(57)【要約】  本発明は、交番磁界における加熱特性を向上させ、非線形磁化挙動を向上させた、コーティングされた酸化鉄の単結晶及び/又は多結晶質シングルナノ粒子を含む磁性粒子分散剤及びそのナノ粒子凝集体(マルチコア粒子)に関する。磁性粒子スペクトロメーター(MPS)において測定すると、粒子分散剤は、特に高調波において明白なオーバートーン構造を示す。これは、以前から知られている全ての粒子系を何倍も上回る。従って、この分散剤は、MPI(磁性粒子画像診断)等の用途に特に有効である。加えて、新規な粒子分散剤は、鉄欠乏性貧血の治療及び治療的温熱療法(特に、身体の一部における受動的温熱療法)の用途、又は、細胞トラッキング及び磁気共鳴画像診断(MRI)に適している。それ故、分散剤の診断及び治療用途と、これらの分散剤を含む診断又は治療対象に関する医薬組成物は、本発明の目的でもある。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性粒子分散剤であって、
前記分散剤は、酸化鉄の単結晶及び/又は多結晶質のシングルナノ粒子並びに前記分散剤における合計鉄含有量に対して少なくとも40重量%の、そのナノ粒子凝集体を含み、
ナノ粒子及びナノ粒子凝集体は、合成ポリマー、カルボン酸又はヒドロキシカルボン酸、単糖、二糖、多糖又はそれらの混合物を含む群から選択される医薬的に許容可能なコーティング材料でコーティングされ、
前記分散剤は、交番磁界をかけると非線形磁化挙動を示し、
25,25kHzのインシデント基本周波数、10mTの磁束密度及び36.6℃の温度で、10〜90mmol Fe/lの鉄含有量を有する分散剤によって生じ且つ磁性粒子スペクトロメーターによって測定した磁気モーメントの振幅値Akは、第3調波で0.31045から15.79576 Am2/mol Fe、第21調波で3.78193・10-4から2.61583・10-2 Am2/mol Fe、そして、第51調波で3.98370・10-6から1.23649・10-4 Am2/mol Feに及ぶ、磁性粒子分散剤。
【請求項２】
シングルナノ粒子及びナノ粒子凝集体の平均粒子径(流体力学的径)は、10から80nmである、請求項1に記載の磁性粒子分散剤。
【請求項３】
前記医薬的に許容可能なコーティング材料は、デキストラン、澱粉、燐酸澱粉、キトサン、グリコサミノグリカン、デキストリン、マルトデキストリン、ポリマルトース、アラビアゴム、イヌリン、アルギン酸及びそれらの誘導体又はそれらの混合物を含む群より選択される多糖である、請求項1又は2に記載の磁性粒子分散剤。
【請求項４】
前記医薬的に許容可能なコーティング材料は、カルボキシ化多糖、好ましくはカルボキシメチル化多糖、より好ましいカルボキシメチルデキストラン又はカルボキシメチルデキストリンである、請求項3に記載の磁性粒子分散剤。
【請求項５】
前記医薬的に許容可能なコーティング材料は、D-マンニトール、グルコース、D-マンノース、フルクトース、ソルビトール、イノシトールからなる群より選択される単糖、好ましくはD-マンニトールである、請求項1又は2に記載の磁性粒子分散剤。
【請求項６】
前記医薬的に許容可能なコーティング材料は、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、脂肪酸又はそれらの混合物からなる群より選択されるカルボン酸又はヒドロキシカルボン酸、好ましくはクエン酸又はD-グルコン酸酸である、請求項1又は2に記載の磁性粒子分散剤。
【請求項７】
前記ナノ粒子酸化鉄は、マグネタイト(Fe3O4)、マグヘマイト(γ-Fe2O3)、Mo、Cr、Mn、Co、Cu、Ni、Znを有する鉄混合酸化物又はそれらの混合物、好ましくはマグネタイト及び/又はマグヘマイト、より好ましくは酸化鉄の合計含有量に対して少なくとも70重量%の量のマグネタイト及び/又はマグヘマイトを含む、請求項1〜6のいずれかに記載の磁性粒子分散剤。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれかに記載の磁性粒子分散剤を作成する方法であって、
a)  アルカリ性溶液を用いて鉄(II)塩溶液からグリーンラストのアルカリ沈殿を行なうステップであって、前記アルカリ性溶液は、ステップb)の後に得られる酸化鉄ナノ粒子を有する分散剤のpH値を7.9〜9.0に保証する量を加えるステップと、
b)  酸化剤を用いて酸化を行い、マグネタイト及びマグヘマイトを含むナノ粒子酸化鉄結晶に形成するステップと、
c)  任意に、磁気分離によって粒子を精製するステップと、
d)  医薬的に許容可能なコーティング材料を用いて前記粒子をコーティングし、次に、85〜100℃で加熱又は100〜400℃且つ1〜240barでの加圧滅菌を行い、前記粒子の成長、凝集及びサイズに影響を与えるステップ、又は
d)  前記粒子の成長、凝集及びサイズに影響を与える85〜100℃でのコーティングを行っていない粒子を加熱し、次に、医薬的に許容可能なコーティング材料によって粒子をコーティングし、その後、85〜100℃の加熱又は100〜400℃且つ1〜240barでの加圧滅菌を行ない、前記粒子の成長、凝集及びサイズに影響を与えるステップと、
e)  磁気分離による得られた粒子を分画し、限外ろ過、透析、遠心及び/又はダイアフィルトレーションを用いてろ液又は上清が10μS未満の伝導率値になるまでそれらを洗浄し、アルカリの追加後又は追加することなく磁気分離によってそれらを再分画するステップ、からなるa)からe)の5つのステップを有する方法。
【請求項９】
塩化鉄(II)四水和物又は硫酸鉄(II)七水和物の水溶液を鉄(II)塩溶液として使用する、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
ステップb)における酸化は、酸化剤として、H2O2、純酸素、大気中酸素、NaNO3、NaClO4又はNaOCl、好ましくはH2O2によって実行される、請求項8又は9に記載の方法。
【請求項１１】
ステップd)又はd')におけるコーティングされた又はコーティングされていない粒子のサイズ、凝集及び成長に影響を与える加熱は、85〜95℃、最も好ましくは約90℃で実施される、請求項8〜10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ステップd)における加熱は、2〜36時間、好ましくは4〜20時間、特に好ましくは7.5〜15時間実行する、請求項7〜10のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
請求項1〜7のいずれかに記載の磁性粒子分散剤又は請求項8〜12のいずれかに従って作成される磁性粒子分散剤及び医薬的に許容可能な補助物質を含む医薬組成物。
【請求項１４】
磁性粒子画像診断(MPI)又は磁気共鳴画像診断(MRI)による疾患の診断、好ましくは脾臓疾患、骨髄疾患、リンパノード疾患、循環器疾患、腫瘍及び脳卒中の診断に用いるための、及び、腫瘍の病期分類に用いるための、請求項1〜7のいずれかに記載の磁性粒子分散剤、請求項8〜12のいずれかに従って作成される磁性粒子分散剤又は請求項13に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
MPIによる細胞トラッキングに用いるための、請求項1〜7のいずれかに記載の磁性粒子分散剤、請求項8〜12のいずれかに従って作成される磁性粒子分散剤又は請求項13に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
温熱療法及び腫瘍治療に用いるための、請求項1〜7のいずれかに記載の磁性粒子分散剤、請求項8〜12のいずれかに従って作成される磁性粒子分散剤又は請求項13に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
好ましくは非経口鉄補充による鉄欠乏性貧血の治療に用いるための、請求項1〜7のいずれかに記載の磁性粒子分散剤、請求項8〜12のいずれかに従って作成される磁性粒子分散剤又は請求項13に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、交番磁界における加熱特性を向上させ、非線形磁化挙動を向上させた、個々にコーティングされた酸化鉄の単結晶及び/又は多結晶質ナノ粒子を含む磁性粒子分散剤及びそのナノ粒子凝集体(マルチコア粒子)に関する。磁性粒子スペクトロメーター(MPS)において測定すると、粒子分散剤は、特に高調波において明白なオーバートーン構造を示す。これは、以前から知られている全ての粒子系を何倍も上回る。従って、この分散剤は、MPI(磁性粒子画像診断)等の用途に特に有効である。加えて、新規な粒子分散剤は、鉄欠乏性貧血の治療及び治療的温熱療法(特に、身体の一部における受動的温熱療法)の用途、又は、細胞トラッキング及び磁気共鳴画像診断(MRI)に適している。それ故、分散剤の診断及び治療用途と、これらの分散剤を含む診断又は治療対象に関する医薬組成物は、本発明の目的でもある。
【０００２】
技術的に応用される分野において、分散剤は、エレクトレット、色素、機能的塗料を製造するために、及び、例えば、非金属含有部品の工業生産での最終検査のために、用いることができる。
【０００３】
先行技術文献には、膨大な数の種々の磁性ナノ粒子及びそれらを含む水性分散剤又は懸濁液が記載されている。記載されている粒子は、いわゆるシングルコア粒子又はマルチコア粒子である。インビボ用途及び安定化のために、磁性粒子は、生体適合性外皮、好ましくは生体適合性ポリマーでコーティングされている。
【０００４】
最も広く使われている粒子は、磁性酸化鉄に基づく粒子である。マグネタイト(Fe3O4)及び/又はマグヘマイト(γ-Fe2O3)に基づく酸化鉄は、磁界でフェリ磁性挙動を示す。マグネタイト(Fe3O4)及び/又はマグヘマイト(γ-Fe2O3)のナノ粒子が特定サイズ未満にある場合、それらの挙動はある種の状況下では超常磁性である。即ち、それらは、前もってアクティブであった磁界をオフにした後では如何なる残留磁化(残留磁気)も存在しない。超常磁性酸化鉄ナノ粒子は、例えば、磁気共鳴断層撮影(MRT)において広く用いることができる。MRTに用いられるかかる粒子製剤の製造及び用途は、例えば、US 5,424,419、DE 196 12 001 A1及びDE 4 428 851 A1に記載されている。MRT及びMPI法の画像診断に使用される物理的現象は、基本的には異なるため、MRT用造影剤としての粒子の適合性は、その粒子がMPIに適している否かを決定するものではない。
【０００５】
磁性粒子画像診断(MPI)は、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPIO)を直接的に表現して定量化することを可能にする新規な画像診断様式である。磁界でのSPIOの磁化曲線は非線形であり、交番磁界でのインシデント基本周波数に加えて、オーバートーンを測定することが可能になる。これらのシグナルは、SPIOに特異的であるため、高感度での測定値が可能になる。MRTと比較して、この方法は、潜在的に時間分解能及び空間分解能がより高いため、プラスチック分野での技術な応用だけでなく、非侵襲性医療診断、例えば循環器疾患の症候、特に虚血性心疾患の分野でも用いることができる。MPIの潜在的能力を利用するには、交番磁界での特に明白なオーバートーン構造を示す特別なトレーサを必要とし、結果としてMPI測定が潜在的に高感度になる。磁性粒子スペクトロメーター(MPS)は、交番磁界でのサンプルによって生じるオーバートーンを測定することができる。
【０００６】
MPIに適している酸化鉄ナノ粒子製剤は、例えば、EP 1 738 774 A1に記載されている。これらの粒子は、20nmから1μmの直径で、全粒径/コア直径比が6未満である。それらは、医薬的に許容可能なポリマー(例えばカルボキシデキストラン又はPEG)によりコーティングされている。カルボキシデキストラン安定化酸化鉄粒子は、リゾビスト(登録商標)と呼ばれているMRT造影剤に含まれる粒子である。EP 1 738 774 A1の実施例から、リゾビスト(登録商標)がMPIにも適していることは明白である。
【０００７】
マルチコアナノ粒子の合成は、「Dutz, S, J H Clement, D Eberbeck, T Gelbrich, R Hergt, R Mueller, J Wotschadlo, and Zeisberger. "Ferrofluids of Magnetic Multicore Nanoparticles for Biomedical Applications." Journal of magnetism and magnetic materials 321, no. 10 (2009): doi:10.1016/j.jmmm.2009.02.073.」に記載されている。この刊行物の所定の製法に従って作成された分散剤は、良好な安定性を示さないことが明らかになっている。
【０００８】
酸化鉄ナノ粒子製剤は、治療的温熱療法についても説明されている。身体の一部における治療的な受動的温熱療法は、酸化鉄含有粒子分散剤を腫瘍又は腫瘍細胞に標的導入して、強磁場によって加熱することで、直接腫瘍細胞に損傷を与えること及び/又は投与された化学療法剤の効果を高めることを伴う。身体の一部における治療的な受動的温熱療法のための酸化鉄を含む粒子分散剤の用途は、例えばWO 2006/125452に記載されている。強磁場の使用は、粒子加熱を引き起こすだけでなく、金属含有埋設物を強く加熱することも引こ起こす。従って、金属義歯は、治療前に患者から取り外さなければならない。
【０００９】
加えて、酸化鉄ナノ粒子製剤は、鉄欠乏性貧血の治療について説明されている。経口による鉄補充は、鉄欠乏の良好な治療には必ずしも充分ではない。血清鉄レベルが強く低下するケースにおいて、非経口鉄補充薬は、鉄代謝を調節して、鉄貯蔵を正常化し、赤血球新生を高めるのに必要である。
【００１０】
一方で、鉄は、必要不可欠な元素である。一方では、第二鉄及び第一鉄のような鉄イオンは、酸化損傷を誘導するそれらの潜在的能力に主に起因して、生体に有害である。トランスフェリン又はフェリチンのような生体分子は、哺乳類の生体における主要な鉄輸送形態又は保管形態である。しかしながら、鉄が急速に放出される場合、非経口鉄剤は、この系に過度の負荷を与える可能性がある。臨床的に承認された全ての鉄補充薬は、アモルファスのフェリハイドライト、赤金鉱又はマグネタイト若しくはマグヘマイトの鉄を有する鉄糖質配合物に基づくものである。
【００１１】
第一非経口鉄補充薬のいくつかは、InFed(登録商標)のようなアモルファスフェリハイドライトデキストラン配合物に基づくものである。デキストランを主成分とするこれら全ての薬の欠点は、これらの薬に対するアナフィラキシー反応を引き起こすデキストランの炭水化物感受性である。特に慢性腎疾患を患っている患者において、複数の鉄補充は、治療コース中に感作(senzitation)になる。
【００１２】
フェルレシット(Ferrlecit)(登録商標)(グルコン酸第二鉄)又はヴェノファー(登録商標)(鉄スクロース)のようなモノマー糖質鉄配合物を有する他の薬は、血液循環段階中に第二鉄及び第一鉄を積極的に放出するという欠点を有することから、結果として主に腎臓での酸化的ストレス及び細胞傷害となる。
【００１３】
オキシ水酸化鉄である赤金鉱の形態として鉄を有するカルボキシポリマルトースに基づく薬フェリンジェクト(登録商標)は、任意の潜在的な過敏症又は鉄イオン毒性にかからないと考えられていた。不都合なことに、この薬は、静脈内投与後に病理学的及び持続性の低リン酸血を誘導する。
【００１４】
還元カルボキシメチルデキストランでコーティングされた赤金鉱を有するマグヘマイト-マグネタイトのナノ結晶に基づく薬フェラヘム(登録商標)は、ラットにおいて、デキストランに基づくアナフィラキシー反応を誘導しなかった(WO 00/61191 A)。ヒトにおいては、残念ながら、この有害反応がそれでも現れる。この有害反応は、分析的抗体反応試験によって確認された。
【００１５】
現在、承認された全ての非経口鉄補充薬には、患者に不必要な薬関連有害反応を導く1又は複数の欠点が存在する。この知識に基づく非経口鉄補充薬に関する基礎的要件は、以下の通りに要約することができる:
-  投与後の血液循環段階中に血清中に第一鉄又は第二鉄が放出されない
-  鉄代謝を伴う細胞(例えば、脾臓及び肝臓マクロファージ)による迅速な取り込み
-  生体による分解の可能性及び必要な鉄放出
-  病理学的低リン酸血を誘導しない。
【００１６】
先行技術文献に記載されている分散剤又は懸濁液と比較して非線形磁化挙動が向上し、交番磁界での熱特性が向上している安定した磁性粒子分散剤を提供することが本発明の目的であった。本発明の分散剤は、磁性粒子画像診断(MPI)及び治療的温熱療法に特に有効であろう。更に、本発明の分散剤は、磁気共鳴画像診断(MRI)にも有効であろう。
【００１７】
何ヶ月にもわたって安定的であり加圧滅菌にも耐える磁性粒子分散剤に基づいて、好ましくは非経口鉄補充による鉄欠乏性貧血の治療用医薬組成物を提供することが本発明の更なる目的であった。
【００１８】
本発明によって提供される磁性粒子分散剤は、酸化鉄の単結晶及び/又は多結晶質シングルナノ粒子、及び、分散剤における酸化鉄の合計含有量に対して少なくとも40重量%、好ましくは少なくとも50重量%、特に好ましい50-95重量%の、そのナノ粒子凝集体(マルチコア粒子)を含み、ナノ粒子及びナノ粒子凝集体は、合成ポリマー、カルボン酸又はヒドロキシカルボン酸、単糖、二糖、多糖又はそれらの混合物を含む群から選択される医薬的に許容可能なコーティング材料でコーティングされている。分散剤は、交番磁界をかけると非線形磁化挙動を示し、そして、25kHzのインシデント基本周波数、10mTの磁束密度及び36.6℃の温度で、鉄含有量が10〜90mmol Fe/lの分散剤によって生じ且つ磁性粒子スペクトロメーターによって測定した磁気モーメントの振幅値Akは、第3調波で0.31045から15.79576 Am2/mol Fe、第21調波で3.78193・10-4から2.61583・10-2 Am2/mol Fe、そして、第51調波で3.98370・10-6から1.23649・10-4 Am2/mol Feに及ぶ。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態において、同じ条件下での本発明の分散剤によって生じる磁気モーメントの振幅値Akは、第3調波で0.31045から0.51994 Am2/mol Fe、第21調波で3.78193・10-4から7.76261・10-4 Am2/mol Fe、及び、第51調波で3.98370・10-6から7.839487・10-6 Am2/mol Feに及ぶ。
【００２０】
本発明の他の好ましい実施形態において、同じ条件下での本発明の分散剤によって生じる磁気モーメントの振幅値Akは、第3調波で0.3104500から0.3631403 Am2/mol Fe、第21調波で3.78193・10-4から4.035128・10-4 Am2/mol Fe、及び、第51調波で3.983704・10-6から7.839487・10-6 Am2/mol Feに及ぶ。
【００２１】
MPIによる本発明の磁性粒子分散剤の検出のために、0.1mTから1Tのフィールド及び1mHzから1MHzの周波数を用いることができる。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、磁性粒子分散剤は、酸化鉄の合計含有量に対して50〜95重量%のマルチコア粒子を含む。マルチコア構造に基づくと、上記粒子は、磁界がない場合は顕著な磁気モーメントを持たない。従って、粒子間相互作用の低減によって分散剤が安定する。
【００２３】
本発明では、磁性粒子分散剤は、好ましくは、合計鉄含有量に対して0-15重量%の2価鉄を含む。
【００２４】
本発明の一実施形態によれば、医薬的に許容可能なコーティング材料は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン及びその誘導体、ポリオキシプロピレン及びその誘導体、ポリアミノ酸、乳酸及びグリコール酸コポリマー又はそれらの混合物からなる群より選択される合成ポリマー又はコポリマーであってもよい。
【００２５】
他の本発明の好ましい実施形態によれば、医薬的に許容可能なコーティング材料は、デキストラン、澱粉、キトサン、グリコサミノグリカン(GAG)、燐酸澱粉、デキストリン、マルトデキストリン、ポリマルトース、アラビアゴム、イヌリン、アルギン酸及びそれらの誘導体、又は、それらの混合物からなる群より選択される多糖又はカルボキシ化多糖、好ましくはカルボキシメチル化多糖である。デキストラン、デキストリン、デキストラン誘導体又はデキストリン誘導体は、特に好ましい。デキストラン又はデキストリン誘導体は、カルボキシ基を有するデキストラン若しくはデキストリン、アルデヒド基を有するデキストラン若しくはデキストリン、ビオチン化デキストラン若しくはビオチン化デキストリン、SH基を有するデキストラン若しくはデキストリン、還元型デキストラン、還元型カルボキシメチルデキストラン又はそれらの混合物からなる群より選択される。本発明のコーティング材料として用いることができるGAGの例は、例えば、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヒアルロナンを含む。
【００２６】
カルボキシメチル化多糖は、特にカルボキシメチルデキストリン及びカルボキシメチルデキストラン(CMD)は、本発明の好ましく使用されるコーティング材料でもある。
【００２７】
本発明の他の好適な実施形態において、医薬的に許容可能なコーティング材料として、D-マンニトール、グルコース、D-マンノース、フルクトース、ソルビトール、イノシトール、それらの誘導体又はそれらの混合物からなる群より選択される単糖が用いられ、好ましくはD-マンニトールが用いられる。
【００２８】
本発明によれば、上記の多糖と上記の単糖との組合せ(例えばD-マンニトール及びカルボキシメチルデキストラン(CMD)の組合せ)は、ナノ粒子のコーティング材料として用いることもできる。
【００２９】
クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、脂肪酸又はそれらの混合物からなる群より選択されるカルボン酸及びヒドロキシカルボン酸は、本発明のコーティング材料としても有用である。好ましくはクエン酸酸又はD-グルコン酸酸を用いることができる。
【００３０】
本発明のナノ粒子酸化鉄結晶は、マグネタイト(Fe3O4)及び/又はマグヘマイト(γ-Fe2O3)を含み、加えて、他の鉄酸化物及びMo、Cr、Mn、Co、Cu、Ni、Znを有する鉄混合酸化物又はそれらの混合物を含むことができる。好ましくは、本発明の分散剤の酸化鉄結晶は、酸化鉄の合計含有量に対して少なくとも70重量%の量のマグネタイト及び/又はマグヘマイトを含む。
【００３１】
水又は有機溶媒中のナノ粒子酸化鉄結晶の安定化は、酸化鉄結晶を囲むコーティング材料の結果として、立体配置的に及び/又は静電的に進行し、本発明の分散剤又は懸濁液は、磁界において超常磁性特性を示す。本発明の好ましい実施態様において、コーティングされた酸化鉄結晶は、水で分散又は懸濁され、好ましくは、それらは水で分散される。
【００３２】
本発明の得られた粒子分散剤は、2から50nmのサイズを有する多結晶及び/又は単結晶質シングルナノ粒子と、コーティング材料のマトリクスに埋め込まれたその凝集体を含む。シングル及びマルチコア粒子の全平均粒子径(流体力学的径)は、10から80nmである。個々の多結晶質及び/又は単結晶質コアは、モノドメイン-マルチドメイン限度(10〜50nmを意味するもの)まで及ぶサイズを有する。多結晶及びマルチコア粒子は、同一サイズの単結晶ナノ粒子と比較して、異等方性の低減が向上した特性を示すことから、エネルギー転移及び/又はMPSシグナルが向上し、分散剤の安定性が向上する。
【００３３】
更に、本発明の別の目的は、本発明の磁性粒子分散剤の調製方法及びこの方法によって取得可能な磁性粒子分散剤である。
【００３４】
新規な粒子分散剤の調製は、以下の、a)からe)の5つのステップを含む；
a)  アルカリ性溶液を用いて鉄(II)塩溶液からグリーンラスト(green rust)のアルカリ沈殿(混合水酸化第一鉄/第二鉄アニオン水和物)を行なうステップであって、上記アルカリ性溶液は、ステップb)の後に得られる酸化鉄ナノ粒子を有する分散剤のpH値を7,9〜9,0に保証する量を加えるステップと、
b)  酸化剤を用いて酸化を行い、マグネタイト及びマグヘマイトを含むナノ粒子酸化鉄結晶を形成するステップと、
c)  任意に、磁気分離によって粒子を精製するステップと、
d)  医薬的に許容可能なコーティング材料を用いて上記粒子をコーティングし、次に、85℃〜100℃で加熱又は100〜400℃且つ1〜240barでの加圧滅菌を行い、上記粒子の成長、凝集及びサイズに影響を与えるステップ、又は、
d')  上記粒子の成長、凝集及びサイズに影響を与える85〜100℃でのコーティングを行っていない粒子を加熱し、次に、医薬的に許容可能なコーティング材料によって粒子をコーティングし、その後、85〜100℃の加熱又は100〜400℃且つ1〜240barでの加圧滅菌を行ない、上記粒子の成長、凝集及びサイズに影響を与えるステップと、
e)  磁気分離による得られた粒子を分画し、限外ろ過、透析、遠心及び/又はダイアフィルトレーションを用いてろ液又は上清が10μS未満の伝導率値になるまでそれらを洗浄し、アルカリの追加後又は追加することなく磁気分離によってそれらを再分画するステップ。
【００３５】
アルカリ性の範囲での合成は、ステップb)において形成されるナノ粒子酸化鉄結晶が主に、好ましくは少なくとも70重量%、マグネタイト及びマグヘマイトからなることを確実にする。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態において、ステップd)を実行する。これは、粒子が最初にコーティングされ、その次に加熱されることを意味する。ここで、コーティングされたマルチコア粒子の他にも、コーティングされたシングルコア粒子が存在する。ステップd)における加熱は、2〜36時間、特に4〜20時間、特に好ましくは7.5〜15時間実行して、シングルコア及び凝集体の良好な成長を確実にする。ステップd')の場合、コーティングされていない粒子を30分〜60分間加熱するだけで十分である。医薬的に許容可能なコーティング材料によって粒子をコーティングした後の加熱は、ステップd)において、2〜36時間、特に4〜20時間、特に好ましくは7,5〜15時間実行して、シングルコア及び凝集体の良好な成長を確実にする。
【００３７】
本発明の好適な実施形態においてステップd)又はd')におけるコーティングされた又はコーティングされていない粒子のサイズ、凝集及び成長に影響を与える加熱は、85〜95℃、最も好ましくは約90℃で実施される。
【００３８】
本発明の好適な実施形態において、FeCl2の水溶液又は塩化鉄(II)四水和物の水溶液が、鉄(II)塩溶液として用いられる。好適に用いることができる他のFe(II)塩は、FeSO4又は硫酸鉄(II)七水和物である。ステップa)における沈殿のためのアルカリ溶液は、好ましくは、含水水酸化アンモニウム又は含水水酸化カリウム溶液である。用いることができる他の塩基は、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、K2CO3、KHCO3である。ステップb)における酸化は、H2O2溶液、好ましくは5重量%水溶液によって実施される。用いることができる他の酸化剤は、純酸素、大気中酸素、NaNO3、NaClO4及びNaOClである。
【００３９】
発明の好適な実施形態において、ステップd)又はd')におけるコーティングは、周囲温度でコーティング材料を加えて撹拌することによって実行される。
【００４０】
本発明の調製方法に従って作成される上記の磁性粒子分散剤は、磁性粒子スペクトロメーターにて測定すると、公知の製剤を上回る明白なオーバートーン構造を高調波に示す。従って、本発明の分散剤は、MPI(磁性粒子画像診断)に潜在的に適している。エネルギー転移の向上の結果、本発明の新規な粒子分散剤は、腫瘍の温熱療法の用途に用いることもできる。新規な粒子分散剤は、以前使用されていたものよりも、磁化が容易(より穏やかな磁性)である。その結果、上記治療は、より低いフィールド強度を使用して実行することができる。これによって、この方法での副作用が著しく低減される。外部の交番磁界から酸化鉄系へのエネルギー転移の向上は、結果として加熱の向上になる。それらの良好な磁気性質のため、記載の粒子分散剤はMRI用途にも適している。加えて、本発明の含水粒子分散剤が9ヵ月から12ヵ月まで安定であることを明らかにした。
【００４１】
従って、本発明は、本発明の磁性粒子分散剤を含む医薬組成物と、任意に、医薬的に許容可能な補助物質に関する。診断又は治療用溶液に加えることができるこれらの補助物質は、当業者にとって周知である。かかる補助物質は、例えば、防腐剤、安定剤、界面活性剤、担体、香料又は燐脂質であって磁性粒子をリポソーム又はミセルにカプセル化するものである。それらが分散剤と適合する場合は、例外なく、それらを本発明の分散剤に加えることができる。本発明の医薬組成物が安定化コロイド溶液であることが好ましい。本発明の特別な実施形態において、医薬組成物は、分散剤の粒子をミセル及びリポソームに組み込むために、燐脂質又はプルロニック(登録商標)のような界面活性剤を含むことができる。これらの磁気リポソーム及び磁気ミセルは、特別な特性を有し、診断及び治療に非常に有効な可能性がある。従って、リポソーム又はミセルにカプセル化された磁性粒子を含む医薬組成物は、本発明の目的でもある。
【００４２】
本発明の医薬組成物は、特に磁性粒子画像診断(MPI)又は磁気共鳴画像診断(MRI)によって、腫瘍の病期分類及び疾患(例えば肝臓、脾臓、骨髄、リンパ節、循環器疾患、腫瘍及び脳卒中)の診断において有用である。それらは、細胞トラッキング又は温熱療法、特に身体の一部における受動的温熱療法、及び、温熱療法による腫瘍治療において有用である。
【００４３】
加えて、記載されている通り、磁性粒子分散剤を含む本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口鉄補充による鉄欠乏性貧血の治療において有用である。このことは、粒子が加圧滅菌中に変化しないため可能になる。これは、非経口薬を提供するための供給品となる。
【００４４】
本発明の分散剤に関する分析及びインビボ試験から読み取れる通り、上述した非経口鉄補充に関する全ての要件は満たされている。一方、粒子特性及び密集したマグヘマイト-マグネタイト結晶は、鉄が放出することなく迅速なファゴサイトーシスを誘導すると考えられる。加えて、これらのタイプの酸化鉄のマルチコア特性によって、例えば比較例2のように、大きなシングルコア粒子では不可能な細胞内鉄代謝酵素のための表面を大きくすることができる。
【００４５】
抗デキストラン抗体は、本発明のカルボキシメチルデキストリンコーティング磁性ナノ粒子と交差反応しないことを示すこともできる。これは、カルボキシメチルデキストリンコーティングの利点の根拠となる。本発明の磁性ナノ粒子製剤は、ラットの肝臓において生分解性であり、リン酸塩結合能が低いことを示すことも明らかにした。本発明の製剤は、3mmol Fe/kg体重の非経口用量ではラットにおいて副作用を示さない。上記粒子は、静脈内注射後、ラット血管で良好な循環半減期を有する。これは、それらが造影剤として適する可能性があることを証明している。本発明のマルチコア粒子がシングルコア粒子よりも生分解性が良好であることを明らかにした(比較例21)。加えて、本発明の分散剤は、MPSシグナルを減少又は変化させることなく加圧滅菌に耐えることができる。これは、製剤用供給品としての分散剤の安定性を証明している。
【００４６】
本発明は、腫瘍治療を必要とする患者を治療する方法であって、本発明の磁性粒子分散剤又は医薬組成物を患者の患部組織に直接投与するステップと、交番磁界(AMF)を磁性粒子分散剤に印加して、磁性粒子を誘導的に加熱するステップと、を有する、上記方法に関する。磁性粒子分散剤は、塞栓剤又は塞栓剤と化学療法剤との混合物の構成成分とすることも可能であり、カテーテルを介した血液供給によって投与することも可能である。
【００４７】
本発明の医薬組成物は、経口、非経口、腫瘍内、腫瘍周辺、リンパ管内、組織内、静脈内(IV)、動脈内、大脳内投与のために調製することができる。
【００４８】
本発明は、鉄補充療法を必要とする、鉄欠乏性貧血を患っている患者を治療する方法であって、本発明の磁性粒子分散剤又は本発明の医薬組成物を非経口的に投与するステップと、を有する、方法に関する。
【００４９】
技術的領域において、本発明の新規な粒子分散剤は、エレクトレット、色素、機能的塗料を製造するために、及び、例えば、非金属含有部品の工業生産での最終検査のために、用いることができる。
【００５０】
以下の実施例では、本発明の磁性粒子分散剤の調製及び交番磁界におけるそれらの物理的挙動を図示するために提供する。実施例は、いかなる点においても限定することを目的とするものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図1は、リゾビスト(登録商標)と比較した、本発明による分散剤のいくつかのMPS測定値(奇数調波)を示す。
【図１ａ】図1aは、実施例1、溶液2、実施例10、溶液5、リゾビスト(登録商標)及びフェラヘム(登録商標)を示す。
【図１ｂ】図1bは、実施例8、溶液5及びリゾビスト(登録商標)を示す。
【図１ｃ】図1cは、実施例11、溶液1-3及びリゾビスト(登録商標)を示す。
【図１ｄ】図1dは、比較例1、沈殿4及び上清1-2及びリゾビスト(登録商標)を示す。
【図１ｅ】図1eは、比較例2及びリゾビスト(登録商標)を示す。
【図１ｆ】図1fは、実施例15、溶液2と比較した、実施例15、溶液1を示す。
【図２】図2は、実施例4の溶液2のTEMイメージを示す。
【図３】図3は、実施例1の溶液2のTEMイメージを示す。
【図４】図4は、実施例2の溶液2のTEMイメージを示す。
【図５】図5は、実施例8の溶液5のTEMイメージを示す。
【図６】図6は、実施例10の溶液5のTEMイメージを示す。
【図７】図7は、実施例14の肝臓薬物動態の磁気共鳴画像を示す。肝臓でのシグナル減少は迅速な血液からの除去を示している。シグナル増加は非誘磁体鉄貯蔵に対する分解を示している
【図８】図8は、実施例13の注射前(a)及び注射後(b)の雄スプラーグドーリーラットのT1強調(T1e)グラジエントエコー(GRE)MRイメージを示す。
【図９】図9は、実施例10のデキストラン-抗体結合試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
図2〜6においてシングルコア粒子のサイズは、通常の書式で与えており、マルチコア粒子は、太字でマークしており、マルチコア粒子のシングルコアは、下線を引いて表している。
【実施例】
【００５３】
磁性粒子分散剤の調製
実施例1(塩基としてNH4OH、多糖を添加)
1.98gの塩化鉄(II)四水和物を200mlの水に、室温、空気雰囲気(20%の酸素)下で、5分にわたって撹拌しながら溶解する。その後、2mlの含水水酸化アンモニウム(25重量% NH3)を一回の量として加えて、約5分間撹拌する。その後、1mlの含水過酸化水素(5重量%)を一回の量として加えて、溶液を10分間撹拌する(分散剤のpH値: 8.81)。その後、4gのカルボキシメチルデキストランナトリウム塩(CMD-Na)を加えて、10分間撹拌する。混合物を90℃で600分間加熱する。その後、磁気分離を20分間実行し、上清を移して沈殿物を200mlの水にて懸濁し、20分間の更なる磁気分離を行なう。上清を移して沈殿物を200mlの水にて懸濁し、5分間の超音波処理を行い、20分間の磁気分離を行なう。そして、上清を移す。沈殿物は、更なる検査のために用いることができる。上清を一つにまとめて、Vivaflow200フィルター(100kDa RC)を用いた限外ろ過を介してろ液が10μS未満の伝導値になるまで水によって洗浄し、その後、約25mlまで濃縮する。分散剤を一晩磁石上に設置し、約25ml(溶液1)をピペットで吸い出して溶液1を取得する。沈殿物を、25mlの水で満たし、溶液のpHが約10になるまで、0.85N含水水酸化カリウム溶液を滴状に加える。一晩の磁気分離後、約25mlの溶液(溶液2)をピペットで吸い出して溶液2を取得する。沈殿物は、更なる検査のために用いることができる。
【００５４】
溶液1の分析データ:鉄含有量:3.74 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:11.47%;流体力学的サイズ:21.0-37.84 nm
【００５５】
溶液2の分析データ:鉄含有量:0.71 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:12.61%;流体力学的サイズ:24.4-43.8 nm
【００５６】
実施例2(塩基としてKOH、コーティング前凝集及び多糖添加)
1.98gの塩化鉄(II)四水和物を200mlの水に、室温、空気雰囲気(20%の酸素)下で、5分にわたって撹拌しながら溶解する。その後、22mlの0.85N含水水酸化カリウム溶液を一回の量として加えて、約5分間撹拌する。その後、1mlの含水過酸化水素(5重量%)を一回の量として加えて、溶液を10分間撹拌する(分散剤のpH値: 8.03)。その後、磁気分離を5分間実行して、上清を移して廃棄する。沈殿物を100mlの水で満たし、更に10分間磁石上に設置する。10分間の撹拌の後、懸濁液を90℃で30分間加熱し、その後、4.2gのカルボキシメチルデキストランナトリウム塩(CMD-Na)を加えて5分間撹拌する。混合物を90℃で420分間加熱する。その後、磁気分離を20分間実行し、上清を移して沈殿物を200mlの水にて懸濁し、20分間の更なる磁気分離を行なう。上清を移して沈殿物を200mlの水にて懸濁し、20分間の磁気分離を行る。そして、上清を移して沈殿物を200mlの水にて懸濁し、20分間の更なる磁気分離を行なう。上清を移す。沈殿物は、更なる検査のために用いることができる。上清を一つにまとめて、Vivaflow200フィルター(100kDa RC)を用いた限外ろ過を介してろ液が10μS未満の伝導値になるまで水によって洗浄し、その後、約30mlまで濃縮する。分散剤を一晩磁石上に設置して、約20ml(溶液1)をピペットで吸い出して溶液1を取得する。沈殿物を、25mlの水で満たし、溶液のpHが約10になるまで、0.85N含水水酸化カリウム溶液を滴状に加える。一晩の磁気分離後、約23mlの溶液(溶液2)をピペットで吸い出して溶液2を取得する。沈殿物を25mlの水及び280mgのグリセロリン酸と混ぜ合わせて5分間撹拌する。一晩の磁気分離後、約30mlの溶液(溶液3)をピペットで吸い出して溶液3を取得する。沈殿物は、更なる検査のために用いることができる。
【００５７】
溶液1の分析データ:鉄含有量:2.20 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:13.11%;流体力学的サイズ:18.2-32.7 nm
【００５８】
溶液2の分析データ:鉄含有量:1.12 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:13.05%;流体力学的サイズ:18.2-32.7 nm
【００５９】
溶液3の分析データ:鉄含有量:0.48 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:14.08%;流体力学的サイズ:24.0-37.8 nm
【００６０】
実施例3(塩基としてKOH、クエン酸を添加)
1.98gの塩化鉄(II)四水和物を200mlの水に、室温、空気雰囲気(20%の酸素)下で、5分にわたって撹拌しながら溶解する。その後、22mlの0.85N含水水酸化カリウム溶液を一回の量として加えて、約5分間撹拌する。その後、1mlの含水過酸化水素(5重量%)を一回の量として加えて、溶液を10分間撹拌する(分散剤のpH値: 8.05)。その後、磁気分離を5分間実行して、澄んだ上清を移して放棄する。沈殿物を50mlの水で満たし、1.1gのクエン酸一水和物を加えて室温で10分間撹拌する。混合物を水で90mlまで希釈して、90℃で90分間加熱する。その後、磁気分離を10分間実行し、上清を移して沈殿物を100mlの水にて懸濁し、10分間の更なる磁気分離を行なう。上清を移して沈殿物を100mlの水にて懸濁し、10分間の磁気分離を行なう。そして、上清を移す。沈殿物は、更なる検査のために用いることができる。上清を一つにまとめて、Vivaflow200フィルター(30 kDa PES)を用いた限外ろ過を介してろ液が10μS未満の伝導値になるまで水によって洗浄し、その後、約30mlまで濃縮する。分散剤を一晩磁石上に設置して、約20ml(溶液1)をピペットで吸い出して溶液1を取得する。沈殿物を、25mlの水で満たし、溶液のpHが約11になるまで、0.85N含水水酸化カリウム溶液を滴状に加える。一晩の磁気分離後、約20mlの溶液(溶液2)をピペットで吸い出して溶液2を取得する。沈殿物は、更なる検査のために用いることができる。
【００６１】
溶液1の分析データ:鉄含有量:0.78 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:6.25%;流体力学的サイズ:7.5-15.7 nm
【００６２】
溶液2の分析データ:鉄含有量:0.56 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:6.93%;流体力学的サイズ:11.7-21.0 nm
【００６３】
実施例4(塩基としてKOH、多糖を添加)
3.96gの塩化鉄(II)四水和物を200mlの水に、室温、空気雰囲気(20%の酸素)下で、5分にわたって撹拌しながら溶解する。その後、44mlの0.85N含水水酸化カリウム溶液を一回の量として加えて、約10分間撹拌する。その後、2mlの含水過酸化水素(5重量%)を一回の量として加えて、溶液を10分間撹拌する(分散剤のpH値: 7.91)。その後、磁気分離を5分間実行して、上清を移して放棄する。沈殿物を200mlの水で満たし、更に15分間磁石上に設置する。その後、8gのカルボキシメチルデキストランナトリウム塩(CMD-Na)を加えて、室温で10分間撹拌する。混合物を水で希釈して合計量250mlとして、90℃で900分間加熱する。その後、100mlの得られた混合物を用いて磁気分離を20分間実行し、上清を移して沈殿物を200mlの水にて懸濁し、20分間の更なる磁気分離を行なう。上清を移して沈殿物を200mlの水にて懸濁し、20分間の磁気分離を行なう。上清を移す。沈殿物を200mlの水にて懸濁し、20分間の更なる磁気分離を行い、上清を移す。沈殿物を200mlの水にて懸濁して20分間の更なる磁気分離を行い、上清を移す。そして、沈殿物は、廃棄するか、更なる検査のために用いることができる。上清を一つにまとめて、Vivaflow200フィルター(100 kDa RC)を用いた限外ろ過を介してろ液が10μS未満の伝導値になるまで水によって洗浄し、その後、約40mlまで濃縮する。分散剤を15分間磁石上に設置して、約35mlをピペットで吸い出す(上清1)。沈殿物(沈殿1)を保存して、上清1を一晩磁石に設置し、25ml(溶液1)をピペットで吸い出し溶液1を取得する。沈殿物を、40mlの水で満たし、溶液のpHが約10になるまで、0.85N含水水酸化カリウム溶液を滴状に加える。15分間の磁気分離後、約42mlの溶液をピペットで吸い出す(上清2)。上清2を一晩磁石上に設置して約40ml(溶液2)をピペットで吸い出して溶液2を取得する。沈殿物は、更なる検査のために用いることができる。
【００６４】
溶液1の分析データ:鉄含有量:2.03 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:7.89%;流体力学的サイズ:18.2-28.2 nm
【００６５】
溶液2の分析データ:鉄含有量:1.05 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:8.63%;流体力学的サイズ:18.2-32.7 nm
【００６６】
実施例5(塩基としてKOH、単糖及び多糖を添加)
3.96gの塩化鉄(II)四水和物を200mlの水に、室温、空気雰囲気(20%の酸素)下で、5分にわたって撹拌しながら溶解する。その後、44mlの0.85N含水水酸化カリウム溶液を一回の量として加えて、約5分間撹拌する。その後、2mlの含水過酸化水素(5重量%)を一回の量として加えて、溶液を10分間撹拌する(分散剤のpH値: 8.42)。その後、8gのD-マンニトールを加えて、室温で10分間撹拌する。混合物を水で希釈して合計量250mlとして、90℃で240分間加熱する。まだ熱いうちに、150mlのこの混合物を15分間磁石上に設置して、その後移す。沈殿物を100mlの水で満たし、4.8gのカルボキシメチルデキストランナトリウム塩(CMD-Na)を加えて分散剤を10分間撹拌する。混合物を90℃で510分間加熱する。その後、磁気分離を20分間実行し、上清を移して沈殿物を200mlの水にて懸濁し、20分間の更なる磁気分離を行なう。上清を移して沈殿物を200mlの水にて懸濁し、20分間の磁気分離を行なう。そして、上清を移す。沈殿物は、更なる検査のために用いることができる。上清を一つにまとめて、Vivaflow200フィルター(100 kDa RC)を用いた限外ろ過を介してろ液が10μS未満の伝導値になるまで水によって洗浄し、その後、約40mlまで濃縮する。沈殿物は、更なる検査のために用いることができる。
【００６７】
分析データ:鉄含有量:6.25 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:2.29%
【００６８】
実施例6(塩基としてKOH、単糖を添加)
1.98gの塩化鉄(II)四水和物を50mlの水に、室温、空気雰囲気(20%の酸素)下で、5分にわたって撹拌しながら溶解する。その後、22mlの0.85N含水水酸化カリウム溶液を一回の量として加えて、約5分間撹拌する。その後、1mlの含水過酸化水素(5重量%)を一回の量として加えて、溶液を10分間撹拌する(分散剤のpH値: 7.87)。その後、4gのD-グルコン酸ナトリウムを加えて、室温で10分間撹拌する。混合物を90℃で240分間加熱する。溶液のpHが約10になるまで、混合物に0.85N含水水酸化カリウム溶液を加える。その後、磁気分離を20分間実行し、上清を移して沈殿物を100mlの水にて懸濁し、20分間の更なる磁気分離を行なう。上清を移して沈殿物を100mlの水にて懸濁し、20分間の磁気分離を行なう。そして、上清を移す。沈殿物を100mlの水にて懸濁して20分間更なる磁気分離を行い、そして、上清を移す。沈殿物は、更なる検査のために用いることができる。上清を一つにまとめて、Vivaflow200フィルター(100 kDa RC)を用いた限外ろ過を介してろ液が10μS未満の伝導値になるまで水によって洗浄し、その後、約40mlまで濃縮する。沈殿物は、更なる検査のために用いることができる。
【００６９】
分析データ:鉄含有量:4.58 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:1.02%
【００７０】
実施例7(塩基としてKOH、多糖を添加)
3.96gの塩化鉄(II)四水和物を200mlの水に、室温、空気雰囲気(20%の酸素)下で、5分にわたって撹拌しながら溶解する。その後、44mlの0.85N含水水酸化カリウム溶液を一回の量として加えて、約10分間撹拌する。その後、2mlの含水過酸化水素(5重量%)を一回の量として加えて、溶液を10分間撹拌する(分散剤のpH値: 7.98)。その後、磁気分離を12分間実行して上清を移して放棄する。沈殿物を200mlの水で満たし、更に15分間磁石上に設置する。その後、8gのカルボキシメチルデキストランナトリウム塩(CMD-Na)を加えて、室温で10分間撹拌する。混合物を水で希釈して合計量250mlとして、90℃で450分間加熱する。その後、磁気分離を23分間実行し、上清を移して沈殿物を165mlの水にて懸濁し、23分間の更なる磁気分離を行なう。上清を移して、沈殿物を165mlの水にて懸濁し、23分間の磁気分離を行なう。そして、上清を移す。沈殿物を165mlの水にて懸濁し、23分間の更なる磁気分離を行い、上清を移す。そして、沈殿物は、廃棄するか、更なる検査のために用いることができる。上清を一つにまとめて、Vivaflow200フィルター(100 kDa RC)を用いた限外ろ過を介してろ液が10μS未満の伝導値になるまで水によって洗浄し、その後、約67mlまで濃縮する。
【００７１】
分散剤を15分間磁石上に設置して、約60mlをピペットで吸い出す(上清1)。沈殿物(沈殿1)を保存して、上清1を一晩磁石に設置し、45ml(溶液1)をピペットで吸い出し溶液1を取得する。沈殿1を67mlの水で満たし、溶液のpHが約10になるまで、0.85N含水水酸化カリウム溶液を滴状に加える。15分間の磁気分離後、約80mlの溶液をピペットで吸い出す(上清2)。上清2を一晩磁石上に設置して約70ml(溶液2)をピペットで吸い出して溶液2を取得する。沈殿物は、更なる検査のために用いることができる。
【００７２】
溶液1の分析データ:鉄含有量:5.86 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:12.27%
【００７３】
溶液2の分析データ:鉄含有量:1.12 g Fe/l;溶液2:全鉄中の2価鉄の含有量:12.35%;流体力学的サイズ:21,04-43,82 nm
【００７４】
実施例8(塩基としてKOH、多糖を添加)
3.96gの塩化鉄(II)四水和物を200mlの水に、室温、空気雰囲気(20%の酸素)下で、5分にわたって撹拌しながら溶解する。その後、44mlの0.85N含水水酸化カリウム溶液を一回の量として加えて、約10分間撹拌する。その後、2mlの含水過酸化水素(5重量%)を一回の量として加えて、溶液を10分間撹拌する。その後、1mlの含水過酸化水素(5重量%)を一回の量として加えて、溶液を10分間撹拌する(分散剤のpH値: 8.05)。その後、磁気分離を15分間実行して、上清を移して放棄する。沈殿物を100mlの水で満たす。その後、8gのカルボキシメチルデキストランナトリウム塩(CMD-Na)を加えて、室温で10分間撹拌する。混合物を水で希釈して合計量190mlとして、90℃で480分間加熱する。その後、得られた混合物を用いて磁気分離を20分間実行し、上清を移して沈殿物を200mlの水にて懸濁し、20分間の更なる磁気分離を行なう。上清を移して沈殿物を200mlの水にて懸濁し、20分間の磁気分離を行なう。そして、上清を移す。沈殿物を200mlの水にて懸濁し、20分間の更なる磁気分離を行い、上清を移す。そして、沈殿物は、廃棄するか、更なる検査のために用いることができる。上清を一つにまとめて、Vivaflow200フィルター(100 kDa RC)を用いた限外ろ過を介してろ液が10μS未満の伝導値になるまで水によって洗浄し、その後、約40mlまで濃縮する。分散剤を一晩磁石上に設置して、約30mlピペットで吸い出す(溶液1)。沈殿物(沈殿1)を25mlの水で満たし、溶液のpHが約10になるまで0.85NのKOH溶液を滴状に加える。一晩の磁気分離後、約25mlの溶液をピペットで吸い出し(溶液2)、沈殿物(沈殿2)を25mlの水で満たして一晩磁石上に設置する。そして、25mlをピペットで吸い出し(溶液3)、沈殿物(沈殿3)を25mlの水で満たして一晩磁石上に設置する。そして、25mlをピペットで吸い出し(溶液4)、沈殿物(沈殿4)を25mlの水で満たして一晩磁石上に設置する。そして、25mlをピペットで吸い出し(溶液5)、沈殿物(沈殿5)は、更なる検査のために用いることができる。
【００７５】
溶液1の分析データ:鉄含有量:8.71 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:7.37%;流体力学的サイズ:15.7-28.2nm
【００７６】
溶液2の分析データ:鉄含有量:8.66 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:8.92%;流体力学的サイズ:21.0-37.8nm
【００７７】
溶液3の分析データ:鉄含有量:2.40 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:8.05%;流体力学的サイズ:21.0-37.8nm
【００７８】
溶液4の分析データ:鉄含有量:1.56 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:9.32%;流体力学的サイズ:24.4-37.8nm
【００７９】
溶液5の分析データ:鉄含有量:1.28 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:8.79%;流体力学的サイズ:28.2-43.8nm
【００８０】
実施例9(カルボキシメチルデキストリンナトリウム塩)
10.10gの水酸化ナトリウムを28mlの水にて溶解した。この溶液に、8.35gのデキストリンをゆっくり加えて、10分間撹拌した。その後で、140mlのイソプロピルアルコールを加えて、混合物を室温で20分間撹拌した。この後、18.20gのブロモ酢酸を加えて、混合物を70℃で120分間急速に撹拌してデキストリンを完全に溶解し、そして一晩室温で撹拌した。溶媒を真空で取り除き、残留物を28mlの水に溶かし、カルボキシメチルデキストリン塩を252mlの冷メタノールによって沈殿させて混合物を4℃で一晩保存した。その後、混合物を濾過して、沈殿物をメタノールにて洗浄し、100mlの水に溶かして真空で蒸発させ、50mlの水にて再度溶かして、60℃で乾燥させた。収量: 15.5gカルボキシメチルデキストリンナトリウム塩(CM-デキストリン-Na)。
【００８１】
実施例10(塩基としてKOH、多糖を添加)
3.96gの塩化鉄(II)四水和物を200mlの水に、室温、空気雰囲気(20%の酸素)下で、5分にわたって撹拌しながら溶解する。その後、44mlの0.85N含水水酸化カリウム溶液を一回の量として加えて、約10分間撹拌する。その後、2mlの含水過酸化水素(5重量%)を一回の量として加えて、溶液を10分間撹拌する。その後、1mlの含水過酸化水素(5重量%)を一回の量として加えて、溶液を10分間撹拌する(分散剤のpH値: 8.36)。その後、磁気分離を15分間実行して、上清を移して放棄する。沈殿物を100mlの水で満たす。その後、8gのカルボキシメチルデキストリンナトリウム塩(CM-デキストリン-Na、実施例9)を加えて、室温で10分間撹拌する。混合物を水で希釈して合計量190mlとして、90℃で480分間加熱する。その後、得られた混合物を用いて磁気分離を20分間実行し、上清を移して沈殿物を200mlの水にて懸濁し、20分間の更なる磁気分離を行なう。上清を移して沈殿物を200mlの水にて懸濁し、20分間の磁気分離を行なう。そして、上清を移す。沈殿物を200mlの水にて懸濁し、20分間の更なる磁気分離を行い、上清を移す。そして、沈殿物は、廃棄するか、更なる検査のために用いることができる。上清を一つにまとめて、Vivaflow200フィルター(100 kDa RC)を用いた限外ろ過を介してろ液が10mS未満の伝導値になるまで水によって洗浄し、その後、約40mlまで濃縮する。分散剤を一晩磁石上に設置して、約30mlピペットで吸い出す(溶液1)。沈殿物(沈殿1)を25mlの水で満たし、溶液のpHが約10になるまで0.85NのKOH溶液を滴状に加える。一晩の磁気分離後、約25mlの溶液をピペットで吸い出し(溶液2)、沈殿物(沈殿2)を25mlの水で満たして一晩磁石上に設置する。そして、25mlをピペットで吸い出し(溶液3)、沈殿物(沈殿3)を25mlの水で満たして一晩磁石上に設置する。そして、25mlをピペットで吸い出し(溶液4)、沈殿物(沈殿4)を25mlの水で満たして一晩磁石上に設置する。そして、25mlをピペットで吸い出し(溶液5)、沈殿物(沈殿5)は、更なる検査のために用いることができる。
【００８２】
溶液4の分析データ:鉄含有量:0.56 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:5.60%;流体力学的サイズ:21.0-32.7nm
【００８３】
溶液5の分析データ:鉄含有量:2.85 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:4.65%;流体力学的サイズ:24.4-37.8nm
【００８４】
実施例11(塩基としてKOH、多糖を添加)
11.88gの塩化鉄(II)四水和物を600mlの水に、室温、空気雰囲気(20%の酸素)下で、5分にわたって撹拌しながら溶解する。その後、132mlの0.85N含水水酸化カリウム溶液を一回の量として加えて、約10分間撹拌する。その後、6mlの含水過酸化水素(5重量%)を一回の量として加えて、溶液を10分間撹拌する(分散剤のpH値: 8.45)。その後、磁気分離を15分間実行して、上清を移して放棄する。沈殿物を600mlの水で満たし、さらに15分間磁石上に設置する。その後、24.08gのカルボキシメチルデキストランナトリウム塩(CMD-Na)を加えて、室温で10分間撹拌する。混合物を水で希釈して合計量750mlとして、90℃で450分間加熱する。その後、磁気分離を23分間実行し、上清を移して沈殿物を500mlの水にて懸濁し、23分間の更なる磁気分離を行なう。上清を移して沈殿物を500mlの水にて懸濁し、23分間の磁気分離を行なう。そして、上清を移す。沈殿物を500mlの水にて懸濁し、23分間の更なる磁気分離を行い、上清を移す。そして、沈殿物を500mlの水にて懸濁し、23分間の更なる磁気分離を行い、上清を移す。沈殿物は、廃棄するか、更なる検査のために用いることができる。上清を一つにまとめて、Vivaflow200フィルター(100 kDa RC)を用いた限外ろ過を介してろ液が10μS未満の伝導値になるまで水によって洗浄し、その後、約200mlまで濃縮する。
【００８５】
分散剤を25分間磁石上に設置して、約180mlをピペットで吸い出す(上清1)。沈殿物(沈殿1)を保存して上清1を一晩磁石に設置し、150ml(溶液1)をピペットで吸い出し溶液1及び沈殿2を取得する。沈殿1を180mlの水で満たし、溶液のpHが約11.5になるまで0.85NのKOH溶液を滴状に加える。25分間の磁気分離後、約180mlの溶液をピペットで吸い出す(上清2)。上清2を一晩磁石上に設置し、約155ml(溶液2)をピペットで吸い出して溶液2及び沈殿3を取得する。沈殿3は、更なる検査のために用いることができる。沈殿2を180mlの水で満たし、溶液のpHが約10.3になるまで0.85NのKOH溶液を滴状に加える。一晩の磁気分離後、約175mlの溶液をピペットで吸い出して(上清3)、溶液3及び沈殿4を取得する。沈殿4は、更なる検査のために用いることができる。実施例18(リン酸塩溶液におけるリン酸塩吸着及び鉄の放出)のために、実施例11溶液2を、Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units(PLHK Ultracel-PL Membrane、100kDa)を使用して、3112x gの遠心によって0.062M Fe/L(溶液2k)に濃縮した。
【００８６】
溶液1の分析データ:鉄含有量:3.29 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:3.48%;流体力学的サイズ:21.0-32.7nm
【００８７】
溶液2の分析データ:鉄含有量:0.61 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:2.43%;流体力学的サイズ:24.4-37.8nm
【００８８】
溶液3の分析データ:鉄含有量:1.79 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:2.01%;流体力学的サイズ:24.4-37.8nm
【００８９】
実施例12(非経口製剤  バージョン1)
実施例7、溶液2を、Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units(PLHK Ultracel-PL Membrane、100kDa)を使用して、3112xgの遠心によって濃縮した。4.2gのD-マンニトール及び0.7ml(2g/l)の含水乳酸ナトリウムを、得られた溶液68ml(0.171M Fe/l)に加えた。その後、溶液を0.2μm(酢酸セルロース)シリンジフィルタ(濾過滅菌)に通して、120℃で20分間、1barで加圧滅菌した。最終溶液の鉄含有量:0.165 M/l Fe。
【００９０】
実施例13(非経口製剤  バージョン2)
実施例7、溶液2を、Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units(PLHK Ultracel-PL Membrane、100kDa)を使用して、3112xgの遠心によって濃縮した。0.48gのD-マンニトール及び80μl(2g/l)含水乳酸ナトリウムを、得られた溶液7.5ml(0.041M Fe/l)に加え、合計容量が8mlになるまで水を加えた。その後、溶液を0.2μm(酢酸セルロース)シリンジフィルタ(濾過滅菌)に通して、120℃で20分間、1barで加圧滅菌した。最終溶液の鉄含有量:0.039 M/l Fe。
【００９１】
実施例14(非経口製剤  バージョン3)
0.48gのD-マンニトールを8mlの実施例10、溶液5(0.051M Fe/l)に加えた。その後、溶液を0.2μm(酢酸セルロース)シリンジフィルタ(濾過滅菌)に通して、120℃で20分間、1barで加圧滅菌した。最終溶液の鉄含有量:0.050 M/l Fe。
【００９２】
実施例15(非経口製剤  バージョン4)
実施例7、溶液2を、Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units(PLHK Ultracel-PL Membrane、100kDa)を使用して、3112xgの遠心によって濃縮した。0.120gのD-マンニトールを、得られた溶液(溶液1)2ml(0.170M Fe/l)に加えた。その後、溶液を0,2μm(酢酸セルロース)シリンジフィルタ(濾過滅菌)に通して、120℃で20分間、1barで加圧滅菌した(溶液2)。最終溶液(溶液2)の鉄含有量:0.165 M/l Fe。
【００９３】
図1fから読み取れる通り、溶液1は、MPSシグナルを減少又は変化させることなく加圧滅菌に耐えることができることを明らかにした。これは、分散剤の安定性を証明している。
【００９４】
実施例16(デキストラン-抗体結合試験)
アガロース試験ゲルは、8mlの1%(wt/v)低ゲル化温度アガロース(シグマアルドリッチ、A9414)と2mlの試験鉄剤配合物の溶液(実施例10、溶液4、フェラヘム、ポジティブデキストランコントロール、ネガティブコントロール)を、0.9%塩化ナトリウム溶液中に40μg Fe/mlの濃度として混ぜ合わせることによって作成した。
【００９５】
アガロース試験配合物の混合物をシャーレに満たした。ゲル化後、3mmの穴(whole)を作成し、5μl(原液)の一次抗デキストラン抗体Clone DX1(StemCell Inc., Nr. 60026)で満した。4℃で2日間のインキュベーション後、プレートをPBS緩衝液で3回洗浄し、穴を二次抗体Alexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgG1(Life Technologies Inc., Nr. A21121)で満した。25時間のインキュベーション後、プレートをPBS緩衝溶液で3回洗浄し、PBS緩衝液で4℃3日間、更にインキュベーションした。
【００９６】
文書は、画像ソフトウェアGene Snap Version 7.09と共にSyngene G:Box(VWR company)を用いた画像化によってドキュメント化を実行した。
【００９７】
フェラヘム(登録商標)及びポジティブデキストランコントロールは、沈殿リングを示すが、実施例10、溶液4及びネガティブコントロールのプレートでは生じなかった(図9)。
【００９８】
この実施例は、抗デキストラン抗体が実施例10溶液4のカルボキシメチルデキストリンコーティング磁気ナノ粒子と交差反応しないことを示す。
【００９９】
実施例17(実施例13で薬物動態)
実施例13で薬物動態は、3つの雄スプラーグドーリーラット(Charles River, Germany)において、市販の四肢コイルを使用するシーメンスMagnetom Syncro Maestro Class(Siemens, Germany)での磁気共鳴画像によって試験した。鉄代謝に関する主要な標的器官としての肝臓及び脾臓のMR画像は、130msの繰り返し時間、5.4msのエコー時間及び40度のフリップ角、2mmのスライス厚及び1×1mmの平面解像度での2Dグラジエントエコー系列を用いて取得した。
【０１００】
ラットは、0.045mmol Fe/kg bwの静脈内投与前と、その投与の5分後、15分後、30分後、60分後、24時間後、2週間後及び4週間後に画像化した。シグナルの強さは、肝臓において測定し、バックグラウンド及びSNRは以下の通りに算出した:SNR = 臓器シグナル/バックグラウンドシグナル
【０１０１】
15分以内に、肝臓のSNRは、12.34±1.5から0.86±0.2に減少し、脾臓のSNRは、10.97±3.2から1.6±4.1に減少した。24時間後のSNRは、これらの値うちの低い値を保持していた。14日以内に、肝臓シグナルは、6.01±2.6のSNRへ増加し、脾臓SNRは、9.8±3.5に増加した。4週後の肝臓のSNRは、8.21±2.0であり、脾臓SNRは、11.8±2.8のベースライン値に達した。
【０１０２】
結論として、MRIは、鉄代謝に関与する細胞によって迅速に除去されることを明らかにし、非磁性体鉄化合物の鉄結晶コアマグヘマイト(magehemite)構造が良好に分解されていることを示すシグナルの増加が見られる(図7)。
【０１０３】
この実施例は、実施例13の粒子製剤が生分解性であることを示している。
【０１０４】
実施例18(リン酸塩溶液におけるリン酸塩吸着及び鉄放出)
リン酸塩吸着は、pH 7の含水リン酸ナトリウム溶液において測定した。40mMのリン酸塩溶液(溶液A)は、リン酸二水素ナトリウム(S0751、シグマアルドリッチ、ミュンヘン、ドイツ)を使用して作成した。水酸化ナトリウム又は塩酸を加えることによってpH7調整した。
【０１０５】
水性媒体としての溶液Aを1ml用いて、3mlの合計容量中に0.1mmolの鉄含有量となるように、以下で示す製造例及び比較例の水溶液を作成した(溶液B)。溶液Bを37℃で2時間インキュベートした。溶液は、3kDaのAmicon ultracel Ultra-0.5 ml超遠心フィルタを用いて濾過(9900xg)した。0.5mlの希釈溶液(水で1:500)のアリコートを、0.01mlの10%アスコルビン酸、0.02mlのモリブデン酸塩試薬(25mlの13%ヘプタモリブデン酸アンモニウム+ 75mlの9M硫酸+ 25mlの0.35%酒石酸アンチモニルカリウム三水和物)及び0.47mlの二段蒸留水(bidestilled water)と混ぜ合わせた。室温で30分間のインキュベーション後、吸光度を、880nm(Specord 205, Analytic Jena AG、ドイツ)で測定した。リン酸塩は、較正曲線(0-4mg PO4-/l)に基づいて算出した。鉄分析のために、0.2mlのろ液を、0.1mlの10%塩酸ヒドロキシルアミン及び0.7mlの0.1%1,10フェナントロリンを混ぜ合わせた(フェナントロリン方法)。室温で15分間のインキュベーション後、吸光度を、510nm(Specord 205, Analytic Jena AG、ドイツ)で測定した。鉄濃度は、較正曲線(1-10mg 鉄/ml)に基づいて算出したた。
【０１０６】
【表１】
2015519302.tif 000002
【０１０７】
表1は、ヴェノファー(登録商標)及びフェリンジェクト(登録商標)と比較した、実施例10(溶液5)、11(溶液2)、11(溶液2k)及び比較例2のリン酸塩結合容量を示している。データは、本発明にかかる分散剤のリン酸塩結合容量がヴェノファー(登録商標)及びフェリンジェクト(登録商標)よりも優れている(値がより低い)ことを示している。本発明にかかる分散剤の鉄放出は、ヴェノファー(登録商標)よりも優れており、フェリンジェクト(登録商標)とは同等である。
【０１０８】
この実施例は、ヴェノファー(登録商標)、フェリンジェクト(登録商標)及び比較例2と比較した、実施例10溶液5及び実施例11溶液2kの低リン酸塩結合容量を示している。高リン酸塩結合能は、低リン酸血を引き起こす可能性がある。
【０１０９】
実施例19(非臨床安全試験)
許容度を、体重300gの雄スプラーグドーリーラット(Charles River, Germany)において試験した。最終的な薬実施例12は、3mmol Fe/kg bwの投与量をスローボーラス注射によって、2分間にわたり静脈内的に外側尾静脈へ投与した。ヴェノファー(登録商標)は、同じ用量で試験した。試験前、及び、試験の5分、15分、30分、45分、60分、120分、180分、240分並びに24時間後に、ラットは、1分間、清潔なマクロロンボックスの中に慎重にセットして、挙動及び重要な兆候を観察した。自発的に放出された尿を集めて、シーメンスマルティスティックス(Mulstix)(登録商標)8SGを用いて病理学的尿パラメーターを分析した。有害反応の兆候は、観察されなかった。尿パラメーターは、試験期間を通じて変化が見られなかった。2mmol Fe/kgは、上記の試験実施例については、無毒性量(NOAEL)であると、結論付ることができた。これとは反対に、ヴェノファー(登録商標)の投与後、ラットは、有害反応の臨床徴候を示さなかったが尿マルティスティックスは、僅かにヘモグロビン尿2プラスを伴う、300mg/lの量を超えるタンパク尿が劇的に増加していること示した。尿パラメーターの病理学的変化は、投与の24時間後に完全に正常化した。
【０１１０】
この実施例は、3mmol Fe/kg bwの非経口投与量で副作用を示さなかった実施例12についてのラットの高い許容度を示す。
【０１１１】
実施例20(実施例13の短期血中薬物動態)
短期血中薬物動態は、雄スプラーグドーリーラット(300g bw、Charles River Sulzfeld)を画像化する磁気共鳴画像によって試験して、0.045mmol Fe/kg bwの実施例13の静脈内投与前及び5分毎に30分後まで、市販の四肢コイルを用いたシーメンスMagnetom Syncro Maestro Classで、前額断方向に、T1緩和時間強調三次元グラジエントエコー系列(5msの繰り返し時間、1.2msのエコー時間、60度のフリップ角(anlfe))により、0.6x 0.6mmの平面解像度及び0.5mmのスライス厚で画像化した。大静脈におけるシグナルの強さは、経時的に測定した。一次カイネティックシグナルに従う単一指数関数適合を用いて、血中半減期を算出した。静脈内注射の後、著しいシグナル増加が、実施例13の半減期4.4分で残存する血管においてのみ観察された。
【０１１２】
この実施例は、実施例13の粒子がラットの静脈内注射後に4.4分の(血管における)循環半減期を有することを示している。
【０１１３】
実施例21(M.R, Jahn et. al. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2011, 78, 480-491に従う酸性状態下での分解)
【０１１４】
鉄化合物の酸加水分解を、10mg/Lの濃度の鉄化合物を有する、0.9%の塩化ナトリウム/0.2375MのHClの溶液において試験した。混合物を、室温で50時間穏やかに振盪して、次に、3kDa Amicon Ultra-0.5ml超遠心フィルタを通じて5900xgで濾過し、ろ液の鉄含有量をフェナントロリン方法で測定した。
【０１１５】
表2は、酸性条件下で比較例2と比較した、実施例8溶液5及び実施例10溶液5の迅速な加水分解を示している。実施例8溶液5及び実施例10溶液5のマルチコア形状は、比較例2の大きな結晶よりも、加水分解反応のための表面がより大きいと考えることができる。これは、本発明にかかる分散剤の良好な生分解性のための指標とすることができる。
【０１１６】
【表２】
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【０１１７】
この実施例は、酸性条件下で比較例2と比較した、実施例10溶液5及び実施例8溶液5の迅速な加水分解を示すものであり、良好な生分解性の指標とすることができた。
【０１１８】
比較例1
マルチコアナノ粒子は、"Dutz, S, J H Clement, D Eberbeck, T Gelbrich, R Hergt, R Mueller, J Wotschadlo, and Zeisberger. "Ferrofluids of Magnetic Multicore Nanoparticles for Biomedical Applications." Journal of magnetism and magnetic materials 321, no. 10 (2009): doi:10.1016/j.jmmm.2009.02.073に従って作成した。
【０１１９】
1M NaHCO3溶液を、FeCl2/FeCl3溶液(合計Fe-濃度: 0.625M; Fe2+/Fe3+比率= 1/1.3)に、0.75ml/minの速度でゆっくり加えた。pH値が8に達した時に、重炭酸塩溶液の追加を停止した。得られた褐色がかった沈殿物は、CO2放出下で5分間、100℃まで加熱した。作成した粒子を脱イオン水によって3回洗浄して、得られた懸濁液のpHを希釈HClの追加によってpH 2-3に調整した。そして、混合物を数秒間の超音波処理によってホモジナイズ(Sonorex Digital 10P, Bandelin electronic)して、45℃まで加熱した。約1:3のCMD/MCNP比率を有するCMD(CMDナトリウム塩、Fluka)水溶液を懸濁液に加えて、45℃で60分間撹拌した。コーティング粒子をイオン除去水によって洗浄して、得られた粒子分散剤を、実験用遠心分離機(Labofuge 400R, Heraeus Sepatech)にて、1029xg及び20℃で遠心分離した。沈殿物を保存して、上清を取り除いた。上清を1525xgにて再び遠心分離した。この手法を2521xg及び2958xgにて二回繰り返した。合計して、8画分(4つの沈殿物及び4つの上清)を得た。
【０１２０】
得られた粒子分散剤の磁気的性質が本発明のものと同等でないことを明らかにした(図1d)。加えて得られた粒子分散剤は、高い凝集傾向を伴う良好な安定性を示さず、非経口薬としての使用を制限するものであった。
【０１２１】
比較例2
マルチコアナノ粒子は、2003年5月1日(2003-05-01)のWO 03/035113(BERLIN HEART AG DE; GANSAU CHRISTIAN Department of Employment; BUSKE NORBERT Department of Employment; GOETZ)A1の15ページの実施例1及び22ページの実施例17に従って作成した。
【０１２２】
15ページの実施例1:
10gのシクロデキストリンを200mlの2-プロパノールと混ぜ合わせ、撹拌しながら40℃まで加熱した。水20ml中に6gの水酸化ナトリウム水溶液(溶液1)及び溶液2：水40ml中に15gのクロロ酢酸ナトリウム塩(溶液2)を加え、得られた溶液を70℃まで加熱して90分間急速撹拌した。室温に冷却した後、2-プロパノール層(上層)を移して、残留部(下層)をpH8に合わせ、120mlのメタノールで処理して原産物を沈殿させた。メタノール性溶液を移し、沈殿物を100mlの水に溶かして酸性イオン交換樹脂(ダウエックス50)を通過させた。得られた溶液を一晩透析して凍結乾燥をし、カルボキシメチル-β-シクロデキストリンを得た。
【０１２３】
22ページの実施例17:
20gの塩化鉄(II)を300mlの水に溶かして70℃まで加熱し、撹拌しながら40mlの6M含水水酸化カリウム溶液で処理した。その後、9.7mlの10重量%含水過酸化水素溶液をゆっくり加えて、得られた溶液を70-75℃で40分間撹拌した。沈殿物を磁石によって分離して、水によって数回洗浄し、200mlの水と共に混合した。混合物のpHをpH1.5に調整して、混合物を50℃まで加熱した。そして、1.5gのカルボキシメチル-β-シクロデキストリン溶液(ページ15の実施例1)及び40mlの水を加えて、得られた混合物を50℃で30分間撹拌した。懸濁液を磁石によって分離して水によって数回洗浄し、40mlの水中に懸濁して、3M水酸化ナトリウム水溶液によって中和し、超音波によって分散させた。
【０１２４】
分析データ:鉄含有量:34.85 g Fe/l;全鉄中の2価鉄の含有量:15.57%;流体力学的サイズ:78.8-141.8nm
【０１２５】
得られた粒子分散剤の磁気的性質が本発明のものと同等でないことを明らかにした(図1e)。更に、得られた粒子分散剤は、高い凝集傾向を伴う良好な安定性を示さず、非経口薬としての使用を制限するものであった。
【０１２６】
リゾビスト(登録商標)と比較した本発明の分散剤のMPS測定
実施例1(溶液2)、実施例2(溶液2及び3)、実施例4(溶液2)、実施例7(溶液2)、実施例8(溶液5)及び実施例10(溶液5)の原液サンプルを、10mT、25,2525 kHz、36,6℃及び10sでの磁性粒子スペクトロメーター(MPS)(Bruker Biospin, Germany)にて測定した。比較のために、市販のリゾビスト(登録商標)分散剤を水で希釈して33mmol Fe/Lとし、同じ条件下で測定した。測定は、30μlのサンプル容量を有するLife TechnologiesのPCRチューブにて実行した。評価のために磁気モーメントの振幅に対応する各調波に関する得られた測定値を、各サンプルのそれぞれの鉄含有量に標準化して、AkをAm2/mol Feとして与えた。結果を表3及び図1に表している。奇数調波だけを示している。
【０１２７】
【表３】
2015519302.tif 000004
【０１２８】
表３から読み取れる通り、本発明の分散剤は、リゾビスト(登録商標)製剤よりも優れている。例えば実施例1の溶液2は、リゾビスト製剤よりも第3調波で2倍、そして第51調波で6倍優れている。
【図１】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
2015519302.tif 000008
【図１ｄ】
2015519302.tif 000009
【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図２】
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【図３】
2015519302.tif 000013
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年12月4日(2014.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性粒子分散剤であって、
前記分散剤は、酸化鉄の単結晶及び/又は多結晶質のシングルナノ粒子並びに前記分散剤における合計鉄含有量に対して少なくとも40重量%の、そのナノ粒子凝集体を含み、
ナノ粒子及びナノ粒子凝集体は、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、脂肪酸又はそれらの混合物からなる群より選択されるカルボン酸又はヒドロキシカルボン酸、単糖、二糖、多糖又はそれらの混合物を含む群から選択される医薬的に許容可能なコーティング材料でコーティングされ、
前記分散剤は、交番磁界をかけると非線形磁化挙動を示し、
25,25kHzのインシデント基本周波数、10mTの磁束密度及び36.6℃の温度で、10〜90mmol Fe/lの鉄含有量を有する分散剤によって生じ且つ磁性粒子スペクトロメーターによって測定した磁気モーメントの振幅値Akは、第3調波で0.31045から15.79576 Am2/mol Fe、第21調波で3.78193・10-4から2.61583・10-2 Am2/mol Fe、そして、第51調波で3.98370・10-6から1.23649・10-4 Am2/mol Feに及ぶ、磁性粒子分散剤。
【請求項２】
シングルナノ粒子及びナノ粒子凝集体の平均粒子径(流体力学的径)は、10から80nmである、請求項1に記載の磁性粒子分散剤。
【請求項３】
前記医薬的に許容可能なコーティング材料は、デキストラン、澱粉、燐酸澱粉、キトサン、グリコサミノグリカン、デキストリン、マルトデキストリン、ポリマルトース、アラビアゴム、イヌリン、アルギン酸及びそれらの誘導体又はそれらの混合物を含む群より選択される多糖である、請求項1又は2に記載の磁性粒子分散剤。
【請求項４】
前記医薬的に許容可能なコーティング材料は、カルボキシ化多糖、好ましくはカルボキシメチル化多糖、より好ましいカルボキシメチルデキストラン又はカルボキシメチルデキストリンである、請求項3に記載の磁性粒子分散剤。
【請求項５】
前記医薬的に許容可能なコーティング材料は、D-マンニトール、グルコース、D-マンノース、フルクトース、ソルビトール、イノシトールからなる群より選択される単糖、好ましくはD-マンニトールである、請求項1又は2に記載の磁性粒子分散剤。
【請求項６】
前記医薬的に許容可能なコーティング材料は、クエン酸又はD-グルコン酸からなる群より選択されるヒドロキシカルボン酸である、請求項1又は2に記載の磁性粒子分散剤。
【請求項７】
前記ナノ粒子酸化鉄は、マグネタイト(Fe3O4)、マグヘマイト(γ-Fe2O3)、Mo、Cr、Mn、Co、Cu、Ni、Znを有する鉄混合酸化物又はそれらの混合物、好ましくはマグネタイト及び/又はマグヘマイト、より好ましくは酸化鉄の合計含有量に対して少なくとも70重量%の量のマグネタイト及び/又はマグヘマイトを含む、請求項1〜6のいずれかに記載の磁性粒子分散剤。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれかに記載の磁性粒子分散剤を作成する方法であって、
a)  アルカリ性溶液を用いて鉄(II)塩溶液からグリーンラストのアルカリ沈殿を行なうステップであって、前記アルカリ性溶液は、ステップb)の後に得られる酸化鉄ナノ粒子を有する分散剤のpH値を7.9〜9.0に保証する量を加えるステップと、
b)  酸化剤を用いて酸化を行い、マグネタイト及びマグヘマイトを含むナノ粒子酸化鉄結晶に形成するステップと、
c)  任意に、磁気分離によって粒子を精製するステップと、
d)  医薬的に許容可能なコーティング材料を用いて前記粒子をコーティングし、次に、85〜100℃で加熱又は100〜400℃且つ1〜240barでの加圧滅菌を行い、前記粒子の成長、凝集及びサイズに影響を与えるステップ、又は
d)  前記粒子の成長、凝集及びサイズに影響を与える85〜100℃でのコーティングを行っていない粒子を加熱し、次に、医薬的に許容可能なコーティング材料によって粒子をコーティングし、その後、85〜100℃の加熱又は100〜400℃且つ1〜240barでの加圧滅菌を行ない、前記粒子の成長、凝集及びサイズに影響を与えるステップと、
e)  磁気分離による得られた粒子を分画し、限外ろ過、透析、遠心及び/又はダイアフィルトレーションを用いてろ液又は上清が10μS未満の伝導率値になるまでそれらを洗浄し、アルカリの追加後又は追加することなく磁気分離によってそれらを再分画するステップ、からなるa)からe)の5つのステップを有する方法。
【請求項９】
塩化鉄(II)四水和物又は硫酸鉄(II)七水和物の水溶液を鉄(II)塩溶液として使用する、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
ステップb)における酸化は、酸化剤として、H2O2、純酸素、大気中酸素、NaNO3、NaClO4又はNaOCl、好ましくはH2O2によって実行される、請求項8又は9に記載の方法。
【請求項１１】
ステップd)又はd')におけるコーティングされた又はコーティングされていない粒子のサイズ、凝集及び成長に影響を与える加熱は、85〜95℃、最も好ましくは約90℃で実施される、請求項8〜10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ステップd)における加熱は、2〜36時間、好ましくは4〜20時間、特に好ましくは7.5〜15時間実行する、請求項7〜10のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
請求項1〜7のいずれかに記載の磁性粒子分散剤又は請求項8〜12のいずれかに従って作成される磁性粒子分散剤及び医薬的に許容可能な補助物質を含む医薬組成物。
【請求項１４】
磁性粒子画像診断(MPI)又は磁気共鳴画像診断(MRI)による疾患の診断、好ましくは脾臓疾患、骨髄疾患、リンパノード疾患、循環器疾患、腫瘍及び脳卒中の診断に用いるための、及び、腫瘍の病期分類に用いるための、請求項1〜7のいずれかに記載の磁性粒子分散剤、請求項8〜12のいずれかに従って作成される磁性粒子分散剤又は請求項13に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
MPIによる細胞トラッキングに用いるための、請求項1〜7のいずれかに記載の磁性粒子分散剤、請求項8〜12のいずれかに従って作成される磁性粒子分散剤又は請求項13に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
温熱療法及び腫瘍治療に用いるための、請求項1〜7のいずれかに記載の磁性粒子分散剤、請求項8〜12のいずれかに従って作成される磁性粒子分散剤又は請求項13に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
好ましくは非経口鉄補充による鉄欠乏性貧血の治療に用いるための、請求項1〜7のいずれかに記載の磁性粒子分散剤、請求項8〜12のいずれかに従って作成される磁性粒子分散剤又は請求項13に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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