(57)【要約】本発明は、疾患に罹患している対象の抗病性浸潤Ｔリンパ球の細胞媒介抑制を阻止するための弱毒生リステリアを使用するための方法および組成物を提供する。一実施形態において、疾患に罹患している対象または対象の疾患部位において、浸潤Ｔリンパ球／サプレッサー細胞比率を増大させるための方法が提供され、この方法は、前記対象に弱毒生リステリアワクチン株を含む組成物を投与するステップを含む。一局面において、前記浸潤Ｔリンパ球がＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。【選択図】図３５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患に罹患している対象または対象の疾患部位において、浸潤Ｔリンパ球／サプレッサー細胞比率を増大させるための方法であって、前記対象に弱毒生リステリアワクチン株を含む組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項２】
前記浸潤Ｔリンパ球がＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サプレッサー細胞が制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）または骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記リステリアが、ポリペプチドまたはそれらの機能性断片をそれぞれコードする読み枠を含む組換え核酸配列を含み、前記ポリペプチドまたはそれらの機能性断片が内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記リステリアが、第１のポリペプチドおよび少なくとも第２のポリペプチドをそれぞれコードする第１の読み枠および少なくとも第２の読み枠を含む組換え核酸配列を含み、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合した異種抗原またはそれらの機能性断片をそれぞれ含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸が第３のポリペプチドをコードする第３の読み枠をさらに含み、前記第３のポリペプチドが、内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合した異種抗原またはそれらの機能性断片を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の異種抗原、前記第２の異種抗原、または前記第３の異種抗原またはそれらの機能性断片が、感染性病原体、または腫瘍細胞によって発現されるか、またはこれに由来する、請求項１〜３または５〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸分子が、代謝酵素をコードする追加の読み枠をさらに含み、前記代謝酵素が、前記組換えリステリア株の染色体が欠失している内在性遺伝子を補完する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記追加の読み枠によりコードされる前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リステリアが、第２の代謝酵素をコードする追加の読み枠をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記代謝酵素がＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えリステリアが、ゲノムＡｃｔＡ遺伝子、ＰｌｃＡ遺伝子、ＰｒｆＡ遺伝子またはＰｌｃＢ遺伝子の変異または欠失を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子が前記リステリアゲノム中に組み込まれる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸分子が、抗生物質による選択のない場合に、前記組換えリステリアワクチン株中で安定に維持されるプラスミド中に存在する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＥＳＴ含有ポリペプチドが、Ｎ末端短縮ＬＬＯポリペプチド、Ｎ末端ＡｃｔＡポリペプチド、もしくはＰＥＳＴペプチド、またはそれらの機能性断片である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１抗原、前記第２抗原または前記第３抗原が、局所組織環境に関連し（これはさらに癌の発生または転移に関連する）、腫瘍回避または癌に対する抵抗性に関連し、血管新生抗原であり、または宿主のアレルギー性、炎症性反応を引き起こすアレルゲンである、請求項１〜３または５〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾患が特異的疾患部位に限局しているか、または前記疾患が全身性である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記疾患が、感染症、呼吸疾患もしくは炎症性疾患、または癌もしくは腫瘍である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記呼吸または炎症性疾患が喘息である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
腫瘍部位の前記サプレッサー細胞の数を減少させることが、前記腫瘍を有する前記対象の抗腫瘍免疫応答を増強する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象がヒトである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
対象の疾患のサプレッサー細胞の割合を減少させるための方法であって、弱毒生リステリアワクチン株を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項２３】
前記リステリアが、ポリペプチドまたはそれらの機能性断片をそれぞれコードする読み枠を含む組換え核酸配列を含み、前記ポリペプチドまたはそれらの機能性断片が内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記リステリアが、第１のポリペプチドおよび少なくとも第２のポリペプチドをそれぞれコードする第１の読み枠および少なくとも第２の読み枠を含む組換え核酸配列を含み、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合した異種抗原またはそれらの機能性断片をそれぞれ含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸が、第３のポリペプチドをコードする第３の読み枠をさらに含み、前記第３のポリペプチドが内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに縮合した異種抗原またはそれらの機能性断片を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸分子が、代謝酵素をコードする追加の読み枠をさらに含み、前記代謝酵素が、前記組換えリステリア株の染色体が欠失している内在性遺伝子を補完する、請求項２２〜２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記追加の読み枠によりコードされる前記代謝酵素が、アラニンラセマーゼ酵素である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記リステリアが、第２の代謝酵素をコードする追加の読み枠をさらに含む、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記代謝酵素がＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記組換えリステリアが、ゲノムＡｃｔＡ遺伝子、ＰｌｃＡ遺伝子、ＰｒｆＡ遺伝子またはＰｌｃＢ遺伝子の変異または欠失を含む、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸分子が、前記リステリアゲノムに組み込まれる、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸分子が、抗生物質による選択がない場合には、前記組換えリステリアワクチン株中で安定に維持されるプラスミド中に存在する、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象がヒトである、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＰＥＳＴ含有ポリペプチドが、Ｎ末端短縮ＬＬＯポリペプチド、Ｎ末端ＡｃｔＡポリペプチド、もしくはＰＥＳＴペプチド、またはそれらの機能性断片である、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１、前記第２または前記第３の異種抗原またはそれらの機能性断片が、感染性病原体、または腫瘍細胞によって発現されるか、またはこれに由来する、請求項２２または２４〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１、前記第２または前記第３の抗原が、局所組織環境に関連し、腫瘍回避または癌に対する抵抗性に関連し（これはさらに癌の発生または転移に関連する）、血管新生抗原であり、または宿主のアレルギー性、炎症性反応を引き起こすアレルゲンである、請求項２２または２４〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記疾患が特異的疾患部位に限局しているか、または前記疾患が全身性である、請求項２２〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記疾患が、感染症、呼吸疾患もしくは炎症性疾患、または癌もしくは腫瘍である、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記呼吸または炎症性疾患が喘息である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
腫瘍部位の前記サプレッサー細胞の数を減少させることが、前記腫瘍を有する前記対象の抗腫瘍免疫応答を増強する、請求項２２〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記サプレッサー細胞が制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である、請求項２２〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記サプレッサー細胞が骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）である、請求項２２〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記サプレッサー細胞が対象の抗腫瘍Ｔ細胞応答を抑制する、請求項２２〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リステリア患者におおいて抗病性浸潤Ｔリンパ球細胞媒介抑制を阻止するための弱毒生リステリアを使用するための方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）は、主として抗原提示細胞に侵入し、抗原提示細胞の細胞質内での生存に適合した細胞内病原体である。リステリア・モノサイトゲネス、およびそれが産生するリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）という名称のタンパク質は、細胞ベースの免疫療法で使用されるほとんどのアジュバントとは異なり、抗原特異的処理を行った後に投与できる強力なアジュバント特性を有する。
【０００３】
Ｔｒｅｇは、末梢自己免疫寛容の維持に重要な役割を果たしている。天然ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＴｒｅｇは、胸腺で産生され、ＦｏｘＰ３（Ｔｒｅｇ系列の独自性およびサプレッサー機能の樹立と維持に必要な転写因子）を発現する。Ｔｒｅｇは、疾患部位に蓄積可能であり、当該部位で疾患特異的Ｔ細胞のエフェクター機能を抑制する。これが生じると、適切な抗原またはこれらの抗原を攻撃するように活性化されたＴ細胞が存在していても、疾患が増悪する可能性がある。腫瘍浸潤ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの密度の増大は、膵臓、卵巣、および肝細胞癌などの種々の固形腫瘍の予後不良に関連しているとされている。Ｔｒｅｇの欠乏は、マウスモデルで抗腫瘍免疫および腫瘍拒絶の増強が生じるが、自己免疫疾患が発生する場合もある。
【０００４】
骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）は、異なる分化段階にある初期骨髄系前駆細胞、未熟顆粒球、マクロファージ、および樹状細胞の異種集団である。これらの細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）およびＮＫＴ細胞の細胞傷害活性、およびＣＤ８＋Ｔ細胞媒介適応免疫反応の両方を抑制する能力があるため、大きく関心を集めている。ＮＫ細胞抑制の機序は現状よく理解されていないが、１）アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）の産生、および２）一酸化窒素シンターゼ２（ＮＯＳ２）の発現上昇などの複数の経路がＭＤＳＣ媒介Ｔ細胞抑制の原因である。ＡＲＧ１およびＮＯＳ２は、Ｌ−アルギニンを代謝し、一緒に、または別々にＴ細胞ＣＤ３ゼータ鎖の翻訳を阻止し、Ｔ細胞増殖性を抑制し、Ｔ細胞アポトーシスを促進する。さらに、ＭＤＳＣは、免疫抑制性サイトカインを分泌し、調節性Ｔ細胞発生を誘導する。マウスでは、ＭＤＳＣは、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１／Ｌｙ−６Ｇ＋細胞として広く定義されているが、Ｌｙ−６ＧとＬｙ−６Ｃとの相対的発現レベルにより２種の特異的サブセットとして区別できる。ヒトＭＤＳＣは、通常、Ｓｉｇｌｅｃ−３／ＣＤ３３を発現し、系列マーカーとＨＬＡ−ＤＲを欠いているが、ＣＤ１４とＣＤ１５の不均一発現は、複数のサブセットが存在することを示唆する。
【０００５】
ＭＤＳＣは、炎症促進性サイトカインにより誘導され、感染性および炎症性病理学的状態では数の増加が認められている。ＭＤＳＣは、血液、骨髄、および腫瘍保持マウスの二次リンパ系器官中に蓄積し、腫瘍微小環境中でのその存在は、腫瘍関連免疫抑制促進の原因となる役割を有することが示唆されてきた。現在、ＭＤＳＣが、腫瘍進行を防ぐための標的として使用できることは明らかであるが、ＭＤＳＣを抑制できる有効な機序を特定するには、さらなるキャラクタリゼーションが必要である。
【０００６】
本発明は、腫瘍保持対象に投与すると直ちにＴｒｅｇおよびＭＤＳＣ機能を抑制し始め、それにより、抗腫瘍Ｔ細胞を複製可能にし、腫瘍増殖を抑制可能にするリステリアワクチン剤を提供することにより、ＴｒｅｇおよびＭＤＳＣなどのサプレッサー細胞を抑制する効果的な機構を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施形態では、本発明は、疾患に罹患している対象の、または対象の疾患部位の浸潤Ｔリンパ球／サプレッサー細胞比率を増大させるための方法に関し、この方法は、弱毒生リステリアワクチン株を含む組成物を対象に投与するステップを含む。
【０００８】
別の実施形態では、本発明は、対象の疾患のサプレッサー細胞の割合を減少させる方法に関し、この方法は、弱毒生リステリアワクチン株を対象に投与するステップを含む。
【０００９】
本発明の他の特徴と利点は、下記の詳細な説明の例および図から明らかとなろう。しかし、当業者であれば、この詳細な説明から本発明の趣旨および範囲内で種々の変更と修正が明らかになると思われるので、詳細な説明および具体的な例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、これらは例示目的のみのために提示されていることを理解されたい。
【００１０】
次の図は、本明細書の一部を構成し、本開示の特定の態様をさらに示すために包含されており、本明細書で提示される具体的実施形態の詳細な説明と合わせて、１つまたは複数のこれらの図を参照することにより、本開示の発明がさらに良く理解できる。特許または特許出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含む。このカラー図面を含む特許または特許出願公報のコピーは、要求があれば、有料で米国特許商標局より提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７が異なる発現系を使用してＥ７を発現、分泌することを示す図である。Ｌｍ−Ｅ７は、Ｌ．モノサイトゲネスゲノムのｏｒｆＺドメイン中に遺伝子カセットを導入することにより生成された（Ａ）。ｈｌｙプロモーターが、ｈｌｙシグナル配列およびＬＬＯの最初の５個のアミノ酸（ＡＡ）と、それに続くＨＰＶ−１６Ｅ７の発現を促進する。Ｂ）プラスミドｐＧＧ−５５を使用してｐｒｆＡ−株ＸＦＬ−７を形質転換することによりＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７が生成される。ｐＧＧ−５５は、ＬＬＯ−Ｅ７の非溶血性融合体の発現を促進するｈｌｙプロモーターを有する。また、ｐＧＧ−５５は、インビボでＸＦＬ−７によるプラスミドの保持のためにｐｒｆＡ遺伝子を含む。
【図２】Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７がＥ７を分泌すること示す図である。Ｌｍ−Ｇａｇ（レーン１）、Ｌｍ−Ｅ７（レーン２）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（レーン３）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（レーン４）、ＸＦＬ−７（レーン５）、および１０４０３Ｓ（レーン６）を３７℃のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔｏｎｉブロス中で一晩増殖させた。６００ｎｍの吸収のＯＤにより測定した同数の細菌を沈殿させ、１８ｍｌのそれぞれの上清をＴＣＡ沈殿させた。Ｅ７発現をウェスタンブロットにより分析した。ブロットを抗Ｅ７  ｍＡｂに続けて、ＨＲＰ標識抗マウス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でプローブした後、ＥＣＬ検出試薬を使用して発色させた。
【図３】ＬＬＯ−Ｅ７融合体を用いた腫瘍免疫療法の有効性を示す図である。腫瘍接種後の７、１４、２１、２８および５６日目のマウスの腫瘍サイズ（ミリメートル）を示す。無処理マウス：白丸、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７：黒丸、Ｌｍ−Ｅ７：正方形；Ｌｍ−Ｇａｇ：白菱形、およびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ：黒三角。
【図４】ＴＣ−１細胞に暴露されるとＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７−免疫マウス由来の脾細胞が増殖することを示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫し、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、または対照ｒＬｍ株で追加免疫した。追加免疫後６日目に脾細胞を採取し、示した比率の照射ＴＣ−１細胞と一緒に播種した。細胞に３Ｈチミジンを適用し、採取した。ｃｐｍを（実験ｃｐｍ）−（ＴＣ−１不含対照）と定義する。
【図５Ａ】（Ａ）：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７がＥ７を分泌することを示すウェスタンブロットの図である。レーン１：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、レーン２：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７．００１、レーン３、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−２．５．３、レーン４：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−２．５．４。（Ｂ）：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（矩形）、Ｌｍ−Ｅ７（卵型）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（Ｘ）、および無処理マウス（非ワクチン接種：黒三角）を投与したマウスの腫瘍サイズを示す図である。
【図５Ｂ】（Ａ）：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７がＥ７を分泌することを示すウェスタンブロットの図である。レーン１：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、レーン２：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７．００１、レーン３、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−２．５．３、レーン４：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−２．５．４。（Ｂ）：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（矩形）、Ｌｍ−Ｅ７（卵型）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（Ｘ）、および無処理マウス（非ワクチン接種：黒三角）を投与したマウスの腫瘍サイズを示す図である。
【図６Ａ】（Ａ）：４種のＬＭワクチン剤の作成に使われたプラスミド挿入物を模式的に表した図である。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７挿入物は、使われた全てのリステリア遺伝子を含む。それは、ｈｌｙプロモーター、ｈｌｙ遺伝子（タンパク質ＬＬＯをコードする）の最初の１．３ｋｂ、およびＨＰＶ−１６Ｅ７遺伝子を含む。ｈｌｙの最初の１．３ｋｂは、シグナル配列（ｓｓ）およびＰＥＳＴ領域を含む。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、ならびにＰＥＳＴおよびＥ７配列を含むが、短縮ＬＬＯ遺伝子の残りのものは除かれる。Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７は、ＰＥＳＴ領域を除外するが、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、Ｅ７、および短縮ＬＬＯの残りのものを含む。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、およびＥ７のみを有する。（Ｂ）上段パネル：ＰＥＳＴ領域含有リステリア構築物が腫瘍縮小を誘導するのを示す図である。下段パネル：２種の別々の実験で腫瘍投与後２８日目の平均腫瘍サイズを示す図である。（Ｃ）ＰＥＳＴ領域を含むリステリア構築物が、脾臓中で高い割合のＥ７特異的リンパ球を誘導することを示す図である。３種の実験からのデータの平均およびＳＥを示す。
【図６Ｂ】（Ａ）：４種のＬＭワクチン剤の作成に使われたプラスミド挿入物を模式的に表した図である。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７挿入物は、使われた全てのリステリア遺伝子を含む。それは、ｈｌｙプロモーター、ｈｌｙ遺伝子（タンパク質ＬＬＯをコードする）の最初の１．３ｋｂ、およびＨＰＶ−１６Ｅ７遺伝子を含む。ｈｌｙの最初の１．３ｋｂは、シグナル配列（ｓｓ）およびＰＥＳＴ領域を含む。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、ならびにＰＥＳＴおよびＥ７配列を含むが、短縮ＬＬＯ遺伝子の残りのものは除かれる。Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７は、ＰＥＳＴ領域を除外するが、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、Ｅ７、および短縮ＬＬＯの残りのものを含む。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、およびＥ７のみを有する。（Ｂ）上段パネル：ＰＥＳＴ領域含有リステリア構築物が腫瘍縮小を誘導するのを示す図である。下段パネル：２種の別々の実験で腫瘍投与後２８日目の平均腫瘍サイズを示す図である。（Ｃ）ＰＥＳＴ領域を含むリステリア構築物が、脾臓中で高い割合のＥ７特異的リンパ球を誘導することを示す図である。３種の実験からのデータの平均およびＳＥを示す。
【図６Ｃ】（Ａ）：４種のＬＭワクチン剤の作成に使われたプラスミド挿入物を模式的に表した図である。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７挿入物は、使われた全てのリステリア遺伝子を含む。それは、ｈｌｙプロモーター、ｈｌｙ遺伝子（タンパク質ＬＬＯをコードする）の最初の１．３ｋｂ、およびＨＰＶ−１６Ｅ７遺伝子を含む。ｈｌｙの最初の１．３ｋｂは、シグナル配列（ｓｓ）およびＰＥＳＴ領域を含む。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、ならびにＰＥＳＴおよびＥ７配列を含むが、短縮ＬＬＯ遺伝子の残りのものは除かれる。Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７は、ＰＥＳＴ領域を除外するが、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、Ｅ７、および短縮ＬＬＯの残りのものを含む。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、およびＥ７のみを有する。（Ｂ）上段パネル：ＰＥＳＴ領域含有リステリア構築物が腫瘍縮小を誘導するのを示す図である。下段パネル：２種の別々の実験で腫瘍投与後２８日目の平均腫瘍サイズを示す図である。（Ｃ）ＰＥＳＴ領域を含むリステリア構築物が、脾臓中で高い割合のＥ７特異的リンパ球を誘導することを示す図である。３種の実験からのデータの平均およびＳＥを示す。
【図７Ａ】（Ａ）：ＴＣ−１腫瘍細胞を投与し、その後、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７を投与した、またはワクチン接種なし（無処理）のマウスにおける脾臓中のＥ７特異的ＩＦＮガンマ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導、および腫瘍に侵入した数を示す図である。（Ｂ）：（Ａ）で記載のマウス中への脾臓および腫瘍中のＥ７特異的ＣＤ８＋細胞の誘導および侵入を示す図である。
【図７Ｂ】（Ａ）：ＴＣ−１腫瘍細胞を投与し、その後、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７を投与した、またはワクチン接種なし（無処理）のマウスにおける脾臓中のＥ７特異的ＩＦＮガンマ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導、および腫瘍に侵入した数を示す図である。（Ｂ）：（Ａ）で記載のマウス中への脾臓および腫瘍中のＥ７特異的ＣＤ８＋細胞の誘導および侵入を示す図である。
【図８Ａ】ＰＥＳＴ領域含有リステリア構築物が腫瘍内にさらに高い割合のＥ７特異的リンパ球を誘導することを示す図である。（Ａ）は、１種の実験由来のデータを示す。（Ｂ）は、全３種の実験由来のデータの平均およびＳＥを示す。
【図８Ｂ】ＰＥＳＴ領域含有リステリア構築物が腫瘍内にさらに高い割合のＥ７特異的リンパ球を誘導することを示す図である。（Ａ）は、１種の実験由来のデータを示す。（Ｂ）は、全３種の実験由来のデータの平均およびＳＥを示す。
【図９Ａ】大腸菌−リステリアシャトルプラスミドｐＧＧ５５（上段）およびｐＴＶ３（下段）のマップ図である。ＣＡＴ（−）：大腸菌クロラムフェニコールトランスフェラーゼ；ＣＡＴ（＋）：リステリアクロラムフェニコールトランスフェラーゼ；Ｏｒｉ  Ｌｍ：リステリア用複製起点；Ｏｒｉ  Ｅｃ：ｐ１５大腸菌用複製起点；ｐｒｆＡ：リステリア病原性調節因子Ａ；ＬＬＯ：プロモーターを含むＣ末端切断型リステリオリシンＯ；Ｅ７：ＨＰＶＥ７；ｐ６０−ｄａｌ；ｐ６０プロモーターの発現カセットおよびリステリアｄａｌ遺伝子。選択制限部位も示す。
【図９Ｂ】大腸菌−リステリアシャトルプラスミドｐＧＧ５５（上段）およびｐＴＶ３（下段）のマップ図である。ＣＡＴ（−）：大腸菌クロラムフェニコールトランスフェラーゼ；ＣＡＴ（＋）：リステリアクロラムフェニコールトランスフェラーゼ；Ｏｒｉ  Ｌｍ：リステリア用複製起点；Ｏｒｉ  Ｅｃ：ｐ１５大腸菌用複製起点；ｐｒｆＡ：リステリア病原性調節因子Ａ；ＬＬＯ：プロモーターを含むＣ末端切断型リステリオリシンＯ；Ｅ７：ＨＰＶＥ７；ｐ６０−ｄａｌ；ｐ６０プロモーターの発現カセットおよびリステリアｄａｌ遺伝子。選択制限部位も示す。
【図１０】リステリア株ＥＧＤのゲノム上のｉｎｌＣ領域の上流と下流に存在するＤＮＡ配列（配列番号８１）を示す図である。ＤＮＡ−上流（赤）、ｉｎｌＣ遺伝子（青）およびＤＮＡ−下流（黒）。
【図１１】温度感受性プラスミドのｐＫＳＶ７中でクローン化されてｉｎｌＣ欠失変異体を作るＤＮＡの配列（配列番号８２）を示す図である。これらの領域のクローニングに使われる制限酵素部位は、下線付き大文字で示されており、ＧＡＡＴＴＣ−ＥｃｏＲＩ、ＧＧＡＴＣＣ−ＢａｍＨＩおよびＣＴＧＣＡｇ−ＰｓｔＩである。ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ挿入物は、ベクターのｐＫＳＶ７中でクローン化される。
【図１２】Ｌｍ−ｄｄおよびＬｍ−ｄｄＤ  ａｃｔＡ株を模式的に表した図である。ゲルは、Ｌｍ−ｄｄおよびＬｍ−ｄｄDａｃｔＡ株のｅ染色体ＤＮＡを使用して得たｏｌｉｇｏ１／２とｏｌｉｇｏ３／４をテンプレートとしてとして使ったＰＣＲ産物の大きさを示す。
【図１３】リステリア染色体のａｃｔＡ遺伝子の上流と下流に存在するＤＮＡ配列（配列番号８３）を示す図である。イタリック体の領域は、ＬｍｄｄDａｃｔＡ株中に存在する残留ａｃｔＡ配列要素を含む。下線配列ｇｔｃｇａｃは、ＸｈｏＩの制限酵素部位を表し、これは、ａｃｔＡのＮ−ＴとＣ−Ｔ領域との間の接合部である。
【図１４】ＬＭワクチン株（Ａ）の投与に反応して腫瘍縮小を示す図である。円は無処理マウスを表し、逆三角形はＬｍｄｄ−ＴＶ３を投与したマウスを表し、十字はＬｍ−ＬＬＯＥ７を投与したマウスを表す。
【図１５】（Ａ）：ＬｍｄｄＡ株の染色体のｄａｌ−ｄａｔ欠失を補完するために、恒常的リステリアｐ６０プロモーターの制御下の枯草菌ｄａｌ遺伝子を有するｐＡｄｖ１６４のプラスミドマップを示す図である。また、それは、短縮ＬＬＯ（１−４４１）のキメラヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子との融合体を含み、この融合体は、３種のＨｅｒ２／ｎｅｕの断片：ＥＣ１（ａａ４０〜１７０）、ＥＣ２（ａａ３５９〜５１８）およびＩＣＩ（ａａ６７９−８０８）の直接融合により構築された。（Ｂ）：ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現と分泌がＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８）およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）中で、抗ＬＬＯ抗体を使ったＴＣＡ沈殿細胞培養上清のウェスタンブロット分析により検出されたことを示す図である。約１０４ＫＤの差が認められるバンドは、ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に対応する。内在性ＬＬＯは５８ＫＤのバンドとして検出される。リステリア対照はＣｈＨｅｒ２の発現が欠失している。
【図１６】（Ａ）：免疫マウス由来の脾細胞中でＨｅｒ２／ｎｅｕを刺激剤としてＮＴ−２細胞を使い、標的として３Ｔ３／ｎｅｕ細胞を使用してリステリアベースワクチン剤により誘発された細胞傷害性Ｔ細胞応答を試験した結果の図である。Ｌｍ対照は、無関係な抗原（ＨＰＶ１６−Ｅ７）を発現したこと以外は全て同じ方式であるＬｍｄｄＡバックグラウンドをベースにした。（Ｂ）：マイトマイシンＣ処理ＮＴ−２細胞でインビトロ刺激の２４時間後に、免疫ＦＶＢ／Ｎマウス由来の脾細胞により細胞培地中に分泌され、ＥＬＩＳＡにより測定されたＩＦＮ−γを示す図である。（Ｃ）：タンパク質の異なる領域由来のペプチドとのインビトロインキュベーションに応答した、キメラワクチンで免疫したＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウス由来の脾細胞によるＩＦＮ−γ分泌を示す図である。図の凡例に示すように、組換えＣｈＨｅｒ２タンパク質を陽性対照として使い、無関係のペプチドまたはペプチド不含の基を陰性対照として構成した。ＩＦＮ−γ分泌は、コインキュベーションの７２時間後採取した細胞培養上清を使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出された。それぞれのデータポイントは、３回繰り返したデータの平均±標準誤差とした。＊Ｐ値＜０．００１。
【図１７】各組換えリステリア−ＣｈＨｅｒ２または対照リステリアワクチンを６回投与したＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子導入マウスからの結果を示す図である。免疫化を６週齢で開始し、３週毎、２１週まで続けた。腫瘍の外観を原則毎週モニターし、無腫瘍マウスのパーセンテージで表現した。＊ｐ＜０．０５、Ｎ＝９／群。
【図１８】ＦＶＢ／Ｎマウスを、１×１０６ＮＴ−２細胞をｓ．ｃ．接種し、各ワクチンを使用して１週間隔で３回免疫した結果を示す図である。２回目の免疫の７日後に脾臓を採取した。免疫細胞の単離後、それらを、Ｔｒｅｇの検出のために抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３抗体により染色した。代表的実験からのＴｒｅｇのドットプロットを、異なる処理群全体にわたる合計ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージとして表した、ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の発生頻度を示す。
【図１９】ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６ＮＴ−２細胞をｓ．ｃ．接種し、各ワクチンを使用して１週間隔で３回免疫した結果を示す図である。２回目の免疫の７日後に腫瘍を採取した。免疫細胞の単離後、Ｔｒｅｇを検出するために、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３抗体で染色した。（Ａ）：代表的実験からのＴｒｅｇのドットプロット。（Ｂ）：異なる処理群全体にわたる、合計ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するパーセンテージで表したＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の発生頻度（左パネル）および腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比率（右パネル）。データは、２つの独立した実験から得た平均±ＳＥＭとして示される。
【図２０】ｐＡｄｖ１３４プラスミドおよびデュアルプラスミドの模式図である。抗原１のクローニングに使われる制限酵素部位（ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ）および抗原２（ＸｂａＩおよびＳａｃＩまたはＢｇｌＩＩ）遺伝子が示されている。黒色矢印は転写の方向を示す。ｐ１５ｏｒｉおよびＲｅｐＲは、リステリアおよび大腸菌複製起点を意味する。ｔＬＬＯは、短縮リステリオリシンＯタンパク質（１−４４１ａａ）で、ｔＡｃｔＡは、短縮ＡｃｔＡ（１−２３３ａａ）タンパク質である。バチルス−ｄａｌ遺伝子は、Ｄ−アラニンラセマーゼをコードし、これは、ＬｍDｄａｌ  ｄａｔ株中でのＤ−アラニンの合成を補完する。
【図２１】腫瘍中のＭＤＳＣおよびＴｒｅｇの減少を示す図である。Ｌｍワクチン（ＬｍｄｄＡＰＳＡおよびＬｍｄｄＡＥ７）接種後のＭＤＳＣ（右側パネル）およびＴｒｅｇ（左側パネル）の数を示す。
【図２２】リステリアワクチン接種後、ＴＰＳＡ２３腫瘍由来の単球性ＭＤＳＣは、抑制性が少ないことを立証するサプレッサーアッセイデータを示す図である。このＭＤＳＣの抑制能力の変化は、同じ抑制の減少がＰＳＡ抗原特異的Ｔ細胞および非特異的に刺激されたＴ細胞でも認められるので、抗原特異的ではない。無ＭＤＳＣ群は、無刺激のままの場合にはレスポンダーＴ細胞の分裂が起こらないことを示し、最後の群は、分裂を抑制するＭＤＳＣが加えられなかった場合の刺激された細胞の分裂を示す。左側パネルは、各群の個別細胞分裂周期を示す。右側パネルは、全体分裂周期を示す。
【図２３】リステリアが脾臓単球性ＭＤＳＣに対し効果を示さず、抗原特異的方式で抑制するのみであることを示すサプレッサーアッセイデータの図である。無ＭＤＳＣ群は、無刺激のままの場合にはレスポンダーＴ細胞の分裂が起こらないことを示し、最後の群は、分裂を抑制するＭＤＳＣが加えられなかった場合の刺激された細胞の分裂を示す。左側パネルは、各群の個別細胞分裂周期を示す。右側パネルは、全体分裂周期を示す。
【図２４】リステリアワクチン接種後、腫瘍由来の顆粒球性ＭＤＳＣで、Ｔ細胞抑制能力が低下することを示すサプレッサーアッセイデータの図である。このＭＤＳＣの抑制能力の変化は、同じ抑制の減少がＰＳＡ抗原特異的Ｔ細胞および非特異的に刺激されたＴ細胞でも認められるので、抗原特異的ではない。無ＭＤＳＣ群は、無刺激のままの場合にはレスポンダーＴ細胞の分裂が起こらないことを示し、最後の群は、分裂を抑制するＭＤＳＣが加えられなかった場合の刺激された細胞の分裂を示す。左側パネルは、各群の個別細胞分裂周期を示す。右側パネルは、全体分裂周期を示す。
【図２５】リステリアが脾臓単球性ＭＤＳＣに対し効果を示さず、抗原特異的方式で抑制するのみであることを示すサプレッサーアッセイデータの図である。無ＭＤＳＣ群は、無刺激のままの場合にはレスポンダーＴ細胞の分裂が起こらないことを示し、最後の群は、分裂を抑制するＭＤＳＣが加えられなかった場合の刺激された細胞の分裂を示す。左側パネルは、各群の個別細胞分裂周期を示す。右側パネルは、全体分裂周期を示す。
【図２６】腫瘍由来のＴｒｅｇが依然として抑制性であることを示すサプレッサーアッセイデータの図である。この腫瘍モデルでは、非抗原特異的にＴｒｅｇの抑制能力のわずかな低下が認められる。無Ｔｒｅｇ群は、無刺激のままの場合にはレスポンダーＴ細胞の分裂が起こらないことを示し、最後の群は、分裂を抑制するＴｒｅｇが加えられなかった場合の刺激された細胞の分裂を示す。左側パネルは、各群の個別細胞分裂周期を示す。右側パネルは、全体分裂周期を示す。
【図２７】脾臓Ｔｒｅｇが依然として抑制性であることを示すサプレッサーアッセイデータの図である。無Ｔｒｅｇ群は、無刺激のままの場合にはレスポンダーＴ細胞の分裂が起こらないことを示し、最後の群は、分裂を抑制するＴｒｅｇが加えられなかった場合の刺激された細胞の分裂を示す。左側パネルは、各群の個別細胞分裂周期を示す。右側パネルは、全体分裂周期を示す。
【図２８】マウスの腫瘍中で認められるか、または脾臓中で認められるかにかかわらず、従来のＣＤ４＋Ｔ細胞が細胞分裂に影響を与えないことを示すサプレッサーアッセイデータの図である。左側および右側パネルは、全体分裂周期を示す。
【図２９】リステリアワクチン接種後、４Ｔ１腫瘍由来の単球性ＭＤＳＣの抑制能力が低下することを示すサプレッサーアッセイデータの図である。このＭＤＳＣの抑制能力の変化は、同じ抑制の減少がＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原特異的Ｔ細胞および非特異的に刺激されたＴ細胞でも認められるので、抗原特異的ではない。無ＭＤＳＣ群は、無刺激のままの場合にはレスポンダーＴ細胞の分裂が起こらないことを示し、最後の群は、分裂を抑制するＭＤＳＣが加えられなかった場合の刺激された細胞の分裂を示す。左側パネルは、各群の個別細胞分裂周期を示す。右側パネルは、全体分裂周期を示す。
【図３０】脾臓単球性ＭＤＳＣに与えるリステリア特異的効果がないことを示すサプレッサーアッセイデータの図である。無ＭＤＳＣ群は、無刺激のままの場合にはレスポンダーＴ細胞の分裂が起こらないことを示し、最後の群は、分裂を抑制するＭＤＳＣが加えられなかった場合の刺激された細胞の分裂を示す。左側パネルは、各群の個別細胞分裂周期を示す。右側パネルは、全体分裂周期を示す。
【図３１】リステリアワクチン接種後、４Ｔ１腫瘍由来の顆粒球性ＭＤＳＣの抑制能力が低下することを示すサプレッサーアッセイデータの図である。このＭＤＳＣの抑制能力の変化は、同じ抑制の減少がＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原特異的Ｔ細胞および非特異的に刺激されたＴ細胞でも認められるので、抗原特異的ではない。無ＭＤＳＣ群は、無刺激のままの場合にはレスポンダーＴ細胞の分裂が起こらないことを示し、最後の群は、分裂を抑制するＭＤＳＣが加えられなかった場合の刺激された細胞の分裂を示す。左側パネルは、各群の個別細胞分裂周期を示す。右側パネルは、全体分裂周期を示す。
【図３２】脾臓単球性ＭＤＳＣに与えるリステリア特異的効果がないことを示すサプレッサーアッセイデータの図である。無ＭＤＳＣ群は、無刺激のままの場合にはレスポンダーＴ細胞の分裂が起こらないことを示し、最後の群は、分裂を抑制するＭＤＳＣが加えられなかった場合の刺激された細胞の分裂を示す。左側パネルは、各群の個別細胞分裂周期を示す。右側パネルは、全体分裂周期を示す。
【図３３】リステリアワクチン接種後、４Ｔ１腫瘍由来のＴｒｅｇの抑制能力が低下することを示すサプレッサーアッセイデータの図である。この減少は、Ｔｒｅｇ抑制能力の変化がＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的および非特異的レスポンダーＴ細胞の両方で認められるので、抗原特異的ではない。左側パネルは、各群の個別細胞分裂周期を示す。右側パネルは、全体分裂周期を示す。
【図３４】脾臓Ｔｒｅｇに与えるリステリア特異的効果がないことを示すサプレッサーアッセイデータの図である。レスポンダーＴ細胞は、抗原特異的であるなしにかかわらず、全て、分裂可能である。左側パネルは、各群の個別細胞分裂周期を示す。右側パネルは、全体分裂周期を示す。
【図３５】顆粒球性ＭＤＳＣの抑制能力がｔＬＬＯの過剰発現に起因し、相手の融合抗原とは無関係であることを示すサプレッサーアッセイデータの図である（Ａ〜Ｄ）。左側パネルは、各群の個別細胞分裂周期を示す。右側パネルは、全体分裂周期を示す。
【図３６】同様に、単球性ＭＤＳＣの抑制能力がｔＬＬＯの過剰発現に起因し、相手の融合抗原とは無関係であることを示すサプレッサーアッセイデータの図である（Ａ〜Ｄ）。左側パネルは、各群の個別細胞分裂周期を示す。右側パネルは、全体分裂周期を示す。
【図３７】Ｌｍワクチン接種後、脾臓から精製された顆粒球性ＭＤＳＣが抗原特異的レスポンダーＴ細胞の分裂抑制能力を保持していることを示すサプレッサーアッセイデータの図である（Ａ、Ｂ）。しかし、非特異的刺激後、活性化Ｔ細胞（ＰＭＡ／イオノマイシンを使用）は、依然として分裂可能である（Ｃ、Ｄ）。左側パネルは、各群の個別細胞分裂周期を示す。右側パネルは、全体分裂周期を示す。
【図３８】Ｌｍワクチン接種後、脾臓から精製された単球性ＭＤＳＣがその抗原特異的レスポンダーＴ細胞の分裂抑制能力を保持していることを示すサプレッサーアッセイデータの図である（Ａ、Ｂ）。しかし、非特異的刺激後、活性化Ｔ細胞（ＰＭＡ／イオノマイシンで刺激）は、依然として分裂可能である（Ｃ、Ｄ）。左側パネルは、各群の個別細胞分裂周期を示す。右側パネルは、全体分裂周期を示す。
【図３９】レスポンダー細胞が抗原特異的に活性化されるか（Ａ、Ｂ）、または非特異的に活性化されるか（Ｃ、Ｄ）に関わらず、Ｌｍ処理群のいずれの腫瘍から精製されたＴｒｅｇでも、わずかに低減したレスポンダーＴ細胞の分裂抑制能力を有することを示すサプレッサーアッセイデータの図である。左側パネルは、各群の個別細胞分裂周期を示す。右側パネルは、全体分裂周期を示す。
【図４０】脾臓から精製されたＴｒｅｇが、依然として、抗原特異的に（Ａ、Ｂ）および非特異的に（Ｃ、Ｄ）活性化されたレスポンダーＴ細胞の両方を抑制できることを示すサプレッサーアッセイデータの図である。
【図４１】レスポンダー細胞が抗原特異的に（Ａ、Ｂ）または非特異的に（Ｃ、Ｄ）活性化されたかどうかに関わらず、腫瘍Ｔｃｏｎ細胞がＴ細胞の分裂を抑制できないことを示すサプレッサーアッセイデータの図である。
【図４２】レスポンダー細胞が抗原特異的に（Ａ、Ｂ）または非特異的に（Ｃ、Ｄ）活性化されたかどうかに関わらず、脾臓Ｔｃｏｎ細胞がＴ細胞の分裂を抑制できないことを示すサプレッサーアッセイデータの図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一実施形態では、疾患に罹患している対象または対象の疾患部位において浸潤Ｔリンパ球／サプレッサー細胞比率を増大させる方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、疾患に罹患している対象または対象の疾患部位においてＣＤ８＋Ｔ細胞／サプレッサー細胞の比率を増大させる方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、浸潤Ｔリンパ球／サプレッサー細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞／サプレッサー細胞比率を増大させるための方法は、対象に本発明の弱毒生リステリア、または組換えリステリア株を含む組成物を投与するステップを含む。
【００１３】
一実施形態では、疾患に罹患している対象または対象の疾患部位において浸潤Ｔリンパ球／制御性Ｔ細胞の比率を増大させる方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、疾患に罹患している対象または対象の疾患部位においてＣＤ８＋Ｔ細胞／制御性Ｔ細胞の比率を増大させる方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、浸潤Ｔリンパ球／制御性Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞／制御性Ｔ細胞の比率を増大させる方法は、対象に本発明の弱毒生リステリア、または組換えリステリア株を含む組成物を投与するステップを含む。
【００１４】
一実施形態では、疾患に罹患している対象または対象の疾患部位において浸潤Ｔリンパ球／骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の比率を増大させるための方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、疾患に罹患している対象または対象の疾患部位においてＣＤ８＋Ｔ細胞／骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の比率を増大させるための方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、浸潤Ｔリンパ球／骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）またはＣＤ８＋Ｔ細胞／骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の比率を増大させるための方法は、対象に本発明の弱毒生リステリア、または組換えリステリア株を含む組成物を投与するステップを含む。
【００１５】
一実施形態では、浸潤Ｔリンパ球は、腫瘍浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）である。
【００１６】
一実施形態では、疾患に対する免疫応答を抑制する細胞の量を減少させるための方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、免疫応答を抑制する細胞は、抑制性細胞である。別の実施形態では、抑制性細胞は骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）である。別の実施形態では、抑制性細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。
【００１７】
ヒトＭＤＳＣの通常の血漿マーカーには、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１５、ＣＤ１４陰性、ＭＨＣクラスＩＩ陰性、ＨＬＡＤＲｌｏｗ  ｏｒ−、が含まれる。通常の細胞内のマーカーには、アルギナーゼ、およびｉＮＯＳが含まれる。さらに、ヒトＭＤＳＣの抑制作用または機序には、一酸化窒素（ＮＯ）、アルギナーゼ、またはニトロチロシンの使用が含まれる。マウスでは、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）は、ＣＤ１１ｂおよびＧｒ−１ダブルポジティブであり、Ｆ４／８０ｉｎｔ、ＣＤ１１ｃｌｏｗ、ＭＨＣＩＩ−／ｌｏｗ、Ｌｙ６Ｃ＋として記載されてきた。免疫抑制能力を持つＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ−１＋細胞は、ＩＦＮ−γを産生するとして説明されてきた。ＭＤＳＣは、単球性であり、加えて顆粒球性であり得る。
【００１８】
一実施形態では、腫瘍ＭＤＳＣは、予想外にも、抗原特異的機能および非特異的Ｔ細胞機能の両方を抑制できるが、脾臓ＭＤＳＣは、抗原特異的Ｔ細胞の機能のみを抑制できる。下記実施例で示されるように（実施例１７〜２０参照）、本明細書で提供される弱毒生リステリアは、腫瘍部位、例えば、腫瘍部位の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団に対する疾患のサプレッサー細胞の割合を減少させる。
【００１９】
ヒト上皮Ｃａｃｏ−２細胞中のＬｍまたは半熔解性の用量のＬＬＯが、細菌の細胞内増殖を減らし、誘導型一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）の過剰発現を引き起こすＩＬ−６の発現を誘導する。一酸化窒素は、Ｌｍに対する自然免疫応答に重要な成分であると思われ、好中球およびマクロファージの殺リステリア菌活性で重要な役割を持ち、誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）の欠如は、Ｌｍ感染に対する感受性を生じる。
【００２０】
また、Ｌｍ感染は、強力なＭＨＣクラス２拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を生じ、ＣＤ４＋Ｔ細胞の表現型をＴｈ−１に転換する。さらに、ＣＤ４＋Ｔ細胞ヘルプは、Ｌｍに対する機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞記憶の生成および維持に必要とされる。さらに、マウス腹腔内へのＬｍの感染は、腹膜腔中のＩＬ−１７分泌を伴うＣＤ４＋Ｔγδ細胞の局所的誘導を引き起こすが、これらの注射後、脾臓またはリンパ節Ｔ細胞集団では変化は観察されなかったとの報告がある。さらに、リステリア感染は、実質的に免疫系の一部ではない他の系も含むが、しかし、これらの系は、免疫機能が骨髄造血および血管内皮細胞機能などの治療結果に影響を与えるのを支援する。
【００２１】
Ｌｍに感染したマクロファージは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１８およびＩＬ−１２を産生する。これらの全ては、ＩＦＮ−γの産生の誘導およびその後のファゴソーム中でのＬｍの死滅と分解に重要である。ＩＬ−１２欠乏は、リステリア症に対する感受性の増加をもたらし、これは、ＩＦＮ−γの投与により元に戻すことができる。ＮＫ細胞は、初期の感染におけるＩＦＮ−γの主要供給源である。再感染時に同種抗原が存在しない場合には、記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞がＩＬ−１２およびＩＬ−１８に応答してＩＦＮ−γを産生する能力を有する。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、脾臓のＴ細胞領域中のマクロファージおよびＬｍと共存し、そこで、それらは、抗原と関係なくＩＦＮ−γを産生する。ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生は、部分的には、ＬＬＯの発現に依存する。
【００２２】
ＩＦＮ−γは、Ｌｍベースワクチン剤により得られる抗腫瘍応答で重要な役割を果たす。最初はＮＫ細胞により産生されるが、ＩＦＮ−γレベルは、その後ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞によりさらに長い期間維持される。Ｌｍワクチン剤は、効果的腫瘍縮小のためにＩＦＮ−γが必要であり、ＩＦＮ−γは、リンパ球の腫瘍浸潤には特に必要とされる。また、ＩＦＮ−γは、ワクチン接種後の早期エフェクター相中の腫瘍部位における血管新生を阻害する。
【００２３】
一実施形態では、ＬＬＯは、ＤＮＡ発現の制御に影響を与えるエピジェネティックな修飾を誘導する能力を有する。細胞外のＬＬＯは、リステリア感染症の初期相中のヒストンタンパク質Ｈ３の脱リン酸化および類似のヒストンＨ４の脱アセチル化を誘導する。このエピジェネティック効果は、免疫機能に関与する特定の遺伝子の転写の減少をもたらし、この結果、ＬＬＯが免疫応答に必要な遺伝子産物の発現を調節できる機序を与える。別の実施形態では、別のＬＬＯのゲノム効果は、ＩＣＡＭおよびＥ−セレクチンの発現と関連したＮＦ−κβの転座、およびＩＬ−８とＭＣＰ−１の分泌を増大させる能力である。別の実施形態では、ＬＬＯの影響を受ける別のシグナル伝達カスケードは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路であり、細胞膜を通るＣａ２＋流入の増加を生じ、これは、リステリアの内皮細胞中への侵入およびそれらのその後の感染を促進する。
【００２４】
一実施形態では、ＬＬＯは、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−a、およびＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦなどの炎症性サイトカイン、ならびに自然および適応免疫反応に重要なＮＯ、ケモカイン、および共刺激分子の強力な誘導因子である。一実施形態では、ＬＬＯの存在下のマクロファージは、ＩＬ−１a、ＴＮＦ−a、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８を放出し、次にこれらがＮＫ細胞を活性化してＩＦＮ−γを放出し、マクロファージ活性化が増強される。
【００２５】
一実施形態では、サイトゾルＬｍにより分泌されたＬＬＯがマクロファージ中で特定の遺伝子発現上昇を引き起こし、重要なＩＦＮ−γの転写と分泌をもたらす。別の実施形態では、サイトゾルＬＬＯは、ＮＦ−κβとＭＡＰＫの検出可能な活性化なしに、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に依存しない侵襲的Ｌｍに対する強力なタイプＩインターフェロン応答を活性化する。
【００２６】
一実施形態では、本明細書で提供されるリステリア（Ｌｍ）ワクチン株は、ＴｒｅｇおよびＭＤＳＣの割合を減らし、疾患部位でのサプレッサー細胞に対するエフェクターの比率を相応に変化させる。別の実施形態では、本明細書で提供されるＬｍワクチン剤は、対象の特定の疾患部位においてＴｒｅｇおよびＭＤＳＣの割合ならびにＭＤＳＣの絶対数を減少させることにより、免疫応答の改善に役立つ。このような部位は、アレルギー、外傷、感染症、疾患による炎症部位であってもよく、または部位は、腫瘍部位であってもよい。
【００２７】
別の実施形態では、リステリア処理マウスの腫瘍から精製された単球性および顆粒球性ＭＤＳＣの両方が、未処理マウスの腫瘍から精製されたＭＤＳＣよりも、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分裂の抑制を少なくできるが、一方で、これらの同じ腫瘍保持マウスの脾臓から精製された単球性および顆粒球性ＭＤＳＣは、リステリアでワクチン接種後、それらの機能に変化が認められない（本明細書の実施例１７〜２０参照）。一実施形態では、脾臓ＭＤＳＣが抗原特異的にのみ抑制することが理由でこの効果が認められる。従って、リステリアによる処理は、ＴｒｅｇおよびＭＤＳＣなどの腫瘍抑制性細胞の腫瘍特異的抑制を可能とするという別の利点を有する。本明細書で提供される方法および組成物の弱毒生リステリアにより得られる別の予想外の利点は、腫瘍中により少ない量のＴｒｅｇが存在し、それが、Ｔ細胞複製を抑制する能力を失ったままの状態を持続することである。
【００２８】
別の実施形態では、短縮ＬＬＯ発現リステリア処理マウスの腫瘍から精製された単球性および顆粒球性ＭＤＳＣの両方は、未処理マウスの腫瘍から精製されたＭＤＳＣよりも、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分裂の抑制を少なくできるが、一方で、これらの同じ腫瘍保持マウスの脾臓から精製された単球性および顆粒球性ＭＤＳＣは、リステリアでワクチン接種後、それらの機能に変化が認められない（本明細書の実施例２１参照）。一実施形態では、脾臓ＭＤＳＣが抗原特異的にのみ抑制することが理由でこの効果が認められる。従って、短縮ＬＬＯ発現リステリアによる処理は、ＴｒｅｇおよびＭＤＳＣなどの腫瘍抑制性細胞の腫瘍特異的抑制を可能とするという別の利点を有する。本明細書で提供される方法および組成物の短縮ＬＬＯ発現弱毒生リステリアにより得られる別の予想外の利点は、腫瘍中により少ない量のＴｒｅｇとＭＤＳＣが存在し、それらが、Ｔ細胞複製を抑制する能力を失ったままの状態を持続し、この効果は、異種抗原などのＬＬＯ融合相手がない場合にも観察されることである。
【００２９】
別の実施形態では、短縮ＬＬＯ発現弱毒生リステリアワクチンの投与により、ＴｒｅｇおよびＭＤＳＣ媒介Ｔ細胞抑制が低減され、抗腫瘍Ｔ細胞応答が増強される（本明細書の実施例２１参照）。
【００３０】
一実施形態では、対象の疾患部位のサプレッサー細胞の割合を減少させるための方法が本明細書で提供され、この方法は、弱毒生リステリアワクチン株を対象に投与するステップを含む。
【００３１】
別の実施形態では、対象の疾患部位のサプレッサー細胞のＴ細胞複製抑制能力を低下させる方法が本明細書で提供され、この方法は、弱毒生リステリアワクチン株を前記対象に投与するステップを含む。
【００３２】
一実施形態では、疾患部位のサプレッサー細胞の数を減少させることにより、効果的に疾患を治療する。別の実施形態では、疾患部位のサプレッサー細胞の数を減少させることにより、疾患に罹患している対象の疾患部位の抗病性免疫応答が増大される。別の実施形態では、免疫応答は、細胞媒介免疫応答である。別の実施形態では、免疫応答は、腫瘍浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）免疫応答である。
【００３３】
一実施形態では、対象の疾患のサプレッサー細胞の割合を減らし、対象の疾患に対する治療の応答を増大させるための方法が本明細書で提供され、この方法は、弱毒生リステリアワクチン株を対象に投与し、それにより、疾患のサプレッサー細胞の割合を減らし、対象の疾患に対する治療の応答を増大させるステップを含む。
【００３４】
別の実施形態では、抑制する対象の疾患のＴ細胞の複製を抑制するサプレッサー細胞の能力を低下させ、対象の疾患に対する治療の応答を増大させるための方法が本明細書で提供され、この方法は、弱毒生リステリアワクチン株を対象に投与するステップが含まれる。
【００３５】
一実施形態では、対象の疾患の骨髄由来サプレッサー細胞の数を減少させるための方法が本明細書で提供され、この方法は、弱毒生リステリアワクチン株を前記対象に投与するステップを含む。
【００３６】
一実施形態では、用語の「〜の割合を減少させる」とは、アッセイ中または免疫応答中に、浸潤Ｔ細胞の存在に関連して疾患部位での存在が減らされるかまたは縮減されるＴｒｅｇまたはＭＤＳＣサプレッサー細胞の量を表す。
【００３７】
別の実施形態では、用語の「〜の数を減少させる」とは、本明細書で提供される弱毒生リステリアまたは本明細書の別のところでも記載されている類似の効果を達成できる別の試薬の投与の結果として、絶対数が減らされたか、または縮減されたＴｒｅｇ、またはＭＤＳＣサプレッサー細胞の絶対数を意味する。
【００３８】
一実施形態では、本明細書で提供されるサプレッサー細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。別の実施形態では、サプレッサー細胞は、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）である。
【００３９】
別の実施形態では、本明細書で提供される弱毒生リステリアは、第１のポリペプチドおよび少なくとも第２のポリペプチドをそれぞれコードする第１の読み枠および少なくとも第２の読み枠を含む組換え核酸配列を含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、それぞれ、内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合した異種抗原またはその機能性断片を含む。
【００４０】
一実施形態では、本明細書で提供される異種抗原またはその機能性断片および内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドは、単一読み枠で翻訳される。別の実施形態では、本明細書で提供される各異種抗原性ポリペプチドおよび内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドは、別々に翻訳された後で融合される。
【００４１】
別の実施形態では、本明細書で提供される組換え核酸は、第３のポリペプチドをコードする第３の読み枠をさらに含み、第３のポリペプチドは、内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合した異種抗原またはその機能性断片を含む。
【００４２】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ含有ポリペプチドは、Ｎ末端切断型ＬＬＯポリペプチド、Ｎ末端ＡｃｔＡポリペプチド、もしくはＰＥＳＴペプチド、またはそれらの機能性断片である。
【００４３】
別の実施形態では、第１、第２または第３の異種抗原またはそれらの機能性断片は、感染性病原体、または腫瘍細胞によって発現されるか、またはそれらから誘導される。
【００４４】
一実施形態では、第１、第２または第３の抗原は、局所組織環境に関連し、該環境がさらに癌の発生または転移に関連するか、または腫瘍回避もしくは癌に対する抵抗性に関連するか、または血管新生抗原である。
【００４５】
別の実施形態では、異種抗原は、宿主のアレルギー性、炎症性の反応を引き起こすアレルゲンである。
【００４６】
別の実施形態では、本明細書で提供される疾患は、局在型疾患、すなわち、特定の疾患部位に局限された疾患、または全身性疾患である。
【００４７】
別の実施形態では、疾患は、感染症、呼吸疾患もしくは炎症性疾患、または癌もしくは腫瘍である。
【００４８】
別の実施形態では、感染症は、限定するものではないが、ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア破傷風、百日咳、ヘモフィルス・インフルエンザ、Ｂ型肝炎、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ、インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）パンデミック、麻疹および風疹、流行性耳下腺炎、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、経口小児麻痺ワクチン、１価、２価および３価肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、炭疽菌（炭疽）、ボツリヌス毒素（ボツリヌス症）、ペスト菌（ペスト）、大痘瘡（天然痘）および他の関連ポックスウイルス、野兎病菌（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラウイルス（デング熱）、フィロウイルス（エボラ出血熱、マールブルグウイルス）、類鼻疽菌、Ｑ熱コクシエラ（Ｑ熱）、ブルセラ菌種（ブルセラ症）、鼻疽菌（鼻疽）、オウム病クラミジア（オウム病）、リシン毒素（トウゴマ由来）、クロストリジウム毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、発疹チフス（発疹チフスリケッチア）、他のリケッチア、食物および水媒介病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ菌、赤痢菌属種、サルモネラ菌ＢＣＧ／、ジェジュニ菌、腸炎エルシニア）、ウイルス（カリシウイルス、肝炎Ａ、西ナイルウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ニパーウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介性出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫類（小形クリプトスポリジウム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミティス、細菌性腟症、トラコーマクラミジア、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、デュクレー桿菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、腟トリコモナス、または当技術分野で既知の本明細書で挙げられていないいずれかの他の感染症、病原体のいずれか１種により引き起こされるものである。
【００４９】
別の実施形態では、感染症は、家畜感染症である。別の実施形態では、家畜疾患は、人に伝染させることができ、「人獣共通感染症」と呼ばれる。別の実施形態では、これらの疾患には、限定するものではないが、口蹄疫、西ナイルウイルス、狂犬病、イヌパルボウイルス、ネコ白血病ウイルス、ウマインフルエンザウイルス、感染性ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ）、仮性狂犬病、豚コレラ（ＣＳＦ）、畜牛のウシヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）感染症が原因のＩＢＲ、およびブタの仮性狂犬病（オーエスキー病）、トキソプラズマ症、炭疽、水疱性口内炎ウイルス、ロドコッカス・エクイ、野兎病、ペスト（ペスト菌）、トリコモナス、が含まれる。
【００５０】
別の実施形態では、呼吸または炎症性疾患は、喘息である。
【００５１】
弱毒生リステリア株は、抗炎症剤または気管支拡張剤などの他の治療薬の同時投与を行わなくても喘息症状を和らげることができる。別の実施形態では、本明細書で提供される方法は、対象に弱毒生リステリア株および１種以上の治療薬を同時投与するステップをさらに含む。別の実施形態では、治療薬は、抗喘息剤である。別の実施形態では、薬剤は、抗炎症剤、非ステロイド性抗炎症剤、抗生物質、抗コリン剤、気管支拡張剤、コルチコステロイド、短時間作用型ベータアゴニスト、長時間作用のベータアゴニスト、配合吸入剤、抗ヒスタミン剤、またはこれらの組み合わせである。
【００５２】
別の実施形態では、本医薬組成物は、弱毒生リステリア株および同時投与治療薬の両方を含んでもよい。また、弱毒生リステリア株および同時投与治療薬が、別の医薬組成物であってもよい。
【００５３】
別の実施形態では、薬剤は、吸入型副腎皮質ステロイドを含み、これには、フルチカゾン（Ｆｌｏｖｅｎｔ  Ｄｉｓｋｕｓ、Ｆｌｏｖｅｎｔ  ＨＦＡ）、ブデソニド（Ｐｕｌｍｉｃｏｒｔ  Ｆｌｅｘｈａｌｅｒ）、モメタゾン（Ａｓｍａｎｅｘ）、フルニソリド（Ａｅｒｏｂｉｄ）、ベクロメタゾン（Ｑｖａｒ）などが含まれる。これらは、最もよく処方されるタイプの長期作用型喘息薬である。経口副腎皮質ステロイドと異なり、これらのコルチコステロイド薬は副作用のリスクが比較的低く、通常、長期使用で安全である。
【００５４】
薬剤は、ロイコトリエン受容体拮抗薬であってもよい。これらの経口薬剤には、モンテルカスト（Ｓｉｎｇｕｌａｉｒ）、ザフィルルカスト（Ａｃｃｏｌａｔｅ）およびジロートン（Ｚｙｆｌｏ、Ｚｙｆｌｏ  ＣＲ）が含まれる。これらは、２４時間にわたり喘息症状を防ぐのを助ける。
【００５５】
さらに、薬剤は、長時間作用型ベータアゴニスト（ＬＡＢＡ）であってもよい。これらの吸入型薬剤には、サルメテロール（Ｓｅｒｅｖｅｎｔ  Ｄｉｓｋｕｓ）およびフォルモテロール（Ｆｏｒａｄｉｌ  Ａｅｒｏｌｉｚｅｒ）が含まれる。ＬＡＢＡは、気道を開き、炎症を低減させる。しかし、重度の喘息発作に関連があるとされてきた。ＬＡＢＡは、吸入型コルチコステロイドとの併用でのみ摂取されるべきである。
【００５６】
一実施形態では、本発明の方法で治療される癌は乳癌である。別の実施形態では、癌は子宮頸癌である。別の実施形態では、癌はＨｅｒ２含有癌である。別の実施形態では、癌は黒色腫である。別の実施形態では、癌は膵臓癌である。別の実施形態では、癌は卵巣癌である。別の実施形態では、癌は胃癌である。別の実施形態では、癌は膵臓の癌の病巣である。別の実施形態では、癌は肺腺癌である。別の実施形態では、それは多形神経膠芽腫である。別の実施形態では、それは低酸素固形腫瘍である。別の実施形態では、癌は結腸直腸腺癌である。別の実施形態では、癌は肺扁平上皮腺癌である。別の実施形態では、癌は胃腺癌である。別の実施形態では、癌は卵巣表面上皮腫瘍（例えば、良性の増殖性またはその悪性変種）である。別の実施形態では、癌は、口腔扁平上皮癌である。別の実施形態では、癌は非小細胞肺癌である。別の実施形態では、癌は子宮内膜癌である。別の実施形態では、癌は膀胱癌である。別の実施形態では、癌は頭頸部癌である。別の実施形態では、癌は前立腺癌である。それぞれの癌に対する可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【００５７】
一実施形態では、本明細書で提供される異種抗原は、ＨＰＶ−Ｅ７である。別の実施形態では、抗原はＨＰＶ−Ｅ６である。別の実施形態では、抗原はＨｅｒ−２／ｎｅｕである。別の実施形態では、抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１である。別の実施形態では、抗原はテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）である。別の実施形態では、抗原はＳＣＣＥである。別の実施形態では、抗原はＣＥＡである。別の実施形態では、抗原はＬＭＰ−１である。別の実施形態では、抗原はｐ５３である。別の実施形態では、抗原は炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）である。別の実施形態では、抗原はＰＳＭＡである。別の実施形態では、抗原は前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）である。別の実施形態では、抗原はＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態では、抗原はＷＴ−１である。別の実施形態では、抗原はＨＩＶ−１  Ｇａｇである。別の実施形態では、抗原はプロテイナーゼ３である。別の実施形態では、抗原はチロシナーゼ関連タンパク質２である。別の実施形態では、抗原はＰＳＡ（前立腺特異的抗原）である。別の実施形態では、抗原は、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、Ｈｅｒ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）、ＳＣＣＥ、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＷＴ−１、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ＣＥＡ、ＬＭＰ−１、ｐ５３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２、Ｍｕｃ１、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、またはこれらの組み合わせから選択される。
【００５８】
別の実施形態では、本明細書で提供される異種抗原は、腫瘍関連抗原である。これは、一実施形態では、次の腫瘍抗原の内の１種である：ＭＡＧＥ（黒色腫関連抗原Ｅ）タンパク質、例えば、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、チロシナーゼ；変異ｒａｓタンパク質；変異ｐ５３タンパク質；ｐ９７黒色腫抗原、進行癌関連ｒａｓペプチドまたはｐ５３ペプチド；子宮頸癌関連ＨＰＶ１６／１８抗原、乳癌関連ＫＬＨ抗原、結腸直腸癌関連ＣＥＡ（癌胎児抗原）、ｇｐ１００、黒色腫関連ＭＡＲＴ１抗原、または前立腺癌関連ＰＳＡ抗原。別の実施形態では、本明細書で提供される組成物と方法のための抗原は、黒色腫関連抗原である。これは、一実施形態では、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＨＳＰ−７０、ベータ−ＨＣＧ、またはこれらの組み合わせである。本明細書で記載していないが、当業者なら、本明細書で提供される方法および組成物への使用が当技術分野で既知の任意の異種抗原を使用できるであろうことは理解できよう。
【００５９】
一実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、代謝酵素をコードする第２の読み枠をさらに含む。別の実施形態では、代謝酵素は、組換えリステリア株の染色体中で欠失している内在性遺伝子を補完する。別の実施形態では、第２の読み枠でコードされる代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素である。一実施形態では、リステリアは、追加の代謝酵素をコードする第３の読み枠をさらに含む。別の実施形態では、第３の読み枠によりコードされる代謝酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。別の実施形態では、核酸分子は、異種抗原またはその断片をコードする第４の読み枠を含む。
【００６０】
一実施形態では、核酸分子は、リステリアゲノムに組み込まれる。別の実施形態では、核酸分子は、組換えリステリアワクチン株中のプラスミドの中に存在する。別の実施形態では、プラスミドは、抗生物質による選択のない場合に、組換えリステリアワクチン株中で安定に維持される。別の実施形態では、プラスミドは、抗生物質耐性を組換えリステリアに付与しない。
【００６１】
一実施形態では、リステリアを形質転換して組換えリステリアを作るために使われる核酸分子が本明細書で提供される。別の実施形態では、本明細書で提供されるリステリアを形質転換するために使われる核酸は、病原性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、核酸分子は、リステリアゲノム中に組み込まれ、非機能性の病原性遺伝子を有する。別の実施形態では、病原性遺伝子は、組換えリステリア中で変異される。さらに別の実施形態では、核酸分子を使用してリステリアゲノム中に存在する内在性遺伝子が不活化される。さらに別の実施形態では、病原性遺伝子は、ＡｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌＡ遺伝子、およびｉｎｌＢ遺伝子、ｉｎｌＣ遺伝子、ｉｎｌＪ遺伝子、ＰｌｂＣ遺伝子またはＰｒｆＡ遺伝子である。病原性遺伝子は、組換えリステリア中で病原性と関連付けられることが当技術分野で既知のいずれの遺伝子であってもよいことは当業者には理解されよう。
【００６２】
一実施形態では、代謝遺伝子、病原性遺伝子などが、リステリア株の染色体中を欠失している。別の実施形態では、代謝遺伝子、病原性遺伝子などが、染色体中、およびリステリア株のいずれのエピソーム遺伝要素中においても欠失している。別の実施形態では、代謝遺伝子、病原性遺伝子、などが、病原性株のゲノム中で欠失している。一実施形態では、病原性遺伝子が、染色体中で変異される。別の実施形態では、病原性遺伝子が、染色体から欠失している。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【００６３】
一実施形態では、用語の「核酸分子」は、別の実施形態では、プラスミドを意味する。別の実施形態では、この用語は、組込み型ベクターを意味する。別の実施形態では、この用語は、組込み型ベクターを含むプラスミドを意味する。別の実施形態では、組込み型ベクターは、部位特異的組込み型ベクターである。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の核酸分子は、当技術分野で既知の任意のタイプのヌクレオチドから構成される。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【００６４】
別の実施形態では、構築物または核酸分子は、相同組換えによってリステリア染色体に組み込まれる。相同組換えの技術は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｂａｌｏｇｌｕ  Ｓ、Ｂｏｙｌｅ  ＳＭ、ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｉｔｈｅｒ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｐａｒｔｉａｌ  ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ  ｏｒ  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｌ７／Ｌ１２  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００５、１０９（１−２）：１１−７）；およびＪｉａｎｇ  ＬＬ、Ｓｏｎｇ  ＨＨ、ｅｔ  ａｌ．、（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）２００５、３７（１）：１９−２４）中に記載されている。別の実施形態では、相同組換えは、米国特許第６，８５５，３２０号に記載のように行われる。この場合、Ｅ７を発現する組換えＬｍ株は、ｈｌｙプロモーターの制御下で、遺伝子産物の分泌を確実にするためのｈｌｙシグナル配列を包含して、Ｅ７遺伝子の染色体への組込みにより作成され、Ｌｍ−ＡＺ／Ｅ７と呼ぶ組換えが得られた。別の実施形態では、温度感受性プラスミドを使用して組換え体を選択する。それぞれの技術は、本発明の別の実施形態となる。
【００６５】
別の実施形態では、構築物または核酸分子は、トランスポゾン挿入を使用してリステリア染色体中に組み込まれる。トランスポゾン挿入のための技術は、当該技術分野において公知であり、特に、ＤＰ−Ｌ９６７の構築に関し、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９０、５８：３７７０−３７７８）に記載されている。別の実施形態では、トランスポゾン変異により安定なゲノム挿入変異体が形成できるという利点があるが、異質な遺伝子が挿入されている場合に、ゲノム中の位置が分からないという欠点がある。
【００６６】
別の実施形態では、構築物または核酸分子は、ファージ組込み部位を使用してリステリア染色体中に組み込まれる（Ｌａｕｅｒ  Ｐ、Ｃｈｏｗ  ＭＹ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ、ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００２；１８４（１５）：４１７７−８６）。本方法の特定の実施形態では、インテグラーゼ遺伝子およびバクテリオファージの結合部位（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）を使用して異種遺伝子を対応する結合部位へ挿入する。この結合部位はゲノム中のいずれの適切な部位であってもよい（例えば、ａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子のｃｏｍＫまたは３’末端）。別の実施形態では、内在性プロファージは、構築物または異種遺伝子の組込みの前に利用された結合部位から取り除かれる。別の実施形態では、この方法は、単一コピー組込み体を生ずる。別の実施形態では、本発明は、臨床的適用のためのファージベース染色体組込み系をさらに含み、限定するものではないが、ｄ−アラニンラセマーゼなどの必須酵素を栄養要求する宿主株、例えば、Ｌｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）が使用できる。別の実施形態では、「ファージ除去ステップ」を避けるために、ＰＳＡに基づくファージ組込み系が使用される。別の実施形態では、これには、組み込まれた遺伝子を維持するために抗生物質による連続的選択が必要である。従って、別の実施形態では、本発明は、抗生物質を使った選択を必要としないファージベース染色体の組込み系の樹立を可能とする。というよりはむしろ、栄養要求性宿主株の補完が可能となる。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【００６７】
別の実施形態では、ＬＬＯ、ＰＥＳＴもしくはＡｃｔＡ配列またはそれらの機能性断片をコードする内在性核酸配列を含む構築物または核酸分子が、エピソームベクターから発現される。別の実施形態では、構築物または核酸分子は、第１およびなくとも第２のポリペプチドをそれぞれコードする第１の読み枠および少なくとも第２の読み枠を含み、第１のポリペプチドおよび少なくとも第２のポリペプチドは、内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合した異種抗原またはそれらの機能性断片をそれぞれ含む。
【００６８】
別の実施形態では、エピソーム組換え核酸分子を含む組換えリステリア株が本明細書で提供され、核酸分子は、それぞれ第１のポリペプチドおよび少なくとも第２のポリペプチドをコードする第１の読み枠および少なくとも第２の読み枠を含み、第１および少なくとも第２ポリペプチドは、内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合した異種抗原またはそれらの機能性断片をそれぞれ含み、核酸は、プラスミド複製制御領域をコードする読み枠をさらに含む。
【００６９】
一実施形態では、本発明は、エピソーム発現プラスミドを含む組換えリステリア株を産生するための方法を提供し、エピソーム発現プラスミドは、第１のポリペプチドおよび少なくとも第２のポリペプチドをコードする第１および少なくとも第２の核酸を含み、第１のポリペプチドおよび少なくとも第２のポリペプチドは、内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合した異種抗原をそれぞれ含み、方法は、ａ）内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合した第１の異種抗原および第２の異種抗原をそれぞれ含む第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドをコードする第１の核酸および第２の核酸をプラスミド中での組換えにより融合するステップと、ｂ）組換えリステリアをエピソーム発現プラスミドで形質転換するステップと、ｃ）抗原発現を促す条件下、組換えステリア株中で第１、および、少なくとも第２の抗原を発現させるステップとを含む。
【００７０】
一実施形態では、エピソーム発現プラスミドを含む組換えリステリア株を産生するための方法が本明細書で提供され、エピソーム発現プラスミドは、第１のポリペプチド、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドをそれぞれコードする第１の核酸、第２の核酸および第３の核酸を含み、第１のポリペプチド、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合した異種抗原をそれぞれ含み、方法は、内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合した第１の異種抗原、第２の異種抗原および第３の異種抗原をそれぞれ含む第１のポリペプチド、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドをそれぞれコードする第１の核酸、第２の核酸および第３の核酸のプラスミド中での組換えにより融合するステップと、ｂ）組換えリステリアをエピソーム発現プラスミドで形質転換するステップと、ｃ）抗原性発現を促す条件下、組換えステリア株中で第１の抗原、第２の抗原および第３の抗原を発現させるステップとを含む。
【００７１】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも１種のエピソーム組換え核酸分子を含む組換えリステリア株を提供し、核酸分子は、第１のポリペプチドおよび少なくとも第２のポリペプチドをそれぞれコードする第１の読み枠および少なくとも第２の読み枠を含み、第１のポリペプチドおよび少なくとも第２のポリペプチドは、内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに縮合した異種抗原またはそれらの機能性断片をそれぞれ含み、核酸は、プラスミド複製制御領域をコードする読み枠をさらに含む。別の実施形態では、プラスミド制御領域は、エピソーム組換え核酸分子の複製を調節する。
【００７２】
別の実施形態では、プラスミド制御領域は、第１の核酸分子または少なくとも第２の核酸分子から異種抗原発現を抑制する転写抑制因子をコードする読み枠を含む。別の実施形態では、プラスミド制御領域は、第１の核酸分子または少なくとも第２の核酸分子から異種抗原発現を誘導する転写誘導因子をコードする読み枠を含む。別の実施形態では、プラスミド制御領域は、第１の核酸分子、第２の核酸分子または第３の核酸分子から異種抗原発現を抑制する転写抑制因子をコードする読み枠を含む。別の実施形態では、プラスミド制御領域は、第１の核酸分子、第２の核酸分子または第３の核酸分子から異種抗原発現を誘導する転写誘導因子をコードする読み枠を含む。
【００７３】
一実施形態では、異なるタイプの転写調節があり、これらには、「陰性対照」および「陽性対照」が含まれる。陰性対照では、調節タンパク質または抑制因子タンパク質が作動遺伝子に結合し、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に正しく結合するのを阻止する。あるいは、抑制因子タンパク質は、プロモーターへのＲＮＡポリメラーゼの結合を阻止することができないという点で不活性型で合成することができ、その後、コリプレッサーの結合により、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合するのを阻止するように抑制因子が活性化される。このタイプの制御は、同化経路で最もよく見られ（例えば、アルギニン生合成）、この場合、コリプレッサーが同化経路の最終生成物である場合が多い。あるいは、抑制因子タンパク質は、活性型で合成され、作動遺伝子に結合し、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合するのを阻止する。誘導因子が抑制因子に結合する場合、抑制因子は不活性になり、従って、ＲＮＡポリメラーゼはその時点で自由に転写を開始できる。このタイプの制御は、異化経路でもっともよく見られる（例えば、ラクトース異化反応）。誘導因子は、分解されることになる基質の形態である場合が多い。陽性対照では、活性化タンパク質と呼ばれる調節タンパク質は、作動遺伝子に結合し、活性化分子は、プロモーター領域に結合するＲＮＡポリメラーゼを安定化する。これの一例には、アラビノース異化反応が含まれる。調節タンパク質（正および負の調節の両方のための）は、調節遺伝子によりコードされ、低レベルで連続的に合成できる。それらは、自動調節されるように作ることができ、それにより、高濃度の調節タンパク質（高プラスミド産生に関連する）がそれ自体の作動遺伝子に結合し、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合するのを抑制する。これは、そのレベルが低下するまで転写を停止する。これらのタイプの調節のいくつかの例には、ラクトースオペロン、アルギニンオペロン、ジフテリア毒素遺伝子調節系、などが含まれる。転写抑制因子およびそれらの使用方法は、当技術分野で容易に知ることができ、本発明での使用が意図されている。
【００７４】
別の実施形態では、プラスミド複製調節領域は、第１の核酸分子または少なくとも第２の核酸分子それぞれからの外因性の異種抗原の発現の調節を可能とする。別の実施形態では、プラスミド複製調節領域は、第１の核酸分子、第２の核酸分子または第３の核酸分子それぞれからの外因性の異種抗原の発現の調節を可能とする。
【００７５】
一実施形態では、本発明が行われた時点で当技術分野で既知の手段により代謝負荷の測定が行われる。この手段には、限定するものではないが、ワクチン株の増殖速度、光学密度の読み、コロニー形成単位（ＣＦＵ）平板培養、などの測定が含まれる。別の実施形態では、細菌細胞の代謝負荷は、細菌細胞の生存率の測定により求められる。細菌生存率の測定方法は、容易に知ることができ、当技術分野で利用可能であり、それらの一部には、限定するものではないが、生存率計数、ＡＴＰ測定、およびフローサイトメトリーのための細菌平板培養が含まれる。ＡＴＰ染色では、検出は、生存細胞由来のＡＴＰの量を測定するためのルシフェラーゼ反応の使用に基づいており、細胞中のＡＴＰの量が細胞生存率と相関する。フローサイトメトリーに関しては、この方法を当技術分野でも既知の種々の方式、例えば、生細菌細胞により排除され、死細菌細胞により吸収または吸着される死細胞検出試薬を採用した後に使用できる。これらおよびいずれかの当技術分野で既知の細菌生存率測定用の他の方法を本発明で使うことができることを当業者なら容易に理解するであろう。本発明の時点で当技術分野に利用可能な、複数の異種抗原またはそれらの機能性断片を発現しているワクチン株の代謝負荷の測定を可能とするワクチン株の増殖速度またはワクチン株によるマーカー遺伝子の発現の測定のための知識を、当業者なら実行することができるであろうことは理解されよう。
【００７６】
別の実施形態では、「機能性断片」は、免疫原性断片であり、単独で、または本明細書で提供されるワクチン組成物中に入れて対象に投与した場合、免疫応答を誘発する。別の実施形態では、機能性断片は、当業者に理解されるように、さらに本明細書で提供されるように、生物活性を有する。
【００７７】
一実施形態では、用語の「少なくとも第２の核酸分子」は、２個以上の核酸分子、すなわち、３、４、５個などの核酸分子を意味する。
【００７８】
別の実施形態では、組換え核酸分子は、第３のポリペプチドをコードする第３の読み枠をさらに含み、前記第３のポリペプチドは、内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに縮合した異種抗原またはそれらの機能性断片を含む。
【００７９】
一実施形態では、少なくとも２種の抗原を送達する多価プラスミドが本明細書で提供される。別の実施形態では、プラスミドは、デュアルプラスミドである。別の実施形態では、多価プラスミドをコードするエピソーム組換え核酸が本明細書で提供される。別の実施形態では、エピソーム組換え核酸骨格は、配列番号１を含む配列によりコードされる。別の実施形態では、本明細書で提供されるエピソーム組換え核酸は、配列番号１を含む配列によりコードされる。別の実施形態では、本明細書で提供されるエピソーム組換え核酸は、配列番号１で示される配列によりコードされる。
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【００８０】
一実施形態では、多価プラスミド骨格は、少なくとも２種の抗原をコードする少なくとも２種の核酸配列を含む。別の実施形態では、組換えエピソーム核酸は、プラスミド骨格配列、および少なくとも２種の抗原をコードする。別の実施形態では、抗原は、プラスミドを保持する細菌宿主に対し異種の抗原である。別の実施形態では、抗原は、プラスミドを保持するリステリア宿主に対し異種抗原である。別の実施形態では、プラスミド骨格および少なくとも２種の異種抗原をコードする組換えエピソーム核酸配列は、配列番号２を含む。別の実施形態では、プラスミド骨格および少なくとも２種の異種抗原をコードする組換えエピソーム核酸配列は配列番号２からなる。
【化１−１】
2015511602.tif 000003
【化１−２】
2015511602.tif 000004
【化１−３】
2015511602.tif 000005
（配列番号２）
【００８１】
別の実施形態では、配列番号２内の配列でコードされる抗原の１つは、Ｅ７である（配列番号２中の太字で示される）。別の実施形態では、Ｅ７配列は、配列番号３で示される。
【００８２】
Ｃｔｃｇａｇｃａｔｇｇａｇａｔａｃａｃｃｔａｃａｔｔｇｃａｔｇａａｔａｔａｔｇｔｔａｇａｔｔｔｇｃａａｃｃａｇａｇａｃａａｃｔｇａｔｃｔｃｔａｃｔｇｔｔａｔｇａｇｃａａｔｔａａａｔｇａｃａｇｃｔｃａｇａｇｇａｇｇａｇｇａｔｇａａａｔａｇａｔｇｇｔｃｃａｇｃｔｇｇａｃａａｇｃａｇａａｃｃｇｇａｃａｇａｇｃｃｃａｔｔａｃａａｔａｔｔｇｔａａｃｃｔｔｔｔｇｔｔｇｃａａｇｔｇｔｇａｃｔｃｔａｃｇｃｔｔｃｇｇｔｔｇｔｇｃｇｔａｃａａａｇｃａｃａｃａｃｇｔａｇａｃａｔｔｃｇｔａｃｔｔｔｇｇａａｇａｃｃｔｇｔｔａａｔｇｇｇｃａｃａｃｔａｇｇａａｔｔｇｔｇｔｇｃｃｃｃａｔｃｔｇｔｔｃｔｃａｇａａａｃｃａｔａａａｃｔａｇｔ（配列番号３）
【００８３】
一実施形態では、配列番号２内の配列によりコードされる抗原の１つは、キメラＨｅｒ２−ｎｅｕ抗原である（配列番号２中のイタリックで示される）。別の実施形態では、キメラＨｅｒ２−ｎｅｕ配列は、配列番号４で示される。
【００８４】
ｃｔａｇｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇａｔｇｇａｇｃｔｃａｇａｔｃｔｇｔｃｔａａｇａｇｇｃａｇｃｃａｔａｇｇｇｃａｔａａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｇｃｔｇｃａｃｃｇｔｇｇａｔｇｔｃａｇｇｃａｇａｔｇｃｃｃａｇａａｇｇｃｇｇｇａｇａｃａｔａｔｇｇｇｇａｇｃｃｃａｃａｃｃａｇｃｃａｔｃａｃｇｔａｔｇｃｔｔｃｇｔｃｔａａｇａｔｔｔｃｔｔｔｇｔｔｇｇｃｔｔｔｇｇｇｇｇａｔｇｔｇｔｔｔｔｃｃｃｔｃａａｃａｃｔｔｔｇａｔｇｇｃｃａｃｔｇｇａａｔｔｔｔｃａｃａｔｔｃｔｃｃｃｃａｔｃａｇｇｇａｔｃｃａｇａｔｇｃｃｃｔｔｇｔａｇａｃｔｇｔｇｃｃａａａａｇｃｇｃｃａｇａｔｃｃａａｇｃａｃｃｔｔｃａｃｃｔｔｃｃｔｃａｇｃｔｃｃｇｔｃｔｃｔｔｔｃａｇｇａｔｃｃｇｃａｔｃｔｇｃｇｃｃｔｇｇｔｔｇｇｇｃａｔｃｇｃｔｃｃｇｃｔａｇｇｔｇｔｃａｇｃｇｇｃｔｃｃａｃｃａｇｃｔｃｃｇｔｔｔｃｃｔｇｃａｇｃａｇｔｃｔｃｃｇｃａｔｃｇｔｇｔａｃｔｔｃｃｇｇａｔｃｔｔｃｔｇｃｔｇｃｃｃｔｃｇｇｇｃｇｃａｃａｇｃｔｇｇｔｇｇｃａｇｇｃｃａｇｇｃｃｃｔｃｇｃｃｃａｃａｃａｃｔｃｇｔｃｃｔｃｔｇｇｃｃｇｇｔｔｇｇｃａｇｔｇｔｇｇａｇｃａｇａｇｃｔｔｇｇｔｇｃｇｇｇｔｔｃｃｇａａａｇａｇｃｔｇｇｔｃｃｃａｇｇｇｃａｃｃｇｔｇｔｇｃａｃｇａａｇｃａｇａｇｇｔｇｇｇｔｇｔｔａｔｇｇｔｇｇａｔｇａｇｇｇｃｃａｇｔｃｃａｃｔｇｃｃｃａｇｔｔｃｃｃｔｃａｇｔｇａｇｃｇｃａｇｃｃｃｃａｇｃｃａｇｃｔｇａｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｔｔｇｃａｇｇｇｔｃａｇｃｇａｇｔａｇｇｃｇｃｃａｔｔｇｔｇｃａｇａａｔｔｃｇｔｃｃｃｃｇｇａｔｔａｃｔｔｇｃａｇｇｔｔｃｔｇｇａａｇａｃｇｃｔｇａｇｇｔｃａｇｇｃａｇｇｃｔｇｔｃｃｇｇｃｃａｔｇｃｔｇａｇａｔｇｔａｔａｇｇｔａａｃｃｔｇｔｇａｔｃｔｃｔｔｃｃａｇａｇｔｃｔｃａａａｃａｃｔｔｇｇａｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇｃｔｇｇａｇｃｇｇｇｇｃａｇｔｇｔｔｇｇａｇｇｃｔｇｇｇｔｃｃｃｃａｔｃａａａｇｃｔｃｔｃｃｇｇｃａｇａａａｔｇｃｃａｇｇｃｔｃｃｃａａａｇａｔｃｔｔｃｔｔｇｃａｇｃｃａｇｃａａａｃｔｃｃｔｇｇａｔａｔｔｃｔｔｃｃａｃａａａａｔｃｇｔｇｔｃｃｔｇｇｔａｇｃａｇａｇｃｔｇｇｇｇｇｔｔｃｃｇｃｔｇｇａｔｃａａｇａｃｃｃｃｔｃｃｔｔｔｃａａｇａｔｃｔｃｔｇｔｇａｇｇｃｔｔｃｇａａｇｃｔｇｃａｇｃｔｃｃｃｇｃａｇｇｃｃｔｃｃｔｇｇｇｇａｇｇｃｃｃｃｔｇｔｇａｃａｇｇｇｇｔｇｇｔａｔｔｇｔｔｃａｇｃｇｇｇｔｃｔｃｃａｔｔｇｔｃｔａｇｃａｃｇｇｃｃａｇｇｇｃａｔａｇｔｔｇｔｃｃｔｃａａａｇａｇｃｔｇｇｇｔｇｃｃｔｃｇｃａｃａａｔｃｃｇｃａｇｃｃｔｃｔｇｃａｇｔｇｇｇａｃｃｔｇｃｃｔｃａｃｔｔｇｇｔｔｇｔｇａｇｃｇａｔｇａｇｃａｃｇｔａｇｃｃｃｔｇｃａｃｃｔｃｃｔｇｇａｔａｔｃｃｔｇｃａｇｇａａｇｇａｃａｇｇｃｔｇｇｃａｔｔｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｔａｇｇｔｇａｇｔｔｃｃａｇｇｔｔｔｃｃｃｔｇｃａｃｃａｃｃｔｇｇｃａｇｃｃｃｔｇｇｔａｇａｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｃａｔｇｔｃｃａｇｇｔｇｇｇｔｔｃｔａｇａｔ（配列番号４）
【００８５】
「代謝酵素」は、別の実施形態では、宿主細菌により必要とされる栄養素の合成に関与する酵素を意味する。別の実施形態では、この用語は、宿主細菌により必要とされる栄養素の合成に必要な酵素を意味する。別の実施形態では、この用語は、宿主細菌により利用される栄養素の合成に関与する酵素を意味する。別の実施形態では、この用語は、宿主細菌の持続性増殖に必要な栄養素の合成に関与する酵素を意味する。別の実施形態では、酵素は、栄養素の合成に必要である。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【００８６】
「安定に維持される」は、別の実施形態では、選択（例えば、抗生物質による選択）がない場合に、１０世代の間、検出可能な損失なしに行われる核酸分子またはプラスミドの維持を意味する。別の実施形態では、期間は１５世代である。別の実施形態では、期間は２０世代である。別の実施形態では、期間は２５世代である。別の実施形態では、期間は３０世代である。別の実施形態では、期間は４０世代である。別の実施形態では、期間は５０世代である。別の実施形態では、期間は６０世代である。別の実施形態では、期間は８０世代である。別の実施形態では、期間は１００世代である。別の実施形態では、期間は１５０世代である。別の実施形態では、期間は２００世代である。別の実施形態では、期間は３００世代である。別の実施形態では、期間は５００世代である。別の実施形態では、期間は５００世代超である。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロで（例えば、培養液中で）安定に維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビボで安定に維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロおよびインビトロの両方で安定に維持される。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【００８７】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物の代謝酵素は、アミノ酸代謝酵素であり、別の実施形態では、代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素である。別の実施形態では、代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。別の実施形態では、代謝酵素は、組換えリステリア株中で、細胞壁合成に使われるアミノ酸の形成を触媒する。別の実施形態では、代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素である。
【００８８】
別の実施形態では、代謝酵素をコードする遺伝子は、リステリアｐ６０プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態では、ｉｎｌＡ（インターナリンをコードする）プロモーターが使われる。別の実施形態では、ｈｌｙプロモーターが使われる。別の実施形態では、ＡｃｔＡプロモーターが使われる。別の実施形態では、インテグラーゼ遺伝子がいずれか他のグラム陽性プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態では、代謝酵素をコードする遺伝子がリステリア中で機能するいずれか他のプロモーターの制御下で発現される。当業者なら、他のプロモーターまたは多シストロン性発現カセットを使用して遺伝子の発現を進行させることができることを理解するであろう。それぞれの可能な態様は、本発明の別の実施形態となる。
【００８９】
一実施形態では、弱毒生リステリアは、組換えリステリアである。別の実施形態では、組換えリステリアは、ゲノムインターナリンＣ（ｉｎｌＣ）遺伝子、ＡｃｔＡ遺伝子、ＰｌｃＡ遺伝子、ＰｒｆＡ遺伝子またはＰｌｃＢ遺伝子の変異または欠失を含む。別の実施形態では、組換えリステリアは、ゲノムａｃｔＡ遺伝子およびゲノムインターナリンＣ遺伝子の変異または欠失を含む。
【００９０】
一実施形態では、組換えリステリア株は動物宿主で継代培養された。別の実施形態では、動物宿主は非ヒト動物宿主である。別の実施形態では、継代はワクチンベクターとしての株の効力を最大化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病原性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を増大させる。別の実施形態では、継代はリステリア株病原性を増大させる。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜系を除去する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜系の有病率を減少させる。別の実施形態では、継代は株を弱める、または別の実施形態では、株の病原性をより少なくする。動物宿主で組換えリステリア株を継代する方法は当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許出願第１０／５４１，６１４号に記載されている。それぞれの可能な形態は、本明細書で提供される方法および組成物に関する別の実施形態となる。
【００９１】
一実施形態では、本発明は、ヒト対象の疾患予防、疾患治療、およびワクチン接種のための方法および組成物を提供する。
【００９２】
別の実施形態では、本発明は、ヒトの抗腫瘍免疫応答の増強に関する。別の実施形態では、本明細書で提供される組成物を投与することによる対象の抗腫瘍応答の増強方法は、他の既知の抗腫瘍または抗癌療法と組み合わせることができる。別の実施形態では、Ｌｍ−ＬＬＯを単独で、またはアジュバントが好適するが、通常、アジュバントが使用されていない設定で利益を得ることができる化学療法または放射線療法などのいずれかの療法と組み合わせて使用することができる。
【００９３】
別の実施形態では、本明細書で提供されるリステリア株は、代謝酵素をコードする第３の読み枠をさらに含む。
【００９４】
一実施形態では、代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態では、第２の読み枠でコードされる代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。別の実施形態では、第３の読み枠でコードされる代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。別の実施形態では、代謝酵素は、コードされたｄａｌ遺伝子であり、別の実施形態では、ｄａｌ遺伝子は枯草菌由来である。別の実施形態では、代謝酵素は、ｄａｔ遺伝子によりコードされる。
【００９５】
別の実施形態では、組換えリステリアは、弱毒化された栄養要求性株である。
【００９６】
一実施形態では、弱毒化株は、Ｌｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）である。別の実施形態では、弱毒化株は、Ｌｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ）である。ＬｍｄｄＡは、病原性遺伝子ａｃｔＡの欠失により弱毒化され、ｄａｌ遺伝子の補完によるインビボおよびインビトロでの所望の異種抗原または短縮ＬＬＯ発現のためのプラスミドを保持するリステリアワクチンベクターに基づいている。
【００９７】
別の実施形態では、弱毒化株はＬｍｄｄａである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍDａｃｔＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍDＰｒｆＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍDＰｌｃＢである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍDＰｌｃＡである。別の実施形態では、株は、上述の株のいずれかの二重変異体または三重変異体である。別の実施形態では、この株は、リステリアベースワクチン剤の固有の性質である強力なアジュバント効果を発揮する。別の実施形態では、この株は、ＥＧＤリステリア骨格から構築される。別の実施形態では、本発明で使用される株は、非溶血性ＬＬＯを発現するリステリア株である。さらに別の実施形態では、リステリア株は、ｐｒｆＡ変異体、ＡｃｔＡ変異体、ｐｌｃＢ欠失変異体、またはｐｌｃＡおよびｐｌｃＢの両方が欠失した二重変異体である。これら全てのリステリア株は、本明細書で提供される方法での使用が意図されている。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【００９８】
一実施形態では、リステリアの隣接細胞への転座は、この転座プロセスに関与するａｃｔＡ遺伝子および／またはｉｎｌＣ遺伝子の欠失により抑制され、それにより、予想外に高いレベルの弱毒化を生じ、ワクチン骨格としての免疫原性および有用性が増加する
【００９９】
一実施形態では、本明細書で提供される組換えリステリア株は、弱毒化される。別の実施形態では、組換えリステリアは、ＡｃｔＡ病原性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組換えリステリアは、ＰｒｆＡ病原性遺伝子を欠いている。
【０１００】
別の実施形態では、組換えリステリアワクチン株は、アジュバントを含み、アジュバントはリステリオリシンＯである。別の実施形態では、組換えリステリアワクチン株は、アジュバントを含み、アジュバントはＡｃｔＡである。別の実施形態では、組換えリステリアワクチン株は、アジュバントを含み、アジュバントはＰＥＳＴアミノ酸配列である。
【０１０１】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法は、自己抗原である異種抗原に対する耐性を克服するか、または「壊す」方法をさらに含む。このような抗原は、本明細書で提供される方法および組成物を使うことにより、本発明の範囲に該当する治療または予防を受ける種々の腫瘍により異常発現する場合がある。
【０１０２】
一実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物よにより誘導される免疫応答は、治療効果のある応答である。別の実施形態では、これは、予防効果のある免疫応答である。別の実施形態では、それは、本明細書で提供される状態に罹患している対象の免疫応答の誘導に関し、当技術分野で利用可能な方法よりも増強された免疫応答である。別の実施形態では、免疫応答は、本明細書で提供される対象を苦しめている腫瘍の除去につながる。
【０１０３】
一実施形態では、他の治療様式と組み合わせた組換え弱毒化、短縮リステリオリシンＯ発現リステリアは、免疫応答の増強、ならびに癌または固形腫瘍などの疾患の予防および治療のために有用である。一実施形態では、他の治療様式と組み合わせた組換え弱毒化、短縮ＡｃｔＡ発現リステリアは、免疫応答の増強、ならびに癌または固形腫瘍などの疾患の予防および治療のために有用である。一実施形態では、他の治療様式と組み合わせた組換え弱毒化、ＰＥＳＴアミノ酸配列発現リステリアは、免疫応答の増強、ならびに癌または固形腫瘍などの疾患の予防および治療のために有用である。
【０１０４】
別の実施形態では、治療ワクチンの免疫原性の改善方法が本明細書で提供され、この方法は、ワクチンおよび弱毒生リステリアを対象に同時に投与することを含み、弱毒生リステリアは、ワクチンの免疫原性を増大させ、それにより、ワクチンの免疫原性を改善する。別の実施形態では、弱毒生リステリアは組換えリステリアである。一実施形態では、方法は、ワクチンが特異的である腫瘍の治療を可能とする。
【０１０５】
一実施形態では、抗原に依存しない疾患に対する免疫応答を増強するための方法が本明細書で提供され、この方法は、弱毒生リステリアまたは組換えリステリアを対象に投与することを含む。
【０１０６】
別の実施形態では、本明細書で提供される弱毒生または組換えリステリアは、ＬＬＯタンパク質またはその非溶血性断片を発現する。別の実施形態では、本明細書で提供されるリステリアは、単独で、または追加のアジュバントと組み合わせて使用される。別の実施形態では、本発明の方法および組成物において利用される追加のアジュバントは、別の実施形態では、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質である。別の実施形態では、アジュバントは、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質を含む。別の実施形態では、アジュバントは、ＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントは、ＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１である。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１を含む。別の実施形態では、アジュバントはモノホスホリル脂質Ａである。別の実施形態では、アジュバントは、モノホスホリル脂質Ａを含む。別の実施形態では、アジュバントはＳＢＡＳ２である。別の実施形態では、アジュバントは、ＳＢＡＳ２を含む。別の実施形態では、アジュバントは、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、アジュバントは、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインである。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインを含む。別の実施形態では、アジュバントは、免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントは、免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントは、クイルグリコシド（ｑｕｉｌｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）であるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは、細菌性マイトジェンであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは、細菌性毒素であるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは、当技術分野で既知のいずれか他のアジュバントであるか、またはこれを含む。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１０７】
本明細書で提供される方法および組成物において利用されるＬＬＯは、一実施形態では、リステリアＬＬＯである。一実施形態では、ＬＬＯが得られるリステリアは、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）である。別の実施形態では、リステリアは、リステリアイバノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）である。別の実施形態では、リステリアは、リステリアウェルシメリである。別の実施形態では、リステリアは、リステリアゼーリゲリである。
【０１０８】
一実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、
ａｔｇａａａａａａａｔａａｔｇｃｔａｇｔｔｔｔｔａｔｔａｃａｃｔｔａｔａｔｔａｇｔｔａｇｔｃｔａｃｃａａｔｔｇｃｇｃａａｃａａａｃｔｇａａｇｃａａａｇｇａｔｇｃａｔｃｔｇｃａｔｔｃａａｔａａａｇａａａａｔｔｃａａｔｔｔｃａｔｃｃａｔｇｇｃａｃｃａｃｃａｇｃａｔｃｔｃｃｇｃｃｔｇｃａａｇｔｃｃｔａａｇａｃｇｃｃａａｔｃｇａａａａｇａａａｃａｃｇｃｇｇａｔｇａａａｔｃｇａｔａａｇｔａｔａｔａｃａａｇｇａｔｔｇｇａｔｔａｃａａｔａａａａａｃａａｔｇｔａｔｔａｇｔａｔａｃｃａｃｇｇａｇａｔｇｃａｇｔｇａｃａａａｔｇｔｇｃｃｇｃｃａａｇａａａａｇｇｔｔａｃａａａｇａｔｇｇａａａｔｇａａｔａｔａｔｔｇｔｔｇｔｇｇａｇａａａａａｇａａｇａａａｔｃｃａｔｃａａｔｃａａａａｔａａｔｇｃａｇａｃａｔｔｃａａｇｔｔｇｔｇａａｔｇｃａａｔｔｔｃｇａｇｃｃｔａａｃｃｔａｔｃｃａｇｇｔｇｃｔｃｔｃｇｔａａａａｇｃｇａａｔｔｃｇｇａａｔｔａｇｔａｇａａａａｔｃａａｃｃａｇａｔｇｔｔｃｔｃｃｃｔｇｔａａａａｃｇｔｇａｔｔｃａｔｔａａｃａｃｔｃａｇｃａｔｔｇａｔｔｔｇｃｃａｇｇｔａｔｇａｃｔａａｔｃａａｇａｃａａｔａａａａｔａｇｔｔｇｔａａａａａａｔｇｃｃａｃｔａａａｔｃａａａｃｇｔｔａａｃａａｃｇｃａｇｔａａａｔａｃａｔｔａｇｔｇｇａａａｇａｔｇｇａａｔｇａａａａａｔａｔｇｃｔｃａａｇｃｔｔａｔｃｃａａａｔｇｔａａｇｔｇｃａａａａａｔｔｇａｔｔａｔｇａｔｇａｃｇａａａｔｇｇｃｔｔａｃａｇｔｇａａｔｃａｃａａｔｔａａｔｔｇｃｇａａａｔｔｔｇｇｔａｃａｇｃａｔｔｔａａａｇｃｔｇｔａａａｔａａｔａｇｃｔｔｇａａｔｇｔａａａｃｔｔｃｇｇｃｇｃａａｔｃａｇｔｇａａｇｇｇａａａａｔｇｃａａｇａａｇａａｇｔｃａｔｔａｇｔｔｔｔａａａｃａａａｔｔｔａｃｔａｔａａｃｇｔｇａａｔｇｔｔａａｔｇａａｃｃｔａｃａａｇａｃｃｔｔｃｃａｇａｔｔｔｔｔｃｇｇｃａａａｇｃｔｇｔｔａｃｔａａａｇａｇｃａｇｔｔｇｃａａｇｃｇｃｔｔｇｇａｇｔｇａａｔｇｃａｇａａａａｔｃｃｔｃｃｔｇｃａｔａｔａｔｃｔｃａａｇｔｇｔｇｇｃｇｔａｔｇｇｃｃｇｔｃａａｇｔｔｔａｔｔｔｇａａａｔｔａｔｃａａｃｔａａｔｔｃｃｃａｔａｇｔａｃｔａａａｇｔａａａａｇｃｔｇｃｔｔｔｔｇａｔｇｃｔｇｃｃｇｔａａｇｃｇｇａａａａｔｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｔｇａｔｇｔａｇａａｃｔａａｃａａａｔａｔｃａｔｃａａａａａｔｔｃｔｔｃｃｔｔｃａａａｇｃｃｇｔａａｔｔｔａｃｇｇａｇｇｔｔｃｃｇｃａａａａｇａｔｇａａｇｔｔｃａａａｔｃａｔｃｇａｃｇｇｃａａｃｃｔｃｇｇａｇａｃｔｔａｃｇｃｇａｔａｔｔｔｔｇａａａａａａｇｇｃｇｃｔａｃｔｔｔｔａａｔｃｇａｇａａａｃａｃｃａｇｇａｇｔｔｃｃｃａｔｔｇｃｔｔａｔａｃａａｃａａａｃｔｔｃｃｔａａａａｇａｃａａｔｇａａｔｔａｇｃｔｇｔｔａｔｔａａａａａｃａａｃｔｃａｇａａｔａｔａｔｔｇａａａｃａａｃｔｔｃａａａａｇｃｔｔａｔａｃａｇａｔｇｇａａａａａｔｔａａｃａｔｃｇａｔｃａｃｔｃｔｇｇａｇｇａｔａｃｇｔｔｇｃｔｃａａｔｔｃａａｃａｔｔｔｃｔｔｇｇｇａｔｇａａｇｔａａａｔｔａｔｇａｔｃｔｃｇａｇ（配列番号５）の（配列番号５）で示される以下の核酸配列によりコードされる。
【０１０９】
別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＬ（配列番号６）の配列番号６の配列を有する。この配列に対応するタンパク質の最初の２５個のアミノ酸は、シグナル配列であり、細菌により分泌されるときに、ＬＬＯから切断される。従って、本実施形態では、完全長活性ＬＬＯタンパク質は、５０４残基長である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、ジェンバンク受入番号ＤＱ０５４５８８、ＤＱ０５４５８９、ＡＹ８７８６４９、Ｕ２５４５２、またはＵ２５４５２で規定される配列を有する。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、ＬＬＯタンパク質の変異体である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、ＬＬＯタンパク質の同族体である。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１１０】
別の実施形態では、「短縮ＬＬＯ」または「ｔＬＬＯ」は、ＰＥＳＴ様ドメインを含むＬＬＯの断片を意味する。別の実施形態では、この用語は、アミノ末端に活性化ドメインを含まず、システイン４８４を含まないＬＬＯ断片を意味する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＰＥＳＴ配列からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＰＥＳＴ配列を含む。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、５２９アミノ酸完全長ＬＬＯタンパク質の最初の約４００〜４４１アミノ酸からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、非溶血型のＬＬＯタンパク質である。
【０１１１】
一実施形態では、ＬＬＯ断片は、およそ残基１〜２５からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、およそ残基１〜５０からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、およそ残基１〜７５からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、およそ残基１〜１００からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、およそ残基１〜１２５からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、およそ残基１〜１５０からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、およそ残基１７５からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、およそ残基１〜２００からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、およそ残基１〜２２５からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、およそ残基１〜２５０からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、およそ残基１〜２７５からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、およそ残基１〜３００からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、およそ残基１〜３２５からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、およそ残基１〜３５０からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、およそ残基１〜３７５からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、およそ残基１〜４００からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、およそ残基１〜４２５からなる。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１１２】
別の実施形態では、ストレプトリジンＯ、パーフリンゴリジンＯ、ニューモリシンなど、またはそれらの断片などの既知のリシンを含む他の種由来のＬＬＯの同族体を本発明で使用可能である。
【０１１３】
一実施形態では、本明細書で提供される弱毒生リステリアまたは組換えリステリアは、ＡｃｔＡタンパク質またはその断片を発現する。本発明の方法および組成物の別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片は、同様に本明細書で提供される異種抗原またはその断片に融合される。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片は、
【０１１４】
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ（配列番号７）の配列を有する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、配列番号７で示される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、配列番号７の同族体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、配列番号７の変異体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、配列番号７の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、配列番号５のアイソフォームである。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１１５】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、
ＡＴＧＣＧＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＡＴＴＧＣＡＴＴＡＣＧＡＴＴＡＡＣＣＣＣＧＡＣＡＴＡＡＴＡＴＴＴＧＣＡＧＣＧＡＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＡＡＣＡＣＡＧＡＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＣＣＡＡＧＣＧＡＧＧＴＡＡＡＴＡＣＧＧＧＡＣＣＡＡＧＡＴＡＣＧＡＡＡＣＴＧＣＡＣＧＴＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧＡＡＣＴＡＧＡＡＡＡＡＴＣＧＡＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＡＡＡＴＡＣＧＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＣＴＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＡＡＧＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＡＣＡＡＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＴＡＴＡＡＡＴＧＡＡＧＡＧＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＡＧＣＴＡＴＡＣＡＡＧＴＧＧＡＧＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＡＧＧＡＴＴＧＣＣＡＴＣＧＧＡＴＡＧＣＧＣＡＧＣＧＧＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＧＣＣＡＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧＧＡＴＡＧＴＧＡＧＣＴＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＣＴＴＡＴＣＣＧＧＡＴＡＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＡＧＴＡＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＴＴＧＣＧＧＡＴＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＣＴＴＡＧＡＴＴＣＴＡＧＣＡＴＧＣＡＧＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＡＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＡＡＧＣＡＡＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＴＡＡＡＧＴＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＧＣＧＧＧＧＡＡＡＴＧＧＧＴＡＣＧＴＧＡＴＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＡＧＴＡＡＡＧＡＡＡＧＣＧＡＴＴＧＴＴＧＡＴＡＡＡＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＴＡＡＴＴＧＡＣＣＡＡＴＴＡＴＴＡＡＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＧＧＡＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＡＡＧＡＣＴＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＧＡＧＡＣＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＴＴＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＡＡＣＣＧＡＧＣＴＣＡＴＴＣＧＡＡＴＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＡＡＧＡＣＴＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＧＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＴＴＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧＡＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＴＣＧＡＡＴＴＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＴＡＧＡＡＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＣＣＴＣＧＣＴＡＧＡＴＴＣＴＡＧＴＴＴＴＡＣＡＡＧＡＧＧＧＧＡＴＴＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＴＡＴＴＡＡＴＣＧＣＣＡＴＡＧＴＣＡＡＡＡＴＴＴＣＴＣＴＧＡＴＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＴＴＧＡＡＣＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＡＧＡＣＣＡ（配列番号８）の配列を含む組換えヌクレオチドによりコードされる。別の実施形態では、組換えヌクレオチドは、配列番号８で示される配列を有する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号８で示される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号８の同族体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号８の変異体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号８の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号８のアイソフォームである。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１１６】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、下記の配列を含む組換えヌクレオチドによりコードされる。
【０１１７】
Ｔｔｔａｔｃａｃｇｔａｃｃｃａｔｔｔｃｃｃｃｇｃａｔｃｔｔｔｔａｔｔｔｔｔｔｔａａａｔａｃｔｔｔａｇｇｇａａａａａｔｇｇｔｔｔｔｔｇａｔｔｔｇｃｔｔｔｔａａａｇｇｔｔｇｔｇｇｔｇｔａｇａｃｔｃｇｔｃｔｇｃｔｇａｃｔｇｃａｔｇｃｔａｇａａｔｃｔａａｇｔｃａｃｔｔｔｃａｇａａｇｃａｔｃｃａｃａａｃｔｇａｃｔｃｔｔｔｃｇｃｃａｃｔｔｔｔｃｔｃｔｔａｔｔｔｇｃｔｔｔｔｇｔｔｇｇｔｔｔａｔｃｔｇｇａｔａａｇｔａａｇｇｃｔｔｔｃａａｇｃｔｃａｃｔａｔｃｃｇａｃｇａｃｇｃｔａｔｇｇｃｔｔｔｔｃｔｔｃｔｔｔｔｔｔｔａａｔｔｔｃｃｇｃｔｇｃｇｃｔａｔｃｃｇａｔｇａｃａｇａｃｃｔｇｇａｔｇａｃｇａｃｇｃｔｃｃａｃｔｔｇｃａｇａｇｔｔｇｇｔｃｇｇｔｃｇａｃｔｃｃｔｇａａｇｃｃｔｃｔｔｃａｔｔｔａｔａｇｃｃａｃａｔｔｔｃｃｔｇｔｔｔｇｃｔｃａｃｃｇｔｔｇｔｔａｔｔａｔｔｇｔｔａｔｔｃｇｇａｃｃｔｔｔｃｔｃｔｇｃｔｔｔｔｇｃｔｔｔｃａａｃａｔｔｇｃｔａｔｔａｇｇｔｃｔｇｃｔｔｔｇｔｔｃｇｔａｔｔｔｔｔｃａｃｔｔｔａｔｔｃｇａｔｔｔｔｔｃｔａｇｔｔｃｃｔｃａａｔａｔｃａｃｇｔｇａａｃｔｔａｃｔｔｃａｃｇｔｇｃａｇｔｔｔｃｇｔａｔｃｔｔｇｇｔｃｃｃｇｔａｔｔｔａｃｃｔｃｇｃｔｔｇｇｃｔｇｃｔｃｔｔｃｔｇｔｔｔｔｔｔｃｔｔｃｔｔｃｃｃａｔｔｃａｔｃｔｇｔｇｔｔｔａｇａｃｔｇｇａａｔｃｔｔｃｇｃｔａｔｃｔｇｔｃｇｃｔｇｃａａａｔａｔｔａｔｇｔｃｇｇｇｇｔｔａａｔｃｇｔａａｔｇｃａｇｔｔｇｇｃａｇｔａａｔｇａａａａｃｔａｃｃａｔｃａｔｃｇｃａｃｇｃａｔ（配列番号９）。別の実施形態では、組換えヌクレオチドは、配列番号９で示される配列を有する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号９で示される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号９の同族体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号９の変異体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号９の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号９のアイソフォームである。別の実施形態では、配列番号９は、同様に本明細書で提供される配列番号２の構築物を形成するために使用される。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１１８】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片は、異種抗原またはその断片に融合される。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片は、ジェンバンク受入番号ＡＡＦ０４７６２に示される配列を有する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、ジェンバンク受入番号ＡＡＦ０４７６２に示される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、ジェンバンク受入番号ＡＡＦ０４７６２の同族体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、ジェンバンク受入番号ＡＡＦ０４７６２の変異体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、ジェンバンク受入番号ＡＡＦ０４７６２の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、ジェンバンク受入番号ＡＡＦ０４７６２のアイソフォームである。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１１９】
本発明の方法および組成物において利用されるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片は、別の実施形態では、ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰの配列番号１０で示される配列を有する。
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、配列番号１０で示される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、当技術分野で既知の他のいずれかのＡｃｔＡ断片である。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１２０】
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする組換えヌクレオチドは、Ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｔｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｔａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａａｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔａａａｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａｇａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇａａａａａｇｃａｇａａａａａｇｇｔｃｃａａａｔａｔｃａａｔａａｔａａｃａａｃａｇｔｇａａｃａａａｃｔｇａｇａａｔｇｃｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｃｃｇａｃｃｇａｃｃａｇｃｔａｔａｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇａｔｔｇｃｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇｇａａａｇｃｃａｔａｇｃａｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃｇｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｔａａａｔａａｇａａａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｃｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｔｇａｇｔｃｔｔｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｃｃａａｃａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃａｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃｇｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｃａｔｃｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｔｃｃｔｃｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇａｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇａｇａａａｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｔｃａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｃｃｃａｃｃａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔａｇａｃｃａの配列番号１１で示される配列を含む。別の実施形態では、組換えヌクレオチドは、配列番号１１で示される配列を有する。別の実施形態では、組換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードするほかのいずれかの配列を含む。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１２１】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、ジェンバンク受入番号ＡＦ１０３８０７で示される配列を含む組換えヌクレオチドによりコードされる。別の実施形態では、組換えヌクレオチドは、ジェンバンク受入番号ＡＦ１０３８０７で示される配列を有する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、ジェンバンク受入番号ＡＦ１０３８０７で示される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、ジェンバンク受入番号ＡＦ１０３８０７の同族体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、ジェンバンク受入番号ＡＦ１０３８０７の変異体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、ジェンバンク受入番号ＡＦ１０３８０７の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、ジェンバンク受入番号ＡＦ１０３８０７のアイソフォームである。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１２２】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、当技術分野で既知の他のいずれかのＡｃｔＡ断片である。別の実施形態では、本発明の組換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードするほかのいずれかの配列を含む。別の実施形態では、組換えヌクレオチドは、全体ＡｃｔＡタンパク質をコードする他のいずれかの配列を含む。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１２３】
一実施形態では、本明細書で提供される弱毒生リステリアまたは組換えリステリアは、ＰＥＳＴ配列ペプチドを発現する。本発明の方法および組成物の別の実施形態では、ＰＥＳＴ  ＡＡ配列は、異種抗原または断片に融合される。別の実施形態では、ＰＥＳＴ  ＡＡ配列は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号１２）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫ（配列番号１３）である。別の実施形態では、本明細書で列挙されたＰＥＳＴ  ＡＡ配列の内の１つを含むいずれかのＬＬＯ配列への抗原の融合体は、ＨＭＷ−ＭＡＡに対する細胞媒介免疫を増強できる。
【０１２４】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ  ＡＡ配列は、リステリアＡｃｔＡタンパク質由来のＰＥＳＴ配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号１４）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号１５）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号１６）、または、ＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号１７）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、本明細書に記載で上に記載したＰＥＳＴ配列の変異体であり、これは、一実施形態では、当業者なら分かると思われるように、ＫＥＳＶＶＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号１８）、ＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号１９）、またはＲＧＧＲＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号２０）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、リステリアゼーリゲリ細胞溶解素由来であり、ｌｓｏ遺伝子によりコードされる。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ＲＳＥＶＴＩＳＰＡＥＴＰＥＳＰＰＡＴＰ（配列番号２１）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、連鎖球菌属のストレプトリジンＯタンパク質由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、化膿性連鎖球菌ストレプトリジンＯ由来で、例えば、ＡＡ３５〜５１の位置のＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号２２）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ストレプトコッカス・エクイシミリスストレプトリジンＯ由来で、例えば、ＡＡ３８〜５４の位置のＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号２３）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、配列番号１４〜２０から選択される配列を有する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、配列番号１４〜２３から選択される配列を有する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、原核生物生物体由来の別のＰＥＳＴ  ＡＡ配列である。
【０１２５】
ＰＥＳＴ配列の特定は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｒｏｇｅｒｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ（Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｃｏｍｍｏｎ  ｔｏ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｄｅｇｒａｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｔｈｅ  ＰＥＳＴ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６；２３４（４７７４）：３６４−８）およびＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ（ＰＥＳＴ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １９９６；２１（７）：２６７−７１）に記載されている。「ＰＥＳＴ配列」は、別の実施形態では、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）残基に富んだ領域を意味する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、いくつかの正に帯電したアミノ酸を含む１種以上のクラスターが隣接している。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、それを含むタンパク質の急速細胞内分解を媒介する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、Ｒｏｇｅｒｓらにより開示されたアルゴリズムに適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒらにより開示されたアルゴリズムに適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、１つまたは複数の内部リン酸化部位を含み、これらの部位のリン酸化は、タンパク質分解より前に起こる。
【０１２６】
一実施形態では、原核生物生命体のＰＥＳＴ配列は、例えば、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ（１９９６、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２６７−２７１）でＬＭに関して、およびＲｏｇｅｒｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６；２３４（４７７４）：３６４−８）に記載されているような方法に従って特定される。あるいは、他の原核生物生命体由来のＰＥＳＴ  ＡＡ配列も、この方法に基づいて特定できる。他の原核生物生命体では、ＰＥＳＴ  ＡＡ配列が、限定するものではないが、他のリステリア種を含むと期待できる。一実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、Ｒｏｇｅｒｓらにより開示されたアルゴリズムに適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒらにより開示されたアルゴリズムに適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ＰＥＳＴ−ｆｉｎｄプログラムを使用して特定される。
【０１２７】
別の実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの特定は、指定タンパク質配列内の正に帯電したＡＡのＲ、Ｈ、およびＫに対する最初のスキャンにより行うことができる。正に帯電した隣接領域の間の全ＡＡが計数され、ウインドウサイズパラメータと等しいかまたはそれより大きい数のＡＡを含むモチーフのみが更に考慮される。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、少なくとも１Ｐ、１ＤまたはＥ、および少なくとも１ＳまたはＴを含まなければならない。
【０１２８】
別の実施形態では、重要なＡＡの局所濃縮ならびにモチーフの疎水性に基づいたスコアリングパラメータを用いてＰＥＳＴモチーフの質が精密化される。Ｄ、Ｅ、Ｐ、ＳおよびＴの濃縮を重量パーセント（ｗ／ｗ）で表現し、１当量のＤまたはＥ、１当量のＰおよび１当量のＳまたはＴに対して補正した。別の実施形態では、疎水性の計算は、原理的に、Ｊ．ＫｙｔｅとＲ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｋｙｔｅ、Ｊ  ａｎｄ  Ｄｏｏｔｌｉｔｔｌｅ、ＲＦ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７、１０５（１９８２））、の方法に従う。
【０１２９】
別の実施形態では、可能なＰＥＳＴモチーフの疎水性は、産物のモルパーセントおよび各ＡＡ種に対する疎水性指標の合計として計算される。目的のＰＥＳＴスコアは、下記の式で表されるように、局所濃縮項および疎水性項の合計として得られる：
【０１３０】
ＰＥＳＴスコア＝０．５５＊ＤＥＰＳＴ−０．５＊疎水性指標
【０１３１】
用語の「ＰＥＳＴ配列」、「ＰＥＳＴ様配列」または「ＰＥＳＴ様配列ペプチド」は、上記アルゴリズムを使用して、少なくとも＋５のスコアを有するペプチドを包含できることが理解されよう。別の実施形態では、この用語は、少なくとも６のスコアを有するペプチドを意味する。別の実施形態では、ペプチドは、少なくとも７のスコアを有する。別の実施形態では、スコアは少なくとも８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも９である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１１である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１３である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１４である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１５である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１６である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１７である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１９である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２１である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２４である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２４である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２５である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２６である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２７である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２９である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３５である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも４０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも４５である。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１３２】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、当技術分野で既知の他のいずれかの方法またはアルゴリズム、例えば、ＣａＳＰｒｅｄｉｃｔｏｒ（Ｇａｒａｙ−Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ  ＨＭ、Ｏｃｃｈｉｕｃｃｉ  ＪＭ、Ａｌｖｅｓ  Ｊ、Ｂｅｌｉｚａｒｉｏ  ＪＥ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００５  Ｊｕｎ；２１  Ｓｕｐｐｌ１：ｉ１６９−７６）を使用して特定される。別の実施形態では、以下の方法が使用される。
【０１３３】
ＰＥＳＴ指数は、１の値をＡＡ  Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＧｌｎに割り当てることにより、それぞれの適切な長さの配列（例えば、３０〜３５ＡＡ配列）に対し計算される。それぞれのＰＥＳＴ残基に対する計数値（ＣＶ）は、１で、他のＡＡ（非ＰＥＳＴ）に対する計数値は０である。
【０１３４】
ＰＥＳＴ様配列を特定するためのそれぞれの方法は、本発明の別の実施形態となる。
【０１３５】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、当技術分野で既知の他のいずれかのＰＥＳＴ配列である。それぞれのＰＥＳＴ配列およびそのタイプは、本発明の別の実施形態となる。
【０１３６】
用語の「ＰＥＳＴ配列に対する融合」は、ＰＥＳＴ配列を含むタンパク質断片への融合を包含することは理解されよう。別の実施形態では、この用語は、タンパク質断片がＰＥＳＴ配列以外の周辺配列を含むケースを含む。別の実施形態では、タンパク質断片は、ＰＥＳＴ配列からなる。また、用語の「融合」は、それぞれの末端で一緒に連結されるか、または他のものの中に埋め込まれる形態の２つのペプチドまたはタンパク質断片の融合を包含することも理解されよう。
【０１３７】
別の実施形態では、本発明の組換えのリステリアを含むワクチンが本明細書で提供される。
【０１３８】
別の実施形態では、本発明の換え型のリステリアの培養物が本明細書で提供される。
【０１３９】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のリステリアは、リステリア・モノサイトゲネスである。別の実施形態では、リステリアは、リステリアイバノビである。別の実施形態では、リステリアは、リステリアウェルシメリである。別の実施形態では、リステリアは、リステリアゼーリゲリである。それぞれのタイプのリステリアは、本発明の別の実施形態となる。
【０１４０】
一実施形態では、ＬＭ  ΔａｃｔＡ変異体、Ｌ．モノサイトゲネスΔｐｌｃＡ、またはΔＡｃｔＡ、ΔＩＮＬ−ｂ、ΔＩＮＬ−ｃなどの弱毒化リステリア株が本発明で使用される。別の実施形態では、本明細書で開示された知識を有する当業者なら理解できるように、弱毒化リステリア株は、１種以上の弱毒化変異を導入することにより構築される。このような株の例には、限定するものではないが、芳香族アミノ酸栄養要求性リステリア株およびリポテイコ酸形成のための変異体ならびに病原性遺伝子の欠失により弱毒化されたものが含まれる（本明細書の実施例を参照）。
【０１４１】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の核酸分子は、プロモーター／調節配列に動作可能に連結される。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の第１の読み枠は、プロモーター／調節配列に動作可能に連結される。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の第２の読み枠は、プロモーター／調節配列に動作可能に連結される。別の実施形態では、それぞれの読み枠は、プロモーター／調節配列に動作可能に連結される。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１４２】
本開示および本明細書で提供される方法を学習した当業者なら、異なる転写プロモーター、ターミネーター、キャリアベクターまたは特異的遺伝子配列（例えば、市販のクローニングベクター中のもの）を本発明の方法および組成物に有効に使用できることを容易に理解するであろう。本発明で意図されているように、これらの機能は、例えば、ｐＵＣシリーズとして知られる市販のベクターで提供されている。別の実施形態では、非必須ＤＮＡ配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）は除去される。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。別の実施形態では、本発明で市販のプラスミドが使われる。このようなプラスミドは、種々の製造元、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から入手するか、または当技術分野でよく知られた方法を使用して作成できる。
【０１４３】
別の実施形態は、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）などのプラスミドである。これは、原核生物生物体中での発現を促進するための原核生物複製起点およびプロモーター／調節エレメントを備えた原核生物発現ベクターである。別の実施形態では、外来性ヌクレオチド配列が除去されてプラスミドのサイズが減らされ、その中に配置できるカセットのサイズが増やされる。
【０１４４】
このような方法は、当技術分野でよく知られ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＡｕｓｕｂｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている。
【０１４５】
抗生物質耐性遺伝子は、分子生物学およびワクチン調製でよく採用される従来の選択およびクローニングプロセスで使用される。本発明で意図されている抗生物質耐性遺伝子には、限定するものではないが、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイシン、ヒグロマイシン、ゲンタマイシンおよび当技術分野でよく知られたその他の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子産物が含まれる。それぞれの遺伝子は、本発明の別の実施形態となる。
【０１４６】
細菌の形質転換方法は、当該技術分野において公知であり、塩化カルシウムコンピテント細胞ベース法、電気穿孔法、バクテリオファージ媒介形質導入、化学的および物理的形質転換技術が含まれる（ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ、１９８９、Ｃｅｌｌ  ５６：６４１−６４９；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ、１９９５、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、９：１９０−１９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、１９９４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ；Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２、Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）。別の実施形態では、本発明のリステリアワクチン株は、電気穿孔により形質転換される。それぞれの方法は、本発明の別の実施形態となる。
【０１４７】
別の実施形態では、接合を使用して、遺伝物質および／またはプラスミドを細菌中に導入する。接合の方法は当技術分野でよく知られ、例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｎｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ  ｂｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｐｌａｓｍｉｄ．２００６  Ｎｏｖ；５６（３）：２２３−７、およびＡｕｃｈｔｕｎｇ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｍｏｂｉｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００５  Ａｕｇ  ３０；１０２（３５）：１２５５４−９）に記載されている。それぞれの方法は、本発明の別の実施形態となる。
【０１４８】
用語の「形質転換」は、用語の「遺伝子導入」と同義に使うことができ、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子を取り込むように細菌細胞を操作することを意味することは理解されよう。また、用語の「形質転換」は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子の遺伝子を発現するように細菌細胞を操作することを意味してもよいことは理解されよう。
【０１４９】
プラスミドおよび本発明に有用な他の発現ベクターは、本明細書の別の場所に記載されており、プロモーター／調節配列、グラム陰性およびグラム陽性細菌用の複製起点、融合タンパク質をコードする単離核酸ならびにアミノ酸代謝遺伝子をコードする単離核酸などの機能を含むことができる。さらに、融合タンパク質およびアミノ酸代謝遺伝子をコードする単離核酸は、このような単離核酸の発現を進行させるのに適したプロモーターを持つであろう。細菌系中の発現を進行させるのに有用なプロモーターは、当技術分野でよく知られ、これらには、バクテリオファージラムダ、ｐＢＲ３２２のベータラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、およびｐＢＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターが含まれる。原核生物プロモーターのさらなる例には、５バクテリオファージラムダの主要ライトおよびレフトプロモーター（ＰＬおよびＰＲ）、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｄ、およびｇａｌプロモーター、アルファアミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ、１９８５．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２）および枯草菌のＳ２８特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ、１９８４  Ｇｅｎｅ  ３２：１１−２０）、バチルスのバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ、１９８２、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ならびにストレプトマイセスプロモーター（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ、１９８６、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８）が含まれる。追加の原核生物プロモーターは、例えば、Ｇｌｉｃｋ（１９８７、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７−２８２）；Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ、（１９８６、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、６８：５０５−５１６）；およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ、（１９８４、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２）により概説されている。本発明で意図されているプロモーター／調節エレメントのさらなる例には、限定するものではないが、リステリアｐｒｆＡプロモーター、リステリアｈｌｙプロモーター、リステリアｐ６０プロモーターおよびリステリアＡｃｔＡプロモーター（ジェンバンクＡｃｃ．Ｎｏ．ＮＣ＿００３２１０）またはこれらの断片が含まれる。
【０１５０】
一実施形態では、組換え非溶血性ＬＬＯをコードするＤＮＡは、ＤＮＡ増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して産生される。最初に、新規終端の両側の天然ＤＮＡのセグメントが別々に増幅される。一方の増幅配列の５’末端がペプチドリンカーをコードし、一方、もう一方の増幅配列の３’末端が同様にペプチドリンカーをコードする。最初の断片の５’末端は、２回目の断片の３’末端に相補的であるので、その２つの断片は（例えば、ＬＭＰアガロース上で部分的に精製後）、３回目のＰＣＲ反応のオーバーラッピングテンプレートとして使用できる。増幅配列は、コドン、開口部位のカルボキシ側のセグメント（現在アミノ配列を形成しているセグメント）、リンカー、および開口部位のアミノ側の配列（現在カルボキシル配列を形成している部位の配列）を含む。抗原は、プラスミドに連結される。それぞれの方法は、本発明の別の実施形態となる。
【０１５１】
本発明の組換えタンパク質は、別の実施形態では、組換えＤＮＡ法を使用して合成される。これは、一実施形態では、ＤＮＡ配列を作製すること、特異的プロモーター／調節エレメントの制御下でＤＮＡを本発明のプラスミドなどの発現カセット中に置くこと、およびタンパク質を発現させることを含む。別の実施形態では、例えば、クローニングおよび該当する配列の制限、またはＮａｒａｎｇらのホスホトリエステル法（１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９）；Ｂｒｏｗｎらのリン酸ジエステル法（１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  ６８：１０９−１５１）；Ｂｅａｕｃａｇｅらのジエチルホスホルアミダイト法（１９８１、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．、２２：１５  １８５９−１８６２）；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持法（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｍｅｔｈｏｄ）などの方法による直接化学合成を含むいずれかの適切な方法により、本発明のタンパク質（例えば、非溶血性ＬＬＯ）をコードするＤＮＡが調製される。
【０１５２】
別の実施形態では、化学合成を使用して、単鎖オリゴヌクレオチドが産生される。種々の実施形態では、この単鎖オリゴヌクレオチドは、相補的配列を使ったハイブリダイゼーションにより、または単鎖をテンプレートとして使ったＤＮＡポリメラーゼによる重合により、二重鎖ＤＮＡに変換される。当業者なら、ＤＮＡの化学合成は約１００塩基までの配列に限定されるが、より長い配列は、短い配列の連結反応により得ることができることを分かるであろう。別の実施形態では、部分配列がクローン化され、必要な部分配列が適切な制限酵素を使用して切断される。次に、断片が連結され、目的のＤＮＡ配列が産生される。
【０１５３】
別の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用して、本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡがクローン化される。このようにして、適切な制限酵素部位を含むセンスプライマーおよびクローニングを促進するために別の制限酵素部位、例えば、同一でない制限酵素部位を含むアンチセンスプライマーを使用して非溶血性ＬＬＯの遺伝子がＰＣＲ増幅される。
【０１５４】
別の実施形態では、組換え融合タンパク質遺伝子は、それぞれの宿主の適切な発現制御配列に動作可能に連結される。プロモーター／調節配列は、本明細書の別の場所で詳細に記載される。別の実施形態では、プラスミドは、追加のプロモーター調節エレメント、ならびにリボソーム結合部位および転写終止シグナルをさらに含む。真核細胞の場合は、制御配列は、例えば、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス、など由来のプロモーターおよびエンハンサー、およびポリアデニル化配列を含む。別の実施形態では、配列は、スプライスドナーおよびアクセプター配列を含む。
【０１５５】
一実施形態では、用語の「動作可能に連結される」は、そのように記載される構成要素がそれらの意図する方式でそれらを機能させることを可能とする関係にあるような並置を意味する。コード配列に「動作可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるような方法で連結される。
【０１５６】
別の実施形態では、プラスミドを含む栄養要求性細菌として選択するために、形質転換栄養要求性細菌をアミノ酸代謝遺伝子の発現用に選択する培地上で増殖させる。別の実施形態では、Ｄ−グルタミン酸合成のための栄養要求性細菌が、Ｄ−グルタミン酸合成用遺伝子を含むプラスミドで形質転換され、Ｄ−グルタミン酸がない場合には栄養要求性細菌が増殖するが、一方、プラスミドで形質転換されなかったか、またはＤ−グルタミン酸合成用タンパク質をコードするプラスミドを発現しなかった栄養要求性細菌は増殖しない。別の実施形態では、プラスミドが、Ｄ−アラニン合成用のアミノ酸代謝酵素をコードする単離核酸を含み、形質転換されて本発明のプラスミドを発現している場合で、Ｄ−アラニンがない場合は、Ｄ−アラニン合成用栄養要求性細菌が増殖する。必要な増殖因子、栄養補助剤、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、などを含むか、または欠いている適切な培地を作製するこのような方法は当技術分野でよく知られ、市販品として入手可能である（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）。それぞれの方法は、本発明の別の実施形態となる。
【０１５７】
別の実施形態では、本発明のプラスミドを含む栄養要求性細菌が適切な培地上で選択されると直ちに、細菌は選択圧の存在下で増殖する。このような増殖は、栄養要求性因子のない場合に、培地中で細菌を増殖させることを含む。栄養要求性細菌中でアミノ酸代謝酵素を発現しているプラスミドの存在は、プラスミドが細菌と一緒に複製されること、従って、プラスミドを含む細菌を連続的に選択することを確実にする。本明細書の開示および方法を身につけた当業者なら、プラスミドを含む栄養要求性細菌が増殖している培地の量を調整することにより、リステリアワクチンベクターの産生規模拡大が容易にできるであろう。
【０１５８】
当業者なら、別の実施形態で、本発明で使用するために他の栄養要求株および補完系が採用されることを理解するであろう。
【０１５９】
一実施形態では、本発明の組成物を投与するための方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、本発明のワクチンを投与するための方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、本発明の弱毒化組換えリステリアを投与するための方法が本明細書で提供される。
【０１６０】
別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載のいずれかの形態または実施形態において、組換えリステリア・モノサイトゲネスを投与するステップを含む。一実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載のいずれかの形態または実施形態で、組換えリステリア・モノサイトゲネスを投与するステップからなる。別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載のいずれかの形態または実施形態で、組換えリステリア・モノサイトゲネスを投与するステップから実質的に構成される。一実施形態では、用語の「〜を含む」は、その方法における組換えリステリア・モノサイトゲネスを投与するステップの包含、ならびに他の方法または当該技術分野で公知であってもよい処置の包含を意味する。別の実施形態では、用語の「〜から実質的になる」は、機能的構成要素は、組換えリステリア・モノサイトゲネスの投与であるが、しかし、その方法の治療効果に直接には関与しない他の方法のステップを含んでもよい方法を意味し、さらに、例えば、組換えリステリア・モノサイトゲネスの投与の効果を促進するステップを意味してもよい。一実施形態では、用語の「構成される」は、追加のステップのない組換えリステリア・モノサイトゲネスを投与するための方法を意味する。
【０１６１】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物によって誘発される免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は、主にＣＤ８＋Ｔ細胞媒介応答からなる。別の実施形態では、唯一検出可能な免疫応答要素は、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介応答である。
【０１６２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物によって誘発される免疫応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞媒介応答からなる。別の実施形態では、唯一検出可能な免疫応答要素は、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介応答である。
【０１６３】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物によって誘発される免疫応答は、自然免疫応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は、主に自然免疫応答からなる。別の実施形態では、唯一検出可能な免疫応答要素は、自然免疫応答である。自然免疫応答の活性化は、Ｍ１マクロファージなどのマクロファージの活性化および樹状細胞（ＤＣ）の活性化を同様に含むことは理解されたい。
【０１６４】
別の実施形態では、本発明は、癌または感染症またはアレルギーの発生率を減少させるための方法を提供し、本発明の組成物を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、癌または感染症またはアレルギーの改善につながる方法を提供し、本発明の組成物を投与することを含む。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１６５】
一実施形態では、本発明で使用する組換えリステリア・モノサイトゲネスは、異種ペプチドを分泌する。別の実施形態では、本発明で使用する組換えリステリア・モノサイトゲネスは、異種ペプチドを発現する。別の実施形態では、本発明で使用する組換えリステリア・モノサイトゲネスは、本明細書に記載の非溶血性ＬＬＯを発現し、分泌する。
【０１６６】
一実施形態では、本発明の治療プロトコルは、治療効果がある。別の実施形態では、プロトコルは、予防効果がある。別の実施形態では、本発明のワクチン剤を使用して、当業者ならわかっているような乳癌または他のタイプの腫瘍などの癌の素因になる家族性遺伝または他の環境のために、これらのタイプの病気に関し危険な状態にある人を保護する。別の実施形態では、本発明のワクチン剤を使用して、当業者ならわかっているような乳癌または他のタイプの腫瘍などの癌の素因になる家族性遺伝または他の環境のために、これらのタイプの病気の人を治療する。別の実施形態では、当業者ならわかっているような乳癌または他のタイプの腫瘍などの癌の素因になる家族性遺伝または他の環境のために、これらのタイプの病気の人の代替治療法の前に、本発明のワクチン剤が使われる。別の実施形態では、このような治療には、化学療法、手術、照射、などが含まれる。このような治療の前に、本発明のワクチン剤が投与され、それにより、ワクチン腫瘍抗原に対するＣＴＬ応答が残っている転移を破壊し、癌からの寛解を延ばす。別の実施形態では、本発明のワクチン剤を使用して、以前の定着腫瘍の増殖に影響を与え、既存腫瘍細胞を死滅させる。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１６７】
別の実施形態では、上述のいずれかの方法で使用されたワクチン剤および免疫原性組成物は、本発明のワクチン剤および免疫原性組成物の特性のいずれかを有する。それぞれの特性は、本発明の別の実施形態となる。
【０１６８】
種々の投与量範囲の実施形態が本発明で意図されている。ワクチンベクターの場合の一実施形態では、投与量は、０．４ＬＤ５０／用量の範囲である。別の実施形態では、投与量は、約０．４〜４．９ＬＤ５０／用量である。別の実施形態では、投与量は、約０．５〜０．５９ＬＤ５０／用量である。別の実施形態では、投与量は、約０．６〜０．６９ＬＤ５０／用量である。別の実施形態では、投与量は、約０．７〜０．７９ＬＤ５０／用量である。別の実施形態では、投与量は、約０．８ＬＤ５０／用量である。別の実施形態では、投与量は、０．４ＬＤ５０／用量〜０．８ＬＤ５０／用量である。
【０１６９】
別の実施形態では、投与量は、１０７細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、１．５×１０７細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、２×１０７細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、３×１０７細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、４×１０７細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、６×１０７細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、８×１０７細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、１×１０８細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、１．５×１０８細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、２×１０８細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、３×１０８細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、４×１０８細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、６×１０８細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、８×１０８細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、１×１０９細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、１．５×１０９細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、２×１０９細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、３×１０９細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、５×１０９細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、６×１０９細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、８×１０９細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、１×１０１０細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、１．５×１０１０細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、２×１０１０細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、３×１０１０細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、５×１０１０細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、６×１０１０細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、８×１０１０細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、８×１０９細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、１×１０１１細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、１．５×１０１１細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、２×１０１１細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、３×１０１１細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、５×１０１１細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、６×１０１１細菌／用量である。別の実施形態では、投与量は、８×１０１１細菌／用量である。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１７０】
別の実施形態では、本発明の方法は、対象に追加免疫ワクチンを投与するステップをさらに含む。一実施形態では、追加免疫ワクチン接種は、単回の初回抗原刺激ワクチン接種の後で行う。別の実施形態では、単回の追加免疫ワクチンが初回抗原刺激ワクチン接種の後で投与される。別の実施形態では、２回の追加免疫ワクチンが初回抗原刺激ワクチン接種の後で投与される。別の実施形態では、３回の追加免疫ワクチン接種が初回抗原刺激ワクチン接種の後で投与される。一実施形態では、初回抗原刺激と追加免疫ワクチン接種との間の間隔は、当業者により実験的に決定される。別の実施形態では、初回抗原刺激と追加免疫ワクチン接種の間の間隔は、１週間、別の実施形態では２週間、別の実施形態では３週間、別の実施形態では４週間、別の実施形態では５週間、別の実施形態では６〜８週間であり、さらに別の実施形態では、追加免疫ワクチンは、抗原刺激ワクチン接種の８〜１０週間後に投与される。
【０１７１】
一実施形態では、本発明のワクチンまたは免疫原性組成物は、単独で対象に投与される。別の実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、別の療法と一緒に投与される。追加の療法は、感染症のための抗生物質媒介療法、もしくは化学療法、免疫療法、照射、もしくは癌のための手術、または当業者ならわかっている当技術分野で利用可能ないずれか他のタイプの疾患療法であってもよい。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１７２】
別の実施形態では、前述のものを含むタンパク質を発現するために種々のプロモーターの内の１種が使われる。一実施形態では、ＬＭプロモーター、例えば、遺伝子ｈｌｙ、ａｃｔＡ、ｐｌｃＡ、ｐｌｃＢおよびｍｐｌ用のプロモーターが使われ、これらは、それぞれ、リステリアタンパク質溶血素、ａｃｔＡ、ホスホチジリノシトール特異的ホスホリパーゼ、ホスホリパーゼＣ、およびメタロプロテアーゼをコードする。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１７３】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物は、異種抗原の同族体または本発明のＬＬＯ配列を利用する。いずれかのタンパク質またはペプチドに関連する場合の用語の「相同性」、「相同」、などは、一実施形態では、配列の整列後、および最大パーセント相同性を得るために必要に応じ、ギャップ導入後で、配列同一性の部分としてどの保存的置換も考慮していない場合の、対応する天然ポリペプチドの残基と同じ候補配列中のアミノ酸残基の割合を意味する。整列化のための方法とコンピュータプログラムは、当技術分野でよく知られている。 
【０１７４】
別の実施形態では、いずれかの核酸配列に関連する場合の用語の「相同性」は、同様に、対応する天然核酸配列のヌクレオチドと同じ候補配列中のヌクレオチドの割合を示す。
【０１７５】
一実施形態では、相同性は、当技術分野で詳細に記載された方法である配列整列化用のコンピュータアルゴリズムにより決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピュータアルゴリズム解析には、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｕｔｉｌｉｔｙ）、ＧＥＮＰＥＰＴおよびＴＲＥＭＢＬパッケージなどの多くの利用可能なソフトウェアパッケージを含んでもよい。
【０１７６】
別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１〜７６の６０％超の配列から選択された配列に対する同一性を意味する。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１〜７６の７０％超の配列から選択された配列に対する同一性を意味する。別の実施形態では、同一性は、７５％超である。別の実施形態では、同一性は、７８％超である。別の実施形態では、同一性は、８０％超である。別の実施形態では、同一性は、８２％超である。別の実施形態では、同一性は、８３％超である。別の実施形態では、同一性は、８５％超である。別の実施形態では、同一性は、８７％超である。別の実施形態では、同一性は、８８％超である。別の実施形態では、同一性は、９０％超である。別の実施形態では、同一性は、９２％超である。別の実施形態では、同一性は、９３％超である。別の実施形態では、同一性は、９５％超である。別の実施形態では、同一性は、９６％超である。別の実施形態では、同一性は、９７％超である。別の実施形態では、同一性は、９８％超である。別の実施形態では、同一性は、９９％超である。別の実施形態では、同一性は、１００％超である。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。 
【０１７７】
別の実施形態では、相同性は、候補配列ハイブリダイゼーションの測定により決定され、この方法は、当技術分野で詳細に記載されている（例えば、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ、Ｂ．Ｄ．、ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．、Ｅｄｓ．（１９８５）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．；ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ、を参照）。例えば、ハイブリダイゼーション法は、天然カスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの相補配列に対し、中程度からストリンジェント条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、１０〜２０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５Ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ断片処理済みのサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃で一晩のインキュベーションである。
【０１７８】
一実施形態では、免疫ブロット法解析などの当技術分野で詳細に記載された方法により、または利用可能な多くのソフトウェアパッケージのいずれかを利用して、確立された方法によるアミノ酸配列のコンピュータアルゴリズム解析により、本明細書で列挙したいずれかのアミノ酸配列に対するタンパク質および／またはペプチド相同性が決定される。これらのパッケージの一部は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈまたはＳｃａｎｐｓパッケージを含んでもよく、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、および／または解析用に低域的／局所的もしくはＢＬＯＣＫＳ整列、を採用してもよい。それぞれの相同性決定方法は、本発明の別の実施形態となる。
【０１７９】
別の実施形態では、本発明は、本発明の方法を行うのに使用する試薬を含むキットを提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の組成物、ツール、または器具を含むキットを提供する。
【０１８０】
用語の「接触させること」または「投与すること」は、癌細胞、腫瘍、または疾患部位に本発明の組成物を直接接触させることを含んでもよいことは明確に理解されよう。別の実施形態では、この用語は、癌細胞、腫瘍、または疾患部位に本発明の組成物を間接的に接触させることを意味する。別の実施形態では、本発明の方法は、対象が本発明の組成物に接触させられ、その後、組成物が拡散またはいずれか他の当技術分野で既知の化合物が体内を循環する能動輸送または受動輸送プロセスにより、癌細胞、腫瘍、または疾患部位と接触させられる方法を含む。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
【０１８１】
別の実施形態では、用語の「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、本発明のポリペプチドをコードする読み枠を含む核酸分子を意味する。このような天然の対立遺伝子変異は、典型的な例では、所与の遺伝子のヌクレオチド配列の１〜５％の変動を生ずる場合がある。代替対立遺伝子は、多くの異なる個体または生命体中の目的遺伝子のシーケンシングにより特定できる。これは、ハイブリダイゼーションプローブを使用して種々の個体または生命体中の同じ遺伝子座位を特定することにより、容易に行うことができる。天然対立遺伝子変異の結果であり、機能的活性を変えないいずれかの、および全てのこのようなヌクレオチド変異および得られたアミノ酸多型または変異は、本発明の範囲内にあることが意図されている。
【０１８２】
本発明のワクチン剤および組成物を含む医薬組成物は、別の実施形態では、非経口、癌化細胞の近く、経粘膜的、経皮的、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、頭蓋内、腟内または腫瘍内、などの当業者に既知のいずれかの方法によって対象に投与される。
【０１８３】
本明細書で提供される方法および組成物の別の実施形態では、ワクチン剤または組成物が経口的に投与され、従って、経口投与に適する形態、すなわち、固形または液状製剤として処方される。適切な固形経口製剤には、錠剤、カプセル剤、丸剤、粒剤、ペレット剤などが含まれる。適切な液体経口製剤には、溶液、懸濁液、分散液、乳剤、油剤などが含まれる。本発明の別の実施形態では、有効成分は、カプセルに処方される。本実施形態では、本発明の組成物は、活性化合物および不活性キャリアまたは希釈剤に加えて、ゼラチンカプセルを含む。
【０１８４】
別の実施形態では、ワクチン剤または組成物は、液状製剤の静脈内、動脈内、または筋肉内注射により投与される。適切な液体製剤には、溶液、分散液、懸濁液、乳剤、油剤などが含まれる。一実施形態では、医薬組成物は、静脈内に投与され、従って、静脈内投与に適する形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は、動脈内に投与され、従って、動脈内投与に適する形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は、筋肉内に投与され、従って、筋肉内投与に適する形態で処方される。
【０１８５】
用語の「治療」が、疾患の治癒、疾患の予防、疾患の発生率の低減、疾患の症状の回復、疾患の寛解の誘導、疾患の進行の遅延化を包含してもよいことは理解されよう。用語の「低減すること」、「阻止すること」および「阻害すること」は、別の実施形態では、軽減することまたは減少することを意味する。
【０１８６】
用語の「治療的に有効な量」または「治療有効量」は、所望の投与目的としている効果を生じる用量を含んでもよいことができることは十分理解されよう。正確な用量は、既知の技術を使用して、当業者により決定できる。
【０１８７】
用語の「約」は、定量的用語プラスまたはマイナス５％、または別の実施形態では、プラスまたはマイナス１０％、または別の実施形態では、プラスまたはマイナス１５％、または別の実施形態では、プラスまたはマイナス２０％以内に含めることができることは十分理解されよう。
【０１８８】
用語の「対象」は、状態またはその後遺症の治療を必要としているか、またはその影響を受けやすい人を含む哺乳動物を包含でき、同様に、イヌ、ネコ、ブタ、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウスならびにヒトを含んでもよいことは十分理解されよう。用語の「対象」は、あらゆる点で正常な個体を排除しない。
【０１８９】
本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために、以下の実施例を示す。しかし、これらの実施例は、本発明の広範な範囲を限定するものとは解釈されるべきではない。
【０１９０】
実施例
実施例１：ＬＬＯ−抗原融合体が抗腫瘍免疫を誘導
材料および実験方法（実施例１〜２）
細胞株
Ｃ５７ＢＬ／６同系ＴＣ−１腫瘍をＨＰＶ−１６Ｅ６およびＥ７で不死化し、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子で形質転換した。Ｔ．Ｃ．Ｗｕ（ジョンホプキンズ大学医学部、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）から入手したＴＣ−１は、低レベルのＨＰＶ−１６Ｅ６およびＥ７を発現している高度に腫瘍原性の肺上皮細胞であり、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子で形質転換された。ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００μＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０ミクロモル（ｍｃＭ）２−ＭＥ、４００マイクログラム（ｍｃｇ）／ｍｌ  Ｇ４１８、および１０％Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ−１０９培地中、１０％ＣＯ２下、３７℃でＴＣ−１を増殖させた。Ｃ３は、ＨＰＶ１６の全ゲノムで不死化された、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のマウス胚細胞で、ｐＥＪ−ｒａｓで形質導入された。ＥＬ−４／Ｅ７は、レトロウイルスを使用してＥ７で形質導入された胸腺腫ＥＬ−４である。
【０１９１】
Ｌ．モノサイトゲネス株および増殖
使用するリステリア株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（エピソーム発現系のｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子；図１Ａ）、Ｌｍ−Ｅ７（リステリアゲノム中に組み込まれた単回コピーＥ７遺伝子カセット）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（「ＤＰ−Ｌ２０２８」；エピソーム発現系のｈｌｙ−ＮＰ融合遺伝子）、およびＬｍ−Ｇａｇ（「ＺＹ−１８」；染色体中に組み込まれた単回コピーＨＩＶ−１Ｇａｇ遺伝子カセット）とした。Ｅ７を、プライマー５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣ−３’（配列番号２４；ＸｈｏＩ部位を下線で示す）および５’−ＧＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３’（配列番号２５；ＳｐｅＩ部位を下線で示す）を使用してＰＣＲ増幅し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に連結した。Ｅ７をＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ消化によりｐＣＲ２．１から切り出し、ｐＧＧ−５５に連結した。ｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子および多機能性転写因子ｐｒｆＡを多コピーシャトルプラスミドのｐＡＭ４０１（Ｗｉｒｔｈ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６５：８３１、１９８６）に挿入し、ｐＧＧ−５５を生成した。ｈｌｙプロモーターは、ｈｌｙ遺伝子産物の最初の４４１ＡＡ（溶血性Ｃ末端が欠けており、以降で「ΔＬＬＯ」と呼ばれる）の発現を推進する。この産物は、ＸｈｏＩ部位でＥ７遺伝子に連結されて、ＬＬＯ−Ｅ７として転写され、分泌されるｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子を生ずる。リステリアｐｒｆＡ陰性株のＸＦＬ−７（ペンシルベニア大学のＤｒ．Ｈａｏ  Ｓｈｅｎから入手）をインビボでのプラスミド保持のために選択されるｐＧＧ−５５で形質転換した（図１Ａ〜Ｂ）。プライマー５’−ＧＧＧＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３’（配列番号２６；ＮｈｅＩ部位を下線で示す）および５’−ＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＡＣＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番号２７；ＸｈｏＩ部位を下線で示す）を使用してｈｌｙプロモーターおよび遺伝子断片を生成した。プライマー５’−ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＴＧＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３’（配列番号２８；ＸｂａＩ部位を下線で示す）および５’−ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３’（配列番号２９；ＳａｌＩ部位を下線で示す）を使用してｐｒｆＡ遺伝子をＰＣＲ増幅した。Ｅ７の発現およびＬＭゲノムのｏｒｆＺドメイン中への分泌を推進するｈｌｙプロモーターおよびシグナル配列を含む発現カセットを導入してＬｍ−Ｅ７を生成した。プライマー５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣ−３’（配列番号３０；ＢａｍＨＩ部位を下線で示す）および５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧ−３’（配列番号３１；ＸｂａＩ部位を下線で示す）を使用してＥ７をＰＣＲ増幅した。その後、Ｅ７をｐＺＹ−２１シャトルベクターに連結した。ＬＭ株１０４０３Ｓを得られたプラスミドのｐＺＹ−２１−Ｅ７で形質転換した。このプラスミドは、ＬＭゲノムのｏｒｆＸ、Ｙ、Ｚドメインに対応する１．６−ｋｂ配列の中央に挿入された発現カセットを含む。相同性ドメインは、相同組換えによるＥ７遺���子カセットのｏｒｆＺドメインへの挿入を許容する。クローンをＥ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの組込みのために選別した。クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を含む場合（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ）、または含まない場合（Ｌｍ−Ｅ７およびＺＹ−１８）について、ブレインハートインフュージョン培地中で細菌を増殖した。細菌の一定分量を−８０℃で凍結した。発現をウェスタンブロッティングで確認した（図２）。
【０１９２】
ウェスタンブロッティング
リステリア株をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔｏｎｉ培地中、３７℃で増殖させ、６００ｎｍで測定時の同一光学密度で採取した。上清をＴＣＡ沈殿させ、１×の０．１Ｎ  ＮａＯＨ補充試料緩衝液中に再懸濁した。同量のそれぞれの細胞沈殿物またはそれぞれのＴＣＡ沈殿後の上清を４〜２０％トリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮＯＶＥＸ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に添加した。ゲルを二フッ化ポリビニリデンに転写し、抗Ｅ７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）でプローブした後、ＨＲＰ標識抗マウス二次Ａｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｕ．Ｋ．）と共にインキュベートし、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ検出試薬で展開し、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に露光した。
【０１９３】
腫瘍増殖の測定
最小および最大表面積径を計るキャリパを使用して腫瘍を１日おきに測定した。これらの２つの測定値の平均を種々の時点で平均腫瘍径（ミリメートル）としてプロットした。腫瘍径が２０ｍｍに達するとマウスを屠殺した。それぞれの時点の生存マウスのみの腫瘍測定値が示される。
【０１９４】
樹立腫瘍増殖に与えるリステリア組換え体の影響
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）の左脇腹に、２×１０５ＴＣ−１細胞を皮下注射した。腫瘍接種の１週間後、腫瘍が直径４〜５ｍｍの触知可能サイズに達した。その後、７および１４日目に、８匹のマウス群を０．１ＬＤ５０ｉ．ｐ．Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１０６ＣＦＵ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（１０７ＣＦＵ）、またはＬｍ−Ｇａｇ（５×１０５ＣＦＵ）で免疫化処理した。
【０１９５】
５１Ｃｒ放出アッセイ
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを０．１  ＬＤ５０のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇでｉ．ｐ．免疫した。接種の１０日後、脾臓を採取した。脾細胞を照射ＴＣ−１細胞と共に（１００：１、脾細胞：ＴＣ−１）フィーダー細胞として培養し、インビトロで５日間刺激後、次記の標的を使用して標準５１Ｃｒ放出アッセイに使用した：Ｅ７Ｈ−２ｂペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）（配列番号３２）を適用したＥＬ−４、ＥＬ−４／Ｅ７、またはＥＬ−４。Ｅ：Ｔ細胞比を８０：１、４０：１、２０：１、１０：１、５：１、および２．５：１とし、それぞれを３通り作成した。３７℃で４時間インキュベーション後、細胞を沈殿させ、各ウエルから５０μｌの上清を採取した。試料をＷａｌｌａｃ１４５０シンチレーションカウンター（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で評価した。特異的溶解パーセントを、［（実験カウント／分（ｃｐｍ）−自然発生ｃｐｍ）／（合計ｃｐｍ−自然発生ｃｐｍ）］×１００として測定した。
【０１９６】
ＴＣ−１特異的増殖
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０．１ＬＤ５０のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇで免疫し、２０日後、これらの１ＬＤ５０のｉ．ｐ．注射で追加免疫した。追加免疫の６日後、免疫および無処理マウスから脾臓を採取した。Ｅ７抗原供給源としての２．５×１０４、１．２５×１０４、６×１０３、３×１０３照射ＴＣ−１細胞／ウエルと共に、またはＴＣ−１細胞なしで、または１０μｇ／ｍｌ  Ｃｏｎ  Ａと共に、平底９６ウエルプレートで５×１０５／ウエルの脾細胞を培養した。４５時間後、細胞に０．５μＣｉ［３Ｈ］チミジン／ウエルを適用した。１８時間後、Ｔｏｍｔｅｃハーベスター９６（Ｏｒａｎｇｅ、ＣＴ）を使用してプレートの細胞を収集し、Ｗａｌｌａｃ  １４５０シンチレーションカウンターで増殖状態を評価した。ｃｐｍの変化を、実験ｃｐｍ−抗原なしの場合のｃｐｍ、として計算した。
【０１９７】
フローサイトメトリー分析
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０．１ＬＤ５０Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−Ｅ７で静脈内（ｉ．ｖ．）免疫し、３０日後、追加免疫した。ＣＤ８（５３−６．７、ＰＥ標識）、ＣＤ６２リガンド（ＣＤ６２Ｌ；ＭＥＬ−１４、ＡＰＣ標識）、およびＥ７Ｈ−２Ｄｂテトラマーに対し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を備えたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーターを使用して、三色フローサイトメトリーを行った。Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）（配列番号３２）または対照（ＨＩＶ−Ｇａｇ）ペプチドを保持したＨ−２Ｄｂテトラマーを使用して追加免疫の５日後に採取した脾細胞を室温（ｒｔ）で染色した。テトラマーは１／２００希釈で使用した。テトラマーは、Ｄｒ．Ｌａｒｒｙ  Ｒ．Ｐｅａｓｅ（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＭＮ）ならびにＮＩＡＩＤ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ  Ｃｏｒｅ  ＦａｃｉｌｉｔｙおよびＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍより提供を受けた。テトラマー＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞を分析した。
【０１９８】
Ｂ１６Ｆ０−Ｏｖａ実験
２４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５Ｂ１６Ｆ０−Ｏｖａ細胞を接種した。３、１０および１７日目に、８マウスからなる群を０．１ＬＤ５０Ｌｍ−ＯＶＡ（１０６ｃｆｕ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡ（１０８ｃｆｕ）で免疫し、８匹の動物を未処理で残した。
【０１９９】
統計
腫瘍径の比較のために、それぞれの群に対し腫瘍サイズの平均とＳＤを測定し、スチューデントｔ−検定により統計的有意性を決定した。ｐ≦０．０５を優位であると判断した。
【０２００】
結果
Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の能力のＴＣ−１増殖に与える影響に関し比較した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に皮下腫瘍を樹立した。７日後、腫瘍が触知できるサイズ（４−５ｍｍ）に達した。マウスを、７および１４日目に、０．１  ＬＤ５０Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、または、対照としてＬｍ−ＧａｇおよびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰでワクチン接種した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、７５％の樹立ＴＣ−１腫瘍の完全縮小を誘導したが、一方、腫瘍増殖は、群中の他の２匹のマウスで制御された（図３）。対照的に、Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−Ｇａｇによる免疫化は、腫瘍縮小を誘導しなかった。この実験は複数回繰り返され、常に全く類似の結果であった。さらに、異なる免疫化プロトコル下でのＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７に対しても類似の結果が得られた。別の実験では、単回免疫化により、樹立された５ｍｍのＴＣ−１腫瘍マウスの治癒が可能であった。
【０２０１】
他の実験でも、類似の結果が、他の２種のＥ７発現腫瘍細胞株：Ｃ３とＥＬ−４／Ｅ７で得られた。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチン接種の効力を確認するために、腫瘍を除去した動物を６０または４０日目にそれぞれＴＣ−１またはＥＬ−４／Ｅ７腫瘍細胞で再刺激した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で免役された動物は、実験の終了（ＴＣ−１の場合は１２４日目、ＥＬ−４／Ｅ７の場合は５４日目）まで無腫瘍のままであった。
【０２０２】
このように、ΔＬＬＯとの融合タンパク質としての抗原の発現は、抗原の免疫原性を増大させる。
【０２０３】
実施例２：ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７処理は、ＴＣ−１特異的脾細胞増殖を誘発する
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を含むＬｍ−Ｅ７によるＴ細胞の誘導を測定するために、免疫マウスの抗原特異的免疫能の尺度であるＥ７特異的増殖応答を測定した。２０：１、４０：１、８０：１、および１６０：１の細胞：ＴＣ−１比でＥ７源として照射ＴＣ−１細胞に暴露した場合、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７免疫マウス由来脾細胞は増殖した（図４）。逆に、Ｌｍ−Ｅ７およびｒＬｍ対照免疫マウス由来の脾細胞は、バックグラウンドレベルの増殖を示すのみであった。
【０２０４】
実施例３：ＡｃｔＡ−Ｅ７およびＰＥＳＴ−Ｅ７融合体は抗腫瘍免疫を付与する
材料と実験方法
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の作成
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７は、ＬＭの組換え株であり、短縮型のａｃｔＡタンパク質に融合されたＥ７タンパク質を発現するプラスミドを含む。Ｌｍ−ａｃｔＡ−Ｅ７は、ｐＤＰ−２０２８の修飾により作成されたプラスミドベクターｐＤＤ−１をリステリア中に導入することにより生成される。ｐＤＤ−１は、３１０ｂｐのｈｌｙプロモーターおよびｈｌｙシグナル配列（ｓｓ）のコピーを発現する発現カセットを含み、このカセットは、ＡｃｔＡ−Ｅ７；４つのＰＥＳＴ配列（配列番号１１）を含む１１７０ｂｐのａｃｔＡ遺伝子（分子の最初の３９０ＡＡ（配列番号１０）からなる短縮ＡｃｔＡポリペプチド）；３００ｂｐのＨＰＶＥ７遺伝子；１０１９ｂｐのｐｒｆＡ遺伝子（病原性遺伝子の発現を制御する）；および形質転換細菌クローンの選択のためのＣＡＴ遺伝子（クロラムフェニコール耐性遺伝子）の発現と分泌を促進する（Ｓｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）、Ａｒｃｈ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．、１３０：９２−９７）。
【０２０５】
ｈｌｙプロモーター（ｐＨｌｙ）および遺伝子断片を、プライマー５’−ＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３’（ＸｂａＩ部位は下線で示される。配列番号３３）およびプライマー５’−ＡＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＣＴＧＴＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＧＣ−’３（ＮｏｔＩ部位は下線で示される。最初の１８ヌクレオチドは、ＡｃｔＡ遺伝子オーバーラップである：配列番号３４）を使用して、ｐＧＧ５５（実施例１）からＰＣＲ増幅した。ａｃｔＡ遺伝子を、プライマー５’−ＧＣＧＣＡＡＣＡＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＡＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＴ−３’（ＮｏｔＩ部位は下線で示される：配列番号３５）およびプライマー５’−ＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＡＧＧＣＧＡＴＣＡＡＴＴＴＣ−３’（ＸｈｏＩ部位は下線で示される：配列番号３６）を使用してＬＭ１０４０３ｓ野生型ゲノムからＰＣＲ増幅した。Ｅ７遺伝子を、プライマー５’−ＧＧＡＡＴＴＧＡＴＣＧＣＣＴＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡ−３’（ＸｈｏＩ部位は下線で示される：配列番号３７）およびプライマー５’−ＡＡＡＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＡＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３’（ＸｍａＩ部位は下線で示される：配列番号３８）を使用してｐＧＧ５５（ｐＬＬＯ−Ｅ７）からＰＣＲ増幅した。ｐｒｆＡ遺伝子を、プライマー５’−ＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３’（ＸｍａＩ部位は下線で示される：配列番号３９）およびプライマー５’−ＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３’（ＳａｌＩ部位は下線で示される。配列番号４０）を使用してＬＭ１０４０３ｓ野性型ゲノムからＰＣＲ増幅した。ｈｌｙプロモーターａｃｔＡ遺伝子融合（ｐＨｌｙ−ａｃｔＡ）をＰＣＲ生成し、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号３３）および下流ａｃｔＡプライマー（配列番号３６）を使用して精製ｐＨｌｙ  ＤＮＡおよび精製ａｃｔＡ  ＤＮＡからから増幅した。
【０２０６】
ｐｒｆＡ遺伝子に融合したＥ７遺伝子（Ｅ７−ｐｒｆＡ）をＰＣＲ生成し、精製Ｅ７ＤＮＡおよび精製ｐｒｆＡＤＮＡから上流Ｅ７プライマー（配列番号３７）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号４０）を使用して増幅した。
【０２０７】
Ｅ７−ｐｒｆＡに融合産物に融合したｐＨｌｙ−ａｃｔＡ融合産物をＰＣＲ生成し、精製融合ｐＨｌｙ−ａｃｔＡ  ＤＮＡ産物および精製融合Ｅ７−ｐｒｆＡ  ＤＮＡ産物から上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号３３）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号４０）を使用して増幅し、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）に連結した。コンピテント大腸菌（ＴＯＰ１０’Ｆ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）をｐＣＲＩＩ−ＡｃｔＡＥ７で形質転換した。溶解および単離後、プラスミドを、ＢａｍＨＩ（予測断片サイズ７７０ｂｐおよび６４００ｂｐ（またはベクターへの挿入が逆の場合：２５００ｂｐおよび４１００ｂｐ））、およびＢｓｔＸＩ（予測断片サイズ２８００ｂｐおよび３９００ｂｐ）を使用して制限分析により選別し、同様に、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号３３）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号４０）を使用してＰＣＲ分析で選別した。
【０２０８】
ｐＨｌｙ−ａｃｔＡ−Ｅ７−ｐｒｆＡ  ＤＮＡ挿入物を、ＸｂａＩおよびＳａｌＩの２重消化によりｐＣＲＩＩから切り取り、ＸｂａＩおよびＳａｌＩにより同様に消化されたｐＤＰ−２０２８に連結した。ＴＯＰ１０’Ｆコンピテント大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）を発現系ｐＡｃｔＡＥ７で形質転換後、クロラムフェニコール耐性クローンを、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号３３）および下流ＰｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号４０）を使ったＰＣＲ分析により選別した。ｐＡｃｔＡＥ７を含むクローンをブレインハートインフュージョン培地（クロラムフェニコール（２０ｍｃｇ（マイクログラム）／ｍｌ（ミリリットル）、Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈ．を含む）中で増殖させ、ｐＡｃｔＡＥ７をミディプレップＤＮＡ精製システムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を使用して細菌細胞から単離した。ペニシリン処理リステリア（株ＸＦＬ−７）のｐｒｆＡ陰性株を、Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２２０９−２２１８）で記載のように発現系ｐＡｃｔＡＥ７で形質転換し、インビボでのプラスミドの保持ためにクローンを選択した。クローンを、クロラムフェニコール（２０ｍｃｇ／ｍｌ）を含むブレインハートインフュージョン培地中、３７℃で増殖させた。細菌の一定分量を−８０℃で凍結した。
【０２０９】
免疫ブロット法による抗原発現の検証
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７がＡｃｔＡ−Ｅ７（約６４ｋＤ）を分泌することを検証するために、リステリア株をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔｏｎｉ（ＬＢ）培地中、３７℃で増殖させた。培養液上清からトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）でタンパク質を沈殿させ、０．１Ｎナトリウム水酸化物を含む１×試料緩衝液に再懸濁した。同量の各ＴＣＡ沈殿上清を４％〜２０％のトリスグリシンナトリウムドデシル硫酸塩−ポリアクリルアミドゲル（ＮＯＶＥＸ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ）に添加した。ゲルを二フッ化ポリビニリデン膜に転写し、１：２５００抗Ｅ７モノクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ）、続けて、１：５０００西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｅｎｇｌａｎｄ）でプローブした。ブロットをＡｍｅｒｓｈａｍ増強化学ルミネッセンス検出試薬で展開し、オートラジオグラフィーフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に露光した（図５Ａ）。
【０２１０】
Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉの作成（図６Ａ）
Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、ｈｌｙ遺伝子のプロモーターおよびＰＥＳＴ配列、特に、ＬＬＯの最初の５０ＡＡのみを含むことを除いて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同じである。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を生成するために、ＳＯＥ（重複伸張による遺伝子スプライシング）ＰＣＲ技術を使用して、ｈｌｙプロモーターＰＥＳＴ領域を完全長Ｅ７遺伝子に融合した。Ｅ７遺伝子およびｈｌｙ−ＰＥＳＴ遺伝子断片をＬＬＯの最初の４４１ＡＡを含むプラスミドｐＧＧ−５５から増幅し、通常のＰＣＲ技術により一緒にスプライシングした。最終プラスミド：ｐＶＳ１６．５を生成するために、ｈｌｙ−ＰＥＳＴ−Ｅ７断片およびｐｒｆＡ遺伝子を、インビトロ選択のためにクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドｐＡＭ４０１にサブクローンニングし、生成したプラスミドをＸＦＬ−７の形質転換に使用した。
【０２１１】
Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７は、ＰＥＳＴ配列を欠いていることを除いて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同じ組換えリステリア株である。ｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子からＰＥＳＴ含有領域（ｂｐ３３３〜３８７）を取り除くように設計されているプライマーを使用してエピソーム発現系が作成されたことを除いて、実質的にＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７の場合の記載と同様にＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７を作成した。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、ＰＥＳＴ領域またはＬＬＯを含まないＥ７を分泌する組換え株である。この株を形質転換するために使用するプラスミドは、Ｅ７遺伝子に融合したｈｌｙプロモーターおよびシグナル配列の遺伝子断片を含む。この構築物は、染色体に組み込まれたＥ７遺伝子の単一コピーを発現した元のＬｍ−Ｅ７とは異なる。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、発現したＥ７抗原の形態以外は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７と完全に同質遺伝子的である。
【０２１２】
結果
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の誘導と、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の誘導による抗腫瘍免疫を比較するために、２×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞をマウスの皮下に移植し、触知可能なサイズ（約５ミリメートル［ｍｍ］）まで増殖させた。マウスを、７および１４日目に、１ＬＤ５０のＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（５×１０８ＣＦＵ）、（十字）Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０８ＣＦＵ）（正方形）またはＬｍ−Ｅ７（１０６ＣＦＵ）（円）でｉ．ｐ．免疫した。２６日目まで、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の全動物は、無腫瘍のままであったが、一方、全無処理動物（三角形）およびＬｍ−Ｅ７で免疫された動物は、大きな腫瘍に増殖した（図５Ｂ）。このように、ＡｃｔＡ−Ｅ７融合体のワクチン接種は腫瘍縮小を引き起こした。
【０２１３】
さらに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉのＥ７発現腫瘍を縮小させる能力に関し比較した。Ｓ．ｃ．ＴＣ−１腫瘍を４０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に樹立した。腫瘍が４〜５ｍｍに到達後、マウスを８匹のマウスの５つの群に分割した。各群を、４種の組換えＬＭワクチン剤の内の１種で処理し、１つの群は未処理で残した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、それぞれ、５／８および３／８症例で樹立腫瘍の縮小を誘導した。いずれの時点でも、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７またはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で処理されたマウスの平均腫瘍サイズの間に統計的差異は認められなかった。しかし、ＰＥＳＴ配列不含のＥ７を発現したワクチン剤：Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７とＬｍ−Ｅ７ｅｐｉは、１匹を除く全マウスで腫瘍を縮小させることができなかった（図６Ｂ、上段パネル）。これは、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７で処理された腫瘍およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉまたはＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７で処理された腫瘍の間で２８日目の平均腫瘍サイズの統計的有意差が観察された２つの実験の代表的な結果であった（Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ−検定、図６Ｂ、下段パネル）。さらに、ＰＥＳＴ含有ワクチン剤（図６Ｃ）を接種したマウスの脾臓中の３つの実験で、テトラマー陽性脾細胞の割合の増加が再現性よく認められた。このように、ＰＥＳＴ−Ｅ７融合体のワクチン接種は腫瘍を縮小させる。
【０２１４】
実施例４：Ｅ７のＬＬＯ、ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ様配列への融合はＥ７特異的免疫を増大させ、腫瘍浸潤Ｅ７特異的ＣＤ８＋細胞を生成する
材料および実験方法
燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１００ｍｃｌの２×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞および４００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．）を含む５００ｍｃｌ（マイクロリットル）のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）を１２匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）の左脇腹の皮下に移植した。７、１４および２１日目にマウスに腹腔内免疫し、２８日目に脾臓および腫瘍を採取した。腫瘍ＭＡＴＲＩＧＥＬをマウスから取り出し、氷上に置いた２ミリリットル（ｍｌ）のＲＰ１０培地を含むチューブ中、４℃で一晩インキュベートした。腫瘍を鉗子で切り刻んで２ｍｍのブロックにし、３ｍｌの酵素混合物（ＰＢＳ中の０．２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ−Ｐ、１ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼ−１）と共に３７℃で１時間インキュベートした。組織懸濁液をナイロンメッシュを通して濾過し、テトラマーおよびＩＦＮガンマ染色のためにＰＢＳ中の５％ウシ胎仔血清＋０．０５％のＮａＮ３で洗浄した。
【０２１５】
脾細胞および腫瘍細胞を、１マイクロモル（ｍｃｍ）Ｅ７ペプチドと共に、１０７細胞／ｍｌのブレフェルジンＡの存在下、５時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、５０ｍｃｌの抗マウスＦｃ受容体上清（２．４Ｇ２）中、４℃で１時間または一晩インキュベートした。細胞の表面分子ＣＤ８およびＣＤ６２Ｌを染色し、透過処理キットＧｏｌｇｉ−ｓｔｏｐ（登録商標）またはＧｏｌｇｉ−Ｐｌｕｇ（登録商標）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）を使用して透過処理し、固定して、ＩＦＮガンマを染色した。２台のレーザーフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して５００，０００イベントを取得し、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を使用して解析した。活性化（ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）ＣＤ８＋Ｔ細胞内のＩＦＮガンマ分泌細胞のパーセンテージを計算した。
【０２１６】
テトラマー染色では、Ｈ−２Ｄｂテトラマーにフィコエリトリン（ＰＥ）標識Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号３２）を加え、室温で１時間染色し、抗アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識ＭＥＬ−１４（ＣＤ６２Ｌ）およびＦＩＴＣ標識ＣＤ８βを使用して４℃で３０分間染色した。細胞を脾臓中と腫瘍中のテトラマー＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞の比較により分析した。
【０２１７】
結果
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の抗原特異的免疫を増大させる能力を分析するために、マウスにＴＣ−１腫瘍細胞を移植し、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、もしくはＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（２×１０８ＣＦＵ）で免役化処理するか、または処理しなかった（無処理）。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７群由来のマウスの腫瘍は、Ｌｍ−Ｅ７または無処理マウスより高いパーセンテージのＩＦＮガンマ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞（図７Ａ）およびテトラマー特異的ＣＤ８＋細胞（図７Ｂ）を含んでいた。
【０２１８】
別の実験では、腫瘍保持マウスにＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、またはＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを投与し、腫瘍内のＥ７特異的リンパ球のレベルを測定した。７および１４日目にマウスを０．１ＬＤ５０の４種のワクチン剤で処理した。腫瘍を２１に目に採取し、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８に対する抗体、およびＥ７／Ｄｂテトラマーで染色した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を接種したマウスで、腫瘍内のテトラマー陽性リンパ球の割合の増加が認められた（図８Ａ）。この結果は、３回の実験で再現性良好であった（図８Ｂ）。
【０２１９】
このように、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７、およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、それぞれ、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞および腫瘍縮小の誘導に効果的である。
【０２２０】
材料および実験方法（実施例５〜１０参照）
細菌株、形質転換および選択
大腸菌株ＭＢ２１５９を標準的プロトコルによる形質転換に使用した。細菌細胞をＨ２Ｏで洗浄することにより電気穿孔用の準備を行った。
【０２２１】
大腸菌株ＭＢ２１５９（Ｓｔｒｙｃｈ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２００１  Ｍａｒ  １５；１９６（２）：９３−８）は、Ｄ−アラニンラセマーゼを合成できないａｌｒ（−）／ｄａｄＸ（−）欠損変異体である。リステリア株Ｌｍｄａｌ（−）／ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）は、ｄａｌおよびｄａｔ遺伝子の部分的欠失のために、同様にＤ−アラニンラセマーゼを合成できない。
【０２２２】
プラスミド作成
ｐｌｃＡ遺伝子の公開された配列（Ｍｅｎｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９８９５７、３６９５−３７０１）を使用して、染色体ＤＮＡ由来の遺伝子をＰＣＲ増幅した。その後、増幅産物をＳａｌＩ−およびＸｂａＩ−生成ＤＮＡ末端を使用してｐＡＭ４０１に連結し、ｐＤＰ１４６２を生成した。
【０２２３】
ＸｂａＩとＰｓｔＩによる制限、平滑末端化するためのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ末端の処理、および分子内連結反応の後、ｐＤＰ１４６２からｐｌｃＡ遺伝子：塩基４２９〜１３４９（Ｍｅｎｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．、同上）を取り除くことによりｐｒｆＡ単独を含むプラスミドｐＤＰ１５００を作成した。
【０２２４】
ＰｓｔＩとＮｓｉＩによる制限ならびに分子内連結反応の後で、ｐＤＰ１３３９からｐｌｃＡ内部断片：塩基４２８〜８８２（Ｍｅｎｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９８９  ５７、３６９５−３７０１）を除去することにより、ｐｌｃＡプロモーターおよびｐｌｃＡの３’末端の一部を含むプラスミドｐＤＰ１４９９を作成した。
【０２２５】
ＢＡＭＨＩとＸｂａＩで制限されたｐＫＳＶ７、ｐｌｃＡの５’末端含有ｐＡＭ４０１：：ｐｌｃＡ由来４６８ｂｐ  ＸｂａＩとＮｓｉＩ生成断片（塩基８８２〜１３５１；Ｍｅｎｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．、同上）、ならびにｐｌｃＡの３’末端含有ｐＡＭ４０１：：ｐｌｃＡ  ｐｒｆＡ由来５０１ｂｐ  ＰｓｔＩとＢａｍＨＩ生成断片（塩基７７〜４２９；Ｍｅｎｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．、同上）、の３部分連結反応を１回行うことによりｐＤＰ１５２６（ｐＫＳＶ７：：ΔｐｌｃＡ）を作成した。
【０２２６】
ｐＤＰ１４６２のＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ二重消化により、ｐｒｆＡプロモーター：塩基１〜４２９（Ｍｅｎｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．、同上）を単離し、その後、断片をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ制限ｐＫＳＶ７に連結し、ｐＤＰ１４９８を生成した。２種のランダムＨｉｎｄＩＩＩ生成１０４０３Ｓ染色体ＤＮＡ断片（約３ｋｂ長さ）をＨｉｎｄＩＩＩ制限ｐＫＳＶ７に連結し、ランダムインテグレーション制御プラスミドｐＤＰ１５１９およびｐＤＰ１５２１を生成した。
【０２２７】
Ｌ．モノサイトゲネス変異体株の作成
以前記載（Ｃａｍｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９０、１７２、３７３８−３７４４）のように生成したＳＬＣＣ５７６４のＴｎ９１７−ＬＴＶ３バンクから低減されたレシチナーゼ（ＰＣ−ＰＬＣ）を有する変異体としてＬ．モノサイトゲネス株ＤＰ−Ｌ１３８７を単離した。以前記載（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９０  ５８、３７７０−３７７８）のように、Ｔｎ９１７−ＬＴＶ３挿入部位を、１つのトランスポゾン染色体のＤＮＡ接合部をシーケンシングすることにより決定した。以前記載（Ｃａｍｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、同上）のように、Ｌ．モノサイトゲネスをプラスミドＤＮＡで形質転換した。１ｍｌの培地当たり１０μｇのクロラムフェニコールの存在下、Ｌ．モノサイトゲネス中でのｐＡＭ４０１、ｐＫＳＶ７、およびそれらの誘導体の維持のための選択圧を加えた。さらに、ｐＫＳＶ７誘導体の維持には、グラム陽性細菌中でのプラスミド複製に許容される温度の３０℃下の増殖が必要である。
【０２２８】
ｐＫＳＶ７誘導体のＬ．モノサイトゲネス染色体中への組込みは、プラスミド上のＬ．モノサイトゲネスＤＮＡ配列と、それらの対応する染色体対立遺伝子との間の相同組換えにより生ずる。ｐＫＳＶ７複製に対する非許容温度の４０℃で、１ｍｌの培地当たり１０μｇのクロラムフェニコールを含むブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）ブロス中での約３０世代の増殖により挿入変異体が増加した。その後、それぞれの組込み株を１ｍｌの培地当たり１０μｇのクロラムフェニコールを含むＢＨＩ寒天上でコロニー精製を行い、４０℃でインキュベートした。それぞれの組込み株から単離した染色体ＤＮＡのサザンブロット分析により、組込みプラスミドの存在を確認した。
【０２２９】
ＤＰ−Ｌ１５５２の作成は、ｐＫＳＶ７誘導体のｐＤＰ１５２６を組込み、上述の部分二倍体中間体を生成することにより実現される。分子内の相同組換えによる組込みプラスミドの自然切除が低い頻度で発生する。プラスミドが染色体から切除された元の細菌は、ＢＨＩブロス中、３０℃での約５０世代にわたる増殖により増やされた。このステップ中の選択圧の性質は既知ではなかったが、組込み温度感受性プラスミドを含む株のわずかな増殖障害が原因である可能性がある。約５０％の切り取りイベント、すなわち、３’欠失配列間の相同組換えから生じたイベントは、染色体上の野性型対立遺伝子に対するΔｐｌｃＡの対立遺伝子交換を生じた。
【０２３０】
ＢＨＩ中、４０℃で約３０世代にわたり細菌を増殖させることにより、切り取ったプラスミドがキュアーされる。染色体上にΔｐｌｃＡ対立遺伝子を保持するプラスミドが除かれた細菌は、５ｍｌのＢＨＩ寒天／２．５％卵黄／２．５％リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＢＨＩ／卵黄寒天）上敷きを含むＢＨＩ寒天プレート上で増殖後、コロニー周辺の濁度ゾーンを産生できないことにより特定された。混濁状ゾーンは、卵黄中でのＰＩのＰＩ−ＰＬＣ加水分解から生じ、不溶性のジアシルグリセロール沈殿物を生成したものである。Ｌ．モノサイトゲネス染色体上の正確なｐｌｃＡ欠失は、欠失対立遺伝子をＰＣＲを使用して増幅し、欠失全体にわたりシーケンシングすることにより確認された。
【０２３１】
このように、本発明に従って、ＰＩ−ＰＬＣ陰性変異体（ｐｌｃＡ欠失変異体）を使用して、弱毒化Ｌ．モノサイトゲネスワクチン剤を生成できる。他の変異体も、同じ方法、すなわち、ａｃｔＡ欠失変異体、ｐｌｃＢ欠失変異体、およびｐｌｃＡとｐｌｃＢの両方を欠く二重変異体を使用して作製された。また、本開示に従ってこれら全ての変異体を使用して、弱毒化Ｌ．モノサイトゲネスワクチン剤を生成することもできる。本開示を考慮すると、当業者なら、上述のものに加えて、他の弱毒化変異体を形成できるであろう。
【０２３２】
Ｌｍｄｄの作成
染色体遺伝子と、元の８５０−ｂｐｄａｌ遺伝子ＰＣＲ産物の５′末端由来の４５０−ｂｐ断片と、ｄａｌ遺伝子ＰＣＲ産物の３′末端由来の４５０−ｂｐ断片との間にエリスロマイシン耐性遺伝子を保持する温度感受性シャトルプラスミドｐＫＳＶ７（Ｓｍｉｔｈ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．１９９２  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；７４（７−８）：７０５−１１）との間での二重対立遺伝子交換によりｄａｌ遺伝子を最初に不活化した。その後、所望の欠失周辺のインタクト遺伝子の５′および３′末端（遺伝子の上流および下流配列を含む）由来の相同性領域を保持するｐＫＳＶ７との類似の交換反応によりの８２％の範囲にわたるｄａｌ遺伝子を欠失した変異体を生成した。ＰＣＲ分析を使用してこの染色体の欠失構造を確認した。
【０２３３】
類似の対立遺伝子交換反応により染色体ｄａｔ遺伝子を不活化した。インタクトｄａｔ遺伝子（遺伝子の上流および下流配列を含む）の５′および３′末端の両方から得た４５０−ｂｐ断片を保持するようにｐＫＳＶ７を改変した。適切なＰＣＲによりこれらの２つの断片を連結した。この生成物の染色体中への置換により、ｄａｔ遺伝子の３０％の中央部塩基の欠失を生じ、この結果は、ＰＣＲ分析により確認された。
【０２３４】
リステリア細菌培養およびインビボ継代
標準的方法に従って大腸菌を培養した。リステリアを、２５０ｒｐｍ振盪下、ＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）＋５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン中、３７℃で増殖させ、指数増殖期中に採取した。Ｌｍ−ＬＬＯＥ７に対しては、培地に３７μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを加えた。増殖動速度を測定値するために、細菌を１０ｍｌのＬＢ＋抗生物質中で１６時間増殖させた。ＯＤ６００ｎｍを測定し、株間で培養密度を正規化した。ＬＢ＋適切な抗生物質および該当する場合にはＤ−アラニンを加えて、培養液を１：５０に希釈した。
【０２３５】
ＬＭのマウス中継代
１×１０８ＣＦＵをＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。３日目に、脾臓を単離し、ＰＢＳ中でホモジナイズした。適用可能な場合には抗生物質を含むＬＢプレート上に一定分量の脾臓懸濁液を蒔いて培養した。いくつかのコロニーを増殖させ、混合して注入用ストックを形成した。
【０２３６】
抗生物質耐性因子不含プラスミドｐＴＶ３の作成
ｐ６０−ｄａｌカセットの作成。
抗生物質耐性遺伝子不含ベクターの作成の最初のステップは、短縮ｐ６０プロモーターのｄａｌ遺伝子への融合体の作成であった。ＬＭアラニンラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子（順方向プライマー：５’−ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＡＴＣ−３’；配列番号４１）（逆方向プライマー：５’−ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＧＴＡ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＡＧＧ−３’；配列番号４２）および最小ｐ６０プロモーター配列（順方向プライマー：５’−ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＴＡＧ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  ＴＡＧ  ＴＣＣ−３’；  配列番号４３）（逆方向プライマー：５’−ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３’；配列番号４４）をＬＭ株１０４０３ＳのゲノムからＰＣＲ増幅によって単離した。その後のスプライス重複伸張（ＳＯＥ）−ＰＣＲによるｐ６０とｄａｌの融合のために、プライマーは、ＰａｃＩ部位をｐ６０配列の上流に、ＮｈｅＩ部位をｄａｌ配列の下流に（太字：制限酵素部位）に、さらに重複ｄａｌ配列（最初の１８ｂｐ）をｐ６０プロモーターの下流に導入した。短縮ｐ６０プロモーターの配列は：ＣＡＡＡＴＡＧＴＴＧＧＴＡＴＡＧＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＡＴＴＡＴＣＴＣＡＴＣＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＣＴＴＡＧＴＡＴＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＴＡＣＴＴＡＡＴＴＡＣＧＴＡＣＴＧＧＧＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣ（配列番号４５）（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７３：４６６８−７４、１９９１）であった。ＳＯＥ−ＰＣＲを使用して、ｐ６０およびｄａｌ  ＰＣＲ産物を融合し、クローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に挿入した。
【０２３７】
ｐＧＧ５５から抗生物質耐性遺伝子の除去。
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子をｐＧＧ５５から除去、およびｐ６０−ｄａｌカセットを導入するためのその後のクローニング法では、グラム陽性複製領域の除去が散発的に発生した（ｏｒｉＲｅｐ；Ｂｒａｎｔｌ  ｅｔ  ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １８：４７８３−４７９０、１９９０）。グラム陽性ｏｒｉＲｅｐを再導入するために、ＮａｒＩ／ＥｈｅＩ部位を配列（ＧＧＣＧＣＣＡＣＴＡＡＣＴＣＡＡＣＧＣＴＡＧＴＡＧ、配列番号４６）の上流に追加する５’−プライマー、およびＮｈｅＩ部位を配列（ＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＣＧ、配列番号４７）の下流に追加する３’−プライマーを使用してｏｒｉＲｅｐをｐＧＧ５５からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をクローニングベクターｐＣＲ２．１に挿入し、配列を確認した。
【０２３８】
ｐ６０−ｄａｌ配列をｐＧＧ５５ベクター中に導入するために、ｐ６０−ｄａｌ発現カセットを、ＰａｃＩ／ＮｈｅＩ二重消化によりｐＣＲ−ｐ６０ｄａｌから切り出した。ｐＧＧ５５中のグラム陽性細菌の複製領域を、ｐＣＲ−ｏｒｉＲｅｐからＰＣＲ（プライマー１、５’−ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＣＧＧ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＡＧ−３’；配列番号４８）；（プライマー２、５’-ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡＧ  ＣＴＡ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＣＧ−３’；配列番号４９）により増幅し、ＥｈｅＩおよびＮｈｅＩ用の追加の制限酵素部位を導入した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）に連結し、配列を確認した。複製領域をＥｈｅＩ／ＮｈｅＩ消化により切り出し、ＥｈｅＩおよびＮｈｅＩでベクターｐＧＧ５５を二重消化し、プラスミドから両方のＣＡＴ遺伝子を同時に除去した。２つの挿入物のｐ６０−ｄａｌとｏｒｉＲｅｐ、およびｐＧＧ５５断片を一緒に連結し、ｐＴＶ３を得た（図９）。また、ｐＴＶ３は、ｐｒｆＡ（病原性調節因子Ａ）遺伝子も含む。この遺伝子は、ｐＴＶ３の機能にとって必要ではないが、追加の選択マーカーが必要であるか、または望ましい状況下で使用できる。
【０２３９】
リアルタイムＰＣＲのためのＤＮＡの調製
Ｍａｓｔｅｒｐｕｒｅ（登録商標）全ＤＮＡキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して全リステリアＤＮＡを調製した。２５ｍｌのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔｏｎｉブロス（ＬＢ）中、２５０ｒｐｍの振盪下、３７℃で２４時間リステリアを培養した。細菌細胞を遠心分離により沈殿させ、５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム補充ＰＢＳ中に再懸濁し、３７℃で２０分間、インキュベートした後、ＤＮＡを単離した。
【０２４０】
リアルタイムＰＣＲ用の標準的標的ＤＮＡを得るために、ＬＬＯ−Ｅ７遺伝子をｐＧＧ５５からＰＣＲ増幅し（５’−ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴＡＣ−３’（配列番号５０）；５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号５１））、ベクターｐＥＴｂｌｕｅ１（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に挿入した。同様に、ｐｌｃＡアンプリコンをｐＣＲ２．１に挿入した。大腸菌をｐＥＴ−ＬＬＯＥ７およびｐＣＲ−ｐｌｃＡでそれぞれ形質転換して、リアルタイムＰＣＲで使用するために精製プラスミドＤＮＡを調製した。
【０２４１】
リアルタイムＰＣＲ
プラスミド標的としてＥ７を含むＴａｑｍａｎプライマープローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）をＡＢＩ  ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、リステリアゲノム標的として下記のプライマーを使用して設計した：５’−ＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧ−３’（配列番号５２）；５’−ＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ−３’（配列番号５３）；５’−ＦＡＭ−ＴＧＣＧＴＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＧＴＡＧＡＣＡＴＴＣＧＴＡＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号５４）および１コピー遺伝子ｐｌｃＡ（ＴＧＡＣＡＴＣＧＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＴＡＧ−３’（配列番号５５）、５’−ＧＣＡＧＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＡＣＣＡＧＧＴＡＣ−３’（配列番号５６）；５’−ＴＥＴ−ＴＴＡＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴＡＴＧＴＣＴＣＣＧＴＴＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＧＴＡ−ＴＡＭＲＡ−３’；配列番号５７）。
【０２４２】
製造業者の推奨に従い、０．４μＭプライマーおよび０．０５ｍＭプローブをＰｕＲＥ  Ｔａｑ  ＲＴＧ  ＰＣＲビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）と混合した。精製プラスミドＤＮＡ、ｐＥＴ−ＬＬＯＥ７およびｐＣＲ−ｐｌｃＡ（内部標準）を含む各標的に対し検量線を作成し、未知の試料中の遺伝子コピー数の計算に使用した。検量線に基づいてＥ７コピー／ｐｌｃＡコピーの平均比を計算し、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３およびＬｍ−ＬＬＯＥ７の結果を、ゲノム中に組み込まれたＥ７遺伝子の単一コピーを有するリステリア株のＬｍ−Ｅ７からの結果で除算することにより較正した。ｑＰＣＲアッセイをそれぞれ３回繰り返すことにより、全ての試料を３回試験した。試料間の変化を、ＫｙＰｌｏｔソフトウェアを使用して２元配置分散分析により解析した。ｐ＜０．０５の場合に結果を統計的に優位であると見なした。
【０２４３】
増殖測定
細菌を、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地＋／−１００マイクログラム（μｇ）／ｍｌ  Ｄ−アラニンおよび／または３７μｇ／ｍｌクロラムフェニコール中、３７℃、２５０ｒｐｍ振盪下で増殖させた。ＯＤ６００ｎｍ測定値に基づいて全ての株で同じになるように出発接種菌を調節した。
【０２４４】
溶血溶解アッセイ
４×１０９ＣＦＵのリステリアを解凍し、遠心分離（１分、１４０００ｒｐｍ）で沈殿させ、１Ｍシステインを含む１００μｌ  ＰＢＳ、ｐＨ５．５中に再懸濁した。細菌を１：２系列希釈し、分泌ＬＬＯを活性化するために３７℃で４５分間インキュベートした。脱繊維素全ヒツジ血液（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｈｏｒｎｂｙ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を５倍量のＰＢＳで２回、６倍量のＰＢＳ−システインで３〜４回、上清が透明なままになるまで洗浄し、洗浄ステップの間に３０００×ｇで８分間細胞を沈殿させて、再懸濁して最終濃度のＰＢＳ−システイン中１０％（ｖ／ｖ）とした。１００μｌの１０％洗浄血液細胞を１００μｌのリステリア懸濁液と混合し、３７℃でさらに４５分間インキュベートした。次に、非溶解血液細胞を遠心分離（１０分、１０００×ｇ）で沈殿させた。１００μｌの上清を新規プレートに移し、ＯＤ５３０ｎｍを測定し、試料希釈に対しプロットした。
【０２４５】
Ｌｍｄｄ−Ｔｖ３の治療有効性
１０５ＴＣ−１（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）をＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）の皮下に移植し、約７日間増殖させた後、腫瘍が触知可能となった。ＴＣ−１は、ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７で不死化され、活性化ｒａｓで形質転換された皮下移植時に腫瘍を形成するＣ５７ＢＬ／６上皮細胞系統である。マウスを腫瘍細胞移植後７および１４日目に０．１ＬＤ５０の適切なリステリア株で免疫した。また、非免疫対照群（無処理）も含めた。腫瘍増殖を電子キャリパで測定した。
【０２４６】
ＡｃｔＡ欠失変異体の作成
株Ｌｍｄａｌｄａｔ（Ｌｍｄｄ）は、病原性因子：ＡｃｔＡの不可逆的欠失により弱毒化された。下流遺伝子の発現に対しどのような極性効果も与えないようにＬｍｄａｌｄａｔ（Ｌｍｄｄ）バックグラウンド中のａｃｔＡのインフレーム欠失が形成された。ＬｍｄａｌｄａｔΔａｃｔＡは、ＡｃｔＡのＮ末端の最初の１９アミノ酸およびＣ末端の２８アミノ酸残基を含み、５９１アミノ酸を欠失している。染色体スポット中の遺伝子の欠失は、ａｃｔＡ欠失領域外にアニーリングするプライマーを使用して確認した。これらは、図１２に示すプライマー３（Ａｄｖ３０５−ｔｇｇｇａｔｇｇｃｃａａｇａａａｔｔｃ）（配列番号５８）および４（Ａｄｖ３０４−ｃｔａｃｃａｔｇｔｃｔｔｃｃｇｔｔｇｃｔｔｇ）（配列番号５９）である。ＬｍｄｄおよびＬｍ−ｄｄΔａｃｔＡから単離された染色体のＤＮＡに対しＰＣＲ分析を行った。２つの異なるセットのプライマー対１、２および３、４で増幅後のＤＮＡ断片のＬｍ−ｄｄ染色体ＤＮＡ中のサイズは、３．０Ｋｂおよび３．４Ｋｂであると予測された。しかし、Ｌｍ−ｄｄΔａｃｔＡに対しては、プライマー対１、２および３、４を使ったＰＣＲの予測サイズは、１．２Ｋｂおよび１．６Ｋｂであった。従って、図１２のＰＣＲ分析で、株：Ｌｍ−ｄｄΔａｃｔＡ中のａｃｔＡの１．８ｋｂ領域が欠失したことが確認される。また、ＰＣＲ産物に対しＤＮＡシーケンシングを行い、株：Ｌｍ−ｄｄΔａｃｔＡ中のａｃｔＡ含有領域の欠失が確認された（図１３）。
【０２４７】
【化２】
2015511602.tif 000006
（配列番号６０）。
【０２４８】
炎症性サイトカインの産生
ＲＡＷ２６４．７などのマクロファージを、Ｌｍ  ｐｒｆＡ−（ｐＧＧ５５）、Ｌｍ  ｄａｌ  ｄａｔ、Ｌｍ  ｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡ、Ｌｍ  ｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡ  ΔｉｎｌＣおよびＬｍ  ｄａｌ  ｄａｔ  ΔｉｎｌＣなどの異なるリステリア骨格に感染させ、上清を異なる時点で採取し、異なるＥＬＩＳＡベースキットを使用して種々のサイトカインのレベルを定量した。定量したサイトカインには、ＩＦＮ−g、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６が含まれる。
【０２４９】
サイトカインのインビボ産生
サイトカイン産生および好中球の補充をインビボで測定するために、別々の１０８ＣＦＵのＬｍ  ｐｒｆＡ−（ｐＧＧ５５）、Ｌｍ  ｄａｌ  ｄａｔ、Ｌｍ  ｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡ、Ｌｍ  ｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡ  ΔｉｎｌＣおよびＬｍ  ｄａｌ  ｄａｔ  ΔｉｎｌＣ、リステリア対照または等容量の食塩水をＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に注射した。１２時間後、マウスを屠殺し、腹腔を２ｍＬのＰＢＳで洗浄した。増殖培地上での平板培養、およびＭＩＰ−１a、ＫＣ、ＭＣＰなどの炎症促進性サイトカインの分析後、腹腔洗浄液の細菌量を調べた。Ｇｒ−１、ＣＤ１１ｂおよびＦ４／８０などのマーカーで染色後、フローサイトメトリーを使用して、好中球およびマクロファージの数を測定し、さらに、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用してこれらの集団を定量した。
【０２５０】
トランスウェル遊走アッセイ
このアッセイは、骨髄由来マクロファージまたは樹状細胞のｉｎｌＣ欠失株への感染後、好中球の遊走の増加があるか否かを測定するために行われる。骨髄由来マクロファージまたは樹状細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６などのマウスから単離され、ｉｎｌＣ欠失変異体または対照リステリアに感染させられる。トランスウェルアッセイは、感染細胞を使用してＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒトランスウェルプレートにより設定される。アッセイは、最初、３、５、または８ミクロン気孔トランスウエルプレートを使用して標準に合わせられる。好中球遊走を試験するために、チャンバー中のプレートの底に感染ＡＰＣを、ウエルの上部に好中球を播種した。異なる時点で細胞を計数して、底部に遊走した好中球の数を測定した。
【０２５１】
Ｌｍ  ｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡ  ΔｉｎｌＣ変異体の治療有効性
ｉｎｌＣ変異体の治療有効性を測定するために、ヒト前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を概念実証としての腫瘍抗原として使用する。骨格Ｌｍ  ｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡ  ｉｎｌＣは、ＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２を生ずるヒトＰＳＡ用の発現カセットを含むプラスミド：ｐＡｄｖ１４２で形質転換される。株ＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２は、融合タンパク質：ｔＬＬＯ−ＰＳＡの発現および分泌で特徴付けられる。さらに、株ＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２は、マウス中、インビボで２回継代培養され、２回のインビボ継代後に得られたコロニーの融合タンパク質：ｔＬＬＯ−ＰＳＡの発現および分泌が検査される。２回目のインビボ継代後得られたコロニーからワクチン作業ストックが調製され、治療効果および免疫原性の評価に使用される。
【０２５２】
腫瘍微小環境に与える影響
ＬｍｄｄＡ、ＬｍｄｄＡΔａｃｔＡ、ＬｍｄｄＡΔＰｌｃＡ、ＬｍｄｄＡΔＰｌｃＢ、ＬｍｄｄＡΔｐｒｆＡ、ＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２、ＬｍｄｄＡ１４２および他の対照株の腫瘍微小環境中で免疫細胞の浸潤を引き起こす能力が測定される。この調査では、０日目に、１×１０６ＴＰＳＡ２３腫瘍細胞がマウスに接種され、７、１４および２１日目に、１０８ＣＦＵのＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２、ＬｍｄｄＡ１４２および他の対照株でワクチン接種される。２８日目に腫瘍を採取し、さらに、Ｇｒ−１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＮＫ１．１およびＣＤ６２Ｌなどの異なる細胞表面マーカーで染色するための処理を行う。これらのマーカーを使用して調べられる異なる細胞集団には、マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋）、ＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋）、好中球（Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋）、ミエロイド由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）（Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋）、制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）およびエフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）が含まれる。さらに、エフェクターＴ細胞は、ＩＦＮ−g、ＴＮＦ−aおよびＩＬ−２などのエフェクターサイトカインを産生するその機能的能力により特徴付けられる。腫瘍内制御性Ｔ細胞およびＭＤＳＣの、Ｔ細胞増殖性の抑制を引き起こす能力に関し試験を行う。
【０２５３】
結果
実施例５：抗生物質耐性遺伝子の代わりにアミノ酸代謝酵素を含むプラスミドがインビトロおよびインビボの両方で大腸菌およびＬＭ中に保持される
抗生物質耐性遺伝子を使用しないでＬＭ中のプラスミドの保持を媒介するために、Ｄ−アラニンラセマーゼベースの栄養要求株補完系を利用した。大腸菌株ＭＢ２１５９は、Ｄ−アラニンラセマーゼを合成できないａｌｒ（−）／ｄａｄＸ（−）欠損変異体である。リステリア株Ｌｍｄａｌ（−）／ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）は、ｄａｌおよびｄａｔ遺伝子の部分的欠失に起因して、同様に、Ｄ−アラニンラセマーゼを合成できない。大腸菌リステリアシャトルベクターｐＡＭ４０１をベースにしたプラスミドｐＧＧ５５は、リステリアｐ６０プロモーターの制御下で、両方のＣＡＴ遺伝子の除去およびそれらのｐ６０−ｄａｌ発現カセットによる置換により改変され、ｐＴＶ３を生成した（図９）。ＤＮＡをいくつかのコロニーから精製した。
【０２５４】
実施例６：代謝酵素含有プラスミドは細菌の病原性を増大させない
病原性はＬＬＯ機能に関連しているので、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３とＬｍ−ＬＬＯＥ７との間の溶血性溶解活性を比較した。このアッセイは、赤血球の溶解によりＬＬＯ機能を試験するもので、培養液上清、精製ＬＬＯまたは細菌細胞を使用して行うことができる。Ｌｍｄｄ−ＴＶ３は、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７より高い溶血性溶解活性を示した。
【０２５５】
また、より直接的な、従って正確な病原性の測定手段であるＬＤ５０値を測定することによりインビボ病原性を測定した。Ｌｍｄｄ−ＴＶ３のＬＤ５０（０．７５×１０９）は、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７の値（１×１０９）に極めて近く、代謝酵素を含むプラスミドは、細菌の病原性を増大させないことを示した。
【０２５６】
実施例７：代謝酵素含有プラスミドによる抗腫瘍免疫の誘導
代謝酵素含有プラスミドの癌ワクチンとしての有効性を腫瘍縮小モデルで測定した。ＨＰＶワクチン開発用として十分に特徴が明らかにされ、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３またはＬｍ−ＬＬＯＥ７で免疫化後の類似サイズの樹立腫瘍縮小の対照比較を可能とするＴＣ−１細胞株モデルを使用した。２つの別々の実験では、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３およびＬｍ−ＬＬＯＥ７によるマウスの免疫化は、ワクチン接種群間で統計的に有意差のない（ｐ＜０．０５）類似の腫瘍縮小を生じた（図１４）。全免疫マウスは、６３日後でもまだ生存していたが、一方、非免疫マウスは、それらの腫瘍が２０ｍｍ直径に達すると屠殺しなければならなかった。治癒マウスは、実験の終了まで無腫瘍のままで残った。
【０２５７】
このように、代謝酵素含有プラスミドは、治療用癌ワクチンとして有効である。治療用癌ワクチンに対して要求される免疫応答は、予防用癌ワクチンに対する要求より強力であるので、これらの結果は、予防用癌ワクチンとしても同様に有用であることを示す。
【０２５８】
実施例８：ｉｎｌＣ欠失変異体は極めて高レベルのケモカインおよびサイトカインを生成する
ｉｎｌＣ欠失変異体は、感染部位への好中球および白血球の浸潤を生ずるＭＩＰ−１a、ＫＣ（ＩＬ−８のマウス相同体）、ＭＣＰなどの極めて高いレベルのケモカインを生成する。従って、異なるリステリア株が腹腔内に投与される場合、ｉｎｌＣ変異体は、これらのサイトカインおよびケモカインの産生の増加を示し、これらは、注射の１２時間後に得られた腹水中の好中球およびマクロファージを引きつける。さらに、ｉｎｌＣ欠失変異体は、対照株に比べて極めて高いレベルの炎症性サイトカインを生成する。
【０２５９】
実施例９：ｉｎｌＣ欠失変異体は好中球遊走を誘導する
ｉｎｌＣ欠失変異体に感染したマクロファージは、他の対照株と比較した場合、種々の時点で、好中球の遊走の顕著な増加を示す。この実験の結果は、感染中の好中球などの免疫細胞を引きつけるこの株の能力を強く裏付ける。
【０２６０】
実施例１０：ｉｎｌＣ欠失変異体は治療用抗腫瘍応答をもたらす
ＬｍｄｄＡ１４２およびＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２の両方を使った抗腫瘍調査の結果は、相互に極めて類似しており、腫瘍の治療的縮小が観察される。さらに、高レベルの自然応答および炎症促進性サイトカインの分泌の増加を生ずるする能力のために、２用量のＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２は、３用量の株ＬｍｄｄＡ１４２に相当する。
【０２６１】
材料および方法（実施例１１〜１６）
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）でオリゴヌクレオチドを合成し、Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃ、Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ  ＮＪでＤＮＡシーケンシングを行った。フローサイトメトリー試薬をＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。特に示さない限り、細胞培地、栄養補助剤および全ての他の試薬をＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ、ＭＯ）から入手した。ＥＺｂｉｏｌａｂｓ（Ｗｅｓｔｆｉｅｌｄ、ＩＮ）でＨｅｒ２／ｎｅｕＨＬＡ−Ａ２ペプチドを合成した。完全ＲＰＭＩ１６４０（Ｃ−ＲＰＭＩ）培地には、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および１ｍＭピルビン酸ナトリウム塩、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、ヘペス（２５ｍＭ）を含めた。ポリクローナル抗ＬＬＯ抗体については、前に記載した。抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体はＳｉｇｍａから購入した。
【０２６２】
マウスおよび細胞株
全ての動物実験をペンシルバニア大学またはラトガース大学のＩＡＣＵＣによる承認プロトコルに従って行った。ＦＶＢ／ＮマウスをＪａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。ラットＨｅｒ２／ｎｅｕ腫瘍タンパク質を過剰発現するＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子導入マウスを、ペンシルバニア大学の動物ケア施設に収容、飼育した。高レベルのラットＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を発現するＮＴ−２腫瘍細胞株をこれらのマウスの自然乳房腫瘍から得て、前に記載のように増殖させた。ＤＨＦＲ−Ｇ８（３Ｔ３／ｎｅｕ）細胞をＡＴＣＣから入手し、ＡＴＣＣの推奨方法に従って増殖させた。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞株はＤｒ．Ｊｏｈｎ  Ｏｈｌｆｅｓｔ（ミネソタ大学、ＭＮ）からいただいた贈呈品であるが、これを完全Ｃ−ＲＰＭＩ培地中で増殖させた。生物発光作業は、小動物イメージング施設（ＳＡＩＦ）のガイダンスに従いペンシルバニア大学（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）で行った。
【０２６３】
リステリア構築物および抗原発現
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−ｐＧＥＭ７Ｚは、ペンシルバニア大学のＤｒ．Ｍａｒｋ  Ｇｒｅｅｎｅにより提供いただいたが、これはｐＧＥＭ７Ｚプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）に挿入された完全長ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ（ｈＨｅｒ２）遺伝子を含んでいた。ｈＨｅｒ−２／ｎｅｕの３種のセグメント、すなわち、ＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１を、ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および表１に示すオリゴを使用してＰＣＲで増幅するためのテンプレートとしてこのプラスミドを使用した。
【０２６４】
【表１】
2015511602.tif 000007
【０２６５】
重複伸長による遺伝子スプライシングＰＣＲ法による直接融合により、それぞれ別々のｈＨｅｒ−２／ｎｅｕセグメントをテンプレートとして、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕキメラ構築物を生成した。プライマーを表２に示す。
【０２６６】
【表２】
2015511602.tif 000008
【０２６７】
異なるセグメントのヒトＨｅｒ２領域の増幅用プライマー配列
【０２６８】
ＣｈＨｅｒ２遺伝子をＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限酵素を使用してｐＡｄｖ１３８から切り出し、ＬＬＯの短縮非溶血性断片とインフレームでＬｍｄｄシャトルベクター：ｐＡｄｖ１３４中に挿入した。挿入物、ＬＬＯおよびｈｌｙプロモーターの配列をＤＮＡシーケンシング分析で確認した。このプラスミドを、エレクトロコンピテントａｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ変異体リステリア・モノサイトゲネス株：ＬｍｄｄＡに電気穿孔により導入し、ストレプトマイシン（２５０mｇ／ｍｌ）を含むブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天プレート上で陽性クローンを選択した。一部の実験では、比較のために、ｈＨｅｒ２／ｎｅｕ（Ｌｍ−ｈＨｅｒ２）断片を発現している類似のリステリア株を使った。これらは以前に記載している。全調査で、免疫系に対するリステリアの抗原非依存性効果を説明するために、無関係のリステリア構築物（Ｌｍ対照）を含めた。Ｌｍ対照は、ＡＤＸＳ３１−１６４と同じリステリアプラアットホームをベースにしたが、ＨＰＶ１６−Ｅ７またはＮＹ−ＥＳＯ−１などの異なる抗原を発現した。リステリアからの融合タンパク質の発現および分泌を試験した。各構築物をインビボで２回継代培養した。
【０２６９】
細胞傷害性アッセイ
３〜５匹のＦＶＢ／Ｎマウス群を、１×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、Ｌｍ−ｈＨｅｒ２ＩＣＩまたはＬｍ対照（無関係の抗原を発現している）で１週間おきに３回免疫するか、または無処理で残した。ＮＴ−２細胞をインビトロで増殖させ、トリプシンで取り外し、マイトマイシンＣ（血清不含Ｃ−ＲＰＭＩ培地中の２５０mｇ／ｍｌ）を使用して３７℃で４５分間処理した。５回の洗浄後、それらを免疫または無処理動物から採取した脾細胞と共に、１：５（刺激物質：レスポンダー）比率、５％ＣＯ２下、３７℃で５日間共インキュベートした。ユーロピウム標識３Ｔ３／ｎｅｕ（ＤＨＦＲ−Ｇ８）細胞を標的として使い、以前記載の方法に従って標準的細胞傷害性アッセイを行った。４時間のインキュベーション後、分光光度計（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｖｉｃｔｏｒ２）を使用して、死滅させた標的細胞から放出されたユーロピウムを５９０ｎｍで測定した。特異的溶解パーセントを、
（実験群の溶解−自然溶解）／（最大溶解−自然溶解）
として定義した。
【０２７０】
免疫マウス由来脾細胞によるインターフェロン−γ分泌
３〜５匹のＦＶＢ／ＮまたはＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウス群を、１×１０８（ＣＦＵ）のＡＤＸＳ３１−１６４：陰性リステリア対照（無関係の抗原を発現している）で１週間おきに３回免疫するか、または無処理で残した。最後の免疫の１週間後、ＦＶＢ／Ｎマウス由来の脾細胞を単離し、２４ウエルプレートを用い、５×１０６細胞／ウエル、Ｃ−ＲＰＭＩ培地中のマイトマイシンＣ処理ＮＴ−２細胞の存在下で共培養した。ＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウス由来の脾細胞を、大腸菌中で産生され、ニッケルベース親和性クロマトグラフィーシステムで精製された、１μＭのＨＬＡ−Ａ２特異的ペプチドまたは１μｇ／ｍｌの組換えＨｉｓ−タグＣｈＨｅｒ２タンパク質の存在下でインキュベートした。２４または７２時間後、上清由来試料を得た後、マウスＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して、製造業者の推奨法に従いインターフェロン−g（ＩＦＮ−g）の存在に関する試験を行った。
【０２７１】
Ｈｅｒ２遺伝子導入動物中の腫瘍調査
６週齢のＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子導入マウス（９〜１４匹／群）を、５×１０８ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４またはＬｍ対照で６回免疫した。それらのマウスの自然乳房腫瘍の出現を週２回観察し、電子キャリパを使用して５２週まで測定した。腫瘍が平均直径で１ｃｍ２のサイズに達すると、生育した腫瘍を摘出し、−２０℃でＲＮＡｌａｔｅｒ中に保存した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質中の変異がこれらの腫瘍の生育に与える影響を測定するために、ゲノムＤＮＡ単離キットを使用してゲノムＤＮＡを抽出し、配列決定した。
【０２７２】
脾臓および腫瘍中の制御性Ｔ細胞に与えるＡＤＸＳ３１−１６４の影響
マウスの皮下に（ｓ．ｃ．）１×１０６ＮＴ−２細胞を移植した。７、１４および２１日目に、１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、ＬｍｄｄＡ対照でマウスを免疫するか、または無処理で残した。２８日目に腫瘍および脾臓を抽出し、ＦＡＣＳ分析によりＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの存在に関する試験を行った。簡単に説明すると、Ｃ−ＲＰＭＩ培地中の２枚のガラススライドの間で脾臓をホモジナイズすることにより脾細胞を単離した。腫瘍を無菌のカミソリの刃を使用して刻み、ＰＢＳ中のＤＮアーゼ（１２Ｕ／ｍｌ）およびコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍｌ）含有緩衝液で消化した。室温で攪拌しながら６０分間インキュベーションを行った後、細胞を激しいピペット操作により分離した。赤血球をＲＢＣ溶解緩衝液で溶解し、続いて、１０％ＦＢＳ含有完全ＲＰＭＩ−１６４０培地で数回洗浄した。ナイロンメッシュを通して濾過後、腫瘍細胞および脾細胞をＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ）に再懸濁し、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ２５−ＡＰＣ抗体で染色し、続けて透過処理し、抗Ｆｏｘｐ３−ＰＥで染色した。４色ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）を使用してフローサイトメトリー分析を行い、データをｑｕｅｓｔｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ）を使用して分析した。
【０２７３】
統計解析
生存データ用にログランク検定、カイ二乗検定を使用し、ＣＴＬおよびＥＬＩＳＡアッセイ用にスチューデントｔ−検定を使用し、アッセイを３回繰り返した。これらの解析では、０．０５未満のｐ値（＊で標識）を統計的に有意であると見なした。全ての統計解析をプリズムソフトウェア、Ｖ．４．０ａ（２００６）またはＳＰＳＳソフトウェア、Ｖ．１５．０（２００６）で行った。別段の記載がない限り、全てのＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子導入調査に対しては、８〜１４匹のマウス／群を使用し、全ての野性型ＦＶＢ／Ｎ調査に対しては、少なくとも８匹のマウス／群を使用した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子導入マウスモデルの長期腫瘍試験を除いて、全ての調査を少なくとも１回繰り返した。
【０２７４】
結果
実施例１１：Ｈｅｒ−２断片に融合したＬＬＯ断片を分泌するＬ．モノサイトゲネス株の生成：ＡＤＸＳ３１−１６４の作成
キメラＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子（ＣｈＨｅｒ２）の作成は前に記載した。簡単に述べると、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の２つの細胞外断片（ａａ４０〜１７０およびａａ３５９〜４３３）および１つの細胞内断片（ａａ６７８〜８０８）の重複伸長による遺伝子スプライシングＰＣＲ法による直接融合法を使用してＣｈＨｅｒ２遺伝子を生成した。キメラタンパク質は、既知のヒトＭＨＣクラスＩタンパク質の大部分のエピトープを含む。プラスミド：ｐＡｄｖ１３８（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の作成に使われる）からＣｈＨｅｒ２遺伝子を切り出し、ＬｍｄｄＡシャトルプラスミドに挿入し、プラスミドｐＡｄｖ１６４を得る（図１５Ａ）。これらの２つのプラスミド骨格の間には２つの大きな差異がある。１）ｐＡｄｖ１３８は、組換え細菌のインビトロでの選択のためにクロラムフェニコール耐性マーカー（ｃａｔ）を使う一方で、ｐＡｄｖ１６４は、枯草菌由来のＤ−アラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）を持ち、これは、ｄａｌ−ｄａｔ遺伝子を欠くＬｍｄｄＡ株中のインビトロでの選択用およびインビボでのプラスミド保持用に代謝補完経路を使う。このワクチンプラットホームは、操作リステリアワクチン株の抗生物質耐性に関するＦＤＡの懸念に対処するために設計・開発された。２）Ｌｍｄｄ株のインビボでの補完に必要ではないので、ｐＡｄｖ１３８とは異なり、ｐＡｄｖ１６４は、プラスミド中にｐｒｆＡ遺伝子のコピーを持たない（下記配列および図１５Ａ参照）。また、ＬｍｄｄＡワクチン株は、ａｃｔＡ遺伝子（リステリアの細胞内移動および細胞から細胞への伝染の原因となる）が欠失し、そのため、この骨格由来の組換えワクチン株は、その親株のＬｍｄｄ由来のワクチン株よりも病原性が１００倍少ない。また、ＬｍｄｄＡベースワクチン剤は、ＬｍｄｄＡベースワクチン剤よりもはるかに速く（４８時間未満に）免疫マウスの脾臓から排出される。約１０４ＫＤのバンドがウェスタンブロット分析を使用して抗ＬＬＯ抗体により検出されたので、この株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌は、インビトロ増殖の８時間後のＴＣＡ沈殿細胞培養液上清中のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌と同等であった（図１５Ｂ）。ｔＬＬＯのみを発現しているリステリア骨格株を陰性対照として使った。
【０２７５】
ｐＡｄｖ１６４配列（７０７５塩基対）（図１５参照）：
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【０２７６】
実施例１２：ＡＤＸＳ３１−１６４はＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２と同等の免疫原性である
抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的細胞傷害性Ｔ細胞の生成の観点からＡＤＸＳ３１−１６４の免疫特性を標準的ＣＴＬアッセイによりＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２ワクチンの特性と比較した。両ワクチン剤は、強力に誘発するが、３Ｔ３／ｎｅｕ標的細胞によって発現するＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答は同等である。従って、ＬＬＯに融合したＨｅｒ２の細胞内断片のみを発現しているリステリアで免役されたマウスは、より多くのＭＨＣクラスＩエピトープを含むキメラより低い溶菌活性を示した。無処理の動物または無関係のリステリアワクチンを注射されたマウスではＣＴＬ活性は検出されなかった（図１６Ａ）。また、ＡＤＸＳ３１−１６４は、野性型ＦＶＢ／Ｎマウス由来の脾細胞によりＩＦＮ−γの分泌を刺激することが可能であった（図１６Ｂ）。このことは、高レベルのＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原を発現するマイトマイシンＣ処理ＮＴ−２細胞と共培養されたこれらの細胞培養液上清中で検出された（図１９Ｃ）。
【０２７７】
ＡＤＸＳ３１−１６４で免疫後のヒトＭＨＣクラスＩエピトープの適切なプロセッシングと提示に関し、ＨＬＡ−Ａ２マウスで試験した。免疫ＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入動物由来の脾細胞を、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ分子の細胞外ドメイン（ＨＬＹＱＧＣＱＶＶ配列番号７４またはＫＩＦＧＳＬＡＦＬ配列番号７５）または細胞内ドメイン（ＲＬＬＱＥＴＥＬＶ配列番号７６）の位置にあるマップされたＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープに対応するペプチドと共に７２時間共インキュベートした（図１６Ｃ）。組換えＣｈＨｅｒ２タンパク質を陽性対照として使用し、無関係のペプチドまたはペプチド不含のものを陰性対照として使用した。この実験結果データは、ＡＤＸＳ３１−１６４が、標的抗原の異なるドメインに位置するヒトエピトープに対する抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的免疫応答を誘発できることを示す。
【０２７８】
実施例１３：ＡＤＸＳ３１−１６４は自然乳房腫瘍の発症の予防の点でＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２よりも高い有効性を示した
２０〜２５週齢で増殖が遅い自然乳房腫瘍を発症するＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子導入動物中のＡＤＸＳ３１−１６４の抗腫瘍効果を、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２と比較した。無関係のリステリア対照ワクチンで免疫された全ての動物は、２１〜２５週以内に乳房腫瘍を発症し、３３週の前に屠殺された。対照的に、リステリア−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ組換えワクチン剤は、乳房腫瘍の形成の遅延を生じた。４５週目では、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２で免役されたマウスの場合の２５％に比べて、５０％超のＡＤＸＳ３１−１６４ワクチン接種マウス（９匹の内の５匹）がその時点でも無腫瘍であった。５２週目には、ＡＤＸＳ３１−１６４で免疫の８匹のマウスの内の２匹がその時点でも無腫瘍のまま残り、一方、他の実験群の全てのマウスは、既に疾患で死亡してしまった（図１７）。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４は、より弱毒化されているにも関わらず、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子導入動物の自然乳房腫瘍の発症の防止の点でＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２より効果的であることを示している。
【０２７９】
実施例１４：ＡＤＸＳ３１−１６４で免疫時のＨＥＲ２／ＮＥＵ遺伝子の変異
Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＭＨＣクラスＩエピトープの変異は、小断片ワクチン剤またはトラスツズマブ（ハーセプチン）（Ｈｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメイン中のエピトープを標的とするモノクローナル抗体）で免疫時に腫瘍成長を引き起こすと考えられてきた。これを確かめるために、ゲノム材料を遺伝子導入動物の生育腫瘍から抽出し、キメラまたは対照ワクチン剤で免役された腫瘍中の対応するｎｅｕ遺伝子の断片を配列決定した。どのワクチン接種腫瘍試料のＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子内にも変異は観察されず、別の生育機序を示唆している（データは示さず）。
【０２８０】
実施例１５：ＡＤＸＳ３１−１６４は腫瘍内制御性Ｔ細胞の顕著な減少を引き起こす
ＡＤＸＳ３１−１６４の脾臓および腫瘍中の制御性Ｔ細胞の発生頻度に与える影響を明らかにするために、マウスにＮＴ−２腫瘍細胞を移植した。３回の免疫後、脾細胞および腫瘍内リンパ球を単離し、Ｔｒｅｇの染色を行った。Ｔｒｅｇは、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞として定義されたが、別々に分析した場合、ＦｏｘＰ３またはＣＤ２５マーカーを使用しても同様の結果が得られた。結果は、無関係のリステリアワクチンまたは無処理動物に比べて、ＡＤＸＳ３１−１６４による免疫は脾臓中のＴｒｅｇの発生頻度に対し影響を与えないことを示した（Ｓｅｅ図１８）。対照的に、リステリアワクチン剤による免疫は、腫瘍中のＴｒｅｇの存在に対しかなりの影響を生じた（図１９Ａ）。無処理腫瘍の全ＣＤ３＋Ｔ細胞の平均１９．０％がＴｒｅｇであったが、この発生頻度は、無関係のワクチンでは４．２％に、ＡＤＸＳ３１−１６４では３．４％に減少し、腫瘍内Ｔｒｅｇの発生頻度は５倍の減少であった（図１９Ｂ）。いずれかのＬｍｄｄＡワクチン剤で処理したマウス中の腫瘍内Ｔｒｅｇの発生頻度の減少の原因を腫瘍サイズの差異に帰することはできなかった。代表的実験では、ＡＤＸＳ３１−１６４で免役されたマウス由来の腫瘍径［６．７１±０．４３、ｎ＝５］は、未処理マウス由来の腫瘍径（平均径（ｍｍ）±ＳＤ＝８．６９±０．９８、ｎ＝５、ｐ＜０．０１）または無関係のワクチンで処理した腫瘍径（８．４１±１．４７、ｎ＝５、ｐ＝０．０４）よりもかなり小さいが、一方、これらの後者の２群の比較は、腫瘍サイズの統計的有意差を示さなかった（ｐ＝０．７３）。ＬｍｄｄＡワクチン剤で処理した腫瘍中のより低いＴｒｅｇ発生頻度は、腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比率の増加を生じ、ＬｍｄｄＡワクチン剤で免疫後に、より好ましい腫瘍微小環境を得ることができることを示唆している。しかし、標的抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＡＤＸＳ３１−１６４）を発現しているワクチンのみが、腫瘍増殖を低減でき、このことは、Ｔｒｅｇの減少は、腫瘍中の抗原特異的応答の存在下でのみ効果があることを示す。
【０２８１】
実施例１６：２種の異種抗原を同時に送達するデュアルプラスミドの作成
ａｃｔＡプロモーター領域およびＡｃｔＡのＮ末端の１〜２３３アミノ酸に対応するＤＮＡを、リステリアゲノムＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、プライマー：ＡｃｔＡ−Ｆ−５’−ａｔｃｃｃｇｇｇｔｇａａｇｃｔｔｇｇｇａａｇｃａｇｔｔｇｇｇ−３’（ＸｍａＩ）（配列番号７７）およびＡｃｔＡ−Ｒ−ａｔｔｃｔａｇａｔｔｔａｔｃａｃｇｔａｃｃｃａｔｔｔｃｃｃｃｇｃ（ＸｂａＩ）（配列番号７８）を使用して増幅した。クローニングに使用した制限酵素部位を下線で示す。ＸｍａＩ／ＸｂａＩセグメントをプラスミドｐＮＥＢ１９３中に挿入し、ｐＮＥＢ１９３−ＡｃｔＡを形成した。さらに、キメラＨｅｒ２の抗原２を、プライマー：Ｃｈ−Ｈｅｒ２−Ｆ−５’−ａｔｔｃｔａｇａａｃｃｃａｃｃｔｇｇａｃａｔｇｃｔｃｃｇｃｃａｃ−３’（ＸｂａＩ）（配列番号７９）およびＣｈ−Ｈｅｒ２−Ｒ−５’−ｇｔｃｇａｃａｃｔａｇｔｃｔａｇｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇａｔｇｇａｇｃｔｃａｇａｔｃｔｇｔｃｔａａｇａｇｇｃａｇｃｃａｔａｇｇｇｃ−３’（ＲＥ部位−ＳａｌＩ−ＳｐｅＩ−ＳａｃＩ−ＢｇｌＩＩ）（配列番号８０）を使用してＰＣＲ増幅した。Ｃｈ−Ｈｅｒ２のＸｂａＩおよびＳａｌＩ断片をプラスミドｐＮＥＢ１９３−ＡｃｔＡ中に挿入し、ｐＮＥＢ１９３−ＡｃｔＡ−Ｃｈ−Ｈｅｒ２プラスミドを作成した。ＨｉｓタグＤＮＡ配列をＳａｃＩとＳｐｅＩ制限酵素部位との間のＣｈ−Ｈｅｒ２逆方向プライマー配列中に含めている。ＸｍａＩ／ＳｐｅＩ制限ｐＡｄｖ１３４中にクローニングしてデュアルプラスミドを作成するために、プラスミドｐＮＥＢ１９３−ＡｃｔＡ−Ｃｈ−Ｈｅｒ２からｔＡｃｔＡ−Ｃｈ−Ｈｅｒ２−Ｈｉｓに対応するＸｍａＩ／ＳｐｅＩ断片を切り出した。
【０２８２】
その後、融合タンパク質として２種の組換え抗原を同時に送達するリステリアベースプラスミドが生成される。このプラスミドによって発現された２種の融合タンパク質は、ｔＬＬＯ−抗原１およびｔＡｃｔＡ−抗原２を含む。抗原１の発現および分泌は、ｈｌｙプロモーターおよびＬＬＯシグナル配列の制御下にあり、抗原１は、リステリオリシンＯ（短縮ＬＬＯまたはｔＬＬＯ）の非溶血性断片との融合体として発現される。抗原２の発現および分泌は、ａｃｔＡプロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列の制御下にあり、抗原２は、ＡｃｔＡ（短縮ＡｃｔＡまたはｔＡｃｔＡ）の１〜２３３アミノ酸との融合体として発現される。抗生物質マーカー不含プラスミドｐＡｄｖ１３４の作成は、前に記載したが、これはｔＬＬＯ−抗原１融合タンパク質の発現用遺伝子カセットを含む。ｐＡｄｖ１３４のｔＬＬＯ−抗原１の下流に存在するＳｐｅＩおよびＸｍａＩ制限酵素部位は、ａｃｔＡプロモーター−ｔＡｃｔＡ−抗原２ＤＮＡセグメント（図２０）のクローニング用に使われる。ＸｂａＩ、ＳａｃＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素部位をカセット中に追加し、ＸｂａＩ／ＳａｃＩまたはＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩ部位での抗原２挿入物のクローニングを促進する。ＨｉｓタグをコードするＤＮＡ配列をＳａｃＩ部位の後ろに追加し、ｔＡｃｔＡ−抗原２−ｈｉｓ融合タンパク質の検出を容易にする。デュアルプラスミドは、２種の異なる抗原を融合タンパク質として同時に発現および分泌できる。
【０２８３】
材料および方法（実施例１７〜２１）
ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ機能
腫瘍を、腫瘍モデルに応じてマウスの側腹部または生理的部位に移植した。７日後、マウスにワクチン接種したが、初回のワクチン接種日は、使われる腫瘍モデルに依存する。次いで、ワクチン投与１週後、マウスに追加免疫ワクチンを投与した。
【０２８４】
追加免疫の１週間後、または、高悪性度腫瘍モデルの場合には追加免疫の３〜４日後、マウスを屠殺し、腫瘍および脾臓を採取した。腫瘍採取の５日前に、レスポンダーＴ細胞として使用するために無腫瘍マウスにワクチン接種した。脾細胞に対し、標準的方法を使用する準備をした。
【０２８５】
簡単に説明すると、腫瘍および脾臓の両方の単一細胞懸濁液を調製した。脾臓を手作業で粉砕し、赤血球を溶解した。腫瘍を刻み、コラゲナーゼ／ＤＮアーゼと共にインキュベートした。または、腫瘍解離キットを備えたＧＥＮＴＬＥＭＡＣＳ（登録商標）ディソシエーターを使った。
【０２８６】
ＭｉｌｔｅｎｙｉキットおよびカラムまたはａｕｔｏＭＡＣＳ分離器を使用して、ＭＤＳＣまたはＴｒｅｇを腫瘍および脾臓から精製した。その後、細胞を計数した。
【０２８７】
単一細胞懸濁液を調製し、赤血球を溶解した。次に、レスポンダーＴ細胞をＣＦＳＥで標識した。
【０２８８】
２：１のレスポンダーＴ細胞のＭＤＳＣまたはＴｒｅｇに対する比率（全ての分裂周期ステージから）で、１×１０５Ｔ細胞／ウエルの密度下、９６ウエルプレートに細胞を一緒に播種した。その後、適切なペプチド（ＰＳＡＯＲＣＡ９）で、または非特異的にＰＭＡ／イオノマイシンでレスポンダーＴ細胞を刺激した。細胞を暗所、５％ＣＯ２下、３７℃で２日間、インキュベートした。２日後、細胞をＦＡＣＳ用に染色し、ＦＡＣＳ装置で分析した。
【０２８９】
Ｔ細胞応答の解析
ＥＬＩＳＡによるサイトカイン分析に対しては、脾細胞を採取し、培地、ＳＥＡまたはｃｏｎＡ（陽性対照として）の存在下、１．５百万細胞／ウエルを４８ウエルプレートに播種した。７２時間のインキュベーション後、上清を採取し、ＥＬＩＳＡ（ＢＤ）によりサイトカインレベルを分析した。抗原特異的ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔに対しては、脾細胞を採取し、培地、特異的ＣＴＬペプチド、無関係のペプチド、特異的ヘルパーペプチドまたはｃｏｎＡ（陽性対照として）の存在下、３００Ｋおよび１５０Ｋ細胞／ウエルをＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔプレートに播種した。２０時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳｐｏｔｓ（ＢＤ）を行い、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃ．Ｔ．Ｌ．）でスポットを計数した。スポットの数／百万脾細胞を図表化した。
【０２９０】
脾細胞をＣｏｕｌｔｅｒＣｏｕｎｔｅｒ、Ｚ１を使用して計数した。ｇａｇ−ＣＴＬ、ｇａｇヘルパー、培地、無関係の抗原、およびｃｏｎＡ（陽性対照）で再刺激後、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の発生頻度を標準的ＩＦＮ−γベースＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、測定した。
【０２９１】
簡単に説明すると、５ｍｇ／ｍｌのｍＡｂＲ４６−Ａ２および最適希釈で使われるポリクローナルウサギ抗体−ＩＦＮ−γ（Ｄｒ．ＰｈｉｌｌｉｐＳｃｏｔｔ、ペンシルバニア大学、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、より提供いただいた）を使用してＩＦＮ−γを検出した。マウスｒＩＦＮ−γ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使った検量線と比較することにより、ＩＦＮ−γのレベルを計算した。ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧＡｂ（ＩＦＮ−γ）を使用してプレートを発色させた。その後、プレートを４０５ｎｍで読み取った。アッセイの検出下限値は、３０ｐｇ／ｍｌであった。
【０２９２】
結果
実施例１７：リステリアワクチン処理後のサプレッサー細胞機能
０日目に、腫瘍をマウスに移植した。７日目に、マウスをＬｍｄｄａ−Ｅ７またはＬｍｄｄＡ−ＰＳＡでワクチン接種した。１４日目に、腫瘍を採取し、ワクチン接種および無処理分に対し浸潤ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇの数とパーセンテージを測定した。リステリア処理マウスの腫瘍中でＭＤＳＣおよびＴｒｅｇの両方のパーセンテージ、ならびにＭＤＳＣの絶対数の減少があり、一方、同じ効果は、脾臓または流入領域リンパ節（ＴＬＤＮ）中では観察されないことが明らかになった（図２１）。
【０２９３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡおよびＬｍ−ＬＬＯ−ＣＡ９、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｈｅｒ２（図２２〜３４）による腫瘍中のＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ（脾臓および腫瘍ＭＤＳＣならびに脾臓および腫瘍Ｔｒｅｇ）の存在に対する免疫の効果を明らかにするために、上記実験の腫瘍保持マウスから抽出した単離脾細胞および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を合わせ、ＣＤ３、およびＣＤ８の染色を行った。それぞれのカラムは、特定の細胞分裂ステージでのＴ細胞集団％であり、特定の処理群（無処理、ペプチド−ＣＡ９またはＰＳＡ−処理、非ＭＤＳＣ／Ｔｒｅｇ、および無ＭＤＳＣ＋ＰＭＡ／イオノマイシン）下で小群に分割される（図２２〜３４参照）。
【０２９４】
腫瘍保持マウス由来の血液中に存在するＴｒｅｇおよびＭＤＳＣの割合を分析した。Ｌｍワクチン接種後のマウスの血液中でＭＤＳＣおよびＴｒｅｇの両方の減少が認められる。
【０２９５】
実施例１８：脾臓ではなくＴＰＳＡ２３腫瘍由来ＭＤＳＣは、リステリアワクチン接種後、抑制が少ない
非特異的に活性化した無処理マウス細胞を含むＴＰＳＡ２３腫瘍、および特異的に活性化した細胞（ＰＳＡ、ＣＡ９、ＰＭＡ／イオノマイシン）から単離した単球性および顆粒球性ＭＤＳＣを使用して、サプレッサーアッセイを行った。結果は、Ｌｍワクチン接種群由来細胞から単離したＭＤＳＣが、無処理マウスの腫瘍由来ＭＤＳＣに比べて、活性化したＴ細胞の分裂を抑制する能力を弱めることを示した（図２２と２４のＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡおよびＬｍ−ＬＬＯ−処理群を参照されたい。図の右側パネルは、左側パネルのデータを統合した細胞分裂データを示す）。さらに、ＭＤＳＣが存在せず、細胞が刺激されず／活性化された場合の非処理マウス由来のＴレスポンダー細胞は、それらの親（休止）状態（図２２と２４）のままであり、一方、ＰＭＡまたはイオノマイシンで刺激されたＴ細胞は、複製することが観察された（図２２と２４）。さらに、Ｇｒ＋Ｌｙ６Ｇ＋およびＧｒｄｉｍＬｙ６Ｇ−ＭＤＳＣの両方で、リステリアワクチン剤で処理後の抑制作用が少ないことが認められた。活性化ＰＳＡ特異的Ｔ細胞および非特異的（ＰＭＡ／イオノマイシン刺激された）Ｔ細胞の両方の分裂を抑制するそれらの能力の低下についても同じことが言える。
【０２９６】
さらに、非特異的に活性化された無処理マウス細胞を含むＴＰＳＡ２３腫瘍から単離したＭＤＳＣを使用して行ったサプレッサーアッセイにより、Ｌｍワクチン接種群由来の腫瘍から単離されたＭＤＳＣは、無処理マウスの腫瘍由来ＭＤＳＣに比べて、活性化Ｔ細胞の分裂を抑制する能力を弱めることが示された（図２２と２４を参照）。
【０２９７】
さらに、図２２および１８に関連してすぐ上で考察された観察は、脾臓ＭＤＳＣを使った場合には認められなかった。後者では、無処理群、リステリア処理群（ＰＳＡ、ＣＡ９）、およびＰＭＡ／イオノマイシン刺激群（陽性対照）由来の脾細胞／Ｔ細胞は、全て同じレベルの複製を示した（図２３と２５）。従って、これらの結果から、腫瘍中のリステリア媒介サプレッサー細胞抑制は、抗原特異的および非特異的方式で機能したが、一方、リステリアは、抗原特異的方式でのみ抑制的であるであるため、脾臓顆粒球性ＭＤＳＣに対しては効果がないことがわかる。
【０２９８】
実施例１９：腫瘍制御性Ｔ細胞の抑制の低下
リステリア処理後、ＴＰＳＡ２３腫瘍から単離されたＴｒｅｇを使用してサプレッサーアッセイを行った。リステリアで処理後、腫瘍由来Ｔｒｅｇの抑制能力の低下が認められた（図２６）が、しかし、脾臓Ｔｒｅｇは、まだ抑制的であることが認められた（図２７）。
【０２９９】
対照として、従来のＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＭＤＳＣまたはＴｒｅｇの代わりに使われ、細胞分裂に対する効果がないことが明らかになった（図２８）。
【０３００】
実施例２０：脾臓ではなく４Ｔ１腫瘍由来のＭＤＳＣおよびＴＲＥＧは、リステリアワクチン接種後、抑制が低下する
４Ｔ１腫瘍を使用して上記と同じ実験を行い、同じ観察結果、すなわち、ＭＤＳＣはリステリアワクチン接種後、抑制力が低下すること（図２９と３１）、リステリアは、脾臓単球性ＭＤＳＣに対しては特異的効果がないこと（図３０と３２）、リステリアワクチン接種後、４Ｔ１腫瘍由来のＴｒｅｇの抑制能力が低下すること、（図３３）、およびリステリアは、脾臓Ｔｒｅｇの抑制能力に対し効果を示さないこと（図３４）が得られた。
【０３０１】
最後に、リステリアは、脾臓Ｔｒｅｇの抑制能力に対し効果を示さないことが観察された。
【０３０２】
実施例２１：顆粒球性および単球性ＭＤＳＣの抑制能力の変化はｔＬＬＯの過剰発現に起因する
ＬＬＯプラスミドは、ＴＡＡまたは無関係の抗原を含むリステリアワクチン剤と類似の結果を示す（図３５）。これは、顆粒球性ＭＤＳＣの抑制能力の変化はｔＬＬＯの過剰発現が原因であり、相手の融合抗原とは無関係であることを意味する。また、空のプラスミド構築物単独でも、ＭＤＳＣの抑制能力の変化につながるが、プラスミド上に短縮ＬＬＯを含むワクチン剤のいずれかと正確に同じレベルではない。平均３回の独立した実験は、空のプラスミドとｔＬＬＯを含む他のプラスミド（腫瘍抗原を含んでも、含まなくても）との間の抑制の差は、かなり大きいことを示す。抗原特異的または非特異的に刺激されたレスポンダーＴ細胞が使われたかどうかという事実に関係なく、ＭＤＳＣ抑制能力の減少は同等である。
【０３０３】
顆粒球性ＭＤＳＣと同様に、平均３回の独立した実験は、Ｌｍ不含プラスミドワクチンでワクチン接種後の腫瘍から生成された単球性ＭＤＳＣの抑制能力で観察された他のワクチン構築物に比べた差は、かなり大きいことを示す（図３６）．
【０３０４】
上記観察と同様に、脾臓から精製された顆粒球性ＭＤＳＣは、Ｌｍワクチン接種後、抗原特異的レスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を保持している（図３７）。しかし、非特異的刺激後、活性化Ｔ細胞（ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化）は、まだ、分裂できる。これらの結果のいずれも、ＬＬＯのみ、または空のプラスミドワクチン剤の使用で変化を受けず、Ｌｍベースワクチン剤が脾臓顆粒球性ＭＤＳＣに影響を与えないことを示している（図３７）。
【０３０５】
同様に、脾臓から精製された単球性ＭＤＳＣは、Ｌｍワクチン接種後に、抗原特異的レスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を保持する。しかし、非特異的活性化（ＰＭＡ／イオノマイシンにより刺激）後、Ｔ細胞は、まだ、分裂が可能である。これらの結果のいずれも、ＬＬＯのみ、または空のプラスミドワクチン剤の使用で変化を受けず、Ｌｍワクチン剤が、脾臓単球性ＭＤＳＣに影響を与えないことを示している（図３８）。
【０３０６】
Ｌｍ処理群のいずれかの腫瘍から精製されたＴｒｅｇは、レスポンダー細胞が抗原特異的であるか、または非特異的に活性化されたかに関係なく、わずかに減弱されたレスポンダーＴ細胞分裂抑制能力を有する。特に、非特異的に活性化されたレスポンダーＴ細胞に対しては、空のプラスミドを含むワクチンは、プラスミド上にＬＬＯを含む全てのワクチン剤と同じ結果を示すように見える。この実験を他の結果と平均化することにより、差異が大きくないことが示される（図３９）。
【０３０７】
脾臓から精製されたＴｒｅｇは、まだ、抗原特異的および非特異的に活性化されたレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制できる。脾臓Ｔｒｅｇの抑制能力に対するＬｍ処理の影響はない（図４０）。
【０３０８】
レスポンダー細胞が抗原特異的に、または非特異的に活性化されたかに関わらず、Ｔｃｏｎ細胞は、Ｔ細胞の分裂を抑制できない。この結果は、これらの細胞が非抑制的であるという事実と一致する。Ｌｍは、これらの細胞に対して影響を与えず、細胞がマウスの腫瘍から精製された場合も、または脾臓から精製された場合も、差異がなかった（図４１〜４２）。
【０３０９】
上記の実施例は本発明の実施形態をさらに完全に例示するために提示されている。しかし、これらの実施例は、本発明の広い範囲を限定するものとは決して解釈されるべきではない。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
2015511602000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月19日(2014.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍または癌に罹患している対象において浸潤Ｔリンパ球／サプレッサー細胞比を増大させ、前記対象の腫瘍または癌を治療するのに使用するための組成物であって、前記組成物は、組換え核酸を含む組換えリステリア株を含み、前記組換え核酸が、短縮ＬＬＯを含むポリペプチドをコードする第１の読み枠を含む、組成物。
【請求項２】
腫瘍または癌に罹患している対象の前記腫瘍または癌に対する免疫応答を抗原非依存性的に増強するために使用するための組成物であって、前記組成物は、組換え核酸を含む組換えリステリア株を含み、前記組換え核酸が、増強させる短縮ＬＬＯを含むポリペプチドをコードした第１の読み枠を含み、前記リステリアが前記対象の浸潤Ｔリンパ球／サプレッサー細胞比を増大させる、組成物。
【請求項３】
前記浸潤Ｔリンパ球が、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記サプレッサー細胞が制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）または骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが異種抗原またはその機能性断片をさらに含み、任意選択で、前記異種抗原またはその機能性断片が腫瘍細胞によって発現されるか、またはこれに由来するこれに由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記核酸が、代謝酵素をコードする追加の読み枠をさらに含み、前記代謝酵素が前記組換えリステリア株の染色体を欠いている内在性遺伝子を補完する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項７】
前記追加の読み枠によりコードされた前記代謝酵素が、アラニンラセマーゼ酵素またはＤアミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組換えリステリアが、ゲノムＡｃｔＡ遺伝子、ＰｌｃＡ遺伝子、ＰｒｆＡ遺伝子またはＰｌｃＢ遺伝子の変異または欠失を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項９】
前記核酸が前記リステリアゲノムに組み込まれるか、または抗生物質による選択のない場合に、前記組換えリステリアワクチン株中に安定に維持されるプラスミド中に存在する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗原が、局所組織環境に関連該環境がさらに癌の発生もしくは転移に関連するか、または腫瘍回避もしくは癌に対する抵抗性に関連するか、または血管新生抗原である、請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
対象の前記浸潤Ｔリンパ球／サプレッサー細胞比を増大させることが、前記腫瘍または癌のサプレッサー細胞の割合を減少させる、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１２】
前記腫瘍または癌が特異的部位に局在化しているか、または全身性である、請求項２または１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記腫瘍もしくは癌が、前立腺腫瘍もしくは癌、頸部腫瘍もしくは癌、乳房腫瘍もしくは癌、Ｈｅｒ２含有腫瘍もしくは癌、胃腫瘍もしくは癌、膵臓腫瘍もしくは癌、または頭頸部腫瘍もしくは癌である、請求項２または１０に記載の組成物。
【請求項１４】
腫瘍部位において前記サプレッサー細胞の数を減少させることが、前記腫瘍または癌に罹患している前記対象の抗腫瘍免疫応答を増強する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記対象がヒトである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記サプレッサー細胞が対象の抗腫瘍Ｔ細胞応答を抑制する、請求項４に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
次の図は、本明細書の一部を構成し、本開示の特定の態様をさらに示すために包含されており、本明細書で提示される具体的実施形態の詳細な説明と合わせて、１つまたは複数のこれらの図を参照することにより、本開示の発明がさらに良く理解できる。特許または特許出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含む。このカラー図面を含む特許または特許出願公報のコピーは、要求があれば、有料で米国特許商標局より提供される。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
疾患に罹患している対象または対象の疾患部位において、浸潤Ｔリンパ球／サプレッサー細胞比率を増大させるための方法であって、上記対象に弱毒生リステリアワクチン株を含む組成物を投与するステップを含む方法。
（項目２）
上記浸潤Ｔリンパ球がＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記サプレッサー細胞が制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）または骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）である、項目１〜２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４）
上記リステリアが、ポリペプチドまたはそれらの機能性断片をそれぞれコードする読み枠を含む組換え核酸配列を含み、上記ポリペプチドまたはそれらの機能性断片が内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドである、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
上記リステリアが、第１のポリペプチドおよび少なくとも第２のポリペプチドをそれぞれコードする第１の読み枠および少なくとも第２の読み枠を含む組換え核酸配列を含み、上記第１のポリペプチドおよび上記第２のポリペプチドが、内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合した異種抗原またはそれらの機能性断片をそれぞれ含む、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
上記核酸が第３のポリペプチドをコードする第３の読み枠をさらに含み、上記第３のポリペプチドが、内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合した異種抗原またはそれらの機能性断片を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
上記第１の異種抗原、上記第２の異種抗原、または上記第３の異種抗原またはそれらの機能性断片が、感染性病原体、または腫瘍細胞によって発現されるか、またはこれに由来する、項目１〜３または５〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
上記核酸分子が、代謝酵素をコードする追加の読み枠をさらに含み、上記代謝酵素が、上記組換えリステリア株の染色体が欠失している内在性遺伝子を補完する、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
上記追加の読み枠によりコードされる上記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記リステリアが、第２の代謝酵素をコードする追加の読み枠をさらに含む、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
上記代謝酵素がＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記組換えリステリアが、ゲノムＡｃｔＡ遺伝子、ＰｌｃＡ遺伝子、ＰｒｆＡ遺伝子またはＰｌｃＢ遺伝子の変異または欠失を含む、項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
上記核酸分子が上記リステリアゲノム中に組み込まれる、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
上記核酸分子が、抗生物質による選択のない場合に、上記組換えリステリアワクチン株中で安定に維持されるプラスミド中に存在する、項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
上記ＰＥＳＴ含有ポリペプチドが、Ｎ末端短縮ＬＬＯポリペプチド、Ｎ末端ＡｃｔＡポリペプチド、もしくはＰＥＳＴペプチド、またはそれらの機能性断片である、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
上記第１抗原、上記第２抗原または上記第３抗原が、局所組織環境に関連し（これはさらに癌の発生または転移に関連する）、腫瘍回避または癌に対する抵抗性に関連し、血管新生抗原であり、または宿主のアレルギー性、炎症性反応を引き起こすアレルゲンである、項目１〜３または５〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
上記疾患が特異的疾患部位に限局しているか、または上記疾患が全身性である、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
上記疾患が、感染症、呼吸疾患もしくは炎症性疾患、または癌もしくは腫瘍である、項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
上記呼吸または炎症性疾患が喘息である、項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
腫瘍部位の上記サプレッサー細胞の数を減少させることが、上記腫瘍を有する上記対象の抗腫瘍免疫応答を増強する、項目１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
上記対象がヒトである、項目１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
対象の疾患のサプレッサー細胞の割合を減少させるための方法であって、弱毒生リステリアワクチン株を上記対象に投与するステップを含む方法。
（項目２３）
上記リステリアが、ポリペプチドまたはそれらの機能性断片をそれぞれコードする読み枠を含む組換え核酸配列を含み、上記ポリペプチドまたはそれらの機能性断片が内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
上記リステリアが、第１のポリペプチドおよび少なくとも第２のポリペプチドをそれぞれコードする第１の読み枠および少なくとも第２の読み枠を含む組換え核酸配列を含み、上記第１のポリペプチドおよび上記第２のポリペプチドが内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合した異種抗原またはそれらの機能性断片をそれぞれ含む、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
上記核酸が、第３のポリペプチドをコードする第３の読み枠をさらに含み、上記第３のポリペプチドが内在性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに縮合した異種抗原またはそれらの機能性断片を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
上記核酸分子が、代謝酵素をコードする追加の読み枠をさらに含み、上記代謝酵素が、上記組換えリステリア株の染色体が欠失している内在性遺伝子を補完する、項目２２〜２５に記載の方法。
（項目２７）
上記追加の読み枠によりコードされる上記代謝酵素が、アラニンラセマーゼ酵素である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記リステリアが、第２の代謝酵素をコードする追加の読み枠をさらに含む、項目２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
上記代謝酵素がＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
上記組換えリステリアが、ゲノムＡｃｔＡ遺伝子、ＰｌｃＡ遺伝子、ＰｒｆＡ遺伝子またはＰｌｃＢ遺伝子の変異または欠失を含む、項目２２〜２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
上記核酸分子が、上記リステリアゲノムに組み込まれる、項目２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
上記核酸分子が、抗生物質による選択がない場合には、上記組換えリステリアワクチン株中で安定に維持されるプラスミド中に存在する、項目２２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
上記対象がヒトである、項目２２〜３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
上記ＰＥＳＴ含有ポリペプチドが、Ｎ末端短縮ＬＬＯポリペプチド、Ｎ末端ＡｃｔＡポリペプチド、もしくはＰＥＳＴペプチド、またはそれらの機能性断片である、項目２２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
上記第１、上記第２または上記第３の異種抗原またはそれらの機能性断片が、感染性病原体、または腫瘍細胞によって発現されるか、またはこれに由来する、項目２２または２４〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
上記第１、上記第２または上記第３の抗原が、局所組織環境に関連し、腫瘍回避または癌に対する抵抗性に関連し（これはさらに癌の発生または転移に関連する）、血管新生抗原であり、または宿主のアレルギー性、炎症性反応を引き起こすアレルゲンである、項目２２または２４〜３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
上記疾患が特異的疾患部位に限局しているか、または上記疾患が全身性である、項目２２〜３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
上記疾患が、感染症、呼吸疾患もしくは炎症性疾患、または癌もしくは腫瘍である、項目２２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
上記呼吸または炎症性疾患が喘息である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
腫瘍部位の上記サプレッサー細胞の数を減少させることが、上記腫瘍を有する上記対象の抗腫瘍免疫応答を増強する、項目２２〜３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
上記サプレッサー細胞が制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である、項目２２〜４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
上記サプレッサー細胞が骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）である、項目２２〜４１のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
上記サプレッサー細胞が対象の抗腫瘍Ｔ細胞応答を抑制する、項目２２〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2015511602.tif 000105
2015511602.tif 000106
2015511602.tif 000107