(57)【要約】カンピロバクター・ジェジュニは、急性下痢から神経疾患に及ぶヒトにおける細菌性食品媒介性疾患の主な原因である。Ｃ．ジェジュニに特異的な単離又は精製された抗体又はその断片が記載されている。抗体又はその断片は、鞭毛タンパク質と結合し、Ｃ．ジェジュニの運動性を低下させる。抗体又はその断片は、Ｃ．ジェジュニ鞭毛タンパク質を用いて免疫処置したラクダ科動物の重鎖ＩｇＧ可変ドメイン断片（ＶＨＨ）に由来している。抗体又はその断片の多価形態並びにファージ形式が記載されている。動物又は動物環境におけるＣ．ジェジュニの存在を低減する方法、Ｃ．ジェジュニ感染を治療するための方法及び製剤並びにＣ．ジェジュニを検出する方法も記載される。【選択図】  なし
2015535224.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ．ジェジュニ鞭毛と特異的に結合する単離又は精製された抗体又はその断片であって、
配列ＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡ（配列番号１）又はＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧ（配列番号４）を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１と、
配列ＩＳＷＳＲＤＲＱ（配列番号２）又はＩＧＳＤＧＴＶ（配列番号５）を含むＣＤＲ２と、
配列ＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹ（配列番号３）又はＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳ（配列番号６）を含むＣＤＲ３と
を含む、抗体又はその断片。
【請求項２】
配列ＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡ（配列番号１）のＣＤＲ１と、配列ＩＳＷＳＲＤＲＱ  （配列番号２）のＣＤＲ２と、配列ＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹ（配列番号３）のＣＤＲ３とを含む、請求項１に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項３】
配列
ＱＶＸ１ＬＸ２ＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＸ３ＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＸ４ＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号７）
［式中、Ｘ１＝Ｋ又はＱであり、Ｘ２＝Ｅ又はＶであり、Ｘ３＝Ａ又はＣであり、Ｘ４＝Ｉ又はＣである］又はそれと実質的に同一の配列を含む、請求項２に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項４】
配列
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＡＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＩＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号８）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＡＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＩＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９）；
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＣＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＣＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０）；
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＣＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＣＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１１）；
又はそれらと実質的に同一の配列を含む、請求項２又は３に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項５】
配列ＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧ（配列番号４）のＣＤＲ１と、配列ＩＧＳＤＧＴＶ（配列番号５）のＣＤＲ２と、配列ＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳ（配列番号６）のＣＤＲ３とを含む、請求項１に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項６】
配列
ＱＶＸ１ＬＸ２ＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＸ３ＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＸ４ＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１２）、
［式中、Ｘ１＝Ｋ又はＱであり、Ｘ２＝Ｅ又はＶであり、Ｘ３＝Ａ又はＣであり、Ｘ４＝Ｉ又はＣである］又はそれと実質的に同一の配列を含む、請求項５に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項７】
配列
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＡＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１３）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＡＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１４）；
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＣＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＣＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１５）；
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＣＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＣＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１６）；
又はそれらと実質的に同一の配列を含む、請求項５又は６に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項８】
フラジェリンと特異的に結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項９】
フラジェリンのＦｌａ  Ａ成分と特異的に結合する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項１０】
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項１１】
ｓｄＡｂが、ラクダ科動物起源のものである、請求項１０に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項１２】
多価提示である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項１３】
ベロ毒素Ｂサブユニットとの融合タンパク質として発現される、請求項１２に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項１４】
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＡＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＩＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号１９）；
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＡＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＩＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号２０）；
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＣＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＣＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号３４）；
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＣＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＣＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号３５）；
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＡＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号２１）；
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＡＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号２２）；
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＣＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＣＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号３６）；
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＣＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＣＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号１６）；
又はそれらと実質的に同一の配列からなる群から選択される１種又は複数の配列を含む、請求項１３に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片をコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１７】
検出可能な標識と連結している、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項１８】
動物又は動物環境におけるＣ．ジェジュニの存在を低減する方法であって、動物に、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片を投与するステップを含む、方法。
【請求項１９】
単離又は精製された抗体又はその断片が経口投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
単離又は精製された抗体又はその断片が、酵母発現系中に含まれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
動物に、抗生物質、バクテリオシン又はＣ．ジェジュニに対して有効であるその他の植物若しくは動物由来化合物を投与するステップをさらに含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
プロバイオティック系において、任意選択で同時発現されるか、又は同時に含有される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片と一緒に、動物に競合微生物を投与するステップをさらに含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
動物環境へのＣ．ジェジュニの導入を低減する方法であって、動物環境に新入動物を入れる前に、新入動物に、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片を投与するステップを含む、方法。
【請求項２４】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片及び賦形剤を含む、Ｃ．ジェジュニワクチン。
【請求項２５】
経口送達用である、請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２６】
Ｃ．ジェジュニに感染した対象を治療する方法であって、対象に、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片を投与するステップを含む、方法。
【請求項２７】
対象にＣ．ジェジュニに対して有効な抗生物質を投与するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
対象が、ニワトリ、ウシ及びヒツジからなる群から選択される家畜動物である、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
対象がヒトである、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片及び賦形剤を含む、Ｃ．ジェジュニ感染の治療に使用するための製剤。
【請求項３１】
それを必要とする対象においてＣ．ジェジュニ感染を治療するための医薬を調製するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片の使用。
【請求項３２】
それを必要とする対象においてＣ．ジェジュニ感染を治療するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片の使用。
【請求項３３】
サンプル中のＣ．ジェジュニを検出する方法であって、サンプルを、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片と接触させるステップ及び結合している単離又は精製された抗体又はその断片の存在を検出するステップを含む、方法。
【請求項３４】
サンプルが、体液又は糞便物質を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
サンプルが、食品又は食品から得た表面スワブを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片及びＣ．ジェジュニの検出に使用するための説明書を含む、請求項３３に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項３７】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片及び適した担体を含む、サンプル中のＣ．ジェジュニを検出するための検出試薬。
【請求項３８】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片を含む、単離された抗Ｃ．ジェジュニ抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本開示内容は、一般には、抗体、その断片及びこのようなタンパク質の誘導体及び適用に関する。記載される抗体及び断片は、Ｃ．ジェジュニ（ｊｅｊｕｎｉ）の鞭毛タンパク質に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
[0002]カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属は、多数の形態学的に多様な群（らせん状の、湾曲した又は桿状の形状の）細菌を包含し、３５種を超える種及び亜種が報告されており、そのうち２０種が、ヒトにとって病原性であり腸及び腸外の疾病を引き起こすか、又はヒトにおいて多様な数の部位にコロニーを形成する（Ｍａｎ、２０１１年）。
【０００３】
[0003]カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、グラム陰性菌のらせん状細菌は、世界中で、現在、最も流行している食品媒介病原菌の１種であり、ヒトにおける細菌性胃腸炎の主な原因である。北アメリカでは、カンピロバクター症は、組み合わせた、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって引き起こされた疾病の報告症例を数で上回る（Ｓｔｅｒｎ  ＆  Ｒｏｂａｃｈ、２００３年；Ｎｅｗｅｌｌら、２００３年；Ｂｌａｓｅｒ、１９９７年）。カンピロバクター感染は、比較的軽度の下痢性疾病にもかかわらず、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、ポリオの根絶以来の麻痺の主な原因；非麻痺性変異型のミラーフィッシャー症候群（Ｈｕｍｐｈｅｒｙら２００７年；Ｈａｒｉｈａｒａｎら２００４；Ｂｌａｓｅｒら１９８６年）；反応性関節炎（ＲｅＡ）；及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（Ｒａｕｔｅｌｉｎら２０００年；Ｇｅｌｌｙｎｃｋら２００８年）を含めた重症の長期の合併症を伴ってきた。
【０００４】
[0004]ヒトカンピロバクター症の症例の５０〜８０％が、ニワトリの消費に起因し得ると推測され、従って、ブロイラーの食肉は、病原体をヒトに感染させる第一媒介物と考えられる（ＥＦＳＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１１年；Ｈｅｒｍａｎｓら２０１１年）。家禽、特に、ニワトリにおけるカンピロバクターレベルの制御及び低下は、家禽製品の安全性を改善し、カンピロバクター誘発性胃腸炎の発生率を低減し得る。従って、ヒトにおける長期の合併症が低減され、その結果、世界中で入院及びその他の関連費用が何百億ドルも節約され得る（ＥＦＳＡ  ｒｅｐｏｒｔ、２０１１年；Ｎｙａｃｈｕｂａ、２０１０年；Ｂｕｚｂｙら１９９７年）。
【０００５】
[0005]Ｃ．ジェジュニ及びその他のあまり頻繁ではない株（例えば、Ｃ．コリ（ｃｏｌｉ）及びＣ．ラリ（ｌａｒｉ））に対する現在の介入戦略は、家禽繁殖（一次介入）の間、食肉製造の間及び／又は食肉加工の間を含めた製造の種々の段階で適用される。最も受け入れられている戦略は、衛生バリア及びフライスクリーンを取り付けることによってカンピロバクター種が群れに侵入することを防ぐこと、高品質水の使用、食肉処理齢の低下及び間引きの中止である（Ｎｅｗｅｌｌ  ＆  Ｗａｇｅｎａａｒ、２０００年；Ｗａｇｅｎａａｒら、２００６年、２００８年；Ｌｉｎ  ２００９年；ＥＦＳＡ  ｒｅｐｏｒｔ、２０１１年）。しかし、Ｃ．ジェジュニによる感染に対するニワトリの感受性及び環境におけるその偏在性が、これらのバイオセキュリティーアプローチの成功に負に影響を及ぼしており、細菌感染が制御又は排除され得る代替アプローチの必要性が強調される。飼料添加物又は獣医用医薬品としてのニワトリへのバクテリオファージの投与について、０．５〜５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇの盲腸カンピロバクターレベルの低下が報告されている（Ｅｌ−Ｓｈｉｂｉｎｙら、２００９年；Ｃａｒｒｉｌｌｏら、２００５年；Ｗａｇｅｎａａｒら、２００５年）。
【０００６】
[0006]より効率的に、家禽の飲用水へ添加されたバクテリオシンを用いる処置は、症例の９０％において病原体を完全に排除するか、又は１０６倍以上そのレベルを低下させた（Ｓｖｅｔｏｃｈら、２０１０年）。プロバイオティクス（Ｓａｎｔｉｎｉら、２０１０年；Ｗｉｌｌｉｓら、２００８年）及び植物生物活性化合物（Ｃａｓｔｉｌｌｏら、２０１１年；Ｋｕｒｅｃｋｃｉら、２０１２年）などのその他の生物学的試薬も、食物又は水添加物として使用されており、ニワトリ糞便中のカンピロバクター含量を大幅に低減するとわかった。Ｃ．ジェジュニに対する乳酸菌（ＬＡＢ）などのプロバイオティック株の殺菌効果は、有機酸、バクテリオシン又はバクテリオシン様物質の製造に起因していた（Ｓａｎｔｉｎｉら、２０１０年；Ｍｅｓｓａｏｕｄｉら、２０１１年）。これらのアプローチの多くは、有効性、安全性、毒性、製造及び精製のスケールアップ並びにカンピロバクター耐性の発生などの問題のために、当技術分野では広く採用されていない。
【０００７】
[0007]フルオロキノロン及びマクロライドなどの抗生物質は、家禽及びヒトの両方においてカンピロバクター種の治療のために承認されている。しかし、ヒト及び動物の健康におけるその長期の使用は、世界中の多くの国において耐性カンピロバクター株の急速な増大につながり、動物飼料ストックでは、その使用は、もはや推奨されない（Ｓｍｉｔｈら、２０１０年；Ｌｕａｎｇｔｏｎｇｋｕｍら、２００９年；Ａｌｆｒｅｄｓｏｎら、２００７年；Ｓｉｌｖａら、２０１１年）。中鎖脂肪酸（例えば、カプリル酸）及びモノアシルグリセロールは、抗生物質の代替物であり、ニワトリにおいてカンピロバクター含量を制御又は排除するための食物及び水添加物として使用されてきた（ｄｅ  ｌｏｓ  Ｓａｎｔｏｓら、２００９年；Ｈｅｒｍａｎｓら、２０１０年、Ｍｏｌａｔｏｖａら、２０１０年）。それにもかかわらず、化合物を用いる処置の際のカンピロバクターの数及び有病率に関するデータは、一貫性がなく、その有効性に関する明確な結論を下すことができない（Ｔｈｅ  ＥＦＳＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１１年）。家禽において感染の供給源を低減若しくは排除するための、又はヒト感染を治療するための、バージニアマイシン、エリスロマイシン、ネオマイシン又はシプロフロキサシンの使用を含めた抗生物質治療は、有用なツールである。しかし、動物製造における抗生物質治療の広範な使用に関する増大する問題は、耐性カンピロバクター株の発生及びニワトリ由来の抗生物質耐性カンピロバクターが、ヒトにおいて抗生物質耐性感染を引き起こし得るという事実である。
【０００８】
[0008]多数の感染性疾患に対するワクチン接種は、商業的に飼育されたニワトリにおいて広く使用されている（Ｃｌａｒｋら、２０１２年）。カンピロバクター種コロニー形成に対する保護のための家禽のワクチン接種も広く研究されてきた。しかし、短期間（３〜４週間）にわたる迅速で強力な免疫応答を誘発できる交差反応性ワクチン標的の同定は、新規アジュバントの必要性と相まって、克服されるべき課題の一部である（ｄｅ  Ｚｏｅｔｅら、２００７年；Ｌａｙｔｏｎら、２０１１年；Ｚｅｎｇら、２０１０年；Ｃｌａｒｋら、２０１２年）。結果的に、Ｃ．ジェジュニに対する市販のワクチンは、現在入手可能ではない。
【０００９】
[0009]Ｎｕｒｍｉ及びＲａｎｔａｌａ（１９７３）によって最初に記載された競合排除（ＣＥ）アプローチは、カンピロバクターがその特定の微小環境、とりわけ、盲腸を占有することを防ぐための、健常なニワトリの腸から得られた定義された又は未定義の微生物を使用する保護的腸内フローラの確立に基づいている（Ｚｈａｎｇら、２００７年；Ｃｈｅｎ、２００１年；Ｓｔｅｒｎ、２００１年）。ＣＥアプローチを適用することの困難さとして、ＣＥ製品における複合種の同定における標準化がないこと並びにカンピロバクター感染の低減における、限定された、可変の成功率が挙げられる（Ｌｉｎ、２００９年；ＥＦＳＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１１年）。
【００１０】
[0010]最後に、カンピロバクター種に対するニワトリの感受性又は耐性は、宿主の遺伝子系に応じて変わり、非免疫及び免疫機構の両方を含むことが示唆されている（Ｋａｉｓｅｒら、２００９年）。従って、選択的育種は、遺伝的に受け継がれる耐性ニワトリ系統を拡大するための選択方法であろう。この関連で、４種の近交系ニワトリ系統間でカンピロバクター種コロニー形成における１０〜１００倍の相違が観察され、受け継がれる耐性パターンは、単一の常染色体優性遺伝子座と一致した（Ｂｏｙｄら、２００５年）。しかし、食肉又は卵製造及び品質を保ちながらの耐性ニワトリ系統の確立は、時間のかかるプロセスであり、予測できない結果を伴う。今日までに、上記の実験的介入のうち、モデル化されたものはなく、現場レベルで適用されたものはなく、従って、商業的に成功していない。
【００１１】
[0011]抗体は、最初は、１８９０年代の初期にＢｅｈｒｉｎｇ及びＫｉｔａｓａｔｏによって有効な抗菌試薬として認識され（Ｂｅｈｒｉｎｇ  ＆  Ｋｉｔａｓａｔｏ、１８９０年；Ｃａｓａｄｅｖａｌｌら、２００４年）、それから、血清治療が、多数の感染性疾患と闘うための有効な戦略となった。血清又は腸分泌物中の特異的抗体の存在は、Ｃ．ジェジュニによるコロニー形成に対するウサギ（Ｂｕｒｒら、１９８８年；Ｐａｖｌｏｖｓｋｉｓら、１９９１年；Ｒｏｌｌｗａｇｅｎら、１９９３年）及びマウス（Ｄｏｌｂｙ  ＆  Ｎｅｗｅｌｌ  １９８６年；Ｒｏｌｌｗａｇｅｎら、１９９３年）の耐性と関連していた。若いニワトリ（２〜３週齢未満）では、カンピロバクター種に対する移行抗体の存在が、コロニー形成の開始を遅延し、群れにおけるＣ．ジェジュニの水平伝播の速度を低下させ（Ｓａｈｉｎら、２００３年）、これは、抗カンピロバクター種抗体を使用する受動免疫療法が、ニワトリにおいて細菌コロニー形成を干渉するための魅力的なアプローチであり得ることを示唆する。実際、抗鞭毛モノクローナル抗体を用いる受動免疫は、マウスにおいてＣ．ジェジュニコロニー形成を低減すると既に示されている（Ｕｅｋｉら、１９８７年）。同様に、過免疫抗Ｃ．ジェジュニウサギ血清又は抗Ｃ．ジェジュニ抗体の使用は、ニワトリにおいてＣ．ジェジュニコロニー形成を減少させるのに有効であるようである（Ｓｔｅｒｎら、１９９０年）。これと一致して、他の人が、血液中に高力価のカンピロバクター種特異的ＩｇＧ循環を有する家禽食肉処理場作業員は、稀にしか、カンピロバクター症にかからないことを示した（Ｃａｗｔｈｒａｗら、２０００年）。すべてのこれらの知見にもかかわらず、カンピロバクター含量を低減するための薬剤としての抗体は、高い製造費用、ＧＩ管プロテアーゼに対する従来の抗体の感受性、有効なＧＩ管送達系がないこと及びカンピロバクターの種々の株を標的とするために複数の抗体調製物を必要とするカンピロバクター種間の高い抗原性変異のために市場の注目を大きく浴びることはなかった。
【００１２】
[0012]米国特許第８，１７３，１３０号（Ｓａｌｚｍａｎら）、米国特許出願公開第２００９／０２０８５０６号（Ｒａｃｈａｍｉｍら）及び米国特許出願公開第２０１０／０２３９５８３号（Ｍｕｒｔｈｙら）には、細菌感染を阻止し、並びに炎症性腸疾患を含めた疾患を治療又は予防するために使用され得る、カンピロバクターを含めた種々のグラム陰性菌由来のフラジェリンに対するモノクローナル抗体が記載されている。これらの抗体は、エンジニアリングの困難性、製造の困難性及び費用並びにｉｎ  ｖｉｖｏで使用された場合の遅い組織浸透を含めたこのような分子の共通の不利点を共有する。さらに、ｍＡｂ及びその断片（例えば、ｓｃＦｖ及びＦａｂ）は、ＧＩ管プロテアーゼに対して極めて感受性であり、これは、経口投与が望まれる場合に不都合である。
【００１３】
[0013]ウサギ及びマウスの血清又は腸分泌物中の特異的抗体の存在は、Ｃ．ジェジュニによる胃腸管コロニー形成に対する耐性と関連している。ニワトリにおける研究もまた、能動免疫は、Ｃ．ジェジュニによる腸管感染のレベルを低減し得ると示唆するが、ニワトリの早期食肉処理に先立って十分な免疫応答を得るための時間枠並びに費用及び実現可能性が、このアプローチを実現困難にしている。
【００１４】
[0014]供給源、特に、家禽飼育場内でのカンピロバクターの管理は、病原体に対するヒト曝露の危険を低減し、食品の安全性及び公衆衛生に対して相当な影響を与えるであろう。より安全な食品を提供することで、供給業者が費用のかかる操業停止及び製品の回収を避けることを可能にすることは有利である。環境曝露を低減すること、バイオセキュリティーを改善すること、競合排除、ワクチン接種、宿主遺伝学的特徴の選択並びにバクテリオファージ治療及びバクテリオシン治療を含めた抗菌物質又は抗生物質戦略が有益であるが、食品供給においてＣ．ジェジュニを低減するための改善された戦略が依然として必要である。カンピロバクター・ジェジュニによって示される課題に対する革新的なアプローチは、公衆にとって有益となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
[0015]従って、食品供給においてＣ．ジェジュニを低減する費用効率の高い方法に対して、当技術分野で必要性が残っており、また、高親和性を有するが、ＩｇＧ及びその変異体の欠点を克服できる抗体に対して、当技術分野で必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
[0016]本開示内容は、一般には、抗体、その断片及びこのようなタンパク質の誘導体及び適用に関する。記載される抗体及び断片は、Ｃ．ジェジュニの鞭毛タンパク質に向けられる。
【００１７】
[0017]単離又は精製された抗体又はその断片は、ペンタボディなどの多量体形態を含めたその改変体と共に本明細書において記載されるとおりである。Ｃ．ジェジュニ鞭毛に対する抗体又はその断片の親和性特異性が示されている。抗体は、例えば、経口投与された場合のニワトリにおけるＣ．ジェジュニコロニー形成レベルの低下において有効性を示す。開示される抗体は、細菌鞭毛に対して特異的結合を示す。本明細書に記載される抗体及び多量体はＣ．ジェジュニの運動性を低減する。さらに、有利な生物物理学的特性を有する変異体が記載されている。特異的パニングの試み及びジスルフィド結合エンジニアリング戦略によって、良好な熱的安定性及びプロテアーゼ耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）又は耐性を示す抗体が記載されている。優れた熱的安定性及び主要な胃腸（ＧＩ）プロテアーゼに対する耐性を有する高安定化抗体又はその断片も記載されている。
【００１８】
[0018]従って、本開示内容は、
配列ＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡ（配列番号１）又はＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧ（配列番号４）を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１と；
配列ＩＳＷＳＲＤＲＱ（配列番号２）又はＩＧＳＤＧＴＶ（配列番号５）を含むＣＤＲ２と；
配列ＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹ（配列番号３）又はＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳ（配列番号６）を含むＣＤＲ３と
を含む、Ｃ．ジェジュニ鞭毛と特異的に結合する、単離又は精製された抗体又はその断片を提供する。
【００１９】
[0019]上記で記載されるような単離又は精製された抗体又はその断片は、配列ＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡ（配列番号１）のＣＤＲ１と、配列ＩＳＷＳＲＤＲＱ（配列番号２）のＣＤＲ２と、配列ＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹ（配列番号３）のＣＤＲ３とを含み得る。より詳しくは、単離又は精製された抗体又はその断片は、配列：
ＱＶＸ１ＬＸ２ＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＸ３ＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＸ４ＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号７）
［式中、Ｘ１＝Ｋ又はＱであり；Ｘ２＝Ｅ又はＶであり；Ｘ３＝Ａ又はＣであり；Ｘ４＝Ｉ又はＣである］又はそれと実質的に同一の配列を含み得る。特定の限定されない例では、単離又は精製された抗体又はその断片は、配列：
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＡＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＩＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号８）；
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＡＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＩＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９）；
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＣＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＣＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０）；
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＣＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＣＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１１）；
又はそれらと実質的に同一の配列
を含み得る。
【００２０】
[0020]或いは、単離又は精製された抗体又はその断片は、配列ＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧ（配列番号４）のＣＤＲ１と、配列ＩＧＳＤＧＴＶ（配列番号５）のＣＤＲ２と、配列ＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳ（配列番号６）のＣＤＲ３とを含み得る。より詳しくは、単離又は精製された抗体又はその断片は、配列：
ＱＶＸ１ＬＸ２ＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＸ３ＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＸ４ＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１２）
［式中、Ｘ１＝Ｋ又はＱであり；Ｘ２＝Ｅ又はＶであり；Ｘ３＝Ａ又はＣであり；Ｘ４＝Ｉ又はＣである］又はそれと実質的に同一の配列を含み得る。特定の限定されない例では、単離又は精製された抗体又はその断片は、配列：
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＡＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１３）；
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＡＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１４）；
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＣＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＣＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１５）；
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＣＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＣＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１６）；
又はそれらと実質的に同一の配列を含み得る。
【００２１】
[0021]本明細書において記載されるような単離又は精製された抗体又はその断片は、フラジェリンと特異的に結合し得る；より詳しくは、単離又は精製された抗体又はその断片は、フラジェリンのＦｌａＡ成分と特異的に結合し得る。
【００２２】
[0022]上記で記載されるような単離又は精製された抗体又はその断片は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）であり得る。ｓｄＡｂは、ラクダ科動物起源のものであり得る。
【００２３】
[0023]単離又は精製された抗体又はその断片は、多価提示で提供され得る。例えば、単離又は精製された抗体又はその断片は、ベロ毒素Ｂサブユニットとの融合タンパク質として発現され得る。融合タンパク質は、ペンタボディにアセンブルし得る。特定の限定されない例では、多量体は、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＡＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＩＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号１９）；
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＡＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＩＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号２０）；
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＣＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＣＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号３４）；
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＣＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＣＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号３５）；
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＡＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号２１）；
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＡＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号２２）；
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＣＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＣＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号３６）；
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＣＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＣＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号１６）；
又はそれらと実質的に同一の配列
から選択される１種又は複数の融合タンパク質を含み得る。
【００２４】
[0024]本開示内容はまた、本明細書において記載される単離又は精製された抗体又はその断片をコードする核酸配列を提供する。ここで記載された核酸分子を含むベクターも提供される。
【００２５】
[0025]本開示内容の単離又は精製された抗体又はその断片は、検出可能な標識と連結され得る。
【００２６】
[0026]本開示内容は、動物又は動物環境におけるＣ．ジェジュニの存在を低減する方法をさらに提供する。本方法は、動物に、本開示内容の単離又は精製された抗体又はその断片を投与するステップを含む。単離又は精製された抗体又はその断片は、経口投与され得る。単離又は精製された抗体又はその断片は、酵母発現系に含まれ得る。記載されるような方法では、抗生物質、バクテリオシン又はＣ．ジェジュニに対して有効であるその他の植物若しくは動物由来化合物が、動物にさらに投与され得る；或いは、プロバイオティック系において、任意選択で、同時発現されるか、若しくは同時に含有される競合微生物が、動物にさらに投与されてもよい。
【００２７】
[0027]本開示内容はまた、動物環境へのＣ．ジェジュニの導入を低減する方法も提供する。単離又は精製された抗体又はその断片は、動物環境に新入動物を入れる前に、新入動物に投与される。
【００２８】
[0028]本開示内容は、本明細書において記載されるような単離又は精製された抗体又はその断片及び賦形剤を含むＣ．ジェジュニワクチン又は製剤をさらに提供する。ワクチンは、経口送達用であり得る。
【００２９】
[0029]Ｃ．ジェジュニに感染した対象を治療する方法もまた提供され；対象は、本明細書において記載されるような単離又は精製された抗体又はその断片を投与するステップによって治療される。任意選択で、方法はまた、Ｃ．ジェジュニに対して有効な抗生物質を投与するステップを含み得る。ここで記載されるような方法では、対象は、ニワトリ、ウシ及びヒツジからなる群から選択される家畜動物であり得る；或いは、対象は、ヒトであり得る。
【００３０】
[0030]本開示内容は、それを必要とする対象においてＣ．ジェジュニ感染を治療するための、又は治療するための医薬を調製するための、本明細書において記載される単離又は精製された抗体又はその断片の使用をさらに提供する。
【００３１】
[0031]サンプル中のＣ．ジェジュニを検出する方法も提供される。サンプルを、本明細書において記載される単離又は精製された抗体又はその断片と接触させ、次いで、結合している抗体の存在が検出される。サンプルは、体液又は糞便物質を含み得る；或いは、サンプルは、食品又は食品から得た表面スワブを含み得る。
【００３２】
[0032]本開示内容はまた、サンプル中のＣ．ジェジュニを検出するためのキットを提供する。キットは、本開示内容の単離又は精製された抗体又はその断片及びＣ．ジェジュニの検出に使用するための説明書を含み得る。本明細書において記載される単離又は精製された抗体又はその断片及び適した担体を含む、サンプル中のＣ．ジェジュニを検出するための検出試薬もまた提供される。
【００３３】
[0033]本開示内容のその他の態様及び特徴は、添付の図とともに、以下の特定の実施形態の説明を再検討すると当業者には明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
本開示内容の実施形態は、単に例として、添付の図を参照してここで記載される。
【図１】本明細書において調製されるＶＨＨ単量体及び五量体の配列を示す図である。
【図２】単量体及び五量体ＶＨＨのＣ．ジェジュニ表面抗原との結合のＥＬＩＳＡ分析並びにクマシー染色された精製された単量体及び五量体抗体の像を示す図である。種々の濃度（１０〜０．０００１μｇ／ｍｌの範囲）の鞭毛特異的抗体（ＶＨＨ）の単量体（ＦｌａｇＶ１Ｍ）及び五量体（ＦｌａｇＶ１Ｐ）形態をＥＬＩＳＡに使用した。吸光度データを、単量体及び五量体形式のＶＨＨ分子の実際の数に対して標準化した。中黒の四角は、ペンタボディＶＨＨを表し、中白の四角は、単量体ＶＨＨを示す。クマシー染色された精製された単量体及び五量体ＶＨＨの代表的な像は、ＥＬＩＳＡ分析の上に示されている。
【図３】単量体ＶＨＨ  ＦｌａｇＶ１Ｍ及びＦｌａｇＶ６ＭのＣ．ジェジュニ鞭毛との結合のＳＰＲ分析を示す図である。センサーグラムは、２８、４２、５６、７０、１４０及び１９０ｎＭのＦｌａｇＶ１Ｍ（図３Ａ）又はＦｌａｇＶ６Ｍ（図３Ｂ）の、ＳＡセンサーチップ上に捕獲された７００ＲＵのビオチン化フラジェリンとの結合を示す。中白丸は、データ点であり、湾曲した線は、データの１：１相互作用モデルへのフィッティングである。図３Ｃは、機能的親和性（結合力）の増大を示す五量体ＦｌａＶ１ＰのＳＰＲセンサーグラムであり；これによって、図２に示されるＥＬＩＳＡ結果が確認される。
【図４】ウエスタンブロットにおけるＦｌａｇＶ１ＰペンタボディによるフラジェリンのＦｌａＡ成分の検出を例示する。Ｃ．ジェジュニのＦｌａ  Ａ突然変異体（レーン１）、Ｆｌａ  Ｂ突然変異体（レーン２）及び野生型８１−１７６（レーン３）株から調製された鞭毛を、ニトロセルロースメンブレン上にブロットし、ＦｌａｇＶ１Ｐと反応させた。抗Ｈｉｓ  ＡＰコンジュゲート（レーン１〜３）によってフラジェリン成分を検出した。
【図５】ＦｌａｇＶ１Ｍ及びＦｌａｇＶ６ＭのＳＰＲ同時注入実験の結果を示すセンサーグラムである。各ＶＨＨを固定化された鞭毛上に注入した。第２の注入でシグナルがおよそ２倍になったので、ＦｌａｇＶ１Ｍ及びＦｌａｇＶ６Ｍは、別個の、非重複エピトープと結合すると思われた。
【図６】Ｃ．ジェジュニ（株８１１７６）（パネルａ、ｂ）又は対照としてＣ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）菌（パネルｃ、ｄ）及びＣ．ジェジュニ（株１２９３）（パネルｅ、ｆ）のいずれかとハイブリダイズした蛍光標識されたＦｌａｇＶ１Ｐを示す写真を示す。Ｃ．ジェジュニ株（ａ、ｂ）は、ＦＩＴＣ標識五量体によって特異的に検出され、画像（ａ、ｂ）において白で示されており、対照株は、同抗体によって染色されない（暗い又は灰色のバックグラウンドとして示される；ｃ、ｄ、ｅ及びｆ）。
【図７】種々のＣ．ジェジュニ株８１−１７６、８１−１７６ｆｌａＡ−ｆｌａＢ−、又はＣ．ジェジュニ株１１１６８鞭毛と結合しているＦｌａｇＶ１Ｐ（横列Ａ）及びＦｌａｇＶ６Ｐ（横列Ｂ）を示す蛍光顕微鏡像の収集物を示す図である。横列Ｃは、３種の株の各々と結合しているウサギポリクローナル抗８１−１７６鞭毛抗体を示す蛍光顕微鏡像である。５μｍバーによって示されるような同倍率ですべての像の代表的な視野が示されている。ＦＩＴＣ標識ペンタボディの結合は、横列Ａ（左パネル）；横列Ｂ（左及び右パネル）；及び横列Ｃ（左及び右パネル）の像において白色として現れた。ＦｌａｇＶ１Ｐは、Ｃ．ジェジュニ株１１６８を標識しなかった（横列Ａ、右パネル）；ＦｌａｇＶ１Ｐ及びＦｌａｇＶ６Ｐは両方とも、８１−１７６ｆｌａＡ−ｆｌａｂ−突然変異体（横列Ａ、Ｂ及びＣ、中央パネル）を標識しなかった。
【図８】Ｆｌａｇ１Ｖ１Ｐ及びＦｌａｇＶ６Ｐの、Ｃ．ジェジュニの９種の異なる株から得た鞭毛単離物との結合のＥＬＩＳＡ結果を示す棒グラフである。吸光度値は、２回の独立した実験の平均を示す。
【図９】ＦｌａｇＶ１Ｐの不在下又は存在下でのＣ．ジェジュニの運動性アッセイの結果を示す。写真は、５３時間インキュベートした後に撮られた。パネルＡ：対照としてバッファーとともにインキュベートしたＣ．ジェジュニ菌；パネルＢ：非関連ペンタボディとともにインキュベートした細菌；パネルＣ：ＦｌａｇＶ１Ｍとともにインキュベートした細菌；及びパネルＤ：ＦｌａｇＶ１Ｐとともにインキュベートした細菌。
【図１０】細菌がペンタボディ及び抗生物質の組合せを用いて処理された場合の、Ｃ．ジェジュニの運動性アッセイの結果を表す図である。上の横列は、対照バッファーを用いて処理された場合の細菌成長を示し、下の横列は、ＦｌａｇＶ１Ｐ（１μｇ／ｍｌの濃度で）を用いて処理された細菌を表す。漸増濃度のテトラサイクリンを使用した：０μｇ／ｍｌ（縦列Ａ）、４μｇ／ｍｌ（縦列Ｂ）、１６μｇ／ｍｌ（縦列Ｃ）及び６４μｇ／ｍｌ（縦列Ｄ）。写真は２４時間インキュベートした後に撮られた。
【図１１】ＦｌａｇＶ６ＰのＣ．コリとの交差反応性を示すが、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）とは示さない運動性アッセイの結果を示す。Ｃ．コリ株ＶＣ１６７（図１１Ａ）及びＳ．エンテリカ（ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型チフィムリウム（図１１Ｂ）の細菌成長を種々の時点で測定した。１μｇ／μｌの濃度で抗体を使用した。
【図１２】１０８個Ｃ．ジェジュニ細胞を接種されたニワトリのカンピロバクター・ジェジュニコロニー形成のレベルに対するＦｌａｇＶ１Ｐ及びＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｐの経口投与の効果を示す。Ｃ．ジェジュニを用いる抗原投与後、ニワトリにＦｌａｇＶ１Ｐ（標識されたＦｌａｇＶ１Ｐ２Ｒ５）又はＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｐ（標識されたＦ２３Ｐ）を与えた。非感染陰性対照群も含めた。図１２Ａは、個々の盲腸における細菌負荷の散布図を示し、平均盲腸細菌負荷は、水平線によって表されている。図１２Ｂは、ＰＢＳ（中白バー）、ＦｌａｇＶ１Ｐ（中黒バー）又はＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｐ（斜線のバー）を用いて処理されたニワトリの盲腸における細菌負荷（平均＋ＳＥＭ）＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析と、それに続く、ボンフェローニ多重比較検定を示す。
【図１３】ニワトリ体重に対するＦｌａｇＶ１Ｐ（１ｍｇ）の投与の効果を示す図である。Ｃ．ジェジュニ単独を用いる抗原投与又は抗原投与とそれに続くペンタボディ投与の１日後及び４日後にニワトリの体重を量った。ＰＢＳを対照として使用し、１日目及び４日目に体重（グラムで）を測定した。各群について、２８の反復から得られた値の平均体重±標準偏差が示されている。群間に有意差は見られなかった。
【図１４】ニワトリ腸管の種々の部分におけるＦｌａｇＶ１Ｐの検出の結果を示す棒グラフを示す図である。ニワトリに、ＦｌａｇＶ１Ｐを用いて胃管栄養を施し、腸液を、盲腸、回腸、空腸及び十二指腸から採取した。２倍段階希釈を調製し、ＥＬＩＳＡに付した。グラフの結果は、ペンタボディは、盲腸及び回腸液抽出物において最も検出されたことを示す。
【図１５】プロテアーゼ耐性ＶＨＨ  ＦｌａｇＶ１Ｍ変異体を単離するための方法論を示す図である。図１５Ａは、ファージミドベクターｐＭＥＤ６の多重クローニング部位を示す。Ｈｉｓ６／ＨＡタグをコードするＤＮＡを、‘３ＳｆｉＩ部位（太字及びイタリック体）とアンバー停止コドン（下線が引かれている）の間の配列から除去した。図１５Ｂは、ＦｌａｇＶ１Ｍ  ＶＨＨエラープローンＰＣＲライブラリーの構築、ファージのプロテアーゼ処理及びパニングスキームを強調するワークフロー図を示す。図１５Ｃは、Ｖ１エラープローンＰＣＲライブラリーから得られたプロテアーゼ処理したファージのパニングから単離された９種のＶＨＨのファージＥＬＩＳＡ結果を示す棒グラフである。アスタリスクは、ＦｌａｇＶ１Ｍに対して同等のシグナルを示したクローンを表す。
【図１６】ＦｌａｇＶ１由来抗体の生物物理学的を提供する図である。Ｖ１＝ＦｌａｇＶ１Ｍ；Ｆ２３＝ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ；Ｖ１−ＤＳＢ＝ＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢ；Ｆ２３−ＤＳＢ＝ＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢ。図１６Ａは、種々のＶＨＨの分離を示す非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり；可溶性細菌発現は、最大２３ｍｇ／ＬのＶＨＨを生じさせた。すべてはその予測された分子量に移動した。図１６Ｂは、種々のＶＨＨのシングルサイクルカイネティックＳＰＲセンサーグラムを示す。ＶＨＨは、固定化されたＣ．ジェジュニ鞭毛との高親和性結合を保持し、１：１結合モデルとフィットする。各ＶＨＨのＫＤがセンサーグラム上に示されている。図１６Ｃは、種々のＶＨＨのＳｕｐｅｒｄｅｘ７５（商標）サイズ排除クロマトグラフィープロフィールを示し、すべてが非凝集単量体であり、すべてのサンプルが１００％の単量体ピークに近似することを実証する。
【図１７】中性ｐＨ（７．３）及び酸性ｐＨ（２．０）での、ＦｌａｇＶ１Ｍ及びＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ  ＶＨＨ並びにそれらのジスルフィド結合変異体の熱的アンフォールディング曲線を示す図である。中点アンフォールディング温度（融点、Ｔｍ）を算出した。ｐＨ２．０では、２５℃の出発温度で、Ｖ１は、十分に変性し、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍは部分的に変性した。ｐＨ２．０で、ＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢは、部分的に変性したが、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢは、十分にフォールディングしており、ＶＨＨ熱的安定性に対するＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ及び追加のジスルフィド結合の相加作用を実証した。中白丸は、反復１を表し；中黒丸は、反復２を表す。Ｖ１＝ＦｌａｇＶ１Ｍ；Ｆ２３＝ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ；Ｖ１−ＤＳＢ＝ＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢ；Ｆ２３−ＤＳＢ＝ＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢ
【図１８】ＦｌａｇＶ１Ｍ及びＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ  ＶＨＨ並びにそれらのジスルフィド結合変異体の、主要な胃腸プロテアーゼに対するプロテアーゼ感受性を示す図である。ＶＨＨを、ペプシン、トリプシン及びキモトリプシンを用いて消化し、対照実験では、酵素の不在下でＶＨＨをインキュベートした。消化されたＶＨＨ及び対照を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。棒グラフは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度測定分析によって生じたプロテアーゼ耐性プロフィールを要約するものである。各ＶＨＨ及び各プロテアーゼについて、合計３回の独立した消化を実施した。エラーバーは、平均プロテアーゼ耐性±ＳＥＭを表す。Ｖ１＝ＦｌａｇＶ１Ｍ；Ｆ２３＝ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ；Ｖ１−ＤＳＢ＝ＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢ；Ｆ２３−ＤＳＢ＝ＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢ
【図１９】複数のプロテアーゼに曝露されたＶＨＨによるＣ．ジェジュニ運動性の低下を示す図である。図１９Ａは、ペプシンと、それに続いてトリプシン及びキモトリプシンを用いるＶＨＨの連続消化を示す模式図である。図１９Ｂは、連続消化の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析である。図１９Ｃは、運動性アッセイの棒グラフ概要である。バーは、３回の独立した実験から得られた、バッファー対照、ＶＨＨ又はプロテアーゼ消化されたＶＨＨで処理したプレート上のＣ．ジェジュニの平均直径を表し；エラーバーは、ＳＥＭを表す。５ｍｍでの破線は、プレート上のＣ．ジェジュニの出発直径を表す。一元配置分散分析と、それに続いて、すべてＶＨＨを用いない対照に対して、ダネットの多重比較検定によって統計分析を実施した（＊＊ｐ＜０．０１）。ＦｌａｇＶ１Ｍ及びＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ  ＶＨＨ
【図２０】代表的なＣ．ジェジュニ運動性アッセイの結果を表す図である。Ｃ．ジェジュニ運動性は、機能的ＶＨＨの存在下で低下する。Ｃ．ジェジュニ株８１−１７６を、対照バッファー又はＶＨＨを有するプレートに適用した。プレート播種の２４時間後に細菌成長の直径を測定した。（ｉ）プロテアーゼを含有する対照バッファー（ＶＨＨなし）とともに２４時間インキュベートした後の対照Ｃ．ジェジュニ、（ｉｉ）画像の凡例、（ｉｉｉ）ＦｌａｇＶ１Ｍ対照、１５及び３０分消化、（ｉｖ）ＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢ対照、１５及び３０分消化、（Ｖ）ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ対照、１５及び３０分消化並びに（ｖｉ）ＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢ対照、１５及び３０分消化。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
[0055]一般には、本開示内容は、Ｃ．ジェジュニと特異的に結合する抗体及びその断片に関する。本明細書において記載される抗体及びその断片は、食物連鎖におけるＣ．ジェジュニ有病率の管理又は減少において有用である。Ｃ．ジェジュニレベルを低下させる、動物へのＣ．ジェジュニ特異的単一ドメイン抗体の投与を含む方法が記載されている。
【００３６】
[0056]配列ＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡ（配列番号１）又はＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧ（配列番号４）を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１と、
配列ＩＳＷＳＲＤＲＱ（配列番号２）又はＩＧＳＤＧＴＶ（配列番号５）を含むＣＤＲ２と、
配列ＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹ（配列番号３）又はＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳ（配列番号６）を含むＣＤＲ３と
を含む、Ｃ．ジェジュニ鞭毛と特異的に結合する、単離又は精製された抗体又はその断片。
【００３７】
[0057]精製された抗体又はその断片は、Ｃ．ジェジュニ鞭毛との特異的結合を示す。抗Ｃ．ジェジュニは、Ｃ．ジェジュニの鞭毛タンパク質との結合、Ｃ．ジェジュニの運動性の低下又はＣ．ジェジュニのコロニー形成若しくは感染の発生率の低下の点で、機能的に決定され得る。結合及び／又は運動性の評価は、本明細書において記載される技術を使用して、十分に当業者の能力の範囲内である。１つの限定されない例では、精製された抗体又はその断片は、フラジェリンと特異的に結合する。さらなる限定されない例では、精製された抗体又はその断片は、フラジェリンのＦｌａＡ成分と特異的に結合する。
【００３８】
[0058]用語「抗体」はまた、本明細書において使用される「免疫グロブリン」（Ｉｇ）と当技術分野で呼ばれ、対となる重鎖及び軽鎖ポリペプチドから構築されるタンパク質を指し；ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを含めた種々のＩｇアイソタイプが存在する。抗体が正しくフォールディングされる場合には、各鎖は、より線形のポリペプチド配列によって接続されるいくつかの別個の球状ドメインにフォールディングする。例えば、免疫グロブリン（ｉｍｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）軽鎖は、可変（ＶＬ）及び定常（ＣＬ）ドメインにフォールディングするが、重鎖は、可変（ＶＨ）及び３つの定常（ＣＨ、ＣＨ２、ＣＨ３）ドメインにフォールディングする。重鎖及び軽鎖可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）の相互作用は、抗原結合領域（Ｆｖ）の形成をもたらす。各ドメインは、当業者によく知られる十分に確立された構造を有する。
【００３９】
[0059]軽鎖及び重鎖可変領域は、標的抗原との結合に関与しており、従って、抗体間で相当な配列多様性を示し得る。定常領域は、配列多様性をあまり示さず、重要な生化学的事象を誘発するいくつかの天然タンパク質との結合に関与している。抗体の可変領域は、分子の抗原結合決定基を含有し、従って、その標的抗原に対する抗体の特異性を決定する。配列多様性の大部分は、可変重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）あたり各３つの、６つの超可変領域中で生じ；超可変領域が組み合わさって、抗原結合部位を形成し、抗原決定基の結合及び認識に寄与する。抗体の、その抗原に対する特異性及び親和性は、超可変領域の構造並びに抗原に示す表面のその大きさ、形状及び化学によって決定される。超可変性の領域を同定するために種々のスキームが存在し、２つの最も一般的なものは、Ｋａｂａｔのもの並びにＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋのものである。Ｋａｂａｔら（１９９１ａ；１９９１ｂ）では、ＶＨ及びＶＬドメインの抗原結合領域での配列多様性に基づいて「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が定義されている。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７年）では、ＶＨ及びＶＬドメイン中の構造的ループ領域の位置に基づいて「超可変ループ」（Ｈ又はＬ）が定義されている。これらの個々のスキームが、隣接するか、又は重複しているＣＤＲ及び超可変ループ領域を定義しているので、抗体の技術分野の当業者は、用語「ＣＤＲ」及び「超可変ループ」を同義的に利用することも多く、それらは本明細書においてそのように使用され得る。この理由のために、抗原結合部位を形成する領域は、現在、本明細書において、ＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体の場合には、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｌ３、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、ＣＤＲ  Ｈ３と、重鎖又は軽鎖いずれかの抗原結合領域の場合にはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれる。ＣＤＲ／ループは、本明細書において、可変ドメインの比較を容易にするために開発されたＩＭＧＴ付番方式（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ら、２００３年）に従って呼ばれる。この方式では、保存されたアミノ酸（Ｃｙｓ２３、Ｔｒｐ４１、Ｃｙｓ１０４、Ｐｈｅ／Ｔｒｐ１１８及び位置８９の疎水性残基など）は、同一位置を常に有する。さらに、フレームワーク領域（ＦＲ１：位置１〜２６；ＦＲ２：３９〜５５；ＦＲ３：６６〜１０４；及びＦＲ４：１１８〜１２９）の、及びＣＤＲ（ＣＤＲ１：２７〜３８、ＣＤＲ２：５６〜６５；及びＣＤＲ３：１０５〜１１７）の標準化された限界の設定が提供される。
【００４０】
[0060]ＣＤＲの外側の領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ＦＲは、可変ドメインに構造的完全性を提供し、免疫グロブリンフォールディングの保持を確実にする。抗体のこの特徴的構造が、実質的な抗原結合多様性が抗原のブロードアレイに対して特異性を得るように、免疫系によって探索され得る安定なスキャフォールドを提供する（Ｐａｄｌａｎら、１９９４年）。
【００４１】
[0061]本明細書において「抗体断片」は、当技術分野で公知の任意の適した抗原結合性抗体断片を含み得る。抗体断片は、天然に存在する抗体の操作によって得られる場合も、組換え法を使用して得られる場合もある。例えば、抗体断片は、それだけには限らないが、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；ペプチドリンカーで連結されたＶＬ及びＶＨからなる分子）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）及びこれらの多価提示を含み得る。
【００４２】
[0062]限定されない例では、抗体断片は、天然に存在する供給源に由来する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）であり得る。ラクダ科動物起源の重鎖抗体（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、１９９３年）は、軽鎖を欠き、従って、その抗原結合部位は、ＶＨＨと呼ばれる１つのドメインからなる。ｓｄＡｂはまた、サメでも観察され、ＶＮＡＲと呼ばれ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、１９９５年；Ｎｕｔｔａｌｌら、２００３年）；その他のｓｄＡｂは、ヒト重鎖又は軽鎖配列に基づいて操作され得る（Ｊｅｓｐｅｒｓら、２００４年；Ｔｏら、２００５年）。本明細書において、「ｓｄＡｂ」は、ファージディスプレイ又はその他のディスプレイ技術によって任意の起源のＶＬ、ＶＨ、ＶＨＨ又はＶＮＡＲリザーバーから直接単離されたもの及びヒト化、親和性成熟、安定化、可溶化（例えば、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚａｔｉｏｎ））又は抗体エンジニアリングのその他の方法によるこのようなｓｄＡｂのさらなる改変によって作製されたものを含む。また、ｓｄＡｂの抗原結合機能及び特異性を保持する相同体、誘導体又は断片も本発明に記載された実施形態によって包含される。
【００４３】
[0063]ＳｄＡｂは、その高い熱安定性、高い界面活性剤耐性、プロテアーゼに対する比較的高い耐性（Ｄｕｍｏｕｌｉｎら、２００２年）及び高い製造収率（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、１９９７年）のために、新規抗体分子の優れたビルディングブロックである；それらはまた、免疫ライブラリーからの単離によって（Ｌｉら、２００９年）又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性成熟によって（Ｄａｖｉｅｓ  ＆  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、１９９６年）極めて高い親和性を有するよう操作され得る。
【００４４】
[0064]毒素中和及び／又は標的不活性化などの適用には、抗体断片（特に、ｓｄＡｂ）は、原核生物系における低い製造費用及び遺伝子操作の容易さのために全抗体（例えば、ＩｇＧ）よりも好ましい。さらに、ＶＨＨは、組換え発現系を使用して単量体として、クローニングされ、発現される場合に、極めて安定であると示されている（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、１９９７年；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ２００１年）。
【００４５】
[0065]当業者は、単一ドメイン抗体の構造について精通しているであろう。ｓｄＡｂは、免疫グロブリンフォールディングを保持する単一免疫グロブリンドメインを含み；最も注目すべきことに、３つのＣＤＲのみが抗原結合部位を形成する。しかし、すべてのＣＤＲが、抗原の結合にとって必要であるわけではない。例えば、限定は望まないが、ＣＤＲのうち１、２又は３つが、本開示内容のｓｄＡｂによる抗原の結合及び認識に寄与し得る。ｓｄＡｂのＣＤＲは、本明細書においてＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と呼ばれ、ＩＭＧＴ付番方式（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ら、２００３年）に基づいている。
【００４６】
[0066]これまでに記載されたように、抗体又はその断片は、ｓｄＡｂであり得る。ｓｄＡｂは、ラクダ科動物起源のものであり得、従って、ラクダ科動物フレームワーク領域がもとになり得；或いは、ＣＤＲは、その他の抗体ドメインのフレームワーク領域、例えば、それだけには限らないが、ＶＮＡＲ、ヒトＶＨ又はヒトＶｌフレームワーク領域にグラフトされ得る。さらに別の代替法では、上記のＣＤＲは、抗体断片のその他の種類のフレームワーク領域（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）にグラフトされ得る。本実施形態は、当技術分野で公知の任意の適した方法、例えば、それだけには限らないが、ＣＤＲグラフト化及びべニアリングを使用して「ヒト化」されている抗体断片をさらに包含する。抗体又は抗体断片のヒト化は、抗原結合能又は特異性を喪失することなく、配列中のアミノ酸を、ヒトコンセンサス配列中に見られるようなそのヒト対応物と置換することを含む；このアプローチは、ヒト対象に導入される場合に、抗体又はその断片の免疫原性を低下させる。ＣＤＲグラフト化のプロセスでは、本明細書において定義される１種又は複数の重鎖ＣＤＲが、ヒト可変領域（ＶＨ又はＶＬ）と、又はその他のヒト抗体断片フレームワーク領域（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）と融合又はそれにグラフト化され得る。このような場合には、前記の１種又は複数の超可変ループのコンホメーションが保存され、ｓｄＡｂのその標的（すなわち、鞭毛）に対する親和性及び特異性も保存される。ＣＤＲグラフト化は、当技術分野で公知であり、少なくとも以下：米国特許第６１８０３７０号、同５６９３７６１号、同６０５４２９７号、同５８５９２０５号及び欧州特許第６２６３９０号に記載されている。ベニアリングはまた、当技術分野で「可変領域再表面形成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」とも呼ばれ、抗体又は断片のヒト化溶媒に曝露される位置を含み；従って、埋め込まれたＣＤＲコンホメーションにとって重要であり得る非ヒト化残基が保存され、溶媒に曝露される領域に対する免疫学的反応の可能性が最小化される。ベニアリングは、当技術分野で公知であり、少なくとも以下：米国特許第５８６９６１９号、同５７６６８８６号、同５８２１１２３号及び欧州特許第５１９５９６号に記載されている。当業者ならば、このようなヒト化抗体断片を調製する方法に十分に精通しているであろう。
【００４７】
[0067]本開示内容の単離又は精製された抗体又はその断片は、配列ＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡ（配列番号１）のＣＤＲ１と、配列ＩＳＷＳＲＤＲＱ（配列番号２）のＣＤＲ２と、配列ＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹ（配列番号３）のＣＤＲ３とを含み得る。抗体又はその断片は、ｓｄＡｂであり得る。ｓｄＡｂは、ラクダ科動物起源のものであり得、従って、ラクダ科動物フレームワーク領域が基になり得る。より特定の例では、単離又は精製された抗体又はその断片は、配列：
ＱＶＸ１ＬＸ２ＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＸ３ＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＸ４ＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号７）を含み得る。
【００４８】
[0068]［式中、Ｘ１＝Ｋ又はＱ；Ｘ２＝Ｅ又はＶ；Ｘ３＝Ａ又はＣ；Ｘ４＝Ｉ又はＣ］又はそれと実質的に同一の配列。さらなる限定されない例では、単離又は精製された抗体又はその断片は、配列：本明細書においてＦｌａｇＶ１Ｍとも呼ばれる、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＡＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＩＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号８）；
本明細書においてＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍとも呼ばれる、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＡＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＩＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９）；
本明細書においてＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢとも呼ばれる、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＣＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＣＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０）；
本明細書においてＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢとも呼ばれる、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＣＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＣＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１１）
又はそれらと実質的に同一の配列を含み得る。
【００４９】
[0069]配列ＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧ（配列番号４）のＣＤＲ１と、配列ＩＧＳＤＧＴＶ（配列番号５）のＣＤＲ２と、配列ＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳ（配列番号６）のＣＤＲ３とを含む、単離又は精製された抗体又はその断片が本明細書において記載される。抗体又はその断片は、ｓｄＡｂであり得る。ｓｄＡｂは、ラクダ科動物起源のものであり得、従って、ラクダ科動物フレームワーク領域が基になり得る。より特定の例では、単離又は精製された抗体又はその断片は、配列：
ＱＶＸ１ＬＸ２ＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＸ３ＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＸ４ＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１２）
［式中、Ｘ１＝Ｋ又はＱ；Ｘ２＝Ｅ又はＶ；Ｘ３＝Ａ又はＣ；Ｘ４＝Ｉ又はＣ］又はそれと実質的に同一の配列を含み得る。さらなる限定されない例では、単離又は精製された抗体又はその断片は、配列：本明細書においてＦｌａｇＶ６Ｍとも呼ばれる、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＡＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１３）；
本明細書においてＦｌａｇＶ６Ｆ２３Ｍとも呼ばれる、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＡＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１４）；
本明細書においてＦｌａｇＶ６ＭＤＳＢとも呼ばれる、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＣＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＣＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１５）；
本明細書においてＦｌａｇＶ６Ｆ２３ＭＤＳＢとも呼ばれる、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＣＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＣＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１６）
又はそれらと実質的に同一の配列を含み得る。
【００５０】
[0070]実質的に同一の配列は、１種又は複数の保存的アミノ酸突然変異を含み得る。参照配列に対する１種又は複数の保存的アミノ酸突然変異が、参照配列と比較して生理学的、化学的又は機能的特性の実質的変化を伴わない突然変異体ペプチドをもたらし得ることは当技術分野で公知であり；このような場合には、参照及び突然変異体配列は、「実質的に同一の」ポリペプチドと考えられる。保存的アミノ酸突然変異は、アミノ酸の付加、欠失又は置換を含み得；１つの限定されない例では、保存的アミノ酸突然変異は、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基の、同様の化学的特性（例えば、大きさ、電荷又は極性）を有する別のアミノ酸残基との置換として本明細書において定義される。
【００５１】
[0071]保存的アミノ酸置換は、塩基性、中性、疎水性又は酸性アミノ酸を、同一群の別のものと置換し得る。用語「塩基性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨで通常、正に荷電している、７を超える側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を意味する。塩基性アミノ酸として、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）及びリシン（Ｌｙｓ又はＫ）が挙げられる。用語「中性アミノ酸」（また「極性アミノ酸」）とは、生理学的ｐＨで荷電されていないが、２つの原子によって共通して共有される電子の対が、原子の一方によってより接近して保持される少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸を意味する。極性アミノ酸として、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）及びグルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）が挙げられる。用語「疎水性アミノ酸」（また「非極性アミノ酸」）とは、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４年）の標準化されたコンセンサス疎水性スケールに従ってゼロより大きい疎水性を示すアミノ酸を含むものとする。疎水性アミノ酸として、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、アラニン（Ａｌａ又はＡ）及びグリシン（Ｇｌｙ又はＧ）が挙げられる。「酸性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨで通常、負に荷電している、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸として、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）が挙げられる。
【００５２】
[0072]配列同一性は、２種の配列の類似性を評価するために使用され；２種の配列が、残基位置間で最大一致を求めてアラインされた場合に、同一である残基のパーセントを算出することによって決定される。配列同一性を算出するために任意の公知の方法が使用され得；例えば、配列同一性を算出するためにコンピュータソフトウェアが利用可能である。限定は望まないが、配列同一性は、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓによって維持されるＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ２サービス（ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｂｌａｓｔ／）で見られるような、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ又はＦＡＳＴＡ−Ｎなどのソフトウェア又は当技術分野で公知である任意のその他の適当なソフトウェアによって算出され得る。
【００５３】
[0073]実質的に同一の配列は、少なくとも９０％同一であり得；別の例では、実質的に同一の配列は、本明細書において記載される配列に対して、アミノ酸レベルで少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％同一であり得る。例えば、いかなる方法による限定も望まないが、ＦｌａｇＶ１Ｍ、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ、ＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢ及びＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢのアラインメントは、９６．８％から９８．４％の間の配列同一性につながる。重要なことに、実質的に同一の配列は、参照配列の活性及び特異性を保持する。当業者には公知であろうが、抗体の、特に、フレームワーク領域内の特定のアミノ酸残基は、抗体の抗原結合特性及びその他の機能的特性に影響を及ぼすことなく突然変異され得る。
【００５４】
[0074]抗体又はその断片はまた、組換え抗体又はその断片の発現、検出又は精製に役立つさらなる配列を含み得る。例えば、限定は望まないが、抗体又はその断片は、ターゲッティング又はシグナル配列（例えば、それだけには限らないが、ｏｍｐＡ）、検出タグ（例えば、それだけには限らないが、ｃ−Ｍｙｃ）、精製タグ（例えば、それだけには限らないが、ヒスチジン精製タグ、Ｈｉｓ５又はＨｉｓ６）又はそれらの任意の組合せを含み得る。
【００５５】
[0075]抗体又はその断片はまた、多価提示であり得る。多量体化は、当技術分野で公知の任意の適した方法によって達成され得る。例えば、いかなる方法による限定も望まないが、多量体化は、国際公開第２００３／０４６５６０号パンフレットに記載されるように、自己アセンブリー分子を使用して達成され得る（Ｚｈａｎｇら、２００４年；Ｍｅｒｒｉｔｔ  ＆  Ｈｏｌ、１９９５年）。記載される方法は、抗体又はその断片及びＡＢ５毒素ファミリーのＢ−サブユニットの五量体化ドメインを含む融合タンパク質を発現させることによってペンタボディをもたらし（Ｎｉｅｌｓｏｎら、２０００年；国際公開第２００３／０４６５６０号パンフレット）；例えば、限定は望まないが、五量体化ドメインの配列は、
ＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号１７）であり得る。五量体化ドメインは、五量体にアセンブルし、それによって、抗体又はその断片の多価提示が形成される。当業者には認識されるであろうが、五量体中の各サブユニットは、上記の融合タンパク質を含む。当業者には容易に認識されるであろうが、抗体又はその断片の五量体化は、その抗原結合又は認識を決して変更しない（すなわち、抗体又はその断片は、同一の特異性及び親和性で同様の方法で同一抗原と結合する）。得られたペンタボディは、緻密であり、高い結合力（機能的親和性）を有し、安定な抗原結合分子である（Ｚｈａｎｇら、２００４年）。これらの五価抗体はまた、抗原と結合している場合には、凝集を増強でき（Ｚｈａｎｇら、２００４年）、それによってその有効性を高める。
【００５６】
[0076]本明細書において記載される多量体の各サブユニットは、同一である場合も、異なる場合もある。さらに、多量体化ドメインは、リンカーを使用して抗体又は抗体断片と連結され得；このようなリンカーは、２つの分子の柔軟な結合を提供するために十分な長さ及び適当な組成のものでなくてはならないが、抗体の抗原結合特性を妨害してはならない。１つの限定されない例では、リンカーは、リンカーＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１８）であり得る。
【００５７】
[0077]１つの特定の限定されない例では、多量体は、配列：
本明細書において、ＦｌａｇＶ１Ｐとも呼ばれる
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＡＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＩＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号１９）；
本明細書において、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｐとも呼ばれる、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＡＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＩＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号２０）；
本明細書において、ＦｌａｇＶ１ＰＤＳＢとも呼ばれる、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＣＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＣＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号３４）；
本明細書において、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＰＤＳＢとも呼ばれる、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＣＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＣＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号３５）；
本明細書において、ＦｌａｇＶ６Ｐとも呼ばれる、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＡＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号２１）；
本明細書において、ＦｌａｇＶ６Ｆ２３Ｐとも呼ばれる、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＡＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号２２）；
本明細書において、ＦｌａｇＶ６ＰＤＳＢとも呼ばれる、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＣＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＣＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号３６）；
本明細書において、ＦｌａｇＶ６Ｆ２３ＰＤＳＢとも呼ばれる、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＣＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＣＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＥＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＡＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ（配列番号１６）；
又はそれらと実質的に同一の配列を含み得る。
【００５８】
[0078]多価提示のその他の形態も包含される。例えば、限定は望まないが、抗体又はその断片は、二量体、三量体又は任意のその他の適したオリゴマーとして提示され得る。これは、当技術分野で公知の方法、例えば、直接結合連結（Ｎｉｅｌｓｅｎら、２０００年）、ｃ−ｊｕｎ／Ｆｏｓ相互作用（ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら、１９９６年）、「ノブ・イントゥ・ホールズ（Ｋｎｏｂ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ）」相互作用（Ｒｉｄｇｗａｙら、１９９６年）によって達成され得る。多量体はまた、Ｚｈｕら（２０１０年）によって記載される多量体化ドメインを使用して形成され得；本明細書において「コンボディ（ｃｏｍｂｏｄｙ）」形態と呼ばれるこの形態は、本明細書において記載されるような抗体又はその断片と、コイルドコイルペプチドの融合物であり、多量体分子をもたらす（Ｚｈｕら、２０１０年）。
【００５９】
[0079]多量体化のための当技術分野で公知の別の方法は、Ｆｃドメインを使用して抗体又はその断片を二量体することである。このアプローチでは、Ｆｃ遺伝子が発現ベクター中に挿入され；抗体又はその断片のヌクレオチド配列が増幅され、追加の残基を付加せずに、抗体又はその断片のＣ末端が、Ｆｃのヒンジ領域に連結されるように、ベクター中に挿入され得る。得られたベクターは、哺乳類細胞株にトランスフェクトされ得、融合タンパク質が組換えによって発現され、次いで、アフィニティークロマトグラフィーによって（例えば、プロテインＡカラムで）精製され得る。このような多量体化の方法の１つの限定されない例は、Ｂｅｌｌら（２０１０年）及びＩｑｂａｌら（印刷中）によって記載されている。このような二量体化を実行する技術は、当業者に公知であろう。
【００６０】
[0080]上記のような多量体では、多量体内のサブユニットは、本明細書において記載されるような、同一又は異なる抗体又はその断片を含み得る。
【００６１】
[0081]本明細書において記載されるような抗体又はその断片をコードする核酸配列も包含される。当業者には容易に理解されるであろうが、遺伝暗号の縮重を考えると、いくつかのヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコードするという効果を有するであろう。核酸配列は、コドン最適化され得る。ここで記載されるような核酸を含むベクターが包含される。
【００６２】
[0082]本明細書において記載される抗体又はその断片の任意の１種をコードするヌクレオチドを含む宿主細胞も当業者には容易に認識されよう。
【００６３】
[0083]本明細書において記載される抗体又はその断片を含む、及び／又はウイルスコートタンパク質（例えば、それだけには限らないが、繊維状ファージのｇ３ｐ）の１種との融合物として提示する、及び／又は抗体又はその断片をコードするヌクレオチドを含むファージも包含される。
【００６４】
[0084]本明細書において記載される抗体又はその断片は、検出可能な標識で標識され得る。標識は、検出可能にされ得るか、それ自体検出可能であり得、その結果、Ｃ．ジェジュニとの結合の存在が観察され得る。検出可能な標識は、放射性同位元素、常磁性標識（例えば、ガドリニウム又は酸化鉄）、フルオロフォア、フルオロフォア、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ又は高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ））、近赤外（Ｎｅａｒ  Ｉｎｆｒａ−Ｒｅｄ）（ＮＩＲ；例えば、Ｃｙ５．５、Ａｌｅｘａ６８０、Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０又はＤｙｌｉｇｈｔ８００）蛍光色素又は色素、エコー源性マイクロバブル、検出可能なタンパク質ベースの分子、ヌクレオチド、量子ドット、ナノ粒子、ナノワイヤー若しくはナノチューブと融合している親和性標識（例えば、ビオチン、アビジンなど）又はイメージング法によって検出され得る任意のその他の適した物質であり得る。抗体又はその断片は、当技術分野で公知の任意の方法（組換え技術、化学的コンジュゲーションなど）を使用して検出可能な物質と連結され得；任意選択で、必要に応じてリンカーが使用され得る。検出するステップは、当技術分野で公知の任意の適した方法、例えば、それだけには限らないが、光学イメージング、免疫組織化学又は分子診断イメージング、ＥＬＩＳＡ又はその他の適した方法によって達成され得る。特定の限定されない例では、抗体又はその断片は、ＦＩＴＣなどの蛍光物質と連結され得るか、又は高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）と遺伝的に融合され得る。
【００６５】
[0085]動物又は動物環境におけるＣ．ジェジュニの存在を低減する方法が、本明細書において記載される。個々の動物内で存在を低減することは、動物の表面の、又は動物の胃腸管内の汚染を低減することを含み得る。動物が、全身感染していれば、本明細書において記載される方法が、Ｃ．ジェジュニの存在を低減するために使用され得る。動物の環境は、ケージ又は設備の壁又は床、動物の囲い内の摂食又は給水装置、動物の囲い中に見られる寝床材料又は絶対に、動物の領域内の動物の外側に存在する糞便物質などの動物を直接取り囲むものと関連し得る。動物に本明細書において記載される抗体又はその断片を投与することは、抗体又はその断片が投与される動物又はこのような動物の子孫内の、又は動物が生きている群れ、ケージ若しくは家畜小屋内の、Ｃ．ジェジュニの存在を低減する目的のためであり得る。動物の胃腸管内のＣ．ジェジュニを低減することは、動物の環境内の汚染を低減するための１つの方法であり、汚染の発生率の低いより安全な食品サプライチェーンにつながる。
【００６６】
[0086]動物への投与は、当技術分野で公知の任意の適した方法によってであり得る。本明細書において記載される抗体又はその断片は、経口投与され得ることが有利である。経口送達によって、抗体又はその断片が動物への水又は食品供給内に送達されることが可能となり、注射よりも、動物にとってあまり目立つものではなく、ストレスの多いものではない。経口投薬計画の高度に的確な送達が必要である場合には、胃管栄養法もまた、許容される経口経路である。全身による、又は直腸送達経路などのその他の投与経路も考慮され得る。例えば、いかなる方法による限定も望まないが、抗体又はその断片は、動物の食品供給中に含まれ得る。１つの限定されない例では、抗体又はその断片は、動物の食品供給中に含まれる酵母発現系中で提供され得る。限定されない例では、抗体又はその断片は、酵母コートタンパク質（複数可）上に提示され得るか、又は酵母によって内部に若しくは外部に発現され得る。
【００６７】
[0087]Ｃ．ジェジュニに対して有効である別の物質の同時投与も、動物環境においてＣ．ジェジュニを低減するための可能性ある戦略である。例えば、動物に、抗生物質を抗体又はその断片の送達と同時に又は隣接する時間に投与することは、相加作用を有し得るか、又は相乗作用を有し得る。その結果は、Ｃ．ジェジュニ汚染の可能性の低減であるが、抗生物質の使用の低減もまたそうである。Ｃ．ジェジュニに対して有効なバクテリオシンも、相加作用又は相乗作用を求めて抗体又はその断片とともに動物に提供され得る。バクテリオシンに加えて、又はその代替物として、Ｃ．ジェジュニに対して効果を有する小分子、ペプチド又はタンパク質などの任意のその他の植物又は動物由来化合物が、本明細書において記載される抗体又はその断片とともに使用され得る。競合微生物も、相加作用又は相乗作用を達成するために、抗体又はその断片と同時に動物に提供され得る。競合微生物は、プロバイオティック系の一部として本明細書において記載される抗体又はその断片と一緒に使用され得る。このようなプロバイオティック系内で、抗体又はその断片は競合微生物と同時投与され得るか、又は連続送達され得る。プロバイオティック系内の本明細書において記載される抗体又はその断片の発現も保障され得る。
【００６８】
[0088]ＣＤＲ領域の外側の抗体又はその断片の部分のスキャフォールドエンジニアリングは、さらなるプロテアーゼ耐性並びに熱及び低ｐＨ耐性を付与し得る。送達形態はまた、腸酵素、熱又は低ｐＨ効果に対する保護効果を提供するコーティング又は賦形剤を用いて変更され得、このようにして、抗体又はその断片の配列は、それ自体が改変される必要はなく、むしろ、経口送達用に調製された製剤自体が、抗体又はその断片が送達されるべき対象の種のために最適化され得る。
【００６９】
[0089]投与形は、動物へのペプチド送達のために許容される任意の種類のものであり得る。望ましい場合には、コーティング形態及び持続放出形態が使用され得る。液体、散剤、結晶、ゲル、半固体又は錠剤形態も使用され得る。
【００７０】
[0090]抗体又はその断片が送達され得る動物は、ブロイラー又は産卵鶏などのトリであり得る。ウシ、ヒツジなどのその他の種類の家畜動物も、動物の腸又は周囲の環境中にＣ．ジェジュニが存在する場合には、ペプチドから恩恵を受け得る。従って、家畜適用は、家禽に制限されない。通常の動物環境は、家畜小屋又は家禽農場などの農場であり得る。Ｃ．ジェジュニを実質的に含まない動物環境の汚染を避けるために、家畜小屋などの環境への新規の汚染動物又は「新入」動物の侵入を防ぐ方法が提供される。このような方法では、家畜小屋又は農場などの動物環境に新入動物を入れる前に、新入者に抗体又はその断片を投与すること。このようにして、動物は、汚染の可能性から開放され、その後、すでに処置を受けたその他の動物との居住を再開し得る。
【００７１】
[0091]本明細書において記載される抗体又はその断片を賦形剤と一緒に含む抗Ｃ．ジェジュニワクチンが本明細書において記載されている。ワクチンは、上記のように、経口送達用に製剤化され得る。
【００７２】
[0092]対象に、上記の抗体又はその断片を投与することを含む、Ｃ．ジェジュニに感染した対象を治療する方法も記載される。任意選択で、Ｃ．ジェジュニに対して有効な抗生物質が、対象に同時投与されてもよい。対象は、ニワトリなどの家畜であり得るが、方法はまた、ヒト対象にも適用可能である。
【００７３】
[0093]Ｃ．ジェジュニ感染の治療におけるこのような使用のための製剤は、抗体又はその断片を、賦形剤と一緒に含む。従って、抗体又はその断片は、それを必要とする対象においてＣ．ジェジュニ感染を治療するための医薬の調製に使用され得る。
【００７４】
[0094]本明細書において記載される抗体又はその断片はまた、サンプル中のＣ．ジェジュニを検出する方法にとって有用である。このような方法では、サンプルを、標識の存在下又は不在下で抗体又はその断片と接触させ、続いて、結合している抗体又はその断片の存在が任意の許容される手段を使用して検出される。検出が個体の汚染又は感染を調べるために使用される場合には、サンプルは、体液又は糞便物質を含み得る。Ｃ．ジェジュニの存在が食品において、又は食品加工環境において評価されるべきである実施形態では、抗体又はその断片によって接触されるサンプルは、食品、食品容器、食品加工装置又は食品、容器若しくは加工装置から得た表面スワブであり得る。
【００７５】
[0095]抗体又はその断片自体を、Ｃ．ジェジュニの検出に使用するための説明書と一緒に含むであろう、このような方法を実施するためのキットが提供される。任意選択で、このような検出キットに使用されるべき試薬が、ユーザーの便宜のために含まれ得る。
【００７６】
[0096]抗体又はその断片自体が、サンプル中のＣ．ジェジュニを検出するために使用されるべき検出試薬の主成分であり得る。このような検出試薬はまた、バッファーなどの適した担体でもあろう。
【００７７】
[0097]本発明者らは、ＦｌａｇＶ１Ｍ及びＦｌａｇＶ６Ｍを単離し、フラジェリン結合性単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を鞭毛タンパク質に対するパニングによって過免疫されたラマファージディスプレイライブラリーから単離した。ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍを、ＦｌａｇＶ１Ｍ  ＤＮＡにランダム突然変異を導入するためにエラープローンＰＣＲアプローチが使用されたライブラリーから単離し；プロテアーゼ処理条件下でパニングを実施した。同等の突然変異が、ＦｌａｇＶ６Ｍにも付与され、ＦｌａｇＶ６Ｆ２３Ｍが得られた。ｓｄＡｂの、ベロ毒素Ｂホモ五量体に由来するタンパク質ドメインとの融合によって、ＦｌａｇＶ１Ｍ、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ及びＦｌａｇＶ６Ｍ抗体に五価が付与され、タンパク質ＦｌａｇＶ１Ｐ、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｐ及びＦｌａｇＶ６Ｐが生じた。「ペンタボディ」と呼ばれることもある得られた抗体又はその断片は、緻密であり、高い結合力を示し、安定な抗原結合分子である。これらの五価ＶＨＨは、抗原と結合される場合の、Ｃ．ジェジュニ及びＣ．コリの凝集を増強できた。
【００７８】
[0098]単一ドメイン抗体は、一般に、従来の抗体断片よりもプロテアーゼに対して大幅により耐性である。しかし、ＦｌａｇＶ１Ｍ、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ、ＦｌａｇＶ６Ｍ及びＦｌａｇＶ６Ｆ２３Ｍはまた、腸酵素に対して増大した耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を有するよう改変され、従って、経口送達の有効性が増大した。ポリペプチドに対して破壊効果を有し得る通常の腸酵素として、ペプシン、トリプシン及びキモトリプシンが挙げられる。従って、ペプチドが腸管内の周囲のＣ．ジェジュニと結合するのにより長い曝露時間を有するであろうから、これらの酵素に対する耐性は有利である。残基５４と７８の間に第２のジスルフィド橋を導入することによって、ＦｌａｇＶ１Ｍ、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ、ＦｌａｇＶ６Ｍ及びＦｌａｇＶ６Ｆ２３Ｍへの改変を行い、それぞれ、ｓｄＡｂ  ＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢ、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢ、ＦｌａｇＶ６ＭＤＳＢ及びＦｌａｇＶ６Ｆ２３ＭＤＳＢが生じた。ジスルフィド架橋で改変された抗体の調製における改変の部位は、システイン残基が特定の部位に導入される場合のＶＨＨ熱安定性及びタンパク質分解安定性への最適変更に基づいて選択した。
【００７９】
[0099]ＶＨＨ及びペンタボディ対応物は、蛍光顕微鏡によって実証されるように、フラジェリン、Ｃ．ジェジュニ細胞表面抗原に対して特異的であった。さらに、本発明者らは、フラジェリンに対して開発されたペンタボディが、ｆｌａＡタンパク質と結合し、哺乳類細胞の侵入において役割を果たすことを実証した。ＳＰＲは、ＶＨＨが、標的に対して低いナノモル親和性を有することを実証した。ＶＨＨはまた、運動性アッセイにおいて実証されるように、カンピロバクター成長及び運動性を防止／撹乱できた。ＶＨＨはまた、経口投与された場合に、ニワトリにおいてＣ．ジェジュニコロニー形成のレベルを大幅に低下させた。さらに、カンピロバクターの制御における、抗体及び抗生物質の組み合わされた治療の研究は、ＶＨＨ及びペンタボディの投与は、抗生物質の必要な用量を最大３５倍低下させ得ることを示す。
【実施例】
【００８０】
[00100]本発明は、以下の実施例でさらに例示される。しかし、これらの実施例は、例示目的であって、いかなる方法でも本発明の範囲を制限するために使用されてはならないということは理解されるべきである。
【００８１】
[00101]実施例１：抗原の調製
【００８２】
[00102]鞭毛を、その後の実施例において抗原として使用するために調製した。
【００８３】
[00103]Ｃ．ジェジュニ（株８１−１７６）鞭毛を、先に記載されたように単離した（Ｐｏｗｅｒら、２００３年）。手短には、鞭毛を調製するために、Ｃ．ジェジュニを一晩培養し、細胞をミュラー−ヒントン培養液中に掻きとって入れ、一晩インキュベートした。次いで、細胞を遠心分離によって回収し、１００ｍＬのｔｒｉｓ緩衝生理食塩水溶液中に再懸濁した。鞭毛を、氷上でワーリングブレンダーを使用して細胞から剪断した。細胞片を遠心分離によってペレットとし、上清を超遠心管に移した。鞭毛を４５，０００ｒｐｍで１時間の遠心分離によってペレットとした。サンプルの２％  ＳＤＳでの再懸濁及び遠心分離によってさらなる精製を行った。ペレットを２００〜５００μＬのｄＨ２Ｏに再懸濁した。
【００８４】
[00104]実施例２：ラマ免疫処置及び血清応答
【００８５】
[00105]Ｃ．ジェジュニ鞭毛を標的とするＶＨＨを単離するために、実施例１において得られた鞭毛抗原を用いてラマを免疫処置した。
【００８６】
[00106]雄のラマ（ラマ・グラマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ））を、Ｃ．ジェジュニ鞭毛（実施例１）を用いて皮下に免疫処置した。合計７回の注射を実施し、各注射について、０．５ｍｌの総容量の１００μｇの抗原を、等容量の完全（１日目）又は不完全（２１、３５、４９、６３日目）フロイントのアジュバント（Ｓｉｇｍａ）と混合した。最後の２回の注射（７６及び９０日目）は、アジュバントを用いずに１００μｇの抗原を用いて実施した。免疫前血液（１５〜２０ｍｌ）を第１の注射の前に、並びに２１、４９、７６及び９０日目に採取した。特異的免疫応答を、総免疫前及び免疫血清を使用してＥＬＩＳＡによって分析した。９０日目に得たラマ血清を、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら（１９９３年）に従って分画した。製造業者の説明書に従う血清分画のためにプロテインＧ及びＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、分離された画分を１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．８を用いてｐＨ６に調整し、４℃の予冷したＰＢＳに対して一晩透析した。個々の重い画分（Ｇ１、Ａ１及びＡ２）及びＧ２（従来のＩｇＧ）を、ＥＬＩＳＡによって鞭毛に対する特異的結合について分析した。手短には、マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート）（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を、ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌの鞭毛抗原（実施例１）を用い、４℃で一晩コーティングした。ウェルをすすぎ、２００μｌの１％カゼインを用いてブロッキングした。精製ＩｇＧ画分（Ｇ１、Ｇ２、Ａ１及びＡ２）の種々の希釈物を添加し、室温で１．５時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（０．０５％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いてウェルを洗浄し、ヤギ抗ラマＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＰＢＳ中、１：１，０００）（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ）と、続いて、ブタ抗ヤギＨＲＰ（ＰＢＳ中、１：３，０００）（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）とともにインキュベートした。１００μｌ／ウェルのＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を添加することによってシグナルを検出した。１００の１Ｍリン酸を添加することによって反応を停止し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用してＡ４５０を測定した。
【００８７】
[00107]ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ラマ血清画分（Ｇ１、Ｇ２、Ａ１及びＡ２；示されていないデータ）の純度が確認された。画分のＥＬＩＳＡによって、免疫前出血（示されていないデータ）と比較した場合に、鞭毛抗原に対して重鎖並びに従来の画分において強い免疫応答が示された。これらの結果はまた、総血清から得られたＥＬＩＳＡ結果（示されていないデータ）と同等である。
【００８８】
[00108]実施例３：鞭毛結合性ＶＨＨのライブラリー構築及び選択
【００８９】
[00109]実施例２において採取された血清から単離されたＲＮＡに基づいて、過免疫されたラマＶＨＨライブラリーを構築した。
【００９０】
[00110]ファージディスプレイライブラリーを先に記載されたように（Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）構築した。手短には、ＱＩＡａｍｐ  ＲＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を使用して免疫処置の９０日後に採取したおよそ１×１０７個のリンパ球から全ＲＮＡを単離した。第一鎖ｃＤＮＡを、製造業者（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の推奨に従って、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用い、鋳型として５μｇの全ＲＮＡを使用して合成した（Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）。オリゴヌクレオチドＭＪ１−３（センス）並びに２種のＣＨ２ドメインアンチセンスプライマーＣＨ２及びＣＨ２ｂ３（プライマー配列については、Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年を参照のこと）を使用して、可変ドメインＤＮＡ及び定常ドメインＤＮＡの一部を増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎｅ）を使用して重鎖断片（５５０〜６５０ｂｐの長さ）をゲル精製した。ＭＪ７及びＭＪ８プライマー（プライマー配列については、Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年を参照のこと）を使用する第２のＰＣＲ反応において、重鎖抗体（ＩｇＧ２及びＩｇＧ３）の可変領域を再増幅した。増幅されたＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎｅ）を用いて精製し、ＳｆｉＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を用いて消化し、同キットを使用して再精製した。ＬｉｇａＦａｓｔ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ連結系及びそのプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、１２マイクログラムの消化されたＶＨＨ断片を、４０μｇの（それぞれ、３：１モル比）Ｓｆｉ消化されたｐＭＥＤ１ファージミドベクター（Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）とライゲーションし、先に記載されたように（Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）、市販のエレクトロコンピテントなＴＧ１大腸菌細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に形質転換し、５×１０７の形質転換体のライブラリーの大きさが得られた。３０コロニーから得られたＶＨＨ断片を、ＰＣＲ増幅し、配列決定してライブラリーの複雑性を分析し；すべてのクローンは、予測される大きさの挿入部分を有しており、そのコードするＶＨＨ断片の配列決定によって決定されるように、そのＣＤＲ領域で互いに異なっていた。ライブラリーを、２Ｘ  ＹＴ／Ａｍｐ−グルコース（２％  ｗ／ｖ）培地において、３７℃、２５０ｒｐｍで３〜４時間増殖させた。細菌細胞をペレットにし、同培地に再懸濁し、先に記載されたように、−８０℃でグリセロールストックとして保存した（Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）。
【００９１】
[00111]パニング実験を、本質的に先に記載されたように実施した（Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、１９９７年及び２００９年）。パニングを、鞭毛抗原に対して合計４ラウンド実施した。２ミリリットルのライブラリーストックを、２Ｘ  ＹＴ／Ａｍｐ−グルコース（２％  ｗ／ｖ）培地において３７℃、２５０ｒｐｍで１〜２時間増殖させた（Ａ６００＝０．４〜０．５）、３７℃でＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｂａｓ）を用いて１時間感染させた。４℃で培養物を遠心分離した後、感染細胞ペレットを、２００ｍｌの、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを有する２Ｘ  ＹＴ／Ａｍｐに再懸濁し、３７℃及び２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。先に記載されたように、培養上清中のファージ粒子をＰＥＧ沈殿させ（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）、ファージペレットを２ｍｌの滅菌ＰＢＳに再懸濁し、ファージ力価を決定した。９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートを、３０μｇの鞭毛抗原を用いて４℃で一晩コーティングした。ウェルをＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ／１％（ｗ／ｖ）カゼインを用いて３７℃で２時間ブロッキングした。およそ１０１２個の救出されたファージ粒子を、ブロッキングされたウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴ（０．１％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて５回、ＰＢＳを用いて５回洗浄した。０．１Ｍトリエチルアミンを用いて結合しているファージを溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ＰＨ７．４を用いて中和し、対数増殖期のＴＧ１細胞とともにインキュベートした。３７℃で３０分インキュベートした後、細胞をＭ１３ＫＯ７にさらに１５分間重複感染させ、２Ｘ  ＹＴ−Ａｍｐ−Ｋａｎ中、３７℃で一晩増殖させた。抗原濃度を２０、１５及び１０μｇ／ウェルに低下させた点を除いて同一条件に従って、パニングをさらに３ラウンド継続し、それぞれ、第２、第３及び第４ラウンドのパニングに対して、洗浄をＰＢＳ−Ｔ及びＰＢＳを用いて７、１０及び１２回増加した。第４ラウンドのパニング後、４８種の無作為に選び取ったコロニーを増殖させ、マイクロタイタープレート上に５μｇ／ｍｌの鞭毛がコーティングされた点を除いて先に記載されたように（Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）、ファージＥＬＩＳＡスクリーニングに付した。陽性クローンとして、ＦｌａｇＶ１Ｍ及びＦｌａｇＶ６Ｍ（配列番号８及び配列番号１３；図１）が挙げられ、これらは、本明細書においてさらに研究される。
【００９２】
[00112]実施例４：単量体ＶＨＨの発現及び精製
【００９３】
[00113]実施例３において同定された鞭毛に対するＶＨＨを、ＢｂｓＩ１−ＶＨＨフォワードプライマー及びＢａｍＨＩ−ＶＨＨリバースプライマー（表１）を用いてｐＭＥＤ１ファージミドベクターからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片を、ＢｂｓＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素を用いて消化し、同様に消化したｐＳＪＦ２Ｈ発現ベクター（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）中にライゲーションした。連結すると、すべてのプラスミドを、エレクトロコンピテントなＴＧ１大腸菌に形質転換し、ＬＢ寒天プレート＋アンピシリン上で選択した。コロニーを、挿入部分についてコロニーＰＣＲによってスクリーニングし、ＤＮＡを配列決定した。
【００９４】
[00114]ＶＨＨ抗体を、５日最小培地法を使用して発現させた（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）。タンパク質発現を誘導した後、細胞培養物を６，０００ｒｐｍ×３０分（４℃）で回収し、上清をデカントし、細胞ペレットから周辺質内容物を抽出した。手短には、単量体ＶＨＨのペレットを２０ｍｌの氷冷ＴＥＳ（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２０％（ｗ／ｖ）スクロース、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、３０ｍｌの氷冷１／８ＴＥＳ（ｄＨ２Ｏで希釈した）を添加し、氷上でさらに３０分インキュベートし、スラリーを１２，０００ｒｐｍで３０分（４℃）遠心分離した。ＶＨＨを含有する得られた上清を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）バッファーＡ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）中に一晩透析し、記載されたように精製した（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）。説明書に従ってＨｉＴｒａｐ（商標）Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して抗体の精製を行った。分画を、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ精製系（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、出発バッファーとして１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用い、溶出バッファーとして１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０を用いて実施した。
【００９５】
[00115]精製タンパク質画分をプールし、ＰＢＳに対して透析した。溶出された画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングによって分析し、その後、ＰＢＳ中に透析した。ＶＨＨ濃度を、Ｐａｃｅら、１９９５年に従って、理論的ＭＷ及びＥｘＰＡＳｙ  ＰｒｏｔＰａｒａｍ  Ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ．ｈｔｍｌ）を用いて算出された吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸光度測定によって決定した。精製単量体ＦｌａｇＶ１Ｍ及びＦｌａｇＶ６Ｍ  ＶＨＨの収量は、１０〜８０ｍｇ／細菌培養物１ｌの範囲であった（図２）。
【００９６】
[00116]表１．実施例４及び５に記載されるような、単量体及び五量体ＶＨＨクローンの構築に使用されたプライマー
【表１】
2015535224.tif 000003
【００９７】
[00117]実施例５：五量体ＶＨＨの発現及び精製
【００９８】
[00118]単量体ＶＨＨの五量体を、ＶＨＨを、ＡＢ５毒素ファミリーのＢ−サブユニットの五量体化ドメインと融合することによって調製した。発現されると、サブユニットは五量体と自己アセンブルする。ＦｌａｇＶ１Ｐ及びＦｌａｇＶ６Ｐ（配列番号１９及び配列番号２１；図１）を調製した。
【００９９】
[00119]実施例３において同定された鞭毛に対するＶＨＨを、ＢｂｓＩ１−ＶＨＨフォワードプライマー及びＡｐａＩ−ＶＨＨリバースプライマー（表１）を用いてｐＭＥＤ１ファージミドベクターからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片を、ＢｂＳＩ及びＡｐａＩ制限酵素を用いて消化し、同様に消化したｐＶＴ２発現ベクター（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）中にライゲーションした。連結すると、すべてのプラスミドをエレクトロコンピテントなＴＧ１大腸菌に形質転換し、ＬＢ寒天プレート＋アンピシリン上で選択した。コロニーを、挿入部分についてコロニーＰＣＲによってスクリーニングし、ＤＮＡを配列決定した。
【０１００】
[00120]五量体抗体を、５日最小培地法を使用して発現させた（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）。タンパク質発現を誘導した後、細胞培養物を６，０００ｒｐｍ×３０分（４℃）で回収し、上清をデカントし、細胞ペレットから周辺質内容物を抽出した。細胞を１００ｍｌの氷冷溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭ  ＮａＣｌ）中に再懸濁し、氷上、−２０℃で一晩維持するか、又はドライアイス上で１時間凍結した。凍結懸濁液に、１ｍｌの１００ｍＭ  ＰＭＳＦ及び２００μｌの１Ｍ  ＤＴＴを添加し、次いで、これを、時折振盪しながら、室温で解凍した。３ｍｌの新たに調製したリゾチーム（最終濃度＝１５０μｇ／ｍｌ）を添加することによって細胞を溶解した。懸濁液を、時折振盪しながら、粘性になるまで室温で３０〜５０分間インキュベートし、その時点で２００μｌ〜３００μｌのＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ）（１Ｍ  ＭｇＣｌ２中の、１５ユニット／μｌ）を添加し、続いて、室温でさらに１５分インキュベートした。細胞溶解物を遠心分離し、０．２２μｍメンブレンフィルターを通して濾過した。ＶＨＨを含有する得られた上清を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）バッファーＡ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）中に一晩透析し、記載されたように精製した（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）。説明書に従ってＨｉＴｒａｐ（商標）Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して抗体の精製を行った。分画を、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ精製系（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、出発バッファーとして１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を、溶出バッファーとして１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０を用いて実施した。
【０１０１】
[00121]精製タンパク質画分をプールし、ＰＢＳに対して透析した。溶出された画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングによって分析し、その後、ＰＢＳ中に透析した。ＶＨＨ濃度を、Ｐａｃｅら、１９９５年に従って、理論的ＭＷ及びＥｘＰＡＳｙ  ＰｒｏｔＰａｒａｍ  Ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ．ｈｔｍｌ）を用いて算出された吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸光度測定によって決定した。精製五量体の収量は、１０〜５０ｍｇ／細菌培養物１ｌの範囲であった。
【０１０２】
[00122]実施例６：抗鞭毛抗体の生物物理学的特性決定
【０１０３】
[00123]実施例４及び５において発現及び精製されたＦｌａｇＶ１Ｍ、ＦｌａｇＶ６Ｍ、ＦｌａｇＶ１Ｐ及びＦｌａｇＶ６Ｐ抗体を特性決定した。
【０１０４】
[00124]表面プラズモン共鳴。単量体及び五量体ＦｌａｇＶ１及びＦｌａｇＶ６（実施例４）を、それぞれ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中で、サイズ排除カラム、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５及びＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通した。単量体ＶＨＨ画分を採取し、Ａ２８０測定値を測定することによってタンパク質濃度を決定した。０．８ｍｇ／ｍｌの抗フラジェリンＶＨＨを、１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中、およそ１０倍モル過剰のＰｉｅｒｃｅ  ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と室温で３０分間混合することによってビオチン化し、続いて、同バッファーに対して透析した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析を実施した。すべての測定は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．００５％界面活性剤Ｐ２０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中、２５℃で実施した。５μｌ／分の流速で、およそ７００〜９００ＲＵのビオチン化フラジェリンがＳＡセンサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に捕獲された。種々の濃度の抗体を、４０μｌ／分の流速で、参照としてＳＡ表面を使用してフラジェリン−ＳＡ表面上に注入した。ランニングバッファーを用いて洗浄することによって表面を再生した。ＢＩＡ評価４．１ソフトウェアを用いてデータを分析した。
【０１０５】
[00125]鞭毛は、ＣＭ％センサーチップ上での固定化に使用した酸性条件に対して感受性であったので、ビオチン化抗原をストレプトアビジン上に捕獲した。ＳＰＲ結果が図３に示されている。すべてのデータセットは、１：１相互作用モデルに対して合理的に良好なフィッティングを示し、速度定数及び親和性を導き出すことが可能となり（以下、表２に示される）、これは、２０〜３０ｎＭの範囲であった。図３Ｃは、ＦｌａｇＶ１Ｐが、ＦｌａｇＶ１Ｍと比較して極めて遅い解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）を有することを示し（図３Ａ）、これは、機能的親和性の増大を示す。
【０１０６】
[00126]抗体結合アッセイ。ＥＬＩＳＡを、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＰＢＳ−カゼイン（１％）を用いてブロッキングした後に、それぞれのウェルにＦｌａｇＶ１Ｍ、ＦｌａｇＶ１Ｐ又はＦｌａｇＶ６Ｐの５μｇ／ｍｌの溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベートした点を除いて、実施例２に記載されるように実施した。ウェルを、ＰＢＳＴ（０．０５％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０）及びＨＲＰとコンジュゲートしたウサギ抗Ｈｉｓ６  ＩｇＧ（ＰＢＳ中、１：５０００）（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて洗浄し、室温で１時間インキュベートした。結合をＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて検出し、反応を１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を用いて停止し、上記のようにＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用してＡ４５０を測定した。
【０１０７】
[00127]ＥＬＩＳＡ結果は、図２に示されている。ＦｌａｇＶ１Ｍは、ＥＬＩＳＡによって強力な結合活性を示した。示されるように、ＦｌａｇＶ１Ｍについて、０．２μｇ／ｍｌ（１５．６ｎＭ）で５０％最大結合を達成したのに対し、五量体ＦｌａｇＶ１Ｐは、０．００５μｇ／ｍｌ（４０ｐＭ）で５０％最大結合に達した−機能的親和性のほぼ４００Ｘの増大。ＥＬＩＳＡによって得られたＦｌａｇＶ１Ｍのおよその親和性（２０〜３０ｎＭの範囲の）は、ＳＰＲによって得られた値と一致する。
【０１０８】
[00128]エピトープマッピング。上記のように、８１−１７６の野生型株の全細胞溶解物とともに、Ｃ．ジェジュニのＦｌａ  Ａ及びＦｌａ  Ｂ突然変異体株から鞭毛を調製した。鞭毛調製物を、還元条件下で１２．５％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロースメンブレンに移した。メンブレンを、ＰＢＳ中、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを用いてブロッキングし、ＦｌａｇＶ１Ｐペンタボディと室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴを用いて５回洗浄した後、メンブレンを、マウス抗ベロ毒素とそれに続くヤギ抗マウスＡＰコンジュゲート又は抗Ｈｉｓ  ＡＰコンジュゲート（ブロッキングバッファーで１：５，０００希釈した）（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）のいずれかとともにインキュベートした。最後に、メンブレンを４回洗浄し、ＡＰ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とともに１０分間インキュベートした。メンブレンを蒸留Ｈ２ＯですすぐことによってＡＰ反応を停止し、風乾した。
【０１０９】
[00129]結果が図４に示されている。ＦｌａｇＶ１Ｐは、フラジェリンのＦｌａ  Ａ成分と結合した。おそらくは、Ｆｌａ  Ａ及びＦｌａ  Ｂタンパク質間の高いＤＮＡ配列同一性（９５％）のために（Ｗａｓｓｅｎａａｒら１９９１年）、Ｆｌａ  Ｂとの弱い交差反応性が観察された。
【０１１０】
[00130]ＦｌａｇＶ１Ｍ及びＦｌａｇＶ６Ｍが同一エピトープと結合するかどうかを調べるために、上記のようにＳＰＲ同時注入実験を実施した。両抗体について、そのＫＤ値の５０ｘ濃度の各ＶＨＨの６０〜１００μｌを、３０μｌ／分で６００〜７００ＲＵの固定化された鞭毛上に注入した。結果が図５に示されている。第２の注入でシグナルがおよそ２倍になったので、ＦｌａｇＶ１Ｍ及びＦｌａｇＶ６Ｍは、別個の、非重複エピトープと結合すると思われた。これは、ＦｌａｇＶ１及びＦｌａｇＶ６単量体又は五量体両方の組合せが、抗原、すなわち、鞭毛とのより高い結合の効率、ひいては、カンピロバクターコロニー形成の速度の低下における抗体の潜在的に良好な有効性を提供し得ることをさらに示唆する。
【０１１１】
[00131]ペンタボディのＦＩＴＣ標識及び蛍光顕微鏡。ＦｌａｇＶ１Ｐ及びＦｌａｇＶ６Ｐを、ＦＩＴＣを２ｍｇ／ｍｌの濃度で用い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＦＩＴＣ標識キットを製造業者の説明書に従って使用して標識した。標識されたペンタボディを、ＰＢＳに対して数回透析して、組み込まれていないＦＩＴＣを除去した。野生型Ｃ．ジェジュニ８１１７６及び突然変異体ｃｊ１２９３を、３％ホルマリンを用いて対数期増殖で一晩固定した。細胞をＰＢＳで洗浄して、ホルマリンを除去し、次いで、約１×１０８個／ｍｌで１０μｌをガラスカバースリップ上で風乾した。非特異的結合は、５０μｌの５％ミルク−ＰＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングした。細胞を、ＰＢＳで８０μｇ／ｍｌに希釈した５０μｌのＦＩＴＣ標識ＦｌａｇＶ１Ｐ中で、室温で１時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎを用いて洗浄し、次いで、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ−ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｃａｎａｄａ）封入剤を用いてガラススライド上に載せた。スライドをＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）で調べた。実験は、２連で、３回の独立した機会に、像がとられた各カバースリップ上の少なくとも３視野を用いて実施した。
【０１１２】
[00132]結果は図６に示されている。ペンタボディは、Ｃ．ジェジュニ、株８１１７６を特異的に標識するが、Ｃ．ジェジュニ（株１２９３）又はＣ．ディフィシル菌との特異的結合は、検出されなかった。ＦｌａｇＶ１Ｐの結合が蛍光顕微鏡によって実証され、それによって、Ｃ．ジェジュニ８１−１７６細胞の極に位置する鞭毛繊維と結合している抗体が見られる。Ｃ．ジェジュニ８１−１７６のフラジェリンは、プソイダミン酸を有しグリコシル化されていると示されており（Ｔｈｉｂａｕｌｔら、２００１年）、プソイダミン酸の生合成に関与している遺伝子ｐｓｅＢの不活性化は、細胞を鞭毛繊維をアセンブルできないようにする（Ｓｃｈｏｅｎｈｏｆｅｎら、２００６年；Ｇｏｏｎら、２００３年）。図６において観察されるように（パネルｅ及びｆ）、この遺伝子の撹乱は、ＦｌａｇＶ１ＰがＣ．ジェジュニ細胞と結合できないことにつながり、この結合が鞭毛繊維に特異的であることが確認される。
【０１１３】
[00133]別の実験では、蛍光顕微鏡観察を、Ｃ．ジェジュニ株８１−１７６、８１−１７６ｆｌａＡ−ｆｌａＢ−、又はＣ．ジェジュニ株１１１６８を、ＦＩＴＣ標識ＦｌａｇＶ１Ｐ又はＦｌａｇ  Ｖ６Ｐとともにインキュベートした点を除いて、本質的に上記のように実施した。ＦＩＴＣ標識ウサギ抗鞭毛ポリクローナルを用いる免疫染色を、陽性対照として使用した。図７における結果は、ＦｌａｇＶ１Ｐは、株８１−１７６のＣ．ジェジュニ鞭毛と結合するが、ＦｌａｇＶ６Ｐは、８１−１７６及び１１１６８株両方の鞭毛と結合することを示す。これは、ＦｌａｇＶ６Ｐ抗体が、Ｃ．ジェジュニ株の広範な鞭毛変異体と相互作用し得ることを実証する。
【０１１４】
[00134]交差反応性ＥＬＩＳＡ。ＥＬＩＳＡを使用して、精製された抗鞭毛五量体（ＦｌａｇＶ１Ｐ、ＦｌａｇＶ６Ｐ）の、Ｃ．ジェジュニの９種の異なる株（株８１−１７６、Ｐ１、１１１６８、Ｐ４、Ｐ１９、Ｐ３６、Ｐ２、Ｐ３及びＰ６４）との交差反応性を調べた。使用したすべての株は、仔ウシから単離された株であるＣ．ジェジュニ株Ｐ２を除いてヒト臨床分離株であった。ウェルを、種々の株から得た１０μｇのカンピロバクター鞭毛タンパク質を用いてコーティングし、結合を、ＦｌａｇＶ１Ｐ又はＦｌａｇＶ６Ｐペンタボディを使用して検出した点を除いて、実施例２に記載されるように、種々の株から鞭毛を調製し、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてマイクロタイタープレートのコーティングのために使用した。吸光度値は、２回の独立した実験の平均を示す。
【０１１５】
[00135]結果は図８に示されている。ＥＬＩＳＡデータは、ＦｌａｇＶ１Ｐは、８１−１７６（免疫原株）及び５種のその他の株と異なる程度に強力に相互作用したが、１１１６８、Ｐ２及びＰ３株とは、試験された条件下では強力には結合しなかったことを示した。これらのデータは、両抗体の同時適用は、Ｃ．ジェジュニ種及び亜種コロニー形成を防ぐためのより有効な製品を提供し得ることを示唆する。
【０１１６】
[00136]実施例７：突然変異体ＶＨＨ及びペンタボディの調製
【０１１７】
[00137]ランダム突然変異誘発によって、ニワトリ胃腸管の厳しい環境に抵抗することを可能にする、腸酵素に対して増大した耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を有するよう変更された抗体を開発した。そのために、ＦｌａｇＶ１Ｍ  ＶＨＨに基づいてエラープローンライブラリーを構築した。ＶＨＨ  Ｖ１エラープローンＰＣＲライブラリーの構築、ファージのプロテアーゼ処理及びパニングスキームを強調するワークフロー図が図１５Ｂに示されている。
【０１１８】
[00138]エラープローンＰＣＲによる突然変異体Ｖ１ライブラリーの構築。Ｖ１エラープローンＰＣＲライブラリーの構築の前に、ｐＭＥＤ１ベクターからプロテアーゼ感受性Ｈｉｓ６／ＨＡタグを除去した。新規ベクターをｐＭＥＤ６（図１５Ａ）と名付け、これまでＨｉｓ６／ＨＡタグが位置していた５’ＳｆｉＩ制限酵素部位の４ヌクレオチド下流にアンバー「タグ」停止コドンを含有していた。エラープローンＰＣＲのために、最初の鋳型として１０ｎｇのＦｌａｇＶ１Ｍ  ＤＮＡを使用し、ランダム突然変異誘発ＰＣＲキット（ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩランダム突然変異誘発キット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）並びにプライマーＭＪ７ＢＡＣＫ及びＭＪＦＯＲ１１（表２）を使用して５０μｌの反応液中で３０サイクル（９５℃で３０秒、５５℃で３０、７２℃で６０秒）の間増幅し、続いて、７２℃で１０分伸長した。ＰＣＲ産物（約５００ｂｐの長さ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を用いて精製し、ＳｆｉＩを用いて５０℃で６時間消化し（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）、同キットを使用して再精製した。２００μｇのｐＭＥＤ６ベクターも、先に記載されたように、５０℃で一晩、続いて、２時間のＰｓｔＩ／ＸｈｏＩで消化した。消化されたベクターを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎｅ）を用いて精製し、滅菌蒸留Ｈ２ＯでＤＮＡを溶出した（Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）。ＬｉｇａＦａｓｔ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ連結系及びそのプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、４５マイクログラムの消化されたＶＨＨ断片を、１５０μｇ（それぞれ、３：１モル比）のＳｆｉＩ消化されたｐＭＥＤ６ファージミドベクター（Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）とライゲーションし、先に記載されたように（Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）、市販のエレクトロコンピテントなＴＧ１大腸菌細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に形質転換し、およそ２×１０９形質転換体のライブラリーの大きさが得られた。３０コロニーから得られたＶＨＨ断片をＰＣＲ増幅し、配列決定して、ＶＨＨアミノ酸配列内の点突然変異の存在を実証した（示されていないデータ）。ライブラリーを、２Ｘ  ＹＴ／Ａｍｐ−グルコース（２％  ｗ／ｖ）培地において、３７℃、２５０ｒｐｍで３〜４時間増殖させた。細菌細胞をペレットにし、同培地に再懸濁し、先に記載されたように、−８０℃でグリセロールストックとして保存した（Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）。
【０１１９】
[00139]表２．エラープローンＰＣＲライブラリーの構築、サブクローニング及びジスルフィド結合突然変異体に使用されたプライマー。これらのプライマーを使用する方法は、実施例７及び１０に記載されている。
【表２】
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【０１２０】
[00140]Ｖ１エラープローンＰＣＲライブラリーのプロテアーゼパニング。パニング実験を、最初のライブラリー及びパニングの各ラウンドから救出され、増幅されたファージを、ニワトリＧＩ管液並びにペプシン、キモトリプシン及びトリプシンプロテアーゼを用いて前処理した点を除いて、先に記載されたように（Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、１９９７年；Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）本質的に実施した。１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８バッファー中の３種のファージアリコート（各１２５μｌ；１×１０１２ファージ粒子）を調製した。第１のファージアリコートに、１２．５μｌのＧＩ管ニワトリプロテアーゼ抽出物（１０×希釈）を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。第２のファージアリコートは、１ｍＭ  ＨＣｌ及び２０ｍＭ  ＣａＣｌ２中でキモトリプシン／トリプシンの等モル混合物（Ｒｏｃｈｅ）（Ｒ１：各プロテアーゼの２．５μＭ、Ｒ２：７．５μＭ及びＲ３〜４：１０μＭ）とともにインキュベートし、１５分（Ｒ１）、４５分（Ｒ２）及び６０分（Ｒ３〜４）間インキュベートした。同様に、ＰＢＳ（Ｒ１：２．５μＭ、Ｒ２：７．５μＭ、Ｒ３〜４  １０μＭ）及び１２５μｌのファージアリコートに対して１／１０容量の１００ｍＭ  ＨＣｌ  ｐＨ２．０中の種々の濃度のペプシン（Ｒｏｃｈｅ）を調製した。ニワトリプロテアーゼ及びトリプシン／キモトリプシンに対しては、１２．５μｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を添加することによって、又はペプシンに対しては、１／２容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を添加することによってプロテアーゼ反応を停止した。
【０１２１】
[00141]プロテアーゼ処理したファージアリコートを混合し、パニングに使用した。鞭毛に対して合計４ラウンドのパニングを先に記載されたように実施した（Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）。手短には、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ）のウェルを、１５μｇの鞭毛又はＰＢＳ（ブランクとして）を用いて、４℃で一晩コーティングした。ウェルをＰＢＳを用いてすすぎ、ＰＢＳ／１％（ｗ／ｖ）カゼインを用いて３７℃で２時間ブロッキングした。混合プロテアーゼ処理したファージ粒子（１００μｌは、およそ１０１１ｐｆｕを含有する）を、ブロッキングされたウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴ（０．１％  （ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて６回、ＰＢＳを用いて６回洗浄した。０．１Ｍトリエチルアミンを用いて結合しているファージを溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を用いて中和し、対数増殖期のＴＧ１大腸菌細胞とともにインキュベートした。３７℃で３０分インキュベートした後、細胞をＭ１３ＫＯ７にさらに１５分間重複感染させ、２Ｘ  ＹＴ−Ａｍｐ−Ｋａｎ中、３７℃で一晩増殖させた。抗原濃度を１２．５、１０及び１０μｇ／ウェルに低下させた点を除いて同一条件に従って、パニングをさらに３ラウンド継続し、それぞれ、第２、第３及び第４ラウンドのパニングに対して、洗浄をＰＢＳ−Ｔ及びＰＢＳを用いて７、１０及び１２回増加した。第４ラウンドのパニング後、２４種の無作為に選び取ったコロニーをコロニーＰＣＲに付し、ＰＣＲ断片を配列決定した。合計９種の、１〜４の点突然変異を有する抗鞭毛ＶＨＨ同定した。突然変異体クローンを、親のＶ１クローンとともに増殖させ、マイクロタイタープレート上に５μｇ／ｍｌの鞭毛をコーティングした点を除いて先に記載されたように（Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年）ファージＥＬＩＳＡスクリーニングに付した。
【０１２２】
[00142]パニングの間、ニワトリＧＩ管環境に抵抗するファージ抗体を選択するために、ファージ抗体を種々のプロテアーゼを含むニワトリＧＩ管液とともに、又は主要なＧＩプロテアーゼ、すなわち、ペプシン、トリプシン及びキモトリプシンとともにプレインキュベートした（図１５Ｂ）。繊維状ファージ（ｆ１、ｆｄ及びＭ１３）は、ほとんどのＧＩ管液プロテアーゼに対して耐性であるとわかっており、従って、ファージディスプレイは、耐性ＶＨＨ単一ドメイン抗体を選択するための理想的なディスプレイプラットフォームである。パニング後、９種の異なるＶＨＨが単離された；しかし、これらのクローンの半分未満が、ファージＥＬＩＳＡアッセイにおいて陽性であるとわかった（図１５Ｃ）。単量体及び五量体発現ベクター（それぞれ、ｐＳＪＦ２及びｐＶＴ２）中に陽性ＶＨＨをサブクローニングした後、クローンＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍのみが、親のＶ１クローンに対して同等のＥＬＩＳＡシグナル及び発現レベルを有しており；その他のクローンは、弱い結合物質であるとわかるか、又は少ない発現を有するのいずれかであった。配列決定データは、ＦｌａｇＶ１Ｍ  ＶＨＨ及びＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ間の唯一の相違は、フレームワーク１中の２つの残基（位置３のＬｙｓ→Ｇｌｎ、位置５のＧｌｕ→Ｖａｌ、ＩＭＧＴ付番方式）に位置することを示した。次いで、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３クローンを単量体及び五量体（配列番号９及び配列番号２０；図１）として発現させた。同一突然変異をＦｌａｇＶ６抗体に適用し（適当なプライマーを使用して）、ＦｌａｇＶ６Ｆ２３Ｍ及びＦｌａｇＶ６Ｆ２３Ｐ（配列番号１４及び配列番号２２；図１）が得られた。
【０１２３】
[00143]可溶性及び五量体ＶＨＨの発現及び精製。ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｐ、ＦｌａｇＶ６Ｆ２３Ｍ及びＦｌａｇＶ６Ｆ２３Ｐを、必要に応じて実施例４及び５に記載されたように発現させ、精製した。
【０１２４】
[00144]実施例８：運動性アッセイ
【０１２５】
[00145]ＶＨＨ及びＶＨＨペンタボディによるカンピロバクター成長及び運動性の阻害を、標準プレートアッセイを使用して研究した。
【０１２６】
[00146]運動性アッセイを、先に記載されたように（Ｋａｌｍｏｋｏｆｆら、２００６年）実施した。０．２５〜１μｇ／μｌの最終濃度の抗体を、Ｃ．ジェジュニ（株８１−１７６）又はＣ．コリ（５×１０７ＣＦＵ）とともに、ＲＴで３０分間インキュベートした。混合物を、ミュラー−ヒントン寒天（０．４％）を含有するペトリディッシュの中心にプレーティングし、微好気性条件（５％  Ｏ２、１０％  ＣＯ２及び８５％  Ｎ２）下３７℃でインキュベートした。細菌運動性は、細菌をプレーティングした２４、４８及び７２時間後に増殖する細菌によって作られた円の直径を測定することによって調べた。ここで記載されたような方法を使用して、抗体のＳ．エンテリカ（ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型チフィムリウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）との交差反応性も調べた。抗体の抗生物質との組合せが、運動性をさらに撹乱し得るかどうかを調べるために、１μｇ／μｌのＦｌａｇＶ１Ｐの存在下で培養プレートに種々の濃度のテトラサイクリン（０〜６４μｇ／ｍｌ）を添加し、アッセイの残りをここで記載されたように実施した。
【０１２７】
[00147]結果は、図９及び表３に示されている。ＦｌａｇＶ１Ｍ、ＦｌａｇＶ１Ｐ、ＦｌａｇＶ６Ｐ又はＦｌａｇＶ１Ｐ及びＦｌａｇＶ６Ｐの組合せとともに同時インキュベートされたカンピロバクター株８１−１７６は、細菌運動性の著しい低下を示した。別のカンピロバクターのよく使用される株、株１１１６８も調べ、ＦｌａｇＶ６Ｐを用いるプレートアッセイでの運動性阻害を実証した。ＦｌａｇＶ１Ｍ及びＦｌａｇＶ１Ｐは両方とも、４８時間インキュベートした後でさえ機能的なままであった。
【０１２８】
[00148]表３．ＦｌａｇＶ１及びＦｌａｇＶ６単量体及び五量体とともにインキュベートした後のプレートでのＣ．ジェジュニ８１−１７６及び１１１６８運動性。播種部位からの細菌の広がりを表す円の直径を測定した。アスタリスクは、ＦｌａｇＶ１及びＦｌａｇＶ６抗体処理対対照非関連ペンタボディの統計的有意性を示す。
【表３】
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【０１２９】
[00149]Ｃ．ジェジュニ（株８１−１７６）の運動性に対するＦｌａｇＶ１Ｐ及び抗生物質の組合せの効果が、図１０に示されている。上の横列は、対照バッファーで処理された場合の細菌成長を示し、下の横列は、１μｇ／μｌの濃度のＦｌａｇＶ１Ｐペンタボディを用いて処理された細菌を表す。プレートは、漸増濃度のテトラサイクリン：０μｇ／ｍｌ（Ａ）、４μｇ／ｍｌ（Ｂ）、１６μｇ／ｍｌ（Ｃ）及び６４μｇ／ｍｌ（Ｄ）を含有していた。写真は、２４時間インキュベートした後に撮った。ＦｌａｇＶ１Ｐペンタボディの添加は、カンピロバクター運動性に対するテトラサイクリンの効果をおよそ３５倍増強する。
【０１３０】
[00150]ペンタボディＦｌａｇＶ１Ｐ処理されたカンピロバクター・コリ及びサルモネラ・チフィムリウムでの運動性アッセイの結果が、それぞれ、図１１Ａ及びＢに示されている。Ｃ．コリ株ＶＣ１６７（Ａ）及びＳ．エンテリカ血清型チフィムリウム（Ｂ）の細菌成長を、種々の時点で測定した。抗体を１μｇ／μｌの濃度で使用した。ペンタボディのうち、サルモネラ菌の運動性に影響を及ぼすと思われるものはなかった。ペンタボディＦｌａｇＶ１Ｐ及びＦｌａｇＶ６ＰのＣ．コリＶＣ１６７との交差反応性の結果も、表Ｂに示されている。
【０１３１】
[00151]表４．運動性アッセイは、ペンタボディＦｌａｇＶ１Ｐ及びＦｌａｇＶ６Ｐの、Ｃ．コリＶＣ１６７との交差反応性を示す。ＦｌａｇＶ６Ｐペンタボディを用いた場合にＣ．コリの運動性の有意な低下が気づかれる。値を、統計分析のためにスチューデントのｔ検定に付した。＊ｐ値＜０．０５；＊＊ｐ値＜０．００５
【表４】
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【０１３２】
[00152]実施例９：ニワトリの病原体局在性及び処置
【０１３３】
[00153]カンピロバクター大流行を予防するための代替アプローチとして、抗鞭毛ＶＨＨ単量体又は五量体を使用するニワトリ腸におけるＣ．ジェジュニコロニー形成の阻害を調べる。Ｃ．ジェジュニの鞭毛は、ニワトリＧＩ管の盲腸における細菌コロニー形成を媒介する毒性因子である。従って、抗体との結合による鞭毛運動性の妨害は、腸における細菌運動性及び増殖を干渉すると提案される。
【０１３４】
[00154]レグホン（ｌｅｇｈｏｒｎ）のひなのＣ．ジェジュニコロニー形成及び処置。リン酸緩衝生理食塩水溶液中で１８時間増殖させたＣ．ジェジュニ８１−１７６菌を回収することによって、ひなコロニー形成実験の播種物を調製した。細菌細胞をＰＢＳで希釈し、使用の直前まで氷上で維持した。カルマリ（Ｋａｒｍａｌｉ）寒天（Ｂａｃｔｏ）上に段階希釈をプレーティングすることによって生菌数を決定した。１日齢特定病原体除去（ＳＰＦ）レグホン（ｌｅｇｈｏｒｎ）ひな（雌雄混合）を、カナダ食品検査庁（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ）、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａの孵化場から得た。それらを陰性対照、陽性対照及び処置群に無作為に割り当て、秤量し、ＩＤタグをつけ、動物封じ込めユニットに収容し、餌及び水を自由に提供した。ユニットを環境的に管理されたレベル２生物学的封じ込め室に収容した。到着すると、トリの１０％をＣ．ジェジュニによるコロニー形成について無作為に調べた。２日目に、３００μｌのＣ．ジェジュニ８１−１７６  １０８ｃｆｕ／ＰＢＳ１ｍｌを用いて、陽性対照及び処置群に経口的に抗原投与した。陽性対照群に３００μｌのＰＢＳを与え、処置群（ｎ＝２８／群、２つの封じ込めユニットの各々中の１４羽のニワトリ）に、抗原投与後、１時間、２４時間及び４８時間に３００μｌのＦｌａｇＶ１Ｐ又はＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｐを与えた。非感染陰性対照群も含めた（ｎ＝１５）。
【０１３５】
[00155]抗体処理の１時間又は４時間又は４８時間後に、トリを、カナダ動物管理協会（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）の承認されたガイドラインに従って、頸椎脱臼によって安楽死させた。コロニー形成の定性的並びに定量的評価のために、盲腸を無菌的に採取した。盲腸内容物を、カルマリ（Ｋａｒｍａｌｉ）寒天（Ｏｘｏｉｄ）上に連続的にプレーティングし、微好気性条件下、３７℃で２日間インキュベートした後にＣ．ジェジュニカウントを行った。Ｃ．ジェジュニ単独を用いる抗原投与後又はペンタボディ投与後１日目及び４日目にニワトリ体重も測定した。対照としてＰＢＳを使用し、１日目及び４日目に体重（グラムで）を測定した。
【０１３６】
[00156]図１２は、カンピロバクター・ジェジュニがコロニーを形成したニワトリにおける病原体レベルに対するＦｌａｇＶ１Ｐ又はＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｐの経口投与の効果を示す。Ｃ．ジェジュニを用いる抗原投与の１時間、２４時間及び４８時間後に、ニワトリに３００μｌの五量体野生型ＦｌａｇＶ１Ｐ又は突然変異体ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｐを与えた。個々の盲腸中の細菌負荷は、ペンタボディ処置ニワトリにおいて有意な低下を示す（図１２Ａ及びＢ）。陰性対照群は、非感染ニワトリの盲腸において検出可能なＣ．ジェジュニを示さなかった。
【０１３７】
[00157]カンピロバクター単独を用いて抗原投与した後又はペンタボディが経口投与された場合に、１日目及び４日目にニワトリを秤量することによって、ニワトリ体重に対する胃管投与されたＦｌａｇＶ１Ｐの効果を調べた。ＰＢＳを対照として使用した。各群について、２８の複製から得られた値の平均体重±標準偏差が、図１３に示されており；群間に有意差は見られなかった。
【０１３８】
[00158]サンドイッチＥＬＩＳＡによるニワトリＧＩ管中の五量体局在性。コロニー形成及び処置について記載されたスケジュールに従って、ニワトリに、１ｍｇのＦｌａｇＶ１Ｐペンタボディを用いて胃管栄養を施した（上記の節を参照）。Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）のウェルを、マウスモノクローナル抗ベロ毒素抗体（１０μｇ／ｍｌ）を用いて、４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ−カゼイン（１％）を用いてブロッキングした後、盲腸、回腸、空腸及び十二指腸から採取した腸液を、２倍段階希釈（１／２〜１／２０４８）でウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳＴ（０．０５％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄し、ＨＲＰにコンジュゲートしたウサギ抗Ｈｉｓ６  ＩｇＧ（ＰＢＳ中、１：５０００）を添加し（１００μｌ／ウェル）（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、室温で１時間インキュベートした。ＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて結合を検出し、１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を用いて反応を停止した。実施例２に記載されたように、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用してＡ４５０を測定した。データは、特に断りのない限り、各群について平均±ＳＥＭとして示されている。組織細菌負荷の相違を、適当な場合には、スチューデントのｔ検定又は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くボンフェローニのポストホック（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ）多重比較検定によって評価した。相違は、ｐ＜０．０５である場合に有意と考えた。
【０１３９】
[00159]盲腸、回腸、空腸及び十二指腸から腸液を採取し、胃管投与されたペンタボディの存在について調べた。図１４は、ニワトリ腸管の種々の部分における抗Ｃ．ジェジュニＦｌａｇＶ１Ｐの検出を示す。示されるように、平均して、盲腸に比較的高濃度のＦｌａｇＶ１Ｐがある。カンピロバクター・ジェジュニコロニー形成の主な部位が盲腸、大腸及び排泄腔であると言及することは注目に値する（Ｂｅｅｒｙら、１９８８年；Ｃａｒｒｉｌｌｏら、２００５年）。このデータは、ＧＩ管中のペンタボディ及びカンピロバクターコロニー形成の部位の同時局在性効果を示唆する。
【０１４０】
[00160]実施例１０：ジスルフィド突然変異体ＶＨＨの調製
【０１４１】
[00161]上記のように、ＶＨＨを、ニワトリ胃腸管中に見られる酵素に対する耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）をさらに増大し得るさらなるジスルフィド橋エンジニアリングを含むよう構築した。
【０１４２】
[00162]ジスルフィド結合突然変異体ＶＨＨの構築。本質的に別の場所で記載されたような（Ｈｕｓｓａｃｋ、２０１１年）、スプライス−オーバーラップ伸長ＰＣＲを使用して、位置５４及び１０４の残基をシステインに突然変異させることによって、さらなるジスルフィド結合をＦｌａｇＶ１Ｍ及びＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍのコア中に導入した。２つのジスルフィド結合を含有するＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢを作製するために、ＢｂｓＩ１−ＶＨＨ／Ｖ１−ＤＳＢ−ｒｅｖ及びＶ１−ＤＳＢ−ｆｏｒ／ＢａｍＨＩ−ＶＨＨプライマーセット（表２）を使用してＦｌａｇＶ１Ｍを増幅した。同様に、Ｆ２３−ＤＳＢ−ｆｏｒ／Ｖ１−ＤＳＢ−ｒｅｖ及びＶ１−ＤＳＢ−ｆｏｒ／ＢａｍＨＩ−ＶＨＨプライマーセット（表２）を用いてＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍを増幅することによってＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢを作製した。すべてを、ｐＳＪＦ２Ｈ発現ベクターにクローニングし、実施例３に記載されたようにＴＧ１大腸菌に形質転換した。ＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢ及びＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢ（それぞれ、配列番号３０及び配列番号３１；図１）を、実施例４に記載されたように、発現させ、精製した。
【０１４３】
[00163]さらなるジスルフィド結合も、上記のような方法を使用してＦｌａｇＶ６Ｍ及びＦｌａｇＶ６Ｆ２３Ｍのコアに導入した。得られた構築物をＦｌａｇＶ６ＭＤＳＢ及びＦｌａｇＶ６Ｆ２３ＭＤＳＢ（それぞれ、配列番号３２及び配列番号３３；図１）と呼んだ。
【０１４４】
[00164]ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるジスルフィド突然変異体の分析は、ＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢ及びＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢは、その予測された分子量に移動し、非還元ゲルでは高次多量体の徴候はないことを示した（図１６）。ＶＨＨ収率は、９．５ｍｇ／ｌ（Ｖ１−ＤＳＢ）〜２１．０ｍｇ／ｌ（表２）の範囲であった。
【０１４５】
[00165]ジスルフィド結合突然変異体のサイズ排除クロマトグラフィー及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。先に記載されたように（Ｈｕｓｓａｃｋ、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、２０１１年）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム及び約５０μＭのＶＨＨ（ＦｌａｇＶ１Ｍ、ＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢ、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ又はＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢ）を使用して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施し、その後、ＳＰＲ分析を実施した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＳＰＲ分析に先立って、Ｃ．ジェジュニ株８１−１７６から得たフラジェリンを、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してビオチン化した。５００ｍＬのフラジェリンＡを調製し（実施例１）、１ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。ビオチンは、２０×モル濃度で、製造業者によって提供された説明書に従って使用した。合計８回の、１０００×容量のＰＢＳに対する透析によって、組み込まれていないビオチンを除去した。すべてのＳＰＲ実験のランニングバッファーは、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、０．００５％  Ｐ２０；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とした。結合分析のために、２０００反応単位（ＲＵ）のビオチン化鞭毛を、ビオチンキャプチャー試薬（ＨＢＳ−ＥＰバッファー中、５０μｇ／ｍｌ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて先にロードされたＣＡＰセンサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定化した。ＳＥＣカラムから溶出されたＶＨＨを、２５〜４００ｎＭの範囲の濃度で、漸増濃度の複数回注入使用して、固定化された鞭毛上に注入した。各ＶＨＨ後に再生バッファー（８Ｍ塩酸グアニジン及び１Ｍ  ＮａＯＨ）を使用して表面を取り除き、上記のように新たなビオチン化鞭毛表面を調製した。シングルサイクルカイネティックパッケージを有するアップデートされたＢｉａ評価４．１ソフトウェアを使用して親和性（ＫＤｓ）を算出した。
【０１４６】
[00166]野生型ＶＨＨは、位置２３／１０４（ＩＭＧＴ付番）に基準ジスルフィド結合を含む。位置５４／７８（ＩＭＧＴ付番）のさらなる非基準ジスルフィド結合の、ＦｌａｇＶ１Ｍ及びＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ変異体への導入によって、ジスルフィド突然変異体ＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢ及びＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢを得た。ジスルフィド突然変異体の可溶性細菌発現は、最大２３ｍｇ／ＬのＶＨＨを生じさせた。ＶＨＨの親和性は、シングルサイクルカイネティックを使用するＳＰＲによって決定した。センサーグラム及びＦｌａｇＶ１Ｍ、ＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢ、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ又はＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢの親和性が、図１６Ｂに示されており、表２で報告されている。ＶＨＨのすべてが、１：１結合モデルとフィットし、Ｃ．ジェジュニ鞭毛に対して高親和性結合を保持しており、ＫＤは２３．９ｎｍ（ＦｌａｇＶ１Ｍ）〜１７．３ｎＭ（ＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢ）の範囲であった。すべてのＶＨＨが単量体である（表２）ことを確認する、ＳＥＣクロマトグラムが示されている（図１６Ｃ）。各クロマトグラムに溶出体積（Ｖｅ）が記載されている。
【０１４７】
[00167]ＶＨＨの熱的アンフォールディング分析。すべてのＶＨＨの熱的アンフォールディング中点温度（Ｔｍ）を、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１５分光光度計（Ｊａｓｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ、ＭＤ）を使用してｐＨ７．３及びｐＨ２．０で円偏光二色性分光法を使用して、データ点が０．２℃毎に得られた点を除いて、本質的に記載されたように（Ｈｕｓｓａｃｋ、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、２０１１年）２１５ｎｍでのＶＨＨアンフォールディングをたどることによって決定した。５０μｇ／ｍｌを使用した高温での凝集のために、ｐＨ７．３でのＴｍ決定のために１０μｇ／ｍｌを使用したＶ１  ＶＨＨの場合を除いて、５０μｇ／ｍＬのタンパク質濃度を使用してＶＨＨアンフォールディングを測定した。
【０１４８】
[00168]ｐＨ７．３ですべてのＶＨＨについて、単一相転移を有するアンフォールディング曲線が得られた。このｐＨで、ジスルフィド突然変異体ＶＨＨのＴｍは、単一ジスルフィド結合を有するＶＨＨよりも高かった。例えば、ＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢ及びＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢのＴｍは、それぞれ、ＦｌａｇＶ１Ｍ及びＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍの６１．６５±０．３８℃及び７２．３３±０．１５℃と比較して、それぞれ、７９．１０±０．１１℃及び８０．１９±０．１２°Ｃであった（図１７；表２）。ＦｌａｇＶ１Ｍは、５０μｇ／ｍｌで調べた場合に６８℃を超える温度で凝集したが（図１７、挿入部分）、濃度を１０μｇ／ｍｌに低下させた場合には、より高温で凝集は検出可能ではなく、単一相アンフォールディング曲線が得られたことは留意されなくてはならない。次いで、ｐＨ２．０でＶＨＨのＴｍを決定した。アンフォールディング実験を実施する前に、ＶＨＨを、ｐＨ２．０で少なくとも２時間インキュベートした。図１７におけるアンフォールディングプロットから得られた証拠のように、Ｖ１は、ｐＨ２．０で出発温度（２５℃）で完全にアンフォールディングし、Ｔｍは、決定され得なかった。対照的に、ＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢは、２５℃、ｐＨ２．０でフォールディングし、４２．４１±０．１１℃のＴｍが決定され、これは、ＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢ安定性に対して第２のジスルフィド結合が有する相当な影響を示す。ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍは、２５℃、ｐＨ２．０で部分的にアンフォールディングされ、３０．５１±０．２６℃のＴｍ、ＦｌａｇＶ１Ｍからの改善が決定された。この結果は、より安定な結合物質の選択におけるプロテアーゼ−パニング戦略の成功を明確に示す。中性ｐＨと同様に、ｐＨ２．０で最高Ｔｍを有するクローンは、Ｆ２３−ＤＳＢであり、４４．５５±０．０３℃のＴｍを有し、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍにおける安定化突然変異の効果及び第２のジスルフィド結合の効果は、高安定化されたＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢドメインの作製において部分的に相乗的であったと示唆する。
【０１４９】
[00169]ＶＨＨのｉｎ  ｖｉｔｒｏプロテアーゼ消化。ＦｌａｇＶ１Ｍ、ＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢ、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ及びＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢ  ＶＨＨを、主要なＧＩプロテアーゼペプシン（Ｓｉｇｍａ）、トリプシン（Ｒｏｃｈｅ）及びキモトリプシン（Ｒｏｃｈｅ）を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏプロテアーゼ消化アッセイに付した。ＶＨＨ消化は、記載されたように正確に実施し（Ｈｕｓｓａｃｋ、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、２０１１年）、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。手短には、ＶＨＨを、１００μｇ／ｍＬのペプシンを用い３７℃、ｐＨ２．０で６０分間消化し、対照ＶＨＨは、ペプシンの不在下でインキュベートした。トリプシン及びキモトリプシン消化については、ＶＨＨを、３７℃、ｐＨ７．３で１０μｇ／ｍＬのプロテアーゼとともに６０分間インキュベートし；対照ＶＨＨは、プロテアーゼの不在下でインキュベートした。消化されたＶＨＨ及び対照をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度測定分析を実施した。各ＶＨＨで、合計３回の独立したプロテアーゼ消化を実施した。
【０１５０】
[00170]結果は、図１８に示されている。ＦｌａｇＶ１Ｍ及びＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍは両方とも、ペプシン分解に対して感受性であり、６０分後に、それぞれ、２２．３±８．１％及び６．８±３．６％のＶＨＨが無傷のままであった。ジスルフィド操作された変異体は、ペプシンに対して相当により耐性であり、ＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢは、試験されたペプシンの濃度（１００μｇ／ｍｌ）で完全な耐性を示した（１００．５±６．７％）。ＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢも、ペプシンに対して極めて耐性であり、６０分後に９６．９±１５．８％のＶＨＨが無傷のままであった。トリプシンを用いて６０分間消化された場合には、Ｆ２３は、完全に耐性であり（１０１．１±４．７％）、Ｖ１（８４．４±１．８％）、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢ（４９．１±１５．４％）及びＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢ（４１．３±２．７％）が続いた。ジスルフィド結合の付加が、両クローンのトリプシン耐性を低下させることは、ここで明らかである。キモトリプシンを用いて６０分間消化されると、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢは、最高の耐性（９０．９±４．１％）を示し、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ（８５．４±３．３％）、ＦｌａｇＶ１Ｍ（５２．９±６．５％）及びＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢ（４９．５±６．７％）が続いた。従って、第２のジスルフィド結合の影響は、キモトリプシン感受性を増大しないが、トリプシン感受性を増大する。これらのデータは、合わせて、プロテアーゼ−パニングから単離されたＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ変異体は、極めて高いトリプシン及びキモトリプシン耐性又は耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）について選択されていることを示す。ペプシン、トリプシン及びキモトリプシン分解に対する改善された耐性は、経口投与のために提供され得るポリペプチドの望ましい特徴である。
【０１５１】
[00171]ＧＩ管における連続プロテアーゼ消化を模倣するために、個々のプロテアーゼ消化に加えて、連続消化反応を実施した（図１９Ａを参照）。ＶＨＨ（５０μｇ）を、５０μｌの総容量で、まず、ペプシン（３７℃、ｐＨ２．０、１０μｇ／ｍｌ最終）を用いて１５又は３０分間消化し、続いて、トリプシン＋キモトリプシン（各々について、３７℃、ｐＨ７．４、１０μｇ／ｍｌ最終）を用いて１５又は３０分間消化した。ペプシン消化後、反応物のｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨを用いて中和した。トリプシン＋キモトリプシン消化後、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を添加して、反応を停止した。連続的に消化されたＶＨＨを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって非処置対照と比較した。
【０１５２】
[00172]ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる連続消化の効果及び非処置対照が、図１９Ｂに示されている。対照ＦｌａｇＶ１Ｍに対して、ＦｌａｇＶ１Ｍのほぼ完全な消化が、１５及び３０分で明らかである（「Ｖ１」対「Ｖ１（１５）」及び「Ｖ１（３０）」を比較する）。ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍは、ＦｌａｇＶ１Ｍよりも耐性であり、連続１５分消化後に存在する強力なバンドを有していた（「Ｆ２３」対「Ｆ２３（１５）」を比較する）。３０分後、ＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍのほぼ完全な消化が見られた。逆に、両ジスルフィド結合変異体は、処置の３０分後でさえ連続プロテアーゼ消化に対して強力に耐性であった（「Ｖ１−ＤＳＢ」対「Ｖ１−ＤＳＢ（３０）」及び「Ｆ２３−ＤＳＢ」対「Ｆ２３−ＤＳＢ（３０）」を比較する）。バンドの濃度測定分析によって、同一処置後に無傷であるＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢ  ＶＨＨの４７．６％と比較して、連続３０分消化後にＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢ  ＶＨＨの７４．５％が無傷であることが示された。
【０１５３】
[00173]プロテアーゼ消化されたＶＨＨでのＣ．ジェジュニ運動性アッセイ。先に記載されたように（Ｋａｌｍｏｋｏｆｆら、２００６年）、運動性アッセイを実施した。１μｇ／μｌの最終濃度の抗体を、Ｃ．ジェジュニ（５×１０４ＣＦＵ）とともに、ＲＴで３０分間インキュベートした。混合物を、ミュラー−ヒントン寒天（０．４％）を含有するペトリディッシュの中心にプレーティングし、微好気性条件（５％  Ｏ２、１０％  ＣＯ２及び８５％  Ｎ２）下３７℃でインキュベートした。細菌運動性は、細菌をプレーティングした２４時間後に増殖する細菌によって作られた円の直径を測定することによって調べた。
【０１５４】
[00174]プロテアーゼ消化されたＶＨＨ突然変異体でのＣ．ジェジュニ運動性アッセイ。ＶＨＨを、上記の節においてここで記載されたような連続プロテアーゼ消化スキームに曝露した。次いで、先に記載されたように（Ｋａｌｍｏｋｏｆｆら、２００６年）、運動性アッセイを実施した。１μｇ／μｌの最終濃度の抗体を、Ｃ．ジェジュニ（株８１−１７６）（５ｘ１０４ＣＦＵ）とともに、ＲＴで３０分間インキュベートした。混合物を、ミュラー−ヒントン寒天（０．４％）を含有するペトリディッシュの中心にプレーティングし、微好気性条件（５％  Ｏ２、１０％  ＣＯ２及び８５％  Ｎ２）下３７℃でインキュベートした。細菌運動性は、プレート播種の２４時間後に増殖する細菌によって作られた円の直径を測定することによって調べた。
【０１５５】
[00175]運動性アッセイにおいてＶＨＨを使用して、連続消化されたＶＨＨが、Ｃ．ジェジュニ運動性の低下において依然として機能的であるかどうかを調べた（図１９Ｃ及び図２０において表されるような）。プロテアーゼを用いて処置されていないＶＨＨは、２４時間インキュベートした後に、プレート上での細菌の成長及び拡散の阻害において有効のままであった。プロテアーゼ処理したＦｌａｇＶ１Ｍ及びＦｌａｇＶ１Ｆ２３Ｍ抗体は、１５分及び３０分のインキュベーション条件両方の後に、活性をほぼ完全に失った。対照的に、ＦｌａｇＶ１ＭＤＳＢ及びＦｌａｇＶ１Ｆ２３ＭＤＳＢ突然変異体の成長阻害活性は、プロテアーゼ処理によってほぼ影響を受けず、ジスルフィド結合突然変異体では、プロテアーゼ処理したＶＨＨが活性であり、機能的であるままであることがさらに確認された。
【０１５６】
[00176]表５．Ｃ．ジェジュニ鞭毛特異的ＶＨＨの生物物理学的特性。速度及び親和性定数又は「結合」及び「解離」速度（ｋａ又はｋｏｎ及びｋｄ又はｋｏｆｆ）並びに腸酵素ペプシン、トリプシン及びキモトリプシンに対する耐性が含まれる。ａＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５サイズ排除クロマトグラフィーピーク面積積分によって決定された；ｂ５０μｇ／ｍｌでのＶ１の凝集のために使用された１０μｇ／ｍｌ；ｃ１００μｇ／ｍｌプロテアーゼを使用して実施された消化；ｄ１０μｇ／ｍｌプロテアーゼを使用して実施された消化；ｎ／ａ：ｐＨ２．０、２５℃で変性されたタンパク質。
【表５】
2015535224.tif 000007
【０１５７】
[00177]細菌及びウイルス感染に対する新規ツールとして単一ドメインＶＨＨ抗体が新たに出現したことは明らかである。これらのポリペプチドの小さい大きさによって、従来の抗体にとって接近しづらいエピトープとの結合が可能となる。タンパク質分解、変性及び凝集に対する耐性などの独特の物理的特性はまた、ヒト又は家畜のための経口送達治療における適用を可能にする。
【０１５８】
[00178]本明細書において記載されるように、Ｃ．ジェジュニ鞭毛に対するＶＨＨ抗体のライブラリーをファージディスプレイ技術を使用して構築し、スクリーニングした。ＶＨＨ及びその五量体形は、抗原と結合でき、経口投与された場合にニワトリにおけるＣ．ジェジュニ含量の低下において有効であることが実証された。
【０１５９】
[00179]ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって、プレートアッセイで、ＦｌａｇＶ１Ｍが、カンピロバクター・ジェジュニと結合し、その成長を撹乱したが、カンピロバクターの密接に関連する株（Ｃ．コリ）では有効ではないことが示された。ＦｌａｇＶ１Ｍ及びＦｌａｇＶ１Ｐは両方とも、使用された濃度で、運動性アッセイにおける細菌の成長の撹乱において有効であった。理論にとらわれようとは思わないが、作用様式は、凝集及び／又はタンパク質腔中にＶＨＨを入れることによって、細菌運動性の撹乱を引き起こすことであり得る。
【０１６０】
[00180]カンピロバクターコロニー形成低減における抗体の有効性を調べるために、フラジェリン特異的ＶＨＨの五量体形を構築し、細菌細胞はペンタボディのＶＨＨドメインによって凝集するようになり、これは、Ｃ．ジェジュニのニワトリ胃腸管にコロニーを形成する能力を損なうという仮定の下で、ニワトリ研究に使用した。カンピロバクターの運動性は、粘性腸粘膜のコロニー形成にとって必要であり、フラジェリンタンパク質は、細胞表面上の免疫優性抗原である。
【０１６１】
[00181]上記の抗体又はその断片のプロテアーゼ耐性及び多量体形態は、ニワトリにおいて、例えば、盲腸において、カンピロバクターのコロニー形成を有利なことに低減する。記載された技術は、カンピロバクター汚染を管理するための新規ツールを提供する。
【０１６２】
[00182]先の記載では、説明する目的で、実施形態の完全な理解を提供するために多数の詳細が示されている。しかし、当業者には理解されようが、これらの特定の詳細は必要ではない。
【０１６３】
[00183]上記の実施形態は、単に例であるものとする。当業者には明らかであるように、記載された特定の実施形態の代替法、改変及び変法は本明細書において包含される。
【０１６４】
参考文献
[00184]本明細書及び本願を通じて参照されるすべての特許、特許出願及び刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
関連出願の相互参照
本願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年１０月２４日に出願された米国特許仮出願第６１／７１８，０６２号の優先権の利益を主張する。
【図１】
2015535224.tif 000008
【図４】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１１】
2015535224.tif 000020
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2015535224.tif 000023
【図１７】
2015535224.tif 000024
【図１８】
2015535224.tif 000025
【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
2015535224000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年7月14日(2015.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ．ジェジュニ鞭毛と特異的に結合する単離又は精製された抗体又はその断片であって、
配列ＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡ（配列番号１）又はＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧ（配列番号４）を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１と、
配列ＩＳＷＳＲＤＲＱ（配列番号２）又はＩＧＳＤＧＴＶ（配列番号５）を含むＣＤＲ２と、
配列ＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹ（配列番号３）又はＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳ（配列番号６）を含むＣＤＲ３と
を含み、フラジェリンと特異的に結合する、抗体又はその断片。
【請求項２】
配列ＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡ（配列番号１）のＣＤＲ１と、配列ＩＳＷＳＲＤＲＱ  （配列番号２）のＣＤＲ２と、配列ＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹ（配列番号３）のＣＤＲ３とを含むか、配列ＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧ（配列番号４）のＣＤＲ１と、配列ＩＧＳＤＧＴＶ（配列番号５）のＣＤＲ２と、配列ＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳ（配列番号６）のＣＤＲ３とを含む、請求項１に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項３】
配列
ＱＶＸ１ＬＸ２ＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＸ３ＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＸ４ＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号７）
［式中、Ｘ１＝Ｋ又はＱであり、Ｘ２＝Ｅ又はＶであり、Ｘ３＝Ａ又はＣであり、Ｘ４＝Ｉ又はＣである］及びそれと少なくとも９０％同一の配列、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＡＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＩＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号８）；
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＡＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＩＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９）；
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＣＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＣＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０）；
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＲＲＬＳＣＡＴＳＧＬＴＦＲＮＦＨＭＡＷＦＲＱＶＡＧＫＥＲＥＶＶＣＡＩＳＷＳＲＤＲＱＹＹＰＤＰＶＫＧＲＦＴＣＴＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＴＡＳＡＳＧＤＷＹＫＧＳＹＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１１）；及び
それらと少なくとも９０％同一の配列
からなる群から選択された配列を含む、請求項２に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項４】
配列
ＱＶＸ１ＬＸ２ＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＸ３ＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＸ４ＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１２）、
［式中、Ｘ１＝Ｋ又はＱであり、Ｘ２＝Ｅ又はＶであり、Ｘ３＝Ａ又はＣであり、Ｘ４＝Ｉ又はＣである］及びそれと少なくとも９０％同一の配列；
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＡＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１３）；
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＡＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１４）；
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＣＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＣＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１５）；
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＶＳＣＴＡＳＶＳＴＦＳＩＮＡＬＧＷＹＲＱＡＰＧＫＡＲＥＬＶＣＡＩＧＳＤＧＴＶＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＣＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＧＫＲＩＧＳＤＧＳＩＷＦＡＶＡＳＦＧＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１６）；及び
それらと少なくとも９０％同一の配列
からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項５】
フラジェリンのＦｌａ  Ａ成分と特異的に結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項６】
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項７】
多価提示である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片をコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１０】
検出可能な標識と連結している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
【請求項１１】
非ヒト動物又は非ヒト動物環境におけるＣ．ジェジュニの存在を低減する方法であって、非ヒト動物に、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片を投与するステップを含む、方法。
【請求項１２】
単離又は精製された抗体又はその断片が経口投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
単離又は精製された抗体又はその断片が、酵母発現系中に含まれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
非ヒト動物に、抗生物質、バクテリオシン又はＣ．ジェジュニに対して有効であるその他の植物若しくは動物由来化合物を投与するステップをさらに含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
プロバイオティック系において、任意選択で同時発現されるか、又は同時に含有される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片と一緒に、非ヒト動物に競合微生物を投与するステップをさらに含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
非ヒト動物環境へのＣ．ジェジュニの導入を低減する方法であって、非ヒト動物環境に新入非ヒト動物を入れる前に、新入非ヒト動物に、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片を投与するステップを含む、方法。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片及び賦形剤を含む、Ｃ．ジェジュニワクチン。
【請求項１８】
経口送達用である、請求項１７に記載のワクチン。
【請求項１９】
Ｃ．ジェジュニに感染した非ヒト対象を治療する方法であって、非ヒト対象に、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片を投与するステップを含む、方法。
【請求項２０】
非ヒト対象にＣ．ジェジュニに対して有効な抗生物質を投与するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
非ヒト対象が、ニワトリ、ウシ及びヒツジからなる群から選択される家畜動物である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片及び賦形剤を含む、Ｃ．ジェジュニ感染の治療に使用するための製剤。
【請求項２３】
それを必要とする非ヒト対象においてＣ．ジェジュニ感染を治療するための医薬を調製するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片の使用。
【請求項２４】
それを必要とする非ヒト対象においてＣ．ジェジュニ感染を治療するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片の使用。
【請求項２５】
サンプル中のＣ．ジェジュニを検出する方法であって、サンプルを、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片と接触させるステップ及び結合している単離又は精製された抗体又はその断片の存在を検出するステップを含む、方法。
【国際調査報告】
2015535224.tif 000028
2015535224.tif 000029
2015535224.tif 000030
2015535224.tif 000031