(57)【要約】  本発明は、ＰＡＫ１阻害剤を使用して黒色腫を治療するための方法及び組成物を提供する。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は黒色腫において過剰発現されているかつ／又は増幅されている。幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において黒色腫を治療するための方法であって、黒色腫を治療有効量のＰＡＫ１阻害剤に接触させることを含む方法。
【請求項２】
黒色腫が野生型ＢＲＡＦ黒色腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＡＫ１が非癌性皮膚細胞と比べて腫瘍において過剰発現されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＰＡＫ１が腫瘍において増幅されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍におけるＰＡＫ１のコピー数が約２．５よりも大きい、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
阻害剤が小分子、核酸、又はポリペプチドである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
小分子がＰＦ−３７５８３０９である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
小分子が式ＶＩＩの化合物である、請求項６に記載の方法。
2015511598.tif 000008
【請求項９】
小分子が式ＶＩＩの化合物であり、Ａは４−インドリル、５−インドリル、４−インダゾリル、５−インダゾリル、４−ベンゾイミダゾリル又は５−ベンゾイミダゾリルであり、Ｒａ、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは独立して水素又はＣ１〜３アルキルであり、Ｒ５は水素又はＣ１〜６アルキルであり、Ｒ６は水素、ハロゲン又はＣ１〜６アルキルであり、Ｒ７はフッ素によって置換されていてもよいシクロアルキルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
個体がヒトである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＡＫ１阻害剤が治療薬と組み合わせて使用される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
個体において黒色腫を治療するためのＰＡＫ１阻害剤の使用。
【請求項１３】
黒色腫が野生型ＢＲＡＦ黒色腫である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
黒色腫の治療において使用するためのＰＡＫ１阻害剤を含む組成物。
【請求項１５】
黒色腫が野生型ＢＲＡＦ黒色腫である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
薬学的に許容される賦形剤を更に含む、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項１７】
黒色腫を治療するための医薬品の製造におけるＰＡＫ１阻害剤の使用。
【請求項１８】
黒色腫が野生型ＢＲＡＦ黒色腫である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
ＰＡＫ１阻害剤及び黒色腫の治療において使用するための指示書を含む、黒色腫を治療するのに使用するためのＰＡＫ１阻害剤を含むキット。
【請求項２０】
黒色腫が野生型ＢＲＡＦ黒色腫である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
個体において黒色腫におけるＣＲＡＦシグナル伝達を阻害する方法であって、黒色腫を治療有効量のＰＡＫ１阻害剤に接触させることを含む方法。
【請求項２２】
黒色腫腫瘍におけるＭＥＫシグナル伝達を阻害する方法であって、黒色腫を治療有効量のＰＡＫ１阻害剤に接触させることを含む方法。
【請求項２３】
ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適しているヒト黒色腫患者を同定する方法であって、黒色腫のＢＲＡＦ遺伝子型を決定することを含み、黒色腫が野生型ＢＲＡＦを含むことが、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示す、方法。
【請求項２４】
ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適しているヒト黒色腫患者を同定する方法であって、黒色腫におけるＰＡＫ１の発現を判定することを含み、非癌性皮膚細胞と比べた黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現が、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示す、方法。
【請求項２５】
黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現が、非癌性皮膚細胞におけるＰＡＫ１の発現よりもＸ％多い、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ヒト黒色腫患者をＰＡＫ１阻害剤を用いて治療するための方法であって、
（ａ）黒色腫のＢＲＡＦ遺伝子型に基づいて患者を選択し、黒色腫が野生型ＢＲＡＦを含むことが、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示すこと、及び
（ｂ）選択された患者に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与すること
を含む方法。
【請求項２７】
ヒト黒色腫患者をＰＡＫ１阻害剤を用いて治療するための方法であって、
（ａ）黒色腫のＰＡＫ１発現レベルに基づいて患者を選択し、黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現が、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示すこと、及び
（ｂ）選択された患者に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与すること
を含む方法。
【請求項２８】
黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現が、非癌性皮膚細胞におけるＰＡＫ１の発現の２．５倍である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ヒト黒色腫患者を治療するための方法であって、黒色腫の遺伝子型がＢＲＡＦの野生型であると判定されている選択された個体に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項３０】
ヒト黒色腫患者を治療するための方法であって、黒色腫が非癌性皮膚細胞と比べてＰＡＫ１を過剰発現していると判定されている患者に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項３１】
黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現が、非癌性皮膚細胞におけるＰＡＫ１の発現の２．５倍である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療を受けている患者において黒色腫の治療を調整する方法であって、黒色腫におけるＰＡＫ１発現を評価することを含み、黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現が、個体の治療がＰＡＫ１過剰発現がもはや検出されなくなるまで調整されることを示す、方法。
【請求項３３】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
悪性黒色腫は皮膚癌による死亡のほぼ８０％を占めている。黒色腫は初期段階で発見された場合には外科的に治癒可能であるが、疾患の局所的及び全身的伝播は予後をかなり悪化させ、転移性黒色腫患者のうち５年間生存するのはわずか１４％である（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ ｆａｃｔｓ ＆ ｆｉｇｕｒｅｓ、２０１１）。最近、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路は幾つかの黒色腫サブタイプにおける決定的増殖経路として解明された（Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｇａｍｉ Ｐ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ．２０１１、２４（５）：９０２〜９２１）。例えば、４４９３患者由来のプールされたデータ解析から、ＢＲＡＦ（ｖ−Ｒａｆマウスの肉腫ウイルス癌遺伝子相同体Ｂ１）突然変異の発生率は皮膚黒色腫で４１％である（Ｌｅｅ ＪＨら、Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１１、１６４（４）：７７６〜７８４）。悪性黒色腫における最も頻度の高いＢＲＡＦ体細胞突然変異は、構成的触媒活性及びシグナル伝達を与える残基６００でのバリンの置換である（Ｄａｖｉｅｓ Ｈら、Ｎａｔｕｒｅ．２００２；４１７（６８９２）、９４９〜９５４）。遺伝子研究により、ＢＲＡＦは前臨床モデル系における黒色腫の開始と維持に必要とされることが確認されている（Ｄａｖｉｅｓ Ｈら、２００２、同書；Ｈｏｅｆｌｉｃｈ ＫＰら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６、６６（２）：９９９〜１００６；Ｄａｎｋｏｒｔ Ｄら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００７、２１（４）：３７９〜３８４４〜６）。これらの発見により、ＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ−４７２０、ＰＬＸ−４０３２／ベムラフェニブ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ（商標））及びＧＳＫ２１１８４３６を含む、ＢＲＡＦの小分子阻害剤を開発するため相次ぐ創薬活動が促がされた（Ｈｏｅｆｌｉｃｈ ＫＰら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９、６９（７）：３０４２〜３０５１；Ｔｓａｉ Ｊら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．２００８、１０５（８）：３０４１〜３０４６；Ｂｏｌｌａｇ Ｇら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１１、４６７（７３１５）：５９６〜５９９；Ｒｉｂａｓ Ａ ＆ Ｆｌａｈｅｒｔｙ ＫＴ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．２０１１、８（７）：４２６〜４３３）。これらの阻害剤はＢＲＡＦ癌遺伝子耽溺腫瘍細胞の増殖を選択的に減少させ、ＢＲＡＦ癌遺伝子に活性化突然変異を有する黒色腫のサブセットを抱えた患者に希望を与えている（Ｒｉｂａｓ Ａ ＆ Ｆｌａｈｅｒｔｙ ＫＴ．、２０１１、同書）。しかし、野生型ＢＲＡＦ黒色腫細胞では、現在のＢＲＡＦ小分子阻害剤について著しく低い抗腫瘍効果が観察されており（Ｈｏｅｆｌｉｃｈ ＫＰら、２００９、同書：３０４２〜３０５１；Ｔｓａｉ Ｊら、同書）、あらゆる分類の黒色腫患者の疾病管理のための生物学、癌遺伝子シグナル伝達及び考え得る治療標的についての新たな洞察を与える追加の黒色腫関連ドライバー遺伝子を同定する必要性が高まっている。ＲＡＦキナーゼファミリーは、ＲＡＳから下流キナーゼであるＭＥＫ１／２及びＥＲＫ１／２へのカノニカルＭＡＰＫシグナル伝達経路においてシグナルを伝達する際に中心的役割を果たしている３種のメンバー、ＡＲＡＦ、ＢＲＡＦ及びＣＲＡＦで構成���れている。しかし、追加のキナーゼもＥＲＫ活性化においてある役割を果たしていることが報告されている。特に、幾つかのグループにより、グループＩ ｐ２１−活性化キナーゼ（ＰＡＫ）が、活性化のために決定的に重要な残基であるＳｅｒ３３８でのＣＲＡＦとＲＡＦキナーゼの基質である活性化ループ残基Ｓｅｒ２１７／Ｓｅｒ２２１の近位にある部位であるＳｅｒ２９８でのＭＥＫ１の両方のリン酸化によりＭＡＰＫ経路活性化に寄与していることが報告されている（Ｋｉｎｇ ＡＪら、Ｎａｔｕｒｅ．１９９８；３９６（６７０７）、１８０〜１８３；Ｔａｎｇ Ｙら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９９、１９（３）：１８８１〜１８９１；Ｆｒｏｓｔ ＪＡら、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９７、１６（２１）：６４２６〜６４３８）。上皮細胞におけるＰＡＫとＭＡＰＫ経路シグナル伝達の間の経路クロストークが、増殖因子刺激及び細胞外マトリックスへの細胞接着を含む種々の条件により誘導されることがある（Ｓｌａｃｋ−Ｄａｖｉｓ Ｋら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００３、１６２（２）：２８１〜２９１；Ｚａｎｇ Ｍら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１、２７６（２７）：２５１５７〜２５１６５；Ｂｅｅｓｅｒ Ａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５、２８０（４４）：３６６０９〜３６６１５）。Ｒｈｏファミリー小ＧＴＰアーゼであるＣｄｃ４２及びＲａｃ１の主要下流エフェクターとして、ＰＡＫ１は、細胞外シグナルをアクチン細胞骨格、細胞形態及び接着力学の変化に結び付けるのにも基本的役割を果たしている（Ａｒｉａｓ−Ｒｏｍｅｒｏ ＬＥ ＆ Ｃｈｅｒｎｏｆｆ Ｊ．、Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｅｌｌ．２００８、１００（２）：９７〜１０８；Ｋｕｍａｒ Ｒら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２００６、６（６）：４５９〜４７１；Ｏｎｇ ＣＣら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１１、２（６）：４９１〜４９６）。ＰＡＫ１は種々の正常組織において広く発現されており、発現は乳癌及び肺癌において著しく増加する（Ｈｏｌｍ Ｃら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２００６、９８（１０）：６７１〜６８０；Ａｒｉａｓ−Ｒｏｍｅｒｏ ＬＥら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０１０、２９（４３）：５８３９〜５８４９；Ｏｎｇ ＣＣら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１、１０８（１７）：７１７７〜７１８２）。機能研究により、細胞形質転換（Ｖａｄｌａｍｕｄｉ ＲＫら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００、２７５（４６）：３６２３８〜３６２４４）及び腫瘍増殖（Ｏｎｇ ＣＣら、２０１１、同書；Ｙｉ Ｃら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８、６８（１９）：７９３２〜７９３７；Ｃｈｏｗ ＨＹら、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ２０１０、５（１１）：ｅ１３７９１）においてもＰＡＫ１が結び付けて考えられている。これらの所見により、ＰＡＫ１は幾つかの疾患状況において腫瘍形成に寄与している可能性があることが示される。
【発明の概要】
【０００２】
本発明は、個体において黒色腫を治療するための方法であって、黒色腫を治療有効量のＰＡＫ１阻害剤に接触させることを含む方法に関する。幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は非癌性皮膚細胞と比べて腫瘍において過剰発現されている。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は腫瘍において増幅される。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されており、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されており、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている。幾つかの実施態様では、黒色腫は突然変異ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、個体はヒトである。幾つかの実施態様では、本発明は、個体において黒色腫を治療するための方法であって、個体に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【０００３】
幾つかの実施態様では、本発明は、個体において黒色腫を治療するための方法であって、黒色腫を小分子、核酸、又はポリペプチドである治療有効量のＰＡＫ１阻害剤に接触させることを含む方法を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、個体において黒色腫を治療するための方法であって、個体に小分子、核酸、又はポリペプチドである治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む方法を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、個体において黒色腫を治療するための方法であって、黒色腫を治療有効量のＰＡＫ１阻害剤に接触させることを含み、ＰＡＫ１阻害剤が治療薬と組み合わせて使用される、方法を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、個体において黒色腫を治療するための方法であって、個体に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含み、ＰＡＫ１阻害剤が治療薬と組み合わせて使用される、方法を提供する。
【０００４】
幾つかの態様では、本発明は、個体において黒色腫を治療するためのＰＡＫ１阻害剤の使用を提供する。本発明は、黒色腫を治療するための医薬品の製造におけるＰＡＫ１阻害剤の使用を提供する。幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は非癌性皮膚細胞と比べて腫瘍において過剰発現されている。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は腫瘍において増幅される。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されており、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されており、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている。幾つかの実施態様では、黒色腫は突然変異ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、個体はヒトである。
【０００５】
幾つかの態様では、本発明は黒色腫の治療において使用するためのＰＡＫ１阻害剤を含む組成物及びキットを提供する。これらの治療法に関係する様々な実施態様は本明細書に記載されており、組成物及びキットに適用する。幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は非癌性皮膚細胞と比べて腫瘍において過剰発現されている。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は腫瘍において増幅される。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されており、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されており、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている。幾つかの実施態様では、黒色腫は突然変異ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、個体はヒトである。
【０００６】
幾つかの実施態様では、本発明は、個体において黒色腫におけるＣＲＡＦシグナル伝達及び／又はＭＥＫシグナル伝達を阻害する方法であって、黒色腫を治療有効量のＰＡＫ１阻害剤に接触させることを含む方法を提供する。幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は非癌性皮膚細胞と比べて腫瘍において過剰発現されている。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は腫瘍において増幅される。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は非癌性皮膚細胞と比べて腫瘍において過剰発現されている。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は腫瘍において増幅される。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されており、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されており、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている。幾つかの実施態様では、黒色腫は突然変異ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、個体はヒトである。幾つかの実施態様では、本発明は、個体において黒色腫を治療するための方法であって、個体に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【０００７】
幾つかの態様では、本発明は、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適しているヒト黒色腫患者を同定する方法であって、黒色腫のＢＲＡＦ遺伝子型を決定することを含み、黒色腫が野生型ＢＲＡＦを含むことが、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示す、方法を提供する。幾つかの態様では、本発明は、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適しているヒト黒色腫患者を同定する方法であって、黒色腫におけるＰＡＫ１の発現を判定することを含み、非癌性皮膚細胞と比べた黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現が、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示す、方法を提供する。幾つかの態様では、本発明は、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適しているヒト黒色腫患者を同定する方法であって、黒色腫においてＰＡＫ１のコピー数を決定することを含み、黒色腫におけるＰＡＫ１の増幅が、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示す、方法を提供する。幾つかの態様では、本発明は、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適しているヒト黒色腫患者を同定する方法であって、黒色腫のＢＲＡＦ遺伝子型を決定し、黒色腫におけるＰＡＫ１の発現を判定することを含み、野生型ＢＲＡＦの存在及び／又は非癌性皮膚細胞と比べた黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現が、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示す、方法を提供する。幾つかの態様では、本発明は、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適しているヒト黒色腫患者を同定する方法であって、黒色腫のＢＲＡＦ遺伝子型を決定すること、黒色腫におけるＰＡＫ１の発現を判定すること、及び黒色腫においてＰＡＫ１のコピー数を決定することのうちの一又は複数を含み、野生型ＢＲＡＦの存在、非癌性皮膚細胞と比べた黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現、及び黒色腫におけるＰＡＫ１の増幅のうちの一又は複数が、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示す、方法を提供する。
【０００８】
幾つかの態様では、本発明は、ヒト黒色腫患者をＰＡＫ１阻害剤を用いて治療するための方法であって、（ａ）黒色腫のＢＲＡＦ遺伝子型に基づいて患者を選択し、黒色腫が野生型ＢＲＡＦを含むことが、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示すこと、及び（ｂ）選択された患者に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
幾つかの態様では、本発明は、ヒト黒色腫患者をＰＡＫ１阻害剤を用いて治療するための方法であって、（ａ）黒色腫のＰＡＫ１発現レベルに基づいて患者を選択し、非癌性細胞と比べて黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現が、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示すこと、及び（ｂ）選択された患者に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む方法を提供する。幾つかの態様では、本発明は、ヒト黒色腫患者をＰＡＫ１阻害剤を用いて治療するための方法であって、（ａ）黒色腫におけるＰＡＫ１のコピー数に基づいて患者を選択し、黒色腫におけるＰＡＫ１の増幅が、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示すこと、及び（ｂ）選択された患者に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
幾つかの態様では、本発明は、ヒト黒色腫患者をＰＡＫ１阻害剤を用いて治療するための方法であって、（ａ）黒色腫のＢＲＡＦ遺伝子型及び黒色腫のＰＡＫ１発現レベルに基づいて患者を選択し、黒色腫が野生型ＢＲＡＦを含むこと及び／又は非癌性細胞と比べて黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現が、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示すこと、並びに（ｂ）選択された患者に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１１】
幾つかの態様では、本発明は、ヒト黒色腫患者をＰＡＫ１阻害剤を用いて治療するための方法であって、黒色腫のＢＲＡＦ遺伝子型、黒色腫におけるＰＡＫ１の発現レベル、及び黒色腫におけるＰＡＫ１のコピー数のうちの一又は複数に基づいて患者を選択し、黒色腫が野生型ＢＲＡＦ、非癌性細胞と比べた黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現、及びＰＡＫ１の増幅のうちの一又は複数を含むことが、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示すこと、並びに（ｂ）選択された患者に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１２】
幾つかの態様では、本発明は、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療を受けている患者において黒色腫の治療を調整する方法であって、黒色腫におけるＰＡＫ１発現を評価することを含み、黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現が、個体の治療がＰＡＫ１過剰発現がもはや検出されなくなるまで調整されていることを示す、方法を提供する。幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は黒色腫において増幅されている。幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型黒色腫であり、ＰＡＫ１は黒色腫において増幅されている。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＰＡＫ１がヒト黒色腫において高度に発現されていることを示す図である。（Ａ）ヒト黒色腫組織における１１ｑ１３コピー数増加の分析。縦の赤線はＰＡＫ１遺伝子の染色体位置を表す。（Ｂ）黒色腫腫瘍試料について相関付けられたＰＡＫ１ ＤＮＡコピーとｍＲＮＡ発現（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＭＡＳ５．０シグナルでの２２６５０７＿）。（Ｃ）原発性ヒト悪性黒色腫におけるＰＡＫ１免疫組織化学の代表的画像。細胞質発現スコア：０（Ｉ）、１（ＩＩ）、２（ＩＩＩ）及び３（ＩＶ）。色素原沈着はヘマトキシリン対比染色に対する免疫反応性を示している。ＰＡＫ１発現は間質細胞（ＩＩＩ）とランゲルハンス細胞を表す可能性のある表皮内に挿入している細胞（ＩＶ）においても見られた。
【図２】ＰＡＫ１がＢＲＡＦ野生型黒色腫細胞の増殖に決定的に重要な役割を果たしていることを示す図である。（Ａ）ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでのトランスフェクションに続く黒色腫細胞の増殖はＣｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ ＡＴＰ消費アッセイにより測定した。ＰＡＫ１は細胞増殖に必要であり、データは対照に対して正規化され、平均±ＳＤとして示した。（Ｂ）黒色腫細胞系統のパネルでは、ＰＡＫ１阻害は、ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）突然変異のある細胞（ｎ＝９；ｐ＝０．０７；６２４ＭＥＬ、８８８ＭＥＬ、９２８ＭＥＬ、ＲＰＭＩ−７９５１、Ａ３７５、Ｃｏｌｏ８２９、ＬＯＸ−ＩＭＶＩ、Ｍａｌｍｅ−３Ｍ、Ａ３７５）と比べてＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）突然変異のない細胞（ｎ＝５；５３７ＭＥＬ、Ｈｓ９４０Ｔ、ＭｅＷＯ、ＳＫ−ＭＥＬ２、ＳＫ−ＭＥＬ２３、ＳＫ−ＭＥＬ３０）の増殖を選択的に損ねた。（Ｃ）ＰＡＫ１／２の阻害はＥＲＫ１／２及びＭＥＫ１／２リン酸化並びにサイクリンＤ１の蓄積を減少した。（Ｄ）ＳＫ−ＭＥＬ２３ ＢＲＡＦ野生型黒色腫細胞におけるＰＡＫ１／２阻害は、逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）分析により決定される場合、細胞骨格、ＭＡＰＫ、増殖及びＮＦ−κＢ経路へのシグナル伝達を減少する。正規化されたＲＰＰＡ結果は平均±ＳＤとして提示している。ｓｉＮＴＣ＝非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ。ｓｉＮＲＡＳ＝ＮＲＡＳ特異的ｓｉＲＮＡ。ｓｉＰＡＫ１＝ＰＡＫ１特異的ｓｉＲＮＡ。ΔＰＡＫ１＝ＰＡＫ１遺伝子の染色体欠失。
【図３】ＰＡＫ１がＢＲＡＦ野生型黒色腫細胞においてＣＲＡＦ活性化に必要とされることを示す一連の免疫ブロットを描いている図である。（Ａ）ＰＡＫ１及びＰＡＫ２選択的又は非ターゲティング対照（ＮＴＣ）ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドをＳＫ−ＭＥＬ２３及び５３７ＭＥＬ黒色腫細胞にトランスフェクトした。４８時間後、内在性ＭＥＫ１（Ａ）、ＭＥＫ２（Ｂ）又はＣＲＡＦ（Ｃ）タンパク質を免疫沈降させ、複合体は免疫ブロットして触媒活性化に極めて重要な残基のリン酸化を検出した。免疫複合体中の全タンパク質レベルも負荷対照として決定した。（Ｄ）細胞はＤＭＳＯ又は５μＭのＰＦ−３７５８３０９で４時間処置し、内在性ＣＲＡＦは免疫沈降させ、Ｓｅｒ３３８リン酸化について免疫ブロットした。免疫複合体中の全ＣＲＡＦレベルも示している。（Ｅ）ＳＫ−ＭＥＬ２３細胞はＤＭＳＯ、５μＭのＰＦ−３７５８３０９又は２０μＭのＩＰＡ−３で４時間処置した。ＣＲＡＦ免疫複合体はキナーゼバッファー中で３０分間、不活性ＭＥＫ１と一緒にインキュベートした。ホスホＭＥＫ１（Ｓｅｒ２１７／Ｓｅｒ２２１）のレベルを決定し、ＣＲＡＦ触媒活性は、全ＣＲＡＦタンパク質に正規化されたＭＥＫ１リン酸化のレベルとして報告する。
【図４】ＰＡＫが黒色腫細胞移動に必要であることを示す画像を含んでいる図である。７２時間の非ターゲティング対照（ＮＴＣ）又はＰＡＫ１／２ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドトランスフェクションに続いて、集密的ＷＭ−２６６−４黒色腫細胞は傷つけられ、傷が付けられたとき（黒い濃淡）と２８時間のインキュベーション後（明視野）の画像を記録した。相対的傷密度の差は統計的に有意であった（ｐ＜０．００１；ｎ＝３）。
【図５】ＰＡＫ阻害剤を用いて処置されたＢＲＡＦ野生型及びＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）黒色腫細胞におけるＭＡＰＫシグナル伝達のインビトロ分差感度を示す一連の免疫ブロットを描いている図である。（Ａ）ＳＫ−ＭＥＬ２３及びＡ３７５細胞はＤＭＳＯ、５μＭのＰＦ−３７５８３０９又は０．２μＭのＰＬＸ−４７２０で４時間処置し、溶解物はＭＡＰＫ経路成分のリン酸化について分析した。ｐ−ＭＥＫ１／２（Ｓ２１７／Ｓ２２１）免疫ブロットの明るいほうの露出と暗いほうの露出を示している。（Ｂ）Ｆｌａｇエピトープタグ付きＰＡＫ１の異所性発現はＡ３７５細胞においてＭＡＰＫ経路活性化を推進した。対照としてＰＦ−３７５８３０９阻害剤処置を使用して特異性を示した。
【図６】自社製ＰＡＫ阻害剤を用いた処置のためにＢＲＡＦ野生型黒色腫細胞の減少した生存率を示す一連のグラフを描いている図である。Ｉ−００７、Ｉ−０５４、Ｉ−０８７及びＰＥ−３７５８３０９処置によるＰＡＫ１の触媒阻害は、４日間Ｃｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）生存率アッセイを使用し、（Ａ）ＳＫ−ＭＥＬ２３及び（Ｂ）５３７ＭＥＬ細胞を使用してインビトロで試験した。
【図７】ＢＲＡＦ野生型とＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）黒色腫の異種移植腫瘍マウスモデルにおけるＰＡＫ阻害によるＭＡＰＫシグナル伝達のインビボ分差感度を示す図である。（Ａ）ビヒクル又は３５ｍｇ／ｋｇのＰＦ−３７５８３０９いずれかの投与に続くＣＲＡＦ（Ｓｅｒ３３８）のリン酸化により測定されたＢＲＡＦ野生型及び変異腫瘍の薬力学的応答。（Ｂ）ＢＲＡＦ野生型黒色腫のＳＫ−ＭＥＬ２３前臨床腫瘍モデルにおける１０、１５及び２５ｍｇ／ｋｇ ＰＦ−３７５８３０９腹腔内毎日投与の抗腫瘍有効性。
【図８Ａ−１】ＢＲＡＦ野生型黒色腫のＳＫ−ＭＥＬ２３前臨床腫瘍モデルについての個々の腫瘍データを示す一連のグラフを描いている図である。図８Ａ−１は、腫瘍増殖阻害が、ビヒクルのみで処置された個々の動物について示されている。時間をかけた同一動物由来の腫瘍量の繰り返し測定を分析するために、三次回帰スプラインを使用して、ｌｏｇ２腫瘍量の時間経過に非線形プロファイルを適合させた。次に、これらの非線形プロファイルを混合モデル内の用量に関連付けた。三次回帰スプラインを使用して、ｌｏｇ２腫瘍量の時間経過に非線形プロファイルを適合させた。次に、これらの非線形プロファイルを混合モデル内の用量に関連付けた。ビヒクルの百分率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）は、式：％ＴＧＩ＝１００×（１−ＡＵＣｄｏｓｅ／ＡＵＣｖｅｈ）を使用して、ビヒクルに対する１日当たりの本用量群についての近似曲線下の面積（ＡＵＣ）の百分率として計算した。Ｒバージョン２．８．１及びエクセルバージョン１２．０．１（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用してプロッティングを実施し作成した。データはＲバージョン２．８．１（Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ；Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して分析し、混合モデルは、ｎｌｍｅパッケージ、バージョン３．１−８９を使用してＲ内に適合させた。
【図８Ａ−２】ＢＲＡＦ野生型黒色腫のＳＫ−ＭＥＬ２３前臨床腫瘍モデルについての個々の腫瘍データを示す一連のグラフを描いている図である。図８Ａ−２は、腫瘍増殖阻害が、１０ｍｇ／ｋｇ ＰＦ−３７５８３０９で処置された個々の動物について示されている。時間をかけた同一動物由来の腫瘍量の繰り返し測定を分析するために、三次回帰スプラインを使用して、ｌｏｇ２腫瘍量の時間経過に非線形プロファイルを適合させた。次に、これらの非線形プロファイルを混合モデル内の用量に関連付けた。三次回帰スプラインを使用して、ｌｏｇ２腫瘍量の時間経過に非線形プロファイルを適合させた。次に、これらの非線形プロファイルを混合モデル内の用量に関連付けた。ビヒクルの百分率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）は、式：％ＴＧＩ＝１００×（１−ＡＵＣｄｏｓｅ／ＡＵＣｖｅｈ）を使用して、ビヒクルに対する１日当たりの本用量群についての近似曲線下の面積（ＡＵＣ）の百分率として計算した。Ｒバージョン２．８．１及びエクセルバージョン１２．０．１（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用してプロッティングを実施し作成した。データはＲバージョン２．８．１（Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ；Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して分析し、混合モデルは、ｎｌｍｅパッケージ、バージョン３．１−８９を使用してＲ内に適合させた。
【図８Ａ−３】ＢＲＡＦ野生型黒色腫のＳＫ−ＭＥＬ２３前臨床腫瘍モデルについての個々の腫瘍データを示す一連のグラフを描いている図である。図８Ａ−３は、腫瘍増殖阻害が、１５ｍｇ／ｋｇ ＰＦ−３７５８３０９で処置された個々の動物について示されている。時間をかけた同一動物由来の腫瘍量の繰り返し測定を分析するために、三次回帰スプラインを使用して、ｌｏｇ２腫瘍量の時間経過に非線形プロファイルを適合させた。次に、これらの非線形プロファイルを混合モデル内の用量に関連付けた。三次回帰スプラインを使用して、ｌｏｇ２腫瘍量の時間経過に非線形プロファイルを適合させた。次に、これらの非線形プロファイルを混合モデル内の用量に関連付けた。ビヒクルの百分率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）は、式：％ＴＧＩ＝１００×（１−ＡＵＣｄｏｓｅ／ＡＵＣｖｅｈ）を使用して、ビヒクルに対する１日当たりの本用量群についての近似曲線下の面積（ＡＵＣ）の百分率として計算した。Ｒバージョン２．８．１及びエクセルバージョン１２．０．１（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用してプロッティングを実施し作成した。データはＲバージョン２．８．１（Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ；Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して分析し、混合モデルは、ｎｌｍｅパッケージ、バージョン３．１−８９を使用してＲ内に適合させた。
【図８Ａ−４】ＢＲＡＦ野生型黒色腫のＳＫ−ＭＥＬ２３前臨床腫瘍モデルについての個々の腫瘍データを示す一連のグラフを描いている図である。図８Ａ−４は、腫瘍増殖阻害が、２５ｍｇ／ｋｇ ＰＦ−３７５８３０９で処置された個々の動物について示されている。時間をかけた同一動物由来の腫瘍量の繰り返し測定を分析するために、三次回帰スプラインを使用して、ｌｏｇ２腫瘍量の時間経過に非線形プロファイルを適合させた。次に、これらの非線形プロファイルを混合モデル内の用量に関連付けた。三次回帰スプラインを使用して、ｌｏｇ２腫瘍量の時間経過に非線形プロファイルを適合させた。次に、これらの非線形プロファイルを混合モデル内の用量に関連付けた。ビヒクルの百分率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）は、式：％ＴＧＩ＝１００×（１−ＡＵＣｄｏｓｅ／ＡＵＣｖｅｈ）を使用して、ビヒクルに対する１日当たりの本用量群についての近似曲線下の面積（ＡＵＣ）の百分率として計算した。Ｒバージョン２．８．１及びエクセルバージョン１２．０．１（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用してプロッティングを実施し作成した。データはＲバージョン２．８．１（Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ；Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して分析し、混合モデルは、ｎｌｍｅパッケージ、バージョン３．１−８９を使用してＲ内に適合させた。
【図８Ｂ−１】ＢＲＡＦ野生型黒色腫のＳＫ−ＭＥＬ２３前臨床腫瘍モデルについての個々の腫瘍データを示す一連のグラフを描いている図である。図８Ｂ−１は、体重減少が、ビヒクルのみで処置された個々の動物について示されている。時間をかけた同一動物由来の腫瘍量の繰り返し測定を分析するために、三次回帰スプラインを使用して、ｌｏｇ２腫瘍量の時間経過に非線形プロファイルを適合させた。次に、これらの非線形プロファイルを混合モデル内の用量に関連付けた。三次回帰スプラインを使用して、ｌｏｇ２腫瘍量の時間経過に非線形プロファイルを適合させた。次に、これらの非線形プロファイルを混合モデル内の用量に関連付けた。ビヒクルの百分率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）は、式：％ＴＧＩ＝１００×（１−ＡＵＣｄｏｓｅ／ＡＵＣｖｅｈ）を使用して、ビヒクルに対する１日当たりの本用量群についての近似曲線下の面積（ＡＵＣ）の百分率として計算した。Ｒバージョン２．８．１及びエクセルバージョン１２．０．１（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用してプロッティングを実施し作成した。データはＲバージョン２．８．１（Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ；Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して分析し、混合モデルは、ｎｌｍｅパッケージ、バージョン３．１−８９を使用してＲ内に適合させた。
【図８Ｂ−２】ＢＲＡＦ野生型黒色腫のＳＫ−ＭＥＬ２３前臨床腫瘍モデルについての個々の腫瘍データを示す一連のグラフを描いている図である。図８Ｂ−２は、体重減少が、１０ｍｇ／ｋｇ ＰＦ−３７５８３０９で処置された個々の動物について示されている。時間をかけた同一動物由来の腫瘍量の繰り返し測定を分析するために、三次回帰スプラインを使用して、ｌｏｇ２腫瘍量の時間経過に非線形プロファイルを適合させた。次に、これらの非線形プロファイルを混合モデル内の用量に関連付けた。三次回帰スプラインを使用して、ｌｏｇ２腫瘍量の時間経過に非線形プロファイルを適合させた。次に、これらの非線形プロファイルを混合モデル内の用量に関連付けた。ビヒクルの百分率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）は、式：％ＴＧＩ＝１００×（１−ＡＵＣｄｏｓｅ／ＡＵＣｖｅｈ）を使用して、ビヒクルに対する１日当たりの本用量群についての近似曲線下の面積（ＡＵＣ）の百分率として計算した。Ｒバージョン２．８．１及びエクセルバージョン１２．０．１（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用してプロッティングを実施し作成した。データはＲバージョン２．８．１（Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ；Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して分析し、混合モデルは、ｎｌｍｅパッケージ、バージョン３．１−８９を使用してＲ内に適合させた。
【図８Ｂ−３】ＢＲＡＦ野生型黒色腫のＳＫ−ＭＥＬ２３前臨床腫瘍モデルについての個々の腫瘍データを示す一連のグラフを描いている図である。図８Ｂ−３は、体重減少が、１５ｍｇ／ｋｇ ＰＦ−３７５８３０９で処置された個々の動物について示されている。時間をかけた同一動物由来の腫瘍量の繰り返し測定を分析するために、三次回帰スプラインを使用して、ｌｏｇ２腫瘍量の時間経過に非線形プロファイルを適合させた。次に、これらの非線形プロファイルを混合モデル内の用量に関連付けた。三次回帰スプラインを使用して、ｌｏｇ２腫瘍量の時間経過に非線形プロファイルを適合させた。次に、これらの非線形プロファイルを混合モデル内の用量に関連付けた。ビヒクルの百分率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）は、式：％ＴＧＩ＝１００×（１−ＡＵＣｄｏｓｅ／ＡＵＣｖｅｈ）を使用して、ビヒクルに対する１日当たりの本用量群についての近似曲線下の面積（ＡＵＣ）の百分率として計算した。Ｒバージョン２．８．１及びエクセルバージョン１２．０．１（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用してプロッティングを実施し作成した。データはＲバージョン２．８．１（Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ；Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して分析し、混合モデルは、ｎｌｍｅパッケージ、バージョン３．１−８９を使用してＲ内に適合させた。
【図８Ｂ−４】ＢＲＡＦ野生型黒色腫のＳＫ−ＭＥＬ２３前臨床腫瘍モデルについての個々の腫瘍データを示す一連のグラフを描いている図である。図８Ｂ−４は、体重減少が、２５ｍｇ／ｋｇ ＰＦ−３７５８３０９で処置された個々の動物について示されている。時間をかけた同一動物由来の腫瘍量の繰り返し測定を分析するために、三次回帰スプラインを使用して、ｌｏｇ２腫瘍量の時間経過に非線形プロファイルを適合させた。次に、これらの非線形プロファイルを混合モデル内の用量に関連付けた。三次回帰スプラインを使用して、ｌｏｇ２腫瘍量の時間経過に非線形プロファイルを適合させた。次に、これらの非線形プロファイルを混合モデル内の用量に関連付けた。ビヒクルの百分率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）は、式：％ＴＧＩ＝１００×（１−ＡＵＣｄｏｓｅ／ＡＵＣｖｅｈ）を使用して、ビヒクルに対する１日当たりの本用量群についての近似曲線下の面積（ＡＵＣ）の百分率として計算した。Ｒバージョン２．８．１及びエクセルバージョン１２．０．１（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用してプロッティングを実施し作成した。データはＲバージョン２．８．１（Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ；Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して分析し、混合モデルは、ｎｌｍｅパッケージ、バージョン３．１−８９を使用してＲ内に適合させた。
【図９】は、Ｇ９４５ ＢＲＡＦ阻害剤又はＰＦ−３７５８３０９のいずれかで処置したＢＲＡＦ野生型腫瘍の異なる薬力学的応答を示す免疫ブロットを示す図である。３５ｍｇ／ｋｇのＰＦ−３７５８３０９腹腔内又は１０ｍｇ／ｋｇのＧ９４５（ＢＲＡＦ阻害剤）経口化合物の投与に続いて、ＳＫ−ＭＥＬ２３異種移植腫瘍についてＣＲＡＦ（Ｓｅｒ３３８）のリン酸化を判定した。腫瘍は投与の１時間後に採取し、急速冷凍した。それぞれのレーンは個々の異種移植マウス由来の腫瘍溶解物を表す。
【図１０】は、ＢＲＡＦ野生型黒色腫におけるＰＡＫ１についての作用機序を描いている図である。（Ａ）発癌性突然変異という文脈で、ＢＲＡＦはＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化を強力に推進し、これらの腫瘍細胞はこのキナーゼの阻害に感受性である。（Ｂ）ＢＲＡＦが変異していない黒色腫では、ＰＡＫ１の上昇した発現とゲノム増幅は頻繁に起こり、ＣＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ及び潜在的にさらなるエフェクター経路へのシグナル伝達が増加する。黒色腫のこのサブセットはＢＲＡＦ阻害に相対的に非感受性であり、増殖能はＰＡＫ１に依存している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、黒色腫を治療有効量のＰＡＫ１阻害剤に接触させる、個体において黒色腫を治療するための方法及び組成物を提供する。本発明は、個体に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含むそのような治療方法も提供する。幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は非癌性細胞と比べてＰＡＫ１を過剰発現している。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は黒色腫において増幅されている。幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫であり、非癌性細胞と比べてＰＡＫ１を過剰発現している。幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫であり、黒色腫は非癌性細胞と比べてＰＡＫ１を過剰発現しており、ＰＡＫ１は黒色腫において増幅されている。
【００１５】
特許出願、特許出願公開、及びＧｅｎｂａｎｋ受託番号を含む、本明細書で引用される全ての参考文献は、それぞれ個々の参考文献が参照により組み込まれていることがあたかも具体的に及び個別に示されているかのように、参照により組み込まれている。
【００１６】
定義
本明細書において記載される又は参照される技法及び手順は当業者には一般によく理解されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３版（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、（２００３））；シリーズ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）編 １９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ及びＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、及びＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編１９９３〜８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ及びＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ及びＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編 １９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編 １９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ及びＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ及びＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ及びＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ���ｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ及びＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）；及びＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９３）に記載される広く利用されている方法論などの、従来の方法論を使用して通常用いられている。
【００１７】
別の定義がなされていなければ、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野で当業者に通常理解されているものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．１９９４）、並びにＭａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ 第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．１９９２）は当業者に、本出願において使用される用語の多くについての一般的指針を提供している。
【００１８】
「ＰＡＫ」とは、本明細書で使用されるように、非受容体セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ（ＳＴＫ）のファミリーのことである。セリン／スレオニンタンパク質キナーゼのｐ２１活性化タンパク質キナーゼ（ＰＡＫ）ファミリーは、細胞骨格系、細胞形態形成、細胞プロセス及び細胞生存において重要な役割を果たしている（Ｄａｎｉｅｌｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９９ ２４：３５０〜３５５；Ｓｅｌｌｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７ ７：１６２〜１６７）。ＰＡＫファミリーは６つのメンバーからなり、配列相同性とグループＩ ＰＡＫにおける自己抑制的領域の存在に基づいて区別されるＰＡＫ１〜３（グループＩ）とＰＡＫ４〜６（グループＩＩ）の２つのグループに細分化されている。ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）は、Ｒａｃ及びＣｄｃ４２ ＧＴＰアーゼ機能並びにＲａｓ推進される腫瘍形成に必要な経路の重要な媒介物の役割を果たしている（Ｍａｎｓｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ １９９４ ３６７：４０〜４６；Ｂ Ｄｕｍｍｌｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ Ｒｅｖ．２００９ ２８：５１〜６３；Ｒ．Ｋｕｍａｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ２００６ ６：４５９〜４７３）。
【００１９】
本明細書で使用される「ＰＡＫ１」又は「ｐ２１活性化タンパク質（Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ）活性化キナーゼ１」とは、別の定義がなければ、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源由来の天然のＰＡＫ１のことである。前記用語は、遺伝子位置（例えば、１１ｑ１３−ｑ１４細胞遺伝学的バンド、染色体１１：７７０３３０６０−７７１８５１０８、及び／又はＧＣ１１Ｍ０７７０３３）、「完全長」非プロセス型ＰＡＫ１並びに細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のＰＡＫ１を包含する。前記用語は、ＰＡＫ１の天然に存在する変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例となるヒトＰＡＫ１核酸の配列はＮＣ＿００００１１．９である。例となるヒトＰＡＫ１アミノ酸配列はＮＰ＿００１１２２０９２１又はＮＰ＿００２５６７．３である。例となるマウスＰＡＫ１核酸の配列はＮＣ＿００００７３．６であり、又は例となるマウスＰＡＫ１アミノ酸配列はＮＰ＿０３５１６５．２である。例となるラットＰＡＫ１核酸の配列はＮＣ＿００５１００．２であり、又は例となるラットＰＡＫ１アミノ酸配列はＮＰ＿０５８８９４．１である。例となるイヌＰＡＫ１核酸の配列はＮＣ＿００６６０３．３であり、又は例となるイヌＰＡＫ１アミノ酸配列はＸＰ＿８４９６５１．１である。例となるウシＰＡＫ１核酸の配列はＡＣ＿０００１８６．１又はＮＣ＿００７３３０．５である。例となるウシＰＡＫ１アミノ酸配列はＮＰ＿００１０７０３６６．１である。例となるアカゲザルＰＡＫ１核酸の配列はＮＣ＿００７８７１．１である。例となるアカゲザルＰＡＫ１アミノ酸配列はＸＰ＿００１０９０３１０．１又はＮＰ＿００１０９０４２３．２である。例となるニワトリＰＡＫ１核酸の配列はＮＣ＿００６０８８．３であり、又は例となるニワトリＰＡＫ１アミノ酸配列はＮＰ＿００１１５５８４４．１である。
【００２０】
「ＢＲＡＦ」又は「セリン／スレオニンタンパク質キナーゼＢ−Ｒａｆ」とは、本明細書で使用されるように、本明細書で使用される通りのものを指し、別の定義がなければ、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源由来の天然のＢＲＡＦのことである。前記用語は、遺伝子位置（例えば、７ｑ３４細胞遺伝学的バンド、染色体７：１４０４３３８１２−１４０６２４５６４、及び／又はＧＣ０７Ｍ１４０４２４）、「完全長」非プロセス型ＢＲＡＦ並びに細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のＢＲＡＦを包含する。前記用語は、ＢＲＡＦの天然に存在する変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例となるヒトＢＲＡＦ核酸の配列はＮＣ＿０００００７．１３であり、又は例となるヒトＢＲＡＦアミノ酸配列はＮＰ＿００４３２４．２である。例となるマウスＢＲＡＦ核酸の配列はＮＣ＿００００７２．６であり、又は例となるマウスＢＲＡＦアミノ酸配列はＮＰ＿６４７４５５．３である。例となるラットＢＲＡＦ核酸の配列はＮＣ＿００５１０３．２であり、又は例となるラットＢＲＡＦアミノ酸配列はＸＰ＿２３１６９２．４である。例となるイヌＢＲＡＦ核酸の配列はＮＣ＿００６５９８．３であり、又は例となるイヌＢＲＡＦアミノ酸配列はＸＰ＿５３２７４９．３である。例となるニワトリＢＲＡＦ核酸の配列はＮＣ＿００６０８８．３であり、又は例となるニワトリＢＲＡＦアミノ酸配列はＮＰ＿９９０６３３．１である。例となるウシＢＲＡＦ核酸の配列はＡＣ＿０００１６１．１であり、又は例となるウシＢＲＡＦアミノ酸配列はＸＰ＿００２６８７０４８．１である。例となるウマＢＲＡＦ核酸の配列はＮＣ＿００９１４７．２であり、又は例となるウマＢＲＡＦアミノ酸配列はＸＰ＿００１４９６３１４．２である。
【００２１】
「野生型ＢＲＡＦ」とは本明細書では、黒色腫とは関連のない天然に存在するＢＲＡＦ（天然に存在する変異体を含む）のことである。野生型ヒトＢＲＡＦの例はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４３２４．２により供給される。当技術分野では公知であるように、ＢＲＡＦに関しては、黒色腫はＢＲＡＦタイプ、すなわち野生型ＢＲＡＦと突然変異ＢＲＡＦにより範疇化し分類することができる。
【００２２】
本明細書で使用される「突然変異ＢＲＡＦ」とは、黒色腫と関連する一又は複数の突然変異を有するＢＲＡＦタンパク質のことである。突然変異ＢＲＡＦの例は、６００位のバリンがグルタミン酸で置き換えられている（Ｖ６００Ｅ）突然変異ＢＲＡＦである。当技術分野では公知であるように、黒色腫はＢＲＡＦタイプ、すなわち野生型ＢＲＡＦと突然変異ＢＲＡＦにより範疇化することができる。
【００２３】
本明細書で使用される「ＣＲＡＦ」又は「ｖ−ｒａｆ白血病ウイルス癌遺伝子１」は、本明細書で使用されるように、別の定義がなければ、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源由来の天然のＣＲＡＦのことである。前記用語は、遺伝子位置（例えば、３ｐ２５細胞遺伝学的バンド、染色体３：１２６２５１００−１２７０５７００、及び／又はＧＣ０３Ｍ０１２６２５）、「完全長」非プロセス型ＣＲＡＦ並びに細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のＣＲＡＦを包含する。前記用語は、ＣＲＡＦの天然に存在する変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例となるヒトＣＲＡＦ核酸の配列はＮＣ＿０００００３．１１である、又は例となるヒトＣＲＡＦアミノ酸配列はＮＰ＿００２８７１．１である。
【００２４】
「ＭＥＫ」又は「マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ」とは、本明細書で使用されるように、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）をリン酸化するキナーゼ酵素のファミリーのことである。７つの遺伝子、ＭＡＰ２Ｋ１（ＭＥＫ１）、ＭＡＰ２Ｋ２（ＭＥＫ２）、ＭＡＰ２Ｋ３（ＭＫＫ３）、ＭＡＰ２Ｋ４（ＭＫＫ４）、ＭＡＰ２Ｋ５（ＭＫＫ５）、ＭＡＰ２Ｋ６（ＭＫＫ６）、及びＭＡＰ２Ｋ７（ＭＫＫ７）が存在する。ｐ３８（ＭＫＫ３及びＭＫＫ６）、ＪＮＫ（ＭＫＫ４及びＭＫＫ７）、及びＥＲＫ（ＭＥＫ１及びＭＥＫ２）の活性化因子が独立したＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路を定義する。例となるヒトＭＥＫ１核酸の配列はＮＣ＿００００１５．９である、又は例となるヒトＭＥＫ１アミノ酸配列はＮＰ＿００２７４６．１である。例となるヒトＭＥＫ２核酸の配列はＮＣ＿００００１９．９である、又は例となるヒトＭＥＫ２アミノ酸配列はＮＰ＿１０９５８７．１である。例となるヒトＭＥＫ３核酸の配列はＮＣ＿００００１７．１０である。例となるヒトＭＥＫ３アミノ酸配列はＮＰ＿００２７４７．２又はＮＰ＿６５９７３１．１である。例となるヒトＭＥＫ４核酸の配列はＮＣ＿００００１７．１０である、又は例となるヒトＭＥＫ４アミノ酸配列はＮＰ＿００３００１．１である。例となるヒトＭＥＫ５核酸の配列はＮＣ＿００００１５．９である。例となるヒトＭＥＫ５アミノ酸配列はＮＰ＿００１１９３７３３．１、ＮＰ＿００２７４８．１又はＮＰ＿６６０１４３．１である。例となるヒトＭＥＫ６核酸の配列はＮＣ＿００００１７．１０である、又は例となるヒトＭＥＫ６アミノ酸配列はＮＰ＿００２７４９．２である。例となるヒトＭＥＫ７核酸の配列はＮＣ＿００００１９．９である、又は例となるヒトＭＥＫ７アミノ酸配列はＮＰ＿６６０１８６．１である。
【００２５】
「ポリヌクレオチド」、又は「核酸」とは、本明細書では互換的に使用されるように、任意の長さのヌクレオチドのポリマーのことであり、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、及び／又はその類似体、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、又は合成反応によりポリマーに組み込むことができる任意の基質であることが可能である。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチド及びその類似体を含んでいてもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組立て前又は後に与えてもよい。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド成分が割り込んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、合成後に、標識を用いたコンジュゲーションなどによって、更に改変されてもよい。他の種類の改変には、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの一又は複数の類似物での置換、例えば、無電荷連鎖（例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、アミド亜リン酸エステル、カルバミン酸、等）及び電荷連鎖（例えば、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、等）を有する修飾、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リシン、等）などのペンダント部分を含有する修飾、介入物（例えば、アクリジン、ソラレン、等）を有する修飾、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属、等）を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、改変された連鎖（例えば、アルファアノマー核酸、等）を有する修飾などのヌクレオチド間修飾、並びに非改変型の（一又は複数の）ポリヌクレオチドが含まれる。更に、糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれでも、例えば、ホスホン酸エステル基、リン酸基で置換される、標準保護基により保護される、又は活性化されて追加のヌクレオチドへの追加の連鎖を調製してもよいし、又は固体もしくは半固体支持体にコンジュゲートされていてもよい。５’及び３’末端ＯＨはリン酸化する又はアミンもしくは１から２０炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルも標準保護基に誘導体化しうる。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−又は２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似物、？−アノマー糖、アラビノーズ、キシロース、又はリキソースなどのエピメリック糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及びメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオシド類似体を含む、当技術分野で一般に知られているリボース又はデオキシリボース糖の類似形態も含有することができる。一又は複数のホスホジエステル連鎖は代わりの連結基で置換してもよい。これらの代わりの連結基には、リン酸がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（「ギ酸アセタール」）で置換されており、それぞれのＲ又はＲ’は独立してＨである又は場合によりエーテル（−Ｏ−）連鎖、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルを含有する置換されたもしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）である実施態様が含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド内の全ての連鎖が同一である必要はない。先行する説明は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む、本明細書で言及される全てのポリヌクレオチドに当てはまる。
【００２６】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」とは、一般的には、約２５０ヌクレオチド長未満であるが必ずしもそうではない短い一本鎖のポリヌクレオチドのことである。オリゴヌクレオチドは合成でもよい。用語「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」は相互排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記説明は、オリゴヌクレオチドに対して等しく、完全に適用可能である。
【００２７】
用語「プライマー」とは、核酸にハイブリダイズし、一般に遊離の３’−ＯＨ基を与えることにより続いて相補的核酸を重合化することができる一本鎖ポリヌクレオチドのことである。
【００２８】
用語「小分子」とは、分子量が約２０００ダルトン又はそれよりも少ない、好ましくは約５００ダルトン又はそれよりも少ない任意の分子のことである。
【００２９】
用語「抗体」は本明細書では、その最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、及び所望の抗原結合活性を示す限りで抗体断片を含むがこれらに限定されない種々の抗体構造体を包含する。
【００３０】
用語「検出」は直接的検出と間接的検出を含む、いかなる検出手段でも含む。
【００３１】
本明細書で使用される用語「バイオマーカー」とは、試料中で検出することができる、例えば、予測的、診断的及び／又は予後的指標物質のことである。バイオマーカーは、ある種の分子的、病態的、組織学的、及び／又は臨床的特徴に特徴のある疾患又は障害（例えば、癌）の特定のサブタイプの指標物質としての働きをすることができる。例えば、黒色腫についてのバイオマーカーには、野生型ＢＲＡＦの存在、ＰＡＫ１の過剰発現及びＰＡＫ１の増幅が含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
個体にとっての臨床的利益の増加と関連するバイオマーカーの「量」、又は「レベル」は、生体試料における検出可能なレベルである。これらは当業者に公知であり本明細書でも開示されている方法により測定することができる。評価されるバイオマーカーの発現レベル又は量を使用して、治療に対する応答を判定することができる。
【００３３】
用語「発現のレベル」と「発現レベル」は一般に互換的に使用され、一般には生体試料中のバイオマーカーの量のことである。「発現」とは一般には、（例えば、遺伝子にコードされた及び／又はエピジェネティックな）情報が細胞内に存在し作用する構造物に変換されるプロセスのことである。したがって、本明細書で使用されるように、「発現」とはポリヌクレオチドへの転写、ポリペプチドへの翻訳、又はポリヌクレオチド及び／もしくはポリペプチド修飾（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾）さえも指すことがある。転写されたポリヌクレオチド、翻訳されたポリペプチド、又はポリヌクレオチド及び／もしくはポリペプチド修飾（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾）の断片も、選択的スプライシングにより生成された転写物又は分解した転写物由来であれ、例えば、タンパク質分解によりポリペプチドの翻訳後プロセシング由来であれ、発現されたと見なすことにする。「発現された遺伝子」には、ｍＲＮＡとしてポリヌクレオチドに転写され、その後ポリペプチドに翻訳される遺伝子、及びＲＮＡに転写されるがポリペプチドには翻訳されない（例えば、トランスファーＲＮＡ及びリボソームＲＮＡ）遺伝子も含まれる。
【００３４】
「上昇した発現」、「上昇した発現レベル」、「上昇したレベル」及び「過剰発現された」とは、疾患又は障害（例えば、癌）に罹っていない個体（単数又は複数）などの対照、又は内部対照（例えば、ハウスキーピングバイオマーカー）と比べて個体におけるバイオマーカーの増加した発現又は増加したレベルのことである。幾つかの実施例では、上昇した発現又は過剰発現は遺伝子増幅の結果である。
【００３５】
「低下した発現」、「低下した発現レベル」、又は「低下したレベル」とは、疾患又は障害（例えば、癌）に罹っていない個体（単数又は複数）などの対照、又は内部対照（例えば、ハウスキーピングバイオマーカー）と比べて個体におけるバイオマーカーの減少した発現又は減少したレベルのことである。
【００３６】
用語「ハウスキーピングバイオマーカー」とは、典型的にはあらゆる細胞型に類似して存在するバイオマーカー又はバイオマーカーの群（例えば、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド）のことである。幾つかの実施態様では、ハウスキーピングバイオマーカーは「ハウスキーピング遺伝子」である。「ハウスキーピング遺伝子」とは本明細書では、その活性が細胞機能の維持に不可欠なタンパク質をコードし、典型的にはあらゆる細胞型に類似して存在する遺伝子又は遺伝子の群のことである。
【００３７】
本明細書で使用される「増幅」とは一般に、所望の配列の複数のコピーを産生するプロセスのことである。「複数のコピー」は少なくとも２つのコピーを意味する。「コピー」は鋳型配列に対して必ずしも完全な配列相補性又は同一性を意味するわけではない。例えば、コピーには、デオキシイノシンなどの類似物、意図的配列変化（例えば、鋳型にハイブリダイズすることが可能であるが相補的ではない配列を含むプライマーを通じて導入される配列変化）、及び／又は増幅中に生じる配列エラーが含まれうる。二倍体細胞は典型的には、所与の遺伝子の２つのコピー、それぞれの染色体上に１つずつを含有する。本発明の幾つかの態様では、細胞中の染色体遺伝子の「増幅」とは、遺伝子の２つよりも多いコピーが細胞中に存在するプロセスのことである。
【００３８】
用語「多重ＰＣＲ」とは、１回の反応で２つ以上のＤＮＡ配列を増幅する目的で１つよりも多いプライマーセットを使用して単一供給源（例えば、個体）から得られる核酸で実行される単一ＰＣＲのことである。
【００３９】
用語「診断」は本明細書では、分子状態又は病理学的状態、疾患又は状態（例えば、癌）の同定又は分類を指すのに使用される。例えば、「診断」は特定種類の癌の同定を指すことがある。「診断」は、例えば、組織病理学的基準による、又は分子特徴（例えば、バイオマーカー（例えば、特定の遺伝子又は前記遺伝子によりコードされるタンパク質）のうちの１つ又は組合せの発現に特徴のあるサブタイプ）による癌の特定のサブタイプの分類を指すこともある。
【００４０】
用語「診断を支援する」は、本明細書では、疾患又は障害（例えば、癌）の特定種類の症状又は状態の存在、又は性質に関して臨床的決定を下すのを支援する方法を指すのに使用される。例えば、疾患又は状態（例えば、癌）の診断を支援する方法は、個体由来の生体試料におけるある種のバイオマーカーを測定することを含むことができる。
【００４１】
「相関させる（ｃｏｒｒｅｌａｔｅ又はｃｏｒｒｅｌａｔｉｎｇ）」とは、いかなる方法であれ、第一の分析又はプロトコールの成績及び／又は結果を第二の分析又はプロトコールの成績及び／又は結果と比較することを意味する。例えば、第二のプロトコールを実行するのに第一の分析又はプロトコールの結果を使用してもよいし、第二の分析又はプロトコールを実施すべきかどうかを決定するために第一の分析又はプロトコールの結果を使用してもよい。ポリヌクレオチド分析又はプロトコールの実施態様に関して、特定の治療計画を実施すべきかどうかを決定するのにポリヌクレオチド発現分析又はプロトコールの結果を使用してもよい。
【００４２】
「個体の応答」又は「応答」は、（１）減速及び完全停止を含む疾患進行（例えば、癌進行）のある程度の阻害、（２）腫瘍サイズの減少、（３）隣接する末梢器官及び／もしくは組織への癌細胞浸潤の阻害（例えば、減少、減速又は完全停止）、（４）転移の阻害（例えば、減少、減速又は完全停止）、（５）疾患もしくは障害（例えば、癌）に関連する一又は複数の症状のある程度の軽減、（６）無増悪生存期間の長さの増加、並びに／又は（９）治療に続く所与の時点での死亡率の減少を含むが、これらに限定されない、個体に対する利益を示す任意のエンドポイントを使用して評価することができる。
【００４３】
用語「予測」又は「予測すること」は、患者が特定の抗癌治療に有利に又は不利に応答する見込みを指すのに本明細書では使用される。一実施態様では、予測又は予測することはその応答の程度に関する。一実施態様では、予測又は予測することは、患者が治療、例えば、特定の治療薬を用いた治療に続いて、疾患の再発なしで一定期間生存する又は好転するかどうか及び／又はその可能性に関する。本発明の予想法を臨床的に使用して、任意の特定の患者に最も適している治療様式を選択することにより治療法を決定することができる。本発明の予想法は、例えば、所与の治療薬もしくは組合せの投与、外科的処置、ステロイド処置、等を含む所与の治療計画などの治療計画に患者が有利に応答する可能性があるかどうか、又は治療計画に続いて患者の長期生存の可能性があるかどうかを予測する際の貴重なツールである。
【００４４】
用語「実質的に同じ」は、本明細書で使用されるように、当業者であれば２つの値の差を、前記値（例えば、Ｋｄ値又は式）により測定される生物学的特徴という文脈内でほとんど差の無い又は生物学的及び／もしくは統計的に有意ではないと見なすほど、２つの数値間の十分高度な類似性を意味する。前記２つの値の差は、基準／コンパレーター値の関数として、例えば、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、及び／又は約１０％未満であってもよい。
【００４５】
語句「実質的に異なる」とは、本明細書で使用されるように、当業者であれば２つの値の差を、前記値（例えば、Ｋｄ値）により測定される生物学的特徴という文脈内で統計的に有意であると見なすほど、２つの数値間の十分に高度な差を意味する。前記２つの値の差は、基準／コンパレーター分子の値の関数として、例えば、約１０％よりも大きい、約２０％よりも大きい、約３０％よりも大きい、約４０％よりも大きい、及び／又は約５０％よりも大きい。
【００４６】
本明細書で使用される場合の単語「標識」とは、検出可能な化合物又は組成物のことである。標識は典型的には、ポリヌクレオチドプローブ又は抗体などの試薬に直接的に又は間接的にコンジュゲートされる又は融合され、前記標識がコンジュゲートされている又は融合されている試薬の検出を促進する。標識はそれ自体が検出可能であってもよい（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）し、又は酵素標識の場合は、基質化合物又は組成物の化学的変化を触媒して、検出可能な産物を生じてもよい。
【００４７】
「有効量」の薬剤とは、必要な用量で必要な期間、所望の治療結果又は予防結果を達成するのに有効な量のことである。
【００４８】
本発明の「治療的有効量」の物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストは、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体において所望の応答を誘発する物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの能力に応じて変化しうる。治療的有効量は、物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの毒作用又は有害作用よりも治療的に有益な効果のほうが上回る量でもある。
【００４９】
「予防的有効量」とは、必要な用量で必要な期間、所望の予防結果を達成するのに有効な量のことである。典型的にはしかし必ずしもではないが、予防用量は疾患に先立って又はその初期段階で対象において使用されるために、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないことになる。
【００５０】
黒色腫の場合では、治療有効量のＰＡＫ１阻害剤は、癌細胞の数を減らす、原発性腫瘍サイズを減らす、周囲器官への癌細胞浸潤を阻害する（すなわち、ある程度遅くする、好ましくは停止させる）、腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度遅くする、好ましくは停止させる）、腫瘍増殖もしくは腫瘍進行をある程度阻害するもしくは遅らせる、及び／又は障害に付随する症状のうちの１つもしくは複数をある程度軽減することがある。薬物が存在する癌細胞の増殖を防ぐ及び／又は死滅させる限りは、薬物は細胞増殖抑制性及び／又は細胞傷害性であり得る。癌療法では、インビボでの有効性は、例えば、生存期間、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）、奏効率（ＲＲ）、奏功期間、及び／又は生活の質を評価することにより測定することが可能である。
【００５１】
「減らす」又は「阻害する」は、基準と比べた場合、活性、機能、及び／又は量を減少する又は減らすことである。ある種の実施態様では、「減らす」又は「阻害する」は、２０％以上の全体的減少を引き起こす能力を意味する。別の実施態様では、「減らす」又は「阻害する」は、５０％以上の全体的減少を引き起こす能力を意味する。更に別の実施態様では、「減らす」又は「阻害する」は、７５％、８５％、９０％、９５％以上の全体的減少を引き起こす能力を意味する。減らす及び阻害するは、治療されている障害の症状、転移の存在もしくはサイズ、原発性腫瘍のサイズ、又は血管新生障害における血管のサイズもしくは数に言及することができる。
【００５２】
用語「薬学的製剤」とは、活性成分の生物活性が効果的であることを可能にするような形態であり、前記製剤が投与されると考えられる対象にとって容認できないほど有毒である追加の成分を含有しない調製物のことである。そのような製剤は無菌であり得る。
【００５３】
「無菌」製剤は無菌性である又はあらゆる生きた微生物及びその胞子がない。
【００５４】
「薬学的に許容される担体」とは、活性成分以外の薬学的製剤中の、対象にとって無毒の成分のことである。薬学的に許容される担体には、バッファー、賦形剤、安定化剤、又は保存料が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書で使用されるように、「治療」とは、有益な又は所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益な又は所望の臨床結果には、一又は複数の症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の伝播（例えば、転移、例えば、肺への又はリンパ節への転移）を防ぐ又は遅延させること、疾患の再発を防ぐ又は遅延させること、疾患の進行を遅延させる又は遅らせること、疾患状態の寛解、及び緩解（部分的であれ全体的であれ）のうちのいずれか一又は複数が含まれるが、これらに限定されない。「治療」は、増殖性疾患の病理的帰結の減少も包含する。本発明の方法は治療のこれらの態様のうちの任意の一又は複数を考慮している。
【００５６】
用語「黒色腫」とは、正常な皮膚のメラニン形成細胞又は黒子で始まり急速に広範囲に転移する悪性度の高い腫瘍のことである。用語「黒色腫」は、用語「悪性黒色腫」、「黒色癌」、「黒色上皮腫」、及び「黒色肉腫」と互換的に使用することができる。
【００５７】
「腫瘍」とは、本明細書で使用されるように、悪性であれ良性であれ、全ての腫瘍細胞成長及び増殖並びに全ての前癌性及び癌性細胞と組織のことである。用語「癌」、「癌性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」は、本明細書で言及される場合、互いに排他的ではない。
【００５８】
用語「癌」及び「癌性の」は、典型的には調節されない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理的状態を指す又は記述する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ系腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
そのような癌の更に具体的な例には、扁平上皮癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌及び胃腸間質癌を含む胃癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、尿路の癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子由来黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節性メラノーマ、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度瀰漫性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ腫白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄芽球性白血病、及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、並びに母斑症関連異常血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍関連浮腫）、メイグス症候群、脳並びに頭頸部癌及び関連転移が含まれるが、これらに限定されない。ある種の実施態様では、本発明の抗体による治療を受け入れられる癌には、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、神経膠芽腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、膵臓癌、軟部肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌、頭頸部癌、卵巣癌、中皮腫、及び多発性骨髄腫が含まれる。幾つかの実施態様では、癌は、小細胞肺癌、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、乳癌、胃癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、及び肝細胞癌から選択される。しかし、幾つかの実施態様では、癌は、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、神経膠芽腫及び乳癌、これらの癌の転移形態から選択される。
【００６０】
用語「抗癌療法」とは、癌を治療するのに有用な療法のことである。抗癌治療剤には、例えば、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害性薬剤、放射線療法に使用される薬剤、抗血管形成剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、及び癌を治療するための他の薬剤、抗ＣＤ２０抗体、血小板由来増殖因子阻害剤（例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標）（イマチニブメチル酸塩））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、（一又は複数の）ＢＣＭＡ受容体、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２のうちの一又は複数に結合するアンタゴニスト（例えば、中和抗体）、並びに他の生体活性剤及び有機化学剤等が含まれるが、これらに限定されない。それらの組合せも本発明に含まれる。
【００６１】
本明細書で使用される用語「細胞傷害剤」とは、細胞の機能を阻害するもしくは妨害するかつ／又は細胞の破壊を引き起こす物質のことである。用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位元素）；化学療法剤、例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンもしくは他の挿入剤、核酸分解酵素などの酵素及びその断片、抗生物質、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の小分子毒素もしくは酵素的に活性な毒素などの毒素、その断片及び／もしくは変異体も含む、並びに下に開示される様々な抗腫瘍もしくは抗癌剤を含むことが意図される。他の細胞傷害性薬物は下に記載されている。殺腫瘍性薬物は腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００６２】
「毒素」は細胞の成長又は増殖に対して有害効果を及ぼすことができる任意の物質である。
【００６３】
「化学療法剤」とは、癌の治療に有用な化学化合物のことである。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホン酸塩；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリメチロメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン、ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似物トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレチン、及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼルシン及びビゼレシン合成類似物を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似物ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド（ｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）；フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ｎｉｃｏｌａｏｕら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３：１８３〜１８６（１９９４）参照）；ＣＤＰ３２３、経口アルファ−４インテグリン阻害剤；ダイネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）Ａを含むダイネミシン；エスペラミシン；並びにネオカルジノスタチンクロモフォア及び関連色素タンパク質エネジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフ���リン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ（ｐｙｒｒｏｌｉｎｏ）−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソームインジェクション（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、リポソーマルドキソルビシン（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）ＴＬＣ Ｄ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグ化リポソーマルドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似物；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似物；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似物；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗アドレナル（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌｓ）；フォリン酸などの葉酸補液；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビスアントレン；エダトレキサート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジクオン；エルフロルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム：エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシン及びアンサマイトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）ポリサッカライド複合体（ＪＨＳ天然物、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラク���ン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標））、及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン（例えば、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））、及びカルボプラチンなどの白金薬剤；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））、及びビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））を含む、チューブリン重合が微小管を形成するのを妨げるビンカ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロン酸；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＥＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））を含む、レチノイン酸などのレチノイド；クロドロン酸（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロン酸（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロン酸（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロン酸（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロン酸（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、又はリセドロン酸（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））などのビスホスホネート；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似物）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、及び上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）などの、異常な細胞増殖に関係するシグナル伝達経路における遺伝子発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子療法ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどのワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ−１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリフォシン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ又はエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えば、ＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ−７７９；ティピファニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；オブリメルセンナトリウムなどのＢｃｌ−２阻害剤（Ｇ���ＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（下の定義参照）；チロシンキナーゼ阻害剤（下の定義参照）；ラパマイシンなどのセリン−スレオニンキナーゼ阻害剤（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標））；ロナファーニブなどのファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＳＣＨ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲＴＭ）；並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体；並びに、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法を表す略字）；並びにＦＯＬＦＯＸ（オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）を５−ＦＵ及びロイコボリンと併用した治療レジメンを表す略字）などの上記のうちの２つ以上の薬剤の組合せが含まれる。
【００６４】
本明細書に定義される化学療法剤には、癌の増殖を促進することができるホルモンの効果を調節する、減少する、ブロックする又は阻害するように作用する「抗ホルモン剤」又は「内分泌療法」が含まれる。化学療法剤は、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、４−ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケイキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、及びＳＥＲＭ３などの選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）を含む、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを有する抗エストロゲン；フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、及びＥＭ８００（そのような薬剤はエストロゲン受容体（ＥＲ）二量体化をブロックし、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲターンオバーを増加させ、及び／又はＥＲレベルを抑制しうる）などのアゴニスト特性のない純粋な抗エストロゲン；ホルメスタン及びエキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））などのステロイドアロマターゼ阻害剤、並びにアナストロゾール（ａｎａｓｔｒａｚｏｌｅ）（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））及びアミノグルテチミドなどの非ステロイドアロマターゼ阻害剤を含むアロマターゼ阻害剤、並びに他のアロマターゼ阻害剤にはボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、ファドロゾール、及び４（５）−イミダゾールが含まれる；リュープロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、ゴセレリン、ブセレリン、及びトリプテレリンを含む、黄体ホルモン放出ホルモンアゴニスト；酢酸メゲストロール及び酢酸メドロキシプロゲステロンなどのプロゲスチン、ジエチルスチルベストロール及びプレマリンなどのエストロゲン、並びにフルオキシメステロン、オールトランスレチオニン酸（ａｌｌ ｔｒａｎｓｒｅｔｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）及びフェンレチニドなどのアンドロゲン／レチノイドを含む、性ステロイド；オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）；抗プロゲステロン（ａｎｔｉ−ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅｓ）；エストロゲン受容体下方調節因子（ＥＲＤ）；フルタミド、ニルタミド及びビカルタミドなどの抗アンドロゲン；並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体；並びに上記のうちの２つ以上の組合せを含むが、これらに限定されず、ホルモンそれ自体でもよい。
【００６５】
本出願において使用される用語「プロドラッグ」とは、親ドラッグと比べて腫瘍細胞に対して細胞傷害性が少なく、酵素的に活性化される又はより活性な親形態に転換することができる薬学的に活性な物質の前駆体又は誘導体形態のことである。例えば、Ｗｉｌｍａｎ、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、１４、３７５〜３８２ページ、６１５ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）及びＳｔｅｌｌａら、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｂｏｒｃｈａｒｄｔら、（編）、２４７〜２６７ページ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照されたい。本発明のプロドラッグには、より活性な無細胞傷害性ドラッグに転換することができるリン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、場合により置換フェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は場合により置換フェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。本発明において使用するためにプロドラッグ形態に誘導化することができる細胞傷害性薬物の例には、上記の化学療法剤が含まれるがこれらに限定されない。
【００６６】
本明細書で使用される場合の「増殖阻害薬剤」とは、細胞（例えば、黒色腫細胞）の増殖を阻害する化合物又は組成物のことである。増殖阻害薬剤の例には、Ｇ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤などの細胞周期進行をブロックする（Ｓ期以外の場所で）薬剤が含まれる。古典的Ｍ期ブロッカーには、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、並びにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が含まれる。Ｇ１を停止させる薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、及びアラビノフラノシル−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤はＳ期停止にも波及する。追加の情報は、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＩｓｒａｅｌ、編、Ｃｈａｐｔｅｒ １、ｅｎｔｉｔｌｅｄ「Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ、ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ」ｂｙ Ｍｕｒａｋａｍｉら、（ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９５）、特に１３ページに見ることができる。タキサン（パクリタキセル及びドセタキセル）は、両方ともイチイに由来する抗癌薬である。ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）は、ヨーロッパイチイに由来するが、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類似物である。パクリタキセル及びドセタキセルはチューブリン二量体からの微小管の構築を促進し、細胞において有糸分裂を阻害する脱重合を妨げることにより微小管を安定化する。
【００６７】
「放射線療法」は、正常に機能する細胞の能力を制限する又は細胞を完全に破壊するように細胞に対する十分な損傷を誘導する有向のガンマ線又はベータ線を使用することを意味する。治療の投与用量及び持続時間を決定する当技術分野で公知の方法が数多く存在することが認識される。典型的な治療は１回投与として与えられ、典型的な投与用量は１日当たり１０から２００単位（グレイ）に及ぶ。
【００６８】
「個体」又は「対象」は哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。ある特定の実施態様では、個体又は対象はヒトである。
【００６９】
一又は複数の追加の治療薬「と組み合わせた」投与には、任意の順序での同時（併用）及び連続又は逐次投与が含まれる。
【００７０】
用語「同時に」とは、投与の少なくとも一部が時間的に重なっている２つ以上の治療薬の投与を指すのに本明細書では使用される。したがって、同時投与には、一又は複数の他の薬剤の投与を中断した後に一又は複数の薬剤の投与が続く投与計画が含まれる。
【００７１】
「減少させる又は阻害する」は、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれよりも多い全体的減少を引き起こす能力を意味する。減少させる又は阻害するは、治療されている障害の症状、転移の存在もしくは大きさ、又は原発性腫瘍の大きさに言及することができる。
【００７２】
用語「添付文書」は、適応症、用法、投与量、投与、併用療法、禁忌症及び／又はそのような治療製品に関する警告についての情報を含む、治療製品のコマーシャルパッケージに通例含まれる使用説明書に言及するのに使用される。幾つかの実施態様では、本発明添付文書はＰＡＫ１阻害剤を用いて黒色腫を治療するための使用説明書を含む。
【００７３】
「製品」は、少なくとも１つの試薬、例えば、疾患もしくは障害（例えば、癌）の治療のための薬物、又は本明細書に記載されるバイオマーカーを特異的に検出するためのプローブを含む任意の製造品（例えば、パッケージ又は容器）又はキットである。ある種の実施態様では、製造品又はキットは、本明細書に記載される方法を実施するためのユニットとして販売促進され、流通され、又は販売される。
【００７４】
「標的オーディエンス」は、特に特定の使用、処置、又は効能のために市場に出す又は宣伝することにより、特定の薬物が販売促進されている又は販売促進されることが意図されている対象となる人の集団又は施設であり、例えば、個体、全住民、新聞、医学文献、及び雑誌の読者、テレビ又はインターネット視聴者、ラジオ又はインターネットの聴取者、医者、製薬会社、等である。
【００７５】
当業者により理解されているように、本明細書の値又はパラメータの「約」への言及は、その値又はパラメータ自体に向けられている実施態様を含む（及び記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は「Ｘ」の記述を含む。
【００７６】
本明細書に記載される本発明の態様及び実施態様には、態様及び実施態様「からなる」及び／又は「基本的にからなる」が含まれることは理解されている。本明細書で使用されるように、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」には他の方法で指示されていなければ複数の参照が含まれる。
【００７７】
「個体」、「対象」又は「患者」は脊椎動物である。ある種の実施態様では、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ）、スポーツ動物、ペット（例えば、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類、マウス及びラットが含まれるが、これらに限定されない。ある種の実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【００７８】
用語「試料」又は「試験試料」は、本明細書で使用されるように、例えば、物理的、生化学的、化学的及び／又は生理学的特徴に基づいて特徴付けられるかつ／又は同定されることになる細胞実体及び／又は他の分子実体を含有する関心の対象から得られる又はこれに由来する組成物のことである。例えば、語句「疾患試料」及びその変種とは、特徴付けられることになる細胞実体及び／又は分子実体を含有することが予測される又は分かっている関心の対象から得られる任意の試料のことである。一実施態様では、定義は生体由来の血液及び他の液体試料並びに生検標本もしくは組織培養物などの組織試料又はそれに由来する細胞を包含する。組織試料の供給源は、新鮮な、凍結及び／もしくは保存器官又は組織試料由来の固体組織又は生検あるいは吸引液、血液もしくは任意の血液構成物、体液、並びに対象の妊娠もしくは発生における任意の時間由来の細胞又は血漿であり得る。試料には、一次細胞もしくは培養細胞又は細胞系統、細胞上澄み、細胞可溶化物、血小板、血清、血漿、硝子体液、リンパ液、滑液、卵胞液、精液、羊水、乳、全血、血液由来細胞、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、発汗、粘液、腫瘍可溶化物、及び組織培養培地、均質化された組織などの組織抽出物、腫瘍組織、細胞抽出物、並びにその組合せが含まれるがこれらに限定されない。
【００７９】
用語「試料」又は「試験試料」には、タンパク質もしくはポリヌクレオチドなどのある種の成分についての試薬を用いた処置、可溶化、もしくは濃縮により、又は切片を得るために半固体もしくは固体マトリックスに包埋することによりなどの、その調達後にいかなる方法であれ操作されている生体試料が含まれる。本明細書での目的では、組織試料の「切片」とは、組織試料の単一部分又は断片、例えば、組織試料から切り取られる組織の薄片又は細胞を意味する。一実施態様では、試料は臨床試料である。別の実施態様では、試料は診断アッセイにおいて使用される。幾つかの実施態様では、試料は原発又は転移腫瘍から得られる。組織検体は腫瘍組織の代表的小片を得るのに使用されることが多い。代わりに、腫瘍細胞は、対象の腫瘍細胞を含有すると分かっている又は考えられる組織又は体液の形態で間接的に得ることができる；例えば、皮膚の試料。
【００８０】
「組織試料」又は「細胞試料」とは、対象又は個体の組織から得られる類似の細胞の収集物を意味する。組織又は細胞試料の供給源は、新鮮な、凍結したかつ／もしくは保存された器官由来の固形組織、組織試料、生検並びに／又は吸引液；血液又は血漿などの任意の血液成分；脳脊髄液、羊水、腹水、又は間質液などの体液；対象の妊娠又は発生における任意の時間に由来する細胞でもよい。組織試料は一次細胞もしくは培養細胞又は細胞系統でもよい。場合により、組織又は細胞試料は疾患組織／器官から得られる。組織試料は、保存料、抗凝血剤、バッファー、固定液、栄養剤、抗生物質又は同類のものなどの、天然の組織と天然に混ざり合ってはいない化合物を含有していてもよい。
【００８１】
「基準試料」、「基準細胞」、「基準組織」、「対照試料」、「対照細胞」、又は「対照組織」とは、本明細書で使用されるように、比較目的で使用される試料、細胞、組織、標準、又はレベルのことである。一実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、又は対照組織は、同じ対象又は個体の身体（例えば、組織又は細胞）の健康な及び／又は非疾患部分から得られる。例えば、疾患細胞又は組織に隣接する健康な及び／又は非疾患細胞又は組織（例えば、腫瘍に隣接する細胞又は組織）である。幾つかの実施態様では、基準試料は非癌性皮膚細胞である。別の実施態様では、基準試料は同じ対象又は個体の身体の非処置組織及び／又は細胞から得られる。幾つかの実施態様では、基準試料は同じ対象又は個体の身体の非癌性皮膚細胞である。更に別の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、又は対照組織は対象でも個体でもない個体の身体（例えば、組織又は細胞）の健康な及び／又は非疾患部分から得られる。幾つかの実施態様では、基準試料は対象でも個体でもない個体の非癌性皮膚細胞である。更に別の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、又は対照組織は対象でも個体でもない個体の身体の非処置組織及び／又は細胞から得られる。
【００８２】
ある種の実施態様では、基準試料は、試験試料が得られるときとは異なる一又は複数の時点で得られる同じ対象又は患者由来の単一試料又は混合した複数の試料である。例えば、基準試料は、試験試料が得られるときより早期の時点で同じ対象又は患者から得られる。そのような基準試料は、基準試料が癌の初期診断中に得られるのであれば有用であることがあり、試験試料は後の癌が転移性になったときに得られる。
【００８３】
ある種の実施態様では、基準試料には、対象でも患者でもない一又は複数の個体から得られる用語「試料」の下で上に定義されるあらゆる種類の生体試料が含まれる。ある種の実施態様では、基準試料は、対象でも患者でもない血管新生障害（例えば、癌）を抱えた一又は複数の個体から得られる。
【００８４】
ある種の実施態様では、基準試料は、対象でも患者でもない一又は複数の健康な個体由来の混合した複数の試料である。ある種の実施態様では、基準試料は、対象でも患者でもない疾患又は障害（例えば、癌などの血管新生障害など）に罹った一又は複数の健康な個体由来の混合した複数の試料である。ある種の実施態様では、基準試料は、対象でも患者でもない一又は複数の個体由来の正常組織からプールされたＲＮＡ試料又はプールされた血漿もしくは血清試料である。ある種の実施態様では、基準試料は、対象でも患者でもない疾患又は障害（例えば、癌などの血管新生障害など）に罹った一又は複数の個体由来の腫瘍組織からプールされたＲＮＡ試料又はプールされた血漿もしくは血清試料である。
【００８５】
本明細書での目的のために、組織試料の「切片」とは、組織試料の単一部分又は片、例えば、組織試料から切断される組織又は細胞の薄切片を意味する。組織試料の同じ切片は形態的レベルでも分子レベルでも分析される、又はポリペプチドとポリヌクレオチドの両方に関して分析されると理解されているという条件で、組織試料の複数の切片が採取され分析にかけられてもよいと理解されている。
【００８６】
遺伝子又はバイオマーカーの発現レベル／量は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、タンパク質断片及び／又は遺伝子コピー数を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の適切な基準に基づいて定性的に及び／又は定量的に決定することができる。ある種の実施態様では、第一の試料における遺伝子又はバイオマーカーの発現／量は第二の試料における発現／量と比べて増加している。ある種の実施態様では、第一の試料における遺伝子又はバイオマーカーの発現／量は第二の試料における発現／量と比べて減少している。ある種の実施態様では、第二の試料は基準試料である。
【００８７】
ある種の実施態様では、用語「増加する」又は「過剰発現する」とは、基準試料と比べた場合、本明細書に記載される方法などの公知の標準技術により検出されるタンパク質又は核酸のレベルが約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のうちのいずれかの全体的増加のことである。ある種の実施態様では、用語「増加する」又は「過剰発現する」とは、増加が基準試料中のそれぞれの遺伝子又はバイオマーカーの発現レベル／量の少なくとも約１．５×、１．７５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２５×、５０×、７５×、又は１００×のうちのいずれかである試料中の遺伝子又はバイオマーカーの発現レベル／量の増加のことである。
【００８８】
ある種の実施態様では、本明細書の用語「減少する」とは、基準試料と比べた場合、本明細書に記載される方法などの公知の標準技術により検出される、タンパク質又は核酸のレベルが約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のうちのいずれかの全体的減少のことである。ある種の実施態様では、用語減少するとは、減少が基準試料中のそれぞれの遺伝子又はバイオマーカーの発現レベル／量の少なくとも約０．９×、０．８×、０．７×、０．６×、０．５×、０．４×、０．３×、０．２×、０．１×、０．０５×、又は０．０１×のうちのいずれかである試料中の遺伝子又はバイオマーカーの発現レベル／量の減少のことである。
【００８９】
「検出」には、直接的検出及び間接的検出を含む、任意の検出手段が含まれる。ある種の実施態様では、「相関する」又は「相関している」は、第一の分析又はプロトコールの成績及び／又は結果を第二の分析又はプロトコールの成績及び／又は結果といかなる方法であれ比較することを意味する。例えば、第二のプロトコールを実行する際に第一の分析もしくはプロトコールの結果を使用してもよい及び／又は第一の分析もしくはプロトコールの結果を使用して第二の分析もしくはプロトコールを実施するべきかどうかを決定してもよい。遺伝子発現分析又はプロトコールの実施態様に関しては、遺伝子発現分析又はプロトコールの結果を使用して特定の治療計画を実施するべきかどうかを決定してもよい。
【００９０】
本明細書で使用される場合の単語「標識」とは、核酸プローブ又は抗体などの試薬に直接的に又は間接的にコンジュゲートされる又は融合され、それがコンジュゲートされている又は融合されている試薬の検出を促進する化合物又は組成物のことである。標識はそれ自体が検出可能であることもあれば（例えば、放射線標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合は、検出可能である基質化合物又は組成物の化学的変化を触媒してもよい。
【００９１】
用語「ポリペプチド」とは、任意の長さのアミノ酸のポリマーのことである。ポリマーは直鎖のことも又は分岐していることもあり、修飾されたアミノ酸を含むこともあり、非アミノ酸が割り込んでいることもある。前記用語は、天然に又は介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識成分を用いたコンジュゲーションなどの他の任意の操作もしくは修飾により修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。前記定義内には、例えば、アミノ酸の一又は複数の相同物（例えば、非天然アミノ酸、等を含む）、及び当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は具体的には「タンパク質」を包含する。本明細書で使用される用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は具体的には抗体を包含する。
【００９２】
「単離された」核酸分子とは、それがポリペプチド核酸の天然の供給源の中で通常は会合している少なくとも１つの汚染物質核酸分子から同定され分離されている核酸分子である。単離された核酸分子は、それが自然の中で見いだされる形態又は背景中以外のものである。したがって、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在するときの核酸分子から区別されている。しかし、単離された核酸分子には、例えば、通常ポリペプチドを発現する細胞であって、核酸分子が天然の細胞の核酸分子とは異なる染色体位置にある細胞に含有される核酸分子が含まれる。
【００９３】
「遺伝子」、「標的遺伝子」、「標的バイオマーカー」、「標的配列」、「標的核酸」又は「標的タンパク質」は、本明細書で使用されるように、その検出が望まれる対象のポリヌクレオチド又はタンパク質である。一般に、「鋳型」は、本明細書で使用されるように、標的ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドである。幾つかの例では、用語「標的配列」、「鋳型ＤＮＡ」、「鋳型ポリヌクレオチド」、「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」及びその変種は互換的に使用される。
【００９４】
「天然配列」ポリペプチドは、天然に由来するポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。したがって、天然配列ポリペプチドは、任意の哺乳動物由来の天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列を有することができる。そのような天然配列ポリペプチドは自然から単離することができる又は組合せ手段もしくは合成手段により生産することができる。用語「天然配列」ポリペプチドは、ポリペプチドの天然に存在する切断型又は分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に存在する変異体型（例えば、オルタナティブスプライシング型）及びポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子バリアントを特に包含する。
【００９５】
「単離された」ポリペプチド又は「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定され、分離されかつ／又は回収されたポリペプチド又は抗体である。その天然環境の汚染物質成分は、ポリペプチドについて診断使用又は治療使用を妨げると考えられる物質のことであり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性の溶質を含むことがある。ある種の実施態様では、ポリペプチドは、（１）ローリー法で決定した場合ポリペプチドの９５重量％よりも上まで、もしくは９９重量％よりも上まで、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によりＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度にまで、又は（３）クーマシーブルーもしくは銀染色を使用して還元条件もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製されることになる。単離されたポリペプチドには、ポリペプチド天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないために、組換え細胞内にポリペプチドがインサイツで含まれる。しかし、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製ステップにより調製されることになる。
【００９６】
ポリペプチド「変異体」とは、天然配列ポリペプチドと少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端で、一又は複数のアミノ酸残基が付加されている、又は欠失しているポリペプチドが含まれる。通常は、変異体は天然配列ポリペプチドと少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性、更に好ましくは少なくとも約９０％アミノ酸配列同一性、更に好ましくは少なくとも約９５％アミノ酸配列同一性を有することになる。
【００９７】
用語「利益」は最も広い意味で使用され、いかなる望ましい効果をも指しており、特に本明細書で定義される臨床的利益が含まれる。
【００９８】
臨床的利益は、様々なエンドポイント、例えば、減速及び完全停止を含む疾患進行のある程度の阻害、疾患エピソード及び／又は症状の数の減少、病変サイズの縮小、隣接する末梢器官及び／又は組織への疾患細胞浸潤の阻害（すなわち、縮小、減速又は完全停止）、疾患伝播の阻害（すなわち、縮小、減速又は完全停止）、自己免疫応答の減少を評価することにより測定することができるが、これらのエンドポイントは、疾患病変の後退もしくはアブレーション、障害に付随する１つもしくは複数の症状のある程度の軽減、処置に続く無病プレゼンテーション、例えば、無憎悪生存期間の長さの増加、全生存期間の増加、より高い応答速度、及び／又は処置に続く所与の時点での死亡率の減少をもたらすことはあるが、もたらさなくてもよい。
【００９９】
本発明の方法
本発明は、個体において黒色腫を治療するための方法であって、黒色腫を治療有効量のＰＡＫ１阻害剤に接触させることを含む方法を提供する。幾つかの実施態様では、この方法は、個体に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む。
【０１００】
黒色腫はメラニン形成細胞、例えば、皮膚の色の原因となる黒い色素であるメラニンを産生する細胞の悪性腫瘍である。黒色腫は主に皮膚において発生するが、腸及び目（例えば、ブドウ膜黒色腫）を含む、身体の他の部分にも見られる。黒色腫はメラニン形成細胞を含有する身体のいかなる部分でも起こり得る。黒色腫の例には、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子由来黒色腫、及び末端黒子型黒色腫が含まれるが、これらに限定されない。黒色腫は、サイズ、潰瘍、リンパ節への伝播、及び／又は他の組織もしくは器官への伝播を含む、幾つかの基準に応じて病期分類することができる。幾つかの実施態様では、本発明は、黒色腫をＰＡＫ１の阻害剤に接触させることにより、個体においてＩ期黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、黒色腫をＰＡＫ１の阻害剤に接触させることにより、個体においてＩＩ期黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、黒色腫をＰＡＫ１の阻害剤に接触させることにより、個体においてＩＩＩ期黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、黒色腫をＰＡＫ１の阻害剤に接触させることにより、個体においてＩＶ期黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、黒色腫をＰＡＫ１の阻害剤に接触させることにより、個体において転移性黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、黒色腫をＰＡＫ１の阻害剤に接触させることにより、個体において再発黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、この方法は、個体に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１阻害剤はＰＡＫ１の小分子阻害剤である。幾つかの実施態様では、個体は哺乳動物である。幾つかの実施態様では、個体はヒトである。幾つかの態様では、本発明は、個体において野生型ＢＲＡＦ黒色腫である黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、野生型ＢＲＡＦ黒色腫を治療する方法であって、黒色腫を治療有効量のＰＡＫ１阻害剤に接触させることを含む方法を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、野生型ＢＲＡＦ黒色腫を治療する方法であって、個体に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む方法を提供する。ＢＲＡＦは、セリン／スレオニン特異的タンパク質キナーゼのＲａｆキナーゼファミリーのメンバーである。ＢＲＡＦは、細胞分裂、分化、及び分泌に影響を及ぼすＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫシグナル伝達経路（ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路）を調節するのに役割を果たしている。ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達は癌において調節不全になっていることが多い。ヒト癌に関連するＢＲＡＦ遺伝子の３０を超える突然変異が同定されている。ＢＲＡＦ突然変異の頻度は、黒色腫における８０％超から肺癌における１〜３％及び結腸直腸癌における５％などの他の腫瘍におけるわずか０〜１８％までヒト癌では広く変動する。癌、特に黒色腫において見られる一般的突然変異は、グルタミンによるコドン６００でのバリンの置換（すなわち、Ｖ６００Ｅ）である。例えば、チミンはヌクレオチド１７９９でアデニンにより置換され、Ｖ６００Ｅ突然変異を生じる。ＢＲＡＦのＶ６００突然変異により、構成的ＢＲＡＦキナーゼ活性がもたらされる。黒色腫におけるＢＲＡＦの遺伝子型を決定するための方法は当業者には公知であり、例えば、黒色腫由来のＢＲＡＦ遺伝子のヌクレオチド配列は、標準塩基配列決定法を使用して、又はＫＡＳＰ ＳＮＰ遺伝子型判定システム（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用することにより決定することができる。幾つかの実施態様では、本発明は、個体において野生型ＢＲＡＦ黒色腫である黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、個体において野生型ＢＲＡＦ黒色腫であり非癌性細胞と比べてＰＡＫ１を過剰発現している黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、個体において野生型ＢＲＡＦを含みＰＡＫ１が増幅されている黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、黒色腫は、非癌性細胞と比べてＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されており、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、本発明は、個体において突然変異ＢＲＡＦ黒色腫である黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、個体において突然変異ＢＲＡＦ黒色腫であり非癌性細胞と比べてＰＡＫ１を過剰発現している黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、個体において突然変異ＢＲＡＦを含みＰＡＫ１が増幅されている黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、個体においてＶ６００Ｅ突然変異ＢＲＡＦではない突然変異ＢＲＡＦを含む黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、個体は哺乳動物である。幾つかの実施態様では、個体はヒトである。
【０１０１】
幾つかの態様では、本発明は、黒色腫を治療有効量のＰＡＫ１阻害剤に接触させることにより、個体において黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの態様では、本発明は、個体に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することにより、個体において黒色腫を治療する方法を提供する。ＰＡＫは、ヒト癌細胞においては一般に調節解除されている幾つかの経路に関与している。ＰＡＫ１は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、ＪＵＮ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ステロイドホルモン受容体、及び核因子（ＮＦ）シグナル伝達経路の成分であり、これらはすべて腫瘍形成と関連付けられてきた。ＰＡＫはＭＥＫとＲＡＦ１を、それぞれセリン２９８とセリン３３８上でリン酸化することにより活性化する。ＰＡＫ１によるＲａｓ誘導形質転換の増加は、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）−ＭＡＰＫ経路を通じてシグナル伝達に対するその効果と相関しており、ＪＮＫ又はｐ３８−ＭＡＰＫ経路に対する効果からは分離できた。（Ｒ．Ｋｕｍａｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ２００６ ６：４５９）。ＥＲＫ／ＭＥＫ経路の構成的活性化は、腫瘍の形成、進行及び生存と関連付けられており、更に、無制御増殖、アポトーシスの制御の喪失及び予後不良を特徴とする悪性表現型と関連している（Ｊ．Ａ．Ｓｐｉｃｅｒ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２００８ ３：７）。腫瘍形成と進行は癌細胞におけるアポトーシス促進性シグナルの不活化を必要とする。ＰＡＫ活性は幾つかの重要なアポトーシス促進性経路を下方調節することが明らかにされている。ＲＡＦ１のＰＡＫ１リン酸化は、ミトコンドリアへのＲＡＦ１の移行を誘導し、そこでＲＡＦ１は細胞死のアポトーシス促進性タンパク質ＢＣＬ２アンタゴニスト（ＢＡＤ）をリン酸化する。ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫ４及びＰＡＫ５も、（サル）起源でＳＶ４０（ＣＯＳ）腎臓を担持しているＣＶ−１、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞などの選択された細胞型においてＢＡＤを直接リン酸化し不活化することが報告されている（Ｒ．Ｋｕｍａｒら、同書）。しかし、ヒト腫瘍細胞におけるＰＡＫ１の関連経路下流は依然として部分的にしか理解されていない。
【０１０２】
ＰＡＫ１は種々の正常組織において広く発現されているが、卵巣癌、乳癌及び膀胱癌では発現が著しく増加している。（Ｓ．Ｂａｌａｓｅｎｔｈｉｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４ ２７９：４７４３；Ｍ．Ｉｔｏら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．２００７ １７８：１０７３；Ｐ．Ｓｃｈｒａｍｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２００３ １６３：９８５）。管腔乳癌では、ＰＡＫ１のゲノム増幅は、おそらくＰＡＫ１によるエストロゲン受容体の直接リン酸化とリガンド非依存性トランス活性化の結果として起こる、タモキシフェン治療に対する抵抗性と関連付けられている（Ｓ．Ｋ．Ｒａｙａｌａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６．６６：１６９４〜１７０１）。
【０１０３】
幾つかの態様では、本発明は黒色腫を治療有効量のＰＡＫ１阻害剤に接触させることにより、個体において黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの態様では、本発明は個体に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することにより、個体において黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１遺伝子は黒色腫において増幅される。幾つかの実施態様では、黒色腫におけるＰＡＫ１のコピー数は、約２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０又は５．０超のいずれかである。黒色腫におけるＰＡＫ１遺伝子のコピー数を決定する方法は当技術分野では公知である。例えば、ＰＡＫ１遺伝子のコピー数は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ５００Ｋ ＳＮＰアレイ分析などのＳＮＰアレイを使用することにより決定することができる。幾つかの実施態様では、本発明は、黒色腫におけるＰＡＫ１のコピー数が約２．５よりも大きい、個体において黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、黒色腫におけるＰＡＫ１のコピー数を決定し、続いてＰＡＫ１阻害剤を用いて治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、黒色腫におけるＰＡＫ１のコピー数が非癌性細胞、例えば、非癌性皮膚細胞におけるＰＡＫ１のコピー数と比較される。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は黒色腫において増幅されており、黒色腫がＰＡＫ１を過剰発現している。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は黒色腫において増幅されており、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、個体は哺乳動物である。幾つかの実施態様では、個体はヒトである。
【０１０４】
幾つかの態様では、本発明は、ＰＡＫ１が過剰発現されている黒色腫を治療有効量のＰＡＫ１阻害剤に接触させることにより、個体において黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの態様では、本発明は、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されている個体に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することにより、個体において黒色腫を治療する方法を提供する。ＰＡＫ１の発現を判定するための方法は当技術分野では公知である。黒色腫におけるＰＡＫ１の発現レベルを決定するための方法の例には、免疫組織化学、逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）、定量的ＰＣＲ、免疫アッセイなどが含まれるが、これらに限定されない。ＰＡＫ１発現のレベルは、遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ）データベースを使用することにより他の腫瘍及び細胞と比較することができる。
【０１０５】
幾つかの実施態様では、本発明は、非癌性細胞と比べてＰＡＫ１が過剰発現されている黒色腫をＰＡＫ１阻害剤に接触させることにより、個体において黒色腫を治療するための方法を提供する。幾つかの態様では、本発明は、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されている個体に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することにより、個体において黒色腫を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、黒色腫におけるＰＡＫ１の発現は、非癌性細胞における発現の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超のいずれかである。幾つかの実施態様では、黒色腫におけるＰＡＫ１の発現は、非癌性細胞におけるＰＡＫ１の発現と比べて約１．５倍、２．０倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、１０倍又は１０倍超のいずれかである。幾つかの実施態様では、黒色腫は非癌性細胞と比べてＰＡＫ１を過剰発現しており、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は非癌性細胞と比べてＰＡＫ１を過剰発現しており、ＰＡＫ１は黒色腫において増幅されている。幾つかの実施態様では、黒色腫は非癌性細胞と比べてＰＡＫ１を過剰発現しており、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫であり、ＰＡＫ１は黒色腫において増幅されている。幾つかの実施態様では、個体は哺乳動物である。幾つかの実施態様では、個体はヒトである。
【０１０６】
幾つかの態様では、本発明は、個体において黒色腫におけるＣＲＡＦシグナル伝達を阻害する方法であって、黒色腫を治療有効量のＰＡＫ１阻害剤に接触させることを含む方法を提供する。幾つかの態様では、本発明は、個体において黒色腫におけるＣＲＡＦシグナル伝達を阻害する方法であって、個体に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む方法を提供する。ＣＲＡＦシグナル伝達を測定する方法は当技術分野では公知である。例えば、ＣＲＡＦ活性化は、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療前及び／又は後で個体由来の黒色腫から単離されたＣＲＡＦの免疫ブロットにより判定することができる。ＣＲＡＦの活性化は、ホスホＣＲＡＦ（Ｓｅｒ３３８）抗体を使用して測定してもよい。幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は黒色腫において過剰発現されている。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されており、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は黒色腫において過剰発現されており、ＰＡＫ１は黒色腫において増幅されている。幾つかの実施態様では、個体は哺乳動物である。幾つかの実施態様では、個体はヒトである。
【０１０７】
幾つかの態様では、本発明は、個体において黒色腫におけるＭＥＫシグナル伝達を阻害する方法であって、黒色腫を治療有効量のＰＡＫ１阻害剤に接触させることを含む方法を提供する。幾つかの態様では、本発明は、個体において黒色腫におけるＭＥＫシグナル伝達を阻害する方法であって、個体に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む方法を提供する。ＭＥＫシグナル伝達を測定する方法は当技術分野では公知である。例えば、ＭＥＫ活性化は、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療前及び／又は後で個体由来の黒色腫から単離されたＭＥＫの免疫ブロットにより判定することができる。ＭＥＫの活性化は、ホスホＭＥＫ１／１（Ｓｅｒ２１７／Ｓｅｒ２２１）抗体を使用して測定してもよい。幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は黒色腫において過剰発現されている。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されており、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は黒色腫において過剰発現されており、ＰＡＫ１は黒色腫において増幅されている。幾つかの実施態様では、個体は哺乳動物である。幾つかの実施態様では、個体はヒトである。
【０１０８】
ＰＡＫ１の阻害剤
本明細書に記載される方法において有用であるＰＡＫ１の阻害剤（例えば、ＰＡＫ１アンタゴニスト）が本明細書で提供される。幾つかの実施態様において、ＰＡＫ１阻害剤は小分子、核酸、ポリペプチド又は抗体である。ＰＡＫ阻害剤の例は、ＷＯ２００７／０７２１５３とＷＯ２０１０／０７１８４において提供されており、前記特許文献は両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０９】
小分子
黒色腫の治療のためのＰＡＫ１阻害剤として使用するための小分子が本明細書で提供される。
【０１１０】
小分子は好ましくは、本明細書に記載されるＰＡＫ１に結合する又はＰＡＫ１シグナル伝達を妨げる本明細書で定義される結合ポリペプチド又は抗体以外の有機分子である。結合有機小分子は公知の方法を使用して同定され化学的に合成されうる（例えば、ＰＣＴ出願番号ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５参照）。結合有機小分子は通常大きさは約２０００ダルトン未満である、又は大きさは約１５００、７５０、５００、２５０もしくは２００ダルトン未満であり、本明細書に記載されるポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができるそのような有機小分子は、周知の技法を使用する不必要な実験なしで同定しうる。この点に関して、ポリペプチド標的に結合することができる分子を求めて有機小分子ライブラリーをスクリーニングするための技法は当技術分野では周知であることが知られている（例えば、ＰＣＴ出願番号ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５参照）。結合有機小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ−置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、ウレア、カルバミン酸、炭酸、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホン酸、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホン酸、芳香族化合物、複素環式化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｅ）、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアン酸、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物、酸クロリド、又は同類のものでありうる。
【０１１１】
ＰＡＫキナーゼの小分子阻害剤は記載されている（ＷＯ２００６０７２８３１、ＷＯ２００７０２３３８２、ＷＯ２００７０７２１５３、ＷＯ２０１０／０７１８４６、ＵＳ２００９０２７５５７０参照）。
2015511598.tif 000002
【０１１２】
２−アミノピリド（ｐｙｒｉｄｏ）［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−ワン（Ｉ）スキャフォールド上で精巧に作り上げられた一連のＰＡＫ１選択的阻害剤は、一連の特許出願（ＷＯ２００９０８６２０４、ＷＯ２０１００７１８４６、ＷＯ２０１１０４４５３５、ＷＯ２０１１１５６６４６、ＷＯ２０１１１５６７８６、ＷＯ２０１１１５６６４０、ＷＯ２０１１１５６７８０、ＷＯ２０１１１５６７７５、ＷＯ２０１１０４４２６４）においてＡｆｒａｘｉｓ、Ｉｎｃ．により開示されている。ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａは、式ＩＩの二環式複素環式ＰＡＫ１阻害剤を開示している（ＷＯ２００６１０６３２６参照）。
2015511598.tif 000003
【０１１３】
Ｐｆｉｚｅｒは、１Ｈ−チエノ［３，２−ｃ］ピラゾール（ＩＩＩ）、３−アミノ−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール（ＩＶ）及びＮ４−（１Ｈ−ピラゾール−３−イル）ピリミジン−２，４−ジアミン（Ｖ）上で精巧に作り上げられたＰＡＫ阻害剤を開示している（ＷＯ２００４００７５０４、ＷＯ２００７０２３３８２、ＷＯ２００７０７２１５３、及びＷＯ２００６０７２８３１参照）。
2015511598.tif 000004
【０１１４】
ＰＦ−３７５８３０９（ＶＩ）は、臨床試験中であるＰＡＫ１、４、５及び６の強力なＡＴＰ競合阻害剤である。（Ｂ．Ｗ．Ｍｕｒｒａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１０ １０７（２０）：９４４６；Ｒｏｓｅｎ Ｌら、進行性固形腫瘍を有する患者における経口ＰＡＫ阻害剤である単剤ＰＦ−０３７５８３０９の第１相、用量漸増、安全性、薬物動態及び薬力学研究［摘要］、Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＡＣＲ−ＮＣＩ−ＥＯＲＴＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；２０１１ １１月１２〜１６日；Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＰＡ）：ＡＡＣＲ；Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２０１１；１０（１１ Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｒ Ａ１７７）。
2015511598.tif 000005
【０１１５】
Ｎ４−（１Ｈ−ピラゾール−３−イル）ピリミジン−２，４−ジアミン（ＶＩＩ）の一連のＮ２−二環式インドリル、インダゾリル及びベンゾイミダゾリル誘導体（２０１１年８月２５日提出の米国特許出願第６１／５２７，４５３号）並びにそのアザ−インドリル、インダゾリル及びベンゾイミダゾリル誘導体（２０１１年１２月２２に日提出の米国特許出願第６１／５７９，２２７号）は開示されており、それらの特許文献は参照によりその全体を組み込まれている。（Ａ＝インドリル、インダゾリル及びベンゾイミダゾリル又はそのアザ誘導体）。
【０１１６】
核酸
本発明は、個体における黒色腫の治療のためのＰＡＫ１のポリヌクレオチドアンタゴニストを本明細書で提供する。ポリヌクレオチドは、ゲノムもしくは合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）を含む、ｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡザイム、ＤＮＡザイム、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、又はこれらの任意の断片であることが可能であり、これらのポリヌクレオチドは一本鎖でも二本鎖でもよく、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に対する、又は天然起源でも合成起源でも、例えば、ｉＲＮＡ、リボヌクレオタンパク質（例えば、ｉＲＮＰ）を含む任意のＤＮＡ様又はＲＮＡ様物質に対するセンス鎖又はアンチセンス鎖を表していてもよい。幾つかの実施態様では、ポリヌクレオチドはＰＡＫ１発現を標的にする（例えば、ＰＡＫ１ ｍＲＮＡを標的にする）。
【０１１７】
ポリヌクレオチドはアンチセンス核酸及び／又はリボザイムでもよい。アンチセンス核酸は、ＰＡＫ１のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含む。しかし、絶対的な相補性は、好ましいけれども、必要ではない。
【０１１８】
本明細書で言及される「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列とは、前記ＲＮＡとハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成することができるのに十分な相補性を有する配列を意味し、二本鎖ＰＡＫ１アンチセンス核酸の場合、したがって、二重鎖ＤＮＡの一本鎖を試験することができ、又は三重鎖形成をアッセイしうる。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度と長さの両方に依拠することになる。一般に、ハイブリダイズしている核酸が大きいほど、核酸はＰＡＫ１ＲＮＡとそれだけ多くの塩基ミスマッチを含有するが、それでも安定な二重鎖（又は、場合によっては、三重鎖）を形成しうる。当業者であれば、ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準法の使用によりミスマッチの許容可能な程度を確認することができる。
【０１１９】
メッセージの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでの５’非翻訳配列、及びＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列に相補的であるポリヌクレオチドは翻訳の阻害に最も効率よく機能するはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列も同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに効果的であることが明らかにされている。一般的には、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３〜３３５を参照されたい。したがって、ＰＡＫ１遺伝子の５’−又は３’−非翻訳、非コード領域のどちらかに相補的であるオリゴヌクレオチドであれば、内在性ＰＡＫ１ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのにアンチセンスアプローチを使用することができる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なポリヌクレオチドであればＡＵＧ開始コドンの相補体を含むはずである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは翻訳を阻害する効率は低くなるが、本発明に従えば使用することができる。ＰＡＫ１ｍＲＮＡの５’−、３’−又はコード領域にハイブリダイズするように設計されていようと、アンチセンス核酸は少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、好ましくは６〜約５０ヌクレオチド長に及ぶオリゴヌクレオチドである。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド又は少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０１２０】
一実施態様では、本発明のＰＡＫ１アンチセンス核酸は、外来性配列の転写により細胞内で産生される。例えば、ベクター又はその一部は転写されて、ＰＡＫ１遺伝子のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。そのようなベクターであれば、ＰＡＫ１アンチセンス核酸をコードする配列を含有していると考えられる。そのようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生することができさえすれば、エピソームのままである又は染色体に組み込まれることも可能である。そのようなベクターは、当技術分野で標準的方法である組換えＤＮＡ技術により構築することができる。ベクターは、脊椎動物細胞における複製及び発現のために使用されるプラスミド、ウイルス、又は当技術分野で公知の他のものであることが可能である。ＰＡＫ１をコードする配列又はその断片の発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作用する当技術分野で公知のいかなるプロモーターによっても可能である。そのようなプロモーターは誘導性でも構成的でも可能である。そのようなプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ及びＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２９：３０４〜３１０（１９８１））、ラウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウイルスの３’長末端リピートに含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ ２２：７８７〜７９７（１９８０））、ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１〜１４４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９〜４２（１９８２））、等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２１】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、黒色腫の治療において使用するためのＰＡＫ１阻害剤としても機能することができる。ＰＡＫ１発現は、ＰＡＫ１の発現が特異的に阻害されるように、黒色腫を小二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又は小二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクター又は構築物に接触させることにより可能である。適切なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡコードベクターを選択するための方法は当技術分野では周知である（Ｔｕｓｃｈｉ，Ｔら、（１９９９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３（２４）：３１９１〜３１９７；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ＳＭら、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４〜４９８；Ｈａｎｎｏｎ，ＧＦ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ ４１８：２４４〜２５１；ＭｃＭａｎｕｓ ＭＴ及びＳｈａｒｐ、ＰＡ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：７３７〜７４７；Ｂｒｅｍｍｅｌｋａｍｐ，ＴＲら、（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０〜５５３、米国特許第６，５７３，０９９号及び米国特許第６，５０６，５５９号並びに国際特許公開第ＷＯ０１／３６６４６号、ＷＯ９９／３２６１９及びＷＯ０１／６８８３６）。ＰＡＫ１ ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド配列の例には、１）ＧＡＡＧＡＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＡＡＡ、２）ＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＣＧＡＡＧＣＡＴＡ、３）ＡＣＣＣＡＡＡＣＡＴＴＧＴＧＡＡＴＴＡ、４）ＧＧＴＴＴＡＴＧＡＴＴＡＡＧＧＧＴＴＴが含まれるが、これらに限定されない。これらの配列はすべてＤｈａｒｍａｃｏｎ、Ｉｎｃ．より得られた。
【０１２２】
ポリペプチド
本発明は、個体において黒色腫を治療するためのＰＡＫ１活性のポリペプチド阻害剤を提供する。例えば、結合ポリペプチドは、本明細書に記載されるＰＡＫ１に好ましくは特異的に結合するポリペプチドである。幾つかの実施態様では、結合ポリペプチドはＰＡＫ１アンタゴニストである。結合ポリペプチドは、既知のポリペプチド合成法を使用して化学的に合成してもよいし、又は組換え技術を使用して調製し精製してもよい。結合ポリペプチドは通常、少なくとも約５アミノ酸長、又は少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００アミノ酸長もしくはそれよりも長く、そのような結合ポリペプチドは、本明細書に記載されるＰＡＫ１に好ましくは特異的に結合することができる。結合ポリペプチドは、周知の技法を使用する必要以上の実験をせずに同定しうる。この点に関して、ポリペプチド標的に特異的に結合することができる結合ポリペプチドを求めてポリペプチドライブラリーをスクリーニングするための技法は当技術分野では周知であることは知られている（例えば、米国特許第５，５５６，７６２号、米国特許第５，７５０，３７３号、米国特許第４，７０８，８７１号、米国特許第４，８３３，０９２号、米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５７１，６８９号、米国特許第５，６６３，１４３号；ＰＣＴ出願番号ＷＯ８４／０３５０６及びＷＯ８４／０３５６４；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１：３９９８〜４００２（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２：１７８〜１８２（１９８５）；Ｇｅｙｓｅｎら、ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、１３０〜１４９（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１０２：２５９〜２７４（１９８７）；Ｓｃｈｏｏｆｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４０：６１１〜６１６（１９８８）、Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３７８；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８３６３、及びＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２：６６���参照）。
【０１２３】
この点に関して、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大量のポリペプチドライブラリーをスクリーニングして、標的ＰＡＫ１に特異的に結合することができるライブラリーの一又は複数のメンバーを同定することができる１つの周知の技法である。ファージディスプレイは、変異体ポリペプチドがバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質への融合タンパク質として提示される技法である（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．及びＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６）。ファージディスプレイの有用性は、選択的に無作為化されたタンパク質変異体（又は無作為にクローニングされたｃＤＮＡ）の大きなライブラリーを、標的分子に高親和性で結合する配列について迅速かつ効率的に分類することができることにある。ファージ上へのペプチド（Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３７８）又はタンパク質（Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ Ｊ．Ｄ．ら、（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８３６３）ライブラリーの提示は、特異的結合特性を有するものを求めて何百万のポリペプチド又はオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されてきた（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２：６６８）。ランダム変異体のファージライブラリーを分類するには、多数の変異体を構築し増殖させるための戦略、標的受容体を使用する親和性精製のための手順、及び結合濃縮の結果を評価する手段が必要である。米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５７１，６８９号、及び米国特許第５，６６３，１４３号。
【０１２４】
大半のファージディスプレイ法は繊維状ファージを使用してきたが、ラムダ状ファージディスプレイシステム（ＷＯ９５／３４６８３；Ｕ．Ｓ．５，６２７，０２４）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（Ｒｅｎら、Ｇｅｎｅ、２１５：４３９（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５８（１５）：３２０９〜３２１４（１９９８）；Ｊｉａｎｇら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６５（１１）：４７７０〜４７７７（１９９７）；Ｒｅｎら、Ｇｅｎｅ、１９５（２）：３０３〜３１１（１９９７）；Ｒｅｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、５：１８３３（１９９６）；Ｅｆｉｍｏｖら、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ、１０：１７３（１９９５））及びＴ７ファージディスプレイシステム（Ｓｍｉｔｈ及びＳｃｏｔｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２１７：２２８〜２５７（１９９３）；Ｕ．Ｓ．５，７６６，９０５）も知られている。
【０１２５】
追加の改良により、選択された標的分子への結合についてペプチドライブラリーをスクリーニングし、所望の特性を求めてこれらのタンパク質をスクリーニングする可能性のある機能的タンパク質を提示するディスプレイシステムの能力は増強されている。ファージディスプレイ反応のためのコンビナトリアル反応装置が開発され（ＷＯ９８／１４２７７）、ファージディスプレイライブラリーを使用して、二分子相互作用（ＷＯ９８／２０１６９；ＷＯ９８／２０１５９）及び束縛されたヘリックスペプチドの特性（ＷＯ９８／２００３６）を解析し制御してきた。ＷＯ９７／３５１９６は、ファージディスプレイライブラリーを、リガンドが標的分子に結合する１つの溶液とアフィニティーリガンドが標的分子に結合しない第２の溶液に接触させて、結合リガンドを選択的に単離する、アフィニティーリガンドを単離する方法を記載している。ＷＯ９７／４６２５１は、ランダムファージディスプレイライブラリーを親和性精製された抗体でバイオパンし、次に結合ファージを単離し、続いて高親和性結合ファージを単離するためのマイクロプレートウェルを使用するマイクロパンニングプロセスの方法を記載している。親和性タグとしての黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）タンパク質Ａの使用も報告されている（Ｌｉら、（１９９８）Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、９：１８７）。ＷＯ９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリーであることもあるコンビナトリアルライブラリーを使用して酵素特異性を区別するための基質サブストラクションライブラリーの使用を記載している。ファージディスプレイを使用する洗剤中で使用するのに適した酵素を選択するための方法はＷＯ９７／０９４４６に記載されている。特異的結合タンパク質を選択する追加の方法は、米国特許第５，４９８，５３８号、米国特許第５，４３２，０１８号、及びＷＯ９８／１５８３３に記載されている。
【０１２６】
ペプチドライブラリーを作製しこれらのライブラリーをスクリーニングする方法も、米国特許第５，７２３，２８６号、米国特許第５，４３２，０１８号、米国特許第５，５８０，７１７号、米国特許第５，４２７，９０８号、米国特許第５，４９８，５３０号、米国特許第５，７７０，４３４号、米国特許第５，７３４，０１８号、米国特許第５，６９８，４２６号、米国特許第５，７６３，１９２号、及び米国特許第５，７２３，３２３号に開示されている。
【０１２７】
抗体
本発明の幾つかの実施態様では、個体において黒色腫を治療するためのＰＡＫ１阻害剤は、ＰＡＫ１に結合する単離された抗体である。幾つかの実施態様では、抗体はヒト化されている。本発明の追加の態様では、抗ＰＡＫ１抗体又はＰＡＫ１を阻害する抗体は機能する。幾つかの実施態様では、抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。幾つかの実施態様では、抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施態様では、抗体は完全長抗体、例えば、無傷のＩｇＧ１’’抗体又は本明細書で定義される他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。
【０１２８】
ある特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体及び／又は結合ポリペプチドのアミノ酸配列変異体が想定されている。例えば、抗体及び／又は結合ポリペプチドの結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善するのが望ましいことがある。抗体及び／又は結合ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、適切な改変を抗体及び／又は結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中に導入することにより、又はペプチド合成により調製しうる。そのような改変には、例えば、抗体及び／又は結合ポリペプチドのアミノ酸配列からの残基の欠失、及び／又は内への残基の挿入及び／又は残基の置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴、例えば、標的結合性を有するのであれば、欠失、挿入、及び置換のどんな組合せでも行って最終構築物に到達することができる。
【０１２９】
ある特定の実施態様では、一又は複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体及び／又は結合ポリペプチド変異体が提供される。置換的変異誘発のための対象の部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。アミノ酸置換は対象の抗体及び／又は結合ポリペプチドに導入され、生成物は、所望の活性、例えば、保持された／改善された抗原結合性、減少した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングされうる。
【０１３０】
置換的変異体の一種は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる研究のために選択される一又は複数のこうして得られる変異体は、親抗体と比べてある種の生物学的特性（例えば、増加した親和性、減少した免疫原性）に改変（例えば、改善）を有することになる及び／又は親抗体のある種の生物学的特性を実質的に保持していることになる。例となる置換的変異体は親和性成熟抗体であり、この抗体は、例えば、本明細書に記載されている技法などのファージディスプレイベースの親和性成熟技法を使用して都合よく産生しうる。手短に言えば、一又は複数のＨＶＲ残基は変異され、変異体抗体はファージ上に提示され、特定の生物活性（例えば、結合親和性）を求めてスクリーニングされる。
【０１３１】
例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいて変更（例えば、置換）を加えることもできる。そのような変更はＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で突然変異を受けるコドンによりコードされている残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９〜１９６（２００８）参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）において加えることができ、こうして得られる変異体ＶＨ又はＶＬは結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築しそこから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ１７８：１〜３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（２００１））に記載された。親和性成熟の幾つかの実施態様では、種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、チェインシャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異）のうちのいずれかにより成熟のために選択された可変遺伝子に多様性が導入される。次に、二次ライブラリーが作製される。次に、前記ライブラリーはスクリーニングされて、所望の親和性を有る任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入する別の方法は、幾つかのＨＶＲ領域（例えば、１度に４〜６残基）がランダム化されるＨＶＲ指向性アプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用して、特異的に同定しうる。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３は特に標的にされることが多い。
【０１３２】
ある特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、そのような変更が抗原に結合する抗体の能力を実質的に減少させない限り、一又は複数のＨＶＲ内で起こってもよい。例えば、結合親和性を実質的に減少させない保存的変更（例えば、本明細書で提供される保存的置換）をＨＶＲにおいて加えうる。そのような変更はＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってよい。上に提供される変異体ＶＨ及びＶＬ配列のある特定の実施態様では、それぞれのＨＶＲは変更されない、又は１つ以下、２つ以下又は３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
【０１３３】
併用療法
本明細書に記載される方法のＰＡＫ１阻害剤は、黒色腫の治療のための療法において単独で又は他の薬物と組み合わせて使用することができる。例えば、本明細書に記載されるＰＡＫ１阻害剤は、別のＰＡＫ１阻害剤を含む少なくとも１つの追加の治療薬と同時投与することができる。ある種の実施態様では、追加の治療薬は化学療法薬である。幾つかの実施態様では、追加の治療薬は、アルデスロイキン、ダカルバジン、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（ダカルバジン）、イピリムマブ、プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）（アルデスロイキン）、ベムラフェニブ、エルボイ（Ｙｅｒｖｏｙ）（イピリムマブ）、及び／又はゼルボラフ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ）（ベムラフェニブ）でもよい。併用療法におけるＰＡＫ１阻害剤の使用の例は、２０１１年１１月１４日提出のＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０７０００８により与えられる。
【０１３４】
上記のそのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療薬が同じ又は別々の製剤中に含まれる）及び個別投与を包含しており、後者の場合、ＰＡＫ１阻害剤の投与は、追加の治療薬及び／又はアジュバントの投与に先立って、同時に、及び／又は続いて行うことができる。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１阻害剤は、放射線療法と組み合わせて個体における黒色腫の治療のために使用される。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１阻害剤は、個体からの黒色腫のすべて又は一部の外科切除と組み合わせて個体における黒色腫の治療のために使用される。
【０１３５】
本発明の幾つかの実施態様では、個体は、例えば、抗癌療法を使用して、前もって黒色腫の治療を受けている。一例では、抗癌療法は手術である。別の実施態様では、対象は、ＰＡＫ１阻害剤の投与前に、投与中に（例えば、同時に）、又は投与後に追加の抗癌療法で更に治療されていてもよい。抗癌療法の例には、限定せずに、手術、放射線療法、生物療法、免疫療法、化学療法、又はこれらの療法の組合せが含まれる。
【０１３６】
投与経路
投与経路は、単一もしくは複数ボーラス又は適切な様式、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病変内もしくは関節内経路による注射もしくは注入、局所投与、吸入での長期間にわたる注入による、又は徐放もしくは持続放出手段によるなどの公知の認められた方法に従う。幾つかの実施態様では、本発明は、ＰＡＫ１阻害剤が個体の静脈内に投与される、個体において黒色腫をＰＡＫ１阻害剤を用いて治療するための方法を提供する。他の実施態様では、本発明は、ＰＡＫ１阻害剤が個体に局所的に投与される、個体において黒色腫をＰＡＫ１阻害剤を用いて治療するための方法を提供する。
【０１３７】
医薬組成物
本発明の方法では、本発明の治療製剤は、所望の純度を有するＰＡＫ１阻害剤を任意選択の生理的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．編（１９８０））と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で保存するために調製される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる投与量及び濃度ではレシピエントには無毒であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０１３８】
本明細書の製剤は治療されている特定の適応症に必要な１つよりも多い、好ましくは互いに悪影響を与えない補完的活性を有する活性成分も含有しうる。例えば、免疫抑制剤を更に与えるのが望ましこともある。そのような分子は、意図している目的に有効である量で組み合わせて適切に存在している。
【０１３９】
活性成分はまた、コロイド薬送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）において又はマクロエマルションにおいて、例えば、コアセルベーション技法により又は界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに封入してもよい。そのような技法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版 Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
【０１４０】
徐放性製剤を調製しうる。徐放性製剤の適切な例には、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、前記マトリックスは造形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形状をしている。
【０１４１】
徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドで構成された注射用マイクロスフィア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日間以上の間分子の放出を可能にするが、ある種のハイドロゲルがタンパク質を放出するのはもっと短い期間である。被包性抗体は、長時間身体内に残る場合、３７℃での湿気への曝露の結果として変性する又は凝集し、生物活性を喪失し免疫原性が変化することが起こり得る。関与する機序に応じて、安定化のための合理的戦略を考案することが可能である。例えば、凝集機序がチオ−ジスルフィド交換を通じた分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが分かった場合、スルフヒドリル残基を改変する、酸性溶液から凍結乾燥する、含水量を制御する、適切な添加剤を使用する、及び特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することにより安定化を達成することができる。
【０１４２】
幾つかの態様では、本発明は、黒色腫の治療において使用するためのＰＡＫ１阻害剤を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は黒色腫において過剰発現されている。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が非癌性細胞、例えば、非癌性皮膚細胞と比べて黒色腫において過剰発現されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されており、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は黒色腫において過剰発現されており、ＰＡＫ１は黒色腫において増幅されている。幾つかの実施態様では、黒色腫は突然変異ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は突然変異ＢＲＡＦ黒色腫であり、黒色腫は非癌性細胞と比べてＰＡＫ１を過剰発現しており及び／又はＰＡＫ１は黒色腫において増幅されている。幾つかの実施態様では、本発明は哺乳動物における黒色腫の治療において使用するためのＰＡＫ１阻害剤を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明はヒトにおける黒色腫の治療において使用するためのＰＡＫ１阻害剤を含む組成物を提供する。
【０１４３】
幾つかの態様では、本発明は、黒色腫の治療のための医薬品の製造におけるＰＡＫ１阻害剤の使用を提供する。幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は黒色腫において過剰発現されている。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が非癌性細胞、例えば、非癌性皮膚細胞と比べて黒色腫において過剰発現されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は、ＰＡＫ１が黒色腫において過剰発現されており、ＰＡＫ１が黒色腫において増幅されている野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１は黒色腫において過剰発現されており、ＰＡＫ１は黒色腫において増幅されている。幾つかの実施態様では、黒色腫は突然変異ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫は突然変異ＢＲＡＦ黒色腫であり、黒色腫は非癌性細胞と比べてＰＡＫ１を過剰発現しており及び／又はＰＡＫ１は黒色腫において増幅されている。幾つかの実施態様では、本発明は、哺乳動物における黒色腫の治療のための医薬品の製造におけるＰＡＫ１阻害剤の使用を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、ヒトにおける黒色腫の治療のための医薬品の製造におけるＰＡＫ１阻害剤の使用を提供する。
【０１４４】
キット
本発明は、本明細書に記載される方法のいずれかにおける使用のためのキット、医薬、組成物、及び単位剤形も提供する。
【０１４５】
本発明のキットは、ＰＡＫ１阻害剤（又は単位剤形及び／もしくは製品）を含む一又は複数の容器を含み、幾つかの実施態様では、本明細書に記載される方法のいずれかに従った黒色腫の治療において使用するための使用説明書を更に含む。キットは、治療に適している個体の選択（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子型に基づく選択）に関する記述を更に含んでいてもよい。本発明のキットに供給される使用説明書は典型的にはラベル又は添付文書（例えば、キット中に含まれる紙シート）に使用説明書が書かれているが、機械読取り可能使用説明書（例えば、磁気又は光記憶ディスク上に保持される使用説明書）も受け入れられる。幾つかの実施態様では、キットは別の治療薬も更に含む。
【０１４６】
本発明のキットは適切に包装されている。適切な包装には、バイアル、瓶、広口瓶、フレキシブル包装（例えば、密封マイラー又はプラスチック袋）などが含まれるが、これらに限定されない。キットは場合により、バッファーなどの追加の成分及び解説情報を提供してもよい。したがって、本出願は、バイアル（密封バイアルなどの）、瓶、広口瓶、フレキシブル包装などを含む、製品も提供する。
【０１４７】
黒色腫バイオマーカー及び処置
本発明は、一又は複数の黒色腫バイオマーカーの存在を判定することにより、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適しているヒト黒色腫患者を同定する方法を提供する。幾つかの実施態様では、黒色腫バイオマーカーは、黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現、黒色腫におけるＰＡＫ１の増幅、及び／又は黒色腫における野生型ＢＲＡＦの存在である。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１の過剰発現は非癌性組織、例えば、非癌性皮膚組織との比較により判定される。幾つかの実施態様では、バイオマーカーは個体から得られる試験試料において検出される。幾つかの実施態様では、バイオマーカーの存在は試験試料と基準試料の比較により判定される。
【０１４８】
一実施態様では、本発明は、黒色腫においてＰＡＫ１の発現を判定することにより、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適しているヒト黒色腫患者を同定するために方法であって、非癌性細胞と比べた場合の黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現が、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示す、方法を提供する。幾つかの実施態様では、黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現が、非癌性細胞と比べて約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超のいずれかであることが、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示す。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１の過剰発現が、非癌性細胞におけるＰＡＫ１の発現と比べて、約１．５倍、２．０倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、又は１０倍のいずれかであることが、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示す。ＰＡＫ１の発現を判定するための方法は当技術分野では公知である。黒色腫におけるＰＡＫ１の発現レベルを決定するための方法の例には、免疫組織化学、逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）、定量的ＰＣＲ、免疫アッセイなどが含まれるが、これらに限定されない。ＰＡＫ１発現のレベルは、遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ）データベースを使用することにより他の腫瘍及び細胞と比較することができる。
【０１４９】
別の実施態様では、本発明は、黒色腫におけるＰＡＫ１の増幅を検出することにより、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適しているヒト黒色腫患者を同定するための方法であって、黒色腫におけるＰＡＫ１遺伝子の増幅が、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示す、方法を提供する。幾つかの実施態様では、黒色腫における約２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０又は１０超のいずれかのＰＡＫ１コピー数は、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示す。遺伝子の増幅を判定するための方法は当技術分野では公知である。例えば、ＰＡＫ１遺伝子のコピー数は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ５００Ｋ ＳＮＰアレイ分析などのＳＮＰアレイを使用することにより決定することができる。
【０１５０】
別の実施態様では、本発明は、黒色腫におけるＢＲＡＦの遺伝子型を検出することにより、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適しているヒト黒色腫患者を同定する方法であって、黒色腫における野生型ＢＲＡＦが、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示す、方法を提供する。黒色腫におけるＢＲＡＦ遺伝子の遺伝子型を決定するための方法は当技術分野では公知であり、例えば、黒色腫由来のＢＲＡＦ遺伝子のヌクレオチド配列は、標準塩基配列決定法を使用して、又はＫＡＳＰ ＳＮＰ遺伝子型判定システム（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用することにより決定することができる。
【０１５１】
本発明は、患者が、黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現、黒色腫におけるＰＡＫ１の増幅、及び／又は黒色腫における野生型ＢＲＡＦの存在から選択される黒色腫についてのバイオマーカーを有することが見出されているという条件で患者において黒色腫を治療する方法であって、患者に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む方法を提供する。幾つかの実施態様では、患者はヒト患者である。上記実施態様のうちの幾つかの実施態様では、バイオマーカーのうちの少なくとも１つはＰＡＫ１の過剰発現であり、ＰＡＫ１が黒色腫において非癌性細胞と比べて、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上のいずれかで過剰発現されている。幾つかの実施態様では、黒色腫におけるＰＡＫ１の発現は、非癌性細胞におけるＰＡＫ１の発現と比べて、約１．５倍、２．０倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、又は１０倍のいずれかを超える。ＰＡＫ１の発現を判定するための方法は当技術分野では公知である。黒色腫におけるＰＡＫ１の発現レベルを決定するための方法の例には、免疫組織化学、逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）、定量的ＰＣＲ、免疫アッセイなどが含まれるが、これらに限定されない。ＰＡＫ１発現のレベルは、遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ）データベースを使用することにより他の腫瘍及び細胞と比較することができる。
【０１５２】
上記実施態様のうちの幾つかの実施態様では、バイオマーカーのうちの少なくとも１つは、黒色腫におけるＰＡＫ１の増幅であり、ＰＡＫ１のコピー数は黒色腫において約２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０又は１０超のいずれかである。遺伝子の増幅を判定するための方法は当技術分野では公知である。例えば、ＰＡＫ１遺伝子のコピー数は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ５００Ｋ ＳＮＰアレイ分析などのＳＮＰアレイを使用することにより決定することができる。
【０１５３】
上記実施態様のうちの幾つかの実施態様では、バイオマーカーのうちの少なくとも１つは黒色腫におけるＢＲＡＦの遺伝子型であり、患者は野生型黒色腫を含有する黒色腫を有する。
【０１５４】
上記実施態様のうちの幾つかの実施態様では、患者における黒色腫バイオマーカーの存在は、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に先立って前もって判定されている。
【０１５５】
本発明は、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療を受けており、黒色腫におけるＰＡＫ１の発現が判定されている患者において黒色腫の治療を調整する方法を提供する。幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現は、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療を続けてよいことを示している。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療を受けている患者での黒色腫におけるＰＡＫ１の発現は時間をかけてモニターされる。幾つかの実施態様では、黒色腫におけるＰＡＫ１の発現は少なくとも毎日、少なくとも毎週、少なくとも毎月モニターされる。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療を受けている患者での黒色腫におけるＰＡＫ１の発現は時間をかけてモニターされる。ＰＡＫ１発現がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療の経過中に増加する場合、患者に投与されるＰＡＫ１阻害剤の量は増加される又は同じままである。幾つかの実施態様では、患者に投与されるＰＡＫ１阻害剤の量は、ＰＡＫ１発現のレベルが減少する又はもはや検出されなくなるまで増加される。ＰＡＫ１発現がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療の経過中に減少する場合、患者に投与されるＰＡＫ１阻害剤の量は減少される又は同じままである。幾つかの実施態様では、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療を受けている患者の黒色腫におけるＰＡＫ１の発現は時間をかけてモニターされ、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療は、黒色腫におけるＰＡＫ１発現がもはや検出されなくなるまで続けられる。
【０１５６】
例となる実施態様
幾つかの実施態様では、本発明は、個体において黒色腫を治療するための方法であって、黒色腫を治療有効量のＰＡＫ１阻害剤に接触させることを含む方法を提供する。追加の実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。更に追加の実施態様では、ＰＡＫ１は、非癌性皮膚細胞と比べて腫瘍において過剰発現されている。上記実施態様のいずれかの追加の実施態様では、ＰＡＫ１は腫瘍において増幅されている。追加の実施態様では、腫瘍におけるＰＡＫ１のコピー数は約２．５よりも大きい。
【０１５７】
上記実施態様のいずれかの追加の実施態様では、阻害剤は、小分子、核酸、又はポリペプチドである。幾つかの実施態様では、小分子はＰＦ−３７５８３０９である。幾つかの実施態様では、小分子は式Ｉの化合物である。
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【０１５８】
追加の実施態様では、小分子は式Ｉの化合物であり、Ａは４−インドリル、５−インドリル、４−インダゾリル、５−インダゾリル、４−ベンゾイミダゾリル又は５−ベンゾイミダゾリルであり、Ｒａ、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは独立して水素又はＣ１〜３アルキルであり、Ｒ５は水素又はＣ１〜６アルキルであり、Ｒ６は水素、ハロゲン又はＣ１〜６アルキルであり、Ｒ７はフッ素によって置換されていてもよいシクロアルキルである。
【０１５９】
上記実施態様のいずれかの追加の実施態様では、個体はヒトである。
【０１６０】
上記実施態様のいずれかの追加の実施態様では、ＰＡＫ１阻害剤は治療薬と組み合わせて使用される。
【０１６１】
本発明は、個体において黒色腫を治療するためのＰＡＫ１阻害剤の使用を提供する。使用の幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。
【０１６２】
本発明は、黒色腫の治療において使用するためのＰＡＫ１阻害剤を含む組成物を提供する。組成物の幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。幾つかの実施態様では、組成物は薬学的に許容される賦形剤を更に含む。
【０１６３】
本発明は、黒色腫の治療のための医薬品の製造におけるＰＡＫ１阻害剤の使用を提供する。使用の幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。
【０１６４】
本発明は、ＰＡＫ１阻害剤及び黒色腫の治療において使用するための指示書を含む、黒色腫を治療するのに使用するためのＰＡＫ１阻害剤を含むキットを提供する。キットの幾つかの実施態様では、黒色腫は野生型ＢＲＡＦ黒色腫である。
【０１６５】
本発明は、個体において黒色腫におけるＣＲＡＦシグナル伝達を阻害する方法であって、黒色腫を治療有効量のＰＡＫ１阻害剤に接触させることを含む方法を提供する。
【０１６６】
本発明は、黒色腫腫瘍におけるＭＥＫシグナル伝達を阻害する方法であって、黒色腫を治療有効量のＰＡＫ１阻害剤に接触させることを含む方法を提供する。
【０１６７】
本発明は、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適しているヒト黒色腫患者を同定する方法であって、黒色腫のＢＲＡＦ遺伝子型を決定することを含み、黒色腫が野生型ＢＲＡＦを含むことが、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示す、方法を提供する。
【０１６８】
本発明は、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適しているヒト黒色腫患者を同定する方法であって、黒色腫におけるＰＡＫ１の発現を判定することを含み、非癌性皮膚細胞と比べた黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現が、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示す、方法を提供する。方法の幾つかの実施態様では、黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現は、非癌性皮膚細胞におけるＰＡＫ１の発現の２．５倍である。
【０１６９】
本発明は、ヒト黒色腫患者をＰＡＫ１阻害剤を用いて治療するための方法であって、（ａ）黒色腫のＢＲＡＦ遺伝子型に基づいて患者を選択し、黒色腫が野生型ＢＲＡＦを含むことが、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示すこと、及び（ｂ）選択された患者に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【０１７０】
本発明は、（ａ）黒色腫のＰＡＫ１発現レベルに基づいて患者を選択し、黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現が、患者がＰＡＫ１阻害剤を用いた治療に適していることを示すこと、及び（ｂ）選択された患者に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む方法を提供する。方法の幾つかの実施態様では、黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現は、非癌性皮膚細胞におけるＰＡＫ１の発現の２．５倍である。
【０１７１】
本発明は、ヒト黒色腫患者を治療するための方法であって、黒色腫の遺伝子型がＢＲＡＦの野生型であると判定されている選択された患者に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【０１７２】
本発明は、ヒト黒色腫患者を治療するための方法であって、黒色腫が非癌性皮膚細胞と比べてＰＡＫ１を過剰発現していると判定されている患者に治療有効量のＰＡＫ１阻害剤を投与することを含む方法を提供する。方法の幾つかの実施態様では、黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現は、非癌性皮膚細胞におけるＰＡＫ１の発現の２．５倍である。
【０１７３】
本発明は、ＰＡＫ１阻害剤を用いた治療を受けている患者において黒色腫の治療を調整する方法であって、黒色腫においてＰＡＫ１発現を評価することを含み、黒色腫におけるＰＡＫ１の過剰発現が、個体の治療がＰＡＫ１過剰発現がもはや検出されなくなるまで調整されることを示す、方法を提供する。
【０１７４】
本明細書に開示される特徴の全ては、いかなる組合せにも組み合わせることができる。本明細書に開示されるそれぞれの特徴は、同じ、等価の、又は類似する目的を果たす別の特徴により置き換えることができる。したがって、別段に明白に述べられていなければ、開示されているそれぞれの特徴は包括的な一連の等価な又は類似する特徴の例に過ぎない。
【０１７５】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的実施例により説明される。明細書中の全ての参考文献の開示は、参照により本明細書に明白に援用される。
【実施例】
【０１７６】
下の実施例は完全に本発明の例であることを意図しており、したがって決して本発明を限定すると考えられるべきではない。以下の実施例及び詳細な説明は限定としてではなく例証として提供される。
【０１７７】
実施例１：黒色腫における上昇したＰＡＫ１タンパク質発現及びゲノム増幅
ヒト黒色腫におけるＰＡＫ１調節不全のありうる度合いを決定するために、８７人の黒色腫患者由来の原発性腫瘍組織を、高解像度一塩基多型（ＳＮＰ）アレイを使用してＤＮＡコピー数変化についてアッセイした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ５００Ｋ ＳＮＰアレイ分析、ゲノムＤＮＡ調製、チップ処理及びデータ解析は以前公表されている通りに（Ｈａｒｖｅｙ ＰＭら、（２００８）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ、４７（６）：５３０〜５４２）実施して、試料採取した黒色腫組織において、第１１染色体のうちのＰＡＫ１遺伝子を宿す領域である１１ｑ１３のコピー増加を測定した。適合した腫瘍試料について発現アレイデータを収集するために、ＲＮＡを凍結腫瘍組織から抽出し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）ＨＧＵ１３３遺伝子発現マイクロアレイに適用した。ＰＡＫ１増幅の頻度は、この腫瘍パネル（図１Ａ）では９％（コピー数≧２．５の８７検体のうちの８）であった。ＲＮＡを４２の黒色腫腫瘍及び細胞株検体から精製し、増加したＰＡＫ１コピー数はｍＲＮＡ発現と相関していた（ピアソン相関＝０．７５；図１Ｂ）。調節不全ＰＡＫ１発現はゲノム増幅単独によって予測されるよりも頻繁であり、それによって、追加の転写又は調節機序がこの兆候ではＰＡＫ１発現を増加させることが示唆される（Ｒｅｄｄｙ ＳＤら、（２００８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６８（２０）：８１９５〜８２００及びｄｅ ｌａ Ｔｏｒｒｅ−Ｕｂｉｅｔａ Ｌら、（２０１０）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ、２４（８）：７９９〜８１３）。正常な皮膚組織と比べた黒色腫におけるＰＡＫ１の上昇した発現も、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓデータベース（ＧＳＥ４５８７）に寄託された遺伝子発現データを使用して実証した。興味深いことに、ＰＡＫ１遺伝子増幅は、ＢＲＡＦ癌遺伝子における活性化突然変異を欠いた腫瘍において、ＢＲＡＦ野生型又は突然変異体についてそれぞれ２２％対０％で優先的に観察された（ｐ＝０．００５、両側ｔ検定；図１Ｂ）。ＰＡＫ１ ｍＲＮＡ発現のレベルは、野生型とＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）又はＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｍ）遺伝子型間で異なっていた（それぞれｐ＝０．００６及びｐ＝０．１２５；図１Ｂ）。総合すると、これにより、ＰＡＫ１は、ＢＲＡＦ野生型黒色腫のサブセットにおいて腫瘍を促進する「ドライバー」遺伝子でありうることが示唆される。ヒト黒色腫におけるＰＡＫ１調節不全の度合いを更に評価するために、ＰＡＫ１タンパク質発現レベルと細胞内局在を、組織マイクロアレイの別個のセットの免疫組織化学（ＩＨＣ）染色により確かめた。手短に言えば、１９９３年から２００９年の間に切除された９２の原発性黒色腫について、ホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックと対応する病理学報告を得た（Ｏｘｆｏｒｄ Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）。黒色腫シリーズは２３の結節状、３つの悪性黒子、４５の表在拡大型、３つの線維形成性、５つの末端性黒子性及び１３の分類不能黒色腫検体を含んでいた。４つの癌はステージｐＴ１、１７はステージｐＴ２、２８はステージｐＴ３、３５はステージｐＴ４及び８症例は正確にステージ分けすることはできなかった。組織マ���クロアレイ（ＴＭＡ）は以前記載されていた通りに構築した（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ Ｌら、（２００１）Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、１９５（１）：７２〜７９）。地元の研究倫理委員会からヒト組織全ての使用についての承認を得た（Ｃ０２．２１６）。免疫組織化学（ＩＨＣ）は以前記載された通りに実施した（Ｏｎｇ ＣＣら、（２０１１）ＰＮＡＳ、１０８（１７）：７１７７〜７１８２）。ＰＡＫ１発現の強度は、新生細胞の細胞質と核において別々にスケール０から３でスコア化した。複製コア間の最も高度な強度スコアは患者ごとのスコアとして使用した。同じ病理医が、臨床データを知らずに全ての症例をスコア化した。カイ二乗検定を使用してカテゴリー変数間の関連を評価した。ＰＡＫ１抗体の頑強で選択性のＩＨＣ反応性は既に実証されていた（Ｏｎｇ ＣＣら、（２０１１）ＰＮＡＳ、１０８（１７）：７１７７〜７１８２）。悪性黒色腫では、９２原発性腫瘍試料のうちの４６（５０％）はＰＡＫ１発現について陽性であり、全ての症例のうちの２６％が悪性細胞においては中程度（２＋）又は強い（３＋）強度の染色を示した（図１Ｃ、パネルＩＩＩ及びＩＶ；表１）。ＰＡＫ１の核局在化が明白であったのは黒色腫のうちのごく僅かな割合だけであった。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識と褐色のジアミノベンジジンに代えてアルカリホスファターゼ標識と急速赤色色素原を用いても同一の結果が見られた。正常な皮膚の基底ケラチノサイトでのＰＡＫ１の発現は弱く、リンパ球と推定ランゲルハンス細胞はＰＡＫ１発現が陽性であった（図１Ｃ、パネルＩＶ）。総合すると、これらのデータにより、ＰＡＫ１ ＤＮＡコピー数、ｍＲＮＡ及びタンパク質発現はヒト黒色腫においては広く上方制御されることが示されている。
【０１７８】
実施例２：原発性黒色腫におけるＰＡＫ１過剰発現とＢＲＡＦ突然変異間の負の関連性
黒色腫におけるＢＲＡＦとＮＲＡＳの癌遺伝子突然変異の蔓延を考慮して（Ｌｅｅ ＪＨら、（２０１１）Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、１６４（４）：７７６〜７８４）、黒色腫組織の遺伝子型を、ＢＲＡＦ（コドン６００）及びＮＲＡＳ（コドン１２、１３、６１及び１４６）遺伝子における既知のホットスポット突然変異について同定した。突然変異状態は、ＫＡＳＰａｒ（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｅｒｔｓ、Ｅｎｇｌａｎｄ）及び従来のＳａｎｇｅｒ ＤＮＡ配列決定法によりＢＲＡＦコドン６００及びＮＲＡＳコドン１２、１３、６１及び１４６について決定した。ＢＲＡＦ（３９のＶａｌ６００Ｇｌｕ、１つのＶａｌ６００Ｌｙｓ及び４６の野生型）及びＮＲＡＳ（１つのＧｌｎ６１Ｈｉｓ、７つのＧｌｎ６１Ｌｙｓ、１つのＧｌｎ６１Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ６１Ａｒｇ＋Ｌｅｕ５９Ａｌａ、１つのＧｌｎ６１Ｌｅｕ、１９のＧｌｎ６１Ａｒｇ、２つのＧｌｎ６１Ａｒｇ＋Ｇｌｎ６１Ｌｙｓ及び５３の野生型）についての遺伝子型データがそれぞれ８６及び８４腫瘍について入手可能であり、皮膚黒色腫について以前発表されている突然変異頻度の範囲と一致していた（Ｌｅｅ ＪＨら、（２０１１）Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、１６４（４）：７７６〜７８４）。ＰＡＫ１ ＩＨＣ染色は臨床病理学的詳細を知らないでスコア化し、突然変異状態と結果は表１に要約している。特に、ＰＡＫ１タンパク質発現は、発癌性Ｖ６００Ｅ又はＶ６００Ｋ突然変異体（高ＩＨＣ染色で４０腫瘍のうち４）を発現している黒色腫と比べてＢＲＡＦ野生型腫瘍では選択的に調節不全であった（４６のうち１９がＰＡＫ１の強ＩＨＣ染色に陽性であった）。ＰＡＫ１発現とＢＲＡＦ突然変異の間のこの負の相関は統計的に有意であった（ｐ＜０．００１、カイ二乗１０．７０２）。ＢＲＡＦとＮＲＡＳ突然変異は相互排他的ではなく、どちらかの突然変異を有する腫瘍の存在もＰＡＫ１タンパク質発現と負の関連をしていた（ｐ＝０．００４、カイ二乗８．１２８）。試料をＮＲＡＳ突然変異体のみと非突然変異状態に二分した場合に、類似の傾向が、統計的に有意ではないにもかかわらず、観察された（ｐ＝０．４５、カイ二乗０．５６９）。ＰＡＫ１タンパク質発現と有糸分裂カウント（ｐ＝０．６１ スチューデントＴ検定）、病理学的腫瘍（ｐＴ）ステージ（ｐ＝０．１４、カイ二乗）、ブレスロウ厚み（ｐ＝０．８５ スチューデントＴ検定）又は潰瘍（ｐ＝０．９１、カイ二乗）の間には有意な関連はなかった。総合すると、これらの結果は、ＰＡＫ１調節不全が、ＢＲＡＦの発癌性突然変異を欠き効果的な標的療法がないヒト黒色腫のサブセットを明確にする皮膚黒色腫と強い関連がある証拠を与えている。
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【０１７９】
実施例３：ＰＡＫ１はＢＲＡＦ野生型黒色腫細胞の増殖に必要である
ＢＲＡＦの野生型であるヒト黒色腫のサブセットにおける上昇したＰＡＫ１発現についてのゲノムと組織学的データを考慮して、腫瘍細胞増殖に対するＰＡＫ１の寄与を明らかにするために、黒色腫細胞株のパネルにおいてＰＡＫ１発現とＰＡＫ１のＲＮＡｉ媒介ノックダウンの効果を調べた。細胞株は米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から取得し、１０％のウシ胎仔血清及び４ｍＭのＬ−グルタミンを有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はロズウェルパーク記念研究所１６４０（ＲＰＭＩ１６４０）培地において３７℃、５％ＣＯ２で維持した。細胞株に、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ ＲＮＡｉ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）製の市販の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴヌクレオチド二重鎖をトランスフェクトさせ、この二重鎖はＰＡＫ１及びＰＡＫ２ノックダウンの効率及び選択性について以前に特徴付けられていた（Ｏｎｇ ＣＣら、（２０１１）ＰＮＡＳ、１０８（１７）：７１７７〜７１８２）。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用してＡＴＰ含有量により評価し、結果は３回の実験の平均±標準偏差を表している。野生型対突然変異ＢＲＡＦを発現している黒色腫における増加したＰＡＫ１タンパク質発現は、培養中の不死化細胞株でも観察された。細胞生存率解析により、５３７ＭＥＬ、ＭｅＷｏ、ＳＫ−ＭＥＬ２３及びＳＫ−ＭＥＬ３０黒色腫細胞が高レベルのＰＡＫ１タンパク質を発現すること、及び複数のＰＡＫ１選択性ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドのプールによるＰＡＫ１の一過性ノックダウンにより、非ターゲティング負対照ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞と比べた場合、細胞生存率の減少は１．８から４．３倍であることが示された（ｐ＜０．０００１；図２Ａ）。更に、ＰＡＫ１を阻害すると一般に、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ細胞と比べてＢＲＡＦ野生型黒色腫細胞の増殖は減少し（ｐ＜０．０７；ｎ＝１４）、この黒色腫サブタイプにおける増殖の駆動物質としてのＰＡＫ１の役割を更に支持していた（図２Ｂ）。ＰＡＫ１が増殖に寄与する機序を更によく評価するために、ＰＡＫ依存性細胞シグナル伝達が５３７ＭＥＬ及びＳＫ−ＭＥＬ２３細胞において評価された。細胞溶解物からのタンパク質抽出物を、細胞抽出バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ホスファターゼ阻害剤カクテル１／２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、及び１錠の完全無ＥＤＴＡ ＭｉｎｉＴＭプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて４℃で調製した。ウェスタンブロット分析では、タンパク質を４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、ニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に移した。免疫ブロッティングは、示した一次抗体を使用して実施し、増強された化学発光（ＥＣＬ）のために二次抗体を使用して分析した。ＭＡＰＫ経路活性化は、ＥＲＫとＭＥＫのリン酸化により判���される場合、ＰＡＫノックダウンにより劇的に阻害された（図２Ｃ）。この結果と一致して、サイクリンＤ１（これはサイクリン依存性キナーゼ及びＧ１／Ｓ進行を調節するのに不可欠である）レベルもＰＡＫ１消失の結果として減少した。ＢＲＡＦ野生型黒色腫細胞におけるＰＡＫ１シグナル伝達は、逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）ホスホプロテオミクスプラットフォームを使用して更に調べた。タンパク質溶解物は、最初に全ての試料を最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈することによってＲＰＰＡ（Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ Ｈｅａｌｔｈ、ＬＬＣ）により分析した。試料希釈液はスライド上に２通りにプリントし、次にこれを、主に特定のリン酸化又は切断タンパク質に対して産生された抗体パネルを用いた免疫染色に供した。これらの抗体はそれぞれが、免疫ブロッティングにより適切な分子量での単一バンド検出を使用してリン酸化とタンパク質特異性の両方について既に広範な検証を受けていた。各エンドポイントに対する強度値は、それぞれのスポットでのバックグランド除去後の染色の線形ダイナミックレンジ内にある試料ごとに、２通りの希釈曲線ごとにスポットを同定することにより決定した（スライド局所バックグラウンド内及び二次抗体のみで染色されたスライドに対しても）。それぞれの値は、Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色されたスライド由来の試料について全タンパク質強度値に対して正規化した。ＲＰＰＡデータはｌｏｇ２変換と線形スケーリング（ｚスコア変換）により処理して、正規性と線形性を確保した。ＲＰＰＡ解析により、ＢＲＡＦ野生型（ＳＫ−ＭＥＬ２３）黒色腫細胞におけるＰＡＫ１阻害に続くＭＡＰＫ、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）及び細胞骨格経路へのシグナル伝達の減少が明らかにされたが、ＢＲＡＦ突然変異体（Ａ３７５）黒色腫細胞では減少は見られなかった（図２Ｄ）。
【０１８０】
ＰＡＫ１は、ＣＲＡＦ（Ｓｅｒ３３８）とＭＥＫ１（Ｓｅｒ２９８）の両方をリン酸化することが明らかにされている（１７、２９〜３１）。したがって、ＰＡＫ１がＢＲＡＦ野生型黒色腫細胞においてＭＡＰＫ経路の活性化を惹起させる分子機序を調べた。ＭＥＫタンパク質上のＳｅｒ２１７／Ｓｅｒ２２１活性化ループ部位に対して産生されるリン酸特異的抗体はＭＥＫ１とＭＥＫ２を区別しないので、対照又は先述のＰＡＫ選択性ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（Ｈａｔｚｉｖａｓｓｉｌｉｏｕ Ｇら、（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ、４６４（７２８７）：４３１〜４３５）のいずれかでトランスフェクトされた細胞からＭＥＫアイソフォームを免疫沈降させ、ＭＥＫ活性化を、リン酸ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／Ｓｅｒ２２１）抗体を用いた免疫ブロッティングにより検出した。ＰＡＫノックダウンにより、５３７ＭＥＬ及びＳＫ−ＭＥＬ２３細胞においてＭＥＫ１（図３Ａ）とＭＥＫ２（図３Ｂ）両方のリン酸化は減少した。ＭＥＫ１上のＳｅｒ２９８リン酸化部位はＭＥＫ２では保存されていないので、両ＭＥＫアイソフォームのＰＡＫ依存性活性化は、ＣＲＡＦへの上流シグナル伝達がＢＲＡＦ野生型黒色腫細胞ではＭＡＰＫ経路調節の駆動物質である可能性があることを示唆していると考えられる。対照又は先述のＰＡＫ選択性ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（Ｈａｔｚｉｖａｓｓｉｌｉｏｕ Ｇら、（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ、４６４（７２８７）：４３１〜４３５）のいずれかでトランスフェクトされた細胞からＣＲＡＦを免疫沈降させ、ＣＲＡＦ活性化を、リン酸ＣＲＡＦ（Ｓｅｒ３３８）抗体を用いた免疫ブロッティングにより検出した。ＰＡＫ消失により、このキナーゼの完全活性化に極めて重要な残基であるＳｅｒ３３８上のＣＲＡＦのリン酸化が減少したことがウェスタン分析により示された（図３Ｃ）。ＰＡＫ触媒活性に対するＣＲＡＦ（Ｓｅｒ３３８）リン酸化（図３Ｄ）とＣＲＡＦエフェクターシグナル伝達（図３Ｅ）の依存性も、現在臨床開発中のＰＡＫの阻害剤であるＰＦ−３７５８３０９（Ｍｕｒｒａｙ ＢＷら、（２０１０）ＰＮＡＳ、１０７（２０）：９４４６〜９４５１）とＰＡＫ１〜３に結合してＲｈｏファミリーＧＴＰアーゼによる活性化を妨げるアロステリック阻害剤であるＩＰＡ−３（Ｄｅａｃｏｎ ＳＷら、（２００８）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１５（４）：３２２〜３３１）を使用して確かめた。
【０１８１】
ＢＲＡＦ野生型黒色腫細胞におけるＰＡＫ１の役割を分析するための追加の機能喪失研究は、黒色腫細胞移動へのＰＡＫ１の寄与を調べることによって実行した。手短に言えば、ＷＭ−２６６−４黒色腫細胞を、非ターゲティング対照（ＮＴＣ）又はＰＡＫ１／２ ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドで７２時間トランスフェクトし、集密的ＷＭ−２６６−４黒色腫細胞をそれに続いて傷つけた。傷が付けられたとき（黒い濃淡）と創傷の２８時間後（明視野）の画像を記録した。相対的傷密度の差は統計的に有意であり（ｐ＜０．００１；ｎ＝３）、黒色腫細胞の移動においてＰＡＫ１が必要条件であることを明らかにした（図４）。総合すると、ＢＲＡＦ野生型黒色腫細胞におけるＰＡＫ１遮断の機能的帰結には、ＣＲＡＦ活性化の減少とそれに続くＭＡＰＫ経路シグナル伝達による明白な細胞増殖抑制効果が包含される。
【０１８２】
実施例４：ＰＡＫとＢＲＡＦ阻害に対するＢＲＡＦ野生型黒色腫細胞の差次的感受性
感受性及び非感受性腫瘍型内でのＰＡＫシグナル伝達の活性及び細胞作用機序を更に詳細に調べるため、ＰＡＫとＢＲＡＦの小分子阻害を、ＳＫ−ＭＥＬ２３ ＢＲＡＦ野生型とＡ３７５ ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）細胞を使用して比較した。経路調節の分析では、ＭＡＰＫ経路成分のリン酸化について細胞溶解物を分析する前の４時間、細胞をＢＲＡＦ阻害剤である５μＭのＰＦ−３７５８３０９で又は０．２μＭのＰＬＸ−４７２０で処理した。触媒活性に極めて重要なキナーゼループ残基上のＥＲＫ１／２及びＭＥＫ１／２リン酸化を測定することにより決定される場合、ＰＦ−３７５８３０９の投与により、ＳＫ−ＭＥＬ２３細胞（レーン２）では重度のＭＡＰＫ経路調節が生じたが、Ａ３７５細胞（レーン５）では起きなかった（図５Ａ）。比較すると、ＰＬＸ−４７２０媒介シグナル伝達変化の分析により、ＳＫ−ＭＥＬ２３細胞ではＥＲＫ１／２及びＭＥＫ１／２リン酸化の中程度の阻害のみが明らかにされ（レーン３）、同じ処理条件がＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）細胞ではＭＡＰＫ活性化を強力に阻害した（レーン６）。対照として、この実験では全ＥＲＫ１／２又はＭＥＫ１／２タンパク質レベルに差は認められなかった。以前の報告と一致して、ＭＥＫ１−Ｓｅｒ２９８はＰＡＫ特異的リン酸化部位として確認されたが、Ｓｅｒ２９８リン酸化はＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）黒色腫細胞ではＭＥＫ活性化ループリン酸化とは非連鎖であった（レーン５）。ＭＥＫ１−Ｓｅｒ２９８のＰＡＫ１リン酸化の生物学的帰結は現在十分に理解されてはいないが、ＰＡＫ１−ＭＥＫ１シグナル伝達が細胞−細胞接触及び接着により媒介され得ることが明らかにされている（Ｓｌａｃｋ−Ｄａｖｉｓ ＪＫら、（２００３）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１６２（２）：２８１〜２９１）。ＰＡＫシグナル伝達も、ＰＡＫ１の内在性発現が中程度に過ぎないＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）細胞におけるＦｌａｇ−ＰＡＫ１の異所性発現により誘導された。Ａ３７５細胞におけるＰＡＫ１シグナル伝達の上昇により、ＰＦ−３７５８３０９の添加により可逆的であるＣＲＡＦとＭＥＫのリン酸化が有意に増大し（図５Ｂ）、ＰＡＫ１過剰発現を獲得することが黒色腫における発癌性ＢＲＡＦに対する依存性を克服するもう一つの機序である可能性があることが示唆される（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ ＣＭら、（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ、４６８（７３２６）：９６８〜９７２）。
【０１８３】
ＰＡＫ阻害剤が野生型ＢＲＡＦ黒色腫細胞の細胞生存率を減少させるかどうかを判定するために、ＳＫ−ＭＥＬ２３及び５３７ＭＥＬ細胞を、ＰＦ−３７５８３０９を用いた又は（Ｓ）−Ｎ２−（１−（１Ｈ−インドール−５−イル）エチル）−Ｎ４−（５−シクロプロピル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−６−メチルピリミジン−２，４−ジアミン（Ｉ−００７）、Ｎ２−（（１Ｈ−インドール−４−イル）メチル）−Ｎ４−（５−シクロプロピル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−６−メチルピリミジン−２，４−ジアミン（Ｉ−０５４）及びＮ２−（（４−クロロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−イル）メチル）−Ｎ４−（５−シクロプロピル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−Ｎ２−メチル−ピリミジン−２，４−ジアミン（Ｉ−０８７）を用いた処理後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）でアッセイした。試験したＰＡＫ阻害剤すべてを用いた処理によるＰＡＫ１の阻害により、細胞増殖は有意に減少し、ＰＡＫシグナル伝達の阻害がＢＲＡＦ野生型黒色腫の治療のための標的であることが示されている（図６Ａ及びＢ）。
【０１８４】
インビトロ観察を延長するため、ＰＡＫ小分子阻害剤による薬力学的調節を、腫瘍異種移植片モデルを使用して評価した。培養されたＳＫ−ＭＥＬ−２３、Ａ２０５８．Ｘ１及びＡ３７５．Ｘ１細胞を培養から取り除き、ハンクス緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）に懸濁し、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）と１対１で混合し、実験に使われたことのない雌ＮＣＲヌード（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）又はベージュヌードＸＩＤ（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ）マウスの右脇腹の皮下に移植した。およそ２５０ｍｍ３の平均体積の腫瘍を持つ動物は処置コホートに分類した。腫瘍体積は以下の式：腫瘍体積＝０．５×（ａ×ｂ２）、「ａ」は最大腫瘍径、「ｂ」は垂直腫瘍径により計算した。腫瘍体積結果は、平均腫瘍体積±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として提示している。研究終了時（ＥＯＳ）のパーセント増殖阻害（％ＩＮＨ）は、％ＩＮＨ＝１００［（ＥＯＳビヒクルＥＯＳ処置）／（ＥＯＳビヒクル）］として計算した。ダネットｔ検定を使用するデータ解析とｐ値作成はＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して行った。全ての実験手順は米国生理学会の指針に従い、ジェネンテック動物実験委員会（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ’ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を得た。腫瘍確立に続いて、動物に生理食塩水又はＰＦ−３７５８３０９（２５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）のいずれかを投与し、腫瘍は投与の１時間後に採取した。腫瘍は凍結させ、小Ｂｅｓｓｍａｎ組織粉砕機（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）を使用してドライアイス上で微粉砕し、タンパク質抽出物は細胞抽出バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ホスファターゼ阻害剤カクテル１／２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、及び１錠の完全無ＥＤＴＡ ＭｉｎｉＴＭプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて４℃で調製した。タンパク質は引き続き４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、示された抗体での免疫ブロッティングのために、ニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に移した。ＰＦ−３７５８３０９で処理すると、ＳＫ−ＭＥＬ２３腫瘍においてＣＲＡＦ、ＭＥＫ１／２、及びＥＲＫ１／２リン酸化は実質的に減少した（図７Ａ）。Ａ２０５８．Ｘ１ ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）腫瘍では、ＰＦ−３７５８３０９投与に続いてＣＲＡＦ（Ｓｅｒ３３８）のリン酸化の減少は観察されなかった。ＢＲＡＦ野生型腫瘍の増殖及び維持に対するＰＦ−３７５８３０９の効果も、２１日間の有効性実験において評価した（図７Ｂ及び図８Ａ〜Ｂ）。１０、１５及び２５ｍｇ／ｋｇ ＰＦ−３７５８３０９での処理により、投与の最終日に測定した場合、ビヒクルコホートと比べて腫瘍増殖は有意に減っていた（対照コホートと比べてそれぞれ７４％、７６％及び９１％阻害）（ダネットｔ検定、ｐ＜０．０００１）。比較すると、ＣＲＡＦリン酸化の最小抗腫瘍有効性及び阻害が、インビボでの強力なＲＡＦ阻害剤を用いて処理したＳＫ−ＭＥＬ２３腫瘍で観察された（図９Ｂ）（Ｈｏｅｆｌｉｃｈ ＫＰら、（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６９（７）：３０４２〜３０５１）。更に、ＰＬＸ−４７２０ＢＲＡＦ阻害剤で処理したＢＲＡＦ変異体（Ａ３７５）及び野生型（ＳＫ−ＭＥＬ２３）細胞のホスホプロテオミック解析によれば、黒色腫のこれらの細胞サブタイプがＢＲＡＦ阻害のために異なるシグナル伝達応答を示していることが実証された（図９Ａ）。総合すると、ＰＦ−３７５８３０９によるＭＡＰＫ経路不活化の大きさはＢＲＡＦ野生型黒色腫異種移植片モデルにおける抗腫瘍効果と相関しており、これらのデータは、ＰＡＫシグナル伝達を妨げれば黒色腫のこのサブセットにおいて治療効果をもたらすことができるという結論を支持している（図１０に描かれているモデル）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ａ−１】
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【図８Ａ−２】
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【図８Ａ−３】
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【図８Ａ−４】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｂ−１】
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【図８Ｂ−２】
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【図８Ｂ−３】
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【図８Ｂ−４】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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