(57)【要約】本発明は、単離された安定化抗ＣＤ２０抗体、ならびにその製造方法ならびにヒトリンパ腫、白血病および自己免疫を含む動物疾患の診断および処置におけるその使用方法を提供する。本発明はまた、本発明によって提供される上記安定化抗ＣＤ２０抗体を含む、免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖またはその両方をコードする単離された核酸を提供する。本発明は、上記安定化抗ＣＤ２０抗体を作製する方法を提供する。従って、本発明は、上記安定化抗ＣＤ２０抗体の免疫グロブリン重鎖および軽鎖の一方または両方を発現するベクターを含む細胞を提供する。
2015506687.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された安定化抗ＣＤ２０抗体であって、  ａ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ｐ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｙ７０ＦおよびＡ７９Ｐのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；  ｂ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、配列番号２または以下のアミノ酸配列変化：Ｖ３７ＬおよびＭ２０Ｌ、Ｍ２０ＬおよびＡ９２Ｇ、Ｑ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ｅ１０Ｇ、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｔ２８Ｓ、Ｙ３２Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９Ｄ、Ａ１１３Ｑ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９ＬならびにＶ３１２Ｉのうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；ならびに  ｃ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、（ａ）に列挙した配列番号１におけるアミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含む、または前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、（ｂ）に列挙した配列番号２におけるアミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含む、単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項２】
前記軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項３】
前記軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｉアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項４】
前記重鎖アミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列変化Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤまたはＶ２６３Ｌのうち１つを有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項５】
前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項６】
前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｉアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項７】
前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ８１Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項８】
前記重鎖アミノ酸配列が、Ａ９２Ｇアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項９】
前記重鎖アミノ酸配列が、Ｎ１０９Ｄアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１０】
前記重鎖アミノ酸配列が、Ｖ２６３Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１１】
ａ．前記軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含み、および  ｂ．前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤおよびＶ２６３Ｌのアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１２】
ａ．前記軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１を含み、および  ｂ．前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤおよびＶ２６３Ｌのアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１３】
ａ．前記軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含み、および  ｂ．前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２ＧおよびＮ１０９Ｄのアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１４】
ａ．前記軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１を含み、および  ｂ．前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２ＧおよびＮ１０９Ｄのアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１５】
ａ．前記軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１を含み、および  ｂ．前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌ、Ｍ８１ＬおよびＡ９２Ｇのアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１６】
前記抗ＣＤ２０抗体の重鎖または軽鎖のいずれかが、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、円二色性（ＣＤ）分光法、蛍光発光分光法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、サイズ排除クロマトグラフィーまたは熱的チャレンジアッセイによって測定した場合に、野生型抗ＣＤ２０抗体の対応する重鎖または軽鎖よりも優れた熱安定性を有する場合に、該抗ＣＤ２０抗体が安定化しているとみなされる、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１７】
前記抗ＣＤ２０抗体が、同じ量の野生型抗ＣＤ２０抗体と比較した場合に、増強された抗原結合活性、有効期間、血清半減期、ＡＵＣまたはＣｍａｘを有する、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１８】
単離された安定化抗ＣＤ２０抗体であって、  ａ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列または該軽鎖アミノ酸配列の等価物が、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ｐ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｙ７０ＦおよびＡ７９Ｐのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；  ｂ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列または該重鎖アミノ酸配列の等価物が、配列番号２または以下のアミノ酸配列変化：Ｖ３７ＬおよびＭ２０Ｌ、Ｍ２０ＬおよびＡ９２Ｇ、Ｑ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ｅ１０Ｇ、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｔ２８Ｓ、Ｙ３２Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９Ｄ、Ａ１１３Ｑ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９ＬならびにＶ３１２Ｉのうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；  ｃ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列または該軽鎖アミノ酸配列の等価物が、（ａ）に列挙した配列番号１におけるアミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み、または該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列もしくは該重鎖アミノ酸配列の等価物が、（ｂ）に列挙した配列番号２におけるアミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み；ならびに  ｄ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体が、インタクトな抗体、Ｆｖ断片、単鎖可変領域（ＳｃＦｖ）抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片またはＦａｂ’２  Ｆａｂ抗体断片の形態である、単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１９】
請求項１８に記載の安定化抗ＣＤ２０抗体の単一の軽鎖または重鎖をコードする、単離された核酸。
【請求項２０】
ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項１９に記載の単離された核酸。
【請求項２１】
請求項１９に記載の核酸のうちいずれか１つの発現を導く、単離されたベクター。
【請求項２２】
前記発現が誘導性である、請求項２１に記載の単離されたベクター。
【請求項２３】
請求項１９に記載のベクターのうち１つまたは複数を含む、単離された細胞。
【請求項２４】
原核生物細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
真核生物細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２６】
チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項２５に記載の真核生物細胞。
【請求項２７】
前記ベクターのうち１つまたは複数によって一過性に形質転換される、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２８】
前記ベクターのうち１つまたは複数によって安定に形質転換される、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２９】
単離された前記抗ＣＤ２０抗体の軽鎖または重鎖アミノ酸配列が、  ａ．該抗ＣＤ２０抗体がＣＤ２０分子に結合する能力、補体を固定する能力、ＣＤ−２０発現細胞をオプソニン化する能力、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化する能力、抗体依存性プログラム細胞死を活性化する能力、マクロファージ依存性抗ＣＤ２０免疫応答を活性化する能力、化学療法に対して感受性のＣＤ２０保有細胞を活性化する能力を増強する；  ｂ．該抗ＣＤ２０抗体が補体を固定する能力を低減させる；  さらなるアミノ酸配列変化、ならびに、  ｃ．（ａ）および（ｂ）のさらなるアミノ酸配列変化の組合せ、を有する、請求項１に記載の単離された抗ＣＤ２０抗体。
【請求項３０】
前記抗ＣＤ２０抗体がエフェクターに結合している、請求項１のいずれか１項に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項３１】
前記エフェクターが、放射性同位体、化学療法剤、毒素、生体応答改変因子または第２の抗体である、請求項３０に記載の単離された抗ＣＤ２０抗体。
【請求項３２】
ＰＥＧ、アルブミンまたはポリシアル酸に結合している、請求項１に記載の単離された抗ＣＤ２０抗体。
【請求項３３】
請求項１に記載の抗ＣＤ２０抗体および薬学的に許容されるキャリアを含む、薬理学的組成物。
【請求項３４】
患者において疾患を処置する方法であって、薬学的に許容されるキャリア中の治療有効量の安定化抗ＣＤ２０抗体を該患者に投与するステップを含み、ここで、  ａ．単離された前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ｐ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｙ７０ＦおよびＡ７９Ｐのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；  ｂ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、配列番号２または以下のアミノ酸配列変化：Ｖ３７ＬおよびＭ２０Ｌ、Ｍ２０ＬおよびＡ９２Ｇ、Ｑ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ｅ１０Ｇ、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｔ２８Ｓ、Ｙ３２Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９Ｄ、Ａ１１３Ｑ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９ＬならびにＶ３１２Ｉのうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；ならびに  ｃ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、（ａ）に列挙した配列番号１における該アミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含む、または該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、（ｂ）に列挙した配列番号２における該アミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含む、方法。
【請求項３５】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｉアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列変化Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤまたはＶ２６３Ｌのうち１つを有する配列番号２を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｉアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ８１Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ａ９２Ｇアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｎ１０９Ｄアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｖ２６３Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
ａ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含み、および  ｂ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤおよびＶ２６３Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
ａ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１を含み、および  ｂ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤおよびＶ２６３Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４６】
ａ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含み、および  ｂ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２ＧおよびＮ１０９Ｄアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４６】
ａ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１を含み、および  ｂ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、およびＮ１０９Ｄアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４８】
ａ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１を含み、および  ｂ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌ、Ｍ８１ＬおよびＡ９２Ｇアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗ＣＤ２０抗体の重鎖または軽鎖のいずれかが、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、円二色性（ＣＤ）分光法、蛍光発光分光法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、サイズ排除クロマトグラフィーまたは熱的チャレンジアッセイによって測定した場合に、野生型抗ＣＤ２０抗体の対応する重鎖または軽鎖よりも優れた熱安定性を有する場合に、該抗ＣＤ２０抗体が安定化しているとみなされる、請求項３４に記載の方法。
【請求項５０】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体が、同じ量の野生型抗ＣＤ２０抗体と比較した場合に、増強された抗原結合活性、有効期間、血清半減期、ＡＵＣまたはＣｍａｘを有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗ＣＤ２０抗体の軽鎖または重鎖アミノ酸配列が、該抗体がＣＤ２０分子に結合する能力、、補体を固定する能力、ＣＤ−２０発現細胞をオプソニン化する能力、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化する能力、抗体依存性プログラム細胞死を活性化する能力、マクロファージ依存性抗ＣＤ２０免疫応答を活性化する能力、化学療法に対して感受性のＣＤ２０保有細胞を活性化する能力を増強する、または該抗ＣＤ２０抗体が補体を固定する能力を低減させるさらなるアミノ酸変化、ならびにそれらの組合せを有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗ＣＤ２０抗体がエフェクターに結合している、請求項３４に記載の方法。
【請求項５３】
前記エフェクターが、放射性同位体、化学療法剤、毒素、生体応答改変因子または第２の抗体である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗ＣＤ２０抗体が、ＰＥＧ、アルブミンまたはポリシアル酸に結合している、請求項３４に記載の方法。
【請求項５５】
前記疾患が、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、関節リウマチ、ウェゲナー肉芽腫症または顕微鏡的多発血管炎である、請求項３４に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗ＣＤ２０抗体が、インタクトな抗体、単鎖可変領域（ＳｃＦｖ）抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片またはＦａｂ’２抗体断片の形態である、請求項３４に記載の方法。
【請求項５７】
患者においてＣＤ２０ポリペプチドを定量的に検出する方法であって、薬学的に許容されるキャリア中の診断有効量の安定化抗ＣＤ２０抗体を該患者に投与するステップを含み、  ａ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列または該軽鎖アミノ酸配列の等価物が、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ｐ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｙ７０ＦおよびＡ７９Ｐのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；  ｂ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列または該重鎖アミノ酸配列の等価物が、配列番号２または以下のアミノ酸配列変化：Ｖ３７ＬおよびＭ２０Ｌ、Ｍ２０ＬおよびＡ９２Ｇ、Ｑ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ｅ１０Ｇ、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｔ２８Ｓ、Ｙ３２Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９Ｄ、Ａ１１３Ｑ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９ＬならびにＶ３１２Ｉのうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；  ｃ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列または該軽鎖アミノ酸配列の等価物が、（ａ）に列挙した配列番号１における該アミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み、または該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列もしくは該重鎖アミノ酸配列の等価物が、（ｂ）に列挙した配列番号２における該アミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み；ならびに  ｄ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体が、インタクトな抗体、Ｆｖ断片、単鎖可変領域（ＳｃＦｖ）抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片またはＦａｂ’２  Ｆａｂ抗体断片の形態である、方法。
【請求項５８】
生物学的検体中のＣＤ２０ポリペプチドを定量的に検出する方法であって、診断量の安定化抗ＣＤ２０抗体を該生物学的検体と接触させるステップを含み、  ａ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列または該軽鎖アミノ酸配列の等価物が、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ｐ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｙ７０ＦおよびＡ７９Ｐのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；  ｂ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列または該重鎖アミノ酸配列の等価物が、配列番号２または以下のアミノ酸配列変化：Ｖ３７ＬおよびＭ２０Ｌ、Ｍ２０ＬおよびＡ９２Ｇ、Ｑ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ｅ１０Ｇ、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｔ２８Ｓ、Ｙ３２Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９Ｄ、Ａ１１３Ｑ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９ＬならびにＶ３１２Ｉのうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；  ｃ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列または該軽鎖アミノ酸配列の等価物が、（ａ）に列挙した配列番号１における該アミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み、または該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列もしくは該重鎖アミノ酸配列の等価物が、（ｂ）に列挙した配列番号２における該アミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み；ならびに  ｄ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体が、インタクトな抗体、Ｆｖ断片、単鎖可変領域（ＳｃＦｖ）抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片またはＦａｂ’２  Ｆａｂ抗体断片の形態である、方法。
【請求項５９】
前記抗ＣＤ２０抗体が、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット、スロットブロット、抗原捕捉アッセイまたはマイクロアレイアッセイにおいて使用される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
単離された抗ＣＤ２０抗体であって、  ａ．該抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｑ１Ｄ、Ｓ５Ｔ、Ａ９Ｓ、Ａ９Ｌ、Ｉ１０Ｌ、Ｉ１０Ｆ、Ｉ１０Ｓ、Ｉ１０Ｔ、Ａ１３Ｖ、Ｐｌ５Ａ、Ｐ１５Ｌ、Ｐｌ５Ｖ、Ｋ１８Ｑ、Ｋ１８Ｒ、Ｋ１８Ｅ、Ｍ２１Ｉ、Ｍ２１Ｌ、Ｓ２７Ｑ、Ｓ２７Ｋ、Ｉ３２Ｌ、Ｈ３３Ｎ、Ｆ３５Ｙ、Ｐ３９Ｓ、Ｓ４１Ａ、Ｓ４１Ｔ、Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ａ、Ｓ４２Ｐ、Ｐ４５Ｌ、Ｐ４５Ｒ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ａ４９Ｄ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｆ６１Ｔ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｓ６９Ｔ、Ｙ７０Ｆ、Ｓ７１Ｔ、Ａ７９Ｐ、Ａ８２Ｌ、Ａ８２Ｖ、Ａ８２Ｆ、Ｑ８８ＬおよびＧ９９Ｑのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；  ｂ．該抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、配列番号２、または以下のアミノ酸配列変化：    ｉ．Ｖ３７Ｌ、Ｍ２０Ｌ、ならびにＱ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ａ９Ｇ、Ａ９Ｌ、Ｅ１０Ｇ、Ｋ１３Ｑ、Ｔ２８Ｓ、Ｔ３０Ｓ、Ｋ６７Ｒ、Ｋ６７Ｒ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｙ８０Ｆ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｗ１０６Ｓ、Ｆ１０８Ａ、Ｎ１０９ＤおよびＡ１１３Ｑのうち１つもしくは複数；    ｉｉ．Ｍ２０Ｌ、Ａ９２Ｇ、ならびにＶ１８Ｌ、Ｋ１９Ｒ、Ｋ１９Ｓ、Ｋ１９Ｔ、Ｍ２０Ｉ、Ｍ２０Ｖ、Ｓ２５Ｔ、Ｙ２７Ｆ、Ｙ３２Ｆ、Ｙ３２Ｓ、Ｐ４１Ｈ、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５Ｒのうち１つもしくは複数；および    ｉｉｉ．Ｖ２４４Ｌ、Ｌ２４６Ｉ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６７Ａ、Ｖ２６７Ｉ、Ｖ２６７Ｌ、Ｖ２７０Ｌ、Ｖ２７０Ｓ、Ｖ２７０Ｆ、Ｖ２７０Ｉ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９Ｉ、Ｆ２７９Ｌ、Ｖ３０６Ｔ、Ｖ３１２Ｉ、Ｖ３１２Ｌ、Ｖ３２７Ａ、Ｖ３２７Ｌ、Ｉ３４０Ａ、Ｉ３４０Ｌ、Ｔ２５４Ｅ、Ｍ２５６Ｌ、Ｍ２５６Ｙ、Ｔ２６０Ｅ、Ｔ２６０ＦおよびＴ２６０Ｋ、のうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；ならびに  ｃ．ここで、該抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、（ａ）に列挙した配列番号１におけるアミノ酸変化のうち少なくとも１つを含み、または該抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、（ｂ）に列挙した配列番号２におけるアミノ酸変化のうち少なくとも１つを含む、単離された抗ＣＤ２０抗体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】  発明の背景  リツキシマブ（ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８、ＲＩＴＵＸＡＮ、ＭＡＢＴＨＥＲＡとしても公知）は、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、関節リウマチおよびウェゲナー肉芽腫症（顕微鏡的多発血管炎の１形態）を処置するために使用されるキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。ＣＤ２０は、膜貫通Ｃａ２＋コンダクタンスおよびヒトＢ細胞活性化の間の細胞周期進行の調節に関与するＢリンパ球特異的細胞表面分子である。ＣＤ２０は、主にＩｇ重鎖再配列後に、骨髄においてヒトプレＢ細胞によって最初に発現され、その発現は形質細胞の分化まで持続する。ＣＤ２０は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の９０％の表面上で発現するが、造血幹細胞、プロＢ細胞、正常形質細胞または正常非造血組織上では見出されない。ＣＤ２０は、細胞表面から抜け落ちることはなく、遊離ＣＤ２０抗原は循環中に見出されない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究に基づき、リツキシマブＦｃドメインが免疫エフェクター機能を動員してＢ細胞溶解を媒介すると現在考えられている。【０００２】  抗体は、ウイルスおよび細菌などの外来病原体を同定し中和するために、免疫系によって産生されるタンパク質分子である。その精巧な結合感度および特異性に起因して、抗体は、広範な治療的用途および診断的用途を有する有用な試薬である。抗原は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗体の合成を刺激する分子である。抗原に結合すると、抗原は、補体の固定、抗原保有細胞の食作用および直接的細胞媒介性細胞傷害などを含む、新生物または自己免疫Ｂ細胞を攻撃するために使用され得る多数のプロセスを活性化し得る。【０００３】  しかし、ほとんどのタンパク質分子の場合と同様に、抗体は、化学的および生物学的安定性を保持するために、狭い範囲のｐＨ、温度および溶媒条件内に維持される必要がある。さらに、各抗体に独自の特異性を付与するアミノ酸配列における差異に起因して、個々の抗体は安定性が大きく変動する。その抗原結合活性を維持しつつ抗体の安定性を増強できる方法および組成物が、最近記載されている（例えば、米国特許出願第１３／００２０１３号；公開第２０１１０１３０３２４号を参照のこと）。治療抗体のかかる安定化は、血清半減期の改善、より低い投薬量の必要性、副作用の低減、有効期間の改善ならびに出荷および貯蔵コストの低減を生じ得る。  従って、リツキシマブを含む全ての治療抗体の、安定化バージョンの必要性が長年にわたり存在してきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１／０１３０３２４号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】  発明の簡単な要旨  本発明は、単離された安定化抗ＣＤ２０抗体を提供し、（ａ）単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ｐ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｙ７０ＦおよびＡ７９Ｐのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含むバリアントを含み；（ｂ）単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列は、配列番号２または以下のアミノ酸配列変化：Ｖ３７ＬおよびＭ２０Ｌ、Ｍ２０ＬおよびＡ９２Ｇ、Ｑ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ｅ１０Ｇ、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｔ２８Ｓ、Ｙ３２Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９Ｄ、Ａ１１３Ｑ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９ＬならびにＶ３１２Ｉのうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含むバリアントを含み；（ｃ）単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列は、（ａ）に列挙した配列番号１におけるアミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含む、または該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列は、（ｂ）に列挙した配列番号２におけるアミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含む。単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体ならびにそれらの個々の免疫グロブリン軽鎖および重鎖は、「野生型抗ＣＤ２０抗体」およびその対応する個々の免疫グロブリン軽鎖および重鎖との比較において安定化しており、この「野生型抗ＣＤ２０抗体」とは、軽鎖（配列番号１）および重鎖（配列番号２）配列（これらは、米国特許第５，８４３，４３９号において最初に報告されたリツキシマブ配列に基づくが、そこに含まれる重鎖配列の２つの補正を有する）を有する抗体を指す。【０００６】  本発明はまた、本発明によって提供される上記安定化抗ＣＤ２０抗体を含む、免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖またはその両方をコードする単離された核酸を提供する。本発明は、上記安定化抗ＣＤ２０抗体を作製する方法を提供する。従って、本発明は、上記安定化抗ＣＤ２０抗体の免疫グロブリン重鎖および軽鎖の一方または両方を発現するベクターを含む細胞を提供する。【０００７】  本発明は、インタクトな抗体、Ｆｖ断片、単鎖可変領域（ＳｃＦｖ）抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片またはＦａｂ’２  Ｆａｂ抗体断片の形態の抗体が挙げられるがこれらに限定されない、本発明に従う単離された安定化抗ＣＤ２０抗体を提供する。【０００８】  本発明はさらに、患者において疾患を処置する方法を提供し、この方法は、治療有効量の任意の１種または複数の上記安定化抗ＣＤ２０抗体を患者に投与するステップを含む。好ましい実施形態では、本発明は、上記安定化抗ＣＤ２０抗体を用いて、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、関節リウマチ、ウェゲナー肉芽腫症および顕微鏡的多発血管炎を処置する方法を提供する。【０００９】  さらに、本発明は、患者または生物学的検体中のＣＤ２０ポリペプチドを定量的に検出する方法を提供し、この方法は、診断有効量の本発明によって提供される安定化抗ＣＤ２０抗体を該患者に投与するステップまたは該検体をこの診断有効量の本発明に���って提供される安定化抗ＣＤ２０抗体と接触させるステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、そのシグナル配列なしの野生型抗ＣＤ２０抗体軽鎖アミノ酸配列である配列番号１を示す図である。
【００１１】
【図２】図２は、そのシグナル配列なしの野生型抗ＣＤ２０抗体重鎖アミノ酸配列である配列番号２を示す図である。配列は、米国特許第５，８４３，４３９号に開示されている抗ＣＤ２０配列に基づき、一重および二重の下線によって示される２つの配列補正を有する。
【００１２】
【図３】図３は、そのシグナル配列ありの野生型抗ＣＤ２０抗体軽鎖アミノ酸配列である配列番号３を示す図である。
【００１３】
【図４】図４は、そのシグナル配列ありの野生型抗ＣＤ２０抗体重鎖アミノ酸配列である配列番号４を示す図である。
【００１４】
【図５】図５は、野生型およびバリアント抗ＣＤ２０抗体のキャピラリー示差走査熱量測定分析の結果を示す図である。野生型抗ＣＤ２は、試料ＲＷ００４として同定される。試料ＲＷ００５〜００９は、安定化バリアントからなる。配列変化およびＴｍ値は表８に示す。
【００１５】
【図６】図６は、プロテインＡ結合熱的チャレンジアッセイ（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ａｓｓａｙ）の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】  発明の詳細な説明  本発明は、増強された安定性を有する特定のＣＤ２０結合性抗体、該抗体の産生および該抗体の使用に関する。
【００１７】  定義
【００１８】  「単離された」および「精製された」は、本明細書で相互交換可能に使用され、タンパク質、核酸、脂質および多糖などの他の生体分子から実質的に分離されている状態の分子を指す。これは、膨大な数の他の分子の存在下で存在するかかる分子の通常のｉｎ  ｖｉｖｏ状態とは対照的である。
【００１９】  本明細書で使用する場合、用語「安定化」、「安定化タンパク質」および「安定化ポリペプチド」は、本明細書で相互交換可能に使用され、かつ、野生型タンパク質（即ち、上記アミノ酸変化のないタンパク質）と比較してそのタンパク質の正常な機能を減少させる傾向のある条件、例えば、熱、低温、震動、浸透圧などに対してこのタンパク質をより抵抗性にするアミノ酸変化がなされたタンパク質を指す。例えば、タンパク質の安定性は、温度依存的である、アンホールディングのギブズ自由エネルギーΔＧｕに関連する。ほとんどのタンパク質の安定性は、温度と共に減少する；温度が上昇すると、ΔＧｕは減少し、折り畳まれたタンパク質の濃度と高次構造がほぐされた（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）タンパク質の濃度とが等しくなる平衡においてゼロになる。この点において、この温度は「融点」（Ｔｍ）とみなされる。蛍光色素の存在下でのタンパク質の熱的アンホールディングは、タンパク質のＴｍを評価するために使用され得る。平衡法ではないものの、この技術は、相対的Ｔｍに従ってタンパク質をランク付けするために使用され得る（例えば、Ｎｉｅｓｅｎ  Ｆ．  Ｈ．、Ｂｅｒｇｌｕｎｄ  Ｈ．およびＶｅｄａｄｉ  Ｍ．：Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２００７年、２号：２２１２〜２１頁もまた参照のこと）。本発明に従う安定化タンパク質は、例えば、野生型Ｔｍより少なくとも０．３℃高いＴｍ、好ましくは野生型Ｔｍより少なくとも０．３℃高いＴｍ、より好ましくは野生型Ｔｍより少なくとも０．５℃高いＴｍ、なおさらには野生型Ｔｍより少なくとも１．０℃高いＴｍ、および、なおより好ましくは野生型Ｔｍより少なくとも５．０℃高いＴｍを有し、Ｔｍは、当業者に公知の任意の適切な方法によって決定される。
【００２０】  「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で相互交換可能に使用され、かつ、ペプチド結合によって連結したアミノ酸残基の鎖から構成される化合物を指す。ポリペプチドの「活性部分」とは、全長ポリペプチド未満であるが、測定可能な生物学的活性を保持し、生物学的検出を保持するペプチドを意味する。
【００２１】  本明細書で使用する場合、用語「腫瘍」とは、良性であれ悪性（がん性）であれ、原発部位病変であれ転移であれ、任意の新生物の成長、増殖または細胞塊を指す。
【００２２】  本明細書で使用する場合、用語「がん」とは、正常な成長制御に対する感受性を喪失した細胞の増殖によって引き起こされるまたはかかる細胞の増殖を特徴とする増殖性障害を指す。同じ組織型のがんは、同じ組織に通常起源し、その生物学的特徴に基づいて異なるサブタイプに分けられ得る。がんの４つの一般的な分類は、癌腫（上皮細胞由来）、肉腫（結合組織または中胚葉由来）、白血病（血液形成組織由来）およびリンパ腫（リンパ組織由来）である。がんは、全ての器官に影響し得、身体の組織が罹患し得る。がんの定義を限定しないがんの具体的な例には、黒色腫、白血病、星状細胞腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫および慢性リンパ性白血病を挙げることができる。種々のがんに罹患し得る器官および組織の例には、膵臓、乳房、甲状腺、卵巣、子宮、精巣、前立腺、脳下垂体、副腎、腎臓、胃、食道、直腸、小腸、結腸、肝臓、胆嚢、頭頸部、舌、口腔、眼および眼窩、骨、関節、脳、神経系、皮膚、血液、鼻咽頭組織、肺、喉頭、尿路、子宮頸部、膣、外分泌腺ならびに内分泌腺が挙げられる。あるいは、がんは、多中心性または原発部位不明のがん（ＣＵＰＳ）であり得る。
【００２３】  本明細書で使用する場合、「腫瘍を標的とする抗体」とは、疾患を標的とする抗体を指し、この疾患は、リンパ腫、白血病、腫瘍、がん、新生物などである。
【００２４】  本明細書で使用する場合、「治療有効量」とは、哺乳動物における疾患または状態の１つまたは複数の症状を（通常の熟練した臨床家によって判断されるように、ある程度まで）軽減する組成物の量を指す。さらに、組成物の「治療有効量」とは、疾患もしくは状態と関連するまたは疾患もしくは状態の原因である生理学的または生化学的パラメータを、部分的または完全に正常に戻す量を意味する。当技術に熟練した臨床家は、静脈内、皮下、腹腔内、経口、または吸入を介してなどで投与される場合、特定の疾患状態または障害を処置もしくは予防するために、組成物の治療有効量を決定できる。治療的に有効であるために必要とされる組成物の正確な量は、多くの患者の具体的考慮事項に加えて、例えば、活性薬剤の比活性、使用される送達デバイス、該薬剤の物理的特徴、投与の目的などの多数の因子に依存する。しかし、本明細書に示される開示を理解すれば、治療有効量の決定は、通常の熟練した臨床家の技術の範囲内である。
【００２５】  用語「処置する」、「処置」、「療法」および「治療的処置」は全て、本明細書で使用する場合、治癒的療法、予防療法（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）または予防的療法（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）を指す。「予防的療法」の例は、標的とした疾患（例えば、がんまたは他の増殖性疾患）またはそれに関連する状態の危険性を、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも１５％、なおより好ましくは少なくとも２０％、低下させることである。処置を必要とする者には、その疾患または状態を既に有している者、および予防すべき疾患または状態を有しやすい者が含まれる。用語「処置する」、「処置」、「療法」および「治療的処置」は、本明細書で使用する場合、疾患または関連する状態と闘うことを目的とした哺乳動物の管理およびケアもまた記述し、症状、副作用、または該疾患、状態の他の合併症を緩和するための組成物の投与を含む。がんの治療的処置には、手術、化学療法、放射線療法、遺伝子療法および免疫療法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】  本明細書で使用する場合、用語「エフェクター」、「薬剤」または「薬物」または「治療剤」とは、治療的特性または医薬的特性を有すると疑われる、化学剤、化合物の混合物、生物学的高分子、または細菌、植物、真菌または動物（特に哺乳動物）の細胞もしくは組織などの生物学的材料から作製した抽出物を指す。上記薬剤または薬物は、精製され得る、実質的に精製され得る、または部分的に精製され得る。本発明に従う「薬剤」には、放射線療法剤または「化学療法剤」（例えば、小分子薬物）もまた挙げられる。
【００２７】  本明細書で使用する場合、用語「診断剤」とは、例えば、免疫組織学的検査またはフローサイトメトリーなどの任意の適切な方法による、血漿／循環ＣＤ２０などのＣＤ２０の検出および／または定量を可能にする剤を指す。
【００２８】  本明細書で使用する場合、用語「化学療法剤」とは、がん、新生物および／または増殖性疾患に対する活性を有する化学剤（例えば、小分子薬物）を指す。
【００２９】  本明細書で使用する場合、用語「放射線療法レジメン」または「放射線療法」とは、がん性細胞を死滅させるための放射線の投与を指す。放射線は、上記細胞内の種々の分子と相互作用するが、細胞死を生じる一次標的はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。しかし、放射線療法はまた、細胞膜および核膜ならびに他のオルガネラに対する損傷を生じることも多い。ＤＮＡ損傷は通常、糖−リン酸骨格における一本鎖または二本鎖の切断を含む。さらに、細胞機能を破壊し得るＤＮＡおよびタンパク質の架橋が存在し得る。放射線の種類に依存して、ＤＮＡ損傷の機構は、その生物学的効果比が様々であるように、様々であり得る。例えば、重粒子（即ち、陽子、中性子）は、ＤＮＡを直接損傷し、より大きい生物学的効果比を有する。一方、電磁放射線は、細胞水のイオン化によって主に産生される短命のヒドロキシルフリーラジカルを介して作用する間接的なイオン化を生じる。放射線の臨床的適用は、外部ビーム放射線（外部供給源から）および近接照射療法（患者に移植または挿入した放射線の供給源を使用する）からなる。外部ビーム放射線は、Ｘ線および／またはガンマ線からなるが、近接照射療法は、自然崩壊してアルファ粒子を放出する、またはガンマ線と共にベータ粒子を放出する放射性核を使用する。
【００３０】  本明細書で使用する場合、用語「生物製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）」、「生物学的製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）」、「生物学的薬剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅｎｔｓ）」、「代替的治療レジメン」または「代替的療法」は、例えば、受容体チロシンキナーゼインヒビター（例えば、Ｉｒｅｓｓａ（商標）（ゲフィチニブ）、Ｔａｒｃｅｖａ（商標）（エルロチニブ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）（セツキシマブ）、イマチニブメシル酸塩（Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標）））；プロテオソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）インヒビター（例えば、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（商標）））；ＶＥＧＦＲ２インヒビター、例えばＰＴＫ７８７（ＺＫ２２２５８４）、オーロラキナーゼインヒビター（例えば、ＺＭ４４７４３９）；ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）インヒビター、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）インヒビター、ラパマイシンインヒビター（例えば、シロリムス（Ｒａｐａｍｕｎｅ（商標）））；ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（例えば、ティピファーニブ（Ｚａｒｎｅｓｔｒａ（商標）））；マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター（例えば、ＢＡＹ  １２−９５６６；硫酸化多糖テコガラン（ｔｅｃｏｇａｌａｎ））；新脈管形成インヒビター（例えば、Ａｖａｓｔｉｎ（商標）（ベバシズマブ）；フマギリンのアナログ、例えばＴＮＰ−４；カルボキシアミノトリアゾール；ＢＢ−９４およびＢＢ−２５１６；サリドマイド；インターロイキン−１２；リノミド（ｌｉｎｏｍｉｄｅ）；ペプチド断片；ならびに血管増殖因子および血管増殖因子受容体に対する抗体；血小板由来増殖因子受容体インヒビター、タンパク質キナーゼＣインヒビター、マイトジェン活性化キナーゼインヒビター、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼインヒビター、ラウス肉腫ウイルス形質転換がん遺伝子（ＳＲＣ）インヒビター、ヒストンデアセチラーゼインヒビター、小分子低酸素誘導因子インヒビター、ヘッジホッグインヒビター、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターなどを含む、手術、化学療法（小分子薬物）または放射線療法以外の療法である。
【００３１】  上記と一致して、免疫療法剤もまた、代替的治療レジメンとして考慮される。例えば、予め形成された抗体を含む血清またはガンマグロブリン；非特異的免疫賦活性アジュバント；特異的能動免疫療法；および養子免疫療法。さらに、代替的療法は、例えばアンチセンス分子を含むポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、遺伝子療法ベクターなどの他の生物学をベースとした化学的実体を含み得る。かかる代替的療法は、単独で、または本明細書に記載される他の治療レジメンと併用して投与され得る。投薬レジメンおよび投与レジメンを含む併用療法における化学療法剤および代替的治療レジメンで使用される他の薬剤の使用方法もまた、当業者に公知である。
【００３２】  本明細書で使用する場合、用語「腫瘍局在化」または「疾患局在化」とは、本明細書で使用する場合、腫瘍保有動物への注射により、ＣＤ２０発現腫瘍中またはＣＤ２０発現腫瘍の部位において抗ＣＤ２０抗体が集合または濃縮する程度を指す。腫瘍局在化は、抗体を蛍光色素で標識すること、腫瘍を有する動物に現在蛍光性の抗体を注射すること、および腫瘍の蛍光対任意の腫瘍全体から離れた皮膚または他の組織からの蛍光の比率を決定することが挙げられるがこれらに限定されない任意の適切な方法によって測定され得、この局在化は、上記比率が＞２０、好ましくは＞１０、より好ましくは＞５の場合に存在する。
【００３３】  本明細書で使用する場合、用語「ベクター」とは、抗ＣＤ２０抗体の軽鎖もしくは重鎖またはそれらの一部をコードする配列から構成され得る（即ち、「コード配列」が、ベクターへとクローニングされる）任意のポリヌクレオチドを意味し、細胞の形質転換に使用され得る（例えば、そのポリヌクレオチドがその細胞中で複製できるように、および例えば、上記ポリヌクレオチドの存在が抗生物質によって選択できるように、ＤＮＡトランスフェクションによって）。従って、ベクターは、そのベクターが、クローニングされた遺伝子の転写を指示し得る制御配列（例えば、リプレッサーを欠く一方、プロモーター、エンハンサー）を含む場合に、そのベクターへとクローニングされた遺伝子「を発現させることが可能」であると言うことができる。本明細書で使用する場合、「発現が誘導性である」と言う場合、抗ＣＤ２０抗体またはその一部をコードするベクター配列の転写が制御され得、その結果、上記転写がオンにされ得るまたはオフにされ得ることを意味する。細胞は、ベクター配列が限定的な期間（例えば、数日間）にわたり該細胞中で維持される場合にこのベクターで「一過性に形質転換される」と言うことができ、または該ベクター配列が無期限に（特に、選択される場合）該細胞中で維持される場合に「安定に形質転換される」と言うことができる。
【００３４】  本明細書で使用する場合、用語「配列変化」は、アミノ酸配列または核酸配列における変更（即ち、「変異」）を意味する。
【００３５】  抗ＣＤ２０抗体
【００３６】  一般に、抗体は、２つの軽鎖分子および２つの重鎖分子から構成される；これらの鎖は、一般的「Ｙ字」形状を形成し、軽鎖および重鎖の両方がＹ字のアームを形成し、重鎖がＹ字の基部を形成する。軽鎖および重鎖は、構造的および機能的相同性のドメインへと分けられる。軽鎖および重鎖の両方の可変ドメイン（「ＶＬ」および「ＶＨ」）は、認識および特異性を決定する。軽鎖および重鎖の定常領域ドメイン（「ＣＬ」および「ＣＨ」）は、重要な生物学的特性、例えば、抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体固定、オプソニン化、抗体依存性細胞傷害（「ＡＤＣＣ」）の活性化などを付与する。抗体産生細胞において免疫グロブリン遺伝子発現を導く一連の事象は複雑である。可変ドメイン領域の遺伝子配列は、「ＶＨ」、「ＤＨ」および「ＪＨ」、または「ＶＬ」および「ＪＬ」と称される別々の生殖系列遺伝子セグメントに位置する。これらの遺伝子セグメントは、ＤＮＡ再配列によって連結して、それぞれ重鎖および軽鎖において発現する完全Ｖ領域を形成する。次いで、再配列し連結したＶセグメント（ＶＬ−ＪＬおよびＶＨ−ＤＨ−ＪＨ）は、それぞれ軽鎖および重鎖の完全な可変領域または抗原結合性ドメインをコードする（本明細書で使用する場合、用語「免疫グロブリン重鎖および軽鎖」、「抗体重鎖および軽鎖」ならびに「重鎖および軽鎖」は、相互交換可能である）。
【００３７】  本明細書で使用する場合、用語「抗ＣＤ２０抗体」は、一般に「ＣＤ２０」と称されるヒトＢリンパ球制限分化抗原Ｂｐ３５として典型的に指定された３５，０００ダルトンの細胞表面非グリコシル化リンタンパク質を特異的に認識する抗体である。本明細書で使用する場合、用語「野生型抗ＣＤ２０抗体」とは、Ｆｖ断片、単鎖可変領域（ＳｃＦｖ）抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片またはＦａｂ’２  Ｆａｂ抗体断片の形態の、配列番号１の免疫グロブリン軽鎖アミノ酸配列および配列番号２の免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列またはそれらの等価物を有するＣＤ２０結合性抗体を意味する。
【００３８】  本明細書で使用する場合、用語「キメラ」とは、２つ以上の異なる種（例えば、マウスおよびヒト）由来の一部を含む抗体を指す。特に、抗ＣＤ２０抗体に関して使用する場合、この用語は、組換えデオキシリボ核酸技術を使用して最も好ましくは誘導され、ヒト（免疫学的に「関連する」種、例えばチンパンジーが含まれる）構成成分および非ヒト構成成分の両方を含む抗体を包含する：該キメラ抗体の定常領域は、天然ヒト抗体の定常領域と実質的に同一であり；該キメラ抗体の可変領域は、非ヒト供給源に由来し、ＣＤ２０細胞表面抗原に対する所望の抗原特異性を有する。
【００３９】  本明細書で使用する場合、語句「免疫学的に活性な」は、キメラ抗ＣＤ２０抗体に関して使用される場合、ヒトＣ１ｑを結合し、補体を固定し、表面ＣＤ２０保有細胞をオプソニン化し、ヒトＢリンパ系細胞系の補体依存的溶解（「ＣＤＣ」）を媒介し、抗体依存性細胞傷害（「ＡＤＣＣ」）を介してヒト標的細胞を溶解させる抗体を意味する。
【００４０】  リツキシマブは、１４５ｋＤのおよその分子量およびおよそ８．０ｎＭのＣＤ２０結合親和性を有する完全抗体分子である。上記抗体結合親和性は、当業者に公知の任意の適切な方法によって決定できる。例えば、その抗原に対する抗体結合の強度は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、またはカラム支持形式での結合によって評価できる。解離は、変性条件を増加させることによって、または関連抗原もしくは非放射能の抗原との競合によって、実施される。解離定数Ｋｄは、スキャッチャードプロットによって決定され得る（例えば、米国特許第５，８４３，４３９号および米国特許第８，０５７，７９３号を参照のこと）。
【００４１】  タンパク質安定性の体系的改善のための最近記載された方法は、米国特許出願第１３／００２，０１３号（特許出願公開第２０１１０１３０３２４号）に開示されており、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の安定化を用いて抗体分子に適用されている。特に、このアプローチを使用して、抗原結合性に有意に影響を与えることなしに安定化を生じるアミノ酸配列変化が、抗体軽鎖および重鎖においてなされ得る。この方法は、その結合特性の修飾を回避するために抗体のフレームワーク領域に焦点を当てているので、これが可能である。本発明は、全長の治療モノクローナル抗体へのこの安定化アプローチの適用を初めて実証している。このポリペプチド安定化技術は、その結合機能に影響を与えることなしに抗体の安定性を改善する可能性があるアミノ酸変化を同定するために所有権のある方法を利用する。一般的な用語では、このタンパク質安定化方法は、（１）熱的安定性および熱力学的安定性が特徴付けられた抗体ドメインバリアントの所有権のあるデータベースを使用する標的配列の評価、ならびに（２）機能的相同タンパク質において生じる配列バリエーションの同定、に基づく。
【００４２】  従って、本発明は、単離された安定化抗ＣＤ２０抗体ならびにその製造および使用の方法を提供し、（ａ）単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列またはこの軽鎖アミノ酸配列の等価物は、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ｐ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｙ７０ＦおよびＡ７９Ｐのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；（ｂ）単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列またはこの重鎖アミノ酸配列の等価物は、配列番号２または以下のアミノ酸配列変化：Ｖ３７ＬおよびＭ２０Ｌ、Ｍ２０ＬおよびＡ９２Ｇ、Ｑ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ｅ１０Ｇ、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｔ２８Ｓ、Ｙ３２Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９Ｄ、Ａ１１３Ｑ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９ＬならびにＶ３１２Ｉのうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；（ｃ）単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列またはこの軽鎖アミノ酸配列の等価物は、（ａ）に列挙した配列番号１におけるアミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み、またはこの安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列もしくはこの重鎖アミノ酸配列の等価物は、（ｂ）に列挙した配列番号２におけるアミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み；ならびに（ｄ）単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体は、インタクトな抗体、Ｆｖ断片、単鎖可変領域（ＳｃＦｖ）抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片またはＦａｂ’２  Ｆａｂ抗体断片の形態である。「Ｆｖ断片」とは、両方の鎖にカップリングしたジスルフィド結合、アミノ酸リンカー配列または非ペプチド分子などが含まれる、任意の適切な手段によって一緒にされた、短縮化重鎖および軽鎖の任意の組合せを意味する。
【００４３】  それぞれ配列番号１および２によって示される軽鎖または重鎖アミノ酸配列の「等価物」とは、局所配列アラインメントに基づきかつそのＫａｂａｔまたはＥＵ残基番号（表１〜３を参照のこと）に鑑みて、本明細書に開示される配列番号１または２に基づくアミノ酸変化に対応する、問題のＦｖ断片、単鎖可変領域（ＳｃＦｖ）抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片またはＦａｂ’２  Ｆａｂ抗体断片の配列におけるアミノ酸残基を意味する。
【００４４】  本発明は、単離された安定化抗ＣＤ２０抗体であって、その軽鎖アミノ酸配列がＷ４６Ｌアミノ酸変化を有する配列番号１を含み、その重鎖アミノ酸配列が以下の配列変化Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤまたはＶ２６３Ｌのうち１つを有する配列番号２を含む、ＣＤ２０抗体、ならびにそれらの製造および使用の方法を提供する。
【００４５】  本発明はまた、単離された安定化抗ＣＤ２０抗体ならびにそれらの製造および使用の方法を提供し、ここで、その軽鎖アミノ酸配列は、Ｗ４６ＬまたはＷ４６Ｉアミノ酸変化を有するまたは有さない配列番号１を含み、その重鎖アミノ酸配列は、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤまたはＶ２６３Ｌアミノ酸変化を有する配列番号２を含み；その重鎖アミノ酸配列は、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２ＧおよびＮ１０９Ｄアミノ酸変化を有する配列番号２を含み；その重鎖アミノ酸配列は、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１ＬおよびＡ９２Ｇアミノ酸変化を有する配列番号２を含む。
【００４６】  本発明はさらに、単離された安定化抗ＣＤ２０抗体ならびにそれらの製造および使用の方法を提供し、ここで、該抗体は、その重鎖または軽鎖のいずれかが、例えば示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、円二色性（ＣＤ）分光法、蛍光発光分光法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、サイズ排除クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ）または熱的チャレンジアッセイが挙げられる当業者に公知の任意の適切な方法によって測定した場合に、対応する野生型抗ＣＤ２０抗体の重鎖または軽鎖よりも優れた熱安定性を有する場合に、安定化しているとみなされる。
【００４７】  他の実施形態では、本発明は、アミノ酸配列変化の結果として、同じ量の野生型抗ＣＤ２０抗体と比較した場合に、抗原結合活性、有効期間、血清半減期、ＡＵＣまたはＣｍａｘの増強を有する抗ＣＤ２０抗体を生じる、安定化抗ＣＤ２０抗体ならびにそれらの製造および使用の方法を提供する。
【００４８】  本発明は、例えば核酸がＲＮＡまたはＤＮＡである場合を含む、本明細書に記載される安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖または重鎖をコードする単離された核酸を提供する。本発明はまた、例えば上記発現が誘導性である場合を含む、上記核酸のうちいずれか１つまたは複数の発現を指示する単離されたベクター（即ち、モノシストロン性、ビシストロン性またはポリシストロン性のベクター）を提供する。従って、本発明は、例えば細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である場合を含む、これらのベクターのうち１つまたは複数を含む原核生物細胞および真核生物細胞を提供する。上記細胞は、上記ベクターで安定にまたは一過性に形質転換され得、上記抗ＣＤ２０の軽鎖および重鎖の発現は、構成的または誘導性であり得る。
【００４９】  本発明は、単離された抗ＣＤ２０抗体ならびにそれらの製造および使用の方法を提供し、ここで、この抗ＣＤ２０抗体の軽鎖または重鎖アミノ酸配列は、該抗体がＣＤ２０分子に結合する能力、補体を固定する能力、ＣＤ−２０発現細胞をオプソニン化する能力、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化する能力、抗体依存性プログラム細胞死を活性化する能力、マクロファージ依存性抗ＣＤ２０免疫応答を活性化する能力、化学療法に対して感受性のＣＤ２０保有細胞を活性化する能力を増強するか、または該抗ＣＤ２０抗体が補体を固定する能力を低減させるさらなるアミノ酸配列変化、ならびにそれらの組合せを有する（例えば、米国特許第８，０８４，５８２号を参照のこと）。
【００５０】  本発明は、単離された安定化抗ＣＤ２０抗体ならびにそれらの製造および使用の方法を提供し、ここで、この抗ＣＤ２０抗体は、例えば、エフェクターが、放射性同位体、化学療法剤、毒素、生体応答改変因子（ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）または第２の抗体である場合を含むエフェクターに結合している。本発明の単離された抗ＣＤ２０抗体はまた、ＰＥＧ、アルブミンまたはポリシアル酸に結合している抗ＣＤ２０抗体ならびにその製造および使用の方法を含む。従って、本発明は、本明細書に記載される安定化抗ＣＤ２０抗体のうちいずれか１つおよび薬学的に許容されるキャリアを含む薬理学的組成物を提供する。
【００５１】  免疫原性および免疫応答を回避するために、ヒト化ＣＤ２０結合性抗体またはＦａｂ’、ＦａｂもしくはＦａｂ２などの適切な断片を使用することがしばしば好ましい。ヒト化抗体またはその断片は、例えば以下を含む任意の適切な方法によって産生され得る：１）ヒト化抗体は、ヒトＩｇＧ骨格を使用し、その可変ＣＤＲ領域を、ＣＤ２０に対する抗体の可変ＣＤＲ領域で置き換えることによって構築され得、この重鎖および軽鎖は、別々のプロモーターの下で独立して発現するか、またはＩＲＥＳ配列を有する１つのプロモーターの下で共発現する；２）ヒト化モノクローナル抗体は、ヒト免疫系を有するように操作されたマウスを使用してＣＤ２０に対して出現させることができる；３）ＣＤ２０に対するヒト化抗体は、ファージミド（Ｍ１３、ラムダ大腸菌ファージまたは表面提示が可能な任意のファージ系）を使用して出現させることができる。完全抗体の発現は、例えば、ＣＨＯ細胞または２９３細胞などの哺乳動物細胞における重鎖および軽鎖の共発現によって達成され得る。同様に、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦａｂ２断片および単鎖抗体は、当業者に公知の任意の適切な方法を使用して調製し得る。
【００５２】  モノクローナル抗体をヒト化するための４つの一般的なステップが存在する。これらは以下である：（１）出発抗体軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を決定するステップ、（２）ヒト化抗体を設計するステップ、即ち、上記ヒト化プロセスの間に使用する抗体フレームワーク領域を決定するステップ、（３）実際のヒト化方法論／技術、ならびに（４）該ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，８０７，７１５号；米国特許第５，８６６，６９２号；米国特許第６，３３１，４１５号；米国特許第５，５３０，１０１号；米国特許第５，６９３，７６１号；米国特許第５，６９３，７６２号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第６，１８０，３７０号；および米国特許第６，５４８，６４０号（これらは参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと。例えば、定常領域は、上記抗体がヒトにおける臨床試験および処置において使用される場合に免疫応答を回避するために、ヒト定常領域に対してより似るように操作され得る。例えば、米国特許第５，９９７，８６７号および米国特許第５，８６６，６９２号（これらは参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００５３】  あるいは、抗体は、ファージディスプレイ技術によってスクリーニングおよび組換え作製され得る。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；米国特許第５，５８０，７１７号；米国特許第５，７３３，７４３号および米国特許第６，２６５，１５０号（これらは参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと。あるいは、上記ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８巻：５５２〜５５３頁（１９９０年））は、ヒト抗体および抗体断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生するために使用され得る。
【００５４】  安定化抗ＣＤ２０抗体の生成
【００５５】  本発明によって提供される安定化抗ＣＤ２０抗体は、「部位特異的変異誘発」によって生成させた。部位特異的変異誘発は、所定の新たな配列を生成するように、特定の部位でＤＮＡ配列を変化させる確立された組換えＤＮＡ技術である。任意の適切な部位特異的変異誘発技術が、本発明に従って使用され得る。部位特異的変異誘発のための１つの例示的な適切な技術は、オリゴヌクレオチドミスマッチ変異誘発である。この技術は、クローニングされた遺伝子への所定の単一のヌクレオチド変化を導入するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ合成を使用する。一般的アプローチは、単鎖組換えＤＮＡの回収を可能にするＭ１３またはファージミドベクターへと遺伝子またはｃＤＮＡをクローニングするステップを含む。次いで、その配列が、変異される領域における遺伝子配列に対して相補的であるが、意図した変異部位において単一ヌクレオチドの差異を有する、変異原性オリゴヌクレオチドが設計される。この変異原性オリゴヌクレオチドは、所望の変異を含む相補的全長配列を生じる新たなＤＮＡ合成を開始させるように作用する。変異体および野生型配列は、アニーリングして、ヘテロ二重鎖を形成する。これらのヘテロ二重鎖は、細胞を形質転換するために使用され、所望の変異体遺伝子は、この変異についてスクリーニングすることによって同定され得る。
【００５６】  ＰＣＲによる部位特異的変異誘発は、当業者に周知であり、塩基の置換、欠失および挿入を可能にする多数の適切な戦略が存在する。部位特異的変異誘発のための１つのかかる適切なＰＣＲ技術は、所望の配列変化を含む改変されたＰＣＲプライマーを使用する。このＰＣＲプライマー配列は、元の配列を単に置き換える（その変化が、意図した標的に該プライマーがアニーリングするのを可能にするのに最小限に十分である限りにおいて）（例えば、Ｋａｄｏｗａｋｉ  Ｈら：「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｃａｔａｌｙｓｅｄ  ｂｙ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｇｅｎｅ（１９８９年）７６巻（１号）：１６１〜１６６頁を参照のこと）。
【００５７】  「オーバーラップ伸長ＰＣＲ」は、部位特異的変異誘発のための別の適切で例示的な技術であり、標的領域を変異させるためにネステッドＰＣＲプライマーを使用する。オーバーラップ末端を有する２つのＤＮＡ断片を生成するために、相補的ＰＣＲプライマーおよびポリメラーゼ連鎖反応が使用される。これらの断片は、上記オーバーラップ末端がアニーリングし、各鎖の３’オーバーラップが相補鎖の３’伸長のためのプライマーとして作用するのを可能にする、その後の「融合」反応において結び付けられる。得られた融合産物は、ＰＣＲによってさらに増幅される。ヌクレオチド配列における特異的変更は、オーバーラップするプライマーへとヌクレオチド変化を組み込むことによって導入され得る（例えば、Ｈｏ  ＳＮら：「Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ」、Ｇｅｎｅ（１９８９年）７７巻（１号）：５１〜５９頁を参照のこと）。
【００５８】  部位特異的変異誘発のためのなお別の適切で例示的な技術は、「インバースＰＣＲ」を使用する。この技術は、プラスミドを変異させるために使用される。この技術は、プラスミド全体を増幅するために２つの背中合わせのプライマーを使用し、その線状産物は、次いでライゲーションして環状形態に戻される。プライマー結合領域は、プライマー配列を所望の変異を含むように変更することによって変化させることができる（例えば、Ｈｅｍｓｌｅｙ  Ａら：「Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９年）１７巻（１６号）：６５４５〜６５５１頁を参照のこと）。
【００５９】  配列番号１もしくは２または配列番号１もしくは２の一部のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する任意の適切なポリヌクレオチドが、本発明に従う部位特異的変異誘発のための出発材料として使用され得る。米国特許第５，８４３，４３９号（これは、その全体が本明細書中に記載されているかのように、参照によって本明細書に組み込まれる）中に開示されている配列番号１もしくは２または配列番号１もしくは２の一部のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドは、本発明に従う部位特異的変異誘発のための出発材料として十分適している。
【００６０】  熱安定性を評価する
【００６１】  熱安定性は、任意の適切な技術を使用して本発明の組成物の融点（Ｔｍ）を測定することによって評価され得る。上記融点は、組成物の分子の５０％が折り畳まれた状態にある熱転移曲線の中点の温度である。
【００６２】  熱安定性は、熱量測定によって評価され得る。例示的な熱量測定方法は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）である。ＤＳＣは、ほとんどのタンパク質またはタンパク質ドメインのアンホールディングに付随する熱吸収度に対して感受性である熱量計を使用する（例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＳａｎｃｈｅｚ−Ｒｕｉｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７巻：１６４８〜５２頁、１９８８年を参照のこと）。タンパク質の熱安定性を決定するために、該タンパク質の試料が熱量計に挿入され、抗体、軽鎖または重鎖の高次構造がほぐされるまで、温度を上昇させる。上記タンパク質の高次構造がほぐされる温度は、全体的なタンパク質安定性を示す。
【００６３】  熱安定性は、分析的分光法によって評価され得る。例示的な分析的分光法は、円二色性（ＣＤ）分光法である。ＣＤ分光法は、漸増する温度の関数として、組成物の光学活性を測定する。円二色性（ＣＤ）分光法は、構造的非対称性に起因して生じる、左回り偏光対右回り偏光の吸収における差異を測定する。不規則構造または高次構造がほぐされた構造は、規則構造または折り畳まれた構造のものとは非常に異なるＣＤスペクトルを生じる。このＣＤスペクトルは、漸増する温度の変性効果に対するタンパク質の感受性を反映し、従って、タンパク質の熱安定性を示す（例えば、ｖａｎ  ＭｉｅｒｌｏおよびＳｔｅｅｍｓｍａ、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７９巻（３号）：２８１〜９８頁、２０００年を参照のこと）。
【００６４】  熱安定性を測定するための別の例示的な分析的分光法は、蛍光発光分光法である。熱安定性を評価するための蛍光ベースの方法は、熱的アンホールディングの際の内因性のフルオロフォア（例えば、トリプトファンおよびチロシンアミノ酸）または外因性のフルオロフォア（例えば、ＡＮＳまたはＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ）の蛍光における変化をモニタリングする（例えば、Ｎｉｅｓｅｎ  Ｆ．  Ｈ．、Ｂｅｒｇｌｕｎｄ  Ｈ．およびＶｅｄａｄｉ  Ｍ．：  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２００７年、２巻：２２１２〜２１頁を参照のこと）。抗体、軽鎖または重鎖の熱安定性を測定するためのなお別の例示的な分析的分光法は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法である（例えば、ｖａｎ  ＭｉｅｒｌｏおよびＳｔｅｅｍｓｍａ、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７９巻（３号）：２８１〜９８頁、２０００年を参照のこと）。
【００６５】  組成物の熱安定性（ｔｈｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ）は、生化学的にも測定され得る。熱安定性を評価するための例示的な生化学的方法は、熱的チャレンジアッセイである。「熱的チャレンジアッセイ」では、本発明の組成物は、一定期間にわたって一連の上昇した温度に供される。例えば、試験抗体、軽鎖もしくは重鎖分子、ｓｃＦｖ分子、またはｓｃＦｖ分子を含む分子が、例えば０．１〜１．５時間にわたって、一連の漸増する温度に供され得る。上記タンパク質の活性が次いで、適切な生化学的アッセイによってアッセイされる。例えば、このタンパク質が結合性タンパク質（例えば、プロテインＡに結合する）である場合、この結合性タンパク質の結合活性は、機能的アッセイまたは定量ＥＬＩＳＡによって決定され得る。
【００６６】  さらに、かかるアッセイは、ハイスループット形式で行われ得る。例えば、かかる実施形態では、ｓｃＦｖバリアントのライブラリーが、当該技術分野で公知の方法を使用して創製され得る。ｓｃＦｖ発現が誘導され得、ｓｃＦｖが熱的チャレンジに供され得る。そのチャレンジされた試験試料は、結合についてアッセイされ得、安定であるｓｃＦｖは、スケールアップされ得る、およびさらに特徴付けされ得る。
【００６７】  関連の技術では、熱安定性は、分析的熱量測定技術（例えば、ＤＳＣ）を使用して、本発明の組成物の比熱または熱容量（Ｃｐ）を測定することによって評価される。組成物の比熱は、１ｍｏｌの水の温度を１℃上昇させるために必要とされるエネルギー（例えば、ｋｃａｌ／ｍｏｌで表される）である。大きいＣｐは、変性したまたは不活性なタンパク質組成物の品質証明である。組成物の熱容量（δＣｐ）における変化は、その熱転移の前および後に組成物の比熱を決定することによって測定される。他の実施形態では、熱安定性は、アンホールディングのギブズ自由エネルギー（δＧ）、アンホールディングのエンタルピー（δＨ）またはアンホールディングのエントロピー（δＳ）を含む熱力学的安定性の他のパラメータを測定または決定することによって評価され得る。
【００６８】  安定化抗ＣＤ２０抗体の製造
【００６９】  本発明によって提供される安定化抗ＣＤ２０抗体は、当業者に周知の技術を使用して、合成、検出、定量化および精製され得る。例えば、安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖および重鎖を構成するポリペプチドを発現する細胞は、当業者に周知の方法によって、安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖および重鎖を構成するポリペプチドの発現を駆動するために、適切な原核生物細胞または真核生物細胞へとトランスフェクトまたは形質転換させたベクターにおける強いプロモーター／翻訳開始シグナルの制御下にｃＤＮＡを配置することによって、生成され得る。
【００７０】  あるいは、安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖および重鎖を構成するポリペプチドは、当業者に周知の方法によって化学的に作製され得る。安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖および重鎖を構成するポリペプチドは、標準的な固相合成によって調製し得る。当業者に一般に公知のように、必要な長さのペプチドは、干渉基（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）をブロッキングするため、反応させるアミノ酸を保護するため、カップリングするため、脱保護のため、および未反応の残基のキャッピングのために、製造者の指示に従って市販の機器および試薬を使用して調製し得る。例えば、軽鎖および重鎖ペプチドは、ｔ−ブトキシカルボニル−アルファ−アミノ酸を使用する適切な側鎖保護を用いて、標準的な自動化固相合成プロトコールを使用して合成され得る。完成したペプチドは、標準的なフッ化水素方法を使用する同時側鎖脱保護を用いて、固相支持体から取り出される。粗製ペプチドは、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中のアセトニトリル勾配を使用して、半分取逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８）によってさらに精製する。これらのペプチドは、アセトニトリルを除去するために真空乾燥され、水中０．１％のＴＦＡ溶液から凍結乾燥される。純度は、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣによって検証され得る。これらのペプチドは、凍結乾燥され得、次いで、重量で１〜２ｍｇ／ｍＬの濃度で、水または０．０１Ｍ酢酸のいずれかに可溶化し得る。適切な機器は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡまたはＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｒａｐｈａｅｌ、ＣＡから得ることができる。
【００７１】  本発明は、安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖および重鎖を構成するポリペプチドの一方または両方をコードするポリヌクレオチド配列の発現を制御するエレメントを含む組換えベクターもまた提供する。さらに、本発明は、かかるポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供し、この細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞である。微生物および組織培養の方法は、当業者に周知である（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１年）、１６．１〜１６．５４頁を参照のこと）。本発明は従って、安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖および重鎖を構成するポリペプチドを作製する方法を提供し、この方法は以下を含む：（ａ）安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖および／または重鎖ポリペプチドをコードする核酸で細胞を形質転換するステップ；（ｂ）その形質転換した細胞によるこれらのポリペプチドの発現を誘導するステップ；（ｃ）該ポリペプチドを精製するステップ；ならびに（ｄ）機能的抗体をアセンブルするステップ。
【００７２】  ポリペプチド発現は、ＤＮＡシグナルによって次に調節されるＲＮＡ転写のレベルに依存する。同様に、ｍＲＮＡの翻訳は、そのコード配列の５’末端の１０〜１００ヌクレオチド以内に通常は位置するＡＵＧ開始コドンを最低限必要とする。ＡＵＧ開始コドンに隣接する配列は、その認識に影響を与えることが示されている。例えば、真核生物リボソームによる認識のために、完全な「Ｋｏｚａｋコンセンサス」配列に準拠して配列に埋め込まれたＡＵＧ開始コドンが、最適な翻訳を生じる（例えば、Ｋｏｚａｋ、Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  １９６巻：９４７〜９５０頁（１９８７年）を参照のこと）。また、細胞における外因性核酸の首尾良い発現は、得られるタンパク質の翻訳後修飾を必要とし得る。
【００７３】  本明細書に記載される核酸分子は、好ましくは、真核生物細胞において機能的なプロモーターなどの適切なプロモーターに作用的に連結したコード領域を含む。例えばＲＳＶプロモーターおよびアデノウイルス主要後期プロモーターであるがこれらに限定されないウイルスプロモーターが、本発明において使用され得る。適切な非ウイルスプロモーターには、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよび伸長因子１αプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。非ウイルスプロモーターは、望ましくは、宿主細胞の種から誘導される。その多くが当該技術分野で公知のさらなる適切な遺伝的エレメントもまた、さらなる機能、発現のレベルまたは発現のパターンを提供するために、本発明の核酸および構築物に結合し得るまたは本発明の核酸および構築物に挿入し得る。
【００７４】  さらに、本明細書に記載される核酸分子は、転写を促進するために、エンハンサーに作用的に連結し得る。エンハンサーは、隣接遺伝子の転写を刺激するＤＮＡのシス作用性エレメントである。多くの種由来の多数の異なる細胞型において、連結した遺伝子に対し高レベルの転写を付与するエンハンサーの例には、ＳＶ４０およびＲＳＶ−ＬＴＲ由来のエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。かかるエンハンサーは、細胞型特異的な効果を有する他のエンハンサーと組み合わされ得るか、または任意のエンハンサーが単独で使用され得る。
【００７５】  真核生物細胞におけるタンパク質産生を最適化するために、本発明の核酸分子は、この核酸分子のコード領域の後ろにポリアデニル化部位をさらに含み得る。所望の場合、上記外因性核酸もまた、インフレームの全長転写物を維持しながらｍＲＮＡ産生を促進するために、スプライス部位（即ち、スプライスアクセプター部位およびスプライスドナー部位）を組み込み得る。さらに、本発明の核酸分子は、プロセシング、分泌、細胞内局在化などに適した配列をさらに含み得る。
【００７６】  これらの核酸分子は、任意の適切なベクターへと挿入し得る。適切なベクターには、ウイルスベクターが挙げられるがこれに限定されない。適切なウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ワクシニアベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよび鶏痘ウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。これらのベクターは、好ましくは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞などの真核生物細胞を形質転換する、天然または操作された能力を有する。さらに、本発明に関して有用なベクターは、プラスミドもしくはエピソームなどの「裸の（ｎａｋｅｄ）」核酸ベクターであり得、またはこれらのベクターは、他の分子と複合体化され得る。本発明の核酸と適切に組み合わされ得る他の分子には、ウイルスコート、カチオン性脂質、リポソーム、ポリアミン、金粒子、および細胞性分子を標的とするリガンド、受容体もしくは抗体などのターゲティング部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】  本明細書に記載される核酸分子は、任意の適切な細胞、典型的には真核生物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３もしくはＢＨＫなどへと形質転換され得、望ましくは、本明細書に記載される配列番号１もしくは２またはそれらのバリアントもしくはホモログから構成されるポリペプチドなどの軽鎖または重鎖ポリペプチドの発現を生じる。この細胞は、核酸分子の発現を提供するために培養され得る。
【００７８】  従って、本発明は、本明細書に記載される本発明の核酸分子で形質転換またはトランスフェクトした細胞を提供する。細胞を外因性ＤＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトする手段は、当該技術分野で周知である。例えば、限定ではなく、ＤＮＡ分子は、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト（ｐｒｏｔｏｂｌａｓｔ）融合、エレクトロポレーション、リポソーム、カチオン性脂質および直接的マイクロインジェクションなどの当該技術分野で周知の標準的な形質転換またはトランスフェクション技術を使用して、細胞へと導入される（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１年）、１．１〜１．１６２頁、１５．１〜１５．５３頁、１６．１〜１６．５４頁を参照のこと）。
【００７９】  形質転換方法の別の例は、プロトプラスト融合方法であり、高コピー数の対象のプラスミドを保有する細菌由来のプロトプラストは、培養された哺乳動物細胞と直接混合される。細胞膜の融合（通常、ポリエチレングリコールを用いる）の後、細菌の内容物は、哺乳動物細胞の細胞質へと送達され、プラスミドＤＮＡは、核に移行される。
【００８０】  種々の哺乳動物細胞および植物細胞への短時間の高電圧電気パルスの適用であるエレクトロポレーションは、形質膜におけるナノメートルサイズの孔の形成を導く。ＤＮＡは、これらの孔を介してまたは孔の閉鎖に伴う膜構成成分の再分布の結果として、細胞の細胞質へと直接取り込まれる。エレクトロポレーションは、極めて効率的であり得、クローン遺伝子の一過性の発現のため、および対象の遺伝子の統合されたコピーを保有する細胞系の樹立のための両方に使用され得る。
【００８１】  かかる技術は、真核生物細胞の安定な形質転換および一過性の形質転換の両方のために使用され得る。安定に形質転換した細胞の単離は、対象の遺伝子を用いた形質転換と併せて、選択マーカーの導入を必要とする。かかる選択マーカーには、ネオマイシンならびにＨＰＲＴ陰性細胞におけるＨＰＲＴ遺伝子に対する抵抗性を付与する遺伝子が挙げられる。あるいは、安定な形質転換体は、ＤＨＦＲ含有ベクターを使用して、ＤＨＦＲ陰性であるＣＨＯ−ＤＧ４４などの細胞において作製され得る。選択は、少なくとも約２〜７日間、好ましくは少なくとも約１〜５週間にわたる、選択培地中での長期培養を必要とし得る（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１年）、１６．１〜１６．５４頁を参照のこと）。高い抗体産生力を有する真核生物細胞系は、抗体遺伝子を増幅可能な遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）に連結する転写的に活性な領域または系への抗体構築物の挿入に依存する発現系を使用して取得され得る。
【００８２】  安定化抗ＣＤ２０抗体ポリペプチドの軽鎖または重鎖は、組換え宿主細胞から発現および精製され得る。組換え宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌、酵母などの真菌細胞、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびカイコ由来の細胞系が挙げられるがこれらに限定されない昆虫細胞、ならびに哺乳動物の細胞および細胞系が挙げられるがこれらに限定されない、原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。
【００８３】  原核生物における最適なポリペプチド発現のために考慮すべき問題には、使用される発現系、宿主株の選択、ｍＲＮＡ安定性、コドンバイアス、インクルージョンボディの形成および防止、融合タンパク質および部位特異的タンパク質分解、区画指向性の分泌が挙げられる（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１５巻（２００５年）１１３〜１２８頁を参照のこと）。
【００８４】  発現は通常、遺伝的背景に適合する系を内に有するプラスミドから誘導される。発現プラスミドの遺伝的エレメントには、複製起点（ｏｒｉ）、抗生物質抵抗性マーカー、転写プロモーター、翻訳開始領域（ＴＩＲ）ならびに転写および翻訳ターミネーターが挙げられる。
【００８５】  任意の適切な発現系が使用され得、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、その相対的な単純さ、高密度培養、周知の遺伝学、ならびにポリペプチド発現のために利用可能な種々の利用可能なプラスミド、組換え融合パートナーおよび変異株を含む多数の適合するツールにより、タンパク質発現を促進する。組換え発現のためのＥ．ｃｏｌｉ株または遺伝的背景は非常に重要である。発現株は、最も有害な天然プロテアーゼが欠損し、発現プラスミドを安定に維持し、発現系にとって適切な遺伝的エレメントを付与するべきである（例えば、ＤＥ３）。
【００８６】  プラスミドコピー数は、好ましくは緩慢な様式で複製する複製起点によって制御される。現代の発現プラスミドに存在するＣｏｌＥ１レプリコンは、ｐＢＲ３２２（コピー数１５〜２０）またはｐＵＣ（コピー数５００〜７００）ファミリーのプラスミドから誘導されるが、ｐ１５Ａレプリコンは、ｐＡＣＹＣ１８４（コピー数１０〜１２）から誘導される。組換え発現プラスミドにおける最も一般的な薬物抵抗性マーカーは、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリンに対する抵抗性を付与する。
【００８７】  適切なＥ．ｃｏｌｉ発現系には、一般的なｐＵＣベクター、Ｔ７ベースのｐＥＴ発現系（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）、ラムダＰＬプロモーター／ｃＩリプレッサー（例えば、ｐＬＥＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ））、Ｔｒｃプロモーター（例えば、ｐＴｒｃ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ））、Ｔａｃプロモーター（例えば、ｐＧＥＸ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ））およびハイブリッドｌａｃ／Ｔ５（例えば、ｐＱＥ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ））およびＢＡＤプロモーター（例えば、ｐＢＡＤ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】  転写されたメッセンジャーＲＮＡの翻訳開始領域（ＴＩＲ）からの翻訳開始は、シャイン−ダルガーノ（ＳＤ）配列および翻訳開始コドンを含むリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を必要とする。上記シャイン−ダルガーノ配列は、効率的な組換え発現系における標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ＡＵＧである開始コドンの７±２ヌクレオチド上流に位置する。最適な翻訳開始は、ＳＤ配列ＵＡＡＧＧＡＧＧを有するｍＲＮＡから取得される。
【００８９】  Ｅ．ｃｏｌｉにおけるコドン使用頻度は、その細胞質において利用可能な同種のアミノ−アシル化ｔＲＮＡのレベルによって反映される。メジャーコドンは、高度に発現する遺伝子に存在するが、マイナーまたは稀なコドンは、低レベルで発現する遺伝子に存在する傾向がある。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて稀なコドンは、真核生物、古細菌および異なるコドン頻度の優先傾向を有する他の遠縁の生物などの供給源由来の異種遺伝子に、豊富であることが多い。稀なコドンを含む遺伝子の発現は、マイナーコドンｔＲＮＡにカップリングしたアミノ酸の組込みを必要とする位置での、リボソーム停止の結果として、翻訳エラーを導き得る。コドンバイアス問題は、ダブレットおよびトリプレットなどのクラスターにおける稀なコドンを含む転写物が大量に蓄積する場合、組換え発現系において高度に優勢となる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏであれｉｎ  ｖｉｖｏであれ、非ヒト細胞において安定化抗ＣＤ２０抗体ポリペプチドの軽鎖または重鎖を発現させる場合、該ペプチドをコードするかかるポリヌクレオチドについて選択されるコドンは、所与の細胞型（即ち、種）について最適化され得る。コドン最適化のための多数の技術は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｊａｙａｒａｊら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３３巻（９号）：３０１１〜６頁（２００５年）；Ｆｕｇｌｓａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  ３１巻（２号）：２４７〜９頁（２００３年）を参照のこと）。
【００９０】  タンパク質の活性は、正確な３次元構造への折り畳みを要求する。ヒートショックなどのストレス状況は、ｉｎ  ｖｉｖｏで折り畳みを損ない、折り畳み中間体は、インクルージョンボディと称される無定形なタンパク質顆粒へと会合する傾向がある。
【００９１】  インクルージョンボディは、組換えタンパク質が高い率で発現する場合に、ストレス応答として生じることがしばしば理解される、一群の構造的に複雑な凝集体である。Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質中２００〜３００ｍｇ／ｍｌの濃度でのタンパク質の巨大分子密集は、特に組換え体の高レベル発現の間の、高度に望ましくないタンパク質折り畳み環境を示唆する。高次構造がほぐされた鎖上の露出したパッチ間の疎水性相互作用によってまたは特異的クラスタリング機構によって生じる受動的事象を介してインクルージョンボディが形成するかどうかは、未知である。精製された凝集体は、尿素および塩酸グアニジン（ｇｕａｄｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）などの洗剤を使用して、可溶化し得る。機能的タンパク質は、希釈、透析またはオンカラム再折り畳み方法のいずれかによって、可溶化したインクルージョンボディから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの再折り畳みによって調製し得る。再折り畳み戦略は、分子シャペロンの含有（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）によって改善され得る。しかし、所与のタンパク質に対する再折り畳み手順の最適化は、時間のかかる努力を必要とし、高い産物収量にいつも貢献するわけではない。インクルージョンボディ形成の防止のための可能な戦略は、分子シャペロンの共過剰発現である。
【００９２】  広範なタンパク質融合パートナーが、組換えタンパク質の精製および発現を単純化するために開発されてきた。融合タンパク質またはキメラタンパク質は通常、特異的プロテアーゼの認識部位によってパッセンジャーまたは標的タンパク質に連結したパートナーまたは「タグ」を含む。ほとんどの融合パートナーが、特異的親和性精製戦略のために利用される。融合パートナーは、細胞内タンパク質分解からパッセンジャーを保護し得、溶解性を増強し得、または特異的発現レポーターとして使用され得る場合にもまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで有利である。高い発現レベルは、ほとんどおそらくはｍＲＮＡ安定化の結果として、Ｎ末端融合パートナーから貧弱に発現するパッセンジャーへとしばしば移され得る。一般的な親和性タグは、固定化した金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）と適合するポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）およびグルタチオンベースの樹脂での精製のためのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグである。いくつかの他の親和性タグが存在し、広範に調べられている。
【００９３】  組換え発現したタンパク質は原則として、３つの異なる位置、即ち、細胞質、ペリプラズムまたは培養培地へと向けられ得る。種々の利点および欠点は、特定の細胞区画への組換えタンパク質の指向（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）に関連する。産生収量が高いので、細胞質における発現が通常好ましい。ジスルフィド結合の形成は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて隔離されており、Ｄｓｂ系によってペリプラズム中で活発に触媒される。あるいは、ｔｒｘＢ株およびｇｏｒ株が使用され得る。その細胞質におけるシステインの還元は、チオレドキシンおよびグルタレドキシンによって達成される。チオレドキシンは、チオレドキシンレダクターゼによって還元されたままに維持され、グルタレドキシンは、グルタチオンによって還元されたままに維持される。低分子量グルタチオン分子は、グルタチオンレダクターゼによって還元される。２つのレダクターゼをコードするｔｒｘＢ遺伝子およびｇｏｒ遺伝子の破壊は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質におけるジスルフィド結合の形成を可能にする。
【００９４】  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遺伝子発現およびタンパク質合成のための無細胞系が、多数の異なる原核生物および真核生物の系について記載されている（例えば、ＥｎｄｏおよびＳａｗａｓａｋｉ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００６年、１７巻：３７３〜３８０頁を参照のこと）。ウサギ網状赤血球ライセートおよびコムギ胚芽抽出物などの真核生物無細胞系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ鋳型の翻訳に必要とされる全ての構成成分を含む粗製抽出物から調製しる。真核生物無細胞系は、翻訳反応のための鋳型としてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成された単離されたＲＮＡを使用する（例えば、ウサギ網状赤血球ライセート系またはコムギ胚芽抽出物系）。カップリングした真核生物無細胞系は、原核生物ファージＲＮＡポリメラーゼを真核生物抽出物と組み合わせ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質合成のためにファージプロモーターと共に外因性ＤＮＡまたはＰＣＲ生成した鋳型を利用する（例えば、ＴＮＴ（登録商標）Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ
【００９５】  安定化抗ＣＤ２０抗体ポリペプチドの精製された軽鎖または重鎖の溶解性は、当該技術分野で公知の方法によって改善され得る。例えば、発現したタンパク質（例えばＥ．ｃｏｌｉ中で）の溶解性を増加させるために、ＧｅｏｒｇｉｏｕおよびＶａｌａｘ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７巻：１９０〜１９７頁（１９９６年）に記載されるように、増殖温度を低下させ、より弱いプロモーターを使用し、より低いコピー数のプラスミドを使用し、誘導因子濃度を低下させ、増殖培地を変えることによって、タンパク質合成の速度を低減させることができる。これは、タンパク質合成の速度を減少させ、通常はより可溶性のタンパク質が取得される。適切な折り畳みもしくはタンパク質安定性に重要な補欠分子族（ｐｒｏｓｔｅｔｈｉｃ  ｇｒｏｕｐ）もしくは補因子を添加すること、または増殖の間の培地のｐＨのゆらぎを制御するためのバッファを添加すること、または最もリッチな培地（例えば、ＬＢ、２×ＹＴ）中に存在するラクトースによるｌａｃプロモーターの誘導を抑制するために、１％グルコースを添加することもできる。ポリオール（例えば、ソルビトール）およびスクロースは、これらの添加によって引き起こされる浸透圧の増加が、ネイティブのタンパク質構造を安定化する浸透圧保護剤の、細胞における蓄積を導くので、これらもまた培地に添加され得る。エタノール、低分子量チオールおよびジスルフィドならびにＮａＣｌが添加され得る。さらに、シャペロンおよび／またはフォルダーゼ（ｆｏｌｄａｓｅ）は、所望のポリペプチドと共に共発現され得る。分子シャペロンは、折り畳み中間体と一過性に相互作用することによって、適切な異性化および細胞ターゲティングを促進する。Ｅ．ｃｏｌｉシャペロン系には、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＧｒｏＥＳ−ＧｒｏＥＬ、ＤｎａＫ−ＤｎａＪ−ＧｒｐＥ、ＣＩｐＢ、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ。ペリプラズムペプチジル−プロリルシス，トランス−イソメラーゼＦｋｐＡが特に適切である。
【００９６】  フォルダーゼは、折り畳み経路に沿った律速ステップを加速させる。３つの型のフォルダーゼが重要な役割を果たす：ペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼ（ＰＰＩ）（ＦｋｐＡ）、ジスルフィドオキシドレダクターゼ（ＤｓｂＡ）およびジスルフィドイソメラーゼ（ＤｓｂＣ）、タンパク質システイン酸化およびジスルフィド結合異性化の両方を触媒する真核生物タンパク質であるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）。これらのタンパク質のうち１つまたは複数と標的タンパク質との共発現は、より高いレベルの可溶性標的タンパク質を導き得る。
【００９７】  安定化抗ＣＤ２０抗体ポリペプチドの軽鎖または重鎖は、その溶解性および産生を改善するために、融合タンパク質として産生され得る。この融合タンパク質は、安定化抗ＣＤ２０抗体ポリペプチドの軽鎖または重鎖と、インフレームで一緒に融合した第２のポリペプチドとを含む。この第２のポリペプチドは、融合するポリペプチドの溶解性を改善するための、当該技術分野で公知の融合パートナー、例えば、ＮｕｓＡ、バクテリオフェリチン（ＢＦＲ）、ＧｒｐＥ、チオレドキシン（ＴＲＸ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）であり得る。Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）は、ＮｕｓＡ−標的融合物の形成を可能にするｐＥＴ  ４３．１ベクターシリーズを提供する。ＤｓｂＡおよびＤｓｂＣもまた、融合パートナーとして使用される場合、発現レベルに対する正の効果を示しており、従って、より高い溶解性を達成するためにペプチドリガンドドメインと融合するために使用され得る。
【００９８】  かかる融合タンパク質の一態様では、安定化抗ＣＤ２０抗体ポリペプチドの発現した軽鎖または重鎖は、プロテアーゼによって加水分解可能なペプチド結合を含むプロテアーゼ切断部位を含むリンカーポリペプチドを含む。結果として、ポリペプチドにおけるペプチドリガンドドメインは、タンパク質分解によって発現後に該ポリペプチドの残部から分離され得る。このリンカーは、上記プロテアーゼの触媒部位もまた結合する上記結合のいずれかの側に１つまたは複数の追加のアミノ酸を含み得る（例えば、ＳｃｈｅｃｔｅｒおよびＢｅｒｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２７巻、１５７〜６２頁（１９６７年）を参照のこと）。あるいは、上記リンカーの切断部位は、上記プロテアーゼの認識部位とは別々であり得、その２つの切断部位および認識部位が、１つまたは複数（例えば２つ〜４つ）のアミノ酸によって分離され得る。一態様では、このリンカーは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０またはそれより多くのアミノ酸を含む。より好ましくは、このリンカーは、約５〜約２５アミノ酸長であり、最も好ましくは、このリンカーは、約８〜約１５アミノ酸長である。
【００９９】  例えば、細菌で産生した融合タンパク質と共に一般に使用される適切なプロテアーゼには、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、第Ｘａ因子プロテアーゼ、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。本発明で有用ないくつかのプロテアーゼは、以下の参考文献において議論されている：Ｈｏｏｐｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３２１巻：２６５〜２７９頁（１９９７年）；Ｗｅｒｂ、Ｃｅｌｌ  ９１巻：４３９〜４４２頁（１９９７年）；Ｗｏｌｆｓｂｅｒｇら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １３１巻：２７５〜２７８頁（１９９５年）；ＭｕｒａｋａｍｉおよびＥｔｌｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  １４６巻：１２４９〜１２５９頁（１９８７年）。細胞表面プロテアーゼもまた、本発明に従って切断可能なリンカーと共に使用され得、これには以下が挙げられるがこれらに限定されない：アミノペプチダーゼＮ；ピューロマイシン感受性アミノペプチダーゼ；アンギオテンシン変換酵素；ピログルタミルペプチダーゼＩＩ；ジペプチジルペプチダーゼＩＶ；Ｎ−アルギニン二塩基性転換酵素；エンドペプチダーゼ２４．１５；エンドペプチダーゼ２４．１６；アミロイド前駆体タンパク質セクレターゼアルファ、ベータおよびガンマ；アンギオテンシン変換酵素セクレターゼ；ＴＧＦアルファセクレターゼ；ＴＮＦアルファセクレターゼ；ＦＡＳリガンドセクレターゼ；ＴＮＦ受容体−Ｉおよび−ＩＩセクレターゼ；ＣＤ３０セクレターゼ；ＫＬ１およびＫＬ２セクレターゼ；ＩＬ６受容体セクレターゼ；ＣＤ４３、ＣＤ４４セクレターゼ；ＣＤ１６−ＩおよびＣＤ１６−ＩＩセクレターゼ；Ｌ−セレクチンセクレターゼ；葉酸受容体セクレターゼ；ＭＭＰ１、２、３、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５；ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子；組織プラスミノーゲン活性化因子；プラスミン；トロンビン；ＢＭＰ−１（プロコラーゲンＣ−ペプチダーゼ）；ＡＤＡＭ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１；ならびにグランザイムＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ。
【０１００】  細胞会合型プロテアーゼに依存することの代替法は、自己切断型リンカーを使用することである。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａプロテアーゼがリンカーとして使用され得る。これは、２Ａ／２Ｂ接合部においてＦＭＤＶのポリタンパク質を切断する、１７アミノ酸の短いポリペプチドである。ＦＭＤＶ  ２Ａプロペプチドの配列は、ＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰである。切断は、最後のグリシン−プロリンアミノ酸対においてそのペプチドのＣ末端において生じ、他のＦＭＤＶ配列の存在とは独立しており、異種配列の存在下でさえ切断する。
【０１０１】  アフィニティクロマトグラフィーは、安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖および重鎖を構成するポリペプチドの精製において、単独で、またはイオン交換、分子サイジングもしくはＨＰＬＣクロマトグラフィー技術と併せて使用され得る。かかるクロマトグラフィーによるアプローチは、カラムまたはバッチ形式を使用して実施され得る。かかるクロマトグラフィーによる精製方法は、当該技術分野で周知である。
【０１０２】  抗ＣＤ２０抗体の大規模産生
【０１０３】  生物学的産物の２つの主要な型の組換え発現が存在し、一方は、チャイニーズハムスター卵巣細胞の使用において最も頻繁に見られる、該細胞によって栄養培地へと分泌される生物学的産物の可溶性形態であり、もう一方は、発現のためにＥ．ｃｏｌｉを使用する場合に最も頻繁に見られる、インクルージョンボディを形成する細胞の内側での生物学的産物の保持である。遺伝子操作における最近の進歩は、インクルージョンボディとしてその内側で保持される代わりに、可溶性タンパク質を分泌する細菌の遺伝子をコードすることが可能になっている。これは、細胞溶解およびインクルージョンボディ可溶化の厄介なプロセスを回避するためである。
【０１０４】  任意の適切な方法が、抗ＣＤ２０抗体を大規模で産生するために使用され得る。例えば、種々の容器（ｖｅｓｓｅｌ）および方法が、商業的規模で微生物、特に細菌および酵母の発酵を実施するために、数年にわたって開発されてきた。数十万リットルのステンレス鋼の発酵容器は一般的であり、その発酵方法には、回分、流加、連続または半連続灌流が挙げられる。これらの容器内の細胞は望ましくは、典型的には、該容器中への空気、酸素または二酸化炭素の注入によってガス交換を促進し、容器内に位置する撹拌ブレードを回転させることによって、懸濁物で維持される。
【０１０５】  さらに、使い捨て発酵槽もまた当業者に公知である。かかる使い捨て発酵槽の例は、波振とう（ｗａｖｅ  ａｇｉｔａｔｉｏｎ）に基づく系である（例えば、米国特許第６，５４４，７８８号；ＰＣＴ公開ＷＯ００／６６７０６を参照のこと）。この型の発酵槽は、単一の使い捨て容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）中で、比較的感受性の細胞、例えば、ＣＨＯ細胞（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｊ．  ３巻：５１〜５６頁（２００４年））、ハイブリドーマ細胞（例えば、Ｌｉｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｐｒｏｇ．、１９巻：１５８〜１６２頁（２００３年））、昆虫細胞（例えば、Ｗｅｂｅｒら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈ．  ３８巻：７７〜８５頁（２００２年））および足場依存性細胞（例えば、Ｓｉｎｇｈ、Ｃｙｔｏｔｅｃｈ．  ３０巻：１４９〜１５８頁（１９９９年））を培養するために使用され得る。かかる使い捨てユニットは、比較的安価であり、その単回の使用に起因して感染のリスクを減少させ、これらの容器が使用の間に存在するロッキングプラットフォームは、内部液体においてガス交換を促進する波様の形態を誘導するので、内部撹拌部品を必要としない。
【０１０６】  一態様では、別の適切な方法は、種々の生物学的産物を調製するのに使用するためのバイオリアクターを提供する（例えば、米国特許出願公開第２０１１０１１７５３８号を参照のこと）。このバイオリアクターは、栄養培地および生物学的培養物を含む所定の体積の液体を収容するために適切であり、以下：（ａ）少なくとも１つの内壁を有する容器；（ｂ）少なくとも１つの入口；（ｃ）少なくとも１つの出口；（ｄ）少なくとも１つのガス入口；（ｅ）少なくとも１つのガス出口；および（ｆ）少なくとも１つのガス入口に取り付けられた少なくとも１つの円筒形スパージングフィルター、を含み、このスパージングフィルターは、ガスが該スパージングフィルターから液体へと放射状に放出されるようにする、その軸に沿って複数の孔を含み、この複数の孔の直径は、約５０μｍを超えず、該容器内の少なくとも１つのスパージングフィルターの配向は、該液体内での複数の孔の浸漬を提供し、該液体を通じた放出ガスの実質的に均質な分散を提供する。
【０１０７】  米国特許出願公開第２０１１０１１７５３８号に開示されているかかるバイオリアクター系の関連の態様は、栄養培地および生物学的培養物を含む所定の体積の液体から生物学的産物を産生する方法を提供し、この方法は、（ａ）バイオリアクターを提供するステップ；（ｂ）栄養培地および生物学的培養物をその容器へと導入するステップ；（ｃ）スパージングフィルターを介して液体へとガスを通過させるステップ；（ｄ）所定の時間間隔で該液体中の細胞の密度を検出するステップ；ならびに（ｅ）該容器内の液体中の細胞の密度が所定の値に達した場合に、該液体およびそれにより産生された任意の生物学的産物を該容器から取り出すステップ、を含む。
【０１０８】  別の適切な方法は、米国特許出願公開第２０１１０１９８２８６号に開示されているものなどのバイオリアクターを提供する。この系は、生物学的産物を大量に結合することが可能な多くの樹脂の最近の利用可能性から利益を得る。ほとんどの現代の樹脂は、樹脂１ｍＬ当たり２０〜１２５ｍｇの間の生物学的産物を結合する。これらの樹脂の多くは、生物学的産物に対して高度に特異的であり、それらの多くは、組み合わせることにより、培養培地をバイオリアクターから取り出す一方で、樹脂に結合した生物学的産物を保持するのに十分に強い物理化学的結合の単純なプロセスによって、溶液から任意の型および量の生物学的産物を取り出すことができる。生物学的産物精製の分野はここで、樹脂と該生物学的産物との間の結合を破壊する溶出緩衝液のｐＨ、イオン強度または他の特徴を調整することによって、これらの結合した生物学的産物を該樹脂から溶出させる能力を有する。これは、さらなる精製の準備ができた、そして、ある場合には使用のための最終産物でさえあり得る、高度に濃縮された溶液としてのバイオリアクターからの生物学的産物の取り出しを可能にする。
【０１０９】  カップリングした抗ＣＤ２０抗体組成物
【０１１０】  本発明は、本明細書に開示される本発明の抗ＣＤ２０抗体を含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、この組成物は、抗ＣＤ２０抗体および薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的に許容される組成物である。
【０１１１】  抗体は、いくつかのエフェクター機構を介してがん性細胞を除去するように作用し得る。完全ヒトまたはキメラである抗体について、この分子のＦｃ部分は、ヒト免疫系を効率的に活性化し得、ヒト免疫系と相互作用し得る。この方法によって、細胞は、免疫系の可溶性構成成分（補体）によってまたはＡＤＣＣ媒介性の細胞死滅化を介して、破壊され得る。さらに、標的抗原への上記抗体の結合は、アポトーシスを導き得る生物学的応答を開始させ得る。さらに、抗体分子は、薬物、放射性同位体、毒素または酵素などの治療的部分を輸送するための送達ビヒクルとして使用され得る。
【０１１２】  本発明の組成物は、活性薬剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、この活性薬剤は、その薬理学的効果を直接発揮することができる薬学的に活性な治療剤または「エフェクター」である。他の実施形態では、この活性薬剤は診断剤である。いくつかの活性薬剤は、診断剤および治療剤の両方として有用であり、従って、かかる用語は相互に排他的ではないことが理解される。好ましい実施形態では、この活性薬剤は、抗ＣＤ２０抗体にコンジュゲートまたはカップリングした診断的または治療的活性薬剤である。
【０１１３】  抗体またはその断片への適切な治療薬、化学療法薬、放射性核種などのカップリングまたはコンジュゲーションのための方法は、当該技術分野で十分に記載されている。例えば、限定ではなく、リシンのイプシロン−アミノ基などの、タンパク質中の遊離アミノ基は、カルボジイミド（ｃａｒｏｄｉｉｍｉｄｅ）またはヘテロ二官能性剤（ｈｅｔｅｒｏｂｉｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｇｅｎｔ）などの試薬とコンジュゲートされ得る。あるいは、例えば、スルフヒドリル基が、コンジュゲーションに使用され得る。さらに、抗体を含む糖タンパク質に結合した糖部分は、当該技術分野で公知の多数のカップリング手順において有用なアルデヒド基を形成するために酸化され得る。本発明に従って形成されるコンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定であり得る、または酵素的に分解可能なテトラペプチド結合または酸不安定性シス−アコニチルもしくはヒドラゾン結合などのように不安定であり得る。さらに、本発明は、抗ＣＤ２０抗体融合タンパク質を提供し、これには、例えば、重鎖もしくは軽鎖コード配列（またはそれらのコード断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ’およびＦａｂ’２断片）が、診断的に有用なタンパク質ドメイン（例えば、ハプテン、ＧＦＰ）、免疫学的に活性なタンパク質ドメイン（例えば、ＴＦまたはＴＮＦ）または毒素ドメインの上流または下流と融合したものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】  本発明の組成物は、上記活性薬剤単独の送達と比較して、疾患部位への該活性薬剤の送達を増強するために使用され得る。好ましい実施形態では、上記抗ＣＤ２０抗体へのカップリングは、カップリングしていない活性薬剤によって上記疾患部位において達成されるレベルと比較して、少なくとも１０％、少なくとも（ａｔ  ｌｅａｓａｔ）２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、その疾患部位において該活性薬剤のレベルを増加させる。
【０１１５】  本明細書で使用する場合、語句「間接的標識化」および「間接的標識化アプローチ」は共に、キレート剤が抗体に共有結合的に結合し、少なくとも１つの放射性核種が該キレート剤へと挿入されることを意味する。適切なキレート剤および放射性核種は、参照によって本明細書に組み込まれるＳｒｉｖａｇｔａｖａ，  Ｓ．  Ｃ．およびＭｅａｓｅ，  Ｒ．  Ｃ．、「Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｌｉｇａｎｄｓ，  Ｎｕｃｌｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏ．  １８巻／６号：５８９〜６０３頁（１９９１年）に記載されている。特に好ましいキレート剤は、１−イソチオシクマトベンジル−３−メチルジオテレントリアミン五酢酸（１−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｃｍａｔｏｂｅｎｚｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｄｉｏｔｈｅｌｅｎｅ  ｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（「ＭＸ−ＤＴＰＡ」）である；間接的標識化に特に好ましい放射性核種には、インジウム−１１１およびイットリウム−９０が挙げられる。本明細書で使用する場合、語句「直接的標識化」および「直接的標識化アプローチ」は共に、放射性核種が（典型的にはアミノ酸残基を介して）抗体に直接共有結合的に結合していることを意味する。適切な放射性核種は、Ｓｒｉｖａｇｔａｖａ；または引用において提供され、直接的標識化に特に好ましい放射性核種は、チロシン残基を介して共有結合的に結合するヨウ素−１３１である。この間接的標識化アプローチが特に好ましい。
【０１１６】  上記抗ＣＤ２０抗体へのカップリングのために使用される薬剤は、化学療法剤または抗がん剤などの、任意の適切な治療剤（または「エフェクター」）または診断剤であり得る。適切な診断剤には、蛍光色素、放射性薬剤、ＭＲＩ造影剤、Ｘ線造影剤、超音波造影剤およびＰＥＴ造影剤が挙げられる。本発明に従って使用するための適切な化学療法剤または他の抗がん剤には、チロシンキナーゼインヒビター（ゲニステイン）、生物学的に活性な薬剤（ＴＮＦ、ｔＴＦ）、放射性核種（１３１Ｉ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、２１１Ａｔ、３２Ｐおよび他の公知の治療的放射性核種）、アドリアマイシン、アンサマイシン抗生物質、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブシル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトテシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エポチロン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メルファラン（ｍｅｐｌｈａｌａｎ）、メトトレキサート、ラパマイシン（シロリムス）および誘導体、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、コンブレタスタチン、ディスコデルモリドならびにトランスプラチナが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１７】  本発明に従って使用するための他の適切な化学療法剤には、代謝拮抗剤（例えば、アスパラギナーゼ）、有糸分裂阻害剤（例えば、ビンカアルカロイド）、ＤＮＡ損傷剤（例えば、シスプラチン）、アポトーシス促進剤（ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃｓ）（プログラム細胞死またはアポトーシスを誘導する薬剤）（例えば、エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｏｔｏｘｉｎ））、分化誘導剤（例えば、レチノイド）、抗生物質（例えば、ブレオマイシン）およびホルモン（例えば、タモキシフェン、ジエチルスチルベストロール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｂｅｓｔｒｏｌ））が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、本発明に従って使用するために適した化学療法剤には、例えば、ＩＦＮ−アルファ、フマギリン、アンジオスタチン、エンドスタチン、サリドマイドなどの抗新脈管形成剤（新脈管形成インヒビター）、などが挙げられる。
【０１１８】  さらに、薬学的に活性な薬剤は、ｓｉＲＮＡであり得る。好ましい実施形態では、このｓｉＲＮＡ分子は、例えば、ｃ−Ｓｉｓおよび他の増殖因子、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、他の受容体チロシンキナーゼ、Ｓｒｃ−ファミリー遺伝子、Ｓｙｋ−ＺＡＰ−７０ファミリー遺伝子、ＢＴＫファミリー遺伝子、他の細胞質チロシンキナーゼ、Ｒａｆキナーゼ、サイクリン依存的キナーゼ、他の細胞質セリン／スレオニンキナーゼ、Ｒａｓタンパク質および他の調節性ＧＴＰａｓｅなどの、腫瘍に関連する遺伝子の発現を阻害する。
【０１１９】  抗ＣＤ２０抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にもコンジュゲートされ得る。ＰＥＧコンジュゲーションは、タンパク質の循環半減期を増加させ得、該タンパク質の免疫原性および抗原性を低減させ得、その生体活性を改善し得る。例えば、メトキシ−ＰＥＧを、ＣＤ２０結合性抗体の利用可能なアミノ基または例えばヒスチジンもしくはシステインなどの他の反応性部位と反応させることが挙げられるがこれらに限定されない、コンジュゲーションの任意の適切な方法が使用され得る。さらに、組換えＤＮＡアプローチが、ＰＥＧ反応性基を有するアミノ酸を本発明のＣＤ２０結合性抗体に付加するために使用され得る。ＰＥＧは、ＣＤ２０結合性抗体と反応させる前に処理され得、例えば、リンカー基が該ＰＥＧに付加され得る。さらに、例えばＣＤ２０結合性抗体のＰＥＧ化などの、放出可能なハイブリッドＰＥＧ化戦略が、本発明に従って使用され得、その結果、該ＣＤ２０結合性抗体における特定の部位に付加されたＰＥＧ分子がｉｎ  ｖｉｖｏで放出される。かかるＰＥＧコンジュゲーション方法は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．  ５５巻：２１７〜２５０頁（２００３年）を参照のこと）。
【０１２０】  抗ＣＤ２０抗体製剤
【０１２１】  本発明の組成物は一般に、薬学的に許容されるキャリアなどのキャリアを有する製剤で提供される。典型的には、このキャリアは液体であるが、固体、または液体構成成分と固体構成成分との組合せでもあり得る。このキャリアは望ましくは、生理学的に許容される（例えば、薬学的または薬理学的に許容される）キャリア（例えば、賦形剤または希釈剤）である。適切な薬学的賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤およびｐＨ調整剤が挙げられる。適切な添加剤には、生理学的に生体適合性の緩衝剤、キレート剤もしくはカルシウムキレート錯体の添加、または必要に応じて、カルシウム塩もしくはナトリウム塩の添加が挙げられる。医薬組成物は、液体形態での使用のために包装され得、または凍結乾燥され得る。好ましい生理学的に許容されるキャリア媒体は、水、緩衝化水、ノーマルセーライン（ｎｏｒｍａｌ  ｓａｌｉｎｅ）、０．４％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などである。生理学的に許容されるキャリアは周知であり、容易に入手可能である。キャリアの選択は、標的組織および／または細胞の位置、ならびに上記組成物を投与するために使用される特定の方法によって、少なくとも一部決定される。
【０１２２】  上記組成物は、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、皮下の、経粘膜（例えば、肺を含む）を含む経路による投与のために製剤化され得る。この組成物は、例えば希釈剤、アジュバント、賦形剤、保存剤およびｐＨ調整剤などの追加の構成成分もまた含み得る。
【０１２３】  注射可能な投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤およびこの製剤を意図したレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水性および非水性の等張無菌注射液剤、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）および保存剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁剤が挙げられる。これらの製剤は、アンプルおよびバイアルなどの、単位用量または複数回用量の密封容器で提示され得、使用の直前に注射のために水などの無菌液体キャリアの添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即時注射液剤および懸濁剤は、無菌の粉末、顆粒または錠剤から調製し得る。
【０１２４】  無菌注射用液剤は、必要とされるとおり、上に列挙した成分のうち１つまたはそれらの組合せと共に、適切な溶媒中に必要な量で活性化合物を取り込み、その後濾過滅菌することによって調製し得る。好ましくは、注射のための溶液は、内毒素を含まない。一般に、分散物は、基礎分散媒および上に列挙した成分のうち必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに活性化合物を取り込むことによって調製し得る。無菌注射用液剤の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、以前に無菌濾過されたその溶液から、活性成分＋任意の追加の所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥およびフリーズドライである。全ての場合において、この製剤は無菌でなければならず、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性でなければならない。この製剤は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製し得る。分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中で、ならびに油中でもまた調製し得る。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。
【０１２５】  好ましい実施形態では、これらの活性成分は、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製したマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に、封入され得る。適切な技術は、Ｒｅｚｌｅｒら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２９巻（１６号）：４９６１〜７２頁（２００７年）；Ｓａｍａｄら、Ｃｕｒｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  ４巻（４号）：２９７〜３０５頁（２００７年）；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および米国特許第４，５４４，５４５号に開示されている。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１２６】  特に有用なリポソームは、例えば、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成され得る。
【０１２７】  上記医薬組成物は、薬物送達系を使用して送達し得る。かかる送達系には、ヒアルロン酸溶液またはコラーゲン断片の懸濁物が挙げられる。これらの薬物は、制御放出に適したポリマー性材料、例えばポリ乳酸、エチルヒドロキシセルロース、ポリカプロラクトン、ポリカプロラクトンジオール、ポリリシン、ポリグリコール酸、ポリマレイン酸、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミド］などを用いて設計されたマイクロカプセル中に製剤化され得る。薬物送達系を使用する特定の製剤は、液体懸濁物、軟膏、包帯への複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｏ  ａ  ｂａｎｄａｇｅ）、コラーゲンシールドなどの形態であり得る。
【０１２８】  上記組成物は、特に組成物および／またはその最終用途の安定性を増強するために、任意の他の適切な構成成分をさらに含み得る。従って、本発明の組成物の種々様々な適切な製剤が存在する。
【０１２９】  本発明によって提供される組成物は、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの活性薬剤の濃度で、例えば、ＣＤ２０結合性抗体にカップリングした該活性薬剤を含む水性液体または有機液体を約０．５ｍＬ〜約４ｍＬ含み得る。
【０１３０】  抗ＣＤ２０抗体を用いる処置および診断の方法
【０１３１】  本発明は、抗ＣＤ２０抗体を含む診断有効量または治療有効量の組成物を投与することによって、動物において疾患を診断または処置するための方法を提供する。特に、本発明は、患者において疾患を処置する方法であって、治療有効量の抗ＣＤ２０抗体を動物に投与するステップを含む、方法を提供する。
【０１３２】  免疫学的に活性なキメラ抗ＣＤ２０抗体の好ましい有効投薬量（即ち、治療有効量）は、約０．００１〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、なおより好ましくは約０．４〜約２０．０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。あるいは、上記好ましい有効投薬量は、約２５０ｍｇ／ｍ２〜約５００ｍｇ／ｍ２、より好ましくは約３７５ｍｇ／ｍ２と記載され得る。
【０１３３】  しかし、他の投薬量が実行可能である；投薬量に影響を与える因子には、疾患の重症度；以前の処置アプローチ；患者の全体的健康；他の疾患の存在などが挙げられるがこれらに限定されない。当業者は、特定の患者を評価し、上記範囲内に入るまたは必要な場合該範囲の外側の適切な投薬量を決定することが容易に可能である。
【０１３４】  従って、抗ＣＤ２０抗体の任意の適切な投薬量レベルが本発明に従って使用され得、例えば、投与１回当たり約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重のオーダーの投薬量レベルが、疾患の処置において有用である。適切な投薬量に関して、抗体は、体重１ｋｇ当たり約７５ｍｇ未満、または体重１ｋｇ当たり約７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１もしくは０．０００５ｍｇ未満、および体重１ｋｇ当たり２００ｎｍｏｌ未満の抗体、または体重１ｋｇ当たり１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ｎｍｏｌ未満の抗体、の単位用量で投与され得る。単位用量は、例えば、注射（例えば、静脈内もしくは筋肉内、髄腔内で、または器官内に直接）、吸入、または局所適用によって、投与され得る。
【０１３５】  同様に、本発明は、１種または複数の抗がん剤および抗ＣＤ２０抗体を用いて動物において腫瘍を処置する方法をさらに提供し、この方法は以下のステップを含む：該動物から生物学的試料（検体）を単離するステップ、該生物学的試料中のＣＤ２０タンパク質もしくはＲＮＡの発現を検出するステップ、または該生物学的試料中のＣＤ２０タンパク質もしくはＲＮＡの量を定量化するステップ、ならびに該生物学的試料中のＣＤ２０タンパク質もしくはＲＮＡが閾値レベルを上回って存在する場合には、治療有効量の該抗がん剤および治療有効量の該抗ＣＤ２０抗体を投与するステップ。
【０１３６】  試料に存在するＣＤ２０タンパク質のレベルは、典型的には、ブロットまたはＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗ＣＤ２０抗体を使用して検出される。しかし、いくつかの実施形態では、ＣＤ２０タンパク質の発現は、抗体の一部のみを使用して、抗体ではないＣＤ２０結合性分子を使用して、または抗体もＣＤ２０結合性分子も必要としないＣＤ２０発現を検出するいくつかの他の方法、例えば、質量分析法を使用して、決定され得る。ＣＤ２０のＲＮＡレベルは、例えば、ノザンブロット、スロットブロット、マイクロアレイ分析、定量的ＰＣＲ、定量的ＴＭＡおよび定量的インベーダーを含む任意の適切な方法によって取得され得る。
【０１３７】  本発明はまた、適切な中和抗ＣＤ２０抗体を使用するＣＤ２０活性の阻害のための方法を提供する。かかる中和抗体は、例えば、抗ＣＤ２０と可溶性もしくは細胞表面リガンドとの相互作用を遮断する能力、またはシグナル伝達に必要とされるＣＤ２０のコンフォメーション変化（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｎａｌ  ｃｈａｎｇｅ）を防止する能力を有し得る。
【０１３８】  他の実施形態では、本発明の方法は、リポソーム結合した化学療法剤またはアルブミン結合した化学療法剤を含む治療有効量の医薬組成物を哺乳動物に投与するステップを含み、ここで、このリポソームまたはアルブミンは、適切な疾患を標的とする抗ＣＤ２０抗体にカップリングされる。上記化学療法剤は、任意の適切な方法を使用して抗ＣＤ２０抗体にカップリングされ得る。好ましくは、この化学療法剤は、例えば、ジスルフィド結合を含む共有結合を介して、この化合物に化学的にカップリングされる。
【０１３９】  上記したものなどの、１種または複数の化学療法剤の１つまたは複数の用量もまた、本発明の方法に従って投与され得る。本発明の方法において使用される化学療法剤の型および数は、特定の腫瘍型に対する標準的な化学療法レジメンに依存する。言い換えれば、特定のがんは、単一の化学療法剤を用いて慣用的に処置され得るが、別のがんは、化学療法剤の組合せを用いて慣用的に処置され得る。以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、当然、本発明の範囲を限定すると決して解釈すべきではない。
【０１４０】  本発明に従う方法には、例えば併用療法が含まれ、ここで上記動物は、手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、免疫療法、ホルモン療法およびレーザー療法からなる群より選択される１種または複数のがん療法もまた受けている。用語「共投与」および「併用療法」とは、２種以上の治療的に活性な薬剤を被験体に投与することを指す。これらの薬剤は、単一の医薬組成物に含まれ得、同時に投与され得るか、またはこれらの薬剤は、別々の製剤に含まれ得、被験体に逐次的に投与され得る。２種の薬剤が上記被験体において同時に検出され得る限り、これら２種の薬剤は共投与されたと言われる。
【０１４１】  本発明において意図される併用療法には、併用の（ｃｏｎｃａｍｉｎａｎｔ）抗体投与、ワクチン投与、細胞傷害剤の投与、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチドアナログおよび生体応答改変因子が挙げられるがこれらに限定されない。２種以上の併用された化合物は、一緒にまたは続いて使用され得る。化学療法剤の例には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然産物、ホルモンおよびアンタゴニスト、ならびに種々の薬剤が挙げられる。アルキル化剤の例には、ナイトロジェンマスタード、例えばメクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）およびクロラムブシル；エチレンイミンおよびメチルメラミン、例えばヘキサメチルメラミンおよびチオテパ；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン；ニトロソウレア、例えばカルムスチン（ＢＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）およびストレプトゾシン（ストレプトゾトシン）；ＤＮＡ合成アンタゴニスト、例えばリン酸エストラムスチン；ならびにトリアジン、例えばダカルバジン（ＤＴＩＣ、ジメチル−トリアゼノイミダゾールカルボキサミド）およびテモゾロミドが挙げられる。代謝拮抗剤の例には、葉酸アナログ、例えばメトトレキサート（アメトプテリン）；ピリミジンアナログ、例えばフルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｎ）（５−フルオロウラシル、５−ＦＵ、５ＦＵ）、フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン、ＦＵｄＲ）、シタラビン（シトシンアラビノシド）およびゲムシタビン；プリンアナログ、例えばメルカプトプリン（６−メルカプトプリン（６−ｎｉｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン、ＴＧ）およびペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン、デオキシコホルマイシン）、クラドリビンおよびフルダラビン；ならびにトポイソメラーゼインヒビター、例えばアムサクリンが挙げられる。天然産物の例には、ビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン（ＶＬＢ）およびビンクリスチン；タキサン、例えばパクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））；エピポドフィロトキシン、例えばエトポシドおよびテニポシド；カンプトテシン、例えばトポテカンおよびイリノテカン；抗生物質、例えばダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン（ｒｕｂｉｄｏｍｙｃｉｎ））、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン（マイトマイシンＣ）、イダルビシン、エピルビシン；酵素、例えばＬ−アスパラギナーゼ；ならびに生物学的応答改変因子、例えばインターフェロンアルファおよびインターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｌｕｋｉｎ）２が挙げられる。ホルモンおよびアンタゴニストの例には、黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト（ｌｕｔｅｉｎｉｓｉｎｇ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｇｏｎｉｓｔ）、例えばブセレリン；副腎皮質ステロイド、例えばプレドニゾンおよび関連調製物；プロゲスチン、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロール；エストロゲン、例えばジエチルスチ���ベストロールおよびエチニルエストラジオールならびに関連調製物；エストロゲンアンタゴニスト、例えばタモキシフェンおよびアナストロゾール；アンドロゲン、例えばプロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロンならびに関連調製物；アンドロゲンアンタゴニスト、例えばフルタミドおよびビカルタミド；ならびにゴナドトロピン放出ホルモンアナログ、例えばリュープロリドが挙げられる。種々の薬剤の例には、サリドマイド；プラチナ配位錯体、例えばシスプラチン（ｃｚｓ−ＤＤＰ）、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；アントラセンジオン、例えばミトキサントロン；置換尿素、例えばヒドロキシウレア；メチルヒドラジン誘導体、例えばプロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）；副腎皮質抑制剤、例えばミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミド；ＲＸＲアゴニスト、例えばベキサロテン；ならびにチロシンキナーゼインヒビター、例えばイマチニブが挙げられる。
【０１４２】  本発明の方法において取り上げられる組成物は、単回用量または複数回用量で投与され得る。上記抗体の投与が注入による場合、この注入は、単回の持続的用量であり得、または複数回の注入によって送達し得る。上記薬剤の注射は、異常な標的遺伝子発現の部位またはその近傍で組織へと直接であり得る。上記薬剤の複数回注射は、上記部位またはその近傍の組織中へとなされ得る。
【０１４３】  当業者はまた、所与の被験体に本発明の抗体を投与するための適切な投薬量レジメンを容易に決定できる。例えば、上記抗ＣＤ２０抗体組成物は、ＣＤ２０発現の部位またはその近傍で、単回注射または沈殿物（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）として、被験体に１回投与され得る。本発明の組成物は、毎日、週に２回、週に１回、隔週で、月に２回、月に１回、隔月でまたは臨床医の裁量で投与され得る。いくつかの実施形態では、これらの組成物は、約３〜約２８日間、より好ましくは約７〜約１０日間の期間にわたり、被験体に毎日１回または２回投与される。さらなる実施形態では、上記単位用量は、１日１回未満の頻度で、例えば、２、４、８または３０日毎に１回未満で、投与される。他の実施形態では、この単位用量は、ある頻度で投与されない（例えば、一定の頻度ではない）。
【０１４４】  投薬量レジメンが複数回の投与を含む場合、上記被験体に投与される抗ＣＤ２０抗体組成物の有効性は、投薬量レジメン全体にわたって投与される抗体の総量を含み得ることが理解される。当業者は、正確な個々の投薬量が、投与されている特定の抗ＣＤ２０抗体組成物、投与の時間、投与の経路、製剤の性質、排泄の速度、処置されている特定の障害、該障害の重症度、オリゴヌクレオチド剤の薬力学、ならびに患者の年齢、性別、体重および全般的健康を含む種々の因子に幾分依存して調整され得ることを理解する。必要な投薬レベルにおける広いバリエーションは、投与の種々の経路の異なる効率に鑑みて予測される。
【０１４５】  有効用量は、特定の状況下で望ましい場合または適切とみなされる場合、単位用量または２回以上の用量で投与され得る。反復注入または頻繁な注入を促進することが望ましい場合、送達デバイス、例えば、ポンプ、半永久的ステント（例えば、静脈内、腹腔内、槽内または包内）、またはレザバの移植が賢明であり得る。首尾良い処置の後、疾患状態の再発を予防するために、患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合がある。上記抗体組成物の濃度は、障害を処置もしくは予防するのに有効であるのに十分な量、またはヒトにおいて生理学的状態を調節するのに十分な量である。投与する抗体の濃度または量は、上記薬剤および投与方法について決定されたパラメータに依存する。
【０１４６】  疾患または障害の重症度、以前の処置、被験体の全般的健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患が挙げられるがこれらに限定されない特定の因子が、被験体を有効に処置するために必要とされる投薬量に影響を与え得る。処置に使用される上記抗体の有効な投薬量は、特定の処置の過程にわたって増加または減少し得ることもまた理解される。投薬量の変化が生じ得、これは、診断アッセイの結果から明らかになり得る。例えば、被験体は、抗体組成物を投与した後にモニタリングされ得る。そのモニタリングからの情報に基づいて、追加の量の上記抗体組成物が投与され得る。当業者は、最適な投薬量、投薬方法論および反復率を容易に決定できる。
【０１４７】  以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、当然、本発明の範囲を限定すると決して解釈すべきではない。
【実施例】
【０１４８】  （実施例１）  この実施例は、変化したアミノ酸配列を有する一連のバリアント抗ＣＤ２０抗体の軽鎖および重鎖が、部位特異的変異誘発によって作製できることを実証する。【０１４９】  クローニングされた抗ＣＤ２０軽鎖および重鎖コード配列の部位特異的変異を、ＭＯＲＰＨ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（５  Ｐｒｉｍｅ  ｔｏ  ３  Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．）、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ＫｉｔおよびＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（全てＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡから）を含む、当業者に周知の種々のプロトコールを使用して実施した。具体的には、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ法は、非鎖置換ポリメラーゼ（ｎｏｎ−ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｐｆｕ）を使用して、相補的なミスマッチしたプライマー対およびプライマー伸長を使用した。形質転換前に、親鋳型（メチル化するＥ．ｃｏｌｉ株から調製した）を、ＤｐｎＩ（メチル化ＤＮＡに対して特異的であり、新たに合成された二重鎖ＤＮＡを消化しない）で消化した。全ての変異を、ジデオキシ配列決定によって検証した。得られた軽鎖および重鎖ポリペプチドの発現および精製を、記載されたように実施した（Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｓｔｅｖｅｎｓら：  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ４巻：４２１〜４３２頁（１９９５年））。抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株ＢＬ２６で発現させた。小規模（３０ｍＬ）振盪培養を使用して十分なタンパク質を産生し、熱安定性を評価した。Ｈｉｓタグ化タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）とのインキュベーションによって、Ｅ．ｃｏｌｉペリプラズム画分から単離した。この親和性樹脂を、９６ウェルフィルタープレート上で収集し、洗浄した。タンパク質を、５００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液で溶出した。【０１５０】  表１〜３は、配列番号１および２に関し、それぞれ野生型抗ＣＤ２０抗体の軽鎖および重鎖を示し、その残基は共に、Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．、Ｗｕ  Ｔ．Ｔ．、Ｐｅｒｒｙ  Ｈ．Ｍ．、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ  Ｋ．Ｓ．およびＦｏｅｌｌｅｒ  Ｃ．（１９９１年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（編者Ｋａｂａｔ）、第１巻、第５版、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９��１年）（ＶＬおよびＶＨ配列）またはＥＵ番号付け（ＣＨ２配列）に従って定められるように番号付けされている（特に示さない限り、本明細書で使用した全てのアミノ酸配列番号付けは、配列番号１および２を参照している／配列番号１および２に基づく）。  表１．野生型抗ＣＤ２０軽鎖可変ドメインアミノ酸配列番号付けシステム【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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表２．野生型抗ＣＤ２０重鎖可変ドメインアミノ酸配列番号付けシステム
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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表３．野生型抗ＣＤ２０重鎖定常ドメイン２アミノ酸配列番号付けシステム
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【０１５１】  以下の抗ＣＤ２０抗体軽鎖を生成し、各々をそのアミノ酸配列変化（複数可）によって同定した（配列番号１に従って番号付けした）：Ｑ１Ｄ、Ｓ５Ｔ、Ａ９Ｓ、Ａ９Ｌ、Ｉ１０Ｌ、Ｉ１０Ｆ、Ｉ１０Ｓ、Ｉ１０Ｔ、Ａ１３Ｖ、Ｐｌ５Ａ、Ｐ１５Ｌ、Ｐｌ５Ｖ、Ｋ１８Ｑ、Ｋ１８Ｒ、Ｋ１８Ｅ、Ｍ２１Ｉ、Ｍ２１Ｌ、Ｓ２７Ｑ、Ｓ２７Ｋ、Ｉ３２Ｌ、Ｈ３３Ｎ、Ｆ３５Ｙ、Ｐ３９Ｓ、Ｓ４１Ａ、Ｓ４１Ｔ、Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ａ、Ｓ４２Ｐ、Ｐ４５Ｌ、Ｐ４５Ｒ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ａ４９Ｄ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｆ６１Ｔ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｓ６９Ｔ、Ｙ７０Ｆ、Ｓ７１Ｔ、Ａ７９Ｐ、Ａ８２Ｌ、Ａ８２Ｖ、Ａ８２Ｆ、Ｑ８８ＬおよびＧ９９Ｑ。【０１５２】  以下の抗ＣＤ２０抗体重鎖を生成し、各々をそのアミノ酸配列変化（複数可）によって同定した（配列番号２に従って番号付けした）：【０１５３】  ｉ．Ｖ３７Ｌ、Ｍ２０Ｌ、ならびにＱ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ａ９Ｇ、Ａ９Ｌ、Ｅ１０Ｇ、Ｋ１３Ｑ、Ｔ２８Ｓ、Ｔ３０Ｓ、Ｋ６７Ｒ、Ｋ６７Ｒ：Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｙ８０Ｆ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｗ１０６Ｓ、Ｆ１０８Ａ、Ｎ１０９ＤおよびＡ１１３Ｑのうち１つ；【０１５４】  ｉｉ．Ｍ２０Ｌ、Ａ９２Ｇ、ならびにＶ１８Ｌ、Ｋ１９Ｒ、Ｋ１９Ｓ、Ｋ１９Ｔ、Ｍ２０Ｉ、Ｍ２０Ｖ、Ｓ２５Ｔ、Ｙ２７Ｆ、Ｙ３２Ｆ、Ｙ３２Ｓ、Ｐ４１Ｈ、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５Ｒのうち１つ；および【０１５５】  ｉｉｉ．Ｖ２４４Ｌ、Ｌ２４６Ｉ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６７Ａ、Ｖ２６７Ｉ、Ｖ２６７Ｌ、Ｖ２７０Ｌ、Ｖ２７０Ｓ、Ｖ２７０Ｆ、Ｖ２７０Ｉ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９Ｉ、Ｆ２７９Ｌ、Ｖ３０６Ｔ、Ｖ３１２Ｉ、Ｖ３１２Ｌ、Ｖ３２７Ａ、Ｖ３２７Ｌ、Ｉ３４０Ａ、Ｉ３４０Ｌ、Ｔ２５４Ｅ、Ｍ２５６Ｌ、Ｍ２５６Ｙ、Ｔ２６０Ｅ、Ｔ２６０ＦおよびＴ２６０Ｋ。【０１５６】  さらに、複数のアミノ酸配列変化を有する抗ＣＤ２０抗体重鎖を生成した（表４を参照のこと）。  表４．複数のアミノ酸配列変化を有する抗ＣＤ２０抗体重鎖【表４】
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【０１５７】  次いで、これらのバリアント抗ＣＤ２０軽鎖および重鎖を、増強された安定性についてスクリーニングした。  （実施例２）【０１５８】  この実施例は、部位特異的変異誘発が、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）スクリーニングアッセイに基づいて、増強された安定性を有する抗ＣＤ２０抗体軽鎖および重鎖ポリペプチド（ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｅａｖｙ  ｌｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を創製するために使用できることを実証している。【０１５９】  示差走査蛍光定量法は、蛍光色素の存在下でタンパク質の熱的アンホールディングをモニタリングし、リアルタイムＰＣＲ装置を使用することによって典型的には実施される。ＤＳＦは、抗体の軽鎖および重鎖を含む広範なタンパク質に適用され得る。ＤＳＦに使用され得る蛍光色素は、蛍光がクエンチされる水溶液と比較して、非極性環境、例えば、高次構造がほぐされたタンパク質上の疎水性部位において高度に蛍光性である。使用されてきた種々の色素は、その光学特性に関して、特に、変性したタンパク質に結合することによって引き起こされる蛍光量子収率において、異なっている。タンパク質安定性分析のためにＤＳＦを使用する場合、蛍光強度は、温度の関数としてプロットされて、二状態転移によって記述され得るシグモイド曲線を生成する。転移曲線の屈曲点（Ｔｍ）は、Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ方程式などの単純な方程式を使用して計算される（例えば、Ｎｉｅｓｅｎ  Ｆ．  Ｈ．、Ｂｅｒｇｌｕｎｄ  Ｈ．およびＶｅｄａｄｉ  Ｍ．：  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２巻：２２１２〜２１頁（２００７年）を参照のこと）。【０１６０】  ＶＬドメインおよびＶＨドメインの相対的安定性を、タンパク質色素ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅの存在下でＤＳＦによって個々に分析した（同上文献もまた参照のこと）。簡潔に述べると、５×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅを含むＰＢＳ中１０〜２０μＭのタンパク質試料４０μｌを、４９２ｎｍでの励起および５８０ｎｍでの発光を用いて、ＭＸ４０００  ｑＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）中で１℃の増分で２５℃から９０℃に加熱した。タンパク質のアンホールディングを、変性したタンパク質に対する色素ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の結合の際の蛍光の増加として検出した。転移中点を、プログラムＰｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して、Ｂｏｌｔｚｍａｎ方程式へのデータの非線形最小二乗曲線フィットによって決定した（Ｎｉｅｓｅｎ  Ｆ．  Ｈ．、Ｂｅｒｇｌｕｎｄ  Ｈ．およびＶｅｄａｄｉ  Ｍ．：  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２巻：２２１２〜２１頁（２００７年）もまた参照のこと）。（ＶＨバリアントを、Ｖ３７Ｌ／Ｍ２０ＬまたはＭ２０Ｌ／Ａ９２Ｇアミノ酸変化を有する「発現最適化」ドメインとして試験した。これらの組合せの全てを全長抗体において試験したわけではない。抗体断片をｈｉｓタグ化し、ＩＭＡＣを使用して精製した（完全抗ＣＤ２０抗体は、プロテインＡ樹脂で精製した）。【０１６１】  表中に列挙したＴｍにおける変化（即ちΔ）を、変異体タンパク質のＴｍから野生型タンパク質のＴｍを差し引くことによって計算する（ＶＨバリアント（ｖａｒｉｅｎｔ）の場合、野生型ＶＨは発現しなかったので、本発明者らは、発現を改善するための安定化残基を含む２つの異なるＶＨドメインと比較してデルタＴｍを決定した）。０．３℃以上の任意のΔＴｍを、安定性の増強とみなした。結果を表４〜６に示す。  表５．リツキシマブＶＬドメインのアミノ酸改変および熱安定性【表５】
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ａＴｍは、蛍光ベースの熱安定性アッセイにおけるシグナルが乏しいために得られなかった。ｂ変異が得られなかったまたは不十分なタンパク質発現。  表６．リツキシマブＶＨドメインのアミノ酸改変および熱安定性
【表６】
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ａ野生型リツキシマブＶＨドメインは発現が乏しかった。本発明者らは、ＶＨドメインのバリアントを操作して、発現を改善した。これらは、変異誘発のためのフレームワークとして機能した。示された△Ｔｍ値は、対応するフレームワークと比較したものである。ｂ明確に測定されなかったフレームワーク変異に関する外挿された△Ｔｍ値は、以下のとおりである：Ｖ３７Ｌ（１．０℃）、Ｍ２０Ｌ（４．５℃）。  表７．リツキシマブＣＨ２ドメインのアミノ酸改変および熱安定性
【表７】
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（実施例３）
【０１６２】  この実施例は、キャピラリー示差走査熱量測定（ｃＤＳＣ）を使用することによって、本発明によって提供されるいくつかの抗ＣＤ２０抗体バリアントの増強された安定性をさらに確認する。【０１６３】  上記ＤＳＦ研究から、一連のバリアント抗体を、ｃＤＳＣによる安定性分析のために選択した。二本鎖抗体を、ＣＨＯ−Ｓ（懸濁培養に順応したチャイニーズハムスター卵巣）細胞系における一過性発現のために、重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターの共トランスフェクションによって産生した。【０１６４】  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＭＡＸ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、抗ＣＤ２０抗体の一過性発現に使用した。ＣＨＯ−Ｓ細胞を、Ｌ−グルタミンを補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍで培養した。トランスフェクションのために、細胞を１×１０６／ｍｌに希釈し、１ｕｇ  ＤＮＡ／ｍｌ培養物でトランスフェクトした。１：１の比率の重鎖：軽鎖プラスミドを、製造業者によって記載されたように、ＯｐｔｉＰｒｏ  Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍで希釈し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＭＡＸ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔと混合した。この混合物を１０分間インキュベートして、脂質−ＤＮＡ複合体を形成させ、ＣＨＯ−Ｓ細胞に添加した。この培養物を、１３５ｒｐｍで回転するオービタルシェイカープラットフォーム上で３７℃、８％ＣＯ２でインキュベートした。この培養培地を、４〜７日後に収集し、抗ＣＤ２０抗体をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。【０１６５】  ＤＳＦにおいて有望な結果を生じたアミノ酸配列変化を有する抗ＣＤ２０抗体バリアントのパネルを、ｃＤＳＣによって特徴付けた。結果およびそのあり得る解釈を表８に示す。  表８．単一アミノ酸変化の考えられる意味【表８】
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【０１６６】  複数のアミノ酸配列変化を有する抗ＣＤ２０抗体バリアントの第２のパネルを、ｃＤＳＣによって特徴付けた。野生型抗ＣＤ２０抗体は、試料「ＲＷ００４」として同定される。試料「ＲＷ００５〜００９」は安定化バリアントである。そのアミノ酸配列変化を表４に示す。６つの安定化アミノ酸変化（表５〜７から選択される）の組合せは、抗ＣＤ２０  Ｆａｂドメイン（結合機能を含む該抗体の一部）の融点（Ｔｍ）を、８６．５℃まで改善した。これは、野生型タンパク質を超える最大１１．１℃までの改善を示す。【０１６７】  結果およびその解釈は、図５および表９に示される。  表９．複数のアミノ酸配列変化を有する抗ＣＤ２０抗体バリアントのｃＤＳＣの結果【表９】
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（実施例４）
【０１６８】  この実施例は、熱的チャレンジアッセイを使用して、本発明によって提供される複数のアミノ酸配列変化を有する一群の抗ＣＤ２０抗体バリアントの増強された安定性をさらに実証する。【０１６９】  野生型および安定化抗ＣＤ２０抗体バリアントのアリコートを、示された温度で１０分間加熱し、次いで即座に氷上で冷却した。これらの試料を遠心分離して、いずれの沈澱した材料も除去した。プロテインＡ結合活性を保持する抗体を、プロテインＡセンサーキットを使用して、Ｏｃｔｅｔ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）で定量した。プロテインＡは上記抗体のＦｃ部分（特に、最も安定性が低いドメインであるＣＨ２ドメイン）に結合するので、そのデータは、可変ドメインの安定化が、上記抗体分子の全体的安定性を増加させたことを示す。２つ組（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）は、異なる一過性発現実験から精製された抗体を示す。【０１７０】  結果は図６に示され、野生型に対してバリアントの明確な増強された安定性を示す。【０１７１】  本明細書で引用した、刊行物、特許出願および特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が個々にかつ具体的に参照によって組み込まれることが示され、その全体が本明細書中に記載されているのと同じ程度まで、参照によって本明細書に組み込まれる。【０１７２】  本発明を説明することに関して（特に、以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに類似の指示対象の使用は、本明細書に特に示さない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に示さない限り、オープンエンドの用語（即ち、「含むがそれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書に特に示さない限り、その範囲内に入る各別々の値に個々に言及する簡略化された方法として機能することのみを意図し、各別々の値は、本明細書で個々に列挙されているかのように、本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に特に示さない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書に提供される任意のおよび全ての例または例示的用語（例えば、「〜など／例えば（ｓｕｃｈ  ａｓ）」の使用は、本発明をより良く説明することのみを意図しており、特に特許請求されない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の用語は、任意の特許請求されていない要素を、本発明の実施に必須のものとして示すと解釈してはならない。【０１７３】  本発明を実施するための、本発明者らが知る最良の形態を含む本発明の好ましい実施形態が、本明細書に記載される。好ましい実施形態のバリエーションは、上記の説明を読めば当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者が、適宜かかるバリエーションを使用することを予期しており、また本発明者らは、本発明が、本明細書中に具体的に記載された以外の方法で実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容される限り、本明細書に添付された特許請求の範囲において列挙される主題の全ての改変および等価物を含む。さらに、全てのその可能なバリエーションでの上記要素の任意の組合せが、本明細書に特に示さない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年9月18日(2014.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された安定化抗ＣＤ２０抗体であって、
ａ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ｐ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｙ７０ＦおよびＡ７９Ｐのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；
ｂ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、配列番号２または以下のアミノ酸配列変化：Ｖ３７ＬおよびＭ２０Ｌ、Ｍ２０ＬおよびＡ９２Ｇ、Ｑ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ｅ１０Ｇ、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｔ２８Ｓ、Ｙ３２Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９Ｄ、Ａ１１３Ｑ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９ＬならびにＶ３１２Ｉのうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；ならびに
ｃ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、（ａ）に列挙した配列番号１におけるアミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含む、または前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、（ｂ）に列挙した配列番号２におけるアミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含む、
単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項２】
前記軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項３】
前記軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｉアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項４】
前記重鎖アミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列変化Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤまたはＶ２６３Ｌのうち１つを有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項５】
前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項６】
前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｉアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項７】
前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ８１Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項８】
前記重鎖アミノ酸配列が、Ａ９２Ｇアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項９】
前記重鎖アミノ酸配列が、Ｎ１０９Ｄアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１０】
前記重鎖アミノ酸配列が、Ｖ２６３Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１１】
ａ．前記軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含み、および
ｂ．前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤおよびＶ２６３Ｌのアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１２】
ａ．前記軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１を含み、および
ｂ．前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤおよびＶ２６３Ｌのアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１３】
ａ．前記軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含み、および
ｂ．前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２ＧおよびＮ１０９Ｄのアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１４】
ａ．前記軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１を含み、および
ｂ．前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２ＧおよびＮ１０９Ｄのアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１５】
ａ．前記軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１を含み、および
ｂ．前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌ、Ｍ８１ＬおよびＡ９２Ｇのアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
請求項１に記載の単離された抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１６】
前記抗ＣＤ２０抗体の重鎖または軽鎖のいずれかが、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、円二色性（ＣＤ）分光法、蛍光発光分光法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、サイズ排除クロマトグラフィーまたは熱的チャレンジアッセイによって測定した場合に、野生型抗ＣＤ２０抗体の対応する重鎖または軽鎖よりも優れた熱安定性を有する場合に、該抗ＣＤ２０抗体が安定化しているとみなされる、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１７】
前記抗ＣＤ２０抗体が、同じ量の野生型抗ＣＤ２０抗体と比較した場合に、増強された抗原結合活性、有効期間、血清半減期、ＡＵＣまたはＣｍａｘを有する、請求項１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１８】
単離された安定化抗ＣＤ２０抗体であって、
ａ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列または該軽鎖アミノ酸配列の等価物が、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ｐ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｙ７０ＦおよびＡ７９Ｐのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；
ｂ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列または該重鎖アミノ酸配列の等価物が、配列番号２または以下のアミノ酸配列変化：Ｖ３７ＬおよびＭ２０Ｌ、Ｍ２０ＬおよびＡ９２Ｇ、Ｑ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ｅ１０Ｇ、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｔ２８Ｓ、Ｙ３２Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９Ｄ、Ａ１１３Ｑ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９ＬならびにＶ３１２Ｉのうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；
ｃ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列または該軽鎖アミノ酸配列の等価物が、（ａ）に列挙した配列番号１におけるアミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み、または該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列もしくは該重鎖アミノ酸配列の等価物が、（ｂ）に列挙した配列番号２におけるアミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み；ならびに
ｄ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体が、インタクトな抗体、Ｆｖ断片、単鎖可変領域（ＳｃＦｖ）抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片またはＦａｂ’２  Ｆａｂ抗体断片の形態である、
単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１９】
請求項１８に記載の安定化抗ＣＤ２０抗体の単一の軽鎖または重鎖をコードする、単離された核酸。
【請求項２０】
ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項１９に記載の単離された核酸。
【請求項２１】
請求項１９に記載の核酸のうちいずれか１つの発現を導く、単離されたベクター。
【請求項２２】
前記発現が誘導性である、請求項２１に記載の単離されたベクター。
【請求項２３】
請求項１９に記載のベクターのうち１つまたは複数を含む、単離された細胞。
【請求項２４】
原核生物細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
真核生物細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２６】
チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項２５に記載の真核生物細胞。
【請求項２７】
前記ベクターのうち１つまたは複数によって一過性に形質転換される、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２８】
前記ベクターのうち１つまたは複数によって安定に形質転換される、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２９】
単離された前記抗ＣＤ２０抗体の軽鎖または重鎖アミノ酸配列が、
ａ．該抗ＣＤ２０抗体がＣＤ２０分子に結合する能力、補体を固定する能力、ＣＤ−２０発現細胞をオプソニン化する能力、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化する能力、抗体依存性プログラム細胞死を活性化する能力、マクロファージ依存性抗ＣＤ２０免疫応答を活性化する能力、化学療法に対して感受性のＣＤ２０保有細胞を活性化する能力を増強する；
ｂ．該抗ＣＤ２０抗体が補体を固定する能力を低減させる；  
さらなるアミノ酸配列変化、ならびに、
ｃ．（ａ）および（ｂ）のさらなるアミノ酸配列変化の組合せ、
を有する、請求項１に記載の単離された抗ＣＤ２０抗体。
【請求項３０】
前記抗ＣＤ２０抗体がエフェクターに結合している、請求項１のいずれか１項に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
【請求項３１】
前記エフェクターが、放射性同位体、化学療法剤、毒素、生体応答改変因子または第２の抗体である、請求項３０に記載の単離された抗ＣＤ２０抗体。
【請求項３２】
ＰＥＧ、アルブミンまたはポリシアル酸に結合している、請求項１に記載の単離された抗ＣＤ２０抗体。
【請求項３３】
請求項１に記載の抗ＣＤ２０抗体および薬学的に許容されるキャリアを含む、薬理学的組成物。
【請求項３４】
患者において疾患を処置するための組成物であって、該組成物は、薬学的に許容されるキャリア中の治療有効量の安定化抗ＣＤ２０抗体を含み、ここで、
ａ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ｐ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｙ７０ＦおよびＡ７９Ｐのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；
ｂ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、配列番号２または以下のアミノ酸配列変化：Ｖ３７ＬおよびＭ２０Ｌ、Ｍ２０ＬおよびＡ９２Ｇ、Ｑ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ｅ１０Ｇ、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｔ２８Ｓ、Ｙ３２Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９Ｄ、Ａ１１３Ｑ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９ＬならびにＶ３１２Ｉのうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；ならびに
ｃ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、（ａ）に列挙した配列番号１における該アミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含む、または該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、（ｂ）に列挙した配列番号２における該アミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含む、
組成物。
【請求項３５】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｉアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列変化Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤまたはＶ２６３Ｌのうち１つを有する配列番号２を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３８】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｉアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４０】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ８１Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４１】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ａ９２Ｇアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４２】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｎ１０９Ｄアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４３】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｖ２６３Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４４】
ａ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含み、および
ｂ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤおよびＶ２６３Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
請求項３４に記載の組成物。
【請求項４５】
ａ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１を含み、および
ｂ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤおよびＶ２６３Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
請求項３４に記載の組成物。
【請求項４６】
ａ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含み、および
ｂ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２ＧおよびＮ１０９Ｄアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
請求項３４に記載の組成物。
【請求項４７】
ａ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１を含み、および
ｂ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、およびＮ１０９Ｄアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
請求項３４に記載の組成物。
【請求項４８】
ａ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１を含み、および
ｂ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌ、Ｍ８１ＬおよびＡ９２Ｇアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
請求項３４に記載の組成物。
【請求項４９】
前記抗ＣＤ２０抗体の重鎖または軽鎖のいずれかが、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、円二色性（ＣＤ）分光法、蛍光発光分光法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、サイズ排除クロマトグラフィーまたは熱的チャレンジアッセイによって測定した場合に、野生型抗ＣＤ２０抗体の対応する重鎖または軽鎖よりも優れた熱安定性を有する場合に、該抗ＣＤ２０抗体が安定化しているとみなされる、請求項３４に記載の組成物。
【請求項５０】
前記安定化抗ＣＤ２０抗体が、同じ量の野生型抗ＣＤ２０抗体と比較した場合に、増強された抗原結合活性、有効期間、血清半減期、ＡＵＣまたはＣｍａｘを有する、請求項３４に記載の組成物。
【請求項５１】
前記抗ＣＤ２０抗体の軽鎖または重鎖アミノ酸配列が、該抗体がＣＤ２０分子に結合する能力、補体を固定する能力、ＣＤ−２０発現細胞をオプソニン化する能力、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化する能力、抗体依存性プログラム細胞死を活性化する能力、マクロファージ依存性抗ＣＤ２０免疫応答を活性化する能力、化学療法に対して感受性のＣＤ２０保有細胞を活性化する能力を増強する、または該抗ＣＤ２０抗体が補体を固定する能力を低減させるさらなるアミノ酸変化、ならびにそれらの組合せを有する、請求項３４に記載の組成物。
【請求項５２】
前記抗ＣＤ２０抗体がエフェクターに結合している、請求項３４に記載の組成物。
【請求項５３】
前記エフェクターが、放射性同位体、化学療法剤、毒素、生体応答改変因子または第２の抗体である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記抗ＣＤ２０抗体が、ＰＥＧ、アルブミンまたはポリシアル酸に結合している、請求項３４に記載の組成物。
【請求項５５】
前記疾患が、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、関節リウマチ、ウェゲナー肉芽腫症または顕微鏡的多発血管炎である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記抗ＣＤ２０抗体が、インタクトな抗体、単鎖可変領域（ＳｃＦｖ）抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片またはＦａｂ’２抗体断片の形態である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項５７】
患者においてＣＤ２０ポリペプチドを定量的に検出するための組成物であって、該組成物は、薬学的に許容されるキャリア中の診断有効量の安定化抗ＣＤ２０抗体を含み、
ａ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列または該軽鎖アミノ酸配列の等価物が、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ｐ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｙ７０ＦおよびＡ７９Ｐのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；
ｂ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列または該重鎖アミノ酸配列の等価物が、配列番号２または以下のアミノ酸配列変化：Ｖ３７ＬおよびＭ２０Ｌ、Ｍ２０ＬおよびＡ９２Ｇ、Ｑ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ｅ１０Ｇ、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｔ２８Ｓ、Ｙ３２Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９Ｄ、Ａ１１３Ｑ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９ＬならびにＶ３１２Ｉのうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；
ｃ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列または該軽鎖アミノ酸配列の等価物が、（ａ）に列挙した配列番号１における該アミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み、または該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列もしくは該重鎖アミノ酸配列の等価物が、（ｂ）に列挙した配列番号２における該アミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み；ならびに
ｄ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体が、インタクトな抗体、Ｆｖ断片、単鎖可変領域（ＳｃＦｖ）抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片またはＦａｂ’２  Ｆａｂ抗体断片の形態である、
組成物。
【請求項５８】
生物学的検体中のＣＤ２０ポリペプチドを定量的に検出する方法であって、診断量の安定化抗ＣＤ２０抗体を該生物学的検体と接触させるステップを含み、
ａ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列または該軽鎖アミノ酸配列の等価物が、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ｐ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｙ７０ＦおよびＡ７９Ｐのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；
ｂ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列または該重鎖アミノ酸配列の等価物が、配列番号２または以下のアミノ酸配列変化：Ｖ３７ＬおよびＭ２０Ｌ、Ｍ２０ＬおよびＡ９２Ｇ、Ｑ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ｅ１０Ｇ、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｔ２８Ｓ、Ｙ３２Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９Ｄ、Ａ１１３Ｑ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９ＬならびにＶ３１２Ｉのうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；
ｃ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列または該軽鎖アミノ酸配列の等価物が、（ａ）に列挙した配列番号１における該アミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み、または該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列もしくは該重鎖アミノ酸配列の等価物が、（ｂ）に列挙した配列番号２における該アミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み；ならびに
ｄ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体が、インタクトな抗体、Ｆｖ断片、単鎖可変領域（ＳｃＦｖ）抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片またはＦａｂ’２  Ｆａｂ抗体断片の形態である、方法。
【請求項５９】
前記抗ＣＤ２０抗体が、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット、スロットブロット、抗原捕捉アッセイまたはマイクロアレイアッセイにおいて使用される、請求項５７に記載の組成物。
【請求項６０】
単離された抗ＣＤ２０抗体であって、
ａ．該抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｑ１Ｄ、Ｓ５Ｔ、Ａ９Ｓ、Ａ９Ｌ、Ｉ１０Ｌ、Ｉ１０Ｆ、Ｉ１０Ｓ、Ｉ１０Ｔ、Ａ１３Ｖ、Ｐｌ５Ａ、Ｐ１５Ｌ、Ｐｌ５Ｖ、Ｋ１８Ｑ、Ｋ１８Ｒ、Ｋ１８Ｅ、Ｍ２１Ｉ、Ｍ２１Ｌ、Ｓ２７Ｑ、Ｓ２７Ｋ、Ｉ３２Ｌ、Ｈ３３Ｎ、Ｆ３５Ｙ、Ｐ３９Ｓ、Ｓ４１Ａ、Ｓ４１Ｔ、Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ａ、Ｓ４２Ｐ、Ｐ４５Ｌ、Ｐ４５Ｒ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ａ４９Ｄ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｆ６１Ｔ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｓ６９Ｔ、Ｙ７０Ｆ、Ｓ７１Ｔ、Ａ７９Ｐ、Ａ８２Ｌ、Ａ８２Ｖ、Ａ８２Ｆ、Ｑ８８ＬおよびＧ９９Ｑのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；
ｂ．該抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、配列番号２、または以下のアミノ酸配列変化：
ｉ．Ｖ３７Ｌ、Ｍ２０Ｌ、ならびにＱ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ａ９Ｇ、Ａ９Ｌ、Ｅ１０Ｇ、Ｋ１３Ｑ、Ｔ２８Ｓ、Ｔ３０Ｓ、Ｋ６７Ｒ、Ｋ６７Ｒ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｙ８０Ｆ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｗ１０６Ｓ、Ｆ１０８Ａ、Ｎ１０９ＤおよびＡ１１３Ｑのうち１つもしくは複数；
ｉｉ．Ｍ２０Ｌ、Ａ９２Ｇ、ならびにＶ１８Ｌ、Ｋ１９Ｒ、Ｋ１９Ｓ、Ｋ１９Ｔ、Ｍ２０Ｉ、Ｍ２０Ｖ、Ｓ２５Ｔ、Ｙ２７Ｆ、Ｙ３２Ｆ、Ｙ３２Ｓ、Ｐ４１Ｈ、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５Ｒのうち１つもしくは複数；および
ｉｉｉ．Ｖ２４４Ｌ、Ｌ２４６Ｉ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６７Ａ、Ｖ２６７Ｉ、Ｖ２６７Ｌ、Ｖ２７０Ｌ、Ｖ２７０Ｓ、Ｖ２７０Ｆ、Ｖ２７０Ｉ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９Ｉ、Ｆ２７９Ｌ、Ｖ３０６Ｔ、Ｖ３１２Ｉ、Ｖ３１２Ｌ、Ｖ３２７Ａ、Ｖ３２７Ｌ、Ｉ３４０Ａ、Ｉ３４０Ｌ、Ｔ２５４Ｅ、Ｍ２５６Ｌ、Ｍ２５６Ｙ、Ｔ２６０Ｅ、Ｔ２６０ＦおよびＴ２６０Ｋ、
のうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；ならびに
ｃ．ここで、該抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、（ａ）に列挙した配列番号１におけるアミノ酸変化のうち少なくとも１つを含み、または該抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、（ｂ）に列挙した配列番号２におけるアミノ酸変化のうち少なくとも１つを含む、
単離された抗ＣＤ２０抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
さらに、本発明は、患者または生物学的検体中のＣＤ２０ポリペプチドを定量的に検出する方法を提供し、この方法は、診断有効量の本発明によって提供される安定化抗ＣＤ２０抗体を該患者に投与するステップまたは該検体をこの診断有効量の本発明によって提供される安定化抗ＣＤ２０抗体と接触させるステップを含む。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
単離された安定化抗ＣＤ２０抗体であって、
ａ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ｐ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｙ７０ＦおよびＡ７９Ｐのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；
ｂ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、配列番号２または以下のアミノ酸配列変化：Ｖ３７ＬおよびＭ２０Ｌ、Ｍ２０ＬおよびＡ９２Ｇ、Ｑ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ｅ１０Ｇ、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｔ２８Ｓ、Ｙ３２Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９Ｄ、Ａ１１３Ｑ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９ＬならびにＶ３１２Ｉのうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；ならびに
ｃ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、（ａ）に列挙した配列番号１におけるアミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含む、または前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、（ｂ）に列挙した配列番号２におけるアミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含む、
単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
（項目２）
前記軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含む、項目１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
（項目３）
前記軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｉアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含む、項目１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
（項目４）
前記重鎖アミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列変化Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤまたはＶ２６３Ｌのうち１つを有する配列番号２を含む、項目１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
（項目５）
前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、項目１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
（項目６）
前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｉアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、項目１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
（項目７）
前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ８１Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、項目１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
（項目８）
前記重鎖アミノ酸配列が、Ａ９２Ｇアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、項目１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
（項目９）
前記重鎖アミノ酸配列が、Ｎ１０９Ｄアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、項目１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
（項目１０）
前記重鎖アミノ酸配列が、Ｖ２６３Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、項目１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
（項目１１）
ａ．前記軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含み、および
ｂ．前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤおよびＶ２６３Ｌのアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
項目１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
（項目１２）
ａ．前記軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１を含み、および
ｂ．前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤおよびＶ２６３Ｌのアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
項目１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
（項目１３）
ａ．前記軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含み、および
ｂ．前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２ＧおよびＮ１０９Ｄのアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
項目１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
（項目１４）
ａ．前記軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１を含み、および
ｂ．前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２ＧおよびＮ１０９Ｄのアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
項目１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
（項目１５）
ａ．前記軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１を含み、および
ｂ．前記重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌ、Ｍ８１ＬおよびＡ９２Ｇのアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
項目１に記載の単離された抗ＣＤ２０抗体。
（項目１６）
前記抗ＣＤ２０抗体の重鎖または軽鎖のいずれかが、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、円二色性（ＣＤ）分光法、蛍光発光分光法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、サイズ排除クロマトグラフィーまたは熱的チャレンジアッセイによって測定した場合に、野生型抗ＣＤ２０抗体の対応する重鎖または軽鎖よりも優れた熱安定性を有する場合に、該抗ＣＤ２０抗体が安定化しているとみなされる、項目１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
（項目１７）
前記抗ＣＤ２０抗体が、同じ量の野生型抗ＣＤ２０抗体と比較した場合に、増強された抗原結合活性、有効期間、血清半減期、ＡＵＣまたはＣｍａｘを有する、項目１に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
（項目１８）
単離された安定化抗ＣＤ２０抗体であって、
ａ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列または該軽鎖アミノ酸配列の等価物が、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ｐ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｙ７０ＦおよびＡ７９Ｐのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；
ｂ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列または該重鎖アミノ酸配列の等価物が、配列番号２または以下のアミノ酸配列変化：Ｖ３７ＬおよびＭ２０Ｌ、Ｍ２０ＬおよびＡ９２Ｇ、Ｑ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ｅ１０Ｇ、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｔ２８Ｓ、Ｙ３２Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９Ｄ、Ａ１１３Ｑ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９ＬならびにＶ３１２Ｉのうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；
ｃ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列または該軽鎖アミノ酸配列の等価物が、（ａ）に列挙した配列番号１におけるアミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み、または該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列もしくは該重鎖アミノ酸配列の等価物が、（ｂ）に列挙した配列番号２におけるアミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み；ならびに
ｄ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体が、インタクトな抗体、Ｆｖ断片、単鎖可変領域（ＳｃＦｖ）抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片またはＦａｂ’２  Ｆａｂ抗体断片の形態である、
単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
（項目１９）
項目１８に記載の安定化抗ＣＤ２０抗体の単一の軽鎖または重鎖をコードする、単離された核酸。
（項目２０）
ＲＮＡまたはＤＮＡである、項目１９に記載の単離された核酸。
（項目２１）
項目１９に記載の核酸のうちいずれか１つの発現を導く、単離されたベクター。
（項目２２）
前記発現が誘導性である、項目２１に記載の単離されたベクター。
（項目２３）
項目１９に記載のベクターのうち１つまたは複数を含む、単離された細胞。
（項目２４）
原核生物細胞である、項目２３に記載の細胞。
（項目２５）
真核生物細胞である、項目２３に記載の細胞。
（項目２６）
チャイニーズハムスター卵巣細胞である、項目２５に記載の真核生物細胞。
（項目２７）
前記ベクターのうち１つまたは複数によって一過性に形質転換される、項目２３に記載の細胞。
（項目２８）
前記ベクターのうち１つまたは複数によって安定に形質転換される、項目２２に記載の細胞。
（項目２９）
単離された前記抗ＣＤ２０抗体の軽鎖または重鎖アミノ酸配列が、
ａ．該抗ＣＤ２０抗体がＣＤ２０分子に結合する能力、補体を固定する能力、ＣＤ−２０発現細胞をオプソニン化する能力、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化する能力、抗体依存性プログラム細胞死を活性化する能力、マクロファージ依存性抗ＣＤ２０免疫応答を活性化する能力、化学療法に対して感受性のＣＤ２０保有細胞を活性化する能力を増強する；
ｂ．該抗ＣＤ２０抗体が補体を固定する能力を低減させる；  
さらなるアミノ酸配列変化、ならびに、
ｃ．（ａ）および（ｂ）のさらなるアミノ酸配列変化の組合せ、
を有する、項目１に記載の単離された抗ＣＤ２０抗体。
（項目３０）
前記抗ＣＤ２０抗体がエフェクターに結合している、項目１のいずれか１項に記載の単離された安定化抗ＣＤ２０抗体。
（項目３１）
前記エフェクターが、放射性同位体、化学療法剤、毒素、生体応答改変因子または第２の抗体である、項目３０に記載の単離された抗ＣＤ２０抗体。
（項目３２）
ＰＥＧ、アルブミンまたはポリシアル酸に結合している、項目１に記載の単離された抗ＣＤ２０抗体。
（項目３２）
項目１に記載の抗ＣＤ２０抗体および薬学的に許容されるキャリアを含む、薬理学的組成物。
（項目３４）
患者において疾患を処置する方法であって、薬学的に許容されるキャリア中の治療有効量の安定化抗ＣＤ２０抗体を該患者に投与するステップを含み、ここで、
ａ．単離された前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ｐ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｙ７０ＦおよびＡ７９Ｐのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；
ｂ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、配列番号２または以下のアミノ酸配列変化：Ｖ３７ＬおよびＭ２０Ｌ、Ｍ２０ＬおよびＡ９２Ｇ、Ｑ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ｅ１０Ｇ、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｔ２８Ｓ、Ｙ３２Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９Ｄ、Ａ１１３Ｑ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９ＬならびにＶ３１２Ｉのうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；ならびに
ｃ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、（ａ）に列挙した配列番号１における該アミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含む、または該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、（ｂ）に列挙した配列番号２における該アミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含む、
方法。
（項目３５）
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｉアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含む、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列変化Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤまたはＶ２６３Ｌのうち１つを有する配列番号２を含む、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｉアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ８１Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ａ９２Ｇアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、項目３７に記載の方法。
（項目４２）
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｎ１０９Ｄアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、項目３７に記載の方法。
（項目４３）
前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｖ２６３Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、項目３７に記載の方法。
（項目４４）
ａ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含み、および
ｂ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤおよびＶ２６３Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
項目３４に記載の方法。
（項目４５）
ａ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１を含み、および
ｂ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｉ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９ＤおよびＶ２６３Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
項目３４に記載の方法。
（項目４６）
ａ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、Ｗ４６Ｌアミノ酸配列変化を有する配列番号１を含み、および
ｂ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２ＧおよびＮ１０９Ｄアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
項目３４に記載の方法。
（項目４６）
ａ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１を含み、および
ｂ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌ、Ｍ８１Ｌ、Ａ９２Ｇ、およびＮ１０９Ｄアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
項目３４に記載の方法。
（項目４８）
ａ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１を含み、および
ｂ．前記安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、Ｍ２０Ｌ、Ｍ８１ＬおよびＡ９２Ｇアミノ酸配列変化を有する配列番号２を含む、
項目３４に記載の方法。
（項目４９）
前記抗ＣＤ２０抗体の重鎖または軽鎖のいずれかが、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、円二色性（ＣＤ）分光法、蛍光発光分光法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、サイズ排除クロマトグラフィーまたは熱的チャレンジアッセイによって測定した場合に、野生型抗ＣＤ２０抗体の対応する重鎖または軽鎖よりも優れた熱安定性を有する場合に、該抗ＣＤ２０抗体が安定化しているとみなされる、項目３４に記載の方法。
（項目５０）
前記安定化抗ＣＤ２０抗体が、同じ量の野生型抗ＣＤ２０抗体と比較した場合に、増強された抗原結合活性、有効期間、血清半減期、ＡＵＣまたはＣｍａｘを有する、項目３４に記載の方法。
（項目５１）
前記抗ＣＤ２０抗体の軽鎖または重鎖アミノ酸配列が、該抗体がＣＤ２０分子に結合する能力、、補体を固定する能力、ＣＤ−２０発現細胞をオプソニン化する能力、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化する能力、抗体依存性プログラム細胞死を活性化する能力、マクロファージ依存性抗ＣＤ２０免疫応答を活性化する能力、化学療法に対して感受性のＣＤ２０保有細胞を活性化する能力を増強する、または該抗ＣＤ２０抗体が補体を固定する能力を低減させるさらなるアミノ酸変化、ならびにそれらの組合せを有する、項目３４に記載の方法。
（項目５２）
前記抗ＣＤ２０抗体がエフェクターに結合している、項目３４に記載の方法。
（項目５３）
前記エフェクターが、放射性同位体、化学療法剤、毒素、生体応答改変因子または第２の抗体である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記抗ＣＤ２０抗体が、ＰＥＧ、アルブミンまたはポリシアル酸に結合している、項目３４に記載の方法。
（項目５５）
前記疾患が、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、関節リウマチ、ウェゲナー肉芽腫症または顕微鏡的多発血管炎である、項目３４に記載の方法。
（項目５６）
前記抗ＣＤ２０抗体が、インタクトな抗体、単鎖可変領域（ＳｃＦｖ）抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片またはＦａｂ’２抗体断片の形態である、項目３４に記載の方法。
（項目５７）
患者においてＣＤ２０ポリペプチドを定量的に検出する方法であって、薬学的に許容されるキャリア中の診断有効量の安定化抗ＣＤ２０抗体を該患者に投与するステップを含み、
ａ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列または該軽鎖アミノ酸配列の等価物が、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ｐ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｙ７０ＦおよびＡ７９Ｐのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；
ｂ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列または該重鎖アミノ酸配列の等価物が、配列番号２または以下のアミノ酸配列変化：Ｖ３７ＬおよびＭ２０Ｌ、Ｍ２０ＬおよびＡ９２Ｇ、Ｑ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ｅ１０Ｇ、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｔ２８Ｓ、Ｙ３２Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９Ｄ、Ａ１１３Ｑ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９ＬならびにＶ３１２Ｉのうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；
ｃ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列または該軽鎖アミノ酸配列の等価物が、（ａ）に列挙した配列番号１における該アミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み、または該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列もしくは該重鎖アミノ酸配列の等価物が、（ｂ）に列挙した配列番号２における該アミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み；ならびに
ｄ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体が、インタクトな抗体、Ｆｖ断片、単鎖可変領域（ＳｃＦｖ）抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片またはＦａｂ’２  Ｆａｂ抗体断片の形態である、
方法。
（項目５８）
生物学的検体中のＣＤ２０ポリペプチドを定量的に検出する方法であって、診断量の安定化抗ＣＤ２０抗体を該生物学的検体と接触させるステップを含み、
ａ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列または該軽鎖アミノ酸配列の等価物が、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ｐ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｙ７０ＦおよびＡ７９Ｐのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；
ｂ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列または該重鎖アミノ酸配列の等価物が、配列番号２または以下のアミノ酸配列変化：Ｖ３７ＬおよびＭ２０Ｌ、Ｍ２０ＬおよびＡ９２Ｇ、Ｑ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ｅ１０Ｇ、Ｍ２０Ｌ、Ｍ２０Ｉ、Ｔ２８Ｓ、Ｙ３２Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｎ１０９Ｄ、Ａ１１３Ｑ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９ＬならびにＶ３１２Ｉのうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；
ｃ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列または該軽鎖アミノ酸配列の等価物が、（ａ）に列挙した配列番号１における該アミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み、または該安定化抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列もしくは該重鎖アミノ酸配列の等価物が、（ｂ）に列挙した配列番号２における該アミノ酸配列変化のうち少なくとも１つを含み；ならびに
ｄ．単離された該安定化抗ＣＤ２０抗体が、インタクトな抗体、Ｆｖ断片、単鎖可変領域（ＳｃＦｖ）抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片またはＦａｂ’２  Ｆａｂ抗体断片の形態である、方法。
（項目５９）
前記抗ＣＤ２０抗体が、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット、スロットブロット、抗原捕捉アッセイまたはマイクロアレイアッセイにおいて使用される、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
単離された抗ＣＤ２０抗体であって、
ａ．該抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号１または以下のアミノ酸配列変化：Ｑ１Ｄ、Ｓ５Ｔ、Ａ９Ｓ、Ａ９Ｌ、Ｉ１０Ｌ、Ｉ１０Ｆ、Ｉ１０Ｓ、Ｉ１０Ｔ、Ａ１３Ｖ、Ｐｌ５Ａ、Ｐ１５Ｌ、Ｐｌ５Ｖ、Ｋ１８Ｑ、Ｋ１８Ｒ、Ｋ１８Ｅ、Ｍ２１Ｉ、Ｍ２１Ｌ、Ｓ２７Ｑ、Ｓ２７Ｋ、Ｉ３２Ｌ、Ｈ３３Ｎ、Ｆ３５Ｙ、Ｐ３９Ｓ、Ｓ４１Ａ、Ｓ４１Ｔ、Ｓ４１Ｑ、Ｓ４２Ａ、Ｓ４２Ｐ、Ｐ４５Ｌ、Ｐ４５Ｒ、Ｗ４６Ｌ、Ｗ４６Ｉ、Ａ４９Ｄ、Ｓ５５Ｐ、Ｖ５９Ａ、Ｖ５９Ｄ、Ｆ６１Ｔ、Ｓ６９Ｄ、Ｓ６９Ｎ、Ｓ６９Ｔ、Ｙ７０Ｆ、Ｓ７１Ｔ、Ａ７９Ｐ、Ａ８２Ｌ、Ａ８２Ｖ、Ａ８２Ｆ、Ｑ８８ＬおよびＧ９９Ｑのうち１つもしくは複数を有する配列番号１を含み；
ｂ．該抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、配列番号２、または以下のアミノ酸配列変化：
ｉ．Ｖ３７Ｌ、Ｍ２０Ｌ、ならびにＱ５Ｖ、Ｐ７Ｓ、Ａ９Ｇ、Ａ９Ｌ、Ｅ１０Ｇ、Ｋ１３Ｑ、Ｔ２８Ｓ、Ｔ３０Ｓ、Ｋ６７Ｒ、Ｋ６７Ｒ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｖ、Ｔ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ａ７２Ｖ、Ｋ７４Ｎ、Ｋ７４Ｔ、Ｙ８０Ｆ、Ｍ８１Ｌ、Ｓ８４Ｎ、Ａ９２Ｇ、Ｗ１０６Ｓ、Ｆ１０８Ａ、Ｎ１０９ＤおよびＡ１１３Ｑのうち１つもしくは複数；
ｉｉ．Ｍ２０Ｌ、Ａ９２Ｇ、ならびにＶ１８Ｌ、Ｋ１９Ｒ、Ｋ１９Ｓ、Ｋ１９Ｔ、Ｍ２０Ｉ、Ｍ２０Ｖ、Ｓ２５Ｔ、Ｙ２７Ｆ、Ｙ３２Ｆ、Ｙ３２Ｓ、Ｐ４１Ｈ、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５Ｒのうち１つもしくは複数；および
ｉｉｉ．Ｖ２４４Ｌ、Ｌ２４６Ｉ、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６７Ａ、Ｖ２６７Ｉ、Ｖ２６７Ｌ、Ｖ２７０Ｌ、Ｖ２７０Ｓ、Ｖ２７０Ｆ、Ｖ２７０Ｉ、Ｖ２７７Ｉ、Ｆ２７９Ｉ、Ｆ２７９Ｌ、Ｖ３０６Ｔ、Ｖ３１２Ｉ、Ｖ３１２Ｌ、Ｖ３２７Ａ、Ｖ３２７Ｌ、Ｉ３４０Ａ、Ｉ３４０Ｌ、Ｔ２５４Ｅ、Ｍ２５６Ｌ、Ｍ２５６Ｙ、Ｔ２６０Ｅ、Ｔ２６０ＦおよびＴ２６０Ｋ、
のうち１つもしくは複数を有する配列番号２を含み；ならびに
ｃ．ここで、該抗ＣＤ２０抗体の軽鎖アミノ酸配列が、（ａ）に列挙した配列番号１におけるアミノ酸変化のうち少なくとも１つを含み、または該抗ＣＤ２０抗体の重鎖アミノ酸配列が、（ｂ）に列挙した配列番号２におけるアミノ酸変化のうち少なくとも１つを含む、
単離された抗ＣＤ２０抗体。
【国際調査報告】
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