(57)【要約】  好完成微生物を検出するための方法が提供される。方法は、試験される試料と、約１．０〜約１０．２重量％のグリセロールを含む水性希釈剤と、微生物の増殖を容易にするために、例数で再構成可能な培地を含む薄膜培養装置と、を提供する工程を含む。方法は、試料を水性希釈剤と混合して、接種材料を形成する工程と、接種材料の所定量を再構成可能な培地に接触させて、播種された薄膜培養装置を形成する工程と、播種された薄膜培養装置を、一定時間にわたってインキュベートする工程と、微生物のコロニーの有無を検出する工程と、を更に含む。この方法に従って、好乾性微生物を検出するためのキットも提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の酵母又はカビ微生物を検出する方法であって、前記方法が、
試料を水性希釈剤と混合し、接種材料を形成する工程であって、前記水性希釈剤が、約１．０〜約１０．２重量％のグリセロールを含む、工程と、
前記接種材料の所定量を、薄膜培養装置の増殖領域に接触させる工程であって、前記装置が、
頂部面と底部面とを有する防水性基材と、
前記基材の前記頂部面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っている、乾燥した冷水で再構成可能な培地であって、前記培地がグアーガム及び／又はキサンタンガム並びに必要に応じて微生物の増殖を支援する栄養素の混合物を含む、培地と、を含む、工程と、
播種された薄膜培養装置を一定時間にわたってインキュベートする工程と、
前記増殖領域内の微生物のコロニーの有無を検出する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
試料中の酵母又はカビ微生物を検出する方法であって、前記方法が、
薄膜培養装置の増殖領域を、水性希釈剤の所定量で水和させる工程であって、
前記水性希釈剤が、１．０〜約１０．２重量％のグリセロールを含み、
前記薄膜培養装置が、
頂部面と底部面とを有する防水性基材と、
前記基材の前記頂部面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っている、乾燥した冷水で再構成可能な培地であって、前記培地がグアーガム及び／又はキサンタンガム並びに必要に応じて微生物の増殖を支援する栄養素の混合物を含む、培地と、を含む、工程と、
播種された薄膜培養装置を一定時間にわたってインキュベートする工程と、
前記増殖領域内の微生物のコロニーの有無を検出する工程と、
を含む、方法。
【請求項３】
前記水性希釈剤が、約１．０〜約５．１重量％のグリセロールを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記培地を、前記接種材料の前記所定量に接触させる工程が、前記培地の所定区域を、前記接種材料の前記所定量に接触させることを更に含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項５】
カバーシートが、第１の表面と第２の表面とを備え、前記第１の表面がそれに付着された乾燥したゲル化剤を含み、前記カバーシートを前記再構成された培地に配置させる工程が、前記カバーシートの前記第１の表面の一部を前記再構成された培地に接触させることを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記装置が、上面と下面とを有する空気透過性膜を更に備え、前記膜の前記下面が、前記基材の前記頂部面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っており、前記再構成可能な培地が、増殖領域を画定するように、前記膜の前記上面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、検出試薬を提供する工程を更に含み、再構成された培地を形成する工程が、前記検出試薬を含んでいる再構成された培地を形成することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記検出試薬が、ホスファターゼ酵素活性に対する酵素基質を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記播種された薄膜培養装置をインキュベートする工程が、前記再構成された培地を２５℃にて７２〜１６８時間にわたってインキュベートすることを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
微生物のコロニーの有無を検出する工程が、好浸透圧性微生物又は好乾性微生物の有無を検出することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
微生物のコロニーの有無を検出する工程が、酵母コロニーの有無を検出することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵母コロニーが、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
微生物のコロニーの有無を検出する工程が、カビコロニーの有無を検出することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記コロニーが、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属のカビ細胞を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記水性希釈剤が、ペプトンの有効濃度を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
微生物を検出するためのキットであって、約１．０〜約１０．２重量％のグリセロールを含んでいる水性希釈剤を含む、キット。
【請求項１７】
更に、ペプトン組成物を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
微生物を検出するためのキットであって、
ペプトンの有効濃度と、
約１．０〜約１０．２重量％のグリセロールと、
から本質的になる水性希釈剤を含む、キット。
【請求項１９】
微生物を増殖させるための薄膜培養装置を更に含み、前記装置が、
頂部面と底部面とを有する防水性基材と、
増殖領域を画定するように、前記基材の前記頂部面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っている、乾燥した冷水で再構成可能な培地であって、前記培地が、グアーガム及び／又はキサンタンガム並びに必要に応じて微生物の増殖を支援する栄養素の混合物を含む、培地と、を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２０】
前記水性希釈剤が、約１．０〜約５．１重量％のグリセロールを含む、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許第６１／６５９，４８９号（２０１２年６月１４日出願）の利益を請求するものであり、参照によりこの開示内容全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
食品工業におけるインジケータ試験は、総従属栄養細菌数、大腸菌群、大腸菌、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属に属する環境微生物、酵母、及びカビ類などの品質指標生物の存在に関する食品の微生物学的試験を包含する。これら指標生物の検出の結果を得るために要する時間を改善するための最近の傾向にもかかわらず、増殖度に基づく酵母及びカビの試験は、結果が得られるまで非常に長い時間（例えば、５〜７日間）を有するままである。結果的に、食品加工業者は、高価な製品が出荷され得る前に、最大一週間待機しなければならないことが頻繁である。このことは、効率の悪い在庫管理をもたらす。
【０００３】
ある種の酵母及びカビは、観測可能なコロニーを形成するまで、現行の従来の微生物培地上で丸７日間のインキュベーションを必要とする。低水分性／低水分活性（Ａｗ）食品の中に、酵母及びカビは一般的に見出される。これら微生物は、一般的に好浸透圧性酵母及び好乾性カビとみなされる。好浸透圧性及び好乾性微生物のいくつかは、微生物培地上での増殖度に基づく試験用に試料を調製する場合、浸透圧ショックから微生物を保護する濃度で溶解した溶質（例えば、炭水化物）を含有する試料懸濁培地（例えば、水性希釈剤）の使用を必要とする。一般的に使用される媒質は、ショ糖、グルコース又はグリセロールである。例えば、Ａｂｄｕｌ−Ｒａｏｕｆらは、参照によりこの内容全体が本明細書に組み込まれる、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｄｉｌｕｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａ  ｆｏｒ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｎｇ  Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ  ｉｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｗａｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｏｄｓ」（Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４，１９：２８〜３１）と題する論文で、４０％又は５０％（ｗ／ｗ）のグルコース若しくは１８％又は２６％（ｗ／ｗ）のグリセロールを含む希釈剤の使用を報告している。
【０００４】
加えて、これら選好性生物の増殖を容易にするよう適切な浸透性の環境を提供するために、好乾性微生物を培養するために使用される半固体の微生物増殖培地は、典型的には、少なくとも１８％（ｗ／ｗ）のグリセロール、少なくとも約３０％（ｗ／ｗ）のグルコース又は少なくとも２０％（ｗ／ｗ）のショ糖を含む。これら培地のいくつかを含有するペトリ皿は、使用前に拡散昼光中で調整されねばならず、これによって、追加の時間と工程を試験方法に付加する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
試料中の酵母及びカビ微生物を検出するためのより簡潔で、迅速な方法に対する要求が未だにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概して、本発明は、試料中の微生物の検出を目的とする。具体的には、本開示は、酵母又はカビ微生物を検出するために、薄膜培養装置を使用する新しい方法において新しい試料希釈剤を提供する。本方法は、好浸透圧性酵母又は好乾性カビ微生物を検出するために使用することができる。好都合なことに、本方法は、好浸透圧性酵母及び好乾性カビを含む酵母及びカビ微生物を検出し、必要に応じて、これらを定量するために、市販の薄膜培養装置と共に使用することができる。本方法では、好浸透圧性又は好乾性菌類を増殖させかつ検出するために、低水分活性を有する増殖培地を調製することが不要になる。
【０００７】
一態様では、本開示は、試料中の酵母又はカビ微生物を検出する方法を提供する。本方法は、試料を水性希釈剤と混合し、接種材料を形成する工程と、接種材料の所定量を、薄膜培養装置の増殖領域に接触させる工程と、播種された薄膜培養装置を一定時間にわたってインキュベートする工程と、増殖領域内の微生物のコロニーの有無を検出する工程と、を含む。水性希釈剤は、約１．０〜約１０．２重量％のグリセロールを含み得る。装置は、頂部面と底部面とを有する防水性基材と、基材の頂部面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っている、乾燥した冷水で再構成可能な培地とを含み得る。この培地は、グアーガム及び／又はキサンタンガム並びに必要に応じて微生物の増殖を支援する栄養素の混合物を含み得る。ｙこの実施形態のいずれかにおいて、培地を、接種材料の所定量に接触させる工程は、培地の所定区域を接種材料の所定量に接触させる工程を更に含み得る。
【０００８】
別の態様では、本開示は、試料中の酵母又はカビ微生物の有無を検出する方法を提供する。本方法は、薄膜培養装置の増殖領域を、水性希釈剤の所定量で水和させる工程と、播種された薄膜培養装置を一定時間にわたってインキュベートする工程と、増殖領域内の微生物のコロニーの有無を検出する工程と、を含み得る。水性希釈剤は、１．０〜約１０．２重量％のグリセロールを含み得る。薄膜培養装置は、頂部面と底部面を有する防水性基材と、基材の頂部面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っている、乾燥した冷水で再構成可能な培地とを含み得る。この培地は、グアーガム及び／又はキサンタンガム並びに必要に応じて微生物の増殖を支援する栄養素の混合物を含み得る。
【０００９】
上記実施形態のいずれかにおいて、カバーシートは、第１の表面と第２の表面とを備えることができ、第１の表面は、これに付着した乾燥したゲル化剤を含み、カバーシートを再構成された培地の上に配置させる工程は、カバーシートの第１の表面の一部を再構成された培地に接触させる工程を含む。上記実施形態のいずれかにおいて、装置は、上面と下面とを有する空気透過性膜を備えることができ、膜の下面は、基材の頂部面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っており、膜の上面は、増殖領域を画定するように、基材の頂部面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っている。上記実施形態のいずれかにおいて、方法は、検出試薬を提供する工程を更に含み得、再構成された培地を形成する工程は、検出試薬を含む再構成された培地を形成する工程を含む。上記実施形態のいずれかにおいて、微生物のコロニーの有無を検出する工程は、好浸透圧性微生物又は好乾性微生物の有無を検出する工程を含み得る。上記実施形態のいずれかにおいて、微生物のコロニーの有無を検出する工程は、酵母又はカビ微生物の有無を検出する工程を含み得る。上記実施形態のいずれかにおいて、水性希釈剤は、ペプトンの有効濃度を含み得る。
【００１０】
更に別の態様において、本開示は、生物を検出するためのキットを提供する。このキットは、約１．０〜約１０．２重量％のグリセロールを含んでいる水性希釈剤を含み得る。任意の実施形態では、キットは、ペプトン組成物を更に含み得る。
【００１１】
更に別の態様において、本開示は、微生物を検出するためのキットを提供する。このキットは、約１．０〜約１０．２重量％のグリセロールから本質的になる水性希釈剤を含み得る。任意の実施形態では、キットは、ペプトン組成物を更に含み得る。
【００１２】
別の態様において、本開示は、微生物を検出するためのキットを提供する。キットは、ペプトンの有効濃度と、約１．０〜約１０．２重量％のグリセロールとから本質的になる水性希釈剤を含み得る。
【００１３】
上記実施形態のいずれかにおいて、このキットは、薄膜培養装置を更に含み得る。本装置は、頂部面と底部面とを有する防水性基材と、基材の頂部面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っている、乾燥した冷水で再構成可能な培地と、を含み得る。この培地は、グアーガム及び／又はキサンタンガム並びに必要に応じて微生物の増殖を支援する栄養素の混合物を含み得る。上記実施形態のいずれかにおいて、このキットは、微生物を検出するための試薬を更に含み得る。
【００１４】
本明細書及び請求項で使用するとき、「空気透過性」は、実質的に、そのエッヂ（複数可）が空気に曝される場合、水平方向（すなわち、その表面に対して平行の方向）で空気に対して十分に透過性であり、培地中の好気性微生物の増殖を支持するために、重層する培地に空気の適切な供給をもたらす膜を示し、
「冷水で再構成可能」は、水中で浮遊性の材料、例えば、室温の水中で分散液、溶液又はゲルを形成する材料を示し、
「冷水可溶性」は、室温の水中で溶液又はゲルを形成する冷水で再構成可能な材料を示し、
「増殖領域」は、そこで微生物を増殖させることを意図する装置の各構成部分を指し、並びに
「粉末」は、例えば、栄養素及び／又はゲル化剤の粒子材料を示し、この粒子は、本発明の装置における使用に好適な平均直径、例えば、約４００μｍ未満の平均直径を有する。
【００１５】
用語「好ましい」及び「好ましくは」とは、特定の状況下で、特定の利益をもたらすことができる、本発明の実施形態を指す。しかしながら、他の実施形態もまた、同じ状況又は他の状況下で、好ましい場合がある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の記載は、他の実施形態が有用でないことを暗示するものではなく、また、本発明の範囲から他の実施形態を排除することを意図するものでもない。
【００１６】
用語「含む」及びその変化形は、これらの用語が、本明細書本文及び特許請求の範囲に現れる場合、限定する意味を有するものではない。
【００１７】
本明細書で使用するとき、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「少なくとも１つの」、及び「１つ以上の」は、互換可能に使用される。したがって、例えば微生物と言う場合には、「１つ以上の」微生物を意味すると解釈することができる。
【００１８】
用語「及び／又は」は、列挙された要素の１つ又は全てを、若しくは列挙された要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
【００１９】
また本明細書では、端点による数値範囲の記載は、その範囲に含まれるすべての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。
【００２０】
上記の本発明の課題を解決するための手段は、本発明の開示されるそれぞれの実施形態又は本発明のすべての実施を説明することを目的としたものではない。以下の説明は、例示的な実施形態をより具体的に例示するものである。本出願の全体にわたるいくつかの箇所で、実施例のリストを通じて指針が提供されるが、それらの実施例は、様々に組み合わせて使用することができる。いずれの場合も、記載される列挙は、あくまで代表的な群としてのみの役割を果たすものであって、排他的な列挙として解釈するべきではない。
【００２１】
これらの実施形態及び他の実施形態の更なる詳細を、添付の図面及び以下の説明文に記載する。他の特徴、目的、及び利点は、説明文及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかとなろう。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本開示の何らかの実施形態が詳細に説明される前に、本発明はその用途で、以下の説明に記載される又は以下の図面に示される構成の詳細及び構成要素の配置に限定されないことを理解すべきである。本発明には他の実施形態が可能であり、本発明は様々な方法で実施又は実行することが可能である。また、本明細書で使用する語法及び専門用語は、説明を目的としたものであり、発明を限定するものとして見なされるべきでない点は理解されるべきである。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、又は「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、及びこれらの変化形は、その後に列記される要素及びそれらの均等物、並びに更なる要素を包むものである。別段の指定又は限定がない限り、用語「接続された」及び「結合された」並びにその変化形は、広義で使用され、直接的及び間接的な接続及び結合の両方を包含する。更に、「接続される」及び「結合される」は、物理的又は機械的な接続若しくは結合に限定されない。本開示の範囲から逸脱することなく、他の実施形態が利用されてもよく、構造的又は論理的な変更がなされてもよいことを理解すべきである。更に、「前方」、「後方」、「上」、「下」といった用語は、各要素の互いに対する関係を説明するためにのみ用いられるものであり、装置の特定の向きを説明すること、装置に必要とされる若しくは求められる向きを指示又は示唆すること、又は本明細書に記載される発明が、使用時にどのように使用、装着、表示、又は配置されるかを特定することを目的とするものでは決してない。
【００２３】
本開示は、全般的には、試料中の酵母及びカビ微生物の検出に使用される増殖度に基づく方法に関する。具体的には、本開示は、試料中の好浸透圧性又は好乾性の微生物（例えば、酵母、糸状菌類）を検出するための方法を提供する。本明細書で使用するとき、「好浸透圧性」とは、高い浸透圧を有する環境内で生き（例えば、耐性を示し）又は、成長する（例えば、増殖する）微生物を指す。好浸透圧性菌類は、頻繁に「好乾性」とも称され、好乾性とは、これら菌類が低水分活性（ａｗ）環境内で増殖することが可能であることを示す。現行の業界基準化は、低水分食品中に存在する酵母及びカビの全てを検出するために少なくとも２つの異なるタイプの培養培地を所定し、これらは、非好乾性微生物を検出するための１つのタイプの培地（例えば、ジクロランローズベンガルクロラムフェニコール（ＤＲＢＣ）寒天、ポテトデキストロース寒天、酸性化ポテトデキストロース寒天、サブロー寒天、グルコース酵母エキスクロラムフェニコール寒天）と、好乾性微生物を検出するための別のタイプの培地（例えば、ジクロラングリセロール（ＤＧ１８）寒天、麦芽塩寒天、グルコース酵母エキスショ糖寒天）である。加えて、現行の実施は、低浸透圧強度希釈剤への曝露から生じる浸透圧ショックが特定の好乾性微生物の回収を低下させる場合があるために、好乾性微生物を検出する方法において高浸透圧強度の希釈剤の使用を奨励している（Ｐ．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ及びＬ．Ｂｅｕｃｈａｔ．１９９５．Ｉｎｔｌ．Ｊ．ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１１〜１８）。
【００２４】
本開示の方法は、好浸透圧性酵母及び好乾性カビを検出するために、薄膜培養装置を使用する。必要に応じて、本方法は、試料中の好浸透圧性及び／又は好乾性微生物のコロニー形成単位の数を定量化する工程を更に含む。好都合なことに、本発明の方法は、作業者が、従来の方法による、別個の培養培地の必要なく、非好浸透圧性及び／又は非好乾性微生物の増殖を検出することを可能にする。加えて、本方法は、従来のピペッティング技術を用いて移動させることが難しい高粘稠な希釈剤を更に不要にする。
【００２５】
好浸透圧性微生物は、例えば、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属するいくつかの非常にゆっくりと増殖する酵母を含む。好浸透圧性酵母の非限定的な例としては、チゴサッカロマイセス・バイリ（Ｚ  ｂａｉｌｉｉ）及びチゴサッカロマイセス・ルーキシィー（Ｚ  ｒｏｕｘｉｉ）が挙げられ、これらは、例えばハチミツ、ジャム、ゼリー等の高い糖含量の食品で日常的に単離される。好乾性微生物はまた、例えば、フザリウム属に属する糸状菌類を含む。好乾性糸状菌類の非限定的な例としては、カビのフザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）が挙げられ、これは、多くの場合、小麦粒及び穀粒で見出される。これらの比較的ゆっくりとした増殖速度に加えて、好乾性酵母及びカビは、試料調製及び増殖プロセス中に、浸透圧安定性を保存するために、特殊な希釈剤の使用を必要とする。
【００２６】
本開示の方法は、試験される試料と、約１．０〜約１０．２重量％のグリセロールを含む水性希釈剤と、微生物の増殖を容易にするための冷水で再構成可能な培地を含む薄膜培養装置とを使用する工程を含む。本方法は、試料を水性希釈剤と混合させて、接種材料を形成する工程と、接種材料の所定量を薄膜培養装置の増殖領域に接触させる工程と、播種された薄膜培養装置を一定時間にわたってインキュベートする工程と、増殖領域内の微生物のコロニーの有無を検出する工程と、を更に含む。
【００２７】
試験される試料は、例えば、好浸透圧性酵母又は好乾性カビ微生物を含める酵母又はカビを含む可能性がある任意の試料であり得る。好適な試料の非限定的な例としては、環境試料（例えば、表面のスワブ）、飲料及び食品試料（原材料、インプロセス試料、及び完成製品試料）が挙げられる。
【００２８】
試験される試料としては、液体並びに液体媒質中に溶解又は懸濁された固体（複数可）が挙げられる。固体試料は、分解されてもよく（例えば、混合、超音波処理、均質化によって）、液体（例えば、水、緩衝液、ブイヨン）中で懸濁されてもよい。いくつかの実施形態では、試料材料を含む試料捕集デバイス（例えば、拭取り検体、スポンジ）が該方法において使用されてもよい。任意の実施形態において、試料材料を本方法で使用する前に、試料採取装置から、その試料材料を溶離させる（例えば、すすぐ、擦り落とす、搾り出す）ことができる。いくつかの実施形態では、液体又は固体試料は、液体（例えば、水、緩衝液、ブイヨン）中で希釈されてもよい。
【００２９】
本開示の水性希釈剤は、試料を希釈するプロセス中に、浸透圧強度を溶液に提供するために、並びに薄膜培養装置内の再構成された培地に追加の浸透圧強度を提供するために、炭水化物媒質を含む。好適な炭水化物は、例えばグリセロールである。この炭水化物は、例えば、約１．０重量％〜約１０．２重量％（１．０重量％と１０．２重量％を含める）の濃度で水性希釈剤中に存在し得る。本方法の好ましい実施形態では、水性希釈剤は、約１．０重量％〜５．１重量％のグリセロールを含む。本方法のより好ましい実施形態では、水性希釈剤は、約２．０重量％〜５．１重量％のグリセロールを含む。
【００３０】
必要に応じて、水性希釈剤は、微生物の回収及び／又は増殖を容易にするために、１つ以上の栄養素の有効濃度を更に含んでもよい。好ましい栄養素は、ペプトンである。微生物の回収及び／又は増殖を容易にするための種々のペプトンの有効濃度は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｒｏｎａｌｄ  Ａｔｌａｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ，第３版，２００４；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ中の２〜４を参照）。好ましい実施形態では、水性希釈剤は、０．１重量％の細菌ペプトンを含む。十分な栄養素が水性希釈剤に提供される場合、薄膜培養装置は栄養素を含む必要はない。好ましい水性希釈剤は、約０．１重量％のペプトンと、約１重量％〜約１０．２重量％のグリセロールとを含み、より好ましくは、水性希釈剤は、約０．１重量％のペプトンと、約１．０重量％〜約５．１重量％のグリセロールとを含み、更により好ましくは、水性希釈剤は、約０．１重量％のペプトンと、約２．０重量％〜約５．１重量％のグリセロールとを含む。本方法の特に好ましい実施形態では、水性希釈剤は、約０．１重量％のペプトンと、約５．１重量％のグリセロールとを含む。
【００３１】
必要に応じて、水性希釈剤は、検出試薬及び／又は緩衝剤を更に含んでもよい。好適な検出試薬の非限定的な例としては、染料（ｐＨ指示染料、酸化還元染料）、発色酵素基質、及び蛍光酵素基質が挙げられる。緩衝剤の非限定的な例としては、例えば、リン酸二ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、及び前述の緩衝剤の任意の２つ又はそれ以上の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、希釈剤は、塩化ナトリウムを更に含んでもよい。
【００３２】
本開示の方法で使用される薄膜培養装置は、例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，５６５，７８３号及び同第５，０８９，４１３号に開示されている器具などの乾燥培養培地装置を含む。薄膜培養装置は、頂部面と底部面とを有する防水性基材と、増殖領域を画定するように、基材の頂部面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っている、乾燥した冷水で再構成可能な培地であって、該培地がグアーガム、キサンタンガム、並びに必要に応じて微生物の増殖を支持する栄養素の混合物を含む、培地と、カバーシートと、を備える。必要に応じて、薄膜培養装置は、カバーシートを更に備えてもよい。カバーシートは、第１の表面と第２の表面とを備え、この第１の表面は、これに付着された乾燥したゲル化剤を含む。乾燥したゲル化剤は、グアーガム、キサンタンガム、イナゴマメゴム、又は前述のガムの任意の２つ又はそれ以上の混合物を含み得る。
【００３３】
必要に応じて、薄膜培養装置は、指示薬（例として、例えば、発色酵素基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸などの酵素基質）を備えてもよい。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本装置は、米国特許第５，０８９，４１３号に記載されている、空気透過性膜を更に備えてもよい。この膜は、上面及び下面を有し得る。薄膜培養装置において、膜の下面は、基材の頂部面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っていることができ、再構成された培地は、増殖領域を画定するように、膜の上面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っていることができる。かかる空気透過性膜は、好気性微生物の増殖を容易にするよう働くことが可能である。空気透過性膜を有する好適な薄膜培養装置の非限定的な例としては、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ミネソタ州のセントポール）から入手可能な３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ  Ｙｅａｓｔ  ＆  Ｍｏｌｄ  Ｃｏｕｎｔ  Ｐｌａｔｅが挙げられる。
【００３５】
本発明の一態様では、試料は、水性希釈剤と混合され、接種材料を形成する。試料は、上述のように、液体、固体、若しくは液体及び固体の混合物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この接種材料は、試料採集装置（例えば、綿棒又はスポンジ）の表面から採集した材料を希釈剤に分配することによって形成される。いくつかの実施形態では、試料の容量又はグラム当たりの微生物の数を計算するために使用され得る希釈係数を画定するように、試料の所定量（例えば、１ミリリットル、１グラム）が、希釈剤の所定容量（例えば、９ミリリットル、９９ミリリットル）と混合される。試料を希釈剤と混合する工程は、必要に応じて、混合物を均質化するために、混合物を渦攪拌及び／又は消化させるなどのプロセスを含み得る。
【００３６】
接種材料を形成した後に、方法は、接種材料の所定量を、再構成可能な培養培地に接触させて、再構成された培地を形成する工程を含む。水性希釈剤が、０．１％（ｗ／ｖ）のペプトンを含む実施形態では、再構成された培地もまた０．１％（ｗ／ｖ）のペプトンを含むことになる。典型的には、所定容量とは、約１ミリリットルであるが、接種材料の量は、薄膜培養装置で使用される増殖区域の寸法で異なり得る（すなわち、より少い接種材料容量が使用されるならば、これと比例してより小さい増殖区域が薄膜培養装置で使用されるべきである）。逆に、より大きな接種材料容量が使用されるならば、これに比例してより大きな増殖区域が使用されるべきである。液体試料移動装置（例えば、ピペット）は、一般的に、培養装置に播種するために使用される。試料が培養装置に移動された後に、乾燥及び／又は汚染を防止するために、（例えば、米国特許第４，５６５，７８３号及び同第５，０８９，４１３号に記載されているカバーシートを使用して）装置は一般的に被覆される。
【００３７】
薄膜培養装置のいくつかの実施形態では、カバーシートは、第１の表面と第２の表面を備え、この第１の表面は、それに付着した乾燥ゲル化剤（例えば、グアーガム、キサンタンガム、イナゴマメゴム、若しくはグアーガム、イナゴマメゴム、及び／又はキサンタンガムの混合物を含む乾燥ゲル化剤）を含む。これら実施形態では、カバーシートを、再構成された培地の上に配置する工程は、カバーシートの第１の表面の一部を再構成された培地に接触させる工程を含み得る。
【００３８】
いくつかの実施形態では、接種材料の所定量を再構成可能な培養培地に接触させて、再構成された培地を形成する工程は、培地の所定区域を接種材料の所定量に接触させる工程を更に含む。この所定区域は、例えば、米国特許第５，０８９，４１３号の図２に示すような、スペーサの正孔によって画定されてもよい。あるいは、所定区域は、例えば、薄膜培養装置に播種するために使用される付属の装置（例えば、ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ薄膜培養装置に播種するための３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能なスプレッダなどのスプレッダ）によって画定されてもよい。
【００３９】
代替接種法を使用して、本開示の方法は、表面平板培養法に使用され得る。表面平板培養法は、試料を前水和させた薄膜培養装置の表面に塗布する工程を伴う。試料は、例えば、平板線条接種法によって、表面接触法（例えば、ロダック平板法に類似する）によって、試料捕捉装置（例えば、綿棒）を前水和させた培地上を転がし又はストリークすることによって、若しくは液体又は固体試料を前水和させた薄膜培養装置の表面に移すことによって、塗布され得る。この実施形態では、薄膜培養装置は、試料材料を含まない水性希釈剤の所定の量（例えば、１ミリリットル）で再水和される。水性希釈剤は、約１．０〜約１０．２重量％のグリセロールを含む。必要に応じて、水性希釈剤は、ペプトン（例えば、約０．１重量％のペプトン）を更に含む。希釈剤は、本明細書に記載されるように、増殖区域の上に散布される。カバーフィルム（あるならば）が増殖区域の上を塞ぎ、冷水ゲル化剤が、約５〜３０分以上の間ゲル化させる（例えば、室温で）。培養装置は、その後開けられ、試料が前水和させた培養装置の増殖区域に塗布される。
【００４０】
上記実施形態のいずれかに従って、薄膜培養装置が播種された後に、本方法は、接種された培養装置を一定時間にわたってインキュベートする工程を含む。培養装置は、好乾性微生物の増殖に好適である温度でインキュベートされる。好乾性微生物の増殖に好適な温度は、当該技術分野において既知であり、例えば、周囲温度（約２５℃）〜約３２℃の範囲のインキュベーション温度が挙げられる。特定の好ましい実施形態では、播種された薄膜培養装置は、２５℃又は２８℃でインキュベートされる。
【００４１】
本方法は、微生物のコロニーの有無を検出する工程を更に含む。コロニーの存在を検出する工程は、培養装置の増殖区域内の微生物コロニーを視覚的に観察する工程を含み得る。コロニーは、それが再構成された培養培地と対照的である方法で着色されている（例えば、色素によって発色し、及び／又は発色性又は蛍光性酵素基質を代謝させることによって）ために、観察することができる。したがって、いくつかの実施形態では、微生物の増殖を検出する工程は、検出試薬（蛍光性又は発色性酵素基質）の代謝産物を検出することを含み得る。
【００４２】
加えて、又は代わりに、コロニーの存在を検出する工程は、薄膜培養装置の画像を取得するための撮像システムを使用し、画像を観測又は解析する工程を含み得る。画像を解析する工程は、画像解析プロトコルに従って画像を解析するために、画像処理装置を使用することを含んでもよい。コロニー検出用の自動化システムの非限定的な例は、３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ  ＰＬＡＴＥ  Ｒｅａｄｅｒ（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮから入手可能）である。
【００４３】
この方法によると、好乾性コロニーの存在を検出する工程は、インキュベーション（例えば、２５℃にてのインキュベーション）の５日後にコロニーの存在を検出することを含む。好乾性微生物のコロニーのいくつかは、３日のインキュベーション後に検出可能であり得る。
【００４４】
本開示の方法によると、微生物のコロニーの有無を検出する工程は、試料中の好乾性コロニー形成単位の数を定量化することを更に含み得る。これは、増殖ゾーン内のコロニーの数を計測し、コロニーの数を希釈係数で掛けて、非希釈試料のグラム（又はミリリットル）当たりの好浸透圧性及び／又は好乾性微生物のコロニー形成単位の数を得ることによって、簡単に行われる。
【００４５】
本開示はまた、好浸透圧性又は好乾性微生物を検出するためのキットを提供する。キットは、約１．０〜約１０．２重量％のグリセロールを含んでいる水性希釈剤を備えることができる。この希釈剤は、例えば、本明細書に記載される微生物を検出するための方法の任意の実施形態で使用され得る。代替実施形態では、このキットは、約１．０〜約１０．２重量％のグリセロールから本質的になる水性希釈剤を備えることができる。上記実施形態のいずれかにおいて、キットは、ペプトン組成物を更に備えてもよい。いくつかの実施形態では、ペプトン組成物は、水性希釈剤に添加され得る、必要に応じて所定の量で提供された乾燥した、粉末状のペプトン組成物を備えてもよい。いくつかの実施形態では、ペプトン組成物は、ペプトンを含んでいる溶液（例えば、水溶液）を備えてもよい。必要に応じて、ペプトン溶液は、無菌溶液として提供され得る。
【００４６】
ペプトン溶液は、本開示により薄膜培養装置内で水性希釈剤と混合される場合、好乾性微生物の回収及び／又は増殖を容易にするために有効である再構成された培地中のペプトンの最終濃度をもたらすペプトンの、ある濃度を含む。ペプトンの有効濃度の例は、０．１重量％である。したがって、例として、本開示によるキットは、１０％（ｗ／ｖ）のペプトンを含有する溶液を備え得る。この例示の１０％ペプトン溶液は、試料を水性希釈剤と混合する前後で、水性希釈剤で希釈され（９９部の水性希釈剤当たり１部のペプトン）、最終混合物中のペプトンの有効量を得ることができる。
【００４７】
代替実施形態では、本開示によるキットは、上記記載のペプトンの有効濃度と、約１．０〜約１０．２重量％のグリセロールとから本質的になる水性希釈剤を備えることができる。
【００４８】
本開示によるキットの上記実施形態のいずれかにおいて、キットは、微生物を増殖させるための薄膜培養装置を更に備えてもよい。装置は、頂部面の底部面とを有する棒水性基材と、増殖領域を画定するように、基材の頂部面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っている、乾燥した冷水で再構成可能な培地あって、該培地が、グアーガム、キサンタンガム、並びに必要に応じて微生物の増殖を支援する栄養素の混合物を含む、培地と、カバーシートと、を備え得る。
【００４９】
キットの上記実施形態のいずれかにおいて、水性希釈剤は、約１．０〜約５．１重量％のグリセロールを含み得る。キットの上記実施形態のいずれかにおいて、キットは、本明細書に記載される、微生物を検出するための試薬を更に備え得る。いくつかの実施形態では、検出試薬は、水性希釈剤内に配置され得る。キットの上記実施形態のいずれかにおいて、キットは、試料中の好浸透圧性酵母及び／又は好乾性カビ微生物を検出するための使用説明書を更に含み得る。使用説明書は、本明細書に開示されている方法の実施形態のいずれかに従って、好浸透圧性又は好乾性微生物を検出する方法を含み得る。
【００５０】
実施形態
実施形態Ａは、試料中の酵母又はカビ微生物を検出する方法であって、該方法が、
試料を水性希釈剤と混合し、接種材料を形成する工程
であって、該水性希釈剤が、１．０〜約１０．２重量％のグリセロールを含む、工程と、
接種材料の所定量を、薄膜培養装置の増殖領域に接触させる工程であって、該装置が、
頂部面と底部面とを有する防水性基材と、
基材の頂部面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っている、乾燥した冷水で再構成可能な培地であって、該培地がグアーガム及び／又はキサンタンガム並びに必要に応じて微生物の増殖を支援する栄養素の混合物を含む、培地と、を含む、工程と、
播種された培養装置をインキュベートする工程と、
増殖領域内の微生物のコロニーの有無を検出する工程と、を含む。
【００５１】
実施形態Ｂは、試料中の酵母又はカビ微生物を検出する方法であって、該方法が、
薄膜培養装置の増殖領域を、水性希釈剤の所定量で水和する工程であって、
前記水性希釈剤が、１．０〜約１０．２重量％のグリセロールを含み、
前記薄膜培養装置が、
頂部面と底部面とを有する防水性基材と、
基材の頂部面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っている、乾燥した冷水で再構成可能な培地であって、該培地が、グアーガム及び／又はキサンタンガム並びに必要に応じて微生物の増殖を支援する栄養素の混合物を含む、培地と、を含む工程と、
播種された薄膜培養装置を一定時間にわたってインキュベートする工程と、
増殖領域内の微生物のコロニーの有無を検出する工程と、を含む。
【００５２】
実施形態Ｃは、水性希釈剤が、約１．０〜約５．１重量％のグリセロールを含む、実施形態Ａ又は実施形態Ｂに記載の方法である。
【００５３】
実施例Ｄは、培地を接種材料の所定量に接触させる工程が、該培地の所定区域を、接種材料の所定量に接触させることを更に含む、実施形態Ａ又は実施形態Ｃに記載の方法である。
【００５４】
実施形態Ｅは、カバーシートが、第１の表面と第２の表面とを備え、第１の表面が、それに付着された乾燥したゲル化剤を含み、カバーシートを再構成された培地の上に配置させる工程が、カバーシートの第１の表面の一部を再構成された培地に接触させることを含む、実施形態Ａ〜Ｄのいずれか１つに記載の方法である。
【００５５】
実施形態Ｆは、乾燥したゲル化剤が、グアーガム、キサンタンガム、若しくはグアーガム及びキサンタンガムの混合物を含む、実施形態Ｅに記載の方法である。
【００５６】
実施形態Ｇは、装置が、上面と下面とを有する空気透過性膜を更に備え、膜の下面が、基材の頂部面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っており、再構成可能な培地が、増殖領域を画定するように、膜の上面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っている、実施形態Ａ〜Ｆのいずれか１つに記載の方法である。
【００５７】
実施形態Ｈは、方法が、検出試薬を提供する工程を更に含み、再構成された培地を形成する工程が、検出試薬を含んでいる再構成された培地を形成することを含む、実施形態Ａ〜Ｇのいずれか１つに記載の方法である。
【００５８】
実施形態Ｉは、微生物の増殖を検出する工程が、検出試薬の代謝産物を検出することを含む、実施形態Ｈに記載の方法である。
【００５９】
実施形態Ｊは、検出試薬が、ホスファターゼ酵素活性に対する酵素基質を含む、実施形態Ｈ又は実施形態Ｉに記載の方法。
【００６０】
実施形態Ｋは、接種された薄膜培養装置をインキュベートする工程が、再構成された培地を２５℃にて７２〜１６８時間にわたってインキュベートすることを含む、実施形態Ａ〜Ｊのいずれか１つに記載の方法である。
【００６１】
実施形態Ｌは、再構成された培地をインキュベートする工程が、接種された薄膜培養装置を２８℃にて７２〜１６８時間にわたってインキュベートすることを含む、実施形態Ａ〜Ｊのいずれか１つに記載の方法である。
【００６２】
実施形態Ｍは、微生物のコロニーの有無を検出する工程が、好浸透圧性微生物又は好乾性微生物の有無を検出することを含む、実施形態Ａ〜Ｌのいずれか１つに記載の方法である。
【００６３】
実施形態Ｎは、微生物のコロニーの有無を検出する工程が、好乾性微生物の有無を検出することを含む、実施形態Ｍに記載の方法である。
【００６４】
実施形態Ｏは、酵母コロニーが、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母細胞を含む、実施形態Ｍに記載の方法である。
【００６５】
実施形態Ｐは、微生物のコロニーの有無を検出する工程が、カビコロニーの有無を検出することを含む、実施形態Ｍに記載の方法である。
【００６６】
実施形態Ｑは、コロニーが、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属のカビ細胞を含む、実施形態Ｐに記載の方法である。
【００６７】
実施形態Ｒは、水性希釈剤が、ペプトンの有効濃度を含む、実施形態Ａ〜Ｑのいずれか１つに記載の方法である。
【００６８】
実施形態Ｓは、水性希釈剤が、緩衝剤を更に含む、実施形態Ａ〜Ｒのいずれか１つに記載の方法である。
【００６９】
実施形態Ｔは、微生物を検出するためのキットであり、該キットが、約１．０〜約１０．２重量％のグリセロールを含んでいる希釈剤を含む、キットである。
【００７０】
実施形態Ｕは、微生物を検出するためのキットであり、該キットが、約１．０〜約１０．２重量％のグリセロールから本質的になる水性希釈剤を含む、キットである。
【００７１】
実施形態Ｖは、ペプトン組成物を更に含む、実施形態Ｔ又は実施形態Ｕに記載のキットである。
【００７２】
実施形態Ｗは、微生物を検出するためのキットであって、該キットが、
ペプトンの有効濃度と、
約１．０〜約１０．２重量％のグリセロールと、から本質的になる水性希釈剤を含む、キットである。
【００７３】
実施形態Ｘは、微生物を増殖させるための薄膜培養装置を更に含み、該装置が、
頂部面と底部面とを有する防水性基材と、
増殖領域を画定するように、基材の頂部面の少なくとも一部に固定されてこれを覆っている、乾燥した冷水で再構成可能な培地であって、該培地が、グアーガム及び／又はキサンタンガム並びに必要に応じて微生物の増殖を支援する栄養素の混合物を含む、培地と、を含む、実施形態Ｔ〜Ｗのいずれか１つに記載のキットである。
【００７４】
実施形態Ｙは、水性希釈剤が、約５．１重量％のグリセロールを含む、実施形態Ｘのいずれか１つに記載のキットである。
【００７５】
実施例Ｚは、微生物を検出するための試薬を更に含む、実施形態Ｔ〜Ｙのいずれか１つに記載のキット。
【００７６】
実施形態ＡＡは、試薬が、水性希釈剤内に配置されている、実施形態Ｚに記載のキットである。
【００７７】
本発明の目的及び利点は、以下の実施例によって更に例示されるが、これらの実施例において列挙された特定の材料及びその量は、他の諸条件及び詳細と同様に本発明を過度に制限するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００７８】
好浸透圧性酵母を検出するための方法
０．１％のペプトン水ブランク（カタログ番号＃  Ｄ２９９）を、Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｎｔａ  Ｍａｒｉａ，ＣＡ）から入手した。グリセロール（カタログ番号＃  ＧＸ０１８５−６；＞９５％  ＡＣＳグレードＲＭＤ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ  ＭＡから取得）を、個々のペプトン水ブランクに加え、０％（ｖ／ｖ）、１％（ｖ／ｖ）、２％（ｖ／ｖ）、５％（ｖ／ｖ）及び１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度を達成した。酵母菌株チゴサッカロマイセス・バイリ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）（ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−４５４９）及びチゴサッカロマイセス・ルーキシィー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２８２５３）を、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｉｎｃ（Ｓｔ  Ｃｌｏｕｄ  ＭＮ）から入手した。各菌株の一回凍結乾燥したディスクを、温かい（３７℃）の０．１％ペプトン水の１０ミリリットルに別々に加え、凍結乾燥したディスク材料から微生物を再懸濁させた。薄膜培養装置（３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ  Ｙｅａｓｔ  ＆  Ｍｏｌｄ  Ｃｏｕｎｔ  Ｐｌａｔｅｓ）を、３Ｍ  ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から入手した。
【００７９】
トップフィルムを持ち上げ、接種材料を底部フィルム上に配置することによって、二通りの３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭプレートを、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種（Ｚ．ｂａｉｌｉｉ  及びＺ．ｒｏｕｘｉｉのそれぞれ）の再懸濁させた凍結乾燥培養物の系列希釈した試料で接種した。製造業者（３Ｍ）によって提供された散布装置を使用して、試料を、所望の表面積（３０ｍｍ２）に均一に散布し、播種したプレートを２５℃で５時間インキュベートした。可視のコロニー（ベージュ色又は水色）は、細菌増殖の指標であり、プレート上に存在する着色したコロニーの数を計測することによって、これを数えた。結果を表１に示す。
【００８０】
【表１】
2015519077.tif 000002
−：可視の増殖なし
＋：比較的少数の可視のコロニー
＋＋：比較的多数の可視のコロニー
【００８１】
本明細書に引用するすべての特許、特許出願及び公開公報、並びに電子的に入手可能な資料の開示内容の全体を援用する。本出願の開示内容と本明細書に援用されるいずれかの文書の開示内容との間になんらかの矛盾が存在する場合には、本出願の開示内容が優先するものとする。上記の詳細な説明及び実施例は、あくまで理解を助ける明確さのために示したものである。これらによって不要な限定をするものと理解されるべきではない。本発明は、示され記載された厳密な詳細事項に限定されるべきではないが、それは当業者に対して明らかな変形が特許請求の範囲において規定された本発明の範囲に包含されるからである。
【００８２】
全ての見出しは、読者の利便性のためであり、指定のない限り、その見出しに続く本文の意味を限定するために使用するべきではない。
【００８３】
本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な改変を行うことが可能である。これら及び他の実施形態は以下の「特許請求の範囲」に含まれる。
【国際調査報告】
2015519077.tif 000003
2015519077.tif 000004
2015519077.tif 000005
2015519077.tif 000006