(57)【要約】本発明は、R1、R2およびnが詳細な説明および特許請求の範囲において定義されている式Iの化合物に関する。特に、本発明は、VLA-4インテグリンアンタゴニストに連結された小分子、ペプチド、核酸、蛍光部分およびポリマーなどの結合体化された部分の製造と、VLA-4を発現する標的細胞への当該部分の送達とにおいて使用される、式Iの化合物に関する。2015511937.tif 000253
2015511937.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I：
2015511937.tif 000228
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、かつ
R1は、
(1) 式：
2015511937.tif 000229
の化合物であって、式中、mは0〜3であり、かつGは、
2015511937.tif 000230
からなる群より選択される、化合物；
(2) 式：
2015511937.tif 000231
の化合物であって、式中、mは0〜3であり、R4およびR5は独立して水素またはハロゲンであり、WはOまたはCH2であり、かつGは、
2015511937.tif 000232
からなる群より選択される、化合物；ならびに
(3) 式：
2015511937.tif 000233
の化合物
からなる群より選択され、
R2は、
(1) 式：
2015511937.tif 000234
の化合物；
(2) 式：
2015511937.tif 000235
の化合物；
(3) 式：
2015511937.tif 000236
の化合物；および
(4) 式：
2015511937.tif 000237
の化合物であって、式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015511937.tif 000238
の化合物のいずれかを表す、化合物
からなる群より選択される、
前記式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステル。
【請求項２】
R1が式：
2015511937.tif 000239
の化合物であって、式中、mは0〜3である、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
R1が式：
2015511937.tif 000240
の化合物であって、式中、mは0〜3である、請求項1に記載の化合物。
【請求項４】
R1が式：
2015511937.tif 000241
の化合物であって、式中、mは0〜3である、請求項1に記載の化合物。
【請求項５】
R1が式：
2015511937.tif 000242
の化合物であって、式中、mは0〜3である、請求項1に記載の化合物。
【請求項６】
R1が式：
2015511937.tif 000243
の化合物であって、式中、mは0〜3であり、R4およびR5は水素またはハロゲンであり、かつWはOまたはCH2である、請求項1に記載の化合物。
【請求項７】
R1が式：
2015511937.tif 000244
の化合物であって、式中、mは0〜3であり、R4およびR5は水素またはハロゲンであり、かつWはOまたはCH2である、請求項1に記載の化合物。
【請求項８】
R1が式：
2015511937.tif 000245
の化合物であって、式中、mは0〜3であり、R4およびR5は水素またはハロゲンであり、かつWはOまたはCH2である、請求項1に記載の化合物。
【請求項９】
R1が式：
2015511937.tif 000246
の化合物であって、式中、mは0〜3であり、R4およびR5は水素またはハロゲンであり、かつWはOまたはCH2である、請求項1に記載の化合物。
【請求項１０】
R1が式：
2015511937.tif 000247
の化合物である、請求項1に記載の化合物。
【請求項１１】
R2が式：
2015511937.tif 000248
の化合物である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
R2が式：
2015511937.tif 000249
の化合物である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
R2が式：
2015511937.tif 000250
の化合物である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
R2が式：
2015511937.tif 000251
の化合物であって、式中、R3は一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、かつXは硫黄または式：
2015511937.tif 000252
の化合物のいずれかを表す、請求項1〜10のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
R3がsiRNA分子である、請求項14に記載の化合物。
【請求項１６】
以下からなる群より選択される、請求項1に記載の化合物：
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]プロピオン酸；
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンチル]カルボニル]アミノ]プロピオン酸；
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]プロピオン酸；および
(S)-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]-エチル]-シクロペンタンカルボニル]-アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸。
【請求項１７】
以下からなる群より選択される、請求項1に記載の化合物：
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[2,6-ジクロロ-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]ベンゾイルアミノ]プロピオン酸；
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[2,6-ジクロロ-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]ベンゾイルアミノ]プロピオン酸；
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[2,6-ジクロロ-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]ベンゾイルアミノ]プロピオン酸；および
(S)-2-[[1-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]ブチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸。
【請求項１８】
以下からなる群より選択される、請求項1に記載の化合物：
(S)-2-[2,6-ジクロロ-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]ベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸；
(S)-2-[2,6-ジクロロ-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]ベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸；および
(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ)メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩。
【請求項１９】
以下からなる群より選択される、請求項1に記載の化合物：
(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ)メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩；
(S)-2-[4-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-アセチルスルファニル-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸；および
(S)-2-[4-[[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニルエトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロピオニル]-[4-[(S)-1-カルボキシ-2-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]エチルカルバモイル]-3,5-ジフルオロベンジルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンジルアミノ]-3-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]プロピオン酸。
【請求項２０】
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸-FITCである、請求項1に記載の化合物。
【請求項２１】
請求項1〜20のいずれか一項に記載の化合物と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療のための方法であって、それを必要とする患者に治療有効量の請求項1〜20のいずれか一項に記載の化合物を投与する段階を含む、方法。
【請求項２３】
炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療または予防のための、請求項1〜20のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項２４】
炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療または予防用の医薬の調製のための、請求項1〜20のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項２５】
以上に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結合体化される部分と標的化実体との間に共有結合が形成されるような、チオールなどの反応性求核剤を含有する他の分子との化学反応に適したリンカーおよび官能基を含有する、強力かつ選択的な小分子インテグリンアンタゴニストの合成および反応に関する。VLA-4アンタゴニストがVLA-4二量体に結合する(α4β1アンタゴニストはインテグリンα4β1(最晩期抗原4)二量体に結合する)ように、当該小分子標的化アンタゴニストは同族受容体系に結合する。共有結合により連結された部分としては、小分子治療薬、ポリマー、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドが挙げられる。5'-チオ-siRNAの標的化送達を可能にする手段としての5'-チオ-siRNA誘導体を形成するための5'-チオ含有オリゴヌクレオチドが含まれる。そのような誘導体化siRNAと適切なトランスフェクション剤との組み合わせは、そのようなインテグリン受容体を発現する細胞へのsiRNAの選択的送達を促進することで、RNA干渉(RNAi)を通じて標的遺伝子の発現を防止する。
【背景技術】
【０００２】
VLA-4(最晩期抗原4、α4β1とも呼ばれる)はインテグリン二量体であり、CD49d(α)およびCD29(β)からなる2つのサブユニットで構成されている。VLA-4は、白血球細胞膜の表面に発現し、(サイトカインによる活性化後に)血管表面のVCAM-1に結合することで白血球を血管内皮に接着させる(粥状動脈硬化または他の炎症性疾患を引き起こす)。また、特定のがん細胞は、VCAM-1に結合するVLA-4を発現することで内皮に接着する(転移の危険性を増大させる)ことがある。したがって、VLA-4に結合する化合物は、VCAM-1との相互作用を遮断することで、この相互作用によって媒介される疾患を潜在的に治療または予防することができる。あるいは、VLA-4に結合する化合物は、疾患の治療または予防のために薬物、核酸または他の治療用化合物をVLA-4発現組織またはVLA-4発現細胞に送達する送達用製剤において使用され得る。
【０００３】
RNA干渉は周知のプロセスであり、このプロセスでは、メッセンジャーRNA(mRNA)のタンパク質への翻訳が、低分子干渉RNA(siRNA)、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)またはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの相補的もしくは部分相補的オリゴヌクレオチドとの会合または結合によって干渉される。siRNAは、通常は長さが19〜25ヌクレオチドの範囲である二本鎖RNA分子であり、RISC(RNA誘導サイレンシング複合体)として知られる細胞質中の一組のタンパク質と会合する。RISCが最終的に二本鎖siRNAを分離することで、1本の鎖がmRNA分子の相補的もしくは部分相補的部分と結合または会合し、その後mRNAはRISCによって破壊されるかまたは翻訳を妨げられ、結果的に、コードされたタンパク質または遺伝子産物の発現が抑制される。
【０００４】
治療用途で(特にヒトにおける全身投与に)siRNAなどの核酸を使用する上での問題の1つは、(1) 特定の標的細胞または標的細胞型、および(2) それらの細胞の細胞質(すなわち、mRNAが存在しかつタンパク質に翻訳される場所)に核酸を送達することにあった。送達上の問題の一部は、核酸が負に帯電しており、容易に分解され(特に無修飾の場合)、腎臓によって効率的に濾過され、それ自体では細胞の細胞質に容易に輸送することができないという事実に基づく。したがって、著しい量の研究が、リポソーム、ミセル、ペプチド、ポリマー、結合体およびアプタマーを含む様々な担体および製剤に関する送達上の問題を解決することに重点を置いた。Ling et al, Advances in Systemic siRNA Delivery, Drugs Future 34(9): 721 (September 2009)（非特許文献1）を参照。一部の比較的有望な送達媒体は、脂質ナノ粒子を含む脂質系の使用を包含している。Wu et al., Lipidic Systems for In Vivo siRNA Delivery, AAPS J. 11(4): 639-652 (December 2009)（非特許文献2）；Hopeらによる国際特許出願公開第WO 2010/042877号（特許文献1）(「Improved Amino Lipids And Methods For the Delivery of Nucleic Acids」)を参照。しかし、特定の標的細胞およびそのような細胞の細胞質へのsiRNA、ならびに小分子、ペプチド、他の核酸、蛍光部分およびポリマーなどの他の物質の標的化について、さらなる改善が依然として必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際特許出願公開第WO 2010/042877号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ling et al, Advances in Systemic siRNA Delivery, Drugs Future 34(9): 721 (September 2009)
【非特許文献２】Wu et al., Lipidic Systems for In Vivo siRNA Delivery, AAPS J. 11(4): 639-652 (December 2009)
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、式I：
2015511937.tif 000003
の化合物であって、式中、R1、R2およびnは詳細な説明および特許請求の範囲に定義されている、化合物に関する。特に、本発明は、様々な治療用途および他の用途のための、小分子、ペプチド、核酸、蛍光部分およびポリマーなどの結合体化された部分の、インテグリンα4β1(最晩期抗原4)二量体を発現する標的細胞への改善された送達のための、式Iの化合物に関する。本発明はまた、そのような化合物を製造および使用する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ヒストグラフを示す(「B」: 二本鎖-27 500nMおよび例140 10μM；「A」: 二本鎖-27)。
【図２】代表的siRNA取り込み画像(二本鎖-27(500nM))を示す。
【図３】例FITC-5(LFA-1アンタゴニスト標識FITC)を10μMで有する、FITCが結合体化されたJurkat細胞の画像を示す。
【図４】例FITC-14(VLA-4アンタゴニスト標識FITC)を10μMで有する、FITCが結合体化されたJurkat細胞の画像を示す。ヒストグラフは、VLA-4標的化要素を伴うsiRNA二本鎖の存在の変化を示す。VLA-4アンタゴニスト例140の存在下では、この変化は扁平状である。
【図５】5'-センス鎖においてインテグリン標的化小分子によって誘導体化されたsiRNA二本鎖で処理された際のH1299細胞におけるAHA1発現の減少を示す。y軸はAHA1の実測発現レベルを示す。比較的低い棒は比較的高度のノックダウン(比較的高度のsiRNAトランスフェクション)を示し、高い棒は比較的低度のノックダウン(すなわち比較的低度のsiRNAトランスフェクション)を示す。青色の二本鎖はセンス鎖の5'-末端における標的化修飾を有し、桃色の二本鎖はセンス鎖の5'-末端における標的化修飾、およびアンチセンス鎖の5'-末端に結合したNu547フルオロフォアを有する。
【図６】細胞の健康状態のマーカーであるGAPDH mRNA発現のレベルを示す。誘導体化siRNAで処理された細胞とモック細胞および未処理細胞とで発現レベルが類似していることは、当該処理の濃度および期間で細胞毒性が存在しないことを示している。
【図７】表1は、特定の5'-誘導体化siRNA一本鎖および二本鎖の組成を示す。
【図８】表2は、小分子siRNA結合体の分析データを示す。
【図９】表3は、アンチセンス鎖の5'がNu547で誘導体化されたsiRNA配列を示す。
【図１０】表4は、インテグリンアンタゴニストアッセイにおける小分子-siRNA結合体の効力、およびsiRNAのKDデータを示す。
【図１１】表5は、FITC異性体標識試薬の同一性、特徴づけおよび結合能を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
別途指定がない限り、明細書および特許請求の範囲において使用される以下の特定の用語および語句は以下のように定義される。
【００１０】
「部分」という用語は、1つもしくは複数の化学結合によって別の原子または分子に結合することで分子の一部を形成する、原子または化学結合した原子の群を意味する。例えば、式Iの可変要素R1およびR2は、式Iに示す構造に対して、示された位置で共有結合によって結合している、部分を意味する。
【００１１】
「結合体化された部分」という用語は、治療用のまたは有用な化合物、ペプチド、ポリマー、小分子、蛍光部分、オリゴヌクレオチドまたは核酸である、部分を意味する。例としては、薬物、治療用ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNAおよびフルオレセインイソチオシアネート(FITC)が挙げられる。
【００１２】
別途指定がない限り、「水素」または「ヒドロ」という用語は水素原子部分(-H)を意味し、H2を意味しない。
【００１３】
「ハロゲン」という用語はフッ素部分、塩素部分、臭素部分またはヨウ素部分を意味する。
【００１４】
「アルキル」という用語は、1〜25個の炭素原子を有する脂肪族直鎖または分岐鎖飽和炭化水素部分を意味する。
【００１５】
「TFA」という用語はトリフルオロ酢酸を意味する。
【００１６】
別途指定がない限り、「下記式の化合物(a compound of the formula)」または「下記式の化合物(a compound of formula)」または「下記式の化合物(compounds of the formula)」または「下記式の化合物(compounds of formula)」という用語は、その式によって定義される化合物の部類より選択される任意の化合物(別途記載がなければそのような任意の化合物の薬学的に許容される任意の塩またはエステルを含む)を意味する。
【００１７】
「薬学的に許容される塩」という用語は、遊離塩基または遊離酸の生物学的な有効性および特性を保持し、生物学的にまたは他の理由で望ましくないということがない塩を意味する。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、好ましくは塩酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、サリチル酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、N-アセチルシステインなどの有機酸によって形成することができる。さらに、塩は、無機塩基または有機塩基を遊離酸に加えることで調製することができる。無機塩基から誘導される塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩などが挙げられるが、それらに限定されない。有機塩基から誘導される塩としては、一級、二級および三級アミン、天然置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニン、N-エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂など）の塩が挙げられるが、それらに限定されない。置換パターンに応じて、本発明の化合物は双性イオンとして存在してもよい。
【００１８】
本発明の化合物は薬学的に許容される塩の形態で存在し得る。本発明の化合物は薬学的に許容されるエステル(すなわち、プロドラッグとして使用される式Iの酸のメチルおよびエチルエステル)の形態で存在してもよい。本発明の化合物は溶媒和、すなわち水和していてもよい。溶媒和は製造プロセスの途中で行われてもよく、例えば当初は無水である式Iの化合物の吸湿性の結果(水和)として行われてもよい。
【００１９】
同一の分子式を有するが原子の性質もしくは結合順序または原子の空間配置が異なる化合物を「異性体」と呼ぶ。原子の空間配置が異なる異性体を「立体異性体」と呼ぶ。ジアステレオマーとは、鏡像異性体ではない、1つまたは複数のキラル中心において相対する立体配置を有する立体異性体のことである。重ね合わせられない互いの鏡像である、1つまたは複数の不斉中心を有する立体異性体を「鏡像異性体」と呼ぶ。ある化合物が不斉中心を1つ有する場合、例えば炭素原子が4つの異なる基に結合している場合、一対の鏡像異性体が可能である。鏡像異性体は、不斉中心の絶対配置によって特徴づけることができ、Cahn、IngoldおよびPrelogのR-およびS-順位則によって、または分子が偏光面を回転させる様式によって記述され、右旋性または左旋性(すなわちそれぞれ(+)または(-)-異性体)と命名される。キラル化合物は個々の鏡像異性体またはその混合物として存在し得る。等しい割合の鏡像異性体を含有する混合物を「ラセミ混合物」と呼ぶ。
【００２０】
「治療有効量」という用語は、疾患の症状を予防し、緩和しもしくは寛解させるか、または治療される対象の生存を延長するために有効な化合物の量を意味する。治療有効量の決定は当技術分野における技能の範囲内である。本発明の化合物の治療上有効な量または投薬量は、広い範囲内で変動し得るし、当技術分野において公知の様式で決定することができる。そのような投薬量は、投与される特定の化合物、投与経路、治療される状態および治療される患者を含む、特定の各症例における個々の要件に対して調整される。1日の投薬量は、単一用量または分割用量で投与してもよく、非経口投与では持続注入として投与してもよい。
【００２１】
「薬学的に許容される担体」という用語は、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに薬学的投与に適合性のある他の材料および化合物を含む、薬学的投与に適合性のあるあらゆる材料を含むように意図される。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の組成物におけるその使用が企図される。補足的な活性化合物も本組成物に組み入れることができる。
【００２２】
詳しくは、本発明は、式I：
2015511937.tif 000004
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は、
(1) 式：
2015511937.tif 000005
の化合物（式中、mは0〜3であり、かつGは、
2015511937.tif 000006
からなる群より選択される）；
(2) 式：
2015511937.tif 000007
の化合物（式中、mは0〜3であり、R4およびR5は独立して水素またはハロゲンであり、WはOまたはCH2であり、かつGは、
2015511937.tif 000008
からなる群より選択される）；ならびに
(3) 式：
2015511937.tif 000009
の化合物
からなる群より選択され、
R2は、
(1) 式：
2015511937.tif 000010
の化合物；
(2) 式：
2015511937.tif 000011
の化合物；
(3) 式：
2015511937.tif 000012
の化合物；および
(4) 式：
2015511937.tif 000013
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015511937.tif 000014
の化合物のいずれかを表す）
からなる群より選択される、
前記式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルに関する。
【００２３】
上記構造中で使用されている
2015511937.tif 000015
という記号は、構造または部分が共有結合によってベース分子（base molecule）に結合する場所を示すために使用される。さらに、上記の記号との組み合わせで使用される「PEGへ」もしくは「Sへ」という語句または同様の文言は、複数の結合点が存在する場合に構造または部分がベース分子に結合する場所または方法を示す。例えば、R2が式：
2015511937.tif 000016
（式中、Xは式：
2015511937.tif 000017
の化合物である）の化合物である場合、
式Iに基づく構造は、式：
2015511937.tif 000018
（式中、R1、R3およびnは式Iに定義の通りである）である。
【００２４】
本発明はまた、式Iの化合物、およびそのような化合物を含有する薬学的組成物を製造および使用する方法に関する。式Iの化合物は、VLA-4受容体を発現する標的細胞への小分子、タンパク質、核酸、ポリマー、蛍光マーカーおよび他の物質の送達を改善する上で有用である。特定の態様では、本発明は、RNA干渉を通じて特定の標的タンパク質の発現を阻害するために、VLA-4受容体を発現する標的細胞の細胞質にsiRNAを送達する上で有用である、式Iの化合物を含有する組成物および製剤に関する。
【００２５】
より特定の態様では、本発明は、VLA-4受容体を発現する腫瘍細胞および他の細胞型へのsiRNAなどの核酸の送達を促進する製剤のための、式Iの化合物の使用に関する。さらに、炎症、およびがんのような増殖性障害を治療する送達用製剤を合成するための式Iの化合物の使用が、本発明の一部である。
【００２６】
R1は、式Iの化合物をVLA-4インテグリン受容体複合体に標的化することで、そのような受容体を発現する細胞への該化合物の送達を促進する、小分子インテグリンアンタゴニストを表す。
【００２７】
特定の態様では、R1の小分子インテグリンアンタゴニスト標的化部分は、インテグリン受容体に対する小分子の結合親和性が遊離小分子インテグリンアンタゴニストに比べて実質的に減少しない位置で結合する。式IのR1部分はVLA-4(インテグリンα4β1または最晩期抗原4)二量体を標的化する。
【００２８】
特定の態様では、R1は、式：
2015511937.tif 000019
（式中、mは0〜3である）のVLA-4標的化部分、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルである。
【００２９】
他の特定の態様では、R1は、式：
2015511937.tif 000020
（式中、mは0〜3である）のVLA-4標的化部分、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルである。
【００３０】
他の特定の態様では、R1は、式：
2015511937.tif 000021
（式中、mは0〜3である）のVLA-4標的化部分、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルである。
【００３１】
他の特定の態様では、R1は、式：
2015511937.tif 000022
（式中、mは0〜3である）のVLA-4標的化部分、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルである。
【００３２】
他の態様では、R1は、式：
2015511937.tif 000023
（式中、mは0〜3であり、R4およびR5は水素またはハロゲンであり、WはOまたはCH2である）のVLA-4標的化部分、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルである。
【００３３】
他の特定の態様では、R1は、式：
2015511937.tif 000024
（式中、mは0〜3であり、R4およびR5は水素またはハロゲンであり、WはOまたはCH2である）のVLA-4標的化部分、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルである。
【００３４】
他の特定の態様では、R1は、式：
2015511937.tif 000025
（式中、mは0〜3であり、R4およびR5は水素またはハロゲンであり、WはOまたはCH2である）のVLA-4標的化部分、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルである。
【００３５】
他の特定の態様では、R1は、式：
2015511937.tif 000026
（式中、mは0〜3であり、R4およびR5は水素またはハロゲンであり、WはOまたはCH2である）のVLA-4標的化部分、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルである。
【００３６】
他の特定の態様では、R1は、式：
2015511937.tif 000027
のVLA-4標的化部分、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルである。
【００３７】
R2は、チオール含有分子などの強力な求核剤を有する、治療用のまたは他の有用な化合物または結合体化される部分との共有結合を形成可能な、反応性部分を表し得る。そのような反応性部分の例としては、
2015511937.tif 000028
からなる群より選択される部分が挙げられる。
【００３８】
あるいは、R2は、治療用のまたは他の有用な化合物、タンパク質またはオリゴヌクレオチドなどの結合体化された部分(R3)に既に結合した部分を表し得る。より具体的には、R2は、式：
2015511937.tif 000029
部分を表し得、
式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015511937.tif 000030
の化合物のいずれかを表す。
【００３９】
特定の態様では、R3はオリゴヌクレオチドを表す。より特定の態様では、R3は、一本鎖または二本鎖で存在し得るRNA分子、例えばsiRNA分子のセンス鎖の5'-末端を表す。RNAi剤としても知られるそのようなsiRNA分子は、細胞中の標的遺伝子の発現を阻害する。特定の態様では、R3は、長さが15〜30ヌクレオチドのオリゴリボヌクレオチド鎖から本質的になるsiRNA分子であり、センスオリゴリボヌクレオチド鎖の5'-末端は、上記構造に示すようにR2に結合しており、標的遺伝子に対応するmRNAの少なくとも一部に相補的である。他の態様では、R3は、5'-末端において結合したDNAのオリゴヌクレオチドである。そのような誘導体化DNAは、一本鎖として、または別のオリゴヌクレオチドの相補鎖とハイブリダイズした1本の鎖として存在し得る。オリゴヌクレオチド鎖は無修飾でもよく、代謝安定性のために修飾されていてもよい。そのような修飾としては、ホスフェート上の特定位置における置換(例えばホスホロチオエート)ならびに2'-ヒドロキシ上の特定位置における置換(例えば2'-O-メチルおよび2'-フルオロ)が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４０】
特定の態様では、式IのR2は-X-S-CH2-R3を表し、式中、R3は、（式Iをベースとする）式5：
2015511937.tif 000031
（式中、R1、nおよびXは式Iに定義の通りである）中に示すRNAのセンス鎖を含む。
【００４１】
他の特定の態様では、センス鎖はアンチセンス鎖に結合し得る。
【００４２】
他の特定の態様では、R2は-X-S-CH2-R3（式中、R3は小分子またはタンパク質を表す）を表し、それによって、共有結合により連結された、式Iの特異的標的化実体が形成される。
【００４３】
より特定の態様では、R2は-X-S-CH2-R3を表し、式中、R3は治療用の小分子またはタンパク質を表す。
【００４４】
他の特定の態様では、R2は-X-S-CH2-R3を表し、式中、R3は、細胞顕微鏡観察技術を使用するこれらのインテグリン受容体結合の可視化に有用な蛍光部分を表す。
【００４５】
他の特定の態様では、R2は-X-S-CH2-R3を表し、式中、R3は、一級反応性スルフィドを有するポリマーを表す。より具体的には、R3は、細胞表面および細胞の細胞質ドメインに対するsiRNAの複合体形成および送達に有用なカチオン性ポリマーを表し得る。
【００４６】
より特定の態様では、本発明は、R3が、
2015511937.tif 000032
に示すフルオレセインイソチオシアネート(FITC)の構造異性体の1つである、式Iの化合物に関する。
【００４７】
より特定の他の態様では、本発明は、R3が、
2015511937.tif 000033
に示すFITC-14の構造異性体の1つである、式Iの化合物に関する。
【００４８】
他の態様では、本発明は、nが9〜13、好ましくは12である、式Iの化合物に関する。
【００４９】
より特定の態様では、本発明は、以下の化合物（またはその薬学的に許容される塩もしくはエステル）のうちの1つからなる群より選択される式Iの化合物に関する：
VLA-4リガンド試薬1
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]プロピオン酸；
VLA-4リガンド試薬2
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンチル]カルボニル]アミノ]プロピオン酸；
VLA-4リガンド試薬3
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]プロピオン酸；
VLA-4リガンド試薬4
(S)-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]-エチル]-シクロペンタンカルボニル]-アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸；
VLA-4リガンド試薬5
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[2,6-ジクロロ-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]ベンゾイルアミノ]プロピオン酸；
VLA-4リガンド試薬6
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[2,6-ジクロロ-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]ベンゾイルアミノ]プロピオン酸；
VLA-4リガンド試薬7
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[2,6-ジクロロ-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]ベンゾイルアミノ]プロピオン酸；
VLA-4リガンド試薬8
(S)-2-[[1-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]ブチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸；
VLA-4リガンド試薬9
(S)-2-[2,6-ジクロロ-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]ベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸；
VLA-4リガンド試薬10
(S)-2-[2,6-ジクロロ-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]ベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸；
VLA-4リガンド試薬11
(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ)メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩；
VLA-4リガンド試薬12
(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ)メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩；
VLA-4リガンド試薬13
(S)-2-[4-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-アセチルスルファニル-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸；および
VLA-4リガンド試薬14
(S)-2-[4-[[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニルエトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロピオニル]-[4-[(S)-1-カルボキシ-2-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]エチルカルバモイル]-3,5-ジフルオロベンジルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンジルアミノ]-3-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]プロピオン酸。
【００５０】
さらに、本発明は、α4β1複合体を発現する標的細胞の細胞質へのsiRNAなどの核酸の改善された送達をもたらす、siRNAと組み合わせた際にナノ粒子を創製するための、式Iの化合物を含有する新規組成物および製剤に関する。特定の態様では、本発明は、(1) R2が5'-siRNAオリゴヌクレオチドを含む、式Iの化合物と、(2) ポリカチオン性トランスフェクション剤とを含む、siRNA製剤に関する。
【００５１】
本発明はまた、そのような化合物および組成物を製造および使用する方法に関する。式Iの化合物は、α4β1複合体を発現する組織または細胞への薬物、核酸または他の治療用化合物の送達を改善する組成物または製剤の成分として有用である。特定の態様では、本発明は、RNA干渉を通じて特定のタンパク質の発現を阻害するために、α4β1複合体を発現する標的細胞の細胞質にsiRNAを送達する上で有用である、式Iの化合物を含有する製剤に関する。より特定の態様では、本発明は、がんまたは炎症性疾患の治療のための、α4β1二量体を発現する腫瘍細胞および他の細胞型にsiRNAを有効に送達可能な、式Iの化合物およびそのような化合物を含有する組成物に関する。そのような化合物および組成物は、式Iの化合物を欠く同様の製剤に比べて、より有効であるし、改善されたノックダウン能力を示す。
【００５２】
一態様では、式I：
2015511937.tif 000034
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は、
(1) 式：
2015511937.tif 000035
の化合物（式中、mは0〜3であり、かつGは、
2015511937.tif 000036
からなる群より選択される）；
(2) 式：
2015511937.tif 000037
の化合物（式中、mは0〜3であり、R4およびR5は独立して水素またはハロゲンであり、WはOまたはCH2であり、かつGは、
2015511937.tif 000038
からなる群より選択される）；ならびに
(3) 式：
2015511937.tif 000039
の化合物
からなる群より選択され、
R2は、
(1) 式：
2015511937.tif 000040
の化合物；
(2) 式：
2015511937.tif 000041
の化合物；
(3) 式：
2015511937.tif 000042
の化合物；および
(4) 式：
2015511937.tif 000043
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015511937.tif 000044
の化合物のいずれかを表す）
からなる群より選択される、
前記式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルが提供される。
【００５３】
一態様では、式I：
2015511937.tif 000045
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、R1は式：
2015511937.tif 000046
（式中、mは0〜3である）である、
前記式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルが提供される。
【００５４】
R2は、
(1) 式：
2015511937.tif 000047
の化合物；
(2) 式：
2015511937.tif 000048
の化合物；
(3) 式：
2015511937.tif 000049
の化合物；および
(4) 式：
2015511937.tif 000050
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015511937.tif 000051
の化合物のいずれかを表す）
からなる群より選択される。
【００５５】
一態様では、式I：
2015511937.tif 000052
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は式：
2015511937.tif 000053
（式中、mは0〜3である）の化合物である、
前記式Iの化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルが提供される。
【００５６】
R2は、
(1) 式：
2015511937.tif 000054
の化合物；
(2) 式：
2015511937.tif 000055
の化合物；
(3) 式：
2015511937.tif 000056
の化合物；および
(4) 式：
2015511937.tif 000057
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015511937.tif 000058
の化合物のいずれかを表す）
からなる群より選択される。
【００５７】
一態様では、式I：
2015511937.tif 000059
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は式：
2015511937.tif 000060
（式中、mは0〜3である）の化合物である、
前記式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルが提供される。
【００５８】
R2は、
(1) 式：
2015511937.tif 000061
の化合物；
(2) 式：
2015511937.tif 000062
の化合物；
(3) 式：
2015511937.tif 000063
の化合物；および
(4) 式：
2015511937.tif 000064
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015511937.tif 000065
の化合物のいずれかを表す）
からなる群より選択される。
【００５９】
一態様では、式I：
2015511937.tif 000066
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は式：
2015511937.tif 000067
（式中、mは0〜3である）の化合物である、
前記式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルが提供される。
【００６０】
R2は、
(1) 式：
2015511937.tif 000068
の化合物；
(2) 式：
2015511937.tif 000069
の化合物；
(3) 式：
2015511937.tif 000070
の化合物；および
(4) 式：
2015511937.tif 000071
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015511937.tif 000072
の化合物のいずれかを表す）
からなる群より選択される。
【００６１】
一態様では、式I：
2015511937.tif 000073
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は式：
2015511937.tif 000074
の化合物（式中、mは0〜3であり、R4およびR5は水素またはハロゲンであり、WはOまたはCH2である）である、
前記式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルが提供される。
【００６２】
R2は、
(1) 式：
2015511937.tif 000075
の化合物；
(2) 式：
2015511937.tif 000076
の化合物；
(3) 式：
2015511937.tif 000077
の化合物；および
(4) 式：
2015511937.tif 000078
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015511937.tif 000079
の化合物のいずれかを表す）
からなる群より選択される。
【００６３】
一態様では、式I：
2015511937.tif 000080
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は式：
2015511937.tif 000081
の化合物（式中、mは0〜3であり、R4およびR5は水素またはハロゲンであり、WはOまたはCH2である）である、
前記式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルが提供される。
【００６４】
R2は、
(1) 式：
2015511937.tif 000082
の化合物；
(2) 式：
2015511937.tif 000083
の化合物；
(3) 式：
2015511937.tif 000084
の化合物；および
(4) 式：
2015511937.tif 000085
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015511937.tif 000086
の化合物のいずれかを表す）
からなる群より選択される。
【００６５】
一態様では、式I：
2015511937.tif 000087
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は式：
2015511937.tif 000088
の化合物（式中、mは0〜3であり、R4およびR5は水素またはハロゲンであり、WはOまたはCH2である）である、
前記式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルが提供される。
【００６６】
R2は、
(1) 式：
2015511937.tif 000089
の化合物；
(2) 式：
2015511937.tif 000090
の化合物；
(3) 式：
2015511937.tif 000091
の化合物；および
(4) 式：
2015511937.tif 000092
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015511937.tif 000093
の化合物のいずれかを表す）
からなる群より選択される。
【００６７】
一態様では、式I：
2015511937.tif 000094
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は式：
2015511937.tif 000095
の化合物（式中、mは0〜3であり、R4およびR5は水素またはハロゲンであり、WはOまたはCH2である）である、
前記式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルが提供される。
【００６８】
R2は、
(1) 式：
2015511937.tif 000096
の化合物；
(2) 式：
2015511937.tif 000097
の化合物；
(3) 式：
2015511937.tif 000098
の化合物；および
(4) 式：
2015511937.tif 000099
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015511937.tif 000100
の化合物のいずれかを表す）
からなる群より選択される。
【００６９】
一態様では、式I：
2015511937.tif 000101
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は式：
2015511937.tif 000102
の化合物である、
前記式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルが提供される。
【００７０】
R2は、
(1) 式：
2015511937.tif 000103
の化合物；
(2) 式：
2015511937.tif 000104
の化合物；
(3) 式：
2015511937.tif 000105
の化合物；および
(4) 式：
2015511937.tif 000106
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015511937.tif 000107
の化合物のいずれかを表す）
からなる群より選択される。
【００７１】
一態様では、式I：
2015511937.tif 000108
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は、
(1) 式：
2015511937.tif 000109
の化合物（式中、mは0〜3であり、かつGは、
2015511937.tif 000110
からなる群より選択される）；
(2) 式：
2015511937.tif 000111
の化合物（式中、mは0〜3であり、R4およびR5は独立して水素またはハロゲンであり、WはOまたはCH2であり、かつGは、
2015511937.tif 000112
からなる群より選択される）；ならびに
(3) 式：
2015511937.tif 000113
の化合物
からなる群より選択され、
R2は、式：
2015511937.tif 000114
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015511937.tif 000115
の化合物のいずれかを表す）である、
前記式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルが提供される。
【００７２】
一態様では、式I：
2015511937.tif 000116
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は、
(1) 式：
2015511937.tif 000117
の化合物（式中、mは0〜3であり、かつGは、
2015511937.tif 000118
からなる群より選択される）；
(2) 式：
2015511937.tif 000119
の化合物（式中、mは0〜3であり、R4およびR5は独立して水素またはハロゲンであり、WはOまたはCH2であり、かつGは、
2015511937.tif 000120
からなる群より選択される）；ならびに
(3) 式：
2015511937.tif 000121
の化合物
からなる群より選択され、
R2は、式：
2015511937.tif 000122
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015511937.tif 000123
の化合物のいずれかを表す）である、
前記式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルが提供される。
【００７３】
一態様では、式I：
2015511937.tif 000124
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は、
(1) 式：
2015511937.tif 000125
の化合物（式中、mは0〜3であり、かつGは、
2015511937.tif 000126
からなる群より選択される）；
(2) 式：
2015511937.tif 000127
の化合物（式中、mは0〜3であり、R4およびR5は独立して水素またはハロゲンであり、WはOまたはCH2であり、かつGは、
2015511937.tif 000128
からなる群より選択される）；ならびに
(3) 式：
2015511937.tif 000129
の化合物
からなる群より選択され、
R2は、式：
2015511937.tif 000130
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015511937.tif 000131
の化合物である）である、
前記式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルが提供される。
【００７４】
一態様では、式I：
2015511937.tif 000132
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は、
(1) 式：
2015511937.tif 000133
の化合物（式中、mは0〜3であり、かつGは、
2015511937.tif 000134
からなる群より選択される）；
(2) 式：
2015511937.tif 000135
の化合物（式中、mは0〜3であり、R4およびR5は独立して水素またはハロゲンであり、WはOまたはCH2であり、かつGは、
2015511937.tif 000136
からなる群より選択される）；ならびに
(3) 式：
2015511937.tif 000137
の化合物
からなる群より選択され、
R2は式：
2015511937.tif 000138
の化合物（式中、R3は一本鎖もしくは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、かつXは硫黄または式：
2015511937.tif 000139
の化合物のいずれかを表す）である、
前記式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルが提供される。
【００７５】
一態様では、式I：
2015511937.tif 000140
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は、
(1) 式：
2015511937.tif 000141
の化合物（式中、mは0〜3であり、かつGは、
2015511937.tif 000142
からなる群より選択される）；
(2) 式：
2015511937.tif 000143
の化合物（式中、mは0〜3であり、R4およびR5は独立して水素またはハロゲンであり、WはOまたはCH2であり、かつGは、
2015511937.tif 000144
からなる群より選択される）；ならびに
(3) 式：
2015511937.tif 000145
の化合物
からなる群より選択され、
R2は、
(1) 式：
2015511937.tif 000146
の化合物；
(2) 式：
2015511937.tif 000147
の化合物；
(3) 式：
2015511937.tif 000148
の化合物；および
(4) 式：
2015511937.tif 000149
の化合物（式中、R3はsiRNA分子である）
からなる群より選択される、
前記式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルが提供される。
【００７６】
本発明の化合物の一般的合成
式Iの化合物を合成するための好適な方法を実施例に示す。一般に、式Iの化合物は、以下に示すスキームに従って調製することができる。別途指定がない限り、以下のスキーム中の変数nならびにR1およびR2は、式Iの部類に関する以前の定義と同様に定義される。
【００７７】
マレイミド-(PEG)n-インテグリンアンタゴニスト結合剤の一般的合成
様々な長さのPEGのスキーム1の26などの化合物は市販されている(例えばPierce BioScienceから)。そのような化合物は、PEGアミノ酸のアミノ末端をアミド結合形成条件下で3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオン酸によってアシル化した後、エステル形成条件下でのN-ヒドロキシコハク酸との反応によって反応性N-ヒドロキシコハク酸エステルを形成することで作製することもできる。スキーム1に示すように、化合物26と27などの一級または二級アミンを含有する化合物との反応を、非プロトン性またはプロトン性溶媒中、DIEA(ジイソプロピルエチルアミン)などの塩基性アミンの存在下、室温で行うことで、PEG化中間体28を生成させる。
2015511937.tif 000150
【００７８】
R4がチオアセチルまたは2-ジチオピリジルであって、様々な長さのPEG部分を有する、スキーム2の29などの化合物も市販されている(例えばPierce BioScienceから)。構造29を有する化合物と27などの一級または二級アミンを含有する化合物との反応を、非プロトン性またはプロトン性溶媒中、DIEA(ジイソプロピルエチルアミン)などの塩基性アミンの存在下、室温で行うことで、PEG化中間体30を生成させる。
2015511937.tif 000151
【００７９】
本発明の特定の非限定的な例として、スキーム3に示すように、中間体26と31とを反応させることでマレイミド中間体32を生成する。
2015511937.tif 000152
【００８０】
同様に、スキーム4に示すように、中間体26と33とを反応させることでマレイミド中間体34を生成することができる。
2015511937.tif 000153
【００８１】
同様に、スキーム5に示すように、中間体29と35とを反応させることで中間体36を生成することができ、R4はチオアセチルまたは2-ジチオピリジルを表す。
2015511937.tif 000154
【００８２】
同様に、スキーム6に示すように、中間体29と37とを反応させることで中間体38を生成することができ、R4はチオアセチルまたは2-ジチオピリジルを表す。
2015511937.tif 000155
【００８３】
一般構造26または29の化合物では、異なるPEGの長さが利用であるかまたは当業者によって容易に作製され、好ましくはn = 8〜24である。このトピックは徹底的に報告および考察されてきた(例えばChemistry for peptide and protein PEGylation, Advanced Drug Delivery Reviews Volume 54, Issue 4, 17 June 2002, Pages 459-476)。
【００８４】
スキーム7に示すように、中間体31は既報(例えばSidduri, A. et al. Bioorganic &amp；Medicinal Chemistry Letters, 2002, 12, 2475-2478)と同様に合成することができる。
2015511937.tif 000156
【００８５】
具体的には、スキーム7に示すように、中間体41を市販の(S)-3-[4-ニトロフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸40から作り出した。メタノール溶液中の市販の出発原料40のニトロ基を塩化アンモニウムの存在下、亜鉛末によって室温で数時間かけて還元してアニリン41を得た。ニトロ還元の他の方法は当業者に公知である。アニリン41をジクロロメタンなどの非プロトン性溶媒中、ジ-イソプロピル-エチルアミンなどの塩基の存在下、室温で、塩化2,6-ジクロロベンゾイル42などのハロゲン化ベンゾイル誘導体によってアシル化した。こうしてアミド43を形成した。t-ブチルカルボニル(Boc)アミン保護基を、当業者に公知の標準的方法に従って、例えば室温でのジオキサン中HCl溶液による処理によって除去し、これにより塩酸塩44を得た。塩酸塩44を公知の1-(2-アジド-エチル)-シクロペンタンカルボン酸45の存在下、アミド結合形成条件(やはり当業者に周知)で処理することで、ジ-アミド46を生成した。中間体46のアジド基をテトラヒドロフランなどの非プロトン性溶媒中、室温でのトリ-アルキルホスフィンによる処理によって還元した。さらに、メチルエステルをエタノールおよびテトラヒドロフランなどの溶媒混合物中、50℃などの高温で15時間の水酸化ナトリウムによる処理によって鹸化した。この方法によって、双性イオンとして提示されることもある中間体31を形成した。
【００８６】
PEG部分の結合は、スキーム8に示すように合成される中間体39によっても可能である。具体的には、3,5-ジクロロフェノール47をDMFなどの極性非プロトン性溶媒中、イミダゾールなどの塩基の存在下で塩化トリ-イソプロピルシリルによって保護した後、無水テトラヒドロフラン中、-78℃などの低温でブチルリチウムなどの強塩基と反応させる。得られたリチウム錯体を、ドライアイスの形態で加えられる二酸化炭素で反応停止させることで、安息香酸誘導体である中間体48を得る。次に中間体48をトルエンなどの非プロトン性溶媒中での塩化スルホニル(SOCl2)による処理によって塩素化することで塩化アシルを形成する。この時点で、塩化アシルとアミン塩酸塩49とをジクロロメタン(DCM)などの非プロトン性溶媒中、ジ-イソプロピルエチルアミン(DIPEA)などの塩基の存在下で反応させることで中間体50を形成する。中間体50のシリル保護基をテトラヒドロフランなどのプロトン性溶媒中、室温でのフッ化テトラブチルアンモニウム(TBAF)による処理によって除去する。このフェノール中間体と3-N-t-ブチル-カーボネート-1-ブロモプロパンとをジメチルホルムアミド(DMF)などの非プロトン性溶媒中、炭酸カリウム(K2CO3)などの塩基の存在下で反応させる。こうして中間体52を形成し、これをトリフルオロ酢酸(TFA)で脱保護し、続いてエタノールなどのプロトン性溶媒中で水酸化ナトリウムなどの塩基によって加水分解することで中間体39を形成する。
2015511937.tif 000157
【００８７】
VLA-4アンタゴニスト誘導体化剤の合成
式：
2015511937.tif 000158
（式中、
2015511937.tif 000159
）の化合物の合成は、スキーム9に従って効率的に達成することができる。
2015511937.tif 000160
【００８８】
スキーム9に示すように、2,6-ジクロロベンゾイル以外のGで表される環を中間体55に導入することができる。次に、中間体55を、スキーム7に示すのと同様の、および式Iの化合物を作製する途中のスキーム4によるカップリングの準備ができた標的分子を生成するための、引き続くカップリングに利用可能にする。上記スキーム9における中間体53の調製の詳細な合成方法は、米国特許第6,388,084 B1号および第6,380,387 B1号に公開されている。簡潔に言えば、アリールもしくはヘテロアリール亜鉛試薬を公知の中間体53または54からジメチルアセトアミド(DMA)などの無水溶媒中で形成する。この時点で、亜鉛試薬と市販の(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-(4-ヨード)フェニル]プロピオン酸エチルエステル55とをテトラヒドロフラン(THF)などの非プロトン性溶媒中、Pd(dba)2などのパラジウム触媒の存在下およびパラジウム配位子トリ-トルイルホスフィンの存在下、50℃で反応させる。こうして一般構造56の中間体を形成する。次に、スキーム7について論じたように、中間体56を4つの工程で中間体57に変換する。
【００８９】
スキーム10に示す合成方法に従って二量体VLA-4アンタゴニスト標的化モチーフを形成することも可能である。こうして、上記スキーム9に記載のものと同様の方法から生成可能な中間体58とHBTUなどのアミド形成試薬および塩基DIPEAとを、スキーム10に従って非プロトン性溶媒DMF中、4-ブロモ-2,6-ジフルオロ安息香酸52の存在下で反応させる。得られた中間体59をテトラヒドロフランなどの溶媒中、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)ホスフィンの存在下でジシアノ亜鉛によって処理することで、シアノ置換生成物である中間体60を形成する。n-プロパノール中、室温での水素ガスおよび触媒パラジウム炭素による水素化によって二級アミン中間体63を形成する。この時点で、ジ-プロピルエステルをジ-メチルエステルに変換した後、ジ-イソプロピルエチルアミドなどの塩基の存在下でN-Cbz-βアラニンの酸クロリドと反応させることで中間体64を形成する。スキーム10に示すように、この中間体を塩基水溶液で鹸化し、N-Cbz基を接触水素化分解によって除去することで二量体VLA-4アンタゴニストアミノ酸65を得る。
2015511937.tif 000161
【００９０】
有用性
式Iの化合物は、様々な治療用途および他の用途で、VLA-4インテグリン受容体複合体を発現する標的細胞に治療薬、小分子、ペプチド、核酸、蛍光部分およびポリマーなどの結合体化された部分を送達する上で有用である。したがって、式Iの化合物は、VLA-4の発現または過剰発現に関連する様々な疾患および状態を治療するために使用することができる。そのような疾患および状態としては炎症、がん、および代謝関連疾患を挙げることができる。
【００９１】
特定の態様では、本発明は、がんの治療または予防を、そのような治療を必要とする哺乳動物(好ましくはヒト)において行う方法であって、治療有効量の式Iの化合物を投与する段階を含む方法を含む。そのような組成物は優良医療規範(good medical practice)に一致する様式で投与することができる。この文脈で考慮される要因としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および開業医に公知の他の要因が挙げられる。投与すべき化合物の「有効量」は、疾患または状態を治療もしくは予防し(例えば標的タンパク質の発現を阻害し)かつ許容されない毒性を回避するために必要な最小量などの考慮事項によって左右される。例えば、そのような量は正常細胞、または哺乳動物全体に毒性のある量を下回ることができる。本発明の式Iの化合物を含有する組成物は非経口投与、腹腔内投与および肺内投与によって投与することができる。非経口注入としては筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与が挙げられる。
【実施例】
【００９２】
本発明は、以下の実施例を参照することでさらに完全に理解されよう。しかし、それらを本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【００９３】
試薬をAldrich、SigmaおよびPierce BioScience、または以下に示す他の供給業者から購入し、さらに精製せずに使用した。マルチミリグラム〜マルチグラムのスケールの精製を当業者に公知の方法、例えばシリカゲルフラッシュカラムの溶離により行った。また、いくつかの場合では、分取フラッシュカラム精製を、CombiFlashシステムで溶離される使い捨て予備充填マルチグラムシリカゲルカラム(RediSep)の使用により行った。また、Biotage(商標)およびISCO(商標)は、中間体の精製に本発明で使用可能なフラッシュカラム機器である。
【００９４】
化合物の同一性および純度を判定する目的で、以下のシステムを使用してLC/MS(液体クロマトグラフィー/質量分析)スペクトルを記録した。質量スペクトルの測定では、システムはMicromass Platform II分光計: ポジティブモードのESイオン化(質量範囲: 150〜1200amu)からなる。同時クロマトグラフィー分離を以下のHPLCシステムで実現した: ES Industries Chromegabond WR C-18 3u 120Å(3.2x30mm)カラムカートリッジ；移動相A: 水(0.02% TFA)および相B: アセトニトリル(0.02% TFA)；勾配10% B〜90% B、3分；平衡化時間1分；流量2mL/分。いくつかの場合では、分取HPLC中に20ミリモル濃度の酢酸アンモニウムを有効イオン化用調節剤として使用した。そのような場合ではアンモニウム塩を単離した。
【００９５】
いくつかの分離では、超臨界流体クロマトグラフィーの使用も有用であり得る。超臨界流体クロマトグラフィー分離は以下の典型的条件でMettler-Toledo Minigramシステムを使用して行った: 12mm ADカラムを超臨界流体CO2中40% MeOHによって100bar、30℃、2.0mL/分で溶離。塩基性アミノ基を有する分析物の場合、0.2%イソプロピルアミンをメタノール調節剤に加えた。
【００９６】
化合物を、Varian Inova 400 MHz NMR分光計またはVarian Mercury 300 MHz NMR分光計を使用する1H-NMR、およびBruker Apex-II高分解能4.7T FT-質量分析計を使用する高分解能質量分析によって特徴づけた。また、最終化合物を、Thermo Electronが販売するLTQ CL Orbitrapを使用する高分解能質量分析によって特徴づけた。
【００９７】
本明細書において使用される略語は以下の通りである。
AIBN         2,2'-アゾビスイソブチロニトリル
Bu           ブチル
DCE          1,2-ジクロロエタン
DCM          ジクロロメタン
DBU          1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン
DIAD         ジイソプロピルアゾジカルボキシレート
DIEA         ジエチルアミン
DIPEA        ジイソプロピルエチルアミン
DMF          N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO         ジメチルスルホキシド
EDC-HCl      1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
EtOAc        酢酸エチル
EtOH         エチルアルコール
FCC          フラッシュカラムクロマトグラフィー
h            時間
HBTU         O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム
ヘキサフルオロホスフェート
HOBt         ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC         高圧液体クロマトグラフィー
HRMS         高分解能質量スペクトル
LRMS         低分解能質量スペクトル
LC           液体クロマトグラフィー
L-Pro        L-プロリン
MCPBA        メタ-クロロ過安息香酸
MeOH         メチルアルコール
MW           マイクロ波
NIS          N-ヨードスクシンイミド
NBS          N-ブロモスクシンイミド
NMP          1-メチル-2-ピロリジノン
PdCl2(dppf)  [1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II)
PEGn         ポリエチレングリコールのn回繰り返し(例えばPEG2 = -OCH2CH2OCH2CH2-)
PG           保護基
PyBroP       ブロモ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
rt           室温
TBAF         フッ化テトラブチルアンモニウム
TBDMS        tert-ブチル-ジメチルシリル
TBTU         2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム
テトラフルオロボレート
TMS          トリメチルシリル
TEA          トリエチルアミン
TFA          トリフルオロ酢酸
THF          テトラヒドロフラン
TLC          薄層クロマトグラフィー
TPP          トリフェニルホスフィン
【００９８】
VLA-4を標的化する化合物の合成
実施例1
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]プロピオン酸;VLA-4リガンド試薬1：
2015511937.tif 000162
【００９９】
工程1：1-(2-ブロモエチル)シクロペンタンカルボン酸メチルエステルの調製
2015511937.tif 000163
ジイソプロピルアミン(56mL、396mmol)のTHF(85mL)溶液に、温度を0℃未満に維持しながらn-ブチルリチウム(240mL、393mmol、1.6M)のヘキサン溶液を-10℃で滴下した。添加後、溶液を0℃で30分間攪拌した。これに、内温を-60〜-70℃に維持しながらシクロペンタンカルボン酸メチルエステル(37.4g、263mmol)のTHF(50mL)溶液を-70℃で滴下した。添加後、反応混合物を-50〜-60℃で1時間攪拌した。次に1,2-ジブロモエタン(47mL、545mmol)のTHF(50mL)溶液を滴下し、明褐色懸濁液を-70〜-60℃で1時間攪拌した。次にそれを室温に昇温させ、終夜攪拌した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液(200mL)に注ぎ、有機化合物をエーテル(2 X 100mL)に抽出した。一緒にした抽出物を飽和塩化ナトリウム溶液(150mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥剤の濾過後、溶液を減圧濃縮し、得られた残渣を95〜105℃/2.5mmHgで蒸留して1-[2-ブロモエチル]シクロペンタンカルボン酸メチルエステル49.6g(収率80%)を無色油状物として得た。
【０１００】
工程2：1-[2-アジドエチル]シクロペンタンカルボン酸メチルエステルの調製
2015511937.tif 000164
1-[2-ブロモエチル]シクロペンタンカルボン酸メチルエステル(49.6g、211mmol)およびアジ化ナトリウム(54g、831mmol)のDMF(200mL)溶液を窒素雰囲気下50℃で5時間攪拌した。次に固体を濾過し、濾液をほぼ濃縮乾固させた。残渣を酢酸エチル(500mL)で希釈し、未溶解固体を濾取し、濾液を濃縮して粗1-(2-アジドエチル)シクロペンタンカルボン酸エチルを得て、これをヘキサン中5%酢酸エチルで溶離するシリカゲル250g上でのクロマトグラフィーで精製して1-[2-アジドエチル]シクロペンタンカルボン酸メチルエステル36.2g(収率87%)を明褐色油状物として得た。EI(+)-HRMS m/e C9H15N3O2の計算値(M-H)+ 196.1086、実測値196.1342。
【０１０１】
工程3：1-[2-アジドエチル]シクロペンタンカルボン酸の調製
2015511937.tif 000165
1-[2-アジドエチル]シクロペンタンカルボン酸メチルエステル(36.2g、184mmol)をTHF(500mL)およびメタノール(250mL)に溶解させ、LiOH一水和物(15.44g、368mmol)の水(300mL)溶液を加えた。得られた溶液を40℃で終夜攪拌し、濃縮した。残渣を、1N NaOH 40mLを含有する水1Lに溶解させ、ヘキサン(500mL)で洗浄した。水層を1N塩酸で酸性化し、有機化合物をエーテル(2x500mL)で抽出した。一緒にした抽出物を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、有機層を無水Na2SO4で乾燥させた。乾燥剤の濾過および濃縮によって1-[2-アジドエチル]シクロペンタンカルボン酸32.5g(収率96%)を琥珀色液体として得た。ES(+)-HRMS m/e C8H13N3O2の計算値(M+Na)+ 206.0900、実測値206.0900。
【０１０２】
工程4：(S)-3-[4-ニトロフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸メチルエステルの調製
2015511937.tif 000166
(S)-3-[4-ニトロフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸(70.2g、226.2mmol)および炭酸ナトリウム(95g、1.13モル)のDMF(500mL)懸濁液にヨウ化メチル(70.4mL、1.13モル)を室温で加えた。懸濁液を室温で15時間攪拌し、その時点で混合物のTLC分析は出発原料の非存在および過剰のヨウ化メチルを示し、一部のDMFを高真空除去した。次にそれを水(2L)に注ぎ、室温で攪拌したところ、析出物が72時間かけてゆっくりと形成された。析出固体を濾取し、水(2L)で洗浄した。風乾および減圧乾燥後、(S)-3-[4-ニトロフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸メチルエステル72g(収率98%)を明黄色固体(融点95〜96℃)として単離した。ES(+)-HRMS m/e C15H20N2O6の計算値(M+H)+ 325.1400、実測値325.1404。
【０１０３】
工程5：(S)-3-[4-アミノフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸メチルエステルの調製
2015511937.tif 000167
(S)-3-[4-ニトロフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸メチルエステル(72g、222mmol)、亜鉛末(約325メッシュ、145.2g、2.2モル、10当量)および塩化アンモニウム(178.1g、3.3モル、15当量)の混合物にメタノール(1L)および水(500mL)を室温で加えた。水の添加後、発熱反応が起こり、内温が45〜50℃に上昇した。懸濁液を室温で30分間〜1時間攪拌し、その時点で混合物のTLC分析は出発原料の非存在を示し、反応混合物をセライトパッドを通じて濾過し、フィルターケーキをメタノール(1L)および水(500mL)で洗浄した。濃縮により大部分のメタノールおよび一部の水を除去することで白色固体を得て、これを濾取し、水で洗浄した。風乾後、(S)-3-[4-アミノフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸メチルエステル65.5g(収率100%)を白色固体(融点86〜89℃)として単離した。ES(+)-HRMS m/e C15H22N2O4の計算値(M+H)+ 294.1621、実測値294.1614。
【０１０４】
工程6：(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステルの調製
2015511937.tif 000168
(S)-3-[4-アミノフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸メチルエステル(37.57g、127.6mmol)および塩化2,6-ジクロロベンゾイル(29.45g、140.6mmol)のジクロロメタン(350mL)溶液にDIPEA(24.8g、192mmol)を室温で加えた。褐色溶液を室温で15時間攪拌して白色懸濁液を得て、この時点で混合物のTLC分析は出発原料の非存在を示した。次に固体を濾取し、固体をジクロロメタン(150mL)で洗浄し、風乾させて(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステル52.75g(収率88.4%)を白色固体として得た: 融点192〜194℃。ES(+)-HRMS m/e C22H24Cl2N2O5の計算値(M+H)+ 466.1062、実測値466.1069。
【０１０５】
工程7：(S)-2-アミノ-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステル塩酸塩の調製
2015511937.tif 000169
ジオキサン(90mL)中の固体(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステル(43.45g、92.97mmol)をジオキサン中4.0N塩酸166mLによって室温で処理した。5分後、固体は溶解し、混合物を2時間攪拌した。次にジオキサンの一部を減圧除去して黄色シロップ状物を得て、エチルエーテル250mLを加えた。形成されたゴム状物をTHF(100mL)およびメタノール(100mL)に溶解させた。溶媒を減圧除去して(S)-2-アミノ-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステル塩酸塩43.7g(収率100%)を白色固体として得た: 融点180〜195℃。これをアルゴン雰囲気下で冷蔵庫に貯蔵した。ES(+)-HRMS m/e C17H16Cl2N2O3の計算値(M+H)+ 367.0616、実測値367.0611。
【０１０６】
工程8：(S)-2-[[1-(2-アジドエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステルの調製
2015511937.tif 000170
(S)-2-アミノ-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステル塩酸塩(10g、24.79mmol)および1-[2-アジドエチル]シクロペンタンカルボン酸メチルエステル(5.0g、27.29mmol)のDMF(100mL)溶液にHBTU(10.37g、27.33mmol)およびDIPEA(8.82g、68.3mmol)を室温で加えた。透明溶液を室温で48時間攪拌し、水(約200mL)を反応混合物に加えて生成物を析出させた。固体を濾取し、水(100mL)およびヘキサン(約100mL)で洗浄した。風乾後、生成物11.2gを明るいれんが状固体として得て、これを高温条件下でアセトニトリル(100mL)によって処理した。すべての不純物はアセトニトリルに溶解させ、固体を濾取してカップリング生成物8.24gを得た。アセトニトリル溶液を減圧除去し、残渣を酢酸エチルに溶解させ、生成物をヘキサンの添加によって析出させた。再度固体を濾取し、固体を風乾させて(S)-2-[[1-(2-アジドエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステルをさらに2.03g(全収率78%)、白色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C25H27Cl2N5O4の計算値(M+Na)+ 554.1332、実測値554.1334。
【０１０７】
工程9：(S)-2-[[1-(2-アジドエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸の調製
2015511937.tif 000171
(S)-2-[[1-(2-アジドエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステル(14.77g、27.7mmol)のTHF(200mL)およびエタノール(200mL)懸濁液に1.0N水酸化ナトリウム水溶液(150mL)を室温で加えた。混合物を室温で15時間攪拌し、その時点で混合物のTLC分析は出発原料の非存在を示した。次にそれを水(20mL)で希釈し、THFおよびエタノールを回転蒸発で除去し、水100mLで希釈し、エーテル(200mL)で抽出してあらゆる中性不純物を除去した。水層を1N HClで中和し、得られた白色固体を濾取し、水およびヘキサンで洗浄した。風乾後、(S)-2-[[1-(2-アジドエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸13.37g(収率93%)を白色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C24H25Cl2N5O4の計算値(M+Na)+ 540.1176、実測値540.1177。
【０１０８】
工程10：(S)-2-[[1-(2-アミノエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸；VLA-4リガンド-1の調製
2015511937.tif 000172
(S)-2-[[1-(2-アジドエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸(6.28g、12.11mmol)のTHF(91mL)溶液にトリメチルホスフィンのTHF溶液(48.5mL、48.46mmol、1.0M)を0℃で加えた。それは当初は透明溶液であり、30分後に何らかの析出物が形成され、この混合物を終夜攪拌し、その時点で混合物のTLC分析は出発原料の非存在を示した。次に水10当量(120mmol、2.16mL)を加え、混合物を室温で2時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をトルエンと2回共沸させてペースト状材料を得て、これをHPLCを使用して精製して(S)-2-[[1-(2-アミノエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸4.57g(収率77%)を非晶質白色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C24H27Cl2N3O4の計算値(M+H)+ 492.1452、実測値492.1451。
【０１０９】
工程11：(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]プロピオン酸;VLA-4リガンド試薬1の調製
2015511937.tif 000173
(S)-2-[[1-(2-アミノエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸(191.5mg、0.39mmol)および3-[2-[2-[2-[[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(200mg、0.39mmol)のDMSO(2mL)溶液に過剰のDIPEA(151mg、203uL、1.17mmol)を窒素雰囲気下、室温で加えた。得られた明黄色溶液を1時間攪拌し、その時点でLCMS分析は出発原料の非存在を示した。次に、過剰のDIPEAを減圧除去し、所望の生成物をHPLC法を使用する精製によって単離して(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]プロピオン酸90mg(収率26%)を白色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C42H53Cl2N5O12の計算値(M+H)+ 890.3141、実測値890.3140。
【０１１０】
実施例2
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンチル]カルボニル]アミノ]プロピオン酸;VLA-4リガンド試薬2の調製
2015511937.tif 000174
(S)-2-[[1-(2-アミノエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸(607mg、1.0mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(689mg、1.0mmol)およびDIPEA(388mg、522uL、3.0mmol)から出発して実施例1、工程11に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に明黄色固体(788mg、74%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C50H69Cl2N5O16の計算値(M+H)+ 1066.4189、実測値1066.4182。
【０１１１】
実施例3
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]プロピオン酸;VLA-4リガンド試薬3の調製
2015511937.tif 000175
(S)-2-[[1-(2-アミノエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸(100mg、0.2mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(176mg、0.2mmol)およびDIPEA(258mg、191uL、2.0mmol)から出発して実施例1、工程11に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に白色固体(28mg、11%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C58H85Cl2N5O20の計算値(M+H)+ 1242.5238、実測値1242.5248。
【０１１２】
実施例4
(S)-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]-エチル]-シクロペンタンカルボニル]-アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸;VLA-4リガンド試薬4の調製
2015511937.tif 000176
(S)-2-[[1-(2-アミノエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸(194mg、0.32mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(190mg、0.32mmol)およびDIPEA(124mg、167uL、0.96mmol)から出発して実施例1、工程11に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に黄色粘稠油状物(220mg、70%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C45H65Cl2N3O14Sの計算値(M+H)+ 974.3637、実測値974.3631。
【０１１３】
実施例5
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[2,6-ジクロロ-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]ベンゾイルアミノ]プロピオン酸;VLA-4リガンド試薬5
2015511937.tif 000177
【０１１４】
工程1：(3,5-ジクロロフェノキシ)-トリイソプロピルシランの調製
2015511937.tif 000178
3,5-ジクロロフェノール(16.3g、100mmol)、イミダゾール(14.98g、220mmol)およびトリイソプロピルクロロシラン(21.21g、110mmol)の混合物にDMF(200mL)を室温で加えた。得られた褐色溶液を15時間攪拌した後、水(500mL)で希釈した。有機化合物を酢酸エチル(2x100mL)に抽出し、一緒にした有機層をブライン溶液で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させた。濾過および濃縮によって粗残渣を得て、これをISCO(400g)カラムクロマトグラフィーを使用して精製して(3,5-ジクロロフェノキシ)-トリイソプロピルシラン31.1g(97%)を無色油状物として得た。EI(+)-HRMS m/e C15H24Cl2OSiの計算値(M)+ 318.0973、実測値318.0971。
【０１１５】
工程2：2,6-ジクロロ-4-トリイソプロピルシラニルオキシ-安息香酸の調製
2015511937.tif 000179
THF(110mL)溶液にn-ブチルリチウム(28mL、70mmol、2.5M)のヘキサン溶液、およびテトラメチルエチレンジアミン(8.42g、10.94mL、72.45mmol)を-78℃で加えた。得られた明黄色溶液をこの温度で30分間攪拌した後、(3,5-ジクロロフェノキシ)-トリイソプロピルシラン(15.97g、50mmol)のTHF(20mL)溶液を30分間滴下した。得られた明黄色溶液を3時間攪拌した後、二酸化炭素ガスを反応混合物に吹き込んだ。CO2の吹き込み中に反応混合物の色は10分以内に褐色から明黄色溶液に変化し、吹き込みを-75で1時間続けた後、30分でCO2の吹き込みを続けながら室温に昇温させた。次にそれを1N HClに注ぎ、有機化合物をジクロロメタン(2x150mL)に抽出した。一緒にした有機層をブライン溶液で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させた。濾過および濃縮によって粗残渣を得て、これをISCO(400g)カラムクロマトグラフィーを使用して精製して2,6-ジクロロ-4-トリイソプロピルシラニルオキシ-安息香酸7.02g(39%)を白色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C16H24Cl2O3Siの計算値(M+H)+ 363.0945、実測値363.0944。
【０１１６】
工程3：(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-(2,6-ジクロロ-4-トリイソプロピルシラニルオキシ-ベンゾイルアミノ)プロピオン酸メチルエステルの調製
2015511937.tif 000180
2,6-ジクロロ-4-トリイソプロピルシラニルオキシ-安息香酸(3.63g、10mmol)のトルエン(50mL)溶液に過剰の塩化チオニル(11.89g、7.2mL、100mmol)を室温で加えた。得られた無色溶液を還流温度に5時間加熱した後、室温に冷却し、溶媒および過剰の塩化チオニルを減圧除去した。得られた残渣をトルエンと1回共沸した。次に上記2,6-ジクロロ-4-トリイソプロピルシラニルオキシ-安息香酸クロリドをジクロロメタン(50mL)に溶解させ、固体(S)-2-アミノ-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステル塩酸塩(4.1g、10mmol)およびDIPEA(3.87g、5.26mL、30mmol)を室温で加えた。得られた溶液を室温で15時間攪拌し、水(約200mL)を反応混合物に加えた。次に有機化合物をジクロロメタン(2x150mL)に抽出した。一緒にした有機層をブライン溶液で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させた。濾過および濃縮によって粗残渣を得て、これをISCO(120g)カラムクロマトグラフィーを使用して精製して(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-(2,6-ジクロロ-4-トリイソプロピルシラニルオキシ-ベンゾイルアミノ)プロピオン酸メチルエステル6.48g(95%)を白色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C33H38Cl4N2O5Siの計算値(M+H)+ 711.1377、実測値711.1377。
【０１１７】
工程4：(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-(2,6-ジクロロ-4-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ)プロピオン酸メチルエステルの調製
2015511937.tif 000181
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-(2,6-ジクロロ-4-トリイソプロピルシラニルオキシ-ベンゾイルアミノ)プロピオン酸メチルエステル(6.76g、9.48mmol)のTHF(150mL)溶液にTBAF(14.22mL、14.22mmol、1M)のTHF溶液を0℃で加えた。得られた溶液を室温にゆっくりと昇温させ、15時間攪拌した。次に反応混合物を水で希釈し、有機化合物を酢酸エチル(2x150mL)に抽出した。一緒にした有機層をブライン溶液で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させた。濾過および濃縮によって粗残渣を得て、これを高温条件下で酢酸エチルに溶解させた後、ヘキサンで希釈した。得られた固体を濾取し、ヘキサンで洗浄した。風乾後、(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-(2,6-ジクロロ-4-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ)プロピオン酸メチルエステル5.23g(99%)を白色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C24H18Cl4N2O5の計算値(M-H)- 552.9897、実測値552.9897。
【０１１８】
工程5：(S)-2-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノプロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステルの調製
2015511937.tif 000182
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-(2,6-ジクロロ-4-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ)プロピオン酸メチルエステル(5.05g、9.07mmol)、3-tert-ブトキシカルボニルアミノプロピルブロミド(2.59g、10.89mmol)および炭酸カリウム(3.77g、27.29mmol)の混合物にDMF(66mL)およびアセトン(132mL)を室温で加えた。次に得られた懸濁液を還流温度に15時間加熱し、その時点でTLC分析は出発原料の非存在を示した。次に反応混合物を室温に冷却し、水で希釈し、有機化合物を酢酸エチル(2x150mL)に抽出した。一緒にした有機層をブライン溶液で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させた。濾過および濃縮によって粗残渣を得て、これをISCO(150g)カラムクロマトグラフィーで精製して(S)-2-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノプロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステル5.75g(89%)を白色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C32H33Cl4N3O7の計算値(M+Na)+ 734.0965、実測値734.0961。
【０１１９】
工程6：(S)-2-[4-(3-アミノプロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステルの調製
2015511937.tif 000183
(S)-2-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノプロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステル(7.5g、7.98mmol)のジクロロメタン(100mL)溶液に過剰のTFA(9.12g、5.9mL、80mmol)を室温で加えた。得られた溶液を15時間攪拌した。次に溶媒を減圧除去し、残渣をトルエンと1回共沸した。高真空乾燥後、(S)-2-[4-(3-アミノプロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステル5.8g(99%)を白色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C27H25Cl4N3O5の計算値(M+H)+ 612.0621、実測値612.0619。
【０１２０】
工程7：(S)-2-[4-(3-アミノプロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸；VLA-4リガンド2の調製
2015511937.tif 000184
(S)-2-[4-(3-アミノプロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステル(5.8g、7.98mmol)のTHF(200mL)溶液に水酸化リチウム(2.4g、100mmol)の水(30mL)溶液を室温で加えた。混合物を室温で15時間攪拌し、その時点で混合物のTLC分析は出発原料の非存在を示した。次に溶媒を回転蒸発で除去し、残渣をHPLC法で精製して(S)-2-[4-(3-アミノプロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸3.7g(収率65%)を白色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C26H23Cl4N3O5の計算値(M+H)+ 598.0465、実測値598.0465。
【０１２１】
工程8：(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[2,6-ジクロロ-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]ベンゾイルアミノ]プロピオン酸;VLA-4リガンド試薬5の調製
2015511937.tif 000185
(S)-2-[4-(3-アミノプロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸(214mg、0.3mmol)、3-[2-[2-[2-[[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(154mg、0.3mmol)およびDIPEA(388mg、522uL、3.0mmol)から出発して実施例1、工程11に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に白色固体(52mg、17%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C44H49Cl4N5O13の計算値(M+Na)+ 1018.1973、実測値1018.1965。
【０１２２】
実施例6
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[2,6-ジクロロ-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]ベンゾイルアミノ]プロピオン酸;VLA-4リガンド試薬6
2015511937.tif 000186
(S)-2-[4-(3-アミノプロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸(107mg、0.15mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(100mg、0.145mmol)およびDIPEA(194mg、261uL、1.5mmol)から出発して実施例1、工程11に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に白色固体(50mg、28%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C52H65Cl4N5O17の計算値(M+Na)+ 1194.3022、実測値1194.3028。
【０１２３】
実施例7
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[2,6-ジクロロ-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]ベンゾイルアミノ]プロピオン酸;VLA-4リガンド試薬7
2015511937.tif 000187
(S)-2-[4-(3-アミノプロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸(143mg、0.2mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(173mg、0.2mmol)およびDIPEA(258mg、348uL、2.0mmol)から出発して実施例1、工程11に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に白色固体(45mg、16.6%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C60H81Cl4N5O21の計算値(M+Na)+ 1370.4070、実測値1370.4066。
【０１２４】
実施例8
(S)-2-[[1-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]ブチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸;VLA-4リガンド試薬8
2015511937.tif 000188
【０１２５】
工程1：1-(4-ブロモブチル)シクロペンタンカルボン酸メチルエステルの調製
2015511937.tif 000189
ジイソプロピルアミン(21mL、150mmol)、n-ブチルリチウム(58mL、145mmol)、シクロペンタンカルボン酸メチルエステル(13.1g、100mmol)および1,4-ジブロモブタン(21.59g、100mmol)から出発して実施例1、工程1に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、蒸留後に無色油状物(12.8g、48%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C11H19BrO2の計算値(M+H)+ 262.0568、実測値262.0565。
【０１２６】
工程2：1-[4-アジドブチル]シクロペンタンカルボン酸メチルエステルの調製
2015511937.tif 000190
1-[4-ブロモブチル]シクロペンタンカルボン酸メチルエステルおよびアジ化ナトリウムから出発して実施例1、工程2に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製した。
【０１２７】
工程3：1-[4-アジドブチル]シクロペンタンカルボン酸の調製
2015511937.tif 000191
1-[4-アジドブチル]シクロペンタンカルボン酸メチルエステルおよび水酸化リチウムから出発して実施例1、工程3に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製した。
【０１２８】
工程4：(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸メチルエステルの調製
2015511937.tif 000192
亜鉛末(52.29g、800mmol)のTHF(26.0mL)懸濁液に1,2-ジブロモエタン(4.58mL、53.2mmol)を室温で加えた。エチレンガスの生成が停止する(ことが観察される)まで、この懸濁液をヒートガンで60〜65℃に加熱した。懸濁液を室温に冷却し、トリメチルクロロシラン(3.38mL、26.6mmol)を加え、混合物を15分間攪拌した。5-ヨード-1,3,6-トリメチルウラシル(74.6g、266mmol)のDMA(225mL)懸濁液を昇温させて透明溶液を得て、反応混合物に1回で加えた。添加後、混合物を70℃に加熱した。反応混合物の内温は発熱反応が理由で80〜85℃に上昇した。反応混合物を70℃で3〜4時間攪拌し、その時点で、飽和塩化アンモニウムで反応停止したアリコートのTLCは出発原料の非存在を示した。反応混合物をTHF(140mL)で希釈し、室温に冷却し、過剰の亜鉛末を2〜3時間かけて沈殿させた。
【０１２９】
Pd(dba)2(4.6g、8mmol)、トリ-o-トリルホスフィン[P(Tol)3](9.0g、29.6mmol)および(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-(4-ヨード)フェニル]プロピオン酸メチルエステル(75.56g、186mmol)のTHF(280mL)溶液に、亜鉛化合物(266mmol)を含有するこの溶液を室温で加え、明黄色混合物を50〜55℃で48時間攪拌した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム溶液に注ぎ、酢酸エチル(3x750mL)で抽出した。一緒にした抽出物をブライン溶液(1.5L)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥剤の濾過、および濃縮によって粗生成物を得て、これをBiotage(75m)カラムを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸メチルエステル57.88g(収率72%)を非晶質白色固体として得た。EI-HRMS m/e C22H29N3O6の計算値(M+) 431.2056、実測値431.2054。
【０１３０】
工程5：(S)-2-アミノ-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸メチルエステル塩酸塩の調製
2015511937.tif 000193
上記で得た固体(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸メチルエステル(7.4g、17.15mmol)の一部をジオキサン中4N塩酸(17mL、68mmol)によって室温で処理し、溶液を1時間攪拌したところ、白色析出物が形成された。混合物をジエチルエーテルで希釈し、上澄み液をデカントし、残渣を最初にロータリーエバポレーター上で乾燥させ、次に高真空乾燥させて(S)-2-アミノ-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸メチルエステル塩酸塩6.28g(収率99%)を非晶質黄色固体として得た。FAB-HRMS m/e C17H21N3O4の計算値(M+H) 332.1610、実測値332.1617。
【０１３１】
工程6：(S)-2-[[1-(4-アジドブチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステルの調製
2015511937.tif 000194
(S)-2-アミノ-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル(10.78g、30mmol)、1-[4-アジドブチル]シクロペンタンカルボン酸(8.24g、39mmol)、HBTU(14.79g、39mmol)およびDIPEA(11.63g、15.68mL、90mmol)から出発して実施例1、工程8に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、ISCOカラムクロマトグラフィー精製後に非晶質帯黄白色固体(14.1g、85%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C29H40N6O5の計算値(M+H)+ 553.3133、実測値553.3133。
【０１３２】
工程7：(S)-2-[[1-(4-アジドブチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸の調製
2015511937.tif 000195
(S)-2-[[1-(4-アジドブチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル(4.1g、7.42mmol)およびNaOH(35mL、35mmol、1M)から出発して実施例1、工程9に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、白色固体(3.75g、99%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C26H34N6O5の計算値(M+H)+ 511.2664、実測値511.2664。
【０１３３】
工程8：(S)-2-[[1-(4-アミノブチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸；VLA-4リガンド3の調製
2015511937.tif 000196
(S)-2-[[1-(4-アジドブチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸(1.02g、2mmol)およびトリメチルホスフィン(8mL、8mmol、1M)から出発して実施例1、工程10に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製して白色固体(0.96g、99%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C26H36N4O5の計算値(M+H)+ 485.2759、実測値485.2757。
【０１３４】
工程9：(S)-2-[[1-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]ブチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸;VLA-4リガンド試薬8の調製
2015511937.tif 000197
(S)-2-[[1-(4-アミノブチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸(300mg、0.62mmol)、3-[2-[2-[2-[[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(318mg、0.62mmol)およびDIPEA(160mg、215uL、1.24mmol)から出発して実施例1、工程11に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に明黄色固体(274mg、50%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C44H62N6O13の計算値(M+H)+ 883.4448、実測値883.4449。
【０１３５】
実施例9
(S)-2-[2,6-ジクロロ-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]ベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸;VLA-4リガンド試薬9
2015511937.tif 000198
【０１３６】
工程1：(S)-2-(2,6-ジクロロ-4-トリイソプロピルシラニルオキシ-ベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステルの調製
2015511937.tif 000199
(S)-2-アミノ-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル(3.95g、11mmol)、2,6-ジクロロ-4-トリイソプロピルシラニルオキシ-安息香酸(3.63g、10mmol)、HBTU(5.42g、14.3mmol)およびDIPEA(4.26g、5.75mL、33.0mmol)から出発して実施例1、工程8に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、ISCOカラムクロマトグラフィー精製後に非晶質白色固体(1.7g、24%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C35H47Cl2N3O6Siの計算値(M+H)+ 704.2684、実測値704.2683。
【０１３７】
工程2：(S)-2-(2,6-ジクロロ-4-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステルの調製
2015511937.tif 000200
(S)-2-(2,6-ジクロロ-4-トリイソプロピルシラニルオキシ-ベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル(1.66g、2.35mmol)およびTBAF(3.5mL、3.5mmol、1M)から出発して実施例5、工程4に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、ISCOカラムクロマトグラフィー精製後に白色固体(884mg、69%)を得た。ES(+)-LRMS m/e C26H27Cl2N3O6の計算値(M+H)+ 548、実測値548。
【０１３８】
工程3：(S)-2-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノプロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステルの調製
2015511937.tif 000201
(S)-2-(2,6-ジクロロ-4-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル(558mg、1.07mmol)、3-tert-ブトキシカルボニルアミノプロピルブロミド(306mg、1.28mmol)および炭酸カリウム(445mg、3.22mmol)から出発して実施例5、工程5に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、ISCOカラムクロマトグラフィー精製後に白色固体(654mg、87%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C34H42Cl2N4O8の計算値(M+H)+ 705.2453、実測値705.2451。
【０１３９】
工程4：(S)-2-[4-(3-アミノプロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステルトリフルオロ酢酸塩の調製
2015511937.tif 000202
(S)-2-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノプロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル(781mg、1.1mmol)およびTFA(1.14g、742uL、10mmol)から出発して実施例5、工程6に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製して吸湿性白色固体(790mg、99%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C29H34Cl2N4O6の計算値(M+H)+ 605.1928、実測値605.1929。
【０１４０】
工程5：(S)-2-[4-(3-アミノプロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩の調製
2015511937.tif 000203
(S)-2-[4-(3-アミノプロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル(852mg、1.1mmol)およびLiOH(53mg、2.2mmol)から出発して実施例5、工程7に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製して非晶質白色固体(740mg、99%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C26H28Cl2N4O6の計算値(M+H)+ 563.1459、実測値563.1455。
【０１４１】
工程6：(S)-2-[2,6-ジクロロ-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]ベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸；VLA-4リガンド試薬9の調製
2015511937.tif 000204
(S)-2-[4-(3-アミノプロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩(203mg、0.3mmol)、3-[2-[2-[2-[[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(154mg、0.3mmol)およびDIPEA(194mg、261uL、1.5mmol)から出発して実施例1、工程11に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に非晶質白色固体(175mg、61%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C44H54Cl2N6O14の計算値(M+H)+ 961.3148、実測値961.3156。
【０１４２】
実施例10
(S)-2-[2,6-ジクロロ-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]ベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸;VLA-4リガンド試薬10の調製
2015511937.tif 000205
(S)-2-[4-(3-アミノプロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩(98mg、0.145mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(100mg、0.145mmol)およびDIPEA(187mg、252uL、1.45mmol)から出発して実施例1、工程11に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に吸湿性白色固体(88mg、53%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C52H70Cl2N6O18の計算値(M+H)+ 1137.4197、実測値1137.4196。
【０１４３】
実施例11
(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ)メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩;VLA-4リガンド試薬11
2015511937.tif 000206
【０１４４】
工程1：(S)-2-(4-ブロモ-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステルの調製
2015511937.tif 000207
(S)-2-アミノ-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル(4.67g、13mmol)、4-ブロモ-2,6-ジフルオロ安息香酸(3.12g、13.16mmol)、HBTU(4.99g、13.16mmol)およびDIPEA(6.8mL、39mmol)から出発して実施例1、工程8に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、ISCOカラムクロマトグラフィー精製後に非晶質帯黄白色固体(6.71g、89%)を得た。ES-HRMS m/e C26H26BrF2N3O5の計算値(M+H)+ 578.1097、実測値578.1096。
【０１４５】
工程2：(S)-2-(4-シアノ-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステルの調製
2015511937.tif 000208
DMF(40mL、蒸留および脱気済み)中、(S)-2-(4-ブロモ-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル(5.78g、10mmol)の懸濁液にシアン化亜鉛(940mg、8mmol)およびテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(1.16g、1mmol)を室温で加えた。得られた溶液を85℃に加熱し、24時間攪拌し、その時点で混合物のTLC分析は出発原料の非存在を示した。次に反応混合物を室温に冷却し、水(100mL)に注いで混濁懸濁液を得た。次に有機化合物を酢酸エチル(2x100mL)で抽出した。一緒にした抽出物をブライン溶液(100mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥剤の濾過および溶媒の濃縮によって粗生成物を得て、これをISCO(150g)カラムクロマトグラフィーを使用して精製して(S)-2-(4-シアノ-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル5.2g(収率99%)を非晶質白色固体として得た。ES-HRMS m/e C27H26F2N4O5の計算値(M+H)+ 525.1944、実測値525.1942。
【０１４６】
工程3：(S)-2-(4-アミノメチル-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステルの調製
2015511937.tif 000209
水素化ホウ素ナトリウム(0.29g、7.62mmol、2当量)のTHF(5ml)溶液にTFA(566μL、7.62mmol、2当量)を加え、反応液を10分間攪拌した後、(S)-2-(4-シアノ-2,6-ジフルオロ-ベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロ-ピリミジン-5-イル)-フェニル]-プロピオン酸プロピルエステル(2.0g、3.81mmol)のTHF(6ml)溶液を滴下した(フラスコをTHF(2x1ml)ですすいで反応液に加えた)。反応液を窒素下、室温で1.3時間攪拌した。反応混合物を氷浴中で冷却し、水(20ml)および塩化ナトリウム溶液(水20ml、飽和溶液100ml)で反応停止させた。水性混合物をDCM(2x200ml)で抽出し、次に有機層をブラインで洗浄し、一緒にし、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濃縮して帯黄白色固体1.77gを得た。粗生成物を酢酸イソプロピル(75ml)に懸濁させ、イソプロピルアルコール(0.75ml)およびTMSCl(1ml)を滴下した。反応液を室温で2時間攪拌し、白色析出物を濾過し、酢酸イソプロピルおよびヘキサンで洗浄して(S)-2-(4-アミノメチル-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル1.5g(収率63%)を非晶質白色固体として得た。ES-HRMS m/e C27H30F2N4O5の計算値(M+H)+ 529.2257、実測値529.2258。
【０１４７】
工程4：(S)-2-(4-アミノメチル-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩；VLA-4リガンド4の調製
2015511937.tif 000210
(S)-2-(4-アミノメチル-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル(508mg、0.96mmol)のTHF(10mL)懸濁液に水酸化リチウム(240mg、10mmol)の水(2mL)溶液を室温で加えた。混合物を15時間攪拌し、その時点でTLC分析は出発原料の非存在を示した。次にTHFを減圧除去し、残渣を水(100mL)で希釈し、混合物をTFAで酸性化した。粗生成物をHPLCで精製してTFA塩としての(S)-2-(4-アミノメチル-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸450mg(収率78%)を白色固体として得た。ES-LRMS m/e C24H24F2N4O5の計算値(M+H)+ 487、実測値487。
【０１４８】
工程5：(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ)メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸の調製
2015511937.tif 000211
(S)-2-(4-アミノメチル-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸TFA塩(120mg、0.2mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(103mg、0.2mmol)およびDIPEA(129mg、174uL、1.0mmol)から出発して実施例1、工程11に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に白色固体(75mg、43%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C42H50F2N6O13の計算値(M+Na)+ 907.3296、実測値907.3296。
【０１４９】
実施例12
(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ)メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩;VLA-4リガンド試薬12の調製
2015511937.tif 000212
(S)-2-(4-アミノメチル-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸TFA塩(121mg、0.2mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(100mg、0.145mmol)およびDIPEA(258mg、348uL、2.0mmol)から出発して実施例1、工程11に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に白色固体(80mg、38%)を得た。ES(+)-HRMS m/e C50H66F2N6O17の計算値(M+H)+ 1061.4526、実測値1061.4521。
【０１５０】
実施例13
(S)-2-[4-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-アセチルスルファニル-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸；VLA-4リガンド試薬13の調製
2015511937.tif 000213
(S)-2-(4-アミノメチル-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロ-ピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸(64mg、0.11mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-アセチルスルファニル-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(64mg、0.11mmol)およびDIPEA(42mg、56μL、0.32mmol)から出発して実施例1、工程11に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に粘稠油状物(90mg、87%)を得た。ES(+)-LRMS m/e C45H62F2N4O15S1の計算値(M+H)+ 969、実測値969。
【０１５１】
実施例14
(S)-2-[4-[[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニルエトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロピオニル]-[4-[(S)-1-カルボキシ-2-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]エチルカルバモイル]-3,5-ジフルオロベンジルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンジルアミノ]-3-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]プロピオン酸；VLA-4リガンド試薬14の調製
2015511937.tif 000214
【０１５２】
工程1：(S)-2-[4-[[3,5-ジフルオロ-4-[(S)-1-プロポキシカルボニル-2-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]エチルカルバモイル]ベンジルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]プロピオン酸プロピルエステルの調製
2015511937.tif 000215
n-プロパノール(20mL)に溶解した(S)-2-(4-シアノ-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロ-ピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル(524mg、1.0mmol)を含有し、窒素で掃流した100mLフラスコに、パラジウム炭素(10%、106mg)を加えた。反応液を封止し、窒素への3回の曝露およびハウスバキュームで脱気した後、窒素バルーンに終夜曝露した。反応液をEAで希釈し、再度脱気し、水素に終夜曝露した。反応液をセライトを通じて濾過し、濃縮し、HPLCで精製して標記化合物(204mg、19%)を得た。ES(+)-LRMS m/e C54H57F4N7O10の計算値(M+H)+ 1041、実測値1041。
【０１５３】
工程2：(S)-2-[4-[[3,5-ジフルオロ-4-[(S)-1-カルボキシ-2-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]エチルカルバモイル]ベンジルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]プロピオン酸の調製
2015511937.tif 000216
(S)-2-[4-[[3,5-ジフルオロ-4-[(S)-1-プロポキシカルボニル-2-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]エチルカルバモイル]ベンジルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]プロピオン酸プロピルエステル(1004mmg、0.97mmol)を含有する200mLフラスコにTHF(25mL)、水(25mL)およびLiOH(193mg、4.6mmol)を加え、反応液を室温で終夜攪拌した。反応液を濃縮し、アセトニトリルから乾燥させて白色固体を得て、これをDMSO(13mL)および水(12mL)と混合した。この混合物を最小限に加熱し、濾過し、濾液にTFA(0.25mL)を加えて析出物を得た。析出物を水(50mL)で希釈し、濾過し、水およびヘキサンで洗浄し、高真空乾燥させて標記化合物を白色固体(696mg、75%)として得た。ES(+)-LRMS m/e C48H45F4N7O10の計算値(M+H)+ 956、実測値956。
【０１５４】
工程3：(S)-2-[4-[[3,5-ジフルオロ-4-[(S)-1-メトキシカルボニル-2-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]エチルカルバモイル]ベンジルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]プロピオン酸メチルエステルの調製
2015511937.tif 000217
(S)-2-[4-[[3,5-ジフルオロ-4-[(S)-1-カルボキシ-2-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]エチルカルバモイル]ベンジルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]プロピオン酸(560mg、0.59mmol)を含有するフラスコにメタノール(50mL)およびTMSCl(398mg、460mL、3.66mmol)を加え、反応液を終夜攪拌した。反応液をEA(10mL)、DCM(140mL)で希釈し、NaHCO3水溶液(水:飽和溶液50mL:50mL、ブライン10mL)およびブライン(100mL)で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して標記化合物を白色固体として得て、直接そのまま使用した。ES(+)-LRMS m/e C50H49F4N7O10の計算値(M+H)+ 984、実測値984。
【０１５５】
工程4：(S)-2-[4-[[3-ベンジルオキシカルボニルアミノプロピオニル]-3,5-ジフルオロ-4-[(S)-1-メトキシカルボニル-2-[4-[[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロ-ピリミジン-5-イル]フェニル]エチルカルバモイル]ベンジルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-((1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロ-ピリミジン-5-イル)フェニルプロピオン酸メチルエステルの調製
2015511937.tif 000218
CBZ-βアラニン(123mg、0.55mmol)およびDCM(1mL)を含有するフラスコに、DCM(5mL)に溶解した塩化オキサリル(710mg、0.488mL、5.5mmol)を滴下した。反応液を室温で2.5時間攪拌した後、固体に濃縮した。固体をDCM(1mL)に再懸濁させ、(S)-2-[4-[[3,5-ジフルオロ-4-[(S)-1-メトキシカルボニル-2-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]エチルカルバモイル]ベンジルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]プロピオン酸メチルエステル(0.59mmol)のDMF(5mL)およびDIPEA(131mg、0.178mL、1.0mmol)溶液に、DCM(2x0.4mL)でさらにすすぎながら少しずつ滴下し、反応液を室温で週末にかけて攪拌した。反応液をEA(200mL)で希釈し、NaHCO3水溶液(水:飽和溶液100ml:100mL)およびブライン(100mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮し、DCM中10% MeOH/DCMの濃度を30%に増大させるフラッシュクロマトグラフィーで精製した。標記化合物を白色固体(400mg、67%)として単離した。ES(+)-LRMS m/e C61H60F4N8O13の計算値(M+H)+ 1189、実測値1189。
【０１５６】
工程5：(S)-2-[4-[[3-ベンジルオキシカルボニルアミノプロピオニル]-3,5-ジフルオロ-4-[(S)-1-カルボキシ-2-[4-[[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロ-ピリミジン-5-イル]フェニル]エチルカルバモイル]ベンジルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-((1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロ-ピリミジン-5-イル)フェニルプロピオン酸の調製
2015511937.tif 000219
(S)-2-[4-[[3-ベンジルオキシカルボニルアミノプロピオニル]-3,5-ジフルオロ-4-[(S)-1-メトキシカルボニル-2-[4-[[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロ-ピリミジン-5-イル]フェニル]エチルカルバモイル]ベンジルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-((1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロ-ピリミジン-5-イル)フェニルプロピオン酸メチルエステル(380mg、0.32mmol)、THF(8mL)、水(8mL)、LiOH(51mg、1.21mmol)および1N HClから出発して実施例5、工程7に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、析出、溶解および濃縮後に白色固体(325mg)を得た。ES(+)-LRMS m/e C59H56F4N8O13の計算値(M+H)+ 1161、実測値1161。
【０１５７】
工程6：(S)-2-[4-[[3-アミノプロピオニル]-3,5-ジフルオロ-4-[(S)-1-カルボキシ-2-[4-[[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロ-ピリミジン-5-イル]フェニル]エチルカルバモイル]ベンジルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-((1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロ-ピリミジン-5-イル)フェニルプロピオン酸；VLA-4リガンド6の調製
2015511937.tif 000220
(S)-2-[4-[[3-ベンジルオキシカルボニルアミノプロピオニル]-3,5-ジフルオロ-4-[(S)-1-カルボキシ-2-[4-[[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロ-ピリミジン-5-イル]フェニル]エチルカルバモイル]ベンジルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-((1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロ-ピリミジン-5-イル)フェニルプロピオン酸(313mg、0.27mmol)、パラジウム炭素(10%)および1気圧の水素から出発して実施例14、工程1に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製した。4回の曝露(3x65mg、0.061mmol、室温3時間、4時間、18時間；および205mg、0.19mmol、40℃ 4.5時間)ならびに濾過後に標記化合物を帯黄白色固体(79mg、28%)として得た。ES(+)-LRMS m/e C51H50F4N8O11の計算値(M+H)+ 1027、実測値1027。
【０１５８】
工程7：(S)-2-[4-[[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニルエトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロピオニル]-[4-[(S)-1-カルボキシ-2-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]エチルカルバモイル]-3,5-ジフルオロベンジルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンジルアミノ]-3-[4-[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル]フェニル]プロピオン酸の調製
2015511937.tif 000221
(S)-2-[4-[[3-アミノプロピオニル]-3,5-ジフルオロ-4-[(S)-1-カルボキシ-2-[4-[[1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロ-ピリミジン-5-イル]フェニル]エチルカルバモイル]ベンジルアミノ]メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-((1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロ-ピリミジン-5-イル)フェニルプロピオン酸(84.3mg、0.082mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-アセチルスルファニル-エトキシ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(49.1mg、0.082mmol)およびDIPEA(31mg、43μL、0.246mmol)から出発して実施例1、工程11に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に白色固体(57mg、46%)を得た。ES(+)-LRMS m/e C72H88F4N8O21S1の計算値(M/2+H)+ 755、実測値755。
【０１５９】
フルオレセイン(FITC)標識標的化試薬の調製
標的化試薬は、標的化小分子に対する受容体を発現する細胞へのそれらの結合の追跡を試験するために有用であり得るフルオロフォアで誘導体化することができる。そのような分子は2つの方法の一方または両方で作製することができる。第一に、標的化マレイミドと2-[(5-フルオレセイニル)アミノカルボニル]エチルメルカプタンとの反応を行うことが可能である。あるいは、インテグリンアンタゴニスト小分子標的化リガンドのワンポット反応を行うことが可能であり、2-[(5-フルオレセイニル)アミノカルボニル]エチルメルカプタン、ならびにスキーム17および18に示す二官能性PEG試薬を用いる。
【０１６０】
方法a)の例
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸-FITCの調製
2015511937.tif 000222
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸(37.5mg、0.03mmol)および2-[(5-フルオレセイニル)アミノカルボニル]エチルメルカプタン(FITC試薬)(15.6mg、0.036mml)のメタノール(5mL)中黄色懸濁液に過剰のDIPEA(38.7mg、52uL、0.3mmol)を窒素雰囲気下、室温で加えた。得られた明黄色懸濁液を2時間攪拌し、その時点でLCMS分析は出発原料の非存在を示した。次に、過剰のDIPEAを減圧除去し、所望の生成物をHPLCを使用する精製によって単離して(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸-FITC誘導体25mg(収率50%)を褐色固体として得た。
ES(+)-HRMS m/e C80H104N10O28Sの計算値(M+2H)2+ 843.3444、実測値843.3437。
LCMSデータ = M+H、1687.6
【０１６１】
方法b)の例
2015511937.tif 000223
【０１６２】
工程1. シスタミン二塩酸塩(68mg、0.301mmol)およびDIEA(110μL、2.1当量)をDMF(10mL)に溶解させた後、5-および6-カルボキシフルオレセインの混合物であるNHS-フルオレセイン(300mg、0.634mmol)を加え、得られた反応混合物を室温で終夜攪拌した。次にそれを酢酸エチルで希釈し、水で3回、ブラインで1回洗浄した。抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮し、少量のメタノールおよび酢酸エチルに再溶解させた後、ジエチルエーテルでトリチュレートしてフルオレセイン-シスタミン付加体140mgを明橙色固体として得た。
【０１６３】
工程2. フルオレセイン-シスタミン付加体(80mg、0.092mmol)をメタノールおよび水の3:1混合物(4mL)に溶解させ、TCEP塩酸塩(80mg、3当量)を加えた。得られた反応混合物を室温で2時間攪拌した。生成物をHPLCで精製して生成物78mgを得た。LRMS (ESI) 435.0
【０１６４】
フルオレセイン標識小分子-PEG結合体の調製
2015511937.tif 000224
【０１６５】
一般的手順
リガンド(1当量)のDMSO溶液にDIEA(2当量)およびSM(PEG)4n(1当量)を加えた。得られた反応混合物を室温で1時間攪拌した。次に、チオールハンドルを有するフルオレセイン(1当量)を加え、反応混合物をさらに10分間攪拌した。生成物をHPLCで精製した。
【０１６６】
5'-チオール-siRNAオリゴヌクレオチドへの小分子インテグリン標的化リガンドの共有結合の手順
siRNAの調製
オリゴリボヌクレオチド合成
ABI 394合成機(Applied Biosystems)を10μmolスケールで使用する固相上でのホスホラミダイト技術に従ってオリゴリボヌクレオチドを合成した。
siRNAセンス鎖: SEQ ID NO. 1
siRNAアンチセンス鎖: SEQ ID NO. 2
【０１６７】
対応するsiRNAはハウスキーピング遺伝子AHA1に対するものである。細孔制御ガラスでできた固体支持体(CPG、520Å、負荷75μmol/g、米国ペンシルベニア州アストンのPrime Synthesisから得た)上で合成を行った。定型的RNAホスホラミダイトである2'-O-メチルホスホラミダイト、および補助試薬をProligo(ドイツ・ハンブルク)から購入した。具体的には、以下のアミダイトを使用した: (5'-O-ジメトキシトリチル-N6-(ベンゾイル)-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-アデノシン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイト、5'-O-ジメトキシトリチル-N4-(アセチル)-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-シチジン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイト、(5'-O-ジメトキシトリチル-N2-(イソブチリル)-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-グアノシン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイトおよび5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-ウリジン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイト。2'-O-メチルホスホラミダイトは定型的RNAアミダイトと同一の保護基を有していた。すべてのアミダイトを無水アセトニトリル(100mM)に溶解させ、モレキュラーシーブ(3Å)を加えた。オリゴマーの5'-末端においてスルフヒドリルリンカーを生成させるために、Glen Research(米国バージニア州スターリング)からの1'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイトリンカーである1-O-ジメトキシトリチル-ヘキシル-ジスルフィドを使用した。小分子の結合体化の前に、トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP、以下参照)を使用してジスルフィドリンカーを還元した。Nu547フルオロフォアによる5'-末端標識のために、Thermo Fisher(ウィスコンシン州ミルウォーキー)から得た対応するホスホラミダイトを使用した。5-エチルチオテトラゾール(ETT、アセトニトリル中500mM)をアクチベーター溶液として使用した。カップリング時間は6分とした。ホスホロチオエート結合を導入するために、3-エトキシ-1,2,4-ジチアゾリン-5-オン(EDITH、スコットランド・ラナークシャーのLink Technologiesから得た)の無水アセトニトリル中100mM溶液を使用した。
【０１６８】
支持体結合オリゴマーの開裂および脱保護
固相合成の完了後、乾燥固体支持体を15mL管に移し、メタノール中メチルアミン(2M、Aldrich)によって45℃で180分間処理した。遠心分離後、上澄み液を新たな15mL管に移し、CPGをN-メチルピロリジン-2-オン(NMP、スイス・ブックス、Fluka)1200μLで洗浄した。洗浄液をメチルアミンのメタノール溶液と一緒にし、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩(TEA・3HF、ドイツ・カールスルーエ、Alfa Aesar)450μLを加えた。この混合物を65℃に150分間到達させた。室温に冷却後、NMP 0.75mLおよびエトキシトリメチルシラン(スイス・ブックス、Fluka)1.5mLを加えた。10分後、析出したオリゴリボヌクレオチドを遠心分離により収集し、上澄み液を廃棄し、固体を緩衝液A(以下参照)1mL中で再構成した。
【０１６９】
オリゴリボヌクレオチドの精製
粗オリゴリボヌクレオチドを、AKTA Explorerシステム(GE Healthcare)上で分取22x250mm DNA Pac 100カラム(ドイツ・イトシュタイン、Dionex)を使用する強アニオン交換(SAX)HPLCにより精製した。緩衝液Aは10mM NaClO4、1mM EDTA、10mMトリス(pH 7.4)、6M尿素および20%アセトニトリルからなっていた。緩衝液Bは緩衝液A中に500mM NaClO4を有していた。流量4.5mL/分を使用した。260および280nmでのUVトレースを記録した。55分以内の20%B〜45%Bの勾配を使用した。適切な画分をプールし、3M NaOAc(pH=5.2)および70%エタノールで析出させた。
【０１７０】
粗Nu547標識オリゴマーを、AKTA Explorerシステム(GE Healthcare)上でXTerra Prep MS C8 10x50mmカラム(ドイツ・エシュボルン、Waters)を使用するRP HPLCにより精製した。緩衝液Aは100mM酢酸トリエチルアンモニウム(オランダ・ファルケンスワールト、Biosolve)であり、緩衝液Bは緩衝液A中に50%アセトニトリルを含有していた。流量5mL/分を使用した。260、280および547nm(Nu547標識オリゴリボヌクレオチドの場合)でのUVトレースを記録した。58個のカラム体積(CV)以内の5%B〜60%Bの勾配を使用した。適切な画分をプールし、3M NaOAc(pH=5.2)および70%エタノールで析出させた。
【０１７１】
最後に、精製オリゴマーを、Sephadex G-25(GE Healthcare)を含むカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩した。溶液の濃度を、UV光度計(ドイツ・クレーフェルト、Beckman Coulter)中、260nmでの吸光度測定により決定した。アニーリングまで、個々の鎖を-20℃で凍結溶液として貯蔵した。
【０１７２】
小分子RNA結合体の調製
マレイミド官能基を備えた小分子を、チオエーテル結合を通じた共有結合により、RNAと結合体化させた。この化学反応を可能にするために、5'-ジスルフィドリンカーを含有するRNA約60mgを、TCEP(水中0.5M、Sigma Aldrichから得た)1mLを使用して水(5mL)中で対応するチオールに還元した。分析用アニオン交換HPLCが反応の完了を示した時点で(室温で約2時間)、RNAをエタノール/3M NaOAc(pH 5.4)32:1(v/v)30mLによって-20℃で終夜析出させた。ペレットを遠心分離により収集し、引き続く小分子の結合体化に使用した。
【０１７３】
典型的な結合体化反応において、RNA 10mgをリン酸ナトリウム緩衝液(0.1M、pH 7.0)2mLに溶解させた。この溶液にACN/NMP 1:1(v/v)中小分子(0.12mM)を5分かけて加えた。RP LC-ESI MSが入力RNAの消費を示した時点で、混合物を水(約10mL)で希釈し、エタノール/3M NaOAc(pH 5.4)32:1(v/v)約40mLを-20℃で終夜加えて、結合体化されたRNAを析出させた。ペレットを遠心分離により収集し、水に溶解させ、必要であれば上記に示す手順に従ってアニオン交換HPLCで精製した。結合体が十分に純粋である場合、反応混合物をサイズ排除カラム(Sephadex G-25、GE Healthcare)を通じて濾過した。
【０１７４】
siRNAを生成させるためのオリゴリボヌクレオチドのアニーリング
等モルのRNA溶液を組み合わせることで相補鎖をアニールした。混合物を凍結乾燥させ、適切な量のアニーリング緩衝液(100mM NaCl、20mMリン酸ナトリウム、pH 6.8)で再構成することで所望の濃度を実現した。この溶液を95℃の水浴に入れ、3時間以内に室温に冷却した。表3: siRNA配列情報；小文字: 2'-OMeヌクレオチド；s: ホスホロチオエート結合；dT: デオキシチミジン；(C6SSC6): C-6ジスルフィドリンカー；(Cy5): シアニン5色素。
【０１７５】
Jurkat細胞でのVLA-4/VCAM結合アッセイにおける本発明のVLA-4標的化化合物の阻害効力を評価するために、以下のアッセイを行った。
【０１７６】
以下の接着アッセイが既に報告されており、軽微な修正を加えて本発明において使用した。いずれも参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第6,229,011号および第6,380,387号を参照のこと。Jurkat細胞が膜表面上に高レベルのVLA-4を発現することから、VLA-4(α4β1)標的化脂質(実施例から)のインビトロでの機能的効力を、Jurkat細胞に基づくアッセイ(下記)を使用して決定した。各アッセイは96ウェルプレートで行い、VCAM-1を細胞のカウンターリガンドとして使用した(すなわちVCAM-1をウェルの表面に結合させた)。
【０１７７】
より具体的には、96ウェル高結合F96 Maxisorpイムノマイクロタイタープレート(Nunc)をVCAM-1 25ng/ウェルで終夜コーティングした。非特異的結合を排除するために、実験日に、1%脱脂粉乳を含有するPBS緩衝液でプレートを1時間ブロッキングした。次に、プレートをDPBS(ダルベッコリン酸緩衝食塩水)で洗浄し、ブロット乾燥した。あらゆる過剰の液体をウェルから慎重に吸引した。
【０１７８】
対照として、上記で言及したVLA-4を阻害するための小分子アンタゴニスト(140)を、4% DMSOを含有する緩衝液中にて、対照ウェルに加え、プレートに沿って典型的には1000nM〜0.2nMの濃度範囲で希釈した。JurkatクローンE6-1細胞(ATCC)を、蛍光色素である100μg/ml 6-カルボキシフルオレセイン二酢酸で標識し、続いて、0.5mM 二価カチオンMn2+および0.05%ウシ血清アルブミンを含有するRPMI 1640培地で活性化した。この活性化が、リガンドの最大限の結合を実現するために必要であって、インビボでのサイトカインおよびケモカインによるインテグリンの活性化を刺激し得るということに留意されたい。対照化合物(27)のIC50は約12nMであると決定された(すなわち、50%の細胞が、おそらく細胞のVLA-4受容体が対照化合物に結合または会合したために、ウェルの表面上のVCAM-1に結合しなかった)。
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【０１７９】
本発明のVLA-4標的化化合物(実施例から)によるVLA-4の阻害を評価するために、Jurkat細胞(高レベルのVLA-4を発現)を、最終濃度が96ウェルプレート中2×105細胞/ウェルになるようにVCAM-1コーティングプレートに加え、試験化合物(誘導体化siRNA、小分子)と共に37℃で45分間インキュベートした。ウェルをPBSで穏やかに洗浄することで未結合細胞を除去した後、結合細胞からの蛍光シグナルをTecan Safire2マイクロプレートリーダー上にて450nmで読み取った。ポイントをプロットし、各試験化合物のIC50を、濃度反応曲線の直線部を使用する回帰分析によって決定した。これらの結果を以下の表4および表5に示す。
【０１８０】
標的化送達のための、FITCフルオロフォアおよびsiRNAに共有結合により連結されたインテグリンアンタゴニストの小分子誘導体の細胞透過性および局在の証拠
手順
成長培地(10% FBSを有するRPMI 1640)中で、AML MV4-11細胞を二本鎖-27(500nM)と共に37℃で1時間インキュベートした。VLA-4非依存性結合を決定するために、VLA-4依存性結合をブロッキングする1つの条件に140(10μM)を含めた。インキュベーション後、細胞をD-PBSで2回洗浄し、1%パラホルムアルデヒド中で10分間固定した。ImageStreamx(シアトル、Aminis Corporation)を使用するイメージングフローサイトメトリーによってsiRNAの取り込みを分析した。結果を表Aおよび図1〜4に示す。
【０１８１】
（表Ａ）
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【０１８２】
細胞系におけるAHA1 mRNAをノックダウンするための、5'-センス鎖を修飾したsiRNAのアッセイ
材料および方法
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【０１８３】
リバーストランスフェクション: DharmaFect-1トランスフェクション試薬を0.15μl/ウェルで使用して、明記されたsiRNAを最終濃度50nMでH1299細胞にトランスフェクションした。次に、細胞を96ウェルプレートに5000細胞/ウェルでプレーティングし、37℃で48時間インキュベートした。
【０１８４】
siRNAによるノックダウンの有効性を、ベンダーが報告した通りに分岐DNAアッセイによって測定した。そのようなノックダウンの結果を図5に示す。相対的な細胞生存率を、同一ウェルにおけるGAPDHの絶対発現量によって評価した(図6)。
【０１８５】
反対の記述がない限り、実施例中のすべての化合物は上記のように調製し、特徴づけた。本明細書において引用されるすべての特許および刊行物は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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