(57)【要約】  フラビウイルスの感染性を調節するフラビウイルスのエンベロープタンパク質の中心モノマーの接触界面における変異が行われる。変異は、エンベロープ二量体タンパク質が解離する能力を低下させる。
2015535302.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中心モノマー接触界面に沿って二量体を形成することができるフラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質であって、フラビウイルスのエンベロープタンパク質は、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質のアミノ酸２５６〜２６０に対応する中心モノマー接触界面配列を有し、前記フラビウイルスのエンベロープタンパク質は、二量体の解離を減少させる中心モノマー接触界面において変異を有する上記フラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質。
【請求項２】
前記中心モノマー接触界面での２つの塩橋の形成をもたらす、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記フラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質が、蚊媒介性ウイルス由来であり、前記変異は、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質のアミノ酸２５６に対応するフラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質のアミノ酸が塩基性アミノ酸で置換されている変異を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
塩基性アミノ酸がリジン及びアルギニンからなる群から選択される、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記フラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質が、ダニ媒介性ウイルス由来であり、前記変異は、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質のアミノ酸２６０に対応するアミノ酸が塩基性アミノ酸で置換されている、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
塩基性アミノ酸がリジン及びアルギニンからなる群から選択される、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記中心モノマー接触界面が、ＧＳＱＥＧ（配列番号７）、ＧＮＱＥＧ（配列番号８）、ＧＤＱＴＧ（配列番号９）、及びＧＤＱＴＡ（配列番号１０）からなる群から選択される野生型配列を有する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記フラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質が、ＲＳＱＥＧ（配列番号１）、ＲＮＱＥＧ（配列番号２）、ＧＤＱＴＲ（配列番号３）、ＫＳＱＥＧ（配列番号４）、ＫＮＱＥＧ（配列番号５）、及びＧＤＱＴＫ（配列番号６）からなる群から選択される配列を含む中心モノマー接触界面を有する、請求項１記載のタンパク質。
【請求項９】
前記フラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質が、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、日本脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、デング血清型１ウイルス、デング血清型２ウイルス、デング血清型３ウイルス、デング血清型４ウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ポワッサンウイルス、及びオムスク出血熱ウイルスからなる群から選択されるフラビウイルス由来である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記フラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質が西ナイルウイルス由来である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１１】
請求項１に記載のフラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１に記載のフラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質をコードする弱毒化されたフラビウイルス。
【請求項１５】
前記フラビウイルスが、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、日本脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、デング血清型１ウイルス、デング血清型２ウイルス、デング血清型３ウイルス、デング血清型４ウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ポワッサンウイルス、及びオムスク出血熱ウイルスから選択される、請求項１４に記載の弱毒化されたフラビウイル。
【請求項１６】
キメラフラビウイルスである、請求項１４に記載の弱毒化されたフラビウイルス。
【請求項１７】
フラビウイルスはまた、アミノ酸１０７、１３８、１７６、１７７、２２４、２６４、２８０、３１６、及び４４０からなる群から選択される西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質アミノ酸に対応するアミノ酸残基において１つ以上のエンベロープタンパク質変異を有する、請求項１４に記載の弱毒化されたフラビウイルス。
【請求項１８】
請求項１４に記載の弱毒化されたフラビウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項１９】
アジュバントをさらに含む、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
請求項１８に記載の免疫原性組成物を得て；
該免疫原性組成物を患者に投与する
ことを含む、患者における免疫応答を誘導するための方法。
【請求項２１】
患者がヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
投与が、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１４に記載のフラビウイルスをコードする組換え遺伝子構築物。
【請求項２４】
ベクターをさらに含む、請求項２３に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２５】
前記ベクターがプラスミドである、請求項２４に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２６】
前記プラスミドが、真核生物プロモーターの制御下で、感染性（＋）ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを含む、請求項２５に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２７】
前記真核生物プロモーターがＣＭＶプロモーターを含む、請求項２６に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２８】
請求項２３に記載の組換え遺伝子構築物を用いて安定に又は一時的にトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２９】
請求項２３に記載の組換え遺伝子構築物を含む免疫原性組成物。
【請求項３０】
アジュバントをさらに含む、請求項２９に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１】
請求項２９に記載の免疫原性組成物を得て；
該免疫原性組成物を患者に投与する
ことを含む、患者における免疫応答を誘導するための方法。
【請求項３２】
患者がヒトである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
投与が、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下である、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年１１月７日に出願された米国非仮出願第１３／６７１，１１１号に基づき、その優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルス属は、グローバルとローカルの疫学的重要性のいくつかのヒト病原体を含む、６０以上の近縁ウイルスを包含する。ビリオンは、カプシド（「Ｃ」）、膜（「Ｍ」）、及びエンベロープ（「Ｅ」）と呼ばれる３つの構造タンパク質で構成されている。感染細胞に見られる未成熟フラビウイルスは、Ｍタンパク質に対する前駆体である、事前膜（「ｐｒＭ」）タンパク質を含む。未成熟ビリオンは、ビリオンエンベロープを構成するｐｒＭ−Ｅヘテロ二量体を含む。ｐｒＭは、Ｅをゆっくりと折り畳むためのシャペロンとして機能し、輸送中のｐＨ媒介性の不可逆的な再配列からＥを防止し、ビリオン放出前に切断される。フラビウイルス感染細胞は、エンベロープタンパク質ｐｒＭとＥのみを含む非感染性サブウイルス粒子を放出する。これらは、フラビウイルスｐｒＭ−Ｅカセットの発現によって生成し得る。それらの組み立て経路−細胞内輸送、炭水化物プロセッシング、成熟、ｐｒＭ切断、及び分泌−は、感染性ビリオンのそれに類似する。
【０００３】
Ｅタンパク質は、長い細胞外ドメイン、続いて、ステムアンカー領域を含む。フラビウイルスのＥタンパク質細胞外ドメイン（約４００個のアミノ酸；カルボキシ末端ステムドメイン及び膜貫通ドメインを除く）及びその二量体と三量体形態の三次元構造は、融合前と融合後の立体構造の両方において、ダニ媒介性脳炎及びデング熱ウイルスのＥタンパク質について解析されている。参照により援用されるＢｒｅｓｓａｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｉｔｓ  ｌｏｗ−ｐＨ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＥＭＢＯ  Ｊ  １２  １−１２（２００４）；Ｍｏｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００  ６９８６−６９９１（２００３）Ｅｐｕｂ  Ｍａｙ  ２０，２００３；Ｍｏｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ４２７  ３１３−３１９（２００４）；Ｍｏｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９  １２２３−１２３１（２００５）；及びＲｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ａｔ  ２  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７５  ２９１−２９８（１９９５）を参照されたい。細胞外ドメインは、ウイルス膜に平行に配向されている細長い二量体を形成する（図１、ホモロジーモデリングによって導出されるＮＹ９９  Ｅ４００モデルの上面図を参照されたい）。頭−尾の二量体において、各単量体は、ドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩから構成される。二量体中のモノマー接触は、分子の全長に沿って連続的でない。切断されたｐｒＭの位置を占める二量体軸に沿って２つの穴が存在する（Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ａｔ  ２  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７５  ２９１−２９８（１９９５）を参照されたい）。ドメインＩＩ中の２つの短いヘリックスを超えて、β−ストランドは、分子全体で優勢である。
【０００４】
中心に位置したＮ末端ドメインＩの各々は、２つのジスルフィド架橋を含み、ドメインＩＩの先端に位置した融合ペプチドをシールドする単一の炭水化物側鎖を担持し、二量体の全体的な安定性に寄与する（Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ａｔ  ２  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７５  ２９１−２９８（１９９５）を参照されたい）。ドメインＩＩ、又は二量体化ドメインは、細長い指のような構造を有し、２つの別個の遺伝子座でのモノマー対モノマーの相互作用に関与している。遠位ループは、３つのジスルフィド架橋により安定化され、第２のモノマーのドメインＩ及びＩＩＩによって提供される疎水性ポケットに適合する融合ペプチドを保持する先端部を形成する。この接触は、主に非極性であり、１つのサブユニット上のドメインＩとＩＩＩ、及び他のサブユニット上のドメインＩＩの先端からの残基で構成されている。２つの顕著なαヘリックスを見ることができる中心での接触は、主にドメインＩＩのみの親水性側鎖を含む。ドメインＩＩＩは、Ｃ末端を含み、ビリオンは、ステムに連結され、膜におけるモノマーを固定する膜貫通領域が続く。
【０００５】
異なるフラビウイルスのＥタンパク質のアミノ酸配列の相違にもかかわらず、１２個のシステイン残基は、種間で絶対的に保存されている。これらは、西ナイルウイルスのＥタンパク質における６個のジスルフィド架橋を形成し（Ｎｏｗａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｓ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５６  １２７−１３７（１９８７）参照）、今までに決定された全てのＥタンパク質のＸ線構造において、期待された位置で見出された。これは、全体的な構造組織と折り畳みが全てのフラビウイルスのＥタンパク質に類似しているという現在の理解を強く支持している。
【０００６】
酸性ｐＨへの曝露は、感染性、膜結合、及び融合などの生物学的活性の不活性化を伴うビリオン組織の劇的な再配列をもたらす。誘導された変化は、ウイルス侵入中の融合プロセスの重要なヨウ素である。Ｃｏｒｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｕｂｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ａ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６９  ３７−４６（２０００）；Ｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  ｆｏｒ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４  ４５０−４５５（２００１）；及びＳｔｉａｓｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｉｃｋ−  ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ａｔ  ｌｏｗ  ｐＨ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６  ３７８４−３７９０（２００２）を参照されたい。Ｅタンパク質によって媒介されるｐＨ誘発性融合のメカニズムは、二量体から三量体へのＥの再配列を伴う（Ｓｔｉａｓｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｌｏｗ−ｐＨ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０  ８１４２−８１４７（１９９６）を参照されたい）。融合性Ｅ三量体の形成は、二量体が、最初に、低ｐＨの影響下で解離し、次に、三量体形成を再会合する二段階プロセスである。二段階モデルは、最初に、Ｅ−４００細胞外ドメインの研究で得られた。ステムアンカー領域が存在しない場合、酸性ｐＨへの暴露は、三量化をもたらさない二量体の可逆的解離を引き起こす。さらなる研究は、溶液中での二量体から三量体への低ｐＨ誘発性の不可逆的変換のために、ステムアンカー領域（ほぼアミノ酸４００〜４４９）の機能的役割を実証した（Ａｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｅｍ−ａｎｃｈｏｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３  ５６０５−５６１２（１９９９）を参照されたい）。低ｐＨによって誘導された二量体からの三量体への不可逆変化は、ビリオンにおいてＥが準安定な二量体として存在し、適切なトリガー（この低ｐＨの場合）が適用されるとき、より安定した三量体に変化することを示唆している。Ｅの三量体形態は、二量体形態よりも熱変性に対してより安定であることが示された。クラスＩ融合タンパク質とは対照的に、より安定した立体構造状態へのこのような遷移は、熱処理によって誘導することができず、これは、Ｅの変性をもたらすだけである（Ｓｔｉａｓｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ａｃｉｄｉｃ  ｐＨ  ｉｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｂｙ  ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５  ７３９２−７３９８（２００１）参照）。これは、天然のＥ二量体のプロトン化が、エネルギー的に安定した最終的な三量体形態の形成に必要とされるモノマー中間体構造を生成するために不可欠であることを示唆している（Ｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ，Ａｄｖ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ５９  ６３−９７（２００３）を参照されたい）。
【０００７】
フラビウイルスの数について、神経毒性と神経侵襲性の表現型は、エンベロープタンパク質と関連付けられている。参照により全てが援用されるＣｅｃｉｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｏｒ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍｕｔａｎｔｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８１  ７０−７１（１９９１）；Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ／Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３  ３０９５−３１０１（１９９９）；Ｇｕａｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２  ｕｓｉｎｇ  ｓｔａｂｌｙ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７９  ４３７−４４６（１９９８）；Ｈａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ａｆｆｅｃｔ  ｅｎｔｒｙ  ｉｎｔｏ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９１  １５８−１６５（１９９２）；Ｈｏｌｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ｏｆ  ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６４  ５１５６−５１５９（１９９０）；Ｈｏｌｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｅｓｃａｐｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７８  ３１−３７（１９９７）；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｄｏｎ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｌｏｕｐｉｎｇ  ｉｌｌ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７４  ９３１−９３５（１９９３）；ＭｃＭｉｎｎ，Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７８  ２７１１−２７２２（１９９７）；Ｐｌｅｔｎｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ／ｄｅｎｇｕｅ  ｔｙｐｅ  ４  ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９  １０５３２−１０５３６（１９９２）；及びＰｌｅｔｎｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｄｅｎｇｕｅ  ｔｙｐｅ  ４  ｖｉｒｕｓｅｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６７  ４９５６−４９６３（１９９３）を参照されたい。しかしながら、ゲノムの他の部分の変異はまた、神経毒性の喪失／取得に関与された。全てが参照により援用されるＡｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｄｅｎｇｕｅ  ｔｙｐｅ  ２  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ  １６６８１（ＰＤＫ−５３），ａｒｅ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ５’  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １  ａｎｄ  ３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４  ３０１１−３０１９（２０００）；Ｄｕａｒｔｅ  ｄｏｓ  Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＮＳ３  Ｔｈａｔ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｔｈｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｄｅｎｇｕｅ  Ｔｙｐｅ  １  Ｖｉｒｕｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７４  ２９２−３０８（２０００）；Ｄｕｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６１  ３０９−３１８（１９９９）；  Ｍｕｙｌａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ  ＮＳ１  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２２  １５９−１６８（１９９６）；Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＳＡ１４，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７６  ４０９−４１３（１９９５）；及びＸｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  １７Ｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｖａｃｃｉｎｅｅｓ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ  ｖｅｒｙ  ｆｅｗ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ５５  ９３−９９（１９９８）を参照されたい。タンパク質Ｅの変異に起因する弱毒化は、生きた弱毒化されたＪＥワクチンＳＡＭ−１４−２を用いて最も広く研究され、そこでは、９個のアミノ酸の違いが、その病原性親ＳＡＭと弱毒化されたワクチンウイルスを区別するＥタンパク質において同定されている。優勢な弱毒化効果は、いわゆる「ヒンジ」領域を連結しているドメインＩとＩＩに位置したＥ１３８Ｋ変異に関連付けられている（Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ａｔ  ２  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７５  ２９１−２９８（１９９５）を参照されたい）。ヒンジ遺伝子座は、ウイルス侵入に関連したＥタンパク質の二量体から三量体への遷移に重要な役割を果たすと考えられている。この領域内の変更は、マウスにおけるフラビウイルスの病原性を調節する（全てが参照により援用される、Ｃｅｃｉｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍｕｔａｎｔｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８１  ７０−７１（１９９１）；Ｇｕａｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２  ｕｓｉｎｇ  ｓｔａｂｌｙ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  −ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７９  ４３７−４４６（１９９８）；Ｈａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ａｆｆｅｃｔ  ｅｎｔｒｙ  ｉｎｔｏ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９１  １５８−１６５（１９９２）；Ｈｕｒｒｅｌｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｒｒａｙ  Ｖａｌｌｅｙ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｓｉｔｅ−  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｎｇｅ  ａｎｄ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５  ７６９２−７７０２（２００１）；ＭｃＭｉｒｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｒｒａｙ  ｖａｌｌｅｙ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１  １  １０−２０（１９９５）；及びＳｕｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｌｙ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡ，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １７１  １  １４４−１１５１（１９９５）を参照されたい）。病原性の弱毒化又は復帰に重要な更なる遺伝子座は、Ｅにおける位置１７６／１７７と２６４／２７９で定義され、また、ＳＡ１４−１４−２に存在している。前者は、ウイルス侵入中に、融合成分三量体へのＥの酸媒介性の再編成の際に変化を受ける中心ドメインに位置する（Ｂｒｅｓｓａｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｉｔｓ  ｌｏｗ−ｐＨ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＥＭＢＯ  Ｊ  １２  １−１２（２００４）を参照されたい）。また、後者の遺伝子座は、ヒンジ領域に位置し、Ｅ１３８Ｋ変異によって定義される遺伝子座と機能的に強調する場合がある。これは、すぐ近くの位置に関与する変異が、マウスにおいて、Ｅの血球凝集及び融合特性を損なわせ、神経侵襲性を減少させるためである（Ｈｕｒｒｅｌｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｒｒａｙ  Ｖａｌｌｅｙ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｎｇｅ  ａｎｄ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５  ７６９２−７７０２（２００１）、及びＭｃＭｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｒｒａｙ  ｖａｌｌｅｙ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１１  １０−２０（１９９５）を参照されたい）。ＳＡＭ−１４−２に存在する変異の最後のクラスターは、Ｅタンパク質のドメインＩＩＩとステムアンカー領域に位置し、これらは、細胞へのウイルス付着及びｐｒＭとの相互作用に重要である。３１５位辺りの変異は、変更されたウイルス向性と病原性の変化をもたらした（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｆａ
ｔａｌ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １６９  ５１２−５１８（１９９４）；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｄｏｎ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｌｏｕｐｉｎｇ  ｉｌｌ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７４  ９３１−９３５（１９９３）；Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｅｓｃａｐｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４１  ３０−３６（１９９８）；及びＲｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  １７Ｄ−２０４  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｕｂｓｔｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ａｌｔｅｒｓ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４４  ５９−６５（１９９８）を参照されたい）。また、ステムアンカー領域の完全性は、ｐｒＭ−Ｅヘテロ二量体の安定性に必要である（Ａｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｅｍ−ａｎｃｈｏｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３  ５６０５−５６１２（１９９９）を参照されたい）。遠位モノマーの接触界面に見出されるＳＡＭ−１４−２における唯一のアミノ酸変化（図１参照）は、高度に保存された融合ループ（アミノ酸９８〜１１０）におけるＬ１０７Ｆ置換を含む。フラビウイルスの大部分において、この位置は、Ｌｅｕによって占有されるが、ただし、たった２つの既知の例外があり、ＰｏｗａｓｓａｎにおけるＰｈｅ出現と、ＴＢＥウイルスの実質的に弱い病原性のアメリカ類縁であるシカダニフラビウイルスである。Ｌｅｕへのこの変異の復帰は、神経毒性表現型へのほんの部分的な復帰と関連付けられた（Ａｒｒｏｙｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  Ｖｉｒｕｓ／Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｖａｃｃｉｎｅ（ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ−ＪＥ），Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５  ９３４−９４２（２００１））。これは、ほんの僅かな弱毒性変化がこの遺伝子座で許容されることを示す。遠位端又は中心のいずれかの接触界面での他の既知の変異の欠如は、二量体形成に影響を与える変化に対する強い選択圧が存在することを示している。これは、ウイルス感染サイクルの終了時にビリオン集合／成熟と、次の生殖サイクルの初期段階での機能的な分解の両方にとって、この界面の重要性と一致する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、フラビウイルスの感染性を調節するフラビウイルスのエンベロープタンパク質の中心モノマーの接触界面における変異に関する。変異は、ウイルス伝播の遅延又は阻害をもたらす宿主細胞に感染するウイルス能力を有意に減少させる。以前に記載されている変異とは対照的に、これらの変異は、典型的には、ウイルスの複製又は組み立て、及び感染細胞からの感染性ビリオンの放出に影響を与えない。むしろ、組み立てられ、放出されたビリオンは、宿主細胞への融合を介した移行ウイルス前に、中間状態として多数の（全部ではないが）エンベロープウイルスに特徴的な融合前状態への遷移において阻害される。得られたウイルスは、生産的なウイルス血症を確立することができないため、非常に免疫原性であるが、実質的に安全なままである。アプローチは、親病原体と同様の免疫原性を保持する安全な弱毒化されたワクチンの合理的な設計の可能性を開く。
【０００９】
したがって、一態様では、本発明は、高度に保存された中心モノマーの接触界面に沿って二量体を形成することができるフラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質における１以上の変異に関する。フラビウイルスの中心モノマーの接触界面は、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質のアミノ酸２６０〜２５６に相当する。エンベロープタンパク質は、二量体の解離を減少させる中心モノマーの接触界面に１以上の変異を有する。別の態様では、フラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質における１以上の変異は、中心モノマーの接触界面で少なくとも２つの塩橋をもたらす。例示的な態様では、蚊媒介性ウイルスに関して、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質の２５６位に見出されるグリシンに対応するフラビウイルスのアミノ酸は、リジン又はアルギニンなどの塩基性アミノ酸で置換される。別の例示的な態様では、ダニ媒介ウイルスに関して、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質の２６０位に見出されるグリシンに対応するフラビウイルスのアミノ酸は、リジン又はアルギニンなどの塩基性アミノ酸で置換される。
【００１０】
別の態様では、本発明は、ＲＳＱＥＧ（配列番号１）、ＲＮＱＥＧ（配列番号２）、ＧＤＱＴＲ（配列番号３）、ＫＳＱＥＧ（配列番号４）、ＫＮＱＥＧ（配列番号５）、及びＧＤＱＴＫ（配列番号６）からなる群から選択される配列を含む中心モノマーの接触界面を有するフラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質に関する。
【００１１】
好ましい態様では、本発明の変異を有するフラビウイルスは、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、日本脳炎ウイルス、マレーバレーウイルス、デング血清型１ウイルス、デング血清型２ウイルス、デング血清型３ウイルス、デング血清型４ウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、ポワッサンウイルス、及びオムスク出血熱ウイルスからなる群から選択される。
【００１２】
別の態様では、本発明は、本発明の変異を有するフラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、ポリヌクレオチドを含むベクター、このようなベクターを有する宿主細胞に関する。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載されている本発明の変異を有するフラビウイルスのエンベロープ二量体タンパク質をコードする生存した弱毒化されたフラビウイルスに関する。好ましい態様では、フラビウイルスは、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、日本脳炎ウイルス、マレーバレーウイルス、デング血清型１ウイルス、デング血清型２ウイルス、デング血清型３ウイルス、デング血清型４ウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、ポワッサンウイルス、及びオムスク出血熱ウイルスからなる群から選択される。さらに別の態様では、本発明の変異は、生きたキメラフラビウイルスである。場合により、ウイルス（キメラ又は非キメラのいずれか）は、アミノ酸１０７、１３８、１７６、１７７、２２４、２６４、２８０、３１６、及び４４０からなる群から選択される、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質のアミノ酸に対応するアミノ酸残基におけるものなどの１以上のエンベロープタンパク質変異もまた有してもよい。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載されている本発明の変異を有するフラビウイルスのエンベロープ二量体タンパク質をコードする弱毒化されたフラビウイルスを含む免疫原性組成物に関する。このような組成物は、ヒトを含む患者に投与するために使用することができる。投与の典型的な経路は、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下を含む。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載されている本発明の変異を有するエンベロープ二量体タンパク質を有するフラビウイルスをコードするための組換え遺伝子構築物に関する。組換え遺伝子構築物は、プラスミドなどのベクターを含んでもよい。一態様では、組換え遺伝子構築物は、真核生物プロモーターの制御下で、感染性（＋）ＲＮＡ分子をコードする感染性ＤＮＡである。このような組換え遺伝子構築物は、対応する組換えタンパク質をコードすることができる。別の態様では、本発明は、組換え遺伝子構築物で安定に又は一過性にトランスフェクトされた宿主細胞に関する。
【００１６】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載されている本発明の変異を有するフラビウイルスのエンベロープ二量体タンパク質をコードする組換え遺伝子構築物を含む免疫原性組成物に関する。再び、このような組成物は、ヒトを含む患者に投与するために使用することができる。投与の典型的な経路は、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下を含む。
【００１７】
本発明の更なる態様は、利点及びそれに付随する新規な特徴を伴って、一部には、続く説明に記載され、部分的には、後述する試験により当業者に明らかとなり、又は本発明の実施から学ぶことができる。本発明の目的及び利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘された手段及び組み合わせによって、実現され、達成され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＮＹ９９  Ｅタンパク質の細胞外ドメインの三次元モデルである。モデルは、ホモロジーモデリングによって作製された。ドメイン境界は、楕円形及び隣接する数字で示される。
【図２】図２は、ＮＹ９９  Ｅタンパク質の細胞外ドメインの融合前二量体形態の三次元モデルである。パネルＡは、立体リボンとして示されるタンパク質骨格を有する二量体の上面図である。パネルＢ及びＣは、パネルＡにおいて示される中心接触界面の拡大図を示す。上部鎖のＮ→Ｃ方向は、右上において左上正面から背面である；下部鎖のＮ→Ｃ方向は、左下における右下正面から背面である。接触界面のアミノ酸は、概略的に（パネルＢ）、又は空間充填表現（パネルＣ）で示される。明確にするために、後者の配列の概要は、ポリペプチド骨格に正確に従っていない。すなわち、骨格におけるアミノ酸の全てが空間充填表現に明確に視認可能であるわけではないため、隣接するアミノ酸の接続された−Ｃ−Ｎ−Ｃ−Ｎ−ａＣ−原子によってトレースされる、ポリペプチド骨格に従っていない。
【図３】図３は、本発明において使用された感染性ＤＮＡ構築物の概略図である。δ−肝炎δリボザイム配列；ＢＧ−ウシ成長ホルモン転写終結及びポリアデニル化シグナル配列；ＣＭＶ−サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー配列；ｂｌａ−アンピシリン耐性遺伝子；ｏｒｉ−ｐＢＲ３２２複製起点；ｉ２３８３及びｉ３５８／３９３はイントロンの位置を印す。個々のエレメントは縮尺通りに描かれていない。
【図４】図４は、Ｓｅｒ２５７Ａｒｇ（パネルＡ）とＳｅｒ２５７Ｌｙｓ（パネルＢ）変異を有するＮＹ９９  Ｅタンパク質の細胞外ドメインの融合前二量体形態の三次元モデルである。ホモロジーモデリングは、ＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌと座標ファイルＰＤＢ＃１０ＡＮ及びＰＤＢ＃１ＵＺＧを用いて行われた。
【図５】図５は、Ｇｌｙ２５６Ａｒｇ（パネルＡ）とＧｌｙ２５６Ｌｙｓ（パネルＢ）変異を有するＮＹ９９  Ｅタンパク質の細胞外ドメインの融合前二量体形態の三次元モデルである。ホモロジーモデリングは、ＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌと座標ファイルＰＤＢ＃１０ＡＮ及びＰＤＢ＃１ＵＺＧを用いて行われた。
【図６】図６は、野生型及び変異ウイルスの感染性特性のモデルである。カバーガラス上のＢＨＫ細胞は、対応する感染性ＤＮＡでトランスフェクトされ、指定された時間で細胞は固定され、ＷＮ特異的血清、続く抗マウスＩｇＧ  ＦＩＴＣコンジュゲートで染色した。
【図７】図７は、修飾された感染性のＤＮＡ  ｐＣＭＶＮＹ９９の１μｇでの脳内接種後の動物の生存を示すチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、フラビウイルスのエンベロープタンパク質が、二量体形成中に中心モノマーの接触界面を提供する高度に保存された配列を有するという発見に指向される。二量体解離との干渉は、ウイルスの拡散を妨害するために理論化されている。したがって、本発明は、二量体解離を調節するフラビウイルスのエンベロープタンパク質の中心モノマーの接触界面におけるアミノ酸修飾に関する。アミノ酸修飾は、中心モノマーの接触領域におけるポリペプチド配列における置換、挿入、及び／又は欠失を含むことができる。
【００２０】
本発明は、フラビウイルスのエンベロープタンパク質が、二量体の解離を減少させる１以上の変異を有するように、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質のアミノ酸２５６〜２６０に対応するフラビウイルスのエンベロープタンパク質のアミノ酸で中心モノマーの接触界面に沿って二量体を形成することができるフラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質に関する。例示的な実施形態において、蚊媒介性ウイルスに関して、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質の２５６位に対応するアミノ酸（すなわち、ＷＮのＧ２５６に対応する）は、アルギニン又はリジンなどの塩基性アミノ酸で置換される。２５６位のアミノ酸変異は、さらに好ましくは、二量体形成中に対称又はほぼ対称の界面を提供する。別の例示的な態様では、ダニ媒介性ウイルスに関して、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質の２６０位に対応するアミノ酸（すなわち、ＷＮのＧ２６０に対応する）は、リジン又はアルギニンなどの塩基性アミノ酸で置換される。再び、２６０位におけるアミノ酸変異は、さらに好ましくは、二量体形成中に対称又はほぼ対称の界面を提供する。
【００２１】
フラビウイルスは、ＧＳＱＥＧ（配列番号７）、ＧＮＱＥＧ（配列番号８）、ＧＤＱＴＧ（配列番号９）、及びＧＤＱＴＡ（配列番号１０）からなる群から選択される配列を含む野生型の中心モノマーの接触界面を有してもよい。したがって、本発明の一態様では、中心モノマーの接触界面は、中心モノマーの接触界面が、ＲＳＱＥＧ（配列番号１）、ＲＮＱＥＧ（配列番号２）、ＧＤＱＴＲ（配列番号３）、ＫＳＱＥＧ（配列番号４）、ＫＮＱＥＧ（配列番号５）、及びＧＤＱＴＫ（配列番号６）からなる群から選択される配列を有するように、ＧｌｙからＡｒｇへの置換を含む。
【００２２】
表１に一般的に示されるように、ほぼ全ての蚊媒介性フラビウイルスは、中心モノマーの接触界面で、ＧＳＱＥＧ（配列番号７）又はＧＮＱＥＧ（配列番号８）を有する。セリン及びスレオニンはともに、ヒドロキシル含有アミノ酸であり、アスパラギン酸及びグルタミン酸はともに、負に荷電したアミノ酸であり、グリシン及びアラニンは、疎水性の非極性アミノ酸である。西ナイルウイルス及び他の蚊媒介性フラビウイルスでは、一方のエンベロープタンパク質モノマーにおけるＧ２５６に対応するアミノ酸は、モデルにおいて、他のモノマーにおけるＥ２５９に対応するアミノ酸に隣接している。結果として、本明細書に記載されているＧ２５６位の塩基性アミノ酸に対応するアミノ酸における変異は、このようなウイルスにおいて２つの塩端（（−）を有する（＋））の形成をもたらす。表１に示されるように、ほぼすべてのダニ媒介性フラビウイルスは、中心モノマーの接触界面でＧＤＱＴＧ（配列番号９）又はＧＤＱＴＡ（配列番号１０）を有する。ダニ媒介性フラビウイルスにおいて、一方のエンベロープタンパク質モノマーにおけるＤ２５７に対応するアミノ酸は、モデルにおいて、他のモノマーにおけるＧ２６０（又はＡ２６０）に対応するアミノ酸に隣接している。結果として、本明細書に記載されているＧ２６０位の塩基性アミノ酸に対応する変異は、このようなウイルスにおいて２つの塩端（（−）を有する（＋））の形成をもたらす。
【００２３】
当業者に周知であるように、所与のフラビウイルスにおけるアミノ酸が別のフラビウイルスにおけるアミノ酸に対応するという決定は、標準的なアミノ酸配列アラインメントによって行うことができる。西ナイルウイルスに対応するフラビウイルス配列の例を以下の表１に示す。したがって、本発明は、任意のフラビウイルス種又は株において二量体解離を減少させる中心モノマーの接触界面での変異を包含することが理解される。
【００２４】
一態様では、フラビウイルスは、ダニ媒介性ウイルス、蚊媒介性ウイルス、又は
節足動物ベクターを含まないウイルスであってもよい。フラビウイルスとしては、哺乳動物ダニ媒介性ウイルス、例えば、アルクフルマウイルス（「ＡＬＫＶ」）、シカダニウイルス（「ＤＴ」）、ガジェットガリーウイルス（「ＧＧＹＶ」）、カダムウイルス（「ＫＡＤＶ」）、カルシウイルス、キャサヌール森林病ウイルス（「ＫＦＤＶ」）、ランガットウイルス（「ＬＧＴＶ」）、跳躍病気ウイルス（「ＬＩＶ」）、オムスク出血熱ウイルス（「ＯＨＦＶ」）、ポワッサンウイルス（「ＰＯＷＶ」）、ロイヤルファームウイルス（「ＲＦＶ」）、ダニ媒介脳炎ウイルス（「ＴＢＥＶ」）、又はトルコ羊脳炎ウイルス（「ＴＳＥ」）であってもよい。フラビウイルスは、ウミドリ媒介性ウイルス、例えば、メアバンウイルス（「ＭＥＡＶ」）、ソーマレズリーフウイルス（「ＳＲＥＶ」）、又はチュレーニーウイルス（「ＴＹＵＶ」）であってもよい。フラビウイルスは、蚊媒介性ウイルス、例えば、カルベルタードウイルス又はダックテムブスウイルスであってもよい。フラビウイルスは、知られていない脊椎動物宿主を有してもよく、例えば、アエデスフラビウイルス、カルベルタードウイルス、細胞融合剤ウイルス、クレックスフラビウイルス、クレックスセイレリフラビウイルス、カミチリバーウイルス、ナキオゴウイルス、又はキアングビニウイルスが挙げられる。フラビウイルスは、アロアウイルス（「ＡＲＯＡＶ」）、デングウイルス（「ＤＥＮＶ」）、ケドウゴウウイルス（「ＫＥＤＶ」）、ブッサクアラウイルス、カシパコアウイルス（「ＣＰＣＶ」）、コウタンゴウイルス（「ＫＯＵＶ」）、イリェウスウイルス（「ＩＬＨＶ」）、日本脳炎ウイルス（「ＪＥＶ」）、マレーバレー脳炎ウイルス（「ＭＶＥＶ」）、ロシオウイルス（「ＲＯＣＶ」）、セントルイス脳炎ウイルス（「ＳＬＥＶ」）、ウスツウイルス（「ＵＳＵＶ」）、西ナイルウイルス（「ＷＮＶ」）、ヤウンデウイルス（「ＹＡＯＶ」）、ココベラウイルス（「ＫＯＫＶ」）、バガザウイルス（「ＢＡＧＶ」）、イリェウスウイルス（「ＩＬＨＶ」）、イスラエル七面鳥髄膜脳脊髄炎ウイルス（「ＩＴＶ」）、エヌタヤウイルス（「ＮＴＡＶ」）、テムブスウイルス（「ＴＭＵＶ」）、スポンドウエニウイルス群、ジカウイルス（「ＺＩＫＶ」）、バンジウイルス（「ＢＡＮＶ」）、ボウボウイウイルス（「ＢＯＵＶ」）、エッジヒルウイルス（「ＥＨＶ」）、ジュグラウイルス（「ＪＵＧＶ」）、サボヤウイルス（「ＳＡＢＶ」）、セピックウイルス（「ＳＥＰＶ」）、ウガンダＳウイルス（「ＵＧＳＶ」）、ウェセルスブロンウイルス（「ＷＥＳＳＶ」）、又は黄熱ウイルス（「ＹＦＶ」）からなる群から選択されてもよい。知られていない節足動物ベクターを有するウイルスの例としては、エンテベバットウイルス（「ＥＮＴＶ」）、ヨコゼウイルス（「ＹＯＫＶ」）、アポイウイルス（「ＡＰＯＩＶ」）、コウボネリッジウイルス（「ＣＲＶ」）、ジュティアパウイルス（「ＪＵＴＶ」）、モドックウイルス（「ＭＯＤＶ」）、サルビエジャウイルス（「ＳＶＶ」）、サンペルリタウイルス（「ＳＰＶ」）、ブカラサバットウイルス（「ＢＢＶ」）、キャリーアイダンドウイルス（「ＣＩＶ」）、ダカールバットウイルス（「ＤＢＶ」）、モンタナホオヒゲコウモリの白質脳炎ウイルス（「ＭＭＬＶ」）、プノンペンバットウイルス（「ＰＰＢＶ」）、及びリオブラボーウイルス（「ＲＢＶ」）が含まれる。一態様では、フラビウイルスは、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、日本脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、デング血清型１ウイルス、デング血清型２ウイルス、デング血清型３ウイルス、デング血清型４ウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、ポワッサンウイルス、及びオムスク出血熱ウイルスからなる群から選択される。
【００２５】
上記で列挙されたウイルスに加えて、中心モノマーの接触界面における本発明の変異を含むキメラフラビウイルスは本発明の範囲内である。一般的には、キメラフラビウイルスは、異なるフラビウイルス株を含む２以上の異なるフラビウイルスからの配列を含むゲノムを有するウイルスを包含する。例えば、これらのキメラは、構造タンパク質（又は複数のタンパク質）が、第２のウイルスの対応する構造タンパク質（又は複数のタンパク質）で置換されているフラビウイルス（すなわち、骨格フラビウイルス）を含むことができる。例えば、キメラは、フラビウイルスのｐｒＭ及びＥタンパク質が、第２のウイルス（例えば、デングウイルス（血清型１〜４）、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、又は別のウイルス、例えば、本明細書に言及されているウイルスのいずれか）のｐｒＭ及びＥタンパク質で置換されている骨格フラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルス）からなっていてもよい。キメラウイルスは、ウイルス又はそれらの株の任意の組み合わせから作製することができる。典型的なキメラは、Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ（米国特許第７，４５５，８３２号）及びＧｕｉｒａｋｈｏｏら（米国特許出願第２００７／０２６９４５８号）に記載され、それらは、参照により援用される。
【００２６】
本発明のフラビウイルスのエンベロープタンパク質は、弱毒化されたフラビウイルス株を調製するために有用である。このような使用に加えて、タンパク質は、フラビウイルスのエンベロープタンパク質の作用メカニズムと機能を解明するための補完的なツールとしても有用である。例えば、タンパク質は、瞬時のタンパク質の活性を調節する分子（フラビウイルスによって誘発される感染を治療することができる）のスクリーニングに使用することができる。一態様では、本発明のフラビウイルスのエンベロープタンパク質は、単離及び／又は精製することができる。別の態様において、本発明は、本明細書に記載されているタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関し、これは、遺伝子コードの縮重に起因するこれらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列のすべての可能な例を含む。本発明の核酸は、組換えＤＮＡ技術及び／又は化学的ＤＮＡ合成の周知の方法によって得ることができる。本発明はまた、瞬時のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え構築物、又はこのようなタンパク質をコードする弱毒化されたフラビウイルス株を提供する。構築物は、本発明のベクターによって形質転換された原核生物又は真核生物の宿主細胞におけるベクターの形であってもよい。
【００２７】
したがって、別の態様において、本発明はまた、生きている弱毒化されたフラビウイルスに関し、この場合、フラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質は、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質のアミノ酸２５６〜２６０に対応するアミノ酸で中心モノマーの接触界面に沿った二量体を形成することができ、フラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質は、二量体の解離を減少させる１以上の変異を有する。
【００２８】
本発明の生きている弱毒化されたウイルスは、感染性ＤＮＡアプローチを用いてインビボで生成されてもよく、例えば、Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ（米国特許第７，４５９，１６３号）とＹａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ（米国特許第７，４５５，８３２号）に記載されているものが挙げられ、参照により援用される。本発明の感染性ＤＮＡは、任意の適切なベクターを用いて形成されてもよいことは、当業者には理解される。一般に、ベクターは、宿主細胞にパッセンジャー核酸配列（すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を移入するように機能する核酸分子（典型的には、ＤＮＡ又はＲＮＡ）である。ベクトルの３つの一般的なタイプとしては、プラスミド、ファージ、及びウイルスが挙げられる。好ましくは、ベクターはプラスミドである。すなわち、本発明の感染性ＤＮＡワクチンは、動物組織に導入し得るプラスミドとして生成され、そこで、フラビウイルスゲノムのサイズのメッセンジャーリボ核酸（「ｍＲＮＡ」）分子を生成させるために、動物細胞によって発現されるＤＮＡで構成され、該ｍＲＮＡは転写されて、ウイルスポリタンパク質を生成し、細胞マシナリーによってプロセッシングを受け、全セットのフラビウイルスタンパク質を生成する。これらのタンパク質は、上記の一次ＲＮＡ転写物の複製を開始し、したがって、上記ＤＮＡプラスミドが導入された動物組織においてウイルス複製サイクルを開始する。
【００２９】
従来のＤＮＡワクチンに使用されている、適した例示的なプラスミドベクターとしては、限定されないが、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ＃３１３４４）；ｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ＃３７２５４）；ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｃａｔ．ＮＯ．Ｖ３８５−２０；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｖｅｃｔｏｒｄａｔａ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）で利用可能なＤＮＡ配列；ｐＮＧＶＬ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＭＩ）；ｐ４１４ｃｙｃ（ＡＴＣＣ＃８７３８０）、ｐ４１４ＧＡＬＳ（ＡＴＣＣ＃８７３４４）、ｐＢＡＤ１８（ＡＴＣＣ＃８７３９３）、ｐＢＬＣＡＴ５（ＡＴＣＣ＃７７４１２）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌＫＳ、（ＡＴＣＣ＃８７０４７）、ｐＢＳＬ１３０（ＡＴＣＣ＃８７１４５）、ｐＣＭ１８２（ＡＴＣＣ＃８７６５６）、ｐＣＭＶｔｋＬＵＣ（ＡＴＣＣ＃８７６３３）、ｐＥＣＶ２５（ＡＴＣＣ＃７７１８７）、ｐＧＥＭ−７ｚｆ（ＡＴＣＣ＃８７０４８）、ｐＧＥＸ−ＫＮ（ＡＴＣＣ＃７７３３２）、ｐＪＣ２０（ＡＴＣＣ＃８７１１３、ｐＵＢ１１０（ＡＴＣＣ＃３７０１５）、ｐＵＢ１８（ＡＴＣＣ＃３７２５３）が挙げられる。
【００３０】
また、本発明の感染性ＤＮＡは、好ましくは、適当なプロモーターの制御下にある。真核生物発現に関して、適切なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）初期プロモーター、あるいはラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）ＬＴＲプロモーター、及びＳＶ４０プロモーターが含まれる。
【００３１】
本発明の免疫原性組成物に存在する、生きている弱毒化されたウイルス又は組換え構築物の量は、好ましくは、治療的有効量である。例えば、ＷＮ組換え構築物の場合、治療有効量のプラスミドは、一般的に、組成物が投与される宿主において過度に負の効果を引き起こすことなしに、ＷＮウイルスをコードするヌクレオチド配列がその免疫学的役割を果たすように必要とされる量である。使用されるべきプラスミドの正確な量、及び投与されるべき組成物／ワクチンの正確な量は、因子、例えば、使用される転写プロモーターの強さ、治療される状態のタイプ、投与様式、並びに組成物中の他の成分に従って変更される。好ましくは、組成物又はワクチン製剤は、約１０ｎｇから約１μｇのプラスミドから構成される。非複製ＤＮＡワクチンは、通常、プラスミドＤＮＡ（典型的には１０〜１００μｇ）の多量を必要とすることに留意することが重要である。
【００３２】
本発明のワクチン及び医薬組成物はまた、医薬として許容される担体を含むことができる。担体には、弱毒化された生きたウイルス又は感染性ＤＮＡが投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルが含まれる。このような医薬担体は、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む水及び油などの無菌の液体であり得る。適切な医薬としての賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。また、組成物は、所望であれば、湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤の少量を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。組成物は、トリグリセリドなど従来の結合剤及び担体を含む、坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、標準的な担体を含むことができ、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。適切な医薬としての担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。担体は、補助剤を含むことができ、例えば、限定されないが、希釈剤、安定化剤（すなわち、糖及びアミノ酸）、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、粘度増加剤、着色剤などが挙げられる。担体としては、限定されないが、安定剤、保存剤、及び緩衝剤が挙げられる。好適な安定剤は、例えば、ＳＰＧＡ、Ｔｗｅｅｎ組成物（例えば、Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能なもの）、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストラン、グルタミン酸、又はグルコース）、タンパク質（例えば、乾燥乳清、アルブミン、又はカゼイン）、又はその分解生成物である。適切な緩衝剤の非限定的な例としては、アルカリ金属リン酸塩が挙げられる。適切な保存剤は、チメロサール、メルチオレート及びゲンタマイシンである。希釈剤は、水、水性緩衝液（例えば、緩衝化された生理食塩水）、アルコール、及びポリオール（例えば、グリセロール）を含む。組成物は、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、マクロファージコロニー刺激因子（「Ｍ−ＣＳＦ」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン１２（「ＩＬ−１２」）、及び／又はＣｐＧオリゴヌクレオチドを含んでもよい。このような組成物を調製するために、当該技術分野で周知の方法を用いることができる。本発明の様々な実施形態によるワクチン及び免疫原性組成物は、液体、凍結懸濁液の形態又は凍結乾燥形態で調製され及び／又は販売することができる。典型的には、本発明に従って調製されるワクチン及び／又は医薬組成物は、このような組成物に習慣的に使用される医薬として許容される担体を含む。医薬組成物及びワクチン製剤の例としては、Ｓｔｅｒｎｅｒら（米国特許第８０４８４２９号）に記載され、それは、参照により援用される。
【００３３】
皮下注射、皮内導入、皮膚を通した注射、及び腹腔内、静脈内、経口、又は吸入送達などの他の投与様式も好適である。例えば、本発明の感染性ＤＮＡを含有するベクターは、当該技術分野において知られている方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子、マイクロカプセル、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リポソーム融合）、遺伝子銃（微粒子銃）又はＤＮＡベクタートランスポーターの使用によって所望の宿主に導入することができる。
【００３４】
投与は、単回又は複数回（すなわち、単回投薬、ブースターを含む）であってもよい。このような投与は、単独で、又はフラビウイルスに対する活性な他の治療剤との組み合わせであってもよい。ワクチン精製、他のワクチン成分、ワクチン調製、及びワクチン投与は、概して、Ｗｉｃｋｅｒら（米国公開特許出願第２００９／０１１７１４９号）、ブラウンら（米国公開特許出願第２０１１／０２３６４２１）に記載され、これらの全ては参照により援用される。
【００３５】
本発明はまた、高病原性ＮＹ９９ウイルス株を含む病原性フラビウイルス株に対する免疫応答又は防御免疫を誘発するための組換え構築物及び医薬組成物に関する。関連する態様によれば、本発明は、フラビウイルス関連疾患を予防及び／又は治療するためのワクチンに関する。
【００３６】
用語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」とは、１以上を意味し得る。本明細書において、特許請求の範囲で使用するとき、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と結びつけて用いる場合、用語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１又は１を超えることを意味し得る。
【００３７】
用語「約」は、数値がデバイスのエラーの固有の変動を含むことを示すために使用され、本方法は、数値又は研究対象間に存在する変動を決定するために使用される。
【００３８】
核酸に関して用語「コードする」又は「コードしている」とは、当業者によって、本発明を容易に理解できるようにするために使用される；しかしながら、これらの用語は、それぞれ、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と交換可能に使用され得る。
【００３９】
用語「又は」とは、代替のみ代替が相互に排他的であることを意味するものといて明示的に意図されていない限り、「及び／又は」を意味し、本開示は、代替のみと「及び／又は」を意味する定義を支持する。本明細書で使用するとき、「別の」とは、少なく友も第２の又はそれを超えるものを意味してもよい。
【００４０】
用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、「ポリタンパク質」、及び「タンパク質」とは、本明細書において交換可能に使用され、コードされた及びコードされていないアミノ酸、化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。
【００４１】
用語「治療する」とは、フラビウイルス複製又は関連する疾患の症状が阻害、改善、又は完全に除去されるプロセスを指す。本明細書で使用するとき、用語「予防する」とは、フラビウイルス複製又は関連疾患が妨害又は遅延されるプロセスを指す。
【００４２】
本明細書で使用される用語「組換え」とは、特定の配列が、天然の系に見出される相同な配列から区別できる構造的コード配列を有する構築物を生じる、クローニング、制限、及び／又は連結のステップの様々な組み合わせの産物であることを意味する。例えば、構造的コード配列をコードするＤＮＡ配列は、組換え転写ユニット中に発現させることができる合成遺伝子を提供するために、ｃＤＮＡフラグメント及び短いオリゴヌクレオチドリンカーから、又は一連のオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。このような配列は、典型的には、真核生物の遺伝子に存在する、内部非翻訳配列又はイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供することができる。逆に、安定化のために、このような配列は、天然ではウイルス遺伝子に存在しない人為的な非翻訳配列又はイントロンの挿入によって中断されたオープンリーディングフレームの形態で提供することができる。また、関連する配列を含むゲノムＤＮＡを使用することができる。イントロン以外の非翻訳ＤＮＡの配列はまた、オープンリーディングフレームから５’又は３’に存在してもよく、この場合、このような配列は、コード領域の操作又は発現に干渉しない。したがって、例えば、用語「組換え」ポリヌクレオチド又は核酸とは、天然に存在しないか、又は配列の２つの他の分離したセグメントの人為的な組み合わせによって作製されるものを指す。この人為的な組み合わせは、多くの場合、核酸の単離されたセグメントの化学合成手段又は人為的な操作、例えば、遺伝子工学的手法のいずれかによって達成される。このようなものとして、通常、典型的には配列認識部位を導入又は除去しながら、同じ又は保存アミノ酸をコードする重複するコドンでコドンを置換することが行われる。あるいは、機能の所望の組み合わせを生成するために、所望の機能の核酸セグメントを一緒に結合することが行われる。
【００４３】
用語「構築物」とは、概して、特定のヌクレオチド配列（単数又は複数）の発現のために生成された組換え核酸、一般には、組換えＤＮＡを指し、又は他の組換えヌクレオチド配列の構築に使用されるべきものである。
【００４４】
同様に、用語「組換えタンパク質」とは、天然に存在しないか、又はアミノ酸配列の２つの別の分離されたセグメントの人為的な組み合わせによって作製される、ポリペプチド又はポリタンパク質を指す。この人為的な組み合わせは、例えば、すなわち、上述のような組換えＤＮＡ技術の標準的な技術によって達成することができ、すなわち、組換えタンパク質は、組換えポリヌクレオチドによってコードされ得る。従って、組換えタンパク質は、全ての又は一部の組換えポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列である。
【００４５】
用語「免疫学的に活性な」又は「免疫原性と」は、患者における接種に応じた特定の液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導する、天然、組換え若しくは合成のウイルス又はペプチド、あるいは天然、組換え若しくは合成の、このようなウイルス又はペプチドをコードする核酸の能力を指す。
【００４６】
従って、用語「免疫応答」とは、フラビウイルスタンパク質などの抗原に対するＴ細胞応答若しくは抗原に対する抗体の血清レベルの増加、又は抗原に対する中和抗体を指す。
【００４７】
用語「保護」又は「防御免疫」とは、本明細書において、フラビウイルスによって引き起こされる疾患又は死に対して（部分的又は全体的に）保護するために免疫中に誘導される血清抗体又はＴ細胞応答の能力を指す。
【００４８】
本発明の用語「対象」又は「患者」は、好ましくは、トリ、例えば、ニワトリ、カラス、タカ、オウム、ガチョウ、フラミンゴなど、又は哺乳動物、例えば、マウス、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどであり、好ましくはヒトである。
【００４９】
用語「治療有効投薬量」又は「治療有効量」とは、投与される所望の効果を生じる投薬量又は量を意味する。正確な投薬量は、治療の目的に依存し、既知の技術を用いて当業者により確認され得る。
【００５０】
用語「医薬として許容される」とは、連邦又は州政府の規制当局によって承認され、又は動物での使用、より具体的にはヒトでの使用のために、米国薬局方又は他の一般に認められた薬局方に列挙されていることを意味する。したがって、本明細書で使用するとき、用語「医薬として許容される担体」とは、限定されないが、副作用なしに哺乳動物に接種され得る、本発明のＤＮＡ構築物又は弱毒化された生きたウイルスを含有させるためのビヒクルを意味する。
【００５１】
本発明は、中心モノマーの接触界面における変異に関して記載されているが、本発明のウイルスは、１以上のさらなる変異を含むことができることは理解される。例えば、西ナイルウイルス（又は他のフラビウイルス）の場合、このような追加の変異（単数又は複数）は、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質の１０７位（例えば、ＬからＦ）、３１６位（例えば、ＡからＶ）、若しくは４４０（例えば、ＫからＲ）（又はこれらの組み合わせ）の領域であってもよいしたがって、変異は、例えば、西ナイルエンベロープタンパク質のアミノ酸１０２〜１１２、１３８（例えば、ＥからＫ）１７６（例えば、ＹからＶ）、１７７（例えば、ＴからＡ）、２４４（例えば、ＥからＧ）、２６４（例えば、ＱからＨ）、２８０（例えば、ＫからＭ）、３１１〜３２１、及び／又は４３５〜４４５であってもよい。具体的な例として、参考として西ナイルウイルス株ＮＹ９９フラミンゴ３８２−９９（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１９６８３５）の配列を用いて、１０７位のリジンがフェニルアラニンに置換され得て、３１６位のアラニンがバリンに置換され得て、及び／又は４４０位のリジンがアルギニンに置換され得る。変異させることができるアミノ酸の追加の組み合わせの例としては、次のとおりである：１７６、１７７、及び２８０；１７６、１７７、２４４、２６４、及び２８０；並びに１３８、１７６、１７７、及び２８０。さらに、これらの変異はまた、本明細書で記載されているように、他のフラビウイルスの対応するアミノ酸に存在することができる。
【００５２】
以下の実施例は、本発明の例示的な実施形態を実証するために含まれる。当業者は、本発明の実施において十分に機能するために、発明者によって発見された典型的な技術に従う実施例に開示された技術が、その実施のための好ましい様式を構成すると考えられ得ると理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、多くの変更が、開示され、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、同様又は類似の結果を得ている特定の実施形態においてなされ得ることを理解すべきである。
【実施例】
【００５３】
実施例１：ＷＮ  ＮＹ９９エンベロープタンパク質の相同性モデリングとモノマー接触界面の分析
ＤＥＮ２（ＰＤＢ  ＃１０ＡＮ，  （Ｍｏｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｌｉｇａｎｄ−  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００  ６９８６−６９９１［Ｅｐｕｂ  Ｍａｙ  ２０  ２００３］（２００３）参照）とＤＥＮ３（ＰＤＢ  ＃１ＵＺＧ，（Ｍｏｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９  １２２３−１２３１（２００５）参照）Ｅホモ二量の座標ファイルは、Ｓｗｉｓｓモデル（Ｇｕｅｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ：ａｎ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １８  ２７１４−２７２３（１９９７）、及びＳｃｈｗｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ：ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｓｅｒｖｅｒ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１  ３３８１−３３８５（２００３））を用いた相同性モデリングにおいて使用され、ＮＹ９９細胞外ドメイン二量体のモデルを構築した；これらのモデルは、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩソフトウェアパッケージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの３Ｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｅｗｅｒを用いて、表示され、探索され、操作された。図２に示されるように、２つのモノマー間の接触界面は、ｐｒＭの代わりに、２つの穴と接触していない（Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ａｔ  ２  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ［ｃｏｍｍｅｎｔｓ参照］，Ｎａｔｕｒｅ  ３７５  ２９１−２９８（１９９５）を参照されたい）。密接な接触の領域は、二量体の中心において形成され、対称的に、そのいずれかの遠位部分のいずれかで形成される。それぞれ、ボックスと２つの楕円によって図２に示される。先端の接触は、ドメインＩ及びＩＩＩによって形成された疎水性ポケットに嵌合したｃｄ融合ループを備え、主に非極性アミノ酸を含む。
【００５４】
対照的に、中心の接触界面は、図２Ｂと２Ｃに詳細に示され、主に親水性及び極性アミノ酸を含む。各鎖が提供する２つの同一のαヘリックスを構成するアミノ酸は、密接な接触を形成していない。２つのモノマーのポリペプチド鎖は、二量体におけるこの遺伝子座で鋭角で交差し、これは、「Ｘ」（画像平面の上部に対応する側から見た場合）に似ており、ヘリックスは、「Ｘ」配置の左角と右角を占める。しかしながら、交差点周囲のアミノ酸（ＧＳＱＥＧ、図２Ｂに模式的に示され、空間として図２Ｃに記入）は、密着した接触を形成するように見える。表１に示すように、実際、配列は、同種の菌株間だけでなく、属のメンバー間でも非常に保存されている。特に、ダニ媒介ウイルスのサブグループ全体は、相互交換（Ｓ＾ＤとＥ＾Ｄ）を持ち、このように、これらの位置で負に帯電した、ヒドロキシル含有アミノ酸の組み合わせを維持する。この配列の空間を満たす表記では、各鎖中のＳｅｒ−２５７のヒドロキシル側鎖が並置されている。ヒドロキシル基は、同一鎖のＧｌｎ−２５８又はＧｌｕ−２５９のいずれかの骨格ＮＨに等しく近接し（３．１１対３．１５Ａ）、水素結合を形成する可能性がある。１つの鎖中のＧｌｕ−２５９の側鎖の酸素原子は、二量体の安定性に寄与し得る水素結合を形成するために、反対の鎖におけるＳｅｒ−２５７の骨格ＮＨに近接する（３．０６−３．１４Ａ）。保存されたＧｌｎ−２５８の側鎖は、図２Ｃの画像平面の裏側に両方の鎖において露出され、構造体の他の要素に近接しているようではない。２５６と２６０位の小さなアミノ酸（Ｇｌｙ又はＡｌａ）についての選択圧は、接触界面での高い対称配置の空間制約によって課される可能性がある。
【００５５】
【表１】
2015535302.tif 000003
【００５６】
明確にするために、中心モノマーの接触界面の両側に隣接する２つのアミノ酸もまた表１に示す。
【００５７】
実施例２：ＷＮフラビウイルスの感染性クローン
ＷＮ系統２ウイルス（ｐＳＰ６ＷＮ９５６）の安定した感染性クローンの組み立てについて報告されている。Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｌｏｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８１  ２９４−３０４（２００１）を参照されたい。このクローンは、ＳＰ６プロモーターの転写制御下で組み立てられた。取り扱いを簡素化し、感染性クローンを安定化させるために、それは、ＪＥ感染性ＤＮＡの安定化のために開発されたスキームを使用して、感染性ＤＮＡ（ｉＤＮＡ）フォーマットに変換された（Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｎｅｗ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ＋ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｌｏｎｅｓ  ｅｎａｂｌｉｎｇ  ｔｈｅｉｒ  ｓｔａｂｌｅ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８１  ２７２−２８０（２００１））。ｐＳＰ６ＷＮ９５６構築物中のＳＰ６プロモーターをＣＭＶプロモーターで置換し、１３２ｂｐの人工イントロンを、大腸菌内での増殖中に構築物の安定性を高めるために３５８位（カプシド遺伝子の末端）に挿入した。ウシ成長ホルモン転写終結シグナル（「ＢＧ」）が続く、アンチセンス鎖肝炎δリボザイムは、３’末端形成の増加した忠実度のためにＷＮ  ｃＤＮＡの末端に遺伝子操作され、最終構築物ｐＣＭＶＷＮ９５６（ｉ３５８）６ＢＧ（さらには、ｐＣＭＶＷＮ９５６と呼ばれる；図３参照）を生じさせた。ウイルス増幅病巣は、このプラスミドによるトランスフェクションの２４時間後、間接的免疫蛍光によって容易に検出可能である（図４）。ＷＮ  ｉＤＮＡの特異的感染は、Ｖｅｒｏ細胞において、１〜５×１０6ｐｆｕ／μｇ  ＤＮＡである。
【００５８】
分離株３８５−９９は、Ｖｅｒｏ継代１でＲ．Ｔｅｓｈ（Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ，ＴＸ）によって提供された。ウイルスは、１９９９年８月に、Ｂｒｏｎｘ  Ｚｏｏ，ＮＹＣで死亡したシロフクロウから回収した。分離株の地理的位置と時期に起因して、それは、ＮＹ９９株の独立した分離株である可能性が非常に高い。Ｖｅｒｏ継代２で決定された３８５−９９ゲノムの完全なヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃ＤＱ２１１６５２）は、６３０位の１つのサイレントなＡ−Ｇ置換において、初期に提出された同分離株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃ＡＹ８４２９３１）のヌクレオチド配列とは相違する。３８５−９９分離株は、プロトタイプＮＹ９９分離株３８２−９９（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃ＡＦ１９６８３５）由来の８ヌクレオチドと、Ｅ１６７（Ｐｈｅ−Ｌｅｕ）での１つのアミノ酸において相違する。ｐＳＰ６ＷＮ９５６とは対照的に、同様のｐＳＰ６ＮＹ９９構築物は、非常に不安定であり、自発的な再配列に高い傾向を示した。ｉＤＮＡフォーマットは、大腸菌内での増殖中に問題領域の発現を妨げる短いイントロンの挿入によって、このような不安定な構築物の安定化を可能にする（Ｍｉｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ’ｍｉｎｉｍａｌ’ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ＤＮＡ，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ８１  １１３−１２３（２００１）、及びＹａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｎｅｗ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ＋ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｌｏｎｅｓ  ｅｎａｂｌｉｎｇ  ｔｈｅｉｒ  ｓｔａｂｌｅ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８１  ２７２−２８０（２００１））；イントロンは、ウイルスＯＲＦを回復する感受性細胞のトランスフェクション後に、真核生物の転写機構によって正確に除去される。３９３及び２３８４位でのイントロンの挿入は、比較的安定したＮＹ９９感染性クローンの構築を可能にした。ｐＣＭＶＮＹ９９（ｉ３９３ｉ２３８４）８ＢＧ構築物（さらにｐＣＭＶＮＹ９９と呼ばれる、図３）は、トランスフェクションの２４時間後に抗原陽性病巣が得られ、トランスフェクションの４０時間後にほぼ完全に単層に感染した。特異的感染力は、５〜８×１０6ｐｆｕ／μｇである；このｉＤＮＡから回収されたウイルスは、親３８５−９９と同じ生物学的特性を有している（結果は示さず）。上記の２つのｉＤＮＡプラスミドは、構造タンパク質遺伝子の相互交換を有するキメラ構築物を作製するために使用された。このようなキメラｐＣＭＶ［ＣｐｒＭＥ  ＮＹ９９］ＷＮ９５６の１つは、ヒト弱毒化西ナイルワクチンの継続的な開発において本発明者によって使用されている誘導体であって、図３に示される。それは、ＷＮ９５６の代わりに、３８５−９９のすべての構造タンパク質を担持し、前者の高い免疫原性と後者の弱毒化された表現型を兼ね備えている。
【００５９】
実施例３：ウイルス感染性に影響を与える変異の同定
上述したように、高度に保存された配列ＧＳＱＥＧは、Ｅ二量体で本質的に回文状の中心モノマーの接触界面を形成する。モデル実験では、この接触界面での相互作用を強化し、二量体のウイルス感染性のｐＨを媒介性分解に関してその生存に影響を与える可能性があるいくつかの変異を選択した。
【００６０】
理論的根拠：モノマー対モノマーの相互作用を強化することができる変異を選択する。中心接触界面のパリンドローム特性は、図２の一番上の画面に見られる二量体の二重の対称性から生じる。図２Ｂと２Ｃの拡大画面は、野生型タンパク質において、ＧＳＱＥＧ配列が高度に対称的な接触を形成することを示す。この対称性の保存は、本発明者らの変異モデル実験における重要な因子として含められた。換言すると、対称又はほぼ対称の界面を生じさせるために側鎖の立体構造を適合することができなかったアミノ酸を排除した。一般に、この界面でのモノマー対モノマーの相互作用を妨害する変異を調査しなかった。このような変異はビリオン組み立てに有害であることを期待するのは妥当である。対照的に、モノマー間の相互作用を強化する変異は、ビリオン組み立てにはほとんど影響を及ぼさず、むしろ二量体の解離に悪影響を及ぼす可能性がある。界面の対称性は、ＧＳＱＥＧ配列中の単一の変異が各鎖の寄与により界面での二重効果をもたらすことを暗に意味する。
【００６１】
高度に保存された負に帯電したアミノ酸の存在（蚊媒介性フラビウイルスについてＥ、及びダニ媒介サブグループについてＤ）は、接触界面でのモノマー相互作用が、それと塩橋を形成することができる正に帯電したアミノ酸の導入によって強化され得るかどうかについての調査を促進した。上述したように、Ｇｌｎ−２５８側鎖は、図２Ｃの画像平面の裏面側に露出しているが、それらの潜在的な相互作用は同定されなかった。しかしながら、１つの鎖中のＧｌｙ−２５６とＳｅｒ−２５７の両方は、他の鎖中のＧｌｕ−２５９の側鎖に近接し、これらの位置での変異の探索を促進する。Ａｒｇ又はＬｙｓに置換されるＳｅｒ−２５７を有するＥ変異タンパク質のモデリングを図４Ａと４Ｂに示す。Ａｒｇ−２５７及びＬｙｓ−２５７のいずれも対称的な界面を形成することができないことは明らかである。（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｄｅｅｐ  Ｖｉｅｗ  ３．７を使用した）ねじれ角を操作することによって、両方の鎖における側鎖の折り畳みの対称性を改善する試みは、原子間の複数の衝突によって成功しなかった（結果は示さず）。Ａｒｇ−２５７はわずかに良好にフィットし得たが、得られた配列は、いずれかの鎖中のＡｒｇ−２５７側鎖が、同じ鎖のＧｌｕ−２５９側鎖の近傍に出現することを示している。したがって、２つの鎖間の所望の潜在的な塩橋を形成することができなかった。
【００６２】
Ａｒｇ又はＬｙｓによって置換されるＧｌｙ−２５６を有するＥ変異タンパク質のモデリングは、より多くの有望な結果をもたらした。得られたＲＳＱＥＧ（図５Ａ）及びＫＳＱＥＧ（図５Ｂ）の両方は、ほぼ対称な界面を形成するようであり、ねじれ角の操作は、原子間の衝突なしに、改良された対称性を有するいくつかの回転異性体を生成させた（結果は示さず）。最も重要なことは、一方の鎖中のＡｒｇ−２５６とＬｙｓ−２５６の両方の側鎖は、他の鎖のＧｌｕ−２５９側鎖に近接しているようであり、したがって、鎖間の所望の塩橋を形成することができた。上述のように、単一の変異は、パリンドローム接触界面のいずれかの側で２つの塩橋の形成をもたらす。このため、Ｇｌｙ２５６Ａｒｇ及びＧｌｙ２５６Ｌｙｓ変異は、ＮＹ９９Ｅタンパク質二量体の形成と挙動に、及びＮＹ９９ウイルスの生物学的特性に対するそれらの影響を探索するために選択された。
【００６３】
実施例４：変異体構築物回復の設計と変異ウイルスの生物学的特性
記載された修飾の弱毒化効果を調べるために、ｐＣＭＶＮＹ９９感染性ＤＮＡ構築物におけるＧｌｙ２５６ＡｒｇとＧｌｙ２５６Ｌｙｓ変異が、図３に示されるように導入された。比較について、配列ＧＳＱＥＧ（蚊媒性ウイルスに見られる）は、ダニ媒介性フラビウイルスについてのその特徴をＧＤＱＴＧに変更された。ｐＣＭＶＹ９９プラスミドは、通常、哺乳動物細胞のトランスフェクション時とマウスの直接接種後の両方で、感染性が高く、病原性が高いＮＹ９９ウイルスを生成する。後者は、任意の経路（ｉ．ｍ、ｉ．ｄ．、ｉ．ｅ．）による感染性ＤＮＡのわずか１ｐｇの接種後、結果として動物の死亡率が１００％となる。
【００６４】
図６に示されるように、両方の二量体を強化した変異は、野生型構築物から生成されたＮＹ９９ウイルスと比較して、トランスフェクトされた哺乳動物細胞内で広がるウイルスの遅延をもたらすウイルス感染性に対する効果を顕著に示した。対照的に、ダニ媒介性フラビウイルス立体構造の挿入は、ウイルス感染性に明らかな影響を及ぼさなかった。
【００６５】
変異誘導体の毒性は、成体マウスの脳内接種モデルにおいて試験された。５〜６週齢マウスのグループは、すなわち、１μｇのｐＣＭＶＮＹ９９のＧ２５６Ｒ、Ｇ２５６Ｋ、又は（Ｓ２５７Ｄ、Ｅ２５９Ｔ）誘導体で接種され、動物は、死亡率について２１日間観察された。瀕死の動物を安楽死させ、それらが、ウイルス特異的ＲＴ−ＰＣＲによって、脳内のウイルス存在によって確認された感染により死亡したものとしてカウントした。トランスフェクション実験と一致して、（Ｓ２５７Ｄ、Ｅ２５９Ｔ）変異体は、接種後の５日目にすべての動物を死滅させる強毒性であった。対照的に、Ｇ２５６Ｒ、Ｇ２５６Ｋグループのそれぞれにおけるたった２匹のマウスが、Ｇ２５６Ｋグループは病的であることが分かり、安楽死させた；しかしながら、ＲＴ−ＰＣＲによる脳内のウイルス存在の実証がなされなかった。それにもかかわらず、動物の死亡が感染によって引き起こされたものと仮定すると、脳内接種などの厳しい試験における６７％生存率は、両方の変異体ウイルスの高い弱毒化レベルを示す。全ての生存動物は、終点希釈力価が１：２５６０を超える、ＮＹ９９特異的抗体の高レベルを実証し、これは、実際に、動物が感染性ＤＮＡに暴露されたことを示す。
【００６６】
上記から、本発明は、本明細書において上述される全ての目的及び課題を達成するように十分に適合されたものであり、自明であり、本発明に固有である他の利点を伴うものである。多数の可能な実施形態は、本発明の範囲から逸脱することなしになされ得るため、本明細書に記載され、又は添付の図面に示された全ての事項は、制限するという意味ではなく、例示的なものとして解釈されるべきであることを理解する必要がある。具体的な実施形態が示され、検討されているが、当然に、様々な変更を行うことができ、本発明は、本明細書に記載されている部分及び工程の具体的な形態又は配置に限定されるべきでない。ただし、このような限定が、以下の特許請求の範囲に含まれることは除く。
【００６７】
以下の参考文献は、本明細書に記載されているものを補足する例示的な手法又は他の詳細を与える程度で、参照により本明細書に具体的に援用される。
【００６８】
【化１】
2015535302.tif 000004
【００６９】
【化２】
2015535302.tif 000005
【００７０】
【化３】
2015535302.tif 000006
【００７１】
【化４】
2015535302.tif 000007
【図１】
2015535302.tif 000008
【図２Ａ】
2015535302.tif 000009
【図２Ｂ】
2015535302.tif 000010
【図２Ｃ】
2015535302.tif 000011
【図３】
2015535302.tif 000012
【図４Ａ】
2015535302.tif 000013
【図４Ｂ】
2015535302.tif 000014
【図５Ａ】
2015535302.tif 000015
【図５Ｂ】
2015535302.tif 000016
【図６】
2015535302.tif 000017
【図７】
2015535302.tif 000018
【配列表】
2015535302000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月16日(2015.10.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中心モノマー接触界面に沿って二量体を形成することができるフラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質であって、フラビウイルスのエンベロープタンパク質は、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質のアミノ酸２５６〜２６０に対応する中心モノマー接触界面配列を有し、前記フラビウイルスのエンベロープタンパク質は、二量体の解離を減少させる、野生型に対して中心モノマー接触界面において変異を有し、ここで、前記中心モノマー接触界面がＲＳＱＥＧ（配列番号１）の配列を含まない、上記フラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質。
【請求項２】
前記中心モノマー接触界面が、ＧＳＱＥＧ（配列番号７）、ＧＮＱＥＧ（配列番号８）、ＧＤＱＴＧ（配列番号９）、及びＧＤＱＴＡ（配列番号１０）からなる群から選択される野生型配列を有する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記変異が中心モノマー接触界面での２つの塩橋の形成をもたらす、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記フラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質が、ダニ媒介性ウイルス由来であり、前記変異が、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質のアミノ酸２６０に対応するアミノ酸が塩基性アミノ酸で置換されている変異を含み、又は前記フラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質が、蚊媒介性ウイルス由来であり、前記変異が、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質のアミノ酸２５６に対応するフラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質のアミノ酸が塩基性アミノ酸で置換されている変異を含む、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記塩基性アミノ酸がリジン及びアルギニンからなる群から選択される、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項１に記載のフラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
中心モノマー接触界面に沿って二量体を形成することができるフラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質をコードする弱毒化されたフラビウイルスであって、フラビウイルスのエンベロープタンパク質は、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質のアミノ酸２５６〜２６０に対応する中心モノマー接触界面配列を有し、前記フラビウイルスのエンベロープタンパク質は、二量体の解離を減少させる、野生型に対して中心モノマー接触界面において変異を有する弱毒化されたキメラフラビウイルス。
【請求項８】
前記中心モノマー接触界面が、ＧＳＱＥＧ（配列番号７）、ＧＮＱＥＧ（配列番号８）、ＧＤＱＴＧ（配列番号９）、及びＧＤＱＴＡ（配列番号１０）からなる群から選択される野生型配列を有する、請求項７に記載の弱毒化されたフラビウイルス。
【請求項９】
前記変異が中心モノマー接触界面での２つの塩橋の形成をもたらす、請求項７に記載の弱毒化されたフラビウイルス。
【請求項１０】
前記フラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質が、蚊媒介性ウイルス由来であり、前記変異が、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質のアミノ酸２５６に対応するフラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質のアミノ酸が塩基性アミノ酸で置換されている変異を含む、請求項７又は８に記載の弱毒化されたフラビウイルス。
【請求項１１】
前記塩基性アミノ酸がリジン及びアルギニンからなる群から選択される、請求項１０に記載の弱毒化されたフラビウイルス。
【請求項１２】
前記フラビウイルスのエンベロープモノマータンパク質が、ダニ媒介性ウイルス由来であり、前記変異が、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質のアミノ酸２６０に対応するアミノ酸が塩基性アミノ酸で置換されている、請求項７又は８に記載の弱毒化されたフラビウイルス。
【請求項１３】
前記塩基性アミノ酸がリジン及びアルギニンからなる群から選択される、請求項１２に記載の弱毒化されたフラビウイルス。
【請求項１４】
前記フラビウイルスが、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、日本脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、デング血清型１ウイルス、デング血清型２ウイルス、デング血清型３ウイルス、デング血清型４ウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ポワッサンウイルス、及びオムスク出血熱ウイルスからなる群から選択される、請求項７に記載の弱毒化されたフラビウイル。
【請求項１５】
フラビウイルスはまた、アミノ酸１０７、１３８、１７６、１７７、２２４、２６４、２８０、３１６、及び４４０からなる群から選択される西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質アミノ酸に対応するアミノ酸残基において１つ以上のエンベロープタンパク質変異を有する、請求項７に記載の弱毒化されたフラビウイルス。
【請求項１６】
請求項７〜１５のいずれか１項に記載のフラビウイルスをコードする組換え遺伝子構築物。
【請求項１７】
ベクターをさらに含む、請求項１６に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１８】
前記ベクターが、真核生物プロモーターの制御下で、感染性（＋）ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを含むプラスミドである、請求項１７に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１９】
請求項７に記載の弱毒化されたフラビウイルス、又は請求項１６に記載の組換え遺伝子構築物を含む免疫原性組成物。
【請求項２０】
患者における免疫応答の誘導に使用するための、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【国際調査報告】
2015535302.tif 000019
2015535302.tif 000020
2015535302.tif 000021
2015535302.tif 000022
2015535302.tif 000023
2015535302.tif 000024