(57)【要約】本出願は、5〜7個の天然または非天然アミノ酸の合成修飾ペプチド、ならびに感覚ゲーティング機能障害と関連する行動異常を示す疾患もしくは障害、うつ病または認知障害、特に統合失調症およびアルツハイマー病の治療における使用のための、それらを含む薬学的組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)以下の配列の環状または直鎖ペプチド：
R1-Xaa1-Gly-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-NHR2（SEQ ID NO：2および1）
ここで、
Xaa1は、Phe、Ile、Leu、Val、Nle、およびそれらのアナログより選択され；
Xaa2は、Leu、Ile、Val、Nle、Phe、およびそれらのアナログより選択され；
Xaa3は、Arg、Lys、homo-Arg、homo-Lys、Orn、およびArgのアナログより選択され；
Xaa4は、Trpおよびそのアナログより選択され；
Xaa5は、Tyr、His、O-メチル-Tyr、および2-ヒドロキシ-3-メチル-Pheより選択され；
R1は、para-アミノフェニルアラニン（Pap）、NH2C6H4(CH2)1-3CO、Fmoc-Pap、FMS-Pap、およびC5-C20アシル-Papより選択され、ここで、該C5-C20アシルは、Papのα-アミノ基へ連結された飽和または不飽和C5-C20脂肪酸から誘導され；かつ
R2はHまたは(CH2)0-4CH3である、ならびに
(ii)以下の配列の直鎖ペプチド：
R1-Xaa1-Gly-Xaa2-Xaa3-Xaa4-NHR2（SEQ ID NO：3）
ここで、
Xaa1〜Xaa4は上記に定義される通りであり；
R1は、9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）または2-スルホ-Fmoc（FMS）であり；かつ
R2は上記に定義される通りである、
ならびに、それらの薬学的に許容される塩より選択される、合成ペプチド。
【請求項２】
前記Argのアナログが、L-2-アミノ-3-グアニジノプロピオン酸およびΝ-ω,ω-ジメチル-L-アルギニンより選択され；
前記Trpのアナログが、β-(3-ベンゾチエニル)-L-Ala、6-メチルTrp、5-メトキシ-Trp、5-ヒドロキシ-Trp、5-フルオロ-Trp、7-アザトリプトファン、5-ブロモトリプトファン、および5-メチルトリプトファンより選択され；
前記Pheのアナログが、2-フルオロフェニルアラニン、4-フルオロフェニルアラニン、4-ブロモフェニルアラニン、2-クロロフェニルアラニン、L-ホモフェニルアラニン、4-ニトロフェニルアラニン、およびα-メチルフェニルアラニンより選択され；かつ
前記LeuまたはValのアナログが、t-ブチル-L-アラニン、L-シクロヘキシルグリシン、およびL-シクロペンチルグリシンより選択される、請求項1記載の合成ペプチド。
【請求項３】
(i)以下の配列の環状ペプチド：
2015511600.tif 000012
ここで、
Xaa1はTyrおよびHisより選択され；かつ
R2はHまたは(CH2)0-4CH3である、ならびに
(ii)以下の配列の直鎖ペプチド：
R1-Phe-Gly-Leu-Arg-Trp-NHR2（SEQ ID NO：5）
ここで、
R1はFmocまたはFMSであり；かつ
R2は上記に定義される通りである、
ならびに、それらの薬学的に許容される塩より選択される、請求項1記載の合成ペプチド。
【請求項４】
環状であり、かつ、以下の配列：
2015511600.tif 000013
を有する、請求項3記載の合成ペプチド。
【請求項５】
直鎖状であり、かつ、以下の配列：
Fmoc-Phe-Gly-Leu-Arg-Trp-NH2（SEQ ID NO：8）
を有する、請求項3記載の合成ペプチド。
【請求項６】
感覚ゲーティング機能障害と関連する行動異常を示す疾患または障害の治療における使用のための、請求項1〜5のいずれか一項記載の合成ペプチド。
【請求項７】
前記疾患または障害が、統合失調症、自閉症性障害、ハンチントン舞踏病、強迫性障害、注意欠陥多動性障害（ADHD）およびトゥーレット症候群より選択される、請求項6記載の合成ペプチド。
【請求項８】
前記疾患または障害が統合失調症である、請求項7記載の合成ペプチド。
【請求項９】
アルツハイマー病（AD）の治療における使用のための、請求項1〜5のいずれか一項記載の合成ペプチド。
【請求項１０】
うつ病または認知障害の治療における使用のための、請求項1〜5のいずれか一項記載の合成ペプチド。
【請求項１１】
前記うつ病および／または前記認知障害が、統合失調症またはアルツハイマー病と関連している、請求項10記載の合成ペプチド。
【請求項１２】
SEQ ID NO：6に記載の配列を有する、請求項8〜11のいずれか一項記載の合成ペプチド。
【請求項１３】
請求項1〜5のいずれか一項記載の合成ペプチドまたはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
経口投与用に製剤化された、請求項13記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
有効量の請求項1〜5のいずれか一項記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩をその必要がある患者へ投与する工程を含む、感覚ゲーティング機能障害と関連する行動異常を示す疾患もしくは障害、うつ病または認知障害の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、合成ペプチドおよびそれらの薬学的に許容される塩ならびにそれらを含む薬学的組成物、ならびにアルツハイマー病などの行動異常を示す疾患もしくは障害、または特に、統合失調症などの感覚ゲーティング機能障害と関連する疾患もしくは障害を治療するための、および／またはうつ病を治療するための、および／または認知機能を改善するための、それらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
統合失調症は、集団の約1%が冒される重篤な精神障害である。統合失調症の病因は複雑であり、遺伝的および環境的要因を含む。統合失調症は、陽性、陰性および認知症状によって説明されることが多い。大部分の人は、妄想および幻覚などの陽性症状を通常経験しない。陰性症状は、正常な情動反応または思考過程の障害であり、認知症状は認知機能不全である。陰性および認知症状は、陽性症状よりも投薬にあまり反応せず、陽性症状よりもより、低クオリティー・オブ・ライフ、機能的障害、および他者への負担の原因となっている。
【０００３】
抗精神病薬は、統合失調症および双極性躁病を含む精神障害の現在の標準治療であり続けている。ハロペリドールなどの第一世代抗精神病薬（定型）は、ドーパミンD2受容体を阻害し、統合失調症の陽性症状の治療に適度に有効であるが、錐体外路運動障害を引き起こす場合がある。第二世代（非定型）抗精神病薬は、他の受容体（特に、5-ヒドロキシトリプタミン2A（5-HT2A）受容体）と共にD2受容体を阻害する。非定型抗精神病薬は、運動障害を引き起こす可能性が低いことがわかったが、体重増加、プロラクチンおよびグルコース上昇、ならびに鎮静と関連する。最近のデータは、代謝型グルタミン酸受容体（mGluR）を標的化する薬剤が、有望な新しいクラスの抗精神病薬となり得ることを示しており、そのような薬剤は、現在、数社によって開発中である。それにもかかわらず、米国国立衛生研究所が後援している、CATIEとして公知の大規模な試験によって、低い耐容性または不完全な効能のいずれかに起因して、患者の74%が治療の18ヶ月以内に使用を中止することが判明し、このことは新しい治療の必要性を示している。
【０００４】
Kissl遺伝子の産物である、キスペプチン（以前はメタスチンとして公知）は、GPR54として公知のGタンパク質共役型受容体へ結合する。Kisslはもともとヒト転移抑制遺伝子と同定された。キスペプチン-GPR54シグナル伝達カスケードは、性ホルモンの調節において重要な役割を有することが数年前に認識され、思春期のゲートキーパーであると考えられている。さらに、最近の研究によって、キスペプチンは、心血管系、血管形成、およびエネルギーバランスにおけるさらなる生理的機能に役立つことが示された。海馬において、キスペプチンは、歯状回の顆粒細胞の興奮性および成長因子、脳由来神経栄養因子（BDNF、Arai and Orwig, 2008）の分泌を高める。BDNFは、神経系の発達において、ならびに記憶、学習、および薬物嗜癖などの脳の可塑性に関連するプロセスにおいて重要な機能を有する。様々な研究によって、BDNFと、うつ病、統合失調症、強迫性障害、アルツハイマー病、ハンチントン病、レット症候群、および認知症、ならびに神経性食欲不振症および神経性過食症などの病気との関連の可能性が示された。
【０００５】
同一出願人のWO 2010/137022は、ナイーブマウスの海馬における青春期（8週間）の間のKisslのmRNA発現の上昇を開示している。さらに、海馬におけるKissl発現の調節は、視床下部におけるその発現とは異なり、免疫依存性である。従って、免疫不全の存在（SCIDマウス）、思春期での海馬におけるキスペプチンの異常発現、および情報処理障害の間の機能的関連性が、これらのマウスにおいてわかった（プレパルス抑制（PPI）によって測定された）（Cardon et al., 2010）。PPIは、低強度プレパルス刺激が後の驚愕誘発ノイズに対する反応を弱める現象である。PPIの異常は一般に統合失調症の病態生理と関連する（Braff and Geyer, 1990）が、異常なPPIは他の精神障害においても見られた（Castellanos et al., 1996; Ornitz et al., 1992; Perry et al., 2007; Swerdlow et al., 1993; Swerdlow et al., 1995）。
【０００６】
WO 2010/137022はまた、PPI反応障害を有するSCIDマウスへのおよびいくつかの統合失調症マウスモデルへのキスペプチン由来ペプチドKp-10
2015511600.tif 000002
の投与が、PPI反応レベルを改善したことを開示している。さらに、Kp-10は尾懸垂試験による潜在的な抗うつ活性を有すること、およびKp-10はいくつかのマウスモデルにおいて水迷路における空間学習および記憶を改善することが開示されており、それが学習および記憶などの認知機能の広い局面に寄与することを示している。
【発明の概要】
【０００７】
本発明によれば、新規の修飾Kp-10由来ペプチドを合成し、これがナイーブマウスならびに統合失調症およびアルツハイマー病マウスモデルにおいてPPI反応を改善することがわかった。
【０００８】
従って、本発明は、以下ならびにそれらの薬学的に許容される塩より選択される合成ペプチドを提供する：
(i)以下の配列の環状または直鎖ペプチド：
R1-Xaa1-Gly-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-NHR2（SEQ ID NO：2および1）
ここで：
Xaa1は、Phe、Ile、Leu、Val、Nleおよびそれらのアナログより選択され；
Xaa2は、Leu、Ile、Val、Nle、Pheおよびそれらのアナログより選択され；
Xaa3は、Arg、Lys、homo-Arg、homo-Lys、OrnおよびArgのアナログより選択され；
Xaa4は、Trpおよびそのアナログより選択され；
Xaa5は、Tyr、His、O-メチル-Tyrおよび2-ヒドロキシ-3-メチル-Pheより選択され；
R1は、para-アミノフェニルアラニン（Pap）、NH2C6H4(CH2)1-3CO、Fmoc-Pap、FMS-PapおよびC5-C20アシル-Papより選択され、ここで、該C5-C20アシルは、Papのα-アミノ基へ連結された飽和または不飽和C5-C20脂肪酸から誘導され；かつ
R2はHまたは(CH2)0-4CH3である、および
(ii)以下の配列の直鎖ペプチド：
R1-Xaa1-Gly-Xaa2-Xaa3-Xaa4-NHR2（SEQ ID NO：3）
ここで：
Xaa1〜Xaa4は上記に定義される通りであり；
R1は、9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）または2-スルホ-Fmoc（FMS）であり；かつ
R2は上記に定義される通りである。
【０００９】
本発明は、以下の配列を有する環状合成ペプチをさらに提供する：
2015511600.tif 000003
【００１０】
本発明は、以下の配列を有する直鎖合成ペプチをさらに提供する：
2015511600.tif 000004
【００１１】
本発明はまた、本発明の合成ペプチドまたはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物を提供する。
【００１２】
本発明の合成ペプチドはまた、感覚ゲーティング機能障害と関連する行動異常を示す疾患または障害の治療における使用のために提供される。疾患または障害は統合失調症であり得る。
【００１３】
本発明の合成ペプチドは、うつ病または認知障害の治療における使用のためにさらに提供される。
【００１４】
本発明の合成ペプチドはまた、アルツハイマー病（AD）の治療における使用のために提供される。
【００１５】
本発明はまた、有効量の本発明のペプチドまたはその薬学的に許容される塩をその必要がある患者へ投与する工程を含む、感覚ゲーティング機能障害と関連する行動異常を示す疾患もしくは障害、うつ病または認知障害の治療方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】プレパルス抑制（PPI）に対する合成ペプチドの効果を示す。雄性C57Bl/6Jナイーブマウスに合成ペプチド（淡色バー）またはPBS中1% DMSO（対照, 黒色バー）を注射し；プレパルス強度は69、73、78または81デシベル(dB)であった。15μg環状ペプチド2（SEQ ID NO：10）, n=12, 対照 n=8, 反復測定ANOVA, F (自由度) (1,18) = 4.2, P = 0.06。
【図１Ｂ】プレパルス抑制（PPI）に対する合成ペプチドの効果を示す。雄性C57Bl/6Jナイーブマウスに合成ペプチド（淡色バー）またはPBS中1% DMSO（対照, 黒色バー）を注射し；プレパルス強度は69、73、78または81デシベル(dB)であった。8.3μg環状ペプチド5（SEQ ID NO：12）, n=8, 対照 n=6; 反復測定ANOVA, F (1,12) = 0.1, P = 0.7。
【図１Ｃ】プレパルス抑制（PPI）に対する合成ペプチドの効果を示す。雄性C57Bl/6Jナイーブマウスに合成ペプチド（淡色バー）またはPBS中1% DMSO（対照, 黒色バー）を注射し；プレパルス強度は69、73、78または81デシベル(dB)であった。8.75μg環状ペプチド6（SEQ ID NO：6）, n=8, 対照 n=10; 反復測定ANOVA, F (1,19) = 4.7, P = 0.047, *はP < 0.05を示す, Fisher LSD post hoc解析。
【図１Ｄ】プレパルス抑制（PPI）に対する合成ペプチドの効果を示す。雄性C57Bl/6Jナイーブマウスに合成ペプチド（淡色バー）またはPBS中1% DMSO（対照, 黒色バー）を注射し；プレパルス強度は69、73、78または81デシベル(dB)であった。15.3μgペプチド7（SEQ ID NO：13）, n=12, 対照 n=9, 反復測定ANOVA, F (1,18) = 1.15, P = 0.3。
【図１Ｅ】プレパルス抑制（PPI）に対する合成ペプチドの効果を示す。雄性C57Bl/6Jナイーブマウスに合成ペプチド（淡色バー）またはPBS中1% DMSO（対照, 黒色バー）を注射し；プレパルス強度は69、73、78または81デシベル(dB)であった。8.75μgペプチド8（SEQ ID NO：8）, n=17, 対照 n=16, 反復測定ANOVA, F (1,31) = 5.3, P = 0.028, *はP < 0.05を示す, Fisher LSD post hoc解析。
【図２】MK-801で処置したマウスにおけるPPIに対するKp-10（SEQ ID NO：14）ならびに修飾Kp-10由来ペプチド6および8の効果を示す。C57BL/6Jマウスに、DMSO中に溶解しそして0.2% (w/v) DMSOの最終濃度までPBS中に希釈したペプチドを注射し、15分後にMK-801を注射し、15分後にPPIの測定を69、73、78および81デシベルで行った。マウスを以下で処置した（各強度について左から右へ）：PBS中0.2% DMSO（対照, 黒色バー, n=25）、MK-801のみ（0.1 mg/kg, 白色バー, n=12）、MK-801およびKp-10（13μg/マウス, 淡灰色バー, n=28）、MK-801およびペプチド6（SEQ ID NO：6, 8.75μg/マウス, 中間灰色バー, n=16）またはMK-801およびペプチド8（SEQ ID NO：8, 8.75μg/マウス, 暗灰色バー, n=14）；反復測定ANOVA, F (4,90) = 8.6, P < 0.0001；*はP < 0.05を示す, 対照と比較してのFisher LSD post hoc解析；#はP < 0.05を示す, MK-801と比較してのFisher LSD post hoc解析。
【図３】クロザピンと比較してのペプチド6（SEQ ID NO：6）の抗うつ効果を示す。マウスを以下で処置し（左から右へ）：0.003N HClおよび0.2% DMSO（対照, 黒色バー, n=8）、ペプチド6（8.75μg, 淡灰色バー, n=7）、またはクロザピン（0.3mg/kg, 暗灰色バー, n=6）、尾懸垂試験へ供した。ペプチド6は最初の無動化が生じるまでの潜伏時間を増加させ（最初の無動化, ANOVA, F (2,18) = 10.8, P = 0.0008）、無動化の総時間を減少させた（総無動化, ANOVA, F (2,18) = 3.95, P = 0.039）。*はP < 0.05を示す, 対照と比較してのFisher LSD post hoc解析；#はP < 0.05を示す, クロザピン処置と比較してのFisher LSD post hoc解析。
【図４】ペプチド6処置の治療効果および副作用の欠如を示す。（A）ペプチド6は用量依存様式で尾懸垂試験において総無動化時間を減少させた。左から右へ：対照（0.2% DMSO）、0.0029、0.029、0.29、2.9 mg/kgのペプチド6（それぞれ、n= 12/10/9/9/9, 一元配置ANOVA, F (4,44) = 11.3, P < 0.0001）。（B）MK-801、およびリスペリドン、オランザピンまたはペプチド6で処置したマウスにおけるPPI。左から右へ：対照（0.003N HClおよび0.2% DMSO, 白色バー）、MK-801のみで処置（淡灰色バー）、およびMK-801と、リスペリドン（MK-801+Ris, 0.1 mg/kg, 中間灰色バー）、オランザピン（MK-801+Ola, 0.375 mg/kg, 暗灰色バー）またはペプチド6（MK-801+Pep6, 0.29 mg/kg, 黒色バー）との組み合わせで処置（それぞれ、n=11/10/10/12/15, 反復測定ANOVA, F (4,53) = 2.7, P = 0.03）。（C）69、73、78および81デシベルでのPPIに対するペプチド6の反復注射の効果。マウスに0.29 mg/kgのペプチド6を3日間1日1回腹腔内注射し、PPIを第3注射の30分後に記載の強度で測定した。白色バー：対照（0.2% DMSO）、黒色バー：ペプチド6（n=18/16。反復測定ANOVA, F (1,32) = 4.4, P = 0.04）。*P < 0.05, Fisher LSD post hoc解析。（D）カタレプシー時間に対するハロペリドール、オランザピンおよびペプチド6での処置の効果。左から右へ：対照（0.003N HClおよび0.2% DMSO, 白色バー）、ハロペリドール（HAL - 1 mg/kg, 淡灰色バー）、オランザピン（OLA 0.375 mg/kg, およびOLA 1.125 mg/kg, 暗灰色バー）、ならびにペプチド6（Pep6 0.29 mg/kg, およびPep6 2.9 mg/kg, 黒色バー）で処置（それぞれ、n=7/6/7/7/7/6, * -一元配置ANOVA, F (5,34) = 6.2, P = 0.0003）。（E）鎮静に対するハロペリドール、オランザピンおよびペプチド6の効果。左から右へ：対照（0.003N HClおよび0.2% DMSO）、ならびにハロペリドール（HAL - 1 mg/kg）、オランザピン（OLA 0.375 mg/kg, OLA 1.125 mg/kg）、およびペプチド6（Pep6 0.29 mg/kg, Pep6 2.9 mg/kg）で処置。（それぞれ、n=8/7/8/7/8/7, 一元配置ANOVA, F (5,39) = 4.3, P < 0.0001）。（F）オープンフィールドにおける自発活動に対するハロペリドール、オランザピンおよびペプチド6の効果。距離−フィールド内で移動した総距離（メートル）。左から右へ：対照（0.003N HClおよび0.2% DMSO, 白色バー）、ハロペリドール（HAL - 1 mg/kg, 淡灰色バー）、オランザピン（OLA 0.375 mg/kg, OLA 1.125 mg/kg, 暗灰色バー）、ならびにペプチド6（Pep6 0.29 mg/kg, およびPep6 2.9 mg/kg, 黒色バー）。（それぞれ、n=6/6/7/7/6/7, 一元配置ANOVA, F (5,32) = 17.8, P < 0.0001）。（G）各マウスがロータロッドから落下するために要した時間（秒）として測定された強制活動に対するハロペリドール、オランザピンおよびペプチド6の効果。左から右へ：対照（0.003N HClおよび0.2% DMSO, 白色バー）、ハロペリドール（HAL - 1 mg/kg, 灰色バー）、オランザピン（OLA 0.375 mg/kg, OLA 1.125 mg/kg, 淡灰色バー）、ならびにペプチド6（Pep6 0.29 mg/kg, およびPep6 2.9 mg/kg, 黒色バー）。（それぞれ、n=7/6/7/7/7/6, 一元配置ANOVA, F (5,34) = 6.3, P =0.0003）。*はP < 0.05を示す, 対照と比較してのFisher LSD post hoc解析；#はP < 0.05を示す, MK-801と比較してのFisher LSD post hoc解析。
【図５】経口投与されたペプチド6は尾懸垂試験において総無動化を減少させる。DMSOを1%含む水100μl中の2.9 mg/kgのペプチド6を経口胃管栄養法によってナイーブ野生型マウスへ投与し、30分後に尾懸垂試験（TST）によってマウスを試験した。黒色バー：対照；白色バー：ペプチド6（対照および試験についてn=10/12；*はt-検定によるP < 0.02を示す）。
【図６】Morris水迷路におけるアルツハイマー病マウスモデル、5XFADマウスのパフォーマンスに対するペプチド6の効果。Y軸は、実験の各日におけるマウスがプラットフォームに到着するために要した時間（秒）である。各日のデータは、この日の全てのトライアルの平均値である（それぞれn=8/8, 反復測定ANOVA, F (1,13) = 4.6, P < 0.05）。黒四角−対照（0.1% DMSO）、灰色三角−ペプチド6で処置されたマウス。習得およびリバーサル段階を実験セクションにおいて説明する。各ポイントにおけるバーは標準誤差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、修飾キスペプチンペプチドKp-10誘導体である合成直鎖および環状ペプチド、ならびにそれらの薬学的に許容される塩に関する。
【００１８】
潜在的に改善された薬学的特性を有するキスペプチンアナログを開発しようとして、本発明者らは、以下に詳細に説明する、Kp-10（メタスチンアミノ酸45-54）およびKp-5（メタスチンアミノ酸50-54）のいくつかの誘導体を設計および作製した。Kp-5配列（キスペプチンのC末端の最後の5個のアミノ酸）は、GPR54への結合配列を形成し、一方、キスペプチンのN末端は、受容体結合のために必要ではなく、しかしタンパク質消化からの保護および安定化のために必要であり得る。
【００１９】
ある態様において、本発明の合成ペプチドは、配列R1-Xaa1-Gly-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-NHR2によって示されるアミド化直鎖ペプチドである。Xaa1およびXaa2は、フェニルアラニン（Phe）、イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、バリン（Val）、ノルロイシン（Nle）およびそれらのアナログより選択される疎水性アミノ酸であり；Xaa3は、アルギニン（Arg）、リジン（Lys）、homo-アルギニン（homo-Arg）、homo-リジン（homo-Lys）、オルニチン（Orn）およびArgのアナログより選択される塩基性アミノ酸であり；Xaa4は、トリプトファン（Trp）およびそのアナログより選択される芳香族アミノ酸であり；Xaa5は、チロシン（Tyr）、ヒスチジン（His）、O-メチル-チロシンおよび2-ヒドロキシ-3-メチル-フェニルアラニンより選択される芳香族アミノ酸であり；R1は、para-アミノフェニルアラニン（Pap）、式NH2C6H4(CH2)1-3COのPapアナログ、ならびにFmoc、FMSおよびC5-C20アシルより選択される基へそのα-アミノ基によって結合されたPapより選択され、ここで、該C5-C20アシルは飽和または不飽和C5-C20脂肪酸から誘導され；かつR2は水素原子または1〜5個の炭素を有するアルキル基である（SEQ ID NO：1）。
【００２０】
ある態様において、SEQ ID NO：1の直鎖ペプチドは、PapまたはPapアナログとチロシンまたはヒスチジン残基との間で形成されるアゾ結合によって環化され、対応の環状ペプチド（SEQ ID NO：2）が得られる。一般に、この環化法は、酸性媒体中でのジアゾ化初期工程、続いての弱塩基性媒体中での分子内アゾ環化を使用することによって、直鎖前駆体中に存在するPap残基の側鎖をチロシンまたはヒスチジン残基の側鎖へ連結するアゾ結合を形成することを含む。
【００２１】
ある態様において、本発明の合成ペプチドは、配列R1-Xaa1-Gly-Xaa2-Xaa3-Xaa4-NHR2によって示されるアミド化直鎖ペプチドである。Xaa1およびXaa2は、フェニルアラニン（Phe）、イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、バリン（Val）、ノルロイシン（Nle）およびそれらのアナログより選択される疎水性アミノ酸であり；Xaa3は、アルギニン（Arg）、リジン（Lys）、homo-アルギニン（homo-Arg）、homo-リジン（homo-Lys）、オルニチン（Orn）およびArgのアナログより選択される塩基性アミノ酸であり；Xaa4は、トリプトファン（Trp）およびそのアナログより選択される芳香族アミノ酸であり；R1は、9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）または2-スルホ-Fmoc（FMS）であり；かつR2は、水素原子または1〜5個の炭素を有するアルキル基である（SEQ ID NO：3）。
【００２２】
ある態様によれば、合成ペプチドは、配列R1-Xaa1-Gly-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-NHR2によって示されるアミド化直鎖ペプチドであり、ペプチドは環状であり、ここで、R1はPapであり、Xaa1はPheであり、Xaa2はLeuであり、Xaa3はArgであり、Xaa4はTrpであり、Xaa5はTyrまたはHisであり、かつR2はHまたは1〜5個の炭素を有するアルキル基である（SEQ ID NO：4）。
【００２３】
ある態様において、本発明の合成ペプチドは、配列R1-Xaa1-Gly-Xaa2-Xaa3-Xaa4-NHR2によって示されるアミド化直鎖ペプチドであり、ここで、R1はFmocまたはFMSであり、Xaa1はPheであり、Xaa2はLeuであり、Xaa3はArgであり、Xaa4はTrpであり、かつR2はHまたは1〜5個の炭素を有するアルキル基である（SEQ ID NO：5）。
【００２４】
ある態様によれば、本発明の合成ペプチドは、配列
2015511600.tif 000005
（ペプチド6、SEQ ID NO：6）の環状ペプチドである。
【００２５】
ある態様によれば、本発明の合成ペプチドは、配列Fmoc-Phe-Gly-Leu-Arg-Trp-NH2（ペプチド8、SEQ ID NO：8）の直鎖ペプチドである。
【００２６】
ある態様において、C5-C20アシルが誘導される飽和脂肪酸は、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびアラキジン酸であり得、不飽和脂肪酸は、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、アラキドン酸およびエイコサペンタエン酸であり得る。
【００２７】
ある態様によれば、Argのアナログは、L-2-アミノ-3-グアニジノプロピオン酸およびΝ-ω,ω-ジメチル-L-アルギニンより選択され；Trpのアナログは、β-(3-ベンゾチエニル)-L-Ala、6-メチルトリプトファン、5-メトキシトリプトファン、5-ヒドロキシトリプトファン、5-フルオロトリプトファン、7-アザトリプトファン、5-ブロモトリプトファンおよび5-メチルトリプトファンより選択され；Pheのアナログは、2-フルオロフェニルアラニン、4-フルオロフェニルアラニン、4-ブロモフェニルアラニン、2-クロロフェニルアラニン、L-ホモフェニルアラニン、4-ニトロフェニルアラニンおよびα-メチルフェニルアラニンより選択され；かつ、LeuまたはValのアナログは、t-ブチル-L-アラニン、L-シクロヘキシルグリシンおよびL-シクロペンチルグリシンより選択される。
【００２８】
本発明の直鎖ペプチドの合成について、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、F-moc固相ペプチド合成技術を使用することができる。
【００２９】
本発明の合成ペプチドは、それらの遊離形態、またはそれらの塩もしくは化学誘導体、例えばエステルの形態であってもよい。本明細書において使用される場合、用語「塩」は、ペプチド分子のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を指す。カルボキシル基の塩は、当技術分野において公知の手段によって形成されてもよく、無機塩との塩、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄または亜鉛塩など、および有機塩基との塩、例えば、アミン、例えば、トリエタノールアミン、アルギニン、またはリジン、ピペリジン、プロカインを用いて形成されるものなどを含む。酸付加塩としては、例えば、例えば塩酸または硫酸などの鉱酸との塩、および例えば酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩が挙げられる。エステルは、ペプチド化学において使用される適切なアルコールを末端カルボキシル基とまたはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基の遊離非末端カルボキシル基と反応させることによって形成してもよい。
【００３０】
本明細書において使用される場合、句「薬学的に許容される」は、ヒトまたは他の哺乳動物と生理学的に適合性である非毒性、不活性、および／または組成物を指す。
【００３１】
本発明に従って、それぞれSEQ ID NO：6および8のペプチド6および8に加えて、いくつかの修飾Kp-10由来ペプチドを作製した。追加のペプチドは、以下に示される配列を有し、ナイーブマウスにおける初期情報処理を評価するためのパラダイムにおいて有意な効果を有さないことがわかり、従って、比較のためにのみ本出願において使用される：
2015511600.tif 000006
【００３２】
感覚ゲーティングは、脳が刺激に対するその反応を調節する、大部分は自動的なプロセスである。例えば、ある刺激が与えられると、反応が生じる；しかし、第1の刺激の直後に続いて第2の刺激が与えられると、第2の刺激に対する反応は鈍くなる。これは、多くの他の気をそらすものの中で刺激に脳が集中するのを助ける、過剰刺激を防ぐための適応機構であり、バックグラウンドをサイレンシングすることによって重要な出来事に選択的に注意を配分する能力に寄与する。個人のゲーティングプロセスの特徴は可塑的であり、遺伝および発達プロセスによってだけでなく、環境変化、CNSの神経化学およびホルモン状態によっても支配されると考えられている。感覚ゲーティングは、統合失調症およびアルツハイマー病を含む、様々な障害において乱されることが示された。
【００３３】
低強度プレパルス刺激が後の驚愕誘発刺激に対する反応を弱める現象である、プレパルス抑制（PPI）を、感覚ゲーティング機能の測定として使用する（Swerdlow and Geyer, 1998）。
【００３４】
本発明によれば、統合失調症の影響を模倣する精神病症状を誘発する、MK-801で処置されたマウスに、本発明のペプチド6（SEQ ID NO：6）もしくはペプチド8（SEQ ID NO：8）、または統合失調症についてのマウスモデルにおいてPPIを改善することが以前にわかったKp-10（SEQ ID NO：14）を注射することが、MK-801のみで処置された動物と比較してPPIを有意に改善することがわかった。さらに、ペプチド6での処置は、PPIを正常レベルへ戻し、Kp-10、またはペプチド8のそれよりも大きな効果を有した（図2）。
【００３５】
本発明によれば、MK-801統合失調症マウスモデルにおけるPPIに対するペプチド6の効果は、公知の抗精神病薬−リスペリドンおよびオランザピンのそれよりも大きいことが、さらにわかった（図4B）。さらに、ペプチド6は、ハロペリドールおよびオランザピンなどの抗精神病薬に典型的な副作用を有さなかった（図4D〜4G）。
【００３６】
従って、本発明は、医薬としての使用のための、上記に定義される本発明の合成ペプチドまたはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００３７】
本発明は、上記に定義される通りの本発明のペプチドまたはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物をさらに提供する。
【００３８】
PPI障害は、精神病理の単一の形態に特有ではない。統合失調症に加えて、PPI障害は、自閉症性障害、ハンチントン舞踏病、強迫性障害、注意欠陥多動性障害（ADHD）、トゥーレット症候群、およびアルツハイマー病の一部の症例などのいくつかの疾患において報告された（Castellanos et al. 1996; Ornitz et al. 1992; Perry et al., 2007; Swerdlow et al. 1993; Swerdlow et al. 1995; Ueki et al., 2006）。従って、PPIは、初期情報処理の調節を評価するための、パラダイムとしてしばしば使用され、動物における抗精神病薬作用を調べるために広く使用されている。
【００３９】
従って、ある態様によれば、本発明の合成ペプチドは、感覚ゲーティング機能障害と関連する行動異常を示す疾患または障害を治療するために有用である。ある態様によれば、そのような疾患は、統合失調症、自閉症性障害、ハンチントン舞踏病、強迫性障害、注意欠陥多動性障害（ADHD）またはトゥーレット症候群である。ある態様によれば、疾患は統合失調症である。ある態様において、合成ペプチドはSEQ ID NO：6に記載の配列を有する。ある態様において、合成ペプチドはSEQ ID NO：8に記載の配列を有する。
【００４０】
句「感覚ゲーティング機能障害と関連する行動異常を示す疾患または障害」は、例えばPPI障害などの、上述のような感覚ゲーティング障害との何らかの関連がわかった、任意の疾患または障害に関するように本明細書において使用される。
【００４１】
本発明によれば、ペプチド6は、アルツハイマー病についてのマウスモデルにおいてMorris水迷路における空間学習および記憶を改善することがさらにわかった（図6）。
【００４２】
ある態様によれば、本発明の合成ペプチドは、アルツハイマー病を治療するために使用してもよい。ある態様によれば、合成ペプチドはペプチド6である。
【００４３】
本発明によれば、ペプチド6がナイーブ動物における尾懸垂試験において抗うつ効果を有し（図3および4A）、その効果が公知の抗精神病薬クロザピンのそれよりも高いことがさらに示された。ペプチド6は、さらに、ナイーブ動物においてPPIを増加させる効果を有することがわかった（図1Cおよび4C）。
【００４４】
従って、ある態様によれば、本発明の合成ペプチドは、うつ病および／または認知障害を治療するために使用してもよい。ある態様によれば、合成ペプチドはペプチド6である。
【００４５】
統合失調症およびアルツハイマー病の公知の症状にはうつ病ならびに認知障害がある。
【００４６】
従って、ある態様によれば、本発明の合成ペプチドは、統合失調症またはアルツハイマー病と関連するうつ病および／または認知障害を治療するために使用してもよい。
【００４７】
ある態様において、本発明の合成ペプチドは、統合失調症およびアルツハイマー病以外の疾患と関連するうつ病および／または認知障害を治療するために使用してもよい。
【００４８】
ある態様において、ペプチドは、SEQ ID NO：6に記載の配列を有する、ペプチド6である。
【００４９】
ある態様によれば、本発明の薬学的組成物は、単一の本発明の合成ペプチドまたは2つ以上の本発明の合成ペプチドを含んでもよい。
【００５０】
本発明の薬学的組成物は、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed., 1995に記載されるような、通常の技術によって作製してもよい。組成物は固体、半固体もしくは液体形態であってもよく、またはそれはペプチドの徐放用に設計することができる。ある態様によれば、本発明の組成物に、賦形剤、例えば、安定剤、矯味矯臭剤、防腐剤、結合剤、酸化防止剤などをさらに混合してもよい。
【００５１】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、本発明の化合物を患者へ送達するための、薬学的に許容される溶媒、懸濁化剤またはビヒクルである。担体は、液体であっても固体であってもよく、意図される投与様式を考慮して選択される。リポソームも薬学的担体であり得る。
【００５２】
本発明はさらに、有効量の本発明の合成ペプチドまたはその薬学的に許容される塩をその必要がある患者へ投与する工程を含む、感覚ゲーティング機能障害と関連する行動異常を示す疾患もしくは障害、うつ病または認知障害の治療方法を提供する。
【００５３】
ある態様によれば、疾患は統合失調症である。ある態様によれば、疾患はアルツハイマー病である。ある態様によれば、合成ペプチドはペプチド6である。
【００５４】
本明細書において使用される場合、句「有効量」または「治療有効量」は、本発明の様式で使用された場合に合理的なベネフィット／リスク比に見合った過度の有害な副作用（例えば、毒性、刺激、またはアレルギー反応）の無い所望の治療反応を生じさせるに十分である成分の量を指す。
【００５５】
本明細書において使用される場合、用語「治療」は、疾患または障害と関連する症状を改善する、緩和する、軽減するおよび／またはさらには消失させることを含む。統合失調症の場合、本発明の合成ペプチドでの治療が、その疾患と関連する精神病症状および／またはうつ症状を改善／緩和すること、ならびに／または統合失調症患者において害された認知機能を改善することが、本発明によって意図される。
【００５６】
ある態様によれば、統合失調症の治療は、統合失調症の治療に適した1つまたは複数の薬物、例えば、クロザピン、アミスルプリド、オランザピン、リスペリドン、クエチアピン、ジプラシドン、アリピプラゾールまたはパリペリドンと組み合わせてのまたは単独での本発明のペプチドまたはその薬学的に許容される塩の投与を含む。
【００５７】
ある態様によれば、アルツハイマー病の治療は、アルツハイマー病の治療に適した1つまたは複数の薬物、例えば、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（例えば、タクリン、リバスチグミン、ガランタミンおよびドネペジル）またはNMDA受容体拮抗薬、例えばメマンチン、または第一世代抗精神病薬、例えばクロルプロマジン、ハロペリドール、ペルフェナジン、フルフェナジンと組み合わせてのまたは単独での本発明のペプチドまたはその薬学的に許容される塩の投与を含む。
【００５８】
経口（例えば、錠剤、カプセル剤、マイクロカプセルなどの形態で）、非経口（例えば、皮下、筋肉内、関節内、または静脈内注射の形態で）、吸入、鼻腔内（スプレーの形態で）、髄腔内、腹腔内、皮内、経皮、またはヒトへのペプチドの投与に適した他の公知の投与経路を含む、任意の適切な組成物および投与経路が本発明によって包含される。
【００５９】
ある態様によれば、本発明のペプチドを経口投与によって投与する。
【００６０】
投与されるペプチドの用量は、有能な医師によって決定され、使用される薬剤、疾患の重症度、患者の年齢および体重に依存し、経口適用については0.1〜100 mg、好ましくは1.0〜50mg、より好ましくは1.0〜20mg；または非経口適用については0.01〜30mg、好ましくは1.0〜30mg、より好ましくは1.0〜20mg；または静脈内（IV）適用については0.01〜10 mg、好ましくは0.05〜5mg、より好ましくは0.05〜0.2mgまで変化し得る。
【００６１】
本発明をここで下記の非限定的な実施例によって説明する。
【実施例】
【００６２】
材料および方法
特に指示のない限り、ペプチド6（cKp-7、Pap-Phe-Gly-Leu-Arg-Trp-Tyr-NH2 Pap= p-アミノフェニルアラニン；PapおよびTyrは内部アゾ架橋で連結されて、環状ペプチドを生じさせる（GL Biochem (Shanghai) Ltd.））を、DMSO中に溶解し、0.1% DMSOの最終濃度までPBS中に希釈し、100μlを行動分析の30分前に記載の用量で腹腔内注射した。
【００６３】
リスペリドン（Sigma, Israel）を0.06N HCL中に溶解し、PPI分析の30分前に、0.003N HCL, 0.1% DMSOの最終濃度において0.1 mg/kgの用量で腹腔内投与した。
【００６４】
オランザピン（Sigma, Israel）を0.06N HCL中に溶解し、行動分析の30分前に、0.003N HCL, 0.1% DMSOの最終濃度において0.375または1.125 mg/kgの用量で腹腔内投与した。
【００６５】
ハロペリドール（Sigma, Israel）を0.06N HCL中に溶解し、行動分析の30分前に、0.003N HCL, 0.1% DMSOの最終濃度において1 mg/kgの用量で腹腔内投与した。
【００６６】
動物  近交系12〜16週齢C57Bl/6マウスは、Weizmann Institute of ScienceのAnimal Breeding Centerによって供給された。性周期はPPIに影響を与えるので、特に指示のない限り、雄性マウスを全ての実験において使用した。全ての動物を、Weizmann Institute's Animal Care and Use Committeeによって定められた規則に従って扱い、病原体の無い環境で維持した。
【００６７】
Kp-10ペプチド  キスペプチン-10（Kp-10、ヒトメタスチンアミノ酸45-54、
2015511600.tif 000007
、Weizmann Peptide FacilityまたはSigma-Aldrich, Israel）を、PPI分析の30分前に、PBS中に溶解された13μg/マウスの用量で腹腔内注射した。MK-801（Sigma）を0.1 mg/kgで使用し、PPI分析の15分前に投与した。
【００６８】
聴覚驚愕反応（プレパルス抑制、PPI）試験  聴覚驚愕反応試験を、Cardon et al., 2010に記載されるように、Med Associates, Inc.(Med Associates, St. Albans, VT, USA)から購入した驚愕チャンバ内で行った。順化期間の間、65デシベル（dB）バックグラウンドノイズを5分間与え、テストセッションの間継続した。聴覚驚愕反応試験のための全てのセッションは、驚愕トライアル（パルスのみ、40ミリ秒（ms）、120-dB）、プレパルストライアル（プレパルス20-ms、69、73、78または81 dB、続いて[100-ms遅延]パルス）、および無刺激トライアルからなった。全てのセッションを擬似ランダム順で与えた。トライアル間の平均時間は15秒であった（範囲12〜30秒）。驚愕反応を最初のパルス単独トライアルに対する反応から計算した。
【００６９】
プレパルス抑制（PPI）の計算  PPIを以下のように計算した：%PPI＝100−{[(プレパルス+パルスについての驚愕反応)/(パルス単独についての驚愕反応)]×100}。PPIの減少は、統合失調症に関連する行動を示す。Kp-10処置マウスとPBS処置マウスとの差異は驚愕反応およびプレパルス単独トライアルにおいては観察されず、ここで、反応はパルストライアルと比較して無視できるほどであった。
【００７０】
尾懸垂試験  スタンドによって支えられた水平金属棒で尾懸垂装置を作製した。接着テープを使用して各マウスを尾で吊り下げ、各マウスを個々に吊り下げた。無動化時間を6分間観察期間の間測定し、最初の無動化までの潜時および総無動化を計算する。
【００７１】
オープンフィールド試験  オープンフィールド装置は、床が塗装されている16個の正方形（10 x 10 cm）（外側12個および内側4個）を有する白色プレキシガラスボックス（40 x 40 x 30 cm）からなった。各マウスを装置の中央に配置し、15分間テストセッションを開始した。内側の正方形への進入回数、内側の正方形において費やされた時間（分）、およびフィールド内で移動した総距離（cm）をモニタリングした。
【００７２】
ラジアルアーム水迷路（RAWM）  Alamed et al.(2006)に記載されるように、マウスを水プール中の6ラジアルアーム水迷路パラダイムにおいて2日間試験した。簡単に説明すると、各日の最初に、マウスに本発明のペプチドを注射した。1日目に、15回のトライアルを行い、トライアル1、3、5、7、9および11においては、プラットフォームは目に見え、他の全てのトライアルにおいては、プラットフォームを隠した。2日目に、12回のトライアルを行い、それらの全てにおいて、プラットフォームを隠した。プラットフォームに到着するために要した時間および1分間のエラー数（間違ったアーム進入）を記録した。
【００７３】
Morris水迷路（MWM）試験  習得段階：マウスに6日間連続して1日当たり3〜4回のトライアルを与えた。各トライアルにおいて、マウスは、直径1.4 mのプール中の水面下1.5 cmに設置された隠されたプラットフォームを発見する必要があった。試験部屋内で、沈められたプラットフォームの位置について遠位の視空間的な手掛かりのみが利用可能であった。逃避潜時、即ち、マウスがプラットフォームを発見しそれに上がるために要した時間を、60秒間まで記録する。各マウスに20秒間プラットフォーム上に残ることを許し、次いで、迷路からそのホームケージへ移す。マウスが60秒以内にプラットフォームを発見しない場合、マウスを手動でプラットフォーム上に置き、20秒後にそのホームケージへ戻した。トライアル間の間隔は600秒であった。第6日に、各マウスをプローブトライアルによって試験し：プラットフォームをプールから除去し、プール中の各マウスの位置を60秒間追跡した。リバーサル段階について、マウスに2日間連続して1日当たり4回のトライアルを与え、プラットフォームは異なる位置にあった。Etho Vision自動追跡システム（Noldus）を使用して、データを記録した。
【００７４】
カタレプシーおよび鎮静効果  カタレプシーは無動化の状態であり、バーテストによって測定した。動物の前足をバー（直径0.75 cm、床上5 cm）上に置き、マウスがバーから前足を動かすまでの潜時を測定した。
【００７５】
マウスを観察し、鎮静状態を以下のようにスコアリングすることによって、鎮静効果を評価した：0、自発運動；1、軽度に断続的な自発運動；2、重度に断続的な自発運動；3、自発運動無し；4、聴覚反射消失；5、角膜反射消失；6、尾をつねることに対する反応の消失。
【００７６】
強制活動（ロータロッド）を、ロータロッド装置（Jones and Roberts 7650, Ugo Basile, Italy）を使用して分析した。動物を加速ロッド上に置き、各マウスがロッドから落下するまでに要した時間を記録した。3回のトライアルから、動物がロッドから落下するまでに要した最長の時間を記録し、分析のために使用した。
【００７７】
実施例1：修飾Kp-10由来ペプチドの合成
直鎖ペプチド8（SEQ ID NO：8）、および同一配列を有する環状ペプチド6（SEQ ID NO：6）の前駆体である直鎖ペプチド4（SEQ ID NO：7）を、Fmoc戦略について製造業者が推奨する商業的プロトコルに従って、Advanced Chemical APEX 396マルチプルペプチドシンセサイザー（Louisville, KY）を使用して固相法によって合成した。ペプチド鎖アセンブリの完了後、ペプチド4を脱保護し、室温で3時間、トリフルオロ酢酸（TFA）、チオアニソールトリエチルシランおよび水の混合物（85:5:5:5 v/v）を用いてポリマー支持体（Rinkアミド）から切断した。ペプチド8は、N末端Fmoc保護をそのままにして、ポリマー担体から切断した。t-ブチルエーテルでの析出に続いて、粗製ペプチドをHPLCによって精製した（>95%へ）。
【００７８】
0℃にて酸性pH約1での等モル量の亜硝酸（HNO2）との反応、およびpH 8への調節での高希釈（1 mg/2 ml）での環化に従って、ペプチド4を環化し、Pap残基およびTyr残基の間に内部アゾ結合を形成させ、それによってペプチド6が得られた。環化はほぼ定量的であった。HPLCによる最終精製（>95%）によって、質量分析およびアミノ酸分析によって明らかにされたように所望の環状生成物が得られた。環化手順はFridkin et al., 2006およびFridkin et al., 2011に従った。
【００７９】
それぞれ、環状ペプチド2および5と同一の配列を有する、直鎖ペプチド1および3（それぞれ、SEQ ID NO：9および11）を、上述のように固相法によって合成し、酢酸アンモニウムの溶液pH 7中、フェロシアン化カリウムで滴定し、対応のシスチン（S-S）環状ペプチド2および5（それぞれ、SEQ ID NO：10および12）が形成された。
【００８０】
ペプチド7（SEQ ID NO：13）をペプチド8について上述したように合成した。
【００８１】
実施例2：修飾Kp-10由来ペプチドはナイーブマウスにおけるPPIを改善する
行動に対するKp-10誘導体の効果を測定するために、本発明者らは、PPIに対するペプチド2、5、6、7および8の各々の効果を研究した。
【００８２】
ペプチド2（SEQ ID NO：10）を試験するために、ペプチドをDMSO中に溶解し、次いで、1% (w/v) DMSOの最終濃度までPBS中に希釈した。雄性C57Bl/6Jナイーブマウスに15μgのペプチドまたはPBS中1% DMSO（対照）を腹腔内注射した。プレパルス強度分析を30分後に69、73、78または81デシベルで行った。図1Aから理解され得るように、ペプチド2は、対照と比べて%PPIを僅かに改善し、しかし、効果は有意ではなかった（反復測定ANOVA, F (自由度) (1,18) = 4.2, P = 0.06）。
【００８３】
ペプチド5（SEQ ID NO：12）を試験するために、マウスにPBS中1% DMSO中8.3μgペプチド5またはPBS中1% DMSO（対照）を同様に注射した。プレパルス強度分析を30分後に69、73、78または81デシベルで行った。図1Bから理解され得るように、ペプチド5は、対照と比べて73、78および81デシベルで%PPIを僅かに改善し、しかし、効果は有意ではなかった（反復測定ANOVA, F (1,12) = 0.1, P = 0.7）。
【００８４】
ペプチド6（SEQ ID NO：6）を試験するために、マウスにPBS中1% DMSO中8.75μgペプチド6またはPBS中1% DMSO（対照）を注射した。プレパルス強度分析を30分後に69、73、78または81デシベルで行った。図1Cから理解され得るように、ペプチド6は、対照と比べて全ての強度で%PPIを強く上昇させ、この効果は78デシベルで有意であった（反復測定ANOVA, F (1,19) = 4.7, P = 0.047 *P < 0.05, Fisher LSD post hoc解析）。
【００８５】
ペプチド7（SEQ ID NO：13）を試験するために、マウスにPBS中1% DMSO中15.3μgペプチド7またはPBS中1% DMSO（対照）を注射した。プレパルス強度分析を30分後に69、73、78または81デシベルで行った。図1Dから理解され得るように、ペプチド7は、対照と比べて73、78および81デシベルで%PPIを僅かに改善し、しかし、効果は有意ではなかった（反復測定ANOVA, F (1,18) = 1.15, P = 0.3）。
【００８６】
ペプチド8（SEQ ID NO：8）を試験するために、マウスにPBS中1% DMSO中8.75μgペプチド8またはPBS中1% DMSO（対照）を注射した。プレパルス強度分析を30分後に69、73、78または81デシベルで行った。図1Eから理解され得るように、ペプチド8は、対照と比べて全ての強度で%PPIを強く上昇させ、この効果は73デシベルで有意であった（反復測定ANOVA, F (1,31) = 5.3, P = 0.028 *P < 0.05, Fisher LSD post hoc解析）。
【００８７】
要約すると、図1A〜1Eから理解され得るように、ペプチド2、5および7での処置は未処置動物と比べてPPI反応を有意には改善しなかったが、ペプチド6および8の投与は、全ての強度で%PPIを有意に増加させた。
【００８８】
実施例3：修飾Kp-10由来ペプチドは統合失調症についての動物モデルにおいてPPI機能障害から保護する
ナイーブマウスにおいてPPIに最も強く影響を与えるペプチド（ペプチド6および8）が統合失調症の薬物誘発動物モデルにおいて精神病症状を消失させることができるかどうかを測定するために、本発明者らは、MK-801モデルにおいてPPIに対するそれらの効果を分析した。MK-801（N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体チャネルの拮抗薬）は、統合失調症と関連する認知障害および行動異常を模倣する精神病症状を誘発する、精神作用薬として作用する。
【００８９】
MK-801によって誘発される神経伝達物質不均衡は、統合失調症を有する患者の特徴の一つであるPPI機能障害を引き起こす。図2に示す実験において、C57BL/6Jマウスに、DMSO中に溶解し次いで0.2% (w/v) DMSOの最終濃度までPBS中に希釈したKp-10（13μg/マウス, 淡灰色バー）、またはペプチド6（8.75μg/マウス, 中間灰色バー）もしくは8（8.75μg/マウス, 暗灰色バー）を注射し；対照群にはPBS中0.2% DMSOを受容させた（黒色バー）。15分後、MK-801（0.1 mg/kg）を注射し；15分後、PPIの測定を行った。予想通りに、MK-801が注射されたマウス（白色バー）において、PPI反応は、PBS注射対照と比較して減少した。3つの処置の全て（Kp-10、ペプチド6およびペプチド8）は、MK-801処置動物と比較してPPIを有意に改善した（図2、反復測定ANOVA, F (4,90) = 8.6, P > 0.0001；#はP < 0.05を示す, MK-801と比較してのFisher LSD post hoc解析）。しかし、ペプチド6のみが、PPIを正常レベルへ戻し（図2中の*はP < 0.05を示す, 対照と比較してのFisher LSD post hoc解析、MK-801無し対照とペプチド6での処置とで全てのプレパルス強度で有意差は見られなかった）；Kp-10およびペプチド8は、MK-801投与後のPPIを改善したが、その影響を消失させず、これらの群のPPIは対照群のそれと有意に異なったままであった。従って、ペプチド6は、ペプチド8またはKp-10のいずれよりも、PPIに対するMK-801の効果を消失させることにおいてより有効である。
【００９０】
実施例4．修飾Kp-10由来ペプチドの抗うつ効果
統合失調症患者は、精神病症状に加えて、認知および陰性症状（例えば、うつ病）に苦しむ。Kp-10は、海馬スライス中のBDNF mRNAレベルを上昇させることが示され（Arai et al., 2009）、マウスにおける抗うつ様活動をスクリーニングするための確立された方法である尾懸垂試験（Stem et al., 1985；Cryan et al., 2005）によって抗うつ効果を有することがWO 2010/137022においてさらに示された。
【００９１】
本発明のペプチド6を以下のように尾懸垂試験によって抗うつ効果について試験した：ナイーブマウスを本発明のペプチド6（DMSO中に溶解し次いで0.2% DMSO (w/v)の最終濃度までPBS中に希釈したペプチド8.75μg、HCLを0.003Nの最終濃度まで添加した）またはクロザピン（0.3N HCL中に溶解し、0.003N HCLの最終濃度までPBS中に希釈した0.3mg/kg、DMSOを0.2% DMSO (w/v)の最終濃度まで添加した）で処置し、マウスがレバーから尾によって吊り下げられる尾懸垂試験へ供し、そして動物の運動を記録した。図3において理解され得るように、ペプチド6（淡灰色バー）での処置は、対照（黒色バー）およびクロザピン（暗灰色バー）と比較して、最初の無動化が生じるまでの潜時を有意に増加させ（ANOVA, F (2,18) = 10.8, P = 0.0008）、対照およびクロザピン処置と比較して無動化の総時間を有意に減少させた（ANOVA, F (2,18) = 3.95, P = 0.039）。これらの結果は、本発明のペプチド6が抗うつ薬として使用できること、およびそれが抗精神病薬クロザピンよりも高い抗うつ活性を有することを示している。
【００９２】
実施例5．ペプチド6の治療効果および副作用の欠如
ペプチド6の用量効果を測定するために、本発明者らは、漸増投薬量でそれを注射し、尾懸垂試験に対するその効果を分析した。ペプチド6は、0.029、0.29および2.9 mg/kgで、投薬量依存様式で総無動化時間を減少させた（図4A）。この結果は、ペプチド6が広い治療域を有することを示した。0.29 mg/kgの用量は、Kp-10について使用された用量と等しく、これは尾懸垂試験において総無動化を減少させた（WO 2010/137022の図10C）。
【００９３】
本発明者らは、一般的な抗精神病薬、リスペリドンおよびオランザピンと比較しての、MK-801によって誘発されたPPIの低下に対するペプチド6の効果をさらに分析した。これらの薬物は両方とも鎮静効果を引き起こし、鎮静状態のマウスにおいてPPIを正しく測定することができないので、本発明者らは、鎮静効果を引き起こすことなくマウスへ注射することができる最高用量の薬物を最初に評価した：選択した用量は、リスペリドンについては0.1 mg/kg、オランザピンについては0.375 mg/kgであった（データを示さず）。図4Bから理解され得るように、全ての薬物が、MK-801処置マウスにおいてPPIを上昇させ、しかし、ペプチド6（黒色バー）のみが、MK-801の効果に完全に打ち勝ち、PPIレベルを対照レベル（白色バー）へ戻した。パーセントPPIのANOVAは、プレパルス強度のものではなく、処置の有意な主効果を示した。単一の強度の一元配置ANOVA解析は、69、73および81 dBのプレパルス強度で処置間の統計的有意差を明らかにした。
【００９４】
0.29 mg/kgのペプチド6を3日間1日1回注射し、PPIを第3注射の30分後に測定することによって、ペプチド6の反復注射の効果を試験した。図4Cから理解され得るように、ペプチド6の反復注射は全ての強度でPPIを増加させ、効果は69および73デシベルのPPIで有意であった。
【００９５】
ペプチド6の潜在的な副作用を評価するために、本発明者らは、抗精神病薬ハロペリドール（1 mg/kg）およびオランザピン（0.375および1.125 mg/kg）と比較しての、カタレプシーに対するその効果、鎮静効果、ならびに自発（オープンフィールド）および強制（ロータロッド）活動に対する効果を分析した。
【００９６】
ハロペリドール（淡灰色バー、HAL）およびオランザピン（暗灰色バー、OLA 0.375および1.125 mg/kg）は両方とも、低レベルのオランザピンでさえ、カタレプシー効果を有し、他方では、ペプチド6（黒色バー、Pep6 0.29および2.9 mg/kg）は、試験したいずれの投薬量でもカタレプシー効果を有さなかった（図4D）。
【００９７】
次に、本発明者らは、ハロペリドール、オランザピンおよびペプチド6の鎮静効果を分析した。鎮静スコアを使用して動物を観察することによって、鎮静効果を評価した。ハロペリドールは低い鎮静効果を有し、オランザピンは1.125 mg/kgの用量で鎮静効果を有し、ペプチド6は、試験した2つの投薬量のいずれでも鎮静効果を有さなかった（図4E）。
【００９８】
自発および強制活動に関して、ハロペリドール（HAL, 1 mg/kg, 淡灰色バー）およびオランザピン（OLA 0.375およびOLA 1.125 mg/kg, 暗灰色バー）は、オープンフィールド（自発）およびロータロッド（強制）の両方においてマウス活動を減少させ、一方、ペプチド6（Pep6 0.29および2.9 mg/kg, 黒色バー）は、試験したいずれの投薬量でも試験のいずれにおいても活動レベルに影響を与えなかった（図4F、G）。これらの結果は、ペプチド6が他の抗精神病薬と比較して運動副作用を有さないことを示した。
【００９９】
実施例6．経口投与されたペプチド6は尾懸垂試験において総無動化を減少させる
2.9 mg/kgのペプチド6をDMSO中に溶解し、次いで、1% DMSOの最終濃度まで水中に希釈した。100μlを経口胃管栄養法によってナイーブ野生型マウスへ投与し、30分後に尾懸垂試験（TST）によってマウスを試験した。対照マウスにはDMSOを1%含む水100μlを受容させた。図5から理解され得るように、ペプチド6は対照と比べて総無動化を有意に減少させた。
【０１００】
実施例7．ペプチド6の血漿安定性
1μΜ ペプチド6をヒト血漿中に溶解し、0、0.5、1、1.5、2時間のインキュベーション後に、ペプチド濃度をHPLCによって分析した。アッセイはCerep, Inc (Redmond, WA, U.S.A)によって行われた。表1に示すように、ペプチド6は非常に安定しており、>120分の計算半減期を有する。ペプチド6は、60分後には検出可能レベル未満であったKp-10と比べて（chan, et al., 2011, Kisspeptin resets the hypothalamic GnRH clock in men, J Clin. Endocrinol. Metab. 96(6):E908-15）、増加した安定性を示し、60分後に元の物質の94%がヒト血漿中に残っている。
【０１０１】
（表１）ペプチド6の血漿安定性
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【０１０２】
実施例8．アルツハイマー病マウスモデル5XFADトランスジェニックマウスにおける空間学習および記憶に対するペプチド6の効果
5XFADマウスは[APP K670N/M671L (Swedish) + I716V (Florida) + V717I (London)およびPS1 M146L+ L286V]を過剰発現する。5XFADマウスの作製は以前に記載された（Oakley, et al., 2006, J Neurosci 26(40): 10129-40, 2006）。
【０１０３】
空間学習および記憶に対するペプチド6の効果をMorris水迷路行動試験において試験した。習得段階で、マウスに6日間連続して1日当たり3〜4回のトライアルを与えた。各トライアルにおいて、マウスは、直径1.1 mのプール中の水面下1.5 cmに設置された隠されたプラットフォームを発見する必要があった。
【０１０４】
試験部屋内で、沈められたプラットフォームの位置について遠位の視空間的な手掛かりのみが利用可能であった。逃避潜時、即ち、マウスがプラットフォームを発見しそれに上がるために要した時間を、60秒間まで記録した。各マウスに20秒間プラットフォーム上に残ることを許し、次いで、迷路から移した。マウスが60秒以内にプラットフォームを発見しなかった場合、マウスを手動でプラットフォーム上に20秒間置いた。トライアル間の間隔は10分であった。プローブトライアル段階において、プラットフォームをプールから除去し、プール中の各マウスの位置を60秒間追跡した。Etho Vision自動追跡システム（Noldus）を使用して、データを記録した。
【０１０５】
リバーサル段階について、マウスに2日間連続して1日当たり4回のトライアルを与え、この段階において、プラットフォームは異なる位置にあった。マウスを処置しなかったか（対照）、または試験の30分前に腹腔内注射によって8.75μg/マウスのペプチド6で処置した。図6から理解されるように、ペプチド6（灰色三角）で処置したマウスは、習得段階の第5日および第6日ならびにリバーサル段階の第1日および第2日において、プラットフォームを発見するために要した時間が未処置マウス（黒四角）よりも少なかった。
【０１０６】
全体として、上記の結果は、ペプチド6が、Kp-10と比較して高い有効性および増加した安定性、広い治療域ならびに高い耐容性を有する有望な薬物候補であることを実証している。
【０１０７】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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