(57)【要約】  本発明は、癌組織、および宿主を打ち負かすために腫瘍により用いられる生物学的エフェクターに対する免疫応答を、胎盤の組織、細胞、分子、およびそれらの組合せを使用して哺乳動物を免疫処置することによって刺激する方法を開示する。一実施形態では、本発明は、免疫源として、同系、同種異系、異種、およびそれらの組合せを利用することを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答の抑制と関連した免疫不全を治療するための、異種宿主の免疫処置に適した胎盤または胎盤抽出物を含む組成物。
【請求項２】
前記胎盤が実質的にホモジナイズされ、単離された細胞が免疫処置のために使用される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記単離された細胞が、栄養膜、栄養膜の合胞細胞、および内皮細胞である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
抗原提示細胞をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記免疫不全が、癌、ヒト免疫不全ウイルス、慢性疲労症候群、またはウイルス誘導免疫抑制である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
必要とするレシピエントへの異種胎盤の投与を含む、癌を治療するための方法。
【請求項８】
前記胎盤が、実質的にホモジナイズされ、単離された細胞またはその生成物がワクチン接種のために使用される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記単離された細胞が、栄養膜、栄養膜の合胞細胞、または内皮細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抗原提示細胞の投与をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記胎盤調製物の起源がブタであり、前記レシピエントがヒトである、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記胎盤ワクチン接種が、免疫原性を高めるためにアジュバントと一緒に投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）胎盤タンパク質を単離し精製すること、
（ｂ）前記精製された異種胎盤タンパク質の１つまたは複数を用いて、腫瘍担持実験レシピエントを免疫処置すること、および
（ｃ）目的の個々の腫瘍に対する免疫の最も強力な誘導物質である、異種胎盤からのタンパク質を同定すること
を含む、腫瘍交差反応性抗原の抽出のための抗原供給源。
【請求項１５】
異種胎盤タンパク質抽出物、異種胎盤由来細胞、異種栄養膜、または同種異系もしくは異種腫瘍細胞と融合された異種栄養膜を含む組成物による、必要とする患者の免疫処置を含む、癌を治療する方法。
【請求項１６】
アジュバントが加えられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アジュバントが、化学物質、化学物質の組成物、細菌由来の化合物、または免疫刺激受容体のアゴニストである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アジュバントが、ＤＥＴＯＸ、ＩＬ−１２、ＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド、ＣＴＬＡ−４遮断薬、ＩＦＮ−アルファ２ｂ、ＣＣＲ５遮断薬、水酸化アルミニウム、ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１、ＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アジュバントが樹状細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記アジュバントが、４−ＩＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＯＸ−４０リガンド、ＩＦＮ−ガンマ、熱ショックタンパク質７０、およびシャペロンリッチな細胞溶解物からなる群から選択された遺伝子でトランスフェクトされた樹状細胞である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌組織、および宿主を打ち負かすために腫瘍により用いられる生物学的エフェクターに対する免疫応答を、胎盤の組織、細胞、分子、およびそれらの組合せを使用して哺乳動物を免疫処置することによって刺激する方法を開示する。一実施形態では、本発明は、免疫源として、同系、同種異系、異種、およびそれらの組合せを利用することを提供する。
【０００２】
優先権請求
本出願は２０１２年８月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／６９１，１８７号明細書に対する優先権を主張するものであり、この仮出願の内容全体は参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【０００３】
開示の本発明は、免疫調節の分野に関する。より具体的には、本発明は、治療上有用な抗原を含有すると同時に、免疫機能を増強する両機能的調製物に関する。
【背景技術】
【０００４】
外科手術、放射線療法、および化学療法は、白血病、固形腫瘍、および転移を含む癌の治療に対する承認済みの標準的アプローチである。
【０００５】
不運にも、これらのアプローチには極めて高い毒性および有害作用が付随する。従来の癌治療に対する補助として、体内の免疫系を直接的または間接的に使用して、癌を縮小または根絶させる免疫療法が長年研究されてきた。ヒト免疫系が癌治療のための未開発の資源であり得ること、また、一旦免疫系の成分が適切に利用できれば、有効な治療法が開発され得ることが想定されている。重要な免疫制御分子および免疫シグナルが同定され、治療試薬として調製されているので、そのような試薬の臨床有効性を、確立された癌モデルを使用して試験することができる。免疫療法の戦略としては、ワクチン投与、活性化細胞、抗体、サイトカイン、ケモカイン、ならびに小分子阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および遺伝子治療が挙げられる。本明細書に提供される本発明は、癌治療の現行のアプローチに付随した毒性を伴わない、癌治療のための新規方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
開示の本発明は、異種胎盤、胎盤抽出物、細胞、細胞株、または精製タンパク質の組合せによる免疫処置を介して、宿主に抗腫瘍および免疫刺激効果を誘導する新規方法を教示する。同種異系胎盤ワクチン接種に比較して、異種胎盤ワクチン接種のアプローチが有するいくつかの利点は、以下のものに対する免疫応答を刺激する異種抗原成分の予期せぬ効果的性質にある：（１）腫瘍関連抗原；（２）機能性腫瘍関連抗原；および（３）腫瘍分泌免疫抑制成分。開示の本発明の有用性および実用性については、宿主が免疫刺激を必要とする他の免疫抑制関連状態の治療に向いている。
【０００７】
本発明の一態様では、同種異系胎盤を利用するが、前記胎盤組織またはその細胞を、免疫原性を刺激することができる薬剤で前処理することにより免疫原性を増強する。免疫原性を刺激できる薬剤としては、以下に限定されるものではないが、サイトカイン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤などＭＨＣ発現の活性化剤が挙げられる。免疫調節のさらなる手段としては、異種または同種異系の成分による細胞のトランスフェクション、ならびに免疫刺激サイトカインによるトランスフェクションが挙げられる。
【０００８】
免疫刺激サイトカインの非限定例としては、Ｂリンパ球走化性因子（「ＢＬＣ」）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン１１（「エオタキシン−１」）、好酸球走化性タンパク質−２（「エオタキシン−２」）、果粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、Ｉ−３０９、細胞間接着分子−１（「ＩＣＡＭ−１」）、インターフェロンガンマ（「ＩＦＮ−ガンマ」）、インターロイキン−１アルファ（「ＩＬ−１アルファ」）、インターロイキン−１ベータ（「ＩＬ−１ベータ」）、インターロイキン１受容体アンタゴニスト（「ＩＬ−１  ｒａ」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−４（「ＩＬ−４」）、インターロイキン−５（「ＩＬ−５」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、インターロイキン−６可溶性受容体（「ＩＬ−６  ｓＲ」）、インターロイキン−７（「ＩＬ−７」）、インターロイキン−８（「ＩＬ−８」）、インターロイキン−１０（「ＩＬ−１０」）、インターロイキン−１１（「ＩＬ−１１」）、インターロイキン−１２のサブユニットベータ（「ＩＬ−１２  ｐ４０」または「ＩＬ−１２  ｐ７０」）、インターロイキン−１３（「ＩＬ−１３」）、インターロイキン−１５（「ＩＬ−１５」）、インターロイキン−１６（「ＩＬ−１６」）、インターロイキン−１７（「ＩＬ−１７」）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２（「ＭＣＰ−１」）、マクロファージコロニー刺激因子（「Ｍ−ＣＳＦ」）、ガンマインターフェロンにより誘導されるモノカイン（「ＭＩＧ」）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２（「ＭＩＰ−１アルファ」）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド４（「ＭＩＰ−１ベータ」）、マクロファージ炎症性タンパク質−１−デルタ（「ＭＩＰ−１デルタ」）、血小板由来増殖因子サブユニットＢ（「ＰＤＧＦ−ＢＢ」）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５、ランテス（「ＲＡＮＴＥＳ」）、ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤１（「ＴＩＭＰ−１」）、ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤２（「ＴＩＭＰ−２」）、腫瘍壊死因子、リンフォトキシン−アルファ（「ＴＮＦアルファ」）、腫瘍壊死因子、リンフォトキシン−ベータ（「ＴＮＦベータ」）、可溶性ＴＮＦ受容体タイプ１（「ｓＴＮＦＲＩ」）、ｓＴＮＦＲＩＩＡＲ、脳由来神経栄養因子（「ＢＤＮＦ」）、塩基性線維芽細胞増殖因子（「ｂＦＧＦ」）、骨形態形成タンパク質４（「ＢＭＰ−４」）、骨形態形成タンパク質５（「ＢＭＰ−５」）、骨形態形成タンパク質７（「ＢＭＰ−７」）、神経成長因子（「ｂ−ＮＧＦ」）、上皮増殖因子（「ＥＧＦ」）、上皮増殖因子受容体（「ＥＧＦＲ」）、内分泌腺由来血管内皮細胞増殖因子（「ＥＧ−ＶＥＧＦ」）、線維芽細胞増殖因子４（「ＦＧＦ−４」）、角化細胞増殖因子（「ＦＧＦ−７」）、増殖分化因子１５（「ＧＤＦ−１５」）、グリア細胞由来神経栄養因子（「ＧＤＮＦ」）、成長ホルモン、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（「ＨＢ−ＥＧＦ」）、肝細胞増殖因子（「ＨＧＦ」）、インスリン様増殖因子結合タンパク質１（「ＩＧＦＢＰ−１」）、インスリン様増殖因子結合タンパク質２（「ＩＧＦＢＰ−２」）、インスリン様増殖因子結���タンパク質３（「ＩＧＦＢＰ−３」）、インスリン様増殖因子結合タンパク質４（「ＩＧＦＢＰ−４」）、インスリン様増殖因子結合タンパク質６（「ＩＧＦＢＰ−６」）、インスリン様増殖因子１（「ＩＧＦ−１」）、インスリン、マクロファージコロニー刺激因子（「Ｍ−ＣＳＦ  Ｒ」）、神経成長因子レセプター（「ＮＧＦ  Ｒ」）、ニューロトロフィン−３（「ＮＴ−３」）、ニューロトロフィン−４（「ＮＴ−４」）、破骨細胞形成抑制因子（「オステオプロテゲリン」）、血小板由来増殖因子受容体（「ＰＤＧＦ−ＡＡ」）、ホスファチジルイノシトール−グリカン生合成（「ＰＩＧＦ」）、Ｓｋｐ、カリン、Ｆ−ボックス含有複合体（「ＳＣＦ」）、幹細胞因子受容体（「ＳＣＦ  Ｒ」）、形質転換増殖因子アルファ（「ＴＧＦアルファ」）、形質転換増殖因子ベータ−１（「ＴＧＦベータ１」）、形質転換増殖因子ベータ−３（「ＴＧＦベータ３」）、血管内皮細胞増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、血管内皮細胞増殖因子受容体２（「ＶＥＧＦＲ２」）、血管内皮細胞増殖因子受容体３（「ＶＥＧＦＲ３」）、ＶＥＧＦ−Ｄ  ６Ｃｋｉｎｅ、チロシン−プロテインキナーゼ受容体ＵＦＯ（「Ａｘｌ」）、ベータセルリン（「ＢＴＣ」）、粘膜関連上皮性ケモカイン（「ＣＣＬ２８」）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２７（「ＣＴＡＣＫ」）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１６（「ＣＸＣＬ１６」）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン５（「ＥＮＡ−７８」）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２６（「エオタキシン−３」）、顆粒球走化性タンパク質２（「ＧＣＰ−２」）、ＧＲＯ、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１４（「ＨＣＣ−１」）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１６（「ＨＣＣ−４」）、インターロイキン−９（「ＩＬ−９」）、インターロイキン−１７Ｆ（「ＩＬ−１７Ｆ」）、インターロイキン−１８−結合タンパク質（「ＩＬ−１８  ＢＰａ」）、インターロイキン−２８Ａ（「ＩＬ−２８Ａ」）、インターロイキン２９（「ＩＬ−２９」）、インターロイキン３１（「ＩＬ−３１」）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（「ＩＰ−１０」）、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３（「Ｉ−ＴＡＣ」）、白血病抑制因子（「ＬＩＦ」）、Ｌｉｇｈｔ、ケモカイン（Ｃモチーフ）リガンド（「リンホタクチン」）、単球走化性タンパク質２（「ＭＣＰ−２」）、単球走化性タンパク質３（「ＭＣＰ−３」）、単球走化性タンパク質４（「ＭＣＰ−４」）、マクロファージ由来ケモカイン（「ＭＤＣ」）、マクロファージ遊走阻止因子（「ＭＩＦ」）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２０（「ＭＩＰ−３アルファ」）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン１９（「ＭＩＰ−３ベータ」）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２３（「ＭＰＩＦ−１」）、マクロファージ刺激タンパク質アルファ鎖（「ＭＳＰアルファ」）、ヌクレオソームアセンブリータンパク質１様４（「ＮＡＰ−２」）、分泌型リン酸化タンパク質１（「オステオポンチン」）、肺性および活性化調節性サイトカイン（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）（「ＰＡＲＣ」）、血小板第４因子（「ＰＦ４」）、間質細胞由来因子−１アルファ（「ＳＤＦ−１アルファ」）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１７（「ＴＡＲＣ」）、胸腺発現ケモカイン（「ＴＥＣＫ」）、胸腺間質性リンホポエチン（「ＴＳＬＰ  ４−１ＢＢ」）、ＣＤ１６６抗原（「ＡＬＣＡＭ」）、表面抗原分類８０（「Ｂ７−１」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（「ＢＣＭＡ」）、表面抗原分類１４（「ＣＤ１４」）、表面抗原分類３０（「ＣＤ３０」）、表面抗原分類４０（「ＣＤ４０リガンド」）、癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（胆汁糖タンパク質）（「ＣＥＡＣＡＭ−１」）、細胞死受容体６（「ＤＲ６」）、デオキシチミジンキナーゼ（「Ｄｔｋ」）、１型膜糖タンパク質（「エンドグリン」）、受容体型チロシンプロテインキナーゼｅｒｂＢ−３（「ＥｒｂＢ３」）、内皮細胞−白血球間接着分子−１（「Ｅ−セレクチン」）、アポトーシス抗原１（「Ｆａｓ」）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（「Ｆｌｔ−３Ｌ」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１（「ＧＩＴＲ」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１４（「ＨＶＥＭ」）、細胞間接着分子３（「ＩＣＡＭ−３」）、ＩＬ−１  Ｒ４、ＩＬ−１  ＲＩ、ＩＬ−１０  Ｒベータ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−２１Ｒ、リソソーム膜タンパク質２（「ＬＩＭＰＩＩ」）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（「リポカリン−２」）、ＣＤ６２Ｌ（「Ｌ−セレクチン」）、リンパ内皮（「ＬＹＶＥ−１」）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（「ＭＩＣＡ」）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（「ＭＩＣＢ」）、ＮＲＧｌ−ベータ１、ベータ型血小板由来増殖因子受容体（「ＰＤＧＦ  Ｒベータ」）、血小板内皮細胞接着分子（「ＰＥＣＡＭ−１」）、ＲＡＧＥ、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（「ＴＩＭ−１」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ｃ（「ＴＲＡＩＬ  Ｒ３」）、Ｔｒａｐｐｉｎタンパク質トランスグルタミナーゼ結合ドメイン（「Ｔｒａｐｐｉｎ−２」）、ウロキナーゼ受容体（「ｕＰＡＲ」）、血管細胞接着タンパク質１（「ＶＣＡＭ−１」）、ＸＥＤＡＲＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ、アグーチ関連タンパク質（「ＡｇＲＰ」）、リボヌクレアーゼ５（「アンジオゲニン」）、アンジオポエチン１、アンジオスタチン、カテプリンＳ（Ｃａｔｈｅｐｒｉｎ  Ｓ）、ＣＤ４０、潜在性ファミリータンパク質１Ｂ（「Ｃｒｉｐｔｏ−１」）、ＤＡＮ、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（「ＤＫＫ−１」）、Ｅ−カドヘリン、上皮細胞接着分子（「ＥｐＣＡＭ」）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬまたはＣＤ９５Ｌ）、Ｆｃｇ  ＲＩＩＢ／Ｃ、フォリスタチン、ガレクチン−７、細胞間接着分子２（「ＩＣＡＭ−２」）、ＩＬ−１３  Ｒ１、ＩＬ−１３  Ｒ２、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−２  Ｒａ、ＩＬ−２  Ｒｂ、ＩＬ−２３、ＬＡＰ、神経細胞接着分子（「ＮｒＣＡＭ」）、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１（「ＰＡＩ−１」）、血小板由来増殖因子受容体（「ＰＤＧＦ−ＡＢ」）、レジスチン、ストロマ細胞由来因子１（「ＳＤＦ−１ベータ」）、ｓｇｐｌ３０、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（「ＳｈｈＮ」）、シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン（「Ｓｉｇｌｅｃ−５」）、ＳＴ２、形���転換増殖因子−ベータ２（「ＴＧＦベータ２」）、Ｔｉｅ−２、トロンボポイエチン（「ＴＰＯ」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ｄ（「ＴＲＡＩＬ  Ｒ４」）、骨髄系細胞上に発現されるトリガー受容体１（Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  １）（「ＴＲＥＭ−１」）、血管内皮細胞増殖因子Ｃ（「ＶＥＧＦ−Ｃ」）、ＶＥＧＦＲｌＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、アディプシン（Ａｄｉｐｓｉｎ）（「ＡＮＤ」）、アルファ−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、アンジオポエチン様４（「ＡＮＧＰＴＬ４」）、ベータ−２−ミクログロブリン（「Ｂ２Ｍ」）、基底細胞接着分子（「ＢＣＡＭ」）、糖鎖抗原１２５（「ＣＡ１２５」）、癌抗原１５−３（「ＣＡ１５−３」）、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｃＡＭＰ受容体タンパク質（「ＣＲＰ」）、ヒト上皮増殖因子受容体２（「ＥｒｂＢ２」）、フォリスタチン、卵胞刺激ホルモン（「ＦＳＨ」）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（「ＧＲＯアルファ」）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（「ベータＨＣＧ」）、インスリン様増殖因子１受容体（「ＩＧＦ−１  ｓＲ」）、ＩＬ−１  ｓＲＩＩ、ＩＬ−３、ＩＬ−１８  Ｒｂ、ＩＬ−２１、レプチン、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（「ＭＭＰ−１」）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（「ＭＭＰ−２」）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３（「ＭＭＰ−３」）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−８（「ＭＭＰ−８」）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（「ＭＭＰ−９」）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１０（「ＭＭＰ−１０」）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１３（「ＭＭＰ−１３」）、神経細胞接着分子（「ＮＣＡＭ−１」）、エンタクチン（「ナイドジェン−１」）、ニューロン特異的エノラーゼ（「ＮＳＥ」）、オンコスタチンＭ（「ＯＳＭ」）、プロカルシトニン、プロラクチン、前立腺特異的抗原（「ＰＳＡ」）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン９（「Ｓｉｇｌｅｃ−９」）、ＡＤＡＭ１７エンドペプチダーゼ（「ＴＡＣＥ」）、チログロブリン、メタロプロテイナーゼ阻害剤４（「ＴＩＭＰ−４」）、ＴＳＨ２Ｂ４、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質９（「ＡＤＡＭ−９」）、アンジオポエチン２、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメ
ンバー１３／酸性ロイシンリッチ核リン酸化タンパク質３２ファミリーメンバーＢ（「ＡＰＲＩＬ」）、骨形態形成タンパク質２（「ＢＭＰ−２」）、骨形態形成タンパク質９（「ＢＭＰ−９」）、補体成分５ａ（「Ｃ５ａ」）、カテプシンＬ、ＣＤ２００、ＣＤ９７、ケメリン、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー６Ｂ（「ＤｃＲ３」）、脂肪酸結合タンパク質２（「ＦＡＢＰ２」）、線維芽細胞活性化タンパク質、アルファ（「ＦＡＰ」）、線維芽細胞増殖因子１９（「ＦＧＦ−１９」）、ガレクチン−３、肝細胞増殖因子受容体（「ＨＧＦ  Ｒ」）、ＩＦＮ−ガンマアルファ／ベータＲ２、インスリン様増殖因子２（「ＩＧＦ−２」）、インスリン様増殖因子２受容体（「ＩＧＦ−２Ｒ」）、インターロイキン−１受容体６（「ＩＬ−１Ｒ６」）、インターロイキン２４（「ＩＬ−２４」）、インターロイキン３３（ＩＬ−３３」）、カリクレイン１４、アスパラギニルエンドペプチダーゼ（「Ｌｅｇｕｍａｉｎ」）、酸化低密度リポタンパク質受容体１（「ＬＯＸ−１」）、マンノース結合レクチン（「ＭＢＬ」）、ネプリライシン（「ＮＥＰ」）、ノッチホモログ１、転座関連（ショウジョウバエ）（「ノッチ−１」）、腎芽細胞腫過剰発現（「ＮＯＶ」）、オステオアクチビン、プログラム細胞死タンパク質１（「ＰＤ−１」）、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（「ＰＧＲＰ−５」）、セルピンＡ４、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質３（「ｓＦＲＰ−３」）、トロンボモジュリン、Ｔｏｌｌ様受容体２（「ＴＬＲ２」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ（「ＴＲＡＩＬ  Ｒｌ」）、トランスフェリン（「ＴＲＦ」）、ＷＩＦ−ｌＡＣＥ−２、アルブミン、ＡＭＩＣＡ、アンジオポエチン４、Ｂ細胞活性化因子（「ＢＡＦＦ」）、糖鎖抗原１９−９（「ＣＡ１９−９」）、ＣＤ１６３、クラスタリン、ＣＲＴＡＭ、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１４（「ＣＸＣＬ１４」）、シスタチンＣ、デコリン（「ＤＣＮ」）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質３（「Ｄｋｋ−３」）、デルタ様タンパク質（「ＤＬＬ１」）、フェチュインＡ、ヘパリン結合性増殖因子１（「ａＦＧＦ」）、葉酸受容体アルファ（「ＦＯＬＲ１」）、フューリン、ＧＰＣＲ関連ソーティングタンパク質１（「ＧＡＳＰ−１」）、ＧＰＣＲ関連ソーティングタンパク質２（「ＧＡＳＰ−２」）、果粒球コロニー刺激因子受容体（「ＧＣＳＦ  Ｒ」）、セリンプロテアーゼヘプシン（「ＨＡＩ−２」）、インターロイキン−１７Ｂ受容体（「ＩＬ−１７Ｂ  Ｒ」）、インターロイキン２７（「ＩＬ−２７」）、リンパ球活性化遺伝子３（「ＬＡＧ−３」）、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ（「ＬＤＬ  Ｒ」）、ペプシノゲンＩ、レチノール結合タンパク質４（「ＲＢＰ４」）、ＳＯＳＴ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（「シンデカン−１」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１３Ｂ（「ＴＡＣＩ」）、組織因子経路阻害物質（「ＴＦＰＩ」）、ＴＳＰ−１、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１０ｂ（「ＴＲＡＩＬ  Ｒ２」）、ＴＲＡＮＣＥ、トロポニンＩ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（「ｕＰＡ」）、カドヘリン５、ＣＤ１４４としても知られる２型またはＶＥ−カドヘリン（血管内皮）（「ＶＥ−カドヘリン」）、ＷＮＴｌ誘導性シグナル伝達経路タンパク質１（「ＷＩＳＰ−１」）、および核因子κＢ活性化受容体（「ＲＡＮＫ」）が挙げられる。
【０００９】
本発明の別の態様では、栄養膜系列に分化する多能性幹細胞を含む癌ワクチンを使用し、前記多能性幹細胞は、中胚葉、外胚葉、および内胚葉の組織に分化することができる細胞として定義され、さらに、前記多能性幹細胞は、以下の細胞群から選択される：（ａ）胚性幹細胞；（ｂ）単為生殖由来幹細胞；（ｃ）誘導性多能性幹細胞；（ｄ）体細胞核移植由来幹細胞。
【００１０】
本発明の別の態様では、癌ワクチンは、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１４６、プロゲステロン、胎盤増殖因子、および胎盤性ラクトゲンの発現のために最適化された栄養膜系列細胞を含む。本発明はさらに、多能性幹細胞から生成した栄養膜系列委任細胞の使用を提供し、この細胞は、ＦＧＦ−２の非存在下でＢＭＰ−４により多能性幹細胞を処理することにより分化したものである。あるいは、分化は、ＢＭＰ−４を供与しながら、アクチビンおよびＦＧＦ２シグナル伝達の阻害剤に多能性細胞を曝露することにより行うことができる。
【００１１】
本発明の別の態様では、栄養膜系列への分化は、細胞の支持細胞層の存在下でＢＭＰ−４を供与しながらアクチビンおよびＦＧＦ２シグナル伝達の阻害剤に前記多能性細胞を曝露することにより行なわれる。本発明のこの実施形態では、支持細胞層は、（ａ）哺乳動物胚線維芽細胞；（ｂ）哺乳動物ケロイド組織由来細胞；（ｃ）哺乳動物内皮細胞；および（ｄ）哺乳動物間葉系幹細胞を含む群から選択される細胞で実質的に構成される。本発明の別の態様では、栄養膜分化細胞を、免疫原性を高めることができる薬剤に暴露するが、この薬剤は、栄養膜分化細胞上のＭＨＣおよび／または１つもしくは複数の同時刺激分子の発現をアップレギュレートすることができる。
【００１２】
本発明のさらに別の態様では、癌ワクチンを提供するが、この癌ワクチンでは、（ａ）ＣＤ８０；（ｂ）ＣＤ８６；（ｃ）ＣＤ４０；（ｄ）ＩＣＡＭ−１；（ｅ）ＬＦＡ−３；および（ｆ）ＩＬ−１２を含む分子の群から選択される分子の発現を誘導または実質的にアップレギュレートする、免疫原性を高めることができる薬剤で栄養膜を処理している。
【００１３】
本発明の別の態様では、栄養膜または栄養膜様細胞に、免疫原性を高める分子をコードする遺伝子をトランスフェクトするが、前記分子は、（ａ）ＡＢＣＦ１、（ｂ）ＴＮＦ−アルファ；（ｃ）ＴＮＦ−ベータ；（ｄ）ＢＣＬ６、（ｅ）補体Ｃ３；（ｆ）補体Ｃ４Ａ；（ｇ）補体Ｃ５；（ｈ）ＣＥＢＰＢ；（ｉ）ＣＲＰ、（ｊ）ＩＣＥＢＥＲＧ、（ｋ）ＩＬ１Ｒ１、（ｌ）ＩＬ１ＲＮ；（ｍ）ＩＬ８ＲＢ；（ｎ）ＬＴＢ４Ｒ；（ｏ）ＴＯＬＬＩＰ；（ｐ）ＩＦＮＡ２；（ｑ）ＩＬ１２；（ｒ）ＩＬ１３ＲＡ１；（ｓ）ＣＤ４０Ｌ；（ｔ）ＩＦＮＡ２；（ｕ）ＩＬ１７Ｃ；（ｖ）ＩＬ１８；（ｗ）ＩＬ−２１；（ｘ）ＩＬ−２２；（ｙ）Ｇ−ＣＳＦ；（ｚ）ＧＭ−ＣＳＦ；（ａａ）インターフェロンガンマ；（ａｂ）ＨＬＡタンパク質の全体または構成部分；（ａｃ）同種異系ＨＬＡタンパク質の全体または構成部分；および（ａｄ）異種ＨＬＡタンパク質の全体または構成部分から選択される。
【００１４】
本発明の一態様では、胎盤由来栄養膜、多能性由来栄養膜、または栄養膜が細胞の初期化により生成されたものであるかにかかわらず、免疫処置のために利用される細胞は、レシピエントに対して同種異系、異種、または同系である。レシピエントは、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、または他の哺乳動物を含む哺乳動物である。本発明の一態様では、癌ワクチンを提供するが、このワクチンは、十分量の末端炭水化物エピトープＧａｌアルファ（１、３）Ｇａｌの発現を誘導するようにアルファ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼでトランスフェクトされている栄養膜または内皮細胞を含む。本発明の特定の一態様では、提供される癌ワクチンは、トランスフェクトされた細胞が、ヒト血液の存在下で補体カスケードの活性化を誘導することができるほど十分なレベルでトランスフェクトされているアルファ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する。本発明の一態様では、栄養膜様細胞は多能性幹細胞から作製されるが、この栄養膜様細胞は、腫瘍生物活性を示す抗原の発現のために最適化されている。本発明の一態様では、腫瘍ワクチン接種に使用される栄養膜細胞は、前記多能性幹細胞から、（ａ）侵襲性；（ｂ）免疫回避；および／または（ｃ）血管新生を含む生物活性の群から選択される生物活性を発現するように分化している。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施形態による、ブタ肝臓抽出物でも対照でもなく、ブタ胎盤ワクチン（異種）で免疫処置されたＣ５７／ＢＬ６マウスにおけるＢ−１６腫瘍増殖の予防を示す表である。
【図２】本発明の一実施形態による、ブタ肝臓抽出物でも対照でもなく、ブタ胎盤ワクチン（異種）で免疫処置されたＣ５７／ＢＬ６マウスにおけるＢ−１６腫瘍増殖の予防を示す表である。
【図３】本発明の一実施形態による、ブタ肝臓抽出物でも対照でもなく、ブタ胎盤ワクチン（異種）で免疫処置されたＣ５７／ＢＬ６マウスにおけるＢ−１６腫瘍増殖の予防を示す表である。
【図４】本発明の一実施形態による、アジュバントとして同系のＤＣを使用して、異種胎盤抽出物による免疫処置を示す表である。
【図５】本発明の一実施形態による、アジュバントとして同系のＤＣを使用して、異種胎盤抽出物による免疫処置を示す表である。
【図６】本発明の一実施形態による、アジュバントとして同系のＤＣを使用して、異種胎盤抽出物による免疫処置を示す表である。
【図７】本発明の一実施形態による、Ｂ１６細胞溶解物ワクチン接種と異種胎盤ワクチン接種との間の相乗作用を示す表である。
【図８】本発明の一実施形態による、結腸癌マウスモデルの処置における異種胎盤抽出物の治療効果を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
別段の記載がない限り、本文書中で使用される定義および科学用語は、当業者が一般常識として解釈する意味を有する。本文書中で考察または参照される方法論は、当業者により一般に十分理解され、通常使用されるものである。さらに、別に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、開示の本発明が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。具体的には、以下の用語および語句は以下の意味を有する。
【００１７】
「癌の治療」、「癌の阻害」、「癌増殖の低減」は、癌細胞の腫瘍形成活性を阻害または予防することを指す。腫瘍形成活性には、癌細胞の遊走、浸潤、薬剤抵抗性、細胞生存、足場非依存性増殖、細胞死シグナルに対する非応答性、血管新生、またはそれらの組合せを阻害することが含まれ得る。
【００１８】
「癌」、「癌細胞」、「腫瘍」、および「腫瘍細胞」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、一般に、細胞の制御されない異常増殖（例えば、新生物）を特徴とする一群の疾患を指す。癌の一部の形態では、癌細胞は、局所的にまたは血流およびリンパ系を通して、他の身体各部に拡散することがある（「転移癌」）。「ｅｘ  ｖｉｖｏ活性化リンパ球」、「抗腫瘍活性が増強されたリンパ球」、および「樹状細胞サイトカインに誘導されたキラー」は、互換的に使用される用語であり、本発明の文脈内では、ｅｘ  ｖｉｖｏで活性化され、その後再導入される細胞組成物を指す。
【００１９】
「リンパ球」という単語が使用されるが、これには、樹状細胞、ＮＫＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、および他の種々の自然免疫および適応免疫細胞を含む、ｅｘ  ｖｉｖｏ培養工程中に広がった不均一細胞も含まれる。本明細書で使用される場合、「癌」は、白血病、癌腫、および肉腫を含む、動物に見出されるあらゆるタイプの癌または新生物または悪性腫瘍を指す。癌の非限定例としては、脳、黒色腫、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、頭頸部、腎臓、肺、非小細胞肺、中皮腫、卵巣、前立腺、肉腫、胃、子宮、および髄芽腫の癌がある。
【００２０】
「白血病」という用語は、広義には、造血器官／系の進行性の悪性疾患を意味し、一般に、血液および骨髄中の白血球およびその前駆体の異常な増殖および発生を特徴とする。白血病の非限定例としては、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、無白血病性白血病、白血球血症性白血病（ｌｅｕｋｏｃｙｔｈｅｍｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、好塩基球性白血病、芽細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄球性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、未分化細胞性白血病、有毛状細胞性白血病、血球芽細胞性白血病（ｈｅｍｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、血球芽細胞性白血病（ｈｅｍｏｃｙｔｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、組織球白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ向性白血病、リンパ様白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、および前骨髄球性白血病が挙げられる。
【００２１】
「癌腫」という用語は、周辺組織に浸潤し、かつ／または生理学的および非生理学的細胞死シグナルに抵抗性で転移を起こしやすい上皮細胞で構成される悪性新生物を指す。癌腫の非限定的な例示的タイプとしては、腺房癌、小葉癌、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌、腺癌、副腎皮質癌、肺胞腺癌、肺胞上皮癌、基底細胞癌（ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、類基底細胞癌、基底扁平細胞癌（ｂａｓｏｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、細気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支原性癌、大脳様癌、胆管細胞癌、絨毛癌、膠様癌、面皰癌、子宮体部癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円柱状癌、円柱細胞癌、腺管癌、硬性癌、胎生期癌、脳様癌、類表皮癌（ｅｐｉｅｎｎｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺上皮癌、外向発育癌、潰瘍癌、線維癌、膠様癌（ｇｅｌａｔｉｎｉｆｏｒｍ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膠様癌（ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、バレイショ状癌、回転楕円面細胞癌、紡錘体細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌、有棘細胞癌、紐様癌（ｓｔｒｉｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、血管拡張癌、毛細血管拡張症様癌、移行上皮癌、結節癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節癌（ｔｕｂｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣状癌、絨毛癌、巨大細胞癌、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母癌、血様癌、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、硝子状癌、副腎様癌（ｈｙｐｅｍｅｐｈｒｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳児胎生期癌、上皮内癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）、表皮内癌、上皮内癌（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロムペッヘル癌（Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ´ｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クルチツキー細胞癌（Ｋｕｌｃｈｉｔｚｋｙ−ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、大細胞癌、レンズ状癌（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫様癌、リンパ上皮癌、髄様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、悪性黒色腫、軟性癌、粘液性癌、粘液分泌癌、粘液細胞癌、粘液性類表皮癌、粘液癌、粘液性癌、粘液腫様癌、上咽頭癌、燕麦細胞癌、骨化性癌、類骨癌（ｏｓｔｅｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳頭状癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌腫、軟性癌、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫様癌、シュナイダー癌、硬性癌、および陰嚢癌が挙げられる。
【００２２】
「肉腫」という用語は、一般に、胎児結合組織のような物質で構成され、一般に、原線維性の不均一または均一な物質中に埋まった密に詰まった細胞で構成される腫瘍を指す。肉腫としては、以下に限定されるものではないが、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、アバーネシー肉腫（Ａｂｅｍｅｔｈｙ´ｓ  ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ  ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、胞巣状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫（ｃｈｌｏｒｏｍａ  ｓａｒｃｏｍａ）、絨毛癌、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、顆粒球肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫肉腫、傍骨性骨肉腫、細網肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、および毛細血管拡張性肉腫が挙げられる。
【００２３】
さらなる例示的な新生物としては、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵臓インスリノーマ（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｎｓｕｌａｎｏｍａ）、悪性カルチノイド、前癌皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、泌尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、および副腎皮質癌が挙げられる。
【００２４】
本発明の一部の特定の実施形態では、治療される癌は黒色腫である。「黒色腫」という用語は、皮膚および他の器官のメラニン細胞系から発生する腫瘍を意味すると解釈される。黒色腫の非限定例としては、ハーディング−パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性メラノーマ、末端黒子型黒色腫、無色性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫（Ｃｌｏｕｄｍａｎ´ｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、Ｓ９１黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫（ｓｕｂｕｎｇａｌ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、および表在拡大型黒色腫がある。
【００２５】
用語「ポリペプチド」という用語は、「ペプチド」、「改変されたペプチドリガンド」、および「フルオロ炭酸ペプチド（ｆｌｏｕｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」と互換的に使用される。
【００２６】
「薬学的に許容される担体」という用語は、すべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。従来のいかなる媒体または薬剤でも、投与される活性化合物と適合しない場合を除いて、医薬組成物中でそれを使用することが考えられる。二次的な活性化合物も本明細書に記載の組成物に組み込むことができる。
【００２７】
「Ｔ細胞」という用語は、Ｔリンパ球とも呼ばれ、免疫応答に関与するリンパ球の中で胸腺に由来する細胞を意味する。Ｔ細胞には、ＣＤ８ポジティブＴ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞：ＣＴＬ）、ＣＤ４ポジティブＴ細胞（ヘルパーＴ細胞）、サプレッサーＴ細胞、制御性Ｔ細胞などの調節性Ｔ細胞、エフェクター細胞、ナイーブＴ細胞、記憶Ｔ細胞、ＴＣＲアルファ鎖およびベータ鎖を発現するアルファベータＴ細胞、およびＴＣＲガンマ鎖およびデルタ鎖を発現するガンマデルタＴ細胞のいずれも含まれる。Ｔ細胞には、Ｔ細胞への分化が方向づけられているＴ細胞の前駆細胞が含まれる。
【００２８】
「Ｔ細胞を含有する細胞集団」の例としては、血液（末梢血、臍帯血等）および骨髄液などの体液に加えて、体液から採取、単離、精製、または誘導された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血細胞、造血幹細胞、臍帯血単核細胞等を含有する細胞集団が挙げられる。
【００２９】
さらに、Ｔ細胞を含有しかつ造血細胞に由来する種々の細胞集団を、本発明では使用することができる。種々の実施形態では、これらの細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＩＬ−２などのサイトカインにより活性化されたものでもよい。これらの細胞として、生体から採取された細胞またはｅｘ  ｖｉｖｏ培養により得られた細胞、例えば、本発明の方法により得られたそのままのＴ細胞集団または凍結保存により得られたＴ細胞集団のいずれも使用することができる。「抗体」という用語は、インタクトな分子および抗原結合部位を含むそのフラグメントの両方を含むことを意図する。全抗体構造は、Ｈ２Ｌ２として示される場合が多く、抗体が２つのアミノ酸軽鎖（Ｌ）と２つのアミノ酸重鎖（Ｈ）とを一般に含む事実を指す。両鎖とも、構造的に相補的な抗原標的と相互作用することができる領域を有する。
【００３０】
標的と相互作用する領域は、「可変」または「Ｖ」領域と呼ばれ、異なる抗原特異性の抗体とはアミノ酸配列が異なるという特徴がある。Ｈ鎖またはＬ鎖のいずれかの可変領域が、抗原標的に特異的に結合することができるアミノ酸配列を含有する。これらの配列内に、特異性が異なる抗体間で極端に可変性があるため「超可変」と呼ばれるさらに小さな配列がある。このような超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」領域とも呼ばれる。これらのＣＤＲ領域により、特定の抗原決定基構造に対する抗体の基本的な特異性が説明される。
【００３１】
ＣＤＲは、可変領域内に不連続なアミノ酸ストレッチを示すが、種にかかわらず、可変重鎖および軽鎖領域内のこれらの重要なアミノ酸配列の所在位置は、可変鎖のアミノ酸配列内の同様な位置にあることが見出されている。すべての抗体の可変重鎖および軽鎖はそれぞれ、３つのＣＤＲ領域を有し、それぞれのＣＤＲは、軽鎖（Ｌ）および重鎖（Ｈ）それぞれについて、他のＣＤＲ（ＬＩ、Ｌ２、Ｌ３、ＨＩ、Ｈ２、Ｈ３と称される）と連続していない。
【００３２】
本発明による開示の抗体は、全面的に合成されたものであってもよく、抗体のポリペプチド鎖は合成され、おそらく、受容体として本明細書に開示のポリペプチドに対する結合について最適化されている。このような抗体は、キメラ抗体であってもヒト化抗体であってもよく、構造的に完全に四量体であっても二量体であってもよく、単一重鎖と単一軽鎖のみを含むものでもよい。
【００３３】
「有効量」または「治療有効量」という用語は、治療される疾患状態の１つまたは複数の症状を治療、抑制、もしくは緩和するか、またはそうでなければ所望の薬理学的および／または生理的な効果を与える、特に選択した抗原に対するＴ細胞応答を亢進させるのに十分な投与量を意味する。正確な投与量は、被験体に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健全性等）、疾患、および投与処置などの種々の要因に応じて変わることになる。
【００３４】
「個体」、「宿主」、「被験体」、および「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、以下に限定されるものではないが、霊長類、例えばヒト、ならびにマウスおよびラットなどのげっ歯類および他の実験動物を含む哺乳動物を指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「治療レジメン」という用語は、疾患の治療、あるいは所望の生理学的変化、例えば、抗原または免疫源に対する免疫系の応答の増大または低下、例えば、そのような応答に関与する１つまたは複数の細胞または細胞型の数または活性の増大または低下を達成するための方法を指し、前記治療または方法は、動物、例えば哺乳動物、特にヒトに、疾患を有効に治療するかまたは前記生理学的変化をもたらすのに十分な量の、前記レジメンの２つ以上の化学薬剤または成分を投与することを含み、前記化学薬剤または成分は、同じ組成物の一部としてなど一緒に投与されるか、または個別にかつ同時もしくは異なる時に独立して投与され（すなわち、各薬剤または成分の投与は、その薬剤または成分の１つまたは複数とは、有限時間分離される）、前記１つまたは複数の薬剤または成分の投与により、単独でまたは分離して投与される場合における前記薬剤または成分のいずれの投与よりも良好な結果が得られる。
【００３６】
「アネルギー」および「不応答性」という用語は、刺激、例えば活性化受容体またはサイトカインによる刺激に対する免疫細胞の不応答性を含む。アネルギーは、例えば、免疫サプレッサーへの曝露または高用量の抗原への曝露により起こり得る。そのようなアネルギーは、一般に抗原特異的であり、寛容化する抗原への曝露が終了した後でも継続する。例えば、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞におけるアネルギーは、サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）−２を産生しないことを特徴とする。Ｔ細胞アネルギーおよび／またはＮＫ細胞アネルギーは、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の抗原への曝露に際して、第１のシグナル（ＴＣＲまたはＣＤ−３を介するシグナル）が、第２のシグナル（共刺激シグナル）の非存在下で受け取られる場合に、部分的に生じる。
【００３７】
用語「Ｔ細胞機能の増強」、「細胞傷害性の増強」、および「活性の増強」は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞のエフェクター機能が向上していることを意味する。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の機能の増強には、本発明を限定するものではないが、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖速度の亢進、サイトカインの産生量の増加、または細胞傷害性の亢進が含まれる。さらに、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の機能の増強には、アネルギー（不応答）状態などの抑制状態または休止状態にあるＴ細胞および／またはＮＫ細胞の寛容性の解除および抑制、すなわち、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が抑制状態から、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が外部からの刺激に対して応答する状態に移ることが含まれる。
【００３８】
「発現」という用語は、遺伝子、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドなどの核酸から、転写によりｍＲＮＡが生成すること、またはｍＲＮＡから転写によりタンパク質もしくはポリペプチドが生成することを意味する。発現は、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む手段により検出することができる。
【００３９】
「発現の抑制」は、抑制がない場合と比較して、転写産物量または翻訳産物量が顕著に減少することを指す。本明細書における発現の抑制は、例えば、３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、最も好ましくは９０％以上の転写産物量または翻訳産物量の減少を示す。
【００４０】
栄養膜は、ヒト胎盤の形成に関与する細胞の前駆体となる細胞である。胚が分化を開始する場合、胚盤胞の段階では、内部細胞塊中の細胞は胚になる細胞を形成するようにコミットされているが、胚盤胞の外部細胞は胎盤の発生に関与するようにコミットされるようになる。ヒト栄養膜細胞株は、形質転換された胎盤細胞から作製されたものであるが、これは本発明の実施に有用となり得る。本発明の実施において、「栄養膜」には、比較的未分化な絨毛性細胞栄養膜、中間の細胞栄養膜、最終分化した絨毛性合胞栄養膜、および母体脱落膜に浸潤する絨毛外性細胞栄養膜が含まれる。これらの分化した栄養膜は、推定される栄養膜幹細胞集団から発生し、絨毛状の基底膜に細胞集団が含有されると提案されている。
【００４１】
本発明の一実施形態では、第１のトリメスター期間（妊娠６週目から９週目の間）に妊娠を終了することを自発的に選んだ患者から絨毛膜絨毛組織を得る。ＨＥＰＥＳ（２５ｍｍｏｌ）、ＤＮアーゼ１、およびコラゲナーゼ（１５Ｕ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中、３７℃で３０分間、撹拌しながら組織を細かく刻み分離することにより、絨毛性栄養膜細胞層細胞を単離する。分散した細胞を、網ふるい（直径４０μｍの孔）による濾過により分離し、１０％ＦＣＳの存在下で保存する。パーコール勾配遠心分離の後、細胞を、約１×１０６個の単分散細胞の状態で得る。細胞は種々の培地中で培養することができ、一実施形態では、栄養膜細胞層細胞を、１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ培地中で培養する。培養物への他の添加物、例えば、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ｕＭの２−メルカプトエタノール、およびマウス胚線維芽細胞の馴化培地を使用してもよい。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「１つ（「ａ」または「ａｎ」）」という単語は、特許請求の範囲および／または明細書中の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と併せて使用される場合、「１つ」を意味し得るが、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは２つ以上」の意味とも一致する。
【００４３】
「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、互換的であり、これらの用語がオープンエンド形式の用語であることを当業者は承知している。
【００４４】
「胚性生殖細胞」または「ＥＧ細胞」は、精子または卵子を生じるように運命づけられている胚または胎仔の始原生殖細胞に由来する細胞である。ＥＧ細胞は、本発明により培養することができる胚性幹細胞の１つである。
【００４５】
「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」は、動物（例えば、ヒトなどの霊長類）の胚、好ましくは、約８週齢未満の胚から得られる細胞である。始原的な胚性幹細胞を単離するために好ましい胚形成期には、着床前段階の胚の桑実胚または胚盤胞段階が含まれる。細胞を幹細胞とみなすための周知の基準を本明細書では用いるとする。例えば、参照によりその内容全体が組み込まれる、Ｈｏｆｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：６９９−７０８，２００５を参照されたい。
【００４６】
「細胞外マトリックス」（ＥＣＭ）または「マトリックス」とは、支持細胞により合成される細胞外マトリックスにより提供される状態と同じ細胞増殖を支持する状態を実質的に提供する１つまたは複数の物質を指す。マトリックスは基質上に用意することができる。あるいは、マトリックスを含む成分は、溶液で用意することができる。このように、ＥＣＭは、細胞の外部に固定化される分泌分子を基本的にすべて包含する。ＥＣＭは、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、細胞外空間に秩序を与え、分化した組織および器官を確立、分離、および維持することと関連する機能を果たす。ＥＣＭは、例えば結合組織および基底膜の中に見出される複雑な構造であり、基底層とも呼ばれる。結合組織は、典型的には、細胞から天然に分泌されるＥＣＭに取り囲まれた単離細胞を含有する。ＥＣＭの成分は、増殖因子および分化因子、サイトカイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、組織メタロプロテアーゼ阻害因子（ＴＩＭＰ）、および細胞の増殖、遊走、および分化を調節する他の可溶性因子と相互作用および／または結合することが示されている。ＥＣＭおよびその成分の説明は、とりわけ、Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ，Ａｎｃｈｏｒ，ａｎｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２ｄ  ｅｄ．，Ｋｒｅｉｓ  ａｎｄ  Ｖａｌｅ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９（「Ｋｒｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．」）；Ｇｅｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：７９３−８０３，２００１；ｌｏｚｚｏ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．；Ｂｏｕｄｒｅａｕ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３９：４８１−８８，１９９９；Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｔｒｅｕｌｉ  ａｎｄ  Ｇｒａｎｔ，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２０００；Ｍｅｔｚｌｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ，２ｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１，２００１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏに見つけることができる。これらのそれぞれは、その内容全体が参照により組み込まれる。
【００４７】
「多能性」とは、必ずしもすべての細胞型である必要はないが、複数の異なる細胞型の１つに分化することができる細胞を指す。多能性細胞の非限定的な例示的クラスとして、胚性幹細胞があり、これは人体のいかなる細胞型にも分化することができる。したがって、多能性細胞は、複能性細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）および他の分化が進行した細胞型に分化することができるが、逆分化の過程（すなわち、脱分化）は、もっと複雑であると考えられ、初期状態に近くなるように細胞の「初期化」を必要とすることが認識されよう。これは、初期化後、細胞は初期化前に可能であった細胞型よりも多くのまたは異なる細胞型に分化する能力を有するようになることを意味する。本発明により培養される、霊長類の始原幹細胞を含む幹細胞は、任意の適切な技術を使用して任意の適切な供給源から得ることができる。例えば、ヒト始原幹細胞を単離し増殖させるための手順は、米国特許第６，０９０，６２２号明細書に記載されている。アカゲザルおよび他の非ヒト霊長類の始原幹細胞を得るための手順は、国際公開第９６／２２３６２号パンフレットに記載されている。加えて、アカゲザルの始原幹細胞を単離するための方法は、Ｔｈｏｍｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８４４−７８４８，１９９５に記載されている。
【００４８】
「幹細胞」には、ヒトまたは非ヒト供給源由来にかかわらず、いかなる幹細胞または前駆細胞も含まれ、また前駆細胞の特徴を保持する、幹細胞由来の細胞も含まれる。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、例えば、ヒトのｉｎ  ｖｉｖｏ着床前胚、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚、または胚盤胞段階に拡大増殖した１細胞ヒト胚から得られる胚盤胞から単離することができる。例えば、Ｂｏｎｇｓｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．４：７０６を参照されたい。
【００４９】
ヒト胚は、Ｇ１．２およびＧ２．２培地中で培養して胚盤胞段階にすることができる。例えば、Ｇａｒｄｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６９：８４（１９９８）を参照されたい。プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）に短時間曝露することにより胚盤胞から透明帯を除去する。内部細胞塊は、免疫手術または機械的分離により単離することができ、マウス胚支持細胞層上にまたは本明細書に記載の合成培養系に播種する。９〜１５日後、内部細胞塊に由来する増殖物は、１ｍＭのＥＤＴＡを含む、カルシウムおよびマグネシウム不含リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に曝露するか、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、もしくはトリプシンに曝露するか、またはマイクロピペットにより機械的に解離させることにより、凝集塊に解離させる。次いで、解離細胞を、前のように新たな培地中に再播種し、コロニー形成について観察する。未分化形態を示すコロニーを、マイクロピペットにより個々に選択し、機械的に解離して凝集塊にし、再播種する。
【００５０】
胚性幹細胞様形態は、見かけ上高い核対細胞質比および目立つ核小体を有するコンパクトなコロニーとして特徴付けられる。次いで、得られた胚性幹細胞を、短時間トリプシン処理し、ダルベッコのＰＢＳ（カルシウムもマグネシウムも不含で、２ｍＭのＥＤＴＡを含有）に曝露し、ＩＶ型コラゲナーゼ（約２００Ｕ／ｍＬ）に曝露することによって、または例えばマイクロピペットを使用して機械的に解離させることにより個々のコロニーを選択することによって、１〜２週間ごとにルーチン的に分割する。
【００５１】
幹細胞は、単細胞レベルにおいて、自己再生する能力ならびに自己再生前駆体、非再生前駆体、および最終分化細胞を含む子孫細胞を産生するように分化する能力の両方を有することによって定義される未分化細胞である。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）から種々の細胞系列の機能細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化する能力、および移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、かつ胚盤胞への注入後にすべてではないにしてもほとんどの組織に実質的に寄与する能力によっても特徴づけられる。
【００５２】
幹細胞は、以下のようにその発生上の能力により分類される：（１）全能性−すべての胚細胞型および胚外細胞型を生じさせることができる；（２）多能性−すべての胚細胞型を生じさせることができる；（３）複能性−細胞系列のサブセットであるが、特定の組織、器官、または生理系内のすべてを生じさせることができる（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血液細胞に限定される少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）前駆体、および血液の正常成分であるすべての細胞型および要素（例えば、血小板）を含む子孫を産生することができる）；（４）少能性−複能性幹細胞よりも限定された細胞系列のサブセットを生じさせることができる；および（５）単能性−単一細胞系列を生じさせることができる（例えば、精子形成幹細胞）。
【００５３】
癌は、種々の型の悪性新生物および腫瘍を指し、原発腫瘍および腫瘍転移を含む。本発明のセンサーアレイおよび系により検出することができる癌の非限定例としては、脳、卵巣、結腸、前立腺、腎臓、膀胱、乳房、肺、口腔、および皮膚の癌がある。癌の特定例としては、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、および混合型腫瘍がある。特定の腫瘍カテゴリとしては、リンパ球増殖性疾患、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮体癌、骨癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部癌、中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、皮膚癌、腎臓癌、および上記のすべての癌の転移が挙げられる。特定の腫瘍型としては、肝細胞癌、肝細胞腫、肝芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、神経節芽細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋皮肉腫（ｒｈａｂｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、浸潤性腺管癌、乳頭腺癌、黒色腫、肺有棘細胞癌、基底細胞癌、腺癌（高分化型、中分化型、低分化型、および未分化型）、細気管支肺胞上皮癌、腎細胞癌、副腎腫、副腎様腺癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、および大細胞肺癌を含む肺癌、膀胱癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、結腸癌、直腸癌、すべての型の白血病を含む造血悪性腫瘍、ならびに急性骨髄性白血病、急性骨髄球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、肥満細胞白血病、多発性骨髄腫、骨髄性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫が挙げられる。
【００５４】
「実質的に未分化」とは、幹細胞（例えば、霊長類始原幹細胞）の集団が、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、７０％、または８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の未分化幹細胞を含有することを意味する。所望の未分化状態（例えば、始原状態）を表す１つまたは複数のマーカーに対する標識抗体またはレポーター遺伝子／タンパク質（例えば、高感度緑色蛍光タンパク質またはＥＧＦＰ）を使用する蛍光標識細胞分取を使用して、所与の幹細胞集団のうち未分化の細胞の数を測定することができる。この評価を行う目的で、未分化状態と関連する１つまたは複数の細胞表面マーカー（例えばＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１）を検出することができる。
【００５５】
テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）活性およびアルカリホスファターゼもアッセイすることができる。霊長類始原幹細胞の文脈において、ポジティブおよび／またはネガティブセレクションを使用して、例えば、免疫染色またはレポーター遺伝子（例えば、ＥＧＦＰ）の使用によって、特定のマーカーの発現（またはその欠如）（例えば、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ネスチン、テロメラーゼ、Ｍｙｃ、ｐ３００、およびＴｉｐ６０ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、およびアルカリホスファターゼ活性）、または特定の翻訳後修飾（例えば、アセチル化ヒストン）の存在を検出することができ、それによって自己再生または細胞分化の状態の評価が容易になる。
【００５６】
「全能性」とは、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞、神経幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、心筋細胞、神経細胞、星状細胞、筋細胞、および結合組織細胞など、多能性細胞、複能性細胞、および完全に分化した細胞（すなわち、種々の細胞型にもはや分化できない細胞）を含む、いかなる細胞型にも分化することができる細胞を指す。分子遺伝学および遺伝子工学の一般的方法は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．）；および「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）の最新版に記載されている。細胞生物学、タンパク質化学、および抗体技術は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」（Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、および「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．）に見つけることができる。本開示で言及された遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、およびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎＴｅｃｈ、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏなどの商用ベンダーから入手可能である。
【００５７】
量、一定期間等の計測可能な値に言及する場合に本明細書で使用される「約」とは、所定値の±２０％、±１０％、±５％、±１％、および±０．１％の変動を包含することを意図するものであり、このような変動は開示方法の実施にとって妥当なものである。
【００５８】
本発明の特定の実施形態を以下に記載する。本発明の実施形態では、免疫抑制および腫瘍抗原の供給源として異種胎盤の利用を教示する。異種胎盤またはそれに由来する生成物を使用するレシピエントの免疫処置によって、免疫抑制因子および腫瘍関連腫瘍抗原に対する免疫応答を刺激することができる。この免疫応答により、胎盤で見出される免疫抑制化合物と相同性を有する内因性免疫抑制因子が中和され得る。この調製物の異種成分が、同種異系の胎盤組織による免疫処置に比較して、より強固な免疫応答を刺激することにとって重要であることが発見された。具体的には、癌に罹患した宿主を、当技術分野で公知の方法により精製された胎盤抽出物で免疫処置することができる。本発明の具体的な適用としては、以下に限定されるものではないが、ヒト癌患者への免疫処置のためにブタ由来の異種胎盤を利用することが可能である。分娩する雌ブタから得られる胎盤組織を入手して、５％のペニシリン−ストレプトマイシン混合物を含有する無菌リン酸緩衝生理食塩水中で洗浄する。次いで、５０ｍｌのチューブに入れた胎盤組織（約１ｇの組織／チューブ）を、電子ホモジナイザー（Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ２５−Ｓ１；Ｊａｎｋｅ  ＆  Ｋｕｎｋｅｌ  ＫＧ，Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、無菌生理食塩水中で直ちにホモジナイズする。ホモジナイゼーションに続いて、チューブを１０００ｇで１時間回転させ、組織デブリをペレットにする。次いで、全タンパク質内容物を当技術分野で公知の方法を使用して濃縮する。
【００５９】
特定の一実施形態では、胎盤タンパク質の濃縮は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．製のＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジなどの固相抽出カラムによって遂行する。別の実施形態では、上清を凍結乾燥し、脱塩用の１０００Ｄａ超の透析チューブ中で濃縮する。次いで、精製されたタンパク質を、腫瘍免疫処置に関する以前の研究に基づいて、１，１２５ｕｇ〜２，０００ｕｇの間の濃度で患者に注射する。例えば、Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ，Ａ．Ｃ．，Ｔ．Ｈ．Ｓｔｅｗａｒｔ，ａｎｄ  Ｒ．Ｂ．Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ，Ｄｅｌａｙｅｄ−ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｌｕｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，１９７４．５２（２）：ｐ．３２７−３８を参照されたい。注射スケジュールとしては、腕の三角筋部などへの皮下投与での月１回の注射が挙げられる。
【００６０】
注射プロトコールは、患者の必要性に応じて調整することができる。加えて、免疫処置は、当技術分野で公知の他の方法によって実施してもよく、例えば、注射（例えば、皮下、皮内、筋肉内）、エアロゾル、経口、経皮、髄腔内、経粘膜、胸膜腔内、または一般に使用される経路によるものがある。ワクチン調製物の変更形態には、アジュバントとの同時投与、またはＤＣをパルスするための抗原供給源としてのタンパク質調製物の利用、およびワクチン接種調製物としてのパルスＤＣの使用を挙げることができる。
【００６１】
本発明の別の実施形態には、ワクチン源としての精製されたブタ栄養膜の投与がある。前記栄養膜は、当技術分野で公知の方法により精製することができる。一方法は以下のとおりである：約３０ｇの胎盤絨毛叢の塊を生理食塩水中ですすぎ、膜および結合組織から分離し、次いで、はさみで粗く切り刻み、０．１８５％のトリプシン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、および０．４ｍｇ／ｍｌのＩ型ＤＮアーゼを含有する、カルシウムおよびマグネシウム不含のハンクス液に移す。次いで、５分ごとに撹拌しながら、３７℃で３０分間、水浴中で組織をインキュベートする。次いで、上清のアリコートを子ウシ血清の上に重層し、室温で５分間、１０００ｇで遠心する。次いで、ペレットをパーコール勾配の上に重層し、Ｒｅｉｓ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，ｕｒｏｃｏｒｔｉｎ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｌａｃｅｎｔａ，２００２．２３（６）：ｐ．５２２−５にある報告のように、約３５％パーコールレベルを使用して精製する。前記栄養膜は、サイトケラチン、ビメンチン、およびＣＤ４５の染色により判定すると、約９５％の純度である。栄養膜は、必要に応じて、約１０７〜１０８個の細胞を癌患者に注入することができる。あるいは、精製された栄養膜は、ワクチン接種のための異種タンパク質源として利用することができる。タンパク質抽出は、当技術分野で詳細に記載されており、凍結融解サイクルまたはホモジナイザーの使用により実施することができる。
【００６２】
他の栄養膜細胞株が、マウス、ブタ、およびヒトを含む種々の種から作製されている。これらの代替細胞株の異種レシピエントへの利用は、本発明の他の実施形態を表わす。増殖および成長を阻害するために、細胞株を照射することができる。免疫原性を高めるために、インターフェロンガンマまたは細胞上のＭＨＣ  ＩＩなどの免疫原性分子の発現を増大させることが公知の他の薬剤による前処理によって免疫刺激分子を発現するように、栄養膜細胞株を誘導する。細胞株の免疫原性は、以下の方法など当技術分野で公知の方法により高めることができる：（１）免疫刺激サイトカインまたは膜タンパク質、例えば、それぞれＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６によるトランスフェクション；（２）高熱またはフリーラジカルストレスなどの「ストレッサー」の投与；および／または（３）ＩＬ−１０など内因的に発現される免疫抑制分子の阻害。
【００６３】
ＤＣのトランスフェクションのために胎盤抽出物由来のｍＲＮＡを利用することにより、開示の本発明を実行する別の方法が生まれる。胎盤組織由来のＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ試薬の利用など当技術分野で公知の方法を使用して抽出することができる。ＤＣにトランスフェクトされた精製ＲＮＡから、内因性経路を介してＤＣによりプロセシングされるようになる抗原タンパク質の翻訳が始まる。この方法は、腫瘍由来ＲＮＡを使用して腫瘍ワクチンを作製するためにＧｉｌｂｏａのグループが利用した。トランスフェクトされたＤＣは、ＬＰＳおよび／もしくはＴＮＦ−アルファ、ならび／またはポリ（ＩＣ）などのｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストの投与など当技術分野で公知の方法を使用して成熟するように誘導することができる。次いで、成熟または未成熟ＤＣを、免疫刺激のために癌患者に注入することができる。
【００６４】
抗異種応答は高度に強力かつ強固であるが、アジュバントの添加により、胎盤調製物の免疫原性をさらに高めることができる。免疫刺激に適したアジュバントは当業者に周知であり、ＢＣＧ、Ｄｅ−Ｔｏｘ、または非メチル化ｃｐｇモチーフとの同時投与が含まれる。
【００６５】
一実施形態では、本発明は、殺腫瘍能を有する細胞集団を生成させる手段を提供する。具体的には、５０ｍｌの末梢血を癌患者から採取し、フィコール法を使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離する。次いで、ＰＢＭＣを１０ｍｌのＳＴＥＭ−３４培地に再懸濁し、プラスチック表面上に２〜４時間付着させる。次いで、ハンクス緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）中で緩やかに洗浄することにより非付着細胞を除去した後、付着細胞を、１，０００Ｕ／ｍＬの顆粒球−単球コロニー刺激因子および５００Ｕ／ｍＬのＩＬ−４を添加したＳＴＥＭ−３４培地中で３７℃にて培養する。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を添加した培地の容量の半分を一日おきに交換する。未成熟ＤＣを７日目に回収する。
【００６６】
特定の実施形態では、作製したＤＣを使用して、異種抗原と共インキュベートすることにより、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の殺腫瘍活性を刺激する。異種抗原の供給源としては、以下に限定されるものではないが、異種腫瘍またはその抽出物が挙げられる。種々の実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化するために、栄養膜抽出物を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト樹状細胞をパルスする。栄養膜抽出物は、胎盤組織、または高濃度の栄養膜を含有するように精製された胎盤組織を溶解させることにより作製する。より具体的には、抗原として使用する前に、栄養膜をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養して増殖させる。
【００６７】
ヒト胎盤に加えて、ブタ、マウス、イヌ、ウシ、ウマの栄養膜を使用することができる。特定の一実施形態では、血絨毛型胎盤を有する哺乳動物の胎盤から栄養膜を単離する。具体的には、作製したＤＣは、フローサイトメトリーソーティングまたは磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）を使用して培養物からさらに精製してもよく、または半精製集団として患者に投与してもよい。ＤＣは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＮＫおよびＴ細胞活性を刺激するというコンセプトの下で、治療を必要とする前記患者に加えてもよく、あるいは、他の実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含有する細胞集団と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートしてもよい。
【００６８】
種々の特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟を刺激することができる薬剤にＤＣを曝露する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟を刺激する非限定的手段としては、ＤＣまたはＤＣ含有集団をｔｏｌｌ様受容体アゴニストと培養することが挙げられる。ＤＣ成熟を達成する別の手段には、約２０ｎｇ／ｍＬ濃度のＴＮＦ−アルファにＤＣを曝露することがある。
【００６９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化するために、約１０００ＩＵ／ｍｌのインターフェロンガンマを含有する培地中で細胞を培養する。インターフェロンガンマと一緒のインキュベーションは、２時間〜７日間実施することができる。好ましい実施形態では、インキュベーションを約２４時間実施し、その後Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を、胎盤抗原の存在下で、ＣＤ３およびＣＤ２８により刺激する。胎盤抗原は、同種異系、同系、または異種である。これを達成する一手段として、これらの受容体を活性化することができる抗体の添加によるものがある。
【００７０】
例示的な一実施形態では、約１ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８と一緒に、約２ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体を添加する。Ｔ細胞およびＮＫ細胞の生存を促進しかつ増殖を刺激するために、Ｔ細胞／ＮＫ有系分裂促進物質を使用する。特定の一実施形態では、サイトカインＩＬ−２を利用する。本発明の実施に有用なＩＬ−２濃度の一例は、約５００ｕ／ｍＬである。ＩＬ−２および抗体を含有する培地は、約８〜１４日間、４８時間ごとに交換する。特定の一実施形態では、腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を付与するために、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞にＤＣを含める。特定の実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞のアポトーシスの割合を低下させるように、カスパーゼ阻害剤を培養物に添加する。作製した細胞を、以下に限定されるものではないが、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、動脈内、静脈内（カテーテルの留置を含む）、腫瘍内、または輸入リンパ管中を含む、適切な手段によって被験体に投与する。
【００７１】
一実施形態では、異種免疫処置による腫瘍への免疫刺激は、ＩＬ−２などの公知の免疫刺激剤と組み合わせることができる。過剰免疫処置が有害事象をもたらし得る場合、免疫刺激と一緒に静脈内アスコルビン酸（ＡＡ）を利用することが、本明細書に提供される本発明により企図される。ＡＡには全身性炎症プロセスに有益な効果がある。例えば、敗血症様状態を誘導するためにクレブシエラ肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）をチャレンジした後、アスコルビン酸欠乏動物では、対照に比較して、３倍高い死亡率が観察されることが、一マウス実験で示された。例えば、Ｇａｕｔ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｆａｉｌｓ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ，２００６．４０（９）：ｐ．１４９４−５０１；およびＴｙｍｌ，Ｋ．，Ｆ．Ｌｉ，ａｎｄ  Ｊ．Ｘ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓｅｐｔｉｃ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｂｙ  ａｓｃｏｒｂａｔｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，２００８．３６（８）：ｐ．２３５５−６２を参照されたい。
【００７２】
他の実験では、ＡＡを過剰補給すると、敗血症関連低血糖、微小循環異常、および内皮応答性の鈍化に関し良好なアウトカムがもたらされることが示された。例えば、Ｓｈｅｎ，Ｋ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｅｕｇｅｎｏｓｅｄｉｎ−Ａ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｏｎ，ｈｙｐｅｒｇｌｙｃａｅｍｉａ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００５．５７（１）：ｐ．１１７−２５；Ｔｙｍｌ，Ｋ．，Ｆ．Ｌｉ，ａｎｄ  Ｊ．Ｘ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄｅｌａｙｅｄ  ａｓｃｏｒｂａｔｅ  ｂｏｌｕｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ  ｉｎ  ｓｅｐｔｉｃ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，２００５．３３（８）：ｐ．１８２３−８；Ｗｕ，Ｆ．，Ｋ．Ｔｙｍｌ，ａｎｄ  Ｊ．Ｘ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ａｓｃｏｒｂａｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉＮＯＳ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−  ａｎｄ  ＩＦＮ  ｇａｍｍａ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，２００２．５２０（１−３）：ｐ．１２２−６；Ｗｕ，Ｆ．，Ｊ．Ｘ．Ｗｉｌｓｏｎ，ａｎｄ  Ｋ．Ｔｙｍｌ，Ａｓｃｏｒｂａｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉＮＯＳ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ  ｖａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｏｆ  ｓｅｐｔｉｃ  ｍｉｃｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００３．２８５（１）：ｐ．Ｒ５０−６；およびＷｕ，Ｆ．，Ｊ．Ｘ．Ｗｉｌｓｏｎ，ａｎｄ  Ｋ．Ｔｙｍｌ，Ａｓｃｏｒｂａｔｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ａｒｔｅｒｉｏｌａｒ  ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｅｐｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ，２００４．３７（８）：ｐ．１２８２−９を参照されたい。
【００７３】
本明細書に開示の免疫刺激調製物の治療効果を最適化するために、これらの発見を利用することは本発明の範囲内である。ＡＡの使用のさらなる支持は、ＡＡおよびビタミンＥを使用して、敗血症性患者（免疫過剰活性化状態を示す敗血症）で実施された無作為化臨床試験から得られ、これは、酸化ストレスのパラメーターの低下と同様に、優れたアウトカムを示している。
【００７４】
最近の一試験では、全身性炎症の患者においてＡＡを単独で評価した。研究者らは、全身表面積の３０％超が傷害された熱傷患者について検討した。患者に静脈内ＡＡをｉ．ｖ．投与するか（６６ｍｇ／ｋｇ／時を２４時間、ｎ＝１９）、または標準医療のみを施した（対照、ｎ＝１８）。ＡＡ処置により、２４時間全輸液量および体液貯留（血管の漏出を示す）の統計的に有意な減少がもたらされた。おそらく最も顕著なことは、機械的人工呼吸の必要性の低下であった：処置群は、平均１２．１±８．８日間必要としたが、一方対照群は２１．３±１５．６日間必要とした。例えば、Ｔａｎａｋａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ  ｆｌｕｉｄ  ｖｏｌｕｍｅｓ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅｌｙ  ｂｕｒｎｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ．Ａｒｃｈ  Ｓｕｒｇ，２０００．１３５（３）：ｐ．３２６−３１を参照されたい。
【００７５】
血管漏出症候群に伴う数多くの炎症性マーカーがＳＩＲＳおよび重篤な熱傷患者でも見出されることを考慮すると、ＡＡが、ＩＬ−２療法に対して、毒性見込みの軽減および効力の促進の両方によるいくらかの有益な効果を及ぼし得る可能性が提示される。
【００７６】
本発明の一部の実施形態では、精製されたリンパ球集団と一緒に異種応答性免疫細胞の培養を実施する。例えば、細胞集団とＴ細胞を含有する細胞亜集団とを分離するステップを、例えば密度勾配遠心分離による単核細胞画分の分画または指標としてＴ細胞の表面マーカーを使用する分離手段により実施することができる。次いで、表面マーカーに基づいた単離を実施することができる。表面マーカーの非限定例としては、ＣＤ３、ＣＤ８、およびＤ４が挙げられ、これらの表面マーカーに依存する分離法は当技術分野で公知である。
【００７７】
例えば、このステップは、抗ＣＤ８抗体が固定化されているビーズなどの担体または培養容器を、Ｔ細胞を含有する細胞集団と混合し、担体に結合したＣＤ８ポジティブＴ細胞を回収することによって、実施することができる。抗ＣＤ８抗体が固定化されているビーズとして、例えば、ＣＤ８  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ４５０  ＣＤ８、およびＥｌｉｇｉｘ抗ＣＤ８  ｍＡｂコーティングニッケル粒子が好適に使用されている。
【００７８】
これは、指標としてＣＤ４を使用して実施することでも同じであり、例えば、ＣＤ４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  ＣＤ４も使用することができる。本発明の一部の実施形態では、培養の開始前に制御性Ｔ細胞を枯渇させる。制御性Ｔ細胞の枯渇は、ニューロピリン、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＴＬＡ４、および膜結合性ＴＧＦ−ベータなどのマーカーを発現する細胞を除去することによるネガティブセレクションにより実施することができる。当業者による実験は、腫瘍死滅および腫瘍部位への遊走の両方に関して最大活性を有するエフェクターリンパ球または細胞傷害性細胞を生成させるために種々の培養条件で実施することができる。例えば、細胞集団およびＴ細胞を含有する細胞亜集団を培養するステップは、細胞集団に応じた適切な公知の培養条件を選択することにより実施することができる。
【００７９】
加えて、癌細胞に由来する異種抽出物を使用して細胞集団を刺激するステップでは、栄養膜または栄養膜様細胞が培養を行う培地に加えられる。例えば、サイトカイン、ケモカイン、または他の成分を培地に添加することができる。本明細書では、サイトカインは、Ｔ細胞に作用することができる限り、特に限定されることはなく、その例としては、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−ベータ、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＦＮ−アルファ、ＩＬ−１２、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ−２７が挙げられる。
【００８０】
細胞性免疫を増強する観点から、特定の実施形態では、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、またはＩＬ−１２が使用され、またｉｎ  ｖｉｖｏでの移入Ｔ細胞の生存を向上させる観点からは、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはＩＬ−２１が使用される。加えて、ケモカインは、Ｔ細胞に作用し、遊走活性を示す限り、限定されない。その非限定例としては、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ２１、ＭｌＰｌアルファ、ＭｌＰｌベータ、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ１２、ＩＰ−１０、およびＭＩＧが挙げられる。細胞集団の刺激は、Ｔ細胞の表面上に存在する分子、例えばＣＤ３、ＣＤ２８、もしくはＣＤ４４に対するリガンド、および／またはその分子に対する抗体の存在によって実施することができる。
【００８１】
さらに、細胞集団は、細胞表面上の癌抗原に由来するペプチドなどの標的ペプチドを提示する抗原提示細胞（樹状細胞）などの他のリンパ球と接触させることにより刺激することができる。特定の一実施形態では、栄養膜を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖または感作されるようにＴ細胞および／またはＮＫ細胞を刺激する。エンドポイントとして細胞障害性および遊走を評価することに加えて、Ｔ細胞活性を評価する他の手段に基づいて細胞産物を最適化することも本発明の範囲内である。例えば、本発明の方法におけるＴ細胞の機能増強は、サイトカインアッセイ、抗原特異的細胞アッセイ（テトラマーアッセイ）、増殖アッセイ、細胞溶解性細胞アッセイ、あるいは組換え腫瘍関連抗原または免疫原性フラグメントまたは抗原由来ペプチドを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ遅延型過敏性試験を使用して、各ステップの前後の複数時点で評価することができる。
【００８２】
免疫応答の増大を測定するためのさらなる方法の例としては、遅延型過敏性試験、ペプチド主要組織適合遺伝子複合体テトラマーを使用するフローサイトメトリー、リンパ球増殖アッセイ、酵素結合免疫吸着測定法、酵素結合免疫スポット測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  ａｓｓａｙ）、サイトカインフローサイトメトリー、直接細胞傷害性アッセイ、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によるサイトカインｍＲＮＡの測定、または限界希釈法などＴ細胞応答を測定するために現在使用されているアッセイが挙げられる。
【００８３】
本発明を使用する、作製した細胞の効力のｉｎ  ｖｉｖｏ評価は、本発明の機能が増強されたＴ細胞の最初の投与前または治療開始後の種々の時点で、抗原特異的細胞アッセイ、増殖アッセイ、細胞溶解性細胞アッセイ、あるいは組換え腫瘍関連抗原または免疫原性フラグメントまたは抗原由来ペプチドを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ遅延型過敏性試験を使用して、生体で評価することができる。
【００８４】
免疫応答の増大を測定するためのさらなる方法の例としては、遅延型過敏性試験、ペプチド主要組織適合遺伝子複合体テトラマーを使用するフローサイトメトリー、リンパ球増殖アッセイ、酵素結合免疫吸着測定法、酵素結合免疫スポット測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  ａｓｓａｙ）、サイトカインフローサイトメトリー、直接細胞傷害性アッセイ、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によるサイトカインｍＲＮＡの測定、または限界希釈法などＴ細胞応答を測定するために現在使用されているアッセイが挙げられる。さらに、免疫応答は、体重、生体が保持する腫瘍の直径または悪性度、あるいは被験体または被験体群の生存率または生存期間によって評価することができる。
【００８５】
異種免疫処置の起こり得る用量制限毒性の１つは、血管漏出症候群（ＶＬＳ）である可能性がある。これは、ＩＬ−２投与などの他の免疫療法の主要な用量制限有害作用であるとみなされている。転移性腎細胞癌患者で実施された試験のメタ分析では、目的の応答が患者の２３％で観察され、それらの大多数は、１０年を超えて持続した。不運にも、患者の６５％は、ＶＬＳのために治療を中断または中止しなければならない。この症候群は、細胞外液溢出の増大、低血圧、腹水、肺水腫、および水胸症を特徴とし、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）と臨床的に類似している。皮膚症状には、紅斑性発疹、ならびに皮膚の熱傷および掻痒に関連する軽度の乳頭状浮腫が含まれる。
【００８６】
ＶＬＳの重篤な形態は、肺不全または心不全を伴い、約１％の治療患者が死に至るアウトカムになる。典型的には、ＶＬＳの症状は、昇圧療法、および浸透圧効果のためのコロイド溶液を含むものなど妥当な補液により治療される。患者はまた、テオフィリンおよびテルブタリンで治療することも可能であり、これに対する臨床経験によると、急性発作の重症度および頻度の低減が可能になることが示唆される。
【００８７】
細胞レベルでは、ＶＬＳは内皮細胞活性化および血管透過性の亢進と関連することがよく知られている。ＩＬ−２を投与された患者の生検により、ＩＣＡＭおよびＬＦＡ−１などの接着分子の発現が増大することが示された。これらのタンパク質は顆粒球の血管外遊走を促進することが知られているが、そのようなアップレギュレーションは、内皮細胞培養物に直接ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＬ−２を添加した場合には観察されず、この効果が他の宿主成分に媒介されることが示唆される。ＩＬ−２の主要な細胞標的の１つが、２つのＩＬ−２受容体型を発現するＴ細胞であることを考慮すると、最初のＴ細胞活性化が、ＩＬ−２投与後の内皮に対する下流炎症性効果への主要な寄与要因であるように見える。
【００８８】
初期の研究において、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇのグループは、ＩＬ−２を投与したマウスに、放射性ヨウ素化アルブミンを投与して組織の放射活性を評価することによりＶＬＳを定量化するためのマウスモデルを確立した。このモデルでは、ガンマ線カウントの増加が、内皮透過性および組織へのアルブミン漏出と相関する。彼らは、放射線、シクロホスファミド、またはステロイドにより免疫抑制されたヌードマウスまたはマウスへのＩＬ−２の投与が、血管漏出の顕著な低下または血管漏出がないことと関連することを見出した。例えば、Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．，Ｓ．Ｅ．Ｅｔｔｉｎｇｈａｕｓｅｎ，ａｎｄ  Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｌｕｉｄ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９８６．１３７（５）：ｐ．１７３５−４２を参照されたい。したがって、ＬＡＫ生成のプロセスは、ＶＬＳの刺激に関係している可能性がある。
【００８９】
興味深いことには、研究者らは、宿主リンパ球の枯渇により、ＩＬ−２およびＬＡＫ移入に対する応答ではなく、ＩＬ−２単独に対する応答でのみ血管漏出が低減することを見出した。他の研究では、ＮＫマーカーのアシアロ−ＧＭ１を有する細胞が、ＩＬ−２関連毒性の一部と関連することが示された。一グループは、アシアロＧＭ１に対する抗血清が、死亡率、血管漏出症候群、および肝損傷を抑制し、ＩＬ−２処置により誘導されたアシアロＧＭ１＋リンパ球による肺血管系および肝血管系の浸潤を低減することを示した。アシアロ−ＧＭ１担持細胞の枯渇は、リンパ過形成、Ｌｙｔ  ２＋リンパ球による組織浸潤、組織および末梢の好酸球増加または血小板減少を変化させなかった。興味深いことには、この抗血清は、ｃｏｌｏｎ３８結腸癌を担持するＢＤＦマウスにおけるＩＬ−２療法の抗腫瘍効果に影響を及ぼさなかった。したがって、高用量ＩＬ−２によるＴ細胞およびＮＫ細胞活性化は、これに限定されるものではないが、内皮細胞活性化を局所的に誘導することが知られ、全身性にはＳＩＲＳのメディエーターであるＴＮＦ−アルファを含む種々のサイトカインの産生を誘導し得る。癌において免疫系の過剰活性化により誘導される炎症性カスケードについての知識は、当業者が治療効果を維持しながら、有害作用を最小限に抑える方法で本発明を実行するのに有用である。
【００９０】
ＩＬ−２などの効力のある免疫促進剤の投与に付随する別の事象に、補体活性化がある。補体系は、肝臓で主に生成する約３０種の循環タンパク質の酵素カスケードであり、炎症および種々の免疫応答の増幅を引き起こす。補体系は、古典的（抗体媒介）経路、副経路（抗体非依存性）、またはマンノース結合レクチン経路を介して活性化することができ、これらすべてによって、膜に細孔を生成させることにより細胞溶解を引き起こす膜侵襲複合体の形成がもたらされる。
【００９１】
３×１０（６）Ｕ／ｍ２の１日用量で連続５日間、２４時間ｉ．ｖ．点滴によりＩＬ−２を投与された転移性腎癌患者の臨床試験において、古典補体経路成分のＣ３およびＣ４が、ＩＬ−２点滴中およびその休止後毎日測定された。ＩＬ−２投与は、Ｃ３およびＣ４の両方のレベルの顕著な低下を伴った。このレベルはＩＬ−２点滴終了後の平均５日に関し標準化したものである。例えば、Ｌｉｓｓｏｎｉ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２：ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｌｅａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ，１９９０．５（４）：ｐ．１９５−７を参照されたい。
【００９２】
別の試験では、ＩＬ−２を投与された患者におけるＶＬＳの存在がＣ３ａおよび古典的補体成分Ｃ４ａのレベルにより評価された補体活性化と関連した。この試験では、Ｃ３ａのレベルは、敗血症および熱傷の患者で見出されたレベルと同様に上昇した。例えば、Ｔｈｉｊｓ，Ｌ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＩＬ−２．Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｉｄｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９０．１４４（６）：ｐ．２４１９−２４を参照されたい。
【００９３】
インターロイキン２およびリンフォカイン活性化キラー細胞による治療を受けた２３人の癌患者を調査する別の試験では、治療８日目までにＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ濃度が３倍上昇すること、またＣ４ａ  ｄｅｓＡｒｇの濃度も治療終了までに上昇することが示された。補体系の活性化と関連して、補体受容体１型および補体受容体３型の好中球表面における発現が増大した。例えば、Ｍｏｏｒｅ，Ｆ．Ｄ．，Ｊｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−  ２／ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｃａｕｓｅｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，１９９１．４９（４）：ｐ．５０４−８を参照されたい。
【００９４】
補体活性化がＴ細胞に興味深いことに依存することは、ＩＬ−２投与に伴う内皮活性化およびＶＬＳにＴ細胞が必要であることを実証する研究を橋渡しする可能性がある。一試験では、癌患者が同様の前処置を受けて、Ｃ３ａ、Ｂａ、Ｂｂ、およびＳＣ５ｂ−９の血漿レベルが制御されることが示された。ＩＬ−２処置後、Ｃ３ａレベルは対照と比較して平均１５．６倍増大することが示された。補体活性化副経路に属するＢａおよびＢｂタンパク質はそれぞれ、ＩＬ−２処置後８．０倍および５．０倍増大した。エフェクター補体複合体のＳＣ５ｂ−９の血漿レベルは、５．０倍増大し、血漿Ｃ４ｂおよびｉＣ３ｂ濃度はそれぞれ、処置後４．８倍および２．９倍増大した。
【００９５】
補体活性化における患者のリンパ球の関与を示すために、研究者らは、Ｔ細胞マーカーのＣＤ３を発現する細胞が、ＩＬ−２療法後、抗Ｃ３ｃおよび抗ＳＣ５ｂ−９の表面発現をそれぞれ６．２倍および５．１倍増大させることを見出した。これらの結果は、Ｔ細胞がＩＬ−２誘導補体活性化に関与していると研究者に結論を下させるものである。これはまた、炎症性タンパク質であるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の濃度増大がＩＬ−２療法後に見出されること、またＴ細胞がＣＲＢに結合することにおいて示された。Ｔ細胞結合ＣＲＰは、補体副経路を活性化することができた。Ｄｅｅｈａｎ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｐｈａｓｅ  ｒｅａｃｔａｎｔ  ｌｅｖｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＩＬ−２．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９４．９５（３）：ｐ．３６６−７２；Ｖａｃｈｉｎｏ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２（ＩＬ−２）：ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ＩＬ−２−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｂｌｏｏｄ，１９９１．７８（１０）：ｐ．２５０５−１３を参照されたい。
【００９６】
治療的には、補体阻害剤であるＣ１エステラーゼ阻害剤の投与は、患者におけるＩＬ−２誘導低血圧および補体活性化を軽減することができる。補体カスケードの種々の成分は、直接内皮細胞を活性化し、内皮細胞活性化は、リンパ球および好中球の血管外遊走を引き起こすだけでなく、組織因子のアップレギュレーションにより血栓症も引き起こす。Ｃ５ａは、内皮細胞の活性化および透過性を誘導することが実証されている補体活性化の副生成物である。このタンパク質はまた、全身性炎症性障害の主要なエフェクターであり、その抗体は、一部の効果シグナルおよび内皮活性化の抑制に関する、この条件について臨床的に評価されている。
【００９７】
補体エフェクター複合体ＳＣ５ｂ−９が、補体に対する応答遺伝子（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｇｅｎｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）（ＲＧＣ）−３２の発現を刺激することによって（これにより、次いでＣＤＣ２およびＡＫＴ経路が活性化する）、内皮細胞活性化を誘導することがｉｎ  ｖｉｔｒｏで示された。Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｐｌａｔｔのグループは、補体活性化がＩＬ−１の誘導と関連すると結論した。ＩＬ−１の誘導により、Ｅ−セレクチン、細胞内接着分子−１、血管細胞接着分子−１、Ｉカッパ−Ｂアルファ、インターロイキン（ＩＬ）−１アルファ、ＩＬ−ｌベータ、ＩＬ−８、および組織因子の内皮細胞発現が刺激される。Ｓａａｄｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ：ｐｉｖｏｔａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ａｌｐｈａ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２０００．１０１（１５）：ｐ．１８６７−７３を参照されたい。したがって、ＩＬ−２誘導ＶＬＳのカスケードでは、Ｔ細胞活性化が補体活性化と関連している可能性があり、補体活性化により内皮細胞活性化が刺激される。
【００９８】
内皮細胞活性化の基本的特徴の１つは、凝固カスケードの刺激である。したがって、本発明の種々の特定の実施形態では、免疫関連活性化から内皮細胞を保護することが想定される。内皮を保護する手段には、静脈内アスコルビン酸などの静脈内抗酸化剤の投与が含まれる。一般に、アスコルビン酸またはその塩は、５．０〜３０．０ｇの量、好ましくは５．０〜１０．０ｇの量で使用される。非経口製剤のｐＨは、６．０〜８．０の間である。腫瘍患者に対する静脈内アスコルビン酸の使用に関する手引きは、米国特許第６，２８４，７８６号明細書および米国特許第６，４２６，０７６号明細書で見つけることができる。
【００９９】
ＶＬＳにはＳＩＲＳと多くの共通の要素があるという新たな見方によれば、共通の特徴の１つは、局所血小板の発生および凝固系活性化である。自然免疫応答は、凝固刺激およびその結果としての隔離によって病原体を局所的に排除する能力を有する。しかしながら、このプロセスは、ＳＩＲＳまたはＶＬＳなど、全身性レベルで起こる場合には病態になる。組織因子発現のアップレギュレーションが、ＩＬ−２で処置された動物に由来する内皮細胞で見られた。例えば、Ｔｒｉｃｈｏｎａｓ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｅｖａｌｕａｔｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ  ａｎｄ  ｌｅａｋａｇｅ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．５１（３）：ｐ．１６７７−８２を参照されたい。
【０１００】
このタンパク質の発現は、凝固カスケードの活性を引き起こすと共に、炎症過程を刺激することが知られている。Ｈａｃｋらは、ＩＬ−２療法の患者では第ＸＩＩ因子およびプレカリクレインの分解があることを示すことによって、凝固タンパク質の接触系の活性化を実証した。これらのタンパク質の減少は、アルブミン減少に対して補正した場合、それらのレベルが依然として顕著に低下、すなわち、それぞれ８０および５０％であったので、間隙へのタンパク質漏出によるものではないように見えた（内皮はアルブミンに対してよりもこれらの凝固因子に対して透過性が高い可能性がまだあり、これが「ように見えた」を選ぶ理由である）。Ｈａｃｋ，Ｃ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＩＬ−２：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｅｐｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，１９９１．６５（５）：ｐ．４９７−５０３を参照されたい。
【０１０１】
したがって、凝固系の非特異的活性化およびその結果生じる血栓症の可能性が、ＩＬ−２処置の結果として起こる。多くの癌患者が本質的に血栓形成促進状態であることを考慮すると、ＩＬ−２療法が血栓合併症をもたらし得ることは理論的にあり得る。本発明の特定の実施形態では、凝固カスケードの操作が、免疫活性化の間に発生し得る凝固異常を低減するように免疫療法と併用して実施される。
【０１０２】
顆粒球活性化および組織浸潤は、全身性の免疫／炎症活性化の特徴である。ＩＬ−２に関する４人の患者の試験において、顆粒球はＩＬ−２後に活性化されるようになり、ＩＬ−２後６時間に生じたエラスターゼ／アルファ１−アンチトリプシン（Ｅアルファ１Ａ）およびラクトフェリンの平均ピーク値は、それぞれ２１２（標準誤差＝３７）および５３４（標準誤差＝９２）ｎｇ／ｍｌであった。補体カスケードの活性化は、ＩＬ−２の５日目におけるＣ３ａピーク値の用量依存的な上昇により証明された。Ｃ３ａレベルとＩＬ−２後最初の２４時間における低血圧の程度との間の顕著な相関（ｒ＝０．９１）、ならびにＣ３ａレベルと体重の増加および血清アルブミンの減少などの毛細管漏出のパラメーターとの間の顕著な相関（ｒ＝０．７１）が認められ、これにより、ＰＭＮが活性化されると、内皮細胞の損傷が惹起され、次いで補体カスケードの活性化がもたらされるという結論が得られた。
【０１０３】
ＩＬ−２療法の患者の好中球は、強力な好中球活性化の表現型による証拠（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８接着受容体発現のアップレギュレーション）および機能的な証拠（過酸化水素および次亜塩素酸の産生）の両方を示した。したがって、腫瘍に対する過剰免疫の誘導中の好中球活性化についての知識を考慮に入れるべきであり、必要に応じて抗炎症剤を使用することによって、適切に処置されるべきである。心不全、粘膜炎などの慢性的な炎症状態、および敗血症またはＧＶＨＤなどの急性状態と関連するものとして、細菌叢の体循環への移行がある。
【０１０４】
興味深いことには、腸内細菌叢および炎症に対する干渉もまたＩＬ−２毒性の中にあるように見える。最近の試験では、５１匹の雄性ラットを無作為化して、１０（５）（ｎ＝１５）、１０（４）（ｎ＝８）、１０（３）（ｎ＝８）、または１０（２）（ｎ＝８）の用量（ＩＵ）で、１日２回腹腔内注射によりｒＩＬ−２を投与するか、または生理食塩水をボーラス投与した（ｎ＝１２）。５日後に、回腸の組織形態を評価し、腸間膜リンパ節複合体を培養した。結果から、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）による腸間膜リンパ節のコロニー形成が、ｒＩＬ−２の１０（５）ＩＵで処置されたすべてのラットで、また用量が低減されたｒＩＬ−２で処置されたラットの６２％、３７％、および１２％で起こることがわかった。移行は対照動物では観察されなかった。粘膜下リンパ管の増加および時々の粘膜破壊が１０（５）ＩＵを投与された群にのみ見られた。このデータから、ｒＩＬ−２が細菌移行を促進することがわかり、ヒトにおける高用量ｒＩＬ−２の毒性を悪化させる機序が示唆される。Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｊ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｇｕｔ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，１９９５，７２（３）：ｐ．６３４−６を参照されたい。
【０１０５】
恒常的に誘導されるリンパ球活性化に関して臨床的に見られる顕著な効果、およびＴ細胞の恒常的増殖が腸内細菌叢移行と関連していると考えられる最近の発見を考慮すると、ＩＬ−２の腫瘍抑制活性は、腸内細菌叢に高度に依存している可能性があると考えられ、したがってこれにより患者間変動がおそらく説明される。したがって、本発明の一実施形態では、抗生物質またはプロバイオティクスによる腸ミクロビオームの操作は、本発明の文脈内にあると企図される。米国特許第８，１９７，８０５号明細書；同第５，７２８，３８０号明細書；同第５，５８９，１６８号明細書、および同第７，１９５，９０６号明細書に記載されるように、乳酸菌を含む数多くのプロバイオティクスが炎症を軽減することが示されている。これらの文献のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０６】
いくつかの研究から、酸化ストレスが、優先的に補体カスケードを活性化する様式で、内皮細胞を修飾することが実証されている。酸化ストレス後の内皮細胞による補体活性化の促進にマンノース結合レクチンおよびレクチン補体活性化経路（ＬＣＰ）が関与することが、低酸素（２４時間；１％Ｏ（２））／再酸素負荷（３時間；２１％Ｏ２）ヒト内皮細胞を使用する試験で示された。補体活性化のマーカーとしてｉＣ３ｂ沈着を使用すると、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、またはＬ−マンノースではなくＤ−マンノースが活性化を遮断することが示され、酸化ストレスがマンノース依存性経路をアップレギュレートすることが示唆された。これはまた、マンノース結合レクチン欠損血清およびマンノース結合レクチンに対する抗体を使用して実証された。さらに、Ｃ３沈着が、酸化ストレスの公知の誘発要因である心虚血再潅流傷害を受けたラットの虚血領域で見出された。
【０１０７】
本発明の一部の実施形態では、細胞傷害性または他の癌治療薬の投与は、腫瘍体積を縮小させるために、免疫処置の前に行われる。本明細書に記載される本発明の種々の実施形態に有用な癌治療薬としては、以下に限定されるものではないが、アセグラトン；アクラルビシン；アルトレタミン；アミノグルテチミド；５−アミノグレブリン酸（５−Ａｍｉｎｏｇｌｅａｖｕｌｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ）；アムサクリン；アナストロゾール；塩酸アンシタビン；１７−１Ａ抗体；抗リンパ球免疫グロブリン；アンチネオプラストンＡ１０；アスパラギナーゼ；ペガスパルガーゼ；アザシチジン；アザチオプリン；バチマスタット；ベンゾポルフィリン誘導体；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロクスウリジン；ブスルファン；キャンパス−ＩＨ；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルボコン；カルモフール；カルムスチン；クロランブシル；クロロゾトシン；クロモマイシン；シスプラチン；クラドリビン；コリネバクテリウムパルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）；シクロホスファミド；シクロスポリン；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；ジアジコン；ジクロロジエチルスルフィド；ジデムニンＢ；ドセタキセル；ドキシフルリジン；塩酸ドキソルビシン；ドロルオキシフェン（Ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）；エキノマイシン；エダトレキサート；エリプチニウム；エルムスチン；エンロプラチン；エノシタビン；塩酸エピルビシン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトグルシド；エトポシド；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルタミド；ホルメスタン；ホテムスチン；硝酸ガリウム；ゲンシタビン（Ｇｅｎｃｉｔａｂｉｎｅ）；グスペリムス；ホモハリントニン；ヒドロキシ尿素；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；トシル酸イソプロスルファン；イノリモマブ（Ｉｎｏｌｉｍｏｍａｂ）；インターロイキン−２；イリノテカン；ＪＭ−２１６；レトロゾール；リチウムガモレネート（Ｌｉｔｈｉｕｍ  Ｇａｍｏｌｅｎａｔｅ）；ロバプラチン；ロムスチン；ロニダミン；マホスファミド；メイファラン（Ｍｅｉｐｈａｌａｎ）；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキセート；メトトレキセートナトリウム；ミボプラチン；ミルテホシン；ミソニダゾール；ミトブロニトール；ミトグアゾン二塩酸塩；ミトラクトール；マイトマイシン；ミトタン；塩酸ミトザントロン（Ｍｉｔｏｚａｎｅｔｒｏｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ミゾリビン；モピダモール；ムイトライチルペプチド（Ｍｕｉｔｌａｉｃｈｉｌｐｅｐｔｉｄｅ）；ムロモナブ−ＣＤ３；塩酸ムスチン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル；ネダプラチン；ニルタミド；塩酸ニムスチン；オキサリプラチン；パクリタキセル；ＰＣＮＵ；ペノスタチン；硫酸ペプロマイシン；ピポブロマン；ピラルビシン；イセチオン酸ピリトレキシム；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；ポルフィマーナトリウム；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ラルチトレキセド；ラニムスチン；���ゾキサン；ログレチミド；ロキニメックス；セブリプラチン；セムスチン；シロリムス；シゾフィラン；ソブゾキサン；ナトリウムブロメブレート（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｂｒｏｍｅｂｒａｔｅ）；スパルホス酸；スパルホサートナトリウム；ストレプトゾシン（Ｓｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）；スロフェヌル；タクロリムス；タモキシフェン；テガフール；塩酸テロキサントロン；テモゾロミド；テニポシド；テストラクトン；四ナトリウムメソテトラフェニルポルフィンスルホン酸塩（Ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  Ｍｅｓｏｔｅｔｒａｐｈｅｎｙｌｐｏｒｐｈｉｎｅ−ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ）；チオグアニン；チオイノシン；チオテパ；トポテカン；トレミフェン；トレオスルファン；トリメトレキサート；トロホスファミド；腫瘍壊死因子；ウベニメクス；ウラムスチン（Ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；硫酸ビンデシン；酒石酸ビノレルビン；ボロゾール；ジノスタチン；ゾリモマブ・アリトックス（Ｚｏｌｉｍｏｍａｂ  Ａｒｉｔｏｘ）；および塩酸ゾルビシンが挙げられる。
【０１０８】
以下の実施例は、本発明の実施形態をさらに詳細に説明するために提供するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。これらは、使用され得るものの典型であるが、当業者に公知の他の手順、方法論、または技術を代替的に使用することができる。本発明の結果に顕著にまたは実質的に影響を及ぼさない、本開示発明の変更形態は、本開示の手段の範囲内に包含されることを理解されたい。以下に提供される実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、特定の実施形態を説明することを意図するものである。
【実施例】
【０１０９】
実施例１：異種胎盤ワクチンの予防的投与
ブタ組織およびＢ１６溶解物の調製：
ブタ胎盤組織を分娩するブタから入手し、５％のペニシリン−ストレプトマイシン混合物を含有する無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、輸送のために氷上に置いた。胎盤組織を組織粉砕機でホモジナイズし、液体窒素と４２℃の水浴に交互に浸す４回の凍結融解サイクルに付した。細胞デブリを１５００ｇで４５分間遠心分離してペレットにした。上清を回収して、０．２ミクロンのミリポアフィルターで滅菌した。全タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して測定した。対照組織のために、同一プロトコールを使用してブタ肝臓およびＢ１６黒色腫細胞株のタンパク質を単離した。
【０１１０】
ワクチンの調製および投与：
全タンパク質調製物を、２ｍｇ／ｍｌの濃度で無菌注射用ＰＢＳに溶解し、腫瘍チャレンジ７日前にＣ５７／ＢＬ６マウスに５０ｕＬ（全重量１０ｕｇ）を皮下注射した。
【０１１１】
腫瘍モデル
５×１０５個のＢ１６細胞（米国培養細胞系統保存機関（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））を、６〜８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）の後肢側腹部に皮下注射した。腫瘍増殖は、カリパスによる２つの直交する直径の測定により３日ごとに評価し、腫瘍がいずれかの方向で１ｃｍのサイズに達したときに動物を屠殺した。腫瘍容積は、次式により計算した：（最短直径×最長直径）／２
【０１１２】
実験群
１群当たり４匹のＣ５７／ＢＬ６マウスに、腫瘍チャレンジの７日前に、以下の処置を施した：
Ａ．５０μｌの生理食塩水の処置
Ｂ．５０μＬの生理食塩水中の１０μｇのブタ肝臓抽出物
Ｃ．５０μＬの生理食塩水中の１０μｇのブタ胎盤抽出物
Ｄ．５０μＬの生理食塩水中の１０μｇのＢ１６黒色腫細胞抽出物
【０１１３】
結果：
図１〜３に示すように、Ｂ１６黒色腫細胞増殖の統計的に有意な阻害がブタ胎盤抽出物を投与されたマウスで観察されたが、対照のブタ肝臓抽出物では観察されなかった。これは、異種胎盤の組織特異的な癌免疫能力を示す。
【０１１４】
実施例２：アジュバントとして自己由来の樹状細胞を使用する異種胎盤ワクチン接種
本発明をさらに詳細に説明するために、上記実施例に記載のように、胎盤タンパク質抽出物を精製した。腫瘍モデルとして、Ｂ１６黒色腫担持Ｃ５７／ＢＬ６マウスを使用し、同系ＤＣ源を必要とした。手短に言えば、Ｃ５７／ＢＬ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ  ＭＥ）の大腿骨および脛骨から骨髄細胞を摘出し、洗浄し、組換えＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）および組換えマウスＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加された、２ｍｌの完全培地（２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇのストレプトマイシン、５０μΜの２−メルカプトエタノール、および１０％のウシ胎仔血清（すべてＧｉｂｃｏ  ＲＢＬ製）を添加されたＲＰＭＩ−１６４０）中、２４ウェルプレート（１ウェル当たり２×１０６細胞）で培養した。すべての培養物は、５％加湿ＣＯ２中、３７℃でインキュベートした。４８時間の培養後、非付着顆粒球を除去し、新鮮培地を加えた。
【０１１５】
７日間の培養後、ＦＡＣＳにより測定すると、細胞の９０％超が特徴的なＤＣ特異的マーカーを発現していた。ＤＣを洗浄し、４００μｌの無血清ＲＰＭＩ−１６４０中、ウェル当たり２×１０５個の細胞の濃度で、２４ウェルプレートに播種した。７日目に、骨髄由来ＤＣをパルスしないままにするか、または１０μｇ／ｍｌのブタ肝臓ホモジネート（抽出物）もしくは異種ブタ胎盤ホモジネート（抽出物）でパルスした。パルスのために、肝臓または胎盤の抽出物と共にＤＣを２４時間インキュベートした。次いで、マウス当たり５００，０００個の細胞濃度でＤＣを皮下投与した。上記に記載のように、５×１０５個のＢ１６黒色腫細胞を同時に注射投与した。対照として、ブタ肝臓ホモジネートおよびＤＣ単独を投与した。図４、５、および６に示すように、異種胎盤をパルスされたＤＣを投与されたマウスはいずれも顕著な腫瘍を発生しなかった。
【０１１６】
実施例３：異種胎盤ワクチン接種は、腫瘍細胞溶解物ワクチンの免疫原性を高めることができる
異種胎盤ワクチン接種の利用に対する潜在的な懸念は、腫瘍組織特異性の欠如である。胎盤ワクチン接種の免疫刺激特性を考慮すると、異種ワクチン調製物の同時投与が既存の癌ワクチン源の免疫原性を増強するか否かについて疑問があった。
【０１１７】
Ｃ５７／Ｂ６マウスに、実施例１に記載のように、Ｂ１６黒色腫を投与した。次いで、同日にマウスを以下のもので処置した：（ａ）生理食塩水；（ｂ）Ｂ１６溶解物；（ｃ）ブタ肝臓溶解物と一緒にＢ１６溶解物；（ｄ）ブタ胎盤溶解物と一緒にＢ１６溶解物；（ｅ）ブタ肝臓溶解物単独；および（ｆ）ブタ胎盤溶解物単独。
【０１１８】
腫瘍細胞をワクチン調製物と同時にマウスに接種した場合、黒色腫Ｂ１６細胞単独で免疫処置したときには、保護効果はなかった。これに対して、共混合物による免疫処置は、異種胎盤単独よりも強力な効果を示した。注目すべきことには、胎盤単独でも幾分腫瘍予防活性があった（図７）。
【０１１９】
実施例４：異種胎盤ワクチン接種による結腸癌の処置
６〜８週齢の雌性Ｃ５７／Ｂ６マウスの側腹部位に、２００，０００個のＭＣ３８結腸癌細胞を皮下注射した。腫瘍チャレンジ後５日目、１０日目、および１５日目に、動物を以下のいずれかで処置した：（ａ）生理食塩水；（ｂ）ブタ肝臓抽出物（ＰＬＥ）；および（ｃ）ブタ胎盤抽出物（ＰＰＥ）。（２×１０（５））個のＭＣ３８マウス結腸腺癌細胞、腫瘍を１週間に２回測定した。図８に示すように、異種胎盤抽出物（ブタ）は、腫瘍増殖を阻止した。
【０１２０】
特定の実施形態を上記に記載したが、これら記載の実施形態は例としてのみ示したものであることを理解されよう。したがって、本明細書に記載の系および方法は、記載の実施形態に基づいて限定されるべきではない。正しくは、本明細書に記載の組成物および方法は、上記の説明および添付図面と併せて解釈される場合、後続する特許請求の範囲に照らしてのみ限定されるべきである。
【０１２１】
特許、特許出願、および刊行物を含む、本明細書に引用のすべての参考文献は、これまでに具体的に組み込まれているか否かにかかわらず、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
本開示では、その特定の実施形態と関連させて説明しているが、さらなる変更形態も可能であることを理解されよう。本出願は、一般に、本開示の原理に従い、本開示が関係する技術範囲内で公知または通例の実行範囲内になるような、また本明細書の上記に示される基本的な特徴に適用され得るような本開示からの逸脱を含む、本開示のいかなる変更形態、使用、または適応も包含することを意図するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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