(57)【要約】細胞アポトーシスを阻害するために、ならびに化学療法剤および／または電離放射線のアポトーシス効果から細胞および組織を保護するために有効な化合物を開示する。本発明の化合物は、LPA2受容体のアゴニストとして作用する。本発明の化合物は非脂質安息香酸誘導体を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Iの化合物：
2015526521.tif 000027
式中、Aは、
2015526521.tif 000028
であり；
Rは、Hまたは置換もしくは非置換フェニルであり；
R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、独立して、H、NO2、Br、Cl、またはOCH3であり；
Bは、C2〜C8アルキルまたはアルケニルであり；かつ
Cは、F、Cl、Br、NO2、NH2、OCH3、CH3、CO2H、またはフェニルで置換されていてもよい
2015526521.tif 000029
である。
【請求項２】
Aが
2015526521.tif 000030
である、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
Cが
2015526521.tif 000031
である、請求項1に記載の化合物。
【請求項４】
ヒトまたは動物対象の細胞および組織におけるアポトーシスを阻害するための方法であって、下記式Iの化合物を含む組成物の治療有効量を対象に投与する段階を含む、方法：
2015526521.tif 000032
式中、Aは、
2015526521.tif 000033
であり；
Rは、Hまたは置換もしくは非置換フェニルであり；
R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、独立して、H、NO2、Br、Cl、またはOCH3であり；
Bは、C2〜C8アルキルまたはアルケニルであり；かつ
Cは、F、Cl、Br、NO2、NH2、OCH3、CH3、CO2H、またはフェニルで置換されていてもよい
2015526521.tif 000034
である。
【請求項５】
Aが
2015526521.tif 000035
である、請求項4に記載の化合物。
【請求項６】
Cが
2015526521.tif 000036
である、請求項4に記載の化合物。
【請求項７】
1種もしくは複数種の化学療法剤、電離放射線、または両方の組み合わせの抗アポトーシス効果を防止または改善するためにヒトまたは動物対象を治療するための方法であって、治療有効量の下記式Iの化合物を対象に投与する段階を含む、方法：
2015526521.tif 000037
式中、Aは、
2015526521.tif 000038
であり；
Rは、Hまたは置換もしくは非置換フェニルであり；
R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、独立して、H、NO2、Br、Cl、またはOCH3であり；
Bは、C2〜C8アルキルまたはアルケニルであり；かつ
Cは、F、Cl、Br、NO2、NH2、OCH3、CH3、CO2H、またはフェニルで置換されていてもよい
2015526521.tif 000039
である。
【請求項８】
Aが
2015526521.tif 000040
である、請求項7に記載の化合物。
【請求項９】
Cが
2015526521.tif 000041
である、請求項7に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2012年8月27日に出願された米国仮特許出願第61/693,731号の優先権の恩典を主張し、この内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、新規の安息香酸誘導体を含む組成物に関する。より具体的には、本発明は、新規のスルファモイル安息香酸誘導体を含む化合物に関し、これらの化合物はLPA2受容体アゴニストとして作用する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
増殖因子様リゾリン脂質であるリゾホスファチジン酸（LPA）およびスフィンゴシン-1-リン酸（S1P）は、細胞生存、細胞増殖、細胞運動性および移動を含む、多くの基本的な細胞応答を調節する。LPAは、アポトーシスの防止およびアポトーシスカスケードの進行からの細胞の救済において大きな活性を有することが示された。LPA模倣物であるオクタデセニルチオホスフェート（OTP）（Durgam et al., Synthesis and pharmacological evaluation of second-generation phosphatidic acid derivatives as lysophosphatidic acid receptor ligands. Bioorg Med Chem Lett (2006) 16(3): 633-640（非特許文献1））は、放射線誘発アポトーシスからの細胞および動物の救済において、LPAと比較して、インビトロおよびインビボで優れた効能を示した（Deng et al., The lysophosphatidic acid type 2 receptor is required for protection against radiation-induced intestinal injury. Gastroenterology (2007) 132(5): 1834-1851（非特許文献2））。
【０００４】
Gタンパク質共役リゾホスファチジン酸2（LPA2）受容体は、生存促進性の応答を誘発して、アポトーシスから細胞を防ぎかつ救済する。LPA2刺激は、化学療法剤誘発アポトーシスおよび放射線誘発アポトーシスからの保護を提供する。したがって、非常に有効なLPA2特異的アゴニストは、多大な治療的価値を有し得る。
【０００５】
LPAベースの薬物候補の開発は、S1PおよびLPA Gタンパク質共役受容体（GPCR）リガンド結合ポケットの疎水性環境に主に取り組むための、脂質様リガンドの発見にこれまで限られてきた。ごく少数のLPA受容体リガンドが非脂質構造特徴を利用し、これらとしては、Ki16425、LPA1/2/3アンタゴニスト（Ohta et al., Ki16425, a subtype-selective antagonist for EDG-family lysophosphatidic acid receptors. Mol Pharmacol (2003) 64(4): 994-1005（非特許文献3））、およびLPA1選択的化合物のAM095-152シリーズ（Swaney et al., Pharmacokinetic and pharmacodynamic characterization of an oral lysophosphatidic acid type 1 receptor-selective antagonist. J Pharmacol Exp Ther (2011) 336(3): 693-700（非特許文献4））が挙げられる。LPAアナログの開発における大きな障害は、それらの高度な疎水性であり、これにより、これらの薬剤は理想的な薬物候補ではない。別の複雑な要因はLPA GPCRの多様性であり、このことは、LPA2のような単一の標的に特異的な化合物の開発の重大な課題である。
【０００６】
医薬として非脂質分子を使用することには薬理学的利点がある。薬物様非脂質化合物の発見および開発は、望ましい細胞および全身効果をもたらす様式でLPA受容体と相互作用することができる、さらにより効果的な分子をもたらし得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Durgam et al., Synthesis and pharmacological evaluation of second-generation phosphatidic acid derivatives as lysophosphatidic acid receptor ligands. Bioorg Med Chem Lett (2006) 16(3): 633-640
【非特許文献２】Deng et al., The lysophosphatidic acid type 2 receptor is required for protection against radiation-induced intestinal injury. Gastroenterology (2007) 132(5): 1834-1851
【非特許文献３】Ohta et al., Ki16425, a subtype-selective antagonist for EDG-family lysophosphatidic acid receptors. Mol Pharmacol (2003) 64(4): 994-1005
【非特許文献４】Swaney et al., Pharmacokinetic and pharmacodynamic characterization of an oral lysophosphatidic acid type 1 receptor-selective antagonist. J Pharmacol Exp Ther (2011) 336(3): 693-700
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、式Iの化合物に関する：
2015526521.tif 000002
式中、Aは、
2015526521.tif 000003
であり；
Rは、Hまたは置換もしくは非置換フェニルであり；
R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、独立して、H、NO2、Br、Cl、またはOCH3であり；
Bは、C2〜C8アルキルまたはアルケニルであり；かつ
Cは、F、Cl、Br、NO2、NH2、OCH3、CH3、CO2H、またはフェニルで置換されていてもよい
2015526521.tif 000004
である。
【０００９】
本発明はまた、対象の細胞および組織におけるアポトーシスを減少させるために、治療有効量の1種または複数種の式Iの化合物をヒトおよび／または動物対象に投与する段階を含む方法に関する：
2015526521.tif 000005
式中、Aは、
2015526521.tif 000006
であり；
Rは、Hまたは置換もしくは非置換フェニルであり；
R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、独立して、H、NO2、Br、Cl、またはOCH3であり；
Bは、C2〜C8アルキルまたはアルケニルであり；かつ
Cは、F、Cl、Br、NO2、NH2、OCH3、CH3、CO2H、またはフェニルで置換されていてもよい
2015526521.tif 000007
である。
【００１０】
本発明の様々な局面において、方法は、化学療法剤および／または放射線へ供されたヒトおよび／または動物対象の細胞および組織におけるアポトーシスを減少させるために治療有効量の式Iの化合物を投与する方法を含む。様々な局面において、放射線は電離放射線であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】個々のLPA GPCRサブタイプを発現する細胞株におけるLPA GPCR活性化Ca2+トランジェントによって示された、プロトタイプヒット化合物NSC12404の受容体特異性を示す一連の4つのグラフである。この図に示される曲線は、少なくとも2つの実験を代表する。
【図２】個々のLPA GPCRサブタイプを発現する細胞株におけるLPA GPCR活性化Ca2+トランジェントによって示された、プロトタイプヒット化合物NSC12404の受容体特異性を示す一連の4つのグラフである。この図に示される曲線は、少なくとも2つの実験を代表する。
【図３】LPA2 GPCRについてのファルマコフォア作製の図である。作製された三次元ファルマコフォア（パネルA）は、ドッキングされたLPA（パネルB）、GRI977143（パネルC）、およびNSC12404（パネルD）の共通の構造特徴に基づいた。ファルマコフォア作製のために使用した3つのアゴニスト（ボールおよびスティック）を、以前確認されたリガンド結合ポケットの4.5Å以内のキーアミノ酸残基（紫色）との相互作用と共に示す。
【図４】線維芽細胞増殖に対するLPA（1μM）、OTP（1μM）およびGRI977143（10μM）の効果を示すグラフである。パネルAはベクター形質導入MEF細胞の増殖曲線を示し、パネルBはLPA2形質導入MEF細胞の増殖曲線を示す。値は平均値±S.Dであり、2つの独立した実験を代表する（*p≦0.05、**p≦0.01、***p≦0.001）。
【図５】MM1肝細胞がん細胞によるHUVEC単層の浸潤に対するGRI977143の効果を示す棒グラフである。データは、5つの重複していない領域の平均値であり、2つの独立した実験を代表する（*p≦0.05、***p≦0.001）。
【図６】ベクター-（白色バー）またはLPA2-形質導入（黒色バー）MEF細胞におけるアドリアマイシン誘発アポトーシスシグナル伝達に対するLPA（パネルA、B、D：1μM；パネルC：3μM）、OTP（パネルA、B、D：1μM；パネルC：3μM）、およびGRI977143（10μM）の効果を示す一連の棒グラフである。バーおよびデータポイントは三つ組のウェルの平均値を示し、データは3つの独立した実験を代表する（*p≦0.05、**p≦0.01、***p≦0.001）。
【図７】ベクター-（白色バー）またはLPA2-形質導入（黒色バー）MEF細胞における血清除去誘発アポトーシスシグナル伝達に対するLPA（パネルAおよびB：3μM；パネルC、D：10μM）、OTP（3μM）、およびGRI977143（10μM）の効果を示す一連の棒グラフである。バーおよびデータポイントは三つ組のウェルの平均値を示し、データは3つの独立した実験を代表する（*p≦0.05、**p≦0.01、***p≦0.001）。
【図８】IEC-6細胞におけるTNFαおよびCHX処理によって誘発される外因性アポトーシスによって誘発されるDNA断片化に対するLPA（1μM）、OTP（10μM）、およびGRI977143（10μM）の効果を示す棒グラフである。バーは三つ組のウェルの平均値を示し、データは2つの実験を代表する（***p≦0.01）。
【図９】アドリアマイシン-または血清除去-誘発アポトーシス後のベクター-またはLPA2-形質導入MEF細胞における細胞質BaxレベルおよびPARP-1切断に対するGRI977143の効果を示すウェスタンブロットの写真である。示されるウェスタンブロットは3つの実験を代表する。
【図１０】LPA（1μM）、OTP（1μM）、またはGRI977143（10μM）によって活性化されたシグナル伝達経路を示す。GRI977143処理後のベクター-（白色バー）およびLPA2-形質導入（黒色バー）MEF細胞における平均ERK1/2活性化の、代表的なウェスタンブロット（パネルA）およびデンシトメトリー（パネルB）。データをアクチンに基づく同等のローディングについて正規化し、データは3つの独立した実験を代表する（*p≦0.05、***p≦0.001）。パネルCは、GRI977143がFLAG-LPA2、EGFP-NHERF2、および内因性TRIP6間の高分子複合体集合を誘発することを示している。示されるブロットは、2つの共トランスフェクション実験を代表する。
【図１１】LPA18:1、オクタデセニルチオホスフェート(OTP)、およびGRI977143の化学構造を示す。
【図１２】非常に有効かつ特異的なLPA2アゴニストの開発のために本発明者が提案した構造修飾を示す。
【図１３】本発明の化合物の合成についての一連の3つのスキームである。
【図１４】LPA2 DKO MEF細胞（A）およびEV DKO MEF（B）におけるカスパーゼ-3/7活性化の阻害を示す棒グラフである。LPA（1〜3μM）、化合物5a（1〜3μM）および化合物7b（1〜3μM）を、アドリアマイシンでの処理の1時間前に細胞へ添加した。化合物5aおよび7bでの前処理は、LPA2 DKO MEF細胞におけるアポトーシスを有意に減少させたが、EV DKO MEF細胞におけるアポトーシスは有意には減少させなかった（*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001）。
【図１５】LPA2 DKO MEFおよびEV DKO MEF細胞におけるDNA断片化に対するLPA（1〜3μM）および化合物5a（3〜10μM）の効果を示す棒グラフである。化合物5aは、3μM濃度で、アドリアマイシン誘発DNA断片化からLPA2形質導入細胞を選択的に保護した（***p<0.001）。10μMでの60分間の前処理は、LPA2 DKO MEF細胞においてDNA断片化をほぼ50%パーセント減少させた。EV DKO MEF細胞において保護はされなかった。
【図１６】LPA（3μM）、化合物5a（3〜10μM）をアドリアマイシン処理の1時間前に細胞へ添加した、LPA2 DKO MEF細胞および空ベクターDKO MEF細胞におけるイニシエーターカスパーゼ8の阻害を示す棒グラフである。
【図１７】LPA（3μM）、化合物5a（3〜10μM）をアドリアマイシン処理の1時間前に細胞へ添加した、LPA2 DKO MEF細胞および空ベクターDKO MEF細胞におけるイニシエーターカスパーゼ9の阻害を示す棒グラフである。
【図１８】LPA2 DKO MEF細胞（A）およびベクター形質導入細胞（B）におけるLPA、化合物5aおよび7bによるエグゼキューショナー（executioner）カスパーゼ3および7の阻害を示す棒グラフである。保護化合物を15 Gyでの照射の1時間後に細胞へ添加し、カスパーゼ3,7活性化を照射の4時間後に測定した（***p<0.001、照射ビヒクルとの比較）。
【図１９】LPA2 DKO MEF細胞（A）および空ベクターDKO MEF細胞（B）におけるイニシエーターカスパーゼ9の阻害を示す棒グラフである（*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001）。保護化合物LPA（1〜3μM）、5aおよび7b（1〜3μM）を15 Gyでのγ照射の1時間後に細胞へ添加し、DNA断片化を照射の4時間後に測定した（**-p<0.001、照射ビヒクルとの比較）。
【図２０】15.68 Gy PBI-BM5 γ照射へ曝露されたC57BL/6マウスの死亡率プロファイルである。特に、化合物5aおよび7aは死亡率を有意に減少させ（p<0.001）、一方、この投薬および処方での化合物7bは効果がなかった。群サイズは16〜20マウス／群であった。
【図２１】化合物RP-10-71およびRP-10-73のアゴニズムについてのFura-2AM Ca2+アッセイの結果を示すグラフである。LPA18:1と比較してのRP-10-71およびRP-10-73のCa2+動員のEC50値を測定するために、Fura-2AMが負荷されたLPA2 DKO MEF細胞の三つ組のウェルを、Krebs緩衝液中の等モル濃度のBSAの存在下で、0.0003---0.1μM LPA18:1または0.003〜3μM RP化合物で処理した。340/510 nmおよび380/510 nmのEx/Emλで、合計70秒間、蛍光を3.42秒ごとに読み取った。次いで、データ（相対的蛍光）を、各濃度についての三つ組の平均蛍光比率値として記録した。次いで、GraphPad Prismバージョン5.0aを使用し、可変傾斜モデルにおける非線形回帰曲線に適合させ（A）、EC50、Emax、およびカーブフィット(R2)を決定した（B）。数値結果を実施例中の表3に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
本発明者らは、LPA2受容体特異的アゴニストとして有用である安息香酸誘導体を含む化合物を開発し、これらの化合物は、損傷細胞における、例えば、照射によっておよび／または癌化学療法のために使用されるもののような化学療法剤への曝露によって損傷された細胞におけるアポトーシスを、阻害することについて有効である。化合物は、細胞増殖を促進することについても有効であり、標的細胞の増殖を促進するために、治療的にまたは例えば組成培養物中においてのいずれかで使用され得る。LPAは、マクロファージ、シュワン細胞、Tリンパ球、線維芽細胞、内皮細胞、および骨芽細胞における細胞生存の増大と関連付けられた。現在の証拠は、これがLPA2媒介効果であることを示唆している。したがって、本発明の化合物を含む組成物はまた、免疫障害、損傷後の骨再形成、内皮機能不全、およびうっ血性心不全などの様々な状態において治療効果を有し得る。
【００１３】
本発明の化合物は、式Iの化合物を含む：
2015526521.tif 000008
式中、Aは、
2015526521.tif 000009
であり；
Rは、Hまたは置換もしくは非置換フェニルであり；
R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、独立して、H、NO2、Br、Cl、またはOCH3であり；
Bは、C2〜C8アルキルまたはアルケニルであり；かつ
Cは、F、Cl、Br、NO2、NH2、OCH3、CH3、CO2H、またはフェニルで置換されていてもよい
2015526521.tif 000010
である。
【００１４】
本発明者らは、これらの受容体の確認された分子モデルから以前に導き出した類似性探索を使用する仮想スクリーニング戦略を適用した。Lipinskiの5の法則（Lipinski, 2003）を満たす薬物様化合物を有する化学ライブラリーに探索を限定した。放射線および化学療法と関連するプログラム細胞死におけるその役割に起因して（Deng et al., 2007）、LPA2受容体サブタイプについてのリガンドの発見に仮想スクリーニングの焦点を当てた。
【００１５】
本発明者らは、仮想スクリーニング法を使用し、LPA2の特異的アゴニストである4つの非脂質化合物を同定した：
2015526521.tif 000011
2015526521.tif 000012
【００１６】
これらのヒットのうちの1つ（Genome Research Institute（GRI）化学ライブラリーからのGRI977143）を選択し、いくつかのアッセイシステムでその細胞応答およびシグナル伝達応答を特徴付けした。結果は、化合物GRI977143がLPA2の特異的アゴニストであり、いかなる他の公知のまたは推定のLPA GPCRも活性化しないことを実証した。本発明者らはまた、GRI977143が、プログラム細胞死の防止においてはLPAと同様に有効であるが、Ca2+動員アッセイならびにカスパーゼ3および7阻害アッセイにおいてはLPAよりも高いEC50を有することを示した。GRI977143は、カスパーゼ3、7、8、および9の活性化、B細胞リンパ腫2（Bcl-2）結合Xタンパク質（Bax）トランスロケーション、ならびにポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ1（PARP-1）切断を阻害し、外因性または内因性アポトーシスシグナル伝達カスケードの活性化後のDNA断片化を減少させた。さらに、GRI977143が細胞外シグナル制御キナーゼ1/2（ERK1/2）生存経路を強く活性化し、LPA2、甲状腺受容体相互作用タンパク質6（TRIP6）、およびNa+-H+交換調節因子2（NHERF2）からなる高分子シグナロソームの集合をもたらすことを実証し、これは、この受容体サブタイプによって誘発される生存促進性シグナル伝達のために必要とされることが示されており、そのLPA2受容体サブタイプ特異性をさらに確認する。したがって、本発明は、細胞および組織への化学療法および／または放射線損傷後に、アポトーシスを阻害し細胞生存を増大させるための方法を提供する。方法は、ヒトおよび／または動物対象が化学療法剤および／または電離放射線へ曝露された後に細胞生存を増大させるために、治療有効用量のGRI977143をヒトおよび／または動物対象に投与する段階を含む。
【００１７】
各フィンガープリントを使用して類似性探索を別々に行い、類似性を定量化した。各探索からの80%類似性閾値を満たすヒットを、標的分子NSC12404に対する類似性のTanimoto係数指標に基づいてランク付けし、各フィンガープリント探索からの上位75個のユニークなヒットをさらなる分析のために選択した。さらなる分析のために選択した225個の化合物を、Molecular ACCess Systemキーフィンガープリント（MACCSキー）を使用して計算したTanimoto係数に基づいてクラスタリングし、MOEにおいて実行される多様性サブセット機能（diversity subset function）を使用して評価した。これによって、各クラスター中の中央の化合物を選ぶことにより生物学的評価についての27個の化合物の多様性サブセットが選択された。これらの27個の化合物を、LPA2を個々に発現する安定細胞株を使用しておよびさらにベクタートランスフェクト対照細胞にて、10μMの濃度でCa2+動員アッセイにおいて試験した。LPA2を活性化するヒットを、他の確立されたおよび推定のLPA GPCRを発現する細胞を使用してさらに試験した。選択された化合物の実験的試験によって、3つの新しい選択的LPA2アゴニストであるGRI977143、H2L5547924、およびH2L5828102が同定された。H2L5547924、H2L5828102およびGRI977143は、10μMまでのレベルで適用された場合、LPA2のみを活性化し、他の確立されたおよび推定のLPA GPCRのいずれも活性化しなかった。これらの化合物はさらに、10μMで化合物が適用された場合に活性化されなかった受容体における約EC75濃度のLPA18:1によって誘発されるCa2+応答の、10μMでの阻害を試験した。本発明者らは、この高濃度で、NSC12404およびGRI977143はLPA3を阻害したが、試験した他の受容体はいずれもこれらの2つの化合物によって活性化も阻害もされなかったことを見出した。H2L5547924は、LPA2を活性化しただけでなく、LPA1、LPA4、GPR87、およびP2Y10を部分的に阻害もした。H2L5828102は、LPA2の特異的アゴニストであっただけでなく、LPA3を完全に阻害もし、LPA1、GPR87およびP2Y10を部分的に阻害もした。結果を表1に示す。細胞ベースアッセイでのさらなる特徴付けのためにGRI977143を自由裁量によって選択した。
【００１８】
（表１）
2015526521.tif 000013
【００１９】
本発明者らは、次いで、それぞれ、図13のスキーム1、2および3に示されるように、新規のスルファモイル安息香酸誘導体、化合物5a〜c、7a〜c、9および10を設計および合成した。以前に報告された手順の改変によって化合物3a〜cを調製した。簡潔に記載すると、還流条件下にてK2CO3/アセトンの存在下でベンゾ[de]イソキノリン-1,3-ジオン(1)および対応のジブロモアルカン(2a〜c)を反応させることによって、定量的収率で化合物3a〜cを生成した。化合物3a〜cをK2CO3/DMF中において2-スルファモイル安息香酸エチルエステル4と反応させ、中程度の収率で化合物5a〜cを得た（スキーム1）。K2CO3およびDMFの存在下で2-(4-ブロモブチル)ベンゾ[de]イソキノリン-1,3-ジオン(3b)と、置換ベンゾ[d]イソチアゾール-3(2H)-オン-1,1-ジオキシド6a〜cおよび8とを反応させることによって、それぞれ、化合物7a〜cおよび9を生成した（スキーム2および3）。化合物9をEtOH中の水性1N NaOHで処理し、最終化合物10を得た（スキーム3）。
【００２０】
新規に合成した化合物を、LPA2受容体を安定発現するRH7777細胞においてCa2+トランジェントを誘発する能力について試験した。LPA2受容体の活性に対するこれらの新規の化合物（5a〜c、7a〜c、9および10）の効果を表2に示す。
【００２１】
（表２）
2015526521.tif 000014
【００２２】
全ての試薬および溶媒をAldrich、Alfa-Aesar、Chemgenx Product List、Matrix Scientific、およびTCI-America Fine Chemicalsから購入し、さらなる精製をせずに使用した。反応をアルゴンの不活性雰囲気下で行った。1H-NMRスペクトルを、Bruker ARX 400およびVarian 500分光計においてそれぞれ400 MHzおよび500 MHzで記録し、内部(CH3)4Siを基準とした。化学シフト値を百万分率（δ）として報告し、結合定数（J）をHzで提供し、分裂パターンを以下のように示す：bs、ブロードな一重線；d、二重線；t、三重線；q、四重線；m、多重線。質量スペクトルをポジティブおよびネガティブモードでBrucker ESQUIREエレクトロスプレー／イオントラップ装置において収集した。通常の薄層クロマトグラフィー（TLC）をシリカゲルプレート（Analtech, Inc., 250ミクロン）において行った。フラッシュクロマトグラフィーをシリカゲル（Merck, 等級60, 230〜400メッシュ）において行った。
【００２３】
2-(ブロモアルキル)ベンゾ[de]イソキノリン-1,3-ジオン(3a〜c)(GP-1)
乾燥アセトン中のベンゾ[de]イソキノリン-1,3-ジオン1(1当量)の溶液へ、無水K2CO3（3当量）および対応のジブロモアルカン(2a〜c)(3当量)を添加した。反応混合物を22時間還流し、室温まで冷却し、濾過した。溶媒を減圧下で蒸発させ、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、表題化合物を得た。
【００２４】
2-[3-(1,3-ジオキソ-1H,3H-ベンゾ[de]イソキノリン-2-イル)-アルキルスルファモイル]安息香酸(5a〜c)(GP-2)
DMF中の2-スルファモイル安息香酸エチルエステル4(1当量)および無水K2CO3(5当量)の撹拌混合物へ、2-(ブロモアルキル)ベンゾ[de]イソキノリン-1,3-ジオン(3a〜c)(3当量)を添加した。反応混合物を一晩穏やかに還流し、室温まで冷却し、砕氷中へ注いだ。得られた溶液を濃HClで酸性化し、クロロホルムで抽出した。有機層を水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、真空下で濃縮し、粗生成物を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗残渣を精製し、所望の生成物を得た。
【００２５】
2-(N-(4-(1,3-ジオキソ-1H-ベンゾ[de]イソキノリン-2(3H)-イル)ブチル)スルファモイル)-4-置換安息香酸(7a〜c)(GP-3)
DMF中の6-置換ベンゾ[d]イソチアゾール-3(2H)-オン1,1-ジオキシド6a〜c(1当量)および無水K2CO3(5当量)の撹拌混合物へ、2-(4-ブロモブチル)-1H-ベンゾ[de]イソキノリン-1,3(2H)-ジオン(3b)(3当量)を添加した。反応混合物を一晩穏やかに還流し、室温まで冷却し、砕氷中へ注いだ。得られた溶液を濃HClで酸性化し、クロロホルムで抽出した。有機層を水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、真空下で濃縮し、粗生成物を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、表題生成物を得た。
【００２６】
2-(3-ブロモプロピル)ベンゾ[de]イソキノリン-1,3-ジオン(3a)
ベンゾ[de]イソキノリン-1,3-ジオン(1)および1,2ジブロモプロパン(2a)を使用してGP-1に従って、この化合物を調製した。EtOAc-ヘキサンを使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、3aを得た。
2015526521.tif 000015
【００２７】
2-(4-ブロモブチル)ベンゾ[de]イソキノリン-1,3-ジオン(3b)
ベンゾ[de]イソキノリン-1,3-ジオン(1)および1,2ジブロモブタン（1,2 dibromobuane）(2b)を使用してGP-1に従って、この化合物を調製した。EtOAc-ヘキサンを使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗残渣を精製し、3bを得た。
2015526521.tif 000016
【００２８】
2-(5-ブロモペンチル)ベンゾ[de]イソキノリン-1,3-ジオン(3c)
ベンゾ[de]イソキノリン-1,3-ジオン(1)および1,2ジブロモペンタン(2c)を使用してGP-1に従って、この化合物を調製した。EtOAc-ヘキサンを使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、3cを得た。
2015526521.tif 000017
【００２９】
2-[3-(1,3-ジオキソ-1H,3H-ベンゾ[de]イソキノリン-2-イル)プロピルスルファモイル]安息香酸(5a)
2-スルファモイル安息香酸エチルエステル4および化合物3aを使用してGP-2に従って、化合物を調製した。MeOH-CHCl3を使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、5aを得た。
2015526521.tif 000018
【００３０】
2-[4-(1,3-ジオキソ-1H,3H-ベンゾ[de]イソキノリン-2-イル)ブチルスルファモイル]安息香酸(5b)
2-スルファモイル安息香酸エチルエステル4および化合物3bを使用してGP-2に従って、化合物を調製した。MeOH-CHCl3を使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、5bを得た。
2015526521.tif 000019
【００３１】
2-[4-(1,3-ジオキソ-1H,3H-ベンゾ[de]イソキノリン-2-イルペンチルスルファモイル]安息香酸(5c)
2-スルファモイル安息香酸エチルエステル4および化合物3cを使用してGP-2に従って、化合物を調製した。MeOH-CHCl3を使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗残渣を精製し、5cを得た。
2015526521.tif 000020
【００３２】
2-(N-(4-(1,3-ジオキソ-1H-ベンゾ[de]イソキノリン-2(3H)-イル)ブチル)スルファモイル)-4-ニトロ安息香酸(7a)
6-ニトロベンゾ[d]イソチアゾール-3(2H)-オン1,1-ジオキシド6aを使用してGP-3に従って、化合物を調製した。MeOH-CHCl3を使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗残渣を精製し、7aを得た。
2015526521.tif 000021
【００３３】
4-ブロモ-2-(N-(4-(1,3-ジオキソ-1H-ベンゾ[de]イソキノリン-2(3H)-イル)ブチル)スルファモイル)安息香酸(7b)
6-ブロモベンゾ[d]イソチアゾール-3(2H)-オン1,1-ジオキシド6bを使用してGP-3に従って、化合物を調製した。MeOH-CHCl3を使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗残渣を精製し、7bを得た。
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【００３４】
2-(N-(4-(1,3-ジオキソ-1H-ベンゾ[de]イソキノリン-2(3H)-イル)ブチル)スルファモイル)-4-メトキシ安息香酸(7c)
6-メトキシベンゾ[d]イソチアゾール-3(2H)-オン1,1-ジオキシド6cを使用してGP-3に従って、化合物を調製した。MeOH-CHCl3を使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗残渣を精製し、7cを得た。
2015526521.tif 000023
【００３５】
2-(4-(1,3-ジオキソ-1H-ベンゾ[de]イソキノリン-2(3H)-イル)ブチル)-3-オキソ-2,3-ジヒドロベンゾ[d]イソチアゾール-6-カルボン酸1,1-ジオキシド(9)
DMF中の3-オキソ-2,3-ジヒドロベンゾ[d]イソチアゾール-6-カルボン酸1,1-ジオキシド(8)(1 mmol)および無水K2CO3(5 mmol)の撹拌混合物へ、2-(4-ブロモブチル)-1H-ベンゾ[de]イソキノリン-1,3(2H)-ジオン(3b)(3 mmol)を添加した。反応混合物を一晩穏やかに還流し、室温まで冷却し、砕氷中へ注いだ。得られた溶液を濃HClで酸性化し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、真空下で濃縮し、粗生成物を得た。MeOH-CHCl3(2:8)を使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗残渣を精製し、所望の生成物を得た。
2015526521.tif 000024
【００３６】
2-(N-(4-(1,3-ジオキソ-1H-ベンゾ[de]イソキノリン-2(3H)-イル)ブチル)スルファモイル)テレフタル酸(10)
9 (50 mg)および水性1 N NaOH(3 mL)の懸濁液を室温で10分間撹拌した。この懸濁液へ、溶液が透明になるまでエタノール(2 mL)を添加した。出発物質が消滅するまで、撹拌を2時間継続した。溶液を氷水中へ注ぎ、37% HClでpH 1へ酸性化した。得られた塊を酢酸エチルで抽出し、有機層を水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、真空下で濃縮し、粗生成物を得た。EtOAc-ヘキサン-DCMを使用して粗残渣を再結晶させ、表題化合物を得た。
2015526521.tif 000025
【００３７】
本発明のLPA受容体アゴニストおよびアンタゴニストは、患者の治療に適した薬学的組成物を調製するために使用され得る。したがって、本発明のさらなる局面は、薬学的に許容される担体と、本発明の化合物とを含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物はまた、適切な賦形剤または安定剤を含み得、固体または液体形態、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、または乳剤であり得る。典型的に、組成物は、担体、賦形剤、安定剤などと一緒に、活性化合物を約0.01〜99パーセント、好ましくは約20〜75パーセント含有する。固体単位投薬形態は従来のタイプのものであり得る。固体形態は、本発明の化合物と、担体、例えば、滑沢剤、および乳糖、ショ糖、またはトウモロコシデンプンなどの不活性充填剤とを含む、通常のゼラチンタイプなどのカプセル剤であってもよい。別の態様において、これらの化合物を、アカシア、トウモロコシデンプン、またはゼラチンなどの結合剤、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、またはアルギン酸などの崩壊剤、およびステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤と組み合わせて、乳糖、ショ糖、またはトウモロコシデンプンなどの従来の錠剤基剤と共に錠剤化する。
【００３８】
本発明の化合物はまた、薬学的担体と共に、生理的に許容される希釈剤中のこれらの材料の溶液または懸濁液による注射用または局所適用剤形で投与してもよい。そのような担体には、界面活性剤ならびに補助剤、賦形剤または安定剤を含む他の薬学的および生理的に許容される担体を加えた、または加えない、水および油などの、無菌の液体が含まれる。油は、石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、落花生油、ダイズ油、または鉱油であり得る。一般に、水、食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが、特に注射用液剤のための好ましい液体担体である。
【００３９】
エアロゾルとして用いるために、溶液または懸濁液中の本発明の化合物を加圧エアロゾル容器に、適当な噴射剤、例えば、プロパン、ブタン、またはイソブタンなどの炭化水素噴射剤および従来の補助剤と共に包装してもよい。本発明の材料をネブライザーまたはアトマイザーなどの非加圧型で投与してもよい。
【００４０】
行う治療に応じて、本発明の化合物は経口、局所、経皮、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内滴下により、腔内もしくは膀胱内注入により、眼内、動脈内、病巣内、または鼻、喉、および気管支などの粘膜への適用により投与することができる。
【００４１】
各成分の有効量の最適範囲を決定することは当業者の技術範囲内である。本発明者らによって本明細書に提供される開示を考慮すれば、本発明の化合物の投与のための治療レジメンも、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４２】
本発明は以下の非限定的な実施例によってさらに説明され得る。
【実施例】
【００４３】
リゾホスファチジン酸(18:1)をAvanti Polar Lipids (Alabaster, AL)から購入した。OTPは、(Durgam et al., 2006)に記載されるようにRxBio, Inc. (Johnson City, TN)によって合成および提供された。本研究において使用したテスト化合物を以下の業者より得た：Genome Research Institute (GRI)GRI977143は、University of Cincinnati Drug Discovery Center (UC-DDC; Cincinnati, OH)より；Hit2Lead (www.hit2lead.com) H2L5547924およびH2L5828102は、ChemBridge (San Diego, CA)より；ならびにNSC12404は、National Cancer Institute Developmental Therapeutics Program Open Chemical Repositoryより。GRI977143、H2L5547924、H2L5828102、およびNSC12404の10 mMストック溶液をジメチルスルホキシド（DMSO）中において調製した。活性炭処理された脂肪酸フリーのウシ血清アルブミン（BSA）（Sigma-Aldrichl St. Louis, MO）の等モルコンプレックスとしてのLPAおよびOTPの1ミリモル濃度ストックを、使用直前にリン酸緩衝食塩水（PBS）中において調製した。3.45 mMアドリアマイシンのストック溶液を蒸留水中において調製した。
【００４４】
コンピュータドッキング
Autodock Vina（Trott and Olson, AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J. Comput. Chem. (2010) 31(2): 455-461）を使用して、Sardarら（Sardar et al., Molecular basis for lysophosphatidic acid receptor antagonist selectivity. Biochim Biophys Acta (2002) 1582(1-3): 309-317）によって報告された活性化LPA2受容体相同性モデル中へ化合物をフレキシブルにドッキングさせた。ドッキング前に、Molecular Operating Environmentソフトウェア（MOE、2010.10バージョン）中のMerck Molecular Force Field 94（MMFF94）を用いて、化合物および受容体相同性モデルを両方ともエネルギー最適化した。ドッキングシミュレーションを、65×63×50Åの寸法を有するドッキングボックスおよび20の結合モードの探索スペースを使用して行い、網羅的探索パラメータ（exhaustive search parameter）を5に設定した。ベストドッキングポーズを、最小エネルギー・コンフォーメーションに基づいて選択した。最後に、ベストポーズをMOE中のMMFF94を使用してさらにリファインした。
【００４５】
リガンドベースの類似性探索
NSC12404の類似性探索を、UC-DDCライブラリーデータベース（drugdiscovery.uc.edu）を使用して行った。参照化合物についてのTanimoto類似性インデックスを、Pipeline Pilotソフトウェア（Accelerys, Inc.; San Diego, CA）中のECFC6、FCFP4、およびFCFP6フィンガープリントを使用して計算した。Pipeline Pilotフィンガープリントを使用してUC-DCCライブラリーをスクリーニングし、追加のLPA2リガンドを同定した。類似性閾値を80%に設定した。225個のリターンされたヒットの中から、類似性>80%を有する化合物を、類似性および構造がどれくらい緊密に参照化合物を反映したかを注意深く考慮して、目視検査によって選択した。LPA受容体活性化Ca2+動員アッセイを使用しての評価のために、合計27個の化合物を選択した。
【００４６】
残基命名法
BallesterosおよびWeinstein（Ballesteros and Weinstein, Integrated methods for the construction of three dimensional models and computational probing of structure-function relations in G-protein coupled receptors. Methods Neurosci (1995) 25: 366-425）によって記載されたように、膜貫通（TM）ドメイン中のアミノ酸にインデックス位置を割り当て、異なる数のアミノ酸を有するGPCR間の比較を容易にした。インデックス位置はX.YY.の形式であり、ここで、Xは、残基が現れるTMドメインを意味し、YYは、TMドメイン中の最も高度に保存された残基に対するその残基の位置を示し、これに自由裁量によって50位を割り当てる。
【００４７】
LPA受容体媒介Ca2＋動員アッセイ
個々のLPA1、LPA2、LPA3、LPA4、およびLPA5の確立された受容体サブタイプ、ならびに推定のLPA受容体GPR87およびP2Y10を発現する安定細胞株、または適切な空ベクターがトランスフェクトされた対照は、以前に作製および記載された（Murakami et al., Identification of the orphan GPCR, P2Y(10) receptor as the sphingosine-1-phosphate and lysophosphatidic acid receptor. Biochem Biophys Res Commun (2008) 371(4): 707-712; Tabata et al., The orphan GPCR GPR87 was deorphanized and shown to be a lysophosphatidic acid receptor. Biochem Biophys Res Commun (2007) 363(3): 861-866; Williams et al., Unique ligand selectivity of the GPR92/LPA5 lysophosphatidate receptor indicates role in human platelet activation. J Biol Chem (2009) 284(25): 17304-17319）。細胞内Ca2+のリガンド活性化動員についてのアッセイを、以前に記載されたように（Durgam et al., Synthesis and pharmacological evaluation of second-generation phosphatidic acid derivatives as lysophosphatidic acid receptor ligands. Bioorg Med Chem Lett (2006) 16(3): 633-640）、Flex Station 2自動蛍光プレートリーダー（Molecular Devices; Sunnyvale, CA）を使用して行った。適切な濃度のテスト化合物を、単独で使用する（アゴニスト試験のため）か、または、試験されるLPA受容体についてそれぞれ約EC75濃度のLPA18:1と混合した（アンタゴニストスクリーニング）。細胞に、30分間、0.01%プルロニック酸を含有するKrebs緩衝液中のFura-2-アセトキシメチルエステル（Fura-2/AM）を負荷し、Ca2+動員を測定する前にKrebs緩衝液でリンスした。リガンド添加の2分後の510 nmでのピーク発光の比率を、340 nm/380 nmの励起波長について測定した。全てのサンプルを四つ組で実行した。所定の受容体についてのEC75濃度のLPA18:1に対する10μMのテスト化合物によって誘発された阻害（Ι10μM）を、用量反応曲線から内挿した。半最大有効濃度（EC50）、および阻害定数（Ki）値を、KaleidaGraphソフトウェア（バージョン4.1, Synergy Software; Dubai, United Arab Emirates）を使用して用量反応データポイントへシグモイド関数を適合させることによって計算した。
【００４８】
細胞培養
マウス胚線維芽細胞（MEF）を、E13.5 LPA1&2ダブルノックアウト（DKO）胚から単離した。MEFに空ベクターまたはLPA2含有レンチウイルスを形質導入し、1.5μg/mlピューロマイシンで選択した。10%(V/V)ウシ胎仔血清（FBS）、2 mM L-グルタミン、100 U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンが補われたダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中に細胞を維持した。無血清培地はDMEM中に0.1%(W/V)BSAを含有した。ラット腸上皮細胞株6（IEC-6）を、第13継代でAmerican Type Culture Collection (Rockville, MD)から得；第16〜21継代物を全ての実験において使用した。IEC-6細胞を90%空気および10%CO2の雰囲気中において加湿した37℃インキュベーター中に維持した。増殖培地は、5%熱不活性化FBS、10μg/mLインスリン、および50μg/mLゲンタマイシンが補われたDMEMからなった。血清飢餓培地の組成は、それがFBSを含有しなかった点を除いて、完全増殖培地の組成と同一であった。LPA2受容体を安定発現するMcArdleラットヘパトーマ細胞株（RH7777）は、Fumikazu Okajima博士（Gunma University, Maebashi, Japan）から提供された。LPA1またはLPA3受容体を安定発現するRH7777細胞は、インハウスで作製し、以前に特徴付けしていた。野生型およびLPA受容体（LPAR）が安定してトランスフェクトされたRH7777細胞を、250μg/ml G418の存在下で、10% FBSおよび2 mM L-グルタミンが補われたDMEM中において増殖させた。ベクターまたはLPA4受容体のいずれかを安定発現するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞は、Takao Shimizu博士（Tokyo University; Tokyo, Japan）から提供された。10% FBS、2 mM L-グルタミン、および350μg/ml G418を含有するHam F12培地中において細胞を培養した。ラット神経芽細胞腫細胞（B103）に、FLAG-LPA5の野生型を有するレンチウイルスを形質導入し、ピューロマイシンで選択し、安定細胞株を樹立した。10% FBSおよび0.4μg/mlピューロマイシンが補われたDMEM中において安定細胞を維持した。GPR87発現およびP2Y10発現CHO細胞ならびにベクタートランスフェクト対照細胞は、Norihisha Fujita博士（Ritsumeikan University; Shiga, Japan）から提供された。高浸潤性MM1ラットヘパトーマ細胞（Michiko Mukai博士, Osaka University, Japanから提供された）を、10%(V/V)FBS、2 mM L-グルタミン、100 U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンが補われたDMEM中の懸濁液中において増殖させた。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、VEC Technologies Inc. (Rensselaer, NY, USA)から購入し、10%(V/V)FBS、90μg/mLヘパリン、10 ng/mL EGF、1μg/mLヒドロコルチゾン、0.2 mg/mL EndoGrowth (VEC Technologies Inc.)サプリメント、100 U/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、および25μg/mLアンホテリシンBが補われたMCDB-131完全培地中において培養した。
【００４９】
細胞増殖アッセイ
細胞増殖に対するLPA受容体リガンドの効果を測定するために、ベクター-およびLPA2-形質導入MEF細胞（2×104）を、完全増殖培地中の24ウェルプレートの各ウェル中に平板培養した。細胞を翌日カウントし、培地を、1μM LPA、1μM OTP、または10μM GRI977143が補われたまたは補われていない1.5%(V/V)FBSを含有する培地と交換した。LPA、OTP、およびGRI977143を含有する培地を24時間ごとに新しくした。時間の関数としてZ1 Coulter Particle Counter (Beckman Coulter; Hileah, FL)を使用して三つ組で細胞数をカウントすることによって、増殖速度を測定した。
【００５０】
アドリアマイシンまたは血清除去によるアポトーシスの誘発
実験をベクター-およびLPA2-形質導入MEF細胞に対して行った。カスパーゼ3、7、8、または9活性およびDNA断片化を測定するために、細胞を48ウェルプレート中に平板培養した（2×104細胞/ウェル）。PARP-1切断およびBaxトランスロケーションを検出するために、1.5×106細胞を10cm皿中に平板培養し、完全増殖培地中において一晩培養した。翌朝、増殖培地を血清飢餓培地と置き換え、細胞をLPA(1〜10μM)、OTP(1〜10μM)、GRI977143(1〜10μM)、またはビヒクルで1時間前処理した。カスパーゼ活性、DNA断片化、PARP-1切断、およびBaxトランスロケーションを、1.7μMアドリアマイシンとのインキュベーションの5時間後または血清除去の24時間後に測定した。
【００５１】
IEC-6細胞における腫瘍壊死因子α（TNF-α）によるアポトーシスの誘発
コンフルエントな血清飢餓IEC-6細胞を、3時間、OTP(10μM)、GRI977143(10μM)、またはLPA(1μM)の存在下で、TNF-α(10 ng/ml)／シクロヘキシミド（CHX）(20μg/ml)で処理したかまたは処理しなかった。細胞をPBSで2回洗浄し、定量的DNA断片化アッセイを以前に記載されたように行った（Valentine et al., (S)-FTY720-vinylphosphonate, an analogue of the immunosuppressive agent FTY720, is a pan-antagonist of sphingosine 1-phosphate GPCR signaling and inhibits autotaxin activity. Cell Signal (2010) 22(10): 1543-1553）。
【００５２】
カスパーゼ活性アッセイ
Caspase-Glow（登録商標）3/7、Caspase-Glow（登録商標）8およびCaspase-Glow（登録商標）9試薬を、Promega (Madison, WI)から購入し、製造業者の説明書に従って使用した。簡潔に記載すると、1ウェル当たり50μlの溶解試薬を添加し、続いて室温で30分間振盪することによって、細胞を溶解させた。可溶化物200μlを96ウェルホワイトウォールプレートへ移し、BioTek（登録商標）(Winooski, VT)プレートリーダーを使用してルミネセンスを測定した。
【００５３】
DNA断片化ELISA
以前に記載されたように（Valentine et al., 2010）、アポトーシスさせた（apoptotically-challenged）細胞をPBSで2回洗浄し、定量的DNA断片化アッセイを、Cell Death Detection ELISA PLUSキット(Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)を使用して行い、BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, Inc.; Rockford, IL)を使用してタンパク質濃度に対して正規化した。核を含まない細胞可溶化物のアリコートを、ストレプトアビジンコーティングウェル中に置き、2時間室温で抗ヒストン-ビオチン抗体および抗DNAペルオキシダーゼ結合抗体と共にインキュベートした。インキュベーション後、サンプルを除去し、ウェルを洗浄し、室温で2,2'-アジノ-ジ[3-エチルベンゾチアゾリン-スルホネート基質100μlと共にインキュベートし、その後、吸光度を405 nmで読み取った。本発明者らの以前の報告において詳述したように（Ray et al., Mdm2 inhibition induces apoptosis in p53 deficient human colon cancer cells by activating p73- and E2F1-mediated expression of PUMA and Siva-1. Apoptosis(2011) 16(1): 35-44）、結果を405 nmでの吸光度/分/mgタンパク質として表した。
【００５４】
内皮単層のMM1ヘパトーマ細胞浸潤
HUVEC（第5〜7継代の1.3×105細胞）を、0.2%ゼラチンがプレコーティングされた12ウェルプレート（Sigma-Aldrich）の各ウェル中へ播種した。コンフルエントな単層が形成されるまで、細胞を2日間増殖させた。MM1細胞を、2時間、2μg/mLカルセインAM(Life Technologies; Grand Island, NY)でプレ標識し、2回リンスし、1ウェル当たり5×104細胞をHUVEC単層上に播種した。腫瘍-単層細胞浸潤を、1μM LPAまたは1〜10μM GRI977143を添加してまたは添加せずに、1% FBSを含有するMCDB-131完全培地中において20時間行った。単層をPBS（Ca2+およびMg2+を含有する）で繰り返しリンスすることによって非浸潤腫瘍細胞を除去し、続いて10%緩衝ホルマリンでの固定を行った。単層に浸透した腫瘍細胞を、位相差および蛍光照明でNIKON TiU倒立顕微鏡を使用して撮影した。蛍光および位相差画像を、Elements BRソフトウェア（Nikon、バージョン3.1x）を使用して重ね合わせた。1ウェル当たり合計5つの重複していない領域を画像化し、浸潤したMM1細胞（単層の真下で扁平形状を示す）の数をカウントした。
【００５５】
免疫ブロット分析
リガンド誘発ERK1/2活性化を検出するために、ベクター-およびLPA2-トランスフェクトMEF細胞を、1μM LPA、1μM OTP、10μM GRI977143、またはビヒクルへの10分間の曝露の3時間前に、血清飢餓処理した。ERK1/2活性化およびPARP-1切断測定のために、細胞を1×Laemmliサンプルバッファー中に採取し、12% Laemmli SDS-ポリアクリルアミドゲルを使用して分離した。Baxトランスロケーションを評価するために、Cell Fractionation Kit-Standard (MitoSciences; Eugene, OR)を使用して、細胞可溶化物を細胞質、ミトコンドリア、および核フラクションに分離した。次いで、細胞質フラクションを75%トリクロロ酢酸での沈降によって濃縮し、ペレットを50 mM非中和Tris pH 10バッファーおよび6×Laemmliバッファー中に溶解した。サンプルを5分間沸騰させ、12% SDS-ポリアクリルアミドゲルにロードした。ウェスタンブロット法を以前に記載されたように（Valentine et al., 2010）行った。pERK1/2、PARP-1、Bax（Cell Signaling Technology; Beverly, MA）、アクチン（Sigma-Aldrich）に対する一次抗体、および抗ウサギ-ホースラディシュペルオキシダーゼ二次抗体（Promega）を、製造業者の説明書に従って使用した。
【００５６】
LPA2でのリガンド誘発高分子複合体形成の検出
LPA2は、TRIP6およびNHERF2と共に三元複合体を形成する。この複合体は、LPA2のC末端PSD95/Dlg/ZO-1ドメイン(PDZ)結合モチーフへのNHERF2の結合、LPA2のジンクフィンガー様CxxCモチーフへのTRIP6の結合、およびTRIP6のPDZ結合モチーフへのNHERF2の結合を含む、複数のタンパク質間相互作用によってアセンブルされている。リガンド誘発高分子複合体形成を調べるために、本発明者らの以前の刊行物（E et al., The LPA2 receptor-mediated supramolecular complex formation regulates its antiapoptotic effect. J Biol Chem (2009) 284: 14558-14571）に詳細に記載されるように、HEK293T細胞にFLAG-LPA2および高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)-NHERF2をトランスフェクトし、細胞を10分間10μM GRI977143へ曝露した。抗FLAG M2モノクローナル抗体結合アガロースビーズ（Sigma-Aldrich）を使用して複合体をプルダウンし、抗EGFP抗体（A.P. Naren博士；UTHSC, TNから提供された）、抗FLAG抗体（Sigma-Aldrich）、および抗TRIP6抗体（Bethyl Laboratories; Montgomery, TX）を使用するウェスタンブロット法のために処理した。
【００５７】
統計解析
三つ組で実行したサンプルについての平均値± SDまたはSEMとしてデータを表す。各実験を少なくとも2回繰り返した。対照および処理群間の比較のためにスチューデントt検定を使用した。p値≦0.05を有意と考えた。
【００５８】
LPA18:1とドッキングされたLPA2計算モデルは、リガンド結合ポケットを含む13個の残基を示唆する。4つのヒットのコンピュータドッキングは、これらのLPA2リガンドが、13個の共通の残基に加えて、特異的アゴニストに特有のいくつかの追加の残基と相互作用することを示す。LPA2構造へドッキングされたGRI977143のモデルを図3に示す。ドッキングされた構造は、GRI977143が、本発明者らがLPA2のリガンド活性化のために必要とされることを以前に示した、キー残基R3.28、Q3.29、K7.36、およびW4.64の近くにドッキングすることを示す。さらに、モデルは、このリガンドに特有であったW5.40との相互作用を予測した。
【００５９】
MOEソフトウェア（Molecular Operating Environment, MOEソフトウェア (2002), Chemical Computing Group, Montreal）のドッキングファンクションを使用して、構造に基づくファルマコフォアを作製した。化合物NSC12404およびLPAをLPA2の相同性モデル中へドッキングさせた。ファルマコフォアモデルにおいて、本発明者らは、アゴニストとタンパク質との間の相互作用に基づく3つの特徴部位を同定した。本発明者らは、キー残基を本発明者らのLPA2アゴニストの4.5Å以内のものと規定した。リガンド相互作用に関与するファルマコフォア特徴および対応のアミノ酸残基を図3Aに示す。このファルマコフォアモデルは、3つの特徴を有する：疎水性特徴（緑色）、水素結合アクセプター（青色）、およびアニオン性（赤色）特徴。2.8〜4.2Å範囲内の半径を有するファルマコフォア中の4つのボリュームスフェアは、結合ポケット中のリガンドとの種々のタイプの化学的相互作用に理想的な領域を定める。4つのボリュームスフェアの半径と共に化学的特徴間の距離を図3Aに示す。
【００６０】
細胞増殖に対するGRI977143の効果
LPAは、細胞タイプおよびそれが発現する受容体に応じて、マイトジェンまたはアンチマイトジェンとして機能し得る。本発明者らは、ベクター-（図4A）およびLPA2-形質導入MEF細胞（図4B）の細胞増殖に対するGRI977143の効果を試験した。LPAは、空ベクター-形質導入MEF細胞の増殖に対して有意な効果を有さなかった。同様に、GRI 977143は、72時間時点（p<0.05）以外は、ベクター細胞増殖の有意な増加を引き起こさなかった。対照的に、OTPは、24時間以降、空ベクター形質導入MEF細胞の増殖を有意に（p<0.001）増加させた。LPA2-形質導入MEFの増殖に対するLPA、OTPおよびGRI 977143の効果は全て、24時間以降、有意であった。
【００６１】
MM1ヘパトーマ細胞浸潤に対するGRI977143の効果
高浸潤性ラットヘパトーマMM1細胞は、LPA依存様式で中皮細胞単層に浸潤する。LPA2受容体は、MM1細胞において豊富に発現される。本発明者らは、LPA2のGRI977143媒介活性化がMM1細胞によるHUVEC単層の浸潤を刺激し得るかどうかを問題にし、結果は、1μM LPAがMM1細胞浸潤の有意な増加を引き起こした一方、浸潤の同一の有意な増加を誘発するためには、より高い（10μM）濃度のGI977143が必要であったことを示した（図5）。
【００６２】
アドリアマイシン誘発アポトーシスに対するLPA2媒介保護に対するGRI977143の効果
本発明者らは、アポトーシスを誘発するためにアドリアマイシンを使用して、GRI977143の抗アポトーシス特性を調べた。GRI977143(10μM)は、LPA2形質導入MEF細胞におけるカスパーゼ9活性化を46±4%減少させ、この減少は、1μM LPAのそれと大きさの点で同様であり、一方、1μM OTPは、僅かにより小さな38±1%の減少をもたらした（図6A）。GRI977143は、ベクター形質導入細胞におけるカスパーゼ9活性化に影響を与えなかった一方、LPAおよびOTPは、1μM濃度であっても、カスパーゼ9活性化を20〜24%減少させた（図6A）。本発明者らは、次に、ベクター-およびLPA2形質導入MEF細胞におけるアドリアマイシン誘発カスパーゼ3および7活性化に対するテスト化合物の効果を試験した。GRI977143は、3μMを超えると有意な保護を誘発した（p<0.01）。10μM濃度で、GRI977143は、10μM LPAと同程度にカスパーゼ3および7活性化を減少させたが、10μM OTPの効果を上回った。LPAおよびOTPはLPA2形質導入MEF細胞を保護した。しかし、10μMで、LPAはまた、ベクター形質導入細胞において26±1%の阻害効果を有した。対照的に、10μMで適用した場合、GRI977143およびOTPは、ベクター形質導入細胞においてカスパーゼ3/7を弱めなかった（図6B）。
【００６３】
アポトーシスに対するGRI977143の効果をさらに特徴付けするために、本発明者らは、ベクター-およびLPA2 MEF細胞におけるアドリアマイシン誘発DNA断片化を測定した。LPA2形質導入MEF細胞において、GRI977143は、ベクター形質導入細胞における適度の7±1%保護（p<0.05）と比較して、DNA断片化を41±2%減少させた（p<0.001）。3μM LPAおよび3μM OTPもまた、それぞれ、DNA断片化を35±4%および32±1%減少させることによって、LPA2形質導入MEF細胞を保護した（図6C）。さらに、アドリアマイシン誘発アポトーシスモデルにおけるカスパーゼ-8活性化に対するGRI977143の効果を調べた。10μM GRI977143の投与は、LPA2形質導入MEF細胞においてカスパーゼ-8活性化の41±5%の減少をもたらした。1μM LPAまたは1μM OTPでの処理は、それぞれ、カスパーゼ8活性化を36±1%および33±2%減少させた。LPAおよびOTPの同様であるがより少ない効果が、ベクター形質導入細胞において見られ、それぞれ、12±2%および15±5%の減少になった（図6D）。これらの知見は全体として、GRI977143によるLPA2受容体シグナル伝達の選択的活性化は、カスパーゼ3、7、8および9を阻害してDNA断片化を減少させることによって、アドリアマイシン誘発アポトーシスから保護することを確証している。
【００６４】
GRI977143は、MEF細胞において血清除去によって誘発されるアポトーシスを減少させる
本発明者らはまた、GRI977143が、LPA2受容体を発現するまたはLPA2受容体を欠いている血清飢餓MEF細胞へ必要な栄養支援を提供することができるかどうかを調べた。このパラダイムでの実験によって、10μM GRI977143は、カスパーゼ3、7、8、および9活性化を減少させることにおいて非常に有効であり、さらにDNA断片化を減じたことが示された（図7）。GRI977143は、ベクター形質導入MEF細胞においてこれらのアポトーシスインジケータのいかなる減少も引き起こさなかった。対照的に、LPAおよびOTPは、ベクター形質導入MEF細胞も保護した。これらの結果は、アドリアマイシン誘発アポトーシスパラダイムにおける本発明者らの知見を反映し、LPA2活性化の役割を血清除去誘発アポトーシスの防止へと拡張させる。
【００６５】
GRI977143はIEC-6腸上皮細胞におけるTNFα誘発アポトーシスを阻害する
本発明者らは、LPAおよびOTPは、TNFα誘発アポトーシスから非形質転換IEC-6陰窩様腸上皮細胞を保護および救済することを以前に実証した。IEC-6細胞は、LPA1/2/3/4 GPCR、GPR87およびP2Y5を内因的に発現する。したがって、本発明者らは、この外因性アポトーシスモデルにおいてGRI977143の効果を試験した。TNF-α/CHXでの処理はDNA断片化を20倍以上増加させる；断片化は、10μM OTPによって完全に遮断され、1μM LPAまたは10μM GRI977143処理によって有意に減少した（図8）。いずれのLPARアゴニストも、TNF-α/CHXの非存在下で培養物へ添加された場合、DNA断片化の検出可能ないかなる変化も引き起こさなかった。
【００６６】
アドリアマイシンまたは血清除去によって誘発されるBaxトランスロケーションおよびPARP-1切断に対するGRI977143の効果
GRI977143はカスパーゼ3、7、8、および9の活性化を減少させたので、本発明者らは、アドリアマイシンまたは血清除去によって誘発されるミトコンドリアへのBaxトランスロケーションに対する10μM GRI977143の効果を試験した。図9Aに示されるように、10μM GRI977143処理は、アドリアマイシン処理後、LPA2形質導入MEF細胞の細胞質中に高レベルのBaxを維持し、結果的にミトコンドリアへのそのトランスロケーションを減少させた。GRI977143は、ベクター形質導入MEFにおいてBaxトランスロケーションを減少させなかった。アポトーシスの血清除去モデルにおいて、本発明者らは、細胞質ゾルBaxレベルのいかなる変化も検出しなかった（図9B）。
【００６７】
GRI977143処理（10μM）はまた、両方のアポトーシス誘導処理後、PARP-1切断を減少させた（図9C〜D）。この効果は、ベクター形質導入細胞において観察されなかった。これらの実験は、GRI977143が、LPA2受容体を必要とするメカニズムを介してミトコンドリアアポトーシス経路の活性化を弱めるという仮説と一致している。
【００６８】
ERK1/2活性化に対するGRI977143の効果
GRI977143の抗アポトーシス効果を担う分子メカニズムの一部を解明するために、本発明者らは、LPA2受容体媒介抗アポトーシスシグナル伝達において必要なステップである、ERK1/2キナーゼの活性化に対するその効果を調べた。10分間の10μM GRI977143での処理は、LPA2形質導入MEF細胞においてERK1/2活性化を9.6倍増加させたが、ベクター形質導入細胞においてはこれらのキナーゼの基底活性を変化させなかった（図10A〜B）。
【００６９】
LPA2、TRIP6、およびNHERF2間の高分子複合体の集合に対するGRI977143の効果
LPA2受容体媒介超分子複合体形成は、アドリアマイシン誘発アポトーシスに対する保護のために必要である。GRI977143によって活性化される分子メカニズムをさらに解明するために、本発明者らは、TRIP6、NHERF2、およびLPA2のC末端間のアゴニスト誘発シグナロソーム集合に対するその効果を調べた。この高分子（macomolecular）複合体は、ERK1/2およびプロテインキナーゼB-核因子κB（Akt-NFκB）生存経路の刺激による抗アポトーシス効果において重要な役割を果たす。GRI97143は、LPA2受容体へのTRIP6およびEGFP-NHERF2のリクルートメントによって示される高分子複合体の集合を誘発した（図10C）。ビヒクル処理細胞可溶化物中ではごく微量の三元複合体しか検出されず、GRI977143によるLPA2の活性化がシグナル伝達複合体の集合を誘発したことを示している。
【００７０】
LPAは癌細胞浸潤および転移を促進することが示されていた。本発明者らは、転移の実在的モデルと考えられたインビトロ浸潤モデルにおいてGRI977143の効果を試験した。リゾホスファチジン酸（LPA）18:1をAvanti Polar lipids (Alabaster, AL)から購入した。LPAのストック溶液を、活性炭処理された脂肪酸フリーのウシ血清アルブミン（BSA；Sigma-Aldrich, St Louis, MO）の等モルコンプレックスを有するリン酸緩衝食塩水（PBS）中において調製した；化合物5b、GRI977143のメタ-メトキシアナログ、および化合物7b、GRI977143のBr-アナログを、ジメチルスルホキシド（DMSO）中において調製した。
【００７１】
細胞培養
この研究に使用したマウス胚線維芽細胞（MEF）を、LPA1/2ダブルノックアウト（LPA2-DKO）マウス{Lin, 2007 #132}から単離した。これらのMEFは、より低いレベルで内因的にLPA4/5/6受容体を発現するが、LPA1/2/3受容体サブタイプを完全に欠く。ヒトLPA2受容体をレンチウイルス形質導入によってこれらのMEF細胞中へ再導入した。これらをLPA2 DKO MEF{Lin, 2007 #132}と呼ぶ。EV DKO MEFと呼ぶ、空ベクター形質導入MEF細胞を対照として使用した。細胞を、10% v/vウシ胎仔血清（FBS）、2 mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンが補われたDMEM中において培養した。血清飢餓処理の間、増殖培地を、0.1%(w/v)BSAを含有するDMEMで置き換えた。
【００７２】
アドリアマイシンによるアポトーシスの誘発
細胞を48ウェルプレート中に平板培養し（2×104細胞/ウェル）、完全増殖培地中において一晩培養した。翌朝、増殖培地を無血清飢餓培地と置き換え、細胞をLPA（1または3μM）、化合物5bまたは7b（1、3または10μM）で、1時間、前処理した。ベクターおよびLPA2形質導入MEF細胞において、アポトーシスを1.7μMアドリアマイシンによって誘発した。カスパーゼ3、7、8、9活性およびDNA断片化を、アドリアマイシン曝露の5時間後にアポトーシスを評価するために測定した。
【００７３】
直接γ照射によるアポトーシスの誘発
MEF細胞を2×104細胞/ウェルの密度で48ウェルプレート中において照射の前日に平板培養した。照射の1時間前に、増殖培地を無血清飢餓培地へ変更し、細胞培養物を、3.2 Gy/分の線量率で、15 Gy y照射の線量へ曝露した。照射の1時間後、細胞をビヒクル（BSAもしくはDMSO）、LPA（1〜3μM）、化合物5bまたは化合物7b（両方とも1、3もしくは10μMで）のいずれかで処理した。カスパーゼ活性化、DNA断片化を照射の4時間後に測定した。
【００７４】
カスパーゼ活性化アッセイ
カスパーゼ活性化を測定するために、細胞を50μl Caspase-Glow（登録商標）試薬（Caspase 3/7、8、9 Promega, Madison, WI）中において溶解させた。細胞を室温（RT）で30分間カスパーゼ試薬と共に振盪した。30分後、BioTek (Winooski, VT)プレートリーダーを使用して、ルミネセンスを測定した。三つ組での平均カスパーゼ活性／実験群±SDを計算した。LPAを陽性対照として全ての実験において使用した。
【００７５】
DNA断片化ELISA
Cell Death Detection ELISAアッセイキット(Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)を使用することによって、DNA断片化を定量化した。細胞可溶化物20μlを、RTで2時間振盪しながら96ウェルストレプトアビジンコーティングプレート中において抗ヒストン-ビオチン  抗DNA-ペルオキシダーゼ結合抗体と共にインキュベートした。ウェルをインキュベーションバッファーで3回洗浄した後、2,2'-アジノ-ジ(3-エチルベンゾチアゾリン-スルホネート)基質100μl/ウェルを添加し、吸光度を405 nmで測定した。BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL)を使用して、タンパク質濃度を測定した。DNA断片化を吸光度単位/mgタンパク質として表した。LPAを陽性対照として全ての実験において使用した。
【００７６】
5%骨髄遮蔽を伴う15.68 Gy部分照射（PBI-BM5）へ曝露されたC57BL/6マウスにおける放射線誘発死亡率に対するGRIアナログの効果
10週齢雌性C57BL/6マウスを、137Cs源からの15.68 Gy（約LD60/8〜10）線量のγ照射へ曝露した。照射の24時間後、PBS緩衝液中の0.8%DMSO、1%エタノール、2%プロパンジオール中に溶解された1 mg/kgのテスト化合物5b、7a、および7bの200μL単回皮下注射でマウスを処置した。動物を毎日観察し、餌および水を自由摂取させた。第4日以降、マウスにゲル餌も与えた。研究エンドポイントは第20日までの死亡率であった。結果を図20に示す。特に、化合物5aおよび7aは死亡率を有意に減少させ（p<0.001）、一方、この投薬および処方での化合物7bは効果がなかった。
【００７７】
RP-10-71およびRP-10-73のアゴニズムについてのFura-2AM Ca2+アッセイ
LPA18:1と比較してのRP-10-71およびRP-10-73のCa2+動員のEC50値を測定するために、Fura-2AMが負荷されたLPA2 DKO MEF細胞の三つ組のウェルを、Krebs緩衝液中の等モル濃度のBSAの存在下で、0.0003---0.1μM LPA18:1または0.003〜3μM RP化合物で処理した。340/510 nmおよび380/510 nmのEx/Emλで、合計70秒間、蛍光を3.42秒ごとに読み取った。次いで、データ（相対的蛍光）を、各濃度についての三つ組の平均蛍光比率値として記録した。次いで、GraphPad Prismバージョン5.0aを使用し、可変傾斜モデルにおける非線形回帰曲線に適合させ（A）、EC50、Emax、およびカーブフィット(R2)を決定した（B）。結果を表3に示す。
【００７８】
（表３）DKO MEF細胞におけるLPA2 Ca2+動員：薬力学
2015526521.tif 000026
【図１】
2015526521.tif 000042
【図２】
2015526521.tif 000043
【図３】
2015526521.tif 000044
【図４】
2015526521.tif 000045
【図５】
2015526521.tif 000046
【図６】
2015526521.tif 000047
【図７】
2015526521.tif 000048
【図８】
2015526521.tif 000049
【図９】
2015526521.tif 000050
【図１０】
2015526521.tif 000051
【図１１】
2015526521.tif 000052
【図１２】
2015526521.tif 000053
【図１３】
2015526521.tif 000054
【図１４】
2015526521.tif 000055
【図１５】
2015526521.tif 000056
【図１６】
2015526521.tif 000057
【図１７】
2015526521.tif 000058
【図１８】
2015526521.tif 000059
【図１９】
2015526521.tif 000060
【図２０】
2015526521.tif 000061
【図２１】
2015526521.tif 000062
【手続補正書】
【提出日】平成27年6月30日(2015.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉの化合物：
2015526521.tif 000063
式中、Ａは、
2015526521.tif 000064
であり；
Ｒは、Ｈまたは置換もしくは非置換フェニルであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、独立して、Ｈ、ＮＯ２、Ｂｒ、Ｃｌ、またはＯＣＨ３であり；
Ｂは、Ｃ２〜Ｃ８アルキルまたはアルケニルであり；かつ
Ｃは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＯＣＨ３、ＣＨ３、ＣＯ２Ｈ、またはフェニルで置換されていてもよい
2015526521.tif 000065
である。
【請求項２】
Ａが
2015526521.tif 000066
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｃが
2015526521.tif 000067
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
ヒトまたは動物対象の細胞および組織におけるアポトーシスを阻害するための薬学的組成物であって、治療有効量の下記式Ｉの化合物を含む、薬学的組成物：
2015526521.tif 000068
式中、Ａは、
2015526521.tif 000069
であり；
Ｒは、Ｈまたは置換もしくは非置換フェニルであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、独立して、Ｈ、ＮＯ２、Ｂｒ、Ｃｌ、またはＯＣＨ３であり；
Ｂは、Ｃ２〜Ｃ８アルキルまたはアルケニルであり；かつ
Ｃは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＯＣＨ３、ＣＨ３、ＣＯ２Ｈ、またはフェニルで置換されていてもよい
2015526521.tif 000070
である。
【請求項５】
Ａが
2015526521.tif 000071
である、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
Ｃが
2015526521.tif 000072
である、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
１種もしくは複数種の化学療法剤、電離放射線、または両方の組み合わせのアポトーシス効果を防止または改善するためにヒトまたは動物対象を治療するための薬学的組成物であって、治療有効量の下記式Ｉの化合物を含む、薬学的組成物：
2015526521.tif 000073
式中、Ａは、
2015526521.tif 000074
であり；
Ｒは、Ｈまたは置換もしくは非置換フェニルであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、独立して、Ｈ、ＮＯ２、Ｂｒ、Ｃｌ、またはＯＣＨ３であり；
Ｂは、Ｃ２〜Ｃ８アルキルまたはアルケニルであり；かつ
Ｃは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＯＣＨ３、ＣＨ３、ＣＯ２Ｈ、またはフェニルで置換されていてもよい
2015526521.tif 000075
である。
【請求項８】
Ａが
2015526521.tif 000076
である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
Ｃが
2015526521.tif 000077
である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明の様々な局面において、方法は、化学療法剤および／または放射線へ供されたヒトおよび／または動物対象の細胞および組織におけるアポトーシスを減少させるために治療有効量の式Iの化合物を投与する方法を含む。様々な局面において、放射線は電離放射線であり得る。
[本発明1001]
下記式Iの化合物：
2015526521.tif 000078
式中、Aは、
2015526521.tif 000079
であり；
Rは、Hまたは置換もしくは非置換フェニルであり；
R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、独立して、H、NO2、Br、Cl、またはOCH3であり；
Bは、C2〜C8アルキルまたはアルケニルであり；かつ
Cは、F、Cl、Br、NO2、NH2、OCH3、CH3、CO2H、またはフェニルで置換されていてもよい
2015526521.tif 000080
である。
[本発明1002]
Aが
2015526521.tif 000081
である、本発明1001の化合物。
[本発明1003]
Cが
2015526521.tif 000082
である、本発明1001の化合物。
[本発明1004]
ヒトまたは動物対象の細胞および組織におけるアポトーシスを阻害するための方法であって、下記式Iの化合物を含む組成物の治療有効量を対象に投与する段階を含む、方法：
2015526521.tif 000083
式中、Aは、
2015526521.tif 000084
であり；
Rは、Hまたは置換もしくは非置換フェニルであり；
R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、独立して、H、NO2、Br、Cl、またはOCH3であり；
Bは、C2〜C8アルキルまたはアルケニルであり；かつ
Cは、F、Cl、Br、NO2、NH2、OCH3、CH3、CO2H、またはフェニルで置換されていてもよい
2015526521.tif 000085
である。
[本発明1005]
Aが
2015526521.tif 000086
である、本発明1004の化合物。
[本発明1006]
Cが
2015526521.tif 000087
である、本発明1004の化合物。
[本発明1007]
1種もしくは複数種の化学療法剤、電離放射線、または両方の組み合わせの抗アポトーシス効果を防止または改善するためにヒトまたは動物対象を治療するための方法であって、治療有効量の下記式Iの化合物を対象に投与する段階を含む、方法：
2015526521.tif 000088
式中、Aは、
2015526521.tif 000089
であり；
Rは、Hまたは置換もしくは非置換フェニルであり；
R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、独立して、H、NO2、Br、Cl、またはOCH3であり；
Bは、C2〜C8アルキルまたはアルケニルであり；かつ
Cは、F、Cl、Br、NO2、NH2、OCH3、CH3、CO2H、またはフェニルで置換されていてもよい
2015526521.tif 000090
である。
[本発明1008]
Aが
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である、本発明1007の化合物。
[本発明1009]
Cが
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である、本発明1007の化合物。
【国際調査報告】
2015526521.tif 000093