(57)【要約】  本発明は、多臓器チップ装置に関し、この多臓器チップ装置は、ベース層；ベース層上に配置された臓器層；臓器層上に配置された空洞層；及びアクチュエータ層を備え、ベース層が、別の層の固体支持体となるように構成され、臓器層が、多数の個々の臓器等価物であって、各臓器等価物が、１つ以上の臓器成長セクションを備え、各臓器成長セクションが、臓器の少なくとも１つのオルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを備え、かつ臓器成長セクションのオルガノイドキャビティと自立循環系との間の流体の連通のための微小入口及び微小出口を備えるように構成され、臓器層が、臓器：肺、小腸、脾臓、膵臓、肝臓、腎臓、及び骨髄をそれぞれ表現するように構成された少なくとも１つの臓器等価物を含む、多数の個々の臓器等価物、及び臓器成長セクションの微小入口及び微小出口を介して臓器層の臓器成長セクションと直接流体連通するように構成された自立循環系を備えるように構成され、空洞層が、キャビティと臓器成長セクションとの間の流体交換を可能にするために、選択された臓器等価物又は臓器成長セクションと流体連通するように配置された多数のキャビティ及びチューブを備えるように構成され、アクチュエータ層が、選択された臓器等価物、自立循環系、及び／又はそれらの一部にかかる圧力を制御するように配置され構成された多数のアクチュエータを備えるように構成されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多臓器チップ装置において、
ベース層；
前記ベース層上に配置された臓器層；
前記臓器層上に配置された空洞層；及び
アクチュエータ層；を備え、
前記ベース層が、別の層の固体支持体となるように構成され、
前記臓器層が、
多数の個々の臓器等価物であって、前記各臓器等価物が、１つ以上の臓器成長セクションを備え、前記各臓器成長セクションが、臓器の少なくとも１つのオルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを備え、かつ前記臓器成長セクションの前記オルガノイドキャビティと自立循環系との間の流体の連通のための微小入口及び微小出口を備えるように構成され、前記臓器層が、臓器：肺、小腸、脾臓、膵臓、肝臓、腎臓、及び骨髄をそれぞれ表現するように構成された少なくとも１つの臓器等価物を含む、多数の個々の臓器等価物、及び
前記臓器成長セクションの前記微小入口及び前記微小出口を介して前記臓器層の前記臓器成長セクションと直接流体連通するように構成された前記自立循環系を備えるように構成され、
前記空洞層が、前記キャビティと前記臓器成長セクションとの間の流体交換を可能にするために、選択された臓器等価物又は臓器成長セクションと流体連通するように配置された多数のキャビティ及びチューブを備えるように構成され、
前記アクチュエータ層が、選択された臓器等価物、前記自立循環系、及び／又はそれらの一部にかかる圧力を制御するように配置され構成された多数のアクチュエータを備えるように構成されていることを特徴とする、多臓器チップ装置。
【請求項２】
請求項１に記載の多臓器チップ装置において、前記ベース層が、透明な材料から形成され、好ましくは、前記ベース層が、ガラス又は透明な合成ポリマーを含む材料、又はガラス又は透明な合成ポリマーからなる材料から形成されることを特徴とする、多臓器チップ装置。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の多臓器チップ装置において、前記ベース層が、１つ以上の前記臓器等価物、前記臓器成長セクション、及び／又は前記自立循環系から送信される信号を測定し、かつ／又は１つ以上の前記臓器等価物、前記臓器成長セクションに信号を送信するように構成されていることを特徴とする、多臓器チップ装置。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の多臓器チップ装置において、前記自立循環系が、
肺等価物の臓器成長セクションの微小出口を前記臓器層の全ての臓器成長セクションの微小入口に直接接続して、多量のｐＯ２を含む流体の前記臓器成長セクションへの輸送を可能にする細動脈輸送チャネル；及び
前記臓器成長セクションの前記微小出口を前記肺等価物の前記臓器成長セクションの前記微小入口に直接接続して、少量のｐＯ２を含む流体の前記臓器成長セクションから前記肺等価物への輸送を可能にする細静脈輸送チャネルを備えることを特徴とする、多臓器チップ装置。
【請求項５】
請求項４に記載の多臓器チップ装置において、前記自立循環系が、小腸等価物、脾臓等価物、及び膵臓等価物の臓器成長セクションの微小出口が、互いに直接流体連通し、かつ肝臓等価物の臓器成長セクションの追加の微小入口と直接流体連通して接続されるように構成され、これにより、前記脾臓等価物、前記膵臓等価物、前記小腸等価物、及び前記肝臓等価物間の流体連通が可能となり、前記脾臓等価物、前記膵臓等価物、及び前記小腸等価物から前記自立循環系の前記細静脈輸送チャネルに向かう流体連通が、前記肝臓等価物を通る通路によってのみ実現し得ることを特徴とする、多臓器チップ装置。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか１項に記載の多臓器チップ装置において、前記臓器層が、さらなる臓器等価物を含む、好ましくは、前記臓器層が、皮膚、精巣、脳、及び／又は脂肪組織の臓器等価物を含むことを特徴とする、多臓器チップ装置。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の多臓器チップ装置において、前記臓器層と前記空洞層との間に配置された臓器保持層をさらに備え、前記臓器保持層が、選択された臓器等価物に対して前記空洞層との流体連通が維持されるように前記臓器層を密閉し、かつ／又は安定させるように構成されていることを特徴とする、多臓器チップ装置。
【請求項８】
請求項１乃至７の何れか１項に記載の多臓器チップ装置において、前記空洞層が、
前記小腸等価物の上に位置し、かつ前記小腸等価物に栄養物容器から栄養物を供給することができるように前記小腸等価物及び前記栄養物容器と流体連通したキャビティ；
前記小腸等価物の上に位置し、かつ前記小腸等価物から排泄される物質を排泄物容器に輸送することができるように前記小腸等価物及び前記排泄物容器と流体連通したキャビティ；
前記肝臓等価物の上に位置し、かつ前記肝臓等価物から排泄される物質を前記小腸等価物の上に位置するキャビティに輸送することができるように前記小腸等価物の上に位置する前記キャビティ及び前記肝臓等価物と流体連通したキャビティ；及び
前記腎臓等価物の上に位置し、かつ尿容器が前記腎臓等価物から排泄される物質を受け取るように前記腎臓等価物及び前記尿容器に流体連通したキャビティを備えることを特徴とする、多臓器チップ装置。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか１項に記載の多臓器チップ装置において、前記アクチュエータ層が、
心拍動を再現するために、有向流体運動を可能にするように前記自立循環系に作用する１つ以上のアクチュエータ；
腸蠕動運動を再現するために、有向運動を可能にするように前記空洞層に作用する１つ以上のアクチュエータ；
呼吸を再現するために、空気の流れを可能にするように前記肺等価物に作用する１つ以上のアクチュエータ；
骨の圧縮を再現するために、制御された圧縮を可能にするように前記骨髄等価物に作用する１つ以上のアクチュエータ；
細動脈の収縮を再現するために、前記自立循環系の前記細動脈輸送チャネルに作用する１つ以上のアクチュエータ；
前記肝臓等価物から胆汁を逃がすために、有向流体運動を可能にするように前記肝臓等価物に作用する１つ以上のアクチュエータ；及び
腎臓等価物から尿を逃がすために、有向流体運動を可能にするように空洞層に作用する１つ以上のアクチュエータを備えることを特徴とする、多臓器チップ装置。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れか１項に記載の多臓器チップ装置において、前記臓器層が、
前記肝臓等価物の臓器成長セクションが、５〜１５の肝臓オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、前記各肝臓オルガノイドが肝小葉であり、好ましくは、前記オルガノイドキャビティが、１０の肝臓オルガノイドを収容するように構成され；
前記肺等価物の臓器成長セクションが、２０００〜４０００の肺オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、前記各肺オルガノイドが肺胞であり、好ましくは、前記オルガノイドキャビティが、３０００の肺オルガノイドを収容するように構成され；
前記膵臓等価物の臓器成長セクションが、５〜１５の膵臓オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、前記各膵臓オルガノイドがランゲルハンス島であり、好ましくは、前記オルガノイドキャビティが、１０の膵臓オルガノイドを収容するように構成され；
前記脾臓等価物の臓器成長セクションが、５〜１５の脾臓オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、前記各脾臓オルガノイドが白色髄及び赤色髄であり、好ましくは、前記オルガノイドキャビティが、１０の脾臓オルガノイドを収容するように構成され；
前記小腸等価物の臓器成長セクションが、４０〜８０の小腸オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、前記各小腸オルガノイドが絨毛であり、好ましくは、前記オルガノイドキャビティが、６０の小腸オルガノイドを収容するように構成され；
前記腎臓等価物の臓器成長セクションが、１０〜３０の腎臓オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、前記各腎臓オルガノイドがネフロンであり、好ましくは、前記オルガノイドキャビティが、２０の腎臓オルガノイドを収容するように構成され；かつ
前記骨髄等価物の臓器成長セクションが、１０００〜２０００の骨髄オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、前記各骨髄オルガノイドが、骨髄、骨、及び軟骨から形成される単位であり、好ましくは、前記オルガノイドキャビティが、１４００の骨髄オルガノイドを収容するように構成されるよう設計されることを特徴とする、多臓器チップ装置。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載の多臓器チップ装置において、前記臓器層が、
前記皮膚等価物の臓器成長セクションが、１０〜１５の皮膚オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、前記各皮膚オルガノイドが皮膚突起であり、好ましくは、前記オルガノイドキャビティが、１５の皮膚オルガノイドを収容するように構成され；
前記脂肪組織等価物の臓器成長セクションが、２００，０００〜３００，０００の脂肪組織オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、前記各脂肪組織オルガノイドが脂肪クラスターであり、好ましくは、前記オルガノイドキャビティが、２４０，０００の脂肪組織オルガノイドを収容するように構成され；
前記精巣等価物の臓器成長セクションが、１０〜２０の精巣オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、前記各精巣オルガノイドが精巣小胞であり、好ましくは、前記オルガノイドキャビティが、１５の精巣オルガノイドを収容するように構成され；かつ
前記脳等価物の臓器成長セクションが、１５０〜２５０の脳オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、前記各脳オルガノイドが大脳皮質コラムであり、好ましくは、前記オルガノイドキャビティが、２００の脳オルガノイドを収容するように構成されるよう設計されることを特徴とする、多臓器チップ装置。
【請求項１２】
請求項１乃至１１の何れか１項に記載の多臓器チップ装置において、前記臓器等価物及び前記自立循環系が、前記肺等価物を起源とする前記細動脈輸送チャネルが、流れ方向に：
第１の細動脈チャネルが分岐して前記小腸等価物、前記脾臓等価物、及び前記膵臓等価物に供給する第１の分岐部；
第２の細動脈チャネルが分岐して前記肝臓等価物に供給する第２の分岐部；
第３の細動脈チャネルが分岐して前記腎臓等価物に供給する第３の分岐部；
第４の細動脈チャネルが分岐して前記骨髄に供給する第４の分岐部；
第５の細動脈チャネルが分岐して皮膚等価物に供給する任意選択の第５の分岐部；
第６の細動脈チャネルが分岐して脂肪組織等価物に供給する任意選択の第６の分岐部；
第７の細動脈チャネルが分岐して精巣等価物に供給する任意選択の第７の分岐部；及び
第８の細動脈チャネルが分岐して脳等価物に供給する任意選択の第８の分岐部を有するように構成されることを特徴とする、多臓器チップ装置。
【請求項１３】
請求項４乃至１３の何れか１項に記載の多臓器チップ装置において、流れ方向の前記細動脈輸送チャネルの直径が、前記肺等価物から所与の距離にある全ての分岐部を含む全ての細動脈輸送チャネルの断面積の合計が一定に維持されるよう常に縮小されるように構成され、前記細静脈輸送チャネルでは、前記直径の縮小が、前記肺等価物から所与の距離にある全ての分岐部を含む全ての細静脈輸送チャネルの断面積の合計が一定に維持されるように流れ方向において常に元に戻されることを特徴とする、多臓器チップ装置。
【請求項１４】
請求項１乃至１３の何れか１項に記載の多臓器チップ装置において、前記ベース層が、ガラスを含む、又はガラスからなり、前記臓器層が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む、又はＰＤＭＳからなり、前記臓器保持層が、ポリカーボネートを含む、又はポリカーボネートからなり、前記空洞層が、ＰＤＭＳを含む、又はＰＤＭＳからなり、かつ／又は前記アクチュエータ層が、ポリカーボネートを含む、又はポリカーボネートからなることを特徴とする、多臓器チップ装置。
【請求項１５】
請求項１乃至１４の何れか１項に記載の多臓器チップ装置において、前記臓器等価物がそれぞれ、哺乳動物、好ましくはヒトのそれぞれの臓器に平均的に存在するオルガノイドの数に比例した数のオルガノイドを収容するように構成され、前記多臓器チップ装置の全ての臓器等価物が、同じ所定の比例因子、例えば、０．００００１（１／１００，０００）の因子によってサイズが縮小されることを特徴とする、多臓器チップ装置。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
小型３次元（３Ｄ）臓器又はオルガノイド培養系は、学問的及び経済的な関心が高まっている。これらの３Ｄ培養系は、特定の刺激下で臓器がどのように機能し反応するかの検査を可能にすると共に、特定の臓器又は臓器群に対する化合物又は組成物の効果を試験し、かつこのような化合物又は組成物の薬物動態挙動を研究することを目的とする。特に化合物の安全性試験に関しては、動物実験の代わりとなり、かつヒトにおける安全性を効率的かつ確実に予測するためにより容易に使用できるデータを作成するための代替手段が必要である。このようなインビトロ３Ｄ培養系の質は、それぞれの臓器又はオルガノイドの生理学的機能及び環境を可能な限り厳密に反映する能力によって決まる。この目標は、臓器が別個の独立した物体として見なされるのではなく、ある生物中の異なる臓器間の相互作用の複雑さが可能な限り厳密に再現された場合にのみ達成することができる。意味のあるデータの作成を可能にするために、培養系は、長期間に亘って安定を維持する必要がある。しかしながら、現在知られている殆どの既知の３Ｄ培養系は、１つの細胞型のみを反映する、又は臓器もしくはオルガノイドの１つタイプのみをモデル化する。多数の臓器を考慮に入れ、かつこれらの多数の臓器の動的な培養を可能にする３Ｄ培養系が、最近になってようやく記載された。
【０００２】
国際公開第２００９／１４６９１１Ａ２号パンフレットに、臓器チップ装置が記載されている。この臓器チップ装置は、自立式かつセンサ制御されるように設計されている。この装置は、小型チップ形態において臓器又はオルガノイド及び幹細胞ニッチを確立又は維持することを可能にする。臓器チップ装置は、臓器又はオルガノイドを含む多数の臓器成長セクション、培地供給容器、及び培地廃棄容器を備え、これらは互いに機能的に接続され、臓器成長セクションの臓器又はオルガノイドに、培地供給容器から培地を供給することができ、かつ分解産物又は廃棄物を、培地廃棄物容器を介して廃棄することができる。このモデルは、１つのチップで２つ以上の臓器の同時培養を可能にするが、この装置では、チップ上の異なる臓器間の相互作用及びクロストークが不可能である。さらに、この装置は、長期間に亘って培養系の恒常性を達成するために必要な全ての機能を反映するものではない。
【０００３】
国際公開第２０１２／０１６７１１Ａｌ号パンフレットに、３Ｄ細胞培養モデルが記載されており、この３Ｄ細胞培養モデルは、１つ以上の臓器成長セクション、臓器成長セクションで培養される臓器又はオルガノイドに栄養物を供給するように構成された自立循環系、並びに間質液及び分解産物を臓器成長セクションから収集する毛細管外流体又は廃棄物収集器を備える。この系は、２つ以上の臓器の同時培養を可能にし、かつ異なる臓器に血液を供給すると共に、この異なる臓器を相互連結する血管系を再現する。従って、この系は、その臓器間又はオルガノイド間の相互作用及びクロストークを可能にする。しかしながら、この装置は、長期間に亘って培養系の恒常性を達成するために必要な全ての機能を反映するものではない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、臓器及び／又は生物の恒常性に必要な生物の基本機能を再現する多臓器チップ装置に関する。本発明の多臓器チップ装置は、多数の異なる臓器等価物を供給する高等生物の血液系を再現する自立循環系を反映するように設計されている。臓器等価物は、食物供給、廃棄物除去、及び酸素供給の基本機能が、再現され、長期間に亘る臓器等価物の恒常性を維持するために十分に機能するように選択され構成されている。
【０００５】
多臓器チップ装置が提供され、この多臓器チップ装置は、
・ベース層；
・ベース層上に配置された臓器層；
・臓器層上に配置された空洞層；及び
・アクチュエータ層；を備え、
・ベース層が、別の層の固体支持体となるように構成され、
・臓器層が、
多数の個々の臓器等価物であって、各臓器等価物が、１つ以上の臓器成長セクションを備え、各臓器成長セクションが、臓器の少なくとも１つのオルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを備え、かつ臓器成長セクションのオルガノイドキャビティと自立循環系との間の流体の連通のための微小入口及び微小出口を備えるように構成され、臓器層が、臓器：肺、小腸、脾臓、膵臓、肝臓、腎臓、及び骨髄をそれぞれ表現するように構成された少なくとも１つの臓器等価物を含む、多数の個々の臓器等価物、及び
臓器成長セクションの微小入口及び微小出口を介して臓器層の臓器成長セクションと直接流体連通するように構成された自立循環系を備えるように構成され、
・空洞層が、キャビティと臓器成長セクションとの間の流体交換を可能にするために、選択された臓器等価物又は臓器成長セクションと流体連通するように配置された多数のキャビティ及びチューブを備えるように構成され、
・アクチュエータ層が、選択された臓器等価物、自立循環系、及び／又はそれらの一部にかかる圧力を制御するように配置され構成された多数のアクチュエータを備えるように構成されている。
【０００６】
本発明のさらなる詳細及び好ましい実施形態は、以下の明細書及び特許請求の範囲で規定される。
【０００７】
発明の詳細な説明
以下に、本発明が詳細に説明される。特段の記載がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。第１の層もしくは物体が、第２の層もしくは物体の上に配置されるように指定される場合、第１の層もしくは物体は、第２の層もしくは物体の上に直接配置しても良いし、又は第１の層もしくは物体と第２の層もしくは物体との間に別の層もしくは物体が存在しても良い。
【０００８】
本発明の多臓器チップ装置は、異なる機能を有する多数の層から構成される。多臓器チップは、ベース層、臓器層、任意選択の臓器保持層、空洞層、及びアクチュエータ層を備える。
【０００９】
ベース層は、多臓器チップ装置を容易に取り扱い、容易に操作できるように別の層の固体支持層となるように構成されている。好ましくは、前記ベース層は、透明な材料から形成される。これは、臓器層に底面から光学的にアクセス可能であり、顕微鏡、例えば、二光子顕微鏡によって培養中に臓器成長セクションのオルガノイドを観察できるという利点を有する。ベース層が透明な材料から形成されるため、臓器層は、底面からアクセス可能であり、局所間質液ｐＨ測定のための蛍光比イメージング、間質液ｐＯ２のリン光消光顕微鏡検査、及び生理学的ストレスを検出する赤外線分光法を可能にする。
【００１０】
ベース層に好ましい材料として、ガラス及び任意選択の光学的に透明な合成ポリマー、例えば、ポリスチロール（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリシロキサン、及び／又はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が挙げられる。
【００１１】
装置の状態を監視して、オルガノイドの制御された培養を可能にするために、ベース層は、１つ以上の臓器等価物、臓器成長セクション、及び／又は自立培養系から送信される信号を測定し、かつ／又は１つ以上の臓器等価物、臓器成長セクション、及び／又は自立培養系に信号を送信するように構成され配置された１つ以上のセンサを備えることができる。たとえ少量のサンプルでも正確な測定を可能にするために高感度のセンサが使用される。好ましくは、ベース層は、ヒト生物恒常性の主なパラメータ、例えば、オルガノイドもしくは細胞の生存度、温度、ｐＨ、体液平衡、圧力、流量、酸素圧もしくは酸素消費、栄養消費、流体吸着、腸液分泌、アルブミン合成、胆汁合成、尿素排泄、イオン平衡、オスモル濃度、及び電気的結合を検出するセンサを備える。使用できるセンサとして、限定されるものではないが、ｐＨセンサ、ｐＯ２センサ、分析物捕捉センサ、導電率センサ、プラズモン共鳴センサ、温度センサ、ＣＯ２センサ、ＮＯセンサ、走化性センサ、サイトカインセンサ、イオンセンサ、圧力センサ、電位差センサ、電流測定センサ、貫流センサ、充填センサ、インピーダンスセンサ、電磁場センサ、表面音響波センサ、及び代謝センサが挙げられる。好ましくは、ベース層は、少なくとも以下のセンサのセットを備える：
・臓器層の自立循環系の流体中のｐＯ２を測定するように構成され配置された２つのｐＯ２センサであって、好ましくは、１つのｐＯ２センサは、細動脈輸送チャネルの起源である肺等価物の近傍の細動脈輸送チャネルの下に位置し、もう１つのｐＯ２センサは、細静脈輸送チャネルの起源である肺等価物の近傍の細静脈輸送チャネルの下に位置する、２つのｐＯ２センサ；
・自立循環系の漏れを検出する４つの経上皮／内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）センサ（２つのＴＥＥＲセンサ間の抵抗が０の場合は、漏れの可能性が高い）であって、好ましくは、２つのＴＥＥＲセンサは、自立循環系内に位置し、例えば、１つのＴＥＥＲセンサが、細動脈輸送チャネルの起源である肺等価物の近傍に位置し、もう１つのＴＥＥＲセンサは、細動脈輸送チャネルの起源である肺等価物から最も離れた細動脈輸送チャネルの端部に位置し、残りの２つのＴＥＥＲセンサは、肺等価物内で構成され配置され、任意選択で、細胞壁、例えば、臓器と血流との間の上皮細胞壁又は内皮細胞壁の機能を監視するために一緒に皮膚又は腸等価物内で構成され配置された２つの追加のＴＥＥＲセンサが存在しても良い、４つのＴＥＥＲセンサ；
・生物学的ニューロン神経節に結合され、臓器等価物中のこのような神経節に接触するように構成され配置された電気センサ。
【００１２】
本発明の多臓器チップは、ベース層の上に位置する臓器層を備える。臓器層は、それぞれ１つ以上の臓器成長セクションを有する多数の個々の臓器等価物を備えるように構成されている。臓器層の各臓器成長セクションは、特定の臓器型の１つのオルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを備えるように構成されている。各臓器成長セクションは、臓器成長セクションのオルガノイドキャビティと臓器層の自立循環系との間を流体連通させる微小入口及び微小出口を備えるように構成されている。臓器層は、臓器：肺、小腸、脾臓、膵臓、肝臓、腎臓、及び骨髄をそれぞれ表現するように構成された少なくとも１つの臓器等価物を含む。臓器層は、追加の臓器等価物、例えば、皮膚、精巣、脳、及び／又は脂肪組織の臓器等価物を含み得る。さらに、臓器層は、臓器等価物の臓器成長セクションの微小入口及び微小出口を介して臓器層の臓器成長セクションに直接流体連通するように構成された自立循環系を含む。
【００１３】
本明細書で使用される「臓器等価物」という語は、オルガノイド又は１つの特定の臓器型を含む全ての臓器成長セクションを指す。生物、例えば、ヒト生物の全ての臓器及び系は、多数の同一の機能的に自立した構造単位、オルガノイド単位によって構築される。これらのオルガノイド単位は、いくつかの細胞層から最大数ミリメートルと非常に小さい。肝小葉、腎臓のネフロン、皮膚の真皮及び表皮、腸粘膜、膵臓のランゲルハンス島、大脳皮質及び小脳の灰白質及び白質、並びに成人静止状態促進幹細胞ニッチは、このようなヒトオルガノイド構造の少数の例であり、これらの全てが、顕著な機能及び可変性の高い複合ジオメトリを有する。顕著な機能、それぞれの臓器内のこのような微小オルガノイドの高度の自立性及び多様性により、任意の物質に対するこれらの反応パターンが、臓器全体を表現するようである。自然は、生物及び系の最も顕著な機能を実現する非常に小さいが精巧な生物構造を創出した。所与の臓器内のこれらのオルガノイド構造の増殖は、臓器の部分損傷の際に機能の全てを失うのを防止する自然のリスク管理ツールである。他方、この概念は、１つの機能的なオルガノイド単位を構築するために確立されたマスタープランをなお使用した、所与の種、例えば、マウス及びヒトの肝臓の要求に対する臓器のサイズ及び形状の容易な調整を可能にした。ヒト曝露について予測する物質試験のユニークかつ顕著な可能性は、インビトロでのヒト微小オルガノイドの等価物の確立にある。本発明では、「オルガノイド」とは、少なくとも１つの臓器又は組織の機能を示す、好ましくは、大部分又は事実上全ての臓器又は組織の機能を示す、インビトロで様々な種類の細胞の人工的に新たに作製された機能性細胞凝集体を指す。従って、本発明の多臓器チップ装置では、臓器等価物は、１つ以上の臓器成長セクションによって表され、各臓器成長セクションは、それぞれの臓器型の１つのオルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを備える。従って、臓器等価物のサイズは、それぞれの臓器型の臓器成長セクション又はオルガノイドの適切な数を選択することによって容易に調整することができる。
【００１４】
当業者であれば、所与の臓器のオルガノイドの構造を十分に認識しており、前記オルガノイドの作製方法を知っている。以下に、特定の臓器のオルガノイドの一部の例が示されている：肺の肺胞形成オルガノイド、膵臓のランゲルハンス島形成オルガノイド、脾臓の白色髄及び赤色髄形成オルガノイド、小腸の絨毛形成オルガノイド、肝臓の小葉形成オルガノイド、腎臓のネフロン形成オルガノイド、骨髄の単位、骨髄の骨及び軟骨形成オルガノイド、皮膚の突起形成単位、脂肪組織のクラスター形成オルガノイド、精巣の小胞形成オルガノイド、及び脳の大脳皮質形成オルガノイド。
【００１５】
肝臓オルガノイドは、体積が１．２〜２．２ｍｍ３の六角形の肺小葉とすることができる。
肺オルガノイドは、表面積が０．１５〜０．２５ｍｍ２の球状の肺胞とすることができる。
膵臓オルガノイドは、全て球状にまとめられ、外分泌組織によって取り囲まれた、体積が０．２〜０．５ｍｍ３のランゲルハンス島とすることができる。
脾臓オルガノイドは、体積が０．３〜０．６ｍｍ３の球状の白色髄及び赤色髄組織とすることができる。
小腸オルガノイドは、表面積が０．２〜０．４ｍｍ２の柱状の絨毛とすることができる。
腎臓オルガノイドは、球状嚢及び円柱細管を有する、ろ過表面積が６〜７．５ｍｍ２の腎臓ネフロンとすることができる。
骨髄オルガノイドは、骨髄、骨、及び軟骨から形成された、体積が０．００６〜０．００８ｍｍ３のマクロ多孔質形状の単位とすることができる。
皮膚オルガノイドは、表面積が１．２〜２ｍｍ２の、突起を含む六角形のセグメントとすることができる。
脂肪組織オルガノイドは、体積が０．０００４〜０．０００６ｍｍ３の球状の脂肪クラスターとすることができる。
精巣オルガノイドは、体積が０．００６〜０．００８ｍｍ３の球状の精巣小胞とすることができる。
脳オルガノイドは、表面積が０．０２〜０．０３ｍｍ２の円柱状の大脳皮質コラムとすることができる。
【００１６】
臓器層は：
・肝臓等価物の臓器成長セクションが、５〜１５の肝臓オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各肝臓オルガノイドが、肝小葉であり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、１０の肝臓オルガノイドを収容するように構成され；
・肺等価物の臓器成長セクションが、２０００〜４０００の肺オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各肺オルガノイドが、肺胞であり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、３０００の肺オルガノイドを収容するように構成され；
・膵臓等価物の臓器成長セクションが、５〜１５の膵臓オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各膵臓オルガノイドが、ランゲルハンス島であり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、１０の膵臓オルガノイドを収容するように構成され；
・脾臓等価物の臓器成長セクションが、５〜１５の脾臓オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各脾臓オルガノイドが、白色髄及び赤色髄であり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、１０の脾臓オルガノイドを収容するように構成され；
・小腸等価物の臓器成長セクションが、４０〜８０の小腸オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各小腸オルガノイドが、絨毛であり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、６０の小腸オルガノイドを収容するように構成され；
・腎臓等価物の臓器成長セクションが、１０〜３０の腎臓オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各腎臓オルガノイドが、ネフロンであり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、２０の腎臓オルガノイドを収容するように構成され；かつ
・骨髄等価物の臓器成長セクションが、１０００〜２０００の骨髄オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各骨髄オルガノイドが、骨髄、骨、及び軟骨から形成される単位であり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、１４００の骨髄オルガノイドを収容するように構成されるよう設計することができる。
【００１７】
加えて、臓器層は：
・皮膚等価物の臓器成長セクションが、１０〜２０の皮膚オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各皮膚オルガノイドが、皮膚突起であり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、１５の皮膚オルガノイドを収容するように構成され；
・脂肪組織等価物の臓器成長セクションが、２００，０００〜３００，０００の脂肪組織オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各脂肪組織オルガノイドが、脂肪クラスターであり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、２４０，０００の脂肪組織オルガノイドを収容するように構成され；
・精巣等価物の臓器成長セクションが、１０〜２０の精巣オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各精巣オルガノイドが、精巣小胞であり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、１５の精巣オルガノイドを収容するように構成され；かつ
・脳等価物の臓器成長セクションが、１００〜３００の脳オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各脳オルガノイドが、大脳皮質コラムであり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、２００の脳オルガノイドを収容するように構成されるよう設計することができる。
【００１８】
臓器等価物のそれぞれは、哺乳動物、好ましくはヒトのそれぞれの臓器に平均的に存在するオルガノイドの数に比例した数のオルガノイドを収容するように構成することができる。生物を表現するためには、生物の生理学的条件下での臓器のサイズに相対的比例を反映させるように本発明の多臓器チップ装置の全ての臓器等価物のサイズを選択すると有利である。好ましくは、多臓器チップ装置の全ての臓器等価物は、同じ所定の比例因子によってサイズが縮小される。この比例因子は、多臓器チップ装置の目的とするサイズによって異なり得るが、好ましくは、比例因子は０．００００１（１／１００，０００）である。ヒト生物が表現される場合は、多臓器チップ装置は、好ましくは：
１つの肝臓オルガノイド、
３００の肺オルガノイド、
１つの膵臓オルガノイド、
１つの脾臓オルガノイド、
６つの小腸オルガノイド、
２つの腎臓オルガノイド、
１４０の骨髄オルガノイド、及び任意選択の
１つ又は２つの皮膚オルガノイド、
２４，０００の脂肪オルガノイド、
１つ又は２つの精巣オルガノイド、
２０の脳オルガノイド、
又はこれらの倍数を備えるように構成される。
【００１９】
特に好ましい一実施形態では、多臓器チップ装置は、好ましくは：
１０の肝臓オルガノイド、
３０００の肺オルガノイド、
１０の膵臓オルガノイド、
１０の脾臓オルガノイド、
６０の小腸オルガノイド、
２０の腎臓オルガノイド、
１４００の骨髄オルガノイド、及び任意選択の
１５の皮膚オルガノイド、
２４０，０００の脂肪オルガノイド、
１５の精巣オルガノイド、
２００の脳オルガノイド
又はこれらの倍数を備えるように構成される。
【００２０】
好ましくは、臓器成長セクションは、１つ以上の幹細胞ニッチをさらに含む。長期間に亘って恒常性条件下で作動することができる系を提供するためには、オルガノイド内での細胞のターンオーバーを促進することができる細胞源を設けると有利である。各臓器は、臓器の細胞が新しい細胞に代わる特定のターンオーバー時間を有する。臓器のこの細胞ターンオーバーは、臓器の細胞に活力を与え、この細胞が十分に機能するようにする。前記ターンオーバーは、多臓器チップ装置の１つ、いくつか、又は全ての臓器等価物に幹細胞ニッチを導入することによって再現することができる。前記幹細胞ニッチは、臓器等価物の１つ、いくつか、又は全ての臓器成長セクションの一部とすることができる。
【００２１】
臓器キャビティ及び幹細胞ニッチを含むこのような臓器成長セクションの構造及び製造方法は、参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１２／０１６７１１Ａｌ号パンフレット及び国際公開第２００９／１４６９１１Ａ２号パンフレットに既に記載されている。
【００２２】
臓器層は、適切な材料から形成することができる。好ましい材料として、ＳｉＯ２、ガラス、及び合成ポリマーが挙げられる。好ましい合成ポリマーとして、ポリスチロール（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリフェニレンニレンスルフィド（ＰＰＳＥ）、エポキシド樹脂（ＥＰ）、不飽和ポリエステル（ＵＰ）５フェノール樹脂（ＰＦ）、ポリシロキサン、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、メラミン樹脂（ＭＦ）、シアン酸エステル（ＣＡ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、及びこれらの混合物が挙げられる。特に好ましい合成ポリマーとしては、光学的に透明であり、例えば、ポリスチロール（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、及びポリシロキサン、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が挙げられる。特に好ましい材料としては、ＰＤＭＳが挙げられる。
【００２３】
臓器層は、自立循環系を含む。自立循環系は、生物の血管系を再現するように設計され、従って、本発明の多臓器チップ装置の全ての臓器等価物に栄養、Ｏ２を供給し、かつ臓器等価物間の相互作用及びクロストークを可能にする。前記自立循環系の存在は、多臓器チップ装置全体の恒常性にとって極めて重要である。「自立」という語は、流体が循環系で循環可能であること、好ましくは、流体、例えば、培地、血液、又は血液等価物を外部容器から循環系に連続的に供給するための流体接続が存在しないことを指す。これに関連して、「外部」とは、容器が、循環系又は多臓器チップ装置の一体部分ではない、例えば、チューブを介して循環系に接続されていないことを意味する。物質、例えば、栄養物及び／又は流体をインキュベーション中に補充しなければならない場合は、このような栄養物又は流体が、注入ポートを介して不連続的に供給され、この注入ポートが、好ましくは、循環系の細動脈もしくは細静脈輸送チャネルに位置する、又は空洞層に位置するのが好ましい。
【００２４】
自立循環系は、前記臓器成長セクションの微小入口及び微小出口を介して、臓器層の臓器等価物の臓器成長セクションに直接流体連通するように構成されている。このような自立循環系の構造及び製造方法は、参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１２／０１６７１１  Ａ１号パンフレットに既に記載されている。自立循環系の内面は、内皮細胞及び任意選択の平滑筋細胞で覆うことができる。
【００２５】
自立循環系は：
肺等価物の臓器成長セクションの微小出口を前記臓器成長セクションの微小入口に直接接続して、多量のｐＯ２を含む流体の臓器層の臓器成長セクションへの輸送を可能にする細動脈輸送チャネル；及び
臓器成長セクションの微小出口を肺等価物の臓器成長セクションの微小入口に直接接続して、少量のｐＯ２を含む流体の臓器成長セクションから肺等価物への輸送を可能にする細静脈輸送チャネルを備える。
【００２６】
自立循環系は、栄養物及びＯ２を臓器等価物に輸送できる流体で満たすことができる。好ましくは、前記流体は血液又は血液等価物である。
【００２７】
自立循環系内の流体は、多臓器チップ装置のアクチュエータ層のアクチュエータの共同作用によって誘導される方向に循環する。こうすることにより、生物の血管系の圧力に対応する循環系内の十分な圧力を再現するだけではなく、心拍動も再現することが可能である。従って、本発明の多臓器チップ装置の自立循環系は、生理学的条件下で見られる状況に対応する微小環境及びせん断力を実現するのに適している。
【００２８】
自立循環系は、小腸等価物、脾臓等価物、及び膵臓等価物の臓器成長セクションの微小出口が、互いに直接流体連通し、かつ肝臓等価物の臓器成長セクションの追加の微小入口と直接流体連通して接続されるように構成することができ、これにより、脾臓等価物、膵臓等価物、小腸等価物、及び肝臓等価物間の流体連通が可能となり、脾臓等価物、膵臓等価物、及び小腸等価物から自立循環系の細静脈輸送チャネルに向かう流体連通が、肝臓等価物を通る通路によってのみ実現し得る。この構成により、高等生物、例えば、ヒトの消化系の基本機能を再現することが可能となる。このような構成の利点は、空洞層に位置する容器から小腸等価物に栄養物を供給することによって、多臓器チップ装置を長期間に亘って培養できることである。次いで、本発明の多臓器チップ装置の臓器等価物に、消化系を通過した栄養物を供給することができる。従って、栄養物は、生物中の生理学的条件とほぼ同等の形式及び要領で供給される。従って、臓器等価物に供給するために常に循環系に供給される外部培地容器をもはや必要としない。
【００２９】
自立循環系及び臓器等価物は、好ましくは、肺等価物を起源とする細動脈輸送チャネルが、この細動脈チャネルが分岐して臓器等価物に供給する分岐部を流れ方向に有するように構成される。所与の臓器等価物を通過する流体は、それぞれの分岐部で細静脈輸送チャネルから分岐した細静脈チャネルによって細静脈輸送チャネルに戻される。好ましくは、自立循環系及び臓器等価物は、肺等価物を起源とする細動脈輸送チャネルが、流れ方向に：
・第１の細動脈チャネルが分岐して小腸等価物、脾臓等価物、及び膵臓等価物に供給する第１の分岐部；
・第２の細動脈チャネルが分岐して肝臓等価物に供給する第２の分岐部；
・第３の細動脈チャネルが分岐して腎臓等価物に供給する第３の分岐部；
・第４の細動脈チャネルが分岐して腎臓等価物に供給する第４の分岐部；
・第５の細動脈チャネルが分岐して骨髄に供給する第５の分岐部；
・第６の細動脈チャネルが分岐して皮膚等価物に供給する任意選択の第６の分岐部；
・第７の細動脈チャネルが分岐して脂肪組織等価物に供給する任意選択の第７の分岐部；
・第８の細動脈チャネルが分岐して精巣等価物に供給する任意選択の第８の分岐部；及び
・第９の細動脈チャネルが分岐して脳等価物に供給する任意選択の第９の分岐部を有するように構成される。
【００３０】
自立循環系は、流れ方向の細動脈輸送チャネルの直径が、肺等価物から所与の距離にある全ての分岐部を含む全ての細動脈輸送チャネルの断面積の合計が一定に維持されるよう常に縮小されるように構成され、細静脈輸送チャネルでは、前記直径の縮小が、肺等価物から所与の距離にある全ての分岐部を含む全ての細静脈輸送チャネルの断面積の合計が一定に維持されるように流れ方向において常に元に戻される。
【００３１】
臓器層は、臓器成長セクションのオルガノイドキャビティがベース層の反対側で開口するように構成することができる。これにより、多臓器チップ装置が完全に組み立てられる前に、オルガノイド又は前駆細胞をそれぞれのオルガノイドキャビティに導入することが可能となる。この場合、多臓器チップ装置は、存在しない場合に任意選択の臓器保持層をさらに備える。臓器保持層は、臓器層と空洞層との間に配置される。臓器保持層は、選択された臓器等価物に対して空洞層との連通が維持されるように臓器層を密閉し、かつ／又は安定させるように構成されている。臓器保持層は、５０〜５００μｍの厚さ、好ましくは１００〜３００μｍの厚さ、より好ましくは２００μｍの厚さの層として設けることができる。臓器保持層は、合成ポリマー、例えば、ポリスチロール（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリシロキサン、及び／又はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む材料、又はこれらからなる材料から形成することができる。好ましくは、この材料は、ポリカーボネートを含む、又はポリカーボネートからなる。特に、臓器保持層が、腎臓、肝臓、脾臓、及び小腸のように排泄機能を有し、かつ／又はかなりの量の間質液を産生する臓器等価物を覆う領域では、臓器保持層は、臓器層と空洞層との間の流体連通を可能にするように構成されている。この流体連通は、臓器保持層内に孔を設けることによって、好ましくは、平均直径が５〜７μｍの孔を設けることによって達成することができる。あるいは、又はこれに加えて、臓器層と臓器保持層との間の流体連通を可能にする領域における臓器保持層の厚さは、５〜１５μｍ、好ましくは１０μｍの平均厚さに減少させることができる。
【００３２】
本発明の多臓器チップ装置は、臓器層の上に配置された空洞層を備える。空洞層は、この空洞層のキャビティと臓器層の臓器成長セクションとの間の流体交換を可能にするために、選択された臓器等価物又は臓器成長セクションと流体連通するように配置された多数のキャビティ及びチューブを備えるように構成されている。多数の臓器は、排泄機能を有し、かつ／又はかなりの量の間質液を産生し、このような間質液は、長期間の培養又はインキュベーションを考えている場合は逃がさなければならない。自立循環系の流体は、交換及び補充なしで常に循環するため、この系から分解産物を逃がすことが必須である。特に、腎臓等価物に溜まった尿及び小腸等価物から生じる排泄物は、恒常性条件下での長期間に亘る多臓器チップ装置の動作を可能にするために系から除去しなければならない。さらに、培地が系に常に供給されるため、小腸等価物に栄養物を供給するための容器が必要である。好ましくは、この栄養物容器は、臓器層自体の中に配置されるのではなく、空洞層の中に配置される。これにより、臓器層と直接相互作用することなく、多臓器チップ装置の動作中に栄養物容器に不連続に補充することができる。
【００３３】
空洞層は：
小腸等価物の上に位置し、かつ小腸等価物に栄養物容器から栄養物を供給することができるように小腸等価物及び栄養物容器と流体連通したキャビティ；
小腸等価物の上に位置し、かつ小腸等価物から排泄される物質を排泄物容器に輸送することができるように小腸等価物及び排泄物容器と流体連通したキャビティ；
肝臓等価物の上に位置し、かつ肝臓等価物から排泄される物質を小腸等価物の上に位置するキャビティに輸送することができるように小腸等価物の上に位置するキャビティ及び肝臓等価物と流体連通したキャビティ；及び
腎臓等価物の上に位置し、かつ尿容器が腎臓等価物から排泄される物質を受け取るように腎臓等価物及び尿容器に流体連通したキャビティを備えるように構成することができる。
【００３４】
栄養物容器、排泄物容器、及び尿容器は、空洞層の一体部分である。
【００３５】
空洞層は、化合物、例えば、試験化合物の自立循環系への導入、及び自立循環系の流体からのサンプルの採取を可能にするポートをさらに備えることができる。
【００３６】
本発明の多臓器チップ装置は空洞層を備える。アクチュエータ層は、選択された臓器等価物、自立循環系、及び／又はそれらの一部にかかる圧力を制御するように配置され構成された多数のアクチュエータを含むように構成されている。恒常性条件下で生物が生存するためには、系内での制御された運動及び力の印加を確実にする必要がある。明らかに、血管内の血液は、適切な機能を果たすために移動しなければならない。しかしながら、腸蠕動運動も必要であり、さらに空気の流れを可能にするために肺の圧縮及び減圧も必要である。本発明の多臓器チップ装置では、前記運動又は力の導入が、アクチュエータ層のアクチュエータによって促進される。アクチュエータ層内のアクチュエータ要素の構成及び配置は、多臓器チップ装置の全体構造、特に臓器層内の臓器等価物の配置によって決まる。アクチュエータは、臓器等価物、自立循環系、又はそれらの一部に圧力を加えるように構成された空気圧式アクチュエータとして実施することができる。これらのアクチュエータは、プログラム可能とすることができる外部装置によって制御することができる。
【００３７】
好ましくは、アクチュエータ層は：
心拍動を再現するために、有向流体運動を可能にするように自立循環系に作用する１つ以上のアクチュエータ；
腸蠕動運動を再現するために、有向運動を可能にするように空洞層に作用する１つ以上のアクチュエータ；
呼吸を再現するために、空気の流れを可能にするように肺等価物に作用する１つ以上のアクチュエータ；
骨の圧縮を再現するために、制御された圧縮を可能にするように骨髄等価物に作用する１つ以上のアクチュエータ；
細動脈の収縮を再現するために、自立循環系の細動脈輸送チャネルに作用する１つ以上のアクチュエータ；
肝臓等価物から胆汁を逃がすために、有向流体運動を可能にするように肝臓等価物に作用する１つ以上のアクチュエータ；及び
腎臓等価物から尿を逃がすために、有向流体運動を可能にするように空洞層に作用する１つ以上のアクチュエータを備える。
【００３８】
本発明の多臓器チップ装置の好ましい一実施形態では、臓器層は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む、又はＰＤＭＳからなり、臓器ホルダーは、ポリカーボネートを含む、又はポリカーボネートからなり、空洞層は、ＰＤＭＳを含む、又はＰＤＭＳからなり、かつ／又はアクチュエータ層は、ポリカーボネートを含む、又はポリカーボネートからなる。
【００３９】
本発明は、オルガノイド、細胞、及び流体を含まない、上記定義され特許請求の範囲で規定される多臓器チップ装置に関する。本発明はまた、上記定義された、オルガノイド、細胞、及び流体をそれぞれ含む多臓器チップ装置にも関する。
【００４０】
本発明の多臓器チップは、恒常性条件で長期間動作する潜在力、及び生理学的生物に近いことによって特徴付けられる。多臓器チップは、この装置に存在する臓器等価物の内容物及び構造によって、様々な状況に適用することができる。全身安全性試験、免疫モデル、感染モデル、及び／又は腫瘍モデルへの適用に加えて、本発明の多臓器チップ装置の好ましい使用が以下に示される。
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【００４１】
ほんの一例として、本発明が以下に詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、全ての層構造を備えた本発明の多臓器チップ装置の一実施形態の概略全体図を示している。
【図２】図２は、図１の実施形態のアクチュエータ層の概略上面図を示している。
【図３】図３は、図１の実施形態の空洞層の概略上面図を示している。
【図４】図４は、図１の実施形態の臓器保持層の概略上面図を示している。
【図５】図５は、図１の実施形態の臓器層の概略上面図を示している。
【図６】図６は、図１の実施形態のベース層の概略上面図を示している。
【図７】図７ａは、一目で分かるように微小流体多臓器チップ（ＭＯＣ）装置を示している。ポリカーボネートＣＰ、２つの微小血管系（設置面積：７６ｍｍ×２５ｍｍ；高さ：３ｍｍ）及び加熱可能なＭＯＣホルダーを収容するＰＤＭＳガラスチップを備える装置の組立分解図。図７ｂは、一目で分かるように微小流体多臓器チップ（ＭＯＣ）装置を示している。連続的に配置されたＰＤＭＳ膜（厚さ：５００μｍ）のプログラムされた周期的な圧縮及び減圧によって動作する蠕動オンチップ微小ポンプの断面図；矢印は流れの方向を示している。図７ｃは、一目で分かるように微小流体多臓器チップ（ＭＯＣ）装置を示している。それぞれ２つのインサート領域（区画）（インサートの直径：５ｍｍ）を収容する２つの別個の微小流体回路（チャネルの高さ：１００μｍ；幅：５００μｍ）を例示するＭＯＣのレイアウトの上面図。各回路のスポットＡ及びＢは、非侵襲性の流体の流れ及び細胞の分析の位置を指定する。
【図８ａ】図８ａは、図７のＭＯＣにおける流体力学の評価を示している。流体の流れの拍動特性を実証する、２つの別個の流体の流れの分析スポットで測定された全ポンピングサイクル（周波数：０．４６７Ｈｚ）の４つの段階に亘る例示的な速度プロフィール（黒丸＝開いた弁、白丸＝閉じた弁）。
【図８ｂ】図８ｂは、図７のＭＯＣにおける流体力学の評価を示している。両方のスポットでポンピング周波数（Ｈｚ）に対してプロットされた平均速度の大きさ（ｍｍ／秒）及び対応するせん断応力（ｄｙｎ／ｃｍ２）。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
実施例：
実施例１：本発明の多臓器チップ装置
図１に示されているように、多臓器チップ装置１は、ベース層３、臓器層６、臓器保持層５、空洞層４、及びアクチュエータ層２を備える。
【００４４】
図６に示されているように、ベース層３は、さらなる層の固定支持体となるように構成されている。ベース層３は、ガラス、又は透明な合成ポリマー、例えば、ポリスチロール（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリシロキサン、及び／又はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から形成される。ベース層３は、系を監視及び制御するように設計され配置された多数のセンサ３２及び３３も備える。これらのセンサ３２の一部は、臓器層の臓器等価物に電気刺激を加えるように構成され、他のセンサ３３は、適切な機能を保障するために系のパラメータを測定するように構成されている。ベース層３は、センサによって得られたデータを抽出することができるポート備え、このデータは、他の目的、例えば、系の制御に使用される。
【００４５】
臓器層６が図５に示されている。臓器層６は、ベース層３の上に配置され、ＰＤＭＳから形成され、かつ多数の個々の臓器等価物を含むように構成され、各臓器等価物は、１つ以上の臓器成長セクションを備え、各臓器成長セクションは、所与の臓器の少なくとも１つのオルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを備えるように構成されている。臓器層６は、肺等価物２２、小腸等価物２１、脾臓等価物２３、膵臓等価物２４、肝臓等価物２５、腎臓等価物２６、骨髄等価物２７、脂肪組織等価物２８、脳等価物２９、精巣等価物３０、及び皮膚等価物３１を含む。各臓器成長セクションは、臓器成長セクションのオルガノイドキャビティと自立循環系３４との間の流体連通のための微小入口及び微小出口を備える。自立循環系３４は、臓器成長セクションの微小入口及び微小出口を介して臓器層６の臓器成長セクションと直接流体連通するように構成されている。自立循環系３４は、肺等価物２２の臓器成長セクションの微小出口を臓器層６の他の全ての臓器成長セクションの微小入口に直接接続して、多量のｐＯ２を含む流体の前記臓器成長セクションへの輸送を可能にする細動脈輸送チャネル；及び臓器成長セクションの微小出口を肺等価物２２の臓器成長セクションの微小入口に直接接続して、少量のｐＯ２を含む流体の臓器成長セクションから肺等価物２２への輸送を可能にする細動脈輸送チャネルを備える。自立循環系３４は、小腸等価物、脾臓等価物、及び膵臓等価物２１、２３、２４の臓器成長セクションの微小出口が、互いに直接流体連通し、かつ肝臓等価物２５の臓器成長セクションの追加の微小出口に直接流体連通するように構成され、これにより、脾臓等価物、膵臓等価物、小腸等価物、及び肝臓等価物２３、２４、２１、２５間の流体連通が可能となり、脾臓等価物、膵臓等価物、及び小腸等価物２３、２４、２１から自立循環系３４の細静脈輸送チャネルに向かう流体連通が、肝臓等価物２５を通る通路によってのみ実現し得る。臓器等価物及び自立循環系３４は、肺等価物２２を起源とする細動脈輸送チャネルが、流れ方向に：
・第１の細動脈チャネルが分岐して小腸等価物、脾臓等価物、及び膵臓等価物２１、２３、及び２４に供給する第１の分岐部；
・第２の細動脈チャネルが分岐して肝臓等価物２５に供給する第２の分岐部；
・第３の細動脈チャネルが分岐して腎臓等価物２６に供給する第３の分岐部；
・第４の細動脈チャネルが分岐して骨髄等価物２７に供給する第４の分岐部；
・第５の細動脈チャネルが分岐して皮膚等価物３１に供給する任意選択の第５の分岐部；
・第６の細動脈チャネルが分岐して脂肪組織等価物２８に供給する第６の分岐部；
・第７の細動脈チャネルが分岐して精巣等価物３０に供給する第７の分岐部；及び
・第８の細動脈チャネルが分岐して脳等価物２９に供給する第８の分岐部を有するように構成されている。
【００４６】
（肺等価物２２から他の臓器等価物に向かう）流れ方向における細動脈輸送チャネルの直径は、肺等価物２２から所与の距離にある全ての分岐部を含む全ての細動脈輸送チャネルの断面積の合計が一定に維持されるように常に縮小されるように構成され、細静脈輸送チャネルでは、前記直径の縮小が、肺等価物から所与の距離にある全ての分岐部を含む全ての細静脈輸送チャネルの断面積の合計が一定に維持されるように（他の臓器等価物から肺等価物２２に向かう）流れ方向において常に元に戻される。
【００４７】
臓器等価物はそれぞれ、哺乳動物、好ましくはヒトのそれぞれの臓器に平均的に存在するオルガノイドの数に比例した数のオルガノイドを収容するように構成され、多臓器チップ装置の全ての臓器等価物は、同じ所定の比例因子、例えば、０．００００１（１／１００，０００）の因子によってサイズが縮小される。
【００４８】
臓器層６は：
・肝臓等価物２５の臓器成長セクションが、５〜１５の肝臓オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各肝臓オルガノイドが肝小葉であり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、１０の肝臓オルガノイドを収容するように構成され；
・肺等価物２２の臓器成長セクションが、２０００〜４０００の肺オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各肺オルガノイドが肺胞であり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、３０００の肺オルガノイドを収容するように構成され；
・膵臓等価物２４の臓器成長セクションが、５〜１５の膵臓オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各膵臓オルガノイドがランゲルハンス島であり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、１０の膵臓オルガノイドを収容するように構成され；
・脾臓等価物２３の臓器成長セクションが、５〜１５の脾臓オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各脾臓オルガノイドが白色髄及び赤色髄であり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、１０の脾臓オルガノイドを収容するように構成され；
・小腸等価物２１の臓器成長セクションが、４０〜８０の小腸オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各小腸オルガノイドが絨毛であり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、６０の小腸オルガノイドを収容するように構成され；
・腎臓等価物２６の臓器成長セクションが、１０〜３０の腎臓オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各腎臓オルガノイドがネフロンであり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、２０の腎臓オルガノイドを収容するように構成され；
・骨髄等価物２７の臓器成長セクションが、１０００〜２０００の骨髄オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各骨髄オルガノイドが、骨髄、骨、及び軟骨から形成される単位であり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、１４００の骨髄オルガノイドを収容するように構成される；
・皮膚等価物３１の臓器成長セクションが、１０〜１５の皮膚オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各皮膚オルガノイドが皮膚突起であり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、１５の皮膚オルガノイドを収容するように構成され；
・脂肪組織等価物２８の臓器成長セクションが、２００，０００〜３００，０００の脂肪組織オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各脂肪組織オルガノイドが脂肪クラスターであり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、２４０，０００の脂肪組織オルガノイドを収容するように構成され；
・精巣等価物３０の臓器成長セクションが、１０〜２０の精巣オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各精巣オルガノイドが精巣小胞であり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、１５の精巣オルガノイドを収容するように構成され；かつ
・脳等価物２９の臓器成長セクションが、１５０〜２５０の脳オルガノイドを収容するオルガノイドキャビティを画定するように構成され、各脳オルガノイドが大脳皮質コラムであり、好ましくは、オルガノイドキャビティが、２００の脳オルガノイドを収容するように構成されるよう設計される。
【００４９】
以下の表２では、高さが３ｍｍのＰＤＭＳ層から形成された臓器層６に対してパラメータが与えられる。
2015535688.tif 000004
【００５０】
臓器保持層５は、臓器層６と空洞層４との間に配設されている（図４を参照）。臓器保持層５は、選択された臓器等価物に対して空洞層４との流体連通が維持されるように臓器層６を密閉し、かつ／又は安定させるように構成されている。臓器保持層５は、厚さが２００μｍの層として形成される。臓器保持層５は、ポリカーボネート（ＰＣ）を含む材料、又はＰＣからなる材料から形成される。臓器保持層５が、臓器等価物２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１の１つを覆う領域では、臓器保持層５は、臓器層６と空洞層４との間の流体連通を可能にするように構成されている。特に、臓器保持層５が、腎臓２６、肝臓２５、脾臓２３、及び小腸２１のように排泄機能を有し、かつ／又はかなりの量の間質液を産生する臓器等価物を覆う領域では、この流体連通は、例えば、臓器保持層５内に孔を設けることによって、好ましくは、平均直径が５〜７μｍの孔を設けることによって達成することができる。あるいは、又はこれに加えて、臓器層６と空洞層４との間の流体連通を可能にする領域では、臓器保持層５の厚さは、５〜１５μｍ、好ましくは１０μｍの平均厚さに減少させることができる。
【００５１】
空洞層４は、図３に示されており、キャビティと臓器成長セクションとの間の流体交換を可能にするために、臓器層６の選択された臓器等価物又は臓器成長セクションと流体連通するように配置された多数のキャビティ及びチューブを備えるように構成されている。空洞層４は、ＰＤＭＳを含む、又はＰＤＭＳからなる。空洞層４は：
小腸等価物２１の上に位置し、かつ小腸等価物２１に栄養物容器１８から栄養物を供給することができるように小腸等価物２１及び栄養物容器１８と流体連通したキャビティ；
小腸等価物２１の上に位置し、かつ小腸等価物２１から排泄される物質を排泄物容器１９に輸送することができるように小腸等価物２１及び排泄物容器１９と流体連通したキャビティ；
肝臓等価物２５の上に位置し、かつ肝臓等価物２５から排泄される物質を小腸等価物２１の上に位置するキャビティに輸送することができるように小腸等価物２１の上に位置するキャビティ及び肝臓等価物２５と流体連通したキャビティ；及び
腎臓等価物２６の上に位置し、かつ尿容器２０が腎臓等価物２６から排泄される物質を受け取るように腎臓等価物２６及び尿容器２０に流体連通したキャビティを備えるように構成されている。栄養物容器１８、排泄物容器１９、及び尿容器２０は、空洞層４の一体部分であり、好ましくは、外部からアクセスできるように構成される。
【００５２】
アクチュエータ層２は、選択された臓器等価物、自立循環系、及び／又はそれらの一部に加えることができる圧力を制御するように構成され配置された多数のアクチュエータを備えるように構成されている（図２を参照）。このアクチュエータ層はポリカーボネートから形成されている。
【００５３】
アクチュエータ層２は：
心拍動を再現するために、有向流体運動を可能にするように自立循環系３４に作用する３つの圧力式アクチュエータ１０；
腸蠕動運動を再現するために、有向運動を可能にするように空洞層４に作用する３つの蠕動式アクチュエータ１１；
呼吸を再現するために、空気の流れを可能にするように肺等価物２２に作用する１つのアクチュエータ１２；
骨の圧縮を再現するために、制御された圧縮を可能にするように骨髄等価物２７に作用する１つのアクチュエータ１７；
細動脈の収縮を再現するために、自立循環系３４の細動脈輸送チャネルに作用する８つのアクチュエータ１４；
肝臓等価物２５から胆汁を逃がすために、有向流体運動を可能にするように肝臓等価物２５に作用する１つのアクチュエータ１３；及び
腎臓等価物２６から腎臓容器２０に尿を逃がすために、有向流体運動を可能にするように腎臓等価物２６に作用する１つのアクチュエータ１３；及び
脾臓等価物２３に作用する１つのアクチュエータ１３を備える。
【００５４】
さらに、アクチュエータ層は、栄養物容器１８にアクセスするためのポート１６、排泄物容器にアクセスするためのポート１６、尿容器２０にアクセスするためのポート１６、及び自立循環系３４の細静脈輸送チャネルにアクセスするためのポート１６を備える。
【００５５】
実施例２：生物学的脈管構造を本発明の多臓器チップ装置に組み込む
我々は、本発明の多臓器チップ又はヒトチップ装置上で機能的な脈管構造等価物の確立の実現可能性を実証するために、チップ上でヒトの脈管構造−心臓と血管の輸送部分を再現することを目的とした。主にヒトの皮膚の微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）によって十分に覆われた微小チャネル系を通る安定した長期間の流体の流れを維持するチップ上の微小ポンプが確立された。１〜４Ｎ／ｍ２（１０〜４０ｄｙｎ／ｃｍ２）の範囲の安定したせん断応力を加えるＥＣに対するせん断応力の効果を調べる殆どの既存の微小系とは対照的に、異なる実験の設定で以前に使用された反転パターンの拍動せん断応力を目的とする。この実験で使用される微小血管輸送系は、それぞれ最大１００ｍｇのバイオマス収容能力を有する個々の臓器等価物の一体化のために設計された２つの別個の区画を相互接続する。個々の臓器培養区画の領域における血管の分岐部及び直径の減少部を支持して後の臓器の血管新生を支援する特別なインサートを形成した。ＰＤＭＳのソフトリソグラフィ及びレプリカモールディングを利用するラピッドプロトタイピングにより、臓器の数及び臓器の特定の構成に関する設計の柔軟な調整が可能となり、同じ標準的なチップ下部構造の形態を常に順守することができる。さらに、２つの重要な特徴を、殆どの既存の微小流体系の技術的な取り扱いの制約を解消するために実施した：（ｉ）微小系のインキュベータに依存しない動作が、強化チップ支持体によって保障された、及び（ｉｉ）回路チャネルの全ての領域を顕微鏡で観察することができるようになり、リアルタイムのビデオ顕微鏡法が可能となった。
【００５６】
材料及び方法
装置の設計及び製造
我々は、それぞれ別個の蠕動オンチップ微小ポンプによって作動される２つの別個の微小血管回路を収容する微小流体多臓器チップ（ＭＯＣ）装置を設計して製造した。図７は、一目で分かるように系を例示している。カバープレートは、６つの空気圧接続具及び３００μｌの区画を形成する４つのインサートを収容し、それぞれ培地の交換及び後の臓器等価物の一体化に使用される。ＭＯＣホルダーは、３７℃でのＭＯＣの制御された一定のテンパーリングを支援する（図７ａ）。蠕動オンチップ微小ポンプ（図７ｂ）が取り付けられている。微小ポンプソフトウェア制御が、時計回り及び反時計回りの方向の流体の流れを促進する。ポンピング周波数の調整によって流量（Ｑ）を変更することができる。各微小チャネル回路（図７ｃ）は、１０μｌの総体積を有し、さらなる臓器等価物培養用の２つの個々のインサートベースの区画がそれぞれ、最大３００μｌの容積を有する。標準的なＰＤＭＳのソフトリソグラフィ及びレプリカモールディング（Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４，Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ，ＵＳＡ）が、ＭＯＣの製造に適用された。簡単に述べると、シリコンウエハをガラスウエハに接着することによって種型を形成した。シリコンウエハにフォトレジストを塗布し、フォトマスク及びＵＶ光を用いてパターン形成した。続いて、保護されていないシリコン領域をエッチングして、フォトレジストを剥がした。微小系を形成するために、カバープレート（ＣＰ）を、シリコンゴム添加剤（ＷＡＣＫＥＲ（登録商標）ＰＲＩＭＥＲ  Ｇ  ７９０；Ｗａｃｋｅｒ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、８０℃で２０分間処理した。用意したカバープレートを種型（チャネルの高さが１００μｍ、幅が５００μｍ）に嵌めて、ＰＤＭＳ（ＰＤＭＳの硬化剤に対する体積比が１０：１）をこの鋳造ステーションに注入した。このセットアップを少なくとも６０分間、８０℃で保温した。テフロンねじを使用して、４つのＰＤＭＳを含まない培養区画、及び２つのオンチップ微小ポンプを構成する厚さ５００μｍの６つのＰＤＭＳ膜（１つの微小ポンプに付き３枚の膜）を形成した。鋳造ＰＤＭＳスライスは、ＣＰに流体密封接着する。次いで、ＣＰに取り付けられたＰＤＭＳスライスを、低圧プラズマ酸化処理（Ｆｅｍｔｏ；Ｄｉｅｎｅｒ，Ｅｂｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって顕微鏡スライドに不可逆的に接着した。滅菌培地を２つの微小血管回路に迅速に注入して表面の中和を回避した。
【００５７】
流体力学の特徴
我々は、微小流体回路のスポットＡ及びＢ（図７ｃを参照）における流体の流れを特徴付けるために、非侵襲性微小粒子画像速度測定（μＰＩＶ）を行った。簡単に述べると、ＣＭＯＳカメラ（Ｂａｕｍｅｒ  Ｏｐｔｒｏｎｉｃ  ＨＸＣ４０、解像度：２０４８×２０４８画素、インターフェイス：ＣａｍｅｒａＬｉｎｋ；Ｂａｕｍｅｒ  Ｏｐｔｒｏｎｉｃ，Ｒａｄｅｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続された、連続光源として標準的なハロゲンランプを備えたＺｅｉｓｓ  Ｐｒｉｍｏｖｅｒｔ倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、１つの画像に付き４マイクロ秒の露出時間で１５μｍのポリスチレンビーズ（４×１０４ｇ／ｍｌ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の動きを追跡した。低倍率（４×）を選択して、２つのフレーム間のシフトを約５０画素（１画素＝３．２μｍ）に抑制した。ｚ焦点を、それぞれのスポットにおける流体チャネルの中心に設定して（ガラススライドの５０μｍ上）、ピーク速度を検出した。流体チャネルの中心にある検査窓（１０２４画素×１００画素、３．２８ｍｍ×０．３２ｍｍ）を観察して、３，２００フレーム／秒を達成した。最後に、１５，０００フレームの画像スタックを分析して、指定領域におけるｘ成分の変位の最大の相関性を計算するソフトウェアプログラム（Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ  ＩＷＳ，Ｄｒｅｓｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で相関性を調べた。５つの成功したフレームの計算値を平均してアーチファクトを最小化した。次のポンプの設定を全ての実験で使用した：圧力−５０ｋＰａ（５００ｍｂａｒ）；真空−５２ｋＰａ（５２０ｍｂａｒ）；及び気流−３５ｋＰａ（３５０ｍｂａｒ）で１．５Ｌ／分。図７ｃに示されているように、時間依存性を、チップ上の２つの異なる位置（Ａ＋Ｂ）で測定した。
【００５８】
層流は、微小チャネルの中心に最大速度（ｖｍａｘ）を有し、平均せん断応力（τ）を、以下の式を用いて計算することができる。
2015535688.tif 000005
式中、ｖｍａｘはチャネルの中心の平均速度の大きさであり、μは動粘性係数（１ｍＰａ／秒として計算）であり、ｈはチャネル高さ（１００μｍ）である。
【００５９】
細胞の単離及び培養
ＨＤＭＥＣを、若年ドナーの慣習的な割礼後の小児外科手術から得た、同意を得て倫理的に承認されたヒト包皮から単離した。細胞の単離に使用した全ての皮膚サンプルは、除去から１日以内に処置した。単離の前に、包皮を８０％エタノールで３０秒間浄化し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ＰＡＡ，Ｃｏｅｌｂｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ですすいだ。環状の皮膚を広げて、皮下組織を除去した。薄い表皮層を真皮から分離するために、用意した包皮を５ｍｇ／ｍｌのｄｉｓｐａｓｅ  ＩＩ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中、４℃で１５〜１８時間インキュベートした。真皮を切断して小片にし、次いで４ｍｇ／ｍｌのＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＮＢ４溶液（Ｓｅｒｖａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中、３７℃で７５分間インキュベートした。混合物を７０μｍのナイロンフィルタに通し、３００ｇで５分間遠心分離した。得られた細胞ペレットを、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ−Ｐａｃｋ  ＭＶ２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１％Ｐ−Ｓ、及び０．０５％ファンギゾンが添加された内皮細胞増殖培地ＭＶ２（ＥＣＧＭ−ＭＶ２；ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に再懸濁した。細胞をＴ−７５フラスコに播種し、５％ＣＯ２、３７℃で増殖させた。播種の１日後に培地を交換した。最初の播種から２〜５日後に、ＨＤＭＥＣを磁気細胞分離装置（ＭＡＣＳ）によって精製した。細胞を０．０５％（０．５ｍｇ／ｍｌ）トリプシン／ＥＤＴＡ（ＰＡＡ，Ｃｏｅｌｂｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で収集し、ＣＤ３１マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＥＣの陽性選択を製造者の取扱説明書に従って行った。Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ−Ｐａｃｋ  ＭＶ２及び１％Ｐ−Ｓ（完全ＥＣＧＭ−ＭＶ２）が添加されたＥＣＧＭ−ＭＶ２を用いて細胞をカラムから溶出させた。単離された細胞の純度制御を、ＦＡＣＳ分析によって各ＭＡＣＳの後に直接行った。必要な場合は、細胞の９０％超がＣＤ３１陽性となるまで分離サイクルを繰り返した。精製されたＨＤＭＥＣは、後の使用のために凍結するか、又は増殖後にすぐに使用した。完全ＥＣＧＭ−ＭＶ２を含むＴ−７５フラスコ内でＨＤＭＥＣを、３日の栄養法で７０〜９０％のコンフルエンスになるまで増殖させた。細胞がその主な内皮特性を確実に維持するように第３継代から第８継代の間の細胞を全ての研究に使用した。
【００６０】
様々に処置されたＰＤＭＳ表面でのＨＤＭＥＣの培養
３種類のＰＤＭＳ表面：未処置表面、１００μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で被覆された表面、及び空気プラズマで処置された表面に１０４細胞／ｃｍ２の密度でＨＤＭＥＣを播種した。１３．５６ＭＨｚの周波数の低圧プラズマシステム（５０Ｗ）で３０秒間、空気プラズマ処置を行った。培養の４８時間後に、細胞の増殖挙動及び形態を光学顕微鏡で比較した。
【００６１】
ＭＯＣでのＥＣの播種及び培養
播種の前に、各ＭＯＣを培地で洗い流し、５％ＣＯ２、３７℃で３日間静的にインキュベートした。ＨＤＭＥＣを、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（ＰＡＡ，Ｃｏｅｌｂｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて増殖培地から収集した。細胞懸濁液を遠心分離によって濃縮し、ＶｉＣｅｌｌ生存数カウンタ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて細胞数を計数した。細胞生存度は、全ての実験で９０％を超えていた。遠心分離した細胞を、完全ＥＣＧＭ−ＭＶ２を用いて再懸濁して、２×１０７細胞／ｍｌの最終濃度にした。次いで、細胞懸濁液を１ｍｌシリンジに入れた。細胞を、各回路の２つの区画の一方を介して注入した。シリンジを、メス型ルアー×１／４インチ−２８オス型アダプタ（ＩＤＥＸ  Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｅｒｔｈｅｉｍ−Ｍｏｎｄｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続した。この接続具から空気を押し出し、次いで特殊なねじ（ＭＯＣ）アダプタ（ＭｉｃＣｅｌｌ  ＭＯＣ−Ｉ  １／４インチ−２８  ＵＮＦ  ｘ  Ｍ１０  Ｆｉｔｔｉｎｇ（ＰＥＥＫ）；Ｇｅｓｉｍ，Ｄｒｅｓｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にねじ込んだ。空のシリンジを第２の区画に同様に接続した。細胞を両方の回路内に注入した後も、装置を、静的条件下、５％ＣＯ２、３７℃で３時間インキュベートして細胞をチャネル壁に付着させた。３００μｌの量の新鮮な培地を各区画に添加し、次いで、各回路のオンチップ微小ポンプを用いてＰＤＭＳチャネルに勢いよく通した。０．４７６Ｈｚの周波数を、連続的な動的動作のためにＭＯＣの全ての微小血管回路に加えた。静的条件下のＭＯＣ培養では、入口区画と出口区画との間の静水圧の差異を利用してチャネルに新鮮な培地を５分間勢いよく通した。
【００６２】
１区画当たり１５０μｌの量の培地を、１〜２日ごとに動的及び静的ＭＯＣ系の両方で交換し、細胞の増殖及び生存度を、各循環のスポットＡ及びＢ（図７ｃ）で光学顕微鏡検査によって監視した。加えて、細胞生存度をカルセインＡＭアッセイで決定した。５μｇ／ｍｌのＣｅｌｌＴｒａｃｅカルセイン赤色−オレンジＡＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の溶液を１００μｌの量、ＭＯＣの各循環の両方の区画に添加した。ＭＯＣを２分間ポンピングし、次いで、５％ＣＯ２、３７℃の静的条件下で３０分間インキュベートした。その後、区画インサート内の培地を新鮮な培地に交換することによって、微小チャネルを培地で２回洗浄した。蛍光顕微鏡（ＢＺ９０００；Ｋｅｙｅｎｃｅ，Ｎｅｕ−Ｉｓｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて画像を取得した。４日後に、通常のＭＯＣ実験を終了した（１０の動的ＭＯＣ実験と１２の静的ＭＯＣ実験）。個々のＭＯＣを、７日間、１４日間、及び３２日間に亘って同じモードで作動させて、微小血管回路の長期の性能についての最初の指標を得た。図７ａに示されているＭＯＣホルダーによってＭＯＣ動作用のＣＯ２インキュベータの交換の可能性を評価するために、最大７日間の動作時間専用のホルダーを用いて９つのＭＯＣ実験（７つの動的ＭＯＣ実験と２つの静的ＭＯＣ実験）を行った。
【００６３】
ＭＯＣでのＥＣの代謝の特徴付け
培地のグルコース濃度を、製造者の取扱説明書に従ってＳｔａｎｂｉｏ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ＬｉｑｕｉＣｏｌｏｒ（登録商標）（Ｏｘｉｄａｓｅ）処置番号１０７０（Ｓｔａｎｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｏｅｒｎｅ，ＴＸ，ＵＳＡ）を用いて測定した。簡単に述べると、９９μｌの試薬を、３７℃に予熱された９６マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に添加し、１μｌの培地サンプルを添加した。３７℃でさらに５分間インキュベートしてから、グルコース濃度を、基準として水を用いて５００ｎｍでマイクロプレートリーダ（ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａ；ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ，Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で定量した。培地の乳酸濃度を、製造者の取扱説明書に従ってＬＯＤ−ＰＡＰ法（Ｄｉａｇｌｏｂａｌ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。簡単に述べると、９９μｌの試薬を、９６ウェル式マルチウェルプレート内の１μｌの培地サンプルに混合し、吸光度を、基準として水を用いてマイクロプレートリーダで、５２０ｎｍで測定した。
【００６４】
ＭＯＣ内のＥＣの免疫蛍光染色
培養から４日後に、ＥＣを、−２０℃の冷アセトンを用いて１０分間、微小血管回路内に固定し、ＰＢＳで２回５分間すすぎ、１０％ヤギ血清と共にＰＢＳ中、さらに２０分間インキュベートし、次いで、一次抗体、マウス抗ヒトＣＤ３１（１：５００；７．１ｍｇ／ｍｌ；ＤＲＦＺ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。続いて、回路をＰＢＳで２回洗浄し、二次抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ヤギ抗マウス（１：２００、２ｍｇ／ｍｌ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に室温（ＲＴ）で４０分間、暗室でインキュベートした。洗浄後、抗体ヒツジ抗ヒトｖＷＦ−ＦＩＴＣ（１：５０、１０ｍｇ／ｍｌ；Ａｂｅａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を添加し、室温で２時間インキュベートした。核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（１：１０００、１０ｍｇ／ｍｌ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で対比染色した。一次抗体マウス抗ヒトＶＥ−カドヘリン（１：１００、０．２ｍｇ／ｍｌ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた別の免疫蛍光染色を行った：ＥＣを４％ＰＦＡで１０分間固定し、ＰＢＳで２回５分間すすぎ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を５分間透過させた。ＰＢＳでの２回の洗浄後、上記説明されたように、一次抗体及び二次抗体の染色を行った。ＭＯＣ培養物を、製造者の取扱説明書に従って、ＶＥ−カドヘリンと組み合わせたＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８ファロイジン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、線維状アクチンを調べるために染色した。各溶媒をＭＯＣの区画インサートに添加し、均等に分布させるために１〜２分間ポンピングした。標準的な蛍光顕微鏡検査法又は二光子顕微鏡検査法（ＴｒｉＭＳｃｏｐｅ  ＩＩ；ＬａＶｉｓｉｏｎ  ＢｉｏＴｅｃ，Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の何れかで画像を取得した。全ての微小血管チャネルを、顕微鏡スライド壁を介して画像化した。Ｉｍａｒｉｓソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、収集した画像スタックから３Ｄ画像を再構築した。
【００６５】
せん断応力の効果の特徴付け
免疫蛍光染色されたＨＤＭＥＣの画像を、標準的な蛍光顕微鏡を用いて各微小血管回路のスポットＡ及びＢ（図７ｃ）で取得して流れによる形態の変化を監視した。画像上のＨＤＭＥＣ膜を、自動ＥＣ認識のために手動で再トレースした。接続領域認識アルゴリズムを使用してＥＣを識別し、各ＥＣの対応する周囲、細胞サイズ、重心、及び向き（空間的に荷重されていない第２のモーメントの主軸）を計算した。無次元形状係数（ＳＩ）パラメータを使用して、以下のように定義される細胞の伸長を定量した。
2015535688.tif 000006
式中、Ａは細胞の面積であり、Ｐは細胞の外周である。ＳＩは、０〜１の範囲であり、０は直線であり、１は完全な円である。加えて、向きの角度を測定して、流れ方向におけるＨＤＭＥＣの整合を定量した。０度は、流れの方向に完全に整合した細胞の主軸であり、９０度は、流れの方向に直角に整合した細胞である。ソースコードを、Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｈ  Ｗｏｒｋｓ，Ｉｓｍａｎｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実行した。１画像当たり少なくとも２００の細胞でのＳＩ及び細胞の向きの角度を分析に使用した。
【００６６】
フェムト秒レーザーアブレーションによって構築される微小チャネルの形成
Ｒｏｗｉａｋが、波長が１０３０ｎｍ（パルスエネルギー＝１２０ｎＪ）、パルス持続時間が４００フェムト秒、繰り返し数が１０ＭＨｚのＣＡＭ誘導フェムト秒レーザー（ＴｉｓｓｕｅＳｕｒｇｅｏｎ；Ｒｏｗｉａｋ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して僅か４０×４０μｍ２の微小チャネルをＰＤＭＳ材料に形成した。チャネルの設計は、達成可能な最小直径を明らかにし、かつ各分岐チャネルを通る培地の連続的な流れを可能にするように選択した。ＨＤＭＥＣを、ＰＤＭＳ型内の事前に形成された微小チャネルに播種し、培養の１日後にカルセインＡＭアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色した。次いで、ＰＤＭＳ型をＭＯＣの組織区画内に配置した。標準的な蛍光顕微鏡によって画像を取得した。
【００６７】
結果と考察
流体力学の評価
我々は、μＰＩＶを行って、ＭＯＣ回路の異なるスポット（図８ａ）における流体の流れのプロフィールを例示的に特徴付けることに成功した。ＭＯＣの全ての領域の完全な顕微鏡観察により、ＭＯＣの様々な他の領域の詳細な分析及び将来の可変ＭＯＣ設計が促進される。顕微鏡による光学分析の可能性、及び下から見てヒト赤血球で満たされた微小流体ＭＯＣ回路の蠕動微小ポンプ膜の動作方法を実証することができる。ロバストな蠕動オンチップ微小ポンプが、７μｌ／分（最も低い周波数）〜７０μｌ／分（最も高い周波数）の範囲の流量で数週間及び数か月に亘って無菌条件で培地を十分に循環させることができる微小血管回路に組み込まれている。拍動動作の周波数は、最大２．４Ｈｚまで上げることができ、この周波数は、高いがなおヒトの１分当たり１４４の鼓動の心臓の生理活動に相当する。この周波数では、微小血管回路のスポットＡ及びＢで測定されるせん断応力は、約２．５Ｎ／ｍ２（２５ｄｙｎ／ｃｍ２）に達し（図８ｂ）、このせん断応力は、微小血管系における基準の内で最も高い生理せん断応力である。平均速度は、ポンピング周波数と共にほぼ線形に増加した。我々の実験で使用されるポンピング周波数（０．４７６Ｈｚ）は、１分当たり３０未満の「心臓の鼓動」（安静時の成人の生理値の約半分）に相当し、表面被覆の初期段階でのＥＣの減少を回避する。この段階は、インビボでの創傷治癒の要素にやや類似している。図８ａに例示されているように、振動せん断応力−別の望ましい生理学的特徴は、微小ポンプの設計によってＭＯＣの動作に組み入れることができる。微小血管系における特定の局所位置のこのような振動の波形は、ポンピング周波数及びＭＯＣの特定の設計によって決まる。ヒトにおける特定の波形は、特定の疾患感受性に関連する。これは、ヒトの心血管系のこのような病理過程の研究用のＭＯＣプラットフォームのさらなる評価を意味する。
【００６８】
ＥＣの供給源、単離、及び培養
今日まで、微小流体系でのヒトＥＣせん断応力の研究の殆どは、多数の細胞への容易なアクセス及びそれらの高い表現型柔軟性により、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）で行われている。ＨＤＭＥＣは、少なくとも同じ表現型柔軟性を有するが、インビトロで局所環境の変化に対して迅速に対応する可能性がより高いと仮定した。Ｋａｍｍとその同僚は、例えば、微小チャネルの垂直平面でのＨＤＭＥＣの培養に成功し、横平面におけるコラーゲンゲルの中での毛細管の形態形成を監視した。体の他のどの器官とも対照的に、脊椎動物の皮膚は、血管の迅速な収縮又は弛緩によって、最終的に変化する外部温度に迅速に対応する必要がある。さらに、肉食動物の皮膚は、攻撃的な生活様式により最も頻繁に傷害にさらされる器官である。これらの２つの因子及びヒトの寿命により、一致しない表現型柔軟性及び血管新生のユニークな潜在力についてＨＤＭＥＣが選択され得る。両方の因子は、ヒト血管系と等価な機能をインビトロで確立する際に最も重要である。特に、血管新生能力は、ＭＯＣにおけるヒト血管系の第２の部分−臓器等価物の毛細管網の確立に極めて重要である。血管新生の分子機構における最新の発見は、せん断応力を含む局所環境の重要な役割を裏打ちする。ヒトＥＣを様々な組織から単離する様々な技術が記載されている。ＣＤ３１は、実質的に全ての種類のＥＣの表面で構成的に発現され、白血球集団を除くその他の種類の細胞型に存在しないため、組織消化後にＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）ＭｉｃｒｏＢｅａｄを用いてＥＣの磁気ビーズ単離を行った。特に、ＣＤ３１は、皮膚線維芽細胞及び平滑筋細胞では発現しない。内皮起源であることを確認するために形態学的マーカー及びいくつかの内皮特異的マーカーを調べた。単離されたＨＤＭＥＣは、位相コントラストで丸石のような形態を示し、内皮特異的マーカーＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリン、及びフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）に対して陽性であった。５Ｂ５、線維芽細胞特異的マーカー、及びα−平滑筋アクチン、平滑筋細胞特異的マーカーの染色では、他の細胞型の増殖が示されなかった。加えて、ＨＤＭＥＣは、４時間の曝露後にＡｌｅｘａ５９４標識ａｃ−ＬＤＬの取り込みを示した。皮膚線維芽細胞と平滑筋細胞との混合物は、全ての染色法の対照としての役割を果たした（データは不図示）。ＨＤＭＥＣは、形態及びマーカーの発現に著しい変化なしに最大第８継代まで培養することができる。我々のデータは、この方法が、ＣＤ３１陽性ＨＤＭＥＣをヒト包皮から単離するロバストな再現性のある方法であることを示している。ＭＯＣの２つの微小血管回路を十分に覆うＨＤＭＥＣの平均数は、計算によると２×１０５細胞程度であった。平均すると、１つのヒト包皮から、選別後に１×１０７の一次ＨＤＭＥＣを調製することができる。約３０００倍の細胞増殖は、最初の播種とＨＤＭＥＣ培養の第７〜第８継代との間に該当し、従って、１つの包皮から３×１０１０の細像の調製が可能である。理論的には、これは、５０００の細胞が導入されたＭＯＣ（１つのＭＯＣに付き２つの回路）に等しい。ＨＤＭＥＣの収量をさらに改善するために調製及び増殖の最適化を行うこともできる。
【００６９】
ＭＯＣでの安定な微小血管回路の確立
フィブロネクチン被覆ＰＤＭＳ表面へのＥＣの付着と空気プラズマ処置ＰＤＭＳ表面へのＥＣの付着との間の予備的比較試験により、静的培養におけるＨＤＭＥＣのＰＤＭＳへの少なくとも等しい付着が明らかになった。加えて、プラズマ処置は、ＰＤＭＳ微小チャネルの親水性を高める実行可能な技術として長らく認識されている。従って、空気プラズマ処置は、ＭＯＣの製造中の表面活性化のために最終的に選択された。フィブロネクチンは、ＥＣ付着の被覆材料として広く使用され、ＰＤＭＳベースの微小流体装置で培養される。実験室研究規模での取り扱いは容易であるが、フィブロネクチン被覆処置は、後の高スループットの巨大な産業規模では、工程の速度及び滅菌性の妨げとなり得る。我々の手による空気プラズマでのＰＤＭＳ処置は、効率的なＥＣ付着用のＰＤＭＳベースの微小装置を準備するための再現性のある迅速な測定可能な方法である。
次いで、蠕動微小ポンプ、後の臓器等価物の培養のための２つの区画、及び接続微小チャネルを備えた、機能性ＨＤＭＥＣ単層で完全に覆われた微小血管回路は、培養の４日以内に培地の拍動流中に確立された。我々は、他のヒトＥＣ系統での回路の完全な被覆を以前に実証した。ここで、一次ＨＤＭＥＣに基づいたこのような微小ヒト心血管輸送系の迅速な確立に注力した。加えて、ＥＣの代謝活性の追跡を毎日行った。表面処理及び被覆の最初の数日中の代謝活性の上昇は、細胞の運動性及び増殖の増加によって説明することができる。主に汚染によって引き起こされる、実験の段階での系の５０％の減少率を、我々の実験室でのルーチンのＭＯＣの使用の際に約２０％まで効率的に低下させた。全ての産業用のインビトロ実験室に装着された総合的品質管理システムが、この「研究所」の減少率を完全に排除することができる。
ＥＣが、チャネル壁に付着したままであり、生存していることを、カルセインＡＭ赤色オレンジ染色によって確認することができる。加えて、Ａｌｅｘａ５９４−ａｃ−ＬＤＬの取り込みについて細胞を試験した。内皮形態のさらなる変化が、培養から４日しても確認されなかったため、分析のための実験を終了した。４日目の密なＥＣ層の詳細な免疫蛍光分析により、驚くべき生存性と血管機能が明らかになった。微小血管回路を形成するＨＤＭＥＣは、ＣＤ３１、ｖＷＦ、及びＶＥ−カドヘリンに対して陽性であった。さらに、ＨＤＭＥＣは、流体密封層を形成するチャネルの全ての壁を覆うことができる。一方では、このような安定な微小血管回路は、最近記載された周辺ＰＤＭＳスライスへの分子の移動を防止する生物膜として機能し得る。他方、このような微小血管回路は、全血循環用の血液適合血管網として機能し、血液凝固を防止することができる。
【００７０】
せん断応力の影響
層流せん断応力を受けると、ＥＣは、ＥＣ自体及びその微細繊維が流れの方向に整合する。異なる位置にあるインビボのＥＣは、様々な種類の流れ、例えば、層流、拍動、及び乱流にさらされる；例えば、乱流は、代謝回転を上げると記載されている。生理学的せん断応力による伸長及び流れの整合が、静的培養条件下で形成される微小血管回路に対して、拍動流（Ｑ＝４０．５６μｌ／分、τ＝０．５１７Ｎ／ｍ２（５．１７ｄｙｎ／ｃｍ２））で形成される微小血管回路におけるＨＤＭＥＣのＳＩ及び向きの角度をプロットする我々のＭＯＣ培養で証明された。線維状アクチン（Ｆ−アクチン）の分布の変化が、静的培養と動的培養との間で観察された。静的条件でのＥＣは多角形であり、Ｆ−アクチンは、細胞の周辺に高密度帯としてまとまり；一方、約０．５Ｎ／ｍ２（５ｄｙｎ／ｃｍ２）のせん断応力では、Ｆ−アクチンはストレス線維の束を形成する。ＳＩと向きの角度は、ＭＯＣにおけるＥＣの静的培養と動的培養との間で有意に異なるが、微小流体装置におけるＨＤＭＥＣの以前の研究結果の範囲内であった。
最後に、我々は、培養が１４日間（ｎ＝４）に亘る微小血管ＭＯＣ及び３２日間に亘る最初の１つの微小血管ＭＯＣを用いる限定数の長期の指示実験における分析のスポットで等しく顕著な細胞生存度を観察した（データは不図示）。
【００７１】
結論
我々は、生理学的な順序で臓器等価物を互いに接続する、ＥＣが被覆された微小回路を通る血液循環が、微小規模でのヒト生物恒常性を完全に再現するための最も重要な必須条件であると仮定した。従って、我々は、ソフトリソグラフィ、レプリカモールディング、及び二光子レーザーアブレーション技術を利用して、微小規模でのヒト心血管系の輸送機能を再現する、インキュベータに依存しない微小血管循環系を確立することに成功した。微小血管循環系は、二層ガラス−ＰＤＭＳチップ、標準的な顕微鏡スライドの領域に配置され、チャネル高さが１００μｍであり、全高が３ｍｍである。それぞれ９６ウェルプレートの標準的なキャビティの領域である２つの別個の円柱組織培養インサートが、微小血管回路に配置される。蠕動せん断応力を加える４日間のロバスト処置が、系の全ての流体接触面をＨＤＭＥＣの機能的な密閉層で覆うために確立された。文献に記載されている垂直平面のＨＤＭＥＣの増殖とは対照的に、ヒトＥＣで完全に覆われた我々の微小血管系は、このような微小血管系の生物学的血液適合性を初めて可能にする。チップのレイアウトにより、微小血管輸送系を循環する流体の量が１０μｌまで低下し、外部ポンプ及び外部容器で動作するどの系に導入される循環量よりも少なくとも２桁小さい。個々の臓器等価物が次の成長段階で確立されると、それぞれ最大３００μｌの量のより重要な組織培養インサートにより、生理学的な流体と組織の比の正確な調整が可能となる。この製造技術は、便利で汎用性があり、設計の変更は、僅か２〜３か月の設計から装置へのターンアラウンド時間で実施することができる。インビトロで完全に実証された流れ方向におけるＥＣの整合及び伸長は、低速度撮影ビデオ顕微鏡によって完全に細部まで監視された。他の微小流体チャネル設計も、上記の技術によって我々の実験室で等しく効率的にＨＤＭＥＣで覆われた。我々は、微小血管循環系が確立されると、この微小血管循環系が、最終的に少なくとも３２日間の動作寿命を有することを最初に示した。
【符号の説明】
【００７２】
１  多臓器チップ装置
２  アクチュエータ層
３  ベース層
４  空洞層
５  臓器保持層
６  臓器層
１０  圧力式アクチュエータ（心臓）
１１  蠕動式アクチュエータ
１２  空気流アクチュエータ
１３  アクチュエータ
１４  細動脈収縮アクチュエータ
１６  ポート
１７  骨圧縮アクチュエータ
１８  栄養物容器
１９  老廃物容器
２０  尿容器
２１  小腸等価物
２２  肺等価物
２３  脾臓等価物
２４  膵臓等価物
２５  肝臓等価物
２６  腎臓等価物
２７  骨髄等価物
２８  脂肪組織等価物
２９  脳等価物
３０  精巣等価物
３１  皮膚等価物
３２  電気センサ
３３  センサ
３４  自立循環系
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【国際調査報告】
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