(57)【要約】  本発明は、コラーゲン合成を活性化しマトリックスメタロプロテイナーゼの産生を阻害することのできる二官能性ペプチドにおいて、−  少なくとも三回反復されたヘキサペプチドに相当し、コラーゲン合成を刺激するためエラスチンを結合させる受容体タンパク質に結合できる、第一のペプチド部分Ａ；ウロキナーゼプロテアーゼの競合阻害物質として作用しかつ前記プロテアーゼにより開裂され得るテトラペプチドに相当する第二のペプチド部分Ｂ；前記プロテイナーゼの阻害を可能にするためマトリックスメタロプロテイナーゼの少なくとも一つの活性部位を占有するトリペプチドに相当する第三のペプチド部分Ｃ、という三つのペプチド部分Ａ、ＢおよびＣを含む配列を呈する二官能性ペプチドに関する。本発明はさらに、二官能性ペプチドを組込んだ化粧品組成物および／または医薬組成物にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン合成を活性化しマトリックスメタロプロテイナーゼの産生を阻害することのできる二官能性ペプチドにおいて、
−  少なくとも三回反復されたヘキサペプチドに相当し、コラーゲン合成を刺激するためエラスチンを結合させる受容体タンパク質に結合できる、第一のペプチド部分Ａ、
−  ウロキナーゼプロテアーゼの競合阻害物質として作用し、かつ前記プロテアーゼにより開裂され得るテトラペプチドに相当する、第二のペプチド部分Ｂ、
−  前記プロテイナーゼの阻害を可能にするためマトリックスメタロプロテイナーゼの少なくとも一つの活性部位を占有するトリペプチドに相当する、第三のペプチド部分Ｃ、
という三つのペプチド部分Ａ、ＢおよびＣを含む配列を呈することを特徴とする、二官能性ペプチド。
【請求項２】
コラーゲン合成を刺激する第一のペプチド部分Ａが配列Ｘ１−Ｇｌｙ−Ｘ２−Ｘ３−Ｐｒｏ−Ｇｌｙを呈し、この配列が少なくとも三回反復され、ここで、
−  Ｘ１は、任意のアミノ酸に相当し、
−  Ｘ２は、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｌｅｕの中から選択されるアミノ酸に相当し、
−  Ｘ３は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの中から選択されるアミノ酸に相当している、
ことを特徴とする、請求項１に記載の二官能性ペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドの第一のペプチド部分Ａが、配列Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙを呈することを特徴とする、請求項２に記載の二官能性ペプチド。
【請求項４】
プロテアーゼにより開裂可能な第二のペプチド部分Ｂが、配列Ａｒｇ−Ｙ１−Ａｒｇ−Ｙ２を呈し、ここでＹ１とＹ２はＳｅｒ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕの中から選択されるアミノ酸に各々相当していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の二官能性ペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドの第二のペプチド部分Ｂが、配列Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕを呈することを特徴とする、請求項４に記載の二官能性ペプチド。
【請求項６】
マトリックスメタロプロテイナーゼの阻害を可能にする第三の部分Ｃが、配列Ｚ１−Ｉｌｅ−Ｚ２を呈し、ここで、
−  Ｚ１は、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕの中から選択されるアミノ酸に相当し、
−  Ｚ２は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌの中から選択されるアミノ酸に相当している、
ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一つに記載の二官能性ペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドの第三のペプチド部分Ｃが、配列Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕを呈することを特徴とする、請求項６に記載の二官能性ペプチド。
【請求項８】
配列番号１に相当する、
Ｓ１：Ｎ−（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ
という配列Ｓ１を呈し、ここで、ＮおよびＯＨはそれぞれ前記ペプチドの末端のＮ末端およびＣ末端に相当し、ｎ＝３であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つに記載の二官能性ペプチド。
【請求項９】
配列番号２〜配列番号２６の配列の一つに相当することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つに記載の二官能性ペプチド。
【請求項１０】
化学合成により得られることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一つに記載の二官能性ペプチド。
【請求項１１】
凍結乾燥された形で保存されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の二官能性ペプチド。
【請求項１２】
慢性瘢痕形成疾患の治療のための、請求項１〜１１のいずれか一つに記載の二官能性ペプチド。
【請求項１３】
焼痂または潰瘍の治療のための、請求項１２に記載の二官能性ペプチド。
【請求項１４】
真皮組織の修復および／または再生のための請求項１〜１１のいずれか一つに記載の二官能性ペプチド。
【請求項１５】
皮膚老化の治療のための、請求項１４に記載の二官能性ペプチド。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか一つに記載の二官能性ペプチドを組込んだ化粧品組成物および／または医薬組成物。
【請求項１７】
二官能性ペプチドの濃度が１０μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、ほぼ１００μｇ／ｍＬに等しい、請求項１６に記載の化粧品組成物および／または医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に化粧品および医薬品の分野で利用されるペプチドに関する。
【０００２】
本発明は、特に皮膚の老化により損傷を受けた真皮組織の修復または再生の分野で主として利用される。
【背景技術】
【０００３】
皮膚の老化は、皮膚の最も内部の層を構成する真皮の細胞外マトリックスの構成成分の合成および分解の制御機序の多少とも重大な不均衡に起因する。こうして、皮膚の老化の際には、真皮の細胞外マトリックス内部に、一方では、一部の高分子、特にコラーゲンおよびエラスチンの合成の低下、そして他方では、マトリックスメタロプロテイナーゼすなわちＭＭＰなどの一部の酵素の発現の増大が見られる。このマトリックスメタロプロテイナーゼは、特に、コラーゲン分解およびエラスチン分解活性を有し、このため真皮のマトリックスの高分子の分解に寄与する。したがって、真皮はその筋緊張を失い、皮膚はたるみ、それにより皺が出現するに至る。この現象は、同様に、紫外線、汚染、ストレスさらにはタバコに対する曝露などの外部要因によっても増幅され得る。
【０００４】
従来、当該技術分野の現状から、皺の出現を遅らせるための戦略が公知である。このような戦略は、特に以下のことで構成されている。
−  皮膚の厚みを低減させる目的での皮膚の攻撃的な処置に相当する、落屑または皮膚擦傷、
−  それぞれ、皺を埋める効果、および一時的に皺を緩和させる、標的の筋肉の麻痺を示す、ヒアルロン酸またはボツリヌストキシンの皺取り注入。しかしながら、これらの技術は高価で、短期的な効果しか示さない、
−  保湿製品、皺防止クリームまたはスムージングクリームなどの表皮トリートメントの使用。これらの製品は皺の出現を遅らせるもののすでに形成された皺の修正はしない、
−  自家幹細胞に基づく療法。これはまだほとんど究められていない。
【０００５】
数年前から、研究所では、皮膚老化の影響と闘う目的で、他の戦略が実施されてきた。
【０００６】
詳細には、Ｎ−アシルアミノアミド誘導体などの化合物の使用が、欧州特許出願第１２７５３７２号明細書中で提案されている。より詳細には、この文書は、上述のＮ−アシルアミノアミド誘導体以外に、コラーゲンの分解に関与するものであるメタロプロテイナーゼ阻害性タンパク質も組込まれている組成物について記述している。
【０００７】
しかしながら、このような解決法は、特に一方では複数の化合物の組合せを必要とし、また他方ではコラーゲン合成に積極的に作用させることができないことを理由として、最適なものではない。
【０００８】
特に皮膚老化の症候を予防するため、一部のペプチド誘導体の使用もまた開発されている。
【０００９】
その結果として、例えば仏国特許第２８５４８９号明細書において、エラスチンタンパク質に由来するペプチド誘導体を含む化粧品組成物が公知である。より詳細には、ペプチド誘導体は、Ｒ１−（ＡＡ）ｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＲ２という配列を呈する可能性があり、ここで、
−  Ｒ１は、Ｈ、または２〜２２個の炭素を含むアルコキシル鎖に相当し、
−  （ＡＡ）ｎは、ＡＡが任意のアミノ酸またはアミノ酸誘導体から成り、および／またはｎが０〜３である、ペプチド鎖に相当し、
−  Ｒ２は、Ｈ、または１〜２４個の炭素を含むアルキル鎖に相当している。
【００１０】
このようなペプチド誘導体を組込んだ化粧品組成物は、特に、引締め効果および再構築効果を可能にする。
【００１１】
しかしながら、このようなペプチド誘導体またはこの誘導体を組込んだ組成物では、生体の組織、特に真皮の細胞外マトリックスの主要なタンパク質を構成するコラーゲンの分解に関与するプロテイナーゼＭＭＰの活性および／または発現を阻害することができない。コラーゲンでは、特に組織にその耐張力性を付与する。したがって、上述の文書中に記述されたペプチドでは、真皮の筋緊張を保つために不可欠であるこのタンパク質の分解の回避を可能にするものではない。
【００１２】
同様に、国際公開第２００６０５３６８８号から、複数のペプチドを組込み、皺取り治療において使用される組合せも公知である。詳細には、この組合せのペプチドは、コラーゲンおよび／またはフィブロネクチンの合成プロセスに複数のレベルで、特にこの合成を刺激して関与する。
【００１３】
独国特許第１０２００４０５５５４１号明細書に関しては、コラーゲン合成を誘発し得る成長因子ＴＧＦ−βの遊離を刺激するという観点から、ペプチドの組合せを含む組成物について記述している。
【００１４】
しかしながら、これらの特許文書中に記載のペプチドでは、前述のものと同じ欠点、特にここで提案されている配列が細胞外マトリックスのタンパク質、特にコラーゲンの分解を担う酵素の発現を低減させることができないという欠点を呈している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、コラーゲン合成を刺激する特性とコラーゲンの分解カスケードに入るプロテイナーゼを阻害する特性との両方を呈する、二官能性ペプチドを提案することにより、技術的現状のさまざまな欠点を軽減する可能性を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
このため、本発明は、コラーゲン合成を活性化しマトリックスメタロプロテイナーゼの産生を阻害することのできる二官能性ペプチドにおいて、
−  少なくとも三回反復されたヘキサペプチドに相当し、コラーゲン合成を刺激するためエラスチンを結合させる受容体タンパク質に結合できる、第一のペプチド部分Ａ、
−  ウロキナーゼプロテアーゼの競合阻害物質として作用し、かつ前記プロテアーゼにより開裂され得るテトラペプチドに相当する、第二のペプチド部分Ｂ、
−  前記プロテイナーゼの阻害を可能にするためマトリックスメタロプロテイナーゼの少なくとも一つの活性部位を占有するトリペプチドに相当する、第三のペプチド部分Ｃ；
という三つのペプチド部分Ａ、ＢおよびＣを含む配列を呈する、二官能性ペプチドに関する。
【００１７】
有利には、コラーゲン合成を刺激する第一のペプチド部分Ａは、配列Ｘ１−Ｇｌｙ−Ｘ２−Ｘ３−Ｐｒｏ−Ｇｌｙを呈し、この配列は少なくとも三回反復され、ここで、
−  Ｘ１は、任意のアミノ酸に相当し、
−  Ｘ２は、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｌｅｕの中から選択されるアミノ酸に相当し、
−  Ｘ３は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの中から選択されるアミノ酸に相当している。
【００１８】
さらにより有利には、前記ペプチドの第一のペプチド部分Ａは、配列Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙを呈する。
【００１９】
好ましくは、プロテアーゼにより開裂可能な第二のペプチド部分Ｂは、配列Ａｒｇ−Ｙ１−Ａｒｇ−Ｙ２を呈し、ここでＹ１とＹ２は、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕの中から選択されるアミノ酸に各々相当している。
【００２０】
さらにより好ましくは、前記ペプチドの第二のペプチド部分Ｂは、配列Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕを呈する。
【００２１】
有利な一実施形態によると、マトリックスメタロプロテイナーゼの阻害を可能にする第三の部分Ｃは、配列Ｚ１−Ｉｌｅ−Ｚ２を呈し、ここで、
−  Ｚ１は、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕの中から選択されるアミノ酸に相当し、
−  Ｚ２は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌの中から選択されるアミノ酸に相当している。
【００２２】
さらに一層有利には、前記ペプチドの第三のペプチド部分Ｃは、配列Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕを呈する。
【００２３】
好ましい一実施形態によると、本発明に係るペプチドは、
Ｓ１：Ｎ−（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ
という配列番号１に相当する配列Ｓ１を呈し、
ここで、ＮおよびＯＨは、それぞれ前記ペプチドの末端のＮ末端およびＣ末端に相当し、ｎ＝３である。
【００２４】
しかしながら、本発明に係る二官能性ペプチドの配列は、また、配列番号２〜配列番号２６の配列の一つに相当してよい。
【００２５】
好ましくは、本発明に係る二官能性ペプチドは、化学合成により得られる。さらに、そのペプチドは、有利には、凍結乾燥された形で保存され得る。
【００２６】
有利には、本発明に係る二官能性ペプチドは、慢性瘢痕形成疾患の治療、特に焼痂または潰瘍の治療のために使用することができる。
【００２７】
本発明に係る二官能性ペプチドは、また、真皮組織の修復および／または再生のために、特に皮膚老化の治療のためにも使用可能である。
【００２８】
本発明は、また、本発明に係る二官能性ペプチドを組込んだ化粧品組成物および／または医薬組成物にも関する。
【００２９】
好ましくは、化粧品組成物中の二官能性ペプチドの濃度は、１０μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、ほぼ１００μｇ／ｍＬに等しい。
【００３０】
本発明に係る二官能性ペプチドには数多くの利点がある。一方では、この二官能性ペプチドは、特にＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンのコラーゲンタンパク質合成の刺激を可能にする。このＩＩＩ型コラーゲンの産生の増加は、極めて有利である。実際、この型のコラーゲンは、胎児期および幼年時代の間に主として合成されることから、「胎児」型コラーゲンと呼ばれる。この型のコラーゲンは、「完全」瘢痕形成と呼ばれる組織の極めて最適な瘢痕形成を可能にする。他方では、前記ペプチドは、プロテアーゼによるコラーゲン分解の低減を可能にする。その上、二官能性ペプチドのペプチド部分ＡおよびＣそれぞれにより、コラーゲンの合成の刺激とメタロプロテイナーゼの阻害は同時に得られ、二官能性ペプチドはさらに、他のその二つの部分を連結してウロキナーゼにより開裂され得るペプチド部分Ｂを含む。このため、本発明に係るペプチドは、およそ２５個のアミノ酸の短い配列を呈することができ、このことで化学的方法によるその合成が容易になっている。
【００３１】
本発明の他の特徴および利点は、添付図面を参照して、本発明の非限定的な実施形態についての以下の詳細な説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明に係るペプチドの作用機序の概略図である。
【図２】プラスミノーゲン／プラスミン系の酵素カスケードの概略図に相当する。
【図３Ａ．３Ｂ】１００μｇ／ｍｌの濃度の本発明に係るペプチドまたはこの同じペプチドのフラグメントにより処理された線維芽細胞による、Ｉ型およびＩＩＩ型のコラーゲン合成をそれぞれに示すヒストグラムに相当する。
【図４】本発明に係るペプチドまたはこの同じペプチドのフラグメントにより処理された、真皮線維芽細胞の培養における、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンをそれぞれコードする遺伝子ＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ３Ａ１の遺伝子発現をヒストグラムの形で示す。
【図５】患者の年令（３５、４２および５３才）に応じて、これらの患者それぞれに由来の真皮線維芽細胞によるＩ型およびＩＩＩ型のコラーゲンのタンパク質発現に対する、本発明に係る二官能性ペプチドの効果を示す。
【図６Ａ．６Ｂ】合成基質と比べた、ウロキナーゼの活性に対する二官能性ペプチドの効果を示す。
【図７Ａ．７Ｂ】合成基質と比べた、ＭＭＰ−１の活性に対する二官能性ペプチドの効果を示す。
【図８Ａ．８Ｂ】それぞれウロキナーゼによる処理を伴わないおよびこれを伴う、本発明に係るペプチドの溶出のプロファイルを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
予備的に、一情報として、本明細書では三文字の国際コードを用いてアミノ酸を呼称している。したがって、Ａｌａはアラニン（Ａ）に、Ｃｙｓはシスティン（Ｃ）に、Ａｓｐはアスパラギン酸（Ｄ）に、Ｇｌｕはグルタミン酸（Ｅ）に、Ｐｈｅはフェニルアラニン（Ｆ）に、Ｇｌｙはグリシン（Ｇ）に、Ｈｉｓはヒスチジン（Ｈ）に、Ｉｌｅはイソロイシン（Ｉ）に、Ｌｙｓはリシン（Ｋ）に、Ｌｅｕはロイシン（Ｌ）に、Ｍｅｔはメチオニン（Ｍ）に、Ａｓｎはアスパラギン（Ｎ）に、Ｐｒｏはプロリン（Ｐ）に、Ｇｌｎはグルタミン（Ｑ）に、Ａｒｇはアルギニン（Ｒ）に、Ｓｅｒはセリン（Ｓ）に、Ｔｈｒはトレオニン（Ｔ）に、Ｖａｌはバリン（Ｖ）に、Ｔｒｐはトリプトファン（Ｗ）に、そしてＴｙｒはチロシン（Ｙ）に相当する。
【００３４】
皮膚老化およびその結果生じる皺の出現は、細胞および分子レベルで、コラーゲンまたはエラスチンなどの細胞外マトリックスの組成に入る高分子の合成を担う遺伝子の発現の減少によって特徴づけられる。その上、マトリックスのこれらのタンパク質の産生の低下には、概して前記マトリックスタンパク質の分解を担う酵素の過剰発現が随伴する。したがって、これらの酵素、すなわちマトリックスメタロプロテイナーゼつまりＭＭＰが、真皮レベルの筋緊張の低下、皮膚のたるみそして最終的には皺の出現の原因の一部である。
【００３５】
コラーゲンタンパク質は、有機体の組織の細胞外マトリックスの構成において優勢なタンパク質である。詳細には、コラーゲンは、真皮レベルで９０％程度存在し、この真皮は皮膚の堅牢な支持体を構成し、また、栄養摂取、体温調節および病原性微生物に対する防御の役目を同時に果たしている。真皮は、主として、特にコラーゲンの合成ならびに細胞外マトリックスの組織化に関与する線維芽細胞と呼ばれる細胞で構成されている。
【００３６】
したがって、細胞外マトリックスの構造は、コラーゲンだけでなく、エラスチン、構造糖タンパク質およびプロテオグリカンからも構成されている。より特定的には、真皮マトリックスは、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンのフィブリルおよびＶ型コラーゲンのコアを含む。
【００３７】
これらは、２６以上の成員を含むファミリーをもつＭＭＰと呼ばれるタンパク質によって分解される可能性がある。より詳細には、これらのタンパク質は、エンドペプチダーゼ、すなわちタンパク質の内部でペプチド結合を破断するものに相当する。
【００３８】
科学者（Ｖｏｏｒｈｅｓら、Ｈｏｒｎｅｂｅｃｋら、２００９）により行われた研究作業により、真皮細胞つまり線維芽細胞のエイジングが、特にＭＭＰ−１に関して、これらのエンドペプチダーゼの発現の増加により特徴づけられることを明らかにすることができた。このＭＭＰ−１は、間質コラゲナーゼのグループに入っており、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンタンパク質の開裂を担う。ＭＭＰ−１は、皮膚老化が経時老化であるか光誘発性老化であるかに関わらず、皮膚老化の推移に関与する主要なコラゲナーゼとみなされている。
【００３９】
したがって、分解酵素、特にＭＭＰ−１の増加と結びつけられる、真皮マトリックスタンパク質、特にコラーゲンの減少は、皮膚の筋緊張の低下および目に見える皺の出現という形をとる皮膚老化に介入する重要な要素である。
【００４０】
したがって、本発明のアプローチの枠内において、本発明者らは、複数の機能を有し、かつコラーゲン分子の合成プロセスのレベルにおいても、またこれらの同じコラーゲン分子の分解カスケードのさまざまなレベルにおいても作用を可能にするペプチドを開発した。
【００４１】
したがって、きわめて有利なことに、本発明に係る二官能性ペプチドは、特に真皮の細胞外マトリックスの同化プロセス（合成）と異化プロセス（分解）との間の均衡を回復させることに有利に作用するという特性を示す。
【００４２】
極めて好ましいことに、本発明に係るペプチドは、二官能性であり、以下の三つの部分に分けることができる配列を含む。
−  有利にもコラーゲン合成を増大させる能力を示す、部分Ａと呼ばれる第一のペプチド部分、
−  好ましくは、一つのプロテアーゼ、すなわちウロキナーゼにより認識される配列を呈し、このときこのプロテアーゼによって開裂され得る、部分Ｂと呼ばれる第二のペプチド部分、
−  ＭＭＰを阻害することのできる、部分Ｃと呼ばれる第三のペプチド部分。
【００４３】
したがって、本発明に係るペプチドは、一方では、コラーゲン合成を刺激し、他方ではウロキナーゼおよびプロテアーゼＭＭＰ、特にＭＭＰ−１を阻害することによって前記コラーゲンの分解を低減できるようにする。
【００４４】
より詳細には、コラーゲン合成の増大を可能にするペプチド部分Ａは、ヘキサペプチド、すなわち一連の６個のアミノ酸残基で構成される。有利には、このヘキサペプチドは、本発明に係る二官能性ペプチドの内部で少なくとも３回反復される。
【００４５】
好ましくは、二官能性ペプチドのペプチド部分Ａは、Ｘ１−Ｇｌｙ−Ｘ２−Ｘ３−Ｐｒｏ−Ｇｌｙという配列を呈し、ここで、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、アミノ酸に相当する。以上で明記した通り、このヘキサペプチド配列Ｘ１−Ｇｌｙ−Ｘ２−Ｘ３−Ｐｒｏ−Ｇｌｙは、本発明に係るペプチドの内部で少なくとも三回反復される。実際、一部の研究作業により、前記配列の三回の反復が、配列の活性の観点から見て異なる結果、さらにはより有利な結果を導くことが示された（Ａｌｉｘ  ２００１）。
【００４６】
有利な一実施形態によると、ペプチド部分Ａの残基Ｘ１は、アミノ酸のいずれか一つに相当する。残基Ｘ２に関しては、有利には、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、ＡｌａおよびＬｅｕの中から選択されるアミノ酸に相当する。最後に、残基Ｘ３は、好ましくは、Ａｌａ、ＬｅｕおよびＩｌｅの中から選択されるアミノ酸に相当する。
【００４７】
さらにより好ましくは、Ｘ１とＸ２はＶａｌに、そしてＸ３はＡｌａに相当する。こうして、二官能性ペプチドの部分Ａに相当するヘキサペプチドは、好ましくは、配列Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙを呈する。
【００４８】
少なくとも三回反復され、かつペプチド部分ＢおよびＣに結びつけられたこのような配列は、添付図３Ａおよび３Ｂでならびに以下の実施例１中で示され説明されている通り、特にＩＩＩ型コラーゲンに関して、コラーゲンのタンパク質発現の有意な刺激を可能にする。
【００４９】
本発明に係るペプチドは、同様に、図４で示されている通り、それぞれＩ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンをコードする、遺伝子ＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ３Ａ１の遺伝子発現の増大も可能にする。ＩＩＩ型コラーゲンの合成に対する二官能性ペプチドの作用は、極めて有利である。実際、このＩＩＩ型コラーゲンは、胎児レベルにおいて大半を占めるコラーゲンであるものとして公知であり、その産生は、幼年時代の間、漸進的に減少し続け、成人においては非常に低い産生レベルに達する。一例を挙げると、成人においてＩＩＩ型コラーゲンの量は、Ｉ型コラーゲンに比べて６分の１である（Ｍｅｌｉｓｓｏｐｏｕｌｏｓ、１９９８；Ｈｅｒｂａｇｅ、１９９７）。ＩＩＩ型コラーゲンは、大半は筋線維芽細胞によって瘢痕形成中に合成されて、損傷を受けた組織を置換える。胎児レベルで、ＩＩＩ型コラーゲンは、いわゆる「完全」瘢痕形成を可能にする（Ｌｏｒｅｎａら、２００２；ＦｅｒｇｕｓｏｎおよびＯ’Ｋａｎｅ、２００４）。
【００５０】
本発明に係る二官能性ペプチドの配列Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙは、弾性繊維の分解に由来するエラスチンまたはエラストカインのペプチドから構想されたものである。このような配列は、前記配列Ｘ１−Ｇｌｙ−Ｘ２−Ｘ３−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの内部でのプロリンおよびグリシン残基の存在のため、ＶＩＩＩ型のＬ字形立体配座βを取る（Ｆｌｏｑｕｅｔら、２００４）。この構造モチーフは、従来その英語名Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（エラスチン結合タンパク質）、略してＥＢＰの呼称で引用されているエラスチン受容体タンパク質によって認識される。このエラスチン結合タンパク質は、他の二つのサブユニット、すなわち細胞膜に結合している、防御タンパク質またはカテプシンＡ（ＰＰＣＡ）およびノイラミニダーゼ（Ｎｅｕ−１）と結びつけられて、細胞表面に固定化されている。図１に表されている、二官能性ペプチドのペプチド部分Ａによる受容体タンパク質ＥＢＰの占有は、分子集合体の活性化をひき起こし、その結果、特にＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの合成がもたらされる。
【００５１】
分子集合体のこのような活性化は、同様に、線維芽細胞の走化性、増殖、接着および生存だけでなく、血管形成にも作用する可能性があり、この血管形成は、焼痂または潰瘍などの慢性創傷の血管再生プロセスにおいて不可欠である。
【００５２】
ペプチド部分Ｂに関しては、この部分は好ましくは、テトラペプチド、すなわち４個のアミノ酸を含む配列で構成されている。
【００５３】
より詳細には、このテトラペプチドは、基質または競合阻害物質としてセリンプロテアーゼであるウロキナーゼと相互作用することのできるアームを表す。したがってこれにより、細胞の近傍で、他の二つのペプチド部分ＡおよびＣを遊離させることが可能になる。
【００５４】
ウロキナーゼは、好ましくは、二つのアミノ酸Ａｒｇを呈する配列を開裂する。このため、ペプチド部分Ｂは、有利には、配列Ａｒｇ−Ｙ１−Ａｒｇ−Ｙ２を呈し、ここでＹ１とＹ２はアミノ酸に相当する。
【００５５】
特定の一実施例によると、Ｙ１とＹ２はＳｅｒ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、ＶａｌおよびＬｅｕの中から選択されるアミノ酸に各々相当する。開裂可能な部位Ａｒｇに結びつけられたこれらのアミノ酸は、好ましくはウロキナーゼプロテアーゼによって開裂される。
【００５６】
さらにより好ましくは、本発明に係る二官能性ペプチドのペプチド部分Ｂは、配列Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕを含む。
【００５７】
ウロキナーゼプロテアーゼは、プラスミノーゲン−プラスミン系の活性化因子の一つである。プラスミノーゲンは、ウロキナーゼの生理学的基質であり、これがプラスミンの形でその活性化を可能にする。この活性化は、特にＭＭＰ−１とＭＭＰ−３の活性化を結果としてもたらす、タンパク質分解カスケードを開始させる。ウロキナーゼプロテアーゼによって開始される、プラスミノーゲン／プラスミン系の酵素カスケードは、添付の図２に表されている。
【００５８】
このように、プラスミノーゲンに対するウロキナーゼ活性は、コラーゲン、特にＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの分解を間接的に担っている。このため、本発明に係る二官能性ペプチド中のペプチド部分Ｂの存在は、ウロキナーゼの基質または競合阻害物質として作用する。その結果、ウロキナーゼは、ペプチド部分Ｂ上に存在する部位Ａｒｇを開裂し、プラスミノーゲンからプラスミンへの阻害をひき起こすためのその利用可能性は低くなる。したがってコラーゲン分子の分解は削減される。ウロキナーゼの活性に対する本発明に係るペプチドの効果は、特に図６Ａおよび６Ｂに示されている。
【００５９】
ここで二官能性ペプチドのペプチド部分Ｃに関して言うと、この部分は有利には、トリペプチドすなわち３個のアミノ酸を含む配列で構成されている。
【００６０】
好ましくは、ペプチド部分Ｃは、配列Ｚ１−Ｉｌｅ−Ｚ２を呈し、ここでＺ１とＺ２は各々一つのアミノ酸残基に相当する。
【００６１】
有利な一実施例によると、Ｚ１は、Ｇｌｙ、ＩｌｅおよびＬｅｕの中から選択されるアミノ酸であり、一方でＺ２は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌの中から選択されるアミノ酸である。
【００６２】
さらにより好ましくは、Ｚ１はＧｌｙに相当し、Ｚ２はＬｅｕに相当する。したがって、二官能性ペプチドのペプチド部分Ｃは、有利には、配列Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕを呈する。トリペプチドＧｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕは、実際には、ＭＭＰ−１の活性部位の一部分を占有し、その酵素の競合阻害物質として作用し得る。
【００６３】
実際には、これらのアミノ酸は、Ｉ型ＭＭＰのポケットのうちの三つ、すなわちポケットＰ’１、Ｐ’２およびＰ’３を占有する可能性があることから、特に有利である。その結果、Ｉ型コラゲナーゼの活性部位は、前記コラゲナーゼの活性にとって不可欠であるイオンＺｎ２＋をもはやキレート化することができない。したがって、ＭＭＰ−１によるコラーゲン分子の分解は、本発明に係る二官能性ペプチドによって低減される。このことは特に、添付の図７Ａおよび７Ｂに示されている。
【００６４】
したがって、コラーゲン合成、およびＭＭＰ、特にＭＭＰ−１の阻害の観点から見て有利な結果を得ることを可能にする好ましい一実施形態によると、本発明に係る二官能性ペプチドは、下記の配列Ｓ１と記され配列番号１に相当する、
Ｓ１：Ｎ−（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ
という配列を呈する。
【００６５】
好ましくは、配列Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙは、三回反復される。換言すると、ｎは有利には３に等しい。しかしながら、配列はまた、３回超反復されてもよい。
【００６６】
本発明に係るペプチドは、また、例えば配列番号２〜配列番号２６と識別される配列を呈することもできる。しかしながら、この配列表は網羅的なものではなく、したがって本発明を限定するものではない。
【００６７】
特に、配列番号１〜２６の配列のアミノ酸は、例えば、化学的に等価である、すなわち等価の物理化学特性を呈するアミノ酸によって置換されてよい。等価のアミノ酸間の置換は、例えば、脂肪族無極アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕの間、あるいは、ヒドロキシル基を有する極性アミノ酸ＳｅｒおよびＴｈｒの間、アミノ酸ＡｓｎとＧｌｎの間、二つの酸性官能基を有するアミノ酸ＡｓｐおよびＧｌｕの間などで行われる。これらの情報は、プロテアーゼデータベース、Ｍｅｒｏｐｓ（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）中に列挙されている。
【００６８】
本発明に係る二官能性ペプチドは、好ましくは化学合成によって得られる。
【００６９】
有利には、樹脂Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ  ＰＳ上でペプチド鎖の延長を得るために利用されるのは、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）／ターシャルブチル（ｔＢｕ）の技術である。
【００７０】
しかしながら、このような実施形態は本発明を限定するものではなく、二官能性ペプチドの化学的合成は、その効果に適した、当業者にとって公知の他のあらゆる技術によって得ることができる。
【００７１】
有利には、本発明に係るペプチドは、それを最適な形で保存するように凍結乾燥される。
【００７２】
本発明に係る二官能性ペプチドは、真皮組織の修復および／または再生に有利に作用させることを目的とした化粧品組成物の製造に用いるために特に有利である。実際、コラーゲン産生に対するその作用によって、前記ペプチドは、特に、皺の出現を制限することができる。
【００７３】
その上、発明者らは、コラーゲン産生に対する本発明による二官能性ペプチドの効果が、患者の年令により左右されると思われることを示した。実際、図５に関連して以下の実施例３で示されている結果は、Ｉ型コラーゲンの発現と、特にＩＩＩ型コラーゲンの発現がより高齢の患者においてより大きいことを示している。したがって、このような結果は、皮膚老化と閾うことを目的とした化粧品組成物の枠内で使用するにあたっての前記ペプチドの利点を堅固なものにしている。
【００７４】
しかしながら、このような実施形態は、本発明を限定するものではない。例えば、本発明に係る二官能性ペプチドは、同様に、医薬組成物の調製にも役立つ可能性がある。
【００７５】
実際、コラーゲンなどのマトリックスタンパク質の合成とこれらの同じタンパク質の分解との間の均衡の破綻が、焼痂、潰瘍さらには重度の火傷などの慢性瘢痕形成疾患とも呼ばれる慢性創傷の出現をひき起こす可能性があることがわかっている。これらの疾患は、詳細には、マトリックスタンパク質ＭＭＰの過剰発現により特徴づけられ、概して糖尿病または血管障害などの病変を併発している。
【００７６】
これらの慢性瘢痕形成疾患は、特に人口の高齢化のため、先進国においてつねに増加の一途をたどっている。このため、これらの疾患の治療および費用負担は、無視できないようなコストとなっている。
【００７７】
細胞レベルでは、大量のプロテアーゼ、特にＭＭＰ−１型のメタロプロテイナーゼが、焼痂タイプのこれらの慢性創傷の近傍で遊離されることが実証された。同様に、研究によって、Ｉ型またはＭＭＰ−１型のコラゲナーゼの活性が慢性創傷の滲出物中で著しく増大することを証明することもできた。このような増大が、前記創傷の近傍に存在するＩ型およびＩＩＩ型のコラーゲン分子の分解の原因である（Ｂａｒｏｎｅら、１９９８；Ｓｈｉら、２００６）。
【００７８】
ここで潰瘍に関してより詳細に言うと、大量のプロテアーゼがこれらの創傷の近傍において見出されることも実証された。詳細には、研究により、正常値よりも６５倍多いＭＭＰ−１の割合を識別することができており、これらのＭＭＰはこのとき、細胞外マトリックスのタンパク質および同様に成長因子の過剰でかつ長時間の分解を誘発し、瘢痕形成の遅延をひき起こす（Ｆｉｓｃｈｅｒら、２００９）。
【００７９】
最後に、図２を見れば理解できるように、プラスミノーゲン／プラスミン系の活性化因子であり、一部のＭＭＰの活性化を間接的に担うウロキナーゼの濃度が、特に脚の潰瘍中ならびに焼痂のレベルで、大幅に増大することが実証された（Ｗｅｒｃｋｒｏｔｈら、２００４）。
【００８０】
このようにして、プロテアーゼＭＭＰの活性の低下とマトリックスタンパク質合成の増加との両方を可能にする本発明に係るペプチドは、これらの慢性創傷の治療を促進するのに貢献するものであり、負担が大きくコストが高いうえに効果の低い現在の医療的処置に置き換わることができる、ということが明らかである。
【００８１】
特定の一実施形態によると、本発明に係る二官能性ペプチドは、慢性創傷を受けた身体のゾーンに貼り付けることを目的としたパッチの中に組込まれる。
【００８２】
しかしながら、このような実施形態は、いかなる場合であれ本発明を限定するものではなく、クリーム、軟こう、ジェルなどの、治療すべき創傷上に塗布できる調製物に対して本発明に係る二官能性ペプチドを組込むことは、容易に企図できる。
【００８３】
一実施例によると、二官能性ペプチドは、好ましくは、ほぼ１０μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で使用される。実際、本発明に係るペプチドの毒性は、１ｍｇ／ｍｌまでのペプチド濃度で処理された真皮線維芽細胞上では一切確認されなかった。その上、統計的アプローチＳＡＭ（Ｓｉｇｎｉｆｉａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）により毒性遺伝子を調べるために行なわれた研究によって、細胞の死滅、結合組織の崩壊および腫瘍浸潤が、１ｍｇ／ｍｌ超の高い二官能性ペプチド濃度からでしか誘発されないことが示された。
【００８４】
さらに一層好ましくは、特に医薬組成物および／または化粧品組成物中での、ペプチドの使用のために推奨される濃度は、ほぼ１００μｇ／ｍｌに等しい。
【００８５】
本発明の他の利点および特徴は、同様に、一例として非限定的に示された以下の実施例を読むことによっても明らかになる。
【実施例】
【００８６】
実施例１：コラーゲン合成に対する二官能性ペプチドの効果−タンパク質分析
３５〜７５才の健康な患者に対して行なわれた外科手術中に得た腹部の皮膚の生検試料から、真皮線維芽細胞を単離する。
【００８７】
表皮を除去した後、酵素消化により線維芽細胞を回収し、その後１０％のウシ胎児血清と１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ培地（Ｄｕｂｅｌｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）中で３７℃でインキュベートする。
【００８８】
その後、１００μｇ／ｍｌの濃度で、配列Ｓ１を呈するペプチドでか、またはこの配列の複数の異なるフラグメントで、線維芽細胞を処理する。試験した複数の異なるフラグメントは以下の通りである。
−  ペプチド１（ｐｅｐｔ１）：配列Ｓ１を呈するペプチド、
−  ペプチド２（ｐｅｐｔ２）：配列Ｎ−（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）３−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＯＨ
−  ペプチド３（ｐｅｐｔ３）：Ｎ−（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）３−ＯＨ
−  ペプチド４（ｐｅｐｔ４）：Ｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ
−  ペプチド５（ｐｅｐｔ５）：Ｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ
【００８９】
次に、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンのタンパク質発現をウェスタンブロット法によって示し、ＩｍａｇｅＪにより定量した。結果はそれぞれ添付図３Ａおよび３Ｂに示されている。対照（Ｃｔｒ１）は、ペプチドにより処理されていない細胞レベルでのＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの発現に相当する。実験は、トリプリケートで実施された。
【００９０】
図３Ａに見られる結果は、本発明に係るペプチド（ｐｅｐｔ１）ならびに本発明に係るペプチドの部分Ａに相当する配列Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙを組込んだフラグメント（ｐｅｐｔ２とｐｅｐｔ３）が、Ｉ型コラーゲンのタンパク質発現を３０％刺激することを示している。本発明に係るペプチドの部分Ａを含まないペプチドフラグメント（ｐｅｐｔ４およびｐｅｐｔ５）は、Ｉ型コラーゲン合成の刺激を可能にしない。反対に、線維芽細胞がｐｅｐｔ４およびｐｅｐｔ５と接触状態にある場合に合成されるコラーゲンの割合は、より低いように思われる。したがって配列Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙは、Ｉ型コラーゲンの合成の刺激を大きく担っている。
【００９１】
図３Ｂは、配列Ｓ１を呈する本発明に係るペプチドが、ＩＩＩ型コラーゲンの合成の増加を可能にすることを示している。実際、ヒストグラムを見ればわかるように、ＩＩＩ型コラーゲンの産生は、配列Ｓ１を呈するペプチドで線維芽細胞を処理した場合に二倍超に増える。
【００９２】
同様に、配列Ｓ１を呈するペプチド（ｐｅｐｔ１）での線維芽細胞の処理が、配列（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）３のみを呈するペプチド（ｐｅｐｔ３）により処理された線維芽細胞に比べて、ＩＩＩ型コラーゲン合成の３６％の増加を可能にするという点を指摘しておくことも有利である。したがって、本発明に係るペプチドの他の部分も同様に、ＩＩＩ型コラーゲンの合成の増加において一定の役割を果たす。
【００９３】
したがって、本発明に係るペプチドは、極めて有利である。実際、Ｉ型コラーゲンの合成の増加を可能にすることに加えて、このペプチドは同様に、ＩＩＩ型コラーゲンの産生にも有利に作用する。
【００９４】
実施例２：コラーゲン合成に対する二官能性ペプチドの効果−遺伝子発現の分析
１００μｇ／ｍｌの濃度の複数の異なるペプチド（ｐｅｐｔ１〜ｐｅｐｔ５）の存在下で、線維芽細胞の培養におけるＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの遺伝子発現も同様に試験した。
【００９５】
複数の異なるペプチドにより２４時間処理した後、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて培養からＲＮＡを抽出し、次にＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）のＲＴ２  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｋｉｔというキットを用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の逆転写をした。
【００９６】
その後、９６ウェルプレートでＳｔｒａｔａｇｅｎｅのサーマルサイクラーＭｘ３０００ｐを用いて、実時間ＰＣＲ分析を行う。各試料をトリプリケートで分析する。ｃＤＮＡは、試薬ＲＴ２  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ／ＲＯＸ（商標）  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））および増幅すべき遺伝子に特異的なセンスおよびアンチセンスプライマを含む反応混合物中で、マトリックスとして役立つ。各サイクルの最後で蛍光の読取りを実施し、ソフトウェアＭｘＰｒｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により解析する。この場合グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をコードする遺伝子のＲＮＡである「ハウスキーピング」遺伝子から増幅されたＤＮＡ数量で研究対象の遺伝子の増幅産物の数量を標準化することによって、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンをそれぞれコードする関心対象の遺伝子ＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ３Ａ１の相対的発現を得る。１００％の効率を有する増幅に相当するサイクル数から起算して、研究対象のｃＤＮＡの相対的数量を、２−△△ＣＴの方法を用いて計算する（Ｌｉｖａｋ＆Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ、２００１）。
【００９７】
図４に見られる結果は、タンパク質発現の研究の際に得られた結果を確認するものである。本発明に係る二官能性ペプチドならびに配列（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）３を含むペプチドフラグメントｐｅｐｔ２およびｐｅｐｔ３は、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンの遺伝子発現を刺激する。同様に、配列（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）３のみを含むペプチド３の存在下に置かれた細胞に比べて、配列Ｓ１を呈するペプチド（ｐｅｐｔ１）で線維芽細胞を処理した場合のＩＩＩ型コラーゲンの合成の増大も確認される。
【００９８】
配列Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕを含む、誘導ペプチドｐｅｐｔ４およびｐｅｐｔ５は、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンをコードする遺伝子の発現に対して、いかなる効果も及ぼさない。
【００９９】
対照（Ｃｔｒ１）は、線維芽細胞が処理されていない場合に、二つのタイプのコラーゲンをコードする遺伝子の発現に相当する。
【０１００】
実施例３：コラーゲン合成に対する二官能性ペプチドの効果−患者の年令に応じたタンパク質発現および遺伝子発現の試験
多少、年を取った患者（３５、４２および５３才）に由来する真皮線維芽細胞を培養し、配列Ｓ１を呈する本発明に係る二官能性ペプチドを、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンのタンパク質発現および遺伝子発現について試験した。二つのタイプのコラーゲンのタンパク質発現に関して得た結果は、図５に見られる。コラーゲン合成に対する本発明に係るペプチドの作用は、線維芽細胞がより高齢の患者に由来するものである場合により大きいことが分かる。
【０１０１】
実施例４：二官能性ペプチドによるウロキナーゼの競合阻害
プロテイナーゼＭＭＰ−１の活性化カスケードの上流側の酵素であるウロキナーゼに対する本発明に係る二官能性ペプチドの作用を評価した。
【０１０２】
合成基質、Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ＋ＮＨＰｈＮＯ２（Ｓ２４４４）に対するウロキナーゼの活性を、異なる濃度の本発明に係るペプチドの存在下および不在下で試験した。
【０１０３】
結果は添付図６Ａおよび６Ｂに示されている。
【０１０４】
１時間、配列Ｓ１を呈する、１０−３、１０−４および１０−５Ｍの濃度の二官能性ペプチドの存在下でウロキナーゼ（９．２５×１０−６ｍＭ）による基質Ｓ２４４４（０．３ｍＭ）の加水分解反応速度を実施した。非処理物は、ペプチドの不在下での反応速度に相当する。３５分間にわたり５分毎に４０５ｎｍで吸光度（ＤＯ）を測定することにより、酵素活性を評価する。結果は、図６Ａに見られる。
【０１０５】
図６Ｂは、１５分の時点における、使用された二官能性ペプチドの濃度とウロキナーゼの活性との効果／用量の関係のグラフ表示である。図中の点線によって、ＩＣ５０すなわちウロキナーゼの活性を５０％低減させるのに必要なペプチド濃度を判定することができる。ＩＣ５０は、０．８３×１０−５Ｍのペプチド、つまり１９μｇ／ｍｌのペプチドの質量濃度に相当する。
【０１０６】
したがって、本発明に係る二官能性ペプチドは、ウロキナーゼの競合阻害物質として挙動することが分かる。
【０１０７】
実施例５：プロテアーゼＭＭＰ−１の活性に対する二官能性ペプチドの効果
次に、ウロキナーゼにより活性化されるカスケードの下流側の酵素であるＭＭＰ−１の活性に対する、本発明に係る二官能性ペプチドの効果を直接評価した。
【０１０８】
ペプチドの存在下での自らの活性を試験するために使用されたＭＭＰ−１の基質は、合成基質、ＤＮＰ−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｎ−Ｍｅ−Ａｂｚ）−ＮＨ２である。
【０１０９】
濃度８０ｎｇ／μｌのＭＭＰ−１を、１時間、１０−３、１０−４および１０−５Ｍの濃度の二官能性ペプチドの存在下または不在下で、０．４ｎｇ／μｌの合成基質の存在下に置いた。結果は、図７Ａおよび７Ｂに示されている。
【０１１０】
より詳細には、図７Ａは、異なる濃度のペプチドの存在下または不在下（非処理物）でのＭＭＰ−１の合成基質の加水分解化学速度を表わしている。３５分間にわたり５分毎に４６５ｎｍで吸光度（ＤＯ）を測定することによって、ＭＭＰ−１の酵素活性を評価する。
【０１１１】
図７Ｂは、１５分の時点における、使用された二官能性ペプチドの濃度とＭＭＰ−１の活性の用量−効果関係のグラフ表示である。図中の点線によって、ＩＣ５０を判定することができ、ＩＣ５０は、ここでは０．４×１０−４Ｍ、つまり９１μｇ／ｍｌの二官能性ペプチドの濃度に相当する。
【０１１２】
自らの天然基質すなわちヒトの真皮コラーゲン繊維の存在下でのＭＭＰ−１の活性に対する本発明に係るペプチドの効果も同様に試験した。
【０１１３】
このために、ＭＭＰ−１を予め３７℃で１時間半にわたり２０ｍＭのＡＰＭＡ（酢酸４−アミノフェニル水銀）により活性化した。このように活性化されたＭＭＰ−１を、次に、本発明に係るペプチド（１００μｇ／ｍｌ）の存在下または不在下で厚み５μの皮膚切片上に被着させる。３時間後、皮膚の切片を免疫標識して、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンの存在を明らかにし、共焦点顕微鏡で観察する。図示していないものの、結果は、ペプチドで処理しなかった切片のレベルで、コラーゲンＩおよびＩＩＩがＭＭＰ−１によって完全に分解されたことを示している。反対に、二官能性ペプチドの存在下では、前記ＭＭＰ−１の作用は阻害される。実際、コラーゲンＩおよびＩＩＩが検出されている。
【０１１４】
本発明に係る二官能性ペプチドは、ＭＭＰ−１の活性をインシチューで阻害することにより、コラーゲンの分解を阻害する。
【０１１５】
実施例６：ウロキナーゼによる二官能性ペプチドの開裂
細胞周囲レベルでは、およそ１０−４Ｍの過剰のウロキナーゼが観察される。したがって、ウロキナーゼは本発明に係るペプチドの部分Ｂのアルギニン（Ａｒｇ）残基レベルで特に作用するので、ペプチドを開裂することができる。
【０１１６】
Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ）カラム上でのＨＰＬＣにより、０．１％のＴＦＡ水中の０．１％のＴＦＡアセトニトリルの線形勾配の０％から１００％までを１００分間にわたり適用することによって研究を行なった。結果は、二官能性ペプチドの特徴である１１．７５分の時点におけるスペクトルピークの存在を示している（図８Ａ）。しかしながら、二官能性ペプチドに対する過剰のウロキナーゼの作用（０．４５ｍＭ）後、スペクトルピークは異なっている。実際、新たなピークは２０分の時点で溶出されており、こうして、ウロキナーゼによる二官能性ペプチドの開裂を特徴づけている（図８Ｂ）。
【０１１７】
こうして、皮膚老化という条件下で、大量のウロキナーゼの存在下において、本発明に係る二官能性ペプチドは開裂され、こうして配列Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕを組込んだ前記ペプチドのＣ末端部分を遊離する。
【０１１８】
実施例７：ＭＭＰ−１の活性に対する配列Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕの効果
発明者らは、Ｉ型コラゲナーゼ、ＭＭＰ−１のポケットＰ’１、Ｐ’２およびＰ’３を占有する能力を理由として配列Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕを選択した。ＭＭＰ−１の活性を、１０−５、１０−４および１０−３Ｍの濃度の配列Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕを呈するペプチド５の存在下または不在下で、その合成基質ＤＮＰ−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｎ−Ｍｅ−Ａｂｚ）−ＮＨ２上で試験した。
【０１１９】
結果（図示せず）は、ペプチド５が、その合成基質上でのＭＭＰ−１の活性を用量依存的に減少させることを示している。ペプチドＧｌｙ−Ｉｌｅ−ＬｅｕのＩＣ５０を測定した。これは、０．７１×１０−４Ｍ、つまり２１．３μｇ／ｍｌのペプチド濃度である。
【０１２０】
したがって、ウロキナーゼが過剰である場合に本発明に係る二官能性ペプチドの末端部分Ｃ、Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕを生成することができ、これはＭＭＰ−１の活性を阻害できる。これらのデータは、皮膚老化および／または慢性創傷の瘢痕形成と閾うためのペプチドの利点を確証している。
【０１２１】
より完全な研究モデル、すなわち、皮膚老化ならびにそれに付随する一部の病変を模倣することのできるエクスビボの皮膚モデルについても、同様に研究を行なった。得られた結果は示されていないが、インビトロで得られた結果を確証するものである。
【０１２２】
当然のことながら、本発明は、以上で例示し記述した実施例に限定されず、これらの実施例は、本発明の枠内から逸脱することなく、変形形態および修正を呈することが可能である。
【０１２３】
参照文献
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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