(57)【要約】  本発明は、免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するワクチン組成物に特に適した投与法に関する。この投与法は、ワクチン組成物の反復投与を伴うものであって、免疫原性ポリペプチドに対する免疫応答を増強する。【選択図】  図１
2015526403.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする核酸構築物を含有する第１ベクターを含んでなる、プライミング組成物、および
(b) 少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする核酸構築物を含有する第２ベクターを含んでなる、少なくとも１つのブースティング組成物、
を含む、組み合わせワクチンであって、
前記第１ベクター中に含まれる核酸構築物によってコードされる免疫原性ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープは、前記第２ベクター中に含まれる核酸構築物によってコードされる免疫原性ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープと、免疫学的に同一であり、
前記組み合わせワクチンはプライムブーストワクチン接種投与法に使用するためのものもであり、
(i) プライミング組成物は、鼻腔内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、筋肉内投与される；
(ii) プライミング組成物は、鼻腔内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、鼻腔内投与される；
(iii) プライミング組成物は、筋肉内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、筋肉内投与される；または
(iv) プライミング組成物は、筋肉内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、鼻腔内投与される、
前記組み合わせワクチン。
【請求項２】
第1ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１に記載の組み合わせワクチン。
【請求項３】
アデノウイルスベクターが、非ヒト類人猿由来アデノウイルスベクター、好ましくはチンパンジーもしくはボノボアデノウイルスベクターである、請求項２に記載の組み合わせワクチン。
【請求項４】
第2ベクターが、ポックスウイルスベクター、好ましくはMVA、またはアデノウイルスベクターである、請求項１〜３のいずれか１つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項５】
第1の核酸構築物を含有するアデノウイルスベクターが、第2の核酸構築物を含有するアデノウイルスベクターとは免疫学的に異なる、請求項４に記載の組み合わせワクチン。
【請求項６】
第1および/または第2の核酸構築物が、少なくとも2つのポリペプチドをコードする、請求項１〜５のいずれか1つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項７】
ポリペプチドのうち1つがT細胞応答を誘導し、もう1つのポリペプチドがB細胞応答を誘導する、請求項６に記載の組み合わせワクチン。
【請求項８】
第1および/または第2の核酸構築物によってコードされる、少なくとも2つのポリペプチドが、切断部位によって連結されている、請求項６または７に記載の組み合わせワクチン。
【請求項９】
切断部位が、自己切断部位またはエンドペプチダーゼ切断部位である、請求項８に記載の組み合わせワクチン。
【請求項１０】
自己切断部位が、ピコルナウイルス、昆虫ウイルス、アフトウイルス科、ロタウイルス、およびトリパノソーマの、ウイルス2Aペプチドまたは2A様ペプチドからなる一群から選択される2A切断部位であって、好ましくは、2A切断部位が、口蹄疫ウイルスの2Aペプチドである、請求項９に記載の組み合わせワクチン。
【請求項１１】
第1および第2の核酸構築物によってコードされる免疫原性ポリペプチドのアミノ酸配列が、実質的に同一である、請求項１〜１０のいずれか1つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項１２】
少なくとも1つの核酸構築物が、(i) 呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のフュージョンタンパク質F、(ii) RSVの核タンパク質N、および(iii) RSVのマトリックスタンパク質M2を含んでなるポリペプチドをコードする、請求項１〜１１のいずれか1つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項１３】
第1および第2の核酸構築物が、(i) RSVのフュージョンタンパク質F、(ii) RSVの核タンパク質N、および(iii) RSVのマトリックスタンパク質M2を含んでなるポリペプチドをコードする、請求項１２に記載の組み合わせワクチン。
【請求項１４】
(i) 第1ベクターがアデノウイルスベクターであり、第2ベクターがポックスウイルスベクターである；または
第1ベクターがポックスウイルスベクターであり、第2ベクターがアデノウイルスベクターである；ならびに
(ii) 第1および第2の核酸構築物が、(i) RSVのフュージョンタンパク質F、(ii)RSVの核タンパク質N、および(iii)RSVのマトリックスタンパク質M2を含んでなるポリペプチドをコードする、
請求項１〜１３のいずれか1つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項１５】
プライミング組成物が鼻腔内投与され、その後少なくとも1つのブースティング組成物が筋肉内投与される；または、プライミング組成物が鼻腔内投与され、その後少なくとも1つのブースティング組成物が鼻腔内投与される、請求項１４に記載の組み合わせワクチン。
【請求項１６】
(a) 少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする核酸構築物を含有する第1ベクターを含んでなる、プライミング組成物、および
(b) 少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドを含んでなる、少なくとも１つのブースティング組成物、
を含む、組み合わせワクチンであって、
前記プライミング組成物に含まれる核酸構築物によってコードされる免疫原性ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープは、ブースティング組成物に含まれる免疫原性ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープと、免疫学的に同一であり、
プライムブーストワクチン接種投与法に使用するためのものであり、プライミング組成物は、筋肉内または鼻腔内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物がその後投与される、
前記組み合わせワクチン。
【請求項１７】
少なくとも1つのブースティング組成物の投与が筋肉内、または鼻腔内である、請求項１６に記載の組み合わせワクチン。
【請求項１８】
(i) プライミング組成物は、鼻腔内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、筋肉内投与される；
(ii) プライミング組成物は、鼻腔内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、鼻腔内投与される；
(iii) プライミング組成物は、筋肉内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、筋肉内投与される；または
(iv) プライミング組成物は、筋肉内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、鼻腔内投与される、
請求項１６または１７に記載の組み合わせ。
【請求項１９】
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１６〜１８のいずれか1つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項２０】
アデノウイルスベクターが、非ヒト類人猿由来アデノウイルスベクター、好ましくはチンパンジーもしくはボノボアデノウイルスベクターである、請求項１９に記載の組み合わせワクチン。
【請求項２１】
核酸構築物が、少なくとも2つのポリペプチドをコードする、請求項１６〜２０のいずれか1つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項２２】
ポリペプチドのうち1つがT細胞応答を誘導し、もう1つのポリペプチドがB細胞応答を誘導する、請求項１６〜２１のいずれか1つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項２３】
切断部位が、自己切断部位またはエンドペプチダーゼ切断部位である、請求項２２に記載の組み合わせワクチン。
【請求項２４】
核酸構築物が、(i) RSVのフュージョンタンパク質F、(ii) RSVの核タンパク質N、および(iii) RSVのマトリックスタンパク質M2を含んでなるポリペプチドをコードする、請求項２１〜２３のいずれか1つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項２５】
免疫応答をブーストするためのポリペプチドがRSVのフュージョンタンパク質Fである、請求項１６〜２４のいずれか1つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項２６】
B細胞応答を引き起こすポリペプチドに対する、B細胞応答を増強するための、請求項６〜１３、および２２〜２５に記載の組み合わせワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するワクチン組成物に特に適した投与法に関する。前記の投与法は、ワクチン組成物の反復投与を伴うものであって、免疫原性ポリペプチドに対する免疫応答を増強する。
【背景技術】
【０００２】
感染症は未だに人類にとって大きな脅威である。感染症を予防もしくは治療するための１つの方法は、ワクチン接種による免疫応答の人工的誘導であるが、ワクチン接種は、抗原性物質を個体に投与して、それぞれの抗原に対する適応免疫応答が発現されるようにするものである。抗原性物質は、構造的にインタクトであるが不活化されている（すなわち非感染性の）病原体（たとえば、微生物もしくはウイルス）、または、高い免疫原性を示すことが判明している、病原体の精製成分とすることができる。病原体に対する免疫応答を誘導するためのもう１つのアプローチは、病原体の免疫原性タンパク質もしくはペプチドをコードする１つもしくは複数のベクターを含んでなる発現系の提供である。こうしたベクターは、ネイキッドプラスミドDNAの形をとることができるが、免疫原性タンパク質もしくはペプチドは、たとえば改変ワクシニアウイルス（Vaccinia virus）（たとえば改変ワクシニアアンカラ（Modified Vaccinia Ankara）；MVA）またはアデノウイルスベクターに基づいた、ウイルスベクターを使用することによって投与される。このような発現系は、環境条件に対して感受性の低い、十分に特徴付けられた成分を含むという利点がある。
【０００３】
ベクターに基づく発現系が開発されたとき、具体的な目標となるのは、こうした発現系を患者に適用することによって、それぞれの病原体の感染に対抗して防御する免疫応答が誘発されることである。しかしながら、発現系の中には、病原体に対する免疫応答を誘導はするものの、病原体の感染から完全に防御することができるほど強い免疫応答を引き起こすことができないものもある。したがって、病原体に対する防御免疫応答を誘導することができる改良された発現系、ならびに増強された免疫応答を引き起こす、既知の発現系の新規投与法が、依然として必要である。
【発明の概要】
【０００４】
第１の態様において、本発明は：
(a) 少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする核酸構築物を含有する第1ベクターを含んでなる、プライミング組成物、および
(b) 少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする核酸構築物を含有する第2ベクターを含んでなる、少なくとも１つのブースティング組成物、
を含む、組み合わせワクチン（ワクチンの組み合わせ）に関するが、
この第1ベクター中に含まれる核酸構築物によってコードされる免疫原性ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープは、第2ベクター中に含まれる核酸構築物によってコードされる免疫原性ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープと、免疫学的に同一であって、プライムブーストワクチン接種投与法に使用するために、
(i) プライミング組成物は、鼻腔内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、筋肉内投与される；
(ii) プライミング組成物は、鼻腔内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、鼻腔内投与される；
(iii) プライミング組成物は、筋肉内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、筋肉内投与される；または
(iv) プライミング組成物は、筋肉内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、鼻腔内投与される。
【０００５】
別の態様において、本発明は、
(a) 少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする核酸構築物を含有するベクターを含んでなる、プライミング組成物、および
(b) 少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドを含んでなる、少なくとも１つのブースティング組成物
を含む、組み合わせワクチンに関するが、
このプライミング組成物中に含まれる核酸構築物によってコードされる免疫原性ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープは、ブースティング組成物中に含まれる免疫原性ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープと、免疫学的に同一であって、プライムブーストワクチン接種投与法に使用するために、このプライミング組成物は筋肉内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物がその後投与される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】組換えタンパク質Fに関するElisaで測定されたFタンパク質に対する抗体の血清力価。力価は、血清プールの段階希釈によって決定したが、バックグラウンド＋3×標準偏差より高い値を与える希釈度で表す。棒グラフの上の数字は、組換えタンパク質の単回投与に対する別の投与法の抗体価の増加倍率を示す。
【図２】GFPタンパク質を発現する組換えRSV-Aウイルスを用いた、Hep2細胞におけるRSV感染アッセイで、FACSに基づいて中和価を測定した。データは、ウイルス感染を50 %阻害する血清希釈度である、EC50として表される。
【図３】Fタンパク質抗原全体にわたるペプチドプールでex vivo再刺激した後の脾臓および肺リンパ球のIFNγT細胞Elispot。棒グラフは、異なる方法で免疫化した3群の動物で測定されたT細胞応答の、平均＋標準誤差を表す。PanAd3ベクターでプライミングした動物だけが、脾臓と肺の両方でT細胞応答を示す。
【図４】コットンラットの肺（左図）および鼻（右図）におけるRSV複製。ウイルス力価は、それぞれの臓器の溶解液を用いてHep-2細胞のプラークアッセイで測定し、組織グラムあたりのLog10 pfuの平均として表した。青いラインはアッセイの検出限界を示す。
【図５】RSVワクチン抗原全体にわたるペプチドプールでex vivo再刺激した後の脾臓および肺リンパ球のIFNγT細胞Elispot。黒い棒グラフは、筋肉内でPanAd3により免疫化され、次に筋肉内でMVA-RSVにより免疫化された動物群で測定されたT細胞応答の平均を表す。灰色の棒グラフは、鼻腔内でPanAd3により免疫化され、次に筋肉内でMVA-RSVにより免疫化された動物群で測定されたT細胞応答の、平均＋標準誤差を表す。
【図６】Fタンパク質に対する抗体の血清力価（パネルA）は、組換えタンパク質Fに関するELISAで測定した。中和価（パネルB）は、GFPタンパク質を発現する組換えRSV-Aウイルスを用いたHep2細胞のRSV感染アッセイで、FACSに基づいて測定した。データは、ウイルス感染を50 %阻害する血清希釈度である、EC50として表される。
【図７】コットンラットの肺（左図）および鼻（右図）におけるRSV複製。ウイルス力価は、それぞれの臓器の溶解液を用いてHep-2細胞のプラークアッセイで測定し、組織グラムあたりのLog10 pfuの平均として表した。
【図８】感染仔ウシの鼻汁（左図）および肺（右図）におけるRSV複製。ウイルス力価は、鼻スワブまたは肺の各部の溶解液を用いてMDBK細胞のプラークアッセイで測定し、サンプルmlあたりのLog10 pfuの平均として表した。Log 10 = 2はアッセイの検出限界を示す。
【図９】コットンラットの鼻におけるRSV複製。ウイルス力価は、鼻粘膜の溶解液を用いてHep-2細胞のプラークアッセイで測定し、組織グラムあたりのLog10 pfuの平均として表した。点線はアッセイの検出限界を示す。
【図１０】ブースト当日（白抜き三角 = プライムの4週間後）および攻撃感染（challenge）当日（黒三角 = ブーストの3、8、および12週間後）に測定されたRSV血清中和抗体価。中和力価は、ヒトRSV Long株に感染したHep2細胞のプラーク減少アッセイで測定した。データは、対照に対してプラークの60%を阻害する血清の希釈度であるEC60として表される。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明の詳細な説明
他に特に明記しない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
【０００８】
本明細書で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)に記載のように定義されることが好ましい。
【０００９】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲の全体を通じて、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、「含む」（"comprise"）という単語、ならびに"comprises"および"comprising"といった語尾変化形は、当然のことながら、明記された、１つの整数値もしくはステップ、または複数の整数値もしくはステップからなる一群を包含することを意味するが、その他の、１つの整数値もしくはステップ、または複数の整数値もしくはステップからなる一群の、排除を意味しない。
【００１０】
本明細書の本文全体を通して、いくつかの文献が引用される。本明細書に引用される文献のそれぞれは（あらゆる特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、使用説明書などを含む）、上記も下記も、その全体を参考として本明細書に含めるものとする。本明細書の何ものも、本発明が先行発明のせいでそうした開示に先行する資格がないと認めていると解釈されるべきではない。本発明の一態様に関連して本明細書で与えられるすべての定義は、本発明の他の態様にも適用される。
【００１１】
本発明の基礎となる研究において、特定の投与法が、免疫原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを含んでなる、ワクチン組成物によって与えられる免疫を、有意に増加させることが判明した。
【００１２】
したがって、第１の態様において本発明は、
(a) 少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする核酸構築物を含有する第1ベクターを含んでなる、プライミング組成物、および
(b) 少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする核酸構築物を含有する第2ベクターを含んでなる、少なくとも１つのブースティング組成物、
を含む、組み合わせワクチンに関するが、
この第1ベクター中に含まれる核酸構築物によってコードされる免疫原性ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープは、第2ベクター中に含まれる核酸構築物によってコードされる免疫原性ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープと、免疫学的に同一であって、プライムブーストワクチン接種投与法に使用するために、
(i) プライミング組成物は、鼻腔内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、筋肉内投与される；
(ii) プライミング組成物は、鼻腔内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、鼻腔内投与される；
(iii) プライミング組成物は、筋肉内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、筋肉内投与される；または
(iv) プライミング組成物は、筋肉内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、鼻腔内投与される。
【００１３】
一部の例において、好ましいプライムブーストワクチン接種投与法は(i)であり、それは、たとえば、鼻および上気道において強力な免疫応答を引き起こすことによって、特に効果的な防御免疫を与えるからである。
【００１４】
ベクター
「ベクター」という用語は、本明細書では、少なくとも1つのポリヌクレオチド、または、少なくとも1つのポリヌクレオチドと少なくとも1つのタンパク質の混合物を指すが、このタンパク質はベクターに含まれるポリヌクレオチドを細胞内に導入する能力を有するものである。ベクターに含まれる少なくとも1つのポリヌクレオチドは、少なくとも1つの免疫原性タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸構築物からなるか、またはそれを含んでなる。本発明の核酸構築物からなる、またはそれを含んでなる、ポリヌクレオチドに加えて、追加のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドを、細胞に導入してもよい。追加のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドを加えることは、前記の追加ポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドが本発明の核酸構築物を細胞内に導入するために必要であるならば、あるいは、追加のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドが本発明の核酸構築物によってコードされる免疫原性ポリペプチドの発現を増大させるならば、特に望ましい。
【００１５】
本発明との関連において、導入された核酸構築物によってコードされる1つもしくは複数の免疫原性ポリペプチドは、1つもしくは複数のベクターの導入で、細胞内で発現されることが好ましい。適当なベクターの例としては、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、または人工染色体が挙げられるがそれに限定されない。
【００１６】
ある好ましい実施形態において、本発明の核酸構築物を含んでなる第1および第2のベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、および人工染色体からなる一群から選択される。より好ましくは、本発明の実施に適したベクターは、ファージベクター、好ましくはラムダファージおよび繊維状ファージベクター、またはウイルスベクターである。
【００１７】
適当なウイルスベクターは、天然に存在するベクターを基にしているが、それは、非複製的とも呼ばれる複製不全となるように改変されている。非複製型ウイルスは、複製のためにトランスのタンパク質の提供を必要とする。典型的には、そうしたタンパク質は、ウイルス産生細胞株において安定的に、または一過性に発現され、それによってウイルスの複製を可能にする。したがって、ウイルスベクターは好ましくは、感染性であって、しかも非複製的である。当業者は、さまざまなウイルスを複製不全にする方法を承知している。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、ベクターは、アデノウイルス（adenovirus）ベクター、アデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus）(AAV)ベクター (たとえば、AAV血清型5および血清型2)、アルファウイルス（alphavirus）ベクター (たとえば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Venezuelan equine encephalitis virus）(VEE)、シンドビスウイルス（sindbis virus）(SIN)、セムリキ森林ウイルス（semliki forest virus）(SFV)、およびVEE-SINキメラ)、ヘルペスウイルス（herpes virus）ベクター (たとえば、アカゲザルサイトメガロウイルス(RhCMV)のようなサイトメガロウイルス（cytomegalovirus）由来のベクター (14))、アレナウイルス（arena virus）ベクター (たとえば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（lymphocytic choriomeningitis virus）(LCMV)ベクター(15))、麻疹ウイルス（measles virus）ベクター、ポックスウイルス（pox virus）ベクター (たとえば、ワクシニアウイルス、改変ワクシニアアンカラ(MVA)、NYVAC (ワクシニアのコペンハーゲン株に由来する)、およびアビポックス（avipox）ベクター：カナリア痘（canarypox）(ALVAC)および鶏痘（fowlpox）(FPV)ベクター)、水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitis virus）ベクター、レトロウイルス、レンチウイルス（lentivirus）、ウイルス性粒子、および細菌胞子からなる一群から選択される。
【００１９】
特定の施形態において、好ましいベクターは、アデノウイルスベクター、詳細にはヒトもしくは非ヒト類人猿に由来するアデノウイルスベクター、およびポックスウイルスベクター、好ましくはMVAである。アデノウイルスの由来する好ましい類人猿は、チンパンジー（チンパンジー属（Pan））、ゴリラ（ゴリラ属（Gorilla））、およびオランウータン（オランウータン属（Pongo））であるが、好ましくはボノボ（Pan paniscus）およびナミチンパンジー（Pan troglodytes）である。典型的には、天然に存在する非ヒト類人猿アデノウイルスは、個々の類人猿の糞便サンプルから分離される。もっとも好ましいベクターは、hAd5、hAd11、hAd26、hAd35、hAd49、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd55、ChAd63、ChAd73、ChAd82、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2、およびPanAd3 ベクターに基づく非複製型アデノウイルスベクター、または複製不全Ad4およびAd7ベクターである。ヒトアデノウイルスhAd4、hAd5、hAd7、hAd11、hAd26、hAd35、およびhAd49がよく知られている。天然に存在するChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63、およびChAd82に基づくベクターは、WO 2005/071093に詳細に記載されている。天然に存在するPanAd1、PanAd2、PanAd3、ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、およびChAd147に基づくベクターは、WO 2010/086189に詳細に記載されている。
【００２０】
「非複製型アデノウイルス」という用語は、ウイルスの複製に必須の遺伝子産物、たとえばE1、E2、E3およびE4から選択されるアデノウイルス遺伝子のうち1つもしくは複数について、少なくとも機能的な欠失、または完全な除去を含むように操作されたために、複製不能とさせられたアデノウイルスを意味する。
【００２１】
使用される第1のベクターは、好ましくはアデノウイルスベクターであり、より好ましくは非ヒト類人猿、たとえばチンパンジーもしくはボノボ由来アデノウイルスベクターであって、より詳細には、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd55、ChAd63、ChAd73、ChAd82、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2、およびPanAd3に基づく非複製型アデノウイルスベクター、またはhAd4およびhAd7に基づく複製不全ベクターである。もっとも好ましいベクターはPanAd3に基づくものである。
【００２２】
好ましくは、第2のベクターは、ポックスウイルスベクター、特にMVA、であるか、またはアデノウイルスベクター、好ましくは非ヒト類人猿由来アデノウイルスベクターである。好ましい非複製型アデノウイルスベクターは、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd55、ChAd63、ChAd73、ChAd82、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2、およびPanAd3ベクター、または複製不全Ad4およびAd7ベクターに基づく。
【００２３】
第1および第2のベクターがアデノウイルスベクターであるならば、第1および第2のベクターとして免疫学的に異なるアデノウイルスベクターを使用することが、好ましい場合がある。2つのベクターが免疫学的に同一である場合、免疫応答のプライミングの際に第1のベクターに対して形成された抗体が、免疫応答をブーストするために使用される第2のベクターによる、患者の形質導入を損なうリスクが存在する可能性がある。アデノウイルス、ひいてはアデノウイルスベクターは、典型的には、3つのエンベロープタンパク質、すなわち、ヘキソン、ペントン、およびファイバーを含有する。所与のアデノウイルスに対する宿主の免疫応答は、主としてヘキソンタンパク質によって決定される。したがって、2つのアデノウイルスは、その2つのアデノウイルスのヘキソンタンパク質が少なくとも1つのエピトープにおいて異なっていれば、本発明の意味において、免疫学的に相違するとみなされる。ヘキソンのT細胞およびB細胞エピトープはマッピングされている。
【００２４】
本発明のある特定の実施形態において、第1のベクターは、アデノウイルスベクター、特にPanAd3であり、第2のベクターは、ポックスウイルスベクター、特にMVA、またはアデノウイルスベクターである。
【００２５】
本発明のある好ましい実施形態において、第1のベクターはPanAd3であり、第2のベクターはMVAである。MVAに関する記述は、Mayr A, Stickl H, Muller HK, Danner K, Singer H. “The smallpox vaccination strain MVA: marker, genetic structure, experience gained with the parenteral vaccination and behavior in organisms with a debilitated defence mechanism.”  Zentralbl Bakteriol B. 1978 Dec;167(5-6):375-90、およびMayr, A., Hochstein-Mintzel, V. & Stickl, H. (1975). “Abstammung, Eigenschaften und Verwendung des attenuierten Vaccinia-Stammes MVA.“ Infection 3, 6-14に見いだすことができる。
【００２６】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、本明細書を通じて区別なく使用される。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド単量体から作られた高分子として理解される。ヌクレオチド単量体は、核酸塩基、五炭糖（リボースもしくは2'-デオキシリボースなどであるがそれに限定されない）、および1から3個のリン酸基で構成される。典型的には、ポリヌクレオチドは、個々のヌクレオチド単量体間のホスホジエステル結合によって形成される。本発明に関連して、好ましい核酸分子には、リボ核酸（RNA）およびデオキシリボ核酸（DNA）があるが、それに限定されない。さらに、「ポリヌクレオチド」という用語にはDNAもしくはRNAの人工アナログ、たとえばペプチド核酸（PNA）なども含まれる。
【００２７】
ほかに適当なベクターが、PCT/EP2011/074307に詳細に記載されている。この出願の開示は、そこに開示される発現系に関するその開示内容について、参考としてここに組み入れられる。
【００２８】
ポリペプチド
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、本明細書において区別なく使用され、長さ、同時翻訳修飾、または翻訳後修飾にかかわらず、アミノ酸からなる任意のペプチド結合鎖を表す。
【００２９】
本明細書で使用される「翻訳後の」という用語は、ヌクレオチドトリプレットをアミノ酸に翻訳し、その配列の順に前のアミノ酸とペプチド結合を形成した後に起こるイベントを表す。このような翻訳後のイベントは、完全なポリペプチドが形成された後に、または翻訳プロセスの間にすでに、それまでに翻訳されたポリペプチドの部分で、生じる可能性がある。翻訳後のイベントは典型的には、結果として生じるポリペプチドの化学的性質もしくは構造特性を変更もしくは修正する。翻訳後イベントの例としては、アミノ酸のグリコシル化もしくはリン酸化、または、たとえばエンドペプチダーゼによる、ペプチド鎖の切断などのイベントが挙げられるが、それに限定されない。
【００３０】
本明細書で使用される「同時翻訳の」という用語は、ヌクレオチドトリプレットのアミノ酸鎖への翻訳プロセスの間に起こるイベントを表す。そうしたイベントは典型的には、結果として生じるアミノ酸鎖の化学的性質もしくは構造特性を変更もしくは修正する。同時翻訳イベントの例としては、翻訳プロセスを完全に止めることができるイベント、またはペプチド結合形成を中断させて、結果として2つの個別の翻訳産物を生じる可能性のあるイベントがあるが、それに限定されない。
【００３１】
「ポリプロテイン」または「人工ポリプロテイン」という用語は、本明細書では、互いに自然には連結されていない2つのアミノ酸鎖を含んでなる1つのアミノ酸鎖、または基本的にその2つのアミノ酸鎖からなる1つのアミノ酸鎖、またはその2つのアミノ酸鎖からなる1つのアミノ酸鎖を表す。ポリプロテインは、1つもしくは複数の追加のアミノ酸鎖を含んでいてもよい。各アミノ酸鎖は、完全なタンパク質、すなわちORF全体に及ぶものとすることができるが、その断片、ドメインもしくはエピトープであってもよい。ポリプロテインの個々の部分は互いに、恒久的に連結されていても、一時的に連結されていてもよい。恒久的に連結されているポリプロテインの部分は、1つのORFから翻訳され、翻訳時または翻訳後に、後から分離されない。一時的に連結されているポリプロテインの部分も、1つのORFに由来してもよいが、翻訳プロセスの間に、分離によって翻訳と同時に分割されるか、または、たとえばエンドペプチダーゼによるペプチド鎖の切断により、翻訳後に分割される。それに加えて、またはその代わりに、ポリプロテインの部分は、2つの異なるORFに由来してもよく、たとえば共有結合によって、翻訳後に連結される。
【００３２】
本発明で使用可能なタンパク質もしくはポリプロテイン（タンパク質誘導体、タンパク質バリアント、タンパク質断片、タンパク質セグメント、タンパク質エピトープ、およびタンパク質ドメインを含む）は、化学修飾によってさらに修飾することができる。したがって、そうした化学修飾ポリペプチドは、20個の天然に存在するアミノ酸に見られる残基以外の化学基を含んでいる可能性がある。そうしたその他の化学基の例としては、グリコシル化アミノ酸、およびリン酸化アミノ酸があるが、それに限定されない。ポリペプチドの化学修飾は、親ペプチドに比べて有利な特性、たとえば安定性の向上、生物学的半減期の増加、または水溶性の上昇のうち1つもしくはいくつかを与えることができる。本発明で使用可能なバリアントに適用することができる化学修飾には、PEG化や、非グリコシル化親ポリペプチドのグリコシル化、または親ポリペプチドに存在するグリコシル化パターンの変更があるが限定はしない。本発明で使用可能なバリアントに適用することができるこのような化学修飾は、翻訳と同時に行われても、翻訳後に行われてもよい。
【００３３】
本明細書に記載の「免疫原性ポリペプチド」は、少なくとも1つのエピトープを含有する上記のポリペプチドである。「エピトープ」は、抗原決定基としても知られており、免疫系によって認識されるポリペプチドの部分である。好ましくは、この認識は、抗体、B細胞、またはT細胞が当該エピトープに結合することによってなされる。これに関連して、「結合」という用語は好ましくは、特異的結合に関する。好ましくは、抗体とエピトープとの特異的結合は、抗体のFab（フラグメント、抗原結合）領域によってなされ、B細胞の特異的結合は、B細胞受容体に含まれる抗体のFab領域によってもたらされ、T細胞の特異的結合は、T細胞受容体の可変（V）領域によってもたらされる。
【００３４】
本発明の免疫原性ポリペプチドは、ウイルス、細菌、および原虫からなる一群から選択される、病原体に由来することが好ましい。特定の実施形態において、それはウイルスに由来するが、特に好ましい一実施形態において、それは呼吸器合胞体ウイルス（RSV）に由来する。しかしながら、本発明のまた別の実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、がんによって発現されるポリペプチド、またはポリペプチドの断片である。
【００３５】
好ましい免疫原性ポリペプチドは、B細胞応答、またはT細胞応答、またはB細胞応答およびT細胞応答を誘導する。
【００３６】
エピトープは通常、アミノ酸もしくは糖側鎖といった、化学的に活性な表面の分子団からなり、通常、特異的な三次元構造特性、ならびに特異的な電荷特性を有する。「エピトープ」という用語は、立体構造エピトープならびに非立体構造エピトープを表す。立体構造エピトープおよび非立体構造エピトープは、前者との結合が変性溶媒の存在下で失われるが、後者との結合はそうではないという点で区別される。
【００３７】
2つ以上の免疫原性ポリペプチドが同一の抗体、T細胞、もしくはB細胞によって認識されるならば、それらは「免疫学的に同一」である。同一の抗体、T細胞、もしくはB細胞によって2つ以上の免疫原性ポリペプチドが認識されることは、前記抗体、T細胞、もしくはB細胞の「交差反応性」としても知られている。同一の抗体、T細胞、もしくはB細胞によって2つ以上の免疫学的に同一のポリペプチドが認識されるのは、すべてのポリペプチド中に同一もしくは類似のエピトープが存在することによる。類似したエピトープは、同一の抗体もしくはB細胞受容体の、Fab領域、または同一のT細胞受容体のV領域に結び付けられる構造特性および/または電荷特性を十分に共有している。抗体、T細胞受容体、またはB細胞受容体の結合特性は、典型的には、当該エピトープに対する受容体の結合親和性によって決まる。2つの免疫原性ポリペプチドは、低い方の親和定数を持つポリペプチドの親和定数が、高い親和定数を持つポリペプチドの親和定数の、少なくとも30 %、少なくとも40 %、少なくとも50 %、少なくとも60 %、少なくとも70 %、少なくとも80 %、少なくとも90 %、少なくとも95 %、または少なくとも98 %であるならば、本明細書によって明らかなように「免疫学的に同一」である。平衡透析法または酵素結合免疫吸着法（ELISA）などの、受容体に対するペプチドの結合親和性を測定するための方法は、当技術分野でよく知られている。
【００３８】
2つ以上の「免疫学的に同一な」ポリペプチドは、少なくとも1つの同一エピトープを含有することが好ましい。免疫原性ポリペプチドが同一のエピトープを含んでいるか、または同一のアミノ酸配列を有するならば、通常もっとも強いワクチン接種効果を得ることができる。
【００３９】
本明細書において、アミノ酸配列が別のポリペプチドのアミノ酸配列と「実質的に同一」であるポリペプチドは、その別のポリペプチド（またはセグメント、エピトープ、もしくはドメイン）と比べて、アミノ酸配列における1つまたは複数の変化で異なっているポリペプチドバリアントである。タンパク質バリアントが由来するもとのポリペプチドは、親ポリペプチドとしても知られている。典型的には、バリアントは人工的に、好ましくは遺伝子工学の手法によって構築される。典型的には、親ポリペプチドは、野生型タンパク質、または野生型タンパク質ドメインである。本発明に関連して、親ポリペプチド（もしくは親セグメント）は、2つ以上の野生型ポリペプチドの（または野生型セグメント）のコンセンサス配列とすることもできる。さらに、本発明に使用可能なバリアントは、親ポリペプチドのホモログ、オルソログ、もしくはパラログに由来してもよいが、人工的に構築されたバリアントに由来してもよく、ただしそれは、そのバリアントが親ポリペプチドの少なくとも1つの生物活性を示す場合である。好ましくは、バリアントが共有する親ポリペプチドの少なくとも1つの生物活性は、２つのポリペプチドを上記のように「免疫学的に同一な」状態にする、少なくとも１つのエピトープの存在である（または、存在を含む）。
【００４０】
アミノ酸配列の変化は、アミノ酸置換、挿入、欠失、N末端トランケーション、もしくはC末端トランケーション、またはこうした変化の任意の組み合わせとすることができるが、これらの変化は１つの部位で起こっても、複数部位で起こってもよい。ある好ましい実施形態において、本発明に使用可能なバリアントは、アミノ酸配列中に、総数で最大200（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、または200以下）の変化（すなわち、置換、挿入、欠失、N末端トランケーション、および/またはC末端トランケーション）を示す。アミノ酸置換は、保存的および/または非保存的とすることができる。ある好ましい実施形態において、本発明に使用可能なバリアントは、それが由来するもとのタンパク質もしくはドメインと、最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100個までのアミノ酸置換、好ましくは保存的アミノ酸置換により異なる。
【００４１】
その代わりに、またはそれに加えて、本明細書で使用される「バリアント」は、親ポリペプチド、またはそれをもたらす親ポリヌクレオチドに対する、ある程度の配列同一性によって特徴付けることができる。より正確には、別のポリペプチドと「実質的に同一」であるタンパク質バリアントは、その別のポリペプチドに対して少なくとも80 %の配列同一性を示す。本発明との関連において、ポリヌクレオチドバリアントは、その親ポリヌクレオチドに対して少なくとも80 %の配列同一性を示す。好ましくは、タンパク質バリアントの配列同一性は、一続きの20、30、40、50、60、70、80、90、100個、またはそれ以上のアミノ酸の全体にわたる。ポリヌクレオチドバリアントの配列同一性は、一続きの60、90、120、135、150、180、210、240、270、300個、またはそれ以上のヌクレオチドの全体にわたることが好ましい。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態において、その親ポリペプチドと「実質的に同一」であるポリペプチドは、前記親ポリペプチドに対して少なくとも80 %の配列同一性を有する。より好ましくは、前記ポリペプチドは、免疫学的に親ポリペプチドと同一であって、親ポリペプチドに対して少なくとも80 %の配列同一性を有する。
【００４３】
「少なくとも80 %の配列同一性」という表現は、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列比較に関して、本明細書の全体を通して使用される。この表現は、それぞれの基準のポリペプチド、またはそれぞれの基準のポリヌクレオチドに対する、少なくとも80 %、少なくとも81 %、少なくとも82 %、少なくとも83 %、少なくとも84 %、少なくとも85 %、少なくとも86 %、少なくとも87 %、少なくとも88 %、少なくとも89 %、少なくとも90 %、少なくとも91 %、少なくとも92 %、少なくとも93 %、少なくとも94 %、少なくとも95 %、少なくとも96 %、少なくとも97 %、少なくとも98 %、または少なくとも99 %の配列同一性を表す。好ましくは、問題となっているポリペプチド、およびその基準となるポリペプチドは、一続きの20、30、40、50、60、70、80、90、100個、もしくはそれ以上のアミノ酸の全体にわたって、または基準ポリペプチドの全長にわたって、指示された配列同一性を示す。好ましくは、問題となっているポリヌクレオチド、およびその基準となるポリヌクレオチドは、一続きの60、90、120、135、150、180、210、240、270、300個、もしくははそれ以上のヌクレオチドの全体にわたって、または基準ポリペプチドの全長にわたって、指示された配列同一性を示す。
【００４４】
それに加えて、もしくはその代わりに、ポリペプチドのバリアントはアミノ酸の欠失を含んでいてもよく、その欠失はN末端トランケーション、C末端トランケーション、もしくは内部の欠失、またはこれらの任意の組み合わせとすることができる。N末端トランケーション、C末端トランケーション、および/または内部の欠失を含むこのようなバリアントは、本明細書の文脈において「欠失バリアント」または「断片」と称される。「欠失バリアント」および「断片」という用語は、本明細書において区別なく使用される。断片は天然に存在することもあるが（たとえば、スプライスバリアント）、人工的に、たとえば遺伝子工学の手法によって、構築することもできる。断片（すなわち欠失バリアント）は、好ましくはN末端、NおよびC末端、もしくはC末端において、または内部に、親ポリペプチドと比べて、最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100個までのアミノ酸の欠失を有することができる。2つの配列を比較するが、比較して配列同一性パーセンテージを算出すべき基準配列が定められていない場合には、特に別段の指示がない限り、比較すべき2つの配列の長い方を基準として、配列同一性を算出するものとする。基準配列が指示されている場合には、特に別段の指示がない限り、配列同一性は、配列番号で指定された基準配列の全長を基準として算定される。
【００４５】
それに加えて、またはその代わりに、欠失バリアントは、上記の個々のアミノ酸の構造的欠失によるのではなく、上記アミノ酸が阻害されているか、さもなくばその生物学的機能を果たすことができないことに起因して、生じることがある。典型的には、こうした機能的欠失は、結果として得られるタンパク質の機能的特性を変化させる、アミノ酸配列への挿入もしくは置換に起因して生じるものであって、それはたとえば、結果として得られるタンパク質の化学的性質の変化（すなわち、疎水性アミノ酸から親水性アミノ酸への置換）、結果として得られるタンパク質の翻訳後修飾の変化（たとえば、翻訳後切断もしくはグリコシル化パターン）、またはタンパク質の二次構造もしくは三次構造の変化であるがそれに限定されない。好ましくは、上記の機能的欠失は、免疫原性ポリペプチドのエピトープの破壊を結果的にもたらす、少なくとも1つのアミノ酸の挿入もしくは置換によって引き起こされる。
【００４６】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の類似性、すなわち配列同一性のパーセンテージは、配列アラインメントによって求めることができる。このようなアラインメントは、当業界で知られているいくつかのアルゴリズムを用いて実行することができるが、KarlinおよびAltschulの数学アルゴリズム(Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877)、hmmalign (HMMER package, http://hmmer.wustl.edu/)、またはCLUSTALアルゴリズム(Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80)を用いることが好ましく、CLUSTALアルゴリズムはたとえば、http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/、もしくはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html、もしくはhttp://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.htmlで利用することができる。使用される好ましいパラメーターは、http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/もしくはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlで設定すると、デフォルトパラメーターである。配列同一性（配列マッチング）の程度は、たとえば、BLAST、BLAT、またはBlastZ (もしくはBlastX)を用いて算出することができる。同様のアルゴリズムが、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410のBLASTNおよびBLASTPプログラムに組み込まれている。BLASTポリヌクレオチド検索は、BLASTNプログラム、score = 100、word length = 12で行われ、F、N、もしくはM2-1をコードする核酸と相同なポリヌクレオチド配列が得られる。BLASTタンパク質検索は、BLASTPプログラム、score = 50、word length = 3で行われ、Fポリペプチド、Nポリペプチド、もしくはM2-1ポリペプチドと相同なアミノ酸配列が得られる。比較する目的でギャップを入れたアラインメントを得るために、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載のようにGapped BLASTを利用する。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターを使用する。配列マッチング解析は、Shuffle-LAGAN (Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:I54-I62)のような確立された相同性マッピング法、またはマルコフ確率場で補うことができる。配列同一性のパーセンテージが本明細書において言及される場合、これらのパーセンテージは、特に別段の指示がない限り、長い方の配列の全長に対して算出される。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドは、別に指示のない限り、WIPO標準ST.25に準拠する標準的な一文字もしくは三文字表記にしたがって指定されるアミノ酸を含んでなる、タンパク質、ペプチド、またはそれらのバリアントをコードする。別に指示されない限り、一文字もしくは三文字表記は、天然に存在するL-アミノ酸を指示し、アミノ酸配列は、それぞれのタンパク質、ペプチド、もしくはそれらのバリアントのN末端からC末端への方向で示される。
【００４８】
本明細書では、「コンセンサス」という用語は、多重配列アラインメントの結果を表すアミノ酸もしくはヌクレオチド配列を指しており、この関連配列が相互に比較される。このようなコンセンサス配列は、それぞれの位置でもっともよく見られるアミノ酸もしくはヌクレオチドで構成されている。本発明に関連して、コンセンサス配列を得るために配列アラインメントで使用される配列は、さまざまな異なる病気の発生において世界中で分離された、亜型/血清型の異なるウイルス株の配列であることが好ましい。配列アラインメントで使用される個々の配列はそれぞれ、個別のウイルス「分離株」の配列と見なされる。たとえば、2つの分離株のみを比較したために、所定の位置について、「コンセンサスヌクレオチド」も「コンセンサスアミノ酸」も決定することができない場合には、分離株のそれぞれのアミノ酸を使用することが好ましい。
【００４９】
「T細胞応答の誘導」という語句は、病原体特異的、好ましくはウイルス特異的な、CD4+ もしくはCD8+ T細胞の発生または再刺激を表す。本発明のある実施形態において、プライミング組成物および/またはブースティング組成物は、核酸構築物によって発現される1つもしくは複数のポリペプチド中に存在するMHCクラスIまたはクラスIIエピトープに対するT細胞性適応反応を、誘導または再刺激することができる。このようなT細胞応答は、当技術分野でよく知られた方法、たとえば、全ポリペプチドの範囲にわたる合成ペプチドによるT細胞のex vivo再刺激、および増殖分析、またはインターフェロンγ産生によって、測定することができる。
【００５０】
「B細胞応答の誘導」という語句は、クラスIgGまたはIgAの免疫グロブリンを産生する、病原体特異的、たとえばウイルス特異的な、B細胞の発生または再刺激を表す。本発明のある実施形態において、プライミング組成物および/またはブースティング組成物は、核酸構築物によって発現される病原性抗原、たとえばウイルス抗原、に特異的な抗体を産生するB細胞を、誘導または再刺激することができる。このようなB細胞応答は、血清もしくは粘膜免疫グロブリンの、合成抗原によるELISAによって測定することができる。あるいはまた、誘導された抗体価をウイルス中和アッセイで測定することができる。
【００５１】
「抗病原性B細胞応答の誘導」という語句は、クラスIgGまたはIgAの免疫グロブリンを産生する、病原体特異的、たとえばウイルス特異的な、B細胞の発生または再刺激を表すが、この免疫グロブリンはそれぞれの病原体を、不活化、排除、阻止、および/または中和して、病原体に起因する疾病が発症しないようにする、ならびに/または、症状を軽くするものである。これは、病原体に対する「防御免疫反応」とも呼ばれる。本発明の好ましい実施形態において、本発明のプライミングおよび/またはブースティング組成物は、核酸構築物によって発現される病原性抗原、たとえばウイルス抗原、に特異的な抗体を産生するB細胞を、誘導または再刺激することができる。このようなB細胞応答は、血清もしくは粘膜免疫グロブリンの、合成抗原によるELISAによって測定することができる。あるいはまた、誘導された抗体価をウイルス中和アッセイで測定することができる。
【００５２】
「免疫応答の増強」という語句は、免疫原、好ましくは病原体、たとえばウイルス、に対する液性および/または細胞性免疫応答の強化または増大を表す。免疫応答の増強は、本明細書に記載の検査法、および/または当技術分野でよく知られている検査法を使用して、本発明の発現系によって引き起こされる免疫応答を、同じ抗原/免疫原のみを発現する発現系の免疫応答と比較することによって、測定することができる。
【００５３】
適当な免疫原性ポリペプチドは、PCT/EP2011/074307に詳細に記載されている。この明細書の開示内容は、そこに記載された免疫原性ポリペプチドに関するその開示内容について、参考として本明細書に含めるものとする。
【００５４】
ある好ましい実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、次の略号を用いて以下に記載される：「F」または「F0」は本明細書では区別なく使用され、パラミクソウイルス（paramyxovirus）、好ましくはRSVの、フュージョン（融合）タンパク質を表す；「G」は、パラミクソウイルス、好ましくはニューモウイルス亜科（pneumovirinae）、より好ましくはRSVの、糖タンパク質を表す；「H」は、パラミクソウイルス、好ましくはモルビリウイルス（morbillivirus）の、ヘマグルチニンタンパク質を表す；「HN」は、パラミクソウイルス、特にレスピロウイルス（Respirovirus）、アビュラウイルス（Avulavirus）、およびルブラウイルス（Rubulavirus）の、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼタンパク質を表す；「N」は、パラミクソウイルス、好ましくはRSVの、ヌクレオカプシドタンパク質を表す；「M」はパラミクソウイルス、好ましくはRSVの、グリコシル化マトリックスタンパク質を表す；パラミクソウイルスについて、略号「M2」または「M2-1」は、パラミクソウイルス、好ましくはRSVの、非グリコシル化マトリックスタンパク質を表す；「P」は、パラミクソウイルス、好ましくはRSVの、リン酸化タンパク質を表す；パラミクソウイルスについて、略号「NS1」および「NS2」は、パラミクソウイルス、好ましくはRSVの、非構造タンパク質1および2を表す；「L」は、パラミクソウイルス、好ましくはRSVの、ポリメラーゼの触媒サブユニットを表す；「HA」は、オルソミクソウイルス（orthomyxovirus）、好ましくはインフルエンザウイルス（influenzavirus）、より好ましくはインフルエンザAウイルス（influenza A virus）の、ヘマグルチニンを表す；「HA0」は、オルソミクソウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス、より好ましくはインフルエンザAウイルスの、ヘマグルチニンサブユニットHA1およびHA2の前駆体タンパク質を表す；「H1p」は、オルソミクソウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス、より好ましくはインフルエンザAウイルスの、改変ヘマグルチニンを表す；「NA」は、オルソミクソウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス、より好ましくはインフルエンザAウイルスの、ノイラミニダーゼを表す；「NP」は、オルソミクソウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス、より好ましくはインフルエンザAウイルスの、核タンパク質を表す；「M1」は、オルソミクソウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス、より好ましくはインフルエンザAウイルスの、マトリックスタンパク質1を表す；オルソミクソウイルスについて、略号「M2」は、オルソミクソウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス、より好ましくはインフルエンザAウイルスの、マトリックスタンパク質M2を表す；オルソミクソウイルスについて、略号「NS1」は、オルソミクソウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス、より好ましくはインフルエンザAウイルスの、非構造タンパク質1を表す；「NS2/NEP」は、オルソミクソウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス、より好ましくはインフルエンザAウイルスの、非構造タンパク質2（NEP、核外輸送タンパク質とも称される）を表す；「PA」は、オルソミクソウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス、より好ましくはインフルエンザAウイルスの、ポリメラーゼサブユニットタンパク質を表す；「PB1」は、オルソミクソウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス、より好ましくはインフルエンザAウイルスの、ポリメラーゼサブユニットタンパク質を表す；「PB2」は、オルソミクソウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス、より好ましくはインフルエンザAウイルスの、ポリメラーゼサブユニットタンパク質を表す；「PB1-F2」または「PB1F2」は、オルソミクソウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス、より好ましくはインフルエンザAウイルスの、PB1遺伝子セグメントの既存のものに代わる読み枠（ずらした読み枠）によってコードされるタンパク質を表す。
【００５５】
他の好ましい実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、腫瘍特異的タンパク質、または病原体特異的タンパク質である。ある実施形態において、病原体はウイルスであるが、具体的には、パラミクソウイルスもしくはそのバリアントであって、好ましくは、ニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）、パラミクソウイルス亜科（Paramyxovirinae）、フェルドランスウイルス（Fer-de-Lance-Virus）、ナリバウイルス（Nariva-Virus）、Salem-Virus、ツパイアパラミクソウイルス（Tupaia-Paramyxovirus）、Beilong-Virus、J-Virus、Menangle-Virus、Mossmann-Virus、およびMurayama-Virusから選択される。さらにより好ましい実施形態において、ニューモウイルス亜科は、ニューモウイルス属（Pneumovirus）、好ましくはヒトRSウイルス（RSV）、マウス肺炎ウイルス（murine pneumonia virus）、ウシRSV、ヒツジRSV、ヤギRSV、七面鳥鼻気管炎ウイルス（トリニューモウイルス）（turkey rinotracheitis virus）、ならびにメタニューモウイルス属（Metapneumovirus）、好ましくはヒトメタニューモウイルス（human metapneumovirus）（hMPV）、およびトリメタニューモウイルス（avian metapneumovirus）からなる一群から選択される。さらにより好ましい実施形態において、パラミクソウイルス亜科は、レスピロウイルス属（Respirovirus）、好ましくは、ヒトパラインフルエンザウイルス（human parainfluenza virus）1型および3型、ならびにルブラウイルス属（Rubulavirus）、好ましくはヒトパラインフルエンザウイルス（human parainfluenza virus）2型および4型からなる一群から選択される；病原体は、細菌または原虫であって、好ましくは赤痢アメーバ（Entomoeba histolytica）、口腔トリコモナス（Trichomonas tenas）、腸トリコモナス（Trichomonas hominis）、膣トリコモナス（Trichomonas vaginalis）、ガンビアトリパノソーマ（Trypanosoma gambiense）、ローデシアトリパノソーマ（Trypanosoma rhodesiense）、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）、ドノバンリーシュマニア（Leishmania donovani）、熱帯リーシュマニア（Leishmania tropica）、ブラジルリーシュマニア（Leishmania braziliensis）、ニューモシチス肺炎（Pneumocystis pneumonia）、トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）、タイレリア（Theileria lawrenci）、東沿岸熱タイレリア（Theileria parva）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、および四日熱マラリア原虫（Plasmodium malaria）である。
【００５６】
核酸構築物
「核酸構築物」という用語は、少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを表す。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、核酸構築物によってコードされる少なくとも1つのポリペプチドの転写および翻訳を指示するエレメントを、追加して含有する。このようなエレメントには、無細胞系または細胞に基づいた系、好ましくは細胞に基づいた系において、mRNAの転写を指示するプロモーターおよびエンハンサーエレメントがある。核酸構築物が翻訳可能なRNAとして与えられる、もう1つの実施形態において、核酸構築物は、少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドをコードするRNAの翻訳および/または安定化のために必要なエレメント、たとえば、ポリAテール、IRES、キャップ構造などを含有することが想定される。
【００５７】
上記で概説したように、本発明のベクターはウイルスベクターであることが好ましく、したがって、核酸構築物は、ウイルスベクターの複製に必要な核酸配列、および/または免疫原性ポリペプチドの発現を指示する制御エレメントを追加して含有する、より大きなポリヌクレオチドに含まれていることが好ましい。
【００５８】
本発明のある実施形態において、核酸構築物は、1つの免疫原性ポリペプチドをコードする。
【００５９】
本発明の特に好ましい実施形態において、核酸構築物は、少なくとも2つの免疫原性ポリペプチドをコードする。
【００６０】
免疫原性ポリペプチドをコードする適当な核酸構築物は、PCT/EP2011/074307に詳細に記載されている。この明細書の開示内容は、そこに記載された免疫原性ポリペプチドに関する開示内容にについて、参考として本明細書に含めるものとする。
【００６１】
驚くべきことに、PCT/EP2011/074307の基礎となる研究において、T細胞応答を誘導する免疫原性ポリペプチドを、B細胞応答を誘導する免疫原性ポリペプチドに添加すると、後者のポリペプチドに対するB細胞応答が増強されることが判明した。抗原に対するB細胞応答の強さを測定するための方法は、上記に記載されている。当該抗原に対して特異的な抗体の力価は、B細胞応答を誘導する少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドと、T細胞応答を誘導する少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドを組み合わせた免疫化の、少なくとも2週間後、少なくとも4週間後、少なくとも8週間後、少なくとも4ヶ月後、少なくとも8ヶ月後、または少なくとも1年後に、測定することができる。好ましくは、B細胞応答を誘導する免疫原性ポリペプチドに対して特異的な抗体の力価は、B細胞応答を誘導する少なくとも1つの免疫原性ポリペプチド単独で免疫化するのと比較して、併用により、少なくとも10 %、少なくとも20 %、少なくとも30 %、少なくとも50 %、少なくとも75 %、少なくとも100 %、少なくとも150 %、少なくとも200 %だけ増加する。
【００６２】
したがって、本発明の好ましい実施形態において、核酸構築物は、B細胞応答を誘導する少なくとも1つの免疫原性ポリペプチド、およびT細胞応答を誘導する少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドをコードする。
【００６３】
B細胞応答を誘導する免疫原性ポリペプチドは、好ましくは、ウイルスに含まれる構造タンパク質、またはその断片もしくはバリアントである。たとえば、エンベロープを有するウイルスの場合、ウイルスの構造タンパク質は好ましくは、フュージョンタンパク質（F）、およびアタッチメント糖タンパク質G、H、およびHNからなる一群から選択することができる。
【００６４】
アタッチメント糖タンパク質は、エンベロープを有するすべてのウイルスで見いだされ、宿主細胞の細胞膜上の糖部分、もしくはタンパク質の細胞接着ドメイン、もしくは他の分子と結合することによって、ウイルスエンベロープと宿主細胞の細胞膜との間の最初の相互作用に関与する。したがって、アタッチメント糖タンパク質は、ウイルスと宿主細胞膜との間のギャップを埋めるものである。「H」と称されるアタッチメント糖タンパク質はヘマグルチニン活性を有し、モルビリウイルスおよびヘニパウイルス（henipavirus）で見られるが、「HN」と称される糖タンパク質はヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ活性を有しており、レスピロウイルス、ルブラウイルス、およびアビュラウイルスに見いだされる。アタッチメント糖タンパク質は、それがヘマグルチニン活性もノイラミニダーゼ活性も持たない場合「G」と呼ばれる。Gアタッチメント糖タンパク質はニューモウイルス亜科のすべてのウイルスに見いだすことができる。
【００６５】
フュージョンタンパク質「F」は、エンベロープを有するすべてのウイルスで見いだされ、ウイルスエンベロープと宿主細胞の細胞膜との融合に関与する。Fは、それが結合する宿主細胞の細胞表面上にある受容体を認識する、I型糖タンパク質である。Fは、膜貫通ドメインが隣接して存在する融合ペプチドからなり、それぞれHR1およびHR2という2つの7アミノ酸リピート（HR）が続いている。融合ペプチドが宿主細胞の細胞膜に挿入されると、HR1領域は三量体コイルドコイル構造を形成し、その疎水性の溝の中にHR2領域が折り返される。それによってヘアピン構造が形成され、それがウイルスの脂質二重層と細胞の形質膜をいっそう近くに引き寄せて、融合細孔の形成を、したがって両者の脂質二重層の完全な融合を可能にし、ウイルスカプシドが宿主細胞の細胞質内に入れるようにする。上記の特徴はすべて、エンベロープを有するウイルスの融合に関与するタンパク質に共通して認められる。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態において、Fは、1つのRSV分離株のFのアミノ酸配列、または2つ以上の異なるRSV分離株のコンセンサスアミノ酸配列からなるか、または基本的にそれらからなる。ある好ましい実施形態において、Fタンパク質のアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号1、配列番号2、またはそれらのバリアントによるものである。
【００６７】
T細胞応答を誘導する免疫原性ポリペプチドは、好ましくは、ウイルスに含まれる内在性タンパク質、またはその断片もしくはバリアントである。前記のウイルス構造タンパク質は、核タンパク質N、マトリックスタンパク質MおよびM2、リン酸化タンパク質P、非構造タンパク質NS1およびNS2、ならびにポリメラーゼの触媒サブユニット（L）からなる一群から選択することができる。
【００６８】
核タンパク質Nは、リボヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオカプシドの中にRNAゲノムを入れてキャプシド形成することを含むいくつかの機能を果たす。Nはまた、ウイルス構築時にMタンパク質と相互作用し、ゲノムの転写および複製時には、P-Lポリメラーゼと相互作用する。
【００６９】
マトリックスタンパク質Mは、パラミクソウイルスにもっとも大量に存在するタンパク質であって、膜内在性タンパク質の細胞質尾部およびヌクレオカプシドと相互作用することによって、ウイルス形態の中心的なオーガナイザーであると見なされる。M2は、グリコシル化されていない第2の膜結合タンパク質であって、主にニューモウイルスに見られる。
【００７０】
リン酸化タンパク質Pは、すべてのパラミクソウイルスにおいて、NおよびLタンパク質と結合し、RNAポリメラーゼ複合体の一部を形成する。Largeタンパク質Lは、RNA依存性RNAポリメラーゼの触媒サブユニットである。
【００７１】
非構造タンパク質NS1およびNS2の機能は未だ特定されていない；しかしながら、それらがウイルスの複製サイクルに関与するという兆候がある。
【００７２】
ある好ましい実施形態において、Nは、たとえば配列番号3に記載の、1つのRSV分離株のNのアミノ酸配列、または2つ以上の異なるRSV分離株のコンセンサスアミノ酸配列を含んでなり、M2は、たとえば配列番号5に記載の、1つのRSV分離株のM2のアミノ酸配列、または2つ以上の異なるRSV分離株のコンセンサスアミノ酸配列を含んでなる。もう1つの好ましい実施形態において、Nは配列番号4に記載のアミノ酸配列を含有し、M2は配列番号5に記載のアミノ酸配列を含有する。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態において、少なくとも2つの異なる免疫原性ポリペプチドが、同数のオープンリーディングフレーム（ORF）によってコードされ、すなわち、各ポリペプチドは、別々のオープンリーディングフレームでコードされる。この場合、各ORFは、前記ポリペプチドの発現を可能にする適当な発現制御配列と組み合わせられていることが好ましい。
【００７４】
本発明の別の好ましい実施形態において、少なくとも2つの異なる免疫原性ポリペプチドは、1つのORFでコードされ、ペプチドリンカーで連結されている。したがって、核酸構築物の転写および翻訳は、機能的な、すなわち免疫原性の、複数のドメインを有する1つのポリペプチドをもたらす。「異なる免疫原性ポリペプチド」という用語は、その起源となるウイルスもしくは生物において一続きの核酸配列によってコードされない、本明細書の上記の免疫原性ポリペプチドを表す。その起源となるウイルスもしくは生物において、それらは異なるORFによってコードされていてもよい。あるいはまた、それらは、天然の状態でドメインを連結しているアミノ酸配列の欠失、および前記の連結アミノ酸配列のペプチドリンカーによる置換によって、1つのORFでコードされる、1つのポリペプチドの別々のドメインに由来してもよい。後者の実施形態は、免疫応答の誘導に必要なすべてのエピトープを依然として含有する、天然に存在するポリペプチドより短いポリペプチドの生成を可能にする。一例を挙げると：天然に存在するポリペプチドは、免疫原性でない90アミノ酸からなるアミノ酸配列で連結された、免疫応答を誘発するのに役立つ2つのエピトープを含有する。前記の90アミノ酸を10ないし15アミノ酸のペプチドリンカーで置き換えると、それにもかかわらず重要なエピトープを2つとも含有する、より短いポリペプチドがもたらされる。
【００７５】
本発明の特定の好ましい実施形態において、少なくとも2つの異なる免疫原性ポリペプチドが、1つのORFによってコードされ、切断部位によって連結される。したがって、核酸構築物の転写および翻訳は、1つのポリペプチドをもたらすが、それは翻訳と同時に、または翻訳後に切断されて、異なる小さいポリペプチドとなる。
【００７６】
上記の切断部位は、好ましくは、自己切断部位もしくはエンドペプチダーゼ切断部位である。
【００７７】
「オープンリーディングフレーム」（ORF）という用語は、アミノ酸に翻訳することができるヌクレオチド配列を表す。典型的には、このようなORFは、開始コドン、通常3ヌクレオチドの倍数の長さを有する後続の領域を含有するが、終止コドン（TAG、TAA、TGA、UAG、UAA、またはUGA）は、所定の読み枠に含まない。典型的には、ORFは天然に存在し、または人工的に、すなわち遺伝子工学の手法によって構築される。ORFはタンパク質をコードするが、そのタンパク質において、ORFが翻訳されてできるアミノ酸はペプチド結合鎖を形成する。
【００７８】
「ペプチドリンカー」（または短く：「リンカー」）は、本発明の文脈において、1から100アミノ酸のアミノ酸配列を表す。好ましい実施形態において、本発明のペプチドリンカーの最小限の長さは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30アミノ酸である。さらに他の好ましい実施形態において、本発明のペプチドリンカーの最大の長さは、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、もしくは15アミノ酸、またはそれ以下である。ペプチドリンカーは、つなぎ合わされるタンパク質、断片、セグメント、エピトープ、および/またはドメインの2つのアミノ酸の間に可動性を与えることが好ましい。このような可動性は一般に、アミノ酸が小さいと増大する。したがって、本発明のペプチドリンカーは、小型のアミノ酸、特にグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、ロイシン、およびイソロイシンの含有量が多いことが好ましい。好ましくは、ペプチドリンカーの、20%、30%、40%、50%、60%を超える、もしくはそれ以上のアミノ酸が小型のアミノ酸である。好ましい実施形態において、リンカーのアミノ酸は、グリシンおよびセリンから選択される。特に好ましい実施形態において、本発明のペプチドリンカーの、上記の好ましい最小および最大の長さを組み合わせることができる。当業者は、どの組み合わせが数学的に意味をなすかをただちに理解するであろう。ある好ましい実施形態において、本発明のペプチドリンカーは、非免疫原性である；加えて、ヒトに投与するためにデザインされる場合、本発明のペプチドリンカーは典型的には、ヒトに対して非免疫原性となるように選択される。
【００７９】
「切断部位」という用語は、本明細書ではアミノ酸配列を表し、この配列はそのアミノ酸配列での切断を指示するが、その理由は、たとえば、その配列が切断酵素によって認識されること、および/またはその切断が可能であることによる。典型的には、ポリペプチド鎖は、アミノ酸をつなぐ1つもしくは複数のペプチド結合の加水分解によって切断される。ペプチド結合の切断は、化学的切断または酵素的切断によって生じる可能性がある。酵素的切断は、タンパク質分解酵素である、エンドもしくはエキソペプチダーゼ、またはプロテアーゼ（たとえば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ）によって達成される切断を意味する。典型的には、酵素的切断は自己切断に起因して生じるか、または独立したタンパク質分解酵素によってもたらされる。タンパク質もしくはポリペプチドの酵素的切断は、翻訳と同時にも翻訳後にも起こりうる。したがって、本明細書で使用される「エンドペプチダーゼ切断部位」という用語は、この配列がエンドペプチダーゼ（たとえば、トリプシン、ペプシン、エラスターゼ、トロンビン、コラゲナーゼ、フューリン（furin）、サーモリシン、エンドペプチダーゼV8、カテプシン）によって切断される、または切断可能であるような、アミノ酸もしくはヌクレオチド配列内の切断部位を表す。その代わりに、またはそれに加えて、本発明のポリペプチドは、自己プロテアーゼ、すなわち、プロテアーゼも含んでいる同一のタンパク質分子内のペプチド結合を切断するプロテアーゼによって、切断することができる。このような自己プロテアーゼの例が、フラビウイルス（flavivirus）由来のNS2プロテアーゼ、またはビルナウイルス（birnavirus）のVP4である。
【００８０】
あるいはまた、「切断部位」という用語は、アミノ酸の間のペプチド結合の形成を妨げるアミノ酸配列を意味する。たとえば、結合の形成は、ポリペプチドもしくはポリプロテインの翻訳と同時に起こる自己プロセシングに起因して妨げられる可能性があり、結果として2つの不連続の翻訳産物が1つのオープンリーディングフレームの1つの翻訳イベントから生じる。典型的には、このような自己プロセシングは、ペプチド結合を形成することなしに、あるコドンから次のコドンへ移動するように翻訳複合体を誘導する、偽の終止コドン配列が引き起す「リボソームのスキップ」によってもたらされる。リボソームのスキップを誘導する配列の例としては、ピコルナウイルス（Picornavirus）、昆虫ウイルス、アフトウイルス科（Aphtoviridae）、ロタウイルス（Rotavirus）、を含む、いくつかのウイルス科、およびトリパノソーマによって使用される、ウイルス2Aペプチド、または2A様ペプチド（本明細書ではこの2つを総称して「2Aペプチド」と称するか、または区別なく「2A部位」もしくは「2A切断部位」と称する）があるがそれに限定されない。ピコルナウイルス科のライノウイルス（rhinovirus）および口蹄疫ウイルス（foot-and-mouth disease virus）の2A部位がもっともよく知られており、これは典型的には1つのORFから複数のポリペプチドを生成させるために使用される。
【００８１】
したがって、「自己切断部位」という用語は、本明細書では、アミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列内の切断部位であって、そうした切断が追加の分子を必要とすることなく、この配列がそこで切断され、または切断可能であるような前記切断部位、またはこの配列内のペプチド結合もしくはホスホジエステル結合の形成が（たとえば、上記の翻訳時の自己プロセシングによって）そこで最初の段階で妨げられるような前記切断部位を表す。
【００８２】
切断部位は典型的にはいくつかのアミノ酸を含んでいるか、またはいくつかのコドンでコードされていると理解される（たとえば、「切断部位」はタンパク質に翻訳されないが、翻訳の妨害をもたらすような場合）。したがって、切断部位は、ペプチドリンカーの目的を果たすことも可能であり、すなわち、2つのペプチドを立体的に分離することができる。このように、一部の実施形態では、「切断部位」はペプチドリンカーであり、かつ、上記の切断機能を提供する。この実施形態において、切断部位は追加のNおよび/またはC末端アミノ酸を含んでいてもよい。
【００８３】
本発明のある特定の好ましい実施形態において、自己切断部位は、ピコルナウイルス、昆虫ウイルス、アフトウイルス科、ロタウイルス、およびトリパノソーマの、ウイルス2Aペプチドまたは2A様ペプチドからなる一群から選択される。好ましい例において、2A切断部位は、口蹄疫ウイルスの2Aペプチドである。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態において、第1および/または第2のベクターに含まれる核酸構築物は、少なくとも2つの免疫原性ポリペプチドをコードしており、ここで少なくとも1つの前記ポリペプチドはT細胞応答を誘導し、少なくとももう1つのポリペプチドはB細胞応答を誘導する。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態において、第1および第2の核酸構築物によってコードされる免疫原性ポリペプチドのアミノ酸配列は、実質的に同一である。
【００８６】
本発明の別の好ましい実施形態において、少なくとも1つの核酸構築物は、(i) 呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のフュージョンタンパク質F、(ii) RSVの核タンパク質N、および(iii) RSVのマトリックスタンパク質M2からなる一群から選択される、少なくとも1つのポリペプチドをコードする。
【００８７】
本発明の特定の好ましい実施形態において、第1および第2のベクターに含まれる核酸構築物は、(i) 呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のフュージョンタンパク質F、(ii) RSVの核タンパク質N、および(iii) RSVのマトリックスタンパク質M2からなる一群から選択される、1つもしくは複数の同じポリペプチドをコードする。「1つもしくは複数の同じポリペプチド」という表現は、上記のように免疫学的に同一であるポリペプチド、または上記のように実質的に同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを表す。「1つもしくは複数の同じポリペプチド」という表現は、同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを表す。
【００８８】
本発明の特定の好ましい実施形態において、少なくとも1つの核酸構築物は、(i) 呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のフュージョンタンパク質F、(ii) RSVの核タンパク質N、および(iii) RSVのマトリックスタンパク質M2を含んでなるポリペプチドをコードする。ある好ましい実施形態において、前記核酸構築物は、前記の3つのポリペプチドのほかにポリペプチドをコードしない。たとえば、ベクターは、(i) 呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のフュージョンタンパク質F、(ii) RSVの核タンパク質N、および(iii) RSVのマトリックスタンパク質M2を含んでなるポリペプチドをコードする前記核酸構築物のほかに追加の核酸構築物を含まない。
【００８９】
本発明の非常に好ましい実施形態において、2つの核酸構築物はともに、(i) 呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のフュージョンタンパク質F、(ii) RSVの核タンパク質N、および(iii) RSVのマトリックスタンパク質M2を含んでなるポリペプチドをコードする。この実施形態の一例として、2つの核酸構築物はいずれも、前記3つのポリペプチドの他にポリペプチドをコードしない。たとえば、2つのベクターはいずれも、(i) 呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のフュージョンタンパク質F、(ii) RSVの核タンパク質N、および(iii) RSVのマトリックスタンパク質M2を含んでなるポリペプチドをコードする前記核酸構築物のほかに追加の核酸構築物を含まない。
【００９０】
ワクチン
「ワクチン」という用語は、特定の疾患に対する免疫を向上させる生物学的製剤を表す。前記製剤は、生きた病原体を殺したもの、または弱めたものを含有することができる。それはまた、免疫応答を引き起こすのに適した病原体に由来する1つもしくは複数の化合物を含んでいてもよい。本発明の好ましい実施形態において、前記化合物は、前記病原体のポリペプチドと、実質的に同一または免疫学的に同一であるポリペプチドである。ワクチンが、前記病原体のポリペプチドと、実質的に同一または免疫学的に同一である免疫原性ポリペプチドをコードする、核酸構築物を含有することも好ましい。後者の場合、そのポリペプチドがワクチンで処理された個体において発現されることが望ましい。ワクチン接種の基礎となる原理は、免疫「記憶」の生成である。個体の免疫系をワクチンで攻撃すると、ワクチンに含まれる化合物を特異的に認識する免疫細胞の、形成および/または増殖が引き起こされる。前記免疫細胞の少なくとも一部は、ワクチン接種後10年、20年、もしくは30年に及ぶこともある期間のあいだ、生存能力を持ち続ける。もしその個体の免疫系が、免疫応答を誘発することができる化合物の起源であった病原体と、上記の期間内に遭遇すると、ワクチン接種で生成された免疫細胞が再活性化され、ワクチン接種を受けたことがなくて、はじめてその病原体の免疫原性化合物と遭遇する個体の免疫応答と比べて、その病原体に対する免疫応答を増強する。
【００９１】
プライムブーストワクチン接種投与法
多くの場合、1回のワクチン投与は、将来当該病原体に感染した場合に効果的な防御のために必要とされる数の長期間存続する免疫細胞を生成させて、腫瘍性疾患を含めた疾患を防ぎ、または、腫瘍性疾患のような疾患を治療するためには、十分でない。そのため、特定の病原体もしくは疾患に特異的な生物学的製剤を用いて繰り返し抗原投与することが、前記病原体もしくは疾患に対する持続防御免疫を確立するために、または特定の疾患を治癒させるために必要である。同じ病原体もしくは疾患に対するワクチンを繰り返し投与することを含む投与法を、本明細書では、「プライムブーストワクチン接種投与法」と称する。好ましくは、プライムブーストワクチン接種投与法は、特定の病原体、病原体群もしくは疾患に対するワクチンもしくはワクチン組成物の、少なくとも2回の投与を含む。ワクチンの初回投与は「プライミング」と呼ばれ、初回ワクチンと同じワクチン、または同じ病原体に対するワクチンのその後の投与はいずれも「ブースティング」と称することができる。したがって、本発明の好ましい実施形態において、プライムブーストワクチン接種投与法は、免疫応答のプライミングのためのワクチンの1回投与、ならびに免疫応答のブースティングのための、その後の少なくとも1回の投与を含む。当然のことながら、免疫応答のブースティングのために2、3、4、または5回もの投与も、本発明で検討される。
【００９２】
プライムとその後の投与の間の期間は、好ましくは、1週間、2週間、4週間、6週間、または8週間である。より好ましくは、その期間は4週間である。2回以上のブーストが行われる場合には、後のブーストは、好ましくは、前のブーストの1週間、2週間、4週間、6週間、または8週間後に投与される。たとえば、間隔は4週間である。
【００９３】
本発明のプライムブースト投与法で処置される被験体もしくは患者は、好ましくは、哺乳類もしくは鳥類、より好ましくは霊長類、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ガチョウ、ニワトリ、アヒル、またはシチメンチョウであって、もっとも好ましくはヒトである。
【００９４】
好ましくは、本発明の第1もしくは第2の態様にしたがってワクチンを組み合わせて使用することは、病原体もしくは疾患に対する防御免疫を確立し、感染の、もしくは病原体による感染で惹起される疾患の、抑制および/または撲滅をもたらすことになるであろう。
【００９５】
ワクチン組成物
「プライミング組成物」および「ブースティング組成物」で使用される「組成物」という用語は、核酸構築物を含んでなるベクター、および少なくとも1つの追加の化合物からなる組成物を表すが、この化合物は、製薬上許容されるキャリア、医薬品添加物、およびアジュバントからなる一群から選択される。ブースティング組成物がベクターの代わりに免疫原性ポリペプチドを含有する場合、ブースティング組成物は、前記の少なくとも1つの免疫原性ポリペプチド、ならびに、製薬上許容されるキャリア、医薬品添加物、およびアジュバントからなる一群から選択される、少なくとも1つの追加の化合物を含有する。
【００９６】
「製薬上許容される」とは、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に動物用、より詳細にはヒト用として収載されていることを意味する。
【００９７】
「キャリア」という用語は本明細書では、薬理学的に不活性な物質であって、治療効果のある成分がそれとともに投与される、たとえば、希釈剤、賦形剤、または溶媒などの物質を表すが、それに限定されない。このような医薬品キャリアは液体でも固体でもよい。液体キャリアには、滅菌液、たとえば生理食塩水、および石油、動物、植物、または合成起源のものを含めて、油、たとえばピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などが含まれるが、それらに限定されない。生理食塩水、ならびにブドウ糖およびグリセロール水溶液も、液体キャリアとして、特に注射用溶液に使用することができる。塩類溶液は、医薬組成物が静脈内に、または吸入器によって鼻腔内に投与される場合、好ましいキャリアである。
【００９８】
適当な医薬品添加物には、デンプン、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリコール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどがある。
【００９９】
適当な医薬品キャリアの例はE. W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。
【０１００】
「アジュバント」という用語は、細胞性もしくは体液性レベルのいずれかで、組成物の中の活性成分に対する免疫応答を増進、刺激、活性化、増強、もしくは調整する作用物質を表すものであって、たとえば、免疫学的アジュバントは実際の抗原に対する免疫系の応答を刺激するが、それ自体は免疫学的効果を持たない。このようなアジュバントの例には、無機アジュバント（たとえば、無機金属塩、たとえばリン酸アルミニウム、または水酸化アルミニウム）、有機アジュバント（たとえば、サポニン、またはスクアレン）、油性アジュバント（たとえば、フロイント完全アジュバント、およびフロイント不完全アジュバント）、サイトカイン（たとえば、IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS、およびINF-γ）、微粒子アジュバント（たとえば、免疫刺激複合体（ISCOMS）、リポソーム、または生分解性ミクロスフェア）、ビロソーム、細菌性アジュバント（たとえば、モノホスホリルリピドA、またはムラミルペプチド）、合成アジュバント（たとえば、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチドアナログ、または合成リピドA）、または合成ポリヌクレオチドアジュバント（たとえば、ポリアルギニン、またはポリリジン）があるが、それに限定されない。
【０１０１】
「鼻腔内投与」は、肺を含めた全気道の粘膜への本発明のワクチン組成物の投与である。より好ましくは、組成物は鼻の粘膜に投与される。好ましくは、鼻腔内投与は、点鼻、スプレー、もしくはエアロゾルによって行われる。好ましくは、前記投与は、針などの機械的手段で粘膜に穴をあけることを含まない。
【０１０２】
「筋肉内投与」という用語は、個体の任意の筋肉内へのワクチン組成物の注射を意味する。好ましい筋肉注射は、三角筋、外側公筋、または臀部の腹側および背側に投与される。
【０１０３】
驚くべきことに、ポリヌクレオチドベクターとタンパク質の投与の組み合わせが、ワクチン接種の特性（たとえば、強さ）に利点を与えることが判明した。したがって、本発明のもう1つの態様は：
(a) 少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドをコードする核酸構築物を含有するベクターを含んでなるか、基本的にそのベクターで構成されるか、またはそのベクターからなる、プライミング組成物、ならびに
(b) 少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドを含んでなるか、基本的にそのポリペプチドで構成されるか、またはそのポリペプチドからなる、少なくとも1つのブースティング組成物
を含む、組み合わせワクチンに関するものであるが、
このプライミング組成物に含まれる核酸構築物によってコードされる免疫原性ポリペプチドの少なくとも1つのエピトープは、プライムブーストワクチン接種投与法用のブースティング組成物に含まれる免疫原性ポリペプチドの少なくとも1つのエピロープと、免疫学的に同一であり、このプライミング組成物が筋肉内もしくは鼻腔内に投与されて、後に、少なくとも1つのブースティング組成物が投与される。
【０１０４】
本発明の第2の態様に関連して、すべての用語は、本発明の第1の態様について上記で定義された意味を有し、示されている場合には、好ましい意味を有する。具体的には、ベクター、核酸構築物、免疫原性ポリペプチド、筋肉内もしくは鼻腔内投与、プライムブーストワクチン接種投与法という用語は、上記の意味を有する。当然のことながら、免疫原性ポリペプチドに関する教示内容は、ベクターの核酸によってコードされる免疫原性ポリペプチドにも、そのままのものとして投与されるポリペプチドにも適用されるが、核酸構築物に関する教示内容は、ベクターに含まれる核酸にのみ関わる。
【０１０５】
少なくとも1つのブースティング組成物が筋肉内もしくは鼻腔内に投与されることが好ましい。好ましくは、それぞれのブースティング組成物が筋肉内もしくは鼻腔内に投与される。
【０１０６】
好ましい投与法は次のとおり：
(i) プライミング組成物を鼻腔内に投与し、少なくとも1つのブースティング組成物をその後、筋肉内に投与する；
(ii) プライミング組成物を鼻腔内に投与し、少なくとも1つのブースティング組成物をその後、鼻腔内に投与する；
(iii) プライミング組成物を筋肉内に投与し、少なくとも1つのブースティング組成物をその後、筋肉内に投与する；または
(iv) プライミング組成物を筋肉内に投与し、少なくとも1つのブースティング組成物をその後、鼻腔内に投与する；
であるが、投与法(i)を用いることがもっとも好ましい。
【０１０７】
この態様の好ましい実施形態において、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター (たとえば、AAV血清型5および血清型2)、アルファウイルスベクター (たとえば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEE)、シンドビスウイルス(SIN)、セムリキ森林ウイルス(SFV)、およびVEE-SINキメラ)、ヘルペスウイルスベクター (たとえば、アカゲザルサイトメガロウイルス(RhCMV)のようなサイトメガロウイルス由来のベクター (14))、アレナウイルスベクター (たとえば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)ベクター(15))、麻疹ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター (たとえば、ワクシニアウイルス、改変ワクシニアアンカラ(MVA)、NYVAC (ワクシニアのコペンハーゲン株に由来する)、およびアビポックスベクター：カナリア痘(ALVAC)および鶏痘(FPV)ベクター)、水疱性口内炎ウイルスベクター、レトロウイルス、レンチウイルス、ウイルス性粒子、および細菌胞子からなる一群から選択される。
【０１０８】
きわめて好ましいベクターは、アデノウイルスベクター、詳細にはヒトもしくは非ヒト類人猿に由来するアデノウイルスベクター、またはポックスウイルスベクター、好ましくはMVAである。アデノウイルスの由来する好ましい類人猿は、チンパンジー（チンパンジー属（Pan））、ゴリラ（ゴリラ属（Gorilla））、およびオランウータン（オランウータン属（Pongo））であるが、好ましくはボノボ（Pan paniscus）およびナミチンパンジー（Pan troglodytes）である。典型的には、天然に存在する非ヒト類人猿アデノウイルスは、個々の類人猿の糞便サンプルから分離される。もっとも好ましいベクターは、hAd5、hAd11、hAd26、hAd35、hAd49、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd55、ChAd63、ChAd73、ChAd82、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2、およびPanAd3 ベクターに基づく非複製型アデノウイルスベクター、または複製不全Ad4およびAd7ベクターである。
【０１０９】
本発明の好ましい実施形態において、プライミング組成物に含まれる核酸構築物は、上記の構造を有する。
【０１１０】
本発明のある好ましい実施形態において、核酸構築物は、少なくとも、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のフュージョンタンパク質Fをコードする。特定の例において、前記核酸構築物は、前記ポリペプチドの他にポリペプチドをコードしない。たとえば、ベクターは、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のフュージョンタンパク質Fをコードする前記核酸構築物の他に追加の核酸構築物を含まない。
【０１１１】
本発明の特定の好ましい実施形態において、核酸構築物は、(i) 呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のフュージョンタンパク質F、(ii) RSVの核タンパク質N、および(iii) RSVのマトリックスタンパク質M2を含んでなるポリペプチドをコードする。このような実施形態の一例において、前記核酸構築物は、前記の3つのポリペプチドの他にポリペプチドをコードしない。たとえば、ベクターは、(i) 呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のフュージョンタンパク質F、(ii) RSVの核タンパク質N、および(iii) RSVのマトリックスタンパク質M2を含んでなるポリペプチドをコードする前記核酸構築物の他に追加の核酸構築物を含まない。
【０１１２】
本発明の好ましい実施形態において、ブースティング組成物に含まれる、少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドは、上記の構造を有する。好ましくは、そのポリペプチドは、(i) 呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のフュージョンタンパク質F、(ii) RSVの核タンパク質N、および(iii) RSVのマトリックスタンパク質M2、または、前記ポリペプチドもしくは前記ポリペプチドと免疫学的に同一であるポリペプチドのアミノ酸配列と、実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、からなる一群から選択される。
【０１１３】
本発明のより好ましい実施形態において、ブースティング組成物に含まれる少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドは、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のフュージョンタンパク質Fである。たとえば、ブースティング組成物は、前記ポリペプチド（フュージョンタンパク質F）のほかに免疫原性ポリペプチドを含まない。
【０１１４】
本発明の特に好ましい実施形態において、核酸構築物は、(i) 呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のフュージョンタンパク質F、(ii) RSVの核タンパク質N、および(iii) RSVのマトリックスタンパク質M2をコードしており、ブースティング組成物に含まれる唯一の免疫原性ポリペプチドはRSVのフュージョンタンパク質Fである。
【０１１５】
本発明の特に好ましい実施形態において、免疫応答のプライミングは、アデノウイルスベクター（たとえば、本明細書で与えられるアデノウイルスベクターの一覧から選択される）の鼻腔内投与によって行われ、ブースティングは、免疫原性ポリペプチドの筋肉内投与によって行われる。たとえば、好ましくは、アデノウイルスベクターはPanAd3とすることができる。この実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、好ましくはRSVのフュージョンタンパク質Fであり、ベクターに含まれる核酸構築物は、好ましくは、RSVのフュージョンタンパク質F、RSVの核タンパク質N、およびRSVのマトリックスタンパク質M2をコードする。
【０１１６】
本発明の別の特に好ましい実施形態において、免疫応答のプライミングは、アデノウイルスベクターの鼻腔内投与によって行われ、ブースティングは、ポックスウイルスベクターの筋肉内投与によって行われる。プライミングにポックスウイルスベクターを使用し、免疫応答のブースティングにアデノウイルスベクターを使用することも好ましい。たとえば、好ましくは、アデノウイルスベクターはPanAd3、ポックスウイルスベクターはMVAとすることができる。この実施形態において、2つのベクターに含まれる核酸構築物は、好ましくは、RSVのフュージョンタンパク質F、RSVの核タンパク質N、およびRSVのマトリックスタンパク質M2をコードする。
【０１１７】
さらに他の態様において、本発明は、本発明の第1もしくは第2の態様に従う組み合わせワクチン、および使用説明書を含む製品を提供する。
【０１１８】
以下の実施例は、本発明の説明することだけを目的とする。それらは、決して特許請求の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【０１１９】
PanAd3-RSVおよびMVA-RSVの作製
ワクチンデザイン
本発明のワクチン抗原をデザインするために、RSVのF0-、N-、およびM2-1-タンパク質のタンパク質配列を、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information (NCBI)）RSV Resouceデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）から取得した。タンパク質配列は、異なるRSVサブタイプA株から選択された。
【０１２０】
F0コンセンサス配列は、MUSCLE バージョン3.6を用いて多数決原理を適用して、Fタンパク質のすべての同一でない配列のアラインメントによって得られた。ワクチンのF0コンセンサス配列は、さまざまなRSV配列のアラインメントに基づいてデザインされた。ワクチンのコンセンサスF0配列の配列類似性は、BLAST解析を行って評価したが、これはBasic Local Alignment Search Toolの略語であって、NCBIによって公開されている。データベースの全RSV配列を比較して計算されたコンセンサス配列のもっとも高い平均類似性は、ヒト呼吸器合胞体ウイルスA2株に対して100%であった。
【０１２１】
さらに、ワクチンのF0配列は、アミノ酸525〜574にある膜貫通領域を欠いており、F0ΔTMの分泌を可能にする。
【０１２２】
最終的に、ワクチンF0ΔTM配列は、真核細胞での発現のためにコドンを最適化した。
【０１２３】
ワクチンのNコンセンサス配列は、MUSCLE バージョン3.6を用いて多数決原理を適用して、Nタンパク質のすべての同一でない配列のアラインメントによって得られた。Nコンセンサス配列のBLAST解析は、ヒト呼吸器合胞体ウイルスA2株について最適なアラインメントを見いだした。ワクチンのN配列はその後、真核細胞での発現のためにコドンを最適化した。
【０１２４】
M2-1コンセンサス配列は、MUSCLE バージョン3.6を用いて多数決原理を適用して、M2-1タンパク質のすべての同一でない配列のアラインメントによって得られた。M2-1コンセンサス配列のBLAST解析は、ヒト呼吸器合胞体ウイルスA2株について最適なアラインメントを見いだした。最終的に、ワクチンのM2-1配列は、真核細胞での発現のためにコドンを最適化した。
【０１２５】
ワクチンのF0ΔTM配列およびN配列は、口蹄疫ウイルスの切断配列2Aによって、間隔をおいて区切られた。ワクチンのN配列とM2-1配列は、可動性リンカー（GGGSGGG；配列番号6）によって隔てられた。
【０１２６】
最終的に、コドン最適化されたウイルス遺伝子は、1つのオープンリーディングフレームF0ΔTM-N-M2-1としてクローニングされた。
【０１２７】
F0ΔTMおよびF0ΔTM-N-M2-1をコードするDNAプラスミドの作製
コンセンサスF0ΔTM、N、およびM2-1配列は、Kozak配列の付加およびコドン最適化を含めて、哺乳類での発現に向けて最適化された。多抗原ワクチンをコードするDNA配列を化学合成した後、CMVプロモーター制御下でpVJTetOCMVシャトルベクターに、適当な制限酵素EcoRVおよびNotIによってサブクローニングした。
【０１２８】
PanAd3ウイルスベクターRSVワクチンの作製
可動性リンカーで融合されたコンセンサスF0ΔTM、N、およびM2-1タンパク質をコードする809アミノ酸のポリプロテイン（配列番号7）を含有する、ウイルスベクターRSVワクチンPanAd3/F0ΔTM-N-M2-1を作製した。
【０１２９】
ボノボアデノウイルス3型（PanAd3）は、血清陽性率が向上した新規アデノウイルス株であって、すでに報告されている。
【０１３０】
プラスミドベクターpVJTetOCMV/F0ΔTM-N-M2-1からPanAd3 pre-AdenoベクターへのF0ΔTM-N-M2-1のクローニングは、相同領域に隣接する抗原配列の切り出し、および酵素によるin vitro組換えによって行われた。
【０１３１】
シャトルプラスミドベクターp94-F0ΔTM-N-M2-1からのMVAベクターへのF0ΔTM-N-M2-1のクローニングは、酵素によるin vitro組換え、ならびに蛍光顕微鏡による陽性組換えウイルスの選択という2段階で行われた。
【実施例２】
【０１３２】
マウスにおけるPanAd3-RSVによるプライムおよびタンパク質Fによるブースト
材料および方法
各5匹のBALB/cマウス群を、10^8 vpのPanAd3-RSVにより、点鼻または筋肉注射によって免疫化した。もう1つの群は、水酸化アルミニウムとともに製剤された5μgの組換えタンパク質F（Sino Biologicals Inc. cat n.11049-V08B）により、筋肉内で免疫化した。4週間後、すべての動物が筋肉内に、水酸化アルミニウムとともに製剤された5μgの組換えタンパク質Fの投与を受けた。4週間後にすべての動物から採血し、血清を調製した。各群の動物の血清プールをFタンパク質ELISAによって分析した：簡単に述べると、96ウェルマイクロタイタープレートを0.5 μgのタンパク質F（Sino Biologicals Inc. cat n.11049-V08B）でコートし、段階希釈した血清とともにインキュベートした。十分に洗浄した後、アルカリホスファターゼと結合した二次抗マウスIgG抗体が、特異的結合を明らかにした。バックグラウンドは、BALB/c免疫前血清を用いて測定した。抗体価は、バックグラウンド＋3×標準偏差と等しい値を与える希釈度として表された。抗体の中和は、FACSに基づく感染アッセイによって測定した。簡単に述べると、GFPを発現する組換えRSV-Aウイルス（Chen M. et al. J Immunological Methods 2010; 362:180）を使用して、20%の感染細胞を与える重複感染度（Multiplicity of infection (MOI)）で24時間、培養Hep-2細胞に感染させた。段階希釈したマウス血清プールをウイルスとともに1時間37℃でインキュベートしてから細胞を加えた。24時間後に、感染した細胞のパーセンテージを、ホールセルFACS分析によって測定した。抗体価は、50%感染阻害（EC50）をもたらす血清希釈度として表された。
【０１３３】
T細胞応答は、IFNγT細胞Elispotによって測定した：簡単に述べると、脾臓および肺リンパ球を、抗IFNγ抗体でコートした96ウェルマイクロタイタープレートに蒔き、RSVワクチン抗原の全体にわたるペプチドプールでex vivoに刺激した。十分に洗浄した後、分泌されたIFNγがプレートの底部にスポットを形成するのが、アルカリホスファターゼと結合した二次抗体によって明らかになった。スポットの数を自動Elispotリーダーで計数した。
【０１３４】
結果
RSV抗原F、N、およびM2-1を含有するサルアデノウイルスPanAd3-RSVを、BALB/cマウス群に、鼻腔内経路または筋肉内経路で投与した。別の群を、水酸化アルミニウムとともに製剤された組換えFタンパク質で、筋肉注射により免疫化した。4週間後、3群のマウスは、筋肉注射により、水酸化アルミニウムとともに製剤された組換えFタンパク質で追加免疫（ブースト）した。ブーストの4週間後、マウスの血清をFタンパク質ELISAで分析し、FACSに基づくRSV中和アッセイで中和抗体価を測定した。脾臓および肺のT細胞応答はIFNγT細胞Elispotによって測定された。
【０１３５】
図1に示すように、プライミングワクチンとしてPanAd3-RSVの投与を受けたマウス群は、血清中の抗F抗体価が非常に高レベルに達した。PanAd3-RSVによるプライミングは、Adenoを鼻腔内に投与したときの87倍から、Adenoを筋肉内に投与したときの158倍に至るまでの倍率で、Fタンパク質の単回投与により得られる抗体価を増大させたが、タンパク質Fの2回投与は22倍だけ力価を増加させた。
【０１３６】
RSV中和抗体価は、GFPを発現する組換えRSVウイルスを用いて、Hep2細胞で、FACSに基づく細胞培養感染アッセイによって測定された。図2は、50%感染阻害（EC50）をもたらす血清希釈度として表される中和力価を示す。抗F抗体価について観察されたように、中和抗体価も、Adenoプライムとタンパク質ブーストを組み合わせてワクチン接種された動物において、タンパク質/タンパク質投与法に対して増加している。
【０１３７】
T細胞応答は、同じマウス群において、脾臓および肺リンパ球に関するIFNγT細胞Elispotにより測定された。図3に示すように、プライムでAdenoベクターによりワクチン接種された群だけが、全身的にも局所的にもT細胞応答を生じさせた。これと反対に、タンパク質Fでワクチン接種された動物では、F特異的T細胞応答は検出されなかった。
【実施例３】
【０１３８】
コットンラットにおけるPanAd3-RSVによるプライムおよびタンパク質Fによるブースト
材料および方法
各5匹のコットンラット（Sygmoidon Hispidus（アラゲコットンラット））群を、10^8 vpのPanAd3-RSVにより点鼻で、または、水酸化アルミニウムとともに製剤された5μgの組換えタンパク質F（Sino Biologicals Inc. cat n.11049-V08B）により筋肉内で、免疫化した。4週間後、すべての動物が筋肉内に、水酸化アルミニウムとともに製剤された5μgの組換えタンパク質Fの投与を受けた。3週間後、2群の動物群およびワクチン接種しない対照群を、10^5 pfuのRSV Long株の鼻腔内投与によって感染させた。感染の5日後、全動物を屠殺し、鼻上皮および肺を採取して溶解した。段階希釈した組織溶解液を用いて、培養Hep2細胞に感染させ、プラークを計数することによってウイルス力価を測定した。
【０１３９】
結果
2群のコットンラットを、i) 水酸化アルミニウム中で製剤されたタンパク質Fによるプライムおよびブースト、またはii) 鼻腔内のPanAd3-RSVプライム、および筋肉内の、水酸化アルミニウム中で製剤されたタンパク質Fによるブースト、によってワクチン接種した。ブーストの3週間後、動物は、ワクチン接種しない対照群もともに、10^5 pfuのRSV Long株の鼻腔内投与によって攻撃感染させた。感染の5日後、動物を屠殺し、鼻および肺組織の溶解液に対するプラークアッセイによってウイルス量を測定した。図4に示すように、対照動物では、肺および鼻のRSVの力価は4-5 log10に達したが、ワクチン接種群の動物はすべて、肺でのウイルス複製を阻止した。これに対して、Adenoとタンパク質を組み合わせた投与を受けた動物だけが、上気道において完全な殺菌免疫を示した。
【実施例４】
【０１４０】
コットンラットにおけるPanAd3-RSVによるプライムおよびタンパク質Fによるブースト後のRSVに対する中和抗体の寿命
材料および方法
各5匹のコットンラット（Sygmoidon Hispidus（アラゲコットンラット））群を、10^8 vpのPanAd3-RSVにより点鼻で、または、水酸化アルミニウムとともに製剤された5μgの組換えタンパク質F（Sino Biologicals Inc. cat n.11049-V08B）により筋肉内で、免疫化した。4週間後、すべての動物が筋肉内に、水酸化アルミニウムとともに製剤された5μgの組換えタンパク質Fの投与を受けた。3週間後、2群の動物群およびワクチン接種しない対照群を、10^5 pfuのRSV Long株の鼻腔内投与によって感染させた。感染の5日後、全動物を屠殺し、鼻上皮および肺を採取して溶解した。段階希釈した組織溶解液を用いて、培養Hep2細胞に感染させ、プラークを計数することによってウイルス力価を測定した。血清中和抗体は、RSV Long株に感染したHep2細胞におけるプラーク減少アッセイによって測定した。力価は、阻害されない対照に対して60 %のプラークの減少をもたらす血清希釈度として表された。
【０１４１】
結果
2群のコットンラットを、i) 鼻腔内のPanAd3-RSVプライム、および筋肉内の、水酸化アルミニウム中で製剤されたタンパク質Fによるブーストによって、またはii) 水酸化アルミニウム中で製剤されたタンパク質Fによるプライムおよびブーストによって、ワクチン接種した。ブーストの3、8、および12週間後に、動物は、ワクチン接種しない対照群もともに、10^5 pfuのRSV Long株の鼻腔内投与によって攻撃感染させた。感染の5日後、動物を屠殺し、鼻および肺組織の溶解液に対するプラークアッセイによってウイルス量を測定した。図9に示すように、対照動物では、鼻のRSVの力価は4-5 log10に達したが、Adenoとタンパク質を組み合わせた投与を受けた動物だけが、上気道において完全な殺菌免疫を示した。血清中和抗体は、ブースト当日（プライムの4週間後）および攻撃感染当日に測定したが、攻撃感染はブーストの3、8、および12週間後とした。図10に示すように、中和力価は、Adenoとタンパク質の組み合わせでワクチン接種された群でのみ、高いままで維持されたが、タンパク質でワクチン接種された群の中和力価は、時間経過につれて緩やかに低下した。
【実施例５】
【０１４２】
PanAd3-RSVによる鼻腔内プライムおよびMVA-RSVによるブースト後のT細胞応答
材料および方法
RSV抗原F、N、およびM2-1を含有するPanAd3-RSVの108ウイルス粒子(vp)を、点鼻または筋肉内経路で、各10匹のCD1マウス群に投与した。4週間後、すべての動物は筋肉内に、RSV抗原F、N、およびM2-1を含有するMVA-RSVの107プラーク形成単位（pfu）の投与を受けた。4週間後、動物を屠殺し、リンパ球を脾臓および肺から単離し、血液から血清を調製した。T細胞応答、抗F抗体およびRSV中和抗体の力価を上記のように測定した。
【０１４３】
結果
プライムで鼻腔内にPanAd3-RSVを投与し、4週間後MVA-RSVにより筋肉内にブースト接種することを基本とする、異種プライム/ブーストワクチン接種投与法を、PanAd3-RSVプライムおよびMVA-RSVブーストを基本とするが両方とも筋肉内に投与する接種法と、非近交系CD1マウスで比較した。MVAブーストの4週間後、マウスを屠殺し、RSV特異的T細胞応答を脾臓および肺で測定した。図5に示すように、プライムの鼻腔内PanAd3-RSV投与は、脾臓および肺のどちらにも、より強いIFNγT細胞応答を引き起こした。
【０１４４】
鼻腔内Adenoプライム後の免疫応答の向上は、Fタンパク質に対する抗体の増加（図7、パネルA）および血清中の中和抗体価の増加（図7、パネルB）によって確認された。
【実施例６】
【０１４５】
PanAd3-RSVによるプライムおよびMVA-RSVによるブースト後のコットンラットの免疫
材料および方法
各5匹のコットンラット（Sygmoidon Hispidus（アラゲコットンラット））群を、108 vpのPanAd3-RSVにより、点鼻または筋肉注射で免疫化した。4週間後、すべての動物は筋肉内に、107 pfuのMVA-RSVの投与を受けた。3週間後、2群の動物群およびワクチン接種しない対照群を、105 pfuのRSV Long株の鼻腔内投与によって感染させた。感染の5日後、全動物を屠殺し、鼻上皮および肺を採取して溶解した。段階希釈した組織溶解液を用いて、培養Hep2細胞に感染させ、プラークを計数することによってウイルス力価を測定した。
【０１４６】
結果
2群のコットンラットに、PanAd3-RSV/MVA-RSVによる異種プライム/ブーストでワクチン接種し、鼻腔内もしくは筋肉内でのPanAd3-RSVによるプライミングの相違を比較した。2群とも、4週間の間隔で筋肉内に、MVAによるブースト接種を受けた。ワクチン接種しない第3群の動物を対照として使用した。ブーストの三週間後に、動物は、105pfuのRSV Long株の鼻腔内投与によって攻撃感染させた。感染の5日後、動物を屠殺し、鼻および肺組織の溶解液に対するプラークアッセイによってウイルス力価を測定した。図7に示すように、対照動物において、肺および鼻のRSV力価は4-5 log10に達したが、ワクチン接種群の動物はすべて、肺でのウイルス複製を阻止した。これに対して、プライムでAdenoの鼻腔内投与を受けた動物だけが、上気道においても完全な殺菌免疫を示した。
【実施例７】
【０１４７】
PanAd3-RSVによるプライムおよびMVA-RSVによるブースト後のウシの免疫をPanAd3-RSV単独によるワクチン接種と比較する
材料および方法
2群（AおよびB）の3頭および4頭の新生（2-4週齢）血清反応陰性仔ウシ（BRSVプラーク減少アッセイで検査した）を、スプレー装置による経鼻投与で5x10^10 vpのPanAd3-RSVによって免疫化した。プライムの8週間後、B群は筋肉内に2x10^8 pfuのMVA-RSVの投与を受けた。第3の群、C群は、ワクチン接種をせず、対照群として用いた。プライム（A群）、またはブースト（B群）の4週間後、この2群および対照C群の動物は、10^4 pfuのBRSV Snook株の鼻腔内および気管内投与により感染を受けた。感染の6日後、全動物を屠殺した。感染期間中毎日、鼻汁を鼻スワブにより採取した。屠殺時に、気管掻爬検体および肺洗浄液、加えて、肺のさまざまな部分（右葉肺尖部、心臓近くの右葉、心臓近くの左葉）の切片を採取したが、これは適当なバッファー中に溶解した。プラークの計数によりウイルス力価を測定するために、段階希釈した組織溶解液を用いて、培養ウシMDBK細胞に感染させた。
【０１４８】
結果
2群の2-4週齢血清反応陰性仔ウシは、i) PanAd3-RSVの鼻腔内単回投与、またはii) PanAd3-RSVによる鼻腔内プライムに続いて8週間後に筋肉内MVA-RSVブースト、によってワクチン接種を受けた。ワクチン接種の4週間後、104 pfuのBRSV Snook株の鼻腔内および気管内投与によって、動物を攻撃感染させた。感染の6日後、肺および鼻でのウイルス複製のピークが最大の肺病変を引き起こしているときに、動物を屠殺した。MDBK細胞に対するプラークアッセイにより、感染期間を通じて、鼻汁のウイルス力価を測定したが、肺のウイルス力価は屠殺当日に測定した。図8、パネルBの結果は、鼻腔内にPanAd3-RSVの単回投与だけを受けた動物群が、肺でのウイルス複製をほぼ完全に鈍らせることができることを明白に示す。PanAd3-RSVの鼻腔内投与は、対照動物に対して、減少した一過性レベルの、鼻汁中の最大ウイルス量をもたらした（図9、パネルA）。PanAd3-RSVの鼻腔内投与後MVA-RSVの筋肉内投与を受けた動物群は、上気道および下気道のいずれにおいてもウイルスに対する殺菌免疫を示した（図9）。
【０１４９】
結論：
PanAd3-RSV（IN）および組換えタンパク質（IM）の組み合わせは、組換えタンパク質Fの2回IM投与による類似の投与法と比べて、より強く長い持続免疫を誘導した（実施例3および4）。マウスにおいて、PanAd3-RSVによるINプライムおよび組換えタンパク質FによるIMブーストの組み合わせによって、より強い免疫応答が生じることも示された。したがって、ベクターワクチンによる免疫応答のプライミングは、ペプチドワクチンによるプライミングと比較して、ペプチドワクチンによるブーストの有効性を向上させる。
【０１５０】
アデノウイルスベクターおよびポックスウイルスベクターによる異種プライム/ブーストワクチン接種投与法が使用される場合、マウスについて実施例5で、またコットンラットについては実施例6で示すように、鼻腔内プライムと筋肉内ブーストの組み合わせのほうが、筋肉内プライムと筋肉内ブーストよりも強い免疫応答を引き起こした。したがって、異種プライム/ブーストワクチン接種投与法は、最高の免疫化を達成するために、2つのワクチンの投与経路を注意深く選択することによって、最適化することができる。
【図１】
2015526403.tif 000003
【図２】
2015526403.tif 000004
【図３】
2015526403.tif 000005
【図４】
2015526403.tif 000006
【図５】
2015526403.tif 000007
【図６】
2015526403.tif 000008
【図７】
2015526403.tif 000009
【図８】
2015526403.tif 000010
【図９】
2015526403.tif 000011
【図１０】
2015526403.tif 000012
【配列表】
2015526403000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年2月27日(2015.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする核酸構築物を含有する第１ベクターを含んでなる、プライミング組成物、および
(b) 少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする核酸構築物を含有する第２ベクターを含んでなる、少なくとも１つのブースティング組成物、
を含む、組み合わせワクチンであって、
前記第１ベクター及び第２ベクターの少なくとも1つが、(i) 呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のフュージョンタンパク質F、(ii) RSVの核タンパク質N、および／または(iii) RSVのマトリックスタンパク質M2を含んでなる少なくとも１つのポリペプチドをコードし、かつ
前記第１ベクターの核酸構築物によってコードされる免疫原性ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープは、前記第２ベクターの核酸構築物によってコードされる免疫原性ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープと、免疫学的に同一であり、
前記組み合わせワクチンはプライムブーストワクチン接種投与法に使用するためのものもであり、
(i) プライミング組成物は、鼻腔内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、筋肉内投与される；
(ii) プライミング組成物は、鼻腔内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、鼻腔内投与される；
(iii) プライミング組成物は、筋肉内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、筋肉内投与される；または
(iv) プライミング組成物は、筋肉内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、鼻腔内投与される、
前記組み合わせワクチン。
【請求項２】
第1ベクターおよび第２ベクターの少なくとも１つがアデノウイルスベクターである、請求項１に記載の組み合わせワクチン。
【請求項３】
第１及び／又は第２のアデノウイルスベクターが、非ヒト類人猿由来アデノウイルスベクター、好ましくはチンパンジーもしくはボノボアデノウイルスベクターである、請求項２に記載の組み合わせワクチン。
【請求項４】
第2ベクターが、ポックスウイルスベクター、好ましくはMVA、またはアデノウイルスベクターである、請求項１〜３のいずれか１つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項５】
第1の核酸構築物を含有するアデノウイルスベクターが、第2の核酸構築物を含有するアデノウイルスベクターとは免疫学的に異なる、請求項４に記載の組み合わせワクチン。
【請求項６】
第1および/または第2のベクターが、少なくとも2つのポリペプチドをコードする核酸構築物を含む、請求項１〜５のいずれか1つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項７】
ポリペプチドのうち1つがT細胞応答を誘導し、もう1つのポリペプチドがB細胞応答を誘導する、請求項６に記載の組み合わせワクチン。
【請求項８】
第1および/または第2の核酸構築物によってコードされる、少なくとも2つのポリペプチドが、切断部位によって連結されている、請求項６または７に記載の組み合わせワクチン。
【請求項９】
切断部位が、自己切断部位またはエンドペプチダーゼ切断部位である、請求項８に記載の組み合わせワクチン。
【請求項１０】
自己切断部位が、ピコルナウイルス、昆虫ウイルス、アフトウイルス科、ロタウイルス、およびトリパノソーマの、ウイルス2Aペプチドまたは2A様ペプチドからなる一群から選択される2A切断部位であって、好ましくは、2A切断部位が、口蹄疫ウイルスの2Aペプチドである、請求項９に記載の組み合わせワクチン。
【請求項１１】
第1および第2の核酸構築物によってコードされる免疫原性ポリペプチドのアミノ酸配列が、実質的に同一である、請求項１〜１０のいずれか1つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項１２】
第1および第2の核酸構築物の少なくとも1つが、(i) RSVのフュージョンタンパク質F、(ii) RSVの核タンパク質N、および(iii) RSVのマトリックスタンパク質M2を含んでなるポリペプチドをコードする、請求項１〜１１のいずれか1つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項１３】
(i) 第1ベクターがアデノウイルスベクターであり、第2ベクターがポックスウイルスベクターである；または
第1ベクターがポックスウイルスベクターであり、第2ベクターがアデノウイルスベクターである；ならびに
(ii) 第1および第2の核酸構築物が、(i) RSVのフュージョンタンパク質F、(ii)RSVの核タンパク質N、および(iii)RSVのマトリックスタンパク質M2を含んでなるポリペプチドをコードする、
請求項１〜１２のいずれか1つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項１４】
プライミング組成物が鼻腔内投与され、その後少なくとも1つのブースティング組成物が筋肉内投与される；または、プライミング組成物が鼻腔内投与され、その後少なくとも1つのブースティング組成物が鼻腔内投与される、請求項１３に記載の組み合わせワクチン。
【請求項１５】
(a) 少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする核酸構築物を含有する第1ベクターを含んでなる、プライミング組成物、および
(b) 少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドを含んでなる、少なくとも１つのブースティング組成物、
を含む、組み合わせワクチンであって、
前記免疫原性ポリペプチドの少なくとも1つが、(i) 呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のフュージョンタンパク質F、(ii) RSVの核タンパク質N、および／または(iii) RSVのマトリックスタンパク質M2を含んでなり、かつ前記プライミング組成物の核酸構築物によってコードされる免疫原性ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープは、ブースティング組成物の免疫原性ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープと、免疫学的に同一であり、
プライムブーストワクチン接種投与法に使用するためのものであり、プライミング組成物は、筋肉内または鼻腔内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物がその後投与される、
前記組み合わせワクチン。
【請求項１６】
少なくとも1つのブースティング組成物の投与が筋肉内、または鼻腔内である、請求項１５に記載の組み合わせワクチン。
【請求項１７】
(i) プライミング組成物は、鼻腔内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、筋肉内投与される；
(ii) プライミング組成物は、鼻腔内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、鼻腔内投与される；
(iii) プライミング組成物は、筋肉内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、筋肉内投与される；または
(iv) プライミング組成物は、筋肉内投与され、少なくとも１つのブースティング組成物はその後、鼻腔内投与される、
請求項１５または１６に記載の組み合わせ。
【請求項１８】
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１５〜１７のいずれか1つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項１９】
アデノウイルスベクターが、非ヒト類人猿由来アデノウイルスベクター、好ましくはチンパンジーもしくはボノボアデノウイルスベクターである、請求項１８に記載の組み合わせワクチン。
【請求項２０】
核酸構築物が、少なくとも2つのポリペプチドをコードする、請求項１５〜１９のいずれか1つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項２１】
ポリペプチドのうち1つがT細胞応答を誘導し、もう1つのポリペプチドがB細胞応答を誘導する、請求項１５〜２０のいずれか1つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項２２】
切断部位が、自己切断部位またはエンドペプチダーゼ切断部位である、請求項２１に記載の組み合わせワクチン。
【請求項２３】
核酸構築物が、(i) RSVのフュージョンタンパク質F、(ii) RSVの核タンパク質N、および(iii) RSVのマトリックスタンパク質M2を含んでなるポリペプチドをコードする、請求項２０〜２２のいずれか1つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項２４】
免疫応答をブーストするためのポリペプチドがRSVのフュージョンタンパク質Fである、請求項１５〜２３のいずれか1つに記載の組み合わせワクチン。
【請求項２５】
B細胞応答を引き起こすポリペプチドに対する、B細胞応答を増強するための、請求項６〜１２、および２１〜２４に記載の組み合わせワクチン。
【国際調査報告】
2015526403.tif 000013
2015526403.tif 000014
2015526403.tif 000015