(57)【要約】  バチルス株は、（ｉ）アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールへの感受性；（ii）大腸菌（E.coli）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に対する抗菌活性；並びに（iii）培養の２日後に測定した場合、少なくとも８０の胞子形成パーセンテージにより特徴付けられた。本発明は、さらにかかる株を選択するための方法に関する。本発明に従い同定された株の多くは、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）種のものである。いくつかのバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）は、さらにバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）亜種. アミロリクエファシエンス（amyloliquefaciens）と同定され、他のものは、 アミロリクエファシエンス（amyloliquefaciens）亜種. プランタラム（Plantarum）と同定された。本発明のバチルス株は、それがプロバイオティック効果を有する場合に、動物飼料への飼料添加剤として使用され得る。
2015517809.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールへの感受性；
（ii）大腸菌（E.coli）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に対する抗菌活性；並びに
（iii）培養の２日後に測定した場合、少なくとも８０の胞子形成パーセンテージ、
を特徴とするバチルス属の株。
【請求項２】
バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）／アトロファエウス（atrophaeus）／メチロトロフィカス（methylotrophicus）／シアメンシス（siamensis）／バリスモルティス（vallismortis）種から成る群、またはバチルス・モヤヴェンシス（Bacillus mojavensis）／枯草菌（subtilis）／テクィレンシス（tequilensis）種から成る群から選択される、請求項１に記載されたバチルス株。
【請求項３】
Ｂ．モヤヴェンシス（B.mojavensis）である、請求項１または２に記載されたバチルス株。
【請求項４】
Ｂ．アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）である、請求項１または２に記載されたバチルス株。
【請求項５】
枯草菌（B.subtilis）である、請求項１または２に記載されたバチルス株。
【請求項６】
株が、
（ａ）受入番号ＤＳＭ２５８３９の、バチルス・モヤヴェンシス（Bacillus mojavensis）株ＣＨＣＣ１５５１０; 
（ｂ）バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）株の、受入番号ＤＳＭ２５８４０のＣＨＣＣ１５５１６、受入番号ＤＳＭ２７０３２のＣＨＣＣ１５５３６、及び受入番号ＤＳＭ２７０３３のＣＨＣＣ１５５３９；及び
（ｃ）受入番号ＤＳＭ２５８４１の、枯草菌（B.subtilis）株ＣＨＣＣ１５５４１；
並びに（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の突然変異株から成る群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載されたバチルス株。
【請求項７】
（ｉ）アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールへの感受性；
（ii）大腸菌（E.coli）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に対する抗菌活性；並びに
（iii）培養の２日後に測定した場合、少なくとも８０の胞子形成パーセンテージ、
を有するバチルス株を選択するための方法であって、
以下の：
（ｉ）バチルス株のプールから、アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールに感受性であるバチルス株を選択及び単離するステップ、
（ii）バチルス株のプールから、大腸菌（E.coli）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に対する抗菌活性を有するバチルス株を選択及び単離するステップ、
（iii）バチルス株のプールから、培養の２日後に測定した場合、少なくとも８０の胞子形成パーセンテージを有するバチルス株を選択及び単離するステップ、
（iv）ｐＨ４での増殖性細胞の感受性について、バチルス株のプールを検定するステップ、及び
（ｖ）胆汁耐性について、バチルス株のプールを検定するステップ、
を含んで成る方法。
【請求項８】
（ａ）受入番号ＤＳＭ２５８３９の、バチルス・モヤヴェンシス（Bacillus mojavensis）株ＣＨＣＣ１５５１０; 
（ｂ）バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）株の、受入番号ＤＳＭ２５８４０のＣＨＣＣ１５５１６、受入番号ＤＳＭ２７０３２のＣＨＣＣ１５５３６、または受入番号ＤＳＭ２７０３３のＣＨＣＣ１５５３９；或いは
（ｃ）受入番号ＤＳＭ２５８４１の、枯草菌（B.subtilis）株ＣＨＣＣ１５５４１の突然変異株を得るための方法であって、
任意に前記株を突然変異化処理にかけ、そして
以下の特性
（ｉ）アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールへの感受性；
（ii）大腸菌（E.coli）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に対する抗菌活性、並びに
（iii）培養の２日後に測定した場合、少なくとも８０の胞子形成パーセンテージ、
を有する突然変異株を選択することを含んで成る方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載された少なくとも１つのバチルス株の細胞を含んで成る、バチルス組成物。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載された少なくとも２つの株の細胞を含んで成る、請求項９に記載されたバチルス組成物。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載された少なくとも３つの株の細胞を含んで成る、請求項９または１０に記載されたバチルス組成物。
【請求項１２】
前記バチルス株の前記細胞、または株が胞子である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載されたバチルス組成物。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載されたバチルス組成物を、動物飼料に添加することを含んで成る、動物飼料またはプリミックスを生産するための方法。
【請求項１４】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載されたバチルス組成物、または請求項１３に記載された方法に従い生産された動物飼料もしくはプリミックスを、動物に投与することを含んで成る、動物に給餌するための方法。
【請求項１５】
前記動物が、家禽、反すう動物、子ウシ、ブタ、ウサギ、ウマ、魚及び愛玩動物から成る群から選択される動物である、請求項１４に記載された動物に給餌するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
バチルス種は、動物飼料産業においてプロバイオティック溶液に使用され、また生産動物における生産及び健康へのバチルスに基づくプロバイオティックの有益な効果は、周知である（Ｓｐｉｅｈｓ等、２００８；Ｃｕｔｔｉｎｇ、２０１１）。それらの使用は、バチルスの抗生物質使用との置換能、または抗生物質使用の削減能に関連し、動物飼料産業において成長促進物質として使用される。
【０００２】
しかしながら、ヒトに一般に使用される抗生物質に対して抗生物質耐性を有しないバチルス株には、満たされていない要求がある。本発明は、アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールへの感受性により特徴付けられ、且つさらに大腸菌（E.coli）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）等の主な病原菌に対して抗菌活性を有する、単離されたバチルス株を提供する。さらに株は、２日目に測定した場合、少なくとも８０の胞子形成パーセンテージを有するので、動物飼料生産のために安全且つ有用なバチルス胞子を効率良く生産することを可能にする。
【０００３】
本発明は、さらにバチルス株がプロバイオティック（健康、飼料利用及び成長促進）効果を有する場合、動物飼料添加剤、特にブタ及び家禽用の製品の生産のための、本発明のバチルス株の胞子の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
ブタ、特に子ブタは、大腸菌（E.coli）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）Ａ型及びＣ型(C.perfringens)等の細菌により引き起こされ得る下痢に苦しむ。下痢は、未処置のままである場合、死亡損失、及び体重損失を含める深刻な生産損失を引き起こし得る。
【０００５】
大腸菌（E.coli）は、子ブタにおける下痢の主原因であり、且つ飼育場で使用される抗生物質の５０〜７５％は、主に大腸菌（E.coli）により引き起こされる離乳下痢に対して使用される。下痢は、離乳期獣及び成長期獣（４０ｋｇまで）における最も大きな問題であり、且つ大腸菌（E.coli）は、下痢を引き起こす最も重大な病原菌である（Ｋｌｏｓｅ等、２０１０）。
【０００６】
ブタにおける腸内クロストリジウム感染は、圧倒的に離乳期前に起こるが、仕上げ期のブタに影響を及ぼす出血性腸症候群にも関連する。Ｃ．パーフリンジェンス（C.perfringens）Ｃ型に対する予防接種は、離乳期前の死亡率を大幅に減らすが、現在、Ｃ．パーフリンジェンス（C.perfringens）Ａ型用の入手可能な商業用ワクチンはない。Ｃ．パーフリンジェンス（C.perfringens）Ａ型感染は、現在、離乳期前のブタにおける頻度の上昇により認められ、また診断及び予防への取り組みは、共に異なり、且つＣ型感染のものよりも複雑である。
【０００７】
家禽におけるいくつかの感染及び疾患は、大腸菌（E.coli）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）を含める病原性細菌により引き起こされる。病原菌により引き起こされる感染及び疾患は、上昇した死亡率、減少した売上、及び増加した生産費用をもたらす。さらに多くのこれらの病原菌は、ヒトに伝染し得る。エビアン・コライバシローシス（Avian colibacillosis）は、大腸菌（E.coli）により引き起こされる全身性感染症であり、また若いブロイラー及び家禽のヒナにおいて最も一般的に起こる。
【０００８】
プロバイオティックは、クロストリジウム（Clostridia）及び大腸菌（E.coli）等の有害な細菌の減少、並びに乳酸菌（Lactobacillus）種及びビフィオバクテリアム（Bifidobacterium）等の有益な細菌の増加を含める健康な腸管微生物叢を維持するために、動物健康適用において使用さる。プロバイオティックは、病原菌と有益な細菌との間の健常なバランスを維持するのに適切であり、抗生物質とは似ていないために、それらは細菌を無差別に破壊せず、そしてまたそれらは病原性細菌の抗生物質耐性株を導かない。プロバイオティックが、健康な腸管微生物叢を維持すると思われることから、多くのメカニズム：病原性細菌の競合的排除、抗菌物質の生産を介する病原性細菌の減少、有益な腸管微生物叢の成長及び生存能力の増強、並びに動物における全身性免疫応答刺激が存在する。
【０００９】
前述を考慮して、ブタ及び家禽における大腸菌（E.coli）及び／またはクロストリジウム（Clostridium）による感染に起因する疾患を処置または予防するために、１つ以上のバチルス株を有することが所望されるだろう。
【００１０】
Ｇｕｏ等、２００６は、潜在的なプロバイオティックとしてのバチルス株のスクリーニング、及びブタにおける枯草菌（Bacillus subtilis）ＭＡ１３９の試験を発表する。１２４個のサンプルが、ブロイラー、ブタ、土壌、発酵飼料及び漢方薬から収集された。７５０個の好気性胞子形成株がこれらのサンプルから単離された。大腸菌（E.coli）Ｋ８８及びＫ９９、サルモネラ菌（Salmonella）並びに黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対する阻害活性が、ディスクプレート拡散検定を用いて試験された。最も良い活性を有する６つのバチルスが、刺激されたＧＩＴ条件（ｐＨ２及び０．３％胆汁塩）内でのそれらの生存について試験された。枯草菌（B.subtilis）ＭＡ１３９が最良の候補であり、且つ９０匹の子ブタでの２８日間の給餌試験において、子ブタのｉｎ  ｖｉｖｏで試験された。ＡＤＧ及び飼料利用は改善された。乳酸菌は増え、排泄物中の大腸菌（E. coli）は減った。しかしながら、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に対する抗菌活性及び抗生物質への感受性は、試験されなかった。
【００１１】
Ｂａｒｂｏｓａ等、２００５は、有機的に（土壌への接触）飼育されたブロイラーの排泄物から由来する２３７個のバチルスの単離を発表する。３１個の分離株が特徴化された。枯草菌（B.subtilis）及びＢ．リケニフォルミス（B.licheniformis）は、これらの中にあった。いくつかの枯草菌（B.subtilis）株は、Ｃ．パーフリンジェンス（C.perfringens）及び黄色ブドウ球菌（S.aureus）への阻害を示した。Ｂ．リケニフォルミス（B.licheniformis）は、さらにＣ．パーフリンジェンス（C.perfringens）に対する効果を示した。しかしながら、選択されたバチルス分離株で、本出願において定義されるような大腸菌（E.coli）に対する抗菌活性を示したものはない。一つの選択されたバチルス分離株は、成長強度における減少を示したが、大腸菌（E.coli）株Ｏ７８：Ｋ８０に対する完全な阻害ではなく、且つ試験された他の大腸菌（E coli）株に対する効果はない（表５を参照）。２日間の培養後の胞子形成パーセンテージにおける、またはバンコマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、及びクリンダマイシンへの感受性におけるデータは提供されていない。
【００１２】
Ｃｈａｉｙａｗａｎ等、２０１０は、医療処置において広く使用されている抗生物質の影響を受けやすく、またＣ．パーフリンジェンス（C.perfringens）ＡＴＣＣ １５１９１に対する抗菌活性を示すバチルス株ｓｐ.Ｔ３-１を開示する。株は、大腸菌（E.coli）Ｏ１５７に対する抗菌活性は有しない。２日間の培養後の胞子形成パーセンテージにおけるデータは提供されていない。
【００１３】
Ｂｅｎｉｔｅｚ等、２０１１は、近年、損傷のない、または不活性化した大腸菌（E.coli）の存在が、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＬＢＭ５００６株による抗菌性ペプチドの合成を増強させたことを発表した。
【００１４】
ＵＳ７，７５４，４６９は、家禽を処置するための微生物及び方法に関し、またＵＳ８，０２１，６５４は、バチルス株を有するブタを処置するための方法に関する。
【００１５】
しかしながら、効率的な胞子形成、及びそれによるバチルスプロバイオティック生産に有用な株を作製するために、一般にヒトに使用される抗生物質に感受性であり、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）及び大腸菌（E.coli）の両方に対して抗菌活性を有し、並びに高い胞子形成パーセンテージを有するバチルス株を選択することを発表または示唆するものは、これらの論文または特許のいずれにおいても存在しない。
【００１６】
従来技術文献、例えばＢａｒｂｏｓａ等、２００５、Ｃｈａｉｙａｗａｎ等、２０１０、及びＧｕｏ等、２００６はいずれも、一般にヒトに使用される抗生物質への感受性、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）及び大腸菌（E.coli）の両方に対する成長阻害という意味での抗菌活性、並びに高い胞子形成パーセンテージを有する株を開示していない。
【００１７】
要約すると、バチルス株のスクリーニングに関連する従来技術は、本発明の３つの際立つ特徴、すなわち一般にヒトに使用される抗生物質への感受性、大腸菌（E.coli）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に対する抗菌活性、並びに高い胞子形成パーセンテージを提供しない。従来技術は、いずれもこれらの３つの基準を実現するバチルス株を提供していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明により解決されるべき問題は、アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールへの感受性；大腸菌（E.coli）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に対する抗菌活性；並びに２日目に測定した場合に少なくとも８０の胞子形成パーセンテージを特徴とするバチルス株を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
解決法は、これらの改良された特性を有する改良されたバチルス株を同定するために、本発明者等により開発された選択方法に基づく。
【００２０】
選択方法の第一の本質的なステップは、一般にヒトに使用される抗生物質に対して感受性であるバチルス株を特異的にスクリーニングすることである。より詳細には、株は、アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールへの感受性についてスクリーニングされる。
【００２１】
さらに株は、大腸菌（E.coli）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に対する抗菌活性、並びに２日目に測定した場合に少なくとも８０の胞子形成パーセンテージを有することについてスクリーニングされる。
【００２２】
本発明者等により調査された土壌及び排泄物、並びに食物起源から由来する２６１個の分離株の中から、本実施例中に発表される前スクリーニング試験において、１６１個の単離株が抗生物質耐性であった。抗生物質に対し感受性であった１００個の分離株の中の５６個は、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に対する抗菌効果を有し、また２２個だけが大腸菌（E.coli）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）の両方に対して効果を有した。これらの中の１２個は、Ｂ．アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）種から由来する分離株であった。他の体表的な株は、枯草菌（B.subtilis）種及びＢ．モヤヴェンシス（B.mojavensis）から由来した。表２及び３は、Ｃｈｒ. Ｈａｎｓｅｎ所有株の結果を要約する（二次スクリーニングのために選択された３２個の株の内の２２個）。
【００２３】
選択工程は、（ｉ）安全性、（ii）効果及び（iii）生産に適した媒体中での高い胞子形成に焦点があてられた。安全性の観点は、主にヒトにおける増加した耐性細菌の症例に起因する重要な抗生物質耐性の不存在に基づく。これらの細菌は、病原細菌が耐性になるにつれて、もはや抗生物質により処置し得ない周知の疾患をもたらした。
【００２４】
バチルスが、抗菌活性を有し得る、すなわちバクテリオシン、細菌溶解酵素またはサーファクチンのような物質を生産し得ることは周知である。第二の選択基準、大腸菌（E.coli）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に対する効果は、両方の病原菌が、ブタ及び家禽における下痢の主な原因であるので重要である。効果は、３つの株の大腸菌（E.coli）に対して、及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）Ａ型に対して試験されるが、結果は、大腸菌（E.coli）に対する一般的な効果、及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）Ｃ型等の他の型のクロストリジウム（Clostridia）に対する効果についても示すものであると期待される。
【００２５】
第三の選択基準は、プロバイオティックの生産に重要である。生産工程は、バチルスを育てる発酵槽において起こり、そして高い生産効力のためには、工程の終了時での高い胞子形成率が必要とされる。バチルスの胞子形成工程は、多くの年月をかけて調査されてきたが、なお多くの疑問が存在している。したがって、いくつかのバチルス株が、非常に低い胞子形成率を有するということは、バチルスの生産及び工程開発の当業者の中では周知である。バチルスが特定化された細胞の下位個体群、すなわち胞子を形成する群生、複雑な栄養素を分解するための酵素を生産する群生、及び死ぬ群生のような個体群へ分化されるということは、示唆されてきた（Ｌｏｐｅｚ及びＫｏｌｔｅｒ、２０１０）。この分化は、その殆どがバチルス自体により生み出される細胞外シグナルにより調節されていると思われている。したがって、酵素または抗菌性物質の高い生産率が、低い胞子形成効力をもたらし得ると仮定されてきた。したがって通常の当業者にとって、抗菌活性及び高い胞子形成パーセンテージの両方を有するバチルス株は、並外れ、且つ驚くべきものである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、２６１個のバチルス株の抗菌活性を図式的に示す。多くのバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）株が抗菌効果を有することは、驚くべきことである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
２００６年の欧州連合における抗生物質成長促進因子の段階的廃止は、高い効力を伴う費用効果的な飼料添加剤の増加した必要性をもたらし、そしてそれによる新規のプロバイオティックの必要性をもたらした。バチルスに基づくプロバイオティック飼料添加剤は、ブタ及び家禽における健康及び生産へのそれらの好ましい効果について公知である。胞子は熱安定性であり、且つ９０〜９５℃までの温度でのペレット化工程で生存し得るので、これらの製品は、飼料産業に適している。 
【００２８】
ブタのプロバイオティックは、動物、ヒト及び環境に安全であることが必要とされ、また動物の成長及び飼料利用を増加させるだろう。本発明の目的は、３つのステップの中で、多様な起源から由来する広範囲の好気性内生胞子形成細菌（ＡＥＢ）を、ブタにおけるそれらのプロバイオティック効果についてスクリーニングすることであった。ＡＥＢは、発酵飼料（Ｋａｎｔｏｎｇ、及びＧｅｒｇｏｕｓｈ プライマリースターター)、ブタ排泄物、土壌及び多様な培養物コレクションから単離された。１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子のシークエンシングにより２６１個のＡＥＢ分離株を同定し、そしていくつかの関連のある抗生物質の最小の阻害濃度（ＭＩＣ）を決定することにより、関連のある抗生物質耐性について調査した。
【００２９】
さらなる分析は、胆汁及び酸耐性、病原菌阻害、多様な培地における成長、胞子形成、並びに動物細胞株との相互作用を含めて、腸内系における密着結合への好ましい効果の可能性を評価した。結果は、種と株の両方の間で高度な差異を示す。単離された種は、主に食物起源から由来するＢ．アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）、枯草菌（B.subtilis）及びＢ．サフェンシス（B.safensis）、排泄物から由来する枯草菌（B.subtilis）、Ｂ．プミルス（B.pumilus）、Ｂ．アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）、Ｂ．リケニフォルミス（B.licheniformis）、Ｂ．メガテリウム（B.megaterium）並びに土壌から由来するＢ．リケニフォルミス（B.licheniformis）及びＢ．シンプレックス（B.simplex）を含めるバチルス属のものであった。
【００３０】
多くの分離株は、ＥＦＳＡにより定義されたブレイクポイントを超える所望されない抗生物質耐性を示し、そして安全性への懸念から廃棄された。良好な成長は、子ウシのインフュージョン培養液中で一晩成長させた場合に、殆どの株で観察されたが、１６％は、発酵に適した培地中でも不十分な成長であった。スクリーニング工程のステップ２では、抗生物質耐性を有しない３２個の選択株が、ｇｙｒＢ遺伝子のシークエンシング、及びＰＦＧＥフィンガープリンティングにより同定された。さらに選択された病原菌へのそれらの抗菌効果が試験され、そして分離株間で、かなりの数のバリエーションが観察された。いくつかの分離株は、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）の阻害を示したが、ほんの２〜３個の分離株は、大腸菌（E.coli）を阻害した。したがって本発明の結果は、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）及び大腸菌（E.coli）の両方の成長阻害は、まれに組み合わされるのみであることを裏付ける。スクリーニング工程のステップ３は、高い病原菌阻害を有する１０個の株を伴い、且つ胞子の熱安定性、ゲノムシークエンシング、及び密着結合へのそれらの効果を示すさらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究の決定を含めた。
【００３１】
本発明は、（ｉ）アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールへの感受性を特徴とするバチルス株を提供する。
【００３２】
用語「アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールへの感受性」とは、特定の抗生物質に感受性であると考えられる株が、表１において概説されるＥＦＳＡ（ＥＦＳＡ、２００８)により与えられるブレイクポイントレベルで成長してはならないことを意味する。
【００３３】
表１において概説されるＭＩＣ値は、ＥＦＳＡ（抗生物質への細菌耐性のヒト及び獣医学的重要性の評価において使用される最新の基準における、動物飼料において使用されるＰａｎｅｌ ｏｎ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｒ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓにより整えられた技術指導（ＦＥＥＤＡＰ））により発行されているガイドラインに基づく。ＥＦＳＡジャーナル（２００８）７３２、１〜１５は、抗生物質のリスト、及びバチルス属の許容され得るカットオフ値を提供する。バチルスについて、アンピシリンのＥＦＳＡにより与えられるブレイクポイントはないが、ブレイクポインントは、いくつかの他の細菌、すなわち乳酸菌（Lactobacillus）種について存在する。したがってアンピシリンに対するこのバチルス株の感受性は、本発明に関するブレイクポイントとして選択された。
【００３４】
表１：一般にヒトに使用される多様な抗生物質のＥＦＳＡブレイクポイント
【００３５】
【表１】
2015517809.tif 000003
【００３６】
本発明の範囲内にあるためには、株は、全ての上記の抗生物質に対して感受性でなければならない。実際には、これは、微量希釈法により試験される場合、ブレイクポイントレベルで、株の成長がないことを観察することを意味する（最小阻害濃度（ＭＩＣ））。 
【００３７】
本発明によれば、ＭＩＣは、以下のように行わるＣＬＳＩ（臨床・検査標準協会Ｍ０７-Ａ８及びＭ４５-Ａ２)の標準により概説されるような培養液微量希釈法により測定される：
一晩成長の試験される株の懸濁物を、１０5ｃｆｕ/ｍＬ（コロニー形成単位／ｍＬ）の適切な濃度で、試験される抗生物質を倍数連続希釈(総溶液１００μＬ／ウェル)において、マイクロタイタープレート中のＩＳＯ-ＳＥＮＳＩＴＥＳＴ培養液（Ｏｘｏｉｄ ＣＭ０４７３）に接種し、そして２０〜２４時間、３７℃で好気的に培養する。抗生物質アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン、及びクロラムフェニコールを含んで成る前加工パネルＶｅｔＭＩＣ Ｌａｃｔ-１ ＆ Ｌａｃｔ-２が使用され得る。結果は、目に見える成長を阻害する抗生物質の最も低い濃度として、２４時間後に記録される。
【００３８】
本発明の観点（ii）の最初の部分は、大腸菌（E.coli）に対する抗菌活性を示すバチルス株に関する。本発明によれば、これは、以下のように実施される大腸菌（E.coli）寒天スポット試験により測定される：
９ｍＬの子ウシのインフュージョン培養液（ＶＩＢ）を、試験されるバチルス培養物に接種し、そして３７℃及び１７５ｒｐｍで一晩培養する。同時に９ｍＬのブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培養液に、大腸菌（E.coli）Ｏ１４９（Ｏ１４９：ｋ９１、ｋ８８ａ）、大腸菌（E.coli）Ｏ１４７（Ｏ１４７：Ｋ８９ Ｆ４）、及び大腸菌（E.coli）Ｏ１０１（Ｏ１０１、Ｆ５）から選定される大腸菌（E.coli）株を接種し、そして３７℃で一晩培養する。
【００３９】
それぞれ２ｍＬの体積にある一晩の大腸菌（E.coli）の培養物を、２００ｍＬの液体ＶＩＢ寒天中に５０℃で添加し、そしてそれぞれのバイオアッセイ皿に注ぐ。皿は、消毒した作業台中で乾燥させる。試験される一晩のバチルス培養物を、大腸菌（E.coli）と混合したＶＩＢ寒天の表面上にスポットし、そして３７℃で２日間培養する。スポットを取り囲む阻害域の半径及びスポットの直径を記録する。
【００４０】
バチルス株は、阻害域が少なくとも１．５ｍｍであるならば、大腸菌（E.coli）に対して抗菌活性を示すと考えられている。好適には阻害域は、少なくとも２．０ｍｍ、例えば少なくとも２．５ｍｍ、より好適には少なくとも３ｍｍ、最適には少なくとも３．５ｍｍ、またさらに好適には少なくとも４ｍｍ等である。阻害域は、多様な大腸菌（E.coli）株で相違し得る。本発明にかかる大腸菌（E.coli）に対して抗菌活性を示すと考えられている株については、試験される全ての大腸菌（E.coli）株について少なくとも１．５ｍｍの阻害域を示すべきである。２つ以上の阻害域、好適には全ての大腸菌（E.coli）株の３つの阻害域が少なくとも２ｍｍであるのが好適である。本発明のバチルス株は、大腸菌（E.coli）の成長阻害、特に試験される種の成長阻害により特徴付けられる。従来技術により証明され、また本発明により確認されるように、成長阻害なしの１つの大腸菌（E.coli）種は、しばしば成長阻害なしの他の大腸菌（E.coli）種と組み合わされ（表５、Ｂａｒｂｏｓａ等、２００５）、また逆の場合の同じであり、すなわち阻害活性である１つの大腸菌（E.coli）種は、しばしば阻害活性である他の大腸菌（E.coli）種と組み合わされる（表１、Ｇｕｏ等、２００６)。
【００４１】
本発明の観点（ii）の第二の部分は、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に対する抗菌活性を示すバチルス株に関する。本発明によれば、これは、以下のクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）寒天スポット試験により測定される：
９ｍＬのＶＩＢに、試験されるバチルス培養物を接種し、そして３７℃及び１７５ｒｐｍで一晩培養する。同時に９ｍＬのＢＨＩ培養液に、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）Ａ型、ＤＳＭ ７５６を接種し、そして嫌気的な瓶の中で、３７℃で一晩培養する。
【００４２】
バチルス培養物を、ペトリ皿中のＶＩＢ寒天の表面上にスポットし、そして３７℃で一晩培養する。２ｍＬの体積にあるＣ．パーフリンジェンス（C.perfringens）の一晩培養物を、２００ｍＬの液体ＢＨＩ寒天と混合し、そして成長したバチルススポットを有するＶＩＢ寒天上に注ぐ。皿を、嫌気的に、３７℃で１日培養する。明確にされたスポットを取り囲む阻害域の半径を測定する。
【００４３】
バチルス株は、阻害域が少なくとも１．５ｍｍであるならば、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に対して抗菌活性を示すと考えられている。好適には阻害域は、少なくとも６ｍｍ、より好適には少なくとも７ｍｍである。本発明のバチルス株は、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）の成長阻害、特に試験される種の成長阻害により特徴付けられる。当業者に公知であるように、成長阻害なしの１つの種は、しばしば成長阻害なしの他のクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）種と組み合わされ、また逆の場合の同じであり、すなわち成長阻害の１つのクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）種は、しばしば成長阻害の他のクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）種と組み合わされる。
【００４４】
バチルス細胞は、バチルス胞子細胞、及びバチルス増殖性細胞として存在する。参照が本明細書におけるバチルス細胞について成されているならば、これは両方に関連する。
【００４５】
バチルス胞子細胞との関連における用語「バチルス胞子」は、本明細書において、当業界に従い、バチルス細菌により生産される休眠中で、タフな、非増殖性構造として特徴化され得る胞子に関連する。胞子の主要機能は、一般に環境ストレスの時期を通して、細菌の生存を保証することである。したがってそれらは、紫外線及びγ線、乾燥、リゾチーム、温度、飢餓、並びに化学消毒剤に耐性である。胞子は、一般にそれらが長期間生存し得る土壌及び水の中に見出される。胞子被膜は、多くの毒性分子に不浸透性であり、また発芽に関わる酵素を含み得る。コアは、ＤＮＡ及びリボソーム等の正常細胞構造を有すが、代謝的には不活性である。環境条件が不都合になりはじめたことに細菌が気付いた時、それは、約８時間かかる胞子形成の工程を開始し得る。
【００４６】
用語「バチルス増殖性細胞」は、分割してより増殖性の細胞を産し得る、機能的な増殖性バチルス細胞に関する。
【００４７】
観点（iii）では、本発明は、２日目に測定した場合、少なくとも８０の胞子形成パーセンテージを示すバチルス株に関する。本発明によれば、胞子形成パーセンテージは、以下のように検定される：
５０μＬの体積にある試験されるバチルス株を、ディープウェル（ＤＷ）プレート中の７００μＬのＶＩＢに添加し、そして３７℃及び１７５ｒｐｍで、一晩培養する。５０μＬの体積にあるバチルス一晩培養物を、ＤＷプレート中に９５重量％の水；１．５重量％の窒素源（すなわち、イースト）；３重量％のショ糖；０．０６重量％の微量ミネラル；リン酸水素二カリウム ０．１重量％を含んで成る７００μＬの胞子形成培地に移す。プレートを３７℃及び１７５ｒｐｍで、３日間培養する。胞子形成は、微視的に観察され、そして胞子パーセンテージ（バチルス細胞の総数と比較した胞子の数）は、培養の１日（２４時間）、２日（４８時間）及び３日（７２時間）後の視覚評価により決定される。
【００４８】
用語「２日目に測定した場合、少なくとも８０の胞子形成パーセンテージを有す」とは、少なくとも８０％の細胞が、培養の２日後に胞子化したことを意味する。胞子形成パーセンテージは、好適には少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％等より高くなり得る。本発明の重要な目的は、動物飼料生産に有用な株を作るために、高い胞子形成パーセンテージを伴う細胞を有するバチルス株を選定することである。高い胞子形成率とも呼ばれ得る高い胞子形成パーセンテージは、上記のような高い生産効力に必要とされる。
【００４９】
上記のように従来技術は、バチルス株を選定するための方法を発表するが、従来技術のスクリーニング方法は、胞子形成パーセンテージには焦点を当てていなかった。したがって従来技術の選定されたバチルス株は、本明細書において発表される胞子形成パーセンテージに従うのに十分な程度の胞子を形成しそうにない。
【００５０】
高い成長特性及び胞子形成、無抗生物質耐性、並びに高い抗菌活性の組み合わされた能力を有する３株が選定され、そして寄託された。しかし他の株、特にバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）種の株（表２及び３における株Ｄ〜Ｊを参照）も、特許請求の範囲において概説される基準を満たすので、本発明の範囲内に含められる。
【００５１】
図１から明らかであるように、特にバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）種の多くの株は、本発明の範囲内にある。これまでバチルス属の抗菌効果は株特異的であり、且つ種には関連しないと見なされていたので、多くのバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）株が抗菌効果を有するということは、驚くべきことである。 
【００５２】
詳細な検定発表に基づき、通常の当業者は、特定のバチルス株が、本発明の多様な観点である項目（ｉ）の感受性、項目（ii）の抗菌活性及び項目（iii）の胞子形成パーセンテージに適合するか否かを決定するために、これらの検定を繰り返すことができる。本方法では、通常の当業者は、規定された特質を有する株を一貫して生産することができるだろう。好適には選定方法は、（ｉｖ）ｐＨ４での増殖性細胞の感受性について検定すること、及び（ｖ）株が消化管中で十分な程度まで生存できることを保証する胆汁耐性について検定することも含めるだろう。明らかにこれらの検定は、任意の順番で実行でき、またいくつかの株は、それらが基準を満たさなければ工程間で排除され得る。
【００５３】
動物のＧＩＴにおけるバチルス胞子細胞の生存及び発芽、並びにバチルス胞子細胞の増殖性細胞への派生に、胆汁がいくつかの負の影響を及ぼすということは、文献から公知である。したがってプロバイオティック細菌は、一般に、動物飼料に添加するためのプロバイオティックバチルス組成物として有用であるためには、低いｐＨに耐えることができ、また胆汁塩に耐性であることにより、動物の胃腸において生き残り、そして増殖可能であるべきである。実施例は、この点について有用なｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を提供する。低いｐＨ（胃の状態を刺激する）への感受性についての試験は、増殖性細胞のｐＨ４への耐性に焦点を当てる。胞子が２〜３のｐＨ値で耐性であり、また増殖性細胞がｐＨ２で死亡するだろうということは周知である。しかしながら胃のｐＨは、特に給餌条件において４までのｐＨ値を有し得る。これは、胞子の発芽をもたらし得ることから、それは、ｐＨ４での増殖性細胞の感受性を試験することに関連する。選定株は、好適にはｐＨ４に耐性であるべきである。選定株の結果は、表２に示される。
【００５４】
本発明の株は、バチルス属のものであり、好適には、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）亜種．アミロリクエファシエンス（amyloliquefaciens）またはバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）亜種. プランタラム（Plantarum）等のバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）種、バチルス・シンプレックス（Bacillus simplex）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・モヤヴェンシス（Bacillus mojavensis）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・サフェンシス（Bacillus safensis）、バチルス・シンプレックス（Bacillus simplex）、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・アトロファエウス（Bacillus atrophaeus）、バチルス・メチロトロフィカス（Bacillus methylotrophicus）、バチルス・シアメンシス（Bacillus siamensis）、バチルス・バリスモルティス（Bacillus vallismortis）またはバチルス・テクィレンシス（Bacillus tequilensis）の１つである。 
【００５５】
２６１株の最初の同定方法は、１６Ｓに基づいた。本方法は、いくつかの密接に関連したバチルス種の間を区別し得ない。したがって株は、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）／アトロファエウス（atrophaeus）／メチロトロフィカス（methylotrophicus）／シアメンシス（siamensis）／バリスモルティス（vallismortis）種から成る群、またはバチルス・モヤヴェンシス（Bacillus mojavensis）／枯草菌（subtilis）／テクィレンシス（tequilensis）種から成る群に関連するように同定され得る。両群は、本発明の基準を満たす多くの株を含むので、これらの群は、本発明の重要な態様を表す。
【００５６】
適宜、株は、さらにより詳細な方法（ｇｙｒ Ｂ））により同定された。表２及び表３に示されるデータは、主にバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）に基づく（ｇｙｒ Ｂにより同定される）。選定されるバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）分離株は、さらにＲＮＡポリメラーゼβサブユニット（ｒｐｏ Ｂ）遺伝子配列分析により同定され、そして亜種が同定され、そして表４、５及び６に示された。
【００５７】
株は、熱安定性を示すことが所望される。選定株についての結果は、表４に示されている。９９．５℃での熱安定性は、時間０と関連して、２、５及び１０分後の減少として、ｃｆｕにおいて測定される（ｌｏｇ／ｌｏｇ）。２を下回る減少は、一般の商業的なバチルス胞子製剤により達成される。本発明の範囲内にある株についての減少は、好適には２分後に０．５以下、より好適には０．２５以下、最適には０．０５以下であるべきである。好適な態様では、５分後の減少は、好適には２．５以下、より好適には１以下、最適には０．５以下であるべきであり、またさらに１０分後の減少は、好適には２．５以下、より好適には１以下、最適には０．５以下であるべきである。表中の全ての株は、適切な熱安定性を示す。表から明らかであるように、株Ｂ、Ｄ及びＦは、１０分後にでさえ非常に高い熱安定性を有する。Ｂ及びＦの両方が、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）亜種. 本発明の好適な態様である本亜種を作るアミロリクエファシエンス（amyloliquefaciens）株であることは、注目に値することである。
【００５８】
酵素生産は、実施例４において調査された。本発見は、全ての調査された株について、５０ｍＵ／ｍＬ以上のセルラーゼ活性を示す。かかる活性は、本発明のバチルス株の有益な特性であるだろうと考えられる。特定の態様に関し、Ｂ．アミロリクエファシエンス（B．amyloliquefaciens）亜種．本発明の好適な態様である本亜種を作るプランタラム（Plantarum）株に見出されたように、株が１００ｍＵ／ｍＬ以上のようなより高いセルラーゼ活性を有することは、好適であり得る。本発明の範囲内にある株についてのセルラーゼ活性は、好適には５０ｍＵ／ｍＬ以上、より好適には１００ｍＵ／ｍＬ以上、最適には２５０ｍＵ／ｍＬ以上、またより好適には４００ｍＵ／ｍＬ以上であるべきである。 
【００５９】
いくつかの株は、７０ｍＵ／ｍＬ以上の高いキシラナーゼ活性を示す。表５は、調査した株の高いセルラーゼ活性は、４００００ＲＦＵ／ＯＤ以上と定義される高いキシラナーゼまたは高いプロテアーゼ活性と、必ずしも組み合わせる必要はないことを示す。全てＢ．アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）亜種．プランタラム（Plantarum）である株Ｇ、Ｉ及びＪは、全ての３つの酵素に対し高い活性を実証する株の例である。
【００６０】
好適な態様では、バチルス株は、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・モヤヴェンシス（Bacillus mojavensis）またはバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）である。最適には、株は、（ａ）受入番号ＤＳＭ ２５８３９のバチルス・モヤヴェンシス（Bacillus mojavensis）株；（ｂ）受入番号ＤＳＭ ２５８４０、受入番号 ＤＳＭ ２７０３２または受入番号ＤＳＭ ２７０３３のバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）株、及び（ｃ）受入番号ＤＳＭ ２５８４１の枯草菌（Bacillus subtilis）株；並びにその突然変異株から成る群から選定される。
【００６１】
本発明の他の観点は、
（ａ）受入番号ＤＳＭ ２５８３９のバチルス・モヤヴェンシス（Bacillus mojavensis）株; 
（ｂ）受入番号ＤＳＭ ２５８４０、受入番号 ＤＳＭ ２７０３２または受入番号ＤＳＭ ２７０３３のバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）株
；或いは
（ｃ）受入番号ＤＳＭ ２５８４１の枯草菌（Bacillus subtilis）株；の突然変異株を得るための方法に関し；
方法は、任意に株を突然変異化処理にかけ、そして以下
（ｉ）アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールへの感受性：
（ii）大腸菌（E.coli）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に対する抗菌活性、並びに
（iii）２日目に測定した場合、少なくとも８０の胞子形成パーセンテージの特性を有する突然変異株を選定することを含んで成る。
【００６２】
以下にさらに詳細に発表されるように、株は、突然変異株を得るために、突然変異化処理にかけられてよく、そしてその後に選定工程が実施される。或いは選定は、自然発生的に起こる突然変異体のために実施される。
【００６３】
突然変異株を得るための方法は、さらに（ｉｖ）ｐＨ４での増殖性細胞の感受性について検定すること、及び（ｖ）株が消化管において十分な程度まで生存できることを保証するために、胆汁耐性を検定することを含め得る。明らかにこれらの検定は、任意の順番で実施することができ、またいくつかの株は、それらが基準を満たさなければ、工程間で排除され得る。
【００６４】
本明細書において用いられる細菌性の「株」とは、成長または増殖時に、遺伝子学的に未変化のままである細菌に言及する。多様性の同一細菌も含められる。
【００６５】
「野生型株」とは、天然において見出されるような、非突然変異形態に言及する。
【００６６】
「突然変異細菌」または「突然変異株」とは、天然の（自然発生する、または天然に起こる）突然変異細菌、またはそのゲノム（ＤＮＡ）中に、野生型のＤＮＡ中には存在しない１つ以上の突然変異を含んで成る誘導された突然変異細菌に言及する。「誘導された突然変異体」は、突然変異が、（ｉ）ＤＮＡに関連した、またはＤＮＡに導入され始めた突然変異原（塩基類似体等、例えば２−アミノプリン、またはＩＣＲ−１９１等の相互キレート化剤）、（ii）アルキル化剤（ニトロソグアニジンまたはヒドロキシルアミン）、またはエタンメチルスルホン酸塩（ＥＭＳ）もしくはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン（ＮＴＧ）、ＵＶ−またはγ線等を含めるＤＮＡと反応する突然変異原から選定される化学的突然変異原等の化学的突然変異原による処理を含める、任意の慣用的に使用される突然変異化処置による処置等のヒト処置により誘導される場合の細菌である。その一方で、「自然発生する突然変異体」または「天然に起こる突然変異体」では、ヒトによる突然変異化はされてこなかった。
【００６７】
突然変異体は、いくつかの突然変異化処置（単一の処置は、１つの突然変異化ステップ、その後のスクリーニング／選定ステップと理解されるべきである）にかけられてよいとされてきたが、現在は、わずか２０、またはわずか１０、またはわずか５つの処置（またはスクリーニング／選定ステップ）しか行われないことが好適である。現在、好適な突然変異体では、母株と比べて、細菌ゲノム中で１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満、またはさらに０．０００１％未満のヌクレオチドが、他のヌクレオチドに置き換わり、または欠損している。
【００６８】
上記の突然変異細菌は、非−ＧＭＯ、すなわち組み換えＤＮＡ技術により修飾されない。ランダム突然変異生成により突然変異体を提供する上記好適な方法に代わるものとして、さらに部位特異的突然変異生成により、例えば適切に設計されたＰＣＲ技術を用いることにより、または細菌レプリコンにおいて統合可能な転移因子を用いることにより、かかる突然変異体を提供することが可能になる。
【００６９】
自然発生的に起こる突然変異体としての突然変異体が提供される場合、上記野生型の株は、任意の先行する突然変異化処理をせずに、選定ステップにかけられる。
【００７０】
いくつかのバチルス種は、ＧＲＡＳ地位を有し、すなわちそれらは、一般に安全であると認められている。全ての枯草菌（B.subtilis）株は、ＧＲＡＳである。本明細書において発表されるバチルス株は、好気的且つ条件的な胞子形成体である。バチルス種は、ＧＲＡＳと見なされている唯一の胞子形成体である。家畜へのＧＲＡＳ地位を有する採餌微生物は、生産者、獣医師、及び他の畜産業者の間で許容され得る慣行である。
【００７１】
したがってさらなる観点では、本発明は、本発明のバチルス株の細胞を含んで成るバチルス組成物に関する。組成物は、本発明の株の少なくとも１個から選定される、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、またはそれを上回るバチルス株の細胞を含んで成り得る。好適にはバチルス組成物の細胞は、胞子細胞である。
【００７２】
関連のある組成物のバチルス株は、当業者に公知である商業的に関連のある形態で存在し得る。したがって１つの態様では、組成物のバチルス株は、乾燥（例えばスプレー乾燥）細胞として、または凍結細胞として存在する。組成物は、液体、スラリー、粉末またはペレットの形態等にある任意の適切な形態で提供され得る。
【００７３】
好適な態様では、バチルス組成物は、１０5〜１０12 ＣＦＵ／ｇ、より好適には１０6〜１０12ＣＦＵ／ｇ、及び最適には１０7〜１０12ＣＦＵ／ｇを含んで成る。
【００７４】
用語「ＣＦＵ／ｇ」は、組成物中に存在する適切な関連添加物を含めるようなものとしての組成物のグラム重量に関する。当業者に公知であるように、商業的に関連のある細菌組成物は、一般に例えば乳清に属する群の１つの担体／成分等の他の関連のある添加剤もさらに含んで成り得る。乳清は、炭酸カルシウム／石灰石、並びにケイ酸アルミニウム及び珪藻土等のアンチケーキング剤に浸透する。それは、バチルス組成物を梱包するために使用される適切な容器の重量を含めない。１つの態様は、適切な容器中に梱包される組成物に関する。
【００７５】
本発明の組成物は、突然変異体、及び飼料添加剤としてまたは飲料水のための添加剤として動物に供給するのに適するこれらの組成物を作製する担体を含める本発明のバチルス株を含め得る。或いは突然変異体を含める本発明のバチルス株は、飼料タンパク質及び／または飼料炭水化物を含める動物飼料成分と共に製剤化され得る。かかる組み合わせは、標準ペレット化工程を通して押し出されるペレットの形態にあり得る。
【００７６】
本明細書において発表されるバチルス組成物は、動物飼料へのプロバイオティック添加剤として使用され得る。さらに本発明は、本発明のバチルス組成物を動物飼料に添加することを含んで成る、動物飼料またはプリミックスを生産するための方法を提供する。
【００７７】
本明細書において使用される用語「プリミックス」とは、所望される含有率でその後に飼料に添加され、そして動物に与えられるプリミックスを作製するための担体に添加されるバチルス株に言及する。
【００７８】
本発明の他の観点は、本発明のバチルス組成物、或いは本発明により生産される動物飼料またはプリミックスを動物に投与することを含んで成る、動物に給餌するための方法に関する。
【００７９】
実施例５は、 株Ｂ及びＣによる給餌試験を発表し、そして幼獣用の食餌に補充される両バチルス株プロバイオティック製品が、陰性コントロール群と比較して、生産性能を数値的に改善させたことを示す。生産パラメーターの有意な効果は、試験の間に観察され得る。死亡率パーセンテージは、両バチルス群において、及び両試験において減少した。
【００８０】
１つの場所において、重篤な下痢を克服するためにエンロフロキサシンで処置された囲い当たりの動物の数は、バチルスが給餌された動物よりも、コントロール食が給餌された動物のほうが有意に高かった（P＞０．０５）。
【００８１】
したがって本実施例は、本発明のバチルス組成物の投与が、例えば動物における大腸菌（E.coli）及びクロストリジウム（Clostridium）等の病原菌を阻害することにより、疾患を処置及び予防するために使用され得ることを実証する。バチルス組成物は、直接給餌される微生物として、または飼料添加剤として、動物飼料に与えられ得る。本発明の組成物は、動物の胃腸中でクロストリジウム（Clostridia）及び大腸菌（Escherichia coli）等の病原性細菌の成長を減少させるのに有効な量で、動物に投与、または給餌される。
【００８２】
動物は、家禽、反すう動物、子ウシ、ブタ、ウサギ、ウマ、魚及び愛玩動物から成る群から選定され得る。好適な態様では、動物は、ブタ等の消費用に飼育される、またはブロイラー及び卵を産むニワトリ等の食物生産者としての家畜である。
【００８３】
さらに本発明の１つ以上のバチルス株を子ブタに投与する方法が提供される。かかる方法は、本発明の１つ以上のバチルス株を、母ブタに給餌することを含め得る。株（単・複数）は、妊娠、授乳、または両方の期間に給餌され得る。１つ以上のバチルス株は、幼いブタ、及び肥育ブタにも投与され得る。
【００８４】
本発明を発表する文脈における（特に特許請求の範囲に従う文脈における）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」、並びに同様の指示対象の使用は、本明細書において特に断りのない限り、または文脈から明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方に及ぶものと解釈される。用語「含んで成る（comprising）」、「有する（having）」、「含める（including）」及び「含む（containing）」は、特に断りのない限り、変更可能な用語として解釈される（すなわち、「〜に限定されずに含める」という意味）。本明細書における値の記載範囲は、本明細書において他に断りのない限り、範囲内にあるそれぞれの独立した値に対し、個々に言及する簡潔な表現方法としての役割を果たすだけにすぎず、そして個々の独立した値は、それがあたかも個々に本明細書中に挙げられているかのように、本明細書中に組み込まれている。本明細書において発表される全ての方法は、本明細書中に他に断りのない限り、または文脈から明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順番で実施され得る。本明細書において提供される任意の、及び全ての例、または例示の言葉（例えば「等」）の使用は、本発明をより明らかにすることだけを意図し、且つ特許請求の範囲において他に請求されていない限り、本発明の範囲における限定をもたらさない。本明細書において、本発明の実行に必須であるとして、任意の特許請求されていない要素を示していると解釈されるべき言葉はない。
【００８５】
寄託された株
バチルス・モヤヴェンシス（Bacillus mojavensis）株ＣＨＣＣ １５５１０は、２０１２年４月３日の寄託日で、Ｃｈｒ.Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ、デンマークにより、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ, Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７Ｂ、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）にて、受入番号ＤＳＭ ２５８３９の下で寄託されている。寄託は、特許手続の目的のための微生物の寄託の国際的承認におけるブダペスト条約の条件下で成された。
【００８６】
バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）株ＣＨＣＣ １５５１６は、２０１２年４月３日の寄託日で、Ｃｈｒ.Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ、デンマークにより、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ, Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７Ｂ、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）にて、受入番号ＤＳＭ ２５８４０の下で寄託されている。寄託は、特許手続の目的のための微生物の寄託の国際的承認におけるブダペスト条約の条件下で成された。
【００８７】
バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）株ＣＨＣＣ １５５３６は、２０１３年３月２１日の寄託日で、Ｃｈｒ.Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ、デンマークにより、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ, Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７Ｂ、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）にて、受入番号ＤＳＭ ２７０３２の下で寄託されている。寄託は、特許手続の目的のための微生物の寄託の国際的承認におけるブダペスト条約の条件下で成された。
【００８８】
バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）株ＣＨＣＣ １５５３９は、２０１３年３月２１日の寄託日で、Ｃｈｒ.Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ、デンマークにより、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ, Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７Ｂ、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）にて、受入番号ＤＳＭ ２７０３３の下で寄託されている。寄託は、特許手続の目的のための微生物の寄託の国際的承認におけるブダペスト条約の条件下で成された。
【００８９】
枯草菌（B.subtilis）株ＣＨＣＣ １５５４１は、２０１２年４月３日の寄託日で、Ｃｈｒ.Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ、デンマークにより、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ, Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７Ｂ、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）にて、受入番号ＤＳＭ ２５８４１の下で寄託されている。寄託は、特許手続の目的のための微生物の寄託の国際的承認におけるブダペスト条約の条件下で成された。
【００９０】
上記の同定された寄託微生物の全てについて、以下のさらなる指示を適用する：
それぞれの指定国のそれぞれの特許庁に関して、本出願人は、上記の寄託微生物のサンプルが、特許が付与される日、或いは本出願人が拒絶され、もしくは取り下げ、または取り下げたと見なされる日までに、請求人により指名された専門家に入手可能にさせることだけを請求する。
【００９１】
本発明の態様は、非限定的な実施例により、以下に発表される。
【実施例】
【００９２】
材料：
子ウシのインフュージョン培養液（ＶＩＢ）(Ｄｉｆｃｏ、２３４４２０) 
子ウシのインフュージョン培養液（ＶＩＢ）寒天（ＶＩＢ＋１．５％寒天 細菌学的（寒天、ｎｏ．１）、Ｏｘｏｉｄ ＬＰ００１１）
Ｔ３寒天プレート（リットルあたり：３ｇのトリプトン、２ｇのトリプトース、１．５ ｇのイースト抽出物、０．０５Ｍのリン酸二水素ナトリウム、及び０．００５ｇのＭｎＣｌ２ ［ｐＨ ６．８］、及び１５ｇの寒天）
Ｌａｕｒａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（Ｌｂ）培養液（ｇ／Ｌ：Ｂａｃｔｏ トリプトン １０（Ｄｉｆｃｏ ０１２３）、イースト抽出物５（Ｏｘｏｉｄ Ｌ２１）、ＮａＣｌ １０（Ｍｅｒｃｋ ｎｒ.１０６４０４））
ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培養液（Ｏｘｏｉｄ ＣＭ２２５）
ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天（Ｏｘｏｉｄ ＣＭ３７５）
胆汁塩（胆汁抽出物、ブタ；Ｓｉｇｍａ Ｂ８６３１）
バイオアッセイ皿（Ｎｕｎｃ ２４０８４５）
ペトリ皿（Ｐｒｏｃｕｄａｎ １４００９６、リブを伴うペトリ皿）
胞子形成培地：％（ｗ／ｗ）９５％の水；１．５％の窒素源（すなわちイースト）；３％のサッカリド；０．０６％の微量ミネラル；リン酸水素二カリウム０．１％。
ペプトンを有する生理食塩水（０．９％の塩化ナトリウム、１％のペプトン）ＦＫＰ
ＶｅｔＭＩＣ Ｌａｃｔ−１ ＆ Ｌａｃｔ−２（ＳＶＡ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）
ＩＳＯ−ＳＥＮＳＩＴＥＳＴ培養液（Ｏｘｏｉｄ ＣＭ０４７３）
【００９３】
培養物：
バチルス株は、排泄物、土壌、食物起源から単離し、そして株バンクコレクションから収集し、そしてＶＩＢ中で、２０％のグリセロールと共に、ＭＴＰマスタープレートにおいて−８０℃で維持した。
【００９４】
抗生物質：
アンピシリン（Ｓｉｇｍａ、Ａ９５１８−５Ｇ）
バンコマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｖ１７６４−２５０ＭＧ）
ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｇ１２６４−５０ＭＧ）
カナマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｋ１３７７−１Ｇ）
ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓ６５０１−５Ｇ）
エリスロマイシン（ＳｉｇｍａＥ−５３８９）
クリンダマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｃ２５６９−１０ＭＧ）
テトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ−７６６０）
クロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ、Ｃ０３７８−５Ｇ）
【００９５】
病原菌：
大腸菌（E.coli）Ｏ１０１ Ｆ５（Ｓｔａｔｅ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、コペンハーゲン、デンマーク）
大腸菌（E.coli）Ｏ１４７：Ｋ８９ Ｆ４（Ｓｔａｔｅ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、コペンハーゲン、デンマーク）
大腸菌（E.coli）Ｏ１４９：ｋ９１、ｋ８８ａ（ＮＣＴＣ １０６５０） Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ 
大腸菌（E.coli）株を、ＬＢ中で、２０％のグリセロールと共に、ＭＴＰマスタープレートにおいて−８０℃で維持した。
クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）Ａ型、ＤＳＭ ７５６を、ＢＨＩ中で、２０％のグリセロールと共に−８０℃で維持した。
【００９６】
実施例１：前スクリーニング
土壌及び排泄物及び食物起源から由来する２６１個の分離株を、抗生物質感受性、病原菌阻害、胆汁耐性及び低ｐＨへの感受性について前スクリーニングにかけた。
【００９７】
１．１ 抗生物質感受性
５０μＬの体積にあるバチルス株を、ＭＴＰマスタープレートから、ＤＷプレート中の７００μＬのＶＩＢ中に添加し、そして３７℃及び１７５ｒｐｍで、一晩培養した。表１に挙げた抗生物質を、２つの濃度で補充したＩＳＯ試験サンプル、及び抗生物質を含まないＩＳＯコントロールを、１８０μＬの体積にあるＭＴＰプレート中に添加した。一晩のバチルス培養物を１００倍に希釈し、そして２０μＬの分割量でＩＳＯ試験サンプル及びコントロールに移した。ＭＴＰプレートを、３７℃で培養した。６２０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を、接種材料中で、及びＭＴＰ試験プレート中で、培養の２４時間及び４８時間の後に測定した。細菌の抗生物質感受性を、ＩＳＯコントロール中のＯＤに対する、ＩＳＯ試験サンプル中のＯＤのパーセンテージとして見積もった。
【００９８】
１．２ 病原菌阻害に関するバチルス株のスクリーニング
５０μＬの体積にあるバチルス株を、ＭＴＰマスタープレートから、ＤＷプレート中の７００μＬのＶＩＢ中に添加し、そして３７℃及び１７５ｒｐｍで、一晩培養した。検定前に、大腸菌（E.coli）株を、ＬＢ中で、一晩、３０℃で成長させた。Ｃ．パーフリンジェンス（C.perfringens）ＣＨＣＣ１４３７２を、ＢＨＩ中で、一晩、嫌気性の瓶において、３７℃で成長させた。
【００９９】
１.２．１  寒天スポット試験による大腸菌（E.coli）阻害
２ｍＬの大腸菌（E.coli）の一晩培養物を、２００ｍＬの液体ＶＩＢ寒天と、５０℃で混合し、そしてそれぞれのバイオアッセイ皿に注いだ。消毒した作業台中で、皿を乾燥させた。一晩のバチルス培養物、それぞれ２μＬを、大腸菌（E.coli）と混合したＶＩＢ寒天の表面上にスポットし、そして３７℃で、２日間培養した。スポットを取り囲む明確にされた阻害域の半径を測定し、そして２ｍｍを上回る半径を「高」、０．５〜２ｍｍの半径を「中」、及び０．５ｍｍ未満の半径を「低」と記録した。
【０１００】
１.２．２  寒天スポット試験によるＣ．パーフリンジェンス（C.perfringens）阻害
ＶＩＢ寒天を、バイオアッセイ皿中に注ぎ（１皿につき２００ｍＬ）、そして消毒した作業台中で完全に乾燥させた。一晩のバチルス培養物、それぞれ２μＬを、ＶＩＢ寒天皿の表面上にスポットし、そして３７℃で、一晩培養した。２ｍＬの体積にあるＣ．パーフリンジェンス（C.perfringens）Ａ型ＣＨＣＣ１４３７２を、２００ｍＬの液体ＢＨＩ寒天に添加し、混合し、そしてバチルススポットを有するバイオアッセイ皿中にそっと置いた。皿を、嫌気性的に、２７℃で、１日培養した。スポットを取り囲む明確にされた阻害域の半径を測定し、そして２ｍｍ超を「高」、１〜２ｍｍを「中」、及び１ｍｍ未満を「低」と記録した。
【０１０１】
１.２．３  ウェル拡散試験によるＣ．パーフリンジェンス（C.perfringens）阻害
２ｍＬのＣ．パーフリンジェンス（C.perfringens）ＣＨＣＣ１４３７２の一晩培養物を、２００ｍＬの液体ＢＨＩ寒天と混合し、そしてそれぞれのバイオアッセイ皿に注いだ。固化後に、消毒した穴開け機により、ＢＨＩ寒天中に１０ｍｍのウェルを作り、そして８０μＬの一晩のバチルス培養物を、それぞれのウェル中に移した。皿を、嫌気的に、３７℃で、１日培養した。ウェルを取り囲む明確にされた阻害域の半径を測定し、そして２ｍｍ超を「高」、０．５〜２ｍｍを「中」、及び０．５ｍｍ未満を「低」と記録した。
【０１０２】
１．３ 胆汁耐性検定
５０μＬの体積にあるバチルス株を、ＭＴＰマスタープレートから、ＤＷプレート中の７００μＬのＶＩＢ中に添加し、そして３７℃及び１７５ｒｐｍで、一晩培養した。５０μＬの体積にあるバチルスの一晩培養物を、ＤＷプレート中の０．３％の胆汁塩を補充した８００μＬのＶＩＢ（試験サンプル）、及び胆汁を含まないＶＩＢ(コントロール)に移した。プレートを、３７℃及び１７５ｒｐｍで培養した。６２０ｎｍでの光学密度（ＯＤ620）を、胆汁を有するＶＩＢにおいて、０、６及び２４時間で測定し、そしてＶＩＢコントロールにおける対応するＯＤ620値から差し引いた。培養物を、ＯＤ620値の差異に従い、群Ａ（ＯＤ＜０．１）、Ｂ（ＯＤ＝０．１〜０．４）及びＣ（ＯＤ＞０．４）に階層化した。群Ａ中の株は、胆汁塩に最も耐性であると見なされた。選択株は、群ＡまたはＢにあるべきである。選択株の結果を表２に示す。
【０１０３】
１．４（胃の条件を刺激する）低いｐＨへの感受性
８００μＬのＶＩＢ分割量を、１．０Ｍの塩酸によりｐＨ４に調整し、そしてＶＩＢコントロール（ｐＨ７）を、ＤＷプレート中に分配した。５０μＬの体積にあるバチルス株を、ＭＴＰマスタープレートからＤＷプレート中に添加し、そして３７℃及び１７５ｒｐｍで、２４時間培養した。光学密度（ＯＤ620）を、２００μＬの細胞懸濁物中で、培養の０及び２４時間後の時点で測定した。培養前のＯＤ620値を、培養後の対応値から引くことにより、ｐＨ４での細菌の成長を定義した。０．１超のＯＤ620の増加を示す培養物は、ｐＨ４に耐性と見なされ（表２においてＲで示される）、その一方で、０．１未満のＯＤ620値を有する培養物（成長なし、または否定的な値）は、ｐＨ４に感受性であると見なされた（表２においてＳで示される）。
【０１０４】
１．５ 前スクリーニングの結果：
前スクリーング試験に基づき、３２株を２次スクリーニングのために選択した。選択株は、発表される抗生物質に感受性であるべきであり、また大腸菌（E.coli）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）の両方に対して抗菌効果を示すべきであり、また他の実施される試験において合理的に実施されるべきである。
【０１０５】
土壌及び排泄物及び食物起源から由来する２６１個の分離株中、１６１個の分離株は、前スクリーニング試験において抗生物質耐性であった。抗生物質に感受性であった１００個の分離株中、５６個は、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に対する抗菌効果を有し、また２２個だけが、大腸菌（E.coli）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）の両方に対する効果を有した。これらの中の１２個は、Ｂ．アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）種から由来する分離株であった。他の代表的な株は、枯草菌（B.subtilis）種及びＢ．モヤヴェンシス（B.mojavensis）種から由来した。表２及び３は、Ｃｈｒ.Ｈａｎｓｅｎ 所有株の結果を要約する（３２株中の２２個を、２次スクリーニングのために選択した）。
【０１０６】
実施例２：２次スクリーニング
１次スクリーニングの結果に基づき、４０個の選択分離株及び参照株を、寒天スポット試験の反復により、病原菌の阻害について、及び胞子形成について試験した。さらに３２個の株を、ＭＩＣ試験により、抗生物質感受性について試験した。
【０１０７】
２．１ 病原菌阻害に関するバチルス株のスクリーニング
検定前に、９ｍＬのＶＩＢにバチルス培養物を接種し、そして３７℃及び１７５ｒｐｍで、一晩培養した。同時に９ｍＬのＢＨＩ培養液に、大腸菌（E.coli）株を接種し、そして一晩、３７℃で培養した。クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）を、同一の条件で、嫌気性の瓶の中で成長させた。
【０１０８】
２．１．１  寒天スポット試験による大腸菌（E.coli）の阻害：
それぞれ２ｍＬの体積にある病原菌の一晩の培養物を、２００ｍＬの液体ＶＩＢ寒天中に、５０℃で添加し、そしてそれぞれのバイオアッセイ皿中に注いだ。消毒した作業台中で、皿を乾燥させた。一晩のバチルス株培養物を、病原菌と混合したＶＩＢ寒天の表面上にスポットし、そして３７℃で、２日間培養した。スポットを取り囲む阻害域の半径、及びスポット直径を記録した。
【０１０９】
２．１．２ 寒天スポット試験によるＣ．パーフリンジェンス（C.perfringens）の阻害
バチルス培養物を、ペトリ皿中のＶＩＢ寒天の表面上にスポットし、そして３７℃で、一晩培養した。２ｍＬの体積にあるＣ．パーフリンジェンス（C.perfringens）の一晩培養物を、２００ｍＬの液体ＢＨＩ寒天と混合し、そして成長したバチルススポットを有するＶＩＢ寒天中に注いだ。皿を、嫌気的に、３７℃で、１日培養した。スポットを取り囲む明確にされた阻害域の半径を測定した。
【０１１０】
２．２ ＶＩＢ及び胞子形成培地における成長
５０μＬの体積にあるバチルス株を、ＭＴＰマスタープレートから、ＤＷプレート中の７００μＬのＶＩＢ、または胞子形成培地中に添加し、そして３７℃及び１７５ｒｐｍで、２４時間培養した。バチルス成長を、２００μＬの懸濁物において、６２０ｎｍ（ＯＤ620）での光学密度により決定した。胞子形成培地の高い濁度、及びそのウェル間での変動のために、培養前のＯＤ620値を、培養後の対応するウェルにおけるＯＤ620値から差し引いた。０．４超のＯＤ620を示す培養物を群Ａ（高成長）、及び０．４未満のＯＤ620を群Ｂ（低成長）に階層化した。
【０１１１】
２．３ 胞子形成培地における胞子形成
５０μＬの体積にあるバチルス株を、ＭＴＰマスタープレートから、ＤＷプレート中の７００μＬのＶＩＢ中に添加し、そして３７℃及び１７５ｒｐｍで、一晩培養した。５０μＬの体積にあるバチルスの一晩培養物を、ＤＷプレート中の７００μＬの胞子形成培地（ＳＭ）に移した。プレートを、３７℃及び１７５ｒｐｍで、３日間培養した。胞子形成を微視的に観察し、そして胞子パーセンテージ（総細胞と比較した胞子の数）を、培養の１日（２４時間）、２日（４８時間）及び３日（７２時間）後の視覚評価により決定した。
【０１１２】
２．４ ＭＩＣにより測定した抗生物質感受性
多くの抗生物質に関し、株の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を測定することにより、抗生物質感受性について分析した。使用した方法は、ＣＬＳＩ標準（臨床・検査標準協会Ｍ０７−Ａ８及び Ｍ４５−Ａ２）により概説されるような培養液微量希釈法であった。
【０１１３】
一晩成長の試験株の懸濁物を、マイクロタイタープレートにおいて、１０5ｃｆｕ/ｍＬ（コロニー形成単位／ｍＬ）の適切な濃度で、試験される抗生物質の倍数連続希釈(総容積１００μＬ／ウェル)にて、ＩＳＯ-ＳＥＮＳＩＴＥＳＴ培養液（Ｏｘｏｉｄ ＣＭ０４７３）中に接種し、そして２０〜２４時間、３７℃で好気的に培養する。抗生物質アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン、及びクロラムフェニコールを含んで成る前加工パネルＶｅｔＭＩＣ Ｌａｃｔ-１ ＆ Ｌａｃｔ-２を使用し得る。結果は、目に見える成長を阻害する抗生物質の最も低い濃度として、２４時間後に記録する。２つの独立した生物学的反復として、試験を２回実施した。
【０１１４】
２．５ 結果
３２個の選択株の結果は、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）が、抗生物質感受性、抗菌効果及び胞子形成の最も良い組み合わせ特性を有したことを示した（表２を参照）。Ｃｈｒ.Ｈａｎｓｅｎ所有株（３２個の株中の２２個）に関するデータのみが含まれる。
【０１１５】
表２
選択されたバチルス株に関する基本データ
起源、ｇｙｒＢによる種、ＶＩＢ及び胞子形成培地における成長、並びに胞子形成パーセンテージ。
株Ａ=１５５１０；株Ｂ＝１５５１６；株Ｃ１５５４１；株Ｈ＝１５５３６；株Ｉ １５５３９
【０１１６】
【表２】
2015517809.tif 000004
【０１１７】
表３
選択バチルス株による大腸菌（E.coli）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）の阻害 （ｍｍ）、並びに胆汁及び酸に対する耐性
株Ａ＝ＣＨＣＣ１５５１０；株Ｂ＝１５５１６；株Ｃ＝１５５４１；株Ｈ＝１５５３６；株Ｉ＝１５５３９ 
Ｏ１４９、Ｏ１４７及びＯ１０１は、病原菌で述べた３つの大腸菌（E. coli）ブタ病原菌である。
【０１１８】
【表３】
2015517809.tif 000005
【０１１９】
実施例３：熱安定性
３．１ 熱安定性試験に関する方法
バチルス株を、一晩、ＶＩＢ中で、３７℃及び２２０ｒｐｍで成長させた。一晩培養物を、Ｔ３寒天プレート上に広げ（１００μＬの１０５〜１０６希釈物）、そして胞子形成が完了するまで、３７℃で、１〜２日間培養した。胞子をプレートからスクラップし、ＦＫＰ溶液中に懸濁し、そして増殖性細胞を不活性化するために８０℃で１５分間培養した。胞子懸濁物を、加熱後すぐに氷上に置いた。胞子調製品をＦＫＰ中で２回洗浄し、２０％のグリセロールを有するＦＫＰ中で再懸濁し、そして使用前に８０℃で保った。細菌胞子の熱耐性は、ＦＫＰ中に５００μＬの胞子懸濁物を（１ｍＬにつき、約１×１０６ＣＦＵの濃度で）有するエッペンドルフ管を、９９．５℃で、２、５及び１０分間保持することにより可能になった。ＣＦＵ計算は、３７℃で、一晩培養した後に、ＶＩＢ寒天上に固定した加熱懸濁物の希釈において決定した。
【０１２０】
３．２ 熱安定性に関する試験結果
熱安定性データを表４に示す。
表４ 選択バチルス株の９９．５℃での熱安定性；０時間に対する２、５及び１０分後の減少としてｃｆｕにおいて測定した（ｌｏｇ／ｌｏｇ）
株Ｂ＝１５５１６；株Ｃ＝１５５４１、株Ｈ＝１５５３６
【０１２１】
【表４】
2015517809.tif 000006
【０１２２】
一般に、０分に対し、２分後の２（ｌｏｇ／ｌｏｇ）ｃｆｕ未満の減少は、ペレット化用の飼料に含められる胞子に適切であり、また２を下回る結果は、一般的な商業用のバチルス胞子調製品により達成される。したがって試験され、また表４に示された全ての株は、良好な熱安定性を有する。さらにいくつかの株、すなわち株Ｂ及び株Ｆ（両方ともcuf減少がないことを示したＢ．アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）亜属. アミロリクエファシエンス（amyloliquefaciens））は、５及び１０分後に良好な熱安定性を示した。
【０１２３】
実施例４：酵素生産
４．１ セルラーゼ検定法
バチルス株を、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）培地（Ａｂｏｕ-Ｔａｌｅｂ等、２００９）（１つあたり：１０．０ｇのカルボキシメチルセルロース（Ｃ９４８１）、２．０ｇのＢａｃｔｏ トリプトン（ｃａｔ.２１１７０５、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａ/Ｓ、デンンマーク）、４ｇのＫＨ2ＰＯ4、４．０ｇのＮａ2ＨＰＯ4、０．２ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．００４ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ｐＨ ７）中で、３７℃で、及び２４時間の激しい磁気撹拌において成長させた。セルラーゼ生産は、製造者の指示書に従い、ＥｎｚＣｈｅｋ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔキット（ｃａｔ. Ｅ３３９５３、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて決定した。簡潔には、培養物の上澄みを遠心分離により収集し、そしてＭＴＰ（ウェルごとに２００μＬ）中に連続希釈で分配した。２Ｕ／ｍＬから出発して、黒色アスペルギルス（Ｃ１１８４）からのセルラーゼを用いて標準曲線を構築した。ＥｎｚＣｈｅｋ基質溶液を、Ｎｕｎｃ９６ウェルＢｌａｃｋ ＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃプレート（ｃａｔ.２３７１０５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＵＮＣ Ｉｎｃ.）中の培養物の上澄みに添加した。培養の３０分後に、蛍光を、励起３６０ｎｍ／発光４２０ｎｍで記録した（Ｅｎｓｐｉｒｅ ２３００ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｉｎｃ.）。セルラーゼ活性は、２つの独立した実験における標準曲線から算出し、そして手段（Ｕ／ｍＬ）として表した。
【０１２４】
４．２ キシラナーゼ検定法
バチルス培養物を、ブナ材キシラン(Ｃｏｒｄｅｉｒｏ等、２００２)を含む培地（１つあたり：５．０ｇのキシラン（Ｘ４２５２）、２．０ｇのイースト抽出物（ｃａｔ.２８８６２０、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａ/Ｓ、デンマーク)、５．０ｇのＢａｃｔｏペプトン（ｃａｔ.２１１６７７、 Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａ/Ｓ、デンマーク）、０．５ｇのＮａＣｌ、０．５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１５ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、ｐＨ７．５）中で、３７℃で、及び２４時間の激しい磁気撹拌において成長させた。キシラナーゼ検定は、製造者の指示書に従い、ＥｎｚＣｈｅｋ Ｕｌｔｒａキシラナーゼ検定キット（ｃａｔ.Ｅ３３６５０、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施した。簡潔には、培養物の上澄みを遠心分離により収集し、ＭＴＰ（ウェルごとに２００μＬ）中に連続希釈で分配し、そしてキシラナーゼ基質ワーキング溶液を添加した。培養の３０分後に、培養物の上澄み中の蛍光を、励起３６０ｎｍ／発光４２０ｎｍで測定した（Ｅｎｓｐｉｒｅ ２３００ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｉｎｃ.）。好熱性子嚢菌（Thermomyces lanuginosis）（Ｘ２７５３）を標準酵素として使用し、そして２５ｍＵ／ｍＬから出発する連続希釈でＭＴＰに充填した。バチルス株のキシラナーゼ活性は、標準曲線から算出し、そして２つの独立した検定の手段（ｍＵ／ｍＬ）として表した。
【０１２５】
４．３ プロテアーゼ検定法
バチルスの一晩株（３７℃で、ＶＩＢにおいて成長させた）を、基質としてフルオレセインイソチオシアネート-カゼイン（ＦＩＴＣ-Ｃ）（Ｓｉｇｍａ Ｃ３７７７）を有する反応混合物に移し、そして３７℃で、３時間培養した。沈殿後に適量のペプチドを、励起４９７ｎｍ／発光５１５ｎｍでの蛍光により測定した。本検定は、広範囲のプロテアーゼ（セリン、アスパラギン酸、システイン及びメタロプロテアーゼ）を検出する。
【０１２６】
４．４ バイオフィルム生産法
バチルス株を、ＶＩＢ（約１０7のＣＦＵ／ｍＬ）中に添加し、ポリプロピレン（ＰＰ）ＭＴＰ（９６ウェルＣｏｎｉｃａｌ Ｂｔｍ ＰＰ Ｐｌｔ Ｎａｔｕｒａｌ； ＮＵＮＣ Ｉｎｃ.,デンマーク）中に分配し、そして振らずに、３７℃で、２４時間培養した。６２０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）の測定により、成長を制御した。既に発表されているクリスタルバイオレット染色（Ａｕｇｅｒ等.２００９）により、バイオフィルム形成を評価した。簡潔には、蒸留水でウェルを洗浄した後に、０．１（ｗ／ｖ）％のクリスタルバイオレット溶液を、ＰＰ-ＭＴＰに添加し、そしてプレートを３０分間培養した。その後に洗浄手順を繰り返し、そして９６（ｖ／ｖ）％のエタノールをプレートに添加した。培養から１５分後に、５７０ｎｍでの吸収を測定した（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２ 分光光度計、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｉｎｃ.）。バチルス種株を、高（Ａｂｓ570nm ＞２．０）、中（Ａｂｓ570nm ＝１．０〜２．０）、または低（Ａｂｓ570nm ＜１．０）のいずれかのバイオフィルム生産物として分類した。検定は、２回繰り返して実施した。
【０１２７】
４．５.酵素検定の結果
表５ 酵素生産及びバイオフィルム
（ＲＦＵ＝相対蛍光単位）
株Ａ＝１５５１０；株Ｂ＝１５５１６；株Ｃ＝１５５４１；株Ｈ＝１５５３６：株Ｉ＝１５５３９
【０１２８】
【表５】
2015517809.tif 000007
【０１２９】
表は、全てＢ．アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）亜種.プランタラム（Plantarum）である株Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪが、高いセルラーゼ活性を有し、一方でＢ．アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）亜種.アミロリクエファシエンス（amyloliquefaciens）である株Ｂ及びＦが、低いセルラーゼ活性を有することを示す。
【０１３０】
実施例５：子ブタでの試験
２つの選択されたバチルス株（株ＢまたはＣ）を、幼獣用の食餌に補充し、成長成績へのそれらの効果、及び離乳後の子ブタの死亡率を評価した。大腸菌（E.coli）は、生産パラメーター及び死亡率に大きな衝撃を伴う幼獣期における主な病原菌の１つであり、これらの試験は、動物における大腸菌（E.coli）阻害の影響についての情報を与え得る。試験は、２つの異なる場所で実施し；場所１は研究飼育場、及び場所２は大学であった。試験設定は、両方の場所で同様であった。
表６
子ブタでの試験において使用された場所の概説
【０１３１】
【表６】
2015517809.tif 000008
【０１３２】
５．１．１ 場所１での試験設定
離乳日に実験飼育場の２つの連続した離乳バッチ（それぞれ２８８匹の子ブタ）から来た、５７６匹の子ブタ（２８日齢）を、実験において使用した。子ブタは、交配種（ＡＣＭＣ×ピエトレン）であった。選択された子ブタは、良好な一般的な状態を伴う健康体であり、また幼獣期に任意のワクチン接種を受けていなかった。実験飼育場は、豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）に陽性であったが、制御下にあり、また離乳期後におけるいくつかの大腸菌症の問題を有していた。体重により子ブタを分類し、そしてその後に、両方の処置において、それぞれの囲いの区画が、類似する体重の６匹の子ブタ、全部で３匹の雄及び３匹の雌を含むように、両方とも離乳バッチにある４８個の囲いに割り振った（合計で９６個の囲い）。処置は、それぞれの処置が６匹の子ブタの２４個の囲いに適用されるように（１つの処置及び部屋につき６個の囲い；１つの処置及び離乳バッチにつき１２個の囲い）、区画により、軽い子ブタと重い子ブタの囲いに割り振った。バチルス製品を、４００ｇ／トンの飼料、または１．２８＊１０  ７  ＣＦＵｇ／飼料で飼料に添加した。 
【０１３３】
ブタを、２８日齢（０日目；離乳日）、３５日齢、４２日齢及び６３日齢で個々に計量し、平均一日体重増加（ＡＤＷＧ）を計算した。平均一日飼料摂取（ＡＤＦＩ）及び飼料変換率（ＦＣＲ）を、同一相（２８〜３５；３５〜４２；４２〜６３）において、且つ主期間（プレスターター：２８〜４２日齢；スターター：４２〜６３日齢；及び総幼獣期間）について、囲いごとに測定した。死亡率及び病状の発生を、適用される個々の抗生物質処置の記載を含めて、毎日管理した。
表７
場所１での生産パラメーター
コントロールと比較したＰ値（Ａ：Ｐ＝＜０．１；ａ＝＜０．０５） 
株Ｂ＝１５５１６；株Ｃ＝１５５４１
ＳＥ＝標準誤差
【０１３４】
【表７】
2015517809.tif 000009
【０１３５】
５．１．２ 結果
幼獣用の食餌に補充される両方のバチルス株プロバイオティック製品は、陰性コントロール群と比較して、それらの間での差異を示さずに、生産性能を数値的に改良。ＡＤＧ及びＦＵの両方への有意な効果は、プレスターター相（２８〜４２日齢）において観察できた。死亡率パーセンテージは、両バチルス群において減少した（死亡率％：コントロール（３．４７）、株Ｂ（１．３９％）、株Ｃ（２．０８）) 。
【０１３６】
５．２．１ 場所２での実験設定
離乳直後に、全ての選択された子ブタを、２４個の囲いの離乳部屋に、囲いごとに３０匹の動物で住まわせた。部屋は、セントラルヒーティングを備え、また冷却システムを有する換気が施こされ、また完全に床張りであった。それぞれの囲いは、業務用の両面湿乾給餌器を備え、同時に３匹の動物へ給餌することを可能にする不断給餌、及び自由な飲水を保証した。給餌は、全実験段階を通して、不断に成された。
【０１３７】
計７２０匹の商業的な異種交配の離乳子ブタ［ピエトレン×（ランドレース×ラージホワイト）］を使用した。動物は、離乳日に同一の飼育場の雌ブタから獲得し、そして（移送せずに）実験施設に移した。７．０ｋｇ ＳＤ＝１．６４ｋｇのＢＷの２６日齢の雄及び雌の子ブタを使用した。動物の番号を付したプラスチックの耳タグ識別を使用した。動物を、最初の体重別に３つの区画に分けた。それぞれの区画の中の子ブタを、バランスのとれた体重分布で囲いに分けた。したがってそれぞれの区画は、実験食餌が無作為に割り当てられる、３０匹の動物の８個の囲いから成った。
【０１３８】
試験は、２８日齢の離乳時に開始した。動物を、試験の０及び７日目に個々に計量し、そして２１日目及び３５日目に群で計量した。実験を通して、それぞれのホッパーからの飼料の消失を測定した。その結果、飼料摂取の合計により平均一日飼料摂取（ＡＤＦＩ）、平均一日増加（ＡＤＧ）及び飼料取得率（ＦＣＲ）を計算した。子ブタの健康状態を定期的に評価し、そして任意の異常な兆候、または与えられた薬剤を記録した。死亡率及び処分のパーセンテージも計算した。
表８
場所２の生産パラメーター
最小二乗平均、コントロールと比較したＰ値（Ａ：Ｐ＝＜０．１） 
株Ｂ＝１５５１６；株Ｃ＝１５５４１
【０１３９】
【表８】
2015517809.tif 000010
【０１４０】
５．２．２ 結果
幼獣用の食餌に補充された両方のバチルス株は、陰性コントロール群と比較して、それらの間の差を示さずに生産性能を数値的に改善させた。ＡＤＧ及びＦＵの両方への有意な効果は、試験の間に観察できた。
【０１４１】
重篤な下痢を克服するために、囲いごとにエンロフロキサシンにより処置された動物の数は、離乳後の最初の週の間にバチルスを与えられた動物よりも、コントロール食を与えられたそれらの動物において有意に高かった（Ｐ＞０．０５）。同一の結果（Ｐ＜０．０５）は、全試験期間（離乳後０〜３５日）に観察された。死亡率パーセンテージは、両方のバチルス群において減少した（死亡率％：コントロール（４．１７）、株Ｂ（０．０４％）、株Ｃ（２．６５）） 。
【０１４２】
参照
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【図１】
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【国際調査報告】
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