(57)【要約】  リンパ球系細胞由来のＤＮＡ（又はｍＲＮＡ又はそこから逆転写されたｃＤＮＡ）サンプル中の、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又は免疫グロブリン（Ｉｇ）をコードする各再構成遺伝子断片を固有のタグ付加するための組成物及び方法が開示される。これら及び関連する実施形態により、異なるＴＣＲ及び／又はＩｇをコードする配列の正確かつ高スループットの定量が可能になる。更に、例えばサンプル中のＴ又はＢ細胞のクローン性の度合いを特徴付けるため、単一細胞中のＴＣＲ又はＩｇヘテロダイマーの両鎖をコードする遺伝子の定量的シークエンシングのための組成物及び方法が提供される。
2015519909.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチド増幅プライマー組成物であって、
（Ａ）一般式（Ａ）：
Ｕ１−Ｂ１−Ｖ１  （Ａ）
の複数の順方向オリゴヌクレオチド配列と、
一般式（Ｂ）：
Ｕ２−Ｂ２−Ｊ１  （Ｂ）
の複数の逆方向オリゴヌクレオチド配列とを含む第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットを含み、
式中、Ｕ１は第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｕ２は第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｂ１は存在せず、又は６〜２０個の連続するヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ２は存在せず、又は６〜２０個の連続するヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、これにより少なくともＢ１又はＢ２のいずれか一方が存在し、
式中、Ｖ１は第１の適応性免疫受容体のＶ領域コーディング遺伝子配列又はその相補的配列の、少なくとも１５個以上１００個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｊ１は、（ｉ）前記第１の適応性免疫受容体の連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列又はその相補的配列、又は（ｉｉ）前記第１の適応性免疫受容体の定常（Ｃ）領域コーディング遺伝子配列又はその相補的配列の、１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、一般式Ｕ１−Ｂ１−Ｖ１の複数のオリゴヌクレオチド配列のそれぞれについて、Ｖ１は固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、また一般式Ｕ２−Ｂ２−Ｊ１の複数のオリゴヌクレオチド配列のそれぞれについて、Ｊ１は固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、
（Ｂ）一般式（Ｃ）：
Ｕ３−Ｂ３−Ｖ２  （Ｃ）
の複数の順方向オリゴヌクレオチド配列と、
一般式（Ｄ）：
Ｕ４−Ｂ４−Ｊ２  （Ｄ）
の複数の逆方向オリゴヌクレオチド配列とを含む第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットを含み、
式中、Ｕ３は、Ｕ１又はＵ２のいずれかに同一のオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｕ４は、Ｕ３とは同一ではないＵ１又はＵ２のいずれかと同一であるオリゴヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｂ３は、Ｂ１と同じである６〜２０個の連続するヌクレオチドのオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｂ４は、Ｂ２と同じ６〜２０個の連続するヌクレオチドのオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｖ２は第２適応性免疫受容体のＶ領域コーディング遺伝子配列又はその相補的配列の、少なくとも１５個以上１００個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｊ２は、（ｉ）前記第２適応性免疫受容体の連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列又はその相補的配列、又は（ｉｉ）前記第２適応性免疫受容体の定常（Ｃ）領域コーディング遺伝子配列又はその相補的配列の、１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、一般式Ｕ３−Ｂ３−Ｖ２の複数のオリゴヌクレオチド配列のそれぞれについて、Ｖ２は固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、また一般式Ｕ４−Ｂ４−Ｊ２の複数のオリゴヌクレオチド配列のそれぞれについて、Ｊ２は固有のオリゴヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド増幅プライマー組成物。
【請求項２】
Ｕ１がＵ３と同一である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｕ２がＵ４と同一である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
対象のリンパ球系細胞を含む生体サンプル中の、複数の適応性免疫受容体をコードする個々の再構成ＤＮＡ配列を標識するための方法を含み、この方法は：
（ａ）（ｉ）前記産物の各末端に１つ、少なくとも２つのユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドバーコード配列、Ｘ１オリゴヌクレオチド配列、Ｘ２オリゴヌクレオチド配列を含む配列、及び（ｉｉ）（ｉ）の前記配列に対する相補的配列、をそれぞれ含む、二本鎖ＤＮＡ産物を取得するための増幅を促進する条件下で、請求項１〜３に記載のオリゴヌクレオチドプライマー組成物を含む第１の増幅プライマーセットを使用して前記再構成ＤＮＡ配列を増幅する工程と、
（ｂ）（ａ）の二本鎖ＤＮＡ産物を、それぞれ下記：
（ｉ）第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド、又は、
（ｉｉ）第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド、
のいずれかを含む複数の第１及び第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドを含む第２の増幅プライマーセットで増幅する工程とを含み、
シークエンシングのために複数の適応性免疫受容体をコードする再構成ＤＮＡ配列のライブラリを取得するため、（ａ）の前記分離した二本鎖ＤＮＡ産物の両鎖の増幅を促進する条件下で増幅が実施され、かつ
（ｃ）（ｂ）で取得した前記ＤＮＡライブラリをシークエンシングする工程を含み、前記ＤＮＡライブラリ内の各配列は、固有のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含み、これによって各配列を固有の識別可能なバーコード配列で標識する、方法。
【請求項５】
前記第２の増幅プライマーセット内の複数のオリゴヌクレオチドが更に、下記：
（ｉ）Ｂ１及びＢ２から区別される配列を有する６〜２０個の連続するヌクレオチドのオリゴヌクレオチドバーコード配列を含む第３のバーコードオリゴヌクレオチドＢ５を含むサンプル識別バーコードオリゴヌクレオチドであって、前記第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドＢ５は、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドと第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列との間にあり、かつ前記第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドＢ３は、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドと第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列との間にある、サンプル識別バーコードオリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）１〜２０個の連続するヌクレオチドの任意の配列であるスペーサーオリゴヌクレオチドであって、このスペーサーオリゴヌクレオチドは、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドと、第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド内の第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列との間にあり、かつ第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドと、第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド内の第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列との間にある、スペーサーオリゴヌクレオチド、
のいずれか又は両方を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドプライマー組成物であって、一般式（Ｉ）：
５’−Ｕ１−Ｂ１ｎ−Ｘ−３’        （Ｉ）
を有する複数のオリゴヌクレオチド配列を含み、
式中：
Ｕ１は、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、
Ｂ１は、ｎ個の連続するヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、ｎは６個以上のヌクレオチドであり、かつ、
Ｘは、（ｉ）適応性免疫受容体可変（Ｖ）領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、又は（ｉｉ）適応性免疫受容体連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含み、かつ前記複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘが固有のオリゴヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドプライマー組成物。
【請求項７】
前記複数のオリゴヌクレオチド配列が、最高４ｎ個の固有のＢ１オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ｎが７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の連続するヌクレオチドである、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
Ｘが、前記適応性免疫受容体Ｖ領域コーディング遺伝子配列、又は前記相補的配列の、２０、３０、４０又は５０個以上の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｘが、前記適応性免疫受容体Ｖ領域コーディング遺伝子配列、又は前記相補的配列の、７０、６０、又は５５個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｘが、前記適応性免疫受容体Ｊ領域コーディング遺伝子配列、又は前記相補的配列の、１６〜５０個以上の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｘが、前記適応性免疫受容体Ｊ領域コーディング遺伝子配列、又は前記相補的配列の、７０、６０、又は５５個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項６〜８又は１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｘが、Ｖ領域コーディング遺伝子配列に対しハイブリッド形成することができる、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｘが、Ｊ領域コーディング遺伝子配列に対しハイブリッド形成することができる、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
Ｂ１が、再構成ＴＣＲ又はＩｇをコードする個々の配列を識別するための固有のタグである、請求項６〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
Ｂ１が、単一細胞に由来する再構成ＴＣＲ又はＩｇをコードする個々の配列を識別するために使用される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
Ｕ１が、配列番号：１７１０〜１７３１を含む、請求項６〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｂ１が、表８に掲載される配列を含む、請求項６〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
Ｘが、配列番号：１６３１〜１６４３又は１６９６〜１７０８を含む、請求項６〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
Ｘが、配列番号：１６４４〜１６９５を含む、請求項６〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
Ｘが、配列番号：５６１３〜５６２５を含む、請求項６〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記複数のオリゴヌクレオチド配列が配列番号：５６２６〜５６８５を含む、請求項６〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記複数のオリゴヌクレオチド配列が配列番号：１〜１６３０を含む、請求項６〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
一般式（ＩＩ）：
５’−Ｐ１−Ｓ１−Ｂ２−Ｕ１−３’      （ＩＩ）
を含む複数の第２のオリゴヌクレオチド配列を更に含み、
式中、Ｐ１はシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチドを含み、
式中、Ｓ１はシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｂ２はオリゴヌクレオチドバーコード配列を含み、前記オリゴヌクレオチドバーコード配列は、サンプル源を識別するために使用することができ、
式中、Ｕ１は前記第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項６〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記第２複数のオリゴヌクレオチド配列が配列番号：５６８６〜５８７７を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
次のものを含む第１の増幅プライマーのオリゴヌクレオチドプライマー組成物であって：
（Ａ）一般式（ＩＩＩ）：
５’−Ｕ１−Ｂ１ｎ−Ｘ１−３’        （ＩＩＩ）
の複数の第１のオリゴヌクレオチド配列を含み、
式中：
（ｉ）Ｕ１は、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）Ｂ１は、ｎ個の連続するヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、式中、ｎは０又は６〜２０であり、
（ｉｉｉ）Ｘ１は、（ａ）適応性免疫受容体可変（Ｖ）領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、又は（ｂ）適応性免疫受容体連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、かつ、複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ１は固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、並びに、
（Ｂ）一般式（ＩＶ）：
５’−Ｕ２−Ｂ２ｍ−Ｘ２−３’      （ＩＶ）
の複数の第２のオリゴヌクレオチド配列を含み、
式中：
（ｉ）Ｕ２は、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）Ｂ２は、ｍ個の連続するヌクレオチドである第２のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、式中、ｍは０又は６〜２０であり、かつ
（ｉｉｉ）Ｘ２は、（ａ）適応性免疫受容体可変（Ｖ）領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、又は（ｂ）適応性免疫受容体連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、かつ、複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ１は固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、
式中、ｎ及びｍは互いに独立であり、前記第１及び第２の複数のオリゴヌクレオチドにおいて、ｍ及びｎは両方ともゼロにはならず、
式中、Ｘ１が適応性免疫受容体Ｖ領域コーディング遺伝子配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含む場合、Ｘ２は適応性免疫受容体Ｊ領域コーディング遺伝子配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、またＸ１が適応性免疫受容体Ｊ領域コーディング遺伝子配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含む場合、Ｘ２は適応性免疫受容体Ｖ領域コーディング遺伝子配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドプライマー組成物。
【請求項２７】
Ｘ１又はＸ２が、前記適応性免疫受容体Ｖ領域コーディング遺伝子配列、又は前記相補的配列の、２０、３０、４０又は５０個以上の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
Ｘ１又はＸ２が、前記適応性免疫受容体Ｖ領域コーディング遺伝子配列、又は前記相補的配列の、７０、６０又は５５個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２６〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
Ｘ１又はＸ２が、前記適応性免疫受容体Ｊ領域コーディング遺伝子配列、又は前記相補的配列の、１６〜５０個以上の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３０】
Ｘ１又はＸ２が、前記適応性免疫受容体Ｊ領域コーディング遺伝子配列、又は前記相補的配列の、７０、６０又は５５個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２６又は２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
Ｂ１が、再構成ＴＣＲ又はＩｇをコードする個々の配列を識別するための固有のタグである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３２】
Ｂ２が、再構成ＴＣＲ又はＩｇをコードする個々の配列を識別するための固有のタグである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３３】
Ｕ１又はＵ２が、配列番号：１７１０〜１７３１を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３４】
Ｂ１又はＢ２が、表８に掲載される配列を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３５】
Ｘ１又はＸ２が、配列番号：１６３１〜１６４３又は１６９６〜１７０８を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３６】
Ｘ１又はＸ２が、配列番号：１６４４〜１６９５を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３７】
Ｘ１又はＸ２が、配列番号：５６１３〜５６２５を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記複数の第１又は第２のオリゴヌクレオチド配列が、配列番号：５６２６〜５６８５を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３９】
前記複数の第１又は第２のオリゴヌクレオチド配列が、配列番号：１〜１６３０を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項４０】
前記複数のオリゴヌクレオチド配列が、最高４ｎ個の固有のＢ１オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２６〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記複数のオリゴヌクレオチド配列が、最高４ｍ個の固有のＢ２オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２６〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
オリゴヌクレオチド増幅プライマー組成物であって、
（Ａ）一般式（Ｖ）：
Ｕ１／２−Ｂ１−Ｘ１      （Ｖ）
の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットを含み、
式中、Ｕ１／２は、Ｂ１が存在するときに第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｂ１が存在しないときに第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｂ１は存在せず、又は６〜２０個の連続するヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含む、オリゴヌクレオチドを含み、
式中、Ｘ１は、（１）適応性免疫受容体Ｖ領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、又は（２）（ｉ）適応性免疫受容体連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列、若しくは（ｉｉ）適応性免疫受容体定常（Ｃ）領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の、１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、のいずれかを含み、かつ、一般式Ｕ１／２−Ｂ１−Ｘ１の複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ１は固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、かつ、
（Ｂ）一般式（ＶＩ）：
Ｕ３／４−Ｂ２−Ｘ２      （ＶＩ）
の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットを含み、
式中、Ｕ３／４は、Ｂ２が存在するときに第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｂ２が存在しないときに第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｂ２は存在せず、又はＢ１と同じである６〜２０個の連続するヌクレオチドである第２のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含む、オリゴヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｘ２は、（１）適応性免疫受容体Ｖ領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、又は（２）適応性免疫受容体連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の、１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、のいずれかを含み、かつ、一般式Ｕ３／４−Ｂ２−Ｘ２の複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ２は固有のオリゴヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド増幅プライマー組成物。
【請求項４３】
Ｕ３が、Ｕ１又はＵ２と同じ配列を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
Ｕ４が、Ｕ１又はＵ２と同じ配列を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
対象のリンパ球系細胞を含む生体サンプル中の、複数の適応性免疫受容体をコードする個々の再構成ＤＮＡ配列を標識するための方法であって、該方法が：
（ａ）（ｉ）少なくとも１つのユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドバーコード配列、及びＸ、Ｘ１又はＸ２オリゴヌクレオチド配列のうち少なくとも１つの配列、を含む配列、及び（ｉｉ）（ｉ）の配列に対する相補的配列、をそれぞれ含む、二本鎖ＤＮＡ産物を取得するために増幅を促進する条件下で、請求項１〜３６に記載のオリゴヌクレオチドプライマー組成物を含む第１の増幅プライマーセットを使用して前記再構成ＤＮＡ配列を増幅する工程と、
（ｂ）（ａ）の二本鎖ＤＮＡ産物を、それぞれ：
（ｉ）第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド、又は
（ｉｉ）第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド、
のいずれかを含む複数の第１及び第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドを含む第２の増幅プライマーセットで増幅する工程と（ここで、増幅は、シークエンシングのために複数の適応性免疫受容体をコードする再構成ＤＮＡ配列のライブラリを取得するため、（ａ）の前記分離した二本鎖ＤＮＡ産物の両鎖の増幅を促進する条件下で実施されるものである）、
（ｃ）（ｂ）で取得した前記ＤＮＡライブラリをシークエンシングする工程と、を含み、前記ＤＮＡライブラリ内の各配列は、固有のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含み、これによって各配列を固有の識別可能なバーコード配列で標識する、方法。
【請求項４６】
前記第２の増幅プライマーセット内の複数のオリゴヌクレオチドがそれぞれ更に、下記：
（ｉ）Ｂ１及びＢ２から区別される配列を有する６〜２０個の連続するヌクレオチドのオリゴヌクレオチドバーコード配列を含む第３のバーコードオリゴヌクレオチドＢ３を含むサンプル識別バーコードオリゴヌクレオチドであって、第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドＢ３は、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドと第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列との間にあり、また第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドＢ３は、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドと第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列との間にある、サンプル識別バーコードオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉ）１〜２０個の連続するヌクレオチドの任意の配列であるスペーサーオリゴヌクレオチドであって、このスペーサーオリゴヌクレオチドは、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドと、第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド内の第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列との間にあり、かつ、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドと、第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド内の第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列との間にある、スペーサーオリゴヌクレオチドと、
の、いずれか又は両方を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
単一のリンパ球系細胞内の適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチド配列をコードする個々の再構成ＤＮＡ配列又はそこから転写されたｍＲＮＡ配列を標識するための方法であって、
単一リンパ球系細胞、又はそれから単離されたゲノムＤＮＡ、又は単一リンパ球系細胞のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から逆転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をそれぞれに含む、第１の複数の個々の微小液滴（Ａ）を、第２の複数の個々の微小液滴（Ｂ）に接触させる工程を含み、このそれぞれが：
（ｉ）適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１のポリペプチドをコードする再構成ＤＮＡ配列を増幅することができる第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセット、及び
（ｉｉ）適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第２のポリペプチドをコードする再構成ＤＮＡ配列を増幅することができる第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセット、
を含み、
（Ｉ）第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットが請求項４２に記載のＵ１／２−Ｂ１−Ｘ１の組成物を含み、
（ＩＩ）第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットが請求項４２に記載のＵ３／４−Ｂ２−Ｘ２の組成物を含み、
複数の融合イベントが前記第１の微小液滴の１つと前記第２の微小液滴の１つとの間に生じるよう十分な時間にわたって条件を提供し、複数の融合微小液滴を形成する工程と、
前記複数の融合微小液滴内で前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットを用いて、ゲノムＤＮＡ、又はｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡの増幅を可能にする条件を提供する工程と、を含み、
１つ以上の前記複数の融合微小液滴はそれぞれ、
少なくとも１つの第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドの少なくとも１つのＸ１オリゴヌクレオチドＶ領域コーディング遺伝子配列、少なくとも１つの第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、及び適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドの少なくとも１つのＸ１オリゴヌクレオチドＪ領域又はＣ領域コーディング遺伝子配列を含む、第１の二本鎖ＤＮＡ産物と、
少なくとも１つの第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチドバーコード配列、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドの少なくとも１つのＸ２オリゴヌクレオチドＶ領域コーディング遺伝子配列、少なくとも１つの第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、及び適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドの少なくとも１つのＸ２オリゴヌクレオチドＪ領域又はＣ領域コーディング遺伝子配列を含む、第２の二本鎖ＤＮＡ産物と、を含み、
これにより、ゲノムＤＮＡ、又はｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡの増幅により、個々の再構成ＤＮＡ配列又はそこから転写されたｍＲＮＡ配列のそれぞれが、オリゴヌクレオチドバーコード配列で標識される、方法。
【請求項４８】
前記複数の融合微小液滴を破壊して、前記第１及び第２の二本鎖ＤＮＡ産物の異種混合物を取得する工程を更に含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１及び第２の二本鎖ＤＮＡ産物を、第３の増幅プライマーセット及び第４の増幅プライマーセットに接触させる工程を更に含み、
前記第３の増幅プライマーセットは、（ｉ）それぞれ、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、複数の第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）それぞれ、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、複数の第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、を含み、
前記第４の増幅プライマーセットは、（ｉ）それぞれ、第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第３シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、複数の第３シークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）それぞれ、第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第４シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、複数の第４シークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、を含み、
前記接触させる工程は、前記第１及び第２の二本鎖ＤＮＡ産物の両方の鎖を増幅するのに十分な条件及び時間で実施され、これによりシークエンシングのためのＤＮＡライブラリを取得する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＤＮＡライブラリをシークエンシングして、前記適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１及び第２のポリペプチド配列をコードする配列のデータセットを取得する工程を更に含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第３及び第４の増幅プライマーセットが同じである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
単一リンパ球系細胞内の適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチド配列をコードする個々の再構成ＤＮＡ配列を標識するための方法であって、次の工程：
単一リンパ球系細胞のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から逆転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をそれぞれに含む、第１の複数の個々の微小液滴（Ａ）を、第２の複数の個々の微小液滴（Ｂ）に接触させる工程を含み、このそれぞれが：
（ｉ）適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１のポリペプチドをコードする第１のｃＤＮＡ配列を増幅することができる第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセット、及び
（ｉｉ）適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第２のポリペプチドをコードする第２のｃＤＮＡ配列を増幅することができる第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットを含み、
（Ｉ）第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットが請求項４２に記載のＵ１／２−Ｂ１−Ｘ１の組成物を含み、
かつ
（ＩＩ）第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットが請求項４２に記載のＵ３／４−Ｂ２−Ｘ２の組成物を含み、
前記複数の融合微小液滴内で、前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットを用いることにより、前記第１の微小液滴のうち１つと第２の微小液滴のうち１つとの間に複数の融合イベントを起こして複数の融合微小液滴を形成するのに十分な時間にわたって、単一リンパ球系細胞のｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡの増幅を可能にするような条件を提供する工程を含み、１つ以上の前記複数の融合微小液滴はそれぞれ、
少なくとも１つの第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドの少なくとも１つのＸ１オリゴヌクレオチドＶ領域コーディング遺伝子配列、少なくとも１つの第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、及び、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドの少なくとも１つのＸ１オリゴヌクレオチドＪ領域又はＣ領域コーディング遺伝子配列を含む、第１の二本鎖ＤＮＡ産物と、
少なくとも１つの第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチドバーコード配列、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドの少なくとも１つのＸ２オリゴヌクレオチドＶ領域コーディング遺伝子配列、少なくとも１つの第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、及び適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドの少なくとも１つのＸ２オリゴヌクレオチドＪ領域又はＣ領域コーディング遺伝子配列を含む、第２の二本鎖ＤＮＡ産物と、
を含み、これにより、ｃＤＮＡが増幅されたときに、個々の再構成ｃＤＮＡ配列が、固有のオリゴヌクレオチドバーコード配列で標識される、方法。
【請求項５３】
前記複数の融合微小液滴を破壊して、前記第１及び第２の二本鎖ＤＮＡ産物の異種混合物を取得する工程を更に含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記第１及び第２の二本鎖ＤＮＡ産物の混合物を、第３の増幅プライマーセット及び第４の増幅プライマーセットに接触させる工程を更に含み、
前記第３の増幅プライマーセットは、（ｉ）それぞれ、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、複数の第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）それぞれ、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、複数の第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、を含み、
前記第４の増幅プライマーセットは、（ｉ）それぞれ、第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第３シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、複数の第３シークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）それぞれ、第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第４シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、複数の第４シークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、を含み、
前記接触させる工程は、前記第１及び第２の二本鎖ＤＮＡ産物の両方の鎖を増幅するのに十分な条件及び時間で実施され、これによりシークエンシングのためのＤＮＡライブラリを取得する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＤＮＡライブラリをシークエンシングして、前記適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１及び第２のポリペプチド配列をコードする配列のデータセットを取得する工程を更に含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第３の増幅プライマーセットが、前記第４の増幅プライマーセットと同一である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
（１）前記第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットは、前記第１のポリペプチドをコードしている再構成ＤＮＡ配列において、第１のポリペプチドの第１の相補性決定領域−３（ＣＤＲ３）をコードする再構成ＤＮＡ配列を増幅することができること、及び
（２）前記第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットは、前記第２のポリペプチドをコードしている再構成ＤＮＡ配列において、第２のポリペプチドの第２の相補性決定領域−３（ＣＤＲ３）をコードする再構成ＤＮＡ配列を増幅することができること、のいずれか一方又は両方である、請求項４７又は５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
（ａ）前記適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドがＴＣＲ  α（ＴＣＲＡ）鎖であり、かつ前記適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドがＴＣＲ  β（ＴＣＲＢ）鎖であり、又は
（ｂ）前記適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドがＴＣＲ  γ（ＴＣＲＧ）鎖であり、かつ前記適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドがＴＣＲ  δ鎖（ＴＣＲＤ）であり、又は
（ｃ）前記適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドが免疫グロブリン重（ＩＧＨ）鎖であり、かつ前記適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖ＩＧＬ鎖又はＩＧＫ鎖から選択される、請求項４７又は５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドがＩＧＨ鎖であり、かつ前記適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドがＩＧＬ及びＩＧＫの両方である場合は、ＩＧＨに対する第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセット、ＩＧＫに対する第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセット、及びＩＧＬに対する第３のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットを含む３つの異なる増幅プライマーセットが使用される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記第２の複数の個々の微小液滴それぞれが、リンパ球の状態の指標となる分子をコードする第３のｃＤＮＡ配列を増幅することができ、かつ一般式（ＶＩＩ）：
Ｕ５／６−Ｂ−Ｘ３        （ＶＩＩ）
を有する複数のオリゴヌクレオチド配列を含む組成物を含む、第３のオリゴヌクレオチドプライマーセットを更に含み、
式中、Ｕ５／６は、Ｂが存在するときに第５ユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｂが存在しないときに第６ユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含み、
Ｂは、Ｂ１又はＢ２を含み、かつ
Ｘ３は、（ｉ）リンパ球の状態の指標となる分子をコードする遺伝子配列、又はその相補的配列の１５〜８０個の連続するヌクレオチドであるフォワードプライマー、及び（ｉｉ）リンパ球の状態の指標となる分子をコードする遺伝子配列、又はその相補的配列の１５〜８０個の連続するヌクレオチドであるリバースプライマー、のいずれか１つのオリゴヌクレオチドを含み、かつ、一般式Ｕ５／６−Ｂ−Ｘ３の複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ３は固有のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
前記リンパ球の状態の指標となる分子が、ＦｏｘＰ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ６２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ１０３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３８、ＣＤ１６１、ＣＤ２９４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＩｇＧ１−４  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＡ  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＥ  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＤ  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＭ  Ｈ鎖定常領域、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−β、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、及びＴＬＲ１０のうち１つ以上を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
工程（４）が更に、
（ａ）データセット中で識別されるオリゴヌクレオチドバーコード配列に照らして配列のデータセットをソーティングすることにより、それぞれ固有のバーコードを有する複数のバーコード配列セットを取得する工程と、
（ｂ）（ａ）の各バーコード配列セットをＸ１配列含有サブセット及びＸ２配列含有サブセットにソーティングする工程と、
（ｃ）Ｘ１及びＸ２配列に照らしてＸ１及びＸ２配列含有サブセットのそれぞれの構成要素をクラスタリングして、それぞれ、１つ又は複数のＸ１配列クラスターセット及び１つ又は複数のＸ２配列クラスターセットを取得する工程と、１つ以上のいずれかの前記Ｘ１及びＸ２配列クラスターセット内の、単一ヌクレオチドバーコード配列のミスマッチをエラー修復する工程と；
（ｄ）同じ１つ以上のバーコード配列セットに属するＸ１及びＸ２配列クラスターセットの構成要素である、同じ細胞配列に由来するものとして識別する工程と、を含む、請求項５０又は５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
単一リンパ球系細胞内の適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチド配列をコードする再構成ＤＮＡ配列を決定するための方法であって、次の工程：
（１）対象のリンパ球系細胞集団を含む細胞懸濁液の細胞を、前記細胞を収容することができる複数の容器に配分して、１つのリンパ球系細胞又は複数のリンパ球系細胞を含むリンパ球系細胞の亜集団をそれぞれに含む複数の容器を取得する工程と、
（２）複数の容器内のリンパ球系細胞内のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の逆転写を促進するのに十分な条件下及び時間、前記複数の容器内それぞれに、第１及び第２のオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットを接触させる工程であって、（Ａ）第１のオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットは、第１の適応性免疫受容体ヘテロダイマーの複数のポリペプチドをコードする複数の第１のｍＲＮＡ配列を逆転写することができ、また（Ｂ）第２のオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットは、第２適応性免疫受容体ヘテロダイマーの複数のポリペプチドをコードする複数の第２のｍＲＮＡ配列を逆転写することができ、
かつ、
（Ｉ）第１のオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットが、請求項３２に記載の一般式Ｕ１／２−Ｂ１−Ｘ１を含む組成物を含み、
（ＩＩ）第２のオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットが、請求項３２に記載の一般式Ｕ３／４−Ｂ２−Ｘ２を含む組成物を含み、
前記接触工程は、１つ以上の前記複数の容器内で、下記：
少なくとも１つの第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドの少なくとも１つのＸ１オリゴヌクレオチドＶ領域コーディング遺伝子配列、少なくとも１つの第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、及び、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドの少なくとも１つのＸ１オリゴヌクレオチドＪ領域又はＣ領域コーディング遺伝子配列を含む、第１の逆転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）産物と、
少なくとも１つの第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチドバーコード配列、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドの少なくとも１つのＸ２オリゴヌクレオチドＶ領域コーディング遺伝子配列、少なくとも１つの第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、及び、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドの少なくとも１つのＸ２オリゴヌクレオチドＪ領域又はＣ領域コーディング遺伝子配列を含む、第２逆転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）産物と、のうち１つ以上を取得するのに十分な条件下及び時間、実施される、接触させる工程と、
（３）前記複数の容器から前記第１及び第２の逆転写されたｃＤＮＡ産物を合わせて、逆転写されたｃＤＮＡ産物の混合物を取得する工程と、
（４）（３）の第１及び第２の逆転写されたｃＤＮＡ産物の混合物を、第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセット及び第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットと接触させる工程であって、前記第１の増幅プライマーセットは、（ｉ）それぞれ、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、複数の第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）それぞれ、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、複数の第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、を含み、
及び、前記第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットは、（ｉ）それぞれ、前記第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、前記第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第３シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、複数の第３シークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）それぞれ、前記第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、前記第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第４シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、複数の第４シークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、を含み、
前記接触させる工程は、（２）の前記第１及び第２の逆転写されたｃＤＮＡ産物の両方を増幅するのに十分な条件及び時間で実施され、これによりシークエンシングのためのＤＮＡライブラリを取得する、接触させる工程と、
（５）（３）で取得した前記ＤＮＡライブラリをシークエンシングして、前記適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１及び第２のポリペプチド配列をコードする配列のデータセットを取得する工程と、を含む方法。
【請求項６４】
前記工程（５）が更に、
（ａ）データセット中で識別されるオリゴヌクレオチドバーコード配列に照らして配列のデータセットをソーティングすることにより、それぞれ固有のバーコードを有する複数のバーコード配列セットを取得する工程と、
（ｂ）（ａ）の各バーコード配列セットをＸ１配列含有サブセット及びＸ２配列含有サブセットにソーティングする工程と、
（ｃ）Ｘ１及びＸ２配列に照らしてＸ１及びＸ２配列含有サブセットのそれぞれの構成要素をクラスタリングして、それぞれ、１つ又は複数のＸ１配列クラスターセット及び１つ又は複数のＸ２配列クラスターセットを取得する工程と、１つ以上のいずれかの前記Ｘ１及びＸ２配列クラスターセット内の、単一ヌクレオチドバーコード配列のミスマッチをエラー修復する工程と、
（ｄ）既知のＸ１及びＸ２配列に基づいて第１及び第２の適応性免疫受容体ヘテロダイマーポリペプチドをコードする配列それぞれを識別する工程を含み、各Ｘ１配列及び各Ｘ２配列は、１つ又は複数の固有のＢ配列に関連付けられ、各Ｂ配列関連Ｘ１配列及び各Ｂ配列関連Ｘ２配列が由来する容器を識別する工程と、
（ｅ）共通の第１及び第２の適応性免疫受容体ヘテロダイマーポリペプチドをコードする配列とＢ配列が一致する確率に基づいて、（ｄ）のＢ配列関連Ｘ１及びＸ２配列を共通クローン源として組み合わせてマッチングする工程と、これにより、単一リンパ球系細胞に由来する適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチド配列をコードする再構成ＤＮＡ配列を決定する工程と、を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
（１）前記第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットは、前記第１のポリペプチドをコードしている再構成ＤＮＡ配列において、第１のポリペプチドの第１の相補性決定領域−３（ＣＤＲ３）をコードする再構成ＤＮＡ配列を増幅することができること、及び
（２）前記第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットは、前記第２のポリペプチドをコードしている再構成ＤＮＡ配列において、第２のポリペプチドの第２の相補性決定領域−３（ＣＤＲ３）をコードする再構成ＤＮＡ配列を増幅することができること、のいずれか一方又は両方である、請求６３に記載の方法。
【請求項６６】
（ａ）前記適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドがＴＣＲ  α（ＴＣＲＡ）鎖であり、かつ前記適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドがＴＣＲ  β（ＴＣＲＢ）鎖であり、又は
（ｂ）前記適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドがＴＣＲ  γ（ＴＣＲＧ）鎖であり、かつ前記適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドがＴＣＲ  δ鎖（ＴＣＲＤ）であり、又は
（ｃ）適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１のポリペプチドは免疫グロブリン重（ＩＧＨ）鎖であり、かつ適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第２のポリペプチドは免疫グロブリン軽（ＩＧＬ、ＩＧＫ、又はＩＧＬとＩＧＫの両方）鎖である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
１つ以上の容器が、リンパ球の状態の指標となる分子をコードする第３のｃＤＮＡ配列を増幅することができ、かつ一般式（ＶＩＩＩ）：
Ｕ５／６−Ｂ３−Ｘ３      （ＶＩＩＩ）
の複数のオリゴヌクレオチド配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含む組成物を含む、第３のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットを含み、
式中、Ｕ５／６は、Ｂ３が存在するときに第５ユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｂ３が存在しないときに第６ユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド配列を含み、
Ｂ３は、存在しないか、又はＢ１又はＢ２のうち少なくとも１つと同じであるか又は異なる、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の連続するヌクレオチドの第３のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含む、オリゴヌクレオチドを含み、
Ｘ３は、（ｉ）リンパ球の状態の指標となる分子をコードする遺伝子配列、又はその相補的配列の１５〜８０個の連続するヌクレオチドであるフォワードプライマーポリヌクレオチド、及び（ｉｉ）リンパ球の状態の指標となる分子をコードする遺伝子配列、又はその相補的配列の１５〜８０個の連続するヌクレオチドであるリバースプライマーポリヌクレオチド、のいずれか１つのオリゴヌクレオチドを含み、かつ、一般式Ｕ５／６−Ｂ３−Ｘ３の複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ３は固有のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記リンパ球の状態の指標となる分子が、ＦｏｘＰ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ６２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ１０３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３８、ＣＤ１６１、ＣＤ２９４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＩｇＧ１−４  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＡ  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＥ  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＤ  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＭ  Ｈ鎖定常領域、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−β、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９及びＴＬＲ１０のうち１つ以上を含む、請求項６７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（配列表）
本願はＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で提出される配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。そのＡＳＣＩＩコピーは２０１３年４月１２日に作成され、「２３４９６ＰＣＴ＿ＣＲＦ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と名付けられ、ファイルサイズは４，３８２，７０２バイトである。
【０００２】
（発明の開示）
本開示は、概して、マルチプレックス化された核酸増幅反応における、適応性免疫受容体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、Ｔ細胞受容体及び免疫グロブリンをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ）の、定量的高スループットシークエンシングに関する。具体的には、本明細書に記述される組成物及び方法により、単一細胞内の適応性免疫受容体ヘテロダイマーの両鎖をコードするＤＮＡ配列の定量的シークエンシングを可能にする。また本明細書では、マルチプレックス化ＤＮＡ増幅法における特定のオリゴヌクレオチドプライマーの過剰活用及び／又は過少活用バイアスの結果として、適応性免疫受容体コード配列の定量において生じ得る、望ましくない歪みを克服する実施形態が開示される。
【背景技術】
【０００３】
適応性免疫系は、多数の潜在的な病原を認識するために十分な多様性を有するＴ及びＢ細胞抗原受容体、すなわち適応性免疫受容体のレパートリーを、様々な戦略を利用して生成する。Ｔ細胞が、様々ながん又は感染性生物に関連する多数の抗原を認識する能力は、ＴＣＲＡ遺伝子座からのα（アルファ）鎖とＴＣＲＢ遺伝子座のβ（ベータ）鎖とのヘテロダイマー、又はＴＣＲＧ遺伝子座からのγ（ガンマ）鎖とＴＣＲＤ遺伝子座からのδ（デルタ）鎖とのヘテロダイマーである、そのＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）によって与えられる。これらの鎖を構成するタンパク質はＤＮＡによりコードされ、リンパ球系細胞では、その際、ＴＣＲの広範な多様性を生成するために固有の再構成機序が利用される。このマルチサブユニット型免疫認識受容体は、ＣＤ３複合体と会合し、かつ抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ又はＩＩタンパク質のいずれかによって提示されたペプチドと結合する。ＡＰＣ上の抗原性ペプチドへのＴＣＲの結合は、Ｔ細胞活性化における重要なイベントであり、Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞とＡＰＣとの間の接触点の免疫シナプスにて発生する。
【０００４】
各ＴＣＲペプチドは、可変性の相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びにフレームワーク領域（ＦＲ）及び定常領域を含む。αβ  Ｔ細胞の配列多様性の大部分は、α及びβ鎖可変ドメインの第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）ループのアミノ酸配列によって決定され、多様性は、それぞれβ鎖遺伝子座における可変（Ｖβ）、多様性（Ｄβ）、連結（Ｊβ）遺伝子断片間の組換え、並びにα鎖遺伝子座における類似のＶα及びＪα遺伝子断片間の組換えの結果として生じる。ＴＣＲ  α及びβ鎖遺伝子座内にこのような遺伝子断片が多数存在することで、多数の異なるＣＤＲ３配列がコードされ得ることになる。ＣＤＲ３配列の多様性は、ＴＣＲ遺伝子再構成のプロセス中に、Ｖβ−Ｄβ、Ｄβ−Ｊβ及びＶα−Ｊα連結部において、ヌクレオチドが独立して挿入及び欠失されることによって更に増加する。本態様において、免疫適格性は、ＴＣＲの多様性に反映される。
【０００５】
γδ  ＴＣＲは、自然免疫系と密接に相互作用する受容体をコードし、非ＨＬＡ依存様式において抗原を認識する、αβ  ＴＣＲとは異なる。ＴＣＲγδは、発生の早期に発現し、解剖学的分布、固有の病原体及び低分子特異性、並びに先天性及び適応性の細胞相互作用の広域スペクトルが専門化される。ＴＣＲγ  Ｖ及びＪ断片の発現のバイアスパターンが、個体発生の早期に確立される。したがって、成人組織中の多種多様なＴＣＲγレパートリーは、病原体及び毒性分子に対する環境曝露による刺激を受けて広く周辺に拡大した結果として生じる。
【０００６】
Ｂ細胞により発現され、本明細書でＢ細胞受容体（ＢＣＲ）としても参照される免疫グロブリン（Ｉｇ又はＩＧ）は、Ｈ２Ｌ２構造を形成する、４つのポリペプチド鎖、ＩＧＨ遺伝子座からの２つの重鎖（Ｈ鎖）と、ＩＧＫ（κ）又はＩＧＬ（λ）遺伝子座からの２つの軽鎖（Ｌ鎖）とからなるタンパク質である。Ｈ鎖とＬ鎖は両方とも、抗原認識に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、定常ドメインとを含む。ＩＧのＨ鎖は、まずＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域のアイソフォームのいずれかを用い膜結合アイソフォームとして発現されるが、抗原認識後、Ｈ鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＡを含むいくつかの更なるアイソタイプへクラススイッチ可能である。ＴＣＲと同様に、個体内のナイーブＩｇの多様性は、主に超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）によって決定される。ＴＣＲと同様に、ＩＧＨ鎖のＣＤＲ３ドメインは、ＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子断片が組み合わされて連結されることによって作製される。超可変ドメインの配列多様性は、Ｉｇ遺伝子再構成プロセス中の、ＶＨ−ＤＨ、ＤＨ−ＪＨ及びＶＨ−ＪＨ連結部でのヌクレオチドの非依存性の付加及び欠損によって更に増加する。ＴＣＲとは異なり、Ｉｇ配列多様性は、ナイーブＢ細胞による抗原認識後に再構成されたＩＧ遺伝子内の体細胞超変異（ＳＨＭ）によって更に増加する。ＳＨＭのプロセスはＣＤＲ３に限定されず、したがって、フレームワーク領域、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２の生殖細胞系列の配列、並びに体細胞により再構成されたＣＤＲ３において変化を導入できる。
【０００７】
適応性免疫系は、固有のＴＣＲ又はＢＣＲを発現している細胞クローンの増殖によって部分的に機能するので、適応性免疫応答の動態を理解するためには、各クローンの全存在量における変化を正確に測定することが重要である。例えば、健康なヒトは、数百万の固有のＴＣＲβ鎖を有し、各ＴＣＲβ鎖は、健康な個体中のおよそ１兆個のＴ細胞のうち、数百から数千のクローン性Ｔ細胞中に保有されている。高スループットシークエンシングの進展を利用して、膨大なＴＣＲ及びＢＣＲレパートリーを特性付ける、新しい分野の分子免疫学が近年出現している。再構成適応性免疫受容体遺伝子配列のシークエンシングと適応性免疫受容体クローン型決定のための組成物及び方法は、例えば、Ｒｏｂｉｎｓら、２００９  Ｂｌｏｏｄ  １１４、４０９９；Ｒｏｂｉｎｓら、２０１０  Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．２：４７ｒａ６４；Ｒｏｂｉｎｓら、２０１１  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１１．０９．００１；Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、２０１１  Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．３：９０ｒａ６１；Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．第１３／２１７，１２６号（米国特許公開第２０１２／００５８９０２号）、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．第１２／７９４，５０７号（米国特許公開第２０１０／０３３０５７１号）、ＷＯ／２０１０／１５１４１６号、ＷＯ／２０１１／１０６７３８号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２６３７３号）、ＷＯ２０１２／０２７５０３号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４９０１２号）、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．第６１／５５０，３１１号、及びＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．第６１／５６９，１１８号に記述されており、これらは全体が参照により本明細書に援用される。
【０００８】
これまでに、適応性免疫受容体をコードしている核酸を、高スループットで定量的に配列決定するための様々な異なる戦略が用いられており、これらの戦略は、例えば、ＣＤＲ３コード領域を増幅するために使用されるアプローチにより、並びに選択されるゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列決定法により区別することができる。
【０００９】
ｍＲＮＡのスプライシングイベントによりＪ断片とＣ断片と間のイントロンが除去されることから、ｇＤＮＡを配列決定するよりも、ｍＲＮＡを配列決定する方が、簡単な方法である可能性がある。これにより、Ｃ領域において共通の３’ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅プライマーを使用して、異なるＶ領域及びＪ領域を有する適応性免疫受容体（例えば、ＴＣＲ又はＩｇ）を増幅することができる。例えば、各ＴＣＲβに関して、１３個のＪ断片全てが６０塩基対（ｂｐ）長より短い。したがって、スプライシングイベントによって、ＴＣＲβ定常領域（いずれのＶ及びＪ配列が使用されたかは関係ない）をコードしている同一のポリヌクレオチド配列が、１００ｂｐ未満の再構成されたＶＤＪ連結部となる。スプライシングされたｍＲＮＡは、次いで、ｍＲＮＡのポリＡテールに相補的なポリｄＴプライマー、ランダム小プライマー（通常、六量体又はナノマー）又はＣ断片特異的オリゴヌクレオチドを用いて、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写することができる。この逆転写では、バイアスのかかっていないＴＣＲ  ｃＤＮＡライブラリ（ポリｄＴ、ランダム六量体又はＣ断片特異的オリゴのいずれにせよ、全てのｃＤＮＡが同一のオリゴヌクレオチドを提供されるので）を生成する必要があり、次に、このライブラリを配列決定することで、各再構成で使用されたＶ及びＪ断片の情報、並びにＣＤＲ３特異的配列の情報を取得することができる。このようなシークエンシングは、単一の、ＣＤＲ３にわたるロングリード（「ロングリード」）法を利用可能であり、又は代わりに、より長い配列の数多くのコピーの分画、及びより高スループットのより短い配列リードを伴い得る。
【００１０】
しかしながら、ｍＲＮＡシークエンシングに基づき、サンプル中の、特定の再構成されたＴＣＲ（又はＩｇ）を発現する細胞数を定量する試みは、各細胞が異なる量のＴＣＲ  ｍＲＮＡを発現し得ることから、解釈するのが難しい。例えば、インビトロにて活性化されたＴ細胞は、休眠Ｔ細胞よりも、細胞あたり１０〜１００倍多くｍＲＮＡを有する。現在のところ、機能状態の異なるＴ細胞におけるＴＣＲ  ｍＲＮＡの相対量に関する情報は非常に限られていることから、大量のｍＲＮＡの定量は、各ＴＣＲクローンを有する細胞の数を、必ずしも正確に測定するものではない。
【００１１】
一方、ほとんどのＴ細胞は、１つの生産的に再構成されたＴＣＲα遺伝子と、１つの生産的に再構成されたＴＣＲβ遺伝子（又は２つの再構成されたＴＣＲγ及びＴＣＲδ）と、を有し、ほとんどのＢ細胞は、１つの生産的に再構成されたＩｇ重鎖遺伝子と、１つの生産的に再構成されたＩｇ軽鎖遺伝子（ＩＧＫ又はＩＧＬのいずれか）と、を有することから、ＴＣＲ又はＢＣＲをコードしているゲノムＤＮＡサンプルにおける定量は、それぞれサンプル中のＴ又はＢ細胞の数と直接相関するはずである。例えば、代表的な例としてヒトＴＣＲβ鎖を用いる、任意の１種以上の適応性免疫受容体鎖をコードしているポリヌクレオチドのゲノムシークエンシングでは、望ましくは、対象のリンパ球系細胞由来のＤＮＡを含有するサンプル中に存在する多くの可能性のある再構成ＴＣＲβをコードする配列の全てを等しい効率で増幅する必要があり、その後、定量的シークエンシングを実施することで、相対的に多量のそれぞれのクローン型の定量的測定を得ることができる。
【００１２】
しかしながら、そのようなアプローチでは、等しい増幅及び等しいシークエンシング効率は容易に達成することはできないという問題に直面する。例えば、再構成されたＴＣＲβをコードするクローンそれぞれについて、各クローンは５４種類の可能な生殖細胞系Ｖ領域コーディング遺伝子のうち１つと、１３種類の可能なＪ領域コーディング遺伝子のうち１つを用いている。ＴＣＲβゲノム遺伝子座における極めて多様なＶ及びＪ断片の特異的配列は、上記で概説したような多様性生成メカニズムにより、異なるＶ又はＪ遺伝子が用いられることによって生じ得る、膨大な数の再構成により、大きく変動する。
【００１３】
この配列多様性により、複雑なＤＮＡサンプルが生成され、ＤＮＡサンプル中に含まれている複数の異なる配列を正確に決定するに当たって、マルチプレックス化された増幅及び高スループットな配列決定を用いて複数の分子種を同時に定量する際に技術的な制限を受け妨害されることになる。加えて、ＴＣＲ又はＩＧヘテロダイマーの両鎖が同じリンパ球系細胞に由来することを決定できるような方法で、両鎖をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを定量的に配列決定するのは、既存の方法では困難である。
【００１４】
１つ以上の要因によって、シークエンシングデータの出力を歪めるアーティファクトが生じる場合があり、これにより、非常に多種多様なＴＣＲ又はＩＧ遺伝子鋳型を収集してマルチプレックス化増幅することに基づくシークエンス戦略により、信頼できる定量的データを得る能力が損なわれる。これらのアーティファクトは、しばしば、マルチプレックス化増幅工程における多種多様なプライマーの不均等な利用の結果生じる。多種多様な増幅鋳型を利用するマルチプレックス化反応における１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーのこのようなバイアス化された利用は、１つ以上の、鋳型及び／又はオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド塩基組成中の差違、鋳型及び／又はプライマー長における差違、使用する特定のポリメラーゼ、増幅反応温度（例えば、アニーリング、伸長及び／又は変性温度）及び／又は他の因子（例えば、Ｋａｎａｇａｗａ、２００３  Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６：３１７；Ｄａｙら、１９９６  Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：２０３９；Ｏｇｉｎｏら、２００２  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎｏｓｔ．４：１８５；Ｂａｒｎａｒｄら、１９９８  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２５：６８４；Ａｉｒｄら、２０１１  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．１２：Ｒ１８）に応じ生じ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
歪んだ結果（例えば、複合鋳型ＤＮＡ集団のマルチプレックス増幅に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーセット中の１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの利用におけるバイアスによる、個々の配列の過剰発現又は過少発現のミスリードなど）を回避するような方法、並びに同じリンパ系細胞由来のＴＣＲ又はＩＧヘテロダイマーの両鎖をコードする配列の決定を可能にする方法で、複合サンプル中の適応性免疫受容体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡの配列多様性の正確な定量を可能にする、改良された組成物及び方法に対する必要性が、今もなお存在することは明らかである。本明細書で記述された実施形態は、この必要性に取り組み、他の関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、オリゴヌクレオチド増幅プライマー組成物を含む組成物を提供する。このオリゴヌクレオチド増幅プライマー組成物は、（Ａ）一般式（Ａ）：Ｕ１−Ｂ１−Ｖ１（Ａ）の複数の順方向オリゴヌクレオチド配列と、一般式（Ｂ）：Ｕ２−Ｂ２−Ｊ１（Ｂ）の複数の逆方向オリゴヌクレオチド配列とを含む第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットを含み、式中、Ｕ１は第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｕ２は第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、Ｂ１は存在せず、又は６〜２０個の連続するヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ２は存在せず、又は６〜２０個の連続するヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、これにより少なくともＢ１又はＢ２のいずれか一方は存在する。別の一実施形態において、Ｖ１は第１の適応性免疫受容体のＶ領域コーディング遺伝子配列又はその相補的配列の、少なくとも１５個以上１００個以下の連続するヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｊ１は、（ｉ）前記第１の適応性免疫受容体の連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列又はその相補的配列、又は（ｉｉ）前記第１の適応性免疫受容体の定常（Ｃ）領域コーディング遺伝子配列又はその相補的配列の、少なくとも１５個以上８０以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、一般式Ｕ１−Ｂ１−Ｖ１の複数のオリゴヌクレオチド配列のそれぞれについて、Ｖ１は固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、また一般式Ｕ２−Ｂ２−Ｊ１の複数のオリゴヌクレオチド配列のそれぞれについて、Ｊ１は固有のオリゴヌクレオチド配列を含む。オリゴヌクレオチド増幅プライマー組成物は、一般式（Ｃ）：Ｕ３−Ｂ３−Ｖ２（Ｃ）の複数の順方向オリゴヌクレオチド配列と、一般式（Ｄ）：Ｕ４−Ｂ４−Ｊ２（Ｄ）の複数の逆方向オリゴヌクレオチド配列とを含む第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットを含み、式中、Ｕ３はＵ１又はＵ２のいずれかに同一のオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｕ４は、Ｕ３とは同一ではないＵ１又はＵ２のいずれかと同一であるオリゴヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｂ３は、Ｂ１と同じである６〜２０個の連続するヌクレオチドのオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｂ４は、Ｂ２と同じ６〜２０個の連続するヌクレオチドのオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含む。別の一実施形態において、Ｖ２は第２適応性免疫受容体のＶ領域コーディング遺伝子配列又はその相補的配列の、少なくとも１５個以上１００個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む。別の一実施形態において、Ｊ２は、（ｉ）前記第２適応性免疫受容体の連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列又はその相補的配列、又は（ｉｉ）前記第２適応性免疫受容体の定常（Ｃ）領域コーディング遺伝子配列又はその相補的配列の、１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、一般式Ｕ３−Ｂ３−Ｖ２の複数のオリゴヌクレオチド配列のそれぞれについて、Ｖ２は固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、また一般式Ｕ４−Ｂ４−Ｊ２の複数のオリゴヌクレオチド配列のそれぞれについて、Ｊ２は固有のオリゴヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、Ｕ１はＵ３と同一である。別の一実施形態において、Ｕ２はＵ４と同一である。
【００１７】
本発明は、対象のリンパ球系細胞を含む生体サンプル中の、複数の適応性免疫受容体をコードする個々の再構成ＤＮＡ配列を標識するための方法を提供し、この方法は：（ａ）二本鎖ＤＮＡ産物を取得するために増幅を促進する条件下で、本明細書に記述されるオリゴヌクレオチドプライマー組成物を含む第１の増幅プライマーセットを使用し、前記再構成ＤＮＡ配列を増幅する工程を含む。各二本鎖ＤＮＡ産物は、（ｉ）産物の両端それぞれに、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドバーコード配列、Ｘ１オリゴヌクレオチド配列、Ｘ２オリゴヌクレオチド配列を備えた、少なくとも２つのユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含む配列と、（ｉｉ）（ｉ）の配列に対する相補的配列とを含む。この方法は、（ｂ）それぞれ次の、（ｉ）第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド、又は、（ｉｉ）第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド、のいずれかを含む、複数の第１及び第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドを含む第２の増幅プライマーセットにより、（ａ）の二本鎖ＤＮＡ産物を増幅する工程、を含む。いくつかの実施形態において、シークエンシングのために複数の適応性免疫受容体をコードする再構成ＤＮＡ配列のライブラリを取得するため、（ａ）の分離した二本鎖ＤＮＡ産物の両鎖の増幅を促進する条件下で増幅が実施される。この方法は更に、（ｂ）で取得したＤＮＡライブラリをシークエンシングするための工程（ｃ）を含み、ＤＮＡライブラリ内の各配列は、固有のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含み、これによって各配列を固有の識別可能なバーコード配列で標識する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、第２の増幅プライマーセット内の複数のオリゴヌクレオチドは更に、下記のいずれか又は両方を含む：（ｉ）Ｂ１及びＢ２から区別される配列を有する６〜２０個の連続するヌクレオチドのオリゴヌクレオチドバーコード配列を含む第３のバーコードオリゴヌクレオチドＢ５を含むサンプル識別バーコードオリゴヌクレオチドであって、第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドＢ５は、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドと第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列との間にあり、また第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドＢ３は、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドと第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列との間にある、サンプル識別バーコードオリゴヌクレオチド；（ｉｉ）１〜２０個の連続するヌクレオチドの任意の配列であるスペーサーオリゴヌクレオチドであって、このスペーサーオリゴヌクレオチドは、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドと、第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド内の第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列との間にあり、かつ、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドと、第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド内の第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列との間にある、スペーサーオリゴヌクレオチド。
【００１９】
他の実施形態において、本発明は、一般式（Ｉ）：５’−Ｕ１−Ｂ１ｎ−Ｘ−３’（Ｉ）を有する複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドプライマー組成物を提供し、式中：Ｕ１は、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｂ１は、ｎ個の連続するヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、ｎは６個以上のヌクレオチドであり、かつＸは、（ｉ）適応性免疫受容体可変（Ｖ）領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、又は（ｉｉ）適応性免疫受容体連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含み、かつ複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘは固有のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド配列は、最高４ｎ個の固有のＢ１オリゴヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、ｎは７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の連続するヌクレオチドである。他の実施形態において、Ｘは、前記適応性免疫受容体Ｖ領域コーディング遺伝子配列、又は前記相補的配列の、少なくとも２０、３０、４０又は５０個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む。別の一実施形態において、Ｘは、前記適応性免疫受容体Ｖ領域コーディング遺伝子配列、又は前記相補的配列の、７０、６０、又は５５個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む。更に別の一実施形態において、Ｘは、前記適応性免疫受容体Ｊ領域コーディング遺伝子配列、又は前記相補的配列の、少なくとも１６〜５０個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、Ｘは、前記適応性免疫受容体Ｊ領域コーディング遺伝子配列、又は前記相補的配列の、７０、６０、又は５５個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、ＸはＶ領域コーディング遺伝子配列に対しハイブリッド形成させることができる。別の一実施形態において、ＸはＪ領域コーディング遺伝子配列に対しハイブリッド形成させることができる。
【００２１】
他の実施形態において、Ｂ１は再構成ＴＣＲ又はＩｇをコードする個々の配列を識別するための固有のタグである。別の一実施形態において、Ｕ１は配列番号：１７１０〜１７３１を含む。Ｂ１は、表８に記載されている配列を含み得る。Ｘは、配列番号：１６３１〜１６４３又は１６９６〜１７０８を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｘは配列番号：１６４４〜１６９５を含む。他の実施形態において、Ｘは配列番号：５６１３〜５６２５を含む。いくつかの実施形態において、前記複数のオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド組成物は、配列番号：５６２６〜５６８５を含む。他の実施形態において、前記複数のオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド組成物は、配列番号：１〜１６３０を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、この組成物は、一般式（ＩＩ）：５’−Ｐ１−Ｓ１−Ｂ２−Ｕ１−３’（ＩＩ）を含む複数の第２のオリゴヌクレオチド配列を含み、式中、Ｐ１はシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチドを含み、Ｓ１はシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド配列を含み、式中、Ｂ２はオリゴヌクレオチドバーコード配列を含み、前記オリゴヌクレオチドバーコード配列は、サンプル源を識別するために使用することができ、式中、Ｕ１は前記第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、複数の第２のオリゴヌクレオチド配列は、配列番号：５６８６〜５８７７を含む。
【００２３】
別の一実施形態において、本発明は、第１の増幅プライマーセットのためのオリゴヌクレオチドプライマー組成物を含み、これは、（Ａ）一般式（ＩＩＩ）：５’−Ｕ１−Ｂ１ｎ−Ｘ１−３’（ＩＩＩ）の複数の第１のオリゴヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｕ１は、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、（ｉｉ）Ｂ１は、ｎ個の連続するヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、式中、ｎは０又は６〜２０であり、かつ（ｉｉｉ）Ｘ１は、（ａ）適応性免疫受容体可変（Ｖ）領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、又は（ｂ）適応性免疫受容体連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、かつ、複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ１は固有のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
一実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド配列は最高４ｎ個の固有のＢ１オリゴヌクレオチド配列を含む。
【００２５】
別の一実施形態において、第１の増幅プライマーセットは更に：（Ｂ）一般式（ＩＶ）：５’−Ｕ２−Ｂ２ｍ−Ｘ２−３’（ＩＶ）の複数の第２のオリゴヌクレオチド配列を含み、式中：（ｉ）Ｕ２は、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、（ｉｉ）Ｂ２は、ｍ個の連続するヌクレオチドである第２のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、式中、ｍは０又は６〜２０であり、かつ（ｉｉｉ）Ｘ２は、（ａ）適応性免疫受容体可変（Ｖ）領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、又は（ｂ）適応性免疫受容体連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、かつ、複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ１は固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、式中、ｎ及びｍは互いに独立であり、前記第１及び第２の複数のオリゴヌクレオチドにおいて、ｍ及びｎは両方ともゼロにはならず、式中、Ｘ１が適応性免疫受容体Ｖ領域コーディング遺伝子配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含む場合、Ｘ２は適応性免疫受容体Ｊ領域コーディング遺伝子配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、またＸ１が適応性免疫受容体Ｊ領域コーディング遺伝子配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含む場合、Ｘ２は適応性免疫受容体Ｖ領域コーディング遺伝子配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００２６】
一実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド配列は、最高４ｍ個の固有のＢ２オリゴヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
別の一実施形態において、Ｘ１又はＸ２は、前記適応性免疫受容体Ｖ領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列オリゴヌクレオチド配列の、少なくとも２０、３０、４０又は５０個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む。更に別の一実施形態において、Ｘ１又はＸ２は、前記適応性免疫受容体Ｖ領域コーディング遺伝子配列、又は前記相補的配列の、７０、６０、又は５５個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、Ｘ１又はＸ２は、前記適応性免疫受容体Ｊ領域コーディング遺伝子配列、又は前記相補的配列の、少なくとも１６〜５０個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、Ｘ１又はＸ２は、前記適応性免疫受容体Ｊ領域コーディング遺伝子配列、又は前記相補的配列の、７０、６０、又は５５個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む。別の一実施形態において、Ｂ１は、再構成ＴＣＲ又はＩｇをコードする個々の配列を識別するための固有のタグである。更に別の一実施形態において、Ｂ２は、再構成ＴＣＲ又はＩｇをコードする個々の配列を識別するための固有のタグである。
【００２８】
いくつかの実施形態において、Ｕ１又はＵ２は、配列番号：１７１０〜１７３１を含む。一実施形態において、Ｂ１又はＢ２は、表８に記載の配列を含む。別の一実施形態において、Ｘ１又はＸ２は、配列番号：１６３１〜１６４３又は１６９６〜１７０８を含む。更に別の一実施形態において、Ｘ１又はＸ２は、配列番号：１６４４〜１６９５を含む。Ｘ１又はＸ２は、配列番号：５６１３〜５６２５を含み得る。他の実施形態において、複数の第１又は第２のオリゴヌクレオチド配列は、配列番号：５６２６〜５６８５を含む。別の一実施形態において、複数の第１又は第２のオリゴヌクレオチド配列は、配列番号：１〜１６３０を含む。
【００２９】
別の一実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチド増幅プライマー組成物を含み、これは：（Ａ）一般式（Ｖ）：Ｕ１／２−Ｂ１−Ｘ１（Ｖ）の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットを含み、式中、Ｕ１／２は、Ｂ１が存在するときに第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｂ１が存在しないときに第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド配列を含み、式中、Ｂ１は存在せず、又は６〜２０個の連続するヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含む、オリゴヌクレオチドを含み、式中、Ｘ１は、（１）適応性免疫受容体Ｖ領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、又は（２）（ｉ）適応性免疫受容体連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列、若しくは（ｉｉ）適応性免疫受容体定常（Ｃ）領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の、１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、のいずれかを含み、かつ、一般式Ｕ１／２−Ｂ１−Ｘ１の複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ１は固有のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド増幅プライマー組成物は更に、（Ｂ）一般式（ＶＩ）：Ｕ３／４−Ｂ２−Ｘ２（ＶＩ）の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットを含み、式中、Ｕ３／４は、Ｂ２が存在するときに第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｂ２が存在しないときに第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド配列を含み、式中、Ｂ２は存在せず、又はＢ１と同じである６〜２０個の連続するヌクレオチドである第２のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含む、オリゴヌクレオチド配列を含み、式中、Ｘ２は、（１）適応性免疫受容体Ｖ領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、又は（２）適応性免疫受容体連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列、又はその相補的配列の、１５個以上８０個以下の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、のいずれかを含み、かつ、一般式Ｕ３／４−Ｂ２−Ｘ２の複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ２は固有のオリゴヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｕ３はＵ１又はＵ２と同じ配列を有する。他の実施形態において、Ｕ４はＵ１又はＵ２と同じ配列を有する。
【００３１】
本発明の特定の実施形態は、対象のリンパ球系細胞を含む生体サンプル中の、複数の適応性免疫受容体をコードする個々の再構成ＤＮＡ配列を識別するための方法を含み、この方法は：（ｉ）少なくとも１つのユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドバーコード配列、及びＸ、Ｘ１又はＸ２オリゴヌクレオチド配列のうち少なくとも１つの配列、を含む配列、及び（ｉｉ）（ｉ）の配列に対する相補的配列、をそれぞれ含む、二本鎖ＤＮＡ産物を取得するために増幅を促進する条件下で、本明細書に記述されるオリゴヌクレオチドプライマー組成物を含む第１の増幅プライマーセットを使用して前記再構成ＤＮＡ配列を増幅する工程（ａ）を含む。
【００３２】
この方法は、（ｂ）（ａ）の二本鎖ＤＮＡ産物を、それぞれ下記（ｉ）第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド、又は、（ｉｉ）第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド、のいずれかを含む、複数の第１及び第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドを含む第２の増幅プライマーセットで増幅する工程を含み、増幅は、シークエンシングのために複数の適応性免疫受容体をコードする再構成ＤＮＡ配列のライブラリを取得するため、分離した二本鎖ＤＮＡ産物の両鎖の増幅を促進する条件下で実施される。
【００３３】
この方法は、（ｂ）で取得したＤＮＡライブラリをシークエンシングするための工程（ｃ）を含み、ＤＮＡライブラリ内の各配列は、固有のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含み、これによって各配列を固有の識別可能なバーコード配列で標識する。いくつかの実施形態において、第２の増幅プライマーセット内の複数のオリゴヌクレオチドは更に、下記のいずれか又は両方を含む：（ｉ）Ｂ１及びＢ２から区別される配列を有する６〜２０個の連続するヌクレオチドのオリゴヌクレオチドバーコード配列を含む第３のバーコードオリゴヌクレオチドＢ３を含むサンプル識別バーコードオリゴヌクレオチドであって、第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドＢ３は、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドと第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列との間にあり、また第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドＢ３は、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドと第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列との間にある、サンプル識別バーコードオリゴヌクレオチド、及び（ｉｉ）１〜２０個の連続するヌクレオチドの任意の配列であるスペーサーオリゴヌクレオチドであって、このスペーサーオリゴヌクレオチドは、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドと、第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド内の第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列との間にあり、かつ、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドと、第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド内の第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列との間にある、スペーサーオリゴヌクレオチド。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本発明は、単一のリンパ球系細胞内の適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチド配列をコードする個々の再構成ＤＮＡ配列又はそこから転写されたｍＲＮＡ配列を標識するための方法を含み、これには、単一リンパ球系細胞、又はそれから単離されたゲノムＤＮＡ、又は単一リンパ球系細胞のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から逆転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をそれぞれに含む、第１の複数の個々の微小液滴（Ａ）を、第２の複数の個々の微小液滴（Ｂ）に接触させる工程が含まれる。第２の複数の個々の微小液滴はそれぞれ：（ｉ）適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１のポリペプチドをコードする再構成ＤＮＡ配列を増幅することができる第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセット、及び（ｉｉ）適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第２のポリペプチドをコードする再構成ＤＮＡ配列を増幅することができる第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセット、を含む。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットは、本明細書に記述されるＵ１／２−Ｂ１−Ｘ１の組成物を含み、第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットは、本明細書に記述されるＵ３／４−Ｂ２−Ｘ２の組成物を含む。
【００３５】
この方法は更に、複数の融合イベントが前記第１の微小液滴の１つと前記第２の微小液滴の１つとの間に生じるよう十分な時間にわたって条件を提供し、複数の融合微小液滴を形成する工程と、複数の融合微小液滴内で第１及び第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットを用いて、ゲノムＤＮＡ、又はｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡの増幅を可能にする条件を提供する工程とを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の前記複数の融合微小液滴はそれぞれ、少なくとも１つの第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドの少なくとも１つのＸ１オリゴヌクレオチドＶ領域コーディング遺伝子配列、少なくとも１つの第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、及び、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドの少なくとも１つのＸ１オリゴヌクレオチドＪ領域又はＣ領域コーディング遺伝子配列を含む、第１の二本鎖ＤＮＡ産物と、少なくとも１つの第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチドバーコード配列、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドの少なくとも１つのＸ２オリゴヌクレオチドＶ領域コーディング遺伝子配列、少なくとも１つの第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、及び、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドの少なくとも１つのＸ２オリゴヌクレオチドＪ領域又はＣ領域コーディング遺伝子配列を含む、第２の二本鎖ＤＮＡ産物と、を含み、これにより、ゲノムＤＮＡ、又はｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡの増幅により、個々の再構成ＤＮＡ配列又はそこから転写されたｍＲＮＡ配列のそれぞれが、オリゴヌクレオチドバーコード配列で標識される。
【００３６】
いくつかの実施形態において、この方法は、複数の融合微小液滴を破壊して、前記第１及び第２の二本鎖ＤＮＡ産物の異種混合物を取得する工程を含む。この方法は更に、第１及び第２の二本鎖ＤＮＡ産物を、第３の増幅プライマーセット及び第４の増幅プライマーセットに接触させる工程を含み、第３の増幅プライマーセットは、（ｉ）それぞれ、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列を含む、複数の第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）それぞれ、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む複数の第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態において、第４の増幅プライマーセットは、（ｉ）それぞれ、第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第３シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、複数の第３シークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）それぞれ、第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第４シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、複数の第４シークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、を含む。一実施形態において、接触させる工程は、第１及び第２の二本鎖ＤＮＡ産物の両方の鎖を増幅するのに十分な条件及び時間で実施され、これによりシークエンシングのためのＤＮＡライブラリを取得する。
【００３７】
別の一実施形態において、この方法は、ＤＮＡライブラリをシークエンシングして、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチド配列をコードする配列のデータセットを取得する工程を含む。いくつかの実施形態において、第３及び第４の増幅プライマーセットは同じである。
【００３８】
一実施形態において、本発明は、単一リンパ球系細胞内の適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチド配列をコードする個々の再構成ＤＮＡ配列を標識するための方法を含み、この方法には、単一リンパ球系細胞のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から逆転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をそれぞれに含む、第１の複数の個々の微小液滴（Ａ）を、第２の複数の個々の微小液滴（Ｂ）に接触させる工程が含まれる。第２の複数の個々の微小液滴はそれぞれ：（ｉ）適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１のポリペプチドをコードする第１のｃＤＮＡ配列を増幅することができる第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセット、及び（ｉｉ）適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第２のポリペプチドをコードする第２のｃＤＮＡ配列を増幅することができる第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットを含む。第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットは、本明細書に記述されるＵ１／２−Ｂ１−Ｘ１の組成物を含み、第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットは、本明細書に記述されるＵ３／４−Ｂ２−Ｘ２の組成物を含む。
【００３９】
他の実施形態において、この方法は、複数の融合微小液滴内で、第１及び第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットを用いることにより、前記第１の微小液滴のうち１つと前記第２の微小液滴のうち１つとの間に複数の融合イベントを起こして複数の融合微小液滴を形成するのに十分な時間にわたって、単一リンパ球系細胞のｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡの増幅を可能にするような条件を提供する工程を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の前記複数の融合微小液滴はそれぞれ、少なくとも１つの第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドの少なくとも１つのＸ１オリゴヌクレオチドＶ領域コーディング遺伝子配列、少なくとも１つの第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、及び適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドの少なくとも１つのＸ１オリゴヌクレオチドＪ領域又はＣ領域コーディング遺伝子配列を含む、第１の二本鎖ＤＮＡ産物と、少なくとも１つの第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチドバーコード配列、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドの少なくとも１つのＸ２オリゴヌクレオチドＶ領域コーディング遺伝子配列、少なくとも１つの第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、及び適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドの少なくとも１つのＸ２オリゴヌクレオチドＪ領域又はＣ領域コーディング遺伝子配列を含む、第２の二本鎖ＤＮＡ産物と、を含み、これにより、ｃＤＮＡが増幅されたときに、個々の再構成ｃＤＮＡ配列が、固有のオリゴヌクレオチドバーコード配列で固有に標識される。
【００４０】
別の一実施形態において、この方法は、複数の融合微小液滴を破壊して、前記第１及び第２の二本鎖ＤＮＡ産物の異種混合物を取得する工程を含む。他の実施形態において、この方法は、第１及び第２の二本鎖ＤＮＡ産物の混合物を、第３の増幅プライマーセット及び第４の増幅プライマーセットに接触させる工程を含む。一実施形態において、第３の増幅プライマーセットは、（ｉ）それぞれ、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む複数の第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）それぞれ、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む複数の第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、を含む。一実施形態において、第４の増幅プライマーセットは、（ｉ）それぞれ、第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第３シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、複数の第３シークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）それぞれ、第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第４シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む、複数の第４シークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態において、接触させる工程は、第１及び第２の二本鎖ＤＮＡ産物の両方の鎖を増幅するのに十分な条件及び時間で実施され、これによりシークエンシングのためのＤＮＡライブラリを取得する。
【００４１】
特定の実施形態において、この方法は、ＤＮＡライブラリをシークエンシングして、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチド配列をコードする配列のデータセットを取得する工程を含む。別の一実施形態において、第３の増幅プライマーセットは、第４の増幅プライマーセットと同一である。
【００４２】
特定の他の実施形態において、この方法は：（１）前記第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットは、前記第１のポリペプチドをコードしている再構成ＤＮＡ配列において、第１のポリペプチドの第１の相補性決定領域−３（ＣＤＲ３）をコードする再構成ＤＮＡ配列を増幅することができること、及び（２）前記第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットは、前記第２のポリペプチドをコードしている再構成ＤＮＡ配列において、第２のポリペプチドの第２の相補性決定領域−３（ＣＤＲ３）をコードする再構成ＤＮＡ配列を増幅することができること、のいずれか一方又は両方である。
【００４３】
いくつかの実施形態において、前記適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドはＴＣＲα（ＴＣＲＡ）鎖であり、かつ前記適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドはＴＣＲβ（ＴＣＲＢ）鎖である。他の実施形態において、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１のポリペプチドはＴＣＲγ（ＴＣＲＧ）鎖であり、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第２のポリペプチドはＴＣＲδ鎖（ＴＣＲＤ）である。
【００４４】
別の一実施形態において、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１のポリペプチドは免疫グロブリン重（ＩＧＨ）鎖であり、かつ適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第２のポリペプチドは免疫グロブリン軽鎖（ＩＧＬ若しくはＩＧＫ、又はＩＧＬとＩＧＫの両方）である。いくつかの実施形態において、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１のポリペプチドがＩＧＨ鎖であり、かつ適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第２のポリペプチドがＩＧＬ及びＩＧＫの両方である場合は、ＩＧＨに対する第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセット、ＩＧＫに対する第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセット、及びＩＧＬに対する第３のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットを含む３つの異なる増幅プライマーセットが使用される。
【００４５】
更に別の一実施形態において、第２の複数の個々の微小液滴それぞれが、リンパ球の状態の指標となる分子をコードする第３のｃＤＮＡ配列を増幅することができ、かつ一般式（ＶＩＩ）：Ｕ５／６−Ｂ−Ｘ３（ＶＩＩ）を有する複数のオリゴヌクレオチド配列を含む組成物を含む、第３のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含む。一態様において、Ｕ５／６は、Ｂが存在するときに第５ユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｂが存在しないときに第６ユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含む。別の一態様において、ＢはＢ１又はＢ２を含む。更に別の一態様において、Ｘ３は、（ｉ）リンパ球の状態の指標となる分子をコードする遺伝子配列、又はその相補的配列の１５〜８０個の連続するヌクレオチドであるフォワードプライマー、及び（ｉｉ）リンパ球の状態の指標となる分子をコードする遺伝子配列、又はその相補的配列の１５〜８０個の連続するヌクレオチドであるリバースプライマー、のいずれか１つのオリゴヌクレオチドを含み、かつ、一般式Ｕ５／６−Ｂ−Ｘ３の複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ３は固有のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
一実施形態において、リンパ球の状態の指標となる分子は、ＦｏｘＰ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ６２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ１０３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３８、ＣＤ１６１、ＣＤ２９４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＩｇＧ１−４  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＡ  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＥ  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＤ  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＭ  Ｈ鎖定常領域、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−β、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９及びＴＬＲ１０のうち１つ以上を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態において、この方法は、データセット中で識別されるオリゴヌクレオチドバーコード配列に照らして配列のデータセットをソーティングすることにより、それぞれ固有のバーコードを有する複数のバーコード配列セットを取得する工程と、（ａ）の各バーコード配列セットをＸ１配列含有サブセット及びＸ２配列含有サブセットにソーティングする工程と、Ｘ１及びＸ２配列に照らしてＸ１及びＸ２配列含有サブセットのそれぞれの構成要素をクラスタリングして、それぞれ、１つ又は複数のＸ１配列クラスターセット及び１つ又は複数のＸ２配列クラスターセットを取得する工程と、１つ以上のいずれかの前記Ｘ１及びＸ２配列クラスターセット内の、単一ヌクレオチドバーコード配列のミスマッチをエラー修復する工程と、を含む。この方法は更に、同じ１つ以上のバーコード配列セットに属するＸ１及びＸ２配列クラスターセットの構成要素である、同じ細胞配列に由来するものとして識別する工程を含む。
【００４８】
別の一実施形態において、本発明の方法は、単一リンパ球系細胞内の適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチド配列をコードする再構成ＤＮＡ配列を決定するための方法を含み、この方法には、（１）対象のリンパ球系細胞集団を含む細胞懸濁液の細胞を、前記細胞を収容することができる複数の容器に配分して、１つのリンパ球系細胞又は複数のリンパ球系細胞を含むリンパ球系細胞の亜集団をそれぞれに含む複数の容器を取得する工程が含まれる。この方法は更に、（２）複数の容器内のリンパ球系細胞内のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の逆転写を促進するのに十分な条件下及び時間、前記複数の容器内それぞれに、第１及び第２のオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットを接触させる工程を含み、（Ａ）第１のオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットは、第１の適応性免疫受容体ヘテロダイマーの複数のポリペプチドをコードする複数の第１のｍＲＮＡ配列を逆転写することができ、また（Ｂ）第２のオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットは、第２適応性免疫受容体ヘテロダイマーの複数のポリペプチドをコードする複数の第２のｍＲＮＡ配列を逆転写することができる。
【００４９】
別の一実施形態において、この方法は、（Ｉ）本明細書に記載される一般式Ｕ１／２−Ｂ１−Ｘ１の組成物を含む第１のオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットと、（ＩＩ）本明細書に記載される一般式Ｕ３／４−Ｂ２−Ｘ２の組成物を含む第２のオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットとを含む。
【００５０】
更に別の一実施形態において、接触工程は、１つ以上の前記複数の容器内で、次の２つを取得するのに十分な条件下及び時間、実施される：少なくとも１つの第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドの少なくとも１つのＸ１オリゴヌクレオチドＶ領域コーディング遺伝子配列、少なくとも１つの第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、及び、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドの少なくとも１つのＸ１オリゴヌクレオチドＪ領域又はＣ領域コーディング遺伝子配列を含む、第１の逆転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）産物と、少なくとも１つの第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチドバーコード配列、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドの少なくとも１つのＸ２オリゴヌクレオチドＶ領域コーディング遺伝子配列、少なくとも１つの第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、及び、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドの少なくとも１つのＸ２オリゴヌクレオチドＪ領域又はＣ領域コーディング遺伝子配列を含む、第２の逆転写ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）産物。
【００５１】
一実施形態において、この方法は、複数の容器から第１及び第２の逆転写されたｃＤＮＡ産物を合わせて、逆転写されたｃＤＮＡの産物の混合物を取得する工程と、（３）の第１及び第２の逆転写されたｃＤＮＡ産物の混合物を、第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセット及び第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットと接触させる工程とを含む。いくつかの実施形態において、第１の増幅プライマーセットは、（ｉ）それぞれ、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む複数の第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）それぞれ、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む複数の第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、を含む。
【００５２】
別の一実施形態において、第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットは、（ｉ）それぞれ、第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第３シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む複数の第３シークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）それぞれ、第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第４シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とを含む複数の第４シークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、を含む。
【００５３】
別の一実施形態において、接触させる工程は、（２）の第１及び第２の逆転写されたｃＤＮＡ産物の両方を増幅するのに十分な条件及び時間で実施され、これによりシークエンシングのためのＤＮＡライブラリを取得する。一実施形態において、この方法は、（３）で取得したＤＮＡライブラリをシークエンシングして、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチド配列をコードする配列のデータセットを取得する工程を含む。
【００５４】
更に別の一実施形態において、この方法は、（ａ）データセット中で識別されるオリゴヌクレオチドバーコード配列に照らして配列のデータセットをソーティングすることにより、それぞれ固有のバーコードを有する複数のバーコード配列セットを取得する工程と、（ｂ）（ａ）の各バーコード配列セットをＸ１配列含有サブセット及びＸ２配列含有サブセットにソーティングする工程と、を含む。この方法は更に、（ｃ）Ｘ１及びＸ２配列に照らしてＸ１及びＸ２配列含有サブセットのそれぞれの構成要素をクラスタリングして、それぞれ、１つ又は複数のＸ１配列クラスターセット及び１つ又は複数のＸ２配列クラスターセットを取得する工程と、１つ以上のいずれかの前記Ｘ１及びＸ２配列クラスターセット内の、単一ヌクレオチドバーコード配列のミスマッチをエラー修復する工程と、を含む。
【００５５】
別の一実施形態において、この方法は、（ｄ）既知のＸ１及びＸ２配列に基づいて第１及び第２の適応性免疫受容体ヘテロダイマーポリペプチドをコードする配列それぞれを識別する工程を含み、各Ｘ１配列及び各Ｘ２配列は、１つ又は複数の固有のＢ配列に関連付けられ、各Ｂ配列関連Ｘ１配列及び各Ｂ配列関連Ｘ２配列が由来する容器を識別する。いくつかの実施形態において、この方法は、（ｅ）共通の第１及び第２の適応性免疫受容体ヘテロダイマーポリペプチドをコードする配列とＢ配列が一致する確率に基づいて、（ｄ）のＢ配列関連Ｘ１及びＸ２配列を共通クローン源として組み合わせてマッチングする工程と、これにより、単一リンパ球系細胞に由来する適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチド配列をコードする再構成ＤＮＡ配列を決定する工程とを含む。
【００５６】
一実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットは、第１のポリペプチドをコードしている再構成ＤＮＡ配列において、第１のポリペプチドの第１の相補性決定領域−３（ＣＤＲ３）をコードする再構成ＤＮＡ配列を増幅することができる。別の一実施形態において、第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットは、第２のポリペプチドをコードしている再構成ＤＮＡ配列において、第２のポリペプチドの第２の相補性決定領域−３（ＣＤＲ３）をコードする再構成ＤＮＡ配列を増幅することができる。
【００５７】
特定の実施形態において、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１のポリペプチドはＴＣＲα（ＴＣＲＡ）鎖であり、かつ適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第２のポリペプチドはＴＣＲβ（ＴＣＲＢ）鎖であり、又は（ｂ）適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１のポリペプチドはＴＣＲγ（ＴＣＲＧ）鎖であり、かつ適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第２のポリペプチドはＴＣＲδ（ＴＣＲＤ）鎖であり、又は（ｃ）適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１のポリペプチドは免疫グロブリン重（ＩＧＨ）鎖であり、かつ適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第２のポリペプチドは免疫グロブリン軽（ＩＧＬ、ＩＧＫ、又はＩＧＬとＩＧＫの両方）鎖である。
【００５８】
特定の他の実施形態において、１つ以上の容器が、リンパ球の状態の指標となる分子をコードする第３のｃＤＮＡ配列を増幅することができ、かつ一般式（ＶＩ）：Ｕ５／６−Ｂ３−Ｘ３（ＶＩ）の複数のオリゴヌクレオチド配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含む組成物を含む、第３のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｕ５／６は、Ｂ３が存在するときに第５ユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｂ３が存在しないときに第６ユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドを含む。一実施形態において、Ｂ３は、存在しないか、又はＢ１又はＢ２のうち少なくとも１つと同じであるか又は異なる、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の連続するヌクレオチドの第３のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含む、オリゴヌクレオチドを含む。別の一実施形態において、Ｘ３は、（ｉ）リンパ球の状態の指標となる分子をコードする遺伝子配列、又はその相補的配列の１５〜８０個の連続するヌクレオチドであるフォワードプライマーポリヌクレオチド、及び（ｉｉ）リンパ球の状態の指標となる分子をコードする遺伝子配列、又はその相補的配列の１５〜８０個の連続するヌクレオチドであるリバースプライマーポリヌクレオチド、のいずれか１つのオリゴヌクレオチドを含み、かつ、一般式Ｕ５／６−Ｂ３−Ｘ３の複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ３は固有のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００５９】
特定の実施形態において、リンパ球の状態の指標となる分子は、ＦｏｘＰ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ６２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ１０３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３８、ＣＤ１６１、ＣＤ２９４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＩｇＧ１−４  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＡ  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＥ  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＤ  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＭ  Ｈ鎖定常領域、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−β、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９及びＴＬＲ１０のうち１つ以上を含む。
【００６０】
本明細書で記述した発明の実施形態のこれら及び他の態様が、以下の発明を実施するための形態と添付図面を参照して明らかとなるであろう。本明細書内で参照され及びかつ／又は出願データシート内で列記される全ての米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許発行物は、それぞれが個々に援用されるかのように、それらの全体が参照により本明細書に援用される。本発明の態様及び実施形態は、必要に応じて改変可能であり、また更なる実施形態を提供するために、種々の特許、出願及び公報のコンセプトを利用する。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本明細書に記述されている特定の組成物及び方法の模式図を示す。Ｕ１及びＵ２はユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドを表す。ＢＣ１及びＢＣ２はバーコードオリゴヌクレオチドを表す。Ｊは、適応性免疫受容体連結（Ｊ）領域遺伝子を表し、Ｊｐｒは、Ｊ特異的オリゴヌクレオチドプライマーがかかる遺伝子に特異的にアニールする領域を表す。Ｖは、適応性免疫受容体可変（Ｖ）領域遺伝子を表し、Ｖｐｒは、Ｖ特異的オリゴヌクレオチドプライマーがかかる遺伝子に特異的にアニールする領域を表す。ＮＤＮは、一部の適応性免疫受容体コーディング遺伝子に見られる多様性（Ｄ）領域を表し、この領域は、非鋳型ヌクレオチドを含み得る連結ヌクレオチド（Ｎ）に両端が隣接している。Ａｄａｐ１及びＡｄａｐ２はシークエンシングプラットフォーム特異的アダプタを表す。「ｎ６」として示されている断片は、任意のヌクレオチド配列のスペーサーヌクレオチド断片を表し、この場合は６つの無作為に選択されたヌクレオチドのスペーサーを表す。
【図２】本明細書に記述されている特定の組成物及び方法の模式図を示す。個々の第１及び第２の微小液滴が接触して、単一の第１及び第２の微小液滴間に融合イベントを生じさせ、この融合イベントによって、個々のリンパ球系細胞（例えば、Ｔ又はＢ細胞）からのＤＮＡが、融合した微小液滴内で、第１及び第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットに導入され、このそれぞれが、同じ細胞からの第１及び第２の適応性免疫受容体ポリペプチドコーディング遺伝子のＤＮＡコード配列（例えば、ＣＤＲ３コーディングＤＮＡ）を増幅することができる。これにより、同じ細胞に由来する少なくとも２つの再構成ＤＮＡ遺伝子座の増幅及びオリゴヌクレオチドバーコードの標識は、本明細書に記述されるように想到され、例えば、［ＩＧＨ＋ＩＧＬ］、［ＩＧＨ＋ＩＧＫ］、［ＩＧＨ＋ＩＧＫ＋ＩＧＬ］、［ＴＣＲＡ＋ＴＣＲＢ］、［ＴＣＲＧ＋ＴＣＲＧ］、などである。
【図３】本明細書に記述されている特定の組成物及び方法の模式図を示す。これによって例えば、個々のリンパ球系細胞（例えば、Ｔ又はＢ細胞）からのＤＮＡ、又は、単一リンパ球系細胞のｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡが、融合した微小液滴内で、第１及び第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットに導入され、このそれぞれが、同じ細胞からの第１及び第２の適応性免疫受容体ポリペプチドコーディング遺伝子のＤＮＡコード配列（例えば、ＣＤＲ３コーディングＤＮＡ）を増幅することができ、この後、個々の微小液滴を破壊し（例えば、化学的、物理的、及び／又は機械的溶解、分離、破壊などにより）、次いで、放出されたバーコード付加二本鎖ＤＮＡがユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー及びシークエンシングプラットフォーム特異的アダプタで増幅されて、大規模なマルチプレックス定量的シークエンシングが可能となる。略語については図１の簡単な説明を参照のこと。
【図４】オリゴヌクレオチドバーコードとユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列のｃＤＮＡへの組み込みを導くオリゴヌクレオチド逆転写プライマーを使用することによる、逆転写中の適応性免疫受容体ポリペプチドコーディングｃＤＮＡの標識の模式図を示す。
【図５】オリゴヌクレオチドバーコードとユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列のｃＤＮＡへの組み込みをもたらすオリゴヌクレオチド逆転写プライマーを使用することによる、逆転写中の適応性免疫受容体ポリペプチドコーディングｃＤＮＡの標識の模式図を示す。
【図６】逆転写中に、オリゴヌクレオチドバーコード配列及びユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の組み込みをもたらすオリゴヌクレオチド逆転写プライマーを使用して標識し、増幅させた、適応性免疫受容体ポリペプチドコーディングｃＤＮＡの、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングアダプタによる修飾後にシークエンシングを受ける、ＤＮＡ産物の模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本発明は、特定の実施形態において、本明細書で記述するように、免疫グロブリン（ＩＧ）及び／又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のような、適応性免疫受容体をコードしている再構成された遺伝子の、大規模で構造的に多種多様な集団を確実に定量し配列を決定するために有用な組成物及び方法を提供する。これらの再構成された遺伝子は、対象又は生体源（ヒト対象者を含む）のリンパ球系細胞から得たＤＮＡを含む生体サンプル中に存在し得るものであり、及び／又はこれらの再構成遺伝子のｍＲＮＡ転写産物はそのようなサンプル中に存在し得るものであり、逆転写によるｃＤＮＡ合成の鋳型として使用され得る。
【００６３】
本明細書で開示されるのは、個々の、配列が異なるＩＧ及びＴＣＲコーディング遺伝子断片又はそのｍＲＮＡ転写産物、又はそのようなｍＲＮＡ転写産物から逆転写されたｃＤＮＡを固有かつ明確に標識するための、予想外に有益なアプローチである。これは、確立された核酸増幅法を用いて、そのような遺伝子断片又はその転写産物（逆転写産物を含む）の集団を増幅させる従来の工程の前に標識を行うことにより実施される。理論に束縛されるものではないが、シークエンシングに十分な量のＤＮＡコピーを生成するために採用される一般的に実践されている増幅工程の前に、本明細書に記述されるように、個々のＴＣＲ及びＩＧコーディング遺伝子断片又はその転写産物（逆転写により生成された相補的ＤＮＡを含む）を標識することにより、本実施形態は、多様なＴＣＲ及びＩＧをコードする配列の検出及び定量において前例のない感度をもたらし、同時に、増幅プライマーの多様な配列のセットを用いて元のサンプルからの核酸増幅を複数回実施している間にオリゴヌクレオチドプライマー利用における偏りにより生じ得るような、紛らわしい、不正確な、又は不完全な結果を回避することができる。
【００６４】
更に、特定の実施形態において本明細書で記述されるのは、単一細胞由来の適応性免疫受容体ヘテロダイマーにおける両方のポリペプチド（例えばＴ細胞のＴＣＲＡとＴＣＲＢの両方、又はＢ細胞のＩｇＨとＩｇＬの両方）をコードする配列の定量が可能な、前例のない組成物及び方法である。複合サンプル（例えば、対象のＴ及び／又はＢ細胞の異種混合物を含むサンプルなど）からそのような情報を取得する機能を提供することによって、これら及び関連する実施形態では、これまで可能であったよりもいっそう正確な、特定のＴ及び／又はＢ細胞クローン集団のサンプルにおける相対的表現の決定が可能になる。
【００６５】
特定の実施形態では、本明細書に記述されるように、このような増幅産物の定量的高スループットシークエンシングの前に、適応性免疫受容体をコードしている再構成された遺伝子を含有する生体サンプル由来の、増幅され再構成されたＤＮＡ分子集団を生成するために、マルチプレックス化された核酸増幅反応に使用される、オリゴヌクレオチドプライマーセットに対する改変が想到される。再構成ＴＣＲ及びＢＣＲをコードするＤＮＡ配列の、マルチプレックス化された増幅及び高スループットシークエンシングは、例えば、Ｒｏｂｉｎｓら、２００９  Ｂｌｏｏｄ  １１４：４０９９；Ｒｏｂｉｎｓら、２０１０  Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．２：４７ｒａ６４；Ｒｏｂｉｎｓら、２０１１  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１１．０９．００１；Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、２０１１  Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．３：９０ｒａ６１；Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．第１３／２１７，１２６号（米国特許公開第２０１２／００５８９０２号）、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．第１２／７９４，５０７号（米国特許公開第２０１０／０３３０５７１号）、ＷＯ／２０１０／１５１４１６号、ＷＯ／２０１１／１０６７３８号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２６３７３号）、ＷＯ２０１２／０２７５０３号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４９０１２号）、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．第６１／５５０，３１１号、及びＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．第６１／５６９，１１８号に記述されており、したがって、これらの開示は参照により本明細書に援用され、本明細書に記述されている実施形態による使用に適合され得る。
【００６６】
特定の実施形態により、複数の配列多様なＴＣＲ又はＩＧコーディング遺伝子断片を含むサンプル（例えば、ＤＮＡ再構成を起こして機能性ＴＣＲ及び／又はＩＧヘテロダイマーをコードする（又は非機能性ＴＣＲ又はＩＧ偽遺伝子がＤＮＡ再構成に関与している）リンパ球系細胞に由来するＤＮＡ（又はそこから転写されたｍＲＮＡ、又はそのようなｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ）を含むサンプル）において、複数の個別のＴＣＲ又はＩＧをコードする配列は、単回の核酸増幅（例えばポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲ）を介して、本明細書に記述されるような特異的なオリゴヌクレオチドバーコード配列によりそれぞれ固有にタグ付加され得る。次に、タグ付加された一群のポリヌクレオチドを増幅して、タグ付加された分子のライブラリを取得することができ、これは例えば、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．第１３／２１７，１２６号（米国特許公開第２０１２／００５８９０２号）、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．第１２／７９４，５０７号（米国特許公開第２０１０／０３３０５７１号）、ＷＯ／２０１０／１５１４１６号、ＷＯ／２０１１／１０６７３８号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２６３７３号）、ＷＯ２０１２／０２７５０３号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４９０１２号）、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．第６１／５５０，３１１号、及びＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．第６１／５６９，１１８号に記述されているもののような既存の手順により定量的にシークエンシングすることができる。
【００６７】
これらの配列を読み取る過程において、組み込まれたバーコードタグ配列をシークエンシングして、取得した配列データをコンパイルし分析する過程において識別子として使用することができる。特定の実施形態において、各バーコードタグ配列について、関連するＴＣＲ又はＩＧ配列に関するコンセンサス配列を決定することができる。次に、クラスタリングアルゴリズムを適用して、同じ元のクローン細胞集団から生成した分子を識別することができる。そのようなアプローチにより、シークエンシングのアーティファクトに伴う不正確さを克服するやり方で、高品質の配列データを取得することができる。
【００６８】
代表的な一実施形態を図１に示す。これにより、リンパ球系細胞含有集団に由来するゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡの開始鋳型集団から、本明細書に記述される一般式Ｕ１−Ｂ１ｎ−Ｘを有するプライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマー組成物を使用して、２回以上のサイクルのＰＣＲを実施する。図１に示すように、Ｊ特異的プライマー１１０ａは、Ｊ断片の一部に相補的であるＪプライマー配列１００、図１のバーコードタグ（ＢＣ１）１０１、又は遺伝子式のＢ１ｎを含み、また更に第１の外側ユニバーサルアダプタ配列（Ｕ１）１０２を含み、一方でＶ特異的プライマー１１０ｂは、Ｖ断片の一部に相補的であるＶプライマー配列１０３と、第２の外側ユニバーサルアダプタ配列（Ｕ２）１０４とを含む。ただし本発明はそのように限定される必要はなく、更に関連する実施形態も想到され、例えば、バーコードは代わりに又は追加としてＶ特異的プライマーの一部として存在してよく、Ｖ配列と第２のユニバーサルアダプタとの間に配置されていてよい。本開示に基づいて、当業者には、固有に標識された個々のＴＣＲ及び／又はＩＧコーディング遺伝子断片に対し、本明細書に記述されるバーコードタグを導入するための他の好適なプライマーを設計することが可能であることが、理解されよう。
【００６９】
本明細書に記述されるように、多数の（最高４ｎで、式中ｎはバーコード配列の長さ）異なるバーコード配列が、本明細書に記述される一般式Ｕ１−Ｂ１ｎ−Ｘを有するプライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマー組成物中に存在し、これによって、適切なＶ特異的及びＪ特異的プライマーの特異的なアニーリングの後に実施される多数の異なる増幅イベントのＰＣＲ産物が、差別化されて標識される。いくつかの実施形態において、バーコード配列の数は、最大４ｎであるか、又は４ｎ未満である。一実施形態において、長さｎ＝８のバーコードに基づいて、１９２種の異なるバーコード配列のセットが使用される。バーコードの長さ「ｎ」は、可能なバーコードの数（本明細書の記述では４ｎ）を決定するが、いくつかの実施形態において、より小さいサブセットを使用して、密接に関連するバーコード、又は異なるアニーリング温度を備えるバーコードが回避される。他の実施形態において、本明細書に記述されるように、ｍ個及びｎ個のバーコード配列のセットが、後続の増幅工程で使用される（例えば、再構成されたＴＣＲ又はＩＧ配列を個別に標識し、次に、同じ供給源又はサンプルから取得した配列セットを均一に標識する（「テーリング」）。好ましい実施形態において、Ｖプライマー１００及びＪプライマー１０３は、ＣＤＲ３をコードする配列（これは図１でＮＤＮ領域１１１を含む）を含むＴＣＲ又はＩｇをコードする配列の増幅を促進することができる。更に図１に示すように、２回以下の増幅サイクルの後、第１の増幅プライマーセット１１０ａ、１１０ｂが、二本鎖ＤＮＡ産物から分離される。そのような工程により、非限定的な理論に従って、後続の増幅工程による産物調製の汚染が回避されると考えられる。この汚染は、複合的な反応物中に存在する増幅プライマーにより、新しく生成された二本鎖ＤＮＡ分子が増幅されることにより生じ得るものであるが、この増幅プライマーは、最初の１回又は２回の増幅サイクルにおいて二本鎖ＤＮＡを生成するのに使用されるものとは異なる。オリゴヌクレオチド増幅プライマーから二本鎖ＤＮＡを分離するための、様々な化学的及び生物学的技法が当該技術分野において周知である。
【００７０】
固有のバーコードタグ配列が導入される第１の増幅プライマーセット１１０ａ、１１０ｂの除去後、タグ付加された二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）産物を、本明細書に記述され図１に示されている第２の増幅プライマーセット１２０ａ、１２０ｂを使用して増幅させて、シークエンシングに好適なＤＮＡライブラリを取得することができる。第２の増幅プライマーセットは、前述の工程中に、ユニバーサルアダプタ配列１０２、１０４（例えば、図１のＵ１及びＵ２）のｄｓＤＮＡ産物への導入を有利に活用する。したがって、これらのユニバーサルアダプタ配列は、図１において固有のバーコードタグ（ＢＣ１）１０１の外側にあるため、シークエンシングされるＤＮＡライブラリを含む増幅産物は、ユニバーサルアダプタを介して増幅の影響を受けながら、特定の再構成Ｖ−Ｊ遺伝子断片の組み合わせそれぞれにリンクされた固有のバーコード識別子配列を保持する。そのような第２プライマーセットは、「テーリング」プライマーとしても知られ、表７に示される。
【００７１】
好ましい実施形態において、また図１に示されるように、第２の増幅プライマーセット１２０ａ、１２０ｂは、シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列（図１のＡｄａｐ１  １０５及びＡｄａｐ２  １０６）を導入し得るが、これらは特定の他の関連する実施形態では必須ではない。第２の増幅プライマーセット１２０ａ、１２０ｂは、第２のオリゴヌクレオチドバーコード識別子タグ（図１のＢＣ２  １０７）を所望により導入することができ、例えば、特定のサンプルに由来する増幅の全産物を（例えば供給源識別コードとして）好ましく識別することができ、複数のサンプルのマルチプレックス化を容易にしてより高いスループットを実現し得る単一バーコード配列を導入することができる。バーコード（ＢＣ２；図１の１０７）は、アッセイのスループットを増加させる修飾（例えばサンプルをシークエンサーでマルチプレックス化できるようにする）であるが、必須ではない。あるいは、アダプタなしのユニバーサルプライマーを使用して、タグ付き分子を増幅させることができる。増幅の後、この分子を更に、プラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列でタグ付することができる。第２のサンプル識別バーコードのそのような包含は、複数の異なる対象に由来するサンプルが混在している場合の識別、又は不注意による、他のサンプル調製由来の物質によるサンプル調製物の汚染の識別において、有用であり得る。第２の増幅プライマーセットは更に、図１に示すように、所望によりスペーサーヌクレオチド（「ｎ６」；図１の１０８）を含んでいてよく、これはシークエンシングプラットフォーム特異的配列の操作を促進し得る。このスペーサーは、シークエンシングデータの品質を改善するが、特定の実施形態においては必要ではなく、存在しない。スペーサーは特に、本方法のシークエンシング工程の最初の１２サイクル中に、ランダムな塩基対の数を増加させる。最初の１２サイクルの多様性を増加させることにより、クラスターの定義及び塩基の解読が改善される。スペーサーヌクレオチド１０８は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１〜２０、２１〜３０個又はそれ以上のヌクレオチドの任意の配列であってよく、典型的にランダムに作成された配列であり得る。そのようなランダム配列の存在により、そのような配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー間で不均一なアニーリング速度がもたらされる懸念がある場合は、比較的少ない回数で増幅サイクル（典型的には３、４又は５回、又は所望により１〜６回、又は８回以下）を実施して、下流の結果を歪曲し得るような不均一な増幅が生じる可能性を低減することが望ましいこともある。
【００７２】
結果として得られるＤＮＡライブラリは、標準の方法論に従い、本明細書に提供される当該技術分野において周知であるような利用可能な装置を用いて、シークエンシングすることができる。第２のサンプル識別バーコード（ＢＣ２；図１の１０７）が存在する場合、これらのバーコードの両方を読み取るシークエンシングが実施され、これに伴い、２つのサンプル識別バーコード１０７の間にある配列情報（ＣＤＲ３をコードする配列を含むＶ−Ｊ連結で、それぞれの異なる配列を固有のタグを標識する第１のオリゴヌクレオチドバーコードＢＣ１  １０１を伴う）も読み取られる。シークエンシングプライマーには、例えば、図１を参照して、最初の読み取りのためのＮＤＮ  １１１のＪ側のユニバーサルプライマー１０２、次いでバーコード配列ＢＣ１  １０１、Ｊプライマー配列１００、及びＣＤＲ３配列が含まれ得る。増幅プライマーの第２セットには、Ｊ側のプラットフォーム特異的プライマー（Ａｄａｐ１  １０５）を含むフォワードプライマー、ランダムヌクレオチドを含むスペーサー配列（「ｎ６」として記載；図１の１０８）、及びＢＣ２サンプル識別バーコード１０７が含まれる。増幅プライマーの第２セット内のリバースプライマーには、ＮＤＮ  １１１のＶ側のユニバーサルプライマー１０４、ランダムヌクレオチドを含むスペーサー配列１０８、及びＢＣ２サンプル識別バーコード配列１０７、及び所望により、リバース第２シークエンシングプラットフォーム特異的プライマー（Ａｄａｐ２  １０６）を用いたペアドエンドリードが含まれる。第２シークエンシングプラットフォーム特異的プライマー（Ａｄａｐ２  １０６）は、スペーサー配列１０８、サンプル識別バーコード配列ＢＣ２  １０７、ユニバーサルアダプタ配列１０４、Ｖ配列１０３、及びＮＤＮ  １１１をシークエンシングし「読み取る（リードする）」のに使用される。ＣＤＲ３配列を捕捉するためには、Ｊ増幅プライマー、Ｃ増幅プライマー又はＶ増幅プライマーを使用することができる。
【００７３】
配列データはＢＣ２サンプル識別バーコード１０７を使用してソーティングすることができ、更に共通第１のバーコードＢＣ１  １０１を含む配列に従ってソーティングすることができる。そのようにソーティングされた配列で、クラスタリングのための既知の様々なアルゴリズムの任意のものを使用して、ＣＤＲ３配列をクラスタリングし、複数の配列クラスターが存在するか判定することができる（例えば、ＢＬＡＳＴＣｌｕｓｔ、ＵＣＬＵＳＴ、ＣＤ−ＨＩＴ、又はその他、又はＲｏｂｉｎｓら、２００９  Ｂｌｏｏｄ  １１４：４０９９に記述されているもの）。加えて又は代わりに、配列データは、少なくとも２回見出されたこれらの配列に基づいてソーティングされ選択され得る。コンセンサス配列は、次いで、例えばシークエンシングエラーを修正するために、配列比較によって決定することができる。複数の固有の識別子バーコードタグ（ＢＣ１  １０１）が配列内に検出される場合（そうでない場合は共通コンセンサス配列を共有している）、そのような識別されるバーコードタグの数は、同じＴ細胞又はＢ細胞クローンに由来するサンプル内の分子の数を反映したものであると見なされ得る。
【００７４】
単一の適応性免疫細胞に由来するＴＣＲ又はＩＧヘテロダイマーの両鎖の識別
上述のように、特定の他の実施形態において、本明細書では、単一リンパ球系細胞内の適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチド配列をコードする再構成ＤＮＡ配列（又はそこから転写されたｍＲＮＡ配列、又はそのようなｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ）を決定するための方法が提供される。この方法は、特定の細胞及び／又はサンプルを識別するため、各再構成ＤＮＡ配列を固有のバーコード配列で固有に標識する工程を含む。
【００７５】
簡潔に、説明のために非限定的に述べると、これら及び関連の実施形態は：（１）複数の平行反応それぞれにおいて、第１及び第２の微小液滴を接触させ、核酸増幅が可能な条件下でこれらを融合させて、全てが同一バーコードオリゴヌクレオチド配列を含み、かつ適応性免疫受容体ヘテロダイマーの二本鎖に対応する二本鎖ＤＮＡ産物（又は一本鎖ｃＤＮＡ産物）を生成する工程と；（２）融合微小液滴を破壊して二本鎖（又は一本鎖）ＤＮＡ産物の異種混合物を取得する工程と；（３）二本鎖ＤＮＡ（又は一本鎖）産物の異種混合物を増幅して、シークエンシングのためのＤＮＡライブラリを取得する工程と；（４）ライブラリをシークエンシングして、ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のデータセットを取得する工程と、を含む方法を含む。
【００７６】
この方法は、（Ａ）単一のリンパ球系細胞又はこれから単離されたゲノムＤＮＡ、又はｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡをそれぞれに（又はｎ個ごとの液滴に）含む個々の第１の微小液滴を、（Ｂ）それぞれ２つのオリゴヌクレオチド増幅プライマーセット、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１鎖（例えば、ＩＧＨ鎖、又はＴＣＲＡ鎖）をコードする任意の再構成ＤＮＡを増幅させるための第１セット、及びこのヘテロダイマーの第２鎖（例えば、ＩＧＬ鎖、又はＴＣＲＢ鎖）をコードする任意の再構成ＤＮＡを増幅させるための第２セットを含む複数の第２液微小液滴由来の個々の第２の微小液滴と、対にして接触させ、融合させる工程を含む。有意義なこととして、所与の第２の微小液滴において、全てのオリゴヌクレオチド増幅プライマーは同じバーコードオリゴヌクレオチドを含むが、異なる第２の微小液滴内では、このプライマーセットは異なるバーコード配列を含む。この接触工程は、複数のイベントそれぞれにおいて、単一の第１の微小液滴が、単一の第２の微小液滴と融合して、融合した微小液滴が取得されるよう制御される。第１及び第２の微小液滴それぞれの内容物が、この融合した微小液滴内で、互いに接触する。所与のＴＣＲ又はＩＧポリペプチドをコードする任意の再構成ＤＮＡを増幅することができるオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットが、本明細書の他の箇所において、並びにそのような開示のために援用された参照において、記述されている。
【００７７】
当業者には、定義された内容物及び特性（例えば制御可能に融合を行うことができる能力）を有する微小液滴組成物を調製し得るような任意の数多くの微小流体機器及び装置が周知であり、例えばＲａｉｎＤａｎｃｅ（商標）微小液滴デジタルＰＣＲシステム（ＲａｉｎＤａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）、又は、例えば、Ｐｅｋｉｎら、２０１１  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  １１：２１５６；Ｍｉｌｌｅｒら、２０１２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９：３７８；Ｂｒｏｕｚｅｓら、２００９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６：１４１９５；Ｊｏｅｎｓｓｏｎら、２００９  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．８１：４８１３；Ｂａｒｅｔら、２００９  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ９：１８５０；Ｆｒｅｎｚら、２００９  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ９：１３４４；Ｋｉｓｓら、２００８  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８０：８９７５；Ｌｅａｍｏｎら、２００６  Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｓ．３：５４１に記述されている任意のシステムが周知であり、これらは例えば、本開示の見地において慣例的な改変を介して、例えば本明細書に記述されているもののような特定の方法に適合させることができる。
【００７８】
非限定的な一例として、特定の実施形態は、微小流体チャネルを用いて、油相中に分散された水相微小液滴の特性を活用し得る。微小液滴は、油中水型乳剤、水中油型乳剤、又は類似の水性及び非水性乳剤組成物であってよい。微小液滴はまた、微小液滴又はミセル微小液滴とも呼ぶことができる。従来型の油中水型（ＷＯ）乳剤は、生物学において数多くの用途が見出されており、これには次世代シークエンシング（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２００５、４３７、３７６〜３８０）、希少突然変異検出（Ｄｉｅｈｌ、Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００５、１０２、１６３６８〜１６３７３；Ｌｉ、Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００６、３、９５〜９７；Ｄｉｅｈｌ、Ｆ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００８、１４、９８５〜９９０）、及びＤＮＡメチル化の定量的検出（Ｌｉ、Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９、２７、８５８−Ｕ１１８）が挙げられるが、これらの乳剤は液滴多分散性の問題と、乳剤を形成するのに使用される機械的攪拌中に細胞を破壊する可能性がある剪断応力の問題を抱えている。微小流体の使用によりこれらの制限が克服され、生化学及び細胞系アッセイの性能の改善がもたらされる（Ｚｅｎｇ、Ｙ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１０、８２、３１８３〜３１９０）。チャネル直径１０〜１００μｍの微小流体チップは、典型的に、標準のソフトフォトリソグラフィー技法を使用して石英、ケイ素、ガラス、又はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から製造される（Ａ．Ｍａｎｚ、Ｎ．Ｇｒａｂｅｒ  ａｎｄ  Ｈ．Ｍ．Ｗｉｄｍｅｒ：Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ  ｔｏｔａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ：Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｅｎｓｉｎｇ、Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ、Ｂ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（１９９０）２４４〜２４８）。液滴は典型的に、１つのチャネル内の水溶液を油の流れの中に流すことによって、約１〜１０Ｈｚの速度で生成される。流量集束ノズルの使用により、寸法の制御された水相液滴の生成が可能になる。液滴寸法及び液滴生成の速度は、所与のノズル形状に関して、油相と水相の流速の比によって制御される。チップチャネル表面は一般に、例えば、数多く報告されているシラン化化学物質の１つによって、疎水性になるように改変される（Ｚｅｎｇ、Ｙ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１０、８２、３１８３〜３１９０）。液滴を完全に機能する微小容器とするために、疎水性かつ疎油性の油を使用することが有益であり得る。これは、液滴間の分子分散が最小限に抑えられ、また油は、水相に含まれる生物学的試薬に対し低溶解度を有し、かつ良好な気体溶解度を有するため、特定の用途において封入された細胞の生存性を確保できるからである。加えて、液滴は合着しやすい傾向にあるため、特定の実施形態により、界面活性剤を油相に望ましいように混合することができる。界面活性剤は更に、微小液滴界面での生体分子の吸着を阻害し得る。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合させたペルフルオロ化ポリエーテル（ＰＦＰＥ）を含む、新しい種類のブロックコポリマー界面活性剤を、フルオロカーボン油、��えば、ペルフルオロトリ−ｎ−ブチルアミンとジ（ペルフルオロ（ｎ−ブチル））ペルフルオロメチルアミンとの混合物であるフッ素化油ＦＣ−４０（Ｓｉｇｍａ）と共に使用することが報告されている（Ｈｏｌｔｚｅ、Ｃ．ら、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００８、ＤＯＩ：１０．１０３９／ｂ８０６７０６ｆ）。これらの組成物は非常に安定な生体適合性の乳剤をもたらす（Ｂｒｏｕｚｅｓ、Ｅ．ら、ＰＮＡＳ  ２００９、１０６（３４）、１４１９５〜１４２００）。
【００７９】
微小流体チャネルを通過する液滴は、それ自体の表面張力によって個別の微小液滴として保持され得る。表面張力を克服して、望ましいときに液滴を融合させ、試薬を混合するための様々な方法が提案されており、例えば、チャネル内の受動的流量低減エレメントの微小製造による方法（Ｎｉｕ、Ｘ．ら、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ２００８、８、１８３７〜１８４１）、静電荷の使用（電気的融合）による方法（Ｚａｇｎｏｎｉ、Ｍ．ら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２０１０、２６（１８）、１４４４３〜１４４４９）、又は微小チャネル形状の操作による方法（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  Ｍｅｒｇｅｒ  ｃｈｉｐ；ＷＯ／２０１２／０８３２２５号も参照）が提案されている。ピコインジェクター（加圧した試薬を充填したチャネルを、液滴チャネルに対して垂直にし、電界により操作する）を介して微小流体チャネル内の液滴に試薬を追加する方法が最近公開されており（Ａｂａｔｅ、Ａ．Ｒ．ら、ＰＮＡＳ  ２０１０、１０７（４５）、１９１６３〜１９１６６）、これも、本明細書に記述される特定の現在想到される実施形態により適合させることができる。
【００８０】
微小液滴の成分及び接触工程は、ゲノムＤＮＡと増幅プライマーとの間の核酸増幅相互作用を可能にするよう選択される。核酸増幅（例えば、ＰＣＲ）試薬及び条件は周知である。そのような増幅は、本明細書に提供される第１及び第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーのヌクレオチド配列、及びそれらの相補的配列を含む第１及び第２の二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも取得するよう進行させる。よって、例えば、任意の単一の融合微小液滴は、（ｉ）少なくとも第１のユニバーサルアダプタ配列、バーコード配列、ヘテロダイマーの第１の適応性免疫受容体ポリペプチドの一部分をコードするＶ領域及びＪ又はＣ領域配列、並びに第２のユニバーサルアダプタ配列を含む、第１の二本鎖ＤＮＡ産物と、（ｉｉ）少なくとも第３のユニバーサルアダプタ配列、（ｉ）と同じバーコード配列、ヘテロダイマーの第２適応性免疫受容体ポリペプチドの一部分をコードするＶ領域及びＪ又はＣ領域配列、並びに第４のユニバーサルアダプタ配列を含む、第２の二本鎖ＤＮＡ産物と、を含み得る。
【００８１】
融合微小液滴の増幅工程の条件は、次の工程の前に停止される。これは、微小液滴が収容されている環境（例えば容器又はウェル）の温度を変化させて、増幅プロセスを停止することによって達成され得る。
【００８２】
いくつかの実施形態において、この方法は、複数の融合微小液滴を破壊して、第１及び第２二本鎖産物の異種混合物を取得する工程を含む。破壊は、微小液滴の化学的特性及び組成物に基づいて選択することができ、例えば、化学的、生化学的、及び／又は物理的操作によって達成することができ、例えば希釈剤、洗剤、カオトロープ、界面活性剤、浸透圧剤、又はその他の化学剤の導入、又は超音波照射、圧力、電界、又はその他の破壊条件を利用することによって達成できる。好ましい条件には、微小液滴内に含まれる容積に対して、及び／又は破壊工程によって得られる異種混合物に対して、水性溶媒を使用することを伴うことが理解されよう。アッセイ形式として個々の細胞の代わりに微小液滴を使用することによって、サンプル中の数多くの入力細胞についてのデータを分析することができる。またＰＣＲ及びシークエンシング時のエラーを修正することができ、ＩＧ分子の場合には、体細胞超変異（ＳＨＭ）による非生殖細胞系配列と、ＰＣＲエラーにより導入された非生殖細胞系配列とを区別することができる。
【００８３】
いくつかの実施形態において、この方法は、第１及び第２の二本鎖ＤＮＡ産物の混合物を、本明細書に記述される第３及び第４の増幅プライマーセットと接触させる、後工程を含む。この工程の条件は、シークエンシングのためのＤＮＡライブラリを取得するためのＤＮＡ増幅の、認められている方法論を使用して同様に達成することができ、これはまた、数多くの確立されたＤＮＡシークエンシング技法の任意のものによって達成することができる。特定の関連する実施形態において、単一のリンパ球系細胞又はそれから単離されたゲノムＤＮＡを含む第１の液体微小液滴を使用する代わりに、第１の液体微小液滴それぞれが、単一のリンパ球系細胞のｍＲＮＡから逆転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）（例えば、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１鎖をコードする第１のｃＤＮＡと、そのヘテロダイマーの第２鎖をコードする第２のｃＤＮＡ）を含む。
【００８４】
特定の関連する実施形態において、個々の第２の微小液滴はそれぞれ、リンパ球の状態の指標となる分子（１つ又は複数）をコードする追加のｃＤＮＡ配列を増幅することができる第３のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含み得る。第３プライマーセットは、微小液滴内の第１及び第２のプライマーセットに存在する同じバーコード配列で標識される。そのような実施形態において、所与のＴＣＲ又はＩＧヘテロダイマー配列が識別される単一の供給源細胞について、生物学的状態が決定できる。この生物学的状態は、活性化状態と静止状態、成熟段階、ナイーブとメモリー、制御性とエフェクターなどであり得る。代表的なリンパ球の状態の指標となる分子には、例えば、ｌｃｋ、ｆｙｎ、ＦｏｘＰ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ６２、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ１０３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＨＬＡ−ＤＲ、などが挙げられる。
【００８５】
特定の実施形態には、リンパ球の状態の指標となる分子をコードする第３のｃＤＮＡ配列を増幅できる第３のオリゴヌクレオチドプライマーセットが含まれ、第３のオリゴヌクレオチドプライマーセットは、第１及び第２のプライマーセットに存在する同じバーコード配列で標識され、またリンパ球の状態の指標となる分子は、ＦｏｘＰ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ６２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ１０３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３８、ＣＤ１６１、ＣＤ２９４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＩｇＧ１−４  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＡ  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＥ  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＤ  Ｈ鎖定常領域、ＩｇＭ  Ｈ鎖定常領域、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−β、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９及びＴＬＲ１０のうち１つ以上を含む。
【００８６】
【表１】
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【００８７】
しかしながら、これら及び関連する実施形態は、そのように限定される必要はなく、追加的に又は別の方法として、リンパ球の状態の指標となる分子をコードする第３のｃＤＮＡ配列を増幅することができる第３のオリゴヌクレオチドプライマーセットが含まれてよく、第３プライマーセットは、第１及び第２のプライマーセットに存在する同じバーコード配列で標識され、かつリンパ球の状態の指標となる分子は細胞表面受容体を含む。
【００８８】
細胞表面受容体の例としては、ＣＤ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｙ０００２３、ＳＥＧ＿ＨＵＭＣＤ２、Ｍ１６３３６、Ｍ１６４４５、ＳＥＧ＿ＭＵＳＣＤ２、Ｍ１４３６２）、４−１ＢＢ（ＣＤｗ１３７、Ｋｗｏｎら、１９８９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１９６３、４−１ＢＢ  ｌｉｇａｎｄ（Ｇｏｏｄｗｉｎら、１９９３  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２３６１；Ｍｅｌｅｒｏら、１９９８  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１１６）、ＣＤ５（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７８９８５、Ｘ８９４０５）、ＣＤ１０（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ８１５９１、Ｘ７６７３２）ＣＤ２７（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ６３９２８、Ｌ２４４９５、Ｌ０８０９６）、ＣＤ２８（Ｊｕｎｅら、１９９０  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １１：２１１；また更に、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０２９８８、ＳＥＧ＿ＨＵＭＣＤ２８、Ｍ３４５６３）、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ１５００６、Ｘ０５７１９、ＳＥＧ＿ＨＵＭＩＧＣＴＬ）、ＣＤ４０（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ８３３１２、ＳＥＧ＿ＭＵＳＣ０４０Ａ０、Ｙ１０５０７、Ｘ６７８７８、Ｘ９６７１０、Ｕ１５６３７、Ｌ０７４１４）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ；例えば、Ｆａｒｒａｒら、１９９３  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：５７１及びその中に引用されている参考文献、Ｇｒａｙら、１９８２  Ｎａｔｕｒｅ  ２９５：５０３、Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔら、１９８４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６７９０、ＤｅＧｒａｄｏら、１９８２  Ｎａｔｕｒｅ  ３００：３７９）、インターロイキン−４（ＩＬ−４；例えば、５３ｒｄ  Ｆｏｒｕｍ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：５５３〜６４３；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９４  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、２ｎｄ  ｅｄ．、Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、ｐ．９９；Ｋｅｅｇａｎら、１９９４  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔ．Ｂｉｏｌ．５５：２７２、及びその中に引用されている参考文献）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３２６５９、Ｕ４３０８８）及び、インターロイキン−１７受容体（ＩＬ−１７Ｒ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３１９９３、Ｕ５８９１７）、又は同様物が挙げられる。
【００８９】
その他の細胞表面受容体には、ＣＤ５９（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＳＥＧ＿ＨＵＭＣＤ５９０、Ｍ９５７０８、Ｍ３４６７１）、ＣＤ４８（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ５９９０４）、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ａ２５９３３、Ｙ００６３６、Ｅ１２８１７；また更に、ＪＰ１９９７０７５０９０−Ａ）、ＣＤ７２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡ３１１０３６、Ｓ４０７７７、Ｌ３５７７２）、ＣＤ７０（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｙ１３６３６、Ｓ６９３３９）、ＣＤ８０／Ｂ７．１（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９８９  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２７１４；Ｆｒｅｅｍａｎら、１９９１  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：６２５；又は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３３２０８、Ｉ６８３３７９）、ＣＤ８６／Ｂ７．２（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９９３  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２１８５、Ｂｏｒｉｅｌｌｏら、１９９５  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：５４９０；、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０９９１０５、ＳＥＧ＿ＭＭＢ７２Ｇ、Ｕ３９４６６、Ｕ０４３４３、ＳＥＧ＿ＨＳＢ７２５、Ｌ２５６０６、Ｌ２５２５９も参照されたい）、Ｂ７−Ｈ１／Ｂ７−ＤＣ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４１４３、ＡＦ１７７９３７、ＡＦ３１７０８８；Ｄｏｎｇら、２００２  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．Ｊｕｎ  ２４［出版前に電子版公開］、ＰＭＩＤ  １２０９１８７６；Ｔｓｅｎｇら、２００１  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：８３９；Ｔａｍｕｒａら、２００１  Ｂｌｏｏｄ  ９７：１８０９；Ｄｏｎｇら、１９９９  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１３６５）、ＣＤ４０リガンド（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＳＥＧ＿ＨＵＭＣＤ４０Ｌ、Ｘ６７８７８、Ｘ６５４５３、Ｌ０７４１４）、ＩＬ−１７（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３２６５９、Ｕ４３０８８）、ＣＤ４３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５２０７５、Ｊ０４５３６）、ＩＣＯＳ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＨ０１１５６８）、ＣＤ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００７３（γサブユニット）、ＮＭ＿０００７３３（イプシロンサブユニット）、Ｘ７３６１７（δサブユニット））、ＣＤ４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００６１６）、ＣＤ２５（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４１７）、ＣＤ８（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ１２８２８）、ＣＤ１１ｂ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０３９２５）、ＣＤ１４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０３９３６４）、ＣＤ５６（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ６３０４１）、ＣＤ６９（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１７８１）及びＶＬＡ−４（α４β７）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ１２００２、Ｘ１６９８３、Ｌ２０７８８、Ｕ９７０３１、Ｌ２４９１３、Ｍ６８８９２、Ｍ９５６３２）、又は同様物が挙げられる。
【００９０】
下記の細胞表面受容体は、典型的にＢ細胞と関連する：ＣＤ１９（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＳＥＧ＿ＨＵＭＣＤ１９Ｗ０、Ｍ８４３７１、ＳＥＧ＿ＭＵＳＣＤ１９Ｗ、Ｍ６２５４２）、ＣＤ２０（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＳＥＧ＿ＨＵＭＣＤ２０、Ｍ６２５４１）、ＣＤ２２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｉ６８０６２９、Ｙ１０２１０、Ｘ５９３５０、Ｕ６２６３１、Ｘ５２７８２、Ｌ１６９２８）、ＣＤ３０（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ８３５５４、Ｄ８６０４２）、ＣＤ１５３（ＣＤ３０リガンド、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ０９７５３、Ｍ８３５５４）、ＣＤ３７（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＳＥＧ＿ＭＭＣＤ３７Ｘ、Ｘ１４０４６、Ｘ５３５１７）、ＣＤ５０（ＩＣＡＭ−３、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２１６２）、ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５３０５１、Ｘ６７７８３、ＳＥＧ＿ＭＭＶＣＡＭ１Ｃ、また更に米国特許第５，５９６，０９０号を参照）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ８４７３７、Ｓ８２８４７、Ｘ０６９９０、Ｊ０３１３２、ＳＥＧ＿ＭＵＳＩＣＡＭ０）、インターロイキン−１２（例えば、Ｒｅｉｔｅｒら、１９９３  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：１、及びその中に引用されている参考文献）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ２７７１５１）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ１２９６４、ＮＭ＿００１５６１）、ＣＤ８３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ００１０３６、ＡＬ０２１９１８）、ＤＥＣ−２０５（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１１３３３、Ｕ１９２７１）。
【００９１】
他の細胞表面受容体の例としては、ＨＥＲ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４８７２２、ＳＥＧ＿ＨＥＧＦＲＥＸＳ、ＫＯ３１９３）、ＨＥＲ２（Ｙｏｓｈｉｎｏら、１９９４  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２３９３；Ｄｉｓｉｓら、１９９４  Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５４：１６が挙げられ；また更に、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０３３６３、Ｍ１７７３０、ＳＥＧ＿ＨＵＭＨＥＲ２０）、ＨＥＲ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２９３３９、Ｍ３４３０９）、ＨＥＲ４（Ｐｌｏｗｍａｎら、１９９３  Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：４７３に参照され；また更に、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ０７８６８、Ｔ６４１０５）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４８７２２、ＳＥＧ＿ＨＥＧＦＲＥＸＳ、ＫＯ３１９３）、血管内皮細胞増殖因子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｍ３２９７７）、血管内皮細胞増殖因子受容体（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２２３７５、１６８０１４３、Ｕ４８８０１、Ｘ６２５６８）、インスリン様増殖因子−Ｉ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ００１７３、Ｘ５６７７４、Ｘ５６７７３、Ｘ０６０４３が参照され、また更に、欧州特許第ＧＢ  ２２４１７０３号が参照される）、インスリン様増殖因子−ＩＩ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０３５６２、Ｘ００９１０、ＳＥＧ＿ＨＵＭＧＦＩＡ、ＳＥＧ＿ＨＵＭＧＦＩ２、Ｍ１７８６３、Ｍ１７８６２）、トランスフェリン受容体（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ  ａｎｄ  Ｏｍａｒｙ、１９８１  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ  ７８：３０３９が参照され；また更に、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０１０６０、Ｍ１１５０７を参照）、エストロゲン受容体（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ３８６５１、Ｘ０３６３５、Ｘ９９１０１、Ｕ４７６７８、Ｍ１２６７４）、プロゲステロン受容体（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５１７３０、Ｘ６９０６８、Ｍ１５７１６）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨ−Ｒ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ３４２６０、Ｍ６５０８５）、レチノイン酸受容体（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ１２０６０、Ｍ６０９０９、Ｘ７７６６４、Ｘ５７２８０、Ｘ０７２８２、Ｘ０６５３８）、ＭＵＣ−１（Ｂａｒｎｅｓら、１９８９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７１５９が参照され；また更に、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＳＥＧ＿ＭＵＳＭＵＣＩＯ、Ｍ６５１３２、Ｍ６４９２８参照）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ００３１４９、Ｕ８７４５９）、ＮＡ１７−Ａ（例えば、欧州特許第ＷＯ  ９６／４００３９号）、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１（Ｋａｗａｋａｍｉら、１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３５１５が参照され；また更に、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０６６５４、Ｕ０６４５２）、チロシナーゼ（Ｔｏｐａｌｉａｎら、１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９４６１が参照され；また更に、例えば、Ｇ���ｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２６７２９、ＳＥＧ＿ＨＵＭＴＹＲ０、また更に、Ｗｅｂｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ（１９９８）１０２：１２５８）、Ｇｐ−１００（Ｋａｗａｋａｍｉら、１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３５１５が参照され；また更に、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ７３００３、また更に、欧州特許ＥＰ６６８３５０；Ａｄｅｍａら、１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２０１２６）、ＭＡＧＥ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｕｇｇｅｎら、１９９１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６４３；また更に、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ９３１６３、ＡＦ０６４５８９、Ｕ６６０８３、Ｄ３２０７７、Ｄ３２０７６、Ｄ３２０７５、Ｕ１０６９４、Ｕ１０６９３、Ｕ１０６９１、Ｕ１０６９０、Ｕ１０６８９、Ｕ１０６８８、Ｕ１０６８７、Ｕ１０６８６、Ｕ１０６８５、Ｌ１８８７７、Ｕ１０３４０、Ｕ１０３３９、Ｌ１８９２０、Ｕ０３７３５、Ｍ７７４８１）が参照され、ＢＡＧＥ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ１９１８０、また更に、米国特許第５，６８３，８８６号及び同第５，５７１，７１１号が参照される）、ＧＡＧＥ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０５５４７５、ＡＦ０５５４７４、ＡＦ０５５４７３、Ｕ１９１４７、Ｕ１９１４６、Ｕ１９１４５、Ｕ１９１４４、Ｕ１９１４３、Ｕ１９１４２）、任意の受容体ＣＴＡ分類（特にＳＳＸ２遺伝子によりコーディングされたＨＯＭ−ＭＥＬ−４０抗原を含む）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ８６１７５、Ｕ９０８４２、Ｕ９０８４１、Ｘ８６１７４）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ、Ｇｏｌｄ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｄｍａｎ、１９８５  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２１：４３９；また更に、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＳＥＧ＿ＨＵＭＣＥＡ、Ｍ５９７１０、Ｍ５９２５５、Ｍ２９５４０）、並びにＰｙＬＴ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０２２８９、Ｊ０２０３８）、又は同様物に参照される。
【００９２】
リンパ球状態インジケーターは更に、１つ以上のアポトーシスシグナリングポリペプチドを含み得るものであり、この配列は当該技術分野に既知であり、例えば、Ｗｈｅｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｉｅ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ（Ｒ．Ａ．Ｌｏｃｋｓｈｉｎ  Ｅｄｓ．、１９９８  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；また更に、例えば、Ｇｒｅｅｎら、１９９８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３０９及びその中に引用されている参考文献；Ｆｅｒｒｅｉｒａら、２００２  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．８：２０２４；Ｇｕｒｕｍｕｒｔｈｙら、２００１  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓ．Ｒｅｖ．２０：２２５；Ｋａｎｄｕｃら、２００２  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２１：１６５を参照）において概説されている。典型的に、アポトーシスシグナリングポリペプチド配列は、受容体デスドメインポリペプチドの全体又はその一部を含むか、又は受容体デスドメインポリペプチドから誘導され、例えば、ＦＡＤＤ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２４２３１、Ｕ４３１８４、ＡＦ００９６１６、ＡＦ００９６１７、ＮＭ＿０１２１１５）、ＴＲＡＤＤ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３７８９）、ＲＡＩＤＤ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ８７２２９）、ＣＤ９５（ＦＡＳ／Ａｐｏ−１；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ８９１０１、ＮＭ＿００３８２４、ＡＦ３４４８５０、ＡＦ３４４８５６）、ＴＮＦ−α−受容体−１（ＴＮＦＲ１、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ６３３６８、ＡＦ０４０２５７）、ＤＲ５（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２０５０１、ＡＦ０１６２６８、ＡＦ０１２５３５）、ＩＴＩＭドメイン（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８１６７５、ＢＣ０１５７３１、ＮＭ＿００６８４０、ＮＭ＿００６８４４、ＮＭ＿００６８４７、ＸＭ＿０１７９７７；また例えば、Ｂｉｌｌａｄｅａｕら、２００２  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：１６１を参照）、ＩＴＡＭドメイン（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５８４３、ＮＭ＿００３４７３、ＢＣ０３０５８６；また例えば、Ｂｉｌｌａｄｅａｕら、２００２を参照）、あるいは他の当該技術分野に周知のアポトーシス関連受容体デスドメインポリペプチド、例えば、ＴＮＦＲ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ４９４３１、Ｌ４９４３２）、カスパーゼ／プロカスパーゼ−３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿５４６８６）、カスパーゼ／プロカスパーゼ−８（例えば、ＡＦ３８０３４２、ＮＭ＿００４２０８、ＮＭ＿００１２２８、ＮＭ＿０３３３５５、ＮＭ＿０３３３５６、ＮＭ＿０３３３５７、ＮＭ＿０３３３５８）、カスパーゼ／プロカスパーゼ−２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３１４１７４、ＡＦ３１４１７５）、などを含む。アポトーシス進行が疑われる生体サンプル中の細胞は、形態変化、透過性変化、生化学的変化、分子遺伝学的変化、又はその他の、当業者にとって明らかである変化について、検査され得る。
【００９３】
これら及び関連方法は、最初に、単一細胞に由来するＴＣＲ又はＩＧヘテロダイマーの両鎖をコードする再構成ＤＮＡ配列の迅速な決定を可能にする。そのような実施形態は、複数の単一細胞それぞれに由来する適応性免疫受容体をコードする配列の高スループットシークエンシングを可能にすることにより、診断及び予後目的の用途があり、また、ＴＣＲ又はＩＧヘテロダイマーの組み合わせ及びその基盤となる分子メカニズムについての免疫学的検査結果を有用に知らせることができる。多数のＴＣＲ及び／又はＩＧヘテロダイマーの両サブユニットに関するＤＮＡ配列情報を迅速かつ大規模に入手できることによって、合成抗体技術及び関連分野の開発が促進され、例えば、抗体、あるいは完全又は部分的なＴＣＲ又はＩＧ抗原結合領域を、診断、治療、生物模倣、酵素又は触媒（例えばアブザイム）、又はその他の工業的に有用な組成物に、有用に組み入れることができる。本開示により可能となる高スループットＴＣＲ及び／又はＩＧシークエンシングの定量的性質のおかげで、サンプル中に存在するＴＣＲ及び／又はＩＧヘテロダイマー配列の定量的特性付けが高精度になり、特定のＴ細胞又はＢ細胞クローンに属する細胞数を決定する能力が有益に改善されることになる。
【００９４】
上述のように、単一の適応性免疫細胞に由来するＴＣＲ又はＩＧヘテロダイマーの両鎖を識別するためのこれらの実施形態により、任意の所与の第２の微小液滴中では、全てのオリゴヌクレオチド増幅プライマーが同じバーコードオリゴヌクレオチドを含むが、別の第２の微小液滴中では、このプライマーセットは異なるバーコード配列を含む。したがって、配列のデータセットを取得するために上述のように取得されたＤＮＡライブラリのシークエンシングの後に、このデータセット中の配列を、同一のバーコード配列を有する配列グループにソーティングすることができ、更にそのようなバーコードグループを、Ｘ１又はＸ２配列（これはＶ及びＪ又はＣ領域の部分を含む）を有するものにソーティングして、所与の配列が第１のＴＣＲ又はＩＧコーディング鎖（例えば、ＴＣＲＡ又はＩＧＨ鎖）あるいは第２のＴＣＲ又はＩＧコーディング鎖（例えば、ＴＣＲＢ又はＩＧＬ鎖）のいずれの増幅産物を反映しているかを示すことができる。
【００９５】
バーコード及びＴＣＲ又はＩＧ鎖によりこのようにソーティングされた配列は、更に、クラスタリングの様々な既知のアルゴリズムの任意のものを使用して、クラスター分析の対象とすることができ（例えば、ＢＬＡＳＴＣｌｕｓｔ、ＵＣＬＵＳＴ、ＣＤ−ＨＩＴ、また更に、ＩＥＥＥ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ．２０１０；３：１２０〜５４．ｄｏｉ：１０．１１０９／ＲＢＭＥ．２０１０．２０８３６４７；Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｉｎ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ、Ｘｕ  Ｒ、Ｗｕｎｓｃｈ  ＤＣ  ２ｎｄ；Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５  Ｓｅｐ；３１（１）：５５〜８０；Ｄａｔａ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｚｈａｏ  Ｙ、Ｋａｒｙｐｉｓ  Ｇ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；５９３：８１〜１０７．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−６０３２７−１９４−３＿５；Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｆｒａｄｅｓ  Ｉ、Ｍａｔｔｈｉｅｓｅｎ  Ｒ）、また、共有バーコード配列を有する他の配列とはクラスタリングしないが、単一ヌクレオチドが異なるバーコードを有する配列とはクラスタリングするような配列の場合に、エラー修正の対象とすることができる。例えば、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１２  Ｊａｎ  ２４；１０９（４）：１３４７〜５２．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１１１８０１８１０９．Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｊａｎ  ９．Ｄｉｇｉｔａｌ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｉｎｉｍｉｚｅｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉａｓ  ａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏｉｓｅ  ｗｉｔｈ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｂａｒｃｏｄｅｓ．Ｓｈｉｒｏｇｕｃｈｉ  Ｋ、Ｊｉａ  ＴＺ、Ｓｉｍｓ  ＰＡ、Ｘｉｅ  ＸＳ；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳ  Ａ．２０１２  Ｓｅｐ  ４；１０９（３６）：１４５０８〜１３．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２０８７１５１０９．Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ａｕｇ  １．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｌｔｒａ−ｒａｒｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｓｃｈｍｉｔｔ  ＭＷ、Ｋｅｎｎｅｄｙ  ＳＲ、Ｓａｌｋ  ＪＪ、Ｆｏｘ  ＥＪ、Ｈｉａｔｔ  ＪＢ、Ｌｏｅｂ  ＬＡを参照のこと。
【００９６】
したがって、特定の実施形態は、（ａ）データセット中で識別されるオリゴヌクレオチドバーコード配列に照らして配列のデータセット（上述のように取得される）をソーティングすることにより、それぞれ固有のバーコードを有する複数のバーコード配列セットを取得する工程と；（ｂ）（ａ）の各バーコード配列セットをＸ１配列含有サブセット及びＸ２配列含有サブセットにソーティングする工程と；（ｃ）Ｘ１及びＸ２配列に照らしてＸ１及びＸ２配列含有サブセットのそれぞれの構成要素をクラスタリングして、それぞれ、１つ又は複数のＸ１配列クラスターセット及び１つ又は複数のＸ２配列クラスターセットを取得する工程と、１つ以上のいずれかの前記Ｘ１及びＸ２配列クラスターセット内の、単一ヌクレオチドバーコード配列のミスマッチをエラー修復する工程と；（ｄ）同じ１つ以上のバーコード配列セットに属するＸ１及びＸ２配列クラスターセットの構成要素である、同じ細胞配列に由来するものとして識別する工程と、を含む方法を含む。
【００９７】
非限定的な理論に従い、同じバーコード配列セットと共に生じる第１及び第２の適応性免疫受容体鎖をコードする配列は、同じ融合微小液滴に由来している可能性が非常に高く、よって同じ供給源細胞に由来している可能性が非常に高いことが理解されよう。例えば、１０４種類の異なるバーコードが第１及び第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーの構築において使用される場合、同じバーコード配列を有する２つの独立の（すなわち異なる細胞に由来する）二本鎖の第１及び第２の生成物が得られる確率は、１０８分の１である。ゆえに、本明細書に記述される方法に従って、第１及び第２の適応性免疫受容体ポリペプチドをコードする配列（例えば、Ｘ１及びＸ２）の所与のセットの３つ以上のコピーが共通のバーコード配列（例えば、同じバーコード配列セットに属するもの）を共有している場合、それらの配列が独立した細胞供給源に由来しているという確率はゼロに近い。
【００９８】
同様に、本方法に従って取得された配列のデータセットの分析は、ゲノムＤＮＡのリンパ球系細胞供給源の生物学的状態を特性付けるのにも使用できることが理解されよう。例えば、Ｂ細胞においてはＩＧＨ遺伝子再構成はＩＧＬ遺伝子再構成より先に起こることが知られているため、本明細書に記述されるバーコード配列分析は、同じ再構成ＩＧＨ配列であるが異なるＩＧＬ配列を有する複数の単一のリンパ球系細胞ゲノムを明らかにすることができ、免疫のナイーブ細胞におけるこれらの配列の由来を示すことができる。
【００９９】
あるいは、この分析は、Ｔ細胞が自身の機能に固有のタンパク質、例えば本明細書で記述されるリンパ球の状態の指標となる分子などを発現しているという観察を活用することができる。例えば、制御性Ｔ細胞は、タンパク質ＦＯＸＰ３を発現する。Ｔ細胞ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡが、次に増幅される場合、共増幅産物は、ＴＣＲＢ及びＴＣＲＡ分子をコードするｃＤＮＡと共に、例えばＦＯＸＰ３などの表現型特異的タンパク質をコードする他のｍＲＮＡを反映するｃＤＮＡを含み得る。このアプローチは、例えば制御性Ｔ細胞又はエフェクターＴ細胞などの、特異的表現型を有するＴ細胞によって発現される適応性免疫受容体の識別を可能にし得る。
【０１００】
よって、本明細書で提供されるのは、単一リンパ球系細胞内の適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチド配列をコードする再構成ＤＮＡ配列を決定するための方法であり、この方法は、（１）単一のリンパ球系細胞又はそこから単離されたゲノムＤＮＡをそれぞれ含む個々の第１の微小液滴（Ａ）を、複数の第２の液体微小液滴からの個々の第２の微小液滴（Ｂ）に接触させる工程を含み、この第２の液体微小液滴はそれぞれ、（ｉ）適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１のポリペプチドの第１の相補性決定領域−３（ＣＤＲ３）をコードする再構成ＤＮＡ配列を増幅することができる第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットと、（ｉｉ）適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第２のポリペプチドの第２の相補性決定領域−３（ＣＤＲ３）をコードする再構成ＤＮＡ配列を増幅することができる第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットと、を含む。第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットは、一般式：Ｕ１／２−Ｂ１−Ｘ１の複数のオリゴヌクレオチド配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含む組成物を含み、式中、Ｕ１／２は、Ｂ１が存在するときに第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｂ１が存在しないときに第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｂ１は存在せず、又は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の連続するヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、またＸ１は：（ａ）適応性免疫受容体ヘテロダイマー、又はその相補的配列の前記第１のポリペプチドに対する適応性免疫受容体可変（Ｖ）領域コーディング遺伝子配列の、２０、３０、４０又は５０個以上、１００、９０、８０、７０又は６０個以下の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、一般式Ｕ１／２−Ｂ１−Ｘ１の複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ１が固有のオリゴヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドと、（ｂ）（ｉ）適応性免疫受容体ヘテロダイマー、又はその相補的配列の前記第１のポリペプチドに対する適応性免疫受容体連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列、又は（ｉｉ）適応性免疫受容体ヘテロダイマー、又はその相補的配列の前記第１のポリペプチドに対する適応性免疫受容体定常（Ｃ）領域コーディング遺伝子配列であって、一般式Ｕ１／２−Ｂ１−Ｘ１の複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ１が固有のオリゴヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドと、のうちいずれかの、１５〜３０個又は３１〜５０個以上、８０、７０、６０又は５５個以下の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと、のうち一方のオリゴヌクレオチドを含む。第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットは、一般式：Ｕ３／４−Ｂ２−Ｘ２の複数のオリゴヌクレオチド配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含む組成物を含み得るものであり、式中、Ｕ３／４は、Ｂ２が存在するときに第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｂ２が存在しないときに第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドを含み、Ｂ２は存在せず、又は、Ｂ１と同じものからの６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の連続するヌクレオチドの第２のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、またＸ２は：（ａ）適応性免疫受容体ヘテロダイマー、又はその相補的配列の前記第２のポリペプチドに対する適応性免疫受容体可変（Ｖ）領域コーディング遺伝子配列の、２０、３０、４０又は５０個以上、１００、９０、８０、７０又は６０個以下の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、一般式Ｕ３／４−Ｂ２−Ｘ２の複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ２が固有のオリゴヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドと、（ｂ）（ｉ）適応性免疫受容体ヘテロダイマー、又はその相補的配列の前記第２のポリペプチドに対する適応性免疫受容体連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列、又は（ｉｉ）適応性免疫受容体ヘテロダイマー、又はその相補的配列の前記第２のポリペプチドに対する適応性免疫受容体定常（Ｃ）領域コーディング遺伝子配列であって、一般式Ｕ３／４−Ｂ２−Ｘ２の複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ２が固有のオリゴヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドと、のうちいずれかの、１５〜３０個又は３１〜５０個以上、８０、７０、６０又は５５個以下の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと、のうち一方であるオリゴヌクレオチドを含む。接触させる工程は、第１の微小液滴のうち１つと第２の微小液滴のうち１つとの間の複数回の融合イベントに十分な条件及び時間で行うことができ、ゲノムＤＮＡと第１及び第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットとの間で核酸増幅相互作用を起こすような複数の融合微小液滴を生成し、これによって、１つ以上の前記複数の融合微小液滴それぞれの中に：少なくとも１つの第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドの少なくとも１つのＸ１オリゴヌクレオチドＶ領域コーディング遺伝子配列、少なくとも１つの第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、及び、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドの少なくとも１つのＸ１オリゴヌクレオチドＪ領域又はＣ領域コーディング遺伝子配列を含む、第１の二本鎖ＤＮＡ産物を取得する。この条件により更に、１つ以上の前記複数の融合微小液滴それぞれの中に、少なくとも１つの第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチドバーコード配列、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドの少なくとも１つのＸ２オリゴヌクレオチドＶ領域コーディング遺伝子配列、少なくとも１つの第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、及び、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドの少なくとも１つのＸ２オリゴヌクレオチドＪ領域又はＣ領域コーディング遺伝子配列を含む、第２の二本鎖ＤＮＡ産物を取得することも、可能になる。
【０１０１】
この方法は更に、複数の融合微小液滴を破壊して、前記第１及び第２の二本鎖ＤＮＡ産物の異種混合物を取得する工程と、第１及び第２の二本鎖ＤＮＡ産物の混合物を、第３の増幅プライマーセット及び第４の増幅プライマーセットと接触させる工程とを含む。いくつかの実施形態において、第３の増幅プライマーセットは、（ｉ）第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とをそれぞれ含む、複数の第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド、及び（ｉｉ）第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とをそれぞれ含む、複数の第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、を含む。他の実施形態において、第４の増幅プライマーセットは、（ｉ）第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第３シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とをそれぞれ含む、複数の第３シークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド、及び（ｉｉ）第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第４シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とをそれぞれ含む、複数の第４シークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、を含む。接触させる工程は、（２）の第１及び第２の二本鎖ＤＮＡ産物の両方の鎖を増幅するのに十分な条件及び時間で実施することができ、これによりシークエンシングのためのＤＮＡライブラリを得ることができる。この方法は更に、（３）で取得したライブラリをシークエンシングして、ＤＮＡ適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチド配列をコードする配列のデータセットを取得する工程を含む。
【０１０２】
図２は、単一のリンパ球系細胞又はゲノムＤＮＡを含む複数の第１の微小液滴２１０が、複数の個々の第２の微小液滴２２０と融合して、複数の融合微小液滴２３０を形成する、一方法を示す。複数の第２液滴には、本明細書に記述されるように、増幅プライマーセットを含ませることができ、この融合した液滴は、増幅プライマーが微小液滴内の単一のリンパ球系細胞に見出されるＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）を増幅できるような条件下に置くことができる。
【０１０３】
これら及び関連の実施形態により、例えばＩＧＨ＋ＩＧＬ、又はＩＧＨ＋ＩＧＫ、又はＴＣＲＡ＋ＴＣＲＢ、又はＴＣＲＧ＋ＴＣＲＤなどの、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの同じ細胞由来の両鎖をコードする再構成遺伝子の高スループットシークエンシングが可能となる。このアプローチはまた、有利に、所与のＴＣＲ又はＩＧを有するたくさんの細胞を定量することが可能である。代表的な実施形態の模式図を図３に示す。これにより、上述のものに非常に類似しているものの、明らかに、単一のリンパ球系細胞由来のＤＮＡを、本明細書に記述される第１及び第２の増幅プライマーセットに接触させて、第１の増幅反応を実施して、固有の分子タグ付加バーコードを単一微小液滴（これは例えば、ＲａｉｎＤａｎｃｅ（商標）微小液滴デジタルＰＣＲシステム（ＲａｉｎＤａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）（例えば、Ｐｅｋｉｎら、２０１１  Ｌａｂ．Ｃｈｉｐ  １１（１３）：２１５６；Ｚｈｏｎｇら、２０１１  Ｌａｂ．Ｃｈｉｐ  １１（１３）：２１６７；Ｔｅｗｈｅｙら、２００９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：１０２５；２０１０  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１７８）又は他の匹敵するシステム内で使用するための乳剤から形成されるものなど）内に組み込む工程を備える工程が実施され、このいずれも、本明細書に記述される組成物及び方法で使用するため、当業者によって適合され得る。複数の固有の分子タグ付加バーコードを複数の個別のｄｓＤＮＡ産物に組み込んだ後、微小液滴は破壊されてよく、シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチドの増幅及び導入を含む確認工程が、本明細書に記述されかつ図３に示すように実施され得る。
【０１０４】
これら及び関連の実施形態において、単一のタグ付加バーコード（ＢＣ１）は、全てのＪプライマー（又は特定の実施形態においては全てのＶプライマー）によって共有されてよく、特異的及び事前識別されたバーコード配列の有限のセットを備えたそのようなプライマーを作製することが望ましい場合がある。ただし、第１段階では、所与の微小液滴内に、単一のタグ付加バーコード配列（ＢＣ１）のみが存在する。ゆえに、本明細書で提供されるように複数の異種リンパ球系細胞を含むサンプルで開始して実践されるシークエンシング工程の後、大規模で多様な配列情報のセットが得られた後であっても、そのような情報の分析は、同じタグ付加バーコード（ＢＣ１）を含む第１及び第２のＴＣＲ又はＩＧヘテロダイマーポリペプチド鎖をコードする配列の決定を含み得るものであり、これにより、確率的根拠によって、両鎖が同じ細胞の産物であるという可能性が非常に高いことが示される。したがって、本開示は初めて、同じ細胞内で発現されるＴＣＲ又はＩｇヘテロダイマーの両鎖のサンプルにおける相対的表現を決定及び定量するための組成物及び方法を提供する。
【０１０５】
微小液滴を用いないクローン性ヘテロダイマーの配列決定
特定の他の実施形態により、単一細胞の第１及び第２の適応性免疫受容体ヘテロダイマーポリペプチド配列をコードする再構成ＤＮＡ配列の決定は、それぞれ、単一のリンパ球系細胞ゲノムＤＮＡ（又はそのｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ）、及びオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットを含む、第１及び第２の微小液滴の別個の集団を最初に調製せずとも達成することができる。
【０１０６】
代わりに、これら代替の実施形態では、リンパ球系細胞含有細胞懸濁液（例えば、対象由来の血液細胞調製液、又はその細胞亜集団）の細胞を、複数の容器（例えば、マルチウェル細胞培養プレート又はアッセイプレートの複数のウェルなど）（例えば、９６ウェル、３８４ウェル、又は１５３６ウェル形式）に分注することによって、亜集団に分けることが想到される。当業者には、ウェル、容器、試験管、コンパートメント、又は同様物当たりで望ましい数の細胞を得るために、例えば、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、又は自動化少量吐出装置で、又は限界希釈によって、そのような複数の容器に細胞懸濁液を分配する、数多くの装置及び方法が周知である。特定の実施形態において、各容器に実質的に同じ数の細胞を分配することが好ましい場合があるが、特定の他の想到される実施形態ではそのように限定する必要はない。
【０１０７】
簡潔に言うと、これら及び関連の実施形態により、個別に分けられたリンパ球系細胞亜集団は、逆転写（ＲＴ）工程中に付随して標識されるｃＤＮＡ分子を生成する逆転写のための鋳型として使用されるｍＲＮＡ分子を提供し得る（図４及び５を参照）。図４は、オリゴヌクレオチドバーコードとユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列のｃＤＮＡへの組み込みを導くオリゴヌクレオチド逆転写プライマーを使用することによる、逆転写中の適応性免疫受容体ポリペプチドコーディングｃＤＮＡの標識付けの模式図を示す。ｃＤＮＡ鎖は、ｐＧＥＸ−Ｒｅｖ配列、バーコードＢＣ及びＮ６スペーサー配列（ＢＣ−Ｎ６）、及び「Ｃｎ−ＲＣ」配列を含むプライマーで増幅される。増幅されたｃＤＮＡ鎖の３’端は、ｐＧＥＸ−ＦＲＣ配列、バーコードＢＣ−Ｎ６スペーサー配列、及び「Ｓｍａｒｔｅｒ  ＵＡｌｌ」配列を含む。増幅されたｃＤＮＡのウェル又は容器をプールし、この第１のｃＤＮＡ鎖プールに、ＳＰＲＩビーズ精製を実施する。ＰＣＲ増幅は、テーリングｐＧＥＸ  Ｆ／Ｒ配列を使用して実施される。アンプリコンが精製され、サイズに基づいて選択される。結果として得られるｃＤＮＡアンプリコンを図４に示す。
【０１０８】
図５は、オリゴヌクレオチドバーコードとユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列のｃＤＮＡへの組み込みをもたらすオリゴヌクレオチド逆転写プライマーを使用することによる、逆転写中の適応性免疫受容体ポリペプチドコーディングｃＤＮＡの標識の模式図を示す。図６は、逆転写中に、オリゴヌクレオチドバーコード配列及びユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の組み込みをもたらすオリゴヌクレオチド逆転写プライマーを使用して標識し、増幅させた、適応性免疫受容体ポリペプチドコーディングｃＤＮＡの、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングアダプタによる修飾後にシークエンシングを受ける、ＤＮＡ産物の模式図を示す。
【０１０９】
本明細書に提供されるように、そのような実施形態におけるオリゴヌクレオチドＲＴプライマーは、例えばＶ、Ｊ又はＣ領域配列などの適応性免疫受容体コーディング領域を標的として特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド配列を含み、更に、本明細書に記述されるユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列と共に、分子標識としてのオリゴヌクレオチドバーコード配列を含む。したがって、適応性免疫受容体コーディングｍＲＮＡからの逆転写プロセスは、（ｉ）供給源識別子としてのオリゴヌクレオチドバーコード配列、及び（ｉｉ）本明細書に記述される自動化高スループットシークエンシングを促進するためのユニバーサルアダプタを、ｃＤＮＡ産物に組み込むことによって達成され得る。説明のために非限定的に述べると、これらの実施形態の特定のものにおいて、単一の特定の容器（例えばマルチウェルプレートのうち１つのウェル）の内容物と接触させる、オリゴヌクレオチドＲＴプライマーセット内の全てのＲＴプライマーは、共通のバーコードオリゴヌクレオチド配列（Ｂ）を共有し、異なるバーコードオリゴヌクレオチド配列（Ｂ）は、別個の各容器（例えばマルチウェルプレートの各ウェル）に存在する。
【０１１０】
例えば、細胞懸濁液（例えば、血液細胞又はその分画、例えば有核細胞、リンパ球系細胞など）は、マルチウェルプレートの異なるウェルに不規則に分注することによって分け、細胞をサブセットに物理的に分離することができる。各ウェルの細胞のサブセットは、任意の数の従来手順に従って溶解又は他の方法で処理し、細胞内に存在するｍＲＮＡを放出させることができ、ｍＲＮＡには、細胞により発現されているＴＣＲ（例えば、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ、又はＴＣＲＧ及びＴＣＲＧ）又はＩＧ（例えば、ＩＧＨ及びＩＧＬ）ヘテロダイマーの両鎖をコードしているｍＲＮＡが含まれてよく、また更に、１つ以上のリンパ球の状態の指標となる分子をコードするｍＲＮＡも含まれ得る。
【０１１１】
ｍＲＮＡは、次に、本明細書に記載されるように、分けられた各ウェル内で、ｃＤＮＡ産物に導入できるオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセット（ＴＣＲ又はＩＧをコードする配列又はその相補体にリンクされている固有のオリゴヌクレオチドバーコード配列）を使用して、確立した逆転写（ＲＴ）プロトコルの改変によるｃＤＮＡ合成の鋳型として使用することができる（例えば、図４〜５を参照）。バーコードの外側（例えば、ＴＣＲ又はＩＧをコードする配列の、バーコードよりも遠位側）で、オリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットは、本明細書に記述されるユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列及び／又はその他の既知のオリゴヌクレオチド配列の特性（例えば、自動化高スループット定量シークエンシングとの適合性があるものなどの、下流の増幅、プロセシング、及び／又は操作工程を促進し得るようなもの）を導入するよう設計することができる。
【０１１２】
逆転写されたｃＤＮＡ産物のＤＮＡ増幅の後、マルチウェルプレートの所与のウェル内にある増幅されたＤＮＡ分子それぞれが同じオリゴヌクレオチドバーコード配列を有し、一方、異なる各ウェル内の増幅産物のバーコード配列は互いに区別される。このようにして、各ウェル内で、適応性免疫受容体ヘテロダイマー（例えば、ＩＧＨ及びＩＧＬ、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ及びＴＣＲＤ）のいずれかの鎖をコードする全てのＤＮＡ分子が、同じオリゴヌクレオチドバーコード配列を有する。
【０１１３】
増幅産物をプールし、本明細書の他の場所で記述されているように自動化高スループットＤＮＡシークエンシングを使用して定量的にシークエンシングして配列のデータセットを取得することができ、データセットには、関連するオリゴヌクレオチドバーコード配列と共にＴＣＲ及び／又はＩＧ配列が含まれる。本明細書で開示されるように、特定の好ましい実施形態において、配列のデータセットは、組み合わせ論アプローチにより解析することができ、これにより、適応性免疫受容体ヘテロダイマーサブユニットをコードする配列の特定のペアをマッチングして、同じリンパ球系細胞に由来するものとして識別することができる。
【０１１４】
非限定的な例示の実施例として、配列の仮想データセットを、リンパ球系細胞懸濁液を分注した１００ウェルのセットから取得することができる。各ウェルで、細胞のｍＲＮＡ  ｃＤＮＡが、ＴＣＲＡをコードする配列及びＴＣＲＢをコードする配列のそれぞれに特異的な第１及び第２のオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットを使用して逆転写される。このオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットは更に、各個別のウェル内のｃＤＮＡ産物に、異なるオリゴヌクレオチドバーコード配列を導入する。もし仮説的に、単一の共通のクローン供給源を有するＴ細胞（例えば、同一のＴＣＲＡ／Ｂ配列を発現するＴ細胞）が１００ウェルのうち異なる５つのウェルに無作為に分注された場合、その配列データセットには５つの別個のインスタンスが含まれ、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ配列の固有のペアが、同一のバーコード配列を共有するＤＮＡ増幅産物中に生じる。換言すれば、５つの別個のウェルのそれぞれにおいて、オリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットが、同一の再構成ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ配列を有するｃＤＮＡの生成を促進するが、各ウェルのｃＤＮＡ産物は、異なる、ウェル固有のバーコード配列を含む。非限定的な理論により、確率論的根拠に基づいて、固有のＴＣＲＡ／ＴＣＲＢ配列ペアは同じＴ細胞クローンに由来し、同じクローンのメンバーが５つの異なるウェルに無作為に分注されたものである可能性が非常に高い。
【０１１５】
特定の実施形態により、単一のリンパ球系細胞内の適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチド配列をコードする再構成ＤＮＡ配列を決定するためのこの高スループットな方法の更に詳細な説明は、次の通りである：
【０１１６】
リンパ球系細胞を、密度勾配遠心分離（例えば、ＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ（登録商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ））、又は抗体コーティングされた磁気ビーズ（例えばＣＤ４５ビーズ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ））のいずれかを用いて、抗凝血処理された全血サンプルから単離する。あるいは、Ｔリンパ球を、ＣＤ３＋磁気ビーズに結合させることによって全血サンプルから精製し、Ｂリンパ球を、ＣＤ１９＋磁気ビーズに結合させることによって全血サンプルから精製することができる。単離された細胞集団は、次に、生存性を確認することができる。死細胞は、例えばＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｋｉｔを使用して、フィルターによりサンプルから除去することができる。用途に応じて、単離したリンパ球系細胞の生細胞（例えば、ソーティングされていない末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に存在し得るものとして、又は特定の細胞サブセットの調製物として）を、短期間細胞培養で培養することができ、更に特定の実施形態において、細胞は数多くの既知の活性化パラダイムの任意のものによって（例えば、サイトカイン、ケモカイン、特定の抗体、分裂促進因子、ポリクローナル活性化因子などのうち１つ以上に曝露させることによって）活性化させることができる。最終的な細胞サンプルは、この細胞を培地（例えば、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ）又は適切な等張緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）の中に再懸濁させ、細胞凝集を防止する薬剤（例えば、０．１％  ＢＳＡ、１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８）を添加することにより調製することができる。あるいは、全血又はＰＢＭＣを、ソーティングせずに利用することができる。最も一般的な場合として、Ｂ又はＴ細胞を含む水溶液中懸濁液として存在する任意の細胞セットを使用することができる。
【０１１７】
複数のリンパ球系細胞を含む細胞調製物は、複数の物理的に分かれたサブセットに分けられ、例えば、細胞を収容し得る複数の容器又はコンパートメントに、細胞懸濁液を分配することによって、リンパ球系細胞の亜集団をそれぞれ収容する複数の容器又はコンパートメントを取得し、各亜集団は１つのリンパ球系細胞又は複数のリンパ球系細胞を含み、かつ各容器又はコンパートメントは物理的に分かれていて、内容物は互いに流体連通していない。好ましくは、細胞は、各容器が実質的に等しい数の細胞を収容するように、複数の容器に分配又は分けられ、これにより、各容器内には同じ数の細胞を存在させることができ、あるいは、各容器内に存在する細胞の数を、他の容器内の細胞の数の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜３０、３１〜５０、５１〜７０、７１〜８０、又は８１〜１００パーセントとすることができる。代表的な容器は、例えば６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、又は１５３６ウェルのマルチウェルプレートなどのマルチウェル培養プレート又はアッセイプレート、又はその他のマルチウェルプレート形式のウェルであってよく、また、試験管アレイ、フィルター、微細化ウェルアレイ、レーザー生成マトリックス、又は、細胞を収容できるような任意の他の好適な容器も想到される。特定の代表的な実施形態において、細胞は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により複数の容器に分配することができる。所定の数の細胞を単離し、ソーティングし、ＦＡＣＳを使用してマルチウェル（例えば、９６、３８４又は１５３６）反応プレートに配置することができる。マルチウェルプレートに細胞の調製物のソーティングが可能なフローサイトメーターを使用して、任意の数の方法及び器具を採用することができる（例えば、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）ＩＩＩ、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＭｏＦｌｏ（商標）ＸＤＰなど）。ＦＡＣＳによって、抗体染色、バイアビリティ染色、又は特定の細胞染色試薬の多色組み合わせによって、特定の細胞サブセットを単離することが可能になる。細胞選別機を採用して、標的細胞を計数し、所定の数の細胞を採取マルチウェルプレートの各ウェルに配置することができる（１０〜２０％ＣＶ）。あるいは、好ましくは高密度マイクロウェルプレート（３８４、１５３６、３４５６ウェル）に均一な細胞懸濁液の非接触吐出が可能な自動化微量（ウェル当たり容量ｎＬ〜μＬ）ディスペンサー、例えばＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＢｉｏＲＡＰＴＲ  ＦＲＤ（商標）、ＬａｍｂｄａＪｅｔ（商標）ＩＩＩＭＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＣｙＢｉ（商標）Ｄｒｏｐ（Ｊｅｎａ  Ａｎａｌｙｔｉｋ）、Ｆｕｒｕｋａｗａ  Ｐｅｒｆｌｏｗ（商標）、又は類似の機器を使用して、高い精度及び再現性（１０〜２０％ＣＶ）で分取マルチプレートの各ウェルに、所定の数の細胞を配置することができる。
【０１１８】
適応性免疫受容体をコードするポリヌクレオチド配列を、次に、固有の、ウェル特異的なバーコードオリゴヌクレオチドを全サンプルに付着させた各ウェルから増幅させる。これを行う方法の１つは、逆転写工程中に、逆転写により細胞ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、次にオリゴヌクレオチドバーコードの形態の分子標識をこのｃＤＮＡ産物に付加するものである。ウェル内の各ヘテロダイマー適応性免疫受容体分子の両鎖、例えば、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ鎖、並びにＴＣＲＧ及びＴＣＲＤ鎖などをコードするｍＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡに、同じバーコードを追加することができる。この実施形態及び関連の実施形態において、抗原受容体をコードする配列は、ｍＲＮＡからの逆転写により生成されたｃＤＮＡから増幅され、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は増幅されない。これを行うために、マイクロウェルプレートの各ウェルには、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を含む培地、並びに、細胞内のＲＮＡを保護するため（例えばＱｉａｇｅｎ  ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、又は細胞を溶解させてＲＮＡを単離するため（Ｔｒｉｚｏｌ、グアニジウムイソシアネート−Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ（商標）など）設計された培地を、含めることができる。次に、抽出された全細胞ＲＮＡを、別のマルチウェルプレートに移して、ロボットによる液体操作を用いて逆転写反応させることができる。あるいは、ソーティングされた細胞を、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を含む逆転写反応混合物中に直接溶解させることができる。逆転写反応（ＲＴ）は、適切な緩衝液、ｄＮＴＰ、酵素（逆転写酵素）及びオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットを含む反応混合物に、細胞ＲＮＡを曝露させることによって、開始することができる。これらのプライマーは一般に、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｉｇκ、Ｉｇ  λ、ＴＣＲ  α、β、γ及びδ定常領域（Ｃ断片）遺伝子特異的オリゴヌクレオチド配列、並びに、ユニバーサル鋳型切り替えオリゴヌクレオチド（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｓｍａｒｔｅｒ（商標）ＵＡＩＩオリゴヌクレオチド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ））にアニーリングし得る複数のプライマーのサブセットを含む。例えば、Ｃ断片遺伝子特異性プライマー、又はＳｍａｒｔｅｒ（商標）ＵＡＩＩオリゴヌクレオチドのいずれか、又はこれら両方が、ＤＮＡバーコードで固有にタグ付加され、これは固有の配列の６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、．．．個の塩基対長である。ＲＴ反応プレートの各ウェルは、同じ複数のプライマーを含み、混合液中の各プライマーは同じＤＮＡバーコードでタグ付加されるが、各ウェル内では異なるバーコードが使用される。よって、逆転写反応が終了すると、所与のウェルの第１鎖のｃＤＮＡ分子は、同一のＤＮＡバーコード配列でバーコード付けされる。
【０１１９】
【表２】
2015519909.tif 000004
【０１２０】
したがって、複数の容器に細胞を分配する工程の後、この容器のそれぞれに、複数の容器中のリンパ球系細胞内のｍＲＮＡ逆転写を促進するのに十分な条件及び時間で、第１及び第２のオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットを接触させ、（Ａ）第１のオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットは、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの複数の第１のポリペプチドをコードする複数の第１のｍＲＮＡ配列を逆転写することができ、（Ｂ）第２のオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットは、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの複数の第２のポリペプチドをコードする複数の第２のｍＲＮＡ配列を逆転写することができ、かつ：（Ｉ）第１のオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットは、一般式：
Ｕ１／２−Ｂ１−Ｘ１
【０１２１】
の複数のオリゴヌクレオチド配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含む組成物を含み、式中、Ｕ１／２は、Ｂ１が存在するときに第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｂ１が存在しないときに第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドを含み、Ｂ１は存在せず、又は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の連続するヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、またＸ１は：（ａ）適応性免疫受容体ヘテロダイマー、又はその相補的配列の前記第１のポリペプチドに対する適応性免疫受容体可変（Ｖ）領域コーディング遺伝子配列の、２０、３０、４０又は５０個以上、１００、９０、８０、７０又は６０個以下の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、一般式Ｕ１／２−Ｂ１−Ｘ１の複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ１が固有のオリゴヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドと、（ｂ）（ｉ）適応性免疫受容体ヘテロダイマー、又はその相補的配列の前記第１のポリペプチドに対する適応性免疫受容体連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列、又は（ｉｉ）適応性免疫受容体ヘテロダイマー、又はその相補的配列の前記第１のポリペプチドに対する適応性免疫受容体定常（Ｃ）領域コーディング遺伝子配列のいずれかの、１５〜３０個又は３１〜５０個以上、８０、７０、６０又は５５個以下の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと、のうち一方であるオリゴヌクレオチドを含み、一般式Ｕ１／２−Ｂ１−Ｘ１の複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ１は固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、更に、（ＩＩ）第２のオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットは、一般式：
Ｕ３／４−Ｂ２−Ｘ２
【０１２２】
の複数のオリゴヌクレオチド配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含む組成物を含み、式中、Ｕ３／４は、Ｂ２が存在するときに第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｂ２が存在しないときに第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドを含み、Ｂ２は存在せず、又は、複数の容器のうち単に１つと接触する第１及び第２の逆転写プライマーセットそれぞれについて、Ｂ１と同じ、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の連続するヌクレオチドの第２のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、またＸ２は：（ａ）適応性免疫受容体ヘテロダイマー、又はその相補的配列の前記第２のポリペプチドに対する適応性免疫受容体可変（Ｖ）領域コーディング遺伝子配列の、２０、３０、４０又は５０個以上、１００、９０、８０、７０又は６０個以下の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、一般式Ｕ３／４−Ｂ２−Ｘ２の複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれにおいて、Ｘ２が固有のオリゴヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドと、（ｂ）（ｉ）適応性免疫受容体ヘテロダイマー、又はその相補的配列の前記第２のポリペプチドに対する適応性免疫受容体連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列、又は（ｉｉ）適応性免疫受容体ヘテロダイマー、又はその相補的配列の前記第２のポリペプチドに対する適応性免疫受容体定常（Ｃ）領域コーディング遺伝子配列のいずれかの、１５〜３０個又は３１〜５０個以上、８０、７０、６０又は５５個以下の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと、のうち一方であるオリゴヌクレオチドを含み、一般式Ｕ３／４−Ｂ２−Ｘ２、Ｘ２の配列の複数のオリゴヌクレオチド配列それぞれは固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、前記接触させる工程は、前記複数の容器の１つ以上のそれぞれに、少なくとも１つの第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチドバーコード配列、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドの少なくとも１つのＸ１オリゴヌクレオチドＶ領域コーディング遺伝子配列、少なくとも１つの第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、及び適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第１のポリペプチドのうち少なくとも１つのＸ１オリゴヌクレオチドＪ領域又はＣ領域コーディング遺伝子配列、を含む第１の逆転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）産物を取得するのに十分な条件及び時間で実施され、また、前記複数の容器のうち１つ以上のそれぞれで：少なくとも１つの第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチドバーコード配列、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドの少なくとも１つのＸ２オリゴヌクレオチドＶ領域コーディング遺伝子配列、少なくとも１つの第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、及び、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの前記第２のポリペプチドの少なくとも１つのＸ２オリゴヌクレオチドＪ領域又はＣ領域コーディング遺伝子配列を含む、第２逆転写されたｃＤＮＡ産物を取得するのに十分な条件及び時間で実施される。
【０１２３】
接触工程の後、複数の容器に由来する第１及び第２の逆転写されたｃＤＮＡ産物を合わせて、逆転写されたｃＤＮＡ産物の混合物を取得する工程が実施される。
【０１２４】
この合わせる工程の後、第１及び第２の逆転写されたｃＤＮＡ産物の混合物を、第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセット及び第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットと接触させ、第１の増幅プライマーセットは（ｉ）第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とをそれぞれ含む、複数の第１のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド、及び（ｉｉ）第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第２シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とをそれぞれ含む、複数の第２のシークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、を含み、かつ、第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットは（ｉ）第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドに対し特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第３のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第３シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とをそれぞれ含む、複数の第３シークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチド、及び（ｉｉ）第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド配列と、第４のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列の５’の位置に結合している第４シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列とをそれぞれ含む、複数の第４シークエンシングプラットフォームタグ含有オリゴヌクレオチドと、を含み、前記接触させる工程は、第１及び第２の逆転写されたｃＤＮＡ産物の両方を増幅するのに十分な条件及び時間で実施され、これによりシークエンシングのためのＤＮＡライブラリを取得する。
【０１２５】
シークエンシングのためのＤＮＡライブラリがそのように得られた後、これに続く工程において、ＤＮＡライブラリのシークエンシングが実施され、適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチド配列をコードする配列のデータセットが取得される。
【０１２６】
次に、配列のデータセットの分析を、主に本明細書の他の箇所で記述されているように実施して、単一の（すなわち同一の）リンパ球系細胞に由来する適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチドをコードする再構成ＤＮＡ配列が決定される。簡潔に言うと、この方法は更に、次の工程を含み得る：（ａ）データセット中で識別されるオリゴヌクレオチドバーコード配列に照らして配列のデータセットをソーティングすることにより、それぞれ固有のバーコードを有する複数のバーコード配列セットを取得する工程と、（ｂ）（ａ）の各バーコード配列セットをＸ１配列含有サブセット及びＸ２配列含有サブセットにソーティングする工程と；（ｃ）Ｘ１及びＸ２配列に照らしてＸ１及びＸ２配列含有サブセットのそれぞれの構成要素をクラスタリングして、それぞれ、１つ又は複数のＸ１配列クラスターセット及び１つ又は複数のＸ２配列クラスターセットを取得する工程と、１つ以上のいずれかの前記Ｘ１及びＸ２配列クラスターセット内の、単一ヌクレオチドバーコード配列のミスマッチをエラー修復する工程と；（ｄ）既知のＸ１及びＸ２配列に基づいて第１及び第２の適応性免疫受容体ヘテロダイマーポリペプチドをコードする配列それぞれを識別する工程を含み、各Ｘ１配列及び各Ｘ２配列は、１つ又は複数の固有のＢ配列に関連付けられ、各Ｂ配列関連Ｘ１配列及び各Ｂ配列関連Ｘ２配列が由来する容器を識別する工程と；（ｅ）共通の第１及び第２の適応性免疫受容体ヘテロダイマーポリペプチドをコードする配列とＢ配列が一致する確率に基づいて、（ｄ）のＢ配列関連Ｘ１及びＸ２配列を共通クローン源として組み合わせてマッチングする工程と、これにより、単一リンパ球系細胞に由来する適応性免疫受容体ヘテロダイマーの第１及び第２のポリペプチド配列をコードする再構成ＤＮＡ配列を決定する工程。
【０１２７】
したがって、要約すると、本明細書に開示される特定の実施形態において、例えば、ユニバーサルアダプタ配列を、ウェル固有のバーコードの外側の各ｃＤＮＡ分子の各末端に合成することによって、シークエンシングアダプタを、全ての逆転写／増幅されたＴＣＲ及び／又はＩＧコード断片のそれぞれの末端に付着させることができる。次にこのアダプタを、テーリングＰＣＲ反応において、各分子の上に合成することができる。そのような実施形態において、融合ＲＴプライマーが合成され、第１のｃＤＮＡ鎖合成に使用することができる。これらのプライマーは全て、同じ固有のＤＮＡバーコード、並びにユニバーサル（例えば、ｐＧＥＸ）プライミング部位を含む。逆転写により第１のｃＤＮＡ鎖合成が完了した後、全プレートウェルの内容物を定量的な方法で回収してプールし（例えばトラフ上で、上下を返し遠心分離によって）、精製した後、次世代配列分析システム（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））を用いた増幅及びシークエンシングに使用するための配列を組み込むよう設計された「テール」配列を含むユニバーサルアダプタプライマー（ｐＧＥＸ）と共に、ＰＣＲ用の複数のウェルに分ける。あるいは、シークエンシングプラットフォーム固有のアダプタを、タグ付加された分子の端に結合させることができる（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕｅＳｅｑ（商標）サンプル調製方法）。全てのウェルからの分子がプールされ、固有にタグ付加されたＢＣＲ又はＴＣＲ  ｄｓ−ｃＤＮＡ産物の高度に複雑なシークエンシングライブラリが生成される。この分子は全て、高スループットシークエンシングを用いてシークエンシングされる。
【０１２８】
シークエンシングプラットフォーム特異的アダプタに相補的であるユニバーサルシークエンシングプライマーを、望ましいように使用することができる。これにより、複数サンプルのサンプルインデクシングが可能になり、９６、３８４、１５３６ウェルなどの元のＲＴ反応ウェルに由来する、固有にタグ付加されたＩＧＨ／ＴＣＲ産物の各プールについて、サンプル固有のインデックスが使用される。あるいは、ユニバーサルＵＡＩＩ−フォワード／マルチプレックス化Ｖ、Ｊ又はＣリバースプライマーの混合物によるマルチプレックス化ＰＣＲを使用して、元の細胞転写物のバーコードを保存しつつ特定の標的フラグメントを増幅することができる。Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォーム（ＭｉＳｅｑ（商標））が使用される場合、２ｘ  ２５０ｂｐのペアドエンドシークエンシングが、ＢＣＲ／ＴＣＲ重鎖及び軽鎖（α／β；γ／δ）配列全体の大半をカバーし、これによって、各受容体ドメインのコード配列全体のリカバリーが可能になる。あるいは、リード長の延長されたシークエンシングプラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ  ４５４、Ｌｉｆｅ  Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、ＯＧＴなど）を使用して、一方向の単回シークエンシングリードで全ライブラリフラグメントを通して読み取ることができる。シークエンシングの後、複数のサンプルが同じシークエンシングレーンにあった場合は、各サンプルからのリードがマルチプレックス化解除される。マルチプレックス化解除は、ユニバーサルシークエンシングアダプタの一部として使用された複数のインデックスのうち１つに、シークエンシングリードを割り当てることによって、実施することができる。各サンプルのマルチプレックス化が解除されたシークエンスリードについて、全てのリードが、ウェル固有のバーコードによって分割され得る。固有のバーコードでの各リードセットを、別々にクラスター化して、ＰＣＲ及びシークエンシングのエラーを修正し、各バーコードについて固有の配列を決定することができる。
【０１２９】
バーコードによって、及びＴＣＲ又はＩＧ鎖によってそのようにソーティングされた配列には、更に、クラスタリングの既知の様々なアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＣｌｕｓｔ、ＵＣＬＵＳＴ、ＣＤ−ＨＩＴ）の任意のものを使用して、クラスター分析を行い、共有バーコード配列を有する他の配列とのクラスタリングはできないものの、代わりに、単一ヌクレオチドが異なるバーコードを有する配列とのクラスタリングはできるような配列の場合には、エラー修正を行うことができる。固有の配列は、既知の受容体配列との配列マッチングによって、ＩＧ重鎖又は軽鎖（κ又はλ）鎖、又はＴＣＲ（α又はβ；γ又はδ）鎖として識別することができる。したがって、各重鎖及び軽鎖配列は、元のサンプルウェル位置に対応するバーコードのリストに関連付けることができる。このデータは次に、配列により並べ替えることができる。固有の配列それぞれに関連付けられるのは、マルチウェルプレートのウェル固有のバーコードセットで、このセットの中に配列が見出される。あらゆるＢ又はＴ細胞クローンについて、重鎖及び軽鎖配列は、クローンの１つ以上のコピーが存在する全てのウェルに由来するバーコードと関連付けることができる。次に組み合わせ論を使用して、同じクローン由来の重鎖及び軽鎖をマッチングすることができる。例えば、９６ウェルプレートにおいて、特定の重鎖及び軽鎖配列が両方とも同じ１２個のバーコードに関連付けられている場合、この２つの配列が９６個のうち正確に同じ１２個のバーコードを無作為に有する確率がごくわずかである限りにおいて、この特定の重鎖及び軽鎖のペアは、同じクローンに由来するものであると推定することができる。
【０１３０】
例示的アルゴリズム：非限定的な理論に従い、同じバーコード配列セットと共に生じる第１及び第２の適応性免疫受容体鎖をコードする配列は、同じプレートウェルに由来している可能性が非常に高く、よって同じ供給源細胞に由来している可能性が非常に高いことが理解されよう。例えば、第１及び第２のオリゴヌクレオチド逆転写プライマーセットの構成体において１０３個の異なるバーコードが使用される場合、各プレート当たり１個の細胞がソーティングされているとき、２つの独立する（すなわち、異なる細胞に由来する）二本鎖ｃＤＮＡの第１及び第２産物が同じバーコード配列を有して取得される確率は、１０６分の１である。
【０１３１】
ゆえに、本明細書に記述される方法に従って、第１及び第２の適応性免疫受容体ポリペプチドをコードする配列（例えば、Ｘ１及びＸ２）の所与のセットの３つ以上のコピーが共通のバーコード配列（例えば、同じバーコード配列セットに属するもの）を共有している場合、それらの配列が独立した細胞供給源に由来しているという確率はゼロに近い。
【０１３２】
特定の実施形態において、バーコードオリゴヌクレオチドＢ（Ｂ１、Ｂ２）は所望により、第１及び第２のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含んでもよく、第１のバーコード配列は、特定のＶオリゴヌクレオチド配列を固有に識別するよう選択され、第２のバーコード配列は、特定のＪオリゴヌクレオチド配列を固有に識別するよう選択される。バーコードオリゴヌクレオチドＢ１及びＢ２と、ユニバーサルアダプタ（Ｕ）の相対的な配置によって、自動化ＤＮＡシークエンサー（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（商標）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳＥＱ（登録商標）又はＧｅｎｅＡｎａｌｙｚｅｒ（商標）−２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）による短い配列リードと、ペアエンドシークエンシングによる、所与の固有の鋳型オリゴヌクレオチドの増幅産物の迅速な識別及び定量を有利に行うことができる。とりわけ、これら及び関連する実施形態によって、増幅産物中に存在するＶ及びＪ配列の特定の組み合わせを迅速に高スループットで決定することができ、それによって、例えば再構成されたＴＣＲ又はＢＣＲをコードするＤＮＡを含むサンプルなどの、サンプル中に存在し得るＶ特異的プライマー及びＪ特異的プライマーの各組み合わせについて、標的をアニーリングする相対的な表現を特性付けることができる。増幅産物の識別及び／又は量の検証は、より長い配列リードにより達成され得る。
【０１３３】
ＴＣＲ及びＩｇ遺伝子座の非再構成ゲノムＤＮＡ配列、及びこのような遺伝子座にて生産的に再構成されたＤＮＡ配列とそれらのコードされた産物を含む、多数の適応性免疫受容体可変（Ｖ）領域と連結（Ｊ）領域遺伝子配列が、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列として既知である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１３／２１７，１２６号、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１２／７９４，５０７号、国際出願ＵＳ２０１１／０２６３７３号、及び国際出願ＵＳ２０１１／０４９０１２号を参照のこと。本開示の組成物及び方法に含まれるオリゴヌクレオチドの設計及び生産のために、これら及び他の当該技術分野で周知の配列を本開示に従って使用することができる。
【０１３４】
Ｖ領域特異的オリゴヌクレオチドには、適応性免疫受容体（例えば、ＴＣＲ又はＢＣＲ）可変（Ｖ）領域の遺伝子配列、又はその相補的配列の、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００又は４５０個以上、１０００、９００、８００、７００、６００又は５００個以下の連続するヌクレオチドのポリヌクレオチド配列が含まれ、複数のオリゴヌクレオチド配列Ｖは、固有のオリゴヌクレオチド配列を含む。ヒト及び他の種のＴＣＲ及びＢＣＲ  Ｖ領域遺伝子のゲノム配列は既知であり、Ｇｅｎｂａｎｋのような公的データベースから利用可能であり、Ｖ領域遺伝子配列は、発現され、再構成されたＴＣＲ及びＢＣＲ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含み、またＶ領域遺伝子座において同定されている疑似遺伝子のポリヌクレオチド配列を含む。本明細書で開示されたオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る多種多様なＶポリヌクレオチド配列は、長さ、ヌクレオチド組成（例えば、ＧＣ含量）及び実際の直鎖ポリヌクレオチド配列において、非常に多様であり、例えば、特定の配列多様性を示す「ホットスポット」又は超可変領域を含むことが知られている。
【０１３５】
よって、ポリヌクレオチドＶは、ＴＣＲ又はＢＣＲ遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーセットのメンバーが特異的にアニールする配列を含み得る。複数のＴＣＲ又はＢＣＲをコードする再構成されたＤＮＡを増幅可能なプライマーセットが、例えばＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１３／２１７，１２６号、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１２／７９４，５０７号、国際出願ＵＳ２０１１／０２６３７３号又は国際出願ＵＳ２０１１／０４９０１２号等に記述されており、又は本明細書で記述されるように、特定のＴＣＲ又はＢＣＲ遺伝子座（例えば、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＫ又はＩＧＬ）における各固有のＶ遺伝子、又は各Ｊ遺伝子と特異的にハイブリッド形成可能なオリゴヌクレオチド配列を含むように設計されてもよい。例えば、例示の目的であり、限定するものではないが、１つ又は複数のＴＣＲ又はＢＣＲをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマー増幅セットのオリゴヌクレオチドプライマーは典型的に、１５、１６、１７、１８、１９、２０，２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個の連続するヌクレオチド、又はそれ以上のヌクレオチド配列を含んでもよく、本明細書で提供したように、Ｖ又はＪポリヌクレオチドの１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個の連続するヌクレオチドの相補配列に特異的にアニールしてもよい。特定の実施形態において、プライマーは、少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のヌクレオチドを含んでもよく、特定の実施形態において、プライマーは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個以下の連続するヌクレオチドの配列を含んでもよい。プライマーと、他の長さのプライアーアニール部位がまた、本明細書で開示したように、明示的に想到される。
【０１３６】
したがって、Ｖポリヌクレオチドは特定の実施形態において、その開始コドンからそのＣＤＲ３コード領域までの典型的なＶ遺伝子の長さより短いか、同一か、又は同様な長さを有するヌクレオチド配列を含み得るものであり、ＣＤＲ３領域をコードしているヌクレオチド配列を含んでもよいが、必須ではない。特定の好ましい実施形態において、Ｖポリヌクレオチドは、ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列又はその相補的配列の全て又は一部分を含み、ＣＤＲ３配列の長さはかなり多様であってよく、いくつかの異なる番号付けスキームによって特徴づけられている（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ、１９９９  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ７：１３２；Ｋａｂａｔら、１９９１  Ｉｎ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、１９９７  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７；例えば、Ｒｏｃｋら、１９９４  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：３２３；Ｓａａｄａら、２００７  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８５：３２３も参照）。
【０１３７】
簡潔に言えば、ＣＤＲ３領域は典型的には、Ｖ断片中の（トリヌクレオチドコドンＴＧＹによってコードされた、Ｙ＝Ｔ又はＣ）高度に保存されたシステイン残基から、ＴＣＲのＪ断片中の（ＴＴＹによってコードされた）高度に保存されたフェニルアラニン残基まで、又はＩＧＨ中の（ＴＧＧによってコードされた）高度に保存されたトリプトファンまで伸長しているポリペプチド部分に及ぶ。ＴＣＲＢ遺伝子座中の天然の生産的再構成の９０％超は、本基準による２４〜５４ヌクレオチドのＣＤＲ３コード長を有し、これは、アミノ酸が９〜１７個コードされていることに相当する。上述したＣＤＲ３コード領域のナンバリング方法は、保存されているシステイン、フェニルアラニン及びトリプトファンコドンの位置を示し、これらのナンバリング方法はまた、これらの保存されたアミノ酸をコードしている１つ以上のコドンが、異なるアミノ酸をコードしているコドンと置換され得る疑似遺伝子にも適用されてもよい。これらの保存されたアミノ酸を使用しない疑似遺伝子に関し、ＣＤＲ３長は、保存された残基が、以上で引用した確立されたＣＤＲ３配列位置ナンバリング方法の１つに従って、置換を有しないと観察された対応する位置に対して定義されてもよい。
【０１３８】
ポリヌクレオチドＪは、適応性免疫受容体連結（Ｊ）領域コーディング遺伝子配列の１５〜３０、３１〜５０、５１〜６０、６１〜９０、９１〜１２０、又は１２０〜１５０個以上、６００、５００、４００、３００又は２００個以下の連続するヌクレオチド、又はその相補的配列を含むポリヌクレオチドを含み得るものであり、複数のオリゴヌクレオチド配列のそれぞれにおいて、Ｊは固有のオリゴヌクレオチド配列を含む。ポリヌクレオチドＪ（又はその相補的配列）は、ＴＣＲ又はＢＣＲ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーセットのメンバーが特異的にアニール可能な配列を含む。複数のＴＣＲ又はＢＣＲをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なプライマーセットは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１３／２１７，１２６号、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１２／７９４，５０７号、国際出願ＵＳ２０１１／０２６３７３号又は国際出願ＵＳ２０１１／０４９０１２号等に記述されており、また本明細書で記述されるように、特定のＴＣＲ又はＢＣＲ遺伝子座（例えば、ＴＣＲ  α、β、γ又はδ、又はＩｇＨ  μ、γ、δ、α又はε、又はＩｇＬ  κ又はλ）における各固有のＶ遺伝子と、又は各固有のＪ遺伝子と特異的にハイブリッド形成可能なオリゴヌクレオチド配列を含むように設計され得る。
【０１３９】
特定の実施形態において、本明細書に記述されるプライマー組成物中に存在する複数のＪポリヌクレオチドが、既知の天然のＪ遺伝子ヌクレオチド配列の全体長さをシミュレートする長さを有していることが望ましいことがある。本明細書で記述した鋳型におけるＪ領域長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０パーセント以下だけ、天然のＪ遺伝子配列の長さと異なってもよい。したがって、Ｊポリヌクレオチドは、特定の実施形態において、典型的な天然のＪ遺伝子の長さと同一か、又は同様である長さを有するヌクレオチド配列を含み、以上で議論したように、ＣＤＲ３領域をコードしているヌクレオチド配列を含んでもよいが、必須ではない。
【０１４０】
ヒト及び他の種のＴＣＲ及びＢＣＲ  Ｊ領域遺伝子に対するゲノム配列は既知であり、Ｇｅｎｂａｎｋのような公的データベースから利用可能であり、Ｊ領域遺伝子配列は、発現及び未発現の再構成されたＴＣＲ及びＢＣＲ遺伝子の産物をコードするポリヌクレオチド配列を含む。本明細書で開示したプライマーに組み込まれ得る多種多様なＪポリヌクレオチド配列は、ヌクレオチド組成（例えば、ＧＣ含量）、及び実際の直鎖ポリヌクレオチド配列において非常に多様になり得る。
【０１４１】
本明細書で記述したＶ断片及びＪ断片のオリゴヌクレオチドプライマーの構築における使用のための、本明細書で記述したＶ及びＪ配列の代案は、各ＴＣＲ及びＩｇサブユニットの遺伝子のＶ及びＪコード領域に対し公開された遺伝子配列に関し、当該技術分野における知識を用い、本開示に基づき当業者により選択され得る。ヒト適応性免疫受容体配列の参照Ｇｅｎｂａｎｋ登録としては、ＴＣＲα：（ＴＣＲＡ／Ｄ）：ＮＣ＿００００１４．８（ｃｈｒ１４：２２０９００５７．．２３０２１０７５）、ＴＣＲβ：（ＴＣＲＢ）：ＮＣ＿０００００７．１３（ｃｈｒ７：１４１９９８８５１．．１４２５１０９７２）、ＴＣＲγ：（ＴＣＲＧ）：ＮＣ＿０００００７．１３（ｃｈｒ７：３８２７９６２５．．３８４０７６５６）、免疫グロブリン重鎖、ＩｇＨ（ＩＧＨ）：ＮＣ＿００００１４．８（ｃｈｒ１４：１０６０３２６１４．．１０７２８８０５１）、免疫グロブリン軽鎖−κ、ＩｇＬκ（ＩＧＫ）：ＮＣ＿０００００２．１１（ｃｈｒ２：８９１５６８７４．．９０２７４２３５）、及び免疫グロブリン軽鎖−λ、ＩｇＬλ（ＩＧＬ）：ＮＣ＿００００２２．１０（ｃｈｒ２２：２２３８０４７４．．２３２６５０８５）が挙げられる。マウス適応性免疫受容体の遺伝子座配列の参照Ｇｅｎｂａｎｋ登録としては、ＴＣＲβ：（ＴＣＲＢ）：ＮＣ＿００００７２．５（ｃｈｒ６：４０８４１２９５．．４１５０８３７０）、及び免疫グロブリン重鎖、ＩｇＨ（ＩＧＨ）：ＮＣ＿００００７８．５（ｃｈｒ１２：１１４４９６９７９．．１１７２４８１６５）が挙げられる。
【０１４２】
プライマー設計解析及び標的部位選別の検討は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー解析ソフトウェア及び／又はＢＬＡＳＴＮ  ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，２５（１７）：３３８９〜４０２）、又は本技術分野で利用可能な他の同様のプログラムを用いて実施可能である。
【０１４３】
したがって、本開示に基づいて、かつこれらの既知の適応性免疫受容体の遺伝子配列及びオリゴヌクレオチド設計法を考慮して、当業者は、本オリゴヌクレオチドに包含させるために、それぞれ所与のＶ及びＪ遺伝子に固有であるオリゴヌクレオチド配列をそれぞれ独立して含有する、複数のＶ領域特異的、及びＪ領域特異的ポリヌクレオチド配列を設計可能である。同様に、本開示から、かつ既知の適応性免疫受容体の配列を考慮して、当業者はまた、それぞれ所与のＶ及びＪ遺伝子に固有である、特定の配列にそれぞれ独立してアニール可能である複数のＶ領域特異的及びＪ領域特異的オリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーセットを設計可能でもあり、それによって複数のプライマーが、所与の適応性免疫受容体をコードする遺伝子座（例えば、ヒトＴＣＲ又はＩＧＨ遺伝子座）中の実質的に全てのＶ遺伝子と実質的に全てのＪ遺伝子を増幅可能である。このようなプライマーセットによって、（例えば、複数のフォワード及びリバースプライマー対を用いて）マルチプレックス化されたＰＣＲにおいて、再構成されたＶ領域をコードする遺伝子断片によってコードされた第１の末端と、Ｊ領域をコードする遺伝子断片によってコードされた第２の末端とを有する増幅産物を生成することができる。
【０１４４】
典型的に、特定の実施形態において、このような増幅産物はＣＤＲ３コード配列を含み得るものの、本発明はそのように限定されることを意図するものではなく、ＣＤＲ３コード配列を含まない増幅産物が想到される。プライマーは好ましくは、Ｖ及びＪ配列の十分な部分を有する増幅産物と、本明細書に記述される特定の好ましい実施形態においてはバーコード（Ｂ）配列をも産するように設計することができ、産物（アンプリコン）のシークエンシングにより、Ｖ遺伝子が再構成を受け、再構成された適応性免疫受容体をコードする遺伝子を産する近位における、各遺伝子断片の（ｉ）特定のＶ遺伝子、及び（ｉｉ）特定のＪ遺伝子に固有である配列に基づく識別が可能である。典型的に、好ましい実施形態において、ＰＣＲ増幅産物は大きさにして６００塩基対未満であり、これは非限定理論にしたがって、非再構成された適応性免疫受容体遺伝子からの増幅産物を除外するであろう。特定の他の好ましい実施形態において、増幅産物は、短い配列リードによって、配列の異なるアンプリコンの、迅速で高スループットな定量を有利に提供し得るように、大きさにおいて、５００、４００、３００、２５０、２００、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０又は２０塩基対未満とすることができる。
【０１４５】
プライマー
本開示にしたがって、オリゴヌクレオチドプライマーが、複数のＶ断片プライマーと、複数のＪ断片プライマーと、を含むオリゴヌクレオチドプライマーセットにおいて提供され、プライマーセットは、リンパ球系細胞のＤＮＡを含む生体サンプルの適応性免疫受容体をコードしている、再構成されたＤＮＡを増幅可能である。好適なプライマーセットは、当該技術分野で周知であり、また本明細書に開示されており、例えば、ＵＳ２０１２／００５８９０２号、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．第１３／２１７，１２６号；Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．第１２／７９４，５０７号；ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２６３７３号；又はＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４９０１２号；又は同様物；又は表１に示すプライマーセットである。特定の実施形態において、プライマーセットは、サンプル中（疑似遺伝子を含む）各固有のＶ領域遺伝子の、固有のＶ領域配列に特異的にアニール可能な少なくとも１つのプライマーと、サンプル中各固有のＪ領域遺伝子の、固有のＪ領域配列に特異的にアニール可能な少なくとも１つのプライマーを含む、複数のＶ配列特異的プライマーを含むように設計される。
【０１４６】
プライマーの設計は、既知のＴＣＲ及びＢＣＲゲノム配列の観点で、常用の方法論によって達成されてもよい。したがって、プライマーセットは好ましくは、ＴＣＲ又はＢＣＲ遺伝子座におけるＤＮＡ再構成の結果として得られ得る全てのＶ−Ｊの組み合わせを増幅可能である。下記に述べるように、特定の実施形態では、１つ以上のＶプライマーが、２つ以上のＶ領域によって共有され得るが全てのＶ領域に共通なわけではない「固有の」配列に対して特異的にアニール可能であり得るか、及び／又は、１つ以上のＪプライマーが、２つ以上のＪ領域によって共有され得るが全てのＪ領域に共通なわけではない「固有の」配列に対して特異的にアニール可能であり得るような、プライマーセットが想到される。
【０１４７】
特定の実施形態において、本明細書に記述される組成物及び方法に使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、標的Ｖ断片又はＪ断片の１５個ヌクレオチド長の連続配列（すなわち、Ｖ領域又はＪ領域ポリペプチドをコードするゲノムポリヌクレオチドの一部）と同じ配列、又は相補的配列を有する、少なくとも約１５個ヌクレオチド長の核酸を含むかこれから構成される。より長いプライマー、例えば、標的Ｖ又はＪ領域をコードするポリヌクレオチド断片の連続配列と同一の配列、又は相補的な配列を有する約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５又は５０ヌクレオチド長のプライマーがまた、特定の実施形態において利用されるであろう。本明細書で記述されたオリゴヌクレオチドプライマーの全ての中程度の長さが、本明細書で使用のために想到される。当業者に認識され得るように、プライマーには、制限酵素認識部位、配列決定のためのアダプタ配列、バーコード配列等のような、追加配列（例えば、標的Ｖ又はＪ領域コードポリヌクレオチド断片と同一でないか、又は相補的でなくてよいヌクレオチド）を追加してもよい（例えば、表で提供されるプライマー配列及び本明細書で掲載される配列を参照のこと）。したがって、プライマーの長さは、特定の利用又は必要性に応じて、長さにして約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、８０、８５、９０、９５、１００ヌクレオチド以上より長くてもよい。
【０１４８】
特定の実施形態における利用のために、配列表にて示されるものを含む、ヌクレオチド配列が本明細書で提示されるオリゴヌクレオチドプラマーに対して、高度な配列同一性を共有し得る、適応性免疫受容体のＶ断片又はＪ断片のオリゴヌクレオチドプライマー変異体も想到される。したがって、これらの関連する実施形態において、適応性免疫受容体のＶ断片又はＪ断片のオリゴヌクレオチドプライマー変異体は、本明細書で開示された適応性免疫受容体のＶ断片又はＪ断片のオリゴヌクレオチドプライマー配列に実質的に同一性を有してもよく、このようなオリゴヌクレオチドプライマー変異体は、例えば、本明細書で記述した方法（例えば、標準パラメータを用いたＢＬＡＳＴ解析）を用い、本明細書にて開示したオリゴヌクレオチドプライマー配列のような参照ポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を含み得る。当業者は、コドンの縮重、及び読み枠の位置等を考慮し、これらの値を適切に調節して、これに対応する、オリゴヌクレオチドプライマー変異体が適応性免疫受容体セグメントをコードするポリヌクレオチドにアニールする能力を決定可能であることを認識するであろう。
【０１４９】
典型的に、オリゴヌクレオチドプライマー変異体は１つ以上の置換、付加、欠損及び／又は挿入を含有し、好ましくは、変異体オリゴヌクレオチドのアニーリング能力は、本明細書で具体的に示されている適応性免疫受容体のＶ断片又はＪ断片のオリゴヌクレオチドプライマー配列の能力に対して、実質的に劣らないであろう。
【０１５０】
表２は、対象のリンパ球系細胞由来のＤＮＡを含む生体サンプル中のＴＣＲβ−鎖（ＴＣＲＢ）をコードしている生産的に再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットを、非限定例として示す。本プライマーセットにおいて、Ｊ断片プライマーは、実質的な配列相同性を共有し、したがって、１つ以上の標的Ｊポリヌクレオチド配列の間でクロスプライムしてもよいが、Ｖ断片プライマーは、ＶのＣＤＲ２領域内の標的配列に特異的にアニールするように設計され、したがって、各Ｖ断片に固有である。しかしながら、密接に関連した標的遺伝子のファミリー内配列が同一である数個のＶプライマーの場合、例外が存在する（例えば、Ｖ６−２及びＶ６−３は、Ｖ断片のコード配列を通してヌクレオチドレベルで同一であり、したがって、単一プライマー、ＴＲＢ２Ｖ６−２／３を有してもよい）。
【０１５１】
【表３−１】
2015519909.tif 000005
【０１５２】
【表３−２】
2015519909.tif 000006
【０１５３】
【表３−３】
2015519909.tif 000007
【０１５４】
特定の好ましい実施形態において、本明細書で記述したようなＶ断片及びＪ断片のオリゴヌクレオチドプライマーは、再構成された適応性免疫受容体遺伝子座（例えば、Ｖ遺伝子組換えシグナル配列（ＲＳＳ）の配列上流の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の塩基対、好ましくはＶ遺伝子組換えシグナル配列（ＲＳＳ）の配列上流の少なくとも約２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０の塩基対、及び特定の好ましい実施形態において、Ｖ遺伝子組換えシグナル配列（ＲＳＳ）の配列上流の４０超の塩基対、及びＪ遺伝子ＲＳＳの下流の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の塩基対、好ましくはＪ遺伝子ＲＳＳの下流の少なくとも約２２、２４、２６、２８又は３０の塩基対、及び特定の好ましい実施形態において、Ｊ遺伝子ＲＳＳの下流の３０超の塩基対）において増幅産物を生じさせる、特定のＶ遺伝子と特定のＪ遺伝子の両方を固有に識別するために、適切な情報が、再構成された適応性免疫受容体（ＴＣＲ又はＩｇ）の増幅産物の配列内に存在するように、ヌクレオチド配列を含むように設計される。
【０１５５】
この特徴は、単にＶ及びＪ断片に対する適切な大きさの産物の有無の検出のために増幅反応に主として依存する、ＴＣＲコード又はＩｇコード遺伝子配列の増幅に関して、本技術分野で記述されたオリゴヌクレオチドプライマーとは対立する（例えば、特定の大きさのアンプリコンのＰＣＲ反応産物中の存在が、Ｖ又はＪ断片の存在を示すが、増幅されたＰＣＲ産物の配列を提供できず、したがって、スペクトラタイピングでは一般的である通り、その同一性を確認することができない）。
【０１５６】
オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）は、任意の好適な方法によって調製することができ、これには例えば、Ｎａｒａｎｇら、１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０〜９９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら、１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９〜１５１のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９８１、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９〜１８６２のジエチルホスホロアミダート法；及び、米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持法などの方法による直接化学合成が挙げられ、これらはそれぞれ参照により本明細書に援用される。オリゴヌクレオチド及び修飾ヌクレオチド複合体の合成方法の概説が、参照により本明細書に援用されている、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，１９９０，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １（３）：１６５〜１８７にて提供される。
【０１５７】
本明細書で使用する場合、用語「プライマー」は、好適な条件下で、ＤＮＡ合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを意味する。
【０１５８】
このような条件には、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が、適切な緩衝液中、好適な温度にて、４つの異なるヌクレオシド三リン酸と伸長のための薬剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下で誘導されるものが含まれる。
【０１５９】
プライマーは好ましくは一本鎖ＤＮＡである。プライマーの適切な長さは、プライマーに意図される利用によって異なるが、典型的には６〜５０ヌクレオチド、又は特定の実施形態において、１５〜３５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子の場合、一般的に、十分に安定的なハイブリッド複合体を鋳型と形成させるためには、より低温であることが要求される。プライマーには、鋳型核酸の実際の配列を反映させる必要はないが、鋳型にハイブリッド形成するために十分相補的でなければならない。所与の標的配列の増幅のために好適なプライマーの設計は、本技術分野で既知であり、本明細書で引用した文献に記述されている。
【０１６０】
本明細書で記述したように、プライマーには、プライマーの検出又は固定化を可能にする更なる特徴を組み込むことができるが、ＤＮＡ合成の開始点として作用するという、プライマーの基本的特性は変わらない。例えば、プライマーには、標的核酸とハイブリッド形成するのではなく、増幅産物のクローニング、検出又はシークエンシングを促進させる更なる核酸配列を５’末端に含有させてもよい。本明細書では、ハイブリッド形成させるために鋳型に対して十分に相補的なプライマーの領域を、ハイブリッド形成領域と呼ぶ。
【０１６１】
本明細書で使用する際、プライマーは、十分に厳しい条件下での増幅反応において使用した場合に、プライマーが、主に標的核酸とハイブリッド形成するときに、標的配列に「特異的」である。典型的に、プライマーは、プライマーと標的からなる二本鎖の安定性が、プライマーと、サンプル中に見られる任意の他の配列との間に形成される二本鎖の安定性より大きい場合に、標的配列に対して特異的である。塩条件並びにプライマーの塩基組成、ミスマッチの位置のような種々の因子が、プライマーの特異性に影響を与えること、並びに多くの場合、プライマーの特異性は、所定の実験により確認する必要があることを、当業者は認識するであろう。プライマーが標的配列とのみ安定的な二本鎖を形成し得る、ハイブリッド形成条件が選択可能である。したがって、好適な厳しい増幅条件下における標的特異的プライマーの利用によって、標的プライマー結合部位を含有するそれらの標的配列を選択的に増幅することができる。
【０１６２】
特定の実施形態において、本明細書で記述した方法で利用されるプライマーは、標的Ｖ又はＪ断片の１５ヌクレオチド長の連続配列と同一の配列、又は相補的な配列を有する、少なくとも約１５ヌクレオチド長の核酸を含むか、又はそれからなる。より長いプライマー、例えば、標的Ｖ又はＪ断片の連続配列と同一の配列、又は相補的な配列を有する、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５又は５０ヌクレオチド長のプライマーがまた、特定の実施形態において利用されるであろう。上記プライマーの全ての中程度の長さが、本明細書で使用されるために想到される。当業者に認識され得るように、プライマーには、制限酵素認識部位、配列決定のためのアダプタ配列、及びバーコード配列等のような、追加配列（例えば、標的Ｖ及びＪ断片と同一でないか、又は相補的ではなくてよいヌクレオチド）を追加してもよい（例えば、本明細書及び配列表で提供されたプライマー配列を参照のこと）。したがって、プライマーの長さは、特定の使用又は必要性に応じて、長さにして５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、７５ヌクレオチド以上のように、より長くてもよい。例えば、１つの実施形態において、フォワード及びリバースプライマーは両方とも、ＤＮＡシークエンサーと適合する、ユニバーサルフォワードプライマー配列で、５’末端で修飾される。
【０１６３】
特定の実施形態における利用のために、配列表にて示されるものを含む、ヌクレオチド配列が本明細書で提示されるオリゴヌクレオチドプラマーに対して、高度な配列同一性を共有し得る、適応性免疫受容体のＶ断片又はＪ断片のオリゴヌクレオチドプライマー変異体も想到される。したがって、これらの関連する実施形態において、適応性免疫受容体のＶ断片又はＪ断片のオリゴヌクレオチドプライマー変異体は、本明細書で開示された適応性免疫受容体のＶ断片又はＪ断片のオリゴヌクレオチドプライマー配列に実質的に同一性を有してもよく、例えば、このようなオリゴヌクレオチドプライマー変異体は、本明細書で記述した方法（例えば、標準パラメータを用いたＢＬＡＳＴ解析）を用い、本明細書にて開示したオリゴヌクレオチドプライマー配列のような参照ポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を含み得る。当業者は、コドンの縮重、及び読み枠の位置等を考慮し、これらの値を適切に調節して、これに対応する、オリゴヌクレオチドプライマー変異体が適応性免疫受容体セグメントをコードするポリヌクレオチドにアニールする能力を決定可能であることを認識するであろう。
【０１６４】
典型的に、オリゴヌクレオチドプライマー変異体は１つ以上の置換、付加、欠損及び／又は挿入を含有し、好ましくは、変異体オリゴヌクレオチドのアニーリング能力は、本明細書で具体的に示されている適応性免疫受容体のＶ断片又はＪ断片のオリゴヌクレオチドプライマー配列の能力に対して、実質的に劣らないであろう。本明細書の他の場所でまた言及されるように、好ましい実施形態において、適応性免疫受容体のＶ断片及びＪ断片のオリゴヌクレオチドプライマーは、ＣＤＲ３に対するコード領域を含む、再構成されたＴＣＲ又はＩＧＨ配列を増幅可能であるように設計される。
【０１６５】
本明細書で想到される特定の実施形態にしたがって、本開示のマルチプレックスＰＣＲ法で使用されるプライマーは、非Ｔ又はＢ細胞配列の非特異的プライミングを防止するために、機能的にブロックされてもよい。例えば、プライマーは、米国特許出願公開第２０１０／０１６７３５３号にて記述されたように、化学修飾でブロックされてもよい。特定の本明細書で開示された実施形態にしたがって、本マルチプレックスＰＣＲ反応でのこのようなブロックされたプライマーの利用には、ＤＮＡ複製（すなわち、プライマー伸長）がブロックされる不活性配座（inactive configuration）と、ＤＮＡ複製が進行する活性配座（activated configuration）とを有してもよいプライマーが関与する。プライマーの不活性配座は、プライマーが一本鎖である場合、あるいはプライマーが対象の標的ＤＮＡ配列に対し特異的にハイブリッド形成するものの、プライマーの３’末端又はその周辺に結合している化学部位によってプライマー伸長がブロックされたままである場合に存在する。
【０１６６】
プライマーの活性化配座は、プライマーが対象の標的核酸配列にハイブリッド形成し、続いてＲＮａｓｅ  Ｈ又は他の切断試薬による作用を受けて３’ブロッキング基が除去されたときに存在し、これにより、増幅反応中の、酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によるプライマー伸長の触媒が可能になる。理論に束縛されるものではないが、このようなプライマーのハイブリッド形成の速度則は、二次反応に近く、したがって、混合物中のＴ細胞又はＢ細胞遺伝子配列の濃度の関数となると考えられる。ブロックされたプライマーでは、標的とハイブリッド形成させ、続いて切断した後にプライマー伸長を進行させる必要があることから、非特異的反応が最小化される。プライマーが、所望の標的配列と関連するが、塩基対のミスマッチとなる１つ以上の非相補的ヌクレオチドを有する点で異なる配列と不正確にハイブリッド形成する場合、プライマーの切断は、特に切断部位又はその周辺にミスマッチが存在する場合に阻害される。増幅の忠実度を改善するための本戦略は、このような場所における誤ったプライミングの頻度を減少させ、反応の特異性を増加させる。当業者によって認識され得るように、反応条件、とりわけＲＮａｓｅ  Ｈの濃度、及び各サイクル中にハイブリッド形成及び伸長させる時間は、その真の標的配列と正しくハイブリッド形成するときの、プライマーの非常に効率的な切断と、プライマーと不正確にアニールし得る鋳型配列との間でミスマッチが存在するときの、プライマーの切断の乏しさとの間における切断効率の差を最大化するように最適化することができる。
【０１６７】
米国特許第２０１０／０１６７３５３号に記述されるように、伸長を防止するために、オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の３’末端に、又はその近くに配置可能な多数のブロッキング基が本技術分野で既知である。プライマー又は他のオリゴヌクレオチドは、例えば、３’デオキシリボヌクレオチド残基（例えば、コルジセピン）、２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチド残基、非ヌクレオチドの連結又はアルカンジオール修飾（米国特許第５，５５４，５１６号）の付加によって、ＤＮＡ合成の開始を予防、又は阻害するために、３’末端ヌクレオチドにて修飾されてもよい。プライマー伸長を阻害、又はブロックするために使用され得るアルカンジオール修飾はまた、Ｗｉｌｋら、（１９９０  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（８）：２０６５）及びＡｒｎｏｌｄら、（米国特許第６，０３１，０９１号）によって記述されてきた。好適なブロッキング基の更なる例としては、３’ヒドロキシル置換基（例えば、３’−リン酸塩、３’−三リン酸塩又は３−ヒドロキシプロピルのようなアルコールを有する３’−リン酸ジエステル）、２’，３’−環状リン酸塩、末端ＲＮＡ塩基の２’ヒドロキシル置換基（例えば、リン酸塩又はトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）又はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）等の立体的に嵩高な基）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの３’末端にて置換されたＴＩＰＳ及びＴＢＤＭＳのような２’−アルキルシリル基が、参照により本明細書に援用される、Ｌａｉｋｈｔｅｒら、米国特許出願第１１／６８６，８９４号によって記述されている。嵩高な置換基がまた、プライマー伸長をブロックするために、オリゴヌクレオチドの３’−末端残基の塩基上に組み込まれてもよい。
【０１６８】
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長を阻害するために使用されるブロッキング基の上流（例えば、５’）に位置する切断ドメインを含んでもよい。例として、切断ドメインは、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断ドメインであってもよく、切断ドメインは、単一ＲＮＡ残基を含むＲＮａｓｅ  Ｈ２切断ドメインであってもよく、又はオリゴヌクレオチドは、１つ以上の選択的なヌクレオシドでのＲＮＡ塩基の置換を含んでもよい。更なる例示的な切断ドメインが、米国特許第２０１０／０１６７３５３号に記述されている。
【０１６９】
したがって、マルチプレックスＰＣＲシステムは、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５個以上のフォワードプライマーを使用してもよく、各フォワードプライマーは、単独の機能的ＴＣＲ又はＩｇ  Ｖ断片、又は機能的ＴＣＲ又はＩｇ  Ｖ断片の小ファミリー、例えば、ＴＣＲ  Ｖβ断片に相補的であり（例えば、表２、配列番号：１６４４〜１６９５にて示されるようなＴＣＲＢＶプライマーを参照のこと）、例えば、それぞれＴＣＲ  Ｊβ断片（例えば、表２、配列番号：１６３１〜１６４３中のＴＣＲＢＪプライマーを参照のこと）のようなＴＣＲ又はＩｇ  Ｊ断片に特異的な、１３個のリバースプライマーを使用してもよい。他の実施形態において、マルチプレックスＰＣＲ反応は、それぞれ１つ以上の機能的ＴＣＲγＶ断片に特異的な４個のフォワードプライマーと、それぞれ１つ以上のＴＣＲγＪ断片に特異的な４個のリバースプライマーを使用してもよい。他の実施形態において、マルチプレックスＰＣＲ反応は、それぞれ１つ以上の機能的Ｖ断片に特異的な８４個のフォワードプライマーと、それぞれ１つ以上のＪ断片に特異的な６個のリバースプライマーを使用してもよい。
【０１７０】
熱サイクル条件は、当業者の方法にしたがってもよい。例えば、ＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）熱サイクラー（Ｈｙｂａｉｄ，Ａｓｈｆｏｒｄ，ＵＫ）を用いて、以下のサイクル条件が使用されてもよい。９５℃にて１５分間を１サイクル、９４℃にて３０秒間、５９℃で３０秒間及び７２℃で１分間を２５〜４０サイクル、続いて７２℃にて１０分間を１サイクル。当業者によって認識され得るように、熱サイクル条件は、例えば、アニーリング温度、アニーリング時間、サイクル数及び伸長時間を改善することによって最適化されてもよい。当業者によって認識され得るように、使用されるプライマー及び他のＰＣＲ試薬の量、並びにＰＣＲパラメータ（例えば、アニーリング温度、伸長時間及びサイクル数）は、所望のＰＣＲ増幅効率を達成するために最適化されてもよい。
【０１７１】
あるいは、本明細書でまた想到される特定の関連する実施形態において、「デジタルＰＣＲ」法を使用して、標準曲線を必要とせずに、サンプル中の標的ゲノムの数を定量することができる。デジタルＰＣＲにおいて、単一サンプルに対するＰＣＲ反応は、各液滴が増幅するか（例えば、増幅産物の生成によって、マイクロセル又は液滴に少なくとも１種の鋳型分子が存在することを証明する）、又は増幅に失敗するか（所与のマイクロセル又は液滴に鋳型が存在しないことを証明する）のいずれかであるように、１００マイクロセル又は液滴よりも多量に実施される。陽性のマイクロセルの数を単純に数えることによって、入力サンプル中に存在する標的ゲノムの数を直接計数することが可能である。デジタルＰＣＲ法は、典型的に、サーマルサイクル反応において各サイクル後に測定する従来の定量的ＰＣＲシグナルではなく、エンドポイントリードを使用する（例えば、Ｐｅｋｉｎら、２０１１  Ｌａｂ．Ｃｈｉｐ  １１（１３）：２１５６；Ｚｈｏｎｇら、２０１１  Ｌａｂ．Ｃｈｉｐ  １１（１３）：２１６７；Ｔｅｗｈｅｙら、２００９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：１０２５；２０１０  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１７８を参照のこと）。したがって、任意の本明細書に記述した組成物（例えば、適応性免疫受容体遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーセット）と方法を、このようなデジタルＰＣＲ方法論、例えば、ＡＢＩ  ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）１２Ｋ  Ｆｌｅｘ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ｔｈｅ  ＱｕａｎｔａＬｉｆｅ（商標）ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  （ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）又はｔｈｅ  ＲａｉｎＤａｎｃｅ（商標）ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（ＲａｉｎＤａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）での使用に適合させることもできる。
【０１７２】
アダプタ
本明細書に記述されるオリゴヌクレオチドは、特定の実施形態において、第１（Ｕ１）及び第２（Ｕ２）（並びに所望により第３（Ｕ３）及び第４（Ｕ４））ユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含み得るものであり、又は、Ｕ１とＵ２のいずれか又は両方（あるいはＵ３又はＵ４）を欠いてもよい。ユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチドＵは、したがって、存在しないか、又は（ｉ）第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉ）第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に連結して、５’に位置する第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列と、から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを含んでもよく、Ｕ２は、存在しないか、又は（ｉ）第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉ）第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に連結して、５’に位置する第２のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列から選択される配列と、を有するオリゴヌクレオチドを含んでもよい。同様の関係はＵ３及びＵ４についても該当する。
【０１７３】
Ｕ１及び／又はＵ２は、例えば、ユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列及び／又はＨｉＳｅｑ（商標）又はＧｅｎｅＡｎａｌｙｚｅｒ（商標）−２（ＧＡ−２）ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）又は計測、試薬及びソフトウェアの他の好適なシークエンシング一式のような、使用されている単一分子シークエンシング技術に特異的である、シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。そのようなプラットフォーム特異的アダプタ配列を含めることにより、本明細書に記述されているｄｓＤＮＡ増幅産物の直接的定量的シークエンシングが可能になり、本明細書に記述されるように、例えばＨｉＳｅｑ（商標）又はＧＡ２又は同等物などのヌクレオチドシークエンシング方法論を用いて、Ｕがこの中に組み込まれている。したがって、この特徴により、ｄｓＤＮＡ組成物を有利に定性的かつ定量的に特性付けることができる。
【０１７４】
例えば、ｄｓＤＮＡ増幅産物は、更にシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチドを組み込むためのアダプタ配列が各鋳型の各末端に使用され得るように、両末端にユニバーサルアダプタ配列を有するよう生成することもできる。
【０１７５】
理論に束縛されるものではないが、成分ｄｓＤＮＡのそれぞれのｄｓＤＮＡ組成における相対的表現が定量的に変わらないように、３サイクルの変性、アニーリング及び伸長において、５’（５’−プラットフォーム配列−ユニバーサルアダプタ−１配列−３’）及び３’（５’−プラットフォーム配列−ユニバーサルアダプタ−２配列−３’）オリゴヌクレオチドを用いて、プラットフォーム特異的オリゴヌクレオチドをそのようなｄｓＤＮＡの末端に加えることができる。固有の識別子配列（例えば、本明細書で記述するように、個々のＶ及び／又はＪ領域と関連付けられ、これによって識別するバーコード配列Ｂ、又は本明細書に記述されるサンプル識別子バーコード）がアダプタ配列に近接して配置され、これによって、存在する各固有の配列の相対量の基準によってＤＮＡ集団を特性付けるために、短い配列リードにて定量的シークエンシングを行うことができる。
【０１７６】
実施例において記述され、配列表の例示的な鋳型配列（例えば、配列番号：１〜１６３０の５’及び３’末端）に含まれるアダプタ配列に加えて、ユニバーサルアダプタ配列として使用され得る他のオリゴヌクレオチド配列は、本開示の観点から見て、当業者に周知であろう。更なるアダプタ配列の非限定例を、表３に示し、配列番号：１７１０〜１７３１に示す。
【０１７７】
【表４】
2015519909.tif 000008
【０１７８】
バーコード
本明細書に記述されるように、特定の実施形態では、増幅産物全体を配列決定する必要なく、組み込まれたポリヌクレオチド配列（したがって、その産物の増幅を起こす少なくとも１つのプライマー）の明確な識別を可能にする、短いシグネチャー配列を含むよう、オリゴヌクレオチド配列を設計することが想到される。本明細書に記述されるオリゴヌクレオチドにおいて、そのようなバーコードＢ（例えば、Ｂ１、Ｂ２）はそれぞれ、何もないか、又はそれぞれ、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個以上の連続するヌクレオチド（これらの間の全ての整数値を含む）のオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドＢを含み、複数のオリゴヌクレオチド配列Ｂのそれぞれが、特定のＶ及び／又はＪオリゴヌクレオチドプライマー配列を固有に識別する固有のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【０１７９】
例示的なバーコードは、プライマー組成物中に、各オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、Ｖ又はＪプライマー）を固有に識別する、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６個のヌクレオチドの第１のバーコードオリゴヌクレオチドを含み得るものであり、所望により特定の実施形態において、プライマーセット中の各パートナープライマー（例えば、Ｊ又はＶプライマー）を固有に識別する、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６個のヌクレオチドの第２のバーコードオリゴヌクレオチドを含み得るものであり、これによりそれぞれ、長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２個のヌクレオチドのバーコードを提供するが、これら及び関連の実施形態は、そのように限定されることを意図するものではない。バーコードオリゴヌクレオチドは、別の異なる配列（例えば、Ｖ及びＪ配列）を有する２つ以上のポリヌクレオチド産物において、所与のバーコード配列が生じることを除外して、最短のバーコード長が得られる限りにおいて、任意の長さのオリゴヌクレオチド配列を含み得る。
【０１８０】
したがって、異なるＶ−Ｊ配列対を固有に識別するために使用されるバーコード間のこのような冗長性を避けるために、最短バーコード長は、Ｘヌクレオチドであり、４ｘは非同一配列を有することに基づいて差異化される異なる鋳型種の数よりも大きい。実際、バーコードオリゴヌクレオチド配列のリード長は、使用されるべきヌクレオチドシークエンシング装置の配列リード長の制限によってのみ制限され得る。特定の実施形態のために、鋳型オリゴヌクレオチドの個々の種を区別する異なるバーコードオリゴヌクレオチドは、バーコードオリゴヌクレオチド配列中の特定の位置で一致するヌクレオチドの数を最大化するために整列したときに、少なくとも２つのヌクレオチドの不一致（例えば、最小ハミング距離２）を有するべきである。
【０１８１】
当業者は、その間の全ての整数値を含む、例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５個以上の連続するヌクレオチドの設計、合成、及びより大きなオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンストラクト内への組み込みを周知であろう。オリゴヌクレオチドバーコード配列の識別戦略の設計及び実施の非限定的な例としては、例えば、ｄｅ  Ｃａｒｃｅｒら、２０１１  Ａｄｖ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７７：６３１０；Ｐａｒａｍｅｓｗａｒａｎら、２００７  Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．３５（１９）：３３０；Ｒｏｈら、２０１０  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：２９１を参照のこと。
【０１８２】
典型的には、バーコードは、それらが、天然では見られない位置でオリゴヌクレオチドに配置され、すなわち、バーコードが隣接しておかれる配列付近に見られ得る天然に生じるオリゴヌクレオチド配列（例えば、Ｖ及び／又はＪ配列）とは異なるヌクレオチド配列を含む。このようなバーコード配列は、本明細書に記述される特定の実施形態にしたがって、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの要素Ｂ１及び／又はＢ２として含まれてもよい。したがって、本明細書に記述されるオリゴヌクレオチド組成物の特定のものは、特定の実施形態において、１つ、２つ又はそれ以上のバーコードを含み、一方、特定の他の実施形態において、これらのバーコードの一部又は全てが欠如していてもよい。特定の実施形態において、全てのバーコード配列は、同一又は同様のＧＣ含量を有するであろう（例えば、ＧＣ含量の差は、２０％以下、又は１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１又は１０％以下である）。
【０１８３】
シークエンシング
シークエンシングは、種々の利用可能な高スループット単独分子シークエンシング装置及びシステムを用いて実施されてもよい。具体的なシークエンスシステムとしては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ及び関連する装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＰａｃＢｉｏ  ＲＳ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）、又は同様の性能を有する他のシステムのような、合成によるシークエンシング（sequence-by-synthesis）システムが挙げられる。シークエンシングは、増幅されたＤＮＡ分子内の定義された領域にハイブリッド形成する、１セットのシークエンシングオリゴヌクレオチドを用いて達成される。シークエンシングオリゴヌクレオチドは、本開示に基づいて、かつ公的に利用可能なデータベースで見られる既知の適応性免疫受容体遺伝子配列の観点から見て、生成される配列によって、Ｖ−及びＪコード遺伝子断片が固有に識別可能であるように設計される。例えばＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１３／２１７，１２６、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１２／７９４，５０７、国際出願ＵＳ２０１１／０２６３７３号又は国際出願ＵＳ２０１１／０４９０１２号を参照のこと。例示的なＴＣＲＢ  Ｊ領域シークエンシングプライマーが、表４に示される。
【０１８４】
【表５】
2015519909.tif 000009
【０１８５】
用語「遺伝子」は、ＴＣＲ又はＩｇポリペプチド（例えば、ＣＤＲ３含有ポリペプチド）の全て又は一部などのポリペプチド鎖を産生することに関与するＤＮＡのセグメントを意味し、コーディング領域「リーダー及びテーラー」並びに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）の前及び後の領域を含み、また調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、受容体結合部位等）を含んでもよく、また本明細書で記述したように、組換えシグナル配列（ＲＳＳ）も含んでもよい。
【０１８６】
またポリヌクレオチドとして本明細書で呼ばれる、本実施形態の核酸は、ＲＮＡの形態、又はＤＮＡの形態であってもよく、ＤＮＡにはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡが含まれる。ＤＮＡは二本鎖又は一本鎖であってもよく、一本鎖の場合、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。本実施形態にしたがった利用のための、ＴＣＲ又は免疫グロブリン又はその領域（例えば、Ｖ領域、Ｄ断片、Ｊ領域、Ｃ領域等）をコードするコード配列は、任意の所与のＴＣＲ又は免疫グロブリン遺伝子領域又はポリペプチドドメイン（例えば、Ｖ領域ドメイン、ＣＤＲ３ドメイン等）に関する本技術分野で既知のコード配列と同一であってもよく、あるいは遺伝的コードの冗長性又は縮重の結果として、同一のＴＣＲ又は免疫グロブリン領域又はポリペプチドをコードするコード配列であってもよい。
【０１８７】
特定の実施形態において、増幅されたＪ領域をコードする遺伝子断片はそれぞれ、ＲＳＳ部位に対して定義された位置に存在する、２、３、４、５、６、７、８、１０又は約１５、２０ヌクレオチド以上の固有の配列定義識別子タグを有してもよい。例えば、４つの塩基タグが、ＲＳＳ部位から＋１１〜＋１４下流位置にて、増幅されたＴＣＲβ  ＣＤＲ３コード領域のＪβ領域コードセグメント中で使用され得る。しかしながら、これらの関連する実施形態は、そのように制限される必要はなく、また、Ｊ領域をコードする遺伝子断片中で検出され、ＲＳＳ部位に対するそれらの位置に基づいて定義されてもよい、他の相対的短いヌクレオチド配列を定義する識別子タグも想到される。これらは、異なる適応性免疫受容体コード遺伝子座間で様々であってもよい。
【０１８８】
組換えシグナル配列（ＲＳＳ）は、１２＋／−１ｂｐ（「１２−シグナル」）又は２３＋／−ｂｐ（「２３−シグナル」）のいずれかのスペーサーによって分離された、２つの保存配列（ヘプタマー、５’−ＣＡＣＡＧＴＧ−３’及びナノマー５’−ＡＣＡＡＡＡＡＣＣ−３’）からなる。多数のヌクレオチド位置が、ヘプタマーの位置１及び２でＣＡジヌクレオチドを含む組換えに対して重要であるとして特定されており、ヘプタマー位置３でのＣが、ナノマーの位置５、６、７でのＡヌクレオチドと同様、非常に好ましいものと示されてきた。（Ｒａｍｓｄｅｎら、１９９４、Ａｋａｍａｔｓｕら、１９９４、Ｈｅｓｓｅら、１９８９）その他のヌクレオチドの変異では、最小又は一貫性のない効果がもたらされる。よりばらつきは大きくなるものの、スペーサーもまた組換えに大きな影響を与え、単一ヌクレオチド置換は、組換え効率に有意に影響を与えることが示されている（Ｆａｎｎｉｎｇら、１９９６、Ｌａｒｉｊａｎｉら、１９９９、Ｎａｄａｌら、１９９８）。有意に異なる組換え効率を有するＲＳＳポリヌクレオチド配列を識別するための基準が記述されている（Ｒａｍｓｄｅｎら、１９９４、Ａｋａｍａｔｓｕら、１９９４、Ｈｅｓｓｅら、１９８９及びＣｏｗｅｌｌら、１９９４）。したがって、シークエンシングオリゴヌクレオチドは、ＲＳＳ部位の＋１１〜＋１４下流位置にて、増幅されたＪコード遺伝子断片内で、４つの塩基タグに隣接してハイブリッド形成してもよい。例えば、ＴＣＲＢのためのシークエンシング用オリゴヌクレオチドは、この「タグ」のちょうど下流で見られる、コンセンサスヌクレオチドモチーフにアニールするように設計されてよく、配列リードの最初の４つの塩基が、Ｊコード遺伝子断片を固有に識別するであろう（例えば、国際公開第２０１２／０２７５０３号参照）。
【０１８９】
Ｖ断片の第２の保存されたシステインと、Ｊ断片の保存されたフェニルアラニンとの間の、ＴＣＲポリペプチドをコードしているヌクレオチドとして定義される、ＴＣＲのＣＤＲ３コード領域の平均長は、３５＋／−３ヌクレオチドである。したがって、特定の実施形態において、特定のＴＣＲ又はＩｇＨ  Ｊ領域（例えば、本明細書で記述したような、ＴＣＲ  Ｊβ、ＴＣＲ  Ｊγ又はＩｇＨ  ＪＨ）のＪ断片タグから開始する、Ｊ断片オリゴヌクレオチドプライマーとＶ断片オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、ほぼ常に、５０塩基対リード中に完全なＶ−Ｄ−Ｊ連結を得ることができるであろう。Ｖ断片中の保存されたシステインと、Ｊ断片中の保存されたフェニルアラニンと間のヌクレオチドとして定義される、ＩｇＨ  ＣＤＲ３領域の平均長は、ＴＣＲβ遺伝子座におけるよりも制限されないものの、典型的には、約１０〜約７０ヌクレオチドであろう。したがって、特定の実施形態において、ＩｇＨ  Ｊ断片タグから開始する、Ｊ断片オリゴヌクレオチドプライマーとＶ断片オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅により、１００塩基対リード中に完全なＶ−Ｄ−Ｊ連結を得ることができるであろう。
【０１９０】
不一致な鋳型配列にアニールし、ポリヌクレオチド伸長を支持するＰＣＲプライマーは、雑多（promiscuous）なプライマーと呼ばれる。特定の実施形態において、ＴＣＲ及びＩｇ  Ｊ断片リバースＰＣＲプライマーは、マルチプレックスＰＣＲとの関連において、雑多なプライミングを最小化するために、シークエンシングするオリゴヌクレオチドとの重なりを最小化するように設計され得る。１つの実施形態において、ＴＣＲ及びＩｇ  Ｊ断片リバースプライマーは、シークエンシングプライマーの重なりが最小となるよう、コンセンサススプライス部位モチーフにアニールさせることによって３’末端で固定することもできる。一般に、ＴＣＲ及びＩｇ  Ｖ及びＪ断片プライマーは、既知の配列／プライマー設計及びデフォルトパラメータ下での解析プログラムを用いて、一貫したアニーリング温度でのＰＣＲにて動作するように選択されてもよい。
【０１９１】
シークエンシング反応のための、例示的なＩＧＨＪシークエンシングプライマーは、国際公開第２０１２／０２７５０３号にて記述されるように、保存されたＣＡＧ配列にわたって３つのヌクレオチドを伸長する。
【０１９２】
サンプル
試験生体サンプルが得られる対象又は生物源は、ヒト又は非ヒト動物、又はトランスジェニック又はクローン化、又は（幹細胞の利用を介するものを含む）組織遺伝子操作を受けた生物であってもよい。本発明の特定の好ましい実施形態において、対象又は生物源は、血中循環腫瘍又は固形がん又は他の悪性状態、又は自己免疫疾患、又は炎症状態を有することが既知であってよく、あるいは有するという又はリスク下にあるという疑いがあってよく、本発明の特定の好ましい実施形態において、対象又は生物源は、このような疾患のリスク又は存在がないことが既知であってもよい。
【０１９３】
特定の好ましい実施形態は、米国国立がん研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）のものような、又はＤｅＶｉｔａ，Ｈｅｌｌｍａｎ，ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ’ｓ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２００８，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ／Ｏｖｉｄ，ＮｅｗＹｏｒｋ）、Ｐｉｚｚｏ  ａｎｄ  Ｐｏｐｌａｃｋ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ／Ｏｖｉｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）にて記述されたもののような、本技術分野で許容された臨床診断基準にしたがって、がんになる、又はがんにかかるリスクを有する、又はリスクであるとして診断された患者のような、ヒト対象である対象又は生物源を企図し、特定の実施形態が、このような基準によってがんを有する、がんになる、又はがんにかかるリスクがないことが既知であるヒト対象を企図する。
【０１９４】
特定の他の実施形態は、固体腫瘍及び／又は他のがんに関する前臨床モデルを含む、前臨床モデルとして本技術分野に既知であり得るこのような非ヒト対象を含む、非ヒト対象又は生物源、例えばマカク、チンパンジー、ゴリラ、ベルベット、オランウータン、オナガザル又は他の非ヒト霊長類を想到する。特定の他の実施形態は、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、スナネズミ、ハムスター、モルモット又は他の動物である非ヒト対象を想到し、このような哺乳類の多くは、血中循環腫瘍又固形腫瘍及び／又は他のがんを含む、特定の疾患又は疾病に対する前臨床モデルとして本技術分野に対して既知の対象であり得る（例えば、Ｔａｌｍａｄｇｅら、２００７  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７０：７９３；Ｋｅｒｂｅｌ、２００３  Ｃａｎｃ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２（４  Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ１３４；Ｍａｎら、２００７  Ｃａｎｃ．Ｍｅｔ．Ｒｅｖ．２６：７３７；Ｃｅｓｐｅｄｅｓら、２００６  Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｏｎｃｏｌ．８：３１８）。実施形態の範囲は限定されることを意図するものではないが、対象又は生物源が非哺乳類脊椎動物、例えば他の高次脊椎動物、又は鳥類、両生類又はは虫類種、又は他の対象若しくは生物源であり得る他の実施形態も想到される。
【０１９５】
生体サンプルは、対象又は生物源からの、血液サンプル、生検標本、組織外植、器官培養、生体液又は他の組織又は細胞調整物を得ることによって提供されてもよい。好ましくは、サンプルには、例示の目的であり、制限ではないが、１つ以上のＴＣＲ又はＢＣＲ遺伝子座にて再構成されたＤＮＡを含有してもよい、対象又は生物源のリンパ球系細胞由来のＤＮＡが含まれる。特定の実施形態において、試験生体サンプルは、例えば外科的切除、針生検、又は細胞の混合物を含有する試験生体サンプルを得るための他の手段によって、固形組織（例えば、固形腫瘍）から得られる。
【０１９６】
特定の実施形態において、任意の多数の確立された方法論にしたがってリンパ球系細胞（例えば、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞）を単離することが望ましく、単離されたリンパ球系細胞は、天然に生じる組織、環境又は状況から除去又は分離されたものである。Ｂ細胞及びＴ細胞はしたがって、骨髄、胸腺、リンパ腺、リンパ節、末梢組織及び血液を含む様々な組織及び生体液サンプルからのような、生体サンプルから得られるが、末梢血液がもっとも入手しやすい。Ｂ及びＴ細胞の存在のために任意の末梢組織がサンプリングされてもよく、本明細書で記述された方法での使用が想到される。適応性免疫細胞が得られる組織及び生体液としては、皮膚、上皮組織、結腸、脾臓、粘膜分泌物、口腔粘膜、腸粘膜、膣粘膜又は膣分泌液、頸部組織、神経節、唾液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、骨髄、臍帯血、血清、漿膜液、血漿、リンパ、尿、腹水、胸膜液、心膜液、腹膜液、腹液、培養培地、条件培養培地、又は洗浄液が挙げられる。特定の実施形態において、適応性免疫細胞は、アフェレーシスサンプルから単離されてもよい。末梢血液サンプルは、対象から静脈切開によって得られる。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）密度勾配分離によって、当業者に既知の技術によって単離される。特定の実施形態において、全てのＰＢＭＣが解析に使用される。
【０１９７】
核酸抽出に際し、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を用い、本技術分野で既知の方法及び／又は市販のキットを用いて、細胞から全ゲノムＤＮＡを抽出することができる。単一ハプロイドゲノムのおよその重量は３ｐｇである。好ましくは、少なくとも１００，０００〜２００，０００の細胞、すなわち２倍体Ｔ又はＢ細胞からの約０．６〜１．２μｇのＤＮＡが解析に使用される。供給源としてＰＢＭＣを使用して、Ｔ細胞の数は、総細胞の約３０％であると推定可能である。Ｂ細胞の数はまた、ＰＢＭＣ調製物中の総細胞の約３０％であると推定可能である。
【０１９８】
Ｉｇ及びＴＣＲ遺伝子座は、多くの異なる可変（Ｖ）、多様（Ｄ）及び連結（Ｊ）遺伝子断片を含有し、早期リンパ分化の間、再構成プロセスにかけられる。Ｉｇ及びＴＣＲ  Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子配列が本技術分野で既知であり、ＧＥＮＢＡＮＫのような公的データベースにて利用可能である。Ｖ−Ｄ−Ｊ再構成は、Ｄ遺伝子断片の両側にてＶ遺伝子断片の下流と、Ｊ遺伝子断片の上流に位置する、組換えシグナル配列（ＲＳＳ）にてＤＮＡを認識し、切断することによって、ＲＡＧ１及びＲＡＧ２タンパク質が重要な役割を果たす、リコンビナーゼ酵素複合体を介して仲介される。適切でないＲＳＳは、再構成を減少させ、又は完全に妨げる。組換えシグナル配列（ＲＳＳ）は、１２＋／−１ｂｐ（「１２−シグナル」）又は２３＋／−ｂｐ（「２３−シグナル」）のいずれかのスペーサーによって分離された、２つの保存配列（ヘプタマー、５’−ＣＡＣＡＧＴＧ−３’及びナノマー５’−ＡＣＡＡＡＡＡＣＣ−３’）からなる。
【０１９９】
多数のヌクレオチド位置が、ヘプタマーの位置１及び２でＣＡジヌクレオチドを含む組換えに対して重要であるとして特定されており、ヘプタマー位置３でのＣが、ナノマーの位置５、６、７でのＡヌクレオチドと同様、非常に好ましいものと示されてきた。（Ｒａｍｓｄｅｎら、１９９４  Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．２２：１７８５；Ａｋａｍａｔｓｕら、１９９４  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４５２０；Ｈｅｓｓｅら、１９８９  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：１０５３）。その他のヌクレオチドの変異では、最小又は一貫性のない効果がもたらされる。より変動は大きくなるが、スペーサーもまた組換えに大きな影響を与え、単一ヌクレオチド置換が、組換え効率に有意に影響を与えることが示されてきた（Ｆａｎｎｉｎｇら、１９９６  Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．７９：１、Ｌａｒｉｊａｎｉら、１９９９  Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．２７：２３０４；Ｎａｄｅｌら、１９９８  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：６０６８；Ｎａｄｅｌら、１９９８  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１４９５）。有意に異なる組換え効率を有するＲＳＳポリヌクレオチド配列を識別するための基準が記述されている（Ｒａｍｓｄｅｎら、１９９４  Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．２２：１７８５；Ａｋａｍａｔｓｕら、１９９４  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４５２０；Ｈｅｓｓｅら、１９８９  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：１０５３、ａｎｄ  Ｌｅｅら、２００３  ＰＬｏＳ  １（１）：Ｅ１）。
【０２００】
再構成プロセスは一般に、ＤからＪ再構成で開始し、その後、Ｉｇ重鎖（ＩｇＨ）、ＴＣＲ  β（ＴＣＲＢ）及びＴＣＲ  δ（ＴＣＲＤ）遺伝子の場合はＶからＤ−Ｊ再構成が続き、又はＩｇ  κ（ＩｇＫ）、Ｉｇ  λ（ＩｇＬ）、ＴＣＲ  α（ＴＣＲＡ）及びＴＣＲ  γ（ＴＣＲＧ）遺伝子の場合は直接ＶからＪ再構成に関与する。再構成されている遺伝子断片間の配列は一般に、ＴＣＲ切除円（excision circle）（ＴＲＥＣ）又はＢ細胞受容体切除円（ＢＲＥＣ）とも呼ばれる、環状切除産物の形状で検出される。
【０２０１】
Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子断片の多くの異なる組み合わせが、いわゆるコンビナトリアルレパートリーを提示し、これは、Ｉｇ分子に関して〜２×１０６、ＴＣＲαβ分子に関して〜３×１０６、ＴＣＲγδ分子に関して〜５×１０３と推定される。Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子断片の連結部位にて、ヌクレオチドの欠損及びランダム挿入が、再構成プロセスの間に発生し、結果として、非常に多種多様な連結領域がもたらされ、これは有意にＩｇ及びＴＣＲ分子の総レパートリーに寄与し、＞１０１２であると推定される。
【０２０２】
成熟Ｂリンパ細胞は更に、濾胞中心における抗原認識に応じ、Ｉｇ分子を親和性成熟へ導くプロセスである体細胞超変異を介してＩｇレパートリーを拡張する。体細胞超変異プロセスは、ＩｇＨ及びＩｇ軽鎖遺伝子のＶ−（Ｄ−）Ｊエキソンに焦点をあて、単一ヌクレオチド変異に関係し、更に時としてヌクレオチドの挿入又は欠損にも関係する。体細胞変異Ｉｇ遺伝子は更に、濾胞又は濾胞後由来の成熟Ｂ細胞悪性腫瘍に見出される。
【０２０３】
本明細書で記述した特定の実施形態において、ＰＣＲ反応においてＶ断片及びＪ断片プライマーを使用して、試験生体サンプル中の再構成されたＴＣＲ又はＢＣＲ  ＣＤＲ３コードＤＮＡ領域を増幅することができ、各機能的ＴＣＲ又はＩｇ  Ｖコード遺伝子断片は、Ｖ遺伝子組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を含み、各機能的ＴＣＲ又はＩｇ  Ｊコード遺伝子断片は、Ｊ遺伝子ＲＳＳを含む。これらの関連する実施形態において、各増幅され再構成されたＤＮＡ分子は、（ｉ）少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個以上の連続するヌクレオチドが、Ｖ遺伝子ＲＳＳに対して５’に位置して、ＴＣＲ又はＩｇ  Ｖコード遺伝子断片のセンス鎖の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００（その間の全ての整数値を含む）個以上の連続するヌクレオチドを含んでもよく、かつ／又は各増幅され再構成されたＤＮＡ分子は、（ｉｉ）少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００個以上の連続するヌクレオチドがＪ遺伝子ＲＳＳに対して３’で位置して、ＴＣＲ又はＩｇ  Ｊコード遺伝子断片のセンス鎖の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００（その間の全ての整数値を含む）個以上の連続ヌクレチドを含んでもよい。
【０２０４】
本発明の特定の実施形態の実施は、特に反対のことを示さない限り、本技術分野内である微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学及び免疫学の技術における従来の方法を使用し、例示の目的でそのいくつかの参照を以下に行う。このような技法は文献にて完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２００８）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ  ＵＳＡ、１９８５）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ  ２００１  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、ＮＹ）；Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｕｌｉｅ  Ｌｏｇａｎ、Ｋｉｒｓｔｉｎ  Ｅｄｗａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｎｉｃｋ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ、２００９、Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｏｒｆｏｌｋ、ＵＫ；Ａｎａｎｄ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２）；Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ、Ｅｄ．、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｅｄｓ．、１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｅｄｓ．、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｅｄ．、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ���ｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｊａｎｉｔｚ、２００８  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｐａｒｋ、Ｅｄ．、３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、２０１０  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９８）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ、ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  ＣＣ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、ｅｄｓ．、１９８６）；Ｒｉｏｔｔ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８８）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓｔａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ、Ｅｄ．、２００２）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓｔａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ、Ｅｄ．、２００６）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓｔａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ、Ｅｄ．、２００６）；Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ  Ｅｄ．、２００６）；Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｄａｒｗｉｎ  Ｊ．Ｐｒｏｃｋｏｐ、Ｄｏｎａｌｄ  Ｇ．Ｐｈｉｎｎｅｙ、ａｎｄ  Ｂｒｕｃｅ  Ａ．Ｂｕｎｎｅｌｌ  Ｅｄｓ．、２００８）；Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ａ．Ｋｌｕｇ、ａｎｄ  Ｃｒａｉｇ  Ｔ．Ｊｏｒｄａｎ  Ｅｄｓ．、２００１）；Ｈｅｍａ���ｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｅｖｉｎ  Ｄ．Ｂｕｎｔｉｎｇ  Ｅｄ．、２００８）Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｌｅｓｌｉｅ  Ｐ．Ｗｅｉｎｅｒ  Ｅｄ．、２００８）を参照のこと。
【０２０５】
具体的な定義が提供されている場合を除き、本明細書に記述されている分子生物学、分析化学、合成有機化学、並びに医薬及び製薬化学に関連して使用される命名法並びに実験手順及び技法は、当該技術分野で周知であり一般的に使用されているものである。組換え技術、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、製薬調製、処方、及び送達、並びに患者治療については、標準的技法を使用することができる。
【０２０６】
用語「単離」は、材料が元の環境から（例えば、天然に生じる材料の場合は、自然環境から）取り出されることを意味する。例えば、生きている動物の元来の状況下に存在する、天然に生じる組織、細胞、核酸又はポリペプチドは単離されていないが、天然の系において共存する材料の一部分又は全てから分離された同じ組織、細胞、核酸又はポリペプチドは単離されている。そのような核酸は、ベクターの一部とすることができ、及び／又は、そのような核酸又はポリペプチドは、組成物（例えば細胞可溶化物）の一部とすることができ、そのようなベクター内で依然として単離されたままであるか、あるいは、その組成はその核酸又はポリペプチドに関する天然環境の一部ではない。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、コーディング領域の前後の領域である「リーダー及びトレーラー」、並びに、個々のコーディングセグメント（エキソン）の間にある介在配列（イントロン）を含む。
【０２０７】
別途記載が必要とされない限り、本明細書及び請求項全体を通じて、用語「含む（comprise）」及びその変化形、例えば「含み（comprises）」及び「含め（comprising）」は、オープンな包含的意味で、すなわち、「含むがこれらに限定されない」ものとして解釈される。「〜からなる（consisting of）」は、この句の前にあるものを含み、典型的にはこれらに限定されることを意味する。「〜から本質的になる（consisting essentially of）」は、この句の前に列記された要素を含み、列記された要素に関して本開示中で特定される活動又は行為を妨げることも寄与することもない他の要素に限定されることを意味する。よって、「〜から本質的になる（consisting essentially of）」は、列記された要素が必要又は必須であるが、他の要素は必要ではなく、列記された要素の活動又は行為に影響するか否かに依存して存在させてよく又は存在させなくてもよいことを示す。
【０２０８】
本明細書及び添付の請求項において、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明確に別途示されている場合を除き、複数の参照を含む。本明細書で使用される場合、特定の実施形態において、数値の前に付けられる用語「約」又は「およそ」は、プラスマイナス５％、６％、７％、８％又は９％の範囲を示す。別の実施形態において、数値の前に付けられる用語「約」又は「およそ」は、プラスマイナス１０％、１１％、１２％、１３％、又は１４％の範囲を示す。更に別の実施形態において、数値の前に付けられる用語「約」又は「およそ」は、プラスマイナス１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％の範囲を示す。
【０２０９】
本明細書を通して、「１つの実施形態」又は「一実施形態」又は「一態様」の言及は、実施形態に関連して記述される特定の特徴、構造又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通して、種々の場所において、語句「１つの実施形態において」又は「一実施形態において」が出現した場合、必ずしも全て、同一の実施形態について言及しているわけではない。更に、特定の特徴、構造又は特性は、１つ以上の実施形態において任意の好適な方法で組み合わされてもよい。
【実施例】
【０２１０】
実施例１：単分子標識。
単分子標識プロセスは、適応性免疫受容体をコードする配列を固有のバーコード及びユニバーサルプライマーでタグを標識するために、ポリメラーゼ連鎖反応アプローチを使用した。個々のバーコードを付加するＰＣＲ反応では、ＱＩＡＧＥＮ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲマスターミックス（ＱＩＡＧＥＮ部品番号２０６１４５、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、１０％  Ｑ溶液（ＱＩＡＧＥＮ）、及び３００ｎｇの鋳型ＤＮＡを使用した。プールされたプライマーを加え、最終反応物がフォワードプライマー合計濃度２μＭ、リバースプライマー合計濃度２μＭを有するようにした。フォワードプライマーは、Ｖ遺伝子にアニールしたヌクレオチド配列部分（表２に示されるＶ遺伝子にアニールしたセグメント）、及び５’末端にユニバーサルプライマー（ｐＧＥＸｆ、表３）からなっていた。凝集プライマーを表６に列記する。これらのプライマーは、特異性を高めるため、Ｖプライマーの３’末端とユニバーサルプライマー配列の５’末端との間にランダムなヌクレオチドの挿入を有してもよい。リバースプライマーは、Ｊ遺伝子領域にアニールできるヌクレオチド部分を有し（表２）、Ｊプライマーの５’末端にランダムヌクレオチドからなる８ｂｐのバーコード、５’末端に８ｂｐのランダムバーコードのユニバーサルプライマー（ｐＧＥＸｒ、表３）を有する。これらのプライマーの例を表５に列記する。ランダムヌクレオチドからなる８ｂｐのバーコードは、これより短くても長くてもよく、塩基対を追加することで、固有のバーコードの数は増加する。
【０２１１】
ヌクレオチドタグは、７サイクルのＰＣＲ反応において分子に組み込まれた。熱サイクル条件は次の通りとした：９５℃で５分間、次いで、９５°で３０秒間、６８°で９０秒間、７２°で３０秒間のサイクルを７サイクル。サイクル後、反応物を７２°で１０分間保持した。
【０２１２】
８ｂｐのランダムタグを有するプライマーにより抗原受容体分子をタグ付加した後、その他のプライマーは、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（製品番号７８２００、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて破壊した。ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴは、エキソヌクレアーゼＩ及びエビアルカリホスファターゼの活性を使用する、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの製品である。エキソヌクレアーゼＩは単鎖ＤＮＡを破壊し、ＳＡＰはｄＮＴＰを分解する。この実施例では、１０μＬのＰＣＲ試薬と、４μＬのｅｘｏＳＡＰ−ＩＴが使用された。反応物を３７℃で１５分間インキュベーションし、更に８０℃で１５分間インキュベーションすることによってＥｘｏＳＡＰ−ｉｔを不活性化した。この時点で、分子はバーコード及びユニバーサルプライマーで固有にタグ付加された。タグ付加された産物を増幅するために、ユニバーサルｐＧＥＸプライマーを用いてもう一度ＰＣＲ反応を実施した。この反応は、ＱＩＡＧＥＮ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲマスターミックス（ＱＩＡＧＥＮ製品番号２０６１４５、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、１０％  Ｑ溶液（ＱＩＡＧＥＮ）、及び鋳型として６μＬの３００ｎｇの精製済みＰＣＲ反応物を使用した。この混合物に最終濃度が２μＭになるようにフォワードユニバーサル（ｐＧＥＸｆ）プライマーを加え、及びこの反応物に最終濃度が２μＭになるようにリバースユニバーサルプライマー（ｐｇＥＸｒ）を加えた。これらの分子をシークエンシングするために、ｐＧＥＸプライマーを用いてＩｌｌｕｍｉｎａアダプタを組み込んだ。反応条件は上記と同じとしたが、ただしプライマーをテーリングプライマー（下記の表７（配列番号：５６８６〜５８７７）に置き換えた。この分子に、７サイクルのＰＣＲ反応により、同様に８ｂｐのタグ及び６ｂｐのランダムなヌクレオチドセットを含むＩｌｌｕｍｉｎａアダプタを組み込んだ。熱サイクル条件は次の通りとした：９５℃で５分間、次いで、９５°で３０秒間、６８°で９０秒間、７２°で３０秒間のサイクルを７サイクル。サイクル後、反応物を７２°で１０分間保持した。
【０２１３】
標識された分子がＩｌｌｕｍｉｎａアダプタでテーリングされた時点で、シークエンシングを行えるようになった。この実施例では、シークエンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨＩＳＥＱ（商標）シークエンシングプラットフォーム上で、８ｂｐのランダマーを適応性免疫受容体をコードする配列全体に対して実施された。シークエンシングされた分子には、８ｂｐランダムタグが含まれた。同一のＣＤＲ３及び８ｂｐランダムタグ配列を有する全てのシークエンシング済み分子を、単一細胞の適応性免疫受容体をコードするポリヌクレオチド配列から増幅した。
【０２１４】
表５は単分子シークエンシングのＪプライマー（リバースプライマー）を示し、表６はＶプライマー（フォワードプライマー）を示す。ＰＣＲプロトコルは短い：上記プライマーで１回目のＰＣＲ（５サイクル）を行って各分子に固有のタグを付加し、次に、ユニバーサルプライマー（ＰＧＥＸ）で２回目のＰＣＲ（３５サイクル）を行い、分子を増幅する。これらの反応の後、ＰＣＲ反応を行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプタにテーリングを行う。
【０２１５】
【表６】
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【０２１６】
【表７−１】
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【０２１７】
【表７−２】
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【０２１８】
【表７−３】
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【０２１９】
【表７−４】
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【０２２０】
【表７−５】
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【０２２１】
【表８−１】
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【０２２２】
【表８−２】
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【０２２３】
【表８−３】
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【０２２４】
【表８−４】
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【０２２５】
【表８−５】
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【０２２６】
【表８−６】
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【０２２７】
【表８−７】
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【０２２８】
【表８−８】
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【０２２９】
【表８−９】
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【０２３０】
【表８−１０】
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【０２３１】
【表８−１１】
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【０２３２】
【表８−１２】
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【０２３３】
【表８−１３】
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【０２３４】
【表８−１４】
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【０２３５】
【表８−１５】
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【０２３６】
【表８−１６】
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【０２３７】
【表８−１７】
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【０２３８】
【表８−１８】
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【０２３９】
【表８−１９】
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【０２４０】
実施例２：適応性免疫受容体をコードする配列の単細胞標識
この実施例は、ＲＴ−ＰＣＲによる、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体の重鎖及び軽鎖をコードする配列の単細胞標識について述べる。健康なヒト志願者から採血したての血液を、白血球供給源として使用する。１００，０００〜３００，０００個の白血球を取得するのに必要な全血の量は１ｍＬ未満である。血球の単離のために、１〜３ｍＬの血液を使用する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）−１０７７（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の密度勾配遠心分離により、供給メーカーの説明書に従って、血液から単離する。ＣＤ４５＋造血細胞は、Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＣＤ４５  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いて、メーカーの説明書に従い、また本質的にＫｏｅｈｌら（２００３  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １７：２３２）の記述に従って、抗ＣＤ４５コーティングされた磁気ビーズに結合させることにより単離する。白血球懸濁液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗い、濃度を１×１０６個／ｍＬに調節する。１〜３μＬのアリコート（細胞１〜３×１０３個）を、あらかじめ冷却したプレートラック内で氷上に保持した９６ウェルＰＣＲマルチウェルプレートのウェルに分注する。全プレートウェルに充填後、直ちにプレートを密封し、ドライアイスの上に置いて凍結させ、細胞を溶解させる。下記の逆転写の準備工程の間、プレートをドライアイス上に保持する。
【０２４１】
逆転写は、本質的に供給メーカーの説明書に従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング用ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＲＮＡキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して実施する。ストック用反応緩衝液は、３８０μＬの希釈用緩衝液と２０μＬのＲＮＡ分解酵素阻害剤を混合することにより調製する（４０Ｕ／μＬ）。次に２５０μＬの反応緩衝液を、１００μＬの３’Ｓｍａｒｔｅｒ（商標）ＣＤＳ  ＩＩオリゴヌクレオチド（５’−Ｂｉｏ−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＴ（３０）ＮＮ−３’［配列番号：５８７８］の１２μＭ溶液と混合する。式中、Ｂｉｏはビオチン部分、ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣ［配列番号：５８７９］はユニバーサルアダプタ配列、Ｔ（３０）（配列番号：５８８０）はチミン残基が３０個連結したオリゴマー、及びＮは任意のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴ）である。
【０２４２】
逆転写の第１段階のアニーリング反応のセットアップは、溶解した細胞を入れた９６ウェルプレートの各ウェルに、３’Ｓｍａｒｔｅｒ（商標）ＣＤＳ  ＩＩオリゴヌクレオチドプライマーを含む３．５μＬの反応緩衝液を加え、プレートを密封し、７２℃で３分間インキュベーションすることにより行う。この後、マルチプレートは氷上で冷却されているラックに戻す。
【０２４３】
逆転写用マスターミックス（１００個の反応物について４５０μＬ）は、２００μＬの５ｘ第１ストランド緩衝液、２５μＬの１００ｍＭジチオトレイトール（dithithreitol）（ＤＴＴ）、１００μＬのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、２５μＬのＲＮＡ分解酵素阻害剤（４０Ｕ／μＬ）、及び１００μＬの逆転写酵素を混合して調製する。実施する９６ウェルプレートは、ウェル当たり１．０μＬのバーコード付加３’−Ｓｍａｒｔ（商標）ＣＤＳＩＩオリゴヌクレオチドを入れて準備する。３’−Ｓｍａｒｔ  ＣＤＳＩＩオリゴ配列は：５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＢＢＢＢＢＢＢＢｒＧｒＧｒＧ−Ｐ−３’［配列番号：５８８１］であり、式中、ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣ［配列番号：５８７９］はユニバーサルアダプタ配列、ＢＢＢＢＢＢＢＢは８ヌクレオチドのバーコード（バーコードの実施例は下記のリストを参照）、ｒＧはリボグアニン、及びＰは３’リン酸ブロッキング部分である。
【０２４４】
【表９−１】
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【０２４５】
【表９−２】
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【０２４６】
【表９−３】
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【０２４７】
【表９−４】
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【０２４８】
１．０μＬのバーコード付加３’−Ｓｍａｒｔ（商標）ＣＤＳＩＩオリゴヌクレオチドを入れた実施用９６ウェルプレートの各ウェルに、４．５μＬのマスターミックスを加え、アニーリング反応完了後に、バーコード付加３’−Ｓｍａｒｔ（商標）ＣＤＳＩＩオリゴヌクレオチドを含むマスターミックス５．５μＬを、実施用９６ウェルプレートの各ウェルから、逆転写アニーリングプレートの対応する位置の（それぞれの）ウェルに移す。逆転写アニーリングプレートを熱サイクラーの上に置き、プログラムを４２℃で９０分間、その後７０℃で１０分間の工程で実行する。この温度プロファイルにより、各ウェルの白血球から放出された全てのポリＡｍＲＮＡ転写分子の第１のｃＤＮＡ鎖の合成を実行する。非限定的な理論により、第１のｃＤＮＡ鎖合成の後、ウェル内の各ｃＤＮＡ分子は、５’及び３’末端両方にユニバーサルアダプタ配列を含み、５’末端が８ｎｔのバーコードで固有にタグ付加されている。
【０２４９】
所望により、全９６個の反応物から、バーコード付加ｃＤＮＡ分子をこの段階でプールして、ＰＣＲプレートに再びアリコートを分注し、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行うことができる。混合と分割の工程により、実質的に、全てのバーコード付加ｃＤＮＡ分子が、後続の、適応性免疫受容体をコードする（例えば、ＩＧ又はＴＣＲ）Ｃ断片遺伝子特異性プライマーとのＰＣＲ増幅反応において、実質的に均一に表され得る。
【０２５０】
逆転写／ｃＤＮＡ第１鎖合成の産物が、次に、固相可逆不動化精製（ＳＰＲＩ）によって単離される。これは、逆転写反応プレートからの各ウェルの内容物を、２５μＬのＡｍｐｕｒｅ（商標）ＸＰ  ＳＰＲＩ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．、Ｂｒｅａ、ＣＡ）懸濁液と混合し、室温で８分間インキュベーションし、次いで室温で、ＭａｇｎａＢｏｔ（商標）磁気セパレーター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、供給メーカーの説明書に従い、ビーズを分離することによって実施される。
【０２５１】
ＳＰＲＩビーズに固定化されたｃＤＮＡの第１鎖を、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２（商標）ＰＣＲ試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いメーカーの説明書に従い、すぐに５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）ＰＣＲ増幅反応物に加える。各反応物について、ｄＮＴＰ、ＵＰＭプライマー混合物、本明細書の他の箇所に記述されるＩＧ／ＴＣＲプライマー混合物、及びＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２（商標）ポリメラーゼ、及びＰＣＲ緩衝液を含む５０μＬのＰＣＲマスターミックスを加える。熱サイクル条件は次の通りとした：９５℃で１分間；次に、９５℃で３０秒間、６３℃で３０秒間、７２℃で３分間のサイクルを３０サイクル；次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングのための調製までの間、反応物を１０℃に保持する。ＰＣＲプライマー配列は：
【０２５２】
【表１０】
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【０２５３】
Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングライブラリの調製
９６ウェルプレートの上下を返し、遠心分離によりＰＣＲ産物をプールし、供給メーカーの説明書に従い、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｍｐｕｒｅ（商標）ＸＰビーズを使用して、プールした産物を精製して、２００〜３００ｂｐよりも短いＤＮＡ断片を除去する。ＤＮＡ純度は、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を使用して、キャピラリー電気泳動によって評価し、ｄｓＤＮＡの大半が６００〜７００ｂｐの範囲内のサイズであることを確認する。ｄｓＤＮＡ産物を、蛍光定量的に、又はＡ２６０  ＵＶ吸光度によって定量する。
【０２５４】
シークエンシングライブラリの構築は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ（部品番号１５０２６４８６  Ｒｅｖ．Ｃ、Ｊｕｌｙ  ２０１２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）サンプル調製プロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）用のインプットとして１μｇの精製ＤＮＡを使用して実施する。このプロトコルは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（登録商標）、ＨｉＳｅｑ（登録商標）２０００、及びＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００シークエンサーにおけるペアドエンドフローセルを使用してシークエンシングすることが可能なシークエンシングライブラリを生成する。
【０２５５】
Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングは、ＭｉＳｅｑ（登録商標）試薬キットｖ２を使用する５００サイクルのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（登録商標）シークエンサーでのシークエンシングプロトコルにより実施される。この化学製品は、ＭｉＳｅｑ（登録商標）装置でのシークエンシングの最高５２５サイクル分の試薬キットを提供し、２５１サイクルのペアドエンド実施に加え、８サイクルのインデックス付けリード２回分に十分な試薬を提供する。Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプロトコルは、ＭｉＳｅｑ（登録商標）ＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ  ｖ２  ＲｅａｇｅｎｔＰｒｅｐＧｕｉｄｅ、製品番号１５０３４０９７  Ｒｅｖ．Ｂ、Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に記述されている。シークエンシングされるＤＮＡ標的の構造の模式図を、図６に示す（Ｉｇ重鎖が一例として使用されている）。
【０２５６】
上述の様々な実施形態を組み合わせて、更なる実施形態を提供することができる。本明細書において言及されている米国特許、米国特許公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び特許以外の出版物は全て、参照によりその全体が援用される。本実施形態の態様は、必要に応じて改変可能であり、また更なる実施形態を提供するために、種々の特許、出願及び公報のコンセプトを利用する。
【０２５７】
これら及び他の変更は、上述の「発明を実施するための形態」を考慮して実施形態に対して行うことができる。一般に、下記の請求項において、使用されている用語は、本明細書及び請求項に開示されている具体的な実施形態に請求項を制限するよう解釈されるべきではなく、そのような請求項に与えられる同等内容全体を備える全ての可能な実施形態を含むものとして解釈されるべきである。したがって、請求項は本開示によって制限されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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