(57)【要約】  本出願は、多発性硬化症などの神経炎症性疾患、および多発性硬化症などの神経炎症性疾患の影響を防止、処置、あるいは改善するために第ＸＩＩ因子阻害剤を投与する方法に関する。ＦＸＩＩの活性を阻害する薬剤および薬剤を含む医薬組成物も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経炎症性疾患の防止および／または処置および／または改善における使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。
【請求項２】
ＦＸＩＩ阻害剤が野生型インフェスチン−４ポリペプチド配列（配列番号２）、またはその変異体を含み、該変異体が：
（ａ）配列番号２のＮ末端アミノ酸２〜１３；および野生型インフェスチン−４配列との差異をもたらす、該Ｎ末端アミノ酸以外の少なくとも１個から最大５個のアミノ酸変異；
ならびに／または
（ｂ）６個の保存されたシステイン残基；および野生型インフェスチン−４配列に対する少なくとも７０％の相同性
を含む、請求項１に記載の使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。
【請求項３】
ＦＸＩＩ阻害剤が配列番号２のＮ末端アミノ酸２〜１３を含むように突然変異させたＳＰＩＮＫ−１（配列番号３）、または該突然変異させたＳＰＩＮＫ−１の変異体を含み、変異体が、
（ａ）配列番号２のＮ末端アミノ酸２〜１３；および野生型ＳＰＩＮＫ−１配列との差異をもたらし、野生型インフェスチン−４配列に対する該変異体の相同性を増加させる、該Ｎ末端アミノ酸以外の少なくとも１個から最大５個のアミノ酸変異；
ならびに／または
（ｂ）６個の保存されたシステイン残基；および野生型ＳＰＩＮＫ−１配列に対する少なくとも７０％の相同性
を含む、請求項１に記載の使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。
【請求項４】
ＦＸＩＩ阻害剤がＳＰＩＮＫ−１、またはＳＰＩＮＫ−１突然変異体Ｋ１、Ｋ２もしくはＫ３（それぞれ、配列番号３、４、５または６）を含む、請求項３に記載の使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。
【請求項５】
ＦＸＩＩ阻害剤が、Ｈ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＣＫ）、ＡＴＩＩＩ、アプロチニン、アルファ１プロテアーゼ阻害剤、アンチパイン（［（Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］−カルバモイル−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇｉｎａｌ）、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−アルデヒド−ジメチルアセテート、ＤＸ８８、プロリルオリゴペプチダーゼの阻害剤、特に、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒ−ＣＮ、コーン−トリプシン阻害剤、ウシ膵臓トリプシン阻害剤の突然変異体、エコチン、ＹＡＰ（コガネガレイ抗凝固タンパク質）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａのトリプシン阻害剤−Ｖ、またはＣｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａのイソ阻害剤のうちの１つまたはそれ以上を含む、請求項１に記載の使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。
【請求項６】
ＦＸＩＩ阻害剤が抗ＦＸＩＩ抗体またはその抗原結合断片を含み、抗体がＦＸＩＩに結合し、その活性および／または活性化を阻害する、請求項１に記載の使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。
【請求項７】
抗ＦＸＩＩ抗体またはその抗原結合断片が、（ａ）配列番号９に記載の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１に記載の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１３に記載の重鎖ＣＤＲ３を含むＶＨ領域；ならびに／または（ｂ）配列番号１４に記載の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５に記載の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１７に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、請求項６に記載の使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。
【請求項８】
抗ＦＸＩＩ抗体またはその抗原結合断片が、（ａ）配列番号９に記載の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０に記載の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１２に記載の重鎖ＣＤＲ３を含むＶＨ領域；ならびに／または（ｂ）配列番号１４に記載の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５に記載の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１６に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、請求項６または７に記載の使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。
【請求項９】
抗ＦＸＩＩ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７を含むＶＨ領域および配列番号８を含むＶＬ領域を含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。
【請求項１０】
抗ＦＸＩＩ抗体がＩｇＧである、請求項６〜９のいずれか１項に記載の使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。
【請求項１１】
ＦＸＩＩ阻害剤が、アルブミン、アファミン、アルファ−フェトタンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質、ヒトアルブミンもしくはその変異体、免疫グロブリンもしくはその変異体、ＰＥＧもしくはその変異体、またはＩｇＧのＦｃである半減期増強ポリペプチドに連結される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。
【請求項１２】
半減期増強ポリペプチドがリンカーを介してＦＸＩＩ阻害剤に連結される、請求項１１に記載の使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。
【請求項１３】
リンカーが
（ａ）切断可能である；
（ｂ）内因性、外因性、もしくは共通の凝固経路の凝固プロテアーゼにより切断可能である；
および／または
（ｃ）第ＸＩＩａ因子によって切断可能である、
請求項１２に記載の使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。
【請求項１４】
ＦＸＩＩ阻害剤がヒトアルブミン−リンカー−ＦＸＩＩ融合タンパク質である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。
【請求項１５】
神経炎症性疾患が多発性硬化症、横断性脊髄炎、または視神経脊髄炎（デビック病）である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。
【請求項１６】
多発性硬化症が再発寛解型多発性硬化症または一次性進行型多発性硬化症である、請求項１５に記載の使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、多発性硬化症などの神経炎症性疾患、および多発性硬化症などの神経炎症性疾患の影響を防止する、処置する、あるいは改善するために第ＸＩＩ因子阻害剤を投与する方法に関する。第ＸＩＩ因子の活性を阻害する薬剤および薬剤を含む医薬組成物も提供される。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（ＭＳ）は、その病理の一部として、免疫細胞の浸潤、脱髄、および軸索／神経損傷を含む様々な神経炎症性疾患の一部である。世界保健機関（ＩＣＤ−９−ＣＭ診断コード３４０）は、ＭＳを、虚弱、協調運動失調、感覚異常、および言語障害などの症状を含む中枢神経系におけるいくつかの領域の脱髄の存在を特徴とする慢性疾患と記載している。ＭＳおよびそれと同様の他の疾患は、炎症細胞が神経系に侵襲し、脱髄および組織破壊をもたらす自己免疫攻撃により引き起こされる（非特許文献１、非特許文献２）。組織病理学的結果は、細胞浸潤（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ）を有するＭＳプラークであり、これは最終的にはオリゴデンドログリアおよび軸索の損傷を引き起こすと考えられる。破壊的プロセスが進行するにつれて、脱髄は認知機能の障害をもたらす（非特許文献３、非特許文献４）。
【０００３】
脱髄は、神経軸索周囲の絶縁層を形成するミエリン鞘の喪失である。ミエリンは解剖学的位置に応じて異なる細胞型により産生される：オリゴデンドロサイトは中枢神経系（ＣＮＳ）の軸索を有髄化するが、シュワン細胞は末梢軸索を有髄化する。ミエリンは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、およびスフィンゴミエリンなどのいくつかのタンパク質および脂質から構成される。
【０００４】
脱髄疾患の徴候および症状は、脱髄の位置に応じて変わる。いくつかの一般的な徴候および症状は、視覚的問題（複視、眼振、または失明）、チクチクする痛み（ｔｉｎｇｌｉｎｇ）または無感覚（知覚障害）、言語障害、記憶喪失、熱感度、筋痙攣、筋力低下、および協調運動または平衡の喪失を含む。
【０００５】
「多発性硬化症」という名称は、脳および脊髄中のミエリンが失われた領域において形成する複数の瘢痕（「硬化症」）、または病変を指す。ＭＳの疾患パターンは変化してもよい。全米多発性硬化症協会（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）によれば、４つの標準化されたサブタイプが存在する：（１）再発寛解型、（２）二次性進行型、（３）一次性進行型、および（４）再発進行型。再発寛解型は、疾患の最も一般的な初期経過であり、疾患の新しい徴候がない期間が数ヶ月から数年続いてもよい寛解の期間によって隔てられた攻撃を特徴とする。二次性進行型疾患は、名称が意味する通り、再発寛解型ＭＳとして始まるが、明確な寛解期間が最終的には消失する。一次性進行型は、最初の発症後に意義のある寛解が起こっていない疾患を表すものである。進行再発型疾患においては、発症から一様な神経減少が起こるが、それに加えて多重的攻撃が起こる。
【０００６】
多発性硬化症は、臨床所見に加えて磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）に依拠するＭｃＤｏｎａｌｄ基準の２０１０年の改訂版を用いて診断することができる（非特許文献５）。一般に、２つ以上の攻撃または２つ以上の客観的な臨床病変を呈する患者は、さらなる臨床的証拠がなくてもＭＳを有すると考えられる。攻撃または証明できる病変がより少ない患者においては、診断は臨床的知見または臨床的および診断的（ＭＲＩ）知見による空間および／または時間における病変の普及の客観的証明に基づく。
【０００７】
ＭＳの病因は不明であるが、それは身体の免疫系がＣＮＳ中のミエリンを破壊する自己免疫疾患であることが一般に受け入れられている（非特許文献６）。ＣＮＳへの免疫細胞浸潤に関する必要条件は、通常は浸潤からＣＮＳを保護する血液脳関門における破壊である。このプロセスは、ＣＮＳ炎症をもたらし、これはＭＳの第２の病理学的特質である。多くの自己免疫疾患と同様、ＭＳは男性よりも女性においてより一般的であり、１００，０００人あたり約３人が罹患する（非特許文献７）。ＭＳに加えて、他の脱髄炎症疾患も起こる。例えば、中枢神経系の他の脱髄炎症疾患としては、特発性炎症性脱髄疾患、横断性脊髄炎、および視神経脊髄炎（デビック病）が挙げられる。炎症性脱髄は、末梢神経系においても生じ得る：その例としては、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ミラー・フィッシャー症候群、および抗ＭＡＧ末梢神経障害が挙げられる。
【０００８】
ＭＳのための現在の処置は、疾患の自己免疫性に基づくものであり、少なくとも部分的には、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）動物モデルを用いる実験に基づいて開発された（非特許文献８）。再発型のＭＳにおける処置のために２０１０年にＦＤＡによって認可されたフィンゴリモドは、ミエリンの破壊を媒介すると考えられる免疫細胞であるリンパ球を隔離することによって作用するリン脂質である（非特許文献９）。フィンゴリモドはまた、慢性炎症性脱髄性多発神経炎の処置のために２０１０年に欧州においてオーファンドラッグ指定を受けた（ＥＵ／３／０９／７１８）。ＭＳのためのより古い処置としては、免疫調節剤であるインターフェロンベータ−１ａおよびインターフェロンベータ−１ｂ、ならびにグラチラマー酢酸塩が挙げられる（非特許文献１０、非特許文献８）。インテグリンα４に対するヒト化モノクローナル抗体であるナタリズマブは、再発型のＭＳを有する患者の処置のために２００４年に認可された（非特許文献１１）。その使用は生命を脅かすウイルス感染（ＰＭＬ、進行性多巣性白質脳症）の危険性の増加と関連するため、それは一般的には第２選択治療として用いられる。ナタリズマブは、血液から組織中への細胞の通過に関与する特定の細胞接着分子への白血球の結合を遮断する。かくして、ナタリズマブは、ＣＮＳ中への免疫細胞の通過を防止することによって作用し、それによってミエリンのさらなる破壊を防止すると考えられる。ミトキサントロンは、ＤＮＡ合成を遮断する薬剤であり、したがって、リンパ球が増殖する能力を低下させ得る。
【０００９】
それぞれの現在認可されている治療は、再発型のＭＳにおける少なくとも攻撃の回数を減少させることにおいてはいくらかの有効性を示すが、その有効性は限られており、多くの場合、有意な副作用と関連し、長期的な治療を実現困難にしている。したがって、さらなる治療に関する大きな、満たされていない生物医学的な要求が存在する。
【００１０】
第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）は、内因性凝固カスケードの活性化に関与するセリンプロテアーゼである。それは、ポリアニオンとの接触によって活性化される（接触活性化）凝固因子として１９５５年に同定された。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、これらの表面は、活性化された血小板により分泌される無機ポリリン酸塩（ＰｏｌｙＰ）（非特許文献１２）、内皮細胞表面（ｑＣ１ｑＲ）、サイトケラチン１、ウロキナーゼ−プラスミノゲン活性化受容体（ｕ−ＰＡＲ、ＣＤ８７）、関節軟骨、皮膚、脂肪酸、内毒素、プロテオグリカン（ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸Ｅ、脂肪細胞ヘパリン）、およびアミロイドタンパク質（非特許文献１３）を含む。一度、ＦＸＩＩが活性化されてＦＸＩＩａを形成したら、ＦＸＩＩａが循環しているＦＸＩＩを活性化する正のフィードバック反応が起こる。低分子からタンパク質に及ぶ様々なＦＸＩＩ阻害剤が利用可能である。ＦＸＩＩは内因性の経路における開始因子であるが、外因性（組織因子）経路が血栓形成のための主な経路であるため、第ＸＩＩ因子欠損は出血の一因とはならない。
【００１１】
内因性経路におけるその確立された役割にも拘らず、第ＸＩＩ因子の生理学的役割は依然として不明確である（非特許文献１４、非特許文献１５）。ＦＸＩＩは、キニン−カリクレイン系によるブラジキニンの形成を介する炎症プロセスに関与する。ブラジキニンは、血管透過性、一酸化窒素の産生、およびアラキドン酸の移動を増加させる内皮細胞の活性化、ならびに感覚神経終末の刺激により引き起こされる、発赤、熱、腫れ、および疼痛の古典的炎症パラメータに寄与する。それは、虚血における病理学的血栓形成にも関与する（非特許文献１６）。ＦＸＩＩのさらに別の役割は、好中球の走化性、凝集、および脱顆粒におけるものである（非特許文献１７）。それは前炎症性サイトカインＩＬ−１の単球産生も増強することができ、補体系に関与する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｍｏｒａｌｅｓら、Ａｄｖ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００６；９８：２７〜４５頁
【非特許文献２】Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００６；３５４：９４２〜５５頁
【非特許文献３】Ｒａｇｏｎｅｓｅら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００８；１５：１２３〜７頁
【非特許文献４】Ｂｅｒｇａｍａｓｃｈｉら、Ｎｅｕｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ２００５；２５：１５〜１８頁
【非特許文献５】Ｐｏｌｍａｎら、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２０１１；６９：２９２〜３０２頁
【非特許文献６】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ；Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｃａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ２、Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１；４７６：２１４〜９頁
【非特許文献７】Ａｌｏｎｓｏ、２００８
【非特許文献８】Ｓｔｕｅｖｅら、Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．２０１０；６７：１３０７〜１５頁
【非特許文献９】ＧＩＬＥＮＹＡ（フィンゴリモド）、添付文書、２０１１年７月改訂版
【非特許文献１０】Ｈｅｒｒｍａｎｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２０１０；１７７：３０５１〜６０頁
【非特許文献１１】ＴＹＳＡＢＲＩ（ナタリズマブ）添付文書、２０１１年８月改訂版
【非特許文献１２】Ｍｕｌｌｅｒら、２０１０
【非特許文献１３】Ｓｃｈｍａｉｅｒ、２００８
【非特許文献１４】Ｓｃｈｍａｉｅｒ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００８；１１８：３００６〜９頁
【非特許文献１５】Ｓｔａｖｒｏｕ＆Ｓｃｈｍａｉｅｒ、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．２０１０
【非特許文献１６】Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｔｚら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００６；２０３：５１３〜８頁
【非特許文献１７】Ｗａｃｈｔｆｏｇｅｌら、１９８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
かくして、ＦＸＩＩは複数の複雑な経路に関与するが、ＦＸＩＩがこれらの経路のいずれかにとってｉｎ  ｖｉｖｏで必須であるかどうかは依然として不明確である。例えば、ＦＸＩＩが欠損したヒトは、大きな外科的処置の間でも異常な出血性素因に悩まされることがない（Ｓｃｈｍａｉｅｒ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００８；１１８：３００６〜９頁）。さらに、ＦＸＩＩはＭＳにおいて活性化されると報告されているフィブリン沈着（Ｍａｒｉｋら、Ｂｒａｉｎ  ２００７；１３０：２８００〜１５頁）、およびＭＳにも寄与し得るブラジキニンの活性化（Ｇｏｅｂｅｌら、Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０１１；３６：１０６〜１４頁）に関与し得るが、それがこれらの効果を引き起こすＦＸＩＩ依存的経路であるか、または外因性凝固経路によるフィブリン沈着などの同じ最終結果を共有する別の経路であるかどうかは不明確である。したがって、ＭＳの病理学的特色のいずれかにおけるＦＸＩＩの役割の直接的証明は、現在ない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
炎症性脱髄における第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）の役割は以前は認識されていなかったが、本出願の実施形態は、多発性硬化症および他の形態の炎症性脱髄を防止、処置、または改善するためのＦＸＩＩの阻害剤を提供する。本出願は、多発性硬化症などの神経炎症性疾患の影響を防止する、処置する、あるいは改善するために第ＸＩＩ因子阻害剤を投与する方法を提供する。「ＦＸＩＩ阻害剤」とは、第ＸＩＩ因子と活性化第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）のいずれかまたは両方の阻害剤を指す。
【００１５】
したがって、一態様において、本発明は、治療上有効量の第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）阻害剤を、それを必要とする対象に投与することによって、神経炎症性疾患を防止、処置、または改善することを含む、神経炎症性疾患を防止、処置、または改善する方法を提供する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、治療上有効量の第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含む、神経炎症性疾患を防止、処置、または改善する使用のための第ＸＩＩ因子の阻害剤を提供する。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は、治療上有効量の第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含む、神経炎症性疾患を防止、処置、または改善するための第ＸＩＩ因子阻害剤の使用を提供する。
【００１８】
本発明のいずれかの態様の様々な実施形態において、ＦＸＩＩ阻害剤は、野生型インフェスチン−４ポリペプチド配列（配列番号２）、またはその変異体を含んでもよく、その変異体は（ａ）配列番号２のＮ末端アミノ酸２〜１３；および野生型インフェスチン−４配列との差異をもたらす、Ｎ末端アミノ酸以外の少なくとも１個から最大５個のアミノ酸変異；ならびに／または（ｂ）６個の保存されたシステイン残基；および野生型インフェスチン−４配列に対する少なくとも７０％の相同性を含む。
【００１９】
本発明のいずれかの態様の様々な実施形態において、ＦＸＩＩ阻害剤は、配列番号２のＮ末端アミノ酸２〜１３を含むように突然変異されたＳＰＩＮＫ−１（配列番号３）、または突然変異ＳＰＩＮＫ−１の変異体を含んでもよく、その変異体は（ａ）配列番号２のＮ末端アミノ酸２〜１３；および野生型ＳＰＩＮＫ−１配列との差異をもたらし、野生型インフェスチン−４配列に対する変異体の相同性を増加させる、Ｎ末端アミノ酸以外の少なくとも１個から最大５個のアミノ酸変異；ならびに／または（ｂ）６個の保存されたシステイン残基；および野生型ＳＰＩＮＫ−１配列に対する少なくとも７０％の相同性を含む。
【００２０】
本発明のいずれかの態様の様々な実施形態において、ＦＸＩＩ阻害剤は、ＳＰＩＮＫ−１、またはＳＰＩＮＫ−１突然変異体Ｋ１、Ｋ２、もしくはＫ３（それぞれ配列番号３、４、５、または６）を含んでもよい。
【００２１】
本発明のいずれかの態様の様々な実施形態において、ＦＸＩＩ阻害剤は、Ｈ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＣＫ）、ＡＴ  ＩＩＩ、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、Ｃ１阻害剤、アプロチニン、アルファ−１プロテアーゼ阻害剤、アンチパイン（［（Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］−カルバモイル−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇｉｎａｌ）、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−アルデヒド−ジメチルアセテート、ＤＸ８８、ロイペプチン、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒ−ＣＮのようなプロリルオリゴペプチダーゼの阻害剤、コーン−トリプシン阻害剤、ウシ膵臓トリプシン阻害剤の突然変異体、エコチン、ＹＡＰ（コガネガレイ抗凝固タンパク質）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａのトリプシン阻害剤−Ｖ、またはＣｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａのイソ阻害剤を含んでもよい。
【００２２】
本発明のいずれかの態様の様々な実施形態において、ＦＸＩＩ阻害剤は、抗ＦＸＩＩ抗体またはその抗原結合断片を含んでもよく、その抗体はＦＸＩＩに結合し、その活性および／または活性化を阻害する。
【００２３】
ＦＸＩＩ阻害剤が抗体またはその抗原結合断片である実施形態においては、抗ＦＸＩＩ抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号９に記載の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１に記載の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１３に記載の重鎖ＣＤＲ３を含むＶＨ領域；ならびに／または（ｂ）配列番号１４に記載の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５に記載の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１７に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含んでもよい。これらの実施形態のいくつかにおいては、抗ＦＸＩＩ抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号９に記載の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０に記載の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１２に記載の重鎖ＣＤＲ３を含むＶＨ領域；ならびに／または（ｂ）配列番号１４に記載の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５に記載の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１６に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含んでもよい。ある特定の実施形態においては、抗ＦＸＩＩ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７を含むＶＨ領域および配列番号８を含むＶＬ領域を含む。抗体を含む実施形態のいずれかにおいて、抗ＦＸＩＩ抗体はＩｇＧであってもよい。いずれかの実施形態において、抗第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、１：０．２のＦＸＩＩａ−アルファと抗体のモル比で用いられる場合、５０％を超えてヒト第ＸＩＩａ−アルファを阻害してもよい。
【００２４】
本発明のいずれかの態様の様々な実施形態において、ＦＸＩＩ阻害剤を、アルブミン、アファミン、アルファ−フェトタンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質、ヒトアルブミンもしくはその変異体、免疫グロブリンもしくはその変異体、ＰＥＧもしくはその変異体、またはＩｇＧのＦｃである半減期増強ポリペプチドに連結することができる。これらの実施形態のいくつかにおいては、半減期増強ポリペプチドは、リンカーを介してＦＸＩＩ阻害剤に連結される。リンカーを含む実施形態のいくつかにおいては、リンカーは、（ａ）切断可能；（ｂ）内因性、外因性、もしくは共通の凝固経路の凝固プロテアーゼにより切断可能；および／または（ｃ）第ＸＩＩａ因子により切断可能であってもよい。
【００２５】
本発明のいずれかの態様の様々な実施形態において、ＦＸＩＩ阻害剤は、ヒトアルブミン−リンカー−ＦＸＩＩ融合タンパク質を含んでもよい。
【００２６】
本発明のいずれかの態様の様々な実施形態において、神経炎症性疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）であってもよい。ＭＳを含むこれらの実施形態のいくつかにおいては、ＭＳは再発寛解型多発性硬化症であってもよい。ＭＳを含む他の実施形態においては、ＭＳは一次性進行型多発性硬化症であってもよい。
【００２７】
本発明のいずれかの態様の様々な実施形態において、神経炎症性疾患は、横断性脊髄炎であってもよい。
【００２８】
本発明のいずれかの態様の様々な実施形態において、神経炎症性疾患は、視神経脊髄炎（デビック病）であってもよい。
【００２９】
本出願における実施形態のさらなる課題および利点は、以下の説明中に部分的に出現し、説明から一部明らかとなるか、またはそれらを実践において学習することができる。実施形態の課題および利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される要素および組合せを用いて自ら明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】インフェスチンのアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図２】インフェスチン−４（配列番号２）、ＳＰＩＮＫ−１（配列番号３）ならびに３つのＳＰＩＮＫ−１変異体（Ｋ１（配列番号４）、Ｋ２（配列番号５）、およびＫ３（配列番号６））のアミノ酸配列を比較する図である。＊は同一のアミノ酸を示し、｜はインフェスチン−４配列に関して類似するアミノ酸を示す。インフェスチン−４の下線付き配列は、Ｋ１を作成するためにＳＰＩＮＫ−１の１５アミノ酸を置きかえるために用いられた。変異体Ｋ２およびＫ３は、Ｋ１配列上でのさらなる点突然変異（下線付きアミノ酸）により作成された。
【図３】ヒトアルブミンのアミノ酸配列（配列番号１９）を示す図である。
【図４】時間の関数としてのマウスのＥＡＥスコアを示す図である。図４Ａは、対照マウス（Ｃｏｎ）と比較したＦＸＩＩ−／−マウスを示す。図４Ｂは、対照マウス（Ｃｏｎ）と比較したＦＸＩ−／−マウスを示す。図４Ｃおよび４Ｄは、免疫化の当日（図４Ｃ）または１２日目（図４Ｄ）から出発する対照と比較したＦＸＩＩ阻害剤ＰＣＫで処置したマウスに関するスコアを示す。
【図５−１】Ａ〜Ｅは、組織学的データおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの機能データをまとめた図である。図５Ａは炎症性病巣の数を示し、図５Ｂは脱髄した領域／スライスを示し、図５Ｃは対照マウス（左側のバー）、ＰＣＫ処置されたマウス（中央のバー）、およびＦＸＩＩ−／−マウス（右側のバー）における軸索計数を示す。対照マウス（Ｃｏｎ）とＰＣＫ処置されたマウスとの組織学的比較の例を、それぞれの棒グラフについて提示する。図５Ｄは、ＣＤ３／ＣＤ２８またはＭＯＧ刺激に応答する脾細胞の増殖を示す。図５Ｅは、対照マウス（左側のバー）、ＰＣＫ処置されたマウス（中央のバー）、およびＦＸＩＩ−／−マウス（右側のバー）からのサイトカイン分泌をまとめた図である。
【図５−２】図５−１の続き。
【図６】図６Ａは、ＦＸＩＩ阻害剤、ｒＨＡ−インフェスチン−４で処置したマウスに関する時間の関数としてのＥＡＥスコアを示す。図６Ｂは、対照マウス（左側のバー）とｒＨＡ−インフェスチン−４で処置されたマウス（右側のバー）におけるサイトカインＩＬ−１７のレベルを比較する。
【図７】抗第ＸＩＩ因子抗体（黒菱形）またはアイソタイプ対照抗体（白四角）で処置されたマウスに関する時間の関数としての麻痺スコアを示す図である。
【図８】サイトカインＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βに関する抗ＦＸＩＩ処置されたマウスおよび対照マウスの血液中のサイトカインレベルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本出願の実施形態は、神経炎症性疾患の影響を防止する、処置する、あるいは改善するために少なくとも１つの第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）阻害剤を患者に投与することを含む方法に関する。
【００３２】
本出願の実施形態の１つの利点は、ＦＸＩＩ阻害剤は良好な忍容性を示すと予想されるため、それらが他の薬物と比較して改善された安全性プロファイルを有し得ることである。さらに、ＦＸＩＩはいくつかの生理学的カスケードに関与し、その１つまたはそれ以上はＭＳなどの炎症性脱髄疾患に関与し得るため、ＦＸＩＩ阻害剤は単一標的治療と比較して良好な効能プロファイルを有し得る。
【００３３】
Ｉ．炎症性脱髄疾患
一態様において、本発明は、少なくとも１つの第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）阻害剤を、それを必要とする対象に投与することによって、神経炎症性疾患の影響を防止、処置、または改善することを含む、炎症性脱髄疾患の影響を防止する、処置する、あるいは改善する方法に関する。したがって、本発明はまた、炎症性脱髄疾患の影響を防止、処置、または改善するのに使用するための第ＸＩＩ因子阻害剤と薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物も提供する。
【００３４】
本明細書で用いられる用語「処置する」および「処置すること」は、症状の完全な排除を必要とせず、これらの用語は「治癒する」または「治癒すること」と等価ではない。そうではなく、「処置する」および「処置すること」は、疾患の少なくとも１つの徴候または症状が低減、阻害、低下、または遅延されたことを意味する。いくつかの実施形態においては、徴候または症状は以下に記載の一次または二次評価項目のうちの１つまたはそれ以上である。ある特定の実施形態においては、「処置する」または「処置すること」は、疾患の影響を改善することを含んでもよい。しかしながら、一般的には、「影響を改善すること」とは、患者の機能の障害を反映する疾患のいくつかの態様が改善されることを意味する。以下に記載のような、多発性硬化症（ＭＳ）に関するＫｕｒｔｚｋｅの総合障害度（Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｔａｔｕｓ  Ｓｃｏｒｅ（ＥＤＳＳ））（Ｋｕｒｔｚｋｅ  ＪＦ、Ｎｅｕｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．２００８；３１：１〜９頁）の使用を含む、疾患に関する確立された基準を用いて、機能的評価を行うことができる。本明細書で用いられる「防止すること」とは、炎症性脱髄疾患を発症する危険性があることが知られる対象への治療の投与を意味するか、または寛解した後、再発する疾患においては、「防止すること」は寛解にある患者における再発を阻害することを意味してもよい。ＭＳについて以下に注記されるように、「防止すること」は、患者が、ＭＳに関する全てではないが、いくつかの診断基準を満たすが、その診断基準を完全に満たす明白な疾患には進行しないことも意味する。
【００３５】
用語「神経炎症性疾患」および「炎症性脱髄疾患」は、脳または脊髄の１つまたはそれ以上の領域の炎症が起こっている、ヒト患者、または動物における状態を指すように、本質的には互換的に用いられる。これらの用語は、完全に等価ではないが、当業者であれば、神経炎症性疾患が脱髄を必ずしも要するわけではなく、脱髄が炎症後に生じることも多いことを理解するであろう。多発性硬化症は、ヒトにおける炎症性脱髄疾患の一例である。マウス、ラット、およびサルなどの様々な動物において、周知であり、ヒト疾患のモデルとして受け入れられているいくつかの異なる免疫化戦略によって炎症性脱髄を実験的に誘導することができる（Ｋｒｉｓｈｎａｍｏｏｒｔｈｙ＆Ｗｅｋｅｒｌｅ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；３９：２０３１〜３５頁に概説されている）。２つの異なる免疫化戦略を実施例に提示する。得られる誘導疾患、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、実験的疾患であるが、炎症性脱髄疾患の別の例であり、したがって、非ヒト対象に限定される。
【００３６】
いくつかの実施形態においては、炎症性脱髄疾患は、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患である。例示的な疾患としては、限定されるものではないが、多発性硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、横断性脊髄炎、および視神経脊髄炎（デビック病）が挙げられる。
【００３７】
いくつかの実施形態においては、炎症性脱髄疾患は、末梢神経系の疾患である。例示的な疾患としては、限定されるものではないが、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ミラー・フィッシャー症候群、および抗ＭＡＧ末梢神経障害が挙げられる。
【００３８】
ある特定の実施形態においては、本発明は、治療上有効量の少なくとも１つの第ＸＩＩ因子阻害剤を、それを必要とする対象に投与することによって、多発性硬化症を防止もしくは処置するか、または多発性硬化症の影響を改善することを含む、多発性硬化症の影響を防止、処置または改善する方法を提供する。したがって、本発明はまた、多発性硬化症の防止もしくは処置、または多発性硬化症の影響の改善における使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤と薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物も提供する。
【００３９】
多発性硬化症を含むこれらの実施形態においては、ＭＳを有する対象を、臨床所見に加えて磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）に依拠する「ＭｃＤｏｎａｌｄ基準」を用いて診断することができる（Ｐｏｌｍａｎら、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２０１１；６９：２９２〜３０２頁）。一般に、２つ以上の攻撃または２つ以上の客観的な臨床病変を呈する患者は、さらなる臨床的証拠がなくてもＭＳを有すると考えられる。攻撃または証明できる病変がより少ない患者においては、診断は臨床的知見または臨床的および診断的（ＭＲＩ）知見による空間および／または時間における病変の普及の客観的証明に基づく。空間における病変の普及の臨床的証拠は、中枢神経系の４つの以下の領域：脳室周囲、皮質近接（ｊｕｘｔａｃｏｒｔｉｃａｌ）、テント下、または脊髄のうちの少なくとも２つにおける１つまたはそれ以上のＴ２病変により証明される。時間における病変の普及は、任意の時点での追跡ＭＲＩにおける新しいＴ２病変および／もしくはガドリニウム増強病変または無症状性ガドリニウム増強病変および非増強病変の同時的存在により証明される。一次性進行型ＭＳは、１年の疾患進行（遡及も含む）と、Ａ）ＭＳに特徴的な少なくとも１つの領域（脳室周囲、皮質近接、もしくはテント下）における脳中の１つもしくはそれ以上のＴ２病変に基づく空間における普及の証拠、またはＢ）２つより多いＴ２病変に基づく脊髄中の空間における普及に関する証拠、ならびにＣ）脳脊髄液中のオリゴクローナルバンドの存在および／もしくはＩｇＧインデックスの上昇のうちの２つ以上を有する対象において診断される（Ｐｏｌｍａｎら、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２０１１；６９：２９２〜３０２頁）。
【００４０】
いくつかの実施形態においては、患者は、少なくとも１つの臨床的攻撃または少なくとも１つの客観的臨床病変を有するか、または有したことがあるが、ＭｃＤｏｎａｌｄ基準を用いて多発性硬化症の診断を確立するための十分な数の臨床的攻撃および客観的臨床病変を呈していない。そのような患者は、多発性硬化症の「危険性がある」患者であり、ＭＳの「危険性がある」患者へのＦＸＩＩ阻害剤の投与を用いて、ＭＳの診断をＭｃＤｏｎａｌｄ基準の下で行うことができる点まで対象が進行しないという意味でＭＳを防止することができる。したがって、一実施形態においては、多発性硬化症の危険性がある対象に少なくとも１つのＦＸＩＩ阻害剤を投与することによって、多発性硬化症を防止することを含む、多発性硬化症を防止する方法が提供される。同様に、本発明は、多発性硬化症の危険性がある対象における多発性硬化症を防止するのに使用するための、第ＸＩＩ因子阻害剤と薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物も提供する。
【００４１】
多発性硬化症と診断された対象を含むこれらの実施形態においては、対象を、疾患経過に基づいて、（１）再発寛解型、（２）二次性進行型、（３）一次性進行型、および（４）進行再発型ＭＳを有する対象にさらに分類することができる。
【００４２】
かくして、本発明は、ある特定の実施形態においては、治療上有効量の少なくとも１つの第ＸＩＩ因子阻害剤を、再発寛解型ＭＳと診断された患者に投与することによって、再発寛解型ＭＳを防止もしくは処置するか、または再発寛解型ＭＳの影響を改善することを含む、多発性硬化症の影響を防止、処置、または改善する方法を提供する。さらに、本発明は、再発寛解型多発性硬化症の影響の防止、処置、または改善における使用のための、第ＸＩＩ因子阻害剤と薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００４３】
さらなる実施形態において、本発明は、治療上有効量の少なくとも１つの第ＸＩＩ因子阻害剤を、二次性進行型ＭＳと診断された患者に投与することによって、二次性進行型ＭＳを防止もしくは処置するか、または二次性進行型ＭＳの影響を改善することを含む、多発性硬化症の影響を防止、処置、または改善する方法を提供する。さらに、本発明は、二次性進行型多発性硬化症の影響の防止、処置、または改善における使用のための、第ＸＩＩ因子阻害剤と薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００４４】
さらに他の実施形態において、本発明は、治療上有効量の少なくとも１つの第ＸＩＩ因子阻害剤を、一次性進行型ＭＳと診断された患者に投与することによって、一次性進行型ＭＳを防止もしくは処置するか、または一次性進行型ＭＳの影響を改善することを含む、多発性硬化症の影響を防止、処置、または改善する方法を提供する。さらに、本発明は、一次性進行型多発性硬化症の影響の防止、処置、または改善における使用のための、第ＸＩＩ因子阻害剤と薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００４５】
さらなる実施形態において、本発明は、治療上有効量の少なくとも１つの第ＸＩＩ因子阻害剤を、進行再発型ＭＳと診断された患者に投与することによって、進行再発型ＭＳを防止もしくは処置するか、または進行再発型ＭＳの影響を改善することを含む、多発性硬化症の影響を防止、処置、または改善する方法を提供する。さらに、本発明は、進行再発型多発性硬化症の影響の防止、処置、または改善における使用のための、第ＸＩＩ因子阻害剤と薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００４６】
いずれかの型のＭＳの影響を改善するか、またはそれを処置することの一例は、対象の障害度の低下または障害進行までの時間の増加である。障害度を、Ｋｕｒｔｚｋｅの総合障害度（ＥＤＳＳ）を用いて評価（またはスコア化）することができる（Ｋｕｒｔｚｋｅ  ＪＦ、Ｎｅｕｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  ２００８；３１：１〜９頁）。例えば、ある阻害剤が、１２週間にわたって持続したベースラインＥＤＳＳ≧１．０からのＥＤＳＳ上の少なくとも１ポイントの増加、または１２週間にわたって持続したベースラインＥＤＳＳ＝０からのＥＤＳＳ上の少なくとも１．５ポイントの増加と定義される、「障害の持続的増加」の開始までの時間を減少させる場合、その阻害剤は障害スコアを減少させる。いずれかの型のＭＳの影響を改善するか、またはそれを処置することの他の例を、ＭＲＩ：例えば、所定の期間、例えば、１２、２４、３６、もしくは４８ヶ月にわたる新しいか、もしくは新しく拡大するＴ２−高信号病変の中央数の減少；または所定の期間、例えば、１２、２４、３６、もしくは４８ヶ月にわたるＴ１ガドリニウム増強病変の数の減少により測定することができる。
【００４７】
一般に、本発明によるＦＸＩＩ阻害剤がＭＳを処置しているか、またはＭＳの影響を改善していることを示すために用いることができる基準としては、単独の、または任意の副組合せの以下の結果：造影ＭＲＩ病変数の程度の低下；障害の持続的蓄積（ＳＡＤ）評定の低下；再発の発生の減少；再発するまでの時間の増加；初回処置後、例えば、１、２、３年以上で再発していない患者の割合の増加；脳走査上での脳萎縮の比率の低下；ＭＲＩ
Ｔ２病変体積の減少；脳脊髄液（「ＣＳＦ」）オステオポンチンレベルの変化；総合障害度（ＥＤＳＳ）の改善；Ｔｉｍｅｄ  ２５−ｆｏｏｔ  Ｗａｌｋ（Ｔ２５ＦＷ）検査の改善；多発性硬化症機能障害スコア（ＭＳＩＳ）の改善；多発性硬化症機能評価短縮型３６健康調査（ＳＦ３６）の改善；脳脊髄液中のニューロフィラメント重鎖レベルの改善；脳脊髄液中のミエリン塩基性タンパク質レベルの改善；標準脳容積（ＮＢＶ）、灰白質容積（ＧＭＶ）、および／もしくは白質容積（ＷＭＶ）の改善；全脳、病変、正常に見える灰白質（ＮＡＧＭ）、もしくは正常に見える白質（ＮＡＷＭ）における磁化移動率（ＭＴＲ）の改善；病変、ＧＭおよびＮＡＷＭ中のＦＡおよびＡＤＣにおける拡散移動画像化（ＤＴＩ）の改善；ＣＳＦ細胞計数の改善；ＩｇＧインデックスの改善；ＣＳＦ窒素酸化物代謝物の改善；ＣＳＦ−血清アルブミン濃度比（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｑｕｏｔｉｅｎｔ）の改善；ＣＳＦ  ＣＸＣＬ１３レベルの改善；マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）レベルの改善；新しいガドリニウム増強病変（ＧｄＥＬ）の減少；Ｔ２加重ＭＲＩ画像上の病変の体積の減少、Ｔ２加重ＭＲＩ画像上の新しいか、もしくは拡大している病変の数の減少；これらの基準の任意の組合せ；またはこれらの基準の任意の副組合せが挙げられる。いずれかの基準について、処置が始まった時点に関して基準を判定することができる。
【００４８】
再発型のＭＳを含むこれらの実施形態においては、本発明によるＦＸＩＩ阻害剤が、年間再発率を減少させるか、または所定の期間、例えば、６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月、４８ヶ月、もしくは６０ヶ月（もしくはその間の任意の時間）にわたって再発していない患者の割合を増加させる場合、その阻害剤もＭＳを処置または改善する。
【００４９】
ＥＡＥモデルを用いて、特定のＦＸＩＩ阻害剤が多発性硬化症を防止、処置、または改善するかどうかを決定することができる。ＥＡＥモデルは許容されたＭＳの動物モデルであり、多発性硬化症の処置のためにＦＤＡによって認可された薬物を開発するために用いられてきた（例えば、Ｓｔｕｖｅら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．２０１０；６７：１３０７〜１５頁；Ｙｅｄｎｏｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９２）。したがって、特定のＦＸＩＩ阻害剤が、実施例に記載のものなどの１つまたはそれ以上のＥＡＥモデルにおいて活性を示す場合、当業者であれば、ＦＸＩＩ阻害剤が多発性硬化症の影響の防止、処置または改善においても活性を示すと予想することができる。しかしながら、ＥＡＥモデルにおける不活性は多発性硬化症における活性を排除するものではないことには注目すべきである。例えば、ＭＳのための１つの初期処置であるインターフェロンベータは、ＥＡＥモデルにおいてはあまり有効ではなかった（Ｓｔｕｖｅら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．２０１０；６７：１３０７〜１５頁）。
【００５０】
ＩＩ．ＦＸＩＩ阻害剤
用語「第ＸＩＩ因子」および「ＦＸＩＩ」はそれぞれ、第ＸＩＩ因子および活性化第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）のいずれかまたは両方を指す。かくして、「ＦＸＩＩ阻害剤」は、ＦＸＩＩおよびＦＸＩＩａのいずれかまたは両方の阻害剤を含む。さらに、抗ＦＸＩＩ抗体は、ＦＸＩＩおよびＦＸＩＩａのいずれかまたは両方に結合し、これを阻害する抗体を含む。用語「ＦＸＩＩ阻害剤」はまた、いくつかの実施形態においては、リンカーを含む半減期延長ポリペプチドに連結されたＦＸＩＩの阻害剤を含むことも意味する。
【００５１】
いくつかの実施形態においては、ＦＸＩＩ阻害剤は、ＦＸＩＩの直接的阻害剤である。用語「直接的」阻害剤とは、ＦＸＩＩ（またはＦＸＩＩａ）との接触（例えば、結合）を介して作用する阻害剤を意味する。対照的に、間接的阻害剤は、ＦＸＩＩ（またはＦＸＩＩａ）タンパク質と接触せずに作用し得る；例えば、アンチセンスＲＮＡを用いて、ＦＸＩＩ遺伝子の発現を減少させることができるが、それはＦＸＩＩタンパク質と直接的に相互作用するわけではない。かくして、直接的阻害剤とは対照的に、間接的阻害剤は、ＦＸＩＩタンパク質から上流または下流で作用する。直接的阻害剤のいくつかの例を、以下に提示する。ＦＸＩＩ阻害剤は、一般的には非内因性阻害剤である；すなわち、それらは炎症性脱髄疾患を有する対象の体内に天然に存在する阻害剤ではない。
【００５２】
Ａ．インフェスチン−４
一実施形態においては、本出願は、インフェスチンドメイン４、「インフェスチン−４」を含むＦＸＩＩ阻害剤を提供する。最近、インフェスチン−４は、活性化ＦＸＩＩ（ＦＸＩＩａ）の新規阻害剤であると報告された。インフェスチンは、シャーガス病を引き起こすことが知られる寄生虫Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉの主要な媒介生物である吸血昆虫、Ｔｒｉａｔｏｍａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓの中腸に由来するあるクラスのセリンプロテアーゼ阻害剤である（Ｃａｍｐｏｓ  ＩＴＮら、３２  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．９９１〜９９７、２００２；Ｃａｍｐｏｓ  ＩＴＮら、５７７  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５１２〜５１６頁、２００４）。この昆虫は、摂取された血液の凝固を防止するためにこれらの阻害剤を用いる。インフェスチンの完全長前駆体ポリペプチド配列が、図１に提供される（配列番号１）。インフェスチン遺伝子は、凝固経路における異なる因子を阻害することができるタンパク質をもたらす４個のドメインをコードする。特に、ドメイン４は、ＦＸＩＩａの強力な阻害剤であるタンパク質（インフェスチン−４）をコードする。インフェスチン−４は、出血性合併症を伴わずにマウスにおいて投与された（ＷＯ２００８／０９８７２０；Ｈａｇｅｄｏｒｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２０１０；１２１：１５１０〜１７頁）。
【００５３】
したがって、一実施形態においては、インフェスチン−４の変異体を含むＦＸＩＩ阻害剤が提供される。別の実施形態においては、ＦＸＩＩ阻害剤は、インフェスチンドメイン４、ならびに場合によりインフェスチンドメイン１、２および／または３を含む。これらのタンパク質は、ＦＸＩＩの強力な阻害剤であることが知られている（ＷＯ２００８／０９８７２０を参照されたい；また、Ｃａｍｐｏｓ  ＩＴＮら、５７７  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５１２〜５１６頁、２００４も参照されたい）。一実施形態においては、ＦＸＩＩ阻害剤は、（Ｈｉｓ）６タグ付きインフェスチン−４構築物である。別の実施形態においては、ＦＸＩＩ阻害剤は、アルブミン−リンカー−インフェスチン−４からなる融合タンパク質である。一実施形態においては、アルブミン−リンカー−インフェスチン−４は、Ｈａｇｅｄｏｒｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２０１０；１１７：１１５３〜６０頁に記載されたｒＨＡ−インフェスチン−４タンパク質である。ＦＸＩＩのインフェスチン阻害剤の例は、ＷＯ２００８／０９８７２０およびＨａｇｅｄｏｒｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２０１０；１１７：１１５３〜６０頁に記載されている。
【００５４】
本明細書で用いられる場合、インフェスチンの「変異体」という用語は、「突然変異」が野生型インフェスチン−４配列に対する置換、欠失、または付加と定義され、そのような変化がＦＸＩＩを阻害するポリペプチドの機能的能力を変化させないアミノ酸変異を有するポリペプチドを指す。用語「変異体」は、野生型または突然変異型インフェスチン−４配列の断片を含む。そのような変異体のさらなる例を、以下に提供する。
【００５５】
一実施形態においては、インフェスチン−４変異体は、野生型インフェスチン−４配列のアミノ末端に由来するアミノ酸配列ＶＲＮＰＣＡＣＦＲＮＹＶ（配列番号２の残基２〜１３）（図２中の下線付き配列を参照）、および野生型インフェスチン−４配列との差異をもたらす、Ｎ末端アミノ酸以外の少なくとも１個から最大５個のアミノ酸変異、および／または６個の保存されたシステイン残基、および／または野生型インフェスチン−４配列に対する少なくとも７０％の相同性を含む。したがって、いくつかの実施形態においては、インフェスチン−４の変異体は、野生型インフェスチン−４配列のアミノ酸２〜１３の保存されたＮ末端領域、および野生型インフェスチン−４配列との差異をもたらす、これらの保存されたＮ末端アミノ酸以外の少なくとも１個から最大５個のアミノ酸変異を含む。本明細書で用いられる場合、インフェスチン変異体の「Ｎ末端アミノ酸以外」という用語は、配列ＶＲＮＰＣＡＣＦＲＮＹＶ、すなわち、配列番号２に由来するアミノ酸２〜１３を含むアミノ酸の連続するストレッチ以外の変異体のポリペプチド鎖に沿った任意のアミノ酸を指す。別の実施形態においては、インフェスチン−４変異体は、６個の保存されたシステイン残基を含み、野生型インフェスチン−４配列に対する少なくとも７０％の相同性を有する。一実施形態においては、６個の保存されたシステイン残基は、野生型インフェスチン−４配列、配列番号２の６、８、１６、２７、３１および４８位のアミノ酸である（図２を参照されたい）。一実施形態においては、変異体は、４８位に最後の保存されたシステインを含む。他の実施形態においては、システイン残基の正確な位置および互いの相対的位置は、インフェスチン−４変異体中の挿入または欠失に起因して野生型インフェスチン−４配列の６、８、１６、２７、３１、および４８位から変化してもよい。それにも拘らず、これらの実施形態においては、インフェスチン−４変異体は、６個全てのシステインを含み、野生型インフェスチン−４配列に対する７０％、７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはその間の任意のパーセンテージの相同性を有してもよい。
【００５６】
一実施形態においては、ＦＸＩＩ阻害剤は、野生型インフェスチン−４ポリペプチド配列の変異体（配列番号２）を含み、その変異体は配列番号２のＮ末端アミノ酸２〜１３；野生型インフェスチン−４配列との差異をもたらす、前記Ｎ末端アミノ酸以外の少なくとも１個から最大５個のアミノ酸変異；６個の保存されたシステイン残基；および野生型インフェスチン−４配列に対する少なくとも７０％の相同性を含む。
【００５７】
インフェスチン−４変異体の実施形態においては、インフェスチン−４の変異体は、それがＦＸＩＩを阻害することを特徴とする。ＦＸＩＩを阻害する機能的活性を、例えば、ＦＸＩＩ酵素活性の阻害、凝固時間の延長、すなわち、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ；内因性凝固経路に対処する臨床凝固試験）を検査するための直接アッセイ、または凝固を評価するｉｎ  ｖｉｖｏ方法を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの特性評価により評価することができる。
【００５８】
インフェスチン−４変異体のさらなる例は、以下に記載されるＳＰＩＮＫ−１突然変異体である。
【００５９】
Ｂ．ＳＰＩＮＫ−１突然変異体
一実施形態は、ヒトにおける治療的使用のためのＦＸＩＩ阻害剤を含む。インフェスチン−４との高い類似性を有するヒトタンパク質を用いることができる。例えば、インフェスチン−４との最も高い類似性を有するヒトタンパク質は、膵臓中で発現されるＫａｚａｌ型セリンプロテアーゼ阻害剤（膵臓分泌トリプシン阻害剤、ＰＳＴＩとしても知られる）であるＳＰＩＮＫ−１である。Ｋａｚａｌ型セリンプロテアーゼ阻害剤ファミリーは、セリンプロテアーゼ阻害剤のいくつかのファミリーのうちの１つである。異なる種に由来する多くのタンパク質が記載されている（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ  ＭおよびＫａｔｏ  Ｉ、４９  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９３〜６２６頁、１９８０）。
【００６０】
野生型ＳＰＩＮＫ−１配列（配列番号３）に基づいて、異なる変異体を作成して、インフェスチン−４に対するＳＰＩＮＫ−１配列の相同性を増加させることができる。一実施形態においては、ＳＰＩＮＫ−１を、ＦＸＩＩ阻害機能にとって重要であると考えられる、配列番号２のＮ末端アミノ酸２〜１３を含むように突然変異させる。Ｋ１と呼ばれるポリペプチド配列を、配列番号４および図２に与える。
【００６１】
一実施形態においては、突然変異型ＳＰＩＮＫ−１の変異体はまた、野生型インフェスチン−４配列（配列番号２）のＮ末端アミノ酸２〜１３、および野生型ＳＰＩＮＫ−１配列との差異をもたらし、野生型インフェスチン−４配列に対する変異体の相同性を増加させる、前記Ｎ末端アミノ酸以外の少なくとも１個から最大５個のアミノ酸変異も含む。別の実施形態においては、突然変異型ＳＰＩＮＫ−１の変異体は、６個の保存されたシステイン残基を含み、野生型ＳＰＩＮＫ−１配列に対する少なくとも７０％の相同性を有する。突然変異は、置換、欠失、または付加であってもよい。上記で定義された通り、用語「Ｎ末端アミノ酸以外」とは、配列ＶＲＮＰＣＡＣＦＲＮＹＶ、すなわち、配列番号２のアミノ酸２〜１３を含むアミノ酸の連続するストレッチ以外の変異体のポリペプチド鎖に沿った任意のアミノ酸を指す。用語「変異体」は、前記突然変異型ＳＰＩＮＫ−１配列の断片を含む。一実施形態においては、６個の保存されたシステイン残基は、野生型ＳＰＩＮＫ−１配列（配列番号３、図２を参照されたい）の９、１６、２４、３５、３８、および５６位のアミノ酸であってもよい。一実施形態においては、変異体は、最後の保存されたシステインを含む。別の実施形態においては、システインの正確な位置、および互いの相対的位置は、ＳＰＩＮＫ−１変異体中の挿入または欠失に起因して野生型ＳＰＩＮＫ−１配列の９、１６、２４、３５、３８、および５６位から変化してもよい。それにも拘らず、これらの実施形態においては、ＳＰＩＮＫ−１変異体は、６個全部のシステインを含む。実施形態において、ＳＰＩＮＫ−１変異体も、それがＦＸＩＩを阻害することを特徴とする。
【００６２】
一実施形態においては、ＦＸＩＩ阻害剤は、ＳＰＩＮＫ−１の変異体（配列番号３）を含み、ＳＰＩＮＫ−１変異体は配列番号２のＮ末端アミノ酸２〜１３；野生型ＳＰＩＮＫ−１配列との差異をもたらし、野生型インフェスチン−４配列に対する変異体の相同性を増加させる、前記Ｎ末端アミノ酸以外の少なくとも１個から最大５個のアミノ酸変異；６個の保存されたシステイン残基；および野生型ＳＰＩＮＫ−１配列に対する少なくとも７０％の相同性を含む。
【００６３】
ＳＰＩＮＫ−１変異体の例が与えられ、Ｋ１、Ｋ２およびＫ３（それぞれ、配列番号４、５および６）と命名される。ＳＰＩＮＫ−１変異体Ｋ２およびＫ３において、Ｎ末端以外のさらなるアミノ酸置換をＫ１に関して作製して、インフェスチン−４に対する相同性を増加させ、この変異体はまた、それらがＦＸＩＩ活性を阻害することを特徴とする。ＷＯ２００８／０９８７２０を参照されたい。図２は、これらの変異体のアミノ酸配列およびＳＰＩＮＫ−１野生型配列に対する変化の程度を示す。ＳＰＩＮＫ−１変異体Ｋ３の場合、５個のアミノ酸置換はインフェスチン−４との相同性を増加させる。かくして、実施形態においては、ＳＰＩＮＫ−１変異体は、野生型ＳＰＩＮＫ−１配列との７０％、７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはその間の任意のパーセンテージの相同性を有してもよい。
【００６４】
Ｃ．他のＦＸＩＩ阻害剤
ＦＸＩＩとＦＸＩＩａの両方の阻害剤を含む、ＦＸＩＩの他の阻害剤は、ＷＯ２００６／０６６８７８に記載されている。したがって、いくつかの実施形態においては、ＦＸＩＩ阻害剤は、抗トロンビン１１１（ＡＴ１１１）、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、Ｃ１阻害剤、アプロチニン、アルファ−１プロテアーゼ阻害剤、アンチパイン（［（Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］−カルバモイル−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇｉｎａｌ）、Ｚ−Ｐｒｏ−プロアルデヒド−ジメチルアセテート、ＤＸ８８（Ｄｙａｘ  Ｉｎｃ．、３００  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｑｕａｒｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ０２１３９、ＵＳＡ；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＡおよびＢａｉｒｄ  ＬＧ、２９  Ｔｒａｎｓｆｕｓ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  Ｓｃｉ．２５５〜２５８頁、２００３に引用）、ロイペプチン、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒ−ＣＮのようなプロリルオリゴペプチダーゼの阻害剤、コーン−トリプシン阻害剤、ウシ膵臓トリプシン阻害剤の突然変異体、エコチン、コガネガレイ抗凝固タンパク質、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａのイソ阻害剤などのＣｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａのトリプシン阻害剤−Ｖ、またはハマダリン（Ｉｓａｗａ  Ｈら、２７７  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６５１〜２７６５８頁、２００２により開示される）である。
【００６５】
さらに他の実施形態においては、ＦＸＩＩ阻害剤は、Ｈ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＣＫ）である（Ｔａｎｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７；１６４：６３７〜４２頁；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｔｚら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００６；２０３：５１３〜８頁）。
【００６６】
さらに他の実施形態においては、ＦＸＩＩ阻害剤は、米国特許第６，６１３，８９０号のカラム４〜８に開示されたアミロイド前駆体タンパク質のＫｕｎｉｔｚプロテアーゼ阻害剤ドメインの類似体である。
【００６７】
Ｄ．ＦＸＩＩ抗体
他の実施形態においては、ＦＸＩＩ阻害剤は、ＦＸＩＩに結合し、ＦＸＩＩ活性化および／または活性を阻害する抗ＦＸＩＩ抗体である。抗ＦＸＩＩ抗体は、例えば、ＷＯ２００６／０６６８７８およびＲａｖｏｎら、１  Ｂｌｏｏｄ  ４１３４〜４３頁、１９９５に記載されている。ヒト第ＸＩＩ因子に対する他のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）としては、Ｐｉｘｌｅｙら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９８７；２６２、１０１４０〜４５頁）により記載されたＢ７Ｃ９  ｍＡｂ、Ｓｍａｌｌら（Ｂｌｏｏｄ  １９８５；６５：２０２〜１０頁）により記載されたｍＡｂ；Ｎｕｉｊｅｎｓら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：１２９４１〜４９頁）により記載されたｍＡｂ  Ｆ１およびＦ３；ＷＯ８９／１１８６５に記載されたＦＸＩＩの軽鎖に対するＢ６Ｆ５、Ｃ６Ｂ７およびＤ２Ｅ１０  ｍＡｂ；ＷＯ９０／０８８３５に記載されたＦＸＩＩよりもＦＸＩＩａ−βに選択的に結合するｍＡｂ；ならびにＷＯ９１／１７２５８に記載された抗ＦＸＩＩ抗体ＯＴ−２が挙げられる。
【００６８】
さらなる抗第ＸＩＩ因子／ＦＸＩＩａモノクローナル抗体およびその抗原結合断片は、参照によって本明細書に組み入れられる２０１１年７月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／５１０，８０１号に記載されている。これらの抗体は、ヒト第ＸＩＩ因子よりもヒト第ＸＩＩａ−ベータに対する２倍を超える高い結合親和性を有し、ヒト第ＸＩＩａ因子のアミド分解活性を阻害することができる。いくつかの実施形態においては、前記抗体またはその抗原結合断片は、１つまたはそれ以上の下記特徴を有する：（ａ）マウスＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに結合する；（ｂ）配列番号７の配列と８５％を超えて同一である重鎖可変（ＶＨ）領域を含む；（ｃ）配列番号８の配列と８５％を超えて同一である軽鎖可変（ｖＬ）領域を含む；（ｄ）配列番号９の配列と少なくとも８０％同一である重鎖ＣＤＲ１、および／もしくは配列番号１０と少なくとも６０％同一である重鎖ＣＤＲ２、および／もしくは配列番号１２の配列と少なくとも８０％同一である重鎖ＣＤＲ３を含む；（ｅ）配列番号１４と少なくとも５０％同一である軽鎖ＣＤＲ１、および／もしくは配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２、および／もしくは配列Ａ−Ｘ１−Ｗ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｒ−Ｘ６−Ｘ７（式中、Ｘ１はＡもしくはＳであってよく、Ｘ５はＬもしくはＶであってよく、他のＸｎは任意のアミノ酸であってよい）（配列番号１７）を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む；（ｆ）１０−８Ｍより良好なＫＤでヒト第ＸＩＩａ因子−ベータに結合する；（ｇ）ヒト第ＸＩＩａ因子−ベータへの結合について、インフェスチン−４と競合する；または（ｈ）ヒトＩｇＧもしくはその変異体、好ましくはヒトＩｇＧ４もしくはその変異体である。
【００６９】
他の実施形態においては、抗ＦＸＩＩ抗体は、ヒトＦＸＩＩに結合するＩｇＧ抗体であり、（ａ）配列番号９に記載の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１に記載の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１３に記載の重鎖ＣＤＲ３を含むＶＨ領域；ならびに／または（ｂ）配列番号１４に記載の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５に記載の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１７に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。配列番号１１を含む重鎖ＣＤＲ２は、配列ＧＩＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＴＶＹＡＤＳＶＫＧ（式中、Ｘ１はＲ、ＮまたはＤであり、Ｘ２はＰ、Ｖ、ＩまたはＭであり；Ｘ３はＳ、ＰまたはＡであり；Ｘ４はＧ、Ｌ、Ｖ、またはＴであり；Ｘ５は任意のアミノ酸であってよく、好ましくは、Ｘ５はＧ、Ｙ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、またはＭであり；Ｘ６はＴ、Ｇ、またはＳである）を含む。配列番号１３を含む重鎖ＣＤＲ３は、配列ＡＬＰＲＳＧＹＬＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＹＹＹＹＡＬＤＶ（式中、Ｘ１はＩ、ＭまたはＶであり；Ｘ２はＳまたはＫであり；Ｘ３はＰ、Ｋ、ＴまたはＨであり；Ｘ４はＨ、Ｎ、ＧまたはＱである）を含む。配列番号１７を含む軽鎖ＣＤＲ３は、配列
ＡＸ１ＷＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＲＸ６Ｘ７（式中、Ｘ１はＡまたはＳであり；Ｘ２はＤ、Ｙ、Ｅ、Ｔ、Ｗ、ＥまたはＳであり；Ｘ３はＡ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｐ、ＱまたはＥであり；Ｘ４はＳ、Ｄ、Ｐ、Ｅ、ＱまたはＲであり；Ｘ５はＬまたはＶであり；Ｘ６はＧ、ＬまたはＫであり；Ｘ７はＶ、Ａ、Ｄ、Ｔ、ＭまたはＧである）を含む。
【００７０】
他の実施形態においては、抗ＦＸＩＩ抗体抗原結合断片は、ヒトＦＸＩＩに結合し、（ａ）配列番号９に記載の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０に記載の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１２に記載の重鎖ＣＤＲ３を含むＶＨ領域；ならびに／または配列番号１４に記載の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５に記載の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１６に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含むＩｇＧ抗体の断片である。
【００７１】
一実施形態においては、抗ＦＸＩＩ抗体またはその抗原結合断片は、実施例３で用いられる抗体「３Ｆ７」である。３Ｆ７の可変領域およびＣＤＲの配列は、表１に提示される。
【００７２】
【表１】
2015511221.tif 000002
【００７３】
さらに他の実施形態においては、抗ＦＸＩＩ抗体またはその抗原結合断片は、親和性成熟した（３Ｆ７に関して）抗体ＶＲ１１５、ＶＲ１１２、ＶＲ２４、ＶＲ１１０、ＶＲ１１９から選択される。
【００７４】
【表２】
2015511221.tif 000003
【００７５】
上記の通り、配列番号１１は縮重配列である。ＶＲ１１９は、Ｘ１がＮであり、Ｘ２がＶであり、Ｘ３がＰであり；Ｘ４がＬであり、Ｘ５がＹであり；Ｘ６がＧである配列番号１１を含む。ＶＲ１１２は、Ｘ１がＮであり、Ｘ２がＶであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＶであり、Ｘ５がＱであり、Ｘ６がＧである配列番号１１を含む。ＶＲ１１５は、Ｘ１がＤであり、Ｘ２がＩであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＴであり、Ｘ５がＫであり、Ｘ６がＧである配列番号１１を含む。ＶＲ１１０は、Ｘ１がＤであり、Ｘ２がＭであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＴであり、Ｘ５がＫであり、Ｘ６がＧである配列番号１１を含む。ＶＲ２４は、ユニークなＬＣＤＲ１：ＳＧＳＳＥＭＴＶＨＨＹＶＹ（配列番号１８）を含む。
【００７６】
抗体ＣＤＲを含む実施形態においては、ＣＤＲはＫＡＢＡＴの番号付けシステムに従って定義される（Ｋａｂａｔ  ＥＡ、Ｗｕ  ＴＴ、Ｐｅｒｒｙ  ＨＭ、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ  ＫＳ、Ｆｏｅｌｌｅｒ  Ｃ（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．）。
【００７７】
いくつかの実施形態においては、抗体またはその抗原結合断片は、１：０．２のＦＸＩＩａ−アルファと抗体とのモル比で用いた場合、第ＸＩＩａ−アルファを４０％より多く、５０％より多く、または６０％より多く阻害する抗第ＸＩＩ因子／ＦＸＩＩａモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態においては、抗体またはその抗原結合断片は、１：０．５のＦＸＩＩａ−アルファと抗体とのモル比で、第ＸＩＩａ因子−アルファを８０％より多く、８５％より多く、または９０％より多く阻害する。一実施形態においては、抗体は１：０．５のモル比で、ＦＸＩＩａ−アルファの完全な阻害を達成する。一実施形態においては、ＦＸＩＩａ−アルファはヒト第ＸＩＩａ因子−アルファである。一実施形態においては、抗体またはその抗原結合断片は、抗体３Ｆ７と少なくとも同等であるヒトＦＸＩＩａに対する親和性を有する。
【００７８】
上記で考察された通り、「抗ＦＸＩＩ抗体」は、ＦＸＩＩおよびＦＸＩＩａのいずれかまたは両方に結合し、これを阻害する抗体を含む。一実施形態においては、抗体は完全長Ｉｇ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖの形態、または他の形態もしくはその変異体にあってもよい。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよい。抗体は、そのアイソタイプがＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＥ、またはその任意のサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、またはその変異体であることを特徴としてもよい。抗体は、限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ハムスター、またはサルなどの哺乳動物種に由来するものであってもよい。抗体は、ヒト化またはＣＤＲ移植されていてもよい。抗体は、免疫原性、半減期を変化させるために、または治療的抗体に関連する他の有利な特性を付与するために突然変異または改変されていてもよい。一実施形態においては、抗体は、中和エピトープなどの、ＦＸＩＩ（ここで、「ＦＸＩＩ」はＦＸＩＩおよびＦＸＩＩａを含む）の重鎖または軽鎖上のエピトープに結合する抗ＦＸＩＩ抗体である。抗体は、ＦＸＩＩへの結合に関する高い親和性および／または高いアビディティを有してもよい。抗体を、ポリペプチド、核酸または小分子にコンジュゲートしてもよい。
【００７９】
別の実施形態においては、ＦＸＩＩ阻害剤は、タンパク質、ペプチド、核酸、または小分子である。用語「小分子」とは、低分子量化合物を指す。小分子は、例えば、細胞膜を越えて拡散することができる１０００ダルトン未満であってもよい。小分子は、それがＦＸＩＩに高い親和性で結合することを特徴としてもよい。好ましい小分子は、ＧＩ管から吸収され得るものである。
【００８０】
Ｅ．半減期増強ポリペプチドに連結されたＦＸＩＩ阻害剤
本出願の別の態様は、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）に連結されたＦＸＩＩ阻害剤を提供する。一実施形態においては、ＦＸＩＩ阻害剤は、低分子タンパク質である。したがって、他の低分子タンパク質について公開されたような迅速な腎クリアランスを期待することができる（Ｗｅｒｌｅ  ＭおよびＢｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ  Ａ、Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ２００６；３０：３５１〜３６７頁）。ポリペプチド化合物の短い血漿半減期に対処するための１つの方法は、それを反復的に、または連続輸注により注射することである。別の手法は、ポリペプチド自身の内因性血漿半減期を増加させることである。例えば、一実施形態においては、ＦＸＩＩ阻害剤は、半減期延長タンパク質に連結される。
【００８１】
「半減期増強ポリペプチド」は、患者または動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＸＩＩ阻害剤の半減期を増加させる。例えば、アルブミンおよび免疫グロブリンおよびその断片または誘導体が、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）として記載されている。Ｂａｌｌａｎｃｅら（ＷＯ２００１／７９２７１）は、ヒト血清アルブミンに融合させた場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでの機能的半減期の増加および保存可能期間の延長を有すると予測される複数の異なる治療的ポリペプチドの融合ポリペプチドを記載した。
【００８２】
用語「アルブミン」および「血清アルブミン」は、ヒトアルブミン（ＨＡ）およびその変異体（その完全な成熟形態は配列番号１９に与えられる）、ならびに他の種に由来するアルブミンおよびその変異体を包含する。本明細書で用いられる「アルブミン」とは、アルブミンの１つまたはそれ以上の機能的活性（例えば、生物活性）を有する、アルブミンポリペプチドもしくはアミノ酸配列、またはアルブミン変異体を指す。本明細書で用いられる場合、アルブミンは、ＦＸＩＩ阻害剤の治療的活性を安定化させるか、または延長することができる。アルブミンは、任意の脊椎動物、特に、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、またはブタから誘導することができる。非哺乳動物アルブミンとしては、限定されるものではないが、ニワトリおよびサケに由来するアルブミンが挙げられる。アルブミン連結ポリペプチドのアルブミン部分は、治療的ポリペプチド部分とは異なる動物に由来するものであってもよい。アルブミン融合タンパク質の例については、ＷＯ２００８／０９８７２０を参照されたい。
【００８３】
一実施形態においては、アルブミン変異体は、少なくとも１０、２０、４０、もしくは少なくとも７０アミノ酸長であるか、またはヒトアルブミン（ＨＡ）配列（例えば、図３に記載の配列、配列番号１９）に由来する１５、２０、２５、３０、５０個以上の連続するアミノ酸を含んでもよく、またはＨＡの特定のドメインの一部もしくは全部を含んでもよい。アルブミン変異体は、アミノ酸置換、欠失、または付加、保存的または非保存的置換のいずれかを含んでもよく、そのような変化は半減期増強ポリペプチドの治療的活性を付与する活性部位、または活性ドメインを実質的に変化させない。これらの変異体は、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはその間の任意のパーセンテージの相同性を有してもよい。
【００８４】
一実施形態においては、アルブミン変異体は、断片を含み、アルブミンの少なくとも１つの全ドメインまたは前記ドメインの断片、例えば、ドメイン１（配列番号１９のアミノ酸１〜１９４）、２（配列番号１９のアミノ酸１９５〜３８７）、３（配列番号１９のアミノ酸３８８〜５８５）、１＋２（配列番号１９の１〜３８７）、２＋３（配列番号１９の１９５〜５８５）もしくは１＋３（配列番号１９のアミノ酸１〜１９４＋配列番号１９のアミノ酸３８８〜５８５）からなるか、またはあるいは含んでもよい。それぞれのドメインは、それ自身、２つの相同なサブドメイン、すなわち、配列番号１９の残基１〜１０５、１２０〜１９４、１９５〜２９１、３１６〜３８７、３８８〜４９１および５１２〜５８５と共に、残基Ｌｙｓ１０６〜Ｇｌｕ１１９、Ｇｌｕ２９２〜Ｖａｌ３１５およびＧｌｕ４９２〜Ａｌａ５１１を含む可撓性サブドメイン間リンカー領域から構成される。
【００８５】
別の実施形態においては、限定されるものではないが、アルファ−フェトタンパク質（ＷＯ２００５／０２４０４４；ＢｅａｔｔｉｅおよびＤｕｇａｉｃｚｙｋ、２０  Ｇｅｎｅ  ４１５〜４２２頁、１９８２）、アファミン（Ｌｉｃｈｅｎｓｔｅｉｎら、２６９  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８１４９〜１８１５４頁、１９９４）、およびビタミンＤ結合タンパク質（ＣｏｏｋｅおよびＤａｖｉｄ、７６  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２４２０〜２４２４頁、１９８５）などのアルブミンと構造的または進化的に関連する他のタンパク質をＨＬＥＰとして用いることができる。それらの遺伝子は、ヒト、マウス、およびラット中の同じ染色体領域にマッピングされる構造的および機能的類似性を有する複数遺伝子クラスターである。アルブミンファミリーメンバーの構造的類似性は、それらをＨＬＥＰとして用いることができることを示唆する。例えば、アルファ−フェトタンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏで結合した治療的ポリペプチドの半減期を延長させると特許請求された（ＷＯ２００５／０２４０４４）。治療的活性を安定化または延長することができるそのようなタンパク質、またはその変異体を用いることができ、それらは任意の脊椎動物、特に、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、もしくはブタ、または限定されるものではないが、ニワトリもしくはサケなどの非哺乳動物から誘導することができる（ＷＯ２００８／０９８７２０を参照されたい）。そのような変異体は、１０アミノ酸以上の長さであってもよく、または対応するタンパク質配列の約１５、２０、２５、３０、５０個以上の連続するアミノ酸を含んでもよく、または対応するタンパク質の特定のドメインの一部もしくは全部を含んでもよい。アルブミンファミリーメンバー融合タンパク質は、天然の多型変異体を含んでもよい。
【００８６】
一実施形態においては、モノ−またはポリ−（例えば、２〜４）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を用いて、半減期を延長することができる。ペグ化を、利用可能なペグ化反応のいずれかによって実行することができる。ペグ化されたタンパク質生成物を製造する方法は、一般に、（ａ）タンパク質が１つまたはそれ以上のＰＥＧ基に結合されるようになる条件下で、ポリペプチドをポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステルもしくはアルデヒド誘導体など）と反応させること；および（ｂ）反応生成物を取得することを含む。一般に、最適な反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて個別に決定される。当業界で公知のいくつかのＰＥＧ結合方法が存在する。例えば、ＥＰ０４０１３８４；Ｍａｌｉｋら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、２０：１０２８〜１０３５頁（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、３（２）：４〜１０頁（１９９２）；ＥＰ０１５４３１６；ＥＰ０４０１３８４；ＷＯ９２／１６２２１；ＷＯ９５／３４３２６；米国特許第５，２５２，７１４号を参照されたい。
【００８７】
別の実施形態においては、免疫グロブリン（Ｉｇ）、またはその変異体をＨＥＬＰとして用いることができ、その場合、変異体は断片を含む。一実施形態においては、免疫グロブリン定常領域のＦｃドメインまたは部分が用いられる。定常領域は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ免疫グロブリンのものであってもよい。治療的ポリペプチド部分は、切断可能であってもよい、抗体のヒンジ領域またはペプチドリンカーを介してＩｇに接続される。いくつかの特許および特許出願が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの治療的タンパク質の半減期を延長するための免疫グロブリン定常領域への治療的タンパク質の融合を記載している（ＵＳ２００４／００８７７７８、ＷＯ２００５／００１０２５、ＷＯ２００５／０６３８０８、ＷＯ２００３／０７６５６７、ＷＯ２００５／０００８９２、ＷＯ２００４／１０１７４０、米国特許第６，４０３，０７７号）。したがって、別の実施形態は、そのような免疫グロブリン配列、例えば、免疫グロブリンのＦｃ断片およびその変異体を、ＨＬＥＰとして用いることである。ＦＸＩＩの阻害剤をＨＬＥＰとしてＦｃドメインまたは免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部に融合し、細菌、酵母、植物、動物（昆虫を含む）もしくはヒト細胞系などの原核もしくは真核宿主細胞中で、またはトランスジェニック動物（ＷＯ２００８／０９８７２０）中で組換え分子として産生させることができる。
【００８８】
１つのＳＰＩＮＫ突然変異体Ｆｃ融合タンパク質の例、ＳＰＩＮＫ−Ｋ２−Ｆｃ融合タンパク質は、ＷＯ２００８／０９８７２０に記載されている。
【００８９】
Ｆ．リンカー
一実施形態においては、介在ペプチドリンカーを、治療的ポリペプチドとＨＬＥＰとの間に導入することができる。一実施形態においては、特に、ＨＬＥＰが例えば、立体障害により治療的ポリペプチドの特異的活性を妨害する場合、切断可能なリンカーが導入される。ある特定の実施形態においては、リンカーは、内因性、外因性、または共通の凝固経路の凝固プロテアーゼなどの酵素によって切断される。内因性経路の凝固プロテアーゼは、例えば、ＦＸＩＩａ、ＦＸＩａ、またはＦＩＸａなどの接触活性化経路中のプロテアーゼである。一実施形態においては、リンカーはＦＸＩＩａによって切断される。外因性経路のプロテアーゼは、組織因子経路中のプロテアーゼ、例えば、ＦＶＩＩａを含む。共通経路のプロテアーゼは、フィブリノゲンのフィブリンへの変換に関与するプロテアーゼ、例えば、ＦＸａ、ＦＩＩａ、およびＦＸＩＩＩａを含む。
【００９０】
Ｇ．治療製剤および投与
ＦＸＩＩ阻害剤またはその変異体は、８０％を超える純度、または９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を超える純度を有してもよい。一実施形態においては、変異体は、他のタンパク質および核酸などの夾雑巨大分子に関して９９．９％を超えて純粋であり、感染性因子および発熱物質を含まない薬学的に純粋な状態を有してもよい。
【００９１】
精製されたＦＸＩＩ阻害剤を、添加することができる従来の生理的に適合する水性バッファー溶液、場合により、医薬賦形剤に溶解して、患者における炎症性脱髄疾患の影響を防止、処置、または改善するための医薬調製物を提供することができる。そのような医薬担体および賦形剤ならびに好適な医薬製剤は、当業界で周知である。例えば、Ｋｉｂｂｅら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（第３版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ）、２０００を参照されたい。医薬組成物を、凍結乾燥形態または安定可溶性形態で製剤化することができる。当業界で公知の様々な手順により、ポリペプチドを凍結乾燥することができる。凍結乾燥製剤は、注射用滅菌水または滅菌生理食塩溶液などの１つまたはそれ以上の薬学的に許容される希釈剤の添加によって使用前に再構成される。
【００９２】
ＦＸＩＩ阻害剤の製剤は、任意の薬学的に好適な投与手段によって患者に送達される。様々な送達系が公知であり、これを用いて任意の都合のよい経路により組成物を投与することができる。組成物を、非経口的などの全身的に投与することができる。本明細書で用いられる用語「非経口的」は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内および気管内注射；ならびに点滴、スプレー適用、および輸注技術を含む。非経口製剤を、公知の手順に従って、ボーラス形態で、または持続輸注として、静脈内的または皮下的に投与することができる。非経口的使用のための周知である好ましい液体担体としては、滅菌水、塩水、水性デキストロース、糖溶液、エタノール、グリコール、および油が挙げられる。全身的使用のためには、治療的タンパク質を静脈内系または動脈系のために製剤化することができる。製剤を、輸注またはボーラス注射により連続的に投与することができる。
【００９３】
いくつかの実施形態においては、製剤は、脊髄および脳への直接的アクセスが得られるように、くも膜下注射または頭蓋内注射により投与される。これらの実施形態においては、製剤を特殊に製剤化することができる；例えば、製剤は保存剤を欠いてもよい。
【００９４】
いくつかの実施形態においては、製剤は、鼻内投与により投与される。鼻内送達は、脳脊髄液（ＣＳＦ）またはＣＮＳへのウイルスおよび巨大分子の直接的進入を可能にすると報告されている。Ｍａｔｈｉｓｏｎら、Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  １９９８；５：４１５〜４１頁；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｐｏｓ．１９９７；１８：３３５〜４６頁；Ｄｒａｇｈｉａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９５；２（６）：４１８〜２３５頁。一実施形態においては、タンパク質である任意のＦＸＩＩ阻害剤をコードする遺伝子を含む、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクターを、嗅覚受容器ニューロンを介して送達して、脳中でのコードされたタンパク質の発現を得ることができる。Ｄｒａｇｈｉａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９５；２（６）：４１８〜２３頁。
【００９５】
経口投与のための錠剤およびカプセル剤は、結合剤、充填剤、潤滑剤、または湿潤剤などの従来の賦形剤を含有してもよい。経口液体調製物は、水性もしくは油性の懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ、エリキシル剤などの形態にあってもよく、または使用のための水もしくは他の好適なビヒクルによる再構成のための乾燥製品として提供することができる。そのような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル、および保存剤などの従来の添加物を含有してもよい。いくつかの製剤は、遅延放出系、例えば、パッチを包含する。
【００９６】
ＦＸＩＩ阻害剤の用量は、例えば、適応症、製剤、または投与様式などの多くの因子に依存してもよく、それぞれ対応する適応症について前臨床および臨床試験において決定することができる。例えば、一実施形態においては、ＦＸＩＩ阻害剤の用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、もしくはその間の任意の用量、または０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、もしくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇもしくは１〜５００ｍｇ／ｋｇ、もしくは５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、５０〜２００ｍｇ／ｋｇ、もしくは１００〜２００ｍｇ／ｋｇ、もしくはその間の任意の用量範囲である。
【００９７】
治療上有効用量の抗ＦＸＩＩ抗体またはその抗原結合断片を含むこれらの実施形態においては、治療上有効用量は、処置を必要とする患者または対象において正の治療効果をもたらす用量である。治療上有効用量は、一般的には、約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜２ｍｇ／ｋｇもしくは約０．１〜１ｍｇ／ｋｇの範囲、もしくはその間の任意の用量範囲、または上記で提示されたか、もしくは実施例に提示されるＦＸＩＩ阻害剤に関する用量の１つである。
【００９８】
処置は、単回用量または複数回用量を与えることを含んでもよい。複数回用量が必要な場合、それらを毎日、１日置きに、毎週、２週間毎に、毎月、または２ヶ月毎に、または必要に応じて投与してもよい。抗体またはその抗原結合断片をゆっくりと連続的に放出するデポー剤（ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）を用いてもよい。治療上有効用量は、対象におけるＦＸＩＩａを少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、９９％、またはさらには１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）阻害する用量であってもよい。
【００９９】
ＦＸＩＩ阻害剤を、単独で、または他の治療剤と共に投与してもよい。これらの薬剤を同時製剤化するか、または別々の製剤として、同時もしくは別々に、同じ投与経路もしくは異なる投与経路により投与してもよい。ＦＸＩＩ阻害剤の投与のスケジュールまたは用量は、他の医学的状態または治療などの因子に応じて、同じ適応症または異なる適応症を有する個々の患者間で変化してもよい。
【０１００】
実施形態は、限定と解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例示される。他の実施形態は、明細書の考慮および開示された実施形態の実施から当業者には明らかとなるであろう。本出願を通して引用される全ての参考文献、特許、および公開された特許出願の内容は、参照によって本明細書に組み入れる。
【実施例】
【０１０１】
〔実施例１〕
多発性硬化症における革新的標的としての血漿血液凝固系
予備試験は、一次止血および二次止血がＭＳにおける炎症性神経変性に関与することを示唆する。例えば、Ｃａ２＋依存的血小板活性化における重要な分子として既に同定されていたＳＴＩＭ１およびＳＴＩＭ２が、炎症反応および神経変性の重要な病態生理学的決定因子であることが、ＥＡＥ動物モデルにおいて最近証明された（Ｓｃｈｕｈｍａｎｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；１８４：１５３６〜４２頁）。さらに、フィブリノゲンおよびフィブリンの沈着が、ＭＳ患者の中枢血管および脳実質の両方において認められる（Ｓｏｂｅｌ  ＆  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９８９；１３５：１６１〜６８頁；Ｃｌａｕｄｉｏら、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  １９９５；９０：２２８〜３８頁；Ｍａｒｉｋら、Ｂｒａｉｎ  ２００７；Ｉ３０：２８００〜１５頁）。フィブリンは、順に外因系および内因系から作られる、いわゆる血漿血液凝固系の最終生成物である。凝固因子ＸＩＩ（ＦＸＩＩ）は、内因性血液凝固カスケードの出発点であり、最初にＦＸＩの活性化を誘導する。同時に、それは、ブラジキニンの形成である終点である前炎症性接触（キニン）系を活性化する。
【０１０２】
本発明者らの研究により、ブラジキニン受容体Ｂ１ＲはＥＡＥモデルにおける炎症細胞侵襲の重要な調節因子であることが示された（Ｇｏｂｅｌら、Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  ２０１１：３６：１０６〜１４頁）。Ｂ１Ｒ欠損マウスは、あまり重症ではないＥＡＥを経験した。同様に、Ｂ１Ｒの選択的アンタゴニストで処置した野生型マウスも、未処置のマウスと比較してより低い疾患の極大（ｄｉｓｅａｓｅ  ｍａｘｉｍｕｍ）を経験した。対照的に、Ｂ２Ｒ遺伝子の破壊によるブラジキニン受容体Ｂ２Ｒの遮断は、ＥＡＥ疾患経過を変化させなかった。興味深いことに、Ｂ２Ｒはブラジキニンの効果の多くを媒介するが、Ｂ１ＲとＢ２Ｒは両方とも組織損傷後に古典的炎症プロセスを媒介する。さらに、ブラジキニンは少なくとも２つの経路：内因性凝固経路およびＦＸＩＩノックアウトマウスにおいても生じるため、ＦＸＩＩ非依存的であるはずの別の経路によって活性化され得るため、ｉｎ  ｖｉｖｏでブラジキニン活性をもたらす機序は不明である（Ｓｃｈｍａｉｅｒ  ＡＨ、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００８；８：１６１〜６５頁）。
【０１０３】
ＦＸＩＩもまたＥＡＥに寄与するかどうかを試験するために、２００μｇのＭＯＧ３５−５５で１０〜１２週齢のメスＣ５７Ｂｌ／６、ＦＸＩＩ−またはＦＸＩ−欠損マウスを免疫することにより、ＥＡＥを誘導した。Ｃ５７Ｂｌ／６ＭＯＧ３５−５５マウスモデルは、治療化合物の前臨床検証のために一般的に用いられている（Ｋｒｉｓｈｎａｍｏｏｒｔｈｙ  ＆  Ｗｅｋｅｒｌｅ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９；３９：２０３１〜３５頁）。このモデルにおけるＥＡＥの経過は、一度誘導された場合、疾患が寛解しないため、一次性進行型のＭＳと似ている。完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）をＭＯＧに添加して、１ｍｇ／ｍｌの乳濁液を得て、２ｘ１００μｌを、深く麻酔したマウスの脇腹の２つの異なる部位に皮下注射した。百日咳毒素を免疫化の当日および２ｄ後に注射した（４００ｎｇ、Ａｌｅｘｉｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。全ての動物を標準的な条件下で保持し、水および食料を自由に摂取させた。
【０１０４】
毎日静脈内注射により投与されるＦＸＩＩアンタゴニストＨ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＣＫ）（８μｇ／ｇ；Ｂａｃｈｅｍ）を用いて、薬理学的調節も実施した。ＰＣＫは、活性化ＦＸＩＩ（ＦＸＩＩａ）のアミド分解活性およびＦＸＩＩの血漿カリクレイン媒介性活性化を不可逆的に阻害する（Ｔａｎｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７；１６４：６３７〜４２頁；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｔｚ、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００６  Ｍａｒ  ２０；２０３（３）：５１８〜８頁）。
【０１０５】
ＥＡＥの臨床経過を、以下のスコア系を用いて二重盲検調査者によって毎日モニタリングした：等級０、異常なし；１等級、尾の先端を引きずる；２等級、尾を引きずる；３等級、中程度の後ろ肢の弱体；４等級、完全な後ろ肢の弱体；５等級、軽度の不全対麻痺；６等級、不全対麻痺；７等級、重度の不全対麻痺または対麻痺；８等級、四肢不全麻痺；９等級、四肢麻痺または瀕死前状態；１０等級、死亡。７より高いスコアを有する動物を安楽死させ、実験の最後まで一致したスコアを継続した。
【０１０６】
ＦＸＩＩ欠損マウスにおいては、最大疾患率は有意に低下した（図４Ａ）。ＰＣＫによる薬理学的遮断においても同様の結果が得られた（図４Ｃ、４Ｄ）。ＰＣＫは、動物がＥＡＥ症状を既に示していた１２日目に処置を開始した場合でも効果があった（図４Ｄ）。しかし、ＦＸＩ欠損マウスにおいては、ＥＡＥ疾患経過は野生型対象マウスにおけるものと類似していた（図４Ｂ）。ＦＸＩはＦＸＩＩのすぐ下流にあり、ＦＸＩＩａによって活性化されるため、これらの結果は、それがＥＡＥモデルにおける観察された保護効果をもたらした内因性凝固カスケードにおけるＦＸＩＩの役割ではないことを示している。
【０１０７】
疾患スコアの減少に加えて、炎症病巣の数および脱髄と軸索損傷との両方も、ＦＸＩＩ欠損動物において有意に減少した。図５は、対照（左バー）、ＰＣＫ処置されたマウス（中央バー）およびＦＸＩＩ−／−マウス（右バー）における炎症病巣の数（図５Ａ）、脱髄領域／スライス（図５Ｂ）、および軸索計数（図５Ｃ）を示す。定量のために、染色された切片を、ＣＣＤカメラ（Ｖｉｓｉｔｒｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｔｕｃｈｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えた顕微鏡（Ａｘｉｏｐｈｏｔ２、Ｚｅｉｓｓ；Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により盲検方式で検査した。炎症病巣（Ｈ＆Ｅ）、脱髄領域（ＬＦＢ）、および細胞を、ＭｅｔＶｕｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ、ＵＳＡ）を用いて５つの無作為に選択された試料上で計数した。軸索の数を所定の病変において分析した。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ、ＵＳＡ）を用いて蛍光強度を測定した。対照（Ｃｏｎ）とＰＣＫ処置されたマウスとの組織学的比較の例を、それぞれの棒グラフについて提示する。矢印は、炎症（図５Ａ）、脱髄（図５Ｂ）、および軸索損傷（図５Ｃ）の領域を示す。
【０１０８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析により、免疫応答の変化も示された（図５Ｄおよび５Ｅ）。脾細胞を、疾患最大で、およびＥＡＥ誘導の５０日後に免疫したマウスから単離し、ＭＯＧ３５−５５ペプチド（１０ｍｇ／ｍｌ）またはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（細胞：ビーズ比２：１）で刺激した。図５Ｄに示された増殖アッセイについては、１ｘ１０５個の脾細胞を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０ｍＭメルカプトエタノール、５％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、および１％非必須アミノ酸（Ｃａｍｂｒｅｘ；Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含有するＤＭＥＭ  １ｍｌ中で３日間培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（細胞：ビーズ比２：１；Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）または１０ｍｇ／ｍｌのＭＯＧ３５−５５で刺激した。３Ｈチミジン（Ａｍｅｒｈａｍ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を最後の１４時間について添加し、ベータ−シンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｒｏｄｇａｕ−Ｊｕｅｇｅｓｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上で放射活性を測定した。実験を４回行った。
【０１０９】
図５Ｄに示されるように、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した対照（左バー）、ＰＣＫ処置されたマウス（中央バー）およびＦＸＩＩ−／−マウス（右バー）の脾細胞間での増殖は有意に異なっていなかった。ＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いて増殖を刺激した場合、対照とＰＣＫ処置されたマウスとの間に有意差はあったが、対照とＦＸＩＩ−／−マウスとの間には有意差がなかった。
【０１１０】
また、ＭＯＧで再刺激した脾細胞の上清を、製造業者の説明書に従うＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によってＩＦＮγ、ＩＬ−１７、ＩＬ−４およびＩＬ−６タンパク質レベルについて評価した。図５Ｅに提示される結果は、対照と比較してＰＣＫ処置されたマウス（中央バー）およびＦＸＩＩ−／−マウス（右バー）の両方に由来する脾細胞からのＩＬ−１７、ＴＮＦαおよびＩＬ−６の産生が低下したことを示す。ＩＦＮγのレベルは有意に異ならなかった。
【０１１１】
総合すると、これらの結果は、ＦＸＩＩの阻害が末梢免疫応答の変化をもたらし、これは内因性凝固カスケードの変化と関連しないことを示唆している。
【０１１２】
〔実施例２〕
ＦＸＩＩのタンパク質阻害剤は神経自己免疫性炎症の一次性進行モデルにおける疾患の臨床徴候も阻害する
ＦＸＩＩのもう１つの阻害剤であるｒＨＡ−インフェスチン−４も、実施例１で詳細に説明されたＥＡＥモデルにおいて活性であった。この試験においては、マウスを、２００μｇ／ｇの用量で毎日静脈内注射によって、リンカーを介してインフェスチン４ドメインに融合されたヒトアルブミンを含むタンパク質であるｒＨＡ−インフェスチン−４（Ｈａｇｅｄｏｒｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２０１０；１１７：１１５３〜６０頁に記載されている）で処置した。
【０１１３】
図６Ａに示されるように、ｒＨＡ−インフェスチン−４はまた、疾患経過の初期にＥＡＥスコアを減少させた。そしてＰＣＫ処置されたマウスおよびＦＸＩＩ−／−マウスにおける試験において見られたように、ｒＨＡ−インフェスチン−４による処置は、対照と比較してＩＬ−１７産生の有意な減少をもたらした（図６Ｂ）。
【０１１４】
これらの結果は、ＦＸＩＩの薬理学的遮断が、ＭＳの処置のための新しい代替的な抗炎症戦略を提供することのさらなる証拠を提供する。
【０１１５】
〔実施例３〕
抗ＦＸＩＩ抗体処置は神経自己免疫性炎症の再発モデルにおける疾患の臨床徴候を阻害する
また、抗ＦＸＩＩ抗体を用いて、第２のＥＡＥモデル−ＰＬＰペプチド（ミエリンプロテオリピドタンパク質）で免疫したメスＳＪＬマウスにおけるＦＸＩＩの役割も試験した。このＥＡＥマウスモデルは、運動ニューロン機能の変性などのＭＳの多くの臨床徴候および組織病理学的徴候を再現する。Ｃ５７Ｂｌ／６ＭＯＧ３５−５５モデルと同様、ＰＬＰで免疫したＳＪＬマウスは、治療化合物の前臨床検証における使用のための許容されるモデルである（Ｋｒｉｓｈｎａｍｏｏｒｔｈｙ  ＆  Ｗｅｋｅｒｌｅ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９；３９：２０３１〜３５頁）。しかしながら、ＳＪＬ  ＰＬＰモデルもまた、再発寛解型のＭＳにおいて生じるように、寛解および再発を経験する。
【０１１６】
完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）（Ｄｉｆｃｏ、ＢＤ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）中に乳濁したＰＬＰペプチド（１３９〜１５１）（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ、Ｃｌａｙｔｏｎ、Ｖｉｃ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）１００μｇを用いて８〜１２週齢のメスＳＪＬマウスに皮下的に免疫した後、百日咳毒素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）２００ｎｇを０日目に静脈内投与することにより、該マウスにおいてＥＡＥを誘導した。「−１」日目（すなわち、ＥＡＥ誘導注射の前日）、ならびに誘導後１、３、６、８、１０、１３および１５日目に、対照動物にアイソタイプ対照モノクローナル抗体２００μｇの皮下注射を与えたが、実験群は抗ＦＸＩＩｍＡｂ（３Ｆ７）を受けた。０および１５日目に疾患をモニタリングした。それぞれのマウスにつき６の最大スコアを用いて、Ｌａｎｇｒｉｓｈら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００５；２０１：２３３〜４０頁に記載のように臨床スコアを評価した。全ての動物手順は、ＣＳＬ動物倫理委員会によって認可されたものであった。
【０１１７】
中和抗ＦＸＩＩモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いるマウスの処置は、この再発モデルにおいてＥＡＥの臨床進行を阻害した（図７）。阻害は、疾患の初期段階で最も有効であった。
【０１１８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの前炎症性サイトカイン応答に対するＦＸＩＩ遮断の効果を評価するために、動物を９日目に出血させ、製造業者の説明書に従うＬｕｍｉｎｅｘ  ２００装置（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）上でのＬｕｍｉｎｅｘアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）によるサイトカイン分析のために血清を収穫した。抗ＦＸＩＩ抗体処置は、血液中への前炎症性サイトカイン放出の減少をもたらした。図８に示されるように、抗ＦＸＩＩは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βのレベルを減少させた。
【０１１９】
マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）はＥＡＥおよびＭＳ炎症病変において顕著であり、組織損傷の媒介における役割を有する。これらは、前炎症性サイトカインの産生により、自己反応性リンパ球への抗原提示、および直接的ミエリン損傷を引き起こす反応性酸素種の産生に寄与する（Ｇｒａｈａｍら、２００９）。ケメリンは、血液中のチモーゲンとして循環する分子であり、プラスミン、好中球エラスターゼ、およびそれほどではないにせよ、ＦＶＩＩａを含むセリンプロテアーゼにより活性化される。しかしながら、ＦＸＩＩａは、主な活性化因子である（ＱｕおよびＣｈａｉｋｏｆ、２０１０）。活性化ケメリンは、ＣｈｅｍＲ２３としても知られる、ケモカイン様受容体１（ＣＭＫＬＲ１）を発現する細胞のための強力な化学誘引物質である。この受容体は、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、組織常在マクロファージ、単球、およびＮＫ細胞により高度に発現される（ＨａｒｔおよびＧｒｅａｖｅｓ、２０１０）。Ｇｒａｈａｍら（２００９）による研究により、ケメリン受容体、ＣＭＫＬＲ１、またはＣｈｅｍ２３のマウスノックアウトがＥＡＥ実験における全体的なより低い臨床スコアを有することが示された。したがって、少なくとも再発ＥＡＥモデルにおいて、抗体を用いるＦＸＩＩの作用の遮断は、少なくとも部分的には、活性ケメリンの量を減少させることによって、ＥＡＥ実験における治療効果をもたらすことによって作用し得ることが可能である。
【０１２０】
本発明の他の実施形態は、本明細書の考慮および本明細書に開示された本発明の実施から当業者には明らかとなるであろう。明細書および実施例は例示のみと考えられ、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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