(57)【要約】  本発明は、筋萎縮性側索硬化症の処置のための医薬組成物、キット、方法、および使用に関する。特に、本発明は、患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒の発現を低減すること、または患者の運動ニューロンにおけるＭＨＣクラスＩの発現を増加させることによる、筋萎縮性側索硬化症の処置のための医薬組成物、キット、方法、および使用に関する。
2015529685.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒の発現を低減させることにより、筋萎縮性側索硬化症の患者を処置するための方法であって、患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒の発現を低減させる化合物の有効量を含む組成物を該患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
細胞質内毒性顆粒がパーフォリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パーフォリンがパーフォリン１である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞質内毒性顆粒がグランザイムである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
グランザイムがグランザイムＢである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞質内毒性顆粒の減少した発現が、結果として、化合物の投与後の運動ニューロン数の増加、細胞体萎縮の抑制、および神経突起長の伸張からなる群より選択される患者の運動ニューロンへの効果をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
化合物が核酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
核酸が配列番号１の配列を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸が配列番号２の配列を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
患者の運動ニューロンにおいて発現されるＭＨＣクラスＩを増加させることによる筋萎縮性側索硬化症の処置のための方法であって、該患者の運動ニューロンにおけるＭＨＣクラスＩの発現を増加する化合物の有効量を含む組成物を該患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項１２】
ＭＨＣクラスＩの増加した発現が、結果として、化合物の投与後の運動ニューロン数の増加、細胞体萎縮の抑制、および神経突起長の伸張からなる群より選択される患者の運動ニューロンへの効果をもたらす、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
化合物が核酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
核酸が、細菌ベクターまたはウイルスベクターを介して患者に送達される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ベクターがウイルスベクターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ベクターが、レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)ベクターからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
核酸が配列番号３の配列を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
核酸が組織適合遺伝子複合体Ｈ２Ｋをコードしている、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
筋萎縮性側索硬化症が散発性筋萎縮性側索硬化症である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／７０２,０３０号に基づいて、米国特許法第１１９条（ｅ）に規定される優先権の利益を主張し、その開示は、引用により明示的に本明細書に包含される。
【０００２】
政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所(ＮＩＨ)から、助成金番号NRSAF31NS058224号、同ROl NS644912−1A1号および同RC2 NS69476−01号により助成を受けて行った。米国政府は、本発明に一定の権利を保有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、筋萎縮性側索硬化症の処置のための組成物、キット、方法および使用に関する。特に、本発明は、患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒(cytoplasmic toxic granule)の発現を低減させること、または患者の運動ニューロン(ＭＮ)におけるＭＨＣクラスＩの発現を増加させることによる、筋萎縮性側索硬化症の処置のための組成物、キット、方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景および概要
筋萎縮性側索硬化症は、俗に、ルー・ゲーリッグ病と言われ、運動皮質、脳幹および脊髄における運動ニューロンの選択的な早期の変性および細胞死により特徴付けられる。運動ニューロンの喪失は、呼吸器不全から最終的に死に至る進行性の筋肉の麻痺の原因となる。全ての筋萎縮性側索硬化症のおよそ９０％は、家族性疾患ではない散発性筋萎縮性側索硬化症であり、残り約１０％は、家族性筋萎縮性側索硬化症である。危険因子および潜在的感受性遺伝子を同定するための多大な努力にも関わらず、散発性筋萎縮性側索硬化症の病因は、ほとんど未知のままである。
【０００５】
家族性筋萎縮性側索硬化症の約２０％の原因である、ヒトのスーパーオキシドジスムターゼ(ＳＯＤ１)の優性突然変異を有する多数のげっ歯動物モデルが、筋萎縮性側索硬化症おける運動ニューロン毒性のモデルとして有用となっている。これらのモデルは、運動ニューロンのみではなく、ミクログリアおよびアストロサイトを含む非神経細胞もまた、疾患の発症および進行に重要な役割を果たすことが証明されている。近年の研究は、未知の細胞毒性機構により筋萎縮性側索硬化症における運動ニューロン死のメディエーターとして、アストロサイトを同定している。筋萎縮性側索硬化症のアストロサイトによる毒性機能の獲得に関する考察が、筋萎縮性側索硬化症の治療法の開発成功に関係している。
【発明の概要】
【０００６】
すなわち、本発明者らは、筋萎縮性側索硬化症のアストロサイトによるこの毒性機能の獲得機序を発見し、この知見を筋萎縮性側索硬化症の治療法の開発に用いた。本明細書に記載の医薬組成物、方法および使用、ならびにキットは、散発性または家族性筋萎縮性側索硬化症の処置に使用することができる。
【０００７】
本発明のいくつかの態様は、以下に列挙される項目に記載される。
１．患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒(toxic granule)の発現を低減させることにより、筋萎縮性側索硬化症を有する患者を処置するための方法であって、患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒の発現を低減させる化合物の有効量を含む組成物を該患者に投与する工程を含む、方法。
２．細胞質内毒性顆粒がパーフォリンである、項目１に記載の方法。
３．パーフォリンがパーフォリン１である、項目２に記載の方法。
４．細胞質内毒性顆粒がグランザイムである、項目１に記載の方法。
５．グランザイムがグランザイムＢである、項目４に記載の方法。
【０００８】
６．細胞質内毒性顆粒の減少した発現が、化合物の投与後に、運動ニューロン数の増加、細胞体萎縮の抑制、および神経突起長の伸張からなる群より選択される、患者の運動ニューロンへの作用効果をもたらす、項目１から５もいずれかに記載の方法。
７．化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目１から６のいずれかに記載の方法。
８．化合物が核酸である、項目７に記載の方法。
９．核酸がＲＮＡ干渉により機能するか、またはアンチセンスＲＮＡ分子である、項目８に記載の方法。
１０．核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡから成る群より選択される、項目８に記載の方法。
１１．核酸がｓｈＲＮＡである、項目１０に記載の方法。
【０００９】
１２．核酸が、細菌ベクターまたはウイルスベクターを介して患者に送達される、項目８に記載の方法。
１３．核酸が配列番号１の配列を有する、項目８に記載の方法。
１４．核酸が配列番号２の配列を有する、項目８に記載の方法。
１５．筋萎縮性側索硬化症が、散発性筋萎縮性側索硬化症である、項目１から１４のいずれかに記載の方法。
１６．筋萎縮性側索硬化症が、家族性筋萎縮性側索硬化症である、項目１から１４のいずれかに記載の方法。
１７．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり、約１ｎｇから約１ｍｇの範囲である、項目１から１６のいずれかに記載の方法。
【００１０】
１８．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり、約１ｎｇから約５００ｎｇの範囲である、項目１から１７のいずれかに記載の方法。
１９．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり、約１ｎｇから約１００ｎｇの範囲である、項目１から１７のいずれかに記載の方法。
２０．組成物が、担体、添加剤、もしくは希釈剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目１から１９のいずれかに記載の方法。
２１．組成物が、液体担体である薬学的に許容される担体を含む、項目２０に記載の方法。
２２．液体担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目２１に記載の方法。
２３．組成物が、単回用量または複数回用量レジメンで投与される、項目１から２２のいずれかに記載の方法。
【００１１】
２４．患者の運動ニューロンにおいて発現されるＭＨＣクラスＩを増加させることによる筋萎縮性側索硬化症の処置のための方法であって、該患者の運動ニューロンにおけるＭＨＣクラスＩの発現を増加する化合物の有効量を含む組成物を該患者に投与する工程を含む、方法。
２５．ＭＨＣクラスＩの増加した発現が、化合物の投与後の運動ニューロン数の増加、細胞体萎縮の抑制、および神経突起長の伸張からなる群より選択される患者の運動ニューロンへの作用効果をもたらす、項目２４に記載の方法。
２６．化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目２４または２５に記載の方法。
２７．化合物が核酸である、項目２６に記載の方法。
２８．核酸が、細菌ベクターまたはウイルスベクターを介して患者に送達される、項目２７に記載の方法。
２９．ベクターがウイルスベクターである、項目２８に記載の方法。
３０．ベクターが、レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)ベクターからなる群より選択される、項目２９に記載の方法。
【００１２】
３１．核酸が配列番号３の配列を有する、項目３０に記載の方法。
３２．核酸が組織適合遺伝子複合体Ｈ２Ｋをコードしている、項目３１に記載の方法。
３３．筋萎縮性側索硬化症が散発性筋萎縮性側索硬化症である、項目２４から３２のいずれかに記載の方法。
３４．筋萎縮性側索硬化症が家族性筋萎縮性側索硬化症である、項目２４から３２のいずれかに記載の方法。
３５．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり、約１ｎｇから約１ｍｇの範囲である、項目２４から３４のいずれかに記載の方法。
３６．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり、約１ｎｇから約５００ｎｇの範囲である、項目２４から３５のいずれかに記載の方法。
３７．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり、約１ｎｇから約１００ｎｇの範囲である、項目２４から３６のいずれかに記載の方法。
３８．組成物が、担体、添加剤、もしくは希釈剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目２４から３７のいずれかに記載の方法。
３９．組成物が、液体担体である薬学的に許容される担体を含む、項目３８に記載の方法。
【００１３】
４０．液体担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目３９に記載の方法。
４１．組成物が、単回用量または複数回用量レジメンで投与される、項目２４から４０のいずれかに記載の方法。
４２．筋萎縮性側索硬化症を有する患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒(toxic granule)の発現を低減させるのに有効な、化合物の投与量形態を含む、医薬組成物。
４３．化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目４２に記載の組成物。
４４．化合物が核酸である、項目４３に記載の組成物。
４５．核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡから成る群より選択される、項目４４に記載の組成物。
４６．化合物がアンチセンスＲＮＡ分子である、項目４４に記載の組成物。
４７．核酸がｓｈＲＮＡである、項目４５に記載の組成物。
４８．核酸が配列番号１の配列を有する、項目４４に記載の組成物。
４９．核酸が配列番号２の配列を有する、項目４４に記載の組成物。
５０．組成物が、１つまたはそれ以上の担体、添加剤、もしくは希釈剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目４２から４９のいずれかに記載の組成物。
【００１４】
５１．組成物が、液体担体である薬学的に許容される担体を含む、項目５０に記載の組成物。
５２．液体担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目５１に記載の組成物。
５３．化合物の純度が、重量％に基づき少なくとも９８％である、項目４２から５２のいずれかに記載の組成物。
５４．組成物が、アンプルまたは密封バイアル中に存在する、項目４２から５３のいずれかに記載の組成物。
５５．再構成可能な凍結乾燥形態である、項目４２から５０および５３から５４のいずれかに記載の組成物。
５６．筋萎縮性側索硬化症を有する患者の運動ニューロンにおけるＭＨＣクラスＩの発現を増加させるのに有効な、化合物の投与量形態を含む、医薬組成物。
５７．化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目５６に記載の組成物。
５８．化合物が核酸である、項目５６に記載の組成物。
【００１５】
５９．核酸が配列番号３の配列を有する、項目５８に記載の組成物。
６０．組成物が、１つまたはそれ以上の担体、希釈剤、もしくは添加剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目５６から５９のいずれかに記載の組成物。
６１．組成物が、液体担体である薬学的に許容される担体を含む、項目６０に記載の組成物。
６２．液体担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目６１に記載の組成物。
６３．化合物の純度が、重量％に基づき少なくとも９８％である、項目５６から６２のいずれかに記載の組成物。
６４．組成物がアンプルまたは密封バイアル中に存在する、項目５６から６３のいずれかに記載の組成物。
６５．再構成可能な凍結乾燥形態である、項目５６から６０および６３から６４のいずれかに記載の組成物。
６６．組成物が、吸入投与量形態、経口投与量形態、および非経腸投与量形態からなる群より選択される投与量形態である、項目１から６５のいずれかに記載の方法または医薬組成物。
６７．非経腸投与量形態が、皮内投与量形態、皮下投与量形態、筋肉内投与量形態、腹腔内投与量形態、静脈内投与量形態、および髄腔内投与量形態からなる群より選択される、項目６６に記載の方法または医薬組成物。
６８．凍結乾燥形態である、項目５５または６５に記載の組成物。
６９．固体形態である、項目４２から５０、５３から６０および６３から６５のいずれかに記載の組成物。
【００１６】
７０．滅菌バイアル、項目５６から６９のいずれかに記載の組成物、および筋萎縮性側索硬化症を有する患者の処置のための組成物の使用を説明する指示書を含む、キット。
７１．化合物または組成物が、再構成可能な凍結乾燥形態である、項目７０に記載のキット。
７２．化合物の用量が、患者の体重１ｋｇ当たり、１から５μｇの範囲である、項目７０または７１に記載のキット。
７３．化合物の純度が、重量％に基づき少なくとも９８％である、項目７０から７２のいずれかに記載のキット。
７４．化合物または組成物が非経腸投与量形態である、項目７０から７３のいずれかに記載のキット。
７５．非経腸投与量形態が、皮内投与量形態、皮下投与量形態、筋肉内投与量形態、腹腔内投与量形態、静脈内投与量形態、および髄腔内投与量形態からなる群より選択される、項目７４に記載のキット。
７６．組成物が薬学的に許容される担体をさらに含む、項目７０から７５のいずれかに記載のキット。
７７．薬学的に許容される担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される液体担体である、項目７６に記載のキット。
【００１７】
７８．筋萎縮性側索硬化症の処置のための医薬の製造を目的とする、項目４２から６９のいずれかに記載の組成物の使用。
７９．筋萎縮性側索硬化症の処置に使用するための、項目４２から６９のいずれかに記載の医薬組成物。
８０．細胞質中毒性顆粒がＳＯＤ１ではない、項目１から２３のいずれかに記載の方法。
８１．細胞質中毒性顆粒が、抗酸化性細胞質中毒性顆粒ではない、項目１から２３のいずれかに記載の方法。
８２．細胞質中毒性顆粒がＳＯＤ１ではない、項目４２から５５のいずれかに記載の組成物。
８３．細胞質中毒性顆粒が、抗酸化性細胞質中毒性顆粒ではない、項目４２から５５のいずれかに記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１：(A)ウェスタンブロット分析は、野生型（WT）およびSodl G93Aマウスの脊髄におけるパーフォリン(PRFl)およびグランザイムＢ(GZMB)の発現を示す。(B)PRFlおよびGZMBの両方の発現が、アストロサイトで観察されたが、ミクログリアでは観察されなかった。(C) Sodl G93A  アストロサイトを運動ニューロン（ＭＮ）と共に培養することにより、PRFlおよびGZMBの共局在が増大した。スケールバーは、５μｍである。(D) SodlG93A アストロサイトをSodl G93A マウス由来の脊髄細胞と共に培養することにより、PRFlおよびGZMBの共局在が増大した。スケールバーは、２００μｍである。(E) ウェスタンブロット分析は、ヒトＡＬＳ患者および対照患者の死後の神経前駆細胞（NPC）由来のアストロサイトにおけるPRFlおよびGZMBの両方の発現を示す。(F) PRFlおよびGZMBの共局在が、ＡＬＳ患者の脊髄でのみ検出された。スケールバーは、２００μｍを示す。この図において、PRFlを赤色で示し、GZMBを緑色で示し、GFAPを青色で示す。DAPIを核の可視化に用いた。(G) PrflおよびGzmb RNAの発現が、野生型およびS0D1 G93A マウスの両方の脊髄において見出された。(H) 初代およびNPC由来の両方のアストロサイトが、PrflおよびGzmb RNAを発現するが、ミクログリアはGzmbのみを発現した。(I)脾臓細胞のPRFlおよびGZMBの免疫染色は、両細胞傷害性タンパク質の強い特異的なシグナルを明らかにした。灰色は、核のDAPI染色を示す。(J) PRFlおよびGZMBの連続染色プロトコルは、(I)と同様のものを用いた。青色は、アストロサイトマーカーであるGFAPを示す。スケールバーは、５μｍを示す。
【図２】図２：(A) PRFlおよびGZMBは、S0D1 G93A アストロサイトと共に培養することにより早ければ２４時間でＭＮ中に見出される。PRFlおよびGZMBは、S0D1 G93A アストロサイトと共に培養したＭＮ中、時間経過と共に徐々に増えるが、野生型アストロサイトと共に培養したＭＮ中には存在しない。PRFlを赤色で示し、GZMBを緑色で示し、Hb9−GFPを青色で示す。p＜0.001。スケールバーは５μｍを示す。(B) 図２Ａから作成した３次元共焦点画像は、Sodl G93A アストロサイトの表面からＭＮの細胞質に伸びた多数のパーフォリン穿孔様の構造を示す。PRFlを、赤色で示し、Hb9−GFP＋を緑色で示し、EAAT2を青色で示す。(C) Sodl G93Aマウスにおいて、PRFlおよびGZMBは通常見出される。PRFlを赤色で示し、GZMBを緑色で示し、ChATを青色で示す。スケールバーは、５０μｍを示す。(D) Sodl G93A マウスにおいて、PRFlおよびGZMBは、ＭＮ中に検出され得る。PRFlを赤色で示し、GZMBを緑色で示し、ChATを青色で示す。(E)リソソーム関連膜タンパク質であるCD107Aの発現により評価される脱顆粒（degranularization）レベルは、Sodl G93A マウスの脊髄における疾患の進行に伴い増加する。CD107Aを赤色で示し、EAAT2を緑色で示し、ChATを青色で示す。(F) リソソーム関連膜タンパク質であるCD107Aの発現により評価される脱顆粒レベルは、Sodl G93A マウスのＭＮを取り囲むアストロサイトに見出される。CD107Aを赤色で示し、EAAT2を緑色で示し、ChATを青色で示す。スケールバーは、２００μｍである。(G−H) (A)に示される野生型またはS0D1 G93A アストロサイトと共に培養したＭＮ中、異なる時間点で見出されるPRFl (G) および GZMB (H)のレベル。(I) ＳＯＤ１ G93AまたはA4V 変異タンパク質を過剰発現する非ALS対照アストロサイト (1800) は、ＭＮ中にPRFlおよびGZMBを放出するが、PRFlおよびGZMBは、非ALS対照アストロサイトと共に１２０時間培養したＭＮ中には存在しない。PRFlを赤色で示し、GZMBを緑色で示し、Hb9−GFPを青色で示す。スケールバーは、５μｍを示す。(J)野生型アストロサイトと共培養したＭＮにおけるPRFl染色（赤色）の欠失を示す共焦点顕微鏡から得られた三次元画像を示す。アストロサイト表面マーカーであるEAAT2 (青色)を用いて、アストロサイトの膜を可視化した；Hb9−GFP (緑色)を用いてＭＮを可視化した。スケールバーは１００μｍを示す。(K) ウェスタンブロット分析は、初代およびNPC由来のS0D1 G93A アストロサイトの両方が、野生型アストロサイトと比較して、細胞傷害性タンパク質の脱顆粒の指標である、CD107Aの高レベル発現を明らかにした。(L) アストロサイトと共培養したＭＮの免疫蛍光染色は、CD107A 発現が、ＭＮを取り囲むS0D1 G93A アストロサイトに見出されることを示した。CD107A を赤色で示し、Hb9−GFPを緑色で示し、EAAT2 を青色で示した。スケールバーは100μｍを示す。
【００１９】
【図３】図３：(A) 3,3'−ジアミノベンジジン(DAB)免疫染色によるアッセイの通り、ＭＮ中のPRFlおよびGZMBの検出は、ヒトＡＬＳの脊髄に見出された。(B) PRFl陽性運動ニューロンの数の定量は、図３Ａに示す通りである。スケールバーは、20μｍを示す。(C) GZM陽性運動ニューロンの数の定量は、図３Ａに示す通りである。スケールバーは、２０μｍを示す。
【図４】図４：(A) Sodl G93A アストロサイトにおけるPrflおよびGzmB発現のノックダウンは、ＭＮとの共培養により回復する。(B) Sodl G93A アストロサイトにおけるPrflおよびGzmB発現のノックダウンは、全HB9−GFP ＋細胞数を回復させる。(C) Sodl G93A アストロサイトにおけるPrflおよびGzmB発現のノックダウンは、ＭＮの細胞体の萎縮を阻止する。(D) Sodl G93A アストロサイトにおけるPrflおよびGzmB発現のノックダウンは、神経突起の短化を阻止する。(E) FALSおよびSALS アストロサイトにおけるPrflおよびGzmB発現のノックダウンは、ＭＮとの共培養により回復する。(F) FALSおよびSALS アストロサイトにおけるPrflおよびGzmB発現のノックダウンは、全HB9−GFP＋細胞数を回復させる。(G−H) FALSおよびSALS アストロサイトにおけるPrflおよびGzmB発現のノックダウンは、ＭＮの細胞体の萎縮を阻止する。(I−J) FALSおよびSALS アストロサイトにおけるPrflおよびGzmB発現のノックダウンは、神経突起の短化を阻止する。(＊＝ p＜0.05；＊＊＝ p＜0.01；＊＊＊＝ p＜0.001；ns＝ 有意でない；Scr＝ スクランブル)。(K−L) ウェスタンブロット分析は、Prfl shRNA (K) およびGzmb shRNA (L)を用いてレンチウイルスによる形質転換を行ったマウスS0D1G93A アストロサイトにおけるPRFlおよびGZMBの発現の減少を示す。(M) Prfl shRNAおよびGzmb shRNAsは、用いた全てのヒトアストロサイトにおけるPRFlおよびGZMB発現を抑制した。GAPDH をローディングコントロールとして用い、‘a’は、スクランブル shRNAで形質転換したアストロサイトを示し、‘b’は、Prfl shRNAおよびGzmb shRNAで形質転換したアストロサイトを示す。Scr は、スクランブルshRNAを示す。
【図５】図５：(A) ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と同様に、Sodl G93A アストロサイトは、CD56およびCD57を発現する。スケールバーは、１００μｍを示す。(B) ＮＫ細胞と同様に、Sodl G93A アストロサイトは、ＮＫ細胞と通常関係のあるマーカーの上方制御を示す。(C)インビトロでのLY49CおよびLY49Iのロバスト発現から明らかなように、Sodl G93A アストロサイトは、ＭＨＣクラスＩ受容体を発現する。LY49C+Iを赤色で示す。GFAPを緑色で示す。スケールバーは、200μｍを示す。(D) Sodl G93A マウスの脊髄における終末期の疾患での、インビボにおけるLY49Cおよび LY49Iのロバスト発現から明らかなように、Sodl G93A アストロサイトは、ＭＨＣクラスＩ受容体を発現する。LY49C+Iを赤色で示す。GFAPを緑色で示す。スケールバーは、500μおよび200μｍ (挿入)を示す。(E) ＭＨＣクラスＩ受容体であるKIR3DL2が、FALSおよびSALSアストロサイトで発現される。スケールバーは、200μｍを示す。(F)ヒトＭＨＣクラスＩ受容体変異体のRT−PCRによるスクリーニングは、KIR3DL2が、インビトロにおけるFALSおよびSALSアストロサイトで高度に、一般的に発現されることを見出した。スケールバーは、200μｍおよび5μｍ (挿入)を示す。(G)ヒトＭＨＣクラスＩ受容体変異体のRT−PCRによるスクリーニングは、KIR3DL2が、インビボにおけるFALSおよびSALS アストロサイトで高度に、一般的に発現されることを見出した。(H) Ingenuity 社がモデル化した経路分析の倍数変化を、マウスのナチュラルキラー細胞96 StellARayを用いて野生型とS0D1 G93A アストロサイトで比較観察した。赤色で示す分子は、上方制御された転写産物を示す。緑色で示す分子は、下方制御された転写産物を示す。色合いの異なる陰は、高い(＞4)から低い(＜3)の異なる変化比を示す。白色の分子は、顕著な変化比を示さなかったもので、他方、黒色の分子は、アレイに含まれず、さらに調査されなかった遺伝子を示す。
【００２０】
【図６】図６：(A)ＭＨＣクラスＩの経時的下方制御は、Sodl G93A アストロサイトとの共培養によるＭＮ中でのH2K 発現の強度から明らかである。スケールバーは、10μｍを示す。(B) Sodl G93A アストロサイトは、GABA作動性ニューロンにおけるＭＨＣクラスＩ下方制御をもたらさない。スケールバーは、5μｍを示す。(C) Sodl G93Aマウスの疾患末期における、ＭＮにおけるＭＨＣクラスＩの発現の減少。H2Kを赤色で示す。ChATを緑色で示す。ＡＬＳパネルのアスタリスクは、ＭＮを示す。スケールバーは、2ｍｍおよび10μｍ (挿入)を示す。(D)ＡＬＳ患者の脊髄における、終末期疾患のＭＮにおける、ＭＨＣクラスＩの減少した発現。ＭＨＣクラスＩは、3,3'−ジアミノベンジジン(DAB)染色により可視化される。ＡＬＳパネルにおけるアスタリスクは、ＭＮを示す。スケールバーは、20μｍを示す。(E)ヒト脊髄のＭＮ中のＭＨＣクラスＩ発現の定量化を、図6Dに示す。(F−G)ＭＮにおけるＭＨＣクラスＩの過剰発現は、HB9−GFP ＋細胞数から明らかな通り(パネル6G参照)、細胞死 (パネル6F参照)を阻止する。スケールバーは、100μｍを示す。(H)レンチウイルスでの形質転換後のSodl G93A アストロサイトとの共培養により、ＭＮ中のＭＨＣクラスＩ発現が維持された。H2Kを赤色で示す。Hb9を緑色で示す。(I) ＭＨＣクラスＩ過剰発現は、ＭＮ細胞体の萎縮を阻止する。(J) ＭＨＣクラスＩの過剰発現は、神経突起を短化する。＊＝ p＜0.05；＊＊＝ p＜0.01；＊＊＊＝ p＜0.001；ns＝ 有意ではない。(K) S0D1 G93A アストロサイトとの共培養により、表面のＭＨＣクラスＩ染色は、Lv−RFPで形質転換したＭＮでのＭＨＣクラスＩの減少した発現を示すが、Lv−H2Kで形質転換したＭＮ上のＭＨＣクラスＩの発現は維持された。スケールバーは、20μｍを示す。
【図７】図７：細胞傷害性リンパ球におけるFas／FasL活性の阻害に有効であることが公知のKp7−6濃度は、ＭＮに対してS0D1 G93A アストロサイト由来の細胞傷害性を変化させなかった。p＜0.001。
【図８】図８：ShRNA−prf／GFPおよび対照マウスの平均生存率を分析した。結果を、時間 (日)に対する生存割合で示す。
【図９】図９：ShRNA−prf／GFPおよび対照マウスの後肢握り締め強度を分析した。結果を、月齢 (日)に対する力（ｇ）として示す。
【図１０】図１０：ＭＮを、SODlアストロサイト馴化培地の存在下で培養したとき、ＳＯＤ１ アストロサイトにおけるPrflおよび Gzmb 発現のノックダウンは、ＭＮの生存性を増加させ (A−B) (B；全てのグループについて、ｎ＝3、各ｎはトリプリケートで行った) 神経突起伸張を阻止し (C)、細胞体サイズ(D)の退縮が一般的に観察された(C、D；全てのグループについて、n＝100)。(E−F) SODl アストロサイト馴化培地の存在下、PRFl およびGZMBは、ＭＮの細胞体で検出された。(G)ＭＮ生存性の用量依存的増加が、SODl アストロサイト馴化培地に添加したPRFlおよびGZMBを中和する抗体の存在において観察された。抗体添加のないSODl アストロサイト馴化培地を、統計分析の参照グループとして用いた。点線は、５０％度数を示す(C、D)。スケールバーは、200μｍ (A)、5μｍ (E)を示す。エラーバーは、標準誤差（s.e.m）で示す。＊＊P＜0.01、＊＊＊＊P＜0.0001。n.s、有意ではない。Scr、スクランブルshRNA。
【図１１】図１１：(A−C) H2−K1のShRNAノックダウンは、RNA (A)および タンパク質発現 (B−C)により示されるとおり、GABA作動性ニューロンにおけるH2−K1発現の効率的な下方制御をもたらす。(D) GABA作動性ニューロンにおけるH2−K1の抑制は、SODl アストロサイトと共培養することによりPRFl および GZMBの発現を増加させる。(E−G) SODl アストロサイトと共に１２０時間培養後、H2−K1 shRNAで処理したGABAニューロンは、SODl仲介性アストロサイト細胞傷害性に増加した感受性を示し、細胞生存性が減少し(E、F)、細胞体サイズおよび神経突起長が減少した (F；全ての群についてn＝3、各nは、トリプリケートで行った)。点線は、５０％頻度を示す (G)。スケールバーは、5μm (B、D)、100μｍを示す(E)。エラーバーは、標準誤差で示す。＊＊P＜0.01、＊＊＊＊P＜0.0001。Scr、スクランブルshRNA。
【００２１】
【図１２】図１２：(A) ウェスタンブロット分析は、SODl アストロサイトにおけるPRFl および GZMB shRNAの発現と、同様のレベルのヒト SODlを示した。(B) 炎症性遺伝子アレイは、PRFlおよびGZMBのノックダウンによるSODl アストロサイトの炎症性プロファイルにおける明らかな変化は示さなかった。ヒートマップは、個別に集めたサンプルを用いる２つの遺伝子アレイの平均倍数変化を示す。
【図１３】図１３：(A) ウイルスベクターによるshRNA送達によってSODl アストロサイトで達成されるヒト SODl発現ノックダウンのレベルを、ELISA (A；全ての群について、n＝2)および ウェスタン分析(B)で示す。(C−H) SODl shRNA 発現により、PRFlおよびGZMBの共局在のレベルは、細胞当たりの個々の顆粒の全数に影響を与えることなく(D、G)、インビトロ (C−E)およびインビボ (F−H)の両方で有意に減少した。白色の矢印は、ＰＲＦ１およびＧＺＭＢの共局在する顆粒を示す。スケールバーは、５μｍを示す。エラーバーは、標準偏差で示す。＊＊＊＊P＜0.0001。n.s、有意ではない。Scr、スクランブル shRNA。
【図１４】図１４：(A−B) ＳＯＤ１ アストロサイトは、半定量的RT−PCR(A) および定量的RT−PCR (B；全ての群について、n＝2)で示す通り、高レベルのGzmb発現を示すが、Gzmaは低レベルである。Gzmbレベルはまた、野生型アストロサイトと比較してＳＯＤ１ アストロサイトで高かった(A−B)。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
例示的態様の詳細な説明
本発明のいくつかの態様は、以下の列挙される項目によって記載され、本明細書の詳細な説明部分に記載される各態様は、以下の各態様に適用される。
１．患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒(toxic granule)の発現を低減させることにより、筋萎縮性側索硬化症を有する患者を処置するための方法であって、患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒の発現を低減させる化合物の有効量を含む組成物を該患者に投与する工程を含む、方法。
２．細胞質内毒性顆粒がパーフォリンである、項目１に記載の方法。
３．パーフォリンがパーフォリン１である、項目２に記載の方法。
４．細胞質内毒性顆粒がグランザイムである、項目１に記載の方法。
５．グランザイムがグランザイムＢである、項目４に記載の方法。
【００２３】
６．細胞質内毒性顆粒の減少した発現が、化合物の投与後に、運動ニューロン数の増加、細胞体萎縮の抑制、および神経突起長の伸張からなる群より選択される、患者の運動ニューロンへの作用効果をもたらす、項目１から５もいずれかに記載の方法
７．化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目１から６のいずれかに記載の方法。
８．化合物が核酸である、項目７に記載の方法。
９．核酸がＲＮＡ干渉により機能するか、またはアンチセンスＲＮＡ分子である、項目８に記載の方法。
１０．核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡから成る群より選択される、項目８に記載の方法。
１１．核酸がｓｈＲＮＡである、項目１０に記載の方法。
【００２４】
１２．核酸が、細菌ベクターまたはウイルスベクターを介して患者に送達される、項目８に記載の方法。
１３．核酸が配列番号１の配列を有する、項目８に記載の方法。
１４．核酸が配列番号２の配列を有する、項目８に記載の方法。
１５．筋萎縮性側索硬化症が、散発性筋萎縮性側索硬化症である、項目１から１４のいずれかに記載の方法。
１６．筋萎縮性側索硬化症が、家族性筋萎縮性側索硬化症である、項目１から１４のいずれかに記載の方法。
１７．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり、約１ｎｇから約１ｍｇの範囲である、項目１から１６のいずれかに記載の方法。
【００２５】
１８．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり、約１ｎｇから約５００ｎｇの範囲である、項目１から１７のいずれかに記載の方法。
１９．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり、約１ｎｇから約１００ｎｇの範囲である、項目１から１７のいずれかに記載の方法。
２０．組成物が、担体、添加剤、もしくは希釈剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目１から１９のいずれかに記載の方法。
２１．組成物が、液体担体である薬学的に許容される担体を含む、項目２０に記載の方法。
２２．液体担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目２１に記載の方法。
２３．組成物が、単回用量または複数回用量レジメンで投与される、項目１から２２のいずれかに記載の方法。
【００２６】
２４．患者の運動ニューロンにて発現されるＭＨＣクラスＩを増大させることによる筋萎縮性側索硬化症の処置のための方法であって、該患者の運動ニューロンにおけるＭＨＣクラスＩの発現を増加する化合物の有効量を含む組成物を該患者に投与する工程を含む、方法。
２５．ＭＨＣクラスＩの増加した発現が、化合物の投与後に、運動ニューロン数の増加、細胞体萎縮の抑制、および神経突起長の伸張からなる群より選択される患者の運動ニューロンへの作用効果をもたらす、項目２４に記載の方法。
２６．化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目２４または２５に記載の方法。
２７．化合物が核酸である、項目２６に記載の方法。
２８．核酸が、細菌ベクターまたはウイルスベクターを介して患者に送達される、項目２７に記載の方法。
２９．ベクターがウイルスベクターである、項目２８に記載の方法。
３０．ベクターが、レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)ベクターからなる群より選択される、項目２９に記載の方法。
【００２７】
３１．核酸が配列番号３の配列を有する、項目３０に記載の方法。
３２．核酸が組織適合遺伝子複合体Ｈ２Ｋをコードしている、項目３１に記載の方法。
３３．筋萎縮性側索硬化症が散発性筋萎縮性側索硬化症である、項目２４から３２のいずれかに記載の方法。
３４．筋萎縮性側索硬化症が家族性筋萎縮性側索硬化症である、項目２４から３２のいずれかに記載の方法。
３５．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり、約１ｎｇから約１ｍｇの範囲である、項目２４から３４のいずれかに記載の方法。
３６．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり、約１ｎｇから約５００ｎｇの範囲である、項目２４から３５のいずれかに記載の方法。
３７．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり、約１ｎｇから約１００ｎｇの範囲である、項目２４から３６のいずれかに記載の方法。
３８．組成物が、担体、添加剤、もしくは希釈剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目２４から３７のいずれかに記載の方法。
３９．組成物が、液体担体である薬学的に許容される担体を含む、項目３８に記載の方法。
【００２８】
４０．液体担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目３９に記載の方法。
４１．組成物が、単回用量または複数回用量レジメンで投与される、項目２４から４０のいずれかに記載の方法。
４２．筋萎縮性側索硬化症を有する患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒(toxic granule)の発現を低減させるのに有効な、化合物の投与量形態を含む、医薬組成物。
４３．化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目４２に記載の組成物。
４４．化合物が核酸である、項目４３に記載の組成物。
４５．核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡから成る群より選択される、項目４４に記載の組成物。
４６．化合物がアンチセンスＲＮＡ分子である、項目４４に記載の組成物。
４７．核酸がｓｈＲＮＡである、項目４５に記載の組成物。
４８．核酸が配列番号１の配列を有する、項目４４に記載の組成物。
４９．核酸が配列番号２の配列を有する、項目４４に記載の組成物。
５０．組成物が、１つまたはそれ以上の担体、添加剤、もしくは希釈剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目４２から４９のいずれかに記載の組成物。
【００２９】
５１．組成物が、液体担体である薬学的に許容される担体を含む、項目５０に記載の組成物。
５２．液体担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目５１に記載の組成物。
５３．化合物の純度が、重量％に基づき少なくとも９８％である、項目４２から５２のいずれかに記載の組成物。
５４．組成物が、アンプルまたは密封バイアル中に存在する、項目４２から５３のいずれかに記載の組成物。
５５．再構成可能な凍結乾燥形態である、項目４２から５０および５３から５４のいずれかに記載の組成物。
５６．筋萎縮性側索硬化症を有する患者の運動ニューロンにおけるＭＨＣクラスＩの発現を増加させるのに有効な、化合物の投与量形態を含む、医薬組成物。
５７．化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目５６に記載の組成物。
５８．化合物が核酸である、項目５６に記載の組成物。
【００３０】
５９．核酸が配列番号３の配列を有する、項目５８に記載の組成物。
６０．組成物が、１つまたはそれ以上の担体、希釈剤、もしくは添加剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目５６から５９のいずれかに記載の組成物。
６１．組成物が、液体担体である薬学的に許容される担体を含む、項目６０に記載の組成物。
６２．液体担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目６１に記載の組成物。
６３．化合物の純度が、重量％に基づき少なくとも９８％である、項目５６から６２のいずれかに記載の組成物。
６４．組成物がアンプルまたは密封バイアル中に存在する、項目５６から６３のいずれかに記載の組成物。
６５．再構成可能な凍結乾燥形態である、項目５６から６０および６３から６４のいずれかに記載の組成物。
６６．組成物が、吸入投与量形態、経口投与量形態、および非経腸投与量形態からなる群より選択される投与量形態である、項目１から６５のいずれかに記載の方法または医薬組成物。
６７．非経腸投与量形態が、皮内投与量形態、皮下投与量形態、筋肉内投与量形態、腹腔内投与量形態、静脈内投与量形態、および髄腔内投与量形態からなる群より選択される、項目６６に記載の方法または医薬組成物。
６８．凍結乾燥形態である、項目５５または６５に記載の組成物。
６９．固体形態である、項目４２から５０、５３から６０および６３から６５のいずれかに記載の組成物。
【００３１】
７０．滅菌バイアル、項目５６から６９のいずれかに記載の組成物、および筋萎縮性側索硬化症を有する患者の処置のための組成物の使用を説明する指示書を含む、キット。
７１．化合物または組成物が、再構成可能な凍結乾燥形態である、項目７０に記載のキット。
７２．化合物の用量が、患者の体重１ｋｇ当たり、１から５μｇの範囲である、項目７０または７１に記載のキット。
７３．化合物の純度が、重量％に基づき少なくとも９８％である、項目７０から７２のいずれかに記載のキット。
７４．化合物または組成物が非経腸投与量形態である、項目７０から７３のいずれかに記載のキット。
７５．非経腸投与量形態が、皮内投与量形態、皮下投与量形態、筋肉内投与量形態、腹腔内投与量形態、静脈内投与量形態、および髄腔内投与量形態からなる群より選択される、項目７４に記載のキット。
７６．組成物が薬学的に許容される担体をさらに含む、項目７０から７５のいずれかに記載のキット。
７７．薬学的に許容される担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される液体担体である、項目７６に記載のキット。
【００３２】
７８．筋萎縮性側索硬化症の処置のための医薬の製造を目的とする、項目４２から６９のいずれかに記載の組成物の使用。
７９．筋萎縮性側索硬化症の処置に使用するための、項目４２から６９のいずれかに記載の医薬組成物。
【００３３】
本明細書に記載の種々の態様のいずれにおいても、適用可能なとき以下の特徴が存在してよく、本発明のさらなる態様を提供する。すべての態様について、態様の任意の適用可能な組み合わせもまた、企図される。列挙された項目において上記の態様の任意の適用可能な組み合わせもまた、本発明に従っていると考えられる。
【００３４】
一態様では、患者のアストロサイトにおける細胞質中毒性顆粒の発現を減少させることにより、筋萎縮性側索硬化症の患者を処置するための方法を提供する。この方法は、患者のアストロサイトにおける細胞質中毒性顆粒の発現を低下させる化合物の有効量を含む組成物を患者に投与する工程を含む。１つの例示的態様において、細胞質中毒性顆粒はＳＯＤ１ではない。別の例示的態様において、細胞質中毒性顆粒は、抗酸化性細胞質中毒性顆粒ではない。
【００３５】
別の態様において、患者の運動ニューロンにおけるＭＨＣクラスＩ発現を増大させることにより筋萎縮性側索硬化症を処置するための方法が提供される。この方法は、患者の運動ニューロンにおけるＭＨＣクラスＩの発現を増大する化合物の有効量を含む組成物を患者に投与する工程を含む。これらの方法の態様、または任意の対応する使用のいずれかにおいて、患者のアストロサイトにおける細胞質中毒性顆粒の減少した発現、または患者の運動ニューロンにおけるＭＨＣクラスＩの増大した発現が、化合物の投与後の、運動ニューロン数の増加、細胞体萎縮（soma atrophy）の低減、および神経突起長の伸張からなる群より選択されるが、これらに限定されない、患者の運動ニューロンへの影響をもたらす。種々の態様において、運動ニューロンは、患者の運動皮質、脳幹もしくは脊髄、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００３６】
別の例示的面において、筋萎縮性側索硬化症の患者のアストロサイトにおける細胞質中毒性顆粒の発現を減少させるのに有効な化合物の投与量形態を含む医薬組成物が提供される。さらに別の例示的態様において、筋萎縮性側索硬化症の患者の運動ニューロンにおいてＭＨＣクラスＩの発現を増加させるのに有効な化合物の投与量形態を含む医薬組成物が提供される。これらの医薬組成物を含むキットもまた提供される。他の面において、筋萎縮性側索硬化症を処置するための医薬の製造を目的とする、これらの医薬組成物の使用が提供される。さらに他の態様において、これらの医薬組成物は、筋萎縮性側索硬化症の処置における使用のために提供される。
【００３７】
本明細書に記載の方法、キット、使用、および医薬組成物は、散発性または家族性筋萎縮性側索硬化症のいずれかの処置のために使用され得て、ヒトの臨床医薬および動物用薬剤の両方に使用され得る。一態様において、散発性または家族性筋萎縮性側索硬化症の処置に使用され得る本明細書に記載の化合物は、筋萎縮性側索硬化症の患者のアストロサイトにおける細胞質中毒性顆粒の発現を減少させるか、またはその活性を低減させるのに有効な化合物である。別の態様において、散発性または家族性筋萎縮性側索硬化症の処置に使用され得る本明細書に記載の化合物は、筋萎縮性側索硬化症の患者の運動ニューロンにおけるＭＨＣクラスＩの発現を増加させるのに有効な化合物である。化合物は、薬物、ペプチド、および核酸、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００３８】
標的とされる細胞質中毒性顆粒は、運動ニューロンに対して毒性の任意のアストロサイト細胞質中毒性顆粒であり得て、パーフォリン類(例えば、パーフォリン１)およびグランザイム類(例えば、グランザイムＢ)が含まれるが、これに限定されない。一態様において、グランザイムはグランザイムＡではない。パーフォリン類およびグランザイム類の発現または活性は、患者を、筋萎縮性側索硬化症の患者のアストロサイトにおける細胞質中毒性顆粒の発現または活性を低減させる薬物、ペプチドもしくは核酸、またはそれらの組み合わせで処置することにより低減され得る。例えば、パーフォリンのような細胞質中毒性顆粒の活性を低減する化合物には、Ｃａ２＋錯化剤が含まれる。別の態様において、筋萎縮性側索硬化症の患者のアストロサイトにおける細胞質中毒性顆粒の発現は、細胞質中毒性顆粒の発現を阻害する、アンチセンスＲＮＡ分子、siRNA、shRNAまたはmiRNAのような核酸を含む医薬組成物、例えばパーフォリンまたはグランザイムを用いて患者を処置することにより低減され得る。パーフォリン発現または活性の阻害剤にはまた、コンカナマイシンＡ(液胞型H(+)−ATPase (V−ATPase)阻害剤)、バフィロマイシンＡ１(液胞型 H(+)− ATPase (V−ATPase) 阻害剤)、デストラキシンＥ(液胞型 H(+)−ATPase (V−ATPase) 阻害剤)、プロジギオシン２５−Ｃ (液胞型 H(+)−ATPase (V−ATPase) 阻害剤)、サイトカラシンＤ(アクチン重合の阻害剤)、アンチマイシンＡおよびオリゴマイシンＡ(呼吸阻害剤)、カルフォスチンＣ (タンパク質キナーゼ阻害剤)、ハービマイシンＡ(タンパク質キナーゼ阻害剤)、K252a (タンパク質キナーゼ阻害剤)、スタウロスポリン(タンパク質キナーゼ阻害剤)、ジヒドロフロ[3,4−c]ピリジノン類、１−アミノ−２，４−ジシアノピリド[1,2−a]ベンゾイミダゾール類、イソベンゾフラン−１ (３Ｈ)−オン類(パーフォリン誘導性溶解の小分子阻害剤)。アポリポタンパク質Ｂ (ヒト血清中のパーフォリン阻害剤タンパク質)、スラミン、およびグリコサミノグリカン類(その受容体へのLDLの結合をなくして、パーフォリンの溶解作用を阻害する)も含まれる。グランザイムＢ発現の阻害剤にはまた、グランザイムＢ阻害剤Ｉ(Z−AAD−CMK、C19H24C1N307、ヒトおよびマウスグランザイムＢの弱い阻害剤)、グランザイムＢ阻害剤ＩＩ(Ac−IETD−CHO、C21H34N4O10、グランザイムＢおよびカスパーゼ−8の強力な可逆的阻害剤)、細胞透過性のグランザイムＢ阻害剤ＩＩ (Ac− AAVALLPAVLLALLAP−IETD−CHO、C95H162N20O26、カスパーゼ−8およびグランザイムＢの強力な細胞透過性の可逆的阻害剤)、グランザイムＢ阻害剤ＩＩＩ(Z− IE(OMe)TD(OMe)−FMK、C30H43FN4O11、カスパーゼ−8およびグランザイムＢの強力な細胞透過性の可逆的阻害剤)、グランザイムＢ阻害剤ＩＶ(Ac−IEPD−CHO、C22H34N409、グランザイムＢおよびカスパーゼ−8の可逆的阻害剤)、グランザイムＢ阻害剤 (Ac−ESMD−CHO、C19H30N4O1 OS、グランザイムＢおよびカスパーゼ−8の可逆的阻害剤)、ヒトプロテイナーゼ阻害剤９ (PI−9)(8−10)、ならびにセリンプロテアーゼ阻害剤６ (Sip6)が含まれる。
【００３９】
患者へのアンチセンスＲＮＡ分子、siRNA、shRNA、またはmiRNAの好適な送達方法には、細菌またはウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターが含まれる。かかるＲＮＡ分子の例は、本明細書に記載の配列番号１および配列番号２の核酸であって、家族性または散発性筋萎縮性側索硬化症の患者由来のＳＯＤ１ G93A  アストロサイトまたはアストロサイトにおける、パーフォリン１またはグランザイムＢそれぞれの発現を効率的に低減させ、アストロサイトに暴露された運動ニューロンにおける運動ニューロン毒性の効果的な抑制をもたらす(実施例４を参照のこと)。
【００４０】
別の態様において、筋萎縮性側索硬化症の処置に使用され得る本明細書に記載の化合物は、筋萎縮性側索硬化症の患者の運動ニューロンにおけるＭＨＣクラスＩの発現を増加させるのに有効な化合物である。該化合物は、薬物、ペプチド、および核酸、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。１つの例示的態様において、運動ニューロンにおけるＭＨＣクラスＩの持続的な発現をもたらし、ＳＯＤ１ G93A  アストロサイトの毒性作用から運動ニューロンを保護すること(実施例６を参照のこと)が本明細書に記載される組織適合複合体Ｈ２Ｋをコードする配列番号３の核酸は、筋萎縮性側索硬化症を処置するために使用され得る。
【００４１】
これらの態様に従い、医薬組成物は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の配列を含むか、またはそれからなる精製された核酸を含んで提供される(表１参照)。精製された核酸はまた、provided comprising 配列番号１、配列番号２、または配列番号３の相補鎖、または配列番号１、配列番号２または配列番号３からなる配列の相補鎖に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含んで提供される。本発明によれば、”高度にストリンジェントな条件”とは、５Ｘ ＳＳＰＥおよび５０％ホルムアミド中、６５℃にてハイブリダイゼーションさせ、６５℃にて０．５Ｘ ＳＳＰＥ中で洗浄することを意味する。高度、低度、および中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、Sambrook et al., “Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)に記載されており、それは引用により本明細書に包含される。いくつかの例示的面において、ハイブリダイゼーションは、核酸の全長に亘って起こる。
【表１】
2015529685.tif 000003
【００４２】
本発明は、単離されたか、または実質的に精製された核酸を含む。“単離された”または“精製された”核酸分子は、化学的に合成されたとき、化学的前駆体または他の化合物を実質的に含まないか、または組み換えＤＮＡ技術により作製されたとき、細胞物質を実質的に含まない。本明細書に記載の種々の態様において、本明細書に記載の方法、組成物およびキットに使用するための核酸は、二本鎖(例えば、アンチセンスＲＮＡ)または一本鎖であってよいが、核酸は典型的に、一本鎖である。
【００４３】
本明細書に記載の方法、使用、医薬組成物およびキットにおける使用のための核酸は、置換、欠失、切断（truncation）により修飾されて得て、および／または他の核酸分子と融合して、配列番号１、配列番号２または配列番号３の核酸の相補鎖に高度にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸を生じ得て、該修飾された核酸は、本明細書に記載の方法または使用に有用である。ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、およびメチルホスホネート誘導体のような誘導体もまた製造され得る(Goodchild, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:4143−4146 (1986)、引用により本明細書に包含される)。
【００４４】
別の態様において、核酸分子は、配列番号１、配列番号２または配列番号３に、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の相同性を有して提供される。配列間の同一または類似度の決定は、例えば、ＧＡＰプログラム (Genetics Computer Group、ソフトウェア；現在、Accelrys により利用可能。http:／／www.accelrys.com)を用いることにより実施可能であり、アライメントは、例えば、ClustalW アルゴリズム (VNTI ソフトウェア、InforMax Inc.)を用いて行うことができる。配列データベースは、目的の核酸配列を用いて検索することができる。データベース検索のためのアルゴリズムは、典型的には、BLAST ソフトウェアに基づく(Altschul et al., 1990)。いくつかの態様において、同一性パーセントは、核酸の全長に沿って決定され得る。
【００４５】
本明細書に記載の核酸、例えば配列番号１、配列番号２、または配列番号３、またはそれらのフラグメントの核酸の合成技術は、当技術分野で公知であり、化学合成法が含まれる。かかる方法は、Sambrook et al., “Molecular Cloning：A Laboratory Manual”, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)に記載されており、引用により本明細書中に包含される。本明細書に記載の方法に使用するための核酸は、商業的に作製されてよい。本明細書に記載の核酸の精製または単離方法は、当技術分野で公知である。かかる方法は、Sambrook et al., “Molecular Cloning：A Laboratory Manual”, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)に記載されており、引用により本明細書中に包含される。
【００４６】
一態様において、アストロサイトにおけるパーフォリン類またはグランザイム類の発現を低減させるか、または運動ニューロンにおけるＭＨＣクラスＩの発現を誘導するための本明細書に記載の化合物(すなわち、薬物、ペプチド、または核酸)は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体と共に製剤として投与され得る。担体は、添加剤であり得る。担体の選択は、特定の投与方法、溶解性および安定性に対する担体の効果、ならびに投与量形態の特性などの因子に大きく依存し得る。化合物の送達に好適な医薬組成物、または化合物と共に投与されるべきさらなる治療剤、およびそれらの製造方法は、当業者に容易になされ得る。かかる組成物およびそれらの製造方法は、例えば、Remington：The Science & Practice of Pharmacy, 21st Edition (Lippincott Williams ＆ Wilkins, 2005)に見出され得て、引用により本明細書中に包含される。
【００４７】
一態様において、薬学的に許容される担体は、生理学的に適合する、任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等から選択され得る。いくつかの態様において、担体は、非経腸投与に適する。薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の製造のための滅菌粉末を含む。補助的に活性化する化合物もまた、本発明の医薬組成物に組み込まれ得る。
【００４８】
種々の態様において、液体製剤は、懸濁液および溶液を含み得る。かかる製剤は、担体、例えば、水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、または好適な油、および１種またはそれ以上の乳化剤および／または懸濁化剤を含み得る。液体製剤はまた、固体の、例えば凍結乾燥物の再構成によりにより製造され得る。従って、一態様において、凍結乾燥物は、再構成可能な凍結乾燥製物であり得る。
【００４９】
１つの例示的面において、懸濁水溶液は、活性物質を適当な添加剤と混合して含み得る。かかる添加剤は、懸濁化剤であり、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガム；天然のフォスファチド、例えばレシチンであってよい、分散剤または湿潤剤；アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物、例えばポリオキシエチレンステアラート；エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、例えばヘプタデカエチレン−オキシセタノール；エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルとの縮合物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート；または、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである。懸濁液はまた、１つもしくはそれ以上の防腐剤、例えば、アスコルビン酸、エチル、ｎ−プロピル、またはｐ−ヒドロキシ安息香酸塩；または１つもしくはそれ以上の着色剤を含んでいてよい。他の態様において、等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール類、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムは、医薬組成物に包含され得る。
【００５０】
１つの態様において、添加剤はバッファーを含む。一態様において、バッファーのｐＨは、約５．０から約８．０である。バッファーは、記載のｐＨ範囲および生理的に適合性の許容されるバッファーであり得る。さらに、バッファーは、安定化剤としてもさらに作用し得る。一態様において、バッファーは、アスコルビン酸バッファー、ソルベートバッファー、ギ酸バッファー、乳酸バッファー、フマル酸バッファー、酒石酸バッファー、グルタミン酸バッファー、酢酸バッファー、クエン酸バッファー、グルコン酸バッファー、ヒスチジンバッファー、リンゴ酸バッファー、リン酸バッファーまたはコハク酸バッファーを含む。
【００５１】
一面において、本明細書に記載の化合物(すなわち、薬物、ペプチド、または核酸)、またはさらなる治療剤は、血液、筋肉、または組織内に直接投与され得る。非経腸投与に好適な経路は、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、および皮下送達を含む。好適な非経腸投与のための経路は、注射(極微針を含む)、無針注射および点滴技術を含む。非経腸投与量形態の例は、等張食塩水中の活性剤、グルコース (例えば、５％グルコース溶液)、または他の公知の薬学的に許容される液体担体、例えば液体アルコール、グリコール、エステル、およびアミドの水溶液を含む。注射可能組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって実現し得る。
【００５２】
本発明は、本明細書に記載の医薬組成物を含むキットもまた意図する。別の態様において、滅菌バイアル、上記の態様のいずれか１つの医薬組成物、および筋萎縮性側索硬化症の患者を処置するための組成物の使用を記載する使用のための指示書を含むキットが記載される。
【００５３】
別の態様において、化合物または組成物が再構成可能な凍結乾燥物である上記の態様のキットが記載される。
別の態様において、医薬組成物中の化合物の用量が１から５μｇ／ｋｇである、上記のキットの態様のいずれかが記載される。
別の態様において、医薬組成物中の化合物の用量が１から３μｇ／ｋｇである、上記のキットの態様のいずれかが記載される。
【００５４】
別の態様において、化合物の純度が少なくとも９０重量％である、上記のキットの態様のいずれかのキットが記載される。別の態様において、化合物の純度が少なくとも９５重量％である、上記の態様のいずれかのキットが記載される。別の態様において、化合物の純度が少なくとも９８重量％である、上記のキットの態様のいずれかのキットが記載される。別の態様において、化合物の純度が少なくとも９９重量％である、上記のキットの態様のいずれかのキットが記載される。
【００５５】
別の例示的側面において、化合物または組成物が非経腸投与量形態である、上記のキットの態様のいずれかのキットが記載される。非経腸投与量形態は、皮内投与量形態、皮下投与量形態、筋肉内投与量形態、腹腔内投与量形態、静脈内投与量形態、および髄腔内投与量形態からなる群より選択され得る。さらに別の態様において、キットは組成物を含んでいてよく、組成物は薬学的に許容される担体をさらに含んでいてよい。薬学的に許容される担体は、生理食塩水、グルコース、アルコール類、グリコール類、エステル類、アミド類、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される液体担体であり得る。
【００５６】
化合物を投与するための効果的なレジメンが用いられ得る。例えば、化合物は、単回用量で投与され得るか、または一日複数用量のレジメンとして分割して投与され得る。さらに、例えば、１週間に１日から５日だけ投与するような変則的な（staggered）レジメンが毎日の処置の代わりに用いられることもあり、本明細書に記載の医薬組成物、キット、方法、および使用の目的に関して、かかる間欠的または変則的レジメンは、毎日の処置と均等であるとみなされ、考慮される。１つの例示的態様において、疾患状態(すなわち、筋萎縮性側索硬化症)を排除するため、または疾患の症状の軽減もしくは安定化のために、化合物の複数回注射で処置される。一態様において、患者は、複数回(好ましくは、約２回から約５０回まで)、例えば、１２〜７２時間または４８〜７２時間の間隔をあけて注射される。さらなる化合物の注射は、最初の注射の数日または数ヶ月後に患者に投与され得て、このような処置は、疾患の再発を防止するか、または疾患の症状の重症度の悪化を防止し得る。
【００５７】
化合物の一日単一投与量は、患者の状態、処置されるべき疾患状態、化合物の純度およびその投与経路および組織分布、ならびに他の治療処置剤の共投与の可能性によって顕著に代わり得る。患者に投与されるべき有効量は、体表面積、質量、および患者状態の医者による評価に基づく。有効用量は、例えば、約１ｎｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇから約５００μｇ／ｋｇ、および約１μｇ／ｋｇから約１００μｇ／ｋｇの範囲であり得る。これらの用量は、患者の平均体重が約７０ｋｇに基づいており、該ｋｇは、患者の体重(質量)についてのｋｇである。一態様において、化合物または医薬組成物は複数回用量形態である。別の態様において、化合物または医薬組成物は、単回用量形態(すなわち、単一用量形態または投与量形態)である。
【００５８】
一態様において、化合物は、約１．０ｎｇ／ｋｇから約１０００μｇ／ｋｇ、約１０ｎｇ／ｋｇから約１０００μｇ／ｋｇ、約５０ｎｇ／ｋｇから約１０００ｇ／ｋｇ、約１００ｎｇ／ｋｇから約１０００ｇ／ｋｇ、約５００ｎｇ／ｋｇから約１０００ｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇから約５００ｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇから約１００ｇ／ｋｇ、約１ｇ／ｋｇから約５０ｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇから約１０ｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇから約５００μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇから約１００μｇ／ｋｇ、約２０μｇ／ｋｇから約２００ｇ／ｋｇ、約１０ｇ／ｋｇから約５００ｇ／ｋｇ、または約５０ｇ／ｋｇから約５００μｇ／ｋｇの用量で投与され得る。全用量は、単回または分割用量で投与されてよく、医師の判断で、本明細書に記載の一般的範囲外でもよい。これらの投与量は、平均的な患者の体重  約７０ｋｇに基づいており、該ｋｇは患者の体重についてのキログラムである。医師は、重量がこの範囲から外れている対象（例えば、乳幼児および高齢者）に対する用量を容易に決定することができる。
【００５９】
別の態様において、化合物は、約１μg／ｍ２から約５００ｍｇ／ｍ２、約１μg／ｍ２から約３００ｍｇ／ｍ２、または約１００μg／ｍ２から約２００ｍｇ／ｍ２の用量で投与され得る。他の態様において、化合物は、約１ｍｇ／ｍ２から約５００ｍｇ／ｍ２ 、約１ｍｇ／ｍ２から約３００ｍｇ／ｍ２、約１ｍｇ／ｍ２から約２００ｍｇ／ｍ２、約１ｍｇ／ｍ２から約１００ｍｇ／ｍ２、約１ｍｇ／ｍ２から約５０ｍｇ／ｍ２、または約１ｍｇ／ｍ２から約６００ｍｇ／ｍ２の用量で投与され得る。全用量は、単回用量または分割用量で投与されてもよく、医師の裁量で本明細書に記載の典型的な範囲から外れていてもよい。これらの投与量は体表面積（ｍ２）に基づく。
【００６０】
別の態様において、医薬組成物および／または投与のための化合物の投与量形態は、少なくとも約９０％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％、または約９９．５％の純度の化合物から製造される。別の態様において、医薬組成物および／または投与のための化合物の投与量形態は、少なくとも９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％、または９９．５％の純度の化合物から製造される。化合物の純度は、種々のクロマトグラフィーまたは分光学的技法、例えば、高圧もしくは高速液体クロマトグラフィー、核磁気共鳴分光法、TLC、UV吸光分光法、蛍光分光法などを含むいずれかの従来技法を用いて測定され得る。
【００６１】
本明細書で用いる通り、純度決定は、重量パーセント、モルパーセントなどに基づいていてよい。加えて、純度決定は、ある特定の所定の成分の不存在または実質的な不存在に基づいていてよい。また、該純度決定は本明細書に記載の方法により製造された化合物および組成物の溶液に適用可能であると理解される。そのような場合、純度測定（重量パーセントおよびモルパーセント測定を含む）は、溶媒を除く溶液の成分に関係する。別の態様において、化合物または医薬組成物は滅菌容器(例えば、バイアル)またはパッケージ、例えばアンプルもしくは密封バイアルで提供される。
【００６２】
別の態様において、本明細書に記載の方法、医薬組成物、使用、およびキットは、以下の実施例を含む。該実施例は、本明細書に記載の本発明の種々の態様のさらなる特徴をさらに説明する。しかしながら、実施例は例示のためのものであって、本明細書に記載の本発明の他の態様を制限すると解釈されるものではないと理解されるべきである。加えて、実施例の他のバリエーションが本明細書に記載の本発明の各種態様に含まれると解されるべきである。
【実施例】
【００６３】
実施例
実施例１．ＡＬＳアストロサイトは、細胞質中毒性顆粒であるパーフォリンおよびグランザイムを発現し、その増加した共局在を示す。
顆粒エキソサイトーシス経路の細胞質の中毒性顆粒は、細胞毒性活性を有する構造的に関係のあるセリンプロテアーゼファミリーである、膜破壊タンパク質であるパーフォリン(例えば、ＰＲＦ１)、およびグランザイムを含み、グランザイムＢ(ＧＺＭＢ)は、その一例であり、強力なアポトーシス促進因子として同定されている。本実施例は、顆粒細胞死経路の細胞傷害性化合物が脊髄の細胞で発現されるかどうかを分析した。図１Ａに示す通り、ＰＲＦ１およびＧＺＭＢタンパク質は両方とも、野生型およびＳＯＤ１ G93Aマウス(筋萎縮性側索硬化症(ALS)の許容された動物モデル)の脊髄においてウェスタンブロット分析により容易に検出され、転写物の存在がＲＴ−ＰＣＲにより確認された。ＰＲＦ１またはＧＺＭＢの全般的発現レベルは、ＳＯＤ１G93A マウスの疾患の進度に伴って変化しなかった(図１Ａ)。
【００６４】
アストロサイトおよびミクログリアの両方は、運動ニューロン(ＭＮ)に対する細胞毒性を示し、ＧＺＭＢおよびＰＲＦ１の細胞型特異的発現が決定された。ミクログリアはＧＺＭＢを発現したが、ＰＲＦ１を発現しなかった。しかしながら、両タンパク質の共発現がアストロサイトで検出され、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、これらの発見が転写レベルで確認された(図１Ｂ参照)。ＲＮＡ分析は、アストロサイトにおけるＰＲＦ１およびＧｚｍｂの両方の発現を明らかにしたが、ミクログリアではＰＲＦ１は発現されなかった。ＰＲＦ１およびＧｚｍｂの発現は、野生型およびＳＯＤ１ G93A マウスの両方の脊髄において見出された(図１Ｇ参照)。初代およびＮＰＣ由来の両方のアストロサイトはＰＲＦ１およびＧｚｍｂを発現するが、一方、ミクログリアは、Ｇｚｍｂのみを発現した(図１Ｈ参照)。驚くべきことに、ＰＲＦ１およびＧＺＭＢは、ＳＯＤ１ G93A アストロサイトの細胞質において共局在するが、野生型アストロサイトでは共局在しなかった(図１Ｃ参照)。ＰＲＦ１およびＧＺＭＢの細胞質共局在は、細胞内ビークルにおける両細胞傷害性因子の貯蔵を示し、能動的顆粒エキソサイトーシス経路の前提条件が、両因子の相乗作用による顆粒放出に依存することを示唆する。
【００６５】
ＰＲＦ１およびＧＺＭＢの増加レベルはまた、ＳＯＤ１ G93A マウスの脊髄に存在するアストロサイトにおいてインビボで観察され、これらの２つのタンパク質は実質的に共局在している(図１Ｄ参照)。脾臓細胞のＰＲＦ１およびＧＺＭＢの免疫染色は、両細胞傷害性タンパク質のロバストかつ特異的なシグナルを明らかにした(図１Ｉ参照)。ＰＲＦ１およびＧＺＭＢの連続染色プロトコルは、ＳＯＤ１ G93A アストロサイトにおけるこれらの２つの細胞傷害性タンパク質の検出を可能にした(図１Ｊ参照)。両抗体、ＰＲＦ１およびＧＺＭＢは、ウサギに免役して得られたため、連続染色は、これらの２つの抗体が組み合わされて、かつ特異的に検出されるのを可能にする。
【００６６】
重要なことには、ＭＮに毒性を伝える公知の能力を有するＡＬＳ患者由来のアストロサイトを含む、対照およびＡＬＳ患者からのヒト死後ＮＰＣ由来のアストロサイトは、ＰＲＦ１およびＧＺＭＢを発現することが示された(図１Ｅ参照)。ＳＯＤ１ G93A マウスからのアストロサイトと同様に、ＡＬＳ患者の脊髄におけるアストロサイトは、細胞質顆粒と一致するパターンでＰＲＦ１およびＧＺＭＢを含むが、両タンパク質は、非罹患対照では実質的に存在しなかった(図１Ｆ参照)。まとめると、本実施例は、マウスおよびヒトアストロサイトが、細胞傷害性タンパク質ＰＲＦ１およびＧＺＭＢを能動的顆粒細胞死経路と一致する細胞内局在パターンで含むことを実証する。
【００６７】
さらに、アストロサイトにおけるＧｚｍａおよびＧｚｍｂの発現レベルを分析した。ＳＯＤ１アストロサイトは、Ｇｚｍｂを高レベルで発現したが、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ (図１４Ａ)および定量的ＲＴ−ＰＣＲ (図１４Ｂ；全ての群についてn＝2)により示される通り、Ｇｚｍａは低レベルであった。Ｇｚｍｂレベルはまた、ＷＴアストロサイトと比べてＳＯＤ１アストロサイトで高かった(図１４ＡおよびＢ)。
【００６８】
実施例２．ＡＬＳアストロサイトは、パーフォリンおよびグランザイムＢを運動ニューロン中に放出する。
本実施例は、ＳＯＤ１ G93A アストロサイトが、ＰＲＦ１およびＧＺＭＢをＭＮ中に放出する能力を有するかどうかを、インビトロ培養システムを用いてアストロサイトの共培養したＭＮに対する毒性を調べることにより調査した。ＭＮは、ＭＮおよびアストロサイトの共培養における視覚的な差異を可能にする、運動ニューロン特異的なＨＢ９プロモーターの制御下にＧＦＰを発現するｍＥＳ細胞に由来した。ＳＯＤ１ G93A マウスから単離されたアストロサイトの融合層上に培養したＭＮにおいて、細胞質型および膜結合型ＰＲＦ１およびＧＺＭＢタンパク質は、プレーティング後２４時間より早く可視化されるが、一方、野生型アストロサイトと共培養したＭＮは、この時点で如何なるシグナルも示さなかった。この差異は、共培養の時間経過に亘って維持されて、培養の１２０時間後、ＳＯＤ１ G93A アストロサイト上で培養したＭＮにおけるＰＲＦ１およびＧＺＭＢタンパク質の実質的な蓄積をもたらすが、一方、両タンパク質は、野生型アストロサイト上で培養したＭＮには本質的に存在しないままであった(図２Ａ参照)。ＰＲＦ１(図２Ｇ)およびＧＺＭＢ(図２Ｈ)のレベルを、図２Ａに示す通り、野生型またはＳＯＤ１ G93A アストロサイトと共培養されたＭＮにおいて異なる時間点で分析した。
【００６９】
ＳＯＤ１変異体を過剰発現する非ＡＬＳ対照アストロサイトは、ＰＲＦ１およびＧＺＭＢを運動ニューロン中に放出する。ＭＮに毒性を伝えることが示されている、ＳＯＤ１ G93A または Ａ４Ｖ変異タンパク質を過剰発現する非ＡＬＳ対照アストロサイト(1800)は、ＰＲＦ１およびＧＺＭＢをＭＮに放出する。ＰＲＦ１およびＧＺＭＢは、培養の１２０時間後、非ＡＬＳ対照アストロサイトと共培養したＭＮに存在しないままである(図２１参照)。
【００７０】
エフェクターから標的細胞へのＧＺＭＢのパーフォリン仲介性移動は、標的細胞の膜に膜孔様構造を形成することを伴うと考えられる。故に、ＳＯＤ１ G93A アストロサイトとＭＮの相互作用を、３次元撮像能を有する共焦点顕微鏡技術を用いて調べた。
【００７１】
図２Ｂに示す通り、ＰＲＦ１染色は、ＳＯＤ１ G93A アストロサイトと標的ＭＮとの間の細胞間空間の膜孔様構造と共局在した。野生型アストロサイトとＭＮの共培養において、かかる構造は存在しなかった。脊髄切片において、ＰＲＦ１およびＧＺＭＢは、ＳＯＤ１ G93AのＭＮ内に存在するが、野生型マウスのＭＮには存在せず、故に、インビボでの発見が確認された(図２Ｃおよび２Ｄ参照)。３次元画像は、共焦点顕微鏡を用いて得られ、野生型アストロサイトと共培養することによりＭＮにおけるＰＲＦ１染色の欠如を示した(図２Ｊ参照)。
【００７２】
ＡＬＳアストロサイトによるＰＲＦ１およびＧＺＭＢの能動的エキソサイトーシスを確認するために、リソソーム関連膜糖タンパク質LAMP−l／CD107A (すなわち、細胞傷害性リンパ球における、この方法のプロトタイプのマーカー)の発現を決定した。LAMP−1／CD107Aは、野生型細胞と比較してＳＯＤ１G93A 脊髄細胞において実質的に上方制御され、故に、急速な脱顆粒が示唆される(図２Ｅ参照)。この観察と一致して、CD107Aレベルは、ＳＯＤ１G93A マウスにおける疾患の進行に伴い増加した。重要なことには、細胞表面 CD107Aは、インビトロおよびインビボの両方において、ＳＯＤ１G93A アストロサイトでのみ増加し、野生型細胞では増加しなかった(図２Ｆ参照)。増加した脱顆粒は、運動ニューロンとの共培養時にＳＯＤ１G93A アストロサイトで観察された。ウェスタンブロット分析は、初代およびＮＰＣ由来のＳＯＤ１G93A アストロサイトの両方が、野生型アストロサイトと比較して、細胞傷害性タンパク質の脱顆粒の指標である、高レベルのCD107A発現を示すことを明らかにした(図２Ｋ参照)。アストロサイトと共培養したＭＮの免疫蛍光染色は、CD107A発現がＭＮの周囲のＳＯＤ１G93A アストロサイトに顕著であることを示した(図２Ｌ参照)。
【００７３】
実施例３．パーフォリンおよびグランザイムＢは、ヒトＡＬＳ脊髄の運動ニューロンに特に見出される。
マウスモデルにおける結果と一致して、ＰＲＦ１およびＧＺＭＢの実質的な量は、FALS及びSALS患者の脊髄のＭＮにおいて検出されたが、罹患していない対照では検出されなかった（図３Ａ参照）。ヒト脊髄におけるＰＲＦ１またはＧＺＭＢについて陽性のＭＮ数の定量分析は、FALSおよびSALSの両方におけるＭＮの高陽性率を示し、いくつかのサンプルにおいて最大１００％の細胞が両タンパク質を含んだ(図３Ｂおよび３Ｃ参照)。ＡＬＳアストロサイトとＭＮのインビトロにおける共培養システムならびにマウスおよびヒトの両方のＡＬＳ脊髄から得られたこれらの観察は、ＡＬＳアストロサイトが積極的にＰＲＦ１およびＧＺＭＢを脱顆粒し、次いで、これらの細胞のパーフォリンにより仲介されるＭＮへの取り込みを示唆する。
【００７４】
実施例４．ＡＬＳアストロサイトは、パーフォリンおよびグランザイムＢを運動ニューロンを殺すために利用する。
本実施例において、ＡＬＳアストロサイト仲介性ＭＮ毒性におけるＰＲＦ１／ＧＺＭＢ経路の機能的重要性を決定した。まず、アストロサイトにおけるＰＲＦ１およびＧＺＭＢの発現を効率的に排除することが可能なshRNAを同定した。ＳＯＤ１G93A アストロサイトにおけるＰＲＦ１およびＧＺＭＢ発現の排除は、共培養中のＭＮのほぼ完全な保護をもたらした(図４ＡおよびＢ参照)。この保護作用は、より多くの生存ＭＮ数(図４Ｂ参照)、細胞体萎縮（soma atrophy）の減少(図４Ｃ参照)、および伸張した神経長(図４Ｄ参照)により明らかである。この保護作用の特異性は、スクランブルshRNA対照で処理したＳＯＤ１G93A アストロサイトの不変のＭＮ数に対する毒性により確認され、共培養の２０時間以内にＭＮの８０％の細胞死がもたらされた。
【００７５】
パーフォリンおよびグランザイムＢのShRNAノックダウンは、アストロサイトで検出された。ウェスタンブロット分析は、ＰＲＦ１ shRNA (図４Ｋ) およびＧＺＭＢ shRNA (図４Ｌ)でのレンチウイルスを用いた形質導入によるマウスＳＯＤ１G93A アストロサイトにおけるＰＲＦ１およびＧＺＭＢタンパク質の発現の減少を示した。ＰＲＦ１ shRNAおよびＧＺＭＢ shRNAは、用いた全てのヒト アストロサイトにおいて、ＰＲＦ１およびＧＺＭＢ発現を抑制した(図４Ｍ)。
【００７６】
さらに、FALSおよびSALS患者由来のアストロサイトにおける、shRNA−仲介性のＰＲＦ１およびＧＺＭＢ発現の排除は、共培養で効果的にＭＮを保護し、細胞体萎縮（soma atrophy）に顕著な効果を示し、神経突起の短縮をもたらした(図４Ｅ〜４Ｊ参照)。まとめると、これらの結果は、マウスおよびヒトの両方のFALSおよびSALSアストロサイトは、細胞傷害性タンパク質であるＰＲＦ１およびＧＺＭＢを利用してＭＮを殺すことを示唆する。これらのタンパク質のアストロサイトにおける発現を抑制することは、ＡＬＳアストロサイトによるＭＮ毒性を弱毒化させる。
【００７７】
さらに、ＡＬＳアストロサイト馴化培地中のＰＲＦ１およびＧＺＭＢは、ＭＮに対して毒性である。ＰＲＦ１およびＧＺＭＢ発現のＳＯＤ１ アストロサイトにおけるノックダウンは、ＭＮの生存を増加させ(図１０Ａおよび１０Ｂ) (Ｂ；全ての群についてｎ＝３、各ｎをトリプリケートで行った)、ＳＯＤ１ アストロサイト馴化培地の存在下で培養されたとき通常観察される、神経突起(図１０Ｃ)および細胞体サイズ(図１０Ｄ)の退縮を阻止した(図１０ＣおよびＤ；全ての群についてｎ＝１００)。ＳＯＤ１ アストロサイト馴化培地の存在下、ＰＲＦ１およびＧＺＭＢは、ＭＮの細胞体で容易に検出された(図１０Ｅ−Ｆ)。ＭＮの生存率の用量依存的増加が、ＳＯＤ１ アストロサイト馴化培地に添加したＰＲＦ１およびＧＺＭＢ中和抗体の存在下で観察された(図１０Ｇ)。抗体補充なしのＳＯＤ１ アストロサイト馴化培地を、統計分析用の参照群として用いた。点線は、５０％度数を示す（図１０ＣおよびＤ）。スケールバーは、２００μｍ (図１０Ａ)、５μｍ(図１０Ｅ)である。エラーバーは、標準誤差を示す。**P＜0.01、****P＜0.0001。n.s、有意ではない。Scr、スクランブルshRNA。
【００７８】
さらに、アストロサイトにおけるＰＲＦ１およびＧＺＭＢレベルの下方制御は、ヒトＳＯＤ１のレベルもＳＯＤ１ アストロサイトで観察される炎症性プロファイルも変化させなかった。ウェスタンブロット分析は、ＳＯＤ１アストロサイトにおけるＰＲＦ１およびＧＺＭＢ shRNAの発現により、同レベルのヒトＳＯＤ１を示した(図１２Ａ)。炎症性遺伝子アレイは、ＰＲＦ１およびＧＺＭＢのノックダウンによるＳＯＤ１アストロサイトの炎症性プロファイルの明白な変化を示さなかった(図１２Ｂ)。ヒートマップは、独立して収集されたサンプルを用いて２つの遺伝子アレイの平均倍数変化を示す。
【００７９】
また、ＳＯＤ１G93A アストロサイトにターゲティングしたヒトＳＯＤ１は、ＰＲＦ１およびＧＺＭＢの共局在の減少レベルをもたらした。ウイルスベクターによるshRNA 送達によりＳＯＤ１ アストロサイトにおいてヒトＳＯＤ１発現のノックダウンレベルが、ＥＬＩＳＡ(図１３Ａ；全ての群についてｎ＝２)およびウェスタン分析(図１３Ｂ)により示された。ＳＯＤ１ shRNA発現により、ＰＲＦ１およびＧＺＭＢの共局在レベルは、細胞あたりの個々の顆粒の数に影響を与えることなく(図１３ＤおよびＧ)、インビトロ (図１３Ｃ−Ｅ)およびインビボ(図１３Ｆ−Ｈ)の両方で有意に減少した。白色矢先は、ＰＲＦ１およびＧＺＭＢの共局在顆粒を示す。スケールバーは、５μｍである。エラーバーは、標準誤差を示す。****P＜0.0001。n.s、有意ではない。Scr、スクランブルshRNA。
【００８０】
実施例５．ＡＬＳアストロサイトは、ＮＫ様の細胞特性を示す。
ＰＲＦ１／ＧＺＭＢ細胞死経路の積極的使用により、ＡＬＳアストロサイトはＮＫ細胞の機能的特性を採用している。細胞表現型におけるこの明らかな変化の程度を特徴付けるために、本実施例は、ＡＬＳアストロサイトにおけるＮＫ細胞関連マーカーの大規模シリーズの発現レベルを評価した。ＳＯＤ１G93A アストロサイトは、２つのプロトタイプのＮＫマーカーである、ＣＤ５６およびＣＤ５７をロバストレベルで発現し、それらは、野生型アストロサイトでは最小限に発現されている(図５Ａ参照)。さらに、ＮＫ活性化に関与することが知られている受容体、リガンド、および仲介シグナル伝達タンパク質を含む大規模な遺伝子セットの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＳＯＤ１G93A アストロサイトにおけるこれらの遺伝子の大部分の上方制御を明らかにしたが、野生型対照では上方制御されなかった(図５Ｂ参照)。
【００８１】
ＮＫ細胞は、非感染細胞から感染細胞を同定する能力を必要とする、ウイルス感染に対する宿主防御機構を効率的に媒介する特定の機序を進化させてきた。通常、ＮＫ細胞表面上の阻害受容体と、内生細胞により提示される主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原の相互作用は、ＮＫ細胞活性の抑制をもたらす。しかしながら、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）などの特定のウイルスによる感染は、ＮＫ細胞毒性を誘発する、感染細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ抗原の提示を抑制する。ＡＬＳアストロサイトが、ＭＨＣクラスＩ抗原と相互作用する能力を含む、同様の特性を獲得したかどうかを決定するために、ＭＨＣクラスＩ阻害受容体LY49CおよびLY49Iの存在を評価した。両受容体は、インビトロで培養したＳＯＤ１G93A アストロサイトにおいて高度に発現されるが、野生型アストロサイトには存在しなかった(図５Ｃ参照)。遺伝子発現分析は、ＳＯＤ１G93A アストロサイトにおけるＮＫ細胞関連マーカー細胞シグナル伝達経路の活性化を明らかにした(図５Ｈ参照)。
【００８２】
タンパク質および転写レベルの両方のインビボ分析は、脊髄およびＳＯＤ１G93A マウスのアストロサイトにおけるLY49CおよびLY49Iの実質的な発現を確認したが、対照マウスのこれらの組織には存在しなかった(図５Ｄ参照)。ＭＨＣクラスＩ受容体は、FALSおよびSALS患者由来の死後サンプルから得られたＮＰＣ由来のアストロサイトに存在した(図５Ｅおよび５Ｆ参照)。ヒトＡＬＳアストロサイトにおける１４種のＭＨＣクラスＩ受容体の発現を評価した。キラー細胞の免疫グロブリン様受容体 3DL2(KIR3DL2)、ＭＨＣクラスＩ阻害受容体は、評価された全てのFALSおよびSALSアストロサイト株において特異的かつ高度に発現されていたが、正常な対照細胞では発現されなかった(図５Ｆ参照)。免疫染色は、ＡＬＳ患者の脊髄内のアストロサイトにおけるKIR3DL2の高度なレベルを確認したが、健常対照では確認されなかった。これらの結果は、ＡＬＳアストロサイトが、ＮＫ細胞と同様にパーフォリン／グランザイム細胞死経路を活性化するだけでなく、ＭＨＣクラスＩ阻害受容体の発現を含む多くの他のＮＫ細胞特性を採用することを示唆する。
【００８３】
実施例６．ＭＨＣクラスＩの下方制御は、運動ニューロン死と関係している。
ＡＬＳアストロサイトの表面上に発現するＭＨＣクラスＩ阻害受容体は、ＮＫ細胞様の標的細胞との相互作用を、ＭＮ誘発性ＡＬＳアストロサイト毒性によるＭＨＣクラスＩの低減した提示と共に仲介し得る。まず、ＭＨＣクラスＩ受容体のＭＮ表面上のレベルを、アストロサイトと共培養することにより測定した。野生型アストロサイト上に培養したＭＮは、１２０時間以上、ロバストなＭＨＣクラスＩ発現を維持したが、ＳＯＤ１G93A アストロサイトと共培養したＭＮは、ＭＨＣクラスＩ抗原の迅速かつ顕著な減少を示した(図６Ａ参照)。この減少は、共培養２４時間の時点で有意であり、より長時間の共培養でより顕著となり、共培養の１２０時間の時点で最低のＭＨＣクラスＩ発現であった (図６Ａ参照)。ＳＯＤ１G93A アストロサイトと共培養したＭＮ上のＭＨＣクラスＩ発現の減少は、ＭＮ内のＰＲＦ１／ＧＺＭＢレベルの観察された増加に逆相関した(図２Ａ参照)。
【００８４】
ＡＬＳアストロサイトは、主にＭＮに対して毒性を発揮するが、ＧＡＢＡ作動性ニューロンのような他の神経細胞型には毒性を発揮しないため、ＧＡＢＡ作動性ニューロン表面上のＭＨＣクラスＩのレベルを評価した。ＭＮにて観察された発現変化とは対照的に、ＧＡＢＡ作動性ニューロン中のＭＨＣクラスＩ抗原レベルは、野生型およびＳＯＤ１G93A アストロサイトとの長時間の共培養中、一定であった(図６Ｂ参照)。これらの発見は、ＮＫ細胞と同様に、ＡＬＳアストロサイトがＭＨＣクラスＩ発現のレベルを潜在的標的細胞により認識することを示唆する。さらに、ＡＬＳアストロサイトとの接触は、ＭＨＣクラスＩ受容体の下方制御をＭＮに特異的に引き起こすが、他の神経細胞型には引き起こさないことを明らかにし、これらの細胞が、ＡＬＳにおけるアストロサイト仲介性細胞毒性に対する主要な標的細胞であることを示す。
【００８５】
第二に、ＭＮにおけるＭＨＣクラスＩ発現のこの特定の減少のインビボでの確認を、マウスおよびヒト脊髄標本の両方で調べた。インビトロでの結果と一致して、ＭＨＣクラスＩ染色は、ＡＬＳ患者またはＳＯＤ１G93A マウスの脊髄においてのみ、ＭＮにおけるＭＨＣクラスＩ発現の広範かつ実質的な減少を明らかにし、正常組織では見られなかった(図６Ｃおよび６Ｄ)。ＭＮにおけるＭＨＣクラスＩの劇的な下方制御は、FALSおよびSALS患者の脊髄サンプルにおいても同様に検出され、サンプル中ＭＮの８０から１００％でＭＨＣクラスＩ受容体が不存在であった(図６Ｅ)。
【００８６】
ＡＬＳアストロサイトとの共培養によりＭＮにおいて観察されるＭＨＣクラスＩの減少が、シグナル誘発性のアストロサイトに由来する毒性であったとき、ＭＨＣクラスＩ発現が維持され得れば、ＭＮは該毒性を免れるはずである。この仮説を、組織適合性複合体(H2K)のレンチウイルス送達によるＭＮにおけるＭＨＣクラスＩ受容体の過剰発現により調査した。ＭＮにおけるＭＨＣクラスＩの維持された発現は、生存率が野生型アストロサイトと共培養したＭＮと相違しないように、ＳＯＤ１G93A アストロサイトの毒性作用からこれらを保護した(図６Ｆ−６Ｈ参照)。ＳＯＤ１G93A アストロサイトとの共培養により、表面のＭＨＣクラスＩ染色は、Lv−RFPで形質導入されたＭＮ上のＭＨＣクラスＩの発現低下を示すが、Lv−H2Kで形質導入したＭＮ上でのＭＨＣクラスＩの発現を維持した(図６Ｋ参照)。回復は、ＳＯＤ１G93A アストロサイトと共培養したＭＮの変化しない細胞体サイズおよび神経突起長から明らかであった（図６Ｉおよび６Ｊ参照)。ＭＮにおけるコントロール導入遺伝子である赤色蛍光タンパク質(RFP)の持続的発現は、ＭＮに対するＳＯＤ１G93A アストロサイト仲介性毒性を変化させず、共培養の１２０時間後にＭＮの８０％の細胞死をもたらした。これらの結果は、ＭＮにおけるＭＨＣクラスＩ受容体の構成的発現が、ＡＬＳアストロサイトにより誘導される細胞毒性作用からの保護を提供することを示唆する。
【００８７】
さらに、ＭＨＣＩ発現の下方制御によるＳＯＤ１アストロサイト仲介毒性に対するＧＡＢＡニューロンの増加した感受性が示された。H2−K1のShRNAノックダウンは、ＲＮＡ（図１１Ａ）およびタンパク質発現（図１１ＢおよびＣ）により示される通り、ＧＡＢＡ作動性ニューロンにおけるH2−K1発現の効率的な下方制御をもたらした。ＧＡＢＡ作動性ニューロンにおけるH2−K1の抑制は、ＳＯＤ１ アストロサイトとの共培養によるＰＲＦ１およびＧＺＭＢの発生率増加をもたらした(図１１Ｄ)。ＳＯＤ１ アストロサイトとの共培養の１２０時間後、H2−K1 shRNAで処理したＧＡＢＡニューロンは、 細胞生存率の減少(図１１ＥおよびＦ)、細胞体サイズおよび神経突起長の減少(図１１Ｇ；全ての群についてｎ＝３、各ｎをトリプリケートで行った)により示される通り、ＳＯＤ１仲介性アストロサイト毒性に対する感受性の増加を示した。点線は、５０％度数を示す(図１１Ｇ)。スケールバーは、５μｍ(図１１ＢおよびＤ)、１００μｍ (図１１Ｅ)であった。エラーバーは、標準誤差を示す。**P＜0.01、****P＜0.0001。Scr、スクランブル shRNA。
【００８８】
実施例７．Fas およびFasL シグナル伝達の選択的阻害は、運動ニューロンに対するＳＯＤ１G93A アストロサイト毒性を阻止しない。
Kp7−6を、それがＭＮに対するアストロサイト毒性を阻止するかどうかを決定するために分析した。Kp7−6は、Fas／FasL−により仲介されるアポトーシスを特異的に阻害する。Kp7−6を、ＭＮの共培養の２４時間前にＳＯＤ１G93A アストロサイトに添加し、共培養の全ての時点で維持した。細胞傷害性リンパ球においてFas／FasL 活性の阻害に有効であることが知られているKp7−6濃度では、ＭＮに対するＳＯＤ１G93A アストロサイト由来の毒性は変化しなかった (図７参照) p＜0.001。
【００８９】
実施例８．動物
変異 ＳＯＤ１を発現したトランスジェニックマウス(B6SJL−Tg ＳＯＤ１G93A)は、ジャクソン研究所(Bar Harbor、ME)から入手した。動物を、明／暗(１２：１２時間)サイクル下、餌および水の自由摂取下で飼育した。各世代において、ＳＯＤ１ 導入遺伝子コピー数およびＳＯＤ１ タンパク質発現レベルを、それぞれＰＣＲおよびウェスタンブロット分析により確認した。全ての手順は、ＮＩＨガイドラインに従って実施され、全国小児病院施設内動物管理使用委員会により承認を受けた。
【００９０】
実施例９．アストロサイトのマウス脊髄からの単離
アストロサイトを、１１０から１３０日齢のＳＯＤ１G93A および野生型B6SJL マウスから単離した。アストロサイト培養物を、上記の通りに微細な改変をして行った。簡単には、脊髄を、酵素パパイン (2.5 U／ml；Worthington Biochemical, Lakewood, NJ)、ディスパーゼグレード II (1 U／ml；Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN)およびＤｎアーゼ I (250 U／ml；Worthington Biochemical)の混合物で約２０分間処理して単一細胞に分離させた。７０μＭのナイロンメッシュを用いて濾過後、細胞をペレット状にし、１０％胎仔ウシ血清(FBS、Invitrogen) および０．２％Ｎ２サプリメント (Invitrogen)を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２ (Invitrogen, Carlsbad, CA)中に再懸濁し、７５ｃｍ組織培養フラスコ状に播種した。細胞は、２〜３週間以内にコンフルエント状態になり、この時点で、潜在ミクログリア細胞を除去するために、プレートを一晩振盪した。接着状態のコンフルエントなアストロサイトを、シトシンアラビノース (２０μＭ、Sigma− Aldrich, St。Louis、MO)で４８時間処理して、分割中の細胞を迅速に死滅させた。分析前に、アストロサイト調製物を、細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)およびナチュラルキラー(NK)細胞の存在について試験し、これらの細胞型を欠くことが見出された。
【００９１】
実施例１０．マウス脊髄からのミクログリアの単離
ミクログリアを、１１０から１３０日齢のＳＯＤ１G93A および野生型B6SJL マウスから、上記のプロトコルに従い単離した。簡単には、全脊髄をハンクス平衡塩溶液(HBSS)、pH 7.4中でホモジナイズした。得られたホモジネートを７０μｍのナイロン製セルストレーナーに通して濾過し、 ４００ｇで６分間遠心した。上清を除去し、細胞ペレットを７０％の等張パーコール液 (GE Healthcare, Waukesha, WI)中に室温で再懸濁した。不連続パーコール密度勾配を、７０％、５０％、３５％、および０％の等張パーコール液のように設定した。勾配液を、２０００ｇで２０分間遠心し、ミクログリアを７０％と５０％のパーコール層の間の層から集めた。細胞を洗浄し、次いで、HBSS中に懸濁し、ＲＮＡまたはタンパク質の単離に用いた。分析前に、ミクログリア調製物を、CTLおよびＮＫ細胞の存在について試験し、これらの細胞型を欠くことが見出された。
【００９２】
実施例１１．マウスＮＰＣの単離およびアストロサイトへの分化
ＮＰＣを、ＳＯＤ１G93A および野生型B6SJL マウスの脊髄から、上記の方法に従い単離した。簡単には、脊髄を、酵素パパイン(2.5 U／ml；Worthington Biochemical)、ディスパーゼグレード II (1 U／ml；Boehringer Mannheim Corporation)および Dnアーゼ I (250 U／ml;Worthington Biochemical)の混合物で約２０から３０分間処理して単一細胞に分離させた。７０μＭのナイロンメッシュを用いて濾過後、細胞をペレット状にし、１０％FBSを添加したＤＭＥＭ(Invitrogen)中に再懸濁した。細胞懸濁液を、等量の等張パーコール液(GE Healthcare)と混合し、20,000ｇで３０分間、室温にて遠心した。低浮遊画分(赤血球層上の５−１０ｍｌ)から細胞を集め、D− PBS／PSF (Invitrogen) で完全に洗浄し、６０ｍｍの コーティングされていないプレートに播種した。細胞を、１％ Ｎ２ サプリメント (Invitrogen)、２０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子−２ (FGF−2、Peprotech、Rocky Hill、NJ)および２０ｎｇ／ｍｌの内皮増殖因子(EGF、Peprotech)を添加した増殖培地 (DMEM／F12、Invitrogen)中で増殖させた。プレートに付着した細胞の増殖性クラスターは、約１０から１５日目に出現し始めた。７０〜８０％コンフルエントにて、細胞を、ポリオルニチン−ラミニン (P／L)でコーティングしたプレート上に播種した。これらの増殖条件では、マウスＮＰＣ培養は、アストロサイト、ミクログリア、ＣＴＬおよびＮＫ細胞の混入がないことを確認した。培養を確立した後は、野生型およびＳＯＤ１G93A マウス由来のＮＰＣを、明細書に記載の実験のためのアストロサイトを区別するために用いた。ＮＰＣ由来のアストロサイトを、増殖因子を除き、１０％ＦＢＳ (Invitrogen)を添加した培地を添加して得た。培地を３日毎に交換した。アストロサイトは、実験に用いる前に１０％ＦＢＳ中で７日間成熟させた。高度に濃縮されたアストロサイトを、この方法に従い、ミクログリア、ＣＴＬまたはＮＫ細胞の混入が検出されないレベルで得た。
【００９３】
実施例１２．ヒトの死後のＮＰＣ由来のアストロサイト
この実験に用いるヒトＮＰＣ由来のアストロサイトは、上記の通りである。ヒト組織の受取は、全国小児病院施設内倫理委員会(IRB08−00402、筋萎縮性側索硬化症におけるグリアの役割を調査)により承認を受け、全てのヒトサンプルの使用は、その承認されたプロトコルに従った。死後の脊髄または脳を、死後２４時間から７２時間以内に処理し、ＮＰＣの単離のために用いた。ＮＰＣを滅菌条件下で維持し、組織をダイスカットして、単一細胞懸濁液を、３７℃にて３０から４０分間、2.5 U／mlのパパイン (Worthington Biochemical)、250 U／ml のＤＮase Ｉ (Worthington Biochemical) および 1 U／ml の中性プロテアーゼ (Roche)を用いて組織を酵素的に解離することにより得た。解離後、細胞ペレットを１０％ ＦＢＳ (Invitrogen)を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２ (Invitrogen)に再懸濁し、７０μＭフィルターに通して遠心した。細胞ペレットを１０％ ＦＢＳ (Invitrogen)を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２ (Invitrogen)に再懸濁し、パーコール (GE Healthcare)と１：１で混合した。細胞／パーコール混合物を、２０℃にて、２０,０００ ｇで３０分間遠心し、赤血球細胞層上の低浮力画分(１０ｍｌ)を集めた。細胞を洗浄し、１０％ ＦＢＳ (Invitrogen) 、１０％ ＢＩＴ９５００(Stem Cell Technologies)、１％ Ｎ２ サプリメント (Invitrogen)、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２ (Peprotech)、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ (Peprotech)および２０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＡＢ (Peprotech)を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２ (Invitrogen)を含むＮＰＣ培地に再懸濁した。ＮＰＣを、フィブロネクチン (Chemicon)でコーティングしたプレート上で培養し、２４時間後、培地を血清不含有ＮＰＣ培地に置き換えた。その後、培地の半量を２日毎に交換した。約３から４週間後に６０−７０％のコンフルエンスに達したとき、ＮＰＣを継代した。増殖条件において、本発明者らは、ヒトＮＰＣ培養は、アストロサイト、ミクログリア、ＣＴＬおよびＮＫ細胞の混入がないことを確認した。ＮＰＣ培養が確立された後、アストロサイトの分化を、増殖因子を除去し、かつ１０％ ＦＢＳ (Invitrogen)を含む培地を添加することにより誘導した。これらの条件において、アストロサイトは容易に作製され、２０回以上の継代で維持され得た。培養物が８０％コンフルエンスに達したときにアストロサイトをアストロサイトを３日ごとに継代し、ラミニンでコーティングしたプレート上で維持した。ＮＰＣ由来のアストロサイトに関するデモグラフィック情報のまとめを、表４に示す。
【００９４】
【表２】
2015529685.tif 000004
【００９５】
実施例１３．胚性幹細胞からの運動ニューロンの分化
Hb9 プロモーター により駆動される緑色蛍光タンパク質 (GFP)を発現するマウス胚性幹細胞(mES 細胞) (HBG3 細胞)を用いた。ＥＳ細胞を、不活性化されたマウス線維芽細胞 (Millipore, Billerica, MA)の上で培養した。ＭＮの分化を、２μＭのレチノイン酸 (Sigma− Aldrich)および２μＭのプルモルファミン (Calbiochem, Billerica, MA)の存在下で、１０ｃｍディッシュ当たり１〜２×１０６ のmES細胞を播種することにより誘導した。分化の５日後に、胚体を分離し、FACSVantage／DiVa ソーター (BD Biosciences, Rockville, MD)を用いて、ＧＦＰのレベルに基づいて選別した。
【００９６】
実施例１４．ＧＡＢＡ作動性ニューロンへのＮＰＣの分化
マウスのＮＰＣを、０．１％ ＦＢＳ (Invitrogen)、レチノイン酸（１μΜ、Sigma− Aldrich）、およびフォルスコリン（５μΜ、Sigma− Aldrich）を含む増殖培地を補充することにより、ＧＡＢＡ作動性ニューロンに分化するように誘導した。培地を毎日交換した。培養物を実験に使用する前に７日間分化させた。
【００９７】
実施例１５．アストロサイトとＭＮの共培養
マウスアストロサイトおよびＭＮの共培養実験について、アストロサイトを、ラミニンでコーティングした９６ウェルプレートに、１ウェル当たり４０，０００個の細胞密度で播種した。４８時間後、FACS 選別したGFP+ ＭＮを、１ウェル当たり２，０００個の細胞密度でアストロサイト単層の上に播種した。共培養を、５％ウマ血清 (Equitech Bio、Kerrville、TX)、２％ Ｎ２ サプリメント (Invitrogen)、２％ Ｂ２７ サプリメント (Invitrogen)、１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ (Invitrogen)、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ (Invitrogen)、１０ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦ (Invitrogen)を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２ (Invitrogen)を含むＭＮ培地中で行った。培地の半量を毎日交換して、新鮮な増殖因子を添加した。ヒト アストロサイトおよびＭＮの共培養について、アストロサイトを、ラミニンでコーティングした９６ウェルプレートに１ウェル当たり１０，０００個の細胞密度で播種した。４８時間後、GFP+ ＭＮを、１ウェル当たり１０，０００個の細胞密度でアストロサイトの上に播種した。ＭＮ播種の２４時間後、シトシンアラビノース(１μＭ、Sigma− Aldrich)を、残りの分化中のアストロサイトまたは未分化の胚性肝細胞を排除するために４８時間の間、添加した。培地を毎日交換し、増殖因子を添加した。
【００９８】
実施例１６．ＲＮＡ単離およびＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡを、ＲＴ２ ｑ−ＰＣＲ−gradeＲＮＡ アイソレーションキット (Qiagen, Frederick, MD)を用いて採取し、全ＲＮＡを、ＲＴ２ ファーストストランドキット(Qiagen) を製造業者の指示書に従って用いて逆転写した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲのために、転写物を、以下の遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した。ＰＲＦ１−Ｆ：5'−GTCACGTCGAAGTACTTGGTG−3' ；ＰＲＦ１−Ｒ：5 ' − ATGGCTGATAGCCTGTCTCAG−3' ；gzmb−F：5'−CCTGCCCAGGCGCAATGTCA−3' ；gzmb−R：5'−TGGTCTTTGGGTCCCCCGCA−3' ；Ly49c−F：5'− TCCCACGATGAGTGAGCCA−3'；Ly49c−R：5' −TACCTTTAACTCTAGTTGGAA AA−3' ；Ly49i−F：5'− GATGAATGAGCCGGAGGTC−3' ；Ly49i−R：5'− TTTCACTGTTCCATCTGTCCT−3' ；actb−F：5'−GTGGGCCGCCCTAGGCACCA−3' ；actb−R：5' −CTCTTTGATGTCACGC ACGATTTC− 3'。ヒトのキラー細胞免疫グロブリン様受容体転写物 (KIR)の検出を、上記のプライマーセットを用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定した (Thompson et al., Immuno genetics, Nov 2006, 58, 865)。ナチュラルキラー細胞マーカーを、ＳＯＤ１G93A および野生型由来のアストロサイトにおいて、マウス ナチュラルキラー細胞９６ StellARay (Lonza, Hopkinton, MA)を利用して定量的ＲＴ−ＰＣＲによりアッセイした。この StellARayは、細胞表面受容体、リガンド、シグナル伝達分子、接着分子、細胞毒性の媒介物質、サイトカインおよびサイトカイン受容体を含む、ＮＫ細胞生物学の多くの面に関連する遺伝子の発現を測定する。定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ABI プリズム 7000 (Applied biosystems, Carlsband, CA)を付したRT2 リアルタイム SYBR Green／Rox PCR マスターミックス (Qiagen)を用いてデュプリケートで行った。
【００９９】
実施例１７．免疫細胞化学
細胞、マウス脊髄またはパラフィン包埋されたヒト脊髄サンプルにおいて種々の抗原を可視化するために使用される免疫蛍光染色は、表２に記載の抗体およびそれぞれの希釈率で行われた。ほとんどの抗原に関して、サンプルを、０．１％ トライトン−Ｘ および １０％ ロバ血清を含むＴＢＳ中、最初に室温で１時間インキュベートし、次いで４℃にて４８〜７２時間、一次抗体と共にインキュベートした。種々の蛍光色素に結合した二次抗体での標識化を、室温で２時間行った。パラフィン包埋されたヒト組織におけるＰＲＦ１とＧＺＭＢの検出は、ABCおよびVectorRedキットプロトコル（Vector Laboratories, Burlingame, CA)を用いて、ビオチニル化二次抗体を用いて達成された。組織を、簡単に、ヘマトキシリンQS溶液（Vector Laboratories, Burlingame, CA)を用いて対比染色した。ＭＨＣクラスＩ染色を、上記のプロトコルに従って、軽微な変更を加えて行った。簡単には、細胞透過は、マウス脊髄サンプルについて０．０５％のトリトンＸ、およびヒト脊髄サンプルについて０．１％のサポニンを用いて達成された。一次および二次抗体とのインキュベーションを、任意の界面活性剤を用いることなく、１０％のロバ血清中で行った。インビトロでの表面標識のために、カバースリップ上に細胞を固定し、最初に透過処理せずに、ブロッキングし、室温で１時間、一次抗体と共にインキュベートした。膜の完全性を検証するために、各サンプルを、細胞内タンパク質TUJ1について染色した。TUJ1染色の欠失は、無傷の膜を確認し、陽性のTUJ1染色を有するＭＮを、分析から除外した。免疫染色に用いたヒト脊髄組織に関連するデモグラフィック情報のまとめを表３に示す。
【０１００】
【表３】
2015529685.tif 000005
【表４】
2015529685.tif 000006
【０１０１】
実施例１８．共焦点顕微鏡および３次元画像再構成
全ての画像は、レーザー走査型共焦点顕微鏡(Carl Zeiss Microscopy, Thornwood, NY)を用いて得て、３次元再構成は、LSM 510 ソフトウェア(Carl Zeiss)を用いて得た。
【０１０２】
実施例１９．ＭＮ細胞生存率
アストロサイトとＭＮの共培養における種々の時点にて、ＭＮの細胞生存性、神経突起長および細胞体サイズを、完全自動化 IN CELL 6000 セルイメージャー(GE Healthcare)を用いて記録した。画像を、開発および分析ソフトウェアパッケージ (GE Healthcare)を用いて処理した。
【０１０３】
実施例２０．ウイルスベクター
アストロサイトにおけるＰＲＦ１およびＧＺＭＢレベルをノックダウンするために、ＲＮＡiのコンソーシアムレンチウイルスのshRNAライブラリーからの配列をスクリーニングし、関連するプラスミドをOpen Biosystems社から購入した。クローンTRCN0000077206（CCACTCCAAGGTAGCCAATTT）およびTRCN0000032742（CCTATGGATATAAGGATGGTT）をそれぞれ、マウスのアストロサイトにおいてＰＲＦ１およびＧＺＭＢを標的とするために用いた。
クローン TRCN0000007942(ACCTGAATCATGGCCACCTAA) およびTRCN0000006448(CATTGTCTCCTATGGACGAAA)をそれぞれ、ヒトのアストロサイトにおいてＰＲＦ１およびＧＺＭＢをノックダウンするために用いた。スクランブル shRNAを、ＰＲＦ１(GGCACTACCCGATCTATTACA)およびＧＺＭＢ(GACCGATACTCGCGATATATT)についてのコントロールとして用いた。これらの配列は、文献に記載の通り、超遠心分離により上清から収集した２９３細胞およびウイルスのCaCl2媒介性の一過性トランスフェクションにより製造されたレンチウイルス粒子により送達された(Tiscornia et al., Nat Protoc, 2006, 1, 241)。簡単には、ウイルス粒子は、ヘルパープラスミド、VSV−G、MDLおよびREVの存在下での２９３細胞の一過性トランスフェクションにより製造された。トランスフェクションは、１０分間のCaCl2沈殿、その後のさらに２０時間の培地インキュベーションにより得られた。ウイルス上清を、その後９６時間の間、２４時間毎に集め、ウイルス粒子を、５０，０００ｇで２時間の超遠心分離によりペレットとして得た。ウイルス粒子を等分し、使用するまで−８０℃で凍結保存した。アストロサイトに添加する前に、ウイルス力価を、Quick−titer レンチウイルス定量キットを製造業者の指示に従って用いて得た(CellBiolabs Inc、San Diego、CA、USA)。
【０１０４】
H2K cDNA (Mm24845) を、Genecopia (Rockville、MD) から購入し、レンチウイルスベクターの送達を介してＭＮへ送達された。H2K cDNAを、CMVプロモーター下にクローニングした。RFP発現もまた、レンチウイルス構築物中のIRESの存在により得た。運動ニューロンは、最初に、１個の運動ニューロン当たり、２０個のウイルス粒子を含むレンチ−H2Kで感染させた。H2K発現を、アストロサイト播種の４８時間前に生じさせた。アストロサイト−運動ニューロンの共培養を、さらに１２０時間継続した。アッセイを、２０，０００および６０，０００個の運動ニューロンおよびアストロサイトのぞれぞれを９６ウェルに播種することにより行った。
【０１０５】
実施例２１．ＰＲＦ１およびＧＺＭＢshRNA配列のスクリーニング
アストロサイトにおけるＰＲＦ１およびＧＺＭＢ発現をノックダウンするために、ＲＮＡiのコンソーシアムレンチウイルスのshRNA ライブラリーからの配列 (TRC−Mm1.0 および TRC−Hs1.0) をスクリーニングし、Thermo Scientific (Waltham, MA, USA)から購入した。以下の配列をスクリーニングした。
【０１０６】
スクリーニングしたＰＲＦ１配列：
マウス：TRCN0000077203 (CTATGCATAGAGAGGCCACTA)；TRCN0000077204 (GCCCATTTGGTGGTAAGC AAT) ；TRCN0000077205(CGGTGTCGTGTGGAAC AATAA) ；TRCN0000077206(CCACTCCAAGGTAGCCAATTT)；TRCN0000077207 (AGGGTGAAATTCTCCTACCAT)。
ヒト：TRCN0000007938 (CCAACACAATTCTTCTTCCAA) ;TRCN0000007939 (GCCTATGTGAAGCTCTTCTTT) ；TRCN0000007940(CCTCAGGCTTATCTCCAACTA) ；TRCN0000007941 (TGCCGCTTCTACAGTTTCCAT) ；TRCN0000007942 (ACCTGAATCATGGCCACCTAA)。
【０１０７】
スクリーニングしたＧＺＭＢ配列：
マウス：TRCN0000032739 (CGAGAATGTTATCTAATGCTA) ;TRCN0000032740 (CGAGTTTCTTATCCTGGATAA) ；TRCN0000032741(GCCTTACTTTCGATCAAGGAT) ；TRCN0000032742 (CCTATGGATATAAGGATGGTT)；TRCN0000032743 (CAGACTATAATCCTAAGACAT)。
ヒト：TRCN0000006445 (CGAATCTGACTTACGCCATTA)；TRCN0000006446 (GCTTATCTTATGATCTGGGAT) ；TRCN0000006447( AATGGTACTGTCGTAATAATG) ；TRCN0000006448(CATTGTCTCCTATGGACGAAA)；TRCN0000006449 (GCTTCCTGATACAAGACGACT)。
【０１０８】
ウェスタンブロット分析により評価されたノックダウン効率のレベルに基づき、クローン TRCN0000077206 (CCACTCCAAGGTAGCCAATTT)およびTRCN0000007942 (ACCTGAATCATGGCCACCTAA)を、それぞれマウスおよびヒト アストロサイトにおいてＰＲＦ１を標的とするように選択した。ＧＺＭＢを標的とするために、TRCN0000032742 (CCTATGGATATAAGGATGGTT)および TRCN0000006448 (CATTGTCTCCTATGGACGAAA)を、それぞれマウスおよびヒトアストロサイトで用いた。ShRNA配列は、２９３細胞のCaCl2 一過性トランスフェクションにより作製され、超遠心分離により濃縮されたウイルスベクターにより送達された。アストロサイトは、１細胞当たり２０個のウイルス粒子を用いて２４時間に亘って感染させた。ShRNAを、運動ニューロンとの共培養の前に９６時間、アストロサイトにて発現させた。
【０１０９】
実施例２２．ＭＮ感染および培養
ＭＮにおいてＭＨＣクラスＩを発現するために、野生型アストロサイトを、ラミニンでコーティングしたトランスウェル(Corning, Lowell, MA)上にＭＮ培地を用いて播種した。２４時間後、分別されたＧＦＰ＋の ＭＮを、別々のラミニンでコーティングした９６ウェルプレートに野生型アストロサイトで馴化した培地中に播種した。４時間後、野生型アストロサイトを含むトランスウェルを、全てのＭＮが完全に付着し、神経突起伸張を示し始めたことが確認された後、ＭＮプレートに移した。１日後、野生型アストロサイトのトランスウェルを除去し、ＭＮに、H2K cDNA発現構築物をコード化するレンチウイルス(ＭＮ当たり４０ウイルス粒子)を感染させた。感染の１２時間後、トランスウェルによる野生型アストロサイトとの共培養を再開した。７２時間後、トランスウェルを除去し、共培養実験を開始した。
【０１１０】
実施例２３．ウェスタンブロット
粗タンパク質細胞溶解物を、製造者の推奨に従って組織タンパク質抽出試薬 (Pierce, Rockford, IL)を用いて得た。レーン当たり、２０μgのタンパク質を、NuPAGE ４〜１２％のBis−Tris ゲル(Invitrogen)上にローディングした。タンパク質を、１５０Ｖで１時間、電気泳動により分離し、その後、Invitrolon PVDF膜(Invitrogen)に移した。該膜をＴＢＳ中５％脱脂乳、０．１％ トゥイーン−20で１時間ブロッキングし、次いで、一次抗体と共に一晩インキュベートした。結合した一次抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)、次いで、ECLTMウェスタンブロッティング検出試薬(GE Healthcare)を用いる化学発光により検出した。
【０１１１】
実施例２４．生存率および後肢握力
動物。変異ＳＯＤ１G93A導入遺伝子を高レベルで発現したトランスジェニックのオスおよびメス同腹仔マウスを、グループ間で均等に分けた。ＳＯＤ１遺伝子コピー数およびＳＯＤ１タンパク質発現を、ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析により確認した。動物を、明暗(１２：１２時間)サイクル下で、餌および水を自由に摂取できる状況下で飼育した。全ての方法は、全国小児病院施設内動物管理使用委員会により承認を受けたプロトコルを用いて行った。
【０１１２】
パーフォリンのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）抑制：パーフォリンに対するshRNAまたはスクランブルshRNAをコード化するＡＡＶ９ウイルスを作製し、ＳＯＤ１G93A動物の尾静脈に、３週令にて、３×１０１１ DNase 耐性粒子／ｍｌの力価で送達した。動物を毎日モニタリングし、正常姿勢を取る(right themselves)能力を評価した。動物を仰向けにした後、該動物が３０秒以内にもはや正常姿勢を取れないないとき、“死亡”が入力された。“死亡”判断は、評価の時点で処理を知らされていない２人によって行われた。後肢握力の試験は握力計を用いて行われ、毎週試験された。簡単には、動物を自分の後脚でプラットフォーム上に踏ん張らせておき、該動物がプラットフォームから手を放すまでそれを引っ張り、生じた最大力を記録する。図８および９に示す通り、パーフォリンに対するshRNAで処理されたＳＯＤ１G93Aマウスは、対照に対して経時的に増加した生存率および増加した後肢の握力を示した。
【０１１３】
実施例２５． Ｈ２Ｋ ＯＲＦ 配列
AGTGTCGCCGCGGACGCTGGATATAAAGTCCACGCAGCCCGCAGAACTCAGAAGTCGCGAATCGCCGACAGGTGCGATGGTACCGTGCACGCTGCTCCTGCTGTTGGCGGCCGCCCTGGCTCCGACTCAGACCCGCGCGGGCCCACACTCGCTGAGGTATTTCGTCACCGCCGTGTCCCGGCCCGGCCTCGGGGAGCCCCGGTACATGGAAGTCGGCTACGTGGACGACACGGAGTTCGTGCGCTTCGACAGCGACGCGGAGAATCCGAGATATGAGCCGCGGGCGCGGTGGATGGAGCAGGAGGGGCCCGAGTATTGGGAGCGGGAGACACAGAAAGCCAAGGGCAATGAGCAGAGTTTCCGAGTGGACCTGAGGACCCTGCTCGGCTACTACAACCAGAGCAAGGGCGGCTCTCACACTATTCAGGTGATCTCTGGCTGTGAAGTGGGGTCCGACGGGCGACTCCTCCGCGGGTACCAGCAGTACGCCTACGACGGCTGCGATTACATCGCCCTGAACGAAGACCTGAAAACGTGGACGGCGGCGGACATGGCGGCGCTGATCACCAAACACAAGTGGGAGCAGGCTGGTGAAGCAGAGAGACTCAGGGCCTACCTGGAGGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGAAGAACGGGAACGCGACGCTGCTGCGCACAGATTCCCCAAAGGCCCATGTGACCCATCACAGCAGACCTGAAGATAAAGTCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGGGCTTCTACCCTGCTGACATCACCCTGACCTGGCAGTTGAATGGGGAGGAGCTGATCCAGGACATGGAGCTTGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCATCTGTGGTGGTGCCTCTTGGGAAGGAGCAGTATTACACATGCCATGTGTACCATCAGGGGCTGCCTGAGCCCCTCACCCTGAGATGGGAGCCTCCTCCATCCACTGTCTCCAACATGGCGACCGTTGCTGTTCTGGTTGTCCTTGGAGCTGCAATAGTCACTGGAGCTGTGGTGGCTTTTGTGATGAAGATGAGAAGGAGAAACACAGGTGGAAAAGGAGGGGACTATGCTCTGGCTCCAGGCTCCCAGACCTCTGATCTGTCTCTCCCAGATTGTAAAGTGATGGTTCATGACCCTCATTCTCTAGCGTGAAGACAGCTGCCTGGAGTGGACTTGGTGACAGACAATGTCTTCTCATATCTCCTGTGACATCCAGAGCCCTCAGTTCTCTTTAGTCAAGTGTCTGATGTTCCCTGTGAGCCTATGGACTCAATGTGAAGAACTGTGGAGCCCAGTCCACCCCTCTACACCAGGACCCTGTCCCTGCACTGCTCTGTCTTCCCTTCCACAGCCAACCTTGCTGGTTCAGCCAAACACTGAGGGACATCTGTAGCCTGTCAGCTCCATGCTACCCTGACCTGCAACTCCTCACTTCCACACTGAGAATAATAATTTGAATGTAACCTTGATTGTTATCATCTTGACCTAGGGCTGATTTCTTGTTAATTTCATGGATTGAGAATGCTTAGAGGTTTTGTTTGTTTGTTTGATTGATTTGTTTTTTTGAAGAAATAAATGATAGATGAATAAACTTCCAGAATCTGGGTCACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
【０１１４】
実施例２６．統計分析
全ての統計的試験は、群間の平均誤差のBonferroniの事後解析に続く分散多方向分析により行った(GraphPad Prism, San Diego, CA)。各実験は、３または４回繰り返し、各々トリプリケートを使用した。
【図２Ｂ】
2015529685.tif 000007
【図２Ｄ】
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【図２Ｊ】
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【図８】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2015529685.tif 000034
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ−Ｈ】
2015529685.tif 000039
【図４Ｉ−Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図４Ｍ】
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【図５Ａ】
2015529685.tif 000044
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
2015529685.tif 000051
【図６Ａ】
2015529685.tif 000052
【図６Ｂ】
2015529685.tif 000053
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
2015529685.tif 000055
【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
2015529685.tif 000060
【図６Ｊ】
2015529685.tif 000061
【図６Ｋ】
2015529685.tif 000062
【図７】
2015529685.tif 000063
【図９】
2015529685.tif 000064
【図１０Ａ−Ｂ】
2015529685.tif 000065
【図１０Ｃ−Ｄ】
2015529685.tif 000066
【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１Ａ−Ｄ】
2015529685.tif 000070
【図１１Ｅ−Ｇ】
2015529685.tif 000071
【図１２Ａ−Ｂ】
2015529685.tif 000072
【図１３Ａ−Ｄ】
2015529685.tif 000073
【図１３Ｅ−Ｈ】
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【図１４Ａ】
2015529685.tif 000075
【図１４Ｂ】
2015529685.tif 000076
【配列表】
2015529685000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年8月6日(2015.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2015529685.tif 000077
2015529685.tif 000078
2015529685.tif 000079
2015529685.tif 000080