(57)【要約】  本発明は、例えば、構造（式Ｉ）を有する合成化合物Ｏｘｙ１３３、    【化１】2015518493.tif 000010      （式Ｉ）又はＯｘｙ１３３及び薬学的に許容される担体を含む生理活性組成物若しくは医薬組成物に関する。この化合物又は生理活性組成物若しくは医薬組成物を使用して、例えば骨障害、肥満、心血管障害及び神経学的障害を含む種々の障害を処置するための方法もまた開示される。
2015518493.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
2015518493.tif 000009
（式Ｉ）
を有する化合物Ｏｘｙ１３３又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【請求項２】
化合物Ｏｘｙ１３３及び薬学的に許容される担体を含む、生理活性組成物。
【請求項３】
副甲状腺ホルモン、フッ化ナトリウム、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＬＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子II（ＩＬＧＦ−II）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、チトクロムＰ４５０阻害剤、造骨性プロスタノイド、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７及びＢＭＰ１４からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる薬剤をさらに含む、請求項２に記載の生理活性組成物。
【請求項４】
骨障害、骨粗鬆症又は骨折を有する対象を処置する方法であって、有効量の請求項２に記載の生理活性組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項５】
治療有効用量の生理活性組成物を、選択された間隔で有効な剤形で対象に投与して、骨量を増加させるステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
治療有効用量の生理活性組成物を、選択された間隔で有効な剤形で対象に投与して、骨粗鬆症の症状を改善させるステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
骨形態形成及び／又は骨増殖における増加を必要とする対象を処置する方法であって、有効量の請求項２に記載の組成物を対象に投与するステップを含む方法。
【請求項８】
請求項２に記載の組成物を、選択された間隔で有効な剤形で投与して、骨量を増加させるステップを含む、対象を処置して骨形成を誘導する方法。
【請求項９】
哺乳動物間葉系幹細胞の骨芽細胞分化を誘導する、及び／又は哺乳動物間葉系幹細胞の脂肪細胞分化を阻害する方法であって、前記細胞を有効量の請求項２に記載の組成物と接触させるステップを含み、前記哺乳動物間葉系幹細胞が、対象における骨髄間質細胞である方法。
【請求項１０】
黄色腫形成、脂肪パッドの局在化蓄積及び肥満を有する対象を処置する方法であって、有効量の請求項２に記載の生理活性組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１１】
細胞又は組織においてヘッジホッグ（Ｈｈ）経路媒介性の応答を刺激する方法であって、前記細胞又は組織を、有効量の請求項２に記載の生理活性組成物と接触させるステップを含む、方法。
【請求項１２】
ヘッジホッグ（Ｈｈ）経路媒介性の応答が、骨芽細胞分化、骨形態形成、骨増殖の刺激、並びに／又は脂肪細胞分化、脂肪細胞形態形成及び／若しくは脂肪細胞増殖の阻害である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヘッジホッグ（Ｈｈ）経路媒介性の応答が、毛髪成長の刺激である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ヘッジホッグ（Ｈｈ）経路媒介性の応答が、血管新生の刺激である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
心血管障害、動脈硬化症、心筋梗塞、末梢血管疾患及び／又は脳卒中を処置する方法である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ヘッジホッグ（Ｈｈ）経路媒介性の応答が、軟骨形成の刺激である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
変形性関節症を処置する方法である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
対象を処置して骨形成を誘導する方法であって、
哺乳動物間葉系幹細胞を収集するステップと、
前記哺乳動物間葉系細胞を、請求項２に記載の生理活性組成物で処置して、前記細胞の骨芽細胞分化を誘導するステップと、
分化した細胞を前記対象に投与するステップと
を含む方法。
【請求項１９】
生理活性組成物が、対象中の細胞、組織又は臓器に局所的に投与される、請求項４〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物細胞を刺激して、未処置の細胞における骨芽細胞分化の生物学的マーカーのレベルよりも大きいレベルの前記生物学的マーカーを発現させる方法であって、前記哺乳動物細胞を、有効量の請求項１に記載の化合物に曝露させるステップを含む方法。
【請求項２１】
生物学的マーカーが、アルカリホスファターゼ活性、カルシウム取り込み、石灰化及び／又はオステオカルシンｍＲＮＡの発現である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物細胞が、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、又は頭蓋冠の器官培養中の細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
細胞又は組織がインビトロにある、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
細胞又は組織がインビボにある、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
ヒト又は動物の身体における使用のためのインプラントであって、表面を有する基材を含み、前記インプラントの前記表面又は内側が、周囲の骨組織において骨形成を誘導するのに十分な量で、請求項２に記載の生理活性組成物を含むインプラント。
【請求項２６】
基材が、ピン、ネジ、プレート又は人工関節の形状へと形成される、請求項２５に記載のインプラント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年５月７日出願の米国仮特許出願第６１／６４３，７４６号の出願日の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって授与された助成金番号ＡＲ０５９７９４の政府の支援で行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
生物製剤は、骨折治癒及び脊椎障害の外科的管理を含む医療適用において、骨成長を促進するために一般に使用されている（Johnson EE, Urist MR 2000 Human bone morphogenetic protein allografting for reconstruction of femoral nonunion. Clin Orthop Relat Res 371:61-74、Mundy GR 2002 Directions of drug discovery in osteoporosis. Annu Rev Med 53:337-54、Rodan GA, Martin TJ 2000 Therapeutic Approaches to Bone Diseases. Science 289:1508-14、Yoon ST, Boden SD 2002 Osteoinductive molecules in orthopaedics: basic science and preclinical studies. Clin Orthop Relat Res 395:33-43）。脊椎固定は、変性性椎間板疾患並びに腰椎及び頸椎を侵す関節炎に対処するために、整形外科医及び脳神経外科医などによって実施される場合が多い。歴史的に、患者の腸骨稜から一般に採取される自家骨移植片が、椎骨レベル間の固定を増強するために使用されてきた。しかし、関連するドナー部位の罹患率、手術時間の増加、及び自家骨移植片の収集に関連する血液損失の増加（Arrington ED, Smith WJ, Chambers HG, Bucknell AL, Davino NA 1996 Complications of iliac crest bone graft harvesting. Clin Orthop Relat Res 329:300-9、Vaccaro AR, Chiba K, Heller JG, Patel TC, Thalgott JS, Truumees E, Fischgrund JS, Craig MR, Berta SC, Wang JC 2002 Bone grafting alternatives in spinal surgery. Spine J 2:206-15、Rihn JA, Kirkpatrick K, Albert TJ 2010 Graft options in posterolateral and posterior interbody lumbar fusion. Spine 35:1629-39）は、安全で有効な代替法を見出す動機付けを提供してきた。
【０００４】
組換えヒト骨形成タンパク質−２（ｒｈＢＭＰ−２，recombinant human bone morphogenetic protein-2）は、ヒトにおいて脊椎固定を促進するために一般に使用される。その使用は、単一レベルの前方椎体間固定（anterior lumbar interbody fusion）のために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ，Food and Drug Administration）によって２００２年に承認された（Mitka M 2011 Questions about spine fusion product prompt a new process for reviewing data. JAMA 306:1311-2）。ｒｈＢＭＰ−２の使用は、顕著に増加しているが、これは、その使用に関するこの時間及び適応症が、後方腰椎固定（posterior lumbar spinal fusion）並びに頸椎固定を含むように拡張されたからである。ｒｈＢＭＰ−２の効力にもかかわらず、最近の報告により、脊椎固定手術の間に使用される場合、その安全性が疑問視されている。報告された合併症には、血清腫形成、軟部組織腫脹、椎骨骨溶解症、異所的骨形成、逆行性射精症及び発癌性が含まれる（Lewandrowski K-U, Nanson C, Calderon R 2007 Vertebral osteolysis after posterior interbody lumbar fusion with recombinant human bone morphogenetic protein 2: a report of five cases. Spine J 7:609-14、Wong DA, Kumar A, Jatana S, Ghiselli G, Wong K 2008 Neurologic impairment from ectopic bone in the lumbar canal: a potential complication of off-label PLIF/TLIF use of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2). Spine J 8:1011-8、Smucker JD, Rhee JM, Singh K, Yoon ST, Heller JG 2006 Increased swelling complications associated with off-label usage of rhBMP-2 in the anterior cervical spine. Spine. 31:2813-9、Carragee EJ, Hurwitz EL, Weiner BK 2011 A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J 11:471-91）。さらに、頸椎におけるその使用で気道浮腫が観察されており、このため、ＦＤＡは、頸椎手術におけるその使用に関して公衆衛生通知（Public Health Notification）の警告を発行している。ｒｈＢＭＰ−２の有害効果なしに固定を誘導する際に類似の効力を有する適切な代替法は、今日まで同定されていない（Carragee EJ, Hurwitz EL, Weiner BK 2011 A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J 11:471-91）。
【０００５】
オキシステロールは、循環中並びにヒト及び動物の組織中に存在するコレステロールの酸素化誘導体の大きいファミリーを形成する。オキシステロールは、アテローム硬化性病変中に存在することが見出されており、細胞分化、炎症、アポトーシス及びステロイド産生などの種々の生理学的プロセスにおいて役割を果たす。本発明者らの幾人かは、特定の天然に存在するオキシステロールが、強い造骨特性を有することを以前に報告している（Kha HT, Basseri B, Shouhed D, Richardson J, Tetradis S, Hahn TJ, Parhami F 2004 Oxysterols regulate differentiation of mesenchymal stem cells: pro-bone and anti-fat. J Bone Miner Res 19:830-40）。最も強力な造骨性の天然に存在するオキシステロールである２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール（「２０Ｓ」，20(S)-hydroxycholesterol）（Kim W-K, Meliton V, Amantea CM, Hahn TJ, Parhami F 2007 20(S)-hydroxycholesterol inhibits PPARgamma expression and adipogenic differentiation of bone marrow stromal cells through a Hedgehog-dependent mechanism. J Bone Miner Res 22:1711-9）は、骨芽細胞及び脂肪細胞へと分化することが可能な多分化能間葉系細胞に適用される場合、造骨性かつ抗脂肪生成性である。２０Ｓの構造的改変が、ヘッジホッグ（Ｈｈ，Hedgehog）シグナル伝達の活性化を介して造骨性分化を誘導し、骨髄間質細胞（ＭＳＣ，marrow stromal cell）の脂肪生成分化を阻害することが示されたＯｘｙ３４及びＯｘｙ４９を含む、２０Ｓのより強力なアナログを合成するために、以前に実施された（Johnson JS, Meliton V, Kim WK, Lee K-B, Wang JC, Nguyen K, Yoo D, Jung ME, Atti E, Tetradis S, Pereira RC, Magyar C, Nargizyan T, Hahn TJ, Farouz F, Thies S, Parhami F 2011 Novel oxysterols have pro-osteogenic and anti-adipogenic effects in vitro and induce spinal fusion in vivo. J Cell Biochem 112:1673-84）。さらに、Ｏｘｙ３４及びＯｘｙ４９は、後外側脊椎固定のラットモデルにおいてインビボで脊椎固定を刺激する（Johnson JS, Meliton V, Kim WK, Lee K-B, Wang JC, Nguyen K, Yoo D, Jung ME, Atti E, Tetradis S, Pereira RC, Magyar C, Nargizyan T, Hahn TJ, Farouz F, Thies S, Parhami F 2011 Novel oxysterols have pro-osteogenic and anti-adipogenic effects in vitro and induce spinal fusion in vivo. J Cell Biochem 112:1673-84）。以前のオキシステロール分子は、広くかつ予測できない変動をする特性を有する。効能の増加及び効力の増強並びに合成の容易さ及びより低い産生コストを提供するために、ｒｈＢＭＰ−２及び以前のオキシステロールと比較して改善された新たなオキシステロールがなおも必要とされている。新たなオキシステロールは、例えば長骨骨折、脊椎障害及び骨粗鬆症を処置する医師にとってより実行可能な臨床上の選択を可能にする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Johnson EE, Urist MR 2000 Human bone morphogenetic protein allografting for reconstruction of femoral nonunion. Clin Orthop Relat Res 371:61-74
【非特許文献２】Mundy GR 2002 Directions of drug discovery in osteoporosis. Annu Rev Med 53:337-54
【非特許文献３】Rodan GA, Martin TJ 2000 Therapeutic Approaches to Bone Diseases. Science 289:1508-14
【非特許文献４】Yoon ST, Boden SD 2002 Osteoinductive molecules in orthopaedics: basic science and preclinical studies. Clin Orthop Relat Res 395:33-43
【非特許文献５】Arrington ED, Smith WJ, Chambers HG, Bucknell AL, Davino NA 1996 Complications of iliac crest bone graft harvesting. Clin Orthop Relat Res 329:300-9
【非特許文献６】Vaccaro AR, Chiba K, Heller JG, Patel TC, Thalgott JS, Truumees E, Fischgrund JS, Craig MR, Berta SC, Wang JC 2002 Bone grafting alternatives in spinal surgery. Spine J 2:206-15
【非特許文献７】Rihn JA, Kirkpatrick K, Albert TJ 2010 Graft options in posterolateral and posterior interbody lumbar fusion. Spine 35:1629-39
【非特許文献８】Mitka M 2011 Questions about spine fusion product prompt a new process for reviewing data. JAMA 306:1311-2
【非特許文献９】Lewandrowski K-U, Nanson C, Calderon R 2007 Vertebral osteolysis after posterior interbody lumbar fusion with recombinant human bone morphogenetic protein 2: a report of five cases. Spine J 7:609-14
【非特許文献１０】Wong DA, Kumar A, Jatana S, Ghiselli G, Wong K 2008 Neurologic impairment from ectopic bone in the lumbar canal: a potential complication of off-label PLIF/TLIF use of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2). Spine J 8:1011-8
【非特許文献１１】Smucker JD, Rhee JM, Singh K, Yoon ST, Heller JG 2006 Increased swelling complications associated with off-label usage of rhBMP-2 in the anterior cervical spine. Spine. 31:2813-9
【非特許文献１２】Carragee EJ, Hurwitz EL, Weiner BK 2011 A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J 11:471-91
【非特許文献１３】Kha HT, Basseri B, Shouhed D, Richardson J, Tetradis S, Hahn TJ, Parhami F 2004 Oxysterols regulate differentiation of mesenchymal stem cells: pro-bone and anti-fat. J Bone Miner Res 19:830-40
【非特許文献１４】Kim W-K, Meliton V, Amantea CM, Hahn TJ, Parhami F 2007 20(S)-hydroxycholesterol inhibits PPARgamma expression and adipogenic differentiation of bone marrow stromal cells through a Hedgehog-dependent mechanism. J Bone Miner Res 22:1711-9
【非特許文献１５】Johnson JS, Meliton V, Kim WK, Lee K-B, Wang JC, Nguyen K, Yoo D, Jung ME, Atti E, Tetradis S, Pereira RC, Magyar C, Nargizyan T, Hahn TJ, Farouz F, Thies S, Parhami F 2011 Novel oxysterols have pro-osteogenic and anti-adipogenic effects in vitro and induce spinal fusion in vivo. J Cell Biochem 112:1673-84
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】造骨性オキシステロールの分子構造を示す図である。２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール（２０Ｓ）、Ｏｘｙ３４、Ｏｘｙ４９及びＯｘｙ１３３の分子構造が示される。Ｏｘｙ３４は、Ｃ６上に過剰なＯＨ基を有するという点で２０Ｓとは異なっており、Ｃ５とＣ６との間の二重結合が排除されている。Ｏｘｙ４９は、Ｏｘｙ３４と類似の構造を有し、Ｃ２５とＣ２７との間に二重結合を含んでいる。Ｏｘｙ１３３は、Ｃ２７の欠失によってＯｘｙ３４及びＯｘｙ４９とは異なっており、側鎖の長さが１炭素分増加している。
【図２】オキシステロールによるアルカリホスファターゼ活性の用量依存的活性化を示す図である。コンフルエンスにおける（図２Ａ）Ｃ３ＨＴ１０１／２細胞又は（図２Ｂ）Ｍ２−１０Ｂ４細胞を、コントロール媒体又は０．１２５〜１０μＭのＯｘｙ１３３で処置した。Ｏｘｙ１３３との直接比較のために、Ｃ３Ｈ細胞を、Ｏｘｙ３４及びＯｘｙ４９でも処置した（図２Ａ）。４日後、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ，alkaline phosphatase）活性を、全細胞抽出物中で測定した。３回の別々の実験の代表からのデータを、三連決定の平均＋ＳＤとして報告し、タンパク質濃度に対して正規化する（０．２５μＭ又はそれより高い用量の全てのオキシステロールで処置した細胞対コントロール媒体で処置した細胞について、０．０００１未満のｐ）。
【図３】ｏｘｙ１３３が造骨性分化を誘導することを示す図である。（図３Ａ）コンフルエンスにおけるＣ３ＨＴ１０１／２細胞を、造骨性培地において、コントロール媒体又は２．５μＭ  Ｏｘｙ１３３で処置した。造骨性遺伝子Ｒｕｎｘ２、ＡＬＰ、ＢＳＰ、ＯＳＸ及びＯＣＮの発現を、処置の４８時間後（４８時間）、４日後、７日後及び１４日後に、定量リアルタイムＰＣＲによって測定した。代表的実験からの結果を、三連決定の平均±ＳＤとして報告する（ＡＬＰ、ＢＳＰ及びＯＳＸについて全ての時点において、並びにＲｕｎｘ２及びＯＣＮについて４日目、７日目及び１４日目において、コントロール対Ｏｘｙ１３３について、０．００５未満のｐ）。（図３Ｂ）Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を、３週間にわたって、コントロール媒体又は２．５μＭ  Ｏｘｙ１３３で処置した。細胞外石灰化を試験するために、von Kossa染色を実施すると、石灰化したマトリックスは、光学顕微鏡（１０×）下で、暗い黒色の染色として現れる。（図３Ｃ）（Ｂ）に記載したものと並行した培養物中で、石灰化を、４５Ｃａ取り込みアッセイを使用して定量した（コントロール対全ての濃度のＯｘｙ１３３について、０．００５未満のｐ）。（図３Ｄ）初代ヒトＭＳＣを、４週間にわたって、コントロール媒体又は５μＭ  Ｏｘｙ１３３で、造骨性培地中で処置した。造骨性遺伝子ＯＳＸ、ＢＳＰ及びＯＣＮの発現を、定量リアルタイムＰＣＲによって測定した。代表的実験からの結果を、三連決定の平均±ＳＤとして報告する（コントロール対Ｏｘｙ１３３処置された細胞において、全ての遺伝子について０．０５未満のｐ）。（図３Ｅ）初代ヒトＭＳＣを、５週間にわたって、コントロール媒体又は０．５μＭ、１μＭ及び５μＭのＯｘｙ１３３で、造骨性培地中で処置した。細胞外石灰化を試験するために、von Kossa染色を実施すると、石灰化したマトリックスは、光学顕微鏡（１０×）下で、暗い黒色の染色として現れる。
【図４】Ｏｘｙ１３３誘導性の造骨性分化におけるヘッジホッグ経路の役割を示す図である。（図４Ａ）コンフルエンスにおけるＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を、４μＭシクロパミン（Ｃｙｃ，cyclopamine）の存在下又は非存在下で、コントロール媒体又はＯｘｙ１３３で、造骨性培地中で処置した。４日後にＡＬＰ活性を、並びに７日後に造骨性遺伝子ＡＬＰ、ＢＳＰ及びＯＳＸの発現を、定量リアルタイムＰＣＲで測定した（ＡＬＰ活性及び示された全ての遺伝子の発現について、コントロール対Ｏｘｙ１３３及びＯｘｙ１３３対Ｏｘｙ１３３＋Ｃｙｃについて、０．００１未満のｐ）。（図４Ｂ）Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に、コントロールプラスミド（pGL3b）又は８Ｘ−Ｇｌｉルシフェラーゼレポーターを含むプラスミドをトランスフェクトし、コントロール媒体又はＯｘｙ１３３で処置し、ルシフェラーゼ活性を、４８時間後に決定した。代表的実験からの結果を、三連決定の平均±ＳＤとして報告する（コントロール対１００ｎＭ、２５０ｎＭ及び１μＭのＯｘｙ１３３におけるＯｘｙ１３３について、０．００１未満のｐ）。（図４Ｃ）２０Ｓビーズ又はコントロールビーズによって捕捉されたＹＦＰ−Ｓｍｏの量を、競合物を含まない又は５０μＭの遊離競合ステロール（２０Ｓ、Ｏｘｙ１３３又はＯｘｙ１６）を含む試料において比較した。これらのビーズによって捕捉されたＹＦＰ−Ｓｍｏを、ウエスタンブロットによって測定し（上）、競合物なしの結合反応において捕捉された量と比較してプロットした（下）。
【図５】ＢＭＰ２及びＯｘｙ１３３によって形成された固定塊の単純Ｘ線写真を示す図である。術後８週間目の示された群由来の２匹の代表的動物のFaxitron画像が示される。矢頭（arrowhead）は骨形成の欠如を示し；矢印は骨形成を示す。群Ｉ（コントロール）；骨形成なしの横突間突起空間（intertransverse process space）。群II（ＢＭＰ２）；Ｌ４〜Ｌ５における橋渡し骨塊及び両側固定。群III（Ｏｘｙ１３３−２０ｍｇ）；Ｌ４〜Ｌ５における橋渡し骨塊及び両側固定。群IV（Ｏｘｙ１３３−２ｍｇ）；Ｏｘｙ１３３による固定の誘導を示した動物における、Ｌ４〜Ｌ５における橋渡し骨塊及び両側固定。
【図６】ＢＭＰ２及びＯｘｙ１３３によって形成された固定塊のｍｉｃｒｏＣＴを示す図である。示された群由来の２匹の代表的動物のｍｉｃｒｏ  ＣＴが示される。矢頭は骨形成の欠如を示し；矢印は骨形成を示す。群Ｉ（コントロール）；骨形成なしの横突間突起空間。群II（ＢＭＰ２）；Ｌ４〜Ｌ５における横突間突起空間を橋渡しする骨塊及び両側固定。群III（Ｏｘｙ１３３−２０ｍｇ）；Ｌ４〜Ｌ５における横突間突起空間を橋渡しする骨塊及び両側固定。群IV（Ｏｘｙ１３３−２ｍｇ）；Ｏｘｙ１３３による固定の誘導を示した動物における、Ｌ４〜Ｌ５における横突間突起空間を橋渡しする骨塊及び両側固定。群Ｖ（Ｏｘｙ１３３−０．２ｍｇ）；右端の矢印は、Ｌ５横突起からの少量の骨形成を示す。
【図７】脊椎固定に対するＯｘｙ１３３の効果の組織学的分析を示す図である。（図７Ａ）各群由来の２匹の別々の代表的動物の冠状組織学的切片が示される（１０×）。群Ｉ（コントロール）は、横突間突起空間において顕著な骨形成を有さない（矢頭）。群II（ＢＭＰ２）は、固定塊を形成する海綿骨及び皮質骨の明らかな証拠と共に、Ｌ４〜Ｌ５において橋渡し骨を実証する（矢印）。群III（Ｏｘｙ１３３−２０ｍｇ）及び群IV（Ｏｘｙ１３３−２ｍｇ）の標本は、ＢＭＰ２によって誘導されるものと匹敵する海綿骨形成及び皮質骨形成で、横突間突起空間において顕著な骨形成を実証する（矢印）。（図７Ｂ）群II（ＢＭＰ２）及び群III（Ｏｘｙ１３３−２０ｍｇ）中の各２匹の動物由来の冠状組織学的切片は、ＢＭＰ２処置された動物の固定塊における顕著な脂肪細胞形成及びオキシステロール処置された動物由来の固定塊における実質的により少ない脂肪細胞を実証する（矢印、倍率２０×）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
説明
本発明者らは、種々の臨床的使用に十分適した造骨性オキシステロールＯｘｙ１３３を本明細書で同定し、インビトロで造骨性分化を促進し、ラットモデルにおいてインビボで脊椎固定を促進するその能力を記載する。合成及び試験した多数のオキシステロールアナログのうち、Ｏｘｙ１３３は、予想外に特に有効であり、合成が容易であった。Ｏｘｙ１３３は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２マウス胚性線維芽細胞において、造骨性マーカーＲｕｎｘ２、オステリックス（ＯＳＸ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）及びオステオカルシン（ＯＣＮ）の顕著な発現を誘導した。８Ｘ−ＧｌｉルシフェラーゼレポーターのＯｘｙ１３３誘導性の活性化、スムーズンド（Smoothened）に対するその直接的結合、及びヘッジホッグ（Ｈｈ）経路阻害剤シクロパミンによるＯｘｙ１３３誘導性の造骨性効果の阻害は、Ｏｘｙ１３３に対する造骨性応答を媒介することにおけるＨｈ経路の役割を実証した。さらに、Ｏｘｙ１３３は、ＯＳＸ、ＢＳＰ及びＯＣＮの発現を誘導し、初代ヒト間葉系幹細胞における強い石灰化を刺激した。固定部位における、Ｏｘｙ１３３で処置した動物におけるインビボの両側脊椎固定が、たった４週間後にＸ線で観察され、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２，bone morphogenetic protein-2）と等しい効率で、８週間後に手動評価、ｍｉｃｒｏ−ＣＴ及び組織学で確認された。しかし、ＢＭＰ２とは異なり、Ｏｘｙ１３３は、固定塊において脂肪生成を誘導せず、より高いＢＶ／ＴＶ比及びより小さい海綿分離によって明らかな、より高密度の骨の形成を生じた。従って、Ｏｘｙ１３３は、例えば脊椎固定、骨折修復、骨再生／組織操作適用、歯科インプラントのための顎における骨密度の増強、骨粗鬆症などを含む、骨形成の局在化刺激から利益を得る状態を処置するために有用である。
【０００９】
本発明者らは、Ｏｘｙ１３３が多能性ＭＳＣ細胞の脂肪生成を阻害することもまた実証している。従って、Ｏｘｙ１３３は、例えば黄色腫形成、脂肪パッドの局在化蓄積及び肥満などの状態を処置するために有用である。
【００１０】
Ｏｘｙ１３３の利点には、例えば、本発明者らが研究した他の造骨性オキシステロールと比較した場合の、合成のより高い容易さ及び固定までの時間の改善が含まれる。Ｏｘｙ１３３は、次世代の骨タンパク質同化治療剤のメンバーとして、並びにＨｈ経路活性の刺激から利益を得る状態を含む種々の他の状態の処置のための有用な薬剤として機能し得る、小分子造骨性オキシステロールである。
【００１１】
本発明の一態様は、式
【００１２】
【化１】
2015518493.tif 000003
（式Ｉ）
【００１３】
を有するＯｘｙ１３３と命名された化合物又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物である。
【００１４】
本発明の別の態様は、Ｏｘｙ１３３又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物及び薬学的に許容される担体を含む、生理活性組成物又は医薬組成物である。用語「生理活性」組成物又は「医薬」組成物は、本明細書で相互交換可能に使用される。両方の用語は、対象に投与され得る組成物、対象中に導入される医療用デバイスを被覆するために使用され得る組成物又はかかる医療用デバイス中に存在し得る組成物などを指す。これらの生理活性組成物又は医薬組成物は、本明細書で「本発明の医薬組成物又は生理活性組成物」と呼ばれる場合がある。時折、語句「Ｏｘｙ１３３の投与」は、対象へのこの化合物の投与の文脈において本明細書で使用される（例えば、対象を化合物と接触させる）。かかる使用のための化合物は一般に、Ｏｘｙ１３３を含む医薬組成物又は生理活性組成物の形態であり得ることを理解すべきである。
【００１５】
本発明の別の態様は、細胞又は組織においてヘッジホッグ（Ｈｈ）経路媒介性の応答を誘導（刺激、増強）する方法であり、この方法は、この細胞又は組織を有効量（例えば、治療有効量）のＯｘｙ１３３と接触させるステップを含む。この細胞又は組織は、インビトロにあり得、又は哺乳動物（例えばヒト）などの対象中にあり得る。本発明の実施形態では、このヘッジホッグ（Ｈｈ）経路媒介性の応答は、骨芽細胞分化、骨形態形成及び／若しくは骨増殖の刺激である；又はこの応答は、毛髪成長及び／若しくは軟骨形成の刺激である（例えば、有効量の本発明の生理活性組成物を対象に投与するステップを含む、それぞれ脱毛症を有する対象若しくは変形性関節症を有する対象を処置する方法）；又はこの応答は、血管新生などの新脈管形成（neovasculogenesis）の刺激であり、それにより、虚血組織への血液供給を増強する（例えば、有効量の本発明の生理活性組成物を対象に投与するステップを含む、心血管障害、動脈硬化症、心筋梗塞、狭心症、末梢血管疾患及び／若しくは発作を有する対象を処置する方法）；又はこの応答は、脂肪細胞分化、脂肪細胞形態形成及び／若しくは脂肪細胞増殖の阻害である（例えば、有効量の本発明の生理活性組成物を対象に投与するステップを含む、黄色腫形成、脂肪パッドの局在化蓄積及び／若しくは肥満を有する対象を処置する方法）；又はこの応答は、神経発生（神経分化）を経させるような前駆細胞の刺激である（例えば、神経学的障害を有する対象を処置する方法）。Ｈｈ媒介性の応答は、再生医療における使用のための、種々の型の任意の組織の再生を含み得る。
【００１６】
本発明の別の態様は、骨障害、骨減少症、骨粗鬆症又は骨折を有する対象を処置する方法であり、この方法は、Ｏｘｙ１３３を含む有効量の生理活性組成物又は医薬組成物を対象に投与するステップを含む。この対象には、例えば、骨量を増加させるため、骨粗鬆症の症状を改善させるため、アテローム硬化性病変を低減、排除、予防又は処置するためなどに、治療有効用量の生理活性組成物又は医薬組成物が、選択された間隔で有効な剤形で投与され得る。この対象には、骨粗鬆症の症状を改善させるために、治療有効用量の生理活性組成物又は医薬組成物が、選択された間隔で有効な剤形で投与され得る。一実施形態では、（例えば、対象から、又は適切な哺乳動物から、又は組織若しくは細胞バンクから）哺乳動物間葉系幹細胞を収集し、この哺乳動物間葉系細胞をＯｘｙ１３３で処置して、この細胞の骨芽細胞分化を誘導し、分化した細胞を対象に投与することによってこの対象を処置して、骨形成を誘導する。
【００１７】
本発明の任意の方法において、Ｏｘｙ１３３は、局所投与によって細胞、組織又は臓器に投与され得る。例えば、Ｏｘｙ１３３は、クリームなどで局所的に適用され得、又は細胞、組織若しくは臓器中に注射若しくは別の方法で直接導入され得、又は適切な医療用デバイス（例えば、インプラント）で導入され得る。
【００１８】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法の１又は２以上を実施するためのキットである。このキットは、容器に存在してもよい有効量（例えば、治療有効量）のＯｘｙ１３３を含み得る。
【００１９】
本発明の別の態様は、表面を有する基材を含む、対象（例えば、ヒトなどの動物）の身体における使用のためのインプラントである。このインプラントの表面又は内側は、周囲の骨組織において骨形成を誘導するのに十分な量でＯｘｙ１３３を含む生理活性組成物又は医薬組成物を含む。
【００２０】
任意選択で、本発明の生理活性組成物、方法、キット又は医療用デバイスは、１又は２以上の他の適切な治療剤、例えば、副甲状腺ホルモン、フッ化ナトリウム、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＬＧＦ−Ｉ，insulin-like growth factor I）、インスリン様増殖因子II（ＩＬＧＦ−II，insulin-like growth factor II）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β，transforming growth factor beta）、チトクロムＰ４５０阻害剤、造骨性プロスタノイド、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７及び／又はＢＭＰ１４を含み得る。
【００２１】
Ｏｘｙ１３３は、構造
【００２２】
【化２】
2015518493.tif 000004
（式Ｉ）
【００２３】
を有する。
【００２４】
その化学名は、（３Ｓ，５Ｓ，６Ｓ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）１７−（（Ｓ）−２−ヒドロキシオクタン−２−イル）−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３，６−ジオールである。
【００２５】
実施例２は、Ｏｘｙ１３３の設計及びこの分子を合成するための手順を記載している。
【００２６】
式Ｉで示される化合物Ｏｘｙ１３３に加えて、本発明の他の実施形態は、この化合物のジアステレオマー、ラセミ体、鏡像異性体及び他の異性体を含む、この式で示される任意の立体中心における、任意の及び全ての個々の立体異性体を包含する。本発明の実施形態では、「Ｏｘｙ１３３」又は「式Ｉを有する化合物」又は「Ｏｘｙ１３３又はその薬学的に許容される塩」には、この化合物の全ての多形及び溶媒和物、例えば、水和物及び有機溶媒で形成されたものが含まれ得る。「溶媒和物」は、１分子又は２分子以上の溶質、例えば化合物又はその薬学的に許容される塩と、１分子又は２分子以上の溶媒とによって形成される、複合体又は凝集体である。かかる溶媒和物は、実質的に固定されたモル比の溶質及び溶媒を有する結晶性固体であり得る。適切な溶媒は、水、エタノールなど、当業者に公知である。かかる異性体、多形及び溶媒和物は、位置特異的及び／又はエナンチオ選択的な合成及び分割などの、当該分野で公知の方法によって調製され得る。
【００２７】
塩を調製する能力は、化合物の酸性度又は塩基性度に依存する。化合物の適切な塩には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、過塩素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、炭酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸及び２−アセトキシ安息香酸などで作製された酸付加塩；サッカリンで作製された塩；ナトリウム塩及びカリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩及びマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；並びに四級アンモニウム塩などの、有機又は無機の配位子と形成された塩が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
さらなる適切な塩には、この化合物の、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、炭酸水素塩、重硫酸塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クラブラン酸塩、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストル酸塩（estolate）、エシル酸塩（esylate）、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩（glycollylarsanilate）、ヘキシルレゾルシン酸塩（hexylresorcinate）、ヒドラバミン（hydrabamine）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩（hydroxynaphthoate）、ヨウ化物、イソチオン酸塩（isothionate）、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、臭化メチル、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムコ酸塩（mucate）、ナプシル酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩（embonate））、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロ酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド（triethiodide）及び吉草酸塩が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
「Ｏｘｙ１３３」に対する本明細書の言及には、その薬学的に許容される塩又は溶媒和物が含まれると理解すべきである。
【００３０】
本発明の方法、組成物又はキットのいずれかにおいて、特に対象を処置することにおける使用のために、本発明の組成物は、１又は２以上の他の適切な治療剤と組み合わせてもよい。特定の状態の処置に適した任意の治療剤が使用され得る。適切なかかる薬剤又は薬物は、当業者に明らかである。例えば、骨障害の処置のために、従来の治療薬物が、本発明の組成物と組み合わせて使用され得る。いくつかのかかる薬剤には、例えば、副甲状腺ホルモン、フッ化ナトリウム、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＬＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子II（ＩＬＧＦ−II）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、チトクロムＰ４５０阻害剤、造骨性プロスタノイド、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７及び／又はＢＭＰ１４が含まれる。心血管障害又は脂質障害の処置のために、スタチン又は血圧薬物療法が、本発明の組成物と組み合わせて使用され得る。
【００３１】
本発明の組成物又は化合物は、本発明の組成物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として製剤化され得る。「薬学的に許容される担体」とは、生物学的にも別の理由でも望ましくないことがない材料、即ち、材料が、いかなる望ましくない生物学的影響を引き起こすことも、それが含まれる医薬組成物のいかなる他の構成要素とも有害な様式で相互作用することもなしに、対象に投与され得ることを意味する。この担体は、当業者に周知のように、活性成分のいかなる分解をも最小化し、対象におけるいかなる有害な副作用をも最小化するために必然的に選択される。薬学的に許容される担体及び医薬組成物の他の構成要素の議論については、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, 1990を参照のこと。いくつかの適切な医薬担体は、当業者に明らかであり、例えば、水（無菌水及び／又は脱イオン水が含まれる）、適切な緩衝液（例えば、ＰＢＳ）、生理食塩水、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭ）、人工脳脊髄液、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，dimethylsulfoxide）、エタノールなどが含まれる。
【００３２】
当業者は、本発明の特定の製剤が、使用される特定の薬剤又は薬剤の組合せ及び選択された投与経路に、少なくとも一部依存することを理解する。従って、本発明の組成物の適切な製剤の広いバリエーションが存在する。いくつかの代表的な製剤を以下で議論する。他の製剤は、当業者に明らかである。一般に、Ｏｘｙ１３３は、処置を必要とする細胞、組織又は臓器に、局所的に又は直接的に投与される。処置されている組織又は臓器において望ましいアウトカムが達成される場合には、全身的投与もまた使用され得る。
【００３３】
経口投与に適した製剤又は組成物は、水、食塩水又は果汁などの希釈剤中に溶解された有効量のＯｘｙ１４９などの液体溶液；固体、顆粒又はフリーズドライ細胞として所定量の活性成分を各々が含むカプセル剤、サシェ剤（sachet）又は錠剤；水性液体中の溶液又は懸濁物；及び水中油エマルジョン又は油中水エマルジョンからなり得る。錠剤形態は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、結晶セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸並びに他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、香味剤及び薬理学的に適合性の担体のうち、１又は２以上を含み得る。経口送達のための適切な製剤はまた、合成及び天然のポリマー性ミクロスフェア又は胃腸管内での分解から本発明の薬剤を保護するための他の手段中に、取り込まれ得る。
【００３４】
非経口投与（例えば、静脈内）に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を意図したレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る、水性及び非水性の等張無菌注射溶液、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び防腐剤を含み得る水性及び非水性の無菌懸濁物が含まれる。これらの製剤は、アンプル及びバイアルなどの単位用量又は複数用量の密封容器中に提示され得、使用の直前に、注射用の無菌液体担体、例えば水の添加のみを必要とするフリーズドライ（即ち、凍結乾燥）状態で貯蔵され得る。即時注射溶液及び懸濁物は、以前に記載された種類の無菌の粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。
【００３５】
Ｏｘｙ１３３は、単独で又は他の治療剤と組み合わせて、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤にされ得る。これらのエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの圧縮された許容可能な噴霧剤中に配置され得る。
【００３６】
外用投与に適した製剤には、香料、通常はスクロース及びアカシア若しくはトラガント中に活性成分を含むロゼンジ剤（lozenge）；ゼラチン及びグリセリン若しくはスクロース及びアカシアなどの不活性基剤中に活性成分を含むトローチ剤（pastille）；適切な液体担体中に活性成分を含む口腔洗浄薬；又はクリーム、エマルジョン、懸濁物、溶液、ゲル、クリーム、ペースト、フォーム、滑沢剤、スプレー、坐剤などが含まれる。
【００３７】
他の適切な製剤には、Ｏｘｙ１３３の持続放出に適したヒドロゲル及びポリマーなど、又はＯｘｙ１３３の小用量送達のためのナノ粒子が含まれる。かかる製剤は、当業者に周知である。
【００３８】
当業者は、適切な又は適当な製剤が、目の前にある特定の適用に基づいて選択、適応又は開発され得ることを理解する。さらに、本発明の医薬組成物は、種々の異なる経路による投与のために調製され得る。局所投与又は直接投与の例には、関節内、頭蓋内、皮内、肝内、筋内、眼内、腹腔内、くも膜下腔内、静脈内、皮下、経皮で、若しくは直接的注射などによって骨領域のアテローム硬化性部位中に直接的に実施される投与、カテーテル若しくは他の医療用デバイスを用いた導入、外用適用、直接的適用、及び／又は動脈若しくは他の適当な組織部位中にデバイスを移植することによるものが含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
Ｏｘｙ１３３は、外科用若しくは医療用のデバイス若しくはインプラント内に含まれるように製剤化されるか、又は外科用若しくは医療用のデバイス若しくはインプラントによる放出のために適応され得る。特定の態様では、インプラントは、Ｏｘｙ１３３で被覆又は他の方法で処置され得る。例えば、ヒドロゲル又は他のポリマー、例えば生体適合性及び／若しくは生分解性ポリマーが、本発明の組成物でインプラントを被覆するために使用され得る（即ち、この組成物は、ヒドロゲル又は他のポリマーを使用することによって、医療用デバイスとの使用のために適応され得る）。医療用デバイスを薬剤で被覆するためのポリマー及びコポリマーは、当該分野で周知である。インプラントの例には、血管形成術用バルーン、ステント、薬物溶出ステント、縫合糸、装具、血管カテーテル、透析カテーテル、血管移植片、骨移植片、人工心臓弁、心臓ペースメーカー、移植可能な除細動器又はＩＶ針が含まれるが、これらに限定されない。単なる例として、ステント又はステント移植片は典型的に、細長い織物製の管状移植片部分を含み得、血管などの身体の通路の弱い場所を補強又は強化するために通常使用される。ステント移植片の挿入は、カテーテルの使用によって実施され得る。配置は、バルーン血管形成術手順の間又はその後などにバルーンの膨張によって促進され得、或いは、このステント移植片は、自己膨張性であり得る。
【００４０】
「有効量」のＯｘｙ１３３とは、本明細書で使用する場合、少なくとも検出可能な効果をもたらし得る量を指す。「治療有効量」とは、本明細書で使用する場合、合理的な期間にわたって、処置されている対象において少なくとも検出可能な治療応答（例えば、１又は２以上の症状の改善）をもたらし得る量を指す。
【００４１】
本発明の実施形態では、Ｏｘｙ１３３は、種々の従来のアッセイのいずれかで測定されるように、未処置のコントロール試料における治療応答の約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１５０％、２００％又はそれ以上、治療応答を刺激又は阻害し得る。これらの範囲中の中間値もまた含まれる。
【００４２】
Ｏｘｙ１３３の投薬量は、錠剤又はカプセル剤などの単位剤形中に存在し得る。用語「単位剤形」とは、本明細書で使用する場合、動物（例えばヒト）対象のための単位投薬量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体又は媒体と併せて、所望の効果を生じるのに十分な量で計算された、単独又は他の治療剤と組み合わせた、本発明の薬剤の所定の量を含む。
【００４３】
当業者は、個々の患者において薬剤の所望の有効量又は有効濃度を達成するために、使用されている組成物の正確な製剤のための、適切な用量、スケジュール及び投与方法を慣用的に決定することができる。当業者は、疾患、障害又は状態の適切な臨床症状を分析することに加えて、適切な患者試料（例えば、血液及び／又は組織）の直接的又は間接的な分析によって、Ｏｘｙ１３３などの化合物の「有効濃度」の適切な指標を容易に決定及び使用することもできる。
【００４４】
本発明の文脈では、ヒトなどの動物に投与されるＯｘｙ１３３又はその組成物の正確な用量は、対象の種、年齢、体重及び全身状態、処置されている任意の障害の重症度又は機構、使用される特定の薬剤又は媒体、その投与様式、患者が摂取している他の薬物療法、並びに特定の患者に適した個々のレジメン及び用量レベルなどを決定する際に主治医によって通常考慮される他の要因に依存して、対象毎に変動する。インビボで所望の濃度を達成するために使用される用量は、Ｏｘｙ１３３の形態の効能、宿主中でのＯｘｙ１３３と関連する薬力学、さらなる薬剤の有無、感染した個体の疾患状態の重症度、並びに全身的投与の場合には個体の体重及び年齢によって、決定される。用量の大きさは、使用される特定の薬剤又はその組成物に伴い得る任意の有害な副作用の存在によっても決定され得る。可能ならいつでも、有害な副作用を最低限に維持することが、一般に望ましい。
【００４５】
例えば、用量は、約５ナノグラム（ｎｇ，nanogram）〜約１０００ミリグラム（ｍｇ，milligram）の範囲、又は約１００ｎｇ〜約６００ｍｇの範囲、又は約１ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲、又は約２０ｍｇ〜約４００ｍｇの範囲で投与され得る。例えば、この用量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１５００ｍｇ／ｋｇ、又は約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、又は約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ、又は約２０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの、体重に対する用量の比を達成するために選択され得る。例えば、投薬量単位は、約１ｎｇ〜約５０００ｍｇの範囲、又は約５ｎｇ〜約１０００ｍｇの範囲、又は約１００ｎｇ〜約６００ｍｇの範囲、又は約１ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲、又は約２０ｍｇ〜約４００ｍｇの範囲、又は約４０ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲のＯｘｙ１３３又はＯｘｙ１３３を含む組成物であり得る。本発明の一実施形態では、上記のようなＯｘｙ１３３の量（例えば、数グラム）が、例えば脊椎固定手順において足場の一部として局所的に投与される。
【００４６】
用量は、所望の治療効果を惹起するために必要に応じて、１日１回、１日２回、１日４回、又は１日４回よりも多く、投与され得る。例えば、用量投与レジメンは、約０．０１〜約１０００ｎＭの範囲、又は約０．１〜約７５０ｎＭの範囲、又は約１〜約５００ｎＭの範囲、又は約２０〜約５００ｎＭの範囲、又は約１００〜約５００ｎＭの範囲、又は約２００〜約４００ｎＭの範囲の本発明の化合物の血清濃度を達成するために、選択され得る。例えば、用量投与レジメンは、約１マイクログラムパーリットル（μｇ／Ｌ、microgram per liter）〜約２０００μｇ／Ｌの範囲、又は約２μｇ／Ｌ〜約１０００μｇ／Ｌの範囲、又は約５μｇ／Ｌ〜約５００μｇ／Ｌの範囲、又は約１０μｇ／Ｌ〜約４００μｇ／Ｌの範囲、又は約２０μｇ／Ｌ〜約２００μｇ／Ｌの範囲、又は約４０μｇ／Ｌ〜約１００μｇ／Ｌの範囲の本発明の化合物の最大半量用量を有する平均血清濃度を達成するために、選択され得る。
【００４７】
本発明の特定の実施形態は、治療結果を改善するために、独立して又はＯｘｙ１３３と相乗的に作用するさらなる薬剤での処置もまた含み得る。組合せ治療で与えられる場合、Ｏｘｙ１３３以外の薬剤は、Ｏｘｙ１３３と同時に与えることができ、又は投薬は、所望に応じてずらすことができる。２（又は３以上）の薬物もまた、組成物中で組み合わされ得る。各々の用量は、いずれかが単独で使用される場合よりも、組み合わせて使用される場合に低くなり得る。適切な用量は、標準的な投薬量パラメータを使用して、当業者によって決定され得る。
【００４８】
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「この（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数形の指示対象を含む。
【００４９】
「対象」には、本明細書で使用する場合、Ｏｘｙ１３３で処置され得る状態の症状を示す任意の動物が含まれる。適切な対象（患者）には、実験室動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ又はモルモット）、家畜（farm animal）及び家畜（domestic animal）又はペット（例えば、ネコ、イヌ又はウマ）が含まれる。ヒト患者を含む非ヒト霊長類が含まれる。典型的な対象には、異常な量（「正常」又は「健康な」対象よりも低い量）の、ヘッジホッグシグナル伝達によって刺激される１又は２以上の生理学的活性を示す動物が含まれる。これらの異常な活性は、ヘッジホッグ活性の活性化を含む種々の機構のいずれかによって調節され得る。異常な活性は、病理学的状態を生じ得る。
【００５０】
本発明の一実施形態は、インビトロ又はインビボのいずれかでの、本明細書に開示された任意の方法のために有用なキットである。かかるキットは、Ｏｘｙ１３３又はその生理活性組成物若しくは医薬組成物を含み、例えばＨｈ経路媒介性の活性における増加を生じる１若しくは２以上の他のオキシステロール、又は他の適切な治療剤を含み得る。任意選択で、このキットは、この方法を実施するための指示書を含む。本発明のキットの任意選択の要素には、適切な緩衝液、薬学的に許容される担体など、容器、又は包装材料が含まれる。このキットの試薬は、例えば凍結乾燥形態又は安定化液体で試薬が安定である容器中に存在し得る。これらの試薬は、単一の使用形態、例えば単一の剤形中にも存在し得る。当業者は、本発明の任意の方法を実施するのに適したキットの構成要素を認識する。
【００５１】
種々の状態が、単独で又は他の治療剤と組み合わせて使用されるＯｘｙ１３３で処置され得る。
【００５２】
例えば本明細書の実施例で示されるように、Ｏｘｙ１３３は、ヘッジホッグ経路活性における増加を生じる。いかなる特定の機構にも拘束されることを望まないが、この増加は、細胞外から細胞内区画へのヘッジホッグ経路の初期メディエーターであるスムーズンド受容体に対するＯｘｙ１３３の直接的結合に起因することが示唆される。
【００５３】
Ｏｘｙ１３３の１つの効果は、骨芽細胞などの種々の細胞型へのその系譜特異的分化を誘導するために、多能性細胞を標的化することであり、例えば、実施例に示されるように、Ｏｘｙ１３３で処置された間葉系幹細胞は、骨芽細胞分化のマーカーの発現の誘導を示した。いかなる特定の機構にも拘束されることを望まないが、この系譜特異的分化は、これらの細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達の誘導に起因することが示唆される。しかし、本明細書で議論される処置の方法は、Ｏｘｙ１３３が機能する機構に関わらず、本発明に含まれる。Ｏｘｙ１３３は、骨形成、骨芽細胞分化、骨形態形成及び／又は骨増殖の刺激から利益を得る状態を処置するために有用である。これらの状態又は処置には、当業者に明らかな、脊椎固定若しくは骨粗鬆症、骨折の修復若しくは治癒、顎における骨形成の増加が臨床的に有益である歯科手順、口蓋裂／口唇裂などの外傷又は先天的欠損によって誘導される頭蓋顔面骨欠損の修復、並びに自然な骨の成長が不十分な他の多数の筋骨格障害における局在化骨形成の刺激のための骨誘導治療などがある。処置は、開放骨折及び非癒合のリスクが高い骨折を処置するために、脊椎固定（例えば、前方椎体間固定、後方腰椎固定及び頸椎固定）を必要とする対象又は腰椎及び頸椎を侵す変性性椎間板疾患若しくは関節炎を有する対象を含む、脊椎障害を有する対象において、施され得る。さらに、Ｏｘｙ１３３は、特に加齢集団において、骨芽細胞による骨形成の減少と並行した破骨細胞による骨吸収の増加から生じる骨粗鬆症を処置するために使用され得る。
【００５４】
より具体的には、以下の型の骨関連処置が実施され得る：
１．Ｏｘｙ１３３は、例えばコラーゲンＩであるがこれに限定されない適合性の分子から構成される足場を使用して、局在化骨形成を刺激するために身体中に局所的に送達される造骨性薬剤として使用され、この足場は、Ｏｘｙ１３３を吸収し、次いで身体の内側に配置される。例えば、脊椎固定、仮関節及び非癒合固定における、例えば、Ｏｘｙ１３３を含み、２又は３以上の椎骨の固定が示される横突起間又は椎間板中に配置され得る足場。他の実施形態では、Ｏｘｙ１３３を含む足場は、骨形成及び骨折の治癒を刺激するために骨折した骨中に配置され；Ｏｘｙ１３３による骨再生が示される頭蓋冠若しくは顎顔面の骨欠損などの骨欠損に配置され；又は歯科インプラントなどの歯科手順の前に骨を再生させる手段として、骨形成を刺激するために顎の骨中に配置される。
【００５５】
２．Ｏｘｙ１３３は、造骨性薬剤としてインビトロで使用され、例えば、Ｏｘｙ１３３は、局在化骨形成を刺激するために、上記１）で示されたように、整形外科及び他の手順における骨前駆細胞、例えば間葉系幹細胞の適用の前に、その造骨性分化を刺激するために、かかる細胞に投与される。
【００５６】
３．Ｏｘｙ１３３は、骨前駆細胞においてヘッジホッグシグナル伝達経路を刺激するためにインビトロで使用され、それにより、インビトロ又はインビボでの細胞の造骨性分化を導く。
【００５７】
Ｏｘｙ１３３の別の効果は、脂肪細胞分化、脂肪細胞形態形成及び／又は脂肪細胞増殖を阻害することである。Ｏｘｙ１３３のこの効果によって処置され得る状態には、例えば、黄色腫形成、脂肪パッドの局在化蓄積及び肥満がある。
【００５８】
Ｏｘｙ１３３の局所投与から直接的又は間接的に利益を得る他の状態には、毛髪成長、神経発生、軟骨形成などの必要性又は心血管障害が含まれ、これらの状態は、各適応症に関連する細胞、組織又は臓器に対して作用することによるヘッジホッグ経路活性の刺激に関する状態である。
【００５９】
上記及び以下の実施例において、全ての温度は、未修正のセルシウス度で示され；特に示さない限り、全ての部及び百分率は、重量部及び重量百分率である。
［実施例］
【実施例１】
【００６０】
材料及び方法
細胞培養及び試薬
マウス多分化能骨髄間質細胞（ＭＳＣ）株Ｍ２−１０Ｂ４（Ｍ２）及び胚性線維芽細胞細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（Ｃ３Ｈ）を、American Type Culture Collection（Rockville、MD）から購入し、本発明者らが以前に報告したように培養した（Kim W-K, Meliton V, Amantea CM, Hahn TJ, Parhami F 2007 20(S)-hydroxycholesterol inhibits PPARgamma expression and adipogenic differentiation of bone marrow stromal cells through a Hedgehog-dependent mechanism. J Bone Miner Res 22:1711-9、Johnson JS, Meliton V, Kim WK, Lee K-B, Wang JC, Nguyen K, Yoo D, Jung ME, Atti E, Tetradis S, Pereira RC, Magyar C, Nargizyan T, Hahn TJ, Farouz F, Thies S, Parhami F 2011 Novel oxysterols have pro-osteogenic and anti-adipogenic effects in vitro and induce spinal fusion in vivo. J Cell Biochem 112:1673-84）。造骨性分化を誘導するための処置を、５％胎仔ウシ血清、５０μｇ／ｍｌアスコルベート及び３ｍＭ  β−グリセロホスフェート（βＧＰ，β-glycerophosphate）を含む、Ｍ２細胞のためにはＲＰＭＩ中で及びＣ３Ｈ細胞のためにはＤＭＥＭ（分化培地）中で実施した。シクロパミンは、EMD Biosciences, Inc.社（La Jolla、CA）から購入した。初代ヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ，human mesenchymal stem cell）を、Lonza社（Walkersville、MD）から購入し、StemCell Technologies社（Vancouver、Canada）製の増殖培地中で、製造業者の指示に従って培養及び継代した。ＨＭＳＣの造骨性分化を、抗生物質並びに１０％熱不活化ＦＢＳ、１０−８Ｍデキサメタゾン、１０ｍＭ  βＧＰ及び０．２ｍＭアスコルベートを含むＤＭＥＭ低グルコース中で細胞を処置することによって誘導した。
【００６１】
アルカリホスファターゼ活性及びvon Kossa染色
全細胞抽出物に対するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性アッセイ（Kha HT, Basseri B, Shouhed D, Richardson J, Tetradis S, Hahn TJ, Parhami F 2004 Oxysterols regulate differentiation of mesenchymal stem cells: pro-bone and anti-fat. J Bone Miner Res 19:830-40、Kim W-K, Meliton V, Amantea CM, Hahn TJ, Parhami F 2007 20(S)-hydroxycholesterol inhibits PPARgamma expression and adipogenic differentiation of bone marrow stromal cells through a Hedgehog-dependent mechanism. J Bone Miner Res 22:1711-9）、及び石灰化についての細胞単層のvon Kossa染色（Parhami F, Morrow AD, Balucan J, Leitinger N, Watson AD, Tintut Y, Berliner JA, Demer LL 1997 Lipid oxidation products have opposite effects on calcifying vascular cell and bone cell differentiation. A possible explanation for the paradox of arterial calcification in osteoporotic patients. Arterioscler Thromb Vasc Biol 17:680-7）を、以前に記載されたように実施した。
【００６２】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡを、製造業者の指示に従って、Ambion, Inc.社（Austin、TX）製のＲＮＡ単離Trizol試薬を用いて抽出した。ＲＮＡ（１μｇ）を、Bio-Rad社（Hercules、CA）製の逆転写酵素を使用して逆転写して、一本鎖ｃＤＮＡを作製した。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ反応を、iQ SYBR Green Supermix及びiCycler RT-PCR Detection System（Bio-Rad社）を使用して実施した。マウス遺伝子Ｇｌｉ−１、パッチト１（Ｐｔｃｈ１，Patched1）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の骨−肝臓−腎臓アイソザイム、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、Ｒｕｎｘ２、オステリックス（ＯＳＸ）、オステオカルシン（ＯＣＮ）及びＧＡＰＤＨのためのプライマー配列を、以前に記載されたように使用した（Kim W-K, Meliton V, Amantea CM, Hahn TJ, Parhami F 2007 20(S)-hydroxycholesterol inhibits PPARgamma expression and adipogenic differentiation of bone marrow stromal cells through a Hedgehog-dependent mechanism. J Bone Miner Res 22:1711-9）。ヒトプライマー配列は以下であった：ＧＡＰＤＨ 5'-CCT CAA GAT CAT CAG CAA TGC CTC CT（配列番号１）及び3'-GGT CAT GAG TCC TTC CAC GAT ACC AA（配列番号２）、ＢＳＰ 5'- AGA AGA GGA GGA GGA AGA AGA GG（配列番号３）及び3' - CAG TGT TGT AGC AGA AAG TGT GG（配列番号４）、ＯＳＸ 5' - GCG GCA AGA GGT TCA CTC GTT CG（配列番号５）及び3' - CAG GTC TGC GAA ACT TCT TAG AT（配列番号６）；相対的発現レベルを、以前に記載されたように２ΔΔＣＴ法を使用して計算した（Johnson JS, Meliton V, Kim WK, Lee K-B, Wang JC, Nguyen K, Yoo D, Jung ME, Atti E, Tetradis S, Pereira RC, Magyar C, Nargizyan T, Hahn TJ, Farouz F, Thies S, Parhami F 2011 Novel oxysterols have pro-osteogenic and anti-adipogenic effects in vitro and induce spinal fusion in vivo. J Cell Biochem 112:1673-84）。
【００６３】
一過的トランスフェクション及びＧｌｉ依存的レポーターアッセイ
２４ウェルプレート中の７０％コンフルエンスにおける細胞に、本発明者らが以前に記載したように、Ｇｌｉ依存的ホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼベクターを一過的にトランスフェクトした（Dwyer JR, Sever N, Carlson M, Nelson SF, Beachy PA, Parhami F 2007 Oxysterols are novel activators of the Hedgehog signaling pathway in pluripotent mesenchymal cells. J Biol Chem 282:8959-68、Kim W-K, Meliton V, Bourquard N, Hahn TJ, Parhami F 2010 Hedgehog signaling and osteogenic differentiation in multipotent bone marrow stromal cells are inhibited by oxidative stress. J Cell Biochem 111:1199-209）。FuGENE 6トランスフェクション試薬（Roche Applied Science社、Indianapolis、IN）を、ヌクレアーゼを含まない水と３：１の比で使用し、ウェル当たりの総ＤＮＡは、５００ｎｇを超えなかった。ルシフェラーゼ活性を、４８時間にわたって細胞を処置した後に、製造業者の指示に従ってDual Luciferase Reporter Assay System（Promega Corporation社、Madison、WI）を使用して評価した。
【００６４】
Ｏｘｙ１３３の合成及び分子特徴付け
材料を、商業的供給者から取得し、さらなる精製なしに使用した。空気又は湿気感受性の反応を、オーブン乾燥したガラス器具及び標準的なシリンジ／隔壁技術を使用して、アルゴン雰囲気下で実施した。これらの反応を、ＵＶ光（２５４ｎｍ）の下、シリカゲルＴＬＣプレート上でモニタリングし、その後Hanessian染色溶液で可視化した。カラムクロマトグラフィーを、シリカゲル６０上で実施した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、ＣＤＣｌ３中で測定した。得られたデータは、内部標準（ＴＭＳ、０．０ｐｐｍ）からのｐｐｍ：化学シフト（多重度、積分、カップリング定数Ｈｚ）で、以下のように報告される。合成プロトコル並びに中間体及び最終生成物の特徴付けの段階的な詳細な記載は、補足材料において提供される。
【００６５】
スムーズンド結合アッセイ
オキシステロールとスムーズンド（Ｓｍｏ，Smoothened）との相互作用を、本発明者らが以前に報告したように試験した（Nachtergaele S, Mydock LK, Krishnan K, Rammohan J, Schlesinger PH, Covey DF, Rohatgi R 2012 Oxysterols are allosteric activators of the oncoprotein Smoothened. Nat Chem Biol 8:211-20）。Ｓｍｏ−／−：ＹＦＰ−Ｓｍｏ細胞（Rohatgi R, Milenkovic L, Corcoran RB, Scott MP 2009 Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc Natl Acad Sci USA 106:3196-201）を、低張ＳＥＡＴ緩衝液（２５０ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸、１０ｍＭトリエタノールアミン、１０ｍｇ／ｍＬロイペプチン−ペプスタチン−キモスタチン（ＬＰＣ，leupeptin-pepstatin-chymostatin）プロテアーゼ阻害剤ミックス及びSigmaFast EDTA-Freeプロテアーゼカクテル）中で溶解させた。遠心分離（５００×ｇ、５分）による核の除去の後、膜を、９５，０００×ｇで３０分間の遠心分離によってペレット化した。膜を、ｎ−ドデシル−ｂ−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＤＭ，n-dodecyl-b-D-maltopyranoside）抽出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｖ／ｖグリセロール、０．１％ｗ／ｖ  ＤＤＭ及びSigmaFast EDTA-Freeプロテアーゼカクテル）中で４℃で４時間抽出し、その後、遠心分離（１００，０００×ｇ、３０分）によって不溶性材料を除去した。この膜抽出物を、５０ｕＭの遊離２０（Ｓ）又はＯｘｙ１３３若しくはＯｘｙ１６（Ｈｈシグナル伝達を活性化しないオキシステロールアナログ；Parhami et al.の未公開の観察）と共に４℃で１時間インキュベートし、その後、ｎａｔ−２０（Ｓ）−ｙｎｅにカップリングさせた磁気ビーズ又はコントロール磁気ビーズを添加した（Nachtergaele S, Mydock LK, Krishnan K, Rammohan J, Schlesinger PH, Covey DF, Rohatgi R 2012 Oxysterols are allosteric activators of the oncoprotein Smoothened. Nat Chem Biol 8:211-20）。結合反応を、４℃で一晩インキュベートした。全ての実験において、溶媒の量を、各試料において注意深く等しくした。徹底的な洗浄の後、ビーズ上に捕捉されたタンパク質を、還元性ＳＤＳ試料緩衝液で溶出させた。これらの溶出液中のＹＦＰ−Ｓｍｏの存在を、抗ＧＦＰ抗体（Novus社、NB600-308、１：５０００）を用いた定量的免疫ブロッティング及び赤外線画像化（Li-Cor Odysseyシステム）によって決定した。
【００６６】
動物
３８匹の８週齢雄性Lewisラットを、Charles River Laboratories社（Wilmington，MA）から購入し、ＵＣＬＡ研究対象保護局（UCLA Office of Protection of Research Subjects）によって示された規制に従って、ＵＣＬＡ生態動物園において維持及び収容した。この研究は、ＵＣＬＡ動物研究委員会（ＡＲＣ，Animal Research Committee）によって承認されたプロトコルの下で実施した。全ての動物を、脊椎固定手順の８週間後に、標準的なＣＯ２チャンバを使用して安楽死させ、その脊椎を切り出し、４０％エチルアルコール中で貯蔵した。
【００６７】
手術手順
動物に、手術前に３０分間徐放性（sustained release）ブプレノルフィンを予め投薬し、酸素中で投与した２％イソフルラン（１Ｌ／分）で麻酔した。手術部位を剃毛し、Betadine及び７０％エタノールで消毒した。Ｌ４〜Ｌ５における後外側横突間突起脊椎固定を、以前の研究と同様に実施した（Alanay A, Chen C, Lee S, Murray SS, Brochmann EJ, Miyazaki M, Napoli A, Wang JC 2008 The adjunctive effect of a binding peptide on bone morphogenetic protein enhanced bone healing in a rodent model of spinal fusion. Spine 33:1709-13、Miyazaki M, Sugiyama O, Tow B, Zou J, Morishita Y, Wei F, Napoli A, Sintuu C, Lieberman JR, Wang JC 2008 The effects of lentiviral gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone marrow cells on spinal fusion in rats. J Spinal Disord Tech 21:372-9）。Ｌ６椎体を、目印として腸骨稜を使用して同定した。４ｃｍの縦方向正中切開を、Ｌ４〜Ｌ５にわたる皮膚及び皮下組織を介して腰背筋膜に至るまで形成した。次いで、２ｃｍの縦方向正中傍（paramedial）切開を、傍脊柱筋群において両側で形成して、Ｌ４〜Ｌ５の横突起を露出させ、これを高速バールで除皮質した。次いで、この手術部位を、無菌食塩水で洗浄し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）コントロール、ｒｈＢＭＰ−２又はＯｘｙ１３３を含む５ｍｍ×５ｍｍ×１３ｍｍ片のコラーゲンスポンジ（Helistat, Integra Life Sciences社）を両側に配置し、各インプラントは横突起にわたった。次いで、これらのインプラントを、覆っている傍脊柱筋群で被覆し、腰背筋膜及び皮膚を、４〜０のProlene縫合糸（Ethicon, Inc.社、Somerville、NJ）で閉鎖した。動物を、手術の直後に、自由裁量で歩き回らせ、摂食させ、飲水させた。
【００６８】
Ｘ線撮影分析
腰椎の前後方向Ｘ線写真を、Faxitron LX60キャビネットＸ線写真システムを使用して、手術の４週間後、６週間後及び８週間後に各動物について撮影し、以下の標準化尺度を使用して２人の独立した観察者が盲検で評価した：０、固定なし；１、片側固定；及び２、完全な両側固定。これらの観察者からのスコアを一緒に加算し、４のスコアのみを完全な固定とみなした。
【００６９】
固定の手動評価
手術の８週間後、動物を安楽死させ、脊椎を外科的に取り出し、レベル間の動きについて２人の盲検の独立した観察者が評価した。いずれかの側の椎間又は横突起間で動きが観察された場合、偽関節を記録した。動きが両側で観察されなかった場合、完全な固定を記録した。脊椎を、固定された又は固定されていないのいずれかとしてスコア付けした。完全な固定とみなすには、満場一致の同意が必要であった。
【００７０】
マイクロコンピュータ断層撮影
取り出された各脊椎を、２０μｍのボクセル等方性分解能並びに５５ｋＶｐ及び１８１ｍＡのＸ線エネルギーでSkyScan 1172スキャナ（SkyScan社、Belgium）を使用して、高分解能マイクロコンピュータ断層撮影（ｍｉｃｒｏ−ＣＴ，micro-computed tomography）によって分析して、本発明者らが以前に報告したように、固定率をさらに評価し、固定塊を観察した（Johnson JS, Meliton V, Kim WK, Lee K-B, Wang JC, Nguyen K, Yoo D, Jung ME, Atti E, Tetradis S, Pereira RC, Magyar C, Nargizyan T, Hahn TJ, Farouz F, Thies S, Parhami F 2011 Novel oxysterols have pro-osteogenic and anti-adipogenic effects in vitro and induce spinal fusion in vivo. J Cell Biochem 112:1673-84）。３６０の投影を、２２０ｍｓｅｃ／スライスの露光時間で、０．５のステップで、１８０°の角度範囲にわたって獲得した。５つのフレームを、各回転ステップにおいて平均化して、より良いシグナルノイズ比を得た。ビーム硬化（beam hardening）アーチファクトを最小化するために、０．５ｍｍのアルミニウムフィルターを使用して、Ｘ線ビーム周波数を絞り込んだ。仮想画像スライスを、Feldkampアルゴリズム（SkyScan社）に基づくコーンビーム再構成ソフトウェアバージョン２．６を使用して再構成した。これらの設定は、連続断面の１０２４×１０２４ピクセル画像を生じた。試料の再配向及び２Ｄ可視化を、DataViewer（SkyScan社）を使用して実施した。３Ｄ可視化を、Dolphin Imagingバージョン１１（Dolphin Imaging & Management Solutions社、Chatsworth、CA）を使用して実施した。固定を、Ｌ４横突起とＬ５横突起との間の橋渡し骨の両側性の存在として規定した。再構成された画像を、２人の熟練の独立した観察者が、固定されているか固定されていないかについて判断した。各固定塊内に形成された骨の密度を定量するために、塊の組織容量（ＴＶ，tissue volume）、塊内の海綿骨容量（ＢＶ，bone volume）、ＢＶ／ＴＶ比、海綿厚及び海綿分離を計算した。Ｌ４〜５の椎間体（intervertebral body）のレベルを中心として、各固定塊内の５０１の軸方向スライス（１スライス当たり２０ｕｍ、１０．０２ｍｍの長さ）にわたる測定値でDataViewerソフトウェアを使用して、これを実施した。
【００７１】
組織学
ｍｉｃｒｏ−ＣＴを受けた後に、各手術群由来の２つの代表的標本を、本発明者らが以前に報告したように脱水によって脱灰しないで処理し、キシレン中で清浄化し、メタクリル酸メチル中に包埋した（Johnson JS, Meliton V, Kim WK, Lee K-B, Wang JC, Nguyen K, Yoo D, Jung ME, Atti E, Tetradis S, Pereira RC, Magyar C, Nargizyan T, Hahn TJ, Farouz F, Thies S, Parhami F 2011 Novel oxysterols have pro-osteogenic and anti-adipogenic effects in vitro and induce spinal fusion in vivo. J Cell Biochem 112:1673-84、Pereira RC, Stadmeyer LE, Smith DL, Rydziel S, Canalis E 2007 CCAAT/Enhancer-binding protein homologous protein (CHOP) decreases bone formation and causes osteopenia. Bone 40:619-26）。連続冠状切片を、５ｕｍの厚さで切断し、トルイジンブルーｐＨ  ６．４で染色した。切片の顕微鏡写真を、図７Ａでは１０×の倍率で、図７Ｂでは２０×の倍率で、以前に報告されたようにScanScope XT System（Aperio Technologies, Inc.社、Vista、CA）を使用して取得した（Magyar CE, Aghaloo TL, Atti E, Tetradis S 2008 Ostene, a new alkylene oxide copolymer bone hemostatic material, does not inhibit bone healing. Neurosurgery 63:373-378; discussion 378）。
【００７２】
統計分析
統計分析を、StatView 5プログラムを使用して実施した。全てのｐ値を、ＡＮＯＶＡ及びFisher投影最小有意差（ＰＬＳＤ，projected least significant difference）有意性検定を使用して計算した。０．０５未満のｐの値を有意とみなした。
【実施例２】
【００７３】
Ｏｘｙ１３３の合成及び化学的特徴付け
以下は、Ｏｘｙ１３３の化学構造である：
【００７４】
【化３】
2015518493.tif 000005
【００７５】
材料を、商業的供給者から取得し、さらなる精製なしに使用した。空気又は湿気感受性の反応を、オーブン乾燥したガラス器具及び標準的なシリンジ／隔壁技術を使用して、アルゴン雰囲気下で実施した。これらの反応を、ＵＶ光（２５４ｎｍ）の下、シリカゲルＴＬＣプレート上でモニタリングし、その後Hanessian染色溶液で可視化した。カラムクロマトグラフィーを、シリカゲル６０上で実施した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、ＣＤＣｌ３中で測定した。得られたデータは、内部標準（ＴＭＳ、０．０ｐｐｍ）からのｐｐｍ：化学シフト（多重度、積分、カップリング定数Ｈｚ）で、以下のように報告される。以下は、プロトコルの段階的な記載である。本発明者らが以前に報告したＯｘｙ３４及びＯｘｙ４９の構造、その合成（Johnson JS, Meliton V, Kim WK, Lee K-B, Wang JC, Nguyen K, Yoo D, Jung ME, Atti E, Tetradis S, Pereira RC, Magyar C, Nargizyan T, Hahn TJ, Farouz F, Thies S, Parhami F 2011 Novel oxysterols have pro-osteogenic and anti-adipogenic effects in vitro and induce spinal fusion in vivo. J Cell Biochem 112:1673-84）を、Ｏｘｙ１３３の構造との比較のために示す。
【００７６】
【化４】
2015518493.tif 000006
【００７７】
１−（（３Ｓ，５Ｓ，６Ｓ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−３，６−ｂｉｓ（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）エタノン（１）
公開された特許手順（Parhami et al.、国際公開第２００９／０７３８６号パンフレット、５２頁）に従って調製した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ：３．４７（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１１．０，１１．０，４．８，４，８Ｈｚ）、３．３６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１０．４，１０．４，４．４Ｈｚ）、２．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８，８．８Ｈｚ）、２．２０〜２．１４（１Ｈ，ｍ）、２．１０（３Ｈ，ｓ）、２．０１〜１．９７（１Ｈ，ｍ）、１．８８〜１．８２（１Ｈ，ｍ）、１．７３〜０．８９（１７Ｈ，ｍ）、０．８８（１８Ｈ，ｓ）、０．７９（３Ｈ，ｓ）、０．５９（３Ｈ，ｓ）、０．０４３（３Ｈ，ｓ）、０．０４（３Ｈ，ｓ）、０．０３（３Ｈ，ｓ）、０．０２（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ：２０９．５、７２．２、７０．１、６３．７、５６．４、５３．７、５１．８、４４．２、４１．９、３８．９、３７．６、３６．３、３４．３、３３．２、３１．７、３１．５、２５．９４、２５．９２、２４．４、２２．７、２１．１、１８．３、１８．１、１３．５、１３．４、−４．１、−４．６、−４．７。
【００７８】
（Ｒ）−２−（（３Ｓ，５Ｓ，６Ｓ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）３，６−ｂｉｓ（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）オクタ−３−イン−２−オール（２）
ＴＨＦ（６ｍＬ）中のｎ−ヘキシン（１．５ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）の冷（０℃）溶液に、ｎ−ブチルリチウムの１．６Ｍヘキサン溶液（３．７５ｍＬ）を添加した。ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の化合物１（１．２７ｇ、２．２ｍｍｏｌ）の溶液を、カニューレを介して添加するまで、得られた溶液を３０分間撹拌した。この混合物を、３時間かけて室温まで昇温し、水（４０ｍＬ）で希釈し、粗製生成物を、酢酸エチル抽出によって単離した（３×３０ｍＬ）。合わせた有機層を、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濃縮により、油性生成物が得られ、これを、シリカゲル（ヘキサン、酢酸エチル、勾配）で精製して、１．３０ｇの化合物２（９２％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）δ：３．５０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１５．９，１１．０，４．８Ｈｚ）、３．３６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１０．６，１０．６，４．３Ｈｚ）、２．１８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）、２．１０（１Ｈ，ｍ）、１．９１〜１．６２（４Ｈ，ｍ）、１．５３〜１．３１（２Ｈ，ｍ），１．４４（３Ｈ，ｓ）、１．３１〜０．９３（２２Ｈ，ｍ）、０．９３（３Ｈ，ｓ）、０．９２（３Ｈ，ｍ）、０．９０（１８Ｈ，ｓ）、０．８８（３Ｈ，ｓ）、０．６１（１Ｈ，ｍ）、０．０４（６Ｈ，ｓ）、０．０３（６Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）δ：８５．９、８３．９、７２．４、７１．４、７０．３、６０．５、５５．８、５３．８、５１．８、４３．５、３６．３、３３．７、３３．０、３０．７、２５．９、２２．０、１８．４、１８．３、１８．１、１３．６、１３．５、−４．７、−４．７。
【００７９】
（Ｓ）−２−（（３Ｓ，５Ｓ，６Ｓ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）３，６−ｂｉｓ（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）オクタン−２−オール（３）
化合物２（１．３ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を、酢酸エチル（５ｍＬ）及びメタノール（５ｍＬ）中に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％、０．１ｇ）をこの溶液に添加した。この混合物を、真空下で繰り返し脱気し、次いで、大気圧下で水素ガスに曝露させた（バルーン）。室温で１８時間の後、この混合物を酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、セライト（Celite）でろ過して、触媒を除去した。このフィルターを酢酸エチルで洗浄し、合わせた濾液を蒸発させて１．３ｇの還元された生成物３を得、これをさらなる精製なしに使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）δ：３．５０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１５．９，１１．０，４．８Ｈｚ）、３．３６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１０．６，１０．６，４．３Ｈｚ）、２．１〜１．９５（２Ｈ，ｍ）、１．７５〜１．３５（１０Ｈ，ｍ）、１．３２〜１．２９（１０Ｈ，ｍ），１．２４（３Ｈ，ｓ）、０．９１〜１．２１（１０Ｈ，ｍ）、０．８９（１８Ｈ，ｓ）、０．８２（３Ｈ，ｓ）、０．７９（３Ｈ，ｓ）、０．６３（１Ｈ，ｍ）、０．０４（６Ｈ，ｓ）、０．０３（６Ｈ，ｓ）１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）δ：７５．２、７２．３、５７．６、５６．４、５３．８、５１．８、４２．９、３７．６、３６．３、３３．７、３１．９、３０．０、２５．９、２２．６、１８．３、１８．１、１４．１、１３．８、１３．５、−４．６、−４．７。
【００８０】
（３Ｓ，５Ｓ，６Ｓ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）１７−（（Ｓ）−２−ヒドロキシオクタン−２−イル）−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３，６−ジオール（ＯＸｙ１３３）
ＴＢＡＦの１ＭＴＨＦ溶液（８ｍＬ、８ｍｍｏｌ、４当量）を、化合物３（１．３ｇ、２．０ｍｍｏｌ、１．０当量）に直接添加し、得られた溶液をＴＨＦ（１ｍＬ）で希釈し、室温で７２時間撹拌した。次いで、この混合物を水（５０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチルで繰り返し抽出した（４×４０ｍＬ）。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン、酢酸エチル、勾配、次いで酢酸エチル中１０％のメタノール）による粗製生成物の精製により、白色固体（０．６ｇ、７０％）が得られ、これを、水性アセトン（アセトン、水、３：１）中での粉砕に供し、純粋なＯｘｙ１３３、０．５ｇを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）δ：３．５０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１５．９，１１．０，４．８Ｈｚ）、３．３６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１０．６，１０．６，４．３Ｈｚ）、２．１９（１Ｈ，ｍ）、２．１０〜１．９０（３Ｈ，ｍ）、１．８５〜１．６０（７Ｈ，ｍ）、１．５５〜１．３８（７Ｈ，ｍ）、１．２５（１１Ｈ，ｍ）、１．２０〜０．９５（４Ｈ，ｍ）、０．９０（３Ｈ，ｍ）、０．８６（３Ｈ，ｓ）、０．８０（３Ｈ，ｓ），０．６２（１Ｈ，ｍ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）δ：７５．１、７１．１、６９．３、５７．５、５６．２、５３．６、５１．６、４４．０、４２．８、４１．４、４０．１、３７．２、３６．２、３３．５、３２．１、３１．８、３０．９、２９．９、２６．３、２４．２、２３．６、２２．５、２２．２、２０．９、１４．０、１３．６、１３．３。ＭＳ：Ｍ＋Ｈ＝４２０．３６。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ［Ｍ−  ２  Ｈ２Ｏ  Ｈ］＋  Ｃ２７Ｈ４４ＯＨの計算値：３８５．３４７０、実測値３８５．３４７８。
【実施例３】
【００８１】
実験結果：インビボでの骨形成及び脊椎固定の骨発生の刺激
Ｏｘｙ１３３は、骨髄間質細胞、胚性線維芽細胞及びヒト間葉系幹細胞の造骨性分化を誘導する
骨前駆細胞の造骨性分化を誘導することが可能な分子を開発するという目的を達成するために、１００を超える以前に合成されたアナログにおいて観察された構造活性関連性の本発明者らの理解に基づいて、本発明者らは、最も強力な造骨性の天然に存在するオキシステロール、２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール（２０Ｓ）の分子構造を改変した。本発明者らは、強い造骨性分化が、２０Ｓの２つの構造アナログＯｘｙ３４及びＯｘｙ４９で達成されたことを以前に報告している（Johnson JS, Meliton V, Kim WK, Lee K-B, Wang JC, Nguyen K, Yoo D, Jung ME, Atti E, Tetradis S, Pereira RC, Magyar C, Nargizyan T, Hahn TJ, Farouz F, Thies S, Parhami F 2011 Novel oxysterols have pro-osteogenic and anti-adipogenic effects in vitro and induce spinal fusion in vivo. J Cell Biochem 112:1673-84）。これらの分子は、Ｏｘｙ３４及びＯｘｙ４９の両方においては炭素６（Ｃ６）上にαヒドロキシル（ＯＨ）基を付加し、Ｏｘｙ４９においてはＣ２５とＣ２７との間の二重結合を付加することによって、形成した（図１）（Johnson JS, Meliton V, Kim WK, Lee K-B, Wang JC, Nguyen K, Yoo D, Jung ME, Atti E, Tetradis S, Pereira RC, Magyar C, Nargizyan T, Hahn TJ, Farouz F, Thies S, Parhami F 2011 Novel oxysterols have pro-osteogenic and anti-adipogenic effects in vitro and induce spinal fusion in vivo. J Cell Biochem 112:1673-84）。本明細書で報告した研究において、本発明者らは、それぞれ大型動物及びヒトにおける将来の前臨床研究及び臨床研究のために大量までスケールアップするのに適した、より合成が容易でより強力なアナログを開発することによって、これら２つの分子をさらに改善することを試みた。この分子は、脊椎固定及び骨折治癒の刺激のために局所的に骨形成を増加させるための、並びにおそらくは骨減少症及び骨粗鬆症などの障害に対処するために全身的にさえ骨形成を増加させるための、治療剤開発及び臨床使用の候補であり得る。構造活性関連性研究を通じて、新規アナログＯｘｙ１３３を、実施例２に記載されたプロトコルに従って合成し、骨誘導活性について試験した。Ｏｘｙ１３３は、Ｃ２７の欠失及び側鎖の長さの１炭素分の増加により、Ｏｘｙ３４及びＯｘｙ４９とは異なっている（図１）。重要なことに、Ｏｘｙ１３３は、Ｏｘｙ３４及びＯｘｙ４９と比較して顕著にコストがかからない生成物を生じる安価な市販の出発材料に起因して、大規模でより容易に調製され得る。さらに、Ｏｘｙ１３３の調製に使用したアルキン付加は、収率、生成物の純度（ジアステレオ選択性）及びスケーラビリティに関して、Ｏｘｙ３４及びＯｘｙ４９の合成において使用されるGrignard化学よりも優れている。
【００８２】
２０Ｓの他の構造アナログと比較して、Ｏｘｙ１３３は、Ｃ３Ｈ及びＭ２細胞においてＡＬＰ酵素活性アッセイによる測定において、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を誘導する効能を驚くほど改善した。これは、本発明者らが他のオキシステロールアナログについて以前に報告したように（Johnson JS, Meliton V, Kim WK, Lee K-B, Wang JC, Nguyen K, Yoo D, Jung ME, Atti E, Tetradis S, Pereira RC, Magyar C, Nargizyan T, Hahn TJ, Farouz F, Thies S, Parhami F 2011 Novel oxysterols have pro-osteogenic and anti-adipogenic effects in vitro and induce spinal fusion in vivo. J Cell Biochem 112:1673-84）、造骨性活性に関する有用なモデルである。ＡＬＰ活性における用量依存的増加が、低マイクロモル濃度（μＭ，micromolar）の濃度のＯｘｙ１３３で観察された（図２Ａ、Ｂ）。Ｏｘｙ１３３のＥＣ５０は、Ｃ３Ｈにおいてはおよそ０．５μＭであり（図２Ａ）、Ｍ２細胞においてはおよそ０．４４μＭである（図２Ｂ）ことが見出された。Ｃ３Ｈ細胞におけるＯｘｙ３４及びＯｘｙ４９のＥＣ５０は、Ｍ２細胞において以前に報告されたものと類似のそれぞれ０．８μＭ及び０．９μＭであり、Ｏｘｙ１３３のＥＣ５０よりも有意に高かったことが見出された（図２Ａ）。さらに、高用量のＯｘｙ１３３は、Ｃ３Ｈ細胞において、類似の用量のＯｘｙ３４及びＯｘｙ４９よりも高いレベルのＡＬＰ活性を誘導した（図２Ａ）。Ｏｘｙ１３３は、造骨性分化マーカー遺伝子Ｒｕｎｘ２、オステリックス（ＯＳＸ）、ＡＬＰ、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）及びオステオカルシン（ＯＣＮ）の発現の分析を介して、細胞の造骨性分化を誘導する際に、他の有益な効果を有することが見出された。Ｃ３Ｈ細胞では、２．５μＭ  Ｏｘｙ１３３による処置は、Ｒｕｎｘ２発現を、それぞれ処置の４日後及び７日後に２倍及び３．２倍誘導し、これは、１４日目にベースラインレベルまで戻った（図３Ａ）。ＯＳＸ発現は、２日後に３倍有意に誘導され、実験を通じて上昇し続け、４．５倍の最大誘導に達した（図３Ａ）。Ｏｘｙ１３３によるＣ３Ｈ細胞の処置は、２日後にＡＬＰの発現を１８倍誘導し、これは、４日後に１２０倍まで最大化し、次いで、それぞれ７日後及び１４日後に２２倍まで低下した（図３Ａ）。ＢＳＰ発現は、４日目に最大に９倍誘導され、Ｏｘｙ１３３に対する細胞のより長期の曝露による低下にもかかわらず、実験の持続期間にわたって誘導され続けた（図３Ａ）。Ｏｘｙ１３３処置は、骨芽細胞特異的遺伝子オステオカルシンの発現もまた、４日後に２．８倍誘導し、処置の１４日後に４．２倍の最大に達した（図３Ａ）。Ｏｘｙ１３３は、処置の２１日後のvon Kossa染色（図３Ｂ）及び定量的細胞外マトリックス４５Ｃａアッセイ（図３Ｃ）によって決定されるように、Ｃ３Ｈ細胞の培養物において強いマトリックス石灰化を誘導した。これらのデータは、骨誘導オキシステロールとしてのＯｘｙ１３３の効力及び効能を実証している。
【００８３】
Ｏｘｙ１３３の造骨性効果を、処置の１週間後、２週間後及び４週間後に造骨性遺伝子の発現を評価することによって、初代ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）においても試験した。ＡＬＰ発現は、全ての時点において未処置の細胞において高く、Ｏｘｙ１３３処置で変化は存在しなかった（データ示さず）。１週間後、ＢＳＰ発現における顕著な２倍の増加が観察され、これは、２週間後及び４週間後に４倍にまでさらに増加した（図３Ｄ）。Ｏｘｙ１３３は、４週間後に、ＯＳＸ（３倍）及びＯＣＮ（２倍）の顕著な誘導もまた誘導した（図３Ｄ）。さらに、Ｏｘｙ１３３は、処置の５週間後にvon Kossa染色によって実証されたように、初代ヒトＭＳＣ細胞の培養物において強い細胞外マトリックス石灰化を刺激した（図３Ｅ）。
【００８４】
Ｏｘｙ１３３は、ヘッジホッグ経路シグナル伝達の活性化を介して造骨性分化を誘導する
以前の研究により、２０Ｓ並びにその構造アナログＯｘｙ３４及びＯｘｙ４９が、Ｈｈ経路シグナル伝達の活性化を介して造骨性分化を誘導することが実証されている（Johnson JS, Meliton V, Kim WK, Lee K-B, Wang JC, Nguyen K, Yoo D, Jung ME, Atti E, Tetradis S, Pereira RC, Magyar C, Nargizyan T, Hahn TJ, Farouz F, Thies S, Parhami F 2011 Novel oxysterols have pro-osteogenic and anti-adipogenic effects in vitro and induce spinal fusion in vivo. J Cell Biochem 112:1673-84）。しかし、Ｈｈ経路シグナル伝達の造骨性オキシステロール媒介性の活性化に関する分子機構は、以前には知られていなかった。そのより高い造骨性活性を考慮すると、Ｏｘｙ１３３は、Ｈｈ経路活性化及び骨発生が半合成オキシステロールによって達成される分子機構を同定するための有用なツールである。Ｏｘｙ１３３がＨｈ経路を介して造骨性分化を誘導するか否か、及びどのように誘導するかを決定するために、Ｏｘｙ１３３誘導性のＡＬＰ活性並びに造骨性分化マーカーＡＬＰ、ＢＳＰ及びＯＳＸの発現に対する、選択的Ｈｈ経路阻害剤シクロパミンの影響を試験した。シクロパミンは、Ｃ３Ｈ細胞（図４Ａ）及びＭ２細胞（データ示さず）において、Ｏｘｙ１３３誘導性のＡＬＰ活性並びに造骨性マーカーＡＬＰ、ＢＳＰ及びＯＳＸの発現を完全に阻害し、Ｏｘｙ１３３がＨｈシグナル伝達経路を介して作用することが示唆された。Ｏｘｙ１３３によるＨｈシグナル伝達の活性化をさらに分析するために、Ｃ３Ｈ細胞中にトランスフェクトされたＧｌｉ依存的ルシフェラーゼレポーターの活性化を、以前に報告された方法を使用して試験した（Johnson JS, Meliton V, Kim WK, Lee K-B, Wang JC, Nguyen K, Yoo D, Jung ME, Atti E, Tetradis S, Pereira RC, Magyar C, Nargizyan T, Hahn TJ, Farouz F, Thies S, Parhami F 2011 Novel oxysterols have pro-osteogenic and anti-adipogenic effects in vitro and induce spinal fusion in vivo. J Cell Biochem 112:1673-84、Dwyer JR, Sever N, Carlson M, Nelson SF, Beachy PA, Parhami F 2007 Oxysterols are novel activators of the Hedgehog signaling pathway in pluripotent mesenchymal cells. J Biol Chem 282:8959-68）。Ｏｘｙ１３３は、Ｇｌｉ依存的レポーターの活性における用量依存的増加を誘導し、これは、１００ｎＭのＯｘｙ１３３で５倍の誘導及び１μＭのＯｘｙ１３３で１７倍の誘導に達した（図４Ｂ）。
【００８５】
Ｏｘｙ１３３は、スムーズンド受容体に対する結合によってヘッジホッグシグナル伝達経路を活性化する
本発明者らは、２０Ｓが、Ｓｍｏ受容体に対する結合によってＨｈシグナル伝達を選択的に活性化することを以前に報告している（Nachtergaele S, Mydock LK, Krishnan K, Rammohan J, Schlesinger PH, Covey DF, Rohatgi R 2012 Oxysterols are allosteric activators of the oncoprotein Smoothened. Nat Chem Biol 8:211-20）。Ｏｘｙ１３３が同じ機構によってＨｈシグナル伝達を活性化するか否かを決定するために、本発明者らは、磁気ビーズにカップリングされた２０ＳアナログとのＹＦＰタグ化Ｓｍｏ（ＹＦＰ−Ｓｍｏ）の結合について競合するＯｘｙ１３３の能力を試験した。本発明者らが以前に報告したように、このアナログｎａｔ−２０Ｓ−ｙｎｅは、イソ−オクチル鎖上にアルキン部分を含み、クリックケミストリー媒介性の、磁気ビーズに対するカップリングを可能にする（２０Ｓ−ビーズ）（Nachtergaele S, Mydock LK, Krishnan K, Rammohan J, Schlesinger PH, Covey DF, Rohatgi R 2012 Oxysterols are allosteric activators of the oncoprotein Smoothened. Nat Chem Biol 8:211-20）。ステロール結合アッセイのためにこれらのビーズを使用して、競合物なしの試料と比較した、ビーズ上に残留しているＹＦＰ−Ｓｍｏの量を、ウエスタンブロッティングによって測定する。２０Ｓと同じ部位においてＳｍｏを結合する化合物は、２０Ｓ−ビーズと競合し、溶出液中のタンパク質の量を低減させる。本発明者らは、Ｓｍｏ結合アッセイ及びＨｈシグナル伝達アッセイの両方において、多数の他のステロールを試験したが、全ての場合において、Ｓｍｏに対する結合は、Ｈｈ経路活性における変化と相関した（Nachtergaele S, Mydock LK, Krishnan K, Rammohan J, Schlesinger PH, Covey DF, Rohatgi R 2012 Oxysterols are allosteric activators of the oncoprotein Smoothened. Nat Chem Biol 8:211-20）。陽性コントロールであるＯｘｙ１３３及び２０Ｓは共に、２０Ｓカップリングビーズ上に捕捉されたＹＦＰ−Ｓｍｏの量を低減させた（図４Ｃ）。重要なコントロールにおいて、Ｈｈシグナル伝達も骨発生も活性化できなかった（Parhami et al.の未公開の観察）、構造的に関連するアナログＯｘｙ１６は、ＹＦＰ−Ｓｍｏと２０Ｓ−ビーズとの間の相互作用を防止できなかった（図４Ｃ）。遊離Ｏｘｙ１３３の存在下での、２０Ｓ−ビーズにより捕捉されたＹＦＰ−Ｓｍｏの量におけるこの低減は、Ｏｘｙ１３３が、Ｓｍｏ上の、２０Ｓと同じ部位に結合することを示唆している。主に本発明者らが、抽出物中のＹＦＰ−Ｓｍｏの濃度及びビーズ上に生産的に固定化された２０Ｓの量を知らないことに起因して、本発明者らのアッセイが半定量的であり、相互作用についてＫｄを導出するためには使用できないことを強調することが重要である。
【００８６】
Ｏｘｙ１３３は、骨形成及び脊椎固定をインビボで刺激する
８週齢のLewisラットを、手術部位におけるコラーゲンスポンジ内に含まれる試薬だけが異なる５つの処置群に分割した：群１−コントロール媒体（ＤＭＳＯ）のみ（ｎ＝７）、群II−５μｇ  ｒｈＢＭＰ−２（ｎ＝８）、群III−２０ｍｇ  Ｏｘｙ１３３（ｎ＝７）、群IV−２ｍｇ  Ｏｘｙ１３３（ｎ＝８）及び群Ｖ−０．２ｍｇ  Ｏｘｙ１３３（ｎ＝８）。骨形成及び脊椎固定を、Ｘ線撮影分析を介して術後の種々の時点で評価し、並びに手動評価、マイクロコンピュータ断層撮影及び組織学を使用して屠殺の時点で評価した。屠殺の時点の固定率を表１にまとめる。
【００８７】
【表１】
2015518493.tif 000007
【００８８】
Ｘ線撮影分析
第１のセットのＸ線写真を、手術の４週間後に実施した。この時点では、両側固定が、ＢＭＰ２群中の８／８の動物、Ｏｘｙ１３３−２０ｍｇ群中の６／７の動物、Ｏｘｙ１３３−２ｍｇ群中の３／８の動物で観察され、コントロール群及びＯｘｙ１３３−０．２ｍｇ群では固定は観察されなかった。片側固定が、残りのＯｘｙ１３３−２０ｍｇ処置した動物及びＯｘｙ１３３−２ｍｇで処置した３匹の動物において観察された。これは、４週目の時点で固定が観察されなかった、Ｏｘｙ３４及びＯｘｙ４９を用いた以前の研究とは対照的である（Johnson JS, Meliton V, Kim WK, Lee K-B, Wang JC, Nguyen K, Yoo D, Jung ME, Atti E, Tetradis S, Pereira RC, Magyar C, Nargizyan T, Hahn TJ, Farouz F, Thies S, Parhami F 2011 Novel oxysterols have pro-osteogenic and anti-adipogenic effects in vitro and induce spinal fusion in vivo. J Cell Biochem 112:1673-84）。６週目までには、Ｏｘｙ１３３−２０ｍｇ群中の全ての動物が、両側固定されていた。８週目に、固定は、ＢＭＰ２群及びＯｘｙ１３３−２０ｍｇ群中の全ての動物並びにＯｘｙ１３３−２ｍｇ群の４／８において再度注目された（図５）。最後の８週目のＸ線写真では、固定塊はＤＭＳＯ群でもＯｘｙ１３３−０．２ｍｇ（データ示さず）群でも観察されなかった（図５）。
【００８９】
骨形成の手動評価及び肉眼評価
屠殺後、本発明者らが以前に記載したように、脊椎を各動物から外植し、手動評価に供した（Johnson JS, Meliton V, Kim WK, Lee K-B, Wang JC, Nguyen K, Yoo D, Jung ME, Atti E, Tetradis S, Pereira RC, Magyar C, Nargizyan T, Hahn TJ, Farouz F, Thies S, Parhami F 2011 Novel oxysterols have pro-osteogenic and anti-adipogenic effects in vitro and induce spinal fusion in vivo. J Cell Biochem 112:1673-84、Sintuu C, Simon RJ, Miyazaki M, Morishita Y, Hymanson HJ, Taghavi C, Brochmann EJ, Murray SS, Wang JC 2011 Full-length spp24, but not its 18.5-kDa proteolytic fragment, inhibits bone-healing in a rodent model of spine fusion. J Bone Joint Surg Am 93:1022-32、Miyazaki M, Morishita Y, He W, Hu M, Sintuu C, Hymanson HJ, Falakassa J, Tsumura H, Wang JC 2009 A porcine collagen-derived matrix as a carrier for recombinant human bone morphogenetic protein-2 enhances spinal fusion in rats. Spine J 9:22-30、Zhu W, Rawlins BA, Boachie-Adjei O, Myers ER, Arimizu J, Choi E, Lieberman JR, Crystal RG, Hidaka C 2004 Combined bone morphogenetic protein-2 and -7 gene transfer enhances osteoblastic differentiation and spine fusion in a rodent model. J Bone Miner Res 19:2021-32）。肉眼評価及び手動評価の結果は、８週目におけるＸ線撮影的知見と類似していた。ＤＭＳＯ群でもＯｘｙ１３３−０．２ｍｇ群でも、片側固定も両側固定も観察されなかった。いくらかの骨形成が、Ｏｘｙ１３３−０．２ｍｇ群中の２匹の動物において注目された。両側固定は、ＢＭＰ２群中の全ての動物及びＯｘｙ１３３−２０ｍｇ群中の６／７の動物において観察された。Ｏｘｙ１３３−２０ｍｇ群中の残りの動物は、顕著な両側固定塊にもかかわらず、片側で動きを有した。Ｏｘｙ１３３−２ｍｇ群中の半分（４／８）の動物は、手動触診で両側固定が確認されたが、２匹のさらなる動物は片側固定を有し、２匹の動物は固定の証拠を有さなかった。
【００９０】
マイクロコンピュータ断層撮影及び組織学的評価
ｍｉｃｒｏ−ＣＴ分析による橋渡し海綿骨の評価により、Ｘ線写真、肉眼観察及び手動触診で観察された結果が確認された（図６）。いくらかの骨形成が、Ｏｘｙ１３３−０．２ｍｇ群中の２匹の動物において見られたが、両側固定は、この群でもＤＭＳＯ群でも観察されなかった。両側の橋渡し海綿骨は、ＢＭＰ２群及びＯｘｙ１３３−２０ｍｇ群中の全ての動物において見られた。両側固定は、Ｏｘｙ１３３−２ｍｇ群中の４／８の動物においても観察され、２匹のさらなる動物においては片側固定が観察された。ｍｉｃｒｏ−ＣＴ画像からの微細構造分析の結果を表２に示す。ＢＭＰ２固定塊の総容量は、Ｏｘｙ１３３−２ｍｇ試料及び２０−ｍｇ試料の両方よりも有意に高かった。しかし、Ｏｘｙ１３３−２ｍｇ及び２０−ｍｇ固定塊の平均ＢＶ／ＴＶ比は、ＢＭＰ２群よりも有意に高く、これは、塊内のより高密度の骨を示す。海綿厚は、ＢＭＰ２とＯｘｙ１３３−２ｍｇ又はＯｘｙ１３３−２０ｍｇのいずれかとの間で、有意に異ならなかった。海綿分離は、Ｏｘｙ１３３−２ｍｇ及びＯｘｙ１３３−２０ｍｇと比較して、ＢＭＰ２固定塊において有意に大きく、これもまた、ＢＭＰ２固定塊におけるより低い密度の骨を示す。
【００９１】
【表２】
2015518493.tif 000008
【００９２】
次いで、組織学的分析を、ＤＭＳＯ群、ＢＭＰ２群、Ｏｘｙ１３３−２０ｍｇ群及びＯｘｙ１３３−２ｍｇ群中の２匹の代表的動物において実施した。組織学的評価により、ＢＭＰ２又は２ｍｇ用量若しくは２０ｍｇ用量のＯｘｙ１３３で処置したラットにおいて、固定塊内の海綿骨及び完全に固定された腰椎の横突起を接続する連続する皮質骨の形成が実証された（図７Ａ）。骨形成は、コントロールラット由来の標本中には存在しなかった。固定塊の大きさは、２０ｍｇ又は２ｍｇのＯｘｙ１３３と比較して、ＢＭＰ２で処置したラットにおいて増加した。しかし、組織学的標本の目視検査により、ＢＭＰ２が、Ｏｘｙ１３３で処置した群では有意に低かった、固定塊内の脂肪細胞の強い形成もまた誘導したことが示された（図７Ｂ）。さらに、目視検査により、海綿骨形成が、ＢＭＰ２群と比較して、Ｏｘｙ１３３−２０ｍｇ群でより強かったことが示唆された。
【実施例４】
【００９３】
脂肪生成の阻害
従来の手順を使用して、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２骨−脂肪前駆細胞を、脂肪細胞形成を誘導することが報告されている、ＰＰＡＲγアクチベータのトログリタゾン（「Ｔｒｏ」，Troglitazone）で処置した。２週間後、Ｔｒｏ処置したウェルにおける脂肪生成を、Oil Red O染色によって可視化し、脂肪細胞を光学顕微鏡によって定量した。造骨性分化及びＨｈシグナル伝達の両方を誘導する用量におけるＯｘｙ１３３は、脂肪細胞形成を完全に阻害したことが明らかであった。以下はデータである（１視野当たりの平均脂肪細胞≠ＳＤとして）：
視野≠ＳＤ）：
コントロール：２．５≠２
Ｔｒｏ：２８≠４
Ｔｒｏ＋Ｏｘｙ１３３（５ｕＭ）：０．５≠１
Ｏｘｙ１３３（５ｕＭ）：０．８≠１
コントロール対Ｔｒｏ対Ｔｒｏ＋Ｏｘｙ１３３についてのｐ値は、０．０１未満で有意性に達した
【００９４】
上述の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認でき、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明を種々の用途及び条件に適応させ、本発明を最大限に利用するために、本発明の変更及び改変を行い得る。上記好ましい特定の実施形態は、例示にすぎないと解釈すべきであり、何であれ本発明の範囲を限定すると決して解釈すべきではない。２０１２年５月７日出願の米国仮特許出願第６１／６４３，７４６号を含む、上で引用された全ての出願、特許及び刊行物の全開示は、特に本出願で引用された開示に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。国際公開第２００８／１１５４６９号パンフレット、国際公開第２００８／０８２５２０号パンフレット、国際公開第２００７／０９８２８１号パンフレット、国際公開第２００７／０２８１０１号パンフレット、国際公開第２００６／１１０４９０号パンフレット、国際公開第２００５／０２０９２８号パンフレット、国際公開第２００４／０１９８８４号パンフレットとして公開された特許協力条約（ＰＣＴ，Patent Cooperation Treaty）国際出願を含む、本発明者らの実験室からのオキシステロールに関する他の出願もまた、その全体が参照により組み込まれる。
【００９５】
（参考文献）
1. Johnson EE, Urist MR 2000 Human bone morphogenetic protein allografting for reconstruction of femoral nonunion. Clin Orthop Relat Res 371:61-74.
2. Mundy GR 2002 Directions of drug discovery in osteoporosis. Annu Rev Med 53:337-54.
3. Rodan GA, Martin TJ 2000 Therapeutic Approaches to Bone Diseases. Science 289:1508-14.
4. Yoon ST, Boden SD 2002 Osteoinductive molecules in orthopaedics: basic science and preclinical studies. Clin Orthop Relat Res 395:33-43.
5. Arrington ED, Smith WJ, Chambers HG, Bucknell AL, Davino NA 1996 Complications of iliac crest bone graft harvesting. Clin Orthop Relat Res 329:300-9.
6. Vaccaro AR, Chiba K, Heller JG, Patel TC, Thalgott JS, Truumees E, Fischgrund JS, Craig MR, Berta SC, Wang JC 2002 Bone grafting alternatives in spinal surgery. Spine J 2:206-15.
7. Rihn JA, Kirkpatrick K, Albert TJ 2010 Graft options in posterolateral and posterior interbody lumbar fusion. Spine 35:1629-39.
8. Mitka M 2011 Questions about spine fusion product prompt a new process for reviewing data. JAMA 306:1311-2.
9. Lewandrowski K-U, Nanson C, Calderon R 2007 Vertebral osteolysis after posterior interbody lumbar fusion with recombinant human bone morphogenetic protein 2: a report of five cases. Spine J 7:609-14.
10. Wong DA, Kumar A, Jatana S, Ghiselli G, Wong K 2008 Neurologic impairment from ectopic bone in the lumbar canal: a potential complication of off-label PLIF/TLIF use of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2). Spine J 8:1011-8.
11. Smucker JD, Rhee JM, Singh K, Yoon ST, Heller JG 2006 Increased swelling complications associated with off-label usage of rhBMP-2 in the anterior cervical spine. Spine. 31:2813-9.
12. Carragee EJ, Hurwitz EL, Weiner BK 2011 A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J 11:471-91.
13. Kha HT, Basseri B, Shouhed D, Richardson J, Tetradis S, Hahn TJ, Parhami F 2004 Oxysterols regulate differentiation of mesenchymal stem cells: pro-bone and anti-fat. J Bone Miner Res 19:830-40.
14. Kim W-K, Meliton V, Amantea CM, Hahn TJ, Parhami F 2007 20(S)-hydroxycholesterol inhibits PPARgamma expression and adipogenic differentiation of bone marrow stromal cells through a Hedgehog-dependent mechanism. J Bone Miner Res 22:1711-9.
15. Johnson JS, Meliton V, Kim WK, Lee K-B, Wang JC, Nguyen K, Yoo D, Jung ME, Atti E, Tetradis S, Pereira RC, Magyar C, Nargizyan T, Hahn TJ, Farouz F, Thies S, Parhami F 2011 Novel oxysterols have pro-osteogenic and anti-adipogenic effects in vitro and induce spinal fusion in vivo. J Cell Biochem 112:1673-84.
16. Parhami F, Morrow AD, Balucan J, Leitinger N, Watson AD, Tintut Y, Berliner JA, Demer LL 1997 Lipid oxidation products have opposite effects on calcifying vascular cell and bone cell differentiation. A possible explanation for the paradox of arterial calcification in osteoporotic patients. Arterioscler Thromb Vasc Biol 17:680-7.
17. Dwyer JR, Sever N, Carlson M, Nelson SF, Beachy PA, Parhami F 2007 Oxysterols are novel activators of the Hedgehog signaling pathway in pluripotent mesenchymal cells. J Biol Chem 282:8959-68.
18. Kim W-K, Meliton V, Bourquard N, Hahn TJ, Parhami F 2010 Hedgehog signaling and osteogenic differentiation in multipotent bone marrow stromal cells are inhibited by oxidative stress. J Cell Biochem 111:1199-209.
19. Nachtergaele S, Mydock LK, Krishnan K, Rammohan J, Schlesinger PH, Covey DF, Rohatgi R 2012 Oxysterols are allosteric activators of the oncoprotein Smoothened. Nat Chem Biol 8:211-20.
20. Rohatgi R, Milenkovic L, Corcoran RB, Scott MP 2009 Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc Natl Acad Sci USA106:3196-201.
21. Alanay A, Chen C, Lee S, Murray SS, Brochmann EJ, Miyazaki M, Napoli A, Wang JC 2008 The adjunctive effect of a binding peptide on bone morphogenetic protein enhanced bone healing in a rodent model of spinal fusion. Spine 33:1709-13.
22. Miyazaki M, Sugiyama O, Tow B, Zou J, Morishita Y, Wei F, Napoli A, Sintuu C, Lieberman JR, Wang JC 2008 The effects of lentiviral gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone marrow cells on spinal fusion in rats. J Spinal Disord Tech 21:372-9.
23. Pereira RC, Stadmeyer LE, Smith DL, Rydziel S, Canalis E 2007 CCAAT/Enhancer-binding protein homologous protein (CHOP) decreases bone formation and causes osteopenia. Bone 40:619-26.
24. Magyar CE, Aghaloo TL, Atti E, Tetradis S 2008 Ostene, a new alkylene oxide copolymer bone hemostatic material, does not inhibit bone healing. Neurosurgery 63:373-378; discussion 378.
25. Sintuu C, Simon RJ, Miyazaki M, Morishita Y, Hymanson HJ, Taghavi C, Brochmann EJ, Murray SS, Wang JC 2011 Full-length spp24, but not its 18.5-kDa proteolytic fragment, inhibits bone-healing in a rodent model of spine fusion. J Bone Joint Surg Am 93:1022-32.
26. Miyazaki M, Morishita Y, He W, Hu M, Sintuu C, Hymanson HJ, Falakassa J, Tsumura H, Wang JC 2009 A porcine collagen-derived matrix as a carrier for recombinant human bone morphogenetic protein-2 enhances spinal fusion in rats. Spine J 9:22-30.
27. Zhu W, Rawlins BA, Boachie-Adjei O, Myers ER, Arimizu J, Choi E, Lieberman JR, Crystal RG, Hidaka C 2004 Combined bone morphogenetic protein-2 and -7 gene transfer enhances osteoblastic differentiation and spine fusion in a rodent model. J Bone Miner Res 19:2021-32.
【図１】
2015518493.tif 000011
【図２Ａ】
2015518493.tif 000012
【図２Ｂ】
2015518493.tif 000013
【図３Ａ】
2015518493.tif 000014
【図３Ｂ】
2015518493.tif 000015
【図３Ｃ】
2015518493.tif 000016
【図３Ｄ】
2015518493.tif 000017
【図３Ｅ】
2015518493.tif 000018
【図４Ａ】
2015518493.tif 000019
【図４Ｂ】
2015518493.tif 000020
【図４Ｃ】
2015518493.tif 000021
【図５】
2015518493.tif 000022
【図６】
2015518493.tif 000023
【図７Ａ】
2015518493.tif 000024
【図７Ｂ】
2015518493.tif 000025
【配列表】
2015518493000001.app
【国際調査報告】
2015518493.tif 000026
2015518493.tif 000027
2015518493.tif 000028