(57)【要約】本発明の目的は、主に疎水性の性質を有する治療的におよび／または生物学的に活性なタンパク質と組み合わせて特定のヒアルロン酸アミドを含む、長い時間にわたる持続性の緩徐な放出のための、医薬の有効性および患者のコンプライアンスを高める、新規な放出システムである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）主に疎水性の性質を有するタンパク質、および
ｂ）ヒアルロン酸（ＨＡ）アミド
を含む、治療的におよび／または生物学的に活性なタンパク質の持続性放出のためのシステムであって、前記主に疎水性の性質を有するタンパク質は−０．５を超えるＧＲＡＶＹ指数を有し、前記ＨＡアミドは、
・ＨＡヘキサデシルアミド：７％から１４％の間、好ましくは８％から９％の間の範囲のモルアミド化百分率のヘキサデシルアミンを有するＨＡアミド；
・ＨＡオクチルアミド：１０％から１５％の間、好ましくは１０％から１１％の間の範囲のモルアミド化百分率のオクチルアミンを有するＨＡアミド；
・ＨＡドデシルアミド：１０％から１５％の間、好ましくは１０％から１１％の間の範囲のモルアミド化百分率のドデシルアミンを有するＨＡアミド；
・ＨＡｔｅｒｔ−ブチルアミド：７％から１２％の間、好ましくは７％から８％の間の範囲のモルアミド化百分率のｔｅｒｔ−ブチルアミンを有するＨＡアミド；
・ＨＡベンジルアミド：７％から１５％、好ましくは８％から９％のモルアミド化含量のベンジルアミンを有するＨＡアミド
から選択される、タンパク質の持続性放出のためのシステム。
【請求項２】
前記アミドの調製のために使用されるＨＡは、４００Ｄａから３×１０６Ｄａの間、詳細には５０ＫＤａから７３０ＫＤａの間、７５０ＫＤａから１２３０ＫＤａの間、または１５００ＫＤａから２５００ＫＤａの間、なおより詳細には１５０ＫＤａから２５０ＫＤａの間または５００ＫＤａから７３０ＫＤａの間の範囲の重量平均分子量を有する、請求項１に記載のタンパク質の持続性放出のためのシステム。
【請求項３】
主に疎水性の性質を有する治療的におよび／または生物学的に活性なタンパク質は、インスリン、ｈＧＨ、ｓＣＴ、ＩＬ−１Ｒａ、Ｇ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、好ましくはＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＥＰＯ、ＮＧＦβ、トランスフェリン、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３およびＴＩＭＰ−４である、請求項１または２に記載のタンパク質の持続性放出のためのシステム。
【請求項４】
前記ＨＡアミドはヘキサデシルアミドであり、前記アミドの調製のために使用されるＨＡは１５０ＫＤａから２５０ＫＤａの間または５００ＫＤａから７３０ＫＤａの間の範囲の重量平均分子量を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質の持続性放出のためのシステム。
【請求項５】
前記治療的におよび／または生物学的に活性なタンパク質は、ｈＧＨまたはｓＣＴであり、場合によって、安定化剤および賦形剤と組み合わされる、請求項４に記載のタンパク質の持続性放出のためのシステム。
【請求項６】
前記治療的におよび／または生物学的に活性なタンパク質は、インスリンであり、場合によって、安定化剤および賦形剤と組み合わされる、請求項３に記載のタンパク質の持続性放出のためのシステム。
【請求項７】
前記治療的におよび／または生物学的に活性なタンパク質は、ＰＤＧＦ、好ましくはＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦ−β、ＥＧＦまたはＶＥＧＦ−Ｂであり、場合によって、安定化剤および賦形剤と組み合わされる、請求項４に記載のタンパク質の持続性放出のためのシステム。
【請求項８】
前記治療的におよび／または生物学的に活性なタンパク質は、メタロプロテアーゼインヒビターＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３またはＴＩＭＰ−４であり、場合によって、安定化剤および賦形剤と組み合わされる、請求項４に記載のタンパク質の持続性放出のためのシステム。
【請求項９】
骨関節炎によって起こる関節損傷の処置、腱炎の処置、心筋損傷の修復、骨の破砕／腔の修復または皮膚潰瘍／創傷／断裂の治癒における、注射可能用途、関節内用途もしくは局所用途、または経口投与のための、請求項１から８のいずれか一項に記載のタンパク質の持続性放出のためのシステム。
【請求項１０】
骨関節炎、関節リウマチもしくは乾癬性関節炎および／または骨粗鬆症の処置における関節内用途のための、請求項５に記載のタンパク質の持続性放出のためのシステム。
【請求項１１】
骨関節炎によって引き起こされる関節損傷の処置、腱炎の処置、心筋損傷の修復、骨の破砕／腔の修復または皮膚潰瘍／創傷／断裂の治癒における、注射可能用途、関節内用途もしくは局所用途、または経口投与のための、請求項３に記載のタンパク質の持続性放出のためのシステム。
【請求項１２】
骨関節炎によって引き起こされる関節損傷の処置、腱炎の処置、心筋損傷の修復、骨の破砕／腔の修復、または皮膚潰瘍／創傷／断裂の治癒における、注射可能用途、関節内用途もしくは局所用途、または経口投与のための、請求項７に記載のタンパク質の持続性放出のためのシステム。
【請求項１３】
骨関節炎によって引き起こされる関節軟骨損傷の処置および／または骨軟骨性侵食の修復における、注射可能用途または関節内用途のための、請求項８に記載のタンパク質の持続性放出のためのシステム。
【請求項１４】
治療的におよび／または生物学的に活性なタンパク質の持続性放出のためのシステムを形成するための、ヒアルロン酸（ＨＡ）アミドおよび主に疎水性の性質を有するタンパク質の使用であって、前記主に疎水性の性質を有するタンパク質は−０．５を超えるＧＲＡＶＹ指数を有し、前記ＨＡアミドは、
ａ）ＨＡヘキサデシルアミド：７％から１４％の間、好ましくは８％から９％の間の範囲のモルアミド化百分率のヘキサデシルアミンを有するＨＡアミド；
ｂ）ＨＡオクチルアミド：１０％から１５％の間、好ましくは１０％から１１％の間の範囲のモルアミド化百分率のオクチルアミンを有するＨＡアミド；
ｃ）ＨＡドデシルアミド：１０％から１５％の間、好ましくは１０％から１１％の間の範囲のモルアミド化百分率のドデシルアミンを有するＨＡアミド；
ｄ）ＨＡｔｅｒｔ−ブチルアミド：７％から１２％の間、好ましくは７％から８％の間の範囲のモルアミド化百分率のｔｅｒｔ−ブチルアミンを有するＨＡアミド；
ｅ）ＨＡベンジルアミド：７％から１５％の間、好ましくは８％から９％の間の範囲のモルアミド化百分率のベンジルアミンを有するＨＡアミド；
から選択され、
前記アミドの調製のために使用されるＨＡは、４００Ｄａから３×１０６Ｄａの間、詳細には５０ＫＤａから７３０ＫＤａの間、７５０ＫＤａから１２３０ＫＤａの間または１５００ＫＤａから２５００ＫＤａの間、なおより詳細には１５０ＫＤａから２５０ＫＤａの間または５００ＫＤａから７３０ＫＤａの間の重量平均分子量を有する、使用。
【請求項１５】
主に疎水性の性質を有する治療的におよび／または生物学的に活性なタンパク質は、インスリン、ｈＧＨ、ｓＣＴ、ＩＬ−１Ｒａ、Ｇ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、好ましくはＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＥＰＯ、ＮＧＦβ、トランスフェリン、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３およびＴＩＭＰ−４である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記ＨＡアミドはヘキサデシルアミドである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記治療的におよび／または生物学的に活性なタンパク質は、ｈＧＨまたはｓＣＴであり、場合によって、安定化剤および賦形剤と組み合わされる、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
骨関節炎、関節リウマチもしくは乾癬性関節炎および／または骨粗鬆症の関節内処置のための、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
骨関節炎によって引き起こされる関節損傷の処置、腱炎の処置、心筋損傷の修復、骨の破砕／腔の修復または皮膚潰瘍／創傷／断裂の治癒における、注射可能用途、関節内用途もしくは局所用途、または経口投与のための、請求項１５に記載の使用。
【請求項２０】
前記治療的におよび／または生物学的に活性なタンパク質は、メタロプロテアーゼインヒビターＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３またはＴＩＭＰ−４であり、場合によって、安定化剤および賦形剤と組み合わされる、骨関節炎によって引き起こされる関節軟骨損傷の処置および／または骨軟骨性侵食の修復における注射可能用途または関節内用途のための、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、持続性の緩徐なタンパク質放出システムの調製のための、治療的におよび／または生物学的に活性である、主に疎水性の性質のタンパク質と組み合わせた特定のヒアルロン酸アミドを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
生体（細菌）システムを操作することによって得られた最初の医薬は、インスリンであり、１９８２年に食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可された。かつては屍体から抽出されたヒト成長ホルモンもまた、迅速に操作された。１９８６年に、ＦＤＡは、Ｂ型肝炎に対する最初の組換えヒトワクチンを認可した。以後、バイオリアクターとして生体システムを用いる医薬の工業生産は、普及し、特に製造費用が比較的低いことから、今や多数の医薬の好ましい合成方法である。
【０００３】
治療（および非治療）用途のために設計された多くのヒトタンパク質は、エリスロポエチン(貧血の治療のため)、インターロイキン２(腎癌の治療のため)、ＩＬ−１Ｒａ(ＩＬ−１受容体アンタゴニスト)、グルカゴン、インターフェロン、ヒトＤＮａｓｅ酵素、カルシトニン、他多くを含めて、生物工学技術によって産生されている。
【０００４】
前記医薬は、主にタンパク質またはポリペプチドの性質を有し、一般に非経口投与されている（経口投与により活性成分の迅速な分解が引き起こされるだろうとの理由から）。しかし、非経口投与では、治療有効性を確保するために繰り返し投与を必要とするため、患者コンプライアンスの問題を生じる可能性がある。これらのタンパク質は、一般に非常に短い半減期を有する；例えば、（遺伝学的に産生された）成長ホルモンｈＧＨは、毎日の注射を必要とする。結果的に、投与回数を減らして患者コンプライアンスを高めるために、多くの実験が行われ、半減期が増大されるタンパク質／医薬の放出のためのシステムが開発されてきている。
【０００５】
前記放出システムは医薬の活性が維持されることを保証しなければならないことから、タンパク質／医薬の三次元構造がインタクトなままであることを確実にしなければならない。しかし、有機溶媒ならびに／または温度およびｐＨの変動の存在などのそれらの調製の間に起こり得るストレス状態により、タンパク質鎖の脱アミド化または酸化を生じ、変性および治療活性の喪失がもたらされる可能性がある。
【０００６】
例えば、ＰＬＧＡ（ポリ乳酸／グリコール酸）ミクロスフィアの使用は、優れた結果を有する小ペプチドのための放出システムとして公知である（Hutchinson F.G., Biochem. Soc. Trans., 1985, 13:520-523）；しかし、それをｈＧＨの放出にデポーを処方するために使用することは不可能であった。何故なら、タンパク質の変性により、炎症問題が生じたからである。
【０００７】
毒性がなく、しかも送達される活性成分の有効性は変わらないタンパク質／医薬放出システムについて継続的に探索を行ったところ、併用される医薬の動態に(活性成分との組合せに起因して)変化を生じさせ得る処方物のための、天然のポリマーの使用に行き着いた。
【０００８】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、Ｄ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの交互の残基を含むヘテロ多糖である。これは、得られる供給源および使用された調製方法によって５０，０００Ｄａから１３×１０６Ｄａの間の範囲の分子量を有する、天然の直鎖ポリマーである。
【０００９】
これは、細胞周囲のゲル、脊椎動物の結合組織の基底質（この主成分の１つである）、ならびに関節の滑液、硝子液および臍帯において、天然に存在する。
【００１０】
したがって、ＨＡは、多くの組織、例えば皮膚、腱、筋肉および軟骨の細胞についての機械的な支持を提供することにより、生物において重要な生物学的な役目を担う。
【００１１】
その特性により、ヒアルロン酸は、組織をフリーラジカルから保護し、炎症プロセスを制御し、血管形成を刺激する。また、ヒアルロン酸は、創傷治癒の主な全ての段階を調節する際に非常に有効であることが判明している（ＥＰ１１９６１７９）。
【００１２】
様々な種類の医薬の担体としての前記多糖の使用は、ヒアルロン酸との単純な組合せまたはヒアルロン酸による塩化において公知である。何故なら、生物的適合性、生分解性、非免疫原性、粘性および水和性(hydratability)というその特定の性質が、局所レベルおよび全身レベルの両方において、ヒアルロン酸を、医薬および分子についての放出システムとして特に好適にするからである(ＥＰ１９７７１８、ＥＰ４４５２５５)。前記多糖はまた、特定のタンパク質、例えばＩＬ−１Ｒａ(ＵＳ６，０９６，７２８)、エリスロポエチン(Hahn SK. et al., Int J Pharm., 2006, 28, 322:44-51)、インスリン(Nomura M. et al., J Pharm Pharmacol, 1994, 46:768-770)、成長ホルモン（Kim SJ. et al., Journal of Controlled Release, 2005, 104:323-335）、インターフェロンおよびろ胞刺激ホルモン（ＵＳ８，０２５，９００）のための、薬物送達としても研究されている。
【００１３】
これらの全ての場合において、医薬と多糖との組合せは、送達されるタンパク質の「緩徐な」放出を導くが、医薬の投与の回数を減らすほど十分に緩徐ではない。
【００１４】
ＨＡは、体内に存在する酵素（ヒアルロニダーゼ）によって迅速に分解される完全に天然の多糖であり、併用された医薬を比較的迅速に放出する。これらの理由により、ＨＡのカルボキシル基および水酸基は、化学的に修飾されて架橋誘導体を生じる（ＵＳ４，５８２，８６５；ＵＳ４，７１３，４４８；ＵＳ５，６７６，９６４；ＵＳ４，９５７，７４；ＵＳ５，８２７，９３７）か、あるいは他の天然もしくは合成のポリマー、または様々なサイズおよび物理化学的特徴のある分子によって誘導体化されている（ＵＳ４，８５１，５２１）(特許文献１)。しかし、前記誘導体の調製プロセスは、多くの場合、運ばれる薬剤の完全性を損なう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第４８５１５２１号
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】アミノ酸等級表ハイドリパシー値を示す表である。
【図２】Ｈｙａｄｄ４およびｈＧＨによって形成したシステムにより確定したｈＧＨの放出プロフィール対ＰＢＳ中に調製した同じタンパク質によって表される対照を示す図である。
【図３】ＬＭＷ−ＨＡおよびＭＭＷ−ＨＡと組み合わせて処方したｈＧＨタンパク質の放出プロフィールを示す図である。
【図４】本発明に従うアミドおよびｈＧＨによって形成された放出システムからのｈＧＨの放出プロフィールを、ＰＢＳ中のｈＧＨによって表される対照と比較した図である。
【図５】本発明に従うアミドによって形成された放出システムからのｈＧＨの５０％の放出時間を、再び上述の対照に対して示した図である。
【図６】Ｈｙａｄｄ４システムにおけるｓＣＴ放出プロフィールを示すグラフである。
【図７】Ｈｙａｄｄ４システムにおけるＩＬ−１Ｒａ放出プロフィールを示すグラフである。
【図８】Ｈｙａｄｄ４システムにおけるインスリン放出プロフィールを示すグラフである。
【図９】Ｈｙａｄｄ４システムにおけるＲＮａｓｅ放出プロフィールを示すグラフである。
【図１０】ＯＡ滑液中のｈＧＨ放出プロフィールを示すグラフである。
【図１１】ラットへの関節内投与後の、Ｈｙａｄｄ４およびｈＧＨによって形成されたシステムの、血漿中に見出されるｈＧＨのｎｇ／ｍｌでの濃度を、４８時間までの時間の関数としてプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の説明
本発明の目的は、長い時間にわたる持続性の緩徐な放出のための、主に疎水性の性質を有する治療的におよび／または生物学的に活性なタンパク質と関連して特定のヒアルロン酸アミドを含む、新規な放出システムであり、これにより医薬の有効性および患者のコンプライアンスを高める。
【００１８】
本発明に従う、主に疎水性の性質を有する治療的におよび／または 生物学的に活性なタンパク質のいくつかの例は、以下に列挙される：
インスリンは、タンパク同化特性を有するタンパク質ホルモンであり、膵臓におけるランゲルハンス島のベータ細胞によって産生される；これは、２つのスルフィド架橋によって結合した２つの鎖から成る。そのもっともよく知られている機能は、血糖値の制御である。したがって、このタンパク質は、ごく僅かにしかインスリンを産生しないまたは全く産生しない、１型および２型糖尿病を治療するために使用される。このホルモンは、皮下注射によって投与される（何故なら、これが直接血流内に注射されると、この医薬の吸収が速すぎ、血糖低下をもたらす可能性があるからである）。この治療アプローチは、患者によって行われる血糖テストの日々の変動する数、および結果として較正された用量におけるインスリンの投与（３回以上）に、基づく。
【００１９】
成長ホルモン(ＧＨ)は、１９１のアミノ酸から成り、２２，００５Ｄａの重さの、下垂体前葉のペプチドホルモンである。その主な機能は、ほぼ全ての身体組織の細胞の成長および有糸分裂を促進することにより、ヒトの身体(および多くの他の脊椎動物の身体)の発育を刺激することである(特に、これは、骨、軟骨および結合組織の成長を促進する)。
【００２０】
乳児期の間のＧＨの分泌不全は、下垂体小人症を引き起こし、他方で分泌過多は下垂体巨人症を引き起こす。一般に腫瘍により、成長が終わった後に分泌過多が始まった場合、先端巨大症を発症し、顔、手および足の骨がかなり大きくなる。
【００２１】
したがって、ＧＨは、まだ成長段階の患者、および下垂体腫瘍を罹患する成人のために使用される。
【００２２】
ＧＨはまた、ＧＨの欠乏によって引き起こされるのではない障害、例えば、ターナー症候群、慢性腎疾患、ＩＳＳ（突発性低身長）および多発性硬化症を治療するため、および肥満患者、線維筋痛症、クローン病および潰瘍性大腸炎において体重減少を増加するためにも使用される。
【００２３】
ｈＧＨの関節内投与は、近年試験され、骨関節炎(ＯＡ)の治療において優れた結果を有した。また、ＯＡによって起こされた軟骨損傷の修復における前記ホルモンの有効性を実証した(ＥＰ１１５３６０７；Kim SB et al., J Korean Med Sci., 2010, 25:776-80)。
【００２４】
カルシトニン(ＣＴ)は、ヒトにおいて、甲状腺の傍ろ胞細胞(Ｃ細胞としても知られる)によって産生される、３２アミノ酸ポリペプチドから成るホルモンである。カルシトニンの主な機能は、副甲状腺ホルモンであるパラトルモンの効果に反作用することによって、血液中のカルシウム濃度を下げることである。このカルシウム制御機構は、魚類、は虫類、鳥類および哺乳類の動物において見出されている。カルシトニンホルモンはまた、腎臓レベルにおいても作用し、カルシウムの尿細管除去を刺激する。ｓＣＴ(サケＣＴ)は、一般に、骨粗鬆症、過カルシウム血症、骨転移およびパジェット病を治療するために使用される。
【００２５】
繰り返すが、近年の実験データは、骨関節炎の治療におけるカルシトニンの効力を実証している：その投与は、ＯＡによって起こされる侵食に対して関節表面を保護することが判明している（Manicourt DH et al., J Musculoskelet Neuronal Interact, 2005, 5(3):285-293）。
【００２６】
ＩＬ１−Ｒａは、サイトカインＩＬ−１の受容体アンタゴニストであり、局所性および全身性の炎症プロセスの強力な誘導因子である。ＩＬ−１は、細菌刺激または他のサイトカインによる刺激の後に、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球およびマクロファージによって主に産生される；これはまた、肺胞のマクロファージ、内皮細胞、上皮細胞および平滑筋細胞、繊維芽細胞、破骨細胞、滑膜細胞および多くの他の細胞型によっても分泌される。ＩＬ−１は、乾癬および敗血症性ショックのような特に重篤な障害、ならびにいくつかの型の腫瘍の病因に関わる。他のサイトカインとの組合せにおいて、ＩＬ−１は、炎症プロセスの主要な媒介因子の１つを代表し、したがって、骨粗鬆症、関節リウマチ(ＲＡ)、乾癬性関節炎および骨関節炎(ＯＡ)のような多くの障害に関与する。実際に、大量のＩＬ−１が、関節リウマチおよび／または骨関節炎を罹患する患者の滑液において見出されている。
【００２７】
ＩＬ−１は、軟骨マトリクスの分解を担う軟骨細胞によって産生されるプロテアーゼ酵素であるメタロプロテアーゼ(ＭＭＰ)の合成、分泌および活性化を促進するので、ＩＬ−１の発現は、ＯＡの病因に重要である。
【００２８】
ＯＡプロセスに関係する全ての実験データは、ＩＬ−１およびＴＮＦαが関節組織の破壊に関与する主な異化システムを代表するという概念を強く支持する。実際、これは、ＩＬ−１の産生および／または活性化を遮断することによって実証されており、関節マトリクスの破壊は、防がれるか、および／または軽減される（Caron J.P. et al., Arthritis Rheum, 1996, 39: 1535-1544）。
【００２９】
受容体アンタゴニストＩＬ−１Ｒａを含有する新しい医薬は、現在、このサイトカインの効果に反作用するために使用される。何故なら、このレセプターの遮断は、ＩＬ−１が関係する傷害を処置する有効な方法であることが判明しているからである（Burger D. et al., 「Cytokine Reference」, Oppenheim JJ and Feldmann M, Eds. New York, London, Academic Press, 2000, p.31-336；Jiang Y. et al., Arthritis Rheum, 2000, 43(5):1001-9）。
【００３０】
ＩＬ−１Ｒａは、前記インターロイキンの阻害剤として作用するタンパク質である；しかし、ＩＬ−１Ｒａを含有する医薬(例えば、ａｎａｋｉｎｒａに基づくＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)、ヒトタンパク質ＩＬ−１Ｒａの組換え非グルコシル化形態)は、非常に短い半減期を有することから、しばしば臨床結果を損なう。したがって、強化された臨床結果を確実にするために、持続的なゆっくりとした方法で医薬を送達し、より長い半減期を保証する、ＩＬ−１Ｒａを含有する新規な医薬組成物を処方することが重要である。
【００３１】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、骨髄を刺激して、その後血流中に放出される顆粒球および幹細胞を産生する、１７４〜１８０個のアミノ酸糖タンパク質である。この成長因子は、ニューロトロフィンとして活性であることが判明していることから、脳虚血および筋萎縮性側索硬化症の治療のために現在研究されている。これは、通常、腫瘍の患者のために化学療法と併用して使用され、好中球減少症に反作用する。最終的に、近年の実験研究は、Ｇ−ＣＳＦによる静脈内処置が、損傷した心細胞の再生を促進することを実証している。
【００３２】
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、ジスルフィド架橋によって結合する、ＡおよびＢと呼ばれる２つのポリペプチドを含むダイマーから成る生物学的に活性なタンパク質である。これは、巨核細胞において主に合成され、ヒトにおいて、間葉起源の細胞についての主な血清分裂促進剤を代表する。これは、間質性結合組織形成の媒介因子であるため、創傷／潰瘍の治癒を促進するために使用される。これは、全てのこれらの理由のために、現在、新たな骨組織の形成を促進するためにも使用される。
【００３３】
トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦβ）は、免疫システムの制御において、ならびに組織再生、細胞分化および胚発生において、きわめて重要な役割を果たすペプチドである。これは、皮膚創傷／潰瘍の治癒を増大し、骨折の閉鎖を促進するので、創傷治癒剤として主に使用される。これらの理由により、骨粗鬆症およびＯＡの治療においても使用される。最終的に、実験データは、ＴＧＦαは、心臓に対する虚血性損傷後の心保護特性をも有することを実証している。
【００３４】
上皮成長因子（ＥＧＦ）は、成長の制御において、ならびに細胞増殖および分化において、重要な役目を担う成長因子である。ヒトＥＧＦは、５３のアミノ酸残基および３つの分子内ジスルフィド架橋からなる６０４５ダルトンのタンパク質である。これは、血小板、マクロファージ、尿、唾液、乳汁および血漿において見出される。
【００３５】
これは、胃腸粘膜細胞の増殖を刺激するので、胃保護剤として使用されるタンパク質である。これは、皮膚、静脈および他の種類の創傷／潰瘍の治療において新たな肉芽組織の形成を刺激するので、皮膚組織再生を促進するために使用される。最終的に、ＥＧＦの局所使用は、例えば、角膜手術後または角膜炎などの変性障害の場合に、損傷した角膜組織の再生において優れた結果を出している。
【００３６】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ−Ｂ）は、脈管形成（すなわち、胚の時期における循環システムのｅｘ  ｎｏｖｏ発生）、神経発生および血管形成にも関与したタンパク質成長因子である。また、ＮＭＤＡ−媒介型虚血性損傷に対しニューロンを保護する神経保護剤でもある。
【００３７】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）はヒトにおいて、腎臓ならびに、程度はより少ないが、肝臓および脳によって産生される糖タンパク質ホルモンであり、その主な機能は赤血球産生（骨髄による赤血球の産生）を制御することである。
【００３８】
ＥＰＯはまた、研究室においても生産され、腎疾患または血液障害を罹患する患者において貧血を治療するため、または癌患者に対する化学療法の投与後の回復を促進するための、医薬として使用されている。近年の研究において、ＥＰＯは、抗炎症剤として神経保護の役割を果たすことが観察されている。
【００３９】
エリスロポエチンは、約３００００Ｄの重さの糖タンパク質分子である。最終的に、１９８９年から、ＥＰＯは、透析を受けている貧血症の患者のための医薬として利用可能となっている。その後、この使用は、保存療法を受けている慢性腎不全を有する患者にも広げられ、患者の生活の質を改善することを助けている。エリスロポエチンの薬剤生産は、組換えＤＮＡ方法によって行われる。
【００４０】
神経成長因子（ＮＧＦ）は、甲状腺および脳下垂体によって、視床下部において分泌されるタンパク質である。これはまた、平滑筋細胞および繊維芽細胞によっても産生される。活性形態は、２６ＫＤａのＮＧＦβであり、２つの１１８アミノ酸のタンパク質鎖を結合する２つのジスルフィド架橋を有する、ホモダイマーである。これは、末梢ＮＳのニューロンおよびＣＮＳのコリン作動性ニューロンの分化および機能性を担う。したがって、これは、認知症などの神経変性障害を治療するために使用される。ＮＧＦはまた、緑内障を治療するために有用であることが判明している。
【００４１】
トランスフェリンは、血流中の主な鉄輸送タンパク質である。肝臓および単球−マクロファージ系によって合成されるトランスフェリンは、腸レベルで吸収された鉄および赤血球の分解に由来する鉄を、非常に安定的であるが可逆的な方法で結合し、これを使用部位（詳細には骨髄）および貯蔵部位（詳細には肝臓）に運ぶ。
【００４２】
構造的な見地では、これは、６７９アミノ酸ポリペプチド鎖によって形成される約８０ＫＤの分子量を有する糖タンパク質であり、第二鉄イオン（Ｆｅ３＋）についての２つの結合部位を有するが、第一鉄イオン（Ｆｅ２＋）についての親和性は有さない。その半減期は約８日である。
【００４３】
トランスフェリンは主に肝臓によって合成され、血液中のその基準値は２００〜３６０ｍｇ／ｄＬである。トランスフェリンレベルは、避妊ピルの使用の間、妊娠中および鉄欠乏の事象において増大する。反対に、トランスフェリンレベルは、ネフローゼ症候群、肝臓病、栄養失調、慢性炎症性障害、腫瘍、および鉄またはコルチゾンによる処置の場合において低下する。生理学的な低下は、新生児期および老齢において起こり得る。
【００４４】
ＴＩＭＰは、メタロプロテアーゼを阻害するタンパク質であり、すなわち、軟骨マトリクスの分解に関与する酵素である。ＴＩＭＰファミリーは、軟骨細胞、繊維芽細胞、滑膜細胞、骨芽細胞、ニューロン、マクロファージ、平滑筋細胞、肝細胞他によって産生される、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３およびＴＩＭＰ−４の形態を含む。
【００４５】
これらは、結果的に、軟骨細胞、およびＯＡによって起こる軟骨侵食に対し、保護的な役割を果たす。
【００４６】
発明の詳細な説明
本発明は、持続性の緩徐なタンパク質放出システムの調製のために、特定のヒアルロン酸アミドを、主に疎水性の性質の、治療的におよび／または生物学的に活性なタンパク質と組み合わせて（即ち化学的に結合してではなく）含む、新規な医薬組成物に関する。
【００４７】
本発明に従うシステムは、以下をもたらす：
・長い時間にわたる前記タンパク質の持続性放出（「そのまま（ａｓ  ｉｓ）」投与された同じタンパク質と比較して）。この継続的放出は、医薬の治療可能時間域を広げる。何故なら、この医薬は、その投与の直後の時間内に（一般的に「そのまま」投与された医薬の場合のようには）大量に放出されないからである。特定のＨＡアミドと組み合わせた放出システムとしての投与は、医薬の放出される量（時間に対する）および放出の期間を調節する（したがって、時間にわたって放出されるタンパク質の量における段階的な増大が得られ、これが「そのまま」投与された場合に生ずる量を超える量を最終放出期間にもたらす）。結果として、タンパク質の動態学的放出プロフィールは、その治療有効性プロフィールのように、有意に変更される。
・新規な放出システムは、生物適合性かつ生分解性であるため非毒性であり、運ばれるタンパク質／医薬の緩徐な放出を確定して、治療活性の維持を保証する。何ら変性を受けていない、活性成分の三次元構造の完全性は、したがって確実となる。
・本発明による放出システムは、特定のＨＡアミドと、これと組み合わせる／混合する運ばれるタンパク質との組合せによって形成されているので、運ばれるタンパク質の化学的修飾を何ら引き起こさない。したがって、この担体と医薬との間に何ら共有化学結合は確立されず、したがって、タンパク質／医薬の構造的完全性を保証する。
・これらの新規な特徴は、患者コンプライアンスをかなり高める。何故なら、この医薬は、新規な薬物動態学に従って、結果的に異なった用量で、投与され得るからである。投与の間のより長い間隔および投与される医薬の量の変更は、より高い有効性およびより少ない副作用をもたらす。
【００４８】
本発明の目的を形作る薬理学的におよび／または生物学的に活性なタンパク質は、ＧＲＡＶＹ（Ｇｒａｎｄ  Ａｖｅｒａｇｅ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）指数に従って測定して、主に疎水性の特徴を有さなければならない。ペプチドまたはタンパク質のＧＲＡＶＹ値は、このタンパク質中に存在する全てのアミノ酸のハイドロパシー値の合計として計算され、このタンパク質配列中のそれらの残基の数によって除算される。あらゆるアミノ酸は、イソロイシン（明らかに非極性であり結果として疎水性の性質を分子に与える芳香族炭化水素ラジカルによって形成された残基を有するａａ．）についての４．５から、正に荷電した残基を有するアミノ酸であるアルギニンについての−４．５までの範囲の、所与のハイドロパシー指数を有する（Kyte J. et al., J. Mol. Biol., 1982, 157: 105-132）。この等級表(scale)は、ハイドロパシー指数が高いほど、分析されたアミノ酸の疎水性がより高いことを示す（図１）。容易に分析されたタンパク質のＧＲＡＶＹ値を決定するために、研究されるタンパク質の様々な物理化学的特性をそれらの配列を分析することによって与える、ＰｒｏｔＰａｒａｍ（Gasteiger E. et al., 「Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server」, JM Walker ed., The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press, 2005, 571-607）プログラムが、一般に使用される。前記のアミノ酸配列が入力される場合、このプログラムは、タンパク質のＧＲＡＶＹ値を計算し、その疎水性の度数が測定される。
【００４９】
本発明によれば、「主に疎水性の性質を有するタンパク質」は、−０．５以上から正の値までの範囲のＧＲＡＶＹ指数を有するタンパク質を意味する。繰り返すが、ＧＲＡＶＹ指数が高いほど、分析されるタンパク質の疎水性が高い。
【００５０】
本発明が関する、主に疎水性の性質を有するタンパク質のいくつかの例が、以下に列挙される：
・インスリン：ＧＲＡＶＹ指数＝０．２
・ヒト成長ホルモン、ｈＧＨ：ＧＲＡＶＹ指数＝−０．３
・カルシトニン、ｓＣＴ（サケＣＴ）：ＧＲＡＶＹ指数＝−０．５
・ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒａ受容体アンタゴニスト：ＧＲＡＶＹ指数＝−０．４
・顆粒球コロニー刺激因子、Ｇ−ＣＳＦ：ＧＲＡＶＹ指数＝０．２
・血小板由来成長因子、ＰＤＧＦ：ＧＲＡＶＹ指数＝−０．５、ＰＤＧＦ−ＢＢ＝−０．１が好ましい
・トランスフォーミング成長因子ＴＧＦ−β：ＧＲＡＶＹ指数＝−０．３
・上皮成長因子、ＥＧＦ：ＧＲＡＶＹ指数＝−０．５
・血管内皮成長因子Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｂ：ＧＲＡＶＹ指数＝−０．２
・エリスロポエチン（ヒト）またはＥＰＯ：ＧＲＡＶＹ指数＝−０．０３
・神経成長因子すなわちＮＧＦβ：ＧＲＡＶＹ指数＝−０．３
・トランスフェリン（ヒト）：ＧＲＡＶＹ指数＝−０．２
・メタロプロテイナーゼ−２（ヒト）の組織インヒビター、ＴＩＭＰ−２：ＧＲＡＶＹ指数＝−０．２
・メタロプロテイナーゼ−３（ヒト）の組織インヒビター、ＴＩＭＰ−３：ＧＲＡＶＹ指数＝−０．３
・メタロプロテイナーゼ−４（ヒト）の組織インヒビター、ＴＩＭＰ−４：ＧＲＡＶＹ指数＝−０．１８。
【００５１】
本出願人は、以下に列挙する本発明の目的を形作るヒアルロン酸アミドが、タンパク質の中に含有される疎水性の性質を有するタンパク質の持続性の緩徐な放出を決定する放出システムを、形成することを実証する。他方で、同じアミドと組み合わせた主に親水性の性質を有するタンパク質は、長い時間にわたって持続性の緩徐な放出のために好適な放出システムを形成しない。
【００５２】
本発明の目的を形作る前記放出システムを形成するために好適なＨＡアミドは、以下である：
・ＨＡヘキサデシルアミド：７％から１４％の間、好ましくは８％から９％の間の範囲の（１Ｈ−ＮＭＲによって決定された）モルアミド化百分率を有するヘキサデシルアミンを有するＨＡアミド；
・ＨＡオクチルアミド：１０％から１５％の間、好ましくは１０％から１１％の間の範囲の（１Ｈ−ＮＭＲによって決定された）モルアミド化百分率を有するオクチルアミンを有するＨＡアミド；
・ＨＡドデシルアミド：１０％から１５％の間、好ましくは１０％から１１％の間の範囲の（１Ｈ−ＮＭＲによって決定された）モルアミド化百分率を有するドデシルアミンを有するＨＡアミド；
・ＨＡｔｅｒｔ−ブチルアミド：７％から１２％の間、好ましくは７％から８％の間の範囲の（１Ｈ−ＮＭＲによって決定された）モルアミド化百分率を有するｔｅｒｔ−ブチルアミンを有するＨＡアミド；
・ＨＡベンジルアミド：７％から１５％の間、好ましくは８％から９％の間の範囲の（１Ｈ−ＮＭＲによって決定された）モルアミド化百分率を有するベンジルアミンを有するＨＡアミド。
【００５３】
本発明において前記のアミドの調製のために使用されるＨＡは、任意の供給源、例えば、鶏冠からの抽出（ＥＰ１３８５７２）もしくは（例えば、当業者に公知のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉからの）発酵、または技術的プロセス（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓから、ＷＯ２０１２/０３２１５４）に由来し、４００Ｄａから３×ｌ０６Ｄａの間、好ましくは５０ＫＤａから７３０ＫＤａの間、７５０ＫＤａから１２３０ＫＤａの間、または１５００ＫＤａから２５００ＫＤａの間、なおより好ましくは、１５０ＫＤａから２５０ＫＤａの間および／または５００ＫＤａから７３０ＫＤａの間の重量平均分子量（極限粘度数によって決定される：Terbojevich et al., Carbohydrate Research, 1986, 149:363-377法）を有し得る。
【００５４】
１５０ＫＤａから２５０ＫＤａの間または５００ＫＤａから７３０ＫＤａの間の重量平均分子量を有するＨＡヘキサデシルアミドが、好ましい。
【００５５】
本発明の目的を形作る上に列挙したＨＡアミドは、ＥＰ１０９５０６４に記載のように調製され得る。これはまた、薬理学的に活性な物質についての放出システムの形成を含む、その異なる使用も記載するが、使用される医薬の化学的種と選択されるアミドの種類との間に何ら区別をしておらず、中でも、得られる効果を記載していない。しかし、特定のアミド化の百分率および選択されたＭＷ間隔を有する特定のＨＡアミド、例えばヘキサデシルアミド、オクチルアミド、ドデシルアミド、ｔｅｒｔ−ブチルアミドおよびベンジルアミドが、治療的におよび／または生物学的に活性である主に疎水性の性質を有する（したがって、−０．５を超えるＧＲＡＶＹ指数を有する）タンパク質と組み合わせて、前記タンパク質についての新規な持続性の緩徐な放出システムの調製のために有用であることが、見出された。
【００５６】
以下のタンパク質が、好ましい：
・インスリン
・ｈＧＨ
・ｓＣＴ
・ＩＬ−１Ｒａ
・Ｇ−ＣＳＦ
・ＰＤＧＦ、好ましくはＰＤＧＦ−ＢＢ
・ＴＧＦ−β
・ＥＧＦ
・ＶＥＧＦ−Ｂ
・ＥＰＯ
・ＮＧＦβ
・トランスフェリン
・ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、ＴＩＭＰ−４
前記タンパク質は、組換えＤＮＡ技術または組織からの抽出によって生産され得る。 
【００５７】
本発明のさらなる目的は、以下を含む新規な放出システムである：
１．以下と組み合わせたＨＡヘキサデシルアミド、オクチルアミド、ドデシルアミド、ｔｅｒｔ−ブチルアミドまたはベンジルアミド、
２．インスリン、ｈＧＨ、ｓＣＴ、ＩＬ−１Ｒａ、Ｇ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、好ましくはＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ  ＶＥＧＦ−Ｂ、ＥＰＯ、ＮＧＦβ、トランスフェリン、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３およびＴＩＭＰ−４であり、安定化剤（必要な場合）および賦形剤と組み合わせてもよい。
【００５８】
詳細には、本発明の目的は、以下を含むシステムである：
１．ＨＡヘキサデシルアミド、好ましくは１５０ＫＤａから２５０ＫＤａの間、または５００ＫＤａから７３０ＫＤａの間の重量平均分子量を有するＨＡヘキサデシルアミド、
２．ｈＧＨまたはｓＣＴ、
３．安定化剤および賦形剤と組み合わせてもよい。
【００５９】
この新規なシステムは、これらが含有する活性薬剤の持続性の緩徐な放出において有用である。何故なら、これらは、これらと組み合わせたタンパク質／医薬の治療可能時間域を修正するからである。したがって、異なる投薬レジメンが可能であり、より良い患者コンプライアンスをもたらす。
【００６０】
この放出システムに存在するタンパク質は、このシステムの用途を決定する。例えば、ｈＧＨまたはｓＣＴと共にＨＡヘキサデシルアミドを含む放出システムは、好ましくは、関節内投与によってＯＡ、関節リウマチおよび乾癬性関節炎ならびに骨粗鬆症を治療するために使用される。
【００６１】
本出願人は、この新規な放出システムが、治療した関節の滑液中のｈＧＨの継続的な放出を確定し、より大きな治療効果をもたらしたが、（それにより、その関節内の濃度を低下させる）血漿中へ活性薬剤を通過させず、したがって、この医薬の全身性の副作用を予防したことを証明した。
【００６２】
本発明の目的はまた、以下を含むシステムである：
・インスリンと共に、上に列挙して説明された１種または複数のＨＡアミド；この新規なシステムは、出願人により、医薬のより低投与を必要とする糖尿病障害の治療のためのインスリンの緩徐な放出における新規なデポーとして記載される。
【００６３】
本発明の目的はまた、以下を含むシステムである：
・注射可能用途、関節内用途もしくは局所用途のため、または経口投与のための、上に列挙して説明された１種または複数のＨＡアミド；好ましくはヘキサデシルアミドと組み合わせた、タンパク質、例えばＰＤＧＦ（好ましくはＰＤＧＦ−ＢＢ）、ＴＧＦ−β、ＥＧＦまたはＶＥＧＦ−Ｂ。
【００６４】
上記タンパク質因子（ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＥＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｂ）は、存在が公知である成長因子であり、ヒト多血小板血漿（ＰＲＰ）中に特に濃縮されている。これらを含有する新規な放出システムは、好ましくは、腱炎において、ＯＡによって起こった関節損傷を治療するため、心筋損傷を修復するため、骨の断裂／破砕／腔を修復して新たな骨組織の形成を促進するため、最後に、皮膚潰瘍／創傷／断裂の治癒において新たな結合組織の形成を促進するために、有用である。
【００６５】
本発明の別の目的は、以下を含むシステムである：
・注射可能な、好ましくは関節内用途のための、メタロプロテアーゼ阻害剤ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３またはＴＩＭＰ−４と組み合わせた、上に列挙して説明された１種または複数のＨＡアミド、好ましくはヘキサデシルアミド。
【００６６】
この新規な放出システムは、好ましくは、ＯＡによって起こった関節軟骨損傷を治療し、骨軟骨性侵食を修復するために有用である。
【実施例】
【００６７】
この新規な放出システムの調製例、および本発明に従う前記システムの有効性を実証するために本出願人によって行われた実験は、以下に記載される。
【００６８】
例１：  ５００ｋＤａから７３０ｋＤａの間の重量平均ＭＷを有するＨＡのヘキサデシルアミド誘導体、Ｈｙａｄｄ４の、８％から９％の間のモルアミド化百分率での合成
５．００ｇの５００ｋＤａから７３０ｋＤａの間のＭＷを有する発酵起源のヒアルロン酸ナトリウム塩を２５０ｍｌの水に溶解し、得られた溶液を１００ｍｌのテトラブチルアンモニウムの形態のＤｏｗｅｘ樹脂を事前に詰めたガラスカラムを通して濾過する。ＴＢＡ塩の形態のＨＡ溶液を、溶出し、収集して凍結乾燥させる。
【００６９】
このようにして得られた２ｇの生成物を、２００ｍｌのジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)に溶解し、６４μｌのメタンスルホン酸を加える；５３ｍｇの１，１’−カルボニルジイミダゾールを加え、この混合物を、緩やかな撹拌の下で室温にて１時間放置する。次いで、９９８ｍｇのヘキサデシルアミンを加え、アミド化反応を、４２℃にて２４時間行う。
【００７０】
この反応を５ｍｌのＮａＣｌの飽和水溶液を加えることによって止め、３０分後、１．５倍量の無水エタノールを加え、得られた誘導体を単離する。沈殿物を、エタノール／Ｈ２Ｏ  ８０：２０中で、最後に無水エタノール中で洗浄し、次いで高真空下で４０℃にて乾燥させる。
【００７１】
１．３ｇの誘導体を得、そのアミド化の程度を１Ｈ−ＮＭＲによって決定する。
【００７２】
例２：  ５００ｋＤａから７３０ｋＤａの間の重量平均ＭＷを有するＨＡのオクチルアミド誘導体、Ｈｙａｄｄ２の、１０％から１１％の間のモルアミド化百分率での合成
５．００ｇの、５００ｋＤａから７３０ｋＤａの間のＭＷを有する発酵起源のヒアルロン酸ナトリウム塩を２５０ｍｌの水に溶解し、得られた溶液を１００ｍｌのテトラブチルアンモニウムの形態のＤｏｗｅｘ樹脂を事前に詰めたガラスカラムを通して濾過する。ＴＢＡ塩の形態のＨＡ溶液を、溶出し、収集して凍結乾燥させる。
【００７３】
このようにして得られた２ｇの生成物を、２００ｍｌのジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)に溶解し、６４μｌのメタンスルホン酸を加える；６１．４ｍｇの１，１’−カルボニルジイミダゾールを加え、この混合物を緩やかな撹拌の下で室温にて１時間放置する。次いで、３３０ｍｇのオクチルアミンを加え、アミド化反応を４２℃にて２４時間行う。
【００７４】
この反応を５ｍｌのＮａＣｌの飽和水溶液を加えることによって止め、３０分後、１．５倍量の無水エタノールを加え、得られた誘導体を単離する。沈殿物を、エタノール／Ｈ２Ｏ  ８０：２０中で、最後に無水エタノール中で洗浄し、次いで高真空下で４０℃にて乾燥させる。
【００７５】
１．２ｇの誘導体を得、そのアミド化の程度を１Ｈ−ＮＭＲによって決定する。
【００７６】
例３：  ５００ｋＤａから７３０ｋＤａの間の重量平均ＭＷを有するＨＡのドデシルアミド誘導体、Ｈｙａｄｄ３の、１０％から１１％の間のモルアミド化百分率での合成
５．００ｇの、５００ｋＤａから７３０ｋＤａの間のＭＷを有する発酵起源のヒアルロン酸ナトリウム塩を２５０ｍｌの水に溶解し、得られた溶液を１００ｍｌのテトラブチルアンモニウムの形態のＤｏｗｅｘ樹脂を事前に詰めたガラスカラムを通して濾過する。ＴＢＡ塩の形態のＨＡ溶液を、溶出し、収集して凍結乾燥させる。
【００７７】
このようにして得られた２ｇの生成物を、２００ｍｌのジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)に溶解し、６４μｌのメタンスルホン酸を加える；５４．２ｍｇの１，１’−カルボニルジイミダゾールを加え、この混合物を緩やかな撹拌の下で室温にて１時間放置する。次いで、４４８ｍｇのドデシルアミンを加え、アミド化反応を４２℃にて２４時間行う。
【００７８】
この反応を５ｍｌのＮａＣｌの飽和水溶液を加えることによって止め、３０分後、１．５倍量の無水エタノールを加え、得られた誘導体を単離する。沈殿物を、エタノール／Ｈ２Ｏ  ８０：２０中で、最後に無水エタノール中で洗浄し、次いで高真空下で４０℃にて乾燥させる。
【００７９】
１．２５ｇの誘導体を得、そのアミド化の程度を１Ｈ−ＮＭＲによって決定する。
【００８０】
例４：  ５００ｋＤａから７３０ｋＤａの間の重量平均ＭＷを有するＨＡのｔｅｒｔ−ブチルアミド誘導体、Ｈｙａｄｄ６の、７％から８％の間のモルアミド化百分率での合成
５．００ｇの、５００ｋＤａから７３０ｋＤａの間のＭＷを有する発酵起源のヒアルロン酸ナトリウム塩を２５０ｍｌの水に溶解し、得られた溶液を１００ｍｌのテトラブチルアンモニウムの形態のＤｏｗｅｘ樹脂を事前に詰めたガラスカラムを通して濾過する。ＴＢＡ塩の形態のＨＡ溶液を、溶出し、収集して凍結乾燥させる。
【００８１】
このようにして得られた２ｇの生成物を、２００ｍｌのジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)に溶解し、６４μｌのメタンスルホン酸を加える；５３ｍｇの１，１’−カルボニルジイミダゾールを加え、この混合物を緩やかな撹拌の下で室温にて１時間放置する。次いで、１７８ｍｇのｔｅｒｔ−ブチルアミンを加え、アミド化反応を４２℃にて２４時間行う。
【００８２】
この反応を５ｍｌのＮａＣｌの飽和水溶液を加えることによって止め、３０分後、１．５倍量の無水エタノールを加え、得られた誘導体を単離する。沈殿物を、エタノール／Ｈ２Ｏ  ８０：２０中で、最後に無水エタノール中で洗浄し、次いで高真空下で４０℃にて乾燥させる。
【００８３】
１．２５ｇの誘導体を得、そのアミド化の程度を１Ｈ−ＮＭＲによって決定する。
【００８４】
例５：  ５００ｋＤａから７３０ｋＤａの間の重量平均ＭＷを有するＨＡのベンジルアミド誘導体、Ｈｙａｄｄ１の、８％から９％の間のモルアミド化百分率での合成
５．００ｇの、５００ｋＤａから７３０ｋＤａの間のＭＷを有する発酵起源のヒアルロン酸ナトリウム塩を２５０ｍｌの水に溶解し、得られた溶液を１００ｍｌのテトラブチルアンモニウムの形態のＤｏｗｅｘ樹脂を事前に詰めたガラスカラムを通して濾過する。ＴＢＡ塩の形態のＨＡ溶液を、溶出し、収集して凍結乾燥させる。
【００８５】
このようにして得られた２ｇの生成物を２００ｍｌのジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)に溶解し、６４μｌのメタンスルホン酸を加える；５４．０ｍｇの１，１’−カルボニルジイミダゾールを加え、この混合物を緩やかな撹拌の下で室温にて１時間放置する。次いで、２６０ｍｇのベンジルアミンを加え、アミド化反応を４２℃にて２４時間行う。
【００８６】
この反応を５ｍｌのＮａＣｌの飽和水溶液を加えることによって止め、３０分後、１．５倍量の無水エタノールを加え、得られた誘導体を単離する。沈殿物を、エタノール／Ｈ２Ｏ  ８０：２０中で、最後に無水エタノール中で洗浄し、次いで高真空下で４０℃にて乾燥させる。
【００８７】
１．２５ｇの誘導体を得、そのアミド化の程度を１Ｈ−ＮＭＲによって決定する。
【００８８】
例６：  ＨＡおよびｈＧＨを１０：１および２０：１ｗ／ｗの比で含有する処方物の調製
８ｍｇの、１５０ｋＤａから２５０ｋＤａの間のＭＷ（ＬＭＷ）および５００ｋＤａから７３０ｋＤａの間のＭＷ（ＭＭＷ）を有する発酵起源のヒアルロン酸ナトリウム塩を、ｐＨ＝７．４にて１ｍｌのリン酸塩緩衝液に溶解する。溶解が完了したら、０．８ｍｇのｈＧＨを加えて、１０：１の多糖類／タンパク質重量比を得、０．４ｍｇのｈＧＨを加えて、２０：１の多糖類／タンパク質重量比を得る。この２種の成分を、好適に混合して、この組成物を均一にする。この混合物を、緩衝液で１：１０に希釈し、（キャリブレーション曲線を用いて、ＧＨ濃縮値を出す）２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することによって、負荷を計算する。
【００８９】
例７：  １０：１ｗ／ｗの比のＨＡのヘキサデシルアミドおよびｈＧＨによって形成された放出システムを含有する処方物の調製
例１において記載された通りに調製した８ｍｇのＨＡのヘキサデシルアミド誘導体、Ｈｙａｄｄ４を、ｐＨ＝６．９にて１ｍｌのリン酸塩緩衝液に溶解する。溶解が完了したら、水溶液に事前に溶解した０．８ｍｇのｈＧＨを加え、好適に混合して、この組成物を均一にし、このタンパク質をゲル中にトラップする。ゲルの負荷を、ゲルを緩衝液で１：１０に希釈し、（キャリブレーション曲線を用いて、ＧＨ濃縮値を出す）２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することによって、計算する。
【００９０】
例８：  １０：１ｗ／ｗのＨＡのｔｅｒｔ−ブチルアミドおよびｈＧＨによって形成された放出システムを含有する処方物の調製
例４において記載された通りに調製した８ｍｇのＨｙａｄｄ６を、ｐＨ＝６．９にて１ｍｌのリン酸塩緩衝液に溶解する(８ｍｇ／ｍｌ)。溶解が完了したら、水溶液に事前に溶解した０．８ｍｇのｈＧＨを加え、好適に混合して、この組成物を均一にし、このタンパク質をゲル中にトラップする。ゲルの負荷を、ゲルを緩衝液中で１：１０に希釈し、（キャリブレーション曲線を用いて、ＧＨ濃縮値を出す）２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することによって、計算する。
【００９１】
例９：  １０：１ｗ／ｗのＨＡのオクチルアミドおよびｈＧＨによって形成された放出システムを含有する処方物の調製
例２において記載された通りに調製した８ｍｇのＨｙａｄｄ２を、ｐＨ＝６．９にて１ｍｌのリン酸塩緩衝液に溶解する(８ｍｇ／ｍｌ)。溶解が完了したら、水溶液に事前に溶解した０．８ｍｇのｈＧＨを加え、好適に混合して、この組成物を均一にし、このタンパク質をゲル中にトラップする。ゲルの負荷を、ゲルを緩衝液中で１：１０に希釈し、（キャリブレーション曲線を用いて、ＧＨ濃縮値を出す）２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することによって、計算する。
【００９２】
例１０：  １０：１ｗ／ｗのＨＡのドデシルアミドおよびｈＧＨによって形成された放出システムを含有する処方物の調製
例３において記載された通りに調製した８ｍｇのＨｙａｄｄ３を、ｐＨ＝６．９にて１ｍｌのリン酸塩緩衝液に溶解する（８ｍｇ／ｍｌ）。溶解が完了したら、水溶液に事前に溶解した０．８ｍｇのｈＧＨを加え、好適に混合して、この組成物を均一にし、このタンパク質をゲル中にトラップする。ゲルの負荷を、ゲルを緩衝液中で１：１０に希釈し、（キャリブレーション曲線を用いて、ＧＨ濃縮値を出す）２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することによって、計算する。
【００９３】
例１１：  １０：１ｗ／ｗのＨＡのベンジルアミドおよびｈＧＨによって形成された放出システムを含有する処方物の調製
例５において記載された通りに調製した８ｍｇのＨｙａｄｄ１を、ｐＨ＝６．９にて１ｍｌのリン酸塩緩衝液に溶解する（８ｍｇ／ｍｌ）。溶解が完了したら、水溶液に事前に溶解した０．８ｍｇのｈＧＨを加え、好適に混合して、この組成物を均一にし、このタンパク質をゲル中にトラップする。ゲルの負荷を、ゲルを緩衝液中で１：１０に希釈し、（キャリブレーション曲線を用いて、ＧＨ濃縮値を出す）２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することによって、計算する。
【００９４】
例１２：  １０：１ｗ／ｗの比でＨＡのヘキサデシルアミドおよびｓＣＴによって形成された放出システムを含有する処方物の調製
例１において記載された通りに調製した８ｍｇのＨｙａｄｄ４を、ｐＨ＝６．９にて１ｍｌのリン酸塩緩衝液に溶解する。溶解が完了したら、リン酸塩緩衝液に事前に溶解した０．８ｍｇのサケカルシトニン（ｓＣＴ）を１０：１のｗ／ｗ比になるまで加え、好適に混合して、この組成物を均一にし、このタンパク質をゲル中にトラップする。ゲルの負荷を、ゲルを緩衝液中で１：１０に希釈し、（キャリブレーション曲線を用いて、カルシトニン濃縮値を出す）２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することによって、計算する。
【００９５】
例１３：  １０：１ｗ／ｗのＨＡのヘキサデシルアミドおよびＩＬ−１Ｒａによって形成された放出システムを含有する処方物の調製
例１において記載された通りに調製した８ｍｇのＨｙａｄｄ４を、ｐＨ＝６．９にて１ｍｌのリン酸塩緩衝液に溶解する。溶解が完了したら、水溶液に事前に溶解した０．８ｍｇのＩＬ−１Ｒａを加え、好適に混合して、この組成物を均一にし、このタンパク質をゲル中にトラップする。ゲルの負荷を、ゲルを緩衝液中で１：１０に希釈し、（キャリブレーション曲線を用いて、ＩＬ−１Ｒａ濃縮値を出す）２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することによって、計算する。
【００９６】
例１４：  １０：１ｗ／ｗのＨＡのヘキサデシルアミドおよびＲＮａｓｅに基づく処方物の調製
例１において記載された通りに調製した８ｍｇのＨｙａｄｄ４を、ｐＨ＝６．９にて１ｍｌのリン酸塩緩衝液に溶解する。溶解が完了したら、リン酸塩緩衝液に事前に溶解した０．８ｍｇのＲＮａｓｅを加え、好適に混合してこのタンパク質をゲル中にトラップする。ゲルの負荷を、ゲルを緩衝液中で１：１０に希釈し、（キャリブレーション曲線を用いて、ＲＮＡｓｅ濃縮値を出す）２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することによって、計算する。
【００９７】
例１５：  １０：１ｗ／ｗのＨＡのヘキサデシルアミドおよびインスリンによって形成された放出システムを含有する処方物の調製
例１において記載された通りに調製した８ｍｇのＨｙａｄｄ４を、ｐＨ＝６．９にて１ｍｌのリン酸塩緩衝液に溶解する。溶解が完了したら、リン酸塩緩衝液に事前に溶解した０．８ｍｇのインスリンを加え、好適に混合してこのタンパク質をゲル中にトラップする。ゲルの負荷を、ゲルを緩衝液中で１：１０に希釈し、（キャリブレーション曲線を用いて、インスリン濃縮値を出す）２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することによって、計算する。
【００９８】
例１６：  ＨＡまたはＨＡアミドと共に処方されたｈＧＨの放出の研究
例６〜１１に記載した通りに調製した処方物を、１００ｋＤａのカットオフにて透析管内に導入し、ｐＨ７にて穏やかに撹拌しながらリン酸塩緩衝液中に浸漬して、ドナー区画からのその放出をモニタリングする。比較目的のため、０．８ｍｇのｈＧＨを１ｍｌのリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）と混合し、この処方物を透析管内に導入する。
【００９９】
漏出条件(sink condition)を全ての実験を通じて維持する。前設定時間において、５０μｌのアリコートをドナー区画から取り、１：１０に希釈して、時間にわたるタンパク質含量を決定する。この分析を、２８０ｎｍにおけるＵＶ読み取りおよび２２０ｎｍにおけるＲＰ−ＨＰＬＣによって平行して行い、残留しているタンパク質および（あれば）その分解の量を決定する。拡散測定値もまた、処方したタンパク質の凝集の研究のために取る。最後に、サンプルを、レセプター区画から取り、放出されたタンパク質の量がドナー区画から消えた量に相当することを確かめ、質量分析測定値（Ｅｓｉ−Ｔｏｆ）を取って、放出されたＧＨが何ら構造的分解を受けていないことを確認する。放出曲線を、時間にわたって放出されたタンパク質の百分率を示すことによって構築する。図２、３、４および５。
【０１００】
結果
図２は、Ｈｙａｄｄ４およびｈＧＨによって形成したシステムにより確定したｈＧＨの放出プロフィール対ＰＢＳ中に調製した同じタンパク質によって表される対照を示す。
【０１０１】
図３は、ＬＭＷ−ＨＡおよびＭＭＷ−ＨＡと組み合わせて処方したｈＧＨタンパク質の放出プロフィールを示す。どちらの場合においても、ＨＡおよびｈＧＨの２つの異なる重量比（１０：１および２０：１）を試験した。何故なら、この実験により、出願人は、たとえ異なるＭＷを有する多量のＨＡとであっても、疎水性の性質を有するタンパク質の組合せは、タンパク質の放出プロフィールにおいて、ＰＢＳ、すなわち水性溶媒中で調製することによって得られたプロフィールに対し、何ら変化を誘発しないことを証明することを企図したからである。
【０１０２】
図４は、本発明に従うアミドおよびｈＧＨによって形成された放出システムからのｈＧＨの放出プロフィールを、ＰＢＳ中のｈＧＨによって表される対照と比較する。
【０１０３】
図５は、本発明に従うアミドによって形成された放出システムからのｈＧＨの５０％の放出時間を、再び上述の対照に対して示す。
【０１０４】
図３を、図２および４と比較すると、（上で記載し、特許請求される）ＨＡアミドおよび主に疎水性の性質を有するタンパク質（この場合、ｈＧＨ）によって形成される放出システムは、ＰＢＳ中で分析されたタンパク質によって表される対照に対し、および異なるＭＷおよび異なる重量比のＨＡに処方されたタンパク質に対して、明らかに有意な様式で、タンパク質の長い時間にわたる持続性の緩徐な放出をもたらすことが分かる。したがって、本研究の疎水性タンパク質の放出プロフィールにおける変更を決定するものは、濃度および／または多糖のＭＷではなく、ポリマーの化学的性質である。この全ては、ｈＧＨの５０％の放出時間を比較した図５においてなおより明らかである：この図は、本発明が関係する新規な放出システムが、対照（ＰＢＳ中のｈＧＨ）に対して３倍まで放出時間を延長することを示す。
【０１０５】
例１７：ｓＣＴ、ＩＬ１−Ｒａおよびインスリンの放出対親水性タンパク質であるＲＮａｓｅ  Ａの放出プロフィールの研究
例１２〜１５において記載された通りに調製した処方物のそれぞれを、１００ｋＤａのカットオフにて透析管内に導入し、ｐＨ７にて穏やかに撹拌しながらリン酸塩緩衝液中に浸漬する。比較のために、０．８ｍｇのカルシトニン、ＩＬ−１Ｒａ、インスリンまたはＲＮａｓｅを１ｍｌのリン酸塩緩衝液と混合し、この処方物を透析管内に導入して、ドナー区画からのその放出を時間にわたってモニタリングする。
【０１０６】
漏出条件を全ての実験を通じて維持する。前設定時間において、１０μｌのアリコートをドナー区画から取り、１：１０に希釈して、時間にわたるタンパク質含量を決定する。この分析を、２８０ｎｍにおけるＵＶ読み取りによって平行して行い、残留しているタンパク質の量を決定する。拡散測定値もまた、処方したタンパク質の凝集の研究のために取る。最後に、サンプルをレセプター区画から取り、放出されたタンパク質の量がドナー区画から消えた量に相当することを確かめる。放出曲線を構築し、時間にわたって放出されたタンパク質の百分率をその対照に対し示す。
【０１０７】
タンパク質ＲＮａｓｅ  Ａは、ＧＲＡＶＹ指数＝−０．６７を有し、結果として、主に疎水性であるタンパク質として分類することはできず、親水性のタンパク質である。その放出プロフィールを、主に疎水性の性質を有するタンパク質と組み合わせたＨｙａｄｄ放出システムから得られた放出プロフィールと比較し、差異を実証するために、以下に記載する。
【０１０８】
結果
図６〜８は、分析した主に疎水性の性質である３種のタンパク質の放出プロフィールを示す。３つ全ての場合において、前記タンパク質と組み合わせたＨＡヘキサデシルアミドによって形成されたシステムは、対照よりもずっと長い時間、その持続性の緩徐な放出を確定する。
【０１０９】
反対に、図９は、同一の重量比（１０：１ｗ／ｗ）にて、同じヘキサデシルアミドと、主に親水性の性質およびＧＲＡＶＹ指数＝−０．６７を有するタンパク質ＲＮａｓｅとの組合せが、ＰＢＳ中に処方された場合同じタンパク質によって出されたものと同一の放出プロフィールを確定することを実証する。
例１８：骨関節炎を有する患者由来のヒト滑液（ＬＳ）中へのｈＧＨの放出の研究
ホルモンｈＧＨを、まず蛍光プローブ（Ｃｙ５．５）に共有結合させ、他の滑液のタンパク質の存在下で明確に認識できるようにする。この目的のために、１．５ｍｇのｈＧＨをｐＨ８にて２ｍｌのホウ酸塩緩衝液に溶解し、これに６０μｌのＤＭＳＯ中に事前に溶解した２ｍｇのＣｙ５．５を加える。このラベリング反応を、遮光にて、穏やかに撹拌しながら、１８時間行う。次いで、リン酸塩緩衝液に対する４日間の透析およびＭｉｌｌｉＱ水に対する１日間の透析により、精製を行う。次いで、ラベルしたタンパク質を、ゲル濾過によって分析し、その純度を確かめる。
【０１１０】
Ｈｙａｄｄ４およびｈＧＨ−Ｃｙ５．５に基づく処方物を、１０：１の重量比で、例７において記載された通りに調製する。この２種の成分を好適に混合し、この組成物を均一にして、タンパク質をゲル中にトラップする。このようにして得られたゲルを、１００ｋＤａのカットオフにて透析管内に導入し、ＰＢＳおよび骨関節炎を有する患者に由来する滑液から成る（ｖ／ｖ  １：１）培地中に浸漬し、穏やかな撹拌の下で維持する。
【０１１１】
時間にわたってレセプター区画内に放出されたタンパク質の量を、前設定時間において決定する。この分析を蛍光検出器によるＲＰ−ＨＰＬＣによって行い、ｈＧＨ含量を決定するのみでなく、分解を受けていないタンパク質も確認する。放出曲線を構築し、４８時間までの時間にわたって放出されたタンパク質の百分率を示す。
【０１１２】
結果
図１０は、得られた結果を示す：本研究のタンパク質と組み合わせたＨｙａｄｄ４によって形成されたシステムからのｈＧＨのＬＳにおける放出は、図２において前に実証された持続性の緩徐な放出プロフィールが、変わらず維持されたことを実証する。したがって、Ｈｙａｄｄシステム中に含まれるタンパク質／医薬が保護され、酵素、いくつかは性質の分からないタンパク質、および炎症促進性分子によって富化された放出培地、例えばＯＡ患者の滑液中で、分解を受けないと言える。
【０１１３】
例１９：ラットへの関節内投与後の、Ｈｙａｄｄ４およびｈＧＨによって形成されたシステムの薬物動態学研究
例１において記載された通りに調製した８ｍｇのＨｙａｄｄ４をｐＨ＝６．９にて１ｍｌのリン酸塩緩衝液に溶解し、１２１℃にて湿度の高い熱によって滅菌する。その後、水溶液に事前に溶解し、０．２ミクロンの再生セルロースフィルタを通して濾過することによって滅菌した０．８ｍｇのｈＧＨを、無菌環境にて添加し、好適に混合して、この組成物を均一にし、このタンパク質をゲル中にトラップする。
【０１１４】
インビボ研究のために、１００μｇのタンパク質／動物に相当する量の処方物を、ラットの膝に注射する。前設定時間（０．１５、１、２、３、４、５、６、７、８、２４および４８ｈ）にて、血漿サンプルを採取し、ＥＬＩＳＡ試験に供して、ｉ．ａ．投与後に血漿に進入したｈＧＨの濃度を評価する。この実験を３連で行う。
【０１１５】
比較目的のために、１群の動物を、等量の遊離のｈＧＨ（１００μｇ）にて、やはり関節内投与によって処理する。血漿中に見出されるｈＧＨのｎｇ／ｍｌでの濃度を、４８時間までの時間の関数としてプロットすることにより、薬物動態学曲線を得た。
【０１１６】
結果
図１１に示すように、注射したタンパク質は、関節内注射の直後に血漿中に見出され得る。
【０１１７】
しかし、Ｈｙａｄｄシステムによって誘導されたタンパク質の持続性の放出に起因して、タンパク質はインサイチュ（すなわち関節腔内）に残り、血流に進入せず、したがって、この効果全体が注射部位にて起こる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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