(57)【要約】  異なる分析物イオンの混合物を提供することと、分析物イオンに電荷を移送するように、この混合物に電子または試薬イオンを供給することと、を含む質量分析の方法を開示する。電荷を移送すると、分析物イオンの少なくとも一部は解離するが、他の分析物イオンは解離せずに電荷が変化した状態の中間体イオンを形成する。次に、この中間体イオンを他のイオンから単離し、娘イオンへと解離するように励起させる。中間体イオンとその娘イオンを分析し、互いを関連付けして、娘イオンから中間体イオンを同定できるようにする。すると、中間体イオンと分析物イオンの違いは電荷状態のみであるため、中間体イオンから分析物イオンを同定することが可能になる。本発明で開示する方法により、電子または試薬イオンと相互作用させる前に個々の分析物イオンを単離する必要なく、分析物イオンとそのフラグメントイオンを関連付けることが可能になり、よって分析物イオンを同定することが可能になる。【選択図】  図２Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析の方法であって、
（ａ）分析物分子または分析物イオンを提供することと、
（ｂ）試薬イオンまたは電子から前記分析物分子または分析物イオンに電荷を移送するように、前記分析物分子または分析物イオンに前記電子または試薬イオンを供給することと（前記電荷の移送により、前記分析物分子または分析物イオンの少なくとも一部が解離し、前記分析物分子または分析物イオンの他の部分は解離せずに電荷が変化した中間体イオンを形成する）、
（ｃ）前記中間体イオンの少なくとも一部を他のイオンから単離することと、
（ｄ）前記単離した中間体イオンの少なくとも一部を娘イオンへと解離させるように、中間体イオンの上記少なくとも一部を励起させることと、
（ｅ）前記中間体イオンの少なくとも一部を質量分析し、かつ／または前記娘イオンの少なくとも一部を質量分析することと、を含む、
方法。
【請求項２】
前記電子または試薬イオンは、大気圧イオン源内、または＞０．１ミリバール、＞１０ミリバール、＞１００ミリバール、約１バールの群より選ばれる圧力に維持されたイオン源内もしくは反応セル内で前記分析物分子または分析物イオンに供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１のステップ（ｂ）は、前記分析物分子または分析物イオンを解離させて前記中間体イオンを形成させるように、異なる分析物分子または分析物イオンの混合物に前記試薬イオンを供給することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記電子または試薬イオンは、電子捕獲解離（ＥＣＤ）または電子移動解離（ＥＴＤ）を介して前記分析物分子または分析物イオンを解離させる、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
前記中間体イオンは、前記試薬イオンまたは電子との相互作用により電荷が減少したプリカーサー分析物イオンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記電子または試薬イオンは、イオン源内または反応セル内で前記分析物分子または分析物イオンに供給され、前記中間体イオンは、前記イオン源または反応セルの下流で選択的に移送され、続いて励起されて、前記娘イオンへと解離する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記分析物イオンを提供することと、
第１信号を生成するように、最初に前記分析物イオンを前記電子または試薬イオンに曝露せずに、前記分析物イオンを分析することと、
前記分析物イオンの一部が前記中間体イオンを形成するように、前記分析物イオンを前記電子または試薬イオンに曝露することと、第２信号を生成するように、得られたイオンを質量分析することと、
前記第１信号と前記第２信号の違いを確定するように前記第１信号と前記第２信号を比較することと（前記違いは、前記中間体イオンの生成により生じたものであり、前記中間体イオンであるイオンの特性を特定するのに役立つ）、
前記信号の比較により確定された前記特性に基づいて、前記中間体イオンの少なくとも一部を単離する前記ステップを実施することと、を含む、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１信号と前記第２信号は、前記イオンを質量分析することにより生成され、前記信号の比較により確定される前記特性は、前記中間体イオンの質量または質量電荷比である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記分析物イオンを質量分析して前記第１信号を生成し、前記得られたイオンを質量分析して前記第２信号を生成することと、両信号に存在するイオンピークの１つ以上の質量電荷比の位置が前記両信号間で移動しているかを判定するように、前記第１信号と前記第２信号を比較することと、前記位置が移動した１つ以上のピークを生じさせたイオンが中間体イオンであると判断することと、を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
マスフィルタを用いて前記中間体イオンを質量選択的に移送することにより、前記中間体イオンが他のイオンから単離される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記中間体イオンを移送し、他のイオンはフィルタで除去するようにＲＦロッドセットを設定することにより、前記中間体イオンが単離される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１信号と前記第２信号はイオン移動度分離器を用いて生成され、前記信号を比較することにより前記中間体イオンのイオン移動度が確定し、好ましくは、前記イオン移動度を用いて前記中間体イオンが単離される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記中間体イオンとその娘イオンを関連付けるように、前記中間体イオンとその娘イオンの両方が分析される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
解離して娘イオンを形成した前記中間体イオンの少なくとも一部が、その娘イオンから同定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記同定された中間体イオンを用いることにより、前記中間体イオンの派生元の前記分析物分子または分析物イオンが同定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
以下の手法：衝突誘起解離（ＣＩＤ）、電磁波による励起、Ｘ線による励起、赤外線または紫外線による励起、表面誘起解離（ＳＩＤ）、電子移動解離、および電子捕獲解離、のうちの１つ以上により解離するように前記中間体イオンが励起される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記分析物イオンまたは分析物分子は生体分子に由来する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記分析物イオンまたは分析物分子は、ジスルフィド結合した生体分子を含有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記電子は、光イオン化、高圧コロナ放電もしくはグロー放電、またはプラズマのうちのいずれか１つを用いて生成される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
質量分析の方法であって、
異なる分析物分子または分析物イオンの混合物を提供することと、
試薬イオンまたは電子から前記分析物分子または分析物イオンに電荷を移送するように、前記異なる分析物分子または分析物イオンの混合物に前記電子または試薬イオンを提供することと（前記電荷の移送により、前記分析物分子または分析物イオンの少なくとも一部が解離し、前記分析物分子または分析物イオンの他の部分は解離せずに電荷が変化した中間体イオンを形成する）、
前記中間体イオンの少なくとも一部を他のイオンから単離することと、
前記単離した中間体イオンの少なくとも一部を娘イオンへと解離させるように、中間体イオンの前記少なくとも一部を励起させることと、
前記中間体イオンの少なくとも一部とその娘イオンとを関連付けるように、前記中間体イオンの少なくとも一部と、その娘イオンの少なくとも一部とを分析することと、
前記中間体イオンの娘イオンから中間体イオンを同定することと、を含む、
方法。
【請求項２１】
前記同定された中間体イオンを用いて、前記中間体イオンの派生元の前記分析物分子または分析物イオンを同定することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
分析物分子または分析物イオンを受け取るためのイオン源または反応セルと、
試薬イオンまたは電子から前記分析物分子または分析物イオンに電荷を移送するように、前記イオン源または反応セル内で前記分析物分子または分析物イオンに前記電子または試薬イオンを供給する手段と（前記電荷の移送により、前記分析物分子または分析物イオンの少なくとも一部が解離し、前記分析物分子または分析物イオンの他の部分は解離せずに電荷が変化した中間体イオンを形成する）、
前記中間体イオンの少なくとも一部を他のイオンから単離する手段と、
前記単離した中間体イオンの少なくとも一部を娘イオンへと解離させるように、中間体イオンの前記少なくとも一部を励起させる手段と、
前記中間体イオンの少なくとも一部を質量分析し、かつ／または前記娘イオンの少なくとも一部を質量分析する手段と、を含む、
質量分析計。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれかに記載の方法を実施するように構成された、請求項２２に記載の質量分析計。
【請求項２４】
異なる分析物分子または分析物イオンの混合物を受け取るためのイオン源または反応セルと、
試薬イオンまたは電子から前記分析物分子または分析物イオンに電荷を移送するように、前記イオン源または反応セル内で前記異なる分析物分子または分析物イオンの混合物に前記電子または試薬イオンを供給する手段と（前記電荷の移送により、前記分析物分子または分析物イオンの少なくとも一部が解離し、前記分析物分子または分析物イオンの他の部分は解離せずに電荷が変化した中間体イオンを形成する）、
前記中間体イオンの少なくとも一部を他のイオンから単離する手段と、
前記単離した中間体イオンの少なくとも一部を娘イオンへと解離させるように、中間体イオンの前記少なくとも一部を励起させる手段と、
前記中間体イオンの少なくとも一部と、その娘イオンの少なくとも一部とを質量分析する手段であって、前記中間体イオンの少なくとも一部とその娘イオンとを関連付けるように構成された手段と、
前記中間体イオンの娘イオンから中間体イオンを同定する手段と、を含む、
質量分析計。
【請求項２５】
前記同定された中間体イオンを用いて、前記中間体イオンの派生元の前記分析物分子または分析物イオンを同定する手段をさらに含む、請求項２４に記載の質量分析計。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２０１２年４月５日に出願された英国特許出願第１２０６３０９．５号および２０１２年１０月１６日に出願された英国特許出願第１２１８５１７．９号の優先権および利益を主張するものである。参照により、これらの出願の内容全体が本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、試薬イオンまたは電子を用いて分析物イオンまたは分析物分子に電荷を移送して、分析物イオンまたは分析物分子を娘イオンへと解離させる質量分析の方法に関する。娘イオンを用いて分析物の同定を支援することができる。本発明は、この方法を実施するための質量分析計にも関する。
【背景技術】
【０００３】
イオンを解離させるための大気圧電子捕獲解離（ＡＰ−ＥＣＤ）の使用が公知である。ＡＰ−ＥＣＤは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）イオン源により生成されたイオン種のすべてを、ＵＶランプから生じる光電子と反応させることを伴う。分析物の混合物の場合、フラグメントイオンスペクトルには、光イオン化された溶媒バックグラウンドピークによる干渉、ドーパントイオンとその派生物、未反応の前駆体の他、様々なプリカーサーイオンに由来するフラグメントおよび電荷減少種の混合物が含まれ、フラグメントイオンスペクトルが複雑になることがある。分析成分を時間内に分離するように液体クロマトグラフィを使用し、かつ／または減算法を用いてスペクトルからバックグラウンドノイズを除去することにより、このような複雑さを部分的に軽減することができる。しかしながら、スペクトルデータを元にプリカーサーイオンをそのフラグメントイオンに割り当てることは、依然として困難であり得る。現在のところ、ＡＰ−ＥＣＤ源は、プリカーサーイオンを選択してからフラグメントイオンとそのプリカーサーイオンとを関連付ける手段を有していない。その理由は、ＡＰ−ＥＣＤ源においては、質量分析計の上流、すなわちプリカーサーイオンが選択可能になる前にフラグメンテーションが発生するからである。上記の問題は、ＡＰ−ＥＣＤ手法の分析有用性および商業的受入れを制限している。
【０００４】
従来の電子捕獲解離（ＥＣＤ）および電子移動解離（ＥＴＤ）は、ＭＳ／ＭＳ測定器において、プリカーサーイオンとそのフラグメントイオンを関連付けるように使われてきた。上述のＡＰ−ＥＣＤ手法とは異なり、従来のＥＣＤおよびＥＴＤ ＭＳ／ＭＳ測定器は、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）質量分析計の超低真空セル内、または四重極イオントラップもしくは進行波イオンガイドの低圧ＲＦ閉じ込めセル内で、それぞれイオン−電子反応を用いる。このような従来手法では、ＭＳ／ＭＳシステムのＭＳ１モードを用いてプリカーサーイオンを選択し、それに続いて、選択されたプリカーサーイオンにイオン−イオン反応またはイオン−電子反応を施す。得られた生成物には、ｃおよびｚタイプのフラグメントイオンのシグネチャが含まれるが、多くの種で、まだ解離せずに非共有相互作用により保持される中間体種も生成される。このような中間生成物は、通常は電荷が減少したプリカーサーイオンであり、解離していないという理由から、ＥＣＤイオン、ＥＴＤイオンではなく、「ＥＣｎｏＤ」イオン、「ＥＴｎｏＤ」イオンと呼ばれる。ＥＣＤおよびＥＴＤのｃおよびｚフラグメントイオンの存在度をさらに改善するために、追加のイオン活性化により非解離中間体種のフラグメンテーションを支援することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
改良された質量分析方法および改良された質量分析計を提供することが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、質量分析の方法が提供され、この方法は、
（ａ）分析物分子または分析物イオンを提供することと、
（ｂ）試薬イオンまたは電子から上記分析物分子または分析物イオンに電荷を移送するように、上記分析物分子または分析物イオンに上記電子または試薬イオンを供給することと（上記電荷の移送により、上記分析物分子または分析物イオンの少なくとも一部が解離し、上記分析物分子または分析物イオンの他の部分は解離せずに電荷が変化した中間体イオンを形成する）、
（ｃ）上記中間体イオンの少なくとも一部を他のイオンから単離することと、
（ｄ）上記単離した中間体イオンの少なくとも一部を娘イオンへと解離させるように、中間体イオンの上記少なくとも一部を励起させることと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前に上記中間体イオンの少なくとも一部を分析し、かつ／または上記娘イオンの少なくとも一部を分析することと、を含む。
【０００７】
上記背景技術のセクションに記載されている通り、分析物イオンに対して従来の手法で電子捕獲解離（ＥＣＤ）または電子移動解離（ＥＴＤ）を施した場合、得られるフラグメントイオンスペクトルが複雑になり得ることから、特定のフラグメントイオンとその派生元の分析物イオンを関連付けることが困難になることがある。本発明では、いくつかのプリカーサーイオンは、ＥＣＤ反応またはＥＴＤ反応を受けた後も、電荷状態が変化する以外は実質的に同一のまま残り、これらのイオンを用いてスペクトル分析を単純化できると認識している。電荷が変化したプリカーサーイオンは中間体イオンと呼ばれる。中間体イオンは、そのプリカーサーイオンと実質的に同一のままであることが知られているので、ＥＣＤ反応またはＥＴＤ反応が発生した後に存在する他のイオンから中間体イオンを単離することが可能である。次に、単離した中間体イオンを励起させて娘イオンへと解離させ、この娘イオンを分析する。これにより、ＥＣＤまたはＥＴＤのフラグメントスペクトルに存在する中間体イオンの娘イオンを、中間体イオンと関連付けることが可能になる。このように、フラグメントイオンを中間体イオンに割り当てることが可能であり、ゆえに分析物イオンに割り当てることが可能であるので、本発明を用いてＥＣＤおよびＥＴＤのフラグメントスペクトルを単純化することができる。
【０００８】
さらに、本発明の手法は、比較的高圧のイオン源または反応領域（例えば大気圧のイオン源または領域）で使用できる点で有利である。上記背景技術のセクションに記載されている通り、従来、既知のプリカーサーイオンにＥＣＤ反応を施し、ゆえにプリカーサーイオンとそのＥＣＤ娘イオンとを直接関連付けるには、ＥＣＤ反応の前にプリカーサーイオンの選択を行う必要があると考えられていた。このようなプリカーサーイオンの選択は、通常、ＥＣＤ反応セルの上流に配置された低圧領域で実施する必要がある。対照的に、本発明の手法では、ＥＣＤ反応セルまたはＥＴＤ反応セルの上流に低圧領域を配置する必要なく、イオンをその娘イオンと関連付けることができる。なぜなら、ＥＣＤ反応またはＥＴＤ反応の前にプリカーサーイオンを選択する必要がないからである。
【０００９】
本発明によれば、他のイオンから上記中間体イオンを単離する上記ステップ中に、他のすべてのイオンから中間体イオンが単離され得る。中間体イオンは、すべてのプリカーサー分析物イオンまたは分子から単離され、かつＥＣＤまたはＥＴＤのすべてのフラグメントイオンから単離され得る。
【００１０】
好ましくは、上記分析ステップは、中間体イオンを分析することと、分析後の中間体イオンから派生した娘イオンを分析することと、を含む。上記分析ステップは、好ましくは、中間体イオンおよび／または娘イオンを質量分析することを含む。
【００１１】
中間体イオンを単離し励起させるステップおよび娘イオンを分析するステップは、好ましくは、分析後の娘イオンをその派生元中間体イオンと相関させるように行う。したがって、例えば、中間体イオンおよびその娘イオンのリストが含まれたデータベースを検索することにより、娘イオンからその中間体イオンが同定され得る。同定された中間体イオンから、同一イオンであるが電荷状態が異なるイオンとして分析物イオンまたは分析物分子が同定され得る。次に、例えば、分析種とそのイオンを相関させたデータベースを検索することにより、分析物イオンまたは中間体イオンから分析種が同定され得る。
【００１２】
電子または試薬イオンは、好ましくは、大気圧イオン源内、または＞０．１ミリバール、＞１０ミリバール、＞１００ミリバール、約１バールの群より選ばれる圧力に維持された反応セル内で、分析物分子または分析物イオンに供給される。
【００１３】
好ましくは、上記方法は、電子または試薬イオンと相互作用するための異なる分析物分子または分析物イオンの混合物を提供することを含む。このことは、イオンを試薬イオンまたは電子と反応させて解離を起こす前に特定のプリカーサーイオンを質量選別するのとは対照的である。
【００１４】
電子または試薬イオンは、電子捕獲解離（ＥＣＤ）または電子移動解離（ＥＴＤ）を通じて、分析物分子または分析物イオンの解離を引き起こすことができる。中間体イオンは、試薬イオンまたは電子との相互作用により電荷が減少した（すなわち、より負になった）プリカーサーイオンまたは分子であり得る。しかし、本明細書では、試薬イオンから分析種に正の電荷を移送して解離を発生させ得ることを企図している。この場合、中間体イオンは、試薬イオンとの相互作用により電荷が増加した（すなわち、より正になった）プリカーサーイオンまたは分子であり得る。典型的には、試薬種は電子または試薬アニオンであり、分析物イオンはカチオンであると考えられる。しかし、試薬イオンが試薬カチオンであり、分析物イオンが分析物アニオンであり得ることも企図されている。
【００１５】
好ましくは、イオン源内または反応セル内で電子または試薬イオンが分析物分子または分析物イオンに供給され、イオン源または反応セルの下流で中間体イオンが選択的に移送され、続いて励起されて、上記娘イオンへと解離する。中間体イオンは、好ましくは質量選択的に下流に移送される。様々な時点で様々な中間体イオンが選択的に下流に移送されて励起し、様々な時点で解離してよい。
【００１６】
中間体イオンは、選択的に下流に移送することにより単離してから、励起させて解離させてよい。中間体イオンが既知の種類のイオンである場合は、既知のイオンを選択的に移送し他のイオンを排除することにより（例えば、マスフィルタを用いて目的の質量電荷比のイオンを選択的に移送し、他のイオンを排除することにより）、上記を行ってよい。あるいは、どのイオンが中間体イオンであるかが不明の場合もある。この場合、イオンを下流の励起セルに移送するのに使われる装置が、時間の進行と共に質量電荷比が徐々に上昇または低下するイオンを移送するように、この装置を走査することができる。このことは、例えば、イオンを多重極ロッドセットに通して下流へと通過させ、多重極ロッドセットに印加する電圧を変えることにより達成できる。中間体イオンが連続的に励起デバイスに移送されるので、個々の中間体イオンを解離させ分析することができ、所与の中間体イオンとその娘イオンとを関連付けることが可能になる。
【００１７】
好ましくは、上記方法は、どのイオンが中間体イオンであるかを識別することができる。上記方法は、分析物イオンを提供するステップと、第１信号を生成するように、最初に上記電子または試薬イオンに曝露せずに分析物イオンを分析するステップと、分析物イオンの一部が中間体イオンを形成するように、分析物イオンを電子または試薬イオンに曝露するステップと、第２信号を生成するように、得られたイオンを分析するステップと、を随意に含む。上記方法は、第１信号と第２信号の違いを確定するように第１信号と第２信号を比較することと（この違いは、中間体イオンの生成により生じたものであり、中間体イオンであるイオンの特性を特定するのに役立つ）、上記信号の比較により確定した特性に基づいて中間体イオンの少なくとも一部を単離するステップを実施することと、を含んでもよい。
【００１８】
イオンを質量分析することにより第１信号と第２信号を生成してもよく、この場合、中間体イオンの質量または質量電荷比が、上記信号の比較により確定される特性である。この方法の場合、第１信号と第２信号はマススペクトルを表し得る。あるいは、イオン移動度分離器を用いて第１信号と第２信号を生成してもよく、この場合、信号を比較することにより中間体イオンのイオン移動度が確定し、好ましくは、このイオン移動度を用いて中間体イオンを単離する。
【００１９】
好ましくは、上記方法は、分析物イオンを質量分析して第１信号を生成することと、上記の得られたイオンを質量分析して第２信号を生成することと、を含む。次に、第１信号と第２信号を比較することにより、１つ以上のイオンピークの質量電荷比が変化しているかを判定することができる。したがって、イオンピークを生じさせ、そのイオンピークの位置が移動しているイオンが潜在的な中間体イオンと判定され、この中間体イオンを単離し解離させてよい。ある具体例によれば、生成された第１信号では、ｍ／ｚ＝Ａの質量電荷比でピークが観察され、同位体は１／３ａｍｕだけ分離されている。このことは、対象種が３つのプロトンを有することを示し得る。あるいは、この電荷はナトリウム等の金属付加物に起因している可能性もある。例えば、この電荷は、対象種中の２つのプロトンと１つのナトリウム付加物、対象種中の１つのプロトンと２つのナトリウム付加物、または単独で３つのナトリウム付加物に起因している可能性がある。生成された第２信号では、ｍ／ｚ＝３＊Ａにピークが観察される。第１信号で観察されたのと同一種であると考えられるが、分析物イオンに電子または試薬イオンを供給するステップにより、正電荷のうちの２つが電子により中性化されている点が異なる。同様に、第１信号において、ｍ／ｚ＝Ｂの質量電荷比にピークが観察され、１／２ａｍｕだけ分離された同位体を有する場合がある。このことは、対象種が２つのプロトンを有することを示し得る。第２信号では、ｍ／ｚ＝２＊Ｂにピークが観察される。第１信号で観察されたのと同一種であると考えられるが、分析物イオンに電子または試薬イオンを供給するステップにより、プロトンのうちの１つが電子により中性化されている点が異なる。これらの例では、中間生成物（すなわち、電荷が変化した状態のプリカーサーイオン）が生成されたために、ｍ／ｚ＝３＊Ａおよびｍ／ｚ＝２＊Ａに第２信号のピークが観察された可能性があり、したがって、これらのピークに対応するイオンが単離および励起の候補となる。
【００２０】
他のイオンからの中間体イオンの単離は、マスフィルタを用いて中間体イオンを質量選択的に移送することにより行ってよい。好ましくは、中間体イオンの単離は、中間体イオンを移送し、他のイオンはフィルタで除去するように、ＲＦ多重極ロッドセットを設定することにより行う。好適な一実施形態では、マスフィルタは四重極ロッドセットである。
【００２１】
励起させＭＳ／ＭＳ分析を行う中間生成物を、データシステムにより自動選択してよい。好適な一実施形態では、ＭＳモードで中間体イオンを分析する。コンピュータによりＭＳデータを分析し、中間体イオンに対応する質量電荷比ピークを探索してよい。次に、検出されたピークの質量電荷比に対応する質量電荷比を有する中間体イオンのみを移送するように、コンピュータでマスフィルタの透過窓を選択してよい。次に、移送されたイオンを励起させ解離させて、得られた娘イオンを分析してよい。この段階で、プリカーサー中間体イオンと娘イオンとが関連していることが分かる。例えば、クロマトグラフィ、四重極マスフィルタ、および飛行時間（ＴＯＦ）質量分析器を用いる質量分析計では、試料が溶出すると、ＭＳモードのＴＯＦ質量分析器で信号が生成され、その間、四重極マスフィルタは完全に透過性であり、すべてのイオンを通過させる。コンピュータがＭＳデータを分析し、リアルタイムで質量電荷比のピークを探索する。次に、検出されたピークの質量電荷比に対応する質量電荷比のみを移送するように、コンピュータで四重極の透過窓を選択してよい。次に、移送されたイオンを、例えばＣＩＤにより励起させ解離してよく、その結果得られた娘イオンを分析する。この段階で、プリカーサーイオンとフラグメントイオンとが関連していることが分かる。このような自動化システムは、クロマトグラフィ源でない分析種源を用いて提供できることが理解されるであろう。マスフィルタは、四重極フィルタ以外のフィルタであってもよい。質量分析器は、ＴＯＦ質量分析器以外の質量分析器であってもよい。
【００２２】
中間体イオンが解離するように中間体イオンを励起させる手法として、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、電磁波による励起、赤外線もしくは紫外線レーザー光もしくはランプ照射による励起、表面誘起解離（ＳＩＤ）、電子移動解離、電子捕獲解離、またはＸ線のうちの１つ以上を使用してよい。他の励起形態を使用することも可能である。
【００２３】
分析物イオンまたは分析物分子は、好ましくは生体分子に由来する。分析物イオンまたは分析物分子は、例えばＣＩＤや従来のＥＴＤ、ＥＣＤでも解離が困難になる傾向のある、ジスルフィド結合した生体分子を含有してよい。
【００２４】
電子または試薬イオンは、任意の手段で生成してよい。電子を生成する場合、光イオン化（例えばＵＶランプ）、高圧コロナ放電もしくはグロー放電、またはプラズマ（例えば低温プラズマ）のうちいずれか１つを用いて生成してよい。
【００２５】
本発明の第２の態様からも、質量分析の方法が提供され、この方法は、
異なる分析物分子または分析物イオンの混合物を提供することと、
試薬イオンまたは電子から上記分析物分子または分析物イオンに電荷を移送するように、上記異なる分析物分子または分析物イオンの混合物に上記電子または試薬イオンを提供することと（上記電荷の移送により、上記分析物分子または分析物イオンの少なくとも一部が解離し、上記分析物分子または分析物イオンの他の部分は解離せずに電荷が変化した中間体イオンを形成する）、
上記中間体イオンの少なくとも一部を他のイオンから単離することと、
上記単離した中間体イオンの少なくとも一部を娘イオンへと解離させるように、中間体イオンの上記少なくとも一部を励起させることと、
上記中間体イオンの少なくとも一部とその娘イオンとを関連付けるように、上記中間体イオンの少なくとも一部と、その娘イオンの少なくとも一部とを分析することと、
中間体イオンの娘イオンから中間体イオンを同定することと、を含む。
【００２６】
上記方法は、好ましくは、同定された中間体イオンを用いて、これらの中間体イオンの派生元の分析物分子または分析物イオンを同定することをさらに含む。例えば、中間体イオンとその分析物分子または分析物イオンとを相関させるデータベースを検索するように、質量分析計を構成してよい。
【００２７】
上記方法は、本発明の第１の態様に関して上述されている好ましい特徴または任意の特徴のうちのいずれか１つ、または２つ以上の任意の組み合わせを有してよい。
【００２８】
本発明の第３の態様からは質量分析計が提供され、この質量分析計は、
分析物分子または分析物イオンを受け取るためのイオン源と、
試薬イオンまたは電子から上記分析物分子または分析物イオンに電荷を移送するように、上記イオン源内で上記分析物分子または分析物イオンに上記電子または試薬イオンを供給する手段と（上記電荷の移送により、上記分析物分子または分析物イオンの少なくとも一部が解離し、上記分析物分子または分析物イオンの他の部分は解離せずに電荷が変化した中間体イオンを形成する）、
上記中間体イオンの少なくとも一部を他のイオンから単離する手段と、
上記単離した中間体イオンの少なくとも一部を娘イオンへと解離させるように、中間体イオンの上記少なくとも一部を励起させる手段と、
上記中間体イオンの少なくとも一部を質量分析し、かつ／または上記娘イオンの少なくとも一部を質量分析する手段と、を含む。
【００２９】
この質量分析計は、好ましくは、本発明の第１の態様に関して上述されている好ましい特徴または任意の特徴のうちのいずれか１つ、または２つ以上の任意の組み合わせを実施するように配置され構成される。
【００３０】
本発明の第４の態様でも質量分析計が提供され、この質量分析計は、
異なる分析物分子または分析物イオンの混合物を受け取るためのイオン源または反応セルと、
試薬イオンまたは電子から上記分析物分子または分析物イオンに電荷を移送するように、上記イオン源または反応セル内で上記異なる分析物分子または分析物イオンの混合物に上記電子または試薬イオンを供給する手段と（上記電荷の移送により、上記分析物分子または分析物イオンの少なくとも一部が解離し、上記分析物分子または分析物イオンの他の部分は解離せずに電荷が変化した中間体イオンを形成する）、
上記中間体イオンの少なくとも一部を他のイオンから単離する手段と、
上記単離した中間体イオンの少なくとも一部を娘イオンへと解離させるように、上記単離した中間体イオンの少なくとも一部を励起させる手段と、
上記中間体イオンの少なくとも一部と、その娘イオンの少なくとも一部とを質量分析する手段であって、上記中間体イオンの少なくとも一部とその娘イオンとを関連付けるように構成された手段と、
上記中間体イオンの娘イオンから中間体イオンを同定する手段と、を含む。
【００３１】
この質量分析計は、好ましくは、同定された中間体イオンを用いて、これらの中間体イオンの派生元の分析物分子または分析物イオンを同定する手段をさらに含む。例えば、中間体イオンとその分析物分子または分析物イオンとを相関させるデータベースを検索するように、質量分析計を構成してよい。
【００３２】
この質量分析計は、好ましくは、本発明の第１の態様に関して上述されている好ましい特徴または任意の特徴のうちのいずれか１つ、または２つ以上の任意の組み合わせを実施するように配置され構成される。
【００３３】
本発明の第４の態様および第３に関連して上述されている質量分析計は、
（ａ）（ｉ）エレクトロスプレーイオン化（「ＥＳＩ」）イオン源、（ｉｉ）大気圧光イオン化（「ＡＰＰＩ」）イオン源、（ｉｉｉ）大気圧化学イオン化（「ＡＰＣＩ」）イオン源、（ｉｖ）マトリックス支援レーザー脱離イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）イオン源、（ｖ）レーザー脱離イオン化（「ＬＤＩ」）イオン源、（ｖｉ）大気圧イオン化（「ＡＰＩ」）イオン源、（ｖｉｉ）シリコン上脱離イオン化（「ＤＩＯＳ」）イオン源、（ｖｉｉｉ）電子衝撃（「ＥＩ」）イオン源、（ｉｘ）化学イオン化（「ＣＩ」）イオン源、（ｘ）電界イオン化（「ＦＩ」）イオン源、（ｘｉ）電界脱離（「ＦＤ」）イオン源、（ｘｉｉ）誘導結合プラズマ（「ＩＣＰ」）イオン源、（ｘｉｉｉ）高速原子衝撃（「ＦＡＢ」）イオン源、（ｘｉｖ）液体二次イオン質量分析（「ＬＳＩＭＳ」）イオン源、（ｘｖ）脱離エレクトロスプレーイオン化（「ＤＥＳＩ」）イオン源、（ｘｖｉ）ニッケル６３放射性イオン源、（ｘｖｉｉ）大気圧マトリックス支援レーザー脱離イオン化イオン源、（ｘｖｉｉｉ）サーモスプレーイオン源、（ｘｉｘ）大気サンプリンググロー放電イオン化（「ＡＳＧＤＩ」）イオン源、（ｘｘ）グロー放電（「ＧＤ」）イオン源、（ｘｘｉ）インパクタイオン源、（ｘｘｉｉ）リアルタイム直接分析（「ＤＡＲＴ」）イオン源、（ｘｘｉｉｉ）レーザースプレーイオン化（「ＬＳＩ」）イオン源、（ｘｘｉｖ）ソニックスプレーイオン化（「ＳＳＩ」）イオン源、（ｘｘｖ）マトリックス支援インレットイオン化（「ＭＡＩＩ」）イオン源、および（ｘｘｖｉ）溶媒支援インレットイオン化（「ＳＡＩＩ」）イオン源からなる群より選ばれるイオン源、ならびに／または
（ｂ）１つ以上の連続イオン源もしくはパルスイオン源、ならびに／または
（ｃ）１つ以上のイオンガイド、ならびに／または
（ｄ）１つ以上のイオン移動度分離デバイスおよび／もしくは１つ以上の電界非対称イオン移動度分光計デバイス、ならびに／または
（ｅ）１つ以上のイオントラップもしくは１つ以上のイオントラッピング領域、ならびに／または
（ｆ）（ｉ）衝突誘起解離（「ＣＩＤ」）フラグメンテーションデバイス、（ｉｉ）表面誘起解離（「ＳＩＤ」）フラグメンテーションデバイス、（ｉｉｉ）電子移動解離（「ＥＴＤ」）フラグメンテーションデバイス、（ｉｖ）電子捕獲解離（「ＥＣＤ」）フラグメンテーションデバイス、（ｖ）電子衝突もしくは衝撃解離フラグメンテーションデバイス、（ｖｉ）光誘起解離（「ＰＩＤ」）フラグメンテーションデバイス、（ｖｉｉ）レーザー誘起解離フラグメンテーションデバイス、（ｖｉｉｉ）赤外線誘起解離デバイス、（ｉｘ）紫外線誘起解離デバイス、（ｘ）ノズル−スキマー間インタフェースフラグメンテーションデバイス、（ｘｉ）インソースフラグメンテーションデバイス、（ｘｉｉ）インソース衝突誘起解離フラグメンテーションデバイス、（ｘｉｉｉ）熱源もしくは温度源フラグメンテーションデバイス、（ｘｉｖ）電界誘起フラグメンテーションデバイス、（ｘｖ）磁場誘起フラグメンテーションデバイス、（ｘｖｉ）酵素消化もしくは酵素分解フラグメンテーションデバイス、（ｘｖｉｉ）イオン−イオン反応フラグメンテーションデバイス、（ｘｖｉｉｉ）イオン−分子反応フラグメンテーションデバイス、（ｘｉｘ）イオン−原子反応フラグメンテーションデバイス、（ｘｘ）イオン−準安定イオン反応フラグメンテーションデバイス、（ｘｘｉ）イオン−準安定分子反応フラグメンテーションデバイス、（ｘｘｉｉ）イオン−準安定原子反応フラグメンテーションデバイス、（ｘｘｉｉｉ）イオンを反応させて付加イオンもしくはプロダクトイオンを形成するためのイオン−イオン反応デバイス、（ｘｘｉｖ）イオンを反応させて付加イオンもしくはプロダクトイオンを形成するためのイオン−分子反応デバイス、（ｘｘｖ）イオンを反応させて付加イオンもしくはプロダクトイオンを形成するためのイオン−原子反応デバイス、（ｘｘｖｉ）イオンを反応させて付加イオンもしくはプロダクトイオンを形成するためのイオン−準安定イオン反応デバイス、（ｘｘｖｉｉ）イオンを反応させて付加イオンもしくはプロダクトイオンを形成するためのイオン−準安定分子反応デバイス、（ｘｘｖｉｉｉ）イオンを反応させて付加イオンもしくはプロダクトイオンを形成するためのイオン−準安定原子反応デバイス、および（ｘｘｉｘ）電子イオン化解離（「ＥＩＤ」）フラグメンテーションデバイスからなる群より選ばれる１つ以上の衝突セル、フラグメンテーションセル、もしくは反応セル、ならびに／または
（ｇ）（ｉ）四重極質量分析器、（ｉｉ）２Ｄもしくは線形四重極質量分析器、（ｉｉｉ）ポールもしくは３Ｄ四重極質量分析器、（ｉｖ）ペニングトラップ質量分析器、（ｖ）イオントラップ質量分析器、（ｖｉ）磁場セクタ質量分析器、（ｖｉｉ）イオンサイクロトロン共鳴（「ＩＣＲ」）質量分析器、（ｖｉｉｉ）フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（「ＦＴＩＣＲ」）質量分析器、（ｉｘ）静電もしくはオービトラップ質量分析器、（ｘ）フーリエ変換静電もしくはオービトラップ質量分析器、（ｘｉ）フーリエ変換質量分析器、（ｘｉｉ）飛行時間質量分析器、（ｘｉｉｉ）直交加速式飛行時間質量分析器、および（ｘｉｖ）線形加速式飛行時間質量分析器からなる群より選ばれる質量分析器、ならびに／または
（ｈ）１つ以上のエネルギー分析器もしくは静電エネルギー分析器、ならびに／または
（ｉ）１つ以上のイオン検出器、ならびに／または
（ｊ）（ｉ）四重極マスフィルタ、（ｉｉ）２Ｄもしくは線形四重極イオントラップ、（ｉｉｉ）ポールもしくは３Ｄ四重極イオントラップ、（ｉｖ）ペニングイオントラップ、（ｖ）イオントラップ、（ｖｉ）磁場セクタマスフィルタ、（ｖｉｉ）飛行時間マスフィルタ、および（ｖｉｉｉ）ウィーンフィルタからなる群より選ばれる１つ以上のマスフィルタ、ならびに／または
（ｋ）イオンをパルスにして送るためのデバイスもしくはイオンゲート、ならびに／または
（ｌ）実質的に連続したイオンビームをパルスイオンビームに変換するためのデバイスと、
をさらに含んでよい。
【００３４】
質量分析計は、以下のいずれかをさらに含んでよい。
（ｉ）Ｃ−トラップ、および外側樽状電極と同心の内側紡錘状電極とを含むオービトラップ（ＲＴＭ）質量分析器であって、第１の動作モードにおいて、イオンは、Ｃ−トラップに移送されてから、オービトラップ（ＲＴＭ）質量分析器に注入され、第２の動作モードにおいて、イオンは、Ｃ−トラップに移送されてから、衝突セルもしくは電子移動解離デバイスに移送され、少なくとも一部のイオンはフラグメントイオンへと断片化され、フラグメントイオンは、Ｃ−トラップに移送された後、オービトラップ（ＲＴＭ）質量分析器へと注入される、Ｃ−トラップおよびオービトラップ質量分析器、ならびに／または
（ｉｉ）使用時にイオンが通過する開口部をそれぞれ有する複数の電極を含む積層リングイオンガイドであって、イオン経路の長さに沿って電極の間隔が増加し、イオンガイドの上流部分にある電極の開口部は第１の直径を有し、イオンガイドの下流部分にある電極の開口部は第１の直径よりも小さい第２の直径を有し、使用時に逆位相のＡＣ電圧またはＲＦ電圧が連続的電極に印加される、積層リングイオンガイド。
【００３５】
一実施形態によれば、質量分析計は、電極にＡＣ電圧またはＲＦ電圧を供給するように配置され適合されたデバイスをさらに含む。ＡＣ電圧またはＲＦ電圧は、好ましくは、（ｉ）＜５０Ｖピーク・トゥ・ピーク、（ｉｉ）５０〜１００Ｖピーク・トゥ・ピーク、（ｉｉｉ）１００〜１５０Ｖピーク・トゥ・ピーク、（ｉｖ）１５０〜２００Ｖピーク・トゥ・ピーク、（ｖ）２００〜２５０Ｖピーク・トゥ・ピーク、（ｖｉ）２５０〜３００Ｖピーク・トゥ・ピーク、（ｖｉｉ）３００〜３５０Ｖピーク・トゥ・ピーク、（ｖｉｉｉ）３５０〜４００Ｖピーク・トゥ・ピーク、（ｉｘ）４００〜４５０Ｖピーク・トゥ・ピーク、（ｘ）４５０〜５００Ｖピーク・トゥ・ピーク、および（ｘｉ）＞５００Ｖピーク・トゥ・ピークからなる群より選ばれる振幅を有する。
【００３６】
ＡＣ電圧またはＲＦ電圧は、好ましくは、（ｉ）＜１００ｋＨｚ、（ｉｉ）１００〜２００ｋＨｚ、（ｉｉｉ）２００〜３００ｋＨｚ、（ｉｖ）３００〜４００ｋＨｚ、（ｖ）４００〜５００ｋＨｚ、（ｖｉ）０．５〜１．０ＭＨｚ、（ｖｉｉ）１．０〜１．５ＭＨｚ、（ｖｉｉｉ）１．５〜２．０ＭＨｚ、（ｉｘ）２．０〜２．５ＭＨｚ、（ｘ）２．５〜３．０ＭＨｚ、（ｘｉ）３．０〜３．５ＭＨｚ、（ｘｉｉ）３．５〜４．０ＭＨｚ、（ｘｉｉｉ）４．０〜４．５ＭＨｚ、（ｘｉｖ）４．５〜５．０ＭＨｚ、（ｘｖ）５．０〜５．５ＭＨｚ、（ｘｖｉ）５．５〜６．０ＭＨｚ、（ｘｖｉｉ）６．０〜６．５ＭＨｚ、（ｘｖｉｉｉ）６．５〜７．０ＭＨｚ、（ｘｉｘ）７．０〜７．５ＭＨｚ、（ｘｘ）７．５〜８．０ＭＨｚ、（ｘｘｉ）８．０〜８．５ＭＨｚ、（ｘｘｉｉ）８．５〜９．０ＭＨｚ、（ｘｘｉｉｉ）９．０〜９．５ＭＨｚ、（ｘｘｉｖ）９．５〜１０．０ＭＨｚ、および（ｘｘｖ）＞１０．０ＭＨｚからなる群より選ばれる周波数を有する。
【００３７】
好適な一実施形態によれば、分析物イオンに電子または試薬イオンを供給することにより、分析物イオンをＥＣＤ条件またはＥＴＤ条件にさらす。このプロセスは、好ましくはＡＰ−ＥＣＤ源、ＡＰ−ＥＴＤ源等の大気圧領域内で行う。ＥＣＤ条件またはＥＴＤ条件にさらすと、一部の分析物イオンは解離し、その他の分析物イオンは非解離中間体イオンを形成する。この中間体イオンは、ＥＣＤ条件またはＥＴＤ条件により分析物イオンの電荷状態が減少して中間体イオンを形成していること以外は、派生元の分析物イオンと同じである。このような中間体イオンはＥＣｎｏＤまたはＥＴｎｏＤプロダクトイオンと呼ばれる。次に、マスフィルタを用いて中間体イオンを（例えば質量電荷比に応じて）単離する。このようなマスフィルタ処理の例として、目的の質量電荷比のイオンだけを選択的に移送するように、多重極ロッドセットにイオンを通過させ、この多重極ロッドセットに電圧を印加するという方法が挙げられる。この段階で、中間体イオンの少なくとも一部を質量分析してよい。あるいは、分析物イオンが既知であり、中間体イオンは単に電荷が変化した分析物イオンである、あるいは、中間体イオンを単離する方法から、その質量電荷比が決定される（例えばマスフィルタ処理）といった理由で、中間体イオンの識別名が既知であるため、質量分析が不要な場合もある。中間体イオンを単離した後は、中間体イオンを娘イオンへと断片化させるように、補足的な活性化を施す。中間体イオンを断片化する目的で、衝突誘起解離（ＣＩＤ）を用いてよい。この段階で娘イオンを質量分析してよく、好ましくは、その親の中間体イオンと関連付けする。
【００３８】
好ましくは、四重極飛行時間質量分析計の四重極ロッドセットを使用して、補足的活性化を受けるべき、電荷が減少したＥＣｎｏＤまたはＥＴｎｏＤ中間体イオンを選択する。このように、中間体イオンの選択前にイオン−電子ＥＣＤ反応またはイオン−イオンＥＴＤ反応が発生する場合でも、ＭＳ／ＭＳ分析を実施できる。
【００３９】
この好適な実施形態は、従来のＥＣＤおよびＥＴＤ  ＭＳ／ＭＳ手法とは実質的に異なる。その理由は、ＥＣＤ反応およびＥＴＤ反応がすでに発生した後でも、中間生成物を用いてプリカーサーイオンとその娘イオンを関連付けることができるという認識に基づく点にある。従来のＥＣＤおよびＥＴＤの手法では、電子捕獲または電子移動の事象の前にプリカーサーイオンを選択して、どのプリカーサーイオンがどの娘イオンに通じるかを把握しなければならない。このような従来手法の場合、プリカーサーイオンの選択およびＥＣＤ反応またはＥＴＤ反応を、真空条件下で発生させる必要がある。対照的に、本発明の好適な実施形態によれば、イオン選択の必要が生じる前に、分析種にＥＣＤおよびＥＴＤ反応を施すことができる。したがって、高圧力源内でＥＣＤおよびＥＴＤの手法を使用することができる。ゆえに、著しくより複雑で高コストな器具類を伴う既存の真空ＥＣＤおよびＥＴＤシステムと比べて、本発明は著しく単純化される。
【００４０】
次に、添付の下記図面を参照して、本発明の様々な実施形態を単なる例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】従来の手法を用いて試料から得たＭＳマススペクトルの図である。
【図１Ｂ】図１Ａで分析した試料にＡＰ−ＥＣＤを施し、その後に分析して得たマススペクトルの図である。
【図２Ａ】真空中で従来のＥＴＤを施した試料から得たマススペクトルの図である。
【図２Ｂ】本発明の好適な一実施形態による手法で得たマススペクトルの図である。
【図３】本発明の好適な一実施形態に従って、グルフィブリノペプチドを含む試料を質量分析して得たマススペクトルの図である。
【図４】本発明の好適な一実施形態に従って、ウシインスリンを含む試料を質量分析して得たマススペクトルの図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
図１Ａは、ＭＳデータを取得するため、従来の手法を用いて試料（サブスタンスＰ）を質量分析することにより得たマススペクトルを示す。図１Ｂは、同一試料に従来のＡＰ−ＥＣＤを施し、得られたイオンを質量分析して得たマススペクトルを示す。ＵＶランプを用いて光電子を生成し、この光電子を試料イオンと相互作用させてＥＣＤを達成することにより、ＥＣＤ条件を提供した。
【００４３】
図１Ａと図１Ｂの２つのスペクトルを比較すると分かるように、ＡＰ−ＥＣＤプロセスにより、図１Ａの親イオンが図１Ｂの娘イオンへと断片化している。この例では、分析対象試料は既知（サブスタンスＰ）であり、娘イオンピークの一部を同定することが可能である。しかし、図１Ｂのスペクトルには、未知の派生元を有する他の多くのピークが含まれており、どのピークが親イオンまたはフラグメントイオンに起因するかをこの実験から直接知ることは不可能である。分析対象試料に未知の複数の物質の混合物が含まれている場合、データはさらに複雑になり、親イオンと娘イオンのピークを識別することが一層困難になることが理解されるであろう。
【００４４】
図２Ａは、圧力０．０５ミリバールの四重極時間飛行質量分析器（ＱＴＯＦ）の進行波イオンガイド内において、試料に対して従来のＥＴＤフラグメンテーションを行ってから、得られたイオンを質量分析して得たマススペクトルを示す。この従来手法によれば、ＱＴＯＦの四重極ロッドセットを用いてプリカーサーイオンを選択する。次に、プリカーサーイオンに対して真空条件下でＥＴＤフラグメンテーションを行って、プリカーサーイオンを解離させる。得られたイオンを時間飛行質量分析器で質量分析した結果、図２Ａに示すスペクトルを得た。この従来手法では、各プリカーサーイオンを選択してから、断片化してその娘イオンを生成しているので、この従来手法の性質から、プリカーサーイオンとその娘イオンとを確実に互いに直接相関させることが可能になる。しかし、イオン源またはプリカーサーイオン選択の上流にＥＴＤ条件またはＥＣＤ条件が存在し、親イオンがすでにＥＴＤ条件またはＥＣＤ条件にさらされている場合、この手法では親イオンと娘イオンを関連付けることができない。
【００４５】
図２Ｂは、本発明の好適な一実施形態に従って、サブスタンスＰを含む試料を質量分析して得たマススペクトルを示す。この実施形態では、ＵＶランプを用いて試薬電子を生成することにより、プリカーサーイオンの混合物に対して大気圧でＥＣＤフラグメンテーションを行った。次に、得られたイオンを質量分析してスペクトルデータを得た。プリカーサーイオンをＥＣＤ反応条件にさらすと、多くのプリカーサーイオンはフラグメントイオンへと解離するが、一部のプリカーサーイオンは、解離せず単に電荷状態が変化して、ＥＣｎｏＤと呼ばれる中間体イオンを形成する場合がある。この手法では、ＥＣｎｏＤ中間体イオンを識別した後、四重極ロッドセットに質量選択的に通過させることにより、ＥＣｎｏＤ中間体イオンを他のイオンから単離し、同時に他のイオンは排除した。次に、この中間体イオンがフラグメントイオンに解離するよう誘発するため、中間体イオンを穏やかなＣＩＤ条件にさらした。次に、フラグメントイオンを質量分析した。この手法で得たスペクトルデータを図２Ｂに示す。
【００４６】
この好適な実施形態では、電荷状態が変化したためにマススペクトルにおいて質量電荷比の位置が変化したプリカーサーイオン質量ピークを探すことにより、ＥＣｎｏＤイオンを識別した。この例では、サブスタンスＰを含有する試料をイオン化してから質量分析して、（図１Ａに示す）第１のマススペクトルデータを生成した。質量電荷比４５０の位置でサブスタンスＰの三価プロトン化（triply protonated）カチオンが観察され、同じ第１のマススペクトルデータの質量電荷比６７４の位置でサブスタンスＰの二価プロトン化（doubly protonated）カチオンが観察される。次に、親イオンを大気圧ＥＣＤ条件にさらして、マススペクトルデータを得た（図１Ｂ）。この操作は、ＵＶランプを用いて試薬電子を生成し、この試薬電子を親イオンと相互作用させることにより行った。親イオンをＥＣＤ条件にさらした結果、中間体ＥＣｎｏＤイオン（すなわち電荷が減少した非解離の親イオン）が生成された。次に、ＥＣＤ条件から得たイオンを質量分析して、第２のマススペクトルデータを生成した。この段階で、第１のマススペクトルデータに見られたサブスタンスＰの三価（triply）および／または二価（doubly）プロトン化カチオンの電荷がＥＣＤ条件により減少して、第２のマススペクトルデータでは、質量電荷比１３４８、１３４９にサブスタンスＰの一価（singly charged）種（１つまたは２つの電子で中性化されたプロトンを有する）が観察され、このことを認識することにより、中間体ＥＣｎｏＤイオンを識別することが可能になった。したがって、中間体イオンは、質量電荷比１３４８および１３４９を有するものとして識別された。中間体ＥＣｎｏＤイオンを識別した後、これらの中間体イオンだけを選択的に移送するように設定された四重極ロッドセットにイオンを通過させて、これらの中間体イオンを単離した。中間体イオンを単離した後、娘イオンへと解離するように中間体イオンに衝突誘起解離（「ＣＩＤ」）を施した。次に、娘イオンを質量分析して、図２Ｂに示すマススペクトルを生成した。
【００４７】
図２Ａと図２Ｂを比較すると、図２Ｂに示す好適な実施形態で生成された娘イオンの性質が、図２Ａの示す娘イオンと類似していることが明らかである。言い換えれば、この２つの手法は類似のｃおよび／またはｚイオンを生成しており、娘イオンからプリカーサーイオンまたは親イオンを確実に同定する上で、好適な実施形態を使用できることを示している。
【００４８】
留意すべきことは、好適な実施形態の場合、娘イオンに解離させるために中間体イオンの補助的励起を促進するのに必要な衝突エネルギーが、従来のＣＩＤフラグメンテーションで通常必要とされるエネルギーと比べて著しく低いことである。実際、衝突エネルギーは、従来のＣＩＤフラグメントイオンの含有を低減できるほど十分低いエネルギーに設定できる。それにもかかわらず、いくつかの試料でｙ−イオンが生成される場合がある。ｙ−イオンは従来からＣＩＤフラグメンテーションと関連付けられており、実際にＥＣＤプロセスから派生しているかどうかは分かっていない。
【００４９】
図３は、本発明の好適な一実施形態に従って、グルフィブリノペプチドを含む試料を質量分析することにより得たマススペクトルを示す。グルフィブリノペプチドを含有する試料をイオン化してから質量分析して、第１のマススペクトルデータを生成した。第１のマススペクトルデータでは、２＋イオンと３＋イオン（および他のイオン）の混合物が検出された。次に、親イオンを大気圧ＥＣＤ条件にさらした。親イオンをＥＣＤ条件にさらした結果、中間体ＥＣｎｏＤイオン（すなわち電荷が減少した非解離の親イオン）が生成された。次に、ＥＣＤ条件から得たイオンを質量分析して、第２のマススペクトルデータを生成した。この段階で、第１のマススペクトルデータに見られた三価（triply）および二価（doubly）プロトン化カチオンの電荷がＥＣＤ条件により減少して、第２のマススペクトルデータでは、一価（singly charged）カチオン（１つまたは２つの電子で中性化されたプロトンを有する）の信号が著しく増加したことが観察され、このことを認識することにより、中間体ＥＣｎｏＤイオンを識別することが可能になった。したがって、中間体イオンは、第２のマススペクトルデータで信号を増加させたイオンとして識別された。中間体ＥＣｎｏＤイオンを識別した後、これらの中間体イオンだけを選択的に移送するように設定された四重極ロッドセットにイオンを通過させて、これらの中間体イオンを単離した。中間体イオンを単離した後、娘イオンへと解離するように中間体イオンに衝突誘起解離（「ＣＩＤ」）を施した。次に、得られた娘イオンを質量分析して、図３（ｚイオンを示している図）に示すマススペクトルを生成した。
【００５０】
図４は、本発明の好適な一実施形態に従って、ウシインスリンを含む試料（分子量５７３０）を質量分析して得たマススペクトルを示す。図２Ｂおよび図３に関して上述した方法と実質的に同じ方法で試料を分析した。プリカーサーイオンを大気圧ＥＣＤ条件にさらした結果、プリカーサーイオンの電荷が２＋に減少して中間体ＥＣｎｏＤイオンが形成された。次に、励起およびＣＩＤフラグメンテーションによるフラグメンテーションを行うため、この２＋の中間体ＥＣｎｏＤイオンを四重極ロッドセットにより選択した。この手法により、ウシインスリンのβ鎖のＮおよびＣ末端フラグメンテーションを含む高い配列包括度が得られた。得られた娘イオンのスペクトルを図４に示す。留意すべき重要なことは、α鎖とβ鎖はジスルフィド結合で二重に連結されており、従来は、たとえ従来型の真空ＥＣＤや真空ＥＴＤを用いても、断片化するのが非常に困難であったことである。このように、本発明の好適な実施形態は、この種の結合を断片化するための改良された方法を提供する。
【００５１】
好適な実施形態を参照して本発明を説明したが、当業者であれば、添付の請求項に記載の本発明の範囲を逸脱することなく、形態および詳細を様々に変更できることを理解するであろう。
【図１Ａ】
2015512523.tif 000003
【図１Ｂ】
2015512523.tif 000004
【図２Ａ】
2015512523.tif 000005
【図２Ｂ】
2015512523.tif 000006
【図３】
2015512523.tif 000007
【図４】
2015512523.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成26年12月4日(2014.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析の方法であって、
（ａ）異なる分析物分子または分析物イオンの混合物を提供することと、
（ｂ）試薬イオンまたは電子から前記分析物分子または分析物イオンに電荷を移送するように、前記異なる分析物分子または分析物イオンの混合物に前記電子または試薬イオンを供給することと（前記電荷の移送により、前記分析物分子または分析物イオンの少なくとも一部が解離し、前記分析物分子または分析物イオンの他の部分は解離せずに電荷が変化した中間体イオンを形成する）、
（ｃ）前記中間体イオンの少なくとも一部を他のイオンから単離することと、
（ｄ）前記単離した中間体イオンの少なくとも一部を娘イオンへと解離させるように、中間体イオンの前記少なくとも一部を励起させることと、
（ｅ）前記中間体イオンの少なくとも一部を質量分析し、かつ／または前記娘イオンの少なくとも一部を質量分析することと、を含む、
方法。
【請求項２】
前記電子または試薬イオンは、大気圧イオン源内、または＞０．１ミリバール、＞１０ミリバール、＞１００ミリバール、約１バールの群より選ばれる圧力に維持されたイオン源内もしくは反応セル内で前記分析物分子または分析物イオンに供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電子または試薬イオンは、電子捕獲解離（ＥＣＤ）または電子移動解離（ＥＴＤ）を介して前記分析物分子または分析物イオンを解離させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記中間体イオンは、前記試薬イオンまたは電子との相互作用により電荷が減少したプリカーサー分析物イオンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記電子または試薬イオンは、イオン源内または反応セル内で前記分析物分子または分析物イオンに供給され、前記中間体イオンは、前記イオン源または反応セルの下流で選択的に移送され、続いて励起されて、前記娘イオンへと解離する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記分析物イオンを提供することと、
第１信号を生成するように、最初に前記分析物イオンを前記電子または試薬イオンに曝露せずに、前記分析物イオンを分析することと、
前記分析物イオンの一部が前記中間体イオンを形成するように、前記分析物イオンを前記電子または試薬イオンに曝露することと、第２信号を生成するように、得られたイオンを分析することと、
前記第１信号と前記第２信号の違いを確定するように前記第１信号と前記第２信号を比較することと（前記違いは、前記中間体イオンの生成により生じたものであり、前記中間体イオンであるイオンの特性を特定するのに役立つ）、
前記信号の比較により確定された前記特性に基づいて、前記中間体イオンの少なくとも一部を単離する前記ステップを実施することと、を含む、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１信号と前記第２信号は、前記イオンを質量分析することにより生成され、前記信号の比較により確定される前記特性は、前記中間体イオンの質量または質量電荷比である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記分析物イオンを質量分析して前記第１信号を生成し、前記得られたイオンを質量分析して前記第２信号を生成することと、両信号に存在するイオンピークの１つ以上の質量電荷比の位置が前記両信号間で移動しているかを判定するように、前記第１信号と前記第２信号を比較することと、前記位置が移動した１つ以上のピークを生じさせたイオンが中間体イオンであると判断することと、を含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
マスフィルタを用いて前記中間体イオンを質量選択的に移送することにより、前記中間体イオンが他のイオンから単離される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記中間体イオンを移送し、他のイオンはフィルタで除去するようにＲＦロッドセットを設定することにより、前記中間体イオンが単離される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１信号と前記第２信号はイオン移動度分離器を用いて生成され、前記信号を比較することにより前記中間体イオンのイオン移動度が確定し、好ましくは、前記イオン移動度を用いて前記中間体イオンが単離される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記中間体イオンとその娘イオンを関連付けるように、前記中間体イオンとその娘イオンの両方が分析される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
解離して娘イオンを形成した前記中間体イオンの少なくとも一部が、その娘イオンから同定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記同定された中間体イオンを用いることにより、前記中間体イオンの派生元の前記分析物分子または分析物イオンが同定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
以下の手法：衝突誘起解離（ＣＩＤ）、電磁波による励起、Ｘ線による励起、赤外線または紫外線による励起、表面誘起解離（ＳＩＤ）、電子移動解離、および電子捕獲解離、のうちの１つ以上により解離するように前記中間体イオンが励起される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記分析物イオンまたは分析物分子は生体分子に由来する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記分析物イオンまたは分析物分子は、ジスルフィド結合した生体分子を含有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記電子は、光イオン化、高圧コロナ放電もしくはグロー放電、またはプラズマのうちのいずれか１つを用いて生成される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
質量分析の方法であって、
異なる分析物分子または分析物イオンの混合物を提供することと、
試薬イオンまたは電子から前記分析物分子または分析物イオンに電荷を移送するように、前記異なる分析物分子または分析物イオンの混合物に前記電子または試薬イオンを提供することと（前記電荷の移送により、前記分析物分子または分析物イオンの少なくとも一部が解離し、前記分析物分子または分析物イオンの他の部分は解離せずに電荷が変化した中間体イオンを形成する）、
前記中間体イオンの少なくとも一部を他のイオンから単離することと、
前記単離した中間体イオンの少なくとも一部を娘イオンへと解離させるように、中間体イオンの前記少なくとも一部を励起させることと、
前記中間体イオンの少なくとも一部とその娘イオンとを関連付けるように、前記中間体イオンの少なくとも一部と、その娘イオンの少なくとも一部とを分析することと、
前記中間体イオンの娘イオンから中間体イオンを同定することと、を含む、
方法。
【請求項２０】
前記同定された中間体イオンを用いて、前記中間体イオンの派生元の前記分析物分子または分析物イオンを同定することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
異なる分析物分子または分析物イオンの混合物を受け取るためのイオン源または反応セルと、
試薬イオンまたは電子から前記分析物分子または分析物イオンに電荷を移送するように、前記イオン源または反応セル内で前記異なる分析物分子または分析物イオンの混合物に前記電子または試薬イオンを供給する手段と（前記電荷の移送により、前記分析物分子または分析物イオンの少なくとも一部が解離し、前記分析物分子または分析物イオンの他の部分は解離せずに電荷が変化した中間体イオンを形成する）、
前記中間体イオンの少なくとも一部を他のイオンから単離する手段と、
前記単離した中間体イオンの少なくとも一部を娘イオンへと解離させるように、中間体イオンの前記少なくとも一部を励起させる手段と、
前記中間体イオンの少なくとも一部を質量分析し、かつ／または前記娘イオンの少なくとも一部を質量分析する手段と、を含む、
質量分析計。
【請求項２２】
請求項１〜１８のいずれかに記載の方法を実施するように構成された、請求項２１に記載の質量分析計。
【請求項２３】
異なる分析物分子または分析物イオンの混合物を受け取るためのイオン源または反応セルと、
試薬イオンまたは電子から前記分析物分子または分析物イオンに電荷を移送するように、前記イオン源または反応セル内で前記異なる分析物分子または分析物イオンの混合物に前記電子または試薬イオンを供給する手段と（前記電荷の移送により、前記分析物分子または分析物イオンの少なくとも一部が解離し、前記分析物分子または分析物イオンの他の部分は解離せずに電荷が変化した中間体イオンを形成する）、
前記中間体イオンの少なくとも一部を他のイオンから単離する手段と、
前記単離した中間体イオンの少なくとも一部を娘イオンへと解離させるように、中間体イオンの前記少なくとも一部を励起させる手段と、
前記中間体イオンの少なくとも一部と、その娘イオンの少なくとも一部とを質量分析する手段であって、前記中間体イオンの少なくとも一部とその娘イオンとを関連付けるように構成された手段と、
前記中間体イオンの娘イオンから中間体イオンを同定する手段と、を含む、
質量分析計。
【請求項２４】
前記同定された中間体イオンを用いて、前記中間体イオンの派生元の前記分析物分子または分析物イオンを同定する手段をさらに含む、請求項２３に記載の質量分析計。
【国際調査報告】
2015512523.tif 000009
2015512523.tif 000010
2015512523.tif 000011