(57)【要約】  本発明は、ウイルスを非ウイルス特異的宿主細胞へと向け直すための二重特異性アダプター、そのような二重特異性アダプターをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を含む発現カセット、そのような発現カセットを含む組換えコロナウイルス、および医薬としてのそれらの使用、および腫瘍の治療におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異性アダプターをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡまたはＤＮＡ分子を含む発現カセットを組換えコロナウイルスが含むことを特徴とする組換えコロナウイルスであって、該二重特異性アダプターが、コロナウイルス結合性部分とラクダＶＨＨ抗体部分とを含むタンパク質であり、二重特異性アダプターをコードするヌクレオチド配列が転写調節配列（ＴＲＳ）の制御下にある、組換えコロナウイルス。
【請求項２】
該コロナウイルス結合性部分がコロナウイルススパイク−タンパク質受容体を含む、請求項１記載の組換えコロナウイルス。
【請求項３】
該コロナウイルス結合性部分のみが該コロナウイルススパイク−タンパク質受容体の可溶性部分を含むことを特徴とする、請求項２記載の組換えコロナウイルス。
【請求項４】
該コロナウイルススパイク−タンパク質受容体が、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）スパイク−タンパク質受容体、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）スパイク−タンパク質受容体および伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）スパイク−タンパク質受容体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２または３記載の組換えコロナウイルス。
【請求項５】
該ラクダＶＨＨ抗体部分が腫瘍特異的抗原に対するものであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の組換えコロナウイルス。
【請求項６】
医薬としての使用のための、請求項１〜５のいずれか１項記載の組換えコロナウイルス。
【請求項７】
腫瘍の治療における使用のための、請求項１〜４のいずれか１項記載の組換えコロナウイルス。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項記載の組換えコロナウイルスを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスを非ウイルス特異的宿主細胞へと向け直すための二重特異性アダプター、そのような二重特異性アダプターをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を含む発現カセット、そのような発現カセットを含む組換えコロナウイルス、および医薬としてのそれらの使用、および腫瘍の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
既にかなり前から、腫瘍治療における使用のための腫瘍溶解性ウイルスが研究されている（最近の総説としては、参考文献［１，２，３，４，５］を参照されたい）。癌細胞の破壊におけるそれらの成功は、選択的に感染し、これらの細胞を殺すそれらの能力にかかっている。幾つかの腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍細胞に対する自然指向性を有するらしいが、ほとんどのウイルスは、これらの細胞における感染および／または溶解活性を達成するためには、何らかの方法で修飾される必要がある。腫瘍細胞の特異的感染を達成するための方法の１つは、そのような細胞上で発現されるエピトープに対してウイルスを向け直すことによるものである。したがって、種々の標的化アプローチが種々のウイルスに関して開発されている。これらには、シュードタイピング、ウイルス表面タンパク質の修飾、二重特異性アダプターの使用が含まれる（後記および［６，７，８］を参照されたい）。これらのアプローチの全ては、ウイルスの生存性が妨げられないこと、および特異的感染が可能となるように標的化部分が適切に露出されることを要する。適当な標的化エピトープが利用可能であることと共に特定のウイルスが遺伝的に修飾可能であることが該アプローチの成功を決定する。
【０００３】
現在のところ、癌治療におけるコロナウイルスに基づく腫瘍溶解性物質の使用の可能性を記載している少数の報告があるに過ぎない。コロナウイルスは、３つの膜タンパク質、スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）およびマトリックス（Ｍ）を含有するエンベロープに包囲された、約３０ｋｂゲノムおよびヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質を含有するヌクレオキャプシドからなるプラス鎖ＲＮＡウイルスである。これらのうち、スパイク糖タンパク質Ｓは、それが細胞受容体に結合し、膜融合を誘導して、ウイルス侵入およびシンシチウム形成を引き起こす。
【０００４】
ほとんどのコロナウイルスは、スパイク−受容体相互作用により測定された場合に、厳密な種特異性を示す［１２，１３，１４］。コロナウイルスネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）は、例えば、ネコ細胞において、その受容体ネコアミノペプチダーゼＮ（ｆＡＰＮ）を介して選択的に感染し、シンシチウム形成を誘導する［１５］。同様に、外部ドメインがＦＩＰＶスパイクタンパク質のものであるキメラスパイクを含有するマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）の誘導体である組換えネコ化マウス肝炎ウイルス（ｆＭＨＶ）［１６］もｆＡＰＮ分子を介してネコ細胞のみに感染し、融合する。それらの種限定的指向性の結果として、ＦＩＰＶおよびＭＨＶはそれぞれ非ネコ細胞または非マウス細胞に対して非病原性である。しかし、指向性障壁が低減したら、コロナウイルスは異なる種の細胞において複製しうる［１６，１７］。したがって、スパイクタンパク質が腫瘍細胞上の受容体を認識すれば、ＦＩＰＶおよびＭＨＶは癌の治療のための特異的溶解剤へと潜在的に変換されうる。
【０００５】
非ヒトコロナウイルスマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）は、最も良く研究されているコロナウイルスであり、より重要なことに、一般にコロナウイルスに関しては、コロナウイルスゲノムを修飾するために、簡便な逆遺伝学系が利用可能である［１６，１８］。ＭＨＶは、幾つかの他のコロナウイルスとして、それを腫瘍溶解性ウイルスとして適したものにする幾つかの魅力的な特徴を有する。第１に、それは、そのスパイク（Ｓ）糖タンパク質と細胞受容体ｍＣＥＡＣＡＭ１ａとの相互作用により決定される狭い宿主域を有する［１９］。ｍＣＥＡＣＡＭ１ａは非マウス細胞上で発現されないため、ＭＨＶは正常または癌性非マウス細胞のいずれにおいても感染を確立し得ない。第２に、ＭＨＶによる感染は、感染細胞と周囲の未感染細胞との融合を意味する大きな多核シンシチウムの形成を誘導する［１１］。したがって、その比較的短い複製周期をも考慮すると［６〜９］、ＭＨＶは、一旦感染すれば、細胞集団を迅速に破壊する。第３に、ＭＨＶの指向性は、ウイルススパイク外部ドメインの置換により、または二重特異性アダプターの使用により修飾されうる［２０，２１，２２，２３］。
【０００６】
これらの二重特異性アダプターは、ウイルス結合性部分と標的細胞結合性部分とを含むタンパク質である。一方においては、そのようなタンパク質はコロナウイルスに特異的に結合し、もう一方においては、それらは標的細胞上の特異的受容体に特異的に結合する。したがって、それらはコロナウイルスと標的細胞との間の中間体として作用し、そのようなものとして、それらは、特異的コロナウイルスを、そのコロナウイルスに通常は感染しない特異的標的細胞へと向け直すことが可能である。そのような二重特異性アダプターを使用して行われた研究は、宿主細胞指向性障壁が低減したら、例えば、ＭＨＶは非マウス細胞における感染を確立しうることを示した。
【０００７】
コロナウイルスに関しては、そのような二重特異性アダプターは、とりわけ、Ｗｕｒｄｉｎｇｅｒ［２２］により記載されている。この論文は、非ヒトコロナウイルスをヒト癌細胞へと標的化するための二重特異性アダプターとしての二重特異性一本鎖抗体の使用を記載している。この論文において使用されているウイルス結合性部分は、ＦＩＰスパイクタンパク質に対して産生した抗体に由来し、一方、標的細胞結合性部分は、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して産生した抗体に由来する。
【０００８】
Ｗｕｒｄｉｎｇｅｒによるもう１つの論文［２１］においては、ＭＨＶ結合性部分としての、ＭＨＶ細胞受容体ＣＥＡＣＡＭ１ａのＮ末端部分、いわゆる可溶性受容体（ｓｏＲ）（細胞表面から突出している受容体の部分のＮ末端ドメイン）と、標的細胞結合性部分としての、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して産生した抗体とを含むもう１つの二重特異性アダプターが記載されている。
【０００９】
しかし、ウイルスを（腫瘍）細胞に標的化するためのそのような二重特異性アダプターの使用は以下の２つの欠点を有する：１）該二重特異性アダプターは別個に提供される必要があり、該ウイルスと一緒に、好ましくは該ウイルスに結合させて、宿主に投与される必要があること、ならびに２）それは、ウイルスが複製周期を終了し、新たなウイルス粒子を産生するたびに宿主に再投与される必要があること。これは、デノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）産生ウイルス粒子を向け直して更なる（腫瘍）細胞に感染させるために必要である。
【００１０】
理論的には、これらの課題を克服するために、二重特異性アダプターをコードする遺伝情報をウイルスゲノム内に導入して、感染細胞内でウイルスが該アダプター自体を産生することを可能にすることができるであろう。
【００１１】
この概念の理論的実施可能性は、ｓｏＲとＨｉｓタグとから構成される、二重特異性アダプターをコードする発現カセットを、ＭＨＶゲノム内に挿入することにより証明された［２０］。この自己標的化組換えコロナウイルスは、人工Ｈｉｓタグ受容体を発現する組換えヒト細胞に感染しうることが示された。［２３］において、ｓｏＲとヒト上皮増殖因子（ＥＧＦ）とから構成される二重特異性アダプターを今やコードする比較しうる組換えＭＨＶウイルスはＥＧＦ受容体発現細胞における多ラウンド感染が可能であり、著しい細胞−細胞融合および標的グリオブラストーマ細胞の効率的な殺傷をもたらすことが示された。ヌードマウスにおける侵襲性Ｕ８７ΔＥＧＦＲグリオブラストーマの正所性頭蓋内腫瘍モデルを用いて、Ｖｅｒｈｅｉｊｅ［２３］は、向け直された組換えコロナウイルスが実際に腫瘍溶解能を有することを初めて示した。
【００１２】
しかし、以下の理由により、そのようなアプローチは非常に限られた適用可能性しか有していない。
【００１３】
１）コロナウイルスゲノムは、本質的に、挿入される発現カセットの特徴に関して非常に限られた許容性しか有さない。ｓｏＲと１８核酸のＨｉｓタグまたは１５９核酸のＥＧＦのいずれかとをコードする発現カセットはコロナウイルスゲノム内に挿入されうるが、例えばｓｏＲと一本鎖抗体とをコードする発現カセットは許容されない［２０，２１］。
【００１４】
２）該アプローチは、１）の理由、ならびに該ウイルスの腫瘍溶解適用ごとに新たな標的細胞結合性部分を見出し、開発し、クローニングする必要があり、通常、そのような新たな標的細胞結合性部分のサイズおよび／または遺伝子特性はコロナウイルスゲノムの挿入許容性を超えることから、万能アプローチではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、より万能な腫瘍溶解性が必要とされている。
【００１６】
そのような腫瘍溶解性組換えコロナウイルスを提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
驚くべきことに、外来配列に対するコロナウイルスゲノムの非常に限られた許容性にもかかわらず、コロナウイルス結合性部分とラクダＶＨＨ抗体とを含む二重特異性アダプターがコロナウイルスにおいて成功裏に発現されうることが見出された。
【００１８】
本明細書中で用いる「コロナウイルス結合性部分とラクダＶＨＨ抗体部分とを含む二重特異性アダプター」は以下のとおりに理解されるべきである。そのようなアダプターは、一方の側ではコロナウイルスに結合し（これはコロナウイルス結合性部分である）、もう一方の側では細胞成分に結合しうるタンパク質であり、ここで、該細胞部分への前記のもう一方の側の結合は、前記のもう一方の側が該細胞成分に対するいわゆるラクダＶＨＨ抗体（これはラクダＶＨＨ抗体部分である）を含むために生じる。特に、本発明の二重特異性アダプターは、コロナウイルス結合性部分がＶＨＨ抗体部分のＮ末端側に位置し、あるいはコロナウイルス結合性部分がＶＨＨ抗体部分のＣ末端側に位置するタンパク質である。コロナウイルス結合性部分またはＶＨＨ抗体部分は該二重特異性アダプターのＣ末端またはＮ末端に存在することが絶対的に必要なわけではない。
【００１９】
そのような二重特異性アダプターの重要な利点の１つは、ラクダＶＨＨ抗体部分の使用により、それがそれぞれの腫瘍特異的タンパク質への結合のために容易に適合化されうることである。これは、そのような二重特異性アダプターを、腫瘍細胞へのコロナウイルスの標的化のための非常に万能な装置へと変える。そのような二重特異性アダプターのもう１つの利点は、そのようなアダプターを発現するカセットがコロナウイルスにより常に許容されることである。これは、とりわけ、ラクダＶＨＨ抗体部分をコードするカセットの部分が実質的に同じサイズを常に有するために、このカセットが実質的に同じ（小さな）サイズを常に有することによる。それはまた、ＶＨＨタンパク質が同じ基本構造を常に有することによる。１つのタンパク質に対して産生されたＶＨＨ抗体ともう１つのタンパク質に対して産生されたＶＨＨ抗体との間のアミノ酸配列における相違は比較的瑣末なものである。そして主な利点は、コロナウイルス内へのそのような発現カセットの挿入が、感染細胞において該ウイルスがアダプター自体を産生し、それにより自己標的化後代ウイルスを産生することを可能にすることである。
【００２０】
したがって、本発明の第１の実施形態は、該二重特異性アダプターがコロナウイルス結合性部分とラクダＶＨＨ抗体部分とを含むことを特徴とする二重特異性アダプターに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】（Ａ）通常の抗体（左）および重鎖のみの抗体（中央）の概要図。ＣＨ、ＶＨ：重鎖の定常および可変ドメイン；ＣＨＨ、ＶＨＨ：重鎖のみの抗体からの重鎖の定常および可変ドメイン；（Ｂ）ＨＥＲ２結合性ＶＨＨの１１Ａ４  ｅｎ  １Ｃ８のアミノ酸配列。
【図２】ｓｏＲに基づく標的化構築物の概要図。ｓｏＲ：ｍＣＥＡＣＡＭ１のａＮ末端ドメイン；Ｉｇκ：シグナル配列；ｍｙｃ：ｍｙｃタグ；Ｈｉｓ：６−ヒスチジン残基タグ；Ａｌａ：３−アラニン残基タグ；ＶＨＨ：重鎖のみの抗体配列からの重鎖の可変ドメイン；Ｔ７：Ｔ７プロモーター。
【図３】ヒト卵巣癌細胞に対する、ＶＨＨに基づくアダプタータンパク質を使用するＭＨＶの標的化。ワクシニアＴ７に基づく発現系において産生されたアダプタータンパク質をＭＨＶと共にインキュベートし、ついで、それを使用して（Ａ）対照ＣＨＯ−ｓｃＦｖ．Ｈｉｓ、（Ｂ）ヒト卵巣ＭＣＦ７、および（Ｃ）ヒト卵巣ＳＫＯＶ３細胞に接種した。感染後２０時間の時点で、該細胞を固定し、ＭＨＶに対する抗体で染色した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ラクダＶＨＨ抗体は既に２０年以上前から当技術分野で良く知られている。それらは現在、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））と称されることも多い。ＶＨＨ抗体は、ラマ・グラマ（Ｌｌａｍａ  ｇｌａｍａ）を含むラクダ科動物に存在する重鎖のみの抗体の可変領域として定義される。重鎖のみの抗体の存在は２０年以上前に見出され、それ以来、これらの抗体からの可変領域の適用が種々の目的で開発されている。細胞へのウイルスの特異的標的化のための二重特異性アダプターにおけるそのようなナノボディの使用は未知であった。勿論、ウイルスにおいてそのような二重特異性アダプターを発現する発現カセットの組込みが示唆されていないことは言うまでもない。本発明の二重特異性アダプターにおけるラクダＶＨＨ抗体部分としての使用に適したラクダＶＨＨ抗体は、ヒトコブラクダまたはラマのようなラクダを標的細胞の細胞表面タンパク質で免疫化することにより容易に誘導される。そのような標的細胞は腫瘍細胞でありうる。そしてその場合、細胞表面タンパク質は腫瘍特異的細胞表面タンパク質として機能するであろう。腫瘍特異的抗原は、特定のタイプの腫瘍により産生される抗原であって、該腫瘍が発生した組織の正常細胞上に存在しないか又は遥かに少ない量で存在する抗原である。多数のヒト腫瘍特異的抗原が当技術分野で公知であり、例えば、Ｅｒｂ［これは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＲＦ）およびヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）を含む］のような増殖因子受容体のに属する受容体が挙げられる。ＥＧＦＲは全腫瘍の６０〜７０％において過剰発現されるが、Ｈｅｒ２は乳癌の特異的マーカーである。他の腫瘍特異的抗原の例としては、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、細胞表面結合ムチン１（ＭＵＣ−１）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、肝細胞増殖因子受容体、ＩＧＦ様増殖因子受容体１（ＩＧＦ−１Ｒ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ−ＩＸ）およびグルコース輸送体１（Ｇｌｕｔ１）が挙げられる。イヌにおいて見出される腫瘍特異的抗原の例としては、例えば、皮膚癌特異的タンパク質Ｋｉ６７、乳癌特異的ｃ−ｋｉｔプロトオンコジーン（ＰＤＧＦ受容体）、ＩＸ型コラーゲン、およびリンパ腫特異的タンパク質ＡｇＮＯＲ、およびＥｒｂＢファミリーの受容体（ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２）が挙げられる。これらの腫瘍マーカーからは、Ｈｅｒ２受容体がイヌ骨肉腫において頻繁に（過剰）発現される。
【００２３】
それに続く、免疫化動物からの抗原結合性フラグメントのレパトワの単離、およびファージ提示ベクター内へのクローニング、およびパンニングによる抗原特異的クローンの選択が、既に１０年以上前から、抗原特異的分子を選択するための常套的な方法となっている［２４，２５］。この方法はナノボディに適合化されており、これにより、ナノボディの一本鎖特性が該方法を相当に単純化している［２６］。免疫化ヒトコブラクダまたはラマの重鎖抗体の抗原結合性レパトワのタッピング（ｔａｐｐｉｎｇ）は、通常の抗体、例えば、一本鎖可変性フラグメント（ｓｃＦＶ）形態の抗体のレパトワクローニングほどは複雑でない。なぜなら、無傷抗原結合部位が単一遺伝子フラグメントによりコードされているからである。
【００２４】
一般に、ｃＤＮＡは、免疫化ヒトコブラクダまたはラマから単離された末梢血リンパ球から調製される。全てのナノボディは１つの単一遺伝子ファミリーに属しているため、それらは、相同境界配列を伴う単一エキソンによりコードされている。したがって、単一免疫化動物の完全インビトロ成熟ナノボディレパトワは１組のプライマーにより増幅されうる。ついで、より大量の物質を得、クローニング目的の制限酵素部位を含有させるために、ネスティッドプライマーを使用する第２のポリメラーゼ連鎖反応を行う。適当な発現ベクターにおける増幅ナノボディ遺伝子フラグメントのクローニングの後、無傷インビトロ成熟抗原結合レパトワを含有するナノボディライブラリーが得られる［２６］。ＶＨＨのインビボ成熟ゆえに、約１０７〜１０８個のナノボディ遺伝子のライブラリーは通常、対応抗原に対してナノモルのアフィニティを有するナノボディの単離をもたらしている［２６，２７，２８］。ナノボディライブラリーは、直接コロニースクリーニングにより又はパンニングにより、抗原特異的結合体の存在に関してスクリーニングされうる。パンニングによる結合体の回収は好ましい方法である。なぜなら、パンニングは、最高アフィニティを有する結合体の選択を可能にするからである［２９］。二重特異性アダプターをコードする発現カセット内への、所望のナノボディをコードするＤＮＡのクローニング、およびコロナウイルスゲノム内へのそのような発現カセットの導入の一例が、後記の実施例に示されている。ナノボディ、それらの使用およびそれらの製造方法は、とりわけ、［３０〜３３］における総説に記載されている。ヒトに対する使用の場合、ナノボディは、所望により、とりわけ「３４」に記載されているとおりにヒト化されうる。
【００２５】
該二重特異性アダプターのコロナウイルス結合性部分に関しては、コロナウイルス結合性部分としてコロナウイルススパイクタンパク質受容体を選択することが非常に有利である。ＭＨＶが、選択された腫瘍溶解性ウイルスである場合、スパイクタンパク質細胞受容体ＣＥＡＣＡＭ１ａが、選択される細胞受容体であろう。ＣＥＡＣＡＭ１ａは前記に記載されている（前記を参照されたい）。幾つかの他のコロナウイルスに関しても、コロナウイルススパイクタンパク質受容体が公知である。伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に関しては、細胞受容体はブタアミノペプチダーゼＮである［３５，３６］。ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰ）に関しては、それはネコアミノペプチダーゼＮである［３７］。興味深いことに、ＦＩＰスパイクタンパク質細胞受容体は幾つかのＩ群コロナウイルス、例えばヒトコロナウイルスＨＣＶ−２２９Ｅに、およびＴＧＥＶに結合し、したがって、Ｉ群コロナウイルスに対する、より万能な受容体として使用されうる。
【００２６】
したがって、この実施形態の好ましい形態は、コロナウイルス結合性部分がコロナウイルススパイク−タンパク質受容体を含む、本発明の二重特異性アダプターに関する。
【００２７】
原則として、ＣＥＡＣＡＭ１ａのＮ末端部分、いわゆる可溶性受容体（ｓｏＲ）、細胞表面から突出している受容体の部分のドメイン、またはブタアミノペプチダーゼＮもしくはネコアミノペプチダーゼＮのスパイク結合性ドメインが、コロナウイルス結合性部分として好ましいであろう。該受容体の可溶性部分のみの使用は、スパイクタンパク質への結合能が維持されることを保証すると同時に、疎水性領域の存在による二重特異性アダプターの不適切な発現およびプロセシングのリスクが排除される。
【００２８】
したがって、この実施形態のより好ましい形態は、該コロナウイルス結合性部分がコロナウイルススパイク−タンパク質受容体の可溶性部分のみを含むことを特徴とする、本発明の二重特異性アダプターに関する。
【００２９】
コロナウイルススパイク−タンパク質受容体がコロナウイルス結合性部分として選択された場合、好ましくは、コロナウイルススパイク受容体はＭＨＶスパイク−タンパク質受容体、ＦＩＰスパイク−タンパク質受容体またはＴＧＥＦスパイク−タンパク質受容体である。
【００３０】
したがって、この実施形態のより一層好ましい形態は、該コロナウイルススパイク−タンパク質受容体が、ＭＨＶスパイク−タンパク質受容体、ＦＩＰスパイク−タンパク質受容体およびＴＧＥＶスパイク−タンパク質受容体、特に、これらの受容体の可溶性部分からなる群から選択される、本発明の二重特異性アダプターに関する。
【００３１】
前記のとおり、本発明の二重特異性アダプターの最も重要な用途の１つは、腫瘍溶解性コロナウイルスの宿主細胞特異性を腫瘍細胞に標的化することである。したがって、この実施形態のより一層好ましい形態は、該ラクダＶＨＨ抗体部分が腫瘍特異的抗原に対するものである、本発明の二重特異性アダプターに関する。
【００３２】
前記のとおり、該二重特異性アダプターは、例えば、該二重特異性アダプターの遺伝暗号を含むヌクレオチド配列を発現させることにより製造されうる。このヌクレオチド配列は、好ましくは更に、該二重特異性アダプターの発現に影響を及ぼす調節配列を含む。本発明の二重特異性アダプターをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、機能的転写調節配列（ＴＲＳ）の制御下に配置される。プラス鎖ＲＮＡ（コロナ−）ウイルスにおいては、転写調節配列は、ウイルスゲノム内の下流遺伝子の発現を調節するための細胞プロモータの等価体として機能する。本発明の発現カセットがウイルスゲノム内に組込まれる場合には、それは通常、転写調節配列（ＴＲＳ）を含み、および／またはＴＲＳの下流に組込まれるであろう。好ましくは、これはコロナウイルスＴＲＳである。そのようなＴＲＳおよび適当な挿入部位の例は、とりわけ、ｄｅ  Ｈａａｎ（２００２）および（２００３）［４８，５１］に記載されている。
【００３３】
したがって、本発明のもう１つの実施形態は、ＴＲＳの制御下に本発明の二重特異性アダプターをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡまたはＤＮＡ分子を含む発現カセットに関する。該ウイルスにおいては該発現カセットはＲＮＡの形態であるが、該発現カセットのクローニング段階中には該カセットはＤＮＡの形態であろう。これは後記実施例に例示されている（後記を参照されたい）。発現カセットは、ＴＲＳの制御下に本発明の二重特異性アダプターをコードする遺伝情報を含むＲＮＡまたはＤＮＡの伸長であると理解される。
【００３４】
前記のとおり、驚くべきことに、挿入発現カセットに対するコロナウイルスゲノムの非常に限られた許容性にもかかわらず、コロナウイルス結合性部分とラクダＶＨＨ抗体部分とを含む二重特異性アダプターをコードする発現カセットを含む組換えコロナウイルスは尚も生存可能であることが見出された。したがって、本発明のもう１つの実施形態は、該組換えコロナウイルスが本発明の発現カセットを含むことを特徴とする組換えコロナウイルスに関する。
【００３５】
本発明の更にもう１つの実施形態は、医薬としての使用のための、本発明の組換えコロナウイルスに関する。
【００３６】
この実施形態の好ましい形態は、腫瘍の治療（根治）における使用のための、本発明の組換えコロナウイルスに関する。
【００３７】
本発明の組換えコロナウイルスの使用に関しては、以下のとおりに示されうる。該ウイルスは、それらのスパイクに結合したアダプターを既に含有する生形態で投与される。したがって、投与直後に、該ウイルスは、ＶＨＨを産生させた抗原である特異的腫瘍特異的抗原を提示する腫瘍細胞を標的とするであろう。そして本発明の組換えコロナウイルスは感染細胞内で該アダプター自体を産生しうるため、それらは自己標的化後代ウイルスを産生する。この後代ウイルスは今度は新たな腫瘍細胞に感染しうる。したがって、少量のウイルス粒子でさえも最終的に多数の腫瘍細胞を排除しうる。したがって、僅か１０３個のウイルスの量が原理的には腫瘍を最終的に排除すると予想されうる。しかし、本発明の組換えコロナウイルスは、腫瘍特異的タンパク質を提示する細胞のみに結合するため、それらは、基本的に、非腫瘍細胞に対しては無毒性である。したがって、原則として、１０８個のウイルス粒子までの、より高い用量が、副作用を伴うことなく適用されうる。
【００３８】
投与されるウイルス粒子の量に関しては、宿主の免疫系は該ウイルスを外来物として認識し、免疫反応を生成することにより応答することに留意すべきである。免疫応答の誘導は或る速度で生じる。したがって、少量のウイルス粒子の投与の欠点は、宿主内のウイルス力価が全腫瘍細胞への攻撃に十分に高くなるまでに、数ラウンドの複製を要しうることである。そして、この期間中に、免疫系が成熟し、該ウイルスの中和が開始する。この問題は、大量のウイルスを投与することにより、容易に回避されうる。その結果、宿主内のウイルス力価が全腫瘍細胞への攻撃に十分に高くなるまでに、より少数の複製ラウンドで済むであろう。そのような場合、１０５〜１０８個のウイルス粒子の用量が、好ましい用量でありうる。
【００３９】
免疫の誘導の作用から逃れるためのエレガントな代替手段を以下に示す。最初の攻撃は本発明の第１コロナウイルスでなされうる。このウイルスに対する免疫応答が、コロナウイルスの除去を招くレベルに達したら直ぐに、同じ細胞（および好ましくは同じ特異的受容体）に標的化される本発明の第２コロナウイルスが第２攻撃のために使用されうる。この第２コロナウイルスが第１コロナウイルスとの有意な免疫学的交差反応を示さないならば、第２コロナウイルスは、第１コロナウイルスに対して誘導される免疫反応によっては妨げられないであろう。単なる一例に過ぎないが、このアプローチにおいては、本発明のコロナウイルスはＭＨＶであることが可能であり、本発明の第２コロナウイルスはＦＩＰＶであることが可能である。
【００４０】
該腫瘍特異的抗原が完全には腫瘍特異的でないと考えられる理由があり、したがって、遥かに少ない量ではあるが非腫瘍細胞上に存在しうる場合には、より低い用量のウイルス粒子を投与することが安全であろう。そのような場合には、１０４〜１０６個のウイルス粒子の用量が、好ましい用量でありうる。
【００４１】
本発明の組換えコロナウイルスの投与は、好ましくは、注射により行われる。該ウイルスは、好ましくは、医薬上許容される溶液、例えば生理塩液またはバッファー中で投与される。腫瘍は、典型的に、十分に潅流されるため、該ウイルスは、例えば、血流中に直接的に投与されうる。しかし、充実性腫瘍の治療のためには、該腫瘍において又は該腫瘍の周囲に該ウイルスを投与することも有利でありうる。投与されるウイルスの量に応じて、複数の部位および／または時点において複数用量が要求されうる。
【００４２】
また、本発明のもう１つの実施形態は、本発明の二重特異性アダプターを含む医薬組成物に関する。
【００４３】
本発明の更にもう１つの実施形態は、本発明の発現カセットを含む医薬組成物に関する。
【００４４】
本発明の更にもう１つの実施形態は、本発明の組換えコロナウイルスを含む医薬組成物に関する。
【００４５】
後記実施例は、インビボ状況における本発明の組換えコロナウイルスの投与方法に関する十分な情報を提供する。
【実施例】
【００４６】
実施例１：
ＭＣＦ７細胞でのラマ・グラマの免疫化
ヒト卵巣癌細胞の細胞表面タンパク質に対する体液性免疫応答を誘導するために、ＭＣＦ７細胞（注射当たり約１０８個の細胞）の無傷ヒト細胞調製物をラマに注射した。各動物は７用量の皮下投与抗原の投与を１週間間隔で受けた。第０日（免疫化前）ならびに免疫化の４および６週間後に、免疫前血清および免疫血清を集めた。最後の抗原注射の４日後に、血液を集め、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ勾配（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）上の密度勾配遠心分離により精製して、約１０８個のＰＢＬを単離した。
【００４７】
ファージＶＨＨレパトワの構築
全ＲＮＡを、記載されているとおりに（５０）、これらのＰＬＢから抽出し、オリゴ−ｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を該製造業者のプロトコールに従い使用して、ｃＤＮＡへと転写した。次に、ｃＤＮＡをＲＮＡアーゼＨで処理して、残留ＲＮＡを枯渇させた後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して精製を行った。ついで、精製されたｃＤＮＡを鋳型として使用し、２つのフォワードフレームワーク１（ＦＲ１）特異的プライマー：５’−ＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧ−３’および５’−ＧＧＣＴＧＡＧＴＴＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧ−３’を４：１の比で、そしてリバースＣＨ２フラグメントプライマー：５’−ＧＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＴＴＣＣ−３’を使用して、Ｉｇ重鎖コード化遺伝子セグメントのレパトワを増幅した。この増幅操作は約７００ｂｐ（ＦＲ１からＣＨ２までの重鎖のみの抗体に相当する）のＰＣＲ断片を与えた。ついで、それらの２つのクラスの重鎖コード化遺伝子をアガロースゲル上でサイズ分離し、重鎖のみのＩｇＧをコードする遺伝子をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で精製した。次の工程において、精製されたＤＮＡをネスティッドＰＣＲにおいて鋳型として使用した。該ＰＣＲにおいては、フォワードＦＲ１特異的プライマー：５’−ＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＧＧＣＣＴＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧ−３’により、重鎖のみの抗体フラグメントの５’末端にＳｆｉ部位を導入した。ＢｓｔＥＩＩ制限部位はＶＨＨ遺伝子のＦＲ４の約９０％において天然に存在するため、ＰＣＲ増幅遺伝子のレパトワをＳｆｉＩおよびＢｓｔＥＩＩで切断し、生じた４００ｂｐのｃＤＮＡ断片をゲル電気泳動により精製した。最後に、ｃＤＮＡ断片を、繊維状バクテリオファージ上の提示のためにファジミドベクターｐＵＲ８１００内に連結し（５２）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＴＧ１（Ｋ１２，Δ（ｌａｃ−ｐｒｏ），ｓｕｐＥ，ｔｈｉ，ｈｓｄＤ５／Ｆ’ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡ＋Ｂ＋，ｌａｃＩｑ，ｌａｃＺΔＭ１５）内に電気形質転換（ｅｌｅｃｔｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）した。これはそれぞれ約１０６個の形質転換体の「免疫」ＶＨＨレパトワを与えた。
【００４８】
抗ＨＥＲ２  ＶＨＨ断片のファージ提示選択
ヒトＨＥＲ２受容体に結合する抗体を選択するために、幾つかのファージ提示選択を行った。第１のアプローチにおいては、捕捉組換え精製ＨＥＲ２外部ドメイン（ＥＣＤ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｏｘｏｎ，ＵＫ）上で抗ＨＥＲ２ファージを選択した。Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＭＮ，ＵＳＡ）を１／５００の希釈度のポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で４℃で一晩コートし、ついで該プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の漸減量の組換え精製ＨＥＲ２−ＥＣＤ（０，５μｇ／ウェル；０，１μｇ／ウェル；０，０５μｇ／ウェル；０，０１μｇ／ウェル）と共に室温で２時間インキュベートした。未結合ＨＥＲ２−ＥＣＤをＰＢＳで洗い落とし、該コート化ウェルをＰＢＳ中の４％  乳粉末で室温で１時間ブロッキングした。該「免疫」ライブラリーから調製され４％  乳粉末で室温で３０分間にわたってヘッド・オーバー・ヘッド（ｈｅａｄ−ｏｖｅｒ−ｈｅａｄ）で予備ブロッキングされたファージを次いで、固定化ＨＥＲ２−ＥＣＤへの結合のためにパンニングした。ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０での徹底的な洗浄の後、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌ  トリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でファージを３０分間溶出し、ついでＭｉｌｌｉＱ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中の２ｍｇ／ｍｌ  トリプシンインヒビターの添加によりトリプシンを中和した。追い出されたファージを使用して、指数関数的に増殖している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１に３７℃で３０分間にわたって感染させた。２％（ｗ／ｖ）グルコースおよび１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で細菌をプレーティングした。この設定においては、ＶＨＨ−ファージ１Ｃ８を、ＨＥＲ２−ＥＣＤ外部ドメインに高いアフィニティで結合するその能力に基づいて選択した。
【００４９】
第２のアプローチにおいては、２つの工程で、すなわち、第１ラウンドにおいては溶液中の生ＢＴ４７４細胞上で、そして第２ラウンドにおいてはビオチン化ＨＥＲ２−ＥＣＤ上で、「免疫」ライブラリーから調製されたファージをパンニングした。簡潔に説明すると、ＨｙｂｒｉＣａｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびグルタミンを含有する）中の種々の量のＢＴ４７４細胞（４＊１０５細胞〜４＊１０３細胞）と共に、ファージを、室温で回転させながら２時間インキュベートした。未結合ファージを、５００×ｇで５分間の遠心分離により、ＰＢＳでの３回の連続的洗浄工程において除去した。最後の洗浄工程の後、細胞をＰＢＳ中の１ｍｌｇ／ｍｌ  トリプシンに再懸濁させ、室温で３０分間インキュベートした。トリプシンインヒビター（ＭＱ中の２ｍｇ／ｍｌ）を加えて該酵素を中和し、細胞を５００×ｇで５分間遠心沈降させた。溶出ファージを使用して、指数関数的に増殖している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１に３７℃で３０分間にわたって感染させた。感染細菌を、１００μｇ  アンピシリンおよび２％  グルコースで補足されたＬＢ培地に加え、振とう器内で３７℃でＯ／Ｎで増殖させた。この選択で得られたものを第２ラウンドにおいて使用し、ここで、ＰＢＳ中の２％  ＢＳＡで３０分間にわたって予備ブロッキングされたファージを１０ｎＭ〜１０ｐＭ  ビオチン化ＨＥＲ２−ＥＣＤと共にヘッド・オーバー・ヘッド・ローターにおいて室温で２時間インキュベートした。５倍モル過剰のビオチン（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）を使用し、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ビオチンを該製造業者のプロトコールに従い使用して、ＨＥＲ２−ＥＣＤをビオチン化した。未結合ビオチンをゼバ脱塩遠心カラム（Ｚｅｂａ  Ｄｅｓａｌｔ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ）（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）上で除去した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｌ  ＡＳ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中の２％  ＢＳＡで室温で３０分間ブロッキングし、ついでファージおよびビオチン化ＨＥＲ２−ＥＣＤの溶液に室温で１時間にわたって加えた。ヘッド・オーバー・ヘッド・ローター上のインキュベーションの後、該ビーズをＰＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回およびＰＢＳ中で２回洗浄した。結合ファージをトリプシンで溶出し、それを使用して、前記のとおりに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１に感染させた。この設定においては、ＶＨＨ−ファージ１１Ａ４を、ＨＥＲ２外部ドメインに高いアフィニティで結合するその能力に基づいて選択した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ単離法（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、１Ｃ８および１１Ａ４クローンの細菌細胞培養からＤＮＡを単離した。最後に、配列解析を行うことにより、ＶＨＨ  １Ｃ８および１１Ａ４のコード配列を特定した。ＶＨＨ  １Ｃ８および１１Ａ４のアミノ酸配列を図１に示す。
【００５０】
ＶＨＨコード化アダプター構築物の構築
ｍＣＥＡＣＡＭ１ａ受容体のアミノ末端Ｄ１ドメイン（ｓｏＲ）をコードする遺伝子の構築は既に記載されている（２０）。簡潔に説明すると、フォワードプライマー：５’−ＣＡＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＧＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＡＧＣＡＣＡＴ−３’およびリバースプライマー：５’−ＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＴＧＴＡＣＡＴＧＡＡＡＴＣＧ−３’を使用して、プラスミドｐＣＥＰ４：ｓＭＨＶＲ−Ｉｇ（Ｔ．Ｇａｌｌａｇｈｅｒにより快く提供されたもの）上でＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片ｓｏＲは、５’ＳｆｉＩおよび３’ＮｏｔＩ部位（該プライマーにおいて下線で示されている）を含有していた。ついで、これらの制限酵素を使用して、該断片を発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２内にクローニングして、ｓｏＲ−ＶＨＨ発現カセットの生成を可能にする発現ベクターｐＳＴｓｏＲ−ｘ−ｍｙｃｈｉｓを得た（２０）。発現カセットＶＨＨ−ｓｏＲを得るために、まず、ＮｏｔＩ部位の下流に追加的なＨｐａＩ部位を含有するリンカーを発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２に含有させた。該ｓｏＲ遺伝子を、その天然シグナル配列を欠く、より小さなｓｏＲ［これは、それぞれＮｏｔＩおよびＨｐａＩ制限部位（下線部）を有するフォワードプライマー：５’−ＣＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＡＴＴＧＡＧＧＣＴＧＴ−３’および５’−ＡＣＴＧＧＴＴＡＡＣＧＧＧＧＴＧＴＡＣＡＴＧＡＡＡＴＣＧＣ−３’を使用するＰＣＲにより得られた］で置換した。これは発現ベクターｐＳＴ−ｘ−ｓｏＲｍｙｃｈｉｓを与えた。
【００５１】
共にヒトＨＥＲ２に対するものである１Ｃ８および１１Ａ４のＶＨＨ配列を、フォワードプライマー：５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧ−３’およびリバースプライマー：５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧ−３’を使用するＰＣＲにより得た。得られたＰＣＲ断片をＮｏｔＩ（プライマーにおける下線部）で消化し、ついで両方の発現ベクターにおけるこの制限部位内にクローニングした。該インサートの正しい配向および配列が配列決定により確認された。
【００５２】
該構築物の概要図を図２に示す。全ての構築物はｍＣＥＡＣＡＭ１ａのＮ末端ドメインをＶＨＨ配列との融合体（Ｃ末端においてｓｏＲ−ＶＨＨまたはＮ末端においてＶＨＨ−ｓｏＲ）としてコードしている。それらの前方にはアミノ末端Ｉｇκシグナル配列が、後方にはカルボキシ末端ｍｙｃ−Ｈｉｓタグが、Ｔ７プロモーターの制御下で存在する。ｓｏＲ断片とＶＨＨ断片との間に３Ａｌａリンカーが存在する。
【００５３】
アダプタータンパク質の製造
ｓｏＲに基づくアダプタータンパク質の製造のために、Ｏｓｔ７−１細胞のサブコンフルエント単層にＴ７ポリメラーゼを発現するワクシニアウイルス（ｖＴＦ７−３）を５の感染多重度で感染させ（ｔ＝０時間）、それを、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して、ｐＳＴ−ｓｏＲ、ｐＳＴ−ｓｏＲ−ＶＨＨまたはｐＳＴ−ＶＨＨ−ｓｏＲでトランスフェクトした。培地をｔ＝４．５時間において新鮮なものにし、ｔ＝２０時間において回収し、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、それを細胞残渣から取り出した。ｓｏＲタンパク質を含有する上清を２０％  スクロースクッション上にローディングし、１３，０００ｒｐｍで９０分間遠心分離して、ｖＴＦ７−３ウイルスを除去した。該タンパク質バッチを−２０℃で貯蔵した。
【００５４】
細胞およびウイルス
マウスＯｓｔ７−１細胞（５３）（Ｂ．Ｍｏｓｓから入手）、ハムスターＣＨＯ−Ｈｉｓ．ｓｃＦｖ（５４）（Ｔ．Ｎａｋａｍｕｒａから入手）、ヒト卵巣癌細胞系ＳＫＯＶ３（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−７７）およびＭＣＦ７（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２）を全て、１０％  ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００ＩＵ／ｍｌ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン（全て、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍからのもの）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）中で維持した。ＭＨＶ−Ａ５９のストックを増殖させ、力価測定した（既に記載されているとおりに行った（５１））。
【００５５】
細胞培養のイムノペルオキシダーゼ染色
アダプタータンパク質の存在下または非存在下にＭＨＶが接種された細胞を、接種後２０時間の時点で、３．７％  パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳで固定した。該細胞を、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで透過性亢進させ、ついで、１：３００に希釈されたｋ１３４抗ＭＨＶ血清と共に、ついで、１：３００に希釈されたブタ抗ウサギペルオキシダーゼ（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と共に（どちらも、５％  ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ中）、インキュベートした。該細胞を、ＡＥＣ（Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を該製造業者のプロトコールに従い使用して染色し、光学顕微鏡法により分析した。
【００５６】
結果
アダプタータンパク質の機能性
該ｓｏＲ−ＶＨＨアダプタータンパク質の標的化能を調べるために、まず、対照細胞系ＣＨＯ−ｓｃＦｖ．Ｈｉｓ細胞（人工Ｈｉｓ受容体を構成的に発現する）に感染するその能力を試験することにより、これらのタンパク質が適切に産生されるかどうかを試験した。ＭＨＶ−Ａ５９をｓｏＲ−１Ｃ８、ｓｏＲ−１１Ａ４、１Ｃ８−ｓｏＲ、１１Ａ４−ｓｏＲと共に、または標的化装置を伴わないｓｏＲを含有する対照上清と共にプレインキュベートし、これらの混合物を、並行して、これらの細胞上へ２時間接種した。接種後２０時間の時点で、該細胞を固定し、ＭＨＶに対するポリクローナル抗体を使用して免疫染色を行った。全ての場合において染色が観察されたため、全てのアダプタータンパク質がＭＨＶをＣＨＯ−Ｈｉｓ．ｓｃＦｖ細胞に向け直すことが可能であったことを、データは示している（図３Ａ）。また、コロナウイルス感染の目印であるシンシチウム形成が観察できた。模擬トランスフェクト化細胞からの細胞培養上清が接種された細胞は、予想どおり、陰性のままであった（示されていない）。興味深いことに、ｓｏＲ−ＶＨＨおよびＶＨＨ−ｓｏＲは共に、ＭＨＶを向け直すことが可能であった。このことは、ＶＨＨのＮ末端およびＣ末端の両方の伸長が許容され、その標的化能に有害でなかったことを示している。
【００５７】
ヒトＨＥＲ２を発現する細胞の可溶性受容体媒介性ＭＨＶ感染
次に、類似した標的化実験を行った。この場合、ＨＥＲ２発現ヒト卵巣癌細胞にＭＨＶ−アダプタータンパク質混合物を接種した。この目的には、それぞれ高い及び低いＨＥＲ２発現を示すＭＣＦ７細胞およびＳＫＯＶ３細胞の両方を使用した。感染後２０時間の時点で、該接種細胞の免疫染色は、両方の細胞系が、ＶＨＨ含有アダプタータンパク質で向け直されたＭＨＶには感染しうるが、対照タンパク質には感染し得ないことを示した（図３Ｂおよび３Ｃ）。感染ＭＣＦ７細胞の数は陽性ＳＫＯＶ３細胞の数より相当に少なかったが、これはこれらの細胞によるＨＥＲ２受容体発現における相違によるものだと考えられうる。また、明らかなシンシチウム形成がＳＫＯＶ３では観察できたが、ＭＣＦ７細胞では観察できなかった。結論としては、該感染は、特異的ＶＨＨにより代表される標的化部分とＨＥＲ２受容体発現の両方に依存的であった。
【００５８】
実施例２：
標的化組換えのためのベクターの構築
ＭＨＶ−Ａ５９のウイルスゲノムにおける追加的な発現カセットからの該アダプタータンパク質の発現を可能にするために、上流転写調節配列（ＴＲＳ）（２０）を含む、ＶＨＨ−ｓｏＲｍｙｃｈｉｓおよびｓｏＲ−ＶＨＨ−ｍｙｃｈｉｓをコードする遺伝子を、まず、ＭＨＶ−Ａ５９のＳ遺伝子に融合したレプリカーゼ遺伝子１ｂの約１，２００ｂｐの３’末端を含有するｐＸＨ１８０２（４８）内にクローニングする。この目的のために、該インサートを、該ベクターをＥｃｏＲＶおよびＰｍｅＩで消化することにより得、該精製断片をｐＸＨ１８０２のクレノウ処理ＨｉｎｄＩＩＩ部位内にクローニングする。ついで、得られたプラスミドをＲｓｒＩＩおよびＡｖｒＩＩで消化し、得られた断片を、同じ酵素で処理されたｐＭＨ５４（１６）内にクローニングする。これは、標的化組換えに適した転写ベクターｐＭＨ−ｓｏＲ−ＶＨＨ−ｍｙＨｉｓおよびｐＭＨ−ＶＨＨ−ｓｏＲ−ｍｙｃＨｉｓを与えた。
【００５９】
標的化組換え
アダプター遺伝子ＶＨＨ−ｓｏＲ−ｍｙＨｉｓおよびｓｏＲ−ＶＨＨ−ｍｙｃＨｉｓを追加的な発現カセットとして、既に記載されているとおりに（４８，１６，４９，２０）、標的化ＲＮＡ組換えにより、ＭＨＶゲノム内に導入する。簡潔に説明すると、ＰａｃＩで線状化されたプラスミドｐＭＨ−ＶＨＨ−ｓｏＲ−ｍｙＨｉｓおよびｐＭＨ−ｓｏＲ−ＶＨＨ−ｍｙｃＨｉｓからインビトロで転写されたドナーＲＮＡを、４時間前に０．５の感染多重度（ＭＯＩ）でｆＭＨＶに感染したネコＦＣＷＦ−４細胞内にエレクトロポレーションによりトランスフェクトする。ついで、これらの細胞を培養フラスコ内でプレーティングし、２４時間後に培養上清を集める。後代ウイルスをプラーク精製し、ウイルスストックをＬＲ７細胞上で増殖させる。これらのウイルスストックからの精製ウイルスＲＮＡでの逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによる該追加的発現カセットの存在の確認の後、該ストックのウイルス力価をＬＲ７細胞上の終点希釈により決定する。ついで、これらの継代２ウイルスストックを該実験において使用する。各ウイルスに関して、該ウイルスゲノムの他の部分における意図されない突然変異により引き起こされる作用に関する対照としての、２つの独立した組換え体を作製する。
【００６０】
ウイルスＲＮＡ単離およびＲＴ−ＰＣＲ
まず、ＱＩＡＧＥＮウイルスＲＮＡ単離キット（製造業者に従う）を使用して、１４０μｌのウイルス含有培養上清からウイルスＲＮＡを単離する。ついで、ＭＨＶゲノム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ  ００１８４６）のｎｔ  ２４，１１０〜２４，１２８に位置するリバースプライマー１１２７（５’−ＣＣＡＧＴＡＡＧＣＡＡＴＡＡＴＧＴＧＧ−３’）を使用して、該単離ＲＮＡでの逆転写を行う。挿入された発現カセットを含有する領域を重複しているプライマー１１７３  （５’−ＧＡＣＴＴＡＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴＧＡＴＴＧ−３’，ｎｔ  ２１６５０〜２１６７１）および１２６０（５’−ＣＴＴＣＡＡＣＧＧＴＣＴＣＡＧＴＧＣ−３’，ｎｔ  ２４，０４１〜２４，０５８）を使用して、ＰＣＲを行う。ついで、該インサートの配列を確認するために、得られた断片を配列決定する。
【００６１】
標的細胞の接種
１×１０５個の量のＣＨＯ−Ｈｉｓ．ｓｃＦｖ、ＳＫＯＶ３およびＭＣＦ７細胞に０．５×１０５  ＴＩＣＤ５０を接種する。接種後１６時間の時点で、該細胞を固定し、ＭＨＶ抗血清（前記のとおり）を使用するイムノペルオキシダーゼ染色を行って、該細胞がウイルスタンパク質を発現したかどうか、したがって組換えＭＨＶに感染したかどうかを分析する。
【００６２】
文献：
【表１】
2015511489.tif 000002
2015511489.tif 000003
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【図１】
2015511489.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年11月12日(2014.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異性アダプターをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡまたはＤＮＡ分子を含む発現カセットを組換えコロナウイルスが含むことを特徴とする組換えコロナウイルスであって、該二重特異性アダプターが、コロナウイルススパイク−タンパク質受容体部分とラクダＶＨＨ抗体部分とを含むタンパク質であり、二重特異性アダプターをコードするヌクレオチド配列が転写調節配列（ＴＲＳ）の制御下にある、組換えコロナウイルス。
【請求項２】
該コロナウイルススパイク−タンパク質受容体のみが該コロナウイルススパイク−タンパク質受容体の可溶性部分を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組換えコロナウイルス。
【請求項３】
該コロナウイルススパイク−タンパク質受容体が、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）スパイク−タンパク質受容体、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）スパイク−タンパク質受容体および伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）スパイク−タンパク質受容体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の組換えコロナウイルス。
【請求項４】
該ラクダＶＨＨ抗体部分が腫瘍特異的抗原に対するものであることを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項に記載の組換えコロナウイルス。
【請求項５】
医薬としての使用のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えコロナウイルス。
【請求項６】
腫瘍の治療における使用のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えコロナウイルス。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えコロナウイルスを含む医薬組成物。
【国際調査報告】
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