(57)【要約】  本発明の開示は、製剤を用いた眼疾患および状態の処置における、ヒドララジンを含む医薬製剤に関する。本発明の開示はまた、医薬製剤を調製する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、約０．０２−２重量％の間の量でヒドララジンを含む、医薬として活性のある薬物、
３．９−４．５の間のｐＨを有する、８−１２重量％の間の量の酢酸塩緩衝溶液、
０．５−２重量％の間の量のプロピレングリコール、
０．２５−１重量％の間の量の塩化ナトリウム、
０．０１５−０．０６重量％の間の量のメチルパラベン、
０．０１−０．０４重量％の間の量で存在する、５０％溶液の形態での塩化ベンザルコニウムおよび
０．００８−０．０３０重量％の間の量のエデト酸二ナトリウム
を含む眼科用組成物であって、４．０−４．４の間のｐＨを有する組成物。
【請求項２】
薬物が塩酸ヒドララジンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
薬物が、０．５−２重量％の間の量で存在する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
酢酸塩緩衝溶液がｐＨ４．２を有し、１０重量％の量で存在する、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
酢酸塩緩衝溶液が、酢酸ナトリウムおよび２Ｎ酢酸で構成されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
プロピレングリコールが、１重量％の量で存在する、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
メチルパラベンが、０．０３重量％で存在する、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
５０％溶液の形態での塩化ベンザルコニウムが、０．０２重量％で存在する、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
エデト酸二ナトリウムが、０．０１５重量％で存在する、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
眼科用製剤を調製するための方法であって、水と、ｐＨ３．９−４．５を有する酢酸塩緩衝溶液とを混合することによって、第１の中間混合物を形成するステップであって、酢酸塩緩衝溶液が、製剤中に約８−１２重量％の間の酢酸塩緩衝溶液が得られる量で加えられるステップ、
第１の中間混合物にエデト酸二ナトリウムを加えることによって、第２の中間混合物を形成するステップであって、エデト酸二ナトリウムが、製剤中に約０．００８−０．０３０重量％の間のエデト酸二ナトリウムが得られる量で加えられるステップ、
第２の中間混合物にプロピレングリコールを加えることによって、第３の中間混合物を形成するステップであって、プロピレングリコールが、製剤中に約０．５−２重量％の間のプロピレングリコールが得られる量で加えられるステップ、
第３の中間混合物に塩化ナトリウムを加えることによって、第４の中間混合物を形成するステップであって、塩化ナトリウムが、製剤中に約０．２５−１重量％の間の塩化ナトリウムが得られる量で加えられるステップ、
第４の中間混合物に塩化ベンザルコニウムを加えることによって、第５の中間混合物を形成するステップであって、塩化ベンザルコニウムが、製剤中に約０．０１−０．０４重量％の間の塩化ベンザルコニウムが得られる量で加えられるステップ、
第５の中間混合物にメチルパラベンを加えることによって、第６の中間混合物を形成するステップであって、メチルパラベンが、製剤中に約０．０１５−０．０６重量％の間のメチルパラベンが得られる量で加えられるステップ、および
第６の中間混合物にヒドララジンを含む医薬として活性のある薬物を加えることによって、製剤を形成するステップ
を含む眼科用製剤を調製するための方法。
【請求項１１】
加えるステップの１つ以上が、加えながら混合するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
酢酸塩緩衝溶液が、製剤中に１０重量％の酢酸塩緩衝剤が得られる量で加えられる、請求項１０から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
酢酸塩緩衝溶液が酢酸ナトリウムおよび２Ｎ酢酸で構成されている、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
エデト酸二ナトリウムが、製剤中に０．０１５重量％のエデト酸二ナトリウムが得られる量で加えられる、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
プロピレングリコールが、製剤中に１５重量％のプロピレングリコールが得られる量で加えられる、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
塩化ナトリウムが、製剤中に０．５重量％の塩化ナトリウムが得られる量で加えられる、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
塩化ベンザルコニウムが、製剤中に０．０２重量％の塩化ベンザルコニウムが得られる量で加えられる、請求項１０から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
メチルパラベンが、製剤中に０．０３重量％のメチルパラベンが得られる量で加えられる、請求項１０から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
医薬として活性のある薬物が、０．５−２重量％の間で製剤中に存在するヒドララジンである、請求項１０から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
黄斑変性の処置において使用するための、請求項１から９のいずれか一項に記載の眼科用組成物。
【請求項２１】
黄斑変性がドライ型加齢黄斑変性である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
黄斑変性のリスクがあるまたは黄斑変性と診断された対象の眼に、請求項１から９のいずれか一項に記載の眼科用組成物または請求項１０から１９のいずれか一項に記載の方法に従い調製された製剤を投与するステップを含む、黄斑変性を処置するための方法。
【請求項２３】
黄斑変性が、加齢ドライ型黄斑変性である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、この全体を参照により本明細書に組み込む、２０１２年６月１１日に出願した米国仮出願第６１／６５８，３０４号の利益を主張する。
【０００２】
本明細書に記載された主題は、製剤およびこれを用いた眼の処置に関する。
【背景技術】
【０００３】
老化は、眼の脈絡膜血管、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥＣ）およびブルッフ膜を含めた、細胞、組織および器官の変性を引き起こす慢性のプロセスである。動脈硬化性の老化は、脈絡膜血管、特に黄斑性の脈絡毛細管枝を変化させ、毛細管の全血流を結果として低減させる。この結果、網膜色素上皮がドルーゼおよびリポフスチンを蓄積し始め、細胞形状、密度、色素沈着、リソソーム活性および細胞外マトリクス形成を変化させる。徐々に、ブルッフ膜は、肥厚および透過性の低減を示し、結果として、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の出現を可能にし得る崩壊が生じ、この脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の出現が、最終的に新生血管の加齢黄斑変性（また滲出型加齢黄斑変性）および失明をもたらす。臨床的証拠は、脈絡膜血流の虚血または低減は、加齢黄斑変性（ＡＭＤまたはＡＲＭＤ）を含めたいくつかの重症な網膜疾患を伴い得ることを示唆した（Ｇｒｕｎｗａｌｄら、１９９８年、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．、３９巻（２号）：３８５−３９０頁；Ｇｒｕｎｗａｌｄら、２００５年、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．、４６巻（３号）：１０３３−１０３８頁；Ｃｉｕｌｌａら、１９９９年、Ａｍ  Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、１２８巻（１号）：７５−８０頁；Ｍｅｔｅｌｉｔｓｉｎａら、２００６年、Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、９０巻（３号）：３４２−３４６頁；Ｍｅｔｅｌｉｔｓｉｎａら、２００８年、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、４９巻（１号）：３５８−３６３頁）。眼の血管因子および全身性血管因子の両方、例えば、全身性高血圧症および高眼圧症などが、ＡＭＤの発症および脈絡膜血管新生にある役割を果たしていると考えられている（Ｍｅｔｅｌｉｔｓｉｎａ、２００６年；Ｍｅｔｅｌｉｔｓｉｎａ、２００８年；Ｎａｔｈａｎｓｏｎらによる米国特許第５，５００，２３０号）。したがって、脈絡膜血管新生を予防し、および／または脈絡膜血流を増加させる薬剤を特定する必要性が存在する。
【０００４】
加齢黄斑変性を処置するための多くの方法が試されてきたが、不成功に終わっている。これらは、脈絡膜血管新生に対するレーザー光凝固術、照射処置、中心窩下潜在性脈絡膜血管新生の経瞳孔的温熱治療法、黄斑下手術、限局性黄斑移動術、手術における補助，ドルーゼへのアルゴンレーザー、滲出型ＡＭＤの処置のための赤外線ダイオードレーザー光凝固術を含む。最近では、ヒドララジンなどの血圧降下剤を含む、非新生血管のＡＭＤまたはドライ型ＡＭＤを処置するための組成物が、参照により本明細書に組み込む、Ｃｈｉｏｕによる米国特許第８，０８８，７７３号に記載されている。
【０００５】
関連技術の前述の例およびこれらに関連する制限は、例示的であることを意図するもので、限定的であることを意図するものではない。関連技術の他の制限は、明細書を読み、図を研究すれば当業者には明らかである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，５００，２３０号明細書
【特許文献２】米国特許第８，０８８，７７３号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｒｕｎｗａｌｄら、１９９８年、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．、３９巻（２号）：３８５−３９０頁
【非特許文献２】Ｇｒｕｎｗａｌｄら、２００５年、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．、４６巻（３号）：１０３３−１０３８頁
【非特許文献３】Ｃｉｕｌｌａら、１９９９年、Ａｍ  Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、１２８巻（１号）：７５−８０頁
【非特許文献４】Ｍｅｔｅｌｉｔｓｉｎａら、２００６年、Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、９０巻（３号）：３４２−３４６頁
【非特許文献５】Ｍｅｔｅｌｉｔｓｉｎａら、２００８年、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、４９巻（１号）：３５８−３６３頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
以下に記載および例示されている以下の態様およびこの実施形態は、典型的および例示的であることを意図するもので、範囲を制限することを意図するものではない。
【０００９】
一態様において、眼科用組成物が記載されている。一実施形態において、眼科用組成物は、ヒドララジンを約０．０２−２重量％の間の量で含む医薬として活性のある薬物および以下のうちの１種以上を含む：３．５−４．５の間のｐＨを有する１種以上の緩衝溶液；１種以上のキレート剤；１種以上の等張剤；１種以上の保存剤；１種以上の増粘剤および１種以上の希釈剤。ある実施形態において、組成物は、４．０−４．４の間のｐＨを有する。別の実施形態において、眼科用組成物は、約０．０２−２重量％の間の量でヒドララジンを含む医薬として活性のある薬物、３．９−４．５の間のｐＨを有する、８−１２重量％の間の量の酢酸塩緩衝溶液、０．５−２重量％の間の量のプロピレングリコール、０．２５−１重量％の間の量の塩化ナトリウム、０．０１５−０．０６重量％の間の量のメチルパラベン、０．０１−０．０４重量％の間の量で存在する、５０％溶液の形態での塩化ベンザルコニウムおよび０．００８−０．０３０重量％の間の量のエデト酸二ナトリウムを含む。ある実施形態において、この組成物は４．０−４．４の間のｐＨを有する。
【００１０】
医薬として活性のある薬物は塩酸ヒドララジンを含んでもよい。別の実施形態において、この薬物は、０．５−２重量％の間の量で存在する。
【００１１】
別の実施形態において、酢酸塩緩衝溶液は約４．２のｐＨを有し、約１０重量％の量で存在する。酢酸塩緩衝溶液は、酢酸ナトリウムおよび２Ｎ酢酸で構成されていてもよい。
【００１２】
ある実施形態において、プロピレングリコールは約１重量％の量で存在する。別の実施形態において、メチルパラベンは約０．０３重量％の量で存在する。さらに別の実施形態において、塩化ベンザルコニウムは、５０％溶液の形態で存在し、約０．０２重量％の量で存在する。さらなる実施形態において、エデト酸二ナトリウムは、約０．０１５重量％の量で存在する。
【００１３】
別の態様において、眼科用製剤を調製するための方法が想定されている。一実施形態において、本方法は、希釈剤と、約３．５−４．５の間のｐＨを有する１種以上の緩衝溶液とを混合することによって、第１の中間混合物を形成するステップ、１種以上のキレート剤を第１の中間混合物に加えることによって、第２の中間混合物を形成するステップ、１種以上の滑沢剤を第２の中間混合物に加えることによって、第３の中間混合物を形成するステップ、１種以上の等張剤を第３の中間混合物に加えることによって、第４の中間混合物を形成するステップ、１種以上の保存剤を第４の中間混合物に加えることによって、第５の中間混合物を形成するステップ、およびヒドララジンを含む医薬として活性のある薬物を第５の中間混合物に加えることによって、眼科用製剤を形成するステップを含む。
【００１４】
ある実施形態において、緩衝剤は、製剤中に約８−１２重量％の間の酢酸塩緩衝溶液が得られる量で加えられる、約３．９−４．５のｐＨを有する酢酸塩緩衝溶液である。別の実施形態において、酢酸塩緩衝溶液は、製剤中に約１０重量％の酢酸塩緩衝剤が得られる量で加えられる。さらなる実施形態において、酢酸塩緩衝溶液は酢酸ナトリウムおよび２Ｎ酢酸で構成されている。
【００１５】
ある実施形態において、キレート剤はエデト酸二ナトリウムであり、このエデト酸二ナトリウムは、製剤中に約０．００８−０．０３０重量％の間のエデト酸二ナトリウムが得られる量で加えられる。さらなる実施形態において、エデト酸二ナトリウムは、製剤中に約０．０１５重量％のエデト酸二ナトリウムが得られる量で加えられる。
【００１６】
ある実施形態において、滑沢剤は、製剤中に約０．５−２重量％の間のプロピレングリコールが得られる量で加えられるプロピレングリコールである。さらなる実施形態において、プロピレングリコールは、製剤中に約１５重量％のプロピレングリコールが得られる量で加えられる。
【００１７】
さらなる実施形態において、等張剤は、製剤中に約０．２５−１重量％の間の塩化ナトリウムが得られる量で加えられる塩化ナトリウムである。ある実施形態において、塩化ナトリウムは、製剤中に約０．５重量％の塩化ナトリウムが得られる量で加えられる。
【００１８】
さらに別の実施形態において、保存剤は、製剤中に約０．０１−０．０４重量％の間の塩化ベンザルコニウムが得られる量で加えられる塩化ベンザルコニウムである。別の実施形態において、塩化ベンザルコニウムは、製剤中に約０．０２重量％の塩化ベンザルコニウムが得られる量で加えられる。さらなる実施形態において、第２の保存剤が加えられ、この第２の保存剤は、製剤中に約０．０１５−０．０６重量％の間のメチルパラベンが得られる量で加えられるメチルパラベンである。さらに別の実施形態において、メチルパラベンは、製剤中に約０．０３重量％のメチルパラベンが得られる量で加えられる。
【００１９】
実施形態において、医薬として活性のある薬物は、約０．５−２重量％の間で製剤中に存在するヒドララジンである。さらなる実施形態において、医薬として活性のある薬物は塩酸ヒドララジンである。特定の実施形態において、医薬として活性のある薬物は、製剤中に約１重量％で存在する塩酸ヒドララジンである。
【００２０】
実施形態において、加えるステップの１つ以上は、加えながら混合するステップをさらに含む。
【００２１】
さらなる態様において、黄斑変性を処置するための方法が想定されている。実施形態において、本方法は、黄斑変性のリスクがある、または黄斑変性であると診断された対象の眼に、本明細書に記載されたまたは本明細書に記載された方法で調製した眼科用組成物を投与するステップを含む。ある実施形態において、黄斑変性は加齢黄斑変性である。特定の実施形態において、加齢黄斑変性はドライ型加齢黄斑変性である。
【００２２】
上の実施形態は、記載されたさらなる実施形態のうちの１つ以上、またはすべてと合わせることができることを理解されたい。上に記載された典型的な態様および実施形態に加えて、さらなる態様および実施形態が、図の参照によりおよび以下の記載の研究により明らかとなる。
【００２３】
本発明の方法および組成物などのさらなる実施形態は、以下の記載、図、実施例および特許請求の範囲から明らかとなる。前述の記載および以下の記載から理解できるように、本明細書に記載されたそれぞれおよびすべての特徴、ならびにこのような特徴の２つ以上のそれぞれおよびすべての組合せは、本発明の開示の範囲内に含まれているが、ただし、このような組合せに含まれる特徴は相互に矛盾しないものとする。さらに、任意の特徴または特徴の組合せが、本発明の任意の実施形態から特異的に除外されてもよい。本発明のさらなる態様および利点は、特に付随の実施例および図と関連させて考慮した場合、以下の記載および特許請求の範囲に記述されている。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】１％塩酸ヒドララジン製剤の滴下後、０、３０、６０および１２０分の時点での脈絡膜血流（単位：μｌ／分／ｍｇ）のグラフである。
【図２】フルオレセインにより測定した場合の、０％、０．５％、１％および２％塩酸ヒドララジン製剤の投与後のＣＮＶ面積（単位：ｍｍ２）のグラフである。
【図３】脈絡膜フラットマウントで測定した場合の、０％、０．５％、１％および２％塩酸ヒドララジン製剤の投与後のＣＮＶ面積（単位：μｍ２）のグラフである。
【図４】ラット網膜におけるＮａＩＯ３誘発性ＲＰＥ変性に対する１．０％塩酸ヒドララジン製剤の作用を示すＥＲＧ  ｃ波信号（単位：ボルト）のグラフである（平均値±標準偏差：＊＊＝Ｐ＜０．０１または＊＃＃＝Ｐ＜０．０１）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
ここで、様々な態様が本明細書のこれより以下でより完全に説明されることになる。しかし、このような態様は多くの異なる形態で実施形態化されてもよく、本明細書に記述された実施形態を制限すると解釈されるべきではない；むしろ、これらの実施形態が提供されることによって、本開示は十分および完全となり、この範囲は当業者に完全に伝わるようになる。
【００２６】
Ｉ．定義
本明細書で使用されているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、そうでない事が内容から明白である場合を除き、複数形も含む。したがって、例えば、「薬物」への言及は、単一の薬物ならびに２種以上の、同一でありまたは異なる薬物を含み、「賦形剤」への言及は、単一の賦形剤ならびに２種以上の、同一でありまたは異なる賦形剤を含む。
【００２７】
濃度、量、ｐＨ値などは、本明細書で多くの場合、範囲形式で提示されている。範囲形式での記載は、便宜さおよび簡潔さのためだけであり、本発明の範囲への柔軟性のない制限と解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は、具体的に開示されたすべての可能な下位の範囲ならびにこの範囲内の個々の数値を有するとみなされるべきである。例えば、ある範囲の記載、例えば、３．８−４．４のｐＨは、具体的に開示された下位の範囲、例えば、３．８−４．４、３．８−４．２、３．８−４．０、４．０−４．４、４．２−４．４、３．９−４．２、４．０−４．２など、ならびにこの範囲内の個々の数、例えば、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３および４．４などを有するとみなされるべきである。この解釈は、範囲の大きさに関わらず、および本開示全体を通してすべての文脈に適用される。
【００２８】
「治療有効量」は、視力障害または視覚低下または眼疾患の予防、処置、または進行の遅延に有用な医薬として活性のある物質、薬剤または薬物の量を指す。
【００２９】
本明細書中の「薬物」または「薬剤」または任意の具体的な組成物もしくは化合物を、ヒドララジンなどの名称で言及する場合、薬理学的活性化合物ならびにこの医薬として許容される塩、プロドラッグ、例えば、エステルもしくはエーテルなど、またはプロドラッグの塩、または溶媒和物、例えば、エタノレートなど、または薬理学的活性化合物の他の誘導体を含む。本明細書中で「薬物またはこの塩」または「薬剤またはこの塩」または任意の具体的な化合物もしくは組成物を、「またはこの塩」と関連させてヒドララジンなどの名称で言及する場合、この言及は、薬理学的活性剤およびこの薬物の任意の医薬として許容される塩を意図する。薬理学的活性のある薬物の塩は、無機酸または有機酸および無機塩基または有機塩基から誘導することができる。無機酸の例として、これらに限定されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸およびリン酸が挙げられる。塩基の例として、これらに限定されないが、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニアおよび式Ｎ−Ｗ４＋（式中、ＷはＣ１−４アルキルである）の化合物が挙げられる。有機酸塩の例として以下が挙げられる：酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、ヘキサン酸塩、ヘプタン酸塩、ウンデカン酸塩、パモ酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、カンファー酸塩、ニコチン酸塩、ペクチン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、トシル酸塩、グルコン酸塩、ジグルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ドデシル硫酸塩、カンファースルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、チオシアン酸塩、リン酸塩、グリセロリン酸塩およびフェニルプロピオン酸塩。他の塩は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９９５年）、第８３章（本明細書でこれより以下、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮと称す）に列挙されている。
【００３０】
本明細書で使用されているように、「眼疾患」とは、視力損失、かすんだまたは低下した中心の近接視力および遠視力、盲点、異なる色または形状で出現する対象、血管系眼疾患の神経眼科的症状を引き起こす任意の様々な疾患、機能障害、または欠陥を意味し、虚血性視神経症、前部虚血性視神経症、網膜動脈閉塞症、無症候性網膜塞栓、網膜組織の無症候性網膜塞栓または虚血、網膜浮腫、一過性黒内障、視野の減少，眼血管の閉塞、細動脈内の血流の低迷、白内障、緑内障、眼球突出症、眼瞼後退、限定的ミオパシー、複視（二重視）、圧迫性視神経症および／または兎眼性角膜症を含む。一実施形態において、眼疾患は黄斑変性または糖尿病性眼疾患である。さらなる実施形態において、眼疾患は加齢黄斑変性である。またさらなる実施形態において、眼疾患はドライ型または非新生血管性加齢黄斑変性である。別の実施形態において、眼疾患は糖尿病性黄斑浮腫である。「眼疾患」は１種以上の眼疾患を包含し得ることを理解されたい。すなわち、本発明の製剤は、１種以上の眼疾患を処置し、予防し、および／またはこの進行を遅延／停止させることができる。本発明は、視力欠陥または機能障害をもたらしている任意の特定の根底疾患を処置することだけに制限されることを意図していない。
【００３１】
本明細書で使用されているように、「黄斑変性」とは、網膜黄斑の一部の劣化を引き起こす任意の状態を意味する。この変性は、部分的または全部であってよく、疾患の進行段階だけに制限されることは意図されない。例えば、加齢黄斑変性に関して、「黄斑変性」とは、対象が視覚障害の任意の症状を有していなかったとしても、ドルーゼと診断された対象を含むことを意図する。非限定的実施形態において、黄斑変性は加齢黄斑変性を指すことができる。
【００３２】
本明細書で使用されているように、「脈絡膜血管新生を低下させるように機能する」化合物とは、脈絡膜血管新生の統計学的に有意な減少を意味し、この有意な減少は、例えば、レーザーを介したまたは眼疾患による眼のブルッフ膜の物理学的破壊後、化合物を投与してからある程度時間が経過した後で、当技術分野で公知の方法、例えば、フルオレセイン血管造影で測定される。脈絡膜血管新生を低下させるように機能する化合物を特定するための方法の詳細な記載が、本明細書に記載されている。
【００３３】
「異性体」とは、同じ割合の同じ要素で構成されているが、原子の三次元の配置が異なる２種以上の物質のいずれかを意味し、この異性体には、エナンチオマー異性体（すなわち、鏡像）およびジアステレオマー異性体が含まれる。
【００３４】
本明細書で使用されているように、「塩」という用語は、所望の機能、例えば、生物活性を保持しながら、本明細書に含まれている、特定された化合物と複合体を形成する任意の塩を指す。このような塩の例として、これらに限定されないが、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）と形成される酸付加塩、ならびに有機酸、例えば、これらに限定されないが、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸およびポリガラクツロン酸などと形成される塩が挙げられる。塩化合物はまた、当業者には公知の医薬として許容される第四級塩としても投与することができ、具体的には、式−−ＮＲ，Ｒ’，Ｒ’’＋Ｚ−（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’は、独立して、水素、アルキル、またはベンジルであり、Ｚは対イオン、例えば、これらに限定されないが、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、アルコキシド、トルエンスルホネート、メチルスルホネート、スルホネート、ホスフェート、またはカルボキシレート（例えば、ベンゾエート、スクシネート、アセテート、グリコレート、マレエート、マレート、フマレート、シトレート、タルタレート、アスコルベート、シンナモエート、マンデロエートおよびジフェニルアセテートなど）が挙げられる）の第四級アンモニウム塩が挙げられる。
【００３５】
「有害な薬物反応」とは、侵害性がありおよび／または意図的ではなく、ならびに予防法、診断、または治療のための投与量において生じる、薬物に対する任意の応答を意味し、副作用、毒性、過感受性、薬物相互作用、合併症、または他の特異体質を含む。副作用とは、多くの場合、意図していない器官系に対してこの薬理学的作用により生じる、薬物の治療的血清レベルにより生じる、有害な症状である（例えば、抗コリン抗ヒスタミン剤によるかすみ目）。有毒性副作用とは、薬物への過剰なまたは長期の化学的曝露により生じる有害な症状または他の作用（例えば、ジギタリス毒性および肝臓毒性）である。過感受性は、免疫媒介性の有害反応である（例えば、アナフィラキシー、アレルギー）。薬物相互作用は、他の薬物、食物または疾患状態との相互作用（例えば、ワルファリンおよびエリスロマイシン、シサプリドおよびグレープフルーツ、ロペラミドおよびクロストリジウム・ディフィシル大腸炎）に起因する、通常有害な作用である。合併症は、薬物により引き起こされる疾患である（例えば、ＮＳＡＩＤ誘発性胃潰瘍、エストロゲン誘発性血栓症）。有害な薬物反応は、公知のまたは不明の機序により媒介され得る（例えば、クロラムフェニコールまたはクロザピンに伴う無顆粒球症）。このような有害な薬物反応は、当技術分野で公知の対象観察、アッセイまたは動物モデルにより判定することができる。
【００３６】
「誘導体」という用語は、化学化合物に関して使用された場合、適用時、例えば、対象への投与の際に、化学化合物が有することが開示された機能を直接的または間接的に提供することが可能な同様の構造を指す（ただし、この誘導体の機能に増減は有り得る）。例えば、化学化合物の中で１個の原子を別の原子で置換する、例えば、炭素原子を窒素原子で置換することによって、同様の構造の化合物を提供する。同様の構造の化合物は、例えば、脈絡膜血管新生を低減させるなど、同様の機能が可能となり得る。ある特許請求された実施形態は、化学構造における微量な変化を包含することを意図するが、ただし、この誘導体は、眼疾患を処置し、予防し、この進行を停止または遅延させることができるものとする。
【００３７】
「管理する」という用語は、疾患または状態に関連して使用された場合、予防用または治療用薬剤を投与された対象へ有利な作用を提供することを意味し、この場合、結果として疾患の治癒は生じない。ある特定の実施形態において、対象に、１種以上の予防用または治療用薬剤を投与して疾患を管理することによって、疾患の進行または疾患の悪化を予防する。
【００３８】
本明細書で使用されているように、「予防する」および「予防している」という用語は、疾患の再発、拡散または開始を予防することを含む。本発明が完全な予防に制限されることは意図されていない。一部の実施形態において、開始が遅延され、または疾患の重症度が減少する。
【００３９】
「対象」とは、任意の動物を意味し、好ましくはヒト患者、家畜、または飼い慣らしたペットを意味する。
【００４０】
本明細書で使用されているように、「処置する」および「処置している」という用語は、対象（例えば、患者）が治癒し、疾患が根絶される場合に制限されない。むしろ、本発明はまた、単に症状を減少させ、視力を（ある程度）改善させ、疾患進行を遅延および／または停止する処置を想定している。
【００４１】
本明細書で使用されているように、「医薬として許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトにおける使用に対して、連邦政府もしくは州政府の監督官庁で認可されている、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識された薬局方に列挙されていることを意味する。
【００４２】
ＩＩ．医薬としての眼科用製剤
第１の態様において、眼科用組成物または製剤が提供される。医薬としての製剤は、これらに限定されないが、ヒドララジンまたはこの塩、置換された誘導体、もしくは非置換の誘導体を含めた血圧降下剤、および特定の他の構成成分（これらは共同で有利な組成物を提供する）を含み、これらは以下に説明されることになる。
【００４３】
特許請求されている組成物および方法を裏付けるように行われた研究において、ヒドララジンを含む眼科用製剤が実施例１に記載の通り調製された。製剤は、一実施形態において、ヒドララジンならびにより良い安定性および／またはバイオアベイラビリティーを提供する選択された賦形剤を含む。
【００４４】
ヒドララジン
ヒドララジンは、以前は血圧降下剤として使用されたベンゾピリダジン誘導体である。動物およびヒトにおけるヒドララジンの生化学、生理、代謝および排出が大いに研究されてきた（Ｖｅｌｌｉｑｕｅｔｔｅら、２００３年、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ、３０７巻（３号）：１１０４−１１１１頁；Ｃａｒｍｏｄｙら、２００７年、Ｃａｒｄｉｏｌ  Ｒｅｖ、１５巻（１号）：４６−５３頁；Ａｄｏｒｉｓｉｏら、２００６年、Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ  Ｒｅｖ、１１巻（２号）：１０９−１２３頁；Ａｒｔｍａｎら、１９８４年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、６９巻（５号）：９４９−９５４頁；Ｃａｍｅｒｏｎら、１９８４年、２８９巻（６４４２号）：４１０−４１２頁；およびＰｅｒｒｙら、１９７３年、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ、５４巻（１号）：５８−７２頁）。ヒドララジンは、細動脈筋の緩和を引き起こし、末梢血管拡張作用を発揮する、直接作用性抗高血圧薬物であるが、ヒドララジンがこのように作用する機序は完全に理解されてはいない（Ｆｒｅｅｍａｎｔｌｅら、２００８年、Ｃｏｃｈ  Ｄａｔ  Ｓｙｓ  Ｒｅｖ、２００８年（２巻）：１−５頁；Ｂｒｕｎｔｏｎら編、２００８年、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１１版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｐｒｅｓｏｌｉｎｅ（登録商標）パッケージ添付文書、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ、１９９５年）。ヒドララジンはカルシウム代謝を変化させ、これによって、収縮状態の開始または延長を引き起こす血管平滑筋内でのカルシウム移動を妨げると提案されている。抹消血管拡張作用はいくつかの心臓の作用をもたらす：動脈圧の低減（心臓収縮期よりも心臓拡張期）；末梢血管耐性の低減；ならびに心拍、一回拍出量および心拍出量の増加。ヒドララジンは普通、恐らく反射交感神経放電に応答して、血漿中のレニン活性を増加させる。この薬物はまた、腎臓および大脳の血流を維持または増加させることが判明した。眼における血管拡張剤（１クラスとして）の予測される潜在的作用のうちのいくつかには、細動脈の拡大が含まれ、この細動脈の拡大は、脈絡膜および網膜の循環および動脈または細動脈の壁の痙縮（眼内の病変または他の拘縮による）の緩和および硬化の回避を改善すると予想されている（Ｌａｗｓ、１９６４年、Ｃａｎ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ  Ｊ、９１巻：３２５−３３０頁）。
【００４５】
ヒドララジンは消化管を介してよく吸収され、ファストアセチレーターにおいては全身性バイオアベイラビリティーは１６％であり、スローアセチレーターにおいては全身性バイオアベイラビリティーは３５％である（Ｂｒｕｎｔｏｎ、２００８年；塩酸ヒドララジンＵＳＰパッケージ添付文書、Ｐａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、２００５年）。ヒドララジンは腸および／または肝臓内でＮ−アセチル化する。ヒドララジンの血漿半減期は３−７時間であるが、ただし、この低血圧作用は１２時間まで持続できる（Ｐａｒ  ２００５年）。ヒドララジンは、α−ケト酸とすばやく組み合わさって、ヒドラゾンを形成し、この主要代謝物はヒドララジンピルビン酸ヒドラゾンである。アセチル化形態のヒドララジンは不活性であるため、ラピッドアセチレーターは通常、スローアセチレーターよりも多量の投与量を必要とするが、米国の人口の約半分がファストアセチレーターである；アセチル化速度はバイオアベイラビリティーの１つの要素であるが、肝臓のクリアランス速度が高いため、薬物の全身性排除における要素とはならない（全身性クリアランスは５０ｍＬ／ｋｇ／分であり、これは肝臓の血流を超える）。経口的に投与されたヒドララジンの血漿中のピーク濃度および最大の低血圧作用は投与から３０−１２０分内に生じる。ヒドララジンの筋肉内注射は、組織抽出物中で低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）タンパク質を誘発させ、これが次に血管内皮成長因子を調節する（Ｋｎｏｗｌｅｓら、２００４年、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、９５巻（２号）：１６２−１６９頁において、ヒドララジンが、血管新生促進作用を発揮し、虚血性心疾患に有利となり得ることを示唆している）。網膜内の血流の減少および焦点虚血は、ＡＭＤの進行において重要な要素であることが示唆されている（Ｇｒｕｎｗａｌｄ、１９９８年、Ｍｅｔｅｌｉｔｓｉｎａ  ２００６年、Ｓｐｒａｕｌら、１９９８年、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、３９巻（１１号）：２２０１−２２０２頁；Ｐｏｕｒｎａｒａｓら、２００６年、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、４７巻（４号）：１５８１−１５８６頁；Ｆｅｉｇｌら、２００７ａ、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｔｏｍ、９０巻（４号）：２６３−２７１頁；Ｆｅｉｇｌら、２００７ｂ、Ｅｙｅ、２１巻（６号）：６８９−６９６頁）。
【００４６】
一実施形態において、製剤に使用するためのヒドララジンはヒドララジン塩、例えば、塩酸ヒドララジンなどである。塩酸ヒドララジンは、分子量１９６．６４を有し、式Ｃ８Ｈ８Ｎ４・ＨＣｌを有する、白色からオフホワイト色の、臭気なしの結晶性粉末である。塩酸ヒドララジンＵＳＰは、水２５に対して１およびアルコール５００に対して１の割合で可溶性である。２％水溶液は約３．５−４．２のｐＨを有し、ｐＨ約３．５−４．５で極めて安定しているように見える。ｐＨプロファイルでは、塩酸ヒドララジンは、薬物がカチオン形態であるｐＨ３．５の付近で極めて安定していることを示している。カチオン形態である場合、２５℃、ｐＨ３．５での速度定数は、１０％未満の損失で（外挿で取得）、１．５年である。
【００４７】
好ましくは、ヒドララジン製剤は、ヒドララジンまたはこの塩、この置換もしくは非置換の誘導体を含む、眼用または眼科用溶液または製剤である。一つの特定の実施形態において、製剤は塩酸ヒドララジンを含む。別の実施形態において、製剤はヒドララジンの酢酸塩を含む。実施形態において、眼用溶液は水溶液である。
【００４８】
賦形剤
製剤中に含まれている典型的な賦形剤は、取り込み増強剤、粘稠化剤および安定性増強剤、緩衝剤、保存剤、キレート剤、滑沢剤、等張剤、ｐＨ調整のための酸および塩基、ならびに／または希釈剤を含む。
【００４９】
適切な緩衝剤は当技術分野で公知であり、制限なしで、酢酸塩、アスコルビン酸塩、トリス、酢酸ナトリウム三水和物、酢酸、クエン酸塩緩衝剤、ホウ酸塩、炭酸塩、酢酸塩および／またはリン酸塩が挙げられる。実施形態において、１種以上の緩衝剤が使用されている。１つの非限定的実施形態において、溶液または軟膏剤を生理学的に許容される範囲で維持するための適切な量の緩衝剤が溶液または軟膏剤中に含まれている。非限定的実施形態において、ｐＨ約３．８−７．５または３．８−４．４を維持するのに適切な量の緩衝剤が溶液または軟膏剤に加えられる。眼科用溶液のｐＨ範囲は、一般的に約３．０−７．７の範囲であり、大部分の眼科用溶液は約５−７ｐＨを有する。実施形態において、本発明の製剤のｐＨは、約３．０−７．７の間または約５−７の間である。他の実施形態において、眼科用溶液は、ｐＨ約３．５−４．５、３．５−４．２、３．５−４．０、３．８−４．４、または４．０−４．５を有する。使用される緩衝剤は、維持されるべきｐＨに依存することを理解されたい。他の実施形態において、ｐＨ調整剤を使用して、製剤のｐＨを調整することができる。当技術分野で公知であり、眼への局所用投与に対して適切な、任意のｐＨ調整剤を使用することができることを理解されたい。非限定的実施形態において、ｐＨ調整剤は、水酸化ナトリウムおよび／または塩酸から選択される。典型的な緩衝剤として、酢酸ナトリウム三水和物ＵＳＰおよび酢酸ＵＳＰ（２Ｎ）が挙げられる。さらなる典型的な緩衝剤は、酢酸ナトリウム三水和物ＵＳＰおよび酢酸ＵＳＰを含む、酢酸塩緩衝溶液ＵＳＰである。
【００５０】
制限なしで、エデト酸二ナトリウム二水和物を含めた、任意の適切なキレート剤が想定されている。適切な滑沢剤として、これらに限定されないがプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールおよびグリセリンが挙げられる。典型的なキレート剤はエデト酸二ナトリウム二水和物ＵＳＰである。典型的な滑沢剤はプロピレングリコールＵＳＰである。
【００５１】
等張剤は一般的に、生理学的に許容され、製剤と接触している細胞膜を通した水の正味の拡散を防止するために、製剤に適切な張度を付与する薬剤または化合物である。適切な等張剤として、これらに限定されないが、塩化ナトリウムを含めた塩ならびにデキストロースおよびラクトースなどの糖が挙げられる。眼の重量オスモル濃度は約２９０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。眼科用溶液に対する重量オスモル濃度範囲は一般的に、約２５０−３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間であり、大部分が約２９０−３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間に入る。実施形態において、本発明の製剤の重量オスモル濃度は、眼の重量オスモル濃度、またはこの付近であるべきである。特に、非限定的な実施形態において、本発明の製剤の重量オスモル濃度は一般的に、約２５０−３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間、または約２９０−３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間である。一つの特定の実施形態において、本発明の製剤の重量オスモル濃度は約３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。典型的な等張剤は塩化ナトリウムＵＳＰである。
【００５２】
一実施形態において、製剤は、約３．５と４．５との間のｐＨを有する。好ましい一実施形態において、製剤は、約３．８と４．４との間のｐＨを有する。別の実施形態において、製剤は、約４．０と４．４との間のｐＨを有する。
【００５３】
適切な保存剤は、当技術分野で公知であり、これらに限定されないが、塩化ベンザルコニウム、メチルパラベン、クロロブタノール、チメロゾール、プロピルパラベンおよびポリクオタニウム−１が挙げられる。ＦＤＡ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  ＯＴＣ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（最終報告期日：１９７９年１２月）によると、塩化ベンザルコニウムＵＳＰに対する、眼科用製剤中での使用の最大濃度は０．０１３％であり、メチルパラベンＮＦに対する最大濃度は０．１−０．２％である。塩化ベンザルコニウムＵＳＰは細菌に対して最も活性があるが、シュードモナスおよびカビに対してより弱いとみなされている。メチルパラベンＮＦは真菌およびグラム陽性細菌に対して最も活性があるが、グラム陰性細菌に対してより弱いとみなされている。典型的な保存剤として、塩化ベンザルコニウムＮＦおよび／またはメチルパラベンＮＦが挙げられる。
【００５４】
適切な希釈剤は当技術分野で公知であり、これらに限定されないが、精製水ＵＳＰおよび注射用の水が挙げられる。典型的な希釈剤として、水、特に注射用の水ＵＳＰおよび生理食塩水が挙げられる。
【００５５】
適切な増粘剤は当技術分野で公知であり、これらに限定されないが、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンが挙げられる。
【００５６】
典型的なヒドララジン製剤が表１に提示されており、製剤を調製する典型的な方法が実施例１に記述されている。
【００５７】
【表１】
2015519398.tif 000002
【００５８】
さらに一般的に、製剤は、活性のある治療剤、ヒドララジンおよび担体を含む。「担体」という用語は、これと共に活性化合物が投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような医薬としての担体は、水および油状物などの液体であってよく、石油、動物、植物または合成由来のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含む。医薬としての担体は、水、生理食塩水であってよく、リン酸緩衝食塩水、水性溶媒、ポリアルキレングリコール、石油ベースのゼリー、エチルセルロース、オレイン酸エチル、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジン、ミリスチン酸イソプロピル、ガムアカシア、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、ウレアなどを含む。活性化合物が静脈内に投与される場合、水がビヒクルとなり得る。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体担体として利用することができる。適切な医薬としての担体はまた、賦形剤、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、穀粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥した脱脂乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなども含む。さらなる適切な担体として、これらに限定されないが、グリシンおよびヒアルロン酸が挙げられる。本発明の組成物はまた、所望する場合、湿潤剤もしくは乳化剤および／またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。さらに、助剤、安定化剤、粘稠化剤、乳化剤、滑沢剤および／または着色剤を使用することができる。
【００５９】
対象に投与された場合、医薬として許容されるビヒクルは好ましくは滅菌である。適切な滅菌法は当技術分野で公知であり、これらに限定されないが、加熱殺菌、化学的殺菌および／または濾過殺菌が挙げられる。別の実施形態において、成分の１種以上を別個に滅菌し、製剤を無菌の条件下で調製してもよい。
【００６０】
本発明の組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、持続放出製剤の形態をとることができ、または使用するのに適切な任意の他の形態をとることができる。一実施形態において、医薬として許容されるビヒクルは眼科用溶液、懸濁液、乳濁液、軟膏または軟膏剤である。
【００６１】
投与のための組成物は、投与部位での疼痛を和らげるために、眼への投与に対して適切な局所麻酔薬を場合によって含むことができる。一般的に、成分は、別個に供給される、または単位剤形内で一緒に混合して供給される。
【００６２】
ＩＩＩ．製剤を調製する方法
一態様において、製剤は成分の段階的添加により調製し得る。ある実施形態において、本方法は、第１に、適切な量の緩衝溶液を適切な量の精製水に混合しながら加えるステップを含む。好ましくは、精製水は、最終製剤の容量を保持する適切なサイズの容器内に配置される。任意の適切な混合方法が許容される。好ましい方法は、連続的混合、例えば、当業者には周知のような撹拌プレートおよび回転棒により提供されるものなどである。緩衝溶液は、別個に調製しても、または商業的に購入してもよい。１つの非限定的実施形態において、緩衝溶液は酢酸塩緩衝溶液である。１つの非限定的実施形態において、酢酸塩緩衝溶液は、酢酸ナトリウム、酢酸および精製水を含む。このような緩衝溶液は、購入しても、または調製してもよい。緩衝剤は適切なｐＨで選択され得る。典型的な実施形態において、酢酸塩緩衝溶液は、約４．２−４．６のｐＨを有する。特定の実施形態において、緩衝剤は４．２のｐＨを有する。非限定的例として、酢酸塩緩衝溶液は、１．７５ｇの酢酸ナトリウムおよび１８．６ｍｌの酢酸２Ｎを、精製水（１０００ｍＬになるまで適量）と共に１Ｌメスフラスコに加えることによって調製することができる。この典型的な緩衝溶液は、約４．２のｐＨを有するべきである。緩衝溶液が購入されるのではなく、むしろ調製された場合、緩衝液を調製する前のステップが必要となることを理解されたい。
【００６３】
第２に、適切な量の１種以上のキレート剤、例えば、エデト酸二ナトリウム二水和物などを、混合しながら緩衝化溶液に加え、キレート化剤が完全にまたはほぼ溶解するまで生成した溶液（Ａ）を混合する。第３に、１種以上の滑沢剤を混合しながらこのＡ溶液に加える。生成した溶液（Ｂ）を、滑沢剤が完全にまたはほぼ溶解するまで混合する。眼科用製剤における使用に対して適切な任意の滑沢剤が想定されている。１つの非限定的実施形態において、滑沢剤はプロピレングリコールである。第４に、１種以上の等張剤を混合しながらＢ溶液に加える。生成した（Ｃ）溶液を、等張剤が完全にまたはほぼ完全に溶解するまで混合する。第５に、１種以上の保存剤を混合しながらＣ溶液に加える。生成した（Ｄ）溶液を、保存剤が完全にまたはほぼ完全に溶解するまで混合する。第６に、これに限定されないが、塩酸ヒドララジンを含めた１種以上の治療剤を混合しながらＤ溶液に加える。生成した（Ｅ）溶液を、治療剤が完全にまたはほぼ完全に溶解するまで混合する。１種類を超える成分、例えば、２種以上の保存剤が使用されている場合、成分は一緒にまたは別個に加えてもよいことを理解されたい。成分が別個に加えられる場合、次の成分が加えられる前にこの溶液は完全にまたはほぼ完全に混合されてもよい。製剤パラメータが測定されてもよく、製剤は適宜調整されてもよい。例えば、ｐＨは測定され、必要であれば、調整されてもよい。
【００６４】
典型的な製剤の調製が実施例２に詳述されている。実施例２に提示されたデータにより証明されたように、この調製方法は驚くほど安定した製剤を生成する。表８−１０に見られるように、この０．５％および１．０％塩酸ヒドララジン製剤は、点眼容器内のすべての３つの温度において好ましく安定している。すなわち、製剤の大部分について、１カ月および２カ月の保存後、３つの温度のそれぞれにおいて、活性剤のｗ／ｗ％の低減は約１％未満とかなり少なかった。製剤の多くについて、１カ月および２カ月の保存後、３つの温度のそれぞれにおいて、活性剤のｗ／ｗ％の低減は約０．５％未満とかなり少なかった。０．５％および１％製剤は、１カ月、２カ月および３カ月後、特に４℃および２５℃での保存で、極めて安定していた。２％製剤はまた極めて安定しており、２５℃での保存で最も安定していた。製剤はまた約４．０−６．６のｐＨでも極めて安定していたが、データは示されていない。保存用ガラスバイアル内で、ｐＨ４．０−５．５で製剤を保存後（１週間から１カ月）、活性剤の１００％が回収された。
【００６５】
投薬
加齢黄斑変性の処置または予防に効果的な活性化合物の量は、標準的な研究技術で求めることができる。例えば、加齢黄斑変性の処置または予防に効果的である活性化合物の用量は、活性化合物を、モデル、例えば、当業者に公知の動物モデル、または他のモデル、例えば、コンピュータモデルなどの動物に投与することによって求めることができる。さらに、インビトロアッセイを利用することによって、最適な用量範囲を特定するのを場合によって助けることができる。
【００６６】
ある特定の有効投与量の選択は、当業者に公知であるいくつかの要素を考慮に入れて、当業者により決定することができる（例えば、治験を介して）。このような要素として、処置すべきまたは予防すべき疾患、関連する症状、対象の体重、対象の免疫の状態および当業者に公知の他の要素が挙げられる。
【００６７】
ヒトなどの対象に投与される活性化合物の投与量は可変であり、独立した判断の対象となり得る。多くの場合、活性化合物の１日量を１日の様々な時間に投与するのが実用的である。しかし，任意の所与のケースにおいて、投与される活性化合物の量は、活性構成成分の溶解度、使用される製剤、対象の状態（例えば体重など）および／または投与経路などの要素に依存することになる。
【００６８】
活性化合物の有効量の一般的範囲は、単独でまたは別の予防用もしくは治療用薬剤と組み合わせて、約０．００１ｍｇ／日から約１０００ｍｇ／日であり、より好ましくは約０．００１ｍｇ／日７５０ｍｇ／日であり、より好ましくは約０．００１ｍｇ／日から５００ｍｇ／日であり、より好ましくは約０．００１ｍｇ／日から２５０ｍｇ／日であり、より好ましくは約０．００１ｍｇ／日から１００ｍｇ／日であり、より好ましくは約０．００１ｍｇ／日から７５ｍｇ／日であり、より好ましくは約０．００１ｍｇ／日から５０ｍｇ／日であり、より好ましくは約０．００１ｍｇ／日から２５ｍｇ／日であり、より好ましくは約０．００１ｍｇ／日から１０ｍｇ／日であり、より好ましくは約０．００１ｍｇ／日から１ｍｇ／日である。当然、化合物の１日量を１日の様々な時間に少しずつ投与するのが多くの場合実用的である。しかし、任意の所与のケースにおいて、投与される化合物の量は、活性構成成分の溶解度、使用される製剤、対象の状態（例えば体重など）および／または投与経路などの要素に依存することになる。
【００６９】
ＩＶ．処置方法
一態様において、本製剤は眼疾患の処置に有用である。いくつかの非限定的実施形態において、製剤は、黄斑変性を処置し、予防し、この進行を停止および／または遅延させるのに有用である。他の非限定的実施形態において、本製剤は糖尿病性黄斑浮腫を処置するのに有用である。
【００７０】
Ａ．黄斑変性
黄斑変性は、眼の中心視の焦点を絞ることに関与しているエリアである、網膜黄斑として知られている網膜の中心部分の劣化により引き起こされる。黄斑変性は、年齢５０才未満の個人に影響を及ぼす黄斑ジストロフィーならびに加齢黄斑変性（ＡＭＤまたはＡＲＭＤ）の両方を指すことを意図している。
【００７１】
加齢黄斑変性は、５０才を超える年齢の成人における視力損失の主要な原因であり、世界中の失明全体の３番目に主要な原因である（国立眼学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｙｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））。ＡＭＤは、ドライ型（萎縮性、非新生血管性、非浸出性）または滲出型（新生血管性、浸出性）の形態と特徴づけることができる。
【００７２】
ＡＭＤの発症および進行に関与している細胞の変化と分子の変化との間の関係は明らかに理解されていないが、臨床経過はより良く描かれている。ＡＭＤは、網膜黄斑の下位にある支持的網膜色素上皮（ＲＰＥ）およびブルッフ膜に、老化による非浸出性（ドライ型）変化が生じることから開始する。非浸出性のＡＭＤは、さらに重症の萎縮性ＡＭＤ（地図状萎縮としても知られている）にまで進行し、また網膜黄斑の下から増大する病的脈絡膜の新生血管性膜を特徴とする浸出性（滲出型）形態を発症する可能性がある。重症の視力損失は通常、浸出性の形態を発症するすべてのＡＭＤ患者の１０−１５％と関連する；しかし、ＡＭＤから生じた正当な失明のうちの２０％までが進行した萎縮性、非浸出性の形態によるものである。
【００７３】
ドライ型形態は非新生血管性であり、ＡＭＤ症例の約９０％を占め、ドルーゼと呼ばれる複数の、小型の、丸い、黄色−白色のスポットで特定される。これらのスポットは通常、外網膜のレベルで、眼の裏に位置する。これらのスポットを有する対象は、優れた視力を有し、症状がないこともある。ドルーゼは網膜と脈絡膜との間に蓄積することがあり、これによって、網膜剥離を引き起こし得る。非浸出性ＡＭＤは、３つの臨床的段階を有する：初期、中間および後期。これらの段階は、ＲＰＥにおける異常の程度に加えて、網膜黄斑の下の黄色のドルーゼ堆積物の程度およびサイズにより臨床的に特徴づけられている。初期の非浸出性ＡＭＤでは、ドルーゼのサイズは小型から中間であり、色素異常は最小から無しである。非浸出性ＡＭＤが地図状萎縮へと進行するまでには、臨床的知見は、広範な黄斑のドルーゼの段階を通り、ＲＰＥの局所的な閉塞を示している。ＲＰＥの地図状萎縮は、これが中心の網膜黄斑（すなわち、窩）の下に位置した場合、この上にある光受容体および機能的視力の損失をもたらす。
【００７４】
新生血管性、滲出型の形態において、新しく作り出された異常な血管は、網膜の中心の下で増大する。これらの血管は、漏れ出し、出血し、網膜を傷つけ、視力をゆがめ、または中心視を破壊する。視力のゆがみは一方の眼において始まり、後で他方の眼に影響を及ぼし得る。滲出型形態はＡＭＤ症例の１０％を占めるが、ＡＭＤで引き起こされた視力損失の９０％を占める。年間、ドライ型ＡＭＤの症例の１０％が滲出型ＡＭＤへと進行していることが推測されている。
【００７５】
いくつかの要素が潜在的にＡＭＤの発症および進行に関与している。心疾患およびＡＭＤは、リスクファクターとして高血圧症および無症候性アテローム性動脈硬化症を共有するという所見は、ＡＭＤの病因の血流力学モデル（また血管系モデルとして知られている）の開発につながった。ＡＭＤは、硬化した堆積物、眼組織のコンプライアンスの低減および脈絡膜の脈管構造を介した血流の低減が疾患進行につながる血管系疾患の形態であることを、このモデルは全身性血管系疾患と同じ方式で強く主張している。特に、モデルは、網膜黄斑内の脂質の進行性の浸潤および堆積が眼組織のコンプライアンスを低減させ、黄斑の脈絡毛細管枝を狭めると断言している。この脈絡毛細管枝の狭小化は、年齢に伴う普通の狭小化と相まって、静水圧の上昇と共に血流をさらに低減させる。次に、これがＲＰＥにより分泌されるリポタンパク質および他の物質のクリアランスを減少させる。結果は臨床的に明らかなドルーゼおよび色素性の変化、ならびにブルッフ膜の石灰化および破断であり、これらが脈絡膜血管新生をもたらす。
【００７６】
炎症もまたＡＭＤにおいてある役割を果たすという増大する数の証拠が存在する。補体構成成分は、ＡＭＤにおいて最も良く理解されている炎症性メディエーターである。補体Ｃ５、および補体構成成分５ｂ−９からなる膜侵襲複合体がドルーゼ中に検出された。同様に、様々な研究により、ドルーゼ、ＲＰＥ細胞および／またはブルッフ膜に限局している免疫複合体、補体および／または補体調節タンパク質の存在が示された。さらに、多くの遺伝子研究がＡＭＤにおける補体の役割を裏付けている。さらに、組織破壊性マクロファージはＡＭＤを悪化させると考えられている。したがって、脈絡膜血流を治療により増加させること、酸化ストレスを減少させることおよび／または慢性炎症を制御することのうちの１種以上により、ＡＭＤを有意に処置し、および／またはこの進行を遅延させることができる。
【００７７】
黄斑変性の１つの症状は中心視の変化である。患者は、読書時に、かすんだ中心視またはページ上のブランクスポットに気が付くこともある。患者は、視覚的ゆがみ、例えば、曲がった直線などに気が付くこともある。像がより小さく見えることもある。色知覚における変化に気が付く患者もいれば、異常な光感覚を経験する患者もいる。これらの症状は突発的に現れ、徐々に重くなっていくこともある。
【００７８】
本明細書で使用されているように、黄斑変性の診断は、対象における黄斑の変化または機能の任意の分析が必要となり得る。任意の特定の方法に限定されることは意図されていない。例えば、眼の検査者、例えば、医師は、瞳孔を点眼剤で広げ、ドルーゼの黄色の隆起、眼の病変の存在について、または薄化などの網膜黄斑の全体の変化について網膜を観察することで、眼の内部を検査することができる。眼の検査者はまた、中心視にブランクスポットを探す視野試験を施すこともできる。検査者は、網膜内の血管が漏れているかどうかを判定するためにフルオレセイン血管造影（蛍光色素の静脈内投与と、これに続く、眼の裏の外観検査および写真）を要求することもできる。
【００７９】
黄斑変性を有することに対するいくつかのリスクファクターとして、年齢、喫煙および飽和脂肪が豊富な食生活が挙げられる。この他に、遺伝子の継承または環境的曝露により黄斑変性に対するリスクが高くなり得る者もいる。
【００８０】
実施形態において、本明細書に記載された方法は、加齢黄斑変性の処置または予防に関し、好ましくは防止的予防および処置に関する。他の実施形態において、本明細書に記載された方法は、本明細書に記載された製剤を用いて、加齢黄斑変性を予防するまたはこの進行を遅延させることに関する。一実施形態において、本明細書に記載された製剤で非浸出性または浸出性のＡＭＤと診断された患者におけるＣＮＶを予防または遅延させる方法が想定されている。
【００８１】
一実施形態において、１％（ｗ／ｗ）ヒドララジン眼科用溶液は、病気に冒された、１つ以上の眼に毎日少なくとも１回滴下され、他の実施形態において、毎日１回から５回滴下される。他の実施形態において、０．５％−４％ｗ／ｗのヒドララジン眼科用溶液は、病気に冒された、１つ以上の眼に毎日少なくとも１回滴下され、他の実施形態において、毎日１回から５回滴下される。またさらなるに実施形態において、０．５％−２％ｗ／ｗのヒドララジン眼科用溶液は、病気に冒された、１つ以上の眼に毎日少なくとも１回滴下され、他の実施形態において、毎日１回から５回滴下される。一つの特定の実施形態において、１％ｗ／ｗのヒドララジン眼科用溶液は、病気に冒された、１つ以上の眼に毎日少なくとも１回滴下され、他の実施形態において、毎日１回から３回滴下される。
【００８２】
実施例３に示されている安全性データから見られるように、本明細書に記載された方法に従い調製した塩酸ヒドララジン眼科用溶液は安全であり、一般的にヒトに十分に許容され、治療下で発現する有害事象（ＡＥ）は低い発生率で起こるが、この有害事象は、全般的に軽度の重症度であり、２つの対象集団の間で比較的均等に分布していた。研究の過程において有意な有害事象（ＳＡＥ）、死亡および他の臨床的に有意な安全性の知見は何もなかった。眼の充血が、この研究における対象の大部分により報告された、最も共通して報告された治療関連の眼のＡＥであった。眼の充血の発生率は、ヒドララジンの抹消血管拡張作用と一致し、予期せぬことではなかった。したがって，局所用塩酸ヒドララジン製剤の反復投与は安全であり、ヒトに十分許容されていた（Ｒａｌｓｔｏｎら、２０１０年、ＡＲＶＯ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ、Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．９１３／Ａ１９６）。
【００８３】
実施例４および５は、本明細書に記載された方法に従い調製された、本明細書に記載された製剤を使用した単回投与および反復投与研究について記述している。実施例５において、ウサギモデルを使用して、２８日の、ＧＬＰ適合した、反復投与を行った眼の研究は、初期の投薬において生じていた眼への刺激が、反復投薬中に十分に許容されるようになることを示している。いかなる有意な投与量関連の毒性もないことは、この特に感受性の動物モデルにおいて少なくとも２．０％ｗ／ｗまでの塩酸ヒドララジンの濃度での安全性に対して妥当な潜在能力があることをさらに示している。
【００８４】
脈絡膜血流の減少および焦点虚血が初期のＡＭＤへとつながる事象の進行における原因因子となり得ることが提案されてきた（Ｆｅｉｇｌら、２００７ｂ年）。さらに、脈絡膜および網膜における低酸素の長期的作用が、初期から後期ＡＭＤの進行の特徴である、内皮増殖因子のアップレギュレーションおよび脈絡膜新生血管性増大の発生に関与していることが提案された（Ｆｅｉｇｌら、２００７ｂ年）。実施例６に示されているように、ヒドララジン１．０％点眼剤の滴下は、ウサギの眼のモデルにおいて脈絡膜血流を有意に改善させた。図１に見られるように、１％ヒドララジン製剤を滴下後３０分で、脈絡膜血流は、起始点より維持されたばかりでなく、実際に改善された。対照的に、対照の滴下は、脈絡膜血流の低減をもたらした（図１を見ると約４０％低減した）。３０分後、１％ヒドララジン製剤での処置により、脈絡膜血流は少なくとも約７５％多くなり、または対照よりも少なくとも約３倍から４倍多くなった。対照的に、対照での処置は脈絡膜血流を約４０％低減させた。また図１からも見られるように、ヒドララジン製剤の滴下後６０分で、脈絡膜血流は少なくとも約６５％多くなり、または対照よりも少なくとも約２倍から３倍多くなった。１２０分後、１％ヒドララジン製剤での処置により、脈絡膜血流は少なくとも約５０％多くなり、または対照よりも少なくとも約２倍多くなった。対照的に、対照での処置は、脈絡膜血流を約３０％低減させた。脈絡膜血流の増加は、対照と比較して、少なくとも２時間維持された。レーザー誘発性ＣＮＶモデルにおいて、４週間のヒドララジン点眼剤の導入（すべての濃度において）は、ＣＮＶ形成の面積を有意に減少させた。実施例７を参照されたい。ＣＮＶ形成に対するヒドララジン製剤（０％、０．５％、１％および２％。ｗ／ｗ）の作用が図２および３に示されている（それぞれフルオレセインまたは脈絡膜フラットマウントで測定）。図２に見られるように、ヒドララジン製剤のそれぞれは、フルオレセインで測定したＣＮＶ面積を減少させた。０．５％製剤は、ＣＮＶ面積を約３３％減少させた。１％製剤は、ＣＮＶ面積を約３０％減少させ、一方で２％製剤はＣＮＶ面積を約２６％減少させた。図３に見られるように、ヒドララジン製剤のそれぞれは、脈絡膜フラットマウントで測定されたＣＮＶ面積を減少させた。０．５％製剤はＣＮＶ面積を約２０−２５％減少させた。１％製剤は、ＣＮＶ面積を約２５％減少させ、一方で２％製剤はＣＮＶ面積を約３０−３５％減少させた。さらに、実施例８に記載されたように、ＨＵＶＥＣのインビトロでの管形成（これは、抗血管新生活性の徴候とみなすことができる）がヒドララジンにより阻止された。これらのデータは、ヒドララジンは、複数の作用機序を有し得、脈絡膜血流の改善および新たな血管形成の阻止の両方を介してＣＮＶ形成の程度を減少させることができたことを示唆している。
【００８５】
ＲＰＥにおける細胞上でのヨウ素酸ナトリウムの選択性の毒性は、長年の間公知である（Ｎｏｅｌｌ、１９５３年、Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、３６巻（６：２）：１０３−１１６頁）。ＲＰＥの損傷および機能障害は、ＡＭＤの進行における初期事象のうちの１つと考えられる。したがって、網膜のＲＰＥ層内に化学物質誘発性損傷を選択的に作り出すというこのアプローチは、ＡＭＤに対する潜在的治療法を調べるために使用されてきた（Ｌｉら、２００６年、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、４７巻（４号）：１６４６−１６５２頁；Ｏｂａｔａら、２００５年、Ｅｙｅ、１９巻（４号）：４６４−４６８頁）。実施例９および１０に示されているように、高濃度のＮａＩＯ３は、インビトロにおいてヒトＲＰＥ細胞に対して毒性を持つ。文献の報告と一致して、ＮａＩＯ３の単回静脈内注射は、時間依存的および投与量依存的形式でラットの網膜に有意な損傷を引き起こした。高投与量のＮａＩＯ３は、組織病理学で示されているように網膜全体に損傷を引き起こし、光受容体細胞（ａ波）、神経網膜（ｂ波）およびＲＰＥ細胞（ｃ波）から生じる電気生理学的信号の抑制を引き起こした。注射されたＮａＩＯ３投与量を調整することによって、ラットにおいて、損傷がＲＰＥ細胞に限定されているように見える条件が特定された。ＥＲＧ  ｃ波信号は抑制されていたが、ａ波およびｂ波信号は正常レベルのままだった。ＮａＩＯ３誘発性の、ｃ波信号の選択的抑制は４週間超持続した。したがって、これらのパラメータは、非浸出性ＡＭＤに対するラットモデルとして有用となり得る。
【００８６】
このモデルにおいて、これらの最適化された条件（３５ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３および注射後４週間）を使用して、ヒドララジン１．０％眼科用溶液を毎日３回、４週間の実験継続時間の間滴下すると、ＮａＩＯ３の注射により作り出されたＥＲＧ  ｃ波信号に観察された電気生理学的欠乏が有意に低減したことが示された（実施例１０）。図４に見られるように、ＮａＩＯ３の滴下は、対照と比較して、ＥＲＧ  ｃ波において７０％の低減をもたらした。１％ヒドララジン製剤の滴下はＥＲＣ  ｃ波信号の約５０％の低減しかもたらさなかった。したがって、１％ヒドララジン製剤の滴下は、ＮａＩＯ３単独の注射と比較して、ＥＲＧ  ｃ波信号の約２０％を維持した。実施例１０に記載されたデータはまた、局所用導入は保護作用を発揮するのに十分なヒドララジンを網膜に送達することを示している。ヒドララジンがＮａＩＯ３誘発性損傷からＲＰＥを保護する機序は、脈絡膜血流を増加させる薬物の能力またはその抗酸化特性に関係し得る。網膜への血液および酸素の流れを増加させることによって、ヒドララジンは、非浸出性加齢黄斑変性の発症を延期させることもあり、初期段階（ドライ型）ＡＭＤに対する処置として使用することができる。ある実施形態において、本明細書に記載された製剤は、非浸出性または浸出性のＡＭＤと診断された患者において脈絡膜血流を増加させる方法において有用である。
【００８７】
ラットにおけるＮａＩＯ３誘発性ドライ型ＡＭＤモデルの結果は、実施例９および１０において記載されたように、ＮａＩＯ３への曝露で誘発させた損傷から網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を保護する、したがってドライ型ＡＭＤの患者において、視覚的機能を保護し、恐らく回復させる、塩酸ヒドララジン製剤の能力を示している。
【００８８】
ＲＰＥ細胞の損失は、ＡＭＤの初期段階の主要な症状であると提案されている（Ｃａｉら、Ｐｒｏｇ  Ｒｅｔｉｎ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ、２０００年、１９巻（２号）：２０５−２２１頁）。酸化ストレスは、ＲＰＥ細胞の損失およびＡＭＤの病因においてある役割を果たし得る（Ｂｅａｔｔｙら、２０００年、Ｓｕｒｖ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、４５巻（２号）：１１５−１３４頁；Ｆｉｎｋｅｌら、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ、４０８巻（６８０９号）：２３９−２４７頁）。現存する保護的機序の減少または反応性酸素種（ＲＯＳ）の数および濃度の増加による酸化ストレスの増加が、ある程度、ＡＭＤの病因の一因となっていると考えられている（Ｂｏｕｌｔｏｎら、１９９４年、Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、７８巻（２号）：１２５−１２９頁）。ヒドララジンは、ＡＭＤの処置において有用となり得る抗酸化特性および血管拡張性特性を有する。
【００８９】
低酸素は酸化ストレス誘発性機序を介してＲＰＥ細胞の死を引き起こすことができることがさらに報告されている（Ｃａｉ、２０００年）。低酸素および酸化的外傷に関連したいくつかの作用が存在し（Ｅｍｅｒｉｔら、１９９８年、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｑｕｉｎｔａｎｉｌｈａ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）、これらは、ミトコンドリアの酸化的リン酸化の脱共役およびアデノシン三リン酸のアデノシン二リン酸への分解を含む。さらに、Ｏ２分圧の突発的低減は、しっかりと制御された電子伝達鎖からのフリーラジカルの放出を可能にし、これらＲＯＳと隣接する膜脂質との反応が結果として膜および細胞の損傷を生じる。細胞を低酸素誘発性損傷から保護するヒドララジンの能力を評価するために、ＡＲＰＥ−１９細胞を、低酸素に制御されたチャンバー内で低酸素環境に曝露させて（１％Ｏ２）、様々な濃度のヒドララジンと共に２４−７２時間インキュベートした。１μｇ／ｍＬのヒドララジン製剤は、４８時間および７２時間の時点で、ＡＲＰＥ−１９細胞に対する低酸素誘発性損傷を有意に減少させた。このデータは、ヒドララジンは、低酸素誘発性細胞損傷を予防することができるが、低酸素を化学的に模倣することを意図した化学物質（ＮａＮ３）誘発性細胞損傷は予防することができないことを示している。理論に関して制限されることなく、この差は、低酸素条件下で化学薬品ＮａＮ３およびミトコンドリアから放出されたＲＯＳにより引き起こされた細胞傷害の機序が異なるためであってよい。
【００９０】
実施例１１に記載されたように、ヒト網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９細胞）をインビトロで使用して、ヒドララジンの抗酸化特性を調べ、ＲＯＳ関連の損傷または低酸素関連の損傷から細胞を保護するヒドララジンの能力を評価した。
【００９１】
フリーラジカルは奇数の、不対電子を有する分子である；この不対電子は、分子を不安定にし、極めて反応性にする（Ｆａｎｔｏｎｅら１９８５年、Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ、１６巻（１０号）：９７３−９７８頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８６年、Ｐｒｏｇ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｉｓ、２８巻（６号）：４４９−４６２頁；ＭｃＣｏｒｄら、１９８５年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３１２巻（３号）：１５９−１６３頁）。酸素フリーラジカル、超酸化物アニオン（Ｏ２−）、ヒドロキシル基（ＯＨ−）およびこれらの中間の、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が虚血中におよび再灌流の際に組織内に作られると考えられている。これらのＲＯＳは、以下を含めた多種多様な経路を介して細胞に細胞傷害性となり得る：脂肪酸との反応、これが、膜内の脂質過酸化物の形成へとつながる；タンパク質中のアミノ酸の酸化；スルフヒドリル基の酸化；およびポリペプチド鎖の切断（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、１９８６年、ＭｃＣｏｒｄ、１９８５年、Ｋｌｏｎｅｒら、１９８９年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８０巻（５号）：１１１５−１１２７頁）。
【００９２】
Ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔ−ＢＨＰ）、有機ヒドロペルオキシド（Ｒｕｓｈら、１９８５年、Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、７８巻（３号）：４７３−４８３頁）は、肝実質細胞内でグルタチオンペルオキシダーゼにより代謝され、酸化グルタチオンを生成することができる（Ａｌｉａら、２００６年、Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２１２巻（２号）：１１０−１１８頁）。グルタチオン（ＧＳＨ）の枯渇およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の酸化は、カルシウムホメオスタシスの変化を伴い、細胞生存度の損失へとつながる（Ｍａｒｔｉｎら、２００１年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、６２巻（６号）：７０５−７１２頁）。代わりに、ｔ−ＢＨＰは、チトクロムＰ４５０酵素および遊離鉄依存性反応により、このペルオキシルおよびアルコキシルフリーラジカルに変換され得る。これらのフリーラジカルは、続いて脂質過酸化を開始することができ、細胞分子（例えば、ＤＮＡおよびタンパク質など）と共有結合を形成し、ＧＳＨレベルをさらに低減する。後者の作用は、カルシウムホメオスタシスを変化させることに加えて、ミトコンドリアの膜電位に影響を及ぼし、最終的に細胞死を引き起こす（Ｖａｎ    ｄｅｒ  Ｚｅｅら、１９９６年、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ、２０巻（２号）：１９９−２０６頁；Ｈｉｘら、２０００年、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ、１３巻（１０号）：１０５６−１０６４頁）。ＲＯＳ（Ｍａｒｔｉｎ、２００１年；Ｌｉｍａら、２００６年、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ、７９巻（２１号）：２０５６−２０６８頁）、ｔ−ＢＨＰラジカル（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｅｅ、１９９６年；Ｄａｖｉｅｓ、１９８９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、２５７巻（２号）：６０３−６０６頁）および細胞内鉄イオン（Ｈｉｘ２０００）がｔ−ＢＨＰの毒性に関与していることは明らかである；これらのパラメータに対する直接的作用は、損傷のレベルを減少させる傾向にある。Ｈ２Ｏ２は、細胞内の鉄とのフェントン反応により、大部分の有機物質を分解することが可能な、極めて反応性の高いヒドロキシルラジカル（．ＯＨ）を形成することができる（Ｐｅｓａｋｈｏｖら、２００７年、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１７６８巻（３号）：５９０−５９７頁）。実施例１１に示されているデータによると、ヒドララジンは、ｔ−ＢＨＰおよびＨ２Ｏ２誘発性細胞傷害性から細胞を保護することができる。
【００９３】
実施例１１および本明細書に記載されたように、３種の酸化ストレス誘発薬剤（Ｈ２Ｏ２、ｔ−ＢＨＰおよびＮａＮ３）を使用して、ＲＯＳ誘発性損傷および低酸素誘発性損傷からＡＲＰＥ−１９細胞を保護するヒドララジンの能力を評価した。ヒドララジン製剤は、濃度依存的方式でｔ−ＢＨＰ誘発性およびＨ２Ｏ２誘発性の酸化ストレス損傷を阻害したが、ＮａＮ３で引き起こされた損傷に対してはわずかな作用しかなかった、または作用がまったくなかったことをデータは示した。
【００９４】
ヒドララジン製剤は、０．０１ｍＭおよび０．０３ｍＭのｔＢＨＰでの侵襲後、明らかに濃度依存的方式でｔＢＨＰ誘発性細胞損傷の統計学的に有意な阻害を示した。０．０１と０．０３ｍＭの両方のｔＢＨＰでの侵襲後の最大生存能力保護作用が、１００μｇ／ｍＬのヒドララジンで観察された。
【００９５】
ヒドララジン製剤は、０．３ｍＭおよび１．０ｍＭのＨ２Ｏ２での侵襲後、明らかに濃度依存的方式でＨ２Ｏ２誘発性細胞損傷の統計学的に有意な阻害を示した。０．３ｍＭのＨ２Ｏ２での侵襲後、最大生存能力保護作用が３０μｇ／ｍＬのヒドララジンで観察され、０．３ｍＭのＨ２Ｏ２での侵襲後、最大生存能力保護作用が３０μｇ／ｍＬのヒドララジンで観察された。最大逆転作用が、４８時間および７２時間の時点で、１μｇ／ｍＬのヒドララジンに見られた。
【００９６】
ミトコンドリア毒素は、インビボでの一過性虚血中に生じる可逆的エネルギー不全を修正するグルタメート中毒（グルタミンにより引き起こされる中毒であり、これは細胞内部位でカルシウムの氾濫を誘発することによって細胞を死滅させる興奮性薬剤である）の代替物となり得る。アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）は、細胞培養物において（Ｖａｒｍｉｎｇら、１９９６年、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ、４４巻（１号）：４０−４６頁；Ｇｒａｍｍａｔｏｐｏｕｌｏｓら、２００４年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ、５０巻（３号）：２９９−３０６頁；Ｇｒａｍｍａｔｏｐｏｕｌｏｓら、２００２年、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ、９９巻（２号）：１１４−１２４頁）ならびにインビボ実験において（Ｖｅｃｓｅｉら、２００１年、Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ、１０８巻（３号）：２７３−２７８頁）、「化学的虚血」を誘発させるためにすでに使用されている。この正確な作用機序は、部分的に不明のままである。作用は普通、シトクロムｃオキシダーゼの呼吸鎖複合体ＩＶ阻害に起因し、超酸化物は電子移動連鎖の遮断後、ミトコンドリアから放出される主要生成物となり得る（Ｄｕｒａｎｔｅａｕら、１９９８年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７３巻（１９号）：１１６１９−１１６２４頁）。示されていない他の実験において、ＡＲＰＥ−１９細胞は、ＮａＮ３単独に、またはヒドララジンの存在下で曝露された（１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍＬの濃度で）。ＮａＮ３（０．１−１００ｍＭ）による侵襲およびヒドララジンでの処置後、生存可能なＡＲＰＥ細胞の割合をＭＴＴアッセイで測定すると、ヒドララジンで処置したＡＲＰＥ−１９細胞では、ＮａＮ３で化学的に誘発された低酸素に対して有意な作用が見られなかった。これらの実験において、ヒドララジンは、ＮａＮ３誘発性細胞傷害性を逆転しなかったが、これは、ヒドララジンは、ミトコンドリア誘導性ＲＯＳに拮抗しないことを示し得る。
【００９７】
したがって、ヒドララジン製剤は、インビトロで低酸素誘発性損傷からの有意な保護をＡＲＰＥ−１９細胞に対してもたらす。理論に関して制限されることなく、この作用は、ＲＯＳをクエンチするヒドララジンのフリーラジカルスカベンジ作用が原因となり得る。ＲＰＥ細胞への酸化ストレス媒介性損傷に関与している細胞内シグナル伝達は依然として十分に理解されていないが、ＲＰＥ細胞における抗酸化性防御または酸化ストレス応答の仲介のいずれかに関与している化学物質の同定は、ＡＭＤに対する治療的ストラテジーの将来の発展を可能にするはずである。ヒドララジンは、低酸素およびＲＯＳで引き起こされる損傷からＲＰＥ細胞を保護し、したがって加齢黄斑変性（ＡＭＤ）および虚血性網膜症を処置する潜在能力を有している。
【００９８】
ヒドララジンの眼および全身性安全性プロファイルは十分に確立されており、以前の非臨床的および臨床的研究ならびに５０年にわたる全身性使用の歴史に基づき十分に理解されている。このデータは、塩酸ヒドララジン眼科用溶液を用いたドライ型ＡＭＤの処置に対する実施例６の結果により裏付けされている。
【００９９】
Ｂ．糖尿病性黄斑浮腫または糖尿病性黄斑変性
別の非限定的実施形態において、本明細書に開示された製剤は、糖尿病性黄斑浮腫または糖尿病性黄斑変性を処置または予防するのに有用である。糖尿病性黄斑変性は、糖尿病による網膜黄斑の劣化である。類嚢胞黄斑変性とは、黄斑領域内での液体充満エリア（嚢胞）による網膜黄斑における視力の損失である。これは、他の障害、炎症、または強度近視の結果であることもある。
【実施例】
【０１００】
以下の実施例は本来例示的であり、決して限定することを意図しない。
【０１０１】
［実施例１］
ヒドララジン製剤
ヒドララジン眼科用溶液としての使用のための製剤を調製した。５３０６ｇの精製水ＵＳＰを、回転棒を備えた６Ｌフラスコに、混合しながら加えた。酢酸ナトリウムおよび酢酸（２Ｎ）を含む、６００ｇの酢酸塩緩衝溶液（ｐＨ４．２）を、６Ｌフラスコ内の精製水に撹拌しながら加えた。均一になるまで混合を継続した。０．９ｇのエデト酸二ナトリウムＵＳＰをフラスコに加え、溶解するまで混合した。次に、６０ｇのプロピレングリコールＵＳＰをフラスコに加え、溶解するまで混合した。次に、３０ｇの塩化ナトリウムＵＳＰをフラスコに加え、溶解するまで混合した。１．２ｇの塩化ベンザルコニウム５０％溶液ＮＦをフラスコに加え、均一になるまで混合した。最後に、１．８ｇのメチルパラベンＮＦをフラスコに加え、溶解するまで混合した。生成した溶液のｐＨは４．４であった。
【０１０２】
ヒドララジン製剤を調製するため、次いで、塩酸ヒドララジンのある量を溶液に加え、均一になるまで混合した。
【０１０３】
［実施例２］
ヒドララジン製剤の保存安定性
０．５％、１％および２％の塩酸ヒドララジン製剤を本質的に実施例１に記載されたように調製して、製剤の安定性を査定した。製剤の成分およびパーセンテージが以下の表３に示されている。
【０１０４】
【表２】
2015519398.tif 000003
【０１０５】
対照製剤を、ゴム張りしたキャップ付の８ｍＬのＥ−Ｃアンバーガラス試料バイアル（Ｉｔｅｍ  ２２４７３５、Ｌｏｔ  １４０２５６５、Ｗｈｅａｔｏｎ、Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ、ＮＪ）内に入れた。塩酸ヒドララジン製剤を、１３ｍｍのＬＤＰＥ制御された滴下先端、４０μＬおよび１３ｍｍ−４２５ポリプロピレン仕上げの密閉を有するビーズ点眼容器付の６ｃｃのＬＤＰＥ円形シリンダー内に入れた（Ｃｏｍａｒ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ、Ｂｕｅｎａ、ＮＪ）。製剤を、４℃±２℃、２５℃±２℃および４０℃±２℃で３カ月保存することによって、室温での保存、冷蔵保存および高温保存について査定した。活性成分のｐＨ、重量オスモル濃度およびｗ／ｗ％を、ゼロの時点で試験し、結果が以下の表４に示されている。活性成分のｐＨ、外観およびｗ／ｗ％を１カ月後、２カ月後および３カ月後に試験し、結果が以下の表５−１３に示されている。
【０１０６】
アンバーガラスバイアルでの対照の試験は、ｐＨのドリフトおよびアッセイ結果の低減により１カ月後に中断した（結果は示されていない）。ｐＨのシフトは、ガラスバイアルのアルカリ性が原因であると疑われる。
【０１０７】
【表３】
2015519398.tif 000004
【０１０８】
【表４】
2015519398.tif 000005
【０１０９】
【表５】
2015519398.tif 000006
【０１１０】
【表６】
2015519398.tif 000007
【０１１１】
【表７】
2015519398.tif 000008
【０１１２】
【表８】
2015519398.tif 000009
【０１１３】
【表９】
2015519398.tif 000010
【０１１４】
【表１０】
2015519398.tif 000011
【０１１５】
【表１１】
2015519398.tif 000012
【０１１６】
【表１２】
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【０１１７】
製剤の記載に対する「合格」とは、目視検査による透明な、無色の溶液を指す。ｐＨは、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｃｃｕｍｅｔ  Ｂａｓｉｃ  ｐＨ計で測定した。
【０１１８】
［実施例３］
ヒドララジン製剤投与後の脈絡膜血流に対する作用
年齢５０才以上の３１名の患者における単一中心、非盲検研究を行った：２０名の患者はいかなる臨床的に有意な眼疾患も持たず、または異常がなく、２０／３０より良いスネレン等価最高矯正視力（ＢＣＶＡ）を有し、１１名の患者が初期の非浸出性加齢黄斑変性（ドライ型ＡＭＤ）の徴候および症状を有していた。３日の期間にわたり、塩酸ヒドララジン製剤の７回の眼への局所的投与後、安全性、快適さおよび脈絡膜血流を評価した。
【０１１９】
ドライ型ＡＭＤ群の対象は、小さなおよび中間のドルーゼ、網膜黄斑内に最小の色素異常がある、または色素異常がない（すなわち、ＡＲＥＤＳ単純化評定スケールでリスクファクター２）、スネレン等価最高矯正視力（ＢＣＶＡ）が２０／１００以上であるという証拠を有していた。すべての対象は、脈絡膜血流の正確な測定が可能な位十分に透明な透光体を有していた。この研究では、一時的に増加した結膜の充血が示されたが、他の安全性または耐容性の懸案事項は示されなかった。
【０１２０】
患者には、１つの眼に１滴の試験物質を投与し、反対側の眼にはビヒクル対照を投与した。患者には、各日の第１回目の投与量を臨床現場で投与し、この日の残りの２回の投与量は所定の時点において自己投与された。以下のパラメータを査定した：
視力（スネレン）
眼内圧
完全な前眼部スリット−ランプ検査
広げた後眼部スリット−ランプ検査
ＡＥの収集（誘発され、観察された）
バイタルサイン
Ｇｅｖａｌｔｅｃ  ＡＧ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により提供されているコンパクトレーザードップラー流量計を使用して査定された脈絡膜血流。
【０１２１】
研究の主な目的は、実施例１に記述されているように調製した塩酸ヒドララジン眼科用溶液の安全性および快適さを評価することであった。しかし、塩酸ヒドララジン眼科用製剤活性についての初期の臨床的薬理学的なデータを得るために、患者の脈絡膜血流に対する試験物質の作用もまた評価した。各日の第１回目の投与量の投与前に、患者は、スネレン眼チャートによる視力、バイタルサイン、眼内圧（ＩＯＰ）、生体顕微鏡検査法による全般的な眼の健康状態および脈絡膜血流について査定された。各日の第１回目の投与量の投与後１または４時間枠にわたり、快適さ、脈絡膜血流、ＩＯＰおよび全般的な眼の健康状態について患者をモニターした。１日目には、塩酸ヒドララジン投与から３０、６０、１２０および２４０分後に評価を行った。２日目および３日目には、評価は最初の２つの時点の後に行った。７回目の投与量が３日目の朝に投与された。最終投与量の後、７日目に電話を介して患者と接触して、あらゆる研究後の有害事象または問題を評価した。
【０１２２】
脈絡膜血流
眼内圧（ＩＯＰ）、視力（ＶＡ）、前眼部および後眼部の生体顕微鏡検査法による知見ならびにバイタルサインについて、いずれの眼においてもベースラインからの臨床的に有意な変化は判明しなかった。他の安全性関連の問題は報告されなかった。
【０１２３】
２６名の（８４％）対象において眼の有害事象（ＡＥ）が生じたが、これらのすべては性質上軽度なものであった。異物感があるという１つのＡＥを除いて（これについては不明と分類された）、すべての眼のＡＥは研究期間中に解決された。
【０１２４】
最も一般的な治療関連の眼のＡＥは、眼の充血であり、これは、塩酸ヒドララジン処置した２１の眼において生じた（ＡＭＤ群中７名の対象［６４％］および正常／健康な群中１４名の対象［７０％］）が、ビヒクル処置した眼ではほんの１つにしか生じなかった。眼の充血のすべてのケースが解決され、すべての対象に対して解決までの平均時間は１．８５日（１から４日の範囲）であった。
【０１２５】
塩酸ヒドララジン製剤で処置した眼に発見された眼の充血の発生率は、この活性成分である、十分確立した末梢血管拡張作用を有する、認可された直接作用性抗高血圧薬物の公知の薬理学的作用と一致する。
【０１２６】
塩酸ヒドララジン眼科用溶液は、両対象群における液滴の滴下の直後に、ビヒクルよりもわずかに快適さが低かったことが判明したが、液滴の滴下後３０分までに発見された快適さスコアにおいて目立つ差はなかった。
【０１２７】
各日の第１回の試験物質の投薬後、脈絡膜血流、速度および容量を査定した。１日目に、投与後３０、６０、１２０および２４０分の時点で脈絡膜血流測定を行い、２日目および３日目には、最初の２つの時点だけで測定を行った。中心窩下の脈絡膜血流を視覚化および測定するための最新の、非侵襲的および定量的アプローチである、レーザードップラー流量測定装置を使用して測定を行った。
【０１２８】
全体的な結果は、塩酸ヒドララジン眼科用製剤が、眼への局所的投薬後、薬理学的活性を有したことを示している：
塩酸ヒドララジンで処置した眼において脈絡膜の平均血液量および速度値が増加する傾向があり、これは、１日目には、眼への局所的投薬後約２時間でピークに達し、投薬後約４時間でベースライン値に戻った（すなわち、２時間後）。ＡＭＤ群においても、血液量の増加が１日目の早くも投薬後３０分の時点で、塩酸ヒドララジンで処置した眼に見出された。
【０１２９】
脈絡膜血流について、ＡＭＤ対象の塩酸ヒドララジンで処置した眼において、平均スコアが改善される傾向にあった。対照的に、正常／健康な対象では、１日目のすべての時点において、平均値およびこれに伴う標準偏差（ＳＤ）の両方が低いままであった。
【０１３０】
１日目について、ＡＭＤと正常群との間で、脈絡膜血流の結果のオッズ比分析を評価した。群の差に対する検定は、ＳＡＳバージョン９．２（ＳＡＳ、２００９年）のＦＲＥＱ手順を使用して計算したフィッシャーの正確検定に基づいた。脈絡膜の血液量について、オッズ比が６０分の時点の０．２２（ｐ＝０．３３７）から、１２０分の時点で６．６７（ｐ＝０．１０６）に変化したが、これは、１２０分の時点ではＡＭＤ患者において、より高い塩酸ヒドララジン応答があった可能性を示唆している。
【０１３１】
この研究の結果は、塩酸ヒドララジン眼科用溶液は安全であり、一般的に十分に許容され、治療下で発現するＡＥは低い発生率で起こるが、この有害事象は、全般的に軽度の重症度であり、２つの対象集団の間で比較的均等に分布していたことを示している。研究の過程において、ＳＡＥはなく、死亡はなく、他の臨床的に有意な安全性の知見はなかった。眼の充血は最も一般的に報告された治療関連の眼のＡＥであり、この研究において大部分の対象により報告された。しかし、眼の充血の発生率は、塩酸ヒドララジンの抹消血管拡張作用と一致し、予期せぬことではなかった。脈絡膜の血液データの分析は、眼への局所的滴下後、塩酸ヒドララジンが眼の裏の黄斑エリアに到達することによって、脈絡膜の血液循環を改善できることを示唆している。血流の障害は、ドライ型ＡＭＤの進行における寄与因子となり得るので、これらの結果は、塩酸ヒドララジンがドライ型ＡＭＤの処置に対して有用な治療剤となり得ることを示唆している。
【０１３２】
［実施例４］
ヒドララジン製剤の単回投与の毒性
ヒドララジン眼科用製剤を用いた単回投与の眼への刺激の研究は、ウサギモデルを使用したＤｒａｉｚｅ手順に従い、製剤が眼への刺激をもたらす傾向が最小から軽度であることを示している。
【０１３３】
ヒドララジンの様々な投与量（０．０％、０．５％、１．０％および２．０％［ｗ／ｗ］）を使用して、ヒドララジンの眼への刺激物としての可能性を査定するいくつかの研究が完了した。ヒドララジン製剤は、本質的に実施例１に記載されたように調製した。若いメスの成体ニュージーランド白ウサギを対照と３つの処置群に分けた（各群に対してｎ＝３）。０．１ｍＬの投与量（対照または０．５％、１．０％、または２．０％ヒドララジン製剤）を各ウサギの右眼に滴下し、左眼は対照とした。ウサギは、同様のヒトの応答を予測する上で貴重となるような形で眼への刺激に応答するその能力が実証されたことから、これらの研究で試験モデルとして使用した。ウサギモデルは、いくつかの刺激に対してヒトよりもいくぶん感受性が高いことが知られている（Ｍｉｌｌｌｉｃｈａｍｐ、１９９９ａ年、Ｍｉｌｌｉｃｈａｍｐ、１９９９ｂ年）。緩衝されたｐＨ４．２および一時的な眼の刺激を引き起こすことが知られている保存剤を利用して、安定性および投与量の完全性を確かめた。
【０１３４】
全体的には、試験したすべての製剤は、ウサギモデルを使用した主要な眼への刺激研究において最小の眼への刺激を示した。２．０％ヒドララジンを用いて試験した製剤は、０．０％、０．５％、または１．０％塩酸ヒドララジンを含有する製剤よりもわずかにより大きな刺激を示した；各濃度は、全Ｄｒａｉｚｅスコアの最大平均値２．０を示し、刺激性は最小限であると分類された。
【０１３５】
［実施例５］
ヒドララジン製剤の反復投与の毒性
塩酸ヒドララジン眼科用溶液は、本質的に実施例１に記載されたように、０．０％（ビヒクル）、０．５％塩酸ヒドララジン、１．０％塩酸ヒドララジンおよび２．０％塩酸ヒドララジンの濃度で調製した。製剤、ビヒクルまたは対照は、表２に示されているように、４０匹のオランダベルトウサギ（１群当たりオス５匹およびメス５匹）の指定された眼に２８日間毎日投与した。
【０１３６】
【表１３】
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【０１３７】
群１には、左眼にビヒクルおよび右眼に生理食塩水を与え、群２−４には、左眼に塩酸ヒドララジン（低い投与量［０．５％ヒドララジン、ｗ／ｗ、０．２ｍｇ／ｋｇ／投与量］、中間の投与量［１．０％ヒドララジンｗ／ｗ、０．４ｍｇ／ｋｇ／投与量］、または高い投与量［２．０％ヒドララジン、ｗ／ｗ、０．８ｍｇ／ｋｇ／投与量］のいずれか）を与え、右眼にビヒクルを与えた。
【０１３８】
２８日間の眼の局所的処置後、ビヒクルまたは塩酸ヒドララジンの適用は、オランダベルトウサギの眼における、慣用的眼の評価、眼圧測定、体重、器官体重、臨床化学、眼の病態、炎症、変性、または毒性の組織学的証拠などの査定を含めて、有意な投与量関連の毒物学的変化の発生を結果として生じなかった。
【０１３９】
この研究において投与された最も高い投与量濃度は、ヒドララジン活性医薬成分の良好な溶解度を維持しながら眼科用調製ビヒクルを使用して調製することができる最大可能濃度であった。投与した最大投与量は、ウサギ動物モデルの眼に適用することができる最大容量であった。この結果、１回当たりの全投与量４０μＬを使用して、最大１日量である０．８ｍｇ／ｋｇ／投与量が投与された。
【０１４０】
飼料消費はすべての群の間で同様であり、群間に体重の統計学的に有意な差はなかった。所定の身体検査および臨床的検査に対して、治療関連の知見は指摘されなかった。予定外の死亡もなかった。
【０１４１】
２８日目に行われた測定に対して、群１と群２−４との間で、オスまたはメスウサギのいずれかで、巨視的な眼検査の知見において統計学的に有意な差はなかった。
【０１４２】
投薬前および２９日目に光反射を試験した。すべての時間枠でのすべての瞳孔の応答はすべての処置群について正常であった。
【０１４３】
スリットランプ生体顕微鏡の使用後、改造したＨａｃｋｅｔｔおよびＭｃＤｏｎａｌｄ顕微鏡を用いた眼の評定システム（Ｈａｃｋｅｔｔ、１９９６年）を眼の知見に適用したが、これには、ブルーフィルターを挿入して、フルオレセイン色素保持を査定することが含まれていた。顕微鏡を用いて評価されたいずれの眼検査パラメータに対しても、投薬前または２９日間の研究測定期間中に群１と群２−４との間で、オスまたはメスウサギのいずれかで、統計学的に有意な差はなかった。
【０１４４】
投薬前および２９日目における対照および試験ウサギのＩＯＰの平均眼圧測定（Ｔｏｎｏ−ｐｅｎ；Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｄｅｐｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）記録は、１５−２５ｍｍＨｇの間であり、これは正常な生理学的範囲内である。停止（２９日目）前、１つのパラメータが統計学的に有意な差を示した：群１の平均値と比較した場合、群４のメスの左眼の平均ＩＯＰが増加したが、ただしこの平均値（２２ｍｍＨｇ）正常な生理学的範囲内であった；さらに、左眼の平均ＩＯＰは、群４のメスのプラシーボ処置した右眼の平均ＩＯＰと異ならなかった。
【０１４５】
２９日目の試料において、群２および４のメスのウサギにおいて低いログ変換された絶対好酸球カウント数があったこと以外は、血液学的指標に対する統計学的に有意な差は、研究のいずれの期間中にも群間で生じなかった。
【０１４６】
２９日目の試料において群２および４のメスのコレステロール値が低かったことを除いて、血清化学的性質指標に対する統計学的に有意な差は、研究のいずれの期間中にも群間で生じなかった。
【０１４７】
平均器官体重および相対的器官体重において、オスおよびメスウサギの両方に対して、統計学的に有意な差は、群１と群２−４との間で存在しなかった。剖検中に観察された、投与量関連とみなすことができた、有意な全体的病的変化はなかった。
【０１４８】
各眼、涙腺および眼付属器の側頭部切片、中心切片（視神経を含む）および鼻の矢状切片からなる４０（４０）セットのヘマトキシリンおよびエオシン着色したスライドについて、有資格の獣医学的眼科医が組織病理学検査を行った。すべての群において、知見は、結膜のリンパ様ろ胞、角膜上皮の局所的損失もしくは広汎性損失および／または網膜襞からなった。これらの知見は、右眼と左眼において、および群１から４の間で、ほぼ等しい頻度で生じ、人工産物のプロセシングに伴い、偶発的知見とみなされる。２．０％までの塩酸ヒドララジンまたはビヒクルの毎日の適用は、２８日の眼の局所的処置後のオランダベルトウサギの眼において、眼の病態、炎症、変性、または毒性の組織学的証拠の発生を結果として生じなかった。
【０１４９】
提案された製剤を用いて実施したこれらの眼の投薬研究から得た結果に基づき、２．０％ｗ／ｗまでの塩酸ヒドララジンの配合された投与量であれば、ヒトの眼の使用に対してかなり十分に許容され、安全であるはずであるように思われる。
【０１５０】
［実施例６］
脈絡膜血流に対するヒドララジン製剤の作用
１．０％ヒドララジン眼科用溶液を、本質的に実施例１に記載されたように調製した。
【０１５１】
１２匹のメスのニュージーランド白ウサギ、体重２．５−３．０ｋｇを、３５ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび５ｍｇ／ｋｇのキシラジン（筋肉内）により麻酔下においた。初期投与量の半分を１時間ごとに与えて、麻酔を維持した。
【０１５２】
眼の高血圧症のモデルを作るための前眼房の穿刺により左眼の眼内圧を４０ｍｍＨｇに上昇させることによって、眼の高血圧症のモデルを作り出した。ミクロスフェア注射のために、右の頸動脈を介して左室をカニューレ処置した（ＩＭＴ−Ｓｔａｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＡ）。大腿動脈を血液サンプリングのためにカニューレ処置した。
【０１５３】
対照として５０μＬの生理食塩水（ｎ＝５）、または１．０％ヒドララジン眼科用溶液（ｎ＝７）を左眼に局所的に滴下した。この後、０、３０、６０および１２０分の時点で、脈絡膜血流を有色ミクロスフェアで測定した。各時点において、０．２ｍＬの異なる有色ミクロスフェアを参照用に左室に注射し、ミクロスフェアの注射後、正確に１分間、大腿動脈から血液試料を採取した。血液試料をヘパリン処置した管内に収集し、容量を記録した。
【０１５４】
最終の血液サンプリング後に、１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムを注射してウサギを安楽死させた。左眼を摘出し、脈絡膜を切除した。組織試料を秤量し、分解し、組織内のミクロスフェアを血球計算板でカウントした。ある時点での各組織の血流を以下の方程式を使用して計算した：
Ｑｍ＝（Ｃｍ×Ｑｒ）／Ｃｒ
（式中、ＱｍはμＬ／分／ｍｇで表した組織の血流であり、Ｃｍは組織１ｍｇ当たりのミクロスフェアカウントであり、ＱｒはμＬ／分で表した血液試料の流量であり、Ｃｒは参考にした血液試料における全ミクロスフェアカウントである）。
【０１５５】
図１に結果が示されているように、１．０％濃度のヒドララジン点眼剤は、薬物滴下後３０および６０分で、対照と比較して、ウサギの脈絡膜血流を有意に向上させることが判明した（Ｐ＜０．０５）。
【０１５６】
［実施例７］
レーザー誘発性脈絡膜血管新生に対するヒドララジン製剤のインビボでの作用
０．５％、１．０％および２．０％ヒドララジン眼科用溶液を、本質的に実施例１に記載されたように調製した。
【０１５７】
２５匹のブラウンノルウェーラット、体重１５０−１８０ｇを、３５ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび５ｍｇ／ｋｇのキシラジン（筋肉内）で麻酔下においた。１％トロピカミド（Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ；Ｔａｍｐａ、Ｆｌａ．）および２．５％フェニレフリンの局所的適用により瞳孔を広げた。ＶＯＬＫ  ｓｕｐｅｒ  ｐｕｐｉｌ  ＸＬ生体顕微鏡検査法レンズ（Ｋｅｅｌｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｉｎｃ．、Ｂｒｏｏｍａｌｌ、ＰＡ）を用いて眼底を視覚化した。２周波Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（Ｌａｓｅｒｅｘ  ＬＰ３５３２；Ｌｕｍｅｎｉｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ  ＵＴ）を５３２ｎｍ波長で使用して、ブルッフ膜を貫通した。スポットサイズは１００μｍであった。送達電力は２００ｍＷであり、０．１５秒の曝露を適用した。視神経からほぼ等しい距離で眼底に６つの病変を作製した。バブル形成を伴うレーザースポットのみを含めた。かなりの網膜出血を伴う病変は除外した。
【０１５８】
０．５％（ｎ＝５）、１．０％（ｎ＝１０）、または２．０％（ｎ＝５）塩酸ヒドララジンまたは生理食塩水点眼剤（ｎ＝５）を含むヒドララジン点眼剤を、レーザー処置の直後、１日３回、４週間の間、両眼に滴下した。レーザー処置の直後の薬物の投与は、ドライ型ＡＭＤに対するより良いモデルであると考えられ、出血が生じている点へのレーザー侵襲から約２週間後に薬物が投与される普通のレーザー誘発性ＣＮＶ（滲出型ＡＭＤ）モデルとは異なる。
【０１５９】
広がった瞳孔を有する麻酔下の動物の処置の４週間後、デジタル眼底カメラ（ＴＲＣ−５０ＥＸ：Ｔｏｐｃｏｎ、Ｊａｐａｎ）および標準的フルオレセインフィルターを使用してフルオレセイン血管造影を実施した。０．３ｍｌの１０％フルオレセインイソチオシアネート−デキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、０．１４ｍＬ／１００ｇ（体重）の量で、舌下静脈を介して静脈内に注射した。フルオレセインの像を２０分以内に記録し、Ｉｍａｇｅｎｅｔ２０００デジタル画像システム（Ｔｏｐｃｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｐａｒａｍｕｓ  ＮＪ）を使用して、ＣＮＶ形成の面積を測定するために、最も鮮明な品質の像を選んだ。結果は図２において示されている。
【０１６０】
フルオレセイン血管造影像を記録した後、ラットを屠殺し、眼を摘出し、１０％リン酸塩緩衝ホルマリン液中に固定した。角膜およびレンズを切除し、全網膜を慎重に解剖した。脈絡膜の端から眼球赤道へ向かって脈絡膜を半径方向に切断し（普通４−６）、脈絡膜側を上に向けて眼杯をフラットマウントした。フラットマウントをＡｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）上で蛍光顕微鏡法により撮像し、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウエア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を使用して、ＣＮＶの面積を測定した。この結果は図３に示されている。
【０１６１】
４週間の処置後、処置群のすべては、フルオレセイン染色されたＣＮＶ面積の有意な減少（２．０％に対してＰ＜０．０５；０．５％および１．０％に対してＰ＜０．０１）を示した。同じ結果が、脈絡膜フラットマウントで実証された（すべての群に対してＰ＜０．０１）。
【０１６２】
これらの分析の両方において、少なくとも１．０％塩酸ヒドララジン眼科用溶液で有意な減少が見られ、この１．０％塩酸ヒドララジン眼科用溶液はまた脈絡膜血流における有意な減少も示した。
【０１６３】
［実施例８］
管形成に対するヒドララジン製剤のインビトロでの作用
内皮細胞は、適切な増殖条件下、マトリクスゲル表面上で増殖させた場合、インビトロで管状構造を形成することになる。この研究は、ヒドララジン製剤のインビトロでの管形成の阻害能力を測定し、インビトロの抗血管形成アッセイを意味する。
【０１６４】
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＳｃｉｅｎｃｅＣｅｌｌ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。内皮基礎培地（ＥＢＭ−２；Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、１０％ウシ胎児血清および内皮成長培地（ＥＧＭ−２  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ；Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ．）を用いて培地を調製し、この培地は２ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有している。０（対照）、１、３、１０、３０および１００μｇ／ｍＬの濃度のヒドララジンを時間０で培地に加えた。５％ＣＯ２および９５％空気の大気中、３７℃で、２．５％マトリクスゲル上で細胞を培養し、ＨＵＶＥＣを４８時間インキュベートした。従来の顕微鏡撮影（Ｚｅｉｓｓ）を使用して細胞形態の画像を得た。ＨＵＶＥＣによる管形成を研究するインビトロ実験を３回反復した。
【０１６５】
１ｍｇ／ｍＬのヒドララジンでの処置は、対照とは異ならないことが判明した。３μｇ／ｍＬのヒドララジンを用いると、いくつかのＨＵＶＥＣは、管へと増大することができず、この作用は３０μｇ／ｍＬのヒドララジンにおいて最も明らかとなった。１００μｇ／ｍｌではヒドララジンがアポトーシスを引き起こした。
【０１６６】
［実施例９］
非浸出性加齢黄斑変性のヨウ素酸ナトリウム誘発性ラットモデルのインビトロでの作用
ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ３）の静脈内注射は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）内の細胞に選択性の毒性をもたらす（Ｎｏｅｌｌ、１９５３年）。ＲＰＥに対する作用はＮａＩＯ３の投与量に依存する。このアプローチを使用して、ヒドララジン製剤の潜在的保護作用を評価することができる非浸出性ＡＭＤのラットモデルを作り出した。
【０１６７】
ヒトの網膜色素上皮細胞株（ＡＲＰＥ−１９；アメリカ培養細胞系統保存機関、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を使用して、ＮａＩＯ３の毒性をインビトロで評価した。加湿した５％ＣＯ２および９５％空気の大気中、３７℃で細胞をインキュベートした。成長培地は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改質Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、ならびに１．２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、２．５ｍＭのＬ−グルタミン、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１０％ウシ胎児血清（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を含有するＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地の１：１混合物で構成された。０．２５％トリプシン−０．２ｇ／Ｌエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に分解させてコンフルエントな培養物を収集した。細胞増殖アッセイのため、９６ウェル組織培養物プレート内でＡＲＰＥ−１９細胞を一晩増殖させた。次いで、培地を、様々な濃度のＮａＩＯ３（０、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍＬ）を含有する新鮮な培地に置き換えた。４８時間のインキュベーション後、細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓリン酸緩衝食塩水で１回洗浄し、１００μＬの１０％３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）と共に正確に４時間さらにインキュベートした。次いで培地を吸引除去し、１００μＬのＤＭＳＯを各ウェルに加え、シャーレを２分間振盪することによって、細胞および有色のホルマザン産物を溶解した。ＳｐｅｃｔｒａＣｏｕｎｔプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｍｅｒｉｄａｎ、ＣＴ）を使用して、５７０ｎｍ（ＯＤ５７０）で各ウェルの光吸収性を読み取った。加えたＮａＩＯ３の細胞生存度に対する作用を、ＮａＩＯ３に曝露した細胞のＯＤ５７０と、対照細胞のＯＤ５７０との比として計算し、対照のパーセンテージとして表現した。各実験中、各群に対して６つのウェルを使用して、実験を６回反復した。
【０１６８】
ＭＴＴ比色のアッセイを使用して、ＲＰＥ細胞に対するＮａＩＯ３の毒性作用をインビトロで定量化した。１０μｇ／ｍＬ以下のＮａＩＯ３濃度において、細胞増殖における有意な減少はなかった。３０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬのＮａＩＯ３濃度は、生存可能なＡＲＰＥ−１９細胞の数を、対照において観察されたレベルのそれぞれ約６５％および４０％に減少させた。
【０１６９】
［実施例１０］
ヨウ素酸ナトリウム誘発性非浸出性加齢黄斑変性のインビボラットモデル
ＮａＩＯ３モデルを作るため、１２：１２時間周期性照明スケジュールを有する標準的な動物部屋の中で、２８匹の週齢８週のオスのブラウンノルウェーラット（Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｔｅｘａｓ）を飼育した。動物には普通の食物および水を与えた。すべての手順は、Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＲｅｓｅａｒｃｈのＡＲＶＯ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎに準拠した。
【０１７０】
ＮａＩＯ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を３．０％の濃度で生理食塩水中に溶解した。ラットには、舌下静脈を介して、０、７．５、１５、２０、３０、４０および６０ｍｇＮａＩＯ３／ｋｇ（体重）の投与量で、ＮａＩＯ３の単回注射を行った（１つの濃度群当たりそれぞれラット４匹）。
【０１７１】
機能的変化（ＥＲＧ、眼底像およびフルオレセイン血管造影）および組織学的変化を、注射後３から５６日の間の時点において選択的に試験した。
【０１７２】
ヒドララジン１．０％眼科用溶液（Ｐａｍ  Ｌｅｗｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）を用いた実験に対して、正常な群には、ＮａＩＯ３注射はせずに、生理食塩水を単独で両眼に滴下した。ＮａＩＯ３群には、３５ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３の単回注射後、生理食塩水を単独で滴下し、ヒドララジン１．０％＋ＮａＩＯ３群には、３５ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３の注射後、ヒドララジン１．０％点眼剤を滴下した。すべての点眼剤は、注射直後から開始して、１日３回、４週間の間滴下した。
【０１７３】
ＥＰＩＣ−２０００Ｖｉｓｕａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＫＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して、網膜の機能試験を実施した。Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＰＳ２２光刺激器（Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で閃光刺激を与えた。光刺激装置を眼から５インチの位置に配置した。各エンドポイント（２および４週）で、すべてのラットにおいて網膜電位図（ＥＲＧ）ｃ波を以下の通り測定した。ラットは一晩暗い場所に順応させ、次いで筋肉内投与された３５ｍｇ／ｋｇのケタミンプラス５ｍｇ／ｋｇのキシラジンで麻酔下においた。この後、初期投与量の半分を毎時間与えて麻酔を維持した。各１滴のアトロピン１％、トロピカミド１％およびフェニレフリン２．５％ですべてのラットの瞳孔を広げた。記録前、１滴のｏｐｔｉｃａｉｎｅを表面麻酔のために使用した。すべての動物は、ＥＲＧ測定中保温されていた。
【０１７４】
ラット網膜は、神経網膜層から光受容体およびＲＰＥ細胞層まで、高投与量のＮａＩＯ３により不可逆的に損傷を受けた。高投与量のＮａＩＯ３は重症の網膜毒性を誘発させた；より低い投与量では、このように多くの、またはこのように重症の変化は見出されなかった。これらの結果は、中程度の投与量のＮａＩＯ３であれば、ドライ型ＡＭＤの処置のための動物モデルに適切であることを示唆している；３０ｍｇ／ｋｇから４０ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３であれば、この動物モデルに使用するのに最適である。
【０１７５】
各ラットは、第１にＤＣ−ＥＲＧ記録で測定し、次いでＡＣＥＲＧ記録で測定した。ＡＣ−ＥＲＧ記録のため、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を、基準電極として角膜とそっと接触させて配置した。１滴のＮａＣｌ０．９％を角膜と電極との間に使用して、安定した信号コンダクタンスを確立した。ステンレススチールの長い電極を２つの眼の間の額の皮膚の下に挿入し、別のステンレススチールの短い電極をアース電極として脚の皮下に挿入した。単一の暗順応の白色フラッシュ（２０ｍｓの継続時間）を使用して、ＥＲＧおよびｂ波を誘発した。刺激強度は６２８ｃｄｓ／ｍ２であり、０．３から５００Ｈｚでバンドパスフィルターにかけた。ＤＣ−ＥＲＧに対して、以前に記述された方法に従い（Ｐｅａｃｈｅｙら、２００２年、Ｖｉｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１９巻（６号）：６９３−７０１頁）、Ｈａｎｋ’ｓ平衡塩類溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を充填した、直径１−ｍｍのフィラメント付ガラスキャピラリー管（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）を使用して、コネクターが付随しているＡｇ／ＡｇＣｌワイヤ電極と接触させた。キャピラリー管をラットの角膜表面と接触させた。反対側の眼の表面上に配置した別の同様の電極は基準リードとしての役目を果たした。応答を増幅させ（ＤＣ−１００Ｈｚ、増幅率＝１０００×）（ＤＰ−３０１；Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｈａｍｄｅｎ、ＣＴ）、１０Ｈｚまたは１０００Ｈｚでデジタル化した。データをｉＷＯＲＸ  ＬａｂＳｃｒｉｂｅ  Ｄａｔａ  Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｉＷｏｒｘ０ＣＢ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｄｏｖｅｒ、ＮＨ）で分析した。刺激輝度を調整するために光路内にニュートラルデンシティフィルター（Ｏｒｉｅｌ、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ、ＣＴ）を配置した、ファイバーライト高強度照明器（Ｄｏｌａｎ−Ｊｅｎｎｅｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｏｘｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を使用して光チャネルから光刺激を誘導した。この実験で使用した刺激輝度は、３．２２ログｃｄ／ｍ２であり、継続時間は４分間であった。ラット眼が位置している光ファイバー束の出力側に焦点をあてたＭｉｎｏｌｔａ（Ｒａｍｓｅｙ、ＮＪ）ＬＳ−１１０測光器を用いて輝度キャリブレーションを実施した。
【０１７６】
ＡＣ−ＥＲＧ記録中に、ベースラインから最初の負のトラフまでａ波を測定した；最大ｂ波振幅（Ｖｂｍａｘ）を最初の負のトラフ（ａ波）からｂ波の最初の正のピークまで測定した。ＤＣ−ＥＲＧ記録に対して、ｂ波に続く第２の正のピークはｃ波であり、ｂ波の後のトラフ（後電位；ＡＰ）からｃ波のピークまでこの振幅を測定した。高速振動（ＦＯ）の振幅をｃ波ピークからＦＯトラフまで測定した。光ピーク（ＬＰ）をＦＯ最低値からＬＰ最大まで測定した（Ｐｅａｃｈｅｙ、２００２年）。
【０１７７】
デジタル眼底カメラ（ＴＲＣ−５０ＥＸ；ＴＯＰＣＯＮ）およびＩｍａｇｅｎｅｔ２０００デジタル画像化システム（Ｔｏｐｃｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、網膜有色像およびフルオレセイン血管造影図を記録した。フルオレセイン血管造影を使用する場合、１０ｍｇのフルオレセインナトリウムを、ラットの舌下静脈を介して注射した。麻酔および瞳孔拡大を上に記載のように実施した。
【０１７８】
機能検査後、すべてのラットを屠殺した。約１６匹のラット（異なるヒドララジン処置群に属する）において、眼を除去し、２．５％グルタルアルデヒド中に２時間固定し、次いで５％ホルマリン中に一晩固定した；各動物の一方の眼は組織学および免疫組織学研究に使用し、他方の眼はフラットマウント上の自己蛍光測定用に準備した。組織査定のため、パラフィン包埋した組織を３μｍの厚さに切断した。垂直の経線に沿って角膜から視神経頭まで眼に切り込みを入れ、次いでヘマトキシリンおよびエオシンで着色した。Ａｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して画像を記録した。フラットマウント調製のため、各動物から１つの眼を摘出した。固定後、眼の前方部分、ならびに角膜、レンズおよび感覚網膜をそっと除去し、残りの眼杯をＰＢＳ中で洗浄した。端から中心にかけて４つの切れ目を入れることによって、眼杯をガラススライド上で平らにしやすくした。フラットマウント中のＲＰＥの自己蛍光を研究し、アルゴンレーザー（波長４８８ｎｍ）を使用して共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０；Ｚｅｉｓｓ）で記録した。
【０１７９】
スチューデントｔ検定を統計分析のために使用した。インビボ実験に対して片側ｔ検定を使用し、インビトロアッセイに対して両側ｔ検定を使用した。
【０１８０】
フルオレセイン血管造影および眼底写真
６０ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３投与量群において、注射後早くも３日目には全網膜中の過蛍光を観察した；しかし、この初期の時点において眼底像に明らかな変化は何も見られなかった。４０ｍｇ／ｋｇと３０ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３の両投与量群において、注射後３日目に部分的な網膜過蛍光を見ることができたが、この作用は、６０ｍｇ／ｋｇ群において観察されたもののように明白ではなかった。注射後より長い時間が経過すると（２８から５６日の間と定義）、周辺網膜において低蛍光が明らかとなった。早くも７日目には、すべての３つの群において、黄色の斑点または瘢痕（これらはＮａＩＯ３の投与量に関係し、ネクローシスを示すものであった）が網膜の周辺から中心までに見ることができた。２０ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３群では、眼底像およびフルオレセイン血管造影の両方において、２８日目まで変化は明らかではなかった。
【０１８１】
ＥＲＧに対するＮａＩＯ３の作用
４０または６０ｍｇ／ｋｇの投与量でのＮａＩＯ３の単回注射は、最大ｂ波振幅（Ｖｂｍａｘ）に対して劇的な作用があり、これは、注射後３日目および７日目までに明らかとなった。処置後２８日目までには６０ｍｇ／ｋｇの群においてＥＲＧ  ｂ波は完全に消えた。４０ｍｇ／ｋｇの群において、ｂ波の大きさは注射後３日目までに有意に低減し、この後のすべての時点において継続して低減した；５６日目で、ｂ波は測定不可能となった。２０ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３は、ｂ波の大きさを７日目に低減したが、１４日目以降は、対照群において見られるレベルまで回復した。
【０１８２】
１５または７．５ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３の投与量は、ＥＲＧ波のいずれも、いずれの時点においても抑制しなかった。３０ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３の単回注射は、注射後７日目でＥＲＧ波のすべてにおいて低減を引き起こした。３０ｍｇ／ｋｇ投与量群のａ波およびｂ波信号は、この後の時点において回復したように見えた（１４日および２８日目）。対照的に、ｃ波信号は、３０ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３注射後のすべての時点において抑制された。ｃ波に対してＦＯおよびＬＰ指標を測定したが、これらはｃ波データにおいて見られたＮａＩＯ３投与量への応答を反映している。
【０１８３】
ＥＲＧ  ｃ波はＲＰＥにおいて生じる。ＥＲＧ  ｃ波信号に対するＮａＩＯ３の抑制作用は、この化合物の既知の毒性作用と一致する。ＥＲＧ  ｃ波信号の長期的抑制は、非浸出性ＡＭＤの研究に対するこのラットモデルの使用を裏付ける。
【０１８４】
網膜組織病理学に対する作用
３０ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３群においていくつかの網膜壊死が、注射後３日目に出現し、より高い投与量群（すなわち、４０または６０ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３）においてさらに重症になり、または注射後さらに長い時間でさらに重症になった。より低い投与量群（＜３０ｍｇ／ｋｇ）においてラットからの網膜に明らかな組織学的変化はなかった。同様に、網膜フラットマウント上でのＲＰＥ単層の検査は、注射後３日目で、より高い投与量群においてネクローシスの証拠を示した；３０ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３および低い投与量群では有意な変化は見られなかった。ＲＰＥ細胞と光受容体細胞の両方の密度の低減は、６０ｍｇ／ｋｇの投与量群において、注射後３日目またはそれ以降の時点でラットからの網膜において明らかであった。４０ｍｇ／ｋｇの投与量群では、同様の変化が、注射後７日目から観察され始めた。３０ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３の投与量群では、ＲＰＥ細胞内のメラニン顆粒の数の低減が、注射後７日目から指摘され始めた。２０ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３の投与量群では、明らかな変化は見られなかった。
【０１８５】
フラットマウント調製物において、ＲＰＥ細胞のレーザー誘発性自己蛍光を共焦点顕微鏡法で測定した。３０ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３またはそれ以上の投与量の投与後、３日目に小さな孔がＲＰＥに観察され、これらは注射後さらに長時間で数が増加した。ＲＰＥ自己蛍光信号におけるこれらの欠陥は、ＲＰＥ細胞のネクローシスの領域を示唆している。２０ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３投与量群では、ＲＰＥ自己蛍光の中に小さな孔が７日目から観察され始め、より高い投与量群で観察された数より少なかった。
【０１８６】
ヒドララジン製剤のＮａＩＯ３誘発性損傷を遮断する能力
上に記載された時間依存性および投与量依存性実験の結果に基づいて、ラットＥＲＧパターンに対するＮａＩＯ３の作用を遮断するヒドララジンの能力を試験するために、３５ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３の濃度および２８日という時点が実験に選ばれた。正常な群には、ＮａＩＯ３をまったく与えず、生理食塩水のみの点眼剤を与えた。３５ｍｇ／ｋｇの投与量でＮａＩＯ３を注射後４週目に、ＥＲＧ  ｃ波振幅は、対照群のものの３１％まで著しく落ち込んだ（Ｐ＜０．０１）。ヒドララジン１．０％＋ＮａＩＯ３群のＥＲＧ  ｃ波振幅は、対照群のものの５０％に落ち込んだ（Ｐ＜０．０５）。１．０％ヒドララジン＋ＮａＩＯ３群において観察されたｃ波信号の大きさは、ＮａＩＯ３のみの群の信号を有意に超えた（Ｐ＜０．０１）（図４）。これは、このモデルにおけるヒドララジン１．０％点眼剤の保護作用を実証している；ヒドララジンは、ＮａＩＯ３注射により引き起こされたＲＰＥ細胞への損傷の６１％を遮断した（または回復させた）。
【０１８７】
［実施例１１］
網膜色素上皮細胞に対するヒドララジンの抗酸化作用
細胞損傷誘発性酸化ストレスの定量的測定
１０％ウシ胎児血清、５０単位／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシンおよび２．５ｍＭのグルタミンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改質必須培地（ＤＭＥＭ）内での、５％ＣＯ２、３７℃でのインキュベーションで、ヒトＲＰＥ細胞株ＡＲＰＥ−１９（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を培養した。細胞株は形質転換せず、ＲＰＥに特徴的な構造および機能特性をインビボで有していた。細胞を９６−ウェルプレートに播種し、３から１０継代内でサブコンフルエントの細胞単層を研究した。実験手順の開始前、培地を除去し、１％の子牛の血清、０．０６％のグルタミンおよび１％のペニシリン−ストレプトマイシンを補充した、フェノールレッドを含まない低グルコースＤＭＥＭと置き換えた。
【０１８８】
培養したＡＲＰＥ−１９細胞を、１×１０５個の細胞／ｍＬの濃度で、９６−ウェルプレートに播種した。細胞は、接触阻止を防止するために８０％コンフルエンスに到達した時点で実験に使用した。ＡＲＰＥ−１９細胞を、酸化ストレス（Ｈ２Ｏ２、ｔ−ＢＨＰ）または低酸素（ＮａＩＯ３）をシミュレートするように作られている化学薬品に曝露し、様々な濃度のヒドララジン（１、３、１０、３０、または１００μｇ／ｍＬ）の、損傷を遮断する能力を測定した。
【０１８９】
酸化ストレスおよび低酸素実験のため、特定の化学薬品およびヒドララジン製剤の両方を（または、対照については化学薬品のみ）ウェルに加え、プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。各培養物内の生細胞の相対的な数（生細胞だけしか、ＭＴＴ分子を暗紫色の物質ホルマザンに変換するために必要とされるミトコンドリアの酵素活性を持たない）を判定する３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを使用して細胞生存度を査定した（Ｓｗａｎｓｏｎ、１９９２年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ、１４７巻（２号）：１４３−１４６頁））。２４時間の曝露後、ＭＴＴ試薬：培養培地容量の比１：１０でＭＴＴ試薬溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに加えた。３７℃で３時間、培養物をＭＴＴ試薬と共にインキュベートした。インキュベーションの終わりに、ＭＴＴ溶液を除去し、０．１ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を各ウェルに加えることによって紫色のホルマザン産物を可溶化した。ＳｐｅｃｔｒａＣｏｕｎｔプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｍｅｒｉｄａｎ、ＣＴ）を使用して、各試料の光学密度（ＯＤ）を５７０ｎｍ（Ａ５７０）で測定することによって、生存細胞の割合を求めた。等しい密度で細胞を播種し、次いでＭＴＴアッセイを実施し、並行した複製培養物について血球計算板細胞を手作業でカウントすることによって、ＭＴＴ比色アッセイにおけるＯＤ記録と正確な細胞数との間の関係を判定した。トリパンブルーを血球計算板培養物に加えて、生存可能な、色素を除いた細胞だけがカウントされるようにした。このアプローチは、Ａ５７０対細胞数に対する検量線の確立を可能にした。
【０１９０】
Ｓｗａｎｓｏｎら（Ｓｗａｎｓｏｎ、１９９２年；Ｖａｒｍｉｎｇ、１９９６年）により記載された、修正した方法を使用することによって、化学的低酸素を誘発させた。ＲＰＥ細胞を洗浄し、様々な濃度のＮａＮ３（０．１ｍＭ−１００ｍＭ）を含有する新鮮なＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に置き換えた。次いでヒドララジン製剤を加え、培養物および試験薬剤を３７℃で２４時間インキュベートした。培地を洗浄することによって、反応を停止させた。ＭＴＴ試薬溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を、ＭＴＴ試薬：培養培地容量の比１：１０で加え、次いで３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、ＭＴＴ溶液を除去し、０．１ｍＬのＤＭＳＯを各ウェルに加えることによって、紫色のホルマザン産物を可溶化した。ＳｐｅｃｔｒａＣｏｕｎｔプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｍｅｒｉｄａｎ、ＣＴ）を使用して、各試料のＯＤを５７０ｎｍで測定することによって、生存細胞の割合を判定した。
【０１９１】
すべてのデータは、平均値±標準誤差として提示した。対応のないスチューデントｔ検定を実施して、ある時点での２つの平均値間の有意性を分析した。この差はＰ＜０．０５において有意であるとみなされた。一酸化窒素測定に対する結果は、１ｘ１０６個の細胞当たりの亜硝酸塩および硝酸塩のμＭとして表現した。
【０１９２】
ｔＢＨＰ誘発性毒性に対するヒドララジンの作用
０．０１ｍＭのｔＢＨＰでの侵襲後、対照の細胞生存度（ｔＢＨＰ単独で処置した細胞）は８９．９０％±２．８０％に減少し、０．０３ｍＭのｔＢＨＰでの侵襲後、５５．８０％±４．０８％に減少した。０．０１ｍＭおよび０．０３ｍＭのｔＢＨＰでの侵襲後、ヒドララジン製剤は、明らかな濃度依存性方式で、ｔＢＨＰ誘発性細胞損傷を阻害した。０．０１および０．０３ｍＭのｔＢＨＰの両方での侵襲後、最大生存能力保護作用が、１００μｇ／ｍＬのヒドララジンで観察された（０．０１ｍＭのｔＢＨＰに対して１０９．９９％±２．４１％；０．０３ｍＭのｔＢＨＰに対して１００．８４％±１３．００％）；対照と比較した場合、これらの差は統計学的に有意であった（Ｐ＜０．００１）。統計学的に有意な保護作用（Ｐ＜０．０１）はまた、０．０１ｍＭのｔＢＨＰでの侵襲後の３０μｇ／ｍＬのヒドララジンおよび０．０３ｍＭのｔＢＨＰでの侵襲後のすべての濃度のヒドララジン（Ｐ＜０．００１）でも観察された。
【０１９３】
ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＨ２Ｏ２誘発性毒性に対するヒドララジンの作用
対照（Ｈ２Ｏ２単独で処置した細胞）の細胞生存度は、０．３ｍＭのＨ２Ｏ２での侵襲後、４８．７４％±２．４０％に減少し、１．０ｍＭのＨ２Ｏ２での侵襲後、４１．２８％±０．８０％に減少した。０．３ｍＭおよび１．０ｍＭのＨ２Ｏ２での侵襲後、ヒドララジン製剤は、明らかな濃度依存性方式でＨ２Ｏ２誘発性細胞損傷を阻害した。０．３ｍＭのＨ２Ｏ２での侵襲後、最大生存能力保護作用が、３０μｇ／ｍＬのヒドララジンで観察された（７４．３０％±０．８０％）；対照と比較した場合、この差は統計学的に有意であった（Ｐ＜０．００１）。０．３ｍＭのＨ２Ｏ２での侵襲後、最大生存能力保護作用が３０μｇ／ｍＬのヒドララジンで観察された（６８．０４％±０．６７％）；対照と比較した場合、この差は統計学的に有意であった（Ｐ＜０．００１）。統計学的に有意な保護作用はまた、０．３ｍＭのＨ２Ｏ２での侵襲後の１００μｇ／ｍＬ（Ｐ＜０．００１）および１０μｇ／ｍＬ（Ｐ＜０．００１）のヒドララジン、ならびに１．０ｍＭのＨ２Ｏ２での侵襲後の１００μｇ／ｍＬ（Ｐ＜０．００１）のヒドララジンでも観察された。
【０１９４】
ＡＲＰＥ−１９細胞における低酸素誘発性細胞損傷に対するヒドララジンの作用
ＰｒｏＯｘ低酸素システムを使用して、インビトロの低酸素処置を行った。ＡＲＰＥ−１９細胞は、一晩結合させておき、次いで、正常酸素または低酸素条件下で２４、４８および７２時間の間ヒドララジン（０．１−１００μｇ／ｍＬ）に曝露した。低酸素において、Ｎ２およびＣＯ２ガス供給源付きの、Ｏ２およびＣＯ２コントローラー（ＰｒｏＯｘモデル１１０およびＰｒｏＣＯ２モデル１２０；ＢｉｏＳｐｈｅｒｉｘ  Ｌｔｄ．、Ｒｅｄｆｉｅｌｄ、ＮＹ）により温度制御および湿度制御された環境Ｃ−チャンバーを使用して１％Ｏ２および５％ＣＯ２の酸素濃度を維持した。培地を洗浄することによって、反応を停止させ、３７℃で３時間、培養培地容量に対して１：１０の希釈で５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを加えた。インキュベーションの終わりに、ＭＴＴ溶液を除去し、細胞を０．１ｍＬ／ウェルＤＭＳＯ中に溶解した。ＳｐｅｃｔｒａＣｏｕｎｔプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｍｅｒｉｄａｎ、ＣＴ）を使用して５７０ｎｍで各試料のＯＤを測定することによって、生存細胞の割合を判定した。
【０１９５】
対照（ヒドララジン処置なしで、１％のＯ２および５％のＣＯ２に曝露した細胞）の細胞生存度は、４８および７２時間で、それぞれ９８．９１％±０．５６％および９７．４５％±０．５２％であった。対照と比較して、ヒドララジン製剤は、低酸素誘発性細胞損傷を有意に逆転した。最大逆転作用は、１μｇ／ｍＬのヒドララジンで、４８時間（１０１．２１％±０．５４％；Ｐ＜０．００１）および７２時間（１０３．５５％±１．７５％；Ｐ＜０．００１）の時点において見られた。
【０１９６】
［実施例１２］
ＡＲＰＥ−１９細胞の一酸化窒素（ＮＯ）産生に対するヒドララジンの作用
以前のセクションに記載されたように、ヒドララジン製剤への曝露および化学物質とのインキュベーションの後、フェノールレッドの試料およびデキサメタゾンを含まない培養培地を抽出し、亜硝酸塩／硝酸塩Ｇｒｅｉｓｓ試薬システムを使用して、一酸化窒素（ＮＯ）の比較的安定した最終生成物である亜硝酸塩および硝酸塩のレベルを判定した。６０μＬアッセイ緩衝液中の５０μＬアリコートのフェノールレッドを含まない培養培地を、それぞれ１０μＬの硝酸レダクターゼ調製物および硝酸レダクターゼコファクター調製物（独自仕様の濃縮物）（硝酸塩を亜硝酸塩に変換する）と共に、９６−ウェルのミクロアッセイプレート内で、室温で６０分間インキュベートした。必要とされるインキュベーション時間の後、１０μＬのＤＡＮ試薬を各ウェルに加え、１０分間インキュベートし、次いで２０μＬのＮａＯＨを各ウェルへ加えて反応を停止させた。ＳｐｅｃｔｒａＣｏｕｎｔプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｍｅｒｉｄａｎ、ＣＴ）を使用して、各試料のＯＤを５４０ｎｍで測定することによって、全亜硝酸塩／硝酸塩を求めた。硝酸塩検量線を用いてデータを計算した。
【０１９７】
ヒドララジン製剤で処置後、ＮＯ産生の有意な作用は検出されなかった。
【０１９８】
［実施例１３］
塩酸ヒドララジン眼科用製剤を用いた非浸出性加齢黄斑変性（ドライ型ＡＭＤ）の処置
この研究は、ビヒクル対照の、二重盲検、単一中心研究であり、軽度から中程度の非浸出性ＡＭＤを有する６０名のヒト個人の１つの眼を、局所用塩酸ヒドララジン１％またはビヒクル対照のいずれかの投与を１日３回、２年間受けるようにランダムに割り当てた。すべての対象が１２、１８および２４カ月の期間を完了したら、第１および第２のエンドポイントの分析を行う。
【０１９９】
１％塩酸ヒドララジン眼科用溶液は、１％（１０ｍｇ／ｍＬ）塩酸ヒドララジンを含有する無色の等張液として供給されるが、これは、濾過滅菌されている。不活性成分は以下を含む：保存剤としての塩化ベンザルコニウムおよびメチルパラベンに加えて、ｐＨ範囲３．８−４．４および重量オスモル濃度範囲３００−３４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇでの、酢酸塩緩衝溶液中のエデト酸二ナトリウム、塩化ナトリウムおよびプロピレングリコール（すべて米国薬局方［ＵＳＰ］等級）。
【０２００】
ビヒクルは、塩酸ヒドララジン眼科用溶液と等しい方式で製造するが、活性剤を含まない。各ボトルは、７ｍＬを含有し、ボトルは、１滴当たり４０から５０マイクロリットルを測定する滴びんを有する。
【０２０１】
製剤およびビヒクル対照は、１日３回：朝、午後および晩に患者により自己投与される。各液滴は、保存剤を加えた無菌生理食塩水ビヒクル中の４０−５０μＬ液滴の１％塩酸ヒドララジン活性成分からなる。薬物またはビヒクルは、２４カ月間、研究用の眼ＴＩＤに１滴の滴下により自己投与される。
【０２０２】
処置前の眼検査（処置眼のみ）を実施するが、これは以下を含む：ＥＴＤＲＳ視力、屈折、眼内圧、瞳孔の査定、スリットランプ検査（まぶた／まつ毛、結膜／強膜、角膜、前眼房、虹彩、レンズ、前方の硝子体を査定）および拡張型眼底検査（視神経、硝子体、血管、網膜黄斑および末梢を査定）。処置眼のさらなる試験は以下を含む：暗順応、フラビンタンパク質蛍光、リポフスチン蛍光、色眼底写真、ＯＣＴおよび脈絡膜の流量測定。処置後１カ月および３カ月の時点で、以下を含む研究眼の眼検査を実施する：ＥＴＤＲＳ視力、屈折、眼内圧、瞳孔査定、スリットランプ検査（まぶた／まつ毛、結膜／強膜、角膜、前眼房、虹彩、レンズ、前方の硝子体を査定）および拡張型眼底検査（視神経、硝子体、血管、網膜黄斑および末梢を査定）。６、１２、１８および２４カ月の時点で、処置眼の眼検査ならびに処置眼の試験を実施する。
【０２０３】
臨検全域での桿体妨害データの勾配（最も良い線形適合）を計算して、変化の年率換算を得ることによって、桿体妨害におけるベースラインからの変化について処置群を比較することにより、主要な有効性の尺度である暗順応（桿体妨害）を分析する。暗順応は、網膜外層のパラメータ、例えば、桿体機能などの定量化を可能にする。これは、Ｊａｃｋｓｏｎら（Ｊ  Ｏｃｕｌ  Ｂｉｏｌ  ＤｉｓＩｎｆｏｒｍ．、１：７−１１頁、２００８年）に記載された方法を使用して、コンピュータ化された暗順応計（ＡｄａｐｔＤｘ；Ａｐｅｌｉｏｔｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ、ＵＳＡ）で測定する。暗順応機能は、Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏ（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）を使用してプロットする。第１のエンドポイントは桿体妨害であり、これは数分で測定され、機器上に提示される。さらなる尺度として、円錐体感度のプラトー値、桿体−円錐体破壊および桿体感度回復勾配が挙げられる。暗順応試験は、ベースラインおよび処置後６、１２、１８および２４カ月の時点で実施される。
【０２０４】
第１の有効性分析は、１２カ月データについて行う。研究は、２４カ月まで通して二重盲検を継続し、１８カ月および２４カ月の時点で有効性および安全性についてさらに分析する。
【０２０５】
対象が１つの尺度しか提供しない場合、ゼロの勾配が振り分けられる。処置の割当は固定要素であり、ベースラインの桿体妨害は共変量である共分散モデルの分析を使用して、平均勾配における群間の差を試験する。勾配の欠損に対しておよび群間に差分欠損が存在する場合ゼロの値を振り分けられた群に対して、異なるインピュテーション方法を用いて感度分析を実施する。
【０２０６】
各群内の３０の試料サイズは、両側の有意レベル０．０５を有する２群ｔ検定を使用して、少なくとも０．８６３である、平均値における差と共通標準偏差との比を検出するため９０％の検出力を有する。
【０２０７】
例：ＳＤが４分間であり、群間の差が１年あたり３．４５分間であった場合、３０／群では９０％の検出力が存在する（３．４５／４．００＝０．８６３）。
【０２０８】
第２の有効性の尺度として、以下が挙げられる：ＥＴＤＲＳ視力、フラビンタンパク質蛍光、リポフスチン自己蛍光、カラー写真、ＯＣＴ、暗順応（円錐体感度、桿体−円錐体破壊、桿体感度回復勾配）および脈絡膜の流量測定。主要な第２のエンドポイント分析として以下が挙げられる：
すべての対象が１８カ月の期間を完了している場合、査定したベースラインからの桿体妨害時間の変化
すべての対象が２４カ月の期間を完了している場合、査定したベースラインからの桿体妨害時間における変化
フラビンタンパク質蛍光の平均強度。ＯｃｕＭｅｔ  Ｂｅａｃｏｎ（ＯｃｕＭｅｔ  Ｂｅａｃｏｎ、ＯｃｕＳｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）は、網膜組織のフラビンタンパク質蛍光（ＦＰＦ）を測定する。このＦＰＦ信号は、網膜組織内のミトコンドリアの代謝状態と相関することが示されている。グレイスケール単位（ｇｓｕ）および平均曲線幅におけるＦＰＦの平均強度は、ベースライン尺度および対照対象と比較して、組織機能障害のレベルを区別するための機能的尺度として使用することができる。窩を中心とした５つのＦＰＦ画像を処置眼から得る。５１２×５１２ピクセルファイルとして保存したＦＰＦ画像を分析して、ヒストグラムを作成する。０から６５，５３６のグレイスケール単位の範囲のピクセル強度のヒストグラムを、処置眼に対してプロットすることによって、グレイスケール平均単位波形を作成する。フラビンタンパク質蛍光像をベースライン、さらに処置後の６、１２、１８および２４カ月の時点で撮る。ＯｃｕＳｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃにおいて開発されているコンピュータサイエンスの専門的知識を利用して、マスクされた様式で分析を実施する。
【０２０９】
リポフスチン蛍光の平均強度：リポフスチンは、脂質リソソーム分解から誘導され、網膜色素上皮（ＲＰＥ）内のこの蓄積はＲＰＥ疾患および光受容体変性の有用なマーカーである。逆に、リポフスチン蛍光の損失は、ＲＰＥ細胞が失われるにつれて、ＡＭＤにおける地図状萎縮の徴候となり得る。したがって、眼底自己蛍光は、ＡＭＤにおける疾患進行の有用なモニタリング法としての役目を果たすことができる。フラビンタンパク質蛍光の定量化と同様に，ピクセル強度のヒストグラムを処置眼に対してプロットすると、平均グレイスケール単位波形が生じる。さらに、地図状萎縮は定性的に観察される。リポフスチン蛍光画像は、スクリーニング、ベースライン、さらに処置から６、１２、１８および２４カ月後に得る。
【０２１０】
光干渉断層撮影による網膜の平均厚さ。処置割当が固定要素であり、ベースライン桿体妨害が共変量である共分散モデルの分析を使用して、ベースラインからの平均変化における群間の差を試験した。概要は、両方の観察された症例に対しておよび進められた最終観察に対する結果を提供している。スペクトルドメインＯＣＴ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、約５ミクロンまでの解像度で中心の網膜黄斑の断面の画像を得ることができる。画像化後の分析により、中心の網膜厚さ、内節／外節（ＩＳ／ＯＳ）破壊の完全性、硝子体牽引の存在、より高度な深度画像化を用いた脈絡膜の厚さおよび脈絡膜の新生血管性膜または色素上皮の解離の存在が定量化されることになる。ＯＣＴは、スクリーニング、ベースラインさらに処置後６、１２、１８および２４カ月の時点で撮る。
【０２１１】
１．約０．０２−２重量％の間の量でヒドララジンを含む、医薬として活性のある薬物、
３．９−４．５の間のｐＨを有する、８−１２重量％の間の量の酢酸塩緩衝溶液、
０．５−２重量％の間の量のプロピレングリコール、
０．２５−１重量％の間の量の塩化ナトリウム、
０．０１５−０．０６重量％の間の量のメチルパラベン、
０．０１−０．０４重量％の間の量で存在する、５０％溶液の形態での塩化ベンザルコニウムおよび
０．００８−０．０３０重量％の間の量のエデト酸二ナトリウム
を含む眼科用組成物であって、４．０−４．４の間のｐＨを有する組成物。
２．薬物が塩酸ヒドララジンである、実施形態１に記載の組成物。
３．薬物が、０．５−２重量％の間の量で存在する、単一のまたは合わせた実施形態１または２に記載の組成物。
４．酢酸塩緩衝溶液がｐＨ４．２を有し、１０重量％の量で存在する、単一のまたは合わせた実施形態１から３に記載の組成物。
５．酢酸塩緩衝溶液が、酢酸ナトリウムおよび２Ｎ酢酸で構成されている、単一のまたは合わせた実施形態１から４に記載の組成物。
６．プロピレングリコールが、１重量％の量で存在する、単一のまたは合わせた実施形態１から５に記載の組成物。
７．メチルパラベンが、０．０３重量％で存在する、単一のまたは合わせた実施形態１から６に記載の組成物。
８．５０％溶液の形態での塩化ベンザルコニウムが、０．０２重量％で存在する、単一のまたは合わせた実施形態１から７に記載の組成物。
９．エデト酸二ナトリウムが、０．０１５重量％で存在する、単一のまたは合わせた実施形態１から８に記載の組成物。
１０．水と、ｐＨ３．９−４．５を有する酢酸塩緩衝溶液とを混合することによって、第１の中間混合物を形成するステップであって、酢酸塩緩衝溶液が、製剤中に約８−１２重量％の間の酢酸塩緩衝溶液が得られる量で加えられるステップ、
第１の中間混合物にエデト酸二ナトリウムを加えることによって、第２の中間混合物を形成するステップであって、エデト酸二ナトリウムが、製剤中に約０．００８−０．０３０重量％の間のエデト酸二ナトリウムが得られる量で加えられるステップ、
第２の中間混合物にプロピレングリコールを加えることによって、第３の中間混合物を形成するステップであって、プロピレングリコールが、製剤中に約０．５−２重量％の間のプロピレングリコールが得られる量で加えられるステップ、
第３の中間混合物に塩化ナトリウムを加えることによって、第４の中間混合物を形成するステップであって、塩化ナトリウムが、製剤中に約０．２５−１重量％の間の塩化ナトリウムが得られる量で加えられるステップ、
第４の中間混合物に塩化ベンザルコニウムを加えることによって、第５の中間混合物を形成するステップであって、塩化ベンザルコニウムが、製剤中に約０．０１−０．０４重量％の間の塩化ベンザルコニウムが得られる量で加えられるステップ、
第５の中間混合物にメチルパラベンを加えることによって、第６の中間混合物を形成するステップであって、メチルパラベンが、製剤中に約０．０１５−０．０６重量％の間のメチルパラベンが得られる量で加えられるステップ、および
第６の中間混合物にヒドララジンを含む医薬として活性のある薬物を加えることによって、前記製剤を形成するステップ
を含む眼科用製剤を調製するための方法。
１１．加えるステップのうちの１つ以上が、加えながら混合するステップを含む、実施形態１０に記載の方法。
１２．酢酸塩緩衝溶液が、製剤中に１０重量％の酢酸塩緩衝剤が得られる量で加えられる、単一のまたは合わせた実施形態１０から１１に記載の方法。
１３．酢酸塩緩衝溶液が、酢酸ナトリウムおよび２Ｎ酢酸で構成されている、単一のまたは合わせた実施形態１０から１２に記載の方法。
１４．エデト酸二ナトリウムが、製剤中に０．０１５重量％のエデト酸二ナトリウムが得られる量で加えられる、請求項単一のまたは合わせた実施形態１０から１３に記載の方法。
１５．プロピレングリコールが、製剤中に１５重量％のプロピレングリコールが得られる量で加えられる、単一のまたは合わせた実施形態１０から１４に記載の方法。
１６．塩化ナトリウムが、製剤中に０．５重量％の塩化ナトリウムが得られる量で加えられる、単一のまたは合わせた実施形態１０から１５に記載の方法。
１７．塩化ベンザルコニウムが、製剤中に０．０２重量％の塩化ベンザルコニウムが得られる量で加えられる、単一のまたは合わせた実施形態１０から１６に記載の方法。
１８．メチルパラベンが、製剤中に０．０３重量％のメチルパラベンが得られる量で加えられる、単一のまたは合わせた実施形態１０から１７に記載の方法。
１９．医薬として活性のある薬物が、０．５−２重量％の間で製剤中に存在するヒドララジンである、単一のまたは合わせた実施形態１０から１８に記載の方法。
２０．黄斑変性のリスクがあるまたは黄斑変性と診断された対象の眼に、請求項１から９のいずれか一項に記載の眼科用組成物または請求項１０から１９に記載の方法に従い調製された製剤を投与するステップを含む、黄斑変性を処置するための方法。
２１．前記黄斑変性が加齢ドライ型黄斑変性である、実施形態２０に記載の方法。
２２．黄斑変性の処置において使用するための、合わせたもしくは別個の実施形態１から９に記載の組成物または合わせたもしくは別個の実施形態１０から１９に記載の方法により形成された眼科用製剤。
２３．ドライ型加齢黄斑変性の処置において使用するための、実施形態２２に記載の組成物または製剤。
【０２１２】
いくつかの典型的な態様および実施形態が上記で考察されてきたが、当業者は、このある修正、変形、追加および下位の組合せを認識している。したがって、以下の添付の特許請求の範囲およびこれより以下に導入されている特許請求の範囲は、すべてのこのような修正、変形、追加および下位の組合せを、これらの真の趣旨および範囲内に含むものとみなす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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