(57)【要約】  本発明は、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ２ではなく、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ１の活性を選択的に阻害することによって、アミロイド斑の大きさおよび密度を減少させ、アミロイド病理に関連した認知低下を減少させ、アルツハイマー病を処置するための方法を特徴とする。
2015529222.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイド斑の大きさおよび密度を減少させるための方法であって、処置を必要とする対象に、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ１の活性を選択的に阻害する剤の有効量を投薬し、それによって対象におけるアミロイド斑の大きさおよび密度を減少させることを含む、前記方法。
【請求項２】
剤が、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ２についてＩＣ５０値を有し、当該値が、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ１について対応するＩＣ５０値の少なくとも２倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
剤が、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ２の発現を阻害しない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
剤が、１ｎＭ〜１００μＭの範囲でＩＣ５０値を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
剤が、対象の脳へ選択的に送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ１の選択的インヒビターが、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ１インヒビターが、リポソームまたはナノ粒子によって投薬される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アミロイド病理に関連した認知低下を減少させるための方法であって、処置を必要とする対象に、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ１の活性を選択的に阻害する剤の有効量を投薬し、それによって対象におけるアミロイド病理に関連した認知低下を減少させることを含む、前記方法。
【請求項９】
剤が、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ２についてＩＣ５０値を有し、当該値がアシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ１について対応するＩＣ５０値の少なくとも２倍である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
剤が、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ２の発現を阻害しない、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
剤が、１ｎＭ〜１００μＭの範囲でＩＣ５０値を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
剤が、対象の脳へ選択的に送達される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ１の選択的インヒビターが、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ１インヒビターが、リポソームまたはナノ粒子によって投薬される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アルツハイマー病を処置するための方法であって、処置を必要とする対象に、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ１の活性を選択的に阻害する剤の有効量を投薬し、それによって対象のアルツハイマー病を処置することを含む、前記方法。
【請求項１６】
剤が、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ２についてＩＣ５０値を有し、当該値がアシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ１について対応するＩＣ５０値の少なくとも２倍である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
剤が、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ２の発現を阻害しない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
剤が、１ｎＭ〜１００μＭの範囲でＩＣ５０値を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
剤が、対象の脳へ選択的に送達される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ１の選択的インヒビターが、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ１インヒビターが、リポソームまたはナノ粒子によって投薬される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
アミロイド斑の大きさおよび密度を減少させるための方法であって、処置を必要とする対象に、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ１の発現を選択的に阻害するマイクロＲＮＡを投薬し、それによって対象におけるアミロイド斑の大きさおよび密度を減少させることを含む、前記方法。
【請求項２３】
マイクロＲＮＡが、対象の脳へ選択的に送達される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アミロイド病理に関連した認知低下を減少させるための方法であって、処置を必要とする対象に、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ１の発現を選択的に阻害するマイクロＲＮＡを投薬し、それによって対象におけるアミロイド病理に関連した認知低下を減少させることを含む、前記方法。
【請求項２５】
マイクロＲＮＡが、対象の脳へ選択的に送達される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アルツハイマー病を処置するための方法であって、処置を必要とする対象に、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ１の発現を選択的に阻害するマイクロＲＮＡを投薬し、それによって対象のアルツハイマー病を処置することを含む、前記方法。
【請求項２７】
マイクロＲＮＡが、対象の脳へ選択的に送達される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
緒言
この発明は、国立衛生研究所より授与された認可番号R01HL060306の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
アルツハイマー病は、２つの病理学的特質、すなわち、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解切断に由来するアミロイドベータ（Ａβ）ペプチドの凝集体である、細胞外における斑の蓄積、および高リン酸化型のタウ(tau)の細胞内における蓄積を特徴とする（Hardy & Selkoe (2002) Science 297:353-356）。ＡＰＰは、２つの競合する経路、異なる細胞内におけるタンパク質分解の部位およびＡＰＰ内の切断点によって識別されるアルファおよびベータセクレターゼ経路によって切断され得る（Thinakaran & Koo (2008) J. Biol. Chem. 283:29615-29619）。
【０００３】
いくつかのプロテアーゼはアルファ切断を生じさせることができ、当該切断後、プレセニリン１を触媒サブユニットとして含むガンマセクレターゼ複合体はさらにＡＰＰフラグメントを切断し、小さな非アミロイド形成的フラグメントを産生する。ベータセクレターゼ経路は、ベータセクレターゼ複合体およびガンマセクレターゼ複合体による連続的切断に関与し、Ａβを生成する。ＡＰＰおよびセクレターゼはすべて膜に結合したタンパク質／酵素である。
【０００４】
細胞におけるコレステロール含有量は、細胞膜における様々なセクレターゼの酵素活性を調節するコレステロールの能力に一部依拠して、Ａβの産生に影響を及ぼし得ることが研究によって示された（Wolozin (2004) Neuron 41:7-10）。コレステロールの代謝もまた、他の様式においてアルツハイマー病の病因に関わる（Jiang, et al. (2008) Neuron 58:681-693; Wellington (2004) Clin. Genet. 66:1-16; Hartmann (2001) Trends Neurosci. 24:S45-48）。
【０００５】
脳においてコレステロールは内因性の生合成に由来する（Dietschy & Turley (2004) J. Lipid Res. 45:1375-1397）。転写因子ＳＲＥＢＰ２は、律速酵素ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）を含む、コレステロールの生合成に関与する酵素の発現を制御する（Goldstein, et al. (2006) Cell 124:35-46）。肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）を含む他の転写因子は、ａｐｏＥ、ＡＢＣＡ１および他を含む（Wang, et al. (2008) FASEB J. 22:1073-1082; Tarr & Edwards (2008) J. Lipid Res. 49:169-182）、コレステロールの輸送において機能するタンパク質の発現を制御する（Repa & Mangelsdorf (2000) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16:459-481; Beaven & Tontonoz (2006) Annu. Rev. Med. 57:313-329）。
【０００６】
脳において、コレステロールは、脳に特異的な酵素、２４−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ４６Ａ１）（Russell, et al. (2009) Annu. Rev. Biochem. 78:1017-1040）によって２４Ｓ−ヒドロキシコレステロール（２４ＳＯＨ）と呼ばれるオキシステロールに酵素的に変換することができる；２４ＳＯＨの濃度は、脳における他のオキシステロールのそれをはるかに超える（Lutjohann, et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9799-9804 Bjorkhem (2006) J. Intern. Med. 260:493-508; Karu, et al. (2007) J. Lipid Res. 48:976-987）。
【０００７】
２４ＳＯＨを含む様々なオキシステロールは、無処置の細胞およびin vitroでのステロール合成を下方制御することができる（Song, et al. (2005) Cell Metab. 1:179-189; Wang, et al. (2008) J. Proteome Res. 7:1606-1614）。ニューロンに提供された場合、２４ＳＯＨはＡβの分泌を減少させる（Brown, et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:34674-34681）。しかしながら、２４ＳＯＨまたは他のオキシステロールがin vivoで同様な様式で作用するかどうかはまだ実証されていない。２４ＳＯＨのレベルは、アルツハイマー病患者からの脳サンプルにおいて減少することが示されており（Heverin, et al. (2004) J. Lipid Res. 45:186-193）、２４ＳＯＨとアルツハイマー病との関係性を示唆する。
【０００８】
アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）は遊離コレステロールをコレステロールエステルに変換し、細胞のコレステロール代謝における重要な酵素の１つである。２つのＡＣＡＴ遺伝子が２つの異なる酵素、ＡＣＡＴ１およびＡＣＡＴ２（ＳＯＡＴ１およびＳＯＡＴ２としても知られる）をコードするものとして同定された。ＡＣＡＴ１およびＡＣＡＴ２の両方は肝臓および腸において存在するが、これらの組織内において、いずれかの酵素を含有する細胞は別個のものであり、ＡＣＡＴ１およびＡＣＡＴ２が別々の機能を有することを示唆する。両方の酵素は、脂質異常症およびアテローム性動脈硬化症を処置するための潜在的な薬剤標的である。
【０００９】
ヒトＡＰＰ（７５１）を発現するトランスジェニックマウスの脳において、ロンドン型（Ｖ７１７Ｉ）およびスウェーデン型（Ｋ６７０Ｍ／Ｎ６７１Ｌ）の変異を含有するアルツハイマー病様病理は、非選択的ＡＣＡＴインヒビター、ＣＰ−１１３，８１８（Chang et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:28083-28092）を使用することによって実証された（Hutter-Paier, et al. (2004) Neuron. 44(2):227-38）。
【００１０】
ＣＰ−１１３，８１８を用いた２ヶ月の処置によって、アミロイド斑の蓄積を８８％〜９９％低減し、膜／不溶性のアミロイドβレベルを８３％〜９６％低減することが示されたが、脳のコレステリル−エステルもまた８６％減少することが示された。さらに、可溶性のＡβ（４２）は脳のホモジェネートにおいて３４％低減された。空間学習はわずかに改善され、減少したＡβレベルと関連した。非トランスジェニックの同腹子においてもまた、ＣＰ−１１３，８１８は脳における内因性ＡＰＰの外部ドメイン排出(shedding)を低減した。
【００１１】
ＡＣＡＴ１発現の５０％の減少によって、コレステリルエステルのレベルを２２％低減し、ＡＰＰのタンパク質分解プロセッシングを低減し、Ａβの分泌を４０％減少させること（Huttunen, et al. (2007) FEBS Lett. 581(8):1688-92）もまたin vitroの神経細胞株において示された。この点について、ＡＣＡＴの阻害は、アルツハイマー病を処置するための戦略として働くことができるであろうと示唆された（Huttunen & Kovacs (2008) Neurodegener. Dis. 5(3-4):212-4）。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、アミロイド病理に関連した認知低下を減少させ、処置を必要とする対象に、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ１（ＡＣＡＴ１）の発現または活性を選択的に阻害する剤を投薬することによってアルツハイマー病を処置する、アミロイド斑の大きさおよび密度を減少させるための方法を特徴とする。一態様において、剤はＡＣＡＴ１のＩＣ５０値を有し、当該ＩＣ５０値は対応するＡＣＡＴ２のＩＣ５０値の半分以下である。
【００１３】
別の態様において、剤はＡＣＡＴ２の発現を阻害しない。代替の態様において、剤はｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ分子である。さらなる態様において、剤は１ｎＭ〜１００μＭの範囲でＩＣ５０値を有する。本発明の特定の態様において、剤を対象の脳に選択的に送達する。特定の態様において、剤をリポソームまたはナノ粒子によって投薬する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、野生型（ＷＴ）アルツハイマー病（ＡＤ）マウスの半脳(hemibrain)、または、ＰＢＳの注射、もしくは陰性対照のｍｉＲＮＡを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターもしくはＡＣＡＴ１（ＡＣＡＴ１  ＫＤ）を標的とするｓｉＲＮＡを用いた注射の後、Ａｃａｔ１（Ａｃａｔ１−／−）を欠損したＡＤマウスの半脳における、アミロイドベータ４２（Ａβ１−４２）レベルを示す。マウスを生後１０ヶ月で注射し、生後１２ヶ月で分析した。
【００１５】
群１、ＷＴマウス（ｎ＝１）；群２、ＰＢＳで注射した混合バックグラウンドＡＤマウス（ｎ＝６）；群３、陰性対照のＡＡＶで注射した混合バックグラウンドＡＤマウス（ｎ＝８）；群４、Ａｃａｔ１  ＫＤ  ＡＡＶで注射した混合バックグラウンドＡＤマウス（ｎ＝１３）；群５、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で注射した混合バックグラウンドＡＤ／Ａｃａｔ１−／−マウス（ｎ＝９）；群６、陰性対照のＡＡＶ（ＡＡＶ  ＮＣ）で注射した混合バックグラウンドＡＤ／Ａｃａｔ１−／−マウス（ｎ＝４）；群７、Ａｃａｔ１  ＫＤ  ＡＡＶで注射した混合バックグラウンドＡＤ／Ａｃａｔ１−／−マウス（ｎ＝４）。
【００１６】
【図２】図２は、ＷＴマウス、ＡＤマウスおよびＡＤ／Ａｃａｔ−／−マウスの半分の脳における、ヒト全長アミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）レベルおよびＡβ１−４２の分析の結果を示す。Ａβ１−４２のＥＬＩＳＡアッセイレベルの結果をパネル２Ａに示す。スクロース緩衝液におけるマウス脳ホモジェネートのサンプルプールをギ酸抽出に供した。中和した抽出物をＡβ１−４２についてＥＬＩＳＡによってアッセイした。ギ酸抽出を種々のサンプルプールについて３つの別々の回に分けて行い、続いてＥＬＩＳＡを行った；各々の回においてＥＬＩＳＡアッセイを各々のサンプルについて二重または三重に行った。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【００１７】
パネル２Ｂにおいて、ｈＡＰＰ定量の結果を示す。ＰＢＳ、ＡＡＶ−ＮＣまたはＡＡＶ−Ａｃａｔ１のいずれかで処置し、生後１０ヶ月で脳注射を受けた生後１２ヶ月のＡＤまたはＡＤ／Ａｃａｔ−／−マウスからの脳ホモジェネートサンプルプールにおける、総（成熟＋未成熟）ｈＡＰＰの６つのウェスタンブロットの定量。総ｈＡＰＰバンド強度をレーンにおけるポンソーＳ染色に対して規格化した；データをＰＢＳで処置したＡＤマウスに対して相対的に示す。エラーバーは平均＋ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５。
【００１８】
当該図において、以下の省略を適用する：ＷＴ＝野生型マウス；ＡＤ＝アルツハイマー病マウス；ＡＤ／Ａｃａｔ−／−＝Ａｃａｔ１遺伝子がノックアウトされたアルツハイマー病マウス；ＡＡＶ＝アデノ随伴ウイルス；ＡＣＡＴ＝アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ；ＡＤ＝アルツハイマー病；ｈＡＰＰ＝ヒトアミロイド前駆体タンパク質；ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水。
【００１９】
本発明の詳細な説明
特定の脳領域におけるアミロイドベータ−ペプチド（ＡベータまたはＡβ）の蓄積は、アルツハイマー病（ＡＤ）の病理学的特質である。ＡＣＡＴ１は、ＡＣＡＴ２と異なり、in vivoでのＡＤのアミロイド病理において重要な役割を果たすことが現在見出されている。具体的には、ＡＣＡＴ１はアミロイド斑の大きさおよび密度、ならびにＡＤのマウスモデルにおいてin vivoで現れた認知低下を調節する。神経細胞株においてin vitroで行った従来の報告（Huttunen, et al. (2007) FEBS Lett. 581(8):1688-92）に反して、部分的なＡＣＡＴ１欠損は、ＡＤの動物モデルにおいて、in vivoでＡβペプチド１−４２の有意な減少をもたらすことが示されている。
【００２０】
さらに、このＡＤマウスモデルにおいて、認知欠損は生後６ヶ月で明らかになる；Ａβペプチド１−４２蓄積もまた生後１０ヶ月で明らかになる。ＡＣＡＴ１を標的とするｓｉＲＮＡを発現するＡＡＶを生後１０ヶ月のＡＤマウスに送達した場合、Ａβ１−４２ペプチドは、ｓｉＲＮＡ処置（生後１２ヶ月）を開始して２ヶ月以内で減少することが実証された。この結果は、ＡＣＡＴ１がＡＤを処置するための標的であり、病の進行を処置するか、または病が発生することを抑制することを明確に実証する。
【００２１】
したがって、本発明は、アミロイド斑の大きさおよび密度を減少させ、アミロイド病理に関連した認知低下を減少させ、ＡＤを処置するための組成物および方法を特徴とする。この発明の方法にしたがって、ＡＤを有するか、有することが疑われるか、またはＡＤを有する素因がある対象にＡＣＡＴ１の活性を選択的に阻害する剤の有効量を投薬し、対象におけるアミロイド斑の大きさおよび密度が減少させ、アミロイド病理に関連した認知低下が減少させ、かつ／またはＡＤの進行を遅くさせるか、または抑制し、それによってＡＤを処置する。
【００２２】
本明細書中に使用されるように、「ＡＣＡＴ１の選択的インヒビター」または「ＡＣＡＴ１−選択的インヒビター」は、ＡＣＡＴ１酵素のインヒビターであるが、ＡＣＡＴ２を阻害しないか、または極めて小さい程度で阻害する、あらゆる分子種である。ＡＣＡＴ１インヒビターの選択性を評価するための方法は、当該分野で知られており、物質の最大半量（５０％）の阻害濃度（ＩＣ）（すなわち５０％ＩＣまたはＩＣ５０）、インヒビターの結合親和性（すなわちＫｉ）、および／またはＡＣＡＴ１のインヒビターの最大半量の有効濃度（ＥＣ５０）を、ＡＣＡＴ２と比較して決定することを含むが、それらに限定されない、あらゆる従来のアッセイに基づいてもよい。例えば、Lada, et al. (2004) J. Lipid Res. 45:378-386および米国特許第５，９６８，７４９号を参照。
【００２３】
当業者が理解するように、ＡＣＡＴインヒビターの低いＩＣ５０値は、インヒビターがＡＣＡＴ１またはＡＣＡＴ２の活性のインヒビターとしてより効力があるか、またはより活性であることを示す。したがって、選択的なＡＣＡＴインヒビターは、ＡＣＡＴ１の阻害のＩＣ５０値がＡＣＡＴ２の阻害のＩＣ５０値よりも低いものである。かかるアッセイで用いることができるＡＣＡＴ１およびＡＣＡＴ２タンパク質は、当該分野で周知であり、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号NP_000010（ヒトＡＣＡＴ１）およびNP_005882（ヒトＡＣＡＴ２）に記載されている。米国特許第5,834,283号もまた参照。
【００２４】
特定の態様において、ＡＣＡＴ１の選択的インヒビターは、対応するＡＣＡＴ２のＩＣ５０値よりも少なくとも２倍、または、より望ましくは、少なくとも３培、４倍、５倍または６倍低いＡＣＡＴ１のＩＣ５０値を有する剤である。最も望ましくは、ＡＣＡＴ１の選択的インヒビターは、ＡＣＡＴ２のＩＣ５０値よりも少なくとも１桁または少なくとも２桁低いＡＣＡＴ１のＩＣ５０値を有する。
【００２５】
ＡＣＡＴ１活性の選択的インヒビターが記載されている。例えば、Ikenoya, et al.（(2007) Atherosclerosis 191:290-297）は、Ｋ−６０４がヒトＡＣＡＴ１については０．４５μｍｏｌ／Ｌ、ヒトＡＣＡＴ２については１０２．８５μｍｏｌ／ＬのＩＣ５０値を有することを教示する。よって、Ｋ−６０４はＡＣＡＴ２よりもＡＣＡＴ１に２２９倍より選択的である。さらに、ピロ炭酸ジエチルは、ＡＣＡＴ−２（ＩＣ５０＝１７０μＭ）と比較して４倍強い活性（ＩＣ５０＝４４μＭ）でＡＣＡＴ１を阻害することが示されている（Cho, et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Comm. 309:864-872）。
【００２６】
Ohshiro, et al. ((2007) J. Antibiotics 60:43-51)は、ボーベリオライドＩ（０．６μＭ対２０μＭ）およびＩＩＩ（０．９μＭ対＞２０μＭ）を用いた、ＡＣＡＴ１対ＡＣＡＴ２の選択的阻害を教示する。さらに、ボーベリオライドアナログ２５８、２８０、２７４、２８５および３０１は６〜７の範囲でｐＩＣ５０値を有するＡＣＡＴ１選択的阻害を示す（Tomoda & Doi (2008) Accounts Chem. Res. 41:32-39）。Lada, et al. ((2004) J. Lipid Res. 45:378-386) は、ＡＣＡＴ２についてよりもＡＣＡＴ１について６６〜１８７倍低いＩＣ５０値で、ＡＣＡＴ２よりも効率的にＡＣＡＴ１を阻害する、化合物（当該文献中に化合物１Ａとして示される）、およびその誘導体（当該文献中に化合物１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄとして示される）を教示する。
【００２７】
さらに、Lee, et al.（(2004) Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:3109-3112）は、サウセルネオールＢおよびマナッサンチンＢを含有するハンゲショウの根のメタノール抽出物がＡＣＡＴ活性を阻害することを教示する。サウセルネオールＢはヒトＡＣＡＴ−１（ｈＡＣＡＴ１）およびヒトＡＣＡＴ−２（ｈＡＣＡＴ２）をそれぞれ４３．０および１２４．０μＭのＩＣ５０値で阻害するが、マナッサンチンＢは８２．０μＭのＩＣ５０値でｈＡＣＡＴ−１を阻害し、１ｍＭという極めて高い濃度でｈＡＣＡＴ２の３２％の阻害を示すに過ぎない。
【００２８】
望ましくは、本発明のＡＣＡＴ１−選択的インヒビターは、１ｎＭ〜１００μＭの範囲でＩＣ５０値を有する。より望ましくは、本発明のＡＣＡＴ１−選択的インヒビターは１００μＭ以下のＩＣ５０値を有する。最も望ましくは、本発明のＡＣＡＴ１−選択的インヒビターはｎＭ範囲におけるＩＣ５０値を有する（例えば１〜９９９ｎＭ）。
【００２９】
上記参照のＡＣＡＴ１−選択的インヒビターに加えて、あらゆる従来の薬剤スクリーニングアッセイを、追加のもしくはより選択的なＡＣＡＴ１インヒビター、または既知のＡＣＡＴ１インヒビターの誘導体もしくはアナログを同定または選択するために用いることができると考えられる。例えば、Lada, et al. (2004) J. Lipid Res. 45:378-386を参照。かかる剤は、純粋な剤または剤の混合物の集合を含有する化合物のライブラリーから同定し、得ることができる。
【００３０】
純粋な剤の例は、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質、合成または半合成の化学物質および精製した天然物を含むが、それらに限定されない。剤の混合物の例は、原核細胞または真核細胞および組織の抽出物、ならびに醗酵ブロスおよび細胞または組織の培養上清を含むが、それらに限定されない。剤の混合物の場合、所望の活性を有するそれらの粗混合物を同定するだけなく、治療上の薬剤としての特性評価および開発のために、混合物からの活性成分の精製をモニターしてもよい。
【００３１】
特に、同定した混合物は、沈殿、遠心分離、濾過、限外濾過、選択的消化、抽出、クロマトグラフィー、電気泳動または複合体形成を含んでもよいが、それらに限定されない、当業者に一般的に知られた方法によって連続的に分画化してもよい。各々の得られたサブ分画は、純粋な生理活性剤が得られるまで、当初のアッセイを使用して所望の活性についてアッセイしてもよい。
【００３２】
ライブラリースクリーニングは、例えば９６ウェル多様性のマルチウェルプレートなどにおける多重反応の迅速な準備および処理を可能にする、あらゆるフォーマットにおいて行うことができる。剤ならびにアッセイ成分のストック溶液は、手作業で準備し、後に続くすべてのピペット操作、希釈、混合、洗浄、インキュベート、サンプル読み出しおよびデータ収集は、市販のロボットピペット操作機器、自動化ワークステーションおよびアッセイによって生成されるシグナルを検出するための分析機器を使用して行われる。
【００３３】
かかる検出器の例は、ルミノメーター、分光光度計、熱量計および蛍光光度計およびラジオアイソトープの崩壊を測定する装置を含むが、それらに限定されない。あらゆる好適なＡＣＡＴ酵素アッセイを、かかるスクリーニングアッセイにおいて使用することができるものと考えられる。さらに、ＡＣＡＴ１インヒビターの前臨床有効性は、従来のＡＤの動物モデルを使用して評価することができる。従来のＡＤの動物モデルの例は、科学文献において議論されるモデルおよび本明細書中に引用されるモデルを含むが、それらに限定されない。
【００３４】
これらのモデルの多くは、マウスが、一定の遺伝子を発現するか、または一定の遺伝子の発現を除去するために遺伝子的に改変された（トランスジェニックマウス）モデルである。かかるトランスジェニックマウスモデルは、ヒトにおける潜在的な治療上の活性について薬剤をスクリーニングするための使用において良く許容され、薬剤開発において一般的に使用される。
【００３５】
本明細書中に開示されるとおり、ＡＣＡＴ１の発現を調節することなく、ＡＣＡＴ１の活性を選択的に阻害する多数の好適な分子がある。したがって、本発明の一態様において、「ＡＣＡＴ１の選択的インヒビター」は、分子、例えばアンチセンス分子またはリボザイムなどを特異的に除外する。しかしながら、代替の態様において、ＡＣＡＴ１選択的インヒビターは、ＡＣＡＴ２の発現を調節することなく、ＡＣＡＴ１の発現を選択的に阻害する分子である。いくつかのＲＮＡｉ分子は脳組織において著しい神経毒性を引き起こすことが示されているが（McBride, et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:5868-5873）、この発明の特定の態様は、１または２以上のｓｉＲＮＡおよび／またはマイクロＲＮＡ分子をＡＣＡＴ１−選択的インヒビターとして含む。
【００３６】
当該分野で従来のものであるとおり、ｍｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡは、遺伝子発現のポスト転写制御因子として作用する内因性の遺伝子に由来する、１９〜２５ヌクレオチドのノンコーディングＲＮＡを指す。それらは、ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ酵素ダイサーによって、プレ−ｍｉＲＮＡと呼ばれる長い（約７０〜８０ヌクレオチド）ヘアピン様前駆体から処理される。マイクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＰと呼ばれるリボヌクレオタンパク質複合体において集合し、アンチセンス相補性によってそれらの標的部位を認識し、それによってそれらの標的遺伝子の下方制御を仲介する。
【００３７】
実例として、マウスＡＣＡＴ１マイクロＲＮＡ分子について標的配列は、表２において配列番号３７〜４０として列記したものを含むが、それらに限定されない。ヒトＡＣＡＴ１遺伝子（例えば、参照によって取り込まれたＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号NM_000019）に対する人工マイクロＲＮＡもまた生成され、ヒト細胞においてヒトＡＣＡＴ１タンパク質発現を８０％減少させることが示されている。ヒトＡＣＡＴ１を標的とする典型的なマイクロＲＮＡ配列は、表４に列記したものを含むが、それらに限定されない。同様な様式において、霊長動物のＡＣＡＴ１遺伝子に対するマイクロＲＮＡ（例えば、参照によって取り込まれたＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号XM_508738）を開発し、霊長動物ＡＣＡＴ１の発現を選択的に阻害するために使用することができる。
【００３８】
ＡＣＡＴ１の発現を選択的に阻害する、ｓｉＲＮＡおよび／またはマイクロＲＮＡ分子は、裸の分子として、またはｓｉＲＮＡおよび／またはマイクロＲＮＡをコードする核酸を有するベクター（例えば、プラスミド、またはウイルスベクター、例えばアデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスベクターなど）によって投薬することができる。望ましくは、本発明にしたがって使用するベクターは、ｓｉＲＮＡおよび／またはマイクロＲＮＡの発現を促進するために、すべての必要な制御配列を提供する。
【００３９】
かかる発現制御配列は、プロモーター配列、エンハンサー配列などを含んでもよいが、それらに限定されない。かかる発現制御配列、ベクターなどは周知であり、当業者によって日常的に用いられる。特定の態様において、ｓｉＲＮＡおよび／またはマイクロＲＮＡ分子は、非ウイルス送達法、例えばリポソーム、ナノ粒子またはリポソーム−ｓｉＲＮＡ−ペプチド複合体によって送達される（Pulford et al. 2010. PloS One 5:e11085）。
【００４０】
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、安定性を増加させるため、ヌクレアーゼ分解などに対する耐性を増加させるために、当該分野で知られている方法によって改変してもよい。これらの改変は、当該分野で知られ、オリゴヌクレオチドのバックボーンを改変すること、糖部位を改変すること、または塩基を改変することを含むが、それらに限定されない。一態様において、本発明は、ｓｉＲＮＡ分子を特徴とし、ここでｓｉＲＮＡ分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含み、アンチセンス領域はＡＣＡＴ１遺伝子によってコードされたＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列であり、センス領域はアンチセンス領域に相補的であるヌクレオチド配列を有する。
【００４１】
一定の態様において、ｓｉＲＮＡは２つの核酸分子、例えばセンスおよびアンチセンス鎖で構成される。他の態様において、ｓｉＲＮＡは、センスおよびアンチセンス鎖がリンカーによって連結している、１つの核酸分子で構成される。一態様において、アンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−デオキシ−プリンヌクレオチドを含む。別の態様において、アンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドを含む。
【００４２】
上記いずれかの態様において、アンチセンス領域は、アンチセンス領域の３’末端におけるホスホロチオエートのヌクレオチド間結合を含んでもよい。代替の態様において、アンチセンス領域は、アンチセンス領域の３’末端におけるグリセリル改変を含む。上記のあらゆるｓｉＲＮＡ分子の別の態様において、あらゆるアンチセンス鎖（例えばオーバーハング領域）の非相補的領域において存在するヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。例えばUS 8,232,383；WO 00/44914；またはWO 01/68836を参照。
【００４３】
示されるように、ＡＣＡＴ１の選択的インヒビターによって、アミロイド斑の大きさおよび密度を減少させるための方法、アミロイド病理に関連した認知低下を減少させるための方法、およびＡＤを処置するための方法における用途が見い出される。一般的に、かかる方法は、処置を必要とする対象に、ＡＣＡＴ１の選択的インヒビターを、ＡＣＡＴ１の活性を少なくとも６０％〜１００％まで有効に低減する、６０％〜１００％の阻害のレベルを含む、量で、投薬することに関与する。
【００４４】
本発明の剤を用いた処置の利益を受ける対象は、ＡＤを有することが確認された対象、ＡＤを有することが疑われる対象、またはＡＤを有する素因がある対象（例えば、ダウン症候群の家族歴を有する対象またはアルツハイマー病に対する遺伝子的素因を有する対象）を含む。この発明の文脈において、対象はヒト、伴侶動物（例えば、イヌまたはネコ）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタまたはウマ）または動物学的な動物（例えばサル）を含む、あらゆる哺乳動物であってもよい。特定の態様において対象はヒトである。
【００４５】
この発明の一定の態様はin vivoでの用途を含むが、本発明の剤のin vitroでの使用は、脳の特定の細胞、組織または領域に対するＡＣＡＴ１阻害の効果を検討することもまた考えられる。処置に加え、本発明の剤によって、ＡＤの動物モデルにおけるアミロイド病理の表現型の結果（例えば、斑形成率または認知低下率）をモニターする用途もまた見出される。
【００４６】
治療上の用途において使用する場合、本発明のＡＣＡＴ１−選択的インヒビターは、ＡＣＡＴ１−選択的インヒビターを用いた処置を受けない対象と比較して、対象においてアミロイド斑の大きさおよび密度を減少させる治療上の利益、対象においてアミロイド病理に関連した認知低下を減少させるか、または遅らせる治療上の利益、および／または対象におけるＡＤを処置する治療上の利益を有するだろう。本発明のＡＣＡＴ１−選択的インヒビターは、対象におけるアミロイド斑の大きさおよび密度を、未処置の対象と比較して１０％〜６０％またはそれ以上のあらゆる量で減少させることが期待される。
【００４７】
同様に、本発明のＡＣＡＴ１−選択的インヒビターは、アミロイド病理に関連した認知低下を、（例えば、Blessed Information-Memory-Concentration Test、Blessed Orientation-Memory-Concentration TestおよびShort Test of Mental StatusまたはMini-Mental State Exminationを含むだろうが、それらに限定されない、一般的に適用された試験によって決定されるように）未処置の対象と比較して、１０％〜６０％またはそれ以上のあらゆる量で減少させるか、または遅らせることが期待される。
【００４８】
認知評価は、新規な情報の学習および保持（例えば、対象が最近の会話、出来事、予約を思い出すことに苦労すること；または頻繁に物体を置き違えること）をモニターすること、複雑な課題の扱い（例えば、対象が、思考の複合な連続性(train)を追うことができる、多くの段階を必要とする課題、例えば小切手帳の差引勘定をすることができる、または食事を調理することができるなど）をモニターすること、推論能力（例えば、対象が仕事または家庭での問題に対して合理的な計画で対処できる、例えば浴室が浸水した場合に何をすべきかわかるなど）をモニターすること、対象の空間的な能力および方向定位(orientation)（例えば、対象が運転できる、家の周辺の物を整理できる、または馴染みの場所の周辺で彼または彼女のところにたどり着くことができるなど）をモニターすること、および／または言語（例えば、対象が、彼または彼女が何を言いたいのか表現するための言葉を見つけることが困難であること、および会話についていくことが困難であること）をモニターすることを含んでもよい。観察および／または測定されるＡＤの兆候および症状の減少に基づき、本発明の剤を用いた処置を受ける対象において、ＡＤを抑制したり、または遅らせたりして、それによってＡＤを処置するであろうことが期待される。
【００４９】
ＡＣＡＴ１−選択的インヒビターの成功した臨床使用は、当業者、例えば臨床医または獣医などによって、日常的な臨床診療、例えば、本明細書中に開示される方法によって認知低下をモニターすること、機能的な活性のレベルをモニターまたは測定すること（例えばthe Functional Activities Questionnaire）、および当該分野で知られている方法によって感覚障害および身体障害のレベルをモニターまたは測定することに基づいて決定することができる。
【００５０】
治療上の使用のために、ＡＣＡＴ１−選択的インヒビターは、適切な投与量で薬学的に許容可能な担体を用いて製剤化してもよい。かかる薬学的な組成物は、当該分野で周知の方法によって調製することができ、当該分野で周知の担体を含有してもよい。かかる方法および成分の一般的に認識された概要は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro, editor, 20th ed. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000である。薬学的に許容可能な担体、組成物または媒体、例えば液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤または溶媒封入材料などは、対象においてある臓器または体の部分から、別の臓器または体の部分に剤を運搬または輸送することに関与する。
【００５１】
各々の担体は、製剤の他の成分と互換性があるという意味で許容可能でなければならず、いくつかの毒性のレベルもまた期待され得るが、患者に対して著しく有害であってはならない。当業者は、対象において使用したあらゆる剤が、対象に対する利益が対象に対するリスクを上回ることものであることを、どのように確保するかを理解するだろう。ＡＤの深刻な性質を考慮すれば、対象の健康に対する毒性またはリスクのいくつかのレベルを有する剤は、ＡＤを処置するための有用な治療剤として許容され、開発し得るだろう。
【００５２】
薬学的に許容可能な担体として働くことができる材料の例は、糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロースなど；デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど；トラガント粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばココアバターおよび座薬ワックスなど；油、例えばピーナッツ油、綿種子油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油など；グリコール、例えばプロピレングリコールなど；ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど；エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；アルギン酸；パイロジェンを含まない水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；ｐＨ緩衝溶液；ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；および薬学的な製剤において用いられる、他の無毒性の互換性のある物質を含む。湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなど、ならびに着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味剤、着香剤および芳香剤、防腐剤および抗酸化剤もまた前記組成物に存在してもよい。
【００５３】
本発明の組成物は、非経口的(例えば、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内注射による)、局所的、経口的、鼻腔内、膣内または直腸に、標準的な医療行為によって投薬することができる。
【００５４】
本発明の一定の態様において、ＡＣＡＴ１−選択的インヒビターは、脳に選択的に送達される。本発明の目的のために、「脳への選択的な送達」または「脳へ選択的に送達された」は、剤を対象の脳へ直接的に投薬すること（例えばシャントまたはカテーテルによる；例えば米国特許出願第20080051691号を参照）、直接的な髄腔内注射なしで対象の傍脊椎(perispinal)空間へ直接的に投薬すること（例えば米国特許第7,214,658号を参照）、または血液脳関門を横切る送達を促進する形態において投薬すること、それによって他の臓器または組織におけるＡＣＡＴ１阻害と関連した潜在的な副作用を低減させることを意味することを意図する。
【００５５】
この点について、安定剤の存在下におけるモノマーの重合化によって形成されるナノ粒子中への剤の製剤化（例えば、メチルメタクリル酸、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸−コポリマーまたはポリグルタルアルデヒド）は、剤によって他の臓器に影響を及ぼすことなく血液脳関門の通過を可能にする。例えば、参照によってその全体が本明細書中に取り込まれた、米国特許第7,402,573号を参照。さらに、マイクロＲＮＡを脳に選択的に送達するための典型的な系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系である。例えば、Cearley & Wolfe (2007) J. Neurosc. 27(37):9928-9940を参照。
【００５６】
ＡＣＡＴ１−選択的インヒビターの選択した投与量レベルは、用いる本発明の特定の剤の活性、投薬の経路、投薬の時間、用いる特定の剤の排泄率または代謝率、処置の持続、用いた特定の剤と併せて使用する他の薬剤、化合物および／または材料、年齢、性別、重さ、症状、総合的な健康および処置する患者の病歴および医療分野において周知の他の因子を含む様々な因子に依存するだろう。
【００５７】
当業者、例えば医師または獣医などは、同様な化合物の投薬に基づいて、または日常的な実験的な決定の後に、必要とされる薬学的な組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師または獣医は、所望の治療上の効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで剤の投与量を開始させ、所望の効果を達成するまで投与量を徐々に増加させることができるであろう。これは、当業者の技術の範囲内であると考えられ、最適な投与量を決定するために、特定の剤または同様な剤について既存の文献を調べることができる。
本発明を、以下の非限定的な例によって、より詳細に記載する。
【００５８】
例１：方法
マウス。マウスを標準的な固形飼料で不断給餌し、単一換気ケージにおける病原体を含まない環境において維持し、１２時間の明／暗スケジュールで保った。
Ａｃａｔ１−／−Ａｌｚ（Ａ１−／Ａｌｚ）およびＡｃａｔ２−／−／Ａｌｚ（Ａ２−／Ａｌｚ）マウスの生成。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおけるＡｃａｔ１−／−およびＡｃａｔ２−／−マウス（Meiner, et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14041-14; Buhman, et al. (2000) Nat. Med. 6:1341-1347）は当該分野で知られている。ハイブリッド１２９／Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおける３ＸＴｇ−Ａｌｚマウス（アルツハイマー病マウス）は、神経細胞に特異的なプロモーターの下で２つの変異ヒト導入遺伝子、スウェーデン型変異（ｈＡＰＰｓｗｅ）を有するｈＡＰＰおよび変異ｈタウ（ｈタウＰ３０１Ｌ）を含有し、ノックイン変異プレセニリン１（ＰＳ１Ｍ１４６Ｖ）を含有する（Oddo, et al. (2003) Neuron 39:409-421）。
【００５９】
マウス組織分離。動物をＣＯ２窒息によって犠牲死させた。脳、副腎および肝臓を迅速に分離した。マウス脳を氷上で５分以内に様々な領域に解剖し、すぐに使用するか（ＡＣＡＴ酵素活性アッセイについて）、または他の使用のためにドライアイス上で迅速に凍結した。
【００６０】
ＡＣＡＴ活性アッセイ、免疫沈降（ＩＰ）およびイムノブロット分析。分離したばかりの組織サンプルを、氷上で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．８中においてホモジナイズし、２．５％ＣＨＡＰＳおよび１Ｍ  ＫＣｌを使用して洗剤中に可溶化した。ホモジェネートを１００，０００ｇで４５分間遠心分離した。上清を混合ミセルにおいてＡＣＡＴ活性アッセイならびにＩＰおよびイムノブロット分析（Chang, et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:35132-35141; Chang, et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:28083-28092）に使用した。
【００６１】
ＲＮＡ分離、ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲ。総ＲＮＡを、TRIZOL試薬（Invitrogen）を用いて分離し、−８０℃で保存し、製造業者によって提供されたプロトコルを使用してＲＴ−ＰＣＲ実験に使用した。リアルタイムＰＣＲをDYNAMO HS SYBR Green qPCR kitを使用して行った（New England Biolabs）。相対定量をデルタＣＴ法（Pfaffl, et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:e36）を使用して決定した。マウスＡＣＡＴ１およびヒトＡＰＰプライマーを、Oligo 4.0 Primer Analysis Softwareを使用して設計した。マウスＡＣＡＴ２、神経フィラメント１２０−ｋＤ（ＮＦ１２０）、ＧＡＰＤＨプライマー配列は、当該分野で知られている（Sakashita, et al. (2003) Lab. Invest. 83:1569-1581; Kuwahara, et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:763-766; Pan, et al. (2007) BMC Mol. Biol. 8:22）。本明細書中で使用したプライマーの配列を表１に列記する。
【００６２】
【表１】
2015529222.tif 000003
【００６３】
ＡＣＡＴ１、ＡＣＡＴ２、ＧＡＰＤＨ、ＮＦ１２０およびヒトＡＰＰの増幅のＰＣＲ反応条件は、９４℃で５分間の最初の変性を含んだ。その後、９４℃で１０秒間の変性、５６℃で２０秒間のアニーリング、および７２℃で２９秒間の伸長を含む増幅を４０サイクル行った。表１に列記した残りのプライマーについての増幅条件は、従来記載されたとおりであった（Van Eck, et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:23699-23705）。
【００６４】
in situハイブリダイゼーション、免疫組織化学およびチオフラビンＳ染色。in situハイブリダイゼーションを、標準的な手順を使用して行った（Poirier, et al. (2008) J. Biol. Chem. 283:2363-2372）。免疫組織化学を標準的な方法によって行った（Oddo, et al. (2003) supra）。チオフラビンＳ染色は、浮動部（free-floating section）を使用してプロトコルの記載（Guntern, et al. (1992) Experientia 48:8-10）にしたがった。チオフラビンＳ−陽性のアミロイド沈着の共焦点分析は、既知の方法（Dickson & Vickers (2001) Neuroscience 105:99-107）を使用して行った。
【００６５】
脳ホモジェネートの調製ならびにＡＰＰおよびそのフラグメントおよびヒトタウのイムノブロット分析。脳ホモジェネートを、公表されたプロトコルによって４℃でプロテアーゼインヒビターを用いてスクロース緩衝液中で調製した（Schmidt, et al. (2005) Methods Mol. Biol. 299:267-278）。ホモジェネートの一定部分をドライアイス上で急速に凍結させ、−８０℃で保存した。使用に際し、凍結したホモジェネートを氷上で解凍し、４℃で１時間、１００，０００ｇで遠心分離した；上清は、ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβを含む可溶性のタンパク質を含有したが、ペレットは、全長ＡＰＰ、ＣＴＦα、ＣＴＦβなどを含む膜に関連した不溶性のタンパク質を含有した。
【００６６】
ＡＰＰおよびそのフラグメントのイムノブロット分析は（Cheng, et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:23818-23828）にしたがった。以下の抗体を使用した：抗ヒトＡβ  ６Ｅ１０（１：５０００）（Covancｅ）、抗ヒトＡＰＰ  ３６９抗血清（１：１０００）、抗ヒトタウＨＴ７（１：１０００）（Pierce）、Ｓｅｒ２０２においてリン酸化した抗ヒトタウＡＴ８（１：１０００）（Peirce）、モノクローナル抗ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼＩｇＧ−Ａ９（１：３）（ATCCから得た）およびβ−アクチン（１：５０００）（Sigma）。濃度測定分析はNIH Image softwareを使用して行った。
【００６７】
ＥＬＩＳＡによるＡβ分析。サンプルを標準的なプロトコル（Schmidt, et al. (2005) Methods Mol. Biol. 299:279-297）によって調製し、次に無希釈または５〜１０倍に希釈したものを「ヒトβアミロイド（１−４０）」または「ヒトβアミロイド（１−４２）」ＥＬＩＳＡプレート（Wako）に添加し、製造業者（Wako）によって提供されるプロトコルによって分析した。
【００６８】
恐怖文脈条件付け。恐怖文脈条件付けを、公表されたプロトコル（Comery, et al. (2005) J. Neurosci. 25:8898-8902; Jacobsen, et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:5161-5166）によって行った。聴覚合図(auditory cue)はｅ２ｓ（London, U.K.）からであった。GoldWave software programを、聴覚合図を編集するために使用した；Winamp softwareを、スピーカーを使用して合図音を再生するために使用した。デジタル音レベルメーター（RadioShack）を、合図音レベルを８７ｄＢに調節するために使用した。各々のマウスの動作を、コンピューターウェブカメラ（LogitechからのQuickCam）およびANY-maze記録ソフトウェアを使用して記録した。ビデオを５秒間隔の時間サンプリングを使用して凍結動作について分析した。
【００６９】
マウスの脳におけるステロール組成物の分析。マウスの前脳をホモジナイズし、クロロホルム：メタノール（２：１）を使用して抽出し（マウス脳１つにつき１２ｍｌの最終体積）、窒素下において乾燥させ、メタノールに再溶解させた。サンプルの１０パーセントを２ｍｌ  ＧＣ／ＭＳ  オートサンプラーバイアルに入れ、乾燥させ、０．５ｍｌ  ＴＲＩ−ＳＩＬ  ＴＢＴ（Pierce）を用いて一晩かけて室温でトリメチルシリル誘導体化した。１マイクロリッターの誘導体化したサンプル（またはコレステロール測定には０．１μｌ）をShimadzu QP 2010 GC-Mass機器に注入した。ステロールのＧＣ／ＭＳ分析を、選択イオンモニタリング（コレステロール：２４  ３２９、３５３、３６８、４５８；デスモステロール：４４１、ラノステロール：３９３；２４Ｓ−ヒドロキシコレステロール：４１３）および定量のための標準曲線を使用して、改変した既知の方法（Ebner, et al. (2006) Endocrinology 147:179-190）によって行った。
【００７０】
マウス脳におけるステロール、脂肪酸およびコレステロールエステル合成。マウス脳におけるステロールおよび脂肪酸合成を既知の方法（Reid, et al. (2008) J. Neurosci. Methods 168:15-25）によって測定した。同様な方法を３Ｈ−コレステロールからのコレステロールエステル化をin vivoで測定するために開発した：マウスをケタミンキシラジン（０．１ｍｌ／体重３０ｇ）で麻酔し、Kopf定位固定機器上に乗せた。矢状に皮膚を切開した後、３μｌのＰＢＳ中の５ｍＭ  メチルベータ−シクロデキストリンに調製した３Ｈコレステロールを、１０μＣｉ／マウスでガラスシリンジを用いて右側脳室に注射した（２分以内）。
【００７１】
マウスを３時間ケージに保ち、次にＣＯ２ガスによって安楽死させた。前脳を除去した；脂質を前記のとおりメタノール中に抽出し、再溶解させた。再溶解させたサンプルの１０パーセントをAnaltechからのプレートを使用してＴＬＣによって分析し、溶媒系ヘキサン：エチルエーテル（無水）：酢酸（６０：４０：１）。コレステロールおよび３Ｈコレステロールエステル（ＣＥ）バンドをＴＬＣプレートからこすり落とし、数えた。ＣＥ数を総３Ｈ−コレステロール数で割ることによって、コレステロールエステル化のパーセントを決定した。
【００７２】
初代神経細胞培養におけるステロール合成およびコレステロールのエステル化。標準的なプロトコル（Brewer (1997) J. Neurosci. Methods 71:143-155; Price & Brewer (2001) In Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff & Richardson, editors. Totowa, NJ: Humana Press, Inc. 255-264）によって、生後５日のＡ１＋／ＡｌｚおよびＡ１−／Ａｌｚマウスから海馬神経細胞を分離した。細胞をトリプリケートで６ウェルディッシュに３００，０００細胞／ウェルで播種し、１×Ｂ２７、０．５ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｎおよび５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦを有する３ｍｌ／ウェル  Neurobasal A培地中で１４日間成長させた。７日に一度、培地の半分を新鮮な培地で交換した。
【００７３】
第二の培地の交換から４８時間後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の５０μＣｉの［３Ｈ］酢酸ナトリウム（１００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を１ウェルにつき３時間加えた。細胞および培地における脂質を、本明細書中に記載された同じＴＬＣ系を使用して抽出し、けん化し、分析した。ステロール酸化を最小化するために、サンプルを脂質抽出の間、光および熱から保護し、保存することなく、分析した。分離を改善するために、サンプルの添加後、クロマトグラフィーの前に、ＴＬＣプレートを３０分間真空下に置いた。３Ｈ−標識したステロールバンドを、脂質抽出の前にサンプルに加えた非標識のステロールのヨウ素染色に基づき同定した。
【００７４】
Ｒｆ値：ラノステロール、０．５；コレステロール、０．３８；２４ＳＯＨ：０．２。バンドをこすり落とし、数えた。各々の標識したステロールについて、細胞および培地において存在する数を、そのステロールの合成率を算出するために加えた。無処置の細胞におけるコレステロールのエステル化を、確立した方法（Chang, et al. (1986) Biochemistry 25:1693-1699）によって行った；３Ｈ−オレイン酸パルス時間は３時間であった。
【００７５】
統計的分析。対応のない両側スチューデント検定を使用して統計的な比較を行った。Ｐ値が０．０５未満である場合、２つのセットの値間の相違は、有意であると考えられた。使用した記号：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００７６】
例２：マウス脳におけるＡＣＡＴ発現
脳組織がＡＣＡＴ酵素活性を有するか否かについては従来報告されていなかった。したがって、これを検討するために、脳のホモジェネートを野生型、Ａｃａｔ１−／−（Ａ１−）およびＡｃａｔ２−／−（Ａ２−）マウスから調製した。この分析は、野生型およびＡ２−マウスの脳組織は同等のＡＣＡＴ酵素活性を含有したが、Ａ１−脳組織は無視できる活性を含有したことを示した。野生型マウスから調製した様々な脳領域はすべてＡＣＡＴ活性を含有したが、Ａ１−マウス脳において検討した領域は、測定可能な活性を含有しなかった。マウスＡＣＡＴ１は４６ｋＤａのタンパク質である（Meiner, et al. (1997) J. Lipid Res. 38:1928-1933）。
【００７７】
イムノブロット分析は、マウス脳から調製したホモジェネートにおいて（しかし他のマウス組織からのものではない）、非ＡＣＡＴ１タンパク質バンドが４６ｋＤａの領域において現れたことを示した；この非特異的なバンドの存在は、マウス脳においてＡＣＡＴ１を同定するための、イムノブロッティングまたは組織化学的染色の使用を妨げた。明確にＡＣＡＴ１タンパク質を同定するために、免疫沈降（ＩＰ）実験を、洗剤によって可溶化した野生型マウス脳の抽出物を使用して行った。ＩＰ実験の結果はＡＣＡＴ活性が、対照抗体ではなく、ＡＣＡＴ１に特異的な抗体によって免疫力を効率的に低下させることができるであろうことを示した。
【００７８】
免疫沈降物のイムノブロット分析を次に行った。結果は、野生型マウス脳領域からのホモジェネートにおいて、ＡＣＡＴ１抗体は特異的に４６ｋＤａのタンパク質バンドを同定したことを示した；対照実験は、このバンドがＡ１−マウスの副腎および脳から調製されたホモジェネートにおいて存在しなかったことを示した。この結果は、ＡＣＡＴ１がマウス脳組織において発現し、主要なＡＣＡＴ同位酵素であることを示した。
【００７９】
マウスの脳におけるＡＣＡＴ１  ｍＲＮＡの分布パターンを決定するために、in situハイブリダイゼーション実験を行った。海馬および大脳皮質の両方がＡＣＡＴ１  ｍＲＮＡを含有した；海馬はより強いシグナルを示した。他のＡＣＡＴ１陽性の領域は、脈絡叢、内側手綱核、扁桃および嗅脚の吻側延長を含んだ。その後、海馬に富む領域および大脳皮質に富む領域を野生型マウスから分離し、ＡＣＡＴ１  ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって比較した。
【００８０】
本結果によって、in situハイブリダイゼーション実験が正当であることが確認され、ＡＣＡＴ１  ｍＲＮＡが大脳皮質よりも海馬の方において〜２倍高かったことを示した。ＡＣＡＴ２に特異的なプライマーを使用した別々のＲＴ−ＰＣＲ実験によって、視床に富む領域のみが、低いが検出可能なＡＣＡＴ２  ｍＲＮＡを発現し、しかし他の脳領域では発現しなかったことを示した。サルの脳組織はほとんど検出不可能なレベルのＡＣＡＴ２  ｍＲＮＡを示すことが同様に示されている（Anderson, et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:26747-26754）。
【００８１】
例３：ＡＣＡＴ１欠損アルツハイマー病のマウス（Ａ１−／Ａｌｚマウス）
非選択的ＡＣＡＴ阻害がＡＤ病理におけるＡＣＡＴ活性の役割を示唆したが、ＡＣＡＴインヒビターの効果がＡＣＡＴ活性単独を阻害する活性のためであるか否か、またはマウス脳組織における他の生物学的過程（単数または複数）のおける活性のためであるか否か、または両方の組み合わせのためであるか否かは示されていない。したがって、ＡＤの病理における各々のＡＣＡＴ同位酵素の役割を決定的に評価するために、遺伝子的手法を用いた。
【００８２】
この分析を実行するために、ＡＤを研究するための有効な研究ツールと示されている（Morrissette, et al. (2009) J. Biol. Chem. 284:6033-6037）、トリプルトランスジェニックＡＤマウスモデル（３ＸＴｇ−Ａｌｚ；Oddo, et al. (2003) supra）をＡＣＡＴ１（Ａ１−）またはＡＣＡＴ２（Ａ２−）ノックアウトマウス（Buhman, et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1529:142-154）に交雑させ、ＡＣＡＴを有するか、または有していないマウスにおいてアミロイド病理の進展をモニターした。結果は、生後４ヶ月で、対照マウスと比較した場合に、海馬の神経細胞における神経細胞内のアミロイドβ負荷がＡ１−／Ａｌｚマウスにおいて有意に減少したが、Ａ２−／Ａｌｚマウスにおいてはそうでなかったことを示した。
【００８３】
生後１７ヶ月では、対照マウスと比較した場合に、アミロイド斑の大きさおよび密度は、Ａ１／Ａｌｚ−マウスにおいて有意に減少した。動作分析によって、ＡＣＡＴ１欠損がＡＤのマウスモデルにおいて現れる認知低下を救ったことを示した。これらの結果は、ＡＣＡＴ１遺伝子の不活化がＡＤのマウスモデルにおけるアミロイド病理の有意な減少を引き起こしたことが示された。したがって、ＡＣＡＴ１はＡＤを処置するための治療上の標的であり、しかしＡＣＡＴ２は標的ではない。
【００８４】
例４：Ａβ沈着、ｈＡＰＰプロセッシングおよびｈタウに対するＡＣＡＴ１を不活化する効果
３ＸＴｇ−Ａｌｚマウスにおけるアミロイドおよびタウ病理に対するＡＣＡＴ１を不活化する効果を調べるために、生後４ヶ月のマウスの海馬脳組織のＣＡ１領域における神経細胞内の免疫染色を行うために、ヒト特異的な抗Ａβ抗体６Ｅ１０を使用して、Ａ１−／Ａｌｚマウスを検討した。結果は、Ａ１−／Ａｌｚマウスにおいて染色が有意に減少（〜７８％の減少）したことを示した。生後１７ヶ月のマウス脳ホモジェネートの総Ａβ４０およびＡβ４２レベルを測定するために、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を次に使用した。
【００８５】
結果は、Ａ１−／ＡｌｚマウスにおいてＡβ４２レベルが有意に減少（〜７８％の減少）したことを示した；Ａβ４０レベルもまた減少したが、観察された相違は統計的に有意ではなかった。対照実験は、非トランスジェニックマウスの脳は測定可能なＡβを含有しなかったことを示した。チオフラビンＳは、その後、生後１７ヶ月のＡｌｚマウス脳におけるアミロイド斑を染色するために使用した。結果は、Ａ１−／Ａｌｚマウスにおける脳組織の海馬領域におけるアミロイド斑負荷は有意に低減した（〜７７％の低減）ことを示した；大脳皮質領域において、これらのマウスにおけるアミロイド斑負荷は、減少傾向を示した（ｐ＝０．１７）。
【００８６】
生後４ヶ月のＡｌｚマウスにおけるヒトＡＰＰプロセッシングに対するＡ１−の効果もまた分析した。ヒト特異的な抗Ａβ抗体６Ｅ１０を、全長ヒトＡＰＰｓｗｅ（ｈＡＰＰ）およびそのタンパク質分解フラグメントｓＡＰＰα（ｈｓＡＰＰα）（αセクレターゼ切断によって産生される可溶性のＡＰＰフラグメント）およびＣＴＦβ（ｈＣＴＦβ）（βセクレターゼ切断によって産生されるＣ末端ＡＰＰフラグメント）（Thinakaran & Koo (2008) supra）を検出するために使用した。結果は、Ａ１−／Ａｌｚマウスにおいて、ｈｓＡＰＰαおよびｈＣＴＦβレベルが減少したことを示した（それぞれ〜６７％および〜３７％の減少）。予想外に、ｈＡＰＰレベルもまた有意に低減した（〜６２％の低減）。ｈＡＰＰタンパク質レベルとは対照的に、Ａ１＋／ＡｌｚマウスとＡ１−／Ａｌｚマウスとの間のｈＡＰＰｍＲＮＡレベルに相違はなかった。
【００８７】
ｈＡＰＰは小胞体において（〜１０５ｋＤａの分子量を有する）未成熟形態で合成される；未成熟形態は分泌経路によって小胞体からゴルジに移動し（Cai, et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:3446-3454）、高グリコシル化される（成熟形態は〜１１５ｋＤａの分子量を有する）（Weidemann, et al. (1989) Cell 57:115-126; Oltersdorf, et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:4492-4497; Thinakaran, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:9390-9397）。したがって、若い（生後２５日の）ＡｌｚマウスにおけるｈＡＰＰの未成熟形態および成熟形態に対するＡ１−の効果を検討した。結果は、Ａ１−が両方の形態をおよそ同程度まで減少させた（〜５２〜５４％の減少）ことを示し、新規に合成されたｈＡＰＰが小胞体に存在する前にＡ１−の効果（単数または複数）が発生することを示した。
【００８８】
Ａｌｚマウスは、ｈＡＰＰおよび内因性の（マウス）ＡＰＰの両方を発現する。Ａ１−はｈＡＰＰおよびｍＡＰＰレベルの両方に影響を及ぼす可能性がある。Ａｌｚマウスにおける総ＡＰＰレベルを調べるために、ｈＡＰＰおよびｍＡＰＰの両方のＣ末端フラグメントを認識する（Buxbaum, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6003-6006）、異なる抗体（抗血清３６９）を使用した。結果は、非Ｔｇ、Ａ１＋／ＡｌｚおよびＡ１−／Ａｌｚマウス間において総ＡＰＰレベルに検出可能な相違はなかったことを示し、内因性のｍＡＰＰタンパク質レベルと比較した場合に、Ａｌｚマウス系統において、ｈＡＰＰは過剰発現されないことを示した。ｍＡＰＰプロセッシングもまたｈＡＰＰ遺伝子を含有しないマウスにおいて検討した。
【００８９】
これらのマウスにおいて、Ａ１−もまたｍＡＰＰのレベル（およびそのホモログＡＰＬＰ２（Slunt, et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:2637-2644)）またはｍＡＰＰに由来するあらゆるタンパク質分解フラグメントのレベルに影響を及ぼさなかった。これらの結果は、Ａ１−のみがｈＡＰＰレベルを低減し、ｍＡＰＰレベルは低減しなかったという結論をもたらした。わずかな配列の相違がｈＡＰＰとｍＡＰＰとの間に存在し、これらの相違がｈＡＰＰおよびｍＡＰＰの運命の差異を引き起こすことに重要な役割を果たし得ることが知られている（Du, et al. (2007) J. Pharmacol. Exp. Ther. 320:1144-1152; Muhammad, et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:7327-7332）。
【００９０】
本明細書中の結果は、ＡＣＡＴインヒビターがマウスＡＰＰのタンパク質分解プロセッシングに影響を及ぼし、さらに、ｈＡＰＰのプロセッシングに影響を及ぼすことを示した従来の報告（Hutter-Paier et al. (2004) supra）とは対照的である。本明細書中の結果とHutter-Paier, et alのものとの間にある矛盾はそれらの研究において使用されたＡＣＡＴインヒビターのオフターゲットまたは副作用（単数または複数）に起因し得る。
【００９１】
タウ病理はＡＤの特質の１つである。したがって、変異ヒトタウ（ｈタウ）に対するＡ１−の効果を３ＸＴｇ−Ａｌｚマウスにおいて分析した。結果は、生後４ヶ月のＡ１−マウスはｈタウの有意な減少を示したが（〜５７％の減少）、生後１７ヶ月のＡ１−マウスは高リン酸化型のｈタウのレベルを増加させたことを示した。Ａ１＋／ＡｌｚとＡ１−／Ａｌｚマウスとの間で海馬神経原線維濃縮体の数に有意な変化は観察されなかった。これらの結果は、Ａ１−はＡｌｚマウスにおけるタウ病理を緩和しないことを示した。
【００９２】
例５：Ａｌｚマウスの認知欠損に対するＡＣＡＴ１を不活化する効果
Ａｌｚマウスにおける認知欠損に対する剤の効果を検討するために、同齢（生後２、９および１２ヶ月）のＡ１＋／Ａｌｚ、Ａ１−／Ａｌｚおよび非Ｔｇマウスについて、前後関係（海馬依存的）および合図（扁桃依存的）の記憶試験を行った。結果は、異なる月齢のすべての３つの遺伝子型のマウスが同等に良好に学習することができたことを示した。前後関係の記憶試験において、これらの生後２ヶ月のマウス間で相違はなかった。しかしながら、生後９および１２ヶ月において、非Ｔｇマウスと比較した場合に、Ａ１＋／Ａｌｚマウスは〜５０％の欠損を示したが、Ａ１−／Ａｌｚマウスは欠損を示さなかった。
【００９３】
合図の記憶試験において、生後２ヶ月のマウス間で再び相違がなかった。しかし、生後９ヶ月において、非Ｔｇマウスと比較した場合に、Ａ１＋／Ａｌｚマウスは低下傾向を示した；しかしながら、相違は統計的に有意ではなかった。生後１２ヶ月において、Ａ１＋／Ａｌｚマウスの統計的に有意な記憶低下が観察された。対照的に、Ａ１−／Ａｌｚマウスは生後９ヶ月または１２ヶ月のいずれにおいても欠損を示さなかった。
【００９４】
これらの結果は、Ａ１−は生後９〜１２ヶ月のＡｌｚマウスにおける海馬および扁桃依存的な認知欠損を改善したことを示す。対照として、生後９ヶ月および生後１２ヶ月のＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＡ１＋マウスおよびＡ１−マウスについて、前後関係および合図の試験もまた行った。結果は、前後関係または合図の記憶試験のいずれにおいても、Ａ１＋およびＡ１−マウスが同等に良好に学習することができたことを示し、Ａ１−マウスおよびＡ１＋マウス間の相違は統計的に有意ではなかった。
【００９５】
例６：Ａｌｚマウス脳におけるステロール代謝に対するＡＣＡＴ１不活化の効果
ＡＣＡＴは細胞のコレステロールホメオスタシスにおいて重要な酵素である。Ａ１−はＡｌｚマウス脳におけるステロール代謝に影響を及ぼすことによってｈＡＰＰ含有量を減少させ得ると考えられた。これを実証するために、Ａ１＋／ＡｌｚおよびＡ１−／Ａｌｚマウス脳からのステロール画分をＧＣ／ＭＳによって分離し分析した。結果は、生後４ヶ月において、ＡＣＡＴ１欠損は、ラノステロールまたはデスモステロール含有量のいずれにも有意な変化を引き起こさずに、コレステロール含有量の〜１３％の減少を引き起こし（ｐ＝０．０４）、２４ＳＯＨ含有量の〜３２％の増加を引き起こした（ｐ＝０．００７）ことを示した。遊離コレステロールを決定するために比色酵素アッセイキット（Wako）を使用した場合に、Ａ１−／Ａｌｚマウス脳のコレステロール含有量の同様な減少が観察された。
【００９６】
生後２ヶ月のＡｌｚマウスの脳において、Ａ１欠損はコレステロール含有量の〜１０％の減少および２４ＳＯＨ含有量の〜２３％の増加を引き起こしたこともまた見出された。その後、相対ステロール合成率および脂肪酸合成率を、これらのマウスの脳においてin vivoで比較した。結果は、Ａ１−が、脂肪酸合成率を有意に変化させることなく、ステロール合成率の〜２８％の減少を引き起こした（ｐ＝０．０４）ことを示した。マウス脳において、コレステリルエステル含有量は、極めて低いことが報告されている（Yusuf & Mozaffar (1979) J. Neurochem. 32:273-275; Liu, et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:2377-2382）。
【００９７】
カラムクロマトグラフィーを使用して遊離コレステロール画分からＣＥ画分を分離し、ＣＥをけん化した後にＣＥにおけるコレステロール含有量をＧＣ／ＭＳによって決定することによって、Ａ１＋マウス脳組織におけるＣＥを測定することを試みた。低レベルのＣＥは信頼性の高い測定を抑制したが、結果はＣＥがマウス脳組織における総コレステロール量の１％以下で存在し得ることを示唆した。２４ＳＯＨエステル含有量を決定するための同様な手順を使用して、脳において総２４ＳＯＨの１％以下がエステル化されたものと推定された。これらの結果は、様々なオキシステロールとは対照的に、ＡＣＡＴはその酵素基質としてコレステロールを使用することを好むという知見に一致する（Zhang, et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:11642-11647; Liu, et al. (2005) Biochem. J. 391:389-397）。
【００９８】
無処置のマウス脳においてＡＣＡＴ１の機能性を実証するために、無処置のマウス脳に３Ｈ−標識したコレステロールを（シクロデキストリン複合体として）注射することによってin vivoでＣＥ合成を測定するために、手順を開発した。Ａ１＋およびＡ１−マウスにおいて産生された３Ｈ−ＣＥを注射から３時間後にモニターした。この実験の結果は、Ａ１＋／Ａｌｚマウスにおいて、３Ｈ−コレステロールの小さいパーセントが３Ｈ−ＣＥに変換され（３時間以内で０．５６％）；対照的に、かかる変換はＡ１−／Ａｌｚマウス脳において検出可能ではなかったことを示した。この結果は、無処置のマウス脳におけるＡＣＡＴ１は低い率ではあるもののＣＥを合成できることを実証した。
【００９９】
本明細書中のデータは、Ａｌｚマウス脳において、Ａ１−は増加した２４ＳＯＨレベルをもたらし、次にステロール合成率の下方制御をもたらすことを示した。細胞培養における研究は、２４ＳＯＨが、２つの作用機序、すなわち、ＳＲＥＢＰ２標的遺伝子の転写活性化を遮断すること、および／またはＨＭＧＲタンパク質の分解率を増加させること（Goldstein, et al. (2006) Cell 124:35-46）によって、ステロール合成を下方制御し得ることを示唆した。第一の可能性を試験するために、様々なＳＲＥＢＰ２およびＬＸＲ標的遺伝子のｍＲＮＡレベル（すなわち、ＨＭＧＲ、ＨＭＧＳ、ＳＱＳ、ＬＲＰ、ＬＤＬＲ、ＳＲＥＢＰ２、ＳＲＥＢＰ１、ＡＰＯＥ、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１、ＡＢＣＧ４およびＣＹＰ４６Ａ１）をＡ１＋／ＡｌｚおよびＡ１−／Ａｌｚマウス脳において比較した。この分析は、ＡＣＡＴ１を有するか、または有しないマウスの脳におけるこれらの遺伝子の発現レベルの有意な変化を示さなかった。
【０１００】
第二の可能性を試験するために、ＡＣＡＴ１を有するか、または有しないＡｌｚマウスから調製した脳ホモジェネートについてイムノブロット分析を行った。結果は、ＨＭＧＲタンパク質含有量がＡ１−／Ａｌｚマウス脳において〜６５％減少したが（ｐ＝０．０００９）、Ａ１−マウス脳におけるＨＭＧＲ  ｍＲＮＡは変化しなかったことを示した。追加の結果は、生後２５日のＡｌｚマウスにおいて、Ａ１−はＨＭＧＲタンパク質含有量の〜６２％の減少を引き起こしたことを示し、若齢マウスにおいてＨＭＧＲ含有量に対するＡ１−の効果が発生することを実証した。
【０１０１】
例７：海馬神経細胞培養における２４ＳＯＨの生合成
本明細書中に記載された結果は、Ａ１−／Ａｌｚマウス脳が高い２４ＳＯＨレベルを示し、マウス神経細胞において、Ａ１−は２４ＳＯＨの生合成の増加を引き起こし得ることを示す。脳から分離した培養された神経細胞が２４ＳＯＨを合成および分泌することが示された限りにおいて（Russell, et al. (2009) supra; Kim, et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:2851-2861）、これらの細胞が２４ＳＯＨの生合成の増加を示すか否かを決定するために、海馬神経細胞培養系をＡ１＋／ＡｌｚおよびＡ１−／Ａｌｚマウスから確立した。ＣＥ生合成を標識した３Ｈ−オレイン酸とのインキュベーションによってこれらの神経細胞においてモニターした。
【０１０２】
細胞への移入に際し、３Ｈ−オレイン酸はＡＣＡＴによって３Ｈ−ＣＥへ迅速に変換される。Ａ１＋細胞およびＡ１−細胞の両方はＣＥを合成する；しかしながら、Ａ１−細胞はＡ１＋細胞と比較して３Ｈ−ＣＥをはるかに低減された能力で合成する。２４ＳＯＨ生合成に対するＡ１−の効果は、その後神経細胞にステロール前駆体３Ｈ−アセタートを３時間与えることによって分析し、次に細胞および培地において存在する標識したステロールを分離し分析した。結果は、Ａ１−細胞はコレステロール合成率の低減傾向を示し；Ａ１＋細胞とＡ１−細胞との間で観察される相違は近づいたが、統計的な有意性には到達しなかった（ｐ＝０．０５）ことを示した。
【０１０３】
Ａ１−細胞における２４ＳＯＨ合成率は有意に増加した（〜２７％の増加）。Ａ１＋およびＡ１−細胞の培地における３Ｈ−ステロールもまた検討した。結果は、３Ｈ−コレステロール含有量は有意に異なることはなく；対照的に、Ａ１−細胞における３Ｈ−２４ＳＯＨ含有量は、有意にＡ１＋細胞のそれよりも高かった（〜５６％）ことを示した。培地中に分泌された総３Ｈ−ステロールのパーセントを算出し、神経細胞は総３Ｈ−コレステロールの約２％のみを分泌したが、培地中に総３Ｈ−２４ＳＯＨの１３〜１５％を分泌したことが見出された。
【０１０４】
本明細書中の結果は、Ａ１−が神経細胞における増加した２４ＳＯＨの生合成率を引き起こすことを実証する。培養において維持されたマウス神経細胞は、単一の５３ｋＤａのタンパク質としてＣＹＰ４６Ａ１を発現し、それはイムノブロット分析によって同定することができる（Russell, et al. (2009) supra）。Ａ１−神経細胞において観察された２４ＳＯＨ合成の増加は、これらの神経細胞におけるＣＹＰ４６Ａ１タンパク質含有量の増加が原因である可能性がある。これを決定するために、Ａ１＋およびＡ１−神経細胞におけるＣＹＰ４６Ａ１タンパク質含有量をイムノブロット分析によって分析した。結果は、５３ｋＤａのタンパク質のバンドの強度がＡ１＋／Ａｌｚ細胞型とＡ１−／Ａｌｚ細胞型との間で同等であったことを示した。この結果は、海馬神経細胞において、２４ＳＯＨ合成におけるＡ１−に関連した増加に関与する作用機序（単数または複数）はＣＹＰ４６Ａ１タンパク質含有量の増加を必要としないことを示す。
【０１０５】
例８：Ａｌｚマウス神経細胞の２４ＳＯＨ処置はｈＡＰＰタンパク質含有量を減少させる
無処置のＡ１−／Ａｌｚマウス脳における観察（すなわち、２４ＳＯＨ含有量の増加およびｈＡＰＰ含有量の減少）は、２４ＳＯＨが神経細胞におけるｈＡＰＰ含有量を減少させ得ることを示した。これを試験するために、Ａ１＋／Ａｌｚマウスからの海馬神経細胞を２４ＳＯＨで処置し、ｈＡＰＰタンパク質含有量およびＨＭＧＲタンパク質含有量を並行してモニターした。１μＭ  ２４ＳＯＨはｈＡＰＰおよびＨＭＧＲの両方のタンパク質含有量を迅速に減少させた（３時間以内）ことが見出された。別々の実験は、１〜５μＭ  ２４ＳＯＨは、そのｍＲＮＡレベルに影響を及ぼすことなくｈＡＰＰタンパク質含有量の迅速な低下を引き起こしたことを示した。この結果は、神経細胞における２４ＳＯＨの蓄積は、ｈＡＰＰタンパク質含有量をin vivoで下方制御し得ることを示す。
【０１０６】
したがって、現在の知見は、細胞のコレステロール輸送とＡＣＡＴ１、ＣＹＰ４６Ａ１、２４ＳＯＨ合成および小胞体のＨＭＧＲとを関連させる。神経細胞において、小胞体の内外におけるコレステロール輸送が発生する。小胞体（および他の膜）における非エステル化コレステロールの不要な形成は有毒である（Tabas (2002) J. Clin. Invest. 110:905-911; Warner, et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:5772-5778）。コレステロール蓄積を最小化するために、小胞体に位置する常駐酵素であるＡＣＡＴ１（Chang, et al. (2006) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22:129-157）は、コレステロールをＣＥに変換することによって小胞体の一部を除去する。
【０１０７】
ＡＣＡＴ１欠損は小胞体コレステロールプールの増加をもたらし、ＣＹＰ４６Ａ１、別の小胞体常駐酵素の基質レベルを向上させる（Russell, et al. (2009) supra）。これは、神経細胞における２４ＳＯＨ生合成の増加をもたらす。増加した２４ＳＯＨ濃度は、ｈＡＰＰタンパク質含有量の迅速な下方制御をもたらし、その能力をＡβの産生に限定させる。神経細胞によって分泌された２４ＳＯＨは星状細胞および他の細胞型に入ることができ、これらの細胞においてＨＭＧＲおよびコレステロール生合成の効率的な下方制御をもたらす。
【０１０８】
したがって、コレステロール生合成およびアミロイド病理に対するＡＣＡＴ１阻害の有益な効果は、Ａｌｚマウス脳において２４ＳＯＨレベルを増加させるその能力に起因する。したがって、ＡＣＡＴ１酵素活性を阻害するか、またはＡＣＡＴ１遺伝子の発現を減少させる剤は、アミロイド病理を改善することができ、ヒトのＡＤを処置するための治療上の価値を有する。これらの結果は、２４ＳＯＨの濃度を増加させる剤は、脳におけるＡＰＰ含有量を減少させることによってＡＤと戦うことを助け得ることもまた示す。かかる剤は２４ＳＯＨそれ自体を含むが、それらに限定されない。
【０１０９】
例９：マイクロＲＮＡに仲介されたＡＣＡＴ１発現の阻害
表２に列記したマウスＡＣＡＴ１配列のコード配列の５’末端を標的とする人工マイクロＲＮＡ分子を設計した。
【表２】
2015529222.tif 000004
【０１１０】
例えば、マイクロＲＮＡ＃５４および＃５５のプレ−マイクロＲＮＡ（センス、アンチセンスおよびループ領域を含む）は、それぞれ５’−TGC TGT CCA GTA TCA GAA TGA ACC GGG TTT TGG CCA CTG ACT GAC CCG GTT CAC TGA TAC TGG A−３’（配列番号４１）および５’−TGC TGT ACA GTA GGA GTC CTT GGG TAG TTT TGG CCA CTG ACT GAC TAC CCA AGC TCC TAC TGT A−３’（配列番号４２）である。
【０１１１】
ＮＩＨ-３Ｔ３マウス線維芽細胞を、ＥｍＧＦＰおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）＃５２、＃５３、＃５４または＃５５をコードするいくつかのｒＡＡＶベクターの１つで一過的にトランスフェクションさせた。トランスフェクションから４８時間後、ＧＦＰ陽性の細胞をＦＡＣＳによって採取した。ＧＦＰ陽性の細胞を洗浄し、次に１０％ＳＤＳ中に溶解させ、シリンジでホモジナイズした。１つのサンプルにつき２０マイクログラムのタンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥに供した。ウェスタンブロット分析の後、バンドを、ImageJを用いて定量した。ＡＣＡＴ１強度をローディング対照としてのＧＡＰＤＨに対して規格化し、相対強度として表した。この分析の結果を表３に示す。
【０１１２】
【表３】
2015529222.tif 000005
この分析は、マウスＡＣＡＴ１配列を対象としたマイクロＲＮＡ分子によって、マウスＡＣＡＴ１遺伝子発現を、未処置の対照と比較して５０％以上有効に減少できたことを示した。
【０１１３】
同様に、表４に列記したマイクロＲＮＡのいずれかを用いた、ヒトＨｅＬａ細胞またはＭＣＦ-７細胞の処置（１０ｎＭ濃度で２日間）によって、ヒトＡＣＡＴ１タンパク質発現が８０％減少した。
【表４】
2015529222.tif 000006
【０１１４】
例１０：治療上の有効性の臨床評価
あり得る、または可能性のあるＡＤについて、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ基準（McKhann, et al. (1984) Neurology 34:939-44）を満たす対象のコホートを募集する。サンプル群の中央年齢を決定する。臨床診断は、例えば、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ基準を厳守した病の症状のチェックリストに基づいて、精神科医および神経科医によって独立的に行われる。認知評価は、ＭＭＳＥ（Mini Mental State Examination; Folstein et al. (1975) J. Psychiatric Res. 12:189-98）を使用して、訓練された臨床研究看護師によって記録される。評価は、評価者間の信頼性を最大化するために標準化されたプロトコルにしたがう。すべての対象を、３年以上までの期間、各々の場合についてＭＭＳＥを繰り返し、毎年の間隔でフォローアップする。
【０１１５】
試験期間中、対象は、ＡＣＡＴ１選択的インヒビターまたはプラセボのいずれかの規則的な投与量を受ける。認知低下率は、１年当たりのＭＭＳＥの点変化の平均的な傾きにもとづく。ＡＣＡＴ１選択的インヒビターのＫバリアントの存在または非存在による、群全体におけるＭＭＳＥ低下の年平均の相違は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ試験によって評価する。次に対象は４つのカテゴリーに、それらのベースラインＭＭＳＥスコア（例えば、＞２４；≦２４および＞１６；≦１６および＞８；≦８点）に依存して分類される。
【０１１６】
ＡＣＡＴ１選択的インヒビターのＫバリアントの存在または非存在による、４つのカテゴリーにおける、ＭＭＳＥ低下の年平均の相違は、独立したｔ試験によって最初に評価する。次に、ＭＭＳＥ低下の年平均を従属変数として用いた線形回帰分析を使用し、独立変数、例えば、ベースラインのＭＭＳＥ、年齢、オンセットの年齢および性別、による混同および効果改変について評価する。この分析の結果によって、ＡＣＡＴ１選択的インヒビターを受ける対象が、プラセボを受ける対象と比較して、認知低下の率または重症度の減少を示すことが期待される。
【０１１７】
例１１：ＡＣＡＴ１インヒビターの特異性
ＡＣＡＴインヒビターＣＰ１１３８１８またはＣＩ  １０１１をＡＤマウスに投薬する場合、アミロイド斑は有意に低減され、認知欠損は救われることが示されており、ＡＣＡＴを阻害することは、ＡＤの進行を抑制および／または遅らせ得ることを示唆する（Hutter-Paier, et al. (2004) supra; Huttunen & Kovacs (2008) supra; Huttunen, et al. (2009) supra）。しかしながら、本データと従来技術のデータとの密接な比較は、ＡＣＡＴインヒビターの効果とＡＣＡＴ１遺伝子発現の効果との間にいくつかの重要な相違が存在することを示す。ＣＰ１１３８１８は、ヒトＡＰＰおよびマウスＡＰＰの両方のプロセッシングを阻害するが、ＣＩ  １０１１はｈＡＰＰの成熟／未成熟の比率を減少させる。
【０１１８】
対照的に、Ａ１−は全長ヒトＡＰＰタンパク質含有量の減少を引き起こすのみであり、あらゆるレベルにおいてマウスＡＰＰに影響を及ぼすことはなく、またはｈＡＰＰの成熟／未成熟の比率を変えることはなかった。別の重要な相違は、Ａ１−の効果とは異なり、ＣＰ１１３８１８は全長ｈＡＰＰ含有量の減少を引き起こすことである（Hutter-Paier, et al. (2004) supra）。結果の相違は、従来技術において使用されるＡＣＡＴインヒビターは、ＡＣＡＴ１の完全な除去（ＡＴ１−）に見られる結果における相違から明らかなように、ＡＣＡＴ１に対して選択的ではないことを示す。
【０１１９】
ＡＣＡＴは、膜結合型のＯ-アシルトランスフェラーゼ（ＭＢＯＡＴ）酵素ファミリーに属し（Hofmann (2000) Trends Biochem. Sci. 25:111-112）、当該ファミリーは、同様な基質特異性および同様な触媒機構を有するが、多様な生物学的機能を有する１６の酵素を含む。さらに、多くのＡＣＡＴインヒビターは疎水的な膜活性分子である（Homan & Hamelehle (2001) J. Pharm. Sci. 90:1859-1867）。細胞に投薬された場合、それらは高濃度において膜を仕切り、それによって非特異的に膜の特性を不安定化させる傾向がある。ＣＰ１１３８１８およびＣＩ  １０１１はＡＣＡＴインヒビターとして示されるが、それらはＭＢＯＡＴファミリーの他の酵素もまた阻害し、かつ／または他の生物学的過程に干渉し得る。
【０１２０】
本データは、ＡＣＡＴ１遺伝子単独を不活化することは、３ＸＴｇ−ＡＤマウスモデルにおけるアミロイド病理を改善するために十分であることを示す。このマウスモデルにおいて、Ａ１−は、主にｈＡＰＰタンパク質含有量を低減させることによって、Ａβ負荷を低減させるために作用する。この文脈において、Ａ１−の作用は、神経栄養効果を有するペプチド混合物であるセレブロリシンのそれと同様である。セレブロリシンが、主にｈＡＰＰタンパク質含有量を減少させることによって、ＡＤマウスモデルにおいてＡβを低減することが示された（Rockenstein, et al. (2006) J. Neurosci. Res. 83:1252-1261; Rockenstein, et al. (2007) Acta Neuropathol. 113:265-275）。
【０１２１】
Ａ１−がｈＡＰＰ含有量の低減をもたらすことをさらに実証するために、Ａ１−／Ａｌｚマウスの脳は有意に大量の２４ＳＯＨを含有することが示された。さらに、神経細胞に富む培養において、培地に加えた場合、２４ＳＯＨは、ｈＡＰＰタンパク質含有量の迅速な減少をもたらすことが示された。ＡＰＰがステロール感知タンパク質として作用する可能性がある（Beel, et al. (2008) Biochemistry 47:9428-9446）；配列分析は、ＡＰＰがコレステロールに結合することが知られているコンセンサスモチーフである、３つのＣＲＡＣモチーフを含有することを示す（Epand (2008) Biochim. Biophys. Acta 1778:1576-1582）。コレステロールおよび／またはオキシステロールは、分解速度を加速させるために、ｈＡＰＰタンパク質と直接的に相互作用する可能性もある。代替的に、２４ＳＯＨは膜コレステロール含有量を低減させることによって間接的に作用し得る。
【０１２２】
本明細書中に示されたデータは、マウス脳において、Ａ１−がＨＭＧＲタンパク質の減少およびコレステロール生合成の減少を引き起こしたこともまた示す。この知見は、マクロファージまたはＣＨＯ細胞におけるＡＣＡＴの阻害が、ＨＭＧＲレベルおよびＳＲＥＢＰプロセッシングの下方制御を引き起こすＥＲ「制御ステロールプール」を増加させることを示す従来の分析に一致する（Tabas, et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:3147-3155; Scheek, et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11179-11183）。研究は、「制御ステロール」、コレステロールそれ自体および／またはコレステロールに由来するオキシステロールになり得ることを示唆した；しかしながら、オキシステロール（単数または複数）が脳におけるin vivoでのステロール生合成の制御において重要な役割を果たすか否かは議論されている（Bjorkhem (2009) J. Lipid Res. 50:S213-218）。
【０１２３】
この問題に対処するために、２４−ヒドロキシラーゼ遺伝子Ｃｙｐ４６ａ１をノックアウトすることによって、２４ＳＯＨ含有量のほぼ完全な除去、脳におけるコレステロール生合成率の減少、および脳におけるコレステロール代謝回転の減少を引き起こし；Ｃｙｐ４６ａ１−／−マウスにおける総脳コレステロール含有量は変化せず；Ｃｙｐ４６ａ１−／−はＡＤマウスモデルおけるアミロイド病理に影響を及ぼさなかったことが示された（Lund, et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:22980-22988; Kotti, et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3869-3874; Halford & Russell (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:3502-3506）。
【０１２４】
対照的に、マウス脳におけるＣｙｐ４６ａ１の異所発現を駆動するために、細胞型の非特異的なプロモーターを使用することによって、過剰発現するＣｙｐ４６ａ１が２４ＳＯＨ含有量の２倍の増加を引き起こし、ＡＤマウスにおけるアミロイド病理を有意に改善することが示される（Hudry, et al. (2010) Mol. Ther. 18:44-53）。この研究において、ｈＡＰＰタンパク質含有量の減少は観察されなかった；代わりに、ｈＡＰＰプロセッシングの減少、ＳＲＥＢＰ２  ｍＲＮＡの増加、および変化のない脳コレステロール含有量が実証された。本結果は、Ａ１-／Ａｌｚマウスにおいて、脳コレステロール含有量における２４ＳＯＨの３０％の増加、コレステロール生合成率のわずかな減少、およびアミロイド病理の有意な低減が生じたことを示す。
【０１２５】
マウスにおけるＣｙｐ４６ａ１遺伝子のノックアウトまたはＣｙｐ４６ａ１の過剰発現は、Ａ１−マウスにおいて発生しなかった補整効果を産生し得、逆もまた同様である；したがって、上記の結果の直接的な比較は困難である。他方、組み合わせた結果は、２４ＳＯＨはコレステロール代謝およびアミロイド生物学に影響を及ぼす、補助的であるが義務的ではない役割を果たし得、その効果は細胞型依存的であり得ることを示唆する。他の証拠に基づき、所与のオキシステロールは、細胞のコレステロールホメオスタシスの制御において、補助的であるが義務的ではない役割を果たし得ることが独立して提案されている（Brown & Jessup (2009) Mol. Aspects Med. 30:111-122）。
【０１２６】
本データは、細胞のコレステロール輸送において、小胞体（ＥＲ）のレベルにおいて、ＡＣＡＴ１、ＣＹＰ４６Ａ１、２４ＳＯＨ合成およびＨＭＧＲの関連を実証する。ＥＲ（および他の膜）における非エステル化コレステロールの不要な形成は有毒である（Warner, et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:5772-5778; Tabas (2002) J. Clin. Invest. 110:905-911）。コレステロールの蓄積を最小化するために、ＥＲに位置する常駐酵素であるＡＣＡＴ１（Sun, et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:27688-27694）は、それをＣＥに変換することによってＥＲコレステロールの一部を除去する。Ａ１−は、ＥＲコレステロールプールの増加、および別のＥＲ常駐酵素であるＣＹＰ４６Ａ１の基質レベルの向上をもたらす。これは、神経細胞における２４ＳＯＨ生合成の増加をもたらす。
【０１２７】
ＥＲにおいて増加した２４ＳＯＨおよび／またはコレステロール濃度は、ｈＡＰＰタンパク質含有量の迅速な下方制御をもたらし、それによってＡβを産生するその能力を限定する。神経細胞によって分泌された２４ＳＯＨは、星状細胞および他の細胞型に入ることができ、これらの細胞においてＨＭＧＲおよびコレステロール生合成の効率的な下方制御をもたらす。したがって、ＡＤマウス脳におけるコレステロール生合成およびアミロイド病理に対するＡ１−の有益な効果は、ＥＲコレステロールの増加（単数または複数）および／または神経細胞における２４ＳＯＨレベルに起因する。脳におけるコレステロール代謝を変えることによって引き起こされる潜在的な副作用がなければ、本データは、ＡＣＡＴ１酵素活性を選択的かつ特異的に阻害するか、またはＡＣＡＴ１遺伝子発現を減少させる剤は、アミロイド病理を改善することができ、ヒトのＡＤを処置するための治療上の価値を有することを示す。
【０１２８】
例１２：Ａｃａｔ１  ｓｉＲＮＡを発現する組換アデノ随伴ウイルスの効果
マウスＡｃａｔ１遺伝子を標的とする、４つの異なるｓｉＲＮＡ配列（＃５２〜＃５５；表２）を、InvitrogenのRNAi design toolを使用して、内因性のマウスマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）スキャホールドに挿入した。人工ｍｉＲを哺乳動物の発現ベクターｐｃＤＮＡ６．２−ＧＷ／ＥｍＧＦＰ−ｍｉＲにライゲーションした。これらのＡｃａｔ１ｍｉＲコンストラクトを、あらゆる既知の脊椎動物の遺伝子の配列と一致しない陰性対照（ＮＣ）ｍｉＲ（５’−TACTGCGCGTGGAGACG−３’；配列番号９）とともに、ＮＩＨ−３Ｔ３マウス線維芽細胞において試験した。ｍｉＲを標準的なｃＤＮＡトランスフェクションプロトコルを使用して細胞に送達した。結果は、Ａｃａｔ１  ｍｉＲ（ｓｉＲＮＡ配列＃５４、５’−TACAGTAGGAGTCCTTGGGTA−３’；配列番号１０、および配列＃５５、５’−TCCAGTATCAGAATGAACCGGG−３’；配列番号１１を含有する）の２つは、処置したマウス３Ｔ３線維芽細胞においてＡＣＡＴ１タンパク質含有量の５０〜６０％の減少を引き起こすことに有効であったことを示した。
【０１２９】
これらの２つのＡｃａｔ１  ｍｉＲ配列およびＮＣ  ｍｉＲ配列もまた神経細胞特異的なｈＳｙｎプロモーター（Sibley, et al. (2012) Nucl. Acids Res. Doi:10.1093/nar/gks712）を含有するｒＡＡＶバックボーンベクター（ＡＡＶ−６Ｐ−ＳＥＷＢ）にサブクローニングした。このベクターは、ウイルスゲノムが発現されるあらゆる細胞型において、Ａｃａｔ１  ｍｉＲを発現する、強い細胞型の非特異的なプロモーターを含有する。同定目的のために、それはｍｉＲとともにＧＦＰもまた共発現する。これらの３つのコンストラクトは、３つの組換ＡＡＶウイルスを産生するために使用する。これらのウイルスの有効性および特異性を試験するために、ＡＤマウス（ＡＤ／Ａｃａｔ１＋／＋マウス）からのトリプルトランスジェニックアルツハイマー神経細胞から分離した初代海馬神経細胞を培養し、ＮＣ  ＡＡＶまたはｓｉＲＮＡ  Ａｃａｔ１  ＃５５を含有するｍｉＲを発現するＡＡＶで処置した。ウイルス感染から２週間後、コレステリルエステル生合成に対するＡＡＶの効果を神経細胞において試験した。結果は、ｓｉＲＮＡ  Ａｃａｔ１  ＃５５を有するＡＡＶが、ＮＣウイルスで処置した細胞の値と比較した場合に、コレステリルエステル生合成を５０％以上低減した（Ｐ＜０．０１）ことを示した。
【０１３０】
ＮＣ  ＡＡＶまたはＡｃａｔ１  ＡＡＶ（ｓｉＲＮＡ  Ａｃａｔ１  ＃５４および＃５５の両方を含む）もまた生後４ヶ月のＡＤマウス海馬領域に注射した。単一の両側(bilateral)注射の後、マウスを回復させた。注射から１ヶ月後、マウスを犠牲死させ、マウス脳ホモジェネートにおけるＡＣＡＴ１酵素活性を、標準的なin vitroのＡＣＡＴ酵素活性アッセイを使用して分析した。結果は、対照値と比較した場合に、Ａｃａｔ１  ＡＡＶはＡＣＡＴ１酵素活性を４２％低減した（Ｐ＜０．００５）ことを示した。
【０１３１】
脳注射はマウスにおいて様々な炎症応答を引き起こし得る。したがって、脳注射から１か月後に、別々の実験において、様々な炎症マーカーの転写物レベルを評価した。結果は、ＰＢＳおよび／またはＡＡＶの脳注射は、様々な炎症マーカー（ｉｂａ、ＧＦＡＰ、ＴＮＦアルファおよびｉＮＯＳ）の転写物レベルの変化を引き起こした；しかしながら、変化の程度はわずかであった（すなわち、対照値の２０％以内）ことを示した。
【０１３２】
その後、ＡＣＡＴ１を有するＡＤマウス（ＡＤ／ＡＣＡＴ１＋／＋）またはＡＣＡＴ１を有さないＡＤマウス（ＡＤ／ＡＣＡＴ１−／−）の海馬領域に対して、ＰＢＳまたはＮＣ  ＡＡＶまたはＡｃａｔ１  ＡＡＶの単一の両側注射を行った；両方のマウス系統は生後１０ヶ月であった。注射の後、マウスを回復させ、Ａβ１−４２含有量を決定するために２ヶ月後に（生後１２ヶ月）犠牲死させた。結果は、ＡＤマウスにおいてＡＡＶを注射することによって、Ａβ１−４２レベルの有意な減少を予想外に引き起こしたことを示した。追加の結果もまた、Ａｃａｔ１  ＫＤマイクロＲＮＡを発現するＡＡＶを注射することによって、Ａβ１−４２レベルの明らかな減少を引き起こしたことを示した（図１を参照）。
【０１３３】
ＡＤマウス脳において、Ａｃａｔ１遺伝子的除去（Ａｃａｔ１−／−）はＡβ１−４２含有量の６０〜８０％の減少を引き起こした；しかしながら、残りのＡβ１−４２はＡＤ／Ａｃａｔ１−／−マウス脳の脳において依然として存在した。対照実験において、ＡＤ／Ａｃａｔ１−／−マウス脳において、Ａｃａｔ１  ＡＡＶ（図１）またはＮＣ  ＡＡＶ（図１）のいずれかで処置することによって、残りのＡβ１−４２レベルの約２５％の低減を引き起こしたことが示され、ＡＡＶを注射することによって、Ａｃａｔ１  ｍＲＮＡ配列を認識するその能力とは独立した様式で、有意なＡβ１−４２の低減を引き起こすことができるであろうことを確認した。
【０１３４】
ベースライン値としてＡＡＶで注射したＡＤ／Ａｃａｔ１−／−マウス脳に残る、残りのＡベータ１−４２レベルを使用して、Ａｃａｔ１  ＡＶＶのＡＣＡＴ１配列依存的な様式でＡβ１−４２を低減する効率は７０％であると推定された。
全体として、これらの結果は、ＡＣＡＴ１に対するｓｉＲＮＡは、これらのマウスにおいて認知欠損が発生した後に、ＡＣＡＴ１酵素活性の阻害を引き起こすため、およびＡＤマウス脳における有意なＡβ１−４２の低減をin vivoで引き起こすために用いることができることを示した。
【０１３５】
生後１０ヶ月で海馬において１．０ｕｌ  ＰＢＳ、ＡＡＶ−ＮＣまたはＡＡＶ−Ａｃａｔ１で脳注射を受けた、生後１２ヶ月のＡＤまたはＡＤ／ＡＣＡＴ１−／−マウスの半分の脳からのホモジェネートを検討し、追加の実験を行った。各々の群を表すサンプルプールを作成するために、個々のマウスからの脳ホモジェネートの等しい量を組み合わせた。サンプルプールをギ酸抽出に供し、続いてＡβ４２についてＥＬＩＳＡアッセイに供した。結果は、Ａβ１−４２の平均レベル間で相違があり、タンパク質のレベルは、ＡＡＶ−ＮＣのＰＢＳで処置したＡＤマウスと比較して、ＡＤ／Ａｃａｔ１−／−マウスのすべての群において有意に減少したことを示した（図２Ａ）。さらに、Ａβ１−４２レベルは、ＡＡＶ−ＮＣまたはＰＢＳで処置したＡＤマウスと比較して、ＡＡＶ−Ａｃａｔ１で処置したＡＤマウスにおいて有意に減少した。
【０１３６】
ＡＡＶ−Ａｃａｔ１で処置したＡＤマウスのＡβ１−４２レベルは、ＡＤ／Ａｃａｔ１−／−マウスに対して相違はなく、ＰＢＳ、ＡＡＶ−ＮＣまたはＡＡＶ−Ａｃａｔ１で処置したＡＤ／ＡＣＡＴ−／−マウスの間においてもまたＡβ１−４２レベルに有意な相違はなかった（図２Ａ）。アミロイドβ１−４０レベルもまたＥＬＩＳＡによってアッセイし、これらのマウスのレベルはアッセイの検出下限付近であり、処置群間で有意な相違は検出されなかった。これらのデータは、ＡＤの動物モデルにおいて、アミロイドタンパク質のレベルを低減するためのｓｉＲＮＡ分子を使用することの治療上の有効性について、in vivoの根拠もまた提供する。これらのデータは、ヒトにおいてＡＤを処置するための、かかる分子の使用を支持する。
【０１３７】
ｈＡＰＰレベルがＡＤ／Ａｃａｔ−／−マウスにおいて有意に減少することが示されたことから、ＡＣＡＴ１ベクターで注射したマウスにおけるｈＡＰＰの役割を調べるために実験を行った。したがって、上記と同じマウスにおいて、ｈＡＰＰのレベルを脳ホモジェネートの分離によって測定し、続いてｈＡＰＰにおけるＮ末端配列を認識し、マウスＡＰＰを認識しない、ｅｈｔ  ６Ｅ１０抗体を使用してウェスタンブロットを行った。結果は、検出したレベルは様々な試験群において見られるＡβ４２のレベルに匹敵したことを示した（図２Ｂ）。
【０１３８】
ＡＡＶ−Ａｃａｔ１で処置したＡＤマウスにおいて、ＰＢＳで処置したＡＤマウスと比較して、ｈＡＰＰが統計的に有意に減少した。ＡＤ／Ａｃａｔ−／−マウスのすべての処置群において、ＰＢＳで処置したＡＤマウスと比較して、全長ｈＡＰＰレベルもまた有意に減少した（図２Ｂ）。これらのデータは、マイクロＲＮＡウイルスベクターでin vivoで送達した場合に、ｓｉＲＮＡ  ＡＣＡＴ１分子のin vivoの活性を実証する。これらのデータは、ＡＣＡＴ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子の治療上の有効性の支持、およびヒトにおけるＡＤを処置するためのかかる分子の使用もまた提供する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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