(57)【要約】  癌試験は、患者（６）から取得された疑わしい組織試料（１０）を処理して、疑わしい全ゲノム配列（ＷＧＳ）（２０）を生成するステップと、患者から取得された正常組織試料（１２）を処理して、正常ＷＧＳ（２２）を生成するステップと、疑わしいＷＧＳを正常ＷＧＳと比較してＷＧＳ比較測定基準を計算するステップと、疑わしい組織試料が癌組織を含むかどうかを計算されたＷＧＳ比較測定基準に基づいて明らかにするステップとを含む。腫瘍描写方法は、証拠となる複数の組織試料（１０４）を患者（６）から腫瘍（１００）の中または付近で取得するステップと、証拠となる組織試料の試料採取位置を記録するステップと、証拠となる各組織試料を、証拠となる組織試料についての遺伝子試験に基づいて、癌に関して分類するステップと、腫瘍の境界（１１０）を、証拠となる組織試料の分類および記録された試料採取位置に基づいて描写するステップとを含む。
2015506024.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から取得された疑わしい組織試料を処理して、疑わしい全ゲノム配列を生成するステップと、
前記対象から取得された正常組織試料を処理して、正常全ゲノム配列を生成するステップと、
前記疑わしい全ゲノム配列を前記正常全ゲノム配列と比較して、全ゲノム配列比較測定基準を計算するステップと、
前記疑わしい組織試料が癌組織を含むかどうかを前記計算された全ゲノム配列比較測定基準に基づいて明らかにするステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記明らかにするステップが、前記組織試料がいかなる特定の種類の癌組織も含むかどうかを明らかにすることを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記明らかにするステップが、前記疑わしい全ゲノム配列内のいかなる特異的な遺伝子変異体も明らかにすることを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記明らかにするステップが、
前記計算された全ゲノム配列比較測定基準に基づいて、前記組織試料を癌組織または正常組織として標識するステップ
を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記計算するステップが、
前記疑わしい全ゲノム配列内の重複リードの測定基準を計算するステップと、
前記正常全ゲノム配列内の重複リードの測定基準を計算するステップと、
前記疑わしい全ゲノム配列内の重複リードの測定基準、および前記正常全ゲノム配列内の重複リードの測定基準に基づいて、前記全ゲノム配列比較測定基準を計算するステップと、
を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記計算するステップが、
（ｉ）前記疑わしい全ゲノム配列に含まれ、かつ（ｉｉ）前記正常全ゲノム配列には含まれない、疑わしいゲノムに特異的なリードの組を決定するステップ
を含み、
前記全ゲノム配列比較測定基準が、前記疑わしいゲノムに特異的なリードの組を含む、またはこのリードの組に基づいて計算される、
請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記計算するステップが、
前記疑わしい全ゲノム配列を参照配列と整列させるステップによって、疑わしいゲノム変異体の組を明らかにするステップと、
前記正常全ゲノム配列を前記参照配列と整列させるステップによって、正常ゲノム変異体の組を明らかにするステップと、
ｉ）前記疑わしいゲノム変異体の組に含まれ、かつ（ｉｉ）前記正常ゲノム変異体の組には含まれない変異体の組を明らかにするステップと、
を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記計算するステップが、
前記疑わしい全ゲノム配列を参照配列と整列させるステップと、
前記正常全ゲノム配列を前記参照配列と整列させるステップと、
前記疑わしい全ゲノム配列を整列させるための整列統計量と前記全ゲノム配列を整列させるための整列統計量との比較に基づいて、全ゲノム配列比較測定基準を計算するステップと、
を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法を実施するための電子データ処理デバイスによって実行可能な命令を記憶する持続性記憶媒体。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成された電子データ処理デバイス
を備える装置。
【請求項１１】
前記対象から腫瘍の中または付近の複数の試料採取位置で組織試料を取得するステップと、
前記試料採取位置を記録するステップと、
組織試料ごとに、前記処理するステップ、計算するステップ、および明らかにするステップを実施するステップと、
前記明らかにするステップおよび前記記録された試料採取位置に基づいて、前記腫瘍の境界を描写するステップと、
をさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
対象から腫瘍の中または付近の試料採取位置で取得された組織試料を、前記組織試料についての遺伝子試験に基づいて癌に関して分類するステップと、
前記分類するステップに基づいて、かつ前記試料が取得された前記試料採取位置についての知識に基づいて前記腫瘍の境界を描写するステップと、
を含む方法。
【請求項１３】
前記分類するステップが、
前記組織試料の遺伝的内容を前記対象の正常組織の遺伝的内容と比較するステップを含み、前記分類するステップが、前記組織試料の遺伝的内容を、ある種類の癌と相関関係にあることが臨床研究で示されている遺伝子変異体と比較することを含まない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
証拠となる複数の組織試料を対象から腫瘍の中または付近で取得するステップと、
前記証拠となる組織試料の試料採取位置を記録するステップと、
証拠となる各組織試料を、前記証拠となる組織試料についての遺伝子試験に基づいて、癌に関して分類するステップと、
前記腫瘍の境界を、前記証拠となる組織試料の分類および前記記録された試料採取位置に基づいて描写するステップと、
を含む方法。
【請求項１５】
正常組織試料を前記対象から、前記正常組織試料が癌組織を含まないことを保証するのに効果的な位置で取得するステップ
をさらに含み、
前記証拠となる各組織試料を分類するステップが、前記証拠となる組織試料の遺伝的内容を前記正常組織試料の遺伝的内容と比較するステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
以下は医療技術、腫瘍学技術、ゲノム技術、および関連技術に関する。腫瘍学的癌描写応用例を具体的に参照して説明するが、以下はより一般に、医学または獣医学の研究および開発、スクリーニング、診断、転移または他の状態の臨床監視、介入計画、ならびに他の腫瘍の状態およびその他の有害な状態を対象とする医学および獣医学の応用例にも適用可能である。
【背景技術】
【０００２】
癌は、正常な体細胞が突然変異またはそれ以外で形質転換して、制御されずに分裂および増殖する癌細胞になるときに発生する。いくつかの癌では、癌細胞は、少なくとも初期には局在したままとなって、微小浸潤によって周囲の組織に侵入することが多い悪性腫瘍を形成する。この時点で、癌は、腫瘍を除去することによって治療できる場合もあるが、このような除去は完全なものでなければならず、さもなければ、残っている癌細胞が増殖し続け、癌の再発につながる可能性がある。外科的除去に加えて、放射線治療、化学療法などのアジュバントおよび／またはネオアジュバント治療（１つまたは複数）を施すことができ、これにより、悪性組織除去が不完全であれば対処することができる。癌は、それが非局在化したものになり、血流またはリンパ系を通って体の大部分に広がった場合に転移する。転移癌は通常、薬物を投与することによって（化学療法）、または放射性移植物の形で照射する（密封小線源治療）もしくは電離放射線を直接適用すること（放射線治療）によって治療される。これらの技法はまた、悪性腫瘍の外科的除去が禁忌である場合に外科的腫瘍除去の代わりに、または腫瘍除去後に残っている癌細胞があれば取り除くための外科的腫瘍除去に加えて、転移の前に使用されることもある。
【０００３】
癌特定のための知られている手段は遺伝子解析である。通常、これには、ある種類の癌と相関関係があることが臨床研究で示されている、特定の遺伝子変異体または変異体の組合せを疑わしい細胞が含むかどうかを明らかにする遺伝子型同定を実施することが伴う。進展中の腫瘍学研究では、様々な種類の癌を特定するためのこのような遺伝子シグネチャのデータベースを継続して拡張している。
【０００４】
これらの遺伝学的手法の有効性は、調査を受ける対象（例えば、人間の腫瘍患者または獣医の腫瘍患畜）の特異的な癌状態に関する既知の遺伝子シグネチャがあることが条件となる。必ずしもこうとは限らないこともある。実際に癌と関係があるいくつかの変異体が新規であることがあり（例えば、ある特定の患者に特有であり、その癌患者のプールでは一般に観察されない）、あるいは集団に特異的（例えば、特定の民族、性、地理的領域などに特異的）なことがある。
【０００５】
腫瘍学文献で特定されている変異体−癌の相関関係の数は常に増大しており、そのため原理上は、癌診断の遺伝子解析の有効性が向上するはずであるが、実際には限界がある。新たに出版物に掲載された変異体を臨床上の診断および監視のために採用するのは、検証についての懸念および／または政府の規制の遅れによって、遅れる可能性がある。さらに、変異体データベースがより大きいと、ますます多くの変異体を取得および試験しなければならないので、処理時間がより長くなる。取得遅れは、先進の配列決定技術を使用して全ゲノム配列（ＷＧＳ）を取得することによって低減することができる。しかし、下流処理遅れは、ＷＧＳ取得によって低減されない。
【０００６】
さらに、変異体データベースは、臨床研究で統計的に検出可能にするには小さすぎる癌プールの一部分で発生するユニークな（またはほぼユニークな）変異体を包含することができない。変異体データベースがより大きいとまた、特定の変異体と特定の癌の間の相関関係（または相関関係の欠如）に関する矛盾する結論を引き出す研究など、曖昧または相いれないデータが得られる可能性も増加する。このような場合では、既存の遺伝子解析で臨床的に有用な結果が生み出される見込みがない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以下では、前述の制限等を克服する改善された装置および方法を企図する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様によれば、当該方法は、患者から取得された疑わしい組織試料を処理して、疑わしい全ゲノム配列を生成するステップと、患者から取得された正常組織試料を処理して、正常全ゲノム配列を生成するステップと、疑わしい全ゲノム配列を正常全ゲノム配列と比較して、全ゲノム配列比較測定基準（ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍｅｔｒｉｃ）を計算するステップと、疑わしい組織試料が癌組織を含むかどうかを計算された全ゲノム配列比較測定基準に基づいて明らかにするステップとを含む。
【０００９】
別の態様によれば、持続性記憶媒体が、すぐ上の段落に記載の方法を実施するための電子データ処理デバイスによって実行可能な命令を記憶する。別の態様によれば、装置が、すぐ上の段落に記載の方法を実施するように構成された電子データ処理デバイスを備える。別の態様によれば、すぐ上の段落に記載の方法はさらに、患者から腫瘍の中または付近の複数の試料採取位置で組織試料を取得するステップと、試料採取位置を記録するステップと、組織試料ごとに、処理するステップ、計算するステップ、および明らかにするステップを実施するステップと、明らかにするステップおよび記録された試料採取位置に基づいて腫瘍の境界を描写するステップとを含む。
【００１０】
別の態様によれば、当該方法は、患者から腫瘍の中または付近の試料採取位置で取得された組織試料を、組織試料についての遺伝子試験に基づいて、癌に関して分類するステップと、分類するステップに基づいて、かつ試料が取得された試料採取位置についての知識に基づいて腫瘍の境界を描写するステップとを含む。
【００１１】
別の態様によれば、当該方法は、証拠となる複数の組織試料を患者から腫瘍の中または付近で取得するステップと、証拠となる組織試料の試料採取位置を記録するステップと、証拠となる各組織試料を、証拠となる組織試料についての遺伝子試験に基づいて、癌に関して分類するステップと、腫瘍の境界を、証拠となる組織試料の分類および記録された試料採取位置に基づいて描写するステップとを含む。
【００１２】
１つの利点は、介入腫瘍学処置の腫瘍描写準備など、スピードが重要な臨床応用例で使用するのに十分な速さで、ＷＧＳデータに基づく癌細胞の特定を実現することにある。
【００１３】
別の利点は、特異的な癌相関変異体をコールすることに依拠しない、ＷＧＳに基づく癌細胞特定を実現することにある。
【００１４】
別の利点は、特定された相関遺伝子変異体を有する特異的な既知の癌型に限定されない、広範囲にわたる癌細胞特定を実現することにある。
【００１５】
別の利点は、特有の形態特徴または染色特性を示す癌細胞に依存しない癌描写を実現することにある。
【００１６】
多数のさらなる利点および利益が、以下の詳細な説明を読むことによって当業者には明らかになろう。
【００１７】
本発明は、様々な構成要素および構成要素の構成、ならびに様々な処理作業および処理作業の構成の形を取りうる。図面は、好ましい実施形態を図示することを目的とするにすぎず、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本明細書に開示の、全ゲノム配列（ＷＧＳ）情報に基づく癌細胞特定を実施するように適切に構成された試料抽出検査所およびゲノム検査所を示す図である。
【図２】ＷＧＳ比較測定基準計算およびこれを用いる癌細胞特定方法の実施形態を示す図である。
【図３】ＷＧＳ比較測定基準計算およびこれを用いる癌細胞特定方法の実施形態を示す図である。
【図４】ＷＧＳ比較測定基準計算およびこれを用いる癌細胞特定方法の実施形態を示す図である。
【図５】ＷＧＳ比較測定基準計算およびこれを用いる癌細胞特定方法の実施形態を示す図である。
【図６】本明細書に開示の介入手順計画で使用するための、腫瘍の中または付近の試料採取位置における患者からの証拠となる組織試料の取得を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
既存の遺伝子解析では、観察可能な遺伝子変異体を特異的な種類の癌と互いに関係づける。この手法では、癌が、明確に定義された種類に分類されると仮定し、また所与の種類の癌を、その種類の癌の患者（または獣医学の文脈では獣医患畜）に共通の相関遺伝子変異体によって特徴づけできると仮定する。
【００２０】
しかし、本明細書では、これらの仮定は多くの状況で適合しない可能性があると認識する。例えば、エストロゲン受容体陽性乳癌とエストロゲン受容体陰性乳癌の両方について報告された研究では、乳癌の病理組織学的表現型が同じである別々の患者からの癌遺伝子間で、かなりの複雑性および異質性が実際には観察されることが示された（腫瘍間異質性）。Ｓｈａｈら、「Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｌｏｂｕｌａｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｕｒ  ｐｒｏｆｉｌｅｄ  ａｔ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ  ｖｏｌ．４６１、８０９〜８１３頁（２００９年）、Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、「Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  ｖｏｌ．４６２、１００５〜１０１０頁（２００９年）、およびＤｉｎｇら、「Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ」、Ｎａｔｕｒｅ  ｖｏｌ．４６４、９９９〜１００５頁（２０１０年）を参照されたい。例えば、Ｓｔｅｐｈｅｎｓらが特定した新規の融合遺伝子のどれも、調査された２４の癌のいずれにも２回以上は存在せず、またＳｈａｈらが報告したように、経過観察のために選択された３つの発現インフレーム融合遺伝子が、調査された追加の２８８の乳癌に存在しなかった。別の研究では、個々の乳癌内での実質的な異質性（腫瘍内異質性）が記述されており、別個の遺伝子プロファイルをそれぞれが有する複数の腫瘍亜集団が特定されている。Ｎａｖｉｎら、「Ｉｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ」、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．２０、６８〜８０頁（２０１０年）を参照されたい。
【００２１】
さらに、変異体−癌の相関関係の違いが集団間で生じうることが知られており、そのため、ある特定の集団について文献に報告されている遺伝子シグネチャ（例えば、突然変異、一塩基多型すなわちＳＮＰ、挿入または欠失すなわちインデルなど）を他の集団に使用することが不適切なことになる可能性がある。例えば、疾病突然変異としてフラグが立てられた配列変異体についての１つの研究では、調査された変異体の７４％が多型であることが分かった。さらに、ある突然変異が、ある特定の種類の癌と相互に関連していると文献でたとえ言及されていても、このことは、それが確かに原因となる突然変異であることを保証するものではない。実際、言及された疾病突然変異の２７％がおそらく多型であること、または誤って注釈されていることが同じ研究で判明した。
【００２２】
実際、従来の発癌のモデル、すなわち、正常細胞から癌細胞に移行する個々の、相対的に離散的な遺伝子突然変異が段階的に蓄積することは疑われてきた。例えば、発癌のいくつかの例で最近開発されたモデルは染色体破砕（ｃｈｒｏｍｏｔｈｒｉｐｓｉｓ）である。このモデルでは、染色体が大規模な破砕をこうむった後に不正確な再組立てが続く。Ｓｔｅｐｈｅｎｓら「Ｍａｓｓｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  Ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｎ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｉｃ  Ｅｖｅｎｔ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｃｅｌｌ  ｖｏｌ．１４４  ｎｏ．１、２７〜４０頁、（２０１１年１月）。この染色体破砕モデルでは、特定の種類の癌が、相関関係にある離散的な遺伝子変異体と関連づけられそうであるとは予測していない。一般的になってきている別のモデルでは、仮説としてドライバー変異とパッセンジャー変異を取り上げる。このモデルは、多くの癌ゲノムが突然変異で満たされるという観察に基づく。このモデルでは、これらの突然変異の大多数はおそらく乗客であり、つまり癌の発生の一因ではなく、それよりむしろ癌の増殖時に発生した突然変異である。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｗｓ−ｍｅｄｉｃａｌ．ｎｅｔ／ｎｅｗｓ／２０１００２１９／Ｃａｎｃｅｒ−ｇｅｎｏｍｅｓ−Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ−ｂｅｔｗｅｅｎ−ｄｒｉｖｅｒ−ａｎｄ−ｐａｓｓｅｎｇｅｒ−ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ａｓｐｘ（最終アクセス２０１１年１０月２７日）を参照されたい。このモデルによれば、生物学データベース中の突然変異のほとんどはパッセンジャー変異であることになる。
【００２３】
本明細書に開示の癌特定技法により、文献ベースの癌相関性遺伝子変異体に頼ることが少なくなるか、または無くなる。代わりに、本開示の技法では、発癌機構にかかわらずすべての癌に有効であると期待される原理・考慮事項にまず依拠する。本開示の技法ではまた、全ゲノム配列（ＷＧＳ）が利用可能であることを活用する。ＷＧＳは、いくつかの既存の市販ゲノムシークエンサーまたは配列決定サービスから得られる（適切なシークエンサーまたは配列決定サービスが、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国、Ｋｎｏｍｅ（登録商標）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、マサチューセッツ州、米国、Ｒｏｃｈｅ  ４５４（Ｒｏｃｈｅ、バーゼル、スイスから入手可能）、およびＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｇｕｉｌｆｏｒｄ、コネチカット州、米国、から入手可能である）。
【００２４】
本明細書に開示の技法は、以下の観察結果を前提とする。すなわち、すべての癌は遺伝子の異常な変化と関連づけられる。これは、特定の発癌の機構にかかわらず、また特定の癌の種類にかかわらず当てはまる。この観察結果に基づき、本開示の技法は、疑わしい細胞のＷＧＳを同じ個体からの正常細胞のＷＧＳと比較することに依拠する。疑わしい細胞が確かに癌細胞である場合には、そのＷＧＳと、同じ個体からの正常細胞のＷＧＳとの間の相違は、同じ個体からの２つの異なる正常細胞のＷＧＳ間の相違よりも大きいと予想される。したがって、ある対象（例えば、人間の医療患者または獣医患畜）から採取された疑わしい組織試料のＷＧＳを、同じ対象から採取された正常組織試料のＷＧＳと比較することによって、疑わしい組織試料が実際に癌組織を含む可能性が容易に評価される。正常組織のＷＧＳは、癌と関係がないゲノムの部分を取り除くフィルタとして使用されて、疑わしい組織が実際に癌組織であるかどうかの証拠となるユニークな変異体だけが残される。
【００２５】
この手法には大きな利点がある。この手法により、良性（すなわち、癌と関係がない）変異体を癌シグネチャとして誤解釈する可能性は、このような良性変異体が同じ対象の正常ＷＧＳとの比較によって選別され除かれるので、大幅に低減する。一方で、文献の変異体−癌相互関連物との比較によっては検出されないユニークな癌関連変異体が、本開示の手法を用いて容易に検出される。
【００２６】
本開示の手法では、疑わしい組織試料が癌を含むかどうかを判定するが、どの種類の癌であるかは特定しない。同業者にはこれが、癌の診断および監視での大きな不利点と見えるかもしれない。しかし、本明細書では、場合によって認められるこの不利点は、当初考えられうるほどには大きくないと認識する。第１に、本開示の手法は、遺伝子材料を変異体の参照データベースと網羅的に比較することに依拠しないので、変異体による従来の癌特定よりもかなり速い。したがって、この手法は、初期の癌スクリーニングに使用することができる（本開示の手法で癌の可能性が示された場合には、変異体による従来の癌特定の形で追跡が行われる）。本開示の手法はまた、癌監視でも有用である。というのはその場合、癌の種類が（通常は）すでに知られており、求められている情報が癌の進行についてのものになるからである。本明細書でさらに開示するように、本開示の手法の速度によりこの手法は、外科的除去または放射線治療などの介入手順のための計画時に、腫瘍の描写で使用するのに実行可能な技法にもなる。
【００２７】
図１を参照すると、本開示の癌試験技法は、試料抽出検査室８で患者６から抽出された１つまたは複数の組織試料について本開示の癌試験を行うゲノム検査室４で適切に実行される。検査室４、８には、様々な関係がありうることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態では、２つの検査室４、８は同じ検査室であり、例えば、それ自体の組織試料採取もまた行う病院にある院内ゲノム検査室である。別の実施形態では、２つの検査室４、８は、同じ病院または他の共同医療施設に設置された別々の院内検査室でよい。さらに別の実施形態では、２つの検査室４、８は組織的および／または地理的に別々でよい。例えば、試料採取検査室８は、ある病院に設置された院内検査室でよく、ゲノム検査室４は商業サービス提供業者でよく、この提供業者は、抽出された組織試料を郵便または他の配達経路を介して受け取り、試験結果を元のその病院にインターネットまたは他の電子通信経路を介して伝達する。
【００２８】
これらの実施形態のいずれでも、試料採取検査室８は、患者６から少なくとも２つの組織試料、すなわち「疑わしい」組織試料１０および「正常」組織試料１２を抽出する。疑わしい組織試料１０は、癌組織を含む疑いがある患者６の部位または領域から取得された組織試料である。例えば、疑わしい組織試料１０は、悪性であることが疑われる、もしくは分かっている腫瘍から（本明細書では「疑われる」は「分かっている」を包含すると理解されたい）、または肺癌があると疑われる肺から、または悪性であると分かっているか疑われる乳癌病変などから取得されてよい。正常組織試料１２は、同じ患者６から取得されるのであるが、正常組織試料１２が癌組織を含まないことを保証するのに有効な患者６の領域または部位から取得される。正常な組織試料１２を抽出できるこのような「正常」領域を特定することは、様々な種類の情報に基づくことができる。例えば、（まだ）転移していない悪性腫瘍の場合、正常組織試料１２は、腫瘍から十分に遠く離れている、無視できない量の癌細胞を含んでいそうにない同じ種類の組織の部位から安全に取り出すことができる。転移癌の場合では、正常組織試料１２は、無視できない量の転移癌細胞を含んでいそうにない種類の組織から取り出すことができる。例えば、癌が口腔組織まで広がっていそうにない場合には、正常組織試料１２は口腔試料でよい。一般に、疑わしい組織試料１０と正常組織試料１２は、同じ組織型のものであることもないこともある。
【００２９】
図１では、試料１０、１２はバイアルによって表されていることに留意されたい。しかし、試料１０、１２は一般に、試料採取された組織の種類に適した任意の形を取ることができ、またその組織の種類に適した任意の容器または支持体によって収容または支持できることを理解されたい。例えば試料１０、１２は、皮下注射針または他の流体収集装置を使用して取得された流体試料（例えば血液）、表面試料（例えば、口腔スワブによって得られ、滅菌スライド上または他の適切な表面に置かれる）、生検針または他の介入機器を使用して取得された生検試料などでよい。（余談であるが、各図面で、正常組織試料１２、および正常組織試料１２だけを利用する処理は、見やすくするために点線を用いて描かれている。）さらに、例示的な疑わしい組織試料１０が単一の試料として表され、例示的な正常組織試料１２が単一の試料として表されているが、どちらかまたは両方の試料が実際には２つ以上の試料の一組を含むことができ、その結果が平均され、またはそれ以外に一緒にされることを理解されたい。
【００３０】
組織試料１０、１２は、試料採取検査室８からゲノム検査室４へ（検査室４、８が同じ物理的施設ではない限り）搬送される。ゲノム検査室４において、各試料１０、１２は、遺伝子配列決定装置１４を使用して適切に準備および処理されて、疑わしい組織試料１０および正常組織試料１２にそれぞれ対応する疑わしい全ゲノム配列（疑わしいＷＧＳ）２０、および正常な全ゲノム配列（正常ＷＧＳ）２２が生成される。遺伝子配列決定装置１４は、全ゲノム配列（ＷＧＳ）を生成できるほぼどんなシークエンサーも使用することができる。いくつかの適切な配列決定装置は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国、Ｋｎｏｍｅ（登録商標）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、マサチューセッツ州、米国、Ｒｏｃｈｅ  ４５４（Ｒｏｃｈｅ、バーゼル、スイスから入手可能）、およびＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｇｕｉｌｆｏｒｄ、コネチカット州、米国、から入手可能である。
【００３１】
本明細書では、「全ゲノム配列」、すなわちＷＧＳ（当技術分野では、「フル」、「完全」、または「全体」ゲノム配列とも呼ばれる）、または類似の用語は、患者の実質的な、しかし必ずしも完全ではない、ゲノムを包含すると理解されたい。当技術分野では、「全ゲノム配列」という用語、すなわちＷＧＳは、いくつかの用途では少なくとも９５％が完全であるような、患者のほぼ完全なゲノムを指すのに用いられる。本明細書で「全ゲノム配列」という用語、すなわちＷＧＳは、ゲノムの０．１％未満が通常はカバーされる、一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子型同定などの遺伝子特異的技法に使用される「配列」を包含しない。本明細書で「全ゲノム配列」という用語、すなわちＷＧＳは、ゲノムをいかなる参照配列とも合わせる必要がなく、また変異体または他の特徴に注釈をつける必要がない。
【００３２】
ＷＧＳ１０、１２は、説明のための図１に代表的なコンピュータ２４で示されている電子データ処理デバイス２４で処理される。より一般には、電子データ処理デバイス２４は、デスクトップ・コンピュータ、ノート型コンピュータ、電子タブレット、ネットワーク・サーバなどでよい。さらに、例示的なコンピュータ２４は、ゲノム検査室４の内側にあるように示されているが、電子データ処理デバイスがゲノム検査室４の外側に設置され、有線または無線のローカル・エリア・ネットワークを介して、および／またはインターネットなどを介して検査室４と通信することもまた企図されている。例えば、電子データ処理デバイス２４は、検査室４から電子病院ネットワークを介してアクセスするネットワーク・サーバでよい。電子データ処理デバイス２４で実行されるＷＧＳ１０、１２の処理は、インシリコの処理と呼ばれることがある。本明細書で開示される様々な実施形態は、本開示のインシリコの処理を実施するようにプログラムされた、またはそれ以外で構成された電子データ処理デバイス２４として物理的に具体化できることを理解されたい。さらに、本明細書に開示の様々な実施形態は、本開示のインシリコの処理を実行するための電子データ処理デバイス２４によって実行可能な命令を記憶する持続性記憶媒体（図示せず）として物理的に具体化することができる。このような持続性記憶媒体には、例えば、ハード・ディスクもしくは他の磁気記憶媒体、または光ディスクもしくは他の光記憶媒体、またはフラッシュメモリ、ランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、もしくは他の電子記憶媒体などが含まれてよい。
【００３３】
本開示の癌特定試験は、疑わしい全ゲノム配列２０と正常全ゲノム配列２２とを、これらのＷＧＳ２０、２２の間の相違が大きければ大きいほど疑わしいＷＧＳ２０が癌組織である可能性が高いという一般的な前提で比較することに基づく。癌細胞の場合、ゲノムの変化は、大きいインデル（挿入／欠失）、大幅なコピー数変化（ＣＮＶ）、染色体異常および染色体再配置、ならびに高度に悪性および脱分化型の腫瘍の極端な場合での染色体異数性によって、より顕著になる。この場合もやはり、これは発癌の機構にかかわらず当てはまる。これらのゲノム変化には、全ゲノム内の顕著な変化またはエラーが含まれ、それによって癌細胞のＷＧＳが正常細胞のＷＧＳから大幅に逸脱することになる。一般には、これは程度の問題である。正常細胞のＷＧＳでも、互いに逸脱があることが予想される。これらの逸脱は、癌細胞ではかなり大きいことが予想される。この前提はまた、１つの癌段階から次の段階への癌進行を監視することに適用することが、後の癌段階では正常細胞ＷＧＳに対してよりいっそうの差別を（より早い段階の癌細胞に対し）示すことが予想されるので可能である。実際、後期段階の癌細胞のＷＧＳは、初期段階の癌細胞のＷＧＳと比較して、定量化できる差別の増大を示すことが予想される。有利なことに、これらの変化は、疑わしい組織試料のＷＧＳを詳細な解析パイプライン（例えば、完全整列／組立て、変異体コーリングおよび注釈づけ、ならびに文献の変異体−癌相関データベースとの比較を含む）にかける前でも確認することができる。
【００３４】
この目的に向けて、動作３０でＷＧＳ比較測定基準を計算して、疑わしい全ゲノム配列２０と正常全ゲノム配列２２の定量的比較を行う。決定動作３２で、定量的ＷＧＳ比較測定基準が癌基準を満たすかどうかを決定する。決定動作３２で達した結論に応じて、疑わしい組織試料１０は、正常組織として分類されるか（動作３４）、または癌組織として分類される（動作３６）。この点で、決定動作３２はまた、分類子または分類動作と見ることもできる。
【００３５】
図１の例示的な分類子３２には２値（すなわち、癌または正常のどちらか）分類が用いられているが、より一般的には、この分類でソフト分類または確率的分類（例えば、試料１０が癌である７０％の確率がある）を用いることができることに留意されたい。この場合、百分率は、試料１０が癌を含む確率として、または試料に含まれる癌の「量」として、様々に解釈することができる。例えば、疑わしい試料１０は、実際には、いくらかの癌細胞およびいくらかの正常細胞を含むことがある。このような場合、分類子３２からの低確率出力が、癌細胞である細胞の割合が低いことを示すことができる。
【００３６】
分類子３２は、癌の種類については見解を述べずに、疑わしい試料１０が癌を含むかどうかについてだけ見解を述べる。出力３４、３６は、様々に解釈および／または利用することができる。図１に図示の例では、動作３０、３２、３４、３６で具体化される癌試験は、癌スクリーニング試験として用いることができる。この応用例では、疑わしい組織試料１０が正常組織であること示す出力３４が得られた場合、さらなる動作は通常起こされない。一方、癌の確率を示す出力３６が得られた場合には、追加の診断が医師の指導の下で通常行われる。
【００３７】
図１に図示の例では、追加の診断には、従来の遺伝子変異体−癌相関解析を行うことが含まれる。有利なことに、この解析は、疑わしいＷＧＳ２０を「再使用」することができる。この目的に向けて、出力３６は、ゲノム整列／組立て４０、変異体コーリング４２および注釈／特定４４の各動作と、癌の種類の出力４６とを呼び出す呼出し動作３８としての役割を果たし、癌の種類の出力４６は、臨床研究においてその種類の癌と相関関係があることが示された遺伝子変異体を特定する動作４０、４２、４４に基づく。この実施形態では、追加の遺伝子試験４０、４２、４４、４６は、癌試験３０、３２、３４、３６の検証としても機能し、また癌の種類を特定することによって追加の情報を提供する。
【００３８】
本明細書に開示の癌試験技法について図１を参照して概説したが、ＷＧＳ比較測定基準計算動作３０および分類子動作３２のいくつかの具体的な実施形態について、図２〜５を参照して説明する。
【００３９】
図２を参照して、ＷＧＳ比較測定基準計算動作３０の第１の実施形態３０１、および分類子動作３２の第１の実施形態３２１について説明する。同等数の組織試料のリードを選択するために適用された塩基クオリティの同じカバー度および同じ閾値に対して試料すべて（複数の場合）を別々に配列決定することによって、疑わしいＷＧＳ２０を作り出す。組織試料ごとのリードは、ブルーム・フィルタのような確率的データ構造で保存される。動作５０で、疑わしいＷＧＳ２０から重複リード（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｒｅａｄ）を除去し、類似の動作５２では、正常ＷＧＳ２２から重複リードを除去する。正常細胞からのリードは癌細胞からのリードほど多く重複しないことが、癌細胞で予想される挿入の数が正常細胞と比較して多いことを反映して、予想される。それに応じて、重複リード除去動作５０、５２では、除去された重複リードの量を、疑わしいＷＧＳ２０の場合の重複であるリードの百分率５４、および正常ＷＧＳ２２の場合の重複であるリードの百分率５６などの、適切な計量によって定量化する。正常試料の百分率５６に基づき（ここでは、それぞれ別個に配列決定された複数の正常組織試料があると仮定して）、正常細胞の閾値が見出される。いくつかの実施形態では、正常細胞について、１０〜１５％の重複リードの閾値が予想されるが、測定された重複値５６に基づくもっと高い値、またはもっと低い値が企図される。動作５８で、百分率５４、５６の比を計算する。「正常」百分率５６を上回る（例えば、原理的に重複挿入を含む発癌に対応する２０％を超える）カットオフ、または下回る（例えば、原理的に欠失を含む発癌に対応する１０％未満の）カットオフがあれば、癌と関連している可能性がある。次に分類子３２１で、動作５８で計算された比が、ここでは前述のカットオフ値で示される規定癌基準を満たすかどうかを判定する。
【００４０】
図２を参照して説明したＷＧＳ比較測定基準計算動作３０１は、事前にゲノムの整列を必要としない、癌の高速インシリコ・スクリーニング試験としての役割を果たすことができる。重複リード検出を効果的に実施する１つの方法は、ブルーム・フィルタを使用することによるものである。ブルーム・フィルタは、０に初期化されるビット列と、配列決定リードを列のビットの１つにマッピングする１組のハッシュ関数とを含む。リードをブルーム・フィルタに加えるために、リードは、すべてのハッシュ関数によってハッシュされ、出力ビットが設定される。所与のリードがブルーム・フィルタにすでに加えられているかを検査するために（つまり、問い合わせを実施するために）、各出力ビットが１または０であるかを見るために検査されること以外は同じ処理を使用し、いずれかの検査されたビットが０に設定されていれば、そのリードが（まだ）ブルーム・フィルタに加えられていないことが分かり、このリードをフィルタに加える加算操作を検査の後に適切に続ける。「Ｂｌｏｏｍ  Ｆｉｌｔｅｒ」、ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｂｌｏｏｍ＿ｆｉｌｔｅｒ（最終アクセス２０１１年９月２３日）を参照されたい。
【００４１】
ブルーム・フィルタの特性は、リードがブルーム・フィルタ内に実際にはある場合に無しとフィルタが誤って表示することが決してないことであるが、ブルーム・フィルタは、リードがフィルタ内にない場合に有りと表示する可能性はある（同Ｗｅｂサイト）。これが起こることは、他の加算操作が、問い合わせのリードを加えることによって設定されたビットのすべてを設定しており、そのため、問い合わせのリードが実際にはブルーム・フィルタに加えられていなくても、その問い合わせがすべての１を返す場合にありうる。しかし、このようなエラーは、重複リードの数を１つだけ大きく見積もりすぎることになるだけであるので、この応用例では特に重要ではない（というのは、リードが検査される初回にリードは、重複ではないときに重複として現われるが、その後は、そのリード検査のどの繰返しも実際に重複であると共に、そのように正しく認識されるからである）。さらに、ブルーム・フィルタは、必要な精度および報告に要する時間が得られるように、列内のビットの数およびハッシュ関数の数を調整することによって微調整することもできる。
【００４２】
図２のＷＧＳ比較測定基準３０１は、計算が高速であるが、ＷＧＳ２０、２２からの多くの情報を使用しない。
【００４３】
図３を参照して、入手可能な情報をより多く使用する、ＷＧＳ比較測定基準計算動作３０の第２の実施形態３０２、および分類子動作３２の第２の実施形態３２２について説明する。疑わしいＷＧＳから重複リードを除去するために、動作５０を図２の実施形態と同様に実行する。正常ＷＧＳ側では、動作６０でリードをブルーム・フィルタに入力して、正常ＷＧＳ２２のリードを表すブルーム・フィルタ６２を作り出す。すでに記したように、これには、正常ＷＧＳからすべての重複を除去する効果がある。動作６４で、リードが正常ＷＧＳ２２の一部であるかどうかを判定するために、疑わしいＷＧＳの各リードをブルーム・フィルタ６２に問い合わせる。ユニークなリード、つまり疑わしいＷＧＳ２０にユニークであり、正常ＷＧＳ２２には含まれないリードを、疑わしいＷＧＳにユニークであるリードの組６６として蓄積する。
【００４４】
動作６４を実行する際、リードがブルーム・フィルタ内に実際にはある場合に無しと誤って表示することが決してないブルーム・フィルタの特性により、ユニークなリードの組６６が、正常ＷＧＳの一部であるリードを全く含まないことが保証される。しかし、ブルーム・フィルタ６２は、リードがフィルタ内にない場合に有りと誤って表示しうるので、２、３個のユニークなリードが誤って動作６４で選別されて除かれる可能性がある。したがって、リード６６はすべて、疑わしいＷＧＳ２０にユニークであることは保証されるが、いくつかのユニークなリードが失われている可能性がある。
【００４５】
ユニークなリードの組６６は、ＷＧＳ比較測定基準として取り扱うことができ、あるいはＷＧＳ比較測定基準を組６６から導出することができる。図３の説明的な実施形態では、ＷＧＳ比較測定基準を組６６から、分類子３２２への入力としての役割を果たすユニークなリードの量として導出する（好ましくは、ユニークなリードの量は、疑わしいＷＧＳ２０内のリードの総数によって、または動作５０によって重複を除去した後の疑わしいＷＧＳ２０内のリードの総数によって正規化される）。別の適切なＷＧＳ比較測定基準は、疑わしいＷＧＳ２０にユニークであるリード６６の合計整列長さと、疑わしいＷＧＳ２０の（任意選択で、動作５０により重複を除去した後の）合計ゲノム長さとの比である。このＷＧＳ比較測定基準は、癌ゲノム内で受けた総変化の有効な尺度であり（疑わしい組織が確かに癌であると仮定して）、分類子３２２によってユニークなリード量の代わりに適用することができる。
【００４６】
あるいは、代替決定動作３２２２として図３にも示されているように、ユニークなリード６６は整列させ、既知の癌変異体と比較することもできる。この手法では、正常なＷＧＳ２２のユニークなリード（重複が除去されている）をブルーム・フィルタ６２の中に集める。複数の正常な組織試料がある場合、これらをブルーム・フィルタ６２の中にプールすることが、すべての試料からのすべての正常なＷＧＳリードを動作６０によりブルーム・フィルタ６２の中に入力することによって可能である。したがって、ブルーム・フィルタ６２は、リードの「正常な組」になる。この「正常な組」を、疑わしいＷＧＳ２０のユニークなリードとして得られた（動作５０により）リードの「癌の組」と比較する。ここでもやはり、複数の疑わしい組織試料が配列決定された場合、これら複数の試料からのリードをプールすることができる。（ここではブルーム・フィルタは、ブルーム・フィルタからリードを呼び戻す方法がなく、所与のリードがブルーム・フィルタ内にあるかどうかを問い合わせることしか可能ではないので、適切ではない。）「正常な組」内にも生じる「癌の組」のリード（つまり、もし供給されれば複数の疑わしい組織試料からのリードをプールすることが一緒の動作５０の出力）は破棄される（この場合もやはり、これは動作６４で、ブルーム・フィルタ６２に対して問い合わせることによって実施される）。残っているユニークなリード６６は、特に癌と関連づけられた変異体を含むという点で、「原因となる組」であると予想される。代替分類子３２２２では、これらのユニークなリード６６を新規に整列させて、一塩基多型（ＳＮＰ）、インデル（挿入または欠失）、または他の遺伝子変異体を特定し、特定された変異体を文献で知られている癌相関性変異体と比較する。この実施形態では、ゲノムのバルクが、証拠となる変異体を得るために整列および探索されないので、ＷＧＳ比較測定基準（この実施形態では、実際のユニークなリードの組６６）を使用することによりかなり高速の処理が可能になる。代わりに、標準参照配列の一部ではなく、かつ調査を受けている特定の患者６の正常ゲノムの変異体ではないリード６６だけを整列させ探索する。
【００４７】
図３の手法では、整列は、ユニークなリードの組６６についてのみ実施する。しかし、疑わしいＷＧＳ２０および正常なＷＧＳ２２の整列を実施した場合でも、疑わしいＷＧＳ２０にユニークである変異体の組を含むＷＧＳ比較測定基準、またはこの組から計算されたＷＧＳ比較測定基準を使用することによって、かなりの効率ゲインを実現することができる。
【００４８】
図４を参照すると、動作７０で、疑わしいＷＧＳ２０を標準参照配列と整列させて、整列された疑わしいＷＧＳ７２を変異体（標準参照ゲノムに対する）に印付きで生成する。同様に、動作７４で、正常ＷＧＳ２２を標準参照配列と整列させて、整列された正常ＷＧＳ７６を変異体に印付きで生成する。整列７０は、好ましくは「緩い」整列であり、つまり、疑わしい組織試料１０が実際に癌試料である場合に存在することが予想される新規の変異体をエラーとして拒否しないように、厳しさを減じて行われる整列である。動作７８で、整列された疑わしいＷＧＳ７２の変異体を整列された正常ＷＧＳ７６の変異体と突き合わせて選別して、疑わしいＷＧＳ２０にユニークである変異体の組を特定する。ＷＧＳ比較測定基準は、このユニークな変異体の組を含むか、またはこの組に基づいて計算される。
【００４９】
１つの手法では、ＷＧＳ比較測定基準は、疑わしいＷＧＳだけに見出されたユニークな変異体の量（この場合もやはり、整列された疑わしいＷＧＳ７２内の変異体の総数によって、または他の正規化係数によって、任意選択で正規化されている）を含む。図示の例では、このＷＧＳ比較測定基準は、分類子３２３への入力としての役割を果たし、分類子３２３では、疑わしいＷＧＳだけに見出されたユニークな変異体の量を適切な癌基準と突き合わせて比較する。通常、疑わしいＷＧＳ２０内のユニークな変異体の数が大きければ大きいほど癌が示唆される傾向があり、したがって、分類子３２３で使用される癌基準は、それを超えると疑わしい組織試料２０が癌と標識される閾値であることが適切である。
【００５０】
図４に代替分類子３２３３としても示されている別の手法では、疑わしいＷＧＳ２０だけに見出されたユニークな変異体を、文献に基づいて評価される影響レベルに従ってランク付けする。例えば、癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の、またはその付近の異常は、テロメア長を増大させるので、強い影響を与えると評価される。トリアレリックおよびテトラアレリック単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）を適切に表にして、局部的な複数の腫瘍細胞集団を示唆するパターンを特定する。
【００５１】
図５を参照すると、ＷＧＳ比較測定基準計算動作３０の第４の実施形態３０４が示されている。この実施形態では、再び整列動作７０、７４を使用して、整列された疑わしいＷＧＳ７２および正常ＷＧＳ７６を生成する。この実施形態では、整列動作７０、７４で生成された整列統計量を動作８０でＷＧＳ比較測定基準に公式化する。様々な整列統計量により、癌ＷＧＳが正常ＷＧＳに対して効果的に差別化されると予想される。本発明者らは、正常ＷＧＳと比較して癌ＷＧＳでは、表１の４つの特徴が一般に著しく異なることを観察した。これらの細胞型を区別するのに効果的であると企図される他のパラメータには、破損対末端、見当たらない対、対配向などが含まれる。
【００５２】
図４および図５を引き続き、図１に戻ってさらに共に参照すると、変異体（標準参照ゲノムに対する）に印が付けられている整列された疑わしいＷＧＳ７２が、図１に示された動作４０の出力に対応することが注目に値する。したがって、変異体による解析４０、４２、４４、４６が、癌３６の結果を出力する試験３０、３２を条件として実施される場合には、動作４０を省略することができ、整列された疑わしいＷＧＳ７２を動作４２に直接入力することができる。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
ＷＧＳデータに基づく本開示の癌試験では、癌に起因する、ありそうな遺伝子変化について大量のＷＧＳを事前選別するための高速評価を実現し、それによって、計算的および時間的に大規模な解析パイプラインの指針が得られる。本開示の癌試験はまた、癌の進行を定量化するのに有用であると期待される。本開示の癌試験実施形態では、全ＷＧＳの規模で癌により受けた遺伝子損傷を効果的に測定する。これらの結果は、詳細な特異的な変異体による遺伝子解析を待たなくても迅速に取得可能である。本開示の癌試験は、通常のゲノム解析とは異なっている、また限定された計算的基盤を使用する、癌の規定された解析パイプラインを選択するのに使用することができる。ＷＧＳ比較測定基準は、癌の脱分化／悪性度のレベルの適切な尺度であり、したがって予測値になる。
【００５５】
いくつかの実際的な癌診断応用例では、疑わしい組織試料１０および正常組織試料１２が同じカバー度まで配列決定され、その生の配列決定リードを使用して癌ゲノムのランダム性が測定される。正常細胞のベースライン（すなわち正常）ＷＧＳ２２は、患者６から、例えば白血球細胞（ＷＢＣ）、口腔からの細胞などでよい正常組織試料１２についての全ゲノム配列決定を行うことによって用意される。疑わしいＷＧＳ２０は、癌細胞配列決定により得られる。生のリードは直接比較され、ＷＧＳ差異測定基準が得られる。
【００５６】
癌進行の検出では、疑わしい組織試料１０が癌組織および境界の別々の領域から集められ、また疾病の結節性進行の場合では、（可能な場合に）関与するリンパ節（１つまたは複数）からも集められる。疑わしい組織試料１０はまた、（実行可能および適用可能である場合に）転移性病巣から集められてもよい。正常組織試料１２は、小さい細胞肺癌腫の場合には正常肺組織などの適切な正常組織から集められ、あるいは基底細胞癌腫／皮膚扁平細胞癌腫の場合には皮膚生検から集められる。正常組織試料１２は、コントロールまたはベースラインとしての役割を果たす。
【００５７】
本明細書で開示の癌細胞特定手法の別の応用例は、腫瘍描写に関する。外科的腫瘍除去、ガンマ・ナイフ手術、または放射線治療の計画過程の一部として、腫瘍は正確に描写されなければならない。しかし、癌細胞は、正常な体細胞と密接な関係があり、したがって正常な体細胞と区別することは困難なことがあるので、このような描写は困難なことになりうる。コンピュータ断層撮影（ＣＴ）または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）などの画像化技法では、腫瘍と周辺の健康な組織との間の明快な描写ができないことがあり、また画像化された境界が、（画像中ではよく画定されていても）微小浸潤などにより癌細胞の物理的な分布と正確に一致しないことがある。病理組織診断を使用することもできる。ここでは、疑わしい組織が抽出され、癌細胞を差別化し特定するために、証拠となる染色と場合によっては併せて、顕微鏡で調べられる。病理組織診断は、形態的に異なる特性を有する、かつ／または適切な染色条件のもとで特定可能に色付く癌細胞に依拠する。残念ながら、これはいつでも当てはまるわけではない。正常細胞との差別が微妙である場合、正確な病理組織学的評価は人間の技師の能力に依拠し、したがってヒューマン・エラーが生じやすい。実際、場合によっては癌細胞が形態的に正常細胞と全く同じであることがあり、それによって病理組織診断は効果的でなくなる。
【００５８】
本開示の癌細胞特定技法によって実現される迅速なスループットにより、これらの技法を腫瘍境界描写に使用することが容易になる。
【００５９】
図６を参照すると、組織試料が患者６から、腫瘍１００の中および付近の部位で、画像誘導試料採集を用いて集められる。この画像誘導試料採集では、生検針などの介入機器１０２により組織試料１０４を画像化システム１０６（そのスキャナ空洞の一部が図示されている）の誘導を受けて取得する。ゲノムＤＮＡ／ｍＲＮＡの配列決定には、介入機器１０２は吸引針であることが適切である（吸引針は、特定の種類の病理組織診断には不十分なこともある）。試料採取では、細針吸引生検（アクセス可能な腫瘍の場合）、神経索腫瘍での定位生検などの適切な任意の取得技法を使用することができる。画像化システム１０６は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）または磁気共鳴（ＭＲ）など、腫瘍１００および隣接する器官または他の重要な構造物（図６には示されていない）などの顕著な特徴を画像化できる任意のモダリティとすることができる。いくつかの実施形態では、画像化システム１０６は、Ｂｒｉｌｌｉａｎｃｅ（登録商標）Ｂｉｇ  Ｂｏｒｅ（登録商標）ＣＴ（Ｋｏｎｉｎｋｌｉｊｋｅ  Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｎ．Ｖ．、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、オランダ、から市販されている）であり、介入試料取得手順を実施しやすくする大きい空洞直径を有する。本明細書で開示の癌細胞特定技法を使用するために、少なくとも１つの正常組織試料１０８もまた患者６から取得される。いくつかの実施形態では、正常組織試料１０８は、口腔試料の場合の口腔スワブなど、介入機器１０２以外の機構によって取得されてよい。説明の目的で、癌組織を含む試料１０４は中が黒い丸として示され、正常組織を含む試料１０４、１０８は中が白い丸で示されている。（もちろん、このように示すことは、参照正常試料１０８の場合を除き、癌細胞試験で決定されるべきことである。）図６にはまた、腫瘍１００の実際の境界１１０も示されており、境界１１０は、正常な組織と癌組織を分離している。（この場合もやはり、境界１１０は、取得された組織試料１０４についての癌細胞試験で決定されるべきである。）
【００６０】
組織試料が採集された後、これらは、各試料１０４を癌組織または正常組織として分類するために、図１〜５を参照して本明細書で開示されたように処理される（各試料１０４は疑わしい組織試料１０に対応し、これら組織試料１０４は個別に処理され、１つまたは複数の組織試料１０８は正常組織試料１２として使用される）。これらの分類と、組織試料１０４が取得された試料位置とに基づいて（これらの位置は、組織試料取得時に、例えば画像化システム１０６から提供される空間座標を用いて記録される）、腫瘍１００の範囲が空間的にマッピングされ、癌組織と正常組織の間の境界１１０が確定される。ＷＧＳを生成する際、いくつかの実施形態では、エクソーム捕獲などの適切な技法を使用して、（ＤＮＡ配列決定の代わりに、またはそれに加えて）ＲＮＡゲノム配列決定が生じる。
【００６１】
１つの手法では、組織試料１０４は、図６に示されたような画像化によって表示された境界の中心から外側への径方向の外向きに、腫瘍の別々の深さから採集される。多次元（例えば、２次元または３次元）マッピングを得るために、この採集は、直交する直径の１つまたは複数の対に沿って適宜に繰り返される（図６にはこのような多次元性は表示されていない）。これらの試料からのＤＮＡおよび／またはＲＮＡが抽出され配列決定されて、試料１０４ごとに疑わしいＷＧＳが生成される。
【００６２】
いくつかの実施形態では、一塩基多型（ＳＮＰ）、インデル、構造変異体（ＳＶ）、コピー数変異体（ＣＮＶ）などの遺伝子変異体が従来の遺伝子解析を用いて抽出され、発現パターンが抽出されると共に、腫瘍１００に対応する癌の種類と関連があると報告されているシグネチャのデータベースと突き合わせて比較される。切除境界１１０は、正常配列パターンが観察される複数の点にまたがって引かれる。
【００６３】
しかし、癌の種類を特定することは、腫瘍１００の性質が一般に、放射線治療、ガンマ・ナイフ手術、外科的腫瘍除去などを計画する前に知られているので、一般には必要ない。したがって、本開示の手法は、例えば図１の動作３０、３２を参照して本明細書で説明したように、適宜に使用されるが、従来の変異体解析よりもかなり速いという利点を有する。
【００６４】
１つの異型の手法では、組織試料１０４が、図６を参照して説明したように採集され、放射状線（腫瘍１００の中心から外側に向かう）に沿って径方向に隣接する試料の対ごとに２つのＷＧＳが互いに比較されて、外側試料の一致しないリードが特定される。これら外側試料の一致しないリードが選択されて、参照配列と突き合わせて整列される。この整列は、外向きに進むことにより外側の対の試料が正常組織の試料になる箇所に達するまで不十分と予想され、その箇所において整列は良好になるはずである（例えば、停止閾値を超える整列百分率として定量化される）。
【００６５】
別の異型の手法では、試料採集は図６を参照して説明したものと同様である。しかし、直接ＤＮＡ配列決定ではなく、ＲＮＡ  ＷＧＳを生成するためのエクソーム捕獲配列決定が行われる。正常試料のトランスクリプトームは癌試料と異なることが予想され、それによって境界１１０の検出が可能になる。
【００６６】
別の異型の手法では、試料採集は図６に示されたものと同様であり、画像化システム１０６を使用する画像誘導を用いる。この異型の手法では、トランスクリプトームのほぼリアル・タイムの配列決定がナノポア配列決定などの配列決定法によって行われる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ／、最終アクセス２０１１年１０月２７日、を参照されたい。トランスクリプトーム解析は、任意選択で、発現シグネチャのデータベースを参照して検証される。
【００６７】
別の異型の手法では、画像誘導組織試料採集が、腫瘍の既知の（平均）微小浸潤の長さの範囲内、およびそれを越えた明らかに正常組織内の画像化によって表示された腫瘍１００の境界周辺で、図６を参照して説明したように行われる。高速ＷＧＳ解析が、図１〜５を参照して説明した技法の１つによって、境界１１０の外側で特定された第１の正常試料を含むすべての試料１０４について行われる。次に、より詳細な、または完全な配列決定（すなわち、「深い配列決定」）が、境界１１０の外側で特定された第１の正常試料について行われて、それが確かに正常組織であることが確認される。この深い配列決定により、悪性組織からの何らかの無視できない寄与が依然としてあることが示された場合には、この試料は切除可能領域に含められる（すなわち境界１１０は、この試料を包含するように外側に拡大される）。後者の場合、処理は任意選択で、高速ＷＧＳ解析を使用して試験の結果が正常であった隣の外側試料について繰り返される。すなわち、この隣の外側試料は、深い配列決定を使用して検査される。
【００６８】
別の異型の手法では、別々の組織試料１０４からの各配列決定リードが互いに差し引かれる。正常組織内の変化の百分率が決定される（例えば、正常組織試料１０８を使用して）。正常組織では、約１．５〜２．５％の変化が一般に予想される。癌組織試料は、正常組織よりも大きい変化を示すと予想され、それによって境界１１０を検出することが可能になる。例えば、いくつかの実施形態では、２つの組織試料間のリード類似性が９７．５％未満である場合、これを細胞型の差異と考えることができ、したがって境界１１０を画定することができる。
【００６９】
本発明を好ましい諸実施形態に関して説明してきた。明らかに、前述の詳細な説明を読み理解することによって、修正形態および代替形態が他の人に想起されよう。本発明は、このような修正形態および代替形態を、これらが添付の特許請求の範囲またはその同等物の範囲内に入る限り含むと解釈されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年6月10日(2014.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疑わしい組織を癌組織として明らかにする方法であって、
対象の、癌組織を含む疑いがある部位または領域から取得された疑わしい組織試料を、遺伝子配列決定装置を使用して処理し、疑わしい全ゲノム配列を生成するステップと、
前記対象の、癌組織を含む疑いがない部位または領域から取得された正常組織試料を、前記遺伝子配列決定装置を使用して処理し、正常全ゲノム配列を生成するステップと、
プロセッサを使用して、前記疑わしい全ゲノム配列を前記正常全ゲノム配列と比較することによって、全ゲノム配列比較測定基準を計算するステップと、
前記プロセッサを使用して、前記疑わしい組織試料が癌組織を含む確率を、前記計算された全ゲノム配列比較測定基準における変異体の閾値に基づいて決定するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記明らかにするステップが、前記組織試料がいかなる特定の種類の癌組織も含むかどうかを明らかにすることを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記明らかにするステップが、前記疑わしい全ゲノム配列内のいかなる特異的な遺伝子変異体も明らかにすることを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記明らかにするステップが、
前記計算された全ゲノム配列比較測定基準に基づいて、前記組織試料を癌組織または正常組織として標識するステップ
を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記計算するステップが、
前記疑わしい全ゲノム配列内の重複リードの測定基準を計算するステップと、
前記正常全ゲノム配列内の重複リードの測定基準を計算するステップと、
前記疑わしい全ゲノム配列内の重複リードの測定基準、および前記正常全ゲノム配列内の重複リードの測定基準に基づいて、前記全ゲノム配列比較測定基準を計算するステップと、
を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記計算するステップが、
（ｉ）前記疑わしい全ゲノム配列に含まれ、かつ（ｉｉ）前記正常全ゲノム配列には含まれない、疑わしいゲノムに特異的なリードの組を決定するステップ
を含み、
前記全ゲノム配列比較測定基準が、前記疑わしいゲノムに特異的なリードの組（６６）を含む、またはこのリードの組に基づいて計算される、
請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記計算するステップが、
前記疑わしい全ゲノム配列を参照配列と整列させるステップによって、疑わしいゲノム変異体の組を明らかにするステップと、
前記正常全ゲノム配列を前記参照配列と整列させるステップによって、正常ゲノム変異体の組を明らかにするステップと、
ｉ）前記疑わしいゲノム変異体の組に含まれ、かつ（ｉｉ）前記正常ゲノム変異体の組には含まれない変異体の組を明らかにするステップと
を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記計算するステップが、
前記疑わしい全ゲノム配列を参照配列と整列させるステップと、
前記正常全ゲノム配列を前記参照配列と整列させるステップと、
前記疑わしい全ゲノム配列を整列させるための整列統計量と前記全ゲノム配列を整列させるための整列統計量との比較に基づいて、全ゲノム配列比較測定基準を計算するステップと
を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法を実施するための電子データ処理デバイスによって実行可能な命令を記憶する持続性記憶媒体。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成された電子データ処理デバイス
を備える装置。
【請求項１１】
前記対象から腫瘍の中または付近の複数の試料採取位置で組織試料を取得するステップと、
前記試料採取位置を記録するステップと、
組織試料ごとに、前記処理するステップ、計算するステップ、および明らかにするステップを実施するステップと、
前記明らかにするステップおよび前記記録された試料採取位置に基づいて、前記腫瘍の境界を描写するステップと、
をさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
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2015506024.tif 000011
2015506024.tif 000012
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