(57)【要約】  本文書は、生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを含む二酸化チタン足場を対象にする。二酸化チタン足場に薄いハイドロゲルコーティングを生成するための方法と、医療用インプラントとしてのハイドロゲルコーティングされた足場の使用も開示されている。
2015529527.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面の少なくとも一部が、少なくとも1種の生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを備える、二酸化チタン足場。
【請求項２】
前記ハイドロゲルコーティングが、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール(PEG)、セルロース、ポリ(アクリル酸)(PAA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸)(PLA)、PLA-PGA、PLA-PEG、デキストラン、デキストラン-PEG、デンプン、コラーゲンベースのゲル、アガロース、プルロニック酸、ヘパラン硫酸、グリコサミノグリカン、ポリエチレンオキシド(PEO)、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー[P(EO-co-PO)]ならびにプルロニック/ポロキサマーからなる群から選択される少なくとも1種のポリマーを含む、請求項1に記載の二酸化チタン足場。
【請求項３】
前記生物学的活性物質が、合成もしくは天然生物活性分子、天然もしくは合成薬物、および/または生細胞からなる群から選択される、請求項1または2に記載の二酸化チタン足場。
【請求項４】
前記生物学的活性物質が、天然または組換え生体接着剤;天然または組換え細胞結合因子;天然、組換えまたは合成バイオポリマー;天然または組換え血液タンパク質;天然または組換え酵素;天然または組換え細胞外マトリックスタンパク質;天然または合成細胞外マトリックス生体分子;天然または組換えシグナル分子、成長因子およびホルモン;天然、組換えおよび合成ペプチド、合成ペプチドホルモン;天然、組換えまたは合成デオキシリボ核酸;天然、組換えまたは合成リボ核酸(ribonucleotide acid);天然または組換え受容体;酵素阻害剤;薬物;生物学的活性アニオンおよびカチオン;ビタミン;アデノシン一リン酸(AMP)、アデノシン二リン酸(ADP)またはアデノシン三リン酸(ATP);マーカー生体分子;アミノ酸;脂肪酸;ヌクレオチド(RNAおよびDNA塩基)、糖、テトラサイクリン等の抗生物質ならびにスタチンおよびビスホスホネート等の小型の生物学的有機分子からなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場。
【請求項５】
前記生細胞が、間葉系幹細胞、骨細胞、多能性細胞、骨前駆細胞、血管細胞、前駆血管細胞およびストロマ細胞からなる群から選択される、請求項3に記載の二酸化チタン足場。
【請求項６】
前記ポリマーが、1000〜200000g/mol等、1000〜1000000g/molの分子量(Mw)を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場。
【請求項７】
前記ハイドロゲルコーティングが、1〜20μm等、少なくとも1μmの湿潤厚さを有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場。
【請求項８】
前記アルギン酸塩が、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸カルシウムおよびアルギン酸ストロンチウムからなる群から選択される、請求項2から7のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場。
【請求項９】
請求項1から8のいずれか一項に記載の生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを含む二酸化チタン足場を生成するための方法であって、
a)二酸化チタン足場を用意する工程と、
b)生物学的活性物質と、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール(PEG)、セルロース、ポリ(アクリル酸)(PAA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸)(PLA)、PLA-PGA、PLA-PEG、デキストラン、デキストラン-PEG、デンプン、コラーゲンベースのゲル、アガロース、プルロニック酸、ヘパラン硫酸、グリコサミノグリカン、ポリエチレンオキシド(PEO)、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー[P(EO-co-PO)]ならびにプルロニック/ポロキサマーからなる群から選択される約1〜10%w/vのポリマーとを含むポリマー溶液を、前記二酸化チタン足場の少なくとも一部に置き、続いて二酸化チタン足場を遠心分離する工程と、
c)工程b)における二酸化チタン足場に置かれたポリマーのゲル化をもたらす工程と、
d)必要に応じて、二酸化チタン足場を乾燥させる工程と
を含み、工程b)およびc)が、少なくとも1回必要に応じて反復される方法。
【請求項１０】
請求項9に記載の方法により得ることができるまたは得られる、生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを含む二酸化チタン足場。
【請求項１１】
請求項1から8または請求項10のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場を含む医療用インプラント。
【請求項１２】
医療用インプラントとして使用するための、請求項1から8または請求項10のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場。
【請求項１３】
骨等、組織の再生、修復、置換および/または回復のために使用するための、請求項1から8もしくは請求項10のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場または請求項11に記載の医療用インプラント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、足場構造を有する医療用インプラントを対象にする。特に、本明細書は、生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを有する二酸化チタン足場およびその使用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
外傷、腫瘍、がん、歯周炎および骨粗鬆症等の状態は、骨喪失や、骨成長および容積の低下をもたらし得る。上述および他の理由により、骨成長を改善し、骨生体構造を回復させる方法を見出すことは、非常に重要である。
【０００３】
三次元足場の助けによる骨原性細胞から天然骨組織の形成は、失われた骨を修復および再生するための自家移植片および同種移植片の代替となる。十分に構築された足場は、細胞が結合および接着するのに適した表面を提供し、多孔性および十分に相互接続されたネットワークが、新たな骨の発達を導き、骨形成細胞の遊走、増殖および分化ならびに内部成長(ingrowth)組織の血管新生を支持する。数種類のポリマーおよびバイオセラミックスが、骨組織工学におけるその使用のために開発されているが、その低い機械的性質は、荷重負荷適用のためのその使用を限定している。
【０００４】
二酸化チタン(TiO2)は、生物活性性質およびある程度の静菌的効果を有することが同様に報告された生体適合性材料である。したがって、セラミックTiO2は、骨組織工学目的のための材料として研究されてきた。90%多孔度および1.63〜2.67MPa圧縮強度の値を達成する高い機械的強度を有する、高い多孔性および十分に相互接続されたTiO2足場が近年開発され(Tiainenら、2010)、その生体適合性および骨伝導(osteoconductive)性質が、in vitroおよびin vivoで実証された。
【０００５】
異なる種類の生物学的活性分子でインプラント構造をコーティングすることにより、例えば、足場生体適合性を改善するため、骨結合(osseointegration)を改善するため、感染および炎症を阻害するための試みが為された。しかし、植え込み後のインプラントにおいてその企図される機能を実行できるようにするために、生物学的活性分子は、その放出を可能にし、その生物学的活性に有害に作用せず、否定的な身体反応を引き起こさない様式等で、インプラントにコーティングされる必要がある。
【０００６】
ハイドロゲルは、空間充填剤(space filling agent)、生物活性分子の送達媒体として、および細胞を組織化し所望の組織の形成を導く刺激を呈する三次元構造として等、組織工学における異なる適用に用いられてきた。ハイドロゲルは、典型的に、親水性かつ高度に吸収性であり、99.9%を超える水を含有し得るポリマー鎖のネットワークを含む。アルギン酸塩(alginate)は、細胞および/または成長因子カプセル包埋ならびに薬物安定性および送達を包含する種々の医療適用において用いられてきた、組織工学用のハイドロゲルを形成するために選ばれるポリマーの一例である。アルギン酸塩は、β-D-マンヌロン酸(M)およびα-L-グルクロン酸(G)単量体の親水性の直鎖状多糖コポリマーである。Ca2+、Ba2+またはSr2+等、二価カチオンが、G単量体のブロックと協同的に相互作用し、異なるポリマー鎖間にイオン性ブリッジを作製すると、アルギン酸塩ゲルが形成される。正常生理的条件下における無毒性、生分解性および所望の形状への加工し易さ等、生体材料に有利な性質のために、アルギン酸塩は、皮膚、軟骨、骨、肝臓および心臓組織の再生を包含する組織工学において広範に研究されてきた。
【０００７】
キトサンは、エビおよびカニ殻の天然構成成分である、キチンの脱アセチル化誘導体である。これは、最大pH6.2の水に可溶性の、生体適合性のpH依存性カチオン性ポリマーである。キトサンは、アルギン酸塩よりも安定的であるが、低pH、例えば、炎症した、感染したまたは低酸素組織において呈される条件において急速に崩壊される。キトサンは、それ自体が抗炎症性質を有するとも考えられている。デンプンおよびコラーゲンベースのゲル等、他のハイドロゲルも同様の特徴を有するが、コラゲナーゼ等の局所的組織因子によってより迅速に崩壊される。セルロースもまたpH依存性であり、必要とされる使用、機械的強度等に応じて数種の異なる化学修飾で作り出すことができる。PLAおよびPGAは、迅速に崩壊されて、組織、感染に、また、組み合わせて用いる場合は他のハイドロゲル(例えば、キトサン)の崩壊速度に有益な局所的効果を有し得る有機酸(即ち、乳酸)となる。
【０００８】
ヒアルロン酸は、生物学的効果を有する別の重要なハイドロゲルである。これは、軟骨の重要な構成物であり、関節において、創傷治癒のために、および眼において一般的に用いられる。これは、僅かに抗炎症性であり、軟骨、靱帯および角膜細胞等、ある特定の種類の結合組織の再生を刺激すると考えられる。PEGは、強度や、設計された崩壊速度のための架橋等に関して高度に柔軟な、非常に生体適合性のハイドロゲルであり、生物学的分子に化学的に連結して、多数の条件のために設計され得る制御された持続放出媒体をもたらすことのできるゲルである。単純に水に溶解させて、イオンの存在下でゲル化させる(キトサン、セルロース、デンプン、コラーゲン、アガロース等、ほぼ全ての生物学的ハイドロゲルの様に)ことができないが、安定的な架橋を形成してゲルとなるためにメルカプトエタノール等の化学的反応物を必要とするという点において、一部のPEGの混合およびゲル化は、他の大部分のハイドロゲルとは異なる。しかし、他のPEGコンジュゲートは、UV光、イオン性相互作用による架橋、二価カチオン塩の添加および縮合反応(ヒドロキシル基またはアミンとカルボン酸またはその誘導体との間の縮合反応は、ポリマーの合成のために頻繁に適用されて、それぞれポリエステルおよびポリアミド、PEGを生じる)等、異なる手段によってゲル化することもできる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO2008/078167
【特許文献２】WO08078164
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、依然として、医療用インプラントおよび組織工学の分野において、例えば、生体適合性であるおよび/または身体におけるインプラントの統合を改善する支持構造をもたらすインプラント構造の必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本文書の一目的は、生体適合性であるおよび/または改善された統合性質を有する、医療用インプラント等、支持構造として適した二酸化チタン足場を提供することである。
【００１２】
この目的は、本開示により得られ、本開示は、その一態様において、二酸化チタン足場の表面の少なくとも一部が、少なくとも1種の生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを備える、二酸化チタン足場を対象にする。係る二酸化チタン足場は、ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場と表示することができる。ハイドロゲルコーティングは、典型的に、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール(PEG)、セルロース、ポリ(アクリル酸)(PAA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸)(PLA)、PLA-PGA、PLA-PEG、デキストラン、デキストラン-PEG、デンプン、コラーゲンベースのゲル、アガロース、プルロニック酸(pluronic acid)、ヘパラン硫酸、グリコサミノグリカン、ポリエチレンオキシド(PEO)、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー[P(EO-co-PO)]ならびにプルロニック/ポロキサマーからなる群から選択される少なくとも1種のポリマーを含むが、ハイドロゲルを形成することのできる他のポリマーを本明細書の他の箇所に開示されている通りに用いることもできる。ハイドロゲルは、典型的に、1000〜200000g/mol等、約1000〜1000000g/molの分子量を有するポリマーを用いることにより形成される。
【００１３】
本文書はまた、本明細書に開示されている生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを含む二酸化チタン足場を生成するための方法であって、
a)二酸化チタン足場を用意する工程と、
b)生物学的活性物質と、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール(PEG)、セルロース、ポリ(アクリル酸)(PAA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸)(PLA)、PLA-PGA、PLA-PEG、デキストラン、デキストラン-PEG、デンプン、コラーゲンベースのゲル、アガロース、プルロニック酸、ヘパラン硫酸、グリコサミノグリカン、ポリエチレンオキシド(PEO)、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー[P(EO-co-PO)]ならびにプルロニック/ポロキサマーからなる群から選択される約1〜10%w/vのポリマーとを含むポリマー溶液を、前記二酸化チタン足場の少なくとも一部に置き、続いて二酸化チタン足場を遠心分離する工程と、
c)工程b)における二酸化チタン足場に置かれたポリマーのゲル化をもたらす工程と、
d)必要に応じて、二酸化チタン足場を乾燥させる工程と
を含み、工程b)およびc)が、少なくとも1回必要に応じて反復される方法を対象にする。
【００１４】
本文書はまた、本方法により得ることができるまたは得られる生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを含む二酸化チタン足場を対象にする。
【００１５】
本文書はまた、生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを含む二酸化チタン足場を含む医療用インプラントと、医療用インプラントとして用いるための係る足場を対象にする。
【００１６】
骨等の組織の再生、修復、置換および/または回復のための、ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場またはこれを含む医療用インプラントと、骨等の組織の再生、修復、置換および/または回復に用いるための、ハイドロゲルコーティングされた足場またはこれを含む医療用インプラントも開示されている。
【００１７】
組織の再生、修復、置換および/または回復のための医療用インプラントの調製のためのハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場の使用も開示されている。
【００１８】
それを必要とする対象への、ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場または係る足場を含む医療用インプラントの植え込みを含む、組織の再生、修復、置換および/または回復のための方法がさらに開示されている。
【００１９】
本発明の他の特色および利点は、次の詳細な説明、図面、実施例および特許請求の範囲から明らかになる。
【００２０】
定義
本文脈における「足場」は、開放多孔性構造に関する。本文脈における足場は、「SC」と省略することができる。「二酸化チタン足場」とは、足場構造の建造材料として主に二酸化チタンを含む足場を意味する、即ち、二酸化チタンは、足場構造形成を担う主要物質である。したがって、二酸化チタン足場は、約51〜100wt%、60〜100wt%、60〜90wt%、70〜100wt%、70〜90wt%、80〜90wt%または80〜95wt%二酸化チタン等、約51wt%、60wt%、70wt%、80wt%、90wt%、95wt%、96wt%、97wt%、98wt%、99wt%または100wt%二酸化チタン等、50wt%を超える二酸化チタンを有する。よって、二酸化チタン足場は、足場の建造材料として二酸化チタンを含むまたはこれからなることができる。
【００２１】
本文書の文脈における「孔径」とは、その周囲の壁を含まない孔の水力直径を企図する。水力直径は、当業者に周知のものであり、孔の周縁の長さで割った孔の4×面積として定義される。
【００２２】
「フラクタル次元支柱(strut)」は、さらにより微細なスケールへとズームダウンするにつれて、どの程度完全にフラクタルが空間を満たすように見えるかに関する指標をもたらす統計的な量である。フラクタル次元には多くの特異的な定義が存在し、そのいずれも普遍的な定義として処理してはならない。値1は、直線に属する。数値が大きくなるにつれて、表面構造はより複雑になる。本文書におけるフラクタル次元は、コルモゴロフまたは「ボックスカウント(box counting)」法を用いて計算される(Liebovitchら、1989)。これは、Skyscan CTAn、Kontich、Belgiumにおいて2dおよび3dの両方において計算される。表面または容積は、一連の等しい正方形または立方体に分けられ、物体表面の部分を含有する正方形の数が計数される。この操作は、3〜100ピクセル等、ボックスサイズの範囲にわたって反復される。表面を含有するボックスの数は、log-logプロットにおいてボックスの長さに対してプロットされ、フラクタル次元は、log-log回帰の勾配から得られる。
【００２３】
本文脈における「総多孔度」は、材料ではない本体内の全区画、例えば、いかなる材料にも占有されていない空間として定義される。総多孔度は、閉鎖および開放孔の両方に関与する。
【００２４】
「内部支柱容積」とは、支柱の内腔の容積を意味する。
【００２５】
「焼結する」、「焼結」その他とは、その粒子が互いに接着するまで材料を加熱することにより(その融点より低く)、粉末から物体を作製するための方法を意味する。焼結は、セラミック物体を製造するために伝統的に用いられており、粉末冶金等の分野においても用途が見出されている。
【００２６】
本文脈における「医療用人工装具」、「医療用インプラント」、「インプラント」その他は、哺乳類、例えば、ヒト哺乳類等、脊椎動物の身体に植え込まれることを企図される装置に関する。本文脈におけるインプラントは、生体構造を置き換えるためおよび/またはいずれかの身体機能を回復させるために用いることができる。係る装置の例として、歯科インプラントおよび整形外科インプラントが挙げられるがこれらに限定されない。本文脈において、整形外科インプラントは、その範囲内において、筋骨格系、特に、関節および骨の機能の保存および回復(これらの構造における疼痛の軽減を包含する)のために、脊椎動物、特に、ヒト等の哺乳類の身体に植え込まれるよう企図されるいずれかの装置を包含する。本文脈において、歯科インプラントは、その範囲内において、歯の修復手技において、脊椎動物、特に、ヒト等の哺乳類の口腔に植え込まれるよう企図されるいずれかの装置を包含する。一般に、歯科インプラントは、1種または数種のインプラント部分で構成される。例えば、歯科インプラントは通常、アバットメント等、第2のインプラント部分にカップリングされた歯科固定具(fixture) および/またはクラウン、ブリッジもしくは有床義歯等の歯科修復剤を含む。しかし、そこに他の部分を接続するべきであっても、植え込みに企図される歯科固定具等、いずれかの装置を単独でインプラントと称してもよい。整形外科および歯科インプラントは、上述から明らかな通り、整形外科および歯科人工装具と表示することもできる。
【００２７】
本文脈において、「対象」は、鳥類、爬虫類、哺乳類、霊長目およびヒト等、いずれかの脊椎動物に関する。
【００２８】
本文脈における「セラミクス」とは、熱処理して凝固構造を形成した、無機粉末材料の物体を意味する。
【００２９】
「生物学的活性物質」とは、生物学的過程に影響を与え得る物質を意味する、即ち、これは生物学的活性を有する。生物学的活性物質は、無機イオン等、小分子であっても、タンパク質等、より大型の分子であっても、細胞等、さらに複雑な構造であってもよい。本文書の文脈における使用に適した生物学的活性物質の例は、後述に開示されている。本文脈における生物学的活性物質は、「生体分子」と表示することもできる。
【００３０】
本文書の文脈における「軟組織」とは、骨以外の、身体の他の構造および臓器を接続、支持または囲む組織を企図する。軟組織は、靱帯、腱、筋膜、皮膚、線維組織、脂肪、滑膜、上皮、筋肉、神経および血管を包含する。
【００３１】
本文書の文脈における「硬組織」とは、骨および歯および軟骨等、石灰化した組織を企図する。石灰化した組織は、柔らかいマトリックスに鉱物を取り込む生物学的組織である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】300mMのCaCl2によりゲル化した、2%のアルギン酸塩(AおよびB)および合成ペプチドを含有する2%のアルギン酸塩(CおよびD)の微細構造を示す図である。×25(AおよびC)および×100の倍率(BおよびD)におけるSEMによる観察。このゲルは、二酸化チタン足場上に存在しておらず、本明細書に開示されているアルギン酸塩コーティングを含む二酸化チタン足場を生成するための方法により調製されていない。したがって、このゲルは、多孔性構造を採る。
【図２】37℃における21日間のインキュベーション後の、FITCで標識されたペプチド2の放出プロファイルを示す図である。棒グラフは、各時点後に放出されたペプチドの量を示す。折れ線グラフは、最大21日間までに放出されたペプチドの累積量を表す。値は、平均±SEMを表す。
【図３】A.上部:培養1および5日後の、異なる量の細胞(30×103、60×103、100×103および200×103細胞/ウェル)を播種した際の接着細胞の数を示す図である。値は、平均±SEMを表す。下部:倍率×200のSEMにより得られる、100×103細胞/ウェルを播種した際に2%アルギン酸塩ハイドロゲルに接着した骨芽細胞の代表的な写真。B.2%アルギン酸塩コーティングにおける骨芽細胞結合を示す図である。培養1(A、C、E、G)および5(B、D、F、H)日後の、30×103(AおよびB)、60×103(CおよびD)、100×103(EおよびF)および200×103(GおよびH)細胞/ウェルを播種した際の、接着細胞の共焦点顕微鏡により得られる代表的な写真。細胞核は、白色(DAPI染色)で提示され(左カラム)、アクチンフィラメントは、白色(ファロイジン-FITC)で提示されている(右カラム)。バー・スケールは、150μmを表す。
【図４】ペプチドなしのアルギン酸塩ハイドロゲル(-)に、または50μg/mlのEmdogain(EMD)もしくは合成ペプチド(P2、P5およびP6)のいずれかを含有するアルギン酸塩ハイドロゲルに、MC3T3-E1細胞を播種した24時間後に収集された培養培地から測定されたLDH活性を示す図である。高対照(100%)は、組織培養プラスチックに播種し、1%TritonX-100と共にインキュベートした細胞由来の細胞培養培地であった。低対照(0%)は、組織培養プラスチックに播種し、0.1%酢酸-PBSと共にインキュベートした細胞由来の細胞培養培地であった。LDH活性のパーセンテージは、次の等式を用いて計算した:細胞毒性(%)=(実験値-低対照)/(高対照-低対照)×100。値は、平均±SEMを表す。マンホイットニー(Mann-Withney)の検定により群間の差を評価した。*p<0.05、対対照アルギン酸塩ハイドロゲル(-)、#p< 0.05、対EMDを含有するアルギン酸塩ハイドロゲル。
【図５Ａ】ペプチドなし(-、対照群)、合成ペプチドまたはEMD(50μg/ml)を含有する2%のアルギン酸塩ハイドロゲルにおいてMC3T3-E1細胞を14および21日間培養した後の、細胞接着関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子により正規化された標的遺伝子の相対mRNAレベルを表し、培養14日目における対照アルギン酸塩ハイドロゲル(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定により群間の差を評価した;(*)p≦0.05、対対照アルギン酸塩ハイドロゲル(-)、(#)p≦0.05、対EMD。
【図５Ｂ】ペプチドなし(-、対照群)、合成ペプチドまたはEMD(50μg/ml)を含有する2%のアルギン酸塩ハイドロゲルにおいてMC3T3-E1細胞を14および21日間培養した後の、細胞接着関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子により正規化された標的遺伝子の相対mRNAレベルを表し、培養14日目における対照アルギン酸塩ハイドロゲル(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定により群間の差を評価した;(*)p≦0.05、対対照アルギン酸塩ハイドロゲル(-)、(#)p≦0.05、対EMD。
【図５Ｃ】ペプチドなし(-、対照群)、合成ペプチドまたはEMD(50μg/ml)を含有する2%のアルギン酸塩ハイドロゲルにおいてMC3T3-E1細胞を14および21日間培養した後の、細胞接着関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子により正規化された標的遺伝子の相対mRNAレベルを表し、培養14日目における対照アルギン酸塩ハイドロゲル(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定により群間の差を評価した;(*)p≦0.05、対対照アルギン酸塩ハイドロゲル(-)、(#)p≦0.05、対EMD。
【図５Ｄ】ペプチドなし(-、対照群)、合成ペプチドまたはEMD(50μg/ml)を含有する2%のアルギン酸塩ハイドロゲルにおいてMC3T3-E1細胞を14および21日間培養した後の、細胞接着関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子により正規化された標的遺伝子の相対mRNAレベルを表し、培養14日目における対照アルギン酸塩ハイドロゲル(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定により群間の差を評価した;(*)p≦0.05、対対照アルギン酸塩ハイドロゲル(-)、(#)p≦0.05、対EMD。
【図６Ａ】ペプチドなし(-、対照群)、合成ペプチドまたはEMD(50μg/ml)を含有する2%のアルギン酸塩ゲルにおいてMC3T3-E1細胞を14および21日間培養した後の、骨芽細胞分化関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子により正規化された標的遺伝子の相対mRNAレベルを表し、培養14日目における対照アルギン酸塩ハイドロゲル(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定により群間の差を評価した;(*)p≦0.05、対対照アルギン酸塩ハイドロゲル(-)、(#)p≦0.05、対EMD。
【図６Ｂ】ペプチドなし(-、対照群)、合成ペプチドまたはEMD(50μg/ml)を含有する2%のアルギン酸塩ゲルにおいてMC3T3-E1細胞を14および21日間培養した後の、骨芽細胞分化関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子により正規化された標的遺伝子の相対mRNAレベルを表し、培養14日目における対照アルギン酸塩ハイドロゲル(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定により群間の差を評価した;(*)p≦0.05、対対照アルギン酸塩ハイドロゲル(-)、(#)p≦0.05、対EMD。
【図６Ｃ】ペプチドなし(-、対照群)、合成ペプチドまたはEMD(50μg/ml)を含有する2%のアルギン酸塩ゲルにおいてMC3T3-E1細胞を14および21日間培養した後の、骨芽細胞分化関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子により正規化された標的遺伝子の相対mRNAレベルを表し、培養14日目における対照アルギン酸塩ハイドロゲル(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定により群間の差を評価した;(*)p≦0.05、対対照アルギン酸塩ハイドロゲル(-)、(#)p≦0.05、対EMD。
【図６Ｄ】ペプチドなし(-、対照群)、合成ペプチドまたはEMD(50μg/ml)を含有する2%のアルギン酸塩ゲルにおいてMC3T3-E1細胞を14および21日間培養した後の、骨芽細胞分化関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子により正規化された標的遺伝子の相対mRNAレベルを表し、培養14日目における対照アルギン酸塩ハイドロゲル(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定により群間の差を評価した;(*)p≦0.05、対対照アルギン酸塩ハイドロゲル(-)、(#)p≦0.05、対EMD。
【図６Ｅ】ペプチドなし(-、対照群)、合成ペプチドまたはEMD(50μg/ml)を含有する2%のアルギン酸塩ゲルにおいてMC3T3-E1細胞を14および21日間培養した後の、骨芽細胞分化関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子により正規化された標的遺伝子の相対mRNAレベルを表し、培養14日目における対照アルギン酸塩ハイドロゲル(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定により群間の差を評価した;(*)p≦0.05、対対照アルギン酸塩ハイドロゲル(-)、(#)p≦0.05、対EMD。
【図６Ｆ】ペプチドなし(-、対照群)、合成ペプチドまたはEMD(50μg/ml)を含有する2%のアルギン酸塩ゲルにおいてMC3T3-E1細胞を14および21日間培養した後の、骨芽細胞分化関連遺伝子の発現を示す図である。データは、参照遺伝子により正規化された標的遺伝子の相対mRNAレベルを表し、培養14日目における対照アルギン酸塩ハイドロゲル(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定により群間の差を評価した;(*)p≦0.05、対対照アルギン酸塩ハイドロゲル(-)、(#)p≦0.05、対EMD。
【図７】37℃における21日間のインキュベーション後の、P2-アルギン酸塩ハイドロゲルコーティングされた足場からのペプチド2(配列番号1)の放出プロファイルを示す図である。棒グラフは、各時点後に放出されたペプチドの量を示す。折れ線グラフは、最大21日間までに放出されたペプチドの累積量を表す。値は、平均±SDを表す。
【図８】培養48時間後に収集された培養培地から測定されたLDH活性を示す図である。値は、平均±SEMを表す。マンホイットニーの検定(p≦0.05):(a)対通常の足場(SC)および(b)対対照アルギン酸塩ハイドロゲルコーティングされた足場(-)。
【図９】10kVおよび40Paにおける、2%アルギン酸塩ハイドロゲルコーティングされたTiO2足場(対照アルギン酸塩足場)のSEM可視化を示す図である。図Aおよび図Bは、50×(A)および300×(B)の倍率における、1層の2%アルギン酸塩ハイドロゲルによるコーティング過程直後のTiO2足場の微細構造を示す。図Cおよび図Dは、50×(C)および300×(D)の倍率における、培養7日後の対照アルギン酸塩足場において培養された細胞を示す。
【図１０】培養7(A、CおよびE)および21(B、DおよびF)日後の、通常の足場(AおよびB)、対照アルギン酸塩足場(CおよびD)およびP2-アルギン酸塩ハイドロゲルコーティングされた足場(EおよびF)において成長するMC3T3-E1細胞のSEM可視化を示す図である。10kV、40Paおよび×50倍率におけるSEMにより足場を観察した。
【図１１】培養7日後の、足場において成長する細胞の数を示す図である。ヘキスト蛍光染色によりDNA含量を解析し、線形検量線と相関させた。値は、平均±SEMを表す。値は、平均±SEMを表す。マンホイットニーの検定:(a)p≦0.05、対通常の足場(SC)および(b)対対照アルギン酸塩ハイドロゲルコーティングされた足場(-)。
【図１２Ａ】TiO2足場において7(□)および21日間(■)培養されたMC3T3-E1細胞におけるItgb1(A)、Itgb3(B)、Fn1(C)およびItga8(D)の相対mRNA発現レベルを示す図である。参照群として通常の足場(SC)を用いた。データは、参照遺伝子(Gapdhおよび18S)により正規化された標的遺伝子の倍数変化を表し、通常の足場(SC)において培養された7日目の細胞(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定:(a)p≦0.05、対通常の足場(SC)および(b)対対照アルギン酸塩足場(-)。
【図１２Ｂ】TiO2足場において7(□)および21日間(■)培養されたMC3T3-E1細胞におけるItgb1(A)、Itgb3(B)、Fn1(C)およびItga8(D)の相対mRNA発現レベルを示す図である。参照群として通常の足場(SC)を用いた。データは、参照遺伝子(Gapdhおよび18S)により正規化された標的遺伝子の倍数変化を表し、通常の足場(SC)において培養された7日目の細胞(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定:(a)p≦0.05、対通常の足場(SC)および(b)対対照アルギン酸塩足場(-)。
【図１２Ｃ】TiO2足場において7(□)および21日間(■)培養されたMC3T3-E1細胞におけるItgb1(A)、Itgb3(B)、Fn1(C)およびItga8(D)の相対mRNA発現レベルを示す図である。参照群として通常の足場(SC)を用いた。データは、参照遺伝子(Gapdhおよび18S)により正規化された標的遺伝子の倍数変化を表し、通常の足場(SC)において培養された7日目の細胞(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定:(a)p≦0.05、対通常の足場(SC)および(b)対対照アルギン酸塩足場(-)。
【図１２Ｄ】TiO2足場において7(□)および21日間(■)培養されたMC3T3-E1細胞におけるItgb1(A)、Itgb3(B)、Fn1(C)およびItga8(D)の相対mRNA発現レベルを示す図である。参照群として通常の足場(SC)を用いた。データは、参照遺伝子(Gapdhおよび18S)により正規化された標的遺伝子の倍数変化を表し、通常の足場(SC)において培養された7日目の細胞(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定:(a)p≦0.05、対通常の足場(SC)および(b)対対照アルギン酸塩足場(-)。
【図１３Ａ】TiO2足場において7(□)および21日間(■)培養されたMC3T3-E1細胞における、A)オステリクス(osterix)(Osx)、B)骨形成タンパク質2(Bmp2)、C)コラーゲン-I(Coll-I)、D)インターロイキン6(Il-6)、E)オステオポンチン(Opn)、F)骨シアロタンパク質(Bsp)、G)アルカリホスファターゼ(Alp)およびH)オステオカルシン(Oc)の相対mRNA発現レベルを示す図である。参照群として通常の足場(SC)を用いた。データは、参照遺伝子(Gapdhおよび18S)により正規化された標的遺伝子の倍数変化を表し、通常の足場(SC)において培養された7日目の細胞(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定:(a)p≦0.05、対通常の足場(SC)および(b)対対照アルギン酸塩足場(-)。
【図１３Ｂ】TiO2足場において7(□)および21日間(■)培養されたMC3T3-E1細胞における、A)オステリクス(Osx)、B)骨形成タンパク質2(Bmp2)、C)コラーゲン-I(Coll-I)、D)インターロイキン6(Il-6)、E)オステオポンチン(Opn)、F)骨シアロタンパク質(Bsp)、G)アルカリホスファターゼ(Alp)およびH)オステオカルシン(Oc)の相対mRNA発現レベルを示す図である。参照群として通常の足場(SC)を用いた。データは、参照遺伝子(Gapdhおよび18S)により正規化された標的遺伝子の倍数変化を表し、通常の足場(SC)において培養された7日目の細胞(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定:(a)p≦0.05、対通常の足場(SC)および(b)対対照アルギン酸塩足場(-)。
【図１３Ｃ】TiO2足場において7(□)および21日間(■)培養されたMC3T3-E1細胞における、A)オステリクス(Osx)、B)骨形成タンパク質2(Bmp2)、C)コラーゲン-I(Coll-I)、D)インターロイキン6(Il-6)、E)オステオポンチン(Opn)、F)骨シアロタンパク質(Bsp)、G)アルカリホスファターゼ(Alp)およびH)オステオカルシン(Oc)の相対mRNA発現レベルを示す図である。参照群として通常の足場(SC)を用いた。データは、参照遺伝子(Gapdhおよび18S)により正規化された標的遺伝子の倍数変化を表し、通常の足場(SC)において培養された7日目の細胞(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定:(a)p≦0.05、対通常の足場(SC)および(b)対対照アルギン酸塩足場(-)。
【図１３Ｄ】TiO2足場において7(□)および21日間(■)培養されたMC3T3-E1細胞における、A)オステリクス(Osx)、B)骨形成タンパク質2(Bmp2)、C)コラーゲン-I(Coll-I)、D)インターロイキン6(Il-6)、E)オステオポンチン(Opn)、F)骨シアロタンパク質(Bsp)、G)アルカリホスファターゼ(Alp)およびH)オステオカルシン(Oc)の相対mRNA発現レベルを示す図である。参照群として通常の足場(SC)を用いた。データは、参照遺伝子(Gapdhおよび18S)により正規化された標的遺伝子の倍数変化を表し、通常の足場(SC)において培養された7日目の細胞(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定:(a)p≦0.05、対通常の足場(SC)および(b)対対照アルギン酸塩足場(-)。
【図１３Ｅ】TiO2足場において7(□)および21日間(■)培養されたMC3T3-E1細胞における、A)オステリクス(Osx)、B)骨形成タンパク質2(Bmp2)、C)コラーゲン-I(Coll-I)、D)インターロイキン6(Il-6)、E)オステオポンチン(Opn)、F)骨シアロタンパク質(Bsp)、G)アルカリホスファターゼ(Alp)およびH)オステオカルシン(Oc)の相対mRNA発現レベルを示す図である。参照群として通常の足場(SC)を用いた。データは、参照遺伝子(Gapdhおよび18S)により正規化された標的遺伝子の倍数変化を表し、通常の足場(SC)において培養された7日目の細胞(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定:(a)p≦0.05、対通常の足場(SC)および(b)対対照アルギン酸塩足場(-)。
【図１３Ｆ】TiO2足場において7(□)および21日間(■)培養されたMC3T3-E1細胞における、A)オステリクス(Osx)、B)骨形成タンパク質2(Bmp2)、C)コラーゲン-I(Coll-I)、D)インターロイキン6(Il-6)、E)オステオポンチン(Opn)、F)骨シアロタンパク質(Bsp)、G)アルカリホスファターゼ(Alp)およびH)オステオカルシン(Oc)の相対mRNA発現レベルを示す図である。参照群として通常の足場(SC)を用いた。データは、参照遺伝子(Gapdhおよび18S)により正規化された標的遺伝子の倍数変化を表し、通常の足場(SC)において培養された7日目の細胞(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定:(a)p≦0.05、対通常の足場(SC)および(b)対対照アルギン酸塩足場(-)。
【図１３Ｇ】TiO2足場において7(□)および21日間(■)培養されたMC3T3-E1細胞における、A)オステリクス(Osx)、B)骨形成タンパク質2(Bmp2)、C)コラーゲン-I(Coll-I)、D)インターロイキン6(Il-6)、E)オステオポンチン(Opn)、F)骨シアロタンパク質(Bsp)、G)アルカリホスファターゼ(Alp)およびH)オステオカルシン(Oc)の相対mRNA発現レベルを示す図である。参照群として通常の足場(SC)を用いた。データは、参照遺伝子(Gapdhおよび18S)により正規化された標的遺伝子の倍数変化を表し、通常の足場(SC)において培養された7日目の細胞(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定:(a)p≦0.05、対通常の足場(SC)および(b)対対照アルギン酸塩足場(-)。
【図１３Ｈ】TiO2足場において7(□)および21日間(■)培養されたMC3T3-E1細胞における、A)オステリクス(Osx)、B)骨形成タンパク質2(Bmp2)、C)コラーゲン-I(Coll-I)、D)インターロイキン6(Il-6)、E)オステオポンチン(Opn)、F)骨シアロタンパク質(Bsp)、G)アルカリホスファターゼ(Alp)およびH)オステオカルシン(Oc)の相対mRNA発現レベルを示す図である。参照群として通常の足場(SC)を用いた。データは、参照遺伝子(Gapdhおよび18S)により正規化された標的遺伝子の倍数変化を表し、通常の足場(SC)において培養された7日目の細胞(100%に設定)のパーセンテージとして表現される。値は、平均±SEMを表す。スチューデントt検定:(a)p≦0.05、対通常の足場(SC)および(b)対対照アルギン酸塩足場(-)。
【図１４】アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場の走査型電子顕微鏡による特徴づけを示す図である。250×(A)および1500×(B、C)の倍率における、TiO2足場の支柱表面をコーティングするアルギン酸塩層(矢印)の走査型電子顕微鏡による可視化。
【図１５】アルギン酸塩コーティングされたおよびコーティングされていないTiO2足場の過ヨウ素酸シッフによる可視化を示す図である。アルギン酸塩コーティングされた(A、B)およびコーティングされていない(C、D)TiO2足場の過ヨウ素酸シッフ染色。アルギン酸塩(赤)は、頂部(A)および中央部(B)から観察される通り、足場の至るところに分布する。
【図１６】シンバスタチン放出を示す図である。37℃における19日間インキュベーション後の、2.4mMおよび0.6mM SIMを含有するアルギン酸塩コーティングされたTiO2足場からのSIMの放出プロファイル。棒グラフは、各時点後に放出されたSIMの量を示す。折れ線グラフは、最大19日間までに放出されたSIMの累積量を表す。値は、平均±SDを表す。
【図１７Ａ】乳酸脱水素酵素活性アッセイを示す図である。14日目まで1日おきに測定された、ドナー1(A)、ドナー2(B)およびドナー3(C)に関する、SIMなしの足場と比較した10nMおよび10μM SIMを有する足場由来の培養培地におけるLDH活性を示す。どちらのSIM濃度も、SIMなしのアルギン酸塩コーティングされた足場の効果と比較してLDH活性の有意な増加を引き起こさなかった。値は、平均±SDを表す。
【図１７Ｂ】乳酸脱水素酵素活性アッセイを示す図である。14日目まで1日おきに測定された、ドナー1(A)、ドナー2(B)およびドナー3(C)に関する、SIMなしの足場と比較した10nMおよび10μM SIMを有する足場由来の培養培地におけるLDH活性を示す。どちらのSIM濃度も、SIMなしのアルギン酸塩コーティングされた足場の効果と比較してLDH活性の有意な増加を引き起こさなかった。値は、平均±SDを表す。
【図１７Ｃ】乳酸脱水素酵素活性アッセイを示す図である。14日目まで1日おきに測定された、ドナー1(A)、ドナー2(B)およびドナー3(C)に関する、SIMなしの足場と比較した10nMおよび10μM SIMを有する足場由来の培養培地におけるLDH活性を示す。どちらのSIM濃度も、SIMなしのアルギン酸塩コーティングされた足場の効果と比較してLDH活性の有意な増加を引き起こさなかった。値は、平均±SDを表す。
【図１８Ａ】アルカリホスファターゼ活性アッセイを示す図である。10nMおよび10μM SIMを有する足場由来の培養培地におけるALP活性(y軸)は、ドナー1(A)、ドナー2(B)およびドナー3(C)に関して、2、8、14および21日目における、対照、SIMなしの足場のパーセンテージで示す。ALP活性は、10nMまたは10μM SIMを有する足場のいずれかで測定された時点のいずれにおいても、SIMなしの足場と比較して培養培地において有意に変化しなかった。値は、平均±SDを表す。
【図１８Ｂ】アルカリホスファターゼ活性アッセイを示す図である。10nMおよび10μM SIMを有する足場由来の培養培地におけるALP活性(y軸)は、ドナー1(A)、ドナー2(B)およびドナー3(C)に関して、2、8、14および21日目における、対照、SIMなしの足場のパーセンテージで示す。ALP活性は、10nMまたは10μM SIMを有する足場のいずれかで測定された時点のいずれにおいても、SIMなしの足場と比較して培養培地において有意に変化しなかった。値は、平均±SDを表す。
【図１８Ｃ】アルカリホスファターゼ活性アッセイを示す図である。10nMおよび10μM SIMを有する足場由来の培養培地におけるALP活性(y軸)は、ドナー1(A)、ドナー2(B)およびドナー3(C)に関して、2、8、14および21日目における、対照、SIMなしの足場のパーセンテージで示す。ALP活性は、10nMまたは10μM SIMを有する足場のいずれかで測定された時点のいずれにおいても、SIMなしの足場と比較して培養培地において有意に変化しなかった。値は、平均±SDを表す。
【図１９Ａ】イムノアッセイ:分泌されたタンパク質の定量化を示す図である。10nMおよび10μM SIMを有する足場から細胞培養培地へのTNFRSF11B、VEGFAおよびBGLAPの分泌は、2、8、14および21日目における対照、SIMなしの足場のパーセンテージで示す。値は、平均±SDを表す。
【図１９Ｂ】イムノアッセイ:分泌されたタンパク質の定量化を示す図である。10nMおよび10μM SIMを有する足場から細胞培養培地へのTNFRSF11B、VEGFAおよびBGLAPの分泌は、2、8、14および21日目における対照、SIMなしの足場のパーセンテージで示す。値は、平均±SDを表す。
【図１９Ｃ】イムノアッセイ:分泌されたタンパク質の定量化を示す図である。10nMおよび10μM SIMを有する足場から細胞培養培地へのTNFRSF11B、VEGFAおよびBGLAPの分泌は、2、8、14および21日目における対照、SIMなしの足場のパーセンテージで示す。値は、平均±SDを表す。
【図２０】リアルタイムRT-PCR解析を示す図である。SIMなしの足場と比較し、参照遺伝子GAPDHに対し正規化した、7、14および21日目における10nMおよび10μM SIMを有する足場において培養された細胞におけるBGLAPの相対mRNA発現レベルを示す。値は、平均±SDを表す。
【図２１Ａ】シンバスタチンありまたはなしのアルギン酸塩コーティングされたTiO2足場におけるI型コラーゲン沈着の共焦点レーザー走査型顕微鏡による可視化を示す図である。アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場において培養された初代ヒト骨芽細胞におけるI型コラーゲンの蛍光免疫細胞化学的解析。I型コラーゲンは、10nM SIM(A)、10μM SIM(B)を有するおよびSIM(C)なしの足場において培養された細胞の大部分で検出される。細胞外コラーゲン原線維は、SIM(C)なしの足場においてのみ観察される。I型コラーゲン、DNA、TiO2足場表面。
【図２１Ｂ】シンバスタチンありまたはなしのアルギン酸塩コーティングされたTiO2足場におけるI型コラーゲン沈着の共焦点レーザー走査型顕微鏡による可視化を示す図である。アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場において培養された初代ヒト骨芽細胞におけるI型コラーゲンの蛍光免疫細胞化学的解析。I型コラーゲンは、10nM SIM(A)、10μM SIM(B)を有するおよびSIM(C)なしの足場において培養された細胞の大部分で検出される。細胞外コラーゲン原線維は、SIM(C)なしの足場においてのみ観察される。I型コラーゲン、DNA、TiO2足場表面。
【図２１Ｃ】シンバスタチンありまたはなしのアルギン酸塩コーティングされたTiO2足場におけるI型コラーゲン沈着の共焦点レーザー走査型顕微鏡による可視化を示す図である。アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場において培養された初代ヒト骨芽細胞におけるI型コラーゲンの蛍光免疫細胞化学的解析。I型コラーゲンは、10nM SIM(A)、10μM SIM(B)を有するおよびSIM(C)なしの足場において培養された細胞の大部分で検出される。細胞外コラーゲン原線維は、SIM(C)なしの足場においてのみ観察される。I型コラーゲン、DNA、TiO2足場表面。
【図２２】アルギン酸塩コーティングされたおよびコーティングされていない足場の過ヨウ素酸シッフ/Pan-カドヘリンによる可視化を示す図である。アルギン酸塩コーティングされた(B)およびコーティングされていない(A)足場の過ヨウ素酸シッフ染色。アルギン酸塩(赤)は、断面(B)から観察される通り、足場の至るところに分布する。2日目における細胞播種されたアルギン酸塩コーティングされた(D)およびコーティングされていない(C)足場の過ヨウ素酸シッフ/Pan-カドヘリン二重染色。細胞を含有するアルギン酸塩層は、足場を覆っている(D)。
【図２３】細胞播種されたアルギン酸塩コーティングされた足場のアクリジンオレンジ/エチジウムブロマイドによる可視化を示す図である。2日目におけるアルギン酸塩コーティングされた足場に播種されたヒト脂肪由来間葉系幹細胞のアクリジンオレンジ/エチジウムブロマイド染色。細胞の大部分は、アルギン酸塩コーティング手順において生存した。生細胞は緑色に染色され、死細胞は赤色に染色される。
【図２４Ａ】乳酸脱水素酵素活性および総タンパク質含量アッセイを示す図である。1日おきに最大14日間測定されたヒト脂肪由来間葉系幹細胞(hAD-MSC)(A、C)および初代ヒト骨芽細胞(hOST)(B、D)に関して、emdogainあり(EMDアルギン酸塩)またはなしの(アルギン酸塩)、細胞播種されたアルギン酸塩コーティングされた足場由来の培養培地における乳酸脱水素酵素活性および総タンパク質含量は、対照、細胞播種されたコーティングされていない足場のパーセンテージで示す。値は、平均+SDを表す。統計解析:(a)p≦0.05、対emdogainなしのアルギン酸塩コーティングされた足場および(b)p≦0.05、対細胞播種されたコーティングされていない足場。
【図２４Ｂ】乳酸脱水素酵素活性および総タンパク質含量アッセイを示す図である。1日おきに最大14日間測定されたヒト脂肪由来間葉系幹細胞(hAD-MSC)(A、C)および初代ヒト骨芽細胞(hOST)(B、D)に関して、emdogainあり(EMDアルギン酸塩)またはなしの(アルギン酸塩)、細胞播種されたアルギン酸塩コーティングされた足場由来の培養培地における乳酸脱水素酵素活性および総タンパク質含量は、対照、細胞播種されたコーティングされていない足場のパーセンテージで示す。値は、平均+SDを表す。統計解析:(a)p≦0.05、対emdogainなしのアルギン酸塩コーティングされた足場および(b)p≦0.05、対細胞播種されたコーティングされていない足場。
【図２４Ｃ】乳酸脱水素酵素活性および総タンパク質含量アッセイを示す図である。1日おきに最大14日間測定されたヒト脂肪由来間葉系幹細胞(hAD-MSC)(A、C)および初代ヒト骨芽細胞(hOST)(B、D)に関して、emdogainあり(EMDアルギン酸塩)またはなしの(アルギン酸塩)、細胞播種されたアルギン酸塩コーティングされた足場由来の培養培地における乳酸脱水素酵素活性および総タンパク質含量は、対照、細胞播種されたコーティングされていない足場のパーセンテージで示す。値は、平均+SDを表す。統計解析:(a)p≦0.05、対emdogainなしのアルギン酸塩コーティングされた足場および(b)p≦0.05、対細胞播種されたコーティングされていない足場。
【図２４Ｄ】乳酸脱水素酵素活性および総タンパク質含量アッセイを示す図である。1日おきに最大14日間測定されたヒト脂肪由来間葉系幹細胞(hAD-MSC)(A、C)および初代ヒト骨芽細胞(hOST)(B、D)に関して、emdogainあり(EMDアルギン酸塩)またはなしの(アルギン酸塩)、細胞播種されたアルギン酸塩コーティングされた足場由来の培養培地における乳酸脱水素酵素活性および総タンパク質含量は、対照、細胞播種されたコーティングされていない足場のパーセンテージで示す。値は、平均+SDを表す。統計解析:(a)p≦0.05、対emdogainなしのアルギン酸塩コーティングされた足場および(b)p≦0.05、対細胞播種されたコーティングされていない足場。
【図２５】RUNX2およびSOX9の共焦点レーザー走査型顕微鏡による可視化を示す図である。emdogainを有するアルギン酸塩コーティングされた足場(A)およびコーティングされていない足場(B)において培養されたヒト脂肪由来間葉系幹細胞におけるRUNX2およびSOX9の蛍光免疫細胞化学的解析。RUNX2は、emdogainを有する足場(A)において培養された細胞の大部分で検出される。しかし、RUNX2およびSOX9は、コーティングされていない足場(B)において培養された細胞において等しく検出される。RUNX2(緑)、SOX9(赤)、TiO2足場表面(白)。
【図２６】開放多孔性構造を示す、本文書の方法により生成されたアルギン酸塩層でコーティングされたTiO2足場の断面を示す図である。切片の直径は3mmである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本文書は、二酸化チタン足場の表面の少なくとも一部が、少なくとも1種の生物学的活性物質(本明細書において生体分子とも表示)を含むハイドロゲルコーティングを備える、二酸化チタン足場を開示する。
【００３４】
少なくとも1種の生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを備える二酸化チタン足場は、本文書の文脈において、「ハイドロゲルコーティングを含む二酸化チタン足場」、「ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場」その他と表示することもできる。ハイドロゲルを備える表面は、二酸化チタン足場の外表面の1個もしくは複数の部分または全体となり得るが、足場内部の孔の部分または大部分の表面(孔の壁)ともなり得る。生物学的活性物質が存在しないことが明確に文脈から明らかでない限り、ハイドロゲルコーティングが、少なくとも1種の生物学的活性物質を含むことを理解されたい。二酸化チタン足場のハイドロゲルコーティングの存在は、足場統合、生体適合性等を改善し得る生物学的活性物質の送達を可能にする。しかし、ハイドロゲルコーティングを構成する物質それ自体が、生物学的活性を有することもできる。
【００３５】
ハイドロゲルは、水を含有するゲルとして定義することができる。本明細書に開示されているハイドロゲルコーティングは、親水性かつ高度に吸収性のポリマー鎖のネットワークを含み、したがって、ハイドロゲルコーティングは、湿った際にゲル様状態を採る。しかし、ハイドロゲルコーティングがこのゲル様状態を採るためには、ある特定の量の水分が必要とされることを理解されたい。したがって、ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場が、例えば、乾燥されるまたは乾燥した場所で貯蔵されると、ハイドロゲルはむしろ、薄い脱水された薄膜層(別名「キセロゲル」)の形態となる。しかし、ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場が、身体への植え込みまたは水溶液への浸漬等、より湿性の環境に付されると、この薄膜層は、再度ハイドロゲルの外観を採る。明確に文脈から明らかでない限り、本文書においてハイドロゲルが言及される場合、ゲルの湿性および乾燥形態の両方を網羅することを理解されたい。
【００３６】
ハイドロゲルは、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール(PEG)、セルロース、ポリ(アクリル酸)(PAA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸)(PLA)、PLA-PGA、PLA-PEG、デキストラン、デキストラン-PEG、デンプン、コラーゲンベースのゲル、アガロース、プルロニック酸、ヘパラン硫酸、グリコサミノグリカン、ポリエチレンオキシド(PEO)、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー[P(EO-co-PO)]ならびにプルロニック/ポロキサマー等、1000〜200000g/mol等、約1000〜1000000g/molの分子量を有する高分子量ポリマーから形成される。
【００３７】
キトサンは、アルギン酸塩よりも安定的であるが、低pH、例えば、炎症した、感染したまたは低酸素組織に存在する条件で急速に崩壊される。キトサンそれ自体が、抗炎症性質を有するとも考えられている。デンプンおよびコラーゲンベースのゲル等、他のハイドロゲルも同様の特徴を有するが、コラゲナーゼ等の局所的組織因子によってより迅速に崩壊される。セルロースもまたpH依存性であり、必要とされる用途、機械的強度等に応じて数種の異なる化学修飾で作り出すことができる。PLAおよびPGAは、迅速に崩壊されて、組織、感染に、また、組み合わせて用いる場合は他のハイドロゲル(例えば、キトサン)の崩壊速度に有益な局所的効果を有し得る有機酸(即ち、乳酸)となる。ヒアルロン酸は、生物学的効果を有する別の重要なハイドロゲルである。これは、軟骨の重要な構成物であり、関節において、創傷治癒のために、および眼において一般的に用いられる。これは、僅かに抗炎症性であり、軟骨、靱帯および角膜細胞等、ある特定の種類の結合組織の再生を刺激すると考えられる。PEGは、強度や、設計された崩壊速度のための架橋等に関して高度に柔軟な、非常に生体適合性なハイドロゲルであり、生物学的分子に化学的に連結して、多数の条件のために設計され得る制御された持続放出媒体をもたらすことのできるゲルである。
【００３８】
ハイドロゲルを形成するために用いることのできるポリマーのさらに別の例として、ポリ(プロピレンオキシド)(PPO)、ポリ(ブチレンオキシド)(PBO)、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ(エチレングリコール)メタクリレート、アクリル酸アクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、ポリアクリルアミド(PAAm)、ポリ(N-ビニルピロリドン)(PNVP)、ポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート)(PHEMA)、ポリ(エチレンオキシド)(PEO)、ポリ(エチレングリコール)モノメチルエーテル(PEGME)、カルボキシメチルセルロース等のメチルセルロース、NVPメタクリル酸(MAA)と共重合されたポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート)(PHEMA)、ブチルメタクリレート(BMA)、メチルメタクリレート(MMA)、3-メトキシ-2-ヒドロキシプロピルメタクリレート(MHPM)、PHEMA/ポリ(エチレンテレフタレート)(PTFE)、PHEMA、P(HEMA-co-MMA)、P(HEMA-b-シロキサン)、PVA、ポリ(アクリル酸)(PAA)、ポリ[グリセリル(glyceriyl)メタクリレート]、HEMA、ポリシアノアクリレート、フマル酸-PEG、セバシン酸/1,3-ビス(p-カルボキシフェノキシ)プロパン[P(CPP-SA)]PHEMA、PVA、PNVP、ポリ(エチレン-co-ビニルアセテート)(PEVAc)、ポリ(アクリルアミド)(PAAm)、ポリ(ジエチルアミノエチルメタクリレート)(PDEAEMA)、ポリ(ジメチルアミノエチルメタクリレート)、(PDMAEMA)、ポリ[メタクリル酸グラフトされたポリ(エチレングリコール)]、(P(MAA-g-EG))、ポリ[アクリル酸グラフトされたポリ(エチレングリコール)][P(PAA-g-EG)]、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)、PNIPAAm/PAA、ポリグリコール-アルギン酸塩、コラーゲンベースのゲル(ゼラチン)およびヘパラン硫酸およびその類似体および他のグリコサミノグリカンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３９】
ハイドロゲルは、生物学的活性物質の担体として機能し得るが、一部のポリマーは、それ自体が生物学的活性を有しても(例えば、キトサン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸およびコラーゲン)、あるいは身体における天然過程により崩壊されて生物学的活性代謝物となってもよい(例えば、PLA、PGA、コラーゲン、ヘパラン硫酸類似体)。
【００４０】
ポリマーは、典型的に、高分子量ポリマー、即ち、約1000〜200000g/mol、10000〜600000g/mol、10000〜100000g/mol、100000〜300000g/mol、250000〜600000g/mol、50000〜150000g/mol、50000〜200000g/molまたは50000〜100000g/mol等、約1000〜1000000g/molの分子量(Mw)を有するポリマーである。ハイドロゲルコーティングは、ハイドロゲルを調製する際に互いに混合された1種または複数の種類のポリマーを含むことができる。あるいは、ハイドロゲルは、異なるポリマーまたは異なるポリマー混合物を含み得るハイドロゲルの異なる層により構成することができる。
【００４１】
ハイドロゲルにおける生物学的活性分子およびそれぞれのハイドロゲル層を構成するポリマーおよび/または異なるハイドロゲル層におけるポリマーを変動させることにより、対象におけるハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場の企図される機能に応じて、ハイドロゲルの所望の生物学的機能を得ることができる。
【００４２】
ハイドロゲルが、アルギン酸塩ハイドロゲルである場合、アルギン酸塩は、例えば、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸カルシウムおよびアルギン酸ストロンチウムとなり得る。アルギン酸塩は、それぞれ(1-4)結合したβ-D-マンヌロン酸塩(M)およびそのC-5エピマーα-L-グルロン酸塩(G)残基のホモポリマーブロックとの直鎖状コポリマーであり、異なる配列またはブロックにおいて一体に共有結合している。単量体は、連続的G残基(Gブロック)、連続的M残基(Mブロック)または交互のMおよびG残基(MGブロック)のホモポリマーブロックにおいて現れ得る。アルギン酸塩の特徴は、異なる比率のMおよびGブロックならびにその配列に応じて変化する。アルギン酸塩は、最小で約60%のグルロン酸塩単量体を含むことができる。
【００４３】
ハイドロゲルは、二酸化チタン足場の外表面に存在するが、異なる程度で足場に浸透し、足場内部の孔の壁をコーティングまたは足場孔空間に充満することもできる。
【００４４】
ハイドロゲルコーティングは、1〜20μmまたは1〜10μm等、少なくとも1μmの湿潤厚さ(wet thickness)を有し得る。係る薄いハイドロゲルは、二酸化チタン足場の外表面の少なくとも一部をコーティングすることができるが、足場内部の孔の壁をコーティングすることもできる。ハイドロゲルコーティングは、1層または複数のその後に形成されたハイドロゲル層を含むことができる。したがって、ハイドロゲルコーティングは、2〜6、2〜4、3または4層等、1〜10層のハイドロゲル層により構成され得る。薄いコーティングは、ハイドロゲルコーティングにより当然ながら孔径が幾分低下するとしても、二酸化チタン足場の孔開口部を実質的に遮断しないことから、薄い厚さのハイドロゲルコーティングが有利となり得る。足場孔のある程度の初期遮断は、薄いハイドロゲルコーティングが調製された場合であっても起こり得るが、生物学的環境において、コーティング過程の直後に遮断されたままであったこれらの孔において、遮断ハイドロゲルコーティングのある程度の分解が観察された(実施例2を参照)。ハイドロゲルコーティングがあるにもかかわらず、細胞および組織による浸透のために孔が容易に到達でき、これにより二酸化チタン足場への細胞成長が改善され得るため、孔遮断が実質的にないことが有利である。
【００４５】
足場孔の壁においても形成される薄いハイドロゲルコーティングによる別の利点は、ハイドロゲルコーティングが基本的に足場の外表面のみに形成される場合と比較して、非常に大きな表面対容積比が存在することである。この構成は、ハイドロゲルコーティングに包含される生物学的活性物質の放出プロファイルに影響を与える。また、ハイドロゲルコーティングが、二酸化チタン足場の外表面から剥がれ落ちる場合であっても、ハイドロゲルが足場の内部にも存在するのであれば、ハイドロゲルが剥がれ落ちることにより足場から全て失われるとは限らず、生体分子を有するハイドロゲルは、足場内部に依然として存在する。
【００４６】
生体分子のサイズは、ハイドロゲル層の数および/またはハイドロゲル層の総合的な厚さの選択に影響を与え得る。より小型の生体分子(即ち、ドキシサイクリン等、より低Mwを有する)は、より大型の生体分子よりも速くハイドロゲルコーティングから拡散する。したがって、より小型の生体分子の遅延放出が望ましい場合、より厚いハイドロゲルコーティングが必要とされる。他方では、より大型の生体分子に関して、ハイドロゲルコーティングからの放出速度は、ハイドロゲルの分解に対する依存性がより高く、生体分子は、より小型の生体分子と同じ速さではハイドロゲルコーティングから拡散しない。したがって、より薄いハイドロゲルコーティングを、より大型の生体分子に用いることができる。生体分子のサイズおよび望ましい放出速度を知ることにより、その結果として、ハイドロゲルコーティングの厚さを調整して、望ましい放出速度を達成することができる。
【００４７】
あるいは、ハイドロゲルは、二酸化チタン足場内部の空間に充満することができる、即ち、異なる程度で(同様に、必要に応じて、二酸化チタン足場の外表面に存在して)孔に充満することができる。幹細胞等、細胞(細胞型の例として、本明細書の他の箇所を参照)を二酸化チタン足場に取り込む必要がある場合、多数の細胞を足場孔内部に沈着させることができるため、これは特に有利となり得る。例えば、二酸化チタン足場内部の総孔容積の約50〜100%、60〜100%、70〜100%、80〜100%、90〜100%または90〜99%を、ハイドロゲルコーティングで充満させることができる。
【００４８】
本明細書に開示されているハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場を生成するための方法は、足場の少なくとも一部が、生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを備える、二酸化チタン足場をもたらす。したがって、本文書はまた、本明細書に開示されている方法により得ることができるまたは得られる、生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを含む二酸化チタン足場を対象にする。
【００４９】
生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを形成するための方法
生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを含む本明細書に開示されている二酸化チタン足場を生成するための方法の一例は、
a)二酸化チタン足場を用意する工程と、
b)生物学的活性物質と、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール(PEG)、セルロース、ポリ(アクリル酸)(PAA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸)(PLA)、PLA-PGA、PLA-PEG、デキストラン、デキストラン-PEG、デンプン、コラーゲンベースのゲル、アガロース、プルロニック酸、ヘパラン硫酸、グリコサミノグリカン、PEO、P(EO-co-PO)およびプルロニック/ポロキサマーからなる群から選択される約1〜10%w/vのポリマーとを含むポリマー溶液を、前記二酸化チタン足場の少なくとも一部に置き、続いて二酸化チタン足場を遠心分離する工程と、
c)工程b)における二酸化チタン足場に置かれたポリマーのゲル化をもたらす工程と、
d)必要に応じて、二酸化チタン足場を乾燥させる工程と
を含み、工程b)およびc)が、少なくとも1回必要に応じて反復される方法である。
【００５０】
方法が、上述の工程a)〜d)からなり、工程b)およびc)が、少なくとも1回必要に応じて反復されてもよい。工程b)およびc)が、反復される場合、2層以上のハイドロゲル層を含むハイドロゲルコーティングが構成される。
【００５１】
工程a)の二酸化チタン足場は、本明細書の他の箇所に開示されている二酸化チタン足場である。
【００５２】
ポリマー溶液は、ハイドロゲルの形成に適したものとして本明細書に収載されているポリマー(または同様の機能を有するポリマー)のうち少なくとも1種を約1〜10%w/vの濃度で含む水溶液である。ポリマー溶液は、好ましくは室温で、例えば1時間から一晩(例えば、1〜24時間)、ポリマーが溶解されるまで撹拌することにより、蒸留水またはリン酸緩衝食塩水等の適したバッファーにおいてポリマーを溶解することにより調製することができる。生物学的活性物質は、本明細書の他の箇所に開示されている生物学的活性物質であり、好ましくは、ポリマー溶液に加えられる。ポリマー溶液に加えられる場合、生物学的活性物質の濃度は、当然ながら、特異的な生物学的活性物質および/または身体におけるその企図される機能に依存する。典型的には、ポリマー溶液におけるその濃度は、マイクログラム範囲内であるが、500ng/ml〜500μg/mlまたは0.5〜500μg/ml等、1ng〜1mg/mlに及び得る。
【００５３】
二酸化チタン足場にポリマー溶液を置くために、二酸化チタン足場は、ポリマー溶液に浸漬することができる。この操作は、例えば、約100rpm/分のオービタルシェーカーにより、かき混ぜつつ行うことができる。かき混ぜは、足場の多孔性ネットワーク中にポリマー溶液を延展するのに役立つ。典型的には、二酸化チタン足場は、1〜2時間、例えば1時間等、約10分間〜2時間の期間浸漬される。浸漬は典型的に、室温で行われる。
【００５４】
ポリマー溶液へと浸漬した後、典型的には、約200〜300×gにおける0.5〜2分間、例えば1分間等の短期間等、二酸化チタン足場の慎重な遠心分離により、過剰な溶液を好ましくは除去する。
【００５５】
工程c)におけるポリマーのゲル化をもたらすために、当業者に公知の標準方法を用いることができる。ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場を調製するために用いられる特異的ポリマーに応じて、工程c)におけるゲル化は、pHまたは温度を変化させることによる、塩の添加、ある特定の波長の光への曝露、架橋剤の使用による等、異なる仕方でもたらすことができる。
【００５６】
アルギン酸塩が、工程c)におけるポリマーとして用いられる場合、二酸化チタン足場に二価カチオン塩溶液が置かれる。二価カチオン塩溶液(本明細書において「二価カチオン溶液」とも表示)は、Ca2+、Mg2+、Ba2+またはSr2+等、少なくとも1種の二価カチオン塩を含む水溶液である。適した二価カチオン塩の例として、CaCl2、SrCl2、SrCO3、SrPO4、CaCO3、CaPO4、MgCl2、MgCO3およびMgPO4が挙げられるがこれらに限定されない。この溶液における二価カチオン塩の濃度は、典型的に、約15〜150、20〜500mM、20〜100mM、20〜400mM、200〜400mM、250〜350mM、30〜80mM、40〜60mM、45〜55mMまたは約50mM等、約15〜500mMである。好ましくは、濃度は、約20〜100mMである。好ましくは、二価カチオン塩は、CaCl2である。二酸化チタン足場に二価カチオン溶液を置くために、二酸化チタン足場は、例えば、1〜2時間、例えば1時間等、10分間〜2時間の期間、二価カチオン溶液に浸漬することができる。この操作は、例えば、約100rpm/分のオービタルシェーカーにより、かき混ぜつつ行うことができる。あるいは、例えば、溶液を二酸化チタン足場に噴霧することによる等、二価カチオン溶液を置くための他の手段を用いてもよい。二価カチオン溶液を二酸化チタンに置いた後に、足場を必要に応じて例えば蒸留水においてすすぎ、過剰な二価カチオン溶液を除去する。それに代えてまたはそれに加えて、約200〜300×gにおける0.5〜2分間、例えば、1分間等、短期間等、二酸化チタン足場の慎重な遠心分離により、過剰な二価カチオン塩溶液を除去することができる。遠心分離工程が適用される場合、必要に応じたすすぎは、好ましくは、遠心分離後に行われる。さらに、生物学的活性物質は、好ましくは、アルギン酸塩溶液に加えられるが、二価カチオン溶液に加えることもできる(例えば、ポリマー溶液に加えられる場合と同じ濃度で)。ポリマーがキトサンまたはPEGである場合、ゲル化は、アルギン酸塩のゲル化に開示されている通りにもたらすこともできる。
【００５７】
ポリマーとしてキトサンが用いられる場合、ゲル化[工程c)]は、pH変化によりまたはイオン性相互作用による架橋によりもたらすことができる。キトサンは、エビおよびカニ殻の天然構成成分である、キチンの脱アセチル化誘導体である。これは、最大pH6.2の水に可溶性の、生体適合性のpH依存性カチオン性ポリマーである。キトサンのゲル化は、例えば、約pH8以上等、塩基性pHまでpHを上昇させることによりもたらすことができる。キトサン溶液の出発pHは、約5.5等、3〜8未満となり得る。pH8を超えるキトサン水溶液の塩基性化は、水分補給されたゲル様沈殿物の形成を導く。キトサンアミン基の中和と、その結果としての反発的鎖間静電力の排除が為され、その後、これにより広範な水素結合および鎖間の疎水性相互作用が可能になり、続いて相分離が行われる。イオン性相互作用による架橋の使用によりキトサンのゲル化がもたらされる場合、アルギン酸塩に関して開示されているものと同様の様式で、工程b)において得られる二酸化チタン足場に二価カチオン塩が置かれる。
【００５８】
工程b)におけるポリマーとしてポリ(エチレングリコール)(PEG)が用いられる場合、ゲル化は、例えば、アルギン酸塩に関して開示されているものと同様の様式で、工程b)において得られる二酸化チタン足場に二価カチオン塩溶液を置くことにより、イオン性相互作用による架橋によりもたらすことができる。より高い二価塩濃度を用いると、ゲル化がより速くなり、より高密度のゲルを作製する。ヒドロキシル基またはアミンとカルボン酸またはその誘導体との間の縮合反応は、ポリマーの合成に頻繁に適用されて、それぞれポリエステルおよびポリアミド、PEGを生じる。しかし、PEGのゲル化をもたらすための多数の他の方法を利用することができ、これは当業者に公知のものである。
【００５９】
ポロキサマーの使用等によりプルロニックハイドロゲルが調製される場合、ゲル化は、温度の増加によりもたらすことができる。この場合、ゲル化がもたらされるべき出発温度は、10℃以下となる必要がある。次に、37℃等、約35〜45℃まで温度を上昇させ、これにより、ポリマーのゲル化およびプルロニックハイドロゲルの形成が引き起こされる。
【００６０】
工程c)においてヒアルロン酸ベースのハイドロゲルが調製される必要がある場合、二酸化チタン足場は、約0.01〜10g/Lの濃度範囲のテトラ-チオール-誘導体化ポリエチレングリコール(PEG)-SH4(MW10,000)等、化学架橋剤を含む溶液に浸漬される。
【００６１】
ポリエチレンオキシド(PEO)ハイドロゲルが形成される必要がある場合、工程c)におけるゲル化は、20℃から37℃への温度の増加または50℃から37℃への温度の減少による温度依存性重合によりもたらすことができる。あるいは、工程b)において得られる二酸化チタン足場は、200〜400nmの波長の光による照射に曝露して、PEOハイドロゲルが形成される必要がある場合の工程c)におけるゲル化をもたらすことができる。工程d)は、約0.5時間から数日間の期間行うことができる。これは、一晩、例えば、0.5〜24時間、5〜10時間または丁度1時間行うことができる。典型的には、この工程は、室温で行われる。
【００６２】
本明細書に開示されているハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場を生成するための方法は、生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを備える二酸化チタン足場を提供する。したがって、本文書はまた、上述の方法により得ることができるまたは得られる、生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを含む本明細書に開示されている二酸化チタン足場を対象にする。
【００６３】
ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場を調製するために上述の方法が用いられる場合、足場の外表面の少なくとも一部は、ハイドロゲルコーティングを備える。しかし、二酸化チタン足場は、上述の方法により多孔性構造を採るため、ポリマー溶液は、足場の孔に浸透することもでき、ハイドロゲルコーティングは結果として、足場内部の孔の少なくとも一部の表面にも形成される。どの程度深くまで足場孔にハイドロゲルコーティングが形成されるかは、当然ながら、足場多孔度(より大きい多孔度は、ポリマーの浸透を容易にし、コーティングが足場内部のより深くに形成されることを可能にする)、ポリマーの濃度および/または工程c)においてゲル化をもたらすために用いられる方法、遠心分離スピード等の因子に依存する。しかし、本方法は、二酸化チタン足場の少なくとも外側の孔の表面(壁)の少なくとも一部がハイドロゲルコーティングでコーティングされることを可能にする。典型的には、ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場を走査型電子顕微鏡(SEM)により解析すると、ハイドロゲルコーティングは、足場構造の至るところに存在している。したがって、上述の方法により、ハイドロゲルコーティングは、二酸化チタン足場の外表面に形成されるだけではなく、変動的な程度で、足場内部の孔の表面にも形成される。典型的には、ハイドロゲルコーティングが置かれた孔表面の大部分は、ハイドロゲルコーティングでコーティングされる。
【００６４】
当然ながら、二酸化チタン足場の一部のみに、ポリマー溶液を置くことができる。重要なことに、ハイドロゲルコーティングが形成されるために、係るハイドロゲルコーティング形成が望まれる足場の一部は、ポリマー溶液およびゲル化をもたらすための方法の両方に付される必要がある。
【００６５】
工程b)における遠心分離は、ポリマー溶液の非常に薄い層が、二酸化チタン足場の外表面と共に孔内部に沈着されることを可能にするため、本方法により、二酸化チタン足場に薄いハイドロゲルコーティングを形成することが可能である。また、理論に制約されることは望まないが、ハイドロゲルコーティングは、用いられるポリマー溶液の低密度の結果となることができ、これは、足場の孔へのその浸透を可能にする。上述の方法は、ハイドロゲルコーティングの各ハイドロゲル層が、それがコーティングする表面に典型的に、約3μm等、少なくとも1μmの湿潤厚さを有することを可能にする。しかし、方法の工程b)およびc)を反復することにより、2層以上のハイドロゲル層からなるハイドロゲルコーティングを構成することができる。したがって、上述の方法を用いて、所望の厚さのハイドロゲルコーティングが得られるまで、2〜100、2〜10、2〜6、2〜4、3または4回等、工程b)およびc)を反復することによりハイドロゲルコーティングの厚さを制御することができる。
【００６６】
また、上述の方法は、より均一な厚さを有するハイドロゲルコーティングが形成されることを可能にする。さらに、本方法により形成されるハイドロゲルコーティングは、実質的に非多孔性である。アルギン酸塩および二価カチオン塩溶液を単純に混合することにより調製される、ある程度の多孔度を有するアルギン酸塩ハイドロゲルと比較されたい(例えば、実施例1において調製される、図1に描写されているゲルを参照)。上に開示されている方法により二酸化チタン足場に調製した際の、ハイドロゲルコーティングの多孔度の実質的な欠如の理由は、恐らく、工程b)における遠心分離後に二酸化チタン足場に形成されるポリマー溶液の薄いコーティングによるものである。
【００６７】
また、上述の方法は、工程b)およびc)を反復することにより、1層または複数のハイドロゲル層を含むハイドロゲルコーティングの形成を可能にする。必要に応じて、この操作は、異なる層に異なる生物学的活性物質および/またはポリマーの種類を有する異なるハイドロゲル層の形成を可能にする。
【００６８】
用いられているポリマーがPEG、キトサンまたはアルギン酸塩である場合、工程b)の前に工程c)を行うことも可能である。しかし、この場合、ハイドロゲルの薄いコーティングは形成されない。むしろこの場合、ハイドロゲルコーティングは、二酸化チタン足場内部の孔の大部分に充満する。これは、多数の細胞が足場孔内部に沈着することを可能にするため、幹細胞等、細胞が二酸化チタン足場に取り込まれる必要がある場合に、特に有利となり得る。工程b)の前に工程c)が行われる場合、二酸化チタン足場の孔の大部分は、工程c)およびb)を1回行った後に既にハイドロゲルコーティングで充満されていると思われるため、工程c)およびb)を反復することは過剰となり得る。
【００６９】
上述の方法を行うことにより、本明細書に開示されているハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場が生成される。したがって、本文書はまた、上述の方法を行うことにより得ることができるまたは得られる、本明細書に定義されているハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場を対象にする。
【００７０】
ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場の適用
ハイドロゲルは、空間充填剤、生物活性分子の送達媒体として、および細胞を組織化し所望の組織の形成を導く刺激を呈する三次元構造として等、組織工学における様々な適用に用いられており、本文書に開示されているハイドロゲルコーティングは、係る目的のいずれかに有利に用いることができる。本文書の二酸化チタン足場はまた、本明細書に開示されている方法によりハイドロゲルでコーティングされる前または後に、細胞播種に有利に用いることができる。
【００７１】
ハイドロゲルコーティングを含む二酸化チタン足場は、典型的に、単独で、あるいはインプラントの一部として含まれた医療用インプラントとして用いられる。本文書の他の部分から明らかな通り、用いられている二酸化チタン足場構造は、インプラントの植え込み部位および企図される機能に特異的に適応するよう、インプラント構造を目的に合わせることを可能にする。したがって、本文書はまた、医療用インプラントとして用いるための、ハイドロゲルコーティングを含む二酸化チタン足場を対象にする。ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場は、優れた生体適合性を有し、細胞の成長および足場または足場を含むインプラントの結合を刺激することのできる多孔性構造を含む。多孔性構造は、足場中への細胞の内部成長を可能にし、これにより、組織の再生を可能にする。その広い表面積も、構造への細胞の成長を容易にし、これにより、足場の結合および組織の再生を容易にする。二酸化チタン足場は、それ自体が、優れた生体適合性を有する材料でできているため、対象に植え込んだ際の足場の有害反応が低下される。
【００７２】
ハイドロゲルコーティングを含む二酸化チタン足場は、対象に植え込むことができ、細胞は、足場構造中に成長する。植え込みに先立ち、ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場に細胞を播種し、成長させることも可能である。二酸化チタン足場の相互接続されたマクロ多孔性(macroporous)構造は、組織工学、とりわけ、現在利用できる骨修復療法の興味深い代替法である骨組織工学に特に適している。この点において、二酸化チタン足場への骨髄由来細胞播種は、当業者に周知の従来の方法を用いて行われる(例えば、Maniatopoulosら、1988を参照)。ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場に細胞を播種し、適した成長条件下で培養する。培養物に、その成長の確立に適切な培地を与える。ハイドロゲルコーティングを足場に置く前に、間葉系幹細胞等、幹細胞等、細胞を二酸化チタン足場に播種することも可能である(アルギン酸塩ハイドロゲルに係る細胞播種を行うための例示的な方法に関して、実施例10を参照)。
【００７３】
骨形成および骨における薬物送達におけるプラスの効果に関連するハイドロゲルは、例えば、キトサン、PEG、プルロニック等のポロキサマー、ヒアルロン酸ベースのハイドロゲル、ポリエチレンオキシド(PEO)ハイドロゲルおよびヘパリン硫酸である。
【００７４】
様々な型の細胞を、ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場の至るところで成長させることができる。より正確には、細胞型は、造血または間葉系幹細胞を包含し、心血管、筋肉またはいずれかの結合組織を生じる細胞も包含する。細胞は、ヒトまたは他の動物起源のものとなり得る。しかし、ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場は、骨原性細胞、前駆骨細胞、先駆細胞、幹細胞、多能性細胞、複能性(multi-potent)細胞、血管(内皮)細胞、特に骨基質を生成する細胞の成長に特に適する。組織工学のため、細胞は、いかなる起源のものであってもよい。細胞は、有利には、ヒト起源のものである。ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場において細胞を成長させる方法は、in vitroステージにおいて、二酸化チタン足場の構造における広汎性分布により、播種された骨原性細胞を、例えば、二酸化チタン足場に浸透させて、骨基質を生成することができる。骨原性細胞浸透と、その結果としての骨基質生成は、機械的、超音波、電場または電子的手段により増強され得る。
【００７５】
ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場は、組織の再生のため等、細胞の成長のための枠組みとして作用する構造を必要とする際に常に有用である。ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場は、骨および軟骨構造の再生に特に有用である。係る構造の再生が必要とされ得る状況の例として、外傷、骨もしくは歯の外科的除去またはがん療法との関連が挙げられる。
【００７６】
全体的にまたは部分的に置き換えることのできる対象における構造の例として、頬骨弓を包含する頭蓋顔面骨、内耳の骨(特に、ツチ骨、アブミ骨およびキヌタ骨)、上顎骨および下顎骨歯槽堤、眼窩の壁および底、洞の壁および底、頭蓋骨ならびに頭蓋骨の欠損、例えば、股関節異形成の場合は股関節の窪み[寛骨臼窩]、上腕骨、橈骨、尺骨、大腿骨、脛骨および腓骨を包含する(これらに制限されない)長骨の複雑骨折、椎骨、手および足の骨、手指および足指の骨、摘出痕の窪み(抜歯による)の充填、歯周欠損の修復ならびにインプラント周囲(periimplant)欠損の修復が挙げられるがこれらに限定されない。加えて、ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場は、腫瘍、がん、感染、外傷、外科手術、先天性形成異常、遺伝性状態、代謝性疾患(例えば、骨粗鬆症および糖尿病)(の除去)に起因するあらゆる種類の骨欠損の充填に有用である。
【００７７】
開示されている方法により調製されるハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場または係る足場を含む医療用インプラントは、骨等、組織の再生、修復、置換および/または回復に用いることができる。したがって、本文書はまた、骨等、組織の再生、修復、置換および/または回復に用いるためのハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場またはこれを含む医療用インプラントを対象にする。
【００７８】
本文書の方法により得ることができるまたは得られる(obatined)ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場は、骨等、組織の再生、修復、置換および/または回復のための医療用インプラントの調製に用いることもできる。ハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場は、骨等、組織の再生、修復、置換および/または回復のための医療用インプラントの調製に用いることもできる。
【００７９】
本文書の方法により得ることができるもしくは得られるハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場またはこれを含む医療用インプラントは、それを必要とする対象への足場または係るハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場を含む医療用インプラントの植え込みを含む、組織の再生、修復、置換および/または回復のための方法において用いることもできる。
【００８０】
生物学的活性物質(生体分子)
前述の通り、ハイドロゲル溶液および/または二価カチオン溶液は、1種または複数の異なる種類の生物学的活性物質を含むことができる。したがって、生物学的活性物質は、ハイドロゲルコーティングに取り込まれ得る。したがって、ハイドロゲルコーティングは、生物学的活性物質の担体として作用することができ、生物学的活性物質は、ハイドロゲルコーティングを介して、アルギン酸塩コーティングされた二酸化チタン足場によって結果として送達される。ハイドロゲルコーティングは、1種類の生物学的活性物質または2種類以上の生物学的活性物質の混合物を含むことができる。前述の通り、ハイドロゲルコーティングが、本明細書の他の箇所に開示されている方法の工程b)およびc)を反復することにより調製される場合、異なる層は、異なる生物学的活性物質を含むことができる。
【００８１】
生物学的活性物質は、合成もしくは天然生物活性分子、天然もしくは合成薬物および/または生細胞等、身体において生物学的活性を有するいかなる物質であってもよい。カルシウム、クロム、フッ化物、金、ヨウ素、カリウム、マグネシウム、マンガン、セレン、イオウ、スズ、ナトリウム、亜鉛、ストロンチウム、硝酸塩、亜硝酸塩、リン酸塩、塩化物、硫酸塩、炭酸塩、カルボキシルまたは酸化物等、無機生物学的活性イオンが取り込まれてもよい。
【００８２】
生物学的活性物質は、細胞であってもよい。ハイドロゲルコーティングに取り込むための生細胞の例として、間葉系幹細胞、骨細胞、多能性細胞、骨前駆細胞、血管細胞、前駆血管細胞および/またはストロマ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８３】
生物学的活性物質の例として、天然もしくは組換え生体接着剤;天然もしくは組換え細胞結合因子;天然、組換えもしくは合成バイオポリマー;天然もしくは組換え血液タンパク質;天然もしくは組換え酵素;天然もしくは組換え細胞外マトリックスタンパク質;天然もしくは合成細胞外マトリックス生体分子;天然もしくは組換えシグナル分子、成長因子およびホルモン;天然、組換えおよび合成ペプチド、合成ペプチドホルモン;天然、組換えもしくは合成デオキシリボ核酸;天然、組換えもしくは合成リボ核酸(ribonucleotide acid);天然もしくは組換え受容体;酵素阻害剤;薬物;生物学的活性アニオンおよびカチオン;ビタミン;アデノシン一リン酸(AMP)、アデノシン二リン酸(ADP)もしくはアデノシン三リン酸(ATP);マーカー生体分子;アミノ酸;脂肪酸;ヌクレオチド(RNAおよびDNA塩基)、糖、テトラサイクリン等の抗菌物質、ならびにスタチンおよび/またはビスホスホネート等の小型の生物学的有機分子も挙げられるがこれらに限定されない。
【００８４】
ハイドロゲルコーティングへの取り込みに適したペプチドおよびタンパク質は、細胞成長および/またはインプラントの骨結合に影響を与えることが公知のペプチドおよびタンパク質を特に包含する。多数の天然ペプチドは、鉱物沈殿を誘導することが示され、したがって、ハイドロゲルコーティングに適切に取り込まれ得る。例として、コラーゲン1および2、アメロゲニン、エナメル芽、細胞骨シアロタンパク質、エナメリンならびにアンソカルシン(ansocalcin)が挙げられる。内骨格石灰化組織へのアパタイトの沈着および成長は、ポリプロリンリッチタンパク質によって導かれる過程である。ポリプロリン反復は、硬組織細胞外マトリックスタンパク質の共通の特徴であり、タンパク質マトリックスのコンパクション、立体構造可変性、アパタイト結晶長さおよびシグナル伝達事象に高頻度で関与するタンパク質ドメインへの結合に役割を果たす。例えば、エナメル基質誘導体(EMD)は、軟および硬組織(soft and hard)成長を生物模倣的に刺激するために用いられるブタ胎仔歯材料の抽出物である。EMDは、炎症および感染の阻害等、多様な他の生物学的活性を有することも立証された。EMDを含む商品は、Straumann(登録商標)Emdogain(Straumann AG社、Peter Merian-Weg 12、CH 4052 Basel、Switzerland)である。EMDは、前述の通り、ハイドロゲルマトリックスに適切に取り込まれ得るタンパク質である、大量のアメロゲニンを含有する。
【００８５】
ハイドロゲルコーティングにおける取り込みに適したペプチドのさらに別の例として、生体内石灰化(biomineralization)を誘導する、WO2008/078167に開示されているコンセンサスペプチドベースのペプチドが挙げられる。
【００８６】
実験セクションにおいて用いられるペプチドP2(配列番号1)、P5(配列番号2)およびP6(配列番号3)は、ハイドロゲルコーティングに適切に取り込まれ得る、WO2008/078167のコンセンサス配列に基づくペプチドの例である。係る配列の他の例は、P1(配列番号4:PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP)、P3(配列番号5:PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP)およびP4(配列番号6:PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP)である。
【００８７】
ハイドロゲルコーティングに必要に応じて取り込まれる生物学的活性物質の拡散速度は、ハイドロゲルコーティングの孔と比較した、生物学的活性物質の分子量およびサイズ[ストークス半径により定義]によって影響され、生物学的活性物質の化学的性質に依存する(相互作用分子-ハイドロゲル、極性化、即ち、親水性物質は非常に急速に拡散することができるが、一方、疎水性物質はハイドロゲルのゲルから徐々に拡散する)。対象におけるハイドロゲルコーティングされた二酸化チタン足場の植え込み1日目または数日後における生物学的活性物質のバースト放出プロファイルは、本文書の実験セクションにおいて用いられるペプチド等、より小型の生物学的活性物質に関して見出すことができる。ハイドロゲルコーティングの孔径を調整し(上述を参照)、生物学的活性物質(分子量、形状、極性等)の性質を考慮に入れることにより、取り込まれた生物学的活性物質の放出速度を調整することができる。
【００８８】
生物学的活性物質は、典型的に、対象における二酸化チタン足場の統合を促進する物質となり得る。
【００８９】
ハイドロゲルにおける生物学的活性物質の濃度は、典型的に、マイクログラムの範囲内であるが、50ng/ml〜50mg/ml、100ng〜50000ng/ml等、1ng〜100mg/mlにも及び得る。当然ながら、ハイドロゲルにおける生物学的活性物質の濃度は、特異的な物質、対象におけるその企図される機能等に依存する。
【００９０】
二酸化チタン足場
本文書の二酸化チタン足場は、細胞結合および内部成長のための三次元空間を作製することにより組織形成を可能にする構造支持体として機能し得る網状足場である。足場の二酸化チタンは、生体適合性であり、異なる形状へと加工して、細胞成長のための機械的支持体および枠組みをもたらすことのできる足場を提供する。よって、二酸化チタン足場は、骨の再生のため等、組織工学において用いるべき適した構造を提供する。
【００９１】
本文書の文脈における使用に適した二酸化チタン足場は、二酸化チタンで基本的に形成される足場である、即ち、二酸化チタンは、二酸化チタン足場の主要な構造構成成分である。二酸化チタン足場は、開放多孔性構造を採るべきである。
【００９２】
二酸化チタン足場は、典型的に、マクロ孔および相互接続を含むマクロ多孔性足場である。二酸化チタン足場のマクロ孔は、20〜2000μm、約30〜1500μmまたは約30〜700μm等、およそ10〜3000μmの間の範囲内の孔径を有する。二酸化チタン足場が、血管および海綿骨等、より大型の構造の内部成長を可能にする、即ち、約100μm以上の直径を有する孔も含むことが重要である。孔の少なくとも一部が、相互接続されているおよび/または部分的に相互接続されていることが重要である。
【００９３】
孔径は、二酸化チタン足場中への細胞の成長の速度および程度に、したがって、その結果得られる組織の構成に影響を与え得る。マクロ多孔系は、典型的に、二酸化チタン足場の少なくとも50%容積を占有する。二酸化チタン足場におけるマクロおよびミクロ孔の容積は、二酸化チタン足場の機能に応じて変動し得る。処置の目標が、多くの骨構造を置き換えることであり、治癒時間において二酸化チタン足場が無負荷(unloaded)を維持し得る場合、二酸化チタン足場は、マクロ多孔系が総足場容積の最大90%を占有するよう作製することができる。
【００９４】
二酸化チタン足場は、典型的に、70〜90%等、約40〜99%の総多孔度を有する。
【００９５】
二酸化チタン足場のフラクタル次元支柱は、典型的に、約2.2〜2.3等、約2.0〜3.0である。支柱の厚さは、二酸化チタン足場の強度に影響を与え、二酸化チタン足場における支柱が厚い程、二酸化チタン足場はより強くなる。
【００９６】
二酸化チタン足場は、典型的に、約0.8〜1.2μm3等、約0.001〜3.0μm3の内部支柱容積を有する。より少ない容積およびより多いフラクタル数は、より強い足場を生じる。
【００９７】
当業者であれば、二酸化チタン足場の表面が、マイクロレベルおよびナノレベルの構造を有することが理解される。このマイクロおよびナノ構造は、製造条件により修飾され得る。マイクロレベルの孔径は、典型的に、1〜10μmの範囲内である。ナノレベルの孔径は、典型的に、1μm未満である。
【００９８】
本文脈における二酸化チタン足場構造は、典型的に、20〜2000μm、30〜1500μmまたは30〜700μm等、およそ10〜3000μmの組み合わせたミクロおよびマクロ孔径を有する。孔径は、40μmを超え、少なくとも20μmの相互接続孔を有することもできる。
【００９９】
二酸化チタン足場のサイズおよび形状は、その企図される用途に応じて判定される。二酸化チタン足場サイズおよび形状は、生産段階において、あるいは用意された足場のより後期の修飾により調整することができる。したがって、二酸化チタン足場は、特異的な対象におけるその特異的な用途のために、容易に目的に合わせることができる。典型的には、二酸化チタン足場のサイズ、形状等は、ハイドロゲルコーティングでコーティングされる前に調整される。
【０１００】
典型的には、二酸化チタン足場は、二酸化チタンスラリーにポリマースポンジ構造を浸し(例えば、WO08078164に開示されている方法を参照)、スポンジにおいてスラリーを凝固させ、1回または複数の焼結工程を行ってスポンジを除去し、強い足場構造を作製する方法により生成することができる。したがって、二酸化チタン足場は、例えば、WO08078164に開示されている二酸化チタン足場となり得る。係る方法は、
a)二酸化チタンのスラリーを調製する工程と、
b)工程a)のスラリーを、スポンジ構造等、多孔性ポリマー構造等、可燃性多孔性構造に置く工程と、
c)可燃性多孔性構造においてスラリーを凝固させる工程と、
d)凝固した二酸化チタンスラリーから可燃性多孔性構造を除去する工程であって、
i)凝固した金属酸化物スラリーを有する可燃性多孔性構造を約500℃までゆっくりと焼結し、この温度を少なくとも30分間保持し、
ii)約3K/分で約最小1500℃または約1750℃まで急速に焼結し、この温度を少なくとも10時間保持し
iii)少なくとも3K/分で室温まで急速に冷却すること
により行うことのできる工程と、
を包含することができる。
【０１０１】
次の実施例において本発明をさらに説明するが、実施例は、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。
実験セクション
【実施例１】
【０１０２】
生物学的活性物質ありまたはなしのアルギン酸塩ハイドロゲルの調製
【０１０３】
【表１】
2015529527.tif 000003
【０１０４】
1.材料と方法
1.1.ペプチドおよびエナメル基質誘導体の調製
エナメル基質誘導体(EMD)は、Straumann GmbH社(Basel、Switzerland)により快く供給された。リン酸緩衝食塩水(PBS)(PAA Laboratories GmbH社、Pasching、Austria)に溶解した0.1%酢酸に、10mg/mlとなるようEMDを溶解した。以前の研究(Rubert Mら、2011)に詳細に記載されている通り、3種の合成ペプチド[Table 1(表1)]を設計した。
【０１０５】
Eurogentec社(Seraing、Belgium)からペプチドを購入した。PBSに溶解した0.1%酢酸に、5または10mg/ml(ペプチド2、FITC標識の場合)となるよう合成ペプチドを溶解した。反復的な凍結融解サイクルを回避するためのアリコートを調製し、使用まで-20℃で貯蔵した。
【０１０６】
1.2.アルギン酸塩ハイドロゲルの調製
単量体の最小60%がグルロン酸塩の低粘性アルギン酸塩である、アルギン酸ナトリウム[Pronova UP LVG(登録商標)]をNovaMatrix(FMC BioPolymer AS社、Norway)から購入した。さらに精製することなくアルギン酸ナトリウムを用いた。PBSにおいて2パーセント(w/v)アルギン酸ナトリウムを調製し、180rpmで室温にて一晩撹拌して、均質なアルギン酸塩ハイドロゲルを得た。最終濃度50μg/mlの合成ペプチドまたはEMDとアルギン酸塩溶液を混合した。続いて、合成ペプチド/EMDを含有するアルギン酸塩の溶液を24ウェル培養プレートに分配し、エアブラシ(aerograph)塗料アトマイザ(Precisso(登録商標)、Madrid、Spain)を用いて300mM CaCl2を噴霧した。室温における1〜2時間のインキュベーション後に、アルギン酸塩ハイドロゲルは完全にゲル化した。
【０１０７】
1.3.走査型電子顕微鏡によるアルギン酸塩ハイドロゲル形態の特徴づけ
走査型電子顕微鏡(SEM、Hitachi S-3400N、Hitachi High-Technologies Europe GmbH社、Krefeld、Germany)を用いて、対照2%アルギン酸塩ハイドロゲルおよび合成ペプチド2(50μg/ml)を含有する2%アルギン酸塩ハイドロゲルの形態を観察した。アルギン酸塩ハイドロゲル(非凍結乾燥および凍結乾燥)の微細構造を観察した。アルギン酸塩ハイドロゲル凍結乾燥のため、-80℃で試料を凍結し、続いて-35℃で凍結乾燥した。続いて、N2中で試料を凍結して、鋭利なメスを用いて正確な(accurated)切断により断面を得た。10kVおよび40Paを用いて×25および×100の倍率でアルギン酸塩ハイドロゲルの構造を観察した。×25倍率の画像のために環境二次電子検出器(ESED)を用い、×100倍率の画像のために後方散乱電子検出器(BSED)を用いた。SEM、Hitachi S-3400Nのソフトウェアを用いて各孔の直径を測定した。
【０１０８】
1.4.ペプチド放出プロファイル
ペプチド放出プロファイルを試験するために、P2をFITCで標識した。蛍光分光測定により、2%アルギン酸塩ハイドロゲルに含有されたペプチド(50μg/ml)の放出を定量化した。先ず、アルギン酸塩ハイドロゲルを培養培地で洗浄して、過剰なCaCl2を除去した。続いて、750μlの細胞培養培地を、ペプチドがロードされたアルギン酸塩ハイドロゲルに加えた。試料を37℃、5%CO2で21日間インキュベートし、細胞培養培地を週2回交換した。既定の(prefixed)時点(24時間目、4日目、7日目、11日目、14日目、18日目および21日目)において、上清を収集し、蛍光分光測定(λex 490nmおよびλem 525nm)により解析して、培地に放出されたペプチドの量を決定した。洗浄工程において放出されたペプチドの量も測定した。実験を3回行い、各試料を三連で解析した。
【０１０９】
各時点の線形検量線を用いて、相対蛍光単位を放出されたペプチドの量と相関させた。
【０１１０】
1.5.MC3T3-E1の細胞培養
マウス骨芽細胞の細胞株MC3T3-E1(DSMZ、Braunschweig、Germany)を以前に記載された通りに維持した(Tiainen Hら、2011)。播種する前に、架橋されたアルギン酸塩ハイドロゲルを含有する24ウェル培養プレートを750μlの培養培地で洗浄して、過剰なCaCl2を除去した。異なる細胞密度を用いて2%アルギン酸塩ゲルにおける細胞接着の効率を評価した後に、最終実験のために、100000細胞/ウェルの密度で細胞を播種した。培地を週2回新しく換えた。播種24時間後に培養培地を収集して、細胞生存率を試験した。14および21日目に細胞を収集して、リアルタイムRT-PCRを用いて接着および骨原性関連マーカーの遺伝子発現を解析した。光学顕微鏡(Leica DMIRB、Leica Microsystems Wetzlar GmbH社、Germany)を用いて培養物をルーチンに観察した。
【０１１１】
1.6.  2%アルギン酸塩ゲルへの細胞接着
実験に最良の播種密度を決定するために、播種1および5日後に、アルギン酸塩ハイドロゲルへの細胞の接着を評価した。30×104〜200×104細胞/ウェルの密度を検査した。凍結融解方法により、アルギン酸塩ハイドロゲルに接着した細胞を脱イオン蒸留水に溶解させた。ヘキスト33 258蛍光アッセイを用いたDNA含量の決定のために細胞ライセートを用いた。TNEバッファーにおける20μg/mlのヘキスト33 258蛍光染色(Sigma社、St. Quentin Fallavier、France)と試料を混合し、多機能マイクロプレートリーダー(Cary Eclipse蛍光分光光度計、Agilent Technologies社、Santa Clara、USA)を用いて356/465nmの励起および発光波長で蛍光の強度を測定した。線形検量線を用いて細胞数と相対蛍光単位を相関させた。
【０１１２】
共焦点顕微鏡(Leica TCS SPE Microsystems Wetzlar GmbH社、Wetlzar、Germany)により、培養1および5日後にアルギン酸塩ハイドロゲルに接着したMC3T3-E1細胞を可視化した。簡潔に説明すると、アルギン酸塩ハイドロゲルに播種された細胞を、PBSにおける4%ホルムアルデヒドにより4℃で10分間固定した。染色のため、0.2%tritonにおいて細胞を透過処理し、PBSにおける3%BSAにより材料自己蛍光をブロッキングした。5μg/ml FITCファロイジン(Sigma社、St. Quentin Fallavier、France)を用いて細胞の細胞骨格を染色し、DAPI(Sigma社、Schnelldorf、Germany)により核を染色した。さらに、PBSにおける4%ホルムアルデヒドにより4℃で10分間細胞固定し、続いて10kV、×200および40PaにおけるSEMおよびESEDを用いて可視化した後に、2%アルギン酸塩ハイドロゲルに最初に播種された100×103細胞の細胞接着および結合を観察した。
【０１１３】
1.7.細胞生存率
24時間後に培養培地において決定されたLDH活性は、膜漏出または細胞溶解の指標とした。サイトゾル酵素の活性を、以前に記載された通りに推定した(Rupert Mら、2011)。
【０１１４】
【表２】
2015529527.tif 000004
【０１１５】
1.8.全RNA単離と、リアルタイムRT-PCRによる骨芽細胞マーカーの遺伝子発現
前骨芽細胞のMC3T3-E1細胞における14および21日間の処理後に、遺伝子発現における、アルギン酸塩ハイドロゲルにロードされた合成ペプチドおよびEMDの効果を試験した。
【０１１６】
メーカーのプロトコールに従って、Tripure(登録商標)(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)を用いて全RNAを単離した。Nanodrop分光光度計(NanoDrop Technologies社、Wilmington、DE、USA)を用いて、260nmにおける全RNAを定量化した。
【０１１７】
サプライヤーのプロトコールに従って大容量RNA-to-cDNAキット(Applied Biosystems社、Foster City、CA)を用いて、同量のRNA(350ng)を逆転写してcDNAを作製した。PCR反応を行うまで、各cDNAのアリコートを凍結した(-20℃)。
【０１１８】
SYBR green検出を用いてLightcycler 480(登録商標)(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)においてリアルタイムPCRを行った。2種の参照遺伝子(18S rRNAおよびグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH))および10種の標的遺伝子[インテグリンアルファ8(Itga8)、インテグリンベータ1(Itgb1)、インテグリンベータ3(Itgb3)、フィブロネクチン1(Fn1)、骨形成タンパク質2(Bmp2)、コラーゲンI型(Coll-I)、骨シアロタンパク質(Bsp)、アルカリホスファターゼ(Alp)、オステオカルシン(Oc)およびオステオポンチン(Opn)]に対してリアルタイムPCRを行った。
【０１１９】
プライマー配列をTable 2(表2)に詳述する。反応条件および相対的定量化を、以前に記載された通りに行った(Tiainen Hら、2011)。
【０１２０】
1.9. 統計解析
全データは、平均値±SEMとして提示されている。その正規分布に応じてマンホイットニーの検定またはスチューデントt検定により群間の差を評価した。異なる変数間の相関を測定するために、ピアソン相関解析を用いた。Windows(登録商標)用SPSSプログラム(Chicago、IL)バージョン17.0を用いた。結果は、p値≦0.05において統計的に有意であると考慮された。
【０１２１】
結果
アルギン酸塩微細構造
図1は、凍結乾燥した2%アルギン酸塩ハイドロゲル[図1A)および図1B)]および合成ペプチドを含有する2%アルギン酸塩ハイドロゲル[図1C)および図1D)]由来の断面の微細構造を示す。SEM画像から分かる通り、合成ペプチドを含有するアルギン酸塩ハイドロゲルは、2%アルギン酸塩ハイドロゲルよりも不規則な構造を示したが、解析した全ゲルにおいて、多孔性および相互接続された構造が観察された。両方の架橋されたハイドロゲルは、それぞれ合成ペプチドありまたはなしの2%アルギン酸塩ハイドロゲルに関して、42.9±3.5μmおよび44.7±4.1μmの孔径を有する多孔性および相互接続された構造を提示した。
【０１２２】
2%アルギン酸塩ハイドロゲルからのペプチド送達
2%アルギン酸塩ハイドロゲルからのペプチド放出プロファイルは、図2に描写されている。インキュベーションの最初の24時間におけるペプチドのバースト放出が観察された(54.67%)。さらに、累積放出プロファイルから分かる通り、25.8%のペプチドが11日目までに徐々に放出され、続いて21日目まで経時的に持続放出された。実験の終わりに(21日後に)、アルギン酸塩ハイドロゲルに理論的に含有される総ペプチドの5.6%が、放出されていなかった。ロードされたペプチドの12.7%が、過剰なCaCl2を除去するための培養培地によるアルギン酸塩ハイドロゲルの洗浄工程において放出されたことに留意されたい。
【０１２３】
細胞接着および増殖
播種された細胞の半分超が、プレーティング1日後にゲルに接着しなかったため、アルギン酸塩ハイドロゲルにおける低い細胞接着率が観察された。にもかかわらず、細胞は、アルギン酸塩ハイドロゲルに結合し、細胞培養にわたって増殖した(図3)。さらに、アルギン酸塩ハイドロゲル表面に結合し広がる骨芽細胞の能力を検証するために、共焦点顕微鏡により細胞を可視化した。共焦点画像は、播種される細胞数が多くなるにつれて、アクチン染色の増加を伴う核の数の増加を示し、1日目から5日目にかけて増加する[図3A)〜図3H)]。さらに、アルギン酸塩ハイドロゲルにおいて培養された骨芽細胞の細胞糸状仮足が、SEMにより認められた。
【０１２４】
細胞生存率における、合成ペプチドをロードしたアルギン酸塩ハイドロゲルの効果
24時間後(図4)または長期間後(データ図示せず)のいずれにおいても、合成ペプチドを含有するアルギン酸塩ハイドロゲルにおいて培養された細胞における毒性効果は見出されなかった。P2は、EMDと比較して24時間後に細胞生存率を有意に増加させたが、P5は、EMDおよび未処理アルギン酸塩ゲルと比較して、有意により低い毒性効果を示した。
【０１２５】
細胞接着マーカーの遺伝子発現における、合成ペプチドをロードしたアルギン酸塩ハイドロゲルの効果
培養21日後の対照と比較して、P5で処理した細胞においてItga8の発現が増加した(図5A)。Itgb1 mRNAレベルは、対照と比較して14日間のP2およびP6による処理後に有意に減少した。21日後に、P6で処理した細胞は、EMDと比較してItgb1 mRNAレベルを有意に低下させた(図5B)。Itgb3およびFn1は、対照と比較して14日間のP2およびP6処理後に有意に減少し(図5Cおよび図5D)、21日後に差は観察されなかった。
【０１２６】
骨芽細胞マーカーの遺伝子発現における、合成ペプチドをロードしたアルギン酸塩ハイドロゲルの効果
Bmp2相対mRNAレベルは、EMDと比較して、14日間のP6処理後に有意に増加したが、21日間のP2処理後に減少した。EMD処理は、対照と比較して14日間の細胞培養後にBmp2 mRNAレベルにおける有意な減少を誘導した一方、21日後にBmp2 mRNAレベルにおける増加が見出されたが、この差は、統計的有意性に達しなかった(図6A)。
【０１２７】
Coll-I遺伝子発現は、対照と比較して、合成ペプチドのいずれかによる14日間の処理後に有意に減少した[図6B)]。Bsp mRNAレベルの差は、異なる処理間に見出されなかった(図6C)。ALP mRNAレベルは、対照と比較して、14日間および21日間のP6による処理ならびにP2による21日間の処理後に有意に減少した[図6D)]。EMDで処理した細胞と比較して、14日間の細胞培養後に、合成ペプチドを含有する2%アルギン酸塩ゲルにおいて培養した細胞におけるOc mRNAレベルの増加が検出された。21日後に、P5またはP6で処理した細胞は、対照と比較してOc mRNAレベルを増加させた[図6(E)]。Opnの発現は、対照と比較して、P2およびP6による14日間の培養後に有意に減少した。21日後に、Opn mRNAレベルは、対照と比較して、合成ペプチドのいずれかおよびEMDにより有意に増加した。EMD処理は、P2およびP6処理と比較して、OpnのmRNA発現レベルを顕著に増加させた[図6F)]。
【０１２８】
考察
ポリプロリンリッチ合成ペプチドは、以前に、in vitroで骨形成および石灰化を誘導し、in vivoにおける骨再吸収を減少させることを示した。本研究の目標は、単独で、または骨格インプラントの生分解性コーティングとして、骨形成および石灰化を促進するこれらの合成ペプチドによる局所的処置のための、ハイドロゲルを有する適した製剤を開発することであった。
【０１２９】
本研究において、細胞を異なる合成ペプチドを含有するアルギン酸塩ゲルに曝露し、長期間培養して、骨芽細胞の生物学的応答における係るペプチドの効果を評価した。ハイドロゲルの最適な製剤は、制御された局所的かつ特異的な生物活性分子送達のためのコンパクトな構造の形成を可能にする必要がある。係る特色は、各特異的適用の物理的性質(例えば、力学、分解、ゲル形成)、物質移行性質(例えば、拡散)および生物学的相互作用要件(例えば、細胞接着およびシグナル伝達)により管理される。
【０１３０】
異なるポリマー濃度(1%、2%、3%、6%および10%)のアルギン酸塩ゲル(Protanal LF200M、FMC polymer社、Oslo、Norway)を用いて行われた以前の研究は、ポリマー濃度が増加するにつれて孔径が減少し、ペプチド媒体として作用する最も有望な製剤として2%の濃度が得られることを示した。これを考慮すると、2%アルギン酸塩ハイドロゲルは、300mMのCaCl2によりイオン的に架橋され、最適な材料として選択された。
【０１３１】
凍結乾燥過程後の合成ペプチドありおよびなしのアルギン酸塩ゲル両方の微細構造のSEM解析は、42〜44μmの孔径を有する多孔性および相互接続された構造を開示した;にもかかわらず、直径およそ1μmの孔径を有するコンパクトな構造が、非凍結乾燥ゲルのSEM解析後に観察された(データ図示せず)。タンパク質の拡散速度は、これらの孔と比較した拡散種の分子量およびサイズにより影響され(ストークス半径により定義)、タンパク質の化学的性質に依存する(相互作用分子-アルギン酸塩、極性化、即ち、親水性薬物は、ゲル孔を通して非常に急速に拡散することができるが、疎水性薬物は、徐々に拡散する)。本研究において用いられる合成ペプチドが、25アミノ酸長を有する小型のペプチドであるという(2509.17〜2782.34Daの範囲の分子量)事実により、ゲルを通した容易な拡散速度が予想される。したがって、本研究において、2%アルギン酸塩ハイドロゲルにロードされたペプチドは、インキュベーションの最初の24時間におけるバースト放出と、続く21日間の期間における進行性および持続放出を提示した。
【０１３２】
アルギン酸塩は、細胞結合のための不十分なタンパク質相互作用による不活性基質として記載されており、哺乳類細胞は、無修飾アルギン酸塩ハイドロゲルと相互作用することができないことが示唆されたため、細胞接着および増殖に関するアルギン酸塩ゲルの効率も試験した。実際に、高度に特異的な接着表面を得るために、大部分の研究は、ECMタンパク質全体または細胞受容体に結合することができるペプチド配列のポリマーに共有結合によりカップリングするアルギン酸塩ハイドロゲルを用いる。実際に、一部の研究は、RGD含有ペプチドによるアルギン酸塩の修飾が、細胞の接着および延展を促進し、一方、最小の細胞接着は、無修飾アルギン酸塩ハイドロゲルにおいて観察されたことを報告した。しかし、本研究は、無修飾アルギン酸塩ハイドロゲル[Pronova UP LVG(登録商標)]が、細胞結合および延展を可能にすることを示す。報告された研究の間の差は、用いられているアルギン酸塩ゲルの組成および純度の間の記載されている関係性、ならびにその表面において増殖する細胞の能力によるものと思われる。本研究において、用いられているアルギン酸塩は、最小で60%G画分を含有し、したがって、細胞結合および延展を可能にした。in vitro研究のための最適播種密度をDNA定量化により評価した。結果は、100×103細胞/ウェルが、細胞接着および細胞増殖の両方においてより高い効率を有する密度であり、したがって、さらなる研究のために選ばれたことを示した。アルギン酸塩ハイドロゲルは、MC3T3-E1細胞に対し無毒性であることを示し、組織培養プラスチックにおいて培養した細胞と比較して、細胞生存率にある種の保護効果を表示した。さらに、短および長時間細胞処理後に以前の研究において得られる結果に一致して、ハイドロゲル製剤として投与された合成ペプチドが非細胞毒性であることが検証された。
【０１３３】
安定的な骨芽細胞の細胞接着は、インテグリンにより大部分は媒介され、このインテグリンは、特異的な組み合わせで二量体形成するαおよびβサブユニットで構成され、細胞外マトリックスタンパク質と相互作用するヘテロ二量体受容体である。骨芽細胞が、成長のための材料に応じて異なるインテグリン受容体を発現することが示された。細胞接着におけるその役割に加えて、インテグリンは、細胞骨格組織化を調節し、シグナル伝達を媒介し、したがって、増殖、分化およびマトリックスリモデリングを制御する遺伝子の発現を調節する。
【０１３４】
合成ペプチドが、アルギン酸塩ハイドロゲルにおけるインテグリン発現および細胞接着に影響を与え得るか調べるために、Itga8、Itgb1、Itgb3および細胞外マトリックスタンパク質Fn1のmRNA発現レベルを試験した。Itgb1、Itgb3およびFn1の発現は、合成ペプチド、特に、P2およびP6による14日間の処理後に有意に減少した。β1インテグリンサブユニットは、ECMへの骨芽細胞の接着を媒介するコラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンの骨受容体に存在し、一方、ανβ3インテグリンは、Opnおよびビトロネクチンへの接着を媒介する。ανβ3インテグリンの発現が、骨芽細胞における細胞増殖を刺激し、マトリックス石灰化を阻害するという;また、FN(β1およびβ3インテグリンサブユニットを包含する多数のインテグリンに結合する豊富なECMタンパク質)も同様に、骨形成初期において高度に発現されるが、細胞成熟化において、マトリックスにおけるその蓄積が低下するという知見が興味深い。さらに、合成ペプチドによる処理は、21日間の処理後にItga8発現を有意に増加させ、細胞をP5で処理した場合、顕著に増加させた。Itga8は、細胞接着および増殖に関与し、石灰化が開始された後にその発現が増加する、骨芽細胞により分泌されるタンパク質であるオステオポンチン(Opn)と相互作用することが示された。そこで、Itga8およびOpn mRNA発現レベルの両側性相関解析は、0.678(p<0.01)のピアソン相関を示した。このような結果は、合成ペプチドで処理した細胞が、対照群と比較して細胞成熟化のより後期に存在し、解析した骨芽細胞マーカーの発現結果と一致することを示し得る。ペプチドのC末端領域におけるPPXPPの短い配列が、転写因子および/またはコアクチベーターのトランス活性化活性に関与することが記載された。合成ペプチドの作用機序は、細胞内シグナル伝達カスケードに影響を与え得る受容体との相互作用に関与することができ、保存されたプロリンリッチ領域(PPLPP)を含有するそのC末端の提示は、合成ペプチドのシグナル伝達活性において重要となり得る。合成ペプチドは、豊富なプロリンの含量により予想される通り、二次構造エレメントを欠くコンパクトな十分に充填された構造のサインを示し、相互作用に適した仕方でそのPPLP
Pストレッチを露出する。ペプチド2およびペプチド6は、2個の別個のループを提示するが、ペプチド5は、CおよびN末端間の接触を可能にするループの異なるトポロジーを有する。したがって、異なるペプチド間におけるC末端の到達性およびこの短いコンセンサス配列(PPXPP)の構造的な硬直性におけるこれらの構造的な差が、受容体との相互作用に影響し得るという事実は、接着遺伝子の差次的発現を説明することができる。
【０１３５】
一方では、石灰化において役割を有する、最も特異的で最も遅く発現する骨芽細胞マーカーであるオステオカルシンが、未処理およびEMDアルギン酸塩ゲルと比較して、製剤化された合成ペプチドによる14および21日間の処理後に有意に誘導された、即ち、培養培地において投与された際に得られる結果に一致したことが判明した。したがって、石灰化が開始された後により高レベルで発現される、様々な分化ステージで産生されるシアロタンパク質であるOpnは、対照と比較して、EMDおよび合成ペプチドの両方による21日間の処理後に有意に上方調節された。他方では、試験した時点において、骨形成に関連する遺伝子(Coll-I、Bmp-2、BspおよびAlp)の発現における差は観察されなかったが、その理由として、これらの遺伝子は、主として増殖およびマトリックス成熟化期において、骨芽細胞分化においてオステオカルシンよりも初期ステージで調節されることが挙げられる。興味深いことに、合成ペプチドにより行われたあらゆる研究は現在のところ、in vitroおよびin vivoの両方でオステオカルシンmRNAレベルの増加を反復して示した。このマーカーの関連性は、近年のin vivo研究(Monjo Mら、2012)において実証され、それによると、全予測マーカーのうちTiインプラントの骨結合の最良の予測マーカーは、オステオカルシンであった。合成ペプチドが、細胞結合のためのアルギン酸塩ハイドロゲル性質を改善すること、また、合成ペプチドにより製剤化されたハイドロゲルにおいて培養された細胞が、対照ハイドロゲルおよびEMDにより製剤化されたハイドロゲルにおいて培養された細胞よりも、成熟した分化過程ステージであったことが示唆される。
【０１３６】
合成ペプチドの作用機序が、細胞分化の初期状態において細胞内シグナル伝達カスケードに影響して、骨芽細胞分化を最終的に刺激することのできる受容体との相互作用に関与し得ること、また、この短いコンセンサス配列(PPXPP)の到達性および構造的な硬直性が、合成ペプチドのシグナル伝達活性において重要となり得ることを仮定できる。さらに、本結果から、ペプチドが、細胞表面に発現されたインテグリンに結合することができ、これにより、先ず第1にアルギン酸塩ハイドロゲル表面における骨芽細胞結合を増加させることができ、第2に、成熟した骨芽細胞表現型に関連する遺伝子の発現をモジュレートすることができると仮定される。
【０１３７】
結論
結論として、結果は、2%のアルギン酸塩ハイドロゲルが、合成ポリプロリンリッチペプチドの局所的送達に適した製剤であり、MC3T3-E1細胞におけるインテグリンアルファ8、オステオポンチンおよびオステオカルシン発現を誘導することを実証する。これらのペプチド修飾アルギン酸塩ハイドロゲルは、骨組織工学適用のための生物学的活性物質を有する新世代の注射可能担体を表すことができ、二酸化チタン足場等、骨格インプラントのための生分解性コーティングとしての使用に有望である。
【実施例２】
【０１３８】
アルギン酸塩コーティングされた二酸化チタン足場の調製
材料と方法
2.1.合成ペプチド2(P2)の調製
合成プロリンリッチペプチド2(P2)(2HN-PLVPSQPLVPSQPLVPSQPQPPLPP-COOH)(配列番号1)をEurogentec社(Seraing、Belgium)から購入した。7.2mgの選択された合成ペプチドを含有する1本のバイアルは、フリーズドライされたペレット形態で発送されており、これをリン酸緩衝食塩水(PBS)(PAA Laboratories GmbH社、Pasching、Austria)に溶解した0.1%酢酸に、10mg/mlとなるよう溶解した。
【０１３９】
反復的な凍結融解サイクルを回避するためのアリコートを調製し、使用まで-20℃で貯蔵した。
【０１４０】
2.2.ペプチド2を含有する2%アルギン酸塩の調製
アルギン酸ナトリウム[Pronova UP LVG(登録商標)](最小60%の単量体がグルロン酸塩である低粘性アルギン酸塩)をNovaMatrix(FMC BioPolymer AS社、Norway)から購入した。
【０１４１】
さらに精製することなくアルギン酸ナトリウムを用いた。3時間室温で撹拌することにより、アルギン酸ナトリウムの含量(2%、w/v)を蒸留水に溶解して、均質なアルギン酸塩溶液を得た。固定された濃度(50μg/ml)のP2を溶液に加え、1時間撹拌した。
【０１４２】
2.3.P2を含有する2%アルギン酸塩でコーティングされたTiO2足場の製作
(Tiainen Hら、2010)により以前に記載された通りに、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および8mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。続いて、P2ありまたはなしの1層の2%アルギン酸塩ゲルによりTiO2足場をコーティングした。簡潔に説明すると、オービタルシェーカー(IKA Vibrax VXR basic、Staufen、Germany)において1時間室温にて100rpmでかき混ぜつつ、P2ありまたはなしの2%アルギン酸塩溶液にTiO2足場を浸した。次に、252×gで1分間足場を遠心分離した。試料を50mM CaCl2に1時間浸漬して、ゲル化させた。次に、足場をdH2Oですすいで、過剰なCaCl2を除去した。最終的に、試料を一晩室温で乾燥させた。1層の2%アルギン酸塩ゲルでコーティングされた足場(対照アルギン酸塩足場)を対照群として用い、一方、コーティングされていないTiO2足場(アルギン酸塩なし、SC)も対照群として用いた。
【０１４３】
2.4.  2%アルギン酸塩ゲルでコーティングされたTiO2足場からのペプチド2放出プロファイル
ペプチド2を含有する2%アルギン酸塩でコーティングされたTiO2足場(P2-アルギン酸塩コーティングされた足場)を、1ml蒸留水(pH7.4)を含有する48ウェルプレート(Nunc GmBh & Co. Kg社、Langenselbold、Germany)内に置いた。細胞培養条件を模倣するために、200rpmのオービタルシェーカー[IKA(登録商標)Schuttler MTS 2、Germany]において6時間37℃、湿度条件(蒸留水容器を用いる)で試料をかき混ぜた。次に、37℃、加湿雰囲気下で最大21日間試料を維持した。既定の時点において(2日目、5日目、7日目、9日目、12日目、14日目、16日目、19日目および21日目)、蒸留水を収集し、新鮮蒸留水を各ウェルに加えた。206nmの波長におけるUV-Vis分光光度計[PerkinElmer(登録商標)Lambda 25 UV/Vis Systems、USA]により試料吸光度を解析して、放出されたペプチドの量を決定した。並行して、1層の2%アルギン酸塩ゲルでコーティングされたTiO2足場を対照として用いて、アルギン酸塩からの分解産物から得られた吸光度値を減算した。
【０１４４】
各時点の線形検量線を用いて、相対吸光度単位を放出ペプチドの量と相関させ、次に、放出された累積P2を計算した。実験を三連で行った。
【０１４５】
2.5.コーティングされたおよびコーティングされていないTiO2足場におけるMC3T3-E1の細胞培養
コーティングされていない、およびペプチドありまたはなしの[P2および対照(-)]2%アルギン酸塩でコーティングされたTiO2足場(SC)を、無菌条件における48ウェルプレート(Nunc GmbH & CO. KG社、Langenselbold、Germany)内に置いた。200,000細胞/足場の密度で細胞を播種し、10%FBS(PAA Laboratories社、Pasching、Austria)ならびに100Uペニシリン/mlおよび100μgストレプトマイシン/ml抗生物質(PAA Laboratories社、Pasching、Austria)を補充したα-MEM(PAA Laboratories社、Pasching、Austria)において維持した。足場内部の均質な細胞分布を保証するため、かき混ぜ播種方法を用いた(Takahashi Yら、2003)。簡潔に説明すると、1mlの細胞懸濁液を足場に添加した後に、オービタルシェーカー(Unitron、Infors HT社、Basel、Switzerland)において6時間180rpmで37℃、湿度条件においてプレートをかき混ぜた。続いて、37℃で5%CO2の加湿雰囲気下において最大21日間細胞を維持した。培養培地(1ml)を1日おきに新しく換えた。
【０１４６】
48時間の処理後に培養培地を収集して、細胞毒性(LDH活性)を検査した。
【０１４７】
この3D系の中で細胞増殖する能力を評価するために、ヘキスト染色を用いたDNA定量化により7日後の細胞の数も試験した。並行して、培養7および21日後にSEMにより足場の中のMC3T3-E1の細胞結合も可視化した。
【０１４８】
リアルタイムRT-PCRにより細胞培養7および21日後の骨芽細胞成熟化および分化に関連するマーカーの発現を評価した。
【０１４９】
2.6.  2%アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場のSEM可視化
走査型電子顕微鏡(SEM、Hitachi S-3400N、Hitachi High-Technologies Europe GmbH社、Krefeld、Germany)を用いて、アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場の形態を観察した。培養7および21日後に、SEMをさらに用いて、TiO2足場構造中の細胞接着を可視化した。簡潔に説明すると、細胞をPBSで2回洗浄し、PBSにおける4%のグルタルアルデヒドで2時間固定した。続いて、固定用溶液を除去し、細胞を蒸留水で2回洗浄した。30分間の間隔で、50%、70%、90%および100%エタノール溶液の添加により細胞を脱水した。エタノールを除去し、細胞を室温に放置して、残ったエタノールを蒸発させた。後方散乱および二次電子検出器を用いて10kVおよび40Paで足場を観察した。提示された画像は、代表的な区域に由来する。
【０１５０】
2.7.細胞生存率
48時間後の培養培地において決定された乳酸脱水素酵素(LDH)活性を細胞生存の指標とした。メーカーのキット説明書(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)に従って、サイトゾル酵素の活性を決定した。
【０１５１】
結果は、コーティングされていない足場において培養した細胞の培地におけるLDH活性(100%に設定)と比べて提示した。
【０１５２】
2.8.細胞数決定
3D足場において成長する細胞を、脱イオン蒸留(destilled)水において凍結融解方法により溶解した。細胞ライセートを、ヘキスト33258蛍光アッセイを用いたDNA含量の決定に用いた。TNEバッファーにおける20μg/mlのヘキスト33258蛍光染色剤(Sigma社、St. Quentin Fallavier、France)と試料を混合し、多機能マイクロプレートリーダー(Cary Eclipse蛍光分光光度計、Agilent Technologies社、Santa Clara、United States)を用いて、356/465nmの励起および発光波長において蛍光の強度を測定した。線形検量線を用いて相対蛍光単位を細胞数と相関させた。
【０１５３】
2.9.RNA単離およびリアルタイムRT-PCR解析
Tripure(登録商標)(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)を用いて、メーカーのプロトコールに従って全RNAを単離した。Nanodrop分光光度計(NanoDrop Technologies社、Wilmington、DE、USA)を用いて、260nmにおける全RNAを定量化した。大容量RNA-to-cDNAキット(Applied Biosystems社、Foster City、CA)を用いて、サプライヤーのプロトコールに従って、同量の全RNA(850ng)を42℃で60分間逆転写してcDNAを作製した。PCR反応を行うまで、各cDNAのアリコートを凍結した(-20℃)。
【０１５４】
Lightcycler 480(登録商標)(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)においてSYBR green検出を用いて、リアルタイムPCRを行った。2種の参照遺伝子[18S rRNAおよびグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(Gapdh)]および12種の標的遺伝子[インテグリンアルファ8(Itga8)、インテグリンベータ1(Itgb1)、インテグリンベータ3(Itgb3)、フィブロネクチン1(Fn1)、オステリクス(Osx)、骨形成タンパク質2(Bmp2)、コラーゲン-I(Coll-I)、インターロイキン-6(Il-6)、骨シアロタンパク質(Bsp)、アルカリホスファターゼ(Alp)、オステオカルシン(Oc)およびオステオポンチン(Opn)]に対してリアルタイムPCRを行った。
【０１５５】
プライマー配列をtable 3(表3)に詳述する。
【０１５６】
【表３】
2015529527.tif 000005
【０１５７】
各反応物は、最終容積10μlにおいて、7μlのLightcycler-FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I(Fast Start Taqポリメラーゼ、反応バッファー、dNTPミックス、SYBRGreen I色素およびMgCl2を含有)、それぞれ0.5μMのセンスおよびアンチセンス特異的プライマーならびに3μlのcDNA希釈物を含有した。増幅プログラムは、鋳型cDNAの変性のためのプレインキュベーション工程(10分間95℃)、続いて変性工程(10秒間95℃)、アニーリング工程(5秒間68℃のOsxおよび8秒間65℃のAlpを除き、8〜10秒間60℃)および伸長工程(10秒間72℃)からなる45サイクルからなった。
【０１５８】
各サイクルの後に、72℃で蛍光を測定した(λex 470nm、λem 530nm)。各アッセイにおいてcDNA鋳型なしの陰性対照を実施した。
【０１５９】
系列希釈を用いてLightCycler 480ソフトウェアにおいて得られた勾配からリアルタイム効率を計算し、調べた全転写物の高いリアルタイムPCR効率速度および異なる濃度を用いた際の高い線形性を示した。PCR産物を、LightCyclerにおける融解曲線解析に付し、その後2%アガロース/TAEゲル電気泳動を行って、それぞれ増幅特異性、Tmおよびアンプリコンサイズを確認した。
【０１６０】
LightCycler 480解析ソフトウェアバージョン1.5(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)によって提供される先進的相対定量化方法を用いて、各試料における標的遺伝子の濃度を同じ試料における2種の参照遺伝子の濃度の平均で割ることにより、PCR後の相対定量化を計算した。
【０１６１】
2.10.統計
全データを平均値±SEMとして提示する。コルモゴロフ・スミルノフ検定を行って、正規性検定のためのパラメトリックまたはノンパラメトリック分布を仮定し、その正規分布に応じてマンホイットニーの検定またはスチューデントt検定により群間の差を評価した。Windows(登録商標)用SPSSプログラム(Chicago、IL、US)バージョン17.0を用いた。結果は、p値≦0.05において統計的に有意であると考慮した。
【０１６２】
結果
ペプチド放出
P2-アルギン酸塩コーティングされた足場からのペプチド放出プロファイルは、図7に描写されている。インキュベーションの最初の2日間におけるペプチドのバースト放出が観察された(21日後に放出されたP2の累積量の42.8%)。5日後に、放出されたペプチドの量は、(21日目までに放出された累積量の)9.4%に減少し、続いてより遅い、但し持続したペプチド放出が、インキュベーション21日目まで経時的に行われた。さらに、累積放出は、インキュベーション21日後に、2%アルギン酸塩ゲルに捕捉されたP2が依然として存在したことを示唆する。
【０１６３】
LDH活性
図8に示す通り、試験した実験群のいずれに対しても毒性効果は観察されなかった。検査した全群において、同様のパーセンテージの細胞生存率が決定され、対照アルギン酸塩足場(-)およびP2-アルギン酸塩コーティングされた足場(P2)のいずれも、細胞培養48時間後に細胞にいかなる毒性効果も示さなかったことを示す。
【０１６４】
2%アルギン酸塩ゲルでコーティングされたTiO2足場のSEM可視化
アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場をSEMにより観察した。図9Aおよび図9Bに示す通り、TiO2足場の一部の孔は、アルギン酸塩によるコーティング過程の後に遮断されたが、細胞播種および標準細胞培養条件(37℃および加湿雰囲気)における7日間のインキュベーション後に、ほぼ全ての孔は遮断解除された(図9Cおよび図9D)。よって、コーティング過程の直後には遮断されたままであった孔において、遮断アルギン酸塩ゲルのある程度の分解が観察された。
【０１６５】
コーティングされていないTiO2足場(SC)において成長する細胞の量(図10Aおよび図10B)は、アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場(図10C〜図10F)よりも高かったが、細胞は、P2ありまたはなしの2%アルギン酸塩ゲルでコーティングされた足場中に浸透し、接着することができた。
【０１６６】
足場において成長する細胞の数の7日目〜21日目の増加が、全実験群に観察された。
【０１６７】
細胞数
培養7日後に、DNA定量化を用いて、TiO2足場において成長する細胞の数を決定した(図11)。SEM画像によると、培養7日後に、細胞の数は、アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場のいずれかにおいて、TiO2足場(SC)と比較して有意により低かった。よって、SCと比較して、それぞれP2なしおよびありのアルギン酸塩コーティングされた足場において、細胞数の61%および49%低下が見出された。データは、統計的有意性に達しなかったが、P2でコーティングされた足場は、アルギン酸塩対照足場(-)よりも32%多い細胞を示した。
【０１６８】
細胞接着関連マーカーの遺伝子発現
図12に示す通り、Itb1の相対mRNAレベルは、培養7日後に、TiO2足場(SC)と比較して、アルギン酸塩コーティングされた足場(P2ありまたはなしのいずれか)において成長する細胞において有意に減少した。にもかかわらず、細胞培養21日後に、群間に差は観察されなかった。21日後に、TiO2足場(SC)と比較して、アルギン酸塩コーティングされた足場(P2ありまたはなしのいずれか)において成長する細胞において、Itgb3 mRNAレベルが増加した。コーティングされていない足場と比較して、より高いmRNAレベルのFn1が、21日後の2%アルギン酸塩コーティングされた足場において成長する細胞と、P2-アルギン酸塩コーティングされた足場において成長する細胞において見出されたが、最後の群に関して、データは、統計的有意性に達しなかった。Itga8 mRNAは、培養21日後に、対照アルギン酸塩足場と比較して、P2-アルギン酸塩コーティングされた足場において成長する細胞において有意に増加した。
【０１６９】
数種類の骨芽細胞分化マーカーの遺伝子発現
図13は、数種類の骨芽細胞分化マーカー遺伝子の相対mRNAレベルを示す。培養21日後に、オステリクスmRNAレベルは、コーティングされていない足場と比較して、アルギン酸塩コーティングされた足場(P2ありまたはなしのいずれか)において成長する細胞において増加した。Bmp-2およびIl-6 mRNAレベルは、細胞培養21日後に、コーティングされていない足場およびアルギン酸塩コーティングされた足場の両方と比較して、P2-アルギン酸塩コーティングされた足場において培養した細胞において有意に増加した。細胞増殖に関連するマーカーであるColl-I mRNAレベルは、細胞培養7日後に、アルギン酸塩コーティングされた足場と比較して、P2-アルギン酸塩コーティングされた足場において培養した細胞において有意に増加した。培養21日後に、Coll-Iは、コーティングされていない足場と比較して、アルギン酸塩コーティングされた足場およびP2-アルギン酸塩コーティングされた足場の両方において有意に増加した。試験した時点のいずれにおいても、実験群間でOpn、Bsp、AlpおよびOc mRNA発現レベルにおける有意な差は観察されなかった。
【０１７０】
考察
本実験において、骨形成および石灰化を促進するための荷重負荷骨組織適用における使用のための、生物学的活性物質ありおよびなしのアルギン酸塩コーティングでコーティングされた二酸化チタン足場の適合性を実証した。TiO2足場は、圧縮強度において最大2.6MPaの強度を有することが報告され(Tiainen Hら、2010)、ブタin vivo試験において優れた機械的抵抗を示した。
【０１７１】
骨組織工学において、足場の構造は、骨形成に最適な微小環境を提供しなければならない。表面の足場多孔度、孔ネットワーク相互接続性、表面積対容積比および物理化学的性質は、細胞遊走および分化、骨内部成長、血管新生ならびに細胞および環境の間の質量移動を決定する。かき混ぜ細胞播種方法を用いた高度に多孔性のTiO2足場の使用は、マウス前骨芽細胞の優れた結合および分布を達成することを立証した。本研究において、1層の2%アルギン酸塩でコーティングされたTiO2足場は、三次元細胞成長のための足場としてのその使用に適した微細構造を表示した。
【０１７２】
いくつかの孔は、コーティング過程の直後に遮断されたままであったが、ほぼ全ての孔は、アルギン酸塩の生分解性性質により、37℃におけるインキュベーション7日後には遮断されておらず、よって、細胞が構造中に浸透および遊走するための開口窓(opening window)をもたらした。細胞生存率における差は、コーティングされたおよびコーティングされていないTiO2足場の間に観察されなかった。アルギン酸塩ハイドロゲル単独と同じパターンに従って、インキュベーションの最初の数時間におけるP2のバースト放出が見出され、続いて、21日間の期間において進行性かつ持続性の放出が見出された。
【０１７３】
TiO2足場は、骨芽細胞が接着、遊走および増殖するために適切な表面をもたらした。アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場中の細胞の量は、コーティングされていないTiO2足場よりも低かったが、アルギン酸塩でコーティングされた足場は、細胞進行および分化を支持した。これらの結果は、アルギン酸塩が、細胞結合のための不活性基質であること、また、プロリン配列が豊富な合成ペプチドが、アルギン酸塩ハイドロゲルの細胞結合のための性質を増加させることを報告する以前の研究に一致した。よって、有意ではなかったが、合成ペプチド2を含有する2%アルギン酸塩でコーティングされたTiO2足場は、アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場と比較して、7日後に細胞結合を改善する(+32%)傾向を示した。
【０１７４】
生体材料組成物が、骨芽細胞成熟化および石灰化における長期効果により、細胞結合および細胞骨格組織化を調節することが報告された。異なる群におけるSEMおよびDNA定量化により観察される細胞結合における効率に従って、Itgb1 mRNAレベルは、コーティングされていない足場において成長する細胞と比較して、アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場において成長する細胞において減少した。さらに、Itgb3およびFn1 mRNAレベル(骨形成初期において高度に発現され、細胞成熟化過程を通じて低下する)は、培養21日後に、コーティングされていない足場と比較して、アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場中に成長する細胞において有意に増加した。さらに、オステオポンチンへの結合により石灰化ステージにおいて役割を果たすインテグリンであるItga8の発現が、アルギン酸塩コーティングされた足場と比較して、P2-アルギン酸塩コーティングされた足場により誘導され、P2が石灰化過程に影響を与え得ることを示唆した。インテグリンは、材料表面への細胞の結合に関与するだけではなく、骨形成および石灰化を誘導するシグナル伝達経路も媒介する。興味深いことに、骨芽細胞分化の初期に関連し、正常には短期で上方調節されてその後に下方調節されるItgb3、Fn1、Coll-IおよびOsx等の遺伝子の発現は、コーティングされていない足場において成長する細胞と比較して、アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場中に成長した細胞において、試験したより後期の時点(21日間)において増加した。アルギン酸塩コーティングされた表面において成長する細胞が、コーティングされていないTiO2足場と比較して、増殖を上回る細胞分化の改善を示すことができる(恐らくアルギン酸塩における細胞接着の初期の困難により)ように、コーティングされていない足場またはアルギン酸塩コーティングされた足場においてMC3T3-E1細胞が成長する場合、骨芽細胞分化に関連する初期マーカーの時系列が変動することが可能である。アルギン酸塩コーティングは、足場における細胞接着および増殖を損なうように思えるが、石灰化に適格性の成熟および組織化されたマトリックス(ECM)の獲得が、群のいずれかの7日目〜21日目におけるAlpおよびBsp mRNAレベルの著しい増加により確認され
た。ECMの合成、組織化および成熟化が終了したら、Oc発現が上方調節されて、石灰化をもたらす。結果は、培養21日後にOc mRNAレベルの微増を示し、したがって、細胞が、ちょうど石灰化過程の初期であったと結論づけることができる。さらに、OpnおよびBspの遺伝子発現レベルによる本出願人らの結果に従うと、コーティングされていないTiO2足場に播種されたMC3T3-E1細胞により以前に報告された通り、骨芽細胞におけるBsp/Opn mRNA関連の増加は、ECM石灰化の刺激を示し得る。
【０１７５】
DNA含量により測定される細胞の量と、Bmp2、Coll-IおよびIl-6のより高い発現レベルにより認めることができる通り、アルギン酸塩へのP2の添加は、アルギン酸塩コーティングされた足場と比較して、細胞増殖および分化のための性質を改善した。現在のところ、ポリプロリン配列が豊富な合成ペプチドは、チタンインプラントがペプチドでコーティングされたin vitroおよびin vivo試験の両方において、さらには、局所的送達のための担体としてのその使用のためにアルギン酸塩ハイドロゲル中にロードされる場合、オステオカルシンmRNAレベルの増加を反復して示した。よって、総合すると、この結果は、P2-アルギン酸塩コーティングされた足場が、in vivo環境におけるより高度な細胞分化および石灰化を促進することを示唆することができる。
【０１７６】
結論
結論として、結果は、アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場が、骨芽細胞分化を誘導するプロリン配列が豊富な合成ペプチド等、生物学的活性物質の送達のためのマトリックスとして作用し得ることを実証する。骨形成および石灰化における、合成プロリンリッチペプチド等の生物学的活性物質の骨原性効果とTiO2足場の物理的および骨伝導性質との組み合わせは、荷重負荷適用における骨組織再生のための新たな戦略を表すことができる。
【実施例３】
【０１７７】
P2を含有するキトサンゲルでコーティングされたTiO2足場の製作
(Tiainen Hら、2010)により以前に記載された通り、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および8mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。次に、P2(配列番号1)ありまたはなしのpH5.5の1層の2%キトサンで足場をコーティングした。キトサンは、エビおよびカニ殻の天然構成成分である、キチンの脱アセチル化誘導体である。これは、最大pH6.2の水に可溶性の、生体適合性のpH依存性カチオン性ポリマーである。簡潔に説明すると、1時間室温でオービタルシェーカー(IKA Vibrax VXR basic、Staufen、Germany)において100rpmでかき混ぜつつ、P2ありまたはなしの溶液にTiO2足場を浸した。次に、252×gで1分間足場を遠心分離した。pH8.0を有する水溶液に試料を浸漬して、ゲル化させた。このpHを上回るキトサン水溶液の塩基性化は、水分補給されたゲル様沈殿物の形成をもたらす。キトサンアミン基の中和と、その結果としての反発的鎖間静電力の排除が為され、その後、これにより広範な水素結合および鎖間の疎水性相互作用が可能になり、続いて相分離が行われる。次に、足場をdH2Oですすいで、過剰な物質を除去した。最終的に、試料を一晩室温で乾燥させた。
【実施例４】
【０１７８】
P2を含有するプルロニックゲルでコーティングされたTiO2足場の製作
(Tiainen Hら、2010)により以前に記載された通り、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および8mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。次に、P2(配列番号1)ありまたはなしの1層の20%ポロキサマー407[Pluronic(登録商標)F127]で足場をコーティングした。1時間10℃でオービタルシェーカー(IKA Vibrax VXR basic、Staufen、Germany)において100rpmでかき混ぜつつ、P2(配列番号1)ありまたはなしの溶液にTiO2足場を浸した。次に、252×gで1分間、10℃にて足場を遠心分離した。次に、試料を37℃に置いて、ゲル化させた。
【実施例５】
【０１７９】
P2を含有するポリ(アクリル酸)(PAA)ゲルでコーティングしたTiO2足場の製作
(Tiainen Hら、2010)により以前に記載された通り、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および8mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。次に、P2(配列番号1)ありまたはなしの1層の3%高分子量ポリ(アクリル酸)(PAA)で足場をコーティングした。PAAは、生体接着ポリマーである。1時間4℃でオービタルシェーカー(IKA Vibrax VXR basic、Staufen、Germany)において100rpmでかき混ぜつつ、P2(配列番号1)ありまたはなしのPAA溶液にTiO2足場を浸した。次に、252×gで1分間、4℃にて足場を遠心分離した。次に、試料を37℃に置いて、ゲル化させた。
【実施例６】
【０１８０】
P2を含有するメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)ハイドロゲルでコーティングされたTiO2足場の製作
(Tiainen Hら、2010)により以前に記載された通り、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および8mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。次に、P2(配列番号1)ありまたはなしの1層の8%メチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)ならびに1wt% NaClで足場をコーティングした。次に、1時間10℃でオービタルシェーカー(IKA Vibrax VXR basic、Staufen、Germany)において100rpmでかき混ぜつつ、P2(配列番号1)ありまたはなしの溶液にTiO2足場を浸した。次に、252×gで1分間、10℃にて足場を遠心分離した。次に、試料を37℃に置いて、ゲル化させた。
【実施例７】
【０１８１】
P2を含有するポリ(アクリル酸)(PAA)-g-ポロキサマーゲルでコーティングされたTiO2足場の製作
(Tiainen Hら、2010)により以前に記載された通り、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および8mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。次に、P2(配列番号1)ありまたはなしの1層の2.5%PAA-g-ポロキサマーグラフトコポリマーで足場をコーティングした。1時間3℃、pH7.4でオービタルシェーカー(IKA Vibrax VXR basic、Staufen、Germany)において100rpmでかき混ぜつつ、P2(配列番号1)ありまたはなしの溶液にTiO2足場を浸した。次に、252×gで1分間、3℃にて足場を遠心分離した。試料を37℃に置いて、ゲル化させた。
【実施例８】
【０１８２】
P2を含有するPEOおよびP(EO-co-PO)ゲルでコーティングしたTiO2足場の製作
(Tiainen Hら、2010)により以前に記載された通り、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および8mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。次に、光開始剤4-ベンゾイルベンジル)トリメチル塩化アンモニウム(BBTMAC)を含有するPEO(5ml、5%w/v)またはP(EO-co-PO)の1層の水溶液で足場をコーティングした[P2(配列番号1)ありまたはなしでTiO2足場に5%のポリマー質量を注いだ]。次に、0.5時間室温でオービタルシェーカー(IKA Vibrax VXR basic、Staufen、Germany)において100rpmでかき混ぜつつ、P2(配列番号1)ありまたはなしの溶液にTiO2足場を浸した。次に、252×gで1分間、室温にて足場を遠心分離した。次に、Dimax光硬化システム、モデル5000 Floodにおいて試料を2分間UV照射して、200〜400nmにおいてゲル化させた。
【実施例９】
【０１８３】
シンバスタチンの局所的送達のためのアルギン酸塩コーティングされた二酸化チタン足場の調製
1.概要
シンバスタチン(SIM)(即ち、生物学的活性物質)含有アルギン酸塩溶液に、高度に多孔性の二酸化チタン(TiO2)足場を浸した。走査型電子顕微鏡および過ヨウ素酸シッフ染色により可視化された足場の微細構造は、TiO2足場支柱の表面を覆う、均一に分布したアルギン酸塩層を明らかにした。進行性かつ持続したSIM放出が最大19日間観察された。SIMなしの足場と比較して、SIMを有する足場による骨芽細胞における細胞毒性効果は観察されなかった。リアルタイムRT-PCRを用いて、骨芽細胞マーカー(コラーゲンI型アルファ1、アルカリホスファターゼ、オステオプロテジェリン、オステオカルシンおよび血管内皮成長因子A)の発現を定量化した。マルチプレックスイムノアッセイ(Luminex)により、オステオプロテジェリン、血管内皮成長因子Aおよびオステオカルシンの分泌を解析した。10μM SIMを有する足場において培養した細胞によるオステオカルシンの相対発現および分泌は、SIMなしの足場と比較して、21日後に有意に増加した。加えて、10nMおよび10μM SIMの両方を有する足場において培養した細胞からの血管内皮成長因子Aの分泌は、SIMなしの足場と比較して、21日目に有意に増強された。結論として、この結果は、SIMコーティングされたTiO2足場が、SIMの持続放出を支持し、骨芽細胞分化を誘導することができることを示す。SIMの骨原性効果とTiO2足場の物理的性質との組み合わせは、即時の荷重負荷が望まれるまたは利用できない欠損における骨再生のための新たな戦略を表すことができる。したがって、本実施例は、例えば骨芽細胞成長にプラスの効果をもたらすために、本文書のアルギン酸塩コーティングされた二酸化チタン足場を用いて、生物学的活性物質を送達することができることを実証する例示的な実施形態である。
【０１８４】
2.材料と方法
2.1.SIMを含有するアルギン酸塩ハイドロゲルでコーティングされたTiO2足場の製作
以前に記載された通りに(Tiainen Hら、2010)、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および8mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。要するに、ポリマー発泡体をTiO2スラリーに含浸し、乾燥させ、その後1500℃で40時間焼結した。第2の層のTiO2スラリーを足場に加え、先述と同じ温度で再焼結した。マイクロ断層撮影法(micro-computed tomography)(1172 micro-CTイメージングシステム、Skyscan、Kontich、Belgium)により決定した足場の総表面積は、20.295cm2であった。生成された足場を、121℃で20分間オートクレーブすることにより滅菌した。SIM(Krebs Biochemicals & Industries社、Andhra Pradesh、India)を100%エタノールに溶解し、その後、所望の濃度でミリQ(milliQ)水における2%(w/v)Pronova UP LVGアルギン酸ナトリウム(FMC BioPolymer社、Sandvika、Norway)に加えて、SIM含有アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場を作製した。使用前に、0.22μm孔径シリンジフィルター(TPP Techno Plastic Products AG社、Trasadingen、Switzerland)により、SIMありまたはなしのアルギン酸塩溶液を滅菌した。
【０１８５】
1時間室温でオービタルシェーカーにおいて100rpmでかき混ぜつつ、SIMありまたはなしのアルギン酸塩溶液にTiO2足場を浸し、続いて300×gで1分間遠心分離して、過剰なアルギン酸塩溶液を除去した。その後、1時間オービタルシェーカーにおいて100rpmでかき混ぜつつ、SIMありまたはなしの50mM CaCl2に足場を浸漬した。アルギン酸塩コーティングされた足場を最終的にミリQ水ですすいで、過剰なCaCl2を除去し、一晩風乾した。SIMなしの2%アルギン酸塩ハイドロゲルでコーティングした足場は、対照群として用いた。
【０１８６】
2.2.SIMを含有するアルギン酸塩ハイドロゲルでコーティングされたTiO2足場の特徴づけ
アルギン酸塩コーティングされた足場を金スパッタリングし(Cressington sputter coater 108 auto、Cressington Scientific Instruments社、Watford、England)、15kV加速電圧における後方散乱二次イオンによる走査型電子顕微鏡(SEM)(TM-1000、Hitachi High-Technologies社、Tokyo、Japan)により、その微細構造を可視化した。過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色により、アルギン酸塩コーティングをさらに評価した。簡潔に述べると、足場をミリQ水で洗浄し、1%過ヨウ素酸溶液(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO、USA)において5分間酸化させた。次に、足場をミリQ水ですすぎ、シッフ試薬(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO、USA)に15分間置いた。最終的に、足場を微温の水道水に5分間浸漬し、その後撮像した(NikonデジタルカメラD700、Sendai Nikon Corporation社、Miyagi、Japan)。
【０１８７】
2.3.アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場からのSIM放出の定量化
アルギン酸塩コーティングされた足場およびSIM(2.4mM、0.6mM)含有アルギン酸塩コーティングされた足場を、加湿雰囲気下にて最大19日間、1mlミリQ水において37℃で維持して、SIMの放出プロファイルを決定した。既定の時点(0.25日目、2日目、4日目、6日目、8日目、10日目、13日目、15日目、17日目、19日目)において、ミリQ水を交換し、UV-Vis分光光度計(PerkinElmer Lambda 25 UV/Vis System、PerkinElmer社、Waltham、MA、USA)を用いて、放出されたSIMの量を定量化した。238nmの波長における試料吸光度を解析し、時点毎に線形検量線を用いて、放出されたSIMの量と相対吸光度単位を相関させた。SIMなしのアルギン酸塩でコーティングされた足場からの吸光度値を対照として用いて、アルギン酸塩分解産物から得られるバックグラウンド値を減算した。実験を三連で行った。
【０１８８】
2.4.初代ヒト骨芽細胞の細胞培養および播種
3名のドナー、うち2名は大腿骨(16歳および10歳の男性)、1名は脛骨(41歳の男性)由来の初代ヒト骨芽細胞(Cambrex Bio Science社、Walkersville、MD、USA)を、75cm2培養フラスコ中で37℃、5%CO2の加湿雰囲気下において、10%ウシ胎仔血清、0.1%ゲンタマイシン硫酸塩およびアンホテリシン-B抗生物質および0.1%アスコルビン酸(Lonza Walkersville、MD、USA)を補充した骨芽細胞培養培地において培養した。継代7〜9由来の細胞を400,000細胞/mlの密度で足場に播種した。足場の至るところにおける均質な細胞分布を確実にするために、かき混ぜ播種方法を用いた(Takahshiら、2003)。培養培地に浸漬した足場を48ウェル培養プレートに置いた。1mlの細胞懸濁液を足場に加えた後に、200rpmで6時間、37℃にてオービタルシェーカーにおいてプレートをかき混ぜた。細胞を播種した足場を新たな培養プレートの1ml培養培地に移し、37℃、5%CO2の加湿雰囲気下で最大21日間維持した。培養培地を1日おきに交換した。細胞毒性、アルカリホスファターゼ(ALP)活性およびタンパク質発現アッセイにおける使用のために、収集した培地を保存した。リアルタイムRT-PCRおよび免疫細胞化学における使用のため、培養7、14および21日後に足場を収集した。
【０１８９】
2.5.細胞毒性アッセイ
培養培地におけるサイトゾル(cytostolic)酵素乳酸脱水素酵素(LDH)の活性に基づき、SIM含有足場の細胞毒性を推定した。メーカーの細胞毒性検出キット説明書(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)に従って、14日目まで1日おきに収集した培地におけるLDH活性を決定した。50μlの試料をキット反応混合物と共に30分間暗所で室温にてインキュベートした。プレートリーダー(Biochrom Asys Expert 96マイクロプレートリーダー、Biochrom社、Holliston、MA、USA)において492nmの試料の吸光度を測定した。
【０１９０】
2.6.ALP活性アッセイ
P-ニトロフェニルリン酸塩(pNPP)基質(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA)を黄色の最終産物、p-ニトロフェノールへと加水分解するALPの能力を用いて、培養2、8、14および21日後に、培養培地におけるALP活性を定量化した。各試料から25μlの培地を採取し、96ウェルプレートにおいて30分間暗所で室温にて100μlのpNPP溶液と共にインキュベートし、その後50μlの3M NaOHを各ウェルに加えて、反応を停止した。プレートリーダー(Biochrom Asys Expert 96マイクロプレートリーダー、Biochrom社、Holliston、MA、USA)において405nmの吸光度を測定し、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ(Promega社、Madison、WI、USA)に基づく検量線を用いてALP活性を定量化した。
【０１９１】
2.7.イムノアッセイ:分泌タンパク質の定量化
メーカーの説明書に従って修飾PES 3K遠心分離フィルター(VWR、Radnor、PA、USA)を用いて、収集した培養培地のアリコートを8倍に上昇濃縮(up-concentrated)した。xMAP技術を用いたLuminex 100/200システム(Luminex社、Austin、TX、USA)において、濃縮細胞培養培地におけるタンパク質レベルの複数分析物(multianalyte)プロファイリングを行った。xPONENT 3.1ソフトウェア(Luminex社、Austin、TX、USA)により、取得した蛍光データを解析した。ヒト骨パネルおよびヒトサイトカイン/ケモカインキット(Millipore社、Billerica、MA、USA)を用いて、培養2、8、14および21日後に、培養培地におけるオステオプロテジェリン(TNFRSF11B)、オステオカルシン(BGLAP)および血管内皮成長因子A(VEGFA)の量を測定した。メーカーのプロトコールに従って、全解析を行った。
【０１９２】
2.8.RNA単離およびリアルタイムRT-PCR解析
メーカーのプロトコールに僅かな修飾を加えて、Qiagen RNA miniキット(Qiagen社、Hilden、Germany)を用いて、細胞播種した足場から全RNAを単離した。簡潔に説明すると、溶解バッファーに1時間4℃で足場を浸漬し、続いて300rpmのオービタルシェーカーにおいて10分間室温でかき混ぜた。その後、足場を廃棄し、ライセートバッファーを2Wで30秒間超音波処理した(Sonics Vibracell VC130PB、CT、USA)。残る手順は、メーカーに提供されるプロトコールに従った。
【０１９３】
オリゴdTプライマーを用いて、RevertAid First Strand cDNA合成キット(Fermentas社、St. Leon- Rot、Germany)によりcDNAを合成した。SsoAdvanced(商標)SYBR(登録商標)Green Supermixを用いて、CFX 384(商標)リアルタイムシステム(Bio-Rad, Hercules、California、USA)においてリアルタイムPCRを行った。3工程増幅(40サイクル:5秒間95℃、60秒間60℃、30秒間72℃)を実行した。増幅対照および鋳型対照は用いなかった。グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)、コラーゲンI型アルファ1(COL1A1)、アルカリホスファターゼ(ALPL)、オステオプロテジェリン(TNFRSF11B)、オステオカルシン(BGLAP)および血管内皮成長因子A(VEGFA)に対し、リアルタイムRT-PCRを行った。プライマー配列をTable 4(表4)に収載する。効率補正したΔΔCT方法(Pfafflら、2001)を用いて、リアルタイムRT-PCRデータを解析した。
【０１９４】
【表４】
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【０１９５】
2.9.免疫細胞化学および共焦点レーザー走査型顕微鏡
培養21日後に、メスの使用により足場を半分に切り、4%パラホルムアルデヒド(PFA)/4.6%D-マンニトールにおいて15分間固定し、その後、さらに加工するまで1%PFA/4.6%D-マンニトールにおいて貯蔵した。ミリQ水(pH7.4)に溶解した0.05%シトラコン酸無水物において15分間95℃に加熱することにより、固定した足場を熱誘導性エピトープ回復に付し、0.2%Triton Xを有するリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解した1.25%ウシ血清アルブミン(BSA)において1μg/mlとなるよう希釈したモノクローナルマウス抗ヒトコラーゲンI型抗体(I-8H5、MP Biomedicals、Santa Ana、CA、USA)と共に1時間室温でインキュベートし、続いて2mg/ml濃度となるよう2.5%BSA/0.05%Tween-20/PBSにおいて希釈したCy3コンジュゲートロバ抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch社、West Grove、PA、USA)において30分間室温でインキュベーションした。細胞を播種しホールマウント染色した足場を、DAPIを用いて対比染色し、カバーガラス上に置き、Dako蛍光マウント用培地(Dako社、Glostrup、Denmark)で覆った。FluoView 1000共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)(Olympus社、Center Valley、PA、USA)において共焦点レーザー走査型顕微鏡法を行った。反射モードでCLSMを用いて足場表面を可視化した。ImageJ(NIH、Bethesda、MD、USA)を用いて画像を解析した。
【０１９６】
2.10.統計
細胞毒性、ALP活性、遺伝子発現およびタンパク質分泌解析により得たデータは、正規性検定[シャピロ・ウイルク(Shapiro-Wilk)]に合格し、パラメトリック一元配置ANOVA(SigmaPlot 12.3、Systat Software、San Jose、CA、USA)に従ったホルム・シダック(Holm-Sidak)検定を用いて群間で比較した。≦0.05の確率を有意と考慮した。
【０１９７】
3.結果
3.1.  2%アルギン酸塩ハイドロゲルでコーティングされたTiO2足場の特徴づけ
アルギン酸塩コーティングされた足場のSEM解析は、浸漬遠心分離技法が、TiO2足場支柱の表面をコーティングするアルギン酸塩の均一な分布をもたらしたことを明らかにした(図14;A〜C)。TiO2足場の頂部(図15A)および中央部(図15B)のPAS染色により可視化される通り、アルギン酸塩の分布には僅かな変動しか観察されなかった。
【０１９８】
3.2.シンバスタチン放出
2.4mMおよび0.6mM SIMを有する足場のSIM放出を調べた。両方の濃度に対し、SIMの緩慢な持続放出を検出した。しかし、2.4mM SIMを有する足場は、0.6mM SIMを有する足場に観察された15日間放出と比較して、より長期の17日間放出期間をもたらした(図16)。累積放出は、19日間のインキュベーションの後であっても、SIMがアルギン酸塩に捕捉されたままであったことを示唆した。この時点の後の濃度が検出限界を下回ったため、連続的な放出を検出することはできなかった。
【０１９９】
3.3.LDH活性
広範な濃度(2.4mM、0.6mM、24μM、10μM、1μM、0.1μMおよび10nM)に関して、アルギン酸塩コーティングされた足場からのSIMの細胞毒性効果を検査した。細胞を足場に播種した場合、SIMは、より高い濃度(10μMを超える)において骨芽細胞に対し高度に細胞毒性であることが判明した(データ図示せず)。より低濃度のSIM(10μMおよび10nM)に関して14日間の細胞毒性試験を行って、持続した期間SIMに曝露した際の骨芽細胞生存率における効果を調べた。より高いLDH活性は概して、14日間の期間を通じて、10nM SIMを有する足場と比較して、10μM SIMを有する足場由来の培地において検出された。SIM濃度のどちらも、SIMなしのアルギン酸塩コーティングされた足場の効果と比較して、LDH活性の有意な増加を引き起こさなかった。LDH活性プロファイルにある程度の変動が見られ、SIMに対する細胞応答におけるドナー依存性の差を示した(図17;A〜C)。
【０２００】
3.4.骨芽細胞分化におけるSIM含有アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場の効果
SIM含有足場における骨芽細胞の培養は、SIMなしの足場と比較して、10nMまたは10μM SIMを有する足場のいずれかに関して、測定した時点のいずれかの培養培地におけるALP活性を有意に変化させなかった(図18;A〜C)。
【０２０１】
SIMなしの足場と比較して、10nMまたは10μM SIMを有する足場のいずれかに由来するいずれかの時点の培養培地のTNFRSF11B含量において、有意な差は観察されなかった(図19A)。しかし、10nMおよび10μM SIMを有する足場両方において培養した細胞由来の培養培地におけるVEGFAの含量は、21日目にSIMなしの足場と比較して有意に増加した(図19B)。10μM SIMを有する足場における細胞由来のBGLAPの分泌は、SIMなしの足場と比較して有意に増強され、一方、培養21日後に、SIMなしの足場と比較して、10nM SIMを有する足場において培養した細胞に有意な差は観察されなかった(図19C)。
【０２０２】
培養21日後に、10μM SIMを有する足場において培養した細胞におけるBGLAPの相対発現は、SIMなしの足場と比較して有意に増加し、GAPDHに対し正規化した。試験した時点のいずれかにおける実験群間に、ALPL、COL1A1、TNFRSF11BまたはVEGFA mRNAレベルの発現における有意な差は観察されなかった(図20)。I型コラーゲンの沈着におけるSIMの効果を評価するために、染色した足場におけるCLSM可視化を行った。全足場における細胞の大部分において、細胞内にI型コラーゲンが検出された。しかし、濃度にかかわらず、SIMを有する足場における細胞外コラーゲン原線維は殆どなかった(図21;A〜B)が、SIMなしの足場において、I型コラーゲン原線維の豊富なネットワークが観察された(図21;C)。
【０２０３】
5.結論
結論として、試験は、アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場が、骨芽細胞分化を誘導するSIM送達のためのマトリックスとして作用し得ることを示す。10μm SIMを含有するアルギン酸塩でコーティングされた足場は、低い細胞毒性を有し、足場において培養した骨芽細胞からのVEGFAおよびBGLAPの分泌が有意に増加した。SIMの局所的骨原性効果およびTiO2足場の物理的性質の組み合わせは、荷重負荷骨における骨組織再生のための新たな戦略を表すことができる。
【実施例１０】
【０２０４】
Emdogain(EMD)の局所的送達のためおよびヒト脂肪由来間葉系幹細胞の支持のためのアルギン酸塩コーティングされた二酸化チタン足場の調製
1.材料と方法
1.1.二酸化チタン足場の製作
以前に記載された通りに(Tiainenら、2010)、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および4mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。要するに、TiO2スラリーにポリマー発泡体を含浸させ、乾燥させ、その後1500℃で40時間焼結した。生成された足場を121℃で20分間オートクレーブすることにより滅菌した。
【０２０５】
1.2.ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の単離、特徴づけおよび細胞培養
皮下(subcutanous)脂肪組織からhAD-MSCを単離した。その間葉系性質を確認するため、その表面抗原発現ならびに環境刺激に応答して骨原性、軟骨形成および脂肪生成系列へと選択的に分化する能力に関して細胞を特徴づけた。次のマーカータンパク質を評価した:
CD14(-)、CD19(-)、CD34(+)、CD45(-)、CD44(+)、CD73(+)、CD90(+)、CD105(+)、HLA-DR(-)およびIgG(-)。runt関連転写因子2(RUNX2)、コラーゲンI型アルファ1(COL1A1)、アルカリホスファターゼ(ALPL)活性/mRNA発現およびアリザリンレッド染色による組織学的評価により、細胞の骨原性分化表現型を評価した。SRY(性決定領域Y)-ボックス9(SOX9)、コラーゲンII型アルファ1(COL2A1)およびアグリカン(ACAN)mRNA発現を評価することにより、軟骨形成分化を解析した。ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマ(PPARG)mRNA発現およびオイルレッド染色による組織学的可視化により、脂肪生成分化を決定した。
【０２０６】
1.3.初代ヒト骨芽細胞の細胞培養
それぞれ1名は脛骨、2名は大腿骨由来の3名の男性ドナー由来のhOST(Cambrex Bio Science社、Walkersville、MD、USA)を、75cm2培養フラスコにおいて37℃で5%CO2の加湿雰囲気下、10%ウシ胎仔血清、0.1%ゲンタマイシン硫酸塩およびアンホテリシン-B抗生物質および0.1%アスコルビン酸(Lonza Walkersville、MD、USA)を補充した骨芽細胞培養培地において培養した。細胞播種時に、脛骨由来のhOSTは、継代9に達し、2名の大腿骨ドナー由来のhOSTは、それぞれ継代6および8に達した。
【０２０７】
1.4.ヒト脂肪由来間葉系幹細胞および初代ヒト骨芽細胞の播種
培養培地に予め浸漬した足場を24ウェル培養プレートに置き、1mlの培養培地における2×105細胞/足場の密度で細胞懸濁液を足場の頂部に滴下して加えた。足場の至るところにおける均質な細胞分布を確実にするために、かき混ぜ播種方法を用いた(Takahashiら、2003)。播種後に、200rpmで6時間37℃、湿度条件で、オービタルシェーカーにおいてプレートをかき混ぜた。細胞を播種した足場を新たな培養プレートの1ml培養培地に移し、37℃で5%CO2の加湿雰囲気下にて維持した。翌日、細胞を播種した足場を全て、4.6%D-マンニトール溶液に2回浸漬し、続いて300×gで1分間遠心分離した。次に、細胞を包埋した足場を、それぞれの群に従って異なる仕方で処理した。対照群におけるコーティングされていない足場を新たな培養プレートの1ml培養培地に直ちに移し、37℃で5%CO2の加湿雰囲気下において最大21日間維持した。300μlの2%(w/v)Pronova UP LVGアルギン酸ナトリウム(FMC BioPolymer、Sandvika、Norway)、600μlの2%(w/v)Pronova UP LVGアルギン酸カルシウム(FMC BioPolymer、Sandvika、Norway)、600μlの0.003%(w/v)クエン酸/4.6%D-マンニトールおよび300μlの4.6%D-マンニトールからなる新しく作製した溶液に10分間浸漬し、続いて300×gで1分間遠心分離して過剰なアルギン酸塩溶液を除去することにより、EMDなしのアルギン酸塩群における足場をアルギン酸塩ハイドロゲルでコーティングした。50mM CaCl2溶液においてアルギン酸塩コーティングされた足場を安定化させ、新たな培養プレートの1ml培養培地に移し、37℃で5%CO2の加湿雰囲気下において最大21日間維持した。600μlの0.003%(w/v)クエン酸/4.6%D-マンニトールが、追加的な150μg/mlのEMD(ロット番号:EMD 9121、Institut Straumann、Basel、Switzerland)を含有し、アルギン酸塩溶液全体に対し50μg/mlの最終EMD濃度をもたらしたこと以外は、EMDなしのアルギン酸塩群における足場と同じ仕方で、EMDを有するアルギン酸塩群における足場を処理した。各ドナー、各処理および2つの収集時点の3回複製が、全54種の足場に包含された。培地を1日おきに交換し、細胞毒性、アルカリホスファターゼ(ALP)活性、総タンパク質含量および発現アッセイにおける使用のために保存した。リアルタイムRT-PCRおよび免疫細胞化学における使用のために、培養14および21日後に足場を収集した。
【０２０８】
1.5.アルギン酸塩ハイドロゲルでコーティングされた細胞を播種した足場の可視化
過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色により、アルギン酸塩コーティングを可視化した。簡潔に述べると、足場をミリQ水で洗浄し、1%過ヨウ素酸溶液(Sigma-Aidrich社、St. Louis、MO、USA)において5分間酸化させた。次に、足場をミリQ水ですすぎ、シッフ試薬(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO、USA)中に15分間置いた。最終的に、足場を微温の水道水に5分間浸漬し、その後撮像した。さらに、培養2日後に、PAS/Pan-カドヘリン二重染色によりアルギン酸塩コーティングにおけるhAD-MSCの接着性を評価した。足場をメスにより半分に切り、4%パラホルムアルデヒド(PFA)/4.6%D-マンニトールにおいて15分間固定し、その後さらに加工するまで1%PFA/4.6%D-マンニトールにおいて貯蔵した。固定した足場を先ずPAS方法に従って染色し、続いてPan-カドヘリン染色した。要するに、PAS染色された足場を、0.2%Triton Xを有するリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解した1.25%ウシ血清アルブミン(BSA)に4μg/mlとなるよう希釈したモノクローナルマウス抗ヒトPanカドヘリン抗体(I-8H5、MP Biomedicals社、Santa Ana、CA、USA)と共に1時間室温でインキュベートし、続いて2μg/mlの濃度となるよう2.5%BSA/0.05%Tween-20/PBSに希釈したCy3コンジュゲートロバ抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch社、West Grove、PA、USA)において、30分間室温でインキュベーションした。細胞を播種したホールマウント染色した足場を、DAPIを用いて対比染色し、カバーガラス上に置き、Dako蛍光マウント用培地(Dako社、Glostrup、Denmark)で覆った。FluoView 1000共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)(Olympus社、Center Valley、PA、USA)において共焦点レーザー走査型顕微法を行った。反射モードでCLSMを用いて足場表面を可視化した。ImageJ(NIH、Bethesda、MD、USA)を用いて画像を解析した。
【０２０９】
1.6.細胞毒性アッセイ
培養培地におけるサイトゾル酵素乳酸脱水素酵素(LDH)の活性に基づき、細胞を播種した足場の細胞毒性を推定した。メーカーの細胞毒性検出キット説明書(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)に従って、培養14日目まで1日おきに収集した培地におけるLDH活性を決定した。50μlの試料を50μlのキット反応混合物と共に30分間暗所で室温にてインキュベートした。プレートリーダー(Biochrom Asys Expert 96マイクロプレートリーダー、Biochrom社、Holliston、MA、USA)において、492nmにおける試料の吸光度を測定した。
【０２１０】
加えて、培養2日目に、アクリジンオレンジ/エチジウムブロマイド染色によりhAD-MSC生存率を可視化した。足場をメスにより半分に切り、4%パラホルムアルデヒド(PFA)/4.6%D-マンニトールにおいて15分間固定し、その後さらに加工するまで1%PFA/4.6%D-マンニトールにおいて貯蔵した。FluoView 1000 CLSM(Olympus社、Center Valley、PA、USA)において共焦点レーザー走査型顕微鏡法を行った。反射モードでCLSMを用いて足場表面を可視化した。ImageJ(NIH、Bethesda、MD、USA)により画像を解析した。
【０２１１】
1.7.総タンパク質含量アッセイ
メーカーの説明書に従ってビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキット(Thermo Scientific Pierce Biotechnology社、Rockford、IL、USA)を用いて、培養2、8、14および21日後に、培養培地における細胞を播種した足場の総タンパク質含量を決定した。25μlの試料を200μlのキット作業試薬と共に30分間暗所で37℃にてインキュベートした。プレートリーダー(Biochrom Asys Expert 96マイクロプレートリーダー、Biochrom社、Holliston、MA、USA)において562nmにおける試料の吸光度を測定し、BSA(Thermo Scientific Pierce Biotechnology社、Rockford、IL、USA)に基づく検量線により総タンパク質量を計算した。
【０２１２】
1.8.アルカリホスファターゼ活性アッセイ
P-ニトロフェニルリン酸塩(pNPP)基質(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO、USA)を黄色の最終産物、p-ニトロフェノールへと加水分解するALPの能力を用いて、hAD-MSCに関しては培養2、4、6、10、16および20日後に、hOSTに関しては培養4、8、12、16および21日後に、培養培地におけるALP活性を定量化した。25μlの試料を100μlのpNPPと共に30分間暗所で室温にてインキュベートし、その後50μlの3M NaOHを加えて、反応を停止した。プレートリーダー(Biochrom Asys Expert 96マイクロプレートリーダー、Biochrom社、Holliston、MA、USA)において405nmにおける吸光度を測定し、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ(Promega社、Madison、WI、USA)に基づく検量線によりALP活性を定量化した。
【０２１３】
1.9.RNA単離およびリアルタイムRT-PCR解析
メーカーにより提供されたプロトコールに従って、Qiagen RNA miniキット(Qiagen社、Hilden、Germany)により、細胞を播種した足場から全RNAを単離した。ランダムプライマーを用いたRevertAid First Strand cDNA合成キット(Fermentas社、St. Leon- Rot、Germany)によりcDNAを合成した。TaqMan(登録商標)ユニバーサルマスターミックスによりApplied Biosystems 7300リアルタイムシステム(Life Technologies社、Paisley、UK)においてリアルタイムPCRを行った。増幅プログラムは、鋳型cDNA変性のためのプレインキュベーション工程(10分間95℃)と、続く変性工程(15秒間95℃)およびアニーリング工程(60秒間60℃)で構成される40サイクルからなった。各アッセイにおいてcDNA鋳型なしの陰性対照を行った。グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)、RUNX2、SOX9、PPARG、COL1A1、オステオプロテジェリン(TNFRSF11B)、分泌リン酸化タンパク質1(SPP1)、ALPLおよびオステオカルシン(BGLAP)に関して、hAD-MSCのリアルタイムRT-PCRを行った。GAPDH、COL1A1、TNFRSF11B、SPP1、ALPLおよびBGLAPに関して、hOSTのリアルタイムRT-PCRを行った。ΔΔCT方法(Pfafflら、2001)を用いて、リアルタイムRT-PCRデータを解析した。
【０２１４】
1.10.イムノアッセイ:分泌タンパク質の定量化
xMAP技術を用いたLuminex 100/200システム(Luminex社、Austin、TX、USA)において、培養培地におけるタンパク質レベルの複数分析物プロファイリングを行った。取得した蛍光データを、xPONENT 3.1ソフトウェア(Luminex社、Austin、TX、USA)により解析した。培養2、8、14および21日後に、ヒト骨パネルキット(Millipore社、Billerica、MA、USA)により、培養培地におけるオステオプロテジェリン(TNFRSF11B)、分泌リン酸化タンパク質1(SPP1)およびオステオカルシン(BGLAP)の量を測定した。メーカーのプロトコールに従って全解析を行った。
【０２１５】
1.11.免疫細胞化学および共焦点レーザー走査型顕微鏡
培養14および21日後に、足場をメスにより半分に切り、4%パラホルムアルデヒド(PFA)/4.6%D-マンニトールにおいて15分間固定し、その後さらに加工するまで1%PFA/4.6%D-マンニトールにおいて貯蔵した。ミリQ水(pH7.4)に溶解した0.05%シトラコン酸無水物において95℃で15分間加熱することにより、固定した足場を熱誘導性エピトープ回復に付し、0.2%Triton Xを有するリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解した1.25%ウシ血清アルブミン(BSA)において1μg/mlとなるよう希釈したモノクローナルマウス抗ヒト抗体(I-8H5、MP Biomedicals社、Santa Ana、CA、USA)と共に1時間室温でインキュベートし、続いて2mg/mlの濃度となるよう2.5%BSA/0.05%Tween-20/PBSに希釈したCy3コンジュゲートロバ抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch社、West Grove、PA、USA)において30分間室温でインキュベーションした。細胞を播種したホールマウント染色した足場を、DAPIを用いて対比染色し、Dako蛍光マウント用培地(Dako社、Glostrup、Denmark)によりカバーガラスにおいてマウントした。FluoView 1000 CLSM(Olympus社、Center Valley、PA、USA)において共焦点レーザー走査型顕微鏡法を行った。反射モードでCLSMを用いて足場表面を可視化した。ImageJ(NIH、Bethesda、MD、USA)により画像を解析した。
【０２１６】
1.12.統計
パラメトリック一元配置ANOVAに従ったホルム・シダック検定を用いて、細胞毒性、ALP活性、遺伝子発現、総タンパク質含量および分泌解析により得られたデータを群間で比較した。等しい分散および/または正規性検定が失敗した場合、順位におけるクラスカル・ワリス一元配置ANOVAを行った(SigmaPlot 12.3、Systat Software、San Jose、CA、USA)。≦0.05の確率を有意として考慮した。
【０２１７】
2.結果
2.1.アルギン酸塩コーティングされた細胞を播種した足場の特徴づけ
アルギン酸塩コーティングされた足場のPAS染色は、TiO2足場支柱の表面全体をコーティングするアルギン酸塩ハイドロゲルの均一な分布を明らかにした(図23A)。さらに、アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場へのhAD-MSC接着性は、PAS/Pan-カドヘリン二重染色により実証された(図22D)。さらに、播種されたhAD-MSCの大部分は、アクリジンオレンジ/エチジウムブロマイド染色によると、培養2日目に生存可能であった(図23)。
【０２１８】
2.2.ヒト脂肪由来幹細胞の特徴
細胞表面抗原発現パターン、CD14(-)、CD19(-)、CD34(+)、CD45(-)、CD44(+)、CD73(+)、CD90(+)、CD105(+)、HLA-DR(-)およびIgG(-)は、造血または内皮起源細胞の非存在を示唆した。骨および脂肪生成分化は、それぞれアリザリンレッドおよびオイルレッドによる組織学的可視化により実証された。加えて、細胞は、培養において骨、軟骨および脂肪沈着細胞へと選択的に分化した。その抗原表面発現パターン、組織学的評価ならびに骨原性、軟骨形成および脂肪生成系列に沿って分化するその潜在力のため、細胞は、hAD-MSCと称された。
【０２１９】
2.3.細胞適合性(cytocompatibility)/乳酸脱水素酵素活性
EMDありまたはなしのアルギン酸塩コーティングされた足場に関して14日間の細胞毒性試験を行って、hAD-MSCおよびhOST生存率におけるアルギン酸塩およびEMDの効果を調べた。より高いLDH活性は概して、14日間の期間を通して、EMDなしのアルギン酸塩コーティングされた足場と比較して、EMDを有するアルギン酸塩コーティングされた足場由来の培地において検出された。EMDを有するアルギン酸塩コーティングされた足場由来のhAD-MSCを除き、足場のどちらも、コーティングされていない足場の効果と比較して、LDH活性の有意な増加を引き起こさなかったことは、EMDなしのアルギン酸塩コーティングされた足場およびコーティングされていない足場と比較して、12日目にLDH活性の有意な増加を明らかにした(図24A)。さらに、EMDありおよびなしのアルギン酸塩コーティングされた足場由来のhOST培地において、コーティングされていない足場と比較して、2、4および14日目にLDH活性の有意な減少が観察された(図24B)。hAD-MSCおよびhOSTのLDH活性プロファイルにおいてある程度の変動が観察され、アルギン酸塩およびEMDに対し細胞応答における細胞型依存性の差を示した(図24;A〜B)。
【０２２０】
2.4.総タンパク質含量
8日目に、コーティングされていない足場と比較してEMDありおよびなしのアルギン酸塩コーティングされた足場由来の培地において総タンパク質量の有意な増加が検出されたこと、12日目に、EMDなしのアルギン酸塩コーティングされた足場およびコーティングされていない足場と比較してEMDありのアルギン酸塩コーティングされた足場由来の培地において総タンパク質量の有意な増加が観察されたことを除き、EMDありまたはなしの足場のいずれかに関し、コーティングされていない足場と比較して、いかなる時点におけるhAD-MSC培養培地の総タンパク質含量においても有意な差は概して観察されなかった(図24C)。2および4日目に、コーティングされていない足場と比較してEMDありおよびなしのアルギン酸塩コーティングされた足場由来の培地において総タンパク質量の有意な減少が検出されたことを除き、EMDありまたはなしの足場のいずれかに関し、コーティングされていない足場と比較して、いかなる時点におけるhOST培養培地の総タンパク質含量においても有意な差は概して観察されなかった(図24D)。
【０２２１】
2.5.アルカリホスファターゼ活性
20日目にEMDなしのアルギン酸塩コーティングされた足場およびコーティングされていない足場と比較して、EMDを有するアルギン酸塩コーティングされた足場において培養した細胞由来の培地におけるALP活性が有意に増加したドナー1と、10日目にEMDなしのアルギン酸塩コーティングされた足場およびコーティングされていない足場と比較して、EMDを有する足場において培養した細胞由来の培地におけるALP活性が有意に減少したドナー3を除き、EMDありまたはなしのアルギン酸塩コーティングされた足場におけるhAD-MSCの培養は、EMDありまたはなしの足場のいずれかに関して、コーティングされていない足場と比較して、測定した時点のいずれにおいても培養培地におけるALP活性を有意に変化させなかった。
【０２２２】
4日目にコーティングされていない足場と比較して、EMDなしのアルギン酸塩コーティングされた足場において培養した細胞由来の培地におけるALP活性が有意に減少したドナー1と、12日目にコーティングされていない足場と比較して、EMDなしのアルギン酸塩コーティングされた足場において培養した細胞由来の培地におけるALP活性が有意に減少したドナー2、ならびに4および16日目にコーティングされていない足場と比較して、EMDありおよびなしのアルギン酸塩コーティングされた足場において培養した細胞由来の培地におけるALP活性が有意に減少したドナー3を除き、EMDありまたはなしのアルギン酸塩コーティングされた足場におけるhOSTの培養は、コーティングされていない足場と比較して、EMDありまたはなしの足場のいずれかに関し、測定した時点のいずれにおいても培養培地におけるALP活性を有意に変化させなかった。ALP活性プロファイルにおいてある程度の変動が観察され、EMDありまたはなしのアルギン酸塩コーティングされた足場に対する細胞応答におけるドナー依存性の差を示した。
【０２２３】
2.6.リアルタイムRT-PCR解析
hAD-MSCにおけるCOL1A1、TNFRSF11B、SPP1、ALPLおよびBGLAP mRNAレベルの発現において、試験した時点のいずれにおいても、実験群間に有意な差は観察されなかった。加えて、RUNX2、SOX9およびPPARG mRNAレベルの発現において、試験した時点のいずれにおいても、実験群間に有意な差は観察されなかった。
【０２２４】
hOSTにおけるSPP1、ALPLおよびBGLAP mRNAレベルの発現において、試験した時点のいずれにおいても、実験群間に有意な差は観察されなかった。にもかかわらず、培養14日後に、COL1A1の相対発現は、EMDなしの足場、コーティングされていない足場と比較して、EMDを有する足場において培養したhOSTにおいて有意に増加し、GAPDHに対し正規化した。TNFRSF11Bの相対発現は、培養14日後に、コーティングされていない足場と比較して、EMDを有する足場において培養した細胞において有意に増加し、GAPDHに対し正規化した。
【０２２５】
2.7.共焦点レーザー走査型顕微鏡によるRUNX2およびSOX9の可視化
RUNX2およびSOX9の沈着におけるEMDの効果を評価するため、染色した足場においてCLSM可視化を行った(図25)。
【０２２６】
2.8.イムノアッセイ:分泌タンパク質の定量化
コーティングされていない足場と比較して、いかなる時点においても、EMDありまたはなしの足場いずれかに由来するhAD-MSCまたはhOST培養培地いずれかのTNFRSF11B、SPP1およびBGLAP含量において、有意な差は観察されなかった。いかなる時点においても、EMDありまたはなしの足場のいずれかに由来する第2のドナーの培養培地中TNFRSF11B含量において、実質的な差は観察されず、第1のドナーに対し、8、14および21日目に、EMDありまたはなしの足場のいずれかに由来する培養培地のTNFRSF11B含量における実質的な差は検出されなかった。しかし、あらゆる時点において、EMDを有する足場と比較して、EMDなしの足場において培養した細胞に由来する培養培地における第3のドナーのTNFRSF11Bの含量は、より増加した。21日目に、EMDなしの足場と比較して、EMDを有する足場において培養した細胞由来の培養培地における第3のドナーのSPP1の含量がより多く発現されたことを除き、いかなる時点においても、EMDありまたはなしの足場のいずれかに由来する培養培地の第1および第3のドナーのSPP1含量において、実質的な差は観察されなかった。さらに、8および21日目において、EMDを有する足場において培養した細胞由来の培養培地における第2のドナーのSPP1含量は、EMDなしの足場と比較してより増強された。いかなる時点においても、EMDありまたはなしの足場のいずれかに由来する第1および第3のドナーの培養培地中BGLAP含量において、実質的な差は観察されなかった。しかし、2および8日目に、EMDを有する足場において培養した細胞由来の第2のドナーの培養培地中BGLAP含量は、EMDなしの足場と比較してより増強された。
【０２２７】
あらゆる時点において、第1および第2のドナーの培養培地中TNFRSF11Bの含量は、EMDなしの足場と比較して、EMDを有する足場において培養した細胞からより多く発現され、2および8日目に、第3のドナーの培養培地中TNFRSF11Bの含量は、EMDを有する足場と比較して、EMDなしの足場において培養した細胞からより多く発現された。しかし、14および21日目に、EMDありまたはなしの足場のいずれかに由来する第3のドナーの培養培地中TNFRSF11B含量において、実質的な差は観察されなかった。あらゆる時点において、EMDを有する足場において培養した細胞に由来する第1のドナーの培養培地中SPP1の含量は、EMDなしの足場と比較してより増加した。2、8および14日目に、EMDを有する足場において培養した細胞に由来する第2のドナーの培養培地中SPP1の含量は、EMDなしの足場と比較してより増加した。2および8日目に、EMDありまたはなしの足場のいずれかに由来する第3のドナーの培養培地中SPP1含量において、実質的な差は観察されなかった。2日目に、EMDなしの足場において培養した細胞に由来する第1のドナーの培養培地中BGLAPの含量は、EMDを有する足場と比較してより増加した。しかし、8日目に、EMDを有する足場において培養した細胞に由来する第1のドナーの培養培地中BGLAPの含量は、EMDなしの足場と比較してより増加した。2および21日目に、EMDなしの足場において培養された細胞に由来する第2のドナーの培養培地中BGLAPの含量は、EMDを有する足場と比較してより増加した。しかし、14日目に、EMDを有する足場において培養した細胞に由来する第2のドナーの培養培地中BGLAPの含量は、EMDなしの足場と比較してより増加した。8、14および21日目に、EMDを有する足場において培養した細胞に由来する第3のドナーの培養培地中BGLAPの含量は、EMDなしの足場と比較してより増加した。しかし、2日目に、EMDなしの足場において培養した細胞に由来する第3のドナーの培養培地中BGLAPの含量は、EMDを有する足場と比較してより増加した。
【０２２８】
5.結論
要約すると、この結果から、本発明者らは、hAD-MSCおよびhOSTが、EMC誘導体送達のためのコーティング手順を生き延びる能力を有すると結論づけることができる。さらに、hOSTは、EMDを有するアルギン酸塩コーティングされた足場内において、骨原性系列へと分化することができ、この結果は、有効性をin vivoで評価する前に重要である。
【実施例１１】
【０２２９】
開放多孔性構造をもたらす放射線不透過性アルギン酸塩層でコーティングされたTiO2足場の製作
(Tiainen Hら、2010)により以前に記載された通り、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および8mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。次に、放射線不透過性コントラスト液[Omnipaque(イオヘキソール)、GE Healtcare社]を有する1層の2%アルギン酸塩ゲルで、TiO2足場をコーティングした。簡潔に説明すると、1時間室温でオービタルシェーカー(IKA Vibrax VXR basic、Staufen、Germany)において100rpmでかき混ぜつつ、P2(配列番号1)ありまたはなしの2%アルギン酸塩溶液にTiO2足場を浸した。次に、252×gで1分間足場を遠心分離した。50mM CaCl2に試料を1時間浸漬して、ゲル化させた。次に、足場をdH2Oですすいで、過剰なCaCl2を除去した。最終的に、試料を室温で一晩乾燥させた。1層の2%アルギン酸塩ゲル(対照アルギン酸塩足場)でコーティングされた足場を対照群として用い、一方、コーティングされていないTiO2足場(アルギン酸塩なし、SC)も対照群として用いた。microCTスキャナー(Skyscan 1172、Kontich、Belgium)において足場をスキャンし、CTvoxにおいて可視化し、CTanにおいて解析した。足場の孔径は、5%しか低下せず、多孔度変化は、3%未満であった。相互接続性は、アルギン酸塩層の塗布により変化せず、足場が依然として開放多孔性構造を有し、ごく僅かな孔が遮断された(暗色)ことを証明した(図26)。支柱の全てがアルギン酸塩の薄層(<10μm)で覆われていることも目に見えた。
【０２３０】
その詳細な説明と併せて本発明を記載してきたが、前述の記載は、本発明の範囲を図解するよう企図されており、これを限定するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲により定義されることを理解されたい。他の態様、利点および修正は、次の特許請求の範囲の範囲内に収まる。
【０２３１】
それとは反対のことが明確に記載されていない限り、本明細書に記載されている好ましい特色のそれぞれは、ありとあらゆる他の本明細書に記載されている好ましい特色と組み合わせて用いることができる。
【０２３２】
(参考文献)
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【図１】
2015529527.tif 000008
【図２】
2015529527.tif 000009
【図３Ｂ】
2015529527.tif 000010
【図４】
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【図５Ａ】
2015529527.tif 000012
【図５Ｂ】
2015529527.tif 000013
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2015529527.tif 000015
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
2015529527.tif 000019
【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７】
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【図８】
2015529527.tif 000023
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図３Ａ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年4月23日(2014.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面の少なくとも一部が、少なくとも1種の生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを備え、
a)二酸化チタン足場を用意する工程と、
b)生物学的活性物質と、1000〜1000000g/molの分子量(Mw)を有する約1〜10%w/vのポリマーとを含むポリマー溶液を、前記二酸化チタン足場の少なくとも一部に置き、続いて二酸化チタン足場を遠心分離する工程と、
c)工程b)における二酸化チタン足場に置かれたポリマーのゲル化をもたらす工程と、
d)必要に応じて、二酸化チタン足場を乾燥させる工程と
を含み、工程b)およびc)が、少なくとも1回必要に応じて反復される方法によって得ることができるまたは得られる、二酸化チタン足場。
【請求項２】
前記ハイドロゲルコーティングが、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール(PEG)、セルロース、ポリ(アクリル酸)(PAA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸)(PLA)、PLA-PGA、PLA-PEG、デキストラン、デキストラン-PEG、デンプン、コラーゲンベースのゲル、アガロース、プルロニック酸、ヘパラン硫酸、グリコサミノグリカン、ポリエチレンオキシド(PEO)、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー[P(EO-co-PO)]ならびにプルロニック/ポロキサマーからなる群から選択される少なくとも1種のポリマーを含む、請求項1に記載の二酸化チタン足場。
【請求項３】
前記生物学的活性物質が、合成もしくは天然生物活性分子、天然もしくは合成薬物、および/または生細胞からなる群から選択される、請求項1または2に記載の二酸化チタン足場。
【請求項４】
前記生物学的活性物質が、天然または組換え生体接着剤;天然または組換え細胞結合因子;天然、組換えまたは合成バイオポリマー;天然または組換え血液タンパク質;天然または組換え酵素;天然または組換え細胞外マトリックスタンパク質;天然または合成細胞外マトリックス生体分子;天然または組換えシグナル分子、成長因子およびホルモン;天然、組換えおよび合成ペプチド、合成ペプチドホルモン;天然、組換えまたは合成デオキシリボ核酸;天然、組換えまたは合成リボ核酸(ribonucleotide acid);天然または組換え受容体;酵素阻害剤;薬物;生物学的活性アニオンおよびカチオン;ビタミン;アデノシン一リン酸(AMP)、アデノシン二リン酸(ADP)またはアデノシン三リン酸(ATP);マーカー生体分子;アミノ酸;脂肪酸;ヌクレオチド(RNAおよびDNA塩基)、糖、テトラサイクリン等の抗生物質ならびにスタチンおよびビスホスホネート等の小型の生物学的有機分子からなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場。
【請求項５】
前記生細胞が、間葉系幹細胞、骨細胞、多能性細胞、骨前駆細胞、血管細胞、前駆血管細胞およびストロマ細胞からなる群から選択される、請求項3に記載の二酸化チタン足場。
【請求項６】
前記ポリマーが、1000〜200000g/molの分子量(Mw)を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場。
【請求項７】
前記ハイドロゲルコーティングが、1〜20μm等、少なくとも1μmの湿潤厚さを有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場。
【請求項８】
前記アルギン酸塩が、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸カルシウムおよびアルギン酸ストロンチウムからなる群から選択される、請求項2から7のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場。
【請求項９】
請求項1から8のいずれか一項に記載の生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを含む二酸化チタン足場を生成するための方法であって、
a)二酸化チタン足場を用意する工程と、
b)生物学的活性物質と、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール(PEG)、セルロース、ポリ(アクリル酸)(PAA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸)(PLA)、PLA-PGA、PLA-PEG、デキストラン、デキストラン-PEG、デンプン、コラーゲンベースのゲル、アガロース、プルロニック酸、ヘパラン硫酸、グリコサミノグリカン、ポリエチレンオキシド(PEO)、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー[P(EO-co-PO)]ならびにプルロニック/ポロキサマーからなる群から選択される約1〜10%w/vのポリマーとを含むポリマー溶液を、前記二酸化チタン足場の少なくとも一部に置き、続いて二酸化チタン足場を遠心分離する工程と、
c)工程b)における二酸化チタン足場に置かれたポリマーのゲル化をもたらす工程と、
d)必要に応じて、二酸化チタン足場を乾燥させる工程と
を含み、工程b)およびc)が、少なくとも1回必要に応じて反復される方法。
【請求項１０】
請求項1から8のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場を含む医療用インプラント。
【請求項１１】
医療用インプラントとして使用するための、請求項1から8のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場。
【請求項１２】
骨等、組織の再生、修復、置換および/または回復のために使用するための、請求項1から8もしくは請求項10のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場または請求項11に記載の医療用インプラント。
【国際調査報告】
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