯ２、又はフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、−ＣＮ又はヘテロ置換基であり得る。上述のように、抗原の溶解度の改善、該抗原の免疫学的効果の（好ましくは量的な）増大、及び／又は化合物の他の部分への連結、例えば表面（ウェル又はチップ等）への連結、及び／又は診断アッセイにおける使用を可能にするために、これらの誘導体が含まれるのが好ましい。
【００２３】
本発明の別の態様は、本発明による腸球菌細胞壁成分を作製する方法であって、該腸球菌細胞壁成分を細菌画分から単離することを含むか、又は該抗原を少なくとも部分的に化学合成によって合成することを含む、方法に関する。単離は、上記細胞壁成分を細菌画分から他の細菌成分を実質的に含まないように精製することを含み得るが、本明細書に記載のように或る特定の細菌画分、例えば細胞壁の他の部分を含む細胞壁画分の一部として単離することも含まれ得る。
【００２４】
本発明の別の態様は、本発明による腸球菌抗原を特異的に認識する抗体、好ましくはモノクローナル抗体又はその抗原断片に関する。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の両方、組換え抗体又はその断片、例えばＦａｂ等、及びヒト抗体又はヒト化抗体を含むものとする。
【００２５】
次に、本発明の別の態様は本発明による抗体を作製する方法であって、哺乳動物、好ましくはウサギを本発明による腸球菌細胞壁成分、又は本発明による医薬組成物、好ましくは本発明によるワクチンで免疫化することを含む、方法に関する。それぞれの方法が当業者に既知であり、現行の技術水準で開示されている。
【００２６】
次に、本発明のまた別の態様は本発明による抗体を作製する方法であって、該抗体をモノクローナル抗体として産生するハイブリドーマ細胞を生成することを含むか、又は上記抗体を宿主細胞において組換え産生することを含む、方法に関する。それぞれの方法が当業者に既知であり、現行の技術水準で開示されている。
【００２７】
次に、本発明の更に別の重要な態様は、ＷＴＡ合成遺伝子ｔａｇＡ、ｔａｇＢ及びｔａｇＯの少なくとも１つの挿入突然変異体が存在するエンテロコッカス・フェカリスの株、例えばエンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２株に関する。この株は、例えば本明細書に記載の特異的及び／又は有効な抗体の本発明によるアッセイ及びスクリーニング検査、又は上述の抗原の産生を抑制することが可能な特定の化合物（小分子等）のスクリーニング及び同定に使用することができる。
【００２８】
次に、本発明の更に別の重要な態様は、抗原に特異的な抗体の産生における抗原としての本発明による腸球菌抗原の使用に関する。
【００２９】
次に、本発明の別の態様は、少なくとも１つの本発明による腸球菌抗原及び／又は少なくとも１つの本発明による抗体を、薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤とともに含む医薬組成物に関する。
【００３０】
式Ｉによる細胞壁成分、すなわちそれぞれの細胞壁多糖を含む本発明による医薬組成物が特に好ましい。
【００３１】
特に腸球菌、抗生物質耐性腸球菌、例えば特に好ましくはエンテロコッカス・フェカリスのＶＲＥ株に起因する感染に対するワクチンとして配合される本発明による医薬組成物が更に好ましい。式Ｉによる上記細胞壁成分が複合糖質ワクチン中に存在する本発明による医薬組成物が最も好ましい。
【００３２】
本発明による細胞壁多糖（抗原単独として、又は本明細書に記載の抽出物若しくは細菌中に存在する）は、能動免疫化又は受動免疫化のための腸球菌ワクチンに使用するのが好ましい。
【００３３】
このため、本発明によると、少なくとも１つの本発明による新たな腸球菌抗原を、任意に薬学的に許容可能な担体、アジュバント及び／又は希釈剤とともに含む、脊椎動物における腸球菌感染の予防のための医薬組成物、特にワクチンが提供される。
【００３４】
典型的には、ワクチンは、本発明の腸球菌抗原を含む少なくとも１つの腸球菌株、好ましくはエンテロコッカス・フェカリスの生きている又は死んだ無傷細胞を含み得る。より典型的には、ワクチンは、腸球菌抗原（単数又は複数）を含むような上記腸球菌株の少なくとも１つに由来する細胞溶解物を含む。更により典型的には、ワクチンは、上記腸球菌株、好ましくはエンテロコッカス・フェカリスの少なくとも１つに由来する粗腸球菌抗原混合物又は精製腸球菌抗原（単数又は複数）を含む。更に典型的には、ワクチンは、上記腸球菌株の少なくとも１つの腸球菌抗原として細胞壁及び関連タンパク質の画分を含む。ワクチンは成分の１つの組合せで構成されていてもよい。本発明による腸球菌抗原を含む複合糖質ワクチンが最も好ましい。別の態様は、含まれる腸球菌抗原が少なくとも部分的に化学合成によって作製された医薬組成物又はワクチンに関する。腸球菌抗原を含有する選択された細菌画分を精製する方法は当業者に既知であり、本明細書で更に記載している。
【００３５】
通常、脊椎動物は単胃動物、草食動物若しくは反芻動物、又はヒト被験体である。更により典型的には、脊椎動物はヒト、非ヒト霊長類、ネズミ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギ、ウサギ、トリ、ネコ及びイヌからなる群から選択される。より典型的には、脊椎動物はヒト、ヒツジ、ラクダ、ブタ、ウシ、ウマ又はイヌからなる群から選択される。
【００３６】
医薬組成物は筋肉内経路、皮下経路、局所経路又は他の非経口経路を介した投与のために配合することができる。概して、本発明の微生物は本質的に片利共生的である。このため、経口投与は一般に有効なワクチン接種経路ではなく、結果として筋肉内経路、皮下経路、局所経路又は他の非経口経路による投与が好ましい。ワクチンは、単独又は組合せで使用されるサイトカイン、例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン又は腫瘍壊死因子αも含み得る。
【００３７】
医薬組成物はアジュバントを含んでいてもよい。より典型的には、アジュバントはフロイント完全／不完全アジュバント、ｍｏｎｔｅｎｉｄｅ  ｍａｃｒｏｌアジュバント、リン酸緩衝生理食塩水及びマンナン油エマルション、サポニン（ＱｕｉＬＡ）デキストラン（硫酸デキストラン、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ）、アルミニウム化合物（Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル（acetylglucosaminyl）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（Ｇｅｒｂｕアジュバント）からなる群から選択される。より典型的には、アジュバントはVaccine 1995, vol 13, p 1203; 1993 vol 11 p 293; and 1992 vol 10 p 427（その開示は引用することにより本明細書の一部をなす）に記載の群から選択される。
【００３８】
次に、本発明のまた別の重要な態様は、細菌感染、特に腸球菌感染、例えば院内感染菌血症感染、心内膜炎、尿路感染、手術創感染及び異物感染等の疾患の治療に使用される本発明による腸球菌細胞壁成分（腸球菌抗原）、本発明による抗体、又は本発明による医薬組成物に関する。
【００３９】
次に、本発明のまた別の重要な態様は、細菌感染の治療、又は特に抗生物質耐性グラム陽性球菌、例えば腸球菌、ＶＲＥ株若しくはエンテロコッカス・フェカリス等に起因する細菌感染、特に腸球菌感染、例えば院内感染菌血症感染、心内膜炎、尿路感染、手術創感染及び異物感染に対する薬剤の調製のための本発明による腸球菌細胞壁成分、本発明による抗体又は本発明による医薬組成物（すなわち腸球菌抗原）の使用に関する。
【００４０】
本発明の更に別の好ましい実施形態によると、脊椎動物における本発明の腸球菌抗原を含む少なくとも１つの腸球菌株に対する免疫応答を誘導する方法であって、上記脊椎動物に免疫学的に有効な量の本発明によるワクチン又は本発明による医薬組成物を投与することを含む、方法が提供される。
【００４１】
本発明の更に別の好ましい実施形態によると、脊椎動物における細菌感染を治療又は予防する方法であって、該脊椎動物に治療的に有効な量の本発明による腸球菌細胞壁成分、本発明による抗体又は本発明による医薬組成物を投与することを含む、方法が提供される。
【００４２】
上記細菌感染が院内感染菌血症、心内膜炎、尿路感染、手術創感染及び異物感染等の腸球菌感染であり、ＶＲＥ株、特にエンテロコッカス・フェカリス等の抗生物質耐性腸球菌に特に起因する本発明による方法が好ましい。
【００４３】
補体媒介オプソニン食作用に対する耐性におけるＷＴＡの役割を調べるために、本発明者らは、ＢＬＡＳＴ分析を用いて枯草菌（Bacillus subtilis）及び黄色ブドウ球菌におけるＷＴＡの生合成に関与する遺伝子と類似性を有するエンテロコッカス・フェカリス遺伝子について研究した。枯草菌（B. subtilis）と比較して、エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３染色体は、ＴａｇＢ（ＥＦ＿１１７２）及びＴａｇＡ（ＥＦ＿１１７３）を含むテイコ酸グリセロール（ｔａｇ）オペロンを１つしか有しない。これら２つの遺伝子に、未知の機能を有する遺伝子（ＥＦ＿１１７４）及びＴａｇＤ（枯草菌Ｗ２３のＴａｒＡと６３％の同一性、８０％の類似性、グリセロール−３−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ；ＥＦ＿１１７５）が続く。Ｖ５８３におけるＷＴＡ生合成の第一段階を触媒する最も明らかな酵素のホモログＴａｇＯは、タンパク質ＥＦ＿２１９８（黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬにおけるＴａｇＯと４１％の同一性、６５％の類似性）である。しかしながら、以前の研究ではこの遺伝子は、腸球菌細胞壁多糖（腸球菌多糖抗原とも呼ばれる）の生合成に関与する遺伝子クラスターであるｅｐａ遺伝子座にも関連付けられていた。興味深いことに、エンテロコッカス・フェカリスＯＧ１ＲＦにおけるＥＦ＿２１９８の破壊突然変異体は、アガロースゲル電気泳動及び特異的Ａｂに対する反応性によって評価したところ依然として細胞壁多糖を発現していた（Teng F, Singh KV, Bourgogne A, Zeng J, Murray BE. Further characterization of the epa gene cluster and Epa polysaccharides of Enterococcus faecalis. Infect Immun. 2009 Sep;77(9):3759-67）。
【００４４】
オプソニン食作用アッセイにおいて、本発明者らは、補体及び好中球単独又は腸球菌細胞表面抗原に特異的なＡｂの存在下でｔａｇＯ（ＥＦ＿２１９８）、ｔａｇＡ（ＥＦ＿１１７３）及びｔａｇＢ（ＥＦ＿１１７２）の野生型細菌及び挿入突然変異体の死滅を比較した。野生型とは対照的に、ＷＴＡ生合成遺伝子の３つ全ての突然変異体は、特異的Ａｂを欠いた血清オプソニン食作用死滅に対して高度の感受性を示していた。死滅の増加は、好中球による食作用の増大及び突然変異株の細菌表面に結合したＣ３ｄの密度の増大に強く相関する。付加的な実験により、古典的及び代替的な経路がエンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２でのＣ３ｂの沈着の増大に関与することが排除され、補体沈着がレクチン経路の活性化によるものであるという証拠がもたらされた。
【００４５】
エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２におけるレクチン経路のリガンドとして働き得る炭水化物構造を同定するために、本発明者らは突然変異株と野生型株との間の補助細胞壁高分子の構造差を調査した。ペプチドグリカンの酵素切断の後、本発明者らはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で以前に腸球菌細胞壁多糖として同定されているＰＡＳ陽性バンドを同定した（Theilacker C, et al. Serodiversity of Opsonic Antibodies against Enterococcus faecalisglycans of the Cell Wall Revisited. PLoS ONE. 2011;6(3):e17839）。
【００４６】
エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２欠損株では、細胞壁多糖の特徴的なバンドがはるかに遅い移動パターンを示した。加えて、この多糖はカチオン染料Ｓｔａｉｎｓ  Ａｌｌに結合するその能力を失っており、またＱ−セファロースに結合せず、アニオン電荷の損失が示唆された。サイズ排除クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、本発明者らは野生型エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３及びエンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２突然変異体から精製細胞壁断片を得た。エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２突然変異体に由来する物質は、含有するＧａｌＮＡｃ、リビトール及びリン酸塩がより少なく、突然変異体の細胞エンベロープからのＷＴＡの喪失が示された（Weidenmaier C, McLoughlin RM, Lee JC. The zwitterionic cell wall teichoic acid of Staphylococcus aureus provokes skin abscesses in mice by a novel CD4+ T-cell-dependent mechanism. PLoS ONE. 2010;5(10):e13227、Neuhaus FC, Baddiley J. A continuum of anionic charge: structures and functions of D-alanyl-teichoic acids in gram-positive bacteria. Microbiol Mol Biol Rev. 2003 Dec;67(4):686-723、Swoboda JG, Campbell J, Meredith TC, Walker S. Wall teichoic acid function, biosynthesis, and inhibition. Chembiochem. 2010 Jan 4;11(1):35-45）。
【００４７】
ＮＭＲ分光法による精製天然補助細胞壁多糖の構造の明確な説明は、両方の株におけるこの炭水化物の複雑さ及び不均一性のために可能ではなかった。したがって、本発明者らはＨＦを用いた脱リン酸化により細胞壁断片を解重合した。ゲルクロマトグラフィーによる分画後に、本発明者らは３つの異なるプールを得た。高分子量プールは腸球菌細胞壁多糖の指標であるＲｈａ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮ及びＧａｌＮを含有していた。メチル化分析により、末端Ｇｌｃ及びヘキソサミン残基を有するポリ−Ｒｈａ鎖が示された。中型のプールは、ムラミン酸並びに約４：１：１のモル比でのアミノ酸Ａｌａ、Ｇｌｕ及びＬｙｓの存在により示されるように、エンテロコッカス・フェカリスのペプチドグリカンの組成と一致するＲｈａ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮ、ＧａｌＮ及びペプチドグリカン断片を含有していた（Bouhss A, Josseaume N, Severin A, Tabei K, Hugonnet JE, Shlaes D, et al. Synthesis of the L-alanyl-L-alanine cross-bridge of Enterococcus faecalis peptidoglycan. J Biol Chem. 2002 Nov 29;277(48):45935-41）。
【００４８】
したがって、オリゴ糖はペプチドグリカンに対する細胞壁多糖の連鎖単位を示すと考えられた。低分子量のプールは約３：２：１：１のモル比のＧａｌＮ、リビトール、Ｇｌｃ及びＲｈａからなっていた。更なる精製工程の後、ＮＭＲ分光法に対して修正可能な２つのオリゴ糖が検出された。構造分析から、２つのリビトール含有テイコ酸断片、すなわちα−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→３）−β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−（１→１）−リビトール及びα−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−［β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）−］β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−（１→１）−リビトールが明らかとなった。
【００４９】
注目すべきことに、ムタノリシンによるＢ群連鎖球菌の炭水化物と莢膜多糖類とを結び付けるペプチドグリカン架橋の切断の失敗が以前に記載されている（Deng L, Kasper DL, Krick TP, Wessels MR. Characterization of the linkage between the type III capsular polysaccharide and the bacterial cell wall of group B Streptococcus. J Biol Chem. 2000 Mar 17;275(11):7497-504）。
【００５０】
要約すると、本発明者らは、野生型と比較したエンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２の細胞壁断片における２つの大きな相違を観察した：ａ）推定細胞壁多糖のＲｈａ含量の増大、及びｂ）突然変異体におけるリビトール含有テイコ酸の喪失。
【００５１】
グラム陽性病原体の研究では、莢膜多糖類（Aoyagi Y, Adderson EE, Rubens CE, Bohnsack JF, Min JG, Matsushita M, et al. L-Ficolin/mannose-binding lectin-associated serine protease complexes bind to group B streptococci primarily through N-acetylneuraminic acid of capsular polysaccharide and activate the complement pathway. Infect Immun. 2008 Jan;76(1):179-88、Krarup A, Sorensen UB, Matsushita M, Jensenius JC, Thiel S. Effect of capsulation of opportunistic pathogenic bacteria on binding of the pattern recognition molecules mannan-binding lectin, L-ficolin, and H-ficolin. Infect Immun. 2005 Feb;73(2):1052-60）、ペプチドグリカン（Nadesalingam J, Dodds AW, Reid KB, Palaniyar N. Mannose-binding lectin recognizes peptidoglycan via the N-acetyl glucosamine moiety, and inhibits ligand-induced proinflammatory effect and promotes chemokine production by macrophages. J Immunol. 2005 Aug 1;175(3):1785-94）、ＬＴＡ（Lynch NJ, et al. L-ficolin specifically binds to lipoteichoic acid, a cell wall constituent of Gram-positive bacteria, and activates the lectin pathway of complement. J Immunol. 2004 Jan 15;172(2):1198-202）及びＷＴＡ（Park KH, et al. Human serum mannose-binding lectin senses wall teichoic acid Glycopolymer of Staphylococcus aureus, which is restricted in infancy. J Biol Chem. 2010 Aug 27;285(35):27167-75）を含む様々な細菌炭水化物抗原との補体相互作用が記載されている。
【００５２】
補助細胞壁高分子の完全な変更は、レクチン経路による補体沈着に対する感受性の増大及び突然変異体細菌のオプソニン食作用死滅の増大をもたらす。したがって、この結果は補体系からの免疫回避における補助細胞壁高分子の構造の重要性を強調するものである。
【００５３】
ここで、本発明を以下の好ましい非限定的な実施例において添付の図面を参照して更に説明する。本発明の目的上、本明細書で引用される全ての参照文献は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ＷＴＡ生合成におけるエンテロコッカス・フェカリス突然変異体のオプソニン食作用及び補体沈着を示す図である。Ａ：１．７％吸収ウサギ乳児補体単独、ヒト白血球（ＷＢＣ）と組み合わせた補体、又は補体、ＷＢＣ及び特異的ウサギＡｂの存在下でのエンテロコッカス・フェカリスＶ５８３及びＷＴＡ生合成突然変異体のオプソニン食作用死滅。死滅率は、細菌及びＷＢＣを含有する対照チューブのコロニー形成単位と比較して決定した。Ｂ：ヒト血清との１５分間のインキュベーション後のＦＩＴＣ標識ホルマリン死滅細菌の食作用。Ｃ：ヒト血清とのインキュベーション後にＦＡＣＳにより測定した腸球菌細菌細胞へのＣ３ｂ沈着。
【図２】酵素的に消化した細胞壁抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。Ａ  過ヨウ素酸及びシッフ試薬（ＰＡＳ）による染色。Ｂ  Ｓｔａｉｎｓ  Ａｌｌによる染色。レーン１：分子量マーカー；レーン２：エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３野生型；レーン３：エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２。
【図３】本発明の２つの好ましいオリゴ糖（ＯＳ）Ｉ及びＩＩのＮＭＲ分光法を示す図である。ＯＳ  Ｉ及びＯＳ  ＩＩのアノマー領域の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル。Ｖ５８３  ｗｔ  ＯＳ  Ｉ（Ｂ）及びＯＳ  ＩＩ（Ｃ）のＲＯＥＳＹスペクトルを下に示す。共有結合を介した１Ｈと１Ｈの連結を示す正のシグナルは緑色で示し、空間を経由した１Ｈと１Ｈの連結を示す負のシグナルは青色で示す。全ての測定は、内部標準のアセトン（δＨ２．２２５）を用いてＤ２Ｏ中、２７℃、７００ＭＨｚで行った。
【図４】ＯＳ  Ｉ（Ａ）及びＯＳ  ＩＩ（Ｂ）の構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００５５】
方法及び材料
細菌株、生育条件及び培地
エンテロコッカス・フェカリスを、指定のそれぞれの抗生物質を添加したトリプチックソイブロス（ＴＳＢ）（Carl Roth，Karlsruhe）中で撹拌せずに３７℃で培養した。短期培養物をトリプチックソイ寒天（ＴＳＡ）で生育させ、４℃で貯蔵した。腸球菌細胞壁多糖の単離のための培養物を静止期まで１８時間生育させ、遠心分離によって採取した。大腸菌（E. coli）培養物を、指定の抗生物質を添加したルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地（Carl Roth，Karlsruhe）中で好気的に培養した。
【００５６】
エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３のＥＦ１１７２遺伝子挿入突然変異体の構築
エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３の遺伝子ＥＦ＿１１７２の標的化挿入突然変異体を、Rigottier-Gois et al.（Rigottier-Gois L, Alberti A, Houel A, Taly J-F, Palcy P, Manson J, et al. Large-Scale Screening of a Targeted Enterococcus faecalis Mutant Library Identifies Envelope Fitness Factors. PLoS ONE. 2011 Dec 15;6(12):e29023）により記載されるように作製し（done）、標的化挿入の局在化を以前に記載されているようなＰＣＲ及びサザンブロット法によって検証した。
【００５７】
補体結合研究における血清及びＡｂ
正常なヒトプール血清を、インフォームドコンセントを受けた健常ボランティアから得た。ウサギ乳児血清はCederlane Laboratoriesから入手した。Ｃ１ｑ枯渇血清はQuidelから購入した。血清の熱不活性化を、５６℃で２０分間のインキュベーションにより行った。血清から、４℃で６０分間の細菌細胞による吸収によってエンテロコッカス・フェカリスＶ５８３に対する特異的Ａｂを枯渇させた。吸収後に、細菌を遠心分離によってペレット化し、上清を０．２μｍフィルターに通した。
【００５８】
オプソニン食作用死滅アッセイ
ヒト白血球（ＷＢＣ）による細菌オプソニン食作用を、以前に記載されているように測定した（Theilacker C, et al. Serodiversity of Opsonic Antibodies against Enterococcus faecalis-Glycans of the Cell Wall Revisited. PLoS ONE. 2011;6(3):e17839）。簡潔に述べると、細菌株をＴＳＢ中で対数中期（ＯＤ６００＝０．４）まで生育させ、１５％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩで希釈した。ＷＢＣを健常ボランティアの血液からヘパリン−デキストランバッファーを用いた沈降により精製し、残存する赤血球を１％ＮＨ４Ｃｌ溶液中での低張溶解（hypotonic lysis）により除去した。１５倍に希釈したウサギ乳児血清を補体源とした。標的株に対する天然Ａｂを除去するために、補体を上記のようにエンテロコッカス・フェカリスＶ５８３で吸収した。熱死滅エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３に対して産生されるウサギ血清を２５００倍の希釈率でＡｂ源とした。対照チューブでは、Ａｂ、補体又はＰＭＮはアッセイから除外した。オプソニン食作用の測定については、等量の２．５×１０６個のＰＭＮ、２．５×１０６ＣＦＵの細菌、補体及び熱不活性化免疫ウサギ血清を合わせた。９０分間のインキュベーションの後、反応を４℃で停止し、ＰＭＮを低張溶解によって溶解し（lysed）、段階希釈物のプレーティングによって生存細胞数を決定した。
【００５９】
食作用アッセイ
食作用アッセイを変更した記載のように行った（Rooijakkers SH, et al. Immune evasion by a staphylococcal complement inhibitor that acts on C3 convertases. Nat Immunol. 2005 Sep;6(9):920-7）。ヒトプール血清を上記のようにエンテロコッカス・フェカリスで吸収させ、０．０５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加したＲＰＭＩでそれぞれの濃度まで希釈した。次に、７．５×１０４個の新たに単離されたヒト好中球及び７．５×１０５個のＦＩＴＣ標識熱死滅エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３野生型又はエンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２を添加し、７５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１５分間インキュベートした。ＲＰＭＩ（０．１％ＨＳＡ）中の１．５％氷冷パラホルムアルデヒドを添加することによって反応を停止した。１００００個のゲーティングした好中球の蛍光を測定するフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；Becton Dickinson）によって食作用を分析した。熱不活性化血清を補体非依存性食作用の対照として使用した。
【００６０】
エンテロコッカス・フェカリスへのＣ３ｂ沈着
エンテロコッカス・フェカリス株をＯＤ６００が０．５となるまでＴＳＢ中で生育させ、０．１％ＢＳＡを含むＨＥＰＥＳ＋＋バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で洗浄した。１２．５×１０５個の細菌を血清とともに９００ｒｐｍで振盪しながら３０分間インキュベートした。細菌を、０．１％ＢＳＡを添加したＰＢＳで洗浄した。Ｃ３ｂ沈着を、マウス抗ヒトＣ３ｄ  Ａｂ（Quidel）及びＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Protos）を用いて検出した。１００００個の細菌の蛍光をフローサイトメトリーによって測定した。古典的経路及びレクチン経路を、細菌を補体とともにＨＥＰＥＳ＋＋バッファー＋５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１０ｍＭ  ＥＧＴＡ（ｐＨ７．５）の存在下でインキュベートすることによって破壊した。古典的経路の特異的な不活性化のために、Ｃ１ｑ枯渇血清（Quidel）を使用した。Ｃ３転換酵素複合体（Ｃ４ｂＣ２ａ）を、ヒトＣ４／Ｃ４ｄに対するモノクローナル抗体（Quidel）、及び二次抗体としてヤギポリクローナル抗マウスＦＩＴＣコンジュゲート（Dako）を用いて測定した。ヤギポリクローナル抗ＭＡＳＰ−２  Ａｂ（Santa Cruz Biotechnology）を用いてＭＡＳＰ−２沈着を検出した。
【００６１】
細胞壁多糖の単離
腸球菌細胞壁多糖の単離のために、細菌を上記のように培養した。細菌を洗浄し、消化バッファー（ＰＢＳ＋２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５％ＮａＮ３）に再懸濁し、ムタノリシン（０．０１ｍｇ／ｍＬ）及びリゾチーム（０．５ｍｇ／ｍＬ）を用いて３７℃で１８時間酵素的に切断した。その後、不溶性物質を遠心分離によって除去し、上清をヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ  Ｉ及びＲＮａｓｅ、最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）を用いて３７℃で１８時間処理した。タンパク質を、プロテイナーゼＫ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を用いて５６℃で８時間の消化によって分解した。上清をＨ２Ｏに対して十分に透析し（１０ｋｕ  ＭＭＣＯ）、凍結乾燥した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）のために、サンプルを５０ｍＭ炭酸アンモニウムバッファー（ｐＨ８．８；０．０２％ＮａＮ３）に溶解し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ  ２００カラム（１．６×１００ｃｍ、GE Healthcare）にアプライした。ヘキソース及びリンの含量を以前に記載されているように測定し（Theilacker C, et al. Opsonic antibodies to Enterococcus faecalis strain 12030 are directed against lipoteichoic acid. Infect Immun. 2006 Oct;74(10):5703-12）、それぞれ０．２９及び０．３１のＫａｖで溶出する陽性画分を合わせ、透析し、凍結乾燥した。得られた物質を２０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．０、０．０２％ＮａＮ３）に溶解し、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＱセファロースＦＦ、GE Healthcare）に供した。
【００６２】
リン酸ジエステル結合を切断するために、１０ｍｇのサンプルを５０μＬの４８％ＨＦに溶解し、４℃で２日間インキュベートした。物質を中和し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０（１．６×１００ｃｍカラム、Biorad）でのＳＥＣによって分離した。分子量の最も低い画分をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２（１×１２０ｃｍカラム、Biorad）でのＳＥＣ、続いてＣａｒｂｏＰａｋ  ＰＡ  １００カラム（９×２５０ｍｍ）及びＥＤ５０電気化学的検出器（Dionex）をアプライする高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ、Dionex）によって更に精製した。Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．６ソフトウェアを用いてデータ分析を行った。
【００６３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
粗腸球菌細胞壁炭水化物のＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、４０ｍＬの培養物を遠沈し、ペレットを上記のようにムタノリシン、リゾチーム、ヌクレアーゼ及びプロテイナーゼＫで消化した。Ｈ２Ｏに対する十分な透析の後、１００μｇの凍結乾燥物質をＮｕｐａｇｅ  ＳＤＳ−ＭＥＳ泳動バッファー（Invitrogen）中のプレキャスト１０％Ｎｕｐａｇｅ  Ｎｏｖｅｘ  ＢｉｓＴｒｉｓゲル（Invitrogen）で分離した。炭水化物をＳｔａｉｎｓ  Ａｌｌ又は過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）試薬で以前に記載されているように染色した（Theilacker C, Kaczynski Z, Kropec A, Sava I, Ye L, Bychowska A, et al. Serodiversity of Opsonic Antibodies against Enterococcus faecalis-Glycans of the Cell Wall Revisited. PLoS ONE. 2011;6(3):e17839、Hancock LE, Gilmore MS. The capsular polysaccharide of Enterococcus faecalis and its relationship to other polysaccharides in the cell wall. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Feb 5;99(3):1574-9）。
【００６４】
一般的及び分析的な化学的方法
中性糖の定性分析及び定量分析を、以前に記載されているように加水分解及び過アセチル化アルジトールアセテートのガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により行った（Haseley SR, Holst O, Brade H. Structural and serological characterisation of the O-antigenic polysaccharide of the lipopolysaccharide from Acinetobacter haemolyticus strain ATCC 17906. Eur J Biochem. 1997 Mar 15;244(3):761-6）。ポリ−（５％−ジフェニル−９５％−ジメチル）−シロキサンＳＰＢ−５−キャピラリーカラム（３０ｍ、内径０．３２ｍｍ）を備えるＡｇｉｌｅｎｔ  ＧＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（６８９０Ｎ）を用いてＧＣ分離を行った。シグナルをフレームイオン化によって検出し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｂ  ０１．０１ソフトウェアで分析した。糖の絶対配置を過アセチル化（Ｓ）−２−ブタノールグリコシドのＧＣによって決定した。
【００６５】
ＨＦ処理物質の部分的にメチル化したアルジトールアセテートをＧＣ−ＭＳで分析することによってメチル化分析を行った（Ciucanu I, Kerek F. A Simple and Rapid Method for the Permethylation of Carbohydrates. Carbohydrate Research. 1984;131(2):209-17）。簡潔に述べると、１５０μｇのＨＦ処理凍結乾燥物質を、粉末ＮａＯＨを添加した無水ＤＭＳＯ（分子篩［４Å］を通して貯蔵した）で３回メチル化した（ヨウ化メチル）。混合物を撹拌しながら２０℃で１時間維持した。次いで、メチル化多糖を２ｍＬのクロロホルムで３回抽出し、乾燥させ、４Ｍ  ＣＦ３ＣＯＯＨを用いて１００℃で４時間加水分解した。続いて、物質を脱イオンＨ２Ｏで蒸発させて残留ＣＦ３ＣＯＯＨを除去し、重水素化ホウ素ナトリウムで還元した（暗所で１８時間）。過アセチル化を上記のように行い、続いてＧＣ−ＭＳ分析を行った。
【００６６】
核磁気共鳴分光法
核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法はＡｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  Ｂｒｕｋｅｒ  ７００ＭＨｚ  Ｕｌｔｒａｓｈｉｅｌｄ  Ｐｌｕｓ分光計で標準ソフトウェア（Bruker）を適用して行った。１Ｈ−ＮＭＲ実験の動作周波数は７００．７５ＭＨｚ、１３Ｃ−ＮＭＲ実験の動作周波数は１７６．２０ＭＨｚ、３１Ｐ−ＮＭＲ実験の動作周波数は２８３．６７ＭＨｚであった。Ｈ−Ｄ交換のためにサンプルを繰り返しＤ２Ｏ（９９．９％）に溶解し（solved）、窒素下で蒸発させ、最終測定のためにサンプルをＤ２Ｏ（９９．９９％）に溶解した。全スペクトルを２７℃で記録した。化学シフトをｐｐｍで帰属し、内部標準として使用したアセトンの値（δＨ：２．２２５；δＣ：３１．４５）に従って較正した。
【００６７】
相関分光法（ＣＯＳＹ）、全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）、核オーバーハウザー増強分光法（ＮＯＥＳＹ）及び回転座標系核オーバーハウザー増強分光法（ＲＯＥＳＹ）のスペクトルを、２０４８×５１２ビットポイ３ントのデータセット（ｔ２×ｔ１）を用いて記録した。ＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹの実験をそれぞれ４００ｍｓ及び１８０ｍｓの混合時間で位相敏感により行った。異核２Ｄ  １Ｈ−１３Ｃ相関を異核多量子コヒーレンス（ＨＭＱＣ）、異核多結合相関（ＨＭＢＣ）及び異核一量子相関（ＨＳＱＣ）の実験によって４０９６×５１２ビットポイントのデータセットを用いて行った。
【００６８】
結果
ＷＴＡ生合成が損なわれたエンテロコッカス・フェカリス突然変異体は、特異的Ａｂの非存在下でのオプソニン食作用に対してより感受性である
テイコ酸グリセロール（ｔａｇ）遺伝子ｔａｇＯ（ＥＦ２１９８）、ｔａｇＡ（ＥＦ１１７３）及びｔａｇＢ（ＥＦ１１７２）に対して高い相同性を有する遺伝子の挿入突然変異体は以前に構築されている（表１）（Rigottier-Gois L, Alberti A, Houel A, Taly J-F, Palcy P, Manson J, et al. Large-Scale Screening of a Targeted Enterococcus faecalis Mutant Library Identifies Envelope Fitness Factors. PLoS ONE. 2011 Dec 15;6(12):e29023）。
【００６９】
表１：ＢＬＡＳＴアルゴリズムによるエンテロコッカス・フェカリスＶ５８３に対する枯草菌Ｗ２３及び黄色ブドウ球菌ＣＯＬのテイコ酸生合成遺伝子の相同性の分析
【表１】
2015511610.tif 000006
【００７０】
本発明者らは、異種オプソニン食作用死滅アッセイにおいて、補体源として標的株への吸収により特異的Ａｂを枯渇させた１．７％ウサギ乳児血清を用いてこれらの突然変異体を研究した（図１）。エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３野生型は、ヒト好中球による補体依存性オプソニン食作用に対して耐性を示す。特異的Ａｂの添加後にのみ、細菌は容易に死滅した。対照的に、ｔａｇＯ（ＥＦ２１９８）、ｔａｇＡ（ＥＦ１１７３）及びｔａｇＢ（ＥＦ１１７２）のエンテロコッカス・フェカリスの挿入突然変異体は補体媒介死滅に対して高度の感受性を示し、特異的Ａｂの添加はオプソニン食作用を更に促進しなかった（図１Ａ）。次に、本発明者らは、ＦＩＴＣ標識熱死滅エンテロコッカス・フェカリス細胞を吸収ヒト血清とともにインキュベートし、ＦＡＣＳ分析によりヒト好中球による取込みを測定した。１０％までの血清濃度では、貪食されたエンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２の割合は野生型細菌と比較してはるかに高かった（図１Ｂ）。
【００７１】
エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３におけるｔａｇＢ（ＥＦ１１７２）の不活性化はレクチン経路によるＣ３ｂ沈着の増大をもたらす
エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２の貪食取込みの増大が補体沈着の増大によるものであるか否かを試験するために、本発明者らはフローサイトメトリーによって細菌細胞に結合したＣ３ｂの量を測定した。標的株を用いた吸収により特異的Ａｂを枯渇させたヒト血清を補体源として使用した。野生型細菌と比較して、エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ２１９８（ｔａｇＯホモログ）及びエンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２（図１Ｃ）に結合したＣ３ｂの濃度の増大が検出された。Ｃ３ｂは補体活性化の古典的経路、レクチン経路及び代替的経路の最終産物である。古典的経路及びレクチン経路の両方がＣ３転換酵素複合体Ｃ４ｂＣ２ｂの形成をもたらし、これによりＣ３がＣ３ａ及びＣ３ｂへと切断される。Ｃａ２＋は古典的経路及びレクチン経路の活性化の必須補因子である。
【００７２】
補体誘導オプソニン食作用死滅に対する感度は、細胞エンベロープ炭水化物の変化と関連する
この仮説を調査するために、本発明者らはエンテロコッカス・フェカリス野生型及びＶ５８３Δ１１７２の細胞壁関連多糖の構造を特性化した。この目的で、ムタノリシン及びリゾチームによるペプチドグリカンの解重合後の細胞壁断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＡＳ及びＳｔａｉｎｓ  Ａｌｌによって染色した（図２）。野生型株の細胞壁断片のＳＤＳ−ＰＡＧＥから約６０ｋｕの広いバンドが明らかとなった。対照的に、エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２においては、このバンドは明らかにより遅く移動し、カチオン染料Ｓｔａｉｎｓ  Ａｌｌによっては染色されず、負電荷モチーフの喪失が示唆された（図２）。
【００７３】
エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２の細胞壁抽出物が含有するリン及びグルコサミンはより少ないが、ラムノースはより多い
エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３野生型及びその挿入突然変異体Ｖ５８３Δ１１７２の細胞壁抽出物をクロマトグラフィーによって更に精製した。最初に、物質をＳＥＣによって分離した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥでの異なる移動パターンにも関わらず、野生型及び突然変異体の細胞壁抽出物はＳＥＣにおいて同様の容量で溶出し、同様の分子量が示された。しかしながら、エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２に由来する物質が含有するリンはより少なかった。更なる分析のために、主要な炭水化物含有ピークの画分を合わせ（ＫＡｖ  ０．３０）、陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。エンテロコッカス・フェカリス野生型に由来する物質は、１７５ｍＭ  ＮａＣｌでＱセファロースから主要なリン含有ピークとして溶出した。対照的に、エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２における主要ピークは陰イオン交換カラムに結合せず、この場合も負電荷の喪失が示唆された。精製抽出物の組成分析から、両方の株の多糖がＲｈａ、Ｇｌｃ、ＧａｌＮ、ＧｌｃＮ、リビトール及びリン酸塩を含有することが明らかとなった。糖、リビトール及びリン酸塩のモル比の比較から、Ｖ５８３Δ１１７２多糖が野生型と比較しておよそ４倍少ないガラクトサミン及びリビトール、並びにおよそ２．５倍少ないリン酸塩を含有することが明らかとなった。１Ｈ  ＮＭＲ分光法では、エンテロコッカス・フェカリス野生型及びＶ５８３Δ１１７２の細胞壁多糖のアノマープロトンシグナルは異なっていたが、アノマー領域の不均一性により分子を更に分解することなく詳細な分析が排除された。
【００７４】
エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２の細胞壁多糖は共有結合ＷＴＡを欠く
両方の細胞壁多糖の構造を更に調査するために、リン酸ジエステル結合をＨＦ水溶液によって加水分解し、加水分解物をＳＥＣによって分画した（補足図１及び図３Ａ）。野生型株の細胞壁断片と比較して、突然変異体多糖の溶出プロファイルは総カラム容量近くで溶出する低分子量ピークを欠いていた。野生型株に由来するこの低分子量物質をサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製し、組成分析を行った。リビトール含有ＴＡの典型的な成分としてＤ−ＧａｌＮ、Ｌ−Ｒｈａ、Ｄ−Ｇｌｃ及びリビトールの存在が確認された（表２）。ＨＰＡＥＣによるこの物質の更なる分離から、ＯＳ  Ｉ及びＯＳ  ＩＩと表される２つの異なるオリゴ糖の存在が明らかとなり、これを続いて分取ＨＰＡＥＣによって単離した。
【００７５】
表２：ＨＦによる脱リン酸化及びＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０でのＳＥＣの後のエンテロコッカス・フェカリスの補助細胞壁高分子の組成分析。エンテロコッカス・フェカリスＶ５８３Δ１１７２では、プール３は存在しなかった。Ｎ．Ｄ．：不検出。Ｒｈａ−ラムノース、Ｇｌｃ−グルコース、ＧｌｃＮ−グルコサミン、ＧａｌＮ−ガラクトサミン、Ａｌａ−アラニン、Ｇｌｕ−グルタミン、Ｌｙｓ−リシン。濃度はｎｍｏｌ／ｍｇで表す。
【表２】
2015511610.tif 000007
【００７６】
ＯＳ  Ｉ（図３を参照されたい）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、アノマー領域において２つの異なるシグナル（すなわち、α−Ｌ−Ｒｈａｐのアノマープロトンとして帰属させられるδ４．８８（Ａ１）及びβ−Ｄ−ＧａｌｐＮのアノマープロトンとして称されるδ４．５８（Ｂ１））を示した。δ１．２７（Ａ６）のシグナルはＲｈａのメチルプロトンに帰属された。ＯＳ  ＩＩの１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（図３を参照されたい）はアノマー領域に３つの異なるシグナルを含んでいた。δ４．５９（Ｅ１）の１つのシグナルはβ−Ｄ−ＧａｌｐＮ残基のアノマープロトンを表し、δ４．９８の別のシグナルはα−Ｄ−Ｇｌｃｐ（Ｄ１）のアノマープロトンに帰属され、δ４．４５（Ｆ１）のシグナルはβ−Ｄ−Ｇｌｃｐのアノマープロトンに帰属された。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルはδ２．０６（ＯＳ  Ｉ）及びδ２．０３（ＯＳ  ＩＩ）にシグナルを示し、両方のサンプルにおけるＧａｌｐＮのＮ−アセチル化が示された。このため、対応する構造はＯＳ  Ｉの三糖α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→３）−β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−（１→１）−リビトール及びＯＳ  ＩＩの分岐四糖α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−［β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）−］β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−（１→１）−リビトールであった。
【図１】
2015511610.tif 000010
【図２】
2015511610.tif 000011
【図３】
2015511610.tif 000012
【図４】
2015511610.tif 000013
【国際調査報告】
2015511610.tif 000014
2015511610.tif 000015
2015511610.tif 000016