(57)【要約】タバコ材料の処理タバコ材料の処理方法を提供する。この方法は異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素を組み合わせて用いてタバコ材料を処理する工程および酵素インキュベーション中にその操作条件を調整する工程からなる。また、このような方法で処理したタバコ材料またはその派生物、並びにこのような方法で処理したタバコ材料を含む喫煙品を提供する。
2015535428.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タバコ材料を処理する方法であって、異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素を組み合わせて用いる工程と酵素インキュベーション中に前記操作条件を調整する工程とを含む方法。
【請求項２】
未処理のタバコ材料に比べて、処理したタバコ材料のタンパク質含有量を低減させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記操作条件の調整にｐＨ調整が含まれることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｐＨ調整が必要に応じて酸を添加してｐＨを低下させることを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ｐＨ調整が必要に応じてアルカリを添加してｐＨを増加させることを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記操作条件の調整に温度調整が含まれることを特徴とする請求項１乃至５いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記温度調整が低い温度を高くする調整を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記温度調整が高い温度を低くする調整を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素の組み合わせが２通りの異なる最適な操作条件を有する酵素からなることを特徴とする請求項１乃至８いずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素の組み合わせが３通りの異なる最適な操作条件を有する酵素からなることを特徴とする請求項１乃至９いずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
未処理のタバコ材料に比べて、前記処理したタバコ材料のタンパク質の含有量を少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、および／または少なくとも９０％低減させることを特徴とする請求項１乃至１０いずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１乃至１１いずれか１項に記載の方法で処理したタバコ材料またはその派生物。
【請求項１３】
請求項１２に記載のタバコ材料を含む喫煙品。
【請求項１４】
酵素インキュベーション中に操作条件を調整することにより、タバコ材料から１種以上のタンパク質を除去するための、異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素の組み合わせの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタバコ材料の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
状況によっては、タバコ材料を紙巻きタバコ等の喫煙品にする前に、タバコ材料の特定の成分の含有量を低減させることが望ましい場合がある。
【発明の概要】
【０００３】
第１の態様によると、タバコ材料の処理方法を提供し、その方法は異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素を組み合わせて用いる工程と、酵素インキュベーション中にその操作条件を調整する工程とを含む。
【０００４】
ある実施態様では、この方法で処理したタバコ材料は未処理のタバコ材料に比べてタンパク質含有量が低減する。
【０００５】
ある実施態様では、操作条件の調整にｐＨ調整が含まれる。ある実施態様では、ｐＨ調整は必要に応じて酸を添加してｐＨを低下させることを含む。ある実施態様では、ｐＨ調整は必要に応じてアルカリを添加してｐＨを増加させることを含む。
【０００６】
ある実施態様では、操作条件の調整に温度調整が含まれる。ある実施態様では、温度調整は低い温度を高くする調整を含む。ある実施態様では、温度調整は高い温度を低くする調整を含む。
【０００７】
ある実施態様では、酵素の組み合わせは２通りの異なる最適な操作条件を有する酵素からなる。ある実施態様では、酵素の組み合わせは３通りの異なる最適な操作条件を有する酵素からなる。
【０００８】
ある実施態様では、未処理のタバコ材料に比べて、処理したタバコ材料のタンパク質含有量が少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、および／または少なくとも９０％低減する。
【０００９】
第２の態様では第１の態様の方法で処理したタバコ材料またはその派生物を提供する。
【００１０】
第３の態様では第２の態様によるタバコ材料を含む喫煙品を提供する。
【００１１】
第４の態様では酵素インキュベーション中に操作条件を調整することにより、タバコ材料から１種以上のタンパク質を除去するために、異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素を組み合わせて使用する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明の実施態様を、単なる例示として、添付図面を参照して以下に述べる。
【図１】本発明の一実施態様によるタバコ材料の処理方法を示すフローチャートである。
【図２】本発明の一実施態様によるタバコ材料の処理方法を示すフローチャートである。
【図３】未洗浄のタバコを酵素インキュベーション中のｐＨ値および／または温度を変化させた異なる最適な操作条件を有する２種のタンパク質分解酵素で処理した結果を示す表である。
【図４】洗浄したタバコを酵素インキュベーション中のｐＨ値および／または温度を変化させた異なる最適な操作条件を有する２種のタンパク質分解で酵素処理した結果を示す表である。
【図５】酵素インキュベーション中のｐＨ値または温度を変化させずにタンパク質分解酵素で処理した結果を示す表である。
【図６】洗浄したタバコを酵素インキュベーション中のｐＨ値をｐＨ１０〜４へ変化させた異なる最適な操作条件を有する２種のタンパク質分解酵素で処理した結果を示すグラフである。
【図７】洗浄したタバコを酵素インキュベーション中のｐＨ値をｐＨ４〜１０へ変化させた異なる最適な操作条件を有する２種のタンパク質分解酵素で処理した結果を示すグラフである。
【図８】本発明の実施態様に従って処理したタバコ材料を含む喫煙品の概略態様図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明はタバコ材料を処理して、タバコ材料からタンパク質を除去する、および／またはタバコ材料のタンパク質含有量を低減する方法に関する。
【００１４】
タバコ材料を処理して、除去することが望ましい１種以上の他の化学物質を除去してもよい。タバコ材料中のタンパク質は多くの場合、そのような物質である、および／またはそれらの前駆体であることが判明している。
【００１５】
これとは別にまたはそれに加えて、タバコ材料の品質向上のために、タバコ材料のタンパク質含有量を低減させることが望ましい場合がある。
【００１６】
タンパク質除去を試みる諸方法が提案されてきたが、それらは傾向として、費用、時間が掛かり、および／またはタバコ材料の物理的構造に悪影響を及ぼす、および／または所望のレベルまでタンパク質含有量が低減されないことがある。
【００１７】
本発明の方法はタバコ材料からタンパク質を除去する。タバコ材料から除去されるタンパク質の例にはＲｕＢｉｓＣＯが含まれる。本発明の方法は未処理のタバコ材料に比べてタバコ材料のタンパク質含有量を低減させる。
【００１８】
図１は一実施態様によるタバコ材料の処理方法を示すフローチャートである。タバコ材料１はタンパク質分解酵素処理１０される。得られた懸濁液の固体成分と液体成分を分離２０することで、低タンパク質含量のタバコ材料３０および液体成分３１が得られる。
【００１９】
本明細書で用いる「タバコ材料」という用語は、任意の部分、例えば、タバコ属の任意の種の葉や茎、およびこれらの再構成材料を含む。本発明で用いるタバコ材料はニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）種からのものが好ましい。
【００２０】
本発明では任意の種類のタバコが用いられる。使用できるタバコの例としてはバージニア種、バーレー種、メリーランド種、オリエンタル種およびルスチカ種のタバコが含まれるがこれらに限定されない。
【００２１】
タバコ材料は本発明の方法で処理する前に、任意の好適な方法で処理してもよい。
【００２２】
本明細書で用いる「インキュベーション中」および「酵素インキュベーション中」という用語は、タバコ材料を１種以上のタンパク質分解酵素でインキュベートしている期間を指す。
【００２３】
本明細書で用いる「最適な操作条件」という用語は、酵素が最適活性を示す反応条件、および／または反応が適切なおよび／または望ましい速度で進むほどの十分な活性を示す反応条件を指す。最適な操作条件には、タンパク質分解酵素が最適活性を示す、および／または反応が適切なおよび／または望ましい速度で進むほどの十分な活性を示すｐＨおよび／または温度の範囲が含まれる。
【００２４】
ある実施態様では、本発明の方法は保存処理したタバコ材料のタンパク質含有量を低減する方法に関する。タバコ材料は本発明の方法で処理する前に、任意の好適な保存処理方法で保存処理してもよい。
【００２５】
タバコ材料は任意の好適な形態のタバコであってよい。タバコ材料は、薄層、シート、再構成、細砕および／または粉砕したタバコ材料を含んでもよい。タバコ材料が薄層のタバコ材料からなる場合、その薄層は条片、刻み、または全葉タバコの形態であってもよい。ある実施態様では、タバコ材料の形態は刻んだ屑状（cut rag）または全葉である。ある実施態様では、タバコ材料は保存処理済みの刻んだ屑状または全葉のタバコである。  
【００２６】
ある実施態様では、タバコ材料はタンパク質分解酵素処理の前に洗浄してもよい。
【００２７】
任意の好適な液体媒体をタバコ材料の洗浄に用いてもよい。典型的な洗浄媒体は水溶液である。
【００２８】
ある実施態様では、タバコ材料は水で洗浄してもよい。タバコ材料は水道水で洗浄してもよい。これとは別にまたはそれに加えて、タバコ材料は精製水で洗浄してもよい。本明細書で用いる「精製水」とは、汚染物質および／または不純物の除去処理をした水に相当する。ある実施態様では、精製水は脱イオン水である。
【００２９】
タバコ材料を洗浄すると、タバコ材料からタンパク質が除去される。例えば、タバコ材料を水で洗浄すると、水溶性タンパク質がタバコ材料から除去される。
【００３０】
タバコ材料を洗浄すると、タンパク質分解酵素処理の前にタバコ材料のタンパク質含有量が既に低減されているという利点がある。従って、タンパク質分解酵素を用いてタンパク質含有量を低減させるのに、未洗浄のタバコ材料よりも洗浄したタバコ材料を用いるほうがより効率的および／またはより効果的である。
【００３１】
これとは別にまたはそれに加えて、酵素処理前に洗浄工程を含めると、所望のレベルのタンパク質除去に要する酵素のインキュベーション時間はより短くてもよく、および／または所望のレベルのタンパク質除去に要する酵素濃度はより低くてもよい。
【００３２】
タバコ材料を好適な洗浄媒体に入れて、１０分間まで、１５分間まで、２０分間まで、２５分間まで、または３０分間まで洗浄してもよい。
【００３３】
洗浄媒体の量は、洗浄媒体に可溶性の任意のタンパク質をタバコ材料から除去するのに十分な量であればよい。当業者であれば、タバコ材料に対する洗浄媒体の比率を変えることで抽出効率を最適化できることが分かる。
【００３４】
タバコ材料と洗浄媒体の温度は周囲温度より高くてもよく、そうすることで抽出過程が促進される。タバコ材料と洗浄媒体の温度は２０℃まで、３０℃まで、４０℃まで、５０℃まで、６０℃まで、７０℃まで、または８０℃までとしてもよい。タバコ材料と洗浄媒体の好適な温度は当業者には周知である。
【００３５】
ある実施態様では、タバコ材料と洗浄媒体の温度は５０℃であり、タバコ材料は２５分間洗浄する。
【００３６】
タバコ材料と洗浄媒体は洗浄中に、例えば、かき混ぜるおよび／または振ることで撹拌してもよい。
【００３７】
洗浄後、タバコ材料を洗浄媒体から分離してもよい。洗浄媒体からタバコ材料を分離する好適な手段は当業者には周知であり、濾過および／または遠心分離が含まれる。
【００３８】
タバコ材料との接触後、洗浄媒体はタバコ材料に保持されるのが望ましい成分を含んでもよい。例えば、洗浄媒体は洗浄媒体に可溶性のタバコタンパク質を含んでもよい。このようなタンパク質はタバコの風味などの特定の官能特性を付与する。これとは別にまたはそれに加えて、洗浄媒体はタバコ材料に保持されるのが望ましいニコチン、糖および／または他の成分を含んでもよい。従って、ある実施態様では、タバコ材料から分離した後、洗浄媒体はタバコ材料に、例えば、タンパク質分解酵素で処理されたタバコ材料に再適用される。
【００３９】
本発明の方法はタンパク質分解酵素活性を用いて、タバコ材料のタンパク質含有量を低減する。
【００４０】
タンパク質分解酵素はタンパク質をより小さいサイズのペプチド類およびアミノ酸類に分解する。従って、本発明の方法においては、タンパク質分解酵素活性でタバコ材料のタンパク質を分解し、その分解されたものがタバコ材料から放出され、その結果、タバコ材料からタンパク質が除去および／またはタバコ材料のタンパク質含有量が低減される。
【００４１】
酵素処理はタバコ材料のタンパク質含有量を低減させる最も効果的な方法の一つと考えられる。更に、タバコ材料のタンパク質含有量の低減に酵素を用いると好都合なのは、酵素は他の材料をそのままの状態に残しながら特定の形質転換だけを触媒する、さらに酵素を用いると有害な化学物質を使わなくて済むからである。これに対して、他のタンパク質低減方法では、例えば、タバコ材料を損なう諸条件が必要となり、タバコ材料の物理的構造を損なうことがある。
【００４２】
本発明で用いるタンパク質分解酵素は任意の種類のタンパク質分解酵素であってよい。本発明で用いるタンパク質分解酵素は国際生化学・分子生物学連合により、ＥＣ３．４（即ち、ペプチダーゼに属する酵素）に分類される。
【００４３】
食品や洗剤業界で商業的に使用されているタンパク質分解酵素であって低コストで利用できるものが本発明の方法に好適である。
【００４４】
タンパク質分解酵素は好適であれば任意の供給源から得てよい。例えば、タンパク質分解酵素は植物、動物、真菌、細菌および／またはウイルス由来のものであってもよい。これとは別にまたはそれに加えて、タンパク質分解酵素を合成してもよい。
【００４５】
タンパク質分解酵素が細菌由来のある実施態様では、タンパク質分解酵素をバチルス属から得てもよい。市販のバチルス属由来タンパク質分解酵素の例としては、Savinase（登録商標）、Esperase（登録商標）、Neutrase（登録商標）およびAlcalase（登録商標）が挙げられる。ある実施態様では、タンパク質分解酵素はバチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）菌種から得る。他の好適な細菌由来タンパク質分解酵素は当業者には周知である。
【００４６】
タンパク質分解酵素が真菌由来のある実施態様では、タンパク質分解酵素をアスペルギルス属から得てもよい。ある実施態様では、タンパク質分解酵素はアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）菌種から得る。市販のニホンコウジカビ菌由来タンパク質分解酵素の例としては、Enzobake（登録商標）が挙げられる。ある実施態様では、タンパク質分解酵素はアスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）菌種から得る。他の好適な真菌由来タンパク質分解酵素は当業者には周知である。
【００４７】
タンパク質分解酵素は酸性酵素であってもよい。本明細書で用いる「酸性酵素」という用語は、酸性ｐＨで最適活性となる酵素を指す。酸性タンパク質分解酵素の例としてはニホンコウジカビ菌由来のものがあり、この酵素はｐＨ３．０〜７．０の範囲で、任意でｐＨ３．０〜５．０の範囲で、またはｐＨ約７．０で最適活性を示す。
【００４８】
タンパク質分解酵素はアルカリ性酵素であってもよい。本明細書で用いる「アルカリ性酵素」という用語は、アルカリ性ｐＨで最適活性となる酵素を指す。アルカリ性タンパク質分解酵素の例としては、バチルス・リケニホルミス菌由来のもの（ｐＨ３．０〜１１．５の範囲で最適活性を示す）およびSavinase（登録商標）（ｐＨ７．０〜１１．０の範囲で最適活性を示す）が挙げられる。
【００４９】
これとは別にまたはそれに加えて、タンパク質分解酵素は中性のｐＨで最適活性を示す酵素であってもよい。
【００５０】
タバコ材料のタンパク質分解酵素処理は溶液中で行ってもよい。ある実施態様では、タバコ材料のタンパク質分解酵素処理は水溶液中で行われる。
【００５１】
タバコ材料のタンパク質分解酵素処理を行う溶液は、用いる特定のタンパク質分解酵素に応じて選択してよい。好適な溶液は当業者には周知である。
【００５２】
ある実施態様では、タンパク質分解酵素は選択した溶液にタバコ材料を加えてから添加する。言い換えると、ある実施態様では、タンパク質分解酵素は選択溶液中のタバコ材料に添加する。
【００５３】
酵素添加時の条件は、酵素活性の損失が無いように選択する。
【００５４】
ある実施態様では、溶液のｐＨは選択溶液に酵素を添加する前に調整する。ｐＨはタンパク質分解酵素が最適活性を示すｐＨに対応させる。
【００５５】
ある実施態様では、選択溶液中のタバコ材料のｐＨはタンパク質分解酵素が最適活性を示すｐＨに対応するので、選択溶液中のタバコ材料のｐＨを調整する必要がない場合もある。
【００５６】
水をタバコ材料に加えると、酸性または中性特性を示す。従って、タバコ材料が酸性タンパク質分解酵素で処理され、かつ選択溶液が脱イオン水などの水である実施態様によっては、選択溶液中のタバコ材料は酸性であり、ｐＨを更に調整する必要がない場合もある。
【００５７】
タンパク質分解酵素が最適活性を示すｐＨに選択溶液中のタバコ材料のｐＨが対応しない実施態様によっては、ｐＨは所望のｐＨに調整してもよい。
【００５８】
当業者はｐＨを調整する好適な方法を知っている。ある実施態様では、ｐＨはクエン酸および／または無機酸などの酸を添加して、または水酸化ナトリウムなどのアルカリを添加して調整する。
【００５９】
ある実施態様では、溶液のｐＨを維持するために緩衝剤を添加してもよい。好適な緩衝剤は当業者には周知である。
【００６０】
ある実施態様では、溶液の温度は選択溶液に酵素を加える前に調整する。溶液の温度はタンパク質分解酵素が最適活性を示す温度に調整してもよい。
【００６１】
ある実施態様では、選択溶液の温度はタンパク質分解酵素が最適活性を示す温度に対応するので、選択溶液の温度を調整する必要がない場合もある。
【００６２】
タンパク質分解酵素が最適活性を示す温度に選択溶液の温度が対応しない実施態様によっては、温度を所望の温度に調整してもよい。
【００６３】
ある実施態様では、選択溶液の温度は約１５℃〜７５℃の間である。ある実施態様では、選択溶液の温度は約６０℃までにして酵素活性への悪影響を最小限に抑える。タバコ材料がアスペルギルス・オリゼ由来のタンパク質分解酵素で処理される実施態様によっては、選択溶液の温度は約３０℃であってもよい。タバコ材料がSavinase（登録商標）で処理される実施態様によっては、選択溶液の温度は約４０℃であってもよい。
【００６４】
タバコ材料とタンパク質分解酵素を組み合わせて、タバコ／酵素混合物を生成してもよい。
【００６５】
ある実施態様では、タンパク質分解酵素処理はタバコ材料を一種のタンパク質分解酵素で処理することを含む。ある別の実施態様では、タンパク質分解酵素処理はタバコ材料を異なるタンパク質分解酵素を組み合わせて処理することを含む。タンパク質分解酵素の組み合わせには異なる最適な操作条件を有する少なくとも２種の酵素を含めてもよい。これとは別にまたはそれに加えて、タンパク質分解酵素の組み合わせには異なる最適な操作条件を有する少なくとも３種の酵素を含めてもよい。
【００６６】
異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素を組み合わせて用いる実施態様によっては、操作条件を酵素インキュベーション中に調整または変化させてもよい。操作条件の調整はｐＨおよび／または温度調整を含んでもよい。
【００６７】
異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素を組み合わせ、これをタバコ材料に同時に加えてタバコ材料を処理すると、タバコ材料のタンパク質含有量を低減させる手順の間に必要となる酵素添加の工程が１回のみという利点があり、この方法を工業または商業規模で実施するのに好適である。
【００６８】
異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素を組み合わせて用いる実施態様によっては、タンパク質分解酵素の最適ｐＨが異なっていることもある。従って、タバコ／酵素混合物のｐＨは酵素インキュベーション中に、タバコ／酵素混合物中の１種のタンパク質分解酵素の最適ｐＨから別種のタンパク質分解酵素の最適ｐＨに調整してもよい。
【００６９】
タバコ／酵素混合物のｐＨを低下または増加させることでｐＨを調整してもよい。
【００７０】
アルカリ性および酸性タンパク質分解酵素を組み合わせて用いる実施態様によっては、タバコ／酵素混合物のｐＨはアルカリ性から酸性ｐＨに、または酸性からアルカリ性ｐＨに調整してもよい。言い換えると、ｐＨは７．０超から７．０未満に、または７．０未満から７．０超に調整してもよい。
【００７１】
アルカリ性酵素および中性ｐＨで最適活性を示す酵素を組み合わせて用いる実施態様によっては、タバコ／酵素混合物のｐＨはアルカリ性から中性ｐＨに、または中性からアルカリ性ｐＨに調整してもよい。言い換えると、ｐＨは７．０超から約７．０に、または約７．０から７．０超に調整してもよい。
【００７２】
酸性酵素および中性ｐＨで最適活性を示す酵素を組み合わせて用いる実施態様によっては、タバコ／酵素混合物のｐＨは酸性から中性ｐＨに、または中性から酸性ｐＨに調整してもよい。言い換えると、ｐＨは７．０未満から約７．０に、または約７．０から７．０未満に調整してもよい。
【００７３】
アルカリ性酵素、酸性酵素および中性ｐＨで最適な活性を示す酵素を組み合わせて用いる実施態様によっては、タバコ／酵素混合物のｐＨは第１酵素の最適活性のｐＨから、第２酵素の最適活性のｐＨに、第３酵素の最適活性のｐＨに調整してもよい。
【００７４】
ｐＨの変化は反応の過程で生じることもある。言い換えると、ｐＨは操作者がｐＨを意図的に調整して変化させなくてもよい場合もある。自然の変化の代わりにまたはそれに加えて、ｐＨを意図的に調整することでｐＨを変化させてもよい。
【００７５】
酵素インキュベーション中のｐＨを低下させるために酸を添加してもよい。好適な酸類は当業者には周知である。ある実施態様では、ｐＨはクエン酸を添加して低下させる。それに代えて、またはそれに加えて、ｐＨはタバコ／酵素混合物中に二酸化炭素を吹き込むことで低下させる。
【００７６】
酵素インキュベーション中のｐＨを増加させるためにアルカリを添加してもよい。好適なアルカリ類は当業者には周知である。ある実施態様では、ｐＨは水酸化ナトリウムを添加して増加させる。
【００７７】
異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素を組み合わせて用いる前記方法の実施態様によっては、タンパク質分解酵素の最適温度が異なっていることもある。従って、タバコ／酵素混合物の温度は酵素インキュベーション中に、タバコ／酵素混合物中の１種のタンパク質分解酵素の最適温度から別種のタンパク質分解酵素の最適温度に調整してもよい。
【００７８】
タバコ／酵素混合物の温度を低下または上昇させることで温度を調整してもよい。
【００７９】
異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素を組み合わせて用いる前記方法の実施態様によっては、タンパク質分解酵素の最適ｐＨおよび最適温度が異なっていることもある。従って、タバコ／酵素混合物のｐＨおよび温度は酵素インキュベーション中に、タバコ／酵素混合物中の１種のタンパク質分解酵素の最適ｐＨおよび温度から別種のタンパク質分解酵素の最適ｐＨおよび温度に調整してもよい。
【００８０】
異なる最適な操作条件を有する酵素を組み合わせて用い、かつその操作条件を調整すると、タバコ材料のタンパク質含有量を低減させる酵素処理工程をより効果的および／またはより効率的に行える。この方法の代わりに、またはこの方法に加えて、異なる最適な操作条件を有する酵素を組み合わせて用い、かつその操作条件を調整すると、タバコ材料の物理的特性に対する影響、例えば、タバコ材料の構造への損傷を最小限に抑えられる。
【００８１】
タバコ材料はタバコ材料のタンパク質含有量を所望のレベルまで低減させるのに十分な時間をかけて、タンパク質分解酵素でインキュベートしてもよい。
【００８２】
異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素を組み合わせて用い、インキュベーション中にその操作条件を調整する実施態様では、タバコ材料は１時間まで、２時間まで、３時間まで、４時間まで、または５時間までタンパク質分解酵素でインキュベートしてもよい。異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素を組み合わせて用いる実施態様によっては、インキュベーション時間は１時間までである。
【００８３】
異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素を組み合わせて用いる実施態様では、操作条件はある割合のインキュベーション時間が経過した後に調整してもよい。操作条件はインキュベーション時間の約２５％が経過した後、約５０％が経過した後、または約７５％が経過した後に調整してもよい。例えば、インキュベーション時間が１時間で、タンパク質分解酵素の組み合わせが２通りの異なる最適な操作条件を有する酵素からなる実施態様では、操作条件はインキュベーション時間の約５０％が経過した後、即ち、約３０分後に調整してもよい。インキュベーション時間が１時間で、タンパク質分解酵素の組み合わせが３通りの異なる最適な操作条件を有する酵素からなる実施態様では、操作条件はインキュベーション時間の約３３％が経過した後、即ち、約２０分後に１回目の調整をし、インキュベーション時間の約６６％が経過した後、即ち、約４０分後に２回目の調整をしてもよい。
【００８４】
タバコ材料／酵素混合物は酵素インキュベーション中に、例えば、かき混ぜる、揺らすおよび／または振とうすることで撹拌してもよい。タバコ材料／酵素混合物はタバコ材料の構造を損傷する機械的応力にタバコ繊維をさらさずに適度に混合するよう攪拌してもよい。
【００８５】
タバコ／酵素混合物中のタンパク質分解酵素の濃度は、所望のインキュベーション時間内に所望のレベルまでタンパク質含有量を低減させるのに十分なものであればよい。また同時に、この方法の間に使用されるタンパク質分解酵素の量は十分なほどの少量でよく、この方法の費用効率が高くなる。
【００８６】
タバコ材料に加えるタンパク質分解酵素および溶液の量は所望の酵素濃度に応じて決めてよい。
【００８７】
タンパク質分解酵素の濃度は約０．０１ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌの間および／または約０．１ｇ／Ｌ〜約２．０ｇ／Ｌの間であってよい。ある実施態様ではタンパク質分解酵素の濃度は約１．０ｇ／Ｌである。ある実施態様では、タンパク質分解酵素の濃度は約１．８ｇ／Ｌである。明確にすると、本明細書中で用いる場合、タンパク質分解酵素の濃度は酵素活性度と同一ではない。
【００８８】
ある実施態様では、タバコ材料は異なる最適な操作条件（双方とも濃度は１．０ｇ／Ｌで）の２種のタンパク質分解酵素で１時間インキュベートする。
【００８９】
タバコ材料の酵素処理でタンパク質断片に分解される。得られるタンパク質断片の多くはタバコ／酵素混合物の液体成分中に可溶化および／または分散されるので、タバコ材料から容易に分離される。
【００９０】
タンパク質分解酵素でタバコ材料をインキュベートした後、不溶性のタバコ材料はタバコ／酵素混合物の液体成分から分離してもよい。タバコ材料と液体成分は任意の好適な装置を用いて分離してよい。ある実施態様では、タバコ材料と液体成分は濾過で分離する。タバコ材料と液体成分を分離する好適な他の方法は当業者には周知であり、遠心分離および／または圧搾機、ふるいおよび／またはベルトフィルターの使用を含めてもよい。
【００９１】
ある実施態様では、タバコ材料と液体成分は１つ以上の濾過工程を用いて分離する。例えば、タバコ／酵素混合物を粗フィルターおよび／または微細フィルターに通してもよい。好適なフィルターは当業者には周知である。
【００９２】
図２は一実施態様によるタバコ材料の処理方法を示すフローチャートである。全葉タバコ材料２は必要に応じて洗浄工程３に通す。次に、タバコ材料を選択溶液に添加４し、溶液中のタバコ材料のｐＨおよび／または温度を必要に応じてタンパク質分解酵素の添加前に調整５する。次いで、タバコ材料はタンパク質分解酵素処理１０される。タバコ材料と得られたタバコ／酵素混合物の液体成分を分離２０することで、低タンパク質含量のタバコ材料３０および液体成分３１が得られる。
【００９３】
タバコ材料から分離した後、液体成分を廃棄してもよい。あるいは液体成分を残してもよい。例えば、液体成分を残して溶液を回収し、それを再利用してもよい。
【００９４】
タバコ／酵素混合物の液体成分から分離した後、タバコ材料を洗浄して任意のタンパク質断片および／または酵素を除去してもよい。タバコ材料は任意の好適な媒体で洗浄してよい。ある実施態様では、洗浄媒体を加熱する。ある実施態様では、洗浄媒体は食塩水である。
【００９５】
タバコ材料を処理してタバコ繊維に残存する任意の酵素を不活性化してもよい。好適な不活性化方法は当業者には周知である。ある実施態様では、タバコ材料を熱処理してタバコ繊維に残存する任意の酵素を不活性化してもよい。
【００９６】
異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素を組み合わせて用い、かつ酵素インキュベーション中にその操作条件を調整することからなる方法でタバコ材料を処理すると、タンパク質含有量は未処理のタバコ材料のタンパク質含有量の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％低減できる。ある実施態様では、タンパク質含有量は少なくとも５０％および／または少なくとも７５％低減される。
【００９７】
これとは別にまたはそれに加えて、異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素を組み合わせて用い、かつ酵素インキュベーション中にその操作条件を調整することからなる方法でタバコ材料を処理すると、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％のタンパク質をタバコ材料から除去できる。
【００９８】
ある実施態様では、異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素を組み合わせて用い、かつ酵素インキュベーション中にその操作条件を調整することからなる方法でタバコ材料を処理すると、未処理のタバコ材料に含有されるタンパク質の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％の量のタンパク質が抽出される。
【００９９】
本発明の方法は１つ以上の更なる処理工程を含んでもよい。好適な追加の処理工程としては、これらに限定されないが、１種以上の好適な非イオン性液体、例えば、水でタバコ材料を処理；１種以上の追加の酵素（ポリフェノール類の修飾を触媒する酵素でもよい）、例えば、フェノール酸化酵素でタバコ材料を処理；任意の好適な溶媒中で、１種以上の好適な界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）でタバコ材料を処理；適切な場合、任意の好適な溶媒中で、１種以上の好適な吸着剤、例えば、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）、ヒドロキシアパタイト、ベントナイト、活性炭、またはアタパルジャイトでタバコ材料を処理；および１種以上の好適な非水性液体、例えば、イオン性液体でタバコ材料を処理することが挙げられる。
【０１００】
その処理工程の代わりに、またはその工程に加えて、本発明の方法で処理したタバコ材料は、その後、更に抽出工程を行ってもよい。
【０１０１】
本発明の方法で処理した後、低タンパク質含量のタバコ材料を喫煙品にしてもよい。
【０１０２】
本明細書で用いる「喫煙品」という用語は、喫煙可能な製品、例えば、紙巻きタバコ、シガーおよびシガリロ（タバコ、タバコ派生物、膨張タバコ、再成タバコまたはタバコ代替品の何れからなるものでも）、並びに加熱するが燃焼しない製品（heat-not-burn products）を含む。喫煙品には喫煙者が吸引する気体用のフィルターを設けてもよい。
【０１０３】
本発明の方法で処理した後、タバコ材料は喫煙品にする前に任意の好適な方法で更に改変してもよい。例えば、タバコ材料を乾燥させて、ある特定の化学物質、例えば、法令で許される範囲の風味物質をタバコ材料に添加し、および／またはタバコ材料を切断および／または細断してから任意の好適な方法で喫煙品にしてもよい。
【０１０４】
本明細書で用いる「風味」および「風味物質」という用語は、成人消費者向け製品において所望の味や香りを生成するために、法令で許される範囲で、使用できる材料を指す。これらには、抽出物（例えば、甘草、アジサイ、朴葉、カモミール、コロハ、チョウジ、メントール、ハッカ、アニス果、シナモン、ハーブ、ヒメコウジ、サクランボ、ベリー類、桃、林檎、ドランブイ、バーボン、スコッチ、ウィスキー、スペアミント、ペパーミント、ラベンダー、カルダモン、セロリ、カスカリラ、ナツメグ、ビャクダン、ベルガモット、ゼラニウム、ハチミツエキス、バラ油、バニラ、レモン油、オレンジ油、カッシア、ヒメウイキョウ、コニャック、ジャスミン、イランイランノキ、セージ、フェンネル、オールスパイス、生姜、アニス、コリアンダー、コーヒー、またはハッカ属の任意の種に由来するハッカ油）、風味増強剤、苦味受容体部位阻害剤、感覚受容体部位活性剤または刺激剤、糖および／または糖代替物（例えば、スクラロース、アセスルファムカリウム、アスパルテーム、サッカリン、チクロ、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、果糖、ソルビトールまたはマンニトール）、並びにその他の添加物（例えば、木炭、葉緑素、ミネラル、植物成分、または呼気清涼化剤）を含めてもよい。これらは模造、合成または天然成分であってもよく、若しくはその混合物であってもよい。これらは任意の好適な形態、例えば、油、液体、または粉末であってもよい。
【０１０５】
図８を参照すると、例示であり限定するものではないが、本発明の一実施態様例による喫煙品１０１はフィルター１０２および円筒形の喫煙材ロッド１０３からなり、その喫煙材ロッド１０３は喫煙材が、例えば、本明細書に記載の発明により処理されたタバコなどからなり、喫煙材ロッド１０３の一端がフィルター１０２の端部に当接するようフィルター１０２と直線状につながる。従来通り、フィルター１０２はプラグラッパー（図示せず）で包み、喫煙材ロッド１０３はチッピング紙（図示せず）でフィルター１０２と接合させる。
【０１０６】
ある実施態様では、本明細書に記載の方法は任意の好適な方法でタバコ材料を改変する１つ以上の更なる工程を含んでもよい。例えば、タバコ材料を改変して、タバコ材料に望ましい１つ以上の特性を付与してもよい。例えば、処理済みのタバコ材料を紙巻きタバコなどの喫煙品にする場合、タバコ材料を処理して燃焼時に生じる風味を変えてもよく、および／または１種以上の化学物質を除去してもよい。
【０１０７】
実験作業
一連の実験はタバコ材料からのタンパク質除去を調べるために異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素を組み合わせて用い、酵素インキュベーション中にその操作条件を調整して行った。開示される実験作業は本発明の範囲を限定するものではない。
【０１０８】
実施例
実施例１−未洗浄タバコ材料を異なる最適な操作条件を有する２種のタンパク質分解酵素で処理
【０１０９】
タバコ材料の処理
全葉タバコを一定重量になるまで４５℃の乾燥室で乾燥してから破砕し、実験室規模でタバコを処理できるようにした。破砕した乾燥タバコ２５ｇを５００ｍＬの脱イオン水または緩衝液（用いる酵素の組み合わせに応じて選択し、酵素はSigma Aldrich（登録商標）社より入手）に入れた。図３を参照すると、第２群および第４群の酵素で処理したタバコは脱イオン水に入れ、アルカリ性緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）はアルカリ性ｐＨから開始するタバコ処理に使用し、酸性緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）は酸性ｐＨから開始するタバコ処理に使用した。異なる最適な操作条件を有する２種の酵素をそれぞれ１．０ｇ／Ｌの濃度で添加した後、得られたタバコ材料の懸濁液および酵素を１２０回転／分（ｒｐｍ）のインキュベーションシェーカーで１時間インキュベートした。インキュベーションシェーカーの温度は酵素の最適作用温度に応じて設定し、場合により、３０分のインキュベーション後に温度を変えた。ｐＨ値は酵素の最適作用ｐＨに応じて設定し、インキュベーション中、ｐＨメーターで観察し、場合により、３０分のインキュベーション後に４０％酢酸を添加して（ｐＨをより酸性にするため）または２Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加して（ｐＨをよりアルカリ性にするため）ｐＨを変えた。第２群または第４群の酵素で処理したタバコのｐＨで反応の過程で低下したものは酸添加の調整はしなかった。酵素でインキュベートした後、タバコ材料は２つの濾過工程で液体成分から分離し、最初の濾過工程は目の粗い濾紙を用いて行い、その濾液を濾紙から０．４５μｍの親水性ＰＶＤＦ膜シリンジフィルター（Rotilabo（登録商標）、直径２５ｍｍ、ドイツのCarl Roth社製）で濾過した。
【０１１０】
タバコ材料の処理に用いるパラメータを図３に概説する。
【０１１１】
タンパク質除去の分析
図３に従って調製し、得られた試料の液体成分に含まれる窒素量を分析した。全窒素はＴＯＣ−Ｎ分析計（島津製作所製）および／または全窒素試験キット（Spectroquant（登録商標）全窒素測光試験、ＤＭＰ１０〜１５０ｍｇ／Ｌ、Merck社製）を用いて測定した。
【０１１２】
液体成分の窒素含有量はニコチンおよび酵素タンパク質による窒素分を、ニコチンの窒素のおおよその割合を１７重量％とし、タンパク質の窒素のおおよその割合を１６重量％として補正した。
【０１１３】
ニコチン定量はＨＰＬＣを用いて、フェノメネックス・ジェミニ（Phenomenex-Gemini）カラムＣ１８．３μｍ、１５０×３ｍｍ、アイソクラティックを３０℃、流速０．６ｍＬ／分、注入量５μＬで行った。分離した液体成分の試料はアセトニトリル−水５０％、Ｎａ２Ｏ３、ｐＨ９．８で希釈した。２７７ｎｍでのＵＶ吸収をニコチンの外部較正標準で測定した。
【０１１４】
分析結果を図３に示す。表内の略語は以下の通りである。
ＴＮ：全窒素
ＴＮ−ＰＮ：酵素タンパク質による窒素
ＮＮ：ニコチンによる窒素
ＴＮ最終：酵素タンパク質およびニコチンによる窒素分を補正した液体成分中の全窒素
ＴＮ最終（％）：窒素除去効率の最も良い群を１００％として、残りの群をこの結果と比較
【０１１５】
実施例２−洗浄タバコ材料を異なる最適な操作条件を有する２種のタンパク質分解酵素で処理
【０１１６】
タバコ材料の処理
全葉タバコを破砕する前に洗浄および乾燥した以外は実施例１に従って全葉タバコを処理した。タバコ葉を手で５分毎にかき混ぜながら、５０℃の脱イオン水で２５分間洗浄した。水溶液を手で葉から押し出してから、タバコ葉を一定重量になるまで４５℃の乾燥室で乾燥し、次いで、実施例１に記載された通りに酵素処理した。
【０１１７】
タバコ材料の処理に用いるパラメータを図４に概説する。実施例１と同様に、第２群および第４群の酵素で処理したタバコは脱イオン水に入れた。
【０１１８】
タンパク質除去の分析
図４に従って調製し、得られた試料の液体成分に含まれる窒素量を実施例１に記載の方法に従って分析し、ニコチンおよび酵素タンパク質による窒素分を補正した。
【０１１９】
分析結果を図４に示す。
【０１２０】
実施例２（洗浄タバコ、図４）に従って調製したタバコ材料では、第１群と第４群の液体成分中の全窒素が最も高かった（即ち、より多くのタンパク質がタバコ原料から除去されたことを示す）。第４群は酵素インキュベーション中にｐＨを低下させて処理し、第１群は温度を３０℃〜４０℃に変化させた。酵素インキュベーション中のｐＨ増加もまた第５群で効果が見られた。
【０１２１】
第２群および第３群に見られたように、酵素インキュベーション中のｐＨの低下は実施例１（未洗浄タバコ、図３）に従って調製した未洗浄タバコ材料からのタンパク質除去に効果が見られた。酵素インキュベーション中のｐＨ増加（第５群で行われた様に）は未洗浄タバコ材料からのタンパク質除去にも効果があった。
【０１２２】
実施例３−未洗浄および洗浄タバコ材料を一定の操作条件下の１種の酵素で処理
【０１２３】
タバコ材料の処理
タバコ材料を１種の酵素で、即ち、同一の最適な操作条件で処理した以外は実施例１または２に従って全葉タバコを処理した。ｐＨおよび温度は酵素インキュベーション中、一定に保った。
【０１２４】
タバコ材料の処理に用いるパラメータを図５に概説する。
【０１２５】
タンパク質除去の分析
図５に従って調製し、得られた試料の液体成分に含まれる窒素量を実施例１に記載の方法に従って分析し、ニコチンおよび酵素タンパク質による窒素分を補正した。
【０１２６】
分析結果を図５に示す。
【０１２７】
１種の酵素で、かつ酵素インキュベーション中に一定のｐＨおよび温度で処理したタバコ材料では、タバコ材料を濃度１．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．５、温度４０℃のバチルス菌種の酵素で処理した時が、液体成分中の全窒素が最も高かった（即ち、より多くのタンパク質がタバコ原料から除去されたことを示す）。しかし、タンパク質除去のレベルは実施例１または２に従って処理される時のタンパク質除去のレベルよりも更に低く、これは異なる最適な操作条件を有する酵素を組み合わせてタバコ材料を処理し、かつ酵素インキュベーション中に操作条件を変化させる場合のほうが、１種の酵素のみでタバコ材料を処理し、かつ／または酵素インキュベーション中に操作条件を変化させない場合よりも効果的であることを示す。
【０１２８】
実施例４−洗浄タバコ材料を異なる最適な操作条件を有する２種のタンパク質分解酵素で処理
【０１２９】
タバコ材料の処理
酵素インキュベーション中にｐＨを１０分毎に約１ｐＨ単位で変化させた以外は実施例１または２に従って全葉タバコを処理した。ｐＨを低下させるのに、３０％酢酸溶液を用いた。ｐＨを増加させるのに、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いた。
【０１３０】
用いたタンパク質分解酵素はSavinase（登録商標）（バチルス菌種由来のタンパク質分解酵素）およびＡ．オリゼ由来のタンパク質分解酵素で、どちらも１．０ｇ／Ｌの濃度であった。酵素インキュベーション時間の合計は１時間で、酵素インキュベーション中の温度は３５℃に維持した。
【０１３１】
タンパク質除去の分析
得られた試料の液体成分に含まれる窒素量は、液体成分にニコチンおよび酵素タンパク質による窒素分の補正をしなかったこと以外は実施例１に記載の方法に従って分析した。
【０１３２】
分析結果を図６および図７に示す。
【０１３３】
図６および図７は液体成分の全窒素含有量が増加（これによって、タバコ材料からのタンパク質除去が増加）するにつれて、酵素インキュベーション時間が増加し、ｐＨが変化することを示す。ｐＨが１０〜４に低下（図６に示す）する場合よりも、ｐＨが４〜１０に増加（図７に示す）する場合のほうが液体成分の窒素含有量がより連続的に増加する。ｐＨがｐＨ１０〜４に変化した時に最高窒素除去が酵素インキュベーションの４０分後に見られ、その時のｐＨは約７〜５の間であった。
【０１３４】
種々の問題に対処し、本技術を進歩させるために、本開示の全体は例として種々の実施態様を示し、その実施態様では特許請求された発明が実施され、優れたタバコ処理、タバコ材料、およびタバコ材料を含む製品が提供される。本開示の利点および特徴は実施態様の単なる代表例であって、包括するおよび／または他を排除するものではない。これらは単に特許請求された特徴の理解を助け、教示するために提示されているに過ぎない。当然のことながら、本開示の利点、実施態様、実施例、機能、特徴、構造、および／または他の態様は特許請求の範囲で規定される本開示またはその均等物を限定するものではなく、本開示の範囲および／または概念から逸脱することなく他の実施態様を用いても、改変してもよい。種々の実施態様は、開示された要素、構成要素、特徴、部分、工程、手段等の種々の組み合わせを好適に含んでも、それらで構成されても、または本質的にそれらで構成されてもよい。更に本開示には、現在特許請求されていないが、将来特許請求される可能性がある他の発明も含まれる。
【図１】
2015535428.tif 000003
【図２】
2015535428.tif 000004
【図３】
2015535428.tif 000005
【図４】
2015535428.tif 000006
【図５】
2015535428.tif 000007
【図６】
2015535428.tif 000008
【図７】
2015535428.tif 000009
【図８】
2015535428.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成27年2月24日(2015.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タバコ材料を処理する方法であって、異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素を組み合わせて用いる工程と酵素インキュベーション中に前記操作条件を１種のタンパク質分解酵素の最適温度および／またはｐＨから別種のタンパク質分解酵素の最適温度および／またはｐＨに調整する工程とを含む方法。
【請求項２】
未処理のタバコ材料に比べて、処理したタバコ材料のタンパク質含有量を低減させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記操作条件の調整にｐＨ調整が含まれることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｐＨ調整が必要に応じて酸を添加してｐＨを低下させることを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ｐＨ調整が必要に応じてアルカリを添加してｐＨを増加させることを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記操作条件の調整に温度調整が含まれることを特徴とする請求項１乃至５いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記温度調整が低い温度を高くする調整を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記温度調整が高い温度を低くする調整を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素の組み合わせが２通りの異なる最適な操作条件を有する酵素からなることを特徴とする請求項１乃至８いずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素の組み合わせが３通りの異なる最適な操作条件を有する酵素からなることを特徴とする請求項１乃至９いずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
未処理のタバコ材料に比べて、前記処理したタバコ材料のタンパク質の含有量を少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、および／または少なくとも９０％低減させることを特徴とする請求項１乃至１０いずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１乃至１１いずれか１項に記載の方法で処理したタバコ材料またはその派生物。
【請求項１３】
請求項１２に記載のタバコ材料を含む喫煙品。
【請求項１４】
酵素インキュベーション中に操作条件を１種のタンパク質分解酵素の最適温度および／またはｐＨから別種のタンパク質分解酵素の最適温度および／またはｐＨに調整することにより、タバコ材料から１種以上のタンパク質を除去するための、異なる最適な操作条件を有するタンパク質分解酵素の組み合わせの使用。
【国際調査報告】
2015535428.tif 000011
2015535428.tif 000012
2015535428.tif 000013