(57)【要約】アルタナリア及び／又はクラドスポリウム属のカビに対するアレルギーの予防又は治療のために使用してもよい医薬製剤であり、製薬上許容可能な担体又は希釈剤、及び以下の少なくとも3個から選択されるポリペプチド又はその製薬上許容可能な塩を含む医薬製剤：(a)アミノ酸配列WSWKIGPAIATGNT(Alt28; SEQ ID NO: 101)もしくは該アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;(b)   アミノ酸配列KYRRVVRAGVKVAQTAR(Alt34A; SEQ ID NO: 107)もしくは該アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;(c)   アミノ酸配列KYAGVFVSTGTLGGG(SEQ ID NO: 112)もしくは該アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;(d)   アミノ酸配列AEVYQKLKALAKKTYGQ(Alt13A; SEQ ID NO: 83)もしくは該アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;(e)   アミノ酸配列SLGFNIKATNGGTLD(Alt01A; SEQ ID NO: 60)もしくは該アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;(f)   アミノ酸配列SAKRMKVAFKLDIEK(Alt06; SEQ ID NO: 72)もしくは該アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;(g)   アミノ酸配列DITYVATATLPNYCR(SEQ ID NO: 111)もしくは該アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;及び(h)   アミノ酸配列GWGVMVSHRSGET(Alt14; SEQ ID NO: 84)もしくは該アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;であって、前記アミノ酸配列のT細胞エピトープ含有変異体配列は、７個までのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列であり、各修飾は独立して、欠失、置換又は挿入であり、各ポリペプチドは、30アミノ酸長までの医薬製剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
製薬上許容可能な担体又は希釈剤、及び
以下の少なくとも３個から選択されるポリペプチド又はその製薬上許容可能な塩
を含む医薬製剤：
(a)アミノ酸配列WSWKIGPAIATGNT(Alt28; SEQ ID NO: 101)もしくは前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;
(b)   アミノ酸配列KYRRVVRAGVKVAQTAR(Alt34A; SEQ ID NO: 107)もしくは前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;
(c)   アミノ酸配列KYAGVFVSTGTLGGG(SEQ ID NO: 112)もしくは前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;
(d)   アミノ酸配列AEVYQKLKALAKKTYGQ(Alt13A; SEQ ID NO: 83)もしくは前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;
(e)   アミノ酸配列SLGFNIKATNGGTLD(Alt01A; SEQ ID NO: 60)もしくは前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;
(f)   アミノ酸配列SAKRMKVAFKLDIEK(Alt06; SEQ ID NO: 72)もしくは前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;
(g)   アミノ酸配列DITYVATATLPNYCR(SEQ ID NO: 111)もしくは前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;及び
(h)   アミノ酸配列GWGVMVSHRSGET(Alt14; SEQ ID NO: 84)もしくは前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;
であって、前記アミノ酸配列のT細胞エピトープ含有変異体配列は、７個までのアミノ酸修飾を有する前記アミノ酸配列であり、各修飾は独立して、欠失、置換又は挿入であり、各ポリペプチドは、30アミノ酸長までである医薬製剤。
【請求項２】
(a)〜(h)のポリペプチドが、それぞれ(a)〜(h)に挙げられたアミノ酸配列又は変異体配列からなる、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】
前記アミノ酸配列の変異体配列が、１又は２個のアミノ酸修飾を有する前記アミノ酸配列であり、該修飾は独立して欠失又は置換である請求項１又は２に記載の医薬製剤。
【請求項４】
該置換が保存的置換である、先行する請求項のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項５】
前記アミノ酸配列の変異体配列が、N末端から２個までのアミノ酸の欠失及び／又はＣ末端から２個までのアミノ酸の欠失を有する前記アミノ酸配列である、先行する請求項のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項６】
各ポリペプチドが20アミノ酸長までである、先行する請求項のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項７】
少なくとも１個のポリペプチドが、前記アミノ酸配列由来タンパク質の天然配列において、前記アミノ酸配列のすぐのN末端側又はＣ末端側の１〜６個のアミノ酸にそれぞれ対応する１〜６個のアミノ酸のN末端及び／又はＣ末端伸長を有する先行する請求項に定義したアミノ酸配列又は変異体配列を有する、先行する請求項のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項８】
(a)のポリペプチド又は塩を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項９】
(b)、(c)もしくは(d)のポリペプチド又は塩の少なくとも１個を含む先行する請求項のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
(a)、(b)及び(c)のポリペプチド又は塩を含む先行する請求項のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１１】
アミノ酸配列YEKYRRVVRAGVKV(Alt34, SEQ ID NO: 106)を有するポリペプチドを含む請求項９又は１０に記載の医薬製剤。
【請求項１２】
アミノ酸配列KKYAGVFVSTGTLGGGK(Alt18, SEQ ID NO: 89)を有するポリペプチドを含む請求項９から１１のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１３】
(a)、(b)及び(d)のポリペプチド又は塩を含む先行する請求項のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
(a)、(b)、(c)及び(d)のポリペプチド又は塩を含む先行する請求項のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
(e)もしくは(f)のポリペプチド又は塩の少なくとも１個を含む先行する請求項のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１６】
アミノ酸配列SAKR-Nle-KVAFKLDIEK(Alt06A、SEQ ID NO: 73)を有するポリペプチド又はその塩を含む請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項１７】
(g)もしくは(h)のポリペプチド又は塩の少なくとも１個を含む先行する請求項のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１８】
アミノ酸配列KDITYVATATLPNY(Alt02; SEQ ID NO: 61)もしくはDITYVATATLPNYSR(Alt02A; SEQ ID NO: 62)を有するポリペプチド又はそのいずれかの塩を含む請求項１７に記載の医薬製剤。
【請求項１９】
アミノ酸配列GWGV-Nle-VSHRSGET(Alt14A, SEQ ID NO: 85)を有するポリペプチド又はその塩を含む請求項１７又は１８に記載の医薬製剤。
【請求項２０】
(a)、(b)、(c)、(d)及び(e)のポリペプチド又は塩を含む先行する請求項のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２１】
(f)、(g)もしくは(h)のポリペプチド又は塩の少なくとも１個を含む請求項２０に記載の医薬製剤。
【請求項２２】
容器に密封されている先行する請求項のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２３】
製薬上許容可能な溶液又は凍結乾燥物である先行する請求項のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２４】
溶液が、皮内投与、皮下投与、経口投与、点鼻投与、局所投与、舌下投与、バッカル投与又は表皮投与用に製剤化されている請求項２３に記載の医薬製剤。
【請求項２５】
溶液が、アンプル、密封バイアル、注射器、カートリッジ、フレキシブルバッグ又はガラスビンで提供される請求項２３又は２４に記載の医薬製剤。
【請求項２６】
凍結乾燥物が密封バイアルで提供される請求項２３に記載の医薬製剤。
【請求項２７】
アルタナリア（Alternaria）及び／又はクラドスポリウム（Cladosporium）に対するアレルギーの治療又は予防方法に使用するための先行する請求項のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２８】
Ｔ細胞が請求項１〜２１のいずれか１項に記載の医薬製剤のポリペプチドを認識するかどうかを判定するインビトロの方法であって、前記Ｔ細胞を前記医薬製剤と接触させる工程及び前記Ｔ細胞が前記ポリペプチドにより刺激されるかどうかを検出する工程を含む方法。
【請求項２９】
個体がアルタナリア（Alternaria）及び／又はクラドスポリウム（Cladosporium）に対するアレルギーを有する又は有する危険性があるかどうかを判定するために行われる請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
アルタナリア（Alternaria）及び／又はクラドスポリウム（Cladosporium）に対するアレルギーの個体を治療する方法又はアルタナリア（Alternaria）及び／又はクラドスポリウム（Cladosporium）に対する個体のアレルギーを予防する方法であって、請求項１〜２１のいずれか１項に定義された医薬製剤の治療又は予防に有効な量を前記個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項３１】
アルタナリア（Alternaria）及び／又はクラドスポリウム（Cladosporium）に対するアレルギーの予防又は治療用薬剤の製造のための、請求項１〜２１に定義された少なくとも３個のポリペプチド又は塩の使用。
【請求項３２】
請求項１〜２１のいずれか１項に定義された少なくとも3個のポリペプチド又は塩を、製薬上許容可能な担体又は希釈剤と組み合わせる工程を含む、本発明の医薬製剤を調製する方法。
【請求項３３】
30アミノ酸長までであり、以下を含むポリペプチド又はその製薬上許容可能な塩:
(I)アミノ酸配列:
(a)   WSWKIGPAIATGNT(Alt28; SEQ ID NO: 101)、
(b)   KYRRVVRAGVKVAQTAR(Alt34A; SEQ ID NO: 107)、もしくは
(c)   KYAGVFVSTGTLGGG(SEQ ID NO: 112);又は
(II)  T細胞エピトープ含有変異体配列、該配列は７までのアミノ酸修飾を有する前記アミノ酸配列(I)であり、各修飾は独立して、欠失、置換又は挿入である。
【請求項３４】
ポリペプチドが、KKYAGVFVSTGTLGGGK(Alt18, SEQ ID NO: 89)及びYEKYRRVVRAGVKV(Alt34, SEQ ID NO: 106)から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３３に記載のポリペプチド又は塩。
【請求項３５】
アルタナリア（Alternaria）及び／又はクラドスポリウム（Cladosporium）に対するアレルギーの治療又は予防方法に使用するための請求項３３又は３４に記載のポリペプチド又は塩。
【請求項３６】
アルタナリア（Alternaria）及び／又はクラドスポリウム（Cladosporium）に対するアレルギーの予防又は治療用薬剤の製造のための請求項３３又は３４に記載のポリペプチド又は塩の使用。
【請求項３７】
アルタナリア（Alternaria）及び／又はクラドスポリウム（Cladosporium）に対するアレルギーの個体を治療する方法又はアルタナリア（Alternaria）及び／又はクラドスポリウム（Cladosporium）に対する個体のアレルギーを予防する方法であって、請求項３３又は３４記載のポリペプチド又は塩の治療又は予防に有効な量を前記個体に投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アルタナリア（Alternaria）及び／又はクラドスポリウム（Cladosporium）属のカビアレルギーの予防又は治療のために使用しうるポリペプチド及び医薬製剤に関する。
【０００２】
発明の背景
カビアレルゲンは、ヒト及び動物におけるアレルギー性疾患の主な原因として認識されており、その例として喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎及びアレルギー性皮膚炎などが挙げられる。寒冷地では、屋外では、晩冬に始まり、晩夏から初秋の月（７月〜１０月）をピークに発見されうる。温帯地域では、カビ胞子は１年を通じて発見され、晩夏から初秋の月では最も高いレベルで発見されうる。いっぽう屋内カビは、１年中発生しうるし、家の中の水分レベルに依存するが、屋外のカビのレベルが高くなる時に屋内カビのレベルはより高くなる。したがって、屋内カビの起源は、屋内カビの混入由来でもありえるが、通常外部環境由来である。
【０００３】
数千のタイプのカビがあるが、これらのうちほんの少ししか通常はアレルギーに関係しない。下記は、空気中で採取されたカビ胞子のタイプに基づくアレルギー疾患の最も起こりうる原因である:アルタナリア（Alternaria）、クラドスポリウム（Cladosporium）、アスペルギルス（Aspergillus）、ペニシリウム（Penicillium）、ヘルミントスポリウム（Helminthosporum）、エピコッカム（Epicoccum）、フザリウム（Fusarium）、オウレオバシディウム（Aureobasidium）、フォーマ（Phoma）、リゾープス（Rhizopus）、ムコール（Mucor）、黒穂病菌（Smuts）及びイースト（Yeasts）。なかでも、アルタナリア属のカビ、特にアルタナリア  アルタネート（Alternaria. Alternata）、及びクラドスポリウム属のカビが、最も重要なアレルギーを起こす菌類であると考えられている。
【０００４】
クラドスポリウムは、最も多い空中を浮遊する屋外カビである。アルタナリアは、子供に影響を及ぼす主要なアレルゲンのひとつである。温暖な気候では、空中を浮遊するアルタナリア胞子は年中（典型的には北半球では５月から１１月）検出され、晩夏及び秋をピークに検出される。アルタナリア胞子の飛散は乾燥している期間に起こる。その期間はより高い風速及びより低い相対湿度を特徴とし、晴れた午後の間に飛散のピークをもたらす。
【０００５】
屋外カビと考えられているが、アルタナリアは十分な湿度と適当な成長物質が与えられるところであればどこでも成長しうる。従って、アルタナリアは一般に屋内で発見されるが、特に地下室、キッチン又はバスルームのような湿ったエリアで発見される。アルタナリアは、冷蔵庫の雫受け、エアーコンディショナー、くず入れ、マットレス、発泡ゴム枕で一般に発見され、又は窓の水滴中でも発見される。アルタナリアは、北アメリカ及びヨーロッパの両方におけるハウスダスト中に発見される最も多いカビ胞子のひとつである。アルタナリアアレルゲンを回避することは実際上不可能である。
【０００６】
発明の概要
本発明は、製薬上許容可能な担体又は希釈剤、及び以下の少なくとも3個から選択されるポリペプチド又はその製薬上許容可能な塩を含む医薬製剤:
(a)アミノ酸配列WSWKIGPAIATGNT(Alt28; SEQ ID NO: 101)もしくは前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;
(b)アミノ酸配列KYRRVVRAGVKVAQTAR(Alt34A; SEQ ID NO: 107)もしくは前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;
(c)アミノ酸配列KYAGVFVSTGTLGGG(SEQ ID NO: 112)もしくは前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;
(d)アミノ酸配列AEVYQKLKALAKKTYGQ(Alt13A; SEQ ID NO: 83)もしくは前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;
(e)アミノ酸配列SLGFNIKATNGGTLD(Alt01A; SEQ ID NO: 60)もしくは前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;
(f)アミノ酸配列SAKRMKVAFKLDIEK(Alt06; SEQ ID NO: 72)もしくは前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;
(g)アミノ酸配列DITYVATATLPNYCR(SEQ ID NO: 111)もしくは前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;及び
(h)アミノ酸配列GWGVMVSHRSGET(Alt14; SEQ ID NO: 84)もしくは前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;
であって、前記アミノ酸配列のT細胞エピトープ含有変異体配列は、７個までのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列であり、各修飾は独立して、欠失、置換又は挿入であり、各ポリペプチドは、30アミノ酸長までである医薬製剤を提供する。
【０００７】
本発明は、さらにクラドスポリウム及び／又はアルタナリアに対するアレルギーの治療又は予防方法に使用するための本発明の医薬製剤を提供する。
【０００８】
本発明は、アルタナリア及び／又はクラドスポリウムに対するアレルギーの個体の治療方法又はアルタナリア及び／又はクラドスポリウムに対する個体のアレルギーを予防する方法も提供し、該方法は本発明の医薬製剤の治療又は予防に有効な量を前記個体に投与する工程を含む。
【０００９】
本発明はさらに、アルタナリア及び／又はクラドスポリウムに対するアレルギーの予防又は治療用薬剤の製造のための上記の少なくとも3個のポリペプチド又は塩の使用を提供する。
【００１０】
本発明はまた、Ｔ細胞が本発明の医薬製剤のポリペプチドを認識するかどうかを判定するインビトロの方法を提供する。該方法は、前記Ｔ細胞を前記医薬製剤と接触させる工程及び前記Ｔ細胞が前記ポリペプチドにより刺激されるかどうかを検出する工程を含む。
【００１１】
本発明は、本発明の医薬製剤を調製する方法も提供し、該方法は上記の少なくとも3個のポリペプチド又は塩を製薬上許容可能な担体又は希釈剤と組み合わせる工程を含む。
【００１２】
本発明は、さらに、30アミノ酸長までであり、以下を含むポリペプチド又はその製薬上許容可能な塩を提供する:
(I)アミノ酸配列:
(a)WSWKIGPAIATGNT(Alt28; SEQ ID NO: 101)、
(b)KYRRVVRAGVKVAQTAR(Alt34A; SEQ ID NO: 107)、もしくは
(c)KYAGVFVSTGTLGGG(SEQ ID NO: 112); 又は
(II)T細胞エピトープ含有変異体配列（７個までのアミノ酸修飾を有する前記アミノ酸配列(I)であり、各修飾は独立して、欠失、置換又は挿入である）。
【００１３】
また本発明は、アルタナリア及び／又はクラドスポリウムに対するアレルギーの治療又は予防方法に使用するための本発明のポリペプチド又は塩を提供し、アルタナリア及び／又はクラドスポリウムに対するアレルギーの予防又は治療用薬剤の製造のための本発明のポリペプチド又は塩の使用を提供する。さらに本発明は、アルタナリア及び／又はクラドスポリウムに対するアレルギーのための個体の治療方法又はアルタナリア及び／又はクラドスポリウムに対する個体のアレルギーを予防する方法を提供し、該方法は本発明のポリペプチド又は塩の治療又は予防に有効な量を前記個体に投与する工程を含む。
【００１４】
配列の説明
SEQ ID NO:1〜118は、実施例1〜10に提示したようなアミノ酸配列を提供する、より詳細には:
SEQ ID NO:１〜６、59〜65及び111は、タンパク質Alt a1由来のアミノ酸配列に対応する。
SEQ ID NO:7〜11、66〜78及び113は、タンパク質Alt a2由来のアミノ酸配列に対応する。
SEQ ID NO:12〜22及び79〜87は、タンパク質Alt a６由来のアミノ酸配列に対応する。
SEQ ID NO:23〜29、88、89、112及び114は、タンパク質Alt a7由来のアミノ酸配列に対応する。
SEQ ID NO:30〜35及び90〜98は、タンパク質Alt a8由来のアミノ酸配列に対応する。
SEQ ID NO:36〜48及び99〜101は、タンパク質Alt a10由来のアミノ酸配列に対応する。
SEQ ID NO:49〜58、102〜107及び115は、タンパク質Alt a13由来のアミノ酸配列に対応する。
SEQ ID NO:108〜110は、上記アルタナリアタンパク質のホモログ由来のアミノ酸配列に対応する。
SEQ ID NO:116〜118は、実施例９で使用したコントロールポリペプチドのアミノ酸配列に対応する。
上記に対して言及したタンパク質のためのNCBIアクセッション番号は、実施例1〜10において提供される。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、クラドスポリウム及び／又はアルタナリアに対するアレルギーの予防又は治療に関し、またこの用途に適したポリペプチド、及び製薬上許容可能なその塩の組合せを提供する。ポリペプチド又は塩の組合せは医薬製剤に提供されうる。
【００１６】
アミノ酸配列及び変異体アミノ酸配列
本発明のポリペプチドは、好ましくは、以下のいずれか1個に示すようなアミノ酸配列を含む、該アミノ酸配列からなる、又は実質的該アミノ酸配列からなりえる:
(a)WSWKIGPAIATGNT(Alt28; SEQ ID NO: 101)、
(b)KYRRVVRAGVKVAQTAR(Alt34A; SEQ ID NO: 107)、
(c)KYAGVFVSTGTLGGG(Alt18; SEQ ID NO: 112)、
(d)AEVYQKLKALAKKTYGQ(Alt13A; SEQ ID NO: 83)、
(e)SLGFNIKATNGGTLD(Alt01A; SEQ ID NO: 60)、
(f)SAKRMKVAFKLDIEK(Alt06; SEQ ID NO: 72)、
(g)DITYVATATLPNYCR(SEQ ID NO: 111)、もしくは
(h)GWGVMVSHRSGET(Alt14; SEQ ID NO: 84)。
【００１７】
本発明の他のポリペプチドは、以下に示すようなアミノ酸配列を含む、該アミノ酸配列からなる、又は実質的該アミノ酸配列からなる:
(i)IEKLRSNITVQYDI(Alt33; SEQ ID NO: 105)、
(j)SAFRSIEPELTVY(Alt10; SEQ ID NO: 77)、
(k)GYTGKIKIAMDVASSE(Alt15; SEQ ID NO: 86)。
【００１８】
あるいは、本発明の医薬製剤に含まれるポリペプチドは、T細胞エピトープ含有変異体配列を含む、該変異体配列からなる、又は実質的に該変異体配列からなりえ、該変異体配列は、７個までのアミノ酸修飾を有する(a)〜(k)のいずれかひとつに示すようなアミノ酸配列であり、各修飾は独立して、欠失、置換又は挿入である。
【００１９】
変異体配列における修飾は、対応する元のアミノ酸配列に存在するT細胞エピトープの機能特性を改変しない。T細胞エピトープの該機能特性をさらに以下に述べる。
【００２０】
好ましい変異体配列においては、T細胞エピトープを含有する対応する元のアミノ酸配列の十分に連続するアミノ酸が、保持されている。典型的には、かかる変異体配列は、少なくとも8個、好ましくは少なくとも9個の元のアミノ酸配列の連続するアミノ酸を保持している。該変異体配列は、８〜１２個又は９〜１２個の元のアミノ酸配列のアミノ酸を保持してもよい。
【００２１】
変異体配列は、７個より少ないアミノ酸修飾を有してもよい。例えば、前記変異体配列は、６個まで又は５個までのアミノ酸修飾を有してもよく、好ましくは、４個までの前記アミノ修飾、より好ましくは３個までのアミノ酸修飾を有してもよく、最も好ましくは１個だけ又は２個のアミノ酸修飾を有してもよい。前記すべての修飾は、独立して、欠失、置換又は挿入である。
【００２２】
特に好ましい実施態様において、変異体配列は、１個又は２個のアミノ酸修飾を有し、該修飾は独立して欠失又は置換である。
【００２３】
欠失
T細胞エピトープ含有変異体配列がアミノ酸修飾の欠失を有している場合、欠失されたアミノ酸は、好ましくは対応する元のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端から除去される。すなわち、変異体配列は、元の配列のＮ末端及び／又はＣ末端から１個以上の連続するアミノ酸を除去することにより形成される元のアミノ酸配列のトランケーション（truncation）である。かかる変異体配列は、他の欠失又は他の修飾を任意で有しえない。
【００２４】
欠失されたアミノ酸は、対応する元のアミノ酸配列中内部位置から除去されうるのはあまり好ましくない。内部位置からの除去とは、欠失されたアミノ酸が、元のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端におけるそれ自体でもなく、元のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端を含む連続するアミノ酸の配列の一部として除去されたものでもないことを意味する。すなわち内部位置からの欠失を考慮すると、前記欠失は、元のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端からの欠失とは独立に生じなければならない。
【００２５】
例えば、元の配列ABCDEFGHと仮定すると、２個のアミノ酸の内部欠失を有する変異体配列の例は、ADEFGHでありえる、すなわちB及びCが内部位置から除去され、元の末端残基A及びHは保持される。対照的に、同じ元の配列のＮ末端から２個の連続するアミノ酸の欠失は、変異体配列CDEFGHとなり、A及びBが除去され、Ｃが現在のＮ末端にある。この場合Ｂの欠失は、内部位置からの除去ではない、なぜならBは元の配列のＮ末端を含む２個の連続するアミノ酸のひとつとして除去されているからである。
【００２６】
１個以上の欠失が変異体配列中に起こる場合には、欠失されたアミノ酸はＮ末端及び／又はＣ末端及び／又は内部位置の如何なる組み合わせからの除去であってもよい。好ましい変異体配列は、内部位置からの１個以下の欠失を有する。特に好ましい変異体配列においては、内部位置からの欠失はなく、欠失されたアミノ酸は、元の配列のＮ末端及び／又はＣ末端のいずれかの組み合わせから除去される。すなわち欠失されたアミノ酸は、元の配列のＮ末端からすべて除去されてもよいし、また元の配列のＣ末端からすべて除去されてもよいし、又はいくつかのアミノ酸が、元の配列の各末端から除去されてもよい。
【００２７】
したがって、ひとつの実施態様においては、変異体配列は、１、２、３、４、５、６又は７個のアミノ酸が(a)〜(k)の前記配列のＮ末端から除去されている、(a)〜(k)のいずれかのひとつのアミノ酸配列である。
別の実施態様においては、変異体配列は、１、２、３、４、５、６又は７個のアミノ酸が(a)〜(k)の前記配列のＣ末端から除去されている、(a)〜(k)のいずれかのひとつのアミノ酸配列である。
【００２８】
別の実施態様においては、前記配列が、合計で６個以下の修飾を有する場合には、変異体アミノ酸配列は、多数のアミノ酸が前記配列のＮ末端及びＣ末端の両方から除去されている(a)〜(k)のいずれかひとつのアミノ酸配列である。かかる変異体配列の好ましい実施態様は、１、２又は３個のアミノ酸が前記配列のＮ末端及び／又はＣ末端から除去され、任意には他の修飾を有しない(a)〜(k)のいずれかひとつのアミノ酸配列である。
【００２９】
少なくとも１個の欠失を有する変異体アミノ酸配列の具体例としては:
変異体配列QKLKALAKKTYGQ(SEQ ID NO: 18)（アミノ酸配列AEVYQKLKALAKKTYGQ(SEQ ID NO: 83)のＮ末端から４個のアミノ酸が欠失している配列）;
変異体配列DITYVATATLPNY(SEQ ID NO: 5)（アミノ酸配列DITYVATATLPNYCR(SEQ ID NO: 111)のＣ末端から２個のアミノ酸が除去されている配列）;
変異体配列RVVRAGVKVAQTA(SEQ ID NO: 58)（アミノ酸配列KYRRVVRAGVKVAQTAR(SEQ ID NO: 107)のＮ末端から３個のアミノ酸、Ｃ末端から１個のアミノ酸が除去されている配列）;及び
変異体配列YEKYRRVVRAGVKV(SEQ ID NO: 106)（アミノ酸配列KYRRVVRAGVKVAQTAR(SEQ ID NO: 107)のＣ末端から５個のアミノ酸残基が除去され、Alt a 13の天然配列中のKYRRVVRAGVKVAQTARのすぐＮ末端側の２個の連続するアミノ酸に対応する２個のアミノ酸がＮ末端で伸長している配列）
が挙げられる。
【００３０】
置換
T細胞エピトープ含有変異体配列が、アミノ酸修飾の置換を有する場合、置換は元のアミノ酸配列中のいずれの位置で起きてもよい。好ましくは、前記置換はプロリン又はシステインを挿入しない。また好ましくは、前記置換は保存的置換である。
【００３１】
保存的置換とは、アミノ酸が、同様の性質を有するいずれかの別のアミノ酸と置換されうることを意味する。下記は実施例の完全に網羅されていないリストである。
【００３２】
リジン、アルギニン又はヒスチジンなどの塩基性側鎖を伴うアミノ酸は、各々独立して、互いに置換されうる。
【００３３】
アスパラギン及びグルタメートのような酸性側鎖を伴うアミノ酸は各々独立して、互いに置換又は、それらのアミド誘導体、アスパラギン及びグルタミンと置換されうる。グルタメート又はグルタミンも好ましくは、ピログルタメートと交換されうる。グルタメート又はグルタミンと置換されたピログルタメートを有する変異体配列は、前記ピログルタメートが、該変異体配列を含む、該変異体配列からなる又は実質的に該変異体配列からなる本発明のポリペプチドのＮ末端に対応している場合には、特に好ましい。Ｎ末端にピログルタメートを伴うポリペプチドは、通常製造中に安定性が向上している。
【００３４】
グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンのような脂肪族側鎖を伴うアミノ酸は各々独立して、互いに置換されてもよい。このカテゴリーにおいては、特に好ましい置換は、より小さな脂肪族側鎖を伴うアミノ酸に限定される、すなわちグリシン、アラニン、バリンに限定され、好ましく各々独立して、互いに置換されてもよい。
【００３５】
他の好ましい置換としては、メチオニンがノルロイシン(Nle)に置換されることが挙げられる。
【００３６】
またより一般的な用語において、中性アミノ酸は別の中性のアミノ酸で置換されてもよく、荷電アミノ酸は別の荷電アミノ酸と置換されてもよく、親水性アミノ酸は、別の親水性アミノ酸と置換されてもよく、疎水性は別の疎水性アミノ酸と置換されてもよく、極性アミノ酸は、別の極性アミノ酸と置換されてもよく、また芳香族アミノ酸は、別の芳香族アミノ酸と置換されてもよい。適当な置換基を選択するために使用することができる20個の主要なアミノ酸のいくつかの特徴は次のとおりである:
【００３７】
2015520771.tif 000002
【００３８】
少なくとも１個の置換を有する変異体アミノ酸配列の具体例は以下である:
・変異体配列SAKR-Nle-KVAFKLDIEK(SEQ ID NO: 73)は、１個の置換を有するアミノ酸配列SAKRMKVAFKLDIEK(SEQ ID NO: 72)である。SEQ ID NO: 72の５位のアミノ酸Mがノルロイシンに置換されている;及び
・変異体配列DITYVATATLPNYSR(SEQ ID NO: 62)は、１個の置換を有するアミノ酸配列DITYVATATLPNYCR(SEQ ID NO: 111)である。SEQ ID NO: 111の１４位のアミノ酸Ｃがセリンに置換されている。他の好ましいSEQ ID NO: 111の変異体配列としては、１４位に、別の、好ましくは類似の置換を伴う配列が挙げられる。例えば、Sで置換するかわりに、１４位のアミノ酸CをT、G、A又はVで置換することができる。
【００３９】
いくつかの変異体配列において、置換及び欠失があり得る。具体例は以下である:
・変異体配列AEVYQKLKSLTK(SEQ ID NO: 108)は、Ｃ末端で５個の欠失及び9位(AlaをSerに)及び11位(AlaをThrに)において２個の置換を有するアミノ酸配列AEVYQKLKALAKKTYGQ(SEQ ID NO: 83)である。他の好ましいSEQ ID NO: 83の変異体配列としては、9及び11位に、別の、好ましくは類似の置換を伴う配列が挙げられる。例えば、S及びＴで置換するかわりに、9及び11位の両方のアミノ酸Ａを独立してG又はVで置換することができる。;及び
・SAKR-Nle-KVAFK(SEQ ID NO: 113)の変異体配列は、Ｃ末端における５個の欠失があり５位において１個の置換(MetをNleに)が行われているアミノ酸配列SAKRMKVAFKLDIEK(Alt06; SEQ ID NO: 72)である。
【００４０】
挿入
変異体配列が、アミノ酸修飾の挿入を有する場合、付加されるアミノ酸は、元のアミノ酸配列中のいずれの位置に挿入されてもよい。挿入はプロリン又はシステインを導入しないことが好ましい。
【００４１】
好ましくは、アミノ酸は、元の配列のＮ末端及び／又はＣ末端において挿入され得る。すなわち、変異体配列は、元の配列のＮ末端及び／又はＣ末端にアミノ酸を付加することにより形成された元のアミノ酸配列の伸長である。かかる変異体配列は、他の挿入又は他の修飾を任意で有しえない。
【００４２】
アミノ酸が内部位置に挿入されうることはあまり好ましくない。内部位置に挿入するとは、Ｃ末端のいずれかの位置のアミノ酸を元の配列のＮ末端におけるアミノ酸に挿入、又はＮ末端のいずれかの位置のアミノ酸を元の配列のＣ末端におけるアミノ酸に挿入することを意味する。
【００４３】
１個以上の挿入が変異体配列中に起こる場合には、付加されたアミノ酸はＮ末端及び／又はＣ末端及び／又は内部位置のいずれかの組み合わせに挿入されうる。好ましい変異体配列は、内部位置において１個以下の挿入を有する。特に好ましい変異体配列においては、内部位置での挿入は無く、付加されたアミノ酸は、元の配列のＮ末端及び／又はＣ末端のいずれかの組み合わせに挿入される。すなわち付加されたアミノ酸は、元の配列のＮ末端にすべて挿入されうるし、又は元の配列のＣ末端にすべて挿入されうるし、又はいくつかのアミノ酸は、元の配列の各末端に挿入されうる。すなわち、付加されたアミノ酸は、Ｎ末端及び／又はＣ末端において元の配列を伸長すると考えられうる。
【００４４】
このように、ひとつの実施態様においては、変異体配列は、１、２、３、４、５、６又は７個のアミノ酸が前記配列(a)〜(k)のＮ末端に挿入されている、(a)〜(k)のいずれかのひとつのアミノ酸配列である。
【００４５】
別の実施態様においては、変異体アミノ酸配列は、１、２、３、４、５、６又は７個のアミノ酸が前記配列(a)〜(k)のＣ末端に挿入されている、(a)〜(k)のいずれかのひとつのアミノ酸配列である
【００４６】
別の実施態様においては、前記配列は合計で７個以下の修飾を有する場合には、変異体アミノ酸配列は、多数のアミノ酸が前記配列(a)〜(k)のＮ末端及びＣ末端の両方に挿入されている(a)〜(k)のいずれかのひとつのアミノ酸配列である。かかる変異体配列の好ましい実施態様は、１、２又は３個のアミノ酸が前記配列(a)〜(k)のＮ末端及び／又はＣ末端に挿入され、任意で他の修飾を含まなくてよい、(a)〜(k)のいずれかのひとつのアミノ酸配列である。
【００４７】
Ｎ末端及び／又はＣ末端に挿入された荷電アミノ酸を有する変異体配列は、前記荷電アミノ酸が、変異体配列を含む、変異体配列からなる又は実質的変異体配列からなる本発明のポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に対応する場合は特に好ましい。ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端の荷電した残基は、ポリペプチドの溶解性を改善することができる。好ましい荷電アミノ酸としては、リジン、アルギニン及びヒスチジンが挙げられる。リジンが特に好ましい。したがって特に好ましい変異体配列は、1個以上の荷電アミノ酸、好ましくは１個以上のリジン残基が前記配列(a)〜(k)のＮ末端及び／又はＣ末端に挿入されている(a)〜(k)のいずれかのひとつのアミノ酸配列である。
【００４８】
少なくとも１個の挿入を有する変異体アミノ酸配列の具体例は以下が挙げられる:
・変異体配列KSAFRSIEPELTVYK(SEQ ID NO: 78)（アミノ酸配列SAFRSIEPELTVY(SEQ ID NO: 77)のＮ末端及びＣ末端にリジンが挿入された配列）;及び
・変異体配列KKYAGVFVSTGTLGGGK(SEQ ID NO: 89)（アミノ酸配列KYAGVFVSTGTLGGG(SEQ ID NO: 112)のＮ末端及びＣ末端にリジンが挿入された配列）。
【００４９】
ポリペプチド
本発明の医薬製剤に含まれるポリペプチドは３０アミノ酸長までであり、上記定義したアミノ酸配列又は変異体配列を含む、該配列からなる、又は実質的に該配列からなる。
【００５０】
前記ポリペプチドは、好ましくは25アミノ酸長まで、より好ましくは20アミノ酸長まで又は17アミノ酸長まで、最も好ましくは15アミノ酸長までである。言い換えれば、ポリペプチドは30、25、20、17又は15アミノ酸の最大長を有しうる。
【００５１】
本発明の医薬製剤に含まれるポリペプチドは、好ましくは、少なくとも8アミノ酸長、より好ましくは少なくとも9アミノ酸長、最も好ましくは少なくとも12アミノ酸長である。言い換えれば、該ポリペプチドは、8、9又は12アミノ酸の最小長を有しうる。
【００５２】
本発明の医薬製剤に含まれるポリペプチドは、前記最少長及び前記最大長のいずれかの組み合わせにより定義される長さのポリペプチドでありえる。例えば、該ポリペプチドは、8〜30、8〜25、8〜20、8〜17又は8〜15アミノ酸長でありえる。ポリペプチドは、9〜30、9〜25、9〜20、9〜17又は9〜15アミノ酸長でありえる。ポリペプチドは、12〜30、12〜25、12〜20、12〜17又は12〜15アミノ酸長でありえる。好ましいポリペプチドは、9〜30アミノ酸長、より好ましくは9〜20アミノ酸長のポリペプチドである。特に好ましいポリペプチドは、12〜17アミノ酸長のポリペプチドである。
【００５３】
本発明の医薬製剤に含まれるポリペプチドは、上記定義のアミノ酸配列又は変異体配列を含んでもよい。したがって、前記ポリペプチドは、前記アミノ酸配列又は変異体配列により定義されていない追加的アミノ酸を含んでもよい。該追加のアミノ酸は、隣接する前記アミノ酸配列又は変異体配列として記載されてもよい。すなわち、追加のアミノ酸は、前記アミノ酸配列又は変異体配列のＮ末端及び／又はＣ末端に含められる。
【００５４】
言い換えれば、本発明の医薬製剤に含まれるポリペプチドは、多数のアミノ酸のＮ末端及び／又はＣ末端伸長を有する前記アミノ酸配列又は変異体配列からなる配列を有してもよい。Ｎ末端及び／又はＣ末端伸長におけるアミノ酸の最大数は、上記定義したようにポリペプチドの最大長により決定される。
【００５５】
前記アミノ酸配列又は変異体配列のＮ末端伸長におけるアミノ酸は、好ましくは、由来するタンパク質の天然配列中の前記アミノ酸配列のすぐＮ末端側のアミノ酸に対応する。
【００５６】
前記アミノ酸配列又は変異体配列のＣ末端伸長におけるアミノ酸は、好ましくは、由来するタンパク質の天然配列中の前記アミノ酸配列のすぐＣ末端側のアミノ酸に対応する。
【００５７】
Ｎ末端及び／又はＣ末端伸長は、由来するタンパク質の配列中の前記アミノ酸配列のすぐＮ末端側又はＣ末端側の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の連続するアミノ酸にそれぞれ対応する１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸であってもよい。
【００５８】
すなわち、Ｎ末端及び／又はＣ末端伸長は、由来するタンパク質の天然配列中の前記アミノ酸配列のすぐＮ末端側又はＣ末端側の１〜１０個の連続するアミノ酸にそれぞれ対応する１〜１０個のアミノ酸である。
【００５９】
好ましくは、Ｎ末端及び／又はＣ末端伸長は、前記アミノのすぐＮ末端側又はＣ末端側の１〜６個の連続するアミノ酸にそれぞれ対応する１〜６個のアミノ酸である。
【００６０】
より好ましくは、Ｎ末端及び／又はＣ末端伸長は、前記アミノのすぐＮ末端側又はＣ末端側の１〜４個の連続するアミノ酸にそれぞれ対応する１〜４個のアミノ酸である。
【００６１】
最も好ましくは、Ｎ末端及び／又はＣ末端伸長は、前記アミノ酸配列のすぐＮ末端側又はＣ末端側の１〜２個の連続するアミノ酸にそれぞれ対応する１〜２個のアミノ酸である。
【００６２】
アミノ酸配列又は変異体配列に対してＮ末端及び／又はＣ末端伸長を含むポリペプチドの具体例としては以下が挙げられる:
AEVYQKLKALAKKTYGQ(SEQ ID NO: 83)は、Alt a 6の天然配列中のAEVYQKLKALAKKTYGQのＮ末端側又はＣ末端側すぐの１、２、３、４、５又は６個の連続するアミノ酸にそれぞれ対応する１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸のＮ末端及び／又はＣ末端伸長、Ｎ末端のアミノ酸E、A、M、R、Q及びGならびにＣ末端のS、A、G、N、V及びGを有してもよい。例えば、１個のアミノ酸伸長が、Ｎ末端及びＣ末端の両方に存在する場合は、本発明のポリペプチドはアミノ酸配列GAEVYQKLKALAKKTYGQS(SEQ ID NO:12; Ｎ末端及びＣ末端伸長は下線)を有する。
【００６３】
SLGFNIKATNGGTLD(SEQ ID NO: 60)は、Alt a 1の天然配列中のSLGFNIKATNGGTLDのＮ末端側及び／又はＣ末端側すぐの１、２、３、４、５又は６個の連続するアミノ酸に対応する１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸のＮ末端及び／又はＣ末端伸長を有してもよい。例えば、６個の連続するアミノ酸が、Ｎ末端伸長に存在し、２個の連続するアミノ酸がＣ末端伸長に存在する場合、本発明のポリペプチドはアミノ酸配列EGTYYNSLGFNIKATNGGTLDFT(SEQ ID NO: 2;Ｎ末端及びＣ末端伸長は下線)を有する。
【００６４】
IEKLRSNITVQYDI(SEQ ID NO: 105)は、Alt a 13の天然配列中のIEKLRSNITVQYDIのＮ末端側すぐの１、２又は３個の連続するアミノ酸に対応する１、２又は３個のアミノ酸のＮ末端伸長、アミノ酸P、K及びTを有してもよい。またAlt a 13の天然配列中のIEKLRSNITVQYDIのＣ末端側すぐの１、２又は３個の連続するアミノ酸に対応する１、２又は３個のアミノ酸のＣ末端伸長、アミノ酸L、E及びRを有してもよい。例えば、３個の連続するアミノ酸すべてがＮ末端伸長に存在し、３個の連続するアミノ酸すべてがＣ末端伸長に存在する場合、本発明のポリペプチドはアミノ酸配列PKTIEKLRSNITVQYDILER(SEQ ID NO: 115；Ｎ末端及びＣ末端伸長は下線)を有する。
【００６５】
GWGVMVSHRSGET(Alt18; SEQ ID NO: 84)は、Alt a 7の天然配列中のGWGVMVSHRSGETのＮ末端側すぐの１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸に対応する１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸のＮ末端伸長、アミノ酸K、D、A、F、G及びAを有してもよい。またAlt a 7の天然配列中のGWGVMVSHRSGETのＣ末端側すぐの１、２又は３個の連続するアミノ酸に対応する１、２又は３個のアミノ酸のＣ末端伸長を有してもよい。該伸長はアミノ酸E、D及びVである。例えば、６個のアミノ酸すべてがＮ末端伸長に存在し、３個の連続するアミノ酸すべてがＣ末端伸長に存在する場合、本発明のポリペプチドはアミノ酸配列KDAFGAGWGVMVSHRSGETEDV(SEQ 15、Ｎ末端及びＣ末端伸長は下線)を有する。
【００６６】
Ｎ末端及び／又はＣ末端伸長中のアミノ酸は、アミノ酸配列又は変異体配列由来のタンパク質の天然配列中のアミノ酸に正確に対応しなくともよい。Ｎ末端及び／又はＣ末端伸長は、例えばポリペプチドの安定性、溶解性又は製造可能性を改善するために、修飾された前記天然配列由来の配列を含んでもよい。例えば、天然配列中のメチオニンは、ノルロイシン（nor-leucine）で置換されてもよく、及び／又は１個以上の荷電残基が、Ｎ末端伸長のＮ末端に、及び／又はＣ末端伸長のＣ末端に付加されてもよい。好ましくは、アルギニン及びリジンのようなプラスに荷電した残基が付加される。ヒスチジン、グルタメート及びアスパルテートから選択されるアミノ酸が付加されてもよい。 
【００６７】
あるいは、Ｎ末端及び／又はＣ末端伸長のアミノ酸は、アミノ酸配列又は変異体配列由来のタンパク質の天然配列中のアミノ酸に対応しなくてもよい。該アミノ酸はかわりに如何なる適当なアミノ酸であってもよく、好ましくは、ポリペプチドの安定性、溶解性又は製造可能性を改善するために選択されたアミノ酸がよい。例えば、１個以上の荷電残基が、本発明のアミノ酸配列又は変異体配列のいずれかのＮ末端及び／又はＣ末端に付加されてもよい。好ましくは、アルギニン及びリジンのようなプラスに荷電した残基が付加される。ヒスチジン、グルタメート及びアスパルテートから選択されるアミノ酸が付加されてもよい。
【００６８】
T細胞エピトープ
本発明の医薬製剤に含まれるポリペプチドは、30アミノ酸長までであり、上記に定義したようなアミノ酸配列又は変異体配列を含む、該配列からなる、又は実質的該配列からなる。各前記アミノ酸配列及び前記変異体配列は、T細胞エピトープを含む。T細胞エピトープは、好ましくはMHCクラスII結合T細胞エピトープである。変異体配列中の修飾は対応する元のアミノ酸配列中に存在するT細胞エピトープの機能特性を改変しないことが好ましい。
【００６９】
好ましい変異体配列においては、T細胞エピトープを含む対応する元のアミノ酸配列の十分に連続するアミノ酸が保持される。典型的に、かかる変異体配列は、少なくとも8個、好ましくは少なくとも9個の元のアミノ酸配列の連続するアミノ酸を保持している。
【００７０】
T細胞エピトープの存在は、好ましくは、インシリコにより行う分析、例えば実施例１〜５に記載の生物情報工学のソフトウェアを使用して、確認してもよい。あるいは、T細胞エピトープの存在はその機能特性の直接評価により確認してもよい。T細胞エピトープの特定機能特性としては、MHC分子、好ましくMHCクラスII分子に結合するエピトープを含むポリペプチドの能力、及び／又はT細胞を活性化する、好ましくはMHCクラスII分子に結合する時に活性化するエピトープを含むポリペプチドの能力が挙げられる。
【００７１】
MHC分子に結合するポリペプチドの能力は、競合アッセイのような適切ないずれかの方法を使用して評価してもよい。好ましいインビトロアッセイは実施例6に記載されている。
【００７２】
T細胞を活性化するポリペプチドの能力も、適切ないずれかの方法を使用して評価してもよい。好ましい方法としては、増殖又はサイトカイン放出のようなＴ細胞活性化に関連する１個以上のパラメータの測定が挙げられる。これらのパラメータのための好ましいアッセイは実施例7に記載されている。関連するサイトカインとしては、IFN-ガンマ、IL-13及びIL-10が挙げられる。本発明の明細書において、ポリペプチドが、IFN-ガンマ、IL-13及びIL-10の１個、２個又はすべての放出を誘発するならばＴ細胞を活性化すると典型的に考えられている。ポリペプチドは、好ましくは、所定のサイトカイン（複数）の50pg／mlより多い放出を誘発する。
【００７３】
上述の通り、変異体配列中の修飾は、対応する元のアミノ酸配列中に存在するT細胞エピトープの機能特性を改変しない。したがって、変異体アミノ酸配列を含む、該配列からなる、又は実質的に該配列からなるポリペプチドは、対応する元のアミノ酸配列を含む、該配列からなる、実質的に対応する該配列からなるポリペプチドと実質的に同じMHCクラスII結合特性及び実質的に同じT細胞活性化特性を有すはずである。
【００７４】
典型的には、もしポリペプチドと別のポリペプチドの両方が同じMHCクラスIIアレルスーパータイプファミリーに属する１個以上のMHCクラスII分子に特異的に結合できるなら、ポリペプチドは別のポリペプチドと実質的に同じMHCクラスII結合特徴を有する。MHCクラスIIアレルスーパータイプファミリーの例としては、HLA-DR1、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR7、HLA-DR8、HLA-DR11、HLA-DR13、HLA-DR15及びHLA-DR51が挙げられる。最も好ましくは、両方のポリペプチドが、同じMHCクラスII分子に、すなわち同じアレルにコードされるMHCクラスII分子に特異的に結合しうる。
【００７５】
典型的には、もしポリペプチドと別のポリペプチドの両方が、同じT細胞受容体を発現するT細胞を特異的に活性化するならば、ポリペプチドは別のポリペプチドと実質的に同じT細胞活性化特性を有する。好ましくは、各ポリペプチドにより誘発された活性化のレベルにおいて有意差はあるべきでない。活性化のレベルは、上述した通り、増殖及び／又はサイトカイン放出をモニターすることにより評価してもよい。
【００７６】
変異体配列を含む、変異体配列からなる、又は実質的に変異体配列からなる適切なポリペプチドは、実験により誘導され、又は公知の基準に従って選択され得る。単一ポリペプチド内に、ＭＨＣ抗原結合溝内での結合に寄与する特定の残基、及びＴ細胞受容体の超可変領域と相互作用する他の残基が存在する(Allen et al(1987) Nature 327: 713-5)。有利なことに、ペプチドは、Ｔ細胞増殖及び脱感作誘導に有利に働くよう設計され得る。MetzlerとWraithは、ポリペプチドＭＨＣ親和性を増強する置換がなされたポリペプチドの免疫寛容誘発能の向上を実証している(Metzler & Wraith(1993) Int Immunol: 1159-65)。改変ポリペプチドリガンドがクローン化Ｔ細胞において長期かつ重度のエネルギーを引き起こし得ることは、Sloan-Lancasterら(1993) Nature 363: 156-9により実証された。 
【００７７】
配列同一性
本発明の医薬製剤中に含まれるポリペプチドのT細胞エピトープ含有変異体配列は、対応する元のアミノ酸配列に対して、その配列同一性の条件においてかわりに記載されてもよい。例えば、変異体配列は、(a)〜(k)のいずれかのひとつのアミノ酸配列に対し、少なくとも65%の同一性を有してもよい。より好ましくは、変異体配列は、(a)〜(k)のいずれかのひとつのアミノ酸配列に対し、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%のアミノ酸同一性を有してもよい。
【００７８】
配列同一性は、典型的に元のアミノ酸配列中の多数の連続するアミノ酸にわたり評価される。例えば、配列同一性は、比較対象のペプチドの大きさに応じて、元のアミノ酸配列中少なくとも9、10、11、12、13、14又は15個の連続するアミノ酸にわたり測定してもよい。配列同一性は、元のアミノ酸配列中少なくとも9個の連続するアミノ酸にわたり測定するのが好ましい。配列同一性は、対応する元のアミノ酸配列の全長にわたり測定することが特に好ましい。
【００７９】
アミノ酸配列との関連で、「配列同一性」とは、以下のパラメータでクラスタルＷ（ClustalW）（Thompson et al., 1994, supra）を使用して評価した場合に、所定の値を有する配列を言う: 
【００８０】
ペアワイズアラインメントパラメータ（Pairwise alignment parameters）−方法：正確（accurate）、マトリクス：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ（Gap open penalty）：１０．００、ギャップエクステンションペナルティ（Gap extension penalty）：０．１０；マルチプルアラインメントパラメータ（Multiple alignment parameters）−マトリクス：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、％アイデンティティーフォーディレイ（% identity for delay）：３０、ペナライズエンドギャップ（Penalize end gaps）:オン、ギャップセパレーションディスタンス（Gap separation distance）：０、ネガティブマトリクス（Negative matrix）：なし、ギャップエクステンションペナルティ：０．２０、残基特異的ギャップペナルティ：オン、親水性ギャップペナルティ：オン、親水性残基：G、P、S、N、D、Q、E、K及びR。特定の残基における配列同一性は、単に誘導体化されている同一の残基を含むことが意図される。
【００８１】
塩
本発明は、本発明のポリペプチドのいずれかの製薬上許容可能な塩を包含する。本発明のポリペプチドの製薬上許容可能な塩としては、例えば、塩化物、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩が挙げられる。塩酸塩又は酢酸塩が好ましい。
【００８２】
合成
本発明のポリペプチドはいずれかの適切な技術によって調製できる。固相ペプチド合成(SPPS)は、好ましい技術である。この技術は小固形ビーズ上にペプチドの形成を伴う。
【００８３】
SPPSを使用する時、ペプチドは、合成中ビーズに共有結合的に付着しとどまる。ペプチドは、カップリング−洗浄−脱保護−洗浄のサイクルを繰り返すことで合成される。特に、固相に付着しているペプチドの遊離Ｎ末端アミンは、単一のN−保護アミノ酸ユニットに結合している。このユニットは、その後脱保護され、新たなＮ末端アミンが出現しさらなる保護アミノ酸が付着される。これらのステップは、ペプチドが完成するまで繰り返される。ペプチドは、その後適切は試薬を使用してビーズから切断される。
【００８４】
SPPSの適当な保護基、試薬、溶媒及び反応条件は、当業者に周知であり、しかるが故に条件は、所定の最適化手順により当業者によって決定することができる。
【００８５】
ポリペプチドの製薬上許容可能な塩は、いずれか適切な技術によって調製しうる。典型的には、塩化は選択された製薬上許容可能な塩を得るための適当な試薬、典型的には酸とポリペプチド又はその塩の反応を伴う。
【００８６】
例えば、ポリペプチドの塩酸塩は、トリフルオロ酢酸を使用して固相からポリペプチドを最初に切断して調製できる。したがって、ポリペプチドは、最初はトリフルオロ酢酸塩でありえる。トリフルオロ酢酸塩は、次に塩酸を溶離液として使用した適切なカラム上でのイオン交換などのいずれかの公知の技術により塩酸塩に変換できる。
【００８７】
ポリペプチド又はポリペプチドの塩の生成物は、必要があれば、いずれかの適切な技術によって精製することができる。例えば、高圧液体クロマトグラフ法(HPLC)を使用することができる。
【００８８】
「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合により連結されている分子だけでなく、ペプチド結合が反転している分子も含む。このようなレトロ−インベルソ（retro-inverso）ペプチド模倣体は、例えばMeziereら(1997) J. Immunol.159,3230-3237に記載されているものなどの、当分野で公知の方法を使用して作製され得る。このアプローチは、主鎖に関する変化を含み、側鎖の配向性に関する変化は含まない擬ペプチドを作製することを含む。Meziereら(1997)は、少なくともＭＨＣクラスＩＩ及びヘルパーＴ細胞応答については、これらの擬ペプチドが有用であることを示している。レトロ−インベルソペプチド（ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含む）は、タンパク質分解に対してはるかに抵抗性である。
【００８９】
同様に、ペプチド結合は、アミノ酸残基の炭素原子間の間隔を保持する適切なリンカー部分が使用される限り、完全になくしてもよい；リンカー部分がペプチド結合と実質的に同じ電荷分布及び実質的に同じ平面性を有している場合が、特に好ましい。末端タンパク質分解性（exoproteolytic）消化への感受性を低減するのを助けるために、ペプチドがそのＮ末端又はＣ末端において都合良くブロックされ得ることも好ましい。例えば、ポリペプチドのＮ末端アミノ基は、カルボン酸と反応させることにより保護され得、ペプチドのＣ末端カルボキシル基は、アミンと反応させることにより保護され得る。修飾の他の例としては、糖鎖付加及びリン酸化が挙げられる。別の可能性のある修飾は、Ｒ又はＫの側鎖アミン上の水素がメチレン基で置換される場合（−ＮＨ２→−ＮＨ（Ｍｅ）又は−Ｎ（Ｍｅ）２）である。
【００９０】
本発明に従うポリペプチドのアナログは、インビボにおけるポリペプチドの半減期を延長又は短縮させるペプチド変異体をも含み得る。本発明に従って使用されるポリペプチドの半減期を延長させることのできるアナログの例としては、ペプチドのペプトイド（peptoid）アナログ、ペプチドのＤ−アミノ酸誘導体、及びペプチド−ペプトイドハイブリッドが挙げられる。本発明に従って使用される変異体ポリペプチドのさらなる実施形態は、Ｄ−アミノ酸型のポリペプチドを含む。Ｌ−アミノ酸ではなくＤ−アミノ酸を使用するポリペプチドの調製は、正常な代謝過程によるこのような薬剤の望ましくないいかなる分解も大幅に減少させ、その投与頻度とともに投与に必要とされる薬剤の量を減少させる。
【００９１】
本発明により提供されるポリペプチドは、親タンパク質鎖をコードする一次転写産物の選択的スプライシングにより作り出されるｍＲＮＡにコードされる親タンパク質のスプライス変異体に由来し得る。ポリペプチドは、親アレルゲンタンパク質のアミノ酸変異体、糖鎖付加変異体及び、他の共有結合誘導体にも由来し得る。典型的な誘導体としては、本発明のポリペプチドが、置換、化学的、酵素的、又は他の適切な手段により、天然に存在するアミノ酸以外の部分によって共有結合的に修飾されている分子が挙げられる。さらに、親タンパク質の、天然に存在する変異体アミノ酸配列が挙げられる。このような変異体アミノ酸配列は、対立遺伝子変異体によりコードされ得、又は選択的スプライシング変異体を示し得る。
【００９２】
上記のような修飾は、ペプチドの合成中に、又は産生後修飾により、あるいはポリペプチドが組換え型の場合には、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、又は核酸の酵素的切断及び／もしくはライゲーションという公知技術を使用して、調製され得る。
【００９３】
本明細書に記載のポリペプチドは、物理化学的特徴を改善するために修飾してもよい。したがって、例えば、元のアミノ酸配列は、溶解性を改善するために改変してもよいし、それに従って変異体配列を有する本発明のポリペプチドは、同じ条件下では、対応する元のアミノ酸配列を有するポリペプチドよりも好ましくより可溶性が増すであろう。ポリペプチドの溶解性を評価する方法は当分野では周知である。
【００９４】
対象への難溶性薬剤の投与が、望ましくない非寛容化炎症応答を引き起こすので、溶解性の改善は、本発明のポリペプチドが由来するアレルゲンに対する対象の寛容化のために有利である。ポリペプチドの溶解性は、Ｔ細胞エピトープを含む領域に隣接する残基を変えることにより改善され得る。例えば、T細胞エピトープに隣接するポリペプチドの残基のＮ末端及びＣ末端側、少なくとも１個のアミノ酸が、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタメート及びアスパルテートから選択され付加されてもよい。他の例においては、
i)T細胞エピトープ中に含まれない、ポリペプチドの天然配列のＮ末端又はＣ末端の３個までのアミノ酸中の任意の疎水性残基が欠失している; 及び／又は
ii)T細胞エピトープ中に含まれない、ポリペプチドの天然配列のＮ末端又はＣ末端における４個までのアミノ酸において配列Asp-Glyを含む任意の２個の連続するアミノ酸が欠失している;及び／又は
iii)ポリペプチドの天然配列のＮ末端及び／又はＣ末端に１個以上のプラスに荷電した残基が付加されている。
【００９５】
任意のシステイン残基を含むポリペプチドは、任意のシステイン残基がセリン又は２−アミノ酪酸で置換されているような二量体形成を抑制するように操作してもよい。
【００９６】
ポリペプチドの組合せ
本発明は、少なくとも３個のポリペプチド又はその塩を含むポリペプチドの組合せを提供する。各ポリペプチドは30アミノ酸長までであり、好ましくは独立して、上記に示したように(a)〜(h)のポリペプチドから選択される。ポリペプチドの組合せは、また独立して、上記に示したように(a)〜(ｋ)のポリペプチドから選択されてもよい。かかるペプチドの組合せは、好ましくは、下記の医薬製剤中に提供される。
【００９７】
(a)〜(ｋ)のポリペプチドから選択される３、４、５、６、７、８個、もしくはそれ以上のポリペプチド、又は前記その塩は、一緒になって組み合わせて提供されてよい。ポリペプチド又はその塩の1個だけが、(a)〜(k)のそれぞれから選択されるのが好ましい。
【００９８】
より好ましくは、(a)〜(ｈ)のポリペプチドから選択される３、４、５、６、７又は８個のポリペプチド、又は前記その塩が、一緒になって組み合わせて提供される。ポリペプチド又はその塩の1個だけが、(a)〜(ｈ)のそれぞれから選択されるのが好ましい。
【００９９】
上記の少なくとも３個のポリペプチドの組合せが、(a)のポリペプチド又はその塩を含むのが特に好ましい。それは、アミノ酸配列(Alt28; SEQ ID NO: 101)もしくは対応する変異体配列を含む、実質的に前記配列からなる、又は前記配列からなる、ポリペプチド又はその塩である。
【０１００】
上記の少なくとも３個のポリペプチドの組合せが、(b)、(c)もしくは(d)の少なくともひとつのポリペプチド又はその塩を含むのも好ましい。それは、アミノ酸配列KYRRVVRAGVKVAQTAR(Alt34A; SEQ ID NO: 107)、KYAGVFVSTGTLGGG(SEQ ID NO: 112)、もしくはEVYQKLKALAKKTYGQ(Alt13A;SEQ ID NO: 83)のいずれかひとつのアミノ酸配列又はいずれかの対応する変異体配列、を含む、実質的に該配列からなる、又は該配列からなる、ポリペプチド又はその塩である。
【０１０１】
SEQ ID NO: 107の好ましい変異体配列は、YEKYRRVVRAGVKV(Alt34, SEQ ID NO: 106)である。任意のポリペプチド組み合わせ及び本明細書に記載の医薬製剤において、Alt34をSEQ ID: 107の代わりに使用してよい。SEQ ID NO: 112の好ましい変異体配列はKKYAGVFVSTGTLGGGK(Alt18; SEQ ID NO: 89)である。任意のポリペプチド組み合わせ及び本明細書に記載の医薬製剤において、Alt18をSEQ ID: 112の代わりに使用してよい。
【０１０２】
少なくとも３個のポリペプチドの上記組合せが、(a)、(b)及び(c)のポリペプチド又はその塩を含むのが特に好ましい。少なくとも３個のポリペプチドの上記組合せが、(ｄ)のポリペプチド又はその塩を含むのも特に好ましい。それは、アミノ酸配列AEVYQKLKALAKKTYGQ(Alt13A;SEQ ID NO: 83)もしくは対応する変異体配列、を含む、実質的に該配列からなる、又は該配列からなる、ポリペプチド又はその塩である。少なくとも３個のポリペプチドのその他の好ましい組合せは、（a)、(b)及び(ｄ)のポリペプチド又はその塩を含む。
【０１０３】
また上記の少なくとも３個のポリペプチドの組合せが、(e)もしくは(f)の少なくともひとつのポリペプチド又はその塩を含むのが好ましい。それは、アミノ酸配列SLGFNIKATNGGTLD(Alt01A; SEQ ID NO: 60)、もしくはSAKRMKVAFKLDIEK(Alt06; SEQ ID NO: 72、又はそれぞれに対応する変異体配列、を含む、実質的に該配列からなる、又は該配列からなる、ポリペプチド又はその塩である。Alt06の好ましい変異体配列は、SAKR-Nle-KVAFKLDIEK(Alt06A, SEQ ID NO: 73)である。Alt06AをAlt06の代わりに、任意のポリペプチド組み合わせ及び本明細書に記載の医薬製剤において使用してよい。
【０１０４】
また上記の少なくとも３個のポリペプチドの組合せが、(e)もしくは(f)の少なくともひとつのポリペプチド又はその塩を含むのが好ましい。それは、アミノ酸配列DITYVATATLPNYCR(SEQ ID NO: 111)、もしくはGWGVMVSHRSGET(Alt14;SEQ ID NO: 84)又はいずれかの対応する変異体配列、を含む、実質的に該配列からなる、又は該配列からなる、ポリペプチド又はその塩である。SEQ ID NO: 111の好ましい変異体配列は、KDITYVATATLPNY(Alt02; SEQ ID NO: 61)及びDITYVATATLPNYSR(Alt02A; SEQ ID NO: 62)である。Alt02又はAlt02AをSEQ ID: 111の代わりに、任意のポリペプチド組み合わせ及び本明細書に記載の医薬製剤において使用してよい。Alt14の好ましい変異体配列は、GWGV-Nle-VSHRSGET(Alt14A、SEQ ID NO: 85)である。Alt14AをAlt14の代わりに、任意のポリペプチド組み合わせ及び本明細書に記載の医薬製剤において使用してよい。
【０１０５】
本発明は、ポリペプチド(d)又はその塩、及び(a)〜(c)及び(e)〜(h)のポリペプチドから選択される少なくとも2個の更なるポリペプチド又はその塩を含む少なくとも３個のポリペプチドの組合せを提供する。例えば、(b)、(c)及び(d)のポリペプチド又はその塩の組合せが提供されうる。本発明は、さらにポリペプチド(b)又はその塩、及び(a)、(c)及び(d)〜(h)のポリペプチドから選択される少なくとも2個の更なるポリペプチド又はその塩を含む少なくとも３個のポリペプチドの組合せを提供する。本発明は、さらにポリペプチド(c)又はその塩、及び(a)、(b)及び(d)〜(h)のポリペプチドから選択される少なくとも2個の更なるポリペプチド又はその塩を含む少なくとも３個のポリペプチドの組合せを提供する。
【０１０６】
少なくとも３個のポリペプチドの上記組合せは、以下から選択される少なくとも１個の追加のポリペプチドをさらに含んでもよく:
(l)アミノ酸配列KKVSMAIAKAAAAEK(Alt11: SEQ ID NO: 79)又は前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド;
(m)アミノ酸配列SYNVAKAGCIHLAK(Alt22;SEQID NO: 92)又は前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド;
(n)アミノ酸配列KLWHSMIPMGRDAK(Alt24; SEQ ID NO: 95)又は前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド;
(o)アミノ酸配列KRSLLVFAVRSSMELRK(Alt27; SEQ ID NO: 99)又は前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド;及び
(p)アミノ酸配列NWLTLHTAALGPTAK(Alt31; SEQ ID NO:103)又は前記アミノ酸配列由来のT細胞エピトープ含有変異体配列を含むポリペプチド;
ここで、アミノ酸配列のT細胞エピトープ含有変異体配列は、前述と同義であり各ポリペプチドは３０アミノ酸長までである。
【０１０７】
Alt11の好ましい変異体配列は、Alt11A(SEQ ID NO:81)である。Alt22の好ましい変異体配列は、Alt22A(SEQ ID NO: 93)である。Alt24の好ましい変異体配列は、Alt24A(SEQ ID NO: 96)である。Alt27の好ましい変異体配列は、Alt27A(SEQ ID NO: 100)である。
【０１０８】
また少なくとも３個のポリペプチドの上記組合せはさらにIEKLRSNITVQYDI(Alt33; SEQ ID NO: 105)、GYTGKIKIAMDVASSE(Alt15; SEQ ID NO: 86)もしくはSAFRSIEPELTVY(Alt10; SEQ ID NO: 77)又はその対応変異体のいずれかのアミノ酸配列、を含む、実質的に該配列からなる、又は該配列からなる、ポリペプチド又はその塩を含んでもよい。Alt15(SEQ ID NO: 86)の好ましい変異体配列は、GYTGKIKIA-Nle-DVASSE(Alt15A, SEQ ID NO: 87)である。
【０１０９】
上記選択のすべては、好ましくは、合計で１２以下のポリペプチド、より典型的には１０以下のポリペプチド、好ましくは９未満、より好ましくは、７又は６以下のような８未満のポリペプチドを含む組合せに影響を受けることになる。組み合わせは、４、５、６又は７個のポリペプチドを含んでよい。本発明の組み合わせは最も好ましくは、６又は７個のポリペプチドを含む。
【０１１０】
好ましい核となるポリペプチドの組み合わせは(1):
・アミノ酸配列WSWKIGPAIATGNT(Alt28; SEQ ID NO: 101)もしくは対応変異体配列を有するポリペプチド、又はその塩;
・アミノ酸配列KYAGVFVSTGTLGGG(SEQ ID NO: 112)もしくは対応変異体配列(特に好ましくAlt18)を含むポリペプチド、又はその塩;
・アミノ酸配列KYRRVVRAGVKVAQTAR(Alt34A; SEQ ID NO: 107)もしくは対応変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;及び
・アミノ酸配列AEVYQKLKALAKKTYGQ(Alt13A; SEQ ID NO: 83)もしくは対応変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩、
である。
【０１１１】
好ましくは、以下の追加のポリペプチドの１個又は両方を(1)の核となるポリペプチドの組み合わせに付加し、５又は６個のポリペプチドの組合せを作ってもよい:
・アミノ酸配列SLGFNIKATNGGTLD(Alt01A; SEQ ID NO: 60)もしくは対応変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;及び
・アミノ酸配列SAKRMKVAFKLDIEK(Alt06; SEQ ID NO: 72)もしくは対応変異体配列(Alt06Aなど)を含むポリペプチド、又はその塩。
【０１１２】
任意で、以下のさらなる追加のポリペプチドの１又は２個を(1)の組合せ又は５又は６個のポリペプチドの上記組合せに付加し、６、７又は８個のポリペプチドの組合せを作ってもよい:
・アミノ酸配列DITYVATATLPNYCR(SEQ ID NO: 111)もしくは対応変異体配列(Alt02又はAlt02Aなど)を含むポリペプチド、又はその塩;及び
・アミノ酸配列GWGVMVSHRSGET(Alt14; SEQ ID NO: 84)もしくは対応変異体配列(Alt14Aなど)を含むポリペプチド、又はその塩。
【０１１３】
別の好ましい核となるポリペプチドの組み合わせは(2):
・アミノ酸配列WSWKIGPAIATGNT(Alt28; SEQ ID NO: 101)もしくは対応変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;
・アミノ酸配列KYAGVFVSTGTLGGG(SEQ ID NO: 112)(特に好ましくはAlt18)もしくは対応変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;
・アミノ酸配列KYRRVVRAGVKVAQTAR(Alt34A; SEQ ID NO: 107)もしくは対応変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;
・アミノ酸配列AEVYQKLKALAKKTYGQ(Alt13A; SEQ ID NO: 83)もしくは対応変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩;及び
・アミノ酸配列SLGFNIKATNGGTLD(Alt01A; SEQ ID NO: 60)もしくは対応変異体配列を含むポリペプチド、又はその塩、
である。
【０１１４】
任意で、以下のさらに追加のポリペプチドの１又は２個を(2)の核となる組み合わせに付加し、６又は７個のポリペプチドの組合せを作ってもよい:
・アミノ酸配列SAKRMKVAFKLDIEK(Alt06; SEQ ID NO: 72)もしくは対応変異体配列(Alt06Aなど)を含むポリペプチド、又はその塩;
・アミノ酸配列DITYVATATLPNYCR(SEQ ID NO: 111)もしくは対応変異体配列(Alt02又はAlt02Aなど)を含むポリペプチド、又はその塩;及び
・アミノ酸配列GWGVMVSHRSGET(Alt14; SEQ ID NO: 84)もしくは対応変異体配列(Alt14Aなど)を含むポリペプチド、又はその塩。
【０１１５】
特に好ましいポリペプチドの組み合わせは、Alt28(SEQ ID NO: 101)又はその塩;Alt18又はその塩;Alt34A(SEQ ID NO: 107)もしくは対応変異体配列(Alt34など)、又はその塩;Alt13A(SEQ ID NO: 83)又はその塩;及びAlt01A(SEQ ID NO: 60)又はその塩を含む。またそれぞれ下記ペプチドのグループのひとつから選択される１、２又は３個のペプチドを、特に好ましいポリペプチドの組み合わせ:(I)Alt06もしくはAlt06A又はどちらかの塩、(II)Alt02もしくはAlt02A、又はどちらかの塩、及び(III)Alt14もしくはAlt14A、又はどちらかの塩、に付加してもよい。特に好ましいポリペプチドの組み合わせは、グループ(I)からのポリペプチド及びグループ(II)からのポリペプチド、グループ(I)からのポリペプチド及びグループ(III)からのポリペプチド、又はグループ(I)からのポリペプチド及びグループ(II)からのポリペプチド、を含んでよい。
【０１１６】
上記ポリペプチドの組合せは、アルタナリア及び／又はクラドスポリウムに対するアレルギーの予防又は治療に使用するのに適切でありえる。本発明は、これらのカビの間で相同なエピトープ領域を表すことに基づきアルタナリア及びクラドスポリウムアレルゲンの両方に対する寛容化に適切なポリペプチドの組合せを提供する。この態様において、下記ポリペプチド又はその塩が好ましく使用されうる。
【０１１７】
SEQ ID NO 83〜87は、Cla h 6と相同のエピトープ領域を含むAlt a 6由来の配列を表す。SEQ ID NO: 108は、Alt a 6と相同のエピトープ領域を含むCla h 6由来の配列を表す。SEQ ID NO: 108は、本明細書に記載した組合せの中で任意のAlt a 6ペプチドのかわりに、又は該ペプチドに加えて使用してもよい。
【０１１８】
SEQ ID NO 90、91及び94〜98は、Cla h 8と相同のエピトープ領域を含むAlt a 8由来の配列を表す。SEQ ID NO:109及び110は、Alt a 8と相同のエピトープ領域を含むCla h 8由来の配列である。SEQ ID NO: 109及び110の１個以上は、本明細書に記載した組合せの中で任意のAlt a 8ペプチドのかわりに、又は該ペプチドに加えて使用してもよい。
【０１１９】
SEQ ID NO 101は、Cla h 10と相同のエピトープ領域を含むAlt a 10由来の配列を表す。SEQ ID NO: 101は、本明細書に記載した組合せの中で任意のAlt a 10ペプチドのかわりに、又は該ペプチドに加えて使用してもよい。
【０１２０】
より広い態様において、本発明は、少なくとも３個のポリペプチドを含むポリペプチドの組合せを提供し、各ポリペプチドは30アミノ酸長までであり、SEQ ID NO 1〜110又は対応変異体配列のいずれかのアミノ酸配列を含む。かかる組合せとしては、典型的に、i)SEQ ID NO:１〜６及び59〜65(Alt a1由来)又は対応変異体配列のいずれかのアミノ酸配列を含む少なくとも１個のポリペプチド;ii)SEQ ID NO:7〜11及び66〜78(Alt a2由来)又は対応変異体配列のアミノ酸配列を含む少なくとも１個のポリペプチド;及びiii)SEQ ID NO:12〜22及び79〜87(Alt a6由来)又は対応変異体配列のアミノ酸配列を含む少なくとも１個のポリペプチド、が挙げられ、好ましくは、前記ポリペプチドは、AEVYQKLKALAKKTYGQ(Alt13A; SEQ ID NO: 83)又は対応変異体配列を含む。
【０１２１】
異なるAltアレルゲン由来のポリペプチド又はその塩を組み合わせることは、複数のカビアレルゲンに由来する寛容化エピトープ(tolerising epitope)を提供することにより、一般集団において観察されるカビアレルギーの広範な適用範囲を可能にしうる。Alt a1、Alt a2及びAlt a6由来のポリペプチド又はその塩を含む上記組合せは、さらに以下を含んでよい:
(iv)SEQ ID NO:23〜29及び88〜89(Alt a7由来)もしくは対応変異体配列のいずれかのアミノ酸配列、又はその塩を含む少なくとも１個のポリペプチド;及び／又は
(v)SEQ ID NO:30〜35及び90〜98(Alt a8由来)もしくは対応変異体配列のいずれかのアミノ酸配列、又はその塩を含む少なくとも１個のポリペプチド;及び／又は
(vi)SEQ ID NO:36〜48及び99〜101(Alt a 10由来)もしくは対応変異体配列のいずれかのアミノ酸配列、又はその塩を含む少なくとも１個のポリペプチド;及び／又は
(vii)SEQ ID NO:49〜58及び102〜107(Alt a 13由来)もしくは対応変異体配列のいずれかのアミノ酸配列、又はその塩を含む少なくとも１個のポリペプチド。
【０１２２】
かかる組合せの非限定的な例として以下が挙げられる:
（１）AEVYQKLKALAKKTYGQ(Alt13A;SEQ ID NO: 83)もしくは対応変異体配列を含むポリペプチド又は塩、グループ(ii)から選択される少なくとも２個のポリペプチド又は塩、及びグループ(iii)から選択される少なくとも２個のポリペプチド又は塩;
（２）AEVYQKLKALAKKTYGQ(Alt13A; SEQ ID NO: 83)もしくは対応変異体配列を含むポリペプチド又は塩、グループ(ii)から選択される少なくとも１個、好ましくは２個のポリペプチド又は塩、グループ(iii)から選択される少なくとも２個、好ましくは２個のポリペプチド又は塩、及びグループ(vi)から選択される少なくとも１個のポリペプチド又は塩;及び
（３）AEVYQKLKALAKKTYGQ(Alt13A; SEQID NO: 83)又は対応変異体配列を含むポリペプチド又は塩、グループ(ii)から選択される少なくとも１個、好ましくは２個のポリペプチド又は塩、グループ(iii)から選択される少なくとも２個、好ましくは２個のポリペプチド又は塩、及びグループ(vii)から選択される少なくとも１個、好ましくは２個のポリペプチド又は塩。
【０１２３】
上記いずれかのポリペプチドの組合せは、任意でさらなるポリペプチド又はさらなるアルタナリア及び／又はクラドスポリウムアレルゲン由来のペプチドを含まなくてもよい。上記いずれかのポリペプチドの組合せは、より詳細に後述するように、本発明の医薬製剤中に組み込まれてもよい。
【０１２４】
より広い態様において、本発明は、30アミノ酸長までであって、SEQ ID NO 1〜110又は対応変異体配列のいずれかひとつのアミノ酸配列を含む、実質的に該配列からなる、又は該配列からなるポリペプチド又はその製薬上許容可能な塩を提供する。
【０１２５】
ポリペプチド又はその医薬上許容される塩は、好ましくは以下を含む:
(I)アミノ酸配列:
(a)WSWKIGPAIATGNT(Alt28; SEQ ID NO: 101)、
(b)KYRRVVRAGVKVAQTAR(Alt34A; SEQ ID NO: 107)、もしくは
(c)KYAGVFVSTGTLGGG(SEQ ID NO: 112);又は
(II)T細胞エピトープ含有変異体配列（７個までのアミノ酸修飾を有する前記アミノ酸配列(I)であり、各修飾は独立して、欠失、置換又は挿入である配列）。
【０１２６】
本発明の他のポリペプチド又は製薬上許容可能なその塩は、上述した通り、アミノ酸配列(d)AEVYQKLKALAKKTYGQ(Alt13A; SEQ ID NO: 83)、(e)SLGFNIKATNGGTLD(Alt01A; SEQ ID NO: 60)、(f)SAKRMKVAFKLDIEK(Alt06; SEQ ID NO: 72);(g)DITYVATATLPNYCR(SEQ ID NO: 111);及び(h)GWGVMVSHRSGET(Alt14; SEQ ID NO: 84)、又は対応変異体配列を含む。
好ましくは、本発明のポリペプチドは、SEQ ID NO 83、60、61、62、72、73、106、107、101、84、85、又は89のいずれかひとつのアミノ酸配列を含む、該配列からなる、又は実質的に該配列からなる。
【０１２７】
本発明は、また本発明のポリペプチド及び製薬上許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬製剤を提供する。本発明は、さらにアルタナリア及び／又はクラドスポリウムに対するアレルギーの治療又は予防方法に使用するための本発明のポリペプチドを提供する。本発明は、さらにアルタナリア及び／又はクラドスポリウムに対するアレルギーの予防又は治療用薬剤を製造するための本発明のポリペプチドの使用を提供する。
【０１２８】
医療用途及び方法
本発明の好ましい態様は、アレルギーの予防又は治療である。この態様において、本発明はアルタナリア及び／又はクラドスポリウムに対するアレルギーの治療又は予防方法に使用するための本発明の医薬製剤(少なくとも３個のポリペプチド又は塩を含む)を提供する。本発明の医薬製剤は、寛容化によりアレルギーを予防又は治療しうる。寛容化は、１個以上のアルタナリア及び／又はクラドスポリウム属のタンパク質アレルゲンに対してありえる。
【０１２９】
本発明は、さらに、アルタナリア及び／又はクラドスポリウムに対するアレルギーの予防又は治療用薬剤の製造のための上記少なくとも３個のポリペプチド又は塩の使用を提供する。
【０１３０】
本発明は、さらにアルタナリア及び／又はクラドスポリウに対するアレルギーの個体を治療する方法又はアルタナリア及び／又はクラドスポリウに対する個体のアレルギーを予防する方法を提供する。該方法は、本発明のポリペプチドもしくは塩、又は本発明の医薬製剤の治療又は予防に有効な量を前記個体に投与する工程を含む。したがって、該方法は、アレルギーを患う個体のアレルギー症状を減少又は改善しうる。該方法は、アレルギーを患う個体の状態を改善しうる。該方法は個体のアレルギー症状の出現を抑制又は遅延しうる。カビに対するアレルギー症状は、以下に考察する。
【０１３１】
本セクションで記載の各方法及び使用において、ポリペプチド又は塩は、前のセクションで定義したポリペプチド又は塩の組合せで置換してよい。しかるがゆえに、本発明は、ポリペプチド又は塩の組合せがクラドスポリウム及び／又はアルタナリアに対するアレルギーの治療又は予防方法に使用されている状況を包含する。前記状況では、組合せ中のポリペプチドは、一緒に投与する必要がなく、及び／又は同じ医薬製剤の一部である必要はない。この方法の複数のペプチドは、同時に、連続的に、又は併用的に各々投与してもよい。
【０１３２】
本発明の医薬製剤は、クラドスポリウム及び／又はアルタナリアアレルゲンに対して脱感作又は寛容化することによりアレルギーを治療又は予防しうる。医薬製剤中に含まれるポリペプチドは、ポリペプチドが由来するアレルゲンに対して個体を寛容化又は脱感作するために使用してもよい。アレルゲンに対して個体の脱感作することは、適切に感作された個体において、アレルゲンによって誘発されるアレルギー性組織反応を抑制する又は弱めることを意味する。「寛容化」という用語は、タンパク質アレルゲンに対するアレルギー性反応のような抗原に対する反応を抑制又は消失させる能力を意味する。寛容化は、望まれない免疫反応を減少もしくは消失、又はタンパク質アレルゲンに対して対象を脱感作させる能力でもある。寛容化は、T細胞応答のインビトロ分析又は個体における症状の減少を観察することにより決定しうる。
【０１３３】
より詳細には、Ｔ細胞が選択的に活性化され得、次いで非応答性にされ得る。さらに、これらのＴ細胞のエナジャイジング（energising）又は除去は、特定のアレルゲンに対する患者の脱感作をもたらす。脱感作は、アレルゲン又はアレルゲン由来ペプチドの２回目以降の投与の際の、アレルゲン又はアレルゲン由来ペプチドへの反応の減少、又は好ましくはこのような反応の除去として現れる。２回目の投与は、脱感作を起こさせるために適切な期間が経過した後になされ得る；これは好ましくは、１日と数週間との間の任意の期間である。およそ4週間の間隔が好ましい。
【０１３４】
医薬製剤が投与される個体は無症候でもよい。医薬製剤の予防的有効量は、かかる個体に投与される。予防的有効量は、１以上のアレルギー症状の発症を予防する量である。
【０１３５】
あるいは、医薬製剤を投与する個体は、それを必要としているものでありえる。すなわち個体は、１以上のアレルギー症状を示していてもよい。医薬製剤の治療有効量はかかる個体に投与される。治療有効量とは、１以上のアレルギー症状を改善するのに有効な量である。
【０１３６】
医薬製剤を投与する個体は好ましくはヒトである。個体は、カビアレルゲンに感作されることが分かっている、感作される危険がある、又は感作されている疑いがある個体でありえる。個体は、当分野において周知であり、本明細書中に記載される技術を使用して、感作について検査され得る。あるいは、個体は、カビに対するアレルギーの家族歴を有し得る。
【０１３７】
カビに曝露されると、個体はアレルギー症状を表し得るため、カビへの感作について個体を検査することは不必要であり得る。曝露とは、例えば、カビ又はカビ由来の物質もしくは製品に、近接することを意味する。近接とは、上記の品目から１０メートル以下、５メートル以下、２メートル以下、１メートル以下、又は０メートルを意味する。アレルギー症状は、鼻のかゆみ、くしゃみ、流涙、喉のかゆみ、口蓋のかゆみ、目のかゆみ、鼻水、呼吸困難、気管支痙攣、喘息、肌の赤化又は発疹が挙げられうる。
【０１３８】
個体は、任意の年齢であり得る。しかし、好ましくは、個体は、１〜９０、５〜６０、１０〜４０、又はより好ましくは１８〜３５の年齢群であり得る。
【０１３９】
好ましくは、個体は、白色人種集団に典型的な頻度の範囲内のＭＨＣ対立遺伝子頻度を有する集団由来である。１１の一般的なＤＲＢ１対立遺伝子ファミリーについての基準集団対立遺伝子頻度は、表１に示される（HLA Facts Book, Parham and Barberからのデータ）。
【０１４０】
【表１】
2015520771.tif 000003
【０１４１】
基準頻度は、頻度を報告する複数の調査の分析により得られ、示される数値は平均値である。したがって好ましくは、治療されるべき個体は、例えばそれらの数値プラス又はマイナス１、２、３、５、１０、１５又は２０％の範囲内で、表１で言及される対立遺伝子について（例えば少なくとも１、２、３、４、５又は全ての対立遺伝子について）基準集団と同等のＭＨＣ対立遺伝子頻度を有する集団由来である。
【０１４２】
好ましくは、個体は、以下のＤＲＢ１対立遺伝子の対立遺伝子頻度が、
４−少なくとも９％、
７−少なくとも１０％、
１１−少なくとも８％
である集団由来である。
個体は、少なくとも２週間、１月間、６月間、１年間、５年間又は５年をこえて、カビへのアレルギーを有していてもよい。個体は、アレルギーにより引き起こされる発疹、鼻づまり、鼻水及び／又はせきを患っていてもよい。個体は、カビアレルギーを治療する他の組成物／化合物を投与されていてもされていなくてもよい。個体は、温帯気候、亜熱帯、熱帯又は北極気候を有する地理的領域に住んでいてもよい。典型的には個体は特定の季節におけるカビに対するアレルギーを患うがアレルギーは通年性でもありえる。季節性のカビアレルギーは、北半球の秋に通常起こりうる。
【０１４３】
アレルギーの個体は、典型的にアルタナリア属のカビ、特にアルタナリアアルテナータ（Alternaria alternata）に対するアレルギーである。アレルギーの個体は、クラドスポリウム属のカビ、特にクラドスポリウムハーバリウム（Cladosporium herbarium）及び／又はクラドスポリウムクラドスポロイデス（Cladosporium cladosporoides）に対するアレルギーでありえる。アレルギーの個体は、アルテナータ（Alternata）及びクラドスポリウムのカビの両方にアレルギーでありえる。
【０１４４】
本明細書に記載のポリペプチド又は塩及び本発明の医薬製剤は、使用に対する適合性を確認するために、カビアレルギーの個体のパネルにおいてスクリーニングしてもよい。カビアレルギーの個体のパネルは、アルタナリア及びクラドスポリウム属のカビに対するアレルギーを知っていても知らなくてもよい個体を含んでもよい。特に複数のポリペプチドが医薬製剤中に組み合わされている場合には、Ｔ細胞のサンプル（各サンプルは集団において異なるカビアレルギーの個体から得られる）の少なくとも20%においてT細胞増殖を引き起こす能力をスクリーニングしてもよい。好ましくは、医薬製剤は、カビアレルギーの個体のパネルから得られたT細胞のサンプルの少なくとも30％において、T細胞増殖を誘導するだろう。より好ましくは、医薬製剤は、パネルのサンプルの35%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上においてT細胞増殖を誘導するだろう。カビアレルギーの個体のパネルにおける個体数は、1よりも大きい任意の数、例えば、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも50、少なくとも80又は少なくとも100の個体であってよい。
【０１４５】
また本明細書に記載のポリペプチド又は塩及び本発明の医薬製剤は、T細胞増殖は引き起こすが、感作された個体に由来する白血球サンプルからのヒスタミン放出はもたらさないことが好ましい。したがって、ポリペプチド、塩又は医薬製剤のヒスタミン放出の推移は確認しうる。適当な白血球サンプルとしては、豊富（enriched）な好塩基球又はマスト細胞の調製物が挙げられる。ヒスタミンはいくらか放出され得るが、有意な量のヒスタミンを放出させないことが好ましい。有意なヒスタミン放出は、個体からの白血球のサンプルが、インビトロで医薬製剤により刺激された場合に、利用できる全白血球ヒスタミンの20％以上を放出することであると考えることができる。本明細書に記載のポリペプチドもしくは塩又は本発明の医薬製剤は、個体からの白血球のサンプルが、インビトロで組成物により刺激された場合に、利用できる全白血球ヒスタミンの5％未満、4％未満、3％未満、2％未満又は1％未満の放出をもたらすことが好ましい。典型的には、通常の個体は、およそ150ng／107細胞の白血球のヒスタミン含量を有する。
【０１４６】
医薬製剤
本明細書に記載のポリペプチド又は塩は、それぞれ単離された形態、実質的に単離された形態、精製された形態又は実質的に精製された形態で個体に提供することができる。例えば、本明細書に記載の組合せのポリペプチド又は塩が一緒に投与されない場合には、他のポリペプチド又はその塩を実質的に含まない本明細書に記載のポリペプチド又は塩を、個体に提供することができる。ポリペプチド又は塩は、未加工の形態で提供することが可能であり得るが、これらを医薬製剤として提供することが好ましい。
【０１４７】
本発明の医薬製剤は、好ましくは、上述の少なくとも３個のポリペプチド又は塩及び製薬上許容可能な担体又は希釈剤を含む。医薬製剤は、上記いずれかのポリペプチド又は塩の組合せを含んでもよい。
【０１４８】
医薬製剤中に存在する担体(１つ又は複数)又は希釈剤(１つ又は複数)は、製剤の他の成分と適合性があり、そのレシピエントに有害ではないという意味で「許容可能な」ものでなければならない。典型的には、注射用担体及び最終的な製剤は無菌であり、発熱物質を含まない。好ましくは、担体又は希釈剤は水である。担体又は希釈剤は、チオグリセロール、メチオニン又はチオアニソールを含んでもよい。
【０１４９】
上述の少なくとも３個のポリペプチド又は塩を含む組成物は、１以上の製薬上許容可能な賦形剤又はビヒクルと組み合わせ医薬製剤を製造することができる。湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が、賦形剤又はビヒクル中に存在してもよい。これらの賦形剤、ビヒクル及び補助物質は、通常、組成物を受け入れる個体において免疫応答を誘導せず、過度の毒性なしで投与され得る薬剤である。製薬上許容可能な賦形剤としては、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロール、チオグリセロール及びエタノールなどの液体が挙げられるが、これらに限定されない。製薬上許容可能な塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩等；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩等が本明細書に挙げられうる。製薬上許容可能な賦形剤、ビヒクル及び補助物質の詳細な考察は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co., N.J. 1991)において入手できる。
【０１５０】
ポリペプチド又は塩は、医薬製剤中に典型的には、0.1重量%〜50重量%、より好ましくは0.1重量%〜5重量%で存在する。ポリペプチド又は塩は、医薬製剤中に0.1重量%未満で存在してもよい。
【０１５１】
製薬上許容可能な担体又は希釈剤は、医薬製剤中に典型的には、50重量%〜99.9重量%、より好ましくは95重量%〜99.9重量%で存在する。製薬上許容可能な担体又は希釈剤は、医薬製剤中に99.9重量%を超えて存在してもよい。
【０１５２】
医薬製剤としては、製薬上許容可能な溶液に限定されないが、凍結乾燥物、懸濁液、油性又は水性ビヒクル中の乳液、ペースト、及び埋め込み型の徐放性又は生分解性製剤が挙げられる。かかる医薬製剤は、さらに、懸濁剤、安定剤、又は分散剤などの１以上の追加成分を含み得るが、これらに限定されない。凍結乾燥物は、トレハロース、チオグリセロール、メチオニン及びチオアニソールの１以上を含んでもよい。非経口投与用医薬製剤の一実施形態において、活性成分は、再構成された医薬製剤の非経口投与の前の、適切なビヒクル（例えば、無菌の発熱物質フリーの水）での再構成のために、乾燥形態（例えば、凍結乾燥物、散剤又は顆粒)で提供される。
【０１５３】
本発明は、さらに上述した通り少なくとも３個のポリペプチド又は塩を製薬上許容可能な担体又は希釈剤と組み合わせる工程を含む本発明の医薬製剤の調製方法を提供する。好ましくは、前記方法は、非経口投与用医薬製剤を調製し、前記ポリペプチド又は塩を乾燥形態て提供し、前記ポリペプチド又は塩を該製薬上許容可能な担体又は希釈剤で再構築する工程を含む。
【０１５４】
医薬製剤は、無菌の注射可能な水性もしくは油性の懸濁液もしくは溶液の形態で、調製、包装、又は販売され得る。この懸濁液又は溶液は、公知技術に従って製剤化され得、活性成分に加えて、本明細書中に記載の分散剤、湿潤剤、又は懸濁剤などの追加成分を含み得る。このような無菌の注射可能な製剤は、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒（例えば、水又は１，３−ブタンジオールなど）を使用して調製され得る。他の許容可能な希釈剤及び溶媒としては、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム溶液、及び合成モノグリセリド又はジグリセリドなどの固定油が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
有用な他の非経口投与可能な医薬製剤としては、微結晶形態で、リポソーム調製物中に、又は生分解性ポリマーシステムの成分として、活性成分を含むものが挙げられる。徐放用又は埋め込み用医薬製剤は、乳液、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、又は難溶性塩などの、製薬上許容可能なポリマー材料又は疎水性材料を含んでよい。
【０１５６】
あるいは、本明細書に記載のポリペプチドは、粒状担体に、封入され、吸着され、又は結合されてもよい。適切な粒状担体としては、ポリメチルメタクリレートポリマー由来のもの、並びにポリ乳酸（poly(lactides)）及びポリ乳酸／グリコール酸共重合体（poly(lactide-co-glycolides)）由来のＰＬＧ微粒子が挙げられる。例えば、Jefferyら(1993) Pharm. Res. 10:362-368を参照されたい。例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジンなどのポリマー、並びにこれらの分子のコンジュゲートなどの他の粒状システム及びポリマーも使用することができる。
【０１５７】
本明細書中で言及されるポリペプチドのいずれかの製剤化は、ポリペプチドの性質及び送達方法などの因子に依存するであろう。医薬製剤は、種々の剤形で投与されてもよい。これは、経口投与（例えば、錠剤、トローチ、薬用ドロップ（lozenges）、水性又は油性の懸濁液、分散性粉末又は顆粒として）、局所投与、非経口投与、皮下投与、吸入投与、静脈内投与、筋肉内投与、リンパ内投与(鼠径部中のリンパ節へなど)、胸骨内（intrasternally）投与、経皮投与、皮内投与、表皮投与、舌下投与、経鼻投与（instranasally）、頬側投与又は点滴技術によって投与されてもよい。投与は扁桃内投与でもよい。投与は、坐薬としてされてもよい。投与はイオン導入によってされてもよい。好ましくは、投与は、皮内、表皮又は経皮投与である。投与はマイクロチン（microtine）パッチのようなパッチによりされてもよい。
【０１５８】
医師は、各特定の個人のために必要な投与経路及び投与手段を決定することができるであろう。
【０１５９】
本発明の医薬製剤は、好ましくは容器に密封されて提供される。医薬製剤が、製薬上許容可能な溶液の場合には、溶液は、アンプル、密封バイアル、注射器、カートリッジ、フレキシブルバッグ又はガラスボトルで提供されてもよい。医薬製剤が凍結乾燥物の場合には、好ましくは密封バイアルで提供される。
【０１６０】
本発明の医薬製剤は、副作用を引き起こすことなく有効であるように、適切な濃度の各ポリペプチドを含みうる。医薬製剤が例えば凍結乾燥物である場合、適切な濃度は、再構築後の各ポリペプチドの濃度となる。典型的には、溶液中ならば医薬製剤中の各ポリペプチドの濃度は、０．０３〜２００ｎｍｏｌ／ｍｌの範囲内となる。より好ましくは、０．３〜２００ｎｍｏｌ／ｍｌ、３〜１８０ｎｍｏｌ／ｍｌ、１０〜１５０ｎｍｏｌ／ｍｌ、５０〜２００ｎｍｏｌ／ｍｌ又は３０〜１２０ｎｍｏｌ／ｍｌの範囲内となる。医薬製剤は、９５％又は９８％よりも高い純度、又は少なくとも９９％の純度を有するべきである。
【０１６１】
アジュバント又は追加的治療剤を本明細書に記載のポリペプチドに組み合せて使用してもよい。アジュバントは、ポリペプチド（ひとつ又は複数）の効果を増強するのに十分な量で投与することが好ましく、その逆も同様である。アジュバント又は追加的治療剤は、本明細書に記載のポリペプチドの効果を増強する薬剤であってもよい。例えば、追加的治療剤は、本発明のペプチドに対する応答を高める免疫調節分子であってもよい。アジュバントの非限定的な例としては、ビタミンD、ラパマイシン、並びにデキサメタゾン、フルチカゾン、ブデソニド、モメタゾン、ベクロメタゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン及びトリアムシノロンなどのグルココルチコイドステロイドが挙げられる。好ましいグルココルチコイドはデキサメタゾンである。
【０１６２】
一実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドが、１以上の他の治療剤又はアジュバンドと組み合わせて治療に使用される実施形態においては、他の治療剤又はアジュバンドは、別々に、同時に又は連続的に投与することができる。それらは同じ又は異なる医薬製剤中に入れて投与することができる。したがって、本明細書に記載のポリペプチド及び１以上の他の治療剤又はアジュバンドも含む医薬製剤を調製することができる。或いは、本発明の医薬製剤は、併用療法の一部としての1つ以上の他の治療用組成物と、同時に、連続的に、又は別々に使用することができる。従って後述の本発明のアレルギーの予防又は治療方法において、対象は追加的治療剤でも治療されうる。
【０１６３】
投与経路
本明細書に記載のポリペプチド又は塩が、医薬製剤中にいれて個体に投与される場合、そのポリペプチド又は塩が適切な抗原提示細胞と接触する能力を有することになり、且つこれ又はこれらが個体のT細胞と接触する機会を有することになる個体の体内の部位に該製剤を投与することが好ましい。
【０１６４】
本発明の医薬製剤は、製剤化された後、種々の公知の経路及び技術を用いてインビボで対象に送達することができる。例えば、医薬製剤は、注射用溶液、懸濁液又はエマルションとして提供することができ、通常の針と注射器、極微針と注射器を使用又は液体ジェット式注射システムを用いて、非経口注射、皮下注射、表皮注射、皮内注射、筋肉内注射、リンパ内注射、動脈内注射、腹腔内注射又は静脈内注射によって投与することができる。マイクロチン（microtine）パッチのようなパッチを用いて投与することができる。医薬製剤はまた、皮膚又は粘膜組織に局所的に、例えば鼻腔内、扁桃内（intratonsillarly）、気管内、腸管内（intestinal）、直腸内、又は膣内などに投与することもでき、又は呼吸器投与もしくは肺内投与に適した微粉化した噴霧剤として提供することもできる。他の投与様式としては、経口投与、坐剤、舌下投与、及び能動的又は受動的な経皮送達技術が挙げられる。
【０１６５】
投与量
本明細書に記載のポリペプチドもしくは塩又は本発明の医薬製剤の投与は、上記の任意の適切な方法によるものであってよい。ポリペプチド又は塩の適切な量は、実験的に決定することができるが、典型的には下に示す範囲内である。各ポリペプチド又は塩の単回投与は、患者が有益な効果を有するのに十分なものであり得るが、ポリペプチド又は塩が1回よりも多く投与される場合、有益となり得ることが理解されるであろう。この場合、典型的な投与レジーム（regime）は、例えば、1週間に1回又は2回を6箇月毎に2〜4週間、又は1日1回を4〜6箇月毎に1週間であり得る。理解されるように、ポリペプチド又は塩の組合せ中の各ポリペプチド又は塩は、単独で、又は組み合わせて、患者に投与してもよい。
【０１６６】
投与用量は、医薬製剤の性質、投与経路並びに投与レジームのスケジュール及びタイミングなどの多くの要因に依存することとなる。本明細書に記載のポリペプチド又は塩の適切な用量は、投与1回あたり、およそ10μgまで、15μgまで、20μgまで、25μgまで、30μgまで、50μgまで、100μgまで、500μgまで、又はそれよりも多い用量程度のものであり得る。適切な用量は、15μg未満であってよいが、少なくとも1ng、又は少なくとも2ng、又は少なくとも5ng、又は少なくとも50ng、又は少なくとも（least）100ng、又は少なくとも500ng、又は少なくとも1μg、又は少なくとも10μgであり得る。本明細書に記載のポリペプチドについては、使用される用量はより多くてもよく、例えば1mgまで、2mgまで、3mgまで、4mgまで、5mgまで、又はそれよりも多い用量であってもよい。かかる用量は、選択された経路による投与に適切な容量を可能にするのに適した濃度で、液体製剤として提供することができる。上記用量は、ペプチド又は塩の組合せの場合には、合計用量に対する用量を意味していることは理解されるであろう。例えば、「３５μgまで（up to 35μg）」は、組合せ又は１より多いペプチドもしくは塩を含む組成物中に、合計のペプチドもしくは塩の濃度が35μgまでであることを意味する。
【０１６７】
核酸及びベクター
本明細書に記載のポリペプチドは、直接投与してもよく、又はコード配列からの発現により間接的に投与してもよい。例えば、本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供されてよい。従って、本明細書に記載のポリペプチドは、それをコードし且つ発現することができるポリヌクレオチドから製造されてよく、また該ポリヌクレオチドの形態で送達されてよい。本明細書に記載のペプチドの使用、送達又は投与への本明細書におけるどの言及も、それをコードするポリヌクレオチドからの発現を介した、かかるペプチドの間接的な使用、送達又は投与を含むことが意図される。
【０１６８】
「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、任意の長さの重合体形態のヌクレオチド、すなわち、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのいずれか、又はこれらの類似体をいう。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーRNA（mRNA）、cDNA、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ及びプライマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、単離された形態又は精製された形態で提供されてよい。
【０１６９】
ポリヌクレオチドは、Sambrookら（1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press）において例として記載された当分野で周知の方法に従って合成することができる。
上記ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリペプチドの製造において、インビトロ、エクスビボ又はインビボで使用してもよい。かかるポリヌクレオチドは、アルタナリア及び／又はクラドスポリウムに対するアレルギーの予防又は治療において投与又は使用してもよい。
【０１７０】
遺伝子送達の方法は当分野で公知である。例えば、米国特許第5,399,346号、第5,580,859号及び第5,589,466号を参照されたい。核酸分子は、例えば標準的な筋肉内注射又は皮内注射；経皮的粒子送達；吸入；局所又は経口、鼻腔内又は粘膜投与方法などによって、レシピエント対象内に直接的に導入することができる。或いは、該分子は、対象から取り出された細胞中にエクスビボで導入することができる。例えば、ポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターは、エクスビボで個体のAPC内に導入することができる。目的の核酸分子を含む細胞は、核酸分子によってコードされるペプチドに対して免疫応答が開始され得るように対象内に再導入される。かかる免疫化に使用される核酸分子は概して本明細書において「核酸ワクチン」という。
【０１７１】
抗原提示細胞（APC）
本発明は、本明細書に記載の少なくとも３個のポリペプチドの組合せのような本明細書に記載のポリペプチドをその表面上に提示するAPC集団の産生方法のインビトロの使用を包含する。前記APC集団は、その後治療に使用されうる。前記産生方法は、患者から得られた細胞のサンプルで、エクスビボで実施することができる。従って、このようにして産生されたAPCは、クラドスポリウム及び／又はアルタナリアアレルギーの治療又は予防に使用することができる医薬品を形成する。該細胞は個体の免疫系に認容されるはずである。なぜならば、該細胞はその個体に由来するからである。従って、このようにして産生された細胞の、それがもともと得られた個体への送達は、本発明の治療に関する実施態様を形成する。
【０１７２】
APCが投与される場合、APCが個体の適切なＴ細胞に接触し、Ｔ細胞を活性化する能力を有するであろう体内の部位にＡＰＣを投与することが好ましい。
【０１７３】
インビトロ方法
本発明は、さらに、Ｔ細胞が本発明の医薬製剤の１以上のポリペプチド又は塩を認識するかどうかを決定するインビトロ方法を提供する。該方法は、前記Ｔ細胞を前記医薬製剤に接触させ、前記Ｔ細胞が前記ポリペプチドによって刺激されるかどうかを検出する工程を含む。
上記方法は、個体が、クラドスポリウム及び／又はアルタナリアに対するアレルギーを有しているか、又は有する危険性があるかどうかを判定するために行なわれうる。
【０１７４】
本発明を以下の実施例によって説明する:
【実施例】
【０１７５】
実施例1
MHCクラスII結合性調査
この研究の目的は、７種の最も一般的なヒトMHCクラスII HLA−DRB1*アロタイプ(平均的白人集団中に見られるアロタイプの合計で約６３％に及ぶ)に対して強い親和性を有するポリペプチドの別個のパネルを同定することである。アルタナリアアルテナータ（Alternaria Alternata）由来の主要なアルタナリアアレルゲンAlt a 1、Alt a 2、Alt a 6、Alt a 7、Alt a 8及びAlt a 10において前記ポリペプチドを同定するために、市販のEpiMatrixアルゴリズム（EpiVax Inc.）を使用して「ペプチドスレディング」として知られるインシリコのアプローチを用いた。これは、MHCクラスII HLA−DR分子の結合溝の内部に収容される可能性について、所定の配列を有するポリペプチドを生物情報学的に解析するものである。
【０１７６】
EpiMatrixは、選択されたMHC分子のそれぞれに結合する推定確率によって、任意のポリペプチド配列に由来する、９アミノ酸が重複する１０アミノ酸の長さの部分をランク付けするマトリクスに基づくアルゴリズムである。（De Grootら、AIDS Research and Human Retroviruses 13:539〜41(1997)）。マトリクスモチーフをつくり出す手順は、Schaferら、16 Vaccine 1998(1998)によって公開された。この実施例においては、HLA DR1、DR2、DR3、DR4、DR7、DR8、DR11、DR13及びDR15について結合可能性を評価する。タンパク質配列中の各１０マーのフレームをスコア化することにより推定MHCリガンドを選択する。このスコアは、１０マーの配列を、各MHCアレルに結合することが知られている１０アミノ酸配列のマトリクスと比較することによって得られる。遡及研究により、EpiMatrixが、公開されたMHCリガンドを正確に予測することが実証されている（Jesdaleら、於Vaccines '97(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997)）。複数のMHC分子に結合するポリペプチドをうまく予想することも確認されている。
【０１７７】
選択したＭＨＣ分子への結合の推定確率は、EpiMatrixにより次のように計算する。所定の配列を有するポリペプチドを、所定のＭＨＣ対立遺伝子に対する既知のＭＨＣ結合物と比較して、各アミノ酸について結合の相対的な促進又は阻害を評価することにより、採点する。この情報をペプチド全体にわたって合計し、サマリースコア（ＥＭＸスコア）をペプチド全体に割り当てる。ＥＭＸスコアを既知のＭＨＣリガンドのスコアと比較した後、EpiMatrixは「推定結合確率」（ＥＢＰと略記するが、厳密には確率ではない）に到達する。ＥＢＰは、所定のＭＨＣ分子に結合するであろう、高い又はより高いEpiMatrixスコアを有するポリペプチドの割合を記述する。ＥＢＰは、１００％（結合する可能性が非常に高い）から１％未満（結合する可能性が非常に低い）にわたる。
【０１７８】
EpiMatrix解析はAlt a 1の公知のアイソフォームの全配列(NCBIアクセッション番号:P79085.1;Q6Q128;PQ8NJ79)について実施した。これらの解析により、良好なMHCクラスII結合性を有すると予測される上記配列に由来する核となるペプチド（及びその隣接配列）が同定された。これらの配列を以下の表2に示す。
【０１７９】
表2において、「配列中の残基」は、解析したポリペプチドの配列内の配列の位置を示す。核となる配列（中央部の太字のアミノ酸）によって、解析中に同定された実際の結合性配列が規定される。安定化する隣接部（flanks）（Ｎ末端及びＣ末端、太字ではない）は、核となる配列とともに使用するために含めたものであり、典型的にはポリペプチドの製造を助けるのに必要である。「ヒット数」は、試験したすべてのMHCの種類に対する、配列内の高い予測結合親和性の数をいう。「EpiMatrixクラスタースコア」は、クラスターの長さに対して正規化したヒット数から得られる。従って、クラスタースコアは、ランダムポリペプチド標準に対する、予測された凝集MHC結合特性の過剰又は不足である。10を超えるスコアは広範なMHC結合特性を示すものとみなされる。
【０１８０】
【表２】
2015520771.tif 000004
【０１８１】
Epimatrixデータのさらなる解析に基づいて、Alt a 1由来の下記追加的配列も、適切なMHC結合特性を有するとして同定された:DITYVATATLPNY(SEQ ID NO: 5)、DAYITLVTLPKSS(SEQ ID NO: 6)、DITYVATATLPNYCR(SEQ ID NO: 111)。
【０１８２】
実施例2
Alt a 2の公知のアイソフォームの全配列（NCBIアクセッション番号：AAD00097）について、上記EpiMatrix解析を実施した。この解析により、良好なMHCクラスII結合特性を有すると予測される前記Alt a 2アイソフォームに由来する核となる配列（及びその隣接配列）が同定された。これらの配列を以下の表3に示す。表3の見出し及び注釈は上記表２と同様である。
【０１８３】
【表３】
2015520771.tif 000005
【０１８４】
Epimatrixデータのさらなる解析に基づいて、Alt a 2由来の下記追加的配列も、適切なMHC結合特性を有するとして同定された:QLLMLSAKRMKVA(SEQ ID NO: 10)、TLYRPRDLLSLLN(SEQ ID NO: 11)。
【０１８５】
実施例3
Alt a 6の公知のアイソフォームの全配列（NCBIアクセッション番号：Q9HDT3）について、上記EpiMatrix解析を実施した。この解析により、良好なMHCクラスII結合を有すると予測される前記Alt a 6アイソフォームに由来する核となる配列（及びその隣接配列）が同定された。これらの配列を以下の表４に示す。表４の見出し及び注釈は上記表２と同様である。
【０１８６】
【表４】
2015520771.tif 000006
【０１８７】
Epimatrixデータのさらなる解析に基づいて、Alt a 6由来の下記追加的配列も、適切なMHC結合特性を有するとして同定された:VSMAIAKAAAAEK(SEQ ID NO: 17)、QKLKALAKKTYGQ(SEQ ID NO: 18)、EFIKKAIELKSCN(SEQ ID NO: 19)、IELKSCNALLLK(SEQ ID NO: 20)、GYTGKIKIAMDVASSEF(SEQ ID NO: 21)、GYTGKIKIAMDVASSEFY(SEQ ID NO: 22)。Alt a 6との相同性及びさらなる設計及びスクリーニングに基づいて、下記Cla h 6由来の配列も適切なMHC結合特性を有するとして同定された:SEQ ID NO: 108(Cla16; AEVYQKLKSLTK)。
【０１８８】
実施例4
Alt a 7の公知のアイソフォームの全配列（NCBIアクセッション番号：P42058）について、上記EpiMatrix解析を実施した。この解析により、良好なMHCクラスII結合を有すると予測される前記Alt a 7アイソフォームに由来する核となる配列（及びその隣接配列）が同定された。これらの配列を以下の表５に示す。表５の見出し及び注釈は上記表２と同様である。
【０１８９】
【表５】
2015520771.tif 000007
【０１９０】
Epimatrixデータのさらなる解析に基づいて、Alt a 7由来の下記追加的配列も、適切なMHC結合特性を有するとして同定された:DAKLFQVAETLPQEVLDK(SEQ ID NO: 28)、GVFVSTGTLGGGQ(SEQ ID NO: 114)、SELELNIAQAQGKAFYE(SEQ ID NO: 29)、KYAGVFVSTGTLGGG(SEQ ID NO: 112)。
【０１９１】
実施例5
Alt a 8の公知のアイソフォームの全配列（NCBIアクセッション番号：P0C0Y4）について、上記EpiMatrix解析を実施した。この解析により、良好なMHCクラスII結合を有すると予測される前記Alt a 8アイソフォームに由来する核となる配列（及びその隣接配列）が同定された。これらの配列を以下の表６に示す。表６の見出し及び注釈は上記表２と同様である。
【０１９２】
【表６】
2015520771.tif 000008
【０１９３】
Epimatrixデータのさらなる解析に基づいて、Alt a 8由来の下記追加的配列も、適切なMHC結合特性を有するとして同定された:FVPQDIQKL(SEQ ID NO: 35)。Alt a 8との相同性及びさらなる設計及びスクリーニングに基づいて、下記Cla h 8由来の配列も適切なMHC結合特性を有するとして同定された:SEQ ID NO: 109(Alt25、VAITYASRAQGAEK)及びSEQ ID NO:110(Alt26, GHHFKERGTGSLVIT)。
【０１９４】
実施例6
Alt a 10の公知のアイソフォームの全配列（NCBIアクセッション番号：P42041）について、上記EpiMatrix解析を実施した。この解析により、良好なMHCクラスII結合を有すると予測される前記Alt a 10アイソフォームに由来する核となる配列（及びその隣接配列）が同定された。これらの配列を以下の表７に示す。表７の見出し及び注釈は上記表２と同様である。
【０１９５】
【表７】
2015520771.tif 000009
【０１９６】
Epimatrixデータのさらなる解析に基づいて、Alt a 10由来の下記追加的配列も、適切なMHC結合特性を有するとして同定された:SLLVFAVRSSMEL(SEQ ID NO: 45)、SLLVFAVRSSMELPIL(SEQ ID NO: 46)、WSWKIGPAIATGN(SEQ ID NO: 47)、DNYIQTKTVSIRL(SEQ ID NO: 48)。
【０１９７】
実施例7
Alt a 13の公知のアイソフォームの全配列（NCBIアクセッション番号：Q6R4B4）について、上記EpiMatrix解析を実施した。この解析により、良好なMHCクラスII結合を有すると予測される前記Alt a 13アイソフォームに由来する核となる配列（及びその隣接配列）が同定された。これらの配列を以下の表８に示す。表８の見出し及び注釈は上記表２と同様である。
【０１９８】
【表８】
2015520771.tif 000010
【０１９９】
Epimatrixデータのさらなる解析に基づいて、Alt a 13由来の下記追加的配列も、適切なMHC結合特性を有するとして同定された:NWLTLHTAALGP(SEQ ID NO: 55)、EKLRSNITVQYDI(SEQ ID NO: 56)、EKYRRVVRAGVKV(SEQ ID NO: 57)、RVVRAGVKVAQTA(SEQ ID NO: 58)。
【０２００】
実施例8
実施例１〜７で実施した解析及び溶解性及び他の物理化学的特徴の検討事項に基づいて、表９に示す配列が所望の特徴を有するとして発明者によって選択された。例えば、SEQ ID NO: 62及びSEQ ID NO: 89の配列は、SEQ ID NO 111及び112にそれぞれ由来の好ましい変異体配列である。これらの変異体配列は、元のアミノ酸配列に対して溶解性及び／又は製造可能性を高めるために選択された。表9の配列からなるポリペプチドが、製造され、次のアッセイでのスクリーニングには特に好ましかった。
【０２０１】
【表９】
2015520771.tif 000011
【０２０２】
Nle:ノルロイシン;Pyr:ピログルタミン。アスタリスク(*)は、所定のアルタナリアアレルゲン及びそのクラドスポリウムホモログの間の潜在的交差反応性エピトープを示す。かかるエピトープの他の事例は、実施例1〜7において提供される。
【０２０３】
実施例9
インビトロ結合分析
実施例１〜８において同定された配列を有するポリペプチドを、水性の酸性の環境での溶解性についてプレスクリーニングをし、ポリペプチドをインビトロMHCクラスII結合アッセイにおいて試験する。
【０２０４】
方法
使用するアッセイは競合的MHCクラスII結合アッセイであり、このアッセイでは、それぞれのペプチドを、調べるそれぞれのヒトMHCクラスIIアロタイプから既知のコントロール結合物（binder）を置換するその能力について解析する。この研究で使用するアロタイプ及びコントロールペプチドは典型的には以下に示したものである：
【０２０５】
2015520771.tif 000012
【０２０６】
競合アッセイにおいて、各ポリペプチドを解析し、コントロールペプチドと比較した相対的結合についてスクリーニングする。競合アッセイの性質に起因して、各ポリペプチドのデータは、コントロールペプチドのIC50に対するそれ自体のIC50の比として測定する。従って、コントロールポリペプチドと同等のIC50値を有するポリペプチドは同一の結合親和性を有するが、1未満の比を有するポリペプチドはより高い親和性を有し、1よりも大きな比を有するポリペプチドはより低い親和性を有する。
【０２０７】
水溶液中での溶解性は、ポリペプチドが効果的な治療剤であるための必須の基準である。従って、溶解性スクリーニングの結果として、多数の結合性の記録（register）における、大きな疎水性アミノ酸残基の頻度が高い非常に疎水性のポリペプチドは排除されることになる。このことは、雑多なHLA−DRB1*結合物（binders）の特徴である。1つ以上のMHCクラスIIアロタイプに結合するポリペプチドを同定する。かかるポリペプチドは、MHC構造の相同性により、試験していない同様のアロタイプに結合する能力を有することが期待される。
【０２０８】
実施例10
以下の方法を、実施例１〜８において同定された配列を有するポリペプチドのT細胞活性化の特徴を評価するために使用した。
【０２０９】
細胞増殖アッセイ
PBMC（試験するすべてのパラメータについて140×106個の細胞を要する）で、細胞増殖アッセイを行う。放射標識化合物3H−チミジンの取り込みによって増殖を測定する。より詳細には、適切な抗原又はポリペプチド濃縮物100μlを96ウェルプレートの適切なウェルの中に分配する。次いで、プレートを37℃、5％CO2の加湿インキュベーターの中に最長4時間まで置く。上記の単離されたPBMCを室温で、完全培地中2×106細胞／mlの濃度に調製する。次いで、抗原／ポリペプチドを含む96ウェルプレートの各ウェルの中に、細胞溶液100μlを分配する。次いで、プレートを6〜8日間インキュベートする。各ウェルにトリチウム化チミジンストック溶液（無血清RPMI培地中1.85MBq／ml）10μlを加えることによって、培養物をトリチウム化チミジン溶液でパルスする。次いで、プレートを8〜16時間インキュベーターに戻しておく。次いで、Canberra Packard FilterMate 196セルハーベスターを用いて培養物を集める。適切なβ線シンチレーションカウンターを用いて、乾燥させたろ過マットをカウントする。
【０２１０】
ポリペプチドを含むウェルからのカウントを、培地単独を含むウェル（1つのグループにつき12ウェル）と統計的に比較する。ノンパラメトリックマンホイットニー（Mann−Whitney）検定を使用する。すべての対象について同じ統計的検定を使用する。培地のみのウェルとポリペプチドで刺激したウェルとの間の統計的に有意な差は、ポリペプチドによるPBMCの陽性刺激とみなす。
【０２１１】
サイトカイン放出アッセイ
このアッセイで使用するポリペプチドを小規模で製造した（およそ10mgのバッチサイズ、非GMP）。各ポリペプチドの純度はHPLCにより少なくとも95％であった。ポリペプチド及びコントロール（ネガティブコントロールは培地であり、ポジティブコントロールはブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）25ng／ml及びアルタナリアアレルゲン全体の抽出物100μg／mlであった）を含む96ウェル培養プレートを予め調製し、アッセイ日前に−20℃で保存した。200μg／ml濃度のポリペプチドを含む100μl体積でポリペプチドをウェルに添加し、その後に100μlの細胞を添加して最終アッセイ濃度が100μg／mlとなるようにした。
【０２１２】
フィコール（Ficoll）密度勾配遠心分離によって、ヘパリン処置した血液から末梢血単核球（PBMC）を単離した。次いで、5×106細胞／mlのPBMC懸濁液の100μlアリコートを各ウェルに添加し、プレートを37℃、5％CO2加湿インキュベーター中に5日間置いた。刺激の後、多重ビーズアッセイにより試験するために培養上清（100μl）を集めた。
【０２１３】
解凍した培養上清に対して多重サイトカインビーズアッセイ（IL−10、IL−13、インターフェロンガンマ（IFN−g））を製造業者の使用説明書に従って実施した。各培養上清サンプルについて単一の測定を実施した。多重アッセイ完了後、アッセイで作成された検量線から内挿法によって個々のサイトカインレベルを決定した。ひとつ以上のIL−13、IL-10及びIFN−gアッセイについては50pg／ml超のサイトカイン放出を陽性の結果とみなした。試験した50のカビアレルギー対象（subject）のうち応答する数を、3個のサイトカインについて、各ポリペプチドについて計算した。
【０２１４】
表９の配列を有するポリペプチドの結果を表１０に要約する。
【０２１５】
【表１０】
2015520771.tif 000013
【０２１６】
示されるように、トップの成績の（top performing）ペプチドは、Alt13Aであった。Alt13Aの配列を有するポリペプチドを含むポリペプチドの組合せは、アルタナリアアレルギーの治療又は予防に好ましい。高い割合の対象中で個別に応答を誘導する他のトップの成績の（top performing）ポリペプチドとしては、Alt10、Alt11A、Alt13、Alt14、Alt14A、Alt15、Alt15A、Alt18、Alt22、Alt22A、Alt24A、Alt27、Alt27A、Alt28、Alt31及びAlt33が挙げられる。また好ましくは、これらのポリペプチドの１以上が本発明のいずれかのペプチドの組合せ中に含まれてもよい。
【０２１７】
集団の適用範囲の解析は、ポリペプチドが、他のペプチドと組み合わせて含まれる時に有利に集団から追加的応答を獲得できるものを決定するために実施された。IL-13又はIFN-g応答を所定の組合せ中に含まれる少なくとも１、２又は３ポリペプチドに対して示す集団中の対象の数を解析した。結果は下記表１１に示す。
【０２１８】
【表１１】
2015520771.tif 000014
【０２１９】
異なるポリペプチドを付加する効果は異なる組合せに応答する追加的対象の数と比較することによりみることができる。
【０２２０】
２つのAlt a1由来のポリペプチド(Alt01A及びAlt02A)及びAlt a2由来のひとつのペプチド(Alt06)は、少なくともひとつのポリペプチドに応答を示し、特にトップの成績の（top-performing）ポリペプチドAlt13A(86%応答、すなわち34／50個体)に応答を示さない対象の数を増やすものとして提供することができた。したがって、Alt01A、Alt02A又はAlt06のいずれかを含む組合せは、集団の適用範囲を増加するのに好ましく、特にポリペプチドAlt13Aと組み合わせるのが好ましい。
【０２２１】
Alt a 13由来のふたつのポリペプチド(Alt33及びAlt34A)も、特に集団の適用範囲を増加するのに有効である。上記組合せに含まれる時には、該ポリペプチドは少なくとも２ポリペプチドに応答する対象の数を１８から３２へ、少なくとも３ポリペプチドに応答する対象の数を６から２４へ増加させた。したがって、Alt33及びAlt34Aも集団の適用範囲を増加させるのに好ましく、特にポリペプチドAlt13A及び／又はAlt01A、Alt02A又はAlt06から１個以上のポリペプチドの組み合せにおいて特に好ましい。
【０２２２】
あるいは、ポリペプチドAlt 15及びAlt 18は、ポリペプチドAlt 33及びAlt 34と置換されうる。上記組合せ中に含まれる時には、少なくとも2ペプチドに応答する３０の対象、及び少なくとも3ポリペプチドに応答する２３の対象を達成した。したがってAlt15及びAlt18も集団の適用範囲を増加させるのに好ましく、ポリペプチドAlt13A及び／又はAlt01A、Alt02A又はAlt06から１個以上のポリペプチドと組み合せるのが特に好ましい。
【０２２３】
ポリペプチドAlt10(Alt a2由来)及びAlt28(Alt10由来)が、Alt01A、Alt02A、Alt06、Alt 13A、Alt 33及びAlt34Aを含む混合物に添加される時には、それぞれ少なくとも2ペプチドに応答する３４又は３６の対象及び少なくとも3ポリペプチドに応答する２７又は２６の対象をそれぞれもたらして、集団の適用範囲をさらに引き上げた。したがって、Alt10及びAlt28も集団の適用範囲を増加させるためにワクチン中にあるのが好ましく、ポリペプチドAlt13A及び／又はAlt01A、Alt02A、Alt06、Alt33又はAlt34Aから１個以上のポリペプチドと組み合せるのが特に好ましい。
【０２２４】
ポリペプチドAlt10又はAlt28もポリペプチドAlt 33又はAlt 34Aに代わるものとして使用しうる。上記に示すように、ポリペプチドAlt33及びAlt34AにかわりAlt10及びAlt28を含む組合せは、少なくとも2ペプチドに応答する３３又は３５の対象及び少なくとも3ポリペプチドに応答する２５又は２３の対象をそれぞれもたらした。したがって、Alt10及びAlt28は、ポリペプチドAlt13A及び／又はAlt01A、Alt02A、Alt06、Alt15又はAlt18から１個以上のポリペプチドを組み合わせて好ましく提供されうる。
【０２２５】
実施例11
多形集団中の応答をカバーしうるポリペプチドの組合せの基礎を提供するように実施例１０において同定されたポリペプチドの製剤開発の特性を解析した。次いで集団の適用範囲の解析は、好ましい製剤開発の特性を有するとして同定されたポリペプチドの追加的組合せに対して実施した。IL-13又はIFN-g応答を所定の組合せ中に含まれる少なくとも１、２又は３ポリペプチドに対して示す集団中の対象の数を解析した。結果は下記表１２に示す。
【０２２６】
【表１２】
2015520771.tif 000015
【０２２７】
異なるポリペプチドを付加する効果は、異なる組合せに応答する追加的対象の数と比較することによりみることができる。 
【０２２８】
３ペプチド組合せ、(a)Alt01A、Alt28及びAlt34Aならびに(b)Alt18、Alt28及びAlt34Aの両者は、トップの成績の（top-performing）ペプチドAlt13Aを欠いているが、Alt13Aが無い場合における集団の適用範囲における差異を評価するために比較した。(b)の３ペプチドの組み合わせは、すべての３ペプチドに応答する対象の数の点で適用範囲の増加をもたらした。
【０２２９】
Alt18、Alt28、Alt34A及びAlt13Aの組合せのような４ペプチドの組合せ中へのトップの成績の（top-performing）ペプチドAlt13Aの添加は、実施例10における結果から予想されるように、少なくともひとつのペプチドに応答する対象の観点から有意に適用範囲を増加させた。
【０２３０】
Alt01A、Alt06、Alt02及びAlt14のようなポリペプチドの添加は、種々の組合せ中の少なくとも１、２及び３個のペプチドに応答する対象の観点からさらに集団の適用範囲を増加させた。
【０２３１】
したがって、Alt01A、Alt06、Alt02及びAlt14は、多形性カビアレルギー集団における応答の有効範囲の基礎として、好ましくはポリペプチドAlt18、Alt28、Alt34A及びAlt13Aと組み合わせて提供されうる。
【０２３２】
実施例12-ペプチド、塩及び医薬製剤の調製
ペプチドは以下のように調製する。合成は、固相ペプチド合成(SPPS)リアクター中で行われ、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)中で置換された樹脂を懸濁することにより始められる。DMFで樹脂を洗浄後、各カップリング手順は、DMF中のN-[(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)(ジメチルアミノ)メチレン]-N-メチルメタンアミニウムテトラフルオロボレート N-オキサイド(TBTU)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)、または塩化メチレン(DCM)及びDMFの混合液中にジイソプロピルカーボジイミド(DIC)及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)の存在下で、N−α−保護アミノ酸誘導体又はN−α−保護ジペプチドを先のアミノ酸に添加することによって実施される。単一の工程ごとに、溶媒及び／又は試薬を添加し、反応液を撹拌し、続いてろ過し溶媒及び／又は試薬を樹脂から除去する。
【０２３３】
それぞれ達成できたカップリング又はキャッピング手順の後、Fmoc脱保護工程手順を行った。それは、DMFで樹脂を洗浄、DMF又は1-メチル-2-ピロリドン(NMP)のいずれかの中で20%(V／V)ピペリジンでFmoc基を切断、そしてその後DMF及びイソプロパノール(IPA)で洗浄する工程からなる。単一の工程ごとに、溶媒及び／又は試薬を添加し、反応液を撹拌し、続いてろ過し溶媒及び／又は試薬を樹脂から除去する。
【０２３４】
Fmoc脱保護及びカップリング手順は、樹脂が所望のペプチドの完全なペプチド配列を担持するまで繰り返される。SPPSは最終のFmoc脱保護及び減圧下ペプチド樹脂の乾燥により完成する。
【０２３５】
特定のペプチドの酢酸塩又は塩酸塩は、下記の方法により調製される。ペプチド樹脂は、室温で1.5〜3時間、1,2-エタンジチオール(EDT)、トリイソプロピルシラン(TIS)、及び水の存在下で、冷トリフルオロ酢酸(TFA)を用いて処理する。濾過及びTFAで樹脂を洗浄後、生成物は冷ジイソプロピルエーテル(IPE)で析出させる。その後ろ過し、IPEで洗浄し、減圧乾燥する。生成物は、続いて再構成され、高圧液体クロマトグラフ法(HPLC)により精製される。
【０２３６】
酢酸塩の調製のためには、トリフルオロ酢酸塩を5%(V／V)酢酸水中で再構成し、イオン交換樹脂に装填する。溶出は、5%(V／V)酢酸水で行った。酢酸塩を0.2μmメンブランフィルターを通してろ過し、凍結乾燥して、白色からオフホワイトの粉末として最終生成物を得る。
【０２３７】
塩酸塩の調製のためには、トリフルオロ酢酸塩を0.01M塩化水素（精製水）中で再構成し、必要ならばろ過する。溶液を塩酸塩へイオン交換するために予備HPLCカラムに装填する。イオン交換は、0.1M塩化アンモニウム溶液でカラムを洗浄し、続いて0.01M塩化水素で洗浄することにより行われる。つづいて、塩酸塩を0.2μmメンブランフィルターを通してろ過し、凍結乾燥して、白色からオフホワイトの粉末として最終生成物を得る。
【０２３８】
典型的な本発明の医薬製剤は、表１３に示す成分を含む。ペプチドの塩は、酢酸塩又は塩酸塩である。
【０２３９】
【表１３】
2015520771.tif 000016
【０２４０】
製剤は、凍結乾燥にかける前に溶液中で調製し凍結乾燥物を製造する。
【配列表】
2015520771000001.app
【国際調査報告】
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2015520771.tif 000018
2015520771.tif 000019
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