(57)【要約】  本発明は、対象者におけるＨＩＶ-２による感染をＨＩＶ-１およびＨＩＶ-２双方による感染と区別するためのイムノアッセイ装置を用いる方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ-２陽性またはＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２陽性のいずれかであることが疑われる対象者において、ＨＩＶ-２による感染をＨＩＶ-１およびＨＩＶ-２双方による感染と区別するためのインビトロの方法であって、下記工程を含んでなる方法：
（ａ）対象者由来の体液試料を、少なくとも１つのＨＩＶ−１エンベロープ抗原およびヒトイムノグロブリンに結合できるコントロール試薬と、前記試料中に存在する抗体と（ｉ）前記ＨＩＶ−１抗原および（ｉｉ）前記コントロール試薬との間に複合体を形成することが可能な時間および条件下で、接触させる工程、
ここで、前記抗原および前記コントロール試薬は、固体支持体上の固有の部位に固定されている；
（ｂ）前記複合体の形成を、定量可能なシグナルを生成するシステムを用いて検出する工程；
（ｃ）前記少なくとも１つのＨＩＶ−１エンベロープ抗原について得られたシグナル強度を、コントロール試薬について得られたシグナル強度で割って正規化することにより、前記少なくとも１つのＨＩＶ−１エンベロープ抗原について正規化した値を得る工程；
（ｄ）いくつかのＨＩＶ−１エンベロープ抗原を使用する場合は、所望によりＨＩＶ−１エンベロープ抗原について正規化した値の平均値を算出する工程；
ここで、ＨＩＶ−１エンベロープ抗原について正規化した値または平均値が、予め決定した閾値よりも低いことは、前記対象者がＨＩＶ-２単独により感染していることを示す。
【請求項２】
少なくとも１つのＨＩＶ−１エンベロープ抗原が、組み換えｇｐ１６０、ｇｐ４１およびｇｐ１２０、その抗原フラグメント、ならびにｇｐ１６０、ｇｐ４１またはｇｐ１２０の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのＨＩＶ-１エンベロープ抗原が、組み換えｇｐ１６０、その抗原フラグメントまたはｇｐ１６０の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのＨＩＶ-１エンベロープ抗原が組み換えｇｐ１６０である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）において、体液試料が、組み換えｇｐ４１、その抗原フラグメントまたはｇｐ４１の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択されるＨＩＶ-１エンベロープ抗原とさらに接触される、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）において、体液試料が、ｇｐ４１の免疫優性エピトープを含むペプチドとさらに接触される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ｇｐ１６０抗原について正規化した値に対する予め決定した閾値が約０.３である、請求項３または４記載の方法。
【請求項８】
ｇｐ１６０抗原について正規化した値に対する予め決定した閾値が０.２７〜０.３３である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ｇｐ１６０およびｇｐ４１抗原についての平均値に対する予め決定した閾値が約０.６である、請求項５または６記載の方法。
【請求項１０】
ｇｐ１６０およびｇｐ４１抗原についての平均値に対する予め決定した閾値が０.５４〜０.６６である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）において、体液試料が、少なくとも１つのＨＩＶ−２抗原とさらに接触される、請求項１〜１０いずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのＨＩＶ−２抗原が、組み換えｇｐ３６、ｇｐ１０５およびｇｐ１４０、その抗原フラグメント、ならびにｇｐ３６、ｇｐ１０５またはｇｐ１４０の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
工程（ａ）において、体液試料が、少なくとも１つのＨＩＶ−１コア抗原および／または少なくとも１つのＨＩＶ−１のｐｏｌ抗原とさらに接触される、請求項１〜１２いずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ａ）において、体液試料が、組み換えｐ３１およびｐ２４、その抗原フラグメント、ならびにｐ３１またはｐ２４の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのＨＩＶ-１抗原とさらに接触される、請求項１〜１２いずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
体液試料が、全血液、血清および血漿からなる群から選択される、請求項１〜１４いずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
イムノアッセイが、遊走型アッセイ、フロースルー試験、ディップスティックアッセイまたはマイクロ流体アッセイである、請求項１〜１５いずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
イムノアッセイが、遊走型アッセイである、請求項１〜１６いずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
コントロール試薬が、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ／Ｇ、タンパク質Ｌおよびその誘導体、ならびに抗ヒトイムノグロブリン抗体からなる群から選択される、請求項１〜１７いずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
コントロール試薬がタンパク質Ａである、請求項１〜１８いずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｂ）において、定量可能なシグナルを生成するシステムが、検出可能な標識とコンジュゲートされたヒトイムノグロブリンに結合できる試薬である、請求項１〜１９いずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ヒトイムノグロブリンに結合できる試薬が、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ／Ｇ、タンパク質Ｌおよびその誘導体、ならびに抗ヒトイムノグロブリン抗体からなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ヒトイムノグロブリンに結合できる試薬が、タンパク質Ａである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
検出可能な標識が、コロイド状金属；非金属性コロイド；カーボン；可視化色素、蛍光色素、発光色素および化学発光色素；磁性粒子；放射性元素；および酵素からなる群から選択される、請求項２０〜２２いずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
定量可能なシグナルを生成するシステムが、コロイド状金属あるいは蛍光色素、発光物色素または化学発光色素とカップリングされたタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ／Ｇ、タンパク質Ｌおよびその誘導体からなる群から選択されるタンパク質を含むコンジュゲートである、請求項１〜２３いずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
定量可能なシグナルを生成するシステムが、コロイド状の金とコンジュゲートされたタンパク質Ａである、請求項１〜２４いずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、イムノアッセイの分野、特にＨＩＶ感染、具体的にはＨＩＶ-２感染を診断および区別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ-１）は、世界中のＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの大多数の件に関与している。ＨＩＶ-１は、ＨＩＶの第２の型、即ちＨＩＶ２型（ＨＩＶ-２）が単離された１９８６年まで、唯一の原因病原体であると考えられていた。
【０００３】
ＨＩＶ-２は、ほぼ西アフリカに限定されるが、この地域以外の国々、例えばポルトガル、フランス、モザンビーク、アンゴラ、インドおよびブラジルにおいて、ＨＩＶ-２感染についての散発的な報告がなされている。しかし、ＨＩＶ-１およびＨＩＶ-２タンパク質に対する抗体の交差反応性のために、ＨＩＶ-２感染患者は、ＨＩＶ-１感染として診断される可能性があり、世界中のＨＩＶ-２感染者数が、かなり少なく算出されるという傾向がある。
【０００４】
ＨＩＶ-１およびＨＩＶ-２は、遺伝子レベルでは５０％の類似性があり、ｇａｇおよびｐｏｌなどの保存遺伝子においては約６０％のホモロジーを有しており、またエンベロープ遺伝子においては約３９〜４５％のホモロジーを有している(Guyader et al., 1987）。それらは、伝播経路または感染細胞型などの多くの特徴が共通しているが、いくつかの固有の特徴も保持している。
【０００５】
ＨＩＶ-２は、ＨＩＶ-１よりも伝搬性が低く、感染の進行はより緩徐であるが、免疫抑制および臨床的ＡＩＤＳへと至らしめる可能性がある。ＨＩＶ-２感染の正確な同定は、ＨＩＶ-１感染とＨＩＶ-２感染では臨床管理および治療法が異なるために重要である。事実、いくつかの抗レトロウイルス薬、例えば非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤およびいくつかのプロテアーゼ阻害剤は、ＨＩＶ-２感染の治療において効力が低い(Ntemgwa et al, 2009）。
【０００６】
ＨＩＶ感染の検査診断のための標準法は、通常、ＨＩＶ抗体イムノアッセイ（第３または第４世代の酵素免疫吸着アッセイ（ＥＩＡ）または簡易迅速試験）を行ない、このアッセイが反応性であれば、その後に検証試験（ウェスタンブロットまたは免疫蛍光アッセイ）を行なうことからなる。ウェスタンブロット（ＷＢ）またはイムノブロッドは、最も広範に使用される検証試験である。しかし、これらの試験は、費用がかさみ、時間を要するものであり、ＨＩＶ-１タンパク質とＨＩＶ-２抗体との交差反応性のために不確定な結果を提供する可能性がある。
【０００７】
新規ＨＩＶ試験の利用可能性に基づいて、この標準法に替わる新規アルゴリズムが、２０１０年に米国で提案された(Pandori and Branson, 2010）。このアルゴリズムには、第３または第４世代ＥＩＡなどの高感度のＨＩＶ-１/２イムノアッセイが含まれ、そしてアッセイが反応性であれば、次に特異性が高いＨＩＶ-１／ＨＩＶ-２識別イムノアッセイが行われる。双方の試験で抗体に反応性がある試料は、ＨＩＶ-１またはＨＩＶ-２抗体のいずれかについて陽性と見なされる。次いで、第２試験で抗体に対して陰性の試料が、核酸増幅試験により試験される(Delaney et al., 2011）。この新規アルゴリズムが検証され、この新規アルゴリズムは、ＨＩＶ-１感染の検出に対する感度がより高く、多くの確定的な結果を提供し、より効率的にＨＩＶ-２を検出したことから、従前のアルゴリズムよりも優れていることが示された(Styer et al., 2011）。
【０００８】
現在までに、いくつかのアッセイ、例えばMultispot（登録商標）HIV-1/HIV-2迅速試験(Bio-Rad Laboratories）、Recombigen（登録商標）HIV-1/HIV-2 RTD試験(Cambridge Biotech）、PEPTI-LAV（登録商標）1-2試験(Bio-Rad Laboratories）、INNO-LIA（登録商標）HIV確認試験(Innogenetics）またはImmunocomb（登録商標）II HIV-1＆2 バイオスポット試験(Orgenics）などが、ＨＩＶ-１型感染とＨＩＶ-２型感染とを区別するために利用できる。INNO-LIA HIV I/II スコアアッセイは、欧州連合で診断的使用のために承認されているが、米国では現在使用することができない。現在までに、ＨＩＶ-１型とＨＩＶ-２型感染とを区別することができる唯一のアッセイとして、Multispot（登録商標）ＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２迅速試験(Bio-Rad Laboratories）がＦＤＡにより承認されている。このフロースルー試験は、ＨＩＶ-２ウイルスｇｐ３６エンベロープ糖タンパク質の免疫優性エピトープを提示する合成ペプチド、組み換えｇｐ４１(ＨＩＶ-１）エンベロープ糖タンパク質、およびＨＩＶ-１ウイルスｇｐ４１エンベロープ糖タンパク質の免疫優性エピトープを提示する合成ペプチドを用いることにより、ＨＩＶ-１をＨＩＶ-２抗体と区別する。しかし、これらのアッセイを用いた場合、かなりの割合の試料が区別されないまま残る。さらに、Multispot（登録商標）アッセイは、間違いが生じ易く、時間を要する希釈を必要とすることが多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
故に、ＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２交差反応性を真のＨＩＶ-２反応性と区別するために、高感度かつ特異的な結果を提供し、これにより不確定試料の割合を低下させる単純で迅速な費用効果のある診断試験に対する必要性が依然として存在している。この試験は、迅速なＨＩＶ試験結果を統計学的に検証するために設計された多重検定アルゴリズムにおいて使用するのに好適である。
【発明の効果】
【００１０】
発明の概要
我々は、試料中に存在しており、かつイムノアッセイ装置の固体支持体上に固定されたＨＩＶ-１エンベロープ抗原に結合できる抗体の反応性を使用して、ＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２交差反応性を真のＨＩＶ-２反応性と区別できることを実証した。このように、本発明は、イムノアッセイ結果を判定するための、かつ不確定試料の割合を減らすための新規方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従って、第一の態様において、本発明は、ＨＩＶ-２陽性またはＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２陽性のいずれかであることが疑われる対象者において、ＨＩＶ-２による感染をＨＩＶ-１およびＨＩＶ-２双方による感染と区別するための方法に関するものであり、この方法は下記の工程を含んでなる：
（ａ）対象者由来の体液試料を、少なくとも１つのＨＩＶ−１エンベロープ抗原およびヒトイムノグロブリンに結合できるコントロール試薬と、前記試料中に存在する抗体と、（ｉ）前記ＨＩＶ−１抗原および（ｉｉ）前記コントロール試薬との間に複合体を形成することが可能な時間および条件下で、接触させる工程、
ここで、前記抗原および前記コントロール試薬は、固体支持体上の固有の部位に固定されている；
（ｂ）前記複合体の形成を、定量可能なシグナルを生成するシステムを用いて検出する工程；
（ｃ）前記少なくとも１つのＨＩＶ−１エンベロープ抗原について得られたシグナル強度を、コントロール試薬について得られたシグナル強度で割って正規化することにより、前記少なくとも１つのＨＩＶ−１エンベロープ抗原について正規化した値を得る工程；
（ｄ）いくつかのＨＩＶ−１エンベロープ抗原を使用する場合は、所望によりＨＩＶ−１エンベロープ抗原について正規化した値の平均値を算出する工程；
ここで、ＨＩＶ−１エンベロープ抗原について正規化した値または平均値が、予め決定した閾値よりも低いことは、前記対象者がＨＩＶ−２単独により感染していることを示す。
【００１２】
試料は、少なくとも１つのＨＩＶ-２抗原、好ましくは少なくとも１つのＨＩＶ-２エンベロープ抗原とさらに接触されてもよい。
【００１３】
好ましくは、体液試料は、全血液、血清および血漿からなる群から選択される。
【００１４】
固体支持体は、組み換えｇｐ１６０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１、その抗原フラグメント、ならびにｇｐ１６０、ｇｐ１２０またはｇｐ４１の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのＨＩＶ−１エンベロープ抗原を含んでいてもよい。組み換えｇｐ３６、ｇｐ１０５およびｇｐ１４０、その抗原フラグメント、ならびにｇｐ３６、ｇｐ１０５またはｇｐ１４０の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのＨＩＶ−２抗原もまた含んでいてもよい。
【００１５】
特に、工程ａ）において、体液試料は、組み換えｇｐ１６０、その抗原フラグメントまたはｇｐ１６０の免疫優性エピトープを含むペプチド、好ましくは組み換えｇｐ１６０と接触されてもよい。この場合、本発明の特定の実施態様によれば、ｇｐ１６０抗原について正規化した値に対して予め決定した閾値は、約０.３、好ましくは０.２４〜０.３６、より好ましくは０.２７〜０.３３、さらに好ましくは０.２８〜０.３２である。所望により、体液試料は、組み換えｇｐ４１、その抗原フラグメント、またはｇｐ４１の免疫優性エピトープを含むペプチド、好ましくはｇｐ４１の免疫優性エピトープを含むペプチドとさらに接触されてもよい。この場合、本発明の特定の実施態様によれば、ｇｐ１６０およびｇｐ４１抗原についての平均値に対して予め決定した閾値は、約０.６、好ましくは０.４８〜０.７２であり、より好ましくは０.５４〜０.６６であり、さらに好ましくは０.５７〜０.６３または０.５８〜０.６２である。
【００１６】
本方法において、体液試料は、支持体上に固定された少なくとも１つのＨＩＶ-１コア抗原および／または少なくとも１つのＨＩＶ-１ｐｏｌ抗原とさらに接触されてもよい。特に、体液試料は、組み換えｐ３１およびｐ２４、その抗原フラグメント、およびｐ３１またはｐ２４の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのＨＩＶ-１抗原とさらに接触されてもよい。
【００１７】
好ましくは、イムノアッセイは、遊走型アッセイ、フロースルー試験、ディップスティックアッセイまたはマイクロ流体アッセイ、より好ましくは遊走型アッセイである。特に、遊走型アッセイは、二経路イムノアッセイであってもよい。
【００１８】
コントロール試薬は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ/Ｇ、タンパク質Ｌおよびその誘導体、抗ヒトイムノグロブリン抗体からなる群から選択されてもよい。好ましくは、コントロール試薬はタンパク質Ａである。
【００１９】
工程（ｂ）において、定量可能なシグナルを生成するシステムとは、検出可能な標識とコンジュゲートされたヒトイムノグロブリンに結合できる試薬であってよい。特に、この試薬は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ/Ｇ、タンパク質Ｌおよびそれらの誘導体ならびに抗ヒトイムノグロブリン抗体からなる群から選択されてもよい。好ましくは、ヒトイムノグロブリンに結合できる試薬は、タンパク質Ａである。検出可能な標識は、コロイド状金属；非金属コロイド類；カーボン；可視化色素、蛍光色素、発光色素および化学発光色素；磁性粒子；放射性元素；ならびに酵素からなる群から選択される。特定の実施態様において、定量可能なシグナルを生成するシステムは、コロイド状金属または蛍光色素、発光色素または化学発光色素とカップリングされたタンパク質を含むコンジュゲートであり、該タンパク質は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ/Ｇ、タンパク質Ｌおよびその誘導体からなる群から選択される。さらに特定の実施態様において、定量可能なシグナルを生成するシステムは、コロイド状の金とコンジュゲートされたタンパク質Ａである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】二経路ＨＩＶ-１/２イムノアッセイ装置の描写。図１Ａ：上部にハウジングのないＨＩＶ-１/２Geenius(登録商標）装置の写真。図１Ｂ：ＨＩＶ-１/２Geenius(登録商標）装置のＨＩＶ-１およびＨＩＶ-２の検査ラインおよび対照線。
【図２】ロットＡのＨＩＶ-１陽性(ｎ＝１３５）および不確定ＨＩＶ-２試料(１５４のＨＩＶ-２陽性試料全てに対する１０３の不確定試料）における、正規化したｇｐ１６０およびｇｐ４１のバンド強度に対する平均値［(ｇｐ１６０のバンド強度＋ｇｐ４１のバンド強度）/コントロールのバンド強度）/２］の分布。
【図３】ｇｐ１６０およびｇｐ４１のバンド強度に対する平均値［(ｇｐ１６０バンド強度＋ｇｐ４１バンド強度）／コントロールのバンド強度）／２］の閾値による、ロットＡのＨＩＶ-１陽性試料(ｎ＝１３５）の累積度数および不確定ＨＩＶ-２陽性試料のパーセンテージ（１５４のＨＩＶ−２陽性試料全てに対する１０３の不確定試料）。
【図４】ｇｐ１６０およびｇｐ４１のバンド強度に対する平均値［（ｇｐ１６０のバンド強度＋ｇｐ４１のバンド強度）／コントロールのバンド強度）／２］についての閾値による、ロットＡのＨＩＶ−１陽性試料（ｎ＝１３５）およびロットＢのＨＩＶ−１陽性試料（ｎ＝５０）の累積度数、ならびにロットＡの不確定ＨＩＶ−２陽性試料のパーセンテージ（１５４のＨＩＶ−２陽性試料全てに対する１０３の不確定試料）およびロットＢの不確定ＨＩＶ−２陽性試料のパーセンテージ（１３２のＨＩＶ−２陽性試料全てに対する９０の不確定試料）。
【００２１】
【図５】ロットＡのＨＩＶ−１陽性試料（ｎ＝１３５）およびロットＢのＨＩＶ−１陽性試料（ｎ＝５０）ならびにロットＡの不確定ＨＩＶ−２試料（１５４のＨＩＶ−２陽性試料全てに対する１０３の不確定試料）およびロットＢの不確定ＨＩＶ−２試料（１３２のＨＩＶ−２陽性試料全てに対して９０の不確定試料）における、ｇｐ１６０のバンド強度を正規化した値（ｇｐ１６０のバンド強度／コントロールのバンド強度）の分布。
【図６】ｇｐ１６０のバンド強度を正規化した値（ｇｐ１６０のバンド強度／コントロールのバンド強度）についての閾値による、ＨＩＶ−１陽性試料（ｎ＝１３５）の累積度数およびロットＡの不確定ＨＩＶ−２陽性試料のパーセンテージ（１５４のＨＩＶ−２陽性試料全てに対する１０３の不確定試料）。
【図７】ｇｐ１６０のバンド強度を正規化した値（ｇｐ１６０のバンド強度／コントロールのバンド強度）についての閾値による、ロットＢのＨＩＶ−１陽性試料（ｎ＝５０）の累積度数および不確定ＨＩＶ−２陽性試料のパーセンテージ（１３２のＨＩＶ−２陽性試料全てに対する９０の不確定試料）。
【図８】ｇｐ１６０のバンド強度を正規化した値（ｇｐ１６０のバンド強度／コントロールのバンド強度）についての閾値による、ロットＡのＨＩＶ−１陽性（ｎ＝１３５）およびＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２陽性試料（ｎ＝４）の累積度数。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（本発明の詳細な説明）
ＨＩＶ-１抗原とＨＩＶ-２抗体との交差反応性の故に、イムノアッセイを用いて、ＨＩＶ-２感染およびＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２重感染を区別する場合に、依然として課題が残っており、不確定試料が有意な割合となることが多い。
【００２３】
本発明者らは、遊走型アッセイ、特に前記試料中に存在するＨＩＶ−１抗体およびＨＩＶ−２抗体を検出および区別するために設計された二経路イムノアッセイを用いて、４７５のＨＩＶ陽性試料の全て（１８５のＨＩＶ−１、２８６のＨＩＶ−２および４のＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２）を含んでなる試料群を分析した。２８６のＨＩＶ−２陽性試料では、１９３の試料（６７.５％）が、ＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−２抗原の双方と反応性であり、不確定なままであった。
【００２４】
本発明者らは、不確定試料の割合を減らすために、ＨＩＶ-１エンベロープ抗原、特にｇｐ１６０および／またはｇｐ４１に対する抗体について得たシグナル強度と、陽性コントロールのシグナル強度との割合を算出した。このようにして、該試料中に存在する抗体とＨＩＶ-１エンベロープ抗原（特に、ｇｐ１６０および／またはｇｐ４１）との間の複合体について得たシグナル強度と、該試料中に存在する抗体とヒトイムノグロブリンを結合するコントロール試薬との間の複合体について得たシグナル強度との割合を、各試料について算出した。この割合を使用して、本発明者らは、ＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２交差反応性を、真のＨＩＶ-２反応性と区別できることを見出した。この割合に対する閾値を決定して、この閾値よりも低い割合を有する試料がＨＩＶ-２陽性であると考えられる。この方法を用いて試験結果を判定すると、区別できなかったのは、合計２８６のＨＩＶ−２陽性試料の全てに対して僅か１６の試料（５.６％）のみであった。
【００２５】
定義
本明細書で使用されるように、用語「対象者」あるいは「患者」は、成人、子供および出生前段階を含めたヒトをいう。好ましくは、対象者のＨＩＶ血清学的状態（即ち、「ＨＩＶ陰性」または「ＨＩＶ陽性」）は、後記するように、予め決定されているのが好ましい。本発明の方法は、ＨＩＶ-２陽性またはＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２陽性のいずれかであると疑われる対象者に特に好適である。
【００２６】
用語「ＨＩＶ陽性対象者」は、本明細書で使用されるように、あらゆる型のヒト免疫不全ウイルスに感染している患者をいう。この感染は、当業者には既知のあらゆる方法、例えば、酵素イムノアッセイ、ウェスタンブロットまたは核酸試験を用いて診断することができる。用語「ＨＩＶ-２陽性」は、本明細書で使用されるように、ＨＩＶ-２にのみ感染している対象者または前記対象者由来の試料をいう。用語「ＨＩＶ-１陽性」は、本明細書で使用されるように、ＨＩＶ-１にのみ感染している対象者または前記対象者由来の試料をいう。用語「ＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２陽性」は、本明細書で使用されるように、ＨＩＶ-１およびＨＩＶ-２の両方に感染している対象者または前記対象者由来の試料をいう。
【００２７】
用語「体液試料」、「試料」または「標本」は、本明細書で使用されるように、対象者から得られる抗体を含むあらゆる液体試料、例えば、全血液、血清、血漿、唾液、ミルク、羊水、尿あるいは精液試料をいう。この用語はまた、対象者由来のあらゆる細胞または組織調製物が培養された培養液を指し得る。体液試料は、全血液、血清または血漿の試料であるのが好ましい。試料は、生の試料または凍結試料であってもよい。試料を、採取直後に使用しても、または試験されるまで貯蔵することも可能である。特に、生の試料を、室温にて（２０〜３０℃）４８時間または２〜８℃で７日まで貯蔵されてもよい。長期貯蔵のためには、試料は、凍結されて（−２０℃またはそれ以下）、使用前に溶かしてもよい。試料を、使用前に、例えば、血液から血漿または血清を調製するか、または粘性液体を希釈するなどして処理してもよい。試料は、使用前に処理されないのが好ましく、特に熱不活性化されないのが好ましい。
【００２８】
用語「ＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２交差反応性抗体」は、本明細書で使用されるように、少なくとも１つのＨＩＶ-１抗原および少なくとも１つのＨＩＶ-２抗原と反応する抗体をいう。
【００２９】
本明細書で使用されるように、用語「ＨＩＶ抗原」は、抗ＨＩＶ抗体により認識されるエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をいう。特に、用語「ＨＩＶ-１抗原」は、ＨＩＶ-１の糖タンパク質に対する抗体により認識されるエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をいい、用語「ＨＩＶ−２抗原」は、ＨＩＶ−２のタンパク質または糖タンパク質に対する抗体により認識されるエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をいう。
【００３０】
用語「ＨＩＶ−１エンベロープ抗原」は、ＨＩＶ−１エンベロープの糖タンパク質に対する抗体により認識されるエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をいい、用語「ＨＩＶ−２エンベロープ抗原」は、ＨＩＶ−２エンベロープのタンパク質または糖タンパク質に対する抗体により認識されるエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をいう。該抗原は、化学的処理、遺伝子組み換えにより作成されてもよく、または生体試料から精製されてもよい。
【００３１】
特定の実施形態において、ＨＩＶ抗原は、ＨＩＶウイルスの組み換え、合成または精製タンパク質、あるいはあらゆるその抗原性フラグメントからなる群から選択される。用語「抗原フラグメント」とは、前記タンパク質または糖タンパク質に対する抗体により認識され得るものであり、かつ後者とのアフィニティー結合を可能とするタンパク質または糖タンパク質のフラグメントを意味することが意図される。好ましくは、前記抗原フラグメントは、少なくとも７つのアミノ酸残基の大きさを有する。より好ましくは、前記抗原フラグメントは、７〜４０のアミノ酸残基の大きさを有する。さらにより好ましくは、前記抗原フラグメントは、免疫優性エピトープを含む。
【００３２】
「組み換えタンパク質」は、組み換え発現系、例えば目的とするポリペプチドをコードする発現ベクターにて形質転換されたヒト細胞株において発現することにより産生されたポリペプチドを意味する。ＨＩＶ組み換えタンパク質は、様々な宿主細胞、例えば細菌(例えば、E. coli）、ヒト細胞、酵母または昆虫細胞［バキュロウイルス発現系を用いる(Arora and Seth, 2003）］で発現されてもよい。
【００３３】
「合成タンパク質」は、既知の方法を用いて化学的に合成されたあらゆる長さのアミノ酸の重合形態を意味する。
【００３４】
「精製タンパク質」は、ＨＩＶ感染細胞の上清から精製された天然ポリペプチドまたは目的とするポリペプチドをコードする発現ベクターにより形質転換された細胞の上清から精製された組み換えタンパク質を意味する。このポリペプチドは、それが元々随伴する細胞成分を実質的に含まない。特に、精製ポリペプチドは、ＨＩＶ抗体と非特異的に相互作用でき、偽陽性または陰性結果をもたらすいずれの成分も含まない。タンパク質の精製方法は、当分野ではよく知られている。 
【００３５】
用語「コントロール試薬」は、本明細書で使用されるように、アッセイの妥当性を決定するために、試料由来のヒトイムノグロブリン、特にＨＩＶおよび非ＨＩＶ抗体を結合できる試薬をいう。好ましくは、コントロール試薬は、ヒトイムノグロブリン、特にヒトＩｇＧのＦｃ領域に結合できる。コントロール試薬として使用され得る化合物の例は、これに限定するものではないが、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ/Ｇ、タンパク質Ｌおよびその誘導体；または、抗ヒトイムノグロブリン抗体、好ましくはヒトイムノグロブリンのＦｃ領域に対する抗体を包含する。特定の実施態様において、コントロール試薬はタンパク質Ａである。
【００３６】
用語「コンジュゲート」は、本明細書で使用されるように、目的とする分析物、特にヒトイムノグロブリンに結合し、かつ検出可能なシグナルを生成するように作成した化合物をいう。このコンジュゲートとは、通常、標識とコンジュゲートされる特異な結合メンバーを含む。
【００３７】
用語「免疫優性エピトープ」は、タンパク質または糖タンパク質の高度に保存された領域および／または高い免疫原性の領域をいう。広範囲に及ぶ研究により、ＨＩＶタンパク質および糖タンパク質の多くの免疫優性エピトープは十分に知られている(例えば、Robinson et al., 1990； Xu et al., 1991； Barin et al., 1996； Tomaras et al., 2008； Penn-Nicholson et al., 2008； Benjouad et al., 1993； Espejo and Uribe, 1990を参照されたい）。このように、当業者は、本発明において使用するための好適な免疫優性エピトープを含むペプチドを容易に作成できる。本発明において使用されるこのペプチドは、１またはいくつかの免疫優性エピトープを含んでもよい。
【００３８】
本明細書に使用されるとおり、用語「約」は、特定値の値±２０％の範囲をいう。例えば、「約２０」には、２０の±２０％または１６〜２４の範囲が含まれる。より好ましくは、用語「約」は、特定値の値±１０％の範囲をいう。さらにより好ましくは、特定値の値±５％または±３％の範囲をいう。
【００３９】
「少なくとも１つ」は、１つ、またはいくつかを意味する。
【００４０】
「いくつか」とは、本明細書では２つ、３つまたは３つ以上であり、好ましくは２を意味する。
【００４１】
以下に開示されたような本発明の方法は、好ましくはインビトロの方法である。
【００４２】
第一の態様において、本発明は、ＨＩＶ−２陽性またはＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２陽性のいずれかであることが疑われる対象者において、ＨＩＶ−２による感染をＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２双方による感染と区別する方法に関し、下記工程を含んでなる：
（ａ）対象者由来の体液試料を、少なくとも１つのＨＩＶ−１エンベロープ抗原およびヒトイムノグロブリンに結合できるコントロール試薬と、前記試料中に存在する抗体と（ｉ）前記ＨＩＶ−１抗原および（ｉｉ）前記コントロール試薬との間に複合体を形成することが可能な時間および条件下で、接触させる工程、
ここで、前記抗原および前記コントロール試薬は、固体支持体上の固有の部位に固定されている；
（ｂ）定量可能なシグナルを生成するシステムを用いて前記複合体の形成を検出する工程；
（ｃ）前記少なくとも１つのＨＩＶ-１エンベロープ抗原について得られたシグナル強度を、コントロール試薬について得られたシグナル強度で割って正規化することにより、前記少なくとも１つのＨＩＶ-１エンベロープ抗原について正規化した値を得る工程；
（ｄ）いくつかのＨＩＶ-１エンベロープ抗原を使用する場合は、所望によりＨＩＶ−１エンベロープ抗原について正規化した値の平均値を算出する工程；
ここで、ＨＩＶ−１エンベロープ抗原について正規化した値または平均値が、予め決定した閾値よりも低いことは、対象者がＨＩＶ-２単独により感染していることを示す。
【００４３】
ＨＩＶ-１エンベロープ抗原について正規化した値または平均値が予め決定した閾値よりも高いことは、対象者がＨＩＶ-１およびＨＩＶ-２双方に感染しているか、またはこの対象者に対して、ＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２交差反応性を真のＨＩＶ-２反応と区別するために少なくとも１つの追加試験が必要であることを示す。
【００４４】
本発明の方法において使用されるイムノアッセイ装置は、ＨＩＶ抗原およびコントロール試薬が結合された固体支持体を組み入れた固相イムノアッセイ装置である。固体支持体は、あらゆる形態（例えば、プレート、チューブまたはビーズ）および多くの好適な材（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、酢酸セルロース、ガラスファイバーまたはその他の多孔ポリマー）を使用することができる。
【００４５】
特に、イムノアッセイは、遊走型アッセイ、フロースルー試験、ディップスティックアッセイまたはマイクロ流体アッセイであってもよい。該イムノアッセイは、好ましくは遊走型アッセイまたはフロースルー試験であり、より好ましくは遊走型アッセイである。
【００４６】
遊走型アッセイ装置は、通常、試料パッド、コンジュゲートパッド、固有の部分（通常、固有のライン）にＨＩＶ抗原およびコントロール試薬を結合させた膜、吸収パッド、および所望により緩衝液パッド（試料パッドと異なる場合）を含んでなる。遊走型アッセイ装置とは、例えば、国際特許出願ＷＯ２００６／０９９１９１に記述したとおりの水平なフローストリップまたは二経路イムノアッセイ装置であってもよい。好ましい実施態様において、イムノアッセイは二経路イムノアッセイである。
【００４７】
フロースルーイムノアッセイ装置は、通常、固有の部分（通常、固有のスポット）にＨＩＶ抗原およびコントロール試薬を結合させた膜またはフィルターおよび吸収パッドを含んでなる。体液試料は、この膜に付され、毛細血管作用により拡散する。その後コンジュゲートが、ＨＩＶ抗体の存在を判定するために用いられる。任意の洗浄工程を、コンジュゲートの添加前および／または後に行なうことができる。
【００４８】
ディップスティックアッセイ装置は、通常、固有の部分（通常、固有のスポット）にてＨＩＶ抗原およびコントロール試薬を結合させた非孔質の固体支持体を含んでなる。アッセイを実施するために、この装置は、体液試料、洗浄溶液、コンジュゲート含有溶液、および所望により第二の洗浄溶液に連続的に浸漬される。
【００４９】
マイクロ流体アッセイは、「ラブオンチップ」装置、ミクロン寸のチャンネルのネットワークを含んでなる。ＨＩＶ抗原およびコントロール試薬は、前記マイクロチャンネルの表面に固定されてもよい(例えば、Ng et al., 2010；Song et al., 2012を参照されたい）。
【００５０】
イムノアッセイのこれらの全ての型は、当業者にはよく知られている。
【００５１】
本発明の方法の工程ａ）において、対象者由来の体液試料は、イムノアッセイ装置の固体支持体上に固定された少なくとも１つのＨＩＶ-１エンベロープ抗原と接触される。このＨＩＶ-１エンベロープ抗原は、ＨＩＶ-１のエンベロープ糖タンパク質またはその抗原フラグメントであってもよく、あるいは前記ＨＩＶ-１エンベロープ糖タンパク質に対する抗体により認識されるエピトープを含むペプチド、特に前記糖タンパク質の免疫優性エピトープを含むペプチドであってもよい。
【００５２】
ＨＩＶ-１エンベロープ糖タンパク質は、ＨＩＶ-１のｅｎｖ遺伝子にコードされる任意のタンパク質、即ちエンベロープ糖タンパク質前駆体ｇｐ１６０、外側エンベロープタンパク質ｇｐ１２０または膜貫通エンベロープタンパク質ｇｐ４１であってもよい。糖タンパク質は、組み換え技術により生成されても、化学的に合成されても、または生物学的試料から精製されてもよい。好ましくは、糖タンパク質は組み換えタンパク質である。
【００５３】
ある実施態様において、試料は、組み換えｇｐ１６０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１、その抗原フラグメント、ならびにｇｐ１６０、ｇｐ１２０またはｇｐ４１の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのＨＩＶ-１エンベロープ抗原と接触される。好ましくは、この試料は、組み換えｇｐ１６０およびｇｐ４１、その抗原フラグメント、ならびにｇｐ１６０またはｇｐ４１の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのＨＩＶ-１エンベロープ抗原と接触される。
【００５４】
特定の実施態様において、試料は、組み換えｇｐ１６０、その抗原フラグメント、およびｇｐ１６０の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのＨＩＶ-１エンベロープ抗原と接触される。好ましくは、この試料は、組み換えｇｐ１６０と接触される。所望により、この試料は、もう一つのＨＩＶ-１エンベロープ抗原、好ましくは組み換えｇｐ４１、その抗原フラグメントおよびｇｐ４１の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される抗原、より好ましくはｇｐ４１の免疫優性エピトープを含むペプチドと接触される。より特別な実施形態において、この試料は、組み換えｇｐ１６０およびｇｐ４１の免疫優性エピトープを含むペプチドと接触される。
【００５５】
別の特定の実施態様において、試料は、組み換えｇｐ４１、その抗原フラグメントおよびｇｐ４１の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのＨＩＶ-１エンベロープ抗原と接触される。
【００５６】
所望により、試料は、イムノアッセイ装置の支持体上に固定された少なくとも１つの別のＨＩＶ-１抗原とさらに接触されてもよい。追加のＨＩＶ-１抗原は、ＨＩＶ−１のｇａｇまたはｐｏｌ遺伝子によってコードされた組み換えタンパク質、合成タンパク質または精製タンパク質（例えば、ｐ６６、ｐ５５、ｐ５１、ｐ４０、ｐ３１／３４（「ｐ３１」）、ｐ２４／２５（「ｐ２４」）またはｐ１８）、あらゆるその抗原性フラグメントおよび前記タンパク質の免疫優性エピトープを含むあらゆるペプチドからなる群から選択されてもよい。特定の実施態様において、試料はさらに、組み換えｐ３１およびｐ２４、その抗原フラグメント、およびｐ３１またはｐ２４の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのＨＩＶ-１抗原と接触される。好ましくは、この試料は、さらにｐ３１および組み換えｐ２４の免疫優性エピトープを含むペプチドと接触される。
【００５７】
試料は、少なくとも１つのＨＩＶ−２抗原と接触されてもよい。ＨＩＶ−２抗原は、ＨＩＶ−２の組み換えタンパク質、合成タンパク質または精製タンパク質（または糖タンパク質）あるいはその抗原フラグメントであってもよい。ＨＩＶ−２抗原はまた、ＨＩＶ−２のタンパク質に対する抗体により認識されるエピトープを含むペプチド、特に前記タンパク質の免疫優性エピトープを含むペプチドであってもよい。
【００５８】
特に、ＨＩＶ−２タンパク質は、ｇａｇタンパク質（ｐ５６、ｐ２６およびｐ１６）、ｐｏｌタンパク質（ｐ６８およびｐ３４）およびエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１４０、ｇｐ１０５／１２５（「ｇｐ１０５」）およびｇｐ３６）からなる群から選択されてもよい。好ましくは、ＨＩＶ−２抗原は、ＨＩＶ−１抗体との交差反応を制限するために選択されてもよい。
【００５９】
ある実施態様において、工程ａ）では、試料は、ＨＩＶ−２のｅｎｖ遺伝子によってコードされた組み換えタンパク質、即ちエンベロープ糖タンパク質前駆体ｇｐ１４０、外側のエンベロープタンパク質ｇｐ１０５および膜貫通エンベロープタンパク質ｇｐ３６、その抗原フラグメント、ならびにｇｐ１４０、ｇｐ１０５またはｇｐ３６の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのＨＩＶ−２抗原とさらに接触される。好ましくは、この試料は、組み換えｇｐ３６およびｇｐ１４０、その抗原フラグメント、ならびにｇｐ３６またはｇｐ１４０の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのＨＩＶ−２抗原とさらに接触される。
【００６０】
特定の実施態様において、試料は、組み換えｇｐ３６、その抗原フラグメントおよびｇｐ３６の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのＨＩＶ−２抗原、好ましくはｇｐ３６の免疫優性エピトープを含むペプチドとさらに接触される。所望により、試料は、もう一つのＨＩＶ−２エンベロープ抗原、好ましくは組み換えｇｐ１４０、その抗原フラグメントおよびｇｐ１４０の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される抗原、より好ましくはｇｐ１４０の免疫優性エピトープを含むペプチドと接触されてもよい。
【００６１】
固体支持体上に固定されたＨＩＶ-抗原およびコントロール試薬の量は、最良の免疫反応性を提供するように当業者により容易に選択される。
【００６２】
試料由来の抗体と固定された抗原/試薬間との複合体形成が可能となる時間および条件は、本発明の方法において使用されるイムノアッセイ装置に依拠し、また当業者により容易に調整される。
【００６３】
試料由来の抗体と（ｉ）ＨＩＶ−抗原および（ｉｉ）コントロール試薬との複合体の形成は、定量可能なシグナルを生成するシステムを用いて後に検出される。このシステムは、各々固定された試薬／抗原に結合した抗体の量と比べて、検出可能なレベルまたは強度のシグナルを生成するように選択される。好ましくは、同じシステムが、ＨＩＶ抗原−抗体の複合体およびコントロール試薬−抗体の複合体についてのシグナルを生成させるために使用される。
【００６４】
通常、定量可能なシグナルを生成するシステムは、シグナル生成化合物にコンジュゲートした特異的な結合メンバーを含んでなる。特に、このシステムは、検出可能な標識とコンジュゲートされたヒトイムノグロブリン、好ましくはヒトイムノグロブリンのＦｃ領域に結合できる試薬であってもよい。
【００６５】
ある実施態様において、ヒトイムノグロブリン質に結合できる試薬は、ヒトイムノグロブリンのＦｃ領域に結合できるタンパク質、例えば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ/Ｇ、タンパク質Ｌおよひその誘導体、またはヒトイムノグロブリンに対する抗体、特にヒトイムノグロブリンのＦｃ領域に対する抗体からなる群から選択されるタンパク質である。
【００６６】
特異的な結合メンバーが抗体であるならば、このメンバーは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、組み換え抗体またはその混合物であり得る。かかる抗体の製造に関する詳細および特異的な結合メンバーとして使用するためのその適合性は、当業者にはよく知られている。
【００６７】
好ましい実施態様において、ヒトイムノグロブリンに結合できる試薬は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ/Ｇ、タンパク質Ｌおよひその誘導体からなる群から選択され、好ましくはタンパク質Ａである。
【００６８】
ヒトイムノグロブリンに結合できる試薬とコンジュゲートされる検出可能な標識は、定量可能な、好ましくは計測機器により定量可能なシグナルを生成するいかなる化合物であってもよい。好適な検出可能な標識は、例えば、金または銀などのコロイド状金属；非金属性コロイド、例えばコロイド状セレニウム、テルリウムまたは硫黄粒子；カーボン；可視化色素、蛍光色素、発光色素および化学発光色素；磁性粒子；放射性元素；および酵素からなる群から選択され得る。
【００６９】
特定の実施態様において、定量可能なシグナルを生成するシステムは、コロイド状金属または蛍光色素、発光色素または化学発光染色物質とカップリングしたヒトイムノグロブリンのＦｃ領域に結合できるタンパク質、好ましくはタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ/Ｇ、タンパク質Ｌおよびその誘導体からなる群から選択されるタンパク質を含むコンジュゲートである。好ましい実施態様において、定量可能なシグナルを生成するシステムは、コロイド状の金とカップリングしたタンパク質Ａを含むコンジュゲートである。
【００７０】
試料由来の抗体と固定された試薬/抗原との間の各複合体についてのシグナル強度は、好適な計測機器、特に画像を撮影および分析できる読取機器を用いて測定できる。計測機器の選択は、本発明の方法に使用される検出可能な標識およびイムノアッセイ装置により放出されるシグナルの性質によって変わる。
【００７１】
ＨＩＶ-１エンベロープ抗原-抗体複合体について得たシグナル強度は、コントロール試薬-抗体複合体により得たシグナル強度で割って正規化される。いくつかのＨＩＶ-１エンベロープ抗原が支持体上に固定される場合、正規化したシグナル強度の値は、これらの抗原各々について算出され得る。
【００７２】
ある実施態様において、ｇｐ１６０および／またはｇｐ４１抗原について正規化した値が算出される。用語「ｇｐ１６０抗原」は、本明細書で使用されるように、好ましくは、組み換えｇｐ１６０、その抗原フラグメントおよびｇｐ１６０の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される抗原をいう。用語「ｇｐ４１抗原」は、本明細書で使用されるように、好ましくは、組み換えｇｐ４１、その抗原フラグメントおよびｇｐ４１の免疫優性エピトープを含むペプチドからなる群から選択される抗原をいう。
【００７３】
いくつかのＨＩＶ-１エンベロープ抗原が固体支持体上に固定され、判定されるべき場合、正規化した値の平均値が算出される。即ち、ｎ個のＨＩＶ-１抗原の正規化した値の合計をｎにより割った値である。
【００７４】
ＨＩＶ-１エンベロープ抗原について得られたシグナル強度を正規化した値または平均値を使用して、ＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２交差反応性を真のＨＩＶ-２反応性と区別できることが認められた。ＨＩＶ-２交差反応性の場合には、この値がＨＩＶ-１およびＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２陽性試料において観察される値よりも統計学的に有意に低いことが判った。即ち、試料について正規化した値または平均値が予め決定した閾値よりも低いということは、ＨＩＶ-２単独による感染であるという指標である。反対に、試料に対して正規化した値または平均値が予め決定した閾値よりも高いということは、ＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２双方による感染の指標であるか、または前記試料について、ＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２交差反応性を真のＨＩＶ-２反応と区別するために追加試験が必要であることを示す。
【００７５】
ＨＩＶ-２陽性試料をその他の試料と区別するための閾値は、ＨＩＶ-１エンベロープ抗原の選択および数によって決定される。好ましくは、この閾値は、次の２つの要件を満たすように選択される：（ｉ）閾値をこえる正規化した値または平均値を有するＨＩＶ−２陽性試料の頻度が出来る限り低いこと、および（ｉｉ）閾値を下回る正規化した値または平均値を有するＨＩＶ−１およびＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２陽性試料の頻度が出来る限り低いこと。特に、この閾値は、正規化した値または平均値に対する（ｉ）ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２陽性試料と（ｉｉ）ＨＩＶ−２陽性試料との累積度数を示す曲線の最小交点として決定される。
【００７６】
ある実施態様において、イムノアッセイは、遊走型アッセイ、好ましくは国際特許出願 ＷＯ２００６/０９９１９１に記述されたような二経路イムノアッセイであり、
（１）ｇｐ１６０抗原について正規化した値が算出され、予め決定された閾値は、約０.３、好ましくは０.２４〜０.３６、より好ましくは０.２７〜０.３３、さらに好ましくは０.２８〜０.３２または０.２９〜０.３１である；
（２）ｇｐ４１抗原について正規化した値が算出され、予め決定された閾値は、約０.９、好ましくは０.７２〜１.０８、より好ましくは０.８１〜０.９９、さらに好ましくは０.８５〜０.９５または０.８７〜０.９３である；または
（３）ｇｐ１６０およびｇｐ４１抗原についての平均値が算出され、予め決定された閾値は、約０.６、好ましくは０.４８〜０.７２、より好ましくは０.５４〜０.６６、さらに好ましくは０.５７〜０.６３または０.５８〜０.６２である。
【００７７】
特定の実施態様において、本発明の方法は、下記の工程を含んでなる：
（ａ）対象者由来の体液試料を、少なくとも１つのｇｐ１６０抗原、好ましくは組み換えｇｐ１６０およびタンパク質Ａであるコントロール試薬と、前記試料中に存在する抗体と（ｉ）前記ＨＩＶ−１抗原および（ｉｉ）前記コントロール試薬との間に複合体を形成することが可能な時間および条件下で、接触させる工程、
ここで、前記抗原および前記コントロール試薬は、固体支持体上の固有の部位に固定されている；
（ｂ）前記複合体の形成を、定量可能なシグナルを生成するシステムを用いて検出する工程、ここで前記システムはコロイド状の金とコンジュゲートされたタンパク質Ａである；
（ｃ）ｇｐ１６０抗原について得られたシグナル強度を、タンパク質Ａについて得られたシグナル強度で割って正規化することにより、前記ｇｐ１６０抗原について正規化した値を得る工程、
ここで、予め決定した閾値である約０.３よりも低いｇｐ１６０抗原について正規化した値は、対象者がＨＩＶ−２単独で感染されていることを示す。好ましくは、予め決定した閾値は、０.２４〜０.３６、より好ましくは０.２７〜０.３３、さらに好ましくは０.２８〜０.３２または０.２９〜０.３１である。
【００７８】
特定の別の実施形態において、本発明の方法は、下記の工程を含んでなる：
（ａ）対象者由来の体液試料を、少なくとも１つのｇｐ４１抗原、好ましくはｇｐ４１の免疫優性エピトープを含むペプチドおよびタンパク質Ａであるコントロール試薬と、前記試料中に存在する抗体と（ｉ）前記ＨＩＶ−１抗原および（ｉｉ）前記コントロール試薬との間に複合体を形成することが可能な時間および条件下で、接触させる工程、
ここで、前記抗原および前記コントロール試薬は、固体支持体上の固有の部位に固定されている；
（ｂ）前記複合体の形成を、定量可能なシグナルを生成するシステムを用いて検出する工程、ここで前記システムはコロイド状の金とコンジュゲートされたタンパク質Ａである；
（ｃ）ｇｐ４１抗原について得られたシグナル強度を、タンパク質Ａについて得られたシグナル強度で割って正規化することにより、前記ｐ４１抗原について正規化した値を得る工程；
ここで、予め決定した閾値である約０.９よりも低いｇｐ４１抗原について正規化した値は、対象者がＨＩＶ−２単独にて感染されていることを示す。好ましくは、予め決定した閾値は、０.７２〜１.０８、より好ましくは０.８１〜０.９９、さらに好ましくは０.８５〜０.９５または０.８７〜０.９３である。
【００７９】
さらなる特定の実施態様において、本発明の方法は、下記の工程を含んでなる：
（ａ）対象者由来の体液試料を、少なくとも１つのｇｐ１６０抗原、好ましくは組み換えｇｐ１６０、少なくとも１つのｇｐ４１抗原、好ましくはｇｐ４１の免疫優性エピトープを含むペプチドおよびタンパク質Ａであるコントロール試薬と、前記試料中に存在する抗体と（ｉ）前記ＨＩＶ−１抗原および（ｉｉ）前記コントロール試薬との間に複合体を形成することが可能な時間および条件下で、接触させる工程、
ここで、前記抗原および前記コントロール試薬は、固体支持体上の固有の部位に固定されている；
（ｂ）定量可能なシグナルを生成するシステムを用いて前記複合体の形成を検出する工程、ここで前記システムはコロイド状の金とコンジュゲートされたタンパク質Ａである；
（ｃ）ｇｐ１６０抗原について得られたシグナル強度およびｇｐ４１抗原について得られたシグナル強度を、タンパク質Ａについて得られたシグナル強度で割って正規化することにより、前記ｇｐ１６０抗原およびｇｐ４１抗原について正規化した値を得る工程；
（ｄ）ｇｐ１６０およびｇｐ４１抗原について正規化した値の平均値を算出する工程；
ここで、予め決定した閾値である約０.６よりも低いｇｐ１６０およびｇｐ４１抗原についての平均値は、対象者がＨＩＶ−２単独にて感染されていることを示す。好ましくは、予め決定した閾値は、０.４８〜０.７２、より好ましくは０.５４〜０.６６、さらに好ましくは０.５７〜０.６３または０.５８〜０.６２である。
【００８０】
別の態様において、本発明は、ＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２交差反応性抗体を生じると疑われる対象者におけるＨＩＶ-２感染を診断するための方法に関し、この方法は次の工程を含んでなる：
(ａ）前記対象者由来の体液試料を、少なくとも１つのＨＩＶ−１エンベロープ抗原およびヒトイムノグロブリンに結合できるコントロール試薬と、前記試料中に存在する抗体と（ｉ）前記ＨＩＶ−１抗原および（ｉｉ）前記コントロール試薬との間に複合体を形成することが可能な時間および条件下で、接触させる工程、
ここで、前記抗原および前記コントロール試薬は、固体支持体上の固有の部位に固定されている；
（ｂ）定量可能なシグナルを生成するシステムを用いて前記複合体の形成を検出する工程；
（ｃ）前記少なくとも１つのＨＩＶ−１エンベロープ抗原について得られたシグナル強度を、コントロール試薬について得られたシグナル強度で割って正規化することにより、前記少なくとも１つのＨＩＶ−１エンベロープ抗原について正規化した値を得る工程；
（ｄ）いくつかのＨＩＶ−１エンベロープ抗原が使用される場合は、所望によりＨＩＶ１エンベロープ抗原について正規化した値の平均値を算出する工程；
ここで、予め決定した閾値よりも低いＨＩＶ−１エンベロープ抗原（複数を含む）について正規化した値または平均値は、対象者がＨＩＶ−２単独にて感染されていることを示す。
【００８１】
第一の態様に従う本発明の方法に関する全ての実施態様は、この態様に包含される。
【００８２】
本発明のさらなる局面および利点は、以下の実施例に記述されており、これは説明として見なされるべきであり、限定を意図するものではない。
【実施例】
【００８３】
実施例
材料および方法
ＨＩＶ陽性試料
ＨＩＶ陽性の対象者を民間の患者登録簿(Promedex または Bocabiolistics）または病院(La Pitie Salpetriere, Bichat, Paris, France）から得た。各標本の分類(ＨＩＶ-１、ＨＩＶ-２またはＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２陽性）を、ウェスタンブロットアッセイ(New Lav Blot 1, New Lav Blot 2, Bio-Rad Laboratories）により確認した。別法としては、その他の好適なウェスタンブロットアッセイ(Genetic Systems HIV-1を含む）および／または好適なＰＣＲ増幅アッセイを使用してもよい。
【００８４】
「Ｇｅｅｎｉｕｓ」イムノアッセイに関する２つのロット：ロットＡおよびロットＢを評価した。第一の試料群は、２９３のＨＩＶ陽性試料（１３５のＨＩＶ−１、１５４のＨＩＶ−２および４つのＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２二重反応性）を含んでなる。第二の試料群は、１８２のＨＩＶ陽性試料（５０のＨＩＶ−１および１３２のＨＩＶ−２）を含んでなる。
【００８５】
「Ｇｅｅｎｉｕｓ」イムノアッセイ装置
実験を、国際特許出願ＷＯ２００６／０９９１９１に記述された二経路イムノアッセイ装置を用いて行なった。この装置を以後「Ｇｅｅｎｉｕｓ」装置という。
【００８６】
簡潔には、この装置は、試験する試料の回収および輸送のための第一ストリップ（図１Ａ、ストリップ１）およびＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に対する抗体を検出するための第二ストリップ（図１Ａ、ストリップ２）を含んでなる。第一および第二ストリップは、プラスチックカード上に積層され、試験部位で互いに接触している。
【００８７】
第一ストリップは、ニトロセルロース膜に取り付けられたセルロース紙の試料パッドを含んでなる。第二ストリップは、緩衝液パッド、金コンジュゲートパッド、試験線および対照線およびシンクパッドを含んでなる。金コンジュゲートパッドは、紫色のコロイド状の金粒子とコンジュゲートされたタンパク質Ａをスプレーして得た。試験線を、ＨＩＶ-１およびＨＩＶ-２ペプチドまたは組み換えタンパク質を固定することにより得た。特に、この実施例において使用した装置は、次のものを含んでなる：線１：合成ＨＩＶ-２ペプチドｇｐ３６(ＨＩＶ-２エンベロープ）；線２：合成ＨＩＶ-２ペプチドｇｐ１４０(ＨＩＶ-２エンベロープ）；線３：合成ＨＩＶ-１ペプチドｐ３１(ＨＩＶ-１ポリメラーゼ）；線４：ＨＩＶ-１組み換えタンパク質ｇｐ１６０(ＨＩＶ-１エンベロープ）；線５：ＨＩＶ-１組み換えタンパク質ｐ２４（ＨＩＶ-１コア）；および線６：合成ＨＩＶ-１ペプチドｇｐ４１(HIV-1 Group M&O envelop）（図１Ｂ）。対照線は、固定されたタンパク質Ａにより構成される。
【００８８】
Ｇｅｅｎｉｕｓ装置を用いる試験方法
各標本について、５μＬの血清または血漿あるいは１５μＬの全血液をＧｅｅｎｉｕｓ装置の試料パッドに６０μＬの緩衝液と共に添加した。試料が試験領域（即ち、試験線および対照線）に達するまで、１ないし５分間（好ましくは１または２分間）待った後に、同じ緩衝液(１５０μＬ）を緩衝液パッドに添加して、金コンジュゲートを試験線および対照線へ移動させた。約１５分後に、試験結果を読み取った。
【００８９】
この結果の基本的な判定は、試験および対照線中の紫色の存在または非存在に基づいた。
【００９０】
対照線のみが紫色を示すならば、この試験をＨＩＶ陰性として判定した。少なくとも２本のＨＩＶ-１線(一つはエンベロープの線である）および対照線が紫色を呈すれば、この試験をＨＩＶ-１抗体に対して陽性として判定した。２本のＨＩＶ-２線および対照線が紫色を示したならば、この試験をＨＩＶ-２抗体に対して陽性と判定した。少なくとも１本のＨＩＶ-１線、少なくとも１本のＨＩＶ-２線および対照線が紫色を呈すれば、この試験を、不確定ＨＩＶ反応の結果として判定した。これらの結果を、画像を撮影および分析した自動読み取り機器を用いて取得した。
【００９１】
Multispot（登録商標）ＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２迅速試験およびINNO-LIA（登録商標）HIVI/IIスコアを用いる試験方法
このアッセイを、製造元の指示書に従い実施した。
マルチスポットアッセイを、希釈していない試料および１：１００の希釈試料について実施した。
【００９２】
結果
Ｇｅｅｎｉｕｓ装置のＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２試験線との反応性に基づくＨＩＶ試料の分類
本明細書において試験した全てのＨＩＶ−試料の反応性を、ウェスタンブロットまたはＰＣＲ増幅により確認した。次いで、これら全ての試料を、上記した「Ｇｅｅｎｉｕｓ」装置を用いて試験した。肉眼または自動読み取り機器により、ＨＩＶ-１および／またはＨＩＶ-２試験線上の紫色の呈色を判定し、試料を、ＨＩＶ-１反応性、ＨＩＶ-２反応性または不確定ＨＩＶ反応性として分類した。
【００９３】
この試験において、ＨＩＶ−１反応性の試料はいずれもＨＩＶ−２線上にて交差反応性を示さなかったが、ＨＩＶ−２反応性の試料の６６.９〜６８.２％が不確定試料と分類された（表１）。
【００９４】
ＨＩＶ-１/２の識別を改善するためのｇｐ１６０およびｇｐ４１バンドの色彩強度の使用
各バンドの色は、紫色のコロイド状の金粒子とコンジュゲートされたタンパク質Ａの凝集により生じる。この凝集は、タンパク質Ａが、固定された抗原と反応するイムノグロブリンのＦｃ部分に結合することを理由におこる。この各バンドの色彩強度は、固定された抗原と結合できる試料中に存在する抗体の量に依って変わる。
【００９５】
この色彩強度を、ロットＡおよびＢのＨＩＶ-１陽性または不確定ＨＩＶ-２陽性の試料各々についてｇｐ１６０、ｇｐ４１およびコントロールバンドを、自動読み取り機器により測定した。ｇｐ１６０およびｇｐ４１バンドから得た生データ値を、コントロールバンドの強度値に対するｇｐ１６０およびｇｐ４１バンドの強度値の割合（ｇｐ１６０＋ｇｐ４１／コントロール）を算出することにより正規化した。２つのＨＩＶ−１エンベロープ抗原についての平均値を算出した［（ｇｐ１６０＋ｇｐ４１／コントロール）／２］。
【００９６】
不確定ＨＩＶ-２試料の平均値は、ＨＩＶ-１陽性試料の平均値よりも有意に低いことがわかり、この割合を使用して、交差反応性を真の反応性と区別できることが実証された(図２〜４）。
【００９７】
平均値［（ｇｐ１６０＋ｇｐ４１）／コントロール）／２］に対する０.６という閾値では、ロットＡおよびロットＢのＨＩＶ−２陽性試料のそれぞれ６.５および４.５％のみが不確定なままであった（図４）。この閾値を考えて、０.６よりも低い平均値を有する試料を、ＨＩＶ−２抗体に対して陽性と判定した。
【００９８】
ＨＩＶ-１/２の識別を改善するためのｇｐ１６０バンドの色彩強度の使用
色彩強度を、ロットＡおよびロットＢのＨＩＶ-１陽性または不確定ＨＩＶ-２陽性の各試料のｇｐ１６０およびコントロールバンドについて自動読取機器を用いて測定した。ｇｐ１６０バンドから得た生データ値を、コントロールのバンド強度値に対するｇｐ１６０のバンド強度値の割合(ｇｐ１６０/コントロール）を算出することにより正規化した。
【００９９】
不確定ＨＩＶ-２試料のｇｐ１６０のバンド強度を正規化した値は、ＨＩＶ-１陽性試料の正規化した値よりも有意に低いことがわかり、この割合を使用して、交差反応性と真の反応性とを区別できることが実証された(図５）。
【０１００】
正規化した値（ｇｐ１６０／コントロール）に対する０.３という閾値では、ロットＡおよびロットＢのＨＩＶ−２陽性試料のそれぞれ５.８および７.６％のみが不確定なままであった（図６および７）。この閾値を考えて、０.３よりも低い正規化した値を有する試料を、ＨＩＶ−２抗体に対して陽性と判定した。
【０１０１】
ＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２重感染
ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２重感染の比率が低いために、試料群には、４つのＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２二重反応性の試料しか含まれなかった。
【０１０２】
ｇｐ１６０のバンド強度の正規化した値（ｇｐ１６０／コントロール）を、上記した方法を用いて各試料について算出した。本発明者らは、この値について、ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２重感染試料の分布が、ＨＩＶ−１陽性試料の分布と類似していることを見出した（図８）。即ち、この値を用いて、交差反応性ＨＩＶ-２陽性試料を、真のＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２反応性試料と区別できる。
【０１０３】
マルチスポットＨＩＶ-１/ＨＩＶ-２の迅速試験を用いる比較
また全ての試料を、マルチスポットＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２迅速試験により、製造元の指示書に従い試験した。結果を下記表１に示した。
【０１０４】
【表１】
2015518156.tif 000002
【０１０５】
この表は、希釈物または非希釈物を用いるマルチスポット試験、判定のためにいずれの割合も用いないＧｅｅｎｉｕｓ試験（試験線上の呈色に基づくのみ）、ならびにｇｐ１６０バンドに対する正規化した値（０.３の閾値を用いる）またはｇｐ１６０およびｇｐ４１バンドに対する平均値（０.６の閾値を用いる）を用いるＧｅｅｎｉｕｓ試験（交差反応性試料を真の反応性試料と区別するため）により得た、ロットＡおよびロットＢ中の不確定ＨＩＶ−２陽性試料のパーセンテージを示している。
【０１０６】
これらの結果は、割合（ｇｐ１６／コントロール）または［（ｇｐ１６０＋ｇｐ４１）／コントロール）／２］を用いるＧｅｅｎｉｕｓ試験の判定が、試料の希釈を必要としない（即ち、方法の簡略化）という利点を有するマルチスポット試験よりも、不確定なＨＩＶ反応性試料数を低下できることを実証するものである。
【０１０７】
INNO-LIA（登録商標）HIVI/IIスコアを用いる比較
これらＨＩＶ−２陽性試料のうち１８の試料を、INNO-LIA（登録商標）HIVI/IIスコア試験、判定のためにいずれの割合も用いないＧｅｅｎｉｕｓ試験（試験線上の呈色に基づくのみ）、ならびにｇｐ１６０およびｇｐ４１バンドの平均値（０.６の閾値を用いる）またはｇｐ１６０バンドを正規化した値（０.３の閾値を用いる）を用いるＧｅｅｎｉｕｓ試験（ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２交差反応性試料をＨＩＶ−２真の反応性試料と区別するため）を用いて試験した。
【０１０８】
全ての試料を、製造元の指示書に従いINNO-LIA（登録商標）HIVI/IIスコア試験を用いて試験した。
【０１０９】
【表２】
2015518156.tif 000003
【０１１０】
INNO-LIA（登録商標）HIVI/IIスコアを用いると、この試料群のうちの２７.８％は不確定なままであった。
Ｇｅｅｎｉｕｓ装置を用いた本発明の方法を使用した場合には、即ちｇｐ１６０のバンド強度(ｇｐ１６０/コントロール）を正規化した値と０.３の閾値またはｇｐ１６０およびｇｐ４１のバンド強度の平均値[(ｇｐ１６０＋ｇｐ４１）/コントロール）/２］と０.６の閾値を用いた場合に、全ての試料がＨＩＶ−２陽性の結果として正しく分類された。
【０１１１】
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【図１Ａ】
2015518156.tif 000004
【図１Ｂ】
2015518156.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2015518156.tif 000009
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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