(57)【要約】本発明は、必要とする被験者の気道過敏症を低減させるための方法に使用するための、抗Ｓ１００Ｂ抗体、抗Ｓ１００ＢアプタマーまたはＳ１００Ｂ遺伝子発現阻害剤からなる群より選択された薬剤に関する。本発明はまた、被験者から得られた生物学的試料中のＳ１００Ｂタンパク質レベルを決定することを含む、前記被験者が気道過敏症を有するまたは発症するリスクがあるかどうかを決定するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗Ｓ１００Ｂ抗体、抗Ｓ１００ＢアプタマーまたはＳ１００Ｂ遺伝子発現阻害剤からなる群より選択された薬剤を被験者に投与することを含む、それを必要とする被験者の気道過敏症を低減させるための方法。
【請求項２】
被験者が、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性気管支肺アルペルギルス症、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、肺気腫、気管支炎、アレルギー性気管支炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、結核、過敏性肺炎、職業性喘息、サルコイド、反応性気道疾患症候群、間質性肺疾患、好酸球増加症候群、鼻炎、副鼻腔炎、運動誘発性喘息、汚染物質により誘発される喘息、および肺寄生虫症からなる群より選択される気道疾患を患う、請求項１記載の方法。
【請求項３】
被験者から得られた生物学的試料中のＳ１００Ｂタンパク質のレベルを決定することを含む、前記被験者が気道過敏症を有するまたは発症するリスクがあるかどうかを決定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、それを必要とする被験者の気道過敏症を低減させるための方法および薬学的組成物に関する。
【０００２】
発明の背景：
気道過敏症（「ＡＨＲ」）は、多くの気道疾患の特徴であり、そして刺激に応答してあまりにも容易にそして／またはあまりにも多大に気道が狭窄することを可能とする気道の異常からなる。多種多様な容態に伴う呼吸器疾患は、一般集団において極めて一般的である。気道過敏症は、特に喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）において観察される。
【０００３】
喘息は、工業国において最も一般的な疾患の１つである。喘息は、気道の可変的な、多くの場合、可逆的な閉塞によって特徴付けられる容態である。この過程は、肺の炎症、いくつかの場合においては肺のアレルギーに関連している。多くの被験者は、「喘息発作」と呼ばれる急性エピソードを有し、慢性容態に罹患している被験者もいる。全ての喘息患者は、この容態に特徴的な一群の症状を有する：突発性気管支収縮、肺炎症、および肺サーファクタントの減少。既存の気管支拡張剤および抗炎症剤が現在市販されており、そして喘息の処置のために処方される。喘息の処置のために利用可能な大半の薬物は、より重要なことには、少数の被験者において殆ど効果的ではない。
【０００４】
ＣＯＰＤは、慢性気管支炎、肺気腫またはその両方によって一般的に引き起こされる気道の閉塞によって特徴付けられる。一般的に、気道の閉塞は完全に可逆的ではないが、被験者の１０〜２０％は、処置により気道の閉塞に幾分の改善を示す。慢性気管支炎では、気道の閉塞は、異常な気道の粘液の慢性かつ過度な分泌、炎症、気管支痙攣および感染から生じる。ＣＯＰＤの症状を軽減し、増悪を予防し、最適な肺機能を保ち、そして日常生活の活動および生活の質を向上させるための現在利用可能な処置は非常に僅かである。多くの被験者は、残りの人生において薬物を慢性的に使用し、増悪中には増加した投与量および追加の薬物が必要とされる。ＣＯＰＤ被験者のために現在処方される薬物としては、速効性のβ２アゴニスト、抗コリン作動性気管支拡張剤、長時間作用型気管支拡張剤、抗生物質および去痰剤が挙げられる。ＣＯＰＤのための現在利用可能な処置の中で、抗コリン作動性薬物、β２アドレナリン作動性アゴニストおよび経口ステロイドの投与から、その進行に対する、長期間の効果ではなく短期間の利点が認められた。短時間および長時間作用型吸入用β２アドレナリン作動性アゴニストは、短期間の気管支拡張をもたらし、そしてＣＯＰＤ被験者に幾分の症状の軽減をもたらすが、疾患の進行に対して意味のある維持効果は全く示さない。
【０００５】
従って、喘息またはＣＯＰＤなどの気道疾患における気道の過敏症を管理する際のさらなる処置の選択肢が必要とされる。
【０００６】
Ｓ１００Ｂは、Ｓ１００タンパク質ファミリーの一員である。Ｓ１００タンパク質は、へリックス・ループ・ヘリックス（「ＥＦハンドタイプ」）コンフォメーションの２つのカルシウム結合部位によって特徴付けられる脊椎動物に見られる低分子量タンパク質である。少なくとも２１種類の異なるＳ１００タンパク質が存在する。名称は、タンパク質が中性ｐＨの硫酸アンモニウム中で１００％可溶性であるという事実に由来する。Ｓ１００Ｂは、２つのβサブユニットからなるホモダイマーとして存在する分子量１２ｋＤａの酸性タンパク質である。２つのモノマーは、２回回転軸で構成され、そして共にジスルフィド結合によって保たれている。Ｓ１００Ｂは、横紋筋および骨格筋の収縮に役割を果たしているカルシウム結合タンパク質として同定されているが、気道過敏症におけるその役割は依然として研究されていない。
【０００７】
発明の要約：
本発明は、それを必要とする被験者の気道過敏症を低減させるための方法に使用するための、抗Ｓ１００Ｂ抗体、抗Ｓ１００ＢアプタマーまたはＳ１００Ｂ遺伝子発現阻害剤からなる群より選択された薬剤に関する。本発明はまた、被験者から得られた生物学的試料中のＳ１００Ｂタンパク質のレベルを決定することを含む、被験者が気道過敏症を有するまたは発症するリスクがあるかどうかを決定するための方法に関する。
【０００８】
発明の詳細な説明：
気管支過敏症は、気道の狭窄および呼吸困難に到る平滑筋細胞の収縮の兆候である。反応性は、急性肺損傷およびアレルギー性喘息のマウスモデルにおいて細菌性またはアレルギー性誘導体によって誘発される。本発明者らは、２つの呼吸器攻撃モデルにおける気道応答に対する、ＲＡＧＥ／ＡＧＥＲ経路のリガンドであるＳ１００ｂの寄与を記載した。Ｓ１００ｂは、気道刺激後に肺において発現され、炎症誘発性サイトカインと類似した動的プロファイルを示した。Ｓ１００ｂを欠失しているマウスは、ＬＰＳにより誘発される気道応答の減少を示し、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６炎症誘発性サイトカインの細胞への動員または分泌に対する影響は全くなかった。同様に、中和抗体による処置は、ＬＰＳ攻撃において、およびＯＶＡにより感作されたアレルギー性喘息モデルにおいて、気管支反応性を消失させた。ＬＰＳによる攻撃後、Ｓ１００ｂを発現している細胞は、気管支の上気道上皮細胞および筋肉細胞の近くに蓄積し、このことは、気道過敏症の最中における細胞リモデリングの動態を制御する際にＳ１００ｂが役割を果たす可能性を示唆する。これらの観察は、カスケードの上流で気管支過敏症を調節しているＳ１００ｂを強調し、そしてＳ１００ｂ遮断を、急性肺損傷および喘息を含む呼吸器疾患のための可能性ある治療戦略として示した。
【０００９】
従って、本発明は、それを必要とする被験者の気道過敏症（ＡＨＲ）を低減させるための方法に使用するための、抗Ｓ１００Ｂ抗体、抗Ｓ１００ＢアプタマーまたはＳ１００Ｂ遺伝子発現阻害剤からなる群より選択される薬剤に関する。
【００１０】
本発明の薬剤が、炎症応答を改変することなくＡＨＲを低減することができることは記載する価値がある（実施例１参照）。
【００１１】
本明細書において使用した「Ｓ１００Ｂ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、そしてDonato Rに記載されたＳ１００カルシウム結合タンパク質Ｂを指す。Ｓ１００：細胞内および細胞外の機能的役割を有するＥＦハンドタイプのカルシウム調節型多重遺伝子タンパク質ファミリー。Int J Biochem Cell Biol. 2001 Jul;33(7):637-68。
【００１２】
本明細書において使用した「抗体」は、天然および非天然抗体の両方を含む。特に、「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、並びにその一価および多価フラグメントを含む。さらに、「抗体」は、キメラ抗体、全合成抗体、一本鎖抗体、およびそのフラグメントを含む。抗体はヒトまたは非ヒト抗体であり得る。非ヒト抗体は、ヒトにおけるその免疫原性を低減させるために組換え法によってヒト化され得る。
【００１３】
本明細書において使用した「抗Ｓ１００Ｂ抗体」は、Ｓ１００Ｂに対して指向される任意の抗体を指す。
【００１４】
抗体は、従来の方法に従って調製され得る。モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein (Nature, 256:495, 1975)の方法を使用して生成され得る。本発明において有用なモノクローナル抗体を調製するために、マウスまたは他の適切な宿主動物を適切な間隔で（例えば、１週間に２回、１週間に１回、１か月に２回、または１か月に１回）抗原形のＳ１００Ｂを用いて免疫化する。動物に、屠殺から１週間以内に最終抗原「ブースト」を投与し得る。免疫化中に免疫アジュバントを使用することがしばしば望ましい。適切な免疫アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ｒｉｂｉアジュバント、Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ  Ｔｉｔｅｒｍａｘ、サポニンアジュバント、例えばＱＳ２１またはＱｕｉｌＡ、またはＣｐＧを含む免疫刺激オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の適切なアジュバントは当技術分野において周知である。動物を、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、鼻腔内、または他の経路によって免疫化し得る。所与の動物を、複数の経路によって種々の形態の抗原を用いて免疫化し得る。
【００１５】
簡潔に言えば、組換え形のＳ１００Ｂは、任意の以前に記載された方法を使用して提供され得る。免疫化計画の後、リンパ球を、脾臓、リンパ節または動物の他の臓器から単離し、そしてポリエチレングリコールなどの薬剤を使用して適切なミエローマ細胞系と融合させて、ハイブリドーマを形成する。融合後、細胞を、標準的な方法を使用して融合対ではなくハイブリドーマの増殖に許容される培地中に入れる。ハイブリドーマの培養後、細胞上清を、所望の特異性の抗体、すなわち、抗原と選択的に結合する抗体の存在について分析する。適切な分析技術としては、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降法、およびウェスタンブロットが挙げられる。他のスクリーニング技術は当技術分野において周知である。好ましい技術は、非変性ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーおよび免疫沈降法などのコンフォメーション的にインタクトで天然にフォールディングされた抗原と抗体との結合を確認するものである。
【００１６】
重要なことには、当技術分野において周知であるように、抗体分子のほんの小さな部分、すなわちパラトープが、抗体とそのエピトープとの結合に関与している。Ｆｃ’およびＦｃ領域は、例えば、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原との結合には関与していない。ｐＦｃ’領域が酵素により切断された抗体、またはｐＦｃ’領域を含まないように産生された抗体は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと称されるが、これはインタクトな抗体の両方の抗原結合部位を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素により切断された抗体、またはＦｃ領域を含まないように産生された抗体は、Ｆａｂフラグメントと称されるが、これはインタクトな抗体分子の一方の抗原結合部位を保持する。さらに進めると、Ｆａｂフラグメントは、共有結合した抗体軽鎖と、Ｆｄで示される抗体重鎖の一部からなる。Ｆｄフラグメントは、抗体特異性の主要な決定基であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体の特異性を変化させることなく、１０個までの異なる軽鎖と結合し得る）、そしてＦｄフラグメントは、単独でエピトープ結合能を保持する。
【００１７】
抗体の抗原結合部分内に、当技術分野において周知であるように、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）、パラトープの３次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）が存在する（一般的にClark, 1986; Roitt, 1991参照）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄフラグメントおよび軽鎖の両方には、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲＳまで）によってそれぞれ分離された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４まで）が存在する。ＣＤＲ、特にＣＤＲＳ領域、より特定すると重鎖ＣＤＲＳは、抗体の特異性に大きく関与する。
【００１８】
哺乳動物の抗体の非ＣＤＲ領域は、元来の抗体のエピトープ特異性を維持しながら、同種特異的または異種特異的抗体の類似領域で置換され得ることが当技術分野においては現在十分に確立されている。これは、非ヒトＣＤＲが、ヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域と共有結合して機能的抗体を産生する、「ヒト化」抗体の開発および使用に最も明瞭に顕現している。
【００１９】
本発明は、特定の態様において、ヒト化形の抗体を含む組成物および方法を提供する。本明細書において使用した「ヒト化」は、ＣＤＲ領域外のいくつか、大半または全てのアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン分子に由来する対応するアミノ酸で置換された抗体を説明する。ヒト化の方法としては、米国特許第４，８１６，５６７号、第５，２２５，５３９号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、および第５，８５９，２０５号（これらは参照により本明細書に組み入れられる）が挙げられれるが、それらに限定されない。上記の米国特許第５，５８５，０８９号および第５，６９３，７６１号および国際公開公報第９０／０７８６１号もまた、ヒト化抗体の設計に使用され得る４つの可能な基準を提案する。最初の提案は、アクセプターとして、ヒト化しようとするドナー免疫グロブリンに珍しく相同である特定のヒト免疫グロブリンからのフレームワークを使用、または多くのヒト抗体からの共通フレームワークを使用することであった。第２の提案は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク中のアミノ酸が普通ではなく、その位置のドナーアミノ酸がヒト配列に典型的なものである場合、アクセプターではなくドナーアミノ酸が選択され得る。第３の提案は、ヒト化免疫グロブリン鎖の３つのＣＤＲのすぐ隣の位置において、アクセプターアミノ酸ではなくドナーアミノ酸が選択され得ることであった。第４の提案は、アミノ酸が、３次元抗体モデルのＣＤＲの３Ａ以内に側鎖原子を有することが予測され、そしてＣＤＲと相互作用することができると予測されるフレームワーク位置においてドナーアミノ酸残基を使用することであった。上記の方法は、当業者がヒト化抗体を作製するために使用することができるいくつかの方法の単なる例である。当業者は、抗体ヒト化のための他の方法を知っているだろう。
【００２０】
ヒト化形の抗体の１つの態様において、ＣＤＲ領域外のいくつか、大半、または全てのアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸で置換されているが、１つ以上のＣＤＲ領域内のいくつか、大半または全てのアミノ酸は不変である。抗体が所与の抗原に結合する能力を消失しない限り、アミノ酸の少数の付加、欠失、挿入、置換または修飾が許容される。適切なヒト免疫グロブリン分子としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＭ分子が挙げられる。「ヒト化」抗体は、元来の抗体と類似した抗原特異性を保持する。しかしながら、特定のヒト化法を使用して、抗体の結合の親和性および／または特異性を、Wu et al., /. Mol. Biol. 294:151, 1999に記載されているように（その内容は本明細書に参照により組み入れられる）、「指向的進化」法を使用して増加させることができる。
【００２１】
完全ヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の部位の大部分についてトランスジェニックであるマウスを免疫化することによって調製することができる。例えば、米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５９８，３６９号、第５，５４５，８０６号、第５，５４５，８０７号、第６，１５０，５８４号、およびそこに引用されている参考文献（その内容は本明細書に参照により組み入れられる）を参照されたい。これらの動物は、内因性（例えばマウス）抗体の産生が機能的に欠失するように遺伝子的に改変されている。動物はヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むようにさらに改変され、よってこれらの動物の免疫化により対象の抗原に対する完全ヒト抗体の産生がなされる。これらのマウス（例えば、XenoMouse (Abgenix)、HuMAbマウス(Medarex/GenPharm)）の免疫化後、モノクローナル抗体を、標準的なハイブリドーマ技術に従って調製することができる。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、それ故、ヒトに投与した場合、ヒト抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）応答を誘起しない。
【００２２】
ヒト抗体を産生するためのin vitroの方法も存在する。これらとしては、ファージディスプレイ技術（米国特許第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号）およびin vitroにおけるヒトＢ細胞の刺激（米国特許第５，２２９，２７５号および第５，５６７，６１０号）が挙げられる。これらの特許の内容は本明細書に参照により組み入れられる。
【００２３】
従って、当業者には明らかであるように、本発明はまた、Ｆ（ａｂ’）２Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄフラグメント；Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同的ヒトまたは非ヒト配列によって置換されているキメラ抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同的ヒトまたは非ヒト配列によって置換されているキメラＦ（ａｂ’）２フラグメント抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同的ヒトまたは非ヒト配列によって置換されているキメラＦａｂフラグメント抗体；並びに、ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が、相同的ヒトまたは非ヒト配列によって置換されているキメラＦｄフラグメント抗体を提供する。本発明はまた、いわゆる一本鎖抗体を含む。
【００２４】
種々の抗体分子およびフラグメントは、ＩｇＡ、分泌ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むがそれらに限定されない、一般的に知られている免疫グロブリンクラスのいずれかに由来し得る。ＩｇＧサブクラスも当業者には周知であり、そしてこれにはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が挙げられるがそれらに限定されない。
【００２５】
別の態様において、本発明による抗体は、単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）または「ＶＨＨ」という用語は、軽鎖を天然的に欠失しているラクダ科哺乳動物に見られる種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このようなＶＨＨはまた、「ナノバディ（商標）」と呼ばれる。本発明によると、ｓｄＡｂは特にラマｓｄＡｂであり得る。
【００２６】
本明細書において使用した「アプタマー」という用語は、分子認識の点で抗体の代替物を示すクラスの分子を指す。アプタマーは、高い親和性および特異性で実質的にあらゆるクラスの標的分子を認識する能力を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチド配列である。従って、「抗Ｓ１００Ｂアプタマー」という用語は、Ｓ１００Ｂに対して指向されるアプタマーを指す。
【００２７】
アプタマーは、ランダム配列ライブラリーのSystematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX)を通して単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって得ることができる。
【００２８】
「Ｓ１００Ｂ遺伝子発現の阻害剤」は、Ｓ１００Ｂ遺伝子の発現を阻害または有意に低減させる生物学的効果を有する天然または合成の化合物を指す。
【００２９】
本発明に使用するための発現阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物に基づき得る。アンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子を含む）は、Ｓ１００ＢｍＲＮＡに結合することによってＳ１００ＢｍＲＮＡの翻訳を直接的に遮断するように作用し、従って、タンパク質の翻訳を妨げるか、またはｍＲＮＡの分解を増加させ、従って、細胞中のＳ１００Ｂのレベルを、従ってその活性を減少させる。例えば、少なくとも約１５塩基で、Ｓ１００ＢをコードするｍＲＮＡ転写物配列の独特な領域に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば従来のホスホジエステル技術によって合成することができ、そして例えば静脈内注射または点滴によって投与することができる。配列が知られている遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技術を使用するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；第６，５６６，１３１号；第６，３６５，３５４号；第６，４１０，３２３号；第６，１０７，０９１号；第６，０４６，３２１号；および第５，９８１，７３２号を参照されたい）。
【００３０】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）はまた、本発明に使用するための発現阻害剤として機能することができる。被験者もしくは細胞を、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、または低分子二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクターもしくは構築物と接触させ、よってＳ１００Ｂの遺伝子発現を特異的に阻害する（すなわちＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ）ことによってＳ１００Ｂ遺伝子発現を減少させることができる。適切なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択する方法は、配列が知られている遺伝子については当技術分野において周知である（例えば、Tuschl, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002);米国特許第６，５７３，０９９号および第６，５０６，５５９号;および国際特許公開公報第ＷＯ０１／３６６４６号、国際特許公開公報第ＷＯ９９／３２６１９号、および国際特許公開公報第ＷＯ０１／６８８３６参照）。本発明のｓｉＲＮＡのホスホジエステル結合の全部または一部が有利には保護される。この保護は、一般的に、当技術分野において公知の方法を使用して化学的経路を介して実行される。ホスホジエステル結合は、例えば、チオールまたはアミン官能基またはフェニル基によって保護され得る。本発明のｓｉＲＮＡの５’および／または３’末端もまた、例えば、ホスホジエステル結合を保護するために上記された技術を使用して有利には保護される。ｓｉＲＮＡ配列は有利には、少なくとも１２個連続したジヌクレオチドまたはその誘導体を含む。
【００３１】
本明細書に使用した本核酸配列に関する「ｓｉＲＮＡ誘導体」という用語は、エリスロポエチンまたはそのフラグメントに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、一例として少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９８％の同一率を有する核酸を指す。
【００３２】
本明細書に使用した２つの核酸配列間の「同一率」は、前記配列の最良のアラインメントを用いて得られた、比較しようとする２つの配列間の同一核酸の比率を意味し、この比率は純粋に統計学的であり、そしてこれらの２つの配列間の差異は、核酸配列全体にランダムに広がっている。本明細書に使用した「最良のアラインメント」または「最適なアラインメント」は、決定された同一率（以下参照）が最も高いアラインメントを意味する。２つの核酸配列間の配列比較は、通常、最良のアラインメントに従って以前にアラインさせておいたこれらの配列を比較することによって実現され；この比較は、局所の同一性領域を同定および比較するために比較セグメント上で実現される。比較を実施するための最良の配列アラインメントは、マニュアル方法の他に、ＳＭＩＴＨおよびＷＡＴＥＲＭＡＮ（Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981）によって開発されたグローバル相同性アルゴリズムを使用することによって、ＮＥＤＤＬＥＭＡＮおよびＷＵＮＳＣＨ（J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970）によって開発された局所相同性アルゴリズムを使用することによって、ＰＥＡＲＳＯＮおよびＬＩＰＭＡＮ（Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988）によって開発された類似法を使用することによって、このようなアルゴリズム（Wisconsin Genetics software PackageのGAP、BESTFIT、BLAST P、BLAST N、FASTA、TFASTA、Genetics Computer Group、575 Science Dr., Madison, WI USA）を使用してコンピューターソフトウェアを使用することによって、ＭＵＳＣＬＥマルチプルアラインメントアルゴリズム（Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004）を使用することによって実現することができる。最善の局所アラインメントを得るために、好ましくはＢＬＡＳＴソフトウェアを使用することができる。２つの核酸配列間の同一率は、最適にアラインさせたこれら２つの配列を比較することによって決定され、前記核酸配列は、これら２つの配列間の最適なアラインメントを得るために参照配列に関して付加または欠失を含むことができる。同一率は、これら２つの配列間の同一位置の数を決定し、そしてこの数字を、比較した位置の総数で割り、そして得られた結果に１００を乗じ、これら２つの配列間の同一率を得ることによって計算される。
【００３３】
ｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）はまた、本発明に使用するための発現阻害剤として機能することができる。
【００３４】
リボザイムはまた、本発明に使用するための発現阻害剤として機能することができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することのできる酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機序は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、その後のエンドヌクレオチド鎖切断を含む。よって、Ｓ１００ＢｍＲＮＡ配列のエンドヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効率的に触媒する工学操作されたヘアピンまたはハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内で有用である。任意の可能性あるＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位はまず、標的分子をリボザイム切断部位（これは、典型的には、以下の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含む）について走査することによって同定される。一旦同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する約１５〜２０のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切なものとし得る二次構造などの予測される構造特徴について評価することができる。
【００３５】
発現阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの両方を公知の方法によって調製することができる。これらとしては、例えば、固相ホスホルアマダイト化学合成などの化学合成技術が挙げられる。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitroまたはin vivoの転写によって生成することができる。このようなＤＮＡ配列を、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ多種多様なベクターに組み込むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドの種々の改変を、細胞内での安定性および半減期を増加させる手段として導入することができる。可能な改変としては、分子の５’および／または３’末端へのリボヌクレオチドまたはデスオキシオリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、あるいはオリゴヌクレオチド骨格内におけるホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは２’−Ｏ−メチルの使用が挙げられるがそれらに限定されない。
【００３６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびリボザイムは、in vivoにおいて単独でまたはベクターと共に送達され得る。その最も広い意味において、「ベクター」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはリボザイム核酸の、細胞への、好ましくはＳ１００Ｂを発現している細胞への導入を促進することのできる任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在下でもたらされる分解の程度と比較して低減された分解を伴って、細胞に核酸を輸送する。一般的に、本発明において有用なベクターとしては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはリボザイム核酸配列の挿入または組込みによって操作されたプラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス源または細菌源に由来する他のビヒクルが挙げられるがそれらに限定されない。ウイルスベクターが好ましいタイプのベクターであり、そしてこれらは、以下のウイルスからの核酸配列を含むがそれらに限定されない：レトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス：エプシュタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；およびＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルス。命名されていないが当技術分野において公知である他のベクターも容易に使用することができる。
【００３７】
好ましいウイルスベクターは、必須ではない遺伝子が対象の遺伝子で置換されている非細胞変性真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスとしては、レトロウイルス（例えばレンチウイルス）が挙げられ、その生活環は、ゲノムウイルスＲＮＡからＤＮＡへの逆転写、その後の、宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルスの組込みを含む。レトロウイルスはヒト遺伝子療法試験に認可されている。最も有用なのは、複製欠損であるレトロウイルスである（すなわち、所望のタンパク質の合成を指令することができるが、感染性粒子を製造することはできない）。このような遺伝子的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、in vivoにおける遺伝子の高効率の導入に全般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的なプロトコール（外来性遺伝子材料をプラスミドに組込む工程、プラスミドを用いてパッケージング細胞系をトランスフェクションする工程、パッケージング細胞系によって組換えレトロウイルスを産生する工程、組織培養培地からウイルス粒子を収集する工程、およびウイルス粒子を用いて標的細胞を感染させる工程を含む）は、Kriegler, 1990およびMurry, 1991によって提供される。
【００３８】
特定の適用のために好ましいウイルスは、アデノウイルスおよびアデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスであり、これは遺伝子療法のヒトへの使用のためにすでに認可されている二本鎖ＤＮＡウイルスである。実際に１２個の異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜１２）が知られており、各々が異なる組織指向性を有する（Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27）。組換えＡＡＶは、依存的パルボウイルスＡＡＶ２に由来する（Choi, VW J Virol 2005; 79:6801-07）。アデノ随伴ウイルス１〜１２型は、複製欠損となるように工学操作され得、そして多種多様な細胞型および細胞腫に感染することができる（Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27）。それはさらに、熱および脂質溶媒に対する安定性；造血細胞を含む多様な系統の細胞における高形質導入頻度；および複数回の形質導入を可能とする重複感染の阻害がないことなどの利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的にヒト細胞ＤＮＡに組み込まれ得、これにより、レトロウイルス感染に特徴的である挿入突然変異誘発の可能性および挿入遺伝子発現のばらつきは最小限となる。さらに、選択圧の非存在下で組織培養液中において１００継代を超える野生型アデノ随伴ウイルス感染が起こり、このことは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組込みが、比較的安定した事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外で機能することができる。
【００３９】
他のベクターとしてはプラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは、当技術分野において十分に記載されており、そして当業者には周知である。例えばSambrook et al., 1989を参照されたい。過去数年間において、プラスミドベクターは、in vivoにおいて抗原をコードする遺伝子を細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されてきた。それらは、このために特に利点がある。なぜなら、それらは、多くのウイルスベクターと同じ安全性の懸念を有さないからである。しかしながら、宿主細胞と適合性であるプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内に作動可能にコードされる遺伝子からペプチドを発現することができる。いくつかの一般的に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは当業者に周知である。さらに、プラスミドは、ＤＮＡの特定のフラグメントを除去および付加する制限酵素およびライゲーション反応を使用してカスタム設計され得る。プラスミドは、種々の非経口、粘膜および局所経路によって送達され得る。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、または他の経路によって注射され得る。それはまた、鼻腔用スプレーまたは液滴、直腸用坐剤および経口によって投与され得る。それはまた、遺伝子銃を使用して表皮または粘膜表面に投与され得る。プラスミドは、水溶液中に与えられても、金粒子上に乾燥されても、または別のＤＮＡ送達システム（リポソーム、デンドリマー、コクリエートおよびマイクロカルセル化を含むがそれらに限定されない）と合わせられていてもよい。
【００４０】
好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはリボザイム核酸配列は、異種調節領域の制御下、例えば異種プロモーターの制御下にある。プロモーターは、ミューラーグリア細胞、マイクログリア細胞、内皮細胞、周皮細胞およびアストロサイトに特異的であり得る。例えば、ミューラーグリア細胞における特異的発現は、グルタミンシンターゼ遺伝子のプロモーターを通して得られることが適切である。プロモーターはまた、例えばウイルスプロモーター、例えばＣＭＶプロモーターまたは任意の合成プロモーターであり得る。
【００４１】
本発明によると、「気道過敏症（airway hyperresponse）」すなわち「ＡＨＲ」は、アレルゲンおよび運動などの多くの環境トリガーに対する過剰な気道狭窄応答からなる気道の異常を指す。ＡＨＲは、炎症または気道リモデリングによって引き起こされた呼吸器系の機能的変化であり得る。気道過敏症は、コラーゲンの沈着、気管支痙攣、気道平滑筋肥大、気道平滑筋収縮、粘液分泌、細胞沈着物、上皮破壊、上皮透過性の変化、平滑筋機能もしくは感受性の変化、肺実質の異常、並びに／または気道内および気道周辺の浸潤性疾患によって引き起こされ得る。これらの多くの要因は、炎症と関連し得る。本発明は、気道の炎症を伴う気道過敏症を含む、あらゆる気道過敏症（例えば好酸球増加症および炎症性サイトカインの産生）に関する。
【００４２】
本明細書に使用した「気道過敏症を低減」は、気道過敏症のあらゆる測定可能な低減および／または被験者に気道過敏症が起こる発生または頻度のあらゆる低減を指す。好ましくは、気道過敏症は、最適には、被験者がもはや不快感に苦しまず、および／または気道過敏症から生じるもしくはそれに伴う機能の変化に苦しまない程度まで低減される。ＡＨＲの低減は、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して測定され得る。呼吸器機能は、例えば、スパイロメトリー、プレチスモグラフィー、最大流量、症状スコア、身体的徴候（すなわち呼吸数）、喘鳴、運動耐容能、レスキュー薬物（すなわち気管支拡張剤）の使用および血液ガスによって測定され得る。
【００４３】
特定の態様において、気道過敏症は、アレルギー性炎症を伴う。
【００４４】
特定の態様において、被験者は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性気管支肺アルペルギルス症、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、肺気腫、気管支炎、アレルギー性気管支炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、結核、過敏性肺炎、職業性喘息、サルコイド、反応性気道疾患症候群、間質性肺疾患、好酸球増加症候群、鼻炎、副鼻腔炎、運動誘発性喘息、汚染物質により誘発される喘息、および肺寄生虫症からなる群より選択された気道疾患に患う。好ましくは、被験者は、喘息、気道の慢性閉塞性疾患、職業性喘息、運動により誘発される喘息、汚染物質により誘発される喘息、および反応性気道疾患症候群（気道の慢性閉塞疾患を含む）を患う。被験者はまた、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、ライノウイルス（ＲＶ）またはアデノウイルスによって引き起こされる感染などのウイルス感染を伴う気道過敏症を患い得る。
【００４５】
本発明の薬剤は、以下に定義したような薬学的組成物の形態で投与され得る。好ましくは、治療有効量の前記薬剤。「治療有効量」によって、任意の医学的処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比でＡＨＲを処置するに十分な薬剤の量を意味する。
【００４６】
薬剤または薬剤を含む薬学的組成物の１日総投与量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当の医師によって決定されることが理解されるだろう。任意の特定の被験者に対する特定の治療有効投与量レベルは、処置する疾患および疾患の重度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成物、被験者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食事；使用される具体的な薬剤の投与時刻、投与経路、および排泄速度；処置の期間；使用される具体的な薬剤と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；および医学分野において周知の同様な因子を含む、多種多様な因子に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで薬剤の投与量を開始し、そして所望の効果が達成されるまで投与量を次第に増加させることは十分に当業者の技能範囲内であろう。しかしながら、薬剤の１日量は、成人１人あたり１日あたり、０．０１〜１，０００mgまでの幅広い範囲で変化し得る。好ましくは、前記組成物は、処置される被験者への投与量の症状による調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０および５００mgの薬剤を含む。薬物は、典型的には、約０．０１mgから約５００mgの活性成分、好ましくは１mgから約１００mgの活性成分を含む。有効量の薬物は、通常、１日あたり０．０００２mg/kg（体重）から約２０mg/kg（体重）、特に１日あたり約０．００１mg/kg（体重）から７mg/kg（体重）の投与量レベルで供給される。
【００４７】
従って、本発明の薬剤は、薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルをさらに含む薬学的組成物へと製剤化することができる。１つの態様において、本発明は、上記した本発明の薬剤、および薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルを含む、薬学的組成物に関する。１つの態様において、本発明は、有効量の本発明の薬剤または薬学的に許容されるその塩および薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルを含む薬学的組成物である。薬学的に許容される担体としては、例えば、目的の投与形に関して適切に選択され、そして慣用的な薬務に対して矛盾のない薬学的な希釈剤、賦形剤または担体を含む。
【００４８】
薬学的に許容される担体は、薬剤の生物学的活性を不当に阻害しない不活性な成分を含み得る。薬学的に許容される担体は、生体適合性であるべきであり、例えば、被験者への投与時に、無毒性であるか、非炎症性であるか、非免疫原性であるか、または他の望ましくない反応または副作用がない。標準的な製薬技術を使用することができる。
【００４９】
本明細書に使用される薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルは、所望の特定の剤形に適した、任意および全ての溶媒、希釈剤または他の液体ビヒクル、分散化または懸濁化補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤、潤滑剤などを含む。Remington's Pharmaceutical Sciences、第１６版、E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980)は、薬学的に許容される組成物の製剤化に使用される種々の担体、およびその調製のための公知の技術を開示する。あらゆる望ましくない生物学的作用を生じることによって、またはさもなくば薬学的に許容される組成物の任意の他の成分と有害に相互作用することなどによって、任意の慣用的な担体媒体が本明細書に記載の化合物と不適合性でない限り、その使用は、本発明の範囲内であると考えられる。
【００５０】
薬学的に許容される担体として作用することのできる材料のいくつかの例としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えばヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えばｔｗｉｎ８０、ホスフェート、グリシン、ソルビン酸、またはソルベート酸カリウム）、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、または亜鉛塩など）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、羊毛脂、糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；デンプン、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース；トラガカント末：麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばココアバターおよび坐剤ワックス；油、例えばピーナッツ油、綿実油；紅花油；ゴマ油；オリーブ油；コーン油および大豆油；グリコール；例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコール；エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天：緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンガー液；エチルアルコール；およびリン酸緩衝溶液、並びに、他の無毒性で適合性の潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、解除剤、コーティング剤、甘味剤、香料および芳香剤、保存剤および抗酸化剤もまた、製剤者の判断に従って、前記組成物に存在し得る。
【００５１】
本明細書に記載された組成物は、経口で、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸に、鼻腔に、頬側に、膣内に、または埋め込まれたレザバーを介して、処置される気道過敏症の重度に依存して投与され得る。本明細書に使用される「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、滑膜内、胸骨内、クモ膜下腔内、肝臓内、病巣内、および頭蓋内への注射または点滴技術を含むがそれらに限定されない。
【００５２】
本明細書に記載された組成物の無菌注射剤形は、水性または油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して当技術分野において公知の技術に従って製剤化され得る。無菌注射製剤はまた、例えば１，３−ブタンジオール溶液などの無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射溶液または懸濁液であり得る。使用され得る許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として慣用的に使用される。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性の不揮発性油を使用し得る。脂肪酸、例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体が、天然の薬学的に許容される油、例えばオリーブ油またはヒマシ油、特にそのポリオキシエチル化形と同様に、注射液の調製に有用である。これらの油性溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、例えばカルボキシメチルセルロース、あるいは薬学的に許容される剤形（エマルションおよび懸濁液を含む）の製剤に一般的に使用される類似の分散剤を含み得る。他の一般的に使用される界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎｓ、Ｓｐａｎｓおよび他の乳化剤またはバイオアベイラビリティ増強剤（これは、薬学的に許容される固体、液体または他の剤形の製造に一般的に使用される）もまた、製剤化の目的に使用され得る。
【００５３】
本明細書に記載された薬学的組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤または液剤を含むがそれらに限定されない、任意の経口的に許容される剤形で経口投与され得る。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用される担体としては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられるがそれらに限定されない。潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムも典型的には添加される。カプセル形での経口投与のために有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液が経口使用のために必要とされる場合、薬剤を、乳化剤および懸濁化剤と合わせる。所望であれば、特定の甘味剤、香料または着色剤も添加され得る。
【００５４】
あるいは、本明細書に記載された薬学的組成物は、直腸投与のための坐剤形で投与され得る。これらは、薬剤を、室温で固体であるが直腸温度で液体であり、それ故、直腸で融解して薬物を放出する適切な非刺激性の賦形剤と混合することによって調製することができる。このような材料としては、ココアバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５５】
薬学的組成物はまた、気道に投与され得る。肺内送達組成物は、被験者による分散剤の吸入により送達され得、よって分散剤内の薬剤は、肺に到達することができ、そこで、例えば、肺胞領域を通して直接的に血液循環中へと容易に吸収され得る。肺内送達は、噴霧化製剤、エアロゾル化製剤、ミセル製剤、およびドライパウダーに基づいた製剤の使用を含む、種々のアプローチによって達成することができ；吸入による投与は経口および／または鼻腔であり得る。送達は、液体噴霧器、エアロゾルに基づいた吸入器、およびドライパウダー分散器具を用いて達成され得る。定量器具が好ましい。噴霧器または吸入器を使用する利点の１つは、汚染の可能性が、器具が自己完結型であるために最小限であることである。ドライパウダー分散器具は、例えば、ドライパウダーとして容易に製剤化され得る薬物を送達する。本発明の薬学的組成物は、単独で、または適切な粉末担体と組み合わせて、凍結乾燥または噴霧乾燥された粉末として安定に保存され得る。本発明の吸入用薬学的組成物の送達は、タイマー、投与量計測器、時間測定器具、または時間表示（器具に取り込まれると、エアロゾル薬物の投与中の、投与量の追跡、コンプライアンスモニタリングおよび／または被験者への投与量のトリガーを可能とする）を含み得る投与タイミングエレメントによって媒介され得る。エアロゾル送達のための薬学的器具の例としては、定量吸入器（ＭＤＩ）、ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）および空気ジェット噴霧器が挙げられる。
【００５６】
本発明のさらなる目的は、被験者から得られた生物学的試料中のＳ１００Ｂタンパク質のレベルを決定することを含む、被験者が気道過敏症を有するまたは発症するリスクがあるかどうかを決定するための方法に関する。
【００５７】
本明細書に使用したような生物学的試料という用語は、被験者が気道過敏症を有するまたは発症するリスクがあるかどうかを決定する目的のために患者から得られた任意の試料を包含する。典型的には、前記生物学的試料は、血液試料または気管支肺胞洗浄液試料であり得る。
【００５８】
生物学的試料中のＳ１００Ｂのレベルの決定は、種々の技術によって実施され得る。典型的には、レベルの決定は、試料を、Ｓ１００Ｂに対して指向される結合対と接触させ、これにより精液試料中のＳ１００Ｂの存在を検出またはＳ１００Ｂの量を測定することを含む。本明細書に使用したような「結合対」という用語は、高い親和性でバイオマーカーに結合することのできる任意の分子（天然または非天然）を指す。前記結合対としては、抗体またはアプタマーが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５９】
抗体またはアプタマーなどの本発明の結合対は、検出可能な分子または物質を用いて、例えば優先的には蛍光分子、または放射性分子、または当技術分野において公知の任意の他の標識を用いて標識され得る。シグナルを一般的に与える（直接的にまたは間接的にのいずれかで）標識は当技術分野において公知である。本明細書に使用したような抗体またはアプタマーに関する「標識された」という用語は、抗体またはアプタマーへのフルオロフォア［例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）またはヨードシアニン（Ｃｙ５）］または放射性薬剤などの検出可能な物質の結合（すなわち物理的に連結）による抗体またはアプタマーの直接的な標識、並びに、検出可能な物質との反応性によるプローブまたは抗体の間接的な標識を包含することを意図する。本発明の抗体またはアプタマーは、当技術分野において公知の任意の方法によって放射性分子で標識され得る。例えば、放射性分子としては、Ｉ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８などのシンチグラフィー研究のための放射性原子が挙げられるがそれらに限定されない。
【００６０】
接触は、プレート、マイクロタイターディッシュ、試験管、ウェル、ガラス、カラムなどの任意の適切な器具において実施され得る。特定の態様において、接触は、結合対でコーティングされた基材上で実施される。基材は固体または半固体基材、例えばガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマーなどを含む任意の適切な支持体であり得る。基材は、種々の形状およびサイズであり得、例えば、スライド、膜、ビーズ、カラム、ゲルなどであり得る。接触は、抗体−抗原複合体などの検出可能な複合体が、結合対と試料のバイオマーカーとの間で形成されるに適した任意の条件下で行われ得る。
【００６１】
Ｓ１００Ｂの存在は、競合、直接反応またはサンドイッチ型アッセイなどのイムノアッセイを含む、標準的な電気泳動技術および免疫診断技術を使用して検出することができる。このようなアッセイとしては、ウェスタンブロット；凝集検査；酵素標識および媒介イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動法；免疫沈降法などが挙げられるがそれらに限定されない。反応は、一般的に、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識または色素分子などの顕現させる標識、または抗原とそれと反応する抗体との間の複合体の形成を検出するための他の方法を含む。
【００６２】
前記のアッセイは、一般的に、抗原−抗体複合体が結合した固相支持体からの、液相中の非結合タンパク質の分離を含む。本発明の実施に使用することのできる固相支持体は、基材、例えばニトロセルロース（例えば膜またはマイクロタイターウェル形）；ポリビニルクロリド（例えばシーツまたはマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えばビーズまたはマイクロタイタープレート）；フッ化ポリビニリデン；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性化ビーズ、磁気応答性ビーズなどを含む。
【００６３】
より特定すると、ＥＬＩＳＡ法を使用することができ、マイクロタイタープレートのウェルは、試験しようとするタンパク質に対する抗体でコーティングされている。その後、マーカータンパク質を含むまたは含むことが疑われる生物学的試料を、コーティングされたウェルに加える。抗体−抗原複合体の形成を可能とするに十分なインキュベーション期間の後、プレートを洗浄して、非結合部分および加えられた検出可能となるように標識された二次結合分子を除去することができる。二次結合分子を、任意の捕捉された試料マーカータンパク質と反応させ、プレートを洗浄し、そして二次結合分子の存在を当技術分野において周知の方法を使用して検出する。
【００６４】
本発明の方法はさらに、Ｓ１００Ｂの発現レベルを基準値と比較することからなる工程を含み得、試料で決定された発現レベルと基準値との差異の検出は、被験者が気道過敏症を有するまたは発症するリスクがあるかどうかを示す。
【００６５】
１つの態様において、基準値は指標値であり得るか、または気道過敏症事象に関する１つ以上のリスク予測アルゴリズムまたはコンピューターで計算された指標から導かれ得る。基準値は、類似の肥満度指数を有する被験者、同じまたは類似した年齢範囲の被験者、同じまたは類似した民族群の被験者、気道疾患の家族歴を有する被験者などを含むがそれらに限定されない集団の研究から導かれた数字または数値に関するものであり得るか、あるいは、気道過敏症を生じ得る気道疾患の処置を受けている被験者の出発試料に関するものであり得る。本発明の１つの態様において、基準値は、実質的に健康である１人以上の被験者（すなわち、気道過敏症を有さない被験者）から得られた対照試料中のＳ１００Ｂのレベルから導かれる。実質的に健康であるこのような被験者は、気道過敏症についての伝統的なリスク因子を欠失している：例えば、習慣的ではない喫煙者、気道疾患の診断歴がない。別の態様において、このような被験者は、気道過敏症事象の存続していないことを確認するためのこのような検査の後、診断的に関連した期間についてモニタリングおよび／または周期的に再検査される（「縦断的研究」）。このような期間は、基準値を決定する最初の検査日から１年間、２年間、２〜５年間、５年間、５〜１０年間、１０年間、または１０年間以上であり得る。さらに、適切に預けられた歴史的被験者試料のＳ１００Ｂレベルの遡及的測定を、これらの基準値を確立する際に使用し得、従って、必要とされる試験時間は短縮され、被験者は、対象の物クレームの範囲を通して、中断期間中も適切に追跡されると推定される。典型的には、気道過敏症のリスクがある被験者のＳ１００Ｂレベルは、一般集団からまたは健康被験者から得られた基準値より高いと推定される。
【００６６】
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例および図面は、いずれにしても、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１Ａ】ｗｔマウスへのＬＰＳの滴下注入後の肺および血清におけるＳ１００Ｂタンパク質の出現の動態。５匹のマウスの群にＬＰＳ（１０μg）を滴下注入し、そして種々の時点（０分後、３０分後、２時間後、４時間後、および６時間後）で麻酔した。炎症の出現を、肺（Ｂ）および血清（Ｃ）における好中球の動員（Ａ）、ＩＬ６、ＴＮＦ−αおよびＳ１００ｂの濃度（μg/ml）を測定することによって制御した。ＬＰＳは、３０分後までに肺において（Ｃ）４時間後までに血清においてＳ１００Ｂの産生を誘発した。全ての結果は平均±ｓｅｍによって表現された。
【図１Ｂ】ｗｔマウスへのＬＰＳの滴下注入後の肺および血清におけるＳ１００Ｂタンパク質の出現の動態。５匹のマウスの群にＬＰＳ（１０μg）を滴下注入し、そして種々の時点（０分後、３０分後、２時間後、４時間後、および６時間後）で麻酔した。炎症の出現を、肺（Ｂ）および血清（Ｃ）における好中球の動員（Ａ）、ＩＬ６、ＴＮＦ−αおよびＳ１００ｂの濃度（μg/ml）を測定することによって制御した。ＬＰＳは、３０分後までに肺において（Ｃ）４時間後までに血清においてＳ１００Ｂの産生を誘発した。全ての結果は平均±ｓｅｍによって表現された。
【図１Ｃ】ｗｔマウスへのＬＰＳの滴下注入後の肺および血清におけるＳ１００Ｂタンパク質の出現の動態。５匹のマウスの群にＬＰＳ（１０μg）を滴下注入し、そして種々の時点（０分後、３０分後、２時間後、４時間後、および６時間後）で麻酔した。炎症の出現を、肺（Ｂ）および血清（Ｃ）における好中球の動員（Ａ）、ＩＬ６、ＴＮＦ−αおよびＳ１００ｂの濃度（μg/ml）を測定することによって制御した。ＬＰＳは、３０分後までに肺において（Ｃ）４時間後までに血清においてＳ１００Ｂの産生を誘発した。全ての結果は平均±ｓｅｍによって表現された。
【図２Ａ】Ｓ１００ｂ＋／−およびＳ１００ｂ−／−マウスにおける気道過敏症の評価。対照食塩水（ＮａＣｌ）溶液の鼻腔内投与は、Ｓ１００ｂ＋／−（Ａ）およびＳ１００ｂ−／−（Ｂ）のいずれのｗｔにおいてもＰｅｎＨに影響を及ぼさなかった。実験は、各条件につき５匹のマウスを用いて２回実施した。１コピーのＳ１００Ｂ遺伝子の欠失は、ＰｅｎＨ値（Ａ）を減少させる傾向があったが、これらの数値は、Ｓ１００ｂ−／−マウス（Ｂ）においては有意に減少した。肺炎症は、ＢＡＬＦへの好中球（Ｃ）、ＩＬ６、およびＴＮＦ−αサイトカイン（Ｄ）の動員、並びに、ミエロペルオキシダーゼ活性（ＭＰＯ）によって測定された。ＮａＣｌはどのパラメーターにも影響を及ぼさなかった。ＬＰＳの細胞および炎症応答は、ｗｔに比べてヘテロ接合体またはホモ接合体突然変異体において測定されたパラメーターについて全く改変を示さなかった。
【図２Ｂ】Ｓ１００ｂ＋／−およびＳ１００ｂ−／−マウスにおける気道過敏症の評価。対照食塩水（ＮａＣｌ）溶液の鼻腔内投与は、Ｓ１００ｂ＋／−（Ａ）およびＳ１００ｂ−／−（Ｂ）のいずれのｗｔにおいてもＰｅｎＨに影響を及ぼさなかった。実験は、各条件につき５匹のマウスを用いて２回実施した。１コピーのＳ１００Ｂ遺伝子の欠失は、ＰｅｎＨ値（Ａ）を減少させる傾向があったが、これらの数値は、Ｓ１００ｂ−／−マウス（Ｂ）においては有意に減少した。肺炎症は、ＢＡＬＦへの好中球（Ｃ）、ＩＬ６、およびＴＮＦ−αサイトカイン（Ｄ）の動員、並びに、ミエロペルオキシダーゼ活性（ＭＰＯ）によって測定された。ＮａＣｌはどのパラメーターにも影響を及ぼさなかった。ＬＰＳの細胞および炎症応答は、ｗｔに比べてヘテロ接合体またはホモ接合体突然変異体において測定されたパラメーターについて全く改変を示さなかった。
【図２Ｃ】Ｓ１００ｂ＋／−およびＳ１００ｂ−／−マウスにおける気道過敏症の評価。対照食塩水（ＮａＣｌ）溶液の鼻腔内投与は、Ｓ１００ｂ＋／−（Ａ）およびＳ１００ｂ−／−（Ｂ）のいずれのｗｔにおいてもＰｅｎＨに影響を及ぼさなかった。実験は、各条件につき５匹のマウスを用いて２回実施した。１コピーのＳ１００Ｂ遺伝子の欠失は、ＰｅｎＨ値（Ａ）を減少させる傾向があったが、これらの数値は、Ｓ１００ｂ−／−マウス（Ｂ）においては有意に減少した。肺炎症は、ＢＡＬＦへの好中球（Ｃ）、ＩＬ６、およびＴＮＦ−αサイトカイン（Ｄ）の動員、並びに、ミエロペルオキシダーゼ活性（ＭＰＯ）によって測定された。ＮａＣｌはどのパラメーターにも影響を及ぼさなかった。ＬＰＳの細胞および炎症応答は、ｗｔに比べてヘテロ接合体またはホモ接合体突然変異体において測定されたパラメーターについて全く改変を示さなかった。
【図２Ｄ】Ｓ１００ｂ＋／−およびＳ１００ｂ−／−マウスにおける気道過敏症の評価。対照食塩水（ＮａＣｌ）溶液の鼻腔内投与は、Ｓ１００ｂ＋／−（Ａ）およびＳ１００ｂ−／−（Ｂ）のいずれのｗｔにおいてもＰｅｎＨに影響を及ぼさなかった。実験は、各条件につき５匹のマウスを用いて２回実施した。１コピーのＳ１００Ｂ遺伝子の欠失は、ＰｅｎＨ値（Ａ）を減少させる傾向があったが、これらの数値は、Ｓ１００ｂ−／−マウス（Ｂ）においては有意に減少した。肺炎症は、ＢＡＬＦへの好中球（Ｃ）、ＩＬ６、およびＴＮＦ−αサイトカイン（Ｄ）の動員、並びに、ミエロペルオキシダーゼ活性（ＭＰＯ）によって測定された。ＮａＣｌはどのパラメーターにも影響を及ぼさなかった。ＬＰＳの細胞および炎症応答は、ｗｔに比べてヘテロ接合体またはホモ接合体突然変異体において測定されたパラメーターについて全く改変を示さなかった。
【図２Ｅ】Ｓ１００ｂ＋／−およびＳ１００ｂ−／−マウスにおける気道過敏症の評価。対照食塩水（ＮａＣｌ）溶液の鼻腔内投与は、Ｓ１００ｂ＋／−（Ａ）およびＳ１００ｂ−／−（Ｂ）のいずれのｗｔにおいてもＰｅｎＨに影響を及ぼさなかった。実験は、各条件につき５匹のマウスを用いて２回実施した。１コピーのＳ１００Ｂ遺伝子の欠失は、ＰｅｎＨ値（Ａ）を減少させる傾向があったが、これらの数値は、Ｓ１００ｂ−／−マウス（Ｂ）においては有意に減少した。肺炎症は、ＢＡＬＦへの好中球（Ｃ）、ＩＬ６、およびＴＮＦ−αサイトカイン（Ｄ）の動員、並びに、ミエロペルオキシダーゼ活性（ＭＰＯ）によって測定された。ＮａＣｌはどのパラメーターにも影響を及ぼさなかった。ＬＰＳの細胞および炎症応答は、ｗｔに比べてヘテロ接合体またはホモ接合体突然変異体において測定されたパラメーターについて全く改変を示さなかった。
【図３Ａ】Ｓ１００Ｂ抗体を用いての処置は、ＬＰＳ依存性気道過敏症を減少させた。５匹のマウスの群を、対照の等張ＮａＣｌ溶液、ＬＰＳまたはＬＰＳと１もしくは２mgのＳ１００Ｂ抗体で処置した。実験は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに２回実施した。１mgのＳ１００Ｂ抗体は、ＰｅｎＨ値（Ａ）を減少させるに十分であったが、応答は、２mgでより均一であった。Ｓ１００Ｂ抗体の存在は、ＬＰＳによる刺激から２４時間後、ＢＡＬＦ中の、好中球の動員（Ｂ）、ＭＰＯ活性（Ｃ）またはＴＮＦ−α（Ｄ）およびＩＬ−６（Ｅ）濃度を改変させなかった。
【図３Ｂ】Ｓ１００Ｂ抗体を用いての処置は、ＬＰＳ依存性気道過敏症を減少させた。５匹のマウスの群を、対照の等張ＮａＣｌ溶液、ＬＰＳまたはＬＰＳと１もしくは２mgのＳ１００Ｂ抗体で処置した。実験は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに２回実施した。１mgのＳ１００Ｂ抗体は、ＰｅｎＨ値（Ａ）を減少させるに十分であったが、応答は、２mgでより均一であった。Ｓ１００Ｂ抗体の存在は、ＬＰＳによる刺激から２４時間後、ＢＡＬＦ中の、好中球の動員（Ｂ）、ＭＰＯ活性（Ｃ）またはＴＮＦ−α（Ｄ）およびＩＬ−６（Ｅ）濃度を改変させなかった。
【図３Ｃ】Ｓ１００Ｂ抗体を用いての処置は、ＬＰＳ依存性気道過敏症を減少させた。５匹のマウスの群を、対照の等張ＮａＣｌ溶液、ＬＰＳまたはＬＰＳと１もしくは２mgのＳ１００Ｂ抗体で処置した。実験は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに２回実施した。１mgのＳ１００Ｂ抗体は、ＰｅｎＨ値（Ａ）を減少させるに十分であったが、応答は、２mgでより均一であった。Ｓ１００Ｂ抗体の存在は、ＬＰＳによる刺激から２４時間後、ＢＡＬＦ中の、好中球の動員（Ｂ）、ＭＰＯ活性（Ｃ）またはＴＮＦ−α（Ｄ）およびＩＬ−６（Ｅ）濃度を改変させなかった。
【図３Ｄ】Ｓ１００Ｂ抗体を用いての処置は、ＬＰＳ依存性気道過敏症を減少させた。５匹のマウスの群を、対照の等張ＮａＣｌ溶液、ＬＰＳまたはＬＰＳと１もしくは２mgのＳ１００Ｂ抗体で処置した。実験は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに２回実施した。１mgのＳ１００Ｂ抗体は、ＰｅｎＨ値（Ａ）を減少させるに十分であったが、応答は、２mgでより均一であった。Ｓ１００Ｂ抗体の存在は、ＬＰＳによる刺激から２４時間後、ＢＡＬＦ中の、好中球の動員（Ｂ）、ＭＰＯ活性（Ｃ）またはＴＮＦ−α（Ｄ）およびＩＬ−６（Ｅ）濃度を改変させなかった。
【図４Ａ】悪化したＬＰＳ応答のモデルであるＰｒｍｔ２＋／−マウスに対するＳ１００Ｂ抗体効果の特徴付け。（Ａ）ＬＰＳを滴下注入されたＰｒｍｔ２＋／−マウスは、等張食塩水溶液（ＮａＣｌ）で処置された対照マウスと比較して、悪化したＡＨＲを示した。応答は、２mgのＳ１００Ｂ抗体の投与により有意に減少した。Ｐｒｍｔ２＋／−マウスは、ｗｔマウスと比較して、ＢＡＬＦ中の、好中球動員（Ｂ）、ＭＰＯ活性（Ｃ）、並びにＴＮＦ−α（Ｄ）およびＩＬ−６（Ｅ）濃度の増加によって特徴付けられる、ＬＰＳ滴下注入後の炎症の増加を示した。Ｓ１００Ｂ抗体の投与は、増加した肺炎症応答を改変させず、肺炎症の調節におけるＰｒｍｔ２およびＳ１００Ｂの独立した役割を示唆する。全ての結果は、平均±ｓｅｍによって表現される。スチューデントｔ検定：＊Ｐ≦０．０５。
【図４Ｂ】悪化したＬＰＳ応答のモデルであるＰｒｍｔ２＋／−マウスに対するＳ１００Ｂ抗体効果の特徴付け。（Ａ）ＬＰＳを滴下注入されたＰｒｍｔ２＋／−マウスは、等張食塩水溶液（ＮａＣｌ）で処置された対照マウスと比較して、悪化したＡＨＲを示した。応答は、２mgのＳ１００Ｂ抗体の投与により有意に減少した。Ｐｒｍｔ２＋／−マウスは、ｗｔマウスと比較して、ＢＡＬＦ中の、好中球動員（Ｂ）、ＭＰＯ活性（Ｃ）、並びにＴＮＦ−α（Ｄ）およびＩＬ−６（Ｅ）濃度の増加によって特徴付けられる、ＬＰＳ滴下注入後の炎症の増加を示した。Ｓ１００Ｂ抗体の投与は、増加した肺炎症応答を改変させず、肺炎症の調節におけるＰｒｍｔ２およびＳ１００Ｂの独立した役割を示唆する。全ての結果は、平均±ｓｅｍによって表現される。スチューデントｔ検定：＊Ｐ≦０．０５。
【図４Ｃ】悪化したＬＰＳ応答のモデルであるＰｒｍｔ２＋／−マウスに対するＳ１００Ｂ抗体効果の特徴付け。（Ａ）ＬＰＳを滴下注入されたＰｒｍｔ２＋／−マウスは、等張食塩水溶液（ＮａＣｌ）で処置された対照マウスと比較して、悪化したＡＨＲを示した。応答は、２mgのＳ１００Ｂ抗体の投与により有意に減少した。Ｐｒｍｔ２＋／−マウスは、ｗｔマウスと比較して、ＢＡＬＦ中の、好中球動員（Ｂ）、ＭＰＯ活性（Ｃ）、並びにＴＮＦ−α（Ｄ）およびＩＬ−６（Ｅ）濃度の増加によって特徴付けられる、ＬＰＳ滴下注入後の炎症の増加を示した。Ｓ１００Ｂ抗体の投与は、増加した肺炎症応答を改変させず、肺炎症の調節におけるＰｒｍｔ２およびＳ１００Ｂの独立した役割を示唆する。全ての結果は、平均±ｓｅｍによって表現される。スチューデントｔ検定：＊Ｐ≦０．０５。
【図４Ｄ】悪化したＬＰＳ応答のモデルであるＰｒｍｔ２＋／−マウスに対するＳ１００Ｂ抗体効果の特徴付け。（Ａ）ＬＰＳを滴下注入されたＰｒｍｔ２＋／−マウスは、等張食塩水溶液（ＮａＣｌ）で処置された対照マウスと比較して、悪化したＡＨＲを示した。応答は、２mgのＳ１００Ｂ抗体の投与により有意に減少した。Ｐｒｍｔ２＋／−マウスは、ｗｔマウスと比較して、ＢＡＬＦ中の、好中球動員（Ｂ）、ＭＰＯ活性（Ｃ）、並びにＴＮＦ−α（Ｄ）およびＩＬ−６（Ｅ）濃度の増加によって特徴付けられる、ＬＰＳ滴下注入後の炎症の増加を示した。Ｓ１００Ｂ抗体の投与は、増加した肺炎症応答を改変させず、肺炎症の調節におけるＰｒｍｔ２およびＳ１００Ｂの独立した役割を示唆する。全ての結果は、平均±ｓｅｍによって表現される。スチューデントｔ検定：＊Ｐ≦０．０５。
【図５Ａ】Ｍｓ１ＹａｈマウスモデルにおけるＳ１００ｂの発現。（Ａ）ＢＡＬＦ中のＳ１００ｂの濃度は、対照マウスと比べて、対照およびＭｓ１Ｙａｈ突然変異マウスへのＬＰＳの全身注射から９０分後に低いことが判明した。食塩水対照溶液（ＮａＣｌ）注射（Ａ）後または血漿・血清中（Ｂ）には変化は全く観察されなかった。Ｓ１００ｂの発現は、Ｍｓ１Ｙａｈ（Ｃ）と比べて、ＬＰＳによる刺激から２時間後、Ｐｒｍｔ２突然変異マウスの肺において増加していた。スチューデントｔ検定：＊＊Ｐ≦０．０１。
【図５Ｂ】Ｍｓ１ＹａｈマウスモデルにおけるＳ１００ｂの発現。（Ａ）ＢＡＬＦ中のＳ１００ｂの濃度は、対照マウスと比べて、対照およびＭｓ１Ｙａｈ突然変異マウスへのＬＰＳの全身注射から９０分後に低いことが判明した。食塩水対照溶液（ＮａＣｌ）注射（Ａ）後または血漿・血清中（Ｂ）には変化は全く観察されなかった。Ｓ１００ｂの発現は、Ｍｓ１Ｙａｈ（Ｃ）と比べて、ＬＰＳによる刺激から２時間後、Ｐｒｍｔ２突然変異マウスの肺において増加していた。スチューデントｔ検定：＊＊Ｐ≦０．０１。
【図６Ａ】Ｓ１００ｂ中和抗体は、ＯＶＡモデルにおける肺応答を減少させた。（Ａ）好酸球の動員は、対照マウスと比べて、ＯＶＡで感作させたＢＡＬＢ／ｃＪマウス後に観察された（ｎ＝６の個体の群；２回反復）。（Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃＪの血清中のＳ１００ｂ濃度は、最後のＯＶＡ感作後に増加し、そしてメタコリン（Ｍｃｈ）は、最後のオボアルブミン注射から２４時間後にＳ１００Ｂの産生を増強した。マウスをＯＶＡで感作せず、そして中和抗体を用いてＭｃｈの１６時間前に処置した場合には、呼吸器作用は全く見られなかった。逆に、最後のＯＶＡ感作から１６時間前に注射した中和抗体は、非処置と比べて、処置マウスにおいてＰｅｎｈ値を有意に減少させた。スチューデントｔ検定：＊Ｐ≦０．０５。
【図６Ｂ】Ｓ１００ｂ中和抗体は、ＯＶＡモデルにおける肺応答を減少させた。（Ａ）好酸球の動員は、対照マウスと比べて、ＯＶＡで感作させたＢＡＬＢ／ｃＪマウス後に観察された（ｎ＝６の個体の群；２回反復）。（Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃＪの血清中のＳ１００ｂ濃度は、最後のＯＶＡ感作後に増加し、そしてメタコリン（Ｍｃｈ）は、最後のオボアルブミン注射から２４時間後にＳ１００Ｂの産生を増強した。マウスをＯＶＡで感作せず、そして中和抗体を用いてＭｃｈの１６時間前に処置した場合には、呼吸器作用は全く見られなかった。逆に、最後のＯＶＡ感作から１６時間前に注射した中和抗体は、非処置と比べて、処置マウスにおいてＰｅｎｈ値を有意に減少させた。スチューデントｔ検定：＊Ｐ≦０．０５。
【図６Ｃ】Ｓ１００ｂ中和抗体は、ＯＶＡモデルにおける肺応答を減少させた。（Ａ）好酸球の動員は、対照マウスと比べて、ＯＶＡで感作させたＢＡＬＢ／ｃＪマウス後に観察された（ｎ＝６の個体の群；２回反復）。（Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃＪの血清中のＳ１００ｂ濃度は、最後のＯＶＡ感作後に増加し、そしてメタコリン（Ｍｃｈ）は、最後のオボアルブミン注射から２４時間後にＳ１００Ｂの産生を増強した。マウスをＯＶＡで感作せず、そして中和抗体を用いてＭｃｈの１６時間前に処置した場合には、呼吸器作用は全く見られなかった。逆に、最後のＯＶＡ感作から１６時間前に注射した中和抗体は、非処置と比べて、処置マウスにおいてＰｅｎｈ値を有意に減少させた。スチューデントｔ検定：＊Ｐ≦０．０５。
【図６Ｄ】Ｓ１００ｂ中和抗体は、ＯＶＡモデルにおける肺応答を減少させた。（Ａ）好酸球の動員は、対照マウスと比べて、ＯＶＡで感作させたＢＡＬＢ／ｃＪマウス後に観察された（ｎ＝６の個体の群；２回反復）。（Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃＪの血清中のＳ１００ｂ濃度は、最後のＯＶＡ感作後に増加し、そしてメタコリン（Ｍｃｈ）は、最後のオボアルブミン注射から２４時間後にＳ１００Ｂの産生を増強した。マウスをＯＶＡで感作せず、そして中和抗体を用いてＭｃｈの１６時間前に処置した場合には、呼吸器作用は全く見られなかった。逆に、最後のＯＶＡ感作から１６時間前に注射した中和抗体は、非処置と比べて、処置マウスにおいてＰｅｎｈ値を有意に減少させた。スチューデントｔ検定：＊Ｐ≦０．０５。
【図７】ＮａＣｌ（Ａ、Ｂ、Ｄ）またはＬＰＳによる処置（Ｃ、Ｅ）の４時間後のｗｔマウスのヘマトキシリン染色肺切片に対するＳ１００ｂタンパク質の免疫組織染色（最初の倍率：Ａ：４０倍；Ｂ〜Ｅ：２０倍）。（Ａ）稀な細胞、おそらく常在肺胞マクロファージ（Ａ）は、刺激されていない肺においてＳ１００ｂ陽性であった。（Ｂ〜Ｅ）Ｓ１００Ｂを発現している細胞の数は、肺胞（Ｂ〜Ｃ）および細気管支周辺（Ｄ、Ｅ）へのＬＰＳの滴下注入後に明らかに増加した。
【００６８】
実施例１：Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｂは、ＬＰＳにより誘発された急性肺損傷およびオボアルブミンにより誘発された喘息モデルにおいて、気道応答を調節する。
序論：
喘息などの呼吸器疾患（ＲＤ）の罹患率は、過去数十年間かけて増加してきた（Umetsu et al., 2002）。病態生理をより良く理解し、重要なマーカーを同定し、そして治療戦略を試験するために、ＲＤのモデルをマウスで開発した（Matute-Bello et al., 2008; NialsおよびUddin, 2008）。従って、マウスへのリポポリ多糖（ＬＰＳ）の滴下注入は、急性肺損傷に類似した肺応答を誘発し、そしてオボアルブミン（ＯＶＡ）への感作、続いてメタコリンによる刺激が、現在、喘息をモデル化するために使用されている。そうしたＲＤモデルは、炎症応答および免疫応答をトリガーし、肺上皮細胞に対して特異的な作用を示す。
【００６９】
ＬＰＳによる刺激後、気道は過敏症を示し、これは、非侵襲的なプレチスモグラフィーによってモニタリングすることができる。マクロファージおよび好中球は、気道に動員および活性化され、そしてＴＮＦ−αおよびＩＬ−６などの炎症誘発性サイトカインが局所的に産生される。簡潔に言えば、さらなる分子を伴うまたは伴わないＬＰＳはそのレセプターであるＴＬＲ４に結合し、これにより、ＮＦ−κＢ転写因子の活性化がもたらされ、これは核へと移動し、それは核で遺伝子の転写を刺激する（Dalloneau et al., 2011a; KarinおよびBen-Neriah, 2000; TakedaおよびAkira, 2007）。古典的な経路の他に、ＬＰＳは、気管支肺胞空間におけるＡＧＥＲ、すなわち「終末糖化産物特異的レセプター」（ＲＡＧＥとも呼ばれる）の発現の増加（Uchida, 2006）、および、そのリガンドであるＳ１００カルシウム結合タンパク質Ｂ、すなわちＳ１００ｂの発現の増加（Morbini et al., 2006）を誘発する。ＡＧＥＲは、細胞表面レセプターの免疫グロブリンのスーパーファミリーに属する。ＡＧＥＲは、ＴＩＲＡＰおよびＭｙＤ８８を通してＴＬＲシグナル伝達経路と相互作用し、炎症応答および他の機能を調節する（Sakaguchi et al., 2011b）。ＡＧＥＲは、発達中に構成的に発現され、その後、その発現は、成人期に特定の組織に限定される（Brett et al., 1993; Sasaki et al., 2001）。しかしながら、その発現は肺においてより重要であり、それは、Ｉ型およびＩＩ型肺胞肺細胞、マクロファージ、および気管支上皮細胞において見られる（Cheng et al., 2005; Dahlin, 2004; Morbini et al., 2006）。
【００７０】
Ｓ１００ｂはＡＧＥＲリガンドの１つであり、そしてＣａ２＋結合特性を有する２５個のタンパク質のファミリーに属する（Donato, 2001; Donato et al., 2009）。ファミリーの他のメンバーと同様に、Ｓ１００ｂは、ヒンジ領域によって相互接続されたＥＦハンドタイプの２つのＣａ２＋結合部位およびＣ末端領域を包含する（Donato, 1999）。Ｓ１００ｂは、ホモダイマーとして（Rustandi et al., 2000）またはＳ１００ｂ／Ｓ１００ａ１ヘテロダイマーとしてのいずれかで存在する（Donato, 2001）。Ｓ１００ｂは、細胞型および微小環境に依存して、異なる転帰を有する制限された数の細胞型において発現される。細胞内Ｓ１００ｂは、細胞増殖および分化を改変し得るか（Arcuri, 2004）、微小管会合を調節するか（Donato, 1988）、ｐ５３依存性転写を調節するか（Wilder et al., 2006）、またはアポトーシスおよび分化を阻害する（Donato et al., 2009）。さらに、Ｓ１００ｂは、アストロサイトによって細胞外空間へと放出され（EldikおよびZimmer, 1987）、そしてそれはまた、血清中にも見られる（Donato et al., 2009）。細胞外因子として、Ｓ１００ｂはＡＧＥＲと相互作用し、そしてタンパク質の濃度、細胞型および微小環境に依存して有益または有害な転帰をもたらす（Donato et al., 2009）。ヒト肺においては、Ｓ１００ｂは、気管支周囲神経および間質性樹状細胞の水準で発現される（Morbini et al., 2006）。ＡＧＥＲへのＳ１００ｂの結合は内皮細胞および筋肉肺細胞、単球並びにＴリンパ球（サイトカインおよび炎症誘発性接着分子の産生に関与する）を活性化する（Donato et al., 2009; Hofmann et al., 1999; Yan et al., 2003）。
【００７１】
この研究において、本発明者らはさらに、Ｃｏｌ６ａ１−Ｐｒｍｔ２遺伝子区間の欠失を有し、そしてＬＰＳによる刺激後により強い炎症応答および阻害された気道過敏症（ＡＨＲ）を示す、Ｍｓ１Ｙａｈマウスの分析を続けた（Besson et al., 2007）。本発明者らは、ＬＰＳにより誘発されたＭｓ１Ｙａｈの表現型よりも強く正反対である応答である悪化した炎症応答およびＡＨＲにおける、Ｐｒｍｔ２の役割を実証した（Dalloneau et al., 2011a）。本発明者らは、マウスへのＬＰＳの滴下注入後に肺および血清において産生されるＳ１００ｂを用いて新規候補を発見した。従って、本発明者らは、ノックアウトアプローチを使用することによって、または中和抗体を用いてのいずれかによって、Ｓ１００ｂの機能を改変させる結果を研究し、そして本発明者らは、Ｓ１００ｂが、ＬＰＳにより誘発されるＡＨＲの制御における重要なプレーヤーであることを発見した。さらに、本発明者らは、中和抗体による処置が、ＯＶＡ感作喘息モデルにおけるメタコリン誘発気道反応性を減少させたことを実証した。これらの観察は、Ｓ１００ｂを、気管支反応性亢進を調節するカスケードの主な寄与因子と見なし、そして急性肺損傷および喘息を含むＲＤを処置するための可能性ある治療戦略としてのＳ１００ｂ遮断を強調した。
【００７２】
材料および方法
マウス株
Ｓ１００ｂのエキソン２（ＡＴＧ翻訳開始コドンを含む）の欠失およびネオマイシン耐性（ｎｅｏ）選択カセットで置換されたそのフランキング５’および３’イントロン配列を有する、Ｓ１００Ｂ＋／−マウスがXiong et al. (44)によって記載された。野生型および突然変異体Ｓ１００ｂ対立遺伝子の存在は、２つの対のプライマーを用いて標準的な条件でＰＣＲによって同定された。Ｐｒｍｔ２およびＭｓ１Ｙａｈ突然変異マウスは以前に記載されている（Besson et al., 2007; Dalloneau et al., 2011b; Yoshimoto et al., 2006）。
【００７３】
ＬＰＳの投与によって誘発される内毒素ショック
動物（ｎ＝１０）を、深い麻酔下で、等張食塩水溶液または１０μgのＬＰＳ（Escherichia coli、血清型O55B5、10 mg、Sigma-Aldrich、St Louis、USA）のいずれかを用いて鼻腔内へと滴下注入することにより処置した。１mgまたは２mgのポリクローナル抗Ｓ１００Ｂ抗体（Santa cruz）を、ＬＰＳ滴下注入の１６時間前に腹腔内投与した。
【００７４】
気道抵抗および気管支肺胞洗浄液
動物（ｎ＝１０）を、深い麻酔下で、等張食塩水溶液（ＮａＣｌ ０．９％）または１０μgのＬＰＳ（Escherichia coli、血清型O55B5、10 mg、Sigma-Aldrich、St Louis, USA）のいずれかを用いて鼻腔内へと滴下注入することにより処置した。気道応答を、処置後６時間の期間をかけて、全身プレチスモグラフィーを使用して調べ、そして呼吸器プロファイルを説明する無次元パラメーターであるＰｅｎＨの測定を、呼気期間および呼吸器サイクル中に密閉チャンバーで測定された圧力の変動を考慮して行なった（EMKA Technologies, Paris, France）。ＰｅｎＨは、胸部流量および鼻流量曲線の位相変化として概念化することができる。増加した位相シフトは、増加した呼吸器系の抵抗と相関する。ＰｅｎＨは、式ＰｅｎＨ＝（Ｔｅ／ＲＴ−１）×ＰＥＦ／ＰＩＦによって計算され、Ｔｅは呼気時間であり、ＲＴは弛緩時間であり、ＰＥＦはピーク呼気流量であり、そしてＰＩＦはピーク吸気流量である（Togbe et al., 2007）。データは、Ｄａｔａｎａｌｙｓｔソフトウェア（EMKA Technologies）を使用して分析し、そして平均±ｓｅｍ（平均の標準誤差）として表現する。刺激から２４時間後、マウスを安楽死させ、そしてＢＡＬＦを、以前に記載されているように（Besson et al., 2007）細胞組成およびサイトカイン数量化について分析した。アリコートをトリパンブルー溶液で染色し、そして分析して細胞中の含量を決定した。顕微鏡スライド上で遠心分離後、風乾させた調製物を固定し、そしてＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（Merz & Dade）で、メイグリュンワルドギムザ染色を使用して染色した。２００個の細胞を、２回、ＢＡＬＦ中の各細胞型の種々の数の決定のために計測した。肺の一部を、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）アッセイのために−８０℃で保存した（Besson et al., 2007; Dalloneau et al., 2011a）。
【００７５】
サイトカインの測定およびミエロペルオキシダーゼアッセイ
ＩＬ−６およびＴＮＦ−α濃度を、標準的な条件で、業者（RnD Systems）のプロトコールを用いて、Ｅｌｉｓａ試験によって推定した。血清を１／４に希釈し、そしてＢＡＬＦを希釈せずに使用した。９６ウェルプレートを解読機ＥＬ８００（BIO-TEK INSTRUMENTS）によって解読した。ＭＰＯ測定のために、右心室を食塩水で還流して、血管内容物を流し、そして肺を使用するまで−８０℃で凍結させた。肺を、ポリトロンによってホモジナイズし、そして遠心分離にかけ、そして上清を廃棄した。ペレットを、０．５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＨＴＡＢ）および５mM ＥＤＴＡを含む１mlのＰＢＳ中に再懸濁した。遠心分離後、５０μlの上清を、２００μlのＰＢＳ−ＨＴＡＢＥＤＴＡ、２mlのＨＢＳＳ、１００μlのｏ−ジアニシジン二塩酸塩（１．２５mg/ml）および１００μlのＨ２Ｏ２０．０５％と共に試験管に入れた。攪拌機で３７℃で１５分間インキュベーションした後、反応を１００μlのＮａＮ３ １％で停止させた。ＭＰＯ活性を、培地に対して４６０nmの吸光度として決定した。
【００７６】
ＬＰＳの投与によって誘発された全身性内毒素ショック
マウスは、１００μgのＬＰＳ（血清型Ｏ５５Ｂ５）（ｎ＝１０）または食塩水対照溶液（ｎ＝６）の腹腔内注射を受けて、in vivoにおける全身炎症応答を評価した（Besson et al., 2007）。９０分後、マウスを安楽死させ、血液を大腿静脈を通して収集し、そして２０００rpmで１５分間遠心分離にかけ、そして血清を収集し、そしてサイトカインアッセイのために−２０℃で保存した。その後、胸部を開き、そして１０mlのＰＢＳを心臓の右心室に注入することによって肺を洗浄する。肺は白色へと薄れた。その後、心臓−肺ブロックを除去し、その後、肺を単離し、そして液体窒素に浸漬させたチューブに保存した。肺を使用して、ＱＲＴ−ＰＣＲによる標的遺伝子の発現を研究した。
【００７７】
ＯＶＡによる感作および肺応答
本発明者らは、急性喘息マウスモデルを開発した。雄ＢＡＬＢ／ｃＪマウスを、無菌ＮａＣｌ ０．９％中２０mg/mlの水酸化アルミニウム（Sigma A8222, Sigma-Aldrich）に吸着させた０．５mg/mlのＯＶＡ（オボアルブミン、ＯＶＡ、Ｖ等級、Sigma）により構成される１００μlの溶液の腹腔内注射によって１日目および７日目に感作させた。その後、マウスは、１８日目から２１日目までオボアルブミンによる攻撃を受けた。そのために、マウスをケタミン（５０mg/kg）およびキシラジン（３．５mg/ml）で麻酔し、そして２５μlの０．４mg/mlのＯＶＡ溶液を滴下注入した。１７日目に、最初の攻撃の１６時間前、マウスの１群が、腹腔内に２mgの抗Ｓ１００Ｂ抗体（Santa Cruz）を受けた。対照群を感作させ、そしてＮａＣｌ ０．９％のみで攻撃した。気管支反応性を、全身プレチスモグラフィーによって、２２日目に、最後の攻撃から１８時間後から２４時間後までに、前記したように評価した。血清、ＢＡＬＦおよび肺試料を、プレチスモグラフィー取得直後の２２日目に収集した。実験を２回、１群あたり全部で１２匹の動物に対して実施した。プレチスモグラフィー取得のためのプロトコールは、マウスの３０分間の安定化（数値を記録することなく）、その後、３０分間かけての基底値の測定（記録、基底と呼ぶ）、その後、３０秒間のＮａＣｌ ０．９％の吸入投与、その後、３０分間のシグナルの記録、その後、３０秒間の漸増量のメタコリン（０．０５；０．１；０．２および０．３Ｍ）の４回の吸入投与、２０分間の間隔でのシグナルの記録からなる。その後、データをＤａｔａｎａｌｙｓｔソフトウェアを用いて処理した。
【００７８】
Ｓ１００ｂの免疫検出
Ｓ１００Ｂ、α−アクチンおよびＳＶ２の免疫検出のために、肺を、６時間かけての氷冷４％（ｗ／ｖ）ＰＦＡのＰＢＳ溶液中に浸漬することによって固定し、ＰＢＳ中で洗浄し、そしてパラフィンに包埋した。免疫染色前に、パラフィン包埋組織からの組織学的切片をスライドガラス状に収集し、９４℃の浴で４０分間かけてトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（１０mMトリス塩基、１mM ＥＤＴＡ溶液、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ９．０）で処理した。免疫染色のために、切片を、色素原免疫染色のために、一晩かけて４℃で単独でウサギポリクローナル抗体Ｓ１００Ｂ（１／１００００の希釈度、ＨＰＡ０１５７６８、Sigma Aldrich）と共にインキュベーションするか、または二重免疫蛍光染色のためにマウスモノクローナル抗体ＳＶ２（１／５００の希釈度、ＳＶ２−ｃ、Developmental Studies Hybridoma Bank）もしくはα平滑筋アクチン（１／１００００の希釈度、Ａ５２２８、Sigma Aldrich）と合わせた。Ｓ１００ｂの色素原免疫染色のために、一次抗体の検出を、ベクタステイン・エリート・ＡＢＣ技術（ＰＫ−６１０１、Vector）を使用して製造業者の説明書に従って達成した。ペルオキシダーゼを、ジアミノベンジジン錠剤（Ｄ４１６８、Sigma Aldrich）を使用して明らかとした。免疫蛍光のために、切片を１時間かけて室温でＣｙ３にコンジュゲートさせたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Jackson Immuno Research Laboratories）（Ｓ１００Ｂについて）または１／５００に希釈したＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−４８８コンジュゲートマウス抗体（Molecular Probes；ＳＶ２およびアクチンについて）を使用してインキュベーションすることによって一次抗体の検出が達成された。切片をＤＡＰＩで対比染色した。
【００７９】
統計学的分析
統計学的分析を、パラメトリックフィッシャースチューデントｔ検定（適用可能な場合）またはノンパラメトリックウィルコクソンマンホイットニーＵ検定のいずれかを使用してＳｔａｔｇｒａｐｈｉｃｓソフトウェア（Centurion XV, Sigma plus, Levallois Perret）を介して実施した。数値は平均±ＳＥＭとして提示され、そして有意な閾値はＰ＜０．０５であるか、または他に示された。
【００８０】
研究の認可
全マウスの手順が、ＩＣＳの地域倫理委員会またはＴＡＡＭによって認可された。本研究の主任研究者であるＹＨは、報告された実験を実施するための適格性認定４５〜３１および６７〜３６９を授与された。
【００８１】
結果：
Ｓ１００ｂは、ＬＰＳによる刺激後、肺および血清に発現される。
ＬＰＳにより誘発された呼吸器応答および炎症応答におけるＳ１００ｂの役割を研究するために、本発明者らはまず、ＬＰＳによる攻撃後のタンパク質の産生を調べた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスの群に、ＬＰＳ（１０μg）を滴下注入し、そして種々の時点（０分後、３０分後、２時間後、４時間後、および６時間後）で安楽死させた。本発明者らは、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ；図１）中の、マクロファージ、好中球およびリンパ球の数と、２つの炎症誘発性サイトカイン、すなわちＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の濃度を測定することによって肺の炎症を評価した。０時間後から２時間後まで、マクロファージは、ＢＡＬＦに見られる主要な細胞型であった。好中球は２時間後に動員され始め、そして本発明者らは、２時間後から４時間後までマクロファージの減少と好中球の増加のシフトを観察した（図１Ａ）。ＴＮＦ−αは、弱い濃度で０分後および３０分後にすでに検出され、そしてＬＰＳ攻撃から２時間後までに強く産生された（図１Ｂ）。ＩＬ−６の分泌は３０分後に開始され、２時間後に重要な増加がみられた（図１Ｂ）。Ｓ１００ｂは、ＬＰＳによる刺激から３０分後にＢＡＬＦ中に強く産生され、ＬＰＳによる処置の２時間後に最高の蓄積を示し、その後、ゆっくりと減少した（図１）。本発明者らは、血清中に同じ現象を観察し、ＴＮＦ−αは、０分後にすでに低いレベルで存在していた。ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＳ１００ｂの血清中濃度は、ＬＰＳによる刺激から４時間後に高感度に増加した（図１Ｃ）。全てのこれらの結果は、Ｓ１００ｂが、肺および血流の両方において炎症誘発性サイトカインと同じ動態を示したことを示した。従って、Ｓ１００ｂは、ＬＰＳによって直接制御される炎症誘発性サイトカインと極めて類似した蓄積動態を有する肺応答のマーカーである。
【００８２】
ＬＰＳの滴下注入は、肺の炎症に影響を及ぼすことなく、Ｓ１００ｂ−／−マウスのＡＨＲを減少させた。
ＢＡＬＦ中のＳ１００ｂの蓄積により、本発明者らは、Ｓ１００ｂ突然変異マウスへのＬＰＳによる攻撃後に肺における変化をモニタリングした。本発明者らは、全身プレチスモグラフィーを使用し、そして本発明者らは、Ｓ１００ｂ突然変異マウスにおけるＬＰＳに対する肺応答を評価するための呼吸器パターンを反映するエンハンスドポーズ時間（ＰｅｎＨ）のパラメーターをスコアリングした。以前に示されているように、１コピーのＳ１００ｂを有するＭｓ１Ｙａｈマウスは、ＬＰＳの滴下注入後に減少した呼吸器応答を示す（Besson et al., 2007）。ＡＨＲにおけるＳ１００ｂの正確な役割を調べるために、本発明者らは、Ｓ１００ｂの機能欠失型対立遺伝子を使用し（Xiong et al., 2000）、そして本発明者らは、ＬＰＳ（１０μg）または食塩水（ＮａＣｌ）対照溶液の滴下注入された、対照野生型（ｗｔ）動物、ヘテロ接合型（Ｓ１００ｂ＋／−）およびホモ接合型（Ｓ１００ｂ−／−）突然変異個体を比較した。食塩水溶液での処置は、ｗｔマウスおよびＳ１００ｂ＋／−およびＳ１００ｂ−／−の両方においてＰｅｎＨによって評価したような呼吸器機能に影響を及ぼさなかった（図２Ａ〜Ｂ）。ＬＰＳの滴下注入は、ｗｔマウスの５を超えるＰｅｎＨ値の増加によって特徴付けられるＡＨＲを誘導した。ＰｅｎＨ値はＳ１００ｂ＋／−で減少する傾向があったが（図２Ｂ）、ＡＨＲはＳ１００ｂ−／−マウスにおいては有意に減少した（図２Ａ）。２コピーのＳ１００ｂの欠失は、ＬＰＳによる刺激によって誘発されたＡＨＲに対して大きな影響を及ぼした。
【００８３】
ＬＰＳの滴下注入されたＭｓ１Ｙａｈマウスは、本発明者らがＰｒｍｔ２（Dalloneau et al., 2011a）と相関させた野生型マウス（Besson et al., 2007）と比較して、気管支肺胞空間において炎症細胞の動員増強並びにＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の産生の増強を示す。本発明者らは、局所炎症応答におけるＳ１００ｂの関与を調べた。ＬＰＳまたは食塩水対照溶液の滴下注入から２４時間後、本発明者らは、野生型、Ｓ１００ｂ＋／−およびＳ１００ｂ−／−マウスにおいてＬＰＳによって誘発された炎症を測定した。本発明者らは、ＢＡＬＦ中の好中球の動員（図２Ｃ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性（図２Ｄ）、並びにＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の濃度を追跡した（図２Ｅ）。食塩水対照溶液の滴下注入されたマウスは、炎症細胞動員の種類に全く変化を示さなかった。測定された炎症パラメーターは、ｗｔマウスと、Ｓ１００ｂ＋／−およびＳ１００ｂ−／−マウスの両方の間で変化を全く提示しない。従って、本発明者らは本明細書において、Ｓ１００ｂ遺伝子機能の改変は、ＬＰＳによって誘発されたＡＨＲを強く損ねたが、肺における炎症応答には干渉しなかったことを実証した。
【００８４】
抗Ｓ１００ｂ中和抗体は、肺の炎症に影響を及ぼすことなく、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＡＨＲを減少させた。
Ｓ１００ｂの不活性化は、炎症シグナルの分泌を改変させることなく、ＬＰＳによる処置後の肺応答を減少させた。その後、本発明者らは、Ｓ１００ｂに対して指向される中和抗体が、ＬＰＳによって誘発されるＡＨＲを改変させ得るかどうかを問うた。ポリクローナル抗Ｓ１００ｂ抗体の注射を使用して、本発明者らは、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスにおいて受動免疫化を実施した。本発明者らは、５個の個体を含む３つの群のＢ６マウスを比較した：対照食塩水溶液で処置されたもの、ＬＰＳの滴下注入された別の陽性対照、ＬＰＳの投与の１６時間前に、Ｓ１００ｂに対する１mgまたは２mgのポリクローナル抗体のいずれかを腹腔内注射された２つのさらなるもの（Vandal et al., 2003b）。実験は、２回独立して実施して、１群あたりｎ＝１０の個体に達した。抗Ｓ１００ｂ前注射により、ＬＰＳのみ投与されたマウスと比較して、ＰｅｎＨ値の有意な減少がもたらされた。１mgの抗体がＡＨＲを減少させるのに十分であったが、応答は、２mgでより均一であった（図３Ａ）。抗Ｓ１００ｂは、ＢＡＬＦで観察された炎症に対しては全く効果を示さなかった。なぜなら測定されたどのパラメーターも、ＬＰＳのみで刺激されたマウスと比較して、１mgまたは２mgの抗体とＬＰＳを投与されたマウスにおいて改変されていなかったからである（図３Ｂ〜Ｅ）。さらに、処置されたマウスにおいて異常な挙動変化は認められなかった。類似の結果が、類似の条件において中和抗体で処置されたＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいて観察された（データは示していない）。得られた全ての結果は、Ｓ１００ｂが、ＬＰＳによって誘発されたＡＨＲに関与していることを確認した。Ｓ１００ｂの活性は、ＬＰＳ攻撃中の炎症に対する強い結果を伴うことなく、中和抗体によって完全に減弱させることができる。
【００８５】
中和抗Ｓ１００ｂは、悪化したＬＰＳ応答モデルであるＰｒｍｔ２＋／−マウスにおけるＡＨＲを減少させた。
Ｐｒｍｔ２＋／−突然変異マウスは、ｗｔと比較して、ＬＰＳの滴下注入後に遅延しているが悪化したＡＨＲを提示する（Dalloneau et al., 2011a）。これらのマウスはまた、血清およびＢＡＬＦの両方において増加した炎症誘発応答を提示する。その後、本発明者らは、Ｐｒｍｔ２欠損マウスにおいて観察された悪化した気道応答に対するＳ１００ｂ抗体の作用を試験した。実験は、前の段落で記載されたようなＰｒｍｔ２＋／−マウスで実施された。抗Ｓ１００Ｂ処置により、ＬＰＳのみを受けたマウスと比較して、ＰｅｎＨ値の有意な減少がもたらされた（図４Ａ）。Ｓ１００Ｂ抗体を用いて処置されたＰｒｍｔ２＋／−マウスは、ｗｔマウスと比較して、ＬＰＳのみを投与されたＰｒｍｔ２＋／−マウスと類似したＢＡＬＦ中に分泌されたより高いレベルのＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を有する同じ悪化した炎症応答を示した（図４Ｂ〜Ｅ）。類似の結果が、Ｐｒｍｔ２ホモ接合型突然変異体に見られた（データは示していない）。
【００８６】
その後、本発明者らは、ＬＰＳの全身注射後にＳ１００ｂ応答を追跡した。Ｓ１００ｂは、血清中よりも肺中により重要には分泌されたことが判明した（図５Ａ、Ｂ）。興味深いことに、Ｓ１００ｂの発現は、突然変異マウスにおいてＰｒｍｔ２の機能の欠失によってさらに刺激され、Ｓ１００ｂが、ＬＰＳによって誘発された肺ＡＨＲにとって重要であるという仮説が強固となった（図５Ｃ）。これらの結果は、一方で、ＬＰＳによって誘発されたＡＨＲにおけるＳ１００ｂの関与を確認し、他方でＳ１００ｂが、ＬＰＳによって誘発された炎症応答の誘発の主要な作用因子ではないことを確認した。それは、（１）Ｓ１００ｂが、ＬＰＳにより誘発された炎症応答におけるＰｒｍｔ２依存性経路、ＬＰＳ／ＴＬＲ４によって制御されるＮＦ−Ｋｂ転写因子、およびＳ１００ｂ／ＡＧＥＲシグナル伝達経路を通して作用すべきであり、そして（２）Ｐｒｍｔ２およびＳ１００ｂ機能の両方の阻害が、Ｍｓ１Ｙａｈ突然変異体におけるＬＰＳによって誘発される表現型を再現するのに必要とされることを確認する（Besson et al., 2007）。
【００８７】
中和抗Ｓ１００ｂは、ＯＶＡ喘息マウスモデルにおけるＡＨＲを減少させた。
Ｓ１００ｂ抗体は、ｗｔおよびＰｒｍｔ２−／−マウスにおいてＬＰＳによって誘発されたＡＨＲを減少させた。従って、本発明者らは、別の肺攻撃、すなわちオボアルブミン（ＯＶＡ）喘息マウスモデルにおけるＳ１００ｂの有効性を調査した。オボアルブミンでの感作後、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスは、メタコリンによるさらなる攻撃後にＡＨＲおよび組織炎症を示した。肺アレルギー性喘息は、２型のヘルパーＴリンパ球（ＬＴｈ２型）によって媒介される炎症応答の導入を必要とする。これらの細胞はＩＬ−４を産生し、好酸球の炎症部位への動員をトリガーする。本発明者らはまず、このＯＶＡ誘発喘息においてＳ１００ｂの産生を確認した。２群の５匹のマウスを、０日後および７日後にオボアルブミンに対して感作させ、そしてアレルゲンを用いて１８日目、１９日目、２０日目および２１日目に攻撃した。２２日目に１つの群が、増加量のメタコリンを投与された（Ｍｃｈ、０．０５；０．１；０．２および０．３Ｍ）。マウスをｔ＝０時間後、２時間後、６時間後および２４時間後に屠殺し、そしてＢＡＬＦおよび本発明者らは好酸球の動員およびＳ１００ｂの産生を評価した（図６）。好酸球は２時間後までに動員され、そして最後の攻撃から２４時間後にＢＡＬＦに依然として存在していた。Ｓ１００ｂは、６時間後に血清中で検出されたが、Ｍｃｈを含まない群では２４時間後に減少した。メタコリンは応答を増幅させたようであった：Ｍｃｈで攻撃されたマウスは、攻撃されなかったマウスで見られるよりも高いＳ１００ｂの濃度を示した。その後、本発明者らは、ナイーブマウスおよび感作マウスにおいてＳ１００ｂに対する抗体の効果を調べた（図６Ｃ〜Ｄ）。２つの群の６匹のマウスを感作させ、その後、以下に記載されているようにオボアルブミンに対して攻撃し、その後、２２日後にＭｃｈ攻撃を用いて呼吸器機能を測定した。
【００８８】
１つの群は、１７日目に、ＯＶＡ攻撃の１６時間前に２mgのＳ１００Ｂ抗体を投与された。実験は２回独立して繰り返された。Ｍｃｈ攻撃に正常に応答した対照ナイーブマウスにおいては有意な効果は観察されなかった（図６Ｃ）。ＯＶＡによる感作後、マウスは、Ｍｃｈに対して過活性を示し、そして本発明者らは、Ｍｃｈの量がより重要であればあるほど、抗体の効果はより顕著であることを見出した（図６Ｄ）。実際に、抗体を投与されたマウスは、対照マウスと比較して、より低いＰｅｎＨ値を有する傾向がある。Ｓ１００ｂタンパク質の阻害は、ＯＶＡ喘息モデルにおけるＭｃｈにより誘発される過活性を減少させた。これらの結果により、特に喘息などの肺疾患における、Ｓ１００ｂの活性を阻害することのできる分子の治療影響を予見することができる。
【００８９】
Ｓ１００ｂは肺において発現され、そしてＬＰＳによる刺激後に増加する。
Ｓ１００ｂに指向される中和抗体は、ＬＰＳにより誘発される炎症応答を改変させることなくＡＨＲを減少させることができる。その後、本発明者らは、Ｓ１００ｂ応答の細胞成分が何かを解読しようと試みた。ＬＰＳ処置の前後でマウス肺におけるＳ１００ｂを検出するために、本発明者らは、マウス肺組織切片に対して免疫組織化学的検査を実施した。ＮａＣｌによる処置を含む通常の条件において、Ｓ１００ｂは、肺胞壁の細胞に点在することが判明した。いくつかの発現している細胞が、肺胞間の空間に見られ、そしてその局在および形態に基づいてマクロファージ（図７Ａ）と同定された。ＬＰＳの滴下注入から４時間後、Ｓ１００ｂの発現は、対照のＮａＣｌで処置された肺と比較して、ＬＰＳにより処置された肺においてはるかに高かった（図７Ｂ〜Ｅ）。ＬＰＳの滴下注入から４時間後の肺切片のヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、肺の肺胞および気管支周囲空間における、炎症細胞、実質的にはＳ１００ｂを発現している好中球およびマクロファージの増加を明らかとした。免疫蛍光を使用して、本発明者らは、Ｓ１００ｂ発現細胞が、実質的に、Ｈ＆Ｅ切片に観察された炎症細胞と同様に、肺胞の間質空間および気管支周辺に見られたことを発見し、このことは、Ｓ１００ｂが、ＬＰＳの滴下注入後に動員されたマクロファージおよび好中球に発現されたことを示す。
【００９０】
ＬＰＳにより媒介されるＡＨＲは抗Ｓ１００Ｂ処置マウスではもはや観察されなかったので、本発明者らは、肺の応答に両方共に関与する気管支周囲平滑筋細胞および神経叢におけるＳ１００Ｂの発現を確認した。Ｓ１００ｂの発現は、ＮＥＢおよび気道神経ネットワークに発現されることが知られているシナプス小胞タンパク質２（ＳＶ２）である神経系に普遍的なマーカーによる二重免疫蛍光染色によって示されるように、気管支上皮の根底にある神経束および神経上皮小体（ＮＥＢ）に見られた。Ｓ１００ｂは、平滑筋α−アクチン抗体を用いての二重免疫蛍光染色によって示されるように、気管支周囲平滑筋細胞で発現されなかった。全体的に見てＳ１００ｂの部分的な発現は、ＳＶ２発現神経で見られ、これは、Ｓ１００ｂが神経の特定の領域に限定されることを示す。
【００９１】
考察：
この報告で、本発明者らは、ＬＰＳ急性肺損傷（ＡＬＩ）モデルおよびＯＶＡ喘息モデルにおける呼吸器機能の調節におけるＳ１００ｂの新たな役割を実証した。Ｓ１００ｂは、重要な炎症パラメーターに変化を伴うことなく、ＬＰＳによって誘発されたＡＨＲの調節に対して用量依存的な効果を示した。Ｓ１００ｂに対する中和抗体の使用は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＪおよびＰｒｍｔ２欠損マウスにおいてＬＰＳにより誘発されたＡＨＲの有意な減少を可能とした（Dalloneau et al., 2011b）。Ｓ１００ｂは、肺胞および気管支の平滑筋細胞付近の刺激された常在マクロファージおよび動員された好中球からＢＡＬＦ中に分泌され、このことは、Ｓ１００ｂが、ＡＨＲの最中に筋肉収縮の制御と干渉する可能性を示唆する。
【００９２】
Ｓ１００ｂとレセプターＡＧＥＲの相互作用は、in vivoにおいて、特に肝臓および肺において（Schmidt et al., 2000）ＮＦ−κＢ転写因子の活性化（Yan et al., 1994）、続いてＩＬ−６の産生を、並びに、ＴＮＦ−αの発現（Hofmann et al., 1999）を誘導する。ＡＧＥＲは、敗血症ショックの最中に（Yamamoto et al., 2011）または肺において（Yamakawa et al., 2011）、ＬＰＳとの間接的または直接的な相互作用のいずれかで炎症応答に寄与することが知られている。ＡＧＥＲは、肺損傷のマーカーとして提案され（Su et al., 2009）、そしてその発現はＬＰＳによる刺激後に増加した（Zhang et al., 2008)。ＡＧＥＲとＴＬＲ４シグナル伝達カスケードとの間のクロストークは、ＡＧＥＲの別のリガンドを別にしてすでに記載されている（Park et al., 2006; Qin et al., 2009）。ここで、本発明者らは、２回の肺への攻撃におけるＡＨＲに対するＳ１００ｂの直接的な影響を発見し、Ｓ１００ｂ突然変異マウスにおいてＬＰＳにより誘発された炎症応答に差異はなかった。細胞動員および炎症誘発性サイトカイン分泌に変化は全く観察されなかった。ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの発現は影響を受けず、このことは、突然変異マウスにおけるＳ１００ｂの非存在下でさえまたは中和抗体を使用しても、ＴＬＲ４／ＮＦ−κＢ経路の改変は全くないことを示唆する。本発明者らは、Ｓ１００ｂの発現は、ＬＰＳによって調節され、そしてＮＦ−κｂの間接的阻害剤であるＰｒｍｔ２が不活性化された場合にはアップレギュレーションさえされることを発見した（Dalloneau et al., 2011a）。Ｓ１００ｂのこのようなＬＰＳ依存性発現は、アストロサイトおよびミクログリアにおいて観察された（Donato et al., 2009; Guerra et al., 2011）。Ｓ１００ｂは、急性肺攻撃モデルにおける気道応答および炎症応答に寄与する、ＴＬＲ４／ＴＩＲＡＰ／ＭＹＤ８８／ＮＦ−κＢ経路と共通の中間体を共有するＡＧＥＲを通してシグナルを伝達する（Sakaguchi et al., 2011a）。
【００９３】
三染色体および一部の一染色体の２１人の患者が、呼吸器感染に対して増加した感受性を示し、これは実際に患者の主要な死亡原因を示す（Day et al., 2005; PanditおよびFitzgerald, 2012）。この現象を解読するために、本発明者らは、ヒト第２１染色体領域の異数性の種々のマウスモデルを開発した（Herault et al., 2012; Raveau et al., 2012）。本発明者らは以前、Ｍｓ１Ｙａｈモデルが、ＬＰＳによって誘発されたＡＨＲがないことを示したことを実証した（Besson et al., 2007）。Ｐｒｍｔ２は、Ｍｓ１Ｙａｈモデルに欠失していた遺伝子であった。それは、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼファミリーに属し、そしてそれはＮＦ−κｂの核への蓄積を調節する。本発明者らは、Ｐｒｍｔ２の発現は用量感受性であり、そしてＬＰＳによる処置後に減少したことを示した（Besson et al., 2007; Dalloneau et al., 2011a）。１または２コピーのＰｒｍｔ２の欠損したマウスの呼吸器パターンの研究は、ｗｔマウスと比較して時間が遅延しそして維持された悪化したＡＨＲを示した（Dalloneau et al., 2011a）。この結果は、Ｐｒｍｔ２−Ｃｏｌ６ａ１領域の少なくとも別の遺伝子が、Ｍｓ１Ｙａｈマウスに観察されたＡＨＲの制御に関与することを指摘した。その後、本発明者らは、肺に発現が認められたＳ１００ｂに注目をした（Besson et al., 2007）。ＬＰＳ滴下注入後の呼吸器パターンの本研究は、ＡＨＲの調節に対するＳ１００ｂの用量効果を示した。ＰｅｎＨ値は、Ｓ１００ｂ＋／−マウスにおいて減少する傾向があり、そしてＳ１００ｂ−／−マウスにおいて有意に減少していた。本発明者らは、初めて、用量依存的に誘発されるＬＰＳ誘発ＡＨＲにおけるＳ１００ｂの明確な役割を実証した。同様に、Ｓ１００ｂは、ＯＶＡ喘息モデルにおいて増加していることが見いだされ、そして中和抗体は、感作および攻撃後のメタコリンにより誘発される狭窄の一部を防ぎ得る。Ｓ１００ｂは、本質的に、いくつかの種類の癌（Hwang et al., 2010）、脳損傷（ZurekおよびFedora, 2011）および心停止（Song et al., 2010）のマーカーであることが知られていたが、今回は、Ｓ１００ｂは、肺応答のマーカーと考えるべきである。
【００９４】
Ｓ１００ｂの機能の低下により、突然変異マウスにおける肺の炎症応答を改変させることなく、呼吸器機能が改善される。最初に、本発明者らは、野生型マウスにおけるＳ１００ｂの阻害は、Ｓ１００ｂ−／−マウスに観察された表現型を再現することを確認した。その後、本発明者らは、呼吸器機能におけるＳ１００ｂの機能を探索するために、遮断抗体を使用した。抗Ｓ１００Ｂ抗体を用いての処置は、Ｂ６マウスの炎症応答を改変させることなく、ＬＰＳによって誘発されたＨＲＡを減少させた。同じ実験を、悪化したＡＨＲを示すＰｒｍｔ２＋／−およびＰｒｍｔ２−／−（データは示していない）マウスにおいて実施した。このモデルにより本発明者らは、抗体の作用を確認することができた。これらのマウスへの抗体の注射により、突然変異体では依然として高い炎症応答の変化を伴うことなく、ＰｅｎＨ値の有意な減少がもたらされる。
【００９５】
Ｓ１００ｂは、２３個のカルシウム結合タンパク質のファミリーに属し、そして同じファミリーの他のタンパク質とは違って、Ｓ１００ｂは、肺炎症の主要な作用因子ではない。事実、Ｓ１００ａ８およびＳ１００ａ９は、炎症部位に特に分泌され、そこでそれらは好中球の走化性および接着を誘発する（Ryckman et al., 2003; Vandal et al., 2003a）。Ｓ１００ａ１２は、ＡＧＥＲとの相互作用を介して作用し、その結果、炎症誘発性メディエーターが分泌される（Hofmann et al., 1999）。これらのＳ１００タンパク質の血清中濃度は、炎症疾患の活性に相関する（Foell et al., 2004; Frosch et al., 2000）。ＬＰＳの滴下注入後、本発明者らは、Ｓ１００ｂを発現している細胞の数は増加するが、Ｓ１００ｂ欠損マウスで測定された炎症パラメーターは改変されないことを実証し、このことは、Ｓ１００ｂが炎症の誘発に必要とされないことを示唆する。正常なヒトの肺では、Ｓ１００ｂは、間質性樹状細胞および気管支周囲神経に高いレベルで、喫煙関連傷害における気道樹状細胞、および肺炎における間質性樹状細胞に発現される（５）。ここで、本発明者らは、肺胞常在マクロファージ、並びにＬＰＳにより活性化されたマクロファージおよび動員された肺好中球において発現されたＳ１００ｂを発見した。しかしＳ１００ｂを発現している細胞の数がこれらの肺疾患または攻撃中に増加したとしても、タンパク質の正確な役割が、この一連の実験を通して判明しただけであり、このことは、Ｓ１００ｂが、ＡＨＲの作用因子であり、従って、呼吸器疾患の作用因子であることを示す。
【００９６】
Ｓ１００ｂはカルシウム結合タンパク質であり、従って筋肉収縮の制御に関与し得る。Ｓ１００ｂは細胞の細胞質に見られ、そしてＣａ２＋の流入を刺激し得、ＰＫＣにより媒介されるリン酸化および微小管の会合を阻害し得る。肺において、Ｓ１００ｂは、ＬＰＳによる刺激後、肺胞常在マクロファージおよび動員された好中球において、神経上皮小体周辺に、および前記したような神経に発現される（５）。肺の平滑筋細胞においてＳ１００ｂの直接的な共局在は全く観察されなかった。Ｓ１００ｂは、カルシウムストックの利用可能性を制御する細胞内および細胞外レギュレーターとして知られている（１８）。Ｓ１００ｂが感知Ｃａ２＋レベルとして作用するならば、ＬＰＳによる処置中のＳ１００ｂの分泌は筋収縮を促進し得、カルシウムの拡散を制限する。あるいは、Ｓ１００ｂは、免疫細胞において数多くのサイトカインおよび炎症誘発性因子をアップレギュレーションする、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインホスファターゼのカルシニューリンに関与するものなどの、Ｃａ２＋依存性細胞内シグナル伝達カスケードを変化させ得る（CrabtreeおよびOlson, 2002）。あるいは、Ｓ１００ｂは、細胞骨格に由来するいくつかのタンパク質と相互作用することが知られ、従って、細胞リモデリングおよび細胞遊走を媒介し得る（Donato et al., 2009）。ＡＨＲにおけるＳ１００ｂの分子機序および細胞機序をより理解するためには、さらなる実験が必要とされるだろう。
【００９７】
炎症応答の重要なパラメーターを変化させることなく、Ｓ１００ｂ機能を低下させそしてＡＨＲを減少させることは、特に長期処置のために、治療的観点から興味深い道筋を示す。実際に本発明者らが喘息発作を考える場合、より不利な態様は、患者の呼吸困難であり、これにより一方で、その収縮後の気管支の寸法の減少に至り、他方で粘液の生産に至る。従って、この場合、長期処置において炎症応答を改変させることなく、気管支拡張を促進することは興味深い。実際に、中和抗体を用いての処置を使用して、アレルギー性喘息または慢性閉塞性気管支肺症に観察される気道抵抗を減少させることができる。今日、喘息の主な処置は、依然として短期間である。副腎皮質ステロイドを用いての長期間の処置は、高血糖、骨粗鬆症、うつ病などのいくつかの副作用を誘発する（Donihi et al., 2006）。ＬＰＳモデルでは、抗体を投与されたマウスは、比較的低い値のＰｅｎＨを提示し、そしてこれは全取得期間におよび続く。ＬＰＳ単独で刺激されたマウス（Ｂ６およびＰｒｍｔ２＋／−）は、６０〜９０分後の間にＰｅｎＨ値の上昇を示し、その後、ピークに達した後、これらの数値は、刺激から１８０分後に抗体を投与されたマウスと同一の基礎レベルを見出す。この観察は、抗Ｓ１００ｂ抗体の効果が、ＬＰＳモデルにおいて少なくとも３時間であることを示し；これは、自己免疫疾患療法に使用される抗体の血清中の半減期が８日間から８週間まで変動するために驚くべきことではない（ChanおよびCarter, 2010）。喘息マウスモデルにおいて抗体の作用の有効性および持続時間を確認することが勿論必要であろう。全てのこれらの結果は、初めて、気管支収縮におけるＳ１００ｂタンパク質の重要性を示し、そしてＬＰＳマウスモデルにおけるＳ１００ｂ抗体の使用によって、Ｓ１００ｂを阻害することができる分子の可能性ある治療効果が判明した。
【００９８】
参考文献：
本出願全体を通して、種々の参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。
【００９９】
【表１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂａｎｄ１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄａｎｄ２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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