(57)【要約】グルコース代謝障害および／または体重障害を有する個人を治療する方法、ならびにそれに関連する組成物が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）図１Ｂ（配列番号３）に示されるポリペプチドに対して少なくとも１つの修飾を含むペプチドであって、前記修飾が前記ポリペプチドのアミノ酸配列を変更しない、前記ペプチド、
ｂ）図１Ｂ（配列番号３）に示される前記配列の変異タンパク質ペプチド、または
ｃ）図１Ｂ（配列番号３）に示される配列の変異タンパク質ペプチドであって、前記変異タンパク質ペプチドのアミノ酸配列を変更しない少なくとも１つの修飾を含む、前記変異タンパク質ペプチド
のうちのいずれか１つを含む、ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、図２に示されるｖ１〜ｖ２３のうちのいずれか１つの変異タンパク質ペプチドを含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記少なくとも１つの修飾が、ペグ化、グリコシル化、ポリシアル酸化、ＨＥＳ化、アルブミン融合、共役脂肪酸鎖を介したアルブミン結合、Ｆｃ融合、またはＰＥＧ模倣体との融合を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記少なくとも１つの修飾が、ペグ化を含む、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペグ化が、前記ペプチドの可溶性を増加させる、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
前記変異タンパク質ペプチドが、図１Ｂ（配列番号３）に示される配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸同一性を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
前記変異タンパク質ペプチドが、図１Ｂ（配列番号３）に示される配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
前記変異タンパク質ペプチドが、図１Ｂ（配列番号３）に示される前記配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドが、約１０個のアミノ酸〜約１１３個のアミノ酸の長さを有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドが、７５個より少ないアミノ酸残基を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドが、５０個より少ないアミノ酸残基を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチドが、２５個より少ないアミノ酸残基を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチドが、組換えにより生成される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１５】
前記核酸分子が、インビトロ、細胞内、またはインビボで前記ペプチドをコードする前記核酸分子の発現を付与する発現制御因子に作動可能に連結される、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
請求項１４または請求項１５に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１７】
前記ベクターが、ウイルスベクターを含む、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のペプチドを発現する、形質転換細胞または宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のペプチドと、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
少なくとも１つの追加の予防剤または治療剤をさらに含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の変異タンパク質ペプチドに特異的に結合する、抗体。
【請求項２２】
請求項１９に記載の薬学的組成物を含む、減菌容器。
【請求項２３】
前記減菌容器が、シリンジである、請求項２２に記載の減菌容器。
【請求項２４】
請求項２２に記載の減菌容器を含む、キット。
【請求項２５】
少なくとも１つの追加の予防剤または治療剤を含む第２の減菌容器をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
対象におけるグルコース代謝障害または体重障害を治療または防止する方法であって、前記対象に、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のペプチドの治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２７】
前記ペプチドが、図２に示されるｖ１〜ｖ２３のうちのいずれか１つの変異タンパク質ペプチドを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ペプチドに対する前記少なくとも１つの修飾が、ペグ化、グリコシル化、ポリシアル酸化、ＨＥＳ化、アルブミン融合、共役脂肪酸鎖を介したアルブミン結合、Ｆｃ融合、またはＰＥＧ模倣体との融合を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの修飾が、ペグ化を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ペグ化が、可溶性を増加させる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療または防止が、前記対象における血中グルコースの減少を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記治療または防止が、前記対象における体重の減少を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記治療または防止が、前記対象における食餌摂取量の減少を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記グルコース代謝障害が、真性糖尿病である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象が、ヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記対象が、肥満である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記投与が、非経口注射による、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
前記非経口注射が、皮下である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、２０１２年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／６１６，２９４号の利益を主張するものであり、この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、特に、肥満、糖尿病、および他の代謝関連障害の治療に有用である成長分化因子である変異タンパク質およびその修飾に関する。
【背景技術】
【０００３】
肥満は、最も一般的に、限られたエネルギー消費および／または身体運動の欠如に加えて過剰な食物摂取に起因する。肥満は、真性糖尿病、高血圧、粥状動脈硬化、冠動脈疾患、睡眠時無呼吸、痛風、リウマチ、および関節炎などの様々な疾患を発達させる可能性を増加させる。さらに、例えば４０を超える肥満度指数は平均して推定寿命を１０年超減少させるため、死亡のリスクは肥満と直接相関する。
【０００４】
現在の薬理学的治療様式は、受容体クラス（例えばＣＢ１、５−ＨＴ２Ｃ、およびＮＰＹ）を標的とする食欲抑制剤、視床下部およびグレリンの分子作用における食欲回路の制御因子、ならびにリパーゼを標的とする栄養吸収阻害剤を含む。残念ながら、現在の様式のいずれも、いくつかは非常に重篤であり得る有害な作用をもたらすことなく肥満を効果的に治療することが示されていない。
【０００５】
高血中グルコース値は、膵ベータ細胞によるインスリンの分泌を刺激する。インスリンは同時に、グルコースの筋肉および脂肪細胞への侵入を刺激し、グリコーゲンおよびトリグリセリドの貯蔵およびタンパク質の合成をもたらす。様々な細胞型におけるインスリン受容体の活性化は、グルコースの取り込みおよび利用を増加させることにより、および肝グルコース排出を減少させることにより、循環グルコースレベルを減少させる。この制御ネットワーク内の崩壊は、人口の大部分および増加率に影響を及ぼす糖尿病および関連する病的症候群をもたらし得る。
【０００６】
グルコース代謝障害を有する患者は、高血糖、高インスリン血症、および／またはグルコース不耐性に罹患する可能性がある。異常なグルコースおよび／またはインスリンのレベルに関連することが多い障害の例は、肝臓、脂肪、および筋肉の細胞が正常な血中インスリンレベルに応答するそれらの能力を失うインスリン耐性である。
【０００７】
現在の治療選択肢の欠点に加えて、肥満、糖尿病、ならびに関連する代謝および非代謝障害の罹患率および重症度を考慮すると、例えば食欲、グルコース、および／またはインスリンレベルを調節し、患者における変動するグルコースレベルに対する生物学的応答を強化する代替えの治療様式は関心の対象のままである。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、様々な疾患、障害、および状態、ならびに／またはそれらの症状を治療する、および／または防止するための、本明細書に記載される薬剤およびその組成物の使用を想定する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および状態、ならびに／またはそれらの症状は、グルコース代謝障害および他の代謝関連障害に関し、一方、他の実施形態では、それらは体重障害に関する。例として、薬剤およびその組成物は、真性糖尿病（例えば２型糖尿病）、インスリン耐性、ならびにインスリン耐性を特徴とする疾患、障害、および状態、インスリン産生の減少、高血糖、低インスリン血症、ならびに代謝症候群の治療および／または防止に使用され得るが、これらに限定されない。薬剤およびその組成物は、例えば食欲抑制をもたらすことにより、肥満および他の体重障害の治療および／または防止にも使用され得る。
【０００９】
ある実施形態では、薬剤は、ヒト成長分化因子１５（ＧＤＦ１５）関連ポリペプチド、ならびにそのホモログ、変異体（例えば変異タンパク質）、断片、および他の修飾形態である。特定の実施形態では、本開示により想定される薬剤は修飾されたヒトＧＤＦ１５分子であり、一方、他の実施形態では、薬剤はＧＤＦ１５変異タンパク質または修飾されたＧＤＦ１５変異タンパク質である。本開示は、前述のものをコードする核酸分子も想定する。便宜上、これ以降記載される修飾されたヒトＧＤＦ１５分子、ＧＤＦ１５変異体（例えば変異タンパク質）、および修飾されたＧＤＦ１５変異体（例えば変異タンパク質）は、以後、集合的に「ポリペプチド（複数可）」と称される。本開示のポリペプチドおよび核酸分子に関連する「ヒト」へのいかなる言及は、ポリペプチドまたは核酸が得られる様式または供給源に関して制限されるものではなく、むしろそれは天然に生じるヒトのポリペプチドまたは核酸分子の配列に対応する場合があるため、配列に関してのみであることを留意するべきである。ヒトのポリペプチドおよびそれらをコードする核酸分子に加えて、本開示は他の種からのＧＤＦ１５関連ポリペプチドおよび対応する核酸分子を想定する。
【００１０】
本開示は、ポリペプチドと同等の（またはそれより大きい）生物学的応答を誘発することができる他のＧＤＦ１５関連薬剤、および／またはポリペプチドの活性を強化することができる薬剤も想定する。
【００１１】
本開示のいくつかの実施形態では、１つ以上のポリペプチドにより治療可能な疾患もしくは障害を有する、またはそれを有するリスクがある対象は、疾患または障害を治療するために効果的な量で投与される。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、高血糖状態、インスリン耐性、高インスリン血症、グルコース不耐性、または代謝症候群である。他の実施形態では、疾患または障害は体重障害（例えば肥満）であり、一方、また他の実施形態では、ポリペプチドは、少なくともある程度、食欲抑制をもたらす。
【００１２】
本開示の他の態様は、細胞系発現系、ベクター、操作された細胞系統、ならびに前述のものに関連する方法および使用を含む。
【００１３】
以後詳細に記載されるように、本開示の一実施形態は、ａ）図１Ｂ（配列番号３）に示される配列に対して少なくとも１つの修飾を含むペプチド、ｂ）図１Ｂ（配列番号３）に示される配列の変異タンパク質ペプチド、またはｃ）変異タンパク質ペプチドが少なくとも１つの修飾を含む、図１Ｂ（配列番号３）に示される配列の変異タンパク質ペプチドのうちのいずれか１つを含むペプチドに関する。
【００１４】
本開示のある実施形態では、ペプチドは、図２に示されるｖ１〜ｖ２３のうちのいずれか１つの変異タンパク質ペプチドを含む。
【００１５】
他の実施形態では、ペプチドに対する修飾は、ペグ化、グリコシル化、ポリシアル酸化、ＨＥＳ化、アルブミン融合、共役脂肪酸鎖を介したアルブミン結合、Ｆｃ融合、またはＰＥＧ模倣体との融合を含む。特定の実施形態では、修飾はペグ化を含む。
【００１６】
またさらなる実施形態では、本開示のペプチドは、図１Ｂ（配列番号３）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸同一性、少なくとも９０％のアミノ酸同一性、少なくとも９３％のアミノ酸同一性、少なくとも９５％のアミノ酸同一性、少なくとも９７％のアミノ酸同一性、少なくとも９８％のアミノ酸同一性、または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１７】
本開示のペプチドは、１００個より少ないアミノ酸残基、７５個より少ないアミノ酸残基、５０個より少ないアミノ酸残基、２５個より少ないアミノ酸残基、または２０個より少ないアミノ酸残基を有し得る。
【００１８】
本開示によると、ペプチドは組換えにより産生され得る。
【００１９】
さらに、本開示は前述のペプチドをコードする核酸分子を想定する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、インビトロ、細胞内、またはインビボでペプチドをコードする核酸分子の発現を付与する発現制御因子に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ベクター（例えばウイルスベクター）は核酸分子のうちの１つ以上を含有する。
【００２０】
いくつかの実施形態は、前述のペプチドのうちの１つ以上を発現する形質転換細胞または宿主細胞を含む。
【００２１】
本開示の特定の実施形態では、前述のペプチドのうちの１つ以上は薬学的組成物を得るために製剤化され、組成物は１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤も含む。ある実施形態では、薬学的組成物は、少なくとも１つの追加の予防剤または治療剤も含む。
【００２２】
本開示のまたさらなる実施形態は、前述の変異タンパク質ペプチドのうちの１つに特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、別個のポリペプチドまたは単一のポリペプチドに存在する軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。本開示の抗体は、ある実施形態では、約１０７Ｍ−１〜約１０１２Ｍ−１の親和性でペプチドに結合する。また他の実施形態では、抗体は、イソ型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の重鎖定常領域を含む。追加の実施形態では、抗体は検出可能に標識され、一方、他の実施形態では、抗体はＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂ’である。
【００２３】
本開示は、共有結合的に連結された非ペプチドポリマー（例えばポリ（エチレングリコール）ポリマー）を含む抗体も想定する。他の実施形態では、抗体は、脂質部分、脂肪酸部分、ポリサッカライド部分、および炭水化物部分から選択される共有結合的に連結された部分を含む。
【００２４】
抗体は、いくつかの実施形態では、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体であり、ｓｃＦｖは、他の実施形態では、多量体化される。
【００２５】
本開示の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはヒト化抗体であり得るが、これらに限定されない。
【００２６】
さらに、本開示は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤と共に製剤化される、上述の抗体を含む薬学的組成物を想定する。そのような薬学的組成物は、少なくとも１つの追加の予防剤または治療剤も含有し得る。
【００２７】
本開示のある実施形態は、上述の薬学的組成物のうちの１つ、および任意に１つ以上の追加の成分を含有する減菌容器を想定する。例として、減菌容器はシリンジであり得るが、これに限定されない。またさらなる実施形態では、減菌容器はキットの１成分であり、キットは、例えば少なくとも１つの予防剤または治療剤を含有する第２の減菌容器も含有し得る。
【００２８】
本開示は、対象に治療有効量のポリペプチドを投与することにより、対象（例えばヒト）におけるグルコース代謝障害を治療する、または防止する方法も想定する。いくつかの方法では、治療または防止は、対象における血漿グルコースの減少、対象における血漿インスリンの減少、または対象におけるグルコース耐性の増加をもたらす。特定の実施形態では、グルコース代謝障害は真性糖尿病である。いくつかの実施形態では、対象は肥満である、および／または体重障害を有する。
【００２９】
任意の特定の投与経路または投薬計画に制限されないが、いくつかの実施形態では、投与は非経口（例えば皮下）注射による。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】ヒトＧＤＦ１５前駆体アミノ酸配列（配列番号１）、およびヒトＧＤＦ１５前駆体アミノ酸配列をコードする対応する核酸（配列番号２）を示す。
【図１Ｂ】成熟ヒトＧＤＦ１５アミノ酸配列（配列番号３）、および成熟ヒトＧＤＦ１５をコードする対応する核酸配列（配列番号４）を示す。
【図２−１】ＧＤＦ１５変異タンパク質ｖ１〜ｖ２３のアミノ酸配列を示す。ｖ１（配列番号５）、ｖ２（配列番号６）、ｖ３（配列番号７）、ｖ４（配列番号８）、ｖ５（配列番号９）、ｖ６（配列番号１０）、ｖ７（配列番号１１）、ｖ８（配列番号１２）、ｖ９（配列番号１３）；ｖ１０（配列番号１４）、ｖ１１（配列番号１５）、ｖ１２（配列番号１６）、ｖ１３（配列番号１７）、ｖ１４（配列番号１８）、ｖ１５（配列番号１９）、ｖ１６（配列番号２０）、ｖ１７（配列番号２１）、ｖ１８（配列番号２２）、ｖ１９（配列番号２３）、ｖ２０（配列番号２４）、ｖ２１（配列番号２５）、ｖ２２（配列番号２６）、ｖ２３（配列番号２７）。
【図２−２】同上
【図２−３】同上
【図２−４】同上
【図２−５】同上
【図２−６】同上
【図２−７】同上
【図３】ＡＡＶを介した遺伝的曝露後２週間のＤＩＯマウス（ｎ＝７）におけるＧＤＦ１５の全身血清曝露のレベルを示す。図に示されるように、低ＡＡＶに関して、用量＝０．７ｎｇ／ｍＬ（丸）、中程度のＡＡＶに関して、用量＝１４．９ｎｇ／ｍＬ（四角）、および高ＡＡＶに関して、用量＝６５．５ｎｇ／ｍＬ（三角）。各用量に関連する横線は平均を示す。
【図４】ＧＤＦ１５の全身送達前（陰影のない棒）および全身送達の２週間後（陰影のある棒）のＤＩＯマウスにおける体重減少に対する作用を示す。ＡＡＶ投薬に関して、低＝０．７ｎｇ／ｍＬ、中程度＝１４．９ｎｇ／ｍＬ、および高＝６５．５ｎｇ／ｍＬ。マウスの各群において、ｎ＝７およびｐ値（＊，ｐ＜０．０５、＊＊，ｐ＜０．０１、＊＊＊，ｐ＜０．００１）は、ＧＤＦ１５投薬およびＰＢＳビヒクル対照投薬後２週目の体重を比較する２元配置ＡＮＯＶＡにより決定された。
【図５】ＧＤＦ１５の全身送達前（陰影のない棒）および全身送達の２週間後（陰影のある棒）のＤＩＯマウスの、４時間の絶食後に測定された血中グルコースに対する作用を示す。ＡＡＶ投薬に関して、低＝０．７ｎｇ／ｍＬ、中程度＝１４．９ｎｇ／ｍＬ、および高＝６５．５ｎｇ／ｍＬ。マウスの各群において、ｎ＝７およびｐ値（＊，ｐ＜０．０５、＊＊，ｐ＜０．０１、＊＊＊，ｐ＜０．００１）は、ＧＤＦ１５投薬およびＰＢＳビヒクル対照投薬後２週目の血中グルコースを比較する１元配置ＡＮＯＶＡにより決定された。
【図６】中程度（１４．９ｎｇ／ｍＬ）のＡＡＶ投薬でのＧＤＦ１５の全身送達前（陰影のない棒）および全身送達の２週間後（陰影のある棒）のＤＩＯマウスにおける体重減少に対するＧＤＦ１５変異タンパク質（ｖ１、ｖ２、ｖ３、ｖ４、ｖ５、ｖ６、およびｖ７、図２を参照）の作用を示す。マウスの各群において、ｎ＝５およびｐ値は、ＧＤＦ１５変異タンパク質投薬およびＰＢＳビヒクル対照投薬後２週目の体重を比較する１元配置ＡＮＯＶＡにより決定され、ｎｓ＝有意ではない。
【図７】中程度（１４．９ｎｇ／ｍＬ）のＡＡＶ投薬でのＧＤＦ１５の全身送達前（陰影のない棒）および全身送達の２週間後（陰影のある棒）のＤＩＯマウスにおける絶食時の血清血中グルコースの減少に対するＧＤＦ１５変異タンパク質（ｖ１、ｖ２、ｖ３、ｖ４、ｖ５、ｖ６、およびｖ７、図２を参照）の作用を示す。マウスの各群において、ｎ＝５およびｐ値（＊，ｐ＜０．０５、＊＊，ｐ＜０．０１、＊＊＊，ｐ＜０．００１）は、ＧＤＦ１５投薬およびＰＢＳビヒクル対照投薬後２週目の４時間の絶食時の血清血中グルコースを比較する１元配置ＡＮＯＶＡにより決定され、ｎｓ＝有意ではない。
【図８】１日目および７日目の、８週齢のｏｂ／ｏｂマウス（３つの投薬群、投薬群当りｎ＝７）において１日２回ｓ．ｃ．投与された組換えＧＤＦ１５の用量依存血清曝露を示す。１日目に、最初の投薬群は０．０２ｍｇ／ｋｇを受け（ｗ／ｗ当量）、２番目の投薬群は０．２  ｍｇ／ｋｇを受け、３番目の投薬群は２ｍｇ／ｋｇを受けた。血清曝露（最後（２番目）の日用量の投与４時間後に測定された）は、陰影のない棒（最初の投薬群）、灰色の陰影のある棒（２番目の投薬群）、および黒色の陰影のある棒（３番目の投薬群）によって表される。２日目から７日目に関して、最初の投薬群は０．０１ｍｇ／ｋｇを１日２回受け（ｗ／ｗ当量）、２番目の投薬群は０．１ｍｇ／ｋｇを１日２回受け、３番目の投薬群は１ｍｇ／ｋｇを１日２回受けた。血清曝露（７日目の最後（２番目）の用量の投与４時間後に測定された）は、陰影のない棒（最初の投薬群）、灰色の陰影のある棒（２番目の投薬群）、および黒色の陰影のある棒（３番目の投薬群）によって表される。
【図９】１週間１日２回のｓ．ｃ．投薬の過程中のｏｂ／ｏｂマウスにおける食餌摂取量（グラム／日／動物）に対する組換えＧＤＦ１５の用量依存作用を示す。１日目に、単独収容された動物を午前中絶食させ、最初の投薬群は０．０２ｍｇ／ｋｇを受け（ｗ／ｗ当量）、２番目の投薬群は０．２ｍｇ／ｋｇを受け、３番目の投薬群は２ｍｇ／ｋｇを受けた。８時間後、この投薬計画を繰り返し、その後食餌を動物ケージに戻した。２日目の朝に、残った食餌を量り、各動物の一晩（Ｏ／Ｎ）の食餌摂取量を計算した。２日目から７日目に関して、最初の投薬群は０．０１ｍｇ／ｋｇを受け（ｗ／ｗ当量）、２番目の投薬群は０．１ｍｇ／ｋｇを受け、３番目の投薬群は１ｍｇ／ｋｇを受けた。２日目から４日目および４日目から７日目の各動物の累積食餌摂取量を再度測定した。ビヒクル対照動物における食餌摂取量は、陰影のない棒によって表され、一方、最初の投薬群の食餌摂取に対する作用は薄灰色の陰影のある棒によって表され、２番目の投薬群の食餌摂取に対する作用は中間灰色の陰影のある棒によって表され、３番目の投薬群の食餌摂取に対する作用は黒色の陰影のある棒によって表される。各投薬群において、ｎ＝７、およびｐ値（＊，ｐ＜０．０５、＊＊，ｐ＜０．０１、＊＊＊，ｐ＜０．００１）は、ビヒクル対照と各時間点の食餌摂取量を比較する２元配置ＡＮＯＶＡにより決定された。
【図１０】１日目、４日目、および７日目のｏｂ／ｏｂマウスにおける体重（グラム）に対する組換えＧＤＦ１５の１日２回のｓ．ｃ．投薬の用量依存作用を示す。１日目に、最初の投薬群は０．０２ｍｇ／ｋｇを受け（ｗ／ｗ当量）、２番目の投薬群は０．２ｍｇ／ｋｇを受け、３番目の投薬群は２ｍｇ／ｋｇを受けた。２日目から７日目に関して、最初の投薬群は０．０１ｍｇ／ｋｇを受け（ｗ／ｗ当量）、２番目の投薬群は０．１ｍｇ／ｋｇを受け、３番目の投薬群は１ｍｇ／ｋｇを受けた。毎日、朝の用量前に体重を記録した。ビヒクル対照動物の体重は、陰影のない棒によって表され、一方、最初の投薬群における体重に対するＧＤＦ１５の作用は薄灰色の陰影のある棒によって表され、２番目の投薬群においては、中間灰色の陰影のある棒によって表され、３番目の投薬群においては、黒色の陰影のある棒によって表される。各投薬群において、ｎ＝７、およびｐ値（＊，ｐ＜０．０５、＊＊，ｐ＜０．０１、＊＊＊，ｐ＜０．００１）は、ビヒクル対照と各時間点の食餌摂取量を比較する２元配置ＡＮＯＶＡにより決定された。
【図１１】ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、投与１６時間後に測定された、非絶食血中グルコースに対する、１日２回ｓ．ｃ．投与された組換えＧＤＦ１５の用量依存作用を示す。１日目に、マウスは、ビヒクル（陰影のある丸）、０．０２ｍｇ／ｋｇ（最初の投薬群、陰影のある四角）、０．２ｍｇ／ｋｇ（２番目の投薬群、陰影のある三角）、または２ｍｇ／ｋｇ（３番目の投薬群、陰影のない丸）を注射された。２日目から７日目に関して、最初の投薬群は０．０１ｍｇ／ｋｇを受け（ｗ／ｗ当量）、２番目の投薬群は０．１ｍｇ／ｋｇを受け、３番目の投薬群は１ｍｇ／ｋｇを受けた。４日目および７日目に、２番目および３番目の投薬群は、ビヒクル対照注射レベルに対して有意に減少した非絶食血中グルコース血清レベル（ｍｇ／ｄｌ）を呈した。マウスの各群において、ｎ＝７およびｐ値（＊，ｐ＜０．０５、＊＊，ｐ＜０．０１、＊＊＊，ｐ＜０．００１）は、ビヒクル対照と各時間点の非絶食血中グルコースを比較する２元配置ＡＮＯＶＡにより決定された。
【図１２】ｏｂ／ｏｂマウスにおける、組換えの部位特異的ペグ化ＧＤＦ１５変異タンパク質の、対応する非ペグ化ＧＤＦ１５変異タンパク質と比較した食餌摂取量に対する作用を示す。マウスは、ビヒクルの単一ｓ．ｃ．用量、非ペグ化（２ｍｇ／ｋｇ）ｖ１、ｖ５、もしくはｖ６、またはペグ化（２ｍｇ／ｋｇ）ｖ１、ｖ５、もしくはｖ６（図２を参照）を受けた。１日目に関して、食餌摂取量（グラム／日／動物）は、投薬１６時間後、その後２日目、５〜７日目、および１５日目に測定された。マウスの各群において、ｎ＝５およびｐ値は、各時間点の食餌摂取量をＰＢＳビヒクル対照と比較する１元配置ＡＮＯＶＡにより決定された。
【図１３】ｏｂ／ｏｂマウスにおける、組換えの部位特異的ペグ化ＧＤＦ１５変異タンパク質の、対応する非ペグ化ＧＤＦ１５変異タンパク質と比較した体重に対する作用を示す。マウスは、ビヒクルの単一ｓ．ｃ．用量、非ペグ化（２ｍｇ／ｋｇ）ｖ１、ｖ５、もしくはｖ６、またはペグ化（２ｍｇ／ｋｇ）ｖ１、ｖ５、もしくはｖ６（図２を参照）を受けた。１日目に関して、体重は、投薬１６時間後、その後２日目、８日目、および１５日目に測定された。マウスの各群において、ｎ＝５およびｐ値は、各時間点の食餌摂取量をＰＢＳビヒクル対照と比較する１元配置ＡＮＯＶＡにより決定された。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な説明
本開示をさらに説明する前に、本開示は本明細書に記載される特定の実施形態に制限されないことを理解し、また本明細書で使用される用語は特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、制限するものではないことも理解する。
【００３２】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値および下限値の間の各介在値（文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１まで）、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が本発明に包含されることを理解する。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、表示範囲内の任意の具体的に除外された値に従って本発明内にも包含される。表示範囲がそれらの上限値および下限値のうちの１つまたは両方を含む場合、それらの包含される上限値および下限値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に包含される。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。
【００３３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数指示対象を含むことに留意すべきである。よって、例えば「ヒトポリペプチド（ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、１つ以上のヒトポリペプチドへの言及を含み、「ポリペプチド（ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は１つ以上のポリペプチドへの言及を含むなどである。特許請求の範囲が任意の要素を除外するように作成されてもよいことにさらに留意する。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単に」、「のみ」等の排他的な専門用語の使用のため、または「否定的な」制限の使用のための先行詞となるよう意図される。
【００３４】
本明細書で論じられる出版物は、本出願の出願日前にそれらを開示するためだけに提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明という理由でそのような出版物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される出版物の日付は、実際の出版日とは異なる場合があり、別々に確認する必要があり得る。
【００３５】
概要
本開示は、様々な疾患、障害、および状態、ならびに／またはそれらの症状を治療する、および／または防止するための、本明細書に記載される薬剤およびその組成物の使用を想定する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および状態、ならびに／またはそれらの症状は、グルコース代謝障害に関連し、一方、他の実施形態では、それらは体重障害に関連する。例として、薬剤およびその組成物は、２型糖尿病、インスリン耐性、ならびにインスリン耐性を特徴とする疾患、障害、および状態、インスリン産生の減少、高血糖、代謝症候群、または肥満の治療および／または防止に使用され得るが、これらに限定されない。
【００３６】
特定の実施形態では、本開示により想定される薬剤は修飾されたヒト成長分化因子１５（ＧＤＦ１５）分子であり、一方、他の実施形態では、薬剤はＧＤＦ１５変異体（例えば変異タンパク質）または修飾されたＧＤＦ１５変異体である。修飾されたヒトＧＤＦ１５分子、ＧＤＦ１５変異体（例えば変異タンパク質）、および修飾されたＧＤＦ１５変異体は、それらがＧＤＦ１５受容体（複数可）に結合する能力を有し、例えば体重の減少および／または本明細書に記載される他の生理学的作用をもたらすシグナル伝達経路を開始するように、ヒトＧＤＦ１５に対して十分な相同性を有する。本開示は、前述のものをコードする核酸分子も想定する。上に示される、これ以降記載される修飾されたヒトＧＤＦ１５分子、ＧＤＦ１５変異体（例えば変異タンパク質）、および修飾されたＧＤＦ１５変異体は、集合的に「ポリペプチド（複数可）」と称される。
【００３７】
様々なＧＤＦ１５変異タンパク質の例は、以下に記載される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＧＤＦ１５残基は、別のアミノ酸で置換される。他の実施形態では、１つ以上のＧＤＦ１５未変性リジン残基は、別のアミノ酸で置換される。しかしながら、以下に記載するＫ６２Ｑ修飾は不活性である。修飾されたＧＤＦ１５分子および修飾されたＧＤＦ１５変異タンパク質の例は、以下に記載される。
【００３８】
本開示は、ＧＤＦ１５およびＧＤＦ１５変異タンパク質に対する修飾を想定し、例えばペグ化およびグリコシル化を含む。特定の実施形態では、戦略は、ペグ化が特定のリジン残基（すなわち、部位特異的ペグ化）でのみもたらされるように採用される。修飾は、例えばポリペプチドの血清半減期を改善し得る。特定の修飾されたＧＤＦ１５分子および修飾されたＧＤＦ１５変異タンパク質の例は、以下に記載される。
【００３９】
定義
用語「患者」または「対象」は、ヒトまたはヒト以外の動物（例えば哺乳類）を指すように互換的に使用される。
【００４０】
用語「治療する（ｔｒｅａｔ）、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」等は、対象を苦しめる疾患、障害、もしくは状態の基礎原因のうちの少なくとも１つ、または対象を苦しめる疾患、障害、状態に関連する症状のうちの少なくとも１つを、一時的または永久的のいずれかで排除する、減少させる、抑制する、緩和する、または寛解させるために、疾患、障害、もしくは状態、またはその症状が診断された、観察された後等に開始される一連の行動（ポリペプチドまたはポリペプチドを含む薬学的組成物の投与など）を指す。よって、治療は、活性疾患（例えば血流中のインスリンおよび／もしくはグルコースのレベルを減少させるために、グルコースレベルの変動を最小にするようにグルコース耐性を増加させるために、ならびに／またはグルコース恒常性の崩壊により生じる疾患に対して保護するために）を阻害する（すなわち、疾患、障害、もしくは状態、またはそれに関連する臨床症状の発達もしくはさらなる発達を停止させる）ことを含む。
【００４１】
本明細書で使用される、用語「治療を必要とする」とは、対象が必要とする、もしくは治療から利益を得るという医師または他の介護者によって行われる判断を指す。この判断は、医師のまたは介護者の専門知識の領域である様々な因子に基づき行われる。
【００４２】
用語「防止する」、「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「防止（ｐｒｅｍｅｎｔｉｏｎ）」等とは、対象の疾患、障害、状態等の発達のリスク（例えば臨床症状の不在により決定される）を、一時的または永久的のいずれかで防止する、抑制する、阻害する、もしくは減少させる、または一般的に特定の疾患、障害、または状態を有する傾向にある対象の状況においてその開始を遅延させるような様式で開始される（例えば疾患、障害、状態、またはその症状の開始前）一連の行動（ポリペプチドまたはポリペプチドを含む薬学的組成物の投与など）を指す。ある場合では、本用語は、疾患、障害、または状態の進行を遅くする、または有害な、もしくはさもなければ望ましくない状態へのその進行を阻害することも指す。
【００４３】
本明細書で使用される、用語「防止を必要とする」とは、対象が必要とする、もしくは予防処置から利益を得るという医師または他の介護者によって行われる判断を指す。この判断は、医師のまたは介護者の専門知識の領域である様々な因子に基づき行われる。
【００４４】
句「治療有効量」とは、患者に投与されたとき、疾患、障害、または状態の任意の症状、態様、または特性に対して任意の検出可能な好ましい作用を有することができる量で、単独または薬学的組成物の一部のいずれかとして、および単一用量または一連の用量の一部のいずれかとして、対象に薬剤を投与することを指す。治療有効量は、関連する生理学的作用を測定することにより確認することができる。例えば、高血糖状態の場合では、血中グルコースの低下もしくは減少、またはグルコース耐性試験における改善は、薬剤の量が高血糖状態を治療するのに効果的であるかを決定するために使用され得る。例えば、治療有効量は、絶食時の血漿グルコース（ＦＰＧ）の任意のレベル（例えばベースラインレベル）を減少させる、または低減させるのに十分な量であり、例えばその量は２００ｍｇ／ｄｌより大きいＦＰＧレベルを２００ｍｇ／ｄｌ未満に減少させるのに十分である、その量は、１７５ｍｇ／ｄｌ〜２００ｍｇ／ｄｌのＦＰＧレベルを開始レベル未満に減少させるのに十分である、その量は、１５０ｍｇ／ｄｌ〜１７５ｍｇ／ｄｌのＦＰＧレベルを開始レベル未満に減少させるのに十分である、その量は、１２５ｍｇ／ｄｌ〜１５０ｍｇ／ｄｌのＦＰＧレベルを開始レベル未満に減少させるのに十分である（例えばＦＰＧレベルを１２５ｍｇ／ｄｌ未満、１２０ｍｇ／ｄｌ未満、１１５ｍｇ／ｄｌ未満、１１０ｍｇ／ｄｌ未満等に減少させる）などである。ＨｂＡＩｃレベルの場合では、有効量は、約１０％〜９％超、約９％〜８％超、約８％〜７％超、約７％〜６％超、約６％〜５％超等減少させる、または低減させるのに十分な量である。より具体的には、ＨｂＡＩｃレベルを約０．１％、０．２５％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％以上減少させる、または低減させることは、本開示により想定される。治療有効量は、投薬計画および対象の状態の診断分析等に関連して調節され得る。
【００４５】
句「変化をもたらすのに十分な量」とは、前に測定された指標のレベル（例えばベースラインレベル）と特定の療法の投与後との間に検出可能な差があることを意味する。指標は、任意の客観的パラメータ（例えばグルコースまたはインスリンのレベル）、または主観的パラメータ（例えば対象の快適感）を含む。
【００４６】
本明細書で使用される、句「グルコース耐性」とは、グルコース摂取が変動するとき、対象が血漿グルコースおよび／または血漿インスリンのレベルを制御する能力を指す。例えば、グルコース耐性は、約１２０分以内に血漿グルコースのレベルを減少させ、グルコースの接種前に測定されたレベルに戻す対象の能力を包含する。
【００４７】
概して、用語「糖尿病」および「糖尿病性」とは、インスリンの不適切な産生または利用を伴い、しばしば高血糖および糖尿を特徴とする糖代謝の進行性疾患を指す。用語「糖尿病前症」および「前糖尿病性」とは、対象が糖尿病において典型的に観察される特性、症状等を有さないが、治療せずに放置した場合、糖尿病に進行する可能性がある特性、症状等を有する状況を指す。これらの状態の存在は、例えば絶食時の血漿グルコース（ＦＰＧ）試験または経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）のいずれかを用いて決定され得る。両方とも、対象が試験開始前少なくとも８時間絶食することが要求される。ＦＰＧ試験では、対象の血中グルコースは、絶食の終了後に測定される。一般的に、対象は一晩絶食し、血中グルコースは、対象が食事を取る前の朝に測定される。健康な対象は一般に、約９０〜約１００ｍｇ／ｄｌのＦＰＧ濃度を有し、「糖尿病前症」の対象は一般に、約１００〜約１２５ｍｇ／ｄｌのＦＰＧ濃度を有し、「糖尿病」の対象は一般に、約１２６ｍｇ／ｄｌを上回るＦＰＧレベルを有するだろう。ＯＧＴＴでは、対象の血中グルコースは、絶食後、およびグルコースが豊富な飲料を飲んだ２時間後に測定される。グルコースが豊富な飲料を摂取した２時間後、健康な対象は一般に、約１４０ｍｇ／ｄｌを下回る血中グルコース濃度を有し、前糖尿病性対象は一般に、約１４０〜約１９９ｍｇ／ｄｌの血中グルコース濃度を有し、糖尿病性対象は一般に、約２００ｍｇ／ｄｌ以上の血中グルコース濃度を有する。前述の血糖値は、ヒト対象に関連するが、正常血糖、中程度の高血糖、および明白な高血糖は、マウス対象においては異なって量られる。４時間の絶食後の健康なマウス対象は一般に、約１００〜約１５０ｍｇ／ｄｌのＦＰＧ濃度を有し、「糖尿病前症」のマウス対象は一般に、約１７５〜約２５０ｍｇ／ｄｌのＦＰＧ濃度を有し「糖尿病」のマウス対象は一般に、約２５０ｍｇ／ｄｌを上回るＦＰＧ濃度を有するだろう。
【００４８】
本明細書で使用される、用語「インスリン耐性」は、正常な量のインスリンが正常な生理学的または分子応答を生成することができない状態を指す。いくつかの場合では、内因的に生成されるか、または外因的に投与されるかのいずれかの過剰なインスリンの生理学的量は、全体的にまたは部分的にインスリン耐性を克服し、生物学的応答を生成することができる。
【００４９】
用語「代謝症候群」は、高インスリン血症、異常なグルコース耐性、肥満、腹部または上体区画への脂肪の再分布、高血圧、異常フィブリノゲン血症（ｄｙｓｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）、ならびに高トリグリセリド、低高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール、および高小密度低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子を特徴とする脂質異常症を含むが、これらに限定されない関連する一群の形質を指す。代謝症候群を有する対象は、２型糖尿病、および例えば粥状動脈硬化を発達させるリスクにある。
【００５０】
句「グルコース代謝障害」は、臨床症状、または健康な個人と比べて対象における上昇したグルコースのレベルおよび／もしくは上昇したインスリンのレベルに関連する臨床症状の組み合わせを特徴とする任意の障害を包含する。上昇したグルコースおよび／またはインスリンのレベルは、次の疾患、障害、および状態：特に、高血糖、ＩＩ型糖尿病、妊娠糖尿病、Ｉ型糖尿病、インスリン耐性、耐糖能障害、高インスリン血症、グルコース代謝不良、糖尿病前症、代謝障害（Ｘ症候群とも称される代謝症候群糖）、および肥満に示され得る。本開示のポリペプチドおよびその組成物は、例えばグルコース恒常性を達成する、および／または維持するために、例えば健康な対象に見られる範囲に血流中のグルコースのレベルを減少させる、および／またはインスリンのレベルを減少させるために使用され得る。
【００５１】
本明細書で使用される、用語「高血糖」とは、上昇したグルコースの量が健康な個人と比べて対象の血漿中に循環する状態を指す。高血糖は、本明細書に記載される絶食時の血中グルコースレベルの測定を含む、当該技術分野に既知の方法を用いて診断され得る。
【００５２】
本明細書で使用される、用語「高インスリン血症」とは、血中グルコースレベルが上昇するか、または正常のいずれかであるとき、同時に、循環するインスリンのレベルが上昇する状態を指す。高インスリン血症は、高トリグリセリド、高コレステロール、高低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および低高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）などの脂質異常症、高尿酸レベル、多嚢胞性卵巣症候群、ＩＩ型糖尿病、および肥満に関連するインスリン耐性に起因し得る。高インスリン血症は、約２μＵ／ｍＬより高い血漿インスリンレベルを有するときに診断され得る。
【００５３】
本明細書で使用される、句「体重障害」とは、過剰な体重および／または食欲増強に関連する状態を指す。様々なパラメータは、対象が、対象の年齢、身長、性別、および健康状態を含む、参照する健康な個人と比較して体重超過であるか否かを決定するために使用される。例えば、対象は、対象のキログラムでの体重を対象のメートルでの身長で割ることによって計算される対象の肥満度指数（ＢＭＩ）の評価により体重超過または肥満と見なされ得る。約１８．５〜約２４．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩを有する成人は正常な体重を有するとみなされ、約２５〜約２９．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する成人は体重超過（前肥満）とみなすことができ、約３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する成人は肥満とみなすことができる。食欲増強は、過剰体重の一因であることが多い。例えば不眠症に関連することが多い、朝の食欲不振および夜の過食を特徴とするが、視床下部の損傷に関する可能性がある夜食症候群を含む、食欲増強に関連する状態がいくつかある。
【００５４】
用語「活性化剤」とは、例えば１つ以上のポリペプチドの機能または活性を刺激する、増加させる、活性化させる、促進する、活性化を強化する、感作する、または上方制御する薬剤を指す。加えて、活性化剤は、ポリペプチドと同じ作用機構を通して動作する薬剤（すなわち、ポリペプチドと類似する様式で、ポリペプチドと同じシグナル伝達経路を調節する薬剤）を含み、ポリペプチドと同等の（またはそれより大きい）生物学的応答を誘発することができる。活性化剤の例としては、小分子化合物などの作動薬が挙げられる。
【００５５】
用語「調節因子」とは、集合的に、ポリペプチドおよび活性化剤を指す。
【００５６】
用語「調節する」、「調節」等は、調節因子が直接的または間接的のいずれかで１つ以上のポリペプチド（またはそれらをコードする核酸分子）の機能または活性を増加させる能力を指す。
【００５７】
本明細書で互換的に使用される、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」とは、遺伝的にコードされた、および遺伝的にコードされないアミノ酸、化学的にもしくは生化学的に修飾された、または誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたポリペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。本用語は、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種性および相同性リーダー配位列を有する、Ｎ終端メチオニン残基を有する、または有さない融合タンパク質、免疫学的にタグ付けされたタンパク質等を含むがこれらに限定されない融合タンパク質を含む。
【００５８】
本開示を通して、１文字または３文字コードに従うアミノ酸を参照することを理解する。読者の便宜上、１文字および３文字のアミノ酸コードが以下に提供される。
【表１】
2015518468.tif 000002
【００５９】
本明細書で使用される、用語「変異体」は、天然に生じる変異体（例えばホモログおよび対立遺伝子変異体）および天然に生じない変異体（例えば変異タンパク質）を包含する。天然に生じる変異体は、ホモログ、すなわち、種によって、それぞれ、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列が異なる核酸およびポリペプチドを含む。天然に生じる変異体は、対立遺伝子変異体、すなわち、種内の個体によって、それぞれ、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列が異なる核酸およびポリペプチドを含む。天然に生じない変異体は、配列における変化が人工的に導入される、例えば変化がヒトの介入（「ヒトの手」）により研究室または他の施設において生成される、それぞれ、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列における変化を含む核酸およびポリペプチドを含む。
【００６０】
ＧＤＦ１５に関して、用語「未変性」とは、生物学的に活性な天然に生じるＧＤＦ１５変異体を含む、生物学的に活性な天然に生じるＧＤＦ１５を指す。
【００６１】
本明細書で使用される、用語「変異タンパク質」とは、突然変異した組換えタンパク質、すなわち、アミノ酸配列において人工的に導入された変化、例えばヒトの介入（ヒトの手」）により研究室または他の施設において生成されたアミノ酸配列における変化を含むポリペプチドを広く指す。これらのタンパク質は、通常、単一または複数のアミノ酸置換を保有し、部位特異的もしくはランダム突然変異を受けたクローン化された遺伝子、または完全に合成された遺伝子にしばしば由来する。
【００６２】
未変性ヒトＧＤＦ１５またはＧＤＦ１５変異タンパク質に関して本明細書で使用される、用語「修飾された」、「修飾」等は、変化がＧＤＦ１５の一次アミノ酸配列を変更しない、ヒトＧＤＦ１５、天然に生じるＧＤＦ１５変異体、またはＧＤＦ１５変異タンパク質の所望の性質を強化する１つ以上の変化を指す。「修飾」は、ＧＤＦ１５ポリペプチド自体の一次アミノ酸配列を変更しない共有結合性化学修飾を含む。そのような所望される性質は、例えば循環半減期の延長、安定性の増加、クリアランスの減少、免疫原性またはアレルギー源性の変更、および検出アッセイに使用するための特定の抗体の発生を可能すること（例えば独特なエピトープの導入により）を含む。実行することができるヒトＧＤＦ１５、天然に生じるＧＤＦ１５変異体、またはＧＤＦ１５変異タンパク質に対する変化は、ペグ化（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１つ以上分子、またはその誘導体の共有結合）、グリコシル化（例えばＮ−グリコシル化）、ポリシアル酸化、およびＨＥＳ化、アルブミン融合、例えば共役脂肪酸鎖（アシル化）を介したアルブミン結合、Ｆｃ融合、およびＰＥＧ模倣体との融合を含むが、これらに限定されない。
【００６３】
用語「ＤＮＡ」、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」等は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、またはそれらの類似体を指すように、本明細書において互換的に使用される。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、直線状および環状の核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、プライマー等が挙げられる。
【００６４】
用語「プローブ」とは、遺伝子または関心の配列に対応するＤＮＡまたはＲＮＡの断片を指し、本断片は放射活性により（例えば３２Ｐもしくは３５Ｓを組み込むことにより）、またはビオチン、ジゴキシゲニン、またはフルオレセインなどのいくつかの他の検出可能な分子を用いて標識された。ＤＮＡまたはＲＮＡの相補的配列との伸長がハイブリダイズするとき、プローブは、例えばウイルスプラーク、細菌コロニー、または関心の遺伝子を含有するゲル上のバンドを標識するために使用することができる。プローブはクローン化されたＤＮＡであるか、または合成ＤＮＡ鎖であってよく、後者は、例えばタンパク質の一部をミクロ配列決定する、タンパク質をコードする核酸配列を推定する、その配列を保有するオリゴヌクレオチドを合成する、配列を放射標識する、およびｃＤＮＡライブラリまたはゲノムライブラリをスクリーニングするためにそれをプローブとして使用することにより、単離したタンパク質からｃＤＮＡまたはゲノムクローンを得るために使用され得る。
【００６５】
用語「異種性」とは、異なる供給源に由来する構造によって定義される２つの成分を指す。例えば、ポリペプチドの文脈では、「異種性」ポリペプチドは、異なるポリペプチド（例えば組換えポリペプチドを含む第１の成分および未変性ＧＤＦ１５ポリペプチドに由来する第２の成分）に由来する作動可能に連結されたアミノ酸配列を含み得る。同様に、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの文脈では、「異種性」ポリヌクレオチドは、異なる遺伝子（例えば本明細書に開示される実施形態に従うポリペプチドをコードする核酸からの第１の成分およびキャリアポリペプチドをコードする核酸からの第２の成分）に由来し得る作動可能に連結された核酸配列を含み得る。他の例示的な「異種性」核酸は、コード配列を含む核酸がコード配列とは異なる遺伝的起源からである制御要素（例えばプロモータ）に作動可能に連結される発現構築物を含む（例えばプロモータ、コード配列、またはその両方とは異なる遺伝的起源であり得る関心の宿主細胞において発現を提供するため）。例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはそのドメインをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＴ７プロモータは異種性核酸と言われる。組換え細胞の文脈では、「異種性」とは、核酸が存在する宿主細胞とは異なる遺伝的起源のものである核酸（またはポリペプチドなどの遺伝子生成物）の存在を指し得る。
【００６６】
用語「作動可能に連結される」とは、所望の機能を提供するための分子間の連結を指す。例えば、核酸の文脈では、「作動可能に連結される」とは、核酸発現制御配列（プロモータ、シグナル配列、または多くの転写因子結合部位など）と第２のポリヌクレオチドとの間の機能的連結を指し、発現制御配列は、第２のポリヌクレオチドの転写および／または翻訳に影響する。ポリペプチドの文脈では、「作動可能に連結される」とは、ポリペプチドの記載される活性を提供するために、アミノ酸配列間（例えば異なるドメインの）の機能的連結を指す。
【００６７】
ポリペプチドの構造の文脈で本明細書で使用される、「Ｎ終端（N-terminus）」（または「アミノ終端（amino terminus）」）および「Ｃ終端（C-terminus）」（または「カルボキシル終端（carboxyl terminus）」）とは、それぞれ、ポリペプチドのアミノ最端およびカルボキシル最端を指し、一方、用語「Ｎ末端（N-terminal）」および「Ｃ末端（C-terminal）」とは、それぞれ、Ｎ終端およびＣ終端に向かうポリペプチドのアミノ酸配列の相対的位置を指し、それぞれ、Ｎ終端およびＣ終端の残基を含み得る。「直ちにＮ末端」または「直ちにＣ末端」とは、第１および第２のアミノ酸残基が連続するアミノ酸配列を提供するために共有結合される、第２のアミノ酸残基に対する第１のアミノ酸残基の位置を指す。
【００６８】
アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列（例えばＧＤＦ１５ポリペプチドに「由来する」アミノ酸配列）の文脈では、「〜に由来する」とは、ポリペプチドまたは核酸が参照ポリペプチドまたは核酸（例えば天然に生じるＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５をコードする核酸）に基づく配列を有することを意味し、タンパク質または核酸が作製される供給源または方法について制限することを意味しない。例として、用語「〜に由来する」は、参照アミノ酸またはＤＮＡ配列のホモログまたは変異体を含む。
【００６９】
「単離された」とは、天然に生じる場合、ポリペプチドが天然に生じ得る環境とは異なる環境にある関心のポリペプチドを指す。「単離された」とは、関心のポリペプチドに関して実質的に濃縮されるサンプル内に存在する、および／または関心のポリペプチドが部分的にまたは実質的に精製されるポリペプチドを含むことを意味する。ポリペプチドが天然に生じない場合、「単離された」は、ポリペプチドが合成または組換え手段のいずれかによって作製された環境から分離されたポリペプチドを示す。
【００７０】
「濃縮された」とは、関心のポリペプチドがａ）生物学的サンプル（例えばポリペプチドが天然に生じる、またはそれが投与後に存在するサンプル）などの開始サンプル中のポリペプチドの濃度より大きい濃度（例えば少なくとも３倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも８倍大きい、少なくとも６４倍以上大きい）、またはｂ）ポリペプチドが作製された環境（例えば細菌細胞中のような）より大きい濃度で存在するように、サンプルが非天然に操作される（例えば科学者または臨床医により）ことを意味する。
【００７１】
「実質的に純粋」とは、成分（例えばポリペプチド）が組成物の総量の約５０％超、典型的には、総ポリペプチド含量の約６０％超を構成することを示す。より典型的には、「実質的に純粋」とは、総組成物の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上が関心の成分である組成物を指す。いくつかの場合では、ポリペプチドは、組成物の総量の約９０％超、または約９５％超を構成する。
【００７２】
用語「抗体」（Ａｂｓ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）とは、同一の構造特性を有する糖タンパク質を指す。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を呈するが、免疫グロブリンは抗原特異性を欠く抗体および他の抗体様分子の両方を含む。抗体は以下に詳細に記載される。
【００７３】
用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質の抗体の集団から得た抗体を指す、つまり、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な天然に生じる突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向される。異なる決定因子（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含むポリクローナル抗体の調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に対して指向される。
【００７４】
「単離された」抗体は、その天然環境の汚染成分から単離された、および／または回収されたものであり、そのような汚染成分は、抗体の診断または治療の使用に干渉する可能性がある物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含み得る。
【００７５】
成長分化因子１５（ＧＤＦ１５）
ＭＩＣ−１（マクロファージ阻害性サイトカイン−１）としても知られるＧＤＦ１５、ＰＤＦ、ＰＬＡＢ、ＮＡＧ−１、ＴＧＦ−ＰＬ、およびＰＴＧＦＢは、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーである。フューリン様プロテアーゼにより後に切断される６２ｋＤａ細胞内前駆体タンパク質として合成されるＧＤＦ１５は、２５ｋＤａジスルフィド連結タンパク質として分泌される。［例えばＦａｉｒｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ  ６５：２−５（１９９９）を参照］。ＧＤＦ１５ｍＲＮＡは、肝臓、腎臓、膵臓、結腸、および胎盤を含むいくつかの組織において見られ、肝臓におけるＧＤＦ１５発現は、肝臓、腎臓、心臓、および肺などの臓器の損傷中に顕著に上方制御され得る。
【００７６】
ＧＤＦ１５前駆体は、２９アミノ酸シグナルペプチド、１６７アミノ酸プロドメイン、およびフューリン様プロテアーゼによってプロドメインから切除される１１２アミノ酸の成熟ドメインを含有する３０８アミノ酸ポリペプチド（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４８５５．２）である。３０８−アミノ酸ＧＤＦ１５ポリペプチドは「完全長」ＧＤＦ１５ポリペプチドと称され、１１２−アミノ酸ＧＤＦ１５ポリペプチド（例えば図１Ａに示されるアミノ酸配列のアミノ酸１９７〜３０８）は、「成熟」ＧＤＦ１５ポリペプチドである。特に記載のない限り、用語「ＧＤＦ１５」とは、１１２アミノ酸成熟配列を指す。加えて、特定のＧＤＦ１５残基に対する数的参照は、１１２アミノ酸成熟配列を指す（すなわち、残基１はＡｌａ（Ａ）であり、残基１１２はＩｌｅ（Ｉ）である（図１Ｂを参照））。
【００７７】
本開示の範囲は、マウス（ＮＰ＿０３５９４９）、チンパンジー（ＸＰ＿５２４１５７）、オランウータン（ＸＰ＿００２８２８９７２）、アカゲザル（ＥＨＨ２９８１５）、ジャイアントパンダ（ＸＰ＿００２９１２７７４）、テナガザル（ＸＰ＿００３２７５８７４）、モルモット（ＸＰ＿００３４６５２３８）、フェレット（ＡＥＲ９８９９７）、ウシ（ＮＰ＿００１１９３２２７）、ブタ（ＮＰ＿００１１６７５２７）、およびイヌ（ＸＰ＿５４１９３８）を含む、他の哺乳類種からのＧＤＦ１５オルソログ、およびその修飾された形態、ならびにそれらの使用を含む。ヒトＧＤＦ１５の成熟形態は、マウスオルソログに対して約６７％のアミノ酸同一性を有する。
【００７８】
特定の実施形態では、本開示により想定される薬剤は修飾されたヒトＧＤＦ１５分子であり、一方、他の実施形態では、薬剤はＧＤＦ１５変異体（例えば変異タンパク質）または修飾されたＧＤＦ１５変異体である。修飾されたヒトＧＤＦ１５分子、ＧＤＦ１５変異体（例えば変異タンパク質）、および修飾されたＧＤＦ１５変異体は、それらがＧＤＦ１５受容体（複数可）に結合する能力を有し、例えば体重の減少および／または本明細書に記載される他の生理学的作用をもたらすシグナル伝達経路を開始するように、ヒトＧＤＦ１５に対して十分な相同性を有する。本開示は、前述をコードする核酸分子も想定する。上に示される、修飾されたヒトＧＤＦ１５分子、ＧＤＦ１５変異体（例えば変異タンパク質）および修飾されたＧＤＦ１５変異体は、以後、集合的に「ポリペプチド（複数可）」と称される。加えて、未変性ＧＤＦ１５と同等またはそれ以上の活性を維持するポリペプチドの断片は、本開示により想定される。
【００７９】
本明細書に想定されるＧＤＦ１５変異タンパク質は、任意の他のアミノ酸を有する未変性のリジン残基（すなわち、残基６２、６９、９１、および１０７）のうちの１つ以上の置換を含む。しかしながら、Ｋ６２Ｑを含有するすべてのＧＤＦ１５変異タンパク質（例えば変異体ｖ２、ｖ３、およびｖ４、図２を参照）は不活性であり、負の対照タンパク質として挙動する。対照的に、Ｋ６２を維持するが、Ｋ６９Ｑ、Ｋ９１Ｒ、および／またはＫ１０７Ｒの任意の組み合わせを組み込むＧＤＦ１５変異タンパク質は（例えば変異体ｖ１、ｖ５、ｖ６、およびｖ７、図２を参照）、体重を、野生型対照と同等のレベルに低下させるのに活性がある。他のＧＤＦ１５変異タンパク質では、１つ以上のＧＤＦ１５残基は、例えば次の置換：Ｈ１８Ｑ、Ｔ１９Ｓ、またはＶ２０Ｌを含む別のアミノ酸で置換される。他のＧＤＦ１５変異タンパク質の例は以下に記載される。ＧＤＦ１５変異タンパク質は、アミノ終端に天然に生じないプロリンを含むＧＤＦ１５ポリペプチドも含む。例として、天然に生じる成熟ＧＤＦ１５ポリペプチドのアミノ酸配列は、Ｎ末端プロリンを含むように修飾され得、得られた変異タンパク質は１１３個のアミノ酸の長さを有し得る。別の例として、天然に生じないＧＤＦ１５変異体のアミノ酸配列は、Ｎ末端プロリンを含み得る。
【００８０】
以下に詳細に記載されるいくつかの技法は、ペグ化、Ｎ−グリコシル化、アルブミン融合分子、およびＦｃ融合分子を含む、未変性ＧＤＦ１５およびＧＤＦ１５変異タンパク質を修飾するように使用され得る。例として、ヒトＧＤＦ１５またはＧＤＦ１５変異タンパク質は、Ｎ終端アラニン残基（すなわち、Ａ１）、または成熟ポリペプチド内の１つ以上のリジン残基（すなわち、残基６２、６９、９１、および１０７）での１つ以上のＰＥＧ分子の共有結合により修飾され得る。特定の実施形態では、戦略は、ペグ化が特定のリジン残基でのみもたらされる（すなわち、部位特異的修飾）ように採用される。標準的なペグ化技法を使用することによって、リジン６２は、タンパク質２量体界面の疎水性コア内に埋められる可能性があり、したがってそのペグ化を防止するためにリジン６２を突然変異させる必要がないため（さらに、上述のように、Ｋ６２Ｑを含む変異タンパク質は不活性である）、修飾されない。修飾されたＧＤＦ１５分子および修飾されたＧＤＦ１５変異タンパク質の例は、以下に記載される。
【００８１】
未変性ＧＤＦ１５と比較して、ＧＤＦ１５の修飾された形態、ＧＤＦ１５変異体（例えば変異タンパク質）、および修飾されたＧＤＦ１５変異体は、例えば安定性の改善および血清半減期の延長を含む、ある望ましい性質を保有し得る。さらに、未変性ＧＤＦ１５と比較して、ＧＤＦ１５の修飾された形態、ＧＤＦ１５変異体、および修飾されたＧＤＦ１５変異体は、検出アッセイに使用するための特定の抗体の発生（例えば独特なエピトープの導入により）、タンパク質精製の容易性を提供する等を可能にする。
【００８２】
ポリペプチドに加えて、本開示は、ポリペプチドと同等の（またはそれより大きい）生物学的応答を誘発することができる他のＧＤＦ１５関連薬剤（すなわち、活性化剤）、および／またはポリペプチドの活性を強化することができる薬剤を想定する。
【００８３】
Ａ．ＧＤＦ１５変異タンパク質、修飾されたＧＤＦ１５、および修飾されたＧＤＦ１５変異タンパク質
本開示は、成熟ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基が別の残基で置換されるＧＤＦ１５変異タンパク質を想定する。特定の実施形態では、１つ以上のリジン残基（すなわち、残基６２、６９、９１、および１０７）は、任意の他のアミノ酸で置換される。Ｋ６２Ｑを含有するＧＤＦ１５変異タンパク質は不活性であり、負の対照タンパク質として挙動するが（例えばそれらは投与２週間後に体重を低下させない）、Ｋ６２を維持するが、Ｋ６９Ｑ、Ｋ９１Ｒ、および／またはＫ１０７Ｒの任意の組み合わせを組み込むＧＤＦ１５変異タンパク質は、体重を、野生型対照と同等のレベルに低下させるのに活性がある。他の実施形態では、１つ以上のＧＤＦ１５残基は別のアミノ酸（例えばＨ１８Ｑ、Ｔ１９Ｓ、またはＶ２０Ｌ）で置換される。ＧＤＦ１５変異タンパク質の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない（図２を参照）：
変異タンパク質ｖ１）Ｋ６９Ｑ、Ｋ９１Ｒ、Ｋ１０７Ｒ（配列番号５）；
変異タンパク質ｖ２）Ｋ６２Ｑ、Ｋ９１Ｒ、Ｋ１０７Ｒ（配列番号６）；
変異タンパク質ｖ３）Ｋ６２Ｑ、Ｋ６９Ｑ、Ｋ１０７Ｒ（配列番号７）；
変異タンパク質ｖ４）Ｋ６２Ｑ、Ｋ６９Ｑ、Ｋ９１Ｒ（配列番号８）；
変異タンパク質ｖ５）Ｋ９１Ｒ、Ｋ１０７Ｒ（配列番号９）；
変異タンパク質ｖ６）Ｋ６９Ｑ、Ｋ１０７Ｒ（配列番号１０）；
変異タンパク質ｖ７）Ｋ６９Ｑ、Ｋ９１Ｒ（配列番号１１）；
変異タンパク質ｖ８）Ｈ１８Ｑ、Ｔ１９Ｓ、Ｖ２０Ｌ、Ｋ６２Ｑ、Ｋ６９Ｑ、Ｋ９１Ｒ、Ｋ１０７Ｒ（配列番号１２）；
変異タンパク質ｖ９）Ｈ１８Ｑ、Ｔ１９Ｓ、Ｖ２０Ｌ、Ｋ６２Ｑ、Ｋ９１Ｒ、Ｋ１０７Ｒ（配列番号１３）；
変異タンパク質ｖ１０）Ｈ１８Ｑ、Ｔ１９Ｓ、Ｖ２０Ｌ、Ｋ６２Ｑ、Ｋ６９Ｑ、Ｋ１０７Ｒ（配列番号１４）；  及び
変異タンパク質ｖ１１）Ｈ１８Ｑ、Ｔ１９Ｓ、Ｖ２０Ｌ、Ｋ６２Ｑ、Ｋ６９Ｑ、Ｋ９１Ｒ（配列番号１５）。
【００８４】
特定のＧＤＦ１５変異タンパク質の体重および絶食時のグルコース血清レベルに対する作用がＧＤＦ１５と比較された。そのような比較の精度を確実にするために、マウスにおけるＧＤＦ１５の全身曝露レベルは、観察された表現型（例えば体重およびグルコースレベル）と、ＧＤＦ１５血清濃度の明確な関係を確立するために（例えば図４〜７を参照）、実験の項に記載される遺伝的方法（例えば図３を参照）から最初に決定された。ベンチマークとしてこれらの曝露レベルを用いて、マウスは、引き続き、遺伝的方法を介して観察されたものとほぼ等価の血清レベル濃度を達成した用量で、組換えＧＤＦ１５を投与された。図８に示されるように、組換えＧＤＦ１５への曝露は、図３で確立されたものと等価の範囲（ｎｇ／ｍＬ）内であり、したがって、これらのデータは、遺伝的および組換えＧＤＦ１５様式の両方の血清ＧＤＦ１５レベルと体重と血中グルコース表現型との間に同等性の相関を確立した。
【００８５】
その後、未変性成熟ヒトＧＤＦ１５および特定のＧＤＦ１５変異タンパク質の体重および絶食時のグルコース血清レベルに対する作用が評価された。特に、ＧＤＦ１５およびＧＤＦ１５変異タンパク質ｖ１〜ｖ７（図２を参照）のマウスにおける体重減少に対する作用は図６に記載され、ＧＤＦ１５およびＧＤＦ１５変異タンパク質ｖ１〜ｖ７のマウスにおける絶食時の血中グルコースの減少に対する作用は図７に記載される。実験の項に記載されるように、様々なＧＤＦ１５変異タンパク質は、ＧＤＦ１５で観察されたものと類似する作用を呈した。比較目的のため、組換えＧＤＦ１５の投与が食餌摂取量（図９を参照）、および体重（図１０を参照）を有意に減少させ、非絶食時の血中グルコース血清レベル（図１１を参照）の有意な減少をもたらすことが確立された。
【００８６】
上に示され、以下により詳細に記載されるように、１つ以上の性質を強化するために、未変性ＧＤＦ１５およびＧＤＦ１５変異タンパク質は、例えばペグ化（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１つ以上分子、またはその誘導体の共有結合）、グリコシル化（例えばＮ−グリコシル化）およびポリシアル酸化、アルブミン融合、例えば共役脂肪酸鎖（アシル化）を介したアルブミン結合、Ｆｃ融合、およびＰＥＧ模倣体との融合を通して修飾され得る。特定の実施形態では、修飾は、部位特異的様式で導入される。
【００８７】
本開示のいくつかの実施形態では、ヒトＧＤＦ１５またはＧＤＦ１５変異タンパク質は、Ｎ終端アラニン残基（すなわち、Ａ１）、および／または成熟ポリペプチド内の１つ以上のリジン残基（すなわち、残基６２、６９、９１、および１０７）での１つ以上のＰＥＧ分子の共有結合により修飾される。特定の実施形態では、戦略はペグ化が特定の残基でのみ生じるように採用される。例として、プロリン残基は、アラニンの遊離アミン基のペグ化を防止するために、位置１のアラニン残基のＮ末端に導入され得る（すなわちＮ終端アラニン）。そのような変異体では、残基はＮ終端プロリンであり、残基１１３はイソロイシンである。Ｎ終端プロリンを含有する未変性成熟ＧＤＦ１５およびＧＤＦ１５変異タンパク質は、以下を含むが、これらに限定されない（図２を参照）：
変異タンパク質ｖ１２）ＮＰｒｏ−ＧＤＦ１５  配列番号１６）；
変異タンパク質ｖ１３）ＮＰｒｏ、Ｋ７０Ｑ、Ｋ９２Ｒ、Ｋ１０８Ｒ（配列番号１７）；
変異タンパク質ｖ１４）ＮＰｒｏ、Ｋ６３Ｑ、Ｋ９２Ｒ、Ｋ１０８Ｒ（配列番号１８）；
変異タンパク質ｖ１５）ＮＰｒｏ、Ｋ６３Ｑ、Ｋ７０Ｑ、Ｋ１０８Ｒ（配列番号１９）；
変異タンパク質ｖ１６）ＮＰｒｏ、Ｋ６３Ｑ、Ｋ７０Ｑ、Ｋ９２Ｒ（配列番号２０）；
変異タンパク質ｖ１７）ＮＰｒｏ、Ｋ９２Ｒ、Ｋ１０８Ｒ（配列番号２１）；
変異タンパク質ｖ１８）ＮＰｒｏ、Ｋ７０Ｑ、Ｋ１０８Ｒ（配列番号２２）；
変異タンパク質ｖ１９）ＮＰｒｏ、Ｋ７０Ｑ、Ｋ９２Ｒ（配列番号２３）；
変異タンパク質ｖ２０）ＮＰｒｏ、Ｈ１９Ｑ、Ｔ２０Ｓ、Ｖ２１Ｌ、Ｋ６３Ｑ、Ｋ７０Ｑ、Ｋ９２Ｒ、Ｋ１０８Ｒ（配列番号２４）；
変異タンパク質ｖ２１）ＮＰｒｏ、Ｈ１９Ｑ、Ｔ２０Ｓ、Ｖ２１Ｌ、Ｋ６３Ｑ、Ｋ９２Ｒ、Ｋ１０８Ｒ（配列番号２５）；
変異タンパク質ｖ２２）ＮＰｒｏ、Ｈ１９Ｑ、Ｔ２０Ｓ、Ｖ２１Ｌ、Ｋ６３Ｑ、Ｋ７０Ｑ、Ｋ１０８Ｒ（配列番号２６）；および
変異タンパク質ｖ２３）ＮＰｒｏ、Ｈ１９Ｑ、Ｔ２０Ｓ、Ｖ２１Ｌ、Ｋ６３Ｑ、Ｋ７０Ｑ、Ｋ９２Ｒ（配列番号２７）。
【００８８】
さらに、実験の項に詳述されるように、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）特異的化学的性質は、部位特異的様式で本開示の組換えＧＤＦ１５変異タンパク質を修飾するように採用され得る。例えば、所望される場合、Ｎ末端アラニンのペグ化の防止は、保護基として機能するアセチル部分を導入するために、スルホ−ＮＨＳ−酢酸塩を用いて達成され得る。１つ以上の内部リジン残基のペグ化を防止するために、上述のものなどのリジン置換が導入され得、リジン６２が標準的な技法を用いてペグ化されないため、そのペグ化を防止するために、残基を突然変異させる必要がない。これらのＮＨＳ化学的性質を用いて、次の変異体は直線状の１０ｋＤａのＰＥＧ部分（実施例４を参照）の結合により修飾された：変異体１はＮ終端（ｖ１−ＰＥＧ１０）（配列番号５）でペグ化された；変異体５はリジン６９（ｖ５−ＰＥＧ１０）（配列番号９）でペグ化された；そして変異体６はリジン９１（ｖ６−ＰＥＧ１０）（配列番号１０）でペグ化された。
【００８９】
それらの天然に生じるおよび天然に生じないイソ型、対立遺伝子変異体、およびスプライス変異体を含む、ポリペプチドをコードする核酸分子は、本開示により想定される。前述のように、ポリペプチドは、保存されたドメインを維持し、天然に生じるポリペプチドと同じ生物学的活性を有する一方で、アミノ酸残基に１つ以上の変更（例えば変異体または種にわたって保存されない位置で）を有するポリペプチドも指す。本開示は、天然に生じるＤＮＡ配列と１つ以上の塩基において異なるが、遺伝的コードの縮重により、ポリペプチドに対応するアミノ酸配列に尚翻訳される核酸配列も包含する。例えば、ＧＤＦ１５は、１つ以上の保存置換、タグ、または抱合体により天然に生じる配列とは異なるアミノ酸配列（例えばポリペプチド）を指し得る。
【００９０】
よって、天然に生じるＧＤＦ１５ポリペプチドに加えて、本開示は、置換が通常保存的アミノ酸置換（例えばポリペプチド）である、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０を有する、または通常２０、１０、または５個のアミノ酸置換を超えないことを想定する。
【００９１】
「保存的アミノ酸置換」とは、一般的に、次の群：１）Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、２）Ｒ、Ｋ、３）Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｗ、Ｒ、４）Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｓ、５）Ｑ、Ｎ、および６）Ｄ、Ｅ内のアミノ酸残基の置換を指す。保存的アミノ酸置換は、タンパク質のアミノ酸（複数可）を、側鎖の類似する酸性度、塩基性度、電荷、極性、または大きさの側鎖を有するアミノ酸と置換することによりタンパク質の活性を保存する。置換、挿入、または欠失の誘導は、異なる変異体タンパク質または異なる種からのタンパク質のアミノ酸配列の整合に基づき得る。
【００９２】
本開示は、成熟ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５変異タンパク質に由来する連続するアミノ酸残基を含有するポリペプチドの活性断片（例えばサブ配列）も想定する。ペプチドまたはポリペプチドのサブ配列の連続するアミノ酸残基の長さは、サブ配列が由来する特定の天然に生じるアミノ酸配列により異なる。一般に、ペプチドおよびポリペプチドは、約５個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約４０個ｎアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸〜約７５個のアミノ酸、約７５個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、または約１００個のアミノ酸〜最大成熟ペプチドまたはポリペプチドの長さであり得る。
【００９３】
加えて、ポリペプチドは、連続するアミノ酸の定義された長さに対する参照配列と比較して（例えば「比較間窓」）、定義された配列同一性を有することができる。比較のための配列の整合方法は当該技術分野において周知である。比較のための最適な配列の整合は、例えばＳｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整合アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似法の検索、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実行、または手動整合、および視覚検査（例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照）によって行うことができる。
【００９４】
例として、好適なポリペプチドは、約５個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約１２個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約４５個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸〜約６０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸〜約７０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸〜約８０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、または約１００個のアミノ酸〜１１２個のアミノ酸、もしくは１１３個のアミノ酸の連続する伸長に対して、次の参照アミノ酸配列：ｖ１〜ｖ２３（図２を参照）のうちの１つの少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００９５】
ポリペプチドは天然源（例えばその天然に生じる環境以外の環境）から単離され得、遺伝的に修飾された宿主細胞がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で修飾される、組換えによっても（例えば細菌、酵母、ピキア、昆虫の細胞等の遺伝的に修飾された宿主細胞において）作製され得る。ポリペプチドは、合成によっても生成することができる（例えば細胞なしの化学合成により）。生成方法は以下により詳細に記載される。
【００９６】
ポリペプチドは、ポリペプチドをコードすることができる構築物を提供するために、当該技術分野において既知の異なるＧＤＦ１５関連核酸を操作するために、組換え技法を用いて生成され得る。特定のアミノ酸配列が提供されるとき、当業者は、例えば個人の分子生物学の背景および経験を考慮して、そのようなアミノ酸配列をコードする様々な異なる核酸分子を認識することを理解する。
【００９７】
Ｂ．調節因子
用語「調節因子」とは、ポリペプチドおよび活性化剤の両方を指す。上に示される、活性化剤は、例えば１つ以上のポリペプチドの機能または活性を刺激する、増加させる、活性化させる、促進する、活性化を強化する、感作する、または上方制御する薬剤である。加えて、活性化剤は、ポリペプチドと同じ作用機構を通して動作する薬剤（すなわち、ポリペプチドと類似する様式で、ポリペプチドと同じシグナル伝達経路を調節する薬剤）を含み、ポリペプチドと同等の（またはそれより大きい）生物学的応答を誘発することができる。活性化剤は、例えば小分子作動薬化合物、または他の生物有機分子であり得る。
【００９８】
いくつかの実施形態では、活性化剤は、小分子作動薬化合物である。小分子化合物の多くのライブラリ（例えばコンビナトリアルライブラリ）が市販されており、そのような活性化剤を識別するための開始点として作用することができる。当業者は、そのような化合物ライブラリが所望の性質を有する１つ以上の化合物を識別するためにスクリーニングされ得る、１つ以上のアッセイ（例えば生化学または細胞系アッセイ）を開発することができ、その後、熟練の医療化学者が、例えばその類似体および誘導体を合成および評価することにより、そのような１つ以上の化合物を最適化することができる。合成および／または分子のモデル化研究は、活性化剤の識別においても利用され得る。
【００９９】
またさらなる実施形態では、活性化剤は、ポリペプチドから構造的に識別できるが、同等の活性を有する作動薬のポリペプチドである。当業者は、所望の性質を有するそのようなポリペプチドを識別することができる。
【０１００】
アミド結合置換
いくつかの場合では、ポリペプチドは、ペプチド結合以外の１つ以上の連結を含み、例えば少なくとも２つの隣接するアミノ酸はアミド結合以外の連結を介して結合される。例えば、望ましくないタンパク質分解、または他の分解手段を減少させる、もしくは排除する、および／または血清の安定性を増加させる、ならびに／または構造的柔軟性を制限する、もしくは増加させるために、ポリペプチドの骨格内の１つ以上のアミド結合が置換され得る。
【０１０１】
別の例として、ポリペプチドにおける１つ以上のアミド連結（−ＣＯ−ＮＨ−）は、−ＣＨ２ＮＨ−、ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、または?ＣＨ２ＳＯ−などのアミド連結の同配体である連結で置換され得る。ポリペプチドにおける１つ以上のアミド連結は、例えば減少された同配体偽性ペプチド結合によっても置換され得る。Ｃｏｕｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４１：１８１−１８４を参照。そのような置換およびどのように作用するかは当業者に既知である。
【０１０２】
アミノ酸置換
１つ以上のアミノ酸置換はポリペプチドにおいて行うことができる。以下は非限定的な例である。
ａ）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、（Ｓ）−２−アミノ酪酸、（Ｓ）−シクロヘキシルアラニン、または分枝状、環状、および直鎖状のアルキル、アルケニル、またはアルキニル置換を含むＣ１−Ｃ１０炭素からの脂肪性側鎖により置換された他の単純なアルファ−アミノ酸を含む、アルキル置換された疎水性アミノ酸の置換；
ｂ）フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、スルホチロシン、ビフェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、２−ベンゾチエニルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジンを含む芳香族置換された疎水性アミノ酸の置換（アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化（フルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨード）、またはアルコキシ（Ｃ１−Ｃ４）置換された上述の芳香族アミノ酸の形態を含み、その例示的な例は、２−、３−、または４−アミノフェニルアラニン、２−、３−、または４−クロロフェニルアラニン、２−、３−、または４−メチルフェニルアラニン、２−、３−、または４−メトキシフェニルアラニン、５−アミノ−、５−クロロ−、５−メチル−、または５−メトキシトリプトファン、２’−、３’−、または４’−アミノ−、２’−、３’−、または４’−クロロ−、２、３、または４−ビフェニルアラニン、２’−、３’−、または４’−メチル−、２−、３−、または４−ビフェニルアラニン、および２−または３−ピリジルアラニンである）；
ｃ）置換基がヘテロ原子（アルファ窒素、または遠位窒素、または窒素など）上、または例えばプロＲ位置のアルファ炭素上にあるか否かに関わらず、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニンを含む誘導体を含む塩基性側鎖を含有するアミノ酸の置換（前のアミノ酸のアルキル、アルケニル、またはアリール置換された（Ｃ１−Ｃ１０分枝状、直線状、または環状））。例示する例として機能する化合物は、Ｎ−イプシロン−イソプロピル−リジン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−グリシン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−アラニン、Ｎ，Ｎ−ガンマ、ガンマ−ジエチル−ホモアルギニンを含む。アルキル基がアルファ−炭素のプロ−Ｒ位置を占める場合、アルファ−メチル−アルギニン、アルファ−メチル−２，３−ジアミノプロピオン酸、アルファ−メチル−ヒスチジン、アルファ−メチル−オルニチンなどの化合物も含まれる。アルキル、芳香族、ヘテロ芳香族（ヘテロ芳香族基が単独でまたは組み合わせで１つ以上の窒素、酸素、または硫黄の原子を有する場合）カルボン酸、または酸塩化物、活性エステル、活性アゾリド、および関連する誘導体などの多くの周知の活性化誘導体のいずれか、ならびにリジン、オルニチン、または２，３−ジアミノプロピオン酸から形成されるアミドも含む；
ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、チロシン、アルキル、アリール、アリールアルキル、および２，４−ジアミノプロピオン酸、オルニチン、またはリジンのヘテロアリールスルホンアミド、ならびにテトラゾール置換されたアルキルアミノ酸を含む酸性アミノ酸の置換；
ｅ）アスパラギン、グルタミン、およびアスパラギンもしくはグルタミンのアルキルまたは芳香族置換された誘導体を含む側鎖アミド残基の置換、ならびに
ｆ）セリン、スレオニン、ホモセリン、２，３−ジアミノプロピオン酸、およびセリンもしくはスレオニンのアルキルまたは芳香族置換された誘導体を含むアミノ酸を含有するヒドロキシの置換。
【０１０３】
いくつかの場合では、ポリペプチドは、アミノ酸の１つ以上の天然に生じる非遺伝的にコードされたＬ−アミノ酸、合成Ｌ−アミノ酸、またはＤ−エナンチオマーを含む。例えば、ポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸のみ含み得る。例えば、ポリペプチドは、次の残基：ヒドロキシプロリン、β−アラニン、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノメチル安息香酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、オルニチン、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン３−ベンゾチエニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、β−２−チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、Ｎ−アセチルリジン、２，４−ジアミノ酪酸、ｒｈｏ−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、ε−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘプタン酸、ω−アミノオクタン酸、ω−アミノデカン酸、ω−アミノテトラデカン酸、シクロヘキシルアラニン、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、δ−−アミノ吉草酸、および２，３、−ジアミノ酪酸のうちの１つ以上を含み得る。
【０１０４】
さらなる修飾
システイン残基またはシステイン類似体は、ジスルフィド連結を介して別のペプチドに連結を提供するために、またはポリペプチドの環化を提供するために、ポリペプチドに導入され得る。システインまたはシステイン類似体を導入する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第８，０６７，５３２号を参照。
【０１０５】
ポリペプチドは環化され得る。１つ以上のシステインまたはシステイン類似体は、導入されたシステインまたはシステイン類似体が第２の導入されたシステインまたはシステイン類似体とジスルフィド結合を形成することができる場合、ポリペプチドに導入することができる。環化の他の手段は、オキシムリンカーまたはランチオニンリンカーの導入を含む（例えば米国特許第８，０４４，１７５号を参照）。環化結合を形成することができるアミノ酸（または非アミノ酸部分）の任意の組み合わせが使用される、および／または導入され得る。環化結合は、アミノ酸と（またはアミノ酸および−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−または−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ６Ｈ４−ＣＯ−）架橋の導入を可能にする官能基の任意の組み合わせにより生成することができる。いくつかの例としては、−（ＣＨ２）ｎ−カルバ架橋、チオアセチル、チオエーテル架橋（シスタチオニンまたはランチオニン）、ならびにエステルおよびエーテルを含有する架橋などのジスルフィド模倣体である。これらの例では、ｎは任意の整数であり得るが、頻繁に１０未満である。
【０１０６】
他の修飾は、例えばＮ−アルキル（またはアリール）置換（ψ［ＣＯＮＲ］）、またはラクタムおよび他の環状構造を構築するための骨格架橋を含む。本開示の調節因子化合物の他の誘導体は、アルキルアミドおよびヒドラジドなどの置換されたアミドを含む、Ｃ末端ヒドロキシメチル誘導体、Ｏ修飾された誘導体（例えばＣ末端ヒドロキシメチルベンジルエーテル）、Ｎ末端により修飾された誘導体を含む。
【０１０７】
いくつかの場合では、ポリペプチドにおける１つ以上のＬ−アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸で置換される。
【０１０８】
いくつかの場合では、ポリペプチドは、レトロインベルソ類似体である。Ｓｅｌａ  ａｎｄ  Ｚｉｓｍａｎ（１９９７）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１１：４４９。レトロ−インベルソペプチド類似体は、アミノ酸配列の方向が逆転し（レトロ）、Ｌ−アミノ酸ではなくＤ−アミノ酸を用いて、１つ以上のアミノ酸の不斉、Ｄ−、またはＬ−が反転される直線状ポリペプチドの異性体である。例えばＪａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：７４４、およびＢｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：６９２を参照。
【０１０９】
ポリペプチドは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖、または脂質２重層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、もしくは小胞膜を横断するのを容易にする有機もしくは無機の化合物を指す「タンパク質形質導入ドメイン」（ＰＴＤ）を含み得る。別の分子に結合されたＰＴＤは、分子が膜を横断する、例えば細胞外の空間から細胞内の空間、または細胞質ゾルから細胞小器官内へ行くのを容易にする。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、ポリペプチドのアミノ終端に共有結合的に連結され、一方、他の実施形態では、ＰＴＤは、ポリペプチドのカルボキシル終端に共有結合的に連結される。例示的なタンパク質形質導入ドメインは、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２８）を含むＨＩＶ−１  ＴＡＴの残基４７〜５７に対応する）、細胞への直接侵入に十分ないくつかのアルギニン（例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０のアルギニン）を含むポリアルギニン配列、ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９−９６）、ショウジョウバエタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２（７）：１７３２−１７３７）切り詰め型ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１２４８−１２５６）、ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１３００３−１３００８）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号２９）、トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号３０）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号３１）、およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３２）を含むが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤは、これらに限定されないが、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２８）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３３）、３個のアルギニン残基〜５０個のアルギニン残基のアルギニンホモポリマーを含み、例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列は、これらに限定されないが、次の：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２８）、ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号３４）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号３５）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号３６）、およびＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号３７）のうちのいずれかを含む。
【０１１０】
ポリペプチドのＣ末端のアミノ酸のカルボキシル基ＣＯＲ３は、遊離形態（Ｒ３＝ＯＨ）、またはナトリウム、カリウム、もしくはカルシウム塩などの生理学的に耐容性を示すアルカリまたはアルカリ土類塩の形態で存在し得る。カルボキシル基はまた、例えばメタノール、分枝状もしくは非分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキルアルコール、例えばエチルアルコールもしくはｔｅｒｔ−ブタノールなどの１級、２級、または３級アルコールでエステル化もされ得る。カルボキシル基はまた、アンモニア、分枝状もしくは非分枝状Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミン、またはＣ１−Ｃ６ジ−アルキルアミン、例えばメチルアミンもしくはジメチルアミンなどの１級または２級アミンでアミド化もされ得る。
【０１１１】
ポリペプチドのＮ−終端のアミノ酸ＮＲ１Ｒ２のアミノ基は、遊離形態（Ｒ１＝ＨおよびＲ２＝Ｈ）、または例えば塩化物もしくは酢酸塩などの生理学的に耐容性を示す塩の形態で存在し得る。アミノ基はまた、Ｒ１＝ＨおよびＲ２＝アセチル、トリフルオロアセチル、またはアダマンチルであるように、酸とアセチル化もされ得る。アミノ基は、例えばＦｍｏｃ、ベンジルオキシ−カルボニル（Ｚ）、Ｂｏｃ、またはＡｌｌｏｃなどのペプチド化学に従来使用されるアミノ保護基によって保護された形態で存在し得る。Ｒ１および／もしくはＲ２＝Ｃ１−Ｃ６アルキル、またはＣ２−Ｃ８アルケニル、またはＣ７−Ｃ９アラルキルであるアミノ基は、Ｎ−アルキル化され得る。アルキル残基は、直鎖、分枝状、または環状（例えば、それぞれ、エチル、イソプロピル、およびシクロヘキシル）であり得る。
【０１１２】
ＧＤＦ１５機能を強化する、および／または模倣するための特定の修飾
ポリペプチドは、検出アッセイ（例えばエピトープタグ）に使用するための抗体の発生を可能にする、タンパク質精製の容易性を提供する等、治療（例えば血清半減期）用に製剤化されるタンパク質に望ましい性質を強化する１つ以上の修飾を含み得る。そのような修飾は、ペグ化（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１つ以上分子、またはその誘導体の共有結合）、Ｎ−グリコシル化およびポリシアル酸化、アルブミン融合、共役脂肪酸鎖（アシル化）を介したアルブミン結合、Ｆｃ融合タンパク質、ならびにＰＥＧ模倣体との融合を含むが、これらに限定されない。
【０１１３】
ペグ化：タンパク質治療薬の臨床的効果は、短い血漿半減期およびプロテアーゼ分解を受けやすいことにより制限されることが多い。様々な治療用タンパク質（例えばフィルグラスチム）の研究は、そのような困難が、様々な非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのいずれかにポリペプチド配列を共役する、または連結する（例えば、典型的には、タンパク質と非タンパク質性ポリマー、例えばＰＥＧの両方に共有結合する連結部分を介して）ことを含む、様々な修飾により克服され得ることを示した。そのようなＰＥＧ共役生体分子は、良好な物理的および熱的安定性、酵素分解への感受性に対する保護、可溶性の増加、より長いインビボ循環半減期、およびクリアランスの減少、免疫原性および抗原性の減少、ならびに毒性の減少を含む、臨床的に有用な性質を保有することを示した。
【０１１４】
ポリペプチド配列への共役に好適なＰＥＧは一般的に室温で水溶性であり、一般式Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒを有し、式中、Ｒは、水素、またはアルキル基もしくはアルカノール基などの保護基であり、ｎは、１〜１０００の整数である。Ｒが保護基である場合、それは一般的に１〜８個の炭素を有する。ポリペプチド配列に共役されたＰＥＧは直線状または分枝状であり得る。分枝状ＰＥＧ誘導体、「ｓｔａｒ−ＰＥＧ」、および多腕ＰＥＧは、本開示に想定される。本開示に使用されるＰＥＧの分子量は、任意の特定の範囲に制限されないが、ある実施形態は、５００〜２０，０００の分子量を有し、一方、他の実施形態は、４，０００〜１０，０００の分子量を有する。
【０１１５】
本開示は、抱合体の組成物も想定し、ＰＥＧは異なるｎ値を有し、よって、様々な異なるＰＥＧは特定の割合で存在する。例えば、いくつかの組成物は、ｎ＝１、２、３、または４の抱合体の混合物を含む。いくつかの組成物では、ｎ＝１の抱合体のパーセンテージは１８〜２５％であり、ｎ＝２の抱合体のパーセンテージは５０〜６６％であり、ｎ＝３の抱合体のパーセンテージは１２〜１６％であり、ｎ＝４の抱合体のパーセンテージは最大５％である。そのような組成物は、当該技術分野に公知の反応条件および精製方法により生成され得る。例えば、カチオン交換クロマトグラフィーは、抱合体を分離するために使用され得、次に、例えば所望の数のＰＥＧが結合され、非修飾タンパク質配列、および他の数のＰＥＧが結合される抱合体を含まない精製された抱合体を含有する画分が識別される。
【０１１６】
ＰＥＧは、末端反応基（「スペーサー」）を介して本開示のポリペプチドに結合され得る。スペーサーは、例えばポリペプチド配列およびポリエチレングリコールのうちの１つ以上の遊離アミノ基またはカルボキシル基間の結合を媒介する末端反応基である。遊離アミノ基に結合し得るスペーサーを有するＰＥＧは、ポリエチレングリコールのコハク酸エステルをＮ−ヒドロキシスクシニルイミドで活性化させることにより調製され得るＮ−ヒドロキシスクシニルイミドポリエチレングリコールを含む。遊離アミノ基に結合され得る別の活性化されたポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルを塩化シアヌルと反応させることにより調製され得る２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−クロロ−ｓ−トリアジンである。遊離カルボキシル基に結合される活性化されたポリエチレングリコールは、ポリオキシエチレンジアミンを含む。
【０１１７】
本開示のポリペプチド配列のうちの１つ以上のスペーサーを有するＰＥＧへの共役は、様々な従来の方法により実行され得る。例えば共役反応は、５〜１０のｐＨ、４℃〜室温の温度で、３０分〜２０時間の間、４：１〜３０：１の試薬に対するタンパク質のモル比を利用して、溶液中で実行され得る。反応条件は、主に所望の程度の置換の生成に向かって反応を方向付けるように選択され得る。一般に、低温、低ｐＨ（例えばｐＨ＝５）、および短い反応時間は、結合されるＰＥＧの数を減少させる傾向があり、一方、高温、中性〜高ｐＨ（例えばｐＨ≧７）、および長い反応時間は、結合されるＰＥＧの数を増加させる傾向がある。反応を停止させるために、当該技術分野に既知の様々な方法が使用され得る。いくつかの実施形態では、反応は、反応混合物を酸性化し、例えば−２０℃で凍結することにより停止する。
【０１１８】
本開示はＰＥＧ模倣体の使用も想定する。いくつかの追加の有利な性質を付与する一方で、ＰＥＧの特質（例えば強化された血清半減期）を維持する組換えＰＥＧ模倣体が開発された。例として、既に関心のペプチドまたはタンパク質薬物（例えばＡｍｕｎｉｘ’ＸＴＥＮ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）に融合された、ＰＥＧに類似する伸長した立体構造を形成することができる単純なポリペプチド鎖（例えばＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒを含む）は、組換えにより生成され得る。これは、製造過程中にさらなる共役ステップの必要性を取り除く。さらに、確立された分子生物学技法は、ポリペプチド鎖の側鎖組成物の制御を可能にし、免疫原性および製造性質の最適化を可能にする。
【０１１９】
グリコシル化およびポリシアル酸化：本開示の目的のため、「グリコシル化」は、グリカンを、タンパク質、脂質、または他の有機分子に結合する酵素過程を広く指すことを意味する。本開示と関連した用語「グリコシル化」の使用は、一般的に、１つ以の糖部分を付加する、または欠失させる（根底にあるグリコシル化部位を除去することにより、または化学および／もしくは酵素手段によりグリコシル化を欠失させることによるいずれか）、ならびに／または未変性配列に存在しても、しなくてもよい１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味することが意図される。加えて、この句は、存在する様々な糖部分の性質および比率の変化を伴う未変性タンパク質のグリコシル化の質的変化を含む。
【０１２０】
グリコシル化は、タンパク質の物理的性質に劇的に影響する可能性があり、タンパク質の安定性、分泌、および細胞内局在化にも重要であり得る。適切なグリコシル化は、生物学的活性に必須であり得る。実際、真核生物からのいくつかの遺伝子は、グリコシル化タンパク質の細胞過程を欠く細菌（例えば大腸菌）において発現されるとき、それらのグリコシル化の欠失の理由により、ほとんど、または全く活性がなく回収されるタンパク質をもたらす。
【０１２１】
グリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変更することにより達成され得る。ポリペプチドの変更は、例えば１つ以上のセリンもしくはスレオニン残基（Ｏ−連結グリコシル化部位に関して）、またはアスパラギン残基（Ｎ−連結グリコシル化部位に関して）の付加、またはそれによる置換により行うことができる。各種類に見られるＮ−連結およびＯ−連結オリゴ糖および糖残基の構造は、異なってもよい。両方に一般的に見られる糖の種類の１つは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（以後シアル酸と称す）である。シアル酸は、通常、Ｎ−連結およびＯ−連結オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負の電荷により、糖タンパク質に酸性の性質を付与することができる。本開示の特定の実施形態は、Ｎ−グリコシル化変異体の生成および使用を含む。
【０１２２】
本開示のポリペプチド配列は、ＤＮＡレベルでの変化を通して、特に所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように予め選択された塩基でポリペプチドをコードするＤＮＡを突然変異させることにより、任意に変更することができる。ポリペプチド上の糖部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学または酵素結合による。糖の除去は、化学的に、もしくは酵素的に、またはグリコシル化されるアミノ酸残基をコードするコドンの置換により達成され得る。化学的脱グリコシル化技法は公知であり、ポリペプチド上の糖部分の酵素切断は、様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成され得る。
【０１２３】
ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、組換え糖タンパク質の生成のために、一般的に使用される宿主細胞である。これらの細胞は、酵素ベータ−グリコシドアルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼを発現せず、したがってアルファ−２，６連結におけるシアル酸を、これらの細胞で生成された糖タンパク質のＮ−連結オリゴ糖に付加しない。
【０１２４】
本開示は、ポリシアル酸化の使用、それらの安定性およびインビボ薬物動態を改善するために、ペプチドおよびタンパク質の、天然に生じる生分解性α−（２→８）連結ポリシアル酸（「ＰＳＡ」）への共役も想定する。ＰＳＡは、高度に親水性である生分解性、非毒性の天然のポリマーであり、それに、血中においてその血清半減期を増加させる高い見かけ分子量を付与する。加えて、ペプチドおよびタンパク質の治療薬の範囲のポリシアル酸化は、著しく減少したタンパク質分解、インビボ活性の維持、ならびに免疫原性および抗原性の減少をもたらした（例えばＧ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ３００（１−２）：１２５−３０を参照）。他の抱合体（例えばＰＥＧ）による修飾と同様に、部位特異的ポリシアル酸化の様々な技法が利用可能である（例えばＴ．Ｌｉｎｄｈｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０８（１８）７３９７−７４０２（２０１１）を参照）。
【０１２５】
アルブミン融合および他の分子との共役：共役に関するさらなる好適な成分および分子は、例えばサイログロブリン、アルブミン（ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）など）、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ポリアミノ酸（ポリ（Ｄ−リジン：Ｄ−グルタミン酸）、ロタウイルスのＶＰ６ポリペプチド、インフルエンザウイルスヘマグルチニン、インフルエンザウイルス核タンパク質、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、ならびにＢ型肝炎コアタンパク質および表面抗原、または前述の任意の組み合わせを含む。
【０１２６】
アルブミンの本開示の１つ以上のポリペプチドへの融合は、例えばＨＳＡをコードするＤＮＡまたはその断片が１つ以上のポリペプチド配列をコードするＤＮＡに結合させるような遺伝的操作により達成され得る。その後、好適な宿主は、融合ポリペプチドを発現するように、例えば好適なプラスミドの形態で、融合されたヌクレオチド配列で形質転換されるか、またはそれを遺伝子導入され得る。発現は、例えば原核細胞もしくは真核細胞からインビトロ、または例えば遺伝子導入生物からインビボでもたらされ得る。本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質の発現は、哺乳類の細胞系、例えばＣＨＯ細胞系において実施される。形質転換は、本明細書において、その外界から、および細胞膜（複数可）を通して取り込まれる外因性の遺伝的物質（外因性ＤＮＡ）の直接的な取り込み、組み込み、および発現によって生じる細胞の遺伝的変更を指すように広く使用される。形質転換は、いくつかの細菌種において天然に生じるが、他の細胞において人工的な手段によってももたらされ得る。
【０１２７】
さらに、アルブミン自体は、その循環半減期を延長するように修飾され得る。修飾されたアルブミンの１つ以上のポリペプチドへの融合は、上述の遺伝的操作法により、または化学的共役により達成され得、得られた融合分子は、未修飾アルブミンとの融合物の半減期を超える半減期を有する。［国際公開第ＷＯ２０１１／０５１４８９号を参照］。
【０１２８】
いくつかのアルブミン結合戦略が、共役脂肪酸鎖（アシル化）を介したアルブミン結合を含む、直接融合の代替物として開発された。血清アルブミンは脂肪酸の輸送タンパク質であるため、アルブミン結合活性を有するこれらの天然リガンドは、小タンパク質治療薬の半減期の延長に使用されてきた。例えば、承認された糖尿病の製品であるインスリンデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ）は、遺伝的に修飾されたインスリンに共役されたミリスチル鎖を含み、長期作用インスリン類似体をもたらす。
【０１２９】
別の種類の修飾は、別のタンパク質（例えば対象タンパク質に異種であるアミノ酸配列を有するタンパク質）などのポリペプチド配列のＮおよび／もしくはＣ終端で１つ以上のさらなる成分もしくは分子、またはキャリア分子を共役する（例えば連結する）ことである。よって、例示的なポリペプチド配列は、別の成分または分子との抱合体として提供され得る。
【０１３０】
共役修飾は、第２の分子のさらなるもしくは相補的な機能または活性を伴う活性を維持するポリペプチド配列をもたらすことができる。例えばポリペプチド配列は、例えば可溶性、貯蔵、インビボもしくは貯蔵半減期または安定性、免疫原性の減少、インビボでの遅延もしくは制御放出等を容易にするために、分子に共役され得る。他の機能または活性は、非共役ポリペプチド配列に対して毒性を減少させる抱合体、非共役ポリペプチド配列より効率的に細胞もしくは臓器の種類を標的とする抱合体、または本明細書に記載される障害もしくは疾患（例えば糖尿病）に関連する原因または作用にさらに対抗する薬物を含む。
【０１３１】
ポリペプチドは、タンパク質；セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなどのポリサッカライド；ポリグルタミン酸、ポリリジンなどのポリマー性アミノ酸；アミノ酸コポリマー；不活性化されたウイルス粒子；ジフテリア、破傷風、コレラ、ロイコトキシン分子からのトキソイドなどの不活性化された細菌性毒素；不活性化された細菌；および樹状細胞などの大きく、ゆっくり代謝される巨大分子にも共役され得る。そのような共役された形態は、所望される場合、本開示のポリペプチドに対して抗体を生成するように使用され得る。
【０１３２】
共役のためのさらなる候補成分および分子は、単離または精製に適したものを含む。特定の非限定的な例としては、ビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対）、抗体、受容体、リガンド、レクチン、または固体支持体（例えばプラスチックもしくはポリスチレンのビーズ、プレートもしくはビーズ、磁気ビーズ、試験片、および膜を含む）を含む分子などの結合分子が挙げられる。
【０１３３】
カチオン交換クロマトグラフィーなどの精製方法は、抱合体をそれらの様々な分子量に効率的に分離する電荷の差によって抱合体を分離するために使用され得る。例えば、カチオン交換カラムは、充填され、次に約２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ約４で洗浄され、次に約３〜５．５のｐＨ、例えばｐＨ約４．５で緩衝された（０Ｍ〜０．５Ｍ）ＮａＣｌの直線的な濃度勾配で溶出され得る。カチオン交換クロマトグラフィーによって得られた画分の内容物は、例えば質量分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの従来の方法、または分子量により分子実体を分離するための他の公知の方法を用いて、分子量により識別され得る。
【０１３４】
Ｆｃ融合分子：ある実施形態では、本開示のポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシル終端は、融合抱合体（または融合分子）を形成するために、免疫グロブリンＦｃ領域（例えばヒトＦｃ）と融合され得る。Ｆｃ融合抱合体は、生物製剤の全身半減期を増加することが示され、よって、生物製剤製品は、頻繁な投与をあまり必要としない可能性がある。
【０１３５】
Ｆｃは、血管を覆う内皮細胞の新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合し、結合によりＦＣ融合分子は分解から保護され、循環内に再放出され、分子をより長く循環内に保つ。このＦｃ結合は、内因性ＩｇＧがその長い血漿半減期を維持する機構であると考えられる。より最近のＦｃ融合技術は、従来のＦｃ融合抱合体と比較して、生物薬剤の薬物動態および薬力学の性質を最適化するために、生物薬剤の単一コピーを抗体のＦｃ領域に連結する。
【０１３６】
他の修飾：本開示は、現在知られている、または将来開発される、１つ以上の性質を改善するためのポリペプチドの他の修飾の使用を想定する。循環半減期を延長する、安定性を増加させる、クリアランスを減少させる、または本開示のポリペプチドの免疫原性もしくは抗原性を変更するためのそのような方法の１つは、分子の特性を修飾するために、他の分子に連結されるヒドロキシエチルデンプン誘導体を利用するＨＥＳ化によるポリペプチド配列の修飾を伴う。ＨＥＳ化の様々な態様は、例えば米国特許出願第２００７／０１３４１９７号および第２００６／０２５８６０７号に記載されている。
【０１３７】
本開示のポリペプチド配列を修飾するために使用される前述の成分および分子のいずれも、リンカーを介して任意に共役され得る。好適なリンカーは、一般的に、修飾されたポリペプチド配列と連結された成分および分子との間のある程度の移動を可能にするのに十分な長さのものである「柔軟なリンカー」を含む。リンカー分子は一般的に、約６〜５０個の原子の長さである。リンカー分子はまた、例えばアリールアセチレン、２〜１０の単量体単位を含有するエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二塩基酸、アミノ酸、またはそれらの組み合わせであってもよい。好適なリンカーは容易に選択することができ、１（例えばＧｌｙ）、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０個のアミノ酸（例えばＧｌｙ）などの任意の好適な長さのものであってよい。
【０１３８】
例示的な柔軟なリンカーは、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば（ＧＳ）ｎ、ＧＳＧＧＳｎ（配列番号４０）、およびＧＧＧＳｎ（４１）、ここでｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、および他の柔軟なリンカーを含む。グリシンおよびグリシン−セリンポリマーは、比較的構造不定であり、したがって、成分間の中性テザーとして機能することができる。例示的な柔軟なリンカーは、ＧＧＳＧ（配列番号４２）、ＧＧＳＧＧ  （配列番号４３）、ＧＳＧＳＧ（配列番号４４）、ＧＳＧＧＧ（配列番号４５）、ＧＧＧＳＧ（配列番号４６）、およびＧＳＳＳＧ（配列番号４７）を含むが、これらに限定されない。
【０１３９】
ポリペプチドの生成方法
本開示のポリペプチドは、組換えおよび非組換え方法（例えば化学合成）を含む任意の好適な方法により生成され得る。
【０１４０】
Ａ．化学合成
ポリペプチドが化学的に合成される場合、液相または固相を介して合成を続行することができる。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、天然ではないアミノ酸および／またはペプチド／タンパク質骨格の修飾の組み込みを可能にする。ＦｍｏｃおよびＢｏｃなどのＳＰＰＳの様々な形態は、本開示のポリペプチドの合成に利用可能である。化学合成の詳細は当該技術分野において公知である（例えばＧａｎｅｓａｎ  Ａ．２００６Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：３−１０、およびＣａｍａｒｅｒｏ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００５  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８）。
【０１４１】
固相ペプチド合成は、以下に記載されるように実施され得る。α官能基（Ｎα）および任意の反応性側鎖は、酸不安定性基または塩基不安定性基で保護される。保護基は、連結アミド結合の条件下で安定しているが、形成されたペプチド鎖を損なうことなく容易に切断され得る。α−アミノ官能基に好適な保護基は、次を含むがこれらに限定されない：ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル、ビ−フェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｍｏｃ）、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシ−ベンジルオキシカルボニル、ｏ−ニトロスルフェニル、２−シアノ−ｔ−ブトキシ−カルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘクス−１−イルイデン）エチル（Ｄｄｅ）等。
【０１４２】
好適な側鎖保護基は、アセチル、アリル（Ａｌｌ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、  ｔ−ブチルジメチルシリル、２−クロロベンジル、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−ＣＩＺ）、２，６−ジクロロベンジル、シクロヘキシル、シクロペンチル、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘクス−１−イルイデン）エチル（Ｄｄｅ）、イソプロピル、４−メトキシ−２，３−６−トリメチルベンジルスルホニル（Ｍｔｒ）、２，３，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、ピバリル、テトラヒドロピラン−２−イル、トシル（Ｔｏｓ）、２，４，６−トリメトキシベンジル、トリメチルシリル、およびトリチル（Ｔｒｔ）を含むが、これらに限定されない。
【０１４３】
固相合成では、Ｃ末端アミノ酸は好適な支持体材料に結合される。好適な支持体材料は、試薬ならびに段階的凝縮の反応条件および合成過程の切断反応に対して不活性であるもの、ならびに使用される反応培地に溶解しないものである。市販の支持体材料の例としては、反応基および／もしくはポリエチレングリコールで修飾されたスチレン／ジビニルベンゼンコポリマー、クロロメチル化スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー、ヒドロキシメチル化もしくはアミノメチル化スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー等が挙げられる。ペプチド酸を調製することが意図される場合、ポリスチレン（１％）−ジビニルベンゼン、または４−ベンジルオキシベンジル−アルコール（Ｗａｎｇ−アンカー）で誘導体化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）、または２−塩化クロロトリチルが使用され得る。ペプチドアミドの場合、ポリスチレン（１％）ジビニルベンゼン、または５−（４’−アミノメチル）−３’，５’−ジメトキシフェノキシ）吉草酸（ＰＡＬ−ａｎｃｈｏｒ）もしくはｐ−（２，４−ジメトキシフェニル−アミノメチル）−フェノキシ基（Ｒｉｎｋアミドアンカー）で誘導体化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）が使用され得る。
【０１４４】
ポリマー支持体への連結は、室温または高温（例えば４０℃〜６０℃）、および例えば２〜７２時間の反応時間で、エタノール、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチルピロリドン、または類似する溶媒中の活性化試薬の添加により、Ｃ末端Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸を支持体材料と反応させることにより達成され得る。
【０１４５】
Ｎα保護されたアミノ酸（例えばＦｍｏｃアミノ酸）のＰＡＬ、ＷａｎｇもしくはＲｉｎｋアンカーへの結合は、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールもしくは１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールの存在下または同様に不在下で、例えばＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）もしくは他のカルボジイミド、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩（ＴＢＴＵ）もしくは他のウロニウム塩、ｏ−アシル−尿素、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＰｙＢＯＰ）もしくは他のホスホニウム塩、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、他のＮ−ヒドロキシイミド、もしくはオキシムなどの結合試薬の補助により、例えばＨＯＢｔの添加によるＴＢＴＵの補助により、例えばジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリエチルアミン、もしくはＮ−メチルモルホリンなどの塩基、例えばジイソプロピルエチルアミンを添加して、または添加することなく、２〜７２時間の反応時間で（例えば１．５〜３倍過剰のアミノ酸および結合試薬で３時間、例えば２倍過剰で、約１０℃〜５０℃の温度、例えば、２５℃で、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、またはジクロロメタンなどの溶媒中、例えばジメチルホルムアミド中で）実行され得る。
【０１４６】
結合試薬の代わりに、上述の条件下で、活性エステル（例えばペンタフルオロフェニル、ｐ−ニトロフェニル等）Ｎα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸の対称無水物、その酸塩化物、または酸フッ化物を使用することも可能である。
【０１４７】
Ｎα−保護されたアミノ酸（例えばＦｍｏｃアミノ酸は、１０〜１２０分、例えば２０分の反応時間で、ＤＩＥＡの添加により、ジクロロメタン中の２−クロロトリチル樹脂に結合され得るが、この溶媒およびこの塩基の使用に限定されない。
【０１４８】
保護されたアミノ酸の連続結合は、ペプチド合成の従来の方法に従い、典型的には自動ペプチド合成機において実行され得る。例えばジメチルホルムアミド中のピペリジン（１０％〜５０％）で５〜２０分、例えばＤＭＦ中５０％のピペリジンで２×２分、およびＤＭＦ中２０％のぺリジンで１×１５分で処理することによる、固相上に結合されたアミノ酸のＮα−Ｆｍｏｃ保護基の切断後、３〜１０倍過剰、例えば１０倍過剰の次の保護されたアミノ酸が、約１０℃〜５０℃、例えば２５℃の温度で、ジクロロメタン、ＤＭＦ、またはその２つの混合物などの不活性で非水性の極性溶媒中で前のアミノ酸に結合される。第１のＮα−Ｆｍｏｃアミノ酸をＰＡＬ、Ｗａｎｇ、またはＲｉｎｋアンカーへ結合するための前述の試薬は、結合試薬として適している。保護されたアミノ酸の活性エステル、または塩化物、もしくはフッ化物、またはそれらの対称無水物も代替物として使用することができる。
【０１４９】
固相合成の終わりに、ペプチドは支持体材料から切断され、同時に側鎖保護基を切断する。切断は、５％〜２０％Ｖ／Ｖのジメチルスルフィド、エチルメチルスルフィド、チオアニソール、チオクレゾール、ｍ−クレゾール、アニソールエタンジチオール、フェノール、または水などのスカベンジャーの添加により、例えば１５％ｖ／ｖのジメチルスルフィド／エタンジチオール／ｍ−クレゾール１：１：１の添加により、０．５〜３時間以内、例えば２時間、トリフルオロ酢酸または他の強酸培地を用いて実行され得る。完全に保護された側鎖を有するペプチドは、２−クロロトリチルアルコールを氷酢酸／トリフルオロエタノール／ジクロロメタン２：２：６で切断することによって得られる。保護されたペプチドはシリカゲルによるクロマトグラフィーにより精製され得る。ペプチドがＷａｎｇアンカーを介して固相に連結される場合、およびそれがＣ末端アルキルアミド化によって得ることが意図される場合、切断はアルキルアミンまたはフルオロアルキルアミンを用いたアミノリシスによって実行され得る。アミノリシスは、約−１０℃〜５０℃（例えば約２５℃）の温度、および約１２〜２４時間の反応時間で実行される。加えて、ペプチドは、例えばメタノールを用いた再エステル化により支持体から切断され得る。
【０１５０】
得られる酸性溶液は、ペプチドを沈殿させ、したがってエーテルに残っているスカベンジャーおよび切断された保護基を分離するために、３〜２０倍量の氷エーテルまたはｎ−ヘキサン、例えば１０倍過剰のジエチルエーテルと混合され得る。さらなる精製は、氷酢酸から数回ペプチドを再沈殿させることにより実行され得る。得られる沈殿物は、水もしくはｔｅｒｔ−ブタノールまたはその２つの溶媒の混合物、例えばｔｅｒｔ−ブタノール／水の１：１の混合物に吸収され、凍結乾燥され得る。
【０１５１】
得られたペプチドは、酢酸塩形態の弱塩基性樹脂に対するイオン交換、非誘導体化されたポリスチレン／ジビニルベンゼンコポリマー（例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ）による疎水吸着クロマトグラフィー、シリカゲルによる吸着クロマトグラフィー、例えばカルボキシメチルセルロースによるイオン交換クロマトグラフィー、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５による分配クロマトグラフィー、交流分配クロマトグラフィー、または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、例えばオクタデシルシリルシリカ（ＯＤＳ）相による逆相ＨＰＬＣを含む、様々なクロマトグラフ法により精製され得る。
【０１５２】
Ｂ．組換え生産
ポリペプチドが組換え技法を用いて生成される場合、ポリペプチドは、任意の好適な構築物、および細菌（例えば大腸菌）または酵母宿主細胞などの、それぞれ、原核細胞または真核細胞であり得る任意の好適な宿主細胞を用いて、細胞内タンパク質として、または分泌タンパク質として生成され得る。宿主細胞として使用することができる真核細胞の他の例としては、昆虫細胞、哺乳類細胞、および／または植物細胞が挙げられる。哺乳類宿主細胞が使用される場合、それらは、ヒト細胞（例えばＨｅＬａ、２９３、Ｈ９、およびＪｕｒｋａｔ細胞）、マウス細胞（例えばＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ細胞、および  Ｃ１２７細胞）、霊長類細胞（例えばＣｏｓ１、Ｃｏｓ７、およびＣＶ１）、およびハムスター細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）を含み得る。
【０１５３】
ポリペプチドの発現に好適な様々な宿主−ベクター系が当該技術分野に公知の標準的な手順に従い採用され得る。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓを参照。遺伝子材料を宿主細胞に導入するための方法は、例えば形質転換、電気穿孔、共役、リン酸カルシウム法等を含む。移動のための方法は、導入されたポリペプチドをコードする核酸の安定した発現を提供するように選択され得る。ポリペプチドをコードする核酸は、遺伝性のエピソーム要素（例えばプラスミド）として提供されるか、またはゲノムにより統合され得る。関心のポリペプチドの生成に使用するための様々な適切なベクターは商業的に入手可能である。
【０１５４】
ベクターは、宿主細胞における染色体外維持を提供するか、または宿主細胞のゲノムへの統合を提供することができる。発現ベクターは転写および翻訳の制御配列を提供し、コード領域が転写開始領域ならびに転写および翻訳の停止領域の転写制御下で作動可能に連結される場合、誘発性または構成的発現を提供することができる。一般に、転写および翻訳の制御配列は、プロモータ配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、およびエンハンサーまたはアクチベータ配列を含み得るが、これらに限定されない。プロモータは、構成的または誘発性のいずれかであり得、強い構成的プロモータ（例えばＴ７）であり得る。
【０１５５】
発現構築物は一般的に、関心のタンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するために、プロモータ配列付近に位置する簡便な制限部位を有する。発現宿主において作動的な選択可能なマーカーは、ベクターを含有する細胞の選択を容易にするために存在し得る。さらに、発現構築物はさらなる要素を含み得る。例えば発現ベクターは、１つまたは２つの複製系を有し得、よって、発現のために生物、例えば哺乳類または昆虫の細胞において、ならびにクローン化および増幅のために原核宿主においてそれを維持することが可能である。加えて、発現構築物は、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含有し得る。選択可能な遺伝子は当該技術分野において公知であり、使用される宿主細胞により変動する。
【０１５６】
タンパク質の単離および精製は、当該技術分野において公知の方法に従い達成され得る。例えば、タンパク質は、タンパク質を構成的におよび／または誘発時に発現するように遺伝的に修飾された細胞の可溶化液から、またはサンプルを抗タンパク質抗体と接触させ、非特異的に結合した材料を除去するために洗浄し、特異的に結合したタンパク質を溶出することを一般的に伴う免疫親和性精製による合成反応混合物から単離され得る。単離されたタンパク質は、透析およびタンパク質精製方法に通常採用される他の方法によりさらに精製され得る。一実施形態では、タンパク質は、金属キレートクロマトグラフィー方法を用いて単離され得る。タンパク質は、単離を容易にするために修飾を含有し得る。
【０１５７】
ポリペプチドは、実質的に純粋な形態または単離された形態（例えば他のポリペプチドを含まない）で調製され得る。ポリペプチドは、存在し得る他の成分に対して（例えば他のポリペプチドまたは他の宿主細胞成分）、ポリペプチドに関して濃縮される組成物中に存在し得る。例えば精製されたポリペプチドは、ポリペプチドが、他の発現タンパク質を実質的に含まない組成物中に存在するように提供され得、例えば、組成物の９０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満が他の発現タンパク質で構成されている。
【０１５８】
抗体
本開示は、ＧＤＦ１５ポリペプチド、例えば本開示のＧＤＦ１５変異タンパク質に特異的に結合する単離された抗体を含む抗体を提供する。用語「抗体」は、無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成される多選択性抗体（例えば２重特異的抗体）、ならびにＦａｂおよびＦ（ａｂ）’２を含む抗体結合断片を包含するが、但し、それらが所望の生物学活性を呈することを条件とする。基本的な全抗体構造単位は３量体を含み、各３量体は２つの同一の一対のポリペプチド鎖から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と、１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。対照的に、各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を画定する。ヒトの軽鎖はカッパおよびラムダとして分類され、一方、ヒトの重鎖はミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のイソ型を定義する。結合断片は、組換えＤＮＡ技法により、または無傷抗体の酵素もしくは化学切断により生成される。結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および単鎖抗体を含む。
【０１５９】
各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後にいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、そのもう一方の端に定常ドメインを有し、この軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。軽鎖および重鎖内の可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合され、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。抗体の鎖はすべて、同じ一般構造である、「相補決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域により結合された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を呈する。各対の２つの鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域により整列され、特定のエピトープに結合することができる。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。
【０１６０】
無傷抗体（intact antibody）は２つの結合部位を有し、２官能性または２重特異性抗体を除き、２つの結合部位は同一である。２重特異性または２官能性抗体は、２つの異なる重／軽鎖対、および２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。２重特異的抗体は、ハイブリドーマの融合、またはＦａｂ’断片の連結を含む様々な方法により生成され得る。
【０１６１】
上述のように、結合断片は、無傷抗体の酵素または化学切断により生成され得る。抗体の酵素パパインによる消化は、「Ｆａｂ」断面、および抗原結合活性を有さない「Ｆｃ」断片としても知られる、２つの同一の抗原結合断片をもたらす。抗体の酵素ペプシンによる消化は、抗体分子の２つの腕が連結されたままであり、２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２  断片をもたらす。Ｆ（ａｂ’）２断片は抗原を架橋する能力を有する。
【０１６２】
本明細書で使用される、用語「Ｆａｂ」とは、軽鎖の定常ドメインと、重鎖のＣＨ１ドメインとを含む抗体の断片を指す。
【０１６３】
本明細書で使用されるとき、用語「Ｆｖ」とは、抗原認識および抗原結合部位の両方を維持する抗体の最小断片を指す。２本鎖Ｆｖ種において、この領域は非共有結合会合において１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの２量体を含む。単鎖Ｆｖ種において、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖および重鎖が２本鎖Ｆｖ種に類似する「２量体」構造において会合することができるように、柔軟なペプチドリンカーにより共有結合的に連結され得る。各可変ドメインの３つのＣＤＲがＶＨ−ＶＬ２量体の表面上の抗原結合部位を画定するように相互作用するのはこの構成である。集合的に６つのＣＤＲは抗体に対して抗原結合特異性を付与するが、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的である３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合抗原を認識する能力を有する。
【０１６４】
本明細書で使用されるとき、用語「相補決定領域」または「ＣＤＲ」とは、特定のリガンドに接触し、その特異性を決定する免疫受容体の一部を指す。
【０１６５】
用語「超可変領域」とは、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般的に、ＣＤＲからのアミノ酸残基、および／または「超可変ループ」からのそれらの残基を含む。
【０１６６】
本明細書で使用される、用語「エピトープ」とは、タンパク質抗原上の抗体の結合部位を指す。エピトープ決定因子は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面分類、ならびに特定の３次元構造特性および特定の電荷特性を含む。抗体は、解離定数が≦１μＭ、≦１００ｎＭ、または≦１０ｎＭであるとき、抗体に結合すると言われている。平衡定数（「ＫＤ」）の増加は、エピトープと抗体との間の親和性が低いことを意味し、一方、平衡定数の低下は、エピトープと抗体との間の親和性が高いことを意味する。ある量を「超えない」ＫＤを有する抗体は、抗体が所与のＫＤ以上を有するエピトープに強く結合することを意味する。ＫＤはエピトープおよび抗体の結合特性を説明するが、「効力」は抗体の機能に関する抗体自体の有効性を説明する。平衡定数と効力との間に必ずしも相関がある必要はなく、よって、例えば比較的低いＫＤは、自動的に高い効力を意味しない。
【０１６７】
抗体に関して、用語「選択的に結合する」とは、抗体が単一の物質にのみ結合することを意味するのではなく、むしろ第１の物質対する抗体のＫＤが第２の物質に対する抗体のＫＤより低いことを意味する。エピトープにのみ排他的に結合する抗体はその単一エピトープに結合する。
【０１６８】
ヒトに投与されるとき、げっ歯類（すなわち、マウスまたはラット）可変および／または定常領域を含有する抗体は時折、例えば身体からの迅速なクリアランス、または抗体に対する身体による免疫応答の発生に関連する。げっ歯類由来の抗体の利用を避けるために、完全ヒト抗体は、げっ歯類が完全ヒト抗体を生成するように、ヒト抗体機能のげっ歯類への導入を通して生成され得る。本明細書において特に識別されない限り、「ヒト」および「完全ヒト」抗体は互換的に使用され得る。用語「完全ヒト」は、部分的にのみヒトである抗体を、全く、または完全にヒトであるものと識別するときに有用であり得る。当業者は、完全ヒト抗体を生成する様々な方法を分かっている。
【０１６９】
可能なヒト抗マウス抗体応答に対処するために、キメラまたはさもなければヒト化抗体が利用され得る。キメラ抗体は、ヒト定常領域およびマウス可変領域を有し、そのようなものとして、ヒト抗キメラ抗体応答が一部の患者において観察され得る。したがって、可能なヒト抗マウス抗体、またはヒト抗キメラ抗体応答を避けるために、多量体酵素に対する完全ヒト抗体を提供することが有利である。
【０１７０】
完全ヒトモノクローナル抗体は、例えば当業者に既知の技法により、ハイブリドーマ細胞系を生成することにより調製され得る。他の調製方法は、ＣＨＯ細胞などの好適な哺乳類宿主細胞の形質転換のための、特定の抗体をコードする配列の使用を伴う。形質転換は、例えばポリヌクレオチドをウイルス（またはウイルスベクターの中）にパッケージングし、ウイルス（またはベクター）を有する宿主細胞を形質導入することを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞の中に導入するための任意の既知の方法により、または当該技術分野に公知の遺伝子導入手順により行うことができる。異種性ポリヌクレオチドを哺乳類細胞の中に導入するための方法は当該技術分野において周知であり、デキストラン媒介遺伝子導入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介遺伝子導入、プロトプラスト融合、電気穿孔、ポリヌクレオチド（複数可）のリポソーム内への封入、およびＤＮＡの核内への直接微量注入を含む。発現の宿主として利用可能な哺乳類細胞系は当該技術分野において周知であり、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、およびヒト肝細胞癌細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１７１】
抗体は本開示のポリペプチドを検出するために使用され得る。例えば、抗体は、検出されたレベルを、標準的な対照レベルまたは前に決定された対象のベースラインレベル（例えば任意の病気前）のいずれかと比較することにより、対象の本開示の１つ以上のポリペプチドのレベルを検出することにより診断法として使用され得る。
【０１７２】
本開示の別の実施形態は、１つ以上のヒトドメイン抗体（ｄＡｂ）の使用を伴う。ｄＡｂは、ヒト抗体（ＩｇＧ）の最も小さい機能結合単位であり、好ましい安定性および可溶性特性を有する。本技術は、ＨＳＡに共役されたｄＡｂ（複数可）（それによって、「ＡｌｂｕｄＡｂ」を形成する、例えば欧州特許第ＥＰ１５１７９２１Ｂ号、国際公開第ＷＯ２００５／１１８６４２号および第ＷＯ２００６／０５１２８８号を参照）、および関心の分子（例えば、本開示のポリペプチド配列）を伴う。ＡｌｂｕｄＡｂは、細菌または酵母などの菌発現系において製造するのがポリペプチドの血清半減期を伸長するために使用される現在の技術より小さく、簡単であることが多い。ＨＳＡは約３週間の半減期を有するため、得られる共役分子は関心の分子の半減期を改善する。ｄＡｂ技術の使用は、関心の分子の有効性も強化することができる。
【０１７３】
治療的および予防的使用
本開示は、本明細書に記載される、ポリペプチドまたはその組成物を投与することにより、高血糖、高インスリン血症、グルコース不耐性、グルコース代謝障害、肥満、および他の体重障害、ならびに他の代謝および代謝関連の疾患、障害、および状態を治療する、または防止するための方法を提供する。そのような方法は、例えば症状の重篤度または頻度を減少させることにより、疾患、障害、または状態に関連する１つ以上の症状に対して有利な作用も有し得る。
【０１７４】
対象が、本明細書に提供される方法による高血糖、高インスリン血症、グルコース不耐性、および／もしくはグルコース障害の治療または防止の候補であり得るか否かを決定するために、当該技術分野に公知の様々な診断方法が利用され得る。そのような方法は、本明細書の別の箇所に記載されるもの（例えば絶食時の血漿グルコース（ＦＰＧ）の評価および経口グルコース耐性試験（ｏＧＴＴ））を含む。
【０１７５】
対象が、本明細書に提供される方法による体重障害（例えば肥満）の治療または防止の候補であり得るか否かを決定するために、これらに限定されないが、対象の状態の原因および程度（例えば対象が参照の健康な個人と比較してどのくらい体重超過であるか）などのパラメータが評価されるべきである。例えば、約２５〜約２９．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する成人は、体重超過（前肥満）とみなすことができ、一方約３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する成人は、肥満とみなすことができる。体重超過である、および／または食事に問題がある（例えば脂肪およびカロリーが高い食事）対象に関して、本開示のポリペプチドのうちの１つ以上を含む治療過程を開始する前に、変更された食事習慣および／または運動法を最初に実施し、それらの作用を評価することが一般的である。本明細書に論じられる、ポリペプチドは食欲の抑制をもたらすことができる。
【０１７６】
薬学的組成物
本開示の調節因子（例えばポリペプチド）は、対象に投与するのに適した組成物の形態であり得る。一般に、そのような組成物は、１つ以上の調節因子、および１つ以上の薬学的に許容される、もしくは生理学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む「薬学的組成物」である。ある実施形態では、調節因子は治療的に許容される量で存在する。薬学的組成物は、本開示の方法において使用され得、よって、例えば薬学的組成物は、本明細書に記載される治療法および予防法ならびに使用を実践するために、エクスビボまたはインビボで対象に投与され得る。
【０１７７】
本開示の薬学的組成物は、意図される方法または投与経路に適合するように製剤化され得、例示的な投与経路は本明細書に記載される。さらに、薬学的組成物は、本開示により想定される疾患、障害、および状態を治療する、または防止するために、本明細書に記載される、他の治療的に活性な薬剤または化合物（例えばグルコース低下剤）と組み合わせて使用され得る。
【０１７８】
薬学的組成物は、典型的には、治療有効量の本開示により想定される調節因子のうちの少なくとも１つ（例えばポリペプチド）と、１つ以上の薬学的および生理学的に許容される製剤用薬剤とを含む。好適な薬学的に許容される、もしくは生理学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤は、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸および重硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えばベンジルアルコール、メチルパラベン、エチルもしくはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾエート）、乳化剤、懸濁剤、分散剤、溶媒、充填剤、増量剤、洗剤、緩衝剤、ビヒクル、希釈剤、および／またはアジュバントを含むが、これらに限定されない。例えば、好適なビヒクルは、生理食塩溶液またはクエン酸塩緩衝食塩水であってよく、可能であれば非経口投与用の薬学的組成物に一般的な他の材料で捕捉される。さらなる例示的なビヒクルは、中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水である。当業者は、薬学的組成物および投与形態に使用することができる様々な緩衝剤を容易に認識するだろう。典型的な緩衝剤は、薬学的に許容される弱酸、弱塩基、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。例として、緩衝剤の成分は、リン酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびそれらの塩などの水溶性材料であり得る。許容される緩衝剤は、例えばトリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、およびＮ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）を含む。
【０１７９】
薬学的組成物が製剤化された後、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または無水、もしくは凍結乾燥された粉末として減菌バイアルに保管され得る。そのような製剤は、すぐに使用できる形態、使用前に再構成を必要とする凍結乾燥形態、使用前に希釈を必要とする液体形態、または他の許容される形態のいずれかで保管され得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、単回使用容器（例えば単回使用バイアル、アンプル、シリンジ、または自動注射器（例えばＥｐｉＰｅｎ（登録商標）に類似する）で提供され、一方、多回使用容器（例えば多回使用バイアル）は他の実施形態において提供される。任意の薬物送達装置は、ポリペプチドを送達するために使用され得、移植片（例えば移植可能なポンプ）およびカテーテル系を含み、その両方は当業者に周知である。一般的に皮下または筋肉内投与されるデポ剤注射も、定義された時間期間にわたり、本明細書に開示されるポリペプチドを放出するために利用され得る。デポ剤注射は通常、固系または油系のいずれかであり、本明細書に記載される製剤成分のうちの少なくとも１つを一般的に含む。当業者は、デポ剤注射の可能な製剤および使用に精通している。
【０１８０】
薬学的組成物は、減菌の注射可能な水性または油性の懸濁液の形態であり得る。この懸濁液は、本明細書に記載されるそれらの好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いた、既知の技術分野に従い製剤化され得る。減菌の注射可能な調製物も、例えば１，３−ブタン−ジオール中の溶液などの非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の減菌の注射可能な溶液または懸濁液であってもよい。採用され得る許容される希釈剤、溶媒、および分散培地は、水、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム溶液、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、およびそれらの好適な混合物を含む。加えて、減菌の固定油は、溶媒または懸濁培地として常用される。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性固定油が採用され得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は注射可能物の調製に用途を見出す。特定の注射可能製剤の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤（例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチン）を含むことにより達成され得る。
【０１８１】
活性成分を含有する薬学的組成物は、例えば錠剤、カプセル、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、エマルジョン、硬カプセルもしくは軟カプセル、またはシロップ、溶液、ミクロビーズ、またはエリキシル剤として、経口使用に好適な形態であり得る。経口使用を目的とする薬学的組成物は、薬学的組成物の製造の分野に公知の任意の方法に従い調製され得、そのような組成物は、薬学的に洗練され、味の良い調製物を提供するために、例えば甘味剤、風味剤、着色剤、および防腐剤などの１つ以上の薬剤を含有することができる。錠剤、カプセル等は、錠剤の製造に適する非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物中に活性成分を含有する。これらの賦形剤は、希釈剤（例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなど）、顆粒剤および崩壊剤（例えばコーンスターチまたはアルギン酸）、結合剤（例えばデンプン、ゼラチン、またはアカシア）、および潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク）であり得る。
【０１８２】
経口投与に適した錠剤、カプセル等は、消化管における崩壊および吸収を遅らせ、それによって持続作用を提供するための既知の技法によりコーティングされても、されなくてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの徐放化材料が採用され得る。それらは、当該技術分野に公知の技法によりコーティングされ、制御放出用の浸透性治療錠剤を形成することができる。さらなる薬剤は、投与した組成物の送達を制御するために、ポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、エチレン−酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、もしくはラクチド／グリコリドコポリマー、ポリラクチド／グリコリドコポリマー、またはエチレン酢酸ビニルコポリマーなどの生分解性もしくは生体適合性粒子またはポリマー物質を含む。例えば、経口剤は、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルもしくはポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルの使用により、それぞれ、コアセルベーション技法により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、あるいはコロイド薬物送達系に封入され得る。コロイド状分散系は、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロ球体、ミクロビーズ、および脂質に基づく系（水中油型エマルジョン、ミセル、混合されたミセル、およびリポソームを含む）を含む。リポソームを調製する方法は、例えば米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、および第４，８３７，０２８号に記載されている。上述の製剤を調製するための方法は当業者に明らかである。
【０１８３】
経口使用用の製剤はまた、活性成分が、不活性固形希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンと混合される硬ゼラチンカプセルとして、あるいは活性成分が、水、または油性培地、例えば、ピーナッツ油、流動パラフィン、もしくはオリーブ油と混合される軟ゼラチンカプセルとして、提示されてもよい。
【０１８４】
水性懸濁液は、その製造に適した賦形剤との混合物中に活性材料を含有する。そのような賦形剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム、およびアカシアガムであり、分散剤もしくは湿潤剤は、天然に生じるホスファチド（例えばレシチン）、またはアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合物（例えばステアリン酸ポリオキシエチレン）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合物（例えばヘプタデカエチレン−オキシセタノール）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルの縮合物（例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルの縮合物（例えばポリエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。水性懸濁液は、１つ以上の防腐剤も含み得る。
【０１８５】
油性懸濁液は、活性成分を植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはヤシ油中に、または流動パラフィンなどの鉱物油中に懸濁させることによって製剤化され得る。油性懸濁液は、糊剤、例えば、蜜蝋、固形パラフィン、またはセチルアルコールを含有し得る。上述のものなどの甘味剤および風味剤は、味の良い経口調製を提供するために添加され得る。
【０１８６】
水の添加によって水性懸濁液の調製に適した分散性粉末および顆粒は、分散剤もしくは湿潤剤、懸濁剤、および１つ以上の防腐剤との混合物中に活性成分を提供する。好適な分散剤もしくは湿潤剤、および懸濁剤は、本明細書において例示される。
【０１８７】
本開示の薬学的組成物はまた、水中油型エマルジョンの形態であってもよい。油相は、植物油、例えば、オリーブ油もしくは落花生油、または鉱物油、例えば、流動パラフィン、またはこれらの混合物であり得る。好適な乳化剤は、天然に生じるガム（例えばアカシアガムもしくはトラガントガム）、天然に生じるホスファチド（例えば大豆、レシチン、および脂肪酸由来のエステルまたは部分エステル）、ヘキシトール無水物（例えばソルビタンモノオレエート）、ならびに部分エステルとエチレンオキシドの縮合物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。
【０１８８】
製剤は、移植片、リポソーム、ヒドロゲル、プロドラッグ、およびミクロ封入された送達系を含む制御放出製剤などの、迅速な分解、または身体からの排除に対して組成物を保護するための担体も含み得る。例えば、モノステアリン酸グリセリル、もしくはステアリン酸グリセリル単独などの徐放化材料、または蝋との組合せで採用され得る。
【０１８９】
本開示は、薬物の直腸投与用の坐剤の形態での調節因子の投与を想定する。坐剤は、薬物を、通常の温度では固体であるが、直腸温度で液体であり、従って薬物を放出するために直腸で融解する好適な非刺激性賦形剤と混合することにより調製され得る。そのような材料は、ココアバターおよびポリエチレングリコールを含むが、これらに限定されない。
【０１９０】
本開示により想定される調節因子は、現在既知の、また将来開発される任意の他の好適な薬学的組成物（例えば鼻または吸入用途のためのスプレー）の形態であり得る。
【０１９１】
製剤中のポリペプチドまたはその断片の濃度は、広く変動し得（例えば約０．１質量％未満、通常約２質％または２質％未満から２０質量％ほど〜５０質量％以上）、主に、例えば選択される特定の投与モードによる、流体量、粘度、および対象に基づく要因に基づき、通常選択される。
【０１９２】
投与経路
本開示は、任意の適切な様式での、開示される調節因子（例えばポリペプチド）、およびその組成物の投与を想定する。好適な投与経路は、非経口（例えば筋肉内、静脈内、皮下（例えば注射または移植片）、腹腔内、大槽内、関節内、腹腔内、脳内（実質内）、および脳室内）、経口、鼻、膣、舌下、眼内、直腸、局所（例えば経皮）、舌下、および吸引を含む。
【０１９３】
一般的に皮下または筋肉内投与されるデポ剤注射も、定義された時間期間にわたり、本明細書に開示される調節因子を放出するために利用され得る。デポ剤注射は通常、固系または油系のいずれかであり、本明細書に記載される製剤成分のうちの少なくとも１つを一般的に含む。当業者は、デポ剤注射の可能な製剤および使用に精通している。
【０１９４】
抗体に関して、例示的な実施形態では、本開示の抗体または抗体断片は、注射用の減菌の等張水性食塩溶液に１０ｍｇ／ｍｌで４℃で保管され、対象に投与する前に、注射のために１００ｍｌまたは２００ｍｌのいずれかの０．９％の塩化ナトリウムに希釈される。抗体は、０．２〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で、１時間にわたり静脈注射により投与される。他の実施形態では、抗体は、１５分〜２時間の期間にわたり静脈注射により投与される。また他の実施形態では、投与手順は皮下ボーラス注射を介してである。
【０１９５】
併用療法
本開示は、１つ以上の活性治療剤または他の予防または治療様式と併用した、調節因子（例えばポリペプチド）の使用を想定する。そのような併用療法では、様々な活性剤は、頻繁に、異なる作用機構を有する。そのような併用療法は、薬剤のうちの１つ以上の用量減少を可能にし、それによって、薬剤のうちの１つ以上に関連する有害な作用を減少させる、または排除することにより特に有益であり、さらにそのような併用療法は、基礎疾患、障害、または状態に対して相乗治療または予防作用を有し得る。
【０１９６】
本明細書で使用される「併用」とは、別個に投与され得る、例えば別個に投与するために別個に製剤化される（例えばキットに提供され得るような）療法、および単一の製剤で一緒に投与され得る（すなわち、共製剤（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ））療法を含むことが意味される。
【０１９７】
ある実施形態では、調節因子は、順次投与されるか、または適用され、例えば１つの薬剤が１つ以上の他の薬剤の前に投与される。他の実施形態では、調節因子は、同時に投与され、例えば２つ以上の薬剤が同時にまたはほぼ同時に投与され、２つ以上の薬剤は、２つ以上の別個の製剤に存在するか、または単一製剤に組み合わされ得る（すなわち、共製剤）。２つ以上の薬剤が順次にまたは同時に投与されるか否かに関わらず、それらは本開示の目的のために併用して投与されると考えられる。
【０１９８】
本開示の調節因子は、本明細書に記載される疾患、障害、または状態の治療、防止、抑制、または寛解に有用な他の薬剤と併用して使用され得、高血糖、高インスリン血症、グルコース不耐性、および他のグルコース代謝障害に罹患する対象に通常投与されるものを含む。
【０１９９】
本開示は、多くの薬剤（およびそのクラス）との併用療法を想定し、１）インスリン、インスリン模倣体、およびインスリン分泌の刺激を伴う薬剤（スルホニル尿素（例えばクロロプロパミド、トラザミド、アセトへキサミド、トルブタミド、グリブリド、グリメピリド、グリピジド）およびメグリチニド（例えばレパグリニド（ＰＲＡＮＤＩＮ）およびナテグリニド（ＳＴＡＲＬＩＸ））を含む）、２）ビグアニド（例えはメトホルミン（ＧＬＵＣＯＰＨＡＧＥ））ならびにグルコース利用、肝グルコース産生の減少および／または腸管グルコース排出の減少を促進することにより作用する他の薬剤、３）アルファ−グルコシダーゼ阻害剤（例えばアカルボーズおよびミグリトール）ならびに糖消化、及びその結果として腸からの吸収を遅くさせ、食後の高血糖を減少させる他の薬剤、４）インスリンの作用を強化し、（例えばインスリンの感作により）、よって末梢組織でのグルコース利用を促進する、チアゾリジンジオン（例えばロシグリタゾン（ＡＶＡＮＤＩＡ）、トログリタゾン（ＲＥＺＵＬＩＮ）、ピオグリタゾン（ＡＣＴＯＳ）、グリピジド、バラグリタゾン、リボグリタゾン、ネトグリタゾン、トログリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾン、アダグリタゾン、ダルグリタゾン、５）ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（例えばビルダグリプチン（ＧＡＬＶＵＳ）およびシタグリプチン（ＪＡＮＵＶＩＡ））を含むグルカゴン様ペプチド、およびグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ならびにＧＬＰ−１作動薬および類似体（例えばエキセナチド（ＢＹＥＴＴＡ））、ならびに６）ＤＰＰ−ＩＶ耐性類似体（インクレチン模倣体）、ＰＰＡＲガンマ作動薬、２重作用ＰＰＡＲ作動薬、パン作用（ｐａｎ−ａｃｔｉｎｇ）ＰＰＡＲ作動薬、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤、ＳＧＬＴ阻害剤、インスリン分泌促進物質、ＲＸＲ作動薬、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３阻害剤、免疫調節因子、ベータ−３アドレナリン受容体作動薬、１１ベータ−ＨＳＤ１阻害剤、およびアミリン類似体を含む。
【０２００】
さらに、本開示は、代謝を刺激する、または食欲を減少させる薬剤などの体重損失を促進するための薬剤および方法、ならびに体重損失を促進するための食事の変更および／または運動法との併用療法を想定する。
【０２０１】
本開示の調節因子は、状況下に適切な任意の様式で、１つ以上の他の薬剤と併用して使用され得る。一実施形態では、少なくとも１つの活性剤および少なくとも１つの本開示の調節因子を用いた治療は、一定の時間にわたり保持される。別の実施形態では、少なくとも１つの活性剤を用いた治療は減少されるか、または中断され（例えば対象が安定しているとき）、一方、本開示の調節因子を用いた治療は一定の投薬計画で保持される。さらなる実施形態では、少なくとも１つの活性剤を用いた治療は減少されるか、または中断され（例えば対象が安定しているとき）、一方、本開示の調節因子を用いた治療は減少される（例えば低用量、投薬頻度の減少、または治療計画の短縮）。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの活性剤を用いた治療は減少されるか、または中断され（例えば対象が安定しているとき）、一方、本開示の調節因子を用いた治療は増加される（例えば高用量、投薬頻度の増加、または治療計画の延長）。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの活性剤を用いた治療は保持され、本開示の調節因子を用いた治療は減少されるか、または中断される（例えば低用量、投薬頻度の減少、または治療計画の短縮）。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの活性剤を用いた治療は保持され、本開示の調節因子を用いた治療は減少されるか、または中断される（例えば低用量、投薬頻度の減少、または治療計画の短縮）。
【０２０２】
投薬
本開示の調節因子（例えばポリペプチド）は、例えば投与の目標（例えば所望される消散の程度）、治療される対象の年齢、体重、性別、ならびに健康および身体状態、調節因子の性質、および／または投与される製剤、投与経路、ならびに疾患、障害、状態、またはその症状（例えばグルコース／インスリンの調節不全の重篤度、および障害の段階）に依存する量で対象に投与され得る。投薬計画は、投与される薬剤（複数可）に関連する任意の有害作用の存在、性質、および程度も考慮に入れることができる。有効投与量および投与計画は、例えば安全性および用量漸増試験、インビボ研究（例えば動物モデル）、および当業者に公知の他の方法により容易に決定することができる。
【０２０３】
一般に、投薬パラメータは、対象に不可逆的に有害であり得る量未満（すなわち最大許容量、「ＭＴＤ」）の投与量であり、対象に対して測定可能な作用を生成するために必要とされる量未満ではない。そのような量は、投与経路および他の要因を考慮に入れる、例えば吸収、分布、代謝、および排出に関連する（「ＡＤＭＥ」）薬物動態および薬力学パラメータにより決定される。
【０２０４】
有効量（ＥＤ）は、それを服用する対象のある一部において、治療応答または所望の作用を生成する薬剤の用量または量である。「薬剤の半有効量」またはＥＤ５０は、それを投与される集団の５０％において、治療応答または所望の作用を生成する薬剤の用量または量である。ＥＤ５０は通常、薬剤の作用の妥当な予測の手段として使用されるが、臨床医がすべての関連因子を考慮に入れた、適切であると判断し得る用量とは限らない。よって、いくつかの場合では、有効量は計算されたＥＤ５０超であり、他の場合では、有効量は計算されたＥＤ５０未満であり、また他の場合では、有効量は計算されたＥＤ５０と同じである。
【０２０５】
加えて、本開示の調節因子の有効量は、対象に１つ以上の用量で投与されたとき、健康な対象に対して所望の結果を生成する量であり得る。例えば、有効量は、高血漿グルコースおよび／または血漿インスリンを有する対象に投与されたとき、健康な対象に対して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または８０％超、所望の減少を達成するものであり得る。
【０２０６】
適切な投与レベルは一般的に、１日当り患者の体重の約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇであり、単回量または多回量で投与され得る。いくつかの実施形態では、投与レベルは、１日当り約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇであり、他の実施形態では、１日当り約０．０５〜約１０ｍｇ／ｋｇである。適切な投与レベルは、１日当り約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ、１日当り約０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ、または１日当り約０．１〜５ｍｇ／ｋｇであり得る。この範囲内で、投与量は、１日当り０．００５〜０．０５、０．０５〜０．５、または０．５〜５．０ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０２０７】
経口剤の投与に関して、組成物は、１．０〜１０００ミリグラムの活性成分、特に１．０、３．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、４００．０、５００．０、６００．０、７５０．０、８００．０、９００．０、および１０００．０ミリグラムの活性成分を含有する、錠剤、カプセル等の形態で提供され得る。調節因子は、例えば１日１〜４回、多くの場合１日１回または２回の計画で投与され得る。
【０２０８】
本開示の調節因子の投与は、調節因子の薬物動態（例えば半減期）および薬力学応答（例えば調節因子の治療作用の持続時間）により、１日１回〜３ヶ月に１回の範囲であり得る、適切な頻度で繰り返され得る。調節因子が抗体もしくはその断片、ポリペプチドもしくはその変異体であるいくつかの実施形態では、投薬は１週間に１回〜３ヶ月に１回の間で頻繁に繰り返される。他の実施形態では、そのような調節因子は、約１ヶ月に１回投与される。
【０２０９】
ある実施形態では、開示される調節因子の投与量は、「単位投与形態」で含有される。句「単位投与形態」とは、物理的に分離した単位を指し、各単位は、単独で、または１つ以上の追加の薬剤との併用のいずれかで、所望の作用を生成するのに十分な既定量の本開示の調節因子を含有する。単位投与形態のパラメータは、達成される特定の薬剤および作用に依存する。
【０２１０】
キット
本開示は、開示される調節因子（例えばポリペプチド）、およびその薬学的組成物を含むキットも想定する。キットは一般的に、以下に記載される様々な成分を収容する物理的構造の形態であり、例えば上述の方法を実践する（例えばグルコース恒常性の回復を必要とする対象への調製因子の投与）のに利用され得る。
【０２１１】
キットは、対象に投与するのに適した薬学的組成物の形態であり得る、本明細書に開示される調節因子のうちの１つ以上を含み得る（例えば減菌容器に提供される）。調節因子は、すぐに使用できる形態で、または例えば投与前に再構成または希釈を必要とする形態で提供され得る。調節因子がユーザによって再構成される必要がある形態であるとき、キットは、緩衝液、薬学的に許容される賦形剤等も含み、調節因子と一緒に、または別個にパッケージされ得る。併用療法が想定されるとき、キットは別個にいくつかの薬剤を含有するか、またはそれらはキットに既に組み合わされていてよい。キットの各成分は、個々の容器内に密閉され得、様々な容器のすべては単一のパッケージ内にあり得る。本開示のキットは、その中に収容された成分を適切に保持するのに必要な状態（例えば冷却または凍結）に設計され得る。
【０２１２】
キットは、その中の成分についての情報およびそれらの使用説明書（例えば作用機構、薬物動態および薬力学、有害作用、禁忌等を含む、活性成分（複数可）の投薬パラメータ、臨床薬理）を識別することを含むラベルまたは添付文書を含み得る。ラベルまたは文書は、ロット番号および使用期限などの製造情報を含み得る。ラベルまたは添付文書は、例えば成分を収容する物理的構造に統合されるか、物理的構造内に別個に収容されるか、またはキットの成分（例えばアンプル、チューブ、またはバイアル）に添付され得る。例示的な説明書は、開示される調節因子、およびその薬学的組成物を用いた血中グルコースの減少または低下、高血糖の治療、糖尿病の治療等のものを含む。
【０２１３】
ラベルまたは文書は、ディスク（例えばハードディスク、カード、メモリディスク）、光学ディスク（ＣＤ−もしくはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭなど）、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープ、または電気記憶媒体（ＲＡＭおよびＲＯＭなど）、またはこれらのハイブリッド（磁気／光学記憶媒体、ＦＬＡＳＨメディア、もしくはメモリ型カードなど）などのコンピュータ可読媒体をさらに含むか、それに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、実際の説明書は、キットに存在しないが、例えばインターネットを介して遠隔源から説明書を得るための手段が提供される。
【実施例】
【０２１４】
以下の実施例は、当業者に本発明をどのように作製および使用するかの完全な開示および説明を提供するように提示され、本発明者が自身の発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、以下の実験が全てまたは唯一の実行される実験であると示すようにも意図されていない。使用される数値（例えば、量、温度等）に対する正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験によるエラーおよび偏差が計上されるはずである。
【０２１５】
別途示されない限り、部は、質量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度（℃）であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。次を含む標準的な略語が使用される：ｂｐ＝塩基対（複数可）、ｋｂ＝キロベース（複数可）、ｐｌ＝ピコリットル（複数可）、ｓもしくはｓｅｃ＝秒（複数可）、ｍｉｎ＝分（複数可）、ｈまたはｈｒ＝時間（複数可）、ａａ＝アミノ酸（複数可）、ｋｂ＝キロベース（複数可）、ｎｔ＝ヌクレオチド（複数可）、ｎｇ＝ナノグラム、μｇ＝マイクログラム、ｍｇ＝ミリグラム、ｇ＝グラム、ｋｇ＝キログラム、ｄｌもしくはｄＬ＝デシリットル、μもしくはμＬ＝マイクロリットル、ｍｌもしくはｍＬ＝ミリリットル、ｌもしくはＬ＝リットル、μＭ＝マイクロモル、ｍＭ＝ミリモル、Ｍ＝モル、ｋＤａ＝キロダルトン、ｉ．ｍ．＝筋肉内（に）、ｉ．ｐ．＝腹腔内（に）、ｓ．ｃ．＝皮下（に）、ｂｉｄ＝１日２回、ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー、ＢＷ＝体重、Ｕ＝単位、ｎｓ＝統計的に有意ではない、ＰＧ＝絶食時の血漿グルコース、ＦＰＩ＝絶食時の血漿インスリン、ＩＴＴ＝インスリン耐性試験、ＰＴＴ＝ピルビン酸塩耐性試験、ｏＧＴＴ＝経口グルコース耐性試験、ＧＳＩＳ＝グルコース刺激されたインスリン分泌、ＰＢＳ＝リン酸緩衝食塩水、ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応、ＮＨＳ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＤＭＥＭ＝ダルベッコ変法イーグル培地、ＧＣ＝ゲノムコピー、ＥＤＴＡ＝エチレンジアミンテトラ酢酸。
【０２１６】
材料および方法
以下の方法および材料は以下の実施例において使用された。
【０２１７】
動物。食事誘発性肥満（ＤＩＯ）の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、６０ｋｃａｌ％の脂肪、２０ｋｃａｌ％のタンパク質、および２０ｋｃａｌ％の糖を含有する高脂肪食（Ｄ１２４９２，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）で１２〜２０週間保持した。すべての動物研究は、施設内動物実験委員会（ＮＧＭ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。
【０２１８】
９週齢の雄のＢ６．Ｖ−ＬＥＰｏｂ／Ｊ（レプチン欠損（ｏｂ／ｏｂ））マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、組換え実行（ｄｏｉｎｇ）研究に使用した。マウスは、高圧減菌蒸留水を自由に摂取し、市販のマウス餌（Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ２０１８  Ｔｅｋｌａｄ  Ｇｌｏｂａｌ  １８％タンパク質げっ歯類食餌，Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＶＡ）を自由に採食した。すべての動物研究は、施設内動物実験委員会により承認された。
【０２１９】
核酸およびアミノ酸配列。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０００５２９．２はヒトＧＤＦ１５をコードするＯＲＦのｃＤＮＡを示し、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４８５５．２は、ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を示す。１１２−アミノ酸ＧＤＦ１５（図１Ｂ）またはＧＤＦ１５変異タンパク質が使用された。
【０２２０】
ＧＤＦ１５ＯＲＦは、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ＃ＭＨＳ１０１１−５８７３５）から購入した組換えＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅された。Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実性ＤＮＡポリメラーゼを有するＰＣＲ試薬キットは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  （Ｆ−５３０Ｌ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から購入した。次のプライマーが使用された：順方向ＰＣＲプライマー：５’ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＧ（配列番号３８）および逆方向ＰＣＲプライマー：５’ＣＣＡＴＣＧＡＴＣＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡ（配列番号３９）。
【０２２１】
増幅されたＤＮＡ断片は、制限酵素Ｘｂａ  ＩおよびＣｌａＩ（制限部位は、それぞれ、５’（Ｘｂａ  Ｉ）および３’（Ｃｌａ  Ｉ）ＰＣＲプライマーに含まれた）により消化され、次に同じ制限酵素で消化されたＡＡＶ導入遺伝子ベクターで連結された。発現に使用されたベクターは、選択可能なマーカー、ならびにクローン化されたコード配列の挿入のための部位の強い真核生物プロモータ５’、続いて３’非翻訳領域およびウシ成長ホルモンポリアデニル化尾から構成される発現カセットを含有した。発現構築物は５’端および３’端の内部末端反復にも隣接する。
【０２２２】
ＡＡＶの生成および精製。２９３個の細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）は、１０％の胎仔ウシ血清および１×抗生物質−抗真菌剤溶液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）で補充されたＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）中で培養された。１日目に、細胞を、１５０ｍＬの細胞培養プレート中で５０％の密度で平板培養した。２日目に、次の３つのプラスミド（２０μｇ／それぞれのプレート）：ＡＡＶ導入遺伝子プラスミド、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）、およびＡＡＶ２／９プラスミド（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１（２００４））で、リン酸カルシウム沈殿法を用いて細胞を遺伝子導入した。
【０２２３】
遺伝子導入４８時間後、細胞をプレートから掻き取り、３０００×ｇで遠心分離することによりペレット化し、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）、１００ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する緩衝液中に再懸濁した。懸濁液をアルコールドライアイス浴で凍結させ、次に３７℃の水浴で解凍し、凍結および解凍サイクルは３回繰り返された。Ｂｅｎｚｅｎａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、５０単位／ｍｌの最終濃度で添加し、デオキシコール酸を０．２５％の最終濃度に添加した。３７℃で３０分間インキュベートした後、５０００×ｇで２０分間遠心分離することにより、細胞片をペレット化した。前述されるように（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：９７３（１９９９））、上清中のウイルス粒子を、イオジキサノール（ｉｏｄｉｘａｎａｌ）（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（製造中止））勾配を用いて精製した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０（ＭＷカットオフ１００，０００ダルトン、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いてウイルスストックを濃縮し、１０％のグリセロールを含むＰＢＳに再懸濁し、−８０℃で保管した。ウイルスゲノムのコピー数を決定するために、２μｌのウイルスストックを、５０単位／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および１０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する６μｌの溶液中で、３７℃で３０分間インキュベートした。
【０２２４】
この後、２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ、０．５％のＳＤＳ、および２５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１５μｌの溶液を添加し、混合物を５５℃でさらに２０分間インキュベートし、ウイルスＤＮＡを解放した。ウイルスＤＮＡをミニＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で洗浄し、４０μｌの水で溶出した。ウイルスＧＣは定量的ＰＣＲを用いて決定された。ウイルスストックは望ましいＧＣ／ｍｌにＰＢＳで希釈された。ウイルス使用液（２００μｌ）を尾血管注射を介してマウスに送達した。
【０２２５】
血中グルコースアッセイ。マウスの尾の切れ目からの血中グルコースを、製造者の指示に従い、ＡＣＣＵ−ＣＨＥＫアクティブメーター（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によって読み取られたＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ活性試験片を用いて測定した。
【０２２６】
血清ＧＤＦ１５変異体曝露レベルアッセイ。マウスの尾の切れ目からの全血（約５０μｌ／マウス）を普通の毛細管チューブ（ＢＤ  Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ  ＳｕｒｅＰｒｅｐ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）に収集した。血清および血液細胞は、チューブをＡｕｔｏｃｒｉｔ  Ｕｌｔｒａ３（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）中で回転させることにより分離した。血清中のＧＤＦ１５曝露レベルは、製造者の指示に従い、ヒトＧＤＦ−１５  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて測定された。
【０２２７】
ＧＤＦ１５変異タンパク質のペグ化。直線状１０ｋＤａ  ＰＥＧ部分（Ｎａｎｏｃｓ  Ｉｎｃ．；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；カタログ番号ＰＧ１−ＳＣ−１０ｋ）を用いて、Ｎ終端でおよび／または内部的に部位特異的様式で組換えＧＤＦ１５変異タンパク質を修飾するために、ＮＨＳ特異的化学的性質を使用した。所望される場合、Ｎ末端アラニンでのペグ化の防止は、スルホ−ＮＨＳ−酢酸塩（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；カタログ番号２６７７７）を用いて達成された。標識反応は製造者の指示に従い、過剰な標識は１Ｍのトリス（ｐＨ８．０）を１／１００（ｖ／ｖ）添加することにより反応停止した。
【０２２８】
実施例１：高脂肪食餌誘発肥満（ＤＩＯ）マウスにおける体重および血中グルコースに対するＧＤＦ１５の作用
体重および絶食時のグルコース血清レベルに対する連続したＧＤＦ１５曝露の作用を評価するために、体重が約４５ｇであり、約２３７ｍｇ／ｄｌの４時間の絶食時のグルコース血清レベルを有する１９週齢の高脂肪採食ＤＩＯマウス（ｎ＝７）は、上述のＧＤＦ１５遺伝子挿入を含有するＡＡＶウイルスの単一ボーラス尾血管注射を受けた。血清全身曝露は、製造者の指示に従い、ヒトＧＤＦ−１５  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）により監視された（図３）。図３のデータは、ＧＤＦ１５血清濃度と比較した観察された表現型の明確な関係を確立するために、遺伝的方法からのマウスにおけるＧＤＦ１５の全身曝露レベルを示す（図４〜７を参照）。これらの曝露レベルをベンチマークとして使用し、実施例３のマウスは、遺伝的検証を介して観察されたものとほぼ同等の血清レベル濃度を達した用量で組換えＧＤＦ１５を投与された。
【０２２９】
図４に示されるように、２週間のＧＤＦ１５の全身曝露は、１４．９ｎｇ／ｍＬを上回る血清濃度で、有意に体重を減少させた。全身曝露の２週間後、１２．４％の減少（＊＊，ｐ＜０．０１）を含む５．９ｇ、および１７．３％の減少（＊＊＊，ｐ＜０．００１）を含む８．２ｇの体重減少が、２週目のＰＢＳ注射ＤＩＯマウスに対して、それぞれ、中（１４．９ｎｇ／ｍＬ）および高（６５．６ｎｇ／ｍＬ）曝露において観察された。マウスの各群において、ｎ＝７およびｐ値は、２週目の体重をＰＢＳビヒクル対照と比較する２元配置ＡＮＯＶＡにより決定された（平均体重＝４７．７ｇ）。
【０２３０】
図５に示されるように、２週間のＧＤＦ１５の全身曝露は、ＧＤＦ１５のすべての全身血清濃度の絶食時の血清グルコースレベルを有意に減少させた。全身曝露の２週間後、１３．５％の減少（＊＊，ｐ＜０．０１）を含む３１．３ｍｇ／ｄｌ、２２．５％の減少（＊＊＊，ｐ＜０．００１）を含む５２．０ｍｇ／ｄｌ、および２３．０％の減少（＊＊＊，ｐ＜０．００１）を含む５３．３ｍｇ／ｄｌの４時間の絶食時の血中グルコース減少が、２週目のＰＢＳ注射ＤＩＯマウスに対して、それぞれ、低（０．７ｎｇ／ｍＬ）、中（１４．９ｎｇ／ｍＬ）および高（６５．６ｎｇ／ｍＬ）曝露において観察された。マウスの各群において、ｎ＝７およびｐ値は、ＰＢＳビヒクル対照と比較した２週目の体重を比較する１元配置ＡＮＯＶＡにより決定された（平均血清グルコースレベル＝２３１．３ｍｇ／ｄｌ）。
【０２３１】
実施例２：高脂肪食餌誘発肥満マウスにおけるＧＤＦ１５変異タンパク質の体重および絶食時の血中グルコースに対する全身曝露作用
体重および絶食時のグルコース血清レベルに対するＧＤＦ１５変異タンパク質の作用を評価するために、１９週齢の高脂肪採食ＤＩＯマウス（体重が約４１ｇであり、約２１８ｍｇ／ｄｌの４時間の絶食時のグルコース血清レベルを有する）は、上述のＧＤＦ１５変異タンパク質遺伝子挿入を含有する中用量（１４．９ｎｇ／ｍＬ）のＡＡＶの単一ボーラス尾血管注射を受けた。全身血清曝露は、図３に記載される中用量のＧＤＦ１５のものと同等であるように近似された。
【０２３２】
図６に示されるように、２週間のＧＤＦ１５変異タンパク質の全身曝露は、中ＡＡＶ用量で減少した体重傾向をもたらした。全身曝露の２週間後、２週目のＰＢＳ注射ＤＩＯマウスに対して、体重減少は次の通りである：ＧＤＦ１５は６．１ｇ（ｎｓ）減少、ｖ１は５．９ｇ（ｎｓ）減少、ｖ２は３．０ｇ（ｎｓ）減少、ｖ３は１．１ｇ（ｎｓ）減少、ｖ４は１．５ｇ（ｎｓ）減少、ｖ５は５．２ｇ（ｎｓ）減少、ｖ６は５．３ｇ（ｎｓ）減少、そしてｖ７は６．２ｇ（ｎｓ）減少。マウスの各群において、ｎ＝５およびｐ値は、ＧＤＦ１５変異タンパク質投薬後２週目の体重をＰＢＳビヒクル対照投薬と比較する１元配置ＡＮＯＶＡにより決定された（平均体重＝４１．４ｇ）。
【０２３３】
図７に示されるように、２週間のＧＤＦ１５変異タンパク質の全身曝露は、中ＡＡＶ用量で、絶食時の血清グルコースレベルを有意に減少させた。全身曝露の２週間後、２週目のＰＢＳ注射ＤＩＯマウスに対して、４時間の絶食時の血清グルコースレベルは、次の通りである：ＧＤＦ１５は３７ｍｇ／ｄｌ減少（＊＊，ｐ＜０．０１）、ｖ１は３６．６ｍｇ／ｄｌ減少（＊＊，ｐ＜０．０１）、ｖ２は１１．８ｍｇ／ｄｌ減少（ｎｓ）、ｖ３は１５．３ｍｇ／ｄｌ減少（ｎｓ）、ｖ４は９．２ｍｇ／ｄｌ減少（ｎｓ）、ｖ５は３０．８ｍｇ／ｄｌ減少（＊，ｐ＜０．０５）、ｖ６は３１ｍｇ／ｄｌ減少（＊，ｐ＜０．０５）、そしてｖ７は３１．８ｍｇ／ｄｌ減少（＊，ｐ＜０．０５）。マウスの各群において、ｎ＝５およびｐ値は、ＧＤＦ１５変異タンパク質投薬後２週目の４時間の絶食時の血清血中グルコースをＰＢＳビヒクル対照投薬と比較する１元配置ＡＮＯＶＡにより決定された（平均血中グルコース＝２２９．２ｍｇ／ｄｌ）。
【０２３４】
実施例３：レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスにおける食餌摂取量、体重、および非絶食時の血中グルコースに対する組換えＧＤＦ１５の作用
食餌摂取量、体重、および非絶食時のグルコース血清レベルに対する用量依存組換えＧＤＦ１５曝露の作用を評価するために、体重が約４４．５ｇであり（すべての投薬群の平均）、約３９３．６ｍｇ／ｄｌの非絶食時のグルコース血清レベルを有する（すべての投薬群の平均）９週齢のｏｂ／ｏｂマウス（３つの投薬群、１群当りｎ＝７）は、ｓ．ｃ．ｂｉｄ送達を介して組換えＧＤＦ１５を受けた。血清ＧＤＦ１５曝露は、製造者の指示に従い、ヒトＧＤＦ−１５  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）により監視された。
【０２３５】
１日目に、最初の投薬群は０．０２ｍｇ／ｋｇを受け（ｗ／ｗ当量）、２番目の投薬群は０．２ｍｇ／ｋｇを受け、３番目の投薬群は２ｍｇ／ｋｇを受けた。図８を参照すると、血清曝露（最後（２番目）の用量の投与４時間後に測定）は、陰影のない棒（最初の投薬群）、灰色の陰影のある棒（２番目の投薬群）、および黒色の陰影のある棒（最高投薬群）によって表される。２日目から７日目に関して、最初の投薬群は０．０１ｍｇ／ｋｇを１日２回受け（ｗ／ｗ当量）、２番目の投薬群は０．１ｍｇ／ｋｇを１日２回受け、３番目の投薬群は１ｍｇ／ｋｇを１日２回受けた。血清曝露（７日目の最後（２番目）の用量の投与４時間後に測定された）は、陰影のない棒（最初の投薬群）、灰色の陰影のある棒（２番目の投薬群）、および黒色の陰影のある棒（３番目の投薬群）によって表される。
【０２３６】
図８に示されるように、組換えＧＤＦ１５への曝露は実施例１で確立されたものと同等の範囲（ｎｇ／ｍＬ）内であった（図３を参照）。これらのデータは、遺伝的および組換えＧＤＦ１５様式の両方の血清ＧＤＦ１５レベルと、体重と、血中グルコース表現型との間に同等性の相関を確立する。
【０２３７】
その後、食餌摂取量（グラム／日／動物）に対する組換えＧＤＦ１５の用量依存作用は、１日２回の１週間にわたるｓ．ｃ．投薬中に決定された。１日目に、単独収容されたマウスを午前中絶食させ、最初の投薬群は０．０２ｍｇ／ｋｇを受け（ｗ／ｗ当量）、２番目の投薬群は０．２ｍｇ／ｋｇを受け、３番目の投薬群は２ｍｇ／ｋｇを受けた。８時間後にこの投薬計画は繰り返された。その後食餌を動物ケージに戻した。２日目の朝に、残った食餌を量り、各動物の一晩（Ｏ／Ｎ）の食餌摂取量を計算した。２日目から７日目に関して、最初の投薬群は０．０１ｍｇ／ｋｇを受け（ｗ／ｗ当量）、２番目の投薬群は０．１ｍｇ／ｋｇを受け、３番目の投薬群は１ｍｇ／ｋｇを受けた。２日目から４日目および４日目から７日目の各動物の食餌摂取量を再度測定した。２日目〜７日目の食餌摂取量の測定は、毎日の用量前に行われた。
【０２３８】
図９を参照すると、ビヒクル対照動物における食餌摂取量は陰影のない棒によって表され、一方、最初の投薬群の食餌摂取量に対する作用は薄灰色の陰影のある棒によって表され、２番目の投薬群の食餌摂取量に対する作用は中間灰色の陰影のある棒によって表され、３番目の投薬群の食餌摂取量に対する作用は黒色の陰影のある棒によって表される。図９に示されるように、組換えＧＤＦ１５は、１、４、および７日目に、ビヒクル対照注射ｏｂ／ｏｂマウスに対して食餌摂取量を有意に減少させた。１日目の食物摂取量は次の通りである：ビヒクル対照投薬群＝５．３ｇ、最初の投薬群＝４．９ｇ（ｎｓ）、２番目の投薬群＝４．３ｇ（＊，ｐ＜０．０５）、および３番目の投薬群＝３．７ｇ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）。２日目〜４日目の食物摂取量は次の通りである：ビヒクル対照投薬群＝７．６ｇ、最初の投薬群＝６．４ｇ（＊，ｐ＜０．０５）、２番目の投薬群＝５．５ｇ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）、および３番目の投薬群＝３．７ｇ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）。４日目〜７日目の食物摂取量は次の通りである：ビヒクル対照投薬群＝７．７ｇ、最初の投薬群＝６．７ｇ（ｎｓ）、２番目の投薬群＝５．３ｇ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）、および３番目の投薬群＝４．３ｇ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）。全時間点（１〜７日目）の実験期間中の平均食物摂取量（グラム／日／動物）は次の通りである：ビヒクル対照投薬群＝７．２ｇ、最初の投薬群＝６．３ｇ（ｎｓ）、２番目の投薬群＝５．２ｇ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）、および３番目の投薬群＝４．５ｇ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）。マウスの各群において、ｎ＝７およびｐ値は、ビヒクル対照と比較した各時間点の食餌摂取量を比較する２元配置ＡＮＯＶＡにより決定された。
【０２３９】
図１０に示されるように、組換えＧＤＦ１５  ｂｉｄ  ｓ．ｃ．を注射されたマウスは、１、４、および７日目に、ビヒクル対照注射ｏｂ／ｏｂマウスと比較して、有意に減少した体重を示した。１日目に、最初の投薬群は０．０２ｍｇ／ｋｇを受け（ｗ／ｗ当量）、２番目の投薬群は０．２ｍｇ／ｋｇを受け、３番目の投薬群は２ｍｇ／ｋｇを受けた。２日目から７日目に関して、最初の投薬群は０．０１ｍｇ／ｋｇを受け（ｗ／ｗ当量）、２番目の投薬群は０．１ｍｇ／ｋｇを受け、３番目の投薬群は１ｍｇ／ｋｇを受けた。毎日、朝の用量前に体重を記録した。
【０２４０】
１日目の体重は次の通りである：ビヒクル対照投薬群＝４４．８ｇ、最初の投薬群＝４４．９ｇ（ｎｓ）、２番目の投薬群＝４４．２ｇ（ｎｓ）、および３番目の投薬群＝４４．７ｇ（ｎｓ）。４日目の体重は次の通りである：ビヒクル対照投薬群＝４７．１ｇ、最初の投薬群＝４６．４ｇ（ｎｓ）、２番目の投薬群＝４４．２ｇ（ｎｓ）、および３番目の投薬群＝４４．６ｇ（ｎｓ）。７日目の体重は次の通りである：ビヒクル対照投薬群＝４８．２ｇ、最初の投薬群＝４７．０ｇ（ｎｓ）、２番目の投薬群＝４４．２ｇ（＊＊，ｐ＜０．０１）、および３番目の投薬群＝４４．０ｇ（＊＊，ｐ＜０．０１）。マウスの各群において、ｎ＝７およびｐ値は、ビヒクル対照と比較した各時間点の体重を比較する２元配置ＡＮＯＶＡにより決定された。
【０２４１】
図１１に示されるように、組換えＧＤＦ１５のｓ．ｃ．ｂｉｄ曝露は、４、および７日目に、ビヒクル対照注注射ｏｂ／ｏｂマウスに対して、投与１６時間後に有意に減少した非絶食時の血中グルコース血清レベルをもたらした。マウスは、ビヒクル（陰影のある丸）、０．０２ｍｇ／ｋｇ（最初の投薬群、陰影のある四角）、０．２ｍｇ／ｋｇ（２番目の投薬群、陰影のある三角）、または２ｍｇ／ｋｇ（３番目の投薬群、陰影のない丸）を注射された。２日目から７日目に関して、最初の投薬群は０．０１ｍｇ／ｋｇを受け（ｗ／ｗ当量）、２番目の投薬群は０．１ｍｇ／ｋｇを受け、３番目の投薬群は１ｍｇ／ｋｇを受けた。４日目および７日目に、２番目および３番目の投薬群は、ビヒクル対照注射レベルに対して有意に減少した非絶食血中グルコース血清レベル（ｍｇ／ｄｌ）を呈した。１日目のグルコースレベルは次の通りである：ビヒクル対照＝３９２．４ｍｇ／ｄｌ、最初の投薬群＝３９５．０ｍｇ／ｄｌ（ｎｓ）、２番目の投薬群＝３９５．４ｍｇ／ｄｌ（ｎｓ）、および３番目の投薬群＝３９１．７ｍｇ／ｄｌ（ｎｓ）。４日目のグルコースレベルは次の通りである：ビヒクル対照＝４２２．１ｍｇ／ｄｌ、最初の投薬群＝３８１．３ｍｇ／ｄｌ（ｎｓ）、２番目の投薬群＝３０１．９ｍｇ／ｄｌ（＊＊，ｐ＜０．０１）、および３番目の投薬群＝２４７．７ｍｇ／ｄｌ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）。７日目のグルコースレベルは次の通りである：ビヒクル対照＝４５５．６ｍｇ／ｄｌ、最初の投薬群＝３８９．７ｍｇ／ｄｌ（ｎｓ）、２番目の投薬群＝３０４．１ｍｇ／ｄｌ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）、および３番目の投薬群＝２０４．７ｍｇ／ｄｌ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）。マウスの各群において、ｎ＝７およびｐ値は、ビヒクル対照と比較した各時間点の非絶食血中グルコースを比較する２元配置ＡＮＯＶＡにより決定された。
【０２４２】
実施例４：レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスにおける食餌摂取量および体重に対するペグ化された組換えＧＤＦ１５変異タンパク質の作用
食餌摂取量および体重に対する組換え部位特異的ペグ化ＧＤＦ１５変異タンパク質の作用は、対応する非ペグ化ＧＤＦ１５変異タンパク質の作用と比較された。上述の方法を用いて、変異体１はＮ終端でペグ化され（ｖ１−ＰＥＧ１０）（配列番号５）、変異体５はリジン６９でペグ化され（ｖ５−ＰＥＧ１０）（配列番号９）、変異体６はリジン９１でペグ化された（ｖ６−ＰＥＧ１０）（配列番号１０）。１０週齢のｏｂ／ｏｂマウスは単一ｓ．ｃ．用量のビヒクル、非ペグ化（２ｍｇ／ｋｇ）ｖ１、ｖ５、もしくはｖ６、またはペグ化（２ｍｇ／ｋｇ）ｖ１、ｖ５、もしくはｖ６（それぞれ、ｖ１−ＰＥＧ１０、ｖ５−ＰＥＧ１０、およびｖ６−ＰＥＧ１０）を受けた。
【０２４３】
図１２に示されるように、組換えＧＤＦ１５変異タンパク質の単一用量の投与は、１、２、５〜７、および１５日目に、ビヒクル対照注射ｏｂ／ｏｂマウスに対して有意に減少した食餌摂取量をもたらした。１日目の最初の用量の１６時間後に測定された食物摂取量（グラム／日／動物）は次の通りである：ビヒクル対照は５．１ｇ、ｖ１は２．５ｇ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）、ｖ５は４．３ｇ（ｎｓ）、ｖ６は３．４ｇ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）、ｖ１−ＰＥＧ１０は３．２ｇ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）、ｖ５−ＰＥＧ１０は３．５ｇ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）、およびｖ６−ＰＥＧ１０は３．２ｇ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）。２〜１５日目の時間期間中に行われた測定は、毎日ほぼ同じ時間（９：３０ａ．ｍ．）に行われた。２日目の食餌摂取量（グラム／日／動物）は次の通りである：ビヒクル対照は５．７ｇ、ｖ１は５．１ｇ（ｎｓ）、ｖ５は５．６ｇ（ｎｓ）、ｖ６は５．７ｇ（ｎｓ）、ｖ１−ＰＥＧ１０は３．８ｇ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）、ｖ５−ＰＥＧ１０は４．３ｇ（＊＊，ｐ＜０．０１）、およびｖ６−ＰＥＧ１０は４．７ｇ（ｎｓ）。５日目〜７日目の１日平均食餌摂取量（グラム／日／動物）は次の通りである：ビヒクル対照は５．４ｇ、ｖ１は５．５ｇ（ｎｓ）、ｖ５は６．０ｇ（ｎｓ）、ｖ６は６．０ｇ（ｎｓ）、ｖ１−ＰＥＧ１０は３．５ｇ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）、ｖ５−ＰＥＧ１０は４．０ｇ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）、およびｖ６−ＰＥＧ１０は４．２ｇ（＊＊，ｐ＜０．０１）。１５日目の食餌摂取量（グラム／日／動物）は次の通りである：ビヒクル対照は５．３ｇ、ｖ１は５．３ｇ（ｎｓ）、ｖ５は５．６ｇ（ｎｓ）、ｖ６は５．８ｇ（ｎｓ）、ｖ１−ＰＥＧ１０は５．２ｇ（ｎｓ）、ｖ５−ＰＥＧ１０は４．９ｇ（ｎｓ）、およびｖ６−ＰＥＧ１０は５．１ｇ（ｎｓ）。マウスの各群において、ｎ＝５およびｐ値は、各時間点の食餌摂取量をＰＢＳビヒクル対照と比較する１元配置ＡＮＯＶＡにより決定された。
【０２４４】
図１３に示されるように、組換えＧＤＦ１５変異タンパク質の単一用量の投与は、それぞれ、１、２、８、および１５日目に、特定の時間点で、ＰＢＳビヒクル対照注射ｏｂ／ｏｂマウスに対して有意に減少した体重をもたらした。１日目の最初の用量の１６時間後に測定された体重は次の通りである：ビヒクル対照は４９．３ｇ、ｖ１は４８．７ｇ（ｎｓ）、ｖ５は４７．５ｇ（ｎｓ）、ｖ６は４９．９ｇ（ｎｓ）、ｖ１−ＰＥＧ１０は４６．８ｇ（ｎｓ）、ｖ５−ＰＥＧ１０は４６．９ｇ（ｎｓ）、およびｖ６−ＰＥＧ１０は４８．６ｇ（ｎｓ）。２〜１５日目の時間期間中に行われた測定は、毎日ほぼ同じ時間（９：３０ａ．ｍ．）に行われた。２日目の体重は次の通りである：ビヒクル対照は５１．０ｇ、ｖ１は４９．１ｇ（ｎｓ）、ｖ５は４８．５ｇ（ｎｓ）、ｖ６は５０．７ｇ（ｎｓ）、ｖ１−ＰＥＧ１０は４７．３ｇ（＊，ｐ＜０．０５）、ｖ５−ＰＥＧ１０は４７．７ｇ（ｎｓ）、およびｖ６−ＰＥＧ１０は４９．４ｇ（ｎｓ）。８日目の体重は次の通りである：ビヒクル対照は５２．９ｇ、ｖ１は５１．７ｇ（ｎｓ）、ｖ５は５０．２ｇ（ｎｓ）、ｖ６は５３．４ｇ（ｎｓ）、ｖ１−ＰＥＧ１０は４５．８ｇ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）、ｖ５−ＰＥＧ１０は４７．３ｇ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）、およびｖ６−ＰＥＧ１０は４８．７ｇ（＊＊，ｐ＜０．０１）。１５日目の体重は次の通りである：ビヒクル対照は５４．８ｇ、ｖ１は５４．０ｇ（ｎｓ）、ｖ５は５２．０ｇ（ｎｓ）、ｖ６は５５．５ｇ（ｎｓ）、ｖ１−ＰＥＧ１０は４８．８ｇ（＊＊＊，ｐ＜０．００１）、ｖ５−ＰＥＧ１０は５０．６ｇ（＊＊，ｐ＜０．０１）、およびｖ６−ＰＥＧ１０は５２．４（ｎｓ）。マウスの各群において、ｎ＝５およびｐ値は、各時間点の体重をＰＢＳビヒクル対照と比較する２元配置ＡＮＯＶＡにより決定された。
【０２４５】
本発明を実行するために発明者が知る最良のモードを含む、本発明の特定の実施形態が本明細書において説明される。前述の説明を読むことにより、開示される実施形態の変形は当業者に明らかとなり、当業者はそのような変形を適切に採用することができることが期待される。したがって、本発明が本明細書に特別に記載したものとは別な方法で実践され、本発明が、適用法令に認められる、添付の請求項に記載される対象の全ての修正および等価物を含むことが意図される。さらに、上記に示される要素の、それらの全ての可能な変形の、どのような組み合わせも、本明細書中に特に記載されない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に含まれる。
【０２４６】
この本明細書に記述される全ての刊行物、特許出願、受託番号、および他の参照文献は、各個別の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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