(57)【要約】抗ＤＬＬ−４抗体に関連するか、またはそれ由来の組成物および方法を記載する。より具体的には、ＤＬＬ−４に結合する完全ヒト抗体、該抗体のＤＬＬ−４結合断片および誘導体ならびに、該断片を含むＤＬＬ−４結合ポリペプチドを記載する。さらに、該抗体、抗体断片および誘導体ならびにポリペプチドをコードする核酸、該ポリヌクレオチドを含む細胞、該抗体、抗体断片および誘導体およびポリペプチドの作製方法、該抗体、抗体断片および誘導体ならびにポリペプチドの使用方法、例えばＤＬＬ−４に関連する障害または症状、例えば種々の炎症性障害および種々のがんに罹患している対象の処置方法、または診断方法を記載する。
2015520172.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１０-６Mの結合親和性でＤＬＬ−４エピトープに結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体であって、
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＨ鎖可変領域を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＬ鎖可変領域を有する、完全ヒト抗体。
【請求項２】
請求項１記載の完全ヒト抗体であって、配列番号１/配列番号２ (Ｃ３と称する)、配列番号３/配列番号４ (Ｃ５と称する)、配列番号５/配列番号６ (Ｃ１０と称する)、配列番号７/配列番号８ (Ｇ６と称する)、配列番号９/配列番号１０ (Ｆ１１と称する)、配列番号１１/配列番号１２ (Ｄ２と称する)、配列番号１３/配列番号１４ (Ｅ１０と称する)、配列番号１５/配列番号１６ (Ｆ１２と称する)、配列番号１７/配列番号１８ (Ｅ５と称する)、配列番号１９/配列番号２０ (Ｈ２と称する)、配列番号２１/配列番号２２ (Ａ１と称する)、配列番号２３/配列番号２４ (Ａ２と称する)、配列番号２５/配列番号２６ (Ａ１１と称する)、配列番号２７/配列番号２８ (Ｃ１２と称する)、配列番号２９/配列番号３０ (Ｄ９と称する)、配列番号３１/配列番号３２ (Ｅ３と称する)、配列番号３３/配列番号３４ (Ｅ６と称する)、配列番号３５/配列番号３６ (Ｆ１と称する)、配列番号３７/配列番号３８ (Ｆ６と称する)、配列番号３９/配列番号４０ (Ｆ１０と称する)およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する、完全ヒト抗体。
【請求項３】
Ｈ鎖由来の可変領域とＬ鎖由来の可変領域とを有するＦａｂ完全ヒト抗体断片であって、
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＨ鎖可変領域配列を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＬ鎖可変領域配列を有する、Ｆａｂ完全ヒト抗体断片。
【請求項４】
請求項３記載の完全ヒト抗体Ｆａｂ断片であって、該抗体が、配列番号１/配列番号２、配列番号３/配列番号４、配列番号５/配列番号６、配列番号７/配列番号８、配列番号９/配列番号１０、配列番号１１/配列番号１２、配列番号１３/配列番号１４、配列番号１５/配列番号１６、配列番号１７/配列番号１８、配列番号１９/配列番号２０、配列番号２１/配列番号２２、配列番号２３/配列番号２４、配列番号２５/配列番号２６、配列番号２７/配列番号２８、配列番号２９/配列番号３０、配列番号３１/配列番号３２、配列番号３３/配列番号３４、配列番号３５/配列番号３６、配列番号３７/配列番号３８、配列番号３９/配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する、完全ヒト抗体Ｆａｂ断片。
【請求項５】
Ｈ鎖由来の可変領域とＬ鎖由来の可変領域およびＨ鎖とＬ鎖の可変領域をつなぐペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体であって、
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＨ鎖可変領域配列を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＬ鎖可変領域配列を有する、一本鎖ヒト抗体。
【請求項６】
請求項５記載の完全ヒト一本鎖抗体であって、配列番号１/配列番号２、配列番号３/配列番号４、配列番号５/配列番号６、配列番号７/配列番号８、配列番号９/配列番号１０、配列番号１１/配列番号１２、配列番号１３/配列番号１４、配列番号１５/配列番号１６、配列番号１７/配列番号１８、配列番号１９/配列番号２０、配列番号２１/配列番号２２、配列番号２３/配列番号２４、配列番号２５/配列番号２６、配列番号２７/配列番号２８、配列番号２９/配列番号３０、配列番号３１/配列番号３２、配列番号３３/配列番号３４、配列番号３５/配列番号３６、配列番号３７/配列番号３８、配列番号３９/配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する、完全ヒト一本鎖抗体。
【請求項７】
Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域の両方を有する請求項５記載の完全ヒト一本鎖抗体であって、配列番号１/配列番号２、配列番号３/配列番号４、配列番号５/配列番号６、配列番号７/配列番号８、配列番号９/配列番号１０、配列番号１１/配列番号１２、配列番号１３/配列番号１４、配列番号１５/配列番号１６、配列番号１７/配列番号１８、配列番号１９/配列番号２０、配列番号２１/配列番号２２、配列番号２３/配列番号２４、配列番号２５/配列番号２６、配列番号２７/配列番号２８、配列番号２９/配列番号３０、配列番号３１/配列番号３２、配列番号３３/配列番号３４、配列番号３５/配列番号３６、配列番号３７/配列番号３８、配列番号３９/配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する、完全ヒト一本鎖抗体。
【請求項８】
有効量の抗ＤＬＬ−４ポリペプチドを投与することを含む、広範囲の哺乳類のがんの処置方法であって、
該ＤＬＬ−４ポリペプチドが、少なくとも１０-６ Mの結合親和性でＤＬＬ−４エピトープに結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体、Ｈ鎖由来の可変領域とＬ鎖由来の可変領域とを有するＦａｂ完全ヒト抗体断片、Ｈ鎖由来の可変領域とＬ鎖由来の可変領域およびＨ鎖とＬ鎖の可変領域をつなぐペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体およびその組み合わせからなる群から選択され；ここで、
該完全ヒト抗体が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＨ鎖可変領域配列を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＬ鎖可変領域配列を有し;
該Ｆａｂ完全ヒト抗体断片が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＨ鎖可変領域配列を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＬ鎖可変領域配列を有し;
該一本鎖ヒト抗体が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＨ鎖可変領域配列を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＬ鎖可変領域配列を有する、処置方法。
【請求項９】
請求項８記載の広範囲の哺乳類のがんの処置方法であって、該完全ヒト抗体が、配列番号１/配列番号２、配列番号３/配列番号４、配列番号５/配列番号６、配列番号７/配列番号８、配列番号９/配列番号１０、配列番号１１/配列番号１２、配列番号１３/配列番号１４、配列番号１５/配列番号１６、配列番号１７/配列番号１８、配列番号１９/配列番号２０、配列番号２１/配列番号２２、配列番号２３/配列番号２４、配列番号２５/配列番号２６、配列番号２７/配列番号２８、配列番号２９/配列番号３０、配列番号３１/配列番号３２、配列番号３３/配列番号３４、配列番号３５/配列番号３６、配列番号３７/配列番号３８、配列番号３９/配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する、処置方法。
【請求項１０】
請求項８記載の広範囲の哺乳類のがんの処置方法であって、該完全ヒト抗体Ｆａｂ断片が、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域の両方を有し、配列番号１/配列番号２、配列番号３/配列番号４、配列番号５/配列番号６、配列番号７/配列番号８、配列番号９/配列番号１０、配列番号１１/配列番号１２、配列番号１３/配列番号１４、配列番号１５/配列番号１６、配列番号１７/配列番号１８、配列番号１９/配列番号２０、配列番号２１/配列番号２２、配列番号２３/配列番号２４、配列番号２５/配列番号２６、配列番号２７/配列番号２８、配列番号２９/配列番号３０、配列番号３１/配列番号３２、配列番号３３/配列番号３４、配列番号３５/配列番号３６、配列番号３７/配列番号３８、配列番号３９/配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する、処置方法。
【請求項１１】
請求項８記載の広範囲の哺乳類のがんの処置方法であって、該完全ヒト一本鎖抗体が、Ｈ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域の両方を有し、配列番号１/配列番号２、配列番号３/配列番号４、配列番号５/配列番号６、配列番号７/配列番号８、配列番号９/配列番号１０、配列番号１１/配列番号１２、配列番号１３/配列番号１４、配列番号１５/配列番号１６、配列番号１７/配列番号１８、配列番号１９/配列番号２０、配列番号２１/配列番号２２、配列番号２３/配列番号２４、配列番号２５/配列番号２６、配列番号２７/配列番号２８、配列番号２９/配列番号３０、配列番号３１/配列番号３２、配列番号３３/配列番号３４、配列番号３５/配列番号３６、配列番号３７/配列番号３８、配列番号３９/配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する、処置方法。
【請求項１２】
請求項８記載の広範囲の哺乳類のがんの処置方法であって、処置する広範囲の哺乳類のがんが、卵巣がん、結腸がん、乳がん、肺がん、骨髄腫、神経芽腫由来ＣＮＳ腫瘍、単球性白血病、Ｂ細胞由来白血病、Ｔ細胞由来白血病、Ｂ細胞由来リンパ腫、Ｔ細胞由来リンパ腫、脂肪細胞由来腫瘍およびその組み合わせからなる群から選択される、処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＤＬＬ−４抗体に関連するまたは由来する組成物および方法を提供する。より具体的には、本発明は、ＤＬＬ−４に結合するヒト抗体、ＤＬＬ−４結合断片および該抗体の誘導体および、該断片を含む、ＤＬＬ−４-結合ポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、抗体、抗体断片および誘導体およびポリペプチド、ならびにかかる抗体、抗体断片および誘導体およびポリペプチドの使用方法、例えば、ＤＬＬ−４-に関連する障害または症状を示す対象の処置または診断方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
細胞間の相互作用は、多くの生物プロセス、例えば分化、増殖およびホメオスタシスに必要である。広範囲の真核生物が用いる系の一つに、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路がある。この経路、特にＮｏｔｃｈ受容体は、機能的な腫瘍血管新生にも重要である。したがって、Ｎｏｔｃｈ受容体の機能の阻害、Ｎｏｔｃｈ受容体の遮断および／またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の遮断は、抗がん用組成物および治療の、戦略であり得る。Ｎｏｔｃｈ受容体の低分子阻害剤は、全身の、野生型（正常）の組織のＮｏｔｃｈ受容体の発現を阻害するため、有害であることが示されている。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の種々のメンバーは、治療標的である可能性があるものとして考えるべきである。
【０００３】
Ｎｏｔｃｈ受容体の脈管構造リガンドは、Delta ４またはＤＬＬ−４(Delta-like ４)である。ＤＬＬ−４は、脈管構造に強く発現しているため、血管形成に重要である (Yan et al., Clin. Cancer Res., 13(24): 7243-7246 (2007); Shutter et al., Genes Dev., 14(11): 1313-1318 (2000); Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004); Krebs et al., Genes Dev., 14(11): 1343-1352 (2000))。ＤＬＬ−４についてヘテロ接合型であるマウスは、血管形成に重大な欠陥があるため、胎生致死である(Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004); Duarte et al., Genes Dev., 18(20): 2474-2478 (2004); Krebs et al., Genes Dev., 18(20): 2469-2473 (2004))。ＤＬＬ−４の発現は、ＶＥＧＦによって誘導し得る (Liu et al., Mol. Cell. Biol., 23(1): 14-25 (2003); Lobov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(9): 3219-3224 (2007))。合わせると、ＤＬＬ−４は一部ではＶＥＧＦＲ２を抑制し、ＶＥＧＦＲ１を誘導することによって、ＶＥＧＦシグナル伝達を負に制御し得る(Harrington et al., Microvasc. Res., 75(2): 144-154 (2008); Suchting et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(9): 3225-3230 (2007))。ＤＬＬ−４とＶＥＧＦの間の絶妙な調和が、機能的な血管新生に不可欠である。
【０００４】
生理学的な役割に加えて、ＤＬＬ−４は、腫瘍血管において発現が上昇する(Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004); Mailhos et al., Differentiation, 69(2-3): 135-144 (2001); Patel et al., Cancer Res., 65(19): 8690-8697 (2005); Patel et al., Clin. Cancer Res., 12(16): 4836-4844 (2006); Noguera-Troise et al., Nature, 444(7122): 1032-1037 (2006))。複数のモデルにおいて、ＤＬＬ−４の遮断により、原発性腫瘍の成長が強く阻害された(Noguera-Troise et al., Nature, 444(7122): 1032-1037 (2006); Ridgway et al., Nature, 444(7122): 1083-1087 (2006); Scehnet et al., Blood, 109(11): 4753-4760 (2007))。ＤＬＬ−４の阻害は、抗ＶＥＧＦ療法に対して抵抗性を示す腫瘍にも有効であった。ＤＬＬ−４とＶＥＧＦの組み合わせ阻害により、抗腫瘍活性が増強した。興味深いことに、腫瘍血管の形成を低下させるＶＥＧＦ阻害と異なり、ＤＬＬ−４の遮断は、腫瘍の血管密度を増加させ、血管が異常になり、効率的な血液輸送を支持できず、非機能性になる。したがって、ＤＬＬ−４は、がん治療の潜在的な標的をもたらすものである。
【０００５】
Ｎｏｔｃｈ受容体とそのリガンドの間の相互作用は、造血発生および発生中の胸腺における細胞の運命決定だけでなく、細胞系譜の決定に関して重要な、進化的に保存された経路を表す(Artavanis-Tsakonas et al. 1999, Science 284:770-776; Skokos et al. 2007; J. Exp. Med. 204:1525-1531; and Amsen et al. 2004, Cell 117:515-526)。ＤＬＬ−４-Ｎｏｔｃｈ１阻害により、Ｔ細胞分化の完全な遮断が引き起こされ、これは、異所的なＢ細胞の出現および、胸腺中で、Ｐｒｏ−Ｔ細胞からＤＣへの運命転換により生じ得る、樹状細胞の増加を伴う (Hozumi et al. 2008, J. Exp. Med. 205(11):2507-2513; Koch et al. 2008, J. Exp. Med. 205(11):2515-2523; and Feyerabend et al. 2009, Immunity 30:1-13)。このように、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が、造血前駆細胞からの細胞運命決定に重要であることを示す根拠が集まっている。さらに、生体内における、制御性Ｔ細胞(Treg)のホメオスタシスの、ＤＣによるフィードバック調節が示されている(Darrasse-Jeze et al. 2009, J. Exp. Med. 206(9):1853-1862)。しかし、ＤＣの起源および発生、ならびに結果的にはＴｒｅｇホメオスタシスの調節におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の役割は未だにわかっていない。Tregの増加を引きおこす新しい方法の特定は、自己免疫性疾患および障害の処置方法として用い得るため、これは臨床面で重要な課題である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Yan et al., Clin. Cancer Res., 13(24): 7243-7246 (2007)
【非特許文献２】Shutter et al., Genes Dev., 14(11): 1313-1318 (2000)
【非特許文献３】Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004)
【非特許文献４】Krebs et al., Genes Dev., 14(11): 1343-1352 (2000)
【非特許文献５】Duarte et al., Genes Dev., 18(20): 2474-2478 (2004)
【非特許文献６】Krebs et al., Genes Dev., 18(20): 2469-2473 (2004)
【非特許文献７】Liu et al., Mol. Cell. Biol., 23(1): 14-25 (2003)
【非特許文献８】Lobov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(9): 3219-3224 (2007)
【非特許文献９】Harrington et al., Microvasc. Res., 75(2): 144-154 (2008)
【非特許文献１０】Suchting et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(9): 3225-3230 (2007)
【非特許文献１１】Mailhos et al., Differentiation, 69(2-3): 135-144 (2001)
【非特許文献１２】Patel et al., Cancer Res., 65(19): 8690-8697 (2005)
【非特許文献１３】Patel et al., Clin. Cancer Res., 12(16): 4836-4844 (2006)
【非特許文献１４】Noguera-Troise et al., Nature, 444(7122): 1032-1037 (2006)
【非特許文献１５】Ridgway et al., Nature, 444(7122): 1083-1087 (2006)
【非特許文献１６】Scehnet et al., Blood, 109(11): 4753-4760 (2007)
【非特許文献１７】Artavanis-Tsakonas et al. 1999, Science 284:770-776
【非特許文献１８】Skokos et al. 2007; J. Exp. Med. 204:1525-1531
【非特許文献１９】Amsen et al. 2004, Cell 117:515-526
【非特許文献２０】Hozumi et al. 2008, J. Exp. Med. 205(11):2507-2513
【非特許文献２１】Koch et al. 2008, J. Exp. Med. 205(11):2515-2523
【非特許文献２２】Feyerabend et al. 2009, Immunity 30:1-13
【非特許文献２３】Darrasse-Jeze et al. 2009, J. Exp. Med. 206(9):1853-1862
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
他のDLL拮抗剤およびその使用は、国際公開第2007/143689号、国際公開第2007/070671号、国際公開第2008/076379号、国際公開第2008/042236号および国際公開第2008/019144号に記載されている。したがって、当該分野では、ＤＬＬ−４-Ｎｏｔｃｈ経路を標的としており、それにより、腫瘍の血管新生および成長を阻害または予防することのできる、治療剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＤＬＬ−４エピトープに少なくとも１０-６Mの結合親和性で結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体であって、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＨ鎖可変領域配列を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＬ鎖可変領域配列を有する、完全ヒト抗体を提供する。好ましくは、該完全ヒト抗体は、Ｈ鎖とＬ鎖の両方を有し、配列番号１/配列番号２ (Ｃ３と称する)、配列番号３/配列番号４ (Ｃ５と称する)、配列番号５/配列番号６ (Ｃ１０と称する)、配列番号７/配列番号８ (Ｇ６と称する)、配列番号９/配列番号１０ (Ｆ１１と称する)、配列番号１１/配列番号１２ (Ｄ２と称する)、配列番号１３/配列番号１４ (Ｅ１０と称する)、配列番号１５/配列番号１６ (Ｆ１２と称する)、配列番号１７/配列番号１８ (Ｅ５と称する)、配列番号１９/配列番号２０ (Ｈ２と称する)、配列番号２１/配列番号２２ (Ａ１と称する)、配列番号２３/配列番号２４ (Ａ２と称する)、配列番号２５/配列番号２６ (Ａ１１と称する)、配列番号２７/配列番号２８ (Ｃ１２と称する)、配列番号２９/配列番号３０ (Ｄ９と称する)、配列番号３１/配列番号３２ (Ｅ３と称する)、配列番号３３/配列番号３４ (Ｅ６と称する)、配列番号３５/配列番号３６ (Ｆ１と称する)、配列番号３７/配列番号３８ (Ｆ６と称する)、配列番号３９/配列番号４０ (Ｆ１０と称する)およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する。
【０００９】
本発明は、Ｈ鎖由来の可変領域とＬ鎖由来の可変領域を有するＦａｂ完全ヒト抗体断片であって、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＨ鎖可変領域配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＬ鎖可変領域配列を有する、Ｆａｂ完全ヒト抗体断片を提供する。好ましくは、該完全ヒト抗体Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域の両方を有し、該抗体は、配列番号１/配列番号２、配列番号３/配列番号４、配列番号５/配列番号６、配列番号７/配列番号８、配列番号９/配列番号１０、配列番号１１/配列番号１２、配列番号１３/配列番号１４、配列番号１５/配列番号１６、配列番号１７/配列番号１８、配列番号１９/配列番号２０、配列番号２１/配列番号２２、配列番号２３/配列番号２４、配列番号２５/配列番号２６、配列番号２７/配列番号２８、配列番号２９/配列番号３０、配列番号３１/配列番号３２、配列番号３３/配列番号３４、配列番号３５/配列番号３６、配列番号３７/配列番号３８、配列番号３９/配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する。
【００１０】
本発明は、Ｈ鎖由来の可変領域とＬ鎖由来の可変領域およびＨ鎖とＬ鎖の可変領域をつなぐペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体であって、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＨ鎖可変領域配列を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＬ鎖可変領域配列を有する、一本鎖ヒト抗体を提供する。好ましくは、該完全ヒト一本鎖抗体は、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域の両方を有し、配列番号１/配列番号２、配列番号３/配列番号４、配列番号５/配列番号６、配列番号７/配列番号８、配列番号９/配列番号１０、配列番号１１/配列番号１２、配列番号１３/配列番号１４、配列番号１５/配列番号１６、配列番号１７/配列番号１８、配列番号１９/配列番号２０、配列番号２１/配列番号２２、配列番号２３/配列番号２４、配列番号２５/配列番号２６、配列番号２７/配列番号２８、配列番号２９/配列番号３０、配列番号３１/配列番号３２、配列番号３３/配列番号３４、配列番号３５/配列番号３６、配列番号３７/配列番号３８、配列番号３９/配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する。
【００１１】
本発明はさらに、有効量の抗ＤＬＬ−４ポリペプチドを投与することを含む広範囲の哺乳類のがんの処置方法であって、該ＤＬＬ−４ポリペプチドが、ＤＬＬ−４エピトープに少なくとも１０-６Mの結合親和性で結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体、Ｈ鎖由来の可変領域およびＬ鎖由来の可変領域を有するＦａｂ完全ヒト抗体断片、Ｈ鎖由来の可変領域とＬ鎖由来の可変領域およびＨ鎖とＬ鎖の可変領域をつなぐペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体およびその組み合わせからなる群から選択され;
該完全ヒト抗体が配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＨ鎖可変領域配列を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＬ鎖可変領域配列を有し;
該Ｆａｂ完全ヒト抗体断片が 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＨ鎖可変領域配列を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＬ鎖可変領域配列を有し;
該一本鎖ヒト抗体が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＨ鎖可変領域配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＬ鎖可変領域配列を有する、処置方法を提供する。
【００１２】
好ましくは、該完全ヒト抗体は、Ｈ鎖とＬ鎖の両方を有し、配列番号１/配列番号２ (Ｃ３と称する)、配列番号３/配列番号４ (Ｃ５と称する)、配列番号５/配列番号６ (Ｃ１０と称する)、配列番号７/配列番号８ (Ｇ６と称する)、配列番号９/配列番号１０ (Ｆ１１と称する)、配列番号１１/配列番号１２ (Ｄ２と称する)、配列番号１３/配列番号１４ (Ｅ１０と称する)、配列番号１５/配列番号１６ (Ｆ１２と称する)、配列番号１７/配列番号１８ (Ｅ５と称する)、配列番号１９/配列番号２０ (Ｈ２と称する)、配列番号２１/配列番号２２ (Ａ１と称する)、配列番号２３/配列番号２４ (Ａ２と称する)、配列番号２５/配列番号２６ (Ａ１１と称する)、配列番号２７/配列番号２８ (Ｃ１２と称する)、配列番号２９/配列番号３０ (Ｄ９と称する)、配列番号３１/配列番号３２ (Ｅ３と称する)、配列番号３３/配列番号３４ (Ｅ６と称する)、配列番号３５/配列番号３６ (Ｆ１と称する)、配列番号３７/配列番号３８ (Ｆ６と称する)、配列番号３９/配列番号４０ (Ｆ１０と称する) およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する。好ましくは、該完全ヒト抗体Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域の両方を有し、該抗体は、配列番号１/配列番号２ (Ｃ３と称する)、配列番号３/配列番号４ (Ｃ５と称する)、配列番号５/配列番号６ (Ｃ１０と称する)、配列番号７/配列番号８ (Ｇ６と称する)、配列番号９/配列番号１０ (Ｆ１１と称する)、配列番号１１/配列番号１２ (Ｄ２と称する)、配列番号１３/配列番号１４ (Ｅ１０と称する)、配列番号１５/配列番号１６ (Ｆ１２と称する)、配列番号１７/配列番号１８ (Ｅ５と称する)、配列番号１９/配列番号２０ (Ｈ２と称する)、配列番号２１/配列番号２２ (Ａ１と称する)、配列番号２３/配列番号２４ (Ａ２と称する)、配列番号２５/配列番号２６ (Ａ１１と称する)、配列番号２７/配列番号２８ (Ｃ１２と称する)、配列番号２９/配列番号３０ (Ｄ９と称する)、配列番号３１/配列番号３２ (Ｅ３と称する)、配列番号３３/配列番号３４ (Ｅ６と称する)、配列番号３５/配列番号３６ (Ｆ１と称する)、配列番号３７/配列番号３８ (Ｆ６と称する)、配列番号３９/配列番号４０ (Ｆ１０と称する)およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する。好ましくは、該完全ヒト一本鎖抗体は、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域の両方を有し、配列番号１/配列番号２、配列番号３/配列番号４、配列番号５/配列番号６、配列番号７/配列番号８、配列番号９/配列番号１０、配列番号１１/配列番号１２、配列番号１３/配列番号１４、配列番号１５/配列番号１６、配列番号１７/配列番号１８、配列番号１９/配列番号２０、配列番号２１/配列番号２２、配列番号２３/配列番号２４、配列番号２５/配列番号２６、配列番号２７/配列番号２８、配列番号２９/配列番号３０、配列番号３１/配列番号３２、配列番号３３/配列番号３４、配列番号３５/配列番号３６、配列番号３７/配列番号３８、配列番号３９/配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する。
【００１３】
好ましくは、処置する広範囲の哺乳類のがんは、卵巣がん、結腸がん、乳がん、肺がん、骨髄腫、神経芽腫由来CNS腫瘍、単球性白血病、Ｂ細胞由来白血病、Ｔ細胞由来白血病、Ｂ細胞由来リンパ腫、Ｔ細胞由来リンパ腫、肥満細胞由来腫瘍およびその組み合わせからなる群から選択される。好ましくは、自己免疫疾患または炎症性疾患は、腸粘膜炎症、大腸炎に伴う消耗性疾患、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ウイルス感染症、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、クローン病および炎症性腸疾患からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】種々の抗ＤＬＬ−４抗体の、細胞表面に発現するＤＬＬ−４への結合についての最初のスクリーニングを示す。ＤＬＬ−４を安定して発現する細胞を、表記するように抗ＤＬＬ−４抗体１μg/mlとともにインキュベーションした。結合はフローサイトメトリー(HTFC, Intellicyt)により解析した。
【図１Ｂ】選択された抗ＤＬＬ−４抗体の細胞表面に発現するＤＬＬ−４への結合を示す。ＤＬＬ−４を安定して発現する細胞に、量を増加させながら抗ＤＬＬ−４抗体を添加し、ともにインキュベーションした。結合はフローサイトメトリーにより解析した。抗ＤＬＬ−４抗体は、OMP21M18 (Oncomed)に匹敵するか、またはそれより優れた結合特性(EC５０)を示した。
【図２】種々の抗ＤＬＬ−４抗体のBiacore解析を示す。生じた結合動態パラメーターを、付属の表に示す。
【図３】OMP21M18抗体 (Oncomed) に関する抗ＤＬＬ−４抗体のエピトープマッピングを示す。Octetにより登録されたさらなる結合は、抗ＤＬＬ−４抗体Ｃ３、C５またはＧ６が、21M18に占められないＤＬＬ−４のエピトープに結合することを示す。
【図４Ａ】抗ＤＬＬ−４抗体が、rhDLL４の固定したrrNotchへの結合をどのように遮断するかを示す。結合が強い程、吸光度の値が高くなるため、試験管内結合活性に基づいて、最も遮断性の高い抗体は、最も値の低いＣ１０およびＧ６であり、OMP21M18 (Oncomed)と匹敵する。
【図４Ｂ】可溶性の組み換えＮｏｔｃｈ-１ (ラットまたはヒト)の、細胞性のヒトＤＬＬ−４への結合を、抗ＤＬＬ−４抗体が遮断することをフローサイトメトリーでの測定により示す。このアッセイにおいて、Ｎｏｔｃｈ-１を蛍光標識しているため、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ: median fluorescence intensity）が高い場合、Ｎｏｔｃｈ-１およびＤＬＬ−４の間の相互作用が強いことを反映している。抗ＤＬＬ−４抗体の存在下では、相互作用の遮断を示す傾向は殆ど〜全く検出されなかった。
【図４Ｃ】選択した抗体の、ＤＬＬ−４-Ｎｏｔｃｈ-１相互作用の濃度依存的な阻害を示す。IC５０値は、可溶性のＮｏｔｃｈ-１とＤＬＬ−４の間の相互作用の５０ %阻害をもたらす抗体濃度を表す。本明細書に記載の抗ＤＬＬ−４抗体は、OMP21M18よりも高い阻害活性を示す。
【図５】選択した抗体の、ＤＬＬ−４を介する細胞機能の中和能を試験管内にて決定するためのＲＴ−ＰＣＲベースのバイオアッセイを示す。データから、本明細書に記載する抗体の例である、抗ＤＬＬ−４抗体Ｃ３が、乳がん細胞(MCL７)における、ＤＬＬ−４-介在性の、Ｎｏｔｃｈ-１依存的なの遺伝子発現の活性化を効率的に阻害し得ることを示す。
【図６】抗ＤＬＬ−４抗体が、ＤＬＬ−４介在性のHUVEC 増殖阻害を妨げ得ることを示す。ＤＬＬ−４は、ＶＥＧＦ介在性のＨＵＶＥＣ増殖を阻害することが知られている。したがって、ＤＬＬ−４コーティングしたプレートで培養すると、ＨＵＶＥＣの増殖は阻害される。データにより、抗ＤＬＬ−４抗体が、この阻害を遮断でき、部分的にＨＵＶＥＣの増殖を回復し得ることが示される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ＤＬＬ−４エピトープに１０-６M 以下の結合親和性で結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体であって、 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＨ鎖可変領域配列を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＬ鎖可変領域配列を有する、完全ヒト抗体を提供する。好ましくは、該完全ヒト抗体は、Ｈ鎖とＬ鎖の両方を有し、配列番号１/配列番号２ (Ｃ３と称する)、配列番号３/配列番号４ (Ｃ５と称する)、配列番号５/配列番号６ (Ｃ１０と称する)、配列番号７/配列番号８ (Ｇ６と称する)、配列番号９/配列番号１０ (Ｆ１１と称する)、配列番号１１/配列番号１２ (Ｄ２と称する)、配列番号１３/配列番号１４ (Ｅ１０と称する)、配列番号１５/配列番号１６ (Ｆ１２と称する)、配列番号１７/配列番号１８ (Ｅ５と称する)、配列番号１９/配列番号２０ (Ｈ２と称する)、配列番号２１/配列番号２２ (Ａ１と称する)、配列番号２３/配列番号２４ (Ａ２と称する)、配列番号２５/配列番号２６ (Ａ１１と称する)、配列番号２７/配列番号２８ (Ｃ１２と称する)、配列番号２９/配列番号３０ (Ｄ９と称する)、配列番号３１/配列番号３２ (Ｅ３と称する)、配列番号３３/配列番号３４ (Ｅ６と称する)、配列番号３５/配列番号３６ (Ｆ１と称する)、配列番号３７/配列番号３８ (Ｆ６と称する)、配列番号３９/配列番号４０ (Ｆ１０と称する)およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する。
【００１６】
本発明は、Ｈ鎖由来の可変領域およびＬ鎖由来の可変領域を有するＦａｂ完全ヒト抗体断片であって、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＨ鎖可変領域配列を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＬ鎖可変領域配列を有する、Ｆａｂ完全ヒト抗体断片を提供する。好ましくは、該完全ヒト抗体Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域の両方を有し、配列番号１/配列番号２、配列番号３/配列番号４、配列番号５/配列番号６、配列番号７/配列番号８、配列番号９/配列番号１０、配列番号１１/配列番号１２、配列番号１３/配列番号１４、配列番号１５/配列番号１６、配列番号１７/配列番号１８、配列番号１９/配列番号２０、配列番号２１/配列番号２２、配列番号２３/配列番号２４、配列番号２５/配列番号２６、配列番号２７/配列番号２８、配列番号２９/配列番号３０、配列番号３１/配列番号３２、配列番号３３/配列番号３４、配列番号３５/配列番号３６、配列番号３７/配列番号３８、配列番号３９/配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する。
【００１７】
本発明は、Ｈ鎖由来の可変領域とＬ鎖由来の可変領域およびＨ鎖とＬ鎖の可変領域をつなぐペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体であって、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＨ鎖可変領域配列を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＬ鎖可変領域配列を揺する、一本鎖ヒト抗体を提供する。好ましくは、該完全ヒト一本鎖抗体は、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域の両方を有し、配列番号１/配列番号２、配列番号３/配列番号４、配列番号５/配列番号６、配列番号７/配列番号８、配列番号９/配列番号１０、配列番号１１/配列番号１２、配列番号１３/配列番号１４、配列番号１５/配列番号１６、配列番号１７/配列番号１８、配列番号１９/配列番号２０、配列番号２１/配列番号２２、配列番号２３/配列番号２４、配列番号２５/配列番号２６、配列番号２７/配列番号２８、配列番号２９/配列番号３０、配列番号３１/配列番号３２、配列番号３３/配列番号３４、配列番号３５/配列番号３６、配列番号３７/配列番号３８、配列番号３９/配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する。
【００１８】
本発明はさらに、有効量の抗ＤＬＬ−４ポリペプチドを投与することを含む広範囲の哺乳類のがんの処置方法であって、該ＤＬＬ−４ポリペプチドがＤＬＬ−４エピトープに少なくとも１０-６Mの結合親和性で結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体、Ｈ鎖由来の可変領域とＬ鎖由来の可変領域を有する Ｆａｂ完全ヒト抗体断片、Ｈ鎖由来の可変領域とＬ鎖由来の可変領域およびＨ鎖とＬ鎖の可変領域をつなぐペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体およびその組み合わせからなる群から選択され;ここで、
該完全ヒト抗体が配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＨ鎖可変領域配列を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＬ鎖可変領域配列を有し;
該Ｆａｂ完全ヒト抗体断片が、 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＨ鎖可変領域配列を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＬ鎖可変領域配列を有し；
該一本鎖ヒト抗体が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＨ鎖可変領域配列を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＬ鎖可変領域配列を有する、処置方法を提供する。
【００１９】
好ましくは、該完全ヒト抗体は、Ｈ鎖とＬ鎖の両方を有し、配列番号１/配列番号２、配列番号３/配列番号４、配列番号５/配列番号６、配列番号７/配列番号８、配列番号９/配列番号１０、配列番号１１/配列番号１２、配列番号１３/配列番号１４、配列番号１５/配列番号１６、配列番号１７/配列番号１８、配列番号１９/配列番号２０、配列番号２１/配列番号２２、配列番号２３/配列番号２４、配列番号２５/配列番号２６、配列番号２７/配列番号２８、配列番号２９/配列番号３０、配列番号３１/配列番号３２、配列番号３３/配列番号３４、配列番号３５/配列番号３６、配列番号３７/配列番号３８、配列番号３９/配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する。好ましくは、該完全ヒト抗体Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域の両方を有し、配列番号１/配列番号２、配列番号３/配列番号４、配列番号５/配列番号６、配列番号７/配列番号８、配列番号９/配列番号１０、配列番号１１/配列番号１２、配列番号１３/配列番号１４、配列番号１５/配列番号１６、配列番号１７/配列番号１８、配列番号１９/配列番号２０、配列番号２１/配列番号２２、配列番号２３/配列番号２４、配列番号２５/配列番号２６、配列番号２７/配列番号２８、配列番号２９/配列番号３０、配列番号３１/配列番号３２、配列番号３３/配列番号３４、配列番号３５/配列番号３６、配列番号３７/配列番号３８、配列番号３９/配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する。好ましくは、該完全ヒト一本鎖抗体は、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域の両方を有し、 配列番号１/配列番号２、配列番号３/配列番号４、配列番号５/配列番号６、配列番号７/配列番号８、配列番号９/配列番号１０、配列番号１１/配列番号１２、配列番号１３/配列番号１４、配列番号１５/配列番号１６、配列番号１７/配列番号１８、配列番号１９/配列番号２０、配列番号２１/配列番号２２、配列番号２３/配列番号２４、配列番号２５/配列番号２６、配列番号２７/配列番号２８、配列番号２９/配列番号３０、配列番号３１/配列番号３２、配列番号３３/配列番号３４、配列番号３５/配列番号３６、配列番号３７/配列番号３８、配列番号３９/配列番号４０およびその組み合わせからなる群から選択されるＨ鎖／Ｌ鎖可変領域配列を有する。
【００２０】
好ましくは、処置する広範囲の哺乳類のがんは、卵巣がん、結腸がん、乳がん、肺がん、骨髄腫、神経芽腫由来CNS腫瘍、単球性白血病、Ｂ細胞由来白血病、Ｔ細胞由来白血病、Ｂ細胞由来リンパ腫、Ｔ細胞由来リンパ腫、肥満細胞由来腫瘍およびその組み合わせからなる群から選択される。
【００２１】
「抗原結合蛋白質」は、抗原結合部位および、場合によっては、抗原結合蛋白質の抗原への結合を促進する構造を抗原結合部位が取ることを可能にする足場もしくはフレームワーク部位を含む、蛋白質である。抗原結合蛋白質の例としては、抗体、抗体断片 (例えば抗体の抗原結合部位)、抗体の誘導体および抗体の類似体が挙げられる。抗原結合蛋白質は、例えば、代替の蛋白質足場または、移植ＣＤＲもしくはＣＤＲ誘導体を含む人工足場を含んでいてもよい。かかる足場としては、例えば、該抗原結合蛋白質の３次元構造を安定させるために導入した変異を含む、抗体由来の足場ならびに、例えば生体適合性のポリマーを含む全体的に合成の足場が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129; Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654を参照のこと。さらに、ペプチド抗体模倣物 (「PAM」)ならびにフィブロネクチン成分を用いた抗体模倣物に基づく足場を、足場として用いてもよい。
【００２２】
抗原結合蛋白質は、例えば、天然起源の免疫グロブリン構造を有していてよい。「免疫グロブリン」は、４量体分子である。天然起源の免疫グロブリンにおいて、各４量体は、それぞれ１本の「Ｌ」鎖（約２５kDa）と「Ｈ」鎖（約５０〜７０kDa）を有する、同一の２対のポリペプチド鎖からなる。各鎖のＮ末端部位は、主に抗原認識の原因となる約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のＣ末端部位は、主にエフェクターの機能の原因となる定常領域を規定する。ヒトのＬ鎖は、κまたはλＬ鎖に分類される。Ｈ鎖は、μ、δ、γ、αまたはεに分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと規定する。Ｌ鎖およびＨ鎖において、可変領域と定常領域は、約１２もしくはそれ以上のアミノ酸からなる「Ｊ領域」により連結しており、Ｈ鎖はまた、約１０もしくはそれ以上のアミノ酸の「Ｄ領域」も含む。一般的なことについては、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))を参照のこと（該文献は、引用により全体が包含される）。インタクトな免疫グロブリンが２つの結合部位を持つように、各Ｌ鎖／Ｈ鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。
【００２３】
天然起源の免疫グロブリン鎖の可変領域は、相補性決定領域すなわちＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域により連結した、比較的保存された、一般的に同じ構造のフレームワーク領域（ＦＲ）を示す。Ｌ鎖およびＨ鎖はともに、Ｎ末からＣ末の方向に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４領域を含む。各ドメインへのアミノ酸の割当は、Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.sup.th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991)の定義にしたがう。免疫グロブリン鎖のアミノ酸についての他の番号付け系としては、IMGT.RTM. (International ImMunoGeneTics information system; Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 29:185-203; 2005)およびAHo (Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657-670; 2001)が挙げられる。
【００２４】
抗体は、血清または血漿のような、種々の抗原特異性を有する免疫グロブリンを含む供給源から入手し得る。該抗体を親和性精製に付した場合、特定の抗原特異性に富むようにすることができる。かかる抗体の富化生成物は、通常、特定の抗原に対する特異的な結合活性を有する抗体が約１０％よりも少ない状態で作製される。これらの生成物に対して親和性精製を複数回行うことで、該抗原に対する特異的な結合活性を有する抗体の割合を上昇させることができる。このように作製した抗体は、しばしば、「単一特異性」と称される。単一特異性抗体生成物は、特定の抗原に対する特異的な結合活性を有する抗体の割合が、約１０%、２０%、３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９９%または９９.９%である状態で製造されてよい。
【００２５】
「抗体」は、特にことわらない限り、インタクトな免疫グロブリンまたは、特定の結合についてインタクトな抗体と競合する、その抗原結合部位を指す。抗原結合部位は、組み換えＤＮＡ技術またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断により作製し得る。抗原結合部位としては、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')２、Fv、ドメイン抗体 (dAb) および相補性決定領域(CDR) 断片、一本鎖抗体(scFv)、キメラ抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体および特定の抗原をポリペプチドに結合させるのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが挙げられる。
【００２６】
Ｆａｂ断片は、VL、VH、CLおよびCH１領域を有する一価の断片であり; F(ab')２断片は、ヒンジ領域においてジスルフィド結合により連結した２つのＦａｂ断片を有する二価の断片であり; Fd断片は、VHおよびCH１領域を有し; Fv断片は、抗体の単一のアームのVL領域およびVH領域を有し; dAb断片は、VH領域、VL領域または、VHもしくはVL領域の抗原結合断片を有する (米国特許第6,846,634号および第6,696,245号、米国特許公開第20/0202512号; 第2004/0202995号; 第2004/0038291号; 第2004/0009507号;第20 03/0039958号およびWard et al., Nature 341:544-546, 1989)。
【００２７】
一本鎖抗体(scFv)は、VL領域およびVH領域が、リンカー(例えばアミノ酸残基の合成配列) により連結して連続的な蛋白質鎖を形成し、該蛋白質が折り重なり、一価の抗原結合部位を形成できる程度に該リンカーが長い抗体である(Bird et al., 1988, Science 242:423-26およびHuston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83)。二特異性抗体は、２つのポリペプチド鎖を含み、各ポリペプチド鎖が、同一鎖上の２つの領域間で対になるには短すぎるリンカーにより連結しているVHおよびVL領域を含むため、各ドメインが他のポリペプチド鎖上の相補的なドメインと対になっている二価の抗体である(Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48およびPoljak et al., 1994, Structure 2:1121-23)。二特異性抗体の２つのポリペプチド鎖が同一である場合、それらが対になることにより生じる二特異性抗体は、２つの同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖は、２つの異なる抗原結合部位を有する二特異性抗体の作製に用いることができる。同様に、三特異性抗体および四特異性抗体は、それぞれ３つおよび４つのポリペプチド鎖を含み、３つおよび４つの抗原結合部位を形成する抗体であり、該抗原結合部位は同一であっても異なっていてもよい。
【００２８】
特定の抗体の相補性決定領域(CDR)およびフレームワーク領域 (FR)は、上述のKabat et ala; Lefranc et al.,および／またはHonegger and Pluckthunに記載されている系を用いて同定し得る。１種以上のCDRを共有結合もしくは非共有結合により分子に組み入れて、抗原結合蛋白質としてもよい。抗原結合蛋白質は、大きいポリペプチド鎖の一部としてCDRを取り込んでも、他のポリペプチド鎖にＣＤＲを共有結合させていても、またはＣＤＲを非共有結合により取り込んでいてもよい。該CDRにより、抗原結合蛋白質が、特定の目的とする抗原に特異的に結合することが可能になる。
【００２９】
抗原結合蛋白質は、１つ以上の結合部位を有していてよい。結合部位が２つ以上である場合、該結合部位は、互いに同一であっても異なっていてもよい。例えば、天然起源のヒト免疫グロブリンは、典型的には２つの同一の結合部位を持ち、「二特異性」または「二機能性」抗体は、２つの異なる結合部位を持つ。
【００３０】
「ヒト抗体」という語は、ヒト免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を１つ以上有する抗体全てを含む。態様の一において、完全ヒト抗体の可変領域および定常領域は、全てヒト免疫グロブリン配列由来である（完全ヒト抗体）。これらの抗体は、例えば以下に示すような種々の方法で作製されてよく、例えば、ヒトのＨ鎖および／またはＬ鎖をコードする遺伝子から得られる抗体を発現するように遺伝的に修飾したマウスを、目的とする抗原で免疫化することにより作製することも含まれる。
【００３１】
ヒト化抗体は、該ヒト化抗体をヒト対象に投与した場合に、非ヒト種抗体と比較して、免疫応答を誘発する可能性が低くなるように、および／または誘発する免疫応答の重症度が低くなるようにするための、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失および／または付加により、非ヒト種由来の抗体配列とは異なる配列を有する。態様の一において、非ヒト種抗体のＨ鎖および／またはＬ鎖のフレームワーク領域および定常領域の特定のアミノ酸を変異させてヒト化抗体を作製する。他の態様において、ヒト抗体の定常領域を、非ヒト種の可変領域に融合させる。他の態様において、非ヒト抗体の１つ以上のＣＤＲ配列の１つ以上のアミノ酸を変異させて、ヒト対象に投与した場合に、該非ヒト抗体の免疫原性を低下させ、ここで、前述の変異させたアミノ酸残基は、抗体の抗原への免疫特異的な結合にとって重要なものでないか、または、アミノ酸配列の変異が、保存的な変異であるため、該ヒト化抗体の抗原への結合が、非ヒト抗体の抗原への結合よりも有意に低くなることはない。ヒト化抗体の作製方法は、例えば米国特許第6,054,297号; 第5,886,152号;および第5,877,293号に記載されている。
【００３２】
「キメラ抗体」という語は、１つの抗体由来の１つ以上の領域と他の１つ以上の抗体由来の１つ以上の領域とを含む抗体を指す。態様の一において、１つ以上のＣＤＲは、ヒト抗ＤＬＬ−４抗体由来である。他の態様において、全てのＣＤＲがヒト抗ＤＬＬ−４抗体由来である。他の態様において、２つ以上のヒト抗ＤＬＬ−４抗体由来のＣＤＲが、キメラ抗体において混合され、対応している。例えば、キメラ抗体は、第一のヒト抗PAR-２抗体のＬ鎖由来のCDR１、第二のヒトＤＬＬ−４抗体のＬ鎖由来のＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに、第三の抗ＤＬＬ−４抗体のＨ鎖由来ＣＤＲを含んでいてよい。他の組み合わせも可能である。
【００３３】
さらに、フレームワーク領域は、同一の抗ＤＬＬ−４抗体の１つ由来であっても、１つ以上の異なる抗体由来であってもよく、例えばヒト抗体由来であっても、またはヒト化抗体由来であってもよい。キメラ抗体の一例においては、Ｈ鎖および／またはＬ鎖の一部は、特定の種由来の抗体と同一であるか、相同であるかもしくは該抗体由来であるか、または、特定の抗体のクラスまたはサブクラスに属しており、一方、該鎖の残りは、他の種由来の抗体と同一であるか、相同であるかもしくは該抗体由来であるか、または他の抗体のクラスもしくはサブクラスに属している。所望の生物活性(すなわち、ＤＬＬ−４に対する特異的な結合能)を示す該抗体の断片も含まれる。
【００３４】
「中和抗体」または「阻害抗体」は、過剰の抗ＤＬＬ−４抗体が本明細書の実施例に記載のアッセイで、活性化の量を少なくとも約２０％低下させる場合、ＤＬＬ−４の蛋白質分解性の活性化を阻害する抗体である。種々の態様において、該抗原結合蛋白質は、ＤＬＬ−４の蛋白質分解性の活性化量を少なくとも３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９９%および９９.９%低下させる。
【００３５】
抗体の断片または類似体は、本明細書の以下の記載および当該分野で公知の技術を用いて当業者により容易に製造し得る。断片または類似体のＮ末端およびＣ末端は、機能性ドメインの境界の近くであることが好ましい。構造ドメインおよび機能性ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を、公共のもしくは私有の配列データベースと比較することにより特定し得る。コンピューターによる比較方法を用いて、構造および／または機能が知られている他の蛋白質に見られる配列モチーフまたは予測される蛋白質立体構造を特定してもよい。公知の３次元構造に折りたたまれる蛋白質配列を特定する方法が知られている (Bowie et al., 1991, Science 253:164)。
【００３６】
「ＣＤＲ移植抗体(CDR grafted antibody)」は、特定の種の抗体またはアイソタイプ由来の１つ以上のＣＤＲと、同じもしくは異なる種の抗体またはアイソタイプ由来のフレームワークを含む抗体である。
【００３７】
「多重特異性抗体」は、１つ以上の抗原の２つ以上のエピトープを認識する抗体である。この種類の抗体のサブクラスは、同じもしくは異なる抗原の２つの異なるエピトープを認識する、「二重特異性抗体」である。
【００３８】
抗原結合蛋白質は、抗原（例えばヒトＤＬＬ−４）に１nM以下の解離定数で結合する場合、「特異的に結合」しているとみなされる。
【００３９】
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」または「抗原結合部位」は、抗原と相互作用し、抗原結合蛋白質の抗原に対する特異性および親和性に寄与するアミノ酸残基（または他の部分）を含む、抗原結合蛋白質の一部である。抗原に特異的に結合する抗体については、ここに、少なくとも１つのＣＤＲドメインの少なくとも一部が含まれる。
【００４０】
「エピトープ」は、抗原結合蛋白質（例えば抗体）が結合する、分子の部位である。エピトープは、該分子の非近接部位(例えば、ポリペプチドにおいて、その一次配列では近接していないが、三次構造および四次構造では、抗原結合蛋白質が結合できる程度に互いに近接しているアミノ酸残基)を含んでいてもよい。
【００４１】
２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の「パーセント同一性」は、該配列をＧＡＰコンピュータープログラム(GCG Wisconsin Package, version 10.3 の一部(Accelrys, San Diego, Calif.))をそのデフォルトのパラメーターで用いて比較することにより決定する。
【００４２】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」という語は、本明細書を通じて互換可能なように用いられ、DNA分子 (例えばcDNAまたはゲノムDNA)、RNA分子 (例えばmRNA)、核酸類似体（例えばペプチド核酸および非天然起源のヌクレオチド類似体）を用いて作製したDNAまたはRNA類似体およびその混成体を含む。該核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。態様の一において、本発明の核酸分子は、抗体、その断片、誘導体、ムテインまたは変異体をコードする、近位のオープンリーディングフレームを含む。
【００４３】
ギャップを導入することなく、１本のポリヌクレオチド中の全てのヌクレオチドが、もう１本のポリヌクレオチドの相補的なヌクレオチドと反対になるように、２本の一本鎖ポリヌクレオチドの配列を逆平行方向に並べることができ、いずれかの配列の５’末端または３’末端に不対ヌクレオチドが生じることがない場合、これらのポリヌクレオチドは互いの「相補体」である。２つのポリヌクレオチドが、適度に厳密な条件下で互いにハイブリダイズすることができる場合、ポリヌクレオチドは、他のポリヌクレオチドと「相補的」である。したがって、ポリヌクレオチドは、他のポリヌクレオチドの相補体ではないが、相補的である場合がある。
【００４４】
「ベクター」は、そこに連結した他の核酸を細胞に導入するのに用い得る核酸である。ベクターの１種は、「プラスミド」であり、これは、付加的な核酸セグメントを結合させることができる、直鎖もしくは環状の二本鎖ＤＮＡ分子を指す。他の種類のベクターとしては、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに導入することができるウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)がある。特定のベクターは、それらが導入されたホスト細胞中で、自立的に複製を行うことができる(例えば、バクテリアの複製起源を含むバクテリアベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター)。他のベクター (例えば非エピソーム哺乳類ベクター) には、ホスト細胞への導入時に、ホスト細胞のゲノムに取り込まれ、それにより、ホストゲノムとともに複製されるものがある。「発現ベクター」は、選択したポリヌクレオチドを発現させ得る、ベクターの一種である。
【００４５】
調節配列がヌクレオチド配列の発現（例えばレベル、タイミングまたは発現部位）に影響を与える場合、ヌクレオチド配列は、調節配列に「作動可能に連結」している。「調節配列」は、それが作動可能に連結している核酸の発現（例えばレベル、タイミングまたは発現部位）に影響を与える核酸である。調節配列は、例えば、直接的に、または１つ以上の他の分子（例えば、調節配列および／または核酸に結合するポリペプチド）の作用を介して、調節される核酸に影響を及ぼし得る。調節配列の例としては、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）が挙げられる。調節配列のさらなる例は、例えば、Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CalifおよびBaron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06に記載されている。
【００４６】
「ホスト細胞」は、核酸、例えば本発明の核酸を発現させるのに用い得る細胞である。ホスト細胞は、大腸菌 (E. Coli)のような原核生物であっても、または真核生物、例えば単細胞真核生物（例えば酵母または他の真菌）、植物細胞（例えばタバコまたはトマト植物細胞）、動物細胞（例えばヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞または昆虫細胞）またはハイブリドーマであってもよい。ホスト細胞の例としては、サルの腎臓細胞であるCOS-７細胞株 (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., 1981, Cell 23:175)、L細胞、C127細胞、3T3細胞 (ATCC CCL 163)、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞またはその誘導体、例えばVeggie CHOおよび血清不含培地で増殖する、関連細胞株(Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31)またはDHFRが欠損しているCHO系統のDX-B１１ (Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20)、HeLa細胞、BHK (ATCC CRL 10)細胞株、アフリカミドリザルの腎臓細胞株CV1由来のCV1/EBNA細胞株 (ATCC CCL 70) (McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821)、ヒト胎児由来腎臓細胞、例えば293、293 EBNAもしくはMSR 293、ヒト表皮Ａ431細胞、ヒトColo205細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常二倍体細胞、初代培養組織の試験管内培養由来の細胞株、初代人工培養組織、HL-60、U937、HaKまたはJurkat細胞が挙げられる。典型的に、ホスト細胞は、ポリペプチドをコードする核酸で形質転換または遺伝子導入し、次にそれを該ホスト細胞中で発現させることのできる培養細胞である。「組み換えホスト細胞」という語は、発現させる核酸で形質転換したか、または遺伝子導入したホスト細胞を表すのに用い得る。ホスト細胞はまた、核酸を含むが、調節配列を該核酸と作動可能に連結するように該ホスト細胞に導入しなければ、所望のレベルでは該核酸を発現しない細胞であってもよい。ホスト細胞という語は、特定の対象細胞だけでなく、該細胞の子孫もしくは潜在的な子孫も指すということは理解されている。世代が引き継がれる際に、例えば変異または環境の影響によって特定の変化が起こり得るため、かかる子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性もあるが、本明細書で用いる該用語の範囲内に含まれる。
【００４７】
好ましくは、処置する哺乳類のがんは、卵巣がん、結腸がん、乳がんまたは肝がん細胞株、骨髄腫、神経芽腫由来CNS腫瘍、単球性白血病、Ｂ細胞由来白血病、Ｔ細胞由来白血病、Ｂ細胞由来リンパ腫、Ｔ細胞由来リンパ腫、肥満細胞由来腫瘍およびその組み合わせからなる群から選択される。
【００４８】
本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の、任意の標準的な方法を用いて作製してよい。一例としては、ポリペプチドは、該ポリペプチドをコードする核酸配列（例えばｃＤＮＡ）を組み換え発現ベクターに挿入し、発現を促進する条件下にて該ＤＮＡ配列を発現させることによる、組み換えＤＮＡ法により作製する。本明細書に記載するVK-8Bポリペプチドをコードする核酸配列の例としては以下が挙げられる：
【００４９】
本明細書に記載する種々のポリペプチドの任意のものをコードする核酸は、化学的に合成してもよい。細胞内の発現を上昇させるために、コドン使用頻度を選択してもよい。該コドン使用頻度は、選択する細胞の種類に依存する。大腸菌および他の細菌ならびに哺乳類細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞について、特定化したコドン使用頻度パターンが発達している (Mayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003 100(2):438-42; Sinclair et al. Protein Expr. Purif. 2002 (1):96-105; Connell N D. Curr. Opin. Biotechnol. 2001 12(5):446-9; Makrides et al. Microbiol. Rev. 1996 60(3):512-38; およびSharp et al. Yeast. 1991 7(7):657-78)。
【００５０】
核酸操作の一般的な技術は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. １-３, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed., 1989またはAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987) およびその最新版に記載されており、これらの文献は引用により本明細書中に包含される。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳類、ウイルスまたは昆虫遺伝子由来の適当な転写もしくは翻訳調節エレメントに作動可能に連結している。かかる調節エレメントには、転写プロモーター、転写を調節する任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列ならびに転写および翻訳の終結を調節する配列が含まれる。さらに、ホスト細胞は、通常複製起点によってもたらされる、複製を行うことができ、形質転換体の認識を促進するための選択遺伝子を含んでいてもよい。
【００５１】
また、該組み換えＤＮＡは、蛋白質精製に有用であり得る、任意の種類の蛋白質タグ配列を含んでいてよい。蛋白質タグの例としては、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＧＳＴタグが挙げられるが、これらに限定されるものではない。細菌、真菌、酵母および哺乳類細胞ホストに用いる適当なクローニングおよび発現ベクターはCloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, N.Y., 1985)に記載されている。
【００５２】
該発現コンストラクトを、適当な方法を用いてホスト細胞に導入する。ホスト細胞へ核酸を導入する方法としては、当該分野において種々の方法が知られており、例えば、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE−デキストランまたは他の物質を用いた遺伝子導入；微粒子銃；リポフェクション；および感染（ベクターが感染性である場合）が挙げられるが、これらに限定されない。適当なホスト細胞としては、原核生物、酵母、哺乳類細胞または細菌細胞が挙げられる。
【００５３】
適当な細菌としては、グラム陰性もしくはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバチルス種(Bacillus spp.)が挙げられる。酵母、好ましくはサッカロマイシス(Saccharomyces)種、例えば出芽酵母(S. cerevisiae)を、ポリペプチドの作製に用いてもよい。種々の哺乳類もしくは昆虫細胞の培養系を、組み換え蛋白質の発現に用いてもよい。昆虫細胞内で異種性の蛋白質を作製するためのバキュロウイルス系は、LuckowおよびSummersにより概説されている(Bio/Technology, 6:47, 1988)。適当な哺乳類ホスト細胞株の例としては、内皮細胞、COS-7サル腎臓細胞、CV-1、L細胞、C127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、HEK（ヒト胎児由来腎臓）細胞、HeLa、293、293TおよびBHK細胞株が挙げられる。精製ポリペプチドは、適当なホスト／ベクター系を培養して組み換え蛋白質を発現させることにより作製する。多くの適用において、本明細書に記載のポリペプチドの多くはサイズが小さいため、大腸菌での発現が好ましい発現方法となる。その後、該蛋白質を、培養培地または細胞抽出物から精製する。
【００５４】
本明細書に記載の蛋白質は、細胞翻訳系を用いて作製してもよい。かかる目的のためには、該ポリペプチドをコードする核酸を修飾して、試験管内での転写によるｍＲＮＡの産生および、用いる特定の無細胞系（真核生物、例えば哺乳類もしくは酵母の無細胞翻訳系または原核生物、例えば細菌の無細胞翻訳系）における該ｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にしなければならない。
【００５５】
ＤＬＬ−４結合ポリペプチドはまた、化学合成 (例えば、 Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, Illに記載の方法)を用いて作製してもよい。該蛋白質の修飾もまた、化学合成によって作製してよい。
【００５６】
本発明のポリペプチドは、蛋白質化学の分野で一般的に知られている蛋白質の単離／精製方法により精製し得る。非限定的な例としては、抽出、再結晶、塩析（例えば、硫酸アンモニウムもしくは硫酸ナトリウムを用いた塩析）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、電気泳動、向流分配またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。精製後、ポリペプチドは、当該分野で公知の任意の方法、例えば非限定的な例としては、濾過および透析によって、緩衝媒体を交換するか、および／または、濃縮してもよい。
【００５７】
該精製ポリペプチドは、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の純度である。厳密な純度の値に関わらず、本ポリペプチドは、医薬的製品として用いるのに充分な純度である。
【００５８】
ポリペプチドの翻訳後修飾
特定の態様において、本発明の結合ポリペプチドは、さらに、翻訳後修飾を含んでいてもよい。翻訳後の蛋白質修飾の例としては、リン酸化、アセチル化、メチル化、ADP-リボース化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、SUMO化、ビオチン化またはポリペプチド側鎖もしくは疎水性基の付加が挙げられる。結果として、修飾された可溶ポリペプチドには、非アミノ酸エレメント、例えば脂質、多糖もしくは単糖、およびリン酸が含まれていてよい。グリコシル化の好ましい形態は、該ポリペプチドに１つ以上のシアル酸部分を結合させる、シアル酸付加である。シアル酸部分は、該蛋白質の溶解度および血清半減期を改善する一方で、免疫原性を低下させる (Raju et al. Biochemistry. 2001 31; 40(30):8868-76)。該非アミノ酸エレメントのポリペプチドの官能性に対する影響は、そのＤＬＬ−４の機能に対する拮抗作用、例えば血管新生または腫瘍成長に対する阻害効果について試験してよい。
【００５９】
特定の態様の一において、対象の可溶ポリペプチドの修飾形態は、かかる対象の可溶ポリペプチドの非蛋白質性のポリマーへの連結を含む。特定の態様の一において、該ポリマーは、米国特許第4,640,835号; 第4,496,689号; 第4,301,144号; 第4,670,417号; 第4,791,192号または第4,179,337号に記載されているように、ポリエチレングリコール(「ＰＥＧ」)、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンである。
【００６０】
ＰＥＧは、市販されているか、または当該分野でよく知られている方法によるエチレングリコールの開環重合により製造し得る水溶性ポリマーである(Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, p 138-161)。「ＰＥＧ」という語は、サイズまたはＰＥＧ末端の修飾に関わらず、任意のポリエチレングリコール分子を広く指すのに用いられ、
式: Ｘ--Ｏ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｎ-１ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ (１)
で表され、式中で、ｎは２０〜２３００であり、ＸはＨまたは末端修飾、例えばＣ１-４アルキルである。態様の一において、本発明のＰＥＧは、一方の末端がヒドロキシまたはメトキシである、すなわち、ＸがＨまたはＣＨ３である(「メトキシＰＥＧ」)。ＰＥＧは、さらに、結合反応に必要な化学基を含んでいてよく; それは、該分子の化学合成により生じたものか、または;分子の距離が最適になるためのスペーサーである。さらに、該ＰＥＧは、互いに結合している１つ以上のＰＥＧ側鎖からなっていてよい。２つ以上のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、多アーム(multiarmed)または分枝ＰＥＧと呼ばれる。分枝ＰＥＧは、例えば、ポリエチレンオキシドを種々のポリオール、例えば、グリセロール、ペンタエリトリトール(pentaerythriol)およびソルビトールに添加することにより作製し得る。例えば、４分枝ＰＥＧは、ペンタエリトリトール(pentaerythriol)とエチレンオキシドから作製し得る。分枝ＰＥＧは、例えば欧州特許公開第0 473 084号および米国特許第5,932,462号に記載されている。ＰＥＧの形態の一つには、リジンの第一級アミノ基を介して結合した２ＰＥＧ側鎖 (ＰＥＧ２) が挙げられる(Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69)。
【００６１】
ＰＥＧはよく知られているが、ＰＥＧ化１０Fn３ポリペプチドが、ＰＥＧ化して、リガンド結合活性を維持し得ることが示されたのは、知る限りではこれが最初である。好ましい態様において、該ＰＥＧ化１０Fn３ポリペプチドは、部位特異的なＰＥＧ化、特に、Ｎ末端またはＣ末端におけるシステインへのＰＥＧの結合により、作製される。したがって、本発明は、薬理学的な性質が改善されている標的結合性の１０Fn３ポリペプチドであって、該１０Fn３ドメインのループの少なくとも１つが標的結合に機能している、約８０〜約１５０アミノ酸の１０Fn３ドメインおよび；共有結合したPEG部分を含む１０Fn３ポリペプチドを提供し、ここで、該１０Fn３ポリペプチドは哺乳類において、１００nMより低いＫＤで標的に結合し、３０mL/時間/kgより低いクリアランス率を示す。該ＰＥＧ部分は、１０Fn３ポリペプチドに、部位特異的なＰＥＧ化、例えばＣｙｓ残基への結合によって結合していてよく、ここで、該Cys残基は、該１０Fn３ポリペプチドのＮ末端またはＮ末端とＮ最末端のβ鎖もしくはβ様鎖の間、または該１０Fn３ポリペプチドのＣ末端またはＣ末端とＣ最末端のβ鎖もしくはβ様鎖の間に位置していてよい。Cys残基は、他の位置、具体的には、標的結合に関与しない任意のループ上であってもよい。ＰＥＧ部分は、他の化学反応、例えば、アミンへの結合によって、結合していてもよい。
【００６２】
ＰＥＧのペプチドまたは蛋白質への結合は、通常、ＰＥＧの活性化および該活性化ＰＥＧ中間体の、標的蛋白質／ペプチドへの直接的なカップリング、もしくは、続いて活性化されて標的蛋白質／ペプチドにカップリングするリンカーへのカップリングを伴う(Abuchowski et al., J. Biol. Chem., 252, 3571 (1977) and J. Biol. Chem., 252, 3582 (1977)、Zalipsky, et al., and Harris et. al., in: Poly(ethylene glycol) Chemistry: BiotechnicalおよびBiomedical Applications; (J. M. Harris ed.) Plenum Press: New York, 1992; Chap.21 and 22を参照のこと)。ＰＥＧ分子を含む結合ポリペプチドもまた、結合蛋白質として知られていること、その一方で、結合しているＰＥＧ分子を欠落する蛋白質は、非結合体と称し得ることは留意されるべきである。
【００６３】
ＤＬＬ−４結合ポリペプチドへの結合については、例えば、約１,０００ダルトン (Da)〜１００,０００Da (ｎは２０〜２３００)の、種々の分子量のＰＥＧを選択してよい。ＰＥＧにおける繰り返しユニットの数「ｎ」は、Ｄａで表される分子量に近似される。活性化リンカー上のＰＥＧの組み合わせた分子量が、医薬用途に適当であることが好ましい。したがって、態様の一において、該ＰＥＧ分子の分子量は、１００,０００Daを超えない。例えば、３つのＰＥＧ分子がリンカーに結合している場合、各ＰＥＧ分子は、１２,０００Da (各ｎは約２７０)という同じ分子量を有し、このとき、リンカー上のＰＥＧの総分子量は約３６,０００Da (ｎの合計は約８２０)である。該リンカーに結合したＰＥＧの分子量は異なっていてもよく、例えば、リンカー上の３つの分子のうち、２つのＰＥＧ分子がそれぞれ５,０００Da (各ｎは約１１０) であり、１つのＰＥＧ分子が１２,０００ Da (ｎは約２７０)であってよい。
【００６４】
本発明の特定の態様において、ＤＬＬ−４結合ポリペプチドは、
式:--ＣＯ--(ＣＨ２)ｘ--(ＯＣＨ２ＣＨ２)ｍ--ＯＲ
のポリ（エチレングリコール）基の１つに、該ポリ(エチレングリコール) 基の--ＣＯ (すなわちカルボニル)が、結合ポリペプチドのアミノ基の１つとアミド結合を形成するように、共有結合しており;Ｒは低級アルキルであり; ｘは２または３であり; ｍは約４５０〜約９５０であり; ｎおよびｍは、結合体から結合性のポリペプチドを引いた分子量が約１０〜４０ kDaになるように選択される。態様の一において、結合ポリペプチドのリジンの６-アミノ基は、利用可能な (遊離の) アミノ基である。
【００６５】
上述の結合体は、より具体的には、式（ＩＩ）:
Ｐ--ＮＨＣＯ--(ＣＨ２)ｘ--(ＯＣＨ２ＣＨ２)ｍ--ＯＲ (II)
によって表され、式中、Pは本明細書に記載の結合ポリペプチドの基であり（すなわち式（ＩＩ）に示すカルボニルとアミド結合を形成するアミノ基を含まない）； Ｒは低級アルキルであり; xは２または３であり; ｍは約４５０〜約９５０であり、結合体から結合ペプチドを引いた分子量が約１０〜約４０kDaになるように選択される。本明細書において、「ｍ」の特定の範囲は、配向について意味を持つ。「ｍ」の範囲は、いずれの場合においても、ＰＥＧ基の分子量によって厳密に決定される。当業者は、例えば、ＰＥＧ化結合ポリペプチドが、治療的にどのように用いられるか、所望の用量、循環時間、蛋白質分解に対する耐性、免疫原性および他の考慮する事項に基づいて、ＰＥＧの適当な分子量を選択し得る。
【００６６】
態様の一において、PEG分子は、活性化して、結合ポリペプチド上のアミノ基、例えばリジンと反応してもよい (Bencham et al., Anal. Biochem., 131, 25 (1983); Veronese et al., Appl. Biochem., 11, 141 (1985).; Zalipsky et al., Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, adrs 9-110 ACS Symposium Series 469 (1999); Zalipsky et al., Europ. Polym. J., 19, 1177-1183 (1983); Delgado et al., Biotechnology and Applied Biochemistry, 12, 119-128 (1990))。
【００６７】
特定の態様の一において、ＰＥＧのカルボネートエステルは、ＰＥＧ−結合ポリペプチド結合体を形成するのに用いられる。Ｎ，Ｎ’-ジスクシンイミジルカルボネート (DSC)を、ＰＥＧとの反応に用いて、活性化混合ＰＥＧ-スクシンイミジルカルボネートを形成し、これを次にリンカーの求核基または結合ポリペプチドのアミノ基と反応させてもよい (米国特許第5,281,698号および第5,932,462号)。同様の種類の反応において、１,１’-(ジベンゾトリアゾリル)カルボネートおよびジ-(２-ピリジル)カルボネートを、ＰＥＧと反応させて、それぞれＰＥＧ-ベンゾトリアゾリルおよびＰＥＧ-ピリジル混合カルボネート(米国特許第５,３８２,６５７号)を形成してよい。
【００６８】
１０Fn３ポリペプチドのＰＥＧ化は、当該分野の最新の方法によって、例えば結合ポリペプチドと求電子活性ＰＥＧ(供給元: Shearwater Corp., USA, www.shearwatercorp.com)の反応によって行ってよい。本発明の好ましいPEG試薬は、例えば、N-スクシンイミジルプロピオネート (PEG-SPA)、ブタノエート (PEG-SBA)、PEG-スクシンイミジルプロピオネートまたは分枝N-ヒドロキシスクシンイミド、例えばmPEG２-NHS (Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69)である。該方法を、結合ポリペプチドのリジンのｆ−アミノ基またはＮ末端のアミノ基でのＰＥＧ化に用いてよい。
【００６９】
他の態様において、ＰＥＧ分子を、結合ポリペプチド上のスルフヒドリル基にカップリングさせてよい(Sartore et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 27, 45 (1991); Morpurgo et al., Biocon. Chem., 7, 363-368 (1996); Goodson et al., Bio/Technology (1990) 8, 343; 米国特許第5,766,897号)。米国特許第6,610,281号および第5,766,897号には、スルフヒドリル基にカップリングさせてよい、反応性のＰＥＧ種の例が記載されている。
【００７０】
ＰＥＧ分子が、結合ポリペプチドのシステイン残基に結合している態様において、該システイン残基は、結合ポリペプチド由来のものである場合もある一方で、他の態様においては、１つ以上のシステイン残基が結合ポリペプチド中に操作により導入されている場合もある。システイン残基を作製するために、結合ポリペプチドコード配列に変異を導入してもよい。これは、例えば、１つ以上のアミノ酸残基をシステインに変異させることにより達成し得る。システイン残基に変異させるのに好ましいアミノ酸としては、セリン、スレオニン、アラニンおよび他の親水性残基が挙げられる。システインに変異させる残基は、表面に露出している残基であることが好ましい。一次配列または蛋白質に基づいて、残基の表面接近性を予測するためのアルゴリズムが、当該分野ではよく知られている。あるいは、結合ポリペプチドがそれに基づいてデザインされ、展開しているフレームワークの結晶構造が解明されている場合、結合ポリペプチドのアミノ酸配列を比較することにより、表面残基を予測し(Himanen et al., Nature. (2001) 20-27; 414(6866):933-8)、それにより表面に露出する残基を特定することができる。態様の一において、システイン残基をＮ末端および／またはＣ末端もしくはその付近、またはループ領域内にて、結合ポリペプチドに導入する。
【００７１】
いくつかの態様において、ＰＥＧ化結合ポリペプチドは、Ｎ末端のアミノ酸のαアミノ基に共有結合したＰＥＧ分子を含む。部位特異的なＮ末端の還元的アミノ化は、Pepinsky et al., (2001) JPET, 297, 1059および米国特許第5,824,784号に記載されている。他の利用可能な求核性アミノ基を用いた蛋白質の還元的アミノ化のためのＰＥＧ−アルデヒドの使用が、米国特許第4,002,531号、Wieder et al., (1979) J. Biol. Chem. 254,12579および Chamow et al., (1994) Bioconjugate Chem. 5, 133に記載されている。
【００７２】
結合反応中の、結合ポリペプチドの活性化ＰＥＧに対する比率は約１:０.５〜１:５０、約１:１〜１:３０または約１:５〜１:１５であってよい。ＰＥＧの結合ポリペプチドへの共有結合による付加を触媒する本発明の方法において、種々の水性緩衝液を用いてよい。態様の一において、緩衝液のpHは、約７.０〜９.０である。他の態様において、該pHは、わずかに塩基性の範囲、例えば約７.５〜８.５である。中性の範囲に近いpKaを有する緩衝液、例えばリン酸緩衝液を用いてもよい。
【００７３】
ＰＥＧ化結合ポリペプチドの精製に、当該分野で知られている慣用的な分離および精製技術、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（例えばゲル濾過）およびイオン交換クロマトグラフィーを用いてよい。生成物は、SDS-PAGEを用いて分離してもよい。分離し得る生成物としては、モノ−、ジ−、トリ−、ポリ−ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化結合ポリペプチドならびに遊離のＰＥＧが含まれる。モノＰＥＧ結合体のパーセンテージは、溶出ピーク周辺のより広範囲の画分をプールすることにより、組成物中のモノＰＥＧのパーセンテージが高くなるように調節することができる。モノＰＥＧ結合体が約９０％である場合に、収量および活性のバランスが良い。例えば、結合体の少なくとも９２％または少なくとも９６％がモノＰＥＧ種である組成物が望ましい場合もある。本発明の態様の一において、モノ−ＰＥＧ結合体のパーセンテージは、９０％〜９６％である。
【００７４】
態様の一において、本発明のＰＥＧ化結合ポリペプチドは、１つ、２つまたはそれより多いＰＥＧ部分を含む。態様の一において、該ＰＥＧ部分は、蛋白質の表面上および／または標的リガンドに接触する表面から離れた、アミノ酸残基に結合している。態様の一において、ＰＥＧ−結合ポリペプチドのＰＥＧの、組み合わせたまたは合計の分子量は、約３,０００Da〜６０,０００Daであり、場合によっては約１０,０００Da〜３６,０００Daである。
【００７５】
本発明の態様の一において、該ＰＥＧ化結合ポリペプチド中のＰＥＧは、例えば４５０mM ヒドロキシルアミン(ｐＨ６.５)、８〜１６時間、室温にてヒドロキシルアミンアッセイを用いて、該ＰＥＧ化アミノ酸残基から加水分解されていないために、安定である。態様の一において、該組成物の８０%より多く、より好ましくは少なくとも９０%、最も好ましくは少なくとも９５%が、安定したモノ-ＰＥＧ-結合ポリペプチドである。
【００７６】
他の態様において、本発明のＰＥＧ化結合ポリペプチドは、修飾されていない蛋白質が有する生物活性を少なくとも２５%、５０%、６０%、７０%、８０%、８５%、９０%、９５%または１００%維持していることが好ましい。態様の一において、生物活性は、KD、konまたはkoffによって評価される、ＤＬＬ−４への結合能を指す。特定の態様の一において、該ＰＥＧ化結合ポリペプチド蛋白質は、非ＰＥＧ化結合ポリペプチドと比較してＤＬＬ−４への結合の上昇を示す。
【００７７】
ＰＥＧ修飾ポリペプチドの血清クリアランス率は非修飾結合ポリペプチドと比較して約１０%、２０%、３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、８０%または９０%低下し得る。該ＰＥＧ修飾ポリペプチドの半減期(t１/２)は、非修飾蛋白質の半減期と比べて、上昇していてよい。ＰＥＧ−結合ポリペプチドの半減期は、非修飾結合ポリペプチドと比較して、少なくとも１０%、２０%、３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、８０%、９０%、１００%、１２５%、１５０%、１７５%、２００%、２５０%、３００%、４００%または５００%または１０００%上昇していてよい。いくつかの態様において、該蛋白質の半減期は、試験管内、例えば緩衝食塩水もしくは血清中で決定する。他の態様において、該蛋白質の半減期は、生体内半減期、例えば、血清または動物の他の体液中での半減期である。
【００７８】
治療用製剤と投与方法
本発明は、ＤＬＬ−４の生物活性の阻害に応答する症状の処置または前症状の予防方法を特徴づける。好ましい例は、炎症または細胞の過剰増殖により特徴づけられる症状である。投与技術および用量は、具体的なポリペプチドの種類および処置する具体的な症状によって変わるが、これは当業者によって容易に決定し得るものである。一般的に、規制当局は、治療剤として用いる蛋白質製剤は、発熱物質が許容できる程度に低いレベルになるように製剤することを要求している。したがって、一般的に治療剤は、本質的に発熱性物質を含まないか、または適当な規制当局（例えばＦＤＡ）により決定された許容されるレベル以下の発熱性物質しか含まないという点において、他の製剤と異なる。
【００７９】
本発明の治療用組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤とともに単位剤形で投与してもよい。投与は、非経口（例えば静脈内、皮下）、経口または局所投与であってよいが、これらに限定されるものではない。さらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸を用いた任意の遺伝子治療技術、例えばＤＮＡ自体の送達、組み換え遺伝子およびベクター、細胞ベースの送達、例えば患者の細胞の生体外操作などを用いてもよい。
【００８０】
本組成物は、経口投与用の丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤または徐放性錠剤；静脈内、皮下もしくは非経口投与用の液剤；局所投与用のゲル剤、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤またはポリマーまたは他の徐放性ビヒクルの形態であってよい。
【００８１】
当該分野でよく知られている、製剤の製造方法は、例えば「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」 (20th ed., ed. A. R. Gennaro A R., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)に記載されている。非経口投与用の製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水、生理食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、植物由来の油または水素化ナフタレンを含んでいてよい。生体適合性の、生分解性乳酸ポリマー、乳酸／グリコール酸コポリマーまたはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを、該化合物の徐放に用いてもよい。ナノ粒子性の製剤(例えば、生体分解性ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム) を該化合物の生体内分布の制御に用いてもよい。有用な可能性のある他の非経口送達系としては、エチレン−ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型注入系およびリポソームが挙げられる。製剤中の該化合物の濃度は、多数の要素、例えば投与する薬物の用量、および投与経路によって変化する。
【００８２】
該ポリペプチドは、薬学的に許容される塩、例えば製薬業で通常用いられている、非毒性の酸付加塩または、金属錯体として投与してもよい。酸付加塩の例としては、有機酸、例えば酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、またはトリフルオロ酢酸など；ポリマー酸、例えばタンニン酸またはカルボキシメチルセルロースなど；無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸などが挙げられる。金属錯体には、亜鉛および鉄などが含まれる。一例において、該ポリペプチドは、熱安定性を高めるために、酢酸ナトリウムの存在下で製剤する。
【００８３】
経口使用に用いる製剤としては、有効成分を、非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合して含む錠剤が挙げられる。これらの賦形剤は、例えば、不活性の希釈剤または注入剤（例えばスクロースおよびソルビトール）、滑沢剤、滑剤および付着防止剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油またはタルク）であってよい。
【００８４】
経口用の製剤はまた、咀嚼錠または有効成分が不活性の固体希釈剤と混合している硬ゼラチンカプセル剤、または有効成分が水もしくは油性媒体と混合している軟ゼラチンカプセル剤として提供されてもよい。
【００８５】
治療上有効な用量、という語は、そのために投与している治療効果をもたらす用量を指す。厳密な用量は、処置する障害により変わるが、公知の技術を用いて当業者により確認できるものである。一般的に、ポリペプチドは、１日あたり約０.０１μg/kg〜約５０mg/kg、好ましくは１日あたり０.０１mg/kg〜約３０mg/kg、最も好ましくは１日あたり０.１mg/kg〜約２０mg/kg投与される。該ポリペプチドは、毎日(例えば、１日１回、２回、３回、または４回) または好ましくはより低い頻度で(例えば毎週、２週間毎、３週間毎、毎月または３ヶ月毎)投与してよい。さらに、当該分野では知られていることであるが、年齢ならびに体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与のタイミング、薬物相互作用および疾患の重症度に応じて調節することが必要な場合もあるが、これらは、当業者の通常の実験方法により決定し得るものである。
【００８６】
使用例
本明細書に記載のＤＬＬ−４結合蛋白質およびその関連する変異体は、多数の治療および診断への適用に有用である。これらには、ＤＬＬ−４への結合の競合または遮断によるＤＬＬ−４の生物活性の阻害ならびに、細胞、特にＤＬＬ−４発現細胞への細胞毒性またはイメージング剤の送達が含まれる。これらの分子のサイズが小さく、構造が安定していることは、薬物の製造、急速なクリアランスが望ましい特定の適用における、体内からの急速なクリアランスまたは、適当な、またはかかる特徴を有する分子を用いて改善される新規の送達系への製剤について特に有用であり得る。
【００８７】
本発明のポリペプチドは、そのＤＬＬ−４生物活性の阻害剤としての有効性に基づいて、多数のがんの症状ならびにがんに起因する合併症、例えば胸水貯留および腹水貯留に対して有効である。好ましくは、本発明のＤＬＬ−４結合ポリペプチドは、過増殖性疾患またはがんおよび、がんの転移による広がりの処置または予防に有用であり得る。本明細書に記載する抗ＤＬＬ−４抗体にとって好ましい適応症としては、結腸直腸がん、頭頸部がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および膵臓がんが挙げられる。がんの非限定的な例としては、膀胱がん、血液がん、骨がん、脳がん、乳がん、軟骨がん、結腸がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、リンパ節がん、神経組織がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、骨格筋がん、皮膚がん、脊髄がん、脾臓がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、気管がん、泌尿生殖器がん、尿管がん、尿道がん、子宮がんまたは膣がんが挙げられる。
【００８８】
さらに、本明細書に記載の抗ＤＬＬ−４結合ポリペプチドにより、種々の炎症性障害を処置し得る。該炎症性障害としては、例えば、腸粘膜炎症、大腸炎に伴う消耗性疾患、多発性硬化症、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬およびクローン病が挙げられる。
【００８９】
ＤＬＬ−４結合ポリペプチドは、単独でまたはさらなる治療、例えば化学療法、放射線療法、免疫療法、外科的介入またはこれらの任意の組み合わせの１つ以上と組み合わせて投与してよい。上述するように、他の治療戦略における補助治療として、長期間の治療も同様に可能である。
【００９０】
かかる方法の特定の態様において、１つ以上のポリペプチド治療剤を、併用的に（同時に）または異なるタイミングで（連続的に）投与してよい。さらに、ポリペプチド治療剤は、他の種類のがんの処置用、または血管新生の阻害用の化合物と併用して投与してよい。
【００９１】
特定の態様において、本発明の対象の抗ＤＬＬ−４抗体薬剤は、単独で使用してよい。あるいは、対象となる剤は、増殖性障害（例えば腫瘍）の処置または予防に関する他の慣用的な抗がん治療法と組み合わせて用いてよい。例えば、該方法は、がんの予防、外科手術後のがんの再発および転移の予防に用いてよく、他の慣用的ながん治療の補助として用いてよい。慣用的ながん治療（例えば化学療法、放射線療法、光線療法、免疫療法および外科手術）の効果を本発明の対象のポリペプチド治療剤によって増強し得ることは、本明細書の記載により確認できる。
【００９２】
一連の広い範囲の既知化合物が、抗腫瘍活性を示すことが示されている。これらの化合物は、化学療法において、固形腫瘍の収縮、転移およびさらなる増殖の予防または白血病性または骨髄悪性腫瘍中の悪性細胞の数を減少させるために医薬剤として用いられている。化学療法は種々の種類の悪性腫瘍を処置する上で効果的であるが、抗腫瘍性の化合物は、多くが望ましくない副作用を誘発する。２つ以上の異なる処置を組み合わせた場合、かかる処置は相乗的に作用し、各処置の用量を低下させ、それにより各化合物が高用量で引き起こす有害な副作用を軽減することができることが示されている。他の例において、処置に対して不応性の悪性腫瘍は、２つ以上の異なる治療の組み合わせには反応する場合がある。
【００９３】
本発明のポリペプチド治療剤を他の慣用的な抗腫瘍剤と組み合わせて、同時または連続的に投与する場合、該治療剤は、該抗腫瘍剤の治療効果を増強するか、または該抗腫瘍剤への細胞の耐性を克服することができることが示され得る。これにより、抗腫瘍剤の用量を低下させ、それにより、望ましくない副作用を低下させるか、または、耐性細胞における抗腫瘍剤の効果を回復することが可能になる。
【００９４】
組み合わせ抗腫瘍治療に用い得る医薬化合物としては：アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、bcg、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン(campothecin)、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエンエストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン(ironotecan)、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンが挙げられるが、これらは例示のみを目的とするものである。
【００９５】
特定の化学療法用抗腫瘍化合物は、その作用機序によって、例えば以下の群に分けられる: 抗代謝剤/抗がん剤、例えばピリミジン類似体(５-フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン)およびプリン類似体、葉酸拮抗剤および関連阻害剤(メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび２-クロロデオキシアデノシン(クラドリビン)); 抗増殖/抗有糸分裂剤、例えば天然産物、例えばビンカアルカロイド (ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビン)、微小管崩壊剤（microtubule disruptor）、例えばタキサン (パクリタキセル、ドセタキセル)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポシロンおよびナベルビン、エピジポドフィロトキシン(epidipodophyllotoxins) (エトポシド、テニポシド)、DNA傷害剤(アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド(iphosphamide)、メルファラン、メクロレタミン(merchlorehtamine)、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphoramide)およびエトポシド(VP１６)); 抗生物質、例えばダクチノマイシン(アクチノマイシンＤ)、ダウノルビシン、ドキソルビシン (アドリアマイシン)、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン(ミスラマイシン) およびマイトマイシン;酵素(L-アスパラギンを全身的に代謝し、自身でアスパラギンを合成する能力を持たない細胞を取り除くＬ−アスパラギナーゼ); 抗血小板剤; 抗増殖/抗有糸分裂アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード(メクロレタミン、シクロホスファミドおよび類似体、メルファラン、クロラムブシル)、エチレンイミンおよびメチルメラミン(ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ)、アルキルスルホネート-ブスルファン、ニトロソウレア(カルムスチン(BCNU) および類似体、ストレプトゾシン)、トラゼン−ダカルバジニン(trazenes-dacarbazinine) (DTIC); 抗増殖/抗有糸分裂抗代謝剤、例えば葉酸類似体 (メトトレキサート); プラチナ配位錯体(シスプラチン、カルボプラチン)、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド; ホルモン、ホルモン類似体 (エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド) およびアロマターゼ阻害剤(レトロゾール、アナストロゾール); 抗凝固剤(ヘパリン、合成ヘパリン塩および他のトロンビン阻害剤); 血栓溶解剤 (例えば組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼ)、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ; 抗遊走剤(antimigratory agent); 抗分泌剤(ブレフェルジン(breveldin)); 免疫抑制剤 (シクロスポリン、タクロリムス (FK-５０６)、シロリムス(ラパマイシン)、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル); 抗血管新生化合物(TNP-４７０、ゲニステイン)および増殖因子阻害剤(例えばＶＥＧＦ阻害剤、線���芽細胞増殖因子(FGF)阻害剤); アンジオテンシン受容体遮断薬; 一酸化窒素ドナー; アンチセンスオリゴヌクレオチド; 抗体 (トラスツズマブ); 細胞周期阻害剤および分化誘導因子 (トレチノイン); mTOR阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤 (ドキソルビシン (アドリアマイシン)、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド(eniposide)、エピルビシン、エトポシド、イダルビシンおよびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン)、コルチコステロイド (コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン(methylpednisolone)、プレドニゾンおよびプレドニゾロン); 増殖因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤; ミトコンドリア機能不全誘導因子およびカスパーゼ活性化因子;およびクロマチン崩壊剤。
【００９６】
組み合わせ療法の性質によって、本ポリペプチド治療剤の投与を、他の治療剤を投与している間および／またはその後に続けてもよい。本ポリペプチド治療剤の投与は、単回用量で行っても複数用量で行ってもよい。本ポリペプチド治療剤の投与は、慣用療法の少なくとも数日前に開始する場合もあれば、慣用療法の直前または慣用療法の投与時に投与を始める場合もある。
【００９７】
本明細書に記載するＤＬＬ−４結合蛋白質は、イメージングまたは診断への適用のために、検出できるように標識して、ＤＬＬ−４発現細胞と接触させてよい。診断目的のために、本発明のポリペプチドは、固体の支持体上に固定されていることが好ましい。好ましい固体支持体としては、カラム（例えば親和性カラム、例えばアガロースベースの親和性カラム）、マイクロチップまたはビーズが挙げられる。
【００９８】
診断適用の一例において、生体試料、例えば不適当な血管新生に特徴づけられる症状を示す疑いのある患者由来の血清または生検組織を、検出可能なように標識した本発明のポリペプチドと接触させて、ＤＬＬ−４のレベルを検出する。次に、検出したＤＬＬ−４のレベルを、標識ポリペプチドと接触させた正常な試料で検出されたＤＬＬ−４レベルと比較する。ＤＬＬ−４のレベルの少なくとも１０%、２０%、３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、８０%または９０%の上昇は、診断の指標とみなし得る。
【００９９】
特定の態様において、ＤＬＬ−４結合ポリペプチドを、検出可能な標識にさらに結合させる(該標識は、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素コファクターであってよい)。活性部分は、例えば、放射活性剤、例えば放射活性重金属、例えば鉄キレート、ガドリニウムまたはマンガンの放射活性キレート、酸素、窒素、鉄、炭素またはガリウムのポジトロン放射体、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３２Ｉまたは９９Ｔｃであってよい。かかる部分に取り付けた結合剤は、イメージング剤として用いてもよく、哺乳類、例えばヒトにおいて診断に用いるために有効量を投与した後、該イメージング剤の局在および集積を検出する。イメージング剤の局在および集積は、ラジオシンチグラフィー、核磁気共鳴イメージング、コンピューター断層撮影、またはポジトロン放出断層撮影により検出し得る。ＤＬＬ−４を対象とする、ＤＬＬ−４結合ポリペプチドを用いた免疫シンチグラフィーは、がんおよび脈管構造の検出および／または診断に使用し得る。例えば、９９テクネチウム、１１１インジウムまたは１２５ヨウ素で標識したＤＬＬ−４マーカーに対する任意の結合ポリペプチドを、かかるイメージングに有効に用いてよい。当業者には明らかなことであるが、投与する放射性同位体の量は、該放射性同位体に依存する。当業者は、活性部分として用いる特定の放射性核種の特定の活性およびエネルギーに基づいて、投与するイメージング剤の量を容易に処方することができる。典型的にはイメージング剤１用量あたり０.１〜１００ミリキュリー、好ましくは１〜１０ミリキュリー、最も頻繁には２〜５ミリキュリーが投与される。したがって、放射活性部分に結合した標的化部分を含む、イメージング剤として有用な本発明の組成物は、０.１〜１００ミリキュリー、いくつかの態様においては、好ましくは１〜１０ミリキュリー、いくつかの態様においては好ましくは２〜５ミリキュリー、いくつかの態様においてはより好ましくは１〜５ミリキュリーを含む。
【０１００】
本ＤＬＬ−４結合ポリペプチドはまた、さらなる治療剤（薬物化合物、化学療法用化合物および放射線療法用化合物を含むが、これらに限定されない）を、ＤＬＬ−４を発現する細胞または組織に送達するのに用いてもよい。一例において、ＤＬＬ−４を発現する腫瘍細胞または組織を標的として送達するために、化学療法剤に本ＤＬＬ−４結合ポリペプチドを融合させる。
【０１０１】
本ＤＬＬ−４結合ポリペプチドは、研究、診断および治療など種々のものに適用するのに有用である。例えば、受容体またはその一部の単離および／または精製、ならびに受容体構造（例えば立体構造）および機能の研究に用い得る。
【０１０２】
特定の局面において、種々の結合ポリペプチドを、ＤＬＬ−４の発現、例えば内皮細胞（例えば静脈内皮細胞）またはＤＬＬ−４遺伝子を遺伝子導入した細胞における発現を検出または測定するのに用い得る。したがって、それらはまた、診断および研究用の目的のためのセルソーティングおよびイメージング（例えばフローサイトメトリーおよび蛍光標示式セルソーティング）への適用にも有用である。
【０１０３】
特定の態様において、本結合ポリペプチドまたはその断片は、診断用の目的のために、標識してもしなくてもよい。典型的には、診断アッセイは、結合ポリペプチドがＤＬＬ−４に結合することにより生じる複合体の形成の検出を伴う。本結合ポリペプチドまたは断片は、抗体と同様に直接標識してよい。種々の標識を用いてよく、例えば、放射性核種、蛍光体、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素阻害剤およびリガンド（例えばビオチン、ハプテン）が挙げられるが、これらに限定されない。多数の適当な免疫アッセイが当業者に知られている (例えば、米国特許第3,817,827号; 第3,850,752号; 第3,901,654号;および第4,098,876号参照)。標識されていない場合、該結合ポリペプチドは、例えば凝集アッセイのようなアッセイに用いてよい。標識していない結合ポリペプチドはまた、該結合ポリペプチドの検出に用い得る他の（１種以上の）適当な試薬、例えば該結合ポリペプチドに反応を示す標識抗体または他の適当な試薬（例えば標識プロテインＡ）と組み合わせて用いてもよい。
【０１０４】
態様の一において、本発明の結合ポリペプチドは、酵素免疫アッセイに使用してよく、ここで、対象となるポリペプチドは、酵素に結合している。ＤＬＬ−４蛋白質を含む生物試料を対象の結合ポリペプチドと組み合わせた場合、該結合ポリペプチドとＤＬＬ−４蛋白質との間に結合が見られる。態様の一において、ＤＬＬ−４蛋白質を発現する細胞（例えば内皮細胞）を含む試料を対象の抗体と組み合わせた場合、該結合ポリペプチドと、該結合ポリペプチドにより認識されるＤＬＬ−４蛋白質を有する細胞の間で結合が見られる。例えば、酵素による作用によって、発色または他の検出可能な変化をもたらす酵素の基質に該試料を接触させることにより、これらの結合した細胞を結合していない試薬から分離し、細胞に特異的に結合した結合ポリペプチド−酵素の結合体の存在を決定することができる。他の態様において、対象となる結合ポリペプチドは標識されていなくてもよく、該対象結合ポリペプチドを認識する二次的な標識ポリペプチド（例えば抗体）を添加してもよい。
【０１０５】
特定の局面において、生体試料中でＤＬＬ−４蛋白質の存在を検出するのに用いるためのキットもまた調製し得る。かかるキットは、ＤＬＬ−４蛋白質または該受容体の一部に結合するＤＬＬ−４結合ポリペプチドならびに該結合ポリペプチドと、該受容体蛋白質もしくはその一部の間の複合体の存在を検出するのに適当な、補助的な試薬を１種以上含む。本発明のポリペプチド組成物は、単独または他のエピトープに特異的なさらなる抗体と組み合わせて、凍結乾燥形態で提供されてよい。本結合ポリペプチドおよび／または抗体は、標識されていてもされていなくてもよく、補助的な成分（例えば緩衝剤、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液および炭酸緩衝液、安定剤、賦形剤、殺生物剤および／または不活性蛋白質、例えばウシ血清アルブミン）とともにキットに含まれていてよい。例えば、本結合ポリペプチドおよび／または抗体は、補助成分とともに凍結乾燥混合物として提供されても、または、該補助成分が、使用者が組み合わせるように別々に提供されてもよい。一般的に、これらの補助物質は、有効結合ポリペプチドまたは抗体の量に基づいて約５%未満で存在しており、通常、ポリペプチドまたは抗体の濃度に基づいて少なくとも約０.００１%の総量で存在している。本結合ポリペプチドに結合できる二次抗体を用いる場合、該抗体を、例えば、別々のバイアルまたは容器中でキット中に提供してもよい。該二次抗体は、存在する場合は、典型的に標識されており、上述の抗体製剤と同様の方法で製剤し得る。
【０１０６】
同様に、本発明はまた、ＤＬＬ−４の発現を検出および／または定量する方法であって、細胞またはその画分（例えば膜画分）を含む組成物を、結合に適当な条件下で、ＤＬＬ−４または該受容体の一部に結合する結合ポリペプチドと接触させ、その結合をモニターする、方法を提供する。結合ポリペプチドとＤＬＬ−４もしくはその一部の間での複合体の形成を示唆する、結合ポリペプチドが検出されると、該受容体が存在することが示される。ポリペプチドの細胞への結合は、標準的な方法、例えば本明細書の実施例に記載する方法により決定し得る。該方法は、個体由来の細胞におけるＤＬＬ−４の発現の検出に使用し得る。場合によっては、内皮細胞の表面上のＤＬＬ−４の定量的な発現を、例えば、フローサイトメトリーによって評価してよく、該染色強度は、疾患の易罹患性、進行または危険性と関連付けられてよい。
【０１０７】
本発明はまた、哺乳類の特定の疾患に対する易罹患性の検出方法を提供する。例えば、該方法は、哺乳類における細胞上のＤＬＬ−４の量および／またはＤＬＬ−４陽性細胞の数に基づいて、進行する疾患に対する哺乳類の易罹患性を検出するのに用いてよい。態様の一において、本発明は、哺乳類の腫瘍に対する易罹患性を検出する方法に関する。この態様において、試験する試料を、結合に適当な条件下にてＤＬＬ−４またはその一部に結合する結合ポリペプチドと接触させ、ここで、該試料は、正常な個体でＤＬＬ−４を発現する細胞を含む。結合および／または結合量を検出し、これは、該個体の腫瘍に対する易罹患性を示し、ここで、受容体のレベルが高い程、該個体の腫瘍に対する罹患性が高くなることを示す。
【０１０８】
ポリペプチド配列は、標準の一文字または三文字の略号を用いて表記する。特にことわらない限り、各ポリペプチド配列は、左側がＮ末端、右側がＣ末端であり；各一本鎖ヌクレオチド配列および各二本鎖核酸配列の上側の鎖は、左側が５’末端、右側が３’末端である。参照配列とどのように相違するかを説明することによって、特定のポリペプチド配列を表記することも可能である。
【０１０９】
特にことわらない限り、以下の語は、以下の意味を持つものと理解される：
【０１１０】
「ＤＬＬ−４阻害剤」および「ＤＬＬ−４拮抗剤」という語は、互換可能に用いられる。それぞれは、ＤＬＬ−４の機能の少なくとも１つを検出可能に阻害する分子である。反対に、「ＤＬＬ−４作動薬」は、ＤＬＬ−４の機能の少なくとも１つを検出可能に上昇させる分子である。ＤＬＬ−４阻害剤により引き起こされる阻害は、アッセイを用いて検出可能であれば、完全なものでなくてもよい。ＤＬＬ−４の機能については任意のアッセイを用いてよく、その例は本明細書に記載する。ＤＬＬ−４阻害剤により阻害され得る、またはＤＬＬ−４作動薬により上昇し得るＤＬＬ−４の機能の例としては、がん細胞増殖またはアポトーシス（プログラム細胞死）などが挙げられる。ＤＬＬ−４阻害剤およびＤＬＬ−４作動薬の種類の例としては、抗原結合蛋白質（例えばＤＬＬ−４阻害性抗原結合蛋白質）、抗体、抗体断片および抗体誘導体などのＤＬＬ−４結合ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
「ペプチド」、「ポリペプチド」および「蛋白質」という語はそれぞれ、ペプチド結合により互いに結合した２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。これらの語は、例えば、天然および人工の蛋白質、蛋白質断片および蛋白質配列のポリペプチド類似体（例えばムテイン、変異体および融合蛋白質）ならびに翻訳後、もしくはそれ以外の方法で、共有結合または非共有結合により修飾された蛋白質を含む。ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質は、単量体もしくは多量体であってよい。
【０１１２】
ポリペプチド（例えば抗体）の「変異体」は、他のポリペプチド配列と比較して、アミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸が挿入されているか、欠失しているかおよび／または置換されているアミノ酸配列を含む。本明細書に記載する変異体としては、例えば、融合蛋白質が挙げられる。
【０１１３】
ポリペプチドの「誘導体」は、例えば他の化学的な部分（例えばポリエチレングリコールまたはアルブミン、例えばヒト血清アルブミン）への結合、リン酸化およびグリコシル化により化学的に修飾されたポリペプチド（例えば抗体）である。特にことわらない限り、「抗体」という語は、２本の全長のＨ鎖および２本の全長のＬ鎖を含む抗体に加え、その誘導体、変異体、断片およびムテインを含み、その例は以下に記載する。
【０１１４】
「抗原結合蛋白質」は、抗原結合部位および、場合によっては、抗原結合蛋白質の抗原への結合を促進する構造を抗原結合部位が取ることを可能にする足場もしくはフレームワーク部位を含む、蛋白質である。抗原結合蛋白質の例としては、抗体、抗体断片 (例えば抗体の抗原結合部位)、抗体の誘導体および抗体の類似体が挙げられる。抗原結合蛋白質は、例えば、代替の蛋白質足場または、移植CDRもしくはCDR誘導体を含む人工足場を含んでいてもよい。かかる足場としては、例えば、該抗原結合蛋白質の３次元構造を安定させるために導入した変異を含む、抗体由来の足場ならびに、例えば生体適合性のポリマーを含む全体的に合成の足場が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129; Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654を参照のこと。さらに、ペプチド抗体模倣物 (「PAM」)ならびにフィブロネクチン成分を用いた抗体模倣物に基づく足場を、足場として用いてもよい。
【０１１５】
抗原結合蛋白質は、例えば、天然起源の免疫グロブリン構造を有していてよい。「免疫グロブリン」は、４量体分子である。天然起源の免疫グロブリンにおいて、各４量体は、それぞれ１本の「Ｌ鎖」（約２５kDa）と「Ｈ」鎖（約５０〜７０kDa）を有する、同一の２対のポリペプチド鎖からなる。各鎖のＮ末端部位は、主に抗原認識の原因となる約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のＣ末端部位は、主にエフェクターの機能の原因となる定常領域を規定する。ヒトのＬ鎖は、κまたはγＬ鎖に分類される。Ｈ鎖は、μ、δ、γ、αまたはεに分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと規定する。好ましくは、本明細書中に記載の抗ＤＬＬ−４抗体は、Ｈ鎖のVHおよびＬ鎖のVLアミノ酸配列の可変領域配列により特徴づけられる。好ましい抗体は、κIgＧ抗体であるＡ６である。Ｌ鎖およびＨ鎖において、可変領域と定常領域は、約１２もしくはそれ以上のアミノ酸からなる「Ｊ領域」により連結しており、Ｈ鎖はまた、約１０もしくはそれ以上のアミノ酸の「Ｄ領域」も含む。一般的なことについては、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))を参照のこと。インタクトな免疫グロブリンが２つの結合部位を持つように、各Ｌ鎖／Ｈ鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。
【０１１６】
「多重特異性抗体」は、１つ以上の抗原の２つ以上のエピトープを認識する抗体である。この種類の抗体のサブクラスは、同じもしくは異なる抗原の２つの異なるエピトープを認識する、「二重特異性抗体」である。
【０１１７】
抗原結合蛋白質は、抗原（例えばヒトＤＬＬ−４）に１nM以下の解離定数で結合する場合、「特異的に結合」しているとみなされる。
【０１１８】
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」または「抗原結合部位」は、抗原と相互作用し、抗原結合蛋白質の抗原に対する特異性および親和性に寄与するアミノ酸残基（または他の部分）を含む、抗原結合蛋白質の一部である。抗原に特異的に結合する抗体については、ここに、少なくとも１つのＣＤＲドメインが少なくとも部分的に含まれる。
【０１１９】
「エピトープ」は、抗原結合蛋白質（例えば抗体）が結合する、分子の部位である。エピトープは、該分子の非近接部位(例えば、ポリペプチドにおいて、その一次配列では近接していないが、三次構造および四次構造では、抗原結合蛋白質が結合できる程度に互いに近接しているアミノ酸残基)を含んでいてもよい。
【０１２０】
２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の「パーセント相同性」は、該配列をＧＡＰコンピュータープログラム(GCG Wisconsin Package, version １０.３ の一部(Accelrys, San Diego, Calif.))をそのデフォルトのパラメーターで用いて比較することにより決定する。
【０１２１】
「ホスト細胞」は、核酸を発現させるのに用い得る細胞である。ホスト細胞は、大腸菌のような原核生物であっても、または真核生物、例えば単細胞真核生物（例えば酵母または他の真菌）、植物細胞（例えばタバコまたはトマト植物細胞）、動物細胞（例えばヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞または昆虫細胞）またはハイブリドーマであってもよい。ホスト細胞の例としては、サルの腎臓細胞であるCOS-7細胞株 (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., 1981, Cell 23:175)、L細胞、C127細胞、3T3細胞 (ATCC CCL 163)、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞またはその誘導体、例えばVeggie CHOおよび血清不含培地で増殖する、関連細胞株(Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31)またはDHFRが欠損しているCHO系統のDX-B11 (Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20)、HeLa細胞、BHK (ATCC CRL 10)細胞株、アフリカミドリザルの腎臓細胞株CV1由来のCV1/EBNA細胞株 (ATCC CCL 70) (McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821)、ヒト胎児由来腎臓細胞、例えば293、293 EBNAもしくはMSR 293、ヒト表皮Ａ431細胞、ヒトColo205細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常二倍体細胞、初代培養組織の試験管内培養由来の細胞株、初代人工培養組織、HL-60、U937、HaKまたはJurkat細胞が挙げられる。典型的に、ホスト細胞は、ポリペプチドをコードする核酸で形質転換または遺伝子導入し、次にそれを該ホスト細胞中で発現させることのできる培養細胞である。「組み換えホスト細胞」という語は、発現させる核酸で形質転換したか、または遺伝子導入したホスト細胞を表すのに用い得る。ホスト細胞はまた、核酸を含むが、調節配列を該核酸と作動可能に連結するように該ホスト細胞に導入しなければ、所望のレベルでは該核酸を発現しない細胞であってもよい。ホスト細胞という語は、特定の対象細胞だけでなく、該細胞の子孫もしくは潜在的な子孫も指すということは理解されている。世代が引き継がれる際に、例えば変異または環境の影響によって特定の変化が起こり得るため、かかる子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性もあるが、本明細書で用いる該用語の範囲内に含まれる。
【０１２２】
抗原結合蛋白質
抗原結合蛋白質 (例えば、抗体、抗体断片、抗体誘導体、抗体ムテインおよび抗体変異体) は、ＤＬＬ−４ (好ましくはヒトＤＬＬ−４)に結合するポリペプチドである。抗原結合蛋白質には、ＤＬＬ−４の生物活性を阻害する抗原結合蛋白質が含まれる。
【０１２３】
１つ以上の抗原結合蛋白質を含む多量体を、ＤＬＬ−４拮抗剤として用いてもよい。多量体は、共有結合もしくは非共有結合により連結した二量体、三量体もしくはそれ以上の多量体の形態であってよい。２つ以上の抗原結合蛋白質を含む多量体は、例えばホモ二量体として用いることが考えられる。他の多量体としては、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などが挙げられる。
【０１２４】
態様の一は、抗原結合蛋白質に融合したペプチド部分間の、共有結合もしくは非共有結合による相互作用を介して結合した複数の抗原結合蛋白質を含む多量体に関する。かかるペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）または、多量体化を促進する性質を持つペプチドであってよい。以下に詳述するように、結合する抗原結合蛋白質の多量体化を促進し得るペプチドとしては、ロイシンジッパーおよび抗体由来の特定のポリペプチドが挙げられる。
【０１２５】
特定の態様において、多量体は、２〜４個の抗原結合蛋白質を含む。該多量体の抗原結合蛋白質は、例えば、上述の変異体または断片のような、任意の形態であってよい。該多量体は、ＤＬＬ−４結合活性を有する抗原結合蛋白質を含むのが好ましい。
【０１２６】
態様の一において、多量体は、免疫グロブリン由来のポリペプチドを用いて作製する。抗体由来のポリペプチドの様々な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合した、特定の異種性ポリペプチドを含む融合蛋白質の作製は、例えば、Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; and Hollenbaugh et al., 1992 “Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11に記載されている。
【０１２７】
態様の一は、ＤＬＬ−４抗体のＤＬＬ−４結合断片を抗体のＦｃ領域に融合させることにより作製した２つの融合蛋白質を含む二量体に関する。該二量体は、例えば、融合蛋白質をコードする遺伝子融合物を適当な発現ベクターに挿入し、該組み換えベクターで形質転換したホスト細胞において該遺伝子融合物を発現させ、発現した融合蛋白質を抗体分子のように集合させて、Ｆｃ部の間に鎖間のジスルフィド結合を形成することを可能にすることによって、二量体を得ることにより作製し得る。
【０１２８】
「Ｆｃポリペプチド」という語は、抗体のＦｃ領域由来のポリペプチドの天然およびムテイン形態を含む。二量体化を促進するヒンジ領域を含む該ポリペプチドの切断型もまた含まれる。Ｆｃ部 (およびそこから形成される多量体) を含む融合蛋白質は、プロテインＡまたはプロテインＧカラムでの親和性クロマトグラフィーによる精製が容易であるという利点をもたらす。
【０１２９】
多量体の抗原結合蛋白質の他の製造方法としては、ロイシンジッパーの使用が挙げられる。ロイシンジッパードメインは、それらが存在する蛋白質の多量体化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元々、いくつかのＤＮＡ結合蛋白質で同定され (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759)、それ以来種々の異なる蛋白質で発見されている。公知のロイシンジッパーには、天然起源のペプチドと、二量体化もしくは三量体化するその誘導体がある。可溶性の多量体蛋白質の作製に適したロイシンジッパードメインの例は、国際公開第94/10308号に記載されており、肺サーファクト蛋白質Ｄ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーが、Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191に記載されている。そこに融合した異種性の蛋白質の安定的な三量体化を可能にする修飾ロイシンジッパーの使用が、Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78に記載されている。一つの方法において、ロイシンジッパーペプチドに融合した、抗ＤＬＬ−４抗体断片またはその誘導体を含む組み換え融合蛋白質を適当なホスト細胞で発現させ、形成した可溶性の多量体抗ＤＬＬ−４抗体断片または誘導体を、培養上清より回収する。
【０１３０】
本発明は、以下の特徴を１つ以上有するＤＬＬ−４結合性抗原結合蛋白質（例えば抗ＤＬＬ−４抗体）を提供する：ヒトおよびマウスのＤＬＬ−４両方に結合する、ヒトＤＬＬ−４の活性化を阻害する、マウスＤＬＬ−４の活性化を阻害する、ＤＬＬ−４の蛋白質溶解性の切断部位もしくはその付近に結合する、細胞表面に発現するＤＬＬ−４の比較的少ない発現低下を引き起こす。
【０１３１】
本発明の抗原結合蛋白質の抗原結合断片は、慣用的な技術により作製してよい。かかる断片の例としては、ＦａｂおよびＦ(ａｂ’)２断片が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１３２】
本発明は、ＤＬＬ−４に結合するモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体は、当該分野で知られている任意の技術、例えば免疫化スケジュールの完了後に遺伝子導入動物から回収した脾臓細胞を不死化することにより作製してよい。該脾臓細胞は、当該分野で公知の任意の技術、例えばそれらを骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製することにより不死化し得る。ハイブリドーマ作製融合手法で用いる骨髄腫細胞は、抗体を産生せず、融合効率が高く、所望する融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択的な培地中での増殖を不可能にする酵素欠損を有することが好ましい。マウスの融合において使用する適当な細胞株の例としては、Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7およびS194/5XX0 Bulが挙げられ; ラット融合に用いる細胞株の例としては、R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983Fおよび48210が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞株としては、U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2およびUC729-6が挙げられる。
【０１３３】
ＤＬＬ−４に対する抗原結合蛋白質を、例えば、試験管内または生体内において、ＤＬＬ−４ポリペプチドの存在を検出するためのアッセイに使用してよい。該抗原結合蛋白質はまた、免疫親和性クロマトグラフィーによるＤＬＬ−４蛋白質の精製に用いてもよい。遮断性抗原結合蛋白質は、本明細書に記載の方法に使用してよい。ＤＬＬ−４拮抗剤として機能する該抗原結合蛋白質は、任意のＤＬＬ−４誘発性の症状、例えば非限定的な例としては種々のがんの処置に使用し得る。
【０１３４】
抗原結合蛋白質は、試験管内手法に使用しても、生体内でＤＬＬ−４誘発性の生物活性を阻害するために投与してもよい。したがって、本明細書中に例を挙げるような、ＤＬＬ−４の蛋白質分解性の活性化により（直接的または間接的に）引き起こされるもしくは悪化する障害を処置してもよい。態様の一において、本発明は、ＤＬＬ−４誘発性の生物活性を低下させるために、ＤＬＬ−４遮断性抗原結合蛋白質を、それを必要としている哺乳類に有効量で生体内投与することを含む、治療方法を提供する。
【０１３５】
抗原結合蛋白質は、ＤＬＬ−４の生物活性を阻害する完全ヒトモノクローナル抗体を含む。
【０１３６】
抗原結合蛋白質は、多数の慣用技術のうちの任意の技術により作製してよい。例えば、天然で発現する細胞から単離してもよく（例えば、抗体を、それを産生するハイブリドーマから精製してよい）または、当該分野で公知の任意の技術を用いて組み換え発現系で作製してよい。例えば、以下を参照のこと：Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980); およびAntibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)。
【０１３７】
当該分野で公知の任意の発現系を、本発明の組み換えポリペプチドの作製に用いてよい。一般的に、ホスト細胞を、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組み換え発現ベクターを用いて形質転換する。使用し得るホスト細胞としては、原核生物、酵母または高等真核生物細胞が挙げられる。原核生物には、グラム陰性または陽性生物、例えば大腸菌または桿菌(bacilli)が含まれる。高等真核生物細胞には、昆虫細胞および哺乳類起源の確立された細胞株が含まれる。適当な哺乳類ホスト細胞株の例としては、サル腎臓細胞のCOS-7株(ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., 1981, Cell 23:175)、L細胞、293細胞、C127細胞、3T3細胞 (ATCC CCL 163)、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO)細胞、HeLa細胞、BHK (ATCC CRL 10) 細胞株および、McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821に記載されている、アフリカミドリザル腎臓細胞株CV1 (ATCC CCL 70)由来のCV1/EBNA細胞株が挙げられる。細菌、真菌、酵母および哺乳類ホスト細胞に用いるのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、Pouwels et alに記載されている(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985)。
【０１３８】
形質転換細胞は、ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養してよく、該ポリペプチドは、慣用的な蛋白質精製手法により回収する。かかる精製手法の１つは、親和性クロマトグラフィー、例えばそこに結合しているＤＬＬ−４の全てまたは一部（例えば細胞外ドメイン）を有するマトリクスに対する親和性クロマトグラフィーの使用を含む。本明細書で使用することを考慮しているポリペプチドとしては、内在性の物質の混入を実質的に含まない、実質的に同種の組み換え哺乳類抗ＤＬＬ−４抗体が挙げられる。
【０１３９】
多数の公知の技術のうちの任意のものを用いて、抗原結合蛋白質を作製し、所望の性質についてスクリーニングしてよい。特定の技術は、目的とする抗原結合蛋白質（例えば抗ＤＬＬ−４抗体）のポリペプチド鎖（またはその一部）をコードする核酸を単離すること、および該核酸を組み換えＤＮＡ技術によって操作することを含む。該核酸はまた、目的とする他の核酸に融合させても、または（例えば変異導入または他の慣用的な技術によって）例えば１以上のアミノ酸残基を付加、欠失または置換させて変異させてもよい。
【０１４０】
一本鎖抗体は、Ｈ鎖とＬ鎖の可変領域（Ｆｖ領域）断片を、アミノ酸架橋（短ペプチドリンカー）を介して連結し、一本鎖のポリペプチド鎖を得ることにより形成し得る。該一本鎖Fv (scFv) は、２つの可変領域ポリペプチド(VLおよびVH)をコードするＤＮＡ間のペプチドリンカーをコードするＤＮＡを融合することにより作製する。得られたポリペプチドは、折りたたまれて、２つの可変領域間の可動性リンカーの長さによって、抗原結合単量体を形成するか、またはマルチマー（例えば二量体、三量体または四量体）を形成し得る(Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108)。異なるVLおよびVHを含むポリペプチドを組み合わせることによって、異なるエピトープに結合するマルチマーのscFvを形成し得る(Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40)。一本鎖抗体の作製用に開発された技術には、米国特許第4,946,778号; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:379-87に記載されているものが含まれる。
【０１４１】
所望の抗体から、異なるサブクラスまたはアイソタイプの抗体を得る、すなわちサブクラススイッチの技術は公知である。したがって、例えば、ＩｇＭ抗体からＩｇＧ抗体を得ることは可能であり、逆もまた可能である。かかる技術により、特定の抗体（親抗体）の抗原結合性を有するが、親抗体とは異なる抗体のアイソタイプもしくはサブクラスに関連する生物学的性質を有する、新規の抗体を作製することが可能である。組み換えＤＮＡ技術を用いてよい。特定の抗体ポリペプチドをコードするクローニングしたＤＮＡ、例えば所望のアイソタイプの抗体の定常領域をコードするＤＮＡを、かかる手法に用いてよい(Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-16)。さらに、ＩｇＧ４抗体を作製しようとする場合、ＩｇＧ４抗体において不均一性をもたらし得るＨ鎖間ジスルフィド結合が形成される傾向を低下させるために、ヒンジ領域に点変異(CPSCP→CPPCP)を導入することが望ましい場合もある (Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407)。
【０１４２】
特定の態様において、本発明の抗原結合蛋白質は、ＤＬＬ−４に対して少なくとも１０６の結合親和性(Ka)を示す。他の態様において、該抗原結合蛋白質は、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９または少なくとも１０１０MのKaを示す。他の態様において、該抗原結合蛋白質は、本明細書の実施例に記載する抗体と実質的に同じKaを示す。
【０１４３】
他の態様において、本発明は、ＤＬＬ−４からの解離速度の低い抗原結合蛋白質を提供する。態様の一において、該抗原結合蛋白質は１X１０-４〜１X１０-１Mまたはそれより低いKoffを示す。他の態様において、Koffは５X１０-５〜５X１０-１Mであるかまたはそれより低い。他の態様において、Koffは、本発明の明細書に記載する抗体と実質的に同じである。他の態様において、該抗原結合蛋白質は、本明細書に記載する抗体と実質的に同じKoffでＤＬＬ−４と結合する。
【０１４４】
他の局面において、本発明は、ＤＬＬ−４の活性を阻害する、抗原結合蛋白質を提供する。態様の一において、該抗原結合蛋白質は、１０００nM以下のIC５０を有する。他の態様において、該IC５０は１００ nM以下であり; 他の態様において、IC５０は１０nM以下である。他の態様において、該IC５０は本明細書の実施例に記載する抗体のIC５０と実質的に同じである。他の態様において、該抗原結合蛋白質は、本明細書に記載する抗体と実質的に同じIC５０でＤＬＬ−４の活性を阻害する。
【０１４５】
他の局面において、本発明は、細胞の表面に発現しているヒトＤＬＬ−４に結合し、そのように結合した場合に、細胞表面のＤＬＬ−４量を有意に減少させることなく細胞内のＤＬＬ−４シグナル伝達活性を阻害する抗原結合蛋白質を提供する。細胞の表面および／または内部のＤＬＬ−４量を決定または評価するための任意の方法を用いてもよい。他の態様において、該抗原結合蛋白質のＤＬＬ−４発現細胞への結合は、細胞表面のＤＬＬ−４の内在化を約７５%、５０%、４０%、３０%、２０%、１５%、１０%、５%、１%または０.１%より低く減少させる。
【０１４６】
他の局面において、本発明は、試験管内または生体内（例えばヒト対象に投与した場合）において、少なくとも１日の半減期を有する、抗原結合蛋白質を提供する。態様の一において、該抗原結合蛋白質は少なくとも３日の半減期を有する。他の態様において、該抗原結合蛋白質は、４日以上の半減期を有する。また別の態様において、該抗原結合蛋白質は、８日以上の半減期を有する。また別の態様において、該抗原結合蛋白質は、誘導体化していないまたは修飾していない抗原結合蛋白質と比較して半減期が長くなるように誘導体化または修飾される。また別の態様において、該抗原結合蛋白質は、例えば、国際公開第00/09560号に記載されているように、血清半減期を長くするための１以上の点変異を含み、該文献は引用により本明細書中に包含される。
【０１４７】
本発明はさらに、多特異性抗原結合蛋白質、例えば二重特異性抗原結合蛋白質、例えば、２つの異なる抗原結合部位または領域を介して、ＤＬＬ−４の異なる２つのエピトープに結合する、またはＤＬＬ−４のエピトープと他の分子のエピトープとに結合する抗体を提供する。さらに、本明細書に記載の二重特異性抗原結合蛋白質は、本明細書に記載する抗体の１つ由来のＤＬＬ−４結合部位と、他文献の引用により本明細書に包含される抗体を含む、本明細書に記載する他の抗体由来の第二のＤＬＬ−４結合領域とを含んでいてもよい。あるいは、二重特異性抗原結合蛋白質は、本明細書に記載する抗体の１つ由来の抗原結合部位と、当該分野で公知の他のＤＬＬ−４抗体、または公知の方法もしくは本明細書に記載の方法により作製した抗体由来の第二の抗原結合部位を含んでいてよい。
【０１４８】
二重特異性抗体の作製方法は当該分野で多数知られている。かかる方法には、Milstein et al., 1983, Nature 305:537に記載のハイブリッド−ハイブリドーマの使用および抗体断片の化学カップリング(Brennan et al., 1985, Science 229:81; Glennie et al., 1987, J. Immunol. 139:2367; 米国特許第6,010,902号)が含まれる。さらに、二重特異性抗体は、組み換え方法、例えばロイシンジッパー部分(すなわち、優先的にヘテロダイマーを形成するFosおよびJun蛋白質由来のロイシンジッパー部分; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547) または米国特許第5,582,996号に記載されるような他の重要な相互作用性のドメイン構造を介して作製してもよい。さらなる有用な技術としては、米国特許第5,959,083号および第5,807,706号に記載されるものも含まれる。
【０１４９】
他の局面において、該抗原結合蛋白質は、抗体の誘導体を含む。かかる誘導体の抗体は、所望の性質、例えば特定の用途における半減期の延長などを該抗体にもたらす任意の分子または物質を含んでいてよい。かかる誘導体抗体は、例えば、検出可能な（または標識）部分（例えば放射活性、発色性、抗原性または酵素分子）、検出可能なビーズ(例えば磁気ビーズ)、高電子密度ビーズ(electrodense)（例えば金ビーズ）または他の分子に結合する分子（例えばビオチンまたはストレプトアビジン）、治療用または診断用部分（例えば放射活性、細胞毒性または薬学的に活性な部分）または該抗体の特定の使用（例えば対象、例えばヒト対象への投与または他の生体内もしくは試験管内の使用）に対する適性を高める分子を含んでいてもよい。抗体を誘導体化させるのに使用し得る分子の例としては、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。抗体のアルブミン連結およびＰＥＧ化誘導体は、当該分野でよく知られている技術を用いて作製し得る。態様の一において、該抗体は、トランスチレチン（ＴＴＲ）またはＴＴＲ変異体に共役しているかまたは別の方法で連結していてよい。該ＴＴＲまたはＴＴＲ変異体は、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルプロリドン）、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群から選択される化学物質により化学的に修飾されていてもよい。
【０１５０】
抗体およびその断片を含む、本発明の医薬組成物は、適応症に対して適当な方法で、対象に投与する。医薬組成物は任意の適当な技術によって投与してよく、例えば、非経口、局所または吸入による投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。注射する場合、該医薬組成物は、例えば、関節内、静脈内、筋肉内、病巣内、腹腔内または皮下経路を介して、ボーラス注射または持続点滴により投与してよい。局所投与、例えば疾患または損傷が考えられる部位への局所投与は、経皮投与およびインプラントからの徐放である。吸入による送達としては、例えば、経鼻もしくは経口吸入、ネブライザーの使用、エアロゾル形態での該拮抗剤の吸入等が挙げられる。他の代替例としては、点眼剤：丸剤、シロップ剤、トローチ剤またはチューインガムを含む経口製剤：およびローション剤、ゲル剤、スプレー剤および軟膏剤のような局所用製剤が挙げられる。
【０１５１】
生体外手法での抗原結合蛋白質の使用もまた考えられている。例えば、患者の血液もしくは他の体液を、生体外でＤＬＬ−４に結合する抗原結合蛋白質と接触させてもよい。該抗原結合蛋白質は、適当な不溶マトリクスまたは固体の支持物質に結合させてよい。
【０１５２】
抗原結合蛋白質は、１つ以上の付加的な成分、例えば生理学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む組成物の形態で有利に投与される。該組成物は、１種以上の生理学的に有効な剤、例えば、第二の炎症もしくは免疫阻害物質、抗血管新生物質、鎮痛物質等を含んでいてよく、その非限定的な例を本明細書中に記載する。種々の特定の態様において、本組成物は、ＤＬＬ−４結合性の抗原結合蛋白質に加えて、１種、２種、３種、４種、５種または６種の生理学的に有効な剤を含む。
【０１５３】
実施例１
この実施例により、本明細書に記載する抗体のいくつかについての初期スクリーニングの一部としての、細胞結合の試験管内データを示す。ＤＬＬ−４を安定的に発現するCHO−K１細胞 (ＣＨＯ-ＤＬＬ−４細胞)を、酵素不含解離バッファー中に入れ、Ｖ底９６ウェルプレートに移した(細胞１００,０００個/ウェル)。細胞を、FACSバッファー (PBS+ ２% FBS) + NaN３中の抗ＤＬＬ−４抗体を添加して、氷上で４５分間インキュベーションした。FACSバッファーで２回洗浄した後、１:１０００希釈したフィコエリトリン結合型抗ヒトIgG (γ鎖特異的) を添加し、３０分間インキュベーションした。 最後の洗浄の後、Intellicyt High Throughput Flow Cytometer (HTFC)で蛍光強度を測定した。データは、非線形回帰を用いてGraphpad Prism ソフトウェアにて解析した。データポイントは、陽性に標識した細胞の蛍光強度中央値(MFI: median fluorescence intensity) ±標準誤差として表す。EC５０値は、ＤＬＬ−４抗体のＤＬＬ−４発現細胞への最大の結合の５０%を達成する抗体濃度として表す。
【０１５４】
結果: この実施例により、本明細書に記載する抗ＤＬＬ−４モノクローナル抗体は、細胞の表面に発現するＤＬＬ−４に効率的に結合できたことが示される。本明細書に記載する抗体のいくつかは、現在臨床試験が行われている抗ＤＬＬ−４抗体であるOMP21M18 (Oncomed)と比較して、より強力な結合特性を示した。EC５０値は、本明細書に記載の抗ＤＬＬ−４抗体であるＣ３、Ｃ１０およびＧ６について算出し、OMP21M18が１.７ nMであったのに対し、０.１〜０.３nMの範囲にあった(図２)。
【０１５５】
実施例２
この実施例は、本明細書に記載する抗ＤＬＬ−４抗体であるＣ３、Ｃ６およびＧ６についての抗原結合親和性決定を示す。親和性の決定には、BIACORE（登録商標）表面プラズモン共鳴技術を用いた。標準的なNHS/EDCカップリング方法を用いて、組み換えhDLL４をCM５センサーチップ上に固定した。測定は全て、HBS-EPバッファー中で、流速３０μL/分にて行った。一連の濃度を得るように抗体を希釈した。データには、１:１ (ラングミュア) 結合モデルを当てはめた。
【０１５６】
抗ＤＬＬ−４抗体のエピトープマッピングは、Octetによって行った。抗ＤＬＬ−４抗体であるＣ３、Ｇ６およびOMP21M18を、アミンカップリングキットを用いてAR２Gセンサーに固定し、rhDLL４を充填した後、異なる抗体について試行を行った。さらなる結合により、該抗体が異なるエピトープに結合することが示される。
【０１５７】
結果: この実施例により、Octetで登録した付加的な結合が示され、これにより、抗体Ｃ３、Ｃ５およびＧ６は、OMP21M18によって占められていないＤＬＬ−４のエピトープに結合することが示される。
【０１５８】
実施例３
この実施例により、ＤＬＬ−４のＮｏｔｃｈ-１への結合の、本明細書に記載の抗ＤＬＬ−４抗体による遮断を示す。ヒトＤＬＬ−４は、内皮細胞に排他的に発現するＩ型膜結合型蛋白質である。ＤＬＬ−４は、膜に結合したＮｏｔｃｈ-１受容体のリガンドである。ＤＬＬ−４は、Ｎｏｔｃｈ-１に結合して、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を活性化させ、該伝達経路は、血管新生および腫瘍血管成長に主要な役割を果たす。この相互作用の遮断により、細胞におけるＮｏｔｃｈ-１機能が阻害される。該遮断は、最初、ELISAをベースとする免疫アッセイにおいて評価した (図４A)。端的にいえば、ラット組み換えＮｏｔｃｈ (５μg/ml) を４℃にて一晩マイクロタイタープレートのウェルにコーティングした後、該プレートをカゼイン-PBSバッファーを用いてブロッキングした。Hisタグ-rhＤＬＬ−４ (４μg/ml) を、予め抗ＤＬＬ−４抗体とともに３０分間インキュベーションした後、Ｎｏｔｃｈコーティングしたプレートに移し、振盪しながら０.５時間インキュベーションした。HRP結合型抗hisタグ抗体を用いて、rhDLL−４のＮｏｔｃｈ-１への結合を検出した。
【０１５９】
並行して、抗ＤＬＬ−４抗体の、ＤＬＬ−４発現CHO-K１細胞への可溶性組み換えＮｏｔｃｈ-１蛋白質の結合の遮断能を、HTFCにより評価した。CHO-ＤＬＬ−４細胞を、酵素不含Cell Dissociation Buffer (GIBCO)中に移し、FITC-rhNotch-１ ２０μg/mlを添加した、FACSバッファー + アザイド中で、抗ＤＬＬ−４抗体の存在下もしくは非存在下にて、固定した抗体濃度で(図４B)または抗体濃度を増加させながら（図４C）、インキュベーションした。データはフローサイトメトリーにより解析した。
【０１６０】
結果: 図４Aにより、本明細書に記載する抗ＤＬＬ−４抗体のうちの３つ (Ｃ３、Ｃ１０およびＧ６) が、ＤＬＬ−４のＮｏｔｃｈ-１への結合遮断について、OMP21M18と同等に有効であったことが示される。このアッセイを細胞状況(cellular context)にて繰り返し（図４Ｂ）、Ｃ３、Ｃ１０およびＧ６が、ヒトＤＬＬ−４と、ヒトおよびラットのＮｏｔｃｈ-１両方との相互作用を効率的に阻害しうることを確認した。これらの３つの抗体(IC５０値２〜６nM)は、OMP21M18 (IC５０=１.７２ nM) よりも効率的であると考えられる (図４C)。
【０１６１】
実施例４
この実施例により、抗ＤＬＬ−４抗体のＮｏｔｃｈ-１経路の活性化に対する影響を示す。ＤＬＬ−４による結合により、Ｎｏｔｃｈ-１細胞内ドメイン (NICD) は切断され、核に移行して特異的な標的遺伝子の発現を活性化させる。ここで、乳がん細胞株において、抗ＤＬＬ−４抗体が、ＤＬＬ−４介在性のＮｏｔｃｈ-１経路の活性化を阻害し、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子の発現を調節することを示す。Ｎｏｔｃｈ-１を発現するMCF７細胞を、ヒトＤＬＬ−４を過剰発現するCHO細胞 (ＤＬＬ−４) または過剰発現しない(ＤＬＬ−４なし) CHO細胞とともに２４時間インキュベーションした。その後、細胞を回収し、全RNAを、マニュアルにしたがって、Trizol (Life Technology) で抽出した。遺伝子発現を、マニュアルにしたがってAccess RT-PCR System kit (Promega) を用いたRT-PCRにより解析した。フォワードプライマーおよびリバースプライマーは以下の通りである:
Notch-１フォワード: CACTGTGGGCGGGTCC 配列番号４１、
Notch-１リバース: GTTGTATTGGTTCGGCACCAT 配列番号４２、
HEY-１フォワード: GGAGAGGCGCCGCTGTAGTTA 配列番号４３、
HEY-１リバース: CAAGGGCGTGCGCGTCAAAGTA、配列番号４４
GAPDHフォワード: GGACCTGACCTGCCGTCTAGAA、配列番号４５
GAPDHリバース: GGTGTCGCTGTTGAAGTCAGAG 配列番号４６
PCR試料を、３%アガロースゲルに流し、バンドの強度をImage Lab Software (BIORAD)を用いて定量した。ヒトGAPDHを、基準化の参照遺伝子として用いた。
【０１６２】
結果: 図５より、ＤＬＬ−４の存在により、Ｈｅｙ-１およびＮｏｔｃｈ-１の発現が刺激され、ならびに、抗ＤＬＬ−４抗体Ｃ３が、Ｎｏｔｃｈ-１標的遺伝子調節のＤＬＬ−４による刺激を効率的に阻害したことが示される。
【０１６３】
実施例５
この実施例により、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)のＤＬＬ−４介在性の増殖阻害に対して、本明細書に記載の抗ＤＬＬ−４抗体が拮抗作用能を示すことを示す、試験管内細胞増殖アッセイを示す。血管新生は、複雑な、良く制御されたプロセスである。ＤＬＬ−４ は、ＶＥＧＦ介在性の内皮細胞増殖を阻害し、ＶＥＧＦによって、ネガティブフィードバック調節因子として誘導され、それにより、過度の血管新生を妨げる。ＤＬＬ−４の阻害により、内皮細胞が過剰増殖を示し、試験管内および生体内の両方で、細胞運命の決定および分化に欠損が引き起こされることは以前に示されていた。このように、ＤＬＬ−４の遮断が、いくつかの腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を阻害することが示されていた。このアッセイにおいて、継代回数の少ないHUVEC細胞をLONZAより入手し、EGMＴＭ-２培地 (LONZA)中で培養した。実験の一日前に、９６ウェルプレートを０.１% ゼラチン + ２μg/ml rHuＤＬＬ−４ (SinoBiologics) または０.１% ウシ血清アルブミン (BSA, SIGMA)で４℃にて一晩コーティングした。その後、細胞をStemPro Accutase (Life Technology) を用いて移し、通常の培養培地中にて、５,０００個 / ウェルでプレートに添加し、３７℃でのインキュベーションに戻して３日間培養した。結果は、標準のMTTアッセイを用いて解析した。
【０１６４】
結果: 図６により、細胞を固定したＤＬＬ−４上で培養した場合、HUVEC増殖が阻害され、本明細書に記載する抗ＤＬＬ−４抗体 (Ｃ３、Ｃ１０およびＧ６) がHUVEC増殖を回復し得ることが示される。このＤＬＬ−４機能の拮抗作用は、OMP21M18抗体(Oncomed)と同等であるか、それよりも強力であった。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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