(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）の化合物及びその薬学的に許容し得る塩に関する。加えて、本発明は、式（Ｉ）の化合物を製造及び使用する方法、並びにそのような化合物を含有する医薬組成物に関する。式（Ｉ）の化合物は、医薬として使用され得る。
2015534957.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１６】
2015534957.tif 000022
［式中、
Ｘは、−ＣＨ−又は窒素であり；
Ｒ１は、低級アルコキシであり；
Ｒ２は、ハロゲンであり；
Ｒ３は、水素又は低級アルコキシであり；
Ｒ４又はＲ４’の一方は、水素又は低級アルキルであり、そして、他方は、水素又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒ５であり；そして
Ｒ５は、アルコキシ、−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、低級アルキル、クロロフェニル又は（フルオロ−ベンゼンスルホニル）−ピペリジニルである］
で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
【請求項２】
Ｘが、窒素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１が、メトキシである、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２が、ヨウ素又は塩素である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３が、水素又はメトキシである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ３が、水素である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ４及びＲ４’が共に、水素である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ５が、メチル、tert−ブトキシ、−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、クロロフェニル又は（フルオロ−ベンゼンスルホニル）−ピペリジニルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ５が、−ＣＦ３である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
以下から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物：
［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−カルバミン酸tert−ブチルエステル；
２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−アセトアミド；
２，２−ジフルオロ−Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−アセトアミド；
Ｎ−［２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド；
［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−メチル−アミン；
２，２−ジフルオロ−Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−Ｎ−メチル−アセトアミド；
Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−Ｎ−メチル−アセトアミド；
２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−６−イルアミン；
２−（２−クロロ−６−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール−６−イルアミン；
Ｎ−［２−（２−クロロ−６−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド；
３−クロロ−Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−ベンズアミド；
３−クロロ−Ｎ−［２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−ベンズアミド；及び
（Ｓ）−１−（４−フルオロ−ベンゼンスルホニル）−ピペリジン−２−カルボン酸［２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−アミド。
【請求項１１】
治療有効量の請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物と薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
治療活性物質としての使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
呼吸器障害の治療又は予防における使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
呼吸器障害の治療又は予防のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１５】
呼吸器障害の治療又は予防のための医薬の調製のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１６】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、アレルギー性鼻炎及び気管支痙攣から選択される呼吸器障害を処置するための方法であって、それを必要とする被検体に治療有効量の請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物を投与する工程を含む方法。
【請求項１７】
本明細書に上述される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性疾患又は障害の哺乳動物における治療及び／又は予防のために有用な有機化合物、特に、置換インドール化合物、それらの製造法、それらを含有する医薬組成物、並びに一過性受容器電位（ＴＲＰ）チャネル拮抗薬としてのそれらの使用に関する。
【０００２】
本発明は、特に、式（Ｉ）：
【化１】
2015534957.tif 000003
［式中、
Ｘは、−ＣＨ−又は窒素であり；
Ｒ１は、低級アルコキシであり；
Ｒ２は、ハロゲンであり；
Ｒ３は、水素又は低級アルコキシであり；
Ｒ４及びＲ４’の一方は、水素又は低級アルキルであり、そして、他方は、水素又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒ５であり；そして
Ｒ５は、アルコキシ、−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、低級アルキル、クロロフェニル又は（フルオロ−ベンゼンスルホニル）−ピペリジニルである］
で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩に関する。
【０００３】
ＴＲＰチャネルは、種々のヒト（及び他の動物）細胞タイプの細胞膜に見いだされるイオンチャネルのクラスである。少なくとも２８個の公知のヒトＴＲＰチャネルがあり、これらは、配列相同性及び機能に基づいて多数のファミリー又はグループに分けられる。ＴＲＰＡ１は、ナトリウム、カリウム及びカルシウムの流動を介して膜電位を調節する、非選択的カチオン透過チャネルである。ＴＲＰＡ１は、ヒトの後根神経節ニューロン及び末梢感覚神経において高度に発現されることが知られている。ヒトでは、ＴＲＰＡ１は、多数の反応性化合物（例えば、アクロレイン、アリルイソチオシアネート、オゾン）並びに非反応性化合物（例えば、ニコチン及びメントール）によって活性化され、従って、「化学センサー」として作用すると考えられている。公知のＴＲＰＡ１作動薬の多くは、ヒト及び他の動物において、疼痛、刺激及び神経性炎症を引き起こす刺激物である。そのため、ＴＲＰＡ１チャネル活性化因子の生物学的効果を遮断するＴＲＰＡ１拮抗薬又は薬剤は、喘息及びその増悪、慢性咳嗽並びに関連疾病のような疾患の処置において有用であろうし、さらには急性及び慢性疼痛の処置にも有用であろうと期待されている。最近では、組織損傷及び酸化ストレスの産物、例えば、４−ヒドロキシノネナール及び関連化合物が、ＴＲＰＡ１チャネルを活性化することも知られている。この知見は、組織損傷、酸化ストレス及び気管支平滑筋収縮に関連する疾患、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、職業性喘息及びウイルス誘導性肺炎症の処置における、小分子ＴＲＰＡ１拮抗薬の有用性についてのさらなる理論的根拠を提供する。
【０００４】
本発明はまた、当該化合物を含む医薬組成物、当該化合物を使用する方法及び当該化合物を調製する方法を提供する。
【０００５】
特に指示のない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される以下の特定の用語及び表現は、次のように定義される：
【０００６】
用語「部分」は、別の原子又は分子に１個又は複数の化学結合によって連結されて、それによって分子の一部を形成する、ある原子又は化学的に結合された原子群を指す。例えば、式Ｉの可変部Ｒ１〜Ｒ６は、式Ｉの核構造に共有結合によって連結された部分を指す。
【０００７】
１個又は複数の水素原子を有する特定の部分に関して、用語「置換されている」は、その部分の水素原子の少なくとも１個が別の置換基又は部分に置き換わっていることを指す。例えば、用語「ハロゲンによって置換されている低級アルキル」は、低級アルキル（以下に定義される）の１個又は複数の水素原子が１個又は複数のハロゲン原子に置き換わっていることを指す（例えば、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、フルオロメチル、クロロメチルなど）。
【０００８】
用語「アルキル」は、１〜２０個の炭素原子を有する、脂肪族の直鎖又は分岐鎖飽和炭化水素部分を指す。特定の実施態様において、アルキルは、１〜１０個の炭素原子を有する。
【０００９】
用語「低級アルキル」は、１〜７個の炭素原子を有するアルキル部分を指す。特定の実施態様において、低級アルキルは、１〜４個の炭素原子を有し、他の特定の実施態様において、低級アルキルは、１〜３個の炭素原子を有する。低級アルキルの例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル及びtert−ブチル、特にメチルを含む。
【００１０】
用語「アルコキシ」は、式−Ｏ−Ｒ’（式中、Ｒ’は、アルキル基である）で表される基を示す。用語「低級アルコキシ」は、同様に、アルキル基Ｒ’が１〜７個の炭素原子を有する、アルコキシ部分を指す。アルコキシ部分の例は、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ及びtert−ブトキシ、特にメトキシ及びtert−ブトキシを含む。
【００１１】
用語「ハロ」、「ハロゲン」及び「ハロゲン化物」は、互換的に使用され得、置換基フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード、特にクロロ又はヨードを指す。
【００１２】
特に指示のない限り、用語「水素」又は「ヒドロ」は、Ｈ２ではなく、水素原子（−Ｈ）の部分を指す。
【００１３】
用語「ベンゼン」は、単独で又は他の基と組み合わされて、フェニル部分を意味する。
【００１４】
特に指示のない限り、用語「式の化合物（a compound of the formula）」又は「式の化合物（a compound of formula）」又は「式の化合物（compounds of the formula）」又は「式の化合物（compounds of formula）」は、その式によって定義される化合物の属（genus）から選択される任意の化合物（特に指定のない場合は、任意のそのような化合物の任意の薬学的に許容し得る塩又はエステルを含む）を指す。
【００１５】
用語「薬学的に許容し得る塩」は、遊離塩基又は遊離酸の生物学的効果及び特性を保持し、生物学的にもその他の面でも望ましくないことはない塩を指す。塩は、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など、好ましくは塩酸）及び有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、サリチル酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、Ｎ−アセチルシステインなど）と形成され得る。加えて、塩は、遊離酸への無機塩基又は有機塩基の付加によっても調製され得る。無機塩基から誘導される塩は、特に限定されないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム及びマグネシウム塩などを含む。有機塩基から誘導される塩は、特に限定されないが、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リシン、アルギニン、Ｎ−エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂などの、第一級、第二級及び第三級アミン、天然の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン並びに塩基性イオン交換樹脂の塩を含む。
【００１６】
本発明の化合物は、薬学的に許容し得る塩の形態で存在することができる。本発明の化合物はまた、薬学的に許容し得るエステル（すなわち、プロドラッグとして使用される式Ｉの酸のメチル及びエチルエステル）の形態で存在することもできる。本発明の化合物はまた、溶媒和、すなわち水和され得る。溶媒和は、製造プロセスの過程で達成され得るか、又はすなわち当初無水であった式（Ｉ）の化合物の吸湿性の結果として起こり得る（水和）。
【００１７】
同じ分子式を有するがそれらの原子の結合の性質若しくは順序又はそれらの原子の空間的配列が異なる化合物は「異性体」と呼ばれ、本発明の範囲内である。それらの原子の空間的配列が異なる異性体は、「立体異性体」と呼ばれる。ジアステレオマーは、１個又は複数のキラル中心に反対の立体配置を有する立体異性体であるが、エナンチオマーではない。互いに鏡像であるが重ね合わせることができない、１個又は複数の不斉中心を有する立体異性体は、「エナンチオマー」と呼ばれる。化合物が不斉中心を有するとき、例えば、炭素原子が４個の異なる基に結合している場合、１対のエナンチオマーが可能である。エナンチオマーは、その不斉中心（１個又は複数）の絶対配置によって特徴付けられ得、Cahn、Ingold及びPrelogのＲ及びＳ順位則によって又はその分子が偏光面を回転させる様式によって記載され、右旋性又は左旋性として（すなわち、それぞれ、（＋）−異性体又は（−）−異性体として）表示される。キラル化合物は、個々のエナンチオマー又はそれらの混合物のいずれかとして存在することができる。エナンチオマーを同じ割合で含有する混合物は、「ラセミ混合物」と呼ばれる。
【００１８】
化合物の用語「治療有効量」は、疾患の症状を予防、緩和又は改善するために、あるいは処置される被検体の生存期間を延長するために効果的な化合物の量を意味する。治療有効量の決定は、当技術分野における技能の範囲内である。本発明に係る化合物の治療有効量又は投与量は、広い範囲内で変えることができ、当技術分野において公知の様式で決定され得る。そのような投与量は、投与される特定の化合物（複数）、投与経路、処置される病態及び処置される患者を含む、それぞれの特定の症例における個別の要件に調整されるだろう。一般に、およそ７０Kgの体重の成人への経口又は非経口投与の場合、約０．１mg〜約５，０００mg、１mg〜約１，０００mg又は１mg〜１００mgの一日投与量が適切であり得るが、必要であればその下限及び上限を超えてもよい。一日投与量は、単回用量として又は分割用量で投与され得るか、又は非経口投与の場合には、点滴として与えられ得る。
【００１９】
用語「薬学的に許容し得る担体」は、溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤を含む、薬剤の投与と適合性のある任意の及び全ての材料、並びに薬剤の投与と適合性のある他の材料及び化合物を含むことが意図される。任意の慣用の媒体又は薬剤が活性化合物と適合性でない場合を除いて、本発明の組成物におけるそれらの使用が考慮される。また、補助活性化合物を当該組成物中に組み込むこともできる。
【００２０】
本発明の組成物の調製に有用な薬学的担体は、固体、液体又は気体であり得；従って、当該組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、坐剤、粉剤、腸溶性コーティング製剤又は他の保護製剤（例えば、イオン交換樹脂に結合しているか又は脂質−タンパク質小胞に封入されている）、徐放性製剤、液剤、懸濁剤、エリキシル剤、エアロゾル剤などの形態をとることができる。担体は、石油、動物、植物又は合成起源の油を含む様々な油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などから選択され得る。水、生理食塩水、デキストロース水溶液及びグリコールが、特に（血液と等張である場合）注射用液剤のための好ましい液体担体である。例えば、静脈内投与用の製剤は、固体活性成分（複数）を水に溶解させて水溶液を生成し、その溶液を滅菌することにより調製される、活性成分（複数）の無菌水性液剤を含む。好適な薬学的賦形剤は、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、乳糖、タルク、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカ、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。当該組成物には、例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤又は乳化剤、浸透圧調整用の塩、緩衝剤などの慣用の薬学的添加剤が付与され得る。好適な薬学的担体及びそれらの製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin に記載されている。そのような組成物は、いずれにしても、レシピエントへ適切に投与するための適切な投与剤形を調製するために、有効量の活性化合物を好適な担体と共に含有するだろう。
【００２１】
本発明の方法の実施において、有効量の本発明の化合物のいずれか１つ又は本発明の化合物のいずれかの組み合わせ又はその薬学的に許容し得る塩若しくはエステルは、当技術分野において公知の通常の許容し得る方法のいずれかを介して、単独又は組み合わせのいずれかで投与される。従って、当該化合物又は組成物は、経口（例えば、口腔）、舌下、非経口（例えば、筋肉内、静脈内又は皮下）、直腸（例えば、坐剤又は洗浄剤によって）、経皮（例えば、皮膚エレクトロポレーション）又は吸入（例えば、エアロゾルによって）によって、錠剤及び懸濁剤を含む、固体、液体又は気体の投与剤形で投与され得る。投与は、適宜、持続的治療での単回の単位投与剤形で、又は単回投与治療で実施され得る。当該治療組成物はまた、パモ酸などの脂溶性の塩と併せた油乳剤又は分散剤の形態であっても、皮下又は筋肉内投与用の生物分解性の徐放性組成物の形態であってもよい。
【００２２】
本発明は、特に、以下に関する：
【００２３】
Ｘが、窒素である、式（Ｉ）の化合物；
【００２４】
Ｘが、−ＣＨ−である、式（Ｉ）の化合物；
【００２５】
Ｒ１が、メトキシである、式（Ｉ）の化合物；
【００２６】
Ｒ２が、ヨウ素又は塩素である、式（Ｉ）の化合物；
【００２７】
Ｒ３が、水素又はメトキシである、式（Ｉ）の化合物；
【００２８】
Ｒ３が、水素である、式（Ｉ）の化合物；
【００２９】
Ｒ４及びＲ４’の一方が、水素又はメチルであり、そして、他方が、水素又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒ５である、式（Ｉ）の化合物；
【００３０】
Ｒ４及びＲ４’が共に、水素である、式（Ｉ）の化合物；
【００３１】
Ｒ５が、メチル、tert−ブトキシ、−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、クロロフェニル又は（フルオロ−ベンゼンスルホニル）−ピペリジニルである、式（Ｉ）の化合物；
【００３２】
Ｒ５が、−ＣＦ３である、式（Ｉ）の化合物；そして
【００３３】
以下から選択される、式（Ｉ）の化合物：
［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−カルバミン酸tert−ブチルエステル；
２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−アセトアミド；
２，２−ジフルオロ−Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−アセトアミド；
Ｎ−［２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド；
［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−メチル−アミン；
２，２−ジフルオロ−Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−Ｎ−メチル−アセトアミド；
Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−Ｎ−メチル−アセトアミド；
２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−６−イルアミン；
２−（２−クロロ−６−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール−６−イルアミン；
Ｎ−［２−（２−クロロ−６−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド；
３−クロロ−Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−ベンズアミド；
３−クロロ−Ｎ−［２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−ベンズアミド；及び
（Ｓ）−１−（４−フルオロ−ベンゼンスルホニル）−ピペリジン−２−カルボン酸［２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−アミド。
【００３４】
Ｒ４及びＲ４’の定義において、低級アルキルは、有利には、メチルである、
【００３５】
Ｒ５の定義において、アルコキシは、有利には、tert−ブトキシである。
【００３６】
別の実施態様において、本発明は、治療有効量の式（Ｉ）に係る化合物と薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００３７】
別の実施態様において、本発明は、治療活性物質としての使用のための、式（Ｉ）に係る化合物を提供する。
【００３８】
別の実施態様において、本発明は、呼吸器障害の治療又は予防のための、式（Ｉ）に係る化合物の使用を提供する。
【００３９】
呼吸器障害の例は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、アレルギー性鼻炎及び気管支痙攣である。
【００４０】
別の実施態様において、本発明は、呼吸器障害の治療又は予防のための医薬の調製のための、式（Ｉ）に係る化合物の使用を提供する。
【００４１】
別の実施態様において、本発明は、呼吸器障害の治療又は予防における使用のための、式（Ｉ）に係る化合物を提供する。
【００４２】
別の実施態様において、本発明は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、アレルギー性鼻炎及び気管支痙攣から選択される呼吸器障害を処置するための方法であって、それを必要とする被検体に治療有効量の式（Ｉ）に係る化合物を投与する工程を含む方法を提供する。
【００４３】
これらの化合物を調製する際に使用される出発物質及び試薬は、一般に、販売業者（例えば、Aldrich Chemical Co.）から入手可能であるか、又はFieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis; Wiley & Sons: New York, 1991, Volumes 1-15; Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Elsevier Science Publishers, 1989, Volumes 1-5 and Supplementals; 及び Organic Reactions, Wiley & Sons: New York, 1991, Volumes 1-40 などの参考文献に記載される手順に従って、当業者に公知の方法によって調製されるかのいずれかである。
【００４４】
以下の合成反応スキームは、本発明の化合物が合成され得るいくつかの方法を単に例示するものであり、これらの合成反応スキームに対して様々な変形を行うことができ、これらは当業者によって本出願に含まれる開示を参考に示唆されるであろう。
【００４５】
合成反応スキームの出発物質及び中間体は、所望であれば、特に限定されないが、濾過、蒸留、結晶化、クロマトグラフィーなどを含む慣用の技術を使用して単離及び精製され得る。そのような物質は、物理定数及びスペクトルデータを含む慣用の手段を使用して特徴付けられ得る。
【００４６】
特に指定のない限り、本明細書に記載の反応は、好ましくは、不活性雰囲気下、大気圧で、約−７８℃〜約１５０℃、より好ましくは、約０℃〜約１２５℃の反応温度範囲で、最も好ましくかつ好都合には、ほぼ室温（又は周囲温度）、例えば、約２０℃で実施される。
【００４７】
本発明の化合物は、多数の慣用の手段によって製造され得る。例えば、これらは、以下のスキーム１に概説されるプロセスに従って製造され得る。
【００４８】
特に指定のない限り、Ｒ１〜Ｒ４’及びＸは、以下のスキームにおいて、上に定義される意味を有する。
【００４９】
【化２】
2015534957.tif 000004
【００５０】
スキーム１に見られるように、化合物２は、触媒（例えば、ピリジン−４−イルアミン及び溶媒（例えば、ＴＨＦ）の存在下で、３−ニトロアナリン（3-nitroanaline）とジ−tert−ジカルボナートとを反応させることによって製造され得る。
【００５１】
得られた（３−ニトロ−フェニル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル２を、次に、ＴＨＦとの溶液にし、（（トリメチルシリル）メチル）マグネシウムクロリドと反応させることができる。次に、ＴＨＦ中の２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノンの溶液を加え、当業者に公知の条件下で反応させて、（３−ニトロ−４−トリメチルシラニルメチル−フェニル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル３を与えることができる。次に、テトラ−ブチルアンモニウムフルオリドを、ＴＨＦ中のエステル３及び４−ヨード−２−メトキシニコチンアルデヒドの溶液に加え、｛４−［２−ヒドロキシ−２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−エチル］−３−ニトロ−フェニル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル４を与えることができる。今度は、化合物４の溶液を２，２，２−トリフルオロ酢酸無水物に加え、反応させて、トリフルオロ−酢酸２−（４−tert−ブトキシカルボニル−アミノ−２−ニトロ−フェニル）−１−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−エチルエステル５を与えることができる。
【００５２】
次に、ＴＨＦ中の粗トリフルオロ−酢酸２−（４−tert−ブトキシカルボニル−アミノ−２−ニトロ−フェニル）−１−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−エチルエステル５の溶液を、８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンに加えることができる。反応させた後、水相の抽出、有機層（organing layer）の洗浄、濾過、濃縮及びクロマトグラフィーは、｛４−［（Ｅ）−２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−ビニル］−３−ニトロ−フェニル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル６を提供することができる。６と亜リン酸トリエチルの溶液の還流、続く、公知の分離工程は、［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−カルバミン酸tert−ブチルエステル７を与えることができる。
【００５３】
［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−カルバミン酸tert−ブチルエステル７の溶液を、２，２，２−トリフルオロ酢酸などの酸に加え、化合物８を与えることができる。化合物８への２，２，２−トリフルオロ酢酸無水物などの無水物の添加、続く、当技術分野において公知の抽出、濾過及び分離工程は、化合物１（式中、Ｒ基及びＸは、例えば、以下の実施例及び特許請求の範囲に記載されるとおりであり得る）を与えることができる。
【００５４】
本発明は、実施例により以降説明されるが、これらは限定性を持つものではない。
【実施例】
【００５５】
本明細書においては、特定の例示的実施態様を記述及び記載しているが、本発明の化合物は、適切な出発物質を使用し、本明細書に一般的に記載される方法に従って、かつ／又は当業者に利用可能な方法によって調製され得る。
【００５６】
中間体及び最終化合物は、フラッシュクロマトグラフィー及び／又は逆相分取ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）のいずれかによって精製された。特に断りのない限り、フラッシュクロマトグラフィーは、（１）Biotage SP1（商標）システム及びQuad 12/25 Cartridgeモジュール（Biotage AB 社製）、（２）ISCO CombiFlash（登録商標）クロマトグラフィー装置（Teledyne Isco, Inc. 社製）、又は（３）Analogix（登録商標）IntelliFlash280（商標）クロマトグラフィー装置（Varian Inc. の子会社であるAnalogix Inc. 社製）を使用して実施された。特に断りのない限り、使用したシリカゲルの種類及び孔径は以下であった：（１）KP-SIL（商標）６０Å、粒径：４０〜６０ミクロン（Biotage AB 社製）；（２）シリカゲルＣＡＳ登録番号：63231-67-4、粒径：４７〜６０ミクロン；又は（３）ＺＣＸ（Qingdao Haiyang Chemical Co., Ltd 社製）、細孔径：２００〜３００メッシュ若しくは３００〜４００メッシュ。逆相分取ＨＰＬＣは、Waters Corporation 社製のWaters（登録商標）Delta-Prep（商標）3000 HPLCシステムを使用し、以下のカラムの１つ又は複数を使用して実施された：Varian, Inc. 社製のVarian Pursuit（登録商標）C-18カラム（１０μm、２０×１５０mm）、Waters Corporation 社製のXbridge（商標）Prep C18カラム（５μm、OBD（商標）２０×１００mm）、又はWaters Corporation社製のSunFire（商標）Prep C18カラム（５μm、OBD（商標）３０×１００mm）。
【００５７】
質量分析（ＭＳ）又は高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）は、Waters（登録商標）ZQ（商標）4000（Waters Corporation 社製）、Waters（登録商標）Quattro micro（商標）API（Waters Corporation 社製）、Micromass（登録商標）Platform II（Waters Corporationの一事業部であるMicromass 社製）、４．７テスラ磁石を備えたBruker（登録商標）Apex（登録商標）II FTICR（Bruker Corporation 社製）、Waters（登録商標）Alliance（登録商標）2795-ZQ（商標）2000（Waters Corporation 社製）、又はMDS Sciex（商標）API-2000（商標）n API（MDS Inc. 社製）を使用して実施された。質量スペクトルデータは、一般に、特に指定のない限り親イオンのみを示す。ＭＳ又はＨＲＭＳデータは、示される特定の中間体又は化合物について提供される。
【００５８】
核磁気共鳴分光法（NMR）は、共にVarian Inc. 社製である、Varian（登録商標）Mercury 300 NMR分光計（1H NMRスペクトルについては、300MHzで取得される）及びVarian（登録商標）Inova 400 NMR分光計（1H NMRスペクトルについては、400MHzで取得される）を使用して実施された。ＮＭＲデータは、示される特定の中間体又は化合物について提供される。
【００５９】
空気感受性の試薬が関与する反応は全て、不活性雰囲気下で実施された。試薬は、特に断りのない限り、販売業者から入手したものをそのまま使用された。
【００６０】
実施例１
［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−カルバミン酸tert−ブチルエステル
【化３】
2015534957.tif 000005
ＴＨＦ（５０mL）中の３−ニトロアニリン（５．００ｇ、３６．２mmol）、ジ−tert−ブチルジカルボナート（７．９０ｇ、３６．２mmol）及びピリジン−４−イルアミン（３．７５ｇ、３９．８mmol）の溶液を２５℃で３時間撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮し、次に、酢酸エチル（５０mL）を加えた。有機溶液を水で３回、ブラインで１回洗浄した。次に、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（８０／２０  ヘキサン／酢酸エチル）は、（３−ニトロ−フェニル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル（７．００ｇ、８１％）を油状物として与えた。
【００６１】
ＴＨＦ（５０mL）中の（３−ニトロ−フェニル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１．２０ｇ、５．０４mmol）の溶液に、窒素ガス下、−７０℃で、（（トリメチルシリル）メチル）マグネシウムクロリド（１．４８ｇ、１０．１mmol）を加えた。次に、溶液を−７０℃で１時間撹拌した。ＴＨＦ（３０mL）中の２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（２．７４ｇ、１２．１mmol）の溶液を加え、反応物を０℃まで温めて、反応物を０℃でさらなる時間撹拌した。反応混合物を酢酸水溶液（５０mL、５％v/v）に注ぎ、水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の油状物を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（８０／２０  ヘキサン／酢酸エチル）は、（３−ニトロ−４−トリメチルシラニルメチル−フェニル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１．２０ｇ、７３％）を軽油として与えた。
【００６２】
ＴＨＦ（１０mL）中の（３−ニトロ−４−トリメチルシラニルメチル−フェニル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１．００ｇ、３．０８mmol）及び４−ヨード−２−メトキシニコチンアルデヒド（８１１mg、３．０８mmol、Ｅｑ：１．００）の溶液に、２５℃で、テトラ−ブチルアンモニウムフルオリド（１２１mg、４６２μmol）を加えると、添加後に溶液の色が暗青色に変化した。反応混合物を２５℃で３０分間撹拌した。粗｛４−［２−ヒドロキシ−２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−エチル］−３−ニトロ−フェニル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（粗１．５９ｇ、３．０８mmol）の溶液を次の工程にそのまま使用した。Ｍ＋Ｈ  ５１５．９。
【００６３】
ＴＨＦ（１０mL）中の粗｛４−［２−ヒドロキシ−２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−エチル］−３−ニトロ−フェニル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（粗１．５９ｇ、３．０８mmol）の溶液を、２５℃で、２，２，２−トリフルオロ酢酸無水物（７３４mg、３．４９mmol）に加えると、色が暗青色に変化した。反応物を２５℃で３０分間撹拌した。粗トリフルオロ−酢酸２−（４−tert−ブトキシカルボニル−アミノ−２−ニトロ−フェニル）−１−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−エチルエステル（粗１．８８ｇ、２．９１mmol）の溶液を次の工程にそのまま使用した。ＭＨ＋  ６１１。
【００６４】
ＴＨＦ（１０mL）中の粗トリフルオロ−酢酸２−（４−tert−ブトキシカルボニル−アミノ−２−ニトロ−フェニル）−１−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−エチルエステル（粗１．８８ｇ、３．０８mmol）の溶液を、２５℃で、８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（１．３３ｇ、８．７４mmol）に加えた。反応物を７０℃で３時間撹拌した。反応混合物を２５℃まで冷まし、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（８０／２０  ヘキサン／酢酸エチル）は、｛４−［（Ｅ）−２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−ビニル］−３−ニトロ−フェニル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（８５０mg、５５％）を油状物として与えた。ＭＨ＋  ４９７．９。
【００６５】
亜リン酸トリエチル（１６．０ml）中の｛４−［（Ｅ）−２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−ビニル］−３−ニトロ−フェニル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（８００mg、１．６１mmol）の溶液を３時間還流した。反応混合物を２５℃まで冷まし、水に注ぎ、水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（７０／３０  ヘキサン／酢酸エチル）は、［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−カルバミン酸tert−ブチルエステル（２５０mg、３３％）を白色の固体として与えた。ＭＨ＋  ４６５．９。
【００６６】
実施例２
２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−アセトアミド
【化４】
2015534957.tif 000006
ＣＨ２Ｃｌ２（５mL）中の［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−カルバミン酸tert−ブチルエステル（９０mg、０．１９mmol）の溶液を、２５℃で、２，２，２−トリフルオロ酢酸（０．５mL）に加えた。溶液を３時間加熱還流した。溶液を真空下で濃縮して、粗２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イルアミン（６５mg、９２％）を明黄色の油状物として与えた。粗生成物を次の工程にそのまま使用した。ＭＨ＋  ３６５．９。
【００６７】
ＣＨ２Ｃｌ２（５mL）中の粗２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イルアミン（６５mg、０．１８mmol）の溶液に、２，２，２−トリフルオロ酢酸無水物（１８７mg、０．８９mmol）、続いて、トリエチルアミン（１８０mg、１．７８mmol）を加えた。溶液を２５℃で１時間撹拌し、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（７０／３０  ヘキサン／酢酸エチル）は、２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−アセトアミド（４８mg、５９％）を白色の固体として与えた。ＭＨ＋  ４６１．８。
【００６８】
実施例３
２，２−ジフルオロ−Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−アセトアミド
【化５】
2015534957.tif 000007
ＣＨ２Ｃｌ２（５mL）中の２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イルアミン（３０mg、０．０８mmol）の溶液に、２，２−ジフルオロ酢酸（１２mg、０．１２mmol）及びＨＡＴＵ（４７mg、０．１２mol）を加えた。溶液を２５℃で１時間撹拌し、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（７０／３０  ヘキサン／酢酸エチル）は、２，２−ジフルオロ−Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−アセトアミド（２４mg、６７％）を白色の固体として与えた。ＭＨ＋  ４４３．９。
【００６９】
実施例４
Ｎ−［２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド
【化６】
2015534957.tif 000008
ＴＨＦ（１０mL）中の（３−ニトロ−４−トリメチルシラニルメチル−フェニル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１．００ｇ、３．０８mmol）及び４−クロロ−２−メトキシニコチンアルデヒド（５２９mg、３．０８mmol）の溶液に、２５℃で、テトラ−ブチルアンモニウムフルオリド（１２１mg、４６２μmol）を加えると、添加後に溶液の色が暗青色に変化した。反応混合物を２５℃で３０分間撹拌した。粗｛４−［２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−２−ヒドロキシ−エチル］−３−ニトロ−フェニル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（粗１．３０ｇ、３．０８mmol）の溶液を次の工程にそのまま使用した。
【００７０】
ＴＨＦ（１０mL）中の｛４−［２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−２−ヒドロキシ−エチル］−３−ニトロ−フェニル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（粗１．３０ｇ、３．０８mmol）の溶液を、２５℃で、２，２，２−トリフルオロ酢酸無水物（７３４mg、３．４９mmol）に加えると、色が暗青色に変化した。反応物を２５℃で３０分間撹拌した。トリフルオロ−酢酸２−（４−tert−ブトキシカルボニルアミノ−２−ニトロ−フェニル）−１−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−エチルエステル（粗１．６０ｇ、３．０８mmol）の溶液を次の工程にそのまま使用した。
【００７１】
ＴＨＦ（１０mL）中のトリフルオロ−酢酸２−（４−tert−ブトキシカルボニルアミノ−２−ニトロ−フェニル）−１−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−エチルエステル（粗１．６０ｇ、３．０８mmol）の溶液を、２５℃で、８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（１．３３ｇ、８，７４mmol）に加えた。反応物を７０℃で３時間撹拌した。反応混合物を２５℃まで冷まし、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（８０／２０  ヘキサン／酢酸エチル）は、｛４−［（Ｅ）−２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−ビニル］−３−ニトロ−フェニル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（８００mg、６８％）を油状物として与えた。ＭＨ＋  ４０６．０。
【００７２】
亜リン酸トリエチル（１６．０ml）中の｛４−［（Ｅ）−２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−ビニル］−３−ニトロ−フェニル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（８００mg、１．９７mmol）の溶液を３時間還流した。反応混合物を２５℃まで冷まし、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（７０／３０  ヘキサン／酢酸エチル）は、［２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１８０mg、３３％）を白色の固体として与えた。ＭＨ＋  ３７４．０。
【００７３】
ＣＨ２Ｃｌ２（５mL）中の［２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１６０mg、０．４３）の溶液を、２５℃で、２，２，２−トリフルオロ酢酸（０．５mL）に加えた。溶液を３時間加熱還流した。溶液を真空下で濃縮して、粗２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イルアミン（１０５mg、９０％）を明黄色の油状物として与えた。粗生成物を次の工程にそのまま使用した。ＭＨ＋  ２７３．９。
【００７４】
ＣＨ２Ｃｌ２（５mL）中の粗２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イルアミン（３０mg、０．１１mmol）の溶液に、２，２，２−トリフルオロ酢酸無水物（１１５mg、０．５５mmol）、続いて、トリエチルアミン（１１１mg、１．１mmol）を加えた。溶液を２５℃で１時間撹拌し、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（７０／３０  ヘキサン／酢酸エチル）は、Ｎ−［２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド（１８mg、４３％）を白色の固体として与えた。ＭＨ＋  ３７０．０。
【００７５】
実施例５
［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−メチル−アミン
【化７】
2015534957.tif 000009
ＴＨＦ（５０mL）中のＮ−メチル−３−ニトロアニリン（１．００ｇ、６．５７mmol）、ジ−tert−ブチルジカルボナート（１．４３ｇ、６．５７mmol）及びピリジン−４−イルアミン（６１９mg、６．５７mmol）の溶液を２５℃で３時間撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮し、次に、酢酸エチル（５０mL）を加えた。有機溶液を水で３回、ブラインで１回洗浄した。次に、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（８０／２０  ヘキサン／酢酸エチル）は、メチル−（３−ニトロ−フェニル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１．６０ｇ、９７％）を油状物として与えた。
【００７６】
ＴＨＦ（５０mL）中のメチル−（３−ニトロ−フェニル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１．６０ｇ、６．３４mmol）の溶液に、窒素ガス下、−７０℃で、（（トリメチルシリル）メチル）マグネシウムクロリド（１．４０ｇ、１０．１mmol）を加えた。次に、溶液を−７０℃で１時間撹拌した。ＴＨＦ（３０mL）中の２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（１．７３ｇ、７．６１mmol）の溶液を加え、反応物を０℃まで温めて、０℃でさらなる時間撹拌した。反応混合物を酢酸水溶液（５０mL、５％）に注ぐ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の油状物を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（８０／２０  ヘキサン／酢酸エチル）は、メチル−（３−ニトロ−４−トリメチルシラニルメチル−フェニル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル（０．８０ｇ、３７％）を軽油として与えた。
【００７７】
ＴＨＦ（１０mL）中のメチル−（３−ニトロ−４−トリメチルシラニルメチル−フェニル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル（０．７５ｇ、１．１０mmol）及び４−ヨード−２−メトキシニコチンアルデヒド（１．１７ｇ、４．４３mmol）の溶液に、２５℃で、テトラ−ブチルアンモニウムフルオリド（１７４mg、６６５μmol）を加えた。添加すると、溶液の色が暗青色に変化した。反応混合物を２５℃で３０分間撹拌した。
【００７８】
次に、反応混合物に、２５℃で、２，２，２−トリフルオロ酢酸無水物（１．３７ｇ、６．５２mmol）を加えると、色が暗青色に変化した。反応物を２５℃で３０分間撹拌した。
【００７９】
次に、反応混合物に、２５℃で、８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（１．６４ｇ、１０．８mmol）を加えた。反応物を７０℃で３時間撹拌した。反応混合物を２５℃まで冷まし、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（８０／２０  ヘキサン／酢酸エチル）は、｛４−［（Ｅ）−２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−ビニル］−３−ニトロ−フェニル｝−メチル−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１．０ｇ、９１％）を油状物として与えた。ＭＨ＋  ５１２．０。
【００８０】
亜リン酸トリエチル（５．０ml）中の｛４−［（Ｅ）−２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−ビニル］−３−ニトロ−フェニル｝−メチル−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１．００ｇ、１．９６mmol）の溶液を３時間還流した。反応混合物を２５℃まで冷まし、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（７０／３０  ヘキサン／酢酸エチル）は、［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−メチル−カルバミン酸tert−ブチルエステル（５５０mg、５９％）を白色の固体として与えた。ＭＨ＋  ４７９．７。
【００８１】
ＣＨ２Ｃｌ２（５mL）中の［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−メチル−カルバミン酸tert−ブチルエステル（５２０mg、１．０８mmol）の溶液を、２５℃で、２，２，２−トリフルオロ酢酸（１mL）に加えた。溶液を３時間加熱還流した。溶液を真空下で濃縮し、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（７０／３０  ヘキサン／酢酸エチル）は、［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−メチル−アミン（３８０mg、９２％）を白色の生成物として与えた。ＭＨ＋  ３７９．９。
【００８２】
実施例６
２，２−ジフルオロ−Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−Ｎ−メチル−アセトアミド
【化８】
2015534957.tif 000010
ＣＨ２Ｃｌ２（５mL）中の［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−メチル−アミン（３０mg、０．０８mmol）の溶液に、２，２−ジフルオロ酢酸（１１mg、０．１２mmol）及びＨＡＴＵ（４５mg、０．１２mol）を加えた。溶液を２５℃で１時間撹拌し、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（７０／３０  ヘキサン／酢酸エチル）は、２，２−ジフルオロ−Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−Ｎ−メチル−アセトアミド（１２mg、３３％）を白色の固体として与えた。ＭＨ＋  ４５７．８。
【００８３】
実施例７
Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−Ｎ−メチル−アセトアミド
【化９】
2015534957.tif 000011
ＣＨ２Ｃｌ２（５mL）中の［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−メチル−アミン（３０mg、０．０８mmol）の溶液に、酢酸無水物（８mg、０．０８mmol）及びトリエチルアミン（８０mg、０．７９１mol）を加えた。溶液を２５℃で１時間撹拌し、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（７０／３０  ヘキサン／酢酸エチル）は、Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−Ｎ−メチル−アセトアミド（１８mg、５３％）を白色の固体として与えた。ＭＨ＋  ４２２．０。
【００８４】
実施例８
２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−６−イルアミン
【化１０】
2015534957.tif 000012
ＴＨＦ（５０mL）中の２−メトキシ−５−ニトロアニリン（３．００ｇ、１７．８mmol）、ジ−tert−ブチルジカルボナート（３．８９ｇ、１７．８mmol）及びピリジン−４−イルアミン（１．６８ｇ、１７．８mmol）の溶液を２５℃で３時間撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮し、次に、酢酸エチル（５０mL）で希釈した。有機溶液を水で３回、ブラインで１回洗浄した。次に、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（８０／２０  ヘキサン／酢酸エチル）は、（２−メトキシ−５−ニトロ−フェニル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル（３．８０ｇ、７９％）を油状物として与えた。
【００８５】
ＴＨＦ（５０mL）中の（２−メトキシ−５−ニトロ−フェニル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１．８０ｇ、６．７１mmol）の溶液に、窒素ガス下、−７０℃で、（（トリメチルシリル）メチル）マグネシウムクロリド（２．４７ｇ、１６．８mmol）を加えた。次に、溶液を−７０℃で１時間撹拌した。ＴＨＦ（３０mL）中の２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（３．０５ｇ、１３．４mmol）の溶液を加え、反応物を０℃まで温めた。反応物を０℃でさらなる時間撹拌した。反応混合物を酢酸水溶液（５０mL、５％）に注ぐ。水相を酢酸エチルで３回抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の油状物を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（８０／２０  ヘキサン／酢酸エチル）は、（２−メトキシ−５−ニトロ−４−トリメチルシラニルメチル−フェニル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１．５０ｇ、６３％）を軽油として与えた。
【００８６】
ＴＨＦ（１０mL）中の（２−メトキシ−５−ニトロ−４−トリメチルシラニルメチル−フェニル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル（０．７５ｇ、２．１２mmol）及び４−ヨード−２−メトキシニコチンアルデヒド（５５７mg、２．１２mmol）の溶液に、２５℃で、テトラ−ブチルアンモニウムフルオリド（８３mg、３１７μmol）を加えると、添加後に溶液の色が暗青色に変化した。反応混合物を２５℃で３０分間撹拌した。粗｛４−［２−ヒドロキシ−２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−エチル］−２−メトキシ−５−ニトロ−フェニル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（粗１．１８ｇ、２．１２）の溶液を次の工程にそのまま使用した。Ｍ＋Ｈ  ５４６．０。
【００８７】
ＴＨＦ（１０mL）中の粗｛４−［２−ヒドロキシ−２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−エチル］−２−メトキシ−５−ニトロ−フェニル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（粗１．１８ｇ、２．１２mmol）の溶液を、２５℃で、２，２，２−トリフルオロ酢酸無水物（１．２７ｇ、６．０５mmol）に加えると、色が暗青色に変化した。反応物を２５℃で３０分間撹拌した。粗トリフルオロ−酢酸２−（４−tert−ブトキシカルボニルアミノ−５−メトキシ−２−ニトロ−フェニル）−１−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−エチルエステル（粗１．３５ｇ、２．１２mmol）の溶液を次の工程にそのまま使用した。ＭＨ＋  ６４１．９。
【００８８】
ＴＨＦ（１０mL）中の粗トリフルオロ−酢酸２−（４−tert−ブトキシカルボニルアミノ−５−メトキシ−２−ニトロ−フェニル）−１−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−エチルエステル（粗１．３５ｇ、２．１２mmol）の溶液に、２５℃で、８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（１．４８ｇ、９．７５mmol）を加えた。反応物を７０℃で３時間撹拌し、２５℃まで冷まし、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（８０／２０  ヘキサン／酢酸エチル）は、｛４−［（Ｅ）−２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−ビニル］−２−メトキシ−５−ニトロ−フェニル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（５６０mg、５５％）を油状物として与えた。ＭＨ＋  ５２７．８。
【００８９】
亜リン酸トリエチル（５．０ml）中の｛４−［（Ｅ）−２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−ビニル］−２−メトキシ−５−ニトロ−フェニル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（５６０mg、１．０６mmol）の溶液を３時間還流し、２５℃まで冷まし、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（７０／３０  ヘキサン／酢酸エチル）は、［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−６−イル］−カルバミン酸tert−ブチルエステル（２５０mg、４８％）を白色の固体として与えた。ＭＨ＋  ４９６．０。
【００９０】
ＣＨ２Ｃｌ２（５mL）中の［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−６−イル］−カルバミン酸tert−ブチルエステル（２５０mg、０．５１mmol）の溶液を、２５℃で、２，２，２−トリフルオロ酢酸（１mL）に加えた。溶液を３時間加熱還流し、次に、真空下で濃縮し、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（５０／５０  ヘキサン／酢酸エチル）は、２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−６−イルアミン（１７０mg、８５％）を白色の固体として与えた。ＭＨ＋  ３９５．０。
【００９１】
実施例９
２−（２−クロロ−６−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール−６−イルアミン
【化１１】
2015534957.tif 000013
ＴＨＦ（１０mL）中の（３−ニトロ−４−トリメチルシラニルメチル−フェニル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１．００ｇ、３．０８mmol）及び２−クロロ−６−メトキシベンズアルデヒド（５２６mg、３．０８mmol）の溶液に、２５℃で、テトラ−ブチルアンモニウムフルオリド（１２１mg、４６２μmol）を加えると、添加後に溶液の色が暗青色に変化した。反応混合物を２５℃で３０分間撹拌し、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（７０／３０  ヘキサン／酢酸エチル）は、｛４−［２−（２−クロロ−６−メトキシ−フェニル）−２−ヒドロキシ−エチル］−３−ニトロ−フェニル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（０．４５ｇ、３５％）を油状物として与えた。
【００９２】
ＴＨＦ（１０mL）中の｛４−［２−（２−クロロ−６−メトキシ−フェニル）−２−ヒドロキシ−エチル］−３−ニトロ−フェニル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（０．４５ｇ、１．０６mmol）の溶液に、２５℃で、２，２，２−トリフルオロ酢酸無水物（６７１mg、３．１８mmol）を加えると、色が暗青色に変化した。反応物を２５℃で３０分間撹拌した後、８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（０．７６ｇ、５．００mmol）を加えた。反応物を７０℃で３時間加熱し、次に、２５℃まで冷まし、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（９０／１０  ヘキサン／酢酸エチル）は、｛４−［（Ｅ）−２−（２−クロロ−６−メトキシ−フェニル）−ビニル］−３−ニトロ−フェニル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（２４０mg、６０％）を油状物として与えた。
【００９３】
亜リン酸トリエチル（５．０ml）中の｛４−［（Ｅ）−２−（２−クロロ−６−メトキシ−フェニル）−ビニル］−３−ニトロ−フェニル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（２４０mg、０．５９mmol）の溶液を３時間還流した。反応混合物を２５℃まで冷まし、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（７０／３０  ヘキサン／酢酸エチル）は、［２−（２−クロロ−６−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１４０mg、６３％）を白色の固体として与えた。ＭＨ＋  ３７３．０。
【００９４】
ＣＨ２Ｃｌ２（５mL）中の［２−（２−クロロ−６−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１２０mg、０．３２mmol）の溶液を、２５℃で、２，２，２−トリフルオロ酢酸（０．５mL）に加えた。溶液を３時間加熱還流し、濃縮して、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（７０／３０  ヘキサン／酢酸エチル）は、２−（２−クロロ−６−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール−６−イルアミン（８０mg、９１％）を白色の固体として与えた。ＭＨ＋  ２７２．９。
【００９５】
実施例１０
Ｎ−［２−（２−クロロ−６−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド
【化１２】
2015534957.tif 000014
ＣＨ２Ｃｌ２（５mL）中の２−（２−クロロ−６−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール−６−イルアミン（５０mg、０．１８mmol）の溶液に、２，２，２−トリフルオロ酢酸無水物（１９３mg、０．９２mmol）、続いて、トリエチルアミン（１８６mg、１．８mmol）を加えた。溶液を２５℃で１時間撹拌し、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（７０／３０  ヘキサン／酢酸エチル）は、Ｎ−［２−（２−クロロ−６−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド（３８mg、５６％）を白色の固体として与えた。ＭＨ＋  ３６９．０。
【００９６】
実施例１１
３−クロロ−Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−ベンズアミド
【化１３】
2015534957.tif 000015
ＣＨ２Ｃｌ２（５mL）中の２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イルアミン（５０mg、０．１４mmol）の溶液に、３−クロロ安息香酸（２１mg、０．１４mmol）及びＨＡＴＵ（５２mg、０．１４mol）を加えた。溶液を２５℃で１時間撹拌し、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（７０／３０  ヘキサン／酢酸エチル）は、３−クロロ−Ｎ−［２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−ベンズアミド（５６mg、８１％）を白色の固体として与えた。ＭＨ＋  ５０３．８。
【００９７】
実施例１２
３−クロロ−Ｎ−［２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−ベンズアミド
【化１４】
2015534957.tif 000016
ＣＨ２Ｃｌ２（５mL）中の２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イルアミン（３０mg、０．１１mmol）の溶液に、３−クロロ安息香酸（１７mg、０．１１mmol）及びＨＡＴＵ（４２mg、０．１１mol）を加えた。溶液を２５℃で１時間撹拌し、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（７０／３０  ヘキサン／酢酸エチル）は、３−クロロ−Ｎ−［２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−ベンズアミド（３５mg、７８％）を白色の固体として与えた。ＭＨ＋  ４１１．９。
【００９８】
実施例１３
（Ｓ）−１−（４−フルオロ−ベンゼンスルホニル）−ピペリジン−２−カルボン酸［２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−アミド
【化１５】
2015534957.tif 000017
ＣＨ２Ｃｌ２（５mL）中の２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イルアミン（３５mg、０．１３mmol）の溶液に、（Ｓ）−１−（４−フルオロ−ベンゼンスルホニル）−ピペリジン−２−カルボン酸（３７mg、０．１３mmol）及びＨＡＴＵ（４９mg、０．１３mol）を加えた。溶液を２５℃で１時間撹拌し、水に注いだ。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過、続く、真空下での濃縮は、褐色の固体を与えた。フラッシュクロマトグラフィー（７０／３０  ヘキサン／酢酸エチル）は、（Ｓ）−１−（４−フルオロ−ベンゼンスルホニル）−ピペリジン−２−カルボン酸［２−（４−クロロ−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−６−イル］−アミド（６０mg、８６％）を白色の固体として与えた。ＭＨ＋  ５４３．０。
【００９９】
実施例１４
ＩＣ５０の決定
用量反応アッセイ：ChanTest hTRPA1-CHOが安定的にトランスフェクトされた細胞株
細胞培養及びアッセイ試薬：
Ham’s F12（GIBCO #11765-047）
テトラサイクリンフリーウシ胎仔血清（ClonTech#631106, Lot A301097018）
ブラストサイジン（原液１０mg/ml）（GIBCO #A11139-02）
ゼオシン（原液１００mg/ml）（GIBCO #R250-01）
ドキシサイクリン（SIGMA #D9891）
ペニシリン−スプレプトマイシン（Spreptomycin）溶液（１００×）（GIBCO #15140-122）
GlutaMAX（１００×）（GIBCO #35050）
トリプシン−ＥＤＴＡ（GIBCO #25200-056）
ＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウム不含）（GIBCO #14190）
ＨＢＳＳ（GIBCO #14025）
Ｈｅｐｅｓ（GIBCO #15630）
ＢＳＡ（脂肪酸フリー、低エンドトキシン）（SIGMA #A8806-5G）
ＤＭＳＯ（SIGMA #D2650）
ＡＰ−１８（SIGMA #A7232）
シンナムアルデヒド（SIGMA #W228613）
ＡＴＰ（SIGMA #A-6419）
ジフェニルボリン酸２−アミノエチル（SIGMA #D9754）
メントール（Sigma #M2772）
ＦＬＩＰＲカルシウム３アッセイキット（Molecular Devices #R8108）
プロベネシド（INVITROGEN #36400）
プレート（BD#35-3962）
【０１００】
CHO-K1 Tet-On HOMSA TRPA1 Clone 20
発現誘導性のチャイニーズハムスター卵巣細胞
２６代継代されたクローン＃２０
この細胞株におけるチャネル発現は、少なくとも８０継代にわたり安定であることが示されている
マイコアラートキット（MycoAlert Kit）でマイコプラズマフリーであることが証明されている
細胞株は増殖及び保存されている
【０１０１】
成長条件：
CHO-K1 Tet-On HOMSA TRPA1 Clone 20用の成長培地
１０％テトラサイクリンフリーＦＢＳを含有するHam’s F-12
１×ペニシリン−ストレプトマイシン
１×glutamax
０．０１mg/mlブラストサイジン
０．４０mg/mlゼオシン
【０１０２】
細胞株の倍加速度は、約１５時間であった。培養プレートは、８０％コンフルエントを超えなかった。
【０１０３】
発現を誘導するために、テトラサイクリンを、最終濃度１ug/mlでブラストサイジン／ゼオシンフリー培地に加えた。誘導の２４時間後に実験を実行した。
【０１０４】
ＣＨＯＫ１／ＴＲＰＡ１細胞のプレーティング条件：
０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡで細胞を回収する。
【０１０５】
抗生物質セレクションを行わずに細胞を成長培地中に再懸濁する。
【０１０６】
細胞密度を測定し、１ug/mlドキシサイクリンを含有する培地中に２．４×１０５細胞/mlに希釈し、３８４ウェル黒色／透明組織培養処理プレートに２５ul/ウェルでプレーティングする。
【０１０７】
３７℃で一晩インキュベートする。
【０１０８】
カルシウム流動アッセイ：
アッセイ日：
試薬：
交換緩衝液：ハンクス平衡塩溶液（２０mM ＨＥＰＥＳと共に０．００５％ＢＳＡ及び２×プロベネシドを含有する）
色素充填緩衝液：１バイアルの内容物を２０mM ＨＥＰＥＳを含有するハンクス平衡塩溶液５００mlに溶解することによって、Ｃａｌ−３ＮＷカルシウム色素を調製した。
【０１０９】
−ＣＨＯＫ１／ＴＲＰＡ１細胞用の対照化合物：
ＡＰ−１８（原液１０mM）から、化合物緩衝液（ＨＢＳＳ／２０mM ＨＥＰＥＳ／０．００５％ＢＳＡ）中に最終濃度１０uMで３．５×化合物希釈物を調製する。
【０１１０】
シンナムアルデヒドの調製（作動薬添加）：
ＦＷ＝１３２．１６
比重＝１．０４６gm/cc
１．３２gm/１．０４６gm/cc＝原液１．２６ml
１．７４mlのＤＭＳＯの添加＝３．３Ｍの原液
４．５×標準溶液（化合物緩衝液：ＨＢＳＳ／２０mM ＨＥＰＥＳ／０．００５％ＢＳＡ中の最終１００uM）
【０１１１】
化合物希釈物を、５又は１０mM原液（１００％ＤＭＳＯ）から調製した。
【０１１２】
滴定時点に容量及び濃度の調整を行って、所望の最終アッセイ濃度を反映した。
【０１１３】
２０μM（３倍希釈系列、１１段階）又は３０μM（２倍希釈系列、１１段階）のいずれかで化合物を試験した。
【０１１４】
希釈化合物３μlを、Weidmann３８４ウェルプレートに２連で並べて移した。
【０１１５】
化合物プレートを、ＨＢＳＳ／２０mM ＨＥＰＥＳ／０．００５％ＢＳＡ緩衝液（化合物緩衝液）１００ulで再懸濁した：
カラム１Ａ−Ｈ：緩衝液／ＤＭＳＯ（ｂｋ）
カラム２Ａ−Ｈ：ＡＰ−１８（ＣＨＯＫ１  ＴＲＰＡ１細胞用の対照拮抗薬）
カラム１Ｉ−Ｐ：ＡＴＰ（ＣＨＯＫ１  ｔｅｔｏｎ細胞用の対照）
カラム２Ｉ−Ｐ：２ＡＰＢ（ＣＨＯＫ１／ＴＲＰＭ８細胞用の対照拮抗薬）。
【０１１６】
成長培地を細胞プレートから除去し（２０ul）、交換緩衝液２０ulを加え、続いて、希釈色素２５ulを添加した。３つの工程は全て、PlateWasher BioTek 407を使用して実施した。次に、プレートを室温で３０秒間インキュベートした。
【０１１７】
インキュベート後、細胞プレートと化合物プレートの両方をＦＬＩＰＲに運び、希釈化合物／拮抗薬／ｂｋ ２０ulをＦＬＩＰＲによって細胞プレートに移した。次に、プレートを室温で３０秒間インキュベートした。３０秒間のインキュベート後、プレートをＦＬＩＰＲに戻し、４．５×シンナムアルデヒド２０ulを細胞プレートに加えた。化合物添加ならびに作動薬添加の間、細胞プレートの３８４ウェル全てからの蛍光読み取りを１．５秒毎に同時に行った。５回の読み取りを行って、安定ベースラインを確立し、次に、細胞プレートの各ウェルに、試料２０ulを迅速（３０ul／秒）かつ同時に加えた。試料／作動薬添加の前、間及び後の蛍光を、１００秒（化合物添加）及び１２０秒（作動薬添加）の総経過時間にわたって継続的にモニタリングした。作動薬添加後の各ウェル中の応答（ピーク蛍光の増加）を決定した。リガンド刺激の前の各ウェルからの初期蛍光読み取りを、そのウェルからのデータについてのゼロベースライン値として使用した。応答を、以下の表１に示すように、阻害薬対照に対する阻害％として表した：
【０１１８】
【表１】
2015534957.tif 000018
【０１１９】
例Ａ
下記の成分を含有するフィルムコーティング剤は常法により製造することができる。
【表２】
2015534957.tif 000019
活性成分を篩にかけ、微晶質セルロースと混合し、混合物を水中のポリビニルピロリドンの溶液で顆粒化する。次に、顆粒をグリコールデンプンナトリウム及びステアリン酸マグネシウムと混合し、圧縮して、それぞれ１２０又は３５０mgの核を得る。上記の皮膜の水溶液／懸濁液により核を滑らかにする。
【０１２０】
例Ｂ
下記の成分を含有するカプセル剤は常法により製造できる。
【表３】
2015534957.tif 000020
成分を篩にかけ、混合し、サイズ２のカプセルに充填する。
【０１２１】
例Ｃ
注射剤は下記の組成を有することができる。
【表４】
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活性成分を、ポリエチレングリコール４００と注射用水（一部）の混合物に溶解する。
酢酸の添加により、ｐＨを５．０に調整する。水の残量を加えて、容量を１．０mlに調整する。溶液を濾過し、適切な過剰量を使用してバイアルに充填し、滅菌する。
【国際調査報告】
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