(57)【要約】  本発明は、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）の新規な菌株及び植物の病害又は害虫を防除するためのその使用方法に関する。本発明はまた、グーゲロチンを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株を培養することにより得られる発酵ブロスにも関し、ここで発酵ブロスは少なくとも約１ｇ／Ｌのグーゲロチンを含有している。また、本発明は、グーゲロチンを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株の発酵ブロスを製造する方法にも関し、ここで発酵ブロスは少なくとも約１ｇ／Ｌのグーゲロチンを含有し、この方法は消化可能な炭素源及び消化可能な窒素源を含有する培地中好気性条件下でストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株を培養することを含んでおり、前記培地は少なくとも１ｇ／Ｌのグーゲロチン濃度を達成するのに有効な濃度のアミノ酸を含有している。本開示は、また、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）に由来のグーゲロチン生合成遺伝子クラスターの分子クローニング、及び、遺伝子クラスター内の個々の遺伝子の同定、並びに、それによりコードされるタンパク質にも関する。１３のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいるグーゲロチン遺伝子クラスターは、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）のある遺伝子座内に位置する。
2015534950.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物食性−殺ダニ性及び／又は殺真菌性のストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性及び／又は殺真菌性の突然変異株の生物学的に純粋な培養物を含む組成物。
【請求項２】
前記突然変異株が層透過活性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記突然変異株が殺卵活性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記突然変異株が残効性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記突然変異株が殺菌活性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記突然変異株が白カビ（ｍｉｌｄｅｗ）に対する活性を有する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記突然変異株が殺虫活性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記突然変異株がコーンルートワームに対する活性を有する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
培養物１ｍＬ当たり少なくとも約１×１０６ＣＦＵの菌株を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
配合成分をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記配合成分が湿潤剤である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
少なくとも約５０％のハダニ効力（Ｓｐｉｄｅｒ  Ｍｉｔｅ  Ｐｏｔｅｎｃｙ）を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
少なくとも約６０％のハダニ効力を有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
殺ダニ性及び／又は殺真菌性のストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性及び／又は殺真菌性の突然変異株の発酵産物を含む組成物。
【請求項１５】
前記発酵産物がさらに配合成分を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記配合成分が湿潤剤である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
少なくとも約５０％のハダニ効力を有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
植物を処理して植物病害又は害虫を防除する方法であって、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性及び／又はそれから誘導される突然変異株を植物、植物の部分及び／又は植物の生育場所に施用することを含む、前記方法。
【請求項１９】
ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性及び／又は殺真菌性の突然変異株を、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性の突然変異株を含む組成物として施用する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性の突然変異株の発酵産物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、前記組成物を植物の茎葉部分に施用することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
防除対象の害虫がダニ及びジアブロチカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ダニが、クローバーハダニ、ニセクローバーハダニ、ハシバミハダニ（ｈａｚｅｌｎｕｔ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、アスパラガスハダニ（ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、ホモノハダニ、マメダニ（ｌｅｇｕｍｅ  ｍｉｔｅ）、カタバミダニ（ｏｘａｌｉｓ  ｍｉｔｅ）、ツゲダニ（ｂｏｘｗｏｏｄ  ｍｉｔｅ）、テキサスミカンハダニ（Ｔｅｘａｓ  ｃｉｔｒｕｓ  ｍｉｔｅ）、オリエンタルミカンハダニ（Ｏｒｉｅｎｔａｌ  ｒｅｄ  ｍｉｔｅ）、ミカンハダニ、リンゴハダニ、キイロハダニ（ｙｅｌｌｏｗ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、イチジクハダニ（ｆｉｇ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、ルイスハダニ（Ｌｅｗｉｓ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、コウノシロハダニ（ｓｉｘ−ｓｐｏｔｔｅｄ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、ウィラメットダニ（Ｗｉｌｌａｍｅｔｔｅ  ｍｉｔｅ）、ユマハダニ（Ｙｕｍａ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、ウェブスピニングマイト（ｗｅｂ−ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｍｉｔｅ）、パイナップルダニ（ｐｉｎｅａｐｐｌｅ  ｍｉｔｅ）、シトラスグリーンマイト（ｃｉｔｒｕｓ  ｇｒｅｅｎ  ｍｉｔｅ）、アメリカサイカチハダニ（ｈｏｎｅｙ−ｌｏｃｕｓｔ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、チャアカハダニ（ｔｅａ  ｒｅｄ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、チビコブハダニ、アボカドブラウンマイト（ａｖｏｃａｄｏ  ｂｒｏｗｎ  ｍｉｔｅ）、トドマツノハダニ、アボカドレッドマイト（ａｖｏｃａｄｏ  ｒｅｄ  ｍｉｔｅ）、バンクスグラスマイト（Ｂａｎｋｓ  ｇｒａｓｓ  ｍｉｔｅ）、ニセナミハダニ、アシノワハダニ、ヤサイハダニ（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、ツミドスパイダーマイト（ｔｕｍｉｄ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、イチゴハダニ（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、ナミハダニ、マクダニエルマイト（ＭｃＤａｎｉｅｌ  ｍｉｔｅ）、パシフィックスパイダーマイト（Ｐａｃｉｆｉｃ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、オウトウハダニ、フォースポッテドスパイダーマイト（ｆｏｕｒ−ｓｐｏｔｔｅｄ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、ショエネイスパイダーマイト（Ｓｃｈｏｅｎｅｉ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、チリヒメハダニ（Ｃｈｉｌｅａｎ  ｆａｌｓｅ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、ブドウヒメハダニ、チャノヒメハダニ、フラットスカーレットマイト（ｆｌａｔ  ｓｃａｒｌｅｔ  ｍｉｔｅ）、ホワイトテイルドマイト（ｗｈｉｔｅ−ｔａｉｌｅｄ  ｍｉｔｅ）、パイナップルホコリダニ（ｐｉｎｅａｐｐｌｅ  ｔａｒｓｏｎｅｍｉｄ  ｍｉｔｅ）、ウェストインディアシュガーケーンマイト（Ｗｅｓｔ  Ｉｎｄｉａｎ  ｓｕｇａｒ  ｃａｎｅ  ｍｉｔｅ）、バルブスケールマイト（ｂｕｌｂ  ｓｃａｌｅ  ｍｉｔｅ）、シクラメンホコリダニ、チャノホコリダニ、ムギダニ、レッドレッグドアースマイト（ｒｅｄ−ｌｅｇｇｅｄ  ｅａｒｔｈ  ｍｉｔｅ）、フィルバートビッグ−ブッドマイト（ｆｉｌｂｅｒｔ  ｂｉｇ−ｂｕｄ  ｍｉｔｅ）、ブドウハモグリダニ、ピーアブリスターリーフマイト（ｐｅａｒ  ｂｌｉｓｔｅｒ  ｌｅａｆ  ｍｉｔｅ）、アップルリーフエッジローラーマイト（ａｐｐｌｅ  ｌｅａｆ  ｅｄｇｅｒｏｌｌｅｒ  ｍｉｔｅ）、ピーチモザイクベクターマイト（ｐｅａｃｈ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ  ｍｉｔｅ）、アルダービー��ゴールマイト（ａｌｄｅｒ  ｂｅａｄ  ｇａｌｌ  ｍｉｔｅ）、ペリアンウォルナットリーフゴールマイト（Ｐｅｒｉａｎ  ｗａｌｎｕｔ  ｌｅａｆ  ｇａｌｌ  ｍｉｔｅ）、ペカンリーフエッジロールマイト（ｐｅｃａｎ  ｌｅａｆ  ｅｄｇｅｒｏｌｌ  ｍｉｔｅ）、イチジクモンサビダニ（ｆｉｇ  ｂｕｄ  ｍｉｔｅ）、オリーブモンサビダニ（ｏｌｉｖｅ  ｂｕｄ  ｍｉｔｅ）、シトラスブッドマイト（ｃｉｔｒｕｓ  ｂｕｄ  ｍｉｔｅ）、ライチエリネウムマイト（ｌｉｔｃｈｉ  ｅｒｉｎｅｕｍ  ｍｉｔｅ）、チューリップサビダニ、ココナッツフラワーアンドナッツマイト（ｃｏｃｏｎｕｔ  ｆｌｏｗｅｒ  ａｎｄ  ｎｕｔ  ｍｉｔｅ）、シュガーケーンブリスターマイト（ｓｕｇａｒ  ｃａｎｅ  ｂｌｉｓｔｅｒ  ｍｉｔｅ）、バッファローグラスマイト（ｂｕｆｆａｌｏ  ｇｒａｓｓ  ｍｉｔｅ）、バミューダグラスマイト（ｂｅｒｍｕｄａ  ｇｒａｓｓ  ｍｉｔｅ）、ニンジンモンサビダニ（ｃａｒｒｏｔ  ｂｕｄ  ｍｉｔｅ）、スウィートポテトリーフゴールマイト（ｓｗｅｅｔ  ｐｏｔａｔｏ  ｌｅａｆ  ｇａｌｌ  ｍｉｔｅ）、ポメグラナテリーフカールマイト（ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ  ｌｅａｆ  ｃｕｒｌ  ｍｉｔｅ）、アシュスプラングルゴールマイト（ａｓｈ  ｓｐｒａｎｇｌｅ  ｇａｌｌ  ｍｉｔｅ）、メイプルブラッダーゴールマイト（ｍａｐｌｅ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｇａｌｌ  ｍｉｔｅ）、アルダーエリネウムマイト（ａｌｄｅｒ  ｅｒｉｎｅｕｍ  ｍｉｔｅ）、レッドベリーマイト（ｒｅｄｂｅｒｒｙ  ｍｉｔｅ）、コットンブリスターマイト（ｃｏｔｔｏｎ  ｂｌｉｓｔｅｒ  ｍｉｔｅ）、ブルーベリーブッドマイト（ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ  ｂｕｄ  ｍｉｔｅ）、チャノナガサビダニ、チャノサビダニ、グレオシトラスマイト（ｇｒｅｙ  ｃｉｔｒｕｓ  ｍｉｔｅ）、サツマイモサビダニ（ｓｗｅｅｔ  ｐｏｔａｔｏ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）、セイヨウトチノキサビダニ（ｈｏｒｓｅ  ｃｈｅｓｔｎｕｔ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）、ミカンサビダニ（ｃｉｔｒｕｓ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）、リンゴサビダニ、ブドウサビダニ、ナシサビダニ、フラットニードルシースパインマイト（ｆｌａｔ  ｎｅｅｄｌｅ  ｓｈｅａｔｈ  ｐｉｎｅ  ｍｉｔｅ）、ワイルドローズブッドアンドフルーツマイト（ｗｉｌｄ  ｒｏｓｅ  ｂｕｄ  ａｎｄ  ｆｒｕｉｔ  ｍｉｔｅ）、ドライベリーマイト（ｄｒｙｂｅｒｒｙ  ｍｉｔｅ）、マンゴーサビダニ（ｍａｎｇｏ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）、アザレアサビダニ（ａｚａｌｅａ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）、モモサビダニ（ｐｌｕｍ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）、モモサビダニ（ｐｅａｃｈ  ｓｉｌｖｅｒ  ｍｉｔｅ）、リンゴサビダニ、トマトサビダニ、ミカンサビダニ（ｐｉｎｋ  ｃｉｔｒｕｓ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）、穀類サビダニ（ｃｅｒｅａｌ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）、イネサビダニ（ｒｉｃｅ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ジアブロチカ（ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）が、バンデッドキューカンバビートル（ｂａｎｄｅｄ  ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｂｅｅｔｌｅ）（ジアブロチカ・バルテアタ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｌｔｅａｔａ））、ノーザンコーンルートワーム（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ）（ジアブロチカ・バルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｒｂｅｒｉ））、サウザンコーンルートワーム（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ）（ジアブロチカ・ウンデシンプンクタタ・ホワーディ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉ））、ウェスタンキューカンバビートル（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｂｅｅｔｌｅ）（ジアブロチカ・ウンデシンプンクタタ・テネラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｔｅｎｅｌｌａ））、ウエスタンスポッテドキューカンバービートル（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｓｐｏｔｔｅｄ  ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｂｅｅｔｌｅ）（ジアブロチカ・ウンデシンプンクタタ・ウンデシンプンクタタ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ））、ウェスタンコーンルートワーム（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ）（ジアブロチカ・ビルギフェラ・ビルギフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ））、メキシカンコーンルートワーム（Ｍｅｘｉｃａｎ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ）（ジアブロチカ・ビルギフェラ・ゼアエ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｚｅａｅ））及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記発酵産物が凍結乾燥粉末又は噴霧乾燥粉末であり、且つ、その発酵産物を約０．６２５ポンド／エーカー〜約５ポンド／エーカーの施用量で施用する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記発酵産物が少なくとも約２重量％のグーゲロチンを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記発酵産物が少なくとも約４重量％のグーゲロチンを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ダニがアバメクチン抵抗性のダニである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記植物病害が菌類により引き起こされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記植物病害が白カビ（ｍｉｌｄｅｗ）又はさび病（ｒｕｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記白カビ（ｍｉｌｄｅｗ）がうどんこ病（ｐｏｗｄｅｒｙ  ｍｉｌｄｅｗ）又はベと病（ｄｏｗｎｙ  ｍｉｌｄｅｗ）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記さび病が、プッシニア・トリシチナ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉｎａ）により引き起こされるコムギ赤さび病、プッシニア・ホルデイ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｈｏｒｄｅｉ）により引き起こされるオオムギの小さび病、プッシニア・レコンジタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｒｅｃｏｎｄｉｔａ）により引き起こされるライ麦の赤さび病、赤さび病（ｂｒｏｗｎ  ｌｅａｆ  ｒｕｓｔ）、冠さび病（ｃｒｏｗｎ  ｒｕｓｔ）及び黒さび病（ｓｔｅｍ  ｒｕｓｔ）からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
グーゲロチン産生性ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株の発酵ブロスであって、少なくとも約１ｇ／Ｌのグーゲロチンを含む、前記発酵ブロス。
【請求項３４】
前記グーゲロチン産生性ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、及び配列番号：４２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項３３に記載の発酵ブロス。
【請求項３５】
前記グーゲロチン産生性ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、及び配列番号：４２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項３４に記載の発酵ブロス。
【請求項３６】
前記発酵ブロスが、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約６ｇ／Ｌ、少なくとも約７ｇ／Ｌ又は少なくとも約８ｇ／Ｌのグーゲロチンを含有する、請求項３３に記載の発酵ブロス。
【請求項３７】
前記発酵ブロスが、約１ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの濃度でグーゲロチンを含有する、請求項３３に記載の発酵ブロス。
【請求項３８】
前記ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株が、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）菌株又はストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）菌株である、請求項３４に記載の発酵ブロス。
【請求項３９】
前記ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）菌株が、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性の突然変異株からなる群から選択される、請求項３８に記載の発酵ブロス。
【請求項４０】
前記ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）菌株が、ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性の突然変異株からなる群から選択される、請求項３９に記載の発酵ブロス。
【請求項４１】
グーゲロチン産生性ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株の発酵ブロスを製造する方法であって、発酵ブロスは少なくとも約１ｇ／Ｌのグーゲロチンを含有し、前記方法は前記消化可能な炭素源及び消化可能な窒素源を含有する培地において好気性条件下でストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株を培養することを含み、前記培地が少なくとも１ｇ／Ｌのグーゲロチン濃度を達成するのに有効な濃度でアミノ酸を含有する、前記方法。
【請求項４２】
前記培地が少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約６ｇ／Ｌ、少なくとも約７ｇ／Ｌ又は少なくとも約８ｇ／Ｌのグーゲロチンの濃度でグーゲロチンを含有するまで、前記ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株を培地中で培養する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記培地が約１ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌのグーゲロチンの範囲の濃度でグーゲロチンを含有するまで、前記ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株を培地中で培養する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記アミノ酸が、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、セリン及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記培地が、少なくとも約２ｇ／Ｌの初期濃度でアミノ酸を含有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記培地が、約５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの初期濃度でグリシンを含有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記培地が、約５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの初期濃度でグルタミン酸を含有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記培地が、炭素源としてグルコースとオリゴ糖の混合物を含有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記オリゴ糖がマルトデキストリン又はデキストリンである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記培地中の初期マルトデキストリン濃度が約５０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記培地中の初期マルトデキストリン濃度が約６０ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記培地中の初期グルコース濃度が約２０ｇ／Ｌ〜６０ｇ／Ｌである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記培地中の初期グルコース濃度が約３０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記培地が約１ｇ／Ｌ〜３ｇ／Ｌの初期濃度で炭酸カルシウムを含有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項５５】
前記窒素源が、少なくとも部分的に、大豆ペプトン、大豆酸加水分解物、大豆粉加水分解物、カゼイン加水分解物、酵母エキス及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５６】
前記ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、及び配列番号：４２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んでいる、請求項４１に記載の方法。
【請求項５７】
前記ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株がストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）菌株である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５８】
前記ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）菌株がストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性の突然変異株からなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株がストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）菌株である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）菌株がストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性の突然変異株である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
グーゲロチン産生性ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株の発酵ブロスのグーゲロチンレベルを高める方法であって、消化可能な炭素源及び消化可能な窒素源を含有している培地中において好気性条件下でストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株を培養する段階を含み、前記培地が、約１ｇ／Ｌ未満の１種以上のアミノ酸を含有している培地で達成されるグーゲロチン濃度より少なくとも２倍大きいグーゲロチン濃度を達成するのに有効な濃度のアミノ酸を含有している、前記方法。
【請求項６２】
前記培地が約２ｇ／Ｌの１種以上のアミノ酸の濃度でアミノ酸を含有する、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
前記アミノ酸がグルタミン酸、セリン又はグリシンである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、及び配列番号：４２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
配列番号：４３のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、該配列の発現を指令するために少なくとも１の外因性及び／又は異種の調節要素に機能的に連結された核酸配列。
【請求項６６】
さらに、配列番号：４３の位置１０８２０〜位置１２０１３のヌクレオチド配列を含む、請求項６５に記載の核酸配列。
【請求項６７】
さらに、配列番号：４３の位置１３２１９〜位置１４３３４のヌクレオチド配列を含む、請求項６５または６６に記載の核酸配列。
【請求項６８】
前記核酸配列が、Ｓ．ミクロフラブス（Ｓ．ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）、Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、Ｓ．アヌラツス（Ｓ．ａｎｕｌａｔｕｓ）、Ｓ．フィミカリウス（Ｓ．ｆｉｍｉｃａｒｉｕｓ）、Ｓ．パルブス（Ｓ．ｐａｒｖｕｓ）、Ｓ．ラベンデュラエ（Ｓ．ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）、Ｓ．アルボビリディス（Ｓ．ａｌｂｏｖｉｒｉｄｉｓ）、Ｓ．プニセウス（Ｓ．ｐｕｎｉｃｅｕｓ）、又はＳ．グラミネアルス（Ｓ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｓ）から単離される、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の核酸配列。
【請求項６９】
請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の核酸配列を含む、宿主細胞。
【請求項７０】
グーゲロチン又はグーゲロチンアナログを製造する方法であって、前記方法は、前記グーゲロチン又はグーゲロチンアナログを生産させ培地中に排泄させるために、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）科のグーゲロチン又はグーゲロチン産生性細菌を培地中で培養する段階と、前記グーゲロチン又はグーゲロチンアナログを培地から収集する段階を含み、前記細菌が請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の核酸配列の遺伝子の発現を高めるように改変されている、前記方法。
【請求項７１】
前記細菌が、Ｓ．ミクロフラブス（Ｓ．ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）、Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、Ｓ．アヌラツス（Ｓ．ａｎｕｌａｔｕｓ）、Ｓ．フィミカリウス（Ｓ．ｆｉｍｉｃａｒｉｕｓ）、Ｓ．パルブス（Ｓ．ｐａｒｖｕｓ）、Ｓ．ラベンデュラエ（Ｓ．ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）、Ｓ．アルボビリディス（Ｓ．ａｌｂｏｖｉｒｉｄｉｓ）、Ｓ．プニセウス（Ｓ．ｐｕｎｉｃｅｕｓ）及びＳ．グラミネアルス（Ｓ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｓ）からなる群から選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記細菌がＳ．ミクロフラブス（Ｓ．ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の核酸配列から選択されるポリペプチドサブユニットをコードする遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項７４】
請求項７３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項７５】
グーゲロチン又はグーゲロチンアナログを製造する方法であって、
（ａ）  請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の核酸配列を含有する組換え発現ベクターを構築するステップ；
（ｂ）  ステップ（ａ）の核酸配列を含有する発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を生成させるステップ；
（ｃ）  ステップ（ｂ）の形質転換体を培養するステップ；及び、
（ｄ）  ステップ（ｃ）の形質転換体の培養産物から前記グーゲロチン又はグーゲロチン  アナログを単離し精製するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項７６】
トランスジェニック原核生物細胞であって、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、及び配列番号：４２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、前記トランスジェニック原核生物細胞。
【請求項７７】
配列番号：１３のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、該配列の発現を指令するために少なくとも１の外因性及び／又は異種の調節要素に機能的に連結される核酸配列。
【請求項７８】
配列番号：１７のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列をさらに含む、請求項７７に記載の核酸配列。
【請求項７９】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１５、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、及び配列番号：４１からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する少なくとも１の核酸配列をさらに含む、請求項７７又は７８に記載の核酸配列。
【請求項８０】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９及び配列番号：４１からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有している核酸配列であって、さらに、外因性の制限酵素開裂部位を含む核酸配列を含んでいる、前記核酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌菌株並びにその植物病害及び害虫を防除する能力の分野に係る。
【０００２】
電子データとして提出された配列表への言及
配列表の公式コピーは、２０１３年１０月１０日に作成された１７５キロバイトのサイズを有するファイル名「２５０−ＵＳ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というＡＳＣＩＩ−形式の配列表として、本明細書と共に、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子データとして提出されている。このＡＳＣＩＩ−形式の文書内に収容されている配列表は本明細書の一部であり、参照によりその全体を本明細書に組み入れる。
【背景技術】
【０００３】
植物食性のダニ類、殊にハダニ類は、果樹園、温室並びに多くの野菜及び果実作物、例えばコショウ、トマト、ジャガイモ、トウナス、ナス、キュウリ及びイチゴの主要な農業害虫である。ダニはその鋭い口器を用いて葉及び／又は果実表面に損害を与える。植物の部分に対する直接損傷（斑点を生じるスティップリングといわれる）の他に、ダニによる摂食はまた、植物病害へのかかりやすさを増大させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ダニ類は昆虫というよりはダニ目であり、またダニに対して有効な広いスペクトルの殺虫剤は殆どない。ダニの特性及び利用可能な殺ダニ剤の特性のため、ダニの防除は難問となっている。例えば、ダニの中で経済的に最も重要な一群であるハダニは、通常植物の葉の裏面にいるので、処理するのが難しい。さらに、ダニは、多くが単一モードの作用様式を有する現在利用可能な殺ダニ剤に対して２〜４年以内に抵抗性を示すようになることが知られている。ダニの卵に対して活性を有する利用可能な殺ダニ剤は殆どなく、繰り返して施用する必要がある。従って、良好なノックダウン活性に加えて層透過性（ｔｒａｎｓｌａｍｉｎａｒ）で殺卵性の強力な残留活性を有する新しい殺ダニ剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性の突然変異体（株）を提供する。１つの実施形態において、植物食性−殺ダニ性及び／又は殺真菌性の突然変異株はストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）Ｍ株である。本発明はまた、ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性及び／又は殺真菌性の突然変異体（株）も提供する。
【０００６】
また、本発明は、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性及び／又は殺真菌性の突然変異体（株）を含有する組成物を提供する。１つの態様において、組成物は、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性及び／又は殺真菌性の突然変異株の発酵産物である。また本発明は、ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性及び／又は殺真菌性の突然変異体（株）を含有する組成物も提供する。１つの態様において、組成物は、ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性及び／又は殺真菌性の突然変異株の発酵産物である。
【０００７】
本発明は、グーゲロチンを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株を培養することによって得られる発酵産物も提供し、ここで発酵産物は少なくとも約１ｇ／Ｌのグーゲロチンを含有する。
【０００８】
また、少なくとも約１ｇ／Ｌのグーゲロチンを含有する発酵ブロスも提供される。１つの実施形態において、この発酵ブロスは後処理に全くかけられていない。特定の実施形態において、発酵ブロスはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株由来である。本発明に適したストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株の種類は本明細書中で詳細に説明する。
【０００９】
グーゲロチンを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株の発酵産物も提供され、ここで発酵産物は少なくとも約１ｇ／Ｌのグーゲロチンを含む。１つの実施形態において、発酵産物は発酵ブロスである。また、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約６ｇ／Ｌ、少なくとも約７ｇ／Ｌ又は少なくとも約８ｇ／Ｌのグーゲロチンを含有する発酵ブロスも提供される。１つの実施形態において、発酵ブロスは約１ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの濃度でグーゲロチンを含有する。１つの実施形態において、グーゲロチンを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株はＳ．ミクロフラブス（Ｓ．ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）、Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、Ｓ．アヌラツス（Ｓ．ａｎｕｌａｔｕｓ）、Ｓ．フィミカリウス（Ｓ．ｆｉｍｉｃａｒｉｕｓ）、Ｓ．パルブス（Ｓ．ｐａｒｖｕｓ）、Ｓ．ラベンデュラエ（Ｓ．ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）、Ｓ．アルボビリディス（Ｓ．ａｌｂｏｖｉｒｉｄｉｓ）、Ｓ．プニセウス（Ｓ．ｐｕｎｉｃｅｕｓ）、又はＳ．グラミネアルス（Ｓ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｓ）である。他に、グーゲロチンを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、及び配列番号：４２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、又は少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。１つの例において、グーゲロチンを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６，配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、及び配列番号：４２からなる群から選択される全てのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、又は少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の例において、グーゲロチンを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、及び配列番号：３０からなる群から選択される全てのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、又は少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。他に、グーゲロチンを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株は、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、及び配列番号：３０からなる群から選択される全てのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、又は少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、グーゲロチンを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株は、配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８１、配列番号：８２、配列番号：８３、配列番号：８４、配列番号：８５、配列番号：８６、配列番号：８７、及び配列番号：８８からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、又は少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。１つの例において、グーゲロチンを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株は、配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８１、配列番号：８２、配列番号：８３、配列番号：８４、配列番号：８５、配列番号：８６、配列番号：８７、及び配列番号：８８からなる群から選択される全てのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、又は少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。さらにもう１つ別の実施形態において、グーゲロチンを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株はストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性及び／又は殺真菌性の突然変異株である。他には、ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性の突然変異株である。さらに他には、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）Ｍ株である。
【００１０】
本発明はまた、グーゲロチンを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株の発酵ブロスを製造する方法も提供し、ここで発酵ブロスは少なくとも約０．５ｇ／Ｌのグーゲロチンを含有し、この方法は消化可能な炭素源及び消化可能な窒素源を含有する培地中において前記ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株を好気性条件下で培養することを含み、ここで培地は少なくとも０．５ｇ／Ｌのグーゲロチン濃度を達成するのに有効な濃度でアミノ酸を含有する。また、本発明は、グーゲロチンを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株の発酵ブロスを製造する方法も提供し、ここで発酵ブロスは少なくとも約１ｇ／Ｌのグーゲロチンを含有し、この方法は消化可能な炭素源及び消化可能な窒素源を含有する培地中において前記ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株を好気性条件下で培養することを含み、ここで培地は少なくとも１ｇ／Ｌのグーゲロチン濃度を達成するのに有効な濃度でアミノ酸を含有する。本発明はまた、植物を処理して植物病害又は害虫を防除する方法も提供し、この方法はストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性の突然変異株を植物、植物の部分及び／又は植物の生育場所に施用することを含む。１つの実施形態においては、菌株の発酵産物又はそれから誘導される突然変異体の発酵産物を植物及び／又は植物の生育場所に施用する。
【００１１】
本発明はまた、植物を処理して植物病害又は害虫を防除する方法を提供し、この方法はストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）株、例えばストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ−５０５５０株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性の突然変異株を植物、植物の部分及び／又は植物の生育場所に施用することを含む。１つの実施形態においては、菌株の発酵産物又はそれから誘導される突然変異体の発酵産物を植物及び／又は植物の生育場所に施用する。
【００１２】
本発明はまた、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）株、例えばストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性の株を植物又は植物を取り巻く土壌に施用することを含む、植物食性のダニ又は昆虫を防除する方法も提供する。１つの実施形態においては、菌株の発酵産物又はそれから誘導される突然変異体の発酵産物を植物及び／又は植物の生育場所に施用する。
【００１３】
また、グーゲロチンを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株の発酵ブロスを製造する方法も提供され、ここで発酵ブロスは少なくとも約１ｇ／Ｌのグーゲロチンを含有し、この方法は消化可能な炭素源及び消化可能な窒素源を含有する培地中において好気性条件下でストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株を培養することを含み、ここで培地は少なくとも１ｇ／Ｌのグーゲロチン濃度を達成するのに有効な濃度でアミノ酸を含有する。１つの実施形態において、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株は、培地が少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約６ｇ／Ｌ、少なくとも約７ｇ／Ｌ又は少なくとも約８ｇ／Ｌのグーゲロチンの濃度でグーゲロチンを含有するようになるまで培地で培養される。他に、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株は、培地が約１ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌのグーゲロチンの範囲の濃度でグーゲロチンを含有するようになるまで培地で培養される。
【００１４】
前記発酵ブロスを製造する方法の１つの実施形態において、アミノ酸はグリシン、グルタミン酸、グルタミン、セリン及びこれらの混合物からなる群から選択される。１つの例において、培地は、少なくとも約２ｇ／Ｌの初期濃度でアミノ酸を含有する。特定の例において、培地は、グリシンをある初期濃度で、及び／又はグルタミン酸を約５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの初期濃度で含有する。
【００１５】
培地は、上記のように、１つの実施形態において、炭素源としてグルコース及びオリゴ糖の混合物を含有する。１つの例において、オリゴ糖はマルトデキストリン又はデキストリンである。特定の例において、培地中の初期のマルトデキストリン濃度は約５０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌである。他に、初期のマルトデキストリン濃度は約６０ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌである。
【００１６】
１つの実施形態において、培地中の初期のグルコース濃度は約２０ｇ／Ｌ〜６０ｇ／Ｌ又は約３０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌである。
【００１７】
１つの実施形態において、培地は、約１ｇ／Ｌ〜３ｇ／Ｌの初期濃度で炭酸カルシウムを含有する。
【００１８】
１つの実施形態において、窒素源は少なくとも部分的に、大豆ペプトン、大豆酸加水分解物、大豆粉加水分解物、カゼイン加水分解物、酵母エキス、及びこれらの混合物からなる群から選択される。
【００１９】
上記したグーゲロチンを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株のいずれもこの方法を実施するのに使用することができる。
【００２０】
また、消化可能な炭素源及び消化可能な窒素源を含有する培地中において好気性条件下でグーゲロチンを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株を培養することを含む、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株の発酵ブロス中のグーゲロチンレベルを高める方法も提供され、ここで培地は約１ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ、又は約１０ｇ／Ｌ未満の１種以上のアミノ酸を含有する培地で達成されるグーゲロチン濃度より少なくとも２倍高いグーゲロチン濃度を達成するのに有効な濃度でアミノ酸を含有する。１つの実施形態において、培地中に使用されるアミノ酸はグルタミン酸、セリン及び／又はグリシンである。１つの実施形態において、グーゲロチンの高まったレベルを得るのに使用される培地（すなわち、増強培地）中のアミノ酸濃度は約２ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌであり、達成されるグーゲロチン濃度は出発培地で達成されるものの少なくとも２倍であり、この出発培地は１つの実施形態において増強培地に含有されるアミノ酸の濃度の約１／２以下を含有する。
【００２１】
上記したグーゲロチンを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株のいずれもこの方法を実施するのに使用することができる。
【００２２】
本発明はまた、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）由来（特にストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０由来）のグーゲロチン生合成遺伝子クラスター、遺伝子クラスター内の個々の遺伝子の特性決定、及びそれによりコードされるタンパク質も提供する。ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）由来のグーゲロチン遺伝子クラスターが開示されており、この遺伝子クラスターはそれぞれＯＲＦ４２５１〜４２５３、４２５５〜４２５９、４２６１〜４２６５、及び４２７１（それぞれ配列番号：１、３、５、９、１１、１３、１５、１７、２１、２３、２５、２７、２９、及び４１）といわれ、本明細書中でそれぞれＧｏｕＡ、ＧｏｕＢ、ＧｏｕＣ、ＧｏｕＤ、ＧｏｕＥ、ＧｏｕＦ、ＧｏｕＧ、ＧｏｕＨ、ＧｏｕＩ、ＧｏｕＪ、ＧｏｕＫ、ＧｏｕＬ、ＧｏｕＭ、及びＧｏｕＮとされている１４のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。対応するタンパク質はそれぞれ配列番号：２、４、６、１０、１２、１４、１６、１８、２２、２４、２６、２８、３０、及び４２として示されている。ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）由来のグーゲロチン生合成遺伝子クラスター及びフランキング領域の幾つかを含むゲノムＤＮＡ配列は配列番号：４３に示されており、遺伝子ＧｏｕＡ〜ＧｏｕＮの位置が示されている。
【００２３】
本発明はまた、ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）由来（特にストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株由来）の部分的なグーゲロチン生合成遺伝子クラスター、遺伝子クラスター内の個々の遺伝子の特性決定、及びそれによりコードされるタンパク質を提供する。ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）由来の部分的なグーゲロチン遺伝子クラスターが開示され、この開示された遺伝子クラスターは１２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、それぞれＯＲＦ（それぞれ配列番号：８９−１００）といわれ、本明細書中ではそれぞれＧｏｕＢ、ＧｏｕＣ、ＧｏｕＤ、ＧｏｕＥ、ＧｏｕＦ、ＧｏｕＧ、ＧｏｕＨ、ＧｏｕＩ、ＧｏｕＪ、ＧｏｕＫ、ＧｏｕＬ、ＧｏｕＭとされている。これらは、それぞれ配列番号：３、５、９、１１、１３、１５、１７、２１、２３、２５、２７、及び２９に提供され、本明細書でそれぞれＧｏｕＢ、ＧｏｕＣ、ＧｏｕＤ、ＧｏｕＥ、ＧｏｕＦ、ＧｏｕＧ、ＧｏｕＨ、ＧｏｕＩ、ＧｏｕＪ、ＧｏｕＫ、ＧｏｕＬ、及びＧｏｕＭとされている遺伝子に対してオルソロガスである。対応するタンパク質はそれぞれ配列番号：７７−８８に示されている。ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）由来のグーゲロチン生合成遺伝子クラスターを含むゲノムＤＮＡ配列は配列番号：７６に提供されている。
【００２４】
また、核酸配列の発現を指令する少なくとも１の外因性及び／又は異種調節要素に機能可能なように結合された、配列番号：４３のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列が提供される。この核酸配列はさらに、配列番号：４３の位置１０８２０〜位置１２０１３のヌクレオチド配列を含んでいてもよく、及び／又はさらに配列番号：４３の位置１３２１９〜位置１４３３４のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。前記核酸配列はＳ．ミクロフラブス（Ｓ．ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）、Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｃｅｕｓ）、Ｓ．アヌラツス（Ｓ．ａｎｕｌａｔｕｓ）、Ｓ．フィミカリウス（Ｓ．ｆｉｍｉｃａｒｉｕｓ）、Ｓ．パルブス（Ｓ．ｐａｒｖｕｓ）、Ｓ．ラベンデュラエ（Ｓ．ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）、Ｓ．アルボビリディス（Ｓ．ａｌｂｏｖｉｒｉｄｉｓ）、Ｓ．プニセウス（Ｓ．ｐｕｎｉｃｅｕｓ）、又はＳ．グラミネアルス（Ｓ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｓ）から単離することができる。
【００２５】
また、本明細書、特に直前の段落に記載されている核酸配列のいずれか１つを含む宿主細胞が提供される。さらにまた、前記核酸配列のいずれか１つを含む発現ベクター、並びに前記ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００２６】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のグーゲロチン又はグーゲロチン産生性細菌を培地中で培養して前記グーゲロチン又はグーゲロチンアナログを産生させ培地中に排泄させ、前記グーゲロチン又はグーゲロチンアナログを培地から収集することを含む、グーゲロチン又はグーゲロチンアナログを製造する方法が提供され、ここで前記細菌は配列番号：４３のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列の発現を高めるように改変されている。細菌はＳ．ミクロフラブス（Ｓ．ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）、Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｃｅｕｓ）、Ｓ．アヌラツス（Ｓ．ａｎｕｌａｔｕｓ）、Ｓ．フィミカリウス（Ｓ．ｆｉｍｉｃａｒｉｕｓ）、Ｓ．パルブス（Ｓ．ｐａｒｖｕｓ）、Ｓ．ラベンデュラエ（Ｓ．ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）、Ｓ．アルボビリディス（Ｓ．ａｌｂｏｖｉｒｉｄｉｓ）、Ｓ．プニセウス（Ｓ．ｐｕｎｉｃｅｕｓ）、及びＳ．グラミネアルス（Ｓ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｓ）からなる群から選択され得る。
【００２７】
グーゲロチン又はグーゲロチンアナログを製造する方法が提供され、ここで、該方法は、以下のステップを含んでいる：（ａ）配列番号：４３の核酸配列を含有し、さらに、配列番号：４３の位置１０８２０〜位置１２０１３のヌクレオチド配列を含有し、及び／又は、さらに、配列番号：４３の位置１３２１９〜位置１４３３４のヌクレオチド配列を含有している組換え発現ベクターを構築するステップ；（ｂ）ステップ（ａ）の核酸配列を含有する発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を生成させるステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）の形質転換体を培養するステップ；及び（ｄ）ステップ（ｃ）の形質転換体の培養産物から前記グーゲロチン又はグーゲロチンアナログを単離し精製するステップ。
【００２８】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、及び配列番号：４２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むトランスジェニック原核生物細胞が提供される。別の実施形態において、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、及び配列番号：４２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むトランスジェニック原核生物細胞が提供される。
【００２９】
配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８１、配列番号：８２、配列番号：８３、配列番号：８４、配列番号：８５、配列番号：８６、配列番号：８７、配列番号：８８からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むトランスジェニック原核生物細胞も提供される。別の実施形態において、配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８１、配列番号：８２、配列番号：８３、配列番号：８４、配列番号：８５、配列番号：８６、配列番号：８７、配列番号：８８からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むトランスジェニック原核生物細胞が提供される。
【００３０】
また、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、及び配列番号：４１からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、さらに外因性の制限酵素開裂部位を含む核酸配列を含む核酸配列も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、細菌候補株を用い、ナミハダニを寄生させたライマメ植物の葉に菌株の希釈した発酵産物を噴霧したときのＵＶ安定性試験の結果を示す。薄い灰色の横棒（各菌株について下の棒）はＵＶ光照射がないときの抗殺ダニ活性を表し、濃い灰色の横棒（各菌株について上の棒）はＵＶ光を２４時間照射した後の抗殺ダニ活性を表す。５日目、植物のダニ及び卵の存在を１〜４の目盛で評価した。
【図２】図２は、試験した細菌候補株の層透過活性を、ナミハダニを寄生させたライマメ植物の葉に菌株の希釈した発酵産物を噴霧して試験したときの結果を示す。薄い灰色の横棒（各菌株について下の棒）は層透過性の（抗殺ダニ）活性を表し、濃い灰色の横棒（各菌株について上の棒）は全抗殺ダニ活性を表す。６日目、植物のダニ及び卵の存在を１〜４の目盛で評価した。
【図３】図３は、１Ｌの振盪フラスコで増殖させたストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株の突然変異体における、親の菌株に対して増大したグーゲロチン産生を示す。
【図４】図４は、５Ｌのバイオリアクターで増殖させたストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株の突然変異体における、親の菌株に対して増大したグーゲロチン産生を示す。
【図５】図５は、グーゲロチンの化学構造、並びにそのセリン、糖、シトシン及びサルコシンサブドメインを示す。
【図６】図６は、グーゲロチンに対する可能な生合成経路を示す。
【図７】図７は、グーゲロチンの特定のサブドメイン構造に関与するか及び／又はそれを担う可能性があるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の番号を併記したグーゲロチンの化学構造を示す。
【図８】図８は、グーゲロチン生合成遺伝子クラスターの構成を示す。
【図９】図９は、アガロースゲル電気泳動によって分解した名前を付けたプライマー対（プライマー対の名称については配列表参照）のＰＣＲ産物を示す。ＭＷ＝１ｋＤａ分子量ラダー。Ｃ＝１６Ｓ陽性対照。ｇｏｕＣ１は配列番号：４４及び４５のプライマーに由来する。ｇｏｕＣ２は配列番号：４６及び４７のプライマーに由来する。ｇｏｕＤは配列番号：４８及び４９のプライマーに由来する。ｇｏｕＧ１は配列番号：５０及び５１のプライマーに由来する。ｇｏｕＧ２は配列番号：５２及び５３のプライマーに由来する。ｇｏｕＩ１は配列番号：５４及び５５のプライマーに由来する。ｇｏｕＦ２は配列番号：５６及び５７のプライマーに由来する。
【図１０】図１０は、ｐＵＣ１１８ベクターの概略図である。
【図１１】図１１は、ｐＫＣ１１３９シャトルベクターの概略図である。
【図１２】図１２は、いろいろなプライマーセットを用いたＰＣＲのＰＣＲ産物を示し、アガロースゲル電気泳動によって分解した。Ｉ＝ｇｏｕＩプライマー、Ｇ＝ｇｏｕＧプライマー、Ｉａ＝アプラマイシン抵抗性の単一クロスオーバー、ＩＫＩ（ＧｏｕＩｕｐ及びｇｏｕＩｄｏｗｎ）、ＣＫＷ（ｇｏｕＣｕｐ及びｇｏｕｗｈｏｌｅｃｕｓｔｅｒｄｏｗｎ）、及びＣＫＩ（ｇｏｕＣｕｐ及びｇｏｕＩｄｏｗｎ）は全てカナマイシン抵抗性二重クロスオーバーである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
【表１】
2015534950.tif 000003
2015534950.tif 000004
2015534950.tif 000005
【００３３】
全ての刊行物、特許及び特許出願は、あらゆる図面及び付属書類を含めて、あたかも個々の刊行物又は特許出願がそれぞれ具体的かつ個別に参照により本明細書に組み入れられると示されているように、参照により本明細書に組み入れられる。
【００３４】
以下の記載は本発明を理解する上で有用であり得る情報を含んでいる。しかし、本明細書に提供された情報のいずれかが現に特許請求の範囲に記載されている本発明に対して従来技術となるか若しくは関連があること、又は具体的若しくは暗黙に言及したいずれかの刊行物が従来技術であることを自認するものではない。
【００３５】
本発明は、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性の突然変異株を提供する。ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株はいろいろな有利な性質を有することが見出された。ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株（又はその発酵産物）はそれ自体が殺ダニ活性を有するだけでなく、例えば、高いＵＶ安定性、良好な層透過活性、良好な殺卵活性、長い残効性、潅注活性並びに広範囲のダニに対する活性も示し（実施例の欄参照）、従って有効な殺ダニ剤としての要件を満たす。さらに、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株（又はその発酵産物）は、殺虫活性と、赤さび病及びベと病のような様々な真菌の植物病原体に対する活性の両方を有する。この独特な活性の組合せのため、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株は極めて多方面に使用できる候補とされ、またこの菌株は植物を処理して植物病害及び／又は植物害虫を防除する方法で広く使用するのに適切となる。かかる広範囲の活性及び農業における可能な応用は公知のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株に関して未だに報告されていない。可能な農業用途に関して、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株は主として１９６０年代後期から１９７０年代早期にかけて刊行物に記載されている。例えば、微生物化合物Ｂ−９８８９１を産生するＡＴＣＣ  ３１１２０として寄託されたストレプトマイセス・リモファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ）Ｂ−９８８９１株について記載している英国特許ＧＢ  １  ５０７  １９３を参照されたい。１９７５年３月に出願されたＧＢ  １  ５０７  １９３によると、微生物化合物Ｂ−９８８９１は、ストレプトマイセス・リモファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ）Ｂ−９８８９１株の、うどんこ病に対する抗真菌活性を提供する活性成分である。１９７２年８月２日に出願された米国特許第３，８４９，３９８号は、菌株ストレプトマイセス・トヨカエンシス変種アスピクラマイセチクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ  ｖａｒ．  ａｓｐｉｃｕｌａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）が、グーゲロチンとしても知られている（Ｔｏｒｕ  Ｉｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２５  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ５４８（１９７２年９月）参照）微生物化合物アスピクラマイシン（ａｓｐｉｃｕｌａｍｙｃｉｎ）を産生することを記載している。米国特許第３，８４９，３９８号によると、グーゲロチンは動物に寄生するギョウ虫などのような寄生生物に対して殺寄生生物作用を有しているが、グーゲロチンはグラム陽性、グラム陰性細菌及び結核菌に対する抗菌活性が弱いといわれている。同様に、１９７８年に発行された特開昭５３１０９９９８は、菌株ストレプトマイセス・トヨカエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ）（ＬＡ−６８１）及び殺ダニ剤として使用されるグーゲロチンを産生するその能力を報告している。しかし、かかるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株に基づく殺ダニ性の発酵産物は市販されてないことに留意されたい。このように、ダニ目（グーゲロチン産生に基づく）、真���及び昆虫に対するその広い効果並びに作用モード（例えば、層透過活性及び残効性）の点でのその有利な特性を有するストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株は、生物学上の重要で予想外の進歩であり、それ自体公知のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株では報告されてない有利な特性を表す。本出願人は、高濃度のグーゲロチンを含有する発酵ブロスを製造するという問題を解決し、商業的殺虫剤として、又は商業的殺虫剤として使用されるグーゲロチンの供給源として発酵ブロスを最終的に使用できるようにした。従って、本発明は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌの濃度でグーゲロチンを含有する発酵ブロスを包含する。さらに、本発明は、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約６ｇ／Ｌ、少なくとも約７ｇ／Ｌ若しくは少なくとも約８ｇ／Ｌ、又は少なくとも約１ｍｇ／ｇ、少なくとも約２ｍｇ／ｇ、少なくとも約３ｍｇ／ｇ、少なくとも約４ｍｇ／ｇ、少なくとも約５ｍｇ／ｇ、少なくとも約６ｍｇ／ｇ、少なくとも約７ｍｇ／ｇ若しくは少なくとも約８ｍｇ／ｇの濃度でグーゲロチンを含有する発酵ブロスを包含する。他の実施形態において、発酵ブロスは、約２ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの範囲の濃度で、例えば約３ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１１ｇ／Ｌ、約１２ｇ／Ｌ、約１３ｇ／Ｌ、及び約１４ｇ／Ｌの濃度で、又は約２ｍｇ／ｇ〜約１５ｍｇ／ｇの範囲の濃度でグーゲロチンを含有する。幾つかの実施形態において、発酵ブロスはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種に由来する。具体的な実施形態において、発酵ブロスはストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）に由来する。さらに他の具体的な実施形態において、発酵ブロスは、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ−５０５５０又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性の突然変異体に由来する。さらに、本出願人は、グーゲロチンの産生を担うストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）遺伝子クラスターを確認し操作した。下記及び図５のグーゲロチンの構造参照。
【化１】
2015534950.tif 000006
【００３６】
特に断らない限り、本明細書に記載した微生物及び特定の菌株は全て、本明細書に記載されているように、自然界から分離し（すなわち、単離し）、振盪フラスコ培養のような人工条件下で、又はバイオリアクターのようなスケールアップされた製造工程によって増殖させる。１つの実施形態において、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株の植物食性−殺ダニ性の突然変異株が提供される。ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）は土壌及び腐敗植物で共通して見られるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する中温性、腐生性の細菌である。ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０は北米大陸のアメリカ合衆国の土壌から単離されたストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）の株である。ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）は、十分に発達した糸状栄養菌糸（〜１．０μｍ幅、１０−１００μｍ長）を産生する好気性、グラム陽性の糸状細菌であり、分生子−無性胞子を産生することができる。菌糸は、渦巻（輪生）状に配列された多かれ少なかれ規則的な間隔でベージュ色の滑らかな胞子を生む長いまっすぐな糸状体からなる。輪生の各々の枝は、その頂点に、２〜幾つかの胞子の鎖を有する散形花序を生成する。
【００３７】
用語「突然変異体」とは、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株から誘導された遺伝的変異体をいう。１つの実施形態において、突然変異体は、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株を同定する（機能上の）特徴の１以上の又は全てを有する。特定の例において、突然変異体又はその発酵産物は（同定する機能上の特徴として）、親のストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株と同じように、少なくともダニを防除する。さらに、突然変異体又はその発酵産物は、殺ダニ活性に関する層透過活性、殺ダニ活性に関する残効性、殺卵活性、殺虫活性、特にジアブロチカ（ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）に対する活性、又は真菌の植物病原体、特にベと病及びさび病に対する活性という特性の１、２、３、４又は５つ全てを有し得る。かかる突然変異体は、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株に対して約８５％より大きい、約９０％より大きい、約９５％より大きい、約９８％より大きい、又は約９９％より大きい配列同一性を有するゲノム配列を有する遺伝的変異体であり得る。突然変異体は、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株細胞を化学物質若しくは照射で処理することにより、又はＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０細胞の集団から（ファージ抵抗性又は抗生物質抵抗性突然変異体のような）自然突然変異体を選択することにより、又は当業者に周知の他の手段により得ることができる。
【００３８】
ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）の突然変異誘発のための適切な化学物質としては、少しだけ挙げると、ヒドロキシルアミン塩酸塩、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、４−ニトロキノリン１−オキシド（ＮＱＯ）、マイトマイシンＣ又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などがある（例えば、Ｓｔｏｎｅｓｉｆｅｒ  ＆  Ｂａｌｔｚ，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  Ｖｏｌ．  ８２、ｐｐ．  １１８０−１１８３、Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９８５参照）。それぞれのストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株の胞子溶液を用いた、例えばＮＴＧによる、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株の突然変異誘発は当業者に周知である。例えば、Ｄｅｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｖｏｌｕｍｅ  ９、Ｉｓｓｕｅ  ２、Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９７０、ｐａｇｅｓ  １６７−１８２、又はＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ  （Ｔｏｋｙｏ）、２００１  Ｎｏｖ；  ５４（１１）、ｐａｇｅｓ  ９６７−９７２．）を参照されたい。より詳細にいうと、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）は、Ｋｉｅｓｅｒ、Ｔ．、ｅｔ  ａｌ．、２０００、上掲  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｈ．  ５  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｎｏｒｗｉｃｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、Ｅｎｇｌａｎｄ  （２０００）、ｐｐ．  ９９−１０７に記載されているプロトコルを用いてＮＴＧによる突然変異にかけることができる。紫外光（ＵＶ）によるストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）の胞子の突然変異誘発は標準的なプロトコルを用いて行うことができる。例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株の胞子懸濁液（２０％グリセロール中で新たに調製又は凍結）は２５４ｎｍの波長のＵＶ光を吸収しない媒質（例えば、水又は２０％グリセロールが適している）に懸濁することができる。その後、胞子懸濁液をガラスシャーレに入れ、絶えず撹拌しながら３０℃において適当な時間、エネルギーの殆どを２５４ｎｍで放出する低圧水銀ランプで照射する（照射の最も適当な時間は線量−生存曲線をプロットすることにより決定することができる）。次に、その照射した濃い胞子懸濁液を、例えば非選択培地のスラント又はプレートに植え付けることができ、そうして得られた突然変異株の特性を以下に説明するように評価することができる。Ｋｉｅｓｅｒ、Ｔ．、ｅｔ  ａｌ．、２０００、上掲参照。
【００３９】
突然変異株は、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株の同定特性の１以上又は全て、特にストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０に匹敵するか若しくはそれより良好な殺ダニ活性を有するあらゆる突然変異株であることができる。殺ダニ活性は、例えば本明細書の実施例２に説明されているようにナミハダニ（「ＴＳＳＭ」）に対して決定することができる。すなわち、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の突然変異株の培養ストックを１Ｌの振盪フラスコ内で２０−３０℃において３−５日実施例２の培地（Ｍｅｄｉａ）１又は培地２中で増殖させることができ、その後希釈した発酵産物を２つの植物のライマメの葉の上面と下面に施用することができ、その処理後、同じ日に植物に５０−１００のＴＳＳＭを寄生させ、温室内に５日間放置することができる。
【００４０】
実施例１６は、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株の突然変異体を生じさせる方法の具体例を提供する。この方法で生じさせた１つの突然変異体は、実施例でより詳細に説明するストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）Ｍ株である。ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）Ｍのグーゲロチン生合成遺伝子クラスターは、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株のグーゲロチン生合成遺伝子クラスター（すなわち、配列番号：４３）に対して約９９％の配列同一性を有する。
【００４１】
本発明の１つの態様において、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はその植物食性−殺ダニ性の突然変異株は層透過活性を有する。本明細書において用語「層透過活性」は当業界におけるその普通の意味で用いられており、従って「層透過活性」とは化合物又は組成物（ここでは、例えばストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はその突然変異株を含有する発酵産物のような組成物）が処理される植物の葉の組織を通って移動する能力を意味する。層透過性の化合物／組成物は葉の組織に浸透し、葉の内部に活性成分のリザーバーを形成する。従って、この層透過活性は葉を摂食する昆虫及びダニに対する残効性も提供する。組成物（又はその１以上の活性成分）は葉を通って移動することができるので、充分な噴霧被覆は通常葉の裏面を摂食するダニのようなダニ目を防除するのにあまり重要ではない。突然変異株単独又はストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０と比較した層透過活性は、例えば本明細書中の実施例６で説明されているようにナミハダニ（「ＴＳＳＭ」）に対して決定することができる。層透過活性は実施例６の条件下で数日（例えば、約５日）後でも観察することができる。本発明の１つの態様において、層透過活性は処理後少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び／又は１０日観察することができる（存在する）。
【００４２】
本発明の別の態様において、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はその植物食性−殺ダニ性の突然変異株は残効性を有する。本明細書で用語「残効性」は当業界におけるその普通の意味で用いられており、従って「残効性」とは、化合物又は組成物（ここではストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はその突然変異株を含有する発酵産物のような組成物）が、施用されたあとで長期間に渡り有効なままである（すなわち、化合物又は組成物が施用されなかった場合と比べてダニのより大きな死亡率を生じるか又はダニの総数の低下を引き起こす）能力を意味する。時間の長さは、製剤（粉剤、液剤など）、植物又は位置の種類、及びストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はその突然変異株を含有する組成物を施用する植物表面又は土壌表面（湿潤、乾燥など）の状態に依存し得る。突然変異株単独又はストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０と比較した残効性は、例えば本明細書の実施例２又は７で説明されるようにナミハダニ（「ＴＳＳＭ」）に対して決定することができ、殺ダニ効果に関して、実施例５の条件下で数日（例えば、約１２日）後でも抗殺ダニ効果を観察することができるということを意味する。本発明の１つの態様において、残効性は、処理後少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、及び／又は４０日観察することができる（存在する）。
【００４３】
本発明の別の態様において、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はその植物食性−殺ダニ性突然変異株は殺卵活性を有する。用語「殺卵活性」は、「卵の破壊又は死を生起させる能力」を意味するとして当業界でその普通の意味で使用されており、本明細書ではダニのようなダニ目の卵に関して使用されている。ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の突然変異株単独又はストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０と比較した殺卵活性は実施例７に記載されている方法を用いて決定することができる。殺卵活性は実施例７の条件下で数日（例えば、約５日）後でも観察することができる。本発明の１つの態様において、殺卵活性は処理後少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び／又は１０日観察することができる（存在する）。
【００４４】
本発明の別の態様において、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はその植物食性−殺ダニ性突然変異株は潅注活性を有し得る。用語「潅注活性」は、本明細書では当業界でその普通の意味で使用されており、土壌又は他の増殖培地から木質部を介して植物を通って上方へ移動する殺虫活性を意味する。ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の突然変異株単独又はストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５と比較した潅注活性は実施例８に記載する方法を用いて決定することができる。本発明の１つの態様において、潅注活性は実施例８の条件下で数日（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１日）後でも観察することができる（存在する）。
【００４５】
本発明の別の態様において、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はその植物食性−殺ダニ性突然変異株は、実施例で例証されるように、限定されるものではないが、ナミハダニに対する活性、ミカンサビダニ（フィロコプツルタ・オレイボラ（Ｐｈｙｌｌｏｃｏｐｔｒｕｔａ  ｏｌｅｉｖｏｒａ））、フシダニ科（ｅｒｉｏｐｈｙｉｄ）（ｒｕｓｓｅｔ）ダニ及びチャノホコリダニ（ｂｒｏａｄ  ｍｉｔｅｓ）に対する活性をはじめとして、いろいろなダニ種に対する殺ダニ活性を有する。
【００４６】
かくして、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はその植物食性−殺ダニ性突然変異株は、以下のものからなる群から選択されるダニに対する活性を有し得る：クローバーハダニ、ニセクローバーハダニ、ハシバミハダニ（ｈａｚｅｌｎｕｔ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、アスパラガスハダニ（ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、ホモノハダニ、マメダニ（ｌｅｇｕｍｅ  ｍｉｔｅ）、カタバミダニ（ｏｘａｌｉｓ  ｍｉｔｅ）、ツゲダニ（ｂｏｘｗｏｏｄ  ｍｉｔｅ）、テキサスミカンハダニ（Ｔｅｘａｓ  ｃｉｔｒｕｓ  ｍｉｔｅ）、オリエンタルミカンハダニ（Ｏｒｉｅｎｔａｌ  ｒｅｄ  ｍｉｔｅ）、ミカンハダニ、リンゴハダニ、キイロハダニ（ｙｅｌｌｏｗ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、イチジクハダニ（ｆｉｇ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、ルイスハダニ（Ｌｅｗｉｓ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、コウノシロハダニ（ｓｉｘ−ｓｐｏｔｔｅｄ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、ウィラメットダニ（Ｗｉｌｌａｍｅｔｔｅ  ｍｉｔｅ）、ユマハダニ（Ｙｕｍａ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、ウェブスピニングマイト（ｗｅｂ−ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｍｉｔｅ）、パイナップルダニ（ｐｉｎｅａｐｐｌｅ  ｍｉｔｅ）、シトラスグリーンマイト（ｃｉｔｒｕｓ  ｇｒｅｅｎ  ｍｉｔｅ）、アメリカサイカチハダニ（ｈｏｎｅｙ−ｌｏｃｕｓｔ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、チャアカハダニ（ｔｅａ  ｒｅｄ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、チビコブハダニ、アボカドブラウンマイト（ａｖｏｃａｄｏ  ｂｒｏｗｎ  ｍｉｔｅ）、トドマツノハダニ、アボカドレッドマイト（ａｖｏｃａｄｏ  ｒｅｄ  ｍｉｔｅ）、バンクスグラスマイト（Ｂａｎｋｓ  ｇｒａｓｓ  ｍｉｔｅ）、ニセナミハダニ、アシノワハダニ、ヤサイハダニ（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、ツミドスパイダーマイト（ｔｕｍｉｄ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、イチゴハダニ（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、ナミハダニ、マクダニエルマイト（ＭｃＤａｎｉｅｌ  ｍｉｔｅ）、パシフィックスパイダーマイト（Ｐａｃｉｆｉｃ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、オウトウハダニ、フォースポッテドスパイダーマイト（ｆｏｕｒ−ｓｐｏｔｔｅｄ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、ショエネイスパイダーマイト（Ｓｃｈｏｅｎｅｉ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、チリヒメハダニ（Ｃｈｉｌｅａｎ  ｆａｌｓｅ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、ブドウヒメハダニ、チャノヒメハダニ、フラットスカーレットマイト（ｆｌａｔ  ｓｃａｒｌｅｔ  ｍｉｔｅ）、ホワイトテイルドマイト（ｗｈｉｔｅ−ｔａｉｌｅｄ  ｍｉｔｅ）、パイナップルホコリダニ（ｐｉｎｅａｐｐｌｅ  ｔａｒｓｏｎｅｍｉｄ  ｍｉｔｅ）、ウェストインディアシュガーケーンマイト（Ｗｅｓｔ  Ｉｎｄｉａｎ  ｓｕｇａｒ  ｃａｎｅ  ｍｉｔｅ）、バルブスケールマイト（ｂｕｌｂ  ｓｃａｌｅ  ｍｉｔｅ）、シクラメンホコリダニ、チャノホコリダニ、ムギダニ、レッドレッグドアースマイト（ｒｅｄ−ｌｅｇｇｅｄ  ｅａｒｔｈ  ｍｉｔｅ）、フィルバートビッグ−ブッドマイト（ｆｉｌｂｅｒｔ  ｂｉｇ−ｂｕｄ  ｍｉｔｅ）、ブドウハモグリダニ、ピーアブリスターリーフマイト（ｐｅａｒ  ｂｌｉｓ��ｅｒ  ｌｅａｆ  ｍｉｔｅ）、アップルリーフエッジローラーマイト（ａｐｐｌｅ  ｌｅａｆ  ｅｄｇｅｒｏｌｌｅｒ  ｍｉｔｅ）、ピーチモザイクベクターマイト（ｐｅａｃｈ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ  ｍｉｔｅ）、アルダービーズゴールマイト（ａｌｄｅｒ  ｂｅａｄ  ｇａｌｌ  ｍｉｔｅ）、ペリアンウォルナットリーフゴールマイト（Ｐｅｒｉａｎ  ｗａｌｎｕｔ  ｌｅａｆ  ｇａｌｌ  ｍｉｔｅ）、ペカンリーフエッジロールマイト（ｐｅｃａｎ  ｌｅａｆ  ｅｄｇｅｒｏｌｌ  ｍｉｔｅ）、イチジクモンサビダニ（ｆｉｇ  ｂｕｄ  ｍｉｔｅ）、オリーブモンサビダニ（ｏｌｉｖｅ  ｂｕｄ  ｍｉｔｅ）、シトラスブッドマイト（ｃｉｔｒｕｓ  ｂｕｄ  ｍｉｔｅ）、ライチエリネウムマイト（ｌｉｔｃｈｉ  ｅｒｉｎｅｕｍ  ｍｉｔｅ）、チューリップサビダニ、ココナッツフラワーアンドナッツマイト（ｃｏｃｏｎｕｔ  ｆｌｏｗｅｒ  ａｎｄ  ｎｕｔ  ｍｉｔｅ）、シュガーケーンブリスターマイト（ｓｕｇａｒ  ｃａｎｅ  ｂｌｉｓｔｅｒ  ｍｉｔｅ）、バッファローグラスマイト（ｂｕｆｆａｌｏ  ｇｒａｓｓ  ｍｉｔｅ）、バミューダグラスマイト（ｂｅｒｍｕｄａ  ｇｒａｓｓ  ｍｉｔｅ）、ニンジンモンサビダニ（ｃａｒｒｏｔ  ｂｕｄ  ｍｉｔｅ）、スウィートポテトリーフゴールマイト（ｓｗｅｅｔ  ｐｏｔａｔｏ  ｌｅａｆ  ｇａｌｌ  ｍｉｔｅ）、ポメグラナテリーフカールマイト（ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ  ｌｅａｆ  ｃｕｒｌ  ｍｉｔｅ）、アシュスプラングルゴールマイト（ａｓｈ  ｓｐｒａｎｇｌｅ  ｇａｌｌ  ｍｉｔｅ）、メイプルブラッダーゴールマイト（ｍａｐｌｅ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｇａｌｌ  ｍｉｔｅ）、アルダーエリネウムマイト（ａｌｄｅｒ  ｅｒｉｎｅｕｍ  ｍｉｔｅ）、レッドベリーマイト（ｒｅｄｂｅｒｒｙ  ｍｉｔｅ）、コットンブリスターマイト（ｃｏｔｔｏｎ  ｂｌｉｓｔｅｒ  ｍｉｔｅ）、ブルーベリーブッドマイト（ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ  ｂｕｄ  ｍｉｔｅ）、チャノナガサビダニ、チャノサビダニ、グレオシトラスマイト（ｇｒｅｙ  ｃｉｔｒｕｓ  ｍｉｔｅ）、サツマイモサビダニ（ｓｗｅｅｔ  ｐｏｔａｔｏ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）、セイヨウトチノキサビダニ（ｈｏｒｓｅ  ｃｈｅｓｔｎｕｔ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）、ミカンサビダニ（ｃｉｔｒｕｓ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）、リンゴサビダニ、ブドウサビダニ、ナシサビダニ、フラットニードルシースパインマイト（ｆｌａｔ  ｎｅｅｄｌｅ  ｓｈｅａｔｈ  ｐｉｎｅ  ｍｉｔｅ）、ワイルドローズブッドアンドフルーツマイト（ｗｉｌｄ  ｒｏｓｅ  ｂｕｄ  ａｎｄ  ｆｒｕｉｔ  ｍｉｔｅ）、ドライベリーマイト（ｄｒｙｂｅｒｒｙ  ｍｉｔｅ）、マンゴーサビダニ（ｍａｎｇｏ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）、アザレアサビダニ（ａｚａｌｅａ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）、モモサビダニ（ｐｌｕｍ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）、モモサビダニ（ｐｅａｃｈ  ｓｉｌｖｅｒ  ｍｉｔｅ）、リンゴサビダニ、トマトサビダニ、ミカンサビダニ（ｐｉｎｋ  ｃｉｔｒｕｓ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）、穀類サビダニ（ｃｅｒｅａｌ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）、イネサビダニ（ｒｉｃｅ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）、及び、これらの組合せ。加えて、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はそ��植物食性−殺ダニ性突然変異株は他のダニ防除剤に対して抵抗性のダニに対する活性を有する。１つの実施形態において、菌株はアバメクチン−抵抗性のダニに対する活性を有する。
【００４７】
本発明の別の態様において、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はその植物食性−殺ダニ性突然変異株は殺虫活性も有し得る。標的の昆虫は、ジアブロチカ（ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）であり得る。ジアブロチカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）は、バンデッドキューカンバビートル（ｂａｎｄｅｄ  ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｂｅｅｔｌｅ）（ジアブロチカ・バルテアタ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｌｔｅａｔａ））、ウエスタンスポッテドキューカンバービートル（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｓｐｏｔｔｅｄ  ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｂｅｅｔｌｅ）（ジアブロチカ・ウンデシンプンクタタ・ウンデシンプンクタタ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ））、又は、コーンルートワーム、例えば、ノーザンコーンルートワーム（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ）（ジアブロチカ・バルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｒｂｅｒｉ））、サウザンコーンルートワーム（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ）（ジアブロチカ・ウンデシンプンクタタ・ホワーディ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉ））、ウェスタンキューカンバビートル（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｂｅｅｔｌｅ）（ジアブロチカ・ウンデシンプンクタタ・テネラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｔｅｎｅｌｌａ））、ウェスタンコーンルートワーム（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ）（ジアブロチカ・ビルギフェラ・ビルギフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ））、メキシカンコーンルートワーム（Ｍｅｘｉｃａｎ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ）（ジアブロチカ・ビルギフェラ・ゼアエ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｚｅａｅ））、及び、そのようなジアブロチカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）の組合せであり得る。ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の突然変異株単独又はストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０と比較した殺虫活性は実施例１０に記載する方法を用いてコーンルートワームに対して決定することができる。
【００４８】
本発明の別の態様において、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はその植物食性−殺ダニ性突然変異株は殺菌活性、すなわち菌類によって引き起こされる植物病害に対する活性を有する。この植物病害は白カビ（ｍｉｌｄｅｗ）又はさび病であり得る。ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はその植物食性−殺ダニ性突然変異株で処理することができる白カビ（ｍｉｌｄｅｗ）の例としては、限定されるものではないが、うどんこ病、例えば、スフェロテカ・フリギネア（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）により引き起こされるキュウリうどんこ病、又は、ベと病、例えば、ペロノスポラ・パラシチカ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）により引き起こされるアブラナ科ベと病などがある。ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はその植物食性−殺ダニ性突然変異株で処理し得るさび病の例としては、限定されるものではないが、プッシニア・トリシチナ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉｎａ）〔プッシニア・レコンジタ（Ｐ．ｒｅｃｏｎｄｉｔａ）としても知られている〕により引き起こされるコムギ赤さび病、プッシニア・グラミニス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｍｉｓ）により引き起こされるコムギ黒さび病、プッシニア・ストリイホルミス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）により引き起こされるコムギ黄さび病、プッシニア・ホルデイ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｈｏｒｄｅｉ）により引き起こされるオオムギの小さび病、プッシニア・レコンジタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｒｅｃｏｎｄｉｔａ）により引き起こされるライ麦の赤さび病、赤さび病（ｂｒｏｗｎ  ｌｅａｆ  ｒｕｓｔ）、冠さび病（ｃｒｏｗｎ  ｒｕｓｔ）及び黒さび病（ｓｔｅｍ  ｒｕｓｔ）などがある。ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の突然変異株単独又はストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０と比較した殺菌活性は実施例９に記載する方法を用いてキュウリうどんこ病に対して決定することができる。殺菌活性は実施例９の条件下で数日（例えば、約７日）後でも観察することができる。本発明の１つの態様において、殺菌活性は処理後約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び／又は１５日に観察することができる（存在する）。
【００４９】
本発明はまた、ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性及び／又は殺真菌性の突然変異株も提供する。ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細菌のＳ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）クレードの一員である。Ｓ．プニセウス（Ｓ．ｐｕｎｉｃｅｕｓ）は好気性でグラム陽性の糸状細菌である。鎖当たり１０〜５０超の胞子を有する中程度に長い成熟した胞子鎖を産生する。胞子組織は滑らかであり、オートミール系寒天上で増殖させるとコロニーは黄色〜赤味がかった色を呈する。ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株は北米大陸のアメリカ合衆国で収集した土壌サンプルから単離された。菌株Ａの発酵産物は実施例１８に記載するように殺ダニ性の性質を有する。１つの実施形態において、ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株の植物食性−殺ダニ性及び／又は殺真菌性の突然変異株が提供される。用語「突然変異体」とは、ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株に由来する遺伝的変異体をいう。１つの実施形態において、突然変異体はストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株を同定するための（機能上の）特性の１以上又は全てを有する。特定の例において、突然変異体又はその発酵産物は（同定する機能上の特性として）少なくとも親のストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株と同じ程度にダニを防除する。かかる突然変異体はストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株に対して約８５％より大きい、約９０％より大きい、約９５％より大きい、約９８％より大きい、又は約９９％より大きい配列同一性を有するゲノム配列を有する遺伝的変異体であり得る。突然変異体は、ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株細胞を化学物質若しくは照射で処理することにより、又はＡ細胞の集団から（ファージ抵抗性又は抗生物質抵抗性の突然変異体のような）自然突然変異体を選択することにより、又は当業者に周知の他の手段、例えばストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０に関連して上記及び実施例１６記載される手段により、得ることができる。ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株は、タンパク質ＧｏｕＢ−ＧｏｕＭをコードするグーゲロチン遺伝子クラスターを含有しており、かつＧｏｕＡを含有すると予期される。ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株のタンパク質ＧｏｕＢ−ＧｏｕＭはストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０に由来のストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌ���ｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０に由来のオルソロガスなタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００５０】
本発明はまた、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のグーゲロチンを含有する発酵ブロス、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株若しくはその植物食性−殺ダニ性若しくは殺真菌性の突然変異株若しくはその無細胞調製物若しくはその代謝産物、又はストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株若しくはその植物食性−殺ダニ性突然変異株若しくはその無細胞調製物若しくはその代謝産物の１種以上を、植物又は葉、茎、花、果実、根、若しくは種子のような植物の部分に投与することにより、又は植物若しくは植物の部分が成長する生育場所、例えば土壌に施用することにより、植物を処理して植物害虫及び病害を防除する方法も包含する。本発明の方法及び発酵産物に適した追加のグーゲロチン産生性菌株は本明細書に記載されている。
【００５１】
本明細書で使用されている用語「植物」とは、植物界（すなわち、植物界のあらゆる属／種）に属する全ての生きている有機体をいう。これには、限定されるものではないが、樹木、薬草、灌木、牧草、ブドウ、シダ、コケ及び緑藻類のようなありふれた有機体が含まれる。この用語は単子葉の植物（単子葉植物）と、双子葉の植物（双子葉植物）の両方を指す。植物は幾つかの実施形態において経済上重要である。幾つかの実施形態において植物は人間が育てる植物、例えば栽培植物であり、農業、林業又は園芸植物であり得る。特定の植物の例としては、限定されるものではないが、二、三の名前を挙げるとトウモロコシ、ジャガイモ、バラ、リンゴ樹木、ヒマワリ、コムギ、イネ、バナナ、トマト、オポ（ｏｐｏ）、カボチャ、トウナス、マメ（例えば、ライマメ）、レタス、キャベツ、オーク樹木、グズマニア、ゼラニウム、ハイビスカス、クレマチス、ポインセチア、サトウキビ、タロイモ、アオウキクサ、マツ樹木、ケンタッキーブルーグラス、シバ、ココナツ樹木、アブラナ科の葉野菜〔例えば、ブロッコリ、ブロッコリラーブ、芽キャベツ、キャベツ、白菜（チンゲンサイ及び白菜（Ｎａｐａ））、カリフラワー、カバロ（ｃａｖａｌｏ）、コラード、ハゴロモカンラン、コールラビ、マスタードグリーン、レイプグリーン（ｒａｐｅ  ｇｒｅｅｎｓ）、及び、他のアブラナ科葉野菜作物〕、鱗茎野菜（例えば、ニンニク、ニラ、タマネギ（乾球（ｄｒｙ  ｂｕｌｂ）、未成熟（ｇｒｅｅｎ）、及び、Ｗｅｌｃｈ）、エシャロット、及び他の鱗茎野菜作物）、柑橘類果実（例えば、グレープフルーツ、レモン、ライム、オレンジ、タンジェリン、柑橘類ハイブリッド、ポメロ、及び他の柑橘類果実作物）、ウリ科野菜（例えば、キュウリ、シトロンメロン、食用ヒョウタン、ガーキン、マスクメロン（例えば、メロンの交配種及び／又は栽培品種）、スイカ、カンタループ、及び他のウリ科野菜作物）、結果野菜（例えば、ナス、酸漿、ペピーノ、コショウ、トマト、トマティーヨ、及び他の結果野菜作物）、ブドウ、葉野菜（例えば、チシャ）、根／塊茎及び球茎野菜（例えば、ジャガイモ）、ヒラマメ、発芽アルファルファ種子、クローバー及び樹木の実（アーモンド、ペカン、ピスタチオ、及びクルミ）、ベリー（例えば、トマト、メギ、フサスグリ、ニワトコの実、グーズベリー、スイカズラ、ポドフィルム、ナニーベリー（ｎａｎｎｙｂｅｒｒｉｅｓ）、オレゴン−ブドウ、シーバックソン（ｓｅｅ−ｂｕｃｋｔｈｏｒｎｓ）、エノキの実、ウワウルシ、リンゴンベリー、イチゴ、ホンダワラ、ブラックベリー、クラウドベリー、ローガンベリー、キイチゴ、サーモンベリー、クロイチゴ、及びワインベリー）、穀類作物（例えば、トウモロコシ、コメ、コムギ、オオムギ、モロコシ、キビ、エンバク、ライ麦、ライコムギ、ソバ、フォニオ、及びキノア）、ナシ果実（例えば、リンゴ、西洋ナシ）、核果（例えば、コーヒー、ナツメ、マンゴ、オリーブ、ココナツ、アブラヤシ、ピスタチオ、アーモンド、アプリコット、サクランボ、ダムソン、ネクタリン、モモ及びプラム）、ブドウ（例えば、テーブルブドウ、ブドウ）、繊維作物（例えば、麻、綿）、観賞植物などがある。幾つかの実施形態におい��、植物は家庭用／家庭用植物、温室植物、農業植物、又は園芸植物であり得る。既に上で指摘したように、幾つかの実施形態において植物は、アカシア、ユーカリ、シデ、ブナ、マホガニー、クルミ、オーク、トネリコ、ヤナギ、ヒッコリー、カバノキ、クリ、ポプラ、ハンノキ、カエデ、アメリカスズカケノキ、イチョウ、ヤシノキ及びスイートガムの１つのような広葉樹であり得る。幾つかの実施形態において、植物はイトスギ、ベイマツ、モミ、セコイア、ツガ、ヒマラヤスギ、セイヨウネズ、カラマツ、マツ、アメリカスギ、トウヒ及びイチイのような針葉樹であり得る。幾つかの実施形態において植物はリンゴ、プラム、西洋ナシ、バナナ、オレンジ、キウイ、レモン、サクランボ、ブドウ、パパイヤ、落花生、及びイチジクのような結果性木本植物であり得る。幾つかの実施形態において植物は綿、竹及びゴム植物のような木本植物であり得る。植物は幾つかの実施形態において農業、林業及び／又は観賞植物、すなわち、造園で、例えば公園、庭園及びバルコニーで一般に使われる植物であり得る。例は、非常に多くの観賞植物の中の二、三のみを挙げると、芝生、ゼラニウム、ペラルゴニア（ｐｅｌａｒｇｏｎｉａ）、ペチュニア、ベゴニア、及びフクシアである。用語「植物」はまたあらゆる植物繁殖体を包含することが意図されている。
【００５２】
用語「植物」は通常、１以上の育種、突然変異誘発及び遺伝子工学によって改変されている植物を包含する。遺伝子工学は組換えＤＮＡ技術の使用に関する。組換えＤＮＡ技術によると、天然の状況下での交雑育種、突然変異又は天然の組換えでは容易に得ることができない改変が可能になる。幾つかの実施形態において遺伝子工学で得られた植物はトランスジェニック植物であり得る。
【００５３】
本明細書で使用されている場合、用語「植物の部分」とは、限定されるものではないが、苗条、根、茎、種子、托葉、葉、花弁、花、胚珠、包葉、枝、葉柄、節間、樹皮、木部、塊茎、綿毛、分げつ、根茎、葉状体、葉身、花粉、雄ずい、小胞子、果実及び種子をはじめとして、植物のあらゆる部分をいう。土壌のような当業界で使用される典型的な培地で増殖させた植物の２つの主要な部位は、多くの場合、「苗条」といわれることが多い「地上」部分と、「根部」といわれることが多い「地下」部分といわれる。
【００５４】
本発明による方法において、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０又はその植物食性−殺ダニ性の突然変異株を含有する組成物は、植物を増殖させるのに使用されたあらゆる種類の培地（例えば、土壌、バーミキュライト、細断した厚紙、及び水）で増殖させたあらゆる植物又はあらゆる植物のあらゆる部分に施用することができ、又はラン又はビカクシダのように空中で増殖させた植物又は植物の部分に施用することができる。組成物は、例えば、散布、噴霧、気化、ばらまき、散粉、潅水、噴出、まき散らし、流し込み又は燻蒸により施用することができる。既に上で指摘したように、施用は、対象の植物が置かれているあらゆる所望の位置、例えば農業、園芸、森林、プランテーション、果樹園、苗床、有機増殖した作物、芝草及び都市環境で実施することができる。
【００５５】
本発明の組成物は、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０又はそれから誘導される突然変異体を、深部発酵、固相発酵又は液面培養のような慣用の大規模な微生物発酵プロセス、例えば、米国特許第３，８４９，３９８号、英国特許第１  ５０７  １９３号、Ｔｏｓｈｉｋｏ  Ｋａｎｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、Ｓｅｒ．  Ａ、Ｖｏｌ．  １５、Ｎｏ．２、Ｊｕｎ．  １９６１、ｐａｇｅｓ  ９３  ｔｏ  ９７、又はＴｏｒｕ  Ｉｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、（Ｓｅｐｔ．  １９７２）、ｐａｇｅｓ  ５４８  ｔｏ  ５５０に記載されている方法を用いて培養することによって得ることができる。発酵は、胞子を含めた生きているバイオマス及び望ましい二次代謝物質を高レベルで発酵容器中に得るように設定されている。高レベルの胞子形成、ｃｆｕ（コロニー形成単位）、及び二次代謝物質を達成するために本発明の菌株に適した具体的な発酵方法は実施例の欄に記載されている。
【００５６】
発酵で得られる培養ブロス（「全ブロス」又は「発酵ブロス」）中の細菌細胞、胞子及び代謝物質は直接使用してもよいし、又は遠心分離、ろ過、及び蒸発のような慣用の工業的方法で濃縮してもよいし、又は、例えば噴霧乾燥、ドラム乾燥及び凍結乾燥によって乾燥粉末及び顆粒に加工してもよい。
【００５７】
本明細書で使用されている用語「全ブロス」及び「発酵ブロス」とは、（少なくとも約１ｇ／Ｌの濃度のグーゲロチンを含有する培養ブロスの生産を含めて）発酵の結果得られ、下流の後処理をする前の培養ブロスをいう。この全ブロスは、微生物（例えば、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０又はその植物食性−殺ダニ性の突然変異株）及びその構成部分、未使用の生の基質、並びに発酵中に微生物が産生した代謝物質を含む。本明細書で使用されている用語「ブロス濃縮液」とは、上記のように慣用の工業的方法によって濃縮されてはいるが、液体形態のままである全ブロス（発酵ブロス）をいう。本明細書で使用されている用語「発酵固体」とは乾燥された発酵ブロスをいう。本明細書で使用されている用語「発酵産物」とは、全ブロス、ブロス濃縮液及び／又は発酵固体を指す。本発明の組成物は発酵産物を包含する。幾つかの実施形態において、濃縮された発酵ブロスは、残留する発酵ブロス及び代謝物質を除去するために、例えば透析ろ過プロセスによって洗浄される。
【００５８】
１つの実施形態において、発酵ブロスは、ブロス１ｍＬ当たり少なくとも約１×１０５コロニー形成単位（ＣＦＵ）の微生物（例えば、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０又はその植物食性−殺ダニ性突然変異株）を含有する。別の実施形態において、発酵ブロスは、ブロス１ｍＬ当たり少なくとも約１×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）の微生物（例えば、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０又はその植物食性−殺ダニ性突然変異株）を含有する。さらに別の実施形態において、発酵ブロスは、ブロス１ｍＬ当たり少なくとも約１×１０７コロニー形成単位（ＣＦＵ）の微生物（例えば、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０又はその植物食性−殺ダニ性突然変異株）を含有する。もう１つ別の実施形態において、発酵ブロスは、ブロス１ｍＬ当たり少なくとも約１×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）の微生物（例えば、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０又はその植物食性−殺ダニ性突然変異株）を含有する。もう１つ別の実施形態において、発酵ブロスは、ブロス１ｍＬ当たり少なくとも約１×１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）の微生物（例えば、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０又はその植物食性−殺ダニ性突然変異株）を含有する。もう１つ別の実施形態において、発酵ブロスは、ブロス１ｍＬ当たり少なくとも約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）の微生物（例えば、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０又はその植物食性−殺ダニ性突然変異株）を含有する。もう１つ別の実施形態において、発酵ブロスは、ブロス１ｍＬ当たり少なくとも約１×１０１１コロニー形成単位（ＣＦＵ）の微生物（例えば、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０又はその植物食性−殺ダニ性突然変異株）を含有する。当業者には理解されるように、上記の濃度は、発酵完了のすぐ後に測定されたＣＦＵであるが、ＣＦＵレベルは貯蔵条件に従って経時的に低下する。本明細書に記載した微生物の未処方の発酵産物ｓのＣＦＵレベルは、その産物を冷たい貯蔵（例えば、約４℃）に維持したときは安定であるが室温では低下する。
【００５９】
１つの実施形態において、発酵ブロス又はブロス濃縮液は、安定剤、保存剤、補佐剤、及び／又は着色剤を添加して液体懸濁液、液体濃縮液、乳剤濃縮液、又は水和剤に処方することができる。
【００６０】
別の実施形態において、発酵ブロス又はブロス濃縮液は、担体、不活性成分、又は添加剤を添加して、又はしないで、慣用の乾燥プロセス又は噴霧乾燥、凍結乾燥、トレー乾燥、流動床乾燥、ドラム乾燥、若しくは蒸発のような方法を用いて乾燥することができる。
【００６１】
幾つかの実施形態においては、発酵ブロス、ブロス濃縮液又は発酵固体を、微生物を死滅させるために処理して、死滅した微生物、その代謝物質及び残留発酵培地からなる発酵産物を得る。これを達成するのに適した処理は当業者に公知であり、例えば、熱処理などがある。
【００６２】
発酵ブロス又はブロス濃縮液を凍結乾燥する実施形態では、１ガロンの発酵ブロスから約０．２ｌｂ（ポンド）〜約１ｌｂの凍結乾燥粉末が得られる。特定の例においては、１ガロンの発酵ブロスから約０．４ｌｂ〜約０．６ｌｂの凍結乾燥粉末が得られる。別の例においては、１ガロンの発酵ブロスから約０．５ｌｂの凍結乾燥粉末が得られる。
【００６３】
さらに別の実施形態においては、得られた乾燥生成物を、不活性成分又は添加剤を添加して、又はしないで粉砕又は造粒などによりさらに加工処理して農業適用に望ましい特定の粒度又は物理的フォーマット若しくは物理的性質を達成し得る。
【００６４】
全ブロス又はブロス濃縮液の使用に加えて、発酵ブロスの抽出、遠心分離及び／又はろ過のような当業界で公知の何らかの手段により、本発明のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の新規な変異体及び菌株の発酵ブロスの無細胞調製物を得ることができる。当業者には理解されるように、いわゆる無細胞調製物は細胞が全くないわけではないが、細胞を除去するのに用いた技術（例えば、遠心分離の速度）に応じて殆どが無細胞又は本質的に無細胞である。得られた無細胞調製物はその施用を補助する成分と共に乾燥及び／又は処方し得る。発酵ブロスについて上に記載した濃縮方法及び乾燥技術は無細胞調製物にも適用可能である。
【００６５】
本発明の組成物は、有効性、安定性、及び物理的性質、有用性を改良し、及び／又は加工処理、包装及び最終用途適用を容易にするために細胞、無細胞調製物又は代謝産物を含む組成物に添加される配合成分を含み得る。かかる配合成分としては、個別に又は組み合わせて添加され得る担体、不活性成分、安定剤、保存剤、栄養分、又は物理的性質改良剤を挙げることができる。幾つかの実施形態において、担体には水、油、及び他の有機又は無機溶剤のような液体物質及び鉱物、ポリマー、又は生物学的に若しくは化学合成により誘導されたポリマー複合体のような固体物質が包含され得る。幾つかの実施形態において、成分は結合剤、補佐剤、又は葉、種子、若しくは根のような植物の部分に対する組成物の付着を促進する粘着剤である。例えば、Ｔａｙｌｏｒ、Ａ．Ｇ．、ｅｔ  ａｌ．、「Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄ  Ｔｒｅａｍｅｎｔｓ」  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．  ２８：  ３２１−３３９  （１９９０）参照。安定剤には凝結防止剤、酸化防止剤、防湿剤、保護剤又は保存剤が包含され得る。栄養分には糖類、多糖類、油、タンパク質、アミノ酸、脂肪酸及びホスフェートのような炭素、窒素、及びリンの供給源が包含され得る。物理的性質改良剤には増量剤、湿潤剤、増粘剤、ｐＨ改良剤、レオロジー改良剤、分散剤、補佐剤、界面活性剤、凍結防止剤又は着色剤が包含され得る。幾つかの実施形態において、発酵により生成した細胞、無細胞調製物又は代謝物質を含む組成物は、他の配合製剤を全く加えないで、場合により希釈剤としての水と共に直接使用することができる。特定の実施形態においては、湿潤剤が凍結乾燥又は噴霧乾燥粉末のような発酵固体に添加される。湿潤剤は表面に施用されたとき（希釈された）活性成分の展延性及び浸透性を増大する。代表的な湿潤剤は当業者に公知であり、例えば、ＭＯＮＡＷＥＴ  ＭＯ−７０（Ｃｒｏｄａ  Ｉｎｃ．、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）のようなスルホスクシネート及び誘導体、ＢＲＥＡＫＴＨＲＵ（Ｅｖｏｎｉｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のようなトリシロキサン、ＡＬＴＯＸ  ４８９４（Ｃｒｏｄａ  Ｉｎｃ．、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）のような非イオン性化合物、ＴＥＲＷＥＴ  ３００１（Ｈｕｎｔｓｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＬＣ、Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、Ｔｅｘａｓ）のようなアルキルポリグルコシド、ＴＥＲＧＩＴＯＬ  １５−ｓ−１５（Ｔｈｅ  Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）のようなＣ１２−Ｃ１４第二級アルコールエトキシレート、ＲＨＯＤＡＦＡＣ  ＢＧ−５１０（Ｒｈｏｄｉａ、Ｉｎｃ．）のようなリン酸エステル、及びＥＭＵＬＳＯＧＥＮ−ＬＳ（Ｃｌａｒｉａｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）のようなアルキルエーテルカルボキシレートなどがある。
【００６６】
幾つかの実施形態において、配合不活性成分は発酵ブロスを濃縮した後、乾燥中及び／又はその後に添加される。
【００６７】
本発明は少なくとも約１ｇ／Ｌの濃度でグーゲロチンを含有する発酵ブロスを包含する幾つかの実施形態においてかかる全ブロス培養物はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のグーゲロチン産生株に由来する。特定の実施形態において、かかるグーゲロチン産生株はストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）、ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）、又はストレプトマイセス・グラミネアルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｓ）である。別の実施形態において、グーゲロチン産生株はＳ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、Ｓ．アヌラツス（Ｓ．ａｎｕｌａｔｕｓ）、Ｓ．フィミカリウス（Ｓ．ｆｉｍｉｃａｒｉｕｓ）、Ｓ．パルブス（Ｓ．ｐａｒｖｕｓ）、Ｓ．ラベンデュラエ（Ｓ．ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）、Ｓ．アルボビリディス（Ｓ．ａｌｂｏｖｉｒｉｄｉｓ）、又はＳ．プニセウス（Ｓ．ｐｕｎｉｃｅｕｓ）である。さらに別の特定の実施形態において、かかるグーゲロチン産生株は中国普通微生物菌種保藏管理中心（Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）ＣＧＭＣＣに寄託されているストレプトマイセス・グラミネアルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｓ）ＣＧＭＣＣ  ４．５０６である。
【００６８】
本発明はまた、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）由来のグーゲロチン生合成遺伝子クラスター、当該遺伝子クラスター内の個々の遺伝子の特性決定、及びそれによりコードされるタンパク質も提供する。グーゲロチン遺伝子クラスターが開示されており、この遺伝子クラスターはそれぞれＯＲＦ４２５１〜４２５３、４２５５〜４２５９、４２６１〜４２６５、及び４２７１（それぞれ配列番号：１、３、５、９、１１、１３、１５、１７、２１、２３、２５、２７、２９、及び４１）と称され、本明細書ではそれぞれＧｏｕＡ、ＧｏｕＢ、ＧｏｕＣ、ＧｏｕＤ、ＧｏｕＥ、ＧｏｕＦ、ＧｏｕＧ、ＧｏｕＨ、ＧｏｕＩ、ＧｏｕＪ、ＧｏｕＫ、ＧｏｕＬ、ＧｏｕＭ、及びＧｏｕＮと称される１４のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。対応するタンパク質はそれぞれ配列番号：２、４、６、１０、１２、１４、１６、１８、２２、２４、２６、２８、３０、及び４２に提供される。グーゲロチン生合成遺伝子クラスター及び幾つかのフランキング領域を含むゲノムＤＮＡ配列が配列番号：４３に提供され、遺伝子ＧｏｕＡ〜ＧｏｕＮの位置が記載されている。本開示は、ある遺伝子座内に位置するグーゲロチン遺伝子クラスターの核酸配列、そこに含まれるＯＲＦ、及びそれによりコードされるタンパク質を提供する。この情報により、例えば、他のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の菌が有するようなグーゲロチン遺伝子クラスター及び対応するＯＲＦのホモログをコードする関連の核酸分子の単離が可能になる。
【００６９】
ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）菌株から同定された配列番号：４３（ヌクレオチド残基１−２１９３３）に含まれるグーゲロチン遺伝子クラスターは、ＯＲＦ４２４８〜４２７１と称される２４のＯＲＦを含んでいる。ＯＲＦ４２５１、４２５２、４２５３、４２５５、４２５６、４２５７、４２５８、４２５９、４２６１、４２６２、４２６３、４２６４、４２６５、及び４２７１はそれぞれ１３の遺伝子ｇｏｕＡ、ｇｏｕＢ、ｇｏｕＣ、ｇｏｕＤ、ｇｏｕＥ、ｇｏｕＦ、ｇｏｕＧ、ｇｏｕＨ、ｇｏｕＩ、ｇｏｕＪ、ｇｏｕＫ、ｇｏｕＬ、ｇｏｕＭ、及びｇｏｕＮである。配列番号：８９−１００（ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）菌株から同定された）はそれぞれオルソロガスな遺伝子ｇｏｕＢ、ｇｏｕＣ、ｇｏｕＤ、ｇｏｕＥ、ｇｏｕＦ、ｇｏｕＧ、ｇｏｕＨ、ｇｏｕＩ、ｇｏｕＪ、ｇｏｕＫ、ｇｏｕＬ、ｇｏｕＭを提供することに留意されたい。これらの遺伝子の潜在的な機能及びグーゲロチン合成における可能な役割を表２に提供する。
【表２】
2015534950.tif 000007
【００７０】
従って、さらに別の実施形態において、少なくとも約０．５ｇ／Ｌのグーゲロチン又は少なくとも約１ｇ／Ｌのグーゲロチンを有する発酵ブロスを含む本発明の発酵産物は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、及び配列番号：４２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を有するグーゲロチン産生性のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株に由来する。さらにもう１つ別の実施形態において、少なくとも約０．５ｇ／Ｌのグーゲロチン又は少なくとも約１ｇ／Ｌのグーゲロチンを有する発酵ブロスを含む発酵産物は、配列番号：４３のヌクレオチド配列又は配列番号：４３のヌクレオチド配列のタンパク質ＧｏｕＡ、ＧｏｕＢ、ＧｏｕＣ、ＧｏｕＤ、ＧｏｕＥ、ＧｏｕＦ、ＧｏｕＧ、ＧｏｕＨ、ＧｏｕＩ、ＧｏｕＪ、ＧｏｕＫ、ＧｏｕＬ、及び／又はＧｏｕＭをコードする領域に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するグーゲロチン産生性のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株に由来する。
【００７１】
特定の実施形態において、上記核酸配列を有するかかるグーゲロチン産生株はストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）又はストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）である。１つの特定の例はストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０又はその植物食性−殺ダニ性突然変異体である。１つの例において、かかる植物食性−殺ダニ性突然変異体はｉｓ  ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）Ｍ株である。別の例において、かかるグーゲロチン産生株はストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株又はその植物食性−殺ダニ性突然変異体である。
【００７２】
少なくとも約１ｇ／Ｌのグーゲロチンを含有する発酵ブロスは、親の菌株より高いレベルのグーゲロチンを産生する突然変異株を獲得するための親のグーゲロチン産生株の発酵最適化及び／又は突然変異誘発のような幾つかの方法で得ることができる。
【００７３】
従って、本発明はまた、グーゲロチン産生性ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株の発酵ブロスで、少なくとも約０．５ｇ／Ｌのグーゲロチンを含有する発酵ブロスを製造する方法も包含する。この方法は、消化可能な炭素源及び消化可能な窒素源を含有する培地において好気性条件下でストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株を培養することを含み、ここで培地はシトシンのようなグーゲロチンの前駆体、ヌクレオ塩基、及び／又は少なくとも０．５ｇ／Ｌのグーゲロチン濃度を達成するのに有効な濃度のアミノ酸を含有する。
【００７４】
幾つかの実施形態において、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株は、培地が少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約６ｇ／Ｌ、約少なくとも７ｇ／Ｌ又は少なくとも約８ｇ／Ｌのグーゲロチンの濃度でグーゲロチンを含有するようになるまで培地中で培養する。
【００７５】
他の実施形態において、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株は、培地が約０．５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌのグーゲロチンの範囲の濃度でグーゲロチンを含有するようになるまで、すなわち、発酵ブロスが通例約０．５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌのグーゲロチン、発酵完了後約０．５ｍｇ／ｇ〜約１５ｍｇ／ｇのグーゲロチンの範囲の濃度でグーゲロチンを含有するようなるまで、培地中で培養する。
【００７６】
これに関連して、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ又は少なくとも約１ｇ／Ｌのグーゲロチン濃度を達成するのに有効な濃度で添加されるアミノ酸は、アミノ酸がオリゴペプチドや部分的に加水分解したタンパク質のような他の化合物との混合物として存在し得る酵母エキス又はタンパク質加水分解物（例えば、二、三の名前だけを挙げるとカゼイン加水分解物、大豆粉加水分解物、大豆ペプトン、大豆酸加水分解物）のような組成物の一部としてではなく、明確に規定された濃度の別個の成分として培地に供給されることに注意されたい。従って、発酵ブロス中の「少なくとも１ｇ／Ｌのグーゲロチン濃度を達成するのに有効な濃度」とは、かかるグーゲロチン濃度を提供するように特に選択される培地中のアミノ酸濃度を意味する。幾つかの実施形態において、所望のグーゲロチン濃度を達成するのに有効な濃度は少なくとも約１ｇ／Ｌの培地中アミノ酸濃度である。従って、この「有効な濃度」は２ｇ／Ｌより高い可能性があり、例えば約２ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの範囲であり得る。この濃度は約３ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１１ｇ／Ｌ、約１２ｇ／Ｌ、約１３ｇ／Ｌ、又は約１４ｇ／Ｌであり得る。
【００７７】
アミノ酸は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌのグーゲロチンの濃度又はより高い濃度、例えば少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約６ｇ／Ｌ、請求項６〜８のいずれかの方法を提供する任意のアミノ酸であり得る。幾つかの実施形態において、アミノ酸はグリシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−セリン、又はこれらの混合物である。幾つかの実施形態において、培地は約５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの濃度でグリシンを含有するが、他の実施形態において培地は約５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの初期濃度でグルタミン酸を含有する。また、培地がグリシンとＬ−グルタミン酸（又はＬ−グルタミン）の両方を約５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの濃度で含有することも可能である。
【００７８】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株が消化可能な（従って利用可能な）あらゆる炭素源を本明細書に記載する発酵ブロスの製造方法（又は発酵方法）に使用することができる。適切な炭素源に例としては、二、三の名前だけを挙げるとグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、モラッセ、デンプン（多糖類の一例）、デキストリン、マルトデキストリン（オリゴ糖の一例）又はグリセリンがある。炭素源（複数でもよい）の総初期濃度は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の適切な増殖及び所望の濃度のグーゲロチンの産生を提供するいかなる濃度でもよく、実験的に決定され得る（使用した炭素源（複数でもよい）の濃度に依存する発酵ブロス内のグーゲロチンの最終濃度を測定する）。炭素源総初期濃度は、例えば約１０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌの範囲であり得、例えば約１０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ、約９０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ、約１１０ｇ／Ｌ又は約１２０ｇ／Ｌであり得る。幾つかの実施形態において、炭素源は２以上の炭素源の混合物、例えば、グルコースとデンプンのような多糖類との混合物、グルコースとデキストリン若しくはマルトデキストリンのようなオリゴ糖との混合物、又はグルコース、デンプン及びデキストリンの混合物であってもよい。幾つかの実施形態において、培地は炭素源としてグルコースとオリゴ糖の混合物を含有する。オリゴ糖はマルトデキストリン又はデキストリンであり得る。かかる実施形態において、培地中の初期のマルトデキストリン濃度は約５０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌ又は約６０ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌであり得る。培地中の初期のグルコース濃度は約２０ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌ、例えば、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ又は約７０ｇ／Ｌであり得る。炭素源としてマルトデキストリン又はデキストリンと共にグルコースを使用する他の実施形態において、グルコース濃度は約２０ｇ／Ｌ〜６０ｇ／Ｌ又は約３０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌであり得る。
【００７９】
消化可能ないかなる窒素源も本明細書に記載する発酵方法で使用することができる。窒素源は単一の供給源でも複数の供給源の混合物でも可能である。例示的な実施形態において窒素源は（少なくとも部分的に）大豆ペプトン、大豆酸加水分解物、大豆粉加水分解物、カゼイン加水分解物、酵母エキス、及びこれらの混合物からなる群から選択される。窒素源（複数でもよい）の総初期濃度はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の適切な増殖及び所望の濃度のグーゲロチンの産生を提供するいかなる濃度でもよく、実験的に決定し得る。培地中の適切な総濃度は、例えば、約１０ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌの範囲であり得、例えば、約２０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌであり得る。例示的な実施形態において、窒素源はカゼイン加水分解物と大豆粉水和物の混合物又は酵母エキスと大豆酸加水分解物の混合物であり得、ここで例えば酵母エキスは培地中に１０ｇ／Ｌの濃度（又は量）で使用され、大豆酸加水分解物は２０ｇ／Ｌの濃度／量で使用される。
【００８０】
培地はさらに塩化カルシウム、又は炭酸カルシウムのようなカルシウム供給源を含有することができる。存在する場合、培地は炭酸カルシウムのようなカルシウム供給源を約１ｇ／Ｌ〜３ｇ／Ｌの初期濃度で含有し得る。
【００８１】
これに関連して、培地の全ての成分の濃度は他に断らない限り発酵の始めの濃度（初期濃度）であることに注意されたい。濃度は発酵に使用する後の接種容量に基づく。本明細書に挙げる初期濃度は発酵中連続的な栄養分の供給によって維持することができる。或いは、発酵の始めにだけ成分（炭素源、窒素源、アミノ酸）を加えることができる。しかし、培地／発酵ブロスのｐＨは通例連続的にモニターされ、適切な酸（例えば硫酸又はクエン酸）及び／又は適切な塩基（例えば水酸化ナトリウム又はアンモニア溶液又は水酸化カリウム）の添加によって制御される。適当なｐＨは経験的に決定することができる。典型的な実施形態において培地／発酵ブロスのｐＨは６．５〜７．５、例えば、６．８〜７．０の範囲である。また、温度及び通気速度プロセスパラメーターも通常発酵プロセス中制御される。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株の培養は好気性条件下で行われるので、発酵ブロスは通例空気、酸素富化空気又は必要であれば純粋な酸素で曝気する。温度は通常２０℃〜３０℃の範囲内になるように選択されるが、本発明ではそれより高い温度も使用することが考えられる。消泡剤のような標準的な発酵試薬を連続的に添加してもよい。発酵ブロスの製造は、例えば、米国特許第３，８４９，３９８号、英国特許第１  ５０７  １９３号、Ｔｏｓｈｉｋｏ  Ｋａｎｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、Ｓｅｒ．  Ａ、Ｖｏｌ．  １５、Ｎｏ．２、Ｊｕｎ．  １９６１、ｐａｇｅｓ  ９３  ｔｏ  ９７、又はＴｏｒｕ  Ｉｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、（Ｓｅｐｔ．  １９７２）、ｐａｇｅｓ  ５４８  ｔｏ  ５５０に記載されている方法を含めて、深部発酵、固相発酵又は液面培養のような慣用の大規模な微生物発酵プロセスを用いて行うことができる。
【００８２】
任意のグーゲロチン産生性ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株を、本明細書に開示されているグーゲロチンを含有する発酵ブロスを製造するために使用することができる。例示的な実施形態において、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株はストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）菌株、ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）菌株又はストレプトマイセス・グラミネアルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｓ）菌株である。ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）は、例えば、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株又はそれから誘導される植物食性−殺ダニ性の突然変異株であり得る。さらに、低レベルであってもグーゲロチンを産生することができる、様々なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ（例えば、限定されるものではないが、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）、ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）及びストレプトマイセス・グラミネアルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｓ））及び桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）のような親の細菌株を、グーゲロチン産生を高めるために変異誘発することができる。実施例１４はかかる突然変異体及びその結果得られる少なくとも１ｇ／Ｌのグーゲロチンを含有する発酵ブロスを製造する１つの方法を記載する。
【００８３】
発酵中具体的な炭素及び窒素源並びに他の栄養分の選択を使用してグーゲロチンの産生を最適化することができる。グーゲロチン産生を高めるのに適した炭素源はデンプン、マルトデキストリン、デキストリン、糖及びグルコースである。特定の実施形態においてグルコースとオリゴ糖の組合せを炭素源及び／又は調達として用いる。グーゲロチン産生を高めるのに適した窒素源は大豆タンパク質加水分解物、カゼイン加水分解物、大豆ペプトン、酵母エキス、及び栄養分がより少ない他の窒素源である。他の適切な窒素源としては、グリシン、Ｌ−グルタミン酸を含むグルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸を含むアスパラギン酸、Ｌ−セリンを含むセリン、及びシトシンのようなアミノ酸及び／又はグーゲロチンの前駆体がある。シトシンは、高いヌクレオ塩基含有率を有する酵母エキスのような高濃度のシトシンを有する培地成分の一部として添加し得る。増大したレベルのグーゲロチンを有する発酵ブロスを製造することができる発酵培地の例を実施例１１、１２及び１３に提供する。
【００８４】
もう１つ別の実施形態において、本発明の発酵産物（例えば、発酵ブロス又は発酵固体）は少なくとも４０％、少なくとも５０％、又は少なくとも６０％の効力を有し、ここで効力は以下のようにして測定される。発酵産物を水界面活性剤溶液（界面活性剤製品ラベルに推奨されている界面活性剤の量を用いる）に希釈して５％全ブロス（又は全ブロスに由来の発酵固体を扱う場合は以下に記載するような全ブロス当量）の溶液を得る。希釈した溶液を葉（例えばライマメの葉）の上面と下面に両面が濡れるまで施用するが、流れ出すまでには施用しない。植物を乾燥させた後１０−２０のナミハダニ（テトラニカス・ウルティカエ・コッホ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ  Ｋｏｃｈ）を寄生させる。処理の４日後、処理した葉を検査し、葉の上の生きている成虫と死んだ成虫の雌及び第２若虫を数える。Ｓｕｎ−Ｓｈｅｐａｒｄ式を用いて効力（すなわち、補正した死亡率）を計算する。補正した％＝１００（処理したプロットの低下率％±未処理集団の変化率％）／（１００±未処理集団の変化率％）。この応用で、上記方法で計算された効力を「ハダニ効力」と称する。
【００８５】
幾つかの実施形態において本発明の組成物は幅広い種類の農業及び／又は園芸作物、例えば種子、生産、造園のために増殖させるもの、及び種子生産のために増殖させるものを処理するのに使用される。本発明の組成物を用いて処理することができる代表的な植物には、限定されるものではないが、アブラナ、鱗茎野菜、穀類穀物、柑橘類、綿、ウリ科、結果野菜、葉野菜、マメ科植物、油科種子作物、落花生、ナシ果実、根野菜、塊茎野菜、球茎野菜、核果、タバコ、イチゴ及び他のベリー、並びに各種の観賞植物などがある。
【００８６】
本発明の組成物は葉面散布として、土壌処理として、及び／又は種子処理／粉衣として投与することができる。葉面処理として使用する場合、１つの実施形態において、１エーカーに付き約１／１６〜約５ガロンの全ブロスを施用する。土壌処理として使用する場合、１つの実施形態において、１エーカーに付き約１〜約１５ガロン又は約１〜約５ガロンの全ブロスを施用する。又は、処理する種子の大きさ及び発酵産物中のコロニー形成単位の濃度に応じて、約０．１ｍｇ〜約１４ｍｇ、又は約０．２ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は約０．２ｍｇ〜約８ｍｇの凍結乾燥産物のような発酵産物を施用する。種子処理として使用する場合１エーカーに付き約１／３２〜約１／４ガロンの全ブロスを施用する。種子処理の場合、最終用途の製剤は１グラムに付き少なくとも１×１０８のコロニー形成単位を含有する。
【００８７】
幾つかの実施形態において、本発明の組成物を植物、植物の部分又は植物の場所に施用する前に、処理を必要とする生育場所を確認する。
【００８８】
微生物（例えば、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０又はその植物食性−殺ダニ性突然変異株）／ｍＬの凍結乾燥粉末をはじめとする全ブロス培養物又は発酵固体のような発酵産物を希釈し、植物の葉に施用する。施用率は１エーカー当たりのガロン又はポンドで提供され、（実施例に記載されているマイクロプロットトライアルのような）より小さい施用に比例して調節することができる。実施例で記載するように、より大きい施用の場合、発酵産物は施用前に１００ガロンの水に希釈する。１つの実施形態において、１エーカーに付き約０．５ガロン〜約１５ガロン、約１ガロン〜約１２ガロン又は約１．２５ガロン〜約１０ガロンの全ブロス培養物（水及び、場合により、界面活性剤に希釈）を植物の葉に施用する。別の実施形態において、１エーカーに付き約０．２〜約８ポンドの凍結乾燥粉末、約０．４〜約７ポンド、又は約０．４ｌｂ〜約６ｌｂ（水及び、場合により、界面活性剤に希釈）を植物の葉に施用する。特定の例において、発酵産物は少なくとも約４０％、少なくとも約５０％又は少なくとも約６０％のハダニ効力を有する。別の例において、発酵産物は約０．５％〜約１５％のグーゲロチン、約１％〜約１２％のグーゲロチン、又は約２％〜約１０％のグーゲロチンを有する発酵粉末（噴霧乾燥又は凍結乾燥粉末を含む）であり、ここでパーセントは全て重量／重量である。もう１つ別の例において、発酵産物は約０．０１％〜約０．５％のグーゲロチン（重量／重量）を有する発酵ブロスである。
【００８９】
特定の実施形態において、１エーカーに付き１．２５ポンドの凍結乾燥粉末又は噴霧乾燥粉末（水及び、場合により、界面活性剤に希釈）のような発酵産物を植物の葉に施用する。これらの実施形態において、最終用途の製剤は少なくとも約１×１０６のコロニー形成単位／ｍＬ、少なくとも約１×１０７のコロニー形成単位／ｍＬ、少なくとも約１×１０８のコロニー形成単位／ｍＬ、少なくとも約１×１０９コロニー形成単位／ｍＬ、又は少なくとも約１×１０１０コロニー形成単位／ｍＬを含有する出発の発酵ブロスに基づく。別の例において、この発酵産物は少なくとも約１重量％のグーゲロチン、少なくとも約２重量％のグーゲロチン、少なくとも約３重量％のグーゲロチン、少なくとも約４重量％のグーゲロチン、少なくとも約５重量％のグーゲロチン、少なくとも約６重量％のグーゲロチン、少なくとも約７重量％のグーゲロチン、又は少なくとも約８重量％のグーゲロチンを含有する。
【００９０】
グーゲロチン遺伝子クラスター、ＯＲＦ、及びそれによりコードされるタンパク質
本開示は、ある遺伝子座内に位置するグーゲロチン遺伝子クラスターの核酸配列、そこに含有されるＯＲＦ、及びそれによりコードされるタンパク質を提供する。この情報は、例えば、他のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の菌にあるようなグーゲロチン遺伝子クラスターのホモログをコードする関連の核酸分子及び対応するＯＲＦの単離を可能にする。本開示はさらに、グーゲロチン遺伝子クラスター又はその一部分によりコードされるタンパク質（例えば、限定されるものではないが、ＧｏｕＡ、ＧｏｕＢ、ＧｏｕＣ、ＧｏｕＤ、ＧｏｕＥ、ＧｏｕＦ、ＧｏｕＧ、ＧｏｕＨ、ＧｏｕＩ、ＧｏｕＪ、ＧｏｕＫ、ＧｏｕＬ、ＧｏｕＭ、及び／又はＧｏｕＮなど）の変異体、及びかかる変異体をコードする核酸分子の生産を可能にする。
【００９１】
ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）株から同定された配列番号：４３（ヌクレオチド残基１−２１９３３）内に含まれるグーゲロチン遺伝子クラスターはＯＲＦ４２４８〜４２７１と称される２４のＯＲＦを含む。ＯＲＦ４２５１、４２５２、４２５３、４２５５、４２５６、４２５７、４２５８、４２５９、４２６１、４２６２、４２６３、４２６４、４２６５、及び４２７１はそれぞれ１３の遺伝子ｇｏｕＡ、ｇｏｕＢ、ｇｏｕＣ、ｇｏｕＤ、ｇｏｕＥ、ｇｏｕＦ、ｇｏｕＧ、ｇｏｕＨ、ｇｏｕＩ、ｇｏｕＪ、ｇｏｕＫ、ｇｏｕＬ、ｇｏｕＭ、及びｇｏｕＮである。配列番号：８９−１００（ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）株から同定された）はそれぞれオルソロガスな遺伝子ｇｏｕＢ、ｇｏｕＣ、ｇｏｕＤ、ｇｏｕＥ、ｇｏｕＦ、ｇｏｕＧ、ｇｏｕＨ、ｇｏｕＩ、ｇｏｕＪ、ｇｏｕＫ、ｇｏｕＬ、ｇｏｕＭを提供することに注意。（これらの遺伝子の潜在的な機能及びグーゲロチン合成におけるその可能な役割は表２に提供する。）
開示された遺伝子座（配列番号：４３）及びそこに含有されるＯＲＦの配列が提供されると、インビトロ核酸増幅（例えば、限定されるものではないが、ＰＣＲなど）を、上記表１に掲げたグーゲロチン生合成タンパク質の１以上をコードする核酸配列を製造するための簡単な方法として利用することができる。このようにしてタンパク質をコードする核酸分子を製造するための代表的な技術を以下に提供する。
【００９２】
当業者に周知のいろいろな方法のいずれかによりＲＮＡ又はＤＮＡを細胞から抽出する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９２）はＲＮＡ又はＤＮＡの単離のための方法の代表的な説明を提供する。グーゲロチン生合成酵素は、少なくとも、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）で発現される。従って、幾つかの例において、ＲＮＡ又はＤＮＡはストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）細胞から抽出され得る。抽出されたＲＮＡは、例えば、ｃＤＮＡを生成するために逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ増幅を実施するための鋳型として使用し得る。ＲＴ−ＰＣＲの代表的な方法及び条件はＫａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）  ２１−２７  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、１９９０）に記載されている。
【００９３】
増幅プライマーの選択は増幅しようとするＤＮＡの部分（複数でもよい）に従って行い得る。プライマーは、１つの実施形態においてＤＮＡのあるセグメント（例えば、特定のＯＲＦ又は隣接するＯＲＦの組）を、又は別の実施形態においては全ＤＮＡ分子を増幅するように選択され得る。異なる長さ及び組成のプライマー及びアンプリコンに適合させるために増幅条件の変更が必要になり得る。かかる問題は当業界で周知であり、例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、１９９０）で論じられている。例として、選択されたグーゲロチン生合成タンパク質をコードする核酸分子（例えば、ｇｏｕＡ〜ｇｏｕＮのいずれか又は組合せ）は、プロトタイプのストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ｇｏｕＡ、ｇｏｕＢ、ｇｏｕＣ、ｇｏｕＤ、ｇｏｕＥ、ｇｏｕＦ、ｇｏｕＧ、ｇｏｕＨ、ｇｏｕＩ、ｇｏｕＪ、ｇｏｕＫ、ｇｏｕＬ、ｇｏｕＭ、及び／又はｇｏｕＮ配列の５’−及び３’−末端に対するプライマーを用いて増幅することができる。多くの異なるプライマーが提供された核酸配列から誘導され得ることが理解されよう。増幅された配列の確認を容易にし、グーゲロチンと増幅された配列との間の天然の変化に関する情報を提供するために、いずれかの増幅手順で得られた増幅産物の再度の配列決定が推奨される。グーゲロチン配列のいずれかから誘導されたオリゴヌクレオチドを、例えば、対応するグーゲロチン（又はグーゲロチン関連）アンプリコンの配列決定に使用することができる。
【００９４】
さらに、グーゲロチン遺伝子クラスター、又はグーゲロチンＯＲＦ（例えば、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、及び４１の１以上）のオルソログをコードする配列をクローニングするために、慣用のハイブリダイゼーションとＰＣＲ増幅の両方の方法を使用し得る。これらの技術の両方に共通するのは、上流及び下流のフランキング領域を伴うか又は伴わないグーゲロチン遺伝子クラスター又はグーゲロチンＯＲＦ核酸配列から誘導されるプローブ又はプライマーのハイブリダイゼーションである。また、ハイブリダイゼーションはノーザンブロット、サザンブロット、又はＰＣＲの状況で起こり得る。
【００９５】
問題の細菌種から調製されたＤＮＡライブラリーに対して直接ＰＣＲ増幅を行ってもよいし、又は標準的な方法を用いて細菌細胞から抽出されたＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行ってもよい。ＰＣＲプライマーは上流及び下流のフランキング領域を伴うか又は伴わないグーゲロチン遺伝子クラスター又はグーゲロチンＯＲＦ核酸配列の少なくとも１０の連続したヌクレオチドを含む。当業者には了解されるように、グーゲロチン遺伝子クラスター又はグーゲロチンＯＲＦ核酸配列と増幅される標的の核酸との間の配列差異は増幅効率を下げる結果となり得る。これを補償するために、より長いＰＣＲプライマー又はより低いアニーリング温度を増幅サイクル中使用し得る。より低いアニーリング温度を使用する場合は、増幅特異性を高めるためにネステッドプライマー対を使用する連続的な増幅ラウンドが有用であり得る。
【００９６】
開示されたグーゲロチン生合成タンパク質のオルソログは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の多くの他の一員、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）種の他の菌株、及び他のグーゲロチン産生性有機体に存在し得る。開示されたグーゲロチン遺伝子クラスター及びそのＯＲＦ４２５１−４２５３、４２５５−４２５９、４２６１−４２６５、及び４２７１、並びにフランキング及び介在性のＯＲＦ４２４８−４２５０及び４２６６−４２７０の核酸配列が提供されたことにより、タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、ＯＲＦ）及びこれらの他の有機体においてグーゲロチン生合成酵素オルソログをコードする遺伝子クラスターの標準的な方法によるクローニングが今や可能になった。開示されたグーゲロチン生合成酵素及びタンパク質のオルソログは、例えばシトシンシンターゼ（ＯＲＦ４２５８；ｇｏｕＧ；配列番号：１５及び１６）又はＣＧＡシンターゼ（ＯＲＦ４２６１；ｇｏｕＩ；配列番号：２１及び２２）のように、本明細書に開示された生物活性又は機能を有する。
【００９７】
オルソログは一般に、開示されたグーゲロチン生合成タンパク質（例えば、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、及び４１の１以上）をコードする核酸配列に対して少なくとも６５％の配列同一性を共有する。具体的な実施形態において、オルソロガスなグーゲロチン遺伝子クラスター又はグーゲロチンＯＲＦは場合により開示されたストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）又はストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）ヌクレオチド又はアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を共有し得る。
【００９８】
慣用のハイブリダイゼーション技術の場合、ハイブリダイゼーションプローブは放射性ラベルのような検出可能なラベルとコンジュゲートするのが好ましく、プローブは長さが少なくとも１０のヌクレオチドであるのが好ましい。当業界で周知のように、ハイブリダイゼーションプローブの長さを増大すると高まった特異性を提供する傾向がある。グーゲロチン遺伝子クラスター又はグーゲロチンＯＲＦ核酸配列から誘導されたラベルされたプローブを細菌性ＤＮＡライブラリーとハイブリッドさせ、当業界で公知の方法を用いてハイブリダイゼーションシグナルを検出し得る。ハイブリダイズするコロニー又はプラーク（使用したライブラリーの種類による）を精製し、そのコロニー又はプラークに含有されるクローニングされた配列を単離し、特性決定することができる。
【００９９】
特定の例において、ゲノムライブラリーの構築は、市販されているいろいろなコスミド又はフォスミド系（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて迅速に達成することができる。有利なことに、これらの系はクローニングされたＤＮＡの不安定性を最小にする。かかる例においては、ゲノムライブラリーのスクリーニングの後、コスミド又はフォスミドを単離し、一群のオーバーラップするクローンにグループ分けし、分析してクラスターの同一性を確立する。コスミド末端配列決定を使用して、天然産物構造及びその推定される生合成起源から予測される期待経路特性に基づく特定のクローンの適切さに関する予備的な情報を得ることができる。
【０１００】
或いは、グーゲロチン遺伝子クラスター（＋／−上流又は下流のフランキング領域）のオルソログ又はグーゲロチンＯＲＦ核酸配列は発現ライブラリーの免疫スクリーニングによって得ることができる。本明細書に開示された遺伝子座（配列番号：４３）の提供により、対応するタンパク質を異種の発現系（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））で発現させ精製することができ、ＧｏｕＡ、ＧｏｕＢ、ＧｏｕＣ、ＧｏｕＤ、ＧｏｕＥ、ＧｏｕＦ、ＧｏｕＧ、ＧｏｕＨ、ＧｏｕＩ、ＧｏｕＪ、ＧｏｕＫ、ＧｏｕＬ、ＧｏｕＭ、及び／又はＧｏｕＮのようなグーゲロチン生合成酵素又はタンパク質に対して特異的な抗体（モノクローナル又はポリクローナル）を産生させるのに使用することができる。抗体はまた、本明細書に提示したグーゲロチンアミノ酸配列（配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、及び４２及び／又は配列番号：７７−８８）から誘導された合成ペプチドに対して産生させてもよい。抗体を産生させる方法は当業界で周知であり、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８に概説されている。かかる抗体は、細菌から生産された発現ライブラリーをスクリーニングするのに使用することができる。例えば、このスクリーニングはグーゲロチンオルソログを同定する。選択されたＤＮＡは配列決定及び酵素活性アッセイにより確認することができる。
【０１０１】
グーゲロチン遺伝子クラスターから誘導されたオリゴヌクレオチド（配列番号：４３）又は遺伝子クラスターのＯＲＦをコードする核酸配列（配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、及び４１）、又はこれらの核酸配列の断片は本開示の範囲内に含まれる。かかるオリゴヌクレオチドは、例えば、プローブ又はプライマーとして使用できる。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドはグーゲロチン遺伝子クラスター（＋／−上流及び下流のフランキング領域）又はグーゲロチンＯＲＦ核酸配列の少なくとも１０の連続したヌクレオチドの配列を含み得る。これらのオリゴヌクレオチドをインビトロ増幅法（例えばＰＣＲ）に使用する場合、オリゴヌクレオチドを長くすると増幅の特異性を高め得る。すなわち、その他の実施形態において、これらの配列の少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又はそれ以上の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用し得る。別の例において、グーゲロチン生合成酵素をコードする核酸分子（例えば、配列番号：１５又は２１など）の３０の連続したヌクレオチドを含むプライマーは、別のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種（又は他のグーゲロチン産生性種）に由来するＤＮＡライブラリー内に存在するグーゲロチン遺伝子クラスター（＋／−上流及び下流のフランキング領域）又はグーゲロチンホモログのような標的配列にアニールし、１５のみのヌクレオチドの対応するプライマーより高い特異性を有する。より大きい特異性を得るために、グーゲロチン遺伝子クラスター（＋／−上流及び下流のフランキング領域）又はグーゲロチンＯＲＦヌクレオチド配列の少なくとも１７、２０、２３、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれ以上の連続したヌクレオチドを含むプローブ及びプライマーを選択することができる。特定の例において、プローブ又はプライマーは、開示されたグーゲロチン遺伝子クラスター（＋／−上流及び下流のフランキング領域）又はグーゲロチンＯＲＦ配列の少なくとも１００、２５０、５００、６００又は１０００の連続した核酸であることができる。
【０１０２】
オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー又はプローブ）は、開示されたグーゲロチン遺伝子クラスター（＋／−上流及び下流のフランキング領域）又はグーゲロチンＯＲＦ核酸配列のいずれかの領域から得ることができる。例として、グーゲロチン遺伝子クラスター（＋／−上流及び下流のフランキング領域）又はグーゲロチンＯＲＦ配列は配列の長さに基づいて約１／２、１／３又は１／４ずつに分けることができ、単離された核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）は分子の１／２ずつに分けた第１又は第２、１／３ずつに分けた３つのうちのいずれか、又は１／４ずつに分けた４つのうちのいずれか誘導することができる。対象の核酸配列はまたより小さい領域、例えば、約１／８ずつ、１／１６ずつ、１／２０ずつ、１／５０ずつなどに分割することもでき、同様の効果がある。或いは、保存されたドメインをコードする領域毎に分割することができる。
【０１０３】
本明細書にグーゲロチン生合成タンパク質及び対応する核酸配列が提供されたことにより、これらの配列の変異体の創成が可能になる。変異体グーゲロチン生合成酵素には、開示されたプロトタイプの酵素とはアミノ酸配列が異なるがそれでも表１に掲げたプロトタイプのタンパク質の生物学的活性／機能を保持するタンパク質を包含される。変異体酵素はまた、グーゲロチンの生合成前駆体であってそれら酵素の活性／機能を産生する生合成前駆体又はグーゲロチンの新規なアナログが除かれていてもよい。
【０１０４】
１つの実施形態において、変異体グーゲロチン生合成タンパク質には、開示されたグーゲロチン生合成タンパク質配列（例えば、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、及び４２及び／又は配列番号：７７−８８）とはアミノ酸配列が異なるがかかる酵素配列と少なくとも６５％のアミノ酸配列同一性を共有するタンパク質が包含される。その他の実施形態において、他の変異体は少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を共有する。標準的な手法（例えば、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ）を使用する開示されたグーゲロチン遺伝子クラスター（＋／−上流及び下流のフランキング領域）及びグーゲロチンＯＲＦヌクレオチド配列の操作はを使用してかかる変異体を生成することができる。最も簡単な改変は類似の生化学的性質を有するアミノ酸の１以上のアミノ酸への置換を含む。これらのいわゆる保存的置換は得られるタンパク質の活性に対する影響が最小でなり得る。
【０１０５】
グーゲロチンの生合成生産
グーゲロチンを創成するための生合成方法はその効率的な生産に有用であり、グーゲロチン及びそのアナログの生産に同様に使用することができる。従って、グーゲロチン生合成遺伝子クラスター又はそれに由来するＯＲＦの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は他のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の菌のような異種の宿主におけるクローニング及び発現は、遺伝子クラスター内に含まれるグーゲロチン、グーゲロチン前駆体、グーゲロチン中間体、又は酵素若しくはタンパク質の生産を増大するのに使用することができる。さらに、遺伝子組換え及びドメイン交換構築体は、伝統的な合成方法を用いて作成するのが困難なグーゲロチン構造の創成を可能にする。
【０１０６】
１つの実施形態において、組換え発現系は原核生物宿主から選択される。細菌細胞はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ；  Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）のような当業者に公知の公共の供給源を含めて数多くの供給源から入手可能である。組換えタンパク質発現に使用される細胞の商業的供給源はまたかかる細胞の利用のための指示を提供する。
【０１０７】
グーゲロチン遺伝子クラスターの発現のための１つの代表的な異種宿主系はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種である。特定の例において、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の菌は非常に大きいサイズの天然産物生合成遺伝子クラスターを発現するための人工の宿主として使用されている（例えば、Ｓｔｕｔｚｍａｎ−Ｅｎｇｗａｌｌ  ａｎｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：  ３１３５−３１３９、１９８９；  Ｍｏｔａｍｅｄｉ  ａｎｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：  ４４４５−４４４９、１９８７；  Ｇｒｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  １５１：  １−１０  １９９４；  Ｋａｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：  ５０９−５１２、１９９４：  ａｎｄ  Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５３：  １１６−１６６、１９８７参照）。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の菌は有用な異種の宿主系であり、すなわち容易に増殖され、生合成遺伝子クラスターの発現及び／又は組込のためのプラスミド及びコスミドは十分に特性が決定されており、機能経路を生成するのに必要とされる改変し補助する酵素の
ａｎｄ  ｔｈｅｙ  ｈｏｕｓｅ  多くを保有するからである（Ｄｏｎａｄｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ９９：１８７−１９８、２００２）。断片化する菌糸体を有する宿主細胞は低い粘度を保つ利点を示し得、宿主細胞の（大量のグーゲロチンを発現する能力に加えて）さらに望ましい特性には迅速な増殖及び簡単な基質による増殖が含まれる。
【０１０８】
グーゲロチン遺伝子クラスター（又は１以上のそのＯＲＦ）の発現のための別の代表的な異種宿主系は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、成長が速く、遺伝子操作が容易であるので魅力的な人工の発現系である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に基づく発現系の近年の進歩により、単一の宿主有機体で同時に複数の遺伝子を発現させる努力が大いに軽減された。今や、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で複雑な生合成系から複数のＯＲＦを同時に発現させることができる。
【０１０９】
しかし、発現系の選択は発現させるポリペプチドに望まれる特徴に依存する。任意の形質導入可能なクローニングベクターを現在開示されている核酸構築体のためのクローニングベクターとして使用することができる。大きいクラスターを発現させたい場合、複数のヌクレオチド配列を宿主細胞中にクローニングするためにファージミド、コスミド、フォスミド、Ｐ１、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＨＡＣ又は同様なクローニングベクターを使用するのが好ましい。これらのベクターは、それぞれＭ１３ファージ及びラムダ  ファージと比較してＤＮＡのより大きい断片を  挿入する能力及び安定に増殖させる能力のために有利である。
【０１１０】
１つの実施形態において、開示されているＯＲＦ及び／又はその変異体の１以上を、当業者に公知の方法を用いて１以上の発現ベクターに挿入することができる。ベクターを使用して、グーゲロチン生合成遺伝子又はグーゲロチン遺伝子クラスターを宿主細胞内に導入する。堅い細胞壁を有する原核生物の宿主細胞又は他の宿主細胞は、当業界で公知のいずれかの方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿、又はエレクトロポレーションを用いて形質転換することができる。代表的な原核生物形質転換技術は、例えばＤｏｗｅｒ（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２：２７５−２９６、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、１９９０）及びＨａｎａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２０４：６３、１９９１）に記載されている。ベクターは所望のＯＲＦに機能可能なように連結された１以上の調節配列を含んでいる。しかし、発現カセットの選択は選択される宿主系及び発現されるポリペプチド又は天然産物に望まれる特徴に依存し得る。通例、発現カセットは、選択された宿主系で機能し、構成的又は誘導可能であることができるプロモーターを含んでいる。１つの実施形態において、発現カセットは、プロモーター、リボソーム結合部位、必要であれば開始コドン、及び場合により所望のＤＮＡ分子に加えてリーダーペプチドをコードする領域、並びに停止コドンを含んでいる。さらに、３’末端領域（翻訳及び／又は転写ターミネーター）をカセット内に含ませることができる。ＤＮＡ分子内に組み入れられたＯＲＦは、転写及び翻訳が宿主細胞内で起こるようにプロモーターにより単独に制御され得る。プロモーターをコードする領域は当業者に周知であり利用可能である。プロモーターの例として、細菌性プロモーター（例えば、ガラクトース、ラクトース及びマルトースのような糖代謝酵素に由来するものなど）、トリプトファンのような生合成酵素に由来するプロモーター配列、ｔｈｅ  ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、バクテリオファージラムダＰＬ及びＴＦ並びにウィルス性プロモーターを挙げることができる。
【０１１１】
発現カセット内の追加の調節配列の存在は宿主細胞の成長に呼応した１以上のＯＲＦの発現の調節を可能にするために望ましい可能性がある。これらの調節配列は当業界で周知である。調節配列の例には、化学物質又は物理的刺激に応答して遺伝子発現をオン・オフする配列、並びにエンハンサー配列がある。調節配列に加えて、形質転換された細胞の選抜を助けるために選択可能なマーカーを含ませることができる。例えば、抗生物質抵抗性又は感受性をプラスミドに与える遺伝子を選択可能なマーカーとして使用し得る。
【０１１２】
対象のグーゲロチン遺伝子クラスター又は１以上のグーゲロチンＯＲＦは、個々のカセットとして別々の調節要素と共に、又は単一の調節要素（例えば、プロモーター）の制御下で１以上の組換えベクター中にクローニングすることができると考えられる。１つの実施形態において、ＯＲＦは、混成合成経路を得ることができるように他のオープンリーディングフレームの容易な欠失及び挿入を可能にするために２以上の制限部位を含む。かかる制限部位の設計及び使用は当業界で周知であり、ＰＣＲ又は部位特異的突然変異誘発のような上記技術を用いて行うことができる。形質転換された細胞により発現されたタンパク質は当業者に周知の標準的な方法に従って回収することができる。例えば、タンパク質は単離を容易にするために便利なタグと共に発現させることができる。さらに、得られたポリペプチドは、ポリペプチドに結合するリガンドを用いることによりアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
【０１１３】
さらに、グーゲロチンの産生について既に記載した発酵条件を利用することにより、対象とする様々なグーゲロチンＯＲＦ、遺伝子クラスター、又はグーゲロチンタンパク質を生産することができると考えられる。生産後、化合物は、例えば、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）をはじめとする当業者に周知の方法により精製及び／又は分析することができる。
【０１１４】
本発明はまた、（ｉ）ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種の菌株をスクリーニングし、（ｉｉ）配列番号４３に対して、又は配列番号：４３のヌクレオチド配列のタンパク質ＧｏｕＡ、ＧｏｕＢ、ＧｏｕＣ、ＧｏｕＤ、ＧｏｕＥ、ＧｏｕＦ、ＧｏｕＧ、ＧｏｕＨ、ＧｏｕＩ、ＧｏｕＪ、ＧｏｕＫ、ＧｏｕＬ、及び／又はＧｏｕＭをコードする領域に対して、少なくとも約６５％の配列同一性、少なくとも約６６％の配列同一性、少なくとも約６７％の配列同一性、少なくとも約６８％の配列同一性、少なくとも約６９％の配列同一性、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する菌株を選択し、（ｉｉｉ）選択された菌株に殺ダニ性の発酵産物を産生させることによって、殺ダニ性及び／又は殺真菌性の細菌産物を同定及び／又は製造する方法も包含する。幾つかの他の実施形態において、選択するステップは、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、及び配列番号：４２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する菌株を選択することを含む。幾つかの実施形態においては、次のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種の菌株をスクリーニングする。Ｓ．ミクロフラブス（Ｓ．ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）、Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、Ｓ．アヌラツス（Ｓ．ａｎｕｌａｔｕｓ）、Ｓ．フィミカリウス（Ｓ．ｆｉｍｉｃａｒｉｕｓ）、Ｓ．パルブス（Ｓ．ｐａｒｖｕｓ）、Ｓ．ラベンデュラエ（Ｓ．ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）、Ｓ．アルボビリディス（Ｓ．ａｌｂｏｖｉｒｉｄｉｓ）、Ｓ．プニセウス（Ｓ．ｐｕｎｉｃｅｕｓ）、又はＳ．グラミネアルス（Ｓ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｓ）。幾つかの実施形態において、スクリーニングされるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種は親のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株の突然変異体である。１つの態様において、かかる突然変異体は、実施例１６に記載される方法を含めて本出願で説明されているようにして、又は当業界で公知の他の方法によって生成させる。幾つかの実施形態において、スクリーニングステップの前に、親のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株の突然変異体を発生させるステップがある。突然変異体を発生させる方法は本明細書に記載されている。幾つかの実施形態において、選択するステップは、菌株の発酵ブロスを調製し、少なくとも約６０％のハダニ効力も有する菌株を選択することも含む。かかる選択するステップは配列同一性に基づいて選択するステップの前又は後に実施することができる。発酵産物を調製し殺ダニ活性を試験する方法は本明細書に記載されている。１つの実施形態において、産生させるステップ（ステップ（ｉｉｉ））の発酵産物は少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約６ｇ／Ｌ、少なくとも約７ｇ／Ｌ、少なくとも約８ｇ／Ｌ、少なくとも約９ｇ／Ｌ、又は少なくとも約１０ｇ／Ｌのグーゲロチン濃度を有する。グーゲロチン濃度を測定する方法は当業者に公知である。
【０１１５】
寄託情報
本発明のストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）株のサンプルは、２０１１年８月１９日、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、米国農務省、１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、ＩＬ  ６１６０４に所在のｔｈｅ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにブダペスト条約下で寄託され、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０という受託番号が付いている。
【０１１６】
ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株の突然変異体（本明細書ではストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）Ｍ株と称され、ＡＱ６１２１．００２ともいう）のサンプルは、２０１３年９月２７日、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、米国農務省、１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、ＩＬ  ６１６０４に所在のｔｈｅ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにブダペスト条約下で寄託されている。この株はまた、２０１３年１０月８日、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ  Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０  ＵＳＡに所在のアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関にもブダペスト条約下で寄託されている。さらにまたこの株は、２０１３年１０月９日、１０１５  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｓｔｒｅｅｔ  Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、Ｍａｎｉｔｏｂａ  Ｃａｎａｄａ  Ｒ３Ｅ  ３Ｒ２に所在のカナダの国際寄託機関（ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｐｏｓｉｔａｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ）にも受託番号０９１０１３−０２（仮）で寄託されている。
【０１１７】
本明細書でストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株（ＡＱ７４３９ともいう）と称するストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）株のサンプルは、２０１３年１０月８日、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ  Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０  ＵＳＡに所在のアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関にブダペスト条約下で寄託されている。またこの株は、２０１３年１０月９日、１０１５  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｓｔｒｅｅｔ  Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、Ｍａｎｉｔｏｂａ  Ｃａｎａｄａ  Ｒ３Ｅ  ３Ｒ２に所在のカナダの国際寄託機関（ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｐｏｓｉｔａｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ）にも受託番号０９１０１３−０１（仮）で寄託されている。
【０１１８】
以下、本発明の純粋な例示として、限定されない目的で実施例を挙げる。
【実施例】
【０１１９】
実施例１．  ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の選抜
菌株の内部コレクションから菌株を採り、初期スクリーニング試験を行って、全般的な殺ダニ活性をスクリーニングするために一般的に使用されるモデル生物であるナミハダニ（「ＴＳＳＭ」）に対する潜在的な候補菌株の有効性を決定した。まず、寒天プレートで急速に成長する変異体のような実験室又は人工培養に適した性質で微生物を選択した。選択した菌株の培養ストックを、実施例２に記載する培地１及び培地２のような、それぞれの菌株に適した培地で増殖させた。得られた発酵産物（全ブロス）を、水及び０．０３％の界面活性剤ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ  ＦＩＲＳＴ  Ｃｈｏｉｃｅ（登録商標）ポリエーテル−ポリメチルシロキサン−コポリマーを用いて２５％溶液に希釈した。その後、８ｍＬの希釈した発酵産物を（２つの植物体の）ライマメ葉の上面及び下面に流れ出すまで施用した（ライマメ植物は１〜１．５週齢であった）。かかる処理の後、同日５０−１００のＴＳＳＭを植物に寄生させ、５日間温室内に放置した。５日目植物をダニ及び卵の存在に関して１〜４のスケールで評価した。殺ダニ剤ＡＶＩＤ（登録商標）（アバメクチン、Ｓｙｎｇｅｎｔａ）を陽性対照として使用した。ダニ及び卵に関して、１は１００％の死亡率を示し、１．５は９０％〜９５％の死亡率を示し、２．０は７５％〜９０％の死亡率を表し、２．５は４０％〜５５％の死亡率を表し、３．０は２０％〜３５％の死亡率を表し、４．０は０％〜１０％の死亡率を表す。ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の他にも、他のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株及び幾つかのＢａｃｉｌｌｕｓ菌株がダニに対して活性であることが判明した。
【０１２０】
さらに選択するため、他の活性の中で、スクリーニングした菌株のＵＶ安定性及び層透過活性を試験した。これは、殺ダニ剤は野外散布で有効であるためにはＵＶ光に対して安定で、層透過活性を保有するべきだからである。
【０１２１】
ＵＶ安定性の評価のため、発酵産物の上記２５％希釈液をライマメ植物の上面に噴霧した。かかる処理の後、同日５０−１００のＴＳＳＭを植物に寄生させ、２４時間ＵＶ光に曝し、５日間温室内に放置した。ダニは、葉に付けてダニに対する無感覚の境界線として役立たせたワセリンリングを用いて葉の向軸の（上の）表面に閉じ込めた。５日目植物を上記のようにダニ及び卵の存在に関して１〜４のスケールで評価した。殺ダニ剤ＡＶＩＤ（登録商標）（アバメクチン、Ｓｙｎｇｅｎｔａ）及びＯＢＥＲＯＮ（登録商標）（スピロメシフェン、Ｂａｙｅｒ  ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ  ＡＧ）を対照として用いた。結果を図１に示す。ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株の発酵産物は試験した全ての菌株の中で最良のＵＶ安定性を示した。
【０１２２】
層透過活性の評価のため、菌株を上記のように培養し、得られた全ブロスを水及び０．３５％の界面活性剤を用いて希釈し、（２つの植物体の）ライマメ葉の下面に流れ出すまで施用した。処理の１日後、処理した葉の上面に５０−１００のＴＳＳＭを寄生させ、これらは葉の上面に付け、上記のようにワセリンリング／物理的障壁を用いて閉じ込めた。６日目植物をダニ及び卵存在に関して１〜４の上記スケールで評価した。殺ダニ剤ＡＶＩＤ（登録商標）（アバメクチン、Ｓｙｎｇｅｎｔａ）及びＯＢＥＲＯＮ（登録商標）（スピロメシフェン、Ｂａｙｅｒ  ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ  ＡＧ）を対照として使用した。結果を図２に示す。ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株の発酵産物は試験した菌株の中で最良の層透過活性を示した。
【０１２３】
実施例２．  ハダニに対する活性
ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０のナミハダニ（「ＴＳＳＭ」）に対する有効性をより厳密に決定するためにさらに試験を行った。ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の培養ストックを１Ｌの振盪フラスコ内の培地１又は培地２において２８℃で５日間増殖させた。培地１は２．０％デンプン、１．０％  デキストロース、０．５％酵母エキス、０．５％カゼイン加水分解物及び０．１％ＣａＣＯ３からなっていた。培地２は２％ＰｒｏＦｌｏ綿実粕、２％麦芽エキス、０．６％ＫＨ２ＰＯ４及び０．４８％Ｋ２ＨＰＯ４からなっていた。得られた発酵産物を、水及び０．０３％界面活性剤ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ  ＦＩＲＳＴ  ＣＨＯＩＣＥ（登録商標）（ポリエーテル−ポリメチルシロキサン−コポリマー）を用いて２５％溶液に希釈し、６ｍＬを（２つの植物体の）ライマメ葉の上面及び下面に流れ出すまで施用した。かかる処理の後、同日植物に５０−１００のＴＳＳＭを寄生させ、温室内に５日間放置した。６日目植物をダニ及び卵の存在に関して１〜４のスケールで評価した。殺ダニ剤ＡＶＩＤ（登録商標）（アバメクチン、Ｓｙｎｇｅｎｔａ）を陽性対照として使用した。ダニ及び卵に関して、１は１００％の死亡率を示し、１．５は９０％〜９５％の死亡率を示し、２．０は７５％〜９０％の死亡率を表し、２．５は４０％〜５５％の死亡率を表し、３．０は２０％〜３５％の死亡率を表し、４．０は０％〜１０％の死亡率を表す。結果を下記表３に示す。ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の両方の発酵産物で９０％以上のダニ死亡率が得られた。
【表３】
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【０１２４】
アーモンドでのパシフィックスパイダーマイト（Ｐａｃｉｆｉｃ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、ブドウでのパシフィックスパイダーマイト（Ｐａｃｉｆｉｃ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、及びイチゴでのナミハダニに関する圃場試験で、上記の温室での結果が確認された。アーモンドにおけるパシフィックスパイダーマイト（Ｐａｃｉｆｉｃ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）に対する圃場試験の結果を下記表４−６に示す。殺ダニ剤ＡＧＲＩ−ＭＥＫ（登録商標）（アバメクチン、Ｓｙｎｇｅｎｔａ）を陽性対照として使用した。培地１を含有する振盪フラスコにＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の凍結培養菌を接種し、２８−３０℃で１−２日増殖させた。得られた発酵産物を用いて培地（６．０％デンプン、３．０％デキストロース、１．５％酵母エキス及び１．５％カゼイン加水分解物並びに０．３％炭酸カルシウム）を含有する２０Ｌのバイオリアクターに播種した。この培地を２８℃で７日間発酵させた。得られた全ブロスを用いてアジュバントＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ  ＦＩＲＳＲ  ＣＨＯＩＣＥ（登録商標）（ポリエーテル−ポリメチルシロキサン−コポリマー）０．０３％と混合した凍結乾燥粉末（「ＦＤＰ」）を作成し、その後試験に使用した。
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【０１２５】
実施例３．  柑橘類ダニに対する圃場活性
バレンシアオレンジにおけるミカンサビダニ（ｃｉｔｒｕｓ  ｒｕｓｔ  ｍｉｔｅ）（フィロコプツルタ・オレイボラ（Ｐｈｙｌｌｏｃｏｐｔｒｕｔａ  ｏｌｅｉｖｏｒａ））に対するＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の有効性を決定するために圃場試験を実施した。培地１（実施例２参照）を含有する振盪フラスコにＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の凍結させた培養株を接種し、２０−３０℃で１−２日増殖させた。これを繰り返した。得られた発酵産物を用いて、培地（６．０％デンプン、３．０％デキストロース、１．５％酵母エキス、２．０％大豆酸加水分解物、０．６％グリシン、及び０．２％炭酸カルシウム）を含有する２０Ｌのバイオリアクターに播種した。この培地を２８℃で８日間発酵させた。得られた全ブロスを用いて、以下の試験に使用した凍結乾燥粉末（「ＦＤＰ」）を作成した。凍結乾燥粉末を水中に希釈し、下記表７に示す割合で１００ｇａｌ／エーカー施用した。殺ダニ剤ＥＮＶＩＤＯＲ（登録商標）（スピロジクロフェン、Ｂａｙｅｒ  ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を陽性対照として使用した。処理１−３においては、ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ  ＦＩＲＳＴ  ＣＨＯＩＣＥ（登録商標）アジュバント（ポリエーテル−ポリメチルシロキサン−コポリマー、上記参照）を０．６６％ｖ／ｖ添加した。０．６２５ｌｂ／Ａの割合で施用した発酵産物は１６−ｆｌ  ｏｚ／Ａの割合で施用したＥＮＶＩＤＯＲ（登録商標）スピロジクロフェンより良好な殺ダニ活性を示した。
【表７】
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【０１２６】
実施例４．  他のダニに対する活性
研究により、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０がフシダニ科（ｅｒｉｏｐｈｙｉｄ）（ｒｕｓｓｅｔ）ダニ及び広範なチャノホコリダニ（ｂｒｏａｄ  ｍｉｔｅｓ）を含めて様々な他のダニに対して活性であることが示された。実施例２に記載した圃場試験のものと同様な発酵ブロスを調製した。得られた発酵ブロスを水及び０．３５％界面活性剤を用いて様々な濃度に希釈し、希釈したブロスの１０ｍＬを（２つの植物体の）ライマメ葉の上面及び下面に流れ出すまで施用した。処理の日に植物に寄生させ、処理の６日後上に記載したスケールで褐色斑点ダニの存在を評価した。４のスコアは防除がないことを示し、評価の時点で少なくとも１００の褐色斑点ダニが存在していたことを示す。殺ダニ剤ＡＶＩＤ（登録商標）（アバメクチン）を陽性対照として使用した。
【表８】
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【０１２７】
実施例５．  残効性
他の研究により、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０が残効性を有することが明らかになった。実施例２の培地１を含有する振盪フラスコに、（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の凍結させた培養株を植え付けておいた）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０のルリアブロスに基づく培養物を接種し、１−２日２８℃で増殖させた。得られた発酵産物を用いて培地（８．０％デキストロース、１．５％酵母エキス、１．５％カゼイン加水分解物及び０．１％炭酸カルシウム）を含有する２０Ｌのバイオリアクターに播種した。この培地を２８℃で７−８日間発酵させた。得られた発酵産物を水及び０．３５％界面活性剤を用いて３．１３％溶液に希釈し、８ｍＬの希釈ブロスを（２つの植物体の）ライマメ葉の上面及び下面に流れ出すまで施用した。かかる処理の６日後植物に５０−１００のＴＳＳＭを寄生させ、処理の１２日後ダニ及び卵の存在を前記スケールで評価した。殺ダニ剤ＡＶＩＤ（登録商標）（アバメクチン）を陽性対照として使用した。結果を下記表９に示す。
【表９】
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【０１２８】
処理された植物に最初に曝露されたダニに対する効果に加えて、処理された葉に後の時点で移動してくるかもしれないダニに対する効果も評価した。全ての植物は、実施例１３に記載するのと同様にして生成させた６．２５％又は１．５６％の全ブロスでゼロ日に処理した。その後、処理後１週間の間隔でダニを植物群に加えた。この処理には比較のために他の殺ダニ剤も含めた。ダニは処理後５週間各週加えた。活性は５週間にわたって維持され、活性低下の速さはＯＢＥＲＯＮ（登録商標）（スピロメシフェン）製品と同様であり、ＡＶＩＤ（登録商標）製品より少し大きかった。この研究では、ライマメ植物の初生葉を処理したとき、後に出て来る葉は保護されなかったことも示された。
【０１２９】
実施例６．  層透過活性
ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０が層透過活性を有するか否かを決定するための研究を行った。実施例５に記載したようにして全ブロスを調製した。得られた全ブロスを水及び０．３５％界面活性剤を用いて希釈し、１０ｍＬの希釈したブロスを（２つの植物体の）ライマメ葉の下の表面に流れ出すまで施用した。処理の１日後処理した葉の上の表面に５０−１００のＴＳＳＭを寄生させた。ＴＳＳＭは葉の上の表面に付け、葉の上の表面においたワセリンリング／物理的障壁を用いて閉じ込めた。処理の５日後植物をダニ及び卵の存在に関して前記スケールで評価した。結果を下記表１０に示す。
【表１０】
2015534950.tif 000015
【０１３０】
実施例７．  殺卵活性
ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の殺卵活性を以下のようにして試験した。全ブロスは実施例５に記載したように調製した。２つのライマメ植物に、処理の４８時間前成虫の雌のダニに葉の表面に産卵させることによってＴＳＳＭの卵を予め寄生させた。その後植物を全ブロスの８ｍＬの様々な希釈液で処理した。処理の５日後植物を査定した。各処理及び対照において存在する生きている卵と死んだ卵の数を以下の表１１に示す。
【表１１】
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【０１３１】
実施例８．  潅注活性
砂で成長させたライマメを用いてＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の潅注活性を検討した。全ブロスは実施例３に記載したようにして調製した。全ブロスの各々１０ｍＬの１２．５％希釈液を二回砂に散布した。ポットの底面からの全ブロスの浸出を防ぐために慎重に植物に水をやった。散布は植え付けの４日後及び５日後に行った。処理２の３日後下の葉に運動性のＴＳＳＭを寄生させた。下の葉に寄生させた９日後上の三つ葉に寄生した。評価は寄生後４、５、８及び１１日に下の葉で行った。上の葉の評価は寄生の２日後に行った。実施例２に記載したスコアシステムに基づく結果を下の表１２に示す。
【表１２】
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【０１３２】
実施例９．  真菌の植物病原体に対する活性
ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の様々な植物真菌性病原体に対する活性を試験した。コムギ赤さび病及びキュウリうどんこ病の両方に対して活性であることが判明した。培地１を含有する振盪フラスコにＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の凍結させた培養菌を接種し、１−２日２０−３０℃で増殖させた。得られた発酵産物を用いて同様な培地を含有する２０Ｌのバイオリアクターに播種し、１−２日２８℃で増殖させた。次に、得られた発酵産物を用いて、培地（７．０％デンプン、３．０％デキストロース、１．５％酵母エキス、２．０％大豆酸加水分解物、０．８％グリシン、及び０．２％炭酸カルシウム）を含有する２００Ｌの発酵槽に播種した。この培地を２６℃で８日間発酵させた。６日齢のコムギ実生を、下記表１３に示す０．０３％アジュバント（ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ  ＦＩＲＳＴ  ＣＨＯＩＣＥ（登録商標）ポリエーテル−ポリメチルシロキサン−コポリマー）を有する蒸留水中に様々な希釈度で調製したＮＲＲＬ−５０５５０の全ブロスで、両方の葉の表面を全ブロスで覆い乾燥させることにより、処理した。かかる処理の１日後実生にコムギ赤さび病懸濁液を接種した。処理の約１週後０−１００％の防除スケールで植物を評価した。ここで０％は防除なし、１００％は完全な防除である。
【表１３】
2015534950.tif 000018
【０１３３】
さらに、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０は、全ブロスを下の葉表面に施用し、病原体を上の葉表面に付けたとき、キュウリうどんこ病に対して活性を示した。
【０１３４】
また、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０は治療試験においてもキュウリうどんこ病に対して活性を示した。植物がマイクロプロットを覆って濃いキャノピーを形成し、天然のうどんこ病が隣接するｐｌｏｔｓｒｅｅｄに現れ始めた時点でキュウリマイクロプロットにキュウリうどんこ病を接種した。感染の６日後、接種による病害の目に見える形跡はなかった。ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の凍結乾燥粉末は実施例１３に記載するのと同様にして調製された発酵ブロスから得られた。その後凍結乾燥粉末を不活性な成分（湿潤剤、安定剤、担体、流動助剤及び分散剤）と共に処方して水和剤を作成した。処方生成物７５重量％の凍結乾燥粉末を含んでいた。水和剤を水に希釈しし、下の表１４に示す割合で１００ｇａｌ／エーカーで施用した。（注意：１エーカー当たり１００ガロンは１マイクロプロット当たり２００ｍＬの噴霧容量に換算される。）評価は上記と同じスケールで行った。
【表１４】
2015534950.tif 000019
【０１３５】
実施例１０．  コーンルートワーム活性
ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０のコーンルートワームに対する有効性を決定するために試験を行った。ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０全ブロスは実施例２に記載した培地１又は培地２中で調製した。ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０全ブロスを希釈し、マイクロタイタープレートで実施したダイエット−ベースアッセイ（ｄｉｅｔ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ）においてウエスタンスポッテドキューカンバービートル（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｓｐｏｔｔｅｄ  ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｂｅｅｔｌｅ）（ジアブロチカ・ウンデシンプンクタタ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ））の幼虫に与えた。活性を評価し、実施例２に記載した１〜４のスケールで等級付けした。殺シロアリ剤／殺虫剤ＴＥＲＭＩＤＯＲ（登録商標）ＳＣ（５−アミノ−１−（２，６−ジクロロ−４（トリフルオロメチル）フェニル）−４−（（１，Ｒ，Ｓ）−（トリフルオロメチル）スルフィニル）−１−Ｈ−ピラゾール−３−カルボニトリル、一般にフィプロニルとして公知、ＢＡＳＦ）を陽性対照として使用した。結果を表１５に示す。ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０は、活性成分フィプロニルを含有する殺虫剤ＴＥＲＭＩＤＯＲ（登録商標）ＳＣと同じ殺虫活性を示した。
【表１５】
2015534950.tif 000020
【０１３６】
実施例１１．  薬量／応答実験室アッセイ
いろいろな薬量のＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０に対するＴＳＳＭの応答を決定するために研究を行った。全ブロスは実施例５に記載したように調製した。得られた全ブロスを水及び０．３５％界面活性剤を用いて下記表１３に示すパーセントに希釈した。水及び０．３５％界面活性剤を対照処理として使用した。２つの別個のトライアルで、１つの薬量当たり４つの複製を用いて、全ブロス溶液及び対照処理をライマメ葉の下の表面に流れ出すまで施用した。かかる処理の１日後植物に５０−１００のＴＳＳＭを寄生させ、処理の５日後ダニ及び卵の存在を前記したスケールで評価した。結果を下記表１６に示す。
【表１６】
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【０１３７】
試験した最低の濃度（０．２０％全ブロス）で、処理のエラーバーに基づいて対照処理と比較して有意な死亡率が観察された。ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の施用に関連する効果の部分は、ダニが植物を離れて去って行くようにさせることであることが観察された。すなわち、致死量以下の薬量でも、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０は植物上のダニ集団を低減させ得る。
【０１３８】
実施例１２．  アバメクチン−抵抗性ハダニに対する活性
ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０のアバメクチン−抵抗性ナミハダニ（テトラニカス・ウルチカエ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ）ＮＬ株）に対する活性を野生型のナミハダニ（テトラニカス・ウルチカエ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ）ＲＷ株）と比較して決定するために研究を行った。フレンチビーン（サヤエンドウ）植物を、実施例９の最終段落に記載したように調製したＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０の発酵産物の水和剤によって、下記表１７に示す希釈後の割合で処理した。処理の１日前に植物に５０−１００の株ＮＬ又はＲＷを寄生させ、処理の７日及び１４日後にダニの存在を評価した。結果を下記表１７に示す。
【表１７】
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【０１３９】
実施例１３．  増大したレベルのグーゲロチンを含有する発酵産物−グリシンの使用
ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０のグーゲロチン産生及び殺ダニ活性を最適化するために発酵を行った。１０．０ｇ／Ｌデンプン、１５．０ｇ／Ｌグルコース、１０．０ｇ／Ｌ酵母エキス、１０．０ｇ／Ｌカゼイン加水分解物（又は１０．０ｇ／Ｌ大豆ペプトン）及び２．０ｇ／ＬＣａＣＯ３からなる培地を用いて、実施例１に記載したように、２Ｌ振盪フラスコ中２０−３０℃で初期種培養物を調製した。約１−２日後、振盪フラスコ内で菌糸増殖が豊富になったとき、中味を新たな培地（上記と同じ、０．１％消泡剤を含む）に移し、４００Ｌの発酵槽において２０−３０℃で増殖させた。約２０−３０時間後、豊富な菌糸増殖が見られるとき、中味を３０００Ｌの発酵槽に移し、８０．０ｇ／Ｌ（８．０％）マルトデキストリン、３０．０ｇ／Ｌ（３．０％）グルコース、１５．０ｇ／Ｌ（１．５％）酵母エキス、２０．０ｇ／Ｌ（２．０％）大豆酸加水分解物、１０．０ｇ／Ｌ（１．０％）グリシン及び２．０ｇ／Ｌ（０．２％）炭酸カルシウム並びに２．０ｍｌ／Ｌ消泡剤からなる培地中で１６０−２００時間２０−３０℃で増殖させた。
【表１８】
2015534950.tif 000023
【０１４０】
第１の３０００Ｌ発酵を一例として用いて、発酵槽におけるグーゲロチンの収量は次のようにして計算される。３３９７ｋｇ×１．７ｍｇ／ｇ発酵ブロス＝５７７４．９０ｇグーゲロチン＝５．７８ｋｇ。発酵槽の初期の量は３４９６ｋｇ（３２５６ｋｇ培地＋２４０ｋｇシード）であり、これが標的の容量３０００Ｌより大きい最終容量となった。標的容量３０００Ｌは生産培地中の全ての成分の量を計算するための基礎となるので、規格化された容量測定生産性は５７７４．９ｇ／３０００Ｌ＝１．９ｇ／Ｌである。このグーゲロチン濃度は、上記と同じ培地を用い、最終発酵ステップ及び培地は（アミノ酸として）グリシンを含有させて行う２０Ｌ発酵で達成される１．８ｇ／Ｌと同様であった。
【０１４１】
本出願を通じて、グーゲロチンレベルは後に実施例１６及び１９で記載する分析ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて検出される。
【０１４２】
実施例１４．  増大したレベルのグーゲロチンを含有する発酵産物−グルタミン酸の使用
ＮＲＲＬ  Ｎｏ．  Ｂ−５０５５０のグーゲロチン産生及び殺ダニ活性を最適化するために発酵を行った。実施例１に記載したように、１０．０ｇ／Ｌデンプン、１５．０ｇ／Ｌグルコース、１０．０ｇ／Ｌ酵母エキス、１０．０ｇ／Ｌカゼイン加水分解物（又は１０．０ｇ／Ｌ大豆ペプトン）及び２．０ｇ／ＬＣａＣＯ３からなる培地を用い、１Ｌ振盪フラスコにおいて２０−３０℃で初期種培養物を調製した。約１−２日後、振盪フラスコ内で豊富な菌糸増殖があるとき、中味を新たな培地（上記と同じ、０．１％消泡剤を含む）に移し、１Ｌ振盪フラスコ内で２０−３０℃で増殖させた。約２０−３０時間後、豊富な菌糸増殖が見られるとき、中味を２０Ｌ発酵槽に移し、１６０−２００時間２０−３０℃で６０．０ｇ／Ｌ（８．０％）デンプン、３０．０ｇ／Ｌ（３．０％）デキストロース、１５．０ｇ／Ｌ（１．５％）酵母エキス、２０．０ｇ／Ｌ（２．０％）大豆酸加水分解物、１２．０ｇ／Ｌ（１．０％）Ｌ−グルタミン酸及び２．０ｇ／Ｌ（０．２％）炭酸カルシウム並びに２．０ｍＬ／Ｌ消泡剤からなる培地中で増殖させた。
【０１４３】
この発酵においてアミノ酸としてＬ−グルタミン酸を用いるこのグーゲロチン濃度は１．１ｇ／Ｌであった。
【０１４４】
実施例１５．  増大したレベルのグーゲロチンを含有する発酵産物−ヌクレオチドの使用
理論に縛られるつもりはないが、本出願人は、図６の仮想の合成経路により示されるように、シトシンの利用可能性がグーゲロチンの産生に極めて重要であると仮定する。すなわち、培地中に供給されるシトシンのレベルを増大すると、得られるグーゲロチンの量も増大するはずである。本出願人は、シトシン、チミン及び／又はウラシルを加えた培地中でのストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）Ｂ−５０５５０によるグーゲロチン産生を試験した。具体的には、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）Ｂ−５０５５０を、２Ｌ振盪フラスコにおいて、２０．０ｇ／Ｌマルトデキストリン、１０．０ｇ／Ｌグルコース、５．０ｇ／Ｌ酵母エキス、６．０ｇ／Ｌ大豆タンパク質酸加水分解物、２．０ｇ／Ｌグリシン、１．０ｇ／ＬＣａＣＯ３及びシトシン、ウラシル及び／又はチミン（各々０又は０．５０ｇ／Ｌの濃度）からなる培地中で６日間２０−３０℃で増殖させた。結果を下の表１９に示す。
【表１９】
2015534950.tif 000024
【０１４５】
実施例１６．  グーゲロチンを過剰生産する突然変異体
グーゲロチンの産生及び生物活性を増大する目的で、個々の抗生物質（ゲンタマイシン、リファンピシン、ストレプトマイシン、パロモマイシン又はトブラマイシン）に抵抗性の突然変異体のライブラリーを生成させる抗生物質−抵抗性突然変異体スクリーニングプログラムにより、親の菌株ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｎｏ．Ｂ−５０５５０から突然変異体を創成した。Ｏｋａｍｏｔｏ−Ｈｏｓｏｙａ、Ｙ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ４３（１２）  Ｄｅｃ  ２０００参照。Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（「ＮＴＧ」）を用いて親の菌株を突然変異誘発に付した後、得られた抗生物質抵抗性突然変異体を選択しスクリーニングした。さらなる研究のためにグーゲロチンを過剰生産する菌株を選抜した突然変異体ライブラリーの創成及びスクリーニングの詳細な説明を以下に記載する。
【０１４６】
ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）Ｂ−５０５５０の胞子懸濁液を、およそ１４日増殖させたか又は胞子形成させたＢ−５０５５０を含有する大豆粉マルトース（ＳＦＭ）寒天プレートから調製し、−８０℃で２０％グリセロール中に保存した。適切なバッファーに溶解させたＮＴＧを、５０％死滅を得るのに適した量（０．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ８．５、１時間３７℃でゆっくり振盪した）で胞子懸濁液に加えた。その後、ＮＴＧで処理した胞子懸濁液を、以下の濃度の抗生物質を補充したＧＹＭ（グルコース４ｇ／Ｌ、酵母エキス４ｇ／Ｌ、麦芽エキス１０ｇ／Ｌ、及び寒天１２ｇ／Ｌ）に蒔いた。下記表２０参照。
【表２０】
2015534950.tif 000025
【０１４７】
Ｋｉｅｓｅｒ、Ｔ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｈ．  ５  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｎｏｒｗｉｃｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、Ｅｎｇｌａｎｄ  （２０００）、ｐｐ．  ９９−１０７参照。以下に記載するようにおよそ３５０の個々の抗生物質抵抗性コロニーを単離し、精製し、スクリーニングした。
【０１４８】
ＧＹＭ抗生物質プレートから取り出した各々の単離菌をＳＦＭ寒天プレートに再度蒔いた。抗生物質抵抗性細菌を含有する寒天プラグを用いて、２．５ｍＬのシード培地を含有する２４−ウェルブロックに接種した。これらの接種したブロック中の細菌を３日間増殖させ、得られた培養ブロスを用いて生産培地を含有する２４−ウェルブロックに接種した。生産ブロック中の細菌を７日間２８℃で増殖させた。シードブロックの各ウェルはトリプシンａｓｅ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）（ＤＩ  Ｈ２Ｏ  １リットル当たり：１７ｇのＢａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（カゼインの膵液消化物）、３ｇのＢａｃｔｏ  Ｓｏｙｔｏｎｅ（大豆粕の膵液消化物）、２．５ｇのデキストロース、５ｇのＮａＣｌ、２．５ｇのリン酸二カリウム）を含有し、生産ブロックの各ウェルは実施例２の培地２（Ｐｒｏｆｌｏ  ２０ｇ／Ｌ、麦芽エキス２０ｇ／Ｌ、一塩基性ＫＨ２ＰＯ４６ｇ／Ｌ、二塩基性Ｋ２ＨＰＯ４４．８ｇ／Ｌ）を含有していた。
【０１４９】
生産ブロックの各々のウェルの全ブロスを、以下のように分析用ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いてグーゲロチン産生に関して試験した。２．４ｍＬの水を生産ブロックの各々のウェルに加えた。ブロックをボルテックスし、遠心分離した。０．８ｍＬの上清を、ウェル当たり４ｍＬの水を含有する抽出ブロックに移した。生産ブロックの各々のウェル内の細胞ペレットに３．２ｍＬの水を加え、ブロックを再度ボルテックスし、遠心分離した。この３．２ｍＬの洗浄水はその後各々の抽出ブロックの適当なウェルに加えた。次に、分析用ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて抽出ブロック中の水性エキスのグーゲロチン含有率をアッセイした。具体的には、Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｈｙｄｒｉｄガードカラムを備えたＣｏｇｅｎｔ  Ｄｉａｍｏｎｄハイブリッドカラム（１００Ａ、４μｍ、１５０×４．６ｍｍ）にサンプルを注入した。カラムを３０分アセトニトリル／ＮＨ４ＯＡＣ勾配（以下参照）で溶出した。流量は１ｍＬ／ｍｉｎであった。グーゲロチンは２５４ｎｍで検出した。グーゲロチンは１９分の概略保持時間で単一のピークとして溶出する。最高の過剰生産突然変異体は、２４ウェルブロック及び２５０ｍＬフラスコの両方で再度増殖させてグーゲロチンレベルを確認することによって確認した。確認されたら幾つかの単離株を少なくとももう一回突然変異誘発及び抗生物質抵抗性スクリーニングのラウンドに付した。各々の次の抗生物質−スクリーニングと併せた突然変異誘発のラウンドは、誘導された単離株が前のラウンドで抵抗性を示さなかった残存する抗生物質を用いて行った。スクリーニングの単一のラウンド後にグーゲロチン産生の小さい（１．２×）上昇が見られ、次のラウンドでは同じ元の低レベル過剰生産株から生じた単離株でより大きい上昇となった。この元の低レベル過剰生産株はこれらの研究で基本培地を用いて小規模に培養したとき約０．３ｍｇ／ｇのグーゲロチンを産生した。図３参照。
【０１５０】
より高くグーゲロチンを産生しＳＦＭ寒天プレートで胞子形成する能力を有する選択された突然変異体を１Ｌのバッフル付き振盪フラスコで増殖させ、その後培地２を含有する５ＬのＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｂ＋バイオリアクター及び／又は２０Ｌのバイオリアクターにスケールアップした。図４参照。
【０１５１】
図３及び４でラウンド３単離株４とされている菌株を、実施例１３に記載する方法に従うスケールアップのために選択した。この菌株は３．８ｍｇ／ｇのグーゲロチンを含有する発酵ブロスを生じた。
【０１５２】
実施例１７．  変換率：全ブロス／凍結乾燥粉末
表２１に、実施例１３に記載したように調製したＢ−５０５５０の全ブロスの幾つかのロットに対する全ブロス／凍結乾燥粉末の変換率を示す。これらの計算では、全ブロスが凍結乾燥粉末及び１ｇ／ｍＬの全ブロスの密度に完全に変換されると仮定している。（注意：何も後処理しないうちの発酵ブロスの密度は約１ｇ／ｍｌである。）「平均％」はあるロットの全ブロスから得られた凍結乾燥粉末の重量平均パーセントである。
【表２１】
2015534950.tif 000026
【０１５３】
実施例１８．  他のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株−発酵及びダニ防除方法
実施例１３に記載したのと同様な条件を用いてストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の幾つかの菌株を培養した。全ての菌株は、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株のＧｏｕＡ−Ｍ又はＧｏｕＢ−Ｍタンパク質（例えば．、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、及び配列番号：３０）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするグーゲロチン生合成遺伝子クラスターをもっていた。菌株の呼称及び実施例１３に記載した方法に準じて（しかし、より小さい規模で）調製した発酵ブロスのグーゲロチン濃度を下記表２２に示す。（濃度ｇ／Ｌに関し、後処理前の発酵ブロスの密度を約１ｇ／ｍｌとしている。）
【表２２】
2015534950.tif 000027
【０１５４】
グリシンを加えたか又は加えない発酵培地で上記菌株を増殖させた別の実験を行った。グリシンの添加により、ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株ではグーゲロチン産生が倍増したが、ストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）Ｂ株又はストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ｂ株のグーゲロチン産生には殆ど効果がなかった。
【０１５５】
水及び界面活性剤で希釈した上記全ブロス（約１．０ｍｇ／ｇのグーゲロチンを有する）を用い、前記実施例２に記載したナミハダニ（ＴＳＳＭ）実験室アッセイを用いて、ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株の発酵ブロスをスクリーニングした。ストレプトマイセス・プニセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ）Ａ株及びストレプトマイセス・ミクロフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０株に対する結果を下記表２３に示す。
【表２３】
2015534950.tif 000028
【０１５６】
実施例１９．  グーゲロチン遺伝子クラスターの機能を確認するためにＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０のグーゲロチン遺伝子クラスターをノックアウトする
推定上の遺伝子クラスターがグーゲロチンの発現を担っていることを確認するために研究を行った。ブラストサイジンのシトシニンシンターゼと類似のアミノトランスフェラーゼ遺伝子（ＯＲＦ４２５８）、シトシルグルクロン酸シンターゼ遺伝子（ＯＲＦ４２６１）、及びＵＤＰ−グルクロン酸の産生に関与するかもしれないデヒドロゲナーゼ／ヒドロキシイソブチレート（ＯＲＦ４２５３）、プラスコード領域の上流の３００ヌクレオチドを含有する３つの構築体をＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０ゲノムＤＮＡから生成した。理論に縛られることは望まないが、本出願人は、アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ＯＲＦ４２５８）及びシトシルグルクロン酸シンターゼ遺伝子（ＯＲＦ４２６１）はグーゲロチン生合成の経路の比較的早期に必要とされると仮定する。ＯＲＦ４２５８とＯＲＦ４２６１はゲノム内で互いに近接しており、また遺伝子クラスターの中央に位置しているので、デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＯＲＦ４２５３）はＵＤＰ−グルクロン酸の産生に関与するかもしれない。本出願人は、この酵素も経路内で早期に必要とされると仮定する。
【０１５７】
使用した細菌菌株及びベクターを表２４に示す。ＤＮＡ断片をプラスミドベクター中でサブクローニングするための制限酵素部位を含有するプライマーは配列番号：４４−７５として提供される。
【表２４】
2015534950.tif 000029
【０１５８】
グーゲロチン遺伝子クラスター配列が正しいことを確認するために、ＰＣＲ及び配列確認のための７対のプライマーを設計した（配列番号：４４−５７）。ＰＣＲ産物のＤＮＡ抽出はＱｉａｇｅｎゲノムＤＮＡ抽出キットプロトコルに従った。ゲノムＤＮＡ及びいろいろなプライマー対のための熱サイクルパラメーターは、９５℃で１５分、次に３５サイクルの９５℃で１分、５８℃で１分及び７２℃で１分、その後７２℃で１０分であり、４℃で貯蔵した。ＰＣＲ産物をアガロースゲルの電気泳動で分離し（図９参照）、また配列確認のために送った。ＰＣＲ産物の大きさ及び配列結果により、グーゲロチン遺伝子クラスター配列が正しいことが確認され、そのようにプライマーを設計してノックアウト実験を行った。
【０１５９】
クロスオーバーのためのカセット構築
特定の遺伝子をノックアウトするために、特異的な制限酵素部位を含有する上流及び下流のプライマーを設計した（配列番号：６０−７５参照）。遺伝子上流では、フォワードプライマーはＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）を、リバースプライマーはＫｐｎＩ部位（ＧＧＴＡＣＣ）を用いた。遺伝子下流では、フォワードプライマーはＸｂａＩ部位（ＴＣＴＡＧＡ）を、リバースプライマーはＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）部位を用いた。中央では、カナマイシン抵抗性遺伝子を選択マーカーとして加えた。構築体は全てｐＵＣ１１８ベクター（図１０）にクローニングした。上流及び下流にカナマイシン抵抗性及びノックアウト遺伝子を含有するカセットを、上流及び下流の配列を配列決定することによって確認した。カセットをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、カナマイシンを選択マーカーとして有するｐＫＣ１１３９シャトルベクター（図１１）にクローニングした。ｐＫＣ１１３９：：ＣｕｐＫＩｄｏｗｎ；ｐＫＣ１１３９：ＣｕｐＫＷｄｏｗｎ；ｐＫＣ１１３９：ＩｕｐＫＩｄｏｗｎ、ｐＫＣ１１３９ＷｕｐＫＷｄｏｗｎ。制限酵素分析、ＰＣＲ、及び配列確認の後、クラスターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＴ１２５６７（ｐＵＺ８００２）にエレクトロポレーションした。形質転換体をアプラマイシン及びカナマイシンの存在下での選抜により選択し、ＰＣＲで上流及び下流のプライマーを確認した。
【０１６０】
遺伝子の崩壊を保証するために、単一クロスオーバー相同組換えを行うように実験を設計した。約１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片をゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＫＣ１１３９のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入してｐＫＣ１１３９：Ｃ、ｐＫＣ１１３９：Ｇ、及びｐＫＣ１１３９：Ｉを得た。
【０１６１】
接合
この実験のドナーはｐＫＣ１１３９シャトルベクター上にノックアウトカセットを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株（ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２）であった。以下に説明する細菌性接合によるプラスミド伝達のための改変プロトコルに従って、カセットがＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０中にうまく導入された。
【０１６２】
プラスミドｐＵＺ８００２  ｗ／  ｐｋｃ１１３９：：ＩｕｐＫＩｄｏｗｎを含有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＥＴ１２５６７株）をルリアブロス（ＬＢ）寒天プレート上に画線し、３０℃又は３７℃で一晩インキュベートして単一のコロニーを得た。２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールＣｍ、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、及び１００μｇ／ｍＬのアプラマイシンを補充した１０ｍＬのＬＢ（ＬＢＣｍ２５Ｋ−Ｋａｎ２５−Ａｐｒ１００）を含有する少なくとも２つの５０ｍＬチューブに単一のコロニーを接種した。コロニーを３７℃振盪培養器内で一晩（２０−２４時間）増殖させた。一晩培養下菌を５０ｍＬのＬＢＡｐｒ１００中で１：１００に希釈した後、３７℃振盪培養器でＯＤ６００が０．４−０．６になるまで（通例４−５時間を要する）増殖させた。その後、細胞をおよそ５０００ＲＣＦ、４℃で１５−２０ｍｉｎペレット化した。得られた上清はデカントし捨てた。ペレットをラックに入れて再懸濁させ、ＬＢで二回洗浄して残留する抗生物質を除去した。ペレット化した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を洗浄している間に、充分なグリセロールストック胞子ｐｒｅｐチューブが解けて試験される各々の受容菌／状態のための細胞が得られた。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）胞子は小さく、数えるのが極めて難しいので、視覚的に濃い調製物を使用した。また、細胞を洗浄する一方で、寒天プレートを選択し、ラミナーフローフードで乾燥させた。各々の接合では、５００μＬの胞子調製物を無菌の２．０ｍＬ微量遠心管内で５００μＬの２×ＹＴブロスと混合した後、５０℃でおよそ２０分ヒートショックにかけた（実験的に、１０分〜１時間の範囲のヒートショック時間は生存能力に検出可能な差異を生じなかった）。ＹＴブロスはルリアブロスより富化した培地である（ＬＢの二倍もの酵母エキスとＬＢより約６０％多くのペプトンを含有する）。次に、混合物を室温に冷却し、その後５００μＬのペレット化した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を各チューブに加え、次いで十分に混合した。細胞を５０００ＲＣＦ、室温で５分遠心分離した。上清をデカントした。ペレット化した細胞を再懸濁し、寒天プレートに蒔いた。細胞を、４−１０の１２ｍｍガラスビーズ又はＬａｚｙ  Ｌスプレッダーを用いて拡げた。プレートを一晩３０℃で（１６−２０時間）インキュベートした。各々のプレートについて、５ｍｇのカナマイシン及び０．５ｍｇのナリジクス酸（ＮａＯＨストック由来）を１ｍＬの水中で調製した後、Ｌａｚｙ  Ｌスプレッダーを用いてプレートに加えて溶液を均一に分布させた。これには、数分の反復展延と空気乾燥が必要であった。その後、プレートを３０℃でさらにインキュベートした。４−６日のインキュベーション後、白色のカナマイシン抵抗性コロニーをＰＣＲ確認及びグーゲロチン産生アッセイ用に選択した。
【０１６３】
ＰＣＲ確認
ＰＣＲ確認用に選択された白色のカナマイシン抵抗性コロニーをカナマイシン抗生物質を含むトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）培地で培養し、ＤＮＡ抽出のためにＡ  ＺＹＧＥＭキット（ＺｙＧＥＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｌｔｄ．（ＮＺ）製）を、製造業者のプロトコルに従い、８８μＬの培養物、１０μＬの１０×グリーンバッファー、１μＬのｐｒｅｐＧＥＭ、及び１μＬのリゾチームを用いて、３７℃で１５ｍｉｎ、７５℃で１５ｍｉｎ及び９５℃で５ｍｉｎインキュベーションして使用した。その後、適当なプライマー及びサイクルパラメーター（９５℃で１５ｍｉｎ、その後３５サイクルの９５℃で１ｍｉｎ、５８℃で１ｍｉｎ、及び７２℃で１ｍｉｎ、次いで７２℃で１０ｍｉｎ）を用いてＰＣＲを行い、４℃で貯蔵した。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルの電気泳動により分離した（図１２）。
【０１６４】
ｐＫＣ１１３９：ＩはｐＫＣ１１３９シャトルベクターに挿入されたｇｏｕＩ断片であり、その後単一の相同クロスオーバーにより染色体に組み込まれる。このアプローチの結果、遺伝子の２つの突然変異対立遺伝子が隣接して存在するベクターの組み込まれたコピーが得られた。ＰＣＲの結果はやはりｇｏｕＩ及びｇｏｕＧのバンドを示した（図１２）。二重クロスオーバーのｐＫＣ１１３９：ＩＫＩ  ＰＣＲはｇｏｕＩ  ＰＣＲ産物を示さなかった（図１２）。ｇｏｕＧ産物のｐＫＣ１１３９：ＣＫＷ、ＰＣＲはより小さい分子量のバンドを示したが、これは遺伝子の部分的な欠失に起因し得るであろう。
【０１６５】
グーゲロチン産生
分析用ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いてグーゲロチン産生を測定した。簡単にいうと、試験サンプル（１．０ｇ）を遠心分離管に移し、３ｍＬの水で抽出する。成分をボルテックス及び超音波処理により混合した後遠心分離を用いて分離する。上清をきれいなフラスコ中にデカントする。この手順をもう一回繰り返し、上清を前に分離した上清と一緒にする。水性エキスを最終容量１０ｍＬとし、分析用ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いてグーゲロチン含有率をアッセイする。
【０１６６】
希釈したサンプルをろ過し、Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｈｙｄｒｉｄガードカラムを備えたＣｏｇｅｎｔ  Ｄｉａｍｏｎｄハイブリッドカラム（１００Ａ、４μｍ、１５０×４．６ｍｍ）を用いてＨＰＬＣにより分析する。カラムを３０分アセトニトリル／ＮＨ４ＯＡＣ勾配（下記参照）で溶出する。流量は１ｍＬ／ｍｉｎである。所望の代謝物質の検出は２５４ｎｍで行う。グーゲロチンは１７−１９分の概略保持時間で単一のピークとして溶出する。野生型ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５５０は０．５ｍｇ／ｇのグーゲロチンを産生することができるが、ｇｏｕＩ遺伝子が不活性化されると、グーゲロチン産生はなくなった（表２５参照）。ｇｏｕＩ及びｇｏｕＧの単一のクロスオーバー不活性化でもグーゲロチン産生がなくなった。また全体のグーゲロチン遺伝子クラスターの不活性化でもグーゲロチン産生がなくなった。
【表２５】
2015534950.tif 000030
【０１６７】
他に定義されない限り、本明細書中の技術及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野で通常の能力を有する者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと類似又は等価なあらゆる方法と材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法と材料は本明細書に記載されている。引用した全ての刊行物、特許及び特許刊行物は、全ての目的で、参照によりその全体を本明細書に組み入れる
本明細書中で論じた刊行物は単に本出願の出願日以前の開示を提供するものである。本明細書の記載はいずれも、先発明という理由で、本発明がかかる刊行物より先になされたものでないと自認するものということを認めるものではない。
【０１６８】
本発明の特定の実施形態に関連して説明して来たが、さらに改変することができ、本出願は、一般に本発明の原理に従い、また本発明が属する技術分野で公知又は通例の慣習であるとして、また以上に記載され後述の特許請求の範囲に規定される必須の特徴に適用され得るとして、本発明のあらゆる変形、使用、又は適合を含めて、本開示からのかかる逸脱を包含することを意図していると理解されたい。
【図１】
2015534950.tif 000031
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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