(57)【要約】  インフリキシマブに対する親和性ペプチドを開示する。より具体的には、親和性ペプチドが生体適合性生分解性ポリマーに共有結合している親和性バイオマトリックスを開示する。上記親和性バイオマトリックスは、インフリキシマブ用の制御放出デバイスの調製において有用である。
2015518834.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及びこれらの断片からなる群より選択されるペプチド配列を有する、インフリキシマブに対する親和性ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチド配列が、配列番号２又は配列番号１０である、請求項１に記載のインフリキシマブに対する親和性ペプチド。
【請求項３】
ポリマー及びインフリキシマブに対する親和性ペプチドを更に含む親和性バイオマトリックスと、インフリキシマブとを含む、制御放出デバイス。
【請求項４】
前記親和性ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及びこれらの断片からなる群より選択されるペプチド配列を有する、請求項３に記載の制御放出デバイス。
【請求項５】
前記ポリマーが、天然ポリマーである、請求項３に記載の制御放出デバイス。
【請求項６】
前記天然ポリマーが、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、シルク、多糖類、ＧＡＧ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の制御放出デバイス。
【請求項７】
前記多糖類が、デンプン、ペクチン、セルロース、アルキルセルロース、アルキルヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロース硫酸、カルボキシメチルセルロースの塩類、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キチン、カルボキシメチルキチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩類、アルジネート、架橋アルジネート／アルギン酸、アルギン酸プロピレングリコール、グリコーゲン、デキストラン、デキストラン硫酸、カードラン、ペクチン、プルラン、キサンタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、キトサン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ポリ−Ｎ−グルコサミン、ポリマンヌロン酸、ポリグルクロン酸、及びポリグルクロン酸からなる群より選択される、請求項６に記載の制御放出デバイス。
【請求項８】
前記天然ポリマーが、コラーゲンである、請求項５に記載の制御放出デバイス。
【請求項９】
前記天然ポリマーが、皮膚、骨膜、軟骨膜、滑膜、筋膜、腸間膜、骨及び腱からなる群から選択される脱細胞化組織である、請求項５に記載の制御放出デバイス。
【請求項１０】
前記コラーゲンが、スポンジ、粒子、注射可能なゲル、注射可能な液体、膜、フィルム、繊維及び繊維系スカフォールドの形態である、請求項８に記載の制御放出デバイス。
【請求項１１】
ポリマー及びインフリキシマブに対する親和性ペプチドを更に含む親和性バイオマトリックスと、インフリキシマブとを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフリキシマブに対する特異的親和性ペプチドに関する。更に、本発明は、インフリキシマブの制御放出デバイスにおけるこれら親和性ペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフリキシマブは、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）を認識し、結合し、作用をブロックするタンパク質の１種である、キメラＩｇＧ１κモノクローナル抗体である。インフリキシマブは、現在、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．（Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ）から商品名ＲＥＭＩＣＡＤＥとして販売されている。インフリキシマブは、尋常性乾癬、リウマチ様関節炎、乾癬性関節炎、成人クローン病、小児クローン病、潰瘍性大腸炎、及び強直性脊椎炎等の炎症性疾患の治療に用いられている。現在、インフリキシマブは、静注によって投与されており、その半減期は、約８週間である。まず、患者は、０、２、及び６週間目に３回注射（５ｍｇ／ｋｇ）を受ける。続いて、８週間毎に患者に投与する（５ｍｇ／ｋｇ）。頻繁に投与が行われ、患者が診療所を訪れるため、インフリキシマブに関するコストは高い。
【０００３】
したがって、頻繁に投与したり、患者が医師を訪れたりしなくてもよく、且つコスト効率のよい治療を提供する、インフリキシマブ用の制御放出デバイスが必要とされている。制御放出デバイスを作製するための標準的な方法としては、典型的には、活性剤を封入するのに使用されるミクロスフィア、ロッド、シート又はペレットの形態のポリマーマトリックスの使用が挙げられる。活性剤をポリマーマトリックスに組み込むことができる様々な技術が既知である。例としては、溶媒蒸発、スプレー乾燥、乳化、溶融ブレンド、及び別個のサイズ又は形状の粒子の単純な物理的混合が挙げられる。これら分子の繊細な性質に起因して、これらアプローチはいずれもペプチド又はタンパク質をポリマーに組み込むのに適用することができない。ペプチド及びタンパク質は、溶媒により、乳化により、熱により、特に最終滅菌により、変性しやすい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、インフリキシマブ用の制御放出デバイスを製造する方法であって、タンパク質を変性させない又はタンパク質の活性を不活化しない方法が必要とされている。また、タンパク質を局所的に持続放出し、頻繁に投与したり患者が医師を訪れたりする必要をなくし、且つコスト効率のよい治療を提供するインフリキシマブ用の制御放出デバイスが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書には、インフリキシマブに対する特異的親和性ペプチドを記載する。インフリキシマブに対して特異的な親和性を有するこれら親和性ペプチドは、親和性バイオマトリックスの調製において有用である。親和性バイオマトリックス及びインフリキシマブから調製されるインフリキシマブ用の制御放出デバイスについても記載する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】直鎖状のジスルフィド結合しているペプチドを含有するインフリキシマブ親和性ペプチドのアミノ酸配列。
【図２Ａ】親和性バイオマトリックス及びインフリキシマブを含む制御放出デバイスの図表現。
【図２Ｂ】親和性バイオマトリックス及びインフリキシマブを含む制御放出デバイスの表面の図表現。
【図３】ファージの選別から得られたファージディスプレイされたペプチドが、インフリキシマブに結合することを確認する、インフリキシマブファージＥＬＩＳＡアッセイ。
【図４Ａ】ｍＡｂ競合者に対する交差反応性ファージＥＬＩＳＡアッセイ。
【図４Ｂ】ヒトｌｇＧに対する交差反応性ファージＥＬＩＳＡアッセイ。
【図４Ｃ】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する交差反応性ファージＥＬＩＳＡアッセイ。
【図４Ｄ】コラーゲンに対する交差反応性ファージＥＬＩＳＡアッセイ。
【図５】ＥＬＩＳＡを用いて決定される、親和性ペプチドのインフリキシマブに対する濃度依存性結合。
【図６Ａ】クリックケミストリーを用いたアジド修飾コラーゲンマトリックスに対する、それぞれ、配列番号２及び配列番号１０のコンジュゲーションのために用いられるアルキンペプチドのアミノ酸配列（配列番号２４及び配列番号２５）。
【図６Ｂ】シッフ塩基ケミストリーを用いたアルデヒド官能化ヒアルロン酸マトリックスに対する、それぞれ、配列番号２及び配列番号１０のコンジュゲーションのために用いられるリジン終端ペプチドのアミノ酸配列（配列番号２６及び配列番号２７）。
【図７】インフリキシマブの存在下で２４時間インキュベートした後のマウスＷＥＨＩ細胞の生存率の評価による、インフリキシマブＴＮＦ−アルファ結合に対する親和性ペプチドの機能的干渉。
【図８Ａ】３４日間にわたるコラーゲンバイオマトリックス及びコラーゲン親和性バイオマトリックスディスクから放出されるインフリキシマブの量を示す、２％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で行われるインビトロ放出試験。（初期ローディング濃度＝２００マイクログラム）
【図８Ｂ】３４日間にわたるコラーゲンバイオマトリックス及びコラーゲン親和性バイオマトリックスディスクから放出されるインフリキシマブの量を示す、２％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で行われる、インビトロ放出試験。（初期ローディング濃度＝５０マイクログラム）
【図９】インフリキシマブに結合する配列番号１８の直鎖状断片を示す突然変異体ファージＥＬＩＳＡ。
【図１０】インフリキシマブに結合する配列番号１８の直鎖状断片のアミノ酸配列。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
インフリキシマブに対する親和性ペプチドを本明細書に記載する。１つの実施形態では、インフリキシマブは、ＴＮＦ−アルファ受容体の結合をブロックする抗炎症性キメラＩｇＧ１κモノクローナル抗体である。インフリキシマブに対する親和性ペプチドは、該ペプチドがインフリキシマブに対して特異的な結合親和性を有していることを示す。該ペプチドは、直鎖状であってもよく、ジスルフィド結合していてもよい。１つの実施形態では、インフリキシマブに対する親和性ペプチドは、図１に示す親和性ペプチドのうちのいずれか１つである。別の実施形態では、親和性ペプチドは、図１に示す親和性ペプチドのうちのいずれか１つの断片であり得る。親和性ペプチドは、インフリキシマブに対して特異的親和性を有するが、親和性ペプチドは、ＴＮＦ−アルファのインフリキシマブに対する結合には干渉しない。これら親和性ペプチドは、インフリキシマブ用の制御放出デバイスの調製において有用である。
【０００８】
図１に示すインフリキシマブに対する親和性ペプチドは、米国特許第６４７２１４７号に記載のｐｌＸファージディスプレイ技術を用いて同定された。高複雑度（ライブラリー当たり１０９個のペプチド配列）を有するプライマリーペプチドファージライブラリーを使用して、インフリキシマブに対する親和性ペプチドを選別した。より具体的には、ビオチン化インフリキシマブを、ストレプトアビジンでコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上に固定化し、ｐｌＸマイナーコートタンパク質上にペプチド配列をディスプレイするファージを導入した。インフリキシマブに結合しなかったファージを洗い流し、インフリキシマブに結合したファージを単離し、増幅した。インフリキシマブに結合している単離ファージを、合計３ラウンドの上記手順に従う選別の第２ラウンドのインプットとして使用した。第３ラウンドの終わりに、インフリキシマブに対する結合に関与するペプチドを決定するために、インフリキシマブに結合しているファージの配列を決定した。インフリキシマブに対して親和性を有するペプチドを図１に列挙する。
【０００９】
インフリキシマブに対する親和性ペプチドは、親和性バイオマトリックスの調製において有用である。親和性バイオマトリックスは、上記のように、少なくとも１つのインフリキシマブに対する親和性ペプチドを生体適合性生分解性ポリマーに共有結合させることにより調製される。親和性バイオマトリックスは、インフリキシマブに対する親和性ペプチドが、ポリマーのバルク中、ポリマーの表面上、又はポリマーのバルク中及びポリマーの表面上の両方に存在するように調製してよい。更に、親和性バイオマトリックスは、インフリキシマブ用の制御放出デバイスとして有用である。制御放出デバイスの代表的な実施形態を図２Ａ及び図２Ｂに図で示す。インフリキシマブ用の制御放出デバイスは、親和性バイオマトリックスとインフリキシマブとを含む。
【００１０】
親和性バイオマトリックスを調製するために使用される生体適合性生分解性ポリマーは、天然ポリマー、合成ポリマー及びこれらの組み合わせであり得る。生分解性ポリマーは、湿った体内組織に曝されると、容易に分解して小さなセグメントになる。セグメントは、次いで、体内に吸収されるか、又は体内を通過する。より具体的には、生分解されたセグメントは、永続的に追跡されないように又はセグメントの残留物が体内に保持されないように、体内に吸収されるか又は体内を通過するので、永続的な慢性の異物反応を誘発しない。
【００１１】
好適な天然ポリマーとしては、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、シルク、グルコサミノグリカン（ＧＡＧ）、トロンビン、フィブロネクチン、ゼラチン、フィブリン、トロポエラスチン、ポリペプチド、ラミニン、プロテオグリカン、フィブリン糊、フィブリン血餅、多血小板血漿（ＰＲＰ）血餅、乏血小板血漿（ＰＰＰ）血餅、自己組織化ペプチドハイドロゲル及びアテロコラーゲン等のタンパク質；デンプン、ペクチン、セルロース、アルキルセルロース（例えば、メチルセルロース）、アルキルヒドロキシアルキルセルロース（例えば、エチルヒドロキシエチルセルロース）、ヒドロキシアルキルセルロース（例えば、ヒドロキシエチルセルロース）、硫酸セルロース、カルボキシメチルセルロースの塩類、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キチン、カルボキシメチルキチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩類、アルジネート、架橋アルジネートアルギン酸、アルギン酸プロピレングリコール、グリコーゲン、デキストラン、硫酸デキストラン、カードラン、ペクチン、プルラン、キサンタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、キトサン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ポリ−Ｎ−グルコサミン、ポリマンヌロン酸、ポリグルクロン酸、ポリグルクロン酸及び誘導体等の多糖類；リボ核酸、デオキシリボ核酸等のポリヌクレオチド；並びにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
１つの実施形態では、天然ポリマーは、コラーゲンである。更に別の実施形態では、天然ポリマーは、脱細胞化組織から得ることができる。脱細胞化組織は、自己移植組織、同種組織又は異種組織から得ることができる。好適な脱細胞化組織としては、皮膚、網、骨膜、軟骨膜、滑膜、筋膜、腸間膜、骨、腱等が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、天然ポリマーは、多糖類である。更に別の実施形態では、多糖類は、ヒアルロン酸である。
【００１３】
好適な合成ポリマーの例としては、脂肪族ポリエステル、ポリ（アミノ酸）、コポリ（エーテル−エステル）、ポリアルキレンオキサレート、ポリアミド、ポリ（イミノカーボネート）、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミン基含有ポリオキサエステル、ポリ（無水物）、ポリホスファゼン、これらの生体分子及びブレンドが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の適用上、脂肪族ポリエステルとしては、ラクチド（乳酸、ｄ−、１−及びメソラクチドを含む）、グリコリド（グリコール酸を含む）、ε−カプロラクトン、ｐ−ジオキサノン（１，４−ジオキサン−２−オン）、炭酸トリメチレン（１，３−ジオキサン−２−オン）、炭酸トリメチレンのアルキル誘導体、δ−バレロラクトン、β−ブチロラクトン、γ−ブチロラクトン、ε−デカラクトン、ヒドロキシブチラート（繰り返し単位）、ヒドロキシバレラ−ト（繰り返し単位）、１，４−ジオキセパン−２−オン（その二量体１，５，８，１２−テトラオキサシクロテトラデカン−７，１４−ジオンを含む）、１，５−ジオキセパン−２−オン、６，６−ジメチル−１，４−ジオキサン−２−オン２，５−ジケトモルホリン、ピバロラクトン、α，α−ジエチルプロピオラクトン、炭酸エチレン、シュウ酸エチレン、３−メチル−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン、３，３−ジエチル−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン、６，８−ジオキサビシクロオクタン−７−オンのホモポリマー及びコポリマー、並びにこれらのポリマーブレンドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
好適な脂肪族ポリエステルとしては、ラクチド（乳酸、Ｄ−、Ｌ−及びメソラクチドを含む）、グリコリド（グリコール酸を含む）、ε−カプロラクトン、ｐ−ジオキサノン（１，４−ジオキサン−２−オン）、炭酸トリメチレン（１，３−ジオキサン−２−オン）、炭酸トリメチレンのアルキル誘導体、δ−バレロラクトン、β−ブチロラクトン、γ−ブチロラクトン、ε−デカラクトン、ヒドロキシブチラート（繰り返し単位）、ヒドロキシバレラ−ト（繰り返し単位）、１，４−ジオキセパン−２−オン（その二量体１，５，８，１２−テトラオキサシクロテトラデカン−７，１４−ジオンを含む）、１，５−ジオキセパン−２−オン、６，６−ジメチル−１，４−ジオキサン−２−オンのホモポリマー及びコポリマー、並びにこれらのポリマーブレンドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
１つの実施形態では、生体適合性生分解性ポリマー及びインフリキシマブに対する親和性ペプチドは、好適な反応基と、該ポリマーに該親和性ペプチドを共有結合させるための対応する官能基とを有する。上記反応基及び上記官能基は、ポリマー、親和性ペプチド、及びこれらの組み合わせ上に存在し得る。好適な反応基としては、アリールアジド、カルボジイミド、ヒドラジン、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、カルボニル、マレイミド、ＮＨＳ−エステル、ＰＦＰ−エステル、チオール、ピリジルジスルフィド及び／又はスルホン酸ビニル等が挙げられるが、これらに限定されない。好適な官能基としては、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、エステル、チオール、アミン、アルケン、アルキン、アルキルハライド、ヒドラジン及び／又はアジド官能基が挙げられるが、これらに限定されない。有機化学又はポリマー化学の当業者であれば、親和性ペプチド及びポリマーを上記好適な反応基及び対応する官能基で官能化して、親和性ペプチドをポリマーに共有結合させることができるであろう。例えば、コラーゲンの場合、コラーゲンからディスプレイされるリジン残基上のアミン官能基は、単純なカルボジイミドケミストリーを用いて、親和性ペプチドのＣ末端カルボキシル基に結合することができる。あるいは、ヒアルロン酸の場合、親和性ペプチドからディスプレイされるリジン残基上のアミン官能基は、単純な酸化ケミストリーを用いて、ヒアルロン酸に結合することができる。
【００１６】
場合により、親和性ペプチドのインフリキシマブに結合する能力を向上させるために、リンカー配列を図１に示すペプチドに付加してもよい。上記リンカー配列は、（ＳＧＧ）ｎ又は（ＸＸＸ）ｎ（式中、Ｘは、セリン、グリシン、アラニン又はトレオニンのいずれかの組み合わせであり得る）であってよい。１つの実施形態では、繰り返し単位の数ｎは、約１〜約１０である。別の実施形態では、繰り返し単位の数ｎは、約３〜約５である。
【００１７】
例えば、親和性バイオマトリックスは、可溶性及び／又は繊維状Ｉ型ウシコラーゲンから調製され得る。簡潔に述べると、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの濃度を有する均質化コラーゲンの水懸濁液を、成形型に流し込み、次いで凍結乾燥させる。熱脱水工程後、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）カップリングケミストリーを用いて、親水性ペプチドをコラーゲンにコンジュゲートさせる。あるいは、熱脱水工程及びアジドによるコラーゲンの官能化後、銅触媒を用いてアルキン修飾親和性ペプチドをコラーゲンにコンジュゲートさせる。上記方法によって調製されるコラーゲン親和性バイオマトリックスは、多孔質三次元発泡体スカフォールドの形態である。
【００１８】
あるいは、親和性バイオマトリックスは、ヒアルロン酸から調製してよい。例えば、ヒアルロン酸糖環における１，２ジオールを、まず、過ヨウ素酸ナトリウムを用いてアルデヒドに酸化する。次に、コンジュゲートしてリジン残基（アミン）を提供しているインフリキシマブに対する親和性ペプチドを、ヒアルロン酸のアルデヒド基と反応させてシッフ塩基を形成する。シッフ塩基を、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤と更に反応させて、粗親和性バイオマトリックスを提供する。親和性バイオマトリックスは、透析によって溶液中で精製してもよく、凍結乾燥によって単離してもよい。次いで、凍結乾燥された親和性バイオマトリックスを、必要に応じて再構成してよい。
【００１９】
親和性バイオマトリックスは、インフリキシマブ用の制御放出デバイスとして有用である。インフリキシマブ用の制御放出デバイスは、親和性バイオマトリックスとインフリキシマブとを含む。親和性バイオマトリックスにロードされ得るインフリキシマブの量は、生体適合性生分解性ポリマーにコンジュゲートした親和性ペプチドの量に依存する。生体適合性生分解性ポリマー上に存在する親和性ペプチドの量は、制御放出デバイス中のインフリキシマブの所望の量以上であってよい。したがって、送達されるインフリキシマブ１モルに対して少なくとも１モルの親和性ペプチドが存在し得る。当業者は、所望の抗炎症反応のために、制御放出デバイスにどのくらいの量のインフリキシマブが必要であるかを決定することができる。制御放出デバイスは、スポンジ、粒子、注射可能なゲル又は液体、膜、フィルム、繊維、繊維系スカフォールド等の形態であり得る。
【００２０】
１つの実施形態では、制御放出デバイスは、注射可能なゲル又は液体の形態であり、この場合、親和性バイオマトリックスは水溶液中にあり、インフリキシマブを含有する。好適な水溶液の例としては、生理学的緩衝液、生理食塩水、水、緩衝生理食塩水、リン酸緩衝液、ハンクス平衡塩類溶液、ＰＢＳ、トリス緩衝生理食塩水、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。注射可能なゲル又は液体のデバイスを調製するために有用なポリマーは、上記天然又は合成ポリマーから選択され得る。注射可能な液体又はゲルの場合、親和性バイオマトリックスは、水溶液中に約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬの量で存在し得る。
【００２１】
インフリキシマブ制御放出デバイスは、所望により、それに配合される殺菌剤及び／又は抗菌剤を有してよい。好適な剤としては、抗菌ペプチド、四級アンモニウム塩類、アジド、銀、バンコマイシン、トブラマイシン、セファマンドール、セファロチン、カルベニシリン、アモキシシリン、ゲンタマイシン、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。また、インフリキシマブ制御放出デバイスは、所望により、それに配合される細胞を有してよい。好適な細胞の種類としては、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、幹細胞、多能性細胞、臍帯細胞、間葉系細胞、間葉系幹細胞、骨髄細胞、胚幹細胞、脂肪組織由来前駆細胞、末梢血前駆細胞、成体組織から単離された幹細胞、遺伝子的に形質転換された細胞、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
インフリキシマブ用の制御放出デバイスは、滅菌親和性バイオマトリックス及びインフリキシマブの滅菌凍結乾燥粉末を含有するキットとして販売され得る。キットに含まれる親和性バイオマトリックス及びインフリキシマブは、電子ビーム、ガンマ線照射及び無菌調製方法を挙げることができるがこれに限定されない従来の滅菌手順を用いて、滅菌することができる。
【００２３】
インフリキシマブ親和性バイオマトリックスは、以下を含む多くの用途／適応症を有し得る。まず、親和性バイオマトリックスは、変形性関節症、椎間板変性症等のＴＮＦ−αに関連する炎症性変性結合疾患を治療するためのインフリキシマブの局所的持続放出に用いてよい。インフリキシマブは、炎症反応及び更には変性の抑制に役立つ。更に、親和性バイオマトリックスは、尋常性乾癬、リウマチ様関節炎、乾癬性関節炎、成人クローン病、小児クローン病、瘻形成クローン病、潰瘍性大腸炎、及び強直性脊椎炎を含む炎症性疾患を治療するためのインフリキシマブの局所的持続放出に用いることができる。また、親和性バイオマトリックスは、癒着防止のため、慢性創傷の治療のための局所塗布のため、及び組織修復デバイスとして、インフリキシマブの局所的持続放出に用いてよい。
【００２４】
インフリキシマブ用の制御放出デバイスは、制御されたやり方で局所的にインフリキシマブを送達することを可能にする。バイオマトリックスにインフリキシマブを拘束することは、治療の半減期を延長し、ひいては、投与頻度及びコストを低減するのに役立つ。
【実施例】
【００２５】
実施例１−ファージディスプレイを用いるインフリキシマブ親和性ペプチドの選別
高複雑度（ライブラリー当たり１０９個のペプチド配列）を有するプライマリーペプチドファージライブラリーを使用して、インフリキシマブに対する親和性ペプチドを選別した。より具体的には、ビオチン化インフリキシマブを、ストレプトアビジンでコーティングしたマグネチックビーズ上に固定化し、ｐｌＸマイナーコートタンパク質上にペプチド配列をディスプレイするファージを導入した。インフリキシマブに結合しなかったファージを洗い流し、インフリキシマブに結合したファージを単離し、増幅した。インフリキシマブに結合した単離ファージを、合計３ラウンドの上記手順に従う選別の第２ラウンド用のインプットとして使用した。
【００２６】
溶液に基づくパニングを開始する前に、全てのプラスチック皿を、Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中３％ミルクでブロッキングし、４℃で一晩インキュベートした。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）によって商品名ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  Ｍ２８０として販売されているストレプトアビジンでコーティングしたマグネチックビーズ（カタログ番号６０２．１０）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。次に、１ミリリットル当たり１５０マイクログラムの濃度のビオチン化インフリキシマブをビーズにロードした。インフリキシマブは、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）から入手した。ロード後、インフリキシマブでコーティングされたマグネチックビーズをＰＢＤで３回洗浄し、次いで、室温で１時間、ＴＢＳＴ中３％ミルクでブロッキングした。一方、エッペンドルフチューブを、ＴＢＳＴ中３％脱水ミルク１ｍＬを用いてブロッキングした（ライブラリー当たり１つ）。３７℃の振盪器において、テトラサイクリンを添加した２×ＹＴ培地中で、２つのＭＣ１０６１Ｆ’ＧＩＩ大腸菌培養を開始した。次に、選別前にファージライブラリーをブロッキングした。次いで、エッペンドルフチューブ内のブロッキング溶液を廃棄し、それぞれのファージライブラリー２００マイクロリットル及びＴＢＳＴ中３％ミルク８００マイクロリットルで置き換えた。室温で１時間混転させることにより、ライブラリーをブロッキングした。選別を開始するために、マグネットを用いて１ミリリットルの樹脂を捕捉し、それぞれのブロッキングされたライブラリー１ミリリットルを導入した。これを、室温で１時間混転させておいた。各パニングラウンドの体積は、１ミリリットルで一定に保持した。任意のゆるく結合しているファージを除去するために、ファージに結合しているインフリキシマブでコーティングされたマグネチックビーズを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで合計２回用手的に洗浄し、次いで、ＰＢＳで１回洗浄した。最後の洗浄後、対数増殖期中期（mid-log）のファージＭＣ１０６１Ｆ’ＧＩＩ大腸菌６００マイクロリットルを各エッペンドルフチューブに導入した。次いで、穏やかに反転させることによってビーズを再懸濁させ、３７℃で３０分間インキュベートした。感染した細菌を、テトラサイクリンを添加した２×ＹＴ培地５０ｍＬ中で３７℃にて４時間増殖させた。次に、この細菌を遠心分離により分離し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を用いてファージを沈殿させた。ＰＥＧで沈殿させたファージを第２ラウンドで使用し、上記プロセスを合計３サイクルの選別プロセスにわたって繰り返した。
【００２７】
第３ラウンドの終わりに、インフリキシマブへの結合に関与するペプチドを決定するために、インフリキシマブに結合しているファージの配列を決定した。ＭＣ１０６１Ｆ’ＧＩＩ大腸菌を含む上層寒天中の単一プラークについて、ファージに感染した細菌をプレートアウトした。得られたプラークを使用して、ＥＬＩＳＡを用いてインフリキシマブに結合するファージを単離した。いったん単一ファージを同定してから、インフリキシマブに結合しているファージを増幅し、ＰＥＧ沈殿させ、配列解析を行った。インフリキシマブに対する親和性を有するペプチドを図１に列挙する。
【００２８】
これらファージを、実施例２に記載のファージ力価測定並びに実施例３に記載の確認及び交差反応性ファージＥＬＩＳＡアッセイに使用した。
【００２９】
実施例２−インフリキシマブ選別アウトプットのファージ力価測定
実施例１に記載のインフリキシマブに結合しているファージのＰＥＧ沈殿から得られたファージの濃度を決定するために、ファージ力価測定を行った。
【００３０】
振盪器（１８０〜２５０ｒｐｍ）において、３７℃で２〜３時間、テトラサイクリンを添加した２×ＹＴ培地中で大腸菌ＭＣ１０６１Ｆ’ＧＩＩを増殖させた。ＰＥＧ沈殿原液が１０１２ファージ／ｍＬを含有していると仮定して、９６ウェルプレートでファージ力価測定を行った。簡潔に述べると、１００マイクロリットルの２×ＹＴ培地を９６ウェルプレートのウェルに導入した。カラム１には、１０マイクロリットルのそれぞれのファージ原液を導入した。連続１：１０希釈物をカラム１２までプレートに対して行い、それぞれ１０１０、１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１、１００、１０−１の濃度のファージを得た。各列は別のファージを含有する。ファージプラーク増殖のために、それぞれ対応するファージ希釈系列１．５マイクロリットルをＬＢ／テトラサイクリン／凝固した上層寒天でコーティングしたＸ−Ｇａｌ寒天プレート／細菌懸濁液に導入した。プレートを上下逆にして３７℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、ファージプラークが良好に分離され、計数することができる希釈液を選択した。以下の式を使用して、力価を計算した：（プラーク数）（６６．７）（１０希釈数−１）×１００＝ファージ／ｍＬ（式中、６６．７は、各ウェル中のファージの希釈係数であり、希釈数は、ファージプラークが計数できるようになるまでに行われた希釈の回数である）。１００を乗じることにより、ファージ懸濁液原液中のファージ／ｍＬの数が得られる。
【００３１】
計算されたファージ数を表１に示す。得られたファージ濃度を使用して、実施例３に記載の確認及び交差反応性ファージＥＬＩＳＡアッセイのための希釈を行った。
【００３２】
【表１】
2015518834.tif 000003
【００３３】
実施例３−確認及び交差反応性ファージ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
この実験では、インフリキシマブに対する、実施例１で同定されたファージの結合を確認する。更に、ファージが、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）競合者、ヒトＩｇＧ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及びコラーゲンに対してほとんど結合しないことも試験する。
【００３４】
９６ウェル黒色ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中５マイクログラム／ｍＬの濃度のストレプトアビジン（カラム１〜４）、ｍＡｂ競合者（カラム５及び６）、ｈＩｇＧ（カラム７及び８）、ヒト血清アルブミン（カラム９及び１０）、及びコラーゲン（カラム１１及び１２）でコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。プレートを、プレート洗浄機を用いてＴＢＳＴで３回洗浄した。カラム３及び４のストレプトアビジンでコーティングされたウェルに、ビオチン化インフリキシマブの５マイクログラム／ｍＬ溶液１００マイクロリットルを導入し、室温で３０分間静置した。他のウェル全てに、１００マイクロリットルのＰＢＳを導入した。これらのプレートを再び、プレート洗浄機を用いてＴＢＳＴで３回洗浄した。次いで、これらのウェルを３％の脱水ミルクのＴＢＳＴ懸濁液２５０マイクロリットルでブロッキングし、最低１時間室温で静置した。ファージの力価測定により決定したファージ濃度を用いて、ファージ原液の希釈を別個の９６ウェルプレートで行って、１０１０、１０９、１０８、１０７、１０６及び１０５ファージ／ウェルのファージ濃度を得た。ブロッキング後、ＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、１００マイクロリットルのファージ希釈液をそれぞれのＥＬＩＳＡプレートに導入し、最低１時間室温で静置した。このＥＬＩＳＡプレートを再び、プレート洗浄機を用いてＴＢＳＴで３回洗浄し、セイヨウワサビペスオキシダーゼ（ＨＲＰ）がコンジュゲートしている抗Ｍ１３ファージＭａｂ（ＰＢＳで１：５０００希釈）１００マイクロリットルを各ウェルに導入した。これらプレートを１時間室温で静置し、その後、このプレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。次に、ペルオキシダーゼに基づく（ＰＯＤ）ＨＲＰ−基質を各ウェルに導入した。１５０のゲインに設定した照度計を用いて、輝度を読み取った。
【００３５】
図３及び図４中のファージＥＬＩＳＡデータは、相対輝度を示し、Ｎ値は２である。図３のデータは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３のインフリキシマブへの結合を確認する。図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、及び図４Ｄのデータは、ファージが、それぞれ、ｍＡｂ競合者、ｈＩｇＧ、ＨＳＡ、及びコラーゲンと最低限の交差反応性しかしないことを示す。
【００３６】
実施例４−インフリキシマブ親和性ペプチドＥＬＩＳＡアッセイ
ＥＬＩＳＡを用いて、親和性ペプチドに対するインフリキシマブの濃度依存性結合効率を評価した。
【００３７】
９６ウェルの黒色ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中５マイクログラム／ｍＬの濃度のヤギ抗ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）、カタログ番号１０９−００６−０９８）でコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。プレート洗浄機を用いてプレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。抗Ｆｃでコーティングされたウェルに、２０マイクログラム／ミリリットルのインフリキシマブ溶液１００マイクロリットルを導入し、室温で１時間静置した。他のウェル全てに、１００マイクロリットルのＰＢＳを導入した。これらのプレートを再び、プレート洗浄機を用いてＴＢＳＴで３回洗浄した。次いで、これらのウェルを３％の脱水ミルクのＴＢＳＴ懸濁液２５０マイクロリットルでブロッキングし、最低１時間室温で静置した。標準的な自動化フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成手順を用いて、配列番号２、配列番号３、配列番号１０及び配列番号１３を有するビオチン化化学合成ペプチドを調製した。アッセイ用の各ペプチド溶液を、５００マイクロモル濃度の原液から調製した。原液をアッセイバッファで連続希釈し、５００、１６６．６、５５．５、１８．５、６．２、２．１、０．６９、０．２３、０．０７６、０．０２５、０．００８５及び０．００２８マイクロモル濃度のペプチド濃度を得た。
【００３８】
ブロッキング後、ＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、１００マイクロリットルの連続希釈ペプチドをＥＬＩＳＡプレートの対応するウェルに添加し、最低１時間室温で静置した。このＥＬＩＳＡプレートを再び、プレート洗浄機を用いてＴＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰがコンジュゲートしているストレプトアビジン（ＰＢＳで１：１００００希釈）１００マイクロリットルを各ウェルに導入した。これらのプレートを１時間室温で静置し、その後、このプレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。次に、ＰＯＤ  ＨＲＰ基質を各ウェルに導入した。１５０のゲインに設定した照度計を用いて、輝度を読み取った。
【００３９】
図５のＥＬＩＳＡデータは、ペプチド配列の分子量に基づいてモル濃度に正規化した。図５のデータは、インフリキシマブに対するペプチドの濃度依存性結合を示す。ペプチド配列は、以下の通り、インフリキシマブに対する濃度依存結合に従って等級付けされた：配列番号２＞配列番号１０＞配列番号３＞配列番号１３。
【００４０】
実施例５−表面プラズモン共鳴
表面プラズモン共鳴測定により、インフリキシマブに対するペプチドの結合親和性を配列番号２及び配列番号１０について評価した。ストレプトアビジンシリーズＳセンサチップを用いて、商品名ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｓ５１（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））として販売されている表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサで測定を実施した。ビオチン化ペプチドを、０．１及び０．２マイクログラム／ｍＬ（配列番号８及び配列番号１０については、ｃ＝１及び１０マイクログラム／ｍＬ）の濃度でセンサチップに固定化した。インフリキシマブを、０、０．７８、１．５６、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０及び１００ｎＭの濃度の親和性ペプチド官能化チップ上に流し、屈折率の変化を記録した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって商品名ＢＩＡＣＯＲＥとして販売されている解析ソフトウェアを用いて、データを１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させた。
【００４１】
表１に示すデータは、Ｎ値２での平均平衡解離定数である。データは、９〜１８ｎＭの平均平衡解離定数を示す。
【００４２】
【表２】
2015518834.tif 000004
【００４３】
実施例６−コラーゲンバイオマトリックスの調製
８０％の繊維性Ｉ型コラーゲン（３２ｍｇ）と２０％の可溶性Ｉ型コラーゲン（８ｍｇ）との４０ｍｇ／ｍＬ水溶液を４℃にて一晩撹拌した。次いで、この懸濁液をブレンダーで３サイクル（１サイクル３０秒間〜１分間）にわたってホモジナイズした。約５ｍＬの懸濁液を、寸法５ｃｍ×５ｃｍ、高さ０．５ｃｍの型に移した。このコラーゲン混合物をスパチュラの平坦な端部を用いて平らにして、コラーゲンの高さ分布の均一性を確保した。次に、サンプルを脱気し、次いで、表３に示すサイクルを用いて凍結乾燥させた。次いで、このサンプルを温度制御真空槽を用いて熱脱水した。次いで、この発泡体コラーゲンバイオマトリックスを生検パンチを用いて６ｍｍのディスクに切断し、乾燥窒素パージ下で室温にて保管した。この実施例で調製したバイオマトリックスを、実施例７に記載の官能化に用いた。
【００４４】
【表３】
2015518834.tif 000005
【００４５】
実施例７−アジド修飾コラーゲンバイオマトリックスの調製
アジド修飾コラーゲンマトリックスを調製するために、実施例６に記載の通り調製した６ｍｍのコラーゲンスポンジディスクを、エッペンドルフチューブ内の５０マイクロモル濃度のホウ酸バッファ１ｍＬに入れ、室温で１時間膨潤させた。スポンジを上記バッファから取り出し、５マイクロモル濃度のＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、カタログ番号２６１３０）を含有する新たな５０マイクロモル濃度のホウ酸バッファ１．５ｍＬに入れた。反応混合物を室温で一晩（約１６〜１８時間）混転させた。次いで、スポンジを反応混合物から取り出し、穏やかに絞って過剰の流体を除去した。次いで、室温で２時間混転させながら、１０ミリリットルのＰＢＳを用いてスポンジを洗浄した。この洗浄プロセスを合計３回の洗浄にわたって繰り返した。この実施例に記載のアジド修飾バイオマトリックスを用いて、実施例８に記載の通り親和性ペプチドにコンジュゲートさせた。
【００４６】
実施例８−インフリキシマブ親和性ペプチドのアジド修飾コラーゲンバイオマトリックスへのコンジュゲート
ペプチドをコンジュゲートさせるために、実施例７に記載の通り調製した６ｍｍのコラーゲンスポンジディスクを、エッペンドルフチューブ内の２０％のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ  １．８ｍＬに入れ、室温で３０分間混転させた。上記バッファからスポンジを取り出し、１ミリモル濃度の親和性コンジュゲーションペプチドを含有する新たな２０％  ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ  １．８ｍＬに入れた。それぞれ、配列番号２及び配列番号１０（図６Ａに示す配列番号２４及び配列番号２５の配列）の親和性コンジュゲーションペプチドを用いて、親和性バイオマトリックスを調製した。標準的な自動化フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成手順を用いて、ペプチドを調製した。サンプルを室温にて１時間混転させた。次に、１０ミリモル濃度の酢酸銅５０ミリモル濃度のアスコルビン酸水溶液３６マイクロリットルを、コラーゲンスポンジを収容している各エッペンドルフに導入した。次いで、これを室温で２日間混転させた。次に、スポンジを、１０ｍＬのＰＢＳ中で２時間混転させることによってすすいだ。これを合計三回のすすぎサイクルにわたって繰り返した。最後に、スポンジをＰＢＳから取り出し、凍結乾燥機で一晩乾燥させた。また、３つの対照サンプルも上記手順で使用した。１＝コラーゲンスポンジ＋バッファ、２＝コラーゲンスポンジ＋ペプチド／バッファ、及び３＝コラーゲンスポンジ＋酢酸銅／アスコルビン酸。全てのサンプルに対して、上清を凍結乾燥して乾燥粉末にし、ＲＰ−Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ＨＰＬＣを用いて分析した。データは、約１０〜３０％のコンジュゲーション効率が得られたことを示す。
【００４７】
実施例９−インフリキシマブ親和性ペプチドのＨＡバイオマトリックスへのコンジュゲーション
ヒアルロン酸（ＨＡ）ハイドロゲル溶液（ＰＢＳ中２０ｍｇ／ｍＬ）を滅菌濾過水で最終濃度２ｍｇ／ｍＬに希釈した。この溶液を室温で１５分間静置した。ＨＡを活性化させるために、１００ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、最終濃度１０ｍＭになるように希釈ＨＡ溶液に導入した。次いで、溶液をアルミホイルで覆い、室温で３０分間静置した。次に、Ｄ−マンニトールの１Ｍ水溶液を最終濃度０．１Ｍになるように導入し、室温で１０分間静置した。次いで、活性化ＨＡを、３．５Ｋ透析カセットを用いて水で透析した。合計２サイクルにわたって２時間毎に水を交換し、次いで、室温で一晩透析を実施した。透析後、凍結乾燥によってサンプルから水を除去した。親和性ペプチド（図６Ｂに示す配列）を活性化ＨＡにコンジュゲートさせるために、２０ｍｇの活性化ＨＡを５ｍＬの滅菌濾過水に導入して、４ｍｇ／ｍＬの活性化ＨＡ溶液を得た。別のバイアルにおいて、５ｍｇの親和性ペプチド（配列番号２６又は配列番号２７）を２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ  ７．５）５ｍＬに溶解させ、１ｍｇ／ｍＬのペプチド溶液を得た。次に、活性化ＨＡ及びペプチドの１：１希釈を実施し（総体積＝１０ｍＬ）、２ｍｇ／ｍＬの活性化ＨＡ：０．５ｍｇ／ｍＬのペプチド溶液を得た。これを室温で４時間静置した。次に、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを最終濃度５ｍＭで導入し、室温で３０分間静置した。次いで、溶液を水で透析し、凍結乾燥させて、精製親和性バイオマトリックスを得た。
【００４８】
実施例１０−親和性ペプチドの存在下におけるインフリキシマブのインビトロ生物活性
この実験では、ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲマウス線維芽細胞を用いて、親和性ペプチドが腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の結合に干渉するかどうかを決定した。細胞生存率は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを用いて、親和性ペプチドの有り無しでインフリキシマブの存在をモニタリングした。
【００４９】
ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞（マウス線維芽細胞株）を、５００００細胞／ウェルで実験を行う２時間前に、９６ウェルプレートのウェルにプレートアウトした。２０ナノグラム／ミリリットルの組み換えヒトＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２１０−ＴＡ／ＣＦ）の原液を、７．５マイクログラム／ミリリットルのアクチノマイシンＤを含有する培養培地中で調製した。６６ナノモル濃度の一定濃度の配列番号２、配列番号１０、及び配列番号１３のペプチドの存在下又は非存在下で、０〜６６ナノモル濃度の濃度範囲のインフリキシマブの連続希釈物を調製して、１、４、１６、６４、２５６、１０２４、４０９４、及び１６３８４のペプチド：インフリキシマブ比を得た。１６０マイクロリットルのそれぞれのインフリキシマブ：ペプチド溶液、及び４０マイクロリットルのＴＮＦ−α溶液を、ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞を含有するウェルに添加する前に３０分間プレインキュベートした。次に、細胞を５０マイクロリットルのＴＮＦ−α：インフリキシマブ：ペプチド溶液で刺激し、５％  ＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベータ内で一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、製品の説明書に従ってＭＴＴ細胞生存率アッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、カタログ番号４８９０−０５０−Ｋ）を用いて細胞生存率を評価した。
【００５０】
図７は、配列番号２、配列番号１０、及び配列番号１３が、インフリキシマブの存在下でＷＥＨＩ−１３ＶＡＲマウス線維芽細胞の生存率に対して最小限の効果しか有しないことを示す。これは、配列番号２、配列番号１０、及び配列番号１３が、インフリキシマブの生物活性に干渉しないことを示唆する。
【００５１】
実施例１１−コラーゲンディスクからのインフリキシマブのインビトロ放出
この実験では、模擬生理的条件下における親和性バイオマトリックスからのインフリキシマブのインビトロ制御放出を評価した。この放出実験のために、実施例６、実施例７及び実施例８に記載の方法により調製されるような親和性バイオマトリックスの直径６ｍｍのディスクを、２４ウェル細胞培養プレートのウェルに入れた。スポンジに５０マイクログラム又は２００マイクログラムのインフリキシマブをロードし、室温で６０分間静置した。実施例６で調製した、親和性ペプチドを含まないコラーゲンの直径６ｍｍのディスクを対照として使用した。次いで、ロードしたコラーゲンスポンジを、熱変性ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１ｍｇ／ｍＬの濃度で添加したＰＢＳを１．５ｍＬ含有する２４ウェル細胞培養プレートのウェルに移した。それぞれの時点において、培地を取り出し、エッペンドルフチューブに移し、次いで、分析まで４℃で保管した。コラーゲンディスクを含有するウェルに、新たな２％のＦＢＳのＰＢＳ溶液を１．５ｍＬ補給した。放出培地を、ＥＬＩＳＡを用いてインフリキシマブ含量について分析した。
【００５２】
図８Ａのデータは、５０マイクログラムのインフリキシマブをロードした親和性バイオマトリックス制御放出デバイスが、２８日目時点で約４０重量％（配列番号２４）及び５５重量％（配列番号２５）のインフリキシマブの蓄積放出を有するが、未修飾対照コラーゲンスポンジは、約１００重量％を放出することを示す。図８Ｂのデータは、２００マイクログラムインフリキシマブをロードした親和性バイオマトリックスが、２８日目時点で約８９重量％（配列番号２４）及び８０重量％（配列番号２５）のインフリキシマブの蓄積放出を有するが、未修飾対照コラーゲンスポンジは、約１００重量％を放出することを示す。親和性ペプチドのバイオマトリックス制御放出デバイスからのインフリキシマブの初期の爆発的な放出は、未修飾対照コラーゲンスポンジと比較して、有意に低減されている。
【００５３】
実施例１２．突然変異体ファージＥＬＩＳＡ
ペプチドの直鎖バージョンを得、インフリキシマブに対する結合にとってどのアミノ酸が重要であるかを理解するために、配列番号１８の親和性ペプチドに対して部位特異的突然変異誘発を実施した。上述の親和性ペプチドの突然変異体は、野性型親和性ペプチド配列番号１８、ＡＧ−ＸＸＸＸ−ＰＷＰＰＴＡＥＳ−ＸＸＸＸ（式中、Ｘは、２０種の天然アミノ酸のうちのいずれかを示す）の残基３〜６及び残基１５〜１８をランダム化することによって構築した。
【００５４】
それぞれの特別注文のオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から入手した。標準的なプロトコルを用いて、前記オリゴヌクレオチド（oligonucletides）をｐＩＸ遺伝子に挿入した。まず、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、前記オリゴヌクレオチドをリン酸化した。次に、このリン酸化オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡテンプレートにアニーリングした。Ｋｕｎｋｅｌ法を用いて、アニーリングしたＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及びＴ７ＤＮＡポリメラーゼを用いてライゲーションした。得られたＤＮＡを、イソプロパノール沈殿を用いて単離し、ゲルで泳動して反応を確認した。最後に、大腸菌のエレクトロコンピテントセルを精製ＤＮＡで形質転換し、２×ＹＴ／Ｔｅｔ／Ｘｇａｌ寒天平板培地にプレートアウトし、一晩増殖させて、シングルコロニーを単離した。５０ｍＬの２×ＹＴ／ｔｅｔ培地中で振盪しながら、形質転換した細胞のアリコートを３７℃で一晩増殖させた。このファージを実施例１の手順に従ってＰＥＧ沈殿させた。ファージ力価測定を行って、実施例２に記載の通り、ＥＬＩＳＡアッセイのためにファージ濃度を決定した。実施例３の手順に従ってＥＬＩＳＡアッセイを実施して、インフリキシマブに結合する配列番号１８の断片を同定した。図９のデータは、配列を図１０に列挙する突然変異体親和性ペプチドがインフリキシマブに結合することを示す。
【００５５】
〔実施の態様〕
（１）  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及びこれらの断片からなる群より選択されるペプチド配列を有する、インフリキシマブに対する親和性ペプチド。
（２）  前記ペプチド配列が、配列番号２又は配列番号１０である、実施態様１に記載のインフリキシマブに対する親和性ペプチド。
（３）  ポリマー及びインフリキシマブに対する親和性ペプチドを更に含む親和性バイオマトリックスと、インフリキシマブとを含む、制御放出デバイス。
（４）  前記親和性ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及びこれらの断片からなる群より選択されるペプチド配列を有する、実施態様３に記載の制御放出デバイス。
（５）  前記ポリマーが、天然ポリマーである、実施態様３に記載の制御放出デバイス。
【００５６】
（６）  前記天然ポリマーが、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、シルク、多糖類、ＧＡＧ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様５に記載の制御放出デバイス。
（７）  前記多糖類が、デンプン、ペクチン、セルロース、アルキルセルロース、アルキルヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロース硫酸、カルボキシメチルセルロースの塩類、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キチン、カルボキシメチルキチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩類、アルジネート、架橋アルジネート／アルギン酸、アルギン酸プロピレングリコール、グリコーゲン、デキストラン、デキストラン硫酸、カードラン、ペクチン、プルラン、キサンタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、キトサン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ポリ−Ｎ−グルコサミン、ポリマンヌロン酸（polymannuronic acid）、ポリグルクロン酸、及びポリグルクロン酸からなる群より選択される、実施態様６に記載の制御放出デバイス。
（８）  前記天然ポリマーが、コラーゲンである、実施態様５に記載の制御放出デバイス。
（９）  前記天然ポリマーが、皮膚、骨膜、軟骨膜、滑膜、筋膜、腸間膜（mesenter）、骨及び腱からなる群から選択される脱細胞化組織である、実施態様５に記載の制御放出デバイス。
（１０）  前記コラーゲンが、スポンジ、粒子、注射可能なゲル、注射可能な液体、膜、フィルム、繊維及び繊維系スカフォールドの形態である、実施態様８に記載の制御放出デバイス。
【００５７】
（１１）  ポリマー及びインフリキシマブに対する親和性ペプチドを更に含む親和性バイオマトリックスと、インフリキシマブとを含む、キット。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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