(57)【要約】  本発明は、反芻動物における急性もしくは亜急性ルーメンアシドーシスまたはルーメンアシドーシスに起因する状態を治療または予防するためのオリゴマー性プロシアニジンを含有する動物飼料添加剤に関する。
2015526082.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反芻動物における急性もしくは亜急性ルーメンアシドーシスまたはルーメンアシドーシスに起因する状態を治療または予防するためのオリゴマー性プロシアニジンを含有することを特徴とする、動物飼料添加剤。
【請求項２】
オリゴマー性プロシアニジンが、鉄イオンおよび／または鉄化合物と複合体を形成して存在することを特徴とする、請求項１に記載の動物飼料添加剤。
【請求項３】
鉄イオンおよび／または鉄化合物とオリゴマー性プロシアニジンとの比が、１：１０から１：２００００の間、好ましくは１：１００から１：８０００の間であることを特徴とする、請求項２に記載の動物飼料添加剤。
【請求項４】
オリゴマー性プロシアニジンが、マツ樹皮粉砕物、ニレ樹皮粉砕物、マツ樹皮抽出物、ニレ樹皮抽出物またはその任意の混合物の形態で含有されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の動物飼料添加剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一つに記載の動物飼料添加剤を、ルーメンアシドーシスまたはルーメンアシドーシスに起因する状態の治療または予防に有効な量で、タンパク質担体、炭水化物担体、粗飼料、サイレージ、脂肪、ビタミン、無機質および微量元素から成る群から選択される１種または複数の飼料成分と一緒に含有することを特徴とする、反芻動物用動物飼料。
【請求項６】
場合により鉄含有溶液で処理されたマツ樹皮粉砕物および／またはニレ樹皮粉砕物を飼料乾物１キログラム当り０．０１ｇ〜２５０ｇ含有することを特徴とする、請求項５に記載の動物飼料。
【請求項７】
場合により鉄含有溶液で処理されたマツ樹皮抽出物および／またはニレ樹皮抽出物を飼料乾物１キログラム当り０．００２ｇ〜５０ｇ含有することを特徴とする、請求項５に記載の動物飼料。
【請求項８】
場合により鉄含有溶液で処理されたマツ樹皮粉砕物および／またはニレ樹皮粉砕物の形態の請求項１〜４のいずれか一つに記載の動物飼料添加剤が、マツ樹皮粉砕物および／またはニレ樹皮粉砕物０．１〜５００ｇ／日／頭の投与に対応する量で含有されることを特徴とする、請求項５に記載の動物飼料。
【請求項９】
場合により鉄含有溶液で処理されたマツ樹皮抽出物および／またはニレ樹皮抽出物の形態の請求項１〜４のいずれか一つに記載の動物飼料添加剤が、マツ樹皮抽出物またはニレ樹皮抽出物０．００２〜１００ｇ／日／頭の投与に対応する量で含有されることを特徴とする、請求項５に記載の動物飼料。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一つに記載の動物飼料添加剤を、タンパク質担体、炭水化物担体、粗飼料、サイレージ、脂肪、ビタミン、無機質および微量元素から成る群から選択される１種または複数の飼料成分と一緒に含有することを特徴とする、請求項５に記載の動物飼料を製造するためのプレミックス。
【請求項１１】
請求項５に記載の動物飼料を製造するための、請求項１〜４のいずれか一つに記載の動物飼料添加剤または請求項１０に記載のプレミックスの使用。
【請求項１２】
反芻動物における急性もしくは亜急性ルーメンアシドーシスまたはルーメンアシドーシスに起因する状態を治療または予防するための動物飼料または動物飼料添加剤または動物飼料プレミックスを製造するための、場合により鉄含有溶液で処理されたマツ樹皮粉砕物、ニレ樹皮粉砕物、マツ樹皮抽出物、ニレ樹皮抽出物またはその任意の混合物の使用。
【請求項１３】
反芻動物が、場合により鉄含有溶液で処理されたマツ樹皮粉砕物および／またはニレ樹皮粉砕物を０．１〜５００ｇ／日得る、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
反芻動物が、場合により鉄含有溶液で処理されたマツ樹皮抽出物および／またはニレ樹皮抽出物を０．００２〜１００ｇ／日得る、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
反芻動物における急性もしくは亜急性ルーメンアシドーシスまたはルーメンアシドーシスに起因する状態を治療または予防するための飲料水添加剤を製造するための、場合により鉄含有溶液で処理されたマツ樹皮粉砕物、ニレ樹皮粉砕物、マツ樹皮抽出物、ニレ樹皮抽出物またはその任意の混合物の使用。
【請求項１６】
飲料水添加剤が、場合により鉄含有溶液で処理されたマツ樹皮抽出物および／またはニレ樹皮抽出物を０．００００８ｇ〜１００ｇ／リットル含有する、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
反芻動物の乳汁中へのアフラトキシン排出を減少させるための動物飼料または動物飼料添加剤または動物飼料プレミックスまたは飲料水添加剤を製造するための、場合により鉄含有溶液で処理されたマツ樹皮粉砕物および／またはニレ樹皮粉砕物の使用。
【請求項１８】
反芻動物の乳汁中へのアフラトキシン排出を減少させるための動物飼料または動物飼料添加剤または動物飼料プレミックスまたは飲料水添加剤を製造するための、場合により鉄イオンおよび／または鉄化合物と複合体を形成しているオリゴマー性プロシアニジンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反芻動物用の動物飼料または飲料水の添加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日では農業動物生産は、可能な限り経済的な条件で、許容できる家畜の生産量レベルおよび高い健康状態を達成することを目指している。良好な健康状態は、後に成長、乳生産量、毛生産、生殖などに関して良好な生産量につながることも示された。以前に、いわゆる抗菌活性物質（例えば抗生物質）の栄養補給により生産量レベルを高めることが試みられた。反芻動物の領域では、長い間、例えば製品Ｆｌａｖｏｍｙｃｉｎ（登録商標）（物質名：フラボホスホリポール）が利用された［Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｒｗｅ  ＢＪら：  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｆｌａｖｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｌ  （Ｆｌａｖｏｍｙｃｉｎ（登録商標））  ｏｎ  ｍｉｌｋ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｌｋ  ｕｒｅａ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｒａｚｉｎｇ  ｄａｉｒｙ  ｃｏｗｓ、Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （ＳＡＳＡＳ）  ２００１、３１（２）：  １０１〜１０５頁（非特許文献１）］。これらの物質の群に関するさらなる例は、イオノフォア抗生物質、例えば製品Ｒｕｍｅｎｓｉｎ（物質名：モネンシンナトリウム）である［Ｃａｌｌａｗａｙ  ＴＲら：  Ｉｏｎｏｐｈｏｒｅｓ：  Ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｒｏｍｏｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｆｏｏｄ  ｓａｆｅｔｙ、Ｃｕｒｒ．  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｉｎｔｅｓｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００３、４：  ４３〜５１頁（非特許文献２）］が、この製品は、その後ＥＵにおいて反芻動物用の飼料添加剤として禁止されている。モネンシンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓによって産生される。反芻動物におけるモネンシンの広範囲にわたる初期の使用に関連して、モネンシンが、ルーメン菌叢の活性に及ぼす影響を介してルーメンアシドーシスの有病率にプラスの効果を有することも証明することができた。この影響は、モネンシンが過剰な炭水化物の利用と、それに伴うルーメンの過剰酸性化を防止することによって、しかもルーメン菌叢の活性に及ぼす影響（微生物菌叢に及ぼす「減衰効果」）によって示される。この作用は、他の抗菌活性物質でも証明することができた。炭水化物分解酵素に及ぼす直接的な影響は、抗菌活性物質によっては示されていない。
【０００３】
抗菌活性物質の使用は、重大な欠点と結び付いている。一方で、科学的見地からは、これらの物質が家畜の生産量レベルに及ぼすプラスの効果は必ずしも常には証明されなかったが［Ｇｒｉｔｚｅｒ  ＫおよびＬｅｉｔｇｅｂ  Ｒ：  Ｕｅｂｅｒｐｒｕｅｆｕｎｇ  ｄｅｒ  Ｗｉｒｋｓａｍｋｅｉｔ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｓｃｈｅｒ  ｕｎｄ  ｍｉｋｒｏｂｉｅｌｌｅｒ  Ｌｅｉｓｔｕｎｇｓｆｏｅｒｄｅｒｅｒ  ｉｎ  ｄｅｒ  Ｒｉｎｄｅｒｍａｓｔ、Ｄｉｅ  Ｂｏｄｅｎｋｕｌｔｕｒ、１９９８、４９（１）：  ５１〜５９頁（非特許文献３）］、他方で、消費者の領域では、自然で残留物のない動物性食品の傾向が生じ、したがって、商業および消費者において、そのような物質を農業に利用することへの抵抗が生じた。そのうえ、科学分野で、農業における抗生物質性生産量促進物質の利用により、特にまたヒトの医薬に利用した場合に、抗生物質耐性が発生するおそれがあるという疑いが強まった。近年、代替品として、いわゆる生酵母が使用された。ルーメン中の細菌に及ぼす生酵母の促進作用およびより良好な乳酸利用によるルーメン中のそれらのｐＨ安定化作用が公知である［Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｗ：  Ｌｅｂｅｎｄｈｅｆｅｎ：  Ｋｌｅｉｎｅ  Ｚｅｌｌｅｎ  ｍｉｔ  ｇｒｏｓｓｅｒ  Ｗｉｒｋｕｎｇ、Ｄｅｒ  ｆｏｒｔｓｃｈｒｉｔｔｌｉｃｈｅ  Ｌａｎｄｗｉｒｔ  ２０１０、２０：  １０〜１２頁（非特許文献４）］。
【０００４】
しかし獣医学分野で、農業用家畜の最適生産量の最大能力が、最適な健康状態を得ることであることが明らかになった。例えばウシ、ヒツジまたはヤギのような農業用反芻家畜では、重大な生産量損失に至る２つの大きな代謝問題がある。それらは、一方がケトーシスであり、他方がアシドーシス、特に亜急性アシドーシス（ＳＡＲＡ）である。ケトーシスおよびアシドーシスは、それらの経済的意味がほぼ等価である。
【０００５】
亜急性ルーメンアシドーシス（ＳＡＲＡ）は、調査対象の地方および飼育形態に応じて乳牛の１０％〜３０％の頻度で発生する。それで、例えばＥｎｅｍａｒｋおよびＪｏｒｇｅｎｓｅｎ（２００１）はデンマークにおける乳牛で頻度を２２％と報告し、Ｏｅｔｚｅｌ（２００３）は、初産牛での無症状ルーメンアシドーシスの頻度を１５％と報告している。したがって、ケトーシスに加えてアシドーシスは、ウシ生産において最大で、経済的見地から最も重要な健康問題である。
【０００６】
ルーメンアシドーシスを阻止する従来の方法は、有効性が限られている。一般に、動物飼料に緩衝物質、特に重炭酸ナトリウムが添加される。但し、重炭酸ナトリウムは、＞１５０ｇ／頭／日の有効用量で飼料摂取の低下に至るので、限定的にのみ使用することができる。
【０００７】
ＥＰ１１５７６９６（特許文献１）から、ルーメンアシドーシスを治癒的、姑息的および予防的に処置するための薬物を製造するためのアカルボースおよびトレスタチンの使用が公知である。
【０００８】
ＷＯ２０１１／１２７４９９（特許文献２）から、Ｐｉｎｕｓ種の木材、木質繊維、樹皮または樹皮繊維のようなリグノセルロース含有鉄イオン結合性物質を、Ｍａｇｎｏｌｉａ属またはＣｉｎｎａｍｏｍｕｍ属の植物の抽出物または植物性物質のような植物性抗菌活性物質と組み合わせて含有する動物飼料添加剤が、公知である。抗菌活性物質、例えばマグノロールおよびホノキオールの作用は、鉄イオン結合性成分との組合せによって最適化される。というのは、鉄イオン結合性成分が鉄の利用能を減少させることによって、成長に鉄を必要とするルーメン菌叢の細菌の抗菌活性物質の作用に対する感受性がより高くなるからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＥＰ１１５７６９６
【特許文献２】ＷＯ２０１１／１２７４９９
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｒｗｅ  ＢＪら：  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｆｌａｖｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｌ  （Ｆｌａｖｏｍｙｃｉｎ（登録商標））  ｏｎ  ｍｉｌｋ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｌｋ  ｕｒｅａ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｒａｚｉｎｇ  ｄａｉｒｙ  ｃｏｗｓ、Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （ＳＡＳＡＳ）  ２００１、３１（２）：  １０１〜１０５頁
【非特許文献２】Ｃａｌｌａｗａｙ  ＴＲら：  Ｉｏｎｏｐｈｏｒｅｓ：  Ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｒｏｍｏｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｆｏｏｄ  ｓａｆｅｔｙ、Ｃｕｒｒ．  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｉｎｔｅｓｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００３、４：  ４３〜５１頁
【非特許文献３】Ｇｒｉｔｚｅｒ  ＫおよびＬｅｉｔｇｅｂ  Ｒ：  Ｕｅｂｅｒｐｒｕｅｆｕｎｇ  ｄｅｒ  Ｗｉｒｋｓａｍｋｅｉｔ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｓｃｈｅｒ  ｕｎｄ  ｍｉｋｒｏｂｉｅｌｌｅｒ  Ｌｅｉｓｔｕｎｇｓｆｏｅｒｄｅｒｅｒ  ｉｎ  ｄｅｒ  Ｒｉｎｄｅｒｍａｓｔ、Ｄｉｅ  Ｂｏｄｅｎｋｕｌｔｕｒ、１９９８、４９（１）：  ５１〜５９頁
【非特許文献４】Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｗ：  Ｌｅｂｅｎｄｈｅｆｅｎ：  Ｋｌｅｉｎｅ  Ｚｅｌｌｅｎ  ｍｉｔ  ｇｒｏｓｓｅｒ  Ｗｉｒｋｕｎｇ、Ｄｅｒ  ｆｏｒｔｓｃｈｒｉｔｔｌｉｃｈｅ  Ｌａｎｄｗｉｒｔ  ２０１０、２０：  １０〜１２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、反芻動物における急性もしくは亜急性ルーメンアシドーシスまたはルーメンアシドーシスに起因する状態を治療または予防するための手段を提供するという課題に取り組んだ。これらの手段には、動物飼料、動物飼料を製造するための動物飼料添加剤またはプレミックス、および飲料水添加剤が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一態様によると、本発明は、反芻動物における急性もしくは亜急性ルーメンアシドーシスまたはルーメンアシドーシスに起因する状態を治療または予防するためのオリゴマー性プロシアニジンを含有する動物飼料添加剤を提供する。
【００１３】
本発明の一態様によると、オリゴマー性プロシアニジンは、動物飼料添加剤中にマツ樹皮粉砕物、ニレ樹皮粉砕物、マツ樹皮抽出物、ニレ樹皮抽出物またはその任意の混合物の形態で含有され得る。
【００１４】
本発明に関連して、驚くことに、マツ種（Ｐｉｎｕｓ  ｓｐｐ．）もしくはニレ（Ｕｌｍｕｓ  ｓｐｐ．）の樹皮またはそのような樹皮の抽出物が、アシドーシス発生に対してプラスの、予防的でもある作用を有することが明らかとなった。これは、特に、前述の樹皮中に含有されるオリゴマー性プロシアニジン（プロアントシアニジンとも呼ばれる）によって生理学的に生じる。これらの物質について、ルーメン液を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に関連してルーメンアミラーゼに対する阻害作用を証明することができた。
【００１５】
以下に図面を参照して例に基づいて本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】（Ａ）アシドーシス感受性動物および（Ｂ）アシドーシス非感受性動物についてのルーメン中の温度およびｐＨ値の経過を示す図である。
【図２】乳牛を用いた飼料試験におけるアシドーシス頻度に及ぼす本発明の動物飼料添加剤の投与の影響を示す図である。
【図３】ルーメンｐＨに及ぼす本発明の動物飼料添加剤の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の別の一実施形態では、動物飼料添加剤は、オリゴマー性プロシアニジンと、鉄イオンおよび／または鉄化合物との組合せを含有し、すなわちオリゴマー性プロシアニジンは、鉄含有複合体の形態で存在するが、その際、鉄イオンおよび／または鉄化合物とオリゴマー性プロシアニジンとの比は、１：１０から１：２００００の間、好ましくは１：１００から１：８０００の間である。
【００１８】
例えば、オリゴマー性プロシアニジンが鉄含有複合体として存在する本発明の動物飼料添加剤の製造は、以下のように行うことができる。鉄イオンおよび鉄化合物とオリゴマー性プロシアニジンとの所望の比に応じて、市販の塩化鉄溶液または乳酸鉄溶液などを使用してマツ樹皮粉砕物および／またはニレ樹皮粉砕物に噴霧し、続いて穏やかに乾燥させる。
【００１９】
さらなる一実施形態は、プロシアニジン含有抽出物を、例えば前述の鉄溶液と所望の比で混合することである。この場合、水溶性プロシアニジン含有抽出物も使用することができ、次にその抽出物は、鉄溶液が添加されると本発明の複合体を生成する。この実施形態は、特に、液体形態でもさらに加工または使用することができ、すなわち液体形態で担体材料、飼料プレミックスなどに噴霧することができ、動物にも液体形態で、例えばドレンチにより投与することができる。
【００２０】
オリゴマー性プロシアニジンが鉄イオンおよび／または鉄化合物と複合体を形成して存在する本発明の実施形態について、ルーメンアミラーゼに対する阻害作用の明らかな改善をｉｎ  ｖｉｔｒｏで証明することができた。
【００２１】
生理学的見地からは、ルーメンアシドーシスが発生しないか、またはルーメンアシドーシスに非感受性の動物において、ルーメンアミラーゼの阻害が起こらないことが重要である。それは、「健康な」動物においてそのような阻害がルーメン発酵の不均衡（Ｅｎｔｇｌｅｉｓｕｎｇ）につながり、後に健康障害および生産量低下につながるおそれがあるからである。技術の現状において使用されるルーメンアミラーゼ阻害物質（例えばアカルボース）から、それらが動物の健康状態に依存せずにルーメンアミラーゼを阻害することが公知である。
【００２２】
本発明に関連して、広範囲にわたる研究が実施され、その際、驚くことにマツ樹皮、ニレ樹皮またはその抽出物が、ｐＨ値の低下（すなわち酸増大）によってトリガー（すなわち作動）される作用メカニズムを示すことが確認された。マツ樹皮およびニレ樹皮中に含有されるオリゴマー性プロシアニジンは、ルーメンアシドーシスまたは亜急性ルーメンアシドーシスの発生に感受性な範囲内にｐＨ値が低下することによって遊離される結果、活性になる。遊離される量および遊離速度は、樹皮の抽出度により影響を受ける可能性がある。粉砕された、すなわち抽出されていない樹皮は、活性物質の遊離の最も大きな遅延を示すので、実際には、健康な動物または非感受性動物でのルーメン生理を不必要に障害する危険を冒すことなくアシドーシス感受性動物に狙いを定めてルーメンアミラーゼの阻害を介してｐＨ低下を回避するために、最良であることが実証された。
【００２３】
本明細書に使用される「急性ルーメンアシドーシス」および「亜急性ルーメンアシドーシス」という表現は、以下のように理解されたい。急性ルーメンアシドーシスは、ルーメン中の過剰な発酵活性により発生し、それに起因する、発酵過程の代謝産物としての酸の生成を伴う。その理由は、しばしば乳生産により発生するエネルギー不足を制限するために泌乳の開始時に必要な、濃厚飼料の大量給与である。ルーメン中のｐＨ値が値５．５未満に長期持続的に低下することにより、ルーメン菌叢の変化、反芻活動の停止、食欲不振、下痢、疝痛から全身状態の重度障害および動作不能（Ｆｅｓｔｌｉｅｇｅｎ）までが起こる。低いｐＨ値は、ルーメンの粘膜を損傷し、それで粘膜はもはやそのバリア機能を果たすことができなくなる。ルーメンから生物内への細菌、生体アミン、真菌、真菌毒素および細菌毒素の侵入が促進され、病状を悪化させる。
【００２４】
ＳＡＲＡ（亜急性ルーメンアシドーシス）は、ウシの生産における一般的な問題である。ＳＡＲＡは、生理的基準未満へのルーメンｐＨ値の低下に関連する。ルーメンアシドーシスの原因は、通例、しばしば組織化原料繊維（ｓｔｒｕｋｔｕｒｉｅｒｔｅ  Ｒｏｈｆａｓｅｒ）の不足に関連する、急速発酵可能な炭水化物の供給過剰である。急性ルーメンアシドーシスと対照的に、ＳＡＲＡでの非生理的な低ｐＨ値（５．８未満）の時期は、時間的に限られており、ほんの数分から最大で数時間持続する。これらのアシドーシス期が３〜４時間よりも長く続くと、ルーメン粘膜の形態的損傷が生じ、その損傷は、通例、死後になって初めて確認することができる。この損傷は、さらにまた細菌、生体アミン、真菌、真菌毒素および細菌毒素の透過性増加を誘発し、それらは、生物に炎症を引き起こし、肝損傷および蹄病（Ｋｌａｕｅｎｅｒｋｒａｎｋｕｎｇ）を促進するか、または場合により乳汁中に排出されるおそれさえある。二次疾患として、蹄病（蹄葉炎）、肝臓の健康障害（特に膿瘍）、繁殖障害、産乳量低下、および肥育牛における肉付き減少が発生する。さらに、ルーメン絨毛の生理障害によって食欲減退（食欲不振）および糞便の固さの変化（すなわち糞便が粥状〜水様になる）が生じる。
【００２５】
場合により上記のように鉄含有溶液で処理された、マツ樹皮粉砕物、ニレ樹皮粉砕物、マツ樹皮抽出物、ニレ樹皮抽出物またはその任意の混合物の動物飼料または飲料水への添加により処置、軽減または回避できる、反芻動物におけるルーメンアシドーシスに起因する状態の例は、ルーメン中のｐＨ低下、ルーメン菌叢の不均衡、反芻活動の停止、乳量低下、乳脂肪含量の低下、慢性的代謝負荷、肝臓の代謝負荷、不妊、更新率の低下、より少ない産仔数および炎症性蹄病である。
【００２６】
本発明のさらなる一態様によると、本発明の飼料添加剤の使用は、反芻動物の乳汁中へのアフラトキシン排出の減少にも至る。このアフラトキシン排出の減少は、本発明の飼料添加剤の使用によってはっきりと減少したアシドーシス頻度と関係する。これは一方で、減少したアシドーシス頻度によってルーメンでの粘膜損傷がより少なくなる結果、粘膜がそのバリア機能をより良好に果たせることに由来する。他方で、本発明の飼料添加剤は、全般に、より良好なルーメン活性を引き起こし、その際にアフラトキシンの分解も生じる。
【００２７】
別の一態様によると、本発明は、反芻動物における急性もしくは亜急性ルーメンアシドーシスまたはルーメンアシドーシスに起因する状態を治療または予防するために有効な量のオリゴマー性プロシアニジン含有動物飼料添加剤と、タンパク質担体、炭水化物担体、粗飼料、サイレージ、脂肪、ビタミン、無機質および微量元素から成る群から選択される１種または複数の飼料成分とを含有する、反芻動物用の動物飼料に関する。
【００２８】
反芻家畜用の飼料糧食の構成は、基本的に以下の通りである：
基礎飼料：これは、通例、牧草および保存食草類（Ｇｒａｓｋｏｎｓｅｒｖｅ）（乾草、サイレージ）、作物飼料（Ａｃｋｅｒｆｕｔｔｅｒ）および保存食作物飼料（Ａｃｋｅｒｆｕｔｔｅｒｋｏｎｓｅｒｖｅｎ）（アルファルファサイレージ）、副産物（例えばビール粕）のような農場自体の飼料である。
濃厚飼料および補助飼料（生産量に依存）：経営体自体の穀物、コムギ、砂糖および油加工の副産物、ならびに補充用ビタミン強化無機質飼料。今日、乳用家畜用の特別な補助飼料（例えば産乳用飼料）またはウシ肥育用の補助飼料（一般に濃厚飼料またはウシ肥育用飼料と呼ばれる）の使用が通例である。
【００２９】
基礎飼料についての１日飼料摂取量は、農業用家畜では、通例、乾物キログラム（ｋｇ  ＴＳ）で示される。したがって、例えば乳牛における乾物摂取能は、体質量の３〜３．８％になり、雄肥育牛において体質量の１．６〜２．５％になる。したがって、乳牛では１日乾物摂取量は通例１５〜２０キログラムである。１日濃厚飼料給餌量は、例えば乳畜用濃厚飼料（＝産乳用飼料）についておよそ５〜１０キログラム／頭／日であり、肥育用飼料の場合は、およそ２〜３キログラム／頭／日である。
【００３０】
オリゴマー性プロシアニジンを含有する動物飼料添加剤は、動物飼料（例えば基礎飼料、産乳用飼料、濃厚飼料など）と混合して投与することができるか、または、そのときどきの飼料の振り分けの上部に加えることができる。
【００３１】
本発明の動物飼料は、マツ樹皮粉砕物および／またはニレ樹皮粉砕物０．１〜５００ｇ／日／頭の投与に対応する量のマツ樹皮粉砕物および／またはニレ樹皮粉砕物の形態でオリゴマー性プロシアニジン含有動物飼料添加剤を含有する。あるいは、本発明の動物飼料は、マツ樹皮抽出物および／またはニレ樹皮抽出物０．００２〜１００ｇ／日／頭の投与に対応する量のマツ樹皮抽出物および／またはニレ樹皮抽出物の形態でオリゴマー性プロシアニジン含有動物飼料添加剤を含有する。これらの量の記述は、樹皮粉砕物または抽出物が上記のように鉄含有溶液で処理されたことにより、オリゴマー性プロシアニジンが鉄含有複合体として存在する実施形態にも当てはまる。
【００３２】
本発明の動物飼料中に使用されるマツ樹皮粉砕物および／またはニレ樹皮粉砕物の量は、飼料乾物１ｋｇ当り樹皮粉砕物０．０１ｇ〜２５０ｇの範囲内で変動し得る。例えば動物飼料は、好ましくは産乳用飼料（乳牛用濃厚飼料）１ｋｇ当りマツ樹皮粉砕物および／またはニレ樹皮粉砕物０．０１ｇ〜１００ｇ、肥育用飼料（肥育牛用濃厚飼料）１ｋｇ当りマツ樹皮粉砕物および／またはニレ樹皮粉砕物０．０３ｇ〜２５０ｇ、ならびに小型反芻動物（例えば乳用ヒツジ、肉用ヒツジ、毛用ヒツジ、乳用ヤギ、肉用ヤギ）用濃厚飼料１ｋｇ当りマツ樹皮粉砕物および／またはニレ樹皮粉砕物０．０３ｇ〜２５０ｇを含有する。これらの量の記述は、樹皮粉砕物が上記のように鉄含有溶液で処理されたことにより、オリゴマー性プロシアニジンが鉄含有複合体として存在する実施形態にも当てはまる。
【００３３】
本発明の動物飼料中に使用されるマツ樹皮抽出物および／またはニレ樹皮抽出物の量は、飼料乾物１ｋｇ当り樹皮抽出物０．００２ｇ〜５０ｇの範囲内で変動し得る。例えば動物飼料は、好ましくは産乳用飼料（乳牛用濃厚飼料）１ｋｇ当りマツ樹皮抽出物および／またはニレ樹皮抽出物０．００２ｇ〜２０ｇ、肥育用飼料（肥育牛用濃厚飼料）１ｋｇ当りマツ樹皮抽出物および／またはニレ樹皮抽出物０．００２ｇ〜５０ｇ、ならびに小型反芻動物（例えば乳用ヒツジ、肉用ヒツジ、毛用ヒツジ、乳用ヤギ、肉用ヤギ）用濃厚飼料１ｋｇ当りマツ樹皮抽出物および／またはニレ樹皮抽出物０．００２ｇ〜５０ｇを含有する。これらの量の記述は、抽出物が上記のように鉄含有溶液で処理されたことにより、オリゴマー性プロシアニジンが鉄含有複合体として存在する実施形態にも当てはまる。
【００３４】
別の一態様によると、本発明は、動物飼料を製造するためのプレミックスに関し、その際、そのプレミックスには、急性もしくは亜急性ルーメンアシドーシスまたはルーメンアシドーシスに起因する状態を治療または予防するためのオリゴマー性プロシアニジン含有動物飼料添加剤が、タンパク質担体、炭水化物担体、粗飼料、サイレージ、脂肪、ビタミン、無機質および微量元素から成る群から選択される１種または複数の飼料成分と一緒に含有される。
【００３５】
本発明は、また、動物飼料を製造するための本発明の動物飼料添加剤または本発明の動物飼料添加剤を含有するプレミックスの使用に関する。
【００３６】
別の一態様によると、本発明は、反芻動物における急性もしくは亜急性ルーメンアシドーシスまたはルーメンアシドーシスに起因する状態を治療または予防するための動物飼料添加剤または動物飼料プレミックスまたは動物飼料を製造するための、場合により上記のように鉄含有溶液で処理されたマツ樹皮粉砕物、ニレ樹皮粉砕物、マツ樹皮抽出物、ニレ樹皮抽出物またはその任意の混合物の使用に関する。
【００３７】
動物飼料がオリゴマー性プロシアニジンをマツ樹皮粉砕物および／またはニレ樹皮粉砕物の形態で含有する場合、用量は、好ましくはマツ樹皮粉砕物および／またはニレ樹皮粉砕物０．１〜５００ｇ／日／頭の範囲内である。動物飼料がオリゴマー性プロシアニジンをマツ樹皮抽出物および／またはニレ樹皮抽出物の形態で含有する場合、用量は、好ましくはマツ樹皮抽出物および／またはニレ樹皮抽出物０．００２〜１００ｇ／日／頭の範囲内である。これらの量の記述は、樹皮粉砕物または抽出物が上記のように鉄含有溶液で処理されたことにより、オリゴマー性プロシアニジンが鉄含有複合体として存在する実施形態にも当てはまる。
【００３８】
本発明のさらなる一形態によると、オリゴマー性プロシアニジン含有マツ樹皮抽出物および／またはニレ樹皮抽出物は、好ましくは水溶性抽出物の形態で、反芻動物用の飲料水にも添加することができる。飲料水に使用される樹皮抽出物の量は、水１リットル当り抽出物０．００００８ｇ〜１００ｇの範囲内を変動し得る。その代わりに、マツ樹皮粉砕物および／またはニレ樹皮粉砕物を飲料水で懸濁して投与することができる。この場合、用量は、例えば０．１から５００ｇ／頭／日の間を変動し得る。これらの量の記述は、樹皮粉砕物または抽出物が上記のように鉄含有溶液で処理されたことにより、オリゴマー性プロシアニジンが鉄含有複合体として存在する実施形態についても当てはまる。
【００３９】
樹皮抽出物の製造は、水、熱水もしくは蒸気を用いた、または例えばエタノールもしくはメタノールのような有機溶媒を用いた、または混合溶媒もしくはそのような溶媒と水との混合物を用いた固液抽出、あるいは抽出媒体として超臨界ＣＯ２を用いる抽出による固液抽出のような、それ自体公知の方法により行うことができる。抽出度は、加水分解的または他の触媒分解的（例えば酵素的、特にセルラーゼのような細胞溶解酵素）条件により最適化することができる。好ましくは、抽出物は、５０℃〜３００℃の範囲内の温度で実施される。
【００４０】
プロシアニジン含量を最適化するために、樹皮は、好ましくは粉砕され、そのように得られた粉末は、パーコレーター中で抽出媒体としての０．１モル濃度塩酸溶液を用いて温度１００℃で抽出される。続いて抽出物の溶媒が蒸発され、水に入れられる。
【００４１】
別の好ましい一抽出方法は、超臨界ＣＯ２が抽出媒体として使用され、流速１２００〜１４００リットル／時で４時間にわたり圧力２５〜３０ＭＰａおよび温度５０℃〜７０℃で抽出される超臨界ＣＯ２抽出である。抽出物は続いてエタノールに入れられる。
【００４２】
オリゴマー性プロシアニジン含量の基準化は、得られた抽出物からのＨＰＬＣ分析の助けを借りて行うことができる。
【００４３】
例
例１：オリゴマー性プロシアニジンを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏテスト
健康で未処置のルーメンフィステル装着雄ウシからルーメン液を取り出し、遠心分離し、上清を直ちに急速冷凍した。解凍したルーメン液１０ｍｌを本発明の物質０．５ｇと混合し、３９℃で６０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分および２４０分間マグネチックスターラーで撹拌した。上清をそのときどきに指定された時点にピペットで採取し、アミラーゼ活性を測定した。そのために、通例、血清中のアミラーゼ活性の決定に使用される市販の測光システムを使用した。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
表１に基づき明らかなように、本発明により使用されたオリゴマー性プロシアニジンは、アミラーゼ活性の阻害を引き起こす。
【００４６】
例２：オリゴマー性プロシアニジン−鉄複合体を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
健康で未処置のルーメンフィステル装着雄ウシからルーメン液を取り出し、遠心分離し、上清を直ちに急速冷凍した。解凍したルーメン液１０ｍｌを、鉄含有複合体として存在する本発明の物質０．５ｇと混合し、３９℃で６０分、９０分、１２０分および２４０分間マグネチックスターラーで撹拌した。上清をそのときどきに指定された時点にピペットで採取し、測光的アミラーゼ活性測定に供した。
【００４７】
【表２】
2015526082.tif 000004
【００４８】
表２から、鉄含有複合体として存在する本発明の物質が、アミラーゼ活性の阻害の原因になることが明白であり、その際、そのアミラーゼ阻害作用は、例１におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏテストからの本発明の物質よりもずっと顕著である。
【００４９】
例３：雄肥育牛を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ試験
すでに上述のように、ルーメンアシドーシスを発生していない動物またはルーメンアシドーシス非感受性動物においてルーメンアミラーゼの阻害が起こらないことが、生理学的見地から重要である。そのような阻害は、健康な動物の場合、ルーメン発酵の不均衡に至るおそれがあり、このことは、今度は健康障害および生産量低下を引き起こす。
【００５０】
この例は、本発明の被検物質（例えばマツ樹皮またはマツ樹皮抽出物）が、抽出度に応じて、ｐＨ値の低下（すなわち酸増大）によって誘発される作用メカニズムを示すことを示している。（亜急性）ルーメンアシドーシスの発生を見込むことができる範囲内で酸増大（すなわちｐＨ低下）によってマツ樹皮のオリゴマー性プロシアニジンが遊離され、それにより活性になることが、大規模な研究から明らかにされた。遊離される量および遊離速度は、樹皮の抽出度に影響され得る。
【００５１】
樹皮粉砕物は、樹皮抽出物よりも活性物質の遊離遅延が大きい。それゆえに、アシドーシス感受性動物に狙いを定めてルーメンアミラーゼ阻害によりｐＨ低下を回避し、その際に健康な動物または非感受性動物におけるルーメンの生理を不必要に障害する危険を冒さないことが問題である場合、樹皮粉砕物が実際のところ特に有利である（図１Ａおよび１Ｂ参照）。
【００５２】
これらの認識は、ルーメン食塊を使用した大規模試験で得られ、その試験では雄肥育牛におけるオリゴマー性プロシアニジンの影響が研究された。使用されたルーメン食塊は測定センサーであり、そのときどきにセンサーが被験動物のルーメン中に入れられる。センサーは、ｐＨ値だけでなく温度もほんの数分間隔で連続的に測定し、これらのデータを記憶する。外部データ記憶ステーションがこれらのデータを毎日幾度も呼び出し、データ活用のためにコンピュータに転送する。
【００５３】
乳牛の場合、乳生産のための揮発性脂肪酸の利用が、泌乳期および乳量に応じて様々であることから、さらなる影響因子となるので、それゆえに、（乳牛よりも）雄肥育牛を実験に組み入れた。
【００５４】
ラテン方格法で、６頭の去勢肥育牛に合計９週間かけてルーメン食塊を用いた試験を行った。一方で、異なる２用量のオリゴマー性プロシアニジンを含有する被験飼料、および本発明の動物飼料添加剤を混合されていない対照飼料を使用した。実験概要を次表３に示す。
【００５５】
【表３】
2015526082.tif 000005
【００５６】
濃厚飼料、トウモロコシサイレージおよび乾草から作られた動物飼料を動物に投与した。その際、濃厚飼料は、同等分率のオオムギ、コムギおよびダイズＨＰ（すなわち高タンパク質ダイズ抽出ミール（Ｓｏｊａｅｘｔｒａｋｔｉｏｎｓｓｃｈｒｏｔ））から成った。飼料の組成を次表４に挙げる。試験期間内に本発明の動物飼料添加剤を動物飼料の上部に加えて混合した。被験飼料の場合、異なる２用量のオリゴマー性プロシアニジン含有飼料添加剤（１５ｇ／頭／日または３０ｇ／頭／日）を給餌した。
【００５７】
【表４】
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【００５８】
図１に、ルーメン食塊で測定されたルーメン中のｐＨ値および温度の経過を、すなわちアシドーシス感受性動物（図１Ａ）およびアシドーシス非感受性動物（図１Ｂ）について示す。
【００５９】
アシドーシス感受性動物において、対照期に、すなわち本発明の飼料添加剤を投与せずに、デンプン豊富な動物飼料を誘発給餌することにより、ｐＨ値の低下が生じた。しかし、試験期間中、すなわち本発明の動物飼料添加剤を投与していた間はより高いｐＨ値が示された。これは、ルーメンアシドーシスを治療または予防するための本発明の動物飼料添加剤の有効性を裏付けるものである。
【００６０】
アシドーシス非感受性動物の場合、対照期に、すなわち本発明の動物飼料添加剤なしに、ルーメンｐＨの低下は示されなかった。試験期間中にルーメンの生理障害を確認することはできなかった。この結果は、本発明の動物飼料添加剤のさらに上に記載した作用メカニズムを裏付けるものである。健康な動物またはアシドーシス非感受性動物において、本発明の動物飼料添加剤によりルーメンの生理障害は生じない。それは、その作用をトリガーするために必要なルーメン中のｐＨ値低下が起こらないからである。
【００６１】
例４：乳牛を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ試験
この試験は、乳牛家畜体での実地試験であった。試験期間中、群れの全ての泌乳牛に、畜舎通例の飼料振り分けの上部にニレ樹皮３０ｇを加えて給餌した。試験期間の群れの健康に関する畜舎通例の日常的な検査データを過去のデータと比較し、過去のデータを対照データ（樹皮の添加給餌なし）として評価した。試験動物として、泌乳牛４０頭を分析することができた。投与された動物飼料は、例４記載の飼料であった。本発明の動物飼料添加剤の用量は、ニレ樹皮３０ｇ／頭／日であった。
【００６２】
この試験に関連して、乳牛において本発明の動物飼料添加剤が特に泌乳の臨界期でより高い産乳量に至ったことを確認することができた。次の表５に明示するように、驚くことにこの効果は、専門的な見地から予想される乳脂肪含量の減少と結び付かなかった。したがって、本発明の動物飼料添加剤の作用は、産乳量の増加が常に乳脂肪含量の低下を伴うという最新技術の教示とは全く対照的である。
【００６３】
【表５】
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【００６４】
日常的に調査した、群れの健康に関するパラメーターも興味深い：
乳汁の尿素含量は、タンパク質供給の指標として利用される。乳汁のタンパク質含量は、動物のエネルギー供給の指標である。両方のパラメーターは、一緒になって尿素／タンパク質として評価することができ、９つのクラスに分類される。その値は、中間域（クラス５）にあるべきである。逸脱は、タンパク質および／またはエネルギーの供給過剰または供給不足を意味する。
【００６５】
本発明の動物飼料添加剤なしの代謝検査尿素／タンパク質（尿素クラス、ＨＫｌ）：
動物の最大４７．５％が最適なクラス５に分類され、動物の最大４２．５％が不都合なクラス２（エネルギー不足）または７、８および９（タンパク質過剰および／またはエネルギー過剰）であった。
【００６６】
本発明の動物飼料添加剤を用いたときの代謝検査尿素／タンパク質（ＨＫｌ）：
動物の７０．７％が最適なクラス５に、９．８％がクラス２に、１７．１％がクラス８に分類され、クラス９であることを実証された動物はいなかった。
【００６７】
代謝検査エネルギー供給のパラメーターは、乳汁のタンパク質含量により動物のエネルギー供給を表す。３．２％〜３．８％のタンパク質含量は、正常として等級付けられ、それを超えるとエネルギー過剰供給、それを下回るとエネルギー供給不足である。原則的に、エネルギー欠乏は、乳タンパク含量低下を伴う。
【００６８】
本発明の動物飼料添加剤なしの代謝検査エネルギー供給：
動物のおよそ５８％が「正常」の範囲内であり、動物の最大３５％が「エネルギー超過」の範囲内であった。
【００６９】
本発明の動物飼料添加剤を用いたときの代謝検査エネルギー供給：
動物のおよそ７３％が「正常」の範囲内であり、動物の１７％だけが「エネルギー超過」の範囲内であった。
【００７０】
ルーメンの健康および代謝状況を反映するこれらのパラメーターの明らかな改善は、本発明の動物飼料添加剤または飲料水添加剤が実際にルーメンの生理の改善およびそれにより動物の全体的代謝状態の改善に至ることを示唆している。
【００７１】
例５：本発明の乳牛用動物飼料
この例は、乳牛用のバランス濃厚飼料（Ａｕｓｇｌｅｉｃｈｓｋｒａｆｔｆｕｔｔｅｒ）の組成物について述べる。
【００７２】
【表６】
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【００７３】
【表７】
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【００７４】
例６：本発明のウシ肥育用動物飼料
この例は、肥育牛用濃厚飼料組成物について述べる。
【００７５】
【表８】
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【００７６】
【表９】
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【００７７】
そのような飼料は、基本的に乳、肉および毛生産でのヒツジ、ならびに乳および肉生産でのヤギのような小型反芻動物にも適している。
【００７８】
例７：乳牛を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ試験
泌乳牛を用いたさらなる飼料試験に関連して、鉄対オリゴマー性プロシアニジンの比が１：５００の鉄含有複合体の実施形態において本発明の物質を用量２５ｇ／頭／日で投与した。この試験に合計５４頭の泌乳牛（品種：ジャーマン・ホルスタイン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｈｏｌｓｔｅｉｎ））を参加させた。試験群の２７頭は、産乳用飼料を介して表示用量の本発明の物質を１４日間得た。対照群は、同様に２７頭から成り、それらの動物に本発明の物質を添加していない同等の産乳用飼料を給餌した。臨床パラメーターおよび代謝パラメーターにより動物のアシドーシス頻度を測定した。図２から明白なように、試験群ではアシドーシス頻度の７０％の減少を測定することができた。これは、本発明の物質の効果が、鉄イオンまたは鉄化合物とオリゴマー性プロシアニジンとの組合せとしてさらに最適化されることを意味する。それは、なんといってもこの効果が約２０％少ない使用用量で達成できたからである。
【００７９】
例８：ルーメンｐＨに及ぼす本発明の動物飼料添加剤の影響
鉄イオンまたは鉄化合物とオリゴマー性プロシアニジンとから成る複合体として存在する本発明の物質のさらなる特別の利点は、１日の経過にわたるルーメンｐＨの小さな変動を平坦にすることができるという事実である。これは、ルーメンｐＨに及ぼす本発明の物質の効果が検討された、図３に示される測定プロトコールから明らかになる。例７の本発明の被検物質を用量２５ｇ／頭／日で投与後（２月１５日〜）、測定プロトコールにおいてｐＨ値の個別の日変動の分散が明らかに小さくなったことが記録された。専門的見地から、これらの日変動の分散がより大きくなることは、おそらく、ルーメン粘膜の健康にとって、そしてさらには無症状アシドーシス事象に対する動物の感受性にとって重要な損傷要因である。
【００８０】
例９：乳汁中へのアフラトキシン排出に及ぼす本発明の動物飼料添加剤の影響
乳家畜における給餌試験に関連して、乳汁中へのアフラトキシン排出に及ぼす本発明の物質の影響を検討した。試験に関連して、家畜動物を、それぞれ泌乳牛５０頭の対照群および試験群に分けた。試験群に、産乳用飼料を介して本発明の物質を用量３０ｇ／頭／日で１４日間加えて給餌した。試験期間の終了時に両群の乳汁試料のアフラトキシン含量を測定した。対照群の乳汁プール試料のアフラトキシン含量は３９．２ｐｐｔ（「兆分率」）であり、試験群の乳汁プール試料中では１１ｐｐｔであった。これは、７２％の減少を意味する。
【００８１】
【表１０】
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【００８２】
さらに、この飼料試験でアシドーシスリスクのパラメーターも判定したが、アシドーシス頻度およびそれに起因する代謝パラメーターの顕著な改善が生じたことを確認することができた。それで、試験群においてアシドーシス事象に関連するパラメーター、すなわち脂肪タンパク質比率（Ｆｅｔｔ−Ｅｉｗｅｉｓｓ−Ｑｕｏｔｉｅｎｔ）が増加することができた。これは、アシドーシス頻度の減少と、それに起因するルーメン中のアフラトキシンの分解改善またはそれに起因する乳汁中へのアフラトキシン排出減少との間の直接関係を確認するものである。
【００８３】
泌乳牛を用いたさらなる給餌試験に関連して、鉄含有複合体（Ｆｅ：オリゴマー性プロシアニジンの比は１：３５０）の形態で存在する本発明の物質を、用量２５ｇ／頭／日で使用した。この試験は、合計７２頭の泌乳牛を用いて２１日間実施した。試験群の３６頭は、産乳用飼料を介して全試験期間にわたり表示用量の本発明の物質を得た。試験期間の終了時に、それらの群の乳汁プール試料のアフラトキシン含量を測定した。対照群では測定値は７５．２ｐｐｔであり、試験群では１９．６ｐｐｔであった。これは、７４パーセントの減少を意味する。
【００８４】
【表１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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