(57)【要約】ＰＰＡＲγ受容体に特異的であり得るかまたはＰＰＡＲγ受容体をモジュレートし得る化合物を含む、ラクトース不耐症を処置するための方法が、本明細書中で開示される。例えば、ラクトース不耐症またはラクターゼ欠損症を処置および／または改善する必要のある患者においてラクトース不耐症またはラクターゼ欠損症を処置および／または改善するための方法であって、ＰＰＡＲアゴニスト化合物を該患者に投与することを包含する、方法が提供される。
2015518483.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトース不耐症またはラクターゼ欠損症を処置および／または改善する必要のある患者においてラクトース不耐症またはラクターゼ欠損症を処置および／または改善するための方法であって、ＰＰＡＲアゴニスト化合物を該患者に投与することを包含する、方法。
【請求項２】
ラクターゼ遺伝子の発現を刺激する必要のある患者においてラクターゼ遺伝子の発現を刺激するための方法であって、ＰＰＡＲγアゴニストを該患者に投与することを包含する、方法。
【請求項３】
ラクトース摂取後の下痢、腹痛および／または鼓脹を処置する必要のある患者においてラクトース摂取後の下痢、腹痛および／または鼓脹を処置するための方法であって、ＰＰＡＲアゴニストを投与することを包含する、方法。
【請求項４】
ラクトースを含む組成物を摂取する患者におけるラクトース不耐症を改善するための方法であって、ＰＰＡＲアゴニストを、該摂取前に、該摂取と実質的に同時に、または該接種後に、投与することを包含する、方法。
【請求項５】
前記ＰＰＡＲアゴニストが、式Ｉ：
【化１４】
2015518483.tif 000018
ならびにその薬学的に受容可能な塩、立体異性体および／またはプロドラッグによって表され、ここで、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、ＨおよびＣ１−６アルキルからなる群より選択されるか；またはＲ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換され得る、５原子もしくは６原子を有する芳香環もしくは脂肪族環を形成し、
ＹおよびＺは、各々独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、−ＯＲ３、−ＣＨ（ＯＲ３）ＣＯＯＨからなる群より選択され；そして
Ｒ３は、Ｈ、１個、２個、３個もしくはそれより多くのハロゲンによって置換されたフェニル、ベンジル、ビニル、アリル、Ｃ１−６アルキルもしくはＣ１−６アルキルからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＰＡＲアゴニストが、（±）−２−ヒドロキシ−３−（３’−アミノフェニル）プロピオン酸；（±）−２−メトキシ−２−（４’−アミノフェニル）酢酸；（±）−２−エトキシ−２−（３’−アミノフェニル）酢酸；（±）−２−エトキシ−２−（４’−アミノフェニル）酢酸；（±）−２−メトキシ−３−（４’−アミノフェニル）プロピオン酸；（±）−２−エトキシ−３−（４’−アミノフェニル）プロピオン酸；（±）−２−エトキシ−３−（３’−アミノフェニル）プロピオン酸、（Ｒ，Ｓ）−２−メトキシ−３−（４−アミノフェニル）プロピオン酸、５−アミノサリチロ−ヒドロキサム酸（化合物５）；３−ジメチルアミノサリチル酸；２−メトキシ−４−アミノ安息香酸；２−メトキシ−５−アミノ安息香酸；５−メチルアミノサリチル酸；４−メチルアミノサリチル酸；４−アセチルアミノサリチル酸；２−エトキシ−４−アミノ安息香酸；２−エトキシ−５−アミノ安息香酸；４−ジメチルアミノサリチル酸；２−エトキシ−４−アミノベンゾイルヒドロキサム酸；６−ヒドロキシキノリン−５−カルボン酸；２−（２−プロピル）オキシ−４−アミノ安息香酸；４−（１−ピペラジニル）サリチル酸；（Ｒ，Ｓ）５−オキサ−キノリン−６−カルボン酸；６−メトキシキノリン−５−カルボン酸；６−メトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−５−カルボン酸；５−ジイソプロピルアミノサリチル酸；および４−ジイソプロピルアミノサリチル酸またはそれらの薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＰＡＲアゴニストが（−）２−Ｒ−メトキシ−３−（４−アミノフェニル）プロピオン酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＰＡＲアゴニストが式Ｉ’：
【化１５】
2015518483.tif 000019
により表される化合物；またはその薬学的に受容可能な塩またはＮ−オキシド；および賦形剤であり、
ここで、Ｘは、ハロゲンまたはヒドロキシルから選択される１個、２個または３個の置換基で必要に応じて置換されたＣ１−Ｃ３アルキレンであり；
Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、およびＣ２−Ｃ６アルキニルからなる群より選択され；
Ｒ２は、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルからなる群より選択され；
Ｒ３は、各出現につき、水素、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシルおよびニトロからなる群より独立して選択され；
Ｒ４は、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルからなる群より選択され；
Ｒ５は、水素  Ｃ１−Ｃ６アルキルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物がＮ−アセチル（Ｒ）−（−）３−（４−アミノフェニル）−２−メトキシプロピオン酸である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＰＡＲアゴニストがメサラミン、スルファサラジン、ピオグリタゾンおよびロシグリタゾンからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
乳製品の成分およびＰＰＡＲアゴニストを含む、食品。
【請求項１２】
前記乳製品の成分がホエイ、ミルク、チーズまたはクリームである、請求項１１に記載の食品。
【請求項１３】
ラクトース不耐症またはラクターゼ欠損症の処置における、ＰＰＡＲアゴニスト化合物の使用。
【請求項１４】
ラクターゼ遺伝子の発現を刺激する方法における、ＰＰＡＲγアゴニストの使用。
【請求項１５】
ラクトース摂取後の下痢、腹痛および／または鼓脹の処置方法における、ＰＰＡＲアゴニストの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１２年４月１８日に出願したＥＰ１２４２５０７３．９および２０１２年７月１８日に出願された米国出願第６１／６７２，９３１号に対する優先権を主張する。これらの出願は両方とも、その全体が参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
ラクターゼタンパク質は、小腸の絨毛の先端に発現し、ラクトースをガラクトースおよびグルコースへと加水分解する能力を有する二糖類分解酵素（ｄｉｓａｃｈａｒｉｄａｓｅ）（β−ガラクトシダーゼ）である。不適切なラクターゼ−フロリジンヒドロラーゼ（ＬＰＨ）活性が、ラクトース摂取後に下痢、腹痛、または鼓脹を引き起こす、ラクトース不耐症／吸収不良の原因である。小腸におけるラクターゼ発現の相対的または絶対的な欠如のために、原発性ラクターゼ欠損症（またはラクターゼ非持続（ｌａｃｔａｓｅ  ｎｏｎ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ）または低ラクターゼ症）が、ラクトース不耐症の主な原因であり、様々な年齢の小児期および種々の人種群で起こる。世界の人口の約７０％が、原発性ラクターゼ欠損症を有する。ラクターゼ（ｌａｃｔｏｓｅ）欠損症のパーセンテージは、民族によって変動し、そして食事中の酪農産物の使用に関連して、北欧の人々では２０％まで、地中海欧州の人々では４０％まで、アフリカの人々では８０％まで、そしてアジアの人々では９０％まで達する。ラクトース不耐症の典型的な処置は、ラクトース除去（栄養障害を引き起こす）、またはラクトース欠損ミルクまたはラクターゼ補充の使用のような、拡張的な（ｅｘｐａｎｓｉｖｅ）レジメである。
【０００３】
２つの特定の一塩基多型（ＳＮＰ）（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ（ＳＮＰ）ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）が、成人型低ラクターゼ症と強く関連することが報告された。フィンランドの人々において、ラクターゼの非持続と、ラクターゼ遺伝子の上流の１３９１０位のＣ（Ｃ＿１３９１０）は１００％関連し、および２２０１８位のＧ（Ｇ＿２２０１８）は９５％より高く関連する。ＳＮＰ。Ｔ＿１３９１０およびＡ＿２２０１８を有する個人の腸管粘膜におけるＬＰＨ  ｍＲＮＡの発現は、Ｃ＿１３９１０およびＧ＿２２０１８を有する個人において見出される発現よりも高く、このことは、ＬＰＨ遺伝子の転写調節を示唆する。しかし、ＬＰＨ遺伝子の調節の多くは未知のままである。よって、ラクトース不耐症および関連する障害の処置において有用な、有効な薬剤が必要である。
【０００４】
ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）は、遺伝子発現を調節するリガンド活性化転写因子である、核ホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＰＰＡＲは、高等生物の細胞分化、発生および代謝の調節において役割を果たす。
【０００５】
３つのタイプのＰＰＡＲが同定された：肝臓、腎臓、心臓および他の組織および臓器で発現されるアルファ、例えば脳で発現されるベータ／デルタ、ならびに３つの形態：ガンマ１、ガンマ２、およびガンマ３で発現されるガンマ。ＰＰＡＲγ受容体は、ケラチノサイト分化の刺激と関連付けられており、そして乾癬およびアトピー性皮膚炎のような皮膚障害を含む、多くの疾患状態の可能性のある薬剤標的となった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
本開示は一般的に、ラクトース不耐症を処置するか、改善するか、または実質的に予防する必要のある患者においてラクトース不耐症を処置するか、改善するか、または実質的に予防する方法に関しており、該方法はＰＰＡＲモジュレーター、例えばＰＰＡＲα、δ、またはγ、例えばＰＰＡＲγモジュレーター、例えばアゴニスト（例えば本明細書中で開示される化合物のような）を含む組成物を、その必要のある患者に投与することを含む。その必要のある患者において、ラクターゼ（ｌａｃｔｏｓｅ）遺伝子発現を刺激するための方法も本明細書中で提供され、該方法はＰＰＡＲアゴニスト、例えばＰＰＡＲα、δ、またはＰＰＡＲγアゴニストを患者に投与することを含む。
【０００７】
ラクトース摂取後の下痢、腹痛、および／または鼓脹を処置する必要のある患者において、ラクトース摂取後の下痢、腹痛、および／または鼓脹を処置するための方法も、本明細書中で提供され、該方法はＰＰＡＲアゴニスト、例えばＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲγアゴニストを投与することを含む。例えば、ラクトースを含む組成物を摂取する患者においてラクトース不耐症を改善するための方法が、本明細書中で提供され、該方法は、該摂取の前に、該摂取と実質的に同時に、または該摂取の後に、ＰＰＡＲアゴニストを投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１Ａは、１ｍＭの化合物３４による２４時間の処置後の同調したＣａｃｏ２細胞において、ｑＰＣＲで評価した遺伝子発現を示す。マイクロアレイにおいて観察された、１２個のアップレギュレートされた遺伝子発現の確認。ＡＱＰ１２、ＯＳＴαおよびＬＺＴＳ１のアップレギュレートされた発現は確認されていない。結果を、コントロール（値１に設定）と比較した倍数で表す。図１Ｂは、１ｍＭの化合物３４による２４時間の処置後の同調したＣａｃｏ２細胞において、ｑＰＣＲで評価した遺伝子発現を示す。マイクロアレイにおいて観察された、１２個のアップレギュレートされた遺伝子発現の確認。ＡＱＰ１２、ＯＳＴαおよびＬＺＴＳ１のアップレギュレートされた発現は確認されていない。結果を、相対的な発現で表す。
【図２】図２Ａは、１ｍＭの化合物３４による２４時間の処置後の同調したＣａｃｏ２細胞において、ｑＰＣＲで評価した遺伝子発現を示す。マイクロアレイにおいて観察された、１５個のアップレギュレートされた遺伝子発現全ての確認。結果を、コントロール（値１に設定）と比較した倍数で表す。図２Ｂは、１ｍＭの化合物３４による２４時間の処置後の同調したＣａｃｏ２細胞において、ｑＰＣＲで評価した遺伝子発現を示す。マイクロアレイにおいて観察された、１５個のアップレギュレートされた遺伝子発現全ての確認。結果を、相対的な発現で表す。
【図３】図３は、倍数で表された刺激２の遺伝子発現が刺激１のマイクロアレイの結果と相関していることを示す（ｒ＝０．７５４、ｐ＝０．００４６）。
【図４】図４は、ラクターゼｍＲＮＡの発現が、ＰＰＡＲによって誘導されることを示す。Ｃａｃｏ−２細胞を、様々なＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲαアゴニストで刺激した。統計学的な差を、ノンパラメトリックマン−ホイットニー検定を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアで分析した。
【図５】図５は、ヒトラクターゼ遺伝子のプロモーター（３０００ｂｐ）における、直列反復配列の同定である。ＤＲ１は太字であり、そしてＤＲ２は太字でありかつ「ＡＧ」で始まる。ＴＡＴＡボックスも示され、そして小文字は最初のエキソンの開始を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
詳細な説明
開示の特徴および他の詳細を、より具体的に説明する。本発明をさらに説明する前に、明細書、実施例、および添付の請求において採用される特定の用語を、ここに集める。これらの定義は、開示の残りの部分を考慮して読まれるべきであり、そして当業者によって理解されるとおりに理解される。他に定義しなければ、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。
【００１０】
定義
「処置する」は、状態、疾患、障害等の改善を引き起こす任意の効果、例えば減少、低減、モジュレーション、または排除を包含する。
【００１１】
本明細書中で使用される「アルケニル」という用語は、本明細書中でそれぞれＣ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、およびＣ２−Ｃ６アルケニルと呼ばれる、２〜１２個、２〜１０個、または２〜６個の炭素原子の直鎖または分岐鎖の基のような、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する、不飽和の直鎖または分岐鎖の炭化水素を指す。代表的なアルケニル基としては、ビニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ブタジエニル、ペンタジエニル、ヘキサジエニル、２−エチルヘキセニル、２−プロピル−２−ブテニル、４−（２−メチル−３−ブテン）−ペンテニル等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１２】
本明細書中で使用される「アルコキシ」という用語は、酸素に結合したアルキル基（−Ｏ−アルキル−）を指す。代表的なアルコキシ基としては、本明細書中でそれぞれＣ１−Ｃ１２アルコキシ、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、およびＣ１−Ｃ６アルコキシと呼ばれる、１〜１２個、１〜８個、または１〜６個の炭素原子のアルキル、アルケニル、またはアルキニルの基を有する基が挙げられるがこれらに限定されない。代表的なアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ等が挙げられるがこれらに限定されない。同様に、代表的な「アルケノキシ」基としては、ビニルオキシ、アリルオキシ、ブテノキシ等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１３】
本明細書中で使用される「アルキル」という用語は、本明細書中でそれぞれＣ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、およびＣ１−Ｃ６アルキルと呼ばれる、１〜１２個、１〜１０個、または１〜６個の炭素原子の直鎖または分岐鎖の基のような、飽和の直鎖または分岐鎖の炭化水素を指す。代表的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、２−メチル−１−プロピル、２−メチル−２−プロピル、２−メチル−１−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−３−ブチル、２，２−ジメチル−１−プロピル、２−メチル−１−ペンチル、３−メチル−１−ペンチル、４−メチル−１−ペンチル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、２，２−ジメチル−１−ブチル、３，３−ジメチル−１−ブチル、２−エチル−１−ブチル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等が挙げられるがこれらに限定されない。ある実施態様において、アルキルはＣ１−Ｃ６アルキルを指す。ある実施態様において、シクロアルキルは、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルを指す。
【００１４】
いくつかの実施態様において、アルキル、アルケニル、およびアルキニル基を、アルカノイル、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミジノ、アミノ、アリール、アリールアルキル、アジド、カルバメート、カルボネート、カルボキシ、シアノ、シクロアルキル、エステル、エーテル、ホルミル、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヒドロキシル、イミノ、ケトン、ニトロ、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、スルフェート、スルフィド、スルホンアミド、スルホニルおよびチオカルボニルから選択される、少なくとも１つの基で必要に応じて置換してもよく、または中断してもよい。
【００１５】
本明細書中で使用される「アルキニル」という用語は、本明細書中でそれぞれＣ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、およびＣ２−Ｃ６アルキニルと呼ばれる、２〜１２個、２〜８個、または２〜６個の炭素原子の直鎖または分岐鎖の基のような、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する、不飽和の直鎖または分岐鎖の炭化水素を指す。代表的なアルキニル基としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、メチルプロピニル、４−メチル−１−ブチニル、４−プロピル−２−ペンチニル、および４−ブチル−２−ヘキシニル等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１６】
本明細書中で使用される「アリール」という用語は、単環式、二環式、または他の多環式の炭素環式芳香環系を指す。ある実施態様において、アリールは、単環式および／または二環式の５〜６員の環を指す。その芳香環を、１つまたはそれより多くの環位置において、アルカノイル、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミジノ、アミノ、アリール、アリールアルキル、アジド、カルバメート、カルボネート、カルボキシ、シアノ、シクロアルキル、エステル、エーテル、ホルミル、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヒドロキシル、イミノ、ケトン、ニトロ、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、スルフェート、スルフィド、スルホンアミド、スルホニルおよびチオカルボニルから選択される置換基で置換し得る。「アリール」という用語はまた、２つまたはそれより多くの環式環を有する多環式環系であって、ここで２つの隣接する環で２つまたはそれより多くの炭素が共通であり（その環は「縮合環」である）、ここでその環の少なくとも１つは芳香族である（例えば、他方の環式環はシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、および／またはアリールであり得る）多環式環系を包含する。代表的なアリール基としては、フェニル、トリル、アントラセニル、フルオレニル、インデニル、アズレニル、およびナフチル、および５，６，７，８−テトラヒドロナフチルのようなベンゾ縮合炭素環式部分が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１７】
本明細書中で使用される「カルボキシ」という用語は、ラジカル−ＣＯＯＨまたはその対応する塩、例えば−ＣＯＯＮａ等を指す。
【００１８】
本明細書中で使用される「シクロアルキル」という用語は、シクロアルカン由来の、本明細書中で例えば「Ｃ４−８シクロアルキル」と呼ばれる、３〜１２個、３〜８個、４〜８個、または４〜６個の炭素の、一価の飽和または不飽和の環式、二環式、または架橋二環式の炭化水素基を指す。代表的なシクロアルキル基としては、シクロヘキサン、シクロヘキセン、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロブタン、およびシクロプロパンが挙げられるがこれらに限定されない。シクロアルキル基を、アルカノイル、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミジノ、アミノ、アリール、アリールアルキル、アジド、カルバメート、カルボネート、カルボキシ、シアノ、シクロアルキル、エステル、エーテル、ホルミル、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヒドロキシル、イミノ、ケトン、ニトロ、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、スルフェート、スルフィド、スルホンアミド、スルホニル、およびチオカルボニルで置換し得る。シクロアルキル基を、他のシクロアルキル、アリール、またはヘテロシクリル基に縮合し得る。ある実施態様において、シクロアルキルは、Ｃ３−Ｃ６アルキルを指す。
【００１９】
本明細書中で使用される「ハロ」または「ハロゲン」または「Ｈａｌ」という用語は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩを指す。
【００２０】
本明細書中で使用される「ハロアルキル」という用語は、１つまたはそれより多くのハロゲン原子で置換されたアルキル基を指す。
【００２１】
本明細書中で使用される「フェニル」という用語は、６員環炭素環式芳香環を指す。フェニル基をまた、シクロヘキサンまたはシクロペンタンの環に縮合し得る。フェニルを、アルカノイル、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミジノ、アミノ、アリール、アリールアルキル、アジド、カルバメート、カルボネート、カルボキシ、シアノ、シクロアルキル、エステル、エーテル、ホルミル、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヒドロキシル、イミノ、ケトン、ニトロ、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、スルフェート、スルフィド、スルホンアミド、スルホニル、およびチオカルボニルを含む、１つまたはそれより多くの置換基で置換し得る。
【００２２】
本明細書中で使用される「薬学的に受容可能な担体」または「薬学的に受容可能な賦形剤」という用語は、医薬の投与と適合性である、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、等張および吸収遅延剤等を指す。薬学的に活性な物質のためにそのような媒体および薬剤を使用することは、当該分野で周知である。その組成物はまた、補助的な、追加の、または増強された治療機能を提供する、他の活性化合物を含み得る。
【００２３】
本明細書中で使用される「医薬品組成物」という用語は、１つまたはそれより多くの薬学的に受容可能な担体と共に製剤化された、本明細書中で開示される少なくとも１つの化合物を含む組成物を指す。
【００２４】
「個体」、「患者」、または「対象」は交換可能に使用され、そして哺乳類、好ましくはマウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、または霊長類、そして最も好ましくはヒトを含む任意の動物を包含する。本発明の化合物を、ヒトのような哺乳類に投与し得るが、獣医学的処置を必要とする動物のような、他の哺乳類、例えば家庭内動物（例えばイヌ、ネコ等）、農場動物（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）、および実験動物（例えばラット、マウス、モルモット等）に投与してもよい。本発明の方法で処置する哺乳類は、望ましくは、ＰＰＡＲ受容体のモジュレーションが望ましい哺乳類である。「モジュレーション」は、拮抗作用（例えば阻害）、アゴニズム、部分的な拮抗作用、および／または部分的なアゴニズムを包含する。
【００２５】
本明細書において、「治療的に有効な量」という用語は、研究者、獣医、医師、または他の臨床医によって求められる、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的な応答を誘発する、対象化合物の量を意味する。本発明の化合物を、疾患を処置するために、治療的に有効な量で投与する。あるいは、化合物の治療的に有効な量は、ＰＰＡＲ受容体に関連する疾患に伴う症状の予防または減少を引き起こす量のような、望ましい治療および／または予防効果を達成するために必要な量である。
【００２６】
本明細書中で使用される「薬学的に受容可能な塩」という用語は、本組成物において使用される化合物に存在し得る、酸性または塩基性の基の塩を指す。本組成物に含まれる、塩基性の性質を有する化合物は、様々な無機酸および有機酸と広く様々な塩を形成し得る。そのような塩基性化合物の、薬学的に受容可能な酸付加塩を調製するために使用し得る酸は、無毒性の酸付加塩、すなわち薬理学的に受容可能な陰イオンを含む塩を形成するものであり、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩（ｇｅｎｔｉｓｉｎａｔｅ）、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびパモエート（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート））という塩を包含するがこれらに限定されない。本組成物に含まれる、アミノ部分を含む化合物は、上記で述べた酸に加えて、様々なアミノ酸と薬学的に受容可能な塩を形成し得る。本組成物に含まれる、酸性の性質を有する化合物は、様々な薬理学的に受容可能な陽イオンと、塩基性塩を形成し得る。そのような塩の例としては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩、および特に、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、リチウム、亜鉛、カリウム、および鉄の塩が挙げられる。
【００２７】
本開示の化合物は、１つまたはそれより多くのキラル中心および／または二重結合を含み得、そして従って、幾何異性体、鏡像異性体、またはジアステレオマーのような、立体異性体として存在し得る。本明細書中で使用される場合、「立体異性体」という用語は、全ての幾何異性体、鏡像異性体、またはジアステレオマーからなる。これらの化合物は、ステレオジェニックな炭素原子の周囲の置換基の配置に依存して、記号「Ｒ」または「Ｓ」によって示され得る。本発明は、これらの化合物の様々な立体異性体およびその混合物を包含する。立体異性体は、鏡像異性体およびジアステレオマーを包含する。鏡像異性体またはジアステレオマーの混合物を、命名法で「（±）」と示し得るが、当業者は、構造が暗にキラル中心を示し得ることを認識する。
【００２８】
本発明の化合物の個々の立体異性体を、非対称性のまたはステレオジェニックな中心を含む、市販で入手可能な出発材料から合成的に調製し得るか、またはラセミ混合物の調製の後に当業者に周知の分割方法によって調製し得る。これらの分割方法は、（１）鏡像異性体の混合物のキラル補助基への結合、できたジアステレオマーの混合物の、再結晶またはクロマトグラフィーによる分離、および補助基からの光学的に純粋な生成物の遊離、（２）光学活性な分割剤を採用する塩形成、または（３）キラルクロマトグラフィーカラムにおける光学鏡像異性体の混合物の直接的な分離によって例示される。立体異性体混合物をまた、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高速液体クロマトグラフィー、キラル塩錯体としての化合物の結晶化、またはキラル溶媒中における化合物の結晶化のような、周知の方法によって、その成分立体異性体へと分割し得る。立体異性体をまた、周知の非対称性合成方法によって、立体的に純粋な中間体、試薬、および触媒から得ることができる。
【００２９】
幾何異性体はまた、本発明の化合物に存在し得る。その記号
【化１】
2015518483.tif 000003
は、本明細書中で記載される場合、単結合、二重結合、または三重結合であり得る結合を意味する。本発明は、炭素−炭素二重結合の周りの置換基の配置、または炭素環式環の周囲の置換基の配置によって生じる、様々な幾何異性体およびその混合物を包含する。炭素−炭素二重結合の周囲の置換基は、「Ｚ」または「Ｅ」の配置であると示され、ここで「Ｚ」および「Ｅ」という用語は、ＩＵＰＡＣ基準によって使用される。他に特定されなければ、二重結合を表す構造は、「Ｅ」および「Ｚ」の両方の異性体を包含する。
【００３０】
あるいは、炭素−炭素二重結合の周囲の置換基を、「シス」または「トランス」と呼び得、ここで「シス」は、二重結合の同じ側の置換基を示し、そして「トランス」は二重結合の反対側の置換基を示す。炭素環式環の周囲の置換基の配置は、「シス」または「トランス」と示される。「シス」という用語は、環の水平面の同じ側にある置換基を示し、そして「トランス」という用語は、環の水平面の反対側にある置換基を示す。環の水平面の同じ側および反対側の両方に置換基が配置している化合物の混合物は、「シス／トランス」と表される。
【００３１】
本明細書中で開示される化合物は、水、エタノール等のような、薬学的に受容可能な溶媒と溶媒和した形態で、および溶媒和していない形態で存在し得、そして本発明は、溶媒和形態および溶媒和していない形態の両方を包含することが意図される。１つの実施態様において、その化合物は無定形である。１つの実施態様において、その化合物は多形である。別の実施態様において、その化合物は結晶形である。
【００３２】
本発明はまた、同位体的に標識された本発明の化合物を包含し、それらは、１つまたはそれより多くの原子が、自然の中で通常見出される原子質量または質量数と異なる原子質量または質量数を有する原子で置換されている以外は、本明細書中で列挙されたものと同一である。本発明の化合物に組み込み得る同位元素の例としては、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、および３６Ｃｌのような、水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素、および塩素の同位元素が挙げられる。
【００３３】
ある同位体的に標識された開示化合物（例えば３Ｈおよび１４Ｃで標識されたもの）は、化合物および／または基質組織分布アッセイにおいて有用である。トリチウム化（すなわち３Ｈ）および炭素−１４（すなわち１４Ｃ）同位元素は、その調製の容易さおよび検出性のために、特に好ましい。さらに、重水素（すなわち２Ｈ）のような、より重い同位元素による置換は、より高い代謝安定性（例えばインビボ半減期の増加または投与量要件の低減）から生じる、ある治療的利点を提供し得、そして従ってある状況において好ましくあり得る。同位体的に標識された本発明の化合物を、一般的に、同位体的に標識された試薬で、非同位体標識試薬を置換することによって、例えば本明細書中の実施例において開示されたものと同様の手順によって調製し得る。
【００３４】
「プロドラッグ」という用語は、インビボで変換されて、開示された化合物またはその化合物の薬学的に受容可能な塩、水和物、もしくは溶媒和物を生じる化合物を指す。その変換は、血液中の加水分解によるような、様々なメカニズムによって起こり得る。例えば、もし本発明の化合物またはその化合物の薬学的に受容可能な塩、水和物、もしくは溶媒和物が、カルボン酸官能基を含むなら、プロドラッグは、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１２）アルカノイルオキシメチル、４から９個の炭素原子を有する１−（アルカノイルオキシ）エチル、５から１０個の炭素原子を有する１−メチル−１−（アルカノイルオキシ）−エチル、３から６個の炭素原子を有するアルコキシカルボニルオキシメチル、４から７個の炭素原子を有する１−（アルコキシカルボニルオキシ）エチル、５から８個の炭素原子を有する１−メチル−１−（アルコキシカルボニルオキシ）エチル、３から９個の炭素原子を有するＮ−（アルコキシカルボニル）アミノメチル、４から１０個の炭素原子を有する１−（Ｎ−（アルコキシカルボニル）アミノ）エチル、３−フタリジル、４−クロトノラクトニル、ガンマ−ブチロラクトン−４−イル、ジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ２−Ｃ３）アルキル（β−ジメチルアミノエチルのような）、カルバモイル−（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルカルバモイル−（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、およびピペリジノ−、ピロリジノ−、またはモルホリノ（Ｃ２−Ｃ３）アルキルのような基による、酸性基の水素原子の置換によって形成されたエステルを含み得る。
【００３５】
同様に、もし本発明の化合物が、アルコール官能基を含むなら、プロドラッグは、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイルオキシメチル、１−（（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイルオキシ）エチル、１−メチル−１−（（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイルオキシ）エチル  （Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニルオキシメチル、Ｎ−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニルアミノメチル、スクシノイル、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイル、α−アミノ（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、アリールアシルおよびα−アミノアシル、またはα−アミノアシル−α−アミノアシルのような基による、アルコール基の水素原子の置換によって形成され得、ここで各α−アミノアシル基は独立に、天然に存在するＬ−アミン酸、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、またはグリコシル（炭水化物のヘミアセタール形態のヒドロキシル基の除去により生じるラジカル）から選択される。
【００３６】
もし本発明の化合物が、アミン官能基を含むなら、Ｒ−カルボニル、ＲＯ−カルボニル、ＮＲＲ’−カルボニル（ここで、ＲおよびＲ’がそれぞれ独立に（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、ベンジルであるか、またはＲ−カルボニルが天然α−アミノアシルもしくは天然α−アミノアシル−天然α−アミノアシルである）、−Ｃ（ＯＨ）Ｃ（Ｏ）ＯＹ１（ここで、Ｙ１がＨ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、またはベンジルである）、−Ｃ（ＯＹ２）Ｙ３（ここで、Ｙ２が（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、そしてＹ３が（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミノ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、またはモノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノアルキルである）、−Ｃ（Ｙ４）Ｙ５（ここで、Ｙ４がＨまたはメチルであり、そしてＹ５がモノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、モルホリノ、ピペリジン−１−イル、またはピロリジン−１−イルである）のような基による、アミン基の水素原子の置換によって、プロドラッグが形成され得る。
【００３７】
ＰＰＡＲモジュレーター
本開示は、少なくとも部分的に、ＰＰＡＲモジュレート活性、例えばＰＰＡＲγモジュレート活性を有する化合物を提供する。そのような化合物を、例えば下記で示す式によって表し得る。開示された式によって表される化合物、および例えば薬学的または美容的に受容可能な担体または賦形剤を含む組成物も、本明細書中で企図される。
【００３８】
例えば、ある実施態様において、企図されるＰＰＡＲモジュレート化合物（例えばＰＰＡＲ活性を有する化合物）を、
【化２】
2015518483.tif 000004
およびその薬学的に受容可能な塩、立体異性体、プロドラッグによって表し得、ここで：
Ｒ１およびＲ２は各々独立して、ＨおよびＣ１−６アルキルからなる群から選択されるか；またはＲ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換され得る、５原子もしくは６原子を有する芳香環もしくは脂肪族環を形成し；
ＹおよびＺは各々独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、−ＯＲ３、−ＣＨ（ＯＲ３）ＣＯＯＨからなる群から選択され；そして
Ｒ３は、Ｈ、１個、２個、３個もしくはそれより多くのハロゲンによって置換されたフェニル、ベンジル、ビニル、アリル、Ｃ１−６アルキルもしくはＣ１−６アルキルからなる群から選択される。
【００３９】
ある実施態様において、ＹはＨまたはＣＯＯＨであり得る。例えば、ＹはＨであり得、そしてＺはＣＨ（ＯＲ３）ＣＯＯＨであり得るか、またはＹはＣＯＯＨであり得、そしてＺは−ＯＲ３であり得る。いくつかの実施態様において、Ｒ３はメチル、エチル、ｎ−プロピル、またはイソプロピルであり得る。
【００４０】
他の実施態様において、ＮＲ１Ｒ２部分は、４’位であり得るか、または３’位であり得る。ある実施態様において、Ｒ１およびＲ２はＨである。
【００４１】
代表的な化合物はまた、式ＩＩａもしくは式ＩＩｂによって表されるもの、またはその薬学的に受容可能な塩、鏡像異性体、もしくは立体異性体を含む：
【化３】
2015518483.tif 000005
ここで：
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、ＨおよびＣ１−６アルキルからなる群から選択されるか；またはＲ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、５原子もしくは６原子を有する芳香環もしくは脂肪族環を形成する；
Ｒ６は、−ＮＨＯＨ、ＯＨ、および−ＯＲ９からなる群から選択される；
Ｒ９は、Ｃ１−６アルキルである；
Ｒ４は、Ｈ、１個もしくはそれより多くのハロゲンによって置換されたフェニル、ベンジル、ビニル、アリル、Ｃ１−６アルキル、もしくはＣ１−６アルキルから選択される；
Ｒ５およびＲ７はそれぞれ独立に、水素またはハロであるか、または；または
【００４２】
Ｒ４およびＲ５、またはＲ４およびＲ６は一緒になって、必要に応じてハロまたはＣ１−６アルキルによって置換された、５原子または６原子を有する、縮合複素環式環を形成する；およびＡは縮合複素環式環である；あるいはその薬学的に受容可能な塩。
【００４３】
ある実施態様において、式ＩＩａのＮＲ１Ｒ２部分は、４’位にあり得るか、または３’位にあり得る。ある実施態様において、Ｒ１およびＲ２はＨである。
【００４４】
Ｒ９は、いくつかの実施態様において、メチル、エチル、ｎ−プロピル、またはイソプロピルであり得る。
【００４５】
いくつかの実施態様において、化合物は
【化４】
2015518483.tif 000006
によって表され得、ここでｐは１または２であり、Ｒ６はＯＨまたは−ＯＲ９であり、ここでＲ９は上記で規定されており、そしてＲ１０は、各出現に関して独立して、Ｈ、ハロ、またはＣ１−６アルキル、例えばメチルまたはエチルからなる群から選択される。
【００４６】
本明細書中で企図される代表的な化合物は、
【化５】
2015518483.tif 000007
またはその薬学的に受容可能な塩を包含する。
【００４７】
いくつかの実施態様において、企図される化合物は、４−アミノ−Ｎ−ヒドロキシ−２−メトキシベンズアミド（化合物１３）；６−メトキシキノリン−５−カルボン酸（化合物３６）；６−メトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−５−カルボン酸（化合物３７）；５−ジイソプロピルアミノサリチル酸（化合物３８）を包含する。
【００４８】
他の代表的な化合物は、
【化６】
2015518483.tif 000008
によって表されるものを包含する。
【００４９】
本明細書中で企図される化合物は、ラセミ混合物、および化合物の鏡像異性体、例えば：（±）−２−ヒドロキシ−３−（３’−アミノフェニル）プロピオン酸（化合物２０）；（±）−２−メトキシ−２−（４’−アミノフェニル）酢酸（化合物２３）；（±）−２−エトキシ−２−（３’−アミノフェニル）酢酸（化合物３２）；（±）−２−エトキシ−２−（４’−アミノフェニル）酢酸（化合物３３）；（±）−２−メトキシ−３−（４’−アミノフェニル）プロピオン酸（化合物３４）「±３４」（ラセミ形態）；（±）−２−エトキシ−３−（４’−アミノフェニル）プロピオン酸（化合物３９）；（±）−２−エトキシ−３−（３’−アミノフェニル）プロピオン酸（化合物４０）を包含する。
【００５０】
例えば、本発明の方法において使用される化合物は、以下のラセミ混合物の鏡像異性体：（Ｒ，Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−（３−アミノフェニル）酢酸（化合物１０）；（Ｒ，Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−（４−アミノフェニル）酢酸（化合物１１）；（Ｒ，Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−（４’−アミノフェニル）プロピオン酸（化合物２１）；（Ｒ，Ｓ）−２−メトキシ−２−（３’−アミノフェニル）酢酸（化合物２２）；（Ｒ，Ｓ）−２−メトキシ−３−（３’−アミノフェニル）プロピオン酸（化合物３５）；（Ｒ，Ｓ）−２−メトキシ−３−（４−アミノフェニル）プロピオン酸（化合物３４）、および鏡像異性体、例えば（＋）２−Ｓ−メトキシ−３−（４−アミノフェニル）プロピオン酸（化合物３４）；（−）２−Ｒ−メトキシ−３−（４−アミノフェニル）プロピオン酸（化合物３４）であり得る。
【００５１】
企図される化合物の他のラセミ型混合物は、例えば（±）−２−ヒドロキシ−２−（３’−アミノフェニル）酢酸（化合物１０）；（±）−２−ヒドロキシ−２−（４’−アミノフェニル）酢酸（化合物１１）；（±）−２−ヒドロキシ−３−（４’−アミノフェニル）プロピオン酸（化合物２１）、および（±）−２−メトキシ−２−（３’−アミノフェニル）酢酸（化合物２２）を包含する。
【００５２】
開示される方法において使用することが企図されるさらなる化合物：５−アミノサリチロ−ヒドロキサム酸（化合物５）；３−ジメチルアミノサリチル酸（化合物６）；２−メトキシ−４−アミノ安息香酸（化合物７）；２−メトキシ−５−アミノ安息香酸（化合物８）；５−メチルアミノサリチル酸（化合物９）；４−メチルアミノサリチル酸（化合物１２）；４−アセチルアミノサリチル酸（化合物１６）；２−エトキシ−４−アミノ安息香酸（化合物１８）；２−エトキシ−５−アミノ安息香酸（化合物１９）；４−ジメチルアミノサリチル酸（化合物２４）；２−エトキシ−４−アミノベンゾイルヒドロキサム酸（化合物２５）；６−ヒドロキシキノリン−５−カルボン酸（化合物２７）；２−（２−プロピル）オキシ−４−アミノ安息香酸（化合物３０）；４−（１−ピペラジニル）サリチル酸（化合物４１）；（Ｒ，Ｓ）５−オキサ−キノリン−６−カルボン酸（化合物１５）；６−メトキシキノリン−５−カルボン酸（化合物３６）；６−メトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−５−カルボン酸（化合物３７）；５−ジイソプロピルアミノサリチル酸（化合物３８）；および４−ジイソプロピルアミノサリチル酸（化合物４２）。
【００５３】
企図される化合物を作製する方法を、例えばＷＯ２００７／０１０５１６およびＷＯ２００７／０１０５１４において見出し得、それらはそれぞれ本明細書中でその全体として参考として援用される。
【００５４】
【化７】
2015518483.tif 000009
によって表される化合物、またはその薬学的に受容可能な塩またはＮ−オキシドも本明細書中で提供され、
ここでＸは、ハロゲンまたはヒドロキシルから選択される１個、２個または３個の置換基で必要に応じて置換された、Ｃ１−Ｃ３アルキレンであり；
Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、およびＣ２−Ｃ６アルキニルからなる群から選択され；
Ｒ２は、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルからなる群から選択され；
Ｒ３は、各出現につき、水素、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、およびニトロからなる群から独立して選択され；
Ｒ４は、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルからなる群から選択され；
Ｒ５は、Ｃ１−Ｃ６アルキルである。
【００５５】
１つの実施態様において、Ｒ１は、メチルのようなＣ１−Ｃ６アルキルであり得る。１つの実施態様において、Ｒ２は水素であり得る。別の実施態様において、Ｒ３は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ハロゲン、およびヒドロキシルからなる群から選択され得る。さらなる実施態様において、Ｒ３は水素であり得る。１つの実施態様において、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり得る。別の実施態様において、Ｒ４は水素であり得、そしてＲ５はメチルであり得る。１つの実施態様において、Ｘは（ＣＨ２）ｎであり得、ここでｎは１または２、例えば１である。
【００５６】
別の実施態様において、−ＮＲ２−ＣＯＲ１は、式ＩＩＩ’において示すように、Ｘに対してメタ位にあり得る。
【化８】
2015518483.tif 000010
【００５７】
別の実施態様において、−ＮＲ２−ＣＯＲ１は、式ＩＶ’において示すように、Ｘに対してパラ位にあり得る。
【化９】
2015518483.tif 000011
【００５８】
本開示は、少なくとも部分的には、下記に示すような、式ＩＩ’によって表される化合物を提供する。式ＩＩによって表される化合物、またはその薬学的に受容可能な塩もしくはＮ−オキシド、および例えば薬学的に受容可能な担体を含む組成物も、本明細書中で企図される。
【化１０】
2015518483.tif 000012
ここでＲ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、およびＣ２−Ｃ６アルキニルからなる群から選択され；
Ｒ２は、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルからなる群から選択され；
Ｒ３は、各出現につき、水素、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、およびニトロからなる群から独立して選択され；
Ｒ５は、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルである。
【００５９】
下記に示すような式ＩＩ’の化合物、ならびに式ＩＩ’によって表される化合物、および例えば薬学的に受容可能な担体を含む組成物も企図される。企図される化合物は、
【化１１】
2015518483.tif 000013
またはその薬学的に受容可能な塩またはＮ−オキシドを含み得、
ここでＲ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、およびＣ２−Ｃ６アルキニルからなる群から選択され；
Ｒ３は、各出現につき、水素、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、およびニトロからなる群から独立して選択され；
Ｒ４は、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルからなる群から選択され；
Ｒ５は、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり；そして
Ａは５員または６員の縮合複素環である。
【００６０】
１つの実施態様において、Ｒ１は、メチルのようなＣ１−Ｃ６アルキルであり得る。別の実施態様において、Ｒ１およびＲ３は、それぞれメチルのようなＣ１−Ｃ６アルキルであり得る。１つの実施態様において、Ｒ２は水素であり得る。
【００６１】
いくつかの実施態様において、化合物を
【化１２】
2015518483.tif 000014
またはその薬学的に受容可能な塩またはＮ−オキシドによって表し得、
ここでｐは１または２であり；
Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、およびＣ２−Ｃ６アルキニルからなる群から選択され；
Ｒ４およびＲ８は、各々独立して、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルからなる群から選択される。
【００６２】
企図される化合物、および少なくとも１つの化合物を含む医薬品組成物を、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−（−）−３−（４−アミノフェニル）−２−メトキシプロピオン酸（化合物Ａ）、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−（−）−３−（４−アミノフェニル）−２−メトキシプロピオン酸（化合物Ｂ）、ラセミ体Ｎ−アセチル−（Ｓ）−（−）−３−（４−アミノフェニル）−２−メトキシプロピオン酸（化合物ＡＢ）；
【化１３】
2015518483.tif 000015
４−アセトアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−２−メトキシベンズアミド；１−アセチル−６−メトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−５−カルボン酸、５−アセトアミド−２−ヒドロキシ安息香酸（例えばアセチル化５−アミノサリチル酸）、またはその薬学的に受容可能な塩またはＮ−オキシドからなる群から選択し得る。
【００６３】
５−アミノサリチル酸（メサラミン）、スルファサラジン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、ザクロの花の抽出物、イブプロフェンを含む非ステロイド性抗炎症薬、およびΨ−バプチゲニンを含む、他のＰＰＡＲモジュレーターまたはアゴニストも、本明細書中で提供される。
【００６４】
本開示はまた、１つまたはそれより多くの薬剤学的または美容的に受容可能な担体と共に製剤化された、本明細書中で開示された化合物を含む医薬品組成物を提供する。これらの製剤は、経口、直腸内、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、バッカル、および非経口（例えば皮下、筋肉内、皮内、または静脈内）投与のために、または例えば美容製品として局所（ｔｏｐｉｃａｌ）使用するために適切なものを包含する。任意の所定の場合において最も適切な投与形態は、処置する状態の程度および重症度、および使用する特定の化合物の性質に依存する。
【００６５】
治療適用
本開示は、少なくとも部分的に、開示化合物のような、ＰＰＡＲモジュレーター、例えばＰＰＡＲγモジュレーターを用いて、ラクトース不耐症を処置または改善することに関する。例えば、ラクトース摂取後の、下痢、腹痛、および／または鼓脹を処置する方法が提供され、ここで開示化合物（または例えば開示化合物を含む組成物）が、その必要のある患者に投与される、例えば経口投与される。
【００６６】
例えば、ラクトースを含む組成物を摂取する患者において、ラクトース不耐症を改善する方法であって、ＰＰＡＲアゴニスト、例えばＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、および／またはＰＰＡＲγアゴニストを、該摂取の前に、該摂取と実質的に同時に、または該摂取の後に、投与することを含む方法が本明細書中で提供される。
【００６７】
ラクトース不耐症を低減するために使用する組成物も、本明細書中で企図され、例えば、開示組成物は、ＰＰＡＲモジュレーターを含む、低ラクトース含量のミルクまたは乳製品の一部を形成し得る、またはそれを製造するために使用される。そのような組成物は、ホエイ、ミルク、またはチーズの一部であり得る。
【００６８】
本発明の化合物を、そのような処置が必要な対象（動物および／またはヒト）に、最適な薬学的効果を提供する投与量で投与し得る。任意の特定の適用において使用するために必要な用量は、選択された特定の化合物または組成物によるだけでなく、投与経路、処置する状態の性質、患者の年齢および状態、併用薬物適用、または患者がその時従っている特別な食事、ならびに当業者が認識する他の因子によっても、患者ごとに異なり、適切な投与量は、最終的に担当医の裁量によることが認識される。上記で述べた臨床状態および疾患を処置するために、本発明の化合物を、従来の無毒性の薬学的に受容可能な担体、アジュバント、および媒体を含む、投与単位製剤において、経口的に、局所的に、非経口的に、吸入スプレーによって、または直腸に投与し得る。本明細書中で使用される非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内の注射または注入の技術を含む。
【００６９】
一般的に、活性成分の治療的に有効な量は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、任意で約１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、任意で約１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。投与する量は、治療する疾患または適応症のタイプおよび程度、その特定の患者の全体的な健康状態、化合物の相対的な生物学的有効性、化合物の製剤、製剤中の賦形剤の存在およびタイプ、ならびに投与経路のような変数に依存する。投与する最初の投与量を、望ましい血液レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために、上のレベルを超えて増加させてもよく、または最初の投与量は最適より低くてもよく、そして毎日の投与量を、特定の状況に依存して治療過程の間に徐々に増加させてもよい。例えば、０．５ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇまで進めるようにデザインされた、従来の第Ｉ相用量漸増試験において、ヒト投与量を最適化し得る。投与経路、投与量、および治療する疾患の状態のような因子に依存して、投薬頻度は変動し得る。代表的な投薬頻度は、１日１回、１週間に１回、および２週間に１回である。
【００７０】
企図される製剤または組成物は、開示された化合物を含み、そして典型的には薬学的に受容可能な担体または賦形剤も含み得る。
【００７１】
企図される組成物を、当該分野において周知であるように、その意図する使用に依存して、様々な手段によって投与し得る。例えば、もし本発明の組成物を経口投与するなら、それらを錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、またはシロップ剤として製剤化し得る。あるいは、本発明の製剤を、注射（静脈内、筋肉内、または皮下）、点滴注入（ｄｒｏｐ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ）調製物または浣腸または坐剤として、非経口投与し得る。眼の粘膜経路による適用に関して、本発明の組成物を、点眼薬または眼軟膏として製剤化し得る。これらの製剤を、従来の手段によって調製し得、そしてもし望ましいなら、その組成物を、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、可溶化剤、懸濁補助剤、乳化剤、またはコーティング剤のような、任意の従来の添加物と混合し得る。
【００７２】
本発明の製剤において、湿潤剤、乳化剤、および滑沢剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味料、香料および芳香剤、保存剤および抗酸化剤が、製剤化された薬剤中に存在し得る。
【００７３】
本組成物は、経口、鼻腔、局所（バッカルおよび舌下を含む）、直腸、膣、エアロゾル、および／または非経口での投与のために適切であり得る。その製剤は、単位投与形態で便利に提供され得、そして薬学分野において周知の任意の方法によって調製され得る。単回の用量を産生するために担体材料と組み合わせ得る組成物の量は、処置する患者、および特定の投与形態に依存して変動する。
【００７４】
経口投与のために適切な製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（香味をつけた基剤、通常ショ糖およびアラビアゴムまたはトラガカントゴムを用いる）、散剤、顆粒剤の形態、または水性もしくは非水性の液体中の溶液もしくは懸濁液、または水中油型もしくは油中水型の液体エマルション、またはエリキシルもしくはシロップ、またはパスティーユ（pastille）（ゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアラビアゴムのような、不活性な基剤を用いる）の形態であり得、それらはそれぞれ活性成分として、前もって決定した量のその本組成物を含む。本発明の組成物をまた、ボーラス、舐剤、またはパスタ剤として投与し得る。
【００７５】
経口投与のための固体投与形態（カプセル剤、錠剤、丸剤、フィルムコーティング錠、糖衣錠、散剤、顆粒剤等）において、本組成物を、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸ジカルシウムのような、１つもしくはそれより多くの薬学的に受容可能な担体、および／または以下のもののいずれかと混合する：（１）デンプン、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸のような、フィラーまたは増量剤；（２）例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖および／またはアラビアゴムのような結合剤；（３）グリセロールのような湿潤剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカのデンプン、アルギネート、特定のシリケート、および炭酸ナトリウムのような崩壊剤；（５）パラフィンのような溶液遅延剤；（６）４級アンモニウム化合物のような吸収促進剤；（７）例えばアセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールのような湿潤剤；（８）カオリンおよびベントナイト粘土のような吸収剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびその混合物のような滑沢剤；ならびに（１０）着色剤。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、その組成物はまた、緩衝剤を含み得る。同様のタイプの固体組成物をまた、ラクトースまたは乳糖、および高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を用いる、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル剤におけるフィラーとして採用し得る。
【００７６】
経口投与のための液体投与形態は、薬学的に受容可能なエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルを包含する。本組成物に加えて、その液体投与形態は、例えば水または他の溶媒のような、当該分野において通常使用される不活性な希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に綿実油、ピーナッツ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、シクロデキストリン、およびそれらの混合物のような可溶化剤および乳化剤を含み得る。
【００７７】
懸濁液は、本組成物に加えて、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、およびトラガカントゴム、およびそれらの混合物のような懸濁化剤を含み得る。
【００７８】
組成物が特定の成分を有する、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載される明細書を通して、組成物はまた、列挙された成分から本質的になるかまたはそれらからなることが企図される。同様に、プロセスが、特定のプロセス工程を有する、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載された場合、そのプロセスはまた、列挙されたプロセス工程から本質的になるかまたはそれらからなる。他に示された場合を除いて、工程の順番またはある作業を行う順番は、本発明が実施可能である限り重要でない。さらに、他に示されなければ、２つまたはそれより多くの工程または作業を、同時に行い得る。
【実施例】
【００７９】
本明細書中で開示される化合物を、有機合成の当業者に周知の多くの方法で調製し得る。
【００８０】
実施例Ａ  材料および方法
細胞培養
Ｃａｃｏ−２結腸腺癌細胞系統を使用した。Ｃａｃｏ−２細胞を、２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｄｕｔｓｃｈｅｒ、Ｂｒｕｍａｔｈ、Ｆｒａｎｃｅ）、１％のペニシリン−ストレプトマイシン（５ｍｌ／ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１％の非必須アミノ酸（５ｍｌ／ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）で増殖させた。全ての細胞系統を、３７℃のコントロールした５％ＣＯ２雰囲気中で、コンフルエントな単層として培養した。各週、コンフルエントな単層をトリプシン処理し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、そして次いで１：１０に希釈した後再びプレーティングした。刺激実験のために、細胞を、６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０６細胞の密度で入れた。細胞を同調させるために、刺激の１６時間前に、血清除去を用いた。
【００８１】
細胞の処置
細胞を、化合物３４（１ｍＭおよび３０ｍＭ）、５−ＡＳＡ（３０ｍＭ）、またはピオグリタゾン（１μＭ）で処置した。必要な場合、媒体ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）をコントロール（Ｃｔｒｌ）として使用する。２４時間の刺激の後、４℃の滅菌ＰＢＳで、ウェルを３回洗浄した。次いで細胞を、１％のβ−メルカプトエタノールを含む溶解緩衝液（ＲＡ１、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）によって溶解した。続くＲＮＡ抽出のために、そのプレートを−８０℃で凍結した。処置期間による遺伝子発現を比較するために、６時間および１２時間の間の、１ｍＭの化合物３４によるＣａｃｏ−２細胞の刺激からなる時間経過実験も行った。
【００８２】
ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｈｏｅｒｄｔ、Ｆｒａｎｃｅ）によって抽出した。ＲＮＡｓｅの不活性化の後、ＤＮＡｓｅ処理によって微量のゲノムＤＮＡを全ＲＮＡから除去し、そしてＲＮＡｓｅフリーでＤＥＰＣフリーの水に溶出した。ＲＮＡの純度を、２２０から３５０ｎｍのＮａｎｏｄｒｏｐシステムにおいて、ＵＶ分光法によって評価する。マイクロアレイ実験の前に、ＲＮＡをまたＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーにおいてプロファイリングした。マイクロアレイ分析において、１μｇの全ＲＮＡを使用した（最低濃度：５０ｎｇ／μｌ）。
【００８３】
マイクロアレイ
サンプル（ＤＭＳＯで処理した細胞（Ｃｔｒｌ）対アゴニストで処理した細胞（Ａｇｏ））由来のｃＲＮＡを比較するために、２色遺伝子発現マイクロアレイを使用した。簡単には、サンプル由来のＲＮＡをまず、ｃＤＮＡに逆転写し（Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ、Ａｇｉｌｅｎｔ）、それを次いで、Ｃｔｒｌサンプルに関してはシアニン３−ＣＴＰ（緑色蛍光）、およびＡｇｏサンプルに関してはシアニン５−ＣＴＰ（赤色蛍光）の存在下で、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるｃＲＮＡの合成および増幅の基質として使用する。次いで２つの標識ｃＲＮＡを混合し、そして同じアレイ上でハイブリダイズし（Ｇ４８５１Ａ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ８×４４Ｋ）、次いでそれをスキャンした（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ２５０５Ｂスキャナーを用いて）。レーザー励起後に蛍光を視覚化し、そして各遺伝子の過剰発現状態または低発現状態を得るために、２つのフルオロフォアの相対強度を比として表す（ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて）。この分析を、各アゴニストに関して行った。次いで各アゴニストに関して得られたトランスクリプトームのプロファイルを比較した。マイクロアレイの結果を確認するために、目的の遺伝子の発現を、定量的ＰＣＲによって定量した。
【００８４】
定量的ＰＣＲ
マイクロアレイの結果を確認するために、遺伝子の転写産物を、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって推定した。１μｇの全ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｃｈｉｖｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて逆転写してｃＤＮＡにした。ｑＰＣＲを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。各転写産物についてのプライマー対を、ｑＰｒｉｍｅｒデポーソフトウェアによって選択した。ｑＰＣＲシグナルの定量を、参照遺伝子としてＧＡＰＤＨを用いて、ΔＣｔ相対的定量法を用いて行った。その値を、ｍＲＮＡレベルの変化の相対的な量、またはコントロール条件と比較した倍数の増加に関して示した。
【００８５】
ＰＰＡＲγノックダウン細胞の作製
ＰＰＡＲγノックダウンＩＥＣを、ｐＳＵＰＥＲ．ｒｅｔｒｏシステム（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ）を用いて得た。ヒトＰＰＡＲｇ  ｍＲＮＡのヌクレオチド１０５−１２３（５’−ＧＣＣＣＴＴＣＡＣＴＡＣＴＧＴＴＧＡＣ−３’）に対応する、正方向および逆方向の標的配列を、ｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏベクター（ｐＲＳ）のＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ制限部位にクローニングして、ＳｈＰＰＡＲ構築物を生じた。ルシフェラーゼ遺伝子に対して標的化した、配列５’−ＡＣＧＣＴＧＡＧＴＡＣＴＴＣＧＡＡＡＴ−３’を含む、ネガティブコントロールｐＲＳプラスミドも産生した（ＳｈＬｕｃ構築物）。両方の構築物を、Ａｍａｘａ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｒ技術を用い、製造会社のプロトコールに従って、Ｃａｃｏ−２細胞にトランスフェクトした。ピューロマイシン（５μｇ／ｍｌ）を補充した完全培養培地によって、トランスフェクションの２４時間後に、安定にトランスフェクトしたクローンを選択した。ＰＰＡＲｇ発現のサイレンシングを、定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析によってチェックした。一旦確立したら、ＳｈＰＰＡＲおよびＳｈＬｕｃ細胞系統を、２．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加した完全培地中で維持した。
【００８６】
実施例１  マイクロアレイ
ＰＰＡＲアゴニスト化合物３４によって刺激された、腸管上皮細胞のトランスクリプトーム分析の実行可能性を評価するために、１ｍＭの濃度の化合物３４のみで刺激されたＣａｃｏ−２細胞の遺伝子発現プロファイルを比較した。細胞刺激を４組行い、そして全部で４４０００の遺伝子をスクリーニングした。５２個の遺伝子が、コントロールと比較して、１ｍＭの化合物３４の条件で有意に異なる発現を示した（ｐ＜０．０５）（表１）。４９個の遺伝子が、コントロールと比較して、１ｍＭの化合物３４の条件でアップレギュレートされた（１つの遺伝子（ＬＣＴ１）は５倍より高い変化、４つの遺伝子は３〜５倍の間の変化、そして１３個の遺伝子は２および３倍の間の変化（表１））。３つの遺伝子が、コントロールと比較して、１ｍＭの化合物３４の条件でダウンレギュレートされた（ＭＹＢ、ＯＸＡ１３およびＡＮＫＲＤ１）。
【００８７】
【表１−１】
2015518483.tif 000016
【表１−２】
2015518483.tif 000017
【００８８】
表１．１ｍＭの化合物３４で処理した上皮細胞とコントロールとのトランスクリプトームプロファイルの比較。結果を倍数で表す。
【００８９】
ｑＰＣＲによる確認
我々は、マイクロアレイの結果を確認するために、定量的ＰＣＲを用いた。我々は、同じ条件で培養されたＣａｃｏ２細胞において、マイクロアレイによって評価された、１５個の最もアップレギュレートされた遺伝子（ＳＧＫ２アルファ、ＳＧＫ２ベータ、ＧＰＡ３３、ＣＫＴ２０、ＬＣＴ１、ＡＡＤＡＣ、ＤＭＢＴ１、ＡＣＳＬ５、ＭＭＰ１９、ＳＬＣ２８Ａ４、ＡＱＰ１２、ＭＢＬ２、ＯＳＴアルファ、ＨＭＧＣｏＡＳ２、ＬＺＴＳ１）の発現を、定量的ＰＣＲによって定量した。定量的ＰＣＲによって得られ、そして図１ａ〜ｂに示されたデータは、ＡＱＰ１２、ＯＳＴαおよびＬＺＴＳ１を除く、１２／１５のアップレギュレートされた遺伝子のマイクロアレイ（μａｒｒａｙ）の結果を確認した。
【００９０】
遺伝子のバリエーションを、刺激したＣａｃｏ−２細胞において、第２の独立した実験で評価した。同じ刺激プロトコールを用いて（１ｍＭの化合物３４対コントロール）、そして遺伝子発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて研究した。我々は、ＧＰＡ３３を除く、選択された遺伝子全ての、化合物３４によって誘導されるアップレギュレーションを確認した（弱く発現するが化合物３４によってアップレギュレートされるＡＱＰ１２、ＯＳＴαおよびＬＺＴＳ１を含む）（図２Ａおよび２Ｂ）。
【００９１】
興味深いことに、この実験において、ＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡの発現は、化合物３４処理の後に調節されなかった。このことは、化合物３４によって媒介された標的遺伝子のアップレギュレーションが、受容体発現の増加ではなく、化合物３４によるＰＰＡＲγ活性のモジュレーションに主に起因することを支持する。
【００９２】
マイクロアレイおよびｑＰＣＲにおいて倍数で表された遺伝子発現間の関連
我々のマイクロアレイのデータの再現性をより決定的に評価するために、我々は、定量的ＰＣＲ評価とマイクロアレイ分析との間の相関を評価した。我々は、倍数変化で表されたマイクロアレイ（刺激１）の結果とｑＰＣＲ（刺激２）の結果との間の、有意な強い相関を確認した（ｒ＝０．７５４、ｐ＝０．００４６）（図３）。
【００９３】
実施例２  （ＰＰＡＲ）標的遺伝子としてのラクターゼ遺伝子
上皮細胞によって発現される化合物３４の１５個の新規標的遺伝子の中で、ラクターゼをコードする遺伝子が、最も強い誘導を有するものであった（倍数変化５．２９）。この誘導は、２回目の刺激によって確認された。このことは、ラクターゼ遺伝子は、我々の分析において最もＰＰＡＲｇ感受性の高い遺伝子の１つであることを示唆した（図２ａ）。２０％の欧州の人々において見出されるよくある障害であるラクターゼ（ｌａｃｔｏｓｅ）欠損症におけるラクターゼ遺伝子異常の機能的結果に起因して、我々は、この結果をさらに深く特徴付けることを決めた。不適切なラクターゼ−フロリジンヒドロラーゼ（ＬＰＨ）活性が、ラクトース摂取後に下痢、腹痛および鼓脹を引き起こす、ラクトース不耐症／吸収不良の原因である。
【００９４】
図４は、ＰＰＡＲの様々なアゴニストによって刺激したＣａｃｏ−２細胞の種々の実験における、ラクターゼ転写産物発現の結果を示す。各実験を、少なくとも２回行った。ラクターゼ遺伝子発現が、２つの異なる濃度（１ｍＭ、増加倍数４．７８、ｐ＝０．０００２；３０ｍＭ、増加倍数７．９、ｐ＝０．０００６）の化合物３４によって刺激されることがまず確認された（図４Ａ）。時間経過実験は、１ｍＭの化合物３４による６時間の刺激が、ラクターゼｍＲＮＡの発現を有意に増加させるために十分であること（ｐ＜０．０５）、および１２時間の処理で最大の発現に達する（ｐ＜０．０００１）ことを示した（図４Ａ）。化合物３４と同様に、３０ｍＭの５ＡＳＡおよび１μＭのピオグリタゾンは、ラクターゼｍＲＮＡ発現を同様に有意に増加させた（図４Ｂ）（それぞれ、１２．６９倍の増加、ｐ＝０．０００６、１１．７６倍の増加、ｐ＝０．０００６）。ＰＰＡＲαアゴニストであるフェノフィブラートは、Ｃａｃｏ−２細胞において、ラクターゼ遺伝子の発現を弱く、および有意性なく誘導した（図４Ｃ）。Ｃａｃｏ２  ＳｈＰＰＡＲ細胞系統において、ＰＰＡＲに対する短いヘアピンアンチセンスＲＮＡを安定に発現する細胞系統は、ＰＰＡＲｇ発現の特異的な７０％の減少を引き起こし、そしてラクターゼｍＲＮＡの発現は、ＳｈＬｕｃコントロール細胞と比較して、６３％有意に抑制される（ｐ＝０．００１２）（図４Ｄ）。合わせると、これらのデータは、ヒトラクターゼ遺伝子がＣａｃｏ−２細胞においてＰＰＡＲアゴニストによって誘発され得ること、そしてラクターゼ遺伝子が腸管上皮細胞において新しいＰＰＡＲ標的遺伝子であり得ることを示した。
【００９５】
ＬＣＴ遺伝子の３０００ｂｐ上流におけるＰＰＲＥ配列の存在
ＰＰＡＲγは、別の核受容体ＲＸＲとのヘテロダイマーとして、ＤＮＡに結合し得る。そのヘテロダイマーＰＰＡＲγ−ＲＸＲは、１つまたは２つのヌクレオチドの間隔をあけた短いダイマーパリンドローム配列（コンセンサスＡＧＧＴＣＡまたはＴＧＡＣＣＴ）を認識し、それはＤＲ１（直列反復配列１）またはＤＲ２（直列反復配列２）を生じ、それによってＰＰＡＲγ応答エレメント（ＰＰＲＥ）を規定する。ＰＰＡＲによるＬＣＴ遺伝子の可能性のある調節をより良く評価するために、我々は、ＬＣＴ遺伝子上流の、ＰＰＲＥ配列の存在の可能性を調査した。ヒトラクターゼ遺伝子においてＰＰＲＥを見つけるために、バイオインフォマティクスのツールを使用した。３つの異なるプログラム：ＮＵＢＩＳｃａｎ、ＰＰＲＥ  Ｓｅａｒｃｈ、およびＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒを使用した。図５は、ヒトラクターゼ遺伝子の転写開始点の３０００塩基対上流のインシリコ分析の結果を示す。少なくとも２つの異なるプログラムによって予測された直列反復配列のみを示す。この分析は、転写開始部位の３０００ｂｐ上流が、ラクターゼの発現を調節するためにＰＰＡＲが使用し得るいくつかのＰＰＲＥを含むことを明らかにした。
【００９６】
腸管上皮細胞のトランスクリプトーム分析は、５２個の遺伝子の有意な調節を示すマイクロアレイを用いて、１ｍＭの化合物３４によって刺激されることを見出した。これらの結果は、異なる独立した実験において定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて確認された。これらの５２個の遺伝子のうち、我々は、ラクターゼをコードする遺伝子に関心を向け、そして５．２９倍アップレギュレートされたＬＣＴ遺伝子発現を確認した。５−ＡＳＡおよびピオグリタゾンも、Ｃａｃｏ２細胞においてＬＣＴ遺伝子発現を増強し得、ＬＣＴ遺伝子発現の自然なレベルは、コントロール上皮細胞と比較して、ＰＰＡＲγ欠損上皮細胞において有意に７０％低減され、５−ＡＳＡおよびピオグリタゾンは、ＰＰＡＲ半欠損上皮細胞において、ＬＣＴ遺伝子発現に対するアップレギュレーション効果を維持した。このことは、ＬＣＴ遺伝子の発現の欠損は、ＰＰＡＲアゴニストによって回復され得ることを示唆した。合わせると、これらのデータは、ＰＰＡＲが、ＬＣＴ遺伝子発現の新しいモジュレーターであり得ることを示し、そしてＰＰＡＲアゴニスト、および特に腸を標的とした新しい種類のＰＰＡＲｇアゴニストが、ラクターゼ欠損症を有する患者を処置するための新しい戦略であり得ることを示唆する。
【００９７】
実施例３  レポーター遺伝子アッセイおよびクロマチン免疫沈降実験
ｐＧＬ４−Ｌｕｃレポーターベクター中のラクターゼ遺伝子プロモーターの３０００ｂｐをクローニングした。この構築物（およびコントロールの空ベクター）を、Ｃａｃｏ−２細胞に一時的にトランスフェクトした。次いでその細胞を、様々なＰＰＡＲアゴニストで処理し、そしてＰＰＡＲモジュレーターによるラクターゼプロモーター活性の調節を評価するために、ルシフェラーゼ活性を測定する。ＰＰＡＲ応答エレメントの同定および位置特定を、ｐＧＬ４−Ｌｕｃレポーターベクターにクローニングしたプロモーター領域の連続的な欠失によって達成する。ラクターゼ遺伝子のプロモーターに対するＰＰＡＲｇの物理的結合を、ＰＰＡＲアゴニストで刺激した、または刺激していないＣａｃｏ−２細胞において、ＣｈＩＰ実験によって研究する。
【００９８】
実施例４−ラクターゼ活性をモジュレートする（増加させる）ＰＰＡＲγアゴニストの能力
Ｃａｃｏ−２細胞の刺激およびマウス腸管の小片のエキソビボ刺激の両方を用いて、ＰＰＡＲγアゴニストがラクターゼ活性を増加させ得るかどうかを試験する。ラクターゼ活性（二糖類分解酵素活性）を、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄガラクトシド（ＯＮＰＧ）を基質として用いて評価する。β−ガラクトシド結合の加水分解時に、ＯＮＰＧは、ガラクトースと、分光光度的方法によって検出され得る黄色化合物ｏ−ニトロフェノール（最大吸収＝４５０ｎｍ）とを生じる。あるいは、経口で化合物３４または５−ＡＳＡを投与したマウスの腸管におけるラクターゼ遺伝子の発現レベルを評価する。
【００９９】
参考文献
下記で列挙する項目を含め、本明細書中で言及された全ての出版物および特許は、あたかも個々の出版物または特許がそれぞれ具体的かつ個々に参考として援用されるように、本明細書中でその全体が参考として援用される。矛盾する場合、本明細書中のあらゆる定義を含め、本明細書が優先する。
【０１００】
均等物
本発明の特定の実施態様が議論されたが、上記の明細書は例示であって限定的ではない。本明細書を概観すると、本発明の多くのバリエーションが、当業者に明らかになる。本発明の完全な範囲は、その均等物の完全な範囲と共に特許請求の範囲を、およびそのようなバリエーションと共に明細書を参照することによって決定されるべきである。
【０１０１】
他に示されなければ、明細書および特許請求の範囲において使用される、成分の量、反応条件等を表す全ての数字は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されると理解される。よって、そうでないと示されなければ、本明細書および添付の特許請求の範囲において述べられる数字のパラメーターは、概数であり、それは本発明によって得ようとする望ましい性質に依存して変動し得る。
【図３】
2015518483.tif 000020
【図５】
2015518483.tif 000021
【図１】
2015518483.tif 000022
【図２】
2015518483.tif 000023
【図４】
2015518483.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月19日(2015.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトース不耐症またはラクターゼ欠損症を処置および／または改善する必要のある患者においてラクトース不耐症またはラクターゼ欠損症を処置および／または改善するための方法であって、ＰＰＡＲアゴニスト化合物を該患者に投与することを包含する、方法。
【請求項２】
ラクターゼ遺伝子の発現を刺激する必要のある患者においてラクターゼ遺伝子の発現を刺激するための方法であって、ＰＰＡＲγアゴニストを該患者に投与することを包含する、方法。
【請求項３】
ラクトース摂取後の下痢、腹痛および／または鼓脹を処置する必要のある患者においてラクトース摂取後の下痢、腹痛および／または鼓脹を処置するための方法であって、ＰＰＡＲアゴニストを投与することを包含する、方法。
【請求項４】
ラクトースを含む組成物を摂取する患者におけるラクトース不耐症を改善するための方法であって、ＰＰＡＲアゴニストを、該摂取前に、該摂取と実質的に同時に、または該接種後に、投与することを包含する、方法。
【請求項５】
前記ＰＰＡＲアゴニストが、式Ｉ：
【化１４】
2015518483.tif 000025
ならびにその薬学的に受容可能な塩、立体異性体および／またはプロドラッグによって表され、ここで、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、ＨおよびＣ１−６アルキルからなる群より選択されるか；またはＲ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換され得る、５原子もしくは６原子を有する芳香環もしくは脂肪族環を形成し、
ＹおよびＺは、各々独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、−ＯＲ３、−ＣＨ（ＯＲ３）ＣＯＯＨからなる群より選択され；そして
Ｒ３は、Ｈ、１個、２個、３個もしくはそれより多くのハロゲンによって置換されたフェニル、ベンジル、ビニル、アリル、Ｃ１−６アルキルもしくはＣ１−６アルキルからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＰＡＲアゴニストが、（±）−２−ヒドロキシ−３−（３’−アミノフェニル）プロピオン酸；（±）−２−メトキシ−２−（４’−アミノフェニル）酢酸；（±）−２−エトキシ−２−（３’−アミノフェニル）酢酸；（±）−２−エトキシ−２−（４’−アミノフェニル）酢酸；（±）−２−メトキシ−３−（４’−アミノフェニル）プロピオン酸；（±）−２−エトキシ−３−（４’−アミノフェニル）プロピオン酸；（±）−２−エトキシ−３−（３’−アミノフェニル）プロピオン酸、（Ｒ，Ｓ）−２−メトキシ−３−（４−アミノフェニル）プロピオン酸、５−アミノサリチロ−ヒドロキサム酸（化合物５）；３−ジメチルアミノサリチル酸；２−メトキシ−４−アミノ安息香酸；２−メトキシ−５−アミノ安息香酸；５−メチルアミノサリチル酸；４−メチルアミノサリチル酸；４−アセチルアミノサリチル酸；２−エトキシ−４−アミノ安息香酸；２−エトキシ−５−アミノ安息香酸；４−ジメチルアミノサリチル酸；２−エトキシ−４−アミノベンゾイルヒドロキサム酸；６−ヒドロキシキノリン−５−カルボン酸；２−（２−プロピル）オキシ−４−アミノ安息香酸；４−（１−ピペラジニル）サリチル酸；（Ｒ，Ｓ）５−オ
キサ−キノリン−６−カルボン酸；６−メトキシキノリン−５−カルボン酸；６−メトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−５−カルボン酸；５−ジイソプロピルアミノサリチル酸；および４−ジイソプロピルアミノサリチル酸またはそれらの薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＰＡＲアゴニストが（−）２−Ｒ−メトキシ−３−（４−アミノフェニル）プロピオン酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＰＡＲアゴニストが式Ｉ’：
【化１５】
2015518483.tif 000026
により表される化合物；またはその薬学的に受容可能な塩またはＮ−オキシド；および賦形剤であり、
ここで、Ｘは、ハロゲンまたはヒドロキシルから選択される１個、２個または３個の置換基で必要に応じて置換されたＣ１−Ｃ３アルキレンであり；
Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、およびＣ２−Ｃ６アルキニルからなる群より選択され；
Ｒ２は、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルからなる群より選択され；
Ｒ３は、各出現につき、水素、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシルおよびニトロからなる群より独立して選択され；
Ｒ４は、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルからなる群より選択され；
Ｒ５は、水素  Ｃ１−Ｃ６アルキルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物がＮ−アセチル−（Ｒ）−（−）−３−（４−アミノフェニル）−２−メトキシプロピオン酸である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＰＡＲアゴニストがメサラミン、スルファサラジン、ピオグリタゾンおよびロシグリタゾンからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
乳製品の成分およびＰＰＡＲアゴニストを含む、食品。
【請求項１２】
前記乳製品の成分がホエイ、ミルク、チーズまたはクリームである、請求項１１に記載の食品。
【請求項１３】
ラクトース不耐症またはラクターゼ欠損症の処置における、ＰＰＡＲアゴニスト化合物の使用。
【請求項１４】
ラクターゼ遺伝子の発現を刺激する方法における、ＰＰＡＲγアゴニストの使用。
【請求項１５】
ラクトース摂取後の下痢、腹痛および／または鼓脹の処置方法における、ＰＰＡＲアゴニストの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
ラクトース摂取後の下痢、腹痛、および／または鼓脹を処置する必要のある患者において、ラクトース摂取後の下痢、腹痛、および／または鼓脹を処置するための方法も、本明細書中で提供され、該方法はＰＰＡＲアゴニスト、例えばＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲγアゴニストを投与することを含む。例えば、ラクトースを含む組成物を摂取する患者においてラクトース不耐症を改善するための方法が、本明細書中で提供され、該方法は、該摂取の前に、該摂取と実質的に同時に、または該摂取の後に、ＰＰＡＲアゴニストを投与することを含む。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ラクトース不耐症またはラクターゼ欠損症を処置および／または改善する必要のある患者においてラクトース不耐症またはラクターゼ欠損症を処置および／または改善するための方法であって、ＰＰＡＲアゴニスト化合物を該患者に投与することを包含する、方法。
（項目２）
ラクターゼ遺伝子の発現を刺激する必要のある患者においてラクターゼ遺伝子の発現を刺激するための方法であって、ＰＰＡＲγアゴニストを該患者に投与することを包含する、方法。
（項目３）
ラクトース摂取後の下痢、腹痛および／または鼓脹を処置する必要のある患者においてラクトース摂取後の下痢、腹痛および／または鼓脹を処置するための方法であって、ＰＰＡＲアゴニストを投与することを包含する、方法。
（項目４）
ラクトースを含む組成物を摂取する患者におけるラクトース不耐症を改善するための方法であって、ＰＰＡＲアゴニストを、該摂取前に、該摂取と実質的に同時に、または該接種後に、投与することを包含する、方法。
（項目５）
前記ＰＰＡＲアゴニストが、式Ｉ：
【化１４】
2015518483.tif 000027
ならびにその薬学的に受容可能な塩、立体異性体および／またはプロドラッグによって表され、ここで、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、ＨおよびＣ１−６アルキルからなる群より選択されるか；またはＲ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換され得る、５原子もしくは６原子を有する芳香環もしくは脂肪族環を形成し、
ＹおよびＺは、各々独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、−ＯＲ３、−ＣＨ（ＯＲ３）ＣＯＯＨからなる群より選択され；そして
Ｒ３は、Ｈ、１個、２個、３個もしくはそれより多くのハロゲンによって置換されたフェニル、ベンジル、ビニル、アリル、Ｃ１−６アルキルもしくはＣ１−６アルキルからなる群より選択される、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記ＰＰＡＲアゴニストが、（±）−２−ヒドロキシ−３−（３’−アミノフェニル）プロピオン酸；（±）−２−メトキシ−２−（４’−アミノフェニル）酢酸；（±）−２−エトキシ−２−（３’−アミノフェニル）酢酸；（±）−２−エトキシ−２−（４’−アミノフェニル）酢酸；（±）−２−メトキシ−３−（４’−アミノフェニル）プロピオン酸；（±）−２−エトキシ−３−（４’−アミノフェニル）プロピオン酸；（±）−２−エトキシ−３−（３’−アミノフェニル）プロピオン酸、（Ｒ，Ｓ）−２−メトキシ−３−（４−アミノフェニル）プロピオン酸、５−アミノサリチロ−ヒドロキサム酸（化合物５）；３−ジメチルアミノサリチル酸；２−メトキシ−４−アミノ安息香酸；２−メトキシ−５−アミノ安息香酸；５−メチルアミノサリチル酸；４−メチルアミノサリチル酸；４−アセチルアミノサリチル酸；２−エトキシ−４−アミノ安息香酸；２−エトキシ−５−アミノ安息香酸；４−ジメチルアミノサリチル酸；２−エトキシ−４−アミノベンゾイルヒドロキサム酸；６−ヒドロキシキノリン−５−カルボン酸；２−（２−プロピル）オキシ−４−アミノ安息香酸；４−（１−ピペラジニル）サリチル酸；（Ｒ，Ｓ）５−オ
キサ−キノリン−６−カルボン酸；６−メトキシキノリン−５−カルボン酸；６−メトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−５−カルボン酸；５−ジイソプロピルアミノサリチル酸；および４−ジイソプロピルアミノサリチル酸またはそれらの薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記ＰＰＡＲアゴニストが（−）２−Ｒ−メトキシ−３−（４−アミノフェニル）プロピオン酸である、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記ＰＰＡＲアゴニストが式Ｉ’：
【化１５】
2015518483.tif 000028
により表される化合物；またはその薬学的に受容可能な塩またはＮ−オキシド；および賦形剤であり、
ここで、Ｘは、ハロゲンまたはヒドロキシルから選択される１個、２個または３個の置換基で必要に応じて置換されたＣ１−Ｃ３アルキレンであり；
Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、およびＣ２−Ｃ６アルキニルからなる群より選択され；
Ｒ２は、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルからなる群より選択され；
Ｒ３は、各出現につき、水素、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシルおよびニトロからなる群より独立して選択され；
Ｒ４は、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルからなる群より選択され；
Ｒ５は、水素  Ｃ１−Ｃ６アルキルである、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記化合物がＮ−アセチル（Ｒ）−（−）３−（４−アミノフェニル）−２−メトキシプロピオン酸である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ＰＰＡＲアゴニストがメサラミン、スルファサラジン、ピオグリタゾンおよびロシグリタゾンからなる群より選択される、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
乳製品の成分およびＰＰＡＲアゴニストを含む、食品。
（項目１２）
前記乳製品の成分がホエイ、ミルク、チーズまたはクリームである、項目１１に記載の食品。
（項目１３）
ラクトース不耐症またはラクターゼ欠損症の処置における、ＰＰＡＲアゴニスト化合物の使用。
（項目１４）
ラクターゼ遺伝子の発現を刺激する方法における、ＰＰＡＲγアゴニストの使用。
（項目１５）
ラクトース摂取後の下痢、腹痛および／または鼓脹の処置方法における、ＰＰＡＲアゴニストの使用。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
【図１】図１Ａは、１ｍＭの化合物３４による２４時間の処置後の同調したＣａｃｏ２細胞において、ｑＰＣＲで評価した遺伝子発現を示す。マイクロアレイにおいて観察された、１２個のアップレギュレートされた遺伝子発現の確認。ＡＱＰ１２、ＯＳＴαおよびＬＺＴＳ１のアップレギュレートされた発現は確認されていない。結果を、コントロール（値１に設定）と比較した倍数で表す。図１Ｂは、１ｍＭの化合物３４による２４時間の処置後の同調したＣａｃｏ２細胞において、ｑＰＣＲで評価した遺伝子発現を示す。マイクロアレイにおいて観察された、１２個のアップレギュレートされた遺伝子発現の確認。ＡＱＰ１２、ＯＳＴαおよびＬＺＴＳ１のアップレギュレートされた発現は確認されていない。結果を、相対的な発現で表す。
【図２】図２Ａは、１ｍＭの化合物３４による２４時間の処置後の同調したＣａｃｏ２細胞において、ｑＰＣＲで評価した遺伝子発現を示す。マイクロアレイにおいて観察された、１５個のアップレギュレートされた遺伝子発現全ての確認。結果を、コントロール（値１に設定）と比較した倍数で表す。図２Ｂは、１ｍＭの化合物３４による２４時間の処置後の同調したＣａｃｏ２細胞において、ｑＰＣＲで評価した遺伝子発現を示す。マイクロアレイにおいて観察された、１５個のアップレギュレートされた遺伝子発現全ての確認。結果を、相対的な発現で表す。
【図３】図３は、倍数で表された刺激２の遺伝子発現が刺激１のマイクロアレイの結果と相関していることを示す（ｒ＝０．７５４、ｐ＝０．００４６）。
【図４】図４は、ラクターゼｍＲＮＡの発現が、ＰＰＡＲによって誘導されることを示す。Ｃａｃｏ−２細胞を、様々なＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲαアゴニストで刺激した。統計学的な差を、ノンパラメトリックマン−ホイットニー検定を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアで分析した。
【図５】図５は、ヒトラクターゼ遺伝子のプロモーター（３０００ｂｐ）（配列番号３）における、直列反復配列の同定である。ＤＲ１は太字であり、そしてＤＲ２は太字でありかつ「ＡＧ」で始まる。ＴＡＴＡボックスも示され、そして小文字は最初のエキソンの開始を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
ＰＰＡＲγノックダウン細胞の作製
ＰＰＡＲγノックダウンＩＥＣを、ｐＳＵＰＥＲ．ｒｅｔｒｏシステム（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ）を用いて得た。ヒトＰＰＡＲｇ  ｍＲＮＡのヌクレオチド１０５−１２３（５’−ＧＣＣＣＴＴＣＡＣＴＡＣＴＧＴＴＧＡＣ−３’（配列番号１））に対応する、正方向および逆方向の標的配列を、ｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏベクター（ｐＲＳ）のＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ制限部位にクローニングして、ＳｈＰＰＡＲ構築物を生じた。ルシフェラーゼ遺伝子に対して標的化した、配列５’−ＡＣＧＣＴＧＡＧＴＡＣＴＴＣＧＡＡＡＴ−３’（配列番号２）を含む、ネガティブコントロールｐＲＳプラスミドも産生した（ＳｈＬｕｃ構築物）。両方の構築物を、Ａｍａｘａ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｒ技術を用い、製造会社のプロトコールに従って、Ｃａｃｏ−２細胞にトランスフェクトした。ピューロマイシン（５μｇ／ｍｌ）を補充した完全培養培地によって、トランスフェクションの２４時間後に、安定にトランスフェクトしたクローンを選択した。ＰＰＡＲｇ発現のサイレンシングを、定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析によってチェックした。一旦確立したら、ＳｈＰＰＡＲおよびＳｈＬｕｃ細胞系統を、２．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加した完全培地中で維持した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2015518483000001.app
【国際調査報告】
2015518483.tif 000029
2015518483.tif 000030
2015518483.tif 000031