(57)【要約】  本発明は、フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする遺伝子を含有するベクターの製造方法、ならびにアミノ酸およびヌクレオチドを生産するための、その使用に関する。本発明によると、フィードバック阻害酵素をコードする遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで変異誘発し、続くステップでベクターへとライゲートし、引き続くステップにおいて、それぞれのベクターで、代謝物濃度が増加すると蛍光タンパク質の合成をもたらす代謝物センサーを含有する微生物を形質転換し、続いて、増加したまたは最も高い蛍光を示す微生物を選択し、フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする遺伝子を含有するベクターを、増加したまたは最も高い蛍光を示す微生物から単離する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする遺伝子を含有するベクターの製造方法であって、
−フィードバック阻害酵素をコードする遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで突然変異誘発し、
−続くステップにおいて、ベクターへライゲートし、
−引き続くステップにおいて、それぞれのベクターで、代謝物濃度が増加すると蛍光タンパク質の合成をもたらす代謝物センサーを含有する微生物を形質転換させ、
−続いて、増加した蛍光を示す微生物を選択し、
−フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする遺伝子を含有するベクターを、増加したまたは最も高い蛍光を示す微生物から単離する、
製造方法。
【請求項２】
突然変異誘発がランダム突然変異により行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フィードバック阻害酵素をコードする遺伝子をライゲートするベクターとして、プラスミド、挿入要素、トランスポゾン、および／またはファージが使用されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
代謝センサーとして、ｐＳｅｎＬｙｓ、ｐＳｅｎＡｒｇ、ｐＳｅｎＳｅｒ、ｐＳｅｎＯＡＳ、ｐＪＣ１−ｌｒｐ−ｂｒｎＦ−ｅｙｆｐからなる群からの少なくとも一つの成分が使用されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
フィードバック阻害酵素をコードする遺伝子として、酵母または細菌に由来する遺伝子が使用されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
フィードバック阻害酵素をコードする遺伝子として、２−イソプロピルリンゴ酸合成酵素、アセトヒドキシ（Ａｃｅｔｏｈｙｄｏｘｙ）酸合成酵素、アセチルグルタミン酸合成酵素、アントラニル酸合成酵素、アスパラギン合成酵素、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、ＡＴＰ−ホスホリボシルトランスフェラーゼ、カルバモイルリン酸合成酵素、コリスミ酸ムターゼＩ、コリスミ酸ムターゼＩＩ、システイン合成酵素、Ｄ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−へプツロソン酸−７−リン酸合成酵素、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸合成酵素、グルタミン合成酵素、グルタミルキナーゼ、ホモシステイントランスメチラーゼ、ホモセリン  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍｏｓｅｒｉｎ  Ｏ−ａｃｅｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ホモセリン  Ｏ−スクシニルトランスフェラーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、メチオニン合成酵素、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素、プレフェナートデヒドロゲナーゼＩ、プレフェナートデヒドロゲナーゼＩＩ、ピロリン−５−カルボン酸レダクターゼ、リボース  １，５−ビスホスホキナーゼ、セリンアセチル（スクシニル）トランスフェラーゼ、トレオニンアンモニウムリアーゼ（Ｔｈｒｅｏｎｉｎａｍｍｏｎｉｕｍｌｙａｓｅ）、またはチロシンアミノトランスフェラーゼが使用されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
最も高い蛍光を示す微生物が選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする遺伝子を含有し、選択後に、増加したまたは最も高い蛍光を有する微生物から単離されたベクターで、生産微生物を形質転換することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
所望の産物の生産にすでに利用されており、生産のさらなる上昇をもたらすベクターへ、フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする遺伝子が挿入されること、およびこれらのベクターで生産株を形質転換することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１０】
フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする遺伝子が、生産株の染色体へ導入されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする遺伝子を含有する、遺伝子またはベクターで形質転換された微生物が、細菌または酵母であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
アミノ酸またはヌクレオチドを製造するための、請求項１〜１１のいずれか一つにより得られたベクターまたは遺伝子の使用。
【請求項１３】
アミノ酸として、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、およびＬ−システインからなる群からの少なくとも一つの成分が生産されることを特徴とする、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
ヌクレオチドとして、オロチジン−５’−ホスファート、５−ホスホリボシルジホスファート、またはイノシン−５’−ホスファートからなる群の少なくとも一つの成分が生産されることを特徴とする、請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする遺伝子を含有するベクターの製造方法、ならびにアミノ酸およびヌクレオチドを生産するための、その使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸は、人間医学、製薬産業、食品産業、および特に飼料において使用される。アミノ酸は、コリネ型細菌株、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、および腸内細菌、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の発酵によって生産されることが公知である。その多大な重要性ゆえに、生産方法の改善が絶えず目指されている。方法の改善は、発酵技術上の方策、例えば、撹拌および酸素供給、または栄養培地の組成、例えば、発酵中の糖濃度、または例えばイオン交換クロマトグラフィーによる製品形態への処理、または微生物自体の固有の性能特性に関係し得る。
【０００３】
それらの微生物の性能特性を改善するためには、突然変異誘発、選択、および突然変異体選択の方法を使用する。このやり方で、代謝拮抗物質に対して耐性であるか、または調節上重要な代謝物に関して栄養要求性であり、アミノ酸を産生する株が得られる。同様に、個々のアミノ酸生合成遺伝子を増幅してアミノ酸生産への影響を調査するというやり方で、Ｌ−アミノ酸生産株の株改善に向けて組換えＤＮＡ技術法が使用される。
【０００４】
微生物中でのアミノ酸の合成は、アミノ酸生合成経路またはアミノ酸合成経路または合成経路とも呼ばれる合成経路を介して行われる。これらの合成経路は、それらのステップにおいてアミノ酸が前駆体から合成される複数の個々のステップからなる。これらの前駆体が、中央代謝において提供される。それらは、例えば、ピルビン酸、α−ケトグルタル酸、オキサロ酢酸、ペントースリン酸、アセチルＣｏＡ、エリトロースリン酸、ホスホエノールピルビン酸、またはホスホグリセリン酸である。さらに、合成経路を経由する前駆体からのアミノ酸合成には、ＮＡＤＰＨ２、ＮＨ４＋および還元型テトラヒドロ葉酸が必要とされる。コリネ型細菌および腸内細菌での合成経路を経由する前駆体からのアミノ酸合成は、当業者には公知である。これは、アミノ酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、プロリン、グリシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、およびＬ−システインに関する。アミノ酸の合成は、エシェリヒア・コリおよびコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて特によく研究されている。
【０００５】
合成経路は、酵素によって触媒される一連の反応からなり、これらの反応は、厳密に調節されている。特に厳密な調節は、フィードバック耐性酵素によって行われる。野生型株では、厳密な調節機構が、アミノ酸のような代謝産物の自家需要を超える産生、および培地中へのその放出を阻止する。それゆえ、製造元の視点からすると有機化合物を過剰生産する株の構築には、これらの代謝調節を克服する必要がある。これらのフィードバック耐性酵素は、好ましくは、合成経路の開始反応（Ｅｉｎｇａｎｇｓｒｅａｋｔｉｏｎ）または合成経路の分岐点を触媒する。その際、この調節は、頻繁には、合成経路の最終産物、つまりアミノ酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、プロリン、グリシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、およびＬ−システインを介して行われる。
【０００６】
Ｏ−アセチルセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、Ｏ−スクシニルセリン、Ｏ−スクシニルホモセリン、またはアデノシルメチオニンのような中間体も調節的に介入することができる。この調節は、上記のアミノ酸または中間体の濃度が増加すると、合成経路のそれぞれの酵素、さらには合成経路のフィードバック耐性酵素が、阻害されるようになされる。
【０００７】
細胞内でのその形成がフィードバック制御されている、従来技術に基づく、合成経路の酵素の例、およびその酵素をコードする遺伝子を表１に示す。さらに、それぞれの反応を、鍵反応の機構の基質と生成物に関して特徴付けるＥＣ番号を記載する。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣ．グルタミカムの、調節される野生型フィードバック耐性酵素の配列に関するアクセッション番号を記載する。これらの遺伝子のヌクレオチド配列、およびコードされるポリペプチド配列は、公的データバンクに保管されている。つまり、Ｃ．グルタミカムに関しては、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（米国国立医学図書館）（ベセスダ、ＭＤ、米国）のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物工学情報センター）（ＮＣＢＩ）データベース中のアクセッション番号ＮＣ＿００３４５０．２およびＢＸ９２７１４８．１〜ＢＸ９２７１５７．１のもと保管されている。Ｅ．ｃｏｌｉのこれらの遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされるポリペプチド配列は、Ｂｌａｔｔｎｅｒ等により記載されており（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：１４５３〜１４６２ページ（１９９７年）（非特許文献１））、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（米国国立医学図書館）（ベセスダ、ＭＤ、米国）のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物工学情報センター）（ＮＣＢＩ）データベース中のアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．２のもと保管されている。同様に、データバンクＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ハイデルベルク）経由のアクセスも存在する。
【０００８】
【表１】
2015529459.tif 000002
【０００９】
例えばアミノ酸、ヌクレオチド、アミノ酸誘導体、または合成経路の中間体のような標的化合物の生産を改善するためには、表１に例示したフィードバック制御酵素の野生型に基づいて、酵素活性の脱調節を達成する必要がある。
【００１０】
調節を排除し、そのため微生物の性能改善に寄与するようなフィードバック耐性酵素の意義は知られており、また野生型に対して突然変異を保持するフィードバック耐性対立遺伝子が記載されている。つまり、ＤＥ１０２００８０４０３５２Ａ１（特許文献１）およびＥＰ０００００２１４７９７２Ａ１（特許文献２）は、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−へプツロソン酸−７−リン酸合成酵素をコードするａｒｏＧの対立遺伝子がトリプトファン生成の改善をもたらすことを記載する。さらに、例えば、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼを含むｌｙｓＣ対立遺伝子を含有する組換えＬ−リジン生産菌が公知である（ＥＰ０３８１５２７Ａ１（特許文献３））。同様に、フィードバック耐性プレフェナートデヒドロゲナーゼを有する組換えＬ−フェニルアラニン生産菌も記載されている（ＥＰ０８８４２４Ａ２（特許文献４））。さらには、突然変異したイソプロピルリンゴ酸合成酵素をコードするｌｅｕＡ対立遺伝子、およびＬ−ロイシンを生産する微生物も記載されている（ＥＰ０００００１５６８７７６Ｂ１（特許文献５））。ＥＰ０７０１７９１８．９（特許文献６）には、ｉｌｖＮサブユニット中に突然変異を有する、突然変異したアセト乳酸合成酵素、およびＬ−バリンを過剰生産する微生物が記載されている。アセチルグルタミン酸合成酵素に関しても、アルギニンに対して、野生型酵素と比べてフィードバック耐性を有する対立遺伝子が記載されており、この対立遺伝子により、より大量のＬ−アルギニンを生産する株が記載されている（ＵＳ７１６９５８６Ｂ２（特許文献７））。ホスホリボシルピロリン酸合成酵素の突然変異対立遺伝子、およびＬ−ヒスチジン生成方法が記載されている（ＥＰ１５２９８３９Ａ１（特許文献８））。ｈｉｓＧおよびｈｉｓＢＨＡＦＩによってコードされるＬ−ヒスチジン生合成酵素がＬ−ヒスチジンによって阻害されることも公知であり、それゆえ、Ｌ−ヒスチジンを生産する能力も、フィードバック阻害に対する耐性を付与する突然変異をＡＴＰ−ホスホリボシルトランスフェラーゼに導入することによって効果的に高めることができる（ロシア特許第２００３６７７号（特許文献９）およびロシア特許第２１１９５３６号（特許文献１０））。酵素としてカルバモイル−リン酸合成酵素を用いて、アルギニン生成の改善を達成することができた（ＥＰ０００００１０２６２４７Ａ（特許文献１１））。Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低下したセリン−Ｏ−アセチル−トランスフェラーゼをコードするｃｙｓＥ対立遺伝子の導入もシステイン生産の上昇をもたらした（ＵＳ６２１８１６８Ｂ１（特許文献１２）；Ｎａｋａｍｏｒｉ等、１９９８年、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６４：１６０７〜１６１１ページ（非特許文献２）；Ｔａｋａｇｉ等、１９９９年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４５２：３２３〜３２７ページ（非特許文献３））。フィードバック耐性ＣｙｓＥ−酵素により、Ｌ−システインの直接的な前駆体であるＯ−アセチル−Ｌ−セリンの生成が、細胞のＬ−システイン濃度からおおかた切り離される。
【００１１】
これらの微生物の制御機構を排除し性能特性を改善するために、突然変異誘発、選択、および突然変異体選択の方法を使用する。このやり方で、例えば、トレオニン類似体、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸（ＡＨＶ）のような代謝拮抗物質に対して耐性であるか、または調節上重要な代謝物に関して栄養要求性でありＬ−アミノ酸、例えばＬ−トレオニンを生産する株が得られる。トリプトファン類似体、５−メチル−ＤＬ−トリプトファン（５−ＭＴ）に対する耐性が、例えば、Ｌ−トリプトファンを生産する株を特徴付ける（ＤＥ１０２００８０４０３５２Ａ１（特許文献１））。さらに、４−アザ−Ｄ，Ｌ−ロイシンまたは３−ヒドロキシ−Ｄ，Ｌ−ロイシン、β−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、および５，５，５−トリフルオロロイシンに対して耐性の株が、フィードバック耐性のイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼを有した（ＥＰ１５６８７７６Ａ２（特許文献１３）、ＥＰ１０６７１９１Ａ２（特許文献１４））。阻害剤、スルホニル尿素およびイミダゾリノンの利用により、そのアセト乳酸合成酵素が、低下したフィードバック阻害を示す株が記載されている（ＣＡ２６６３７１１Ａ１（特許文献１５））。さらに、ゆっくりと成長する突然変異体の選択によって、ａｒｇＡ対立遺伝子を有する、Ｌ−アルギニン生成に適した株の取得に成功した（ＵＳ７１６９５８６Ｂ２（特許文献７））。同じく、耐性を仲介する物質、５−アザウラシル、６−アザウラシル、２−チオウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−アザシトシン、６−アザシトシン、アルギニンヒドロキサマート、２−チオウラシル、および６−アザウラシルを介しても（特許第４９−１２６８１９号（特許文献１６））アルギニン生産体を取得することができた。ピリミジン類似体、例えば、アジドチミジンまたはアジドデオキシウリジンの利用により、例えば、Ｌ−ヒスチジン、プリン、およびピリミジンの共通合成経路のアスパラギン酸トランスカルバモイラーゼのようなフィードバック耐性酵素が突然変異している株を取得することが可能である（ＵＳ５２１３９７２（特許文献１７））。Ｓ−（２−アミノエチル）−システインのようなリジン類似体の利用により、ｌｙｓＣ対立遺伝子の取得に、またはメチオニン類似体、例えば、α−メチル−メチオニン、エチオニン、ノルロイシン、Ｎ−アセチルノルロイシン、Ｓ−トリフルオロメチルホモシステイン、２−アミノ−５−ヘプレノイト酸（ｈｅｐｒｅｎｏｉｔ  ａｃｉｄ）、セレノ−メチオニン、メチオニンスルホキサミン、メトキシン、１−アミノシクロペンタンカルボン酸の利用により、Ｌ−メチオニンを増量して蓄積させる対立遺伝子を有する株の取得に成功した（ＥＰ１７４５１３８Ｂ１（特許文献１８））。１，２，４−トリアゾール−Ｄ−アラニンの使用により、ＨｉｓＧ対立遺伝子、ｈｉｓＧ１３のフィードバック阻害が相殺可能であって、その結果、性能特性が改善された株を取得することができた（Ｍｉｚｕｋａｍｉ  Ｔ等、Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９４年４月、５８（４）：６３５〜８ページ（非特許文献４））。
【００１２】
フィードバック耐性が低下した酵素の従来の取得に関する大きな欠点は、例えば、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸、５−メチル−ＤＬ−トリプトファン、４−アザ−Ｄ，Ｌ−ロイシンまたは３−ヒドロキシ−Ｄ，Ｌ−ロイシン、β−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、５，５，５−トリフルオロロイシン、スルホニル尿素、イミダゾリノン、５−アザウラシル、６−アザウラシル、２−チオウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−アザシトシン、６−アザシトシン、アルギニンヒドロキサマート、２−チオウラシル、６−アザウラシル、アジドチミジン、アジドデオキシウリジン、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、α−メチル−メチオニン、エチオニン、ノルロイシン、Ｎ−アセチルノルロイシン、Ｓ−トリフルオロメチルホモシステイン、２−アミノ−５−ヘプレノイト酸、セレノメチオニン、メチオニンスルホキサミン、メトキシン、１−アミノシクロペンタンカルボン酸、１，２，４−トリアゾール−Ｄ−アラニンのような類似体の使用、およびそのような類似体に対して耐性の突然変異体の単離である。フィードバック耐性酵素を取得するための従来法、および微生物の性能を改善するためのその利用のもう一つの大きな欠点は、ランダム突然変異誘発、および類似体の使用後に、多数の株について性能の改善を調べなければならないことであるが、その理由は、類似体耐性が、様々な原因、例えば、類似体の分解の改善、またはさらには類似体の排出の改善によることもあるからであり、その場合、フィードバック耐性を偽装している恐れがあり、その結果、新規のフィードバック耐性酵素を取得できず、性能特性が改善された株は存在しないことになる。それゆえ、従来の技術は、微生物のアミノ酸生産能を改善するという課題を有するフィードバック耐性酵素を単離する特異的な取得を部分的または不完全にしか解決できないか、さらにはまったく解決できない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＤＥ１０２００８０４０３５２Ａ１
【特許文献２】ＥＰ０００００２１４７９７２Ａ１
【特許文献３】ＥＰ０３８１５２７Ａ１
【特許文献４】ＥＰ０８８４２４Ａ２
【特許文献５】ＥＰ０００００１５６８７７６Ｂ１
【特許文献６】ＥＰ０７０１７９１８．９
【特許文献７】ＵＳ７１６９５８６Ｂ２
【特許文献８】ＥＰ１５２９８３９Ａ１
【特許文献９】ロシア特許第２００３６７７号
【特許文献１０】ロシア特許第２１１９５３６号
【特許文献１１】ＥＰ０００００１０２６２４７Ａ
【特許文献１２】ＵＳ６２１８１６８Ｂ１
【特許文献１３】ＥＰ１５６８７７６Ａ２
【特許文献１４】ＥＰ１０６７１９１Ａ２
【特許文献１５】ＣＡ２６６３７１１Ａ１
【特許文献１６】特許第４９−１２６８１９号
【特許文献１７】ＵＳ５２１３９７２
【特許文献１８】ＥＰ１７４５１３８Ｂ１
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｂｌａｔｔｎｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：１４５３〜１４６２ページ（１９９７年）
【非特許文献２】Ｎａｋａｍｏｒｉ等、１９９８年、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６４：１６０７〜１６１１ページ
【非特許文献３】Ｔａｋａｇｉ等、１９９９年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４５２：３２３〜３２７ページ
【非特許文献４】Ｍｉｚｕｋａｍｉ  Ｔ等、Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９４年４月、５８（４）：６３５〜８ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
それゆえ、本発明の課題は、その方法を用いると、フィードバック耐性酵素またはその阻害が野生型と比べて低下している酵素、およびそれらの酵素をコードするデオキシリボ核酸を、より確かに、より迅速にかつより良好に提供することができる、フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする遺伝子を含有するベクターの取得方法を創成することである。さらに、フィードバック耐性酵素、またはその阻害の点で抑制されている酵素、およびそれらの酵素をコードするデオキシリボ核酸を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
この課題は、請求項１および他の請求項の前提部に基づいて、特徴部分で記載される特徴によって解決される。
【００１７】
本発明による方法を用いると、フィードバック耐性酵素、またはその阻害が野生型と比べて低下している酵素、ならびにそれらの酵素をコードするデオキシリボ核酸、およびこのデオキシリボ核酸を含有するベクターを提供または取得することがもう可能である。この方法は、従来技術の方法よりも正確、確実、かつ迅速であるが、なぜなら、フィードバック耐性、またはフィードバック耐性の抑制が、その研究方法によって偽装されるのではなく、実施される方法との直接的な因果関係において確認されるからである。
【００１８】
本発明の有利なさらなる形態は、従属請求項において記載されている。
【００１９】
以下では、本発明をその一般的な形態で記載する。
【００２０】
−第一ステップでは、元の生物（Ａｕｓｇａｎｇｓｏｒｇａｎｉｓｍｕｓ）としての微生物、例えば、細菌、または酵母の野生型のフィードバック感受性遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで突然変異誘発し、ベクターとライゲートする。
−そのライゲーション混合液を用いて微生物を形質転換し、ベクター遺伝子バンクを得る。その際、形質転換に利用される微生物は、代謝物濃度が増加すると蛍光タンパク質の合成をもたらす代謝物センサーを含有する微生物である。
−続くステップでは、最も高い蛍光を有する微生物を選択し、そのベクターを単離する。野生型の遺伝子を含有する元の生物と比べて増加している、代謝物センサーに起因する蛍光を有する微生物も選択可能である。
【００２１】
これらの方法ステップにより、どの突然変異体が、所望の産物の最も高い生産または増加した生産を引き起こすかを突き止めることができる。
【００２２】
この方法により単離されたベクターは、フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする遺伝子を含有する。
【００２３】
ベクターに含有されている、フィードバック阻害がオフとなったまたは低下した酵素をコードする、これらの遺伝子は、当業者に公知の方法により、アミノ酸、ヌクレオチド、または中間体を生産するために利用可能である。そのために、例えば、当業者には公知の次の方法ステップを実施することができる。
【００２４】
−フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする遺伝子は、ベクター上で、生産株へ導入可能であり、すると、この生産株は、所望の産物をより良く生産できる。
−別法として、フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする遺伝子は、所望の産物の生産にすでに利用されており産物生成のさらなる上昇をもたらすベクターへ挿入されてもよい。
−さらなる一実施形態では、フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする遺伝子は、生産株の染色体へ導入可能であり、すると、この生産株は、所望の産物をより良く生産できる。
【００２５】
フィードバック感受性遺伝子とは、本発明の主旨では、フィードバック阻害される酵素をコードするデオキシリボ核酸と理解される。その際、フィードバック阻害が、生成された産物によって起こるのか、または生産の際に生じる中間体によって起こるのかは重要ではない。
【００２６】
「野生型」という用語は、本発明の主旨では、まだ本発明による方法で変更されていないか、または本発明による変更をすでに受けておりそのコーディング酵素活性がさらに高められるべきである、つまり本発明による方法のための元の遺伝子（Ａｕｓｇａｎｇｓｇｅｎ）として使用されるべきである遺伝子または株由来遺伝子と理解される。その際、元の遺伝子は、天然に存在する遺伝子であっても、または遺伝的に変更された株に由来する遺伝子であってもよく、その遺伝子または株が、出発原料として本発明により実施される突然変異誘発に利用される。
【００２７】
その際、突然変異誘発は、好ましくは、従来技術により公知のランダム法、例えば、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応によって行うことができる。
【００２８】
変更されるべき遺伝子が由来する元の生物は、フィードバック調節またはフィードバック阻害されるタンパク質の遺伝子を含有する、あらゆる任意の微生物、例えば、コリネ型細菌、腸内細菌のような細菌、または例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母であり得る。特に、コリネバクテリウム・グルタミカムまたはＥ．ｃｏｌｉが、元の生物として使用可能である。
【００２９】
限定はしないが例えば、表１に挙げた生物ならびにそれらの遺伝子および酵素を、本発明による変更のために考慮することができる。
【００３０】
本発明による方法の出発原料としての、表１で開示される、フィードバック制御酵素のアミノ酸配列、およびそれらの酵素をコードする遺伝子の核酸配列は、本発明によると、それらの配列の一つに対して（核酸配列に関して）７０％超、好ましくは８０％超、さらに好ましくは８５％超、または（さらにポリペプチドに関しても）９０％超、（両種ともの配列に関して）好ましくは９１％超、９２％超、９３％超もしくは９４％超、さらに好ましくは９５％超もしくは９６％超、特に好ましくは９７％超、９８％超もしくは９９％超の（アミノ酸レベルでの）相同性または（自然の縮重を除く核酸レベルでの）同一性を有するような配列も、そのような配列の作用機構または機能および目的が維持されている限り、含む。本明細書で使用される「相同性」（または同一性）という表現は、方程式Ｈ（％）＝［１−Ｖ／Ｘ］ｘ１００（式中、Ｈは、相同性を意味し、Ｘは、比較配列の核酸塩基／アミノ酸の総数であり、Ｖは、考察されるべき配列の、比較配列と比べて異なる核酸塩基／アミノ酸の数である）によって定義できる。いずれにせよ、ポリペプチドをコードする核酸配列という用語により、遺伝暗号の縮重に応じて可能であるように思われるすべての配列が含まれる。同じことが、本発明により変更されるべきであって表１には列挙されていない、すべての他の可能な遺伝子または酵素にも当てはまる。
【００３１】
本明細書において表１中のアクセッション番号により与えられているアミノ酸配列に対する百分率での同一性は、従来技術で公知の方法により、当業者は容易に算出することができる。本発明により使用可能な、適したプログラムは、ＢＬＡＳＴＰである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、１９９７年、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１７）：３３８９〜３４０２ページ）。
【００３２】
表１に開示される、フィードバック感受性酵素をコードする遺伝子の核酸配列は、本発明によると、記載の配列とハイブリダイズする核酸配列も含む。当業者は、特に、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ社（マンハイム、ドイツ、１９９３年）のハンドブック「Ｔｈｅ  ＤＩＧ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｕｓｅｒｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」およびＬｉｅｂｌ等（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ４１：２５５〜２６０ページ（１９９１年））においてハイブリダイゼーションに関する手引きを見出す。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行われる、つまり、プローブ、例えば遺伝子に対して相補性のヌクレオチド配列、と標的配列、つまりプローブで処理されるポリヌクレオチドとが少なくとも７０％同一であるハイブリッドのみが形成される。洗浄ステップも含めたハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、バッファ組成、温度、および塩濃度の変化によって影響される、または特定されることが公知である。ハイブリダイゼーション反応は、一般的には、洗浄ステップと比べて比較的低いストリンジェンシーで行う（Ｈｙｂａｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ、Ｈｙｂａｉｄ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、テディントン、イギリス、１９９６年）。ハイブリダイゼーション反応に関しては、例えば、５ｘＳＳＣバッファに相応するバッファを、およそ５０℃〜６８℃の温度で使用することができる。その際、プローブは、プローブ配列に対して７０％未満の同一性を有するポリヌクレオチドともハイブリダイズし得る。そのようなハイブリッドは、あまり安定でないため、ストリンジェントな条件下での洗浄によって除去される。これは、例えば、塩濃度を２ｘＳＳＣ、場合によっては続いて０．５ｘＳＳＣ（Ｔｈｅ  ＤＩＧ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、マンハイム、ドイツ（１９９５年））に下げることで達成可能であり、ただし、およそ５０℃〜６８℃、およそ５２℃〜６８℃、およそ５４℃〜６８℃、およそ５６℃〜６８℃、およそ５８℃〜６８℃、およそ６０℃〜６８℃、およそ６２℃〜６８℃、およそ６４℃〜６８℃、およそ６６℃〜６８℃という温度に調整する。好ましくは、洗浄ステップを、およそ６２℃〜６８℃、好ましくは６４℃〜６８℃またはおよそ６６℃〜６８℃、特に好ましくはおよそ６６℃〜６８℃という温度において行う。場合によっては、０．２ｘＳＳＣまたは０．１ｘＳＳＣに相応する濃度にまで塩濃度を下げることが可能である。ハイブリダイゼーション温度を５０℃から６８℃までおよそ１〜２℃ずつ徐々に上げることにより、使用されるプローブの配列に対して例えば少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％〜９５％、または少なくとも９６％〜９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する、フィードバック感受性酵素をコードするポリヌクレオチド断片を単離することができる。ハイブリダイゼーションに関するさらなる手引きは、いわゆるキットの形態で、市場で入手可能であ���（例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ社（マンハイム、ドイツ）のＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ、カタログ番号１６０３５５８）。類似に、表１には挙げていない他のアミノ酸配列、およびそれらのアミノ酸配列をコードする遺伝子も、ハイブリダイズされ、本発明による、変更されたフィードバック耐性遺伝子用の出発原料として使用できる。
【００３３】
ベクターとしては、すべての既知のプラスミド体、トランスポゾン、挿入要素、またはファージが、突然変異誘発された遺伝子がその中に挿入された原料として使用できる。限定はしないが例えば、ｐＡＣＹＣ１８４（Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ等；Ｇｅｎｅ  １０２、７５〜７８ページ（１９９１年））、またはｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍａｎｎ等：Ｇｅｎｅ  ６９：３０１〜３１５ページ（１９８８年））、またはｐＳＣ１０１（ＶｏｃｋｅとＢａｓｔｉａ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８０（２１）：６５５７〜６５６１ページ（１９８３年））から誘導されるベクターが使用可能である。そのような遺伝系は、例えば、特許明細書、ＵＳ４，８２２，７３８、ＵＳ５，８０４，４１４、およびＵＳ５，８０４４１４に記載されている。同様に、ｐＺ１、ｐＸＺ１０１４２、ｐＥＫＥｘ２、ｐＥＫＥｘ３、またはｐＥＣ−ｔ１９ｍｏｂ２のようなベクター（「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ」（編集者：Ｌ．  ＥｇｇｅｌｉｎｇとＭ．  Ｂｏｔｔ）中で引用されている）も使用可能であり、これらのベクターは、本発明による方法のために使用される。
【００３４】
代謝物センサーとしては、公知の代謝物センサー、例えば、ｐＳｅｎＬｙｓ、ｐＳｅｎＡｒｇ、ｐＳｅｎＳｅｒ、ｐＳｅｎＯＡＳ、またはｐＪＣ１−ｌｒｐ−ｂｒｎＦ−ｅｙｆｐを使用できる。代謝物センサーは、自家蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含み、その自家蛍光タンパク質の発現は、ある特定の代謝物の細胞内濃度に依存する。その際、自家蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現制御は、特定の代謝物の細胞内濃度に依存して、転写レベルで起こる。それゆえ、それぞれの代謝物の細胞内濃度に依存して、程度の差はあるがｍＲＮＡが生成され、このｍＲＮＡは、リボゾーム内で自家蛍光タンパク質を生成しながら翻訳され得る。
【００３５】
形質転換に利用される微生物は、あらゆる任意の微生物でもよい。例えば、細菌、酵母、または腸内細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、コリネバクテリウム・グルタミカムまたはサッカロマイセス・セレビシエを挙げることができる。
【００３６】
その際、形質転換に利用される微生物は、元の生物中で存在する代謝物濃度よりも高い代謝物濃度において、蛍光タンパク質の合成をもたらす代謝物センサーを含有する微生物である。
【００３７】
形質転換するためには、フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする遺伝子を含有するベクターを導入することができる。このベクターは、代謝物センサーを利用した選択により直接的に取得可能である。
【００３８】
フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする遺伝子が、所望の産物の生産にすでに利用されている他のベクターに導入される実施形態の場合、所望の産物の生産にすでに使用されている上に、生産に使用される微生物の生産特性を改善する遺伝子をすでに含有しているベクターが重要になり得る。
【００３９】
フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする遺伝子が、生産株の染色体に導入されると、その生産株が、次いで、所望の産物をより良く生産できる実施形態の場合、挿入は、当業者に公知の方法により、染色体中のあらゆる任意の箇所で起こり得る。
【００４０】
生産株としては、フィードバック耐性酵素またはフィードバック感受性の点で抑制されている酵素をコードする、突然変異誘発された遺伝子を含有するプラスミドがその中に導入された、バイオテクノロジーで使用されるすべての株が使用可能である。例えば、コリネ型細菌、腸内細菌、または酵母、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、コリネバクテリウム・グルタミカム、またはサッカロマイセス・セレビシエを挙げることができる。
【００４１】
本発明による方法は、基本的には、阻害から完全に守られるか、またはそのフィードバック阻害が少なくとも抑制されるべきであるかの一方である、興味を引くあらゆる酵素、およびその酵素をコードするデオキシリボ核酸を提供するために使用可能である。
【００４２】
限定はしないが例えば、表１に挙げた酵素、およびそれらの酵素をコードするデオキシリボ核酸のすべてを、本発明により変更されるべき材料として挙げることができる。
【００４３】
本発明による方法を用いると、産物であるアミノ酸、その誘導体、ヌクレオチド、または合成経路の中間体の生産が、従来技術と比べて改善可能である。本発明による方法は、本発明による変更前には、対応する微生物によって、生産されなかったか、またはわずかにしか生産されなかったアミノ酸、その誘導体、ヌクレオチド、または合成経路の中間体の生産を可能にする。
【００４４】
本発明による方法を用いて得られた核酸および酵素は、これらの所望の産物を生産するために使用可能であり、その機能に関してより活動的である。
【００４５】
以下では、本発明を個々に、限定はしないが例として、より詳細に記載する。
【００４６】
本発明の対象は、代謝物センサーを利用して取得される、野生型に比べてフィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする、遺伝子の対立遺伝子であって、ただし、野生型対立遺伝子は、プラスミド上にコードされて存在し、この野生型対立遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発後に、代謝物センサーを含有する微生物、好ましくはコリネ型細菌および腸内細菌に導入され、もはや調節されていない酵素を含有する細胞と識別される単一細胞が、生産または単離される。
【００４７】
代謝物センサーは、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムのようなコリネ型細菌の単一細胞、および、例えば、エシェリヒア・コリのような腸内細菌において、増加した細胞内アミノ酸濃度の直接的証明を可能にする（ＷＯ２０１１１３８００６）。さらに、代謝物センサーは、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、およびＬ−システインの増加した細胞内アミノ酸濃度の検出、特に好ましくはＬ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシンの増加した細胞内アミノ酸濃度の検出を可能にする。
【００４８】
代謝物センサーは、中間体、例えば、アミノ酸またはヌクレオチド合成の中間体、例えば、Ｏ−アセチルセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、シスタチオニン、オロチジン−５’−ホスファート、５−ホスホリボシルジホスファート、またはイノシン−５’−ホスファートの増加した濃度の検出も可能にする。
【００４９】
本発明により変更された酵素の取得方法は、そのフィードバック阻害が中止または抑制されるべきである遺伝子または対立遺伝子が、染色体上にコードされているのではなく、ベクター上、好ましくはプラスミド上にコードされて存在することを特徴とする。本発明により変更されるべき酵素の遺伝子または対立遺伝子は、特に、アミノ酸合成経路の酵素の遺伝子または対立遺伝子、ｌｅｕＡ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＩ、ｉｌｖＨ、ａｒｇＡ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ａｓｎＡ、ａｓｎＢ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＩ、ｌｙｓＣ、ｍｅｔＬ、ｔｈｒＡ、ｈｉｓＧ、ｃａｒＡ、ｃａｒＢ、ｔｙｒＡ、ｐｈｅＡ、ｃｙｓＫ、ｃｙｓＭ、ｓｅｒＡ、ａｒｏＧ、ｄａｐＡ、ｇｄｈ、ｇｌｔＢ、ｇｌｔＤ、ｇｌｎＡ、ｐｒｏＢ、ｍｅｔＥ、ｍｅｔＸ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＬ、ｇｎｄ、ｚｗｆ、ｔｈｒＡ、ｍｅｔＨ、ｐｒｓ、ｐｈｅＡ、ｔｙｒＡ、ｐｒｏＣ、ｐｒｓ、ｃｙｓＥ、ｉｌｖＡ、ｔｙｒＢ、好ましくはｌｙｓＣ、ｈｉｓＧ、ａｒｇＢ、ｃｙｓＥおよびｌｅｕＡである。これらの遺伝子は、公知の方法によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで突然変異誘発される。Ｃ．グルタミカムのこれらの遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされるポリペプチド配列は、ＥＰ−Ａ−１１０８７９０に記載されており、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（米国国立医学図書館）（ベセスダ、ＭＤ、米国）のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物工学情報センター）（ｐｒｓ）データベース中のアクセッション番号ＮＣ＿００３４５０．２およびＢＸ９２７１４８．１〜ＢＸ９２７１５７．１のもと保管されてもいる。Ｅ．ｃｏｌｉのこれらの遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされるポリペプチド配列は、Ｂｌａｔｔｎｅｒ等により記載されており（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：１４５３〜１４６２ページ（１９９７年）（非特許文献１））、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（米国国立医学図書館）（ベセスダ、ＭＤ、米国）のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物工学情報センター）（ＮＣＢＩ）データベース中のアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．２のもと保管されている。そのフィードバック阻害が本発明により軽減されるべきであるか、またはスイッチオフされるべきであるペプチドは、酵素、ＬｅｕＡ、ＩｌｖＮ、ＩｌｖＢ、ＩｌｖＩ、ＩｌｖＨ、ＡｒｇＡ、ＴｒｐＤ、ＴｒｐＥ、ＡｓｎＡ、ＡｓｎＢ、ＰｙｒＢ、ＰｙｒＩ、ＬｙｓＣ、ＭｅｔＬ、ＴｈｒＡ、ＨｉｓＧ、ＣａｒＡ、ＣａｒＢ、ＴｙｒＡ、ＰｈｅＡ、ＣｙｓＫ、ＣｙｓＭ、ＳｅｒＡ、ＡｒｏＧ、ＤａｐＡ、Ｇｄｈ、ＧｌｔＢ、Ｇｎｄ、Ｚｗｆ、ＯｐｃＡ、ＧｌｔＤ、ＧｌｎＡ、ＰｒｏＢ、ＭｅｔＥ、ＭｅｔＸ、ＭｅｔＡ、ＭｅｔＬ、Ｇｎｄ、Ｚｗｆ、ＴｈｒＡ、ＭｅｔＨ、Ｐｒｓ、ＰｈｅＡ、ＴｙｒＡ、ＰｒｏＣ、Ｐｒｓ、ＣｙｓＥ、ＩｌｖＡ、ＴｙｒＢ、好ましくはＬｙｓＣ、ＨｉｓＧ、ＡｒｇＢ、ＣｙｓＥおよびＬｅｕＡのポリペプチドと少なくとも９０〜９５％、特に９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である���うなペプチドも含む。本発明は、ヌクレオチド配列、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＩ、ｉｌｖＨ、ａｒｇＡ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ａｓｎＡ、ａｓｎＢ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＩ、ｌｙｓＣ、ｍｅｔＬ、ｔｈｒＡ、ｈｉｓＧ、ｃａｒＡ、ｃａｒＢ、ｔｙｒＡ、ｐｈｅＡ、ｃｙｓＫ、ｃｙｓＭ、ｓｅｒＡ、ａｒｏＧ、ｄａｐＡ、ｇｄｈ、ｇｌｔＢ、ｇｌｔＤ、ｇｌｎＡ、ｐｒｏＢ、ｍｅｔＥ、ｍｅｔＸ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＬ、ｇｎｄ、ｚｗｆ、ｔｈｒＡ、ｍｅｔＨ、ｐｒｓ、ｐｈｅＡ、ｔｙｒＡ、ｐｒｏＣ、ｐｒｓ、ｃｙｓＥ、ｉｌｖＡ、ｔｙｒＢ、好ましくはｌｙｓＣ、ｈｉｓＧ、ａｒｇＢ、ｃｙｓＥおよびｌｅｕＡにも、ならびにそのような配列の作用機構または機能および目的が維持されているか、または同一である限り、それらの配列の一つに対して（核酸配列に関して）少なくとも７０％、好ましくは８０％、さらに好ましくは８５％の、または９０％、好ましくは９１％超、９２％超、９３％超もしくは９４％超、さらに好ましくは９５％超もしくは９６％超、特に好ましくは９７％超、９８％超もしくは９９％超の相同性を有するような配列にも関する。
【００５０】
プラスミド上にコードされた酵素遺伝子に部位非特異的（ｏｒｔｓｕｎｓｐｅｚｉｆｉｓｃｈ）突然変異を導入するためには、好ましくは、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および増幅技術を利用しながらｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発を行う。その際、反応条件に依存して、合成される遺伝子に、野生型と比べて誤っている個々のヌクレオチドを挿入するポリメラーゼを使用して、突然変異されるべき遺伝子のＰＣＲを行う（Ｔｉｎｄａｌｌ，  Ｋ．Ｒ．とＴ．Ａ．  Ｋｕｎｋｅｌ、Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８８年、２７（１６）：６００８〜１３ページ）。この方法のよく行われる変種は、ＰＣＲ混合液中でのマンガン（ＩＩ）イオンまたはヌクレオチド類似体の使用を含む（Ｃａｄｗｅｌｌ  Ｒ．Ｃ等、（１９９２年）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．  ２：２８〜３３ページ；Ｌｅｕｎｇ  Ｄ．Ｗ．等（１９８９年）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １：１１〜１５ページ）。突然変異を導入するためのこの技術は、「エラープローンＰＣＲ（ｅｐＰＣＲ）」と呼ばれる（Ｌａｂｒｏｕ  ＮＥ．  Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．  ２０１０年；１１：９１〜１００ページ）。突然変異は、例えば、点突然変異であってもよく、例えば、置換、欠失、または挿入がポリメラーゼによって生み出されてもよい。突然変異率は、１ｋｂ当たり１〜４０突然変異、好ましくは１ｋｂ当たり１〜５突然変異である。
【００５１】
本発明により得られた突然変異を酵素遺伝子中に含有するベクター、好ましくはプラスミドを、続いて、形質転換により、微生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃ．グルタミカム、またはサッカロマイセス・セレビシエに導入する。形質転換という用語は、ポリヌクレオチド、特にＤＮＡを、所望の微生物に移送するためのすべての方法を含む。これに数えられるのは、特に、形質転換、電気的形質転換、もしくは電気穿孔法における単離ＤＮＡの使用、接合時のような細胞接触による移送、または微粒子銃（Ｐａｒｔｉｋｅｌｂｅｓｃｈｕｓｓ）を利用したＤＮＡの移送である。
【００５２】
本発明による方法の次の方法ステップでは、細胞内蛍光の検出を介して、代謝物センサーにより検出可能な代謝物に関して、野生型と比べて代謝物の細胞内濃度が高まっている、細胞懸濁液中の個々の形質転換細胞を同定する。そのためには、細胞懸濁液を、代謝物センサーの自家蛍光タンパク質を発光に向けて励起させる周波数の電磁放射線にさらす。自家蛍光タンパク質として好ましいのは、例えば、Ａｅｑｕｏｒａ（クラゲ）属の蛍光タンパク質、例えば、Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（緑色蛍光タンパク質）（ＧＦＰ）、および別の波長範囲で蛍光を発するその変種（例えば、Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（黄色蛍光タンパク質）、ＹＦＰ；Ｂｌｕｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（青色蛍光タンパク質）、ＢＦＰ；Ｃｙａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（青緑色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ）か、またはその蛍光が増強されているその変種（ｅｎｈａｎｃｅｄ（高感度）ＧＦＰもしくはＥＧＦＰ、またはＥＹＦＰ、ＥＢＦＰ、もしくはＥＣＦＰ）をコードする遺伝子配列からリードアウトされるタンパク質である。さらに、本発明によると、他の自家蛍光タンパク質、例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（フランクリン・レイクス、米国）から公知であるような、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗをコードする遺伝子配列も使用可能である。その際、特に好ましい自家蛍光タンパク質は、ＥＹＦＰまたはそれをコードする遺伝子である。
【００５３】
本発明による方法の特別な一形態に基づくと、細胞の同定に引き続き、好ましくは、細胞の同定にすぐ引き続いて、同定された細胞を細胞懸濁液から分離するもう一つの方法ステップを行い、この分離は、好ましくは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ＝ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を利用して、特に好ましくはハイスループットフローサイトメトリー（ＨＴ−ＦＡＣＳ＝ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｐｕｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を利用して行う。フローサイトメトリーを利用した細胞懸濁液の分析に関する詳細は、例えば、Ｓａｃｋ  Ｕ、Ｔａｒｎｏｋ  Ａ、Ｒｏｔｈｅ  Ｇ（編集者）：Ｚｅｌｌｕｌａｅｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ．  Ｇｒｕｎｄｌａｇｅｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｅｎ  ｕｎｄ  ｋｌｉｎｉｓｃｈｅ  Ａｎｗｅｎｄｕｎｇｅｎ  ｄｅｒ  Ｄｕｒｃｈｆｌｕｓｓｚｙｔｏｍｅｔｒｉｅ（細胞診断学。フローサイトメトリーの基礎、方法および臨床応用）、バーゼル、Ｋａｒｇｅｒ、２００７年、２７〜７０ページから読み取れる。
【００５４】
それゆえ、本発明による方法を利用すると、プラスミド上にコードされた酵素の遺伝子バンクを含有する形質転換体が存在する細胞懸濁液中において、フィードバック耐性酵素が、ある特定の代謝物の細胞内濃度の上昇をもたらす細胞を特異的に単離することが可能である。
【００５５】
本発明の対象は、そのように取得されたフィードバック耐性酵素またはフィードバック感受性の点で抑制されている酵素、およびそれらの酵素をコードする遺伝子を、微生物の性能特性の改善に利用することである。このことは、本方法により取得された、フィードバック耐性酵素またはフィードバック感受性の点で抑制されている酵素をコードするベクターを直接に微生物に導入することにより行われ、それらのベクターに関しては、ここでは、限定はしないが例えば、以下に、プラスミドを挙げる。そのためには、プラスミドを公知の方法により単離し、改善されるべき微生物をこのプラスミドで形質転換する。形質転換という用語は、ポリヌクレオチド、特にＤＮＡを、所望の細菌に移送するためのすべての方法を含む。これに数えられるのは、特に、形質転換、電気的形質転換、もしくは電気穿孔法における単離ＤＮＡの使用、接合時のような細胞接触による移送、または微粒子銃を利用したＤＮＡの移送である。
【００５６】
さらなる一実施形態では、本方法により取得された、フィードバック耐性酵素またはフィードバック感受性の点で抑制されている酵素をコードする遺伝子を、まず、例えば、すでに微生物の性能特性を改善する付加的な遺伝子をすでに含有するか、または改善されるべき微生物中でのプラスミドの複製を可能にする複製起点も含有する他のプラスミドに導入する。そのようなプラスミドは、当業者には公知であり、例えば、腸内細菌中で複製可能なプラスミドベクター、例えば、ｐＡＣＹＣ１８４から誘導されるクローニングベクター（Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ等；Ｇｅｎｅ  １０２：７５〜７８ページ（１９９１年））、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍａｎｎ等；Ｇｅｎｅ  ６９：３０１〜３１５ページ（１９８８年））、またはｐＳＣ１０１−誘導体（ＶｏｃｋｅとＢａｓｔｉａ；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８０（２１）：６５５７〜６５６１ページ（１９８３年））、またはさらにはコリネ型細菌および近縁生物中で複製され、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（編集者：ＥｇｇｅｌｉｎｇとＢｏｔｔ）、第２３章、５３５〜６６ページ中、またはＥＰ１０９７９９８Ｂ１中で挙げられているプラスミド、またはさらにはＭｏＢｉＴｅｃｈ  ＧｍｂＨ（ローツェシュトラーセ２２ａ、３７０８３ゲッティンゲン）から市販されているＢａｃｉｌｌｕｓ株用プラスミド、またはさらにはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ用として記載される（Ｗａｎｇ  ＴＴ、Ｌｅｅ  ＢＨ、１９９７年、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｉｎ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ．  １７（３）：２２７〜７２ページ）か、または市販されているプラスミド（ＭｏＢｉＴｅｃｈ  ＧｍｂＨ（ローツェシュトラーセ２２ａ、３７０８３ゲッティンゲン））である。
【００５７】
さらなる一実施形態では、本方法により取得された、フィードバック耐性酵素またはフィードバック感受性の点で抑制されている酵素をコードする遺伝子を、改善されるべき微生物の染色体に導入する。これは、例えば、Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ等（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６０、１２６〜１３２ページ（１９９４年））またはＷＯ０３／０４０３７３に記載されている。この方法の場合、遺伝子を、その性能特性が改善されるべき宿主中で複製できないプラスミドベクターにクローニングする。ベクターとして考慮の対象になるのは、例えば、ｐＳＵＰ３０１（Ｓｉｍｏｎ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １、７８４〜７９１ページ（１９８３年））、ｐＫ１８ｍｏｂまたはｐＫ１９ｍｏｂ（Ｓｃｈａｅｆｅｒ等、Ｇｅｎｅ  １４５、６９〜７３ページ（１９９４年））、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マディソン、ＷＩ、米国）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｓｈｕｍａｎ（１９９４年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６９：３２６７８〜８４ページ；ＵＳ−Ａ５，４８７，９９３）、ｐＣＲ（登録商標）Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（グローニンゲン、オランダ）；Ｂｅｒｎａｒｄ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２３４：５３４〜５４１ページ（１９９３年））、ｐＥＭ１（Ｓｃｈｒｕｍｐｆ等、１９９１年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７３：４５１０〜４５１６ページ）、またはｐＢＧＳ８（Ｓｐｒａｔｔ等、１９８６年、Ｇｅｎｅ  ４１：３３７〜３４２ページ）である。フィードバック耐性酵素またはフィードバック感受性の点で抑制されている酵素をコードする、ならびに場合によってはその遺伝子の発現シグナルおよび／または調節シグナル、および周縁領域を含むプラスミドベクターは、続いて、接合または形質転換により、その性能特性が改善されるべき所望の株に移送される。接合の方法は、例えば、Ｓｃｈａｅｆｅｒ等（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６０、７５６〜７５９ページ（１９９４年））に記載されている。形質転換の方法は、例えば、Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ等（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９、３５６〜３６２ページ（１９８８年））、ＤｕｎｉｃａｎとＳｈｉｖｎａｎ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７、１０６７〜１０７０ページ（１９８９年））、およびＴａｕｃｈ等（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２３、３４３〜３４７ページ（１９９４年））に記載されている。「クロスオーバー」イベントを利用した相同組換え後には、結果として生じる株は、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムまたはＥ．ｃｏｌｉの、プラスミド上の相同ヌクレオチド配列によりあらかじめ定められていた、染色体の所望の遺伝子部位において、プラスミドベクターを含めた異種遺伝子の一つのコピーを含有する。標的遺伝子または標的配列中での、削除を引き起こす適した第二の「クロスオーバー」イベントを利用して、フィードバック耐性であるか、またはフィードバック感受性の点で抑制されている酵素の遺伝子のみの挿入が達成される。
【００５８】
本発明の対象は、ある特定の代謝物、特にアミノ酸、例えば、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、およびＬ−システインの細胞内濃度の上昇をもたらす、フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素、およびそれらの酵素をコードする遺伝子である。本発明の対象は、特に、Ｌ−リジン合成の酵素、とりわけ、Ｌ−リジンをもたらすフィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼでもある。同じく、本発明の対象は、アミノ酸合成またはヌクレオチド合成の中間体、例えば、Ｏ−アセチルセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、シスタチオニン、オロチジン−５’−ホスファート、５−ホスホリボシルジホスファート、またはイノシン−５’−ホスファートの濃度上昇をもたらす、フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素、およびそれらの酵素をコードする遺伝子でもある。
【００５９】
つまり、例えば、アスパラギン酸キナーゼ遺伝子ｌｙｓＣ中の突然変異が、配列番号９に記載されるヌクレオチド配列部位６０、６１、２３３、５５６および９８２において、配列番号１０に記載されるアミノ酸交換２０、２１、７８、１８６、３２８により、または配列番号１１に記載されるヌクレオチド配列部位６０、６１、９３２、１１９６において、配列番号１２に記載される配列部位２０、２１、３１１、３９９でのアミノ酸交換により、または配列番号１３に記載されるヌクレオチド配列部位６１において、配列番号１４に記載される配列部位２１でのアミノ酸交換により、または配列番号１５に記載されるヌクレオチド配列部位６１、８３３、８３９において、配列番号１６に記載される配列部位２１、２７８、２８０でのアミノ酸交換により、または配列番号３３に記載されるヌクレオチド配列部位６１、８３３、８３９、１１７２において、配列番号３４に記載される配列部位２１、２７８、２８０、３９１でのアミノ酸交換により、または配列番号１７に記載されるヌクレオチド配列部位６１および９３２において、配列番号１８に記載される配列部位２１および３１１でのアミノ酸交換により、または配列番号１９に記載されるヌクレオチド配列部位６１、９３２、１１９６において、配列番号２０に記載される配列部位２１、３１１、３９９でのアミノ酸交換により、または配列番号２１に記載されるヌクレオチド配列部位６１および１０９４において、配列番号２２に記載される配列部位２１および３６５でのアミノ酸交換により、または配列番号２９に記載されるヌクレオチド配列部位６１、９０８において、配列番号３０に記載される配列部位２１、３０３でのアミノ酸交換により、または配列番号３１に記載されるヌクレオチド配列部位７１５において、配列番号３２に記載される配列部位２３９でのアミノ酸交換により、または配列番号２３に記載されるヌクレオチド配列部位７１、９３２において、配列番号２４に記載される配列部位２４、３１１でのアミノ酸交換により、または配列番号２５に記載されるヌクレオチド配列部位２０５、３７０、６３１、６８０、７０３、１０４９、１１２０において、配列番号２６に記載される配列部位６９、１２４、２１１、２２７、２３５、３５０、３７４でのアミノ酸交換により、または配列番号２７に記載されるヌクレオチド配列部位４７６、１０１０、１０２１において、配列番号２８に記載される配列部位１５９、３３７、３４１でのアミノ酸交換により取得可能である。
【００６０】
その際、対立遺伝子および酵素につき、それぞれ、ヌクレオチド交換およびアミノ酸交換の一つのみが存在することも、または複数、つまり配列番号２５、または配列番号２６に記載されるように最高７個が存在することも可能である。
【００６１】
除外条項：
以下に列挙する従来技術から公知の突然変異、例えば、ＪＰ１９９４０６２８６６−Ａの申請で記載される突然変異ｌｙｓＣ  Ａ２７９Ｔ（配列１）、またはさらにはＪＰ１９９４２６１７６６−ＡからのｌｙｓＣ  Ａ２７９Ｖ（配列３）、ＪＰ１９９４２６１７６６−ＡからのｌｙｓＣ  Ｓ３０１Ｆ（配列４）、ＪＰ１９９４２６１７６６−ＡからのｌｙｓＣ  Ｔ３０８Ｉ（配列５）、ｌｙｓＣ  Ｇ３４５Ｄ（ＦｏｌｌｅｔｔｉｅとＳｉｎｓｋｅｙ、データバンク登録Ｌ１６８４８）、ｌｙｓＣ  Ｒ３２０Ｇ、ｌｙｓＣ  Ｇ３４５Ｄ（Ｊｅｔｔｅｎ等、データバンク登録Ｌ２７１２５）、ｌｙｓＣ  Ｓ３０１Ｆ（ＵＳ３７３２１４４）、ｌｙｓＣ  Ｓ３８１Ｆ（ＥＰ０４３５１３２）、ｌｙｓＣ  Ｓ３１７Ａ（ＵＳ５６８８６７１（配列１））、およびさらにはｌｙｓＣ  Ｔ３８０Ｉ（ＷＯ０１／４９８５４）は本発明の対象ではない。
【００６２】
本発明の対象は、酵素の、代謝物センサーにより同定された配列部位中、および匹敵する配列部位中での他のアミノ酸交換でもある。つまり、例えば、配列番号２８の酵素アスパラギン酸キナーゼ中では、配列部位１５９のＶａｌがＧｌｙに交換されているが、好ましくは、タンパク質を構成する別のあらゆるアミノ酸、例えば、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＣｙｓまたはＰｈｅが存在してもよい。同じ酵素において、配列部位３３７のＡｓｎがＳｅｒに交換されているが、同じく、タンパク質を構成する別のあらゆるアミノ酸、例えば、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＣｙｓもしくはＰｈｅがこの配列部位に存在してもよいか、または配列部位３４１では、ＡｓｐのＡｓｎへの交換の代わりに、タンパク質を構成する別のあらゆるアミノ酸、例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＣｙｓもしくはＰｈｅが存在してもよい。
【００６３】
「匹敵する配列部位」という表現は、本発明によると、配列比較プログラム（ＢＬＡＳＴ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９０年、２１５、４０３〜４１０ページ）を使用しながら、親配列を比較配列と比較することにより、親配列の意図される部位において、その比較されるべき配列部位とは±５超、好ましくは±４、より好ましくは±３、より好ましくは±２、非常に好ましくは±１だけ異なる、極めて好ましくは異ならない、比較配列中でのアミノ酸配列部位をもたらす配列部位と理解される。
【００６４】
今度は限定的ではない例を手がかりに、本発明をより詳細に説明する。
【実施例】
【００６５】
例１
酵素をコードする遺伝子配列を突然変異させ選択することにより、フィードバック耐性酵素、およびフィードバック耐性酵素を有する、性能特性が改善された本発明による細胞が得られる、ある細胞の例を用いた、第一実施形態に基づく本発明による細胞の製造であって、酵素がアスパラギン酸キナーゼである製造。
【００６６】
ａ）ベクターｐＵＣ１８−ｌｙｓＣの構築およびアスパラギン酸キナーゼ遺伝子ｌｙｓＣのエラープローンＰＣＲ
プライマー対、ｒｓｐＩ（配列番号１）とｕｎｉｖ（配列番号２）、および鋳型としてＣ．グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２の野生型の染色体ＤＮＡを用いて、酵素アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子ｌｙｓＣを増幅した。
（配列番号１）：
ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡＧＡＡＡＴＡＴＧＧ
（配列番号２）：ＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＣＧＴＣＣＧＧＴＧＣＣＴＧＣＡＴＡＡＡＣＧ
【００６７】
Ｔａｕｃｈ等が記載したように（Ｔａｕｃｈ等、１９９５年、Ｐｌａｓｍｉｄ  ３３：１６８〜１７９ページ）、Ｃ．グルタミカムの染色体ＤＮＡを単離した。増幅物をＢａｍＨＩとＳａｌＩとで処理し、同様に処理されたｐＵＣ１８とライゲートすると、ｐＵＣ１８−ｌｙｓＣが得られた。
【００６８】
突然変異を導入するためのエラープローンＰＣＲにおいて、鋳型として反応ごとに１０ｎｇのｐＵＣ１８−ｌｙｓＣを、および０．１〜０．８ｍＭ  Ｍｎ２＋を使用し、ただし、＜０．２ｍＭ  Ｍｎ２＋未満の低濃度の場合、Ｍｇ２＋を加えて総濃度を最低限０．２ｍＭに調整した。反応ごとに、ＦｅｒｍｅｎｔａｓのＴａｑポリメラーゼ（カタログ番号：ＥＰ０４０１）ｘμｌを添加した。プライマーとしてはポリヌクレオチド、
（配列番号３）：ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
（配列番号４）：ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ
を利用した。反応を３０分間インキュベートした。続いて、反応生成物をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで処理し、同様に処理されたベクターｐＳｅｎ−ＬｙｓＴＫ（ｂ）−ｌｙｓＣとライゲートした。このライゲーション産物でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αｍｃｒを形質転換した（Ｇｒａｎｔ、１９９０年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７：４６４５〜４６４９ページ）。
【００６９】
ベクターｐＳｅｎＬｙｓＴＫ（ｂ）−ｌｙｓＣを構築するためには、プライマー対、ＬｙｓＣ−ＰＳＬＴＫＣ−ｆｗ（配列番号５）およびＬｙｓＣ−ＰＳＬＴＫＣ−ｒｖ（配列番号６）、ならびにＣ．グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２の野生型の染色体ＤＮＡを鋳型として用いて、先行する５２０ｂｐを含む遺伝子ｌｙｓＣを増幅した。増幅物をＸｈｏＩおよびＳａｌＩで切断し、ＳａｌＩで切断されたｐＳｅｎＬｙｓＴＫ（ＷＯ２０１１１３８００６）にライゲートした。
（配列番号５）：
ＧＣＣＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＧＣＴＣＡＧＴＣＧＧＡＡＧＡＣＴＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＣＡＴＣ
（配列番号６）：
ＧＣＣＧＴＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＴＴＡＣＧＧＣＣＴＧＣＧＧＡＡＣＧ
ライゲーション産物で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αｍｃｒ細胞を、１リットル当たり４０ｍｇのカナマイシンを含むＬＢ寒天平板（Ｌｅｎｎｏｘ、１９５５年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１：１９０）上にまいた。
【００７０】
ｂ）ｌｙｓＣ遺伝子バンクの調製およびコリネバクテリウム・グルタミカムの形質転換
ライゲーション産物で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αｍｃｒ細胞を一晩インキュベーションした後、ＬＢ寒天平板を、１ｍｌの０．９％ＮａＣｌですすぎ、プラスミドＤＮＡを慣用の方法で調製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）。このプラスミドＤＮＡ調製物を用いて、Ｃ．グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２のエレクトロコンピテント細胞を、Ｋｉｒｃｈｎｅｒ，  Ｏ．とＴａｕｃｈ，  Ａが記載しているように（Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００３年９月４日；１０４（１〜３）：２８７〜９９ページ）形質転換した。形質転換された細胞を２時間再生させてから、１リットル当たり２５ｍｇのカナマイシンを添加し、この懸濁液の１：１０希釈液をＣＧＸＩＩ培地中で１５時間インキュベートした。ＣＧＸＩＩ培地は、Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ等（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９３年９月；１７５（１７）：５５９５〜６０３ページ）に記載されている。
【００７１】
ｃ）ｌｙｓＣ突然変異の選択
突然変異したアスパラギン酸キナーゼを含む細胞を同定および分離するために、ＣＧＸＩＩ培地中の細胞懸濁液を、光学密度０．１未満に調整し、直ちにＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩ  ｈｉｇｈ  ｓｐｅｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ（ハイスピード・セルソーター）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＧｍｂＨ、トゥラシュトラーセ８〜１２、６９１２６ハイデルベルク）に供給した。分析は、励起波長４８８ｎｍおよび６３３ｎｍを用い、検出は、発光波長５３０±１５ｎｍおよび６６０±１０ｎｍ、サンプル圧力７０ｐｓｉで行った。データは、装置付属のソフトウェアバージョンＢＤ  ＤＩＶＡ  ６．１．３で分析した。シース液、ＢＤ  ＦＡＣＳｆｌｏｗを使用した。非細菌粒子を排除するために、電子的ゲート開閉（Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｓｃｈｅ  ｇａｔｉｎｇ）は、ｆｏｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ（前方散乱）およびｂａｃｋｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ（後方散乱）を手がかりに調整した。ＥＹＦＰ陽性細胞を選別するためには、非蛍光細胞を排除するために電子的ゲート開閉の次の段階を選んだ。蛍光細胞を、ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ａｇａｒ（ブレイン・ハートインフュージョン寒天）（Ｄｉｆｃｏ）を含有するペトリ皿上で選び出した。
【００７２】
例２
フィードバック耐性酵素を有する性能特性が改善された本発明による細胞の製造であって、酵素がアスパラギン酸キナーゼである製造、および新規アスパラギン酸キナーゼ配列。
【００７３】
ａ）突然変異したアスパラギン酸キナーゼを酵素として有する単離細胞によるリジン生成。
ペトリ皿上で選び出されたＥＹＦＰ陽性単一細胞を、Ｆｌｏｗｅｒｐｌａｔｅ（フラワープレート）型のマイクロタイタープレート中のＣＧＸＩＩ培地０．７５ｍｌ中に植えつけた。フラワープレートは、ｍ２ｐ−ｌａｂｓ  ＧｍｂＨ（アーヘン）から購入し、Ｍｉｃｒｏｔｒｏｎ  ｈｉｇｈ−ｃａｐａｃｉｔｙ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（マイクロトロン高容量マイクロプレート・インキュベータ）（Ｉｎｆｏｒｓ  ＡＧ）中において、撹拌速度９９０ｒｐｍおよび撹拌半径３ｍｍで一晩インキュベートした。続いて、フラワープレート型のマイクロタイタープレート中の新鮮なＣＧＸＩＩ培地中に植えつけ、４８時間後に、リジン定量をするためにサンプルを採取した。
【００７４】
リジン定量は、ｏ−フタルジアルデヒド誘導体として、ｕＨＰＬＣ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ｓｙｓｔｅｍ（インフィニティーシステム）（Ａｇｉｌｅｎｔ）による高圧液体クロマトグラフィーを利用して、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＡＡＡ  Ｃ１８  ３．５  ｍｉｃｒｏｎ  ４．６ｘ７５ｍｍの逆相カラム上で、蛍光検出器を用いて行った。溶離液としては、０．０１Ｍホウ酸ナトリウムｐＨ８．２からなる、メタノール濃度の上昇を伴う勾配を利用し、蛍光イソインドール誘導体の検出は、励起波長２３０ｎｍおよび発光波長４５０ｎｍで行った。表２に示す、親株と比べてＬ−リジン生成の改善を示すＬ−リジン値が特定された。
【００７５】
【表２】
2015529459.tif 000003
【００７６】
ｂ）アスパラギン酸キナーゼの配列決定
ＬｅｅとＣｏｏｐｅｒが記載するように（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｃｒｅｅｎ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｌｏｎｉｅｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８（２）：２２５〜２２６ページ）、表２に示す株からコロニーＰＣＲを行った。そのために、次の二つのプライマーを利用した：
（配列番号７）：ＴＧＡＧＡＣＧＣＡＴＣＣＧＣＴＡＡＡＧＣＣ
（配列番号８）：ＡＴＣＴＴＡＣＧＧＣＣＴＧＣＧＧＡＡＣＧＴＧ
【００７７】
ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０４）を用いて増幅物を精製し、ＧＡＴＣ社がシークエンスした。次いで、得られたＤＮＡ配列を公知のアルゴリズム、またはＢｕｔｌｅｒによる配列分析プログラムＧＣＧ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ３９、７４〜９７ページ（１９９８年））、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎによるＦＡＳＴＡアルゴリズム（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８５、２４４４〜２４４８ページ（１９８８年））、またはＡｌｔｓｃｈｕｌ等のＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６、１１９〜１２９ページ（１９９４年））で調査し、一般に公開されているデータバンク（ＥＭＢＬ、ハイデルベルク、ドイツ；ＮＣＢＩ、ベセスダ、ＭＤ、米国）に存在する登録配列と比較した。
【００７８】
ｐＳｅｎＬｙｓＴＫ（ｂ）中にｌｙｓＣ対立遺伝子を含むプラスミドを含有する、表２に挙げるそれぞれの株に由来するｌｙｓＣ対立遺伝子の配列番号（配列番号）を表３に記載する。付加的に、アスパラギン酸キナーゼ・ポリペプチド配列の配列番号（配列番号）も共に記載している。さらに、ｌｙｓＣ対立遺伝子のヌクレオチド交換もポリヌクレオチド配列中での配列部位を記載しながら、およびＬｙｓＣポリペプチドのアミノ酸交換もポリペプチド配列中での配列部位を記載しながら合わせて列挙する。
【００７９】
【表３】
2015529459.tif 000004
【配列表】
2015529459000001.app
【国際調査報告】
2015529459.tif 000005
2015529459.tif 000006
2015529459.tif 000007
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