(57)【要約】  多数の新規の改良微小流体構成及びシステム並びに微小流体浸潤アッセイシステムの製造方法及び操作を提供する。
2015517804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小流体細胞培養システムを使用して細胞を培養及び監視するための方法であって、
該微小流体細胞培養システムの細胞チャンバーに細胞の１つ以上の群を導入し；
該細胞チャンバー内において該細胞の１つ以上の群を培養し；
１個以上の微小流体流路を用いて該細胞チャンバー内に勾配を生成しかつ制御し；
ここで、該細胞チャンバーは、培養と勾配の生成及び制御中に、細胞への途切れのない光学経路を与え；
培養中及び勾配の制御中に該微小流体培養システム内における細胞の複数の画像を取得し；
一連の該複数の画像における１個以上の細胞を分析するための情報システムを使用して該１個以上の細胞の移動特性を決定すること
を含む方法。
【請求項２】
前記微小流体流路の１個以上が前記細胞チャンバー内に物質を導入しながら細胞の移動を制限する１個以上の障壁に関連付けられていることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１種以上の物質の勾配パラメータを制御することをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
勾配パラメータを制御して異なる期間で定常状態若しくは変動勾配又はその両方を与えることをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
画像取得中に細胞培養条件の微小流体制御及び化学誘引物質勾配形成を使用して刺激に応答した細胞移動の正確な動的定量を決定することをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ｘ方向の動き（例えば、勾配に対して垂直）をｙ方向の動き（例えば、勾配に平衡）とは別に分析することにより、物質に向かう走化性を方向性のない移動から区別することをさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
勾配条件に対して総移動距離及びユークリッド距離を決定することをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
１種以上の腫瘍、創傷、発生組織、免疫応答及び活発な細胞移動に関して特徴付けることのできる他の生体系における細胞の移動性質に及ぼすシグナル伝達分子、成長因子、又は他の物質の効果を決定することをさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
次の３つの異なる段階で細胞を培養することをさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法：
完全基質供給；
血清飢餓及び
化学誘引物質（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））勾配への曝露。
【請求項１０】
選択された期間後に勾配の方向を逆転させることをさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記選択された期間が、勾配の一方の方向での細胞移動又は他の特性を決定するのに十分な時間、例えば、３、６、１２、２４時間又は任意の適切な期間である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
勾配部分又は培養部分の間で低速度撮影画像を取得し、そして分析のために該画像のデジタル表現を記憶し；ここで、画像は、勾配暴露時間若しくは培養時間又はその両方の間に所望の間隔で取得され；該画像を、情報システムを使用して分析し；ここで、１個以上の個々の細胞を連続シリーズ又は他のシリーズの画像にわたって移動特性のために追跡することをさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
所望の間隔が例えば約２０分間隔又は１分〜４８時間の間隔の任意の数であり；個々の細胞は、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０〜１００又は約１００〜５，０００種の代表的な細胞の１種以上を含み；前記一連の画像は、例えば、培養の８〜１６時間の間に１０〜３６画像、培養の２４時間の間に３６〜３００画像又は任意の所望の培養期間中における画像の任意の所望の規則的又は不規則な取得であることをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１個以上の個々の単一細胞（例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を長期間（例えば、約６時間〜約６日の期間又は約３日の期間）にわたって勾配に応じて監視する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
創傷治癒及び腫瘍の転移などの病理学的現象の基礎となるメカニズムを前記移動からさらに決定する、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
安定した培地中での細胞と栄養素又は他の勾配に暴露された同じ細胞とを比較することによって、細胞移動特性を分析することをさらに含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
細胞の移動を比較して細胞移動が有意に方向付けられるかどうかを決定し、それにより培養チャンバー内における勾配に対する応答を示すことにより細胞移動特性を分析することをさらに含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
細胞を一定の物質中で比較することによって勾配に応答した細胞移動を決定し、そして勾配中における細胞が一定の物質状態における細胞よりもそれらの起点部位から実質的に遠く離れて（約３倍又は約１．５倍〜１０倍）移動しているかどうかを決定することをさらに含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
一定の物質中での細胞の速度と勾配中での細胞の速度とを比較することにより、該勾配に応答した細胞移動を決定することをさらに含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
細胞の増殖及び移動の両方を可能にする実質的な期間（例えば４時間〜６日の期間）にわたって細胞を培養し、画像を勾配誘導後一定期間撮影することをさらに含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
第１チャネル；該第１チャネルを細胞チャンバーから分離する第１障壁；該細胞チャンバーを第２チャネルから分離する第２障壁；第１物質を含むように構成された第１チャネル；第２物質を含むように構成された第２チャネル；を備える微小流体装置を構成することをさらに含み、それによって、該細胞チャンバー内の細胞が、該第１障壁に向かって該細胞を引きつける、該細胞チャンバー内における該第１物質の濃度勾配に曝露される、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
次の構成：
ａ．細胞チャンバー；
ｂ．該細胞チャンバーに第１物質を流すための第１流入口；
ｃ．該細胞チャンバーに第２物質を流すための第２流入口；
ｄ．少なくとも１個の細胞入口；
を備える微小流体装置を構成することをさらに含み、それによって、該細胞チャンバー内の細胞が、該第１物質及び該第２物質の連続的な安定勾配に曝露される、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞チャンバー内の細胞が制御勾配にさらされるように、請求項２６〜４６のいずれかに記載の微小流動装置を構成することをさらに含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
複数の微小流体装置における複数の細胞チャンバー内の細胞が１以上の制御勾配に暴露されるように請求項４７〜５５のいずれかに記載の微小流体システムを構成することをさらに含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
微小流体細胞培養システムを使用して細胞を培養しかつ監視するための方法であって、
細胞（例えば、転移性ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を監視して血清濃度の空間的な変化に応答したそれらの動きを決定し；
勾配（例えばＦＢＳ）に曝露された細胞について、該勾配の正の方向における細胞チャンバーの上部障壁に向かうＹ軸に沿った細胞の移動を検出し；
空間血清勾配の非存在下で培養された１個以上の対照細胞を監視して、はるかにランダムな方向性の動きの少ないものを検出し；
ここで、該勾配に曝露された細胞を、より高い濃度勾配源に向かって優先的に移動すると決定し；しかも、細胞の増殖及び移動の両方が４時間〜６日間隔の間に発生し、勾配誘導後の所定時間に画像を取得する方法。
【請求項２６】
次の構成を備える微小流体装置：
ａ．第１チャンネル；
ｂ．該第１チャネルを細胞チャンバーから分離する第１障壁；
ｃ．該細胞チャンバーを第２チャネルから分離する第２障壁；
ｄ．第１物質を含むように構成された第１チャネル；
ｄ．第２物質を含むように構成された第２チャネル；
ｅ．それによって、細胞保持領域における細胞が、該第１障壁に向かって細胞を引き付ける、該細胞チャンバー内の該第１物質の濃度勾配に曝露される。
【請求項２７】
次の構成を備える微小流体装置：
ａ．細胞チャンバー；
ｂ．該細胞チャンバーに第１物質を流すための第１流入口；
ｃ．該細胞チャンバーに第２物質を流すための第２流入口；
ｄ．少なくとも１個の細胞入口；
ｅ．それによって、該細胞チャンバー内の細胞が、該第１物質及び該第２物質の連続的な安定勾配に曝露される。
【請求項２８】
前記第１若しくは第２流入口又はその両方が物質を前記細胞チャンバーに流入させ、そして該第１又は第２流入口を通って該チャンバーから細胞が通過するのを阻害する複数の灌流通路を備える、請求項２７に記載の微小流体装置。
【請求項２９】
ｆ．前記細胞チャンバーに第３物質を流入させるための第３流入口をさらに備える、請求項２７に記載の微小流体装置。
【請求項３０】
前記装置が、１個以上の流路内の流れを毛管力若しくは重力若しくは能動的空気圧マニホールド又はそれらの任意の組み合わせによって駆動するように構成される、請求項２６〜２９のいずれかに記載の微小流体装置。
【請求項３１】
前記第１若しくは第２流路又はその両方が、約８×８ミクロンの断面微小流体細孔又は通路のセットによって前記細胞チャンバーから分離されている、請求項２６〜３０のいずれかに記載の微小流体装置。
【請求項３２】
前記第１及び第２チャネルウェル内の液体と出口ウェル内の液体とが前記流路と接触した状態にある、請求項２６〜３１のいずれかに記載の微小流体装置。
【請求項３３】
前記培養チャンバー上のウェルが良好なイメージング品質のために空のまま放置され、そして前記プレートの底面がガラススライドである、請求項２６〜３２のいずれかに記載の微小流体装置。
【請求項３４】
１個以上の流路は、幅が約５５０μｍ及び高さが５０μｍである、請求項２６〜３３のいずれかに記載の微小流体装置。
【請求項３５】
１個以上の障壁が約５０×８×８μｍ（長さ×幅×高さ）の通路のネットワークからなる、請求項２６〜３４のいずれかに記載の微小流体装置。
【請求項３６】
１個以上の障壁が、約１００×４×２μｍ（長さ×幅×高さ）の通路のネットワークからなり、さらに、該通路の狭い断面は、細胞が該障壁を通過するのを防止し、さらに、培地及び／又は化学誘引物質、染料若しくは他の材料などの任意の物質が該障壁を越えて拡散し、そして該細胞に対して勾配を形成する、請求項２６〜３５のいずれかに記載の微小流動装置。
【請求項３７】
前記チャンバーが約４．８×０．５×０．０５ｍｍ（長さ×幅×高さ）の寸法であり、かつ、移動する細胞の数をカウントするために使用される、請求項２６〜３６のいずれかに記載の微小流体装置。
【請求項３８】
前記チャンバー内の細胞が、手動又は自動顕微鏡により計数され、そして定量される、請求項２６〜３７のいずれかに記載の微小流体装置。
【請求項３９】
１個以上の流路が約１００×５０μｍ（幅×高さ）であり、少なくとも１個の流路が障壁に沿って流入口ウェルから流出口ウェルに流体を運んで流体を空にし、該障壁を介した流路からの物質の拡散を可能にする、請求項２６〜３８のいずれかに記載の微小流体装置。
【請求項４０】
前記装置が、細胞を様々な物質、ホルモン又は他の刺激、薬剤、化学誘引物質にさらすアッセイを含めて、１以上のアッセイ実験の同時実施を可能にするようにウェルプレートに構成されている、請求項２６〜３９のいずれかに記載の微小流体装置。
【請求項４１】
空気通路及び空気孔によって促進される前記チャネルを画定する材料を介した細胞及び空気の拡散を維持する前記チャンバー内の培養環境を与える構造をさらに含む、請求項２６〜４０のいずれかに記載の微小流体装置。
【請求項４２】
さらに、１個以上の流路内における物質又は液体の流れが前記細胞培養チャンバーに拡散し、かつ、細胞を引き付けつつ細胞に培養のための栄養を与える、請求項２６〜４１のいずれかに記載の微小流体装置。
【請求項４３】
各チャンバーが約１．５×０．５ｍｍのサイズであり、高さが約２００μｍである、請求項２６〜４２のいずれかに記載の微小流体装置。
【請求項４４】
１ユニット当たりの予想細胞数が約５００個の細胞である、請求項２６〜４３のいずれかに記載の微小流体装置。
【請求項４５】
例示灌流速度が約４０μｌ／日である、請求項２６〜４４のいずれかに記載の微小流体装置。
【請求項４６】
例示細胞チャンバー容積が約１５０ｎＬであり、該チャンバーの寸法が約１．５×０．５×０．２ｍｍである、請求項２６〜４５のいずれかに記載の微小流体装置。
【請求項４７】
次の構成を備える微小流体システム：
ａ．請求項２６〜４６のいずれかに記載の１個以上の装置；  
ｂ．該１個以上の装置のそれぞれに関連付けられた少なくとも３個のウェルを有する微小流体プレート；
ｃ．少なくとも１個のウェルが前記第１チャネル又は第２チャネルに化学誘引剤を導入するように構成される。
【請求項４８】
次の構成を備える微小流体システム：
ａ．請求項２６〜４６のいずれかに記載の１個以上の装置；
ｂ．該装置のそれぞれに接続された少なくとも３個のウェルを有するアクティブ制御微小流体プレート；
ｃ．少なくとも１個のウェルが前記第１チャネル又は第２チャネルに化学誘引剤を導入するように構成され；及び
ｄ．細胞培養中に少なくとも１個の装置に連結された少なくとも１個のウェル中において圧力及び／又は内容物を制御するためのマニホールド。
【請求項４９】
圧力を前記マニホールドによって制御する前記少なくとも１個のウェルの他に、流体を受け取り、かつ、受動的な重力駆動流により前記装置に流体を灌流するように構成された少なくとも１個のウェルをさらに備える、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５０】
前記１個以上の装置のそれぞれに関連付けられた少なくとも３個の入口ウェル及び１個の出口ウェルをさらに備える、請求項４８又は４９に記載のシステム。
【請求項５１】
少なくとも３個の流入口ウェルと、少なくとも１個の細胞入口ウェルと、少なくとも１個の細胞出口ウェルと、１個以上の装置のそれぞれに関連付けられた少なくとも１個の撮像／表示窓又はウェルとをさらに備える、請求項４８〜５０のいずれかに記載のシステム。
【請求項５２】
次の構成を備える微小流体システム：
ａ．請求項２６〜４７のいずれかに記載の１個以上の装置；  
ｂ．該装置のそれぞれに接続された少なくとも３個の入口ウェルを有するアクティブ制御微小流体プレート；
ｃ．少なくとも１個ウェルが前記第１チャネル又は第２チャネルに化学誘引剤を導入するように構成され；及び
ｄ．細胞培養中に少なくとも１個の装置に接続された少なくとも１個のウェル内で圧力及び／又は内容物を制御するためのマニホールド。
【請求項５３】
前記１個以上の装置のそれぞれに関連付けられた少なくとも３個の入口ウェル及び１個の出口ウェルをさらに備える、請求項５２に記載のシステム。
【請求項５４】
前記１個以上の装置のそれぞれに関連付けられた少なくとも４個の入口ウェル及び１個の出口ウェルをさらに備える、請求項５２又は５３に記載のシステム。
【請求項５５】
前記装置の少なくとも４個をさらに備え、それぞれ少なくとも２個の入口ウェル、少なくとも１個の出口ウェル及び撮像ウェル又は領域に関連付けられている、請求項５２〜５４のいずれかに記載のシステム。
【請求項５６】
１個以上の微小流体装置であってそれぞれ複数の入口ウェルに関連付けられたものを含むウェルプレート；及び
該プレートに一体化し、かつ、該入口ウェル内の溶液の圧力駆動制御を可能にするための空気圧マニホールド
をさらに備える、請求項４８〜５５のいずれかに記載のシステム。
【請求項５７】
前記マニホールドを介して前記ウェル内の圧力を制御するための論理プロセッサを有する自動化デジタルコントローラをさらに備える、請求項５６に記載のシステム。
【請求項５８】
複数の液体又は試薬入口ウェルが、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法に従う制御実験を可能にすることをさらに含む、請求項５６又は５７に記載のシステム。
【請求項５９】
複数の液体又は試薬入口ウェルは、細胞が前記入口を介して導入された異なる薬剤又は他の刺激に応答する方法に関する制御実験を可能にすることをさらに含む、請求項５６〜５８のいずれかに記載のシステム。
【請求項６０】
前記プレートをマニホールドに取り付けそして実験を実行する前に細胞を保持するのを容易にするために１個以上の装置に関連付けられた重力ウェルをさらに備える、請求項５６〜５９のいずれかに記載のシステム。
【請求項６１】
複数の液体又は試薬入口ウェルが、溶液を細胞に対して迅速に変化させる該入口を介して導入された異なる薬剤又は他の刺激に細胞が応答する方法に関する制御実験を可能にする、請求項５６〜６０のいずれかに記載のシステム。
【請求項６２】
１個以上の細胞チャンバー内における細胞の画像を取得するためのデジタル画像取得装置と、該取得画像を読み取って細胞を計数し又は個々の細胞若しくは細胞の群又はその両方の移動を決定するための情報処理システムをさらに備える、請求項５６〜６１のいずれかに記載のシステム。
【請求項６３】
前記情報処理システムが、前記マニホールドの圧力駆動流を制御する、請求項６２に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、「ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＣ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＳＹＳＴＥＭＳ」という発明の名称で２０１１年１月２１日に出願され、かつ、「ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＣ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＡＲＲＡＹＳ」という発明の名称で２０１０年１月２１日に出願された６１／２９７２７８に対して優先権を主張する米国一部継続特許出願第１３／０１１８５７号である。
【０００２】
本願は、「ＣＵＬＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＩＮＶＡＳＩＯＮ  ＡＳＳＡＹ  ＭＥＴＨＯＤ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭ」という発明の名称で２０１２年４月１日に出願され、かつ、「ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＩＮＶＡＳＩＯＮ  ＡＳＳＡＹ  ＭＥＴＨＯＤ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ」という名称で２０１１年４月１日に出願された６１／４７１１０３に対して優先権を主張する一部継続米国特許出願第１３／４３６９９２号である。また、本願は、「ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＩＮＶＡＳＩＯＮ  ＡＳＳＡＹ  ＭＥＴＨＯＤ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭ」という発明の名称で２０１３年２月５日に出願された６１／７６１２２７に対して優先権を主張する。
【０００３】
著作権表示
３７  ＣＦＲ  １．７１（ｅ）の規定により、出願人は、この開示の一部に、著作権保護の対象である素材（限定されないが、図、装置の写真又は著作権保護が任意の法域で利用できる若しくは利用できる場合があるこの提出の任意の他の側面など）を含むことに言及する。著作権者は、米国特許商標庁の特許ファイル又は記録に見られるように、誰でも特許文書又は特許開示の複写をすることに対して異議がないが、ただし、全ての著作権を留保する場合を除く。
【０００４】
発明の分野
本発明は、様々な実施形態において、微小流体システムを使用して細胞の浸潤挙動又は他の微小対象物の関連挙動を検出するためのアッセイ、システム及び装置に関する。特定の実施形態は、様々な標準的な自動処理システムと共に使用でき、媒体の能動的又は受動的装填及び灌流と共に使用でき、そして細胞浸潤、移動、走化性その他の特性を分析するためのハイスループットマルチアッセイの自動化システムを提供するために使用できる構成を伴う。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
本願と共に提出された任意書類を含め、本願におけるあらゆる場所の任意の研究、出版、販売又は活動についての議論は、このような研究が先行技術を構成することを認めるものと解釈してはならない。ここでの任意の活動、研究又は出版についての議論は、そのような活動、研究又は出版が任意の特定の法域において存在していた又は知られていたことを認めるものではない。
【０００６】
微小流体細胞培養は、薬剤スクリーニング、組織培養、毒性スクリーニング及び生物学的研究における用途にとって重要な技術であり、改善された生物学的機能、より高い品質の細胞ベースのデータ、試薬消費の減少及び低コストを与えることができる。高品質の分子及び細胞試料の調製は、様々な臨床、研究及び他の用途にとって重要である。生体内特性を密接に表す試験管内試料は、潜在的に、幅広い分子及び細胞用途の利益となる場合がある。細胞又は他の生物学的若しくは化学的活性材料（例えば、様々な生体分子でコーティングされたビーズなど）の取り扱い、特徴付け、培養及び可視化は、創薬、疾患の診断及び分析並びに様々な他の治療及び実験的研究の分野においてますます評価されるようになってきている。
【０００７】
微小流体システム、装置、方法及び製造に関連する多くの側面は、上記関連特許出願で議論されている。これらの出願から特定の限定を読み取るべきではないが、これらの援用された文書は、具体的な実施形態に関連する有益な背景資料を提供する。
【０００８】
細胞アッセイ系において関心のある領域は、細胞移動の特性を決定することのできるアッセイである。このようなアッセイは、様々な刺激下で様々なタイプの悪性細胞を特徴付け、また他の細胞も特徴付けるのに重要である。
【０００９】
マイクロチャンバー又はマイクロフルイディクスを用いたいくつかのアッセイが提案されている。他のシステムは、様々な障壁インサートを有する標準的な培養プレートを使用して細胞浸潤を検出しようとしている。しかしながら、現在利用可能なシステムは、使いやすさ、高スループット又は自動化アプリケーションに必要な多数の観点に関して失敗している。
【００１０】
上記で引用した初期の研究及び特許出願は、微小流体細胞培養に関連する様々な構成、方法及びシステムを議論するものであり、その研究及び刊行物は、引用により本明細書に含める。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
要約
本発明は、改良された微小流体細胞培養装置及びシステム、特に侵襲性又はそうでなければ転移性若しくは運動性細胞の培養及び分析のための特定のシステムに関連する様々な構成要素、システム、及び方法を含む。一態様では、本発明は、マルチ培養チャンバープレート又は微小流体構造のいずれかを使用して、以前に提案された浸潤又は移動又は運動性アッセイを超える利点を有する新規微小流体細胞培養装置、システム及び方法を含む。別の態様では、本発明は、複数の微小流体細胞培養及び／又は細胞侵襲アッセイユニットを様々な多細胞培養ユニットシステム、例えば、様々な標準的なウェルプレートフォーマット（例えば、ここで説明する微小流体構造への取り付けを可能にする、９６ウェルＳＢＳ培養プレート又は６、１２、２４、９６、３８４若しくは１５３６個のサンプルウェル並びに開底標準ウェルプレートを含めた他のプレートフォーマット）を含むマイクロタイターウェルプレート構造に組み込むための新規な構造及び方法を含む。
【００１２】
特定の実施形態及び実施例では、設計上の特徴は、プレート自体への配管及びコネクタの排除を可能にする便利なフォーマットの浸潤アッセイ装置を提供すること、受動重力駆動流を用いて長期連続灌流細胞培養物を維持することができること、微小流体プレートの出口ウェル及び／又は細胞浸潤観察ウェル又は培養ウェル上で直接分析を実行することができること、ゲル培地を効果的に処理することができることを含む。
【００１３】
ここで詳細に説明する例の多くは、標準的な又はカスタムウェルプレートと共に使用されるように設計されており、ここで説明する様々な構成の微小流体構造及び培養装置及びシステム及び方法は、ウェルプレート又は様々な他の微小流体装置又はシステムと共に使用されるようには構成されていない様々な一体型ラボオンチップシステムのように、任意のウェルプレートから独立して配置できる。
【００１４】
明確にする目的のために、具体例の観点から装置、方法、及び概念に対して議論する。しかしながら、本発明及びその態様は、様々な種類の装置及びシステムに適用することもできる。したがって、本発明は、特許請求の範囲及びその均等物において提供される以外には限定されないものとする。
【００１５】
さらに、ここで説明するシステム及び方法は、多様な異なる構成要素及び異なる機能をモジュール方式で備えることができることは当技術分野において周知である。本発明の様々な実施形態は、構成要素と機能の様々な組み合わせを含むことができ、かつ、様々な構成要素の一部分として様々な機能を分類することができる。明確にする目的のために、本発明を、多くの異なる革新的な部品及び革新的な部品と公知の部品との革新的な組み合わせを備えるシステムの観点から説明する。本発明を、本明細書中における任意の例示的な実施形態に列挙された革新的な部品の全てを含む組み合わせに本発明を限定するものと推論すべきではない。本明細書に別段の記載がない限り、ここで説明した構成要素の任意の組み合わせは、当業者であれば理解するように、これらの構成要素の任意のサブセットのあらゆるサブコンビネーションのみならず、ここで説明する任意の他の構成要素と組み合わされた、これらの構成要素の任意のサブセットの任意のサブコンビネーションをも含むと理解すべきである。
【００１６】
図面及び以下の詳細な説明のいくつかでは、本発明は、多部品装置又はシステムの重要な独立した実施形態に関して記載されている。これは、ここで提供される教示を使用して、多数の他の状況に適用できる本発明の様々な新規な態様を制限するように解釈されるべきではない。以下の図面及び説明のいくつかでは、本発明は、構造の寸法、液体の圧力又は容積、温度、電気値、持続時間等に関連する特定のパラメータを含む多数の特定の例示実施形態の観点から記載されている。特許請求の範囲内で与えられている場合を除き、これらのパラメータは、例示として提供されるものであり、異なる寸法を有する他の装置又はシステムを包含する本発明を限定するものではない。より明確な説明を提供する目的で、特定の既知の製造工程、細胞処理工程、試薬、化学的又は機械的プロセス、及び本発明の特定の実施形態に従ってシステムを作製する又は装置を製造するために備えられ得る他の公知の部品を例として与える。当業者であれば、例外が本明細書に具体的に注記された場合を除き、様々な既知の置換をここで説明したプロセスになすことができることが分かるであろう。
【００１７】
この明細書で引用した全ての参考文献、刊行物、特許及び特許出願は、全ての目的のためにその全体を引用により援用される。
【００１８】
図面の簡単な説明
本特許出願は、カラーで作成された少なくとも一つの図面を含む。カラー図面を伴う本特許出願のコピーは、リクエスト及び必要な料金の支払いに基づき米国特許商標庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１（Ａ）は、特定の実施形態による例示微小流体プレート設計の概略図であり、この例では、９６ウェルプレート上に２４個の浸潤アッセイユニットを有し、この例では、各ユニットは、４個のウェル：流入口、細胞／ゲル入口、浸潤チャンバー及び流出口を備える。
【図１Ｂ】図１（Ｂ）は、本発明の特定の実施形態による一つの浸潤培養ユニットの詳細を示す模式図である。
【図２】図２Ａ、Ｂは、青色染料が充填された例示単一フローユニットを示す写真図であり、該画像は頂部（Ａ）及び底部（Ｂ）から採取され、底部の写真は、プレートを上下方向に反転させることにより撮影されたものであり、それにより入口ウェルは、両方の写真では左にある。
【図３Ａ−Ｃ】図３Ａ−Ｃは、本発明の特定の実施形態による勾配における浸潤アッセイ操作及び細胞移動を示すためにゲルをロードした後の浸潤チャンバー領域の一連の顕微鏡写真である。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の特定の実施形態によるアッセイシステム及び装置における勾配での癌細胞浸潤及び細胞移動を示す顕微鏡写真である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明の特定の実施形態によるアッセイシステム及び装置における勾配での癌細胞浸潤及び細胞移動を示す顕微鏡写真である。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明の特定の実施形態に従う多数の入口を有する例示細胞培養チャンバー設計の構成及び動作を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本発明の特定の実施形態に従う多数の入口を有する例示細胞培養チャンバー設計の構成及び動作を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明の特定の実施形態に係る例示略矩形細胞培養チャンバー設計及び勾配チャンバー設計の構成及び動作を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明の特定の実施形態に係る例示略矩形細胞培養チャンバー設計及び勾配チャンバー設計の構成及び動作を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、本発明の特定の実施形態に係る例示略矩形細胞培養チャンバー設計及び勾配チャンバー設計の構成及び動作を示す。
【図７】図７は、微小流体生細胞イメージングのための例示カスタマイズプレートフレームの機械製図を示しており、４個の独立したユニット（例えば、行）、改善された光学部品用の大きな撮像窓、空気入／出ポート（例えば該撮像窓に隣接）及びこの例ではマニホールドの真空封止を向上させるためのウェル間の拡張空間を示す。この例では、１個のユニット当たり６個の入口ウェルが２個の出口ウェルと共に存在する（この例では、１個がより多くの容量を収容するために拡張されている）。
【図８】図８は、特定の実施形態に係る、各ユニットについて３個の流入口、撮像窓、細胞入口及び流出口を有する２個の培養ユニットプレートを示す。
【図９】図９は、特定の実施形態に係る、各ユニットについて３個の流入口、撮像窓、細胞入口及び流出口を揺する培養ユニットプレートの１６ユニットバージョンを示す。
【図１０】図１０は、本発明の特定の実施形態に係るガス灌流ラインを有する例示プレートマニホールドの図を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、それぞれが６個の流入口、培養チャンバー及び２個の流出口を有する４個の独立した培養ユニットを有する特定の実施形態に係る能動制御プレートの一例を示す概略図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、それぞれが６個の流入口、培養チャンバー及び２個の流出口を有する４個の独立した培養ユニットを有する特定の実施形態に係る能動制御プレートの一例を示す写真である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、特定の実施形態に従ってここで説明した一つ以上の方法を実施するために使用できる、それぞれ６個の流入口、培養チャンバー及び２個の流出口を有する４個の独立した培養ユニットを有するさらなる例示培養プレートを示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、特定の実施形態に従ってここで説明した一つ以上の方法を実施するために使用できる、それぞれ６個の流入口、培養チャンバー及び２個の流出口を有する４個の独立した培養ユニットを有するさらなる例示培養プレートを示す図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、特定の実施形態に従ってここで説明した一つ以上の方法を実施するために使用できる、それぞれ６個の流入口、培養チャンバー及び２個の流出口を有する４個の独立した培養ユニットを有するさらなる例示培養プレートを示す図である。
【図１３】図１３は、特定の実施形態に係る安定な勾配への曝露後の細胞移動の一例を示す。
【図１４】図１４は、一例として、特定の実施形態に係る微小流体細胞培養装置中における細胞の動きに及ぼす勾配の影響をよく示すためのＸ／Ｙ細胞移動プロットを示す。
【図１５】図１５は、特定の実施形態に係る微小流体細胞培養装置内での移動距離に応じた細胞移動を一例として示す。
【図１６】図１６は、特定の実施形態に従って、微小流体細胞培養装置内における安定勾配に曝露された細胞が安定な媒体環境中におけるよりも速く移動することを示す図を一例として示す。
【図１７】図１７は、特定の実施形態に従って、勾配への曝露が高濃度シンクに向かう細胞の能動的移動を刺激したことを示す一例を示す図である。
【図１８Ａ】図１８Ａは、本発明の特定の実施形態に係る例示マニホールドの概略図の上面図を示す。この例では、右の８個の配管ラインは、圧縮空気のためのものであり、それぞれは、微小流体アレイ内における細胞入口ウェルのカラムに圧力を与えるように構成されている。図中の一番左のラインは、真空のためのものであり、かつ、マニホールドの周辺にある外側真空リングに接続している。ウェルの各カラムは、一般に、イメージング領域上のウェルをスキップした状態で単一の圧力ラインに連通している。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、本発明の特定の実施形態に係る例示マニホールドの概略図の側面図を示す。この例では、右の８個の配管ラインは、圧縮空気のためのものであり、それぞれは、微小流体アレイ内における細胞入口ウェルのカラムに圧力を与えるように構成されている。図中の一番左のラインは、真空のためのものであり、かつ、マニホールドの周辺にある外側真空リングに接続している。ウェルの各カラムは、一般に、イメージング領域上のウェルをスキップした状態で単一の圧力ラインに連通している。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、本発明の特定の実施形態に係る例示マニホールドの概略図の平面図を示す。この例では、右の８個の配管ラインは、圧縮空気のためのものであり、それぞれは、微小流体アレイ内における細胞入口ウェルのカラムに圧力を与えるように構成されている。図中の一番左のラインは、真空のためのものであり、かつ、マニホールドの周辺にある外側真空リングに接続している。ウェルの各カラムは、一般に、イメージング領域上のウェルをスキップした状態で単一の圧力ラインに連通している。
【図１９】図１９は、本発明の特定の実施形態に係る微小流体プレートを操作するための例示システム及びマニホールドを示す。
【図２０】図２０は、本発明の実施形態に係る、追加のガスライン及び対物レンズを有し、かつ、培養装置に接続された微小流体プレート内にある５個の活性ウェルを示すマニホールドを示す。
【図２１】図２１は、本発明の様々な態様を具現化することができる、代表例の論理装置を示すブロック図である。
【図２２】図２２（表１）は、本発明の特定の実施形態に従って評価できる又は薬剤その他の治療を試験できる病気、疾患、又は状態の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
１．概要
「粒子」とは、本発明によるアッセイを受けることのできる哺乳動物細胞又は細菌細胞、ウイルス粒子、又はリポソームその他の粒子などの生体細胞をいう。このような粒子は、約５０〜１００ｎｍの最小寸法を有し、また２０ミクロン以上の大きさであることができる。本発明に係る細胞アッセイを説明するために使用される場合に、用語「粒子」及び「細胞」は区別なく使用できる。
【００２１】
「マイクロチャネル」又は「チャネル」又は「流路」は、一般に、本発明の具体的な実施形態に係るシステム及び装置の様々な部品を流体連結するために使用されるミクロンスケールのチャネルをいう。マイクロチャネルは、典型的には、好ましい実施形態ではそれぞれ１０〜５００ミクロン及び１０〜５００ミクロンの側及び深さの寸法を有する矩形、例えば正方形又は丸みを帯びた断面を有する。マイクロチャネル内を流れる流体は、微小流体挙動を示すことができる。本発明のマイクロウェルアレイ装置内のマイクロチャネルをいうために使用される場合、用語「マイクロチャネル」と「チャンネル」とは区別なく使用される。「流路」とは、一般に、培地、試薬その他の流体又はゲル及びいくつかの実施形態では細胞の通路のために設計されたチャネルを意味する。「培養チャンネル」又は「細胞培養チャネル」とは、一般に、細胞が細胞培養の間に流れ、またとどまるように設計される細胞培養構造の一部分をいう（ただし、いくつかの実施形態では、細胞は培養チャネルの特定の培養領域にとどまることができる）。「空気チャネル」とは、一般に、空気、酸素富化混合物など気体を、流路又は培養領域に接して通過させるために使用される略ミクロンスケールのチャネルをいう。「灌流チャネル」は、培地を培養領域に灌流させる流路及び任意の灌流通路又は構造を示すために使用する場合がある。
【００２２】
「障壁」又は「拡散障壁」又は「灌流障壁」又は「物質移動障壁」とは、一般に、細胞培養領域又はチャンバーから流路を分離する流路よりも小さい、固体構造と通路との組み合わせをいう。通路は、マイクロチャネルの高さ及び／又は幅（例えば、約５〜５０％程度又は約１０％）よりも一般に小さく、いくつかの実施形態では、細胞、他の培養アイテム及びいくつかの実施形態ではゲルを流路への移動から保持するように設計されると共に、拡散、潅流、又は一般に流路内の流体の流れよりもはるかに高い流体抵抗の物質移動メカニズムの任意の組み合わせによりいくつかの流体の流れを可能にする。一実施例では、障壁は４ミクロンの高さ、そうでなければ、マイクロチャネルの長さのほとんどに及ぶ通路を有する。他の実施形態では、障壁は、微小流体チャネルと同じくらいの高さであるが、ただし約４ミクロンの幅の多くの通路を有する。また、障壁は、障壁を通して細胞若しくは細胞成分、又は通路を通過する程度に十分小さい他の材料又は粒子をいくらか移動させることを可能にすることもできる。
【００２３】
「微小流体装置」とは、流体がチャネルを通したその流れにおいて微小流体挙動を示すミクロンスケールのマイクロチャネルによって連結された様々なステーション又はウェルを有する装置をいう。
【００２４】
「マイクロウェルアレイ」とは、基材上に形成された２個以上のマイクロウェルの配列をいう。
【００２５】
「装置」とは、当該技術分野において広く使用されている語であり、かつ、広い範囲の意味を包含する。例えば、その最も基本的かつ最小の精巧化レベルでは、「装置」とは、単に、チャネル、チャンバー及びポートなどの機能を備えた基材を意味する場合がある。精巧さの増したレベルでは、「装置」は、該機能を包囲する基材、又は協調して又は独立して動作する微小流体機能を有する他の層をさらに備えることができる。その最も精巧なレベルでは、「装置」は、外界と基材の微小流体機能との間の相互作用を促進させる対象物と対になる完全に機能的な基材を備えることができる。このような対象物を、後述するように、ホルダー、筐体、ハウジング又は類似の用語と様々にいうことができる。ここで使用されるときに、用語「装置」とは、これらの実施形態又はその文脈が示すことができる精巧化のレベルのいずれかをいう。
【００２６】
ここで使用するときに、部材又は請求の範囲の「任意の組み合わせ」とは、部材、参照物又は参照された個別の部材の組み合わせをいう。
【００２７】
微小流体システムは、生物学的な実験を行うための強力なツールとなる。近年では、エラストマー系マイクロフルイディクスは、その光透過性、ガス透過性及びシンプルな製造方法のため特に好評を博している。しかし、エンドユーザーとの連絡は、エラストマーへの労働集約型の穴開け、及び管とシリンジポンプとの接続の追加工程が必要になる。
【００２８】
本発明は、様々な培養及びアッセイの用途に使用される一体化マイクロフルイディクスを含む。さらに、本発明は、微小流体及び構成要素の製造方法及びそのようなプレートを使用して細胞培養を自動化するためのシステムを含む。特定の実施形態の利点は、標準的なマイクロタイタープレートフォーマット、チューブ遊離細胞培養、及び浸潤、移動又は走化性細胞挙動を分析するための生体模倣微小環境を使用することを含む。
【００２９】
本発明の特定の実施形態に係るシステム（例えば、９６ウェル標準プレートを使用）は、当技術分野において周知のように、標準的なマイクロタイタープレートを取り扱うための標準的な技術及び装置を用いて操作できる。例えば、液体及び／又はゲル又は細胞分配は、標準的なピペット力学を用いて達成され、そして細胞培養及び分析は、既存のインキュベーター及びプレートリーダーに適合できる。
【００３０】
本発明のさらなる実施形態によれば、新規細胞ローディングシステムは、空気圧マニホールド及び空気圧を使用して細胞をマイクロ培養領域に配置する。この細胞ローディングシステムを付加して、微小流体細胞培養及び分析は、標準的なタイタープレートを取り扱うために存在する他の自動化装置を用いて完全に自動化できる。
【００３１】
さらなる実施形態では、重力駆動流培養構成は、出口と入口との培地レベルの差を利用するのみならず、流体抵抗を設計してｎＬ／分レジームでの望ましい流量を達成する。これは、かさばる外部ポンプ又はチューブを使用せずに長期間（例えば、４日まで）にわたって培地を「受動的に」流すことができるという重要な利点を与えるところ、これは、浸潤アッセイの場合には、このアッセイの簡単なセットアップを可能にし、また培養開始後に１以上の時間周期で浸潤アッセイ結果を読むことを容易にする。
【００３２】
さらなる実施形態では、本発明は、接着及び／又は浸潤性又は移動細胞の長期低速度撮影顕微鏡検査のために細胞培養環境の制御を可能にするための微小流体システムを含む。本発明の特定の実施形態によれば、本発明は、他のアッセイのうち低速度撮影顕微鏡実験及び細胞浸潤の検査を可能にする多重化微小流体フローチャンバーを提供する。微小流体チャンバーは、培養チャンバーと浸潤チャンバーとの細胞の浸潤特性を検討するために、灌流障壁を使用して流路及び浸潤障壁から細胞を分離する。例示の実施形態は、標準ウェルプレートに適合され、液体及び細胞／ゲルのサンプルを標準的な装置を使用して適切な入口リザーバに直接ピペッティングすることが可能になる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、カスタムの空気圧式流量制御装置を使用して、細胞を培養領域にロードするだけでなく、異なる露光溶液を切り替えることができる。デジタルソフトウェアインターフェイスを使用して、ユーザーが低速度撮影イメージング中に細胞を複雑な機能にさらすために経時的に特定の入力（パルス、ランプなど）をプログラムすることを可能にすることができる。
【００３４】
生細胞の動的応答は、生体信号処理、遺伝子発現調節、分化及び細胞分裂などの現象のための基礎である。特定の実施形態では、本発明は、現在の細胞培養法と適合できる多重化フォーマットで細胞微小環境を制御することのできるシステムを含む。細胞応答は、細胞内解像度で動態情報を導出するために高倍率蛍光顕微鏡を用いて定量できる。この特性は、動的単一細胞応答実験が現在のところ実用的ではない細胞系生物学において幅広い用途を有する。特定の実施形態に係るいくつかの浸潤アッセイの実施形態は、１種のみの培地／試薬混合物への暴露を伴うほとんど又は完全に受動的なシステムを使用することができ、特定の実施形態に係る試薬混合物の他の浸潤アッセイは、ここで説明したマニホールドを使用して複雑な試薬スケジューリングを用いて実施できる。
【００３５】
２．微小流体培養システム及びアレイ
上で参照した出願は、広く様々な細胞培養構成及び製造技術を議論した。細胞培養領域及び材料の操作の部分は、本発明の背景として有用である。その中のいくつかの例では、１以上のマイクロ培養領域は、流体通路（又は拡散入口又は導管）のグリッドを介して媒体又は試薬チャネルに連通し、ここで、このグリッドは、複数の交差高流体抵抗灌流通路を備える。議論された一例では、グリッド内の通路は、約１〜４μｍの高さ、２５〜５０μｍの長さ及び５〜１０μｍの幅であり、このグリッドは、培地又は試薬チャネルと培養領域とでのより均一な拡散を可能にし、かつ、より容易な製造及びより均一な分散を可能にする。さらに、先の出願は、マイクロチャンバーと灌流／拡散通路又はグリッドとの間の高い流体抵抗比（例えば約１０：１、２０：１〜３０：１の範囲の比）により、以下のような細胞培養のための多くの利点が得られることを議論した：（１）細胞のサイズ排除；（２）マイクロチャンバー内部の細胞の局在；（３）細胞増殖のために均一な流体環境を促進すること；（４）マイクロチャンバー又は培養領域のアレイを構成する能力；（４）製造の容易さ、及び（５）広範囲にわたる弁ネットワークなしでの試薬の操作。発明の特定の実施形態に従ってグリッド状の灌流障壁を培養面積よりもはるかに短くすることができる例、及び近くに又は同じ高さにすることができる培養装置のための様々な構成が示された例が例示された。
【００３６】
３．浸潤アッセイユニット
特定の実施形態では、本発明は、さらに、３Ｄ癌細胞浸潤アッセイ用の微小流体プレートを備える。特定の実装例では、プレートは、微小流体チャネルによって連通した４個のウェルと標準的な９６ウェルプレートフォーマットを使用して個別フロー及び浸潤アッセイユニット（例えば、特定の実施形態では、１個のプレート当たり２４個のユニットを有する）を作製している。いくつかの実施形態では、流れは、本明細書の他の箇所で議論したとおり、毛管力と重力とによって駆動され、プレートを細胞及び培地の最初の導入後に外部連絡を有しない標準的なインキュベーター内で動作させることが可能になる。特定の実施形態では、本発明の装置は、培養チャンバー内にある３Ｄゲル中で細胞を受け取る。培養チャンバーは、浸潤チャンバーから浸潤障壁によって分離され、両者は、例えば、８×８ミクロンの断面の微小流体細孔又は通路のセットにより流路から分離される（ここでは「浸潤障壁」という場合がある）、それによって腫瘍浸潤のための生体内環境がモデリングされる。
【００３７】
図１（Ａ）は、特定の実施形態に係る例示微小流体プレート設計の概略図であり、この例では９６ウェルプレート上に２４個の浸潤アッセイユニットを有し、この例では各ユニットは４個ウェル：流入口、細胞／ゲル入口、浸潤チャンバー及び流出口を備える。この実施形態では、流入口、細胞／ゲル入口及び流出口における液体は、マイクロチャネルと接触した状態にある。浸潤チャンバー上のウェルは、良好なイメージング品質のために空のまま保持されている。プレートの底面はガラススライドである。プレート当たり２４個の流れユニットが存在する（各ユニットは、４個のウェル毎に１ウェルであり、８×１２ウェルプレート上に８×３アレイを形成する）。
【００３８】
図１Ａ、Ｂに示された概略図に戻ると、この図は、３つのレベルの倍率を与えている。例示９６ウェルプレート内における特定のウェルの位置を示すために図１Ａ、ＢにおいてＦ７と示された最も拡大された領域は、特定の実施形態に係る１個の浸潤チャンバーの詳細を示す。この浸潤アッセイ／培養領域は、５個の主要領域を含むものと解することができる。
【００３９】
細胞／ゲルローディングチャネルを図の下部に示している。特定の実施形態によれば、ゲル（例えばマトリゲル、コラーゲン、フィブリンなど）中に混合された細胞は、毛細管流動又は本明細書に記載される他の能動的又は受動的ローディング手段のいずれかを使用して底部チャネルにロードされる。操作中に、このチャネルは、ゲルがローディングチャネルを満たし、また、浸潤障壁及び浸潤チャンバーの一部又は全てを満たすが、灌流障壁を越えないように設計されている。一例示実施形態では、ローディングチャネルは、幅５５０μｍ及び高さ５０μｍである。
【００４０】
特定の実施形態によれば、ローディングチャネルは、浸潤障壁によって浸潤チャンバーから分離されている。具体例では、浸潤障壁は、約５０ｘ８ｘ８μｍ（長さ×幅×高さ）の寸法のチャンネルネットワークからなる。これらのものは、いくつかの実施形態ではゲル又は液体で充填され、かつ、組織内の内皮障壁を模倣する。浸潤性癌細胞は、浸潤障壁の狭いチャネルを通って浸潤チャンバーに移動することができる。この例では、浸潤チャンバーは、約４．８×０．５×０．０５ミリメートル（長さ×幅×高さ）の寸法であり、浸潤障壁を越えてローディングチャネルから侵入又は移動する細胞の数をカウントするために使用される。アッセイ操作の間に、このチャンバー内の細胞を手動若しくは自動顕微鏡又は他の手段によって計数し、そして定量してウェルについての浸潤指数を決定することができる。
【００４１】
灌流障壁は、流路から浸潤チャンバーを分離する、特定の実施形態では１００ｘ４ｘ２ミクロン（長さ×幅×高さ）の寸法のチャネルのネットワークである。狭い断面は、細胞及びゲルが注入障壁を通過するのを防止する。培地（及び化学誘引物質、染料又は浸潤アッセイ若しくは細胞培養に使用される他の材料を含めて、培地中に運ばれる薬剤）は、灌流障壁を越えて拡散し、かつ、浸潤細胞に対して勾配を形成し、血管系における腫瘍環境をモデリングする。
【００４２】
１００×５０μｍ（幅×高）の流路は、流体を流入口ウェルから浸潤チャンバーを越えて流出口ウェルに運び、そして空になる。灌流障壁を通過する流れからの栄養素の拡散が細胞を供給する。このチャネルは、体内の血流をシミュレートする。特定の例示実施形態では、重力駆動流量は〜２０μｌ／日に設定され、ウェルを補充することなく３日以上連続して流れ実験するのを可能にする。
【００４３】
上記のように、ここで提供される寸法は、例えば、培養ユニットについてのものである。様々な特定の実施形態によれば、特定の培地又は培養アイテムに好適な任意の寸法をここで提供される他の教示に従って使用することができる。
【００４４】
４．浸潤アッセイプレート
特定の実施形態によれば、上記浸潤アッセイユニットは、複数の浸潤アッセイ実験の同時実施を可能にするために、標準的な培養ウェルプレートに構成されている。これらの実験は、同一の又は異なる組織試料のいずれかの単一対象物に対する複数のアッセイ、異なる対象物からの複数のアッセイを含むことができ、かつ、細胞を異なる培地、ホルモン又は他の刺激、薬剤、化学誘引物質などに暴露するアッセイを含むことができる。
【００４５】
９６ウェルプレートの４ウェルアッセイ手段の一例を示しているが、ここでした議論及び関連する援用された出願においてした議論から明らかなように、異なるユニットサイズ及び異なる培養プレートサイズも本発明を具現することができる。
【００４６】
図２は、青色染料で満たされた例示単一流れユニットを示す写真であり、該画像は、頂部（Ａ）及び底部（Ｂ）から撮影され、底部写真は、プレートを上下方向に反転させることによって撮影され、その結果、入口ウェルは両方の写真において左側にある。
【００４７】
５．例示操作
図３Ａ−Ｃは、本発明の特定の実施形態に従う浸潤アッセイ操作及び勾配での細胞移動を示すための、ゲルをロードした後の浸潤チャンバー領域の一連の顕微鏡写真である。蛍光色素（赤色）と混合されたマトリゲルをローディングチャネルへの毛細管流動によってロードし、そして３７℃で１５分間重合させた。図３Ａは、ゲルがローディングチャネル、浸潤障壁及び浸潤チャンバーの一部分を満たすことを示す浸潤チャンバーの４０×倍率を示す。図３Ｂは、浸潤障壁の２００×倍率を示す。重合したゲルは、浸潤障壁の内側、並びに浸潤チャンバー内で見ることができる。図３Ｃは、灌流障壁の２００×倍率を示し、これはゲルが狭いチャネルネットワークを横断することができないことを示している。さらに、ここでの教示からさらに理解されるように、「ゲル」は、特定の実施形態及び特定のテストにおいて様々な粘度を液体粘度まで低下させることができる。特定の実施形態では、灌流障壁は、本発明の広範囲のゲル粘度の使用を可能にする。
【００４８】
図４Ａ−Ｂは、本発明の特定の実施形態に係るアッセイシステム及び装置における勾配での癌細胞浸潤及び細胞移動を示す顕微鏡写真である。この例では、ＨＴ−１０８０浸潤性ヒト乳癌細胞を３Ｄマトリゲルにロードし、１０％血清を含む培地で灌流した。図４Ａは、ゲルのロード及び重合直後の細胞が浸潤障壁の底部側に位置することを示す。図４Ｂは、血清含有培地での灌流培養の２４時間後の細胞を示し（ＨＴ−１０８０浸潤についての既知のシグナル）、これらの細胞のいくらかはマトリゲル及び浸潤の障壁を通って移動して浸潤チャンバーを占めている。画像は、４０×倍率で位相コントラストで撮影した。
【００４９】
さらなる実施形態では、様々な戦略を使用してさらなる分析のために浸潤チャンバー中の細胞の全てのいくらかを除去することができる。特定の実施形態によれば、本発明は、細胞をそれらが除去されるまで維持する浸潤チャンバー内に培養環境を与えることによってこれをさらに容易にする。
【００５０】
さらなる実施形態では、微小流体チャネル構造を画定する材料（シリコーンエラストマーポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）など）を通した培養領域への空気拡散をここで説明した空気通路及び空気孔によって促進させることができる。
【００５１】
他の場所で議論するように、様々な改変を上記細胞培養領域に行うことができる。様々な構成は、格子状通路構造などの灌流障壁に対しても可能である。ここで提供された教示を有する当業者であれば他の変形例を提案するであろう。
【００５２】
また、上記構造は、参考文献及びここでの他の例に記載されているような、標準的なマイクロタイターウェルプレート又は完全にカスタマイズされた又は部分的にカスタマイズされたプレートの上により多い又はより少ないウェルを使用するシステムにも適合できる。
【００５３】
ここで説明するプレート及びシステムは、上で参照した特許出願に記載されているような細胞培養領域及び浸潤チャンバー及び微小流体流れ構造の他の構成と共に使用できる。一つの変更された設計では、設けられる細胞培養領域は、本質的に長方形の細胞培養チャンバーである。細胞培養チャンバーは、右に細胞入口及び出口通路を有し、また右に流出口も有する。この例では、細胞通路は対になっており、中央の対が細胞流れのロードのために使用され、いずれかの側の対が細胞流出口として使用される。
【００５４】
細胞がロードされると、任意の浸潤細胞が浸潤障壁を通って移動するのに十分な時間があった後に、浸潤アッセイが上記のように進行する。
【００５５】
図５Ａ−Ｂは、本発明の特定の実施形態に係る複数の入口を有する例示細胞培養チャンバー設計の構成及び動作を示す。この例としては、上記のようなクロスハッチ灌流通路設計及び浸潤障壁を有する細胞／ゲル灌流障壁が挙げられる。クロスハッチ設計は、ゲルマトリックス内の細胞をチャンバーに流入させることを可能にし、かつ、培地の灌流を可能にする。クロスハッチ灌流障壁が現在のところいくつかの設計において好ましいが、異なる灌流障壁を有する又は灌流障壁を有しない培養チャンバーも特定の実施形態に従って実施される。培地用の流れ周辺チャネルは、該障壁の同じ側に出口及び入口の両方を備える。図５Ａは一般的な実施形態を示し、ここでは、出口及び入口の開口部が右に示されている。図５Ｂは、に左に入口チャネル及び右に出口チャネルを示すところ、この構成は、ここで説明するウェルプレートを使用するいくつかの例示システムにより適している。また、この図は、本発明の特定の実施形態に係る試料設計の詳細な例示寸法を提供する。したがって、さらなる実施形態では、細胞培養チャンバーは、３Ｄゲルマトリックス内における細胞の培養をさらに容易にするのを可能にするように改変される。この設計では、灌流障壁は、図示されたように細胞培養領域と流路とを分離する。この障壁は、培養チャンバー内で三次元ゲルを保持するように設計されている。障壁と上記３チャネル細胞／ゲル入口設計とを結合することは、性能の改善を与える重要な特徴である。障壁の両側に別個の流入口／出口を具備することにより、培養チャンバー内に流体ゲルを局所化し、それが流路を妨害させないことが可能である。
【００５６】
上記浸潤障壁は、図中において破線で示す領域に配置されており、本明細書の教示から理解されるように、浸潤チャンバーから細胞入口及び培養チャンバーを分離するために使用される。別の実施形態では、灌流チャネルを、これらが浸潤チャンバーにのみ隣接するように設けることができる。
【００５７】
別の場所で説明したように、特定の実施形態は、本発明は、例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（商標）、コラーゲンなどの温度感受性ゲル培養マトリックスを使用して、生物学的細胞培養及び浸潤アッセイのための３Ｄゲル環境を提供する。例示ゲルは４℃では液体であり、これは、例えば３７℃の室温で重合する。一例の方法では、細胞をまず氷上で細胞懸濁液と混合させる。次いで、この溶液を細胞入口ウェルにピペットで入れ、そして毛細管流動により微小流体チャンバーと培養及び浸潤チャンバーとに運ぶ。特定の例では、プレートは室温に維持される。流量は、十分な細胞／ゲル溶液が重合前に培養チャンバーを完全に満たすと共に、細胞が浸潤通路のサイズのため流体流れ中に浸潤チャンバーに入らないことを可能にする。灌流障壁は、ゲル溶液のうち任意のものが流路に漏れるのを防ぐ。ゲルが温まったら、このものは重合して半固体の塊になり、細胞が培養領域に埋め込まれる。流路内での培地の流れは、浸潤チャンバー及びゲルを介して細胞培養チャンバーに拡散し、そして細胞に培養のための栄養を与えると同時に、浸潤性細胞が浸潤障壁を介して浸潤チャンバーに移動するための誘引材料となる。この新規な設計は、本発明が微小流体装置内に３Ｄゲル培養系を提供すると共に、ゲルが流路を遮断するという問題を回避することを可能にする。
【００５８】
図５Ｂに示す例では、青色の領域は空気の流れを示し、かつ、随意であり全ての実施形態で存在するわけではない。灰色の領域は、約４０μｍの例示高さを有する流体流路を示しており、赤領域は、約２００μｍの例示高さを有する細胞培養及び浸潤領域を示しており、緑領域は、約２μｍの例示高さを有する灌流障壁を示している。黄色の浸潤障壁は、一般に培養領域と同じ高さ又は類似の高さ（例えば、２００μｍ）を有するが、上記の浸潤障壁構造を有する。
【００５９】
細胞がロードされると、任意の浸潤細胞が浸潤障壁を通って移動するのに十分な時間があった後に、上記浸潤アッセイが進行する。
【００６０】
３Ｄゲルシステム
本明細書において３Ｄ：Ｍということがある一例のシステムでは、細胞の多重化灌流イメージングを３Ｄゲルマトリックスで行うことができる。例示プレートは、ユーザーの選択として細胞／ゲルがロードできる２４個の独立した培養ユニットを含む。例示システムでは、プレートの各行（Ａ〜Ｈ）は、媒体入口（例えば、カラム１、５、９）、細胞培養／浸潤／イメージングウェル（カラム２６、１０）、細胞／ゲル入口（カラム３、７、１０）及び出口（カラム４、８、１２）からなる３個の完全に独立した流れユニット（それぞれ４ウェル）を含む。空気拡散チャネル（青）は、細胞への気体移動を与える。入口は、重力駆動プロセスにより４０μｌ／日での培養培地の細胞への連続流れを可能にするように設計されている。この例では、各チャンバーは、１．５×０．５ｍｍのサイズであり、２００μｍの高さを有する。灌流障壁は、ゲルマトリックスを通した均一な栄養素移動を確保し、薄いカバーガラス底（１７０μｍ）は最適な画質を可能にする。浸潤障壁は、培養領域と侵入領域との間に分離を与える。このようなシステムにおける３Ｄゲルローディングは、上記のとおり及び援用した参考文献に記載されたとおりに実施できる。
【００６１】
本明細書の他の箇所で説明したように、様々な新規微小流体細胞培養チャンバー及び関連する微小流体構造のいずれかは、本発明の特定の実施形態に従って、マクロ細胞培養アッセイにおいて一般に使用されているようにウェルタイタープレート装置と一体化できる。多数の具体例を以下に与えるが、本発明は、微小流体装置と一体化するための他のシステムを包含する。
【００６２】
この設計では、各培養ユニットは、４つのウェル位置からなる。第１ウェルは、灌流媒体用であり、第２ウェルは細胞入口用であり、第３ウェルは微小流体チャンバーを撮像するためのものであり、第４ウェルは出口である。細胞障壁／灌流チャネルは、細胞を細胞領域に局在化させ、かつ、連続灌流培養中に栄養素の輸送を改善する。細胞入口の出口路に対する低い流体抵抗は、細胞が外部細胞ローディング機構なしに重力や表面張力法により迅速にロードすることを可能にする。灌流入口流路の高い流体抵抗は、外部ポンプ機構なしに重力流により培地の長期間にわたる連続的灌流を可能にする。浸潤障壁は、浸潤アッセイのために侵入領域から培養細胞を分離するように動作する。
【００６３】
例えば、特定のシステムでは、細胞チャンバーは間質組織環境を模倣するように設計され、細胞は、生理学的細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に埋め込まれ又は重層され、かつ、灌流毛細管チャネルからの拡散を介して連続的に供給される。細胞の微小環境は、例えば、２００ミクロンの厚さのゲル層中において長期的な成長を可能にする。酸素化チャネルは、適切なガス輸送を維持し、ガラスカバースライド底部は、高品質の細胞イメージングを可能にする。標準的なレイアウトは、高度な微小流体ユニットを典型的な９６ウェルプレートのように操作することを可能にする。重力駆動型灌流設計は、上記のようにポンプや配管接続の必要性を排除する。
【００６４】
一例のシステムでは、ユニット当たりの予想細胞数は、約５００個の細胞である。例示灌流速度は、単一のユニットについて４０ｕｌ／日である。細胞チャンバー容積は１５０ｎＬであり、このチャンバーの寸法は１．５×０．５×０．２ｍｍである。ガス拡散膜は、底面＃１．５厚カバーガラスを有する５０μｍのシリコーンである。
【００６５】
また、連続灌流のための開頂部微小流体細胞培養チャンバーを、培養領域から浸潤領域を分離する第２障壁を用いて改変することもできる。
【００６６】
６．例示勾配培養チャンバー
図６Ａ−Ｃは、本発明の特定の実施形態に係る例示略矩形細胞培養チャンバー設計及び勾配チャンバー設計の構成及び動作を示している。この例の設計では、備えられる細胞培養領域は、本質的に矩形細胞培養チャンバーである。図６Ａ及びＢに示される細胞培養チャンバーは、右側に示される細胞入口及び出口通路Ｅ２と、右側に示される流出口Ｅ１とを有する。この例では、細胞通路は対になり、中央の対は、細胞流れのロードのために使用され、いずれかの側の対は、細胞流出口として使用される。複数の別個の流入口は左側に示され、Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ１、Ｃ２と表示されており、この例の設計では、流入口は細胞による閉塞を防止するために格子パターンを有する。チャンバーを囲む空気拡散チャネルが示されている。出口Ｅ１は、培養チャンバーから部分的に隔離される流体の流れのための出口となる。
【００６７】
図６Ｂは、図６Ａに示される培養ユニットにおける細胞ローディングを示す。細胞は、低抵抗流体路（流路内での抵抗がより高い）を介してロードされる。細胞は、流路を抵抗比によって遮断することを妨げられる（細胞は、流路の代わりに細胞出口に優先的に流れる）。チャネルは、この特定の実施形態では、チャネルに入る細胞とチャネルを出る細胞とが、チャンバーの右側にあるように配置されている。これにより、細胞流入通路から細胞流出通路まで図６Ｂに示す鋭く湾曲した流線によって示されるように、細胞の流れがチャンバーに入り、１８０度回転させ、そして流出するユニークな特徴が得られる。したがって、本発明の特定の実施形態によれば、細胞は、中央右チャンネルから（毛管力により）ロードされ、そして頂部及び底部のチャンネルから出る。非常に少量の流れは、側出口チャネルに向けられる（チャンバーの左端から出る図６Ｂに示す長く湾曲の少ない流線）。側方流れは、細胞ローディングにとって重要ではないが、チャンバー内において細胞をさらに均一に分散させるのに役立つ。この流れの低い速度のため、細胞は、いかなる物理的障壁を必要とすることなくチャンバー床に自然に沈降する。細胞出口通路は、ローディングを対称にするだけでなく、チャンバー内にロードされる細胞数を増加させるのに役立つ。このローディング機構を使用して、細胞、粒子、ビーズ、ゲル、細胞を有するゲルをロードすることができる。
【００６８】
図６Ｃは、本発明の特定の実施形態に係る細胞培養チャンバー設計において安定な勾配を確立するために、図６Ａ−Ｂのような設計を使用することを示している。図６Ｃにおける例の設計は図６Ａ−Ｂのそれとはほんのわずかしか相違せず、これら２つの設計について説明した操作モードは他のものにも適用される。図６Ｃの例では、細胞通路は対になっていない。３個の不対流入口が左側に示されており、これらは、細胞による閉塞を防止するためにグリッドパターンを有する。空気拡散チャネルは、一般に、チャンバーの近くに配置されるが、この図には示されていない。図６Ｃは、本発明の特定の実施形態に従って上記微小流体装置において２種（又はそれ以上）の溶液を流すことによって培養チャンバー内に勾配を生じさせることをさらに示す。
【００６９】
７．アクティブ制御灌流プレート
図７は、微小流体生細胞イメージングのための例示カスタマイズプレートフレームの機械製図を示し、４つの独立したユニット（例えば、行）、改善された光学部品用の大きな撮像窓、空気流入／流出ポート（例えば撮像窓に隣接する）、及びこの例ではマニホールドの真空封止を向上させるためのウェル間での拡張空間を示す。この例では、ユニット当たり６個の入口ウェルが２個の出口ウェル（この例では、１個はより多くの容量を収容するために拡張されている）と共に存在する。
【００７０】
図８は、特定の実施形態に係る、各ユニットについて３個の流入口、撮像窓、細胞入口及び流出口を有する２個の培養ユニットプレート示す。
【００７１】
図９は、特定の実施形態に係る、各ユニットについて３個の流入口、撮像窓、細胞入口及び流出口を有する培養ユニットプレートの１６ユニットバージョンを示す。
【００７２】
図１０は、本発明の特定の実施形態に係るガス灌流ラインを有する例示プレートマニホールド図を示す。
【００７３】
図１１Ａ−Ｂは、それぞれが６個流入口、培養チャンバー及び２個の流出口を備える４個の独立した培養ユニットを有する特定の実施形態に係るアクティブ制御プレートの一例を示す回路図及び写真である。図１１Ａは、６個の入口解決手段、開放チャンバー又は他の培養チャンバー、出口及び重力流チャネルを有する４つの独立した流れユニット（プレートの行）を有するプレート設計を示す。図１１Ｂは、４つの開放チャンバー（緑の円）を示し、この開放チャンバーの上には入口流れがあり、下に出口流れがある。この設計は、開放チャンバーを溢れさせることなく流れを入口から出口チャンネルまで通すことを可能にする。複数の液体又は試薬入口の利用可能性は、生細胞イメージング並びに細胞生物学における他の実験及びアッセイに特に優れるシステムを提供する。このようなシステムでは、研究者は、膵臓その他の臓器細胞又は癌細胞の培養を検討して、これらが入口を介して導入された様々な薬剤又は他の刺激に応答するかどうかを決定することができる。この設計の特定の実施形態では、実験を実行する前に細胞を維持する（例えば供給する）のを容易にするために重力ウェルも設ける。プレートは、空気圧マニホールドに密閉され、６個の入口解決手段の圧力駆動制御を可能にすることができる。これは、この解決手段を細胞によって迅速に変化させる実験を可能にする。入口チャンバーと培養チャンバーとの大きい抵抗領域のため１０ＰＳＩまでの圧力駆動流が可能であり、これは、入力圧力の１／１０００未満であるチャンバー付近の圧力につながる。
【００７４】
図は、４つの独立したユニット（行）、６個の上流入口（Ａ１〜Ａ６、Ｂ１〜Ｂ６、Ｃ１〜Ｃ６、Ｄ１〜Ｄ６）、４個の培養チャンバーを有する中央撮像窓、大規模な出口ウェル（楕円形Ａ７、Ｂ７、Ｃ７、Ｄ７）、及び重力灌流ウェル（最後の列Ａ８、Ｂ８、Ｃ８、Ｄ８）を有するアクティブ制御プレートのレイアウトを示している。
【００７５】
図１２Ａ−Ｃは、それぞれ特定の実施形態に係るここで説明した１以上の方法を実施するために使用できる６個の流入口、培養チャンバー及び２個の流出口を有する４つの独立した培養ユニットを具備するさらなる例示の培養プレートを示す図である。２０１０年６月に最初に販売されたこのプレートは、４つの独立した培養チャンバー（例えば、Ａ−Ｄ）を有し、それぞれ、重力流入口（１）、４個の溶液入口（２〜５）、細胞入口（６）及び２個の共有出口ウェル（７及び８）を有する。ウェルの各行と同様に、（Ａ−Ｄ）は対応する培養チャンバーに対処する。（ｂ）４個の培養チャンバーの全ては、高倍率位相目標の移動距離を最小にするために、単一の撮像窓下に配置されている。（ｃ）チャンバーは、流路からチャンバーを分離するために上端と下端とにある灌流障壁によって結合されている。入口ウェル２及び３は培地を上部チャネルに流すと共に、４及び５は、培地を下部チャネルを介して流す。勾配は、上部及び下部のチャネルを介して様々な組成の培地を同時に流すことによって確立される。連続灌流により、安定した勾配が長時間（＞２日間）にわたって維持できる。
【００７６】
８．アプリケーションノート、微小流体培養装置における安定勾配での細胞移動
一般に、細胞移動は、細胞と、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、隣接細胞又は化学誘引物質との相互作用によって刺激され、そして方向付けられる。胚発生時には、細胞移動は、原腸形成から神経の発達に至るまでのほぼ全ての形態形成のプロセスに関与する。成体生物では、細胞移動は、生理学的及び病理学的状態に寄与し、かつ、創傷治癒及び腫瘍転移に影響を与える治療薬の開発の中心となる。最終的に、移動のメカニズムは、移動のモジュレーター（阻害剤又は活性化剤のいずれか）に対する細胞応答を分析することによって理解できる。したがって、移動細胞の定量及び可視化のための技術がライフサイエンス研究の中心となっている。
【００７７】
最も広く受け入れられている細胞移動アッセイは、各ウェル中の膜が２個のチャンバー間に多孔質の境界面を与える２個チャンバーマルチウェルプレートを使用するＢｏｙｄｅｎチャンバーアッセイである。化学誘引物質が下部チャンバー内に配置され、そしてこのシステムを、勾配が上部ウェルと下部ウェルとの間に形成されるであろうという見込みで平衡化させる。しかし、実際には、かなりの急勾配が膜の表面に対して垂直な単一軸に沿って形成し、上部ウェルと下部ウェルと間に化学誘引物質濃度の予想を下回る差が生じる場合がある。結果として、この方法は、特定の勾配特性（すなわち、傾き、濃度、時間的発達など）を備えた特定の細胞応答を相関させること及びマルチ勾配信号積分を研究することには不向きである。さらに、勾配は、「静的な」細胞培養条件下ではあまり安定ではなく、生細胞イメージングを妨げる。
【００７８】
特定の実施形態によれば、上記の図に示すような細胞培養チャンバー又はシステムをさらに使用して、日数の経過により長期的な生細胞イメージングのために十分に安定な、定量的に規定された拡散勾配を生じさせることができる。特定の実施形態及び本明細書に記載の方法に従うこのようなプレートの微小流体勾配培養チャンバーは、培養領域において空間的勾配を生じさせるために、灌流障壁を横切る精密に制御された化学誘引物質拡散を可能にする。
【００７９】
特定の実施形態によれば、培養チャンバーの流入口及び出口は、所定の日数にわたって安定な濃度勾配プロファイルを維持する連続流の「無限の源／シンク」を形成する。上記の例示システムのいくつかでは、勾配の方向性を変化させること、勾配をオン及びオフにすること及び勾配と単一溶液曝露とをトグルで切り換えることが可能である。
【００８０】
さらなる実施形態によれば、安定な化学誘引物質勾配での長期間にわたる生細胞イメージングを使用して、悪性細胞又は運動若しくは移動できる他の細胞を研究することができる。以下に説明する多数の例では、転移性乳癌細胞の移動距離、速度及び走化性の程度に及ぼす特定の実施形態に係る血清勾配の影響を詳細に特徴付ける。
【００８１】
転移性乳癌細胞の移動距離、速度、及び走化性の程度に及ぼす血清勾配の影響
一実験例では、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＨＴＢ−２６（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標））、転移性胸水部位に由来するヒト乳癌株を、完全培地（１Ｏ°／ｏｖ／ｖウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン及び抗生物質（全てＥＭＤミリポア）が追加されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ））中で保持し、そしてトリプシン処理（ＧＩＢＣＯ社製ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ）により通常通り継代して対数増殖期を確保した。
【００８２】
実験では、細胞をトリプシン処理し、遠心分離により採取し、そして完全培地に再懸濁した。１０μＬの各細胞試料と１９０ｕＬのグアバＶｉａＣｏｕｎｔ（登録商標）試薬（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）とを混合し、室温（ＲＴ）で５分間インキュベートした。サンプルデータを、グアバｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）ＨＴ装置で取得し、そしてグアバＶｉａＣｏｕｎｔ（登録商標）ソフトウェア（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて分析した。
【００８３】
図１３は、特定の実施形態に係る安定な勾配への曝露後の細胞移動の一例を示している。この具体例では、上記勾配培養チャンバーの１個以上を使用して安定ＦＢＳ勾配に暴露した後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の移動を示す。この例は、細胞を完全培地中でインキュベートし又はＹ軸（垂直面）に沿って確立された０〜１０％のＦＢＳ勾配に曝露した細胞チャンバーからの代表的な画像（倍率１０倍）を示す。上部のパネルは、細胞ローディング後２４時間の撮影画像を含む。中央のパネルは、ローディング後９６時間の細胞を示す。培養時間を完全培地中で３日間に分割し、その後２４時間の血清飢餓（ＦＢＳなし）を行った。これらの画像から、細胞の増殖及び移動の両方が３日間の間隔で生じたことは明らかである。下のパネルの画像は、勾配誘導後１２時間で撮影された。
【００８４】
図１３は、３日間にわたる、ＦＢＳ勾配に応答する単一ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の移動を示す。細胞の増殖及び移動の両方が頂部の列と中央の列との間で３日間の間隔で生じた。下のパネルの画像は、１２時間の勾配誘導後に撮影した。一般に、ＦＢＳ勾配にさらされる培養について、細胞チャンバーの上部障壁に向かうＹ軸に沿った細胞の明らかな動きがある。これに対し、空間的血清勾配の非存在下で培養した対照細胞は、はるかにランダムな方向性でのより少ない動きを示した。中央及び下のパネルのボックス（１−８と番号の振られたもの）は、特定の細胞を同定し、かつ、１２時間の時間枠内でのそれらの全体的な動きを実証するために使用された。全体的に、ＦＢＳ勾配にさらされた細胞は、より高いＦＢＳ濃度源の方向に優先的に移動する傾向があった。
【００８５】
図１４は、一例として、特定の実施形態に係る微小流体細胞培養装置での細胞運動に及ぼす勾配の影響を例示するためのＸ／Ｙ細胞移動プロットを示す。この例では、プロットは、微小流体培養ユニット（例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上のＦＢＳ勾配）細胞運動における安定勾配の影響を説明するためのＸ／Ｙ移動プロットである。この具体例で示されているのは、４つのプロット：（ａ）０／０ＦＢＳ（勾配無し）、（ｂ）１０／１０ＦＢＳ（勾配無し）、（ｃ）１０／０ＦＢＳ（底部から頂部への勾配）及び（ｄ）０／１０ＦＢＳ（頂部から底部への勾配）である。この特定の例について、各データセットは、低速度撮影ビデオ（１２時間）の最初の３６画像フレームについて追跡された単一の細胞培養チャンバーからの５０個の代表的な細胞から得た。各プロットでは、黒線及び赤線は、それぞれ、Ｙ軸に対して正味の「上向き」又は「下向き」の動きを有する細胞を特定する。
【００８６】
画像Ｊソフトウェアを使用して、様々な培養条件下での個々の細胞の移動特性を追跡することができる。これらの例のいくつかでは、５０個の細胞を合計１２時間監視した。結果を図１４のＸ／Ｙプロットに示す。この分析は、（１）細胞が栄養勾配にさらされた場合には安定した培地中ではるかに少ない程度に移動する傾向があったこと、及び（２）培養チャンバー内に勾配が確立されたときに細胞移動が有意に方向付けられたことを示す。
【００８７】
ＦＢＳに向かう走化性を無方向性移動から区別するために、本出願人は、ｙ軸（勾配に平行）の移動とは別にｘ方向の動き（勾配に垂直）を分析した（図６）。有意な走化性は、ＦＢＳ勾配（１０／０ＦＢＳ  Ａ〜Ｃ及び０／１０ＦＢＳ）に曝露された細胞でしか示されなかった。空間的に一定のＦＢＳ培養における細胞は、全体的な動きが非常に少ないことを示した。
【００８８】
図１５は、一例として、特定の実施形態に係る微小流体細胞培養装置内において移動した距離に応じた細胞移動を示す。この例では、移動距離に応じたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の移動が示されている。６つの条件のそれぞれ（それぞれｎ＝５０の代表的な細胞）について、平均移動距離（μｍで表す）を、合計（ａ）及び（ｂ）ユークリッド距離の関数として測定し、その際、後者は、出発位置から終了位置までの直線を表す。
【００８９】
勾配条件に関連する移動プロット、総移動距離及びユークリッド距離から算出された移動距離を使用することが図１５Ａに示されている。示されるように、勾配培養についての全体的な移動距離は、安定環境中での細胞と比較してわずかに増加した。興味深いことに、０／０（血清飢餓）と１０／１０（完全培地）との条件の間にはほとんど差はなかった。これに対し、正味の（ユークリッド）距離を図１５Ｂで評価したときに、これら２つの条件（安定対勾配）の間には大きな差が見出された。この場合には、ＦＢＳの濃度勾配に曝露された細胞は、一定の培地状態における細胞よりも、それらの出現部位からさらに３倍を超えて移動した。このような知見は、細胞が勾配の高いＦＢＳ濃度端にある栄養豊富な培地を活発に求め、それによってより大きな方向性移動を示すことを示唆するものである。
【００９０】
図１６は、一例として、特定の実施形態に従って、微小流体細胞培養装置において安定な勾配に曝露された細胞が安定な培地環境における細胞よりも速く移動することを示すプロットを例示する。この例は、場合によっては、勾配（例えば、ＦＢＳ）に曝露された細胞が安定培地環境における細胞よりも速く移動することを示す。このグラフは、この例での４つの培養条件間における移動速度（μｍ／分）の差を示す。速度は、平均総移動距離に基づいて計算した。
【００９１】
一般に、細胞は、ＦＢＳ勾配が確立されたチャンバー内においてわずかに高い速度で移動した。注目すべきことは、４つの勾配培養（１０／０ＦＢＳ（Ｑ））の１つにおける移動細胞が、他の例よりもはるかに高い移動速度を示したことである。この実験中に行われた観察から、加速細胞移動に潜在的に寄与し得る２つの要因がある：（１）細胞は、より低い細胞密度の培養物中では遠くに移動する傾向があったこと、（２）細胞クラスターの一員は、単離された対応物よりも速く移動する傾向があったこと。この後者の応答は、以前に細胞−細胞相互作用と移動速度との関係を分析する研究で報告されたとおり、微小環境内での局在化された細胞間連絡によって製剤的に引き起こされる。
【００９２】
図１７は、特定の実施形態に従って勾配に曝露すると高濃度シンクに向かう細胞の活発な移動を刺激したことを示す例を示す。この例では、ＦＢＳ勾配への曝露は、高濃度シンクに向かうＭＤＡＭＢ−２３１細胞の活発な移動を刺激した。移動指数は、Ｘ（勾配に対して垂直）及びＹ（勾配と平行）の両方の方向での細胞の運動（それらの原点位置に対する）の基準を与える。６つのアッセイのそれぞれについて、両方の平面的な動きについての両方の値を示す（各棒は、単一細胞チャンバー内における５０の個別に追跡された細胞の平均を示す）。
【実施例】
【００９３】
実施例の設定
上記の特定の実験の前に、細胞培養チャンバー内の周囲温度を、ＣｅｌｌＡＳＩＣ（商標）ＯＮＩＸ  Ｍｉｃｒｏｉｎｃｕｂａｔｏｒコントローラー、温度較正プレート及びＤｉｒｅｃＴｅｍｐ（商標）温度監視ソフトウェア（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して３７℃に較正した。細胞チャンバーを、ＣｅｌｌＡＳＩＣ（商標）プレートのウェル１、６、７及び８から吸引されたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を使用して下塗りし、そして１０μＬの培地をウェル６にピペットで入れた。この手順をマイクロプレート上の全てのチャンバーユニットについて繰り返した。このプレートをＦ８４マニホールドに真空密封した。ＣｅｌｌＡＳＩＣ（商標）ＯＮＩＸ  ＦＧソフトウェアを使用して、培地を２分間にわたって０．２５ｐｓｉでウェル６から灌流させるように設定した。
【００９４】
細胞ローディングについて、トリプシン処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を完全培地に２×１０6／ｍＬで再懸濁した。培地をウェル１及び６におけるＰＴＦＥリングから吸引した。ウェル１を１０μＬの培地と交換し、そしてウェル６を１０μＬの細胞懸濁液と置き換えた。このプレートをＦ８４マニホールドに真空密封し、そしてＥＶＯＳ（商標）ｆｌ倒立顕微鏡（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｇｒｏｕｐ）のステージ上に配置してローディングプロセスを監視した。細胞を、ＣｅｌｌＡＳＩＣ（商標）ＯＮＩＸ  ＦＧソフトウェアを使用して、ウェル１及び６から０．３分（１８秒）にわたって０．４ｐｓｉで同時に流すことによってロードした。プレートを、標準的な３７℃／５％Ｃ０2インキュベーター内に１時間放置して自動媒体灌流の前に細胞付着を可能にした。
【００９５】
これらの例示の実験について、それぞれは、３つ区別できる段階を伴った：培地供給を完了させる（入口ウェル２及び４から、４８時間にわたり１ｐｓｉで流れる）、血清飢餓（入口ウェル３及び５から、２４時間にわたり１ｐｓｉで流れる）及び０〜１０％ＦＢＳ勾配への曝露。培養チャンバー内で勾配を確立するために、３００μＬの完全培地及び完全培地マイナスＦＢＳを、それぞれ入口ウェル２及び４にロードし、そして１ｐｓｉで同時に流す。所定の場合には、２４時間後に、勾配の向きを、灌流のための源ウェルを切り替えることによって逆転させた。この場合、完全培地マイナスＦＢＳ及び完全培地をそれぞれウェル３及び５にロードし、そして１ｐｓｉで同時に流した。この系における培地灌流は、ＣｅｌｌＡＳＩＣ（商標）ＯＮＩＸ微小流体システムを用いて行った。
【００９６】
画像を、ＥＶＯＳ（商標）ＦＬ倒立顕微鏡を用いて１０倍の倍率で撮影した。低速度撮影イメージングを、各実験のＦＢＳ勾配部分の間に実行した。画像を、勾配暴露時間の長さについて２０分間隔で撮影した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞移動アッセイからの画像を、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウエア（ＮＩＨ）をマニュアルトラッキング（ＮＩＨ）及び走化性ツール（同上）プラグインと組み合わせて用いて分析した。それぞれの場合において、５０個の代表的な細胞を、３６個の画像の連続シリーズにわたる移動特性について追跡した（培養中１２時間）。
【００９７】
これらの実験は、高度に制御された細胞移動研究の際におけるリアルタイム生細胞イメージングを使用して、創傷治癒及び腫瘍転移などの病理学的現象の原因となるメカニズムに関与する細胞移動及び浸潤プロセスを観察し、研究することができることを実証した。
【００９８】
９．空気圧マニホールド
重力又は受動的ローディングがいくつかの微小流体細胞培養装置にとっては効果的であり、かつ、いくつかの実施形態では望ましいが、本明細書において説明しかつ上で参照した出願に記載された専用の空気圧マニホールドをプレートと一体にすることができ、また、浸潤アッセイの間における細胞ローディング及び培養のために空気圧を細胞入口領域に加える。
【００９９】
本発明のさらなる実施形態によれば、新規な細胞ローディングシステムは、空気圧マニホールド及び空気圧を使用してマイクロ培養領域に細胞を配置する。この細胞ローディングシステムにより、微小流体細胞培養及び分析は、標準タイタープレートを取り扱うために存在する他の自動装置を使用して完全に自動化できる。
【０１００】
さらなる実施形態では、本発明は、接着細胞の長期間にわたる低速度撮影顕微鏡検査のための細胞培養環境の制御を可能にする微小流体システムを伴う。「システム生物学」への傾向が続くと、個々の生細胞中における動的挙動を研究することのみならず、ハイスループット生細胞スクリーニングの機能性及び経済性を改善することがますます重要になってくる。本発明の特定の実施形態によれば、本発明は、他のアッセイのうち低速度撮影顕微鏡実験を可能にする多重化された微小流体流れチャンバーを提供する。この微小流体チャンバーは、人工内皮障壁を使用して細胞を流路から分離する。この装置は、標準ウェルプレートにフォーマットされ、液体及び細胞試料を、標準的な装置を使用して適切な入口リザーバに直接ピペットで加えることを可能にする。その後、カスタム空気圧流量コントローラーを使用して、細胞を培養領域にロードするだけでなく、異なる露出溶液を切り替える。デジタルソフトウェアインターフェイスを使用して、ユーザーが低速度撮影イメージング中に複雑な機能に細胞を露出させるように経時的に特定の入力（パルス、傾斜など）をプログラムするのを可能にする。
【０１０１】
生細胞の動的応答は、生体シグナル処理、遺伝子発現の調節、分化及び細胞分裂などの現象の基礎である。特定の実施形態では、本発明は、現在の細胞培養方法に適合する多重化フォーマットで細胞微小環境を制御することのできるシステムを包含する。細胞応答は、高倍率蛍光顕微鏡を用いて細胞以下の解像度で動態情報を導出して定量できる。この能力は、細胞系において幅広い用途を有する。
【０１０２】
図１８Ａ〜Ｃは、本発明の特定の実施形態に係る例示マニホールドの概略図の上面図、側面図及び平面図を示す。この例では、右手の８個の配管ラインは、圧縮空気のためのものであり、それぞれ、微小流体アレイ内にある細胞入口ウェルの列に圧力を与えるように構成されている。図の最も左のラインは、真空のためのものであり、マニホールドの周囲にある外側真空リングに連結している。ウェルの各列は、一般に、撮像領域の上にあるウェルをスキップして単一圧力ラインに連結している。マニホールドは、標準ウェルプレート又はプレートの他の構成の頂部に配置される。ゴムガスケットがプレートとマニホールドの間にあり、孔がマニホールドに一致する（図示しない）。真空ラインはウェル間の空洞内に真空を創り出し、プレートとマニホールドとを一緒に保持する。圧力をウェルに加えて液体を微小流体チャネルに流す（図示せず）。１ｐｓｉの典型的な圧力を使用するため、真空強度は、気密シールを維持するのに十分である。一例では、圧力制御装置に向かう９個の配管ラインが存在する：８個のラインは圧縮空気のためのものであり、１個ラインは真空のためのものである（左端）。特定の例示実施形態では、各列は単一の圧力ラインに接続されている。細胞イメージング領域上の列はスキップされる。
【０１０３】
本発明の特定の実施形態に係るシステムにおける加圧細胞ローディングは、凝集細胞（例えば、固形腫瘍、肝臓、筋肉など）の培養物を調製する際に特に有効であることが分かった。また、加圧細胞ローディングは、細長い培養領域を有する構造に効果的にロードすることを可能にする。灌流操作及び浸潤アッセイのために細胞ローディング及び受動的流れのために加圧マニホールドを使用すると、本発明は、他の設計で使用されるような追加の入口ウェル及び／又は弁を必要とすることなく、かなり単純な２個の入口設計を利用することが可能になる。
【０１０４】
改変マニホールド
さらなる実施形態では、プレートマニホールドは、特定のガス環境（例えば、５％のＣＯ2）を有する微小流体装置内に細胞を浸すように使用される追加の「ガスライン」を備える。他の例としては酸素及び窒素の制御が挙げられるが、任意のガス状混合物を細胞に送ることができる。上記のように、ガスはマニホールドを通って細胞培養領域上にある密封ウェルに流れ、そして微小流体装置内にある孔はガスを特定の微小流体空気流路に流入するのを可能にする。ガス透過性装置層（ＰＤＭＳ）は、細胞を曝露する前に、ガスを培養培地に拡散させることを可能にする。ガスを微小流体プレートを通して連続的に流すことにより、安定したガス環境が維持される。
【０１０５】
これは、微小流体プレートをインキュベーターに配置するためにガス環境を制御する任意手段を提供する。この改変されたマニホールドでは、このマニホールドを使用して、周囲空気から独立した「マイクロインキュベーター」を創り出すことができる。
【０１０６】
図１９は、本発明の特定の実施形態に係る微小流体プレートを操作するための例示システム及びマニホールドを示す図である。
【０１０７】
１０．自動化システム
プレートは、ＳＢＳに準拠した機器を使用して取り扱うように設計されているため、様々な「既製の」機械を使用して自動化システムを作製することができる。この回路図は、これを達成する方法の例を示す。ロボットアーム（プレートハンドラー）が微小流体プレートをステーションからステーションまで移動させる。自動化された培養器は、重力流を介して、長期の灌流にとって適切な温度及び気体環境でプレートを保存する。ピペッターは、入口ウェルに液体（培地、薬剤、アッセイ試薬など）を分配し、かつ、出口ウェルから液体を除去する。プレートリーダーがアッセイのために使用される。実験の開始時に適宜細胞ローダーを使用して微小流体アレイに細胞を導入する。特に、細胞ローダーは、一般に「既製の」ものではなく、かつ、流れを誘導するためにアレイプレートの特定のウェルに空気圧を加えることによって動作する。操作を統合するために標準又はカスタムコンピュータソフトウェアが利用できる。
【０１０８】
基本的なプロセスは、（１）プレートをインキュベーターから取り出し、（２）ピペッターにより出口ウェルから液体を取り出し、（３）培地／薬剤貯蔵プレートを「プレートスタック」から移動させ、（４）液体をピペッターにより培地／薬剤プレートから微小流体プレートに移し、（５）微小流体プレートをインキュベーターに配置し、（６）各プレートについて繰り返し、（７）特定の時間間隔（例えば２４時間）後に繰り返す。
【０１０９】
９６ウェルプレートの規格は、微小流体システムを、標準的な技術及び装置を用いて操作するのを可能にする。例えば、液体分注は、標準的なピペット力学で達成され、細胞培養及び分析は、既存のインキュベーター及びプレートリーダーと互換性がある。カスタム構築された細胞ローディングシステムは、上記のように、空気圧を用いて細胞をロードするために使用できる。重力駆動流培養構成は、入口ウェルと出口ウェルとの間の培地レベル差を利用すると共に流体抵抗を設計してｎＬ／分レジームでの望ましい流量を達成する。これは、かさばる外部ポンプを使用することなく、長期間（例えば、４日まで）にわたって培地を「受動的に」流すことができるという重要な利点を与える。
【０１１０】
統合システム
細胞及び他のデータの収集及び分析並びに本発明のデータベースの編集、保存及びアクセスのための集積システムは、典型的には、配列の検索及び／又は分析のための命令セット及び任意にハイスループットサンプル制御ソフトウェア、画像分析ソフトウェア、収集データ解釈ソフトウェアの一つ以上を含めたソフトウェア、デジタルコンピュータに動作可能に接続された、ソースからのソルーションを宛先（例えば検出装置）に伝えるためのロボット制御用アーマチュア、被験体データをデジタルコンピュータに入力するための入力装置（例えば、コンピュータ・キーボード）、又はロボット制御アーマチュアにより分析操作若しくはハイスループットサンプル伝達を制御するための装置を有するデジタルコンピュータを備える。任意に、この統合システムは、説明したようにマイクロチャンバーに連結するために弁、濃度勾配、流体マルチプレクサ及び／又は他の微小流体構造を備える。
【０１１１】
標準的なオペレーティング・システムを用いて容易に利用可できる計算ハードウェアリソースを、本発明の統合システムで使用するために、ここで与えた教示に従って使用しかつ改変することができる。例えばＰＣ（インテルｘ８６又はＰｅｎｔｉｕｍ（商標）チップ互換性ＤＯＳ（商標）、ＯＳ２（商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ（商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＮＴ（商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ９５（商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ９８（商標）ＬＩＮＵＸ（商標）又はＭａｃｉｎｔｏｓｈ、Ｓｕｎ又はＰＣで十分である）である。ソフトウェア技術における現在の技術は、コンピュータシステム上において本明細書で教示した方法の実施を可能にするのに適切である。したがって、特定の実施形態では、本発明は、本明細書で教示する方法の１つ以上を実行するための論理命令（ソフトウェア又はハードウェアコード化命令のいずれか）のセットを含むことができる。例えば、データ及び／又は統計的分析を提供するためのソフトウェアは、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａ（登録商標）などの標準プログラミング言語を用いて当業者により構築できる。また、このようなソフトウェアは、様々な統計プログラミング言語、ツールキット又はライブラリを利用しても構築できる。
【０１１２】
図２１は、固定媒体７２２に接続されたサーバ７２０に任意に接続できる媒体７１７及び／又はネットワークポート７１９からの命令を読むことができる論理装置と解することできる情報家電（又はデジタル装置）７００を示す。その後、装置７００は、当該技術分野において理解されるように、これらの命令をサーバ又はクライアントロジックに指示して本発明の態様を具体化する。コンピュータシステムで本発明を具現化することができる論理装置の一つのタイプは、ＣＰＵ７０７、随意の入力装置７０９及び７１１、ディスクドライブ７１５及び随意のモニター７０５を含む、７００に例示されるようなコンピュータシステムである。固定媒体７１７又はポート７１９にわたる固定媒体７２２は、このようなシステムをプログラムするために使用でき、かつ、ディスク型の光学又は磁気媒体、磁気テープ、ソリッドステートダイナミック又はスタティックメモリを表すことができる。特定の実施形態では、本発明は、この固定媒体７１５に記録されたソフトウェアとして全体的に又は部分的に具現化できる。また、通信ポート７１９は、このようなシステムをプログラムするために使用される命令を最初に受信するために使用でき、かつ、任意のタイプの通信接続を表すことができる。
【０１１３】
ここで記載するように、遺伝的アルゴリズム及びニューラルネットワークを含めた様々なプログラミング方法及びアルゴリズムを使用して、データ収集、相関及び記憶機能並びに他の望ましい機能の態様を実行することができる。さらに、デジタル又はアナログコンピュータシステムなどのデジタル又はアナログシステムは、ディスプレイ及び／又は入力及び出力ファイルの制御などの他の様々な機能を制御することができる。また、本発明の電気分析方法を実施するためのソフトウェアも、本発明のコンピュータ・システムに含まれる。
【０１１４】
他の実施形態
本発明を様々な特定の実施形態に関して説明してきたが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。本発明の精神内での改変は当業者であれば明らかであろう。
【０１１５】
ここで説明した実施例及び実施形態は例示を目的とするものであり、また、それを考慮した様々な修正や変更がここでの教示により当業者に示唆され、かつ、本願の精神及び範囲並びに請求の範囲に含まれるべきであると解する。
【０１１６】
ここで引用した又は本願と共に提出した全ての刊行物、特許及び特許出願は、情報開示陳述書の一部として提出された参考文献を含めて、その全体を引用により援用する。
【符号の説明】
【０１１７】
７００  装置
７０５  モニター
７０７  ＣＰＵ
７１５  ディスクドライブ
７１７  媒体
７１９  ネットワークポート
７２０  サーバ
７２２  固定媒体
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ−Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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