(57)【要約】  ポルフィリン−リン脂質複合体を含む二重層を含む小胞であって、前記ポルフィリン−リン脂質複合体は、ポルフィリン、ポルフィリン誘導体又は、リン脂質の脂質側鎖、好ましくはsn-1又はsn-2の位置に、共有結合するポルフィリン類似物質を含み、１−１００ミクロンの直径である前記小胞を提供する。
2015506671.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポルフィリン−リン脂質複合体を含む二重層を含む小胞であって、
前記ポルフィリン−リン脂質複合体は、ポルフィリン、ポルフィリン誘導体又は、リン脂質の脂質側鎖、好ましくはsn-1又はsn-2の位置に、共有結合する（covalently attached）ポルフィリン類似物質を含み、
１−１００ミクロンの直径である前記小胞。
【請求項２】
前記小胞が１０−５０ミクロンの直径である請求項１に記載の小胞。
【請求項３】
１５−１００モル％の間のポルフィリン−リン脂質複合体を含む請求項１または２に記載の小胞。
【請求項４】
２０−９０モル％の間のポルフィリン−リン脂質複合体を含む請求項１または２に記載の小胞。
【請求項５】
３０−８０モル％の間のポルフィリン−リン脂質複合体を含む請求項１または２に記載の小胞。
【請求項６】
４０−７５モル％の間のポルフィリン−リン脂質複合体を含む請求項１または２に記載の小胞。
【請求項７】
５０−７０モル％の間のポルフィリン−リン脂質複合体を含む請求項１または２に記載の小胞。
【請求項８】
６０−７０モル％の間のポルフィリン−リン脂質複合体を含む請求項１または２に記載の小胞。
【請求項９】
６５−７０モル％の間のポルフィリン−リン脂質複合体を含む請求項１または２に記載の小胞。
【請求項１０】
約７０モル％のポルフィリン−リン脂質複合体を含む請求項１または２に記載の小胞。
【請求項１１】
前記ポルフィリン−リン脂質複合体における前記ポルフィリン、前記ポルフィリン誘導体または前記ポルフィリン類似物質は、ヘマトポルフィリン（hematoporphyrin）、プロトポルフィリン（protoporphyrin）、テトラフェニルポルフィリン（tetraphenylporphyrin）、ピロフェオホルビド（pyropheophorbide）、バクテリオクロロフィル（bacteriochlorophyll）、クロロフィル（chlorophyll）、ベンゾポルフィリン誘導体（benzoporphyrin derivative）、テトラヒドロキシフェニルクロリン（tetrahydroxyphenyl chlorin）、プルプリン（purpurin）、ベンゾクロリン（benzochlorin）、ナフトクロリン（naphthochlorins）、バーディン（verdin）、ロジン（rhodin）、ケトクロリン（keto chlorin）、アザクロリン（azachlorin）、バクテリオクロリン（bacteriochlorin）、トリポルフィリン（tolyporphyrin）、ベンゾバクテリオクロリン（benzobacteriochlorin）、伸長ポルフィリン（expanded porphyrin）およびポルフィリン異性体（porphyrin isomer）からなるグループから選択される請求項１から１０のいずれか１つに記載の小胞。
【請求項１２】
前記伸長ポルフィリンは、テキサフィリン（texaphyrin）、サフィリン（sapphyrin）、又はヘキサフィリン（hexaphyrin）であり、
前記ポルフィリン異性体は、ポルフィセン（porphycene）、逆位のポルフィリン（inverted porphyrin）、フタロシアジン（phthalocyanine）、又はナフタロシアニン（naphthalocyanine）である請求項１１に記載の小胞。
【請求項１３】
前記ポルフィリン−リン脂質複合体における前記リン脂質は、ホスファチジルコリン（phosphatidylcholine）、ホスファチジルエタノールアミン（phosphatidylethanoloamine）、ホスファチジルセリン（phosphatidylserine）、又はホスファチジルイノシトール（phosphatidylinositol）を含む請求項１から１２のいずれか１つに記載の小胞。
【請求項１４】
前記リン脂質は、炭素数１２から２２のアシル側鎖を含む請求項１３に記載の小胞。
【請求項１５】
前記ポルフィリン−リン脂質複合体における前記ポルフィリンは、ピロフェオホルビド−ａ酸（pyropheophorbide-a acid）である請求項１から１０のいずれか１つに記載の小胞。
【請求項１６】
前記ポルフィリン−リン脂質複合体における前記ポルフィリンは、バクテリオクロロフィル誘導体（bacteriochlorophyll derivate）である請求項１から１０のいずれか１つに記載の小胞。
【請求項１７】
前記ポルフィリン−リン脂質複合体における前記リン脂質は、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1-Palmitoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-Phosphocholine）又は1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1-Stearoyl-2-Hydroxy-sn-Gycero-3-Phosphocholine）である請求項１から１０のいずれか１つに記載の小胞。
【請求項１８】
前記ポルフィリン−リン脂質複合体は、ピロ脂質（pyro-lipid）である請求項１から１０のいずれか１つに記載の小胞。
【請求項１９】
前記ポルフィリン−リン脂質複合体は、オキシ−バクテリオクロロフィル−脂質（oxy-bacteriochlorophyll-lipid）である請求項１から１０のいずれか１つに記載の小胞。
【請求項２０】
前記ポルフィリンは、炭素数０から２０の炭素鎖リンカー（carbon chain linker）により、前記リン脂質におけるグリセロール基（glycerol group）に結合される請求項１から１４のいずれか１つに記載の小胞。
【請求項２１】
前記小胞は、実質的に球状である請求項１から２０のいずれか１つに記載の小胞。
【請求項２２】
前記二重層の内表面に結合する酵素を含む請求項１から２１のいずれか１つに記載の小胞。
【請求項２３】
前記二重層の残部（remainder）は、実質的に他のリン脂質が含まれる請求項１から２２のいずれか１つに記載の小胞。
【請求項２４】
前記他のリン脂質は、ホスファチジルコリン（phosphatidylcholines）、ホスファチジルエタノールアミン（phosphatidylethanolamines）、ホスファチジン酸（phosphatidic acid）、ホスファチジルグリセロ−ル（phosphatidylglycerols）、及びそれらの組合せからなるグループから選択されたものからなるグループから選択される請求項２３に記載の小胞。
【請求項２５】
前記他のリン脂質は、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジン酸（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidic acid）（DPPA）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine）（DPPC）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）（DSPC）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）（DMPC）、1,2-ジベヘノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dibehenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）（DBPC）、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン（1,2-diarachidoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine）（DAPC）、1,2-ジリグノセロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン（1,2-dilignoceroyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine）（DLgPC）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-[ホスホル-rac-(1-グリセロール)]（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-[phosphor-rac-(1-glycerol)]）（DPPG）、L-α-ホスファチジルコリン（L-α-phosphatidylcholine）、及びそれらの組み合わせからなるグループから選択される請求項２３に記載の小胞。
【請求項２６】
さらにコレステロールを含む請求項２３から２５のいずれか１つに記載の小胞。
【請求項２７】
前記コレステロールは、残部の他のリン脂質（remainder other phospholipid）とコレステロールとのモル比率が３：２の状態で存在する請求項２６に記載の小胞。
【請求項２８】
小胞を調製する方法であって、
ａ，ポルフィリン−リン脂質複合体を含む溶液を調製すること、
ｂ，前記溶液を脱水及び再水和し、結果として生じた脂質膜に交流電流をくわえること、を含み、
前記ポルフィリン−リン脂質複合体はポルフィリン、ポルフィリン誘導体又はリン脂質の脂質側鎖、好ましくはsn-1又はsn-2の位置に、共有結合する（covalently attached）ポルフィリン類似物質を含み、
前記溶液は任意でさらにリン脂質及びコレステロールを含む方法。
【請求項２９】
前記溶液は、前記交流電流を供給するワイヤ上にコートされ、好ましくは白金ワイヤ上にコートされる請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記溶液は、溶媒としてクロロホルムを含む請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記交流電流は、アルドゥイーノマイクロコントローラ（Arduino microcontroller）により制御される請求項２８から３０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
図１ａ又は１ｃに記載されるように、前記アルドゥイーノマイクロコントローラは回路の一部である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１から２６のいずれか１つに記載の小胞を調製するための請求項２８から３２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３４】
請求項２８から３２のいずれか１つに記載の方法によって製造される小胞。
【請求項３５】
請求項２８から３２のいずれか１つに記載の方法によって製造される請求項１から２７のいずれか１つに記載の小胞。
【請求項３６】
小胞の開放制御の方法であって、
請求項１から２７のいずれか１つに記載の小胞を調製すること、
前記小胞を開放できるレーザー又は他の光源、好ましくはキセノン又はハロゲンランプで前記小胞を照射すること、
を含む方法。
【請求項３７】
前記開放制御は、前記小胞の二重層の所定の位置で行われ、
前記位置は、前記レーザーにより照射される請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記開放制御は、所定の時間で行われる請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記開放制御は、顕微鏡下で行われる請求項３６から３８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４０】
前記レーザーのパワーは、約660μWである請求項３６から３９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４１】
前記レーザーは、405nmの波長を有する請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記小胞は4mM未満の塩濃度を有する溶液に存在する請求項３６から４１のいずれか１つに記載の小胞。
【請求項４３】
前記開放のサイズはレーザーフルエンスのレベルにより比例的に制御される請求項３６から４２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４４】
請求項１から２７のいずれか１つに記載の小胞のバイオリアクターとしての使用。
【請求項４５】
小胞において少なくとも２つの試薬の間で生体反応を実行する方法であって、
ａ，その中に被包される第一の試薬を有する請求項１から２７のいずれか１つに記載の小胞を調製すること、
ｂ，第二の試薬の前記小胞の中への侵入を許容するために、請求項３６から４２のいずれか１つに記載の方法に基づき、前記小胞の開放制御を実行し、前記小胞に自己閉鎖することを任意に許容すること、
ｃ，前記生体反応が起こることを許容すること、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１１年１２月８日に提出した米国仮特許出願６１／５６８，３５２号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明はポルフィリン−リン脂質小胞並びに、より好ましくは、空間的及び時間的に制御される開放と閉鎖を可能とする巨大ポルフィリン−リン脂質小胞の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
リン脂質−包囲（Phospholipid-enclosed）区画は、内外の生体分子と化学物質との間で一般的境界としての役目を果たす二重層とともに、細胞及び細胞内のホメオスタシスにおいて中心的な役割を果たす。想定される前生物的二重層（prebiotic bilayers）は、どのように細胞が生体分子の製造及び移動を制御するようになったかを理解する事及び模倣する事を検討する中で再現された(1-3参照)。全体的な膜統合性を破壊することなく、二重層を通過する分子の動きを許容するために、広範囲のタンパク質をベースとした輸送システムは生体の中で進化した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、それらの輸送システムは、通常はあるカーゴ（cargo）に特異的であり、天然の又は合成されたリン脂質−封入区画の内部への多目的通路（general purpose gateways）として適切ではない。そのため、電気穿孔（electroporation）や熱ショックなどの破壊的手法は、細胞膜を通り抜けてＤＮＡなどの生体分子が移動することを許容するために発達した（4,5参照）。最近、電気穿孔は、ナノ粒子合成のための巨大小胞を融合するために使用された。（6参照）いくらかの適用により非常に実用的であるが、それらの方法は制御が容易ではない。膨張し、巨大な脂質小胞の開放及び閉鎖はうまく特性化されているが、処理は容易に制御可能でなく、多数の適用が起きないようにする高粘度溶媒を伝統的に使用する。（7参照）二重層浸透性（bilayer permeability）のより正確な制御は、局所的電気穿孔、金ナノ粒子の基部加熱（proximal heating）及び電気注入（electroinjection）などの新手の手法を使用することで達成された。（8-10参照）
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ある側面によれば、ポルフィリン−リン脂質複合体を含む二重層を含む小胞であって、ポルフィリン−リン脂質複合体は、ポルフィリン、ポルフィリン誘導体又は、リン脂質の脂質側鎖、好ましくはsn-1又はsn-2の位置に、共有結合する（covalently attached）ポルフィリン類似物質を含み、１−１００ミクロンの直径である小胞を提供する。
【０００６】
さらなる側面によれば、小胞を調製する方法であって、ポルフィリン−リン脂質複合体を含む溶液を調製することを含み、そこではポルフィリン−リン脂質複合体はポルフィリン、ポルフィリン誘導体又はリン脂質の脂質側鎖、好ましくはsn-1又はsn-2の位置に、共有結合する（covalently attached）ポルフィリン類似物質を含み、そこでは溶液は任意でさらにリン脂質及びコレステロールを含み、溶液を脱水し、結果として生じた脂質膜に交流電流をくわえること、を含む方法が提供される。好ましくは、溶液は交流電流を供給するワイヤ上にコートされ、好ましくは白金ワイヤ上にコートされる。
【０００７】
さらなる側面によれば、ここに記載される方法により製造される小胞が提供される。
【０００８】
さらなる側面によれば、ここに記載される方法により製造されるここに記載される小胞が提供される。
【０００９】
さらなる側面によれば、ここに記載される小胞を調製すること、小胞を開放できるレーザー又は他の光源、好ましくはキセノン又はハロゲンランプで小胞を照射すること、を含む小胞の開放制御の方法が提供される。好ましい様態としては、開放制御は小胞の二重層の所定の位置で行われ、前記位置は、レーザーにより照射される。開放制御は、より好ましくは所定の時間で行われる。好ましい様態としては、開放制御は顕微鏡下で行われる。
【００１０】
さらなる側面によれば、ここに記載される小胞のバイオリアクターとしての使用が提供される。
【００１１】
さらなる側面によれば、小胞において少なくとも２つの試薬の間で生体反応を実行する方法が提供され、当該方法は、その中に被包される第一の試薬を有するここに記載される小胞を調製すること、第二の試薬の小胞の中への侵入を許容するために、ここに記載される方法に基づき、小胞の開放制御を実行し、小胞に自己閉鎖することを任意に許容し、生体反応が起こることを許容すること、を含む。
【００１２】
本発明の実施形態は、下記の記載及び添付の図面を参照することで最もよく理解することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１ａ】図１は、自己消色（self-quenched）巨大ポルフィリン小胞（GPV）の電気的形成（electroformation）を示す。（ａ）低いコスト、オープンソースマイクロコントローラ及び共通実験室設備（common lab equipment）を使用するGPV電気的形成のために使用される実験用の設定。回路図は左上に示される。ＡＣ電圧（V mod.）に接続される一方のポテンションメーターと、周波数（f mod.）に接続される他方。矩形波出力は二つの白金ワイヤの間に示される円の中に表示される。装置設定は右に示される。左の挿入図は共焦点顕微鏡画像及びワイヤ上に形成されるGPVの概要図。
【図１ｂ】（ｂ）白金ワイヤ上で、又はスクロースとともに形成されるGPVの二重層中の蛍光消色。それぞれの画像で同様に設定される共焦点顕微鏡蛍光（Confocal microscope fluorescence）。10μmのスケールバーが示される。
【図１ｃ】（ｃ）（ａ）に示される回路のより詳細な回路図。
【図２ａ】図２は、GPV開放及び自己シールを示す。（ａ）７０モル％のピロ脂質（pyro-lipid）を含み、レーザー照射（白い鎖線の円）で開放され自己シールされるGPV。矢印はGPVの開放を示す。１０ミクロンのスケールバーは表示される。
【図２ｂ】（ｂ）GPVの繰り返される開放と自己シール。矢印はレーザーパルスを行う時間を示す。
【図２ｃ】（ｃ）レーザーの力を変化させてレーザー照射に応答するGPV。頻度図はバー毎に１０の別々のGPV照射から得られた結果に基づく。
【図２ｄ】（ｄ）２００ｍｓ照射時間（200ms irradiation time）を使用し、照射直径（irradiation diameter）を変化させてレーザー照射に応答するGPV。頻度図はバー毎に１０の別々のGPV照射から得られた結果に基づく。
【図３】図３は、GPV細孔における端部張力の概算を示す。典型的細孔開放は時間関数としてのR2ln(r)としてプロットされる。そこでは、ＲはGPV半径であり、ｒは細孔半径である。端部張力は遅い閉鎖期間の間、黒い直線の傾斜に基づき、19fNであった。レーザー照射パラメーターは200ms照射時間、2μm照射直径スポットサイズ、100%のレーザーパワーを使用した。
【図４】図４はGPVの中への生体分子の拡散を示す。（ａ）GPVの共焦点画像と溶液に添加された外因性蛍光色素（fluorophore）。レーザー照射（40μJ/μm2のフルエンス）位置は鎖線の円で表示される。１０ミクロンのスケールバーは示される。（ｂ）GPV中における種々の蛍光色素の拡散平衡（Diffusion equilibrium）。矢印はGPV開放の時点を表示する。（ｃ）種々のサイズの蛍光色素の拡散均衡の半減時間。
【図５】図５はGPV外部のサイズ依存カーゴの光学的通門（optical gating）を示す。異なる分子量の蛍光色素、カルボキシフルオレセイン（０．４ＫＤａ）及びTRITCデキストラン（１５５ｋＤａ）、はGPV中に共に被包（co-encapsulated）され、外部蛍光色素は洗浄により取り除かれた。（ａ，ｂ）GPVは低レーザーフルエンスのパルス（レーザーパルス１：2μJ/μm2）により照射され、低分子量分子（カルボキシフルオレセイン）が放出された。しかしながら、より大きい蛍光色素（TRITCデキストラン）はGPVの中で閉じ込められて残存した。10μmのスケールバーは示される。（ｃ，ｄ）GPVは低レーザーフルエンス（レーザーパルス１）のパルスにより最初に照射され、TRITCデキストランが中に残存する一方で、カルボキシフルオレセインは放出された。２分後、第二のより大きなレーザーフルエンス（レーザーパルス２：20μJ/μm2）が加えられ、大きいTRITCデキストランが放出された。10μmのスケールバーは示される。
【図６】図６は、GPV内容物の連続的ハイブリダイゼーション制御を示す。GPV外部における蛍光標識されたＤＮＡ（１、黄色）はレーザー開放（２）に続いて、GPVに進入することが可能となった。消色部分を有する相補的配列は、その後、外部の培地に加えられ（３、黒い円）、再びGPVが開放し、GPV中で消色が発生すること（４）が可能となった。
【図７】図７は、GPVの内部に対する酵素の選択的結合のための手法を示す。ａ）外部小葉ビオチン部位（external leaflet biotin sites）をブロッキングすることを示す概略図であり、アビジン複合体の添加と、アビジン複合体をGPVの中で選択的に配置する（アビジン複合体は蛍光色素に標識されるか、他の酵素に結合されている）ためのGPVの開放及び閉鎖とが続く。ｂ）多発的な開放及び閉鎖事象はGPV中で共通のアビジン複合体を平等に分布させることが出来る。外部のブロッキングに続き、FITC-アビジンは培地内に配置され、GPVは数字が表示される順序で多数回開放及び閉鎖がされた。
【図８】図８は、レーザー照射に続く、膜の伸長を示す。１０ミクロンのスケールバーは示される。
【図９】図９は、GPV開放のための低い塩の依存性を示す。レーザー照射に続く、所定の塩濃度でのGPVの開放事象の頻度が示される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
自己充足型（self-contained）のマイクロリアクターを開発させるための努力は、確実に、繰り返し、開放、閉鎖することが出来る膜を発生させることの困難さにより限られていた。ここでは、我々は、集中したレーザービームを使用することによりそのままの状態で素早く開放することができるマイクロスケールの巨大ポルフィリン小胞中で、ポルフィリン−リン脂質が電気的集合（electro-assembled）を結合することを明示する。ポルフィリン二重層における大きな開放は１分以内に再シールされ、カーゴサイズに依存する、小胞の中及び外での空間的、一時的な生体分子の拡散の制御を可能にする。固有の浸透特性は、従来のリン脂質のそれよりも小さいオーダーのポルフィリン安定（porphyrin-stabilized）細孔端部張力に基づき提案される。巨大小胞は、制御された様態において素早く開放及び閉鎖されることができ、連続的ＤＮＡハイブリダイゼーション反応が行われることを許容する。ビオチン−アビジン基礎手法（biotin-avidin based strategy）は、選択的に共通の酵素を小胞の内部に結合するように開発され、汎用性の高いマイクロリアクターとしての巨大ポルフィリン小胞の能力を実証する。
【００１５】
ある側面では、小胞はポルフィリン−リン脂質複合体を含み、ポルフィリン−リン脂質複合体はポルフィリン、ポルフィリン誘導体又は、リン脂質の脂質側鎖、好ましくはsn-1又はsn-2の位置に、共有結合する（covalently attached）ポルフィリン類似物質を含み、小胞は直径が１−１００ミクロンであり、好ましくは１０−５０ミクロンである。
【００１６】
本出願の小胞形成において使用されるポルフィリン−リン脂質複合体の例は、共有されるWO11/044671に記載される。
【００１７】
小胞は、１５−１００モル％、２０−９０モル％、３０−８０モル％、４０−７５モル％、５０−７０モル％、６０−７０モル％、及び６５−７０モル％の間のポルフィリン−リン脂質複合体を含み、この順に従い、より好ましくなる。
【００１８】
好ましい様態として、小胞は、約７０モル％のポルフィリン−リン脂質複合体を含む。
【００１９】
ある様態では、ポルフィリン−リン脂質複合体におけるポルフィリン、ポルフィリン誘導体、ポルフィリン類似物質は、ヘマトポルフィリン（hematoporphyrin）、プロトポルフィリン（protoporphyrin）、テトラフェニルポルフィリン（tetraphenylporphyrin）、ピロフェオホルビド（pyropheophorbide）、バクテリオクロロフィル（bacteriochlorophyll）、クロロフィル（chlorophyll）、ベンゾポルフィリン誘導体（benzoporphyrin derivative）、テトラヒドロキシフェニルクロリン（tetrahydroxyphenyl chlorin）、プルプリン（purpurin）、ベンゾクロリン（benzochlorin）、ナフトクロリン（naphthochlorins）、バーディン（verdin）、ロジン（rhodin）、ケトクロリン（keto chlorin）、アザクロリン（azachlorin）、バクテリオクロリン（bacteriochlorin）、トリポルフィリン（tolyporphyrin）、ベンゾバクテリオクロリン（benzobacteriochlorin）、伸長ポルフィリン（expanded porphyrin）およびポルフィリン異性体（porphyrin isomer）からなるグループから選択される。好ましくは、伸長ポルフィリンは、テキサフィリン（texaphyrin）、サフィリン（sapphyrin）、又はヘキサフィリン（hexaphyrin）であり、ポルフィリン異性体は、ポルフィセン（porphycene）、逆位のポルフィリン（inverted porphyrin）、フタロシアジン（phthalocyanine）、又はナフタロシアニン（naphthalocyanine）である。
【００２０】
ここで使用される「リン脂質」は、リン酸基を含む親水性頭部と疎水性脂質尾部とを含む脂質である。
【００２１】
ある様態では、ポルフィリン−リン脂質複合体におけるリン脂質は、ホスファチジルコリン（phosphatidylcholine）、ホスファチジルエタノールアミン（phosphatidylethanoloamine）、ホスファチジルセリン（phosphatidylserine）、又はホスファチジルイノシトール（phosphatidylinositol）を含む。好ましくは、リン脂質は、炭素数１２から２２のアシル側鎖を含む。
【００２２】
ある様態では、ポルフィリン−リン脂質複合体におけるポルフィリンは、ピロフェオホルビド−ａ酸（pyropheophorbide-a acid）である。
【００２３】
ある様態では、ポルフィリン−リン脂質複合体におけるポルフィリンは、バクテリオクロロフィル誘導体（bacteriochlorophyll derivate）である。
【００２４】
ある様態では、ポルフィリン−リン脂質複合体におけるリン脂質は、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1-Palmitoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-Phosphocholine）又は1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1-Stearoyl-2-Hydroxy-sn-Gycero-3-Phosphocholine）である。
【００２５】
ある様態では、ポルフィリン−リン脂質複合体はピロ脂質（pyro-lipid）である。
【００２６】
ある様態では、ポルフィリン−リン脂質複合体はオキシ−バクテリオクロロフィル−脂質（oxy-bacteriochlorophyll-lipid）である。
【００２７】
ある様態では、ポルフィリンは、炭素数０から２０の炭素鎖リンカー（carbon chain linker）により、リン脂質におけるグリセロール基（glycerol group）に結合される。
【００２８】
ある様態では、小胞は実質的に球状である。
【００２９】
ある様態では、小胞は二重層の内表面に結合する酵素を含む。
【００３０】
ある様態では、二重層の残部（remainder）は、実質的に他のリン脂質が含まれる。好ましい様態では、他のリン脂質は、ホスファチジルコリン（phosphatidylcholines）、ホスファチジルエタノールアミン（phosphatidylethanolamines）、ホスファチジン酸（phosphatidic acid）、ホスファチジルグリセロ−ル（phosphatidylglycerols）、及びそれらの組合せからなるグループから選択されたものからなるグループから選択される。さらに好ましい様態としては、他のリン脂質は、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジン酸（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidic acid）（DPPA）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine）（DPPC）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）（DSPC）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）（DMPC）、1,2-ジベヘノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dibehenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）（DBPC）、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン（1,2-diarachidoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine）（DAPC）、1,2-ジリグノセロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン（1,2-dilignoceroyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine）（DLgPC）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-[ホスホル-rac-（1-グリセロール）]（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-[phosphor-rac-(1-glycerol)]）（DPPG）、L-α-ホスファチジルコリン（L-α-phosphatidylcholine）、及びそれらの組み合わせからなるグループから選択される。ある好ましい様態では、小胞は、さらにコレステロールを含む。好ましくは、コレステロールは、残部の他のリン脂質（remainder other phospholipid）とコレステロールとのモル比率が３：２の状態で存在する。
【００３１】
さらなる側面によれば、ポルフィリン−リン脂質複合体を含む溶液を調製し、溶液を脱水し、結果として生じた脂質膜に交流電流をくわえることを含む小胞を調製する方法が提供され、そこではポルフィリン−リン脂質複合体は、ポルフィリン、ポルフィリン誘導体又はリン脂質の脂質側鎖、好ましくはsn-1又はsn-2の位置に、共有結合する（covalently attached）ポルフィリン類似物質を含み、溶媒は、任意でさらにリン脂質及びコレステロールを含む。好ましくは、溶液は、交流電流を供給するワイヤ上にコートされ、好ましくは白金ワイヤ上にコートされる。
【００３２】
ある様態では、溶液は、溶媒としてクロロホルムを含有する。
【００３３】
ある様態では、交流電流は、アルドゥイーノマイクロコントローラ（Arduino microcontroller）により制御される。好ましくは、図１ａ又は１ｃに記載されるように、アルドゥイーノマイクロコントローラは、回路の一部である。
【００３４】
ある様態では、方法は、ここに記載される小胞を調製するためのものである。
【００３５】
さらなる側面によれば、ここに記載される方法によって製造される小胞を提供する。
【００３６】
さらなる側面によれば、ここに記載される方法によって製造される、ここに記載される小胞を提供する。
【００３７】
さらなる側面によれば、ここに記載される小胞を調製し、小胞を開放できるレーザー又は他の光源、好ましくはキセノン又はハロゲンランプで小胞を照射することを含む小胞の開放制御の方法が提供される。好ましい様態では、開放制御は、小胞二重層の所定の位置で行われ、前記位置は、レーザーにより照射される。開放制御は、より好ましくは所定の時間で行われる。好ましい様態では、開放制御は、顕微鏡下で行われる。
【００３８】
ある様態によれば、レーザーのパワーは、約660μWである。
【００３９】
ある様態によれば、レーザーは、405nmの波長を有する。
【００４０】
ある様態によれば、小胞は、4mM未満の塩濃度を有する溶液に存在する。
【００４１】
ある様態によれば、開放のサイズは、レーザーフルエンスのレベルにより比例的に制御される。
【００４２】
さらなる側面によれば、バイオリアクターとしてここに記載される小胞の使用が提供される。
【００４３】
さらなる側面によれば、小胞において少なくとも２つの試薬の間で生体反応を実行する方法が提供され、当該方法は、その中に被包される第一の試薬を有するここに記載される小胞を提供し、第二の試薬を小胞の中に侵入することを許容するために、ここに記載される方法に基づき、小胞の開放制御を実行し、小胞に自己閉鎖することを任意に許容し、生体反応が起こることを許容することを含む。
【００４４】
以下の実施例は本発明のいろいろな側面の例示であり、ここに記載される本発明の広い側面を制限しない。
【実施例】
【００４５】
他に表示されない限り、全ての化学物質はSigmaから取得し、電気材料はMouserから取得した。GPVは改良された電気的形成方法（electroformation method）を使用して形成した。（12参照）eggホスファチジルコリン（egg PC）とコレステロール（chol）（3:2  モル比率  egg PC: chol）（Avanti Polar lipids）との組み合わせであるピロフェオホルビド−脂質（先に記載したように（11参照）、しかし、異性体的に純粋な複合体を発生させる改良されたプロトコルで調整した。原稿は提出した。）は、0.2mg/mlから0.5mg/mlの原液を形成するためにクロロホルム中に分散された。直径0.5mmの２つの白金ワイヤ（#267228, Sigma）は真空グリースを使用してカバースライドに接着される小さいポリテトラフルオロエチレンＯリング（#9559K208,McMaster-Carr）を通り抜けて2mmの距離で平行に分離されて配置されていた。１μｍの原液の水滴は６−１０つ同様の間隔で、２つの白金ワイヤ上に配置された。特に断りのない限り７０モル％のピロフェオホルビド−脂質が使用された。余剰のクロロホルムはＯリング装置を真空中に２０分置くことにより蒸発した。pH8の2mMのTrisとともに0.6ｍｌの水溶液（water solution）はワイヤ上の脂質を水和するために使用された。小胞の電気的形成を誘導するために、装置は３Ｖ、１０ＨｚのＡＣ電流に接続された。低いコスト、オープンソースアルドゥイーノマイクロコントローラが、場（field）を発生させるために、図１における回路図のように使用された。ワイヤ上に形成される小胞は電場（electric field）をオンにして１５分後に可視となった。ワイヤから離れた小胞を可視化するために、脂質は200mOsMのスクロース溶液で水和された。電場を４５分間適用した後、25μlの小胞溶液は、カバースライド上で、200mOsMのグルコース溶液100μlにより希釈され、カバースライド上では小胞が溶液の底に沈み、可視化された。
【００４６】
共焦点顕微鏡（Olympus FluoView FV1000）は、633nmレーザーと40倍水対象レンズ（40X water objective lens）とを使用して、小胞を検査するために使用された。200msの間、660μWのパワーで、2μmの直径スポットサイズで405nmレーザーパルスを使用することで開放は誘導された。蛍光色素拡散のために、カルボキシフルオレセイン（81002, AnaSpec Inc）、テキサスレッドデキストラン（D-1828, Invitrogen）及びTRITCデキストラン（T1287, Sigma-Aldrich）は、培地に添加され、カルボキシフルオレセインのための488nmのレーザーと、テキサスレッドデキストラン及びTRITCデキストラン両者のための543nmを使用して観察された。制御されたDNA蛍光及び消色のために、配列GGTTTTGTTGTTGTTGTTTTC-フルオレセイン（Sigma）（SEQ ID NO. 1）を有するオリゴヌクレオチドが1mMのNaClとともに1μMの濃度で外部培地に添加された。光誘導負荷を実行した後、補完配列DAB-GAAAACAACAACAACAAAACC（Sigma）（SEQ ID NO. 2）が１０倍超えで外部培地に添加され、GPV開放は繰り返された。
【００４７】
アビジン−ビオチン結合のために、0.5mg/mlの水滴1μlを8つワイヤ上に配置し、水とともに再水和することにより、７０％ポルフィリン−脂質GPVは0.05%DSPE-ビオチン（Avanti Polar Lipids）とともに作成された。形成されると、GPVの外部小葉（outer leaf）上のビオチン結合部位をブロックするために、pH8の2mMのTrisは12nMのアビジン（AVD407, BioShop Canada Inc.）とともに外部培地に加えられた。１５分後、アビジン（APA011F, BioShop Canada Inc.）と接合した24nMの蛍光色素はバッファーに加えられ、GPVは蛍光のアビジン結合を観察するために複数回開放された。
【００４８】
私たちは、最近、ポルフィリン２重層から形成されるリポソーム様ナノ小胞中でポルフィリン−脂質複合体は自己組織化（self-assemble）できたと報告した。（11参照）大きなミクロサイズのポルフィリン小胞が形成されるかを試験するため、私たちは、交流電流方法（alternating current method）に基づき、改良された電気的形成（electroformation）アプローチを開発した。（12参照）ローコスト、オープンソースのプログラム可能なアルドゥイーノマイクロコントローラを使用し、ポルフィリン−脂質及びコレステロールを含むクロロホルム中のEggホスファチジルコリンの割合を変化した水溶液は、白金ワイヤ上にコートにされ、蒸着され、再水和され、低周波数交流矩形波場（low-frequency alternating square wave field）にさらされた(図1a及び1c)。この方法を使用することで、マイクロスケールの小胞は発生し、共焦点顕微鏡を使用して見ることが出来る（図1a、挿入図）。電場の存在下で、小胞は自然に形成され、白金ワイヤからゆっくり離れ、この処理は時間と共に繰り返された。電場の除去は小胞の切り離しに必要な振動を止め、相対的に固定化されたポルフィリン小胞の高い密度をワイヤの近位に放置し、共焦点顕微鏡による時間連続観察を大いに促進する。脂質複合体のポルフィリン構成物、ピロフェオホルビド（pyro）、は蛍光であるため、蛍光顕微鏡を使用することにより、外因性の標識なしで二重層が像形成された。ポルフィリン−脂質の割合の増加が二つのタイプの運動制限小胞（movement-restricted vesicles）にどのように影響したかを検査した。二つのタイプの運動制限小胞（movement-restricted vesicles）は、切り離され、離隔されたより少ない密度のグルコースの溶液に移動させた時に沈むスクロース含有小胞と、白金ワイヤ上に固定された小胞である。両方の状況で、１０−５０ミクロンの球状の小胞が形成され、より高いポルフィリン含有量にも関わらず、１モル％を超えるポルフィリン−脂質の添加は全小胞の蛍光自己消色（fluorescence self-quenching）に至らしめた（図1b）。ポルフィリン−脂質の両親媒性により、二重層中の所定の位置にとどまる一貫したポルフィリンの深度は、高ポルフィリン濃度と相まって、二重層環境が動的対面ポルフィリン相互作用（dynamic face to face porphyrin interactions）を作り出し、蛍光消色に至らしめたということを示唆する。しかしながら、マイクロ小胞産生量及び円形形状性質は７０モル％を超えるポルフィリン−脂質で減少し、いくらかの標準的リン脂質が巨大ポルフィリン小胞（GPV）を形成するのに役立ったということを実証する。
【００４９】
７０モル％のポルフィリン−脂質から形成された１０ミクロンのポルフィリン小胞は、それぞれ、約６×１０８のポルフィリンを含有すると推測され、全て薄い部分に留められ、ポルフィリン二重層を包囲する。ポルフィリン二重層の高い光吸収を考慮して、レーザー照射に反応する膜が調査された。高いレベルの蛍光自己消色にも関わらず、二重層は、ポルフィリンのＱバンドを励起するために633nmのレーザーを使用する二重層反応の明瞭な光学的観察を可能にするための十分な蛍光性を保有していた。高パワーのレーザーパルス波長は405nmであり、これは、より強い（intense）ソーレー（Soret）バンドを直接励起した。レーザーパワーはおよそ660μWであるが、パワー密度（power density）をkWs/cm2のオーダーで達成するために、それは小さい体積に集中された。二重層が200msのパルスにさらされた時、二重層は、長時間の間、開放が観察された（図2a）。３０秒後、開放した膜の端部が一緒になり、再シールされ再び元状態が出現した。それらが表示する差異は少ないが、二重層の局所的な蛍光の漂白と対象的に、位相差イメージは二重層が物理的に開放し及び再シールしたことを確認した。再シールにより、小胞は完全に元の状態となって出現し、そのため、単体のGPVの繰り返される開放と自己シールが調査された。GPV開放は低い塩濃度に限定された（図9）。図2bに示す様に、単体のGPVは無制限に繰り返し開放及び閉鎖された。一般的に、GPVの２つの開放端部の間の最大間隔は１５ミクロン以下であった。１％のポルフィリン−脂質が二重層中に組み込まれた時、自己消色がないことにより観察される非常に高い蛍光性にも関わらず、開放する膜は観察されなかった。レーザーに反応する色々なGPVは、無反応、膜伸長、開放のみ又は開放及び閉鎖に分類される（膜伸長の例として、図8を参照）。試験されたレーザーパワーの変化は、高い蛍光性の１％ポルフィリン−脂質マイクロ小胞において、開放を誘導することが出来なかった（図2c）。しかしながら、７０モル％GPVにおいて、開放および閉鎖は常に観察され、より大きなレーザーパワーにより開放及び閉鎖事象の割合が上昇する。GPVの少ない部分は開放を維持したままであり、数分後も再シールしなかった。同様の傾向は、事実上レーザーフルエンスが減少し、照射エリアが増加した時に観察された（図2d）。ポルフィリン蛍光自己消色は、一重項酸素量子収量の自己消色と高く関連するように見えた。（13参照）１％ピロ脂質（pyro-lipid）GPVは、より消色が少なく、実質的により蛍光を発生し、従って、より多い一重項酸素（何百倍以上、同じ構成のポルフィソーム中の消色に基づく（11参照））を発生したが、それらはレーザー照射に反応して開放又は閉鎖しなかった。これは、リン脂質巨大単層小胞（GUVs）における、低モル％（１−１０％）にとどめられるポルフィリンの一重項酸素発生の前の試験と一致し、それは照射に反応する膜穿孔（membrane poration）を生成しなかった。（14参照）
【００５０】
相当量の実験的及び理論的作業は従来のGUVsの圧力誘導開放及び閉鎖の理解に導いた。（7,8,15,16参照）これら確立されたモデルにおいて、細孔開放は、表面張力が増加することにより、開始され、広がる。一旦細孔が形成されると、脂質は、水性環境に暴露される疎水性側鎖を最小にするため、再配向するが、この修正される充填構造は自由エネルギー消費（free energy cost）を有する。それ故、細孔構造を妨害し、細孔閉鎖の原因となる端部張力が発生する。細孔の力学は端部張力の相反力と表面張力とによって均衡が保たれている。我々は、GPVの場合、ポルフィリン二重層は細孔端部を安定化させ、端部張力を減少させる可能性があると仮定した。図３に示すように、典型的なGPV開放は、GUV開放の伝統的様式に従い、迅速な開放、遅い閉鎖及び早い閉鎖段階を含む。Brochard-Wyartグループによって開発され、最近Dimovaグループによってさらに解明された数学モデルに基づき、遅い閉鎖期間の間、時間関数としてR2ln(r)の傾斜から端部張力が測定できることが実証された。そこでは、RはGUVの半径であり、rは細孔の半径である。（8,15参照）端部張力γは方程式１から測定できる。
γ = -(3/2) πηa                  (1)
【００５１】
aは図３に示す遅い閉鎖段階の直線当てはめ（linear fit）の傾斜を表し、ηは培地の粘度であり、このケースでは水である。この技術を使用して、我々はGPV閉鎖の間の典型的端部張力が19fNであると見積る。この値は、伝統的リン脂質二重層より約３オーダー小さいため、注目に値する。（8参照）このように、穿孔されたポルフィリン二重層の端部はポルフィリン自身によって、大いに安定化されているようだ。他の説に縛られること無く、これは、二重層中で発生する広範囲の活動的な直面したポルフィリンpi-pi電子相互作用（face to face porphyrin pi-pi electron interactions）に由来している可能性がある。穿孔の始動及び形成は、細孔部位付近の膜張力を増加することに類似する効果を有する光物理処理に起因するようだ。２つの可能なシナリオは、局所加熱がGPVを分離することができるエネルギーを発生させること、又は二重層の局所漂白（bleaching）が、再拡散する他のポルフィリン−脂質が位置につき、二重層を再シールするまでの間、GPV開放を引き起こす修飾された化学種を発生させることである。
【００５２】
ポルフィリン二重層の統合性を検証し、開放処理が外部分子の移動を制御できるかどうかを判断するために、二つの蛍光色素をGPVの外部の溶液に添加した。一方はカルボキシフルオレセイン、小分子であり、他方は大きいデキストランにより標識されたテキサスレッドである。溶液中に蛍光色素を添加した後、GPVの中で観察された蛍光色素はなく、ポルフィリン二重層はそれらの分子に対して不透であったことを示す（図3a）。レーザー照射の後、GPVが開放し、両色素は内部に侵入した。より速く拡散する小分子が期待されるように、より小さいカルボキシフルオレセイン蛍光色素はテキサスレッドデキストランより早くGPVに侵入した。我々は様々なサイズの３つの蛍光色素の内在化割合を定量し、より小さい0.4kDaのカルボキシフルオレセインが10kDaのデキストランより早く拡散し、同様に、10kDaのデキストランは150kDaのデキストランより早く拡散したことを観察した（図4b）。開放に続き、半分の分子がGPV中に拡散するために要求される時間は１から８秒まで様々であり、カーゴのサイズに起因した（図4c）。この技術を使用し、レーザーフルエンスを変化させることで（照射スポット直径及び照射時間を調整することで）特定のサイズのカーゴは選択的にGPV中に解放された（又は詰め込まれた）。カルボキシフルオレセイン（0.4kDa）及びTRITC−デキストラン（155kDa）はGPVに被包され、外部の蛍光色素は洗い流された。2μJ/μm2のレーザーフルエンスを使用し、GPV膜への照射により、カルボキシフルオレセインは解放されたが、TRITC−デキストランは被包されたままであった（図5a及びb）。他の状況によれば、第一のレーザーパルスを低レーザーフルエンス（2μJ/μm2）で適用した後、カルボキシフルオレセインは解放された。二分後、より高いフルエンス（20μJ/μm2）の他のレーザーパルスが適用され、TRITC-デキストランは解放された。これは、光学的通門（optical gating）の概念を説明するよい例であり、サイズ依存の様態で、特定のカーゴがGPVの内部及び外部に存在することを許容する。GPVが繰り返し、光学的に操作され得る事を示すために、膜開放を誘発するレーザーはオリゴヌクレオチドの移動を制御するために使用された（図6）。フルオレセイン標識DNAオリゴヌクレオチドはGPVとともに培養されたとき、それは小胞の外部に留まった。内在化蛍光色素の増加によって示されるように、レーザー誘発開放を行うことで、DNAはGPV中に拡散した。次に、暗い消色剤、ダブシル（dabcyl）で標識された相補鎖はバッファー外部に添加された。溶液の蛍光性は際立って衰退した。しかしながら、消色オリゴヌクレオチドは、ポルフィリン二重層を通過し、そこに受動的に輸送されるDNAに至ることができなかったため、GPVの内部は蛍光性が維持された。最後に、GPVが再び開放された時、消色剤及び消色ハイブリット形成されたDNA（quenched hybridized DNA）は内部に拡散でき、GPVによりもたらされる蛍光性を取り除くことができた。
【００５３】
便利な包囲マイクロリアクターは望ましい反応を小胞の内部空間に制限すべきである。私たちは、共通の酵素分子を選択的にGPVの内部に結合する方法を開発した（図7a）。少ないモル％のビオチン標識された脂質を処方（formulation）中に含有することで、標準的水性条件下で、本質的にビオチンとの不可逆的な関連を有するアビジン結合をし易いGPVを形成することができた。GPVの外部は、２倍モル過剰のアビジンでブロックされ、GPV二重層の外部小葉のビオチンサイトが塞がれたことを保証する。アビジンが標識された蛍光色素の４倍過剰量（A four excess of fluorescein labeled avidin）は、その後、外部培地に添加された。GPVは、その後、レーザー照射を使用して開放された。標識されたアビジンはGPV中で自由に拡散せず、円周周辺に均一に結合しなかった。代わりに、それはGPVの中の膜開放部位周辺にのみ結合した。これは、ビオチンとアビジンが使用された時に膜で誘発されるより小さい開放に起因するかもしれない。標識されたアビジンの均一な間隔を達成するために、このプロセスは８回繰り返された。この場合、我々は蛍光標識されたアビジンを使用したが、酵素−アビジン複合体もまた有効であり、同様の手法でGPV内部に配置することが出来る。結局、GPV内部に対する選択的酵素結合に続き、基質はGPV中で拡散して酵素的に生成物に変換され、要求に応じてポルフィリン二重層開放により解放される。この手法は、酵素活性最適化、スクリーニング手法又は連続的反応のための小量反応にとって有利であることを証明した。確実に膜を開放及び閉鎖する能力は広範囲にわたる影響を有し、ポルフィリン二重層は小胞の開放及び閉鎖を制御できる。
【００５４】
本発明の好ましい様態はここに記載したものの、添付の請求項の範囲又は本発明の精神から逸脱することなく、変形が作れることは当業者によって理解される。以下の参照リストも含み、ここに述べられる全ての言及は、言及によりそれら全てが組み込まれる。
【００５５】
参照
1.     Kurihara, K. et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chem. 3, 775-781 (2011).
2.     Mansy, S.S. et al. Template-directed synthesis of a genetic polymer in a model protocell. Nature 454, 122-125 (2008).
3.     Luisi, P.L., Walde, P. & Oberholzer, T. Lipid vesicles as possible intermediates in the origin of life. Curr. Opin. Colloid Interface Science 4, 33-39 (1999).
4.     Neumann, E. & Rosenheck, K. Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes. J. Membrane Biol. 10, 279-290 (1972).
5.     Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
6.     Yang, P., Lipowsky, R. & Dimova, R. Nanoparticle Formation in Giant Vesicles: Synthesis in Biomimetic Compartments. Small 5, 2033-2037 (2009).
7.     Sandre, O., Moreaux, L. & Brochard-Wyart, F. Dynamics of transient pores in stretched vesicles. P.N.A.S., U.S.A. 96, 10591 -10596 (1999).
8.     Portet, T. & Dimova, R. A New Method for Measuring Edge Tensions and Stability of Lipid Bilayers: Effect of Membrane Composition. Biophys. J. 99, 3264-3273 (2010).
9.     Kyrsting, A., Bendix, P.M., Stamou, D.G. & Oddershede, L.B. Heat Profiling of Three-Dimensionally Optically Trapped Gold Nanoparticles using Vesicle Cargo Release. Nano Lett. 11, 888-892 (2011).
10.    Karlsson, M. et al. Electroinjection of Colloid Particles and Biopolymers into Single Unilamellar Liposomes and Cells for Bioanalytical Applications. Anal. Chem. 72, 5857-5862 (2000).
11.    Lovell, J.F. et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nature Mater. 10, 324-332 (2011).
12.    Angelova, M.I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, F. & Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI 89, 127-131 (1992).
13.    Lovell, J.F. et al. FRET Quenching of Photosensitizer Singlet Oxygen Generation. J. Phys. Chem. B 113, 3203-3211 (2009).
14.    Riske, K.A. et al. Giant Vesicles under Oxidative Stress Induced by a Membrane-Anchored Photosensitizer. Biophys. J. 97, 1362-1370 (2009).
15.    Brochard-Wyart, F., de Gennes, P.G. & Sandre, O. Transient pores in stretched vesicles: role of leak-out. Physica A: Statistical Mechanics and its Applications 278, 32-51 (2000).
16.  Karatekin, E., Sandre, O. & Brochard-Wyart, F. Transient pores in vesicles. Polymer International 52, 486-493 (2003).
17.    Christian, D.A. et al. Spotted vesicles, striped micelles and Janus assemblies induced by ligand binding. Nature Mater. 8, 843-849 (2009). 
【図１ｃ】
2015506671.tif 000003
【図１ａ】
2015506671.tif 000004
【図１ｂ】
2015506671.tif 000005
【図２ａ】
2015506671.tif 000006
【図２ｂ】
2015506671.tif 000007
【図２ｃ】
2015506671.tif 000008
【図２ｄ】
2015506671.tif 000009
【図３】
2015506671.tif 000010
【図４】
2015506671.tif 000011
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2015506671.tif 000015
【図９】
2015506671.tif 000016
【国際調査報告】
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