(57)【要約】本発明は、（ａ）一層の人工軟骨組織、および（ｂ）一層の人工骨組織であって、構造付与性スキャフォールドおよび骨髄構造を含む前記人工骨組織を含み、前記一層の人工軟骨組織が前記一層の人工骨組織の少なくとも一方の面に接触する３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイド、ならびにその使用および作製方法を対象とする。【選択図】無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）一層の人工軟骨組織、および
（ｂ）一層の人工骨組織であって、構造付与性スキャフォールドおよび骨髄構造を含む前記人工骨組織
を含み、前記一層の人工軟骨組織が前記一層の人工骨組織の少なくとも一方の面に接触する、３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
【請求項２】
前記人工軟骨組織が間葉系前駆細胞を用いて、好ましくはＣＤ１０５+、ＣＤ１０６+、ＣＤ４４+、ＣＤ７３+、ＣＤ９０+およびＣＤ１３+である細胞のうちの少なくとも５０％を含む、または前記細胞から成る間葉系前駆細胞を用いて調製され、より好ましくは単離された初代軟骨細胞から調製される、請求項１に記載の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
【請求項３】
前記人工軟骨組織が請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法によって調製される、請求項１または２に記載の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
【請求項４】
前記人工骨組織の骨髄構造が前記構造付与性スキャフォールドに間葉系幹細胞を播種することにより調製される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
【請求項５】
前記人工骨組織の骨髄構造が、前記構造付与性スキャフォールドに間葉系幹細胞を播種し、そして、前記構造付与性スキャフォールド上で間葉系幹細胞を２〜１０日間培養した後に造血幹細胞を添加することにより調製される、請求項４に記載の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
【請求項６】
前記人工骨組織の構造付与性スキャフォールドが生物性材料または非生物性材料を含む、または生物性材料もしくは非生物性材料から成る、請求項１〜５のいずれか一項に記載の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
【請求項７】
前記人工骨組織の構造付与性スキャフォールドが３Ｄセラミックスキャフォールドを含む、または３Ｄセラミックスキャフォールドから成る、請求項１〜６のいずれか一項に記載の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドを作製する方法であって、
‐構造付与性スキャフォールドに間葉系幹細胞を播種するステップ、
‐前記構造付与性スキャフォールド上で前記間葉系幹細胞を２〜１０日間培養するステップ、
‐骨髄構造を植えつけられた構造付与性スキャフォールドを含む一層の人工骨組織を調製するために、前記構造付与性スキャフォールド上の前記間葉系幹細胞に造血幹細胞を添加し、そして、その結果の混合物を少なくとも５日間培養するステップ、
‐請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法によって調製された人工軟骨組織を供給するステップ、および
‐前記一層の人工骨組織の少なくとも一方の面に前記人工軟骨組織の層を配置するステップ
を含む前記方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドを含む移植物。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドまたは請求項９に記載の移植物、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１１】
軟骨組織または骨組織の特性を調節する物質をインビトロでスクリーニングするための方法であって、
‐請求項１〜７のいずれか一項に記載の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドの試料を提供するステップ、
‐前記の各試料を複数の部分に分割するステップ、
‐スクリーニングを受ける物質と共に少なくとも１つの部分を培養するステップ、および
‐スクリーニングを受ける前記物質と共に培養されなかった別の部分について測定されたパラメーターと前記の処理された部分について測定されたパラメーターを比較するステップ
を含む前記方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの培地供給用貯留槽、請求項１〜７のいずれか一項に記載の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドを収容する少なくとも１つの器官収容空洞を含む少なくとも１つの器官成長区画を含み、前記培地供給用貯留槽がマイクロ流体供給チャンネルによって前記の少なくとも１つの器官成長区画に連結されている自立型３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドオンチップ装置。
【請求項１３】
軟骨形成細胞凝集体を調製する方法であって、
（ａ）間葉系前駆細胞を供給するステップ、および
（ｂ）前記間葉系前駆細胞を非接着性条件下で培養して軟骨形成細胞凝集体を形成するステップ
を含む前記方法。
【請求項１４】
前記間葉系前駆細胞がＣＤ１０５+、ＣＤ１０６+、ＣＤ４４+、ＣＤ７３+、ＣＤ９０+およびＣＤ１３+である細胞のうちの少なくとも５０％を含む、または前記細胞から成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記間葉系前駆細胞が単離された初代軟骨細胞を含む、または単離された初代軟骨細胞から成る、請求項１３または１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
多数の疾患が関節軟骨における退行性変化または骨髄における誤って導かれた分化過程と関連を有する。筋骨格系疾患はドイツにおいて心血管系疾患および消化器系疾患に次ぐ３番目に疾患の治療に最もコストがかかる要因である。当該疾患の治療の成功にとっての必要条件のうちの１つは、これらの疾患の根底にある、またはこれらの疾患と関係がある骨髄における細胞過程を理解することである。それで、例えば、患者の造血系の置換により白血病を治療することが可能である。しかしながら、リウマチ性関節炎または紅斑性狼瘡のような自己免疫疾患も骨髄の特別なニッチにある長寿命の形質細胞およびメモリーＴ細胞によって制御を受ける。
【０００２】
骨髄は特に長骨の内腔に位置する多機能性で多細胞性の組織である。その組織は、軟骨内骨化の状況下でそれらの長骨が発生するおよそ４か月目の胚発生の間に発生する。骨髄は、海綿骨から形成される多孔性構造体と壁の薄い血管である多数の骨髄洞様毛細血管が広がった特別な結合組織を特徴とする。骨髄の主要な機能のうちの１つは造血系の造血細胞の分化に適切な環境を提供することである。造血幹細胞（ＨＳＣ）はこれらの分化過程の出発点であり、造血幹細胞は骨髄の海綿骨構造体内の造血幹細胞ニッチに未分化状態で存在する。造血幹細胞ニッチは機能的に異なる２つのサブタイプに分類される。骨芽細胞ニッチでは、造血性ＨＳＣは特殊化した骨芽細胞と様々な接着分子およびシグナル伝達分子を介して相互作用し、それによってＨＳＣは球形で非増殖性の状態に保たれる。ＨＳＣが動員されると、それらの幹細胞は洞様毛細血管に位置する血管幹細胞ニッチに移動し、そこでそれらのＨＳＣは細胞増殖の増加を示す。骨髄における造血幹細胞ニッチについての現在の理解によると、幹細胞ニッチ系の最小単位は海綿骨の洞様毛細血管に位置する骨芽細胞ニッチと血管性ニッチの組合せから形成される。幹細胞ニッチの機能性構造体とは別に、現在の研究により骨髄は免疫記憶の本拠地として開示されている。間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は形質細胞およびメモリーＴ細胞の生存ニッチの細胞性構成要素として機能する。まとめると、骨髄の生物学的機能性はＨＳＣ、ＭＳＣ、内皮細胞および骨芽細胞のような多数の細胞および区切られた空間の中でのそれらの細胞の適切な相互作用に左右される。
【０００３】
関節の硝子軟骨は、圧力に対する高い弾性および非常に平らな表面というその特性のため、抵抗が少ない関節の動きを可能とする。この組織の主要部分は複数の細胞外マトリックスタンパク質から形成され、細胞性構成物である軟骨細胞はこのマトリックス中に分離してまたは小集団（軟骨単位）でまばらに埋め込まれている。神経線維と血管が無いこと、およびその結果であるその組織への酸素と栄養の供給が少ないことによって、独特な微小環境が軟骨細胞に対して形成される。軟骨組織は何層にも細分化され得、その中では最上層はマトリックス分子の水平方向の配向のために摩擦を弱めることができ、そして、下にある中間層と下層は垂直方向の配向のために動くことから生じる衝撃力を吸収することができる。軟骨細胞は間充織凝縮の初期過程の軟骨内骨化の間に早くも出現し、これらの細胞は骨端の間での骨成長に大いに寄与するが、関節内の硝子軟骨組織は胚発生の非常に遅い時期にしか発生しない。完全に分化した、完全に機能する軟骨の層は、その組織の機械的刺激の開始により出生後にのみ形成される。成体では、軟骨組織の恒常性維持は機械的負荷の種類と強度、および埋め込まれている軟骨細胞の微小環境の種類と強度に非常に左右される。
【０００４】
骨と軟骨組織のインビトロモデルと試験系を開発および提供する多数の試みがなされてきた。しかしながら、これらのアプローチは骨または軟骨組織のどちらかを別々に提供することを対象とする。したがって、これらのモデルは、骨、骨髄および軟骨組織の発生と恒常性維持が生じる自然環境を部分的および不完全にしか表していない。
【０００５】
本発明の目的は先行技術の１つ以上の問題点を克服することである。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１Ａは、脱分化軟骨細胞が間葉系幹細胞の特徴を提示することを示す図である。一群の間葉系表面マーカーについて脱分化軟骨細胞を染色した。それらの細胞はＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１３について陽性であり、造血性マーカーＣＤ３４およびＣＤ４５について陰性であった（１つの代表的な実験が示される、ｎ＝６）。図１Ｂ乃至１Ｄは、脱分化軟骨細胞が間葉系幹細胞の特徴を提示することを示す図である。脂肪生成分化。脂肪生成培地で脱分化軟骨細胞を２８日間処理した。脂肪細胞分化を光学顕微鏡観察とオイルレッド‐Ｏ染色により評価した。（Ｂ）単層細胞の陰性対照、無染色；（Ｃ）単層細胞の陰性対照、オイルレッド‐Ｏ染色；（Ｄ）脂質が充満した油滴の細胞質での形成によって２８日後の脂肪細胞分化が証明される；分化した脂肪細胞における脂質が充満した油滴のオイルレッド‐Ｏ染色（１つの代表的な実験が示される、ｎ＝６）。図１Ｆ及び１Ｇは、脱分化軟骨細胞が間葉系幹細胞の特徴を提示することを示す図である。骨芽細胞分化。骨形成培地で脱分化軟骨細胞を２８日間処理した。フォン・コッサ染色によって分化の成功を評価した。（Ｅ）陰性対照の染色；（Ｆ）石灰化マトリックスの蓄積がフォン・コッサ染色によって示される；（１つの代表的な実験が示される、ｎ＝６）；バー＝５０μｍ。
【図２】図２は、低結合性プレートでの凝縮動態を示す図である。細胞が結合することができない、特別に処理した培養皿の表面をこの３Ｄ培養系において使用する。低結合性プレートに細胞懸濁液（１０６細胞／ｍｌ）を供給した。細胞は３Ｄ培養の誘導後直ちに互いに相互作用し始める；（１つの代表的な実験が示される、ｎ＝６）。
【図３】図３は、凝縮期における軟骨形成関連遺伝子の遺伝子発現動態を示す図である。単層発現と比較される３Ｄ培養誘導後の最初の９０時間または７２時間での遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲ分析。ハウスキーピング遺伝子比が対数目盛、マン・ホイットニーのＵ検定による統計分析（ｎ＝６）で提示されている。
【図４】図４は、低結合性培養の２８日後における軟骨形成関連遺伝子の遺伝子発現を示す図である。単層発現と比較される３Ｄ培養誘導から２８日後における遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲ分析。ハウスキーピング遺伝子比が対数目盛、マン・ホイットニーのＵ検定による統計分析（ｎ＝６）で提示されている。
【図５】図５Ａ及び５Ｂは、差次的に発現した遺伝子の分類を示す図である。それぞれ［Ａ］凝縮期（２４時間）と［Ｂ］分化期（２８日）の独立した２つのマイクロアレイ実験の評価。選択された遺伝子オントロジー群内の発現上昇した遺伝子と発現低下した遺伝子の数がパンサー遺伝子オントロジー・データベースに従って示される。
【図６】図６は、ＰＴＸ処理細胞の細胞凝縮を示す図である。脱分化軟骨細胞に対して凝縮過程の間に３つの異なる濃度で百日咳毒素を投与した。凝縮挙動に関してＰＴＸ処理による重大な変化は観察されなかった（１つの代表的な実験が示される、ｎ＝３）。
【図７】図７は、凝縮過程の間の細胞相互作用と半凝集体結合を示す図である。３Ｄ低結合性培養により誘導される凝縮；培養誘導から１２時間後に網状結合が現れる；（１つの代表的な実験が示される、ｎ＝６）。
【図８】図８は、本発明の自立型３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドオンチップ装置の模式図を示す図である。
【図９】図９Ａは、３Ｄセラミック培養系におけるＭＳＣの挙動を示す図である。ニッチＥＣＭ成分の免疫組織化学と２光子顕微鏡観察。（ｉ）Ｉ型コラーゲン、（ｉｉ）フィブロネクチンおよび（ｉｉｉ）インテグリン４ａは（ａ）培養第１日と（ｂ）培養第７日の間に発現が高い。（スケールバー：１００μｍ）。図９Ｂは、３Ｄセラミック培養系におけるＭＳＣの挙動を示す図である。３Ｄ培養の２週間後のＭＳＣ（ｉ、ｉｉｉ）と海綿骨（ｉｉ、ｉｖ）の間の構造的類似性を示すＳＥＭ画像撮影（スケールバー：１０μｍ）。図９Ｃは、３Ｄセラミック培養系におけるＭＳＣの挙動を示す図である。未播種セラミック（ｉｉ、ｉｖ）と比べた、陽性フォン・コッサ染色（ｉ）およびアリザリンレッド染色（ｉｉｉ）によって視覚化された３Ｄ培養の１週間後のＭＳＣの散発的骨形成性分化。図９Ｄは、３Ｄセラミック培養系におけるＭＳＣの挙動を示す図である。単層と比較した本共培養系における公知のニッチ分子の１週間後と４週間後のリアルタイムＰＣＲ分析（ｎ＝３、エラーバー：平均値のＳＤ、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１０】図１０Ａは、ＨＳＰＣの生存と表現型を示す図である。ＨＳＰＣは本３Ｄ共培養系において播種後（ｉ）１週間、（ｉｉ）２週間、（ｉｉｉ）４週間および（ｉｖ）８週間生存し、蛍光顕微鏡観察により視覚化される。ＭＳＣ細胞核をＤＡＰＩで青色に対比染色する。（スケールバー：１００μｍ）。図１０Ｂ乃至１０Ｄは、ＨＳＰＣの生存と表現型を示す図である。３Ｄ共培養系および伝統的共培養系における初期ＨＳＰＣ（ＣＤ３４+ＣＤ３８-）および分化ＨＳＰＣ（ＣＤ３４+ＣＤ３８+）の（Ｂ）代表的なＦＡＣＳプロットおよび（Ｃ、Ｄ）定量（ｎ＝８、エラーバー：平均値のＳＤ、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１１】図１１Ａは、ＨＳＰＣの増殖を示す図である。異なる培養系におけるＨＳＰＣの差次的増殖を示すＣＦＳＥ‐ＦＡＣＳ分析の代表的なヒストグラム。緩慢増殖性細胞画分（右）と急速増殖性細胞画分（左）が破線によって線引きされる。図１１Ｂは、ＨＳＰＣの増殖を示す図である。４種の培養系における緩慢増殖性細胞の定量。図１１Ｃ乃至１１Ｅは、ＨＳＰＣの増殖を示す図である。培養から１週間後、２週間後、および４週間後における各培養系の緩慢増殖性細胞画分と急速増殖性細胞画分の中の初期ＨＳＰＣ（ＣＤ３４+ＣＤ３８-）の定量（ｎ＝６、エラーバー：平均値のＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１２】図１２Ａ乃至１２Ｃは、ＨＳＰＣの生存度と機能性を示す図である。３Ｄ共培養系および伝統的共培養系におけるネクローシス性（ＰＩ陽性）ＨＳＰＣおよびアポトーシス性（アネキシンＶ陽性）ＨＳＰＣの（Ａ）代表的なＦＡＣＳプロットおよび（Ｂ、Ｃ）定量（ｎ＝８、エラーバー：平均値のＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１２Ｄ及び１２Ｅは、ＨＳＰＣの生存度と機能性を示す図である。３Ｄ共培養系由来のＨＳＰＣの多系列分化能。ＣＦＵ‐ＧＥＭＭアッセイ（ｎ＝３）後の（Ｄ）代表的な（ｉ）ＧＥＭＭコロニー、（ｉｉ）ＢＦＵ‐Ｅコロニー、（ｉｉｉ）ＧＭコロニーと（Ｅ）コロニーの採点。
【図１３】図１３Ａは、本３Ｄ共培養系の構成成分の相互作用を示す図である。（Ａ）培養２週間後における３Ｄ共培養系の免疫組織化学と２光子顕微鏡観察。緑色で追跡されたＨＳＣと赤色で追跡されたＭＳＣは、無染色対照（ｉ）と比較されると、Ａｌｅｘａ３５０（青色）で染色されたＥＣＭ成分である（ｉｉ）Ｉ型コラーゲンおよび（ｉｉｉ）フィブロネクチンと共局在して観察され、ならびに、シグナル伝達分子である（ｉｖ）Ｃ‐Ｋｉｔ、（ｖ）インテグリン４ａ、（ｖｉ）Ｎ‐カドヘリンと共局在して観察される（スケールバー：１００μｍ）。図１３Ｂは、本３Ｄ共培養系の構成成分の相互作用を示す図である。３Ｄ培養２週間後におけるより小さくて円形のＨＳＰＣとより大きくて平坦な接着性ＭＳＣとの間の物理的相互作用を示すＳＥＭ画像撮影（スケールバー：１０μｍ）。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
第一の態様では、本発明は、軟骨と骨組織の密接な相互作用および共同作業を考慮に入れている三次元（３Ｄ）インビトロモデルを対象とする。本発明は、
（ａ）一層の人工軟骨組織、および
（ｂ）一層の人工骨組織であって、構造付与性スキャフォールドおよび骨髄構造を含むその人工骨組織
を含み、前記の一層の人工軟骨組織が前記の一層の人工骨組織の少なくとも一方の面に接触する３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドを提供する。
【０００８】
３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドの人工軟骨組織は間葉系前駆細胞を用いて、好ましくはＣＤ１０５+、ＣＤ１０６+、ＣＤ４４+、ＣＤ７３+、ＣＤ９０+およびＣＤ１３+である細胞のうちの少なくとも５０％を含む、またはそれらの細胞から成る間葉系前駆細胞を用いて調製され得、より好ましくは単離された初代軟骨細胞から調製され得る。特に、その人工軟骨組織は下に明記される本発明の方法によって調製され得る。
【０００９】
本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドの人工骨組織の骨髄構造は、構造付与性スキャフォールドに間葉系幹細胞を播種することにより調製される。その人工骨組織の骨髄構造は構造付与性スキャフォールドに間葉系幹細胞を播種し、そして、その構造付与性スキャフォールド上で間葉系幹細胞を２〜１０日間、好ましくは５〜８日間、より好ましくは７日間培養した後に造血幹細胞を添加することにより調製されることが好ましい。
【００１０】
本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドの人工骨組織の構造付与性スキャフォールドは生物性材料または非生物性材料を含む、またはそれらから成りことが好ましく、３Ｄセラミックスキャフォールドを含む、またはそれから成ることがより好ましい。
【００１１】
別の態様によると、本発明は、本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドを作製する方法を対象とする。前記方法は、
‐構造付与性スキャフォールドに間葉系幹細胞を播種するステップ、
‐前記構造付与性スキャフォールド上で前記間葉系幹細胞を２〜１０日間、好ましくは５〜８日間、より好ましくは７日間培養するステップ、
‐骨髄構造を植えつけられた構造付与性スキャフォールドを含む一層の人工骨組織を調製するために、その構造付与性スキャフォールド上の間葉系幹細胞に造血幹細胞を添加し、そして、その結果の混合物を少なくとも５日間、好ましくは５日間〜８週間、より好ましくは１週間〜４週間培養するステップ、
‐請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法によって調製された人工軟骨組織を供給するステップ、および
‐前記の一層の人工骨組織の少なくとも一方の面に前記の人工軟骨組織の層を配置するステップ
を含む、またはそれらのステップから成る。
【００１２】
別の態様によると、本発明は本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドを含む移植物を対象とする。
【００１３】
さらに、本発明は本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドまたは本発明の移植物、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、軟骨組織または骨組織の特性を調節する物質をインビトロでスクリーニングするための方法であって、
‐本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドの試料を提供するステップ、
‐各試料を複数の部分に分割するステップ、
‐スクリーニングを受ける物質と共に少なくとも１つの部分を培養するステップ、および
‐スクリーニングを受ける物質と共に培養されなかった別の部分について測定されたパラメーターと処理された部分について測定されたパラメーターを比較するステップ
を含む方法も対象とする。
【００１５】
本発明のさらなる態様によると、少なくとも１つの培地供給用貯留槽、本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドを収容する少なくとも１つの器官収容空洞を含む少なくとも１つの器官成長区画を含み、培地供給用貯留槽がマイクロ流体供給チャンネルによって少なくとも１つの器官成長区画に連結されている自立型３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドオンチップ装置が提供される。
【００１６】
本発明は、軟骨形成細胞凝集体を調製する方法であって、
（ａ）間葉系前駆細胞を供給するステップ、および
（ｂ）それらの間葉系前駆細胞を非接着性条件下で培養して軟骨形成細胞凝集体を形成するステップ
を含む方法も対象とする。
【００１７】
この方法に使用される間葉系前駆細胞はＣＤ１０５+、ＣＤ１０６+、ＣＤ４４+、ＣＤ７３+、ＣＤ９０+およびＣＤ１３+である細胞のうちの少なくとも５０％を含む、またはそれらの細胞から成ることが好ましい。前記間葉系前駆細胞は単離された初代軟骨細胞を含む、または単離された初代軟骨細胞から成ることがより好ましい。
【００１８】
本発明は、骨組織の発生と恒常性維持も軟骨組織の発生と恒常性維持も両方の組織の存在と相互作用に影響されるという発見に基づく。骨組織の形成と分化は発生中の骨に加えられた物理的力の存在、程度および方向に影響されることが長らく知られている。自然環境ではこれらの力は、多くの場合、軟骨組織への骨組織の接触面を介してその骨組織に与えられる。軟骨組織の１つの機能は身体の動きから生じる衝撃力を下層の骨組織に適切に移すことである。この相互作用は骨組織の配向と強度への影響を有するばかりか、骨の内側の骨髄と幹細胞ニッチの定義と構成にも影響を与える。骨髄と幹細胞ニッチの構成と分化は個体の免疫系に大きな影響を有することに疑いはない。したがって、両方の組織、すなわち、骨組織と軟骨組織は１つの共通する器官を形成すると見なされるべきである。本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドはこの状況を反映し、そして、両方の組織の存在がそれぞれ有する骨組織および軟骨組織の発生と分化への、および骨髄と幹細胞ニッチの構成と分化への影響を模倣することを可能とする。したがって、本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドは両方の組織種の密接な相互作用の互いに対する効果の研究を初めて可能とする。とりわけ人工軟骨組織の層が機械的刺激による限定された物理的力に曝露され得る試験系において本３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドを使用する場合、自然の状況を厳密に模倣し、そうしてこれらの組織の生物学に対して新しい洞察を得ることを可能にするモデル系であって、ならびに、これらの組織または過程と相互作用する物質の適切なスクリーニング系のためのモデル系が提供される。
【００１９】
本発明の様々な態様が以下により詳細に提供される。そのように定義された各態様は、そうではないと明確に述べられない限り、他のどの態様または他のどの複数の態様とも組合せられ得る。特に、好ましい、または利点があると述べられたどの特徴も、本発明の部分であると述べられた、または好ましい、もしくは利点があると述べられた他のどの特徴または他のどの複数の特徴とも組み合わせられ得る。
【００２０】
本発明は、３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドを対象とする。本発明の目的にとって、「オルガノイド」という用語は、それぞれの器官または組織に典型的である少なくとも１つの機能を示す、好ましくはそれぞれの器官または組織に典型的である機能の大部分を示す、インビトロで様々な種類の細胞からなる人工的で、新規に作製された、機能性の細胞凝集体を表す。
【００２１】
本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドは一層の人工軟骨組織を含む。人工軟骨組織は、新規にインビトロで調製および組織化させられた軟骨組織である。通常、人工軟骨組織は完全に、または少なくとも部分的に分化した軟骨細胞とＩＩ型、ＩＸ型およびＸＩ型コラーゲンを含む細胞外マトリックス成分を含む。
【００２２】
当業者が利用することができる人工軟骨組織をインビトロで調製する多数の技法が存在する。軟骨組織は軟骨細胞の単一２Ｄ層以上のものを通常含むので、３Ｄ培養技法から作製された人工軟骨組織が好ましい。適切な技法はトーテリ（Ｔｏｒｔｅｌｌｉ）とカンセッダ（Ｃａｎｃｅｄｄａ）（“Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ：  Ａ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｍｉｍｉｃ  ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ”，  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  （２００９），  １７，  １−１４）にまとめられている。人工軟骨組織の層を、例えば、ヒドロゲルカプセル化、微小塊培養、高密度細胞ペレットの形成、および生体適合性分解性スキャフォールドまたは生体適合性非分解性スキャフォールドの使用による細胞または細胞凝集体の培養および／または構成を含む技法によって得ることができる。本発明の趣旨における人工軟骨組織を調製する別の好ましい方法が軟骨形成細胞凝集体を調製するための方法として以下にさらに記載される。
【００２３】
一層の人工軟骨組織を提供するため、間葉系前駆細胞とも呼ばれる間葉系幹細胞（ＭＣＳ）を使用して人工軟骨組織を調製する。単離された間葉系前駆細胞を使用することが好ましい。「単離された」という用語は、それらの間葉系前駆細胞が自然の供給源から単離された細胞または、例えば、細胞増殖によって得られたそれらの子孫であることを意味する。使用される間葉系前駆細胞はドナー、個体または患者の軟骨組織に由来することが好ましい。それらの間葉系前駆細胞は形質転換または不死化されたことが無い初代細胞であることが好ましい。特に、それらの間葉系前駆細胞は成体の間葉系前駆細胞を含んでもよく、または成体の間葉系前駆細胞から成ってもよい。そのような成体の間葉系前駆細胞はドナー、個体または患者の非胚性軟骨組織に由来する。それらの間葉系前駆細胞は、分化して軟骨組織を含むようになったあらゆるドナー組織の軟骨組織に由来し得る。それらの間葉系前駆細胞はドナーの関節の軟骨組織に由来することが好ましく、膝関節または肘関節の軟骨に由来することがより好ましい。それらの間葉系前駆細胞はヒト細胞であることが好ましい。ヒト間葉系前駆細胞はヒト起源の軟骨組織に由来する。それらの間葉系前駆細胞はＣＤ１０５+、ＣＤ１０６+、ＣＤ４４+、ＣＤ７３+、ＣＤ９０+およびＣＤ１３+である細胞のうちの少なくとも５０％を含んでよく、またはＣＤ１０５+、ＣＤ１０６+、ＣＤ４４+、ＣＤ７３+、ＣＤ９０+およびＣＤ１３+である細胞から成ってもよい。それらの間葉系前駆細胞は、例えばヒト初代軟骨細胞のような単離された初代軟骨細胞を含む、または単離された初代軟骨細胞から成ることが好ましい。
【００２４】
本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドは一層の人工骨組織であって、構造付与性スキャフォールドおよび骨髄構造を含むその人工骨組織を含む。人工骨組織は新規にインビトロで調製および組織化させられた骨組織である。通常、人工骨組織は完全に、または少なくとも部分的に分化した骨芽細胞、破骨細胞および造血幹細胞を含む。
【００２５】
当業者が利用することができる人工軟骨組織をインビトロで調製する多数の技法が存在する。骨組織はある特定の細胞種の単一２Ｄ層以上のものを通常含むので、３Ｄ培養技法から作製された人工骨組織が好ましい。適切な技法はトーテリ（Ｔｏｒｔｅｌｌｉ）とカンセッダ（Ｃａｎｃｅｄｄａ）（“Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ：  Ａ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｍｉｍｉｃ  ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ”，  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  （２００９），  １７，  １−１４）にまとめられている。人工骨組織の層を、例えば、微小塊培養、および生体適合性分解性スキャフォールドまたは生体適合性非分解性スキャフォールドの使用による細胞または細胞凝集体の培養および／または構成を含む技法によって得ることができる。適切な培養技法とスキャフォールドは当技術分野において公知である。例えば、生物性材料または非生物性材料を含む、またはそれらの材料から成る生物分解性または非分解性スキャフォールドを使用することができる。スキャフォールドとして合成物質ベースの高分子を使用することが、コラーゲンベースのスキャフォールド、例えばチタンベースのスキャフォールドのような金属ベースのスキャフォールド、またはセラミックスベースのスキャフォールドを使用することと同様に記載されてきた。
【００２６】
人工骨組織の調製に使用される細胞は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と造血幹細胞（ＨＳＣ）を含み得る。単離されたＭＳＣおよび／または単離されたＨＳＣを使用することが好ましい。「単離された」という用語は、ＭＳＣおよび／またはＨＳＣが自然の供給源から単離された細胞または、例えば、細胞増殖によって得られたそれらの子孫であることを意味する。使用されるＭＳＣおよび／またはＨＳＣはドナー、個体または患者の適切な組織に由来することが好ましい。それらのＭＳＣおよび／またはＨＳＣは形質転換または不死化されたことが無い初代細胞であることが好ましい。特に、それらのＭＳＣおよび／またはＨＳＣは成体のＭＳＣおよび／またはＨＳＣを含んでもよく、または成体のＭＳＣおよび／またはＨＳＣから成ってもよい。そのような成体のＭＳＣおよび／またはＨＳＣはドナー、個体または患者の非胚性軟骨組織、好ましくは骨または骨髄組織に由来する。それらのＭＳＣおよび／またはＨＳＣはヒト細胞であることが好ましい。ヒトＭＳＣおよび／またはＨＳＣはヒト起源の骨または骨髄組織に由来することが好ましい。
【００２７】
本発明の趣旨における人工骨組織を調製する好ましい方法はセラミック３ＤスキャフォールドにＭＳＣを播種し、培養することを含む。細胞が定植されたセラミック３Ｄスキャフォールドを所定の期間培養し、その後にＨＳＣを添加してもよい。好ましい実施形態では、セラミックスキャフォールド上でＭＳＣを２〜１０日間培養した後にＨＳＣを添加する。その後、細胞が定植されたセラミック３Ｄスキャフォールドを静置培養条件下か連続栄養供給に適した潅流システム内のどちらかでさらに培養する。
【００２８】
人工骨組織を作製するための技法をさらに修正することができる。例えば、成長因子または他のシグナル伝達分子を添加して骨髄機能を支援することができる。骨髄が直面すべき自然条件に類似する低酸素条件を使用してもよい。培養時間ならびに様々な細胞種をスキャフォールドに塗布する順序を最適化しなければはならいこともあり得る。人工骨組織の作製のためにＭＳＣとＨＳＣの外にさらなる細胞種を使用してもよい。これらの追加の細胞は骨または骨髄構造に通常生じる細胞種、例えば免疫細胞、内皮細胞等を含み得る。
【００２９】
インビトロおよび／またはインビボでの研究用ツールとして本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドを使用することができる。生物学またはその構成要素のうちの１つ以上を研究するために本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドを使用することができる。あるいは、軟骨または骨組織の特性を調節する物質をインビトロおよび／またはインビボでスクリーニングする方法において本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドを使用することができる。
【００３０】
本発明は、本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドを含む移植物も対象にし、本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドまたは本発明の移植物および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物も対象とする。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、軟骨組織または骨組織の特性を調節する物質をインビトロでスクリーニングするための方法であって、
‐本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドの試料を提供するステップ、
‐その各試料を複数の部分に分割するステップ、
‐スクリーニングを受ける物質と共に少なくとも１つの部分を培養するステップ、および
‐スクリーニングを受ける前記物質と共に培養されなかった別の部分について測定されたパラメーターと処理された部分について測定されたパラメーターを比較するステップ
を含む方法を対象とする。
【００３２】
好ましい実施形態では、スクリーニングを受ける物質とその部分を培養する前にその部分を自立型器官オンチップ装置にかける。
【００３３】
簡単に説明すると、本発明の方法は、本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドを介して軟骨または骨組織に影響を及ぼすあり得る物質の同定と分析を行う。本発明に従ってある数の対象産物を含むと理解される、その試料を複数の部分に分割する。少なくとも２つのサブセットが提供される。１つはスクリーニングに用いられ、他方は陰性対照として働く。スクリーニング部分の数は対照部分の数を超えることが好ましい。通常、多数の部分がハイスループット・スクリーニングの対象とされる。本発明の方法においてスクリーニングを受ける物質が限定されることは全くない。本発明の実施形態では、それらの物質は、ＲＮＡｉ、リボザイムを含む核酸、アプタマー、抗体、ペプチド、炭水化物、重合体、分子量が５０Ｄａと１，０００Ｄａの間の小分子、およびタンパク質、好ましくは抗体、サイトカインおよびリポカリンからなる群より選択される。これらの物質は、多くの場合、ライブラリーの状態で利用可能である。一種類の化合物を試料の別個の部分の内側で保温することが好ましい。しかしながら、１つの部分の内側で少なくとも２つの物質を保温することによって物質の協同効果を調査することもできる。それらの物質が存在しない状態で対象のさらなるサブセットを同時に培養する。培養過程は様々なパラメーター、例えば、細胞種と検出感度に左右され、その最適化は当業者に知られる常法に従う。本発明の意図における有効物質の同定が、例えば、変化する発現パターンや細胞生存度を判定することにより間接的に行われることが好ましい。ある特定の時機にその判定を実施し、その実験の開始時におけるシグナル強度と陰性対照に対してその判定を相互に関係づけることができる。適切な試験は当業者に知られており、または、いつものこととしてこれを容易に計画することができる。
【００３４】
本発明は国際公開第２００９／１４６９１１号に記載される自立型器官オンチップ装置および本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドを含む自立型３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドオンチップ装置も開示する。
【００３５】
本発明の自立型３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドオンチップ装置は、生細胞撮影法と、例えば、２光子顕微鏡法によるオンライン観察にとって適切であり、例えば化合物の活性、薬力学および薬物動態学の試験のための、または器官もしくはオルガノイドと幹細胞ニッチの自己組織化、恒常性維持、損傷、再生もしくは相互作用、ならびに成熟、加齢、死および時間生物学の現象の研究のためのそれらの使用に適切である超小型チップ形式に本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドを構築または維持することを可能にするように形成される。その目的のため、本発明の自立型３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドオンチップ装置は少なくとも１つの培地供給用貯留槽、本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドを収容する少なくとも１つの器官収容空洞を含む少なくとも１つの器官成長区画を含み、その培地供給用貯留槽がマイクロ流体供給チャンネルによってその少なくとも１つの器官成長区画に連結されている。
【００３６】
本発明の対象物が軟骨および骨組織を含むオルガノイドの超小型インビトロ培養の確立を可能にする。結果生じる本発明の３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドは、例えば、連続潅流条件のような酸素と栄養の連続供給を可能にする条件で例えば培養される最大で３か月間の長期の培養にとって適切である。
【００３７】
本発明の対象物は、例えば身体の動きにより生じる物理的力を模倣する機械的刺激の組み込み、およびオルガノイド内の血管構造の誘導、およびそうして自然の状況に近づいた環境の提供を可能とする。これらの特性に基づくと、本発明の対象物は生体組織工学、細胞分化および組織分化の分子生物学ならびに再生医療の分野における様々な科学的発見を可能とする。本発明の対象物はコストおよび労力がかかる動物実験のインビトロ試験による代替を導くこともできる。
【００３８】
現在では、潅流培養のような長期培養技法に適合し、そして、血管新生の誘導を可能にする単一の集積システムにおいて骨、骨髄および軟骨の機能的に相互関連づけられた組織を組み合わせる３Ｄインビトロオルガノイドを提供する試みは存在しない。その系の機械的力または他の刺激への曝露によって、以前には決して到達していなかった程度にまで自然環境が模倣される。
【００３９】
別の態様では、本発明は軟骨形成細胞凝集体をインビトロで調製する方法を対象とする。その方法は、
（ａ）単離された間葉系前駆細胞を供給するステップ、および
（ｂ）それらの間葉系前駆細胞を非接着性条件下で培養して軟骨形成細胞凝集体を形成するステップ
を含む。
【００４０】
驚くことに、単離された間葉系前駆細胞は、軟骨形成性分化を示す三次元細胞凝集体を形成することができ、胚性細胞の影響は無いことが分かった。この効果は非接着性条件下でそれらの間葉系前駆細胞を培養することによって達成される。そのような非接着性培養条件下でそれらの間葉系前駆細胞は自由に互いに対して配列し、そして、軟骨形成性分化に特異的なマーカーの発現を示し、それ故、軟骨形成細胞凝集体であることが表される細胞凝集体に凝縮することを示すことができるだろう。
【００４１】
本発明の様々な態様が以下により詳細に提供される。そのように定義された各態様は、そうではないと明確に述べられない限り、他のどの態様または他のどの複数の態様とも組合せられ得る。特に、好ましい、または利点があると述べられたどの特徴も、本発明の部分であると述べられた、または好ましい、もしくは利点があると述べられた他のどの特徴または他のどの複数の特徴とも組み合わせられ得る。
【００４２】
本発明の方法はインビトロでの軟骨形成細胞凝集体の調製を対象とする。本発明の目的のため、「軟骨形成細胞凝集体」という用語は軟骨細胞または軟骨組織に特異的な少なくとも１つの機能を示す機能性細胞凝集体を指す。本発明の軟骨形成細胞凝集体は分化した軟骨細胞または軟骨組織の大部分または基本的に全ての器官機能または組織機能を示すことが好ましい。とりわけ本発明の軟骨形成細胞凝集体は機能性軟骨組織のように挙動することができ、および／またはインビトロやインビボで軟骨の発生または分化を誘導することができる。本発明の軟骨形成細胞凝集体は軟骨細胞または軟骨組織の発生または分化と関連するマーカー遺伝子またはタンパク質の発現上昇を特徴とし得る。本発明の軟骨形成細胞凝集体は非接着性培養条件の対象とする直前の間葉系前駆細胞における発現と比べたＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲンおよびＸＩ型コラーゲンの上方制御発現ならびにＩ型コラーゲンおよびＸＩＩ型コラーゲンの下方制御発現を特徴とし得ることが好ましい。
【００４３】
本発明の軟骨形成細胞凝集体は本発明の方法によって形成される。その軟骨形成細胞凝集体は実質的に球形または球状の細胞凝集体を示し得る。その軟骨形成細胞凝集体は０．５ｍｍ〜３ｍｍの平均直径を有し、好ましくは０．５ｍｍ〜２ｍｍの平均直径を有し得る。本発明の軟骨形成細胞凝集体は、軟骨形成細胞凝集体の作製において使用された細胞に由来しないどのような人工的な生物性または非生物性のスキャフォールドまたは担体も含まない。本発明の軟骨形成細胞凝集体は本発明の方法によって形成された細胞凝集体から成ることが好ましく、その方法は前記方法において使用された細胞に直接由来しないどのような生物性または非生物性のスキャフォールドまたは担体を使用または添加することなく実施された。
【００４４】
本発明の方法では、単離された間葉系前駆細胞を使用する。「単離された」という用語は、それらの間葉系前駆細胞が自然の供給源から単離された細胞または、例えば、細胞増殖によって得られたそれらの子孫であることを意味する。使用される間葉系前駆細胞はドナー、対象または患者の軟骨組織に由来することが好ましい。それらの間葉系前駆細胞は形質転換または不死化されたことが無い初代細胞であることが好ましい。特に、それらの間葉系前駆細胞は成体の間葉系前駆細胞を含んでもよく、または成体の間葉系前駆細胞から成ってもよい。そのような成体の間葉系前駆細胞はドナー、対象または患者の非胚性軟骨組織に由来する。それらの間葉系前駆細胞は、分化して軟骨組織を含むようになったあらゆるドナー組織の軟骨組織に由来し得る。それらの間葉系前駆細胞はドナーの関節の軟骨組織に由来することが好ましく、膝関節または肘関節の軟骨に由来することがより好ましい。本発明の方法において使用される間葉系前駆細胞はヒト細胞であることが好ましい。ヒト間葉系前駆細胞はヒト起源の軟骨組織に由来する。それらの間葉系前駆細胞はＣＤ１０５+、ＣＤ１０６+、ＣＤ４４+、ＣＤ７３+、ＣＤ９０+およびＣＤ１３+である細胞のうちの少なくとも５０％を含んでよく、またはＣＤ１０５+、ＣＤ１０６+、ＣＤ４４+、ＣＤ７３+、ＣＤ９０+およびＣＤ１３+である細胞から成ってもよい。それらの間葉系前駆細胞は、例えばヒト初代軟骨細胞のような単離された初代軟骨細胞を含む、または単離された初代軟骨細胞から成ることが好ましい。
【００４５】
本発明の方法では、間葉系前駆細胞を単離後のあらゆる段階で非接着性条件下での培養の対象とすることができる。しかしながら、間葉系前駆細胞が接着性２Ｄ単層条件下で少なくともいくらか培養された場合、細胞凝集体の形成がさらに強化される。非接着性条件下での培養の対象とする前に間葉系前駆細胞が２Ｄ単層培養で少なくとも５継代培養されていることが好ましい。脱分化表現型を確実にするため、２Ｄ単層接着性条件で間葉系前駆細胞を少なくとも１０継代培養することが望ましい。高効率の細胞凝集体の形成が何代にもわたって維持される。しかしながら、間葉系前駆細胞が２Ｄ単層培養で少なくとも５継代および２０継代以下培養されている場合に最良の結果が達成されることが分かった。単離後少なくとも５継代および１５継代以下の２Ｄ単層での培養の後に間葉系前駆細胞を非接着性培養の対象とすることが好ましい。
【００４６】
本発明の方法では、単離された間葉系前駆細胞の供給後、間葉系前駆細胞を非接着性培養条件の対象として軟骨形成細胞凝集体を形成する。
【００４７】
間葉系前駆細胞をある濃度で非接着性培養条件の対象とする場合に細胞凝集体の形成は特に効果的である。濃度があまりに低い場合、細胞はほんのわずかしか互いに接触せず、細胞凝集体への凝縮は効果が弱い。他方、間葉系前駆細胞の濃度があまりに高い場合、細胞は可動性または移動性が低く、したがって、細胞凝集体の形成は効果が弱い。間葉系前駆細胞をｍｌ当たり５×１０４〜５×１０７の濃度で非接着性培養条件の対象とすることが好ましい。間葉系前駆細胞をｍｌ当たり１×１０５〜１×１０７の濃度、好ましくはｍｌ当たり５×１０５〜５×１０６の濃度、および、最も好ましくはｍｌ当たり９×１０５〜１．１×１０６の濃度で非接着性培養条件の対象とする場合、さらに良好な結果が達成される。
【００４８】
本発明の方法では、単離された間葉系前駆細胞を非接着性培養条件下で培養する。このことは、間葉系細胞が培養表面への強力な結合と接着を示す平らで広がった形状をとらない条件下でそれらの細胞を培養することを意味する。播種後の間葉系前駆細胞が球状のままであり、培養表面と結合するとしても弱くしか結合していないことが好ましい。非接着性細胞培養の適切な方法は当技術分野において周知である。非接着性培養条件は、間葉系前駆細胞の接着を支援しない培養表面を有する培養容器における間葉系前駆細胞の培養を含み得る。例えば、超低細胞結合性を示す培養表面を有する培養容器を使用することができる。その目的のため、電気的に中性または正に帯電した培養表面を有する培養容器を使用してもよい。好ましくは、間葉系前駆細胞と培養表面の相互作用をさらに低下させる材料の層でその培養表面を被覆することができる。培養表面を親水性ヒドロゲルで被覆することができる。
【００４９】
非接着性培養条件下で間葉系前駆細胞はかなり急速に会合して細胞凝集体に凝縮するようである。非接着性細胞培養の２４時間後には早くも間葉系前駆細胞は１つの大きい複合体に凝集した。しかしながら、発生の進行、分化および／または機能を有する軟骨形成細胞凝集体である細胞凝集体を調製するため、２４時間を超える期間に非接着性培養を実施することが有利である。本発明の方法では、間葉系前駆細胞を非接着性条件下で少なくとも４８時間、好ましくは少なくとも７２時間、より好ましくは少なくとも１週間、さらにより好ましくは少なくとも２週間、最も好ましくは少なくとも４週間培養することができる。したがって、間葉系前駆細胞を非接着性条件下で４８時間〜８週間、好ましくは６０時間〜６週間、より好ましくは７２時間〜５週間培養することができる。通常の培養皿で培養すると、凝集体は皿の表面に接着し、細胞が移動および増殖し始め、凝集構造が崩壊することになる。したがって、培養全期間に凝集体を非接着性条件下で保持することが好ましい。
【００５０】
本発明の方法では、少なくとも球形を示し、０．５ｍｍ〜３ｍｍの平均直径を有する細胞凝集体が形成されるまで非接着性条件下で間葉系前駆細胞を培養することが好ましく、０．５ｍｍ〜２ｍｍの平均直径を有する細胞凝集体が形成されるまで非接着性条件下で間葉系前駆細胞を培養することがより好ましい。
【００５１】
本発明の方法によって作製される軟骨形成細胞凝集体の適合性は分化した軟骨細胞または軟骨組織を誘導または提供する軟骨形成細胞凝集体の能力に左右される。したがって、結果生じる細胞凝集体が部分的または完全に分化した軟骨細胞または軟骨組織の特性および／または機能を示し始めるまで、単離された間葉系前駆細胞を非接着性条件下で培養することが好ましい。それぞれのマーカー遺伝子、タンパク質または構造体の発現の比較により分化の進行をモニターすることができる。少なくとも形成された細胞凝集体が、非接着性培養条件の対象とする直前の間葉系前駆細胞における発現と比べたＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲンおよびＸＩ型コラーゲンの上方制御発現ならびにＩ型コラーゲンおよびＸＩＩ型コラーゲンの下方制御発現を示すまで、単離された間葉系前駆細胞を非接着性条件下で培養することが好ましい。ステージ特異的マーカー分子の発現分析によってＮ‐カドヘリンの発現維持およびＩＩ型コラーゲンのレベルの上昇が示され、しかし、Ｘ型コラーゲンは発現しないことが示されたので、軟骨形成性前駆細胞と円柱状軟骨細胞の間の分化表現型が示唆されるが、前肥大期へのさらなる分化は示唆されない。この表現型は関節軟骨組織内の軟骨細胞の停止表現型を反映する。例えば定量的または半定量的ＲＴ‐ＰＣＲまたはノーザンブロッティングのような周知の方法によって遺伝子の相対発現レベルを容易に決定することができる。例えばウエスタンブロッティング法およびＥＬＩＳＡ法のような周知の方法によってタンパク質の相対発現レベルも容易に決定することができる。ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルについての発現パターンの分析に加えて、凝集体の品質を指定する免疫組織化学染色ならびに圧力耐性判定による凝集体構造のさらに詳細な特徴解析が含まれる。
【００５２】
先行技術の方法の大半が出会う欠点のうちの１つは、これらの方法では人工的な生物性または非生物性のスキャフォールドまたは担体であって、その上または中で軟骨組織を形成するために細胞を培養するためのスキャフォールドまたは担体の存在が必要であることである。生物性または非生物性のスキャフォールドまたは担体が外部から提供されるものであり、細胞凝集体の形成の際に本発明の方法において使用された細胞によって直接形成されるものではない場合、前記のスキャフォールドまたは担体は人工的または付加的と見なされる。本発明の方法はそのような人工的な生物性または非生物性のスキャフォールドまたは担体の使用または存在を必要としない。本発明の方法は、使用した細胞に由来しないあらゆるそのような人工的な生物性または非生物性のスキャフォールドまたは担体を使用することなく、本発明による軟骨形成細胞凝集体を産生する。好ましい実施形態では、軟骨形成細胞凝集体の形成において生物性または非生物性のスキャフォールドを添加しないように本発明の方法を実施する。
【００５３】
本発明の方法では、標準的な培地を用い、接着性条件または非接着性条件で間葉系前駆細胞を培養する。非接着性条件下で適切な細胞凝集を誘導するために必要な特別な培地は存在しない。当業者は適切な培地をよく知っている。標準ＤＭＥＭをある含量のウシ胎児血清（ＦＣＳ）と共に使用することが典型的であり、ＦＣＳが５％〜１５％の濃度で存在することが好ましく、１０％ＦＣＳの濃度で存在することがより好ましい。
【００５４】
凝集体が形成されるとさらに処理することなく適切な軟骨形成性分化が誘導される事実にもかかわらず、さらなる最適化が有益であり得る。したがって、本発明の方法では、一旦、凝集過程が完了すると、成長因子の投与または低酸素条件下での培養に関してのさらなる最適化ステップが発生と分化をさらに向上させる。
【００５５】
本発明は、本発明の人工軟骨形成細胞凝集体またはそれに由来する組織または構造体を含む、またはそれらから成る移植物も対象とする。
【００５６】
本発明の別の態様では、本発明の人工軟骨形成細胞凝集体、それに由来する組織もしくは構造体または本発明の移植物、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００５７】
本発明の人工軟骨形成細胞凝集体、本発明の移植物または本発明の医薬組成物は軟骨の損傷および／または破壊または軟骨の喪失の治療に使用され得る。
【００５８】
本発明の方法は非胚性供給源に由来する単離された間葉系前駆細胞を用いて機能するので、その方法は特定のドナーまたは患者に由来する細胞から出発して人工軟骨形成細胞凝集体を作製することを可能とする。したがって、本発明の人工軟骨形成細胞凝集体、医薬組成物または移植物を用いて治療される個人の細胞から得られた人工軟骨形成細胞凝集体を提供することが可能である。したがって、拒絶反応が最小限まで低減されるように、または完全に存在しないように、主に、実質的に、または完全に移植物の受容者自身の細胞から得られた移植物を提供することが可能であるようである。
【００５９】
本発明の人工軟骨形成細胞凝集体は分化した軟骨細胞または軟骨組織のインビトロまたはインビボでの作製のために使用され得る。
【００６０】
本発明の人工軟骨形成細胞凝集体、本発明の移植物または本発明の医薬組成物は、インビトロおよびインビボで使用することができる研究ツールとして使用され得る。
【００６１】
本発明の人工軟骨形成細胞凝集体、本発明の移植物または本発明の医薬組成物は、軟骨細胞または軟骨組織の特性を調節する物質をインビトロまたはインビボでスクリーニングする方法において使用され得る。
【００６２】
本発明は、軟骨細胞または軟骨組織の特性を調節する物質をインビトロでスクリーニングする方法であって、
‐本発明の人工軟骨形成細胞凝集体または本発明の方法によって調製された細胞凝集体またはそれらに由来する組織の試料を提供するステップ、
‐各試料を複数の部分に分割するステップ、
‐スクリーニングを受ける物質と共に少なくとも１つの部分を培養するステップ、および
‐スクリーニングを受ける前記物質と共に培養されなかった別の部分について測定されたパラメーターと前記の処理された部分について測定されたパラメーターを比較するステップ
を含む方法をさらに教示する。
【００６３】
好ましい実施形態では、スクリーニングを受ける物質とその部分を培養する前にその部分を自立型器官オンチップ装置にかける。
【００６４】
簡単に説明すると、本発明の方法は、本発明の人工軟骨形成細胞凝集体を介して軟骨細胞または軟骨組織に影響を及ぼすあり得る物質の同定と分析を行う。本発明に従ってある数の対象産物を含むと理解される、その試料を複数の部分に分割する。少なくとも２つのサブセットが提供される。１つはスクリーニングに用いられ、他方は陰性対照として働く。スクリーニング部分の数は対照部分の数を超えることが好ましい。通常、多数の部分がハイスループット・スクリーニングの対象とされる。本発明の方法においてスクリーニングを受ける物質が限定されることは全くない。本発明の実施形態では、それらの物質は、ＲＮＡｉ、リボザイムを含む核酸、アプタマー、抗体、ペプチド、炭水化物、重合体、分子量が５０Ｄａと１，０００Ｄａの間の小分子、およびタンパク質、好ましくは抗体、サイトカインおよびリポカリンからなる群より選択される。これらの物質は、多くの場合、ライブラリーの状態で利用可能である。一種類の化合物を試料の別個の部分の内側で保温することが好ましい。しかしながら、１つの部分の内側で少なくとも２つの物質を保温することによって物質の協同効果を調査することもできる。それらの物質が存在しない状態で対象のさらなるサブセットを同時に培養する。培養過程は様々なパラメーター、例えば、細胞種と検出感度に左右され、その最適化は当業者に知られる常法に従う。本発明の意図における有効物質の同定が、例えば、変化する発現パターンや細胞生存度を判定することにより間接的に行われることが好ましい。ある特定の時機にその判定を実施し、その実験の開始時におけるシグナル強度と陰性対照に対してその判定を相互に関係づけることができる。適切な試験は当業者に知られており、または、いつものこととしてこれを容易に計画することができる。
【００６５】
本発明の人工軟骨形成細胞凝集体を器官、オルガノイドまたは器官前駆体またはその一部と見なすことができるので、自然潅流を模倣する条件下で長期間にその人工軟骨形成細胞凝集体を調製および／または培養することができる試験系を用いることが特に有益であり得る。出願番号ＥＰ１０  ００８  ２４４を有する欧州特許公開公報または出願番号ＷＯ２００９／１４６９１１を有するＰＣＴ公開公報に記載される自立型器官オンチップ装置システムに基づくアッセイ計において本発明の方法および／または本発明の人工軟骨形成細胞凝集体を組み合わせることが特に適切であるようである。
【００６６】
本発明は国際公開第２００９／１４６９１１号に記載される自立型器官オンチップ装置および本発明の人工軟骨形成細胞凝集体を含む自立型人工軟骨形成細胞凝集体オルガノイドオンチップ装置も開示する。
【００６７】
本発明の自立型人工軟骨形成細胞凝集体オルガノイドオンチップ装置は、生細胞撮影法と、例えば、２光子顕微鏡法によるオンライン観察にとって適切であり、例えば化合物の活性、薬力学および薬物動態学の試験のための、または器官もしくはオルガノイドと幹細胞ニッチの自己組織化、恒常性維持、損傷、再生もしくは相互作用、ならびに成熟、加齢、死および時間生物学の現象の研究のためのそれらの使用に適切である超小型チップ形式に本発明の人工軟骨形成細胞凝集体を構築または維持することを可能とするように形成される。その目的のため、本発明の自立型人工軟骨形成細胞凝集体オルガノイドオンチップ装置は、少なくとも１つの培地供給用貯留槽、本発明の人工軟骨形成細胞凝集体を収容する少なくとも１つの器官収容空洞を含む少なくとも１つの器官成長区画を含み、その培地供給用貯留槽がマイクロ流体供給チャンネルによってその少なくとも１つの器官成長区画に連結されている。
【００６８】
本発明は、人工軟骨形成細胞凝集体、ならびに非強制的細胞組織化、あらゆる人工的な生物性または非生物性のスキャフォールドまたは担体の必要性の欠如を特徴とし、および成体細胞から作製されるので胚の細胞または組織を必要としない人工軟骨形成細胞凝集体の作製方法を初めて提供する。
【００６９】
本発明の人工軟骨形成細胞凝集体は、軟骨組織の発生をインビトロおよびインビボで誘導または開始することができる機能性誘導性凝集体である。結果生じる軟骨組織は、生理的な順序で配列されている軟骨組織の部分を典型的に形成する構造体の検証可能な存在を特徴とする。
【実施例】
【００７０】
実施例Ａ
Ｉ．人工骨組織の形成
細胞
標準的な手法により間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離する。簡単に説明すると、骨髄吸引物をＰＢＳで徹底的に濯ぎ、そして、フィコール密度勾配遠心分離によりＰＢＭＣ（末梢血単核球）を単離した。プラスチック接着により間葉系前駆細胞を単離し、最大で４継代の増殖期がそれに続く。ＭＡＣＳ技術（ミルテニー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）バイオテク社）を用いてＣＤ３４の発現によって臍帯血試料からヒト造血幹細胞を単離した。補足培地（ステムスパン（Ｓｔｅｍｓｐａｎ）（登録商標）+１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、ＦＬＴ３、ＩＬ６およびＳＣＦ）中でＨＳＣを培養した。
【００７１】
プラットフォーム
人工骨髄のためのプラットフォームは３Ｄセラミックスキャフォールド（スポンセラム（Ｓｐｏｎｃｅｒａｍ）（登録商標）、ツェルベルク（Ｚｅｌｌｗｅｒｋ）社）によって提供される。協調的増殖、分化および微小環境の再調整を誘導するため、細胞外マトリックスの沈着とシグナル伝達分子の発現に応じて、造血幹細胞の添加の１週間前にこのセラミックスに間葉系幹細胞を播種する。その後、静置培養か連続栄養供給に適した潅流システムのどちらかでそのセラミックスをさらに培養する。遺伝子発現分析、ＦＡＣＳ技術による異なる細胞集団の構成、および典型的な生物学的機能（ＨＳＣの維持と増殖、個々の幹細胞ニッチの発生、免疫学的問題）の判定によって骨髄の機能性を評価する。
【００７２】
ＩＩ．軟骨形成細胞凝集体または人工軟骨組織の形成
骨関節炎とリウマチ性関節炎は両方とも軟骨構造を冒す退行性疾患である。軟骨内の細胞は非常にわずかな固有の自己修復能力しか持たないので、様々な要因（例えば、機械的過剰負荷、年齢、傷害、および炎症）が口火となって、組織構造が不可逆的に失われる。それ故、軟骨の再生過程を誘導するための代替的戦略を見出すことに多くの努力が過去数十年間に払われてきた。近年では、再生医療における自律的細胞の適用が精力的な研究の対象である。しかしながら、間葉系前駆細胞の理想的な供給源とインビトロ分化に最適な培養条件の両方が確立されずにいる。間葉系間質細胞／幹細胞は、骨髄供給源または他の組織供給源から得ることができる細胞の数は限定的であるが、全ての間葉系組織において分化するそれらの能力のために傑出している。したがって、健康な組織から単離され、続いて増殖された自律的細胞を使用することがこの課題を解く１つの有望な戦略である。
【００７３】
不運なことに、細胞はそれらの通常の組織微小環境から取り出されるとそれらの分化表現型を喪失する。したがって、軟骨細胞の通常の三次元関節軟骨マトリックスから酵素消化によって軟骨細胞を単離し、その後に二次元単層培養することによって、細胞が細胞周期に再び入り、それらの球形の表現型を失い、ＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲンおよびＸＩ型コラーゲンからＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンおよびＶ型コラーゲンにそれらのマトリックス分子産生を切り替える過程である細胞の変化が引き起こされる。さらに、２Ｄ培養軟骨細胞は間葉系幹細胞表面マーカーを発現し、多系列分化能を有することが示されている。この過程は脱分化と呼ばれ、そして、軟骨細胞表現型の維持のための完全な３Ｄ環境の重要性を強調する。その結果、近年、発生過程は可溶性因子によって制御されるばかりか、加えて、細胞間相互作用および細胞‐マトリックス間相互作用を仲介するだけではなく、接着性シグナル伝達によって遺伝子発現の調節にも寄与する接着性分子によって提供される空間配置によっても制御されることが明らかになった。したがって、３Ｄ構造体中で前駆細胞を培養することがインビトロでの軟骨形成性再分化過程の間の重要な刺激因子のうちの１つであるようである。それ故、その目的のために様々な３Ｄ培養系が構築された。間葉系細胞または始原細胞を３Ｄシステムで培養するための４種の技法、すなわち、（１）ヒドロゲルカプセル化、（２）微小塊培養、（３）高密度細胞ペレットおよび（４）生体適合性スキャフォールドが一般的に使用される。
【００７４】
３Ｄ微小環境での培養と単層形成の防止が、言及された全ての培養系の原理である。全ての培養モデルがＩＩ型コラーゲンとプロテオグリカンの発現上昇によって証明される軟骨形成性分化を誘導することができるという事実にもかかわらず、重大な欠陥がまだ残っている。それらの細胞は遠心分離（ペレット培養）か重力（微小塊）のどちらかによって細胞性３Ｄ凝集体を形成するように強いられる。他方、ヒドロゲルカプセル化または生体適合性スキャフォールド上で培養されるとき、細胞相互作用の能力は限定的であり、または存在し得ないことさえある。しかしながら、再生医療応用にとって最適な必要条件の獲得とこの多段階過程についての十分な知識を拡大するためのモデル培養系の提供の両方のため、軟骨細胞分化の全インビボ過程をインビトロで模倣することは合理的であるように思える。
【００７５】
間葉系凝縮は骨格要素の発生における最初のステップであり、そのステップにおいて前駆細胞がさらなる骨格形成の部位に移動し、蓄積し始め、そして、凝縮し、結果として高密度細胞凝集体になる。インビトロ再分化の過程の間において、凝集体形成のこの最初のステップを完全なものにすることは一番興味深い。不運なことに、一般的な３Ｄ培養系の全てが独立した単一の細胞が凝縮過程の前に移動する前提条件を欠いているため、それらの培養系の中でそのような目的に適切であるものはない。
【００７６】
我々は、単離された脱分化軟骨細胞の初期細胞凝縮とその後の軟骨形成性再分化を含む無スキャフォールド型培養系を確立した。包括的遺伝子発現分析によって凝縮過程ならびに再分化細胞を徹底的に特徴解析した。その軟骨形成性分化はＩＩ型コラーゲン発現の強力な発現上昇およびプロテオグリカンの大量分泌と蓄積によって実証されるので、この新しい３Ｄ培養系が間充織凝縮刺激過程をインビトロで研究する機会を初めて提供する。凝縮過程は細胞移動から独立しているが、どちらかと言えば、接着分子と細胞間接触の増強によって仲介されていることが細胞凝集中のケモカインシグナル伝達の阻害によって示された。
【００７７】
材料と方法
初代軟骨細胞の単離と培養
自発的なドナーに由来する膝関節軟骨をシャリテ（ドイツ、ベルリン医科大学）のベルリン筋骨格研究センターならびにウィルヒョーキャンパスのシャリテ実験病理学研究所から得た。本研究は地区倫理委員会（ベルリン大学病院、シャリテ・ミッテキャンパス）によって認可された。軟骨組織を小片に細かく切り刻み、そして、ＤＭＥＭ中のコラーゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ、シグマ・アルドリッチ社）を使用して３７℃で一晩酵素消化することにより軟骨細胞を遊離させた。細胞を７０μｍのナイロン製セルストレイナー（ＢＤファルコン（商標）、ベルギー）を通す濾過により消化された組織から分離し、ＰＢＳで洗浄し、そして、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で培養した。３７℃の加湿大気（５％ＣＯ２／空気）を有するウォータージャケット型恒温器内で、１０％ＦＣＳとペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ社）を添加されたＤＭＥＭ培地（ギブコ社）中で初代軟骨細胞を培養した。それらの細胞は少なくとも１０回継代させられて完全脱分化表現型になった。
【００７８】
脱分化軟骨細胞の特徴解析
ＦＡＣＳによる表面発現分析。脱分化軟骨細胞の様々な間葉系幹細胞（ＭＳＣ）表面マーカー分子の発現についてそれらの脱分化軟骨細胞を直接免疫蛍光染色により分析した。細胞をトリプシン処理と遠心分離により回収し、そして、細胞ペレットをＰＢＳ／ＢＳＡ（０．５％）に再懸濁した。細胞を蛍光標識抗体と共に１５分間室温で保温した。イソタイプ対照として、ＭＳＣ抗体と同じイソタイプのＴ細胞マーカー分子で細胞を染色した。次に染色アッセイ物をＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、そして、遠心分離して未結合の抗体を除去した。細胞ペレットを４００μｌのＰＢＳ／ＢＳＡに再懸濁し、ＦＡＣＳカリバー（商標）（ＢＤバイオサイエンス社）で分析した。死細胞の検出については、サイトメトリー分析の直前にヨウ化プロピジウムを添加した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウェアを使用して３０，０００イベントを捕捉し、分析した。
【００７９】
分化能。よく確立された培地添加物（１０％のＦＣＳ、１０μｇ／ｍｌのインスリン、０．２ｍＭのインドメタシン、１μΜのデキサメタゾン、０．５ｍＭの３‐イソブチル‐１メチル‐キサンチン（シグマ社）を有するＤＭＥＭ）を使用する２Ｄ培養物において脂肪生成分化を誘導した。脱分化軟骨細胞を６ウェルプレート（コーニング社、ウェル当たり１００，０００細胞）に播種し、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中で細胞が集密になるまで培養した。培地を４日毎に置換してそれらの細胞を２８日間刺激した。脂質のオイルレッド‐Ｏ染色。２８日後に細胞を４％のパラフォルムアルデヒド中で１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、そして、続いて新規に濾過したオイルレッド‐Ｏ染色溶液（シグマ社）（プロピレングリセロール中に０．７％）と１時間保温した。細胞を２回蒸留水で濯いだ後に光学顕微鏡観察により染色を評価した。適切な分化培地（１０％のＦＣＳ、１０ｍＭのβ‐グリセロリン酸（シグマ社）、１０ｎＭのデキサメタゾン（シグマ社）、０．１ｍＭのＬ‐アスコルビン酸‐２‐リン酸（シグマ社）を含むＤＭＥＭ）を使用して単層培養物において骨形成性分化を誘導した。簡単に説明すると、細胞を６ウェルプレート（コーニング社、ウェル当たり１００，０００細胞）に播種し、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中で細胞が集密に達するまで培養した。培地を４日毎に置換し、骨形成性刺激の２１日後に、骨芽細胞分化のマーカーとして、分泌されたＣａ２+ベースのミネラル化マトリックスに対するフォン・コッサ染色により細胞を染色した。細胞を４％のパラフォルムアルデヒド（シグマ社）で固定した。固定した細胞に硝酸銀溶液（５％、シグマ社）を添加し、培養プレートをＵＶ光の中に２０分間配置した。最後に、細胞を水で濯ぎ、そして、光学顕微鏡観察により評価を行った。
【００８０】
３Ｄ培養系
３Ｄ低結合性培養のため、脱分化軟骨細胞を回収し、ｍｌ当たり１０６細胞の単一の細胞懸濁液を産出するために１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに再懸濁した。その細胞懸濁液（ウェル当たり１ｍｌ）を２４ウェル低結合性プレート（ウルトラ・ロウ・クラスタープレート、コーニング社、ドイツ）に添加した。標準的な組織培養皿の負に帯電した親水性表面と対照的に、その超低結合性プレートは、付着タンパク質の結合を大いに減少させる電気的に中性の親水性ヒドロゲル被覆表面を有する。この特別な培養皿を使用することによって、細胞が、微小塊培養の場合のように、細胞接着により少数の層からなる構造体の状態に定着することがない。２Ｄ単層培養物の形成が防止され、細胞はこの懸濁液培養維持条件下で球形を保持した。さらに、細胞が遠心分離によって強制的に定着させられるペレット培養系と対照的に、低結合性培養系は初期凝縮過程の間に自由な細胞運動と細胞間相互作用の機会を提供する。一定の培養条件を確実にするために培地を３日毎に定期的に交換した。低結合性培養においてＧ‐タンパク質共役受容体により誘発される走化性シグナル伝達に干渉するため、低結合性凝縮実験における培地に様々な濃度で（１０、１００および１０００ｎｇ／ｍｌ）百日咳毒素（シグマ社、ドイツ）を投与した。
【００８１】
組織学
回収した凝集体の切片を５μｍの厚みのクライオスタットで作製し、スーパーフロスト・プラス・スライドガラス（メンツェル社）に固定した。スライドを乾燥および固定した。
【００８２】
ヘマトキシリン染色。切片をヘマトキシリン染色溶液（シグマ社）中で３分間インキュベートし、そして、続いて水道水で濯いだ。切片を脱水し、そして、スライドガラスに固定した。染色された切片を光学顕微鏡観察により分析した。
【００８３】
アルシアンブルー染色。スライドを３％の酸性酸の中で３分間プレインキュベートした後にアルシアンブルー（シグマ社）（３％酢酸中の３％）溶液を用いて室温で３０分間処理した。切片を水で洗浄し、脱水し、そして、スライドガラスに固定した。染色された切片を光学顕微鏡観察により分析した。
【００８４】
プロテインブロック（ダコ・サイトメイション社）を用いてＩＩ型コラーゲン染色スライドを室温で１０分間処理し、次に２Ａ型コラーゲンに対する一次モノクローナル抗体（ＢＤバイオサイエンス社）と４℃で一晩インキュベートした。翌日に切片をＣｙ３結合二次抗体（ダコ・サイトメイション社）と１時間インキュベートし、そして、細胞核をＤＡＰＩにより対比染色した。染色された切片を蛍光顕微鏡観察により分析した。
【００８５】
リアルタイムＰＣＲ。表示の時点までに細胞を溶解し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ  ＩＩキット（マッハライ・アンド・ナーゲル社）を用いてＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡを４００ｎｇの全ＲＮＡの逆転写（Ｔａｑｍａｎ、ロッシュ社）により合成した。次の条件を用いてリアルタイムＰＣＲ実験を実施した：１μｌのｃＤＮＡ、それぞれ０．５μΜのプライマー、６ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのｄＮＴＰ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．８）、５００ｎｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．０５Ｕ／ｍｌのインモレース（バイオライン社）、１×サイバーグリーン（モレキュラー・プローブス社）。発現の相対レベルをＧＡＰＤＨ発現に対する比率として表す。
【００８６】
ＤＮＡマイクロアレイ分析。製品プロトコルに従ってヒトゲノムＣＧＨマイクロアレイ４４Ｋ（アジレント社）を利用した。マイクロアレイ実験は２色比ハイブリダイゼーションとＲＮＡ標識のためのローＲＮＡインプット・フルオレセント・リニアー・アンプリフィケーション（Ｌｏｗ  ＲＮＡ  Ｉｎｐｕｔ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）キット（アジレント社）に基づいた。簡単に説明するとオリゴ（ｄＴ）‐Ｔ７プロモータープライマーとモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ‐ＲＴ）を用いて５００ｎｇの全ＲＮＡを逆転写してファーストストランドｃＤＮＡとセカンドストランドｃＤＮＡを合成した。シアニン３‐シチジン５’‐三リン酸（３‐ＣＴＰ）またはシアニン５‐ＣＴＰのどちらかを同時に取り込むＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して蛍光アンチセンスｃＲＮＡを合成した。シアニン３‐ＣＴＰについてＡ５５２ｎｍの吸光度、およびシアニン５‐ＣＴＰについてＡ６５０ｎｍの吸光度により精製産物を定量し、そして、Ｎａｎｏｄｒｏｐ光度計（キスカー（Ｋｉｓｋｅｒ）社）を使用して標識効率を検証した。ハイブリダイゼーションの前に２μｇずつの標識ｃＲＮＡ産物を断片化し、そして、供給業者のプロトコル（アジレント社）に従って対照標的およびハイブリダイゼーション緩衝液と混合した。ハイブリダイゼーションを６０℃で一晩行った。次に、スライドを洗浄し、そして、ＤＮＡマイクロアレイ・レーザースキャナー（アジレント社）を使用して５μｍの分解度でマイクロアレイのスキャニングを実施した。初期設定を使用する画像分析ツールＡ６．１．１版（アジレント社）で特徴を抽出した。ロゼッタ・インフォマティクス・プラットフォーム・リゾルバー・ビルト（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  Ｒｅｓｏｌｖｅｒ  Ｂｕｉｌｔ）４．０上でデータ分析を実行した。低いｐ値（ｐ＜０．０５）を有するデータポイントのみが選択されるという必要条件と組み合わせた厳密なデータ評価と発現の２倍の変化のカットオフにより発現パターンの変化を特定した。この戦略を用いることによって、データ評価はロゼッタ・リゾルバー・システム（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｒｅｓｏｌｖｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）（アジレント社）により実行されるエラーモデルと無関係であった。
【００８７】
結果
完全な表現型の脱分化を達成するために単離された軟骨細胞を単層で少なくとも１０継代培養した。前に説明したように、それらの細胞はＭＳＣ表面マーカー（ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１３）の発現および多分化能（脂肪細胞および骨細胞）（図１）（Ｒｏｓｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）によって示される一定の前駆細胞の表現型を帯びた。細胞表面発現によると脱分化軟骨細胞の均一な集団が観察された。
【００８８】
低結合性培養による細胞凝縮
この培養技法の基本的な考えは、培養皿の表面への細胞付着を避け、細胞の移動能を維持することである。付着単層培養物の形成を防止するため、特別に処理した表面を有する低結合性プレートのウェルに細胞を播種した。数時間の内に細胞は互いに対して接着し始め、網状の構造体が生じた。次の７２時間の間にそのメッシュ構造が凝縮して、最後には平均で１〜２ミリメーターの直径を有する高密度細胞凝集体がウェル当たり１つ生じた（図２）。細胞凝集体をさらに４週間培養したが、サイズまたは形状に明確な変化は全くなかった。その培養過程を初期段階と後期段階に細分し、個々に評価した。
【００８９】
インビトロでの間葉系凝縮（初期事象）
第１段階では、軟骨形成性分化に特徴的な遺伝子の発現を分析した（図３）。転写因子ＳＯＸ‐５のｍＲＮＡレベルは培養から１２時間後でやや発現上昇した。それより後の時点では発現が単層レベルまで低下した。驚くことに、転写調節因子ＳＯＸ‐９は単層培養と比べて３倍発現低下することが分かった。この低下したｍＲＮＡレベルは凝縮形成の最初の３日の間に維持された。それにもかかわらず、両方の転写因子は、ＧＡＰＤＨ比で表されるように、単層培養と低結合性培養の両方で高発現した。脱分化軟骨細胞はＴＧＦ‐β１のはっきりした発現を示した。しかしながら、この成長因子は細胞凝縮期では変化せずにいた。予想通り、Ｎ‐カドヘリン発現は低結合性凝縮において凝縮の最初の１時間の間におおいに発現上昇した。凝縮体が形成されたそれより後の時点では接着分子について４倍の遺伝子発現の低下が検出された。驚くことに、選択されたマトリックス分子のｍＲＮＡレベルの重大な変化が３Ｄ培養の初期段階においても測定された。１Ａ１型コラーゲンは単層培養では豊富に発現することが分かったが、この分子は３Ｄ培養誘導から４時間後に１０倍発現低下し、そして、次の９０時間の間にさらなる段階的低下を示した。対照的に、軟骨性マトリックス分子である２Ａ１型コラーゲンの発現は低結合性培養から９０時間後に１２倍誘導されることが分かった。しかしながら、プロテオグリカン成分であるアグレカンのｍＲＮＡレベルは非常に初期の時点（４時間）で実質的に１０倍低下し、そして、３Ｄ培養の次の４日の間にさらに低下した（図３）。
【００９０】
軟骨形成性分化（後期事象）
本低結合性３Ｄ培養系の軟骨形成能を分析するために特定の細胞外マトリックス成分の蓄積を明らかにした（図４）。さらに、軟骨形成関連遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲにより定量した（図４）。２８日後に組織学的分析のために凝集体の切片を作製した。凝集体切片のヘマトキシリン染色は高い細胞密度を示した。また、細胞外マトリックスであるプロテオグリカンの大量の蓄積をアルシアンブルー染色によって観察することができた。３Ｄ培養から４週間後における２Ａ１型コラーゲン発現の３桁の上昇が所定のマトリックス分子に関する最も顕著な結果であった。２Ａ１型コラーゲン発現の免疫組織学的動態分析によって、３Ｄ培養の初期段階の間であっても２Ａ１型コラーゲンが蓄積することが示された。培養誘導後から最初の２日の間に２Ａ１型コラーゲンシグナルを検出することができなかった。しかしながら、細胞凝縮の誘導から８日後にはかなりのシグナルが、そして、培養から４週間後には２Ａ１型コラーゲンのさらに広範囲の沈着が明らかであった。さらに、１Ａ１型コラーゲンの発現低下は単層培養物と比べて２５倍のｍＲＮＡレベルの低下によって明らかであった。予期せぬことに、アグレカンｍＲＮＡレベルは増殖性２Ｄ培養物と比べて５倍低下した（図４）。驚くことに、転写因子Ｓｏｘ‐９はＧＡＰＤＨ比によって表される増殖性単層細胞における例外的に高レベルの遺伝子発現を示した。凝集体形成の間の一時的な発現低下の後にそのｍＲＮＡレベルは単層基本値まで戻った。他方、Ｓｏｘ‐５の１４倍までのさらなる発現の増加を検出することができた。したがって、Ｓｏｘ‐５の相対的発現は低結合性培養から４週間後における相対的Ｓｏｘ‐９発現よりも多かった。さらに、ＴＧＦβ１と接着分子Ｎ‐カドヘリンのｍＲＮＡレベルのさらなる上昇を３Ｄ培養において測定することができた（図４）。
【００９１】
凝縮および分化過程の包括的分析
無スキャフォールド型分化系を利用するためにゲノムワイドマイクロアレイ分析を用いて細胞分化をさらに研究し、ならびに、凝縮過程の間の発現パターンの変化を特徴解析した。個々の初代細胞培養物を用いる２つの独立した実験を実施した。蛍光標識プローブをアジレント社の４４Ｋ  ＤＮＡチップにハイブリダイズした。結果生じた両方のチップのデータを評価のために統合した。両方のアレイが少なくとも２倍の遺伝子発現の変化を示した場合、遺伝子は発現調節を受けた遺伝子であることが示された。ｐ値カットオフをｐ＜０．０５に前もって指定した。この特定の調査された生物学的過程の一般的な考えを得るために、発現調節を受けた遺伝子はパンサーＧＯ分類に従ってグループ化された（表１〜５）。初期段階と後期段階の両方で最大数の発現調節を受けた遺伝子を有するグループは細胞間伝達、発生過程およびシグナル伝達（図５）であり、分化過程を誘導するために必要とされる機能グループ内の遺伝子発現の大規模な調節を示している。しかしながら、本３Ｄ培養系の目的は脱分化軟骨細胞の再分化である。よって、パンサー分類である「骨格系の発生」がより詳細に問われた。
【００９２】
凝縮期
表１および２が示すように、成長因子ＴＧＦ‐β３とＧＤＦ‐１５ならびに転写因子Ｆｏｓがこの分類グループで最も発現上昇した遺伝子である。顕著なことに、Ｈｏｘ‐Ａクラスターのいくつかのメンバーの発現が凝縮期の間に上昇することが明らかにされた。ＴＧＦ‐βグループメンバーであるインヒビン‐＿Ｂは最も大幅に発現低下した遺伝子であり、その上、発現抑制は培養から２８日後でも明らかであった。
【００９３】
２８日後の凝集体（表３および４）
２８日後において最も顕著な発現上昇した遺伝子は軟骨関連マトリックス分子であるＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲンおよびＸＩ型コラーゲンである。マトリックスＧｌａタンパク質および軟骨酸性タンパク質もｍＲＮＡレベルの増加を示し、一方、予期しなかったがリアルタイムＰＣＲのデータと一致して、アグレカンとアグレカン合成酵素であるＨＡＳが下方制御されるようであった。この分類グループにおいて最も発現上昇した遺伝子の中に転写因子ＦｏｓおよびＲｕｎｘ２ならびに成長因子ＧＤＦ‐１５が存在し、一方、非軟骨マトリックス分子であるＩ型コラーゲンおよびＸＩＩ型コラーゲンは大幅に減少した。
【００９４】
凝縮過程は細胞間接着によって仲介される
間充織凝縮の過程は緩い間充織凝集を特徴とする。それにもかかわらず、この始原細胞密度の増加がどのように仲介されるのかほとんど分かっていない。パンサー分類内のいくつかのタンパク質ファミリーの多機能性のため、接着分子と走化性分子をＫＥＧＧデータベースに従って狭義でさらに下位グループに分けた。この３Ｄ培養系を利用する最初の試みでＤＮＡマイクロアレイデータは差次的に発現したケモカインと対応する受容体を示した（表５）ので、ケモカインと移動性細胞活性の潜在的な関与を凝縮過程の間に分析すべきである。大多数のケモカイン受容体は７回経膜受容体ファミリーの部分である。このクラスのタンパク質はＧ‐タンパク質共役シグナル伝達によってそれらのシグナル伝達を誘発する。百日咳毒素（ＰＴＸ、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ））はヘテロ三量体Ｇ‐タンパク質複合体のＧサブユニットのＡＤＰリボシル化によりこの経路を混乱させる。凝縮中にケモカイン活性を無効にするためにさまざまな濃度ＰＴＸを添加して低結合性培養実験を実行した。予期せぬことに、ＰＴＸ処理培養物の細胞凝縮物は、適用した濃度と無関係に最初の７２時間の間は対照実験と区別することができないようであった（図６）。培養誘導の直後に細胞は小細胞クラスターを形成し、網様移行段階を経てさらに高密度化して初めてＰＴＸ投与と無関係に、類似の動態で最終的に１つの高密度細胞凝集体が形成された。この観察結果は、ケモカイン介在性細胞移動が細胞凝集過程に関与しないことを示している。興味深いことに、マイクロアレイ評価の結果は差次的に発現した接着分子の７５％が発現上昇するようであることを示し、凝縮段階中の細胞間相互作用の増加を示唆した（表５）。この仮説はより詳細な顕微鏡観察によって確認された。複数の小凝集体が生じる明確な移行期において、細胞突起のような長い樹状突起が現れた。１つの細胞副中心から次の副中心まで結合が直接的に形成されるか（図７Ａ〜Ｃ）、または反対方向に伸びる２つの突起を有する１つの細胞によって結合が構築された（図７Ｄ）。それより後の段階でこれらの細い糸が全ての小凝集体を最終的な凝集体に結合するのに用いられる。そのようにして、ケモカイン介在性細胞移動よりもむしろ、細胞相互作用を強化することになる接着分子の発現上昇によって凝縮過程が強行される。
【００９５】
簡単な説明
自律的始原細胞の適用は骨関節炎において損傷軟骨組織を再生する有望な戦略である。機能性があり、活性がある軟骨細胞へ分化するようにこれらの細胞を誘引することができ、結果として新規に合成された軟骨が生じる。これまで、この目的のためにいくつかの培養系が確立された。軟骨形成性分化はインビボでの間充織凝縮段階によって開始されるので、最初の系列特異的段階をインビトロで完全に特徴解析することが非常に興味深い。したがって、初期凝縮期を含む軟骨形成の全過程を模倣して無スキャフォールド型低結合性３Ｄ培養系を開発した。その培養系は、重要な転写因子であるＳｏｘ‐５とＩＩ型コラーゲンおよびＩＸ型コラーゲンの遺伝子発現の上昇によって示される軟骨形成性分化を誘導することができる。他の確立された３Ｄ培養系と比べて低結合性プレート培養を使用することによって、前に単離し、増殖させた間葉系起源のヒト初代細胞の単一細胞懸濁液から始まって、様々な段階の細胞凝集を分析するための利点が提供される。初期段階の分析により、凝縮過程はケモカインシグナル伝達よりもむしろ細胞間接着の増加によって仲介されることが示される。したがって、本低結合性３Ｄ培養系は、最終的には、軟骨形成性分化のインビボでの誘導または治療用途の移植物のインビトロでの作製に必須である重要な因子の同定に役立ち得る。
【００９６】
ＩＩＩ．自立型３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドオンチップ装置
図８において本発明の自立型３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドオンチップ装置が示される。
【００９７】
自立型３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドオンチップ装置１は、培地供給チャンネル６を介して互いに連結されている２つの培地供給用貯留槽５が形成される基材２を含む。自立型３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドオンチップ装置１は一層の人工軟骨組織４と一層の人工骨組織３を含む３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドが収容される器官空洞７をさらに含み、その中で人工軟骨組織４は人工骨組織３の表面と直接的に接触している。機械的力をその３Ｄインビトロ二相性軟骨オルガノイドに適用させるために作動器８が存在してもよい。
【００９８】
実施例Ｂ
材料と方法
１．ＭＳＣの単離と増殖
前に述べたように、ベルリン医科大学シャリテの倫理委員会のガイドラインに従って同意書を得て、関節置換手術の後に得た大腿骨骨頭骨髄からヒトＭＳＣを単離した。次に、４．５ｇ／ｌのグルコース（ＰＡＡラボラトリーズ社、オーストリア）を有し、１０％ＦＢＳ（ＰＡＡラボラトリーズ社、オーストリア）とペニシリン‐ストレプトマイシン（ＰＡＡラボラトリーズ社）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）においてそれらの細胞を増殖させた。継代４と継代７の間のＭＳＣを共培養実験に使用した。
【００９９】
２．ＨＳＰＣの単離
ベルリン医科大学シャリテの倫理委員会のガイドラインに従って同意書を得て、ヒトＨＳＰＣを臍帯血から単離した。臍帯血をＰＢＳ‐ＢＳＡ‐ＥＤＴＡ溶液中に収集し、そして、単核球を密度勾配遠心分離により単離した。次に、ＭＡＣＳ  ＣＤ３４+単離キット（ミルテニー・バイオテク社、ドイツ）を使用し、製造業者の使用説明書に従って免疫磁性分離によりＨＳＰＣを分離した。次に新しく単離された細胞を２×１０４細胞／培養物の密度で様々な培養系に導入した。
【０１００】
３．セラミックス
ドイツのツェルベルクＧｍｂＨ社より１ｍｍの厚みと１ｃｍの直径を有する酸化ジルコニウムベースのハイドロキシアパタイト被覆スポンセラムＨＡ（登録商標）セラミックディスクを購入した。そのディスクを使用前にオートクレーブした。
【０１０１】
４．細胞培養系
ＨＳＣの播種７日前にセラミックディスクにＭＳＣを約１０６細胞／ディスクの密度で播種した。超低結合性２４ウェルプレート（コーニング社、米国）中の１０％ＦＢＳ（ＰＡＡラボラトリーズ社、オーストリア）とペニシリン‐ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ‐高グルコース（ＰＡＡラボラトリーズ社、オーストリア）中にそれらのセラミックディスクを浸した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で維持した。培地を４８時間毎に交換した。同時に６ウェルプレートにもＭＳＣを播種し、それらは２４時間以内に集密に達した。これらのプレートのうちの１つのセットをセラミックスの培養と同じ培地で培養し、デキサメタゾン、アスコルビン酸およびβ‐グリセロリン酸（シグマ社、米国）を含有する骨誘導性培地で別のセットを処理した。ＭＳＣの播種から７日後に新しく単離されたＨＳＰＣを４つの培養条件に導入した：１つ目の培養条件、セラミックスに播種されたＭＳＣを用いる３Ｄ共培養；２つ目の培養条件、６ウェルプレートに播種されたＭＳＣ単層を用いる２Ｄ共培養；３つ目の培養条件、６ウェルプレートに播種された骨誘導ＭＳＣ単層を用いる２Ｄ共培養；および４つ目の培養条件、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ‐６、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＦＬＴ‐３Ｌ（ペプトテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）社、英国）を添加されたＳｔｅｍｓｐａｎ培地（ステムセル・テクノロジーズ社、カナダ）中での懸濁培養。９つの独立したＭＳＣ試料およびＨＳＣ試料をこの研究のために利用した。培養開始から１週間後、２週間後および４週間後に各培養系に由来する細胞をフローサイトメトリーと免疫組織化学によって分析した。追加の８週間の時点で長期培養能を確認するために３Ｄ培養物を分析した。
【０１０２】
５．ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ調製およびｑＰＣＲ
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ  ＩＩキット（マッハライ‐ナーゲル社、ドイツ）を使用し、提供された使用説明書に従ってＲＮＡの単離を実施した。セラミックス中に培養された細胞をそのセラミックス上で直接的に溶解した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）逆転写試薬ｃＤＮＡキット（アプライド・バイオシステムズ社、米国）を製造業者の使用説明書に従って使用することによってｍＲＮＡの逆転写を実施した。９６ウェルＰＣＲプレート（バイオザイム・サイエンティフィック社、ドイツ）中で１μｌのプライマー混合物およびＳｅｎｓｉＦＡＳＴ（商標）Ｓｙｂｒ  Ｎｏ‐ＲＯＸキット（バイオライン社、ドイツ）と共に１μｌのｃＤＮＡを使用してリアルタイムＰＣＲを実施し、そして、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ３００５Ｐ（商標）マルチプレックス定量的ＰＣＲシステム（アジレント・テクノロジーズ社、米国）で読み込みを行った。ＴＩＢＭｏｌＢｉｏｌ社（ドイツ）へプライマーを注文した。
【０１０３】
６．細胞追跡
蛍光顕微鏡観察によるＨＳＰＣとＭＳＣの長期追跡のため、培養前にＱｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）５２５細胞標識キットとＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）レッドＣＭＴＰＸ（インビトロジェン社、米国）を製造業者の使用説明書に従ってそれぞれ使用して細胞を標識した。細胞分裂を追跡するため、単離直後に２．５μΜの濃度でカルボキシフルオレセインジアセテート・スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、インビトロジェン社、米国）を製造業者の使用説明書に従って使用してＨＳＰＣを標識した。次に、１週間後、２週間後および４週間後にフローサイトメトリーを用いて緑色標識細胞をゲートアウトし、そして、細胞分裂を追跡した。
【０１０４】
７．免疫組織化学
セラミックスキャフォールド内のＥＣＭとシグナル伝達分子を視覚化するために、細胞追跡されるＨＳＰＣを播種してから２週間後に細胞を含むセラミックスをアセトン（シグマ社、米国）中において−２０℃で固定した。次に、解剖刀を使用してそれらのディスクを切断し、そして、９６ウェルプレート中において総計１５０μｌの体積でＩ型コラーゲン（マウス抗ヒト、シグマ社、米国）、Ｃ‐Ｋｉｔ（マウス抗ヒト、サンタクルーズ・バイオテクノロジー社、米国）、フィブロネクチン（マウス抗ヒト、ミリポア社、米国）、インテグリン４ａ（マウス抗ヒト、Ａｂｃａｍ社、英国）およびＮ‐カドヘリン（マウス抗ヒト、サンタクルーズ・バイオテクノロジー社、米国）に対する一次抗体を使用してそれらのディスクを染色した。次に、Ａｌｅｘａ３５０またはＡｌｅｘａ５９４（インビトロジェン社、米国）と連結させたヤギ抗マウス二次抗体でそれらの試料を染色し、洗浄し、そして、顕微鏡観察により視覚化した。
【０１０５】
８．蛍光および２光子顕微鏡観察
１週間後、２週間後、４週間後および８週間後の本共培養系中におけるＱｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）グリーン追跡ＨＳＰＣの存在をＤＡＰＩ（シグマ社、米国）による細胞核の対比染色の後にデジタル蛍光顕微鏡（ＢＺ９０００、キーエンス社、ドイツ）下でそれらを視覚化することにより確認した。２光子顕微鏡（Ｔｒｉｍｓｃｏｐｅ  ＩＩ、ラビジョン・バイオテック（ＬａＶｉｓｉｏｎ  ＢｉｏＴｅｃ）社、ドイツ）を使用してＥＣＭとシグナル伝達分子を３Ｄスタックとして視覚化し、Ｉｍａｒｉｓ第７．５版（ビットプレーン・サイエンティフィック・ソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）社、スイス）を使用して表示した。
【０１０６】
９．走査電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）
細胞播種セラミック培養系と骨髄の間の構造的類似性を、および、ＨＳＰＣとＭＳＣに対する物理的相互作用も視覚化するためにＳＥＭを使用した。共培養から２週間後のＭＳＣおよびＨＳＰＣを含むセラミックディスクと大腿骨骨頭から切り出した１ｃｍ２の小片の骨髄を、アセトンを使用して固定および脱水し、そして、臨界点乾燥により準備した。次にこれらの試料を金および銀で被覆し、日立Ｓ‐５２０ＳＥＭ（日立、日本）を使用して視覚化した。
【０１０７】
１０．フローサイトメトリー
全ての培養系に由来するＨＳＰＣの表現型をフローサイトメトリー分析により表面マーカー発現に基づいて比較した。恒温器内で１×トリプシン‐ＥＤＴＡ（ＰＡＡラボラトリーズ社、オーストリア）と３７℃で３０分間保温することによって全ての接着性培養系から細胞を収集した。懸濁細胞を収集用チューブに単にピペットで分注した。次にそれらの細胞を製造業者の使用説明書に従って次の抗体で染色した：ＣＤ３４‐ＡＰＣ（ミルテニー・バイオテク社、ドイツ）、ＣＤ３８‐ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）社、米国）、アネキシンＶ‐パシフィックブルー（バイオレジェンド社、米国）、ヨウ化プロピジウム（シグマ社、米国）。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）アナライザー（ミルテニー社、ドイツ）フローサイトメーターを使用してフローサイトメトリー分析を実施し、そして、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア、第７．６．５版（ツリー・スター（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）社、米国）を使用してデータを分析した。
【０１０８】
１１．ＣＦＵ‐ＧＥＭＭアッセイ
播種から１週間後、２週間後、４週間後および８週間後に本セラミック共培養系から得られたＨＳＰＣの骨髄分化能を、顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球コロニー形成ユニットアッセイを用いて試験した。１０００細胞をＣＦＵ‐ＧＥＭＭ培地（ミルテニー・バイオテク社、ドイツ）中に播種し、２週間後にコロニーを視覚化し、採点を行った。
【０１０９】
１２．統計分析
２元配置ＡＮＯＶＡ分析とそれに続くボンフェローニ補正が、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア第５．０版（グラフパッド・ソフトウェア社、米国）を使用してデータセットに適用された。０．０５以上のＰ値を有意と見なした。データは平均値±標準偏差として表される。
【０１１０】
結果
１．セラミックス内での７日の培養の間にＭＳＣは骨髄に構造的に非常に類似した微小環境を作り出す。
骨髄ＭＳＣにおける分化とＥＣＭ産生に対する３Ｄ培養条件の影響は広範囲に考証されてきた。この研究において使用されたセラミックスのような堅いスキャフォールドがＭＳＣを骨形成性分化する方向に持っていくことが示されている。したがって、ＭＳＣに対するセラミックスキャフォールド中での３Ｄ培養の効果がＨＳＰＣの導入の前に判定された。
【０１１１】
免疫組織化学分析によって、ＭＳＣが播種から７日後にＩ型コラーゲンとフィブロネクチンから構成されるクモの巣様のＥＣＭのネットワークを形成し（図９Ａ（ｉ、ｉｉ））、そのネットワークの中にＭＳＣが存在することが示された。インテグリン４ａも産生される（図９Ａ（ｉｉｉ））。Ｉ型コラーゲンとフィブロネクチンは骨髄においてＨＳＣニッチの維持に関与することが知られており、そして、それらは骨髄へのＨＳＰＣの確保を仲介すると考えられている。インテグリン４ａはそのニッチ内でのＭＳＣ‐ＨＳＣ相互作用に役割を果たすことが知られている。走査電子顕微鏡観察（図９Ｂ）はヒト骨髄マトリックスの構造（図９Ｂ（ｉｉ、ｉｖ））に対するＭＳＣ播種セラミックスの構造（図９Ｂ（ｉ、ｉｉｉ））の顕著な類似性を明らかにした。
【０１１２】
アリザリンレッド（図９Ｃ（ｉ、ｉｉ））、フォン・コッサ陽性染色（図９Ｃ（ｉｉｉ、ｉｖ））は、セラミックス中に播種されたＭＳＣが培養から７日後に散発的な骨形成性分化を行うことを示した。
【０１１３】
ＭＳＣの単層培養物と比べる初期骨形成マーカーであるオステオポンチンの発現のＱ‐ＰＣＲ分析（図９Ｄ）によってＭＳＣの少なくとも部分的な散発的骨形成性分化が確認される。骨内膜ニッチにおいて推定上の役割を有する他の分子、すなわち、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｎ‐カドヘリン、ＢＭＰＲ１ａ、ＩＣＡＭ１およびＣＸＣＲ４も単層と比べて本３Ｄ培養において発現上昇した。このことは、セラミックスキャフォールド内で培養されるとＭＳＣがＨＳＣ維持を促進する微小環境を散発的に作り出すことを示唆する。７日はその系に造血性幹細胞・前駆細胞を導入するのに適切な時点であると判断された。
【０１１４】
２．初期ＣＤ３４+ＣＤ３８-ＨＳＰＣは最大で８週間本３Ｄ共培養系で維持される。
ＨＳＰＣを維持する手段としての本３Ｄ共培養系の検証について第１の検討事項は、セラミックスに播種されたＨＳＰＣがその中に入り込み、かなりの期間にそこに留まるかということであった。セルトラッカー・グリーン標識ＨＳＰＣが播種から１週間後、２週間後、４週間後および８週間後に（図１０Ａ）共培養系において蛍光顕微鏡観察を用いて検出された。このことは、ＨＳＰＣがＭＳＣ播種セラミックスに浸潤し、最大で８週間安定的に維持されることを示す。さらなる時点を試験することはなかった。
【０１１５】
ＨＳＰＣがそれらの初期（ＣＤ３４+ＣＤ３８-）表現型を維持したか判定するため、および既に使用されているＨＳＰＣ培養戦略に対する本３Ｄ共培養系の利点を探究するため、我々は、伝統的な懸濁培養ならびに最大で４週間の骨誘導ＭＳＣ単層および骨非誘導ＭＳＣ単層との共培養における初期ＨＳＰＣのパーセンテージと我々のセラミック共培養系において維持される初期ＨＳＰＣのパーセンテージをＣＤ３４およびＣＤ３８発現細胞のフローサイトメトリー検出により比較した（図１０Ｂ、Ｃ、Ｄ）。
【０１１６】
セラミック共培養系において維持されるＣＤ３４+、ＣＤ３８-細胞のパーセンテージは播種から８週間まで約５０％で安定していることが分かった。しかしながら、全ての他の培養条件ではＣＤ３４+ＣＤ３８-細胞の割合は、存在する初期ＨＳＰＣが５％未満になるまで一定して減少した（図１０Ｃ）。単層共培養物中の高パーセンテージのＨＳＰＣ（約５０％）は、２週間後には検出されない分化性細胞（ＣＤ３４+ＣＤ３８+）であることが分かった。低パーセンテージ（５％未満）のこれらの細胞も本３Ｄ系において一貫して観察された（図１０Ｄ）。
【０１１７】
３．本セラミックスベースの共培養系において維持されるＨＳＰＣは緩慢分裂性であり、静止状態である。
次に、第１週、第２週および第４週におけるＣＦＳＥ標識ＨＰＳＣのフローサイトメトリー分析によって、本３Ｄ共培養系におけるＨＳＰＣの増殖を先に述べた従来の培養方法と比べた。１回以下の分裂（ＣＦＳＥヒストグラムの右から最初の２つのピーク）を行った細胞を緩慢増殖性と見なし、一方、全ての他の細胞を急速増殖性であると見なした。
【０１１８】
フローサイトメトリー分析とその後のヒストグラムの作製（図１１Ａ）によって、本３Ｄ共培養系の細胞が全ての培養系のうちで最も緩慢増殖性であることが示された。３Ｄ共培養物中の大きな割合（７０％超）のＨＳＰＣが緩慢増殖性細胞であることが分かった。このパーセンテージは第２週と第４週の間にわずかに（１０％未満）減少することがわかった（図１１Ｂ）。緩慢増殖性細胞の割合は本３Ｄ共培養系よりも全ての従来法の培養物において比較的に低いことがわかり、そして、培養４週間までに１０％未満まで減少した（図１１Ｂ）。
【０１１９】
培養から１週間後、２週間後および４週間後にＣＤ３４およびＣＤ３８のフローサイトメトリー分析によって緩慢増殖性ＨＳＰＣおよび急速増殖性ＨＳＰＣの表現型を調査して、本３Ｄ共培養系に由来するＨＳＰＣが培養から１週間後、２週間後および４週間後において初期ＣＤ３４+ＣＤ３８-表現型を有する最大の割合の細胞を保持することが分かった（図１１Ｃ、Ｄ、Ｅ）。その３Ｄ共培養物に由来する５０％を超える緩慢増殖性ＨＳＰＣおよび急速増殖性ＨＳＰＣが最大で４週間初期表現型を保持した。
【０１２０】
急速増殖性細胞におけるＣＤ３４+ＣＤ３８-細胞の割合は、予想通り、緩慢増殖性細胞におけるその細胞の割合よりも少なかった。伝統的方法の共培養物に由来する緩慢増殖性画分および急速増殖性画分における初期細胞のパーセンテージは時間と共に着実に減少する（図１１Ｃ、Ｄ、Ｅ）。
【０１２１】
４．本セラミックスベースの共培養系において維持されるＨＳＰＣは生存可能であり、非アポトーシス性である。
初期ＨＳＰＣ表現型は本３Ｄ培養において最もよく維持されることが立証されたので、早期アポトーシスの広く用いられる指標であるアネキシンＶの発現の測定および後期アポトーシス性細胞とネクローシス性細胞によって取り込まれるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により全ての培養系におけるそれらの細胞の生存度を判定した。
【０１２２】
本３Ｄ共培養系における非常に小さい割合（０．２％未満）のＨＳＰＣが第２週までアネキシンＶを発現し（図１２Ｃ）、ＰＩを取り込み（図１２Ｂ）、その後にはこれらの細胞はもはや存在しない。
【０１２３】
従来の系、特に懸濁培養および骨誘導ＭＳＣとの共培養では、わずかにより大きな割合のＨＳＰＣ（０．５〜１．５％）がアポトーシス性またはネクローシス性（図１２Ｂ、Ｃ）であることが分かった。このデータより我々は、ＨＳＰＣの大部分は全ての培養条件において最大で８週間は生存可能であり、非アポトーシス性を保つと結論した。
【０１２４】
５．本セラミックス共培養物に由来するＨＳＰＣは機能性であり、多系列分化能を有する。
本３Ｄ共培養系において維持されるＨＳＰＣはそれらの初期表現型を保持し、且つ、生存可能であると確認した後に我々はＣＦＵ‐ＧＥＭＭアッセイを用いてこれらの細胞がＨＳＰＣに特徴的な多系列分化能を保持しているか試験した。
【０１２５】
播種から１週間後、２週間後および４週間後に本３Ｄ共培養系より単離されたＣＤ３４+細胞はＣＦＵ‐ＧＥＭＭコロニー、ＢＦＵ‐ＥコロニーおよびＣＦＵ‐ＧＭコロニーを産出した（図１２Ｄ）。これらのコロニーを数えたところ、様々な時点で有意な差は見つからなかった（図１２Ｅ）。したがって、本３Ｄ共培養系において維持されるＣＤ３４+細胞は生存可能であるばかりか、それらの特徴的な多系列分化能も保持している。
【０１２６】
６．本３Ｄ共培養系のＨＳＰＣはＥＣＭおよびそれらの微小環境の細胞成分と相互作用する。
最後に、骨髄ＨＳＰＣニッチ内の相互作用が本セラミックス共培養系内でかなりの程度まで模倣されていることを示すために本セラミックス系内でのＨＳＰＣとＭＳＣの物理的相互作用を調査した。ＨＳＰＣとＭＳＣの共局在が以前に観察されたが（図１０Ａ）、物理的接触の証拠または相互作用機構の兆候は全く得られなかった。
【０１２７】
走査電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）により、約１０μｍの直径を有する小さい球形のＨＳＰＣが本セラミックス共培養系内でより平坦で大きいＭＳＣのうちの１つと密着して常に見つかることが明らかになった（図１３Ｂ）。これらの相互作用に関与する因子をさらに解明するために、免疫組織学的分析を実施した。
【０１２８】
２光子顕微鏡観察により、蛍光標識ＭＳＣ（赤色）とＨＳＰＣ（緑色）は主にフィブロネクチンとＩ型コラーゲンから構成されるＥＣＭネットワークの中に埋め込まれていることが分かった（図１３Ａ  ｉｉ、ｉｉｉ）。シグナル伝達分子Ｃ‐Ｋｉｔ、インテグリン４ａおよびＮ‐カドヘリンの免疫染色により、これらの分子はＨＳＰＣとＭＳＣが接触している領域に位置することが示された（図１３Ａ  ｉｖ、ｖ、ｖｉ）。このことは、我々の３Ｄ共培養系においてＨＳＰＣとＭＳＣがこれらの分子を介して相互作用し、その相互作用が骨髄の骨内膜造血性ニッチに存在すると考えられている相互作用と非常に似ていることを示す。
【０１２９】
考察
造血性幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）が緩慢増殖性初期細胞として維持される骨内膜造血性ニッチは非常に複雑な系であることが分かっている。骨芽細胞、骨形成性前駆細胞および間葉系幹細胞を含むいくつかの異なる細胞種がＥＣＭ分子産生、細胞間直接接触、およびシグナル伝達分子産生などの様々な機構によりニッチ制御に寄与することが分かった。個々の細胞種、シグナル伝達経路および物理的基準さえもニッチ維持の様々な態様に関係づけられてきたが、これらの因子とそのニッチにおけるそれらの正確な役割の間の関係は不明のままである。骨内膜ニッチを効率的に模倣するインビトロモデルの開発は、それ故、そのニッチの相互作用の研究に非常に有用だろう。
【０１３０】
骨内膜ニッチ内の相互作用の模倣に成功するために、間質支持細胞の存在および３Ｄ構造体が必要であることが近年の研究により示された。骨髄間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は初期静止状態ＨＳＣのインビトロでの維持と増殖に特に効率的であることがいくつかの独立した研究により明らかにされた。ＭＳＣはインテグリンのようなシグナル伝達分子、Ｉ型コラーゲンおよびフィブロネクチンを含むＥＣＭ成分の産生、ならびに細胞相互作用によってニッチ維持を仲介すると考えられている。Ｉ型コラーゲンとフィブロネクチンは表面受容体への結合および分泌された因子の捕捉によりＨＳＣの帰巣を仲介することが分かっている。ＭＳＣは、前記のニッチ内でのＨＳＰＣの公知のパートナーである骨芽細胞の前駆体であることも分かっている。骨髄ＨＳＰＣニッチに寄与する骨芽細胞は様々な分化程度の細胞を含む混合集団であることが示されている。
【０１３１】
全てのこれらの因子をできるだけ厳密に模倣するため、我々は臍帯血由来ＨＳＰＣの培養系として骨髄ＭＳＣを播種したハイドロキシアパタイト被覆スポンセラム（登録商標）３Ｄセラミックスキャフォールドを使用した。それらのセラミックスキャフォールドは細胞接着に関して最適化されており、そして、ＭＳＣの散発性骨形成性分化を誘導することが報告されている。
【０１３２】
しかしながら、分化の程度はＢＭＰまたは他の因子で誘導された培養物におけるものよりも低いことが示された。このことは、そのセラミックスキャフォールドだけでＭＳＣを培養することによって、骨髄ニッチにおけるように、骨形成性分化が様々な程度である細胞の集団が生じることを示唆する。
【０１３３】
ＭＳＣを播種したセラミックスの免疫組織化学分析によって、我々はそのセラミックス全体に観察される高密度ネットワーク様構造体の主要成分を構成するＥＣＭ分子であるＩ型コラーゲンとフィブロネクチンの発現を観察した。
【０１３４】
インテグリン４ａのレベルの上昇も検出された。ＭＳＣ播種セラミックスと大腿骨骨頭由来の海綿骨の走査電子顕微鏡分析によりそれら２つの間のかなりの程度の構造的類似性が明らかになった。この培養系のリアルタイムＰＣＲ分析により、初期骨形成マーカーであるオステオポンチンならびに骨内膜ニッチにおいて公知の役割を有する分子であるＪａｇｇｅｄ‐１、Ｃ‐Ｘ‐Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＬ１２）、ＢＭＰ受容体１Ａ（ＢＭＰＲ１Ａ）、Ｎ‐カドヘリンおよびＩｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ‐１（ＩＣＡＭ‐１）の発現が本３Ｄ培養物において上方制御されることが示された。オステオポンチンはＨＳＰＣの増殖と移動を制限することによりニッチ維持とＨＳＰＣの静止状態を促進することが分かっている。Ｊａｇｇｅｄ‐１はＮｏｔｃｈシグナル伝達を介してＨＳＰＣの自己再生を仲介すると考えられている。ＣＸＣＬ１２、ＢＭＰＲ１ＡおよびＮ‐カドヘリンの全てはＨＳＣの帰巣に関係づけられており、そして、ＩＣＡＭ‐１は細胞間結合の公知の媒介物である。こうして、我々はそれらのセラミックスキャフォールドへのＭＳＣの播種から１週間以内に骨髄ニッチに対する構造的および分子的類似性を担持する微小環境が形成されることを観察した。この推定上の人工ニッチを完成させるために次に我々はＣＤ３４+ＨＳＰＣをこの系に導入した。
【０１３５】
我々は蛍光標識ＨＳＰＣの前記のセラミックスへの導入後８週間まで、蛍光顕微鏡観察を用いて本３Ｄ共培養系においてそれらの細胞を検出することができた。このことは、ＨＳＰＣがそのセラミックスへ侵入するだけではなくそこで長期間保持されることを示している。我々は、本セラミックス共培養物中の大きな割合（５０％超）のＨＳＰＣが培養１週間から８週間まで安定的に初期ＣＤ３４+ＣＤ３８-表現型を保持することをフローサイトメトリー分析により示した。対照的に、従来法の単層共培養物において培養されたＨＳＰＣ、または限定的サイトカイン補足培地における懸濁培養物として培養されたＨＳＰＣはそれらの初期表現型を一貫して失っていることが分かった。我々は、全ての培養系の細胞がアポトーシス性またはネクローシス性ではないことも確認した。
【０１３６】
骨内膜ニッチにおける初期ＨＳＰＣはそれらの低速の増殖も特徴とするので、我々はＣＦＳＥ希釈試験を用いてそれらの培養系の各々におけるＨＳＰＣの増殖を調査した。我々は、本３Ｄ共培養系のＨＳＰＣが従来法の培養物のものと比べて非常に少数の分裂（２回未満）を４週間の間に行うことを示した。懸濁培養物の細胞は特に高増殖性であった。我々は、３Ｄ共培養物由来のより大きなパーセンテージの緩慢増殖性細胞がＣＤ３４+ＣＤ３８-表現型を保持することも見出した。
【０１３７】
こうして、我々の３Ｄ共培養系はインビトロで長期間に生存可能であり、緩慢増殖性であり、ＣＤ３４+ＣＤ３８-であるＨＳＰＣを維持することができることを立証したので、我々はＣＦＵＧＥＭＭアッセイを用いてこれらの細胞が機能性であり、そして、赤血球系コロニーおよび骨髄性コロニーを形成することができることを示した。前記のセラミックスに由来するＨＳＰＣのコロニー形成能は培養時間によって変化せず、機能性ＨＳＰＣの安定した維持を示した。
【０１３８】
我々は、本共培養系内の分子相互作用を調査して、ＭＳＣとＨＳＰＣが前に説明されたフィブロネクチンとＩ型コラーゲンが構成するネットワーク内でごく近くに位置することを見出した。ニッチ媒介分子である幹細胞成長因子受容体（Ｃ‐Ｋｉｔ）、Ｎ‐カドヘリンおよびインテグリン４ａもＨＳＰＣおよびＭＳＣと共局在することが観察され、これらの２つの細胞種がこれらの分子を介して相互作用し得ることを示した。Ｃ‐Ｋｉｔは幹細胞成長因子の受容体であり、前記のニッチにおいてニッチマトリックスへの接着を仲介することによりＨＳＣ維持を促進すると考えられている。Ｎ‐カドヘリンとインテグリン４ａも類似の役割を有すると考えられている。さらなるＳＥＭ画像撮影により接着性ＭＳＣとＨＳＰＣの間の物理的相互作用が明らかにされ、本３Ｄ共培養系内のニッチ様細胞相互作用を明確に示された。
【０１３９】
近年の研究は、ＭＳＣとの共培養でそれぞれＩ型コラーゲンおよびフィブリンから構成される３Ｄゲルマトリックス中でＨＳＰＣを維持することに成功した。これらの研究は、インビトロでのＨＳＰＣの維持の成功に３Ｄスキャフォールディング、適切なＥＣＭおよびパートナー細胞の組合せが必要であることを効果的に示した。他の研究は、骨形成性分化細胞が３ＤにおけるＨＳＰＣに対する潜在的な支持細胞であることを示した。単層共培養および移植試験は、ＭＳＣがインビトロとインビボの両方でＨＳＰＣ維持を大いに改善することを示した。我々の３Ｄ共培養系は、細胞的、分子的および構造的構成に関して骨髄ＨＳＰＣニッチを厳密に模倣する人工系を作製するために輪郭がはっきりした堅いスキャフォールド、散発的に適切なＥＣＭ成分を産生し、そして、散発的な分化を行う骨髄ＭＳＣ、および初期ＨＳＰＣを組み合わせる。この系は前に記載された系よりも長期間に初期ＨＳＰＣを維持することができる。
【０１４０】
結論
我々のセラミックスベースの３Ｄ共培養系は骨内膜ＨＳＰＣニッチの最も重要な態様を厳密に模倣しており、そして、健康な状態および疾患状態の両方の状態におけるそのニッチの相互作用を調査するための有用なインビトロモデルを提供するだろう。その３Ｄ共培養系は、そのニッチのあらゆる部分を標的とする薬物についての物質試験プラットフォームとしての大きな能力も有する。この系は移植のための効果的なＨＳＰＣ増殖戦略の基盤を形成することもできるだろう。
【０１４１】
【表１】
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2015511482.tif 000003
【０１４２】
【表２】
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2015511482.tif 000005
【０１４３】
【表３】
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【０１４４】
【表４】
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【０１４５】
【表５】
2015511482.tif 000011
2015511482.tif 000012
【図１】
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【図１Ｂ−Ｇ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【国際調査報告】
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