(57)【要約】標的細胞の集団の単離または他の方法でのその調製に有用な方法および組成物が提供される。一部において、これは、外因性タンパク質分解切断部位を含む組み換え抗体および該抗体をコードする核酸分子に関連する。2015517320.tif 000015
2015517320.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換え抗体で被覆された固体表面に付着した標的細胞を切り離すための方法であって、前記表面に付着した前記標的細胞を、前記抗体内の外因性タンパク質分解切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部と接触させ、それによって前記標的細胞を前記表面から切り離す段階を含む方法。
【請求項２】
混合細胞集団から標的細胞を単離するための方法であって、
(a) 混合細胞集団を、固体表面に付着した抗体と接触させる段階であって、前記抗体が前記集団中の前記標的細胞に特異的に結合し、前記抗体が外因性タンパク質分解切断部位を含む段階
を含む方法。
【請求項３】
(b) 前記表面に結合した前記標的細胞を前記表面に結合していない細胞から分離する段階
をさらに含む方法であって、
任意で、(c) 前記表面に結合した前記標的細胞を、前記切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部と接触させて、前記表面から前記標的細胞を切り離す段階をさらに含み、かつ
任意で、(d) 前記表面から切り離された前記標的細胞を収集する段階をさらに含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
活性化された標的細胞の集団を生成するための方法であって、
(a) 標的細胞を含む細胞集団を、固体表面に付着したアゴニスト抗体と接触させる段階であって、前記抗体が前記集団中の前記標的細胞に特異的に結合し、前記抗体が外因性タンパク質分解切断部位を含む段階と、
(b) 前記細胞、および前記表面に付着した前記抗体を、前記標的細胞の活性化を可能にする条件下でインキュベートする段階と
を含む方法。
【請求項５】
(c) 前記表面に結合した前記標的細胞を前記表面に結合していない細胞から分離する段階
をさらに含む方法であって、
任意で、(d) 前記表面に結合した前記標的細胞を、前記切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部と接触させて、前記表面から前記標的細胞を切り離す段階をさらに含み、かつ
任意で、(e) 前記表面から切り離された前記活性化された標的細胞を収集する段階をさらに含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
抗体を含まない標的細胞の集団をポジティブに単離するための方法であって、
(a) 混合細胞集団を、固体表面に付着した抗体と接触させる段階であって、前記抗体が前記集団中の前記標的細胞に特異的に結合し、前記抗体が外因性プロテアーゼ切断部位を含む段階と、
(b) 前記表面に結合した前記標的細胞を前記表面に結合していない細胞から分離する段階と、
(c) 前記表面に結合した前記標的細胞を、前記切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部と接触させて、前記表面から前記標的細胞を切り離す段階と、
(d) 前記抗体および前記表面から切り離された前記標的細胞を収集して、結合抗体を含まない標的細胞の集団を形成する段階と
を含む方法。
【請求項７】
ビーズを含まない標的細胞の集団を生成するための方法であって、
(a) 混合細胞集団を、ビーズに付着した抗体と接触させる段階であって、前記抗体が前記集団中の前記標的細胞に特異的に結合し、前記抗体が外因性プロテアーゼ切断部位を含む段階と、
(b) 前記ビーズに結合した前記標的細胞を前記ビーズに結合していない細胞から分離する段階と、
(c) 前記ビーズに結合した前記標的細胞を、前記切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部と接触させて、前記ビーズから前記標的細胞を切り離す段階と、
(d) 前記ビーズから切り離された前記標的細胞を収集して、ビーズを含まない標的細胞の集団を形成する段階と
を含む方法。
【請求項８】
前記プロテアーゼが前記標的細胞によって発現されない、請求項1、3および5〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記プロテアーゼがエンドプロテアーゼである、請求項1、3および5〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロテアーゼがウイルスプロテアーゼである、請求項1、3および5〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロテアーゼが、タバコエッチウイルス（tobacco etch virus（TEV））プロテアーゼ、ライノウイルス3Cプロテアーゼ、TVMVプロテアーゼ、プラムポックスウイルスプロテアーゼ、およびカブモザイクウイルスプロテアーゼから成る群から選択される、請求項1、3、5〜8および10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロテアーゼがTEVプロテアーゼである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロテアーゼが、エンテロペプチダーゼ、トロンビンおよび第Xa因子から成る群から選択される、請求項9に記載の方法。
【請求項１４】
前記切断部位が前記抗体のヒンジ領域内にある、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記切断部位が前記抗体の上部ヒンジ領域内にある、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞集団が血液細胞を含む、請求項2〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記血液細胞が末梢血単核細胞である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞集団が幹細胞を含む、請求項2〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的細胞がT細胞である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的細胞が幹細胞である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的細胞がCD34+である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体が標的細胞表面上の内因性タンパク質に特異的に結合する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体が標的細胞表面上の外因性タンパク質に特異的に結合する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体がCD3エピトープに特異的に結合する、請求項22に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体がTra-1-60エピトープに特異的に結合する、請求項22に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体がCD34エピトープに特異的に結合する、請求項22に記載の方法。
【請求項２７】
前記結合した標的細胞の60%超が前記表面から切り離される、請求項1、3および5〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記結合した標的細胞の90%超が前記表面から切り離される、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体が前記固体表面に間接的に付着している、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記固体表面がビーズである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ビーズが常磁性である、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的細胞がT細胞であり、前記抗体が抗CD3抗体である、請求項4に記載の方法。
【請求項３３】
前記(b)のインキュベートする段階がIL-2をさらに含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
ヒンジ領域内に外因性タンパク質分解切断部位を含む組み換え抗体。
【請求項３５】
細胞表面エピトープに特異的に結合する、請求項34に記載の抗体。
【請求項３６】
ヒンジ領域内に外因性タンパク質分解切断部位を含む抗体重鎖をコードする核酸。
【請求項３７】
細胞、組み換え抗体および固体表面を含む組成物であって、前記組み換え抗体が前記細胞に特異的に結合しており、かつ前記固体表面にも付着しており、前記組み換え抗体が外因性タンパク質分解切断部位を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条(e)に基づき、参照により本明細書に組み込まれる2012年5月22日出願の米国仮特許出願第61/650,388号の恩典を主張する。
【０００２】
本発明は、組み換え抗体、および標的細胞集団の単離のためまたは他の方法でのその調製のための方法における該抗体の使用に関連する。特定の実施形態では、これは、外因性タンパク質分解切断部位を含む組み換え抗体および該抗体をコードする核酸分子に関連する。
【背景技術】
【０００３】
背景
単離された細胞または特定の細胞について濃縮された細胞組成物は、研究および臨床コミュニティおよび製薬産業では、長年に渡って強い関心を呼んでおり、役に立ってきた。従って、純度が低いかまたは混合された細胞集団からこのような単離されたまたは濃縮された細胞組成物を調製するために、種々の手法および試薬が開発されてきた。標的細胞のサイズ、形状、運動性および表面分子を含め、さまざまな細胞特性が、混合細胞集団から特定の細胞を分離するために使用されてきた。
【０００４】
関心細胞の表面上の標的分子と特異的に関連する抗体が、望ましい（または標的）細胞を、特定の表面分子を持たない混合集団の他の細胞から分離するために使われてきた。例えば、関心細胞を標識化し、次に標識細胞をポジティブまたはネガティブに選択して望ましい細胞集団を調製するために、特定の細胞表面分子に特異的な抗体が使用されてきた。
【０００５】
特定細胞を捕捉し、集団の非結合細胞から結合細胞を分離するために、抗体で被覆された表面、例えばビーズまたは培養ウェルが使用されてきた。しかし、単離細胞の使用法の多くは、捕捉抗体／表面複合体からの細胞の取り出しを必要とし、この取り出しは、単離された細胞を特定の使用または下流用途に対して不適切または不適合にする細胞損傷または変化をもたらしうる。
【０００６】
例えば、タンパク質分解およびコラーゲン分解酵素のカクテルを使用して、捕捉抗体／ビーズ複合体から細胞を取り出す方法は、多くの細胞表面分子を分解し、単離された細胞の少なくとも表面特性を変化させうる。他の方法では、捕捉抗体をビーズから分離することによって、細胞が捕捉抗体／ビーズ複合体から遊離されるが、捕捉抗体は標的細胞表面に結合したままである。一方、さらに他の細胞単離法では、単離された細胞から捕捉抗体／ビーズ複合体は全く除去されない。
【０００７】
例えば、単離試薬を持ち越したり、細胞の使用およびさらなる用途に対して好ましくないように細胞を変化させることなく、特定の細胞集団を生成する細胞単離のための代替的な手法および試薬に対するニーズがいまだ存在する。
【０００８】
本明細書に引用したすべての特許、特許出願、および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００９】
概要
標的細胞に特異的に結合する組み換え抗体および抗体内の外因性タンパク質分解切断部位を切断するプロテアーゼを使用して、混合集団から標的細胞を単離するための方法が、一部において本明細書に提供されている。また、外因性タンパク質分解切断部位を含む組み換え抗体、並びに該抗体を含む組成物も提供されている。また、該抗体をコードする核酸分子および発現ベクターも提供されている。
【００１０】
1つの態様では、組み換え抗体で被覆された固体表面に付着した標的細胞を切り離すための方法が本明細書に提供されており、方法は、表面に付着した標的細胞を、抗体内の外因性タンパク質分解切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部と接触させ、それによって標的細胞を表面から切り離す段階を含む。
【００１１】
別の態様では、混合細胞集団から標的細胞を単離するための方法が本明細書に提供されており、方法は、(a) 混合細胞集団を、固体表面に付着した抗体と接触させる段階を含み、ここで抗体は集団中の標的細胞に特異的に結合し、抗体は外因性タンパク質分解切断部位を含む。一部の実施形態では、方法は、(b) 表面に結合した標的細胞を表面に結合していない細胞から分離する段階をさらに含み、任意で(c) 表面に結合した標的細胞を、切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部と接触させて、表面から標的細胞を切り離す段階をさらに含み、かつ任意で(d) 表面から切り離された標的細胞を収集する段階をさらに含む。
【００１２】
別の態様では、活性化された標的細胞の集団を生成するための方法が本明細書に提供されており、方法は、(a) 標的細胞を含む細胞集団を、固体表面に付着したアゴニスト抗体と接触させる段階であって、抗体が集団中の標的細胞に特異的に結合し、抗体が外因性タンパク質分解切断部位を含む段階と、(b)細胞、および表面に付着した抗体を、標的細胞の活性化を可能にする条件下でインキュベートする段階とを含む。一部の実施形態では、方法は、(c) 表面に結合した標的細胞を表面に結合していない細胞から分離する段階をさらに含み、任意で(d) 表面に結合した標的細胞を、切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部と接触させて、表面から標的細胞を切り離す段階をさらに含み、かつ任意で(e) 表面から切り離された活性化された標的細胞を収集する段階をさらに含む。
【００１３】
別の態様では、抗体を含まない標的細胞の集団をポジティブに単離するための方法が本明細書に提供されており、方法は、(a) 混合細胞集団を、固体表面に付着した抗体と接触させる段階であって、抗体が集団中の標的細胞に特異的に結合し、抗体が外因性プロテアーゼ切断部位を含む段階と、(b) 表面に結合した標的細胞を表面に結合していない細胞から分離する段階と、(c) 表面に結合した標的細胞を、切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部と接触させて、表面から標的細胞を切り離す段階と、(d) 抗体および表面から切り離された標的細胞を収集して、結合抗体を含まない標的細胞の集団を形成する段階とを含む。
【００１４】
別の態様では、ビーズを含まない標的細胞の集団を生成するための方法が本明細書に提供されており、方法は、(a) 混合細胞集団を、ビーズに付着した抗体と接触させる段階であって、抗体が集団中の標的細胞に特異的に結合し、抗体が外因性プロテアーゼ切断部位を含む段階と、(b) ビーズに結合した標的細胞をビーズに結合していない細胞から分離する段階と、(c) ビーズに結合した標的細胞を、切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部と接触させて、ビーズから標的細胞を切り離す段階と、(d) ビーズから切り離された標的細胞を収集して、ビーズを含まない標的細胞の集団を形成する段階とを含む。
【００１５】
別の態様では、ヒンジ領域内に外因性タンパク質分解切断部位を含む組み換え抗体が本明細書に提供されている。
【００１６】
別の態様では、細胞、組み換え抗体および固体表面を含む組成物であって、組み換え抗体が細胞に特異的に結合しており、かつ固体表面にも付着しており、組み換え抗体が外因性タンパク質分解切断部位を含む組成物が、本明細書に提供されている。
【００１７】
別の態様では、ヒンジ領域内に外因性タンパク質分解切断部位を含む抗体重鎖をコードする核酸分子が本明細書に提供されている。
【００１８】
一部の実施形態では、プロテアーゼは標的細胞によって発現されない。
【００１９】
一部の実施形態では、プロテアーゼはウイルスプロテアーゼである。特定の実施形態では、プロテアーゼは、タバコエッチウイルス（tobacco etch virus （TEV））プロテアーゼ、ライノウイルス3Cプロテアーゼ、TVMVプロテアーゼ、プラムポックスウイルスプロテアーゼ、およびカブモザイクウイルスプロテアーゼから成る群から選択される。
【００２０】
一部の実施形態では、プロテアーゼはエンドプロテアーゼである。特定の実施形態では、プロテアーゼは、エンテロペプチダーゼ、トロンビンおよび第Xa因子から成る群から選択される。
【００２１】
提供された方法および組成物の一部の実施形態では、外因性タンパク質分解切断部位は、標的細胞で発現されていないプロテアーゼに対するものである。
【００２２】
提供された方法および組成物の一部の実施形態では、外因性タンパク質分解切断部位は、ウイルスプロテアーゼに対するものである。特定の実施形態では、外因性タンパク質分解切断部位は、タバコエッチウイルス（TEV）プロテアーゼ、ライノウイルス3Cプロテアーゼ、TVMVプロテアーゼ、プラムポックスウイルスプロテアーゼ、およびカブモザイクウイルスプロテアーゼから成る群から選択されるプロテアーゼに対するものである。
【００２３】
提供された方法および組成物の一部の実施形態では、外因性タンパク質分解切断部位は、エンドプロテアーゼに対するものである。特定の実施形態では、外因性タンパク質分解切断部位は、エンテロペプチダーゼ、トロンビンおよび第Xa因子から成る群から選択されるプロテアーゼに対するものである。
【００２４】
提供された方法および組成物の一部の実施形態では、外因性タンパク質分解切断部位は、抗体のヒンジ領域内にある。一部の実施形態では、外因性タンパク質分解切断部位は、抗体の上部ヒンジ領域内にある。
【００２５】
一部の実施形態では、標的細胞は、T細胞、幹細胞、またはCD34+細胞である。
【００２６】
一部の実施形態では、組み換え抗体は、標的細胞表面上の内因性タンパク質に特異的に結合する。一部の実施形態では、組み換え抗体は、標的細胞表面上の外因性タンパク質に特異的に結合する。一部の実施形態では、組み換え抗体は、CD3エピトープ、Tra-1-60エピトープ、またはCD34エピトープに特異的に結合する。
【００２７】
一部の実施形態では、組み換え抗体は、固体表面に直接付着している。他の実施形態では、組み換え抗体は、固体表面に間接的に付着している。一部の実施形態では、固体表面は培養ウェルまたはビーズである。特定の実施形態では、固体表面は常磁性ビーズである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】抗ヒトCD3をコードするV領域とH鎖およびL鎖遺伝子のゲノム配列とを持つ、高発現主鎖H鎖（図1A、mIgG1-TEV SPV）ベクターおよびL鎖（図1B、mCK-SPV）ベクターのマップを示す。V領域またはC領域スイッチに使用される制限酵素部位が示されている。
【図２】非還元（左）条件下および還元（右）条件下の組み換え抗体（rAb TEV）並びに対照：分子量マーカー（MwM）、精製マウスIgG1（標準IgG1）、モックトランスフェクト細胞からの使用済み上清（Neg）、およびヒトIgGを発現している対照プラスミド（hIgG）の電気泳動を示す。
【図３Ａ】rAb-TEVでの細胞の前処理ありの抗CD3-APCで染色された単核細胞（MNC）のフローサイトメトリー分析を示す。
【図３Ｂ】rAb-TEVでの細胞の前処理なしの抗CD3-APCで染色された単核細胞（MNC）のフローサイトメトリー分析を示す。
【図４】AcTEV（商標）プロテアーゼとインキュベートした後のrAb TEV（レーン3および4）並びに対照：非還元条件下の分子量マーカーおよびrAb-TEV（レーン1）、還元条件下のrAB-TEV（レーン2）、AcTEV（商標）プロテアーゼを使用した対照IgG（レーン5）の電気泳動を示す。AcTEV（商標）プロテアーゼの分子量は27 kDaである。
【図５】Dynabeadsに結合され、抗マウスIgG1-FITC（上パネル）で検出されたrAb-TEV並びに対照：Dynabeadsに結合されたrAb-TEV + 抗マウスIgG2a-FITC（左下パネル）およびDynabeadsに結合されたモックトランスフェクト上清 + 抗マウスIgG1-FITC（右下パネル）のフローサイトメトリー分析を示す。
【図６】Dynabeadsに結合され、AcTEV（商標）プロテアーゼとのインキュベーションの前（左上）と後（左下および右下）に抗マウスカッパ-PE抗体で検出されたrAb-TEVのフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。2つのシナリオを図示する略図が右上に示されている。AcTEV（商標）プロテアーゼとのインキュベーションは、室温（左下）または37oC（右下）で行なわれた。カッパ陽性ビーズのパーセントが各ヒストグラムに示されている。
【図７】10e7ビーズあたりに結合したrAb-TEVのさまざまな量を使用した、MNC集団からのCD3+ T細胞の枯渇パーセントを示すチャートである。
【図８】磁気ビーズに結合されたrAb-TEVおよびビーズ遊離のためのTEVプロテアーゼを使用した、ビーズを含まないCD3+ T細胞のポジティブな単離の例示的ワークフローを示す略図である。
【図９】さまざまな量の付着した抗体を有するビーズを使用して単離されたCD3+細胞およびプロテアーゼなしに実施された対照の回収率、純度および生存率を示す。
【図１０】健常ドナー（n=7）のMNCからポジティブに単離されたCD3+ T細胞の平均回収率と純度を示すチャートである。
【図１１Ａ】プロテアーゼ処理後の捕捉抗体の遊離および細胞上の標的エピトープの利用可能性を示す結果を図示している。
【図１１Ｂ】プロテアーゼ処理後の捕捉抗体の遊離および細胞上の標的エピトープの利用可能性を示す結果を図示している。
【図１１Ｃ】プロテアーゼ処理後の捕捉抗体の遊離および細胞上の標的エピトープの利用可能性を示す結果を図示している。
【図１２】ポジティブに単離されたCD3+ T細胞の活性化および増殖の結果を示す：（図12A）6日目の細胞増殖倍数、（図12B）CD4およびCD8細胞上のCD62LおよびCD27発現。
【図１３】細胞単離のための例示的組成物およびその使用を示す略図である。ハサミは、標的細胞エピトープに特異的な抗体内の外因性タンパク質分解切断部位に特異的なプロテアーゼを示す。
【図１４】抗CD34-FITCで染色したKG1aおよびFreeStyle（商標） 293F細胞の混合物のフローサイトメトリー分析を示す：（図14A）rAb-TEV抗CD34での細胞の前処理なし、（図14B）rAb-TEV 抗CD34での細胞の前処理あり、（図14C）rAb-TEV 抗CD34およびAcTEVプロテアーゼでの細胞の前処理ありで、これは、プロテアーゼ処理後のrAb-TEV 抗CD34の遊離および細胞上の標的エピトープの利用可能性を示す。
【図１５】AcTEV（商標）プロテアーゼとのインキュベーション後のrAb TEV 抗CD34（レーン3および4）並びに対照：分子量マーカー（レーン1）、プロテアーゼなしのrAb-TEV 抗CD34（レーン2）の電気泳動を示す。
【図１６】3つの異なるビーズ遊離後洗浄条件での、ビーズに結合したrAb-TEV 抗CD34を使用した単離CD34+細胞の回収率、枯渇、および純度を示す。示されたデータは3つ組の平均である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
標的細胞の集団の単離に一部において関連する、方法および組成物が本明細書に開示されている。本明細書に提供された方法および組成物は、細胞がさらなる用途に使用された時にシグナル伝達イベントを誘発または阻止しうる単離試薬を、単離された細胞が持つことなく、標的細胞集団を単離するために使用できる。例示的実施形態では、提供された方法および組成物の使用は、捕捉抗体の生物学的活性部分（Fc部分）を含まず、捕捉ビーズを含まない細胞の調製を可能にし、臨床的用途およびインビボの用途のためのこのような細胞調製の使用を可能にする。特定の実施形態の方法のいくつかのステップの概要について、および例示的ワークフローの概要については、それぞれ図13および8の図を参照のこと。
【００３０】
方法は、外因性タンパク質分解切断部位を含む抗体、つまり天然では抗体内に見出されないタンパク質分解切断部位を含むように改変された抗体の使用を伴う。方法は、抗体内に挿入された外因性切断部位に対して特異的なタンパク質分解活性を持つプロテアーゼの使用も伴う。抗体内のタンパク質分解切断部位は、切断が起こる任意の部位を含みうる。一般的に、当技術分野で知られているように、タンパク質分解切断部位は、切断が起こるアミノ酸に加えて、切断部位に対するプロテアーゼ特異性を定めるのに役立つ追加的アミノ酸残基も含む。
【００３１】
外因性タンパク質分解切断部位を含む組み換え抗体は、標的細胞上、つまり望ましい細胞集団を構成する細胞上のエピトープに結合する。組み換え抗体は、標的細胞上のエピトープに結合するので、本明細書では、抗標的エピトープ抗体とも呼ばれる。
【００３２】
方法の1つの態様では、捕捉抗体で被覆された固体表面に付着した標的細胞は、標的細胞／表面複合体をプロテアーゼと接触させることによって切り離され、ここでプロテアーゼは、捕捉抗体の外因性タンパク質分解切断部位に対して特異的である。プロテアーゼとの接触は、抗体内の外因性タンパク質分解部位の切断および該表面からの標的細胞の切り離しをもたらす。
【００３３】
一部の実施形態では、標的細胞の表面上のエピトープには特異的に結合するが、集団中の非標的細胞の表面上のものには結合しない組み換え抗体の使用を通して、標的細胞が混合細胞集団から単離される。抗体による標的細胞エピトープへの結合の前、最中、またはその後に、抗体は表面に付着して、結合していない非標的細胞からの結合した標的細胞の分離を可能にする。組み換え抗体は、外因性タンパク質分解切断部位に特異的なプロテアーゼで細胞／抗体／表面複合体を処理することによって、表面からの細胞の遊離または切り離しを可能にする、挿入された外因性タンパク質分解切断部位を含む。方法は、混合細胞集団からの標的細胞の濃縮または標的細胞の枯渇を可能にする。
【００３４】
方法および組成物の一部の実施形態では、プロテアーゼとの接触は、結合した標的細胞の少なくとも50%の、表面からの切り離しをもたらす。他の実施形態では、プロテアーゼとの接触は、結合した標的細胞の>60%、>70%、>80%、>90%または>95%の、表面からの切り離しをもたらす。
【００３５】
例えば、混合細胞集団から標的細胞を単離するための方法は、(a) 混合細胞集団を、固体表面に付着した抗体と接触させる段階であって、抗体が集団中の標的細胞に特異的に結合し、抗体が外因性タンパク質分解切断部位を含む段階と、(b) 表面に結合した標的細胞を表面に結合していない細胞から分離する段階と、(c) 表面に結合した標的細胞を、切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部と接触させて、表面から標的細胞を切り離す段階と、(d) 表面から切り離された標的細胞を収集する段階を含む。
【００３６】
一部の実施形態では、混合細胞集団は、組み換え抗標的エピトープ抗体を表面に付着させる前に、該抗体と共にインキュベートされる。組み換え抗体が標的細胞に結合した後、抗体を表面に直接的または間接的に付着させて、結合していない非標的細胞からの結合した標的細胞の分離を可能にする。抗体-標的細胞結合の後の表面への抗体付着は、特に、例えばCD34+細胞集団などの希少な細胞集団の単離に対して有用である。
【００３７】
例えば、IL-2の存在下で抗CD3+抗体とインキュベートすることによって活性化できるCD3+ T細胞などの活性化された標的細胞の集団を生成するための方法も提供されている。活性化された標的細胞の集団を生成するための方法の一例は、(a) 標的細胞を含む細胞集団を、固体表面に付着したアゴニスト抗体と接触させる段階であって、アゴニスト抗体が集団中の標的細胞に特異的に結合し、抗体が外因性タンパク質分解切断部位を含む段階と、(b) 標的細胞の活性化を可能にする条件下で、細胞、および表面に付着した抗体をインキュベートする段階とを含む。方法は、(c) 表面に結合した標的細胞を表面に結合していない細胞から分離する段階と、(d) 表面に結合した標的細胞を、切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部と接触させて、表面から標的細胞を切り離す段階と、(e) 表面から切り離された活性化された標的細胞を収集する段階を、任意でさらに含んでもよい。このような単離され活性化された細胞は、特定の用途ですぐ使用することができ、または用途での使用の前に増殖させることもできる。例えば、単離された活性化T細胞は、インビボの用途での使用前に、培養下で10倍〜1000倍増殖させることができる。
【００３８】
一部の実施形態では、外因性タンパク質分解切断部位は、組み換え抗体のヒンジ領域内に挿入される。外因性切断部位がヒンジ領域内にあると、特定のプロテアーゼでの処理は、組み換え抗体を2つのFabフラグメントと1つのFcフラグメントの、3つのフラグメントに切断する。
【００３９】
抗体のFc部分はエフェクター機能を持ち、一部において、Fc受容体および免疫系の他の分子と結合することを通して、免疫系の種々の生理作用を媒介する。標的細胞から組み換え抗体のFc部分を除去する、外因性切断部位を介した抗体／表面複合体からの標的細胞の切り離しは、Fcドメインおよびそれに関連するエフェクター機能を含まない単離された標的細胞集団を生成する。従って、本明細書に提供された方法および組み換え抗体を使用した標的細胞の単離により、抗標的エピトープ抗体Fcドメインを含まない標的細胞集団を生成できる。細胞療法用途での使用については、生物学的に活性な抗体が付着していない（すなわち、Fcドメインが付着していない）細胞の精製が、治療の安全性および有効性のために重要である。
【００４０】
抗体のFabフラグメントは一価であり、少なくとも二価である完全な抗体がエピトープに結合するよりも低い結合活性で標的エピトープと結合する。従って、プロテアーゼ処理の後に細胞上の標的エピトープに結合しているFabフラグメントは、完全抗体よりも容易に細胞から外れる。このように、本明細書に提供された方法および組み換え抗体を使用した標的細胞の単離により、抗体を含まない標的細胞集団を生成できる。
【００４１】
一部の実施形態では、(a) 混合細胞集団を、固体表面に付着した抗体と接触させる段階であって、抗体が標的細胞に特異的に結合し、抗体が外因性タンパク質分解切断部位を含む段階と、(b) 表面に結合した標的細胞を表面に結合していない細胞から分離する段階と、(c) 表面に結合した標的細胞を、抗体内の外因性切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部と接触させて、表面から標的細胞を切り離す段階と、(d) 抗体および表面から切り離された標的細胞を収集して、結合抗体を含まない標的細胞の集団を形成する段階を含む、抗体を含まない標的細胞の集団をポジティブに単離するための方法が提供されている。
【００４２】
一部の実施形態では、(a) 混合細胞集団を、ビーズに付着した抗体と接触させる段階であって、抗体が標的細胞に特異的に結合し、抗体が外因性タンパク質分解切断部位を含む段階と、(b) ビーズに結合した標的細胞をビーズに結合していない細胞から分離する段階と、(c) ビーズに結合した標的細胞を、切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部と接触させて、ビーズから標的細胞を切り離す段階と、(d) ビーズから切り離された標的細胞を収集して、ビーズを含まない標的細胞の集団を形成する段階を含む、ビーズを含まない標的細胞の集団を生成するための方法が提供されている。
【００４３】
本明細書に提供された方法および組成物は、標的細胞が、集団中の他の細胞から区別されうるエピトープを持つ限りは、混合細胞集団において任意のタイプの細胞を他の細胞から単離または分離するために使用される。他の実施形態では、方法および組成物は、標的細胞が組成物の不要な構成要素から区別されうるエピトープを持つ限りは、任意のタイプの細胞を組成物の非細胞構成要素から単離または分離するために使用される。
【００４４】
方法の一部の実施形態では、開始組成物中の標的細胞の少なくとも約15%が回収される。一部の実施形態では、標的細胞の少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、または少なくとも約50%が回収される。特定の実施形態では、開始組成物中の標的細胞の約15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、または90%が回収される。
【００４５】
一部の実施形態では、単離された標的細胞集団の生存率は50%より大きい。他の実施形態では、単離された標的細胞集団の生存率は、60%より大きい、70%より大きい、80%より大きい、90%より大きい、または95%より大きい。特定の実施形態では、単離された標的細胞集団の生存率は、約50%、60%、70%、80%、90%、または95%である。
【００４６】
上述のように、提供された方法および組成物は、単離された細胞集団中の標的細胞の濃縮のために使用されうる。従って、一部の実施形態では、単離された標的細胞集団の純度は50%より大きく、つまり、標的細胞である単離細胞集団全体のパーセントは50%より大きい。他の実施形態では、単離された標的細胞集団の純度は、60%より大きい、70%より大きい、80%より大きい、90%より大きい、または95%より大きい。特定の実施形態では、単離された標的細胞集団の純度は、約50%、60%、70%、80%、90%、または95%である。
【００４７】
標的細胞を捕捉するために、混合細胞集団は、組み換え抗標的エピトープ抗体の表面への付着の前、最中、またはその後に、組み換え抗体と共にインキュベートされる。一部の実施形態では、このインキュベーションは、限定するものではないが例えば、回転運動、揺動運動、または攪拌運動で攪拌されている細胞・抗体懸濁液により実施される。他の実施形態では、細胞・抗体懸濁液のこのインキュベーションは、攪拌なしで実施される。このインキュベーションは、抗体が標的細胞上のエピトープに結合するために適した温度および時間で行なわれる。一部の実施形態では、インキュベーションは室温で行なわれる。他の実施形態では、インキュベーションは、4℃、8℃、25℃、30℃、または37℃で行なわれる。一部の実施形態では、インキュベーションは約5分間〜約2時間である。特定の実施形態では、限定するものではないが、インキュベーションは、約5分間、10分間、15分間、20分間、30分間、40分間、50分間、60分間、75分間、90分間または105分間である。
【００４８】
提供された方法では、標的細胞／組み換え抗体／表面複合体が形成される。この複合体の構成要素は、いくつかの異なる方法で結合されうる。例えば、1つの実施形態では、標的細胞を含む組成物を、表面に付着した抗標的エピトープ組み換え抗体と接触させることができる。別の実施形態では、標的細胞を含む組成物を、抗標的エピトープ組み換え抗体と接触させることができ、標的細胞が抗体に結合した後、抗体を、例えば、組み換え抗体を表面に連結させる別の抗体を介して、表面に付着させることができる。さらに別の実施形態では、標的細胞を含む組成物を、抗標的エピトープ組み換え抗体および表面と同時に接触させることができ、組み換え抗体は、組み換え抗体を表面に連結させるための何らかの手段を持つ。
【００４９】
従って、別の態様では、標的細胞、組み換え抗体および固体表面を含む組成物であって、組み換え抗体が細胞に特異的に結合しており、かつ固体表面にも付着しており、組み換え抗体が外因性タンパク質分解切断部位を含む組成物が、本明細書に提供されている。
【００５０】
組み換え抗体は、表面に直接付着するか、または、例えば組み換え抗体に結合し表面に付着するリンカー、例えば抗体、の使用を通して、表面に間接的に付着しうる。
【００５１】
特定の実施形態では、表面は固体表面である。限定するものでないが、固体表面は、細胞培養ウェルもしくは培養プレート、粒子もしくはビーズ、顕微鏡用スライド、または膜の形態でありうる。固体表面は磁性または非磁性でありうる。表面が非磁性の実施形態では、組み換え抗体／表面複合体に結合した標的細胞の、非標的細胞および材料からの分離は、例えば、洗浄、遠心分離、ろ過および／または篩過によって達成されうる。ポリマービーズなどの、提供された方法での使用に適した非磁性粒子は市販されており、抗体をこのようなビーズに付着させる技術は当技術分野でよく知られている。
【００５２】
細胞単離技術での磁性の使用はよく知られており、このような技術で使用するための磁性表面は市販されている。方法で使用するための磁性表面または磁化可能な表面、例えば粒子は、限定するものではないが、磁性、常磁性、または超常磁性でありうる。「磁性」という用語は本明細書で使用される場合、磁場中に置かれた時に、担体がそれに与えられる磁気モーメントを持つことができ、従って、磁場の作用下で動かすことが可能であることを意味する。従って、磁性粒子は、磁気凝集によってサンプルの他の構成要素から容易に除去され得、これは、標的細胞の結合の後、および同様に抗体／粒子複合体からの標的細胞のタンパク質分解性遊離の後の、粒子の分離の迅速でシンプルでかつ効率的な方法を提供する。さらに、磁気凝集は、遠心分離などのせん断力を生成する技術よりも穏やかな分離方法である。
【００５３】
従って、磁性粒子は、磁場の適用によって、例えば永久磁石の使用によって、除去または分離されうる。サンプル混合物を含む容器の側面に磁石を適用することは、容器の壁に粒子を凝集させ、サンプルの残部（例えば、結合していない非標的細胞）および／または（例えば、プロテアーゼ処理の後に）粒子を除去するために、一般的には十分である。代替的に、磁性粒子の分離は、このような磁性粒子の取り扱いのための自動システムを使用して実施されうる。このような自動システムおよび装置は知られており、市販されている。
【００５４】
磁石の適用は、磁性粒子をサンプルの残部から分離するために十分な時間であり得、例えば、磁性粒子のタイプおよびサンプルの組成に依存する。一般的に、ミクロンおよびサブミクロンサイズの常磁性または超常磁性粒子は、数分間、例えば1〜30分間の磁石の適用によって、水性サンプルを含む容器の側面に分離されうる。例えば、粒子分離は、20分間未満の磁石の適用によって起こりうる。組み換え抗体が付着する表面として磁性粒子を使用した一部の実施形態では、粒子の分離は、1〜20分間の磁石の適用によって達成される。一部の実施形態では、磁石の適用は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20または30分間である。
【００５５】
一部の実施形態では、細胞分離方法に使用するための磁性粒子は、直径が約1〜10マイクロメートルである。特定の実施形態では、粒径は、約1 μm、2 μm、2.8 μm、3.2 μm、3.5 μm、4.5 μm、5 μm、8 μm、または10 μmである。他の実施形態では、磁性粒子は、直径が1 μm未満、例えば、約0.05〜1 μmまたは約0.09〜0.6 μmである。特定の実施形態では、粒径は、約50 nm、90 nm、135 nm、175 nm、200 nm、250 nm、300 nm、400 nm、500 nm、600 nm、700 nm、または800 nmである。
【００５６】
提供された方法での使用に適した磁性粒子は、ポリマー粒子の内部全体に分散された酸化鉄の微粒子、磁性酸化鉄のシラン処理粒子、および磁性多孔質ガラスのシラン処理粒子を含むがこれに限定されない、さまざまな組成物である。磁性ポリマー粒子のポリマー組成物には、例えば、ポリスチレン、セルロースおよびラテックスを含む。市販されている磁性粒子は、捕捉抗体などの分子の粒子表面への直接的または間接的付着が可能なように修飾された表面のものが入手可能である。このような粒子のこのような表面修飾は、限定するものではないが、二次抗体などの固定化抗体、固定化プロテインA、固定化プロテインG、固定化ストレプトアビジン、固定化アビジン、固定化ビオチン、固定化オリゴ（dT）を含み、限定するものではないが、-COOH、-NH2、-OH、エポキシ活性化、トシル活性化、ヒドラジドおよびグリセリルなどの末端基を持つ。
【００５７】
一部の実施形態では、標的細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、ネズミ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウサギ細胞を含むがこれに限定されない、哺乳類細胞などの動物細胞である。標的細胞は、限定するものではないが、血液細胞、胸腺細胞、リンパ球、骨髄細胞、脾細胞、臍帯血液細胞、肝細胞、角膜細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨細胞、成体幹細胞、人工多能性細胞、胚性幹細胞、および間葉系幹細胞を含む。
【００５８】
特定の実施形態では、標的細胞は、限定するものではないが、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、ナチュラルキラーT細胞を含むT細胞である。一部の実施態様では、標的細胞は、CD3+ T細胞である。一部の実施態様では、標的細胞は、CD4+ T細胞である。他の実施態様では、標的細胞は、CD8+ T細胞である。さらに他の実施態様では、標的細胞は、CD34+細胞またはTra-1-60+細胞である。
【００５９】
一部の実施形態では、標的細胞が単離される混合細胞集団は、限定するものではないが、末梢血単核細胞などの血液細胞、肝細胞、骨髄細胞、臍帯血液細胞、脾細胞、内皮細胞および上皮細胞である。
【００６０】
特定の実施形態では、提供された方法および組成物は、細胞上の内因性に発現したエピトープに基づいた標的細胞の単離に使用される。このような方法では、組み換え抗体は、標的細胞表面上の内因性に発現したエピトープに特異的に結合する。
【００６１】
特定の実施形態では、本明細書に提供された方法および組成物は、外因性の受容体または細胞表面マーカーを発現するようにトランスフェクトまたは形質導入された標的細胞の単離に使用される。このような方法では、組み換え抗体は、標的細胞上の外因性の受容体または細胞表面マーカーのエピトープに特異的に結合する。
【００６２】
標的細胞および混合細胞集団は、新鮮単離細胞、冷凍保存細胞、または培養初代細胞を含むがこれに限定されない初代細胞でありうるか、または細胞は不死化細胞株などの不死化細胞でありうる。一部の実施形態では、初代細胞または不死化細胞は、トランスフェクトまたは形質導入された細胞または細胞株でありうる。
【００６３】
1つの態様では、プロテアーゼに対する外因性タンパク質分解切断部位を含む組み換え抗体が提供されている。外因性タンパク質分解部位は、抗体アミノ酸配列に付加された、特定のプロテアーゼによって切断されうる特定のアミノ酸配列である。一部の実施形態では、外因性タンパク質分解切断部位は、抗体のヒンジ領域内に挿入される。例えば、外因性切断部位は、上部ヒンジ領域内、例えばCH1ドメインの直後のヒンジ領域内に挿入されるか、または下部ヒンジ領域内、例えばCH2ドメインの直前のヒンジ領域内に挿入されうる。
【００６４】
提供された方法は、抗標的エピトープ抗体に挿入された外因性タンパク質分解切断部位を特異的に切断するプロテアーゼを使用する。一部の実施形態では、プロテアーゼは、エンテロペプチダーゼ、トロンビンおよび第Xa因子を含むがこれに限定されないエンドプロテアーゼである。一部の実施形態では、プロテアーゼは標的細胞内で発現されない。特定の実施形態では、プロテアーゼは、タバコエッチウイルス（TEV）プロテアーゼ、ライノウイルス3Cプロテアーゼ、タバコ葉脈斑点形成ウイルス（tobacco vein mottling virus（TVMV））プロテアーゼ、プラムポックスウイルスプロテアーゼ、およびカブモザイクウイルスプロテアーゼを含むがこれに限定されないウイルスプロテアーゼである。当業者には明らかなように、特定の切断部位を有する他のプロテアーゼも使用されうる。
【００６５】
プロテアーゼが触媒ドメインを有し、これらが完全長プロテアーゼの代わりに使用できることはよく知られている。従って、方法は、完全長プロテアーゼ、またはその活性部分の使用を包含する。プロテアーゼを改変して、有用な方法で活性を変化させる、例えば活性を増加させる、溶解性を改善する、および／または自己分解を減少させてもよいことも知られており、このような改変プロテアーゼ、またはその活性部分の使用も包含される。従って、一部の実施形態では、プロテアーゼは、改変TEVプロテアーゼであるAcTEV（商標）プロテアーゼ（Invitrogen（商標）、Life Technologies）を含む、S219V改変を有するTEVプロテアーゼである。
【００６６】
プロテアーゼによる最適な抗体切断のための反応条件は、例えば、細胞タイプおよび関与するプロテアーゼによって変化しうる。例えば、プロテアーゼによる組み換え抗体の切断は、切断反応溶液中の還元剤の存在によって改善されうる。従って、一部の実施形態では、抗体で被覆された表面に付着した標的細胞をプロテアーゼと接触させる時に、還元剤が存在する。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断反応の間の還元剤の存在は、還元剤の存在しない反応と比較して、切り離された標的細胞の収率を50%超増加させる。特定の実施形態では、プロテアーゼ切断反応の間の還元剤の存在は、還元剤の存在しない反応と比較して、切り離された標的細胞の収率を60%超、70%超、80%超、または90%超、増加させる。
【００６７】
典型的に、標的細胞の生存率を著しく減少させることなく、抗体を切断するために十分なプロテアーゼ活性を支持する還元剤が、提供された方法に対して適している。一部の実施形態では、還元剤は、プロテアーゼ切断反応の間、細胞の生存率を50%超減少させない濃度で存在する。特定の実施形態では、還元剤は、プロテアーゼ切断反応の間、細胞の生存率を40%超、30%超、20%超、または10%超減少させない濃度で存在する。他の実施形態では、還元剤は、プロテアーゼ切断反応の間、50%を超える生存率を持つ単離標的細胞集団をもたらす濃度で存在する。特定の実施形態では、還元剤は、プロテアーゼ切断反応の間、60%を超える、70%を超える、80%を超える、または90%を超える生存率を持つ単離標的細胞集団をもたらす濃度で存在する。
【００６８】
例示的還元剤には、TCEP（トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン）、DTT（ジチオトレイトール）、NAC（N-アセチルコレート）、GSH（グルタチオン）、チオグリコレートおよび2-ME (ベータ-メルカプトエタノール)を含むがこれに限定されない。このような還元剤は、0.04 mM〜20 mMを含むがこれに限定されない濃度で使用されうる。一部の実施形態では、還元剤は、0.04 mM〜1 mM、0.2 mM〜5 mM、0.4 mM〜10 mM、または0.8 mM〜20 mMを含むがこれに限定されない濃度で使用されうる。プロテアーゼ反応のための例示的温度には、4oC、室温および37oCが含まれるがこれに限定されない。プロテアーゼ切断ステップのための例示的インキュベーション時間は、15分〜16時間、例えば0.5時間、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、12時間または16時間を含むがこれに限定されない。一部の実施形態では、標的細胞／抗体／表面複合体およびプロテアーゼを含む溶液は、プロテアーゼ切断反応の間、限定するものではないが例えば、回転運動、揺動運動、または攪拌運動で攪拌される。他の実施形態では、この反応は攪拌なしで実施される。
【００６９】
一般的に、特定の切断部位でタンパク質を切断するプロテアーゼが、提供された方法での使用に適している。特定のタンパク分解切断部位は、アミノ酸の付加、欠失、および／または修飾を通して組み換え抗体アミノ酸配列に挿入され、外因性タンパク質分解切断部位が生成される。多くのプロテアーゼについては、タンパク質分解切断部位に関してアミノ酸の必要条件が知られている。方法での使用のための例示的プロテアーゼの例示的タンパク質分解切断部位は、エンテロペプチダーゼに対するDDDDK（SEQ ID NO:1）（切断はLysの後で起こる）、トロンビンに対するLVPRGS（SEQ ID NO:2）（切断はArgとGlyの間で起こる）、第Xa因子に対するLVPRGS（SEQ ID NO:2）（切断はArgとGlyの間で起こる）、TEVプロテアーゼに対するENLYFQG（SEQ ID NO:3）（切断はGluとGlyの間で起こる）、ライノウイルス3Cプロテアーゼに対するLEVLFQGP（SEQ ID NO:4）（切断はGluとGlyの間で起こる）を含むがこれに限定されない。切断部位配列内の特定の位置での一部のアミノ酸変化は、プロテアーゼによるタンパク質分解切断と適合しうるが、配列内の他の位置では、変化は許されない。例えば、コンセンサスTEVプロテアーゼ切断部位は、Glu-Xaa-Xaa-Tyr-Xaa-Gln-(Ser/Gly)（SEQ ID NO:5）と定義されており、Xaaは任意のアミノ酸であり、切断はGlnとSer/Glyの間で起こる。
【００７０】
組み換え抗体を生成するために、抗体内のアミノ酸の変異または修飾を通して、抗体の定常領域内またはヒンジ領域内のある位置に、外因性タンパク質分解切断部位が挿入される。抗体のアミノ酸配列の修飾は、当技術分野でよく知られている方法並びに市販の試薬およびキットを使用して達成されうる。
【００７１】
組み換え抗体は、例えば、マウス、ヒト、ウサギ、ラット、ニワトリ、ヤギ、ラクダ科哺乳類（例えば、ラマ、ラクダ、およびアルパカ）、および軟骨魚類（例えば、サメ）の抗体配列を含む、任意の抗体アミノ酸配列または核酸配列を使用して生成されうる。一部の実施形態では、組み換え抗体は、複数のオリジナル抗体または供給源に由来する部分または領域を含みうる。例えば、組み換え抗体は、マウス抗体の定常領域およびヒンジ領域並びにウサギ抗体の可変領域を含みうる。代替的に、組み換え抗体は、完全にマウス抗体配列に基づくが、定常領域および可変領域配列は、2つの異なるマウス抗体に由来しうる。組み換え抗体は、IgG、IgM、IgE、IgD、IgA、もしくはIgYのいずれかに由来する重鎖またはその組み合わせを含みうる。組み換え抗体は、カッパもしくはラムダ軽鎖のいずれか、またはその組み合わせを含みうる。ラクダ科哺乳類および軟骨魚類に見られるように、組み換え抗体は、重鎖のみを含み、軽鎖を欠く場合がある。
【００７２】
本明細書に記述したとおり、組み換え抗体は、全抗体分子、1本鎖抗体、またはエピトープ結合活性を呈する能力を保持している抗体フラグメントもしくは部分でありうる。エピトープ結合部分に加えて、組み換え抗体は、外因性タンパク質分解切断部位を含む。適切な抗体フラグメントには、Fabフラグメント、1本鎖Fvフラグメント（軽鎖および重鎖の両方が融合タンパク質として存在する場合）、およびVHHフラグメント（例えば、ラクダ科哺乳類およびサメで見られるように、天然で軽鎖を欠いている免疫グロブリンの1本重鎖可変ドメイン）が含まれるがこれに限定されない。
【００７３】
一部の実施形態では、外因性タンパク質分解切断部位は、抗体重鎖の一般定常領域主鎖に挿入される。任意の特定の細胞表面マーカーに対する特異性を持つ可変領域を、外因性切断部位を含む重鎖の一般定常領域主鎖と共に組み合わせることができる。このような組み換え抗体の生成は、最適な可変領域をコードする核酸配列を、一般定常領域をコードする核酸配列と組み合わせることによって達成されうる。このような組み換え抗体を作るための技術およびツール、例えば試薬、細胞および装置は、当業者にはよく知られており、市販されている。
【００７４】
また、組み換え抗体をコードする核酸分子も提供されている。例えば、外因性タンパク質分解切断部位を含む抗体重鎖をコードする核酸分子が提供されている。一部の実施形態では、発現ベクターは、外因性タンパク質分解切断部位を含む重鎖をコードする核酸分子を含む。一部の実施形態では、このような発現ベクターは、可変領域および定常領域を含む重鎖全体をコードする核酸分子を含む。他の実施形態では、このような発現ベクターは、最適な可変領域をコードする核酸分子を動作可能なように導入するための挿入部位と共に、重鎖の定常領域をコードする核酸分子を含む。
【００７５】
以下の実施例は、例証として提供されるもので、限定するものではない。
【実施例】
【００７６】
実施例１−挿入されたタンパク質分解切断部位を持つ組み換え抗体をコードするための発現構築物の作成
マウスIgG1の重鎖定常領域（CH）遺伝子のクローニングについては、マウスCガンマ1遺伝子を、プライマー
2015517320.tif 000003
（制限酵素部位HindIIIおよびBamHIに下線が付いている）を使用して、ハイブリドーマ細胞（BerEp4）から単離されたゲノムDNAからPCR増幅した。平滑末端PCR産物を、Zero Blunt（登録商標）TOPO（登録商標）クローニングキット（Invitrogen（商標）、Life Technologies）を使用して、直線化されトポイソメラーゼI活性化されたpCR（登録商標）-Blunt II-TOPOベクターにTOPOクローニングした。マウスIgG1のCH1のイントロン上流にあるBsmI部位は、プライマー5'
2015517320.tif 000004
（変異BsmI部位に下線が付いている）を使用して、QuikChange（登録商標）部位特異的突然変異誘発（Agilent Technologies）によって除去した。
【００７７】
TEVプロテアーゼのタンパク質分解切断部位を挿入するために、Cガンマ1遺伝子を、QuikChangeプライマー
2015517320.tif 000005
および相補的3'プライマーを使用して、上部ヒンジ領域内で改変した。結果として得られたヒンジ領域のアミノ酸配列は、
2015517320.tif 000006
（挿入されたTEV切断部位に下線が付けられている）であった。AcTEV（商標）プロテアーゼ（Invitrogen（商標）、Life Technologies）などのTEVプロテアーゼに供した時、単一Fabフラグメントへの切断を可能にするように、TEV切断部位がヒンジ内のシステインの上流に導入された。
【００７８】
可変（V）および定常（C）領域クローニングカセットを有する発現ベクターにマウスIgG1-TEV構築体をクローニングするために、構築されたCガンマ1-TEVフラグメントを、HindIIIおよびEcoRI制限酵素を使用してpCR（登録商標）-Blunt II-TOPOベクターから切り出し、それぞれの制限部位で抗体発現ベクターpLNOH2（Norderhaug et al. (1997) J. Immunol. Methods 204(1):77-87）にクローニングした。pLNOH2は、任意のVH遺伝子およびCH遺伝子のクローニングのための免疫グロブリンリーダー配列および制限部位を持つpcDNA3.1に基づいている。結果として得られるベクターpLNO_mIgG1-TEVは、マウスCガンマ1-TEVと共に任意のVH領域のクローニングのためのV領域カセット（BsiWI/BsmI）を含む。
【００７９】
マウスカッパ軽鎖定常領域遺伝子のクローニングについては、マウスCカッパ（mCk）を、プライマー
2015517320.tif 000007
（制限酵素部位HindIIIおよびBamHIに下線が付けられている）を使用して、ハイブリドーマ細胞（BerEp4）から単離されたゲノムDNAからPCR増幅した。平滑末端PCR産物を、Zero Blunt（登録商標）TOPO（登録商標）クローニングキット（Invitrogen（商標）、Life Technologies）を使用して、直線化されトポイソメラーゼI活性化されたpCR（登録商標）-Blunt II-TOPOベクターにTOPOクローニングした。
【００８０】
マウスCカッパをコードする核酸分子を発現ベクターにクローニングするために、クローニングされたmCkフラグメントを、HindIIIおよびBamHIを使用してpCR（登録商標）-Blunt II-TOPOベクターから切り出し、pLNOkへとクローニングした。結果として得られるベクターpLNO_mCkは、マウスCカッパ領域と共に任意のVL領域のクローニングのためのVL領域カセット（BsiWI/BsmI）を含む。
【００８１】
実施例２−抗ヒトCD3発現ハイブリドーマ細胞株からの可変重（VH）鎖および可変軽（VL）鎖領域遺伝子の、発現ベクターへのクローニング
VHおよびVL鎖遺伝子を、ポリdCTP 3'-tailed cDNAからPCR増幅した。cDNAは、遺伝子特異的3'プライマー
2015517320.tif 000008
を使用して、抗ヒトCD3抗体を発現しているSPV-3tBハイブリドーマ細胞から単離された全RNAから合成した。V遺伝子は、5'ポリGプライマーおよびC領域遺伝子特異的3'プライマー
2015517320.tif 000009
を使用して、ポリdCTP修飾cDNAからPCR増幅した。平滑末端PCR産物を、Zero Blunt（登録商標）TOPO（登録商標）クローニングキットを使用して、直線化されトポイソメラーゼI活性化されたpCR（登録商標）-Blunt II-TOPOベクターにTOPOクローニングし、産物V遺伝子配列について配列決定および分析した（IMGTデータベース）。
【００８２】
主鎖発現ベクターpLNO_mIgG1-TEVおよびpLNO_mCK（実施例1）へのクローニングを可能にするBsmIおよびBsiWI制限酵素部位を持つ新しいV領域特異的プライマーを合成し、クローニングされたVHおよびVL配列をpCR（登録商標）-Blunt II-TOPOベクターからPCR増幅した。抗ヒトCD3 VLに対するプライマーは、
2015517320.tif 000010
であった。抗ヒトCD3 VHに対するプライマーは、
2015517320.tif 000011
であった（制限酵素部位に下線が付けられており、スプライス部位が太字になっている）。VHおよびVL鎖遺伝子をコードするPCR産物を、BsmIおよびBsIWIを使用して制限酵素で切り、上述の対応する主鎖ベクターに連結して、ヒトCD3に対する特異性を持ち、かつ上部ヒンジ領域に遺伝的に挿入されたTEVタンパク質分解切断部位を持つ組み換え抗体をコードする完全なゲノムL鎖遺伝子発現ベクター（pLNO_mCk-SPV）および完全なゲノムH鎖遺伝子発現ベクター（pLNO_mIgG1TEV-SPV）を得た。
【００８３】
ベクターpLNO_mCk-SPVおよびpLNO_mIgG1TEV-SPVからリーダー領域を含む完全なVおよびC領域カセットをPCR増幅し、SV40 polyA部位に変異BsmI部位を持つpcDNA3.3ベクターにTOPOクローニングした。リーダー配列の5'プライマー上流が、HおよびL鎖ベクターの両方に対して使用された
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。3'プライマーは、mCkに対して
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またはmIgG1-TEVに対して
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特異的に構築された。リーダー配列およびコザック部位を含むPCR産物は、pcDNA3.3-TOPO（登録商標）クローニングキット（Invitrogen）を使用したTOPOクローニングに必要なTA'突出を確実とするためにTaqポリメラーゼを使用して増幅し、CMVプロモーターの挿入下流の正しい配向が確認された。H鎖およびL鎖発現ベクターのマップが、図1に示されている（mIgG1-TEV SPV（図1A）およびmCk-SPV（図1B））。
【００８４】
実施例３−挿入されたタンパク質分解切断部位を持つ組み換え抗体の発現 
抗CD3 L鎖およびH鎖をコードしているベクターを、重鎖対軽鎖1：2の比率でFreeStyle（商標） 293F発現システムを使用して、懸濁液FreeStyle（商標） 293-F細胞（Invitrogen）へと同時トランスフェクションした。上清は5日目に採取され、還元条件下（DTTによる）および非還元条件下で、Coomassieゲル（NuPAGE（登録商標）ゲル、Novex（登録商標）、Life Technologies）上で分析された（図2）。組み換え抗体の発現は、40〜80 μg/mlの間で変化すると推定された。組み換え抗体は、Dynabeads（登録商標）プロテインG（Invitrogen（商標）、Life Technologies）を使用して上清から精製され、pH 2.8の50 mMグリシン中に溶出された。溶出物は、pH 8のトリスHClを加えてpH 7に中和された。マウスIgG1の上部ヒンジ領域内にTEV切断部位を持つ組み換え抗ヒトCD3抗体は、本明細書ではrAb-TEVと呼ばれる。
【００８５】
構築されたrAb-TEVのV領域特異性を実証するために、APCと結合した市販の抗ヒトCD3抗体（抗CD3-APC）で染色する前に、精製されたrAb-TEVをヒト単核細胞（MNC）に加えた。MNCは、陽性対照として、抗CD3-APCのみでも染色した。次に細胞を、フローサイトメトリーで分析した。rAb-TEVは抗ヒトCD3抗体による染色をブロックした。これは、rAb-TEVが同じCD3エピトープに結合することを示している（図3A〜B）。この結果は、クローニングしたVHおよびVL鎖領域が、ヒトCD3に対する特異性を維持したことを示している。
【００８６】
精製されたrAb-TEVを、酵素緩衝液（1 mM DTT）中で、AcTEV（商標）プロテアーゼ（Invitrogen（商標）、Life Technologies）と共にインキュベートし、切断されたタンパク質フラグメントを、還元および非還元条件下で、SDS-PAGE Coomassieブルーゲル上で分析した。結果が図4に示されている。AcTEV（商標）プロテアーゼで処理された時、完全なIgG1は、Fcフラグメントと単一Fabフラグメントに切断された。これは、切断部位が上部ヒンジ領域に挿入された時、組み換え抗体において、該部位がプロテアーゼに対してアクセス可能であることを示している。
【００８７】
実施例４−固体表面に付着した組み換え抗体 
精製されたrAb-TEVを、モノクローナルラット抗マウスIgG1抗体（RAM）と結合した4.5 μm常磁性粒子であるDynabeads（登録商標）マウスIgG1バインダー（Invitrogen（商標）、Life Technologies）と結合させた。IgG1アイソタイプの結合したrAb-TEVは、FITC結合抗マウスIgG1抗体でフローにおいて検出できる（図5、上部パネル）。使用された陰性対照は、FITC結合抗マウスIgG2a（図5、左下）およびビーズと結合させたモックトランスフェクト上清（図5、右下）であり、これらはFITC結合抗マウスIgG1抗体で検出されなかった。これらの結果は、Dynabeads（登録商標）マウスIgG1バインダーへのマウスIgG1 rAb-TEVの特異的結合を示している。
【００８８】
固体表面に固定化されたrAb-TEVの切断を評価するために、Dynabeads（登録商標）マウスIgG1バインダービーズに結合したrAb-TEVを、AcTEV（商標）プロテアーゼと共に、1時間、室温または37℃でインキュベートした。AcTEV（商標）プロテアーゼなしでは、ビーズは、フローサイトメトリー分析でPE結合抗カッパ抗体によって鮮やかに染色され、ビーズの99%がカッパ陽性であった（図6、左上）。しかし、プロテアーゼと1時間インキュベートした後、ビーズのカッパ陽性画分は、室温のインキュベーション（図6、左下）では19%へと、37℃のインキュベーション（図6、右下）では7%へと大きく減少した。これは、Fabフラグメントが、rAb-TEVのFc領域／ビーズ複合体から切断されたことを示している。2つのシナリオを図示する略図が図6の右上に示されている。従って、挿入された外因性タンパク質分解切断部位は、組み換え抗体が固体表面に付着した時、プロテアーゼに対してアクセス可能であった。
【００８９】
実施例５−固体表面に付着した組み換え抗体を使用した混合集団からの標的細胞の枯渇
rAb-TEVを異なる濃度でDynabeads（登録商標）マウスIgGバインダーに結合させ、単核細胞（MNC）の混合集団からCD3+ T細胞を枯渇させるために使用した。CD3+標的細胞1個あたり4個のビーズを加え、20分のインキュベーションの後に、フローサイトメトリーで枯渇したCD3+ T細胞のパーセントを分析した。すべてのビーズがMNC集団中のCD3+ T細胞を効率的に枯渇させ、試験された3つの異なるrAb-TEV/Dynabeadsのすべてが、CD3+ T細胞の94%超に結合して枯渇させた（94〜98%の範囲、図7）。枯渇効率は、SPV-3tB抗ヒトCD3抗体（抗ヒトCD3 V領域がクローニングされたrAb-TEVの親モノクローナル抗体）と共有結合した対応する4.5 μm磁性粒子であるDynabeads CD3と類似しており、これは、rAb-TEVにクローニングしたV領域遺伝子は、Dynabeads（登録商標）マウスIgG1バインダーに結合した時、その特異性および機能性を維持したことを示している。枯渇は、試験された範囲（10E7ビーズあたり0.25〜1 μg rAb-TEV）でロバストであった。
【００９０】
実施例６−ビーズに付着した組み換え抗体＋プロテアーゼを使用したビーズを含まないCD3+ T細胞の単離 
ビーズ捕捉後に細胞を遊離させるため、プロテアーゼは、近接したビーズ-細胞複合体において隠れている可能性のあるタンパク質分解切断部位にアクセスできなければならない。また、ビーズから細胞を遊離させるため、エピトープ結合組み換え抗体（例えば、CD3結合rAb-TEV）の大部分が切断されなければならない。従って、ビーズに結合された組み換え抗体の密度は、単離細胞の効率的な遊離および高い回収率を達成するための因子でありうる。抗CD3組み換え抗体rAb-TEVおよびDynabeads（登録商標）マウスIgGバインダーを使用して、異なる量のrAb-TEVが結合した4つの異なるビーズ複合体が試験された。
【００９１】
末梢MNCが健常ドナーから単離された。混合細胞サンプル中に標的CD3+ T細胞1個あたり4個のrAb-TEV結合Dynabeadsを加えた。細胞をローラー上で20分インキュベートした後、チューブを磁石中に配置することによって非ビーズ結合細胞を除去した。洗浄されたビーズ-細胞複合体を、10 U AcTEV（商標）プロテアーゼを含む400 μlの遊離緩衝液中に再懸濁し、室温で2時間、ローラー上でインキュベートした。インキュベーション後、サンプルを十分に混合し、磁石中に配置してビーズを除去した。ビーズを含まない単離された細胞を含む上清を新しいチューブに移し、単離されたサンプルの回収率および純度を分析した。ワークフローの略図が図8に示されている。
【００９２】
単離された細胞サンプルはフローサイトメトリーで分析され、結果として得られた収率、純度および生存率が図9に示されている。ビーズに結合したrAb-TEVが低密度（0.25 μg／10E7ビーズ）の時、標的細胞の37%が回収された。ビーズに結合したrAb-TEVが0.5 μg／10E7ビーズの密度では、標的細胞の12.6%が回収された。対照的に、ビーズ10E7あたり1 μg rAb-TEVの結合を使用すると、単離細胞サンプルにおいて標的細胞の7%のみが回収され、これは酵素を添加しなかった対照と類似していた（5%）。この実験では、標的CD3+ T細胞の最高回収率は、0.25 μg rAb-TEV/10E7 DynabeadsマウスIgG1バインダーによる調製を使用した時に観察された。これらの単離細胞の純度および生存率も高かった（それぞれ、95%および90%）。
【００９３】
健常ドナーからの末梢MNCを、細胞捕捉のために、10E7ビーズあたり0.25 μgのrAB-TEVに結合させたDynabeads（登録商標）マウスIgG1バインダーと共に、室温で20分間インキュベートした。rABに結合した細胞を、磁石を使用して非結合細胞から分離した。洗浄されたビーズ-細胞複合体を、10 U AcTEV（商標）プロテアーゼを含む遊離緩衝液中に再懸濁し、室温で2時間、インキュベートした。ビーズを、磁石で除去し、ビーズを含まないポジティブに単離されたCD3+ T細胞を回収した。7人の健常ドナー（n=7）からのMNCを用いてこの単離手順を実施した後、標的細胞の平均回収率は64.1%（STDEV 27）であり、平均純度は97.3%（STDEV 2.2）であった（図10）。これらの条件下で、細胞生存率は>90%であり、CD2、CD3、CD4、およびCD8の細胞発現は影響を受けず、単離細胞上には残りのrAB-TEV Fabフラグメントは検出されなかった。
【００９４】
実施例７−単離された細胞はビーズを含まずかつ組み換え抗体を含まない 
組み換え抗体結合ビーズでの細胞捕捉の後、AcTEV（商標）プロテアーゼを使用したビーズからの細胞遊離により、CD3結合rAb-TEVが上部ヒンジ領域において切断されて、単離細胞上のCD3エピトープに結合したままとなりうるrAb-TEV由来のFabフラグメントが生じる。しかし、完全なIgG抗体に比べてFabフラグメントの結合活性は低いので、CD3に結合したFabフラグメントは、完全なIgGよりも高い放出率を有しうる。これを評価するために、APCと結合した市販の抗ヒトCD3抗体（抗CD3-APC）を使用して、AcTEV（商標）プロテアーゼの存在ありまたはなしでrAb-TEVと共にインキュベートされたMNCを染色した。図11に示されるように、プロテアーゼが存在した時、細胞上のCD3エピトープは、rAb-TEVによってはもはやブロックされず、細胞は抗CD3-APCで染色されたことをデータは示しており（図11A）、これは、Fabが、単離後の細胞から効果的に除去されたことを示す。プロテアーゼが存在しなかった時、細胞上のCD3エピトープは、rAb-TEVによってブロックされ、細胞は抗CD3-APCで染色されなかった（図11B）。rAb-TEVおよびAcTEV（商標）プロテアーゼなしでインキュベートされた対照細胞は、抗CD3-APCで染色された（図11C）。標識抗カッパ抗体での細胞集団の染色は、抗CD3-APCで見られた結果を支持する。これらのデータは、細胞単離後にrAb-TEV FabフラグメントがCD3エピトープから効果的に除去され、ビーズを含まずかつ抗体を含まない細胞が残ったことを示す。
【００９５】
実施例８−ポジティブに単離されたCD3+ T細胞の活性化および増殖 
MNCからCD3+ T細胞をポジティブに単離するために、実施例6に記述されたようにDynabeadsに結合された組み合え抗体rAb-TEVおよびAcTEV（商標）プロテアーゼを使用した。次に、製造業者（Gibco（登録商標）、Life Technologies）のプロトコールに従ってDynabeads（登録商標）CD3/CD28 CTS（商標）を使用して、これらの単離T細胞を培養下で活性化および増殖させた。ポジティブに単離されたT細胞は活性化および増殖され、6日目までに35倍超の増殖（図12A）、並びにCD62LおよびCD27発現によって示されるセントラルメモリー表現型を示した（図12B）。この活性化および増殖の量はこのタイプの細胞に対して期待される通りであり、単離された細胞が正常に挙動していることを示す。従って、rAb-TEV／ビーズ複合体を使用して単離され、その後TEVプロテアーゼ処理された細胞を、MNCから単離されたCD3+ T細胞で期待されるのと同じくらい活性化および増殖させることができた。
【００９６】
実施例９−プロテアーゼ切断部位を持つ抗ヒトCD34組み換え抗体
抗CD3組み換え抗体について上述されたように、抗ヒトCD34ハイブリドーマ561からの可変重鎖領域および可変軽鎖領域を、発現ベクターmIgG1-TEVおよびmCkにそれぞれクローニングした。組み換え抗体は、FreeStyle（商標） 293F細胞で発現され、プロテインGを使用して精製され、CD3に対する特異性を持つrAb-TEVについて記述されたようにDynabeads（登録商標）マウスIgG1に結合させた。例えば、実施例2〜4を参照のこと。
【００９７】
CD34に対する特異性を持つ構築されたrAb-TEV（本明細書では「rAb-TEV 抗CD34」と呼ばれる）のV領域特異性を実証するため、FITCと結合した市販の抗ヒトCD34抗体（抗CD34-FITC）で染色する前に、精製されたrAb-TEVを、ヒト細胞の混合物であるCD34+ KG1a細胞およびCD34- FreeStyle（商標） 293F細胞に加えた。陽性対照として、細胞混合物は抗CD34-FITCのみでも染色した。次に細胞を、フローサイトメトリーで分析した。rAb-TEV抗ヒトCD34は抗ヒトCD34抗体による染色をブロックした。これは、rAb-TEVが同じCD34エピトープに結合することを示している（図14、AおよびB）。この結果は、クローニングしたVHおよびVL鎖領域が、ヒトCD34に対する特異性を維持したことを示している。
【００９８】
精製されたrAb-TEV CD34を、AcTEV（商標）プロテアーゼありまたはなしで、室温（22℃）で2時間インキュベートし、その後、還元条件下で、SDS-PAGE Coomassieブルーゲル上で分析した。結果が図15に示されている。プロテアーゼで処理された時、完全なIgG1は、Fcフラグメントと単一Fabフラグメントに切断された。これは、組み換え抗体において、切断部位がプロテアーゼに対してアクセス可能であることを示している。
【００９９】
実施例１０−rAb-TEV抗CD34およびCD34+標的細胞の単離
Dynabeads（登録商標）マウスIgG1に結合されたrAb-TEV抗CD34を使用して、KG1a細胞およびFreeStyle（商標） 293F細胞の混合細胞集団から、CD34+ KG1a細胞を標的細胞としてポジティブに単離した。ビーズに結合したrAb-TEV抗CD34の密度は、10E7ビーズあたり0.25 μgであり、混合細胞サンプル中に標的CD34+ KG1a細胞1個あたり4個のrAb-TEV抗CD34結合Dynabeadsが加えられた。細胞をローラー上で20分インキュベートした後、チューブを磁石中に配置することによって非ビーズ結合細胞を除去した。
【０１００】
同一の酵素切断条件に供する前に、細胞のサンプルをさまざまな洗浄条件に供した。1つのサンプル（図16、「磁石の前に2倍量」）では、ビーズおよび細胞を含むチューブの容量と等しいPBSの容量をチューブに加え、チューブを磁石中に配置し、非ビーズ結合細胞を除去した。別のサンプル（図16、「磁石前に2倍量、洗浄1回」）では、ビーズおよび細胞を含むチューブの容量と等しいPBSの容量をチューブに加え、磁石中にチューブを配置し、非ビーズ結合細胞を除去した。PBS洗浄の追加の容量をビーズ結合細胞に加え、チューブを磁石中に配置し、非ビーズ結合細胞を除去した。別のサンプル（図16、「磁石、洗浄1回」）では、ビーズおよび細胞を含むチューブを磁石中に直接（PBSの添加なしで）配置し、非ビーズ結合細胞を除去した。ある容量のPBSをビーズ結合細胞に加え、チューブを磁石中に配置し、非ビーズ結合細胞を除去した。
【０１０１】
洗浄されたビーズ-細胞複合体を、10 U AcTEV（商標）プロテアーゼを含む、細胞1000万個あたり400 μlの遊離緩衝液中に再懸濁し、室温で2時間、ローラー上でインキュベートした。インキュベーション後、サンプルを十分に混合し、磁石中に配置してビーズを除去した。ビーズを含まない単離された細胞を含む上清を新しいチューブに移し、細胞サンプルを、結果として得られる回収率、枯渇および純度についてフローサイトメトリーで分析した。例示的なCD34+細胞単離の結果は図16に示されている。
【０１０２】
ビーズは、細胞の混合集団からCD34+ KG1a細胞を効率的に枯渇させた。標的細胞は、効率的に回収され、単離細胞の純度も高かった。ビーズを含まないCD34+細胞は、本明細書に記述されたCD3+ T細胞について得られたのと同等の純度および回収率で単離されたことが一般的に見出された。
【０１０３】
プロテアーゼ処理の後の、ビーズを含まない単離された細胞の表面上に、rAb-TEV抗CD34由来のFabフラグメントが存在するかどうかを評価するため、洗浄および市販の抗CD34抗体での染色の前に、KG1a細胞を、AcTEV（商標）プロテアーゼの存在ありまたはなしでrAb-TEV抗CD34と共に2時間インキュベートした。次に抗CD34-FITCを使用して、プロテアーゼありまたはなしでrAb-TEVと共にインキュベートされたKG1a細胞を染色した。
【０１０４】
図14BおよびCに示されるように、プロテアーゼが存在した時、細胞上のCD34エピトープは、rAb-TEV抗CD34によってはもはやブロックされず、細胞は抗CD34-FITCで染色された（図14C）。これは、CD34に結合したFabフラグメントが、プロテアーゼによって細胞から効果的に除去されたことを示す。これらのデータは、この単離方法がビーズを含まずかつ抗体を含まない細胞をもたらすことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2015517320.tif 000026
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2015517320.tif 000028
【図１１Ｃ】
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【図１２】
2015517320.tif 000030
【図１３】
2015517320.tif 000031
【図１４】
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【図１５】
2015517320.tif 000033
【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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