(57)【要約】  ヒドロキシケイ皮酸誘導体、ならびにフラボノールモノ−、ジ−、およびトリグリコシドを、少量の遊離フラボノールとともに含有するシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物から得られる糖尿病および脂質異常症を治療するための医薬組成物を開示する。前記ヒドロキシケイ皮酸誘導体はコーヒー酸、ｐ−クマル酸、フェルラ酸およびシナピン酸ならびに糖グルコース、ガラクトースおよびラムノースと共にケルセチン、ケンフェロールおよびイソラムネチンを含むフラボノールモノ−、ジ−およびトリグリコシドからなる。前記医薬組成物を調製する方法およびその使用も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシケイ皮酸誘導体、ならびにフラボノールモノ−、ジ−、およびトリグリコシドを、遊離型のフラボノールとともに含有するシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物から得られる
糖尿病および脂質異常症を治療するための組成物。
【請求項２】
前記コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物は、シュウ酸の構成成分レベルが６０％未満である、
請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ヒドロキシケイ皮酸誘導体がコーヒー酸、ｐ−クマル酸、フェルラ酸、およびシナピン酸、ならびに糖グルコース、ガラクトース、およびラムノースと共に、ケルセチン、ケンフェロール、およびイソラムネチンを含むフラボノールモノ−、ジ−、およびトリグリコシドからなる、
請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ヒドロキシケイ皮酸誘導体が、ａ）コーヒー酸：約０．１％以上、ｂ）ｐ−クマル酸：約０．１％以上、ｃ）フェルラ酸：約０．１％以上、およびｄ）シナピン酸：約０．１％以上を含む、
請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記フラボノールモノ−、ジ−、およびトリグリコシドが、少量の糖グルコース、ガラクトース、およびラムノースと共に、ａ）ケルセチン：約０．１％以上、ｂ）ケンフェロール：約０．１％以上、およびｃ）イソラムネチン：約０．１％以上を含む、
請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
ケルセチン、ケンフェロール、およびイソラムネチンを含む遊離型のフラボノールをも含有する、
請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記遊離フラボノールが、ａ）約０．１％以上ケルセチン、ｂ）約０．１％以上のケンフェロール、およびｃ）約０．１％以上のイソラムネチンを含む、
請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ヒトを含む哺乳動物のための糖尿病を治療する；脂質異常症および関連する状態を治療する；抗酸化能力を増加させる；膵β細胞を再生する、およびインスリン分泌促進物質効果を増加させることができる、
請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な植物体全体、新鮮な葉、乾燥した葉もしくは乾燥した葉粉末、新鮮な葉の汁、新鮮なもしくは乾燥した地上部またはこれらの組み合わせを抽出することによって得られる、
請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの前記抽出物が、
ａ）シュウ酸含量が約１０％以下のメタノール抽出物；
ｂ）シュウ酸含量が約５％以下の精製メタノール抽出物；
ｃ）シュウ酸含量が約２．５％以下の酢酸エチル抽出物；
ｄ）シュウ酸含量が約１％以下の精製酢酸エチル抽出物
からなる群から選択される、
請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
抽出が、低分子量アルコールまたは水と混合した低分子量アルコール、ハロゲン化炭化水素、有機エーテル、低分子量エステル、他の有機溶媒、および低分子量ケトンから選択される溶媒によって行われる、
請求項１に記載の前記組成物を調製する方法。
【請求項１２】
低分子量アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、およびこれらの組み合わせを含み；ハロゲン化炭化水素が、塩化メチレン、二塩化エチレン、クロロホルム、およびこれらの組み合わせを含み；エステルが、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ｎ−ブチル、およびこれらの組み合わせを含み；ケトンが、アセトン、メチルエチルケトン、およびこれらの組み合わせを含み；かつ、アルカンが、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、およびこれらの組み合わせを含む、
請求項１１に記載の組成物を調製する方法。
【請求項１３】
ａ）前記原材料を選択し、洗浄して塵埃などの任意の異物を含まなくするステップと；
ｂ）前記洗浄した材料を細かく切断するステップと；
ｃ）水、ヘキサン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ｎ−ブチル、およびこれらの組み合わせから選択される溶媒で抽出して抽出物を得るステップと；
ｄ）前記抽出物を８０℃で水を用いて加熱することによって前記抽出物からシュウ酸を除去するステップと；
ｅ）前記結果として生じる抽出物を濃縮し、乾燥させて乾燥粉末型を得るステップと；
ｆ）ステップｃ）に示される前記抽出工程を繰り返し、引き続いてシリカゲルカラムを通過させることによって精製するステップと；
ｇ）前記結果として生じる抽出物を濃縮し、乾燥させて乾燥粉末型を得る前記ステップｅ）を繰り返すステップと
を含む、
請求項１１に記載の前記組成物を調製する方法。
【請求項１４】
ａ）コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの前記選択された部分を洗浄し、細かく切断するステップと；
ｂ）精密濾過用フィルターを備え付けた還流付き抽出器で前記原材料の量の約４倍の量の９０％メタノールによって溶媒抽出して、前記液体を流しながら、固体粒子流を停止するステップと；
ｃ）前記混合物をメタノールの沸点（６０〜７０℃）で１時間以上還流して第１の残渣および上清を得るステップと；
ｄ）前記第１の残渣をさらに２回以上、各回で４倍量のメタノールで抽出するステップと；
ｅ）濾過器、好ましくは吸引濾過器を通して前記抽出器底部から前記上清を排出することによって前記残渣と上清を分離するステップと；
ｆ）前記メタノール抽出物を蒸発器、好ましくは攪拌式薄膜蒸発器（ＡＴＦＥ）で濃縮して濃縮メタノール抽出物を形成するステップと；
ｇ）５００ミリメートル水銀柱以上の真空下で乾燥させてメタノール抽出物の粉末を得るステップと；
ｈ）前記結果として生じた粉末を水とさらに混合し、加熱し、後で残渣と上清（水部）を分離し、前記水部を捨てるステップと；
ｉ）前記残渣を好ましくは５００ミリメートル水銀柱以上の真空下で乾燥させてシュウ酸含量が低い乾燥粉末を得るステップと；
ｊ）前記ステップｈ）およびｉ）を連続して１回または複数回繰り返してシュウ酸含量が約１０％以下とさらに低い前記残渣を得るステップと
を含む、
請求項１１に記載の前記組成物を調製する方法。
【請求項１５】
ａ）ステップ１４ａ）〜１４ｊ）で行われる前記抽出ステップを繰り返すステップと；
ｂ）前記結果として生じた乾燥粉末を容器中でメタノールおよびシリカゲルと混合し、前記メタノールが完全に蒸発して乾燥粉末が得られるまで前記混合物を旋回させるステップと；
ｃ）前記結果として生じた乾燥粉末をシリカゲルおよびヘキサンが湿式充填されたカラムに移し、最初にヘキサン、引き続いてメタノールで溶出するステップと；
ｄ）前記メタノール分画を回収し、前記ヘキサン分画を捨てるステップと；
ｅ）前記メタノール分画を蒸発器、好ましくは攪拌式薄膜蒸発器（ＡＴＦＥ）で濃縮して濃縮抽出物を形成するステップと；
ｆ）前記濃縮物を好ましくはバキュームストリッパー中、５００ミリメートル水銀柱以上の真空下で乾燥させてシュウ酸含量が５％以下と低い精製メタノール抽出物の乾燥粉末を得るステップと
を含む、
請求項１１に記載の前記組成物を調製する方法。
【請求項１６】
ａ）ステップ１４ａ）〜１４ｊ）で行われる前記抽出ステップを繰り返すステップと；
ｂ）前記結果として生じた乾燥粉末を水で溶解し、液体−液体抽出器に移すステップと；
ｃ）酢酸エチルで抽出して水相および酢酸エチル相を生じさせ、前記酢酸エチル相を回収するステップと；
ｄ）前記水相を再度前記液体−液体抽出器で、２回以上酢酸エチルで処理し、各回で前記酢酸エチル相を回収し、前記最後の抽出中に前記結果として生じた水相を捨てるステップと；
ｅ）前記酢酸エチル相をプールし、合わせて、蒸発器、好ましくは攪拌式薄膜蒸発器（ＡＴＦＥ）で濃縮して濃縮酢酸エチル抽出物を形成するステップと；
ｆ）前記酢酸エチル濃縮物をバキュームストリッパーに供給し、５００ミリメートル水銀柱以上の真空下で乾燥させてシュウ酸含量が２．５％以下と低い前記酢酸エチル抽出物の乾燥粉末を形成するステップと
を含む、
請求項１１に記載の前記組成物を調製する方法。
【請求項１７】
ａ）ステップ１６ａ）〜１６ｆ）で行われる前記操作を繰り返すステップと；
ｂ）前記結果として生じた乾燥粉末を容器中でメタノールおよびシリカゲルと混合し、前記メタノールが完全に蒸発して乾燥粉末が得られるまで前記混合物を旋回させるステップと；
ｃ）前記結果として生じた乾燥粉末をシリカゲルおよびヘキサンが湿式充填されたカラムに移し、最初にヘキサン、引き続いてメタノールで溶出するステップと；
ｄ）前記メタノール分画を回収し、前記ヘキサン分画を捨てるステップと；
ｅ）前記メタノール分画を蒸発器、好ましくは攪拌式薄膜蒸発器（ＡＴＦＥ）で濃縮して濃縮抽出物を形成するステップと；
ｆ）前記濃縮物を好ましくはバキュームストリッパー中、５００ミリメートル水銀柱以上の真空下で乾燥させてシュウ酸含量が１％以下と低い精製酢酸エチル抽出物の乾燥粉末を得るステップと
を含む、
請求項１１に記載の前記組成物を調製する方法。
【請求項１８】
糖尿病、脂質異常症および関連する状態から選択される医学的状態のため；抗酸化能力を増加させるため；膵β細胞を再生するためならびにインスリン分泌促進物質効果を増加させるための、
請求項１に記載の前記組成物によって哺乳動物を治療する方法。
【請求項１９】
血糖値を低下させる、グリコシル化Ｈｂレベルを低下させる、血清インスリンレベルを増加させる、ならびに肝および筋グリコーゲンを増加させることによる、
糖尿病のための請求項１８に記載の哺乳動物を治療する方法。
【請求項２０】
総脂質プロファイル（トリグリセリド、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ）を減少させる；およびＨＤＬレベルを増加させることにより高脂血症を制御することによる、
脂質異常症および関連する状態のための請求項１８に記載の哺乳動物を治療する方法。
【請求項２１】
ＴＢＡＲＳレベルを低下させる；ＳＯＤ、カタラーゼ、ＧＳＨおよびＧＰｘレベルを増加させることによる、
抗酸化能力を増加させるための請求項１８に記載の哺乳動物を治療する方法。
【請求項２２】
膵β細胞を再生することによる、
請求項１８に記載の哺乳動物を治療する方法。
【請求項２３】
前記インスリン分泌促進物質効果を増加させることによる、
請求項１８に記載の哺乳動物を治療する方法。
【請求項２４】
前記抽出物の剤形がカプセル剤、錠剤、顆粒剤、サシェ、散剤、ペースト剤、軟膏剤、浸剤、注射剤、アンプル、液剤、懸濁剤、乳剤、丸剤、徐放製剤およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、
請求項１８から２３に記載の哺乳動物を治療する方法。
【請求項２５】
請求項１８から２３に記載のヒトを含む哺乳動物を治療する方法。
【請求項２６】
投与量がヒトの場合、約５００ｍｇ／日〜２０００ｍｇ／日の組成物の範囲にある、
請求項１８から２３に記載の哺乳動物を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツス（Ｃｏｓｔｕｓ  ｐｉｃｔｕｓ）Ｄ．Ｄｏｎの抽出物および前記抽出物を製造する方法、より具体的にはコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎ植物の抽出物から得られる糖尿病および脂質異常症を治療するための組成物ならびに同組成物を製造する方法に関する。シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの前記抽出物の構成成分は、コーヒー酸、ｐ−クマル酸、フェルラ酸およびシナピン酸を含むヒドロキシケイ皮酸誘導体ならびに少量の遊離フラボノールに加えて糖グルコース、ガラクトースおよびラムノースと共にケルセチン、ケンフェロールおよびイソラムネチンを含むフラボノールモノ−、ジ−およびトリグリコシドを含有し、これは糖尿病、脂質異常症および関連する障害を治療するために使用される。これらの脂質には、コレステロール、コレステロールエステル、リン脂質およびトリグリセリドが含まれる。脂質は大きな「リポタンパク質」として血中で輸送される。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、早くも紀元前６世紀に古代インド人に知られていた。Ｃｈａｒａｋａは、彼の「Ｃｈａｒａｋａ  Ｓａｍｈｉｔａ」で、多尿に加えて尿の甘さに言及していた。インド人医師Ｓｕｓｒｕｔａは、西暦５００年に、この疾患を、口臭、猛烈な食欲および倦怠の症状を有する、（糖尿病患者の尿の近くにアリを誘引する現象のために）はちみつの雨を意味する「Ｍａｄｈｕｍｅｈａ」と記載した。Ａｓｔａｎｇａ−ｈｒａｙｄａ、Ｂｈａｖａ−ｐｒａｋａｓａ、Ｍａｄｈａｖ−ｎｉｄａｎａ等のような他の初期のインド人の著書も糖尿病を記載している。
【０００３】
世界的に見て、糖尿病に罹患している人の数は、２０１０年に１億５０００万〜２億２０００万人および２０２５年に３億人という現在の推定から、増加すると予想されている。有病率は、インドなどの発展途上国の特に市街地で増加している。インドの糖尿病患者の推定数は１９９５年に１９４０万人であり、２０２５年には５７２０万人になると予想されている（Ｗ．Ｈ．Ｏ）。米国では、２０１１年現在、２５８０万人の人々（総人口の８．３％）が糖尿病であったと推定される。２０歳未満の人々の約２１万５０００人が糖尿病に罹患している（この年齢群の全人口の０．２６％）。約４００〜５００人に１人の小児および青年が１型糖尿病に罹患している。２０歳以上の年齢群では、２５６０万人（男性の１１．８％および女性の１０．８％）が糖尿病に罹患している。６０歳以上の人々では、１０９０万人（この年齢群の全人口の２６．９％）が糖尿病に罹患している。
【０００４】
主に２つの型の糖尿病が存在する。１型糖尿病は、以前はインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）または若年発症型糖尿病と呼ばれた。この糖尿病は、体の免疫系が、血糖値を制御するインスリンホルモンを産生する体内で唯一の細胞である膵β細胞（β細胞）を破壊すると発症する。
【０００５】
２型糖尿病は、以前は非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）または成人発症型糖尿病と呼ばれた。これは通常、インスリン抵抗性、体の細胞がインスリンに適切に応答することができない障害として始まる。
【０００６】
数十年前に起こっていたこととは異なり、抗糖尿病生薬製剤は、散剤、錠剤、カプセル剤および液剤製剤の形態で現在多量に市販されている。これらの大半は対照臨床試験を受けていない。通常、標準的なアーユルヴェーダの本に記述されているまたは経験豊かなアーユルヴェーダ専門家から得られた知識としての評判のいい抗糖尿病活性を有する薬草が取り上げられ、任意の投与量で混合物が調製される。これらの製剤のいくつかがどれほど有効なのか、また長期の使用でどのような副作用があるのかは確かでない。
【０００７】
薬用植物コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎは、観賞用のつる植物として使用されており、南インドで糖尿病を治療するための齧る栄養補助食品として使用されているショウガ科に属する極めて一般的で広がりやすいショウガである。一般的にスパイラルジンジャー、ステップラダーまたはインスリン植物と呼ばれるコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎは、コスツス科に属する。この植物は、熱帯庭園で観賞用植物として栽培されている。この植物は、最大２〜３ｍまで成長する多年草であり、１．５〜２ｍ広がる。特徴的な波状の縁を有する光沢のある直線状の細い葉が、赤色の茎にらせん状に配置している。葉はあまり多肉質でなく、えぐ味を有する。花序は、葉の多い茎の先端と、あまり多くはないがほぼ葉のない根本的に低い茎の両方に形成する。この植物は赤い点および縞を有する黄色い花によって認識され得、末端円錐で現れ得る。繁殖は茎挿しおよび根茎を通して行われる。
【０００８】
コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの種々の部分から得られたコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの異なる抽出物が、異なる特性を有することが報告されている。
【０００９】
コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎ抽出物は、高濃度のシュウ酸を含む。シュウ酸はコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎ中に高濃度で見られ、毒性であることがわかっているので、本発明者らは、シュウ酸含量が極めて低レベルのコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎ抽出物を製造する方法を標準化した。
【００１０】
シュウ酸は、化学式Ｈ２Ｃ２Ｏ４を有する有機化合物である。シュウ酸は水に溶解して無色溶液をもたらす無色の結晶性固体である。シュウ酸はジカルボン酸として分類される。
【００１１】
シュウ酸は、経口投与すると毒性を示すことが報告されている（Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、第１３版、１２３７頁、６９８０段落；Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎｓ、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ２００３年１２月；Ｓｉｄｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｘａｌｉｃ  ａｃｉｄ、Ｔｒａｃｅｙ  Ｒｏｉｚｍａｎ  ＤＣ、２０１１）。
【００１２】
コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎ抽出物（葉／全植物のアルコール、水および汁抽出物）は、抗糖尿病特性を有することが報告されている（特許第７２５５８８６号明細書、Ｍｅｒｉｎａ  Ｂｅｎｎｙ（２００７）；Ｎａｎｄｈａｋｕｍａｒ  Ｊｏｔｈｉｖｅｌら（２００７）；Ｍ  Ａ  Ｊａｙａｓｒｉら（２００８））。
【００１３】
コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎは、シュウ酸を含有することが報告されている（Ｃａｍａｒｇｏら  ２００６；Ｍｏｒｏｎら  ２００７）。コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの葉は、葉中に高レベルのシュウ酸が存在するために酸味のある味である（Ｒａｊｅｎｄｒａｎ  Ｓａｔｈｉｓｈｒａｊら、２０１１）。
【００１４】
コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎ抽出物は、高濃度のシュウ酸を含む。シュウ酸が少量である場合には、それほど有害にならず、それどころか糖尿病に対して有益となり得る（Ｏｘａｌｉｃ  ａｃｉｄ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｓｔｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ（Ｈｏｎｇ  Ｙｉｎｇ  Ｇａｏら、２０１０））。しかし、シュウ酸は腎石の原因となることが知られている（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｏｘａｌａｔｅ  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｏｎ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｏｘａｌａｔｅ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｏｘａｌａｔｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｓｔｏｎｅｓ、Ｌｉｎｄａ  Ｋ  Ｍａｓｓｅｙ、１９９３）。
【００１５】
上記を考慮して、本発明者らは、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物およびシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎ抽出物の組成物を調製する方法を開発した。本発明は、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物を調製する方法だけでなく、それに由来する組成物も提供する。シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの前記抽出物の構成成分は、ヒドロキシケイ皮酸誘導体ならびに少量の遊離フラボノールに加えてフラボノールモノ−、ジ−およびトリグリコシドを含有し、これは糖尿病、脂質異常症および関連する障害を治療するために使用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特許第７２５５８８６号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、第１３版、１２３７頁、６９８０段落
【非特許文献２】Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎｓ、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ２００３年１２月
【非特許文献３】Ｓｉｄｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｘａｌｉｃ  ａｃｉｄ、Ｔｒａｃｅｙ  Ｒｏｉｚｍａｎ  ＤＣ、２０１１
【非特許文献４】Ｎａｎｄｈａｋｕｍａｒ  Ｊｏｔｈｉｖｅｌ等（２００７）
【非特許文献５】Ｍ  Ａ  Ｊａｙａｓｒｉ等（２００８）
【非特許文献６】Ｃａｍａｒｇｏ等  ２００６
【非特許文献７】Ｍｏｒｏｎ等  ２００７
【非特許文献８】Ｒａｊｅｎｄｒａｎ  Ｓａｔｈｉｓｈｒａｊら、２０１１
【非特許文献９】Ｏｘａｌｉｃ  ａｃｉｄ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｓｔｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ（Ｈｏｎｇ  Ｙｉｎｇ  Ｇａｏら、２０１０）
【非特許文献１０】Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｏｘａｌａｔｅ  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｏｎ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｏｘａｌａｔｅ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｏｘａｌａｔｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｓｔｏｎｅｓ、Ｌｉｎｄａ  Ｋ  Ｍａｓｓｅｙ、１９９３
【発明の概要】
【００１８】
本開示は、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物ならびにヒトを含む哺乳動物のための糖尿病を治療するため；脂質異常症および関連する状態を治療するため；抗酸化能力を増加させるため；膵β細胞を再生するためおよびインスリン分泌促進物質効果を増加させるために有用な医学的組成物を提供する。
【００１９】
さらに、本発明はまた、前記医薬組成物を含むシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物を調製する方法も提供する。
【００２０】
本発明はまた、糖尿病、脂質異常症および関連する状態から選択される医学的状態のため；抗酸化能力を増加させるため；膵β細胞を再生させてインスリン分泌促進物質効果を増加させるための、ヒトを含む哺乳動物を治療する方法も開示している。
【００２１】
シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの前記抽出物の構成成分はまた、約０．１％以上の濃度のコーヒー酸、約０．１％以上の濃度のｐ−クマル酸、約０．１％以上の濃度のフェルラ酸および約０．１％以上の濃度のシナピン酸を含むヒドロキシケイ皮酸誘導体も含有する。前記抽出物はまた、糖グルコース、ガラクトースおよびラムノースと共に約０．１％以上の濃度のケルセチン、約０．１％以上の濃度のケンフェロールおよび約０．１％以上の濃度のイソラムネチンを含むフラボノールモノ−、ジ−およびトリグリコシドも含有する。さらに、前記抽出物はまた、約０．１％以上の濃度のケルセチン、約０．１％以上の濃度のケンフェロールおよび約０．１％以上の濃度のイソラムネチンを含む少量の遊離フラボノールも含有する。
【００２２】
本開示は、保持された成分が酸誘導体、グルコシドとしてまたは遊離型で存在する、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物の構成成分を提供する。
【００２３】
コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの前記抽出物は、コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な全植物、新鮮な葉、乾燥した葉もしくは乾燥した葉粉末、新鮮な葉の汁、新鮮なもしくは乾燥した地上部またはこれらの組み合わせに由来し得る。
【００２４】
前記組成物を製造する方法は、ａ）原材料を選択し、洗浄して塵埃などの任意の異物を含まなくするステップと、ｂ）洗浄した材料を細かく切るステップと、ｃ）水、ヘキサン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ｎ−ブチルおよびこれらの組み合わせから選択される溶媒で抽出して抽出物を得るステップと、ｄ）抽出物を８０℃で水を用いて加熱することによって抽出物からシュウ酸を除去するステップと、ｅ）結果として生じる抽出物を精製および濃縮し、乾燥させて乾燥粉末型を得るステップとを含む。
【００２５】
別の実施形態は、９０％メタノールで抽出することによってコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉から調製したコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物を提供し、該抽出物を８０℃で水を用いて加熱することによって該抽出物中のシュウ酸含量を減少させる。
【００２６】
さらに別の実施形態は、シリカカラムを通過させることによって精製した、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎのメタノール抽出物を提供する。
【００２７】
別の実施形態では、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎのメタノール抽出物を再度酢酸エチルで抽出する。
【００２８】
一般的に、コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物に由来する本発明による前記組成物は、
ａ）メタノール抽出物である場合には約１０％以下；
ｂ）前記メタノール抽出物をさらに精製する場合には約５％以下；
ｃ）酢酸エチル抽出物である場合には約２．５％以下；
ｄ）精製酢酸エチル抽出物である場合には約１％以下
のシュウ酸含量を有しているだろう。
【００２９】
本発明の他の特徴および利点は、好ましい方法についての以下の説明から、また添付する図面の図と併せて読めば明らかになるはずであり、図面は本発明の下にある特定の好ましい実施形態ならびに知見の下で行われる種々の方法の試行の知見を示すものである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ヒドロキシケイ皮酸誘導体（２５４ｎｍ）およびフラボノイド（３２４ｎｍ）に相当するピークを示す２５４ｎｍおよび３２４ｎｍでのシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）クロマトグラムを提供する図である。
【図２】ヒドロキシケイ皮酸誘導体（２５４ｎｍ）およびフラボノイド（３２４ｎｍ）に相当するピークを示す２５４ｎｍおよび３２４ｎｍでのシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）クロマトグラムを提供する図である。
【図３】シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物のアルカリ加水分解生成物の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）データを提供する図である（ヒドロキシケイ皮酸（ｐ−クマル酸、コーヒー酸、フェルラ酸およびシナピン酸）が３２４ｎｍで検出され、参照標準との同時注入によって同定された）。
【図４】図４ａは、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、フェルラ酸およびシナピン酸の存在を示す、アルカリ加水分解後の（シュウ酸含量が低い）コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の可視光でのＨＰＴＬＣフィンガープリントを提供する図である。図４ｂは、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、フェルラ酸およびシナピン酸の存在を示す、アルカリ加水分解後の（シュウ酸含量が低い）コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の可視ＵＶ光でのＨＰＴＬＣフィンガープリントを提供する図である。
【図５】酸加水分解後のシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を提供する図である（フラボノール（ケルセチン、ケンフェロールおよびイソラムネチン）が３６８ｎｍで検出され、参照標準との同時注入によって確認された）。
【図６】図６ａは、抽出物中の糖（グルコース、ガラクトースおよびラムノース）の存在を示す、酸加水分解からのフラボノイドの分離後のシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物中の糖の高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）を提供する図である。図６ｂは、抽出物中の糖（グルコース、ガラクトースおよびラムノース）の存在を示す、酸加水分解からのフラボノイドの分離後のシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物中の糖の高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）を提供する図である。
【図７】シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物のＬＣＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）実行からの３２４ｎｍでのフォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）プロットを提供する図である。
【図８】シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物のＬＣＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）実行からの３７０ｎｍでのフォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）プロットを提供する図である。
【図９】シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物のＬＣＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）実行からの３２４ｎｍでのフォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）プロットがいくつかの成分、主にヒドロキシケイ皮酸誘導体を示すことを示す図である。
【図１０】シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物のＬＣＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）実行からの３７０ｎｍでのフォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）プロットがフラボノイド誘導体の存在を示すことを示す図である。
【図１１】正常群の膵臓の病理組織学的試験を示す図である。印をつけられた領域はランゲルハンス島を示し、β細胞は茶色に染色されている。
【図１２】糖尿病対照群の膵臓の病理組織学的試験を示す図である。印をつけられた領域はランゲルハンス島を示し、β細胞は極めて少ない。
【図１３】グリベンクラミド処理を行ったグループの膵臓の病理組織学的試験を示す図である。印をつけられた領域はランゲルハンス島を示し、β細胞が中程度に染色されている。
【図１４】シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉のメタノール抽出物で処理したグループの膵臓の病理組織学的試験を示す図である。印をつけられた領域はランゲルハンス島を示し、β細胞がまばらに染色されている。
【図１５】シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物のシリカ精製酢酸エチル抽出物で処理したグループの膵臓の病理組織学的試験を示す図である。印をつけられた領域はランゲルハンス島を示し、β細胞が強く染色されており、β細胞の数が増加している。
【図１６】シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物で処理したグループの膵臓の病理組織学的試験を示す図である。印をつけられた領域はランゲルハンス島を示し、β細胞が中程度に染色されている。
【図１７】シュウ酸を含むコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉のメタノール抽出物で処理したグループの膵臓の病理組織学的試験を示す図である。印をつけられた領域はランゲルハンス島を示し、β細胞が中程度に染色されており、β細胞の数が増加している。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、糖尿病を治療するため、脂質異常症および関連する状態を治療するために有用なシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物を提供する。本発明はまた、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物の組成物、およびシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物を調製する方法も提供する。
【００３２】
本開示は、ヒドロキシケイ皮酸誘導体、ならびにフラボノールモノ−、ジ−、およびトリグリコシドを、少量の遊離フラボノールとともに含有する、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物の構成成分を提供する。
【００３３】
本開示は、コーヒー酸、ｐ−クマル酸、フェルラ酸およびシナピン酸を含むヒドロキシケイ皮酸誘導体ならびに糖グルコース、ガラクトースおよびラムノースと共にケルセチン、ケンフェロールおよびイソラムネチンを含むフラボノールモノ−、ジ−およびトリグリコシドを含有する、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物の構成成分を提供する。シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物の構成成分はまた、ケルセチン、ケンフェロールおよびイソラムネチンを含む少量の遊離フラボノールも含有する。
【００３４】
本発明者らは、コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの９０％メタノール抽出物が約５６〜６０％のシュウ酸を含むことを見出した。シュウ酸はコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎ中に高濃度で見られ、毒性であることがわかっているので、本発明者らは、シュウ酸のレベルが極めて低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎ抽出物を製造する方法を標準化した。新規な抽出物をその抗糖尿病作用について試験したところ、本発明者らは、コスツス・ピクツス抽出物の抗糖尿病活性が抽出物中のシュウ酸含量を減少させた後でも低下しないことを見出した。
【００３５】
本開示は、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物の組成物の剤形を提供する。本開示は、経口投与のためのシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物の組成物の剤形を提供する。抽出物の剤形は、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、散剤、ペースト剤、軟膏剤、浸剤、注射剤、アンプル、液剤、懸濁剤、乳剤、丸剤、徐放製剤およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３６】
前記組成物は糖尿病、脂質異常症を治療するために有用であり、哺乳動物の抗酸化能力を増加させるためにも有用である。哺乳動物には、ストレプトゾトシン誘導糖尿病ラットおよびヒトが含まれる。糖尿病および脂質異常症を治療する方法は、約５０ｍｇ／ｋｇ／日〜約２００ｍｇ／ｋｇ／日の用量のシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物の組成物をストレプトゾトシン誘導糖尿病ラットに投与するステップを含む。糖尿病および脂質異常症を治療する方法は、約５００ｍｇ／日〜約２０００ｍｇ／日の用量のシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物の組成物をヒトに投与するステップを含む。
【００３７】
一実施形態では、本発明は、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物の構成成分であって、成分がコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な全植物、新鮮な葉、乾燥した葉もしくは乾燥した葉粉末、新鮮な葉の汁、新鮮なもしくは乾燥した地上部またはこれらの組み合わせ由来であり得る構成成分を提供する。
【００３８】
本開示は、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物の構成成分であって、抽出物が、それ自体としてまたは水と混合した低分子量アルコール、ハロゲン化炭化水素、有機エーテル、低分子量エステル、他の有機溶媒および低分子量ケトンを用いて得られる構成成分を提供する。
【００３９】
抽出物の調製に使用することができる低分子量アルコールには、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノールおよびこれらの組み合わせが含まれる。抽出物調製に使用することができるハロゲン化炭化水素には、塩化メチレン、二塩化エチレン、クロロホルムおよびこれらの組み合わせが含まれる。抽出物調製に使用することができるエステルには、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ｎ−ブチルおよびこれらの組み合わせが含まれる。抽出物調製に使用することができるケトンには、アセトン、メチルエチルケトンおよびこれらの組み合わせが含まれる。抽出物の調製に使用することができるアルカンには、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、イソオクタンおよびこれらの組み合わせが含まれる。
【００４０】
コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の抽出によって調製されるコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物を調製する種々の方法は以下の通りである。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態の１つは、コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉を９０％メタノールで抽出するものであり、ここでは抽出物を８０℃で水を用いて加熱することによってシュウ酸を抽出物から除去する。結果として生じるコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの９０％メタノール抽出物の乾燥粉末はシュウ酸含量が低い。関与する工程ステップは以下の通りである。
【００４２】
コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉を９０％メタノールで抽出する。混合物を１時間還流して第１の残渣および上清を得る。第１の抽出後、第１の残渣をさらに２回、各回で４倍量のメタノールで抽出する。残渣および上清を分離する。全ての上清をプールし、濃縮して濃縮メタノール抽出物を形成する。濃縮メタノール抽出物を乾燥させてコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの９０％メタノール抽出物の粉末を得る。コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの９０％メタノール抽出物の粉末を８０℃で水を用いて加熱する。第１の残渣および水部を得て、水部を捨てる。第１の残渣を８０℃で水を用いて再度加熱する。第２の残渣および水部を得る。水部を捨て、第２の残渣を乾燥させてシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の粉末を得る。
【００４３】
さらに別の好ましい実施形態は、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の精製９０％メタノール抽出物を調製する方法を提供する。シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の粉末を最小量の溶媒に溶解し、シリカゲルを容器に添加する。溶媒が蒸発するまで混合物を旋回させ、既にシリカゲルおよびヘキサンが湿式充填されたカラムに通過させる。次いで、これをヘキサン、引き続いてメタノールで溶出する。メタノール分画を回収し、ヘキサン分画を捨てる。メタノール分画を濃縮し、乾燥させてシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の精製９０％メタノール抽出物を得る。
【００４４】
さらなる別の実施形態は、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物を調製する方法を提供する。コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉を９０％メタノールで抽出してコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの９０％メタノール抽出物の粉末を得る。粉末を水で処理し、８０℃で加熱してシュウ酸内容物を除去してシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の粉末を得る。シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の粉末を水に溶解し、酢酸エチルで抽出し、その後２相−水相と酢酸エチル相に分離する。酢酸エチル部を回収し、濃縮し、乾燥させてシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物の粉末を形成する。水相を捨てる。
【００４５】
別の実施形態では、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物のシリカ精製酢酸エチル抽出物を調製する方法は以下の通りである。シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物を最小量のヘキサンに溶解し、シリカゲルを容器に添加する。溶媒が蒸発するまで混合物を旋回させ、既にシリカゲルおよびヘキサンが湿式充填されたカラムに通過させる。次いで、これをヘキサン、引き続いてメタノールで溶出する。メタノール分画を回収し、ヘキサン分画を捨てる。メタノール分画を濃縮し、乾燥させてシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の精製酢酸エチル抽出物を得る。
【００４６】
前記のようにコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉から得られる本発明で開示されるように得られる抽出物は、抽出物を哺乳動物に投与することによって糖尿病、脂質異常症および関連状態を治療するために有用である。哺乳動物には動物およびヒトが含まれる。
【００４７】
（実施例１）
コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉を回収した（５０００Ｋｇ）。新鮮な葉を洗浄し、細かく切断した。メタノール抽出を行うために、コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の量の４倍量の９０％メタノールを新鮮な葉に添加した。還流冷却器付きの抽出器を用いて抽出を行った。抽出器の底部にポリプロピレン（１００ミクロン）濾布を備え付けた。混合物をメタノールの沸点（６０〜７０℃）で１時間還流して第１の残渣および上清を得た。次いで、第１の残渣をさらに２回、各回で４倍量のメタノールで抽出した。遠心ポンプを用いてポリプロピレン濾布を通して抽出器底部から上清を排出することによって残渣と上清を分離した。全ての上清をプールし、攪拌式薄膜蒸発器（ＡＴＦＥ）で濃縮して濃縮メタノール抽出物を形成した。濃縮メタノール抽出物を５００ミリメートル水銀柱以上の真空下で乾燥させてコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の粉末を得た（収量１２５Ｋｇ）（試料１）。ここでのコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの９０％メタノール抽出物中のシュウ酸含量は５６％である。
【００４８】
コスツス・ピクツスの９０％メタノール抽出物の粉末（試料１  ７５Ｋｇ）を、水を用いて加熱して残渣および上清（水部）を形成した。水部を捨てた。残渣を再度水で処理し、加熱して別の残渣および上清を形成した。残渣を５００ミリメートル水銀柱以上の真空下で乾燥させて粉末を得た。７５ｋｇの出発材料から得られた粉末の量は３４ｋｇであった。この粉末をシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの９０％メタノール抽出物の粉末とした（試料２）。コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの９０％メタノール抽出物中のシュウ酸含量はわずか８％である。
【００４９】
（ＨＰＬＣ分析）
試料２  ５０ｍｇを秤量し、５０ｍｌ標準フラスコに移し、メタノールに溶解し、メタノールを用いて標線に合わせた。
【００５０】
メタノールに溶解した試料２を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ−１８カラム（２５０×４．６ｍｍ）、５μ、室温（２５℃）を用いて、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣで分析した。
【００５１】
５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４）を含む、５％ＡＣＮ（アセトニトリル）水溶液（溶媒Ａ）および９５％ＡＣＮ（アセトニトリル）水溶液（溶媒Ｂ）を用いた勾配溶離を用いた。
【００５２】
溶媒Ｂの組成を５％から３５分に５０％まで変化させ、次いで、４５分に８０％まで変化させ、５５分まで８０％で維持し、次いで、５６分から６０分まで５％で維持した。２５４ｎｍおよび３２４ｎｍでＵＶ検出器を使用してデータを収集した。
【００５３】
２５４／３２４ｎｍでのＵＶデータは、ヒドロキシケイ皮酸誘導体およびフラボノイドに相当するいくつかのピークを示す。アルカリ加水分解および酸加水分解により、ヒドロキシケイ皮酸およびフラボノイドの存在がそれぞれ確認された。
【００５４】
（酸加水分解）
試料２  １５０ｇを秤量し、ガラスライニング容器に移した。次いで、試料２を水３．７５Ｌに溶解し、濃塩酸５６２．５ｍｌを容器に添加し、３時間還流した。容器の内容物を冷却し、液体−液体抽出器に移し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル相と水相を分離し、酢酸エチル相を回収した。酢酸エチル相を液体−液体抽出器に移し、水のＰＨが中性になるまで水で抽出した。酢酸エチル相と水相を分離し、酢酸エチル相を回収し、攪拌式薄膜蒸発器（ＡＴＦＥ）で濃縮して濃縮酢酸エチル抽出物を形成した。酢酸エチル濃縮物をバキュームストリッパーに供給し、５００ミリメートル水銀柱以上の真空下で乾燥させてコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の水処理９０％メタノール抽出物の酸加水分解生成物を形成した（収量７５ｇ）。
【００５５】
酸加水分解生成物（酢酸エチル濃縮物）５０ｍｇを正確に秤量し、５０ｍｌ標準フラスコに移し、メタノールに溶解し、メタノールを用いて標線に合わせた。
【００５６】
溶解試料をＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣで分析した。カラム：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｂｅｔａｓｉｌ、Ｃ１８、２５０×４．６ｍｍ、５μを用いた。溶媒系（イソクラティック（ｉｓｏｃｈｒａｔｉｃ））：１％酢酸を含有するメタノール−アセトニトリル−水（４０：１５：４５ｖ／ｖ／ｖ）を用い、流量１ｍｌ／分で、３６８ｎｍで検出した。
【００５７】
３つのピークが３６８ｎｍで検出され、これらは参照標準との同時注入によって確認されるようにケルセチン、ケンフェロールおよびイソラムネチンに相当した。
【００５８】
（アルカリ加水分解）
シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物（試料２）１５０ｇを秤量した。２Ｍ  ＮａＯＨ  ６Ｌを添加し、混合物を攪拌容器に移した。混合物を、一定に攪拌しながら４０℃で３０分間加熱した。３０分後、混合物を冷却し、濃ＨＣｌを添加して混合物のｐＨを３に調整した。混合物を液体−液体抽出器に移し、酢酸エチルを添加した。酢酸エチル相と水相を分離し、酢酸エチル相を回収し、攪拌式薄膜蒸発器（ＡＴＦＥ）で濃縮して濃縮酢酸エチル抽出物を形成した。濃縮酢酸エチル抽出物をバキュームストリッパーに供給し、５００ミリメートル水銀柱以上の真空下で乾燥させてコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の水処理９０％メタノール抽出物のアルカリ加水分解生成物を形成した（収量７５ｇ）。
【００５９】
アルカリ加水分解生成物５０ｍｇを正確に秤量し、５０ｍｌ標準フラスコに移した。次に、アルカリ加水分解生成物をメタノールに溶解し、メタノールを用いて標線に合わせた。溶解試料をＨＰＬＣによって分析した。カラム：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｂｅｔａｓｉｌ、Ｃ１８、２５０×４．６ｍｍ、５μを用いた。溶媒系：溶媒Ａ−水中１％酢酸、溶媒Ｂ−１％酢酸／水／アセトニトリル（２：６８：３０）を用いた。勾配：０分とした。７％溶媒Ｂを９０％溶媒Ｂまで増加させた。流量は１ｍｌ／分で行った。３２０ｎｍで検出した。ヒドロキシケイ皮酸が３２４ｎｍでＨＰＬＣによって検出され、参照標準との同時注入によって同定された。したがって、抽出物のアルカリ加水分解後に、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、フェルラ酸およびシナピン酸が同定された。
【００６０】
（実施例２）
試料２  ３０Ｋｇを最小量のメタノールに溶解し、シリカゲル約３０Ｋｇを容器に添加した。メタノールが蒸発するまで混合物を旋回させ、乾燥粉末のみが残った。乾燥粉末を、既にシリカゲル（５０Ｋｇ）およびヘキサンが湿式充填されたカラムの上部に移した。カラムを最初にヘキサン、引き続いてメタノールで溶出した。メタノール分画を回収し、ヘキサン分画を捨てた。メタノール分画を攪拌式薄膜蒸発器（ＡＴＦＥ）で濃縮して濃縮抽出物を形成した。濃縮物をバキュームストリッパーに供給し、５００ミリメートル水銀柱以上の真空下で乾燥させ粉末を得た。３０ｋｇの出発材料から得られた粉末の量は４３０ｇであった。この粉末をシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎのシリカ精製９０％メタノール抽出物の粉末とした［試料３］。コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎのシリカ精製９０％メタノール抽出物中のシュウ酸含量は３％であった。
【００６１】
（ＨＰＬＣ分析）
試料３のＨＰＬＣ分析を実施例１に記載のように行った。２５４／３２４ｎｍでのＵＶデータは、ヒドロキシケイ皮酸誘導体およびフラボノイドに相当するいくつかのピークを示す。アルカリ加水分解および酸加水分解により、ヒドロキシケイ皮酸およびフラボノイドの存在をそれぞれ確認した。
【００６２】
（酸加水分解）
試料３  １５０ｇを秤量し、酸加水分解を実施例１に記載のように行った。最終生成物はコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の精製９０％メタノール抽出物の酸加水分解生成物であった（収量７５ｇ）。
【００６３】
コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の精製９０％メタノール抽出物の酸加水分解生成物を実施例１のようにＨＰＬＣによって分析した。
【００６４】
３つのピークが３６８ｎｍで検出され、これらは参照標準との同時注入によって確認されるようにケルセチン、ケンフェロールおよびイソラムネチンに相当した。
アルカリ加水分解
【００６５】
試料３  １５０ｇを秤量し、アルカリ加水分解を実施例１に示されるように行った。最終生成物はコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の精製９０％メタノール抽出物のアルカリ加水分解生成物であった（収量７５ｇ）。
【００６６】
アルカリ加水分解生成物を実施例１のようにＨＰＬＣによって分析した。ヒドロキシケイ皮酸が３２４ｎｍで検出され、参照標準との同時注入によって同定された。したがって、抽出物のアルカリ加水分解後に、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、フェルラ酸およびシナピン酸が同定された。
【００６７】
（実施例３）
コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉３０００Ｋｇを実施例１のように９０％メタノールで抽出した。得られた生成物はコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の粉末であった（収量７５Ｋｇ）。
【００６８】
実施例１に記載の方法によって、コスツス・ピクツスの９０％メタノール抽出物の粉末からシュウ酸を除去した。７５ｋｇの出発材料から得られた粉末の量は３４ｋｇであった。この粉末をシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの９０％メタノール抽出物の粉末とした。シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの９０％メタノール抽出物中のシュウ酸含量は８％であった。
【００６９】
上記の得られた粉末を水に溶解し、液体−液体抽出器に移し、酢酸エチルで抽出した。２つの相−水相および酢酸エチル相を形成した。酢酸エチル相を回収し、水相を再度液体−液体抽出器で、さらに２回酢酸エチルで処理し、各回で酢酸エチル相を回収した。全ての酢酸エチル相を合わせて、攪拌式薄膜蒸発器（ＡＴＦＥ）で濃縮して濃縮酢酸エチル抽出物を形成した。酢酸エチル濃縮物をバキュームストリッパーに供給し、５００ミリメートル水銀柱以上の真空下で乾燥させ粉末を形成した。粉末の収量は３４ｋｇの出発材料から３０ｋｇであった。この粉末をシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物の粉末と呼んだ（試料４）。コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物中のシュウ酸含量は１．５％であった。
【００７０】
（ＨＰＬＣ分析）
試料４のＨＰＬＣ分析を実施例１のように行った。２５４／３２４ｎｍでのＵＶデータは、ヒドロキシケイ皮酸誘導体およびフラボノイドに相当するいくつかのピークを示す。アルカリ加水分解および酸加水分解により、ヒドロキシケイ皮酸およびフラボノイドの存在をそれぞれ確認した。
【００７１】
（酸加水分解）
試料４の酸加水分解を実施例１に示されるように行った。得られた生成物はコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物の酸加水分解生成物であった（収量７５ｇ）。
【００７２】
酸加水分解生成物を実施例１のようにＨＰＬＣによって分析した。３つのピークが３６８ｎｍで検出され、これらは参照標準との同時注入によって確認されるようにケルセチン、ケンフェロールおよびイソラムネチンに相当した。
【００７３】
（アルカリ加水分解）
試料４  １５０ｇを用いてアルカリ加水分解を実施例１に示されるように行った。得られた生成物はコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物のアルカリ加水分解生成物であり（収量７５ｇ）、これを実施例１のようにＨＰＬＣによって分析した。
【００７４】
ヒドロキシケイ皮酸が３２４ｎｍで検出され、参照標準との同時注入によって同定された。したがって、抽出物のアルカリ加水分解後に、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、フェルラ酸およびシナピン酸が同定された。
【００７５】
（実施例４）
試料４  ２５Ｋｇを最小量のメタノールに溶解し、シリカゲル約２５Ｋｇを容器に添加した。メタノールが蒸発するまで混合物を旋回させ、乾燥粉末のみが残った。乾燥粉末を、既にシリカゲル（５０Ｋｇ）およびヘキサンが湿式充填されたカラムの上部に移した。カラムを最初にヘキサン、引き続いてメタノールで溶出した。メタノール分画を回収し、ヘキサン分画を捨てた。メタノール分画を攪拌式薄膜蒸発器（ＡＴＦＥ）で濃縮して濃縮抽出物を形成した。濃縮物をバキュームストリッパーに供給し、５００ミリメートル水銀柱以上の真空下で乾燥させ粉末を得た。２５ｋｇの出発材料から得られた粉末の量は２４５ｇであった。この粉末をシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの９０％メタノール抽出物の精製酢酸エチル抽出物の粉末とした（試料５）。コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの９０％メタノール抽出物の精製酢酸エチル抽出物中のシュウ酸含量は０．２％であった。
【００７６】
（ＨＰＬＣ分析）
試料５のＨＰＬＣ分析を実施例１のように行った。２５４／３２４ｎｍでのＵＶデータは、ヒドロキシケイ皮酸誘導体およびフラボノイドに相当するいくつかのピークを示す。アルカリ加水分解および酸加水分解により、ヒドロキシケイ皮酸およびフラボノイドの存在をそれぞれ確認した。
【００７７】
（酸加水分解）
試料５  １５０ｇを実施例１に示されるように酸加水分解に供した。コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の精製酢酸エチル抽出物の酸加水分解生成物７５ｇが得られた。
【００７８】
酸加水分解生成物を実施例１のようにＨＰＬＣによって分析した。３つのピークが３６８ｎｍで検出され、これらは参照標準との同時注入によって確認されるようにケルセチン、ケンフェロールおよびイソラムネチンに相当した。
【００７９】
（アルカリ加水分解）
試料５のアルカリ加水分解を実施例１のように行った。コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の精製酢酸エチル抽出物のアルカリ加水分解生成物７５ｇが得られた。アルカリ加水分解生成物を実施例１のようにＨＰＬＣによって分析した。ヒドロキシケイ皮酸が３２４ｎｍで検出され、参照標準との同時注入によって同定された。したがって、抽出物のアルカリ加水分解後に、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、フェルラ酸およびシナピン酸を同定した。
【００８０】
（実施例５）
ヒドロキシケイ皮酸は、Ｃ６−Ｃ３構造によって特徴づけられる非フラボノイドフェノール類である（表１）。これらの化合物は植物中に豊富にあり、構造的および化学的植物防御戦略の両方に使用されている。ケイ皮酸の誘導体は多数の野菜および果実中に存在する。コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎ抽出物中では、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、フェルラ酸およびシナピン酸が、糖または他のヒドロキシケイ皮酸またはキナ酸（Ｒ３）と抱合して見られる。
【００８１】
【表１】
2015520225.tif 000002
表１：コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物中に存在する異なるヒドロキシケイ皮酸誘導体の構造。
Ｒ１はコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物中に存在するヒドロキシケイ皮酸によって決まる水素（Ｈ）、ヒドロキシル（ＯＨ）、メトキシ（ＯＣＨ３）基である。
Ｒ２はコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物中に存在するヒドロキシケイ皮酸によって決まる水素（Ｈ）、メトキシ（ＯＣＨ３）である。
Ｒ３はコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物中に存在する４種全てのヒドロキシケイ皮酸において水素（Ｈ）である。
【００８２】
フラボノイドは自然界で広く分布する植物色素である。これらは三炭素架橋によって接続された２個の芳香環を有する１５個の炭素を含むポリフェノール化合物であり、したがってＣ６−Ｃ３−Ｃ６である（表２）。これらは葉および果実の表皮中に高濃度で存在し、ＵＶ保護、色素沈着、窒素固定根粒の刺激および病原抵抗性などの過程に関与している二次代謝産物として重要かつ様々な役割を有する。フラボノールはフラボノイドの最も広範囲にわたるものである。コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎ抽出物中の主要なフラボノールであるケルセチン、ケンフェロールおよびイソラムネチンは、Ｏ−グリコシドおよび遊離フラボノールとして見られる。抱合がＣ環の３位で最も頻繁に起こるが、置換も５、７、４’、３’および５’位で起こり得る。グルコース／ガラクトースおよびラムノースを含有するモノ−、ジ−およびトリグリコシドが見られる。
【００８３】
【表２】
2015520225.tif 000003
Ｒ１はコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物中に存在する３種のフラボノール中でヒドロキシル基（ＯＨ）である。
Ｒ２はコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物中に存在するフラボノールによって決まる水素（Ｈ）、ヒドロキシル（ＯＨ）、メトキシ（ＯＣＨ３）である。
Ｒ３はコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物中に存在するフラボノールの構造中で水素（Ｈ）である。
【００８４】
（高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析）
抽出物を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ−１８カラム（２５０×４．６ｍｍ）、５μ、室温（２５℃）、試料濃度−ＭｅＯＨ：水（１：１）に溶解した１ｍｇ／ｍｌを用いてＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣで分析した。
【００８５】
５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４）を含む、５％ＡＣＮ（アセトニトリル）水溶液（溶媒Ａ）および９５％ＡＣＮ（アセトニトリル）水溶液（溶媒Ｂ）を用いた勾配溶離を用いた。Ｂの組成を５％から３５分に５０％まで変化させ、次いで、４５分に８０％まで変化させ、５５分まで８０％で維持し、次いで、５６分から６０分まで５％で維持した。２５４ｎｍおよび３２４ｎｍでＵＶ検出器を使用してデータを収集した。
【００８６】
２５４／３２４ｎｍでのＵＶデータ（図１および図２）は、ヒドロキシケイ皮酸誘導体およびフラボノイドに相当するいくつかのピークを示す。アルカリ加水分解および酸加水分解により、ヒドロキシケイ皮酸およびフラボノイドの存在をそれぞれ確認した。
【００８７】
（アルカリ加水分解）
２Ｍ水酸化ナトリウムを用いて４０℃で３０分間アルカリ加水分解を行い、ＨＣｌを用いてｐＨ３に酸性化し、酢酸エチルで抽出し、真空下で濃縮および乾燥させた。ヒドロキシケイ皮酸が３２４ｎｍで高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって検出され、参照標準との同時注入によって同定された。したがって、抽出物のアルカリ加水分解後に、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、フェルラ酸およびシナピン酸が同定された（図３）。このことにより、コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎ中のこれらの酸の誘導体の存在が間接的に確認される。
【００８８】
ＨＰＬＣ条件を示す。カラム：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｂｅｔａｓｉｌ、Ｃ１８、２５０×４．６ｍｍ、５μを用いた。溶媒系：溶媒Ａ−１％酢酸水溶液、溶媒Ｂ−１％酢酸／水／アセトニトリル（２：６８：３０）を用いた。勾配：０分を用いた。７％Ｂを９０％Ｂまで増加させた。流量１ｍｌ／分を用いた。３２０ｎｍで検出した。アルカリ加水分解後のコスツス・ピクツスＤ．ＤｏｎのＨＰＴＬＣフィンガープリントを図４に示す。
【００８９】
（酸加水分解）
酢酸エチルによる抽出に引き続いて、１Ｎ  ＨＣｌを用いて４時間還流することによって、酸加水分解を行った。ｐＨが中性になるまで酢酸エチル抽出物を水で洗浄し、濃縮し、真空下で乾燥させ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した。３つのピークが３６８ｎｍで検出され（図５）、これらは参照標準との同時注入によって確認されるようにケルセチン、ケンフェロールおよびイソラムネチンに相当した。ケンフェロールをカラムクロマトグラフィーによって単離したところ、そのプロトンＮＭＲ（核磁気共鳴）データが文献で報告されているものと一致した。
【００９０】
【表３】
2015520225.tif 000004
表３．酸加水分解生成物から単離したケンフェロールの１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲデータ。Ｈは水素を意味し、Ｃは炭素を意味する。
参考文献
Ｙ−Ｌ  Ｌｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１３、１９３１〜４、２００８。
Ｘ．Ｌｉｕら、Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．１０９、９０９〜９１５、２００８。
ＨＰＬＣ条件：−カラム：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｂｅｔａｓｉｌ、Ｃ１８、２５０×４．６ｍｍ、５μ。溶媒系（イソクラティック）：１％酢酸を含有するメタノール−アセトニトリル−水（４０：１５：４５ｖ／ｖ／ｖ）、流量１ｍｌ／分。３６８ｎｍでの検出。
【００９１】
（糖分析）
酸加水分解実験からフラボノイドを分離した後、基準糖を用いた高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）を用いて、中和後の水層を糖について試験した。グルコース、ガラクトースおよびラムノースが水層中で同定され、それによって抽出物中にこれらの糖の抱合体が存在することが示された（ＨＰＴＬＣ  図６）。
【００９２】
（実施例６）
（液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）分析）
抽出物を、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステムが接続したＷａｔｅｒｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ＩＩトリプル四重極質量分析計でのＬＣＭＳ分析に供した。使用したカラムはＴｈｅｒｍｏ−ＯＤＳ−２（２５０×４．６ｍｍ、５μ）であった。５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４）を含む、５％ＡＣＮ（アセトニトリル）水溶液（溶媒Ａ）および９５％ＡＣＮ（アセトニトリル）水溶液を用いた勾配溶離を用いた。Ｂの組成を５％から３５分に５０％まで変化させ、次いで、４５分に８０％まで変化させ、５５分まで８０％で維持し、次いで、５６分から６０分まで５％で維持した。フォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）検出器（２００〜６５０ｎｍ）を使用して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）データを収集した。質量スペクトルを２秒で１００〜１０００Ｄａ（ダルトン）の範囲でスキャンした。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）キャピラリーを３．５ｋＶ（キロボルト）に設定し、コーン電圧を４０Ｖとした。乾燥窒素をネブライザー（１０リットル／時間）および乾燥ガス（２５０リットル／時間）として使用した。発生源温度を８０℃とした。
フォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）検出器が利用可能であり、ＵＶデータを異なる波長で試験することができた。３２４ｎｍおよび３７０ｎｍでのクロマトグラムを図７および図８に示す。主要な構成成分はヒドロキシケイ皮酸誘導体およびフラボノイドグリコシドであるように見える。
【００９３】
（表および図の要約）
（ヒドロキシケイ皮酸誘導体）
図９に示される３２４ｎｍでの液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）クロマトグラムは、複数の成分、主にヒドロキシケイ皮酸誘導体を明確に示している。
【００９４】
これらを、表４に示されるＭＳデータから仮同定することができた。クマル酸がこれらの構成成分の多くの部分であることが明らかである。クロロゲン酸ファミリーの少なくとも７種の成分が存在する。これらはクマロイルキナ酸（ＣＱＡ）であり、その例を以下に示す。
【化１】
2015520225.tif 000005
【００９５】
【表４】
2015520225.tif 000006
表４．質量スペクトルデータからのヒドロキシケイ皮酸の成分の同定
ＲＴ−保持時間
Ｍ．Ｗｔ−分子量
ＭＳデータ−質量スペクトルデータ
【００９６】
（フラボノイド誘導体）
フラボノイドは、約２６０および３４０〜３７０ｎｍでの強い吸収によって特徴づけられる。したがって、３７０ｎｍでのフォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）データは、フラボノイドに特異的なはずである。図１０に示されるデータは、いくつかのフラボノイド誘導体の存在を示している。少なくとも１６種の成分を検出し、仮同定することができた（表５）。糖単位の脱離から得られたフラグメントイオンは、これらのグリコシド中の糖単位の配列を明確に示す。例えば、ｍ／ｚ７５７の親イオンを有する成分は、１個のヘキソースおよび２個のラムノース単位を有するケルセチントリグリコシドに相当する。表５に示されるように他の全てのフラボノイドグリコシド成分について同様に糖配列を同定することができた。これらの全てがフラボノイドグリコシドを確認する約２６０および３５０ｎｍでのＵＶ吸収極大を示した。フラボノイドグリコシドのいくつかの化学式を親イオンの正確な質量測定から得た（表６）。
【００９７】
抽出物の酸加水分解は、アグリコンとしてケルセチン、ケンフェロールおよびイソラムネチンをもたらした。ＨＰＬＣでの標準参照化合物との同時注入によってその同一性を確認した。酸加水分解後の糖分析によってガラクトース、グルコースおよびラムノースの存在も確認した。
【００９８】
【表５】
2015520225.tif 000007
表５．質量スペクトルデータからのフラボノイドの成分の同定。１６種の成分を検出し、フラボノイドグリコシドおよび遊離型として同定する。
ＲＴ−保持時間、Ｍ．Ｗｔ−分子量、ＭＳデータ−質量スペクトルデータ
Ｑｕｅｒ−ケルセチン、ＩｓｏＲ−イソラムネチン、Ｋａｅｍ−ケンフェロール、Ｈｅｘ−ヘキソース、Ｒｈａ−ラムノース
【００９９】
【表６】
2015520225.tif 000008
表６．親イオンの正確な質量測定から得られたフラボノイドグリコシドのいくつかの化学式。
【０１００】
フラボノイドは少量の遊離のフラボノールに加えて、主にケルセチン、ケンフェロールおよびイソラムネチンのトリ−、ジ−およびモノグリコシドであるように見える。全てのトリ−およびジグリコシドがグルコース／ガラクトース／ラムノースを含有するが、モノグリコシドはグルコースまたはガラクトースのみを含有する。
【０１０１】
（実施例７）
（ウィスターラットのストレプトゾトシン誘導１型糖尿病モデルへのコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の異なる分画の効果の評価）
体重２００〜２５０ｇｍの成体雄ウィスターラットで４０日間（処理３０日および誘導１０日）試験を行った。これらのラットを、それぞれ６匹を含む７つのグループにランダムに分けた。５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンの腹腔内投与によって正常対照群を除く全てのグループで糖尿病を誘導した。糖尿病の誘導後、グループ１は糖尿病未処理群として維持し、また、標準薬剤であるグリベンクラミドを３ｍｇ／ｋｇでラットに経口処理した陽性対照を維持した。他の全ての糖尿病誘導群は、異なる抽出物３００ｍｇ／ｋｇを経口処理した。異なる分画の効果は、空腹時血糖値、食後血糖値、血清インスリンレベルおよびグリコシル化Ｈｂを測定することによって評価した。抗高脂血症効果は、総コレステロール、トリグリセリド、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＶＬＤＬ、筋グリコーゲンおよび肝グリコーゲンを見積もることによって評価した。異なる抽出物の抗酸化効果は、ＴＢＡＲＳ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）およびグルタチオンペルオキシダーゼレベル（ＧＰｘ）を測定することによって評価した。ＴＢＡアッセイ（Ｏｈｋａｗａら、１９７９）によってＴＢＡＲＳを測定し、ニトロブルーテトラゾリウム還元法（Ｋａｋｋａｒら、１９８４）を用いてＳＯＤを測定し、Ａｅｂｉ（１９７４）によって記載されている方法を用いてカタラーゼをアッセイした。ＦｌｏｈｅおよびＧｕｎｚｌｅｒ（１９８４）によって記載されているようにＧＰｘを測定し、Ｊｏｌｌｏｗ等（１９７４）の方法によりＧＳＨを測定した。膵臓の病理組織学的試験を行ってコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの異なる分画の抗糖尿病効果を評価した。
【０１０２】
実験設計は以下の通りとした：
グループ１−正常対照
グループ２−糖尿病対照−未処理糖尿病動物
グループ３−陽性対照−グリベンクラミド３ｍｇ／ｋｇを経口処理した糖尿病動物
グループ４−シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉のメタノール抽出物４０ｍｇ／ｋｇを経口処理した糖尿病動物
グループ５−シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物のシリカ精製酢酸エチル抽出物４０ｍｇ／ｋｇを経口処理した糖尿病動物
グループ６−シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物４０ｍｇ／ｋｇを経口処理した糖尿病動物
グループ７−シュウ酸を含むコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉のメタノール抽出物４０ｍｇ／ｋｇを経口処理した糖尿病動物
【０１０３】
（結果）
（血糖値）
試験の結果を表１に示す。コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの異なる分画は１５日目および３０日目で血糖値の低下を示した。シュウ酸含量が低いグループ５によって示された血糖値の低下は、他の処理群より大きかった。シュウ酸を含むコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの９０％メタノール抽出物は、血糖値の３．４５倍の低下を示した。シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの９０％メタノール抽出物は、ストレプトゾトシン誘導糖尿病で血糖値の４．５５倍の低下を示した。
【０１０４】
表．１．ストレプトゾトシン誘導糖尿病における、血糖値（ｍｇ／ｄｌ）へのシュウ酸含量が低いメタノール抽出物（グループ４）、シュウ酸含量が低い９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物（グループ６）およびシュウ酸含量が低いそのシリカ精製部分（グループ５）、ならびにシュウ酸を含むメタノール抽出物（グループ７）の効果
【表１】
2015520225.tif 000009
【０１０５】
経口経管栄養による２．５ｇ／ｋｇのブドウ糖負荷にしたがって経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を行った。試験１日目、１５日目および３０日目にブドウ糖負荷を行った後、３０分（ＰＰＧ１）、６０分（ＰＰＧ２）、１２０分（ＰＰＧ３）および２４０分（ＰＰＧ４）経過後に、血糖を記録した。
【０１０６】
試験の結果を表．２に提示する。コスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの異なる分画は、２４０分後のＰＰＧレベルの低下を示した。シュウ酸含量が低いグループ５によって示されたＰＰＧの低下が他の処理群よりも大きかった。
【０１０７】
表．２．食後血糖値へのシュウ酸含量が低いメタノール抽出物（グループ４）、シュウ酸含量が低い９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物（グループ６）およびシュウ酸含量が低いそのシリカ精製部分（グループ５）、ならびにシュウ酸を含むメタノール抽出物（グループ７）の効果
【表２】
2015520225.tif 000010
2015520225.tif 000011
【０１０８】
（脂質プロファイルおよび組織グリコーゲンレベル）
脂質プロファイルおよび組織グリコーゲンレベルの効果についての試験の結果を表．３および表．４にそれぞれ提示する。総コレステロール、トリグリセリド、ＬＤＬおよびＶＬＤＬの結果は、糖尿病未処理群と比較して低下を示した。高密度リポタンパク質値は、糖尿病未処理群と比較して試料処理群で増加した。筋および肝グリコーゲンレベルの増加が糖尿病未処理群と比較して試料処理群で観察された。脂質プロファイルおよび組織グリコーゲンレベルへの異なる分画の効果はグループ５で大きかった。
【０１０９】
表．３．総コレステロール、トリグリセリド、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびＶＬＤＬレベルへのシュウ酸含量が低いメタノール抽出物（グループ４）、シュウ酸含量が低い９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物（グループ６）およびシュウ酸含量が低いそのシリカ精製部分（グループ５）、ならびにシュウ酸を含むエタノール（ｅｔｈａｎｏｌｉｃ）抽出物（グループ７）の効果
【表３】
2015520225.tif 000012
【０１１０】
表．４．筋グリコーゲンおよび肝グリコーゲンレベルへのシュウ酸含量が低いメタノール抽出物（グループ４）、シュウ酸含量が低い９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物（グループ６）およびシュウ酸含量が低いそのシリカ精製部分（グループ５）、ならびにシュウ酸を含むメタノール抽出物（グループ７）の効果
【表４】
2015520225.tif 000013
【０１１１】
（インスリンおよびグリコシル化Ｈｂレベル）
インスリンおよびグリコシル化Ｈｂレベルへの異なる抽出物の効果を表．５に示す。試料処理群は、糖尿病未処理群と比較してインスリンレベルの増加およびグリコシル化ヘモグロビンレベルの低下を示した。効果はグループ５で大きかった。
【０１１２】
表．５．インスリンおよびグリコシル化Ｈｂレベルへのシュウ酸含量が低いメタノール抽出物（グループ４）、シュウ酸含量が低い９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物（グループ６）およびシュウ酸含量が低いそのシリカ精製部分（グループ５）、ならびにシュウ酸を含むメタノール抽出物（グループ７）の効果
【表５】
2015520225.tif 000014
【０１１３】
（抗酸化酵素）
抗酸化酵素レベルへの抽出物の効果を表．６に示す。糖尿病未処理群と比較して、ＳＯＤ、カタラーゼ、ＧＳＨおよびＧＰｘの抗酸化酵素レベルが試料処理群で増加し、ＴＢＡＲＳレベルの低下が全ての試料処理群で観察された。抗酸化酵素およびＴＢＡＲＳへの効果はグループ５で大きかった。
表．６．抗酸化酵素レベルへのシュウ酸含量が低いメタノール抽出物（グループ４）、シュウ酸含量が低い９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物（グループ６）およびシュウ酸含量が低いそのシリカ精製部分（グループ５）、ならびにシュウ酸を含むメタノール抽出物（グループ７）の効果
【表６】
2015520225.tif 000015
【０１１４】
（膵臓病理組織学）
正常群の膵臓の病理組織学的試験によって、正常な構造が明らかになった。ストレプトゾトシンの投与によりβ細胞の数が減少し、未処理糖尿病群により変性壊死を伴う萎縮した膵島が明らかになった。グループ３、グループ４、グループ５、グループ６およびグループ７の切片では、膵島が未処理糖尿病対照群ほど萎縮していないように見え、β細胞の数の増加も観察された。潜在性リンパ球およびマクロファージの数も減少した。病理組織学的所見はグループ５で優勢であった。グループ１の膵島の平均数は３６であった。グループ２では、膵島の平均数は５であり、グループ３では１８．６６であった。試料処理群、すなわち、グループ４、５、６および７の膵島の平均数はそれぞれ１８、２２．８３、１９．６６および１７．１１であった。このことは、処理群で損傷膵島細胞が再生し、その最大がグループ５で見られたことを示している。さらに、免疫組織化学では、グループ４（図１４）、グループ５（図１５）、グループ６（図１６）およびグループ７（図１７）が、糖尿病対照ならびに正常対照の両方と比較してβ細胞の強い染色および膵島のβ細胞の数の増加を示した。グループ２のβ細胞は極めてまばらであった。グループ３のβ細胞は中程度に染色され、グループ１に匹敵した。
【０１１５】
（実施例８）
（Ｃ５７／ＢＬ  ６Ｊマウスを用いた高脂肪食誘導インスリン抵抗性モデルへのコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの異なる分画の効果の評価）
高脂肪食誘導抵抗性２型糖尿病モデル（ＨＦＤ）へのコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの異なる分画の効果を評価するために試験を設計した。６週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスが食物および水を自由に入手できるようにした。これらのマウスを同一標準条件下で収容した。これらのマウスを７日間順化のために維持した。７日後、マウスを、各々６匹のマウスの６つのグループにランダムに分けた。正常対照群を正常な通常の食餌で処理し、残りのマウスに６週間高脂肪食を与えた。６週間後、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉のメタノール抽出物、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉のメタノール抽出物のシリカ精製酢酸エチル抽出物およびシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物４０ｍｇ／ｋｇを６週間連続して経口投与した。実験設計は以下の通りとした：
グループ１−正常な通常の食餌で処理した正常対照
グループ２−６週間のＨＦＤ処理群
グループ３−６週間のＨＦＤおよび６週間の標準薬剤処理群−メトホルミン
グループ４−６週間のＨＦＤおよび６週間のシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉のメタノール抽出物４０ｍｇ／ｋｇの経口投与
グループ５−６週間のＨＦＤおよび６週間のシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物のシリカ精製酢酸エチル抽出物４０ｍｇ／ｋｇの経口投与
グループ６−６週間のＨＦＤおよび６週間のシュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物４０ｍｇ／ｋｇの経口投与
【０１１６】
（所見）
体重を隔週で測定した。実験期間の最後に、血液試料を収集して血漿グルコース、インスリン、レプチン、グリコシル化ヘモグロビン、トリグリセリド、総コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬおよびＶＬＤＬを測定した。
【０１１７】
（体重）
動物の体重の結果を表．１に示す。６週間後には、全ての動物の平均体重が１５ｇから６０ｇ近くまで増加した。１２週間後には、試料処理群は体重の減少を示した。メトホルミン処理群を除く全ての処理群で効果はほぼ類似であった。試料処理群（グループ４、５および６）中で、グループ５が標準薬剤（メトホルミン）処理群と類似の効果を示した。
表．１．体重へのシュウ酸含量が低いメタノール抽出物（４群）、シュウ酸含量が低い９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物（６群）およびシュウ酸含量が低いそのシリカ精製部分（５群）の効果
【表１】
2015520225.tif 000016
【０１１８】
（血糖）
血糖値の結果を表．２に示す。結果は、全ての試料処理群（グループ４、５および６）の血糖値の低下を示した。血糖活性の低下はグループ５で高かった。
表．２．血糖値へのシュウ酸含量が低いメタノール抽出物（グループ４）、シュウ酸含量が低い９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物（グループ６）およびシュウ酸含量が低いそのシリカ精製部分（グループ５）の効果
【表２】
2015520225.tif 000017
【０１１９】
（脂質プロファイル）
総コレステロール、トリグリセリド、ＬＤＬ、ＨＤＬおよびＶＬＤＬの結果を表．３に示す。ＨＦＤ処理群のＴＣレベルが高かった。全ての試料処理群がＴＣレベルの低下を示した。同様に、ＴＧ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬがＨＦＤ処理群で高い値を示した。ＨＦＤ処理群のＬＤＬ値は低かった。しかし、全ての試料処理群がＴＧ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬの低下およびＨＤＬの増加を示した。試料処理群（グループ４、５および６）中で、グループ５が標準薬剤（メトホルミン）処理群とほぼ類似の脂質プロファイルの低下を示した。
表．３．高脂肪食誘導糖尿病における脂質プロファイルへのシュウ酸含量が低いメタノール抽出物（グループ４）、シュウ酸含量が低い９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物（グループ６）およびシュウ酸含量が低いそのシリカ精製部分（グループ５）の効果
【表３】
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【０１２０】
（血清インスリンレベル）
血清インスリンおよびグリコシル化ヘモグロビンの結果を表．４に示す。ＨＦＤ処理群はインスリン値の増加を示した。他方、試料処理群（グループ４、５および６）は血清インスリンおよびグリコシル化ヘモグロビン値の減少を示した。試料処理群の中で、グループ５で効果が大きく、これは標準薬剤処理群とより類似の活性を示した。
表．４．高脂肪食誘導糖尿病における血清インスリン、レプチンおよびグリコシル化ヘモグロビンレベルへのシュウ酸含量が低いメタノール抽出物（グループ４）、シュウ酸含量が低い９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物（グループ６）およびシュウ酸含量が低いそのシリカ精製部分（グループ５）の効果
【表４】
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【０１２１】
（実施例９）
（単離したマウス膵島を用いたコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの異なる分画のインビトロインスリン分泌促進物質効果）
（手順）
Ｉ．動物
試験のために使用する４〜６週齢の雄マウス（スイスアルビノ系統；体重２５±２ｇ）を、最適な環境条件に維持した。
【０１２２】
ＩＩ．膵島の単離
Ｓｈｅｗａｄａｅら（１９９９）の方法にしたがってＣＯ２麻酔で安楽死させた動物から単離した膵臓を無菌的に（ａｓｐｅｃｔｉｃａｌｌｙ）取り出した。ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で３回洗浄し、３７℃でコラゲナーゼ消化に供した。膵臓を分離培地（コラゲナーゼ、ダイズトリプシン阻害剤およびウシ血清アルブミン分画Ｖを補充したダルベッコ改変最小必須培地（ＤＭＥＭ））中で１０分間インキュベートした。この手順を３回繰り返し、１０％ウシ胎児血清を含む冷却ＤＭＥＭを膵臓消化物に添加することによって分離を停止した。混合物を２００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。ＤＭＥＭで２回洗浄した後、沈渣を、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ  ｐＨ７．２を含有する培養フラスコに播種した。フラスコをＣＯ２インキュベータ中で３７℃でインキュベートした。
【０１２３】
ＩＩＩ．膵島生存率および特異性の評価
トリパンブルー色素排除試験（ＷａｒｂｕｒｔｏｎおよびＪａｍｅｓ、１９９５）によって膵島の生存率をチェックした。この推定は細胞の９８％超が生存可能であることを示した。
【０１２４】
ＩＶ．抽出物および標準の調製
抽出物およびグリベンクラミド（１０ｎＭ）を必要濃度でＨＢＳＳに溶解した。ＨＢＳＳ単独で陰性対照として提供され、グリベンクラミドが陽性対照として提供された。以下の通り、３つのグループに、シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの抽出物を与えた。
グループ１−シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物
グループ２−シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物のシリカ精製酢酸エチル抽出物
グループ３−シュウ酸含量が低いコスツス・ピクツスＤ．Ｄｏｎの新鮮な葉の９０％メタノール抽出物の酢酸エチル抽出物
【０１２５】
Ｖ．インビトロでのインスリン分泌促進物質効果の評価
膵島を滅菌条件下において手で摘み、膵島を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭを入れた２４ウェルブレートの１ウェルに入れた。２４時間の回復期間後、使用済培地を除去し、細胞をＨＢＳＳで洗浄した。細胞は、１ｍｌのＨＢＳＳ中で３７℃で３０分間の初期インキュベーションを行った。次いで、膵島を種々の濃度の試験材料（２５〜２００μｇ／ｍＬ、５つの用量）および陽性対照グリベンクラミド（１０ｎＭ）と共にインキュベートした。次いで、膵島を３７℃で３０分間インキュベートし、上清５０μＬを回収した。全ての試料のインスリン含量をＥＬＩＳＡ法によってアッセイした。実験を３連で行った。
【０１２６】
（結果）
表５：単離した膵島への抽出物Ｅ２のインビトロインスリン分泌促進物質効果
【表５】
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【０１２７】
（推論）
インスリン分泌促進物質効果の評価において、基礎レベルではインスリンレベルの有意な変動はなかった。２５μｇ／ｍＬの抽出物濃度では、培地に放出されるインスリンレベルが増加した。５０μｇ／ｍＬの濃度では、放出が極めて有意であり、陽性対照（グリベンクラミド）に匹敵した。インスリン濃度の増加はグループ２で高かった。
【０１２８】
本発明者は、本発明の好ましい実施形態のいくつかを説明することによって本発明の新規な特徴を明らかにし、当業者が本発明を理解および視覚化することを可能にした。本発明は、上記の説明や実施例に示される詳細にその適用を限定されないことも理解されるべきである。本発明をその特定の好ましい実施形態に関してかなり詳細に記載してきたが、本明細書において上に記載され、以下の特許請求の範囲で定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修正を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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