(57)【要約】本発明は、生物試料、特に血液試料中のタンパク質分解カスケードのペプチド分解産物の測定方法であって、試料が、該タンパク質分解カスケードに関与する少なくとも１つのペプチド分解産物に対して定常状態平衡が達成されるまでインキュベートされ、タンパク質分解カスケードの定常状態平衡における該少なくとも１つのペプチド分解産物が、試料中で定量される方法を開示する。
2015518964.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料中のタンパク質分解カスケードのペプチド分解産物の測定方法であって、試料が、該タンパク質分解カスケードに関与する少なくとも１つのペプチド分解産物に対して定常状態平衡が達成されるまでインキュベートされ、タンパク質分解カスケードの定常状態平衡における該少なくとも１つのペプチド分解産物が、試料中で定量される方法。
【請求項２】
該試料が、全血、血漿または血清などの血液試料、特に、新鮮または凍結抗凝固全血または新鮮または凍結抗凝固血漿である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質分解カスケードの少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのペプチド分解産物が、定常状態平衡濃度において試料中で定量される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも２つのペプチド分解産物が定量され、少なくとも２つのペプチド分解産物の定常状態平衡定量の比が計算される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
試料が、15分、20分、25分、30分、60分、90分、120分、150分、180分、210分、240分、270分まで、または300分までインキュベートされる請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
試料が、30〜50℃、35〜40℃、または約37℃の温度にてインキュベートされる請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
タンパク質分解カスケードが、レニン-アンジオテンシン系（RAS）またはブラジキニン系またはその両方である請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
ペプチド分解産物が、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンI（Ang 1-10）、アンジオテンシン2-10（Ang 2-10）、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシンIII（アンジオテンシン2-8またはAng 2-8）、アンジオテンシンIV（アンジオテンシン3-8またはAng 3-8）、アンジオテンシン1-9（Ang 1-9）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）、アンジオテンシン2-7（Ang 2-7）、アンジオテンシン3-7（Ang 3-7）、アンジオテンシン1-5（Ang 1-5）、カリジン（KDまたはLys-ブラジキニン）、ブラジキニン1-9（BK 1-9）、ブラジキニン2-9（BK 2-9）、ブラジキニン1-8（BK 1-8）、ブラジキニン1-7（BK 1-7）およびブラジキニン1-5（BK 1-5）から選ばれる請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
定量されるペプチド分解産物が、アンジオテンシンI（1-10）、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）およびアンジオテンシン1-5（Ang 1-5）である請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
定量されるペプチド分解産物が、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）およびアンジオテンシン1-5（Ang 1-5）である請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
定量されるペプチド分解産物が、ブラジキニン1-9（BK 1-9）、ブラジキニン1-8（BK 1-8）、ブラジキニン1-7（BK 1-7）およびブラジキニン1-5（BK 1-5）である請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
定量されるペプチド分解産物が、ブラジキニン1-8（BK 1-8）、ブラジキニン1-7（BK 1-7）およびブラジキニン1-5（BK 1-5）である請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
１種以上のプロテアーゼ阻害剤が、少なくとも１つのペプチド分解産物について定常状態平衡が達成されるまでインキュベーション後に添加される請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
定常状態平衡濃度における生物試料中のタンパク質分解カスケードのペプチド分解産物の測定用キット。
【請求項１５】
タンパク質分解カスケードの少なくとも１つのペプチド分解産物について定常状態平衡が達成されるまで一定の期間試料をインキュベートするための使用説明書を含む請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１つに記載の方法を行うための１種以上の使用説明書をさらに含む請求項１４または１５に記載のキット。
【請求項１７】
ペプチド、酵素、酵素阻害剤、緩衝液、溶媒、カオトロピック剤、界面活性剤およびそれらの組合せから選ばれる１種以上の化学的、生化学的および／またはバイオテクノロジー的試薬をさらに含む請求項１４〜１６のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１８】
固相抽出材料またはその他の精製材料、容器およびそれらの組合せから選ばれる１種以上の化学的、生化学的および／またはバイオテクノロジー的実験用部材をさらに含む請求項１４〜１７のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１９】
血液試料、血清試料、血漿試料、組織試料およびそれらの組合せから選ばれる１種以上の生物試料をさらに含む請求項１４〜１８のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２０】
１種以上のプロテアーゼ阻害剤または阻害剤カクテル、供給基質、必要に応じて１種以上の抗凝固剤を含む１種以上の血液採取管、１種以上の標準、１種以上の品質対照、１種以上の固相抽出材料または１種以上の溶媒あるいはそれらの組合せをさらに含む請求項１４〜１９のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２１】
請求項１〜１３のいずれか１つに記載の方法による定量の結果または請求項１４または２０に記載のキットの使用の結果の物理的または電子的表現であって、少なくとも２つまたは少なくとも３つのペプチド分解産物が、物理的または電子的担体で定量されたものであり、少なくとも２つまたは少なくとも３つのペプチド分解産物の定量された量が、タンパク質分解カスケードの順序で提供される、物理的または電子的表現。
【請求項２２】
少なくとも２つまたは少なくとも３つのアンジオテンシンI（Ang 1-10）、アンジオテンシン2-10（Ang 2-10）、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシンIII（アンジオテンシン2-8またはAng 2-8）、アンジオテンシンIV（アンジオテンシン3-8またはAng 3-8）、アンジオテンシン1-9（Ang 1-9）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）、アンジオテンシン2-7（Ang 2-7）、アンジオテンシン3-7（Ang 3-7）、アンジオテンシン1-5（Ang 1-5）、カリジン（KDまたはLys-ブラジキニン）、ブラジキニン1-9（BK 1-9）、ブラジキニン2-9（BK 2-9）、ブラジキニン1-8（BK 1-8）、ブラジキニン1-7（BK 1-7）およびブラジキニン1-5（BK 1-5）の定量の結果が含まれ、それらの相対量に応じて提供される、請求項２１に記載の物理的または電子的表現。
【請求項２３】
アンジオテンシンI（Ang 1-10）、アンジオテンシン2-10（Ang 2-10）、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシンIII（アンジオテンシン2-8またはAng 2-8）、アンジオテンシンIV（アンジオテンシン3-8またはAng 3-8）、アンジオテンシン1-9（Ang 1-9）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）、アンジオテンシン2-7（Ang 2-7）、アンジオテンシン3-7（Ang 3-7）およびアンジオテンシン1-5（Ang 1-5）の定量の結果が含まれ、それらの相対量に応じて提供される、請求項２２に記載の物理的または電子的表現。
【請求項２４】
カリジン（KDまたはLys-ブラジキニン）、ブラジキニン1-9（BK 1-9）、ブラジキニン2-9（BK 2-9）、ブラジキニン1-8（BK1-8）、ブラジキニン1-7（BK 1-7）およびブラジキニン1-5（BK 1-5）の定量の結果が含まれ、それらの相対量に応じて提供される、請求項２２に記載の物理的または電子的表現。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液試料中のタンパク質分解カスケードのペプチド分解産物の測定に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液試料中のタンパク質分解カスケードのペプチド分解産物の出現の質および量は、被験者の生理的および生化学的状態によって様々である。それらは、たとえば、既知の疾患または疑われる疾患、および／または、薬物療法、および／または、その他の因子に関連する被験者の健康状態に応じて変化する。タンパク質分解産物は、主として、それ自体が患者の生理的状態に応じて変化する、血液系におけるタンパク質分解酵素の調節および活性に応じて変化する。
【０００３】
レニン-アンジオテンシン系（RAS）は、多数の酵素およびペプチドで構成されているタンパク質分解カスケードである。このカスケードは、腎臓が分泌するレニンによってプロペプチドであるアンジオテンシノーゲン（AGT）からアンジオテンシンI（アンジオテンシン1-10またはAng 1-10）が放出されるときに開始される。AGTは、ヒトの肝臓において豊富に発現され、循環に分泌されて、AGTの事実上無尽蔵の血漿プールを構成する。様々なプロテアーゼによってAng 1-10から産生されたペプチド代謝物は、アンジオテンシンペプチドによって媒介される生理的機能の多様なパネルをもたらす、異なる組織におけるアンジオテンシン受容体のためのリガンドとして働く。
【０００４】
血圧の調節は、アンジオテンシンペプチドによって影響を受ける、よく研究された生理反応である。アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）は、Ang 1-10から２つのC末端アミノ酸を除去することにより、アンジオテンシン変換酵素（ACE）のタンパク質分解作用によって産生される。Ang 1-8は、血管収縮および血圧の連続的増加をもたらす細胞受容体に結合する。
【０００５】
Ang 1-8の産生におけるACEの重要な役割は、Ang 1-8を、血圧の低下をもたらすAng 1-8レベルの減少に基づいて設定される抗高血圧治療という主な焦点をもつ有利な薬理学的標的にすることである。このことは、また、高血圧治療のために使用中であるACE阻害剤の広範なパネルによって反映される。最近になって、レニンまたは中性エンドペプチダーゼ（NEP）などの他の標的化可能なRAS酵素が、抗高血圧治療のための薬理学的標的として認定され、一方で、ACE阻害剤は、ACEドメイン選択性の欠如によって引き起こされると考えられる副作用の頻度を低下させるように、さらに最適化されている。ACE阻害剤の投与中に頻繁に起こる副作用として、空咳および血管性浮腫が挙げられ、Ang 1-10のみならず特定のBKペプチドが、ACEによって切断されると記載されるので、該副作用は、これらの阻害剤によるブラジキニン（BK）分解の阻害によって引き起こされると考えられる。
【０００６】
このような限定された基質選択性は、RAS酵素に見られる非常に一般的な特徴である。また、その２つのドメインからなる構造ゆえに他のRASとは僅かに相違するACEの他に、アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）もまた、Ang 1-8およびAng 1-10を切断して、それぞれアンジオテンシン1-7（Ang 1-7）およびアンジオテンシン1-9（Ang 1-9）を得ることができることが知られている。
【０００７】
さらに、異なるRASプロテアーゼは、所定の基質に対する酵素の競合をもたらすそれらの基質を共有することができる。たとえば、Ang 1-10は、ACE、ACE2、NEPおよび異なるアミノペプチダーゼによって切断されることが知られている。すべてのこれらの考慮事項は、RASの非常に複雑な像において頂点に達し、多数の因子によって影響を及ぼされたペプチド濃度をもたらす、異なる酵素、受容体およびペプチドの網細工のように見える。
【０００８】
可溶性ACEの公表された血漿レベルを、Ang 1-10血漿濃度と比較すると、循環中に、Ang 1-10と比較して、有意なモル過剰でACE酵素が存在することが明らかになる。このことは、古典的な酵素反応論を用いてRASを説明することにおいて、失敗をもたらす。循環中のアンジオテンシンペプチドレベルが10-200 fmol/mlを超えない生理的条件において、大部分の酵素は、それらの基質と比較して、モル過剰で存在し、古典的なメンテン式から遠ざかって、元の試料マトリックスにおける生理的条件での生化学的プロセスについての信頼できる概説を得ることを研究者に強いる。
【０００９】
たとえば、Ang 1-10は、Ang 1-8よりも非常に低い触媒効率でACE2によって分解されると記載されている。このことを示す実験は、それらの酵素と比較して大過剰の基質を用いる人工的マトリックスにおいて行われ、Ang 1-10からAng 1-9への変換率よりも65倍高いAng 1-8からAng 1-7への最大ACE2変換率が得られた[Riceら、Biochem J.、383(2004）,45-51]。
【００１０】
多数のアンジオテンシンペプチドが、生物活性を示すという事実を先の考慮事項と合せると、生物試料中のRASを評価して試料中の生理物質濃度の維持を確保することに大きな必要性があることが明らかになる。薬理学的手段によるRASの操作は、RASの多数のレベルにおいて酵素活性およびペプチド変換速度を変更すし、このことは、既定の酵素反応のための薬物の効力および阻害剤選択性をモニターするためのRASの包括的な評価にとって明らかに都合がよい。
【００１１】
たとえば、生理的な基質濃度にて未知の範囲まで両方のACEドメインを阻害することが記載されているACE阻害剤は、それらの副作用プロフィールを最適化するために、それらのAng 1-10からAng 1-8への変換の阻害について、そして、Ang 1-7からアンジオテンシン1-5（Ang 1-5）への、あるいはブラジキニン1-9（BK 1-9）からブラジキニン1-7（BK 1-7）への、あるいはBK 1-7からブラジキニン1-5（BK 1-5）への変換に関するそれらの阻害能力についても研究された。
【００１２】
ヒト血漿中でのアンジオテンシンペプチドの濃度および酵素を代謝することについての公表されたデータを合せると、用いた方法の再現性の低さを指摘する、異なるグループ間の大きな分散が明らかになる。それにもかかわらず、レニンと比較して、ヒト血漿中のプレホルモンAGTについては膨大なモル過剰が報告されており、このことは、プレホルモンAGTが、血漿試料中で一定のレニン活性によって産生されるAng 1-10の非常に長命な源として働くことを意味する。この事実はまた、所定の期間にわたるAng 1-10の産生量を用いて、試料中のレニン活性の欠如が計算される最先端のPRA-アッセイで使用されている。残念ながら、これらの値は、産生されたAng 1-10の安定化の欠如（分解の不完全な阻害）により、低すぎることが多く、Ang 1-10の分解速度が、ゼロに近いことを確保するためのプロテアーゼ阻害剤の明確に定義されたセットが必要である[Bystromら、Clin. Chem. 56(2010）、1561-1569]。ドナー間の有意な分散とともにこれらの落とし穴は、限定された診断的価値しかない再現性に乏しい手順をもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって。本発明の目的は、被験者の血液試料を用いることによる、薬物投与、外科手術または血液透析など（これらに限定されるものではない）の特定の治療的処置の前、中および後に、このような被験者の生理的または生化学的状態、特に被験者またはヒト患者の生理学的または生化学的状態を分析するための新たな改善されたツールを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明は、生物試料、特に血液試料中のタンパク質分解カスケードのペプチド分解産物の測定方法であって、試料が、該タンパク質分解カスケードに関与する少なくとも１つのペプチド分解産物に対して定常状態平衡が達成されるまでインキュベートされ、タンパク質分解カスケードの定常状態平衡における該少なくとも１つのペプチド分解産物が、試料中で定量される方法を提供する。
【００１５】
本明細書で用いる用語「定常状態平衡」（SSE）は、タンパク質分解カスケードに関与する少なくとも１つのペプチド分解産物の実際の全体的分解速度が、該ペプチド分解産物の実際の全体的形成速度に等しく、そのことによって、該ペプチド分解産物の安定な濃度、すなわち、以下に詳述するように、一定の期間にわたって実質的に変化しない定常状態平衡ペプチド濃度をもたらすことを意味する。ペプチド分解産物の実際の全体的形成速度は、該ペプチド分解産物の形成に関与する全酵素の実際の代謝回転速度の合計によって定義され、すなわち、該ペプチド分解産物は、該酵素の直接産物である。ペプチド分解産物の実際の全体的分解速度は、該ペプチド分解産物の分解に関与する全酵素の実際の代謝回転速度の合計によって定義され、すなわち、該ペプチド分解産物は、該酵素の直接基質である。
【００１６】
用語本明細書で用いる「タンパク質分解カスケード」は、少なくとも２つの連続したタンパク質分解反応を含むカスケードを意味する。１つの実施態様において、タンパク質分解カスケードは、少なくとも2、3、4または5個の連続したタンパク質分解反応のカスケードである。このようなタンパク質分解カスケードは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16または17個の連続もしくは不連続のタンパク質分解反応、あるいはそれらの組合せを含んでもよく、分岐しているか、または多重分岐していてもよい。たとえば、本発明のタンパク質分解カスケードとして、レニン-アンジオテンシン-アルドステロン系（RAAS）とも呼ばれるレニン-アンジオテンシン系（RAS）、ブラジキニン系、キニン-カリクレイン系、血液凝固カスケード、補体系、アポトーシス経路、神経ペプチドカスケード（たとえば、オキシトシン系）、エンドセリンペプチドカスケードおよびナトリウム利尿ペプチドカスケードが挙げられる。
【００１７】
本明細書で用いる用語「タンパク質分解カスケードに関与するペプチド分解産物」または「タンパク質分解カスケードのペプチド分解産物」は、タンパク質分解カスケードに関与する少なくとも１つの酵素の基質（前駆ペプチド）または産物として、あるいは、タンパク質分解カスケードに関与する少なくとも２つの酵素の基質および産物としての、該所定のタンパク質分解カスケードの部分であるペプチドを意味する。したがって、RAS タンパク質分解カスケードについては、タンパク質分解カスケードに関与するペプチド（またはペプチド分解産物）は、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンI（Ang 1-10）およびその生体分解産物、特に、アンジオテンシンI（Ang 1-10）、アンジオテンシン2-10（Ang 2-10）、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシンIII（アンジオテンシン2-8またはAng 2-8）、アンジオテンシンIV（アンジオテンシン3-8またはAng 3-8）、アンジオテンシン1-9（Ang 1-9）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）、アンジオテンシン2-7（Ang 2-7）、アンジオテンシン3-7（Ang 3-7）およびアンジオテンシン1-5（Ang 1-5）から選ばれてよい。ブラジキニンタンパク質分解カスケードについては、タンパク質分解カスケードに関与するペプチド（またはペプチド分解産物）は、カリジン（KDまたはLys-ブラジキニン）およびその生体分解産物、特に、ブラジキニン1-9（BK 1-9）、ブラジキニン2-9（BK 2-9）、ブラジキニン1-8（BK1-8）、ブラジキニン1-7（BK 1-7）およびブラジキニン1-5（BK 1-5）から選ばれてよい。１つの実施態様において、１種以上のペプチド分解産物は、１種以上のタンパク質分解カスケード、たとえば、別々のカスケード、または、たとえば、１種以上の同一もしくは類似の酵素またはペプチドによって関連もしくは連結され得るカスケードのいずれかである２種以上のタンパク質分解カスケードに関与するペプチドから選ばれてよい。１つの実施態様において、タンパク質分解カスケードは、レニン-アンジオテンシン系（RAS）またはブラジキニン系、あるいは両方である。たとえば、１種以上のペプチド分解産物は、RASおよびブラジキニン系から選ばれてよい。１つの実施態様において、ペプチド分解産物は、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンI（Ang 1-10）、アンジオテンシン2-10（Ang 2-10）、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシンIII（アンジオテンシン2-8またはAng 2-8）、アンジオテンシンIV（アンジオテンシン3-8またはAng 3-8）、アンジオテンシン1-9（Ang 1-9）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）、アンジオテンシン2-7（Ang 2-7）、アンジオテンシン3-7（Ang 3-7）、アンジオテンシン1-5（Ang 1-5）、カリジン（KDまたはLys-ブラジキニン）、ブラジキニン1-9（BK 1-9）、ブラジキニン2-9（BK 2-9）、ブラジキニン1-8（BK1-8）、ブラジキニン1-7（BK 1-7）およびブラジキニン1-5（BK 1-5）から選ばれる。
【００１８】
１つの実施態様において、ペプチド分解産物は、アンジオテンシンI（1-10）、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）およびアンジオテンシン1-5（Ang 1-5）から選ばれる。１つの実施態様において、定量されるペプチド分解産物は、アンジオテンシンI（1-10）、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）およびアンジオテンシン1-5（Ang 1-5）である。
【００１９】
もう１つの実施態様において、ペプチド分解産物は、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）およびアンジオテンシン1-5（Ang 1-5）から選ばれる。１つの実施態様において、定量されるペプチド分解産物は、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）およびアンジオテンシン1-5（Ang 1-5）である。
【００２０】
さらにもう１つの実施態様において、ペプチド分解産物は、ブラジキニン1-9（BK 1-9）、ブラジキニン1-8（BK 1-8）、ブラジキニン1-7（BK 1-7）およびブラジキニン1-5（BK 1-5）から選ばれる。１つの実施態様において、定量されるペプチド分解産物は、ブラジキニン1-9（BK 1-9）、ブラジキニン1-8（BK 1-8）、ブラジキニン1-7（BK 1-7）およびブラジキニン1-5（BK 1-5）である。
【００２１】
さらにもう１つの実施態様において、ペプチド分解産物は、ブラジキニン1-8（BK 1-8）、ブラジキニン1-7（BK 1-7）およびブラジキニン1-5（BK 1-5）から選ばれる。１つの実施態様において、定量されるペプチド分解産物は、ブラジキニン1-8（BK 1-8）、ブラジキニン1-7（BK 1-7）およびブラジキニン1-5（BK 1-5）である。
【００２２】
本明細書で用いる用語「タンパク質分解カスケードに関与する酵素」または「タンパク質分解カスケードの酵素」は、該所定のタンパク質分解カスケードの部分であり、タンパク質分解カスケードに関与する少なくとも１つのペプチドを形成または分解する酵素を意味する。したがって、RASタンパク質分解カスケードについては、タンパク質分解カスケードに関与する酵素は、レニン、アミノペプチダーゼ（AP、特に、アミノペプチダーゼ A（APA）およびアミノペプチダーゼ N（APN））、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（DAP）、カルボキシペプチダーゼ（特に、ACE2）、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ（特に、ACE）およびエンドペプチダーゼ（特に、中性エンドペプチダーゼ、ネプリライシンとも呼ばれる）から選ばれてよい。ブラジキニンタンパク質分解カスケードについては、タンパク質分解カスケードに関与する酵素は、カリクレイン、アミノペプチダーゼ（AP、特に、アミノペプチダーゼ A（APA）およびアミノペプチダーゼ N（APN））、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（DAP）、カルボキシペプチダーゼ（特に、ACE2）、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ（特に、ACE）およびエンドペプチダーゼ（特に、中性エンドペプチダーゼ、ネプリライシンとも呼ばれる）から選ばれてよい。本明細書で用いる用語「実際の」は、試料中に存在する条件下でのペプチドの実際の（または有効な）形成または分解速度、あるいは酵素の実際のまたは有効な代謝回転速度を意味する。
【００２３】
本明細書で用いる用語「に等しい」は、該ペプチドのいずれかのこのような等しい形成または分解速度から得られる（「定常状態平衡のペプチド濃度」または「定常状態平衡のペプチドレベル」）ペプチド濃度、または該ペプチドの形成または分解に関与する少なくとも２つの酵素のいずれかのこのような等しい代謝回転速度から得られるペプチド濃度（「定常状態平衡の酵素代謝回転速度」）が、少なくとも30分、60分、90分、120分、150分、180分、210分、240分、270分または300分の時間にわたって、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%または1%以上変化しないことを意味する。したがって、いずれかの新たにまたは追加で形成される基質が分解されるように、該ペプチドの分解に関与する酵素の実際の全体的代謝回転速度は、基質ペプチドの実際の全体的形成速度によって決定される。しかしながら、このことは、該ペプチドの濃度がゼロであることを必ずしも意味しないが、定常状態平衡にある試料中に存在する正味濃度は、上述したように、有意には変化しない。
【００２４】
したがって、本発明の１つの実施態様において、タンパク質分解カスケードの該少なくとも１つのペプチド分解産物の濃度は、形成と分解の連続的な流れにもかかわらず、定常状態平衡の期間にわたって一定の範囲内に維持される。本発明の１つの実施態様において、定常状態平衡における該少なくとも１つのペプチド分解産物の濃度は、少なくとも30分、60分、90分、120分、150分、180分、210分、240分、270分または300分の時間にわたって、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%または1%以上変化しない。１つの実施態様において、定常状態平衡における該少なくとも１つのペプチド分解産物の濃度は、60分以内で15%または10%以上変化しない。したがって、該ペプチドは、上記特定の時間中に、有意に蓄積しないし、有意に減少しない。
【００２５】
１つの実施態様において、試料は、定常状態平衡濃度における少なくとも１つのペプチド分解産物が試料中で定量される前に、15分、20分、25分、30分、60分、90分、120分、150分、180分、210分、240分、270分まで、または300分までインキュベートされる。もう１つの実施態様において、試料は、6時間以上、特に、8時間、12時間、18時間、24時間まで、または48時間までインキュベートしてもよい。適当なインキュベーション時間は、主として、所定のタンパク質分解カスケード、定量されるペプチド分析物、試料の性質およびインキュベーションパラメーターに応じて変わる。このようなインキュベーション時間は、当業者によって容易に決定されうる。１つの実施態様において、定常状態平衡は、インキュベーション後も保存（または安定化または凍結またはクエンチ）される。
本明細書で用いる用語「保存」、「安定化」、「凍結」および「クエンチ」は、生化学状態の保存、たとえばタンパク質分解の阻害などによる、ペプチドレベルの保存などを意味する。定常状態平衡ペプチドレベル（またはインビボペプチドレベル）の安定化は、１種以上のプロテアーゼ阻害剤の添加、特に、プロテアーゼ阻害剤カクテルの添加によって行うことができる。したがって、１種以上のプロテアーゼ阻害剤は、少なくとも１つのペプチド分解産物について定常状態平衡が達成されるまでインキュベーション後に添加されてもよい。適当なプロテアーゼ阻害剤またはその組合せは、当業者によって選択されうるものであり、たとえば、特異的または非特異的酵素阻害剤の組合せ、あるいはそれらの組合せを含んでよい。１種以上のプロテアーゼ阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤カクテルは、特に、対象のカスケードのタンパク質分解ステップ（すなわち、測定されるペプチドを形成または分解する酵素）またはタンパク質分解カスケードの各酵素が、完全に阻害されるのを確実にする。
【００２６】
１つの実施態様において、タンパク質分解カスケードの各ステップは、阻害され、すなわち、タンパク質分解カスケードに関与する各酵素は、プロテアーゼ阻害剤カクテルの少なくとも１つの成分によって阻害される。もう１つの実施態様において、プロテアーゼ阻害剤カクテルは、タンパク質分解カスケードに関与する各クラスのプロテアーゼの少なくとも１つの特異的または非特異的阻害剤を含む。プロテアーゼ阻害剤カクテルは、タンパク質分解カスケードに関与する１種以上の酵素を阻害する１種以上の阻害剤を含む。RASのこのような阻害剤の例は、でリシノプリル（ACE阻害剤）およびアリスキレン（レニン阻害剤）ある。プロテアーゼ阻害剤カクテルはまた、EDTA（メタロプロテアーゼを阻害する）などのタンパク質分解カスケードに関与する酵素の１種以上のグループを阻害する１種以上の阻害剤を含む。さらに、プロテアーゼ阻害剤カクテルは、１種以上の非特異的阻害剤を含んでもよい。１つの実施態様において、プロテアーゼ阻害剤カクテルは、上述のクラスの阻害剤の少なくとも２つの組合せを含む。もう１つの実施態様において、プロテアーゼ阻害剤カクテルは、供給酵素（供給酵素）の１種以上の阻害剤、特に、供給酵素の特異的阻害剤を含む。
【００２７】
たとえば、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのプロテアーゼ阻害剤が試料に添加される。１つの実施態様において、プロテアーゼ阻害剤カクテルは、ペプスタチンA、1,10-フェナントロリン、EDTA、p-ヒドロキシ水銀安息香酸およびZ-Argを含む。
【００２８】
１種以上のプロテアーゼ阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤カクテルの使用とは別に、あるいはそれに加えて、定常状態平衡は、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸リチウム、塩化マグネシウム、グアニジンチオシアネート（GTC）、塩化グアニジン、フェノール、プロパノール、ブタノール、エタノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、尿素もしくはその他のものなどの１種以上のカオトロピック剤添加によって保存されうる。
【００２９】
１種以上のプロテアーゼ阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤カクテルの使用とは別に、あるいはそれに加えて、定常状態平衡は、熱、塩、pHまたは界面活性剤によって；またはインキュベーション後に試料を直接氷上に置くなどの冷却することによって、誘発される酵素変性などの試料中の酵素の物理的不活化の他の手段によって保存されうる。たとえば、血漿または血清分離および固相抽出（SPE；たとえば、マトリックス欠乏および／またはペプチド富化のため）による分離などの試料の１種以上のさらなる処理ステップのために、周囲温度は、試料中のすべての酵素が不活性であることを確実にするように選択されうる。たとえば、いずれかの試料前処理または試料分析に先立っての試料加工は、少なくともタンパク質分解カスケードに関与する酵素が完全に変性または不活化されるまで（たとえば、SPEカラムから溶出するまで）は、4℃（またはそれより低い温度）の周囲温度において行われてよい。
【００３０】
対照的に、古典的なPRAアッセイは、試料が採取された直後にAng Iの分解経路が完全に阻害されることを目的とし、酵素活性は、該酵素によって形成されたペプチドの蓄積速度に基づいて計算される。このようなPRAアッセイにおけるAng I分解経路の阻害が不完全であっても、Ang Iの正味濃度は、有意に経時変化するので、それらのアッセイは依然として、本発明の定常状態平衡からは程遠い。たとえば、Bystromら(Clin. Chem. 56(2010）、1561-1569）などの上述のPRAアッセイにおいて、Ang I濃度は、有意に経時増加する。さらに、最先端のアッセイは、ELISAおよびRIAベース法によって血漿試料中のレニンの立体配座的活性化形態を測定することによるRASの全体的活性を評価することを追及している（DRG Diagnostics、http：//www.drg-diagnostics.de/49-1-DRG+Renin+active+ELISA.html）。RSSE-フィンガープリント法とは対照的に、これらのアッセイは、使用した抗体の特異性に決定的に依存し、RASの生理的効果の原因となる試料中のエフェクターペプチドの濃度について結論を出すのが不可能である。その理由は、エフェクターペプチドのレベルに影響を及ぼす多数の酵素が存在することである。すべてのこれらのペプチドは、RSSE-フィンガープリント法によって同時に分析されるが、最先端のアッセイは、試料ごとの酵素活性または濃度に焦点を合せている。
【００３１】
本発明の１つの実施態様において、定常状態平衡では、供給酵素の実際の代謝回転速度は最大であり、すなわち、供給基質は供給酵素と比較して、膨大なモル過剰で存在し、外部の供給基質を添加しても、供給酵素の実際の代謝回転速度をさらに増加することはない。したがって、タンパク質分解カスケードの供給酵素は、供給変換反応を引き起こす原因となる酵素、すなわち、次のタンパク質分解カスケードの律速段階（またはンパク質分解カスケードのボトルネック）である。生理的条件下でのRASタンパク質分解カスケードについては、供給酵素は、アンジオテンシノーゲンからアンジオテンシンIへの変換を引き起こす原因となるレニンである。生理系（たとえば、身体中；血液、血漿または血清試料中）において、レニンのための基質としてのアンジオテンシノーゲンは、レニンに対して膨大なモル過剰で存在する。しかしながら、本発明の１つの実施態様において、たとえば、アミノペプチダーゼ（特に、APAおよび／またはAPN）、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ（特に、ACE2）、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ（特に、ACE）、および／またはエンドペプチダーゼ（特に、中性エンドペプチダーゼ、ネプリライシンとも呼ばれる）などのRASタンパク質分解カスケードの１種以上のまたは全ての他の酵素は、いずれかの新たにもしくは追加で形成された基質を分解するのに十分な濃度で存在し、したがって、インキュベーション中の該酵素およびペプチドのための定常状態平衡の確立を可能にし、すなわち、それらの実際の全体的代謝回転速度は、それらの基質ペプチドの実際の全体的形成速度によって決定される。
【００３２】
本発明にしたがって、用語「供給酵素」は、最大の実際の代謝回転速度酵素を有する酵素、すなわち、試料中の該酵素のための最大の達成可能な代謝回転速度である実際の代謝回転速度を有する酵素を意味する。用語「最大の達成可能な代謝回転速度」は、試料中に含まれる酵素の代謝回転速度を意味し、もし基質ペプチドが、少なくとも定常状態平衡が達成されるまで、酵素と比較して膨大なモル過剰で存在する（かまたは可能性がある）か、（あるいは事実上無尽蔵の量）であるならば、試料中の所定の条件下で達成されうる。したがって、供給酵素は、供給酵素と比較して、膨大なモル過剰で、すでに存在するので、供給酵素の実際の代謝回転速度が、外部の基質の添加によってさらに増加されることはない。たとえば、もしいずれかの外部の基質ペプチド（すなわち、タンパク質分解カスケードに関与するペプチド）またはこのような基質の類縁体が、インキュベーション前またはインキュベーション中に、定常状態平衡が達成されるまで試料に添加されるならば、そして、もし添加された基質ペプチドの量が、該基質ペプチドの分解に関与する少なくとも１つの酵素（すなわち、生理的条件下での供給酵素以外の酵素）の最大の達成可能な代謝回転速度をもたらすのに十分であるならば、本発明の定義にしたがって、このことは、タンパク質分解カスケードのための律速段階の変化をもたらし、したがって、またタンパク質分解カスケードの供給酵素の変化をもたらす。たとえば、もし研究中のタンパク質分解カスケードがRASであるならば、そして、もしAng 1-10分解に関与する１種以上のまたは全酵素と比較して、膨大なモル過剰のAng 1-10（またはその類縁体、たとえば、質量ラベルまたはアミノ酸交換などのいずれかの共有結合修飾を有するAng 1-10）が、インキュベーション前またはインキュベーション中に、定常状態平衡が達成されるまで試料に添加されるならば、Ang 1-10の分解に関与する少なくとも１つまたは全酵素（たとえば、ACE、ACE2、APおよび／またはNEP）は、最大の達成可能な代謝回転速度を達成し、したがって、カスケードの次のタンパク質分解反応のための律速供給段階になる可能性がある。
【００３３】
本発明の１つの実施態様において、供給酵素は、試料に添加されてもよい。供給酵素の添加は、酵素カスケードの流入を増加させ、したがって、ペプチドの絶対レベルを増加させるが、一方、相対レベル（ペプチド比）は変化されないままである。したがって、１種以上のペプチドの定常状態平衡レベルは、依然として、生理的状況、すなわち、酵素活性を反映するが、全体的ペプチドレベルは、比例的に増加される。このことは、たとえば、もし供給酵素の添加なしで測定されたペプチドレベルが、ペプチドを定量するのに用いた方法の検出限界以下であるならば有用である可能性がある。任意に、供給基質もまた、添加されてもよい。このことは、供給基質が、供給酵素と比較してモル過剰が維持されること、および、たとえ供給酵素が添加されても、供給基質が依然として、定常状態平衡を定義する特定の時間について安定である供給酵素の代謝回転速度をもたらす事実上無尽蔵の量として存在することを確実にする。
【００３４】
さらなる実施態様において、定常状態平衡における、供給酵素の産物（すなわち、供給酵素によって形成されるペプチド）の実際の全体的分解速度は、その実際の全体的形成速度に等しい。もう１つの実施態様において、タンパク質分解カスケードは、RASであり、上記定義した供給酵素の産物は、Ang Iである。該実施態様において、もし唯一の酵素的Ang I分解経路が試料中で「オープン」であるならば、すなわち、唯一のAng I分解酵素が活性であるならば、定常状態平衡における該Ang I分解酵素の実際の代謝回転速度は、Ang I形成酵素であるレニンの実際の代謝回転速度に等しい。もし１種以上のAng I分解酵素が試料中で活性であるならば、該活性Ang I分解酵素の実際の代謝回転速度の合計（すなわち、Ang Iの実際の全体的分解速度）は、レニンの実際の代謝回転速度（すなわち、Ang Iの実際の全体的形成速度）に等しい。
【００３５】
もう１つの実施態様において、定常状態平衡における、タンパク質分解カスケードに関与する１種以上、特に、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のペプチドの実際の全体的分解速度は、該ペプチドの実際の全体的形成速度に等しい。さらにもう１つの実施態様において、定常状態平衡における、タンパク質分解カスケードに関与する各ペプチドの実際の全体的分解速度は、該ペプチドの実際の全体的形成速度に等しい。
【００３６】
したがって、定常状態平衡は、１種以上のペプチドおよび関連酵素、すなわち、該ペプチドを形成または分解する酵素について達成される。上述したように、もしタンパク質分解カスケードに関与する少なくとも１つのペプチド、二種以上のペプチドまたはすべてのペプチドの正味濃度が、少なくとも30分、60分、90分、120分、150分、180分、210分、240分、270分または300分の時間にわたって、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%または1%以上変化しないならば、定常状態平衡は達成される。該定常状態平衡は、15分、20分、25分、30分、60分、90分、120分、150分、180分、210分、240分、270分または300分または8、12、18、24または48時間試料のインキュベーション後に達成される。定常状態平衡は、少なくとも30分、60分、90分、120分、150分、180分、210分、240分、270分または300分継続する。
【００３７】
本発明の１つの実施態様において、定常状態平衡における、タンパク質分解カスケードに関与する少なくとも１つのペプチドの全体的最大の達成可能な分解速度は、その実際の全体的形成速度に等しいか、またはより高い。本発明によれば、ペプチドの最大の達成可能な分解速度は、該ペプチドを分解する各酵素と比較して、膨大なモル過剰の該ペプチド（または、すなわち、外部のペプチドの添加による、該ペプチドの事実上無尽蔵の量）の存在下での所定の条件下で達成することができた全体的分解速度である。したがって、ペプチドの最大の達成可能な分解速度は、該ペプチドの分解に関与するすべての酵素の最大の達成可能な代謝回転速度の合計である。
【００３８】
１つの実施態様において、インキュベーション時間の開始時における、タンパク質分解カスケードに関与するすべての酵素の量は、タンパク質分解カスケードの供給酵素以外は、それらの各基質の量を超えている。もう１つの実施態様において、タンパク質分解カスケードに関与する該１種以上の酵素またはすべての酵素の量は、タンパク質分解カスケードの供給酵素以外は、インキュベーションの全期間中、その／それらの各基質の量を超えている。
【００３９】
もう１つの実施態様において、上記の特定の条件（すなわち、酵素の量は、各基質の量を超えており、および／または定常状態平衡におけるペプチドの形成速度は分解速度に等しい）は、分析される少なくとも１種以上のペプチド、および／または分析される該ペプチドを形成または分解する各酵素に適用される。
【００４０】
たとえば、もし本発明方法がRASタンパク質分解カスケードの１種以上の成分を試験するために用いられるならば、そして分析されるペプチドがたとえば、Ang 1-10およびAng 1-8であるならば、これは、定常状態平衡が達成されるまで、レニンによるAng 1-10の実際の形成速度が、ACE、アミノペプチダーゼおよびACE2など（これらに限定されるものではない）のAng 1-10分解に関与するすべての酵素実際の分解速度の合計より高いことを意味し；そして、ACEによるAng 1-8の実際の形成速度は、ACE2、APおよび／またはDAPなど（これらに限定されるものではない）のAng 1-8分解に関与するすべての酵素の実際の分解速度の合計より高い。したがって、Ang 1-10およびAng 1-8の濃度は、増加し、すなわち、Ang 1-10およびAng 1-8は、定常状態平衡が達成されるまで蓄積する。定常状態平衡が達成されるとき、Ang 1-10の実際の形成速度は、Ang 1-10分解に関与するすべての酵素の実際の代謝回転速度の合計（Ang 1-10の実際の全体的分解速度）に等しい；そして、Ang 1-8の実際の形成速度は、Ang 1-8分解に関与するすべての酵素の実際の代謝回転速度の合計（Ang 1-8の実際の全体的分解速度）に等しい。たとえば、もしRASに関与する１０個のペプチドのすべてが分析されるならば（図2、3ならびに4A、4C1および4C2）、上記の特定の条件は、１０個のすべてのペプチド、またはRASに関与するすべての酵素に適用されるべきである。
【００４１】
したがって、本発明の定常状態平衡の１つの実施態様において、少なくとも１つのタンパク質分解反応は、タンパク質分解カスケードの少なくとも１つのペプチド、特に、各ペプチドについて、該ペプチドの実際の全体的分解速度が該ペプチドの実際の全体的形成速度に等しいことを可能にする程度まで、活性であるか、または「開放」されていなければならない、すなわち、たとえば、１種以上のプロテアーゼ阻害剤の使用によって、該ペプチドの実際の全体的形成速度が、該ペプチドの実際または最大の達成可能な全体的分解速度を超える程度まで、阻害されないか、または「閉鎖」されない状態でなければならない。
【００４２】
１つの実施態様において、キレート剤は、二価のイオンのキレート形成を介してメタロプロテアーゼにおける阻害効果を有するので、たとえば、EDTA、EGTA、8-ヒドロキシキノリン、フェナントロリンおよびジメルカプロール（ブリティッシュ-アンチ-ルイサイト（Lewisite）またはBALとも呼ばれる）などのキレート剤は、特に、RASカスケードまたはメタロプロテアーゼが関与する他のタンパク質分解カスケードについては、定常状態平衡が達成されるまでインキュベーション前および／または中に添加されない。
【００４３】
１つの実施態様において、たとえば、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸リチウム、塩化マグネシウム、グアニジンチオシアネート（GTC）、塩化グアニジン、フェノール、プロパノール、ブタノール、エタノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、尿素、および/またはその他のものなどのカオトロピック剤は、定常状態平衡が達成されるまでインキュベーション前および／または中に添加されない。
【００４４】
１つの実施態様において、定常状態平衡は、該タンパク質分解カスケードのための生理的条件下で達成され、このことは、タンパク質分解カスケードの成分（酵素および基質またはペプチド産物）、身体から採取された生物試料に存在するそれらの総量および／または相対量、ならびに試料の成分に関するマトリックスおよび／またはpHが、定常状態平衡が達成されるまでインキュベーション前および／または中に実質的に変更されないことを意味する。１つの実施態様において、身体から採取された生物試料に存在するタンパク質分解カスケードに関与する酵素および／またはペプチドの濃度は、定常状態平衡が達成されるまでインキュベーション前および／または中に変更されない。
【００４５】
もう１つの実施態様において、たとえば、天然の形態またはラベリング（たとえば、同位体および／または蛍光標識および／またはアミノ酸修飾または少なくとも１つのアミノ酸交換）によって変更された形態における、内部標準または分解標準などのタンパク質分解カスケードに関与するいずれかの酵素の基質または基質類縁体は、それらの定常状態平衡が達成されるまでインキュベーション前および／または中に添加されない。本発明の１つの実施態様において、タンパク質分解カスケードは、RASであり、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンIおよび／またはアンジオテンシンIIも、それらのいずれかの類縁体も、定常状態平衡が達成されるまでインキュベーション前および／または中に添加されない。
【００４６】
もう１つの実施態様において、たとえば、緩衝基質（Tris、PBS、MES、HEPES、クエン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩もしくは炭酸水素塩（もしくは重炭酸塩））および／またはその他の緩衝基質もしくは各緩衝液などのさらなる基質または試薬は、定常状態平衡が達成されるまでインキュベーション前および／または中に添加されない。
【００４７】
さらにもう１つの実施態様において、EDTA、EGTA、PMSF、AEBSF、BSA、マレイン酸、無水マレイン酸、ギ酸および／または水（脱イオン化された、および／または蒸留されたなどの任意の形態で）などの物質または試薬は、定常状態平衡が達成されるまでインキュベーション前および／または中に添加されない。
【００４８】
しかしながら、そして上記にもかかわらず、１種以上の前述のプロテアーゼ阻害剤、キレート剤、カオトロピック剤、基質、標準、BSA、緩衝液および／またはその他の物質または試薬は、いったん定常状態平衡が達成され、必要に応じて反応を停止されたならば、添加されてもよい。
【００４９】
特に、１種以上の標準、たとえば内部標準および／または分解標準（degradation standards）は、いったん定常状態平衡が達成され、凍結されたならば、添加されてもよい。標準は、たとえば、タンパク質分解カスケードのペプチドであり、質量ラベリングおよび／または化学ラベリング（たとえば、同位体および／または蛍光ラベリング、および／またはアミノ酸修飾、および／または質量タグの使用、および／または少なくとも１つのアミノ酸交換）によって変更される。したがって、内部標準は、たとえば、 WO 03/016861 Aに開示された安定な同位体ラベリングされた内部標準である。１つの実施態様において、生物試料は、被験者から採取されてインキュベートされ（エクスビボ）、すなわち、試料のマトリックスおよび／または分析されるタンパク質分解カスケードの成分の濃度は変更されないが、定常状態平衡が達成され、安定化される前または後のいずれかに、必要に応じて、さらに加工される（たとえば、血漿または血清を得るなど）。必要に応じて、抗凝固剤、すなわち、凝固を防止する（血液の凝固を停止させる）物質は、定常状態平衡が達成されるまでインキュベーション前および／または中に試料に添加されてもよい。しかしながら、このような抗凝固剤は、分析されるタンパク質分解カスケードのプロテアーゼに実質的に影響を及ぼすべきではない。本発明において用いるための適当な抗凝固剤は、ヘパリンである。
【００５０】
もし分析されるタンパク質分解カスケードが血液凝固カスケードならば、当業者は、定常状態平衡が達成されるまでインキュベーション前または中に試料に添加される、血液凝固を防止するが、分析される少なくとも１つのペプチドについての定常状態平衡の確立を依然として可能にする適当な抗凝固剤を決定することができる。たとえば、抗凝固剤は、タンパク質分解カスケードにおけるさらに下流のステップで血液凝固を阻止するように、すなわち、分析されるペプチドの分解（タンパク質分解カスケードの上流）に関与するいずれかの酵素を阻害しないように、選択されうる。
【００５１】
分析前に、試料は、たとえば、血漿または血清分離（たとえば、遠心分離、または凝固の活性化後の遠心分離）、および／またはたとえば、マトリックス欠乏および／またはペプチド富化のための固相抽出（SPE）による精製によって、前処理またはさらなる加工をされてよい。したがって、固相抽出は、逆相クロマトグラフィー材料、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料、イオン交換材料、アフィニティークロマトグラフィー材料、特に C18、C8またはC6H5（フェニル）材料を用いて行われてもよい。
【００５２】
１つの実施態様において、１種以上の分析物は、固体表面から溶離した後に濃縮乾固され、HPLC適合溶媒中で再構成されてよく、このことは、該溶媒の組成が、MS結合HPLCカラムへの１種以上の分析物の結合を妨げないことを意味する。再構成溶媒は、分析物の溶解性を強化するため、および／またはHPLCカラムへの分析物の結合を促進するために、たとえば、プロパノール、ブタノール、2-ブタノール、ペンタノール、2-プロパノール、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、酸または塩基などの添加物を補足されてよい水性溶媒である。
【００５３】
もう１つの実施態様において、本発明方法は、抗凝固剤で処理された試料を提供する；必要に応じて、血漿または血清試料を得るために試料をさらに加工する；タンパク質分解カスケードに関与する少なくとも１つのペプチド分解産物について定常状態平衡が達成されるまで試料をインキュベートする；該定常状態平衡を保存する；必要に応じて、いったん定常状態平衡が保存されたならば、１種以上の内部標準を添加する；試料を用いて固相抽出を行う；および試料を分析する；ステップを含む。血漿または血清分離は、定常状態平衡が血漿、血清または全血中で検査される予定であるかどうかに応じて、定常状態平衡が達成される（および必要に応じて安定化される）までのインキュベーションステップの前または後のいずれかに行われてよい。
【００５４】
定常状態平衡濃度における少なくとも１つのペプチド分解産物の分析は、たとえば、質量分析（MS）；高圧液体クロマトグラフィー（高性能液体クロマトグラフィー、HPLCとも呼ばれる）などの液体クロマトグラフィー；特に、液体クロマトグラフィー−電子スプレーイオン化−質量分析（LC-MS）、および／または液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（LC-MS/MS）によって行われてよい。たとえば、Cuiら(Anal Biochem. 369（2007）、27-33）は、アンジオテンシンペプチドを定量するための液体クロマトグラフィー−電子スプレーイオン化−質量分析（LC-MS）および液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法を開示する。各ペプチドおよび対応する内部標準、異なる質量遷移（mass transitions）を測定することができる。該方法の性能は、品質管理試料を用いてモニターすることができる。
【００５５】
このような品質管理試料として、たとえば、所定の分析物濃度の生物試料ならびに所定の濃度の合成ペプチドの混合物を含む合成試料などが挙げられる。たとえば、品質管理試料は、所定の濃度の１種以上のペプチドを含むプールされた血液、血漿または血清試料あるいはプールされた組織ホモジネート試料であってよい。アンジオテンシンペプチド濃度は、内因性ペプチドシグナルを内部標準シグナルに関連付けることによって計算されうるが、ただし、積分された信号は、10を超えるシグナル対ノイズ比を達成した。
【００５６】
さらに、分析は、ラジオイムノアッセイ（RIA）または酵素結合免疫吸着検査法（ELISA）によって行われてよい。必要に応じて、HPLC精製ステップが、タンパク質分解カスケードのペプチド分解産物のRIAまたはELISAベース定量の前に行われてよい。
【００５７】
１つの実施態様において、試料前処理、試料加工および／または試料の分析は、たとえば、96ウェルプレートなどのマルチウェル形式でおこなわれてよい。
【００５８】
本発明は、被験者における１種以上のタンパク質分解カスケードの観察に基づく、被験者の、特に、被検者の血液系の生理的または生化学的状態の分析のための新規なツールを提供する。さらに詳しくは、本発明方法は、タンパク質分解カスケードの定常条件下での多数のペプチドレベルの決定を可能にする。さらに、本発明方法は、コンパートメント特異的様式でのタンパク質分解カスケードの評価を可能にし、たとえば、全血、血清ならびに血漿などの異なるコンパートメントにおいてRASを分析することができる。本発明のタンパク質分解カスケードのペプチド分解産物の測定は、特定の疾患の有無の指標またはこの疾患の治療の有効性もしくは無効性の指標とすることができる、被験者の生理的または生化学的状態の「フィンガープリント様」の結果、あるいは被験者の「フィンガープリント様」酵素活性プロフィールを提供する（もちろん、ただし、該疾患は、直接的または間接的にタンパク質分解カスケードに影響を及ぼす疾患である）。さらに、本発明方法は、インビボフィンガープリント（試料は即時に安定化され、したがって循環するペプチドレベルを反映する）およびエクスビボフィンガープリント（血漿、血清または全血中の定常状態平衡ペプチドレベル）の比較を可能にする。
【００５９】
したがって、本発明方法は、一般的なタンパク質分解カスケード、患者または患者群におけるその生理的または生化学的状態を研究するため、該タンパク質分解カスケード（もしくはその異常）に直接的または間接的に関連する疾患を診断するため、このような疾患のための治療または治療処方を決定するため、固定用量の組合せを決定するため、作用機序を検査するため、薬物関連副作用または有害事象を最小化するため、または短期および長期効果または毒性を審査するためなどの使用中の薬物または候補薬物の薬理学を審査するために用いることができる。
【００６０】
さらに、本発明方法は、新たな薬物、バイオマーカーまたはバイオマーカーパラメーターのスクリーニングおよび開発のため、特に、該薬物またはバイオマーカーの生理的マトリックス中でのスクリーニングのために用いることができる。
【００６１】
１つの実施態様において、本発明方法は、本発明方法による研究対象であるタンパク質分解カスケードに関連する病的状態または疾患のためのバイオマーカーアッセイとして用いられる。たとえば、ペプチド分解産物の濃度のみならず、本発明の研究対象であるタンパク質分解カスケードに関与する数個またはすべてのペプチドを含む完全定常状態平衡フィンガープリント（SSE-フィンガープリント）、および／または二種以上のペプチド分解産物の濃度の数学関数（たとえば、積、比、合計、差）、および／または少なくとも２つの該数学関数の組合せは、バイオマーカー（またはバイオマーカーコンピレーション（biomarker compilation））として用いることができる。
【００６２】
もう１つの実施態様において、本発明方法は、治療のため、たとえば、治療に対する反応者と非反応者の識別のためなどの、特定の患者群を決定するために用いることができる。
【００６３】
本発明方法はまた、コンパニオン診断として用いることができる。コンパニオン診断は、患者のための治療法を決定する医師を補佐することを意図するアッセイ（試験または測定）である。コンパニオン診断は、身体において薬物がどのように作用するかという情報を提供して、一人の患者、標的である患者群または亜群についての特定の薬物または薬物のクラスの効能および／または安全性を解明することによって行われる。コンパニオン診断には、すでに市販されている薬物のために用いられる試験、ならびに可能性のある薬物の前臨床または臨床開発段階においてすでに用いられている試験を含む２つの主なグループがある。すでに早期開発段階にある薬物についてのコンパニオン診断の使用は、副作用の少ない、より速く効き、より費用効率の高い様式で治療効果の増強された、より安全な薬物が得られることによって、薬物開発プロセスおよび薬物候補の商品化を有意に変更する可能性を有する。
【００６４】
したがって、特に、もし本発明方法が医薬組成物の効果をモニターするため、または医薬組成物の最適用量を決定するため、または１種以上の医薬組成物の何らかの可能性のある毒性相互作用を評価するため、または多数の薬物相互作用を審査するために用いられるならば、生物試料を採取される被験者は、たとえば、プロテアーゼ阻害剤を含む医薬組成物（インビボ）などの１種以上の医薬組成物で治療されていてもよい。
【００６５】
本発明の１つの実施態様において、被験者はヒトである。もう１つの実施態様において、被験者はたとえば、哺乳類、げっ歯類、ブタまたはサルなどの動物である。
【００６６】
本発明方法は、血液試料中のタンパク質分解カスケードの全体的評価のための標準化された手順であるが、その他の試料、特に、生検、組織ホモジネート、組織切片、液体（liquor）、胆液、尿中などののタンパク質分解カスケードにも適している。本発明は、原理的には、血液系で起こるすべてのタンパク質分解カスケード（タンパク質分解カスケードの代謝産物もしくは中間体もしくは最終産物であるペプチド分解産物へのタンパク質またはペプチドの酵素的切断のコントロール下にある）に用いることができる。さらに詳しくは、本発明は、RASなどのヒト血液系、血液凝固カスケード、補体系、アポトーシス経路、神経ペプチドカスケード、エンドセリンペプチドカスケード、ナトリウム利尿ペプチドカスケードにおいて最も関連のあるタンパク質分解カスケードに適している。本発明において、定常状態平衡ペプチド濃度の測定方法が提供され、該濃度は、該ペプチドの代謝酵素の活性および変換速度を反映する。その意味において、ペプチドの定常状態平衡濃度は、ペプチドの形成速度がその分解速度に等しいことを意味し、特定の時間にわたって実質的にまたは有意に経時変化せず、そして、上述したように、最大酵素変換速度よりもむしろ所定の条件下での基質に対する酵素の親和性に強く従属する１つのペプチド濃度がもたらされる。本発明は、生物系に取り組むので、用語「定常状態平衡」は、達成されるべき単一のポイントとみなされず、ペプチド濃度の速度論的対象領域であるとみなされることは明らかであり、所定の時間にわたって有意には経時変化しない。このような定常状態平衡濃度が達成されるまでのより正確な時間は、主として、所定のタンパク質分解カスケード、定量されるペプチド分析、試料の性質およびインキュベーションパラメーターに応じて変化する。これは、各カスケードについて容易に決定することができる。一般に、本発明の定量を行うことができる「定常状態平衡ウィンドウ」は、少なくともいくつかのタンパク質分解カスケード、特に血液中のものにとってかなり大きい。通常、定常状態平衡は、経験的に決定される特定のインキュベーション時間（たとえば、RAS系については30分）の後に達成され、次いで、長期間安定する（たとえば、RAS系については6時間）。次いで、定常状態平衡は、関与する酵素の分解および不活化または試料中の供給基質の欠乏などの影響により妨げられる。所定のカスケードについての供給基質濃度に基づく安定時間（ts）は、試料中の供給酵素の最大代謝回転速度を達成するための最小基質濃度を定義する酵素および試料特異的定数(cmin）で引いた、供給基質（または供給前駆体ペプチド）の濃度（cf）を、供給速度を定義するカスケードの供給酵素の代謝回転速度（Vf）で割ることによって計算することができる。
tｓ＝（cf−cmin）/Vf
tｓ  供給基質濃度に基づく安定時間[時間]
cf  供給基質濃度[mol/L]
cmin  試料中の供給酵素の最大代謝回転速度を達成するための試料特異的最小基質濃度[mol/L]
Vf  カスケードの供給速度[[mol/L]/[時間]]
および
cmin＝f・cE
f  過剰因子
cE  供給酵素濃度
【００６７】
たとえば、供給転換がレニンによって行われるRASへの上記の式の適用により、PRA（血漿レニン活性）、PRC（血漿レニン濃度）についての異なる公開された値（[Nishiyamaら、2010、およびBystromら、Clin. Chem. 56(2010）、1561-1569]などを参照）に基づき、たとえば、70μg/血漿mlのADT濃度および1000などの過剰因子を適用して、約60〜200時間という計算されたRAS定常状態平衡の供給基質濃度に基づく安定時間がもたらされる。もちろん、実際の定常状態平衡の安定時間は、試料ごとに有意に相違しうるので、該計算された供給基質濃度に基づく安定時間は、雑な理論的基準点にすぎないものとみなすべきである。
【００６８】
本発明方法は、Ang 1-10およびその分解産物のモニタリングおよび分析に特に適しており、その結果、ヒト血液試料中のRASの状態を監視することができる。Ang 1-10およびその分解産物の定常状態平衡濃度は、被験者の生理的または生化学的状態の優れた指標である。たとえば、Ang 1-10分解産物の正常な分布からの偏差は、たとえば、血圧の病的上昇またはその他の病的状態または疾患などをもたらしうるRASおよび／またはブラジキニン系の酵素の機能不全を示す。一方、本発明の定常状態平衡におけるAng 1-10分解産物の分布および相対濃度から、RASを標的とする治療的処置のタイプおよび有効性をモニターすることができる。驚いたことに、本発明の定常状態平衡濃度は、定常状態平衡を達成させない状態での血液試料（すなわち、即時に安定化された「古典的」な血液試料）中のAng 1-10またはその他の分解産物の決定よりも、非常に良い指標および相関関係を提供する。
【００６９】
成功率の低い、特定の酵素によって生産されるペプチドを即時に安定化させるために阻害剤を用いる最先端の方法[Bystromら、Clin. Chem. 56(2010）、1561-1569]とは対照的に、本発明によれば、試料が、タンパク質分解カスケードに関与する少なくとも１つのペプチドについて、酵素活性が定義する定常状態平衡を達成するのが可能になる。この革新的なアプローチは、生理的試料マトリックス中のタンパク質分解カスケード、特に、RASの非常に再現性の高い全体的評価を可能にし、タンパク質分解カスケードのペプチドの代謝に関与するすべての酵素活性を統合する。最先端の技術を超えるもう一つの利点は、試料中の所定の条件（たとえば、生理的条件）下での各単一の基質に対する酵素の親和性を考慮すると、本発明アッセイにおける基質濃度が、一般に、代謝酵素（酵素供給を除く）の濃度を下回っていることであり、基質の過剰量を用いることによる単純化の手段のためにこの重要な特徴が無視されるインビトロ酵素活性アッセイとは対照的である。
【００７０】
最後に、本発明方法による定常状態平衡ペプチドレベルの測定は、患者の試料における脱制御の可能性のある部位の識別を可能にし、患者の疾患によって影響を及ぼされたタンパク質分解カスケードの治療操作における患者特異的アプローチ（たとえば、高血圧の治療におけるRAS標的薬のタイプの選択および薬物耐性の予測）のための道を開き、バイオマーカーの発見における該方法の使用に対する有意な可能性を生み出す。
【００７１】
したがって、本発明は、診断分析のため、特に、タンパク質分解カスケード、特に、RASに関連する疾患の診断ための優れたエクスビボプラットホームを提供する。このようなRASに関連する疾患として、たとえば、高血圧症、心疾患、特に、うっ血性心不全、慢性心不全、急性心不全、動脈硬化症、心筋梗塞、腎疾患、特に、腎不全、糖尿病性腎症、肺疾患、特に、急性肺損傷および/または急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、肝疾患、特に、線維症、炎症性疾患、特に、敗血症、関節炎は、リウマチおよび/またはガンが挙げられる。本発明はまた、たとえば、RASに影響を及ぼす物質の同定、RASに影響を及ぼす物質の影響の評価、および／またはRASに影響を及ぼす薬物療法下にある患者のモニタリングなどの患者の多数のルーチン分析に適している。このようなRASに影響を及ぼす薬物療法として、たとえば、アミノペプチダーゼ阻害剤、特に、アマスタチン；ACE阻害剤、特に、カプトプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリル、ベナゼプリル；アンジオテンシンII受容体拮抗薬、特に、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、オルメサルタン、テルミサルタン、バルサルタン；アルドステロン受容体拮抗薬、特に、エプレレノン、スピロノラクトン；および／またはACE2、特に、組換え可溶性ヒトACE2およびレニン阻害剤、特に、アリスキレンなどの１種以上の活性成分が挙げられる。
【００７２】
特に血液試料については、タンパク質分解カスケードに関与する少なくとも１つのペプチドのための定常状態平衡を達成するために、少なくとも、少なくとも１つのペプチドの分解に関与する少なくとも１つの酵素が該少なくとも１つのペプチドについて定常状態が達成されるまで働くのを可能にしない程度まで、本発明方法で観察されるタンパク質分解カスケードのプロテアーゼが、試料へのプロテアーゼ阻害剤の添加によって阻害されない、すなわち、該ペプチドの少なくとも１つの分解酵素が該ペプチドの定常状態平衡を可能にする程度まで活性状態でなければならないことが重要である。したがって、１つの実施態様において、プロテアーゼ阻害剤は、分析される少なくとも１つのペプチドの形成および分解に関与するプロテアーゼの活性が有意に阻害されない程度までは試料に添加されない。該実施態様にしたがって、試料は、このようなプロテアーゼ阻害剤と組合せられないか、またはもしこのような阻害剤がすでに添加されていたならば、このような阻害剤は、定常状態平衡が達成されるまで、阻害される（それらのプロテアーゼ阻害機能において）か、またはインキュベーション前および／または中に除去される。もちろん、本発明方法によって調査されるべき関連タンパク質分解カスケードのプロテアーゼに影響を及ぼさないが、その他のタンパク質分解活性を阻害する阻害剤（たとえば、もしRASが調査されるならば、血液凝固の阻害剤）は、カスケードの少なくとも１つのペプチドについての定常状態平衡を達成さする関連タンパク質分解カスケード（すなわち、分析されるカスケード、たとえば、RAS）の能力に影響を及ぼさないので、試料に添加することができる。
【００７３】
タンパク質分解カスケードは、タンパク質（たとえば、体細胞または体液から排出されるべき食物タンパク質）の単純な消化から、RASまたは血液凝固系などの高度に制御されたカスケードまでの数多くの生理的プロセスに存在する。プロテアーゼは、タンパク質のアミノ酸配列に応じて特定のペプチド結合を切断する（限定されたタンパク質分解）か、または完全なペプチドをアミノ酸に分解する（非限定的タンパク質分解）ことができる。ペプチド結合の特異的切断は、複雑な生体内作用の調節のための中枢機構である。特に、ペプチドホルモンは、不活性な前駆体ペプチドとして頻繁に産生される、過剰量で循環中に存在する。選択的プロテアーゼは、活性ホルモンを遊離させるために必要であり、それらは、次いで、他のプロテアーゼによって順に分解される。
【００７４】
１つの実施態様において、本発明によって分析することができる試料のタイプは、血液試料である。本発明における「血液試料」は、血液または１種以上のそのフラクション（関連タンパク質分解カスケードのプロテアーゼを含む）を含むいずれかの試料でありうる。さらに詳しくは、ヒトのドナーからルーチンで提供されるすべての血液試料、すなわち、全血、血漿もしくは血清または凍結抗凝固血漿を、本発明で用いることができる。「抗凝固」血または血漿は、抗凝固剤、すなわち、凝固を妨げる（血液の凝固を停止させる）物質を含み、もちろんそれらの物質は、定常状態平衡を達成するタンパク質分解カスケードのプロテアーゼの能力において、分析されるプロテアーゼに影響を及ぼすことはない。適当な抗凝固剤はヘパリンである；したがって、ヘパリン化された血液試料は、本発明方法のための適当な源材料である。ヘパリン化された血液試料はさらに、本発明方法が適用される前に、加工されてもよい。たとえば、ヘパリン化された血漿または血清は、該血液試料から誘導されてもよい。別法として、本発明方法はまた、全血において、すなわち、まだ存在している全ての血液細胞（ならびにこのような細胞上もしくは内のプロテアーゼ）を用いて行われてもよい。クエン酸またはEDTAなどの、抗凝固剤としてより一般的に働くプロテアーゼ阻害剤は、あまり適していない；または別法（試料が、たとえば、すでにこのような抗凝固剤を含む場合）は、定常状態平衡が達成されるまで試料のインキュベーションを可能にするために、このようなプロテアーゼ阻害剤のための中和物質の添加を必要としうる。
【００７５】
本発明方法によれば、タンパク質分解カスケードの状態のためのマーカーとして、ただ１つではない特定のペプチドまたはペプチド分解産物を同定することができる。カスケードの１つ以上のペプチドマンバーを分析することが可能であり、それによって被験者におけるこのカスケードの生理的または生化学的状態のさらに精密な分析が可能となる。定常状態平衡にあるタンパク質分解カスケードの異なるペプチドメンバーの相対量が、被検者におけるこのカスケードの生理的または生化学的状態をよく示すことが本発明の過程で判明している。たとえば、定常状態平衡における二種以上のタンパク質分解産物のモル量または濃度の比率は、酵素活性、関連する生理的状態または病理を示すことができる。本発明が提供する例の一つは、定常状態平衡におけるAng 1-8：Ang 1-10のモル比（またはその他のAng 1-10分解産物の相対比）であり、それは、被験者のRAS状態および／または被験者に適用される治療（たとえば、リシノプリル、アマスタチン、ACE、ACE2、NEPなどの物質による治療）に影響を与えるRASを示す。
【００７６】
したがって、本発明の１つの実施態様は、定常状態平衡濃度における試料中のタンパク質分解カスケードの少なくとも２つ、少なくとも３つ、特に、少なくとも４つのペプチド分解産物の定量を含む。本発明方法を用いて、できるだけ多くの定常状態平衡におけるタンパク質分解カスケード中の分解産物を定量して、タンパク質分解カスケードの状態の「フィンガープリント様」評価を得ることが可能である（あるいは分かっている）。
【００７７】
本発明によれば、定常状態平衡における１種以上のタンパク質分解産物を定量することが必要である。このことは、被験者から試料（すなわち、血液試料）が採取された後に即時に安定化されたタンパク質分解カスケードの状態における分析物の定量を通常適用する従来技術分析とは本質的に相違する。通常、このような従来技術試料は、カスケードにおける望ましくない酵素依存性変化を阻止するために、試料採取後即時にプロテアーゼ阻害剤で処理される。しかしながら、本発明は、定常状態平衡が達成されるまで、調査下にあるタンパク質カスケードのプロテアーゼのたんぱく質分解活性が機能するのを可能にすることによって、該カスケードに関する被験者の生理的または生化学的状態の分析においてこのような酵素依存性変化を用いる。このことは通常、被験者からの試料の採取後に即時に安定化された試料と比較した場合に、調査下にあるタンパク質カスケード中のペプチド分解産物の量および組成における変化をもたらす。本発明によれば、試料特異的タンパク質分解活性は、即時に安定化された試料（本発明の、定常状態平衡が達成されるまでのインキュベーションステップなし）よりも、このカスケードに関する被験者の生化学的状態をより詳しく示す定常状態平衡をもたらす。
【００７８】
すでに上述したように、本発明の定常状態平衡は、単一の定量的に正確に決定され、識別されるポイントではなく、相対比における変化が試料中で実質的に低減化された状態である。通常、このような定常状態平衡は、所定の試料および調査下のカスケードのための通常のインキュベーション条件を適用することによって達成されうる。上述したように、試料は、15分、20分、25分、30分、60分、90分、120分、150分、180分、210分、240分、270分または300分までインキュベートされてよい。RASおよび／またはブラジキニン系にのために、試料は、少なくとも30分〜300分または少なくとも30分〜180分または少なくとも30分〜120分または少なくとも30分〜90分または少なくとも30分〜60分インキュベートされてよい。適当なインキュベーション温度は、生理系の温度であるか、または調査下のタンパク質分解カスケードのプロテアーゼがそれらの作用にとって最適温度である温度であり、たとえば、30〜50℃、35〜40℃、または特に、約37℃（ヒト血液試料用）である。
【００７９】
すでに上述したように、本発明は、実施例セクションにおいて、特に、レニン-アンジオテンシン-系（RAS）およびブラジキニン系において、さらに例示される。分析される１種以上のペプチド分解産物は、アンジオテンシンI（Ang 1-10）、アンジオテンシン2-10（Ang 2-10）、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシンIII（アンジオテンシン2-8またはAng 2-8）、アンジオテンシンIV（アンジオテンシン3-8またはAng 3-8）、アンジオテンシン1-9（Ang 1-9）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）、アンジオテンシン2-7（Ang 2-7）、アンジオテンシン3-7（Ang 3-7）およびアンジオテンシン1-5（Ang 1-5）などのアンジオテンシンペプチド；および／またはカリジン（KDまたはLys-ブラジキニン）などのキニンペプチド、およびブラジキニン1-9（BK 1-9）、ブラジキニン2-9（BK 2-9）、ブラジキニン1-8（BK 1-8）、ブラジキニン1-7（BK 1-7）およびブラジキニン1-5（BK 1-5）などのその生物分解産物から選ばれることができる。
【００８０】
１つの実施態様において、ペプチド分解産物は、アンジオテンシンI（1-10）、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）およびアンジオテンシン1-5（Ang 1-5）から選ばれる。もう１つの実施態様において、ペプチド分解産物は、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）およびアンジオテンシン1-5（Ang 1-5）から選ばれる。さらにもう１つの実施態様において、ペプチド分解産物は、ブラジキニン1-9（BK 1-9）、ブラジキニン1-8（BK 1-8）、ブラジキニン1-7（BK 1-7）およびブラジキニン1-5（BK 1-5）から選ばれる。
【００８１】
ので、本発明方法は、試料中に含まれるタンパク質分解活性を適用するので、１種以上の試料、特に、血液試料は、定常状態平衡が達成される前にタンパク質分解カスケードのためのプロテアーゼ阻害剤を含むべきではない。
【００８２】
このようなプロテアーゼ阻害剤は、定常状態平衡が達成され、安定化されるまでインキュベーション後に加えられてもよい。このことは、定常状態平衡を反映するペプチド濃度が、定量ステップ中にも維持されることを保障する（定常状態平衡は通常、一定の期間にわたって安定であるが、このことは本発明方法のためのさらなる品質保証を提供する）。
【００８３】
本発明方法を用いて、RASおよび／またはブラジキニン系の状態をモニターすることが可能である。１つの実施態様において、少なくとも２つのペプチド分解産物が定量され、少なくとも２つのペプチド分解産物の定常状態平衡定量の比が計算される。したがって、本発明の１つの実施態様は、アンジオテンシンI（Ang 1-10）、アンジオテンシン2-10（Ang 2-10）、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシンIII（アンジオテンシン2-8またはAng 2-8）、アンジオテンシンIV（アンジオテンシン3-8またはAng 3-8）、アンジオテンシン1-9（Ang 1-9）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）、アンジオテンシン2-7（Ang 2-7）、アンジオテンシン3-7（Ang 3-7）およびアンジオテンシン1-5（Ang 1-5）、カリジン（KDまたはLys-ブラジキニン）およびブラジキニン1-9（BK 1-9）、ブラジキニン2-9（BK 2-9）、ブラジキニン1-8（BK 1-8）、ブラジキニン1-7（BK 1-7）およびブラジキニン1-5（BK 1-5）などのその生物分解産物の少なくとも２つの定量を用いる。このような少なくとも２つのペプチド分解産物の比または積は、試料中のRASなどのタンパク質分解カスケードの状態のための特に指示性の高いパラメーターを提供するために計算されてよい。たとえば、Ang 1-8とAng 1-10の間の定常状態平衡濃度比は、ACEの生理的または生化学的状態、機能および／または活性を示す。したがって、定常状態平衡における、ペプチド分解産物とその前駆体ペプチド（すなわち、該ペプチド分解産物を形成する酵素の基質）の間の比は、該基質を該ペプチド分解産物に切断する酵素の生理的または生化学的状態、機能および／または活性を示す。１つの実施態様において、ペプチド分解産物とその前駆体ペプチドの間の１つ以上の比が計算される。該少なくとも２つの比は、たとえば、少なくとも２つの比の比または積を計算することによって、あるいは、該比を加算または減算することによって、またはその両方（和の間および／または差もしくは減算の間の比を計算すること）によって、再び互いに関連付けられうる。もう１つの実施態様において、少なくとも１つのインビボペプチドレベル（即時に安定化されたもの）と定常状態平衡における同じペプチドレベルとの間の比が計算される。
【００８４】
本発明方法は、ペプチド分解産物の厳密かつ正確な定量に依存する。多くの資料、特に、血液試料は、タペプチド定量を妨げうるンパク質、塩、酸、塩基、脂質、リン脂質またはその他の成分を含む；定量前の試料の前処理方法が適用されてもよい。
【００８５】
本発明方法は、キットを用いることによって行われてもよい。
【００８６】
もう１つの態様において、本発明は、定常状態平衡濃度における生物試料中のタンパク質分解カスケードのペプチド分解産物の測定用キットに関する。該キットは、タンパク質分解カスケードの少なくとも１つのペプチド分解産物について定常状態平衡が達成されるまで一定の期間試料をインキュベートするための使用説明書を含んでもよい。キットは、上述したように、本発明方法を行うための１種以上の使用説明書をさらに含んでもよい。
【００８７】
したがって、１つの実施態様において、定常状態平衡濃度における生物試料中のタンパク質分解カスケードのペプチド分解産物の測定用キット（すなわち、本発明方法を行うためのキット）は、触媒カスケードの少なくとも１つのペプチド分解産物について定常状態平衡が達成されるまで一定の期間１種以上の試料をインキュベートするための使用説明書を含む。必要に応じて、キットは、ペプチド、酵素、酵素阻害剤、緩衝液、溶媒、カオトロピック剤、界面活性剤およびそれらの組合せから選ばれる１種以上の化学的、生化学的および／またはバイオテクノロジー的試薬をさらに含む。必要に応じて、キットは、固相抽出材料またはその他の精製材料、容器およびそれらの組合せから選ばれる１種以上の化学的、生化学的および／またはバイオテクノロジー的実験用部材をさらに含む。必要に応じて、キットは、血液試料、血清試料、血漿試料、組織試料およびそれらの組合せから選ばれる１種以上の生物試料をさらに含む。たとえば、該生物試料は、血液、血清、血漿および／または組織試料でありえ、たとえば、標準および／または品質管理試料として使用されてもよい。該容器は、試料採取管またはバイアルまたは化学的、臨床的、生化学的および／またはバイオテクノロジー的材料を含むのに適したいずれかの他の標準容器でありうる。１つの実施態様において、容器は、血液または組織容器である。該容器は、必要に応じて、１種以上のヘパリン、EDTAおよび／またはその他の抗凝固剤などの抗凝固剤を含む。該容器は、上述または実施例セクションでさらに特定されるものなどの１種以上の酵素阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤カクテルをさらに含んでもよい。
【００８８】
１つの実施態様において、キットは、１種以上のプロテアーゼ阻害剤または阻害剤カクテル、１種以上の供給基質、必要に応じてヘパリンでコーティングされた１種以上の血液採取管、１種以上の標準、１種以上の品質対照サンプル、１種以上の固相抽出材料、および／または１種以上の溶媒またはそれらの組合せを含む。
【００８９】
上述のキットに含まれるキットの構成要素および使用説明書は、本発明方法に関してさらに定義される。少なくとも１つのペプチド分解産物または触媒カスケードについて定常状態平衡が達成されるまで一定の期間試料をインキュベートするための使用説明書は、たとえば、本発明方法に関して上記特定された方法、試薬および／または条件についての情報、インキュベーション、試料安定化および／または分析のための期間および条件に関する情報を含む。したがって、使用説明書は、たとえば、定常状態平衡が達成されるまでインキュベーション前および／または中に任意のプロテアーゼ阻害剤を加えないこと、および／または添加された任意のプロテアーゼ阻害剤を不活化するか、または除去すること、などのさらなる使用説明を含んでもよい。定常状態ペプチド測定に基づく単一プロテアーゼ活性あるいは定常状態平衡におけるタンパク質分解カスケードおよびペプチドレベルにおける特定のプロテアーゼ阻害剤（または各医薬組成物）の影響の測定などの特定の適用は、定常状態平衡を達成するために、インキュベーション前に特定のプロテアーゼ阻害剤の添加を必要とする可能性がある。したがって、使用説明書は、特定のプロテアーゼ阻害剤を添加するための説明を含んでもよい。しかしながら、上述したように、少なくとも１つのタンパク質分解反応は、タンパク質分解カスケードの少なくとも１つのペプチドについて、該ペプチドの実際の全体的分解速度が該ペプチドの実際の全体的形成速度に等しいことを可能にする程度まで、活性化されなければならない。
【００９０】
このような指示書は、たとえば、紙様式（たとえば、リーフレットもしくはマニュアルとして）または電子的に提供されてよい。このような使用説明書は、キットに直接もしくは間接的に添付されてよく、たとえば、キットの製造者および／または供給者によって提供され、キットパッケージに含まれるか、または他の様式で（たとえば、キットの製造者および／または供給者からの電子メールによるか、またはキットの製造者および／または供給者のウェブページからのダウンロードによって）キットとともに提供される。
【００９１】
もう１つの態様において、本発明は、定常状態平衡濃度における生物試料中のタンパク質分解カスケードのペプチド分解産物の測定のためのキットの使用に関する。キットのこのような使用は、本発明方法に関して上述したように特定される。１つの実施態様において、キットの使用は、該タンパク質分解カスケードに関与する少なくとも１つのペプチド分解産物について定常状態平衡が達成されるまで試料をインキュベートするステップを含む。もう１つの実施態様において、キットの使用は、試料中の定常状態平衡濃度における該少なくとも１つのペプチド分解産物を定量するステップを含む。
【００９２】
もう１つの態様によれば、本発明は、本発明方法による定量の結果または本願発明キットの使用の結果の物理的もしくは電子的表現に関し、ここで、少なくとも２つのペプチド分解産物は、物理的または電子的担体で定量されたものであり、少なくとも２つのペプチド分解産物の定量された量は、タンパク質分解カスケードの順序で提供される。他の実施態様において、少なくとも３つまたは少なくとも４つのペプチド分解産物は、物理的または電子的担体で定量され、少なくとも３つまたは少なくとも４つのペプチド分解産物は、タンパク質分解カスケードの順序で提供される。
【００９３】
本発明の物理的または電子的表現の１つの実施態様において、アンジオテンシンI（Ang 1-10）、アンジオテンシン2-10（Ang 2-10）、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシンIII（アンジオテンシン2-8またはAng 2-8）、アンジオテンシンIV（アンジオテンシン3-8またはAng 3-8）、アンジオテンシン1-9（Ang 1-9）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）、アンジオテンシン2-7（Ang 2-7）、アンジオテンシン3-7（Ang 3-7）およびアンジオテンシン1-5（Ang 1-5）、カリジン（KDまたはLys-ブラジキニン）およびブラジキニン1-9（BK 1-9）、ブラジキニン2-9（BK 2-9）、ブラジキニン1-8（BK 1-8）、ブラジキニン1-7（BK 1-7）およびブラジキニン1-5（BK 1-5）などのその生物分解産物の少なくとも２つまたは少なくとも３つの定量の結果が含まれ、それらの相対量に応じて提供される。
【００９４】
したがって、この物理的または電子的表現は、アンジオテンシンI（Ang 1-10）、アンジオテンシン2-10（Ang 2-10）、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシンIII（アンジオテンシン2-8またはAng 2-8）、アンジオテンシンIV（アンジオテンシン3-8またはAng 3-8）、アンジオテンシン1-9（Ang 1-9）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）、アンジオテンシン2-7（Ang 2-7）、アンジオテンシン3-7（Ang 3-7）およびアンジオテンシン1-5（Ang 1-5）の定量の結果が含まれ、それらの相対量に従属して提供されるという形態で提供される。もう１つの実施態様によれば、この物理的または電子的表現は、カリジン（KDまたはLys-ブラジキニン）およびブラジキニン1-9（BK 1-9）、ブラジキニン2-9（BK 2-9）、ブラジキニン1-8（BK 1-8）、ブラジキニン1-7（BK 1-7）およびブラジキニン1-5（BK 1-5）などのその生物分解産物の定量の結果が含まれ、それらの相対量に従属して提供されるという形態で提供される。
【００９５】
１つの実施態様において、この物理的または電子的表現は、アンジオテンシンI（1-10）、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）およびアンジオテンシン1-5（Ang 1-5）の定量の結果が含まれ、それらの相対量に従属して提供されるという形態で提供される。
【００９６】
もう１つの実施態様において、この物理的または電子的表現は、アンジオテンシンII（アンジオテンシン1-8またはAng 1-8）、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）およびアンジオテンシン1-5（Ang 1-5）の定量の結果が含まれ、それらの相対量に従属して提供されるという形態で提供される。
【００９７】
さらにもう１つの実施態様において、この物理的または電子的表現は、ブラジキニン1-9（BK 1-9）、ブラジキニン1-8（BK 1-8）、ブラジキニン1-7（BK 1-7）およびブラジキニン1-5（BK 1-5）の定量の結果が含まれ、それらの相対量に従属して提供されるという形態で提供される。
【００９８】
さらにもう１つの実施態様において、この物理的または電子的表現は、ブラジキニン1-8（BK 1-8）、ブラジキニン1-7（BK 1-7）およびブラジキニン1-5（BK 1-5）の定量の結果が含まれ、それらの相対量に従属して提供されるという形態で提供される。
【００９９】
本発明による、すなわち、得られた定量結果のマルチパラメーター表現による、健康状態とペプチド分解産物のこの物理的または電子的表現は、障害または疾患（たとえば、RASに関連する障害または疾患）の診断において有意な評価を可能にする、医師にとって価値ある診断ツールである。それは、「フィンガープリント様」様式疾患状態の間の比較（または疾患の異なる段階または治療の異なる段階の比較）を可能にする（本発明の図面において図示する（RAS-フィンガープリント））。これらの結果は、電子的に提供されうる。電子形式において、同じ患者または集団もしくは患者群のいずれかからのこれらの経時的パターンの比較および展開は、容易に分析し、モニターすることができる。図式的表現において、本発明方法の結果が、定量の結果のみならず、ペプチド濃度の根底にある生化学的関係を描く、疾患の診断および／または治療において価値の高い複雑な相互依存型「ファインガープリント様」結果であるように、タンパク質分解カスケードを描くことができる。したがって、本発明のこのツールは、本発明方法によって得られた結果の用途を改善することができる。
【０１００】
本発明をさらに、以下の実施例および図面によって記載するが、もちろんそれらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】RAS定常状態平衡（RSSE）を示す。（A）健康なドナーからヘパリン血液を採取し、37℃にてインキュベートした。示した時間が経過した後、ヘパリン化血液試料のアリコートにプロテアーゼ阻害剤カクテルを加えて、定常状態平衡を保存した。アンジオテンシン1-10（青）およびアンジオテンシン1-8（緑）の濃度を示し、採取中に即時に安定化された同じドナーから採取された血液試料のアリコートと比較する（ICE、t=0）。（B）示されたRAS阻害剤の不在下（赤；コントロール）および存在下（青）で、ヘパリン化された血液中の定常状態平衡アンジオテンシン濃度を決定した。定常状態平衡は、即時に（0時間）または37℃にて2時間および4時間インキュベーションした後に、試料にプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加することによって凍結された。（C）EDTAおよびAEBSFの不在下（赤；コントロール）および存在下（青）で、ヘパリン化された血液中のアンジオテンシン濃度を決定した。インキュベーションは、即時に（0時間）または37℃にて2時間および4時間インキュベーションした後に、試料にプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加することによって凍結された。アンジオテンシン1-10およびアンジオテンシン1-8の濃度を示す。
【図２】RAS定常状態平衡の薬理学的操作を示す。示した作用剤を、2時間のインキュベーション期間の前に添加し、次いで、LC-MS/MSベースRSSE-フィンガープリント法を行った。結果を、大きさの異なる球体としてアンジオテンシンペプチド濃度、ならびに青い矢印および文字によって代謝酵素を表示するフィンガープリント図に示す。球体の下の注釈は、ペプチド名およびペプチド濃度（pg/血液ml）で構成される。低分子量RAS阻害剤（A）、外部から添加されたにRAS酵素（B）および両方の組合せ（C）についてのRSSE-フィンガープリントを示す。
【図３】RSSE-フィンガープリント法のマトリックス依存性を示す。同じドナーからヘパリン化された血液、血漿および１回の凍結／解凍サイクルを受けた血漿を調製し、2時間-37℃のインキュベーション、次いで、試料にプロテアーゼ阻害剤カクテルを加えることによる定常状態平衡の保存およびLC-MS/MS分析を行うRSSE-フィンガープリント法に付す。薬理学的操作をしていないコントロール試料のフィンガープリントグラフ（A）を作成し、アマスタチン（B）またはリシノプリルと併用でのACE2（C）がインキュベーション期間前に添加された試料と比較する。
【図４】健康なボランティアにおけるRAS-ならびにRSSE-フィンガープリント法を示す。プロテアーゼ阻害剤カクテルの存在下で血液試料を健康なボランティアから集め、インビボの、すなわち、いずれかの平衡になる前に存在するアンジオテンシンペプチドレベルを保存し（RAS-フィンガープリントまたはインビボRAS-フィンガープリント）、定常状態平衡が達成されるまでインキュベーションに付されたヘパリン化された血液および血漿（RSSE-フィンガープリントまたはエクスビボフィンガープリント）と並列させて比較した。12人の健康なボランティアのヘパリン化された血液および血漿についての平均RAS-フィンガープリント（保存されたインビボペプチドレベル）および平均RSSE-フィンガープリント（保存されたエクスビボ生成定常状態平衡ペプチドレベル）を示す（A）。ACE [fmol/ml Ang 1-8]/[fmol/ml Ang 1-10]についてのモルSSE-比を計算し、各ドナーについての対応するアンジオテンシン1-10およびアンジオテンシン1-8濃度（pg/mlおよびfmol/ml）とともに提示した（B）。表は、すべてのドナーのRAS-フィンガープリント（図4B1；表1）、血液からのRSSE-フィンガープリント（図4B2；表2）および血漿からのRSSE-フィンガープリント（図4B3；表3）を構成するペプチドレベルの値ならびに計算された平均および標準誤差を示す。12人の健康なボランティアのうち2人のRAS-およびRSSE-フィンガープリントを、下部に示すモルSSE-比についての対応する値とともに示す（C；4C1：ドナー3、4C2：ドナー6）。
【図５】ブラジキニン系の主なペプチド分解ステップの概要、すなわち、主なブラジキニンペプチドおよびそのようなペプチドを形成および／または分解する各酵素を示す。
【図６】示した時間のインキュベーションを行った後にGTCで安定化された同じ血漿試料中のRAS（Ａ）およびブラジキニン系（Ｂ）について測定されたペプチドレベルの表を示す。
【図７】それぞれの棒グラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０２】
実施例：
材料：
C18カートリッジ：Sep-Pak Vac 3cc（500mg）、Waters 
質量分析計：Q TRAP4000-Applied Biosystems
HPLCシステム： 1100シリーズ、Agilent
C18 RP-HPLCカラム：Luna 3u C18(2）100A、100x2.00mm、(Phenomenex、カタログ番号00D-4251-B0）
【０１０３】
試薬：
無水エタノール(Merck、カタログ番号100983）
メタノール(Fluka、カタログ番号14262）
水、LiChrosolv（Merck、カタログ番号115333）
アセトニトリル、LiChrosolv（Merck、カタログ番号114291）
ギ酸、＞98%(Fluka、カタログ番号06440）
Z-Arg、レニン阻害剤として(Bachem、C-3195）
ペプスタチンA（Bachem（N-1125）
p-ヒドロキシメルクリ安息香酸ナトリウム塩（Fluka、55540）
1,10-フェナントロリン一水和物（Sigma、P9375）
リシノプリル（Sigma、L6394）
カプトプリル（Sigma、C4043）
アマスタチン・HCl、(Bachem、N-1410）
ACE、NEPおよびAPNは、R＆D Systemsから購入した。
rhACE2（組換え可溶性ヒトACE2）は、Apeiron Biologicsから購入した。
EDTA（Sigma）
GTC（Sigma、カタログ番号G9277）
トリフルオロ酢酸（TFA）（Sigma-Aldrich、カタログ番号302031）
【０１０４】
内部標準：
生物試料中のペプチドの絶対的定量に用いる内部標準は合成ペプチドであり、それらの配列はペプチド分析物と同一であり、LC-MS/MS分析において、外部からのペプチドと標準ペプチドの間の区別を可能にする質量ラベルでタグ付された。これらの合成ペプチドの物理化学的特性が同一であることによって、それらは、それらの対応するペプチド分析物と比較して、試料処理中に同一の挙動および回収を示す、少量のペプチド定量のための理想的な内部標準になる。内部標準は、すべての操作誘発性バリエーションを考慮して、血液採取中または直後に、試料に加えられた。ペプチド回収は、異なるペプチドと個々の試料の間で異なるので、ペプチド特異的内部標準の使用が、推奨されうる。
【０１０５】
さらに、外部からのペプチドおよび標準ペプチドのMS/MS切断特性は、同一であり、絶対的ペプチドレベルの決定において高い厳密性および正確性を可能にする。
【実施例１】
【０１０６】
実施例I
本発明による血液試料中のタンパク質分解カスケード分解産物の分析（RSSEフィンガープリント）
RSSE-フィンガープリント法：
血液試料を採取し、標準ヘパリン採血管（BD）で抗凝固処理した。図３に示すように、インキュベーションが定常状態平衡を達成する前に各資料について血漿分離を行った。37℃の水浴中で、図１に示す時間の血液または血漿試料のインキュベーションを行った後、または図２、３および４については2時間のインキュベーションを行った後、試料を氷上で冷却し、次いで、ペプスタチンA、1,10-フェナントロリン、EDTA、p-ヒドロキシメルクリ安息香酸およびZ-Arg、ならびに内部標準を含む定常状態平衡保存プロテアーゼ阻害剤カクテルの即時添加を行った。
【０１０７】
LC-MS/MS試料調製および分析：
4℃にて10分間の3000 rcfでの遠心分離による血漿分離に続いて、0.2〜2 mlの血漿を活性化し、平衡化したSep-Pak C18カートリッジに適用した。1 mlの水で３回洗浄することによって、試料マトリックス成分を除去した。次いで、結合した分析物を1 mlのメタノールで溶離した。溶出液を蒸発乾固し、0.1%ギ酸を補足した10%アセトニトリル／90%水で再構成し、次いで、LC-MS/MS分析に付した。
【０１０８】
固相抽出：
真空マニホールドを用いて試料を処理した。
1．活性化：無水EtOH
2．平衡：2 x 1ml H2O
3．ローディング：0.2〜1ml安定化血漿
4．洗浄：3 x 1 ml H2O 
5．溶離：1ml MeOH 
【０１０９】
定量およびシグナル積分：
Applied Biosystemsが提供するAnalyst 1.5.1ソフトウェアを用いて、MRMクロマトグラムを積分した。定量限界のための閾値は、シグナル：ノイズ比10にて設定した。この比に達しない積分シグナルは、ゼロに設定した。分析物シグナルを、内部標準シグナルに関連させ、内部標準の最初に急上昇した量（spiked amounts）から濃度を計算した。
【０１１０】
結果：
アンジオテンシンペプチド濃度に関するRASの評価は、試料採取および試料保存ために用いた条件に大きく依存する。血液試料中のインビボならびにエクスビボ定常状態平衡アンジオテンシンペプチドレベルを有効に保存し、次いで、高感度LC-MS/MS-分析および絶対的定量を行うことができる分析システムが創設された。
【０１１１】
一般に、RASは、プロホルモンAGTから新しいペプチドを定常的に産生するペプチドホルモン系であるが、産生速度は、主としてレニン活性に依存する。循環中に存在するペプチドレベルは、器官特異的発現パターンにより空間的に相違する可溶性プロテアーゼ、血液細胞関連プロテアーゼならびに内皮関連プロテアーゼに依存する。血管の内部表面は、数多くの異なるアンジオテンシン受容体で覆われており、したがって、循環中のアンジオテンシンペプチド濃度の創立において中心部分を引き受けている。ACEまたはACE2などのアンジオテンシン代謝プロテアーゼの器官特異的発現の結果として、血液ペプチドレベルが、全身で空間的に相違しうることが明らかになる。それにもかかわらず、RASの大量の酵素成分は、遊離可溶形態または血液細胞関連形態のいずれかにて血液中に存在し、循環ペプチドレベルに有意に影響を及ぼす。これまでの考慮事項を合せると、RASは、異なる組織および器官におけるペプチド濃度に関して局所的に異なるペプチドホルモン分子の一時的に一定のスループットを有する系を構成する。
【０１１２】
本発明において、１種以上のペプチドレベルについて定常状態平衡が達成されるまで血液または血漿試料をインキュベートすることによってRASなどのペプチドホルモン系に影響を及ぼすすべての血液関連因子を考慮し、次いでペプチドの定量を行う方法が記載される。図1Aに示されるように、腕静脈穿刺によって採取され、プロテアーゼ阻害剤カクテルの添加によって即時試料安定化された血液試料中のインビボ循環アンジオテンシンペプチド濃度を表すRAS-フィンガープリントは、プロテアーゼ阻害剤を添加することなく血液が37℃にてインキュベートされるときに観察されるエクスビボRAS-フィンガープリント（またはRSSE-フィンガープリント）とは有意に異なる。興味深いことに、これらの条件下で達成されたアンジオテンシンペプチド濃度は、注目すべき時間にわたって一定であることが見い出されたレベルに達する。このことは、個々のペプチドについての形成および分解の速度が等しいこと、すなわち、定常状態平衡を特徴とする、試料によって達成された平衡の状態を示していた。定常状態平衡ペプチドレベルは、30分以内に達成され、インキュベーションの開始から少なくとも6時間安定して維持された（図1A）。安定期間は、試料中のAng 1-10濃度の大幅な増加によって終わったが、このことは、試料内での酵素活性の変化を示す。最終的に、インキュベーションの24時間後、Ang 1-10の濃度は急激に減少した。Ang 1-10およびAng 1-8以外には、経過時間中の試料中に他の代謝物の有意な変化はなかった。いわゆるRSSE-フィンガープリント（RAS定常状態平衡フィンガープリント）は、RASを妨害する薬理作用のある作用剤によって有意に影響を及ぼされることが見い出された（図1B、図2A）。RASに影響を及ぼす作用剤の添加が、試料の定常状態平衡を、異なるが安定な定常状態平衡状態にシフトさせうるかどうかをさらに試験した。37℃での2時間または4時間のインキュベーションの前に、ACE阻害剤（カプトプリル）およびアミノペプチダーゼ阻害剤（アマスタチン）または両方の組合せを血液に添加した。2時間および4時間のインキュベーション後のAng 1-10およびAng 1-8の同等なレベルによって示されるように、すべての処置が阻害剤について定常状態平衡特性を達成した（図1B）。ACE阻害剤リシノプリルまたはカプトプリルは、コントロールレベルと比較して、Ang 1-10を増加させ、Ang 1-8定常状態平衡レベルを減少させた。アンジオテンシン産生の最初のステップをブロックするレニン阻害剤は、RASを完全に停止させることが見い出された。特定のアミノペプチダーゼの阻害剤であるアマスタチンは、Ang 1-8レベルを大規模に増加させることが見い出されたが、このことは、インビボでのAng 1-8レベルの調節におけるアミノペプチダーゼの重要な役割を示す。
【０１１３】
図1Cは、EDTAおよびAEBSFの不在下（赤い棒）および存在下（青い棒）で、37℃にて2時間および4時間インキュベーションした後、示された時点で阻害剤カクテルを添加することによってペプチド濃度を保存することによって達成されたペプチド濃度を比較する。EDTAおよびAEBSFの組合せは、血漿レニン活性（PRA）の測定のための最先端の方法において用いられている（Bystromら；Clin. Chem. 56(2010）、1561-1569）。コントロール試料中のアンジオテンシン1-10（上部パネル）およびアンジオテンシン1-8（下部パネル）の濃度は、37℃での2時間および4時間のインキュベーションの間の変化が小さいことによって示されるように、定常状態平衡を達成する（図1Bと比較）。対照的に、EDTAおよびAEBSFの存在下では、37℃での2時間および4時間のインキュベーションの間に、Ang 1-10およびAng 1-8のいずれかのレベルにおいて有意な変化がある。時間をかけてEDTA/AEBSFで処置した試料におけるAng 1-10の強い蓄積は、これらの試料における定常状態平衡の不在を明らかに示す。
【０１１４】
さらに、RSSE-フィンガープリントにおける組換えRAS酵素の効果を、インキュベーション期間の前に、試料に5μg/mlのACE、ACE2、NEPまたはAPNを添加することによって試験した。RSSE-フィンガープリントは、これらの試料（図2B）中で、および酵素と別の薬理学的阻害剤の組合せが添加された試料（図2C）中でも、予想どおりにシフトした。注目すべきことは、ACE阻害剤であるリシノプリルで処理された試料と、ACE2とリシノプリルの組合せで処理された試料との比較によって、元の試料マトリックス中で生理的濃度にてAng 1-10がACE2の基質であり、効率的にAng 1-9を産生することが示されたことである（図2A1、2C1）。ACE2の添加後のAng 1-10の定常状態レベルが高いことは維持されるが、Ang 1-9の方向に注目すべきペプチド流があり、これは臨床使用におけるACE阻害剤の作用の重要な作用機序である可能性がある。さらに、このACE2仲介性Ang 1-9産生は、アマスタチンの存在下で印象的に示され、そのN-末端タンパク質分解を阻害することによって定常状態平衡Ang 1-10レベルをさらに増加させる（図2C3）。ACE阻害は、Ang 1-10のACE2に対するよりもACEに対して有意に高い親和性を指摘する、有意な定常状態平衡Ang 1-9レベルを検出するための必須要件であることが見い出された。このAng 1-10のACE2に対するよりもACEに対してより高い親和性は、ACEの添加をAE2の添加と比較する、より低い定常状態平衡Ang 1-10濃度の観察によって確認することもできた（図2B1）。
【０１１５】
これらの実験から得られた結果は、RSSE-フィンガープリントと試料中に含まれる統合されたRAS酵素活性との直接的関連を明らかに実証した。
【０１１６】
これらの発見に基づいて、血液細胞関連RAS成分がこれらの条件下では失われることが分かっており、大規模分析に関して取扱いがより容易であるという理由で、血液の代わりに新鮮な血漿または凍結血漿を用いる効果を、詳しく調査した。とRSSE-フィンガープリントを、同じドナーからの血液、血漿および凍結／解凍血漿に対して、コントロール試料（図3A）、アマスタチンで急上昇した試料（図3B）およびACE2およびリシノプリルで急上昇した試料（図3C）について比較した。、定常状態平衡の明確に視認できるシフトを達成するために阻害剤および組合せを選択し、臨床分析的質問のための該方法の適格性を試験するために、酵素または低分子量阻害剤のいずれかを用いた。血漿の凍結および解凍は、RSSE-フィンガープリントにおいて最小の変動を引き起こすが、血漿の代わりに血液を用いると、特に、Ang 1-10、Ang 1-8およびAng 1-7に関して、有意な差異がもたらされることが見い出されたが、このことは、血液細胞関連NEP（CD10）およびACE（CD143）の存在を指摘する。
【０１１７】
最後に、各ドナーから得た即時安定化血液、平衡化血液および平衡化血漿において、12人の健康なボランティアの間のRAS-フィンガープリントおよびRSSE-フィンガープリントの変動性を調べ、分析した。測定されたアンジオテンシン濃度の平均を、図4Aのフィンガープリント図に示す。健康なボランティアに存在する主なペプチドであるAng 1-10およびAng 1-8に関するドナー特異的データを、RAS-フィンガープリント（4B1-表1）、血液中のRSSE-フィンガープリント（4B2-表2）ならびに血漿中のRSSE-フィンガープリント（4B3-表3）に示す。pg/mlでのペプチド濃度以外に、fmol/mlでの濃度を計算し、Ang 1-8濃度をAng 1-10濃度で割ることによって、ACEについてのモル定常状態活性比を設立するために用いた。測定されたRAS-フィンガープリントと比較して、RSSE-フィンガープリントは、ドナー間でより大きい変動を示し、このことは、異なるドナー間での可溶性RAS成分の構成における潜在的な多様性を反映する。２人の代表的なドナーを図4Cに示す。ドナー3（図4C1）の血液中のACEについてのモルSSE-比（1-8/1-10）は4.5であり、ドナー6（図4C2）のACE-SSE-比は20.5であり、このことは、このドナーにおいてはAng 1-8の産生におけるACEの役割がより顕著であることを指摘する。ACEについてのRAS-比における差異も存在するが（0.35 対 0.79）、RSSE-フィンガープリントに基づく差異は、よりいっそう区別的である。
【０１１８】
結論として、生物試料中のRASまたはその成分の評価のための有力な方法が、本発明によって提供される。本発明の高感度LC-MS/MSベースのアンジオテンシンペプチド定量法と、革新的な安定化前の試料の定常状態平衡との組合せは、可溶性および血液細胞関連RAS酵素活性の評価のための再現性の高いツールを表す。RASは、さまざまな病的状態に関与するので、この新たなテクノロジーの使用は、バイオマーカーの発見のための非常に大きい可能性を有する。さらに、可溶性および血液細胞関連RAS酵素活性は、いくつかの降圧薬の薬理活性の主な部位を表す。該RASの個別性の理解は、RAS関連疾患の治療における患者特異的アプローチのための道を開く。本発明のテクノロジーは、生物試料中のレニン-アンジオテンシン系への深くて総合的な洞察を提供することによって、この展開を前に押し進める。
【実施例２】
【０１１９】
実施例II
本発明による血液試料中のレニン-アンジオテンシン系ならびにブラジキニン系のタンパク質分解カスケード分解産物の分析
即時あるいは水浴中37℃にて1時間または3時間のインキュベーション後のいずれかに血漿試料が4M GTC/1% TFAの添加によって安定化される以外は、実施例Iに記載のとおりすべての方法を行った。
結果：
図6および7は、本発明方法が、RASのみならず、ブラジキニン系などの他のタンパク質分解カスケードにも適用されうることを示す。さらに、これらの図面は、定常状態平衡が、プロテアーゼ阻害剤カクテルの添加によってのみならず、GTCなどのカオトロピック剤によって効率的に安定化されうることを示す。１時間のインキュベーションと3時間のインキュベーションのペプチドレベルの比較から明らかなように、1時間のインキュベーション期間の後、RASおよびブラジキニン系について定常状態平衡が達成され、安定性は維持される。
【図１Ａ】
2015518964.tif 000003
【図１Ｂ】
2015518964.tif 000004
【図１Ｃ】
2015518964.tif 000005
【図２Ａ１】
2015518964.tif 000006
【図２Ａ２】
2015518964.tif 000007
【図２Ｂ１】
2015518964.tif 000008
【図２Ｂ２】
2015518964.tif 000009
【図２Ｃ１】
2015518964.tif 000010
【図２Ｃ２】
2015518964.tif 000011
【図２Ｃ３】
2015518964.tif 000012
【図３Ａ】
2015518964.tif 000013
【図３Ｂ】
2015518964.tif 000014
【図３Ｃ】
2015518964.tif 000015
【図４Ａ】
2015518964.tif 000016
【図４Ｂ１】
2015518964.tif 000017
【図４Ｂ２】
2015518964.tif 000018
【図４Ｂ３】
2015518964.tif 000019
【図４Ｃ１】
2015518964.tif 000020
【図４Ｃ２】
2015518964.tif 000021
【図５】
2015518964.tif 000022
【図６】
2015518964.tif 000023
【図７Ａ】
2015518964.tif 000024
【図７Ｂ１】
2015518964.tif 000025
【図７Ｂ２】
2015518964.tif 000026
【図７Ｂ３】
2015518964.tif 000027
【図７Ｂ４】
2015518964.tif 000028
【図７Ｂ５】
2015518964.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成27年1月30日(2015.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2015518964000001.app
【国際調査報告】
2015518964.tif 000030
2015518964.tif 000031
2015518964.tif 000032
2015518964.tif 000033
2015518964.tif 000034
2015518964.tif 000035