(57)【要約】Ｙａｒｒｏｗｉａなどの真菌細胞における組換えタンパク質の分解を低減させる方法および材料が、本明細書に記載される。別の態様では、本願は、実質的な数のＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞が、ｐＹＰＳ１活性における欠損およびｐＹＰＳ２活性における欠損を含むように遺伝子操作されている、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞の実質的に純粋な培養物を特徴とする。本願は、Ｙａｒｒｏｗｉａにおいて産生される標的タンパク質の分解を低減させる方法も特徴とする。この方法は、本明細書に記載されるＹａｒｒｏｗｉａ細胞において、標的タンパク質をコードする核酸を発現させるステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＹＰＳ１（ＹＰＳ１タンパク質）活性における欠損およびｐＹＰＳ２（ＹＰＳ２タンパク質）活性における欠損を含むように遺伝子操作された、単離されたＹａｒｒｏｗｉａ細胞。
【請求項２】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
標的タンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
前記標的タンパク質が、リソソームタンパク質、病原体タンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合性断片の１つもしくは２つのポリペプチド鎖、または融合タンパク質である、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
前記抗体が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する抗体、ＣＤ３に結合する抗体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する抗体、ＴＮＦ受容体に結合する抗体、ＣＤ２０に結合する抗体、糖タンパク質ＩＩａ／ＩＩｂ受容体に結合する抗体、ＩＬ２受容体に結合する抗体、ＣＤ５２に結合する抗体、ＣＤ１１ａに結合する抗体およびＨＥＲ２に結合する抗体からなる群から選択される、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
前記抗原結合性断片が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片からなる群から選択される、請求項４に記載の細胞。
【請求項７】
ＯＣＨ１活性がさらに欠損している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
アルファ−１，２マンノシダーゼをコードする核酸を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
前記アルファ−１，２マンノシダーゼが、該アルファ−１，２マンノシダーゼを細胞内区画に向かわせるための標的化配列を含む、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
ＡＬＧ３活性がさらに欠損している、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
アルファ−１，３−グルコシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
グルコシダーゼのアルファサブユニットおよびベータサブユニットをコードする核酸をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩをコードする核酸を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩが、該ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩを細胞内区画に向かわせるための標的化配列を含む、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩＩをコードする核酸を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６】
前記ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩＩが、該ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩＩを細胞内区画に向かわせるための標的化配列を含む、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
前記ガラクトシルトランスフェラーゼが、該ガラクトシルトランスフェラーゼをゴルジ体に向かわせるための標的化配列を含む、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
検出可能なレベルの機能的ｐＹＰＳ１も機能的ｐＹＰＳ２も産生しない、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
機能的ｐＹＰＳ１をコードする検出可能なｍＲＮＡ分子および機能的ｐＹＰＳ２をコードする検出可能なｍＲＮＡ分子を産生しない、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２１】
ＹＰＳ１遺伝子およびＹＰＳ２遺伝子が、前記細胞において破壊されている、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２２】
ＹＰＳ１およびＹＰＳ２のオープンリーディングフレームが欠失されている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３】
実質的な数のＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞が、ｐＹＰＳ１活性における欠損およびｐＹＰＳ２活性における欠損を含むように遺伝子操作されている、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞の実質的に純粋な培養物。
【請求項２４】
（ｉ）ｐＹＰＳ１活性における欠損および（ｉｉ）ｐＹＰＳ２活性における欠損と、（ｉｉｉ）ＡＬＧ３活性における欠損、（ｉｖ）ＯＣＨ１活性における欠損、（ｖ）アルファ−１，２マンノシダーゼをコードする核酸、（ｖｉ）ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩをコードする核酸、（ｖｉｉ）ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩＩをコードする核酸、（ｖｉｉｉ）マンノシダーゼＩＩをコードする核酸、（ｉｘ）α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼをコードする核酸、（ｘ）ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸ならびに（ｘｉ）グルコシダーゼのαサブユニットおよびβサブユニットをコードする核酸のうち１つまたは複数とを含むように遺伝子操作された、単離されたＹａｒｒｏｗｉａ細胞。
【請求項２５】
標的タンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
Ｙａｒｒｏｗｉａにおいて産生される標的タンパク質の分解を低減させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のＹａｒｒｏｗｉａ細胞において、該標的タンパク質をコードする核酸を発現させるステップを含む方法。
【請求項２７】
標的タンパク質を産生する方法であって、ａ）ｐＹＰＳ１活性における欠損、ｐＹＰＳ２活性における欠損、および該標的タンパク質をコードする核酸を含むように遺伝子操作されたＹａｒｒｏｗｉａ細胞を提供するステップ；ならびにｂ）該細胞が該標的タンパク質を産生するような条件下で該細胞を培養するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１１年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／５８１，８５９号への優先権の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、真菌細胞における組換えタンパク質の分解を低減させる方法および材料、ならびにより具体的には、２つの異なるヤプシンペプチダーゼ活性における欠損を有する遺伝子操作されたＹａｒｒｏｗｉａ細胞に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
高性能の発現系が、現在開発下にある殆どの生物医薬品（例えば、組換えタンパク質）を生成するために必要である。酵母ベースの発現系は、遺伝子操作の容易さならびにタンパク質を分泌および改変する能力を有する微生物の発酵を組み合わせる。しかし、組換えタンパク質は、細胞内プロテアーゼならびに細胞外プロテアーゼによって分解されることが多い。したがって、組換えタンパク質の低減された分解を有する酵母ベースの発現系が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
要旨
本願は、２つの異なるヤプシンペプチダーゼ活性、ＹＰＳ１タンパク質（ｐＹＰＳ１）およびＹＰＳ２タンパク質（ｐＹＰＳ２）における欠損を有するＹａｒｒｏｗｉａ細胞において、組換えタンパク質の分解が低減されるという発見に、少なくとも一部基づく。本明細書に記載される遺伝子操作されたＹａｒｒｏｗｉａ株は、未分解の組換えタンパク質（例えば抗体）を産生するのに有用である。
【０００５】
一態様では、本願は、ｐＹＰＳ１活性における欠損およびｐＹＰＳ２活性における欠損を含むように遺伝子操作された、単離されたＹａｒｒｏｗｉａ細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞）を特徴とする。いくつかの実施形態では、この細胞は、検出可能なレベルの機能的ｐＹＰＳ１も機能的ｐＹＰＳ２も産生しない。いくつかの実施形態では、この細胞は、機能的ｐＹＰＳ１をコードする検出可能なｍＲＮＡ分子および機能的ｐＹＰＳ２をコードする検出可能なｍＲＮＡ分子を産生しない。いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１遺伝子およびＹＰＳ２遺伝子は、この細胞において破壊されている。いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１およびＹＰＳ２のオープンリーディングフレームは、欠失している。
【０００６】
別の態様では、本願は、実質的な数のＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞が、ｐＹＰＳ１活性における欠損およびｐＹＰＳ２活性における欠損を含むように遺伝子操作されている、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞の実質的に純粋な培養物を特徴とする。
【０００７】
本願は、Ｙａｒｒｏｗｉａにおいて産生される標的タンパク質の分解を低減させる方法も特徴とする。この方法は、本明細書に記載されるＹａｒｒｏｗｉａ細胞において、標的タンパク質をコードする核酸を発現させるステップを含む。
【０００８】
別の態様では、本願は、標的タンパク質を産生する方法を特徴とする。この方法は、ｐＹＰＳ１活性における欠損、ｐＹＰＳ２活性における欠損、および標的タンパク質をコードする核酸を含むように遺伝子操作されたＹａｒｒｏｗｉａ細胞を提供するステップ；ならびにｂ）該細胞が標的タンパク質を産生するような条件下で該細胞を培養するステップを含む。
【０００９】
本明細書に記載される細胞のいずれかは、ＯＣＨ１活性がさらに欠損していてもよい。
【００１０】
本明細書に記載される細胞のいずれかは、アルファ−１，２マンノシダーゼをコードする核酸をさらに含み得る。このアルファ−１，２マンノシダーゼは、アルファ−１，２マンノシダーゼを細胞内区画に向かわせるための標的化配列を含み得る。
【００１１】
本明細書に記載される細胞のいずれかは、ＡＬＧ３活性がさらに欠損していてもよい。
【００１２】
本明細書に記載される細胞のいずれかは、アルファ−１，３−グルコシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含み得る。
【００１３】
本明細書に記載される細胞のいずれかは、グルコシダーゼのアルファサブユニットおよびベータサブユニットをコードする核酸をさらに含み得る。
【００１４】
本明細書に記載される細胞のいずれかは、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩをコードする核酸をさらに含み得る。このＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩは、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩを細胞内区画に向かわせるための標的化配列を含み得る。
【００１５】
本明細書に記載される細胞のいずれかは、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩＩをコードする核酸をさらに含み得る。このＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩＩは、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩＩを細胞内区画に向かわせるための標的化配列を含み得る。
【００１６】
本明細書に記載される細胞のいずれかは、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含み得る。このガラクトシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼをゴルジ体に向かわせるための標的化配列を含み得る。
【００１７】
本明細書に記載される細胞のいずれかは、標的タンパク質（例えば、リソソームタンパク質、病原体タンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合性断片の１つもしくは２つのポリペプチド鎖、または融合タンパク質）をコードする核酸をさらに含み得る。この抗体は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する抗体、ＣＤ３に結合する抗体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する抗体、ＴＮＦ受容体に結合する抗体、ＣＤ２０に結合する抗体、糖タンパク質ＩＩａ／ＩＩｂ受容体に結合する抗体、ＩＬ２受容体に結合する抗体、ＣＤ５２に結合する抗体、ＣＤ１１ａに結合する抗体およびＨＥＲ２に結合する抗体からなる群から選択され得る。この抗原結合性断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片からなる群から選択され得る。
【００１８】
本願は、（ｉ）ｐＹＰＳ１活性における欠損および（ｉｉ）ｐＹＰＳ２活性における欠損と；（ｉｉｉ）ＡＬＧ３活性における欠損、（ｉｖ）ＯＣＨ１活性における欠損、（ｖ）アルファ−１，２マンノシダーゼをコードする核酸、（ｖｉ）ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩをコードする核酸、（ｖｉｉ）ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩＩをコードする核酸、（ｖｉｉｉ）マンノシダーゼＩＩをコードする核酸、（ｉｘ）α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼをコードする核酸、（ｘ）ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸ならびに（ｘｉ）グルコシダーゼのαサブユニットおよびβサブユニットをコードする核酸、のうち１つまたは複数とを含むように遺伝子操作された、単離されたＹａｒｒｏｗｉａ細胞も特徴とする。例えば、かかる細胞は、（ｉ）ｐＹＰＳ１活性における欠損；（ｉｉ）ｐＹＰＳ２活性における欠損；（ｉｉｉ）ＡＬＧ３活性における欠損；（ｉｖ）ＯＣＨ１活性における欠損；（ｖ）アルファ−１，２マンノシダーゼをコードする核酸；（ｖｉ）ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩをコードする核酸；（ｖｉｉ）ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩＩをコードする核酸；（ｖｉｉｉ）マンノシダーゼＩＩをコードする核酸；（ｉｘ）α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼをコードする核酸；（ｘ）ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸；ならびに（ｘｉ）グルコシダーゼのαサブユニットおよびβサブユニットをコードする核酸を含み得る。かかる細胞は、本明細書に記載される標的タンパク質をコードする核酸をさらに含み得る。
【００１９】
特に規定しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または等価な方法および材料が、本発明の実施および試験において使用され得るが、例示的な方法および材料が以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本出願が支配する。材料、方法および実施例は例示に過ぎず、限定することを意図しない。
【００２０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１Ａは、軽鎖発現構築物（配列番号１）および重鎖発現構築物（配列番号２）のヌクレオチド配列の表示を示す図である。
【００２２】
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｐＹＰＳ１タンパク質（配列番号３）およびｐＹＰＳ２タンパク質（配列番号４）のアミノ酸配列の表示を示す図である。
【００２３】
【図１Ｃ】図１Ｃは、抗ＨＥＲ２抗体の軽鎖（ＬＣ）をコードするヌクレオチド配列（配列番号５）の表示、およびＬＣのアミノ酸配列（配列番号６）の表示を示す図であり、ＬＩＰ２プレプロリーダー配列には下線が付され
【化１】
2015503338.tif 000002
、ＶＬドメイン配列には２本線で下線が付され
【化２】
2015503338.tif 000003
；ＣＫドメインには破線で下線が付される
【化３】
2015503338.tif 000004
。
【００２４】
【図１Ｄ】図１Ｄは、抗ＨＥＲ２抗体の重鎖（ＨＣ）をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）の表示、およびＨＣのアミノ酸配列（配列番号８）の表示を示す図であり、ＬＩＰ２プレプロリーダー配列には下線が付され
【化４】
2015503338.tif 000005
、ＶＨドメイン配列には２本線で下線が付され
【化５】
2015503338.tif 000006
；ＣＨドメインには破線で下線が付され
【化６】
2015503338.tif 000007
；ヤプシン切断部位には「／」が付される。
【００２５】
【図２】図２は、アルファＨＥＲ２重鎖およびアルファＨＥＲ２軽鎖に単一の標的化コピーを組込んで構築した株の系図の概略図を示す図である。
【００２６】
【図３】図３は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株Ｐｏ１ｄにおいて発現した抗ＨＥＲ２抗体のウエスタンブロットの写真を示す図である。軽鎖および重鎖を別々に検出した。軽鎖は、２５ｋＤａの正確な分子量で存在したが、二量体化する傾向を示した。重鎖もまた、５０ｋＤａの正確な分子量で検出されたが、その大部分は、およそ３２ｋＤａの分子量を有する分解産物として存在した。
【００２７】
【図４】図４は、ＹＰＳ遺伝子の破壊のための構築物の概略図を示す図である。
【００２８】
【図５】図５は、単一ヤプシン欠失株の培養上清から取得された重鎖の２つのウエスタンブロットの写真を示す図である。上のパネルにおいて、重鎖は、Δｙｐｓ２欠失株、Δｙｐｓ３欠失株、Δｙｐｓ５欠失株、Δｙｐｓ７欠失株およびΔｙｐｓｘ欠失株、ならびに対照株（ｃｔｒｌ、ヤプシン非欠失）について、２つの時点（４８時間および９６時間）で検出された。下のパネルにおいて、重鎖は、各々がΔｙｐｓ１欠失およびΔｙｐｓ４欠失株である２つのクローンならびに対照株について９６時間の時点で検出された。
【００２９】
【図６】図６は、Δｙｐｓ１欠失株、ＵＲＡ栄養要求性Δｙｐｓ１欠失株、Δｙｐｓ１Δｙｐｓ２二重欠失株、Δｙｐｓ１Δｙｐｓ３二重欠失株、Δｙｐｓ１Δｙｐｓ４二重欠失株および対照株（ヤプシン非欠失）の培養上清から取得された重鎖のウエスタンブロットの写真を示す図である。
【００３０】
【図７】図７は、Δｙｐｓ１Δｙｐｓ２株および野生型（ｃｔｒｌ）株において発現した組換え抗ＨＥＲ２抗体の、銀染色されたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルの写真を示す図である。還元（左側）条件および非還元（右側）条件が示される。重鎖由来の分解産物に星印を付す。非還元条件下では、重鎖のタンパク質分解産物は、対照株において単量体および二量体の両方として存在していた。還元条件下では、グリコシル化バージョンの重鎖および非グリコシル化バージョンの重鎖の両方が認められた。Ｈ２Ｌ２：完全にアセンブルしたＡｂ；ＨＣ：重鎖；ＬＣ：軽鎖。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な説明
一般に、本願は、２つの異なるヤプシンペプチダーゼ、ＹＰＳ１タンパク質（ｐＹＰＳ１）およびＹＰＳ２タンパク質（ｐＹＰＳ２）において欠損を有する遺伝子操作された細胞を使用して、Ｙａｒｒｏｗｉａ（例えば、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）または他の関連の種の二相性酵母などの真菌細胞における組換えタンパク質の分解を低減する方法および材料を提供する。ヤプシンは、限定された基質特異性を有し、細胞表面上に局在化している、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合アスパラギン酸エンドペプチダーゼである。ヤプシンは、対になった塩基性残基（例えば、リシン−アルギニンおよびアルギニン−アルギニン）に対してＣ末端側で；リシンよりアルギニンを優先することなしに、単塩基部位に対してＣ末端側で；および塩基性残基間を、切断できる。例えば、Ｇａｇｎｏｎ−Ａｒｓｅｎａｕｌｔら、ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ  ６巻：９６６〜９７８頁（２００６年）を参照のこと。
【００３２】
本明細書に記載される遺伝子操作された細胞は、組換え標的タンパク質を産生するために使用され得る。いくつかの実施形態では、この組換え標的タンパク質は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（または他の関連の種の二相性酵母）の分泌経路の１つまたは複数のステップを介して輸送されることが可能であり、その結果として宿主細胞機構によるそれらのＮ−グリコシル化が生じる。
【００３３】
組換え産生され得る適切な標的タンパク質には、病原体タンパク質、リソソームタンパク質（例えば、グルコセレブロシダーゼ、セレブロシダーゼまたはガラクトセレブロシダーゼ）、インスリン、グルカゴン、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、Ｆｃ受容体に結合することが可能なタンパク質、抗体もしくはその断片、または抗体もしくは抗体の断片に対する任意のタンパク質の融合物（例えば、タンパク質−Ｆｃ）が挙げられる。病原体タンパク質の非限定的な例には、破傷風トキソイド；ジフテリアトキソイド；およびウイルス表面タンパク質（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）糖タンパク質Ｂ、ＨおよびｇＣＩＩＩ；ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）エンベロープ糖タンパク質；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンベロープ糖タンパク質；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）エンベロープ糖タンパク質；エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）エンベロープ糖タンパク質；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）エンベロープ糖タンパク質；ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）エンベロープ糖タンパク質；インフルエンザウイルス糖タンパク質；ならびに肝炎ファミリー表面抗原）が挙げられる。増殖因子には、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）；ニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ９）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ２）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が挙げられる。サイトカインには、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−３３、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３またはＩＬ−１５）およびインターフェロン（例えば、インターフェロンβまたはインターフェロンγ）が挙げられる。ケモカインには、例えば、Ｉ−３０９、ＴＣＡ−３、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｃ１０、ＭＲＰ−２、ＭＡＲＣ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−２、ＭＲＰ−２、ＣＣＦ１８、ＭＩＰ−１γ、エオタキシン、ＭＣＰ−５、ＭＣＰ−４、ＮＣＣ−１、Ｃｋβ１０、ＨＣＣ−１、ロイコタクチン−１（Ｌｅｕｋｏｔａｃｔｉｎ−１）、ＬＥＣ、ＮＣＣ−４、ＴＡＲＣ、ＰＡＲＣまたはエオタキシン−２が挙げられる。腫瘍糖タンパク質（例えば、腫瘍関連抗原）、例えば、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒトムチン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよび前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）もまた挙げられる［ＨｅｎｄｅｒｓｏｎおよびＦｉｎｎ、Ａｄｖ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６２巻、２１７〜５６頁（１９９６年）］。
【００３４】
いくつかの実施形態では、この標的タンパク質は、リソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）と関連する。ＬＳＤと関連する標的タンパク質の非限定的な例には、例えば、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ベータ−ヘキソサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−マンノシダーゼ、アルファ−Ｌ−フコシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、アルファ−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ベータ−Ｄ−グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）、ヒアルロニダーゼ、アルファ−Ｌ−マンノシダーゼ、アルファ−ノイラミニダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、チオエステラーゼ、カテプシンＫおよびリポタンパク質リパーゼが挙げられる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、この標的タンパク質は抗体である。この抗体は任意の抗体であり得るが、抗体の非限定的な例には、ＣＤ３に結合する抗体、例えば、ＯＫＴ３、テプリズマブもしくはオテリキシズマブ；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する抗体、例えば、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））もしくはインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））；ＴＮＦ受容体に結合する抗体、例えばエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））；ＣＤ２０に結合する抗体、例えば、イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））もしくはリツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））；糖タンパク質ＩＩａ／ＩＩｂ受容体（ＧＰＩＩａ／ＩＩｂ−Ｒ）に結合する抗体、例えばアブシキシマブ（Ａｂｅｉｘｉｍａｂ）（Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標））；ＩＬ２受容体に結合する抗体、例えばバシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））もしくはダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する抗体、例えばセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））；ＣＤ５２に結合する抗体、例えばアレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚａｍａｂ）（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））；ＣＤ１１ａに結合する抗体、例えばエファリズマブ（Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標））；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体、例えばベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、またはＨＥＲ２に結合する抗体、例えばトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚａｍａｂ）（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））が挙げられる。
【００３６】
標的タンパク質は、融合タンパク質であってもよい。融合タンパク質には、例えば、（ｉ）本明細書に記載される任意のタンパク質またはその断片と、（ｉｉ）抗体またはその断片との融合物が挙げられる。融合タンパク質は、（ｉ）と、種々の異種タンパク質、例えば、無関係のタンパク質由来のシグナル配列、免疫グロブリン重鎖定常領域もしくはかかる領域の一部、タグアミノ酸配列（例えば、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質またはそのバリアント）または親和性精製に有用な配列（例えば、ポリヒスチジン、例えばヘキサヒスチジン、ＦＬＡＧタグまたはエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ））のいずれかとの融合物でもあり得る。
【００３７】
抗体断片（抗原結合性抗体断片を含む）もまた対象とされる。かかる断片は、本願に開示される抗体のいずれかの断片であり得る。本明細書で使用する場合、用語「抗体断片」とは、（ａ）抗原結合性断片または（ｂ）Ｆｃ受容体と相互作用できる抗体のＦｃ部分を指す。抗原結合性断片は、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片であり得る。ｓｃＦｖ断片は、そのｓｃＦｖが誘導される抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方を含む単一のポリペプチド鎖である。さらに、二重特異性抗体［Ｐｏｌｊａｋ（１９９４年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２巻（１２号）：１１２１〜１１２３頁；Ｈｕｄｓｏｎら（１９９９年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３巻（１〜２号）：１７７〜１８９頁］および細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）［Ｈｕｓｔｏｎら（２００１年）Ｈｕｍ．  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １０巻（３〜４号）：１２７〜１４２頁；Ｗｈｅｅｌｅｒら（２００３年）Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ８巻（３号）：３５５〜３６６頁；Ｓｔｏｃｋｓ（２００４年）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ  ９巻（２２号）：９６０〜９６６頁］は、産生され得る組換えタンパク質の例である。
【００３８】
標的タンパク質は、必要に応じて標的タンパク質の１つまたは複数のポリペプチド鎖をコードする１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つの）発現ベクター中の、１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つの）核酸によってコードされ得る。したがって、例えば、抗体または抗体の抗原結合性断片の両方の鎖（例えば、軽鎖および重鎖またはその一方もしくは両方の断片）は、単一の発現ベクター中の単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によって、または単一の発現ベクターもしくは２つの別々の発現ベクターのいずれか中の２つのＯＲＦによって発現され得る。したがって、抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含有する抗体ｓｃＦＶは、単一のＯＲＦによって一般にコードされる。その一方、ＩｇＧ抗体全体、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片の軽鎖および重鎖は、各々一般に（必ずとは限らない）別々の発現ベクター中にある２つの別々の核酸内の別々のＯＲＦによって最も一般に（これも必ずとは限らない）発現される。抗体および抗体の抗原結合性断片について上記した同じ原理が、１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つの）非同一ポリペプチド鎖から構成される他のタンパク質にあてはまると理解される。
【００３９】
標的タンパク質はまた、ポリマー、キャリア、アジュバント、免疫毒素または検出可能な（例えば、蛍光、発光もしくは放射性）部分のうち１つまたは複数に連結され得る。例えば、組換えタンパク質は、小さいタンパク質の分子量を増加させるためおよび／または循環滞留時間を増加させるために使用され得る、ポリエチレングリコールに連結され得る。
遺伝子操作された細胞
【００４０】
本明細書に記載される遺伝子操作された細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞）は、ｐＹＰＳ１活性およびｐＹＰＳ２活性における欠損を含有する。例えば、かかる遺伝子操作された細胞は、検出可能なレベルの機能的ｐＹＰＳ１および／または機能的ｐＹＰＳ２を産生しない場合がある。かかる欠損は、例えば、少なくとも２つの内因性ヤプシン遺伝子、例えば、それぞれｐＹＰＳ１およびｐＹＰＳ２をコードするＹＰＳ１（Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ参照番号ＹＡＬＩ０Ｅ１０１７５ｇ；遺伝子ＩＤ：２９１２５８９）およびＹＰＳ２（Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ参照番号ＹＡＬＩ０Ｅ２２３７４ｇ；遺伝子ＩＤ：２９１２９８１）を欠失または破壊することによって、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞において生成され得る。ｐＹＰＳ１およびｐＹＰＳ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３および配列番号４に示される（図１Ｂを参照のこと）。それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿５０３７６８．１、ＧＩ：５０５５２７１６およびＸＰ＿５０４２６５．１、ＧＩ：５０５５３７０８もまた参照のこと。
【００４１】
相同組換えは、内因性遺伝子を破壊するために使用され得る。例えば、「遺伝子置換」ベクターは、選択可能なマーカー遺伝子を含むように、構築され得る。この選択可能なマーカー遺伝子は、５’末端および３’末端の両方において、相同組換えを媒介するのに十分な長さの遺伝子の一部分に作動可能に連結され得る。この選択可能なマーカーは、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２およびＨＩＳ３遺伝子を含む、宿主細胞の栄養要求性を補完するか、または抗生物質耐性を提供するかのいずれかである、任意の数の遺伝子のうち１つであり得る。他の適切な選択可能なマーカーには、酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を付与するＣＡＴ遺伝子、またはβ−ガラクトシダーゼの発現に起因する青色コロニーを生じるｌａｃＺ遺伝子が挙げられる。次いで、遺伝子置換ベクターの線形化されたＤＮＡ断片が、当該分野で周知の方法を使用して細胞中に導入される（以下を参照のこと）。ゲノム中への線状断片の組込みおよび遺伝子の破壊は、選択マーカーに基づいて決定され得、例えばサザンブロット分析によって検証され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子の破壊は、機能的ｐＹＰＳ１をコードする検出可能なレベルのｍＲＮＡ分子および機能的ｐＹＰＳ２をコードする検出可能なレベルのｍＲＮＡ分子を産生しない、遺伝子操作された株を生じる。
選択におけるその使用に続いて、選択可能なマーカーは、例えばＣｒｅ−ｌｏｘＰ系によって、宿主細胞のゲノムから除去され得る（例えば、Ｇｏｓｓｅｎら（２００２年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３６巻：１５３〜１７３頁および米国特許出願公開第２００６００１４２６４号を参照のこと）。マーカー除去のプロセスは、「キュアリング（ｃｕｒｉｎｇ）」と呼ばれる。
【００４２】
あるいは、遺伝子置換ベクターは、破壊される遺伝子の一部分を含むように構築され得、この一部分は、任意の内因性遺伝子プロモーター配列を欠いており、遺伝子のコード配列をコードしないか、または遺伝子のコード配列の不活性な断片をコードする。「不活性な断片」は、その遺伝子の全長コード配列から産生されるタンパク質の活性の、例えば約１０％未満（例えば、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満または０％）を有するタンパク質をコードする、遺伝子の断片である。遺伝子のかかる一部分は、既知のプロモーター配列が遺伝子配列に作動可能に連結されないが、終止コドンおよび転写終結配列がその遺伝子配列のこの一部分に作動可能に連結されるように、ベクター中に挿入される。このベクターは、引き続いて、その遺伝子配列のこの一部分において線形化され得、細胞中に形質転換され得る。次いで、単一の相同組換えによって、この線形化されたベクターは、この遺伝子の内因性同等物中に組み込まれる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ｐＹＰＳ１活性および／またはｐＹＰＳ２活性を有するタンパク質の機能的発現に干渉するＲＮＡ分子が、導入または発現され得る。ＲＮＡ分子には、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ｐＹＰＳ１活性および／またはｐＹＰＳ２活性を有するタンパク質をコードする１つまたは複数の内因性遺伝子のプロモーターエレメントまたはエンハンサーエレメントは、それらがコードするタンパク質の発現が変更されるように、変更され得る。
【００４５】
遺伝子操作に適した細胞には、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞などのＹａｒｒｏｗｉａ細胞および他の関連の二相性酵母細胞が挙げられる。かかる細胞は、本明細書で特定した遺伝子操作の前に、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）などの、種々の商業的供給源および研究資源施設から取得され得る。一実施形態では、ｐｏ１ｄ株のＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが使用される。このｐｏ１ｄ株は、受託番号１３９の下で、Ｃｅｎｔｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｅｎｎｅ、ＣＬＩＢカルチャーコレクションにおいて入手可能である。このｐｏ１ｄ株では、分泌されたアルカリ性細胞外プロテアーゼＡＥＰ（遺伝子ＸＰＲ２）は欠失されており、酸性細胞外プロテアーゼＡＸＰ１（遺伝子ＡＸＰ）は、遺伝子破壊および標的遺伝子の挿入によって欠失され得るか、または発酵培地のｐＨによって制御され得る。
【００４６】
本明細書に記載される遺伝子操作された細胞は、他のアスパラギン酸プロテアーゼ、例えば、プロテイナーゼＡ（ＰＥＰ４遺伝子によってコードされる）などの、ＥＣ３．４．２３の下に分類されるアスパラギン酸プロテアーゼにおける欠損をさらに含み得る。
【００４７】
本明細書に記載される遺伝子操作された細胞は、標的タンパク質（例えば、抗体などの上記標的タンパク質）をコードする核酸をさらに含み得る。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書で相互交換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびＤＮＡ（またはＲＮＡ）含有核酸アナログを含む、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を指す。核酸は、任意の３次元構造を有し得る。核酸は、二本鎖または一本鎖（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖）であり得る。核酸の非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボゾームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー、ならびに核酸アナログが挙げられる。「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で相互交換可能に使用され、長さまたは翻訳後修飾にかかわらず、任意のペプチド結合したアミノ酸の鎖を意味する。
【００４８】
「単離された核酸」とは、天然に存在するゲノム（例えば酵母ゲノム）中のその核酸の一方の側または両側に通常は隣接している核酸を含む、天然に存在するゲノム中に存在する他の核酸分子から分離された核酸を指す。用語「単離された」は、核酸に関して本明細書で使用する場合、任意の天然に存在しない核酸配列もまた含むが、これは、かかる天然に存在しない配列が、天然には見出されず、天然に存在するゲノムにおいて直接接続する配列（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有さないからである。
【００４９】
単離された核酸は例えばＤＮＡ分子であり得、但し、それは天然に存在するゲノム中のそのＤＮＡ分子に直接隣接していることが通常は見出される核酸配列の１つが除去されているか存在しないことを条件とする。したがって、単離された核酸には、他の配列とは独立して別々の分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、化学合成された核酸、あるいはｃＤＮＡまたはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生されるゲノムＤＮＡ断片）、ならびにベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、任意のパラミクソウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）中に組み込まれたＤＮＡ、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれたＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、単離された核酸には、ハイブリッドまたは融合核酸の一部であるＤＮＡ分子などの、操作された核酸を挙げることができる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリー、またはゲノムＤＮＡ制限消化物を含有するゲル（例えば、電気泳動ゲル）スライス内の、数百〜数百万の他の核酸のうちに存在する核酸は、単離された核酸とはみなされない。
【００５０】
用語「外因性」とは、核酸および特定の宿主細胞に関して本明細書で使用する場合、天然に見出されるその特定の細胞中に存在しない（およびその特定の細胞から取得され得ない）任意の核酸を指す。したがって、天然に存在しない核酸は、宿主細胞中に一旦導入されると、その宿主細胞にとって外因性とみなされる。天然に存在しない核酸は、その核酸が全体として天然に存在しないことを条件として、天然に見出される核酸部分配列または核酸配列の断片を含有し得ることに留意することが重要である。例えば、発現ベクター内の、ゲノムＤＮＡ配列を含有する核酸分子は、天然に存在しない核酸であり、したがって、宿主細胞中に一旦導入されると、その宿主細胞にとって外因性であるが、これは、その核酸分子が全体として（ゲノムＤＮＡ＋ベクターＤＮＡ）、天然に存在しないからである。したがって、全体として天然に存在しない任意のベクター、自己複製プラスミドまたはウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）は、天然に存在しない核酸とみなされる。とすると、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生されるゲノムＤＮＡ断片、ならびにｃＤＮＡは、天然に存在しない核酸とみなされるが、これは、これらが、天然に見出されない別々の分子として存在するからである。とすると、天然に見出されない配置の、プロモーター配列およびポリペプチドコード配列を含有する任意の核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）もまた、天然に存在しない核酸である。天然に存在する核酸は、特定の細胞にとって外因性であり得る。例えば、酵母ｘの細胞から単離された染色体全体は、その染色体が酵母ｙの細胞中に一旦導入されると、酵母ｙの細胞に関して外因性核酸である。
【００５１】
組換え核酸は、スフェロプラスト技術またはホールセル塩化リチウム酵母形質転換法などの種々の方法を使用して、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミドまたはウイルス粒子などの発現ベクターの形態で、細胞中に導入され得る。細胞中へのプラスミドまたは線状核酸ベクターの形質転換に有用な他の方法は、例えば、米国特許第４，９２９，５５５号；Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５巻：１９２９頁；Ｉｔｏら（１９８３年）Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １５３巻：１６３頁；米国特許第４，８７９，２３１号；およびＳｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら（１９８７年）Ｇｅｎｅ  ５９巻：１１５頁に記載されている。エレクトロポレーションおよびＰＥＧ１０００ホールセル形質転換手順もまた、ＣｒｅｇｇおよびＲｕｓｓｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第３章、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．、２７〜３９頁（１９９８年）によって記載されるように使用され得る。
【００５２】
形質転換された酵母細胞は、必要とされる生化学的産物（細胞の栄養要求性に起因する）の非存在下で形質転換後の栄養要求性細胞を培養すること、新たな表現型についての選択および新たな表現型の検出、または形質転換体に含有される耐性遺伝子の非存在下で、酵母に対して毒性の抗生物質の存在下で培養することが含まれるがこれらに限定されない技術を使用して、選択され得る。形質転換体は、例えば、サザンブロットまたはＰＣＲ分析によって評価され得る、ゲノム中への発現カセットの組込みによっても選択および／または検証され得る。
【００５３】
Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞などの細胞中にベクターを導入する前に、これらのベクターは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞において増殖（例えば増幅）され得る。ベクターＤＮＡは、細菌環境からのベクターＤＮＡの精製を生じる当該分野で公知の方法のいずれかによって、細菌細胞から単離され得る。精製されたベクターＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ調製物中にＥ．ｃｏｌｉタンパク質が存在しないことを確実にするために、フェノール、クロロホルムおよびエーテルによって広範に抽出され得る。
【００５４】
組込みベクターは、例えば、米国特許第４，８８２，２７９号中に開示されている。組込みベクターは一般に、少なくとも第１の挿入可能なＤＮＡ断片、選択可能なマーカー遺伝子および第２の挿入可能なＤＮＡ断片の、連続的に配置された配列を含む。第１および第２の挿入可能なＤＮＡ断片は、それぞれ、約２００（例えば、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００または約１０００もしくはそれより長い）ヌクレオチド長であり、形質転換される種のゲノムＤＮＡの一部分に対して相同なヌクレオチド配列を有する。発現のための対象の遺伝子（例えば、標的タンパク質をコードする遺伝子）を含有するヌクレオチド配列は、マーカー遺伝子の前であれ後ろであれ、第１の挿入可能なＤＮＡ断片と第２の挿入可能なＤＮＡ断片との間で、このベクター中に挿入される。組込みベクターは、宿主細胞ゲノム中への対象のヌクレオチド配列の組込みを容易にするために、酵母形質転換の前に線形化され得る。
【００５５】
発現ベクターは、酵母において組換え核酸が発現されるのを可能にする酵母（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓまたは他の関連の二相性酵母種）プロモーターの制御下の、組換え核酸を特徴とし得る。適切な酵母プロモーターには、ＴＥＦ１、ＨＰ４Ｄ、ＧＡＰ、ＰＯＸ２、ＡＤＣ１、ＴＰＩ１、ＡＤＨ２、ＰＯＸおよびＧａｌ１０プロモーター（ｐｒｏｍｔｅｒ）が挙げられる。例えば、Ｍａｄｚａｋら、（２０００年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２巻：２０７〜２１６頁；Ｇｕａｒｅｎｔｅら（１９８２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７９巻（２３号）：７４１０頁を参照のこと。さらなる適切なプロモーターは、例えば、ＺｈｕおよびＺｈａｎｇ（１９９９年）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １５巻（７〜８号）：６０８〜６１１頁ならびに米国特許第６，２６５，１８５号に記載されている。
【００５６】
プロモーターは、構成的または誘導性（条件的）であり得る。構成的プロモーターは、その発現が標準的な培養条件下で一定または実質的に一定であるプロモーターであると理解される。誘導性プロモーターは、１つまたは複数の誘導キューに対して応答性のプロモーターである。例えば、誘導性プロモーターは、化学的に調節され得る（例えば、その転写活性が、化学誘導剤、例えば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属または他の低分子の存在または非存在によって調節されるプロモーター）か、または物理的に調節され得る（例えば、その転写活性が、光または高温もしくは低温などの物理的誘導因子の存在または非存在によって調節されるプロモーター）。誘導性プロモーターはまた、化学的キューまたは物理的キューによってそれ自体が直接調節される１つまたは複数の転写因子によって、間接的に調節され得る。
【００５７】
本明細書に記載される遺伝子操作された細胞は、細胞が標的タンパク質上に所望のＮ−グリカンを産生するような、１つまたは複数のさらなる改変をさらに含み得る。このさらなる改変には、（ｉ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする内因性遺伝子の欠失または破壊；（ｉｉ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質（例えば、内因性または外因性タンパク質）の変異体形態をコードする（すなわち、Ｎ−グリコシル化活性を有する変異体タンパク質を発現する）組換え核酸の導入；（ｉｉｉ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の機能的発現を干渉するＲＮＡ分子の導入または発現；（ｉｖ）Ｎ−グリコシル化活性を有する野生型（例えば、内因性または外因性）タンパク質をコードする（すなわち、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質を発現する）組換え核酸の導入；ならびに（ｖ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする１つまたは複数の内因性遺伝子のプロモーターエレメントまたはエンハンサーエレメントを変更し、したがって、コードされたタンパク質の発現を変更すること、のうち１つまたは複数を挙げることができる。項目（ｉｉ）には、例えば、そうして置き換えられる内因性遺伝子と比較してより高いＮ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子による、内因性遺伝子の置き換えが含まれると理解される。遺伝子操作には、付加（例えば、異種配列）、欠失または置換（例えば、点変異などの変異；保存的または非保存的変異）を有するタンパク質を産生するために、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする内因性遺伝子を変更することもまた挙げられる。変異は、特異的に導入され得る（例えば、部位特異的変異誘発または相同組換え）か、またはランダムに導入され得る（例えば、細胞は、例えばＮｅｗｍａｎおよびＦｅｒｒｏ−Ｎｏｖｉｃｋ（１９８７年）Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０５巻（４号）：１５８７頁に記載されるように、化学的に変異誘発され得る）。改変には、例えばＷＯ  ２０１１／０６１６２９号およびＷＯ  ２０１１／０３９６３４号に記載される改変を挙げることができる。
【００５８】
かかるさらなる遺伝子改変は、（ｉ）遺伝子改変された細胞における１つもしくは複数のＮ−グリコシル化活性の増加、（ｉｉ）遺伝子改変された細胞における１つもしくは複数のＮ−グリコシル化活性の減少、（ｉｉｉ）遺伝子改変された細胞における１つもしくは複数のＮ−グリコシル化活性の局在化もしくは細胞内分布の変化、または（ｉｖ）遺伝子改変された細胞における１つもしくは複数のＮ−グリコシル化活性の比率の変化、のうち１つまたは複数を生じ得る。Ｎ−グリコシル化活性の量の増加は、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つもしくは複数のタンパク質の過剰発現、内因性遺伝子のコピー数の増加（例えば、遺伝子重複）、またはその遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の増加を刺激する内因性遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサーにおける変更に起因し得ることが、理解される。１つまたは複数のＮ−グリコシル化活性の減少は、Ｎ−グリコシル化を変更する活性を有する１つもしくは複数のタンパク質の変異体形態（例えば、ドミナントネガティブ形態）の過剰発現、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つもしくは複数のタンパク質の発現を低減する１つもしくは複数の干渉ＲＮＡ分子の導入もしくは発現、またはＮ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする１つもしくは複数の内因性遺伝子の欠失もしくは破壊に起因し得る。
【００５９】
遺伝子操作された改変は、条件的であり得ることが理解される。例えば、遺伝子は、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系などの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用して、条件的に欠失され得る（例えば、Ｇｏｓｓｅｎら（２００２年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３６巻：１５３〜１７３頁および米国特許出願公開第２００６００１４２６４号を参照のこと）。
【００６０】
Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質には、例えば、外鎖伸長（Ｏｕｔｅｒ  ＣＨａｉｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）（ＯＣＨ１）タンパク質、α−１，２−マンノシダーゼ、アスパラギン結合グリコシル化（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）３（ＡＬＧ３）タンパク質、α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼＩＩ、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ  Ｉ）、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ  ＩＩ）またはガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｇａｌ  Ｔ）が挙げられる。
【００６１】
分泌されたタンパク質上の所望のＮ−グリカンは、例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造のいずれかに基づき得る。例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ベース構造を生成するために、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞は、α−１，２−マンノシダーゼ活性が細胞内区画において増加し、ＯＣＨ１活性が減少するように、操作され得る。Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ベース構造を生成するために、ＡＬＧ３の活性、およびいくつかの実施形態ではＯＣＨ１の活性を減少させ、α−１，２−マンノシダーゼの活性、およびいくつかの実施形態ではα−１，３−グルコシルトランスフェラーゼの活性を増加させる。かかる酵母細胞において産生されるタンパク質のＮ−グリカンプロファイルは、以下の活性のうち１つまたは複数を含有するように細胞をさらに操作することによって、変更され得る：ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ  Ｉ）活性、マンノシダーゼＩＩ（Ｍａｎ  ＩＩ）活性、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ  ＩＩ）活性、グルコシダーゼＩＩ活性およびガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｇａｌ  Ｔ）活性。例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを産生するＹａｒｒｏｗｉａ細胞においてＧｎＴ  Ｉを発現させることにより、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンへのＧｌｃＮＡｃ部分の転移が生じ、その結果、それぞれＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンが産生される。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを産生する細胞では、マンノシダーゼＩＩを発現させることにより、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンからの２つのマンノース残基の除去が生じ、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンが産生される。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを産生する細胞では、ＧｎＴ  ＩＩを発現させることにより、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンへの別のＧｌｃＮＡｃ部分の転移が生じ、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンが産生される。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを産生する細胞においてＧａｌ  Ｔを発現させることにより、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンへのガラクトースの転移が生じ、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンが産生される。いくつかの実施形態では、グルコシダーゼ（例えば、αおよびβサブユニットを発現させることによる）が、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ベース構造の生成を増加させるために発現され得る。
【００６２】
Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、かかる遺伝子を含有する任意の種に由来し得る。Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が取得され得る例示的な真菌種には、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｃａｒｓｏｎｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆａｒｉｎｏｓｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｌｕｘｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｖａｌｉｄａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｓｃａｌａｐｈｉｄａｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｍｐｈｉｘｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｔｌａｎｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｔｍｏｓｐｈａｅｒｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｌａｔｔａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｒｐｏｐｈｉｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｈａｕｌｉｏｄｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｏｒｙｄａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｏｓｓｅｙｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｅｒｇａｔｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｒｕｃｔｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｈａｅｍｕｌｏｎｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｓｅｃｔａｍｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｓｅｃｔｏｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｊｅｆｆｒｅｓｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｙｘｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｉｌｌｅｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｏｌｅｏｐｈｉｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｏｒｅｇｏｎｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｑｕｅｒｃｉｔｒｕｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔｅａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｅｍｎｏｃｈｉｌａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｅｎｕｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｓｕｃｈｉｙａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｉｎｏｌａｂｏｒａｎｔｉｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｏｊａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、  Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｃｈｏｄａｔｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｎｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｓｃｕｌｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｓｅｕｄｏｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｒｏｂｅｒｔｓｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｉｔｏｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｒａｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｅｒｒｉｃｏｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｖａｎｒｉｊｉ、Ｐｓｅｕｄｏｚ���ｍａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｍｄｓｈｕｒｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｘｉｇｕｏｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｌｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｗｉｌｌｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ  ｌｕｄｗｉｇｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｃａｐｓｕｌａｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ、Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ  ｈｏｒｄｅｉ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｏｂｕｌｉｇｅｒａ、Ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒａ  ｓａｉｔｏｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄａｉｒｅｎｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｒｏｓｅｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｉ，Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ、Ｄｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｇｌｏｂｏｓａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｇｌｏｂｏｓｕｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌｏｂｏｓａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ  ｓａｔｕｒｎｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｄｉｓｐｏｒｕａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒａｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｌｌｉｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｏｒｉａｎｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉｍ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｊｏｒ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｓｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｃａｒｓｏｎｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆａｒｉｎｏｓｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｌｕｘｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｓｅｕｄｏｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｒｏｂｅｒｔｓｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ  ｌｕｄｗｉｇｉｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｇｌｏｂｏｓａ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ  ｓａｔｕｒｎｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｌｌｉｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ、または当該分野で公知のもしくは本明細書に記載される任意の他の真菌（例えば、酵母）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
例示的な下等真核生物には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｅｓｉｅｌｌｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｎｄｉｄｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｒｎｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｄｅｆｌｅｃｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｇｌａｕｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｏｉｄｅｓ、  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔａｍａｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓｔｕｓ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒが挙げられるがこれらに限定されないＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの種々の種もまた挙げられる。
【００６４】
Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が取得され得る例示的な原生動物属には、Ｂｌａｓｔｏｃｒｉｔｈｉｄｉａ、Ｃｒｉｔｈｉｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｒｙｐａｎｕｍ、Ｈｅｒｐｅｔｏｍｏｎａｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｌｅｐｔｏｍｏｎａｓ、Ｐｈｙｔｏｍｏｎａｓ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ（例えば、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉｉ、Ｔ．ｇａｍｂｉｅｎｓｅ、Ｔ．ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ、およびＴ．ｃｒｕｚｉ）、ならびにＷａｌｌａｃｅｉｎａが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
例えば、ＧｎＴ  Ｉをコードする遺伝子は、ヒト（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ受託番号Ｐ２６５７２）、ラット、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、マウスまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａから取得され得；ＧｎｔＩＩをコードする遺伝子は、ヒト、ラット（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ受託番号Ｑ０９３２６）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓまたはマウスから取得され得；Ｍａｎ  ＩＩをコードする遺伝子は、ヒト、ラット、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、マウス、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ受託番号Ｑ２４４５１）から取得され得；ＧａｌＴをコードする遺伝子は、ヒト（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ受託番号Ｐ１５２９１）、ラット、マウスまたはウシから取得され得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞は、ｐＹＰＳ１活性およびｐＹＰＳ２活性における欠損を有することに加えて、以下の改変のうち１つまたは複数を含み得る。例えば、遺伝子操作された細胞は、ＯＣＨ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＪ５６３９２０）遺伝子またはその遺伝子産物（ｍＲＮＡまたはタンパク質）をさらに欠き得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、ＡＬＧ３（Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号：ＸＭ＿５０３４８８、Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ参照：ＹＡＬＩ０Ｅ０３１９０ｇ）遺伝子またはその遺伝子産物（ｍＲＮＡまたはタンパク質）をさらに欠き得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＡＬＧ６、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号：ＸＭ＿５０２９２２、Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ参照：ＹＡＬＩ０Ｄ１７０２８ｇ）タンパク質をさらに発現（例えば、過剰発現）する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、α−１，２−マンノシダーゼ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＦ２１２１５３）タンパク質をさらに発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩ（例えば、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ．受託番号Ｐ２６５７２）タンパク質をさらに発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、マンノシダーゼＩＩタンパク質またはその触媒ドメイン（例えば、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ．受託番号Ｑ２４４５１）をさらに発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、ガラクトシルトランスフェラーゼＩタンパク質またはその触媒ドメイン（例えば、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ．受託番号Ｐ１５２９１）をさらに発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩＩタンパク質またはその触媒ドメイン（例えば、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ．受託番号Ｑ０９３２６）をさらに発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグルコシダーゼＩＩなどのグルコシダーゼＩＩのアルファサブユニットまたはベータサブユニット（またはアルファサブユニットおよびベータサブユニットの両方）をさらに発現する。遺伝子操作された細胞は、これらの改変の任意の組合せを有し得る。
【００６７】
例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、ＯＣＨ１遺伝子を欠き得、α−１，２−マンノシダーゼ、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩ、マンノシダーゼＩＩおよびガラクトシルトランスフェラーゼＩを発現し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、ＡＬＧ３遺伝子を欠き得、α−１，２−マンノシダーゼ、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩ、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩおよびガラクトシルトランスフェラーゼＩを発現し得る。かかる遺伝子操作された細胞はさらに、α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼを発現し得、ならびに／またはグルコシダーゼＩＩのアルファサブユニットおよびベータサブユニットを発現し得、ならびに／またはＯＣＨ１遺伝子を欠き得る。
【００６８】
かかるタンパク質の１つまたは複数（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）は、異種標的化配列を含有する融合タンパク質であり得る。例えば、α−１，２−マンノシダーゼは、ＨＤＥＬ小胞体（ＥＲ）保有アミノ酸配列を有し得る。Ｎ−グリコシル化活性を有する任意のタンパク質は、ＨＤＥＬ配列を含む融合タンパク質へと操作され得ると理解される。他のタンパク質は、そのタンパク質をゴルジ体に向かわせる異種配列を有し得る。例えば、酵母Ｋｒｅ２ｐ遺伝子によってコードされる最初の１００個のＮ末端アミノ酸、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｍｎｎ２遺伝子によってコードされる最初の３６個のＮ末端アミノ酸（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ．受託番号Ｐ３８０６９）、またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｍｎｎ２ｐ遺伝子によってコードされる最初の４６個のＮ末端アミノ酸が、タンパク質をゴルジに向かわせるために使用され得る。このように、真菌細胞において発現されるタンパク質をコードする核酸は、コードされたタンパク質を細胞内区画に向かわせるための標的化配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。例えば、α−１，２−マンノシダーゼは、ＥＲに向かわせ得るが、ＧｎＴ  Ｉ、ＧｎＴ  ＩＩ、マンノシダーゼおよびＧａｌ  Ｔは、ゴルジに標的化され得る。
【００６９】
標的タンパク質またはＮ−グリコシル化活性を有するタンパク質が、そのタンパク質が発現される細胞とは異なる型の（例えば、異なる種の）細胞である細胞から誘導される実施形態では、このタンパク質をコードする核酸は、対象の特定の細胞における発現のためにコドン最適化され得る。例えば、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ由来の、Ｎ−グリコシル化を有するタンパク質をコードする核酸は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどの酵母細胞における発現のためにコドン最適化され得る。かかるコドン最適化は、対象の細胞におけるタンパク質の発現を増加させるのに有用であり得る。タンパク質をコードする核酸をコドン最適化する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｇａｏら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．（２００４年）２０巻（２号）：４４３〜４４８頁）、Ｋｏｔｕｌａら（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．（１９９１年）９巻、１３８６〜１３８９頁）およびＢｅｎｎｅｔｚｅｎら（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９８２年）２５７巻（６号）：２０３６〜３０３１頁）に記載されている。表１は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのためのコドン使用頻度を示す。データは、５，９６７個のコード配列中に存在する２，９４５，９１９個のコドンから導出した。表１の内容は、ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝２８４５９１のワールドワイドウェブで見出され得るＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅから取得した。
【００７０】
表１
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのコドン使用頻度表
【表１】
2015503338.tif 000008
【００７１】
表のフィールドは、［トリプレット］［頻度：千個当たり］（［数］）として示される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ヒト標的タンパク質が細胞中に導入され得、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つまたは複数の内因性酵母タンパク質が抑制され得る（例えば、欠失または変異され得る）。真菌グリコシル化経路を「ヒト化する」技術は、例えば、Ｃｈｏｉら（２００３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００巻（９号）：５０２２〜５０２７頁；Ｖｅｒｖｅｃｋｅｎら（２００４年）Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂ．  ７０巻（５号）：２６３９〜２６４６頁；およびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ（２００４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２２巻（１１号）：１４１０〜１４１４頁に記載されている。
【００７３】
遺伝子操作が、例えば、タンパク質の発現または外因性タンパク質（内因性タンパク質の変異体形態を含む）の発現の変化を含む場合、遺伝子操作された細胞がそのタンパク質を発現するかどうかを決定するために、種々の技術が使用され得る。例えば、タンパク質をコードするｍＲＮＡまたはタンパク質自体の存在は、それぞれ、例えば、ノーザンブロットもしくはＲＴ−ＰＣＲ分析またはウエスタンブロット分析を使用して検出され得る。Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の細胞内局在化は、細胞成分分画および免疫蛍光を含む種々の技術を使用することによって分析され得る。
【００７４】
標的タンパク質のグリコシル化を検出する方法には、ＤＮＡシーケンサー支援（ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）（ＤＳＡ）、蛍光標識糖質電気泳動法（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＦＡＣＥ）または表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）が挙げられる。例えば、分析は、例えば、糖タンパク質が変性され、次に例えば膜上に固定化される、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを利用し得る。次いで、これらの糖タンパク質は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはβ−メルカプトエタノールなどの適切な還元剤を用いて還元され得る。タンパク質のスルフヒドリル基は、ヨード酢酸などの酸を使用してカルボキシル化され得る。次に、Ｎ−グリカンは、Ｎ−グリコシダーゼＦなどの酵素を使用して、タンパク質から遊離され得る。Ｎ−グリカンは、必要に応じて、還元的アミノ化によって再構成および誘導体化され得る。次いで、誘導体化されたＮ−グリカンは、濃縮され得る。Ｎ−グリカン分析に適した機器には、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７  ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が挙げられる。データ分析は、例えば、ＧＥＮＥＳＣＡＮ（登録商標）３．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施され得る。必要に応じて、単離されたマンノプロテインは、そのＮ−グリカン状態を確認するために、１つまたは複数の酵素でさらに処理され得る。Ｎ−グリカン分析のさらなる方法には、例えば、質量分析法（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、順相、逆相およびイオン交換クロマトグラフィーでの高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、グリカンが標識されていない場合にはパルス電流滴定法を用い、グリカンが適切に標識されている場合にはＵＶ吸光度または蛍光を用いる）が挙げられる。Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔら（２００１年）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１巻（４号）：２７５〜２８１頁およびＦｒｅｉｒｅら（２００６年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  １７巻（２号）：５５９〜５６４頁もまた参照のこと。
【００７５】
本明細書に記載される遺伝子操作された細胞の遺伝子改変のいずれかが、誘導キュー（例えば、化学的キューまたは物理的キュー）の存在に対して誘導性または条件的である場合、この遺伝子操作された細胞は、必要に応じて、核酸の導入の前、その間、またはそれに引き続いて、誘導剤の存在下で培養され得る。例えば、標的タンパク質をコードする核酸の導入後、細胞は、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つまたは複数のタンパク質の発現を促進することが可能な化学的誘導剤に曝露され得る。複数の誘導キューが、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つまたは複数のタンパク質の条件的発現を誘導する場合、細胞は、複数の誘導剤と接触させられ得る。
【００７６】
所望のＮ−グリカンを含むように改変された標的タンパク質は、遺伝子操作された細胞から単離され得る。改変された標的タンパク質は、酵母細胞内で維持され得、細胞溶解の際に放出され得るか、または改変された標的タンパク質は、細胞からのタンパク質の分泌を指示するコード配列（外因性核酸にとってネイティブであるかまたは発現ベクターへと操作されているかのいずれかである）によって提供される機構を介して、培養培地中に分泌され得る。細胞溶解物または培養培地中の改変された標的タンパク質の存在は、そのタンパク質の存在を検出するための種々の標準的なプロトコールによって検証され得る。かかるプロトコールには、変更された標的タンパク質（または標的タンパク質自体）に対して特異的な抗体を用いたイムノブロッティングもしくは放射性免疫沈降、変更された標的タンパク質（または標的タンパク質自体）に対して特異的なリガンドの結合、または改変された標的タンパク質（または標的タンパク質自体）の特異的酵素活性についての試験を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００７７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞から単離された標的タンパク質の少なくとも約２５％が、所望のＮ−グリカンを含有する。例えば、遺伝子操作された細胞から単離された標的タンパク質の少なくとも約２７％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％または少なくとも約９９％が、所望のＮ−グリカンを含有し得る。
【００７８】
いくつかの実施形態では、単離された改変された標的タンパク質は、凍結、凍結乾燥または固定化され得、例えば変更された標的タンパク質が生物学的活性を保持するのを可能にする適切な条件下で保存され得る。
操作された細胞の培養物
【００７９】
本願は、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞のいずれかの、実質的に純粋な培養物もまた提供する。本明細書で使用する場合、遺伝子操作された細胞の「実質的に純粋な培養物」は、培養物中の生存細胞の総数の約４０％未満（すなわち、約３５％未満；約３０％未満；約２５％未満；約２０％未満；約１５％未満；約１０％未満；約５％未満；約２％未満；約１％未満；約０．５％未満；約０．２５％未満；約０．１％未満；約０．０１％未満；約０．００１％未満；約０．０００１％未満；またはさらに少ない）が、遺伝子操作された細胞以外の、例えば細菌細胞、真菌（酵母を含む）細胞、マイコプラズマ細胞または原生動物細胞以外の生存細胞である、細胞の培養物である。この文脈において、用語「約」は、関連する百分率が、特定した百分率を上回るまたは下回る、特定した百分率の１５％パーセントであり得ることを意味する。したがって、例えば、約２０％は、１７％〜２３％であり得る。遺伝子操作された細胞のかかる培養物は、細胞と、増殖培地、保存培地または輸送培地とを含む。培地は、液体、半固体（例えば、ゼラチン質培地）または凍結であり得る。培養物は、液体培地中もしくは半固体培地中／上で増殖している細胞、または凍結保存培地もしくは凍結輸送培地を含む保存培地もしくは輸送培地中で保存もしくは輸送されている細胞を含む。これらの培養物は、培養容器または保存容器または基材（例えば、培養皿、フラスコもしくはチューブまたは保存バイアルもしくは保存チューブ）中に存在する。
【００８０】
本明細書に記載される遺伝子操作された細胞は、例えば、例えばグリセロールまたはスクロースなどの凍結保護剤を含有する緩衝液中での凍結細胞懸濁物として、凍結乾燥細胞として、保存され得る。あるいは、これらの細胞は、例えば、例えば流動床乾燥もしくは噴霧乾燥または任意の他の適切な乾燥方法によって取得された乾燥細胞調製物として、保存され得る。
【００８１】
以下は、本発明の実施の例である。これらは、本発明の範囲を限定すると決して解釈されない。
【実施例】
【００８２】
（実施例１）
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａへの抗体遺伝子の導入
抗ＨＥＲ２抗体重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９巻（１０号）：４２８５〜４２８９頁（１９９２年）；およびＷａｒｄら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７０巻（５号）：２５６７〜２５７６頁（２００４年）から得た。関連するアミノ酸配列は、逆翻訳し、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのためにコドン最適化し、ＧｅｎＡｒｔ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙが合成した。非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域を、可能な場合回避した。最適化プロセスの間に、以下のシス作用性配列モチーフもまた回避した：内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位およびリボゾーム進入部位、ＡＴリッチまたはＧＣリッチな配列ストレッチ、反復配列およびＲＮＡ二次構造ならびに（潜在性の）スプライスドナー部位およびアクセプター部位。
【００８３】
タンパク質の分泌を可能にするために、Ｌｉｐ２タンパク質「プレプロ」シグナルのコード配列（ペプチドリンカー「ＧＧＧ」のコード配列が後に続く）を、軽鎖および重鎖の各々についてコード配列の５’領域に付加した。ＣＡＣＡエンハンサーエレメントもまた、軽鎖および重鎖のコード配列の各々について、開始コドン（ＡＴＧ）に対して５’側に付加した。軽鎖をコードする得られた構築物は、７６９ヌクレオチド長であり、５’から３’へと構築した以下のドメインを含有した：ｃａｃａＡＴＧプレプロシグナル、可変領域（ＶＬ）および定常領域（ＣＬ）。軽鎖（ＬＣ）構築物のヌクレオチド配列を図１Ａ（配列番号１）に示す。コードされたＬＣタンパク質は、２５１アミノ酸長でおよそ２５ｋＤａである。図１Ｃは、ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＬＩＰ２プレプロリーダー配列には下線が付され、ＶＬドメイン配列には２本線で下線が付され
【化７】
2015503338.tif 000009
；Ｃｋ１ドメインには破線で下線が付される
【化８】
2015503338.tif 000010
。
【００８４】
重鎖（ＨＣ）をコードする得られた構築物は、１４８２ヌクレオチド長であり、５’から３’へと構築した以下のドメインを含有した：ｃａｃａＡＴＧプレプロシグナル、可変領域（ＶＨ）および３つの定常領域（ＣＨ１〜３）。「ヒンジ」領域は、ＣＨ１およびＣＨ２にまたがっていた。重鎖構築物のヌクレオチド配列を図１Ａ（配列番号２）に示す。コードされた重鎖タンパク質は、４８６アミノ酸長で、およそ５５ｋＤａである。図１Ｄは、ＨＣのアミノ酸配列を示し、ＬＩＰ２プレプロリーダー配列には下線が付され、ＶＨドメイン配列には２本線で下線が付され
【化９】
2015503338.tif 000011
；ＣＨドメインには破線で下線が付される
【化１０】
2015503338.tif 000012
。
【００８５】
ＨＥＲ２軽鎖をコードする構築物およびＨＥ２重鎖をコードする構築物をそれぞれ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムへの標的化組込み（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）のためにＵＲＡ３遺伝子座またはＬＩＰ２遺伝子座を利用して、ＢａｍＨＩ／ＡｖｒＩＩ断片として、ｐＪＭＥベクターへとクローニングし、それをｐＪＭＥ９２７ＰＴＬｉｐＵｒａ３ｅｘＰＯＸ２プレプロＨｅｒＨＣまたはｐＪＭＥ９２３ＰＴＵｒａＬｅｕ２ＥｘＰＯＸ２プレプロＨｅｒＬＣと呼んだ。トランスポゾンエレメントは使用しなかった。このｐＪＭＥプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのいずれかにおいて複製が可能なシャトルベクターであり、細菌特異的配列およびＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ特異的配列の両方を含有する。プラスミドの細菌部分は、プラスミドｐＨＳＳ６に由来し、細菌複製起点（ｏｒｉ）と、カナマイシンへの耐性を付与するカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）とを含む。プラスミドの組込みカセット部分は、選択可能なマーカー遺伝子（例えば、ＬＥＵ２またはＵＲＡ３）を含有し、発現カセットは、ｈｐ４ｄプロモーターまたはＰＯＸ２プロモーターと、ＬＩＰ２遺伝子のターミネーターとインフレームでαＨＥＲ２軽鎖または重鎖コード配列を挿入するための多重クローニング部位（ＭＣＳ）とから構成された。これらのプラスミドをＮｏｔＩで消化して、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞の形質転換前に組込みカセットを放出させた。
【００８６】
ＮｏｔＩ消化した重鎖発現プラスミドを、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株Ｐｏ１ｄ（（ＭａｔＡ  ｕｒａ３−３０２  ｌｅｕ２−２７０  ｘｐｒ２−３２２）に導入した。ＵＲＡ３遺伝子座への重鎖発現カセットの組込みを、サザン分析によって検証した。抗体全体を発現する株を構築するために、ＮｏｔＩ消化した軽鎖を、重鎖発現株へと導入した。再度、ＬＩＰ２遺伝子座への軽鎖発現カセットの組込みを、サザン分析によって検証した。図２は株の系図を示す。
（実施例２）
抗体の切断部位の同定
【００８７】
重鎖プラスミドおよび軽鎖プラスミドの両方について陽性の形質転換体を、ＳｕｐｅｒＴリッチ培地中で９６時間培養した。４つの異なるクローンの培養物由来の上清を収集し、ウエスタンブロット分析に供した。軽鎖は、マウスにおいて産生されたモノクローナル抗ヒトカッパフリー軽鎖抗体（４Ｃ１１）（製品番号１９３９、ａｂｃａｍ（登録商標））を使用して検出した。重鎖は、マウスにおいて産生されたモノクローナル抗ヒトＩｇＧ（ガンマ鎖特異的）抗体（Ｓｉｇｍａの製品番号Ｉ５８８５）を使用して検出した。軽鎖は、正確な分子量（２５ｋＤａ）で存在したが、二量体化する傾向を示した。重鎖もまた、正確な分子量（５０ｋＤａ）で検出されたが、その大部分は、およそ３２ｋＤａの分子量を有する分解産物として存在した。図３を参照のこと。
【００８８】
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｐｏ１ｄ細胞によって産生された重鎖の分解部位を同定するために、重鎖産物を、プロテインＧクロマトグラフィーを使用して精製し、Ｎ末端ペプチド配列決定に供した。これにより、主な抗体切断が、ＣＨ１ヒンジ領域中のＬｙｓ−Ｌｙｓ結合において生じることが明らかになった。
【００８９】
（実施例３）
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの単一ヤプシンノックアウト株の構築
ヤプシンプロテアーゼが重鎖の分解を担うかどうかを決定するために、単一ヤプシンノックアウトＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株を生成した。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｙｌ）の以下のヤプシン３様遺伝子の配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙデータベース（．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのワールドワイドウェブ）から取得した：
ＹＰＳ１：ＹＡＬＩ０Ｅ１０１７５ｇ  遺伝子ＩＤ：２９１２５８９、ｐＹＰＳ１をコードする
ＹＰＳ２：ＹＡＬＩ０Ｅ２２３７４ｇ  遺伝子ＩＤ：２９１２９８１、ｐＹＰＳ２をコードする
ＹＰＳ３：ＹＡＬＩ０Ｅ２０８２３ｇ  遺伝子ＩＤ：２９１１８３６、ｐＹＰＳ３をコードする
ＹＰＳ４：ＹＡＬＩ０Ｄ１０８３５ｇ  遺伝子ＩＤ：２９１０４４２、ｐＹＰＳ４をコードする
ＹＰＳ５：ＹＡＬＩ０Ａ１６８１９ｇ  遺伝子ＩＤ：２９０６３３３、ｐＹＰＳ５をコードする
ＹＰＳＸ：ＹＡＬＩ０Ｃ１０１３５ｇ  遺伝子ＩＤ：７００９４４５、ｐＹＰＳＸをコードする
ＹＰＳ７：ＹＡＬＩ０Ｅ２４９８１ｇ  遺伝子ＩＤ：２９１２６７２、ｐＹＰＳ７をコードする
ＹＰＳＸｐ：ＹＡＬＩ０Ｅ３４３３１ｇ  遺伝子ＩＤ：２９１２３６７、ｐＹＰＳＸｐをコードする
【００９０】
各ヤプシンオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）標的配列に隣接するプロモーター（「Ｐ」）領域およびターミネーター（「Ｔ」）領域を、プライマーの対を使用して増幅して、Ｐ断片およびＴ断片を取得した。次いで、このＰ断片およびＴ断片を、独自のクローニング（制限）部位（ＩＳｃｅ１およびＩＣｅｕ１）を含み、引き続くＰＣＲの間にＰ断片とＴ断片とが融合されるのを可能にするプライマー対を使用して増幅し、次いで、ＯＸＹＰプラスミドのＮｏｔＩ  Ｅ．ｃｏｌｉ部分へとクローニングした。こうして、各最終破壊構築物（カセット）は、各末端にＮｏｔＩ制限部位を含有し、Ｐ断片とＴ断片との融合領域は、上記の２つのクローニング（制限）部位を含み、１つのクローニング部位はＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａマーカーの挿入のため、および１つのクローニング部位は、対象の遺伝子に作動可能に連結したプロモーターの挿入のためであり、その結果、これらの破壊構築物は、標的化組込み構築物としても使用できた。この破壊構築物を、図４に図式的に示す。
【００９１】
各ヤプシン破壊カセットを、上記Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ｐｏ１ｄ抗体発現株へと独立して形質転換した。遺伝子座の破壊を、サザンブロットまたはＰＣＲ分析によって検証した。単一ヤプシン欠失株を、ｙｐｓ１、ｙｐｓ２、ｙｐｓ３、ｙｐｓ４、ｙｐｓ５およびｙｐｓ７について取得した。
【００９２】
個々の破壊株を示す独自のクローンならびに非ヤプシン欠失対照株（ｃｔｒｌ）を、振盪フラスコ中のＳｕｐｅｒＴリッチ培地中で別々に増殖させた。培養上清試料を、接種の４８時間後および９６時間後に採取し、ウエスタンブロット分析に供して、マウスにおいて産生されたガンマ鎖特異的抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｉ５８８５、モノクローナル抗ヒトＩｇＧ）を使用して重鎖分解を評価した。交差反応性は軽鎖では観察されなかった。Δｙｐｓ２、Δｙｐｓ３、Δｙｐｓ５、Δｙｐｓ７およびΔｙｐｓｘ欠失株について、対照と比較した、タンパク質分解性分解における低減は、４８時間目にも９６時間目にも観察されなかった。図５の上のパネルを参照のこと。
【００９３】
Δｙｐｓ１欠失株およびΔｙｐｓ４欠失株について、各株の２つのクローンを、振盪フラスコ中のＳｕｐｅｒＴ培地中で増殖させ、培養上清試料を、接種の９６時間後に採取し、対照株と比較して重鎖分解について評価した。Δｙｐｓ１株について、Δｙｐｓ４および対照株の両方と比較して低減した量の３２ｋＤａの分解産物が検出されたが、広範な分解は依然として存在した。図５の下のパネルを参照のこと。
【００９４】
Δｙｐｓ１欠失株における分解をさらに評価するために、この株を、ｓｕｐｅｒＴ培地中で増殖させ、培養上清試料を、接種の２４時間後、４０時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後および９６時間後に採取し、対照株と比較して重鎖分解を評価した。全ての時点について、３２ｋＤａのタンパク質分解産物の低減が、対照株と比較して観察された。より後の時点では、より多くの分解産物が検出されたが、対照株において観察された分解よりも依然として低いレベルのままであった。これらの結果は、Δｙｐｓ１株においてタンパク質分解活性の部分的低減が存在したことを示している。
【００９５】
２つのヤプシン遺伝子の破壊がタンパク質分解をさらに低減し得るかどうかを決定するために、第２のヤプシン遺伝子を、Δｙｐｓ１背景において破壊した。以下の４つの株を生成した：Δｙｐｓ１Δｙｐｓ２、Δｙｐｓ１Δｙｐｓ３、Δｙｐｓ１Δｙｐｓ４およびΔｙｐｓ１Δｙｐｓ７。遺伝子の正確な破壊を、サザン分析によって検証した。
【００９６】
Δｙｐｓ１Δｙｐｓ２、Δｙｐｓ１Δｙｐｓ３およびΔｙｐｓ１Δｙｐｓ４株ならびに対照株（非ヤプシン欠失、Δｙｐｓ１、およびΔｙｐｓ１  ＵＲＡ栄養要求性）を培養した。上清試料を、接種の９６時間後に採取し、ウエスタンブロッティングに供した。図６に示すように、重鎖分解産物は、Δｙｐｓ３．１Δｙｐｓ３．２株では観察されなかった。しかし、全長重鎖産物（５０ｋＤａ）の量における全体的な増加は観察されなかった。Δｙｐｓ１Δｙｐｓ３、Δｙｐｓ１Δｙｐｓ４および対照株において、重鎖分解産物が検出された。
【００９７】
活性な分泌された抗体の量を、ＥＬＩＳＡを介して、Δｙｐｓ１Δｙｐｓ２株において決定し、非破壊株の量と比較した。分泌された機能的産物の総量の増加は検出されなかった。
【００９８】
Δｙｐｓ１Δｙｐｓ２株から誘導した、プロテインＧ精製された抗体は、銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、重鎖分解産物の完全な非存在を示した。図７を参照のこと。
他の実施形態
【００９９】
本発明を、その詳細な説明と併せて記載してきたが、上記の説明は例示を意図し、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定しない。他の態様、利点および改変は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１Ａ】
2015503338.tif 000013
【図１Ｂ】
2015503338.tif 000014
【図１Ｃ】
2015503338.tif 000015
【図１Ｄ−１】
2015503338.tif 000016
【図１Ｄ−２】
2015503338.tif 000017
【図２】
2015503338.tif 000018
【図４】
2015503338.tif 000019
【図５】
2015503338.tif 000020
【図３】
2015503338.tif 000021
【図６】
2015503338.tif 000022
【図７】
2015503338.tif 000023
【配列表】
2015503338000001.app
【国際調査報告】
2015503338.tif 000024
2015503338.tif 000025
2015503338.tif 000026