(57)【要約】  配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を含むグリホサート抵抗性を有する、植物、植物の部分、植物器官、植物種子および／または植物細胞ならびに関連する方法が提供される。
2015506702.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子、
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、および
ｃ）高ストリンジェンシー条件下で配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列を有する別の核酸とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む異種核酸
からなる群から選択される、単離された核酸分子。
【請求項２】
植物における発現のために設計された合成配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項４】
異種ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
核酸が、プロモーターと作動可能に連結している、請求項３に記載のベクター。
【請求項６】
プロモーターと作動可能に連結している異種核酸として、請求項１に記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
【請求項７】
プロモーターが、ＡｔＵｂｉ１０プロモーターである、請求項５に記載のベクター。
【請求項８】
植物細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項１に記載の核酸を含む、トランスジェニック植物、植物の一部、植物器官、植物種子または植物細胞。
【請求項１０】
植物、植物の一部、植物器官、植物種子および／または植物細胞が、同種の野生型植物と比較した場合に、グリホサートに対して耐性である、請求項９に記載のトランスジェニック植物、植物の一部、植物器官、植物種子または植物細胞。
【請求項１１】
核酸が、ＬＧＮＡＡＴ（配列番号６１）をコードせず、ＡＬＬＭＸＡＰＬＴ（配列番号６２）（式中、Ｘは、アラニン、セリンおよびトレオニンからなる群から選択される）をコードしない、請求項９に記載のトランスジェニック植物、植物の一部、植物器官、植物種子または植物細胞。
【請求項１２】
核酸が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号１とアラインされた場合に、配列番号１の１０１位に対応する位置にアラニンを含むポリペプチドをコードする、請求項９に記載の植物、植物の一部、植物器官、植物種子または植物細胞。
【請求項１３】
請求項９に記載の植物、植物の一部、植物器官、植物種子および／または植物細胞から製造された再生可能な細胞の組織培養物。
【請求項１４】
請求項９に記載のトランスジェニック植物、植物の一部、植物器官、植物種子または植物細胞から製造されたプロトプラスト。
【請求項１５】
再生可能な細胞が、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、分裂組織細胞、根、根端、葯、花、茎および鞘からなる群から選択される組織種から製造される、請求項１３に記載の組織培養物。
【請求項１６】
グリホサートに対して抵抗性である、請求項１３に記載の組織培養物から再生された植物。
【請求項１７】
ゲノムが、配列番号２または配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸分子を含む、請求項９に記載の植物、植物の一部、植物器官、植物種子または植物細胞。
【請求項１８】
グリホサートに対して抵抗性である、植物、植物の一部、植物器官、植物種子または植物細胞を作製する方法であって、
ａ）植物、植物の一部、植物器官、植物種子または植物細胞を、請求項１に記載の核酸分子を用いて形質転換することと、
ｂ）配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを発現させることと
を含む、方法。
【請求項１９】
形質転換された植物、植物の一部、植物器官、植物種子または植物細胞が、グリホサートに対して抵抗性である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ポリペプチドが、ＬＧＮＡＡＴ（配列番号６１）を含まず、および／またはＡＬＬＭＸＡＰＬＴ（配列番号６２）（式中、Ｘは、アラニン、セリンおよびトレオニンからなる群から選択される）を含まない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ポリペプチドが、配列番号１とアラインされた場合に、配列番号１の１０１位に対応する位置にアラニンを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
核酸分子が、配列番号２または配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
核酸分子が、配列番号２または配列番号３を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
除草剤抵抗性植物を含有する耕作区域において雑草を防除する方法であって、
ａ）耕作区域に、請求項１に記載の核酸分子を含む植物または植物種子を植えることと
ｂ）植物または植物種子に大幅に影響を及ぼすことなく、耕作区域において雑草を防除するのに十分な量の除草剤を耕作区域に適用することと
を含む、方法。
【請求項２５】
除草剤が、グリホサートである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の核酸分子を含む植物または植物種子が、異種ポリペプチドをコードする第２の核酸分子を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
第２の核酸が、ａａｄ−１またはａａｄ−１２を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
植物において除草剤に対する抵抗性を付与する方法であって、
ａ）植物を、請求項１に記載の核酸分子と作動可能に連結しているプロモーターを含むＤＮＡ構築物を用いて形質転換することと、
ｂ）形質転換された植物を再生させることと、
ｃ）核酸分子を発現させて、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを製造することと
を含む、方法。
【請求項２９】
除草剤が、グリホサートである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＤＮＡ構築物が、植物において発現可能な異種ポリペプチドをコードする第２の核酸分子を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
異種ポリペプチドが、ａａｄ−１またはａａｄ−１２を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
異種核酸として請求項１に記載の核酸がそのゲノム中に安定に組み込まれた植物であって、核酸が、プロモーターと作動可能に連結している、植物。
【請求項３３】
ダイズ植物体である、請求項３２に記載の植物。
【請求項３４】
トウモロコシ植物体である、請求項３２に記載の植物。
【請求項３５】
コムギ、トウモロコシ、ダイズ、タバコ、ビロードキビ、イネ、アワ、オオムギ、トマト、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、オレンジ、アルファルファ、ワタ、ニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ、レタス、ホウレンソウ、ペチュニア、バラ、キク、シバクサ、マツ、モミ、トウヒ、重金属蓄積植物、ヒマワリ、ベニバナ、ナタネおよびアラビドプシス属（Arabidopsis）からなる群から選択される、請求項３２に記載の植物。
【請求項３６】
アスパラガス属（Asparagus）、カラスムギ属（Avena）、ビロードキビ属（Brachiaria）、アブラナ属（Brassica）、シトラス属（Citrus）、スイカ属（Citrullus）、トウガラシ属（Capsicum）、カボチャ属（Cucurbita）、ニンジン属（Daucus）、ムカシヨモギ属（Erigeron）、ダイズ属（Glycine）、ワタ属（Gossypium）、オオムギ属（Hordeum）、ヒマワリ属（Helianthus）、アキノノゲシ属（Lactuca）、ドクムギ属（Lolium）、トマト属（Lycopersicon）、リンゴ属（Malus）、キャッサバ属（Manihot）、タバコ属（Nicotiana）、オオアラセイトウ属（Orychophragmus）、イネ属（Oryza）、ワニナシ属（Persea）、インゲンマメ属（Phaseolus）、エンドウ属（Pisum）、ナシ属（Pyrus）、サクラ属（Prunus）、ダイコン属（Raphanus）、ライムギ属（Secale）、ナス属（Solanum）、ソルガム属（Sorghum）、コムギ属（Triticum）、ブドウ属（Vitis）、ササゲ属（Vigna）およびトウモロコシ属（Zea）からなる群から選択される種である、請求項３２に記載の植物。
【請求項３７】
植物体を生成するよう再生可能ではない、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
植物を生成するよう再生可能ではない、請求項９に記載の植物、植物の部分、植物器官、植物種子または植物細胞。
【請求項３９】
植物体を生成するよう再生可能ではない植物、植物の部分、植物器官、植物種子または植物細胞が形質転換される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本願は、２０１２年２月１日に出願された米国特許仮出願番号第６１／５９３，５５５号および２０１２年４月１７日に出願された米国特許仮出願番号第６１／６２５，２２２号の利益を主張する。
【０００２】
３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§  １．８２１（ｃ）または（ｅ）に従う声明−ＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出された配列表
３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§  １．８２１（ｃ）または（ｅ）に準拠して、配列表のＡＳＣＩＩテキスト版を含有するファイルが、本願とともに提出されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、ＤＧＴ−１４を含む新規の、特徴的な植物および関連する方法に関する。いくつかの実施形態は、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンの代謝に関与している新規ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードする核酸およびそれを同定する方法に関する。特定の実施形態は、前記ポリペプチドおよび／または核酸を含む植物、植物の部分および植物細胞に関する。
【背景技術】
【０００４】
雑草種は、耕作地において長く問題であった。かつては労働集約的作業であったが、雑草防除は、効率的な雑草除去用化学除草剤を利用できることによって、より容易になった。除草剤の広範な使用は、改良された作物の多様性および肥料とともに、農業における「緑の革命」に大きく貢献してきた。特に有用な除草剤は、広範囲の除草剤活性を有するものである。残念なことに、広範囲の除草剤は、通常、その除草剤に曝露された作物に対して有害な効果を有する。この問題を克服するための１つの方法は、特定の広範囲の除草剤に対して耐性である植物を製造することである。
【０００５】
広範囲の除草剤の１つの例として、グリホサートとしても知られるＮ−ホスホノメチル−グリシンがある。グリホサートは、例えば、不耕起栽培において、作物の植え付けの前に雑草を防除するために、世界中で農業家によって大々的に使用されてきた。さらに、グリホサートは、生産サイクルまたは輪作の間に雑草および自生植物を防除するための効率的な手段である。グリホサートは、使用後に土壌中を汚染せず、最も環境的に安全であり、農業において使用するために利用可能な広く有効な化学除草剤の１つであると広く考えられている。
【０００６】
グリホサートは、シキミ酸経路を阻害することによって植物を死滅させる。この経路は、アミノ酸、ビタミンおよび植物ホルモンを含めた芳香族化合物の生合成につながる。グリホサートは、「ＥＰＳＰシンターゼ」および「ＥＰＳＰＳ」と通常呼ばれる、酵素５−エノールピルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼと結合することおよびその活性を阻害することによって、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）および３−ホスホシキミ酸の５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸への縮合を遮断する。
【０００７】
残念なことに、グリホサートに対して天然に耐性であると知られている作物はなく、したがって、栽培作物における雑草防除のためのこの除草剤の有用性は、限定されてきた。グリホサート耐性作物を製造するための１つの方法は、遺伝子工学の技術を使用して、ＥＰＳＰＳ遺伝子の異種グリホサート耐性形態をコードする遺伝子を、作物に導入することである。化学的突然変異誘発を使用して、細菌においてＥＰＳＰＳのグリホサート耐性形態が製造され、異種遺伝子が植物に導入され、グリホサート耐性植物が製造された（例えば、Comai et al., Science 221:370-71 (1983)を参照のこと）。所望のレベルの耐性を得るために、異種ＥＰＳＰＳ遺伝子が作物において通常過剰発現される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
関連する技術分野の前記の例およびそれに関連する制限は、例示的なものであり、排他的なものではないよう意図される。関連する技術分野のその他の制限は、本明細書を読んだ際に当業者に明らかとなる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
実施形態において、本開示は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む、植物、植物の部分、植物器官、植物種子および／または植物細胞に関する。
【００１０】
さらなる実施形態では、本開示は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いて、植物、植物の部分、植物器官、植物種子および／または植物細胞を形質転換することおよび核酸を発現させて、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドを製造することとを含む、グリホサートに対して抵抗性である、植物、植物の部分、植物器官、植物種子および／または植物細胞を生成する方法に関する。
【００１１】
実施形態は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む。
【００１２】
特定の例は、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む。
【００１３】
その他の実施形態は、配列番号２または配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含むベクターを含む。例えば、ベクターは、配列番号２または配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【００１４】
実施形態は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する異種ポリペプチドを発現する、グリホサート耐性植物および植物細胞を含む。
【００１５】
さらなる実施形態は、グリホサート抵抗性植物を含有する耕作地または耕作区域において雑草を防除する方法を含み、このような方法は、耕作地または耕作区域に配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む植物または植物種子を植え付けること；耕作地または耕作区域に、十分な量のグリホサートを適用して、植物に大幅に影響を及ぼすことなく、この耕作地において雑草を防除することを含み得る。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本開示は、グリホサートに対して抵抗性である植物の組織培養において使用するための再生可能な細胞に関する。このような組織培養は、前記のグリホサート抵抗性植物の生理学的および形態学的特徴を有する植物を、また前記の抵抗性植物と実質的に同一の遺伝子型を有する植物を再生できる可能性がある。このような組織培養中の再生可能な細胞は、例えば、胚、プロトプラスト、成長点細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、鞘および茎であり得る。特定の実施形態は、本開示の実施形態の組織培養物から再生された植物に関する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本開示は、例えば、グリホサートに対して抵抗性である植物細胞株の製造において使用するための、植物体を生成するよう再生可能ではない細胞に関する。その他の実施形態では、本開示は、幾分かこのような細胞を含む植物に関する。
【００１８】
特定の実施形態では、本開示は、耕作区域に植え付けられた作物への複数の除草剤の適用に関する。複数の除草剤に加えたグリホサートの過度の適用は、異なる除草剤特性が生かされ、その結果、順応性および経済性の改善された組合せを有する雑草防除が提供される。例えば、個々の除草剤は、耕作区域において異なる寿命を有する、すなわち、いくつかの除草剤は、その区域に適用された後、比較的長時間持続し、有効であるが、その他の除草剤は、その他の、および／または非活性化合物に迅速に分解される。特定の実施形態に従う改善された除草剤適用システムは、栽培者が、特定の状況において使用するための特定の除草剤の選択を目的に合わせることができるよう、グリホサートおよび複数の除草剤の使用を可能にする。
【００１９】
その他の実施形態では、本開示は、以下に記載される除草剤または除草剤のクラスもしくはサブクラスのうち２種以上に対して耐性である植物を作製し、使用するための方法および組成物に関する。特定の実施形態では、グリホサートと、その他の除草剤（または除草剤のクラスまたはサブクラス）または化学物質（または別の化学物質のクラスまたはサブクラス）（例えば、殺真菌剤、殺虫剤、植物成長調節物質など）のうちの少なくとも１種の両方に対して耐性である植物が提供される。このような植物は、例えば、複数の除草剤を用いる作物の処置を含む方法において用途があり得る。したがって、本開示は、除草剤または除草剤の組合せ（各々、異なる作用様式によって作用する除草剤の組合せを含む）または少なくとも１種の除草剤と、殺真菌剤、殺虫剤、植物成長調節物質などを含めた少なくとも１種のその他の化学物質との組合せを用いる処置に耐性である除草剤抵抗性植物を提供する。このようにして、本開示は、雑草が選択的に防除される、作物を栽培する改善された方法を記載する。
【００２０】
一実施形態では、除草剤抵抗性植物は、グリホサートに対する耐性を付与する異種ポリペプチドをコードする核酸分子および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。前記段落によれば、植物に、除草剤耐性形質、昆虫抵抗性形質、農学的形質、疾患抵抗性形質、改変された脂肪酸形質または減少したフィチン酸形質からなる群から選択される形質を与えるポリペプチドをコードする少なくとも第３の核酸分子を含む植物が、提供される。
【００２１】
別の実施形態では、除草剤抵抗性植物は、グリホサートに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする異種核酸分子およびグルホシネートに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。いくつかの例は、植物に、除草剤耐性形質、昆虫抵抗性形質、農学的形質、疾患抵抗性形質、改変された脂肪酸形質または減少したフィチン酸形質を与えるポリペプチドをコードする少なくとも第３の核酸分子を含む除草剤抵抗性植物を含む。
【００２２】
別の実施形態では、除草剤抵抗性植物は、グリホサートに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸分子およびアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）酵素（Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449）としても知られるアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）（Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241）を阻害する除草剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。したがって、植物に除草剤耐性形質、昆虫抵抗性形質、農学的形質、疾患抵抗性形質、改変された脂肪酸形質および減少したフィチン酸形質を与えるポリペプチドをコードする少なくとも第３の核酸分子を含む植物がさらに提供される。
【００２３】
別の実施形態では、任意の核酸は、グリホサートまたは別の除草剤に対するさらなる抵抗性または耐性を提供するために、ならびに／または選定された昆虫もしくは疾患に対する抵抗性、ならびに／または栄養強化、ならびに／または改善された農学的特徴、ならびに／またはタンパク質もしくは食餌、食物、工業的用途、医薬的用途もしくはその他の用途において有用なその他の生成物を提供するために、任意のその他の核酸分子と組み合わされ、または「積み重ねられ」得る。実施形態は、植物ゲノム内の対象とする２種以上の核酸配列のスタッキングを含む。このようなスタックは、２以上の事象、対象とする配列を含有する構築物を用いる植物の形質転換、トランスジェニック植物の再形質転換または相同組換えを介した標的組込みによる新規形質の付加を使用する従来の植物育種によって達成され得る。このようなスタックの例は、以下の任意の組合せである：ｄｇｔ−１４核酸分子、Ｃｒｙ３４Ａｂ１核酸分子、Ｃｒｙ３５Ａｂ１核酸分子、Ｃｒｙ１Ｆ核酸分子、Ｃｒｙ１Ａｃ核酸分子、ａａｄ−１２核酸分子、ａａｄ−１核酸分子、ｐａｔ核酸分子、およびＤＳＭ−２核酸分子。
【００２４】
上記の例示的態様および実施形態に加えて、以下の記載の研究によってさらなる態様および実施形態が明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】他のＥＰＳＰシンターゼ酵素、例えば、ｇｒｇ−２３（配列番号５４；米国特許第７，８３４，２４９号由来）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）由来のＣＰ４（配列番号４８；ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＡＥＭ７５１０８．１）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）由来のＤＧＴ−３（配列番号５７；ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：Ｐ１７６８８）、ダイズ（Glycine max）由来のＤＧＴ−１（配列番号５６）、コムギ（Triticum aestivum）由来のＤＧＴ−７（配列番号５５；ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＥＵ９７７１８１）、および大腸菌（Escherichia coli）由来のａｒｏＡ（配列番号５１；Padgette et al., (1991); Eschenburg et al., (2002); Priestman et al., (2005); Haghani et al., (2008)）に対する、ＤＧＴ−１４（配列番号４６）、ＤＧＴ−１１（配列番号４７）、ＤＧＴ−１２（配列番号４９）、ＤＧＴ−１８（配列番号５０）、ＤＧＴ−２９（配列番号５３）、およびＤＧＴ−３０（配列番号５２）の部分配列アラインメントを示す図である。６つすべてのＤＧＴ酵素（ＤＧＴ−１４、ＤＧＴ−１１、ＤＧＴ−１２、ＤＧＴ−１８、ＤＧＴ−３０、およびＤＧＴ−２９）は、ａｒｏＡ  ＥＰＳＰシンターゼ酵素のアミノ酸９６位で保存されたアラニンを共有している。このアミノ酸の位置は、アスタリスクによって示されて、アミノ酸残基には下線が付されている。
【図２】ダイズ（Glycine max）由来のＤＧＴ−１（配列番号５９）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）由来のＤＧＴ−３（配列番号５８；ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：Ｐ１７６８８）、およびコムギ（Triticum aestivum）由来のＤＧＴ−７（配列番号６０；ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＥＵ９７７１８１）の全長酵素のアラインメントを示す図である。グリシンからアラニンに突然変異させたアミノ酸残基の位置を第１のアスタリスクで示している。トレオニンからイソロイシンに突然変異させたアミノ酸残基の位置は、第２のアスタリスクで示されている。プロリンからセリンに突然変異させた第３のアミノ酸残基の位置は、第３のアスタリスクで示されている。
【図３】ｐＤＡＢ１００４２７のプラスミドマップを示す図である。
【図４】ｐＤＡＢ１０２９４６のプラスミドマップを示す図である。
【図５】ｐＤＡＢ１００４３１のプラスミドマップを示す図である。
【図６】ｐＤＡＢ１００４３２のプラスミドマップを示す図である。
【図７】ｐＤＡＢ１００４３５のプラスミドマップを示す図である。
【図８】ｐＤＡＢ１００４４６のプラスミドマップを示す図である。
【図９】ｐＤＡＢ１００４３６のプラスミドマップを示す図である。
【図１０】１ｍＭのＰＥＰを用いて、ＤＧＴ−１（Ａ）およびＤＧＴ−７（Ｂ）内の様々な突然変異の導入後に得られたＩＣ５０値を示す図である。ＡとＢのＩＣ５０曲線の両方について、黒三角は野生型を表し、黒丸はＧＡ突然変異体を表し、白四角はＧＡＰＳ突然変異体を表し、黒四角はＴＩＰＳ突然変異体を表す。
【図１１】ｐＤＡＢ１０７５２６のプラスミドマップを示す図である。
【図１２】ｐＤＡＢ１０２７８７のプラスミドマップを示す図である。
【図１３】ｐＤＡＢ１０５５２５のプラスミドマップを示す図である。
【図１４】ｐＤＡＢ１０５５２６のプラスミドマップを示す図である。
【図１５】ｐＤＡＢ１０５５２７のプラスミドマップを示す図である。
【図１６】ｐＤＡＢ１０５５２８のプラスミドマップを示す図である。
【図１７】ｐＤＡＢ１０５５２９のプラスミドマップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書に開示されたコドン最適化されたｄｇｔ−１４核酸分子は、グリホサート除草剤抵抗性が植物において役に立ち得るさまざまな適用において有用である。
【００２７】
グリホサートに対して抵抗性であるか、または耐性である植物に言及する場合に、植物に対する十分量のグリホサートの適用が、植物に大きな影響を及ぼさないか、または死滅させないということ意味する。植物は、特定の除草剤に対して天然に耐性であり得るか、または植物は、例えば、選択育種、遺伝子形質転換および／または植物のゲノム内の導入遺伝子の導入などの人の手の結果として除草剤耐性であり得る。「グリホサート抵抗性植物」は、それを発現する異種植物またはその他の生物に除草剤耐性を付与する（すなわち、植物またはその他の生物を除草剤耐性にする）ポリペプチドまたは核酸分子を含有する植物である。グリホサートに対して抵抗性であるか、または耐性である植物は、植物へのグリホサートの適用から幾分かの最少の影響を示すこともある。例えば、正常な成長および植物の発達において変更があることがあり、これでは、植物は、ストレスまたは疾患と関連している徴候または症状を示し得る。グリホサートに対して抵抗性であるか、または耐性である植物へのグリホサートの適用に起因するこのような最少の影響は、グリホサートに対して感受性である植物へのグリホサートの適用に起因する悪影響に対して対照的である。感受性植物へのグリホサートの適用は、植物に大幅に影響を及ぼすか、死滅させ得る。耐性を付与する核酸分子を含む植物へのグリホサートの適用は、グリホサートに対する耐性を付与する核酸分子を含まない植物への適用より大幅に少ない影響しかもたらさない。
【００２８】
したがって、植物は、適当な対照植物と比較して、対照植物によって示される損傷よりも、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％または１０００％またはそれ以上少ない損傷を示す場合に、除草剤またはその他の化学物質に対して耐性である。このようにして、除草剤またはその他の化学物質に対して耐性である植物は、適当な対照植物と比較して改善された耐性を示す。除草剤またはその他の化学物質処置に起因する損傷は、当業者が適していると考える植物成長または健全の任意のパラメータを評価することによって評価される。損傷は、個々の植物または植物の群の適したパラメータの、目視検査によって、および／または統計分析によって評価され得る。したがって、損傷は、草丈、植物重量、葉色、葉長、開花、稔性、シルキング、収量および種子生成などのパラメータを評価することによって評価され得る。損傷はまた、特定の発達段階（例えば、シルキング、開花または花粉落下）までに経過した時間または植物が特定の化学物質および／または除草剤を用いる処置から回復するまでに経過した時間を評価することによって評価され得る。
【００２９】
このような評価を行うにあたって、統計分析または定量的比較が行われ得るよう、特定の損傷度に特定の値が割り当てられ得る。特定の損傷度を説明するための、値の範囲の使用は、当技術分野で公知であり、任意の適した範囲または規模が使用され得る。例えば、除草剤傷害スコア（耐性スコアとも呼ばれる）が割り当てられ得る。上記で示されるように、除草剤耐性はまた、このスケールにおいてその他の評点によって示され、これでは、適当な対照植物は、そのスケールで低いスコアを示すか、または適当な対照植物の群は、対象植物の群よりも、除草剤処置に応じて統計的に低いスコアを示す。
【００３０】
除草剤またはその他の化学物質によって引き起こされる損傷は、植物が除草剤を用いて処置された後に種々の時点で評価され得る。損傷は、対照植物が最大損傷を示すおよその時間で評価されることが多い。時には、損傷は、除草剤またはその他の化学物質を用いて処置されなかった対照植物が、測定可能に成長および／または発達した期間の後に、処置が施された大きさまたは段階と比較して評価される。損傷は、対象植物が除草剤を用いて処置された後、様々な時間で、例えば、１２時間で、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日、または３週間、４週間、またはそれより長期間で評価され得る。試験および対照植物の処置に応じた相違の検出を可能にする限り、任意の評価の時間が適している。
【００３１】
除草剤は、植物に対して効果を有さない場合に、または植物に対して幾分かの効果を有し、それから、植物が後に回復する場合に、または有害であるが、例えば、雑草に対する特定の除草剤影響によって相殺するものである効果を有する場合に、植物に対して「大幅に影響を及ぼ」さない。したがって、例えば、作物は、適当な対照植物（例えば、同種の未処置作物）と比較して、植物の健康および／または生産性を示す少なくとも１種の適したパラメータにおいて、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％の低減を示す場合に、「大幅に影響を受け」ない場合もある。植物の健康および／または生産性を示す適したパラメータとして、例えば、草丈、植物重量、葉長、特定の発達段階までに経過した時間、開花、収量および種子生成などが挙げられる。パラメータの評価は、任意の適したパラメータの目視検査によって、および／または統計分析によって実施され得る。比較は、目視検査によって、および／または統計分析によって行われ得る。したがって、作物は、少なくとも１種のパラメータにおいて低減を示すが、その低減が、実際には一時的なものであり、植物が、１週間、２週間、３週間、４週間または６週間内に十分に回復する場合に、除草剤またはその他の処置によって「大幅に損傷を受け」ない。
【００３２】
反対に、植物は、適当な対照植物（例えば、同種の未処置雑草）と比較して、植物の健康および／または生産性を示す少なくとも１種の適したパラメータにおいて５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１５０％または１７０％超の低減を示す場合に、除草剤またはその他の処置によって、大幅に影響を受けるか、または損傷を受ける。したがって、植物は、少なくとも１種のパラメータにおいて低減を示し、植物が、１週間、２週間、３週間、４週間または６週間内に十分に回復しない場合に大幅に損傷を受ける。
【００３３】
植物の除草剤またはその他の化学物質処置に起因する損傷は、当業者によるその他の適当な方法の目視検査によって評価され、適したパラメータの統計分析によって評価される。評価されている植物は、「試験植物」と呼ばれる。通常、適当な対照植物とは、除草剤耐性について評価されている植物（すなわち、「試験植物」）と同一の除草剤耐性ポリペプチド（複数可）を発現するが、除草剤を用いて処置されていないものである。
【００３４】
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本願が支配する。文脈によって別に必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許およびその他の参考文献は、特許または特許公報の特定の節のみが、参照により組み込まれると示されない限り、個々の刊行物または特許出願が各々、具体的に、個別に、参照により組み込まれるよう示されるように、すべての目的のために参照によりその全文が組み込まれる。
【００３５】
この開示をさらに明らかにするために、以下の用語、略語および定義を提供する。
【００３６】
本明細書において使用される場合、用語「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、「含む（includes）」、「含んでいる（including）」、「有する（has）」、「有している（having）」、「含有する（contains）」または「含有している（containing）」またはその任意のその他の変形は、非排他的である、または制約がないものとする。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されず、明確に列挙されていないか、またはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品または装置に特有ではないその他の要素を含み得る。さらに、逆の意味が明確に記載されない限り、「または」とは、包含的またはを指し、排他的またはを指さない。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれによっても満たされる：Ａが真であり（または存在し）、Ｂは偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在しない）、Ｂは真である（または存在する）、ならびにＡおよびＢの両方とも真である（または存在する）。
【００３７】
また、本開示の実施形態の要素または成分に先行する不定冠詞「ａ（１つの）」および「ａｎ（１つの）」は、要素または成分の例の数、すなわち、出現の数に関して非制限的であるものとする。したがって、「ａ（１つの）」および「ａｎ（１つの）」は、１つまたは少なくとも１つのを含むと読み取られなくてはならず、要素または成分の単数形の語形はまた、数が単数形であると明白に意図されない限り複数形を含む。
【００３８】
用語「発明」または「本発明」は、本明細書において、非制限的用語であり、特定の発明のいずれか単一の実施形態を指すものではなく、本願において開示されるようなすべての可能性ある実施形態を包含する。
【００３９】
「除草剤」は、植物に一時的または永久的傷害を引き起こす化学物質である。本開示の種々の方法および組成物において使用され得る除草剤の限定されない例は、本明細書において別の場所でさらに詳細に論じられている。除草剤は、植物中に組み込まれ得るが、または植物もしくはその細胞中に組み込まれることなく植物に対して作用し得る。「有効成分」は、その殺草性に主に関与している除草剤製剤中の化学物質であり、製品ラベルで有効成分として同定される。製品ラベル情報は、米国環境保護局（U.S. Environmental Protection Agency）から入手可能であり、ｏａｓｐｕｂ．ｅｐａ．ｇｏｖ／ｐｅｓｔｌａｂｌ／ｐｐｌｓ．ｏｗｎで、オンラインでアップデートされている。製品ラベル情報はまた、ｗｗｗ．ｃｄｍｓ．ｎｅｔでオンラインで入手可能である。用語「酸当量」とは、除草剤活性親酸としての比率または量を表す。
【００４０】
本明細書において使用される場合、用語「植物」は、限定するものではないが、全植物体および植物の任意の子孫、細胞、組織または一部を含む。
【００４１】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、単数形の核酸ならびに複数形の核酸、核酸断片、その変異体または誘導体、または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を包含するものとする。ポリヌクレオチドまたは核酸は、非翻訳５’および３’配列およびコード配列を含む全長ｃＤＮＡ配列またはその断片のヌクレオチド配列を含有し得る。ポリヌクレオチドまたは核酸は、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドからなり得る。例えば、ポリヌクレオチドまたは核酸は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、もしくはより典型的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子からなり得る。これらの用語はまた、ポリヌクレオチドまたは核酸の、化学的に、酵素によって、または代謝によって修飾された形態も包含する。
【００４２】
その生来の環境から取り出されているポリヌクレオチドまたは核酸配列は、「単離された」と呼ばれ得る。例えば、異種ポリヌクレオチドまたはベクター中に含有されるグリホサート耐性活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチド断片をコードする核酸は、本開示の目的上、単離されていると考えられる。単離ポリヌクレオチドまたは核酸のさらなる例として、異種宿主細胞中に維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の精製された（部分的に、または実質的に）ポリヌクレオチドまたは核酸が挙げられる。本開示の実施形態の単離ポリヌクレオチドまたは核酸は、合成によって製造されるこのような分子をさらに含む。ＤＮＡのポリマーの形態の単離ポリヌクレオチドまたは核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数のセグメントからなり得る。
【００４３】
用語「遺伝子」とは、任意選択で、コード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）調節配列を含む、機能的生成物分子、ＲＮＡまたはタンパク質のいずれかをコードする核酸配列を指す。
【００４４】
本明細書において使用される場合、用語「コード領域」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適した調節配列」とは、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性または翻訳に影響を及ぼす、コード配列の上流に（５’非コード配列）、その中に、または下流に（３’非コード配列）位置するヌクレオチド配列を指す。調節配列として、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造が挙げられ得る。
【００４５】
本明細書において使用される場合、用語「ポリペプチド」は、単数形の「ポリペプチド」ならびに複数形の「ポリペプチド」およびその断片を包含するものとし、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結しているモノマー（アミノ酸）からなる分子を指す。用語「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸の任意の鎖（単数または複数）を指すものであって、特定の長さまたは大きさの生成物を指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２個以上のアミノ酸の鎖（単数または複数）を指すために使用される任意のその他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、任意のこれらの用語の代わりに、または同義的に使用され得る。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から導かれ得るか、組み換え技術によって製造され得るが、必ずしも設計された核酸配列から翻訳されるわけではない。化学合成を含めた任意の方法で作製され得る。
【００４６】
「単離された」ポリペプチドまたは断片、その変異体または誘導体は、その天然環境中にはない意図されたポリペプチドである。特定のレベルの精製は必要ではない。したがって、「単離された」への言及は、本明細書に記載されるような「人の手」の関与を表す。例えば、単離されたポリペプチドは、生来のまたは天然の環境から取り出され得る。宿主細胞において発現される組換えポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適した技術によって、分離、分画または部分的もしくは実質的に精製されている生来のまたは組換えポリペプチドがそうであるように、本開示の目的上単離されたと考えられる。
【００４７】
本明細書において使用される場合、用語「天然」とは、存在する場合には、その自身の調節配列とともに天然に見られるポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドの形態を指す。
【００４８】
本明細書において使用される場合、用語「内因性」とは、生物においてその天然の位置に、または生物のゲノム中にあるポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドの天然形態を指す。「内因性ポリヌクレオチド」は、生物のゲノム中でその天然の位置にある生来のポリヌクレオチドを含む。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中でその天然の位置にある生来の遺伝子を含む。「内因性ポリペプチド」は、生物中でその天然の位置にある生来のポリペプチドを含む。
【００４９】
本明細書において使用される場合、「異種」とは、宿主生物中に普通には見られないが、宿主生物中に導入されているポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドを指す。「異種ポリヌクレオチド」は、対応する生来のポリヌクレオチドとは異なる形態で供給源生物中に再導入されている天然コーディング領域またはその一部を含む。「異種遺伝子」は、対応する天然遺伝子とは異なる形態で供給源生物中に再導入される天然コード領域またはその一部を含む。例えば、異種遺伝子は、天然宿主中に再導入される非天然調節領域を含むキメラ遺伝子の一部である天然コード領域を含み得る。「異種ポリペプチド」は、対応する天然ポリペプチドとは異なる形態で供給源生物中に再導入される天然ポリペプチドを含む。キメラまたは融合タンパク質を製造するために、対象遺伝子およびタンパク質は、その他の遺伝子およびタンパク質と融合され得る。本開示の実施形態と一致する有用な遺伝子およびタンパク質は、具体的に例示される全長配列だけではなく、これらの配列の部分、セグメントおよび／または断片（連続断片ならびに全長分子と比較して内部および／または末端欠失を含む）、その変異体、突然変異体、キメラおよび融合物も含む。
【００５０】
本明細書において使用される場合、用語「修飾」は、本明細書において開示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの低減された、実質的に排除された、または排除された活性をもたらすポリヌクレオチドにおける変化、ならびにポリペプチドの低減された、実質的に排除された、または排除された活性をもたらす本明細書において開示されるポリペプチドにおける変化を指し得る。あるいは、用語「修飾」は、本明細書において開示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの増大または増強された活性をもたらすポリヌクレオチドにおける変化、ならびに本明細書において開示されるポリペプチドの増大または増強された活性をもたらすポリペプチドにおける変化を指し得る。このような変化は、限定するものではないが、欠失すること、突然変異させること（例えば、自発性突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、変異誘発遺伝子によって引き起こされる変異原性またはトランスポゾン突然変異誘発）、置換すること、挿入すること、下方制御すること、細胞位置を変更すること、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの状態を変更すること（例えば、メチル化、リン酸化またはユビキチン化）、補因子を除去すること、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡの導入、干渉ＲＮＡ／ＤＮＡの導入、化学物質修飾、共有結合修飾、ＵＶまたはＸ線を用いる照射、相同組換え、有糸分裂組換え、プロモーター置換方法および／またはそれらの組み合わせを含めた、当技術分野で周知の方法によって行われ得る。どのヌクレオチドまたはアミノ酸残基が修飾され得るかを決定することにおける指針は、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を、相同ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、例えば、相同酵母または細菌のものと比較することおよび高相同性の領域（保存された領域）またはコンセンサス配列において行われる修飾の数を最大化することによって見出され得る。
【００５１】
本明細書において使用される場合、用語「誘導体」とは、本開示において示される配列の修飾を指す。このような修飾の例示的なものとして、作物種における、本明細書において開示されるコード配列の機能を保存するか、わずかに変更するか、または増大する、本明細書において開示されるコード配列の核酸配列に関連する、１個または複数の塩基の置換、挿入および／または欠失がある。このような誘導体は、例えば、配列構造を予測し、最適化するためのコンピュータモデリング技術を使用して、当業者によって容易に決定され得る。したがって、用語「誘導体」はまた、本開示の実施形態のＤＧＴ−１４の製造において使用するための、開示される機能を有することができるような、本明細書において開示されるコード配列と実質的な配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００５２】
本明細書において使用される場合、用語「変異体」とは、本開示の実施形態の具体的に記載されるポリペプチドと、例えば、突然変異誘発などの組換えＤＮＡ技術を使用して作製される、アミノ酸挿入、欠失、突然変異および置換によって異なっているポリペプチドを指す。どのアミノ酸残基が、対象とする活性を無効にすることなく、置換、付加または欠失され得るかを決定することにおける指針は、特定のポリペプチドの配列を、相同ポリペプチドのものと比較することおよび高相同性の領域（保存された領域）において行われるアミノ酸配列変化の数を最少化することによって、またはアミノ酸をコンセンサス配列と置換することによって見出され得る。本開示の実施形態のタンパク質は、所望の機能活性を保持する限り、置換されたアミノ酸を有し得る。「変異体」遺伝子は、同一タンパク質または例示されたタンパク質に対して同等または同様の活性を有する同等のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００５３】
用語「変異体タンパク質」および「同等のタンパク質」とは、標的基質に対して同一または本質的に同一の生物活性／機能活性および例示されるタンパク質と同等の配列を有するタンパク質を指す。本明細書において使用される場合、「同等」配列への言及は、活性を改善するか、または活性に相当な程度に悪影響を及ぼさないアミノ酸置換、欠失、付加または挿入を有する配列を指す。活性を保持する断片もまた、この定義に含まれる。例示されるタンパク質の対応する断片と同一または同様の機能または活性を保持する断片およびその他の等価物は、本開示の実施形態の範囲内にある。
【００５４】
変異体遺伝子を使用して、変異体タンパク質を製造でき、組換え宿主を使用して、変異体タンパク質を製造できる。これらの「遺伝子シャッフリング」技術を使用して、本明細書において例示される任意の配列の任意の５、１０または２０個の連続する残基（アミノ酸またはヌクレオチド）を含む同等遺伝子およびタンパク質が構築され得る。当業者ならば承知しているように、遺伝子シャッフリング技術は、例示または示唆される配列（またはその相補体（全相補体））のいずれかの中のセグメント（同一の大きさの）に対応する、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、または２９３個の連続する残基（アミノ酸またはヌクレオチド）を有する等価物を得るよう、例えば、調整され得る。同様の大きさのセグメント、特に、保存された領域のものはまた、プローブおよび／またはプライマーとして使用され得る。
【００５５】
「シャッフリング」戦略は、対象とするタンパク質の原子の３−Ｄ（三次元）座標および結晶構造を得、調べた後に設計され、標的とされ得る。したがって、タンパク質フォールディングおよび必要不可欠な３−Ｄ構造的完全性と関与している、表面に露出したセグメントおよび好ましくは内部ではないセグメントなどの修飾にとって理想的であるタンパク質の特定のセグメントに「集中されたシャッフリング」が向けられ得る。例えば、米国特許第５，６０５，７９３号には、ランダムまたは集中断片化後のＤＮＡ再構築を使用して、さらなる分子多様性を作成する方法が記載されている。これは、遺伝子「シャッフリング」と呼ばれることもあり、通常、２種以上の異なるＤＮＡ分子の断片（所望の大きさの）を混合することと、それに、再生の反復ラウンドを続けることを含む。これは、開始遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を改善し得る。結果は、活性が改善された、基質特異性が変更された、酵素安定性が増大された、立体特異性が変更された、またはその他の特徴を有するキメラタンパク質である。
【００５６】
アミノ酸「置換」は、あるアミノ酸を、同様の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸と置換すること、すなわち、保存的アミノ酸置換の結果であり得るか、または、あるアミノ酸を、異なる構造的および／または化学的特性を有するアミノ酸と置換すること、すなわち、非保存的アミノ酸置換の結果であり得る。アミノ酸は、以下のクラス：非極性、無電荷極性、塩基性および酸性に入れることができる。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性または両親媒性に基づいて行うことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸として、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられ；極性中性アミノ酸として、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられ；正に荷電している（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられ；負に荷電している（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【００５７】
あるいは、「非保存的」アミノ酸置換は、これらのアミノ酸のいずれかの極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性または両親媒性において相違を選択することによって行うことができる。「挿入」または「欠失」は、組換えタンパク質によって構造的または機能的に許容されるような変動の範囲内にあり得る。許容される変動は、組換えＤＮＡ技術を使用してポリペプチド分子中のアミノ酸の挿入、欠失または置換を系統的に行うことおよび得られた組み換え変異体を活性についてアッセイすることによって経験的に決定できる。
【００５８】
酵素の「活性部位」の特定の変更は、活性または立体特異性に関して特有の機能に影響を及ぼし得る。Muller et. al.,「Structural basis for the enantiospecificities of R- and S-specific phenoxypropionate/alpha-ketoglutarate dioxygenases」, Protein Sci. (2006)を参照のこと。例えば、既知のｔａｕＤ結晶構造が、その特有の基質タウリンと結合されながら、活性部位残基を決定するためのモデルジオキシゲナーゼとして使用された。Elkins et al. (2002) 「X-ray crystal structure of Escherichia coli taurine/alpha-ketoglutarate dioxygenase complexed to ferrous iron and substrates」, Biochemistry 41(16):5185-5192を参照のこと。酵素活性部位の配列最適化および設計性に関しては、Chakrabarti et al., PNAS (Aug. 23, 2005), 102(34):12035-12040を参照のこと。
【００５９】
タンパク質の種々の特性および三次元特徴はまた、タンパク質の活性／機能に悪影響を及ぼすことなく変更され得る。分子の活性および／または三次元立体配置に悪影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換が許容され得る／行われ得る。アミノ酸は、以下のクラス：非極性、無電荷極性、塩基性および酸性に入れることができる。あるクラスのアミノ酸が、同一種の別のアミノ酸と置換される保存的置換は、置換が、化合物の生物活性に反しない限り、本開示の実施形態の範囲内に入る。配列レベルでは異なるが、同一または同様の全体的に必要不可欠な三次元構造、表面電荷分布など保持する変異体タンパク質もまた設計され得る。例えば、米国特許第７，０５８，５１５号；Larson et al., Protein Sci. 2002 11: 2804- 2813、「Thoroughly sampling sequence space: Large-scale protein design of structural ensembles」；Crameri et al, Nature Biotechnology 15, 436-438 (1997), 「Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling」；Stemmer, W.P.C.1994. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751;Stemmer, W.P.C.1994. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature 370: 389-391; Stemmer, W.P.C.1995. Searching sequence space. Bio/Technology 13: 549-553; Crameri, A., Cwirla, S. and Stemmer, W.P.C.1996. Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling. Nature Medicine 2: 100-103；およびCrameri, A., Whitehorn, E.A., Tate, E. and Stemmer, W.P.C. 1996. Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling. Nature Biotechnology 14: 315-319を参照のこと。
【００６０】
ＤＧＴ−１４（合成ヘアピン）に最も適した５’または３’ＵＴＲのコンピュータによる設計も、本開示の実施形態の範囲内で実施され得る。一般に、コンピュータモデリングならびに遺伝子シャッフリングおよび指向進化は、本明細書において別の場所で論じられている。さらに詳しくは、コンピュータモデリングおよびＵＴＲに関して、本開示に一致する５’および３’ＵＴＲ誘導体を予測／評価することにおいて使用するためのコンピュータモデリング技術として、それだけには限らないが、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩから入手可能なＭＦｏＩｄバージョン３．１（Zucker et al., 「Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide」, in RNA Biochemistry and Biotechnology, 11-43, J. Barciszewski & B.F.C. Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, (1999); Zucker et al., 「Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure」, J. Mol. Biol. 288, 911-940 (1999); Zucker et al., 「RNA Secondary Structure Prediction」, in Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, S. Beaucage, D.E. Bergstrom, G.D. Glick, and R.A. Jones eds., John Wiley & Sons, New York, 11.2.1-11.2.10, (2000)）；ウェブサイト、ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｅｄｄｙ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／にアクセスすることによって、ソースコードとして無料配布され、ダウンロードされ得る、ＣＯＶＥ（共分散モデル（確率文脈自由文法）を使用するＲＮＡ構造解析）ｖ．２．４．２（Eddy & Durbin, Nucl. Acids Res. 1994, 22: 2079-2088）；およびウェブサイト、ｂｉｏｉｎｆ．ａｕ．ｄｋ．ＦＯＬＤＡＬＩＧＮ／で同様に無料配布され、ダウンロードのために入手可能なＦＯＬＤＡＬＩＧＮ（「Finding the most significant common sequence and structure motifs in a set of RNA sequences」, J. Grodkin, L. J. Heyer and G. D. Stormo. Nuclic Acids Research, Vol. 25, no. 18 pp. 3724-3732, 1997, 「Finding Common sequence and structure Motifs in a set of RNA Sequences」, J. Gorodkin, L. J. Heyer, and G. D. Stormo. ISMB 5;120-123, 1997）が挙げられる。
【００６１】
全長遺伝子の断片は、標準手順に従って市販のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを使用して作製できる。例えば、Ｂｂｓ  Ｉなどの酵素または部位特異的突然変異誘発を使用して、遺伝子の末端からヌクレオチドを系統的に切断してもよい。また、活性断片をコードする部分遺伝子は、種々の制限酵素を使用して得てもよい。プロテアーゼを使用して、これらのタンパク質の活性断片を直接的に得てもよい。
【００６２】
タンパク質が末端切断型であり、機能活性をなお保持し得ることは、本明細書において開示されるような開示の実施形態の範囲内である。「末端切断型タンパク質」によって、残りの末端切断型タンパク質が、切断後に所望の活性を保持し、示しながら、タンパク質の一部が切断され得るということを意味する。切断は、種々のプロテアーゼによって達成され得る。さらに、効率的に切断されるタンパク質は、前記タンパク質をコードするＤＮＡ塩基が、制限エンドヌクレアーゼを用いる消化によってか、または当業者に利用可能なその他の技術のいずれかによって除去される分子生物学の技術を使用して製造され得る。末端切断後、前記タンパク質は、大腸菌（E. coli）、バキュロウイルス、植物ベースのウイルス系、酵母などといった異種系において発現され、次いで、活性を測定するために本明細書において開示されるような除草剤耐性バイオアッセイに入れられ得る。完全な、全長配列未満を有しながら機能活性を保持するような末端切断型タンパク質が、成功裏に製造され得るということは当技術分野で周知である。例えば、Ｂ．ｔ．タンパク質は、末端切断型（コアタンパク質）形態で使用され得る。（例えば、Hofte et al. (1989)およびAdang et al. (1985)を参照のこと）。本明細書において使用される場合、用語「タンパク質」は、機能的に活性な末端切断を含み得る。
【００６３】
いくつかの場合には、特に、植物における発現にとって、末端切断型タンパク質を発現する末端切断型遺伝子を使用することは有利であり得る。好ましい末端切断型遺伝子は通常、全長タンパク質の、例えば、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％をコードする。
【００６４】
用語「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、全体として、天然遺伝子に由来し得るか、または天然に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素からなり得るか、または合成ＤＮＡセグメントをさらに含み得る。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞種における、または異なる発達段階での、または異なる環境条件もしくは生理学的条件に応じた遺伝子の発現に向けることができるということは当業者によって理解される。ほとんどの時点でのほとんどの細胞種において遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合において、調節配列の正確な境界は、完全に定義されておらず、種々の長さのＤＮＡ断片が、同一のプロモーター活性を有し得るということはさらに認識される。
【００６５】
用語「作動可能に連結された」とは、一方の機能が他方によって影響を受けるような、単一の核酸断片での核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現を達成できる（例えば、コード配列が、プロモーターの転写制御下にある）場合に、コード配列と作動可能に連結される。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で調節配列と作動可能に連結され得る。
【００６６】
用語「発現」とは、本明細書において使用される場合、本開示の実施形態の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指し得る。
【００６７】
本明細書において使用される場合、用語「過剰発現」とは、同一遺伝子または関連遺伝子の内因性発現よりも高い発現を指す。異種遺伝子は、その発現が、匹敵する内因性遺伝子のものよりも高い場合に過剰発現される。
【００６８】
本明細書において使用される場合、用語「形質転換」とは、遺伝的に安定な継承をもたらす、宿主生物への核酸または断片の転移および組込みを指す。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」、「組換え」または「形質転換された」生物と呼ばれる。形質転換の既知方法として、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）媒介性形質転換、リン酸カルシウム形質転換、ポリブレン形質転換、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、超音波法（例えば、ソノポレーション）、リポソーム形質転換、マイクロインジェクション、裸のＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、微粒子銃（微粒子銃）、シリコンカーバイドＷＨＩＳＫＥＲＳ媒介性形質転換、エアゾールビーミングまたはＰＥＧ媒介性形質転換ならびに他の可能な方法が挙げられる。
【００６９】
用語「プラスミド」および「ベクター」とは、本明細書において使用される場合、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を保持することが多く、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態の染色体外要素を指す。このような要素は、任意の供給源に由来する、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、直鎖または環状の、自立複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であり得、これでは、いくつかのヌクレオチド配列が、適当な３’非翻訳配列とともに、選択された遺伝子産物のプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞に導入できる独特の構造に結合または組み換えられている。
【００７０】
本明細書において使用される場合、用語「コドン縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさずにヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝暗号における性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞によって示される「コドン−バイアス」を十分に承知している。したがって、宿主細胞における改善された発現のための遺伝子を合成する場合には、コドン使用のその頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に匹敵するよう遺伝子を設計することが望ましい。
【００７１】
用語「コドン最適化された」とは、種々の宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子のコーディング領域を指す時には、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変更することなく、宿主生物の通常のコドン使用を反映するための遺伝子または核酸分子のコーディング領域中のコドンの変更を指す。このような最適化は、少なくとも１つの、または２以上の、または相当な数のコドンの、その生物の遺伝子においてより頻繁に使用される１つまたは複数のコドンとの置換を含む。
【００７２】
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列における逸脱は、遺伝子をコードする配列における逸脱を可能にする。各コドンは、３つのヌクレオチドからなり、ＤＮＡを含むヌクレオチドは４種の特定の塩基に限定されているので、６４種のヌクレオチドの可能性ある組み合わせがあり、そのうち６１種が、アミノ酸をコードする（残りの３種のコドンは、翻訳を終結するシグナルをコードする）。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝暗号」は、当技術分野でよく知られている。結果として、多数のアミノ酸が、２種以上のコドンによって指定される。例えば、アミノ酸アラニンおよびプロリンは、４種のトリプレットによってコードされ、セリンおよびアルギニンは、６種によってコードされるが、トリプトファンおよびメチオニンは、ただ１種のトリプレットによってコードされる。この縮重によって、ＤＮＡ塩基組成が、ＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変更することなく広範に変わることが可能となる。
【００７３】
多数の生物は、増大するペプチド鎖中に特定のアミノ酸を挿入するためにコードする特定のコドンの使用についてバイアスを示す。コドン優先度またはコドンバイアス、生物間でのコドン使用の相違は、遺伝暗号の縮重によって提供され、多数の生物の中で十分に実証されている。コドンバイアスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関することが多く、これは、順に、とりわけ、翻訳されているコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に応じて変わると考えられている。細胞において選択されるｔＲＮＡの優性は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンを反映するものである。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適遺伝子発現のために目的に合わせられるか、または設計され得る。
【００７４】
様々な動物、植物および微生物種にとって利用可能な多数の遺伝子配列を考えると、コドン使用の相対頻度を算出することが可能である。コドン使用表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で入手可能な「コドン使用データベース（Codon Usage Database）」で容易に入手可能であり、これらの表は、いくつかの方法で適応され得る。Nakamura et al. Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)を参照のこと。この表または同様の表を利用することによって、当業者は、頻度を任意の所与のポリペプチド配列に適用して、ポリペプチドをコードするが、その種に最適なコドンを使用する、コドン最適化されたコーディング領域の合成核酸断片を設計および製造することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書においてさらに記載されるような、本開示のｄｇｔ−１４および／またはその他のアクセサリータンパク質のコドン最適化された形態に関する。
【００７５】
植物において異種遺伝子の高発現を得るために、植物細胞においてより効率的に発現されるよう、前記遺伝子を設計および再設計することが好ましいものであり得、細菌遺伝子が、双子葉植物および単子葉植物細胞の両方において発現されることが望まれる場合には、特に、好ましいものであり得る。ＤＧＴ−１４をコードする野生型遺伝子が単離されており、予測されるアミノ酸配列をコードする生来のヌクレオチド配列コーディングは、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＺＰ＿０１４５２６８３に見出され得る。グリシンがＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＺＰ＿０１４５２６８３のアミノ酸残基１１１のアラニンに修飾された修飾を含むコードされるタンパク質配列は、配列番号１として開示されている。
【００７６】
本開示の実施形態は、合成ｄｇｔ−１４遺伝子配列が、植物における発現のために設計されたｄｇｔ−１４の修飾に関する。単子葉および双子葉植物の両方における同一ＤＧＴ−１４タンパク質の発現のための最適化されたｄｇｔ−１４遺伝子の設計が、最適発現のためのこの遺伝子のタンパク質コーディング領域の再設計とともに示されている。ＤＧＴ−１４ポリペプチドをコードする最適化されたヌクレオチド配列が、本明細書において記載されている。２種のこのような植物に最適化されたｄｇｔ−１４ヌクレオチド配列が、配列番号２および配列番号３に示されている。修飾されたヌクレオチド配列は、配列番号２の双子葉植物に最適化されたｄｇｔ−１４または配列番号３の単子葉植物に最適化されたｄｇｔ−１４と呼ばれ、植物においてグリホサートに対する耐性を提供する。
【００７７】
配列番号２のｄｇｔ−１４核酸分子を、双子葉植物における発現を改善するよう最適化した。配列番号３のｄｇｔ−１４核酸分子を、単子葉植物における発現を改善するよう最適化した。コドン使用は、以下のように好ましいコドン使用に基づいて選択した；タンパク質が、単子葉植物または双子葉植物使用のいずれかに向けたバイアスを有するコドンによってコードされ、有害な配列および過剰な制限部位が、ＤＧＴ−１４ポリペプチドの転写／翻訳の効率を高めるために、またＤＮＡ操作ステップを容易にするために除去されるように、ｄｇｔ−１４を再設計した。そうすることで、植物におけるＤＧＴ−１４の発現は、改善され、ＤＧＴ−１４は、グリホサート適用に対する抵抗性を提供する。
【００７８】
同様に、配列番号４のｄｇｔ−１４（ｖ６）核酸分子を、大腸菌（Echerichia coli）における発現を改善するために最適化した。コドン使用は、以下のように好ましい大腸菌（E. coli）コドン使用に基づいて選択した；タンパク質が、大腸菌（E. coli）使用に向けたバイアスを有するコドンによってコードされるようにｄｇｔ−１４を再設計した。再設計の際に、有害な配列および過剰な制限部位は、ＤＧＴ−１４コード配列の転写／翻訳の効率を高めるために、またＤＮＡ操作ステップを容易にするために除去された。そうすることで、大腸菌（E. coli）におけるＤＧＴ−１４の発現は、ＤＧＴ−１４の酵素的特性決定のための頑強なタンパク質発現をもたらす。
【００７９】
当技術分野において公知の用語「同一性パーセント」（または「同一性％」）とは、配列を比較することによって決定されるような、２種以上のポリペプチド配列または２種以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当技術分野において、「同一性」はまた、場合によっては、一続きのこのような配列間のマッチによって決定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は、それだけには限らないが、以下に開示されるものを含めた公知の方法によって容易に算出され得る。１）Computational Molecular Biology (Lesk、A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988)；２）Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith、D. W., Ed.) Academic, NY (1993)；３）Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994)；４）Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987)；および５）Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., Eds.) Stockton, NY (1991)。
【００８０】
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技術は、当技術分野で公知である。通常、このような技術は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定することおよび／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定することおよびこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列はまた、この様式で決定および比較され得る。一般に、同一性とは、それぞれ、２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸対応を指す。２種以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、その同一性パーセントを決定することによって比較され得る。２種の配列の同一性パーセントは、核酸であるか、アミノ酸配列であるかにかかわらず、２種のアラインされた配列間の正確なマッチの数を短い方の配列の長さで除し、１００を乗じたものである。参照によりその全文が本明細書に組み込まれるRussell, R., and Barton, G.,「Structural Features can be Unconserved in Proteins with Similar Folds」, J. Mol. Biol. 244, 332-350 (1994), at p. 337を参照のこと。
【００８１】
さらに、同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。配列アラインメントおよび同一性パーセント算出は、例えば、ベクターＮＴＩ（登録商標）一式のＡｌｉｇｎＸプログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）またはＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティング一式のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して実施され得る。配列の複数のアラインメントが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖと標識されたアラインメント法（Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)によって開示される）に対応し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティング一式のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）に見出される「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法」を含めた、アルゴリズムのいくつかの変法を包含する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を使用して実施される。マルチプルアラインメントのために、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用するタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび同一性パーセントの算出のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸については、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４であり得る。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを使用する配列のアラインメント後、同一プログラム中の「配列距離」表を見ることによって、「同一性パーセント」を得ることが可能である。さらに、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法」が入手可能であり、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗと標識されたアラインメント法（Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189-191(1992)によって記載される）に対応し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティング一式のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）に見出される。マルチプルアラインメントのデフォルトパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを使用する配列のアラインメント後、同一プログラム中の「配列距離」表を見ることによって、「同一性パーセント」を得ることが可能である。
【００８２】
多数のレベルの配列同一性が、その他の種に由来するポリペプチドを同定することにおいて有用であるということは、当業者によって十分に理解されており、このようなポリペプチドは、同一または同様の機能または活性を有する。同一性パーセントの有用な例として、それだけには限らないが、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％または５５％〜１００％の任意の整数パーセンテージ、例えば、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が、本開示の実施形態の記載において有用であり得る。適した核酸断片は、上記の相同性だけではなく、通常、少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは、少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは、少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは、少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００８３】
用語「配列解析ソフトウェア」とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の解析にとって有用である任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列解析ソフトウェア」は、市販のものである場合も、独立に開発されたものである場合もある。典型的な配列解析ソフトウェアとして、限定するものではないが、１）ＧＣＧ一式のプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；２）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Altschul et al. J.Mol. Biol., 215:403-10 (1990)）；３）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）；および５）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んでいるＦＡＳＴＡプログラム（W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res. [Proc. Int. Symp.], (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Suhai, Sandor(編) Plenum: New York, NY）が挙げられる。本願の文脈内で、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合には、特に断りのない限り、分析の結果は、参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくということが理解される。本明細書において使用される場合、「デフォルト値」とは、最初に初期化される際に配列解析ソフトウェアとともに元々ロードされる任意の一連の値またはパラメータを意味する。
【００８４】
ハイブリダイゼーションに言及する場合、公知のヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む核酸が、プローブ配列に対して相当な量の配列同一性を有する、クローニングされたゲノムＤＮＡ断片またはｃＤＮＡ断片の集団（すなわち、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー）中に存在する他の対応するヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズするプローブとして使用され得る。ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、プラスミドＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチドまたはその他のポリヌクレオチドであり得、３２Ｐなどの検出可能な基、または任意のその他の検出可能なマーカーで標識され得る。したがって、例えば、ハイブリダイゼーションのプローブは、本開示の実施形態のＤＮＡ配列に基づいて合成オリゴヌクレオチドを標識することによって作製され得る。ハイブリダイゼーションのプローブを調製する方法およびｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーを構築する方法は、当技術分野で公知であり、開示されている（Sambrook et al., 1989）。
【００８５】
本開示の実施形態の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズする。サンプルにおいてトランスジェニック事象に由来するＤＮＡの存在を同定するために、任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅法が使用され得る。核酸分子またはその断片は、特定の状況下で他の核酸分子と「特異的にハイブリダイズ」できる。本明細書において使用される場合、２種の核酸分子は、２種の分子が、逆平行の、二本鎖核酸構造を形成できる場合に、互いに特異的にハイブリダイズすると言われる。核酸分子は、２種の核酸分子が、完全な相補性を示す場合に、別の核酸分子の「相補体」であるといわれる。本明細書において使用される場合、分子は、分子の一方のどのヌクレオチドも、もう一方のヌクレオチドと相補的である場合に「完全な相補性」を示すといわれる。完全な相補性を示す分子は、一般に、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で、十分な安定性をもって互いにハイブリダイズし、互いにアニーリングされたままであることを可能にする。
【００８６】
２種の分子は、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で、十分な安定性をもって互いにハイブリダイズでき、互いにアニーリングされたままであることを可能にする場合に「最少の相補性」を示すといわれる。従来の低ストリンジェンシー条件は、Sambrook et al. (1989)によって記載されている。核酸分子について、プライマーまたはプローブとして働くためには、使用される特定の溶媒および塩濃度下で、安定な二本鎖構造を形成できるよう配列の最少の相補性示すことのみが必要である。
【００８７】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす因子は、当業者に周知であり、これとして、限定するものではないが、温度、ｐＨ、イオン強度、ならびに、例えばホルムアミドおよびジメチルスルホキシドなどの有機溶媒の濃度が挙げられる。当業者には公知であるように、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、高温、低イオン強度および低溶媒濃度によって増大される。
【００８８】
用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェンシー条件」は、Sambrook et al. (1989)（９．５２〜９．５５）で論じられた特定のハイブリダイゼーション手順による、核酸プローブの、標的核酸との（すなわち、対象とする特定の核酸配列を含む核酸分子との）ハイブリダイゼーションに関して機能的に定義される。Sambrook et al. (1989)（９．４７〜９．５２および９．５６〜９．５８）も参照のこと。
【００８９】
通常、ストリンジェント条件とは、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３および短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については、少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０を超えるヌクレオチド）については、少なくとも約６０℃である温度で、約１．５Ｍ  Ｎａ＋イオン未満、通常、約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａ＋イオン濃度（またはその他の塩）であるものとなる。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加でも達成され得る。例示的な低ストリンジェンシー条件として、３７℃の、３０〜３５％ホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）のバッファー溶液を用いるハイブリダイゼーションおよび５０〜５５℃の、１Ｘ〜２Ｘ  ＳＳＣ（２０Ｘ  ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍ  クエン酸三ナトリウム）での洗浄が挙げられる。例示的な中程度のストリンジェンシー条件として、３７℃の、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  ＳＤＳでのハイブリダイゼーションおよび５５℃〜６０℃の０．５Ｘ〜１Ｘ  ＳＳＣでの洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシー条件として、約３７℃の、約５０％ホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  ＳＤＳでのハイブリダイゼーションおよび６０〜６５℃の０．１Ｘ  ＳＳＣでの洗浄が挙げられる。
【００９０】
特異性は通常、ハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔｍは、方程式Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ．）−５００／Ｌ（式中、Ｍは、一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍ．は、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは、塩基対でのハイブリッドの長さである）から概算され得る（Meinkoth and Wahl, 1984）。Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が、完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする温度である（特定のイオン強度およびｐＨ下で）。Ｔｍは、ミスマッチの各１％について約１℃低下する；したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、ハイブリダイズする所望の同一性の配列のために調整され得る。例えば、９０％の同一性を有する配列が求められる場合には、Ｔｍは、１０℃低下され得る。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列およびその相補体の融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低いものであるよう選択される。しかし、激しくストリンジェントな条件は、融解点（Ｔｍ）より１、２、３または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用でき；中程度にストリンジェントな条件は、融解点（Ｔｍ）よりも６、７、８、９または１０低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用でき；低ストリンジェンシー条件は、融解点（Ｔｍ）よりも１１〜２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用できる。方程式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物および所望のＴｍを使用することで、当業者ならば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変動は、本質的に記載されているということは理解される。所望の程度のミスマッチが、４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍをもたらす場合には、より高い温度が使用され得るようＳＳＣ濃度を高めることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションの詳細な指針は、(1997) Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, pages 2-40, Third Edit. (1997) and Sambrook et al. (1989)に見出される。
【００９１】
本明細書において使用される標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)によって；またSilhavy et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984)によって；またAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)によって記載されている。
【００９２】
本明細書において開示される組換え宿主の遺伝子操作は、標準遺伝子技術およびスクリーニングを使用して行われ得、遺伝子操作に適している任意の宿主細胞において実施され得る。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される組換え宿主細胞は、遺伝子修飾および組換え遺伝子発現に有用な、任意の生物または微生物宿主であり得る。いくつかの実施形態では、組換え宿主は、それだけには限らないが、双子葉および単子葉植物両方を含めた任意の高等植物ならびに作物およびそのオイルのために使用される植物を含めた消費可能な植物であり得る。したがって、任意の植物種または植物細胞は、以下にさらに記載されるように選択され得る。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本開示に従って遺伝的に修飾される植物（例えば、植物宿主細胞）として、それだけには限らないが、双子葉および単子葉植物の両方、特に、作物を含めた消費可能な植物を含めた任意の高等植物が挙げられる。このような植物として、それだけには限らないが、例えば、アルファルファ、ダイズ、ワタ、ナタネ（セイヨウアブラナとも呼ばれる）、亜麻仁、トウモロコシ、イネ、ビロードキビ、コムギ、ベニバナ、ソルガム、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコおよび芝草を挙げることができる。したがって、任意の植物種または植物細胞が選択され得る。実施形態では、本明細書において使用される植物細胞およびそれから成長したか、またはそれに由来する植物として、それだけには限らないが、ナタネ（セイヨウアブラナ（Brassica napus））、カラシナ（ブラシカ・ジュンセア（Brassica juncea））；エチオピアンマスタード（ブラシカ・カリナタ（Brassica carinata））；カブ（ブラシカ・ラパ（Brassica rapa））；キャベツ（ブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea））；ダイズ（グリシン・マックス（Glycine max））；アマ（リナム・ウシタティシマム（Linum usitatissimum））；トウモロコシ（maize）（トウモロコシ（corn）とも呼ばれる）（ゼア・メイズ（Zea mays））；ベニバナ（カルサムス・チンクトリウス（Carthamus tinctorius））；ヒマワリ（ヘリアンサス・アナス（Helianthus annuus））；タバコ（ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum））；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ブラジルナッツ（バーソレチア・エクセルサ（Betholettia excelsa）；トウゴマ（リシナス・コミュニス（Riccinus communis））；ココナッツ（ココス・ヌシフェラ（Cocus nucifera））；コリアンダー（コリアンドラム・サティバム（Coriandrum sativum））；ワタ（ゴシピウム属種（Gossypium spp.））；ラッカセイ（アラキス・ヒポゲア（Arachis Hypogaea））；ホホバ（シモンドシダ・キネンシス（Simmondsia chinensis））；アブラヤシ（エライズ・グイネーイス（Elaeis guineeis））；オリーブ（オレア・ユーパエア（Olea eurpaea））；イネ（オリザ・サティバ（Oryza sativa））；カボチャ（ククルビタ・マキシマ（Cucurbita maxima））；オオムギ（ホルデウム・ウルガレ（Hordeum vulgare））；サトウキビ（サッカルム・オフィシナルム（Saccharum officinarum））；イネ（オリザ・サティバ（Oryza sativa））；コムギ（トリチカム・デュラム（Triticum durum）およびトリチカム・アスティバム（Triticum aestivum）を含むコムギ属種（Triticum spp.））およびダックウィード（レムナセアエ属種（Lemnaceae sp.））から得られる細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、植物種内の遺伝的背景は、変わり得る。
【００９４】
本明細書において使用される場合、用語「植物の部分」は、限定するものではないが、種子（成熟種子および未熟種子を含む）、植物を切り取ったもの、植物細胞、植物細胞培養物、植物器官、花粉、胚、花、果実、シュート、葉、根、茎、外植片などを含めた植物の任意の部分を含む。植物細胞は、植物の構造的および生理学的単位であり、プロトプラストおよび細胞壁を含む。植物細胞は、単離された単細胞または細胞の凝集体、例えば、もろいカルスもしくは培養細胞の形態であり得、または、高度に組織化された単位、例えば、植物組織、植物器官もしくは植物体の一部であり得る。したがって、植物細胞は、全植物体に再生できるプロトプラスト、生殖体生成細胞、または細胞もしくは細胞の集合であり得る。そのようなものとして、複数の植物細胞を含み、全植物体に再生できる種子が、本開示の目的で植物細胞と考えられる。植物組織または植物器官は、種子、プロトプラスト、カルスまたは構造的もしくは機能的単位に組織されている植物細胞の任意のその他の群であり得る。植物の特に有用な部分は、後代植物の増殖に有用な収穫可能な部分（単数または複数）を含む。植物の収穫可能な部分は、植物の任意の有用な部分、例えば、花、花粉、実生、塊茎、葉、茎、果実、種子、根などであり得る。増殖のために有用な植物の一部として、例えば、種子、果実、切り取ったもの、実生、塊茎、台木などが挙げられる。組織培養物は好ましくは、前記の近交系植物の生理学的および形態学的特徴を有する植物を再生できるもの、また前記の近交系植物と実質的に同一の遺伝子型を有する植物を再生できるものとなる。対照的に、一部の植物細胞は、植物体を生成するよう再生され得ない。好ましくは、このような組織培養物中の再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、成長点細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、トウモロコシの毛、花、穀粒、穂、トウモロコシの穂軸、外皮または柄となる。さらに、本開示の実施形態は、本開示の実施形態の組織培養物から再生された植物を提供する。
【００９５】
遺伝的に修飾された植物の生産に関して、植物の遺伝子工学のための方法は、当技術分野で周知である。例えば、双子葉植物および単子葉植物のための植物形質転換のために、生物学的および物理的形質転換プロトコールを含めた多数の方法が開発されている（例えば、Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282-286 (1999);Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson、J. E.、Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)）。さらに、植物細胞または組織形質転換および植物の再生のためのベクターおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養法は、例えば、Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)において入手可能である。
【００９６】
ＤＮＡを植物宿主細胞中に挿入するために多数の技術が利用可能である。それらの技術は、形質転換剤としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を使用する武装解除したＴ−ＤＮＡを用いる形質転換、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン形質転換、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、超音波法（例えば、ソノポレーション）、リポソーム形質転換、マイクロインジェクション、裸のＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、微粒子銃（biolistic）（微粒子銃（microparticle bombardment））、シリコンカーバイドＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介性形質転換、エアゾールビーミングまたはＰＥＧおよびその他の可能性ある方法を含む。
【００９７】
例えば、ＤＮＡ構築物は、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどの技術を使用して、植物細胞のゲノムＤＮＡ中に直接的に導入され得るか、またはＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ微粒子銃（particle bombardment）などの微粒子銃（biolistic）法を使用して植物組織に直接的に導入され得る（例えば、Klein et al. (1987) Nature 327:70-73を参照のこと）。植物細胞形質転換のためのさらなる方法として、シリコンカーバイドＷＨＩＳＫＥＲＳ媒介性ＤＮＡ取り込みによるマイクロインジェクション（Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418）が挙げられる。あるいは、ＤＮＡ構築物は、ナノ粒子形質転換によって植物細胞中に導入され得る（例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許出願番号第１２／２４５，６８５号を参照のこと）。
【００９８】
植物形質転換の別の公知の方法として、ＤＮＡが微粒子（microprojectile）の表面に保持される微粒子（microprojectile）媒介性形質転換がある。この方法では、発現ベクターは、微粒子（microprojectiles）を、植物細胞壁および細胞膜を透過するのに十分な速度に加速させる微粒子銃（biolistic）装置を用いて、植物組織中に導入される。Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J. C., Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)。
【００９９】
あるいは、遺伝子導入および形質転換法として、それだけには限らないが、塩化カルシウム沈殿によるプロトプラスト形質転換、裸のＤＮＡのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはエレクトロポレーション媒介性取り込み（Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722, Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828；およびShimamoto (1989) Nature 338:274-276を参照のこと）および植物組織のエレクトロポレーション（D’Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505）が挙げられる。
【０１００】
発現ベクターを植物中に導入するために利用されている方法は、アグロバクテリウムの天然形質転換システムに基づいている。Horsch et al. Science 227:1229 (1985)。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換するのに有用であることが知られている植物病原性土壌細菌である。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のＴｉおよびＲｉプラスミドは、それぞれ、植物の遺伝子形質転換に関与する遺伝子を保持する。Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991)。アグロバクテリウムベクター系およびアグロバクテリウム媒介性遺伝子導入のための方法の記載はまた、例えば、Gruber et al., 前掲、Miki et al., 前掲、Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)および米国特許第４，９４０，８３８号および同５，４６４，７６３号において入手可能である。
【０１０１】
形質転換にアグロバクテリウムが使用される場合には、挿入されるべきＤＮＡは、特定のプラスミドに、すなわち、中間体ベクターまたはバイナリーベクターのいずれかにクローニングされるべきである。中間体ベクターは、アグロバクテリウム中では自身で複製できない。中間体ベクターは、ヘルパープラスミド（コンジュゲーション）によってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）中に転移され得る。日本たばこスーパーバイナリー系は、このような系の一例である（Komari et al., (2006) In: Methods in Molecular Biology (K. Wang、ed.) No. 343: Agrobacterium Protocols (2nd Edition, Vol. 1) HUMANA PRESS Inc., Totowa, NJ, pp.15-41；およびKomori et al. (2007) Plant Physiol. 145:1155-60に総説されている）。バイナリーベクターは、大腸菌（e. coli）およびアグロバクテリウムの両方において自身を複製できる。バイナリーベクターは、右および左のＴ−ＤＮＡ境界領域によって囲まれている、選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含む。それらは、アグロバクテリウム中に直接、形質転換され得る（Holsters、1978）。宿主として使用されるアグロバクテリウムは、ｖｉｒ領域を保持するプラスミドを含むこととなる。ＴｉまたはＲｉプラスミドはまた、Ｔ−ＤＮＡの転移に必要なｖｉｒ領域を含む。ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡの、植物細胞への転移にとって必要である。さらなるＴ−ＤＮＡが含有される場合もある。
【０１０２】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主の病原性機能は、細胞が、バイナリーＴ  ＤＮＡベクター（Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721）または同時培養手順（Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231）を使用して細菌に感染すると、構築物および隣接するマーカーを含有するＴ−鎖の、植物細胞ＤＮＡへの挿入を指示する。一般に、アグロバクテリウム形質転換系は、双子葉植物を操作するために使用される（Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384;Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641）。アグロバクテリウム形質転換系はまた、単子葉植物および植物細胞を形質転換するため、ならびに単子葉植物および植物細胞にＤＮＡを転移するために使用され得る。米国特許第５，５９１，６１６号；Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3:3039-3041;Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764; Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179;Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40；およびGould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426-434を参照のこと。遺伝構築物の植物細胞への導入後に、植物細胞を成長させてもよく、シュートおよび根などの組織の分化が出現すると、成熟した植物が生成され得る。いくつかの実施形態では、複数の植物が生成され得る。植物を再生するための方法論は、当業者に公知であり、例えば、Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishersにおいて、およびPlant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press)において見出すことができる。一般に、本明細書において記載される修飾された植物は、発酵培地において培養し、土壌などの適した培地において成長させてもよい。いくつかの実施形態では、高等植物の適した成長培地は、それだけには限らないが、土壌、砂、根成長または水耕培養を支持する任意のその他の粒状培地（例えば、バーミキュライト、パーライトなど）ならびに高等植物の成長を最適化する適した光、水および栄養補助物質を含めた、植物のための任意の成長培地を含み得る。
【０１０３】
上記の形質転換技術のいずれかによって製造される形質転換された植物細胞を、培養して、形質転換された遺伝子型、ひいては、所望の表現型を有する全植物体を再生できる。このような再生技術は、組織培養成長培地中の特定の植物ホルモンの操作に頼るものであり、通常、所望のヌクレオチド配列と一緒に導入されている殺生物剤および／または除草剤マーカーに頼る。培養されたプロトプラストからの植物再生は、Evans, et al., "Protoplast Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983；およびBinding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985に記載されている。再生はまた、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚またはその一部からも得られ得る。このような再生技術は、Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486に全般的に記載されている。
【０１０４】
その他の実施形態では、形質転換されている植物細胞は、植物体を生成するよう再生できない。このような細胞は、例えば、関連表現型、例えば、除草剤抵抗性を有する植物細胞株の開発において使用され得る。
【０１０５】
植物細胞中に導入された核酸を使用して、所望の形質を本質的に任意の植物に付与できる。さまざまな植物および植物細胞系が、本開示の核酸構築物および上記の種々の形質転換法を使用して、本明細書において記載される所望の生理学的および農学的特徴のために操作され得る。好ましい実施形態では、操作のための標的植物および植物細胞として、それだけには限らないが、穀類作物（例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、アワ、オオムギ）、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えば、アルファルファ）、根菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ）、葉菜作物（例えば、レタス、ホウレンソウ）、開花植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹およびマツ（例えば、マツ、モミ、トウヒ）；ファイトレメディエーションにおいて使用される植物（例えば、重金属蓄積植物）；油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）および実験目的のために使用される植物（例えば、アラビドプシス属（Arabidopsis））を含めた作物などの単子葉および双子葉植物のものが挙げられる。したがって、開示された方法および組成物は、それだけには限らないが、アスパラガス属（Asparagus）、カラスムギ属（Avena）、アブラナ属（Brassica）、シトラス属（Citrus）、スイカ属（Citrullus）、トウガラシ属（Capsicum）、カボチャ属（Cucurbita）、ニンジン属（Daucus）、ムカシヨモギ属（Erigeron）、ダイズ属（Glycine）、ワタ属（Gossypium）、オオムギ属（Hordeum）、アキノノゲシ属（Lactuca）、ドクムギ属（Lolium）、トマト属（Lycopersicon）、リンゴ属（Malus）、キャッサバ属（Manihot）、タバコ属（Nicotiana）、オオアラセイトウ属（Orychophragmus）、イネ属（Oryza）、ワニナシ属（Persea）、インゲンマメ属（Phaseolus）、エンドウ属（Pisum）、ナシ属（Pyrus）、サクラ属（Prunus）、ダイコン属（Raphanus）、ライムギ属（Secale）、ナス属（Solanum）、ソルガム属（Sorghum）、コムギ属（Triticum）、ブドウ属（Vitis）、ササゲ属（Vigna）およびトウモロコシ属（Zea）に由来する種を含めた広範囲の植物に対して用途がある。
【０１０６】
形質転換された植物細胞、カルス、組織または植物は、操作された植物材料を、形質転換ＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子によってコードされる形質について選択またはスクリーニングすることによって同定および単離され得る。例えば、選択は、形質転換遺伝子構築物がそれに対する抵抗性を付与する抗生物質または除草剤の阻害量を含有する培地で、操作された植物材料を成長させることによって実施され得る。さらに、形質転換された植物および植物細胞はまた、組換え核酸構築物上に存在し得る、任意の目に見えるマーカー遺伝子（例えば、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼまたはｇｆｐ遺伝子）の活性についてスクリーニングすることによって同定され得る。このような選択およびスクリーニング方法論は、当業者には周知である。
【０１０７】
核酸を細胞中に挿入することに関連して、用語、導入されたとは、細胞への形質転換および従来の植物育種技術におけるような、配列を有する植物を別の植物と掛け合わせ、その結果、第２の植物が異種配列を含有することを含む。このような育種技術は、当業者に周知である。植物育種技術の考察については、Poehlman (1995) Breeding Field Crops, AVI Publication Co., Westport Conn, 4th Editを参照のこと。戻し交配法を使用して、植物に遺伝子を導入してもよい。この技術は、植物に形質を導入するために数十年使用されてきた。周知であるこのおよびその他の植物育種技術の説明の一例は、Poehlman, 前掲およびPlant Breeding Methodology, edit. Neal Jensen, John Wiley & Sons, Inc. (1988)などの参考文献に見出すことができる。通常の戻し交雑プロトコールでは、対象とする元の変種（反復親）を、導入されるべき対象とする単一遺伝子を保持する第２の変種（「非反復親」）と交配する。この交配種から得られた後代を、次いで、反復親と再度交配し、非反復親に由来する単一の転移された遺伝子に加えて、反復親の所望の形態的および生理学的特徴の本質的にすべてが、変換された植物において回収される植物が得られるまでこのプロセスを反復する。
【０１０８】
特定の実施形態は、少なくとも一方の親として、本開示の一実施形態の植物を使用して交雑種を作製するプロセスに関する。例えば、特定の実施形態は、一方または両方の親として、本明細書に例示される植物のいずれかを有するＦ１ハイブリッド植物に関し、その他の実施形態では、このようなＦ１ハイブリッドによって生成される種子に関する。さらにその他の実施形態は、例示された植物を、異なる（例えば、近交系親）植物を交雑させ、得られたハイブリッド種子を回収することによって、Ｆ１ハイブリッド種子を生成する方法に関する。その他の実施形態は、雌親または雄親のいずれかである例示された植物に関する。得られた植物の特徴は、親植物を注意深く考慮することによって改善され得る。
【０１０９】
本開示の実施形態のｄｇｔ−１４ポリヌクレオチドを含有するトランスジェニック植物は、まず、本明細書において参照される系統のいずれか１種の種子から成長した植物からなる第１の親植物を、第２の親植物と雌雄を掛け合わせ、それによって、複数の第１の後代植物を製造すること、次いで、グリホサートに対して抵抗性である第１の後代植物を選択すること、第１の後代植物を自家受粉させ、それによって、複数の第２の後代植物を製造すること、次いで、グリホサートに対して抵抗性である第２の後代植物を選択することによって作り出され得る。これらのステップは、第１の後代植物または第２の後代植物を、第２の親植物または第３の親植物と戻し交配することをさらに含み得る。次いで、特定の実施形態の種子を含む作物またはその後代を植え付けてもよい。
【０１１０】
２種の異なるトランスジェニック植物も、２種の独立に分離する、付加された外因性遺伝子を含有する子孫を製造するために交配され得るということは理解されるべきである。適当な後代の自家受粉は、付加された、外因性遺伝子の両方についてホモ接合体である植物をもたらす。栄養繁殖と同様に、親植物に戻し交雑すること非トランスジェニック植物と外交配することも考慮される。異なる形質および作物のために一般に使用されるその他の育種方法は、当技術分野で公知である。戻し交雑育種は、単純に遺伝される、高度に遺伝性の形質について、反復親である望ましいホモ接合体栽培品種または近交系に遺伝子を転移させるために使用されてきた。移されるべき形質の供給源は、ドナー親と呼ばれる。得られた植物は、反復親（例えば、栽培品種）の特質およびドナー親から転移された望ましい形質を有すると予測される。最初の交配後、ドナー親の表現型を有する個体が、選択され、反復親に反復して交配される（戻し交雑）。得られた親は、反復親（例えば、栽培品種）の特質およびドナー親から転移された望ましい形質を有すると予測される。
【０１１１】
本明細書において記載されるｄｇｔ−１４ヌクレオチド配列をコードする核酸は、複製および／または発現のための原核細胞または真核細胞への形質転換のためにベクター中にクローニングされ得る。ベクターは、原核生物ベクター、例えば、プラスミドまたはシャトルベクター、昆虫ベクターまたは真核生物ベクターであり得る。ｄｇｔ−１４ポリヌクレオチドをコードする核酸は、例えば、植物細胞への投与のために発現ベクター中にクローニングされ得る。時には、大腸菌（E. coli）において機能的であるベクターを有することが好ましいことであり得る（例えば、抗体を作製するためのタンパク質の製造、ＤＮＡ配列分析、インサートの構築、核酸の量を獲得すること）。
【０１１２】
ＤＧＴ−１４タンパク質を発現させるために、通常、ｄｇｔ−１４配列をコードするヌクレオチド配列を、転写を指示するプロモーターを含有する発現ベクター中にサブクローニングする。適した細菌および真核細胞プロモーターは、当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3rd ed., 2001);Kriegler, Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 前掲)に記載されている。ｄｇｔ−１４配列を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（E. coli）、バチルス属種（Bacillus sp.）およびサルモネラ（salmonella）において入手可能である（Palva et al., Gene 22:229-235 (1983)）。このような発現系のキットは、市販されている。哺乳類細胞、酵母および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当業者には周知であり、同様に市販されている。
【０１１３】
遺伝情報を細胞中に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、ＤＧＴ１４タンパク質の意図される使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原虫などにおける発現に関して選択される。標準細菌および動物発現ベクターは、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許公開２００５００６４４７４Ａ１および国際特許公報ＷＯ０５／０８４１９０、ＷＯ０５／０１４７９１およびＷＯ０３／０８０８０９に詳細に記載されている。多量のタンパク質を発現する細菌細胞株を製造するために、標準トランスフェクション法が使用され得、次いで、それは、標準技術を使用して精製され得る。
【０１１４】
ｄｇｔ−１４をコードする核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、個々の適用に応じて変わる。例えば、宿主細胞に適している強力な構成的プロモーターが、ＤＧＴ−１４タンパク質の発現および精製のために通常使用される。好ましい植物プロモーターの限定されない例として、シロイヌナズナ（A.thaliana）ユビキチン−１０（ubi-10）（Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:12486-12493）；Ａ．ツメファシエンス（A.tumefaciens）マンノピンシンターゼ（Δmas）（Petolino et al.、米国特許第６，７３０，８２４号）；および／またはキャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）（Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139）に由来するプロモーター配列が挙げられる。
【０１１５】
本明細書において開示される方法では、植物における遺伝子の発現を指示するいくつかのプロモーターが使用され得る。このようなプロモーターは、構成的プロモーター、化学調節性プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターおよび種子優先（seed-preferred）プロモーターから選択され得る。
【０１１６】
構成的プロモーターとして、例えば、コアカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Odell et al. (1985) Nature 313:810-812)；イネアクチンプロモーター（McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171）；トウモロコシユビキチンプロモーター（米国特許第５，５１０，４７４号;Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632およびChristensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689）；ｐＥＭＵプロモーター（Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）；トウモロコシヒストンプロモーター（Chaboute et al. Plant Molecular Biology, 8:179-191 (1987)）などが挙げられる。
【０１１７】
利用可能な植物適合プロモーターの範囲は、組織特異的および誘導性プロモーターを含む。誘導性調節エレメントは、誘導物質に応じて１種または複数のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接的または間接的に活性化できるものである。誘導物質の不在下で、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されない。通常、誘導性調節エレメントと特異的に結合して転写を活性化するタンパク質因子は、不活性形態で存在し、これは、次いで、誘導物質によって、直接的または間接的に活性形態に変換される。誘導物質は、熱、冷温、塩または毒性要素によって直接的に、またはウイルスなどの病原体もしくは病因物質の作用によって間接的に課せられる、タンパク質、代謝生成物、成長調節物質、除草剤またはフェノール系化合物などの化学物質または生理学的ストレスであり得る。通常、誘導性調節エレメントと特異的に結合して、転写を活性化するタンパク質因子は、不活性形態で存在し、これは、次いで、誘導物質によって、直接的または間接的に活性形態に変換される。誘導性調節エレメントを含有する植物細胞は、噴霧、灌水、加熱または同様の方法によってなど、細胞または植物に誘導物質を外的に適用することによって誘導物質に曝露され得る。
【０１１８】
本開示の実施形態では、任意の誘導プロモーターが使用され得る。Ward et al. Plant Mol. Biol. 22: 361-366 (1993)を参照のこと。例示的な誘導プロモーターとして、エクジソン受容体プロモーター（米国特許第６，５０４，０８２号）；銅に反応するＡＣＥ１系に由来するプロモーター（Mett et al. PNAS 90: 4567-4571 (1993)）；ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤に反応するトウモロコシ由来のＩｎ２−１およびＩｎ２−２遺伝子（米国特許第５，３６４，７８０号；Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227: 229-237 (1991)およびGatz et al., Mol. Gen. Genetics 243: 32-38 (1994)）；Ｔｎ１０由来のＴｅｔレプレッサー（Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227: 229-237 (1991)；転写活性が糖質コルチコステロイドホルモンによって誘導される、ステロイドホルモン遺伝子に由来するプロモーター、Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 10421 (1991)およびMcNellis et al., (1998) Plant J. 14(2):247-257；発芽前除草剤として使用される疎水性求電子性化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター（米国特許第５，９６５，３８７号および国際特許出願公開番号ＷＯ９３／００１２９４）；およびサリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ−１ａプロモーター（Ono S, Kusama M, Ogura R, Hiratsuka K., "Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Reporter System", Biosci Biotechnol Biochem. 2011 Sep 23;75(9):1796-800）が挙げられる。その他の化学物質によって調節される対象とするプロモーターとして、テトラサイクリン誘導性およびテトラサイクリン抑制性プロモーター（例えば、Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237および米国特許第５，８１４，６１８号および同５，７８９，１５６号を参照のこと）が挙げられる。
【０１１９】
対象とするその他の調節可能なプロモーターとして、転写が、それぞれ、冷温または熱に対する曝露に応じて達成され得る、冷温反応性調節エレメントまたは熱ショック調節エレメント（Takahashi et al., Plant Physiol. 99:383-390, 1992）；嫌気性条件によって誘導可能な、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Gerlach et al., PNAS USA 79:2981-2985 (1982);Walker et al., PNAS 84(19):6624-6628 (1987)）；エンドウマメｒｂｃＳ遺伝子またはエンドウマメｐｓａＤｂ遺伝子に由来する光誘導性プロモーター（Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265）；光誘導性調節エレメント（Feinbaum et al., Mol. Gen. Genet. 226:449, 1991;Lam and Chua, Science 248:471, 1990;Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590;Orozco et al. (1993) Plant Mol. Bio. 23(6):1129-1138）；植物ホルモン誘導性調節エレメント（Yamaguchi-Shinozaki et al., Plant Mol. Biol. 15:905, 1990; Kares et al., Plant Mol. Biol. 15:225, 1990）などが挙げられる。誘導性調節エレメントはまた、ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤に応答するトウモロコシＩｎ２−１またはＩｎ２−２遺伝子のプロモーター（Hershey et al., Mol. Gen. Gene 227:229-237, 1991; Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 243:32-38, 1994）およびトランスポゾンＴｎ１０のＴｅｔレプレッサー（Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227:229-237, 1991）であり得る。ストレス誘導性プロモーターとして、Ｐ５ＣＳなどの塩／水ストレス誘導性プロモーター（Zang et al. (1997) Plant Sciences 129:81-89）；ｃｏｒ１５ａなどの冷温誘導性プロモーター（Hajela et al. (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252）、ｃｏｒ１５ｂ（Wilhelm et al. (1993) Plant Mol Biol 23:1073-1077）、ｗｓｃ１２０（Ouellet et al. (1998) FEBS Lett. 423-324-328）、ｃｉ７（Kirch et al. (1997) Plant Mol Biol. 33:897-909）およびｃｉ２１Ａ（Schneider et al. (1997) Plant Physiol. 113:335-45）；Ｔｒｇ−３１（Chaudhary et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:1247-57）およびｒｄ２９（Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnology 18:287-291）などの乾燥誘導性プロモーター；Ｒａｂ１７などの浸透圧誘導性プロモーター（Vilardell et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17:985-93）およびオスモチン（Raghothama et al. (1993) Plant Mol Biol 23:1117-28）；熱ショックタンパク質などの熱誘導性プロモーター（Barros et al. (1992) Plant Mol. 19:665-75;Marrs et al. (1993) Dev. Genet. 14:27-41）、ｓｍＨＳＰ（Waters et al. (1996) J. Experimental Botany 47:325-338）；およびパセリユビキチンプロモーターに由来する熱ショック誘導性エレメント（ＷＯ０３／１０２１９８）が挙げられる。その他のストレス誘導性プロモーターとして、ｒｉｐ２（米国特許第５，３３２，８０８号および米国特許公開第２００３／０２１７３９３号）およびｒｄ２９ａ（Yamaguchi-Shinozaki et al. (1993) Mol. Gen. Genetics 236:331-340）が挙げられる。アグロバクテリウムｐＭＡＳプロモーター（Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505）およびアグロバクテリウムＯＲＦ１３プロモーター（Hansen et al., (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343）を含めた特定のプロモーターは、創傷によって誘導可能である。
【０１２０】
組織優先プロモーターは、特定の植物組織内での増強された転写および／または発現を標的とするために利用され得る。優先発現を指す場合には、意味されることは、特定の植物組織における、その他の植物組織においてよりも高レベルでの発現である。これらの種のプロモーターの例として、ファゼオリンプロモーターによって提供されるものなどの種子優先発現（Bustos et al. 1989. The Plant Cell Vol. 1, 839-853）およびトウモロコシグロブリン−１遺伝子、Belanger, et al. 1991 Genetics 129:863-972が挙げられる。双子葉植物について、種子優先プロモーターとして、それだけには限らないが、マメβ−ファゼオリン、ナピン（napin）、β−コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリンなどが挙げられる。単子葉植物について、種子優先プロモーターとして、それだけには限らないが、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤゼイン、２７ｋＤａゼイン、γ−ゼイン、ワキシー（waxy）、シュランケン（shrunken）１、シュランケン（shrunken）２、グロブリン１などが挙げられる。種子優先プロモーターとしてまた、例えば、γ−ゼインの胚乳優先プロモーターなどの種子内の特定の組織に遺伝子発現を主に向けるプロモーター、タバコ由来の隠れた（cryptic）プロモーター（Fobert et al. 1994. T-DNA tagging of a seed coat-specific cryptic promoter in tobacco. Plant J. 4: 567-577）、トウモロコシ由来のＰ遺伝子プロモーター（Chopra et al. 1996. Alleles of the maize P gene with distinct tissue specificities encode Myb-homologous proteinss with C-terminal replacements.Plant Cell 7:1149-1158, Erratum in Plant Cell.1997, 1:109）、トウモロコシ由来のグロブリン−１プロモーター（Belenger and Kriz.1991. Molecular basis for Allelic Polymorphism of the maize Globulin-1 gene. Genetics 129: 863-972）および種子皮またはトウモロコシ穀粒の殻に発現を向けるプロモーター、例えば、果皮特異的グルタミンシンセターゼプロモーター（Muhitch et al., 2002. Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Synthetase1-2 Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize. Plant Science 163:865-872）が挙げられる。
【０１２１】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、通常、原核生物または真核生物いずれかの宿主細胞における核酸の発現に必要なさらなる要素のすべてを含有する転写単位または発現カセットを含有する。したがって、通常の発現カセットは、例えば、タンパク質をコードする核酸配列と作動可能に連結されたプロモーターおよび例えば、転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位または翻訳終結に必要なシグナルを含有する。カセットのさらなる要素は、例えば、エンハンサーおよび異種スプライシングシグナルを含み得る。
【０１２２】
ベクターのその他の成分はまた、遺伝子の意図される用途に応じて含まれ得る。例として、選択マーカー、ターゲッティングまたは調節配列、最適化された輸送ペプチド配列などの輸送ペプチド配列（米国特許第５，５１０，４７１号を参照のこと）ＲＢ７  ＭＡＲなどの安定化配列（Thompson and Myatt, (1997) Plant Mol. Biol., 34: 687-692およびWO9727207を参照のこと）またはリーダー配列、イントロンなどが挙げられる。植物発現ベクターおよびリポーター遺伝子の一般的な説明および例は、Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al eds; CRC Press pp. 89-119 (1993)中のGruber, et al., "Vectors for Plant Transformation"に見出すことができる。適当な発現ベクターの選択は、宿主および発現ベクターを宿主に導入する方法に応じて変わる。発現カセットはまた、対象とする異種ヌクレオチド配列の３’末端に、植物において機能的である転写および翻訳終結領域を含むこととなる。終結領域は、本開示の実施形態のプロモーターヌクレオチド配列に関して生来的である場合も、対象とするＤＮＡ配列に関して生来的である場合も、または別の供給源に由来する場合もある。オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ（nos）終結領域などの好都合な終結領域は、Ａ．ツメファシエンス（tumefaciens）のＴｉプラスミドから入手可能である（Depicker et al., Mol. and Appl. Genet. 1:561-573 (1982)およびShaw et al. (1984) Nucleic Acids Research vol. 12, No. 20 pp7831-7846(nos)）;Guerineau et al. Mol. Gen. Genet. 262:141-144 (1991);Proudfoot, Cell 64:671-674 (1991);Sanfacon et al. Genes Dev. 5:141-149 (1991);Mogen et al.Plant Cell 2:1261-1272 (1990);Munroe et al. Gene 91:151-158 (1990);Ballas et al. Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 (1989); Joshi et al. Nucleic Acid Res. 15:9627-9639 (1987)も参照のこと。
【０１２３】
発現カセットは、５’リーダー配列をさらに含有し得る。このようなリーダー配列は、翻訳を増強するよう作用し得る。翻訳リーダーは、当技術分野で公知であり、例として、ピコルナウイルスリーダー、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コーディング領域）、Elroy-Stein et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126-6130 (1989)；ポティウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス）Carrington and Freed Journal of Virology, 64:1590-1597 (1990)、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）、Allison et al.、Virology 154:9-20 (1986)；ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、Macejak et al. Nature 353:90-94 (1991)；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡ由来の非翻訳リーダー（ＡＭＶ  ＲＮＡ  ４）、Jobling et al. Nature 325:622-625 (1987)；タバコモザイクウイルスリーダー（TMV）、Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA、237-256頁；およびトウモロコシ退緑斑紋ウイルスリーダー（Maize chlorotic mottle virus leader）（ＭＣＭＶ）Lommel et al. Virology 81:382-385 (1991)が挙げられる。Della-Cioppa et al. Plant Physiology 84:965-968 (1987)も参照のこと。
【０１２４】
構築物はまた、イントロンなどの翻訳および／またはｍＲＮＡ安定性を増強する配列を含有し得る。１種のこのようなイントロンの例として、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のヒストンＨ３．ＩＩＩ変異体の遺伝子ＩＩの第１のイントロンがある。Chaubet et al. Journal of Molecular Biology, 225:569-574 (1992)。
【０１２５】
特定のオルガネラ、特に、プラスチド、アミロプラストに、または小胞体に向けられるか、または細胞の表面もしくは細胞外に分泌される異種核酸配列の発現生成物を有することが望ましい場合には、発現カセットは、輸送ペプチドのコード配列をさらに含み得る。このような輸送ペプチドは、当技術分野で周知であり、それだけには限らないが、アシル担体タンパク質の輸送ペプチド、ＲＵＢＩＳＣＯ、植物ＥＰＳＰシンターゼおよびヒマワリ（Helianthus annuus）の小サブユニット（Lebrun et al.米国特許第５，５１０，４１７号）、トウモロコシＢｒｉｔｔｌｅ−１葉緑体輸送ペプチド（Nelson et al. Plant Physiol 117(4):1235-1252 (1998); Sullivan et al.Plant Cell 3(12):1337-48; Sullivan et al., Planta (1995) 196(3):477-84; Sullivan et al., J. Biol. Chem. (1992) 267(26):18999-9004）などが挙げられる。さらに、最適化された輸送ペプチドなどのキメラ葉緑体輸送ペプチドは、当技術分野で公知である（米国特許第５，５１０，４７１号を参照のこと）。さらなる葉緑体輸送ペプチドが、米国特許第５，７１７，０８４号、同５，７２８，９２５号において、これまでに記載されている。当業者ならば、特定のオルガネラへ産物を発現させることにおいて利用可能な多数の選択肢を容易に理解する。例えば、オオムギアルファアミラーゼ配列は、発現を小胞体に向けるために使用されることが多い（Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985)）。
【０１２６】
当業者には、組換えＤＮＡ技術は、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、核酸分子が転写される効率、得られた転写物が翻訳される効率および翻訳後修飾の効率を操作することによって、トランスフェクトされた核酸分子の発現の制御を改善し得るということは理解される。さらに、プロモーター配列は、天然プロモーターと比較して、発現のレベルを改善するよう遺伝子操作され得る。核酸分子の発現の制御に有用な組換え技術として、それだけには限らないが、１種または複数の宿主細胞染色体中への核酸分子の安定な組込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または修飾、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャイン・ダルガーノ配列またはコザック配列）の置換または修飾、宿主細胞のコドン使用に対応するための核酸分子の修飾および転写物を不安定化する配列の欠失が挙げられる。
【０１２７】
形質転換された細胞または組織または植物部分または植物の選択のためのリポーターまたはマーカー遺伝子が、形質転換ベクター中に含まれ得る。選択マーカーの例として、除草剤または抗生物質などの代謝拮抗剤に対する抵抗性を付与するもの、例えば、メトトレキサートに対する抵抗性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ（Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13:143-149, 1994;Herrera Estrella et al., Nature 303:209-213, 1983;Meijer et al., Plant Mol. Biol. 16:807-820, 1991）；アミノグリコシドネオマイシン、カナマイシンおよびパロマイシン（paromycin）に対する抵抗性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995, 1983およびFraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803 (1983)）およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（Marsh, Gene 32:481-485, 1984;Waldron et al.. Plant Mol. Biol. 5:103-108, 1985;Zhijian et al., Plant Science 108:219-227, 1995も参照のこと）；細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8047, 1988）；細胞がマンノースを利用することを可能にするマンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ（ＷＯ９４／２０６２７）；オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチンに対する抵抗性を付与するオルニチンデカルボキシラーゼ（DFMO; McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.）；およびブラストサイジンＳに対する抵抗性を付与する、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）由来のデアミナーゼ（Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2336-2338, 1995）が挙げられる。
【０１２８】
さらなる選択マーカーとして、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素抵抗性を付与する突然変異体アセト乳酸シンターゼ（Lee et al., EMBO J. 7:1241-1248, 1988）、アトラジンに対する抵抗性を付与する突然変異体ｐｓｂＡ（Smeda et al., Plant Physiol. 103:911-917, 1993）または突然変異体プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（米国特許第５，７６７，３７３号を参照のこと）またはグルホシネートなどの除草剤に対する抵抗性を付与するその他のマーカーが挙げられる。適した選択マーカー遺伝子の例として、それだけには限らないが、クロラムフェニコール（Herrera Estrella et al., EMBO J. 2:987-992, 1983）；ストレプトマイシン（Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210:86-91, 1987）；スペクチノマイシン（Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res. 5:131-137, 1996）；ブレオマイシン（Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171-176, 1990）；スルホンアミド（Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 15:127-136, 1990）；ブロモキシニル（Stalker et al., Science 242:419-423, 1988）；グリホサート（Shaw et al., Science 233:478-481, 1986）；ホスフィノトリシン（DeBlock et al., EMBO J. 6:2513-2518, 1987）に対する抵抗性をコードする遺伝子などが挙げられる。
【０１２９】
選択遺伝子の使用のための１つの選択肢は、グルホシネート抵抗性をコードするＤＮＡであり、一実施形態では、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターの制御下の、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐａｔ）、トウモロコシ最適化ｐａｔ遺伝子またはｂａｒ遺伝子である。これらの遺伝子は、ビアラホスに対する抵抗性を付与する（Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37);Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603; 1990; Uchimiya et al., Biotechnology 11:835, 1993;White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062、1990; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625-631, 1990；およびAnzai et al.、Mol. Gen. Gen. 219:492、1989を参照のこと）を参照。ｐａｔ遺伝子の１つのバージョンとして、トウモロコシ最適化ｐａｔ遺伝子があり、米国特許第６，０９６，９４７号に記載されている。
【０１３０】
さらに、ポリヌクレオチドをコードするマーカーを含有する植物細胞の同定を容易にするマーカーが使用され得る。配列の存在が、測定可能な産物をもたらし、植物細胞の破壊を伴わずに産物をもたらし得る場合には、スコア化可能なまたはスクリーニング可能なマーカーは有用である。例として、種々の発色基質が公知である酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（例えば、米国特許第５，２６８，４６３号および同５，５９９，６７０号）；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Jefferson et al. The EMBO Journal vol. 6 No. 13 pp. 3901-3907）；およびアルカリホスファターゼが挙げられる。好ましい実施形態では、使用されるマーカーは、ベータ−カロテンまたはプロビタミンＡ（Ye et al., Science 287:303-305-(2000)）である。この遺伝子は、イネの栄養を増強するために使用されてきたが、この例では、代わりに、スクリーニング可能なマーカーとしてとして使用され、対象とする遺伝子と連結している遺伝子の存在は、提供される金色によって検出される。遺伝子が、植物へのその栄養的な貢献のために使用される状況とは異なり、マーキング目的には、少量のタンパク質で十分である。その他のスクリーニング可能なマーカーとして、例えば、中でも、植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の製造を調節する生成物をコードする、Ｒ−遺伝子座遺伝子（Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., pp. 263-282 (1988)）；トウモロコシＣ１遺伝子（Kao et al., Plant Cell (1996) 8: 1171-1179;Scheffler et al., Mol. Gen. Genet. (1994) 242:40-48）およびトウモロコシＣ２（Wienand et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 203:202-207）などのフラボノイド色素の生合成を制御する遺伝子；Ｂ遺伝子（Chandler et al., Plant Cell(1989) 1:1175-1183）、ｐ１遺伝子（Grotewold et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88:4587-4591;Grotewold et al., Cell (1994) 76:543-553;Sidorenko et al., Plant Mol. Biol. (1999)39:11-19）；ｂｒｏｎｚｅ遺伝子座遺伝子（Ralston et al., Genetics (1988) 119:185-197;Nash et al., Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049）を含めた、全般的に、アントシアニン／フラボノイド遺伝子が挙げられる（Taylor and Briggs, The Plant Cell (1990)2:115-127での考察を参照のこと）。
【０１３１】
適したマーカーのさらなる例として、シアン蛍光タンパク質（ＣＹＰ）遺伝子（Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54およびKato et al. (2002) Plant Physiol 129: 913-42）、黄色蛍光タンパク質遺伝子（Ｅｖｒｏｇｅｎ製のＰＨＩＹＦＰ（商標）；Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54を参照のこと）；ルシフェラーゼをコードし、例えば、Ｘ線フィルム、シンチレーション計数、蛍光分光光度測定、微光ビデオカメラ、光子計数カメラまたはマルチウェルルミノメトリーを使用してその存在が検出され得る、ｌｕｘ遺伝子（Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子（Sheen et al., Plant J. (1995) 8(5):777-84）；およびマーカー遺伝子で形質転換された植物細胞が、赤色であり、したがって、視覚的に選択可能である、ＤｓＲｅｄ２（Dietrich et al. (2002) Biotechnologys 2(2):286-293）が挙げられる。さらなる例として、種々の発色基質（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色性セファロスポリン）が公知である酵素をコードするβ−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffe, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1978) 75:3737）；発色性カテコールを変換できるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowsky et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:1101）；α−アミラーゼ遺伝子（Ikuta et al., Biotech. (1990) 8:241）およびチロシンをＤＯＰＡおよびドーパキノンに酸化でき、順に、これが縮合して、容易に検出可能な化合物メラニンを形成する酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katz et al., J. Gen. Microbiol. (1983) 129:2703）が挙げられる。明確に、多数のこのようなマーカーが利用可能であり、当業者に公知である。
【０１３２】
特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、任意選択で、対象とする別のヌクレオチド配列と組み合され得る。用語「対象とするヌクレオチド配列」とは、所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする、転写されたＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子であり得る核酸分子（ポリヌクレオチドとも呼ばれ得る）を指し、必ずしもポリペプチドまたはタンパク質をコードしない、全遺伝子を構成しない核酸分子（例えば、プロモーター）も指し得る。例えば、特定の実施形態では、核酸分子は、グリホサートもしくは別の除草剤に対するさらなる抵抗性もしくは耐性、および／または選定された昆虫または疾患に対する抵抗性および／もしくは栄養強化および／もしくは改善された農学的特徴、および／またはタンパク質もしくは食餌、食物、工業的用途、医薬的用途もしくはその他の用途において有用なその他の生成物を提供する別のものと組み合わされ、または「積み重ねられ」得る。植物ゲノム内の対象とする２種以上の核酸配列の「スタッキング」は、例えば、２以上の事象、対象とする配列を含有する構築物を用いる植物の形質転換、トランスジェニック植物トランスジェニック植物の再形質転換または相同組換えを介した標的組込みによる新規形質の付加を使用する従来の植物育種によって達成され得る。
【０１３３】
対象とするこのようなヌクレオチド配列として、それだけには限らないが、以下に提供される実施例が挙げられる。
【０１３４】
１．有害生物または疾患に対して抵抗性を付与する遺伝子またはコード配列（例えば、ｉＲＮＡ）
（Ａ）植物疾患抵抗性遺伝子。植物防御は、植物中の疾患抵抗性遺伝子（Ｒ）の生成物と、病原体中の対応する病原性（Ａｖｒ）遺伝子の生成物間の特定の相互作用によって活性化されることが多い。ある植物の種類が、クローニングされた抵抗性遺伝子を用いて形質転換され、特定の病原体株に対して抵抗性である植物に操作できる。このような遺伝子の例として、クラドスポリウム・フルブム（Cladosporium fulvu）に対する抵抗性のための、トマトＣｆ−９遺伝子（Jones et al., 1994 Science 266:789）、トマト斑葉細菌病に対する抵抗性のためのプロテインキナーゼをコードする、トマトＰｔｏ遺伝子（Martin et al., 1993 Science 262:1432）およびシュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に対する抵抗性のための、アラビドプシス属（Arabidopsis）ＲＳＳＰ２遺伝子（Mindrinos et al.、1994 Cell 78:1089）が挙げられる。
【０１３５】
（Ｂ）Ｂｔ  δ−エンドトキシン遺伝子のヌクレオチド配列などの、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質、その誘導体またはそれをモデルにした合成ポリペプチド（Geiser et al., 1986 Gene 48:109）および栄養型殺虫性（ＶＩＰ）遺伝子（例えば、Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94を参照のこと）。さらに、δ−エンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）からＡＴＣＣ受託番号４００９８、６７１３６、３１９９５および３１９９８の下で購入できる。
【０１３６】
（Ｃ）いくつかのクンシラン（Clivia miniata）マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列などの、レクチン（Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825）。
【０１３７】
（Ｄ）昆虫有害生物に対する殺うじ剤として有用であるアビジンおよびアビジン相同体などの、ビタミン結合タンパク質。米国特許第５，６５９，０２６号を参照のこと。
【０１３８】
（Ｅ）酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤。
このような遺伝子の例として、イネシステインプロテイナーゼ阻害剤（Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793）、タバコプロテイナーゼ阻害剤Ｉ（Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985）およびα−アミラーゼ阻害剤（Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243）が挙げられる。
【０１３９】
（Ｆ）昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン、例えば、エクジステロイドおよび幼若ホルモンその変異体、それをベースとしたミメティックまたはそのアンタゴニストもしくはアゴニスト、例えば、クローニングされた幼若ホルモンエステラーゼのバキュロウイルス発現、幼若ホルモンの不活化（Hammock et al., 1990 Nature 344:458）。
【０１４０】
（Ｇ）発現すると、影響を受ける有害生物の生理学を撹乱する、昆虫特異的ペプチドまたはニューロペプチド（J. Biol. Chem. 269:9）。このような遺伝子の例として、昆虫利尿ホルモン受容体（Regan, 1994）、ディプロプテラ・プンクタータ（Diploptera punctata）において同定されたアロスタチン（allostatin）（Pratt,1989）および昆虫特異的、麻痺性神経毒（米国特許第５，２６６，３６１号）が挙げられる。
【０１４１】
（Ｈ）蛇、スズメバチなどによって天然に産生される昆虫特異的毒液、例えば、サソリ昆虫毒ペプチド（Pang, 1992 Gene 116:165）。
【０１４２】
（Ｉ）モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の高度集積に関与している酵素
【０１４３】
（Ｊ）生物学的に活性な分子の翻訳後修飾を含めた、修飾に関与している酵素、例えば、天然または合成にかかわらず、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼおよびエステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼおよびグルカナーゼ。このような遺伝子の例として、ｃａｌｌａｓ遺伝子（ＰＣＴ公開出願ＷＯ９３／０２１９７）、キチナーゼをコードする配列（例えば、ＡＴＣＣから受託番号３９９９６３７および６７１５２の下で入手できる）、タバコ鉤虫キチナーゼ（Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691）およびパセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子（Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673）が挙げられる。
【０１４４】
（Ｋ）シグナル変換をシミュレートする分子。このような分子の例として、リョクトウカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757）およびトウモロコシカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467）が挙げられる。
【０１４５】
（Ｌ）疎水性モーメントペプチド。米国特許第５，６５９，０２６号および同５，６０７，９１４号を参照のこと；後者は、疾患抵抗性を付与する合成抗菌ペプチドを教示している。
【０１４６】
（Ｍ）膜透過酵素、チャネル形成剤またはチャネル遮断剤、例えば、トランスジェニックタバコ植物をシュードモナス・ソラナセアラム（Pseudomonas solanacearum）に対して抵抗性にする、セクロピン−ベータ溶菌性ペプチド類似体（Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89:43）。
【０１４７】
（Ｎ）ウイルス侵襲性タンパク質またはそれに由来する複合毒素。例えば、形質転換植物細胞におけるウイルスコートタンパク質の蓄積は、ウイルス感染および／またはコートタンパク質遺伝子が由来するウイルスによって、ならびに関連ウイルスによって達成される疾患発生に対する抵抗性を与える。アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチウイルス、タバコ茎えそウイルスおよびタバコモザイクウイルスに対して、コートタンパク質媒介性抵抗性が形質転換植物に付与されている。例えば、Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451を参照のこと。
【０１４８】
（Ｏ）昆虫特異的抗体またはそれに由来する免疫毒素。したがって、昆虫腸において重大な代謝機能にターゲッティングされる抗体は、影響を受ける酵素を不活化し、昆虫を死滅させる。例えば、Taylor et al. (1994) Abstract #497、Seventh Intl. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactionsは、一本鎖抗体断片の製造によるトランスジェニックタバコにおける酵素性不活性化を示す。
【０１４９】
（Ｐ）ウイルス特異的抗体。例えば、組換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、ウイルス攻撃から保護されるということを示すTavladoraki et al. (1993) Nature 266:469を参照のこと。
【０１５０】
（Ｑ）病原体または寄生生物によって天然に生成される発達遅延性タンパク質。したがって、真菌エンドα−１，４−Ｄポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼを可溶化することによって、真菌コロニー形成および植物栄養放出を促進する(Lamb et al., 1992) Biotechnology 10:1436。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害性タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特性決定が、Toubart et al. (1992 Plant J. 2:367)に記載されている。
【０１５１】
（Ｒ）植物によって天然に生成される発達遅延性タンパク質、例えば、真菌疾患に対する増大した抵抗性を提供するオオムギリボソーム不活化遺伝子(Longemann et al., 1992). Biotechnology 10:3305。
【０１５２】
（Ｓ）ＲＮＡ分子が、標的遺伝子の発現を阻害するために使用される、ＲＮＡ干渉。一例では、ＲＮＡ分子は、部分的または完全に二本鎖であり、サイレンシング反応を引き起こし、ｄｓＲＮＡの低分子干渉ＲＮＡへの切断をもたらし、次いで、これが、相同ｍＲＮＡを破壊するターゲッティング複合体中に組み込まれる。例えば、Fire et al.、米国特許第６，５０６，５５９号;Graham et al.同６，５７３，０９９号を参照のこと。
【０１５３】
２．除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子
（Ａ）成長点または分裂組織を阻害する除草剤、例えば、イミダザリノン（imidazalinone）、スルホンアニリドまたはスルホニル尿素除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。このカテゴリー中の例示的遺伝子は、突然変異体ＡＬＳ酵素をコードし（Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241）、これは、ＡＨＡＳ酵素としても知られている（Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449）。
【０１５４】
（Ｂ）突然変異体ＥＰＳＰシンターゼおよびａｒｏＡ遺伝子によって、またはＧＡＴ（グリホサートアセチルトランスフェラーゼ）もしくはＧＯＸ（グリホサートオキシダーゼ）などの遺伝子およびグルホシネート（ｐａｔおよびｂａｒ遺伝子；ＤＳＭ−２）などのその他のホスホノ化合物ならびにアリールオキシフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサンジオン（ＡＣＣアーゼ阻害剤をコードする遺伝子）による代謝不活性化によって与えられる、グリホサートに対する抵抗性または耐性をコードする１種または複数のさらなる遺伝子。例えば、グリホサート抵抗性を付与できるＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列を開示する米国特許第４，９４０，８３５号を参照のこと。突然変異体ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号３９２５６の下で得ることができ、突然変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第４，７６９，０６１号に開示されている。欧州特許出願番号０３３３０３３および米国特許第４，９７５，３７４号には、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を付与するグルタミンシンセターゼ遺伝子のヌクレオチド配列が開示されている。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、欧州特許出願０２４２２４６に提供されている。De Greef et al. (1989) Biotechnology 7:61には、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性のためにキメラｂａｒ遺伝子コーディングを発現するトランスジェニック植物の製造が記載されている。アリールオキシフェノキシプロピオン酸およびセトキシジムおよびハロキシフォップなどのシクロヘキサンジオンに対する抵抗性を付与する遺伝子の例示的なものとして、Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435に記載される、Ａｃｃｌ−Ｓ１、Ａｃｃｌ−Ｓ２およびＡｃｃｌ−Ｓ３遺伝子がある。
【０１５５】
（Ｃ）光合成を阻害する除草剤、例えば、トリアジンに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）およびベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）。Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3:169には、クラミドモナス（Chlamydomonas）を形質転換するための突然変異体ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドの使用が記載されている。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第４，８１０，６４８号に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号５３４３５、６７４４１および６７４４２の下で入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼのＤＮＡコーディングのクローニングおよび発現は、Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173に記載されている。
【０１５６】
（Ｄ）ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）がホモゲンチジン酸に形質転換される反応を触媒する酵素と結合する除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。これは、イソキサゾール（ＥＰ４１８１７５、ＥＰ４７０８５６、ＥＰ４８７３５２、ＥＰ５２７０３６、ＥＰ５６０４８２、ＥＰ６８２６５９、米国特許第５，４２４，２７６号）、特に、トウモロコシの選択的除草剤であるイソキサフルトール、ジケトニトリル（ＥＰ４９６６３０、ＥＰ４９６６３１）、特に、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３Ｃｌ２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、トリケトン（ＥＰ６２５５０５、ＥＰ６２５５０８、米国特許第５，５０６，１９５号）、特に、スルコトリオンおよびピラゾリネートなどの除草剤を含む。例えば、米国特許第６，２６８，５４９号および同６，２４５，９６８号および米国特許出願公開第２００３００６６１０２号に記載される遺伝子を含めた、植物において過剰量のＨＰＰＤを生成する遺伝子は、このような除草剤に対する耐性または抵抗性を提供し得る。
【０１５７】
（Ｅ）遺伝子。フェノキシオーキシン除草剤、例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）に対する抵抗性または耐性をコードし、アリールオキシフェノキシプロピオネート（ＡＯＰＰ）除草剤に対する抵抗性または耐性も付与する遺伝子。このような遺伝子の例として、米国特許第７，８３８，７３３号に記載される、α−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素（ａａｄ−１）遺伝子が挙げられる。
【０１５８】
（Ｆ）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）などのフェノキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性をコードし、フルロキシピルまたはトリクロピルなどのピリジルオキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性も付与し得る遺伝子。このような遺伝子の例として、ＷＯ２００７／０５３４８２  Ａ２に記載されるα−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素遺伝子（ａａｄ−１２）が挙げられる。
【０１５９】
（Ｇ）ジカンバに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子（例えば、米国特許公開第２００３０１３５８７９号を参照のこと）。
【０１６０】
（Ｈ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）を阻害する除草剤に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子（米国特許第５，７６７，３７３号を参照のこと）。
【０１６１】
（Ｉ）光化学系ＩＩ反応中心（ＰＳ  ＩＩ）のコアタンパク質と結合する、トリアジン除草剤（アトラジンなど）および尿素誘導体（ジウロンなど）除草剤に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子(Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245を参照のこと。
【０１６２】
３．価値が付加された形質を付与するか、またはそれに貢献する遺伝子
（Ａ）植物のステアリン酸含量を増大させるために、例えば、アンチセンス遺伝子またはステアロイル−ＡＣＰ不飽和化酵素を用いて、トウモロコシまたはアブラナ属（Brassica）を形質転換することによって修飾された脂肪酸代謝(Knultzon et al., 1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624。
【０１６３】
（Ｂ）減少したフィチン酸含量
（１）クロコウジカビ（Aspergillus niger）フィターゼ遺伝子などのフィターゼをコードする遺伝子の導入（Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87）は、フィチン酸の分解を増強し、より多くの遊離リン酸を形質転換植物に付加する。
（２）フィチン酸含量を低下させる遺伝子は、導入され得る。トウモロコシでは、これは、例えば、クローニングすることおよび次いで、低レベルのフィチン酸を特徴とするトウモロコシ突然変異体と関連している単一の対立遺伝子と関連しているＤＮＡを再導入することによって達成され得る（Raboy et al., 1990 Maydica 35:383）。
【０１６４】
（Ｃ）例えば、植物を、デンプンの分岐パターンを変更する酵素の遺伝子コーディングを用いて形質転換することによって達成される修飾された炭水化物組成物。このような酵素の例として、ストレプトコッカス・ミューカス（Streptococcus mucus）フルクトース転移酵素遺伝子(Shiroza et al., 1988) J. Bacteriol. 170:810、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子（Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ（Pen et al., 1992 Biotechnology 10:292）、トマトインベルターゼ遺伝子（Elliot et al.、1993）、オオムギアミラーゼ遺伝子（Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480）およびトウモロコシ胚乳デンプン分岐酵素ＩＩ（Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450）が挙げられる。
【０１６５】
対象とする配列はまた、相同組換えによって、植物ゲノムの所定の領域中に導入されるヌクレオチド配列であり得る。相同組換えによって、植物細胞の特定の染色体部位内にポリヌクレオチド配列を安定に組み込むための方法は、当技術分野内で記載されている。例えば、米国特許出願公開番号第２００９／０１１１１８８  Ａ１号に記載されるような部位特異的組込みは、ドナーポリヌクレオチド配列の染色体標的への導入を媒介するための、リコンビナーゼまたはインテグラーゼの使用を含む。さらに、国際特許公開番号ＷＯ２００８／０２１２０７には、１種または複数のドナーポリヌクレオチド配列をゲノムの特定の位置内に安定に組み込むためのジンクフィンガー媒介性相同組換えが記載されている。米国特許第６，７２０，４７５号に記載されるようなＦＬＰ／ＦＲＴまたは米国特許第５，６５８，７７２号に記載されるようなＣＲＥ／ＬＯＸなどのリコンビナーゼの使用が、ポリヌクレオチド配列を特定の染色体部位に安定に組み込むために利用され得る。最後に、ドナーポリヌクレオチドを特定の染色体位置へターゲッティングするためのメガヌクレアーゼの使用は、Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060)に記載されている。
【０１６６】
植物細胞内の部位特異的組込みのためのその他の種々の方法は、一般に、公知であり、適用可能である（Kumar et al., Trends in Plant Sci. 6(4) (2001) pp. 155-159）。さらに、いくつかの原核生物および下等真核生物において同定されている部位特異的組換え系は、植物における使用に適用され得る。このような系の例として、それだけには限らないが、酵母ザイゴサッカロミセス・ルキシー（Zygosaccharomyces rouxii）のpSR1プラスミドに由来するR/RSリコンビナーゼ系（Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203）およびファージMuのGin/gix系（Maeser and Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176）が挙げられる。
【０１６７】
種々のアッセイが、本開示の特定の実施形態の核酸分子に関して使用され得る。以下の技術は、様々な状況において有用であり、一実施形態では、植物細胞においてコードされる核酸分子および／またはポリペプチドの存在を検出することにおいて有用である。例えば、分子の存在は、配列のプライマーまたはプローブを使用すること、コードされるタンパク質を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイ、タンパク質を検出するためのウエスタンブロットまたはＲＮＡもしくはＤＮＡを検出するためのノーザンもしくはサザンブロットを含め、様々な方法で決定され得る。酵素ＤＧＴ−１４を検出するために酵素アッセイが使用され得る。さらに、ＤＧＴ−１４タンパク質の存在を検出できる抗体が、当技術分野で認識される手順を使用して生成され得る。in situハイブリダイゼーション、酵素染色および免疫染色などのさらなる技術も、特定の植物器官および組織における組換え構築物の存在または発現を検出するために使用され得る。導入遺伝子は、植物のいくつかの組織において、またはいくつかの発達段階で選択的に発現されることもあり、または導入遺伝子は、実質的にすべての植物組織において、実質的にその全生活環に沿って発現されることもある。しかし、任意のコンビナトリアル発現様式も適用可能である。
【０１６８】
サザン分析は、よく使用される検出法であり、これでは、ＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼを用いて切断され、アガロースゲル上で分画されて、ＤＮＡが分子量によって分離され、次いで、ナイロンメンブランにトランスファーされる。次いで、３２Ｐ（またはその他のプローブ標識）で放射標識されたプローブ断片とハイブリダイズされ、ＳＤＳ溶液で洗浄される。
【０１６９】
同様に、ノーザン分析は、同様のプロトコールを展開し、これでは、ＲＮＡが制限エンドヌクレアーゼを用いて切断され、アガロースゲル上で分画されて、ＲＮＡが分子量によって分離され、次いで、ナイロンメンブランにトランスファーされる。次いで、３２Ｐ（またはその他のプローブ標識）で放射標識されたプローブ断片とハイブリダイズされ、ＳＤＳ溶液で洗浄される。対象とする組織から単離されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の分析は、相対発現レベルを示し得る。通常、ｍＲＮＡが存在するか、ｍＲＮＡの量が増大した場合には、対応する導入遺伝子が発現されていると想定され得る。ノーザン分析またはその他のｍＲＮＡ分析プロトコールは、導入された導入遺伝子または天然遺伝子の発現レベルを決定するために使用され得る。
【０１７０】
ウエスタン分析では、ＤＮＡ／ＲＮＡを単離する代わりに、対象とするタンパク質が抽出され、アクリルアミドゲル上に置かれる。次いで、タンパク質がメンブレンにブロッティングされ、標識物質と接触させられる。例えば、Hood et al., "Commercial Production of Avidin from Transgenic Maize; Characterization of Transformants, Production, Processing, Extraction and Purification" Molecular Breeding 3:291-306 (1997);Towbin et al. (1979) "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some appliations" Proc Natl Acad Sci USA 76(9): 4350-4354; Renart et al. "Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera:  a method for studying antibody specificity and antigen structure" Proc Natl Acad Sci USA 76(7):3116-3120。
【０１７１】
本開示の実施形態の核酸分子またはそのセグメントは、ＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使用され得る。ＰＣＲ増幅の実施では、プライマーおよび鋳型間で特定のミスマッチ度が許容され得る。したがって、例示されたプライマーの突然変異、欠失および挿入（特に、５’末端へのヌクレオチドの付加）は、本開示の範囲内に入る。当技術分野に公知の方法によって、所与のプライマー中に突然変異誘発、挿入および欠失が生じ得る。
【０１７２】
検出方法の別の例として、Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000)によって記載されるピロシーケンス技術がある。この方法では、隣接するゲノムＤＮＡおよび挿入部分ＤＮＡ接合部分と重なるオリゴヌクレオチドが、設計される。オリゴヌクレオチドは、対象とする領域に由来する一本鎖ＰＣＲ産物（挿入された配列中の１種のプライマーおよびそれぞれの両端に位置するゲノム配列中の１種）とハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホスルフェートおよびルシフェリンの存在下でインキュベートされる。ＤＮＴＰが個別に添加され、組込みが光シグナルをもたらし、これが測定される。光シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一または複数塩基伸長によって、導入遺伝子挿入部分／それぞれの両端に位置する配列の存在を示す。（この技術は、特定の遺伝子の、既知である場合の検出にではなく、最初の配列決定に使用される。）
【０１７３】
分子ビーコン（Molecular Beacons）は、配列検出における使用のために記載されている。手短には、それぞれの両端に位置するゲノムおよび挿入部分ＤＮＡ接合部分と重なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが、設計される。ＦＲＥＴプローブの独特の構造が、蛍光および消光部分を極近接して維持する二次構造を含有するものをもたらす。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入部分ＤＮＡ配列中の１種のプライマーおよびそれぞれの両端に位置するゲノム配列中の１種）が、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環される。成功したＰＣＲ増幅後、ＦＲＥＴプローブ（複数可）の標的配列とのハイブリダイゼーションは、プローブ二次構造の除去および蛍光および消光部分の空間的分離をもたらす。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによって、それぞれの両端に位置するゲノム／導入遺伝子挿入部分配列の存在を示す。
【０１７４】
加水分解プローブアッセイは、別に、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Life Technologies、Foster City、Calif.）としても知られる、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量化する方法である。手短には、事象特異的検出のために導入遺伝子内に１つのオリゴおよびそれぞれの両端に位置するゲノム配列中に１つを有するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入部分ＤＮＡ配列中の１種のプライマーおよびそれぞれの両端に位置するゲノム配列中の１種）が、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環される。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションが、ＦＲＥＴプローブ上の消光部分から蛍光部分の切断および放出をもたらす。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによって、それぞれの両端に位置する／導入遺伝子挿入部分配列の存在を示す。
【０１７５】
ＥＬＩＳＡまたは酵素結合免疫測定法は、１９７１年から知られている。一般に、バッファー中に可溶化された抗原が、プラスチック表面上にコーティングされる。血清が添加されると、抗体は、固相上の抗原と結合し得る。これらの抗体の有無は、酵素とコンジュゲートされると実証され得る。適当な基質を添加することで、定量され得る結合しているコンジュゲートの量が検出される。一般的なＥＬＩＳＡアッセイは、ビオチン化抗（タンパク質）ポリクローナル抗体およびアルカリホスファターゼコンジュゲートを使用するものである。例えば、ラッカーゼレベルの定量的測定のために使用されるＥＬＩＳＡは、商業的に得られるポリクローナルウサギ抗体を利用する抗体サンドイッチアッセイであり得る。抗体は、検出のためにアルカリホスファターゼにコンジュゲートされる。別の例では、トリプシンまたはトリプシノーゲンを検出するＥＬＩＳＡアッセイは、ビオチン化抗トリプシンまたは抗トリプシノーゲンポリクローナル抗体およびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを使用する。
【０１７６】
グリホサート、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンを含む組成物は、除草剤において広く使用されている成分である。グリホサートは、通常、水性液濃縮物中の塩、固体濃縮物、エマルジョンまたはマイクロエマルジョンとして製剤される。製剤のいずれかに従って使用され得るグリホサートの適した塩形態として、例えば、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウムおよびカリウム塩、アンモニウム塩、ジメチルアンモニウムなどのジアンモニウム塩、アルキルアミン塩、例えば、ジメチルアミンおよびイソプロピルアミン塩、アルカノールアミン塩、例えば、エタノールアミン塩、アルキルスルホニウム塩、例えば、トリメチルスルホニウム塩、スルホキソニウム塩およびそれらの混合物または組み合わせが挙げられる。グリホサートの市販の製剤の例として、制限するものではないが、ＧＬＹＰＨＯＭＡＸ（登録商標）、ＧＬＹＰＨＯＭＡＸ（登録商標）ＸＲＴ、ＧＬＹＰＨＯＭＡＸ（登録商標）ＰＬＵＳ、ＤＵＲＡＮＧＯ（登録商標）、ＲＯＵＮＤＵＰ  ＵＬＴＲＡ、ＲＯＵＮＤＵＰ  ＵＬＴＲＡＭＡＸ、ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標）ＣＴ、ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標）ＥＸＴＲＡ、ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標）ＢＩＯＡＣＴＩＶＥ、ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標）ＢＩＯＦＯＲＣＥ、ＲＯＤＥＯ（登録商標）、ＰＯＬＡＲＩＳ（登録商標）、ＳＰＡＲＫ（登録商標）、ＡＣＣＯＲＤ（登録商標）ＳＰ、ＡＣＣＯＲＤ（登録商標）ＸＲＴおよびＡＣＣＯＲＤ（登録商標）ＣＯＮＣＥＮＴＲＡＴＥが挙げられ、そのすべては、グリホサートをそのイソプロピルアンモニウム塩（ＩＰＡ）として含有する；グリホサートをそのアンモニウム塩として含有する、ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標）ＤＲＹおよびＲＩＶＡＬ（商標）；ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標）ＧＥＯＦＯＲＣＥ、ナトリウムグリホサート製剤；ＴＯＵＣＨＤＯＷＮ（商標）、グリホサートトリメシウム塩製剤、ＴＯＵＣＨＤＯＷＮ  ＩＱ（商標）、グリホサートジアンモニウム塩製剤、ＴＯＵＣＨＤＯＷＮ  ＴＯＴＡＬ  ＩＱ（商標）、カリウムグリホサート製剤およびＲＯＵＮＤＵＰ  ＷＥＡＴＨＥＲＭＡＸ（登録商標）、カリウムグリホサート製剤が挙げられる。グリホサート製剤は、薬剤軽減剤（safening agent）、界面活性剤および／またはアジュバントを含み得る。グリホサート除草剤製剤に対して抵抗性である植物または植物細胞を提供することは、このような抵抗性を有する植物細胞が、耕作区域において雑草を防除するために使用される十分な量のグリホサートに対する曝露を許容し得る種々の適用において有用であり得る。生来の細菌ｄｇｔ−１４ヌクレオチド配列の修飾は、植物細胞において発現された場合に除草剤グリホサートに対する改善された抵抗性を提供し得る。
【０１７７】
グリホサートは、発芽から植物発達の種々の段階まで、植物の上面に適用され得る。グリホサート除草剤製剤と組み合わせて使用されるグリホサート耐性植物変種は、米国および世界中での作物生産における雑草管理の標準プログラムとなった。グリホサート耐性形質（例えば、ｄｇｔ−１４）を使用することにおける栽培者にとっての主な利点は、優れた作物安全性を有し、植え付け前除草剤適用に対する依存が少ない、不要な植物およびイネ科草本（すなわち、「雑草」）を防除するための、グリホサート、広範囲の、発芽後除草剤の簡単な好都合な適用を可能にするということである。その他の恩恵は、無耕農業および作付体系の減少に良好に適合することを含む。グリホサート耐性作物は、雑草管理の選択肢を広げ、雑草防除の実施をかなり容易に、費用のあまりかからない、より柔軟性のあるものにした。栽培者は、除草剤を適用するために田畑中をより少なく動き回るようになったことおよびより少なく耕して回るようになったことを報告し、これによって、燃料が温存され、土壌侵食が低減される。グリホサート耐性作物は、したがって、除草剤によってもたらされる環境リスクを低減し、一方で、同時に、必要な化学物質雑草防除の有効性を高める。
【０１７８】
したがって、種々の実施形態では、グリホサート抵抗性植物を含有する耕作区域において雑草を選択的に防除するための方法が提供される。方法は、雑草の成長を防除するために作物の葉および雑草に十分な量の除草剤グリホサートを適用することを含む。
【０１７９】
考慮される除草剤組成物（すなわち、粒状固体濃縮物または液体濃縮物あるいはすぐに使える組成物またはタンク混合組成物）中に存在するグリホサートの相対量は、例えば、防除されるべき雑草種および適用方法を含めた多数の因子に応じて変わり得る。しかし、一般的に言えば、グリホサートおよび任意選択で、界面活性剤および／または除草剤組成物において使用されるいくつかのその他のアジュバントまたは添加物（本明細書において別の場所に記載されるような）の濃度は、耕作区域内の雑草を防除するのに十分である。
【０１８０】
さらに、グリホサートおよび任意選択で、界面活性剤および／または除草剤組成物において使用されるいくつかのその他のアジュバントまたは添加物（本明細書において別の場所に記載されるような）の濃度は、耕作区域内の雑草再成長の防除を提供するのに十分である。
【０１８１】
したがって、液体濃縮物組成物は、１リットルあたり少なくとも約５０グラム、少なくとも約７５グラムまたは少なくとも約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０または７００グラム（酸当量またはａ．ｅ．）またはそれ以上の濃度でグリホサートを含むよう製剤される。グリホサート濃度は、例えば、１リットルあたり約５０〜約６８０グラム（ａ．ｅ．）、１リットルあたり約１００〜約６００グラム（ａ．ｅ．）（ｇｐｌ）、１リットルあたり約２５０〜約６００グラム（ａ．ｅ．）、または１リットルあたり約３６０〜約５４０グラム（ａ．ｅ．）の範囲である。グリホサート濃縮物の総重量に基づいた重量パーセンテージとして表される場合には、液体濃縮物は、例えば、少なくとも約１０重量％のグリホサート（酸当量またはａ．ｅ．）、少なくとも約１５重量％、および少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６６、６７、または６８重量％  ａ．ｅ．またはそれ以上を含む。グリホサート濃度範囲は、例えば、約１０重量％〜約７０重量％  ａ．ｅ．、約２０重量％〜約６８重量％  ａ．ｅ．または約２５重量％〜約４５重量％  ａ．ｅ．の範囲である。グリホサートが、すぐに使える組成物として適用される場合には、グリホサート濃度は通常、約１重量％〜約３重量％  ａ．ｅ．および約１重量％〜約２重量％  ａ．ｅ．である。
【０１８２】
グリホサート濃縮物の総重量に基づいた重量パーセンテージとして表される場合には、固体濃縮組成物は、少なくとも約５重量％のグリホサート（酸当量またはａ．ｅ．）、少なくとも約２０重量％  ａ．ｅ．または少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５重量％  ａ．ｅ．またはそれ以上の濃度でグリホサートを含むよう製剤される。グリホサート濃度は、例えば、約５重量％〜約９７重量％  ａ．ｅ．、約３０重量％〜約８５重量％  ａ．ｅ．または約５０重量％〜約７５重量％  ａ．ｅ．の範囲である。
【０１８３】
噴霧組成物は、例えば、１エーカーあたり少なくとも約１ガロン（３．８Ｌ）の噴霧組成物、１エーカーあたり、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ガロン（７５．７Ｌ）およびそれ以上の適用のために製剤され得る。噴霧組成物の噴霧容量は、例えば、空中散布のために、１エーカーあたり約１ガロン（３．８Ｌ）〜約１００ガロン（３８０Ｌ）、１エーカーあたり約２ガロン（７．６Ｌ）〜約４０ガロン（１５１．４Ｌ）および１エーカーあたり約２ガロン（７．６Ｌ）〜約５ガロン（１８．９Ｌ）、また地上散布のために、１エーカーあたり約５ガロン（１８．９Ｌ）〜約２０ガロン（７５．７Ｌ）の範囲である。
【０１８４】
あるいは、適用のための所望の希釈で（すなわち、「すぐに使える」組成物）、またはエンドユーザーによる水での希釈、分散または溶解を必要とする（すなわち、「濃縮」組成物）のいずれかで、すでに製剤されたグリホサート除草剤組成物が、エンドユーザーに提供され得る。このようなあらかじめ製剤された濃縮物は、液体または粒状固体であり得る。
【０１８５】
グリホサートが、主に塩の形態で存在する水相および任意選択で、比較的水に不溶性である第２の除草剤有効成分を含有する非水相を有する液体濃縮物製剤が使用され得る。このような製剤は、例示的に、エマルジョン（マクロエマルジョンおよびミクロエマルジョン、油中水、水中油および水中油中水の種類を含む）、懸濁液およびサスポエマルジョンを含み得る。非水相は、場合によって、マイクロカプセル化した成分、例えば、マイクロカプセル化した除草剤を含み得る。非水相を有する製剤では、組成物中のグリホサートａ．ｅ．の濃度は、全体として、それにもかかわらず、水性濃縮物製剤について本明細書に列挙される範囲内である。
【０１８６】
除草剤噴霧組成物は、組成物が適用の準備が整って製造されるかどうか、液体グリホサート濃縮物のさらなる希釈または粒状固体グリホサート濃縮物への水の添加から得られるかどうかにかかわらず、水溶液または分散物として適用されることに留意されたい。しかし、用語「水性」とは、本明細書において使用される場合、存在する主な溶媒が水である限り、幾分か少量の非水性溶媒の存在を除外しないものとする。
【０１８７】
本開示の実施形態は、作物（例えば、トランスジェニックグリホサート抵抗性植物の）を含有する耕作区域において、雑草または不要な植生を死滅させるか、または防除する方法を対象とする。一実施形態では、本方法は、グリホサートをタンク混合物として適用することおよびグリホサートを許容するよう遺伝的に形質転換された植物の葉に、同時に、このような植物と極近接して成長する雑草に葉に、除草剤として十分な量のタンク混合物を適用することを含む。この使用方法は、雑草または不要な植生の防除をもたらし、一方で、除草剤耐性植物を実質的に無傷で残す。
【０１８８】
本開示の一実施形態では、水性グリホサート組成物は、水性グリホサート組成物を植物の葉組織に適用することによって、一年生および多年生イネ科草本および広葉雑草種を含めたさまざまな不要な植物を死滅させるか、またはその成長を防除するために植物の葉組織に適用され得る。このような植物として、それだけには限らないが、例えば、アルファルファ、ダイズ、ワタ、ナタネ、亜麻仁、トウモロコシ、イネ、ビロードキビ、コムギ、ベニバナ、ソルガム、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコおよび芝草を挙げることができる。したがって、任意の植物種または植物細胞が選択され得る。実施形態では、本明細書において使用される植物細胞およびそれから成長したか、またはそれに由来する植物として、それだけには限らないが、ナタネ（セイヨウアブラナ（Brassica napus））、カラシナ（ブラシカ・ジュンセア(Brassica juncea））；エチオピアンマスタード（ブラシカ・カリナタ（Brassica carinata））；カブ（ブラシカ・ラパ（Brassica rapa））；キャベツ（ブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea)）））；ダイズ（グリシン・マックス（Glycine max））；亜麻仁／アマ（リナム・ウシタティシマム（Linum usitatissimum））；トウモロコシ（maize）（トウモロコシ（corn）とも呼ばれる）（ゼア・メイズ（Zea mays））；ベニバナ（カルサムス・チンクトリウス（Carthamus tinctorius））；ヒマワリ（ヘリアンサス・アナス（Helianthus annuus））；タバコ（ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum））；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ブラジルナッツ（バーソレチア・エクセルサ（Betholettia excelsa））；トウゴマ（リシナス・コミュニス（Riccinus communis））；ココナッツ（ココス・ヌシフェラ（Cocus nucifera））；コリアンダー（コリアンドラム・サティバム（Coriandrum sativum））；ワタ（ゴシピウム属種（Gossypium spp.））；ラッカセイ（アラキス・ヒポゲア（Arachis Hypogaea））；ホホバ（シモンドシダ・キネンシス（Simmondsia chinensis））；アブラヤシ（エライズ・グイネーイス（Elaeis guineeis））；オリーブ（オレア・ユーパエア（Olea eurpaea））；イネ（オリザ・サティバ（Oryza sativa））；カボチャ（ククルビタ・マキシマ（Cucurbita maxima））；オオムギ（ホルデウム・ウルガレ（Hordeum vulgare））；サトウキビ（サッカルム・オフィシナルム（Saccharum officinarum））；イネ（オリザ・サティバ（Oryza sativa））；コムギ（トリチカム・アスティバム（Triticum aestivum）に加えてトリチカム・デュラム（Triticum durum）を含めたコムギ属種（Triticum spp.））およびダックウィード（レムナセアエ属種（Lemnaceae sp.））から得られた細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、植物種内の遺伝的背景は、変わり得る。
【０１８９】
除草剤組成物は、所望の生物学的結果：グリホサート耐性作物に大幅に影響を及ぼすことなく、雑草成長の防除をもたらすのに十分な比率で植物に適用される。これらの適用比率は、普通、処理される単位面積あたりのグリホサートの量として表される。例えば、ヘクタールあたりのグラム（ｇ／ｈａ）。「相当な効果」を構成するものは、組成物を調査し、開発し、市販し、使用するものの標準および実施ならびに組成物にとって大幅に有効である適用比率の選択にしたがって変わり、当業者の技術の範囲内である。通常、成長低減または死滅率によって測定されるような、雑草種の８５％の防除をもたらすための単位面積あたりに適用される組成物の量が、商用比率を規定するために使用されることが多い。
【０１９０】
耕作区域において雑草を防除するのに十分ないくつかのグリホサート除草剤適用比率の選択は、通常の農業科学者の技術の範囲内である。当業者ならば、同様に、個々の植物状態、天候および成長条件ならびに組成物中の特定の有効成分およびその重量比が、本明細書において開示される方法の実施において達成される除草剤有効性の程度に影響を及ぼし得るということは認識する。
【０１９１】
除草剤噴霧組成物は、空中散布および地上散布技術（例えば、地上ブーム式、手動噴霧器およびロープウィック（ｒｏｐｅ−ｗｉｃｋ）など）を含めた、当業者に周知である適当な方法のいずれかによって、処置されるべき植物の葉に適用され得る。
【０１９２】
必要に応じて、ユーザーは、適用組成物を調製する場合に、１種または複数のアジュバントを、本開示の組成物および希釈の水と混合してもよい。このようなアジュバントは、除草剤有効性をさらに増強する目的で、さらなる界面活性剤および／または無機塩、例えば、硫酸アンモニウムを含み得る。
【０１９３】
さらなる改善として、植物をさらに保護するため、および／またはより多くの除草剤に対する交差抵抗性を加えるための適当な薬剤軽減剤（safener）を用いた使用も挙げられる。薬剤軽減剤は、雑草防除有効性を損なうことなく、生理学的または分子的機序によって作物に対する除草剤の殺草性を低減する化学物質である。
【０１９４】
除草剤軽減剤として、ベノキサコール（benoxacor）、クロキントセット（cloquintocet）、シオメトリニル（cyometrinil）、ジクロルミド（dichlormid）、ジシクロノン（dicyclonon）、ジエトラート（dietholate）、フェンクロラゾール（fenchlorazole）、フェンクロリム（fenclorim）、フルラゾオール（flurazole）、フルキソフェニム（fluxofenim）、フリラゾール（furilazole）、イソキサジフェン（isoxadifen）、メフェンピル（mefenpyr）、メフェナート（mephenate）、無水フタル酸およびオキサベトリニル（oxabetrinil）が挙げられる。植物アクチベーター（植物を、その防御機序を活性化することによって保護する化合物の新規クラス）もまた、本開示の実施形態において使用され得る。これらとして、アシベンゾラル（acibenzolar）およびプロベナゾール（probenazole）が挙げられる。
【０１９５】
市販の薬剤軽減剤は、チオカルバメートおよびクロロアセトアニリドファミリーの植え込み前組込み除草剤または発芽前適用除草剤に対する大型種子のイネ科草本作物、例えば、トウモロコシ、穀実用モロコシおよび水稲（wet sown）イネの保護のために使用され得る。薬剤軽減剤はまた、アリールオキシフェノキシプロピオネートおよびスルホニル尿素除草剤の発芽後適用に対してなど、コムギなどの冬作穀物を保護するために開発された。スルホニル尿素、イミダゾリノン、シクロヘキサンジオン、イソキサゾールおよびトリケトン除草剤に対する、トウモロコシおよびイネの保護のための薬剤軽減剤（safeners）の使用もまた、十分に確立されている。薬剤軽減作用を受けた植物における、除草剤解毒作用の薬剤軽減剤誘導性増強は、薬剤軽減作用に関与している主要な機序として広く受け入れられている。薬剤軽減剤は、グルタチオンなどの補助因子ならびにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼおよびグルコシルトランスフェラーゼなどの除草剤解毒酵素を誘導する。Hatzios KK, Burgos N (2004) "Metabolism-based herbicide resistance: regulation by safeners", Weed Science: Vol. 52, No. 3 pp. 454- 467。本明細書において引用されたすべての刊行物および公開された特許文書は、各個々の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれるよう具体的および個々に示されるかのように同一の程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９６】
本開示の実施形態は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、単に例示目的で与えられるということは理解されなくてはならない。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者ならば、本開示の本質的な特徴を確認でき、その趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の使用および条件に適応させるために本開示の実施形態の種々の変法および修飾を行うことができる。したがって、本明細書において示され、記載されるものに加えて、本開示の実施形態の種々の修飾は、以下の記載から当業者に明らかとなる。このような修飾はまた、添付の特許請求の範囲の範囲内にあるものとする。以下は、例示として提供され、本開示の範囲を制限するものではない。
（実施例）
【実施例１】
【０１９７】
突然変異体ＥＰＳＰシンターゼ
大腸菌（Esherichia coli）の５−エノールピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ酵素（ＥＰＳＰシンターゼ）における１アミノ酸突然変異（Ｇ９６Ａ）は、グリホサート非感受性をもたらすことができる（Padgette et al, (1991); Eschenburg et al., (2002); Priestman et al, (2005); Haghani et al, (2008)）。この突然変異はグリホサートに対する耐性を付与するが、その天然基質であるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）によるＥＰＳＰシンターゼの結合に悪影響を及ぼすことも知られている。基質結合効率において生じた変化は、グリホサートに対するｉｎ  ｐｌａｎｔａにおける耐性を提供するために、突然変異した酵素を不適当なものにし得る。
【０１９８】
ＥＰＳＰシンターゼ酵素内の、該酵素の大腸菌（E. coli）バージョンに導入したＧ９６Ａ突然変異と類似した位置でアラニンを天然に含有するＥＰＳＰシンターゼタンパク質配列とポリヌクレオチド配列について（Padgette et al., (1991); Eschenburg et al., (2002); Priestman et al., (2005); Haghani et al., (2008)）、または類似したＧ９６Ａ位置でグリシンに代えてアラニンを導入することによって変更され得たＥＰＳＰシンターゼタンパク質配列とポリヌクレオチド配列について、インシリコにおいてＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋデータベースをスクリーニングした。
【０１９９】
同定された１つの酵素は、鉄酸化細菌（Mariprofundus ferrooxydans）由来のＤＧＴ−１４（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＺＰ ０１４５２６８３）であった。さらに、インシリコのデータマイニングは、ＤＧＴ−１４に相同性を有する５つの他の固有の酵素を示した；ＤＧＴ−１１（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＹＰ＿９８９５５１．１）、ＤＧＴ−１２（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＺＰ＿０１６２２１５５．１）、ＤＧＴ−１８（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＮＰ＿９２８９０９．１）、ＤＧＴ−２９（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＹＰ＿３２２７７２．１）、およびＤＧＴ−３０（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＺＰ＿０２１５６１８９．１）と命名される。これらの酵素の１つ、ＤＧＴ−１１（配列番号５）は、ＥＰＳＰシンターゼ酵素内の、該酵素の大腸菌（E.coli）バージョンに導入されたＧ９６Ａ突然変異と類似した位置で天然のアラニンを含有する。異なる生物由来のＥＰＳＰシンターゼタンパク質は長さが異なるため、ＥＰＳＰシンターゼ酵素の大腸菌（E.coli）バージョンの突然変異の番号付けは、他の生物由来のＥＰＳＰシンターゼ酵素の突然変異の番号付けと必ずしも対応しない。天然またはグリシンアミノ酸残基に導入したアラニンで突然変異された、これらの同定されたＥＰＳＰシンターゼ酵素は、グリホサート耐性またはＰＥＰ基質親和性に関して以前に特徴付けされなかった。
【０２００】
新規なＤＧＴ−１４、ＤＧＴ−１２、ＤＧＴ−１８、ＤＧＴ−２９およびＤＧＴ−３０酵素が得られ、グリシンからアラニンへの突然変異は、ＥＰＳＰシンターゼ酵素の大腸菌（E. coli）バージョンについて記載されたＧ９６Ａ位置に類似した位置でＥＰＳＰシンターゼ酵素に導入された。ＤＧＴ−１４タンパク質配列は、アミノ酸残基１０１でＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＺＰ ０１４５２６８３の内因性グリシンを置き換えるためにアラニンを導入することによって改変され、それにより配列番号１に至った。ＤＧＴ−１２タンパク質配列は、アミノ酸残基１１１でＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＺＰ ０１６２２１５５．１の内因性グリシンを置き換えるためにアラニンを導入することによって改変され、それにより配列番号７に至った。ＤＧＴ−１８タンパク質配列は、アミノ酸残基９６でＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＮＰ＿９２８９０９．１の内因性グリシンを置き換えるためにアラニンを導入することによって改変され、それにより配列番号９に至った。ＤＧＴ−２９タンパク質配列は、アミノ酸残基９６でＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＹＰ＿３２２７７２．１の内因性グリシンを置き換えるためにアラニンを導入することによって改変され、それにより配列番号１１に至った。ＤＧＴ−３０タンパク質配列は、アミノ酸残基９６でＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＺＰ＿０２１５６１８９．１の内因性グリシンを置き換えるためにアラニンを導入することによって改変され、それにより配列番号１３に至った。
【０２０１】
改変されたＥＰＳＰシンターゼ酵素、および天然のＤＧＴ−１１  ＥＰＳＰシンターゼ酵素は、クラスＩ  ＥＰＳＰシンターゼ酵素と比較することによってグリホサート耐性およびＰＥＰ基質親和性について特徴付けられた。以下のクラスＩの酵素：ダイズ（Glycine max）由来のＤＧＴ−１、セイヨウアブラナ（Brassica napus）由来のＤＧＴ−３（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：Ｐ１７６８８）、およびコムギ（Triticum aestivum）由来のＤＧＴ−７（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＥＵ９７７１８１）を比較として使用した。クラスＩのＥＰＳＰシンターゼ酵素およびその変異改変体を合成し、評価した。植物ＥＰＳＰシンターゼ酵素に導入された突然変異は、酵素の大腸菌（E.coli）バージョン由来のＧ９６Ａ突然変異と同様の位置で、ＥＰＳＰシンターゼ酵素内でなされたグリシンからアラニンへの突然変異からなっていた。さらに、トレオニンからイソロイシンおよびプロリンからセリンの突然変異は、Funke et al., (2009)において記載されているように、大腸菌（E.coli）のＥＰＳＰシンターゼにおけるアミノ酸９７（ＴからＩ）とアミノ酸１０１（ＰからＳ）の突然変異と類似した位置で、これらのクラスＩのＥＰＳＰシンターゼ酵素内に導入された。
【０２０２】
図１は、他のＥＰＳＰシンターゼ酵素に対するＤＧＴ−１４、ＤＧＴ−１１、ＤＧＴ−１２、ＤＧＴ−１８、ＤＧＴ−２９、およびＤＧＴ−３０の部分配列のアラインメントを示す。ＤＧＴ−１４、ＤＧＴ−１２、ＤＧＴ−１８、ＤＧＴ−２９およびＤＧＴ−３０についてグリシンに代えてアラニンの修飾の結果として、これらのＤＧＴ酵素は、ａｒｏＡ  ＥＰＳＰシンターゼ酵素のアミノ酸９６位で保存されたアラニンを共有している。このアミノ酸の位置は、アスタリスクによって示されて、アミノ酸残基には下線が付されている。
【０２０３】
図２は、ＤＧＴ−１、ＤＧＴ−３、およびＤＧＴ−７酵素のアラインメントを示す。グリシンからアラニンに突然変異したアミノ酸残基の位置は、第１のアスタリスクで示されている。トレオニンからイソロイシンに突然変異したアミノ酸残基の位置は、第２のアスタリスクで示されている。プロリンからセリンに突然変異した第３のアミノ酸残基の位置は、第３のアスタリスクで示されている。これらの突然変異は、ＤＧＴ−１、ＤＧＴ−３、およびＤＧＴ−７の異なるバージョンに導入された。突然変異を含む遺伝子の異なるバージョンは、以下により詳細に記載されている。
【実施例２】
【０２０４】
植物および細菌における発現のための配列の最適化
鉄酸化細菌（Mariprofundus ferrooxydans）由来のＤＧＴ−１４コード配列の分析は、最適な植物発現に有害であると考えられたいくつかの配列モチーフの存在、ならびに双子葉植物および単子葉植物における発現のために最適でないコドン組成を明らかにした。本開示の実施形態は、双子葉植物または単子葉植物において最適に発現させることができるＤＮＡ配列を生成させるために、ＤＧＴ−１４をコードする植物に最適化された遺伝子の設計を提供し、この場合、配列修飾は、翻訳または転写を阻害しない。
【０２０５】
遺伝暗号の冗長性／縮重によって与えられる可塑性（すなわち、いくつかのアミノ酸は２種以上のコドンによって特定される）により、異なる生物または生物クラスにおけるゲノムの進化は同義コドンの示差的使用をもたらした。この「コドンバイアス」は、タンパク質コーディング領域の平均塩基組成に反映される。例えば、比較的低いＧ＋Ｃ含量を有するゲノムを有する生物は、同義のコドンの３番目の位置にＡまたはＴを有するコドンをより多く利用するが、より高いＧ＋Ｃ含量を有するものは、３番目の位置にＧまたはＣを有するより多くのコドンを利用する。さらに、ｍＲＮＡ内の「少数の」コドンの存在は、特に、少数のコドンに対応する荷電ｔＲＮＡの相対量が低い場合に、そのｍＲＮＡの絶対翻訳速度を低減し得ると考えられる。この推論の拡張は、個々の少数のコドンによる翻訳速度の低下は、複数の少数のコドンの少なくとも付加的なものとなるということである。したがって、少数のコドンの高い相対含量を有するｍＲＮＡは、相当に低い翻訳速度を有する。この速度は、コードされるタンパク質の相応に低いレベルによって反映され得る。
【０２０６】
双子葉または単子葉植物（例えば、ワタ、カノーラ、タバコ、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、イネ）における発現に関するＤＧＴ−１４をコードする遺伝子の操作において、予測される宿主植物（複数可）のコドンバイアスは、例えば、公的に入手可能なＤＮＡ配列データベースを使用して決定し、植物ゲノムのコドン分布または様々な植物遺伝子のタンパク質コード領域についての情報を見出すことができる。コドンバイアスは、植物が、そのタンパク質のアミノ酸をコードするために使用するコドンの統計的分布である。双子葉植物または単子葉植物（トウモロコシ）のための好ましいコドン使用を表１に示す。
【０２０７】
【表１】
2015506702.tif 000003
【０２０８】
コドンバイアスは、すべてのアミノ酸のコドンに対して単一コドンが使用される頻度として算出され得る。あるいは、コドンバイアスは、特定のアミノ酸をコードするために単一のコドンが使用される、そのアミノ酸のすべてのその他のコドン（同義のコドン）に対する頻度として算出され得る。植物発現のためのコーディング領域の設計では、植物によって好まれる主要な（「第一選択」）コドンが決定されなければならず、複数の選択が存在する場合には、好ましいコドンの第２、第３、第４などの選択も決定されなければならない。次いで、同一のＤＧＴ−１４ペプチドのアミノ酸配列をコードする新規ＤＮＡ配列が設計され得るが、新規ＤＮＡ配列は、元のＤＮＡ配列とは、アミノ酸配列内の各位置でアミノ酸を特定する植物の（第１に好ましい、第２に好ましい、第３に好ましい、または第４に好ましいなど）コドンの置換によって異なる。次いで、新規配列は、修飾によって作製された可能性がある制限酵素部位について分析される。同定された部位は、コドンを、第１、第２、第３、第４選択の好ましいコドンと置換することによってさらに修飾され得る。対象とする遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼし得る、配列中のその他の部位として、ステム−ループ構造、エクソン：イントロン接合部（５’または３’）、ポリＡ付加シグナルおよびＲＮＡポリメラーゼ終結シグナルがあり；これらの部位は、植物コドンの置換によって除去され得る。配列は、ＴＡまたはＣＧの対を低減するよう、さらに分析および修飾される。これらの対に加えて、同一である約６個を超える残基を有するＧまたはＣ配列ブロックは、配列の転写または翻訳に影響を及ぼし得る。したがって、これらのブロックは、第１または第２選択のコドンを、次に好ましい選択のコドンと置換することによって有利に修飾され得る。
【０２０９】
このように、様々な方法は、本明細書に記載されている遺伝子を製造するために使用することができる。このようなアプローチの１つの例は、ＰＣＴ出願第ＷＯ９７／１３４０２号にさらに例証されている。したがって、本開示のｄｇｔ−１４遺伝子に機能的に同等である合成遺伝子は、植物を含む宿主を形質転換するために使用することができる。合成遺伝子の製造に関するさらなるガイダンスは、例えば、米国特許第５，３８０，８３１号に見出すことができる。
【０２１０】
ｄｇｔ−１４をコードする植物最適化された遺伝子を遺伝子操作するために、ＤＮＡ配列は、特定の宿主植物のためのタンパク質コード配列からコンパイルされたコドンバイアス表から確立された重複した遺伝コードを利用して、アミノ酸配列をコードするように設計された。表１において、ＤおよびＩ列は、単子葉（トウモロコシ）植物のコード領域に見られるように、それぞれのアミノ酸に対する同義コドンの分布（そのアミノ酸のすべてのコドンに対する使用％で）を示す。ＥおよびＪ列は、双子葉植物のコード領域に見られるように、それぞれのアミノ酸に対する同義コドンの分布（そのアミノ酸のすべてのコドンに対する使用％で）を示す。いくつかのアミノ酸に対するいくつかの同義コドンは、植物遺伝子（例えばＣＧＧ）において稀にしか見られない。通常、コドンは、いずれかの植物タイプ（表１のＣとＨ列においてＤＮＵによって示される）の遺伝子における関連アミノ酸をコードすることが約１０％以下の確率で示される場合、稀に使用されることが考えられた。アミノ酸に対する残りのコドン選択肢の分布を量るために、それぞれのコドンについての加重平均表現は、以下の式を用いて計算された。
Ｃ１の加重平均％＝１／（％Ｃ１＋％Ｃ２＋％Ｃ３＋他）×％Ｃ１×１００（式中、Ｃ１は、対象とするコドンであり、％Ｃ２、％Ｃ３などは、表１の残りの同義コドンの双子葉植物の％値の平均（関連コドンに対する平均％値がＣとＨ列から採用される）を表す）。
【０２１１】
それぞれのコドンについての加重平均％値を表１のＣとＨ列に示す。
【０２１２】
本質的にＤＧＴ−１４タンパク質のアミノ酸配列をコードする新しいＤＮＡ配列は、双子葉植物の遺伝子において見出される頻繁に使用されるコドンの平衡状態のコドン分布を用いて、双子葉植物における最適な発現のために設計された。本質的にＤＧＴ−１４タンパク質のアミノ酸配列をコードする第２のＤＮＡ配列は、単子葉植物の遺伝子において見出される頻繁に使用されるコドンの平衡状態のコドン分布を用いて、単子葉植物における最適な発現のために設計された。２つの新規のＤＮＡ配列は、タンパク質アミノ酸配列内のそれぞれの位置で適切なアミノ酸を特定するための植物（第１の好ましい、第２の好ましい、第３の好ましい、または第４の好ましい）コドンの置換によって、ｄｇｔ−１４をコードする元のＤＮＡ配列とは異なる。植物に最適化されたＤＮＡ配列の設計は、アミノ酸残基１０１で内因性グリシンを置き換えるためにアラニンを導入することによって改変されているＤＧＴ−１４タンパク質配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＺＰ ０１４５２６８３）のタンパク質配列の逆翻訳によって開始された。配列番号１は、表１、ＥとＪ列から構築された双子葉植物コドンバイアス表を用いて逆翻訳された。配列番号１の第２の逆翻訳は、表１、ＤとＩ列から構築された単子葉植物コドンバイアス表を用いて完了させた。次に、最初の配列は、制限酵素認識部位を除去または付加し、高度に安定した鎖内二次構造を除去し、植物において操作された遺伝子のクローニング操作または発現に有害であり得る他の配列を除去するために、コドン変化（全体の加重平均コドン表現を保持したまま）を相殺することによって改変された。次に、ＤＮＡ配列は、改変によって作製された可能性がある制限酵素認識部位について再分析された。同定された部位は、第１、第２、第３、または第４選択の好ましいコドンで関連するコドンを置き換えることによってさらに改変された。対象とする遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼし得る配列における他の部位は、エクソン：イントロン接合部（５’または３’）、ポリＡ付加シグナル、またはＲＮＡポリメラーゼ終結シグナルを含む。改変された配列はさらに分析され、ＴＡまたはＣＧダブレットの頻度を減少させ、およびＴＧまたはＣＴダブレットの頻度を増加させるようにさらに改変された。これらのダブレットに加えて、［Ｇ＋Ｃ］または［Ａ＋Ｔ］の約６を超える連続残基を有する配列ブロックは、配列の転写または翻訳に影響を及ぼし得る。したがって、これらの配列ブロックもまた、第１または第２選択のコドンなどを、最適な他の好ましいコドンで置き換えることによって改変された。稀にしか使用されないコドンは、遺伝子設計において実質的な程度までには含まれず、それ自体、コドン組成とは異なる設計基準を受け入れる必要がある場合のみ（例えば、制限酵素認識部位の付加または欠失）使用される。
【０２１３】
新たに設計された、双子葉植物の最適化されたｄｇｔ−１４  ｖ２ポリヌクレオチド配列は配列番号２に列挙されている。新たに設計された、単子葉植物の最適化されたｄｇｔ−１４  ｖ５ポリヌクレオチド配列は配列番号３に列挙されている。得られたＤＮＡ配列は、高度なコドン多様性、所望の塩基組成を有し、戦略的に配置された制限酵素認識部位を含み、遺伝子の転写または生成物ｍＲＮＡの翻訳を干渉し得る配列を欠損している。
【０２１４】
植物に最適化されたＤＮＡ配列がペーパー上またはインシリコで設計されると、実際のＤＮＡ分子は、設計された配列に正確に配列において対応するように実験室で合成することができる。このような合成核酸分子は、それらが自然源または天然源由来であるかのようにクローニングされ、他には操作され得る。６個のフレーム終止（コード配列の３’端に追加された全６個のリーディングフレームに位置した終止コドン）およびクローニングのための５’制限部位などの追加配列を含有する配列番号２または配列番号３を含むＤＮＡ断片の合成は、商業的供給業者（ＤＡＮ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって行われた。次に、合成核酸分子は、発現ベクターにクローニングされ、以下の実施例に記載されるように、植物または細菌に形質転換された。
【０２１５】
細菌における発現の最適化
大腸菌（Escherichia coli）細胞における発現のために最適化される配列番号１のＤＧＴ−１４タンパク質をコードする新しいＤＮＡ配列を設計した。大腸菌（E. coli）用に最適化されたＤＮＡ配列の設計は、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からの独自のコドン最適化プロトコールを用いて、配列番号１のタンパク質配列の逆翻訳によって開始された。初期配列は、制限酵素認識部位を除去または付加し、高度に安定した鎖内二次構造、および操作された遺伝子のクローニング操作または発現に有害であり得る他の配列を除去するために、コドン変化（全体の加重平均表現を保持しながら）を相殺することによって改変された。コドン領域内で避けるべきこのような有害配列の例としては、例えば２つの連続したアルギニンアミノ酸をコードし得るが、遺伝子内（したがって望ましくない）の翻訳開始シグナルとしても機能する場合がある、ＡＧＧＡＧＧなどの１６ＳリボソームＲＮＡ結合配列（「シャイン・ダルガノ配列」）が挙げられる。配列番号１のタンパク質をコードする大腸菌（E. coli）バイアスｄｇｔ−１４  ｖ６  ＤＮＡ配列を配列番号４として示す。
【０２１６】
クローニングを促進し、効率的な翻訳開始を確実にするために、５’末端ＮｄｅＩ制限酵素認識配列をＡＴＧ翻訳開始コドンの上流に配置させた。また、クローニングを促進し、適切な翻訳終了を確実にするために、２つのＴＡＡ翻訳終止コドンをコードする塩基とＸｈｏＩ制限酵素認識部位をコード領域の３’末端に含めた。配列番号４を含むＤＮＡ断片の合成は、商業的供給業者であるＧｅｎｅＡｒｔによって行われた。
【０２１７】
同様の大腸菌（Escherichia coli）コドン最適化戦略を用いて、ｄｇｔ−１１  ｖ６、ｄｇｔ−１２  ｖ６、ｄｇｔ−１８  ｖ６、ｄｇｔ−２９  ｖ６、およびｄｇｔ−３０  ｖ６を設計した。ｄｇｔ−１、ｄｇｔ−３、およびｄｇｔ−７配列バージョンは、葉緑体標的配列の除去によって改変された。これらの遺伝子の大腸菌（Escherichia coli）コドン最適化バージョンは、それぞれ、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１４として列挙される。
【実施例３】
【０２１８】
グリホサートに対する耐性を付与する遺伝子の細菌発現のためのベクターの構築
大腸菌（E. coli）発現用のｐＥＴ発現ベクター、ｄｇｔ−２８の構築
インビトロ試験のために、ｄｇｔ−１４  ｖ６の大腸菌（E. coli）用に最適化された遺伝子配列（配列番号３）は、合成とクローニングのためにＧｅｎｅＡｒｔに委託された。合成されたｄｇｔ−１４  ｖ６遺伝子配列は、追加されたＮｄｅＩとＸｈｏＩ制限部位を介してｐＥＴ２８発現ベクターにクローニングされた。得られた構築物は、Ｎ末端の６×Ｈｉｓタグおよびトロンビン結合モチーフを導入した。得られた構築物をｐＤＡＢ１００４２７と命名した（図３）。
【０２１９】
アミノ酸残基１０１のグリシン残基で導入されたアラニンの役割を確認するために、合成ｄｇｔ−１４  ｖ６上で部位特異的突然変異誘発を行った。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）からのＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ＩＩ（登録商標）キットを用いて、突然変異誘発を行った。以下のプライマーを設計し、アミノ酸スイッチを作製した：ＤＧＴ１４  ＭｕｔＦ：（配列番号１５ 5′ggATgCCggTAATgCAggAACCTgTgTTCgTCTgATgg）、ＤＧＴ１４  ＭｕｔＲ：（配列番号１６ 5′CCATCAgACgAACACAggTTCCTgCATTACCggCATCC）。ＰＣＲ反応は、鋳型ＤＮＡとしてｐＤＡＢ１００４２７（ｄｇｔ−１４  ｖ６）を用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅプロトコールに従って設定された。反転したｄｇｔ−１４  ｖ１野生型配列（配列番号１７）を含有する構築物をｐＤＡＢ１０２９４５と称し（図４）、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０２２０】
大腸菌（E. coli）発現用の追加の構築物、ｐＥＴ発現ベクター
インビトロ試験について、ｄｇｔ−１１  ｖ６、ｄｇｔ−１２  ｖ６、ｄｇｔ−１８  ｖ６、ｄｇｔ−２９  ｖ６、およびｄｇｔ−３０  ｖ６遺伝子配列は、合成およびクローニングのためにＧｅｎｅＡｒｔに委託された。合成した遺伝子をｐＥＴ２８発現ベクターにクローニングした。得られた構築物は、ｄｇｔ−１１  ｖ６を含有するｐＤＡＢ１００４３１（図５）、ｄｇｔ−１１  ｖ６を含有するｐＤＡＢ１００４３２（図６）、ｄｇｔ−１８  ｖ６を含有するｐＤＡＢ１００４３５（図７）、ｄｇｔ−２９  ｖ６を含有するｐＤＡＢ１００４４６（図８）、およびｄｇｔ−３０  ｖ６を含有するｐＤＡＢ１００４３６（図９）と命名された。
【０２２１】
ｄｇｔ−１、ｄｇｔ−３およびｄｇｔ−７を含有する追加の構築物を合成した。これらの構築物は、合成およびクローニングのためにＧｅｎｅＡｒｔに委託されたｄｇｔ−１  ｖ５、ｄｇｔ−１  ｖ６、ｄｇｔ−１  ｖ７、ｄｇｔ−１  ｖ８、ｄｇｔ−３  ｖ６、ｄｇｔ−３  ｖ７、ｄｇｔ−３  ｖ８、ｄｇｔ−７  ｖ５、ｄｇｔ−７  ｖ６、ｄｇｔ−７  ｖ７、およびｄｇｔ−７  ｖ８遺伝子配列のインビトロ試験について用いられた。合成した遺伝子をｐＥＴ２８発現ベクターにクローニングした。得られた構築物は、ｄｇｔ−１  ｖ５を含有するｐＤＡＢ１０２０２８、ｄｇｔ−１  ｖ６を含有するｐＤＡＢ１０２０２９、ｄｇｔ−１  ｖ７を含有するｐＤＡＢ１０２０３２、ｄｇｔ−１  ｖ８を含有するｐＤＡＢ１０２０３４、ｄｇｔ−３  ｖ６を含有するｐＤＡＢ１００４２９、ｄｇｔ−３  ｖ７を含有するｐＤＡＢ１００４４２、ｄｇｔ−３  ｖ８を含有するｐＤＡＢ１００４３０、ｄｇｔ−７  ｖ５を含有するｐＤＡＢ１０２０３６、ｄｇｔ−７  ｖ６を含有するｐＤＡＢ１０２０３８、ｄｇｔ−７  ｖ７を含有するｐＤＡＢ１０２０４０、およびｄｇｔ−７  ｖ８を含有するｐＤＡＢ１０２０４２と命名された。発現されたこれらの構築物およびＤＧＴタンパク質配列は、全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１１９７５６５８号に記載されている。
【実施例４】
【０２２２】
インビトロ生化学酵素動力学アッセイ
組換えＤＧＴ酵素の過剰発現および精製
組換えＤＧＴタンパク質は、上記の構築物からＲｏｓｅｔｔａ２（商標）（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）において過剰発現された。単一コロニーを用いて、一晩３７℃にて培養されたクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢの５０ｍＬスターター培養物を接種した。一晩培養物を用いて、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢの１Ｌを接種した。Ｏ．Ｄ．６００＝０．６まで培養物を３７℃にて増殖させ、次に、氷水浴に１０分間置いた。標的タンパク質の発現は、５００μＭの最終濃度までＩＰＴＧの添加によって達成された。誘導は、一晩２０℃にて進行させ、８，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットは、精製に必要とされるまで、−８０℃にて保存された。すべての精製工程を４℃にて行った。
【０２２３】
１Ｌの培養物からの細胞ペレットを２０〜３０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭイミダゾール、および５％グリセロール）に再懸濁した。次に、ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（１錠／５０ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）およびリゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加し、懸濁液を２０分間撹拌した。Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０（３×６０秒バースト）を用いて細胞溶解を行い、続いて、１６，０００ｒｐｍで４５分間の遠心分離によって細胞破片を除去した。ＤＧＴ酵素は、５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ粗製カラムを用いて、固定化された金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を介して、一工程で均質になるまで精製された。カラムを緩衝液Ａで平衡化し、試料を同じ緩衝液中に充填した。次に、カラムは、１０カラム体積の緩衝液Ａで洗浄し、続いて、直線勾配で２５カラム体積以上の０〜１００％緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５００ｍＭイミダゾール、および５％グリセロール）で溶出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって判断されるように、標的タンパク質を含む画分は、１０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ超遠心分離デバイスを用いて、２．５ｍＬに濃縮された。精製されたＤＧＴ酵素は、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、および５％グリセロール中に緩衝液交換され、その後、約１ｍＬに濃縮された。試料は、典型的には、１：５０に希釈され、ＵＶ−可視スペクトルは、Ｃａｒｙ５０  Ｂｉｏ  ＵＶ−可視分光光度計で２４０〜７００ｎｍについて記録された。次に、理論上の吸光係数を用いて、２８０ｎｍ（ＥｘＰＡＳｙ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の吸光度に基づいてタンパク質濃度を計算した。
【０２２４】
植物および細菌ＤＧＴ酵素のインビトロ動力学特徴付け
野生型（ＷＴ）および突然変異体ＤＧＴの酵素活性は、Lanzetta et al. (1979)によって記載されている修飾された手法における無機リン酸塩（Ｐｉ）生成によって測定された。Lanzetta P., Alvarez L., Reinach P., and Candia O., (1979) Anal. Bioch. 100:95-97。アッセイは、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｍａｘ  １９０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）上の全５０μＬの９６ウェルプレートフォーマットにおいて行われた。典型的なアッセイは、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、および１ｍＭ  Ｓ３Ｐを含んだ。ＰＥＰおよびグリホサート濃度は指示されるように変化させた。グリホサートは、遊離酸としてＳｉｇｍａから得られ、ｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁された。グリホサートは、混合物のｐＨが中性になるまで、ＫＯＨの添加によって可溶化された。アッセイは、０．０１〜１μＭの間で変化させた濃度でＤＧＴ酵素の添加によって開始した。マラカイトグリーン：モリブデン酸アンモニウム溶液の３：１混合物の２３５μＬの添加によって、反応を停止させた。完全な発色（約１分）後、６６０ｎｍにおける吸光度の変化を記録し、形成されたＰｉの量を標準曲線から計算した。酵素を欠いている対照反応は、バックグラウンド吸光度を補正するために使用された。高濃度のＰＥＰ（＞２ｍＭ）およびグリホサート（＞３０ｍＭ）は、この検出方法を用いて、多量のバックグラウンド吸光度に寄与する。データは、ＫｍとＶｍａｘの決定（式１）を可能にするＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ式に適合され、一方、ＩＣ５０は式２から決定された。ここで、ｙは、相対活性であり、ｓはヒル係数である。データはＧｒａＦｉｔ（商標）バージョン５ソフトウェア（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｈｏｒｌｅｙ、Ｕ．Ｋ．）を用いて分析された。
式１：
【０２２５】
【数１】
2015506702.tif 000004
式２：
【０２２６】
【数２】
2015506702.tif 000005
【０２２７】
競合阻害剤のＩＣ５０値は基質の濃度に依存して変化し、したがって、表２のＩＣ５０値は、１ｍＭのＰＥＰと６０μＭのＰＥＰ（植物の細胞内ＰＥＰ濃度の推定値）で得られた。同濃度のＰＥＰで測定したＩＣ５０値のみを比較する必要がある。さらに、非常に寛容な酵素のＩＣ５０値は、Ｌａｎｚｅｔｔａの方法によって正確に決定することができず、したがって、相対的活性に基づいて推定された。
【０２２８】
植物ＤＧＴの動力学
突然変異していない天然配列を有する２つの酵素のＤＧＴ−１  ｖ５とＤＧＴ−７  ｖ５は、グリホサート感受性について基準パラメータを確立するために最初に試験された。両タンパク質は、ＰＥＰに対して低いＫｍ値を示し（約７０μＭ）、グリホサートに感受性であり、ＩＣ５０値は、１ｍＭのＰＥＰで約２０μＭ（表２）であった。ＤＧＴ−１  ｖ６、ＤＧＴ−３  ｖ６、およびＤＧＴ−７  ｖ６について観察されるように、ＧからＡの単一点突然変異は、グリホサートに対する耐性を有意に改善したが（８〜２１ｍＭのＩＣ５０値）、さらに、ＰＥＰに対するＫｍを約８倍増大させた。すべての植物由来のＤＧＴ（ＤＧＴ−１  ｖ７、ＤＧＴ−３  ｖ７、およびＤＧＴ−７  ｖ７）についての二重突然変異（ＧＡＰＳ）はまた、グリホサート耐性を高めたが、再度、結果としてＰＥＰ  Ｋｍをかなり上昇させた（表２）。ＴＩＰＳ突然変異体（ＤＧＴ−１  ｖ８、ＤＧＴ−３  ｖ８、およびＤＧＴ−７  ｖ８）は、適度な濃度のグリホサート（３〜６ｍＭ）に耐性であるが、ＧＡおよびＧＡＰＳ突然変異体とは対照的に、Ｋｍレベルは、６０〜２００μＭ間の野生型タンパク質に近いままであった。図１０は、特定された突然変異の導入の際に、ＤＧＴ−１（Ａ）およびＤＧＴ−７（Ｂ）についてグリホサート耐性のシフトを示す。ＰＥＰ濃度は、図１０に示されるデータをもたらす実験について１ｍＭに保持した。これは、ＤＧＴ−７  ｖ８に対してＩＣ５０（＞８０ｍＭ）の上昇へと導き得た。さらなる手法は、より低いレベルのＰＥＰが、グリホサートに対する相対的な耐性を改変するかどうかを決定するために行われた。ＰＥＰの生理学的に関連したレベルは、５〜６０μＭの範囲である。６０μＭのＰＥＰを用いると、ＩＣ５０値は有意に減少した（３．６ｍＭ）。これは、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ反応速度論から期待され、表２に記載されているように、最初の決定は過剰なＰＥＰによって影響されたことを示唆した。
【０２２９】
図１０は、１ｍＭのＰＥＰを用いて、ＤＧＴ−１（Ａ）およびＤＧＴ−７（Ｂ）内の様々な突然変異の導入後に得られたＩＣ５０値を示す。ＡとＢのＩＣ５０曲線の両方について、黒三角は野生型を表し、黒丸はＧＡ突然変異体を表し、白四角はＧＡＰＳ突然変異体を表し、黒四角はＴＩＰＳ突然変異体を表す。
【０２３０】
【表２】
2015506702.tif 000006
【０２３１】
細菌ＤＧＴの動力学
突然変異したＤＧＴ−１４  ｖ６（Ｇ１０１Ａ突然変異）酵素は、最も有利な全体的な動力学的パラメータおよびグリホサートに対する耐性を有していた（ｋｃａｔ／Ｋｍと上昇したＩＣ５０）。酵素は、＞８０ｍＭの濃度でグリホサートに対して耐性であり、３×１０４Ｍ−１ｓ−１の触媒効率を示した。予期したように、野生型ＤＧＴ−１４  ｖ１酵素は、０．４４ｍＭの有意に低いＩＣ５０（６０μＭ  ＰＥＰで）とＰＥＰについて２０８．６μＭのＫｍを示した。また、天然酵素または野生型酵素は、高い触媒効率（５．３×１０４Ｍ−１ｓ−１）を示した。データは、ＤＧＴ−１４  ｖ１がＤＧＴ−１４  ｖ６と比較した場合にグリホサートに対してより感受性であるにもかかわらず、それは天然の植物酵素よりも大きい耐性のいくらかの先天的レベルを保持することを実証している。アミノ酸残基１０１でのグリシンに代えたアラニン残基の導入の結果として、ＩＣ５０は、１ｍＭ  ＰＥＰで約２０．１６ｍＭから＞８０．００ｍＭ、および６０ｕＭ  ＰＥＰで０．４４ｍＭから＞．８０ｍＭにシフトした。ＰＥＰの生理学的に関連したレベルは５〜６０μＭの範囲である。同様に、アミノ酸１０１でのグリシンに代えたアラニン残基の導入は、ＰＥＰについて２０８．６μＭから３５２．５μＭにＫｍの増加をもたらした。Ｇ１０１Ａ突然変異の導入は、ＤＧＴ−１４  ｖ６について改善されたグリホサート耐性をもたらした。
【０２３２】
さらに、５つの他の細菌酵素はまた、グリホサートに対するそれらの耐性について評価された。野生型タンパク質配列を含み、天然のアラニンアミノ酸残基を保有するＤＧＴ−１１  ｖ６を除いて、すべてはグリシンをアラニンに突然変異させた変異体であった。動力学的パラメータとＩＣ５０値を表２に記載する。ＤＧＴ−１１  ｖ６、ＤＧＴ−１２  ｖ６、ＤＧＴ−１８  ｖ６、ＤＧＴ−２９  ｖ６、およびＤＧＴ−３０  ｖ６酵素は、１ｍＭ  ＰＥＰで、それぞれ９．９８ｍＭ、４．００ｍＭ、３３．２５ｍＭ、８０ｍＭ、および１５．５５ｍＭの濃度にてグリホサートに耐性であった。アラニンアミノ酸残基を保有する酵素についての動力学的パラメータと耐性は、グリシンアミノ酸残基を保有する天然または野生型植物酵素（ＤＧＴ−１  ｖ５およびＤＧＴ−７  ｖ５）よりも高い。ＤＧＴ−１１  ｖ６、ＤＧＴ−１２  ｖ６、ＤＧＴ−１８  ｖ６、ＤＧＴ−２９  ｖ６、およびＤＧＴ−３０  ｖ６は、酵素がグリホサートに耐性であることを示している動力学的パラメータを有した。
【実施例５】
【０２３３】
植物形質転換ベクターのクローニング
植物バイナリーベクター構築
標準的なクローニング法は、インフレーム融合としてｄｇｔ−１４に連結した葉緑体輸送ペプチドポリヌクレオチド配列を含有するエントリーベクターの構築に使用された。ｄｇｔ−１４に融合した葉緑体輸送ペプチド（ＴｒａＰ）を含むエントリーベクターは、ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて組み立てられた。輸送ペプチドＴｒａＰ４  ｖ５（配列番号１８）、ＴｒａＰ５  ｖ１（配列番号１９）、ＴｒａＰ５  ｖ２（配列番号２０）、ＴｒａＰ８  ｖ２（配列番号２１）、ＴｒａＰ９  ｖ２（配列番号２２）、ＴｒａＰ１２  ｖ２（配列番号２３）、およびＴｒａＰ１３  ｖ２（配列番号２４）は、それぞれ、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって合成され、最大で固有のＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むｄｇｔ−１４の５’端の断片に融合させた。
【０２３４】
様々なＴｒａＰおよびｄｇｔ−１４発現カセットを含んだバイナリープラスミドをシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０プロモーター（ＡｔＵｂｉ１０；Callis, et al, (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493）によって駆動させ、隣接してアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレームの２３個の３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ；米国特許第５，４２８，１４７号）を並べた。
【０２３５】
組み立てられたＴｒａＰおよびｄｇｔ−１４発現カセットは、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて遺伝子操作され、アグロバクテリウムを媒介した植物形質転換を介して植物に形質転換させた。制限エンドヌクレアーゼをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から得て、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＮＡライゲーションのために使用した。選択マーカーカセットキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶ；Verdaguer et al, (1996) Plant Mol. Biol, 31: 1129-1139）−ＤＳＭ−２（米国特許出願第２００７／０８６８１３号）−アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレームの１つの３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦｌ  ３’ＵＴＲ；Huang et al, (1990) J. Bacteriol. 172: 1814-1822）を含む単一のデスティネーションベクターに１つのエントリーベクターを組み込むことによって、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＧａｔｅｗａｙ反応を行った。プラスミド調製は、供給業者の指示に従って、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）プラスミドキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）またはプラスミドＭｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行われた。ＤＮＡ断片は、アガロース、Ｔｒｉｓ−アセテートゲル電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離された。
【０２３６】
すべての組み立てられたプラスミドのコロニーは、最初に、ミニプレップＤＮＡの制限消化によってスクリーニングされた。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、市販のシークエンシングベンダー（ＥｕｒｏｆｉｎｓＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）によって配列決定された。配列データを組み立て、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて分析した。
【０２３７】
以下のバイナリー構築物は、様々なＴｒａＰ：ｄｇｔ−１４融合遺伝子配列を発現する：ｐＤＡＢ１０７５２６（図１１）はＴｒａＰ４  ｖ５：ｄｇｔ−１４  ｖ２（配列番号２５）を含む；ｐＤＡＢ１０２７８７（図１２）はＴｒａＰ５  ｖ１：ｄｇｔ−１４  ｖ２（配列番号２６）を含む；ｐＤＡＢ１０５５２５（図１３）はＴｒａＰ５  ｖ２：ｄｇｔ−１４  ｖ２（配列番号２７）を含む；ｐＤＡＢ１０５５２６（図１４）はＴｒａＰ８  ｖ２：ｄｇｔ−１４  ｖ２（配列番号２８）を含む；ＰＤＡＢ１０５５２７（図１５）はＴｒａＰ９  ｖ２：ｄｇｔ−１４  ｖ２（配列番号２９）を含む；ｐＤＡＢ１０５５２８（図１６）はＴｒａＰ１２  ｖ２：ｄｇｔ−１４  ｖ２（配列番号３０）を含む；ｐＤＡＢ１０５５２９（図１７）はＴｒａＰ１３  ｖ２：ｄｇｔ−１４  ｖ２（配列番号３１）を含む。
【０２３８】
インフレーム融合物を構築した場合、わずかな変更は、ｄｇｔ−１４コード配列の最初のメチオニン残基に対して行われた。例えば、メチオニンは、ｐＤＡＢ１０５５２９、ｐＤＡＢ０１７５２６、ｐＤＡＢ１０５５２５、ｐＤＡＢ１０５５２６、ｐＤＡＢ１０５５２７、およびｐＤＡＢ１０５５２８においてｄｇｔ−１４コード配列のアラニンに変更された。メチオニンは、ｐＤＡＢ１０２７８７では未変化のままであった。変更は、葉緑体輸送ペプチドの後のｄｇｔ−１４コード配列のクローニングを容易にするために導入され、上記の配列表は、変更されたアミノ酸残基を含む。
【実施例６】
【０２３９】
アラビドプシス属（Arabidopsis）への形質転換と選択
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の形質転換
アラビドプシス属（Arabidopsis）は、CloughおよびBent（1998）のフローラルディップ法を用いて形質転換された。上記のバイナリープラスミドの１つを含む選択されたアグロバクテリウムコロニーを使用して、スペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＹＥＰブロスの１つまたは複数の１００ｍＬの前培養物を植菌した。培養物を２２５ｒｐｍで一定に撹拌しながら一晩２８℃にてインキュベートした。細胞を１０分間、室温にて約５０００×ｇでペレットにし、得られた上清を捨てた。５％（ｗ／ｖ）スクロース、１０μｇ／Ｌの６−ベンジルアミノプリン、および０．０４％Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７を含有する４００ｍＬの液体培地において穏やかに再懸濁させた。約１カ月齢の植物は、穏やかに撹拌しながら５〜１０分間、培地中に浸漬させた。植物は、それらの側面を下に置き、２〜３時間、透明または不透明なプラスチックバッグで覆い、その後、直立に配置された。植物は、２２℃にて１６時間の明／８時間の暗の光周期で成長させた。浸漬から約４週間後、種子を回収した。
【０２４０】
形質転換植物の選択
新たに回収したＴ１種子［ｄｇｔ−１４とＤＳＭ−２発現カセットを含む］を７日間室温にて乾燥させた。Ｔ１種子は、２６．５×５１ｃｍの発芽トレイに播種され、それぞれは、予め４０ｍＬの０．１％アガロース溶液に懸濁され、４℃にて２日間保存された、層状にしたＴ１種子の２００ｍｇアリコート（約１０，０００個の種子）を受け、休眠要件を完了し、同期種子発芽を確保した。
【０２４１】
Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｍｉｘ  ＬＰ５は微細なバーミキュライトで覆われ、湿るまでホーグランド液で地下灌漑され、次に、重力排出を可能にした。層状にした種子のそれぞれ４０ｍＬのアリコートは、ピペットを用いてバーミキュライト上に均一に播種され、４〜５日間、湿気ドームで覆われた。ドームは、グルホシネート出芽後噴霧（同時形質転換されたＤＳＭ−２遺伝子を選択する）を使用した最初の形質転換体選択の１日前に外された。
【０２４２】
植え付け後（ＤＡＰ）７日とさらに１１ＤＡＰに、Ｔ１植物（それぞれ子葉と２−４−ｌｆ段階）は、適用あたり２８０ｇ  ａｉ／ｈａグルホシネートの有効比率を達成するために、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ圧縮空気噴霧チップを用いて、１０ｍｌ／トレイ（７０３Ｌ／ｈａ）の噴霧体積で、Ｌｉｂｅｒｔｙ除草剤（２００ｇ  ａｉ／Ｌグルホシネート、Ｂａｙｅｒ  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、ＭＯ）の０．２％溶液で噴霧された。生存者（活発に成長している植物）は、最終噴霧から４〜７日後に特定され、ポッティングメディア（Ｍｅｔｒｏ  Ｍｉｘ  ３６０）を用いて調製された３インチ（７．６ｃｍ）のポットに個別に移植された。移植された植物は、３〜４日間、湿気ドームで覆われ、前述のように２２℃の成長チャンバー内に置かれ、または温室に直接移された。その後、ドームを外し、植物を温室（２２±５℃、５０±３０％ＲＨ、１４時間の明：１０時間の暗、最小５００μΕ／ｍ２ｓ１自然＋補助照明）で育てた。分子確認分析は、生存Ｔ１植物について完了し、グリホサート耐性遺伝子が植物のゲノムに安定に組み込まれたことを確認した。
【０２４３】
分子確認
ｐＤＡＢ１０５５２５、ｐＤＡＢ１０５５２６、ｐＤＡＢ１０５５２７、ｐＤＡＢ１０５５２８、ｐＤＡＢ１０５５２９、ｐＤＡＢ１０２７８７で形質転換されたアラビドプシス属（Arabidopsis）植物のゲノム内でｄｇｔ−２８およびＤＳＭ−２導入遺伝子の存在が確認された。Ｔ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物内のこれらのポリヌクレオチド配列の存在は、最初に、ＴＡＱＭＡＮ（商標）に類似した加水分解プローブアッセイを介してスクリーニングされ、ＤＳＭ−２およびｄｇｔ−１４導入遺伝子の存在を確認した。事象は、遺伝子発現カセットＰＣＲによりスクリーニングされ、ｄｇｔ−１４発現カセットが、再配列することなく、植物ゲノムに完全に組み込まれたかどうかを決定した。これらの研究から得られたデータを用いて、自家受精およびＴ２世代への進行に関して、導入遺伝子のコピー数を決定し、選択アラビドプシス属（Arabidopsis）事象を同定した。また、進行したＴ２アラビドプシス属（Arabidopsis）植物を加水分解プローブアッセイによりスクリーニングし、植物染色体内にＤＳＭ−２遺伝子とｄｇｔ−１４遺伝子の存在を確認し、そのコピー数を推定した。次に、サザンブロットアッセイを用いて、Ｔ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物のサブセット上の推定コピー数を確認した。最後に、事象がＤＧＴ−１４タンパク質を発現したことをウエスタンブロットアッセイによって確認した。
【０２４４】
加水分解プローブアッセイ
後述する加水分解プローブアッセイを用いて、Ｔ１とＴ２アラビドプシス属（Arabidopsis）植物におけるコピー数を決定した。様々な数の導入遺伝子を有する植物を同定し、その後のグリホサート耐性研究に進めた。
【０２４５】
組織試料を９６ウェルプレートに回収し、２日間凍結乾燥した。組織浸軟は、ＫＬＥＣＯ（商標）組織粉砕機とタングステンビーズを用いて実施された（Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ｉｎｃ．、Ｓｗｅｅｔ  Ｈｏｍｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）。組織浸軟後、製造業者が示唆するプロトコールに従って、Ｂｉｏｓｐｒｉｎｔ  ９６植物キット（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて、ハイスループット形式でゲノムＤＮＡを単離した。ゲノムＤＮＡをＱＵＡＮＴ−ＩＴ  ＰＩＣＯ  ＧＲＥＥＮ  ＤＮＡアッセイキット（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって定量した。定量されたゲノムＤＮＡは、ＢＩＯＲＯＢＯＴ３０００（商標）自動化液体ハンドラー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて、加水分解プローブアッセイのために約２ｎｇ／μＬに調整された。加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子のコピー数の決定は、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いたリアルタイムＰＣＲによって行われた。アッセイは、ＤＳＭ−２、ｄｇｔ−１４および内部参照遺伝子、ＴＡＦＩＩ１５（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＮＣ００３０７５；Duarte et al., (201) BMC Evol. Biol., 10:61）について設計された。
【０２４６】
増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）は、ＤＳＭ−２とｄｇｔ−１４用のそれぞれ０．１μＭのプライマー、ＴＡＦＩＩ１５についてそれぞれ０．４μＭのプライマーおよび０．２μＭのそれぞれのプローブを含有する１０μＬ体積の多重反応物において１×最終濃度で調製された（表３）。二段階増幅反応は、６０℃にて４０秒間の伸長を用いて行い、蛍光を得た。すべての試料を実施し、平均サイクル閾値（Ｃｔ）をそれぞれの試料の分析に使用した。リアルタイムＰＣＲデータの分析は、相対的な定量モジュールを用いるＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ソフトウェアリリース１．５を使用して行い、ΔΔＣｔ法に基づいている。このために、１コピーの較正物質由来のゲノムＤＮＡの試料と既知の２コピーチェックをそれぞれの実行に含めた。加水分解プローブスクリーニングのコピー数の結果は、Ｔ１およびＴ２トランスジェニックアラビドプシス属（Arabidopsis）植物について決定された。
【０２４７】
【表３】
2015506702.tif 000007
【０２４８】
サザンブロット分析を介したｄｓｔ−１４組み込み確認
サザンブロット分析を用いて、挿入されたＴ−鎖ＤＮＡ断片の組み込みパターンを確立し、ｄｇｔ−１４を含有する事象を同定した。データを作成し、アラビドプシス属（Arabidopsis）ゲノム内の導入遺伝子挿入物の組み込みと完全性を実証した。サザンブロットデータは、Ｔ−鎖ＤＮＡの無傷のコピーの単純な組み込みを同定するために使用された。詳細なサザンブロット分析は、ｄｇｔ−１４遺伝子発現カセットに特異的なＰＣＲ増幅されたプローブを用いて行われた。特定の制限酵素で消化されたゲノムＤＮＡとプローブのハイブリダイゼーションは、特定の分子量のゲノムＤＮＡ断片を同定した。そのパターンを用いて、次世代への進行のための完全長の単一挿入物Ｔ１トランスジェニック事象を同定した。
【０２４９】
組織試料を２ｍＬのコニカルチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に回収し、２日間凍結乾燥した。組織浸軟は、ＫＬＥＣＫＯ（商標）組織粉砕機とタングステンビーズを用いて実施された。組織浸軟後、ＣＴＡＢ単離手法を用いてゲノムＤＮＡを単離した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔｉｐｓキットを用いて、ゲノムＤＮＡをさらに精製した。ゲノムＤＮＡをＱｕａｎｔ−ＩＴ  Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＡ（商標）アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって定量した。定量されたゲノムＤＮＡは、一定濃度にするために４μｇに調整された。
【０２５０】
それぞれの試料について、制限酵素ＳｗａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、ＭＡ）を用いて、４μｇのゲノムＤＮＡを完全に消化し、２５℃で一晩インキュベートし、次に、反応にＮｓｉＩを添加し、３７℃にて６時間インキュベートした。消化されたＤＮＡは、製造業者が示唆したプロトコールに従って、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて沈殿させて濃縮された。その後、６５℃にて１時間、２５μＬの水にゲノムＤＮＡを再懸濁した。再懸濁した試料は、１×ＴＡＥ中で調製された０．８％アガロースゲルに装填され、１×ＴＡＥ緩衝液中で１．１Ｖ／ｃｍで一晩電気泳動された。連続的に、ゲルは、３０分間の変性（０．２ＭのＮａＯＨ／０．６ＭのＮａＣｌ）、および３０分間の中和（０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１．５ＭのＮａＣｌ）に供された。
【０２５１】
ナイロンメンブレンへのＤＮＡ断片の転写は、クロマトグラフィーペーパーの芯や紙タオルを使用することによって、処理されたＩＭＭＯＢＩＬＯＮ（商標）ＮＹ＋転写メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）上にゲルを介して一晩２０×ＳＳＣ溶液を受動的に吸い上げることによって行われた。転写後、メンブレンは、簡単に、２×ＳＳＣで洗浄し、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（商標）１８００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて架橋し、８０℃にて３時間、真空乾燥させた。
【０２５２】
モデル４００ハイブリダイゼーションインキュベータ（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｙｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、ガラスローラーボトル中で１時間６５℃にてプレハイブリダイゼーション溶液（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｈｙｂ  ｐｌｕｓ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とともにブロットをインキュベートした。プローブは、全コード配列を含むＰＣＲ断片から調製された。ＰＣＲアンプリコンは、ＱＩＡＥＸ  ＩＩゲル抽出キット（商標）を用いて精製され、Ｒａｎｄｏｍ  ＲＴ  Ｐｒｉｍｅ  ＩＴ（商標）標識キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を介して、α３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識された。ブロットは、ブロットあたり約２００万カウント／ｍＬまでハイブリダイゼーション緩衝液に直接添加された変性プローブを用いて、一晩６５℃にてハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーション後、ブロットは、連続して、６５℃にて０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４０分間洗浄された。最後に、ブロットをストレージリン光イメージングスクリーンに曝露し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｓｔｏｒｍ  ８６０（商標）イメージングシステムを用いて撮像した。
【０２５３】
この研究において完成されたサザンブロット分析を用いて、コピー数を決定し、その選択された事象がアラビドプシス属（Arabidopsis）のゲノム内のｄｇｔ−１４導入遺伝子を含有していることを確認した。
【０２５４】
ＰＣＲ分析を介したｄｇｔ−１４遺伝子発現カセットの確認
Ｔ１の植物事象に含まれるｄｇｔ−１４遺伝子発現カセットの存在は、エンドポイントＰＣＲ反応によって検出された。ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２とｄｇｔ−１４遺伝子発現カセットのＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１領域に特異的なプライマー（表４を参照）を検出のために使用した。
【０２５５】
【表４】
2015506702.tif 000008
【０２５６】
ＰＣＲ反応は、遺伝子発現カセットを増幅するために、標準的な三段階のＰＣＲサイクリングプロトコールを必要とした。すべてのＰＣＲ反応は、以下のＰＣＲ条件を使用して完了された：９４℃にて３分間、続いて、９４℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、および７２℃にて３分間の３５サイクル。製造者の指示に従って、ＥＸ−ＴＡＱ  ＰＣＲ（商標）キット（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｏｔｓｕ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を用いて、反応を完了させた。最終サイクル後、反応を７２℃にて１０分間インキュベートした。ＴＡＥアガロースゲル電気泳動を用いて、ＰＣＲアンプリコンのサイズを決定した。予想されるサイズのＰＣＲアンプリコンは、全長遺伝子発現カセットの存在がトランスジェニックアラビドプシス属（Arabidopsis）事象のゲノム中に存在することを示した。
【０２５７】
定量的逆転写ＰＣＲ分析を介したｄｇｔ−１４相対転写の確認
ｄｇｔ−１４トランスジェニック植物の組織試料を９６ウェルプレートに回収し、８０℃にて凍結した。組織浸軟は、ＫＬＥＣＯ（商標）組織粉砕機とタングステンビーズ（Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｅｔａｌ  ＩＮＣ．、Ｓｗｅｅｔ  Ｈｏｍｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）を用いて行った。組織浸軟の後、全ＲＮＡは、製造業者が示唆したプロトコールに従って、カラム上のオプションのＤｎａｓｅＩ処置を含めたＱｉａｇｅｎ  Ｒｎｅａｓｙ  ９６（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いたハイスループット形式で単離された。その後、このステップは、溶出された全ＲＮＡの追加のＤｎａｓｅＩ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）処理に続いた。ｃＤＮＡ合成は、製造業者が示唆した手法に従って、オリゴヌクレオチド、ＴＶＮを加えて、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（商標）キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて、鋳型として全ＲＮＡを使用して行われた。発現の定量は、加水分解プローブアッセイによって完了し、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いたリアルタイムＰＣＲにより行われた。アッセイは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）プローブデザインソフトウェア２．０を用いて、ｄｇｔ−１４および内部参照遺伝子「未知タンパク質」（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＴ４Ｇ２４６１０）について設計された。増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）は、０．４μＭのそれぞれのプライマー、および０．２μＭのそれぞれのプローブを含む１０μＬ体積の一重反応中で１×最終濃度で調製された（表５）。
【０２５８】
二段階の増幅反応は、６０℃にて４０秒間の伸長を用いて行われ、蛍光を得た。すべての試料は３重にして行い、平均サイクル閾値（Ｃｔ）をそれぞれの試料の分析に使用した。マイナス逆転写反応をそれぞれの試料について行い、ｇＤＮＡ汚染がないことを確認した。リアルタイムＰＣＲデータの分析はΔΔＣｔ法に基づいて行った。このアッセイを用いて、ヘミ接合性およびホモ接合性であることが決定されたトランスジェニックアラビドプシス属（Arabidopsis）事象におけるｄｇｔ−１４の相対的発現を決定した。ｄｇｔ−１４  ｍＲＮＡの相対的転写レベルは、内部対照より２５．３倍から３１３．７倍高い範囲であった。これらのデータは、ｄｇｔ−１４トランスジェニック植物が、機能的ｄｇｔ−１４遺伝子発現カセットを含有し、植物がｄｇｔ−１４導入遺伝子を転写することができたことを示している。
【０２５９】
【表５】
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【０２６０】
ウエスタンブロッティング分析
ＤＧＴ−１４は、トランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物から得られる葉の試料において検出された。ｄｇｔ−１４トランスジェニック植物由来の植物抽出物とＤＧＴ−１４タンパク質標準は、８Ｍ尿素変性試料緩衝液とともに、９０℃にて５分間インキュベートされ、アクリルアミドプレキャストゲルにおいて電気泳動的に分離された。次に、タンパク質は、製造者のプロトコールを用いて、ニトロセルロースメンブレン上に電気的に転写された。ＷＥＳＴＥＲＮＢＲＥＥＺＥ（登録商標）ブロッキングミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてブロッキング後、ＤＧＴ−１４タンパク質を抗ＤＧＴ−１４抗血清、次にヤギ抗ウサギホスファターゼによって検出した。検出されたタンパク質は、化学発光基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴウエスタン分析試薬（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）によって可視化された。ウエスタンブロットを介した無傷のＤＧＴ−１４タンパク質の生産は、アッセイされたｄｇｔ−１４トランスジェニック植物がＤＧＴ−１４タンパク質を発現したことを示した。
【実施例７】
【０２６１】
グリホサート耐性
ｄｇｔ−１４導入遺伝子を含むトランスジェニックＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物は、異なる比率のグリホサートで噴霧された。増加した比率を含む様々な濃度のグリホサート比率の分布は、抵抗性の相対レベル（１０５、４２０、１，６８０、または３，３６０ｇ  ａｅ／ｈａ）を決定するために、この研究において適用された。グリホサートの典型的な１×耕作地使用率は、１，１２０ｇ  ａｅ／ｈａである。この研究で使用されたＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物は、ｄｇｔ−１４導入遺伝子のコピー数にばらつきがあった。低コピーのｄｇｔ−１４  Ｔ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物は、上記される分子確認アッセイを用いて同定され、自家受粉し、使用して、Ｔ２植物を作製した。表６は、グリホサート除草剤抵抗性遺伝子であるｄｇｔ−１（全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２５５８３５１号に記載されている）を含む対照植物および野生型対照と比較して、ｄｇｔ−１４トランスジェニック植物に対する抵抗性を示す。
【０２６２】
形質転換されたｄｇｔ−１４アラビドプシス属（Arabidopsis）植物のグリホサート選択の結果
アラビドプシス属（Arabidopsis）Ｔ１形質転換体は、最初に、グルホシネート選択スキームを使用して、非形質転換の種子のバックグラウンドから選択された。上記で選択されたＴ１植物は、分子的に特徴付けられ、その後、植物は、個々のポットに移植され、前述のように、様々な比率の市販のグリホサートで噴霧された。これらの植物の用量応答は、処理から２週間後（ＷＡＴ）、視覚的損傷％の観点から提示される。データは表に示され、損傷がほとんどないもしくは全くない（＜２０％）、中程度の損傷（２０〜４０％）、または重度の損傷（＞４０％）を提示する個々の植物を示す。算術平均および標準偏差は、アラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換のために使用されるそれぞれの構築物について提示される。個別の応答における範囲もまた、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示されている。野生型、非形質転換アラビドプシス属（Arabidopsis）（栽培品種コロンビア）は、グリホサート感受性対照として用いた。
【０２６３】
植物応答のレベルは、Ｔ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物において変化した。この差異は、それぞれの植物が独立した形質転換事象を表すという事実に起因することができ、したがって、対象とする遺伝子のコピー数は、植物ごとに変動する。比率による全体的な集団の損傷平均は表６に示され、様々な比率のグリホサートに対して、葉緑体輸送ペプチド対ｄｇｔ−１および非形質転換の野生型対照と連結されたｄｇｔ−１４構築物のそれぞれによって提供される耐性を実証する。事象は、ＴｒａＰ８  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５２６）、ＴｒａＰ９  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５２７）、ＴｒａＰ１２  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５２８）およびＴｒａＰ１３  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５２９）と連結されたｄｇｔ−１４を含有した。Ｔ１植物のグリホサート選択からのデータは、ｄｇｔ−１４がこれらの葉緑体輸送ペプチドと連結された場合、高レベルのグリホサートに対する強固な耐性が提供されたことを実証した。比較的に、ＴｒａＰ４  ｖ５（ｐＤＡＢ１０７５２６）、ＴｒａＰ５  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５２５）、およびＴｒａＰ５  ｖ１（ｐＤＡＢ１０２７８７）と連結したｄｇｔ−１４は、高濃度のグリホサートの処置に対して耐性を提供しなかったが、これらの構築物は、同じ比率のグリホサートで処理された非形質転換（または野生型）対照よりも耐性であった。さらに、ｄｇｔ−１４の３つ以上のコピーを含有することが示された事象が、高い比率のグリホサートに対してより感受性である例があった。これらの例は、表６に示される視覚的な損傷範囲の割合内で実証される。アラビドプシス属（Arabidopsis）植物内での高いコピー数の導入遺伝子の存在は、ｄｇｔ−２８導入遺伝子の存在にもかかわらず、導入遺伝子サイレンシングをもたらしたかまたはグリホサートに対する感受性をもたらした他のエピジェネティックな効果をもたらす可能性がある。
【０２６４】
【表６】
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2015506702.tif 000011
【０２６５】
導入遺伝子の挿入物の低コピー数（１〜３コピー）を含むことが同定された、選択されたＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物は、グリホサート耐性のさらなる評価のために自家受精され、第２世代を生成した。１〜３コピーのｄｇｔ−１４導入遺伝子を含んだ第２世代のアラビドプシス属（Arabidopsis）植物（Ｔ２）は、グリホサート耐性およびグルホシネート耐性についてさらに特徴付けられた（グルホシネート抵抗性は、ＰＡＴ発現カセットが無傷であり、Ｔ１植物の自殖の際に再配列を受けなかったことを示した）。Ｔ２世代において、ヘミ接合およびホモ接合植物は、それぞれの事象についての試験に利用可能であり、したがって、試験されたそれぞれの比率のグリホサートに含まれた。ヘミ接合植物は、遺伝子座で同じ２つの対立遺伝子を含むホモ接合植物と比較して、遺伝子座で２つの異なる対立遺伝子を含む。Ｔ２植物のコピー数と倍数性レベルは、前述の分子分析プロトコールを用いて確認された。同様に、グリホサートは、前述のような方法および比率を用いて適用された。植物の用量反応は、処置から２週間後（ＷＡＴ）、視覚的損傷％に関して示される。データは、損傷がほとんどないもしくは全くない（＜２０％）、中程度の損傷（２０〜４０％）、または重度の損傷（＞４０％）を提示する個体のヒストグラムとして示される。算術平均および標準偏差は、アラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換のために使用される各構築物について提示されている。個別の応答における範囲もまた、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示される。野生型、非形質転換アラビドプシス属（栽培品種コロンビア）は、グリホサート感受性対照として用いた。さらに、グリホサート除草剤抵抗性遺伝子であるｄｇｔ−１（全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２５５８３５１号に記載されている）を含む植物を正の対照として含めた。
【０２６６】
Ｔ２世代では、単一コピーおよび低コピー（２または３コピー）のｄｇｔ−１４事象の両方がグリホサート耐性について特徴付けられた。比率による全体的な集団の損傷平均は表７に示され、様々な比率のグリホサートに対して、葉緑体輸送ペプチド対ｄｇｔ−１および非形質転換の野生型対照と連結されたｄｇｔ−１４構築物のそれぞれによって提供される耐性を実証する。Ｔ２世代の事象は、ＴｒａＰ８  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５２６）、ＴｒａＰ９  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５２７）、ＴｒａＰ１２  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５２８）およびＴｒａＰ１３  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５２９）と連結されたｄｇｔ−１４を含有した。これらの事象のすべては、グリホサートに対して非常に抵抗性である。結果は、Ｔ２アラビドプシス属（Arabidopsis）植物についての損傷範囲が、試験されたグリホサートのすべての濃度について２０％未満であったことを示した。ＴｒａＰ４  ｖ５（ｐＤＡＢ１０７５２６）、ＴｒａＰ５  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５２５）、およびＴｒａＰ５  ｖ１（ｐＤＡＢ１０２７８７）と連結されたｄｇｔ−１４を含むＴ２アラビドプシス属（Arabidopsis）事象は、他のＴｒａＰ輸送ペプチドを含んでいる他のｄｇｔ−１４構築物と比較して、グリホサートに対して強固な耐性を提供しなかった。しかしながら、ＴｒａＰ４  ｖ５（ｐＤＡＢ１０７５２６）、ＴｒａＰ５  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５２５）、およびＴｒａＰ５  ｖ１（ｐＤＡＢ１０２７８７）と連結されたｄｇｔ−１４構築物は、非形質転換対照と比較して、有意に高い低レベルのグリホサート耐性を提供した。全体的に、結果は、ＤＧＴ−１４を含み、発現する植物が、フィールド比率の最大３倍（１１２０ｇ  ａｅ／ｈａ）のレベルでグリホサートに対する市販レベルの抵抗性をもたらしたことを示した。
【０２６７】
【表７】
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【０２６８】
導入遺伝子の挿入物の低コピー数（１〜３コピー）を含むことが同定された、無作為に選択されたＴ２アラビドプシス属（Arabidopsis）植物は、グリホサート耐性のさらなる評価のために自家受精され、第３世代を生成した。第３世代（Ｔ３）からのアラビドプシス属（Arabidopsis）種子を植え、先に記載したのと同じプロトコールを用いてグリホサート耐性について評価した。Ｔ３世代で試験された事象は、ホモ接合性のそれぞれの系統からの反復を含んでいた（高度な植物のいずれかが導入遺伝子の分離を示したかどうかを識別するためにグルホシネート抵抗性スクリーニングを使用することによって決定された）。これらの事象は、植物がＤＧＴ−１４タンパク質を発現していることを確認するために、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳによってアッセイされた。グリホサートの比率による全体的な集団の損傷平均に関するＴ３世代の結果は表８に示され、この表は、様々な比率のグリホサートについて、ｄｇｔ−１４構築物のそれぞれが提供するグリホサートに対する耐性を示している。典型的な抵抗性Ｔ３事象は、ＴｒａＰ８  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５２６）、ＴｒａＰ９  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５２７）、ＴｒａＰ１２  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５２８）およびＴｒａＰ１３  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５２９）と連結されたｄｇｔ−１４を含んでいた。これらの事象のすべては、グリホサートに対して非常に抵抗性である。結果は、Ｔ３アラビドプシス属（Arabidopsis）植物についての損傷範囲が、試験されたグリホサートのすべての濃度について２０％未満であったことを示した。ＴｒａＰ５  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５２５）およびＴｒａＰ５  ｖ１（ｐＤＡＢ１０２７８７）と連結されたｄｇｔ−１４を含むＴ３アラビドプシス属（Arabidopsis）事象は、異なるＴｒａＰ輸送ペプチドを含んでいる他のｄｇｔ−１４構築物と比較して、グリホサートに対して強固な耐性を提供しなかった。しかしながら、ＴｒａＰ５  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５２５）およびＴｒａＰ５  ｖ１（ｐＤＡＢ１０２７８７）と連結されたｄｇｔ−１４構築物は、非形質転換対照と比較して、有意に高い低レベルのグリホサート耐性を提供した。全体的に、結果は、ＤＧＴ−１４を含み、発現する植物が、フィールド比率の最大３倍（１１２０ｇ  ａｅ／ｈａ）のレベルでグリホサートに対する市販レベルの抵抗性をもたらしたことを示した。
【０２６９】
【表８】
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2015506702.tif 000015
【０２７０】
選択マーカーとしてのｄｇｔ−１４
グリホサート選択剤のための選択マーカーとしてのｄｇｔ−１４の使用は、上記のアラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換植物を用いて試験される。約５０個のＴ４世代アラビドプシス属（Arabidopsis）種子（ｄｇｔ−１４についてホモ接合）は、約５，０００個の野生型（グリホサートに感受性である）の種子に混ぜられる。種子は発芽され、苗木はグリホサートの選択用量で噴霧される。グリホサートのいくつかの処理を比較する：植物のそれぞれのトレイは、以下の処置スキーム：７ＤＡＰ（植え付け後の日数）、１１ＤＡＰ、または７ＤＡＰの後１１ＤＡＰの１つにおいて、グリホサートの１回または２回の適用時期のいずれかを受ける。すべての植物はまた、同じ形質転換ベクターにグルホシネート抵抗性遺伝子を含んでいるため、グリホサートを用いて選択されたｄｇｔ−１４を含む植物は、グルホシネートを用いて選択されたＤＳＭ−２またはｐａｔを含む植物と直接比較することができる。
【０２７１】
前述のように、グリホサート処置は、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ噴霧チップを用いて適用される。ｄｇｔ−１４を含有するトランスジェニック植物は、「抵抗性」または「感受性」１７ＤＡＰとして同定される。植え付け後（ＤＡＰ）７日および１１日に適用された２６．２５〜１６８０ｇ  ａｅ／ｈａグリホサートの処理は、ｄｇｔ−１４を含むトランスジェニックアラビドプシス属（Arabidopsis）植物について有効な選択を示す。感受性および抵抗性の植物をカウントし、グリホサート耐性植物の数は、植え付けられるｄｇｔ−１４導入遺伝子を含むトランスジェニック種子の元の数と相関することが見出される。これらの結果は、ｄｇｔ−１４が、形質転換されたアラビドプシス属（Arabidopsis）の集団に対して代替的な選択マーカーとして効果的に使用できることを示す。
【０２７２】
ｄｇｔ−１４の遺伝可能性
確認されたトランスジェニックＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）事象は、Ｔ２種子を生産するために自家受粉された。これらの種子は、１００個の無作為なＴ２同胞に、グルホシネート（２００ｇ  ａｅ／ｈａ）を含有するＩｇｎｉｔｅ（商標）除草剤を適用することによって後代検定を行われた。それぞれの個々のＴ２植物は、噴霧適用（１８７Ｌ／ｈａ適用率でのトラック噴霧器）前に７．５ｃｍの正方形ポットに移植された。Ｔ１ファミリー（Ｔ２植物）は、カイ二乗分析（Ｐ＞０．０５）によって決定したメンデル遺伝を用いた優性遺伝単一遺伝子座について、予期される３抵抗性：１感受性モデルに分離した。期待されたメンデル遺伝を用いて分離されたＴ１ファミリーの割合は表９に示され、ｄｇｔ−１４形質はＴ２世代にメンデル遺伝を介して渡されることを実証する。種子は、５〜１５個のＴ２個体（Ｔ３種子）から回収された。３〜４個の無作為に選択されたＴ２ファミリーのそれぞれからの２５個のＴ３同胞について前述のように後代検定を行った。データは分離を示さず、したがって、ｄｇｔ−１４は、染色体内に安定に組み込まれ、少なくとも３世代にメンデル様式で遺伝されることを実証した。
【０２７３】
【表９】
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【実施例８】
【０２７４】
追加の作物種の形質転換
ダイズは、ＷＯ２００７／０５３４８２の実施例＃１１または実施例＃１３に従前記載される同じ技術を利用して、ｄｇｔ−１４、ｄｇｔ−１１、ｄｇｔ−１２、ｄｇｔ−１８、ｄｇｔ−２９、またはｄｇｔ−３０遺伝子で形質転換され、除草剤グリホサートに対して高レベルの抵抗性を提供することができる。
【０２７５】
ワタは、特許出願、米国特許第７，８３８，７３３号の実施例＃１４、またはＷＯ２００７／０５３４８２（Wright et al.）の実施例＃１２に従前記載される同じ技術を利用することによって、ｄｇｔ−１４、ｄｇｔ−１１、ｄｇｔ−１２、ｄｇｔ−１８、ｄｇｔ−２９、またはｄｇｔ−３０遺伝子で形質転換され、除草剤グリホサートに対して高レベルの抵抗性を提供することができる。
【０２７６】
カノーラは、特許出願、米国特許第７，８３８，７３３号の実施例＃２６、またはＷＯ２００７／０５３４８２の実施例＃２２（Wright et al.）に従前記載されている同じ技術を利用することによって、ｄｇｔ−１４、ｄｇｔ−１１、ｄｇｔ−１２、ｄｇｔ−１８、ｄｇｔ−２９、またはｄｇｔ−３０遺伝子で形質転換され、除草剤グリホサートに対して高レベルの抵抗性を提供することができる。
【実施例９】
【０２７７】
他の作物のアグロバクテリウムを媒介した形質転換
本開示を考慮すると、追加の作物は、当該技術分野において公知である技術を用いて、本開示の実施形態に従って形質転換され得る。アグロバクテリウムを媒介したライムギの形質転換については、例えば、Popelka JC, Xu J, Altpeter F., "Generation of rye with low transgene copy number after biolistic gene transfer and production of (Secale cereale L.) plants instantly marker-free transgenic rye," Transgenic Res. 2003 Oct;12(5):587-96を参照されたい。アグロバクテリウムを媒介したソルガムの形質転換については、例えば、Zhao et al, "Agrobacterium-mediated sorghum transformation," Plant Mol Biol. 2000 Dec;44(6):789-98を参照されたい。アグロバクテリウムを媒介したオオムギの形質転換については、例えば、Tingay et al, "Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation," The Plant Journal, (1997) 11:1369-1376を参照されたい。アグロバクテリウムを媒介したコムギの形質転換については、例えば、Cheng et al,"Genetic Transformation of Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens," Plant Physiol. 1997 Nov;115(3):971-980を参照されたい。アグロバクテリウムを媒介したイネの形質転換については、例えば、Hiei et al, "Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens," Plant Mol. Biol. 1997 Sep;35(l-2):205-18を参照されたい。
【０２７８】
これらの植物および他の植物のラテン名を以下に示す。他の（非アグロバクテリウム）形質転換技術を用いて、ｄｇｔ−１４を、これらの植物または他の植物に形質転換することできることは明らかなはずである。例として、限定するものではないが、トウモロコシ（Zea mays）、コムギ（コムギ属種（Triticum spp.））、イネ（イネ属種（Oryza spp.）およびマコモ属種（Zizania spp.））、オオムギ（オオムギ属種（Hordeum spp.））、ワタ（アブロマ・アウグスタ（Abroma augusta）およびゴシピウム属種（Gossypium spp.））、ダイズ（Glycine max）、シュガーおよびテーブルビート（ベータ属種（Beta spp.））、サトウキビ（アレンガベンケイソウ（Arenga pinnata））、トマト（トマト（Lycopersicon esculentum）および他の属種、オオブドウホオズキ（Physalis ixocarpa）、ソラナム・インカナム（Solanum incanum）および他の属種、ならびにシフォマンドラ・ベタセア（Cyphomandra betacea））、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、サツマイモ（Ipomoea batatas）、ライムギ（ライムギ属種（Secale spp.））、ペッパー（トウガラシ（Capsicum annuum）、カプシカム・シネンゼ（Capsicum chinense）、およびキダチトウガラシ（Capsicum frutescens））、レタス（レタス（Lactuca sativa）、ラクトウカ・ペレンニス（Lactuca perennis）、およびアメリカニガナ（Lactuca pulchella））、キャベツ（アブラナ属種（Brassica spp.））、セロリ（Apium graveolens）、ナス（Solanum melongena）、ラッカセイ（Arachis hypogea）、ソルガム（ソルガム属種（Sorghum spp.））、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ（Medicago sativa））、ニンジン（Daucus carota）、マメ（インゲンマメ属種（Phaseolus spp.）および他の属）、オート（エンバク（Avena sativa）およびストリゴーサ（Avena strigosa））、エンドウマメ（エンドウ属（Pisum）、ササゲ属（Vigna）、およびテトラゴノロブス属種（Tetragonolobus spp.））、ヒマワリ（Helianthus annuus）、カボチャ（Squash）（カボチャ属種（Cucurbita spp.））、キュウリ（Cucumis sativa）、タバコ（タバコ属種（Nicotiana spp.））、アラビドプシス属（シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、シバクサ（ロリウム属（Lolium）、ヌカボ属（Agrostis）、イナゴツナギ属（Poa）、ギョウギシバ属（Cynodon）および他の属）、クローバー（シャジクソウ属（Trifolium））、ベッチ（ソラマメ属（Vicia））が挙げられる。例えば、ｄｇｔ−１４、ｄｇｔ−１１、ｄｇｔ−１２、ｄｇｔ−１８、ｄｇｔ−２９、およびｄｇｔ−３０遺伝子を用いたこのような植物の形質転換は、本開示の実施形態において意図される。
【０２７９】
ｄｇｔ−１４、ｄｇｔ−１１、ｄｇｔ−１２、ｄｇｔ−１８、ｄｇｔ−２９、およびｄｇｔ−３０遺伝子は、多くの落葉と常緑木材の作付け体系におけるシーズン使用のための主要なグリホサート除草剤の適用性を増加させる能力を有する。グリホサート除草剤抵抗性の樹種は、損傷を懸念せずに、これらの除草剤の過度の使用の柔軟性を高めるであろう。これらの種として、限定するものではないが、ハンノキ（ハンノキ属種（Alnus spp.））、セイヨウトネリコ（トネリコ属種（Fraxinus spp.））、アスペンおよびポプラ種（ポプラ属種（Populus spp.））、ブナノキ（ブナ属種（Fagus spp.））、カバノキ（カバノキ属種（Betula spp.））、チェリー（サクラ属種（Prunus spp.））、ユーカリ（ユーカリ属種（Eucalyptus spp.））、ヒッコリー（ペカン属種（Carya spp.））、カエデ（カエデ属種（Acer spp.））、オーク（コナラ属種（Quercus spp.））、およびマツ（マツ属種（Pinus spp.））が挙げられる。
【０２８０】
観賞用種および果物有利子種における選択的雑草防除のためのグリホサート除草剤抵抗性の使用も、本開示の実施形態の範囲内である。例として、限定するものではないが、バラ（バラ属種（Rosa spp.））、ホウキグサ（ニシキギ属種（Euonymus spp.））、ペチュニア（ペチュニア属種（Petunia spp.））、ベゴニア（begonia）（ベゴニア属種（Begonia spp.））、シャクナゲ（rhododendron）（シャクナゲ属種（Rhododendron spp.））、クラブアップルまたはアップル（リンゴ属種（Malus spp.））、セイヨウナシ（ナシ属種（Pyrus spp.））、モモ（サクラ属種（Prunus spp.））、およびマリーゴールド（マンジュギク属種（Tagetes spp.））が挙げられる。
【実施例１０】
【０２８１】
トウモロコシ形質転換
トウモロコシ形質転換のためのＤＮＡ構築物
標準的なクローニング方法は、上述した通りであり、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を媒介したトウモロコシの形質転換において使用するためのバイナリーベクターの構築に用いる。以下の遺伝子エレメントはｄｇｔ−１４を含むベクターにおいて使用される；トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター（ＺｍＵｂｉ１；米国特許第５，５１０，４７４号）を用いて、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域（ＺｍＬｉｐ  ３’ＵＴＲ；米国特許第７１７９９０２号）に並べられたｄｇｔ−１４コード配列を駆動し、選択マーカーカセットは、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域に並べられたａａｄ−１コード配列（米国特許第７，８３８，７３３号）を駆動するために使用されるトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターからなる。ａａｄ−１コード配列は、例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）およびアリールオキシフェノキシプロピオネート（ＡＯＰＰ）除草剤などのフェノキシオーキシン除草剤に対する耐性を付与する。ｄｇｔ−２８構築物は、標準的なバイナリーベクターおよびアグロバクテリウムスーパーバイナリーシステムベクター（Ｊａｐａｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ、Ｔｏｋｙｏ、ＪＰ）として構築される。
【０２８２】
穂の滅菌および胚の単離
トウモロコシ未熟胚を得るために、トウモロコシ（Zea mays）の同系交配株Ｂ１０４の植物を温室で生育させ、自家受粉または同胞受粉し、穂を生成する。受粉後の約９〜１２日目に穂を回収する。実験日に、穂は、次亜塩素酸ナトリウム（５％）の２０％溶液に浸漬することによって表面を滅菌し、２０〜３０分間振とうし、次に、滅菌水で３回濯ぐ。滅菌後、未熟接合胚（１．５〜２．４ｍｍ）は、それぞれの穂から無菌的に切除し、液体感染培地（ＬＳ基礎培地、４．４３ｇ／Ｌ；Ｎ６ビタミン溶液［１０００×］、１．００ｍＬ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；スクロース、６８．５ｇ／Ｌ；Ｄ（＋）グルコース、３６．０ｇ／Ｌ；１０ｍｇ／ｍｌの２，４−Ｄ、１５０μＬ／Ｌ）を含む微量遠心管に無作為に分配する。所与の実験セットについて、３つの穂からプールされた胚をそれぞれの形質転換に使用する。
【０２８３】
アグロバクテリウム培養開始：
上記のバイナリー形質転換ベクターを含むアグロバクテリウムのグリセロールストックは、適切な抗生物質を含むＡＢ最小培地プレート上に筋状にし、２０℃にて３〜４日間で増殖させる。単一のコロニーを採取し、同じ抗生物質を含むＹＥＰプレート上に筋状にし、２８℃にて１〜２日間インキュベートする。
【０２８４】
アグロバクテリウム培養および共培養
アグロバクテリウムコロニーをＹＥＰプレートから採取し、５０ｍＬ使い捨てチューブ中の１０ｍＬ感染培地に懸濁する。細胞密度は、分光光度計を用いてＯ．Ｄ．６００ｎｍが０．２〜０．４になるように調整する。アグロバクテリウム培養物を１２５ｒｐｍ、室温にてロータリーシェーカー上に置き、胚切除を行う。サイズが１．５〜２．４ｍｍ間の未熟接合胚は、滅菌トウモロコシ穀粒から単離し、１ｍＬの感染培地に入れ、同じ培地で１回洗浄する。アグロバクテリウム懸濁液（２ｍＬ）をそれぞれのチューブに加え、チューブを１０〜１５分間振とうプラットホーム上に置く。胚を共培養培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；ミオ−イノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物  １００．０ｍｇ／Ｌ；３０ｍＭジカンバ−ＫＯＨ、３．３ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）、３．００ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍｌのＡｇＮｏ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；ＤＭＳＯ、１００μΜ）に移し、胚盤を上に向けて配向し、５０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で２５℃にて３日間インキュベートする。
【０２８５】
カルス選択および推定事象の再生
共培養期間後、胚を残りの培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］０．５００ｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物  １００．０ｍｇ／Ｌ；３０ｍＭ  ジカンバ−ＫＯＨ、３．３ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ  ２．３０ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍｌ  ＡｇＮｏ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；カルベニシリン、２５０．０ｍｇ／Ｌ）（選択剤を含まない）に移し、５０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で２５℃にて３日間インキュベートする。増殖阻害用量応答実験により、０．２５ｍＭ以上のグリホサート濃度が非形質転換Ｂ１０４トウモロコシ株において細胞増殖を阻害するのに十分であることが示唆された。胚は、０．５ｍＭグリホサートを含む選択１培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；ミオイノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］０．５００ｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物  １００．０ｍｇ／Ｌ；３０ｍＭ  ジカンバ−ＫＯＨ、３．３ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）２．３０ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍｌ  ＡｇＮｏ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；カルベニシリン、２５０．０ｍｇ／Ｌ）に移され、暗所および／または５０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で２８℃にて７〜１４日間インキュベートされる。増殖中の胚発生カルスは、１．０ｍＭグリホサートを含有する選択２培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００ｍｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］０．５００ｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物  １００．０ｍｇ／Ｌ；３０ｍＭ  ジカンバ−ＫＯＨ、３．３ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）２．３０ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍＬ  ＡｇＮｏ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；カルベニシリン、２５０．０ｍｇ／Ｌ；Ｒ−ハロキシホップ酸０．１８１０ｍｇ／Ｌ）に移し、暗所および／または５０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で２８℃にて１４日間インキュベートされる。この選択工程は、トランスジェニックカルスをさらに増殖および分化させた。カルス選択期間は３〜４週間継続する。増殖中の胚発生カルスは、０．５ｍＭグリホサート含有ＰｒｅＲｅｇ培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００ｍｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、３５０．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］０．２５０ｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物  ５０．０ｍｇ／Ｌ；ＮＡＡ−ＮａＯＨ  ０．５００ｍｇ／Ｌ；ＡＢＡ−ＥｔＯＨ  ２．５０ｍｇ／Ｌ；ＢＡ  １．００ｍｇ／Ｌ；スクロース、４５．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａ��（商標）２．５０ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍｌ  ＡｇＮｏ３、１．００ｍｇ／Ｌ；カルベニシリン、２５０．０ｍｇ／Ｌ）に移し、５０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で２８℃にて７日間培養される。シュート様芽を有する胚発生カルスは、０．５ｍＭグリホサート含有再生培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００．０ｍｇ／Ｌ；スクロース、６０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｌａｎ  Ｇｕｍ  Ｇ４３４（商標）３．００ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；カルベニシリン、１２５．０ｍｇ／Ｌ）に移し、５０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で７日間培養される。一次根を有する小さなシュートは、Ｐｈｙｔｏｔｒａｙ中の発根培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００ｍｇ／Ｌ；スクロース、６０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｌａｎ  Ｇｕｍ  Ｇ４３４（商標）３．００ｇ／Ｌ；カルベニシリン、２５０．０ｍｇ／Ｌ）に移し、１４０〜１９０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の１６／８時間の明／暗で２７℃にて７日間インキュベートされる。推定されるトランスジェニック苗木は、上述のプロトコールを用いて、導入遺伝子のコピー数について分析され、土壌に移される。
【０２８６】
トウモロコシ植物内のｄｇｔ−２８およびａａｄ−１導入遺伝子の存在の分子確認
ｄｇｔ−１４およびａａｄ−１のポリヌクレオチド配列の存在は、加水分解プローブアッセイによって確認される。単離されたＴ０トウモロコシ植物は、最初に、ａａｄ−１とｄｇｔ−１４導入遺伝子の存在を確認するために、ＴＡＱＭＡＮ（商標）に類似した加水分解プローブアッセイを介してスクリーニングされる。これらの研究から生じたデータは、導入遺伝子のコピー数を決定するために使用され、Ｔ１世代へ戻し交配および進行のためのトランスジェニックトウモロコシ事象を選択するために使用される。
【０２８７】
組織試料を９６ウェルプレートに回収し、組織浸軟は、Ｑｉａｇｅｎ（商標）ＲＬＴ緩衝液中でＫＬＥＣＯ（商標）組織粉砕機およびステンレス製ビーズ（Ｈｏｏｖｅｒ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃｕｍｍｉｎｇ、ＧＡ）を用いて行う。組織浸軟後、製造業者が示唆するプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡは、Ｂｉｏｓｐｒｉｎｔ  ９６（商標）Ｐｌａｎｔキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて、ハイスループット形式で単離される。ゲノムＤＮＡは、Ｑｕａｎｔ−ＩＴ  Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＡアッセイキット（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって定量する。定量されたゲノムＤＮＡは、ＢＩＯＲＯＢＯＴ３０００（商標）自動化液体ハンドラー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて、加水分解プローブアッセイのために約２ｎｇ／μＬに調整される。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイに類似した加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子のコピー数の決定は、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いたリアルタイムＰＣＲによって行われる。アッセイは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ２．０を用いて、ａａｄ−１、ｄｇｔ−１４および内部参照遺伝子インベルターゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｕ１６１２３．１）について設計される。増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）は、ａａｄ−１とｄｇｔ−１４についての０．４μＭの各プライマーおよび０．２μＭの各プローブを含有する１０μＬ体積の多重反応において１×最終濃度にて調製される。二段階の増幅反応は、６０℃にて４０秒間の伸長を用いて行われ、蛍光を得る。すべての試料を行い、平均サイクル閾値（Ｃｔ）をそれぞれの試料の分析に使用する。リアルタイムＰＣＲデータの分析は、相対的な定量モジュールを用いたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ソフトウェアリリース１．５を使用して行われ、ΔΔＣｔ法に基づいている。対照は、それぞれの実行に含まれた単一コピー較正因子と既知の２つのコピーチェックからのゲノムＤＮＡの試料を含む。
【０２８８】
ｄｇｔ−２８で形質転換されたＴ０トウモロコシにおける発芽後の除草剤耐性
Ｔ０事象を温室で順化させ、２〜４枚の新しく、通常に見える葉が渦巻きから出現するまで成長させる（すなわち、組織培養から温室生育条件に移行する植物）。植物を、温室で２７℃にて１６時間明所：８時間暗所の条件で生育する。次に、植物を２％ｗ／ｖの硫酸アンモニウムの添加とともにＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡ（商標）（除草剤グリホサートを含有する）の市販製剤で処理する。除草剤適用は、１８７Ｌ／ｈａの噴霧量、５０ｃｍの噴霧高でトラック噴霧器を用いて行われる。Ｔ０植物は、非形質転換トウモロコシ株に重大な損傷を与えることができる２８０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートの範囲のグリホサートで噴霧される。致死量は、近交系Ｂ１０４に対して＞９５％損傷を引き起こす比率として定義される。
【０２８９】
Ｔ０  ｄｇｔ−１４トウモロコシ植物の結果は、グリホサートに対する耐性が最大４４８０ｇ  ａｅ／ｈａの比率で達成されることを実証する。選択されたＴ０植物は、次世代におけるさらなる特徴付けのために自家受粉され、または戻し交配される。追加の実験は、Ｔ１植物を含む選ばれたｄｇｔ−１４株において行われる１００個の植物後代検定を含む。すべての植物は、上述されるように１４０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａのグルホシネートまたは１０５〜１６８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートで噴霧される。選択マーカーとグリホサート抵抗性遺伝子の両方は、同じプラスミド上に構築される。したがって、１つの遺伝子が選択される場合、両方の遺伝子が存在すると考えられる。１４ＤＡＴで、抵抗性および感受性植物は、カイ二乗分析によって決定された単一遺伝子座の優性メンデル形質（３Ｒ：１Ｓ）として分離された株の割合を決定するためにカウントされる。これらのデータは、ｄｇｔ−１４は、単子葉植物種において強固なグリホサート抵抗性遺伝子として遺伝することができることを実証する。グリホサート比率の増加は、ｄｇｔ−１４遺伝子によって提供される耐性および保護をさらに特徴付けるために、Ｔ１またはＦ１生存者に適用される。
【０２９０】
選択マーカーとしてのグリホサートの発芽後の除草剤耐性使用
前述したように、Ｔ０形質転換植物を組織培養から移動させ、温室内で順化させる。試験された事象は、いくつかの異なる葉緑体輸送ペプチドに連結されたｄｇｔ−１４を含有する。これらのＴ０植物は最大４４８０ｇ  ａｅ／ｈａまでのグリホサートに強固な耐性を提供し、非形質転換植物は、２８０ｇ  ａｅ／ｈａ程度に低い濃度のグリホサートで制御されることが実証される。これらのデータは、ｄｇｔ−１４が、２８０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａの範囲のグリホサートの濃度を用いる選択マーカーとして利用され得ることを実証する。
【０２９１】
別の実施形態は、設定数の非形質転換トウモロコシ種子に、ｄｇｔ−１４導入遺伝子を含むトウモロコシの固定された株からの設定数の種子を混ぜることを含む。種子を植え付け、Ｖ１〜Ｖ３発育段階まで生育させ、その時点で、苗木は、２８０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａの範囲でグリホサートの選択用量を用いて噴霧される。７〜１０日後に、感受性および抵抗性植物をカウントし、グリホサート耐性植物の量が、植え付けられるｄｇｔ−１４導入遺伝子を含むトランスジェニック種子の元の数と相関することが認められる。
【実施例１１】
【０２９２】
他の形質とのスタッキング
昆虫抵抗性（ＩＲ）形質を含むトランスジェニック作物は、北米全体でトウモロコシ、ダイズ、およびワタ植物で広く行き渡っており、これらの形質の利用が世界中に拡大している。昆虫抵抗性と除草剤耐性（ＨＴ）の形質を組み合わせた市販のトランスジェニック作物は、複数の種子会社によって開発されている。これらは、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）の形質（例えば、ウェブサイトlifesci.sussex.ac.uk、2006で列挙されているＢｔ毒素）、非Ｂｔ昆虫抵抗性形質、および上記のＨＴ形質のいずれかまたはすべてを含む。ＩＲ形質を介した複数の害虫問題を制御する能力は、価値のある商業的な製品コンセプトである。しかしながら、雑草防除および昆虫防除が互いに独立している場合は、この製品コンセプトの利便性が制限される。ｄｇｔ−１４は、単独でまたは１つまたは複数の追加のＨＴ形質と積み重ねられて、従来の育種を通じて、または新たな形質転換事象として一緒に、１つまたは複数の追加のインプット形質（例えば、昆虫抵抗性、真菌抵抗性、またはストレス耐性など）と積み重ねられ得る（www.isb.vt.edu参照）。例示的なＩＲ形質は、ｄｇｔ−１４とともに積み重ねられる。ＩＲ形質のコード配列を取得すると、当業者は、発現エレメント（例えば、プロモーター、イントロン、３’ＵＴＲなど）を追加し、ＩＲ形質を、組換えＤＮＡ方法論を介して、ｄｇｔ−１４とともに分子的に積み重ねるであろう。例示的なＩＲ形質の候補は、Ｃｒｙ１Ｆ（米国特許第５，１２６，１３３号；第５，１８８，９６０号；第５，６９１，３０８号；第６，０９６，７０８号；第６，５７３，２４０号；および第６，７３７，２７３号）、Ｃｒｙ１Ａ（ｃ）（米国特許第６，１１４，１３８号；第５，７１０，０２０号；第６，２５１，６５６号；および第６，２２９，００４号）、ｄｇｔ−１４のいずれかとのトリプルスタックとしてのＣｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａ（ｃ）、Ｃｒｙ３４Ａｂ（１）（米国特許第７，３２３，５５６号；第７，８９７，３４２号；第７，８８８，４９５号；第７，８７５，４３０号；第７，９３２，０３３号；第７，９５６，２４６号；第６，３４０，５９３号）、Ｃｒｙ３５Ａｂ（１）（米国特許第６，３４０，５９３号；第７，３２３，５５６号；第７，８９７，３４２号；第７，８８８，４９５号；第７，８７５，４３０号；第７，９３２，０３３号；第７，９５６，２４６号）、またはｄｇｔ−１４のいずれかとのトリプルスタックとしてのＣｒｙ３５Ａｂ（１）およびＣｒｙ３４Ａｂ（１）を含む。利点は、ｄｇｔ−１４によって提供される改善された雑草防除を含み、これは、先の実施例に記載され、害虫および／または他の農学的ストレスを管理する能力と連結される。したがって、本開示の実施形態を使用して、柔軟かつコスト効果的に様々な農学的な問題を制御する能力を有する、改善された作物の品質の完全な農学的パッケージを提供することができる。
【０２９３】
組み合わせられたＩＲおよびＨＴ形質は、大部分の農学的および園芸用／観賞用作物および林業における適用を有する。ｄｇｔ−１４と、Ｂｔまたは非ＢｔのＩＲ遺伝子の数のいずれかによって提供される同等の除草剤耐性と昆虫抵抗性との組合せは、（限定するものではないが）実施例８および９に列挙されている作物種に適用することができる。雑草防除の分野における当業者は、記載されている様々な市販の除草剤のいずれかの使用が、ｄｇｔ−１４形質転換、および従来の育種または遺伝子工学のいずれかにより、対応するＨＴ形質またはＩＲ形質と積み重ねることによって可能にされることを認識する。これらの化学を代表する除草剤の特定の比率は、ＣＰＲ（Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）書籍または類似の編集においてコンパイルされた除草剤ラベル、またはオンラインでコンパイルされたラベル（例えば、cdms.net/manuf/manuf.asp）、またはいずれかの商業的または学術的な作物保護ガイド、例えば、Agriliance (2005)からの作物保護ガイドによって決定され得る。単独で使用され、タンク混合され、または連続して使用されるかどうかにかかわらず、ｄｇｔ−１４によって、ＨＴＣにおける使用が可能になったそれぞれの代替の除草剤は、本開示の実施形態の範囲内であると考えられる。
【実施例１２】
【０２９４】
任意の作物におけるＡＡＤ形質と積み重ねられたＤＧＴ形質
従来の育種を通じて、または新たな形質転換事象として一緒に、ｄｇｔ−１４形質をａａｄ形質（例えば、米国特許第７８３８７３３号に記載さているａａｄ−１；またはＷＯ２００７／０５３４８２Ａ２に記載されているａａｄ−１２）と積み重ねることによって、雑草防除効率、柔軟性、および雑草転換と除草剤抵抗性の発生を管理する能力が改善され得る。
【０２９５】
ａａｄ−１を用いた作物の形質転換により、栽培者は、単子葉作物におけるアリールオキシアルカノエート除草剤を選択的に適用することができる。このような単子葉作物は、フェノキシオーキシンの安全性のより高いマージンを有することになる。さらに、フェノキシオーキシンは、ａａｄ−１で形質転換された双子葉作物に選択的に適用することができる。ａａｄ−１２を用いた作物の形質転換により、栽培者は、雑草種を防除するために、双子葉作物においてピリジルオキシオーキシンおよびアリールオキシアルカノエート除草剤を選択的に適用することができる。ｄｇｔ−１４をａａｄ−１またはａａｄ−１２形質と積み重ねることによって、栽培者は、雑草の管理のために幅広い除草剤が提供される。さらに、除草剤の組合せの使用は、雑草種内の除草剤抵抗性を管理するためにより多くの柔軟性をもたらすこととなる。
【０２９６】
改善された雑草防除オプションのためのいくつかのシナリオを想定することができ、この場合、ｄｇｔ−１４形質およびａａｄ形質が任意の単子葉作物種または双子葉作物種において積み重ねられる：
ａ）グリホサートは、ほとんどの草と広葉雑草種の防除のために、標準的な発芽後の適用比率（４２０〜２１６０ｇ  ａｅ／ｈａ、好ましくは、５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａ）で適用され得る。ｄｇｔ−１４形質は、グリホサートのこれらの適用比率で耐性を提供することができる。ヒメムカシヨモギ（Conyza canadensis）のようなグリホサート抵抗性の広葉雑草、またはグリホサートでの防除が本質的に困難である雑草（例えば、ツユクサ属種（Commelina spp））の防除のために、２８０〜２２４０ｇ  ａｅ／ｈａ（好ましくは、５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａ）の２，４−Ｄが、連続的に適用され、タンク混合され、またはグリホサートとの予混合として適用され、さらなる防除を付与し得る。ａａｄ−１とａａｄ−１２はともに２，４−Ｄに対する耐性を提供する。
【０２９７】
さらに、ａａｄ−１２は、トリクロピルおよびフルロキシピルなどのピリジルオキシオーキシン除草剤に対する耐性を提供する。ピリジルオキシオーキシン除草剤は、ヒメムカシヨモギ（Conyza canadensis）とツユクサ属種（Commelina spp）のようなグリホサート抵抗性の広葉雑草を防除するために適用され得る。トリクロピルについては、適用比率は、典型的には、７０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａ、より典型的には、１４０〜４２０ｇ  ａｅ／ｈａの範囲であろう。フルロキシピルについては、適用比率は、典型的には、３５〜５６０ｇ  ａｅ／ｈａ、より典型的には、７０〜２８０ｇ  ａｅ／ｈａの範囲であろう。
【０２９８】
ｂ）グリホサートは、ほとんどの草と広葉雑草種の防除のために、標準的な発芽後の適用比率（４２０〜２１６０ｇ  ａｅ／ｈａ、好ましくは、５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａ）で適用され得る。ボウムギ（Lolium rigidum）またはオヒシバ（Eleusine indica）のようなグリホサート抵抗性の草種の防除のために、１０〜２００ｇ  ａｅ／ｈａ（好ましくは、２０〜１００ｇ  ａｅ／ｈａ）のキザロホップが、連続的に適用され、タンク混合され、またはグリホサートとの予混合として適用され、効果的な防除を付与し得る。ａａｄ−１はキザロホップに対する耐性を提供する。作物種におけるｄｇｔ−１４と組み合わせたａａｄ−１の積み重ねは、上述される除草剤に耐性である作物をもたらすであろう。
【０２９９】
ｃ）グリホサートは、広葉雑草種以外の草種の防除に有効である。ａａｄ−１およびｄｇｔ−１４で積み重ねられた形質は、グリホサートの草に対する有効な比率（１０５〜８４０ｇ  ａｅ／ｈａ、より好ましくは、２１０〜４２０ｇ  ａｅ／ｈａ）の適用を可能にする。次に、２，４−Ｄ（２８０〜２２４０ｇ  ａｅ／ｈａ、より好ましくは、５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａで）が、連続的に適用され、タンク混合され、または草に対する有効な比率のグリホサートとの予混合として適用され、必要とされる広葉雑草の防除を付与し得る。１０〜２００ｇ  ａｅ／ｈａ（好ましくは、２０〜１００ｇ  ａｅ／ｈａ、より好ましくは、２０〜３５ｇ  ａｅ／ｈａ）でのキザロホップのようなＡＯＰＰ除草剤は、より強固なイネ科雑草防除のために、および／またはグリホサート抵抗性の草の発生の遅延のために使用され得る。また、低比率のグリホサートは、広葉雑草防除にいくつかの利点を与えることとなる；しかしながら、主要な防除は２，４−Ｄからのものとなる。
【０３００】
ｄ）同様に、ａａｄ−１２およびｄｇｔ−１４で積み重ねられた形質は、グリホサートの草に対する有効な比率（１０５〜８４０ｇ  ａｅ／ｈａ、より好ましくは、２１０〜４２０ｇ  ａｅ／ｈａ）の適用を可能とする。次に、２，４−Ｄ（２８０〜２２４０ｇ  ａｅ／ｈａ、より好ましくは、５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａで）が、連続的に適用され、タンク混合され、または草に対する有効な比率のグリホサートとの予混合として適用され、必要とされる広葉雑草の防除を付与し得る。また上記で言及された比率で使用されるトリクロピルおよびフルロキシピルは、処置レジメンにおいて許容される成分となる。また、低比率のグリホサートは、広葉雑草防除にいくつかの利点を与えることとなる；しかしながら、主要な防除は、２，４−Ｄ、トリクロピル、またはフルロキシピルからのものとなる。
【０３０１】
雑草防除の当業者は、１つまたは複数の市販のアリールオキシオーキシン除草剤の単独または組み合わせた（連続または独立して）使用が、作物へのａａｄ−１２の形質転換によって可能にされることを認識する。同様に、１つまたは複数の市販のフェノキシオーキシン除草剤の単独、または１つまたは複数の市販のＡＯＰＰ除草剤と組み合わせた（連続または独立して）使用は、ａａｄ−１によって可能にされる。これらの形質のいずれかとｄｇｔ−１４を積み重ねることによって、雑草種のより強固な管理を可能にする。これらの化学を代表する他の除草剤の特定の比率は、ＣＰＲ（Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）書籍においてコンパイルされた除草剤ラベルまたは類似の編集、またはオンラインでコンパイルされたラベル（例えば、cdms.net/manuf/manuf.asp）、またはいずれかの商業的または学術的な作物保護ガイド、例えば、Agriliance (2005)からの作物保護ガイドによって決定され得る。単独で使用され、タンク混合され、または連続して使用されるかどうかにかかわらず、ａａｄ−１２、ａａｄ−１、またはｄｇｔ−１４によって、ＨＴＣにおける使用が可能になったそれぞれの代替の除草剤は、本開示の実施形態の範囲内であると考えられる。
【実施例１３】
【０３０２】
任意の作物におけるＡＨＡＳ形質で積み重ねられたＤＧＴ形質
イミダゾリノン除草剤耐性（ＡＨＡＳ）をコードする形質は、現在、北米において植え付けられた多数の作物に存在するが、限定されないが、トウモロコシ、イネ、ヒマワリ、およびコムギが挙げられる。さらなるイミダゾリノン耐性作物（例えば、ワタ、およびサトウダイコン）が開発されつつあるが、現在まで市販されるに至っていない。多数のイミダゾリノン除草剤（例えば、イマザモックス、イマゼタピル、イマザキン、およびイマザピック）は、現在、様々な従来の作物において選択的に使用されている。イマゼタピル、イマザモックス、および非選択的なイマザピルの使用は、ＡＨＡＳのようなイミダゾリノン耐性形質を通じて可能にされてきた。これまでのイミダゾリノン耐性ＨＴＣは、非トランスジェニックであるという利点を有する。また、この化学クラスは、有意な土壌残留活性を有し、したがって、グリホサートまたはグルホシネートに基づく系とは異なり、適用時期を超えて延びる雑草防除を提供することができる。しかしながら、イミダゾリノン除草剤によって防除される雑草の範囲は、グリホサートほど広くない（Agriliance, 2003）。さらに、イミダゾリノン除草剤は、多数の雑草が抵抗性を生じている作用機序（アセト乳酸合成酵素の阻害、ＡＬＳ）を有する（Heap I (2004)。除草剤抵抗性雑草の国際調査、www.weedscience.comで利用可能）。ｄｇｔ−１４を、従来の育種を通じて、または新たな形質転換事象として一緒に、イミダゾリノン耐性形質とともに積み重ねることによって、雑草防除効率、柔軟性、および雑草転換と除草剤抵抗性の発生を管理する能力が改善され得る。先の実施例において言及したように、ｄｇｔ−１４を用いて作物を形質転換することによって、単子葉作物および双子葉作物においてグリホサート除草剤を選択的に適用することができる。改善された雑草防除のオプションのためのいくつかのシナリオを想定することができ、この場合、ｄｇｔ−１４およびイミダゾリノン耐性形質がいずれもの単子葉作物種または双子葉作物種において積み重ねられる。
ａ）イマゼタピルは、多くの草と広葉雑草種の防除のために、標準的な発芽後の適用比率（３５〜２８０ｇ  ａｅ／ｈａ、好ましくは、７０〜１４０ｇ  ａｅ／ｈａ）で適用され得る。
ｉ）コモンウォーターヘンプ（Amaranthus rudis）、オオブタクサ（Ambrosia trifida）、シロザ（Chenopodium album）（とりわけ、Heap, 2004）のようなＡＬＳ阻害剤抵抗性広葉雑草は、４２０〜２１６０ｇ  ａｅ／ｈａ、好ましくは、５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａでグリホサートをタンク混合することによって防除され得る。
ｉｉ）サツマイモ属種（Ipomoea spp.）のようなイミダゾリノン除草剤に対して、本質的により耐性な広葉種も、４２０〜２１６０ｇ  ａｅ／ｈａ、好ましくは、５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａでグリホサートをタンク混合することによって防除され得る。
ｉｉｉ）セイバンモロコシ（Sorghum halepense）およびドクムギ属種（Lolium spp.）のようなＡＬＳ阻害剤抵抗性イネ科雑草は、４２０〜２１６０ｇ  ａｅ／ｈａ、好ましくは、５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａでグリホサートをタンク混合することによって防除され得る。
ｉｖ）本質的に耐性なイネ科雑草種（好ましくは、シバムギ（Agropyron repens））も、４２０〜２１６０ｇ  ａｅ／ｈａ、好ましくは、５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａでグリホサートをタンク混合することによって防除され得る。
【０３０３】
雑草防除の当業者は、様々な市販のイミダゾリノン除草剤またはグリホサート除草剤のいずれかの単独で、または複数の組み合わせた使用が、ｄｇｔ−１４形質転換によって、および従来の育種もしくは遺伝子工学のいずれかによる任意のイミダゾリノン耐性形質と積み重ねることによって、可能にされることを認識する。これらの化学を代表する他の除草剤の特定の比率は、ＣＰＲ（Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）書籍においてコンパイルされた除草剤ラベルまたは類似の編集、またはオンラインでコンパイルされたラベル（例えば、cdms.net/manuf/manuf.asp）、またはいずれかの商業的または学術的な作物保護ガイド、例えば、Agriliance (2005)からの作物保護ガイドによって決定され得る。単独で使用され、タンク混合され、または連続して使用されるかどうかにかかわらず、ｄｇｔ−１４およびＡＬＳ−耐性形質によって、ＨＴＣにおける使用が可能になったそれぞれの代替の除草剤は、本開示の範囲内である。
【実施例１４】
【０３０４】
ダイズ形質転換
安定に組み込まれたｄｇｔ−１４導入遺伝子を含むトランスジェニックダイズ（Glycine max）は、アグロバクテリウムを媒介したダイズ子葉節外植片の形質転換を介して生成される。機能的ｄｇｔ−１４を含有するバイナリーベクターを担持する安全化されたアグロバクテリウム株を、形質転換を開始するために使用する。
【０３０５】
アグロバクテリウムを媒介した形質転換は、Zengら（Zeng P., Vadnais D.A., Zhang Z., Polacco J.C., (2004), Plant Cell Rep., 22(7): 478-482）の修正された半子葉節手法を用いて行われる。簡単に説明すると、ダイズ種子（品種マーベリック）を基本培地で発芽させ、子葉節を単離し、アグロバクテリウムで感染させる。シュート開始、シュート伸長、および発根培地には、アグロバクテリウムを除去するためのセフォタキシム、チメンチンおよびバンコマイシンが補足される。除草剤を介した選択を、非形質転換シュートの生育を阻害するために使用する。選択されたシュートを、根の発育のために発根培地に移し、次に、苗木の順化のための土壌ミックスに移す。
【０３０６】
選択された苗木の末端の小葉は、推定の形質転換体をスクリーニングするために、除草剤（葉塗装技術）で局所的に処理する。スクリーニングされた苗木を、温室に移し、順化させ、次に、除草剤で葉を塗装し、耐性を再確認する。これらの推定の形質転換されたＴ０植物をサンプリングし、分子分析を用いて、除草剤選択マーカーおよびｄｇｔ−１４導入遺伝子の存在を確認する。Ｔ０植物を温室で自家受粉させ、Ｔ１種子を作製する。
【０３０７】
第２のダイズ形質転換法を用いて、追加のトランスジェニックダイズ植物を作製することができる。機能的ｄｇｔ−１４を含むバイナリーベクターを担持する安全化されたアグロバクテリウム株を使用して、形質転換を開始する。
【０３０８】
アグロバクテリウムを媒介した形質転換は、Paz et al.（Paz M., Martinez J., Kalvig A., Fonger T., and Wang K., (2005) Plant Cell Rep., 25: 206-213）の修正された半種子手法を用いて実施される。簡単に説明すると、成熟ダイズ種子を、塩素ガスで一晩滅菌し、アグロバクテリウムを媒介した植物形質転換の２０時間前に滅菌Ｈ２Ｏを吸収させる。種子は、種子を分離し、種皮を除去するために、へそに沿って長手方向の切り込みによって半分に切断する。胚軸を切除し、いずれもの軸方向のシュート／芽を子葉節から除去する。得られた半種子の外植片をアグロバクテリウムで感染させる。シュート開始、シュート伸長、および発根培地には、アグロバクテリウムを除去するためのセフォタキシム、チメンチンおよびバンコマイシンが補足される。除草剤選択を、非形質転換シュートの生育を阻害するために使用する。選択されたシュートを、根の発育のために発根培地に移し、次に、苗木の順化のための土壌ミックスに移す。
【０３０９】
選択された苗木の末端の小葉は、推定の形質転換体をスクリーニングするために、除草剤で局所的に（葉塗装技術）処理される。スクリーニングされた苗木は、温室に移され、順化させ、次に、除草剤で葉を塗装し、耐性を再確認する。これらの推定の形質転換されたＴ０植物をサンプリングし、分子分析を用いて、選択マーカーおよびｄｇｔ−２８導入遺伝子の存在を確認した。いくつかの事象が、導入遺伝子を含むものとして同定された。これらのＴ０植物を、さらなる分析に進め、温室で自家受粉させ、Ｔ１種子を生じさせた。ｄｇｔ−１４導入遺伝子を含むダイズ植物が得られる。ｄｇｔ−１４ダイズ植物は、様々な濃度のグリホサートで噴霧され、最大３３６０ｇ  ａｅ／ｈａの濃度でグリホサートに対する耐性を提供することが示される。
【実施例１５】
【０３１０】
イネにおけるｄｇｔ−１４遺伝子の形質転換
安定に組み込まれたｄｇｔ−１４導入遺伝子を含むトランスジェニックイネ（コメ（Oryza sativa））は、ダイズ子葉節外植片のアグロバクテリウムを媒介した形質転換を介して生成される。機能的ｄｇｔ−１４を含むバイナリーベクターを担持する安全化されたアグロバクテリウム株は、形質転換を開始するために使用される。
【０３１１】
培養培地は、１ＭのＫＯＨでｐＨ５．８に調整され、２．５ｇ／ｌのＰｈｙｔａｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で固化される。胚発生カルスは、４０ｍｌの半固形培地を含む１００×２０ｍｍのペトリ皿中で培養される。イネ苗木は、ＭＡＧＥＮＴＡボックス中の５０ｍｌの培地上で生育される。細胞懸濁液は、３５ｍｌの液体培地を含む１２５ｍｌのコニカルフラスコ中で維持され、１２５ｒｐｍで回転させる。胚発生培養の誘導および維持は、２５〜２６℃にて暗所で発生させ、植物再生および全植物体培養は、１６時間の光周期（Ｚｈａｎｇら、１９９６）を用いて照明の部屋で発生させる。
【０３１２】
胚発生カルスの誘導および維持は、前述されるような改変されたＮＢ基礎培地（Ｌｉら、１９９３）上で行われ、ここで、培地は、５００ｍｇ／ｌのグルタミンを含むように適合される。懸濁培養物は、マルトースの代わりに３０ｇ／ｌのスクロースを含む、ＳＺ液体培地（Ｚｈａｎｇら、１９９８）中で開始され、維持される。浸透培地（ＮＢＯ）は、それぞれ０．２５６Ｍのマンニトールとソルビトールの添加を伴うＮＢ培地からなる。除草剤抵抗性カルスは、３〜４週間、適切な除草剤選択剤が補足されたＮＢ培地上で選択される。プレ再生は、１週間、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、１ｍｇ／ｌのα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、５ｍｇ／ｌのアブシジン酸（ＡＢＡ）と選択的除草剤を含むＮＢ培地からなる培地（ＰＲＨ５０）上で行われる。苗木の再生は、推定上、トランスジェニックシュートが再生されるまで、２，４−Ｄ、０．５ｍｇ／ｌのＮＡＡおよび選択的除草剤を含有するＮＢ培地を含む再生培地（ＲＮＨ５０）上での培養に続く。シュートは、１％スクロースと選択的除草剤が補足された、半強度のＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ基本塩とＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミンを含む発根培地に移される。
【０３１３】
コメ（Oryza sativa）Ｌ．ジャポニカ品種Ｔａｉｐｅｉ３０９の成熟乾燥種子は、Ｚｈａｎｇら、１９９６に記載されるように滅菌される。胚発生組織は、暗所においてＮＢ培地上で滅菌成熟イネ種子を培養することによって誘導される。約１ｍｍ径の一次カルスは、胚盤から取り出され、ＳＺ液体培地中で細胞懸濁を開始するために使用される。次に、懸濁液は、Zhang、1996に記載されるように維持される。懸濁誘導された胚発生組織は、先の継代培養から３〜５日後、液体培地から取り出され、ＮＢＯ浸透培地上に配置され、ペトリ皿全体において約２．５ｃｍの円を形成し、照射前４時間、培養される。照射の１６〜２０時間後、組織をＮＢＯ培地からＮＢＨ５０選択培地に移し、照射表面が上を向いていることを確認し、暗所にて１４〜１７日間インキュベートされる。次に、新たに形成されたカルスは、元の照射された外植片から分離され、同じ培地上で、近くに配置される。さらに８〜１２日後、比較的にコンパクトであり、不透明なカルスは、視覚的に識別され、暗所での７日間、ＰＲＨ５０プレ再生培地に移される。次に、よりコンパクトで不透明になる成長中のカルスは、１６時間の光周期の下で１４〜２１日間、ＲＮＨ５０再生培地上で継代培養される。再生中のシュートは、１／２のＭＳＨ５０培地を含むＭＡＧＥＮＴＡボックスに移される。単一の外植片から再生された複数の植物は、同胞種であると考えられ、１つの独立した植物株として処理される。植物は、厚く、白い根を生成し、１／２のＭＳＨ５０培地上で積極的に成長している場合、ｄｇｔ−１４遺伝子について陽性として採点される。苗木がＭＡＧＥＮＴＡボックスの最上部に達すると、１００％湿度で１週間、６ｃｍポット中の土壌に移され、次に、３０℃にて１４時間の光周期の成長チャンバーに移動させ、温室において１３ｃｍポットに移植される前に、２１℃にて２〜３週間、暗所に配置される。種子を回収し、４℃で保存する前に１週間、３７℃で乾燥させる。
【０３１４】
３〜５葉段階の推定的トランスジェニックイネ苗木をグリホサート溶液で噴霧する。噴霧した後、苗木を、湿気ドームの外に移動させる前に１時間乾燥させる。グリホサートに対する感受性または抵抗性の評価は、処理から１０〜１４日後（ＤＡＴ）に完了される。ｄｇｔ−１４植物の完全に組み込まれたコピーを含むグリホサート抵抗性イネ苗木を同定する。ｄｇｔ−１４導入遺伝子を含むイネ植物が得られる。ｄｇｔ−１４イネ植物は、様々な濃度のグリホサートで噴霧され、最大３３６０ｇ  ａｅ／ｈａの濃度でグリホサートに対する耐性を提供することが示される。
【実施例１６】
【０３１５】
シバクサの形質転換手順
クリーピングベントグラスにおけるｄｇｔ−１４導入遺伝子のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を媒介した遺伝的形質転換は、種子から開始される胚発生カルスを介して達成される（栽培品種Ｐｅｎｎ−Ａ−４）。「Efficiency of Agrobacterium tumefaciens-mediated turfgrass (Agrostis stolonifera L) transformation」（Luo et. al., 2004）を参照されたい。
【０３１６】
カルス細胞は、単子葉植物特異的プロモーターによって駆動される除草剤抵抗性導入遺伝子（例えば、ｄｇｔ−１４）を含むスーパーバイナリーベクターを有するＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）菌株で感染させる。全体的に安定した形質転換効率は、１８％〜４５％の範囲である。サザンブロットおよび遺伝的分析は、クリーピングベントグラスのゲノム内への導入遺伝子の組み込みと、Ｔ１世代における導入遺伝子の正常な伝達および安定な発現を確認する。すべての独立した形質転換事象は、導入遺伝子の１〜３コピーを担持し、過半数（６０〜６５％）は、明らかな再配列なしに導入遺伝子の単一コピーのみを含む。
【０３１７】
成熟種子は、サンドペーパーで脱穀され、９０分間激しく振とうしながら、１０％（ｖ／ｖ）Ｃｌｏｒｏｘ（商標）漂白剤（６％次亜塩素酸ナトリウム）＋０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０（ポリソルベート２０）中で表面を滅菌する。滅菌蒸留水で５回濯いだ後、種子をカルス誘導培地（ＭＳ基礎塩およびビタミン類、３０ｇ／ｌスクロース、５００ｍｇ／ｌカゼイン加水分解物、６．６ｍｇ／ｌ  ３，６−ジクロロ−ｏ−アニス酸（ジカンバ）、０．５ｍｇ／ｌ  ６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）および２ｇ／ｌ  Ｐｈｙｔａｇｅｌに入れる。培地のｐＨを５．７に調整し、その後、１２０℃で２０分間オートクレーブする。）
【０３１８】
調製された種子外植片を含有する培養プレートを６週間、室温で暗所にて維持する。胚発生カルスを視覚的に選択し、共培養前の１週間、室温で暗所にて新鮮なカルス誘導培地上で継代培養する。
【０３１９】
アグロバクテリウムを媒介した感染の前日に、胚発生カルスは、１〜２ｍｍの小片に分割され、１００μＭアセトシリンゴンを含むカルス誘導培地上に置かれる。次に、ｄｇｔ−１４導入遺伝子を保有するアグロバクテリウム懸濁液（６６０ｎｍでＯＤ＝１．０）の１０μｌアリコートは、カルスのそれぞれの小片に適用され、その後、２５℃で暗所にて３日間共培養される。続いて、カルスを移し、細菌の増殖を抑制するために、１２５ｍｇ／ｌセフォタキシムおよび２５０ｍｇ／ｌカルベニシリンを含むカルス誘導培地上で２週間培養する。
【０３２０】
カルスが、２５０ｍｇ／ｌセフォタキシムおよび除草剤を含むカルス誘導培地に移されるとき、トランスジェニック植物の選択が生じる。カルス材料は、３週間の選択継代間隔で８週間、この培地上で維持される。選択プロセスは、室温で暗所にて行われる。
【０３２１】
植物再生のために、除草剤抵抗性の増殖中のカルス事象は、最初に、セフォタキシムと選択のための除草剤が補足された再生培地（ＭＳ基礎培地、３０ｇ／ｌスクロース、１００ｍｇ／ｌミオイノシトール、１ｍｇ／ｌ  ＢＡＰおよび２ｇ／ｌ  Ｐｈｙｔａｇｅｌ）に移される。これらのカルスを暗所で室温にて１週間維持し、次に、シュートを発生させるために２〜３週間明所に移す。
【０３２２】
発生したシュートを分離し、除草剤およびセフォタキシムを含むホルモン不含の再生培地に移し、選択圧を維持し、いずれもの残りのアグロバクテリウム細胞を抑制しながら、根の成長を促進させる。次に、十分に育った根（３〜５週間）を有する苗木は、温室内または野外のいずれかで土壌に移し、生育される。
【０３２３】
トランスジェニック植物は、１２月の冬至まで、封じ込め苗床（３〜６カ月）でドアの外で維持される。次に、春化処理された植物は、温室に移され、２５℃にて１６／８時間光周期の下で維持され、他の花粉源からトランスジェニック植物を物理的に隔離する非トランスジェニック対照植物に囲まれる。トランスジェニック植物は、温室に戻された後の３〜４週間で開花が始まる。これらの植物は、周囲の対照植物からの花粉を用いて異種交配される。それぞれの個別のトランスジェニック植物から回収された種子は、２５℃にて土壌中で発芽し、Ｔ１植物は、さらなる分析のために温室で生育される。
【０３２４】
記述されたプロトコールに従うｄｇｔ−１４形質転換が考慮される他の草には、スズメノカタビラ（Annual meadowgrass）（Poa annua）、バヒアグラス（Bahiagrass）、ベントグラス（Bentgrass）、バミューダグラス（Bermudagrass）、ブルーグラス（Bluegrass）、ブルーステムス（Bluestems）、ビロードキビ（Brachiaria）、ブロムグラス（Bromegrass）、ブラウントップ・ベント（Browntop bent）（アグロスチス・キャピラリーズ（Agrostis capillaries））、バッファログラス（Buffalograss）、カナリーグラス（Canary Grass）、カーペットグラス（Carpetgrass）、ムカデシバ（Centipedegrass）、チューイングス・フェスク（Chewings fescue）（イトウシノケグサ（Festuca rubra commutate））、メヒシバ（Crabgrass）、クリーピング・ベント（Creeping bent）（コヌカグサ（Agrostis stolonifera））、クレステッド・ヘアグラス（Crested hairgrass）（コエレリア・マクランタ（Koeleria macrantha））、ダリスグラス（Dallisgrass）、フェスク（Fescue）、フェストリウム（Festolium）、ハード／シープ・フェスク（Hard/sheeps fescue）（ウシノケグサ（Festuca ovina））、グラーマグラス（Gramagrass）、インディアングラス（Indiangrass）、ジョンソングラス（Johnsongrass）、ラブグラス（Lovegrass）、ミックス（エクイン（Equine）、パスチュア（Pasture）など）、ネイティブグラス（Native Grasses）、オーチャードグラス（Orchardgrass）、ペレニアルライグラス（Perennial ryegrass）（ペレニアルライグラス（Lolium perenne））、レッドトップ（Redtop）、イヌムギ（Rescuegrass）、一年草および多年草のライグラス（Ryegrass）、スレンダークリーピングレッドフェスク（Slender creeping red fescue）（フェスチュカ・ルブラ・トリコフィラ（Festuca rubra trichophylla））、ナガハグサ（Smooth-stalked meadowgrass）（ポア・プラテンシス（Poa pratensis））、セントオーガスチン（St. Augustine）、ストロングクリーピングレッドフェスク（Strong creeping red fescue）（フェスチュカ・ルブラ・ルブラ（Festuca rubra rubra））、スーダングラス（Sudangrass）、スイッチグラス（Switchgrass）、オニウシノケグサ（Tall fescue）（フェスチュカ・アルンジナセア（Festuca arundinacea））、ヒロハノコメススキ（Tufted hairgrass）（デスチャンプシア・カエピトーサ（Deschampsia caespitosa））、シバクサ（Turfgrasses）、ウィートグラス（Wheatgrass）、およびゾイシアグラス（Zoysiagrass）が含まれる。
【実施例１７】
【０３２５】
セイヨウアブラナ（Brassica napus）におけるＤＧＴ−１４
グリホサートに対する抵抗性を付与するｄｇｔ−１４遺伝子は、アグロバクテリウムを媒介した形質転換を用いて、セイヨウアブラナ（Brassica napus）変種Ｎｅｘｅｒａ（商標）７１０を形質転換するために使用される。
【０３２６】
セイヨウアブラナ（Brassica napus）種子は、１０分間、１０％の市販の漂白剤を用いて表面滅菌され、滅菌蒸留水で３回濯がれる。次に、種子を半分の濃度のＭＳ基礎培地（Murashige and Skoog, 1962）に置き、２５℃、１６時間光／８時間暗の光周期に設定された生育レジームの下で維持する。
【０３２７】
胚軸セグメント（３〜５ｍｍ）は、５〜７日齢の実生から切り出され、前処理として３日間、カルス誘導培地Ｋ１Ｄ１（１ｍｇ／ｌカイネチンおよび１ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄを含むＭＳ培地）に置かれる。次に、セグメントは、ペトリ皿に移され、ｄｇｔ−１４からなる構築物を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株で処理される。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）は、１５０ｒｐｍにてシェーカー上で、一晩、２８℃、暗所で増殖させ、その後、培養培地中に再懸濁される。
【０３２８】
アグロバクテリウムを用いた胚軸セグメントの３０分間の処理後、これらのセグメントは、３日間、カルス誘導培地に戻される。共培養後、セグメントは、回復の一週間、Ｋ１Ｄ１ＴＣ（２５０ｍｇ／ｌカルベニシリンおよび３００ｍｇ／ｌチメンチンを含むカルス誘導培地）に置かれる。あるいは、セグメントは、選択培地Ｋ１Ｄ１Ｈ１（除草剤を含む上記培地）上に直接置かれる。カルベニシリンおよびチメンチンは、アグロバクテリウムを死滅させるために使用される抗生物質である。選択剤は、形質転換細胞の増殖を可能にする。
【０３２９】
単離された独立した事象からのカルス試料をＰＣＲによって試験する。ｄｇｔ−１４の存在について試験で陽性である試料を確認し、再生用の培地に進める。次に、硬化した胚軸セグメントは、Ｂ３Ｚ１Ｈ１（ＭＳ培地、３ｍｇ／ｌベンジルアミノプリン、１ｍｇ／ｌゼアチン、０．５ｇ／ｌ  ＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］、５ｍｇ／ｌ硝酸銀、選択的除草剤、カルベニシリンおよびチメンチン）シュート再生培地に置かれる。３週間後、シュートは再生を始める。シュートとともに胚軸セグメントは、さらに３週間、Ｂ３Ｚ１Ｈ３培地（ＭＳ培地、３ｍｇ／ｌベンジルアミノプリン、１ｍｇ／ｌゼアチン、０．５ｇ／ｌ  ＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］、５ｍｇ／ｌ硝酸銀、選択的除草剤、カルベニシリンおよびチメンチン）に移される。
【０３３０】
シュートは胚軸セグメントから切り出され、２〜４週間、シュート伸長培地ＭＥＳＨ１０（ＭＳ、０．５ｇ／ｌ  ＭＥＳ、選択的除草剤、カルベニシリン、チメンチン）に移される。伸長したシュートは、ＭＳＩ．１（０．１ｍｇ／ｌインドール酪酸を含むＭＳ）上で根の誘導のために培養される。植物が根系を確立したとき、植物を土壌に移植する。植物は、温室に移す前の１〜２週間、Ｃｏｎｖｉｒｏｎ（商標）中で制御された環境条件下で順化される。
【０３３１】
形質転換されたＴ０植物は、Ｔ１種子を得るために温室で自家受粉される。Ｔ０植物とＴ１子孫は、ｄｇｔ−１４遺伝子による保護レベルを確立するために、ある範囲のグリホサート除草剤濃度で噴霧される。
【実施例１８】
【０３３２】
タバコの形質転換
タバコ（cv. Petit Havana）の葉片を、ｄｇｔ−１４導入遺伝子を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いて形質転換した。ｄｇｔ−１４導入遺伝子を含むプラスミドを含有する単一コロニーを、ｄｇｔ−１４を含有するベクターの選択のための抗生物質を含有する４ｍＬのＹＥＰ培地に植菌し、１９０ｒｐｍの振とう機上で一晩２８℃にてインキュベートする。その後、４ｍＬの種子培養物を用いて、１２５ｍＬのバッフルされた三角フラスコ中で同じ培地の２５ｍＬの培養物を植菌する。この培養物を、ＯＤ６００が約１．２に達するまで１９０ｒｐｍで振とうしながら２８℃にてインキュベートする。次に、１０ｍＬのアグロバクテリウム懸濁液を、滅菌した６０×２０ｍｍのペトリ（商標）皿に配置する。ＰｈｙｔａＴｒａｙｓ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）における３０ｇ／Ｌのスクロースを含むＭＳ培地（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｓ、Ｓｈａｗｎｅｅ  Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）上で無菌で成長させた植物の新鮮なカットされた葉片（０．５ｃｍ２）を、アグロバクテリウムの１０ｍＬの一晩培養物に数分間浸漬させ、滅菌ろ紙上にブロット乾燥させ、次に、１ｍｇ／Ｌインドール酢酸および１ｍｇ／Ｌの６−ベンジルアミノプリンの添加を伴う同じ培地上に配置する。３日後、ｄｇｔ−１４導入遺伝子を保有するアグロバクテリウムと共培養された葉片を、５ｍｇ／ＬのＢａｓｔａ（商標）および２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを含む同じ培地に移す。３週間後、個々のＴ０苗木を、１０ｍｇ／ＬのＢａｓｔａ（商標）および２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを含むＭＳ培地に移し、さらに３週間後、土壌に移植し、温室に移す。選択されたＴ０植物（上述の分子分析プロトコールを用いて同定される）に、自家受粉させ、完全に乾燥したとき、種子をカプセルから回収する。Ｔ１実生は、接合性およびレポーター遺伝子発現（後述）についてスクリーニングされ、ｄｇｔ−１４導入遺伝子を含む選択された植物を同定する。
【０３３３】
本発明の態様は、特定の実施形態において説明されてきたが、それらは、本開示の精神および範囲内でさらに変更されてもよい。したがって、本出願は、その一般原理を用いた本発明の実施形態の任意のバリエーション、用途、または適応をカバーすることを意図している。さらに、本出願は、これらの実施形態が関与し、添付の特許請求の範囲の限定に含まれる当該技術分野における公知または慣行に含まれるように本開示からのこのような逸脱をカバーすることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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