(57)【要約】  本発明は、一般的に、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩、もしくは溶媒和物、あるいは、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を含む、Ｘ連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）、常染色体劣性低リン血症性くる病（ＡＲＨＲ）、腫瘍随伴性骨軟化症、腎移植後の低リン血症、表皮母斑症候群、骨空洞性骨異形成症またはＭｃＣｕｎｅ−Ａｌｂｒｉｇｈｔ症候群の処置に使用する医薬組成物に関する。
2015511621.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）、常染色体劣性低リン血症性くる病（ＡＲＨＲ）、腫瘍随伴性骨軟化症、腎移植後の低リン血症、表皮母斑症候群、骨空洞性骨異形成症またはＭｃＣｕｎｅ−Ａｌｂｒｉｇｈｔ症候群の処置に使用するための、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩、Ｎ−酸化物もしくは溶媒和物。
【請求項２】
Ｘ連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）または常染色体劣性低リン血症性くる病（ＡＲＨＲ）の処置に使用するための、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩、Ｎ−酸化物もしくは溶媒和物。
【請求項３】
対照または処置を始める前の皮質骨の体積もしくは厚さと比較して、皮質骨の体積または厚さを増加させるために使用するための、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物。
【請求項４】
骨におけるＦＧＦ２３の発現阻害、または骨におけるＦＧＦ２３の活性阻害に使用するための、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩、Ｎ−酸化物もしくは溶媒和物。
【請求項５】
一リン酸塩の形態の、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素。
【請求項６】
遊離塩基の形態の、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素。
【請求項７】
投与量が１〜５０ｍｇである、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のための３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素。
【請求項８】
処置される疾患が、Ｘ連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）または常染色体劣性低リン血症性くる病（ＡＲＨＲ）である、請求項７に記載の使用のための３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素。
【請求項９】
別のＦＧＦＲ阻害剤、リン酸塩、カルシウム、オステオポンチン（ＯＰＮ）、副甲状腺ホルモンもしくはその類似体（ＰＴＨ）、および／またはビタミンＤもしくはビタミンＤ類似体と組み合わせて、好ましくはリン酸塩、カルシウムおよび／またはビタミンＤもしくはビタミンＤ類似体と組み合わせた、特にビタミンＤまたはビタミンＤ類似体と組み合わせた、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用のための３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩、Ｎ−酸化物もしくは溶媒和物。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか一項に記載の使用のための３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩、Ｎ−酸化物もしくは溶媒和物を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物、あるいは３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を含む、線維芽細胞増殖因子受容体が介在する障害の処置に使用するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーおよびそのシグナル伝達受容体は、虫からヒトまでの生命体の成長および維持に関する重要なプロセス（発育、血管形成および代謝）を司る複数の生物学的活性（増殖、生存、アポトーシス、分化、運動性）に関連する。２２種の別個のＦＧＦが同定されており、そのすべてが、共通した１２０アミノ酸の保存コアドメインを有し、配列同一性は１５〜６５％である。ＦＧＦ２３は、重要であり、骨に由来するリン酸ホメオスタシスの伝達物質であり、腎臓において、ビタミンＤの生合成およびリン酸塩の腎吸収を調節する機能を果たす。腎臓の近位尿細管の上皮細胞において、ＦＧＦ２３のシグナル伝達は、ビタミンＤ代謝酵素であるＣＹＰ２７Ｂ１およびＣＹＰ２４Ａ１の発現を制御し、生合成を低下させ、活性型ビタミンＤ代謝産物である１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５［ＯＨ］２Ｄ３）の代謝回転を上昇させる。さらに、ＦＧＦ２３は、近位尿細管細胞の刷子縁膜におけるナトリウム−リン酸塩共輸送体であり、泌尿器のリン酸塩再吸収を介在するＮＰＴ２ＡおよびＮＰＴ２Ｃの発現を損なう。
【０００３】
ＦＧＦ２３の過剰値、または働きの増進は、低リン血症を生じると共に、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（ビタミンＤ）の生合成を損ない、骨石灰化が損なわれる結果として骨格異常を伴う、Ｘ連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）、および常染色体劣性低リン血症性くる病（ＡＲＨＲ）を含めた、いくつかの遺伝性低リン血症性障害に関連する。さらに、稀な例では、腫瘍細胞によるＦＧＦ２３の分泌は、低リン血症を引き起こすことが確認されており、腫瘍随伴性骨軟化症（ＴＩＯ）を生じる。ＦＧＦ２３値の上昇は、腎移植後の患者においても一般的に観察され、重度の低リン血症を引き起こす。ＦＧＦ２３は、ＦＧＦ２３値の上昇に関連している他の低リン血症性症候群数種、例えば、表皮母斑症候群、骨空洞性骨異形成症およびＭｃＣｕｎｅ−Ａｌｂｒｉｇｈｔ症候群の一因となる。ＸＬＨおよびＦＧＦ２３が介在する他の低リン血症性疾患、例えばＡＤＨＲおよびＡＲＨＲは、一般的に、幼児期早期に臨床的に認められ、身長が低くなり、脚が弓状変形する。
【０００４】
これらの疾患に対する現在の治療手段は、主に、食物中のビタミンＤおよびリン酸塩の添加に限定される。治療により、患者の成長およびくる病は改善されるが、矯正は限定されることが多く、思春期後の背丈に悪影響を及ぼす。疾患の重症度によるが、ＦＧＦ２３シグナル伝達を持続させ、継続して中和する力を構成すること、高用量のリン酸塩およびビタミンＤを投与することが、ＸＬＨおよびＦＧＦ２３に関連する他の低リン血症疾患の薬物治療に必要とされることが多いため、綿密なモニタリングと、毒性リスク、例えば腹痛および下痢または二次性副甲状腺機能亢進症、高カルシウム血症ならびに異所性石灰化を避けるための用量の調整を必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、前述の外観を損なう病気を処置するための、信頼性が高く効果的な薬物が必要であり、ＦＧＦＲ情報伝達を遮ることで病的なＦＧＦ２３シグナル伝達を直接標的とすることにより、現在の処置の標準を上回る有益な治療手段が提供され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
高度に選択的であり、ＢＧＪ３８９としても周知であるＦＧＦＲ阻害剤である、式Ｉに描かれている化合物３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素（ＷＯ２００６／０００４２０の実施例１４５に記載されている）は、驚くべきことに、臨床的に特に活性であり、線維芽細胞増殖因子受容体が介在する他の障害の処置に使用できることが今や見出された。
【０００７】
【化１】
2015511621.tif 000003
【０００８】
したがって、第一の態様において、本発明は、Ｘ連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）、常染色体劣性低リン血症性くる病（ＡＲＨＲ）、腫瘍随伴性骨軟化症、腎移植後の低リン血症、表皮母斑症候群、骨空洞性骨異形成症またはＭｃＣｕｎｅ−Ａｌｂｒｉｇｈｔ症候群の処置に使用するための、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩、Ｎ−酸化物もしくは溶媒和物を提供する。特に、化合物、薬学的に許容されるその塩または溶媒和物は、Ｘ連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）、常染色体劣性低リン血症性くる病（ＡＲＨＲ）または腫瘍随伴性骨軟化症、腎移植後の低リン血症の処置に使用できる。
【０００９】
好ましくは、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、一回用量超で患者に投与される。
【００１０】
化合物３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩、Ｎ−酸化物もしくは溶媒和物を、上で定義したように使用する場合、処置は、好ましくは、場合により中断させながら、少なくとも８週間続けるべきである。２回にわたる化合物の連続投与の時間間隔は、２４時間超、場合により４８時間超であり得る。
【００１１】
式Ｉの化合物は、さらに、別のＦＧＦＲ阻害剤、リン酸塩、カルシウム、オステオポンチン（ＯＰＮ）、副甲状腺ホルモンもしくはその類似体（ＰＴＨ）、および／またはビタミンＤもしくはビタミンＤ類似体と組み合わせて、好ましくはリン酸塩、カルシウムおよび／またはビタミンＤもしくはビタミンＤ類似体と組み合わせて、特にビタミンＤまたはビタミンＤ類似体と組み合わせて処置に使用できる。
【００１２】
第二の態様において、本発明は、上で定義したように使用するための、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩、Ｎ−酸化物もしくは溶媒和物を含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明の別の態様は、対照または処置を始める前の皮質骨の体積もしくは厚さと比較して、皮質骨の体積または厚さを増加させるために使用するための、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩、Ｎ−酸化物または溶媒和物である。
【００１４】
本発明のさらに別の態様は、対照と比較してＦＧＦ２３活性の上昇を示す患者の体重増量に使用するための、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩、Ｎ−酸化物もしくは溶媒和物である。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、骨におけるＦＧＦ２３の発現阻害、または骨におけるＦＧＦ２３の活性阻害に使用するための、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩、Ｎ−酸化物もしくは溶媒和物である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＦＧＦＲ阻害剤の処置により、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の生合成が誘導され、Ｈｙｐマウスにおける低カルシウム血症および低リン血症が緩和されることを示す図である。ＦＧＦＲ阻害における、ｉｎ  ｖｉｖｏでの７時間にわたる、腎臓のＦＧＦ２３標的遺伝子Ｃｙｐ２７ｂ１（Ａ）およびＣｙｐ２４ａ１（Ｂ）の調節を示す。データを、野生型ビヒクル対照群（相対発現量１００）に対する相対的な値として示す。ＡおよびＢに記載されているように処置した野生型およびＨｙｐマウスの（Ｃ）血清１，２５（ＯＨ）２Ｄ３値を、ラジオレセプターアッセイにより測定した。ＢＧＪ３９８（５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルの単回経口投与で処置した野生型およびＨｙｐマウスにおける、投与から２４時間後のカルシウム（Ｅ）およびリン酸塩（Ｆ）の値。リン酸塩およびカルシウム値を血清から測定した。データを、ＳＥＭ（ｎ≧６）付きの平均として得る。データを、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した；＊ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１；ｎ．ｓ．：有意差なし。
【図２】ＦＧＦＲ阻害剤の処置により、腎臓のＦＧＦ２３標的遺伝子の発現が調節され、Ｄｍｐ１−ヌルマウスにおける低カルシウム血症および低リン血症が緩和されることを示す図である。ＦＧＦＲ阻害における、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腎臓のＦＧＦ２３標的遺伝子Ｃｙｐ２７ｂ１（Ａ）およびＣｙｐ２４ａ１（Ｂ）の調節。データを、野生型ビヒクル対照群（相対発現量１００）に対する相対的な値として示し、標準誤差（ＳＥＭ）（ｎ≧６）付きの平均として得る。野生型およびＤｍｐ１−ヌルマウスにおける、血清カルシウム（Ｃ）およびリン酸塩（Ｄ）値に対する薬理学的なＦＧＦＲ阻害効果。データを、ＳＥＭ（ｎ≧６）付きの平均として示す。データを、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した；＊ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１；ｎ．ｓ．：有意差なし。
【図３】ＦＧＦＲ依存性シグナル伝達が、骨におけるＦＧＦ２３の発現を調節することを示す図である。７時間にわたりＢＧＪ３９８を用いて処置した野生型およびＨｙｐマウスにおける、骨ｍＲＮＡ（Ａ）および血清（Ｂ）のＦＧＦ２３値。
【図４】ＦＧＦＲ阻害剤の処置により、カルシウムおよびリン酸塩の血清値が持続的に上昇することを示す図である。式Ｉの化合物の投与から４８時間後における、野生型またはＨｙｐマウスにおける血清からの、カルシウム（Ａ）およびリン酸塩（Ｂ）値の測定。（Ｃ）処置から７時間後および２４時間後における、腎臓中の化合物の濃度（concetration）。
【図５】長期間のＦＧＦＲ阻害により体重および尾長の発育が向上し、Ｈｙｐマウスにおけるミネラルイオンホメオスタシスが回復することを示す図である。野生型またはＨｙｐマウスを、ＦＧＦＲ阻害剤であるＢＧＪ３９８（５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル３ｑｗを用いて、５６日間にわたり処置し、体重（Ａ）および尾長（Ｃ）の発育をモニターした。処置の間における、全体重（Ｂ）および尾長の増加（Ｄ）。カルシウム（Ｅ）およびリン酸塩（Ｆ）ならびに８週間にわたる処置の最後における値を、最終投与から２４時間後の血清から測定した。データを、ＳＥＭ（ｎ≧６）付きの平均として示す。データを、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した；＊ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１；ｎ．ｓ．：有意差なし。
【図６】ＢＧＪ３９８を用いた長期間にわたるＦＧＦＲ阻害後の、ＦＧＦ２３、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の血清値を示す図である。野生型またはＨｙｐマウスを、ＦＧＦＲ阻害剤であるＢＧＪ３９８（５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル３ｑｗを用いて、５６日間にわたり処置し、ＦＧＦ２３（Ａ）、ＰＴＨ（Ｂ）および１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（Ｃ）の値を、最終投与から２４時間後における血清から測定した。データを、ＳＥＭ（ｎ≧４）付きの平均として示す。データを、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した；＊ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１；ｎ．ｓ．：有意差なし。
【図７】長期間にわたるＦＧＦＲ阻害により、Ｈｙｐマウスにおける長骨の成長が向上することを示す図である。ＦＧＦＲ阻害剤であるＢＧＪ３９８（５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル３ｑｗを用いて、５６日間にわたり処置した野生型またはＨｙｐマウスからの大腿骨（Ａ）および脛骨（Ｂ）のＸ線写真。大腿骨（Ｃ）および脛骨（Ｄ）の長さの定量化。データを、ＳＥＭ（ｎ≧６）付きの平均として示す。データを、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した；＊ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１；ｎ．ｓ．：有意差なし。
【図８】長期間にわたるＦＧＦＲ阻害により、Ｈｙｐマウスの大腿骨における皮質の一体性が改善することを示す図である。（Ａ）ＦＧＦＲ阻害剤であるＢＧＪ３９８（５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル３ｑｗを用いて、５６日間にわたり処置した野生型またはＨｙｐマウスからの大腿骨の皮質（成長板領域下）のマイクロＣＴスキャン。相対的な皮質骨の体積（Ｂ）および皮質の平均厚（Ｃ）の定量化。データを、ＳＥＭ（ｎ≧６）付きの平均として示す。データを、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した；＊ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１；ｎ．ｓ．：有意差なし。
【図９】ＦＧＦＲ阻害剤であるＢＧＪ３９８（５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル３ｑｗを用いて、５６日間にわたり処置した野生型またはＨｙｐマウスからの脛骨部位のＧｏｌｄｎｅｒ染色を示す図である（Ａ）。石灰化した組織は白い矢印で指し示され、石灰化していない類骨は黒い矢印で指し示されており、ＢＧＪ３９８（５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル３ｑｗを用いて、５６日間にわたり処置した野生型またはＨｙｐマウスの脛骨の骨端において、（Ｂ）類骨の表面／骨の表面および類骨の幅（Ｃ）を組織形態計測によって測定した。データを、ＳＥＭ（ｎ≧６）付きの平均として示す。データを、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した；＊ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）は、周知である。これは、広範な生物学的活性を有する、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーと考えられている。このタンパク質の配列および／またはタンパク質のコード配列は、当業界で周知の公的に利用できるデータベースから回収される。ヒトのＦＧＦ２３も、ＡＤＨＲ；ＨＹＰＦ；ＨＰＤＲ２；ＰＨＰＴＣとして当業界で周知である。ＦＧＦ２３は、いくつかの低リン血症の症状で、疾患を引き起こす因子である。ＦＧＦＲ阻害剤である３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素（ＢＧＪ３９８）を使用した、ＦＧＦＲの薬理学的阻害により、病的なＦＧＦ２３のシグナル伝達が中和されることが思いがけず観察され、それにより、ＦＧＦ２３に関連した低リン血症性障害を処置するための、有望であり新規な治療手段を描写する。本出願人らは、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩、Ｎ−酸化物もしくは溶媒和物を、Ｘ連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）、常染色体劣性低リン血症性くる病（ＡＲＨＲ）、腫瘍随伴性骨軟化症、腎移植後の低リン血症、表皮母斑症候群、骨空洞性骨異形成症またはＭｃＣｕｎｅ−Ａｌｂｒｉｇｈｔ症候群の処置に使用する場合に、きわめて効果的であり得ることを見出した。この化合物は、Ｘ連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）または常染色体劣性低リン血症性くる病（ＡＲＨＲ）、腎移植後の低リン血症の処置に、とりわけ、Ｘ連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）および常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）、または常染色体劣性低リン血症性くる病（ＡＲＨＲ）の処置に特に有用であり得る。
【００１８】
一実施形態において、本明細書で使用されている、あらゆる疾患または障害を「処置する（treat）」、「処置すること（treating）」または「処置（treatment）」という用語は、疾患または障害を寛解すること（すなわち、疾患または少なくとも１つのその臨床的症候の発症を遅らせる、または停止させる、または低下させる）を指す。別の実施形態において「処置する」、「処置すること」または「処置」は、少なくとも１つの物理的パラメータを、患者によって識別可能にならない恐れがあるパラメータを含めて、軽減する、または寛解することを指す。さらに別の実施形態において、「処置する」、「処置すること」または「処置」は、疾患または障害を、物理的に（例えば、識別可能な症候の安定化）、生理学的に（例えば、物理的パラメータの安定化）、または両方で調節することを指す。さらに別の実施形態において、「処置する」、「処置すること」または「処置」は、疾患または障害の発病または発症または進行を予防する、または遅延させることを指す。
【００１９】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明に従って使用する場合、化合物の生物学的有効性および性質を保持する塩を指し、典型的には、生物学的であってもそうでなくても望ましくないということはない。薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸および有機酸を用いて形成でき、例えば、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、臭化物／臭化水素酸塩、炭酸水素塩／炭酸塩、硫酸水素塩／硫酸塩、カンファースルホン酸塩、塩素／塩酸塩、クロルテオフィロネート（chlortheophyllonate）、クエン酸塩、エタンジスルホン酸塩、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グロクロン酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモエート、リン酸塩／リン酸水素／リン酸二水素、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、スルホサリチル酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリフルオロ酢酸塩またはそのようなものであってよい。このような塩が由来し得る無機酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などを含む。一実施形態において、薬学的に許容される塩は、化合物３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素の一リン酸塩（またはリン酸塩）であり、場合により無水結晶形態であり得る。特定の実施形態において、化合物の塩は、ＷＯ２０１１／０７１８２１に開示されているあらゆる塩または形態である。一実施形態において、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素は、その遊離塩基形態である。
【００２０】
「溶媒和物」という用語は、１つまたは複数の溶媒分子を有する化合物の分子複合体を指す。そのような溶媒分子は、医薬品業界において一般的に使用される分子であり、化合物、例えば、水、エタノールなどに影響を及ぼさないことが周知である。
【００２１】
化合物３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素のＮ−酸化物の１種は、以下の式ＩＩ
【００２２】
【化２】
2015511621.tif 000004
を有する。
【００２３】
ＢＧＪ３９８の単回有効量により、ＢＧＪ３９８の投与から７時間後に、野生型およびＨｙｐマウスの両方で、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の血清値が早くも大幅に上昇した。さらに、カルシウムおよびリン酸塩の値も同様に上昇した。これらの結果は、哺乳類におけるＦＧＦＲの薬理学的阻害は、異常なＦＧＦ２３のシグナル伝達を中和する上で十分であることを示す。本出願人らは、ＦＧＦ２３活性が中和され、体内のカルシウムおよびリン酸塩の値が釣り合うことから、ＦＧＦＲ阻害剤の単回投与により、その効果が早くも引き出されることを見出した。さらに、ＢＧＪ３９８を用いた長期間にわたる処置により、Ｈｙｐマウスにおいて、カルシウムおよびリン酸塩の値の両方が完全に正常化した。したがって、好ましい実施形態において、ＢＧＪ３９８または薬学的に許容される塩、Ｎ−酸化物もしくは溶媒和物が、治療有効一回用量超で必要とする患者に投与される。化合物の「治療有効量」という用語は、対象の生物学的または医学的反応、例えば、キナーゼ活性の低下または阻害、あるいは症候の寛解、症状の緩和、疾患の進行の遅れまたは遅延、あるいは疾患の予防等を引き出すであろうＢＧＪ３９８の量を指す。対象は、ヒトを含めたあらゆる哺乳類であってよい。治療有効量は、約５０〜７０ｋｇの対象に対して約１〜２５０ｍｇのＢＧＪ３９８、または約１〜１５０ｍｇ、例えば１２５ｍｇ、または約０.５〜１００ｍｇ、または約１〜５０ｍｇ、または約１〜２５ｍｇ、または約１〜１０ｍｇの用量でのＢＧＪ３９８であってよい。化合物の治療有効投与量は、単体で、もしくは医薬組成物中において、または以下で説明されるように、他の活性成分との組み合わせにおいて、対象の化学種、体重、年齢および患者の症状、処置される障害もしくは疾患またはその重症度に左右される。
【００２４】
別の態様において、本発明は、対照または処置を始める前の皮質骨の体積もしくは厚さと比較して、皮質骨の体積または厚さを増加させるために使用するための、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩、Ｎ−酸化物もしくは溶媒和物である。実施した実験により、対象がＢＧＪ３９８で処置される場合、皮質骨の体積が、病的な値から、通常の値と区別ができない値まで増加することが明らかに示されている。さらに、皮質の厚さが著しく増加した。
【００２５】
３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素の投与により、対照と比較してＦＧＦ２３活性が上昇したことを示す患者の体重増量に拍車がかかることが観察されている。「対照」は、ＦＧＦ２３活性の値、または各疾患を伴わない個人、数名の対象または母集団の表現を指す。
【００２６】
広範な意味で、本発明の一実施形態は、骨におけるＦＧＦ２３の発現阻害、または骨におけるＦＧＦ２３の活性阻害に使用するための、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩、Ｎ−酸化物もしくは溶媒和物である。「発現」は、遺伝子が転写され、翻訳される場合に産生される核酸またはアミノ酸を指す。例として、転写の活性は、あらゆる適切な方法により評価できる、例えば、ＦＧＦ２３遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量、または遺伝子から転写されるｍＲＮＡの逆転写から産生されるｃＤＮＡの量、または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質の量を検出することを含む。あるいは、遺伝子のコピー数、転写、または翻訳のいずれか１つを、周知の技術を使用して測定できる。例えば、増幅方法、例えばＰＣＲは有用であり得る。骨におけるＦＧＦ２３の発現または活性に影響を与えることにより、骨の構造および成長を調節でき、不正な、または非効率的な（unefficient）成長として認められ、異常、例えば、それに限定されないが、くる病を生じる疾患に特に有用である。
【００２７】
全身のＦＧＦＲを阻害することで起こり得る副作用の発生率を低下させることを目的に、投与が間欠的に行われ得るが、これは対象に対して有害であり得る望ましくない二次的影響を最小限にするためである。投与は、中断なしで連続的に行われ得る、または、まず数回の投与から始めて、必要とする患者において定常状態の濃度を達成し、次いで、投与の時間間隔を変更する。あるいは、初回投与後直ちに、投与を適合させてもよい。２回にわたる化合物の連続投与の時間間隔は、２４時間超、場合により４８時間超または１週間超でもあり得る。特定の実施形態において、投与は、場合により、１日間、２日間、もしくは、３日間の２回にわたる連続投与の間、または再発後のみ、繰り返し行われる。
【００２８】
好ましい実施形態において、化合物３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素は、別のＦＧＦＲ阻害剤、リン酸塩、カルシウム、オステオポンチン（ＯＰＮ）、副甲状腺ホルモンもしくはその類似体（ＰＴＨ）、および／またはビタミンＤもしくはビタミンＤ類似体と組み合わせて、好ましくはリン酸塩、カルシウムおよび／またはビタミンＤもしくはビタミンＤ類似体と組み合わせて、特にビタミンＤまたはビタミンＤ類似体と組み合わせて処置に使用できる。ＢＧＪ３８９は、相加効果または相乗効果さえも引き起こすだけでなく、高用量のＢＧＪ３８９を使用する必要性も低下させ、有害作用のリスクを継続的に限定する利点と組み合わせて使用できる。リン酸塩は、経口的にまたは非経口的に摂取した場合に、血液の無機リン（Ｐ）値を上昇させるあらゆる形態で使用でき、例えばＲＡＮＤＯＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＬＴＤ、ＵＫのキット、および臨床化学分析器、例えば、ＨＩＴＡＣＨＩ  ７１７  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、紫外部測定法により、例えば血清中で測定され得る。摂取した場合に最終的に血液の総カルシウム値を上昇させるカルシウムも、あらゆる形態であってよく、例えば、ＲＡＮＤＯＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＬＴＤのキット、および臨床化学分析器、例えばＨＩＴＡＣＨＩ  ７１７  ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、紫外部測定法により、例えば血清中で測定され得る。分泌リンタンパク質１（secreted phosphoprotein 1）、骨シアロタンパク質Ｉまたは早期Ｔリンパ球活性化１と呼ばれるオステオポンチン（ＯＰＮ）は周知である。これは、骨の再形成に関与する細胞外の構造タンパク質と考えられる。ヒトのオステオポンチンは、当業界でＳＰＰ１として周知である。副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはパラトルモンは、周知である。これは血液中のカルシウム値の調節に関与するホルモンと考えられている。ＰＴＨ類似体は、少なくとも部分的にＰＴＨの活性を保持し、構造的には短いという点のみ完全なＰＴＨと類似し、ＰＴＨ骨格構造に結び付く修飾または追加の置換基を有する分子である。ビタミンＤは、カルシウムホメオスタシスの原因となり、健常な骨の表現型に重要な周知のホルモンである。その類似体は、ビタミンＤの化学構造を模倣し、類似した薬理学的効果を導くという点で構造的に類似した化合物である。ビタミンＤ類似体の例は、カルシポトリオールである。
【００２９】
３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩、Ｎ−酸化物もしくは溶媒和物は、医薬組成物に製剤され、上で説明されているあらゆる処置に同様に使用できる。医薬組成物は、通常、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミド−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩、Ｎ−酸化物もしくは溶媒和物および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む。医薬組成物における化合物の量は、好ましくは、治療有効量である。場合により、別のＦＧＦＲ阻害剤、リン酸塩、カルシウム、オステオポンチン（ＯＰＮ）、副甲状腺ホルモンもしくはその類似体（ＰＴＨ）、および／またはビタミンＤもしくはビタミンＤ類似体、好ましくはリン酸塩、カルシウムおよび／またはビタミンＤもしくはビタミンＤ類似体を組み合わせて、特にビタミンＤもしくはビタミンＤ類似体を組み合わせて、本発明による医薬組成物に加える。医薬組成物は、特定の投与経路、例えば、経口投与、非経口投与および局所投与用等に製剤することができる。さらに、本発明の医薬組成物は、固体形態（カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤または坐剤を含むが限定されない）、または液体形態（液剤、懸濁剤または乳剤を含むが限定されない）に調合することができる。医薬組成物に、従来の製薬工程、例えば圧縮、打錠、濾過、凍結乾燥、滅菌またはそのようなものを施すことができる。賦形剤は、従来のあらゆる不活性希釈剤、潤滑剤、緩衝剤、結合剤、崩壊剤、甘味剤、香味剤、ならびに補助剤、例えば防腐剤、安定剤、湿潤剤、エマルシファー（emulsifer）、溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬剤安定剤、色素などおよびそれらの組み合わせであってよい。
【実施例１】
【００３０】
ＦＧＦＲ阻害剤の処置により、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の生合成が誘導され、Ｈｙｐマウスにおける低カルシウム血症および低リン血症が緩和される。野生型Ｃ５７ＢＬ／６およびＨｙｐ（Ｂ６.Ｃｇ−ＰｈｅｘＨｙｐ／Ｊ）マウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。Ｆｅｎｇら（J.Dent.Res.2003年；82:776〜780頁）により、Ｄｍｐ１−ヌルマウスを作製した。すべてのマウスを、ケージにて標準的な実験室条件下で飼育した。マウスに、標準的なげっ歯類用飼料と合わせて水を不断で供給した。
【００３１】
野生型またはＨｙｐマウスに、ＦＧＦＲ阻害剤であるＢＧＪ３９８の単回経口投与を遊離塩基形態（５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルで行い、化合物の投与から７時間後に試験した。ＢＧＪ３９８またはビヒクルのみ（ＰＥＧ−３００／グルコース５％、２：１で混合）を強制経口投与した。単回投与の場合、５〜７週齢のマウスを使用した。イソフルラン吸入によりマウスに麻酔をかけ、大静脈から血液を収集した。マウスを瀉血により屠殺し、腎臓ならびに脛骨および大腿骨を得た。７時間時点の腎臓におけるＢＧＪ３９８の濃度も測定した。
【００３２】
腎臓を採取し、全ＲＮＡを単離した。マウスの脛骨および大腿骨からのＲＮＡを単離するために、骨端を切断し、骨髄を４℃で遠心分離することにより除去した。Ｐｒｅｃｅｌｌｙｉｓ  ２４というビーズホモジナイザーを使用して、組織を均質化し、ＴＲＩｚｏｌという試薬を用いてＲＮＡを抽出した。続いて、クロロホルム抽出、２−プロパノール沈殿およびＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔによりＲＮＡを精製した。腎臓のＲＮＡに関しては、約６０ｍｇの組織を、ローターステーターホモジナイザーを用いて、１.５ｍｌのＲＴＬ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中で均質化し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔを用いてＲＮＡを精製した。ランダムヘキサマーでプライムしたｃＤＮＡを、０.５〜２μｇのＲＮＡおよびＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ  ＭｕＬＶの逆転写酵素を用いて合成した。
【００３３】
遺伝子発現を定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により分析した。ＴａｑＭａｎのプローブを利用した遺伝子発現アッセイを、マウスＣｙｐ２７ｂ１（Ｍｍ０１１６５９１９）、Ｃｙｐ２４ａ１（Ｍｍ００４８７２４４）およびＧａｐｄｈ（４３５２３３９Ｅ）の発現分析に使用した。マウスのＦｇｆ２３を検出するプライマーの配列およびＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ−標識プローブ（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ）は、５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＴＴＣＡＧ（正）、５’−ＧＴＧＡＴＧＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＴ（逆）および５’−ＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡＣＧＣＴＧＧＡＧＡＡ（プローブ）であった。ｉＱ５リアルタイムＰＣＲ検出系で、プローブアッセイのためのｑＰＣＲ核キットおよび各試料の４０または８０ｎｇ当量のＲＮＡを使用して、定量リアルタイムＰＣＲを行った。データをＧａｐｄｈ発現に正規化した。
【００３４】
高解像度のＸ線撮影系（Ｆａｘｉｔｒｏｎ  ＭＸ−２０）を使用して、ｅｘ  ｖｉｖｏで、大腿骨および脛骨のＸ線写真を撮影した。Ｓｃａｎｃｏ  ｖｉｖａＣＴ  ４０  ｓｙｓｔｅｍ（ボクセルサイズ６μｍ；高解像）を使用して、ｅｘ  ｖｉｖｏでμＣＴ測定を行った。海綿骨および皮質骨を分析するために、固定閾値２００を使用して、スライス５０枚からの石灰化した骨の分画を測定する。ガウスフィルタを利用して、ノイズを除去した（σ＝０.７；支持度＝１）。
【００３５】
血栓アクチベーター遠心分離チューブを使用して、全血から血清を分離した。ＶｅｔＳｃａｎという診断プロファイルシステム（diagnostic profiling system）を使用して、１００μｌの血清をリン酸塩およびカルシウム値の測定に使用した。ラジオレセプターアッセイキットを使用して、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の血清濃度を測定した。無傷のＦＧＦ２３をＥＬＩＳＡ検出することにより、ＦＧＦ２３の血清値を分析した（Ｋａｉｎｏｓ）。
【００３６】
ＦＧＦ２３は、腎臓における１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の代謝酵素である、ＣＹＰ２７Ｂ１およびＣＹＰ２４Ａ１の転写を調節することにより、低リン血症性機能を部分的に発揮する。したがって、本出願人らは、Ｈｙｐマウスおよび野生型の同腹子において、ＢＧＪ３９８を用いた単回投与処置における腎臓のＣｙｐ２７ｂ１およびＣｙｐ２４ａ１の発現をモニターした。ＨｙｐマウスにおいてＦＧＦ２３値の上昇がみられるにもかかわらず、ＨｙｐマウスにおけるＣｙｐ２７ｂ１およびＣｙｐ２４ａ１の発現および１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の血清値は、野生型のマウスと比較して著しく異なる（図１Ａ、ＢおよびＣ）が、これは適合プロセスのためであると考えられ、以前の報告に一致する。野生型およびＨｙｐマウスの両方で、ＢＧＪ３９８を用いた７時間にわたる処置により、Ｃｙｐ２７ｂ１の値が上昇し、Ｃｙｐ２４ａ１の発現は、ほぼ完全にみられなかった（図１ＡおよびＢ）。したがって、ＦＧＦ２３標的遺伝子のこの調節解除により、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の血清値が、ＢＧＪ３９８の投与から７時間後に、野生型およびＨｙｐマウスの両方で大幅に上昇する（図１Ｃ）。
【００３７】
ＢＧＪ３９８を用いた単回投与処置から２４時間後に、野生型およびＨｙｐマウスの両方において、血清カルシウムおよびリン酸塩値の上昇が誘導され、ひいては、対照Ｈｙｐマウスで観察される低カルシウム血症および低リン血症の重症度は軽減する。カルシウムに関して、ＢＧＪ３９８を用いて処置したＨｙｐマウスの血清値は、ビヒクルを用いて処置した野生型マウスと区別ができなかった（図１Ｄ）が、ＦＧＦＲ阻害剤で処置したＨｙｐマウスの血清リン酸塩濃度は、野生型マウスの血清値と比較して、さらに著しく低くなった（図１Ｅ）。図１ＡおよびＢのデータを、野生型対照群に対する相対的な値として示し（相対発現量１００）、標準誤差（ＳＥＭ）（ｎ≧６）付きの平均として得る。
【００３８】
図１で説明されているように、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＧＦＲ阻害における、腎臓のＦＧＦ２３標的遺伝子であるＣｙｐ２７ｂ１（Ａ）およびＣｙｐ２４ａ１（図１Ｂ）の調節が描写されている。また、ＡおよびＢに記載されている処置した野生型およびＨｙｐマウスの（Ｃ）血清１，２５（ＯＨ）２Ｄ３値をラジオレセプターアッセイにより測定した。さらに、ＢＧＪ３９８（５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルの単回経口投与で処置した野生型およびＨｙｐマウスにおける、投与後２４時間でのカルシウム（図１Ｅ）および（図１Ｆ）リン酸塩値を示す。これと同時に、ＦＧＦＲ阻害剤の処置により、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の生合成が誘導され、Ｈｙｐマウスにおける低カルシウム血症および低リン血症が緩和されることを示す。この結果から、ＦＧＦＲの薬理学的阻害は、Ｈｙｐマウスにおいて異常なＦＧＦ２３シグナル伝達を中和する上で十分であることがさらに示される。
【実施例２】
【００３９】
ＦＧＦＲ阻害剤の処置により、腎臓のＦＧＦ２３標的遺伝子の発現が調節され、Ｄｍｐ１−ヌルマウスにおける低カルシウム血症および低リン血症が緩和される。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＧＦＲ阻害における、腎臓のＦＧＦ２３標的遺伝子であるＣｙｐ２７ｂ１（図２Ａ）およびＣｙｐ２４ａ１（図２Ｂ）の調節が図２で示されている。Ｐｈｅｘ欠乏Ｈｙｐモデルにおける本出願人らの調査結果に加えて、本出願人らは、Ｄｍｐ１−ヌルマウスであるＦＧＦ２３に関連した別の低リン血症モデルにおいて、腎臓のＣｙｐ２７ｂ１およびＣｙｐ２４ａ１発現に類似した調節を観察した（図２ＡおよびＢ）。野生型またはＤｍｐ１−ヌルマウスに、ＦＧＦＲ阻害剤であるＢＧＪ３９８（５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルの単回経口投与を行い、化合物を投与してから７時間後に再度試験した。既に述べたように、腎臓を採取し、全ＲＮＡを単離し、ｑＰＣＲにより遺伝子発現を分析した。発現の値を、ＧａｐｄｈのｍＲＮＡコピーに正規化した。ＡおよびＢにおけるデータを、野生型ビヒクル対照群に対する相対的な値として示し、標準誤差（ＳＥＭ）（ｎ≧６）付きの平均として得る。
【００４０】
カルシウムおよびリン酸塩値を分析するために、ＦＧＦＲ阻害剤であるＢＧＪ３９８（５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル単回経口投与を行ったマウスを投与から２４時間後に試験した。リン酸塩およびカルシウム値を血清から測定した。Ｈｙｐマウスに関して、薬理学的なＦＧＦＲ阻害により、Ｄｍｐ１−ヌルマウスにおいて、血清カルシウムおよびリン酸塩値が上昇した（それぞれ図２ＣおよびＤ）。図２におけるデータを、ＳＥＭ（ｎ≧６）付きの平均として示す。データを、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した；＊ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１；ｎ．ｓ．：有意差なし。
【実施例３】
【００４１】
図３は、骨におけるＦＧＦ２３の発現を調節する、ＦＧＦＲ依存性シグナル伝達を示す。ＦＧＦ２３に関連した低リン血症性くる病に対する、２種のマウスモデルにおけるミネラルイオン欠乏が緩和されること以外に、本出願人らは、ＢＧＪ３９８を用いて処置したＨｙｐマウスおける、ＦＧＦＲ阻害剤の処置によるＦＧＦ２３値への抑制作用にも気付いた。マウスに、ＦＧＦＲ阻害剤であるＢＧＪ３９８（５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルの単回経口投与を行い、投与から７時間後に試験した。ＢＧＪ３９８を用いて処置した野生型およびＨｙｐマウスにおける、骨ｍＲＮＡ（図３Ａ）および血清（図３Ｂ）のＦＧＦ２３値を測定した。ＢＧＪ３９８の投与から７時間後に、Ｈｙｐおよび野生型マウス両方の骨におけるＦＧＦ２３の発現がほぼなくなった（図２Ａ）。ＦＧＦ２３の転写抑制により、血清ＦＧＦ２３値が野生型マウスで検出できなくなったが、Ｈｙｐマウスにおける病的な高さのＦＧＦ２３値が、約５０％低下した（図３Ｂ）。この図において、ｍＲＮＡ発現を、野生型ビヒクル対照群（相対的な値１００）に対する相対的な値として示し、ＳＥＭ（ｎ≧７）付きの平均として得る。ｍＲＮＡ発現のＦＧＦ２３値は、Ｇａｐｄｈ  ｍＲＮＡコピーに正規化する。データを、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した；＊ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１。
【実施例４】
【００４２】
図４は、ＦＧＦＲ阻害剤の処置により、カルシウムおよびリン酸塩の血清値の上昇が持続されることを明らかに示す。実施例１と同様に、野生型またはＨｙｐマウスにＦＧＦＲ阻害剤であるＢＧＪ３９８またはビヒクルの単回経口投与を行い、化合物の投与から４８時間後に試験した。カルシウム（図４Ａ）およびリン酸塩（図４Ｂ）値を血清から測定した。データを、ＳＥＭ（ｎ≧３）付きの平均として示す。データを、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した；＊ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１；ｎ．ｓ．：有意差なし。（Ｃ）投与から７時間および２４時間後の腎臓におけるＢＧＪ３９８濃度。値を、ＳＥＭ（ｎ≧５）付きの平均として得る。
【実施例５】
【００４３】
長期間にわたるＦＧＦＲ阻害により、体重および尾長の発育が増加し、Ｈｙｐマウスにおけるミネラルイオンホメオスタシスが回復する。長期間にわたる処置の試験を実施して、Ｈｙｐマウスモデルのくる病に類似した骨表現型の有望な寛解をモニターした。８週間の間、処置を実施した。腎臓のＢＧＪ３９８クリアランスを超えて伸びる（図４）カルシウムおよびリン酸塩値の上昇を持続させるために、ＢＧＪ３９８（５０ｍｇ／ｋｇ体重）またはビヒクルを用いて、１週間に３回（３ｑｗ）、５６日間にわたりマウスを処置し、上で説明したものと同様に分析した。図５は、モニターされた体重（図５Ａ）および尾長（図５Ｃ）の発育を示す。処置の間における、全体重（図５Ｂ）および尾長の増加（図５Ｄ）が、図５でも同様に描写されている。８週間にわたる処置の最後におけるカルシウム（図５Ｅ）およびリン酸塩（図５Ｆ）値を、最終投与から２４時間後の血清から測定し、図５に示す。データを、ＳＥＭ（ｎ≧６）付きの平均として示す。データを、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した；＊ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１；ｎ．ｓ．：有意差なし。
【００４４】
野生型同腹子と比較して、Ｈｙｐマウスは、処置を開始して５週齢で体重の減少を呈した。処置の過程において、Ｈｙｐマウスでは、薬理学的なＦＧＦＲ阻害により、ビヒクル対照群と比較して体重は大幅に増加する（図５Ａ）。全体として、ＢＧＪ３９８を用いて処置したＨｙｐマウスにおける全体重増量は、ビヒクルを用いて処置した野生型マウスと類似していた（図５Ｂ）。尾がより短いことは、Ｈｙｐマウスの低リン血症性くる病表現型の明白な特徴であり、骨の形成が損なわれていることを反映する。したがって、本出願人らは８週間にわたる処置の間、尾長の発育をモニターし、ＢＧＪ３９８を用いて処置したＨｙｐマウスが、対照Ｈｙｐマウスと比較していっそう大幅な尾長の増加を呈することを見出した（図５Ｃ）。さらに、ＦＧＦＲ阻害剤で処置したＨｙｐマウスにおける尾長の増加も、ビヒクルを用いて処置した野生型同腹子と比較して著しく高かった（図５Ｄ）。Ｈｙｐマウスにおけるリン酸塩およびカルシウムホメオスタシスに対する、継続したＦＧＦＲ阻害の効果を検査するために、本出願人らは、８週間にわたる試験の最後に、血清カルシウムおよびリン酸塩濃度を分析した。本出願人らは、ＦＧＦＲ阻害剤の単回投与（図１ＤおよびＥ）と対照的に、ＢＧＪ３９８を用いた長期間にわたる処置により、Ｈｙｐマウスにおけるカルシウムおよびリン酸塩値両方が完全に正常化する（図５ＥおよびＦ）ことを見出した。
【実施例６】
【００４５】
図６は、ＢＧＪ３９８を用いた長期間にわたるＦＧＦＲ阻害後の、ＦＧＦ２３、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の血清値を示す。野生型またはＨｙｐマウスを、ＦＧＦＲ阻害剤であるＢＧＪ３９８（５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル３ｑｗを用いて、５６日間にわたり再度処置し、最終投与から２４時間後に、ＦＧＦ２３（図６Ａ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）（図６Ｂ）および１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（図６Ｃ）値を血清から測定した。血栓アクチベーター遠心分離チューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を使用して、全血から血清を分離することにより、ＰＴＨ値を測定した。２０μｌの血清を、マウスＰＴＨ  ＥＬＩＳＡ（Ｉｍｍｕｔｏｐｉｃｓ）を使用したＰＴＨ値の測定に使用した。データを、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した；＊ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１；ｎ．ｓ．：有意差なし。
【００４６】
ＦＧＦ２３の発現におけるＦＧＦＲ阻害の一時的な抑制作用（図３を参照されたい）にもかかわらず、ＢＧＪ３９８を用いた長期間にわたる処置により、Ｈｙｐマウスにおいて、ＦＧＦ２３の血清濃度がさらに上昇し（図６Ａ）、ＰＴＨ値の正常化が同時に起きた（図６Ｂ）が、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、処置群の間でさほど差はなかった（図６Ｃ）。
【実施例７】
【００４７】
図７に示されているように、長期間にわたるＦＧＦＲ阻害により、Ｈｙｐマウスにおける長骨の成長が向上する。総合すると、上記のこのような結果により、異常なＦＧＦ２３シグナル伝達との関連において、薬理学的なＦＧＦＲ阻害の有益な効果が例示され、Ｈｙｐマウスの骨形成不全の有望な緩和が示される。したがって、本出願人らは、長期間（８週間）にわたるＦＧＦＲ阻害の、長手方向への大腿骨および脛骨の成長に対する効果をＸ線撮影により分析し、ＢＧＪ３９８を用いて処置したＨｙｐマウスが、ビヒクルを用いて処置した対照群と比較して、大腿骨（図７ＡおよびＣ）および脛骨（図７ＢおよびＤ）の両方で著しい伸びを発現したことを見出した。ＦＧＦＲ阻害により、典型的にはくる病で観察される、大腿骨および脛骨両方の成長板領域の拡大が、確かに部分的に緩和された（図７ＡおよびＢ）。図７：ＦＧＦＲ阻害剤であるＢＧＪ３９８（５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル３ｑｗを用いて、５６日間にわたり処置した野生型またはＨｙｐマウスの大腿骨（図７Ａ）および脛骨（図７Ｂ）のＸ線写真。大腿骨（図７Ｃ）および脛骨（図７Ｄ）の長さの定量化。データを、ＳＥＭ（ｎ≧６）付きの平均として示す。データを、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した；＊ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１；ｎ．ｓ．：有意差なし。
【実施例８】
【００４８】
長期間にわたるＦＧＦＲ阻害により、Ｈｙｐマウスの大腿骨における皮質の一体性が改善される。ＦＧＦＲ阻害剤の処置の骨構造に対する効果をより詳細に測定するために、本出願人らは、ＦＧＦＲ阻害剤であるＢＧＪ３９８（５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル３ｑｗを用いて、５６日間にわたり処置した野生型またはＨｙｐマウスから、大腿骨の皮質（成長板領域下）のマイクロコンピュータ断層撮影（microcomputed tomography）（μＣＴ）分析を行った（図８Ａ）。さらに、相対的な皮質骨の体積を定量し（図８Ｂ）、皮質の平均厚を測定した（図８Ｃ）。この分析により、Ｈｙｐマウスにおいて皮質骨領域で損なわれた石灰化が判明し、Ｈｙｐの大腿骨の皮質構造内における隙間および穴により明白になる（図８Ａ、矢印により示される）。野生型マウスと比較して、ビヒクルを用いて処置したＨｙｐマウスは、皮質骨領域（図８Ｂ）における相対的な骨体積の減少を呈し、皮質の平均厚（図８Ｃ）が減少した。対照的に、ＢＧＪ３９８を用いて処置したＨｙｐマウスの皮質は、無傷に見え（図８Ａ）、相対的な皮質骨の体積は、ビヒクルを用いて処置したＨｙｐマウスと比較して野生型マウスのものと区別ができず（図８Ｂ）、皮質の厚さは著しく増加した（図８Ｃ）。
【００４９】
したがって、分析により、Ｈｙｐマウスにおける骨の長手方向の成長および構造的な一体性に対する、ＦＧＦＲ阻害の有益な効果が判明した。
【実施例９】
【００５０】
ＢＧＪ３９８を用いた長期間にわたる処置により、成長板組織Ｈｙｐマウスが回復する。本出願人らは、Ｈｙｐマウスにおいて、脛骨の組織学的部位における成長板組織に対する、ＢＧＪ３９８を用いた処置の寛解効果も見出した（図９Ａ）。図９は、ＦＧＦＲ阻害剤であるＢＧＪ３９８（５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル３ｑｗを用いて、５６日間にわたり処置した野生型またはＨｙｐマウス（図９Ａ）からの脛骨部位のＧｏｌｄｎｅｒ染色を示す。石灰化した組織は、白い矢印により指し示され、石灰化していない類骨は暗灰色により視覚化される（黒い矢印により指し示される）。成長板の構造は、部位（図９Ｂ）の中心部分において明灰色の染色により示す。ＢＧＪ３９８（５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル３ｑｗを用いて、５６日間にわたり処置した野生型またはＨｙｐマウスの脛骨の骨端において、類骨の表面／骨の表面および類骨の幅（図９Ｃ）を、組織形態計測により測定した。データを、ＳＥＭ（ｎ≧６）付きの平均として示す。データを、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した；＊ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１。ビヒクルを用いて処置したＨｙｐマウスでは、野生型マウスにおける高度に整った構造と対照的に、軟骨細胞の円柱状組織および方向性成長が障害を受ける。さらに、石灰化していない多くの類骨によって示されているように、対照Ｈｙｐマウスにおける石灰化が損なわれる。しかし、ＢＧＪ３９８を用いて処置したＨｙｐマウスにおいて、本出願人らは、成長板領域の顕著な再組織（図９Ａ、左パネル）、および成長空間の高さの増加を伴う軟骨細胞の円柱状堆積の再形成（図９Ｂ、右パネル）を観察した。さらに、本出願人らは、成長板に隣接した骨端の骨領域ならびに骨幹端下成長板領域における一次海綿骨の形成における石灰化の向上に気付き、ビヒクルを用いて処置したＨｙｐマウスにはほとんどなかった。また、組織形態計測的な（histomorphometric）分析により、ＦＧＦＲ阻害（図９Ｂ）、および、骨端、骨幹端および皮質骨の区画内での類骨幅の大幅な縮小（図９Ｃ）で、ＨｙｐマウスにおけるＯＳ／ＢＳ比の上昇が弱まったことが判明した。
【００５１】
要約すれば、本出願人らのデータは、薬理学的なＦＧＦＲ阻害は、異常なＦＧＦ２３シグナル伝達を阻害する上で十分であり、低リン血症性くる病の発現型ＸＬＨおよび潜在的にＦＧＦ２３に関連していると考えられる他の低リン血症疾患、例えばＡＲＨＲが緩和されることを示す。特に、ＦＧＦＲ阻害剤であるＢＧＪ３９８の連続投与において、Ｈｙｐマウスにおけるリン酸塩およびカルシウム値を完全に正常化すること、およびくる病に似た骨の骨成長板領域を再組織化することが期待できるが、これは、低リン血症性くる病表現型の有望な逆転に必要な条件を構成するためである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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