(57)【要約】  本発明は、サンプルがEHEC O157:[H7]、O145:[H28]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O26:[H11]、O45:[H2]又はO104:[H4]の少なくとも１つの血清型の腸出血性大腸菌(EHEC)を含むかどうかを予測する方法、及び遺伝子マーカーZ1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156、Z6065、Z2098、ureD又はespVの少なくとも１つとの組合せでの遺伝子espKの検出及び/又は血清型特異的CRISPR配列の検出による前記血清型を同定する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルに存在すると疑われる腸出血性大腸菌(EHEC)の血清型を同定する方法であって、前記サンプル又は該サンプルから単離したDNAにおいて、以下の大腸菌CRISPR配列：
ａ)− 配列番号１、配列番号２及び配列番号３のCRISPR配列であり、その１以上の存在がEHEC O157:[H7]の存在を示す配列；及び/又は
− 配列番号４のCRISPR配列であり、その存在がEHEC O157:[H7]の存在を示す配列
から選択される、EHEC O157:[H7]同定用CRISPR配列；
ｂ) 配列番号５の配列であり、その存在がEHEC O145:[H28]の存在を示すEHEC O145:[H28]同定用CRISPR配列；及び
ｃ) 配列番号６の配列であり、その存在がEHEC O111:[H8]の存在を示すEHEC O111:[H8]同定用CRISPR配列；及び
ｄ) 配列番号７の配列であり、その存在がEHEC O121:[H19]の存在を示すEHEC O121:[H19]同定用CRISPR配列；及び
ｅ) 配列番号８の配列であり、その存在がEHEC O103:[H2]及び/又はEHEC O45:[H2]の存在を示すEHEC O103:[H2]及び/又はEHEC O45:[H2]同定用CRISPR配列；及び
ｆ) 配列番号９の配列であり、その存在がEHEC O104:[H4]の存在を示すEHEC O104:[H4]同定用CRISPR配列；及び
ｇ) 配列番号10の配列であり、その存在がEHEC O26:[H11]の存在を示すEHEC O26:[H11]同定用CRISPR配列
の存否を検出することを含んでなる、方法。
【請求項２】
前記サンプル又は該サンプルから単離したDNAについて、前記CRISPR配列を標的するプライマーの組合せを用いてPCRアッセイを行うことを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマーの組合せが
ａ)− 以下の配列：
GGGAACACAAACCGAAACACA(配列番号11)
CTTAGTGTGTTCCCCGCGC(配列番号12)
で規定される、配列番号１及び配列番号２の両方のCRISPR配列を標的するプライマーセット、及び
− 以下の配列：
GAACACTTTGGTGACAGTTTTTGT(配列番号13)
CTTAGTGTGTTCCCCGCGC(配列番号14)
で規定される、配列番号３のCRISPR配列を標的するプライマーセット；及び/又は
− 以下の配列：
GAACACAAACCGAAACACACG(配列番号15)
ATAAACCGTCACCAAAACAGTG(配列番号16)
で規定される、配列番号４のCRISPR配列を標的するプライマーセット
からなり、前二者のプライマーセットの少なくとも一方の増幅産物の存在及び/又は後者のプライマーセットの増幅産物の存在がEHEC O157:[H7]の存在を示す、EHEC O157:[H7]検出用プライマー；及び
ｂ) 以下の配列：
GAACTTGAGCCCTGCCAGAA(配列番号17)
ACCGCGATCTTTTCCTACCTG(配列番号18)
で規定される、配列番号５のCRISPR配列を標的するプライマーセットからなり、その増幅産物の存在がEHEC O145:[H28]の存在を示す、EHEC O145:[H28]検出用プライマー；及び
ｃ) 以下の配列：
GTGACCGCCTGTACACGC(配列番号19)
CGGATATTTGGGCGTAATACC(配列番号20)
CTGCCGCGAGTGGTTTCAC(配列番号21)
で規定される、配列番号６のCRISPR配列を標的するプライマーセットからなり、配列番号19及び配列番号20又は配列番号19及び配列番号21の少なくとも一方のプライマー対の増幅産物の存在がEHEC O111:[H8]の存在を示す、EHEC O111:[H8]検出用プライマー；
ｄ) 以下の配列：
CGGGGAACACTACAGGAAAGAA(配列番号22)
GGCGGAATACAGGACGGGTGG(配列番号23)
で規定される、配列番号７のCRISPR配列を標的するプライマーセットからなり、その増幅産物の存在がEHEC O121:[H19]の存在を示す、EHEC O121:[H19]検出用プライマー；
ｅ) 以下の配列：
GAGTCTATCAGCGACACTACC(配列番号24)
AACCGCAGCTCGCAGCGC(配列番号25)
で規定される、配列番号８のCRISPR配列を標的するプライマーセットからなり、その増幅産物の存在がEHEC O103:[H2]及び/又はEHEC O45:[H2]の存在を示す、EHEC O103:[H2]及び/又はEHEC O45:[H2]検出用プライマー；及び
ｆ) 以下の配列：
GGAACTCACCGAGCGCCG(配列番号26)
GCCTTTGCAGCGTCTTTCCGATC(配列番号27)
で規定される、配列番号９のCRISPR配列を標的するプライマーセットからなり、その増幅産物の存在がEHEC O104:[H4]の存在を示す、EHEC O104:[H4]検出用プライマー；及び
ｇ) 以下の配列：
ACAATCGTGTGTAAATTCGCGG(配列番号28)
GATAAACCGTGGTACGGAACA(配列番号29)
で規定される第１のプライマーセットと、以下の配列：
TGAAACCACTCGCGGCAGAT(配列番号30)
ATAAACCGATCTCCTCATCCTC(配列番号31)
で規定される第２のプライマーセットとの、配列番号10のCRISPR配列を標的する２つのプライマーセットからなり、それらの少なくとも一方の増幅産物の存在がEHEC O26:[H11]の存在を示す、EHEC O26:[H11]検出用プライマー
を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
espK遺伝子の検出と、以下の標的遺伝子：espV、ureD、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156及びZ6065の１以上の検出とを含んでなる、サンプルがEHEC O157:[H7]、O145:[H28]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O26:[H11]、O45:[H2]及びO104:[H4]血清型の少なくとも１つのEHECを含有するかどうかを予測する方法。
【請求項５】
espK遺伝子の検出と、espV、ureD、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156から選択される少なくとも１つの遺伝子の検出と、Z6065遺伝子の検出とを含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプル又は該サンプルから単離したDNAについて、espKに由来するプライマーセットとespV、ureD、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156及びZ6065の少なくとも１つに由来するプライマーセットとを含んでなるプライマーの組合せを用いてPCRアッセイを行い、各プライマーセットの増幅産物の存否を検出することを含んでなる、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプル又は該サンプルから単離したDNAについて、stx1に由来するプライマーセット及びstx2に由来するプライマーセットを含んでなるプライマーの組合せを用いてPCRアッセイを行い、各プライマーセットの増幅産物の存否を検出することを更に含んでなる、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルがEHEC O157:[H7]、O145:[H28]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O26:[H11]、O45:[H2]及びO104:[H4]の少なくとも１つの血清型の腸出血性大腸菌(EHEC)を含有するかどうかを予測する前工程を含んでなり、該前工程が請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法により行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項３に規定するプライマーセットを含み、任意に該プライマーセットの各々の増幅産物を検出するプローブを含んでもよい、腸出血性大腸菌(EHEC)の血清型の同定キット。
【請求項１０】
espKに由来するプライマーセットと、以下：Z2098に由来するプライマーセット、Z1151に由来するプライマーセット、Z1153に由来するプライマーセット、Z1154に由来するプライマーセット、Z1155に由来するプライマーセット、Z1156に由来するプライマーセット、Z6065に由来するプライマーセットから選択される少なくとも１つのプライマーセットとを更に含んでなり、任意に該プライマーセットの各々の増幅産物を検出するプローブを含んでもよい、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
stx1及びstx2を標的するプライマーセットを更に含んでなり、任意にstx1の増幅産物を検出するプローブとstx2の増幅産物を検出するプローブを含んでもよい、請求項９又は１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの健康にとって重大なリスクとなるシガトキシン産生大腸菌(STEC)の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
シガトキシン産生大腸菌(Escherichia coli)(STEC)は、400を超える大腸菌O:H血清型に属する多様な一群の大腸菌であり、いくつかは下痢から出血性結腸炎(HC)及び溶血性尿毒症症候群(HUS)にわたる食物媒介疾患の大発生及び散発例を引き起こす。ヒトに対する病原性に従い、後者の株は腸管出血性大腸菌(EHEC)とも呼ばれる(Levine 1987，Nataro and Kaper 1998)。HC及びHUSの多くの症例でEHEC血清型O157:H7株が原因とされてきたが、今日では、他の血清型のSTECがEHEC群に属すると認識されている。
【０００３】
よって、多くの国で蓄積された証拠は、30〜60％までのヒトSTEC感染が非-O157 STECにより引き起こされることや、５〜７程度の少数の「優先」血清型のSTECがHC及びHUSの大発生及び散発例に関与していることを示している。これらには、血清型O26:[H11]、O45:[H2]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O145:[H28]、O157:[H7]及びそれらの非運動性派生株が含まれる。加えて、O104:[H4]の非通常株は、2011年の最大規模の世界的なHC及びHUS大発生に関係付けられている(Scheutzら，2011；Frankら，2011；Struelensら，2011；Gaultら，2011)。
【０００４】
その結果として、多くの所管当局がヒトに対して強毒性であるこれらSTEC株から公衆を保護する食品検査プログラムの実施を検討中である。(リスクベースの食品検査プログラムの一部として)これら腸管出血性大腸菌(EHEC)株を検出する合理的アプローチには、優先STECに特有の顕著な特徴(例えば、血清群、血清型、毒性及び他のマーカー)の明確な規定及び食品においてこれら病原性STECを検出する効果的アプローチが必要である。非O157 EHECの検出は特に困難である。なぜなら、非O157 EHECは、同じ生態学的地位を共有する多数の無害の共生大腸菌と区別できる特性を有しないからである。食物媒介大発生に関与する最も重要なＯ-血清群を、疾患の重篤度、発生との関係及び頻度に基づいて同定するフレームワークとして、血清病原型分類がKarmaliら(2003)により提案されているが、種々のSTEC株間で毒性が異なる理由は未解明のままである。この差異は、STEC株が保有する毒性遺伝子のパターンの差に起因するのであろう。このことを実証し、適切な分子マーカーを同定する研究が必要とされている。
【０００５】
例えばstx1/stx2遺伝子及び(腸病原性大腸菌(EPEC)において最初に同定された遺伝子座であるLEE(locus of enterocyte effacement；腸細胞消失の座)に位置する)eae遺伝子の存在を検出することによって、サンプル中のSTEC汚染の存在を決定する技術が存在する。しかし、STEC病原性の遺伝子基礎は、これら遺伝子の一方又は両方の存否より更に複雑である。株の混合物(例えば、STEC株とEPEC株の混合物)を含み得る複雑なサンプル(例えば、食物、便、環境サンプル)におけるstx1/2及びeae遺伝子の存在は、当該サンプルにおけるEHECの存在を示すものではない。
【０００６】
しかし、ヒトにおいて非常に重大な健康問題を引き起こすことがあるSTEC株もあることを考えれば、食品におけるSTEC株の検出は、このSTECがヒトの健康を脅かしそうにないとしても、当該食品の廃棄に繋がる。これは、非病原性STEC株とEHEC株との弁別の欠如に起因する大量の浪費を生じる。
【０００７】
EHEC株を選択的に検出し、非病原性STEC株と弁別するために、stx1/stx2及びeaeマーカーに加えて、他の遺伝子マーカーを使用することが提案されている。例えば、PCT WO 2011/018762には、遺伝子stx1、stx2、eae、nleB及びespKの組合せ検出を含む、サンプル中のEHECの存在を予測する方法が記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、EHEC(非O157 EHECを含む)の存在についての鑑別スクリーニング及び(特に「上位７つ」の血清型O26:[H11]、O45:[H2]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O145:[H28]、O157:[H7]の場合に)含まれるEHEC血清型の特異的検出を可能にする信頼できる検査の必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ヒトの健康にとって重大なリスクとなる幾つかのSTEC株に関係する弁別遺伝子マーカーを同定した。具体的には、本発明者らは、ヒトに対して高毒性を有するEHEC株のCRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)配列内に位置する遺伝子マーカーを同定した。
【００１０】
CRISPRは、大腸菌を含む多くの細菌種のゲノムに存在する。CRISPRは、21〜47bp長の直接反復を含み、類似サイズのスペーサーで隔てられたタンデム配列からなる。スペーサーは、外来核酸(例えば、ファージ又はファージミド)に由来し、それにより、相同なファージ及びファージミドによる感染から細菌が保護され得るという仮説が立てられている。
【００１１】
本発明者らは、世界的に最も頻繁な臨床例と関係する種々のEHEC株のCRISPR遺伝子座を配列決定し、ヒトでのEHEC感染の大部分を担うEHEC血清型O157:[H7]、O145:[H28]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O45:[H2]、O26:[H11]、O104:[H4]及びそれらの非運動性派生株の特異的同定に使用できる異なるスペーサーを同定した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
したがって、本発明の１つの目的は、サンプルに存在すると疑われるEHECの血清型を同定する方法であって、前記サンプル又は該サンプルから単離したDNAにおいて、以下の大腸菌CRISPR配列：
ａ)− 配列番号１、配列番号２及び配列番号３のCRISPR配列であり、その１以上の存在がEHEC O157:[H7]の存在を示す配列；及び/又は
− 配列番号４のCRISPR配列であり、その存在がEHEC O157:[H7]の存在を示す配列
から選択される、EHEC O157:[H7]同定用CRISPR配列；
ｂ) 配列番号５の配列であり、その存在がEHEC O145:[H28]の存在を示すEHEC O145:[H28]同定用CRISPR配列；及び
ｃ) 配列番号６の配列であり、その存在がEHEC O111:[H8]の存在を示すEHEC O111:[H8]同定用CRISPR配列；及び
ｄ) 配列番号７の配列であり、その存在がEHEC O121:[H19]の存在を示すEHEC O121:[H19]同定用CRISPR配列；及び
ｅ) 配列番号８の配列であり、その存在がEHEC O103:[H2]及び/又はEHEC O45:[H2]の存在を示すEHEC O103:[H2]及び/又はEHEC O45:[H2]同定用CRISPR配列；及び
ｆ) 配列番号９の配列であり、その存在がEHEC O104:[H4]の存在を示すEHEC O104:[H4]同定用CRISPR配列；及び
ｇ) 配列番号10の配列であり、その存在がEHEC O26:[H11]の存在を示すEHEC O26:[H11]同定用CRISPR配列
の存否を検出することを含んでなる、方法である。
【００１３】
本発明の１つの好適な実施形態によれば、この方法は、前記サンプル又は該サンプルから単離したDNAについて、前記CRISPR配列の増幅用に設計されたプライマーを用いてPCRアッセイを行い、対応する増幅産物の存在を調べることを含んでなる。
【００１４】
好ましくは、前記PCRアッセイは、
ａ)− 以下の配列：
GGGAACACAAACCGAAACACA(配列番号11)
CTTAGTGTGTTCCCCGCGC(配列番号12)
で規定される、配列番号１及び配列番号２の両方のCRISPR配列を標的するプライマーセット、及び
− 以下の配列：
GAACACTTTGGTGACAGTTTTTGT(配列番号13)
CTTAGTGTGTTCCCCGCGC(配列番号14)
で規定される、配列番号３のCRISPR配列を標的するプライマーセット；及び/又は
− 以下の配列：
GAACACAAACCGAAACACACG(配列番号15)
ATAAACCGTCACCAAAACAGTG(配列番号16)
で規定される、配列番号４のCRISPR配列を標的するプライマーセット
からなり、前二者のプライマーセットの少なくとも一方の増幅産物の存在及び/又は後者のプライマーセットの増幅産物の存在がEHEC O157:[H7]の存在を示す、EHEC O157:[H7]検出用プライマー；及び
ｂ) 以下の配列：
GAACTTGAGCCCTGCCAGAA(配列番号17)
ACCGCGATCTTTTCCTACCTG(配列番号18)
で規定される、配列番号５のCRISPR配列を標的するプライマーセットからなり、その増幅産物の存在がEHEC O145:[H28]の存在を示す、EHEC O145:[H28]検出用プライマー；及び
ｃ) 以下の配列：
GTGACCGCCTGTACACGC(配列番号19)
CGGATATTTGGGCGTAATACC(配列番号20)
CTGCCGCGAGTGGTTTCAC(配列番号21)
で規定される、配列番号６のCRISPR配列を標的するプライマーセットからなり、配列番号19及び配列番号20又は配列番号19及び配列番号21の少なくとも一方のプライマー対の増幅産物の存在がEHEC O111:[H8]の存在を示す、EHEC O111:[H8]検出用プライマー；
ｄ) 以下の配列：
CGGGGAACACTACAGGAAAGAA(配列番号22)
GGCGGAATACAGGACGGGTGG(配列番号23)
で規定される、配列番号７のCRISPR配列を標的するプライマーセットからなり、その増幅産物の存在がEHEC O121:[H19]の存在を示す、EHEC O121:[H19]検出用プライマー；
ｅ) 以下の配列：
GAGTCTATCAGCGACACTACC(配列番号24)
AACCGCAGCTCGCAGCGC(配列番号25)
で規定される、配列番号８のCRISPR配列を標的するプライマーセットからなり、その増幅産物の存在がEHEC O103:[H2]及び/又はEHEC O45:[H2]の存在を示す、EHEC O103:[H2]及び/又はEHEC O45:[H2]検出用プライマー；及び
ｆ) 以下の配列：
GGAACTCACCGAGCGCCG(配列番号26)
GCCTTTGCAGCGTCTTTCCGATC(配列番号27)
で規定される、配列番号９のCRISPR配列を標的するプライマーセットからなり、その増幅産物の存在がEHEC O104:[H4]の存在を示す、EHEC O104:[H4]検出用プライマー；及び
ｇ) 以下の配列：
ACAATCGTGTGTAAATTCGCGG(配列番号28)
GATAAACCGTGGTACGGAACA(配列番号29)
で規定される第１のプライマーセットと、以下の配列：
TGAAACCACTCGCGGCAGAT(配列番号30)
ATAAACCGATCTCCTCATCCTC(配列番号31)
で規定される第２のプライマーセットとの、配列番号10のCRISPR配列を標的する２つのプライマーセットからなり、それらの少なくとも一方の増幅産物の存在がEHEC O26:[H11]の存在を示す、EHEC O26:[H11]検出用プライマー
を含んでなるプライマーの組合せを用いて行う。
【００１５】
増幅産物は、PCR産物を検出する任意の適切な方法により検出することができる。例えば、PCR産物は、それぞれの標的配列に由来するプローブにより検出することができる。
【００１６】
好適なプローブの例を下記に示す：
−  以下の配列：CGATCAATCCGAATATGAGCGGT(配列番号32)で規定され、配列番号１及び配列番号２に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ、及び以下の配列：CACTGTTTTGGTGACGGTTTATCC(配列番号33)で規定され、配列番号３に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ、及び/又は以下の配列：ACAAAAACTGTCACCAAAGTGTTC(配列番号34)で規定され、配列番号４に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  以下の配列：TGGGGCCTCTTTTGTACCCGG(配列番号35)で規定され、配列番号５に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  以下の配列：TGTAATGGCTCACCGGTTTATCCCC(配列番号36)で規定され、配列番号６に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  以下の配列：TCCGCCAACGGCGACAGGGG(配列番号37)で規定され、配列番号７に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  以下の配列：TCGGAACGTGGCGCTATAGGTG(配列番号38)で規定され、配列番号８に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  以下の配列：CTGGGAGGCGTATCTCACGTTCGGT(配列番号39)で規定され、配列番号９に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  以下の配列：TGCTGTCTATATTTCGACCAGTGTTCC(配列番号40)で規定され、配列番号10に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  以下の配列10：CCAGCTACCGACAGTAGTGTGTTCC(配列番号41)で規定され、配列番号10に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ。
【００１７】
本発明の別の１つの観点によれば、サンプルが定型腸出血性大腸菌(EHEC)(本明細書でstx及びeaeの両方について陽性である大腸菌株と定義される)及び/又は非定型EHEC O104:H4(stxについて陽性結果を示し、eaeについて陰性結果を示す)を含有するかどうかを予測する方法が提供される。定型EHEC株には、特に、EHEC O157:H7、O145:H28、O103:H2、O111:H8、O121:H19、O26:H11及びO45:H2血清型並びにそれらの非運動性派生株が含まれる。
この方法は、espK遺伝子の検出と、以下の標的遺伝子：espV、ureD、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156及びZ6065の１以上の検出とを含んでなる。
これら大腸菌遺伝子標的は、種々のゲノムＯ-アイランド：OI-43、OI-44、OI-50、OI-57及びOI-71に由来する非LEEコード化タイプIIIエフェクターに相当する。
espKとespV、ureD、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155及びZ1156の１以上との組合せは、推定毒性マーカーの幾つかの組合せから、定型EHEC(stx及びeae陽性大腸菌株)、特に血清型EHEC O157:[H7]、O145:[H28]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O26:[H11]又はO45:[H2]のEHEC株の存在をより良好に予測できるものとして本発明者らが同定した。espKとZ6065との組合せは、非定型EHEC O104:H4の存在を予測できる。
特に好適な組合せは以下である：
−  espKとespV、ureD、Z2098の１以上の組合せ；
−  espKとZ6065との組合せ；
−  espKとespV、ureD、Z2098の１以上とZ6065との組合せ。
【００１８】
１つの特定の実施形態によれば、本方法は、前記サンプル又は該サンプルから単離したDNAについて、espKに由来するプライマーセットとespV、ureD、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156及びZ6065の少なくとも１つに由来するプライマーセットとを含んでなるプライマーの組合せを用いてPCRアッセイを行い、各プライマーセットの増幅産物の存否を検出することを含んでなる。
この方法の１つの好適な実施形態によれば、プライマーの組合せは、stx1に由来するプライマーセットとstx2に由来するプライマーセットとを更に含んでなる。これにより、STECのマーカーとしてのstx遺伝子と、HC及びHUSの大発生及び散発例に関係する優先STEC血清型に関連付けられた上記の追加の遺伝子マーカーとの両方についてサンプルをスクリーニングすることが可能になる。
従来技術の方法とは対照的に、本発明の方法は、eae遺伝子の検出を必要としない。
espK、espV、ureD、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156、Z6065、stx1又はstx2に由来し、本発明のPCRアッセイでの使用に適切なプライマー及びこれらプライマーで得られた増幅産物の検出を可能にするプローブは、データベースで入手可能なこれら遺伝子の配列に基づいて(例えばGenBankにおいてアクセッション番号AE005174.2で入手可能な大腸菌O157:H7(EDL933株)の注釈付き配列内で)、当業者が容易に設計することができる。
【００１９】
このPCRアッセイでの使用に好適なプライマーセットの非限定例を以下に示す：
−  以下の配列：
GCAGRCATCAAAAGCGAAATCACACC(配列番号42)
TCGTTTGGTAACTGTGGCAGATACTC(配列番号43)
で規定される、espKを標的するプライマーセット
−  以下の配列：
TCAGGTTCCTCGTCTGATGCCGC(配列番号44)
CTGGTTCAGGCCTGGAGCAGTCC(配列番号45)
で規定される、espVを標的するプライマーセット
−  以下の配列：
GCAATAATTGACTCTGATTGCC(配列番号46)
GCTGCTGCGGTAAAATTTACT(配列番号47)
で規定される、ureDを標的するプライマーセット
−  以下の配列：
CTGAAAAGAGCCAGAACGTGC(配列番号48)
TGCCTAAGATCATTACCCGGAC(配列番号49)
で規定される、Z2098を標的するプライマーセット
−  以下の配列：
CGATCATTGTGGGCATGTTATGCC(配列番号50)
CCTGAATTCACACGGTGATGCG(配列番号51)
で規定される、Z1153を標的するプライマーセット
−  以下の配列：
GCCTTTTTATGTTCATTATTGCGGTTG(配列番号52)
GTATAGTTTTAGCAATACCTTCCTGC(配列番号53)
で規定される、Z1154を標的するプライマーセット
−  以下の配列：
GATTGTGGCGATTAATGGGGG(配列番号54)
ACACCGATCTGGTCATTGGCG(配列番号55)
で規定される、Z1155を標的するプライマーセット
−  以下の配列：
AAACGCCTTTAAAATCTGCGTCT(配列番号56)
TGCCGTGCGCACAGTCATAAG(配列番号57)
で規定される、Z1156を標的するプライマーセット
−  以下の配列：
GCCCATGGCTCCACATCCTG(配列番号58)
CCAAAAAAGTTATGATGATTGCACTG(配列番号59)
で規定される、Z1151を標的するプライマーセット
−  以下の配列：
GCACTGGCCCTTGTTGCTCAGGC(配列番号60)
GCTCTTCCAGTGAGAATGTCTTTCCGG(配列番号61)
で規定される、Z6065を標的するプライマーセット
−  以下の配列：
TTTGTYACTGTSACAGCWGAAGCYTTACG(配列番号62)
CCCCAGTTCARWGTRAGRTCMACRTC(配列番号63)
で規定される、stx1及びstx2を標的するプライマーセット。
【００２０】
増幅産物の検出用プローブの非限定例を以下に示す：
−  以下の配列：
ATTCAGATAGAAGAAGCGCGGGCCAG(配列番号64)；
で規定される、espKに由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ
−  以下の配列：
CTTGCAACACGTTACGCTGCCGAGTATT(配列番号65)；
で規定される、espVに由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ
−  以下の配列：
TACGCTGATCACCATGCCTGGTGC(配列番号66)；
で規定される、UreDに由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ
−  以下の配列：
TAACTGCTATACCTCCGCGCCG(配列番号67)；
で規定される、Z2098に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ
−  以下の配列：
TGTAACACCCAGACGGTCAGCAACATG(配列番号68)；
で規定される、Z1153に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ
−  以下の配列：
TCACTTCCAGTTTCTGGTGATGTTTTGAT(配列番号69)
で規定される、Z1154に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  以下の配列：
TGGGTGAGGTTAAAATATAAAGAACGATTGC(配列番号70)
で規定される、Z1155に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  以下の配列：
TAAGATATTTTCTGACTTTCCGCATGCGCTT(配列番号71)
で規定される、Z1156に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  以下の配列：
AAAGAGCCAGCGCAGAGCTGACCAG(配列番号72)
で規定される、Z1151に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  以下の配列：
TTCGCTGGAAGCAGAGCCCGTGC(配列番号73)
で規定される、Z6065に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  以下の配列：
CTGGATGATCTCAGTGGGCGTTCTTATGTAA(配列番号74)
で規定される、stx1に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  以下の配列：
TCGTCAGGCACTGTCTGAAACTGCTCC(配列番号75)
で規定される、stx2に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ。
【００２１】
有利には、本発明は、サンプルがEHEC O157:[H7]、O145:[H28]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O26:[H11]及びO45:[H2]の少なくとも１つの血清型の定型腸出血性大腸菌(EHEC)を含有するかどうかを予測し、更に該EHECの血清型を同定する方法であって、以下：
−  前記サンプルがO157:[H7]、O145:[H28]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O26:[H11]、O45:[H2]及びO104:H4の少なくとも１つの血清型のEHECを含むか否かを評価するためにPCRアッセイを上記のとおり行い、該PCRアッセイの結果が陽性であれば、
−  前記EHECの血清型を同定するためにPCRアッセイを上記のとおり行う
ことを含んでなる方法を提供する。
【００２２】
本発明のPCRアッセイは、EHECを含有する可能性がある物質の任意のサンプル、例えば食物サンプル、水サンプル、土壌サンプルなどを検査するために使用することができる。
本発明のPCRアッセイは、この目的に利用可能な種々の天然の又は遺伝子操作した酵素の任意のものを用い、標的配列のPCR増幅に適切な任意の方法で行うことができる。核酸配列ベース増幅(NASBA)、分岐DNA、鎖置換増幅又はループ媒介等温増幅(LAMP)法(Compton 1991，Chang 1991，Walkerら 1992，Notomiら 2000)のような代替法も使用可能である。
【００２３】
特に好適な方法は、「Real-time PCR in Microbiology: from diagnosis to characterization」(2007) Caister Academic Press，Norfolk，UKにIan M. Mackayが記載したような、リアルタイムPCR増幅を含むものである。
リアルタイムPCR(定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)又は動力学的ポリメラーゼ連鎖反応とも呼ばれる)は、標的のDNA分子を増幅し、同時に定量するために使用される。これは、DNAサンプル中の特定配列の検出及び定量(絶対コピー数、又はDNA投入量若しくは追加の規格化用遺伝子に対して規格化したときの相対量として)を両方とも可能にする。この手順は、ポリメラーゼ連鎖反応の一般原理に従う；その鍵となる特徴は、増幅DNAが反応中に蓄積するにつれ各増幅サイクル後にリアルタイムで定量されることである(Mackay 2007)。２つの一般的な定量法は、二本鎖DNAとインターカレートする蛍光色素の使用、及び相補DNAとハイブリダイズしたときに蛍光発光する修飾DNAオリゴヌクレオチドプローブの使用である(Mackay 2007)。本発明では、発明者らは、これら２つの方法のうち第２の方法(蛍光色素のインターカレーションに基づいてPCR産物を定量する他方の方法ではなく)が本発明の範囲内であることを示した。
【００２４】
適切な蛍光標識の非限定例としては、6カルボキシル-フルオレセイン(FAM)、テトラクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(TET)、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)が挙げられる。二重標識プローブの標識に適切なクエンチャーの非限定例としては、6カルボキシ-テトラメチル-ローダミン(TAMRA)、DABCYL、ブラックホールクエンチャーファミリー(BHQ)のクエンチャーのような非蛍光クエンチャーが挙げられ、マイナーグルーブ結合基(minor groove binder group；MGB)も挙げられる。
本発明のPCRアッセイの各々は、検出すべき各標的配列について別々のPCR反応(単式PCR)を行うことで実行することができる。しかし、多くの場合で、単一反応で幾つかの標的配列の増幅が可能であるマルチプレックスPCRを行うことが好適である。有利には、マクロアレイ(すなわち、所望のDNAプライマーがスポット状に堆積されている基体のような予め形成された構造体)を使用することができる。このようなマクロアレイは、本明細書に記載のマルチプレックスPCRアッセイのルーチン的な実行を可能にする。例として、求める標的を検出・定量するに必要な反応試薬を予め搭載した反応マイクロチャンバにおいて複数標的の同時検出を可能にする、例えばBeutinら(Beutinら，2009)が記載したGeneDisc(登録商標)マクロアレイ(Pall-GeneDisc Technology，Bruz，France)を使用することができる。
【００２５】
アッセイの結果がサンプルの真の含有物を確実に代表するように、いずれの検出産物も真の陽性結果であることを確実にする陰性増幅コントロールを含んでいてもよく、またサンプルのDNAを増幅することができ、よって偽陰性が生じていないことを確実にする阻害コントロールを含んでいてもよい。
本発明はまた、本発明のPCRアッセイの実施を可能にする上記のプライマーセット及びプローブ並びにこれらプライマーセット及びこれらプローブを組み合わせた(更にはPCR反応を行うための試薬を組み合わせてもよい)キットを包含する。これらキットは、増幅反応を行うための指示書を含んでいていもよい。本発明のプライマーを用いる増幅産物も本発明の一部である。
【００２６】
第１の実施形態によれば、本発明のキットは、以下：
−  配列番号11及び配列番号12の配列で規定されるプライマーセット、及び配列番号13及び配列番号14の配列で規定されるプライマーセット、及び/又は配列番号15及び配列番号16の配列で規定されるプライマーセット；
−  配列番号17及び配列番号18の配列で規定されるプライマーセット；
−  配列番号19、配列番号20及び配列番号21の配列で規定されるプライマーセット；
−  配列番号22及び配列番号23の配列で規定されるプライマーセット；
−  配列番号24及び配列番号25の配列で規定されるプライマーセット；
−  配列番号26及び配列番号27の配列で規定されるプライマーセット；
−  配列番号28及び配列番号29の配列で規定されるプライマーセット；
−  配列番号30及び配列番号31の配列で規定されるプライマーセット
を含むプライマーの組合せを含んでなる。
【００２７】
好ましくは、前記キットはまた、
−  上記のような配列番号１及び配列番号２に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ、及び上記のような配列番号３に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ、及び/又は上記のような配列番号４に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  上記のような配列番号５に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  上記のような配列番号６に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  上記のような配列番号７に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  上記のような配列番号８に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  上記のような配列番号９に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ；
−  上記のような配列番号10に由来する増幅産物の検出を可能にする２つのプローブ
を含んでなる。
【００２８】
第２の実施形態によれば、本発明のキットは、
−  espKに由来するプライマーセット、及び
−  espVに由来するプライマーセット、ureDに由来するプライマーセット、Z2098に由来するプライマーセット、Z1151に由来するプライマーセット、Z1153に由来するプライマーセット、Z1154に由来するプライマーセット、Z1155に由来するプライマーセット、Z1156に由来するプライマーセット、Z6065に由来するプライマーセットから選択される１以上のプライマーセット
を含んでなる。
【００２９】
好ましくは、前記キットはまた、espKに由来する増幅産物の検出を可能にするプローブと、以下：espVに由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ、ureDに由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ、又はZ2098に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ、Z1151に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ、Z1153に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ、Z1154に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ、Z1155に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ、Z1156に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ、Z6065に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブから選択される１以上のプローブとを含んでなる。
【００３０】
上記の第２の実施形態に従うキットは、stx1を標的するプライマーセット及びstx2を標的するプライマーセットを更に含んでもよく、好ましくはstx1に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブ及びstx2に由来する増幅産物の検出を可能にするプローブも含んでもよい。
本発明のより良好な理解のため、及び本発明が如何に実施され得るかを示すために、ここで、例示の目的のみで、本発明に従う具体的な実施形態、方法及び過程を示す。
【実施例】
【００３１】
実施例１：腸管出血性大腸菌(EHEC)の特異的同定のための大腸菌CRISPR遺伝子座に由来するDNA配列の同定
材料及び方法
細菌株
CRISPR遺伝子座について高スループットリアルタイムPCRで調べた大腸菌株(ｎ＝955)を下記の表Ｉに示す。
【００３２】
【表１】
2015519075.tif 000002
【００３３】
大腸菌株を、シガトキシン産生大腸菌又はSTEC(ｎ＝160)、腸病原性大腸菌又はEPEC(ｎ＝344)、腸管出血性大腸菌又はEHEC(ｎ＝331)及び非病原性大腸菌(ｎ＝120)に分けた。STEC/EHECタイプは、stx遺伝子及びeae遺伝子の存在に基づいて定義した。EHEC株は、stx遺伝子(stx1及び/又はstx2)及びeae遺伝子を両方とも有するものと定義した。一方、STEC株はstx遺伝子のみを有するものと定義した。STECは、血清型O91:[H21]、O113:[H21]、O104:[H21]のstx陽性、eae陰性大腸菌株(非定型EHECとも呼ばれ、これらは、出血性疾患に関与する頻度が他のEHECより低いが、下痢を頻繁に引き起こす)を含んでいた。EHEC株のStx陰性派生株はEHEC様と名付け、遺伝子espKの存在及びarcA遺伝子の対立遺伝子型２に基づいて同定した血清型O26:H11のEHEC様株(Bugarelら，2011)を除き、Bugarelら(2010；2011)が記載したように、nle遺伝子プロフィール、eaeサブタイプ及び血清型に基づいて定義した。EPEC株は、Bugarelら(2011)により記載されたとおりに定義した。非病原性大腸菌はstx及びeae陰性株と定義した。
【００３４】
本研究で調べた全ての株は、大腸菌のＯ(LPS)及びＨ(鞭毛)抗原について特定し、以前(Bugarelら，2010)に報告されたようにstx遺伝子及びeae遺伝子について特徴付けた。検査のため、細菌をLuria-ブロスプレート上で培養して単一コロニーとし、37℃にて一晩増殖させた。１つのコロニーを採取し、InstaGeneマトリクス(Bio-Rad Laboratories，Marnes La Coquette，France)を用いてDNAを抽出した後、高スループットリアルタイムPCR検査を行った。
【００３５】
DNA配列決定
大腸菌株のCRISPR遺伝子座を、表IIに列挙したプライマーを用いてPCR増幅した。CRISPRアンプリコンの二本鎖DNA配列決定を、表IIに列挙した配列決定プライマーを用いるEurofins MWG Operon(Courtaboeuf，France)で行った。
【００３６】
【表２】
2015519075.tif 000003
【００３７】
高スループットリアルタイムPCR
LightCycler(登録商標) 1536(Roche，Meylan，France)を使用して高スループットリアルタイムPCR増幅を行った。LightCycler(登録商標) 1536マルチウェルプレートのPCRセットアップに、冷却装置及びPlateLoc熱マイクロプレートシーラー(Agilent Technologies)を備えたBravo液体ディスペンサー自動装置(Agilent Technologies，Massy，France)を使用した。PCR反応には、0.5μlのサンプルと１×RealTime ready DNA Probesマスター(Roche)(最終0.7×に相当)、300nMの各プライマー及び300nMの各プローブ(各々最終200nMに相当)を含む１μlのマスターミックスとを含ませた。増幅は、FAM-又はHEX-標識TaqMan(登録商標)プローブを用いて行った。PCR増幅に使用したプライマー及びプローブを表IIIに列挙する。LightCycler(登録商標) 1536リアルタイムPCRシステムを以下の熱プロフィールで使用した：95℃で１分間、続いて95℃で0秒間(ランプ：4.8℃/s)及び60℃で30秒間(ランプ：2.5℃/s)の35サイクル、及び40℃で30秒間の最終冷却工程。ソフトウェアセッティングは、Dual color hydrolysis probes/UPL probes及びMaster Controlであった。
【００３８】
【表３】
2015519075.tif 000004
【００３９】
結果
EHEC O157:H7のCRISPR遺伝子座を標的する特異DNA配列の同定
種々のEHEC O157:[H7]株のCRISPR遺伝子座の配列決定により、この血清型についてのこの遺伝子座の多形性が示された。EHEC O157:[H7]株のCRISPR遺伝子座に特徴的な配列を、配列番号１、２、３及び４に示す。これら配列及びEDL933株のCRISPR遺伝子座(アクセッション番号AE005174)に基づいて、種々のリアルタイムPCRアッセイをEHEC O157:[H7]の検出について設計した(SP_O157_A、SP_O157_B及びSP_O157_C)。アッセイの特異性及び感度を、955株の大腸菌(75株のEHEC O157:[H7]を含む)からなるパネルに対して試験した(表Ｉ)。このPCR検査は、EHEC O157:[H7]について、高感度で高度に特異的であることが証明された。アッセイの感度は92.0％〜97.3％の範囲であり、数株のO157:[H7]が各アッセイで検出できないに過ぎなかった。PCR検査の特異性は高く、99.6〜100％の範囲であった。PCRアッセイSP_O157_Bは、血清群O55の極僅かな株としか交差反応しない独特な検査であった。PCRアッセイSP_O157_B及びSP_O157_Cを組み合わせることで、75株のEHEC O157:[H7]の全てが正確に検出され(感度100％)、３株の血清群O55の単離株のみが交差反応した(特異性99.6％)。
【００４０】
EHEC O145:H28のCRISPR遺伝子座を標的する特異DNA配列の同定
EHEC O145:[H28]のCRISPR遺伝子座を、大腸菌で同定された２つのCRISPR遺伝子座の一方を配列決定して特徴付けた(配列番号５)。このCRISPR配列から、EHEC O145:[H28]を標的するPCRアッセイ(SP_O145)を設計した。このPCR検査で調べた955株の大腸菌のうち29株のEHEC O145:[H28]及び４株のEPEC O28:H28のみが陽性結果を示した。PCRアッセイSP_O145の感度及び特異性は、それぞれ100％及び99.5％であった。
EHEC O111:H8のCRISPR遺伝子座を標的する特異DNA配列の同定
EHEC O111:H8のCRISPR遺伝子座の配列(配列番号６)に基づいて、EHEC O111:[H8]を検出するリアルタイムPCRアッセイを設計した(SP_O111)。PCRアッセイSP_O111で980株の大腸菌を調べた結果、試験した49株のO111:[H8]のうち47株が陽性を示した。１株の血清型O45:H7のEPECのみが陽性結果を示した。このPCRアッセイの感度及び特異性は高く、それぞれ95.9％及び99.9％であった。
【００４１】
EHEC O121:H19のCRISPR遺伝子座を標的する特異DNA配列の同定
本研究ではEHEC O121:[H19]のCRISPR遺伝子座を配列決定した(配列番号７)。この配列から、EHEC O121:[H19]を標的するPCRアッセイ(SP_O121)を設計した。PCRアッセイSP_O121で試験した955株の大腸菌のうち、僅か１株のO104:H7及び12株のEHEC O121:[H19]が陽性であり、このPCR検査は高感度で(100％)、高度に特異的である(99.9％)ことが示された。
EHEC O103:H2及びO45:H2のCRISPR遺伝子座を標的する特異DNA配列の同定
EHEC O45:[H2]のCRISPR遺伝子座の配列(配列番号８)及び株12009について公表されているEHEC O103:H2のCRISPR遺伝子座の配列(アクセッション番号AP010958)に基づいて、PCRアッセイ(SP_O45)を設計した。このPCRアッセイは、本研究で調べた１株のEHEC O45:H2及び38株全てのEHEC O103:H2について陽性結果を示した。よって、PCRアッセイSP_O45は、EHEC O103:[H2]及びO45:[H2]について高感度(100％)を示した。この検査は、大腸菌の大きなパネルについて試験したとき、98.6％の特異性を有し、数株の以下の血清型：O118:H8、O128:[H2]、O128:H8、O128:H2、O89:[H2]、O46:H38、O8:H8、O142、O145:H2のもの及び(鞭毛H2について陰性結果を示した)１つのO103株と僅かな交差反応を示したに過ぎない。
【００４２】
EHEC O104:H4のCRISPR遺伝子座を標的する特異DNA配列の同定
本研究ではEHEC O104:[H4]のCRISPR遺伝子座を配列決定した(配列番号９)。この配列から、EHEC O104:[H4]を標的するPCRアッセイ(SP_O104)を設計した。大腸菌O104:H4のCRISPR遺伝子座を標的するPCRアッセイを、(既知のＯ-血清群の186株及びＨ型の56株を含む)1303株の大腸菌からなるパネルで評価した。このPCRアッセイは、2011年５月に起きた大発生に関連付けられた48株のO104:H4単離株(１株のOr:H4単離株を含む)及び2001年に報告された１株のO104:H4臨床単離株について陽性結果を示した。H4以外のＨ型を有する大腸菌O104の39株は陰性結果を示した。抗O104血清と凝集で交差反応するK9莢膜抗原を有する大腸菌株(O8:K9:H10、O8:K9:H45、O9:K9:H1、O9:K9:H12及びO9:K9:H51)は、全て陰性結果を示した。最終的に、既知のＯ血清群の186株及びＨ型の56株を含む他の大腸菌株のうち、血清型Ont:H2、O43:H2、O141:H2及びO174:H2に属する僅か５つの単離株のみが、EHEC O104:H4のCRISPR遺伝子座用に設計したプライマー及びプローブと交差反応したに過ぎない。よって、更に、O174:H2、O141:H2及びO43:H2株をCRISPR-O104について検査した。3/12のO174:H2、3/4のO43:H2及び1/8のO141:H2が陽性結果を示した。まとめると、これらデータは、このPCR検査が高感度であり(100％)、高度に特異的である(99.6％)ことを示した。
【００４３】
EHEC O26:H11のCRISPR遺伝子座を標的する特異DNA配列の同定
種々のEHEC O26:[H11]株のCRISPR遺伝子座の配列決定により、この血清型についてのこの遺伝子座の多形性が示された。EHEC O26:[H11]のCRISPR遺伝子座に特徴的な配列を、配列番号10に示す。これら配列及びEHEC O26:H11株11368のCRISPR遺伝子座(アクセッション番号AP010953，NC_013361)に基づいて、２つのリアルタイムPCRアッセイをEHEC O26:[H11]の検出について設計した(SP_O26_C及びSP_O26_D)。アッセイの特異性及び感度を、980株の大腸菌(77株のEHEC O26:[H11]及びEHEC様O26:[H11]を含む)からなるパネルに対して試験した。この２つのPCR検査は、EHEC O26:[H11]について、高感度で特異的であることが証明された。PCRアッセイSP_O26_Cの感度は87.0％であった一方、PCRアッセイSP_O26_Dの感度は90.9％であった。数株のO26:[H11]株のみが各アッセイで検出できなかったに過ぎない。PCR検査SP_O26_Cの特異性は98.7％(12株が交差反応)であった一方、PCR検査SP_O26_Dの特異性は98.1％(17株が交差反応)であった。PCRアッセイSP_O26_C及びSP_O26_Dを組み合わせることで、77株のEHEC様及びEHEC O26:[H11]株のうち僅か４株のEHEC様O26:H11株が検出できなかったに過ぎず(94.8％感度)、僅かに26株の大腸菌が交差反応したに過ぎなかった(97.1％特異性)。
【００４４】
結論：
本研究の結果を下記の表IVにまとめる。
【表４】
2015519075.tif 000005
【００４５】
種々のEHEC株のCRISPR遺伝子座の配列決定により、世界的に最も頻繁な臨床例と関係付けられるEHECのCRISPR配列の遺伝的多様性が示された。CRISPR遺伝子座の短いパリンドローム反復配列間に位置するスペーサー配列の分析により、高感度及び高特異性でEHEC株を検出する有用な遺伝子マーカーの同定が可能となった。高スループットリアルタイムPCRアプローチに基づいて、EHEC、EPEC、STEC及び非病原性大腸菌を含む大腸菌株の非常に大きなパネルをCRISPR遺伝子座含有について調べた。最終的に、EHEC O145:H28(ｎ＝29)、O103:H2(ｎ＝38)、O121:H19(ｎ＝12)、O104:H4(ｎ＝49)及びO45:H2(ｎ＝1)は、これらEHEC血清型に由来する種々のCRISPR配列を標的する各PCRアッセイを用いて、100％の感度で検出された。EHEC O157:[H7](ｎ＝75)は、EHEC O157 CRISPR遺伝子座の異なる２つの配列を標的するPCRアッセイSP_O157_B及びSP_O157_Cを組み合わせたとき、100％の感度で検出された。EHEC O111:[H8](ｎ＝49)は95.9％感度で検出された(47/49のO111:[H8]が検出され、僅かに２株が検出されなかったに過ぎない)。O26 CRISPR遺伝子座の異なる２つの配列を標的するPCRアッセイSP_O26_C及びSP_O26_Dを組み合わせたとき、EHEC O26:[H11](ｎ＝77)は94.8％の感度で検出された(73/77のO26:[H11]が検出された；検出されなかった僅か４株はEHEC様O26:H11株であった)。
世界的に最も頻繁な臨床例と関係付けられるEHECのCRISPR遺伝子座を標的する、本研究で開発したPCRアッセイもまた、高度に特異的であった。これらアッセイは、大腸菌株の非常に大きなパネルで検査したとき、97.1％〜100％の特異性を有した。極僅かが交差反応したに過ぎなかった(表IV)。
【００４６】
実施例２：ヒトに対する高毒性と関係付けられるシガトキシン産生大腸菌(STEC)を同定する遺伝子マーカーの特定
非LEEコード化タイプIIIエフェクター(Tobeら，2006；Creuzburgら，2011)及び付着因子(Spearsら，2006；Cergole-Novellaら，2007)の拡大レパートリーは、STEC毒性決定基の最も可能性のある供給源である。しかし、分子リスク評価アプローチを良好に支持する遺伝子標的は、依然として未確定である。食物中のEHECのモニタリングには、特に、EHEC株をEPEC株と明確に弁別できる遺伝子マーカーの選択が必要である。
このような因子を特定しようと、本発明者らは、ヒトの健康にとって重大なリスクとなるSTEC株を重篤な疾患や流行性疾患とは無関係なEPEC株及びSTEC株と弁別する候補因子としての、ゲノムＯ-アイランドOI-43、OI-44、OI-50、OI-57及びOI-71に由来する或る種のnle遺伝子の適合性を調べた。リアルタイムPCR増幅に使用した大腸菌遺伝子標的を下記の表Ｖに示す。
【００４７】
【表５】
2015519075.tif 000006
【００４８】
１)遺伝子マーカーespK、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156及びZ6065
OI-43(Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156)、OI-50(espK)及びOI-71(Z6065)に由来する遺伝子マーカーの分布を種々の大腸菌病原群の間で調べ、ヒトに対して高毒性を有するSTECとの関係を評価した。
材料及び方法
本研究で調べた1252株の大腸菌を、stx遺伝子及びeae遺伝子の存在に基づいて、腸管出血性大腸菌又はEHEC(ｎ＝466)、腸病原性大腸菌又はEPEC(ｎ＝468)、シガトキシン産生大腸菌又はSTEC(ｎ＝179)及び非病原性大腸菌(ｎ＝139)に分けた。STEC株はstxのみを有した。EPEC株はeaeのみを有した。非病原性大腸菌(ｎ＝139)はstx及びeae陰性株と定義した。
高スループットリアルタイムPCR検査を、上記の実施例１に記載したように行った。
遺伝子マーカーespK、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156及びZ6065のPCR増幅に使用したプライマー及びプローブを表VIに列挙する。stx1、stx2及びeae検出用プライマー及びプローブは以前(Bugarelら，2010)に記載されたものであった。遺伝子stx1、stx2及びeaeの増幅を内部コントロールとして及び群割当目的に使用した。
【００４９】
【表６】
2015519075.tif 000007
【００５０】
結果：
大腸菌病原群におけるespK、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156及びZ6065並びにそれらの組合せの分布
異なる大腸菌病原群間での異なる遺伝子マーカーespK、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156及びZ6065の分布を下記表VIIに示す。概して、調べた遺伝子マーカーは、ほとんどがEHEC株で検出され、頻度は51.9％(Z6065)〜90.8％(espK)の範囲であった。これらマーカーはEPEC株とは関係性が低く、頻度は17.7％(Z1154)〜53.8％(Z1155)の範囲であり、STEC(3.4〜20.7％)及び非病原性大腸菌(3.6〜9.4％)では稀にしか検出されなかった。
遺伝子マーカーespK、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156及びZ6065のいずれも、単独では、全てのEHEC株を確実に同定することができない。しかし、espKをOI-43(Z1151、Z1153、Z1154、Z1155及びZ1156)又はOI-71(Z6065)のいずれかの遺伝子マーカーと組み合わせたときには、EHEC株のほとんどが検出され、頻度は95.5％(espK/Z6065)〜98.3％(espK/Z1155)の範囲であった。同じ組合せが、31.2％(espK/Z1156)〜61.8％(espK/Z1155)の範囲の頻度でEPEC株を、6.7％〜23.5％の頻度でSTEC株を、7.9％〜13.7％の頻度で非病原性大腸菌株を検出した。
【００５１】
【表７】
2015519075.tif 000008
【００５２】
腸管出血性大腸菌における遺伝子マーカーの分布
各遺伝子マーカーespK、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156及びZ6065の分布は、EHEC血清型により顕著に異なっていた(表VIII)。興味深いことに、遺伝子マーカーZ6065は、2011年のドイツでの大発生に関与したEHEC O104:H4(stx陽性、eae陰性、aggR陽性)を検出できる独特な遺伝子マーカーである。
いずれのEHEC O45:[H2]でも検出されなかったZ1151及び検査した19株のうち18株のO121:[H19]で存在しなかった(5.3％)Z6065を除き、調べた他の全ての遺伝子マーカーが、上位７つの血清型のEHEC株で見出され、頻度は15.4％(O26:[H11]ではZ6065が優勢)〜100％の範囲であった。
【００５３】
espKをOI-43の以下の遺伝子マーカー：Z1151、Z1153、Z1154、Z1155及びZ1156の１つと組み合わせることで、上位７つのEHEC血清型のEHEC株のほとんどが検出された。よって、使用した遺伝子マーカーの組合せがどんなものであっても、上位７つの血清型の全てのEHEC株が検査で陽性結果を示した。ただし、それぞれespK/Z1154及びespK/Z6065で陰性結果を示したEHEC O121:[H19]の１〜２株；espK/Z1154で検出できなかったO103:[H2]の１株、及び試験した全ての遺伝子マーカーの組合せで陰性であったEHEC O26:[H11]の７〜８株を除く。よって、僅かなEHEC株のみが本研究で検査した遺伝子マーカーと反応しなかったに過ぎない。これらは異常株であり得、古典的なEHECタイプを代表するものではない可能性がある。これら事例的株において他の遺伝子を見るか又はゲノムを配列決定すると、この状況をより明確にする更なる相違点が明らかになるかもしれない。本発明者らは、原理的に、特定の血清型の全メンバーがEHECであるとは限らないと仮定した。
【００５４】
興味深いことに、上位７つの血清型以外の血清型である他のEHEC株が、87.5％〜95.5％の範囲の頻度で高度に検出された。この知見は、検査した遺伝子マーカーの組合せが定型EHEC(stx及びeaeが共に陽性の大腸菌株)を高感度で検出できることを示した。加えて、遺伝子マーカーZ6065の導入により、2011年のドイツでの大発生に関与したEHEC O104:H4(stx陽性、eae陰性、aggR陽性)の検出が可能になる。
【００５５】
【表８】
2015519075.tif 000009
【００５６】
２)遺伝子マーカーespK、espV、Z2098及びUreD
腸管出血性大腸菌(EHEC)によるシガトキシン(Stx)の産生は、出血性結腸炎(HC)及び溶血性尿毒症症候群(HUS)の原因である主要な毒性形質であるが、Stxを産生する多くの大腸菌(STEC)株はHC及びHUSを引き起こさない。ヒト感染に関係付けられるSTEC株は、１以上のタイプのシガトキシンを産生する能力に加え、他の因子を有し、これが、ヒトの健康にとって重大なリスクとなるSTEC株を重篤な疾患や流行性疾患とは無関係なSTEC株と弁別するために使用できる可能性がある。このような因子を同定しようとして、本発明者らは、ヒト健康にとって重大なリスクとなるSTEC株を重篤な疾患や流行性疾患とは無関係なEPEC株及びSTEC株と弁別する候補因子としての、ゲノムＯ-アイランドOI-43、OI-44、OI-50及びOI-57に由来する或る種のnle遺伝子の適合性を調べた。本発明者らは、OI-43及び/又はOI-48がコードするureD(ウレアーゼ活性)、経口感染した子ウシの腸でのEHEC O157:H7の残留性に関与する遺伝子座(Vlisidouら，2006)であるOI-50が有するespK(EspK)に着目した。また、本発明者らは、ヒトに対するSTEC株の増大した毒性と関係付け得るゲノムアイランド(Coombesら，2008；Imamovicら，2010；Bugarelら，2011)であるOI-57に由来する配列であるZ2098にも着目した。また、EHEC株(EHEC O157:H7、O111、O103及びO26)のゲノム配列決定により、他の遺伝子マーカー、例えば疾患におけるその役割が調べられていないespVが指摘された。この遺伝子はEHEC O157:H7のOI-44に位置するが、他の大腸菌病原群での保有率は未だ報告されていない。本研究で、本発明者らは、種々の大腸菌病原群におけるureD、espV、espK及びZ2098の分布を調べ、ヒトに対して高毒性を有するSTEC株との関係を評価し、EHECと他の大腸菌病原群との明確な弁別に対する適合性を調べた。
【００５７】
材料及び方法
本研究で使用した大腸菌株(ｎ＝1100)は、主に、上記の研究で記載したものであった。EHECタイプ株(ｎ＝340)はstx遺伝子及びeae遺伝子の存在に基づいて定義した。STEC株(ｎ＝193)はstxのみを有した。EPEC株(ｎ＝392)はeaeのみを有した。非病原性大腸菌(ｎ＝175)はstx及びeae陰性株と定義した。細菌の培養及びDNAの調製は以前に記載したとおりであった。
高スループットリアルタイムPCR増幅も上記のとおりに行なった。
stx1、stx2及びeaeのPCR増幅に使用したプライマー及びFAM-標識TaqMan(登録商標)プローブは以前(Bugarelら，2010)に記載されたものであった。ureD、espK、Z2098及びespVを標的するために使用したプライマー及びプローブを下記表IXに列挙する。
【００５８】
【表９】
2015519075.tif 000010
【００５９】
結果
大腸菌病原群間でのureD、espV、espK及びZ2098並びにそれらの組合せの分布
異なる大腸菌病原群での遺伝子マーカーureD、espV、espK及びZ2098の分布を表Ｘに示す。概して、調べた遺伝子マーカーは、ほとんどがEHEC株で検出され、頻度は84.4％(espV)〜92.4％(espK)の範囲であった。これらマーカーはEPEC株とは関係性が低く、頻度は18.1％(ureD)〜45.2％(espV)の範囲であり、STEC(0.5〜3.6％)及び非病原性大腸菌(0.6〜2.9％)では稀にしか検出されなかった。全体的には、本発明者らは、調べた遺伝子マーカーの少なくとも１つについて陽性結果を示したEPEC株の26.5％が上位７つのEHEC血清型に属することを観察した。espKについて陽性である57/113のEPEC株が上位７つのEHEC血清型に属していたことは特筆すべきである。同様に、espVについて陽性である59/177のEPEC株は上位７つのEHEC血清型に属していた。また、Z2098について陽性である68/91のEPEC株及びureDについて陽性である58/71のEPEC株も同様に上位７つのEHEC血清型に属していたことも驚くべきことである。興味深いことに、既知のEHEC血清型(例えば、O55:H7、O103:H25及びO156:H25)を有する他のEPEC株もまた、これら遺伝子マーカーの少なくとも１つについて陽性であることが判明した(データは示さず)。この知見は、このような単離株が、EHEC様株とも名付けられている(Bugarelら，2011)、EHECのStx陰性派生株である可能性を示している。本発明者らは、これら単離株が血清型及びnle遺伝子含有によればEHEC派生株であると想定したが、これら単離株はEHEC派生株とは未だ区別できないEPEC株である可能性もある。将来、全ゲノム配列決定を用いる更なる研究によって、これら株の正確な呼称が明らかにされよう。
遺伝子マーカーureD、espV、espK及びZ2098のいずれも、単独では、全てのEHEC株を確実に同定することができない。EHECを最良の特異性で検出するものを特定するために、遺伝子マーカーの組合せを調べた。結果を表Ｘに示す。組合せで、これら遺伝子マーカーはEHECと高度に関係付けられ、頻度は97.9％(espK/Z2098)〜98.8％(espK/ureD)の範囲であった。同じ組合せが、33.4％(espK/ureD)〜54.1％(espK/espV)の範囲の頻度でEPEC株を、1.6％〜3.6％の頻度でSTEC株を、1.1％〜3.4％の頻度で非病原性大腸菌株を検出した。
【００６０】
【表１０】
2015519075.tif 000011
【００６１】
EHEC血清型間でのureD、espV、espK、espN、Z2098及びespM1並びにそれらの組合せの分布
各遺伝子マーカーureD、espV、espK及びZ2098の分布は、EHEC血清型により顕著に異なっていた。種々のEHEC血清群における各遺伝子マーカーの分布を表XIに示す。いずれのEHEC O45:[H2]でも検出されなかったespVを除き、調べた他の全ての遺伝子マーカーが、上位７つの血清型のEHEC株で高度に優勢に見出され、頻度は71.4％(O103:[H2]ではureDが優勢)〜100％の範囲であった。
【００６２】
【表１１】
2015519075.tif 000012
【００６３】
これら遺伝子マーカーの異なる組合せに基づく上位７つのEHEC血清型の検出を表XIIに示す。espK及び/又はZ2098の検出により、ヒト感染に関係するEHEC血清型のほとんどの検出が可能になった。よって、EHEC O111:[H8]、O26:[H11]、O45:[H2]、O103:[H2]及びO145:[H28]株の全ての株が、espK及び/又はZ2098について陽性結果を示した一方、O157:[H7]の97.0％及びO121:[H19]の95％が陽性結果を示した。espKとespV又はureDのいずれかとの組合せも、同様に、上位７つのEHEC血清型の株のほとんどの検出を可能にした。よって、血清型O157:[H7]、O145:[H28]、O111:[H8]、O103:[H2]、O45:[H2]及びO121:[H19]の全ての株がespK及び/又はespVについて陽性結果を示し、O26:[H11]の97.7％がespK及び/又はespVについて陽性結果を示した。espKをureDとの組合せで検査したときのデータは非常に類似していた。この場合で、上位７つのEHEC血清型の全ての株がespK及び/又はureDについて陽性結果を示した。
【００６４】
【表１２】
2015519075.tif 000013
【００６５】
３)まとめ：
上記研究により、定型EHEC株の検出、特にヒト感染で世界的に報告されているEHECの主要な７つの血清型に属するものの検出に有用である遺伝子マーカーZ1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156、Z6065、ureD、espV、espK及びZ2098を選択することができた。異なる大腸菌病原群間でのこれら種々の遺伝子マーカーの分布を調べた。これにより、これらマーカーの最適な組合せを設計することができた。これら研究の結果を下記でまとめる。
遺伝子マーカーureD、espV、espK、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156及びZ6065は、EHEC血清型間で異なる頻度で検出された。本発明者らは、これら遺伝子マーカーの種々の組合せを調べて、EHECの検出についてより高い特異性及び感度を示す最良のマーカーの組合せを検索した。遺伝子マーカーespKと他の９つの遺伝子マーカーの１つとの組合せにより、定型EHEC株のほとんどの検出、特に上位７つのEHEC血清型のものの検出が可能になる。遺伝子マーカーespV、ureD及びZ2098は、EHECの検出のためにespKと組み合わせるべき最良の候補であることが示しされた。これら遺伝子マーカーは、個々には、上位７つのEHEC血清型の全ての株を検出できなかったが、組合せでは、上位７つのEHEC株の99.3％〜100％を検出した。espKとespV、ureD又はZ2098のいずれかとの組合せは、EHEC株のより特異的で高感度な検出に最良の組合せであることが証明された。よって、espK及び/又はespVについての陽性の結果が、ヒト感染で世界的に報告されているEHECの主要な７つの血清型に属するEHEC株の99.6％で観察された(僅かに１つのEHEC O26:H11単離株が陰性の検査結果であった)。また、上位７つの血清型以外の血清型を有するEHEC株の93.7％が、espK及び/又はespVについて陽性の検査結果であった。最終的に、EPEC株の一部(54.1％)のみがespK及び/又はespVについて陽性の検査結果であった。ほとんどのSTEC及び無毒性大腸菌株は、espK及びespVの両方で陰性であることが判明した。別の興味深いアプローチはespKとZ2098とを組み合わせることであった。この遺伝子マーカーの組合せにより、主要な７つのEHEC血清型に属するEHEC株の99.3％及び上位７つの血清型以外の血清型を有するEHEC株の93.7％が検出された。espK及び/又はZ2098の検出は、EPECの36.7％、STECの3.6％、非病原性大腸菌株の2.3％についてのみ報告された。最高の特異性及び感度でEHECを検出する最良のアプローチは、espKをureDと組み合わせることであった。この組合せにより、上位７つの血清型のEHECの100％及び他の血清型を有するEHEC株の93.7％の検出が可能になった。espK及び/又はureDの検出は、EPECの33.4％、STECの3.6％、非病原性大腸菌株の3.4％についてのみ報告された。
【００６６】
これら知見は、espKとespV、ureD又はZ2098のいずれかとの組合せ検出が、世界的に最も頻繁な高い臨床例と関連付けられるEHEC血清型を≧99％の信頼性で同定する高感度で高度に特異的なアプローチであることを示した。複雑なサンプル(食物又は便検体)におけるstxとの組合せでのこれら遺伝子マーカーの検出は、stx及びeaeのみの組合せに比して、よりEHECに標的付けられた診断を提供する。興味深いことに、検出スキームへのZ6065の導入により、欧州で発生した深刻で最大のSTEC大発生に関与した非定型EHEC O104:H4の検出を可能にする。これらPCRアッセイの迅速性を考えれば、このアプローチは、上位７つのEHECの監視及び発生調査に大きな影響を与えるはずであり、公衆衛生に有益である可能性が高い。更に、上位７つのEHEC血清型以外の血清型を有するEHEC株の93.7％でのこれら遺伝子マーカーセットの検出は、新たに生じるEHEC株の同定の助けになり得る。
【００６７】
結論
本発明者らは、高スループットPCRアプローチを使用して、種々の大腸菌病原群のビルローム(virulome)を調べ、病原性STEC株を特徴付ける遺伝形質の特定を試みた。10の遺伝子マーカー(Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156、Z6065、ureD、espV、espK及びZ2098)の分布を、EHEC、EPEC、STEC及び非病原性大腸菌株を含む大腸菌の大きなパネルで調べた。これら遺伝子マーカーの分布は、大腸菌病原群間で、血清型に応じて変化した。
概して、espKと他の９つの遺伝子(Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156、Z6065、ureD、espV及びZ2098)との組合せは、ヒト感染で世界的に報告されているEHECの主要な７つの血清型に属するEHEC株の検出に最良の組合せであることが示された。これら知見は、この該当する遺伝子組合せを用いて、EHEC株のほとんどが陽性の検査結果であった一方、EPEC株の一部のみが交差反応したに過ぎない。また、このアプローチを用いたとき、極少数のSTEC及び無毒性大腸菌株のみが交差反応したに過ぎない。組合せespK/Z6065により、定型EHEC株の検出に加え、2011年に欧州で発生したHC及びHUSの大流行に関与した非定型EHEC O104:H4(stx陽性、eae陰性、aggR陽性)の検出が可能になる。
【００６８】
参考文献
Beutin, L., S. Jahn, and P. Fach. 2009. Evaluation of the 'GeneDisc' real-time PCR system for detection of enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O26, O103, O111, O145 and O157 strains according to their virulence markers and their O- and H-antigen-associated genes. J. Appl. Microbiol. 106(4): 1122-1132.
Bugarel M, Martin A, Fach P, Beutin L. 2011. Virulence gene profiling of enterohemorrhagic (EHEC) and enteropathogenic (EPEC) Escherichia coli strains: a basis for molecular risk assessment of typical and atypical EPEC strains. BMC Microbiol. Jun 21;11:142.
Bugarel M, Beutin L, Scheutz F, Loukiadis E, Fach P. 2011. Identification of genetic markers for differentiation of Shiga toxin-producing, enteropathogenic, and avirulent strains of Escherichia coli O26. Appl Environ Microbiol. Apr;77(7):2275-81.
Bugarel M, Beutin L, Martin A, Gill A, Fach P. 2010. Micro-array for the identification of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) seropathotypes associated with Hemorrhagic Colitis and Hemolytic Uremic Syndrome in humans. Int J Food Microbiol. Sep 1;142(3):318-29.
Bugarel M, Beutin L, Fach P. 2010. Low-density macroarray targeting non-locus of enterocyte effacement effectors (nle genes) and major virulence factors of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC): a new approach for molecular risk assessment of STEC isolates. Appl Environ Microbiol. Jan;76(1):203-11.
【００６９】
Cergole-Novella MC, Nishimura LS, Dos Santos LF, Irino K, Vaz TM, Bergamini AM, Guth BE. 2007. Distribution of virulence profiles related to new toxins and putative adhesins in Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from diverse sources in Brazil. FEMS Microbiol Lett. Sep;274(2):329-34. Epub 2007 Jul 25.
Chang, C. 1991 "Branched DNA Amplification Multimers for the Sensitive, Direct Detection of Human Hepatitis Viruses," Nucleic Acids Symposium Series, no. 24: 197-200.
Compton, J. 1991 "Nucleic Acid Sequence-Based Amplification," Nature 350, no. 6313: 91-92.
Coombes BK, Wickham ME, Mascarenhas M, Gruenheid S, Finlay BB, Karmali MA. 2008. Molecular analysis as an aid to assess the public health risk of non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli strains. Appl Environ Microbiol. Apr;74(7):2153-60.
Creuzburg K, Middendorf B, Mellmann A, Martaler T, Holz C, Fruth A, Karch H, Schmidt H. 2011. Evolutionary analysis and distribution of type III effector genes in pathogenic Escherichia coli from human, animal and food sources. Environ Microbiol. Feb;13(2):439-52.
【００７０】
Frank C, Werber D, Cramer JP, Askar M, Faber M, an der Heiden M, Bernard H, Fruth A, Prager R, Spode A, Wadl M, Zoufaly A, Jordan S, Kemper MJ, Follin P, Muller L, King LA, Rosner B, Buchholz U, Stark K, Krause G; HUS Investigation Team. Epidemic profile of Shiga-toxin-producing Escherichia coli O104:H4 outbreak in Germany. N Engl J Med. 2011 Nov 10;365(19):1771-80.
Gault G, Weill FX, Mariani-Kurkdjian P, Jourdan-da Silva N, King L, Aldabe B, Charron M, Ong N, Castor C, Mace M, Bingen E, Noel H, Vaillant V, Bone A, Vendrely B, Delmas Y, Combe C, Bercion R, d'Andigne E, Desjardin M, de Valk H, Rolland P. Outbreak of haemolytic uraemic syndrome and bloody diarrhoea due to Escherichia coli O104:H4, south-west France, June 2011. Euro Surveill. 2011 Jun 30;16(26).
Imamovic L, Tozzoli R, Michelacci V, Minelli F, Marziano ML, Caprioli A, Morabito S. 2010. OI-57, a genomic island of Escherichia coli O157, is present in other seropathotypes of Shiga toxin-producing E. coli associated with severe human disease. Infect Immun. Nov;78(11):4697-704.
Karmali, M. A., M. Mascarenhas,  S. Shen, K. Ziebell, S. Johnson, R. Reid-Smith, J. Isaac-Renton, C. Clark, K. Rahn, and J. B. Kaper. 2003. Association of genomic O island 122 of Escherichia coli EDL 933 with verocytotoxin-producing Escherichia coli seropathotypes that are linked to epidemic and/or serious disease. J. Clin. Microbiol. 41: 4930-4940.
Levine, M. M. 1987. Escherichia coli That Cause Diarrhea - Enterotoxigenic, Enteropathogenic, Enteroinvasive, Enterohemorrhagic, and Enteroadherent. J. Infect. Dis. 155: 377-389.
【００７１】
Mackay, I. 2007. Real-time PCR in Microbiology, from diagnosis to characterization. Caister Academic Press, Norfolk, UK.
Nataro, J. P. and J. B. Kaper. 1998. Diarrheagenic Escherichia coli. Clinical Microbiol. Rev. 11: 142-201.
Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., and Hase, T. 2000 Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Research 28, no. 12: E63.
Scheutz F, Nielsen EM, Frimodt-Moller J, Boisen N, Morabito S, Tozzoli R, Nataro JP, Caprioli A. Characteristics of the enteroaggregative Shiga toxin/verotoxin-producing Escherichia coli O104:H4 strain causing the outbreak of haemolytic uraemic syndrome in Germany, May to June 2011. Euro Surveill. 2011 Jun 16;16(24).
Spears KJ, Roe AJ, Gally DL. 2006. A comparison of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli pathogenesis. FEMS Microbiol Lett. Feb;255(2):187-202.
【００７２】
Struelens MJ, Palm D, Takkinen J. Enteroaggregative, Shiga toxin-producing Escherichia coli O104:H4 outbreak: new microbiological findings boost coordinated investigations by European public health laboratories. Euro Surveill. 2011 Jun 16;16(24).
Tobe T, Beatson SA, Taniguchi H, Abe H, Bailey CM, Fivian A, Younis R, Matthews S, Marches O, Frankel G, Hayashi T, Pallen MJ. 2006. An extensive repertoire of type III secretion effectors in Escherichia coli O157 and the role of lambdoid phages in their dissemination. Proc Natl Acad Sci U S A. Oct 3;103(40):14941-6.
Vlisidou I, Marches O, Dziva F, Mundy R, Frankel G, Stevens MP. 2006. Identification and characterization of EspK, a type III secreted effector protein of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. FEMS Microbiol Lett. Oct;263(1):32-40.
Walker, G., Fraiser, M., Schram, J., Little, M., Nadeau, J., and Douglas P. Malinowski, D. 1992 Strand Displacement Amplification-An Isothermal, In Vitro DNA Amplification Technique, Nucleic Acids Research 20, no. 7: 1691-1696.
【配列表】
2015519075000001.app
【国際調査報告】
2015519075.tif 000014
2015519075.tif 000015
2015519075.tif 000016
2015519075.tif 000017
2015519075.tif 000018
2015519075.tif 000019