(57)【要約】本発明は、寛容原性ペプチドおよびＧＳＫ−３阻害剤を含む組成物、ならびにその使用に関する。本発明はまた、炎症促進性サイトカインから抗炎症性サイトカインへのリンパ球分泌プロファイルにおけるペプチド媒介性シフトを促進するためのＧＳＫ−３阻害剤の使用に関する。ＧＳＫ−３阻害剤は、抗原特異的免疫療法を増強するのに使用することができる。本発明の一局面において、ＧＳＫ−３阻害剤は、リチウムイオン、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ２１６７６３またはＳＢ６２７７７２であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
寛容原性ペプチドおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）阻害剤を含む、組成物。
【請求項２】
前記寛容原性ペプチドが、自己抗原またはアレルゲン由来のペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＧＳＫ−３阻害剤がリチウムイオンである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＧＳＫ−３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ２１６７６３またはＳＢ６２７７７２である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
自己免疫性疾患、アレルギー反応、移植拒絶に関連する状態、または炎症およびＣＤ４＋Ｔ細胞が病因に寄与する状態、例えば脳マラリア、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病および神経障害性疼痛を処置および／または予防するための方法に使用するための、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
別個の投与、同時投与または逐次的な投与のための、寛容原性ペプチドおよびＧＳＫ−３阻害剤を含む、キット。
【請求項７】
炎症促進性Ｔ細胞に関連する疾患を処置および／または予防するための方法であって、寛容原性ペプチドおよびＧＳＫ−３阻害剤を被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項８】
前記寛容原性ペプチドおよび前記ＧＳＫ−３阻害剤を同時に投与する、逐次的に投与するまたは別個に投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
以下：
（ｉ）ペプチドおよびＧＳＫ−３阻害剤の両方による最初の処置段階；ならびに
（ｉｉ）ＧＳＫ−３阻害剤の非存在下におけるペプチドによる次の処置期
の２つの処置段階を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
炎症促進性Ｔ細胞に関連する前記疾患が、自己免疫性疾患、アレルギー反応、移植拒絶に関連する状態、ならびに炎症およびＣＤ４＋Ｔ細胞が病因に寄与する状態、例えば脳マラリア、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病および神経障害性疼痛から選択される、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記被験体が既存の状態を有するか、または移植を受ける予定であるかもしくは移植を受けている最中である、請求項７〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記被験体が、自己抗原またはアレルゲンに対して特異的な既存のＴｈ１／Ｔｈ１７またはＴｈ２免疫応答を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
抗原特異的免疫療法を増強するのに使用するための、ＧＳＫ−３阻害剤。
【請求項１４】
炎症促進性サイトカインから抗炎症性サイトカインへのＴ細胞分泌プロファイルにおけるペプチド媒介性シフトを促進するのに使用するための、ＧＳＫ−３阻害剤。
【請求項１５】
炎症促進性Ｔ細胞に関連する疾患を処置および／または予防するのに使用するための、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物または請求項６に記載のキット。
【請求項１６】
炎症促進性Ｔ細胞に関連する前記疾患が、自己免疫性疾患、アレルギー反応、移植拒絶に関連する状態、ならびに炎症およびＣＤ４＋Ｔ細胞が病因に寄与する状態、例えば脳マラリア、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病および神経障害性疼痛から選択される、請求項１５に記載の組成物またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗原特異的免疫療法に有用なキットおよび組成物に関する。キットまたは組成物は、ＧＳＫ−３阻害剤および１つ以上のペプチドを含むことができる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アレルギーおよび自己免疫性疾患の現在の処置は、その使用が重度の副作用を伴う免疫抑制薬の適用に依拠している。したがって、疾患標的化される抗原特異的薬物であって、一般的な免疫抑制よりも全身的作用が少ない抗原特異的薬物を生産する方向に向かっている。
【０００３】
可溶性形態の抗原のペプチドエピトープを投与することによって、特定の抗原（例えば、自己抗原またはアレルゲン）に対する免疫寛容を誘導可能であることが示されている。可溶性ペプチド抗原を投与することは、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ−多発性硬化症（ＭＳ）のモデル）（Ｍｅｔｚｌｅｒ  ａｎｄ  Ｗｒａｉｔｈ（１９９３）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：１１５９−１１６５；Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｗｒａｉｔｈ（１９９５）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１２５５−１２６３；Ａｎｄｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｒａｉｔｈ（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１２５１−１２６１）；ならびに関節炎、糖尿病およびブドウ膜網膜炎の実験モデル（上記Ａｎｄｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｒａｉｔｈ（１９９８）で総説されている）において疾患を抑制する有効な手段として実証されている。これはまた、進行中の疾患におけるＥＡＥを処置する手段として実証されている（上記Ａｎｄｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｒａｉｔｈ（１９９８））。
【０００４】
この抗原特異的免疫療法（抗原ＳＩＴ）が有効であるためには、ペプチドを患者に長期間にわたって高用量で反復投与する必要がある。
【０００５】
高用量ペプチド特異的療法は、細胞活性化の初期バーストとそれに続く増殖および過度のサイトカイン放出により、有害な免疫応答を引き起こすこともある。これは、多発性硬化症における改変ペプチドリガンド（ＡＰＬ）療法の試験で明らかになった。ペプチドに対するアレルギー反応が最高用量で誘導されたことが明らかになった場合に、処置が終了された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＭｅｔｚｌｅｒおよびＷｒａｉｔｈ、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）５：１１５９〜１１６５
【非特許文献２】ＬｉｕおよびＷｒａｉｔｈ、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）７：１２５５〜１２６３
【非特許文献３】ＡｎｄｅｒｔｏｎおよびＷｒａｉｔｈ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）２８：１２５１〜１２６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ペプチド療法がより低用量で、および／または用量間もしくは用量後により長期間にわたって有効である改善された抗原特異的免疫治療方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の態様の概要
本発明者は、ＧＳＫ−３阻害が、ペプチドによる寛容誘導を増強することを示した。
【０００９】
したがって、ＧＳＫ−３阻害剤は、抗原特異的免疫療法を増強するための「寛容原性アジュバント」として使用することができる。
【００１０】
したがって、第１の態様では、本発明は、ペプチドおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）阻害剤を含む組成物を提供する。
【００１１】
ペプチドは、寛容原性ペプチドであり得る。
【００１２】
ペプチドは、抗原性ペプチドであり得る。例えば、ペプチドは、自己抗原またはアレルゲンに由来し得る。
【００１３】
ＧＳＫ−３阻害剤は、リチウムイオン、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ２１６７６３またはＳＢ６２７７７２を含むことができる。
【００１４】
第２の態様では、本発明は、自己免疫性疾患、アレルギー反応、移植拒絶に関連する状態、または炎症およびＣＤ４＋Ｔ細胞が病因に寄与する状態、例えば脳マラリア、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病および神経障害性疼痛を処置および／または予防するための方法に使用するための本発明の第１の態様の組成物を提供する。
【００１５】
第３の態様では、本発明は、別個の投与、同時投与または逐次的な投与のための、ペプチドおよびＧＳＫ−３阻害剤を含むキットを提供する。
【００１６】
ペプチドは、寛容原性ペプチドであり得る。
【００１７】
第４の態様では、本発明は、炎症促進性Ｔ細胞に関連する疾患を処置および／または予防するための方法であって、ペプチド、例えば寛容原性ペプチドおよびＧＳＫ−３阻害剤を被験体に投与する工程を含む方法を提供する。
【００１８】
ペプチドおよびＧＳＫ−３阻害剤を同時に投与する、逐次的に投与するまたは別個に投与することができる。
【００１９】
この方法は、以下の２つの処置段階を含むことができる：
（ｉ）ペプチドおよびＧＳＫ−３阻害剤による最初の処置段階；および
（ｉｉ）ＧＳＫ−３阻害剤の非存在下におけるペプチドによる次の処置期。
【００２０】
炎症促進性Ｔ細胞に関連する疾患は、自己免疫性疾患、アレルギー反応、移植拒絶に関連する状態、ならびに炎症およびＣＤ４＋Ｔ細胞が病因に寄与する状態、例えば脳マラリア、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病および神経障害性疼痛から選択され得る。
【００２１】
被験体は既存の状態を有していてもよいし、または移植を受ける予定でもよいしもしくは移植を受けている最中でもよい。
【００２２】
被験体は、自己抗原またはアレルゲンに対して特異的な既存のＴｈ１／Ｔｈ１７またはＴｈ２免疫応答を有し得る。
【００２３】
第５の態様では、本発明は、抗原特異的免疫療法を増強するのに使用するためのＧＳＫ−３阻害剤を提供する。
【００２４】
第６の態様では、本発明は、炎症促進性サイトカインから抗炎症性サイトカインへのＴ細胞分泌プロファイルにおけるペプチド媒介性シフトを促進するのに使用するためのＧＳＫ−３阻害剤を提供する。
【００２５】
第７の態様では、本発明は、炎症促進性Ｔ細胞に関連する疾患を処置および／または予防するのに使用するための本発明の第１の態様の組成物または本発明の第３の態様のキットを提供する。
【００２６】
第８の態様では、本発明は、炎症促進性Ｔ細胞に関連する疾患を処置および／または予防するのに使用するための医薬の製造における寛容原性ペプチドおよびＧＳＫ−３阻害剤の使用を提供する。
【００２７】
炎症促進性Ｔ細胞に関連する疾患は、自己免疫性疾患、アレルギー反応、移植拒絶に関連する状態、ならびに炎症およびＣＤ４＋Ｔ細胞が病因に寄与する状態、例えば脳マラリア、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病および神経障害性疼痛から選択され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１−１】図１：ＧＳＫ３阻害剤は、Ｔｈ１細胞においてＩＬ−１０産生の増大を誘導する。Ａ．ペプチドＭＢＰ  Ａｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１２の存在下でナイーブＴｇ４マウス由来の脾細胞を培養し、培養３日目にＩＬ−２を追加して、ＣＤ４＋細胞をＴｈ１表現型に分極させた。培養７日目に、ＤＭＳＯ（１：１０００；対照）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ＳＢ２１６７６３（５μＭ）またはＳＢ６２７７７２（１０μＭ）およびペプチドＭＢＰ  Ａｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、Ｂ１０＿ＰＬマウス由来の新鮮照射ＡＰＣを用いてＴｈ１細胞を再刺激した。培養３日目にＩＬ−２を追加し、ＰＭＡおよびイオノマイシン刺激後の再刺激７日目にＩＦＮγおよびＩＬ−１０の細胞内サイトカイン染色を行った。データはＣＤ４＋生細胞でゲーティングしたプロットであり、５回の独立した実験の代表的なものである。Ｂ．Ａに示されている５回の独立した実験からのＩＬ１０＋／ＩＦＮγ＋細胞の定量。データは平均およびＳＥＭである；＊ｐ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ；ダネット多重比較事後検定）。Ｃ．ペプチドＭＢＰ  Ａｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１２の存在下でナイーブＴｇ４マウス由来の脾細胞を培養し、培養３日目にＩＬ−２を追加して、ＣＤ４＋細胞をＴｈ１表現型に分極させた。培養７日目にＴｈ１ＣＤ４＋細胞を単離し、ＩＬ−２およびＤＭＳＯ（１：１０００；対照）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ＳＢ２１６７６３（５μＭ）またはＳＢ６２７７７２（１０μＭ）の存在下で、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングビーズを用いて再刺激した。ＰＭＡおよびイオノマイシン刺激後の再刺激７日目にＩＦＮγおよびＩＬ−１０の細胞内サイトカイン染色を行った。データはＣＤ４＋生細胞でゲーティングしたプロットであり、４回の独立した実験の代表的なものである。Ｄ．Ａに示されている６回の独立した実験からのＩＬ１０＋／ＩＦＮγ＋細胞の定量。データは平均およびＳＥＭである；＊ｐ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ；ダネット多重比較事後検定）。Ｅ．再刺激３日目に組織培養上清を採取し、蛍光ビーズイムノアッセイによってＩＬ−１０について分析した。データは平均＋／−ＳＥＭであり、３回の独立した実験の代表的なものである。Ｆ．ペプチドＭＢＰ  Ａｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１２の存在下でナイーブＴｇ４マウス由来の脾細胞を培養し、培養３日目にＩＬ−２を追加して、ＣＤ４＋細胞をＴｈ１表現型に分極させた。培養７日目に、ＤＭＳＯ（１：１０００；対照）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ＳＢ２１６７６３（５μＭ）またはＳＢ６２７７７２（１０□Ｍ）およびペプチドＭＢＰ  Ａｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、Ｂ１０＿ＰＬマウス由来の新鮮照射ＡＰＣを用いてＴｈ１細胞を再刺激した。培養３日目にＩＬ−２を追加した。再刺激７日目にＣＤ４＋生細胞を選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を用いて１６時間刺激した。ＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲによってＩＬ−１０  ｍＲＮＡを定量した。ＩＬ−１０の量をＨＰＲＴ１対照と比べて示す。Ｇ．ペプチドＭＢＰ  Ａｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１２の存在下でナイーブＴｇ４マウス由来の脾細胞を培養し、３日目にＩＬ−２を追加して、細胞を���ｈ１表現型に分極させた。７日目に、Ｂ１０＿ＰＬマウス由来の新鮮照射ＡＰＣ、ＭＢＰのペプチドＡｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）および指示濃度のＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ２１６７６３またはＳＢ６２７７７２を用いて細胞を再刺激した。再刺激７日目にＣＤ４＋細胞をＲＩＰＡ緩衝液に溶解し、ウエスタンブロッティングに供し、βカテニン抗体でプローブした。膜をストリップし、ローディング対照としてのＧＡＰＤＨについて再プローブした。
【図１−２】図１：ＧＳＫ３阻害剤は、Ｔｈ１細胞においてＩＬ−１０産生の増大を誘導する。Ｈ．ＧＳＫ−３阻害は、ナイーブＴ細胞においてＩＬ−１０を誘導しない。
【図２−１】図２：ＧＳＫ３阻害剤は、Ｔｈ２細胞においてＩＬ−１０産生の増大を誘導する。Ａ．ペプチドＭＢＰ  Ａｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）抗ＩＦＮγおよびＩＬ−４の存在下でナイーブＴｇ４マウス由来の脾細胞を培養し、培養３日目にＩＬ−２を追加して、ＣＤ４＋細胞をＴｈ２表現型に分極させた。培養７日目にＴｈ１  ＣＤ４＋細胞を単離し、ＩＬ−２およびＤＭＳＯ（１：１０００；対照）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ＳＢ２１６７６３（５μＭ）またはＳＢ６２７７７２（１０μＭ）の存在下で、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングビーズを用いて再刺激した。ＰＭＡおよびイオノマイシン刺激後の再刺激７日目にＩＬ−４およびＩＬ−１０の細胞内サイトカイン染色を行った。データはＣＤ４＋生細胞でゲーティングしたプロットであり、３回の独立した実験の代表的なものである。Ｂ．Ａに示されている３回の独立した実験からのＩＬ１０＋／ＩＦＮγ＋細胞の定量。データは平均およびＳＥＭである；＊ｐ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ；ダネット多重比較事後検定）。Ｃ．再刺激３日目に組織培養上清を採取し、蛍光ビーズイムノアッセイによってＩＬ−１０について分析した。データは平均＋／−ＳＥＭであり、３回の独立した実験の代表的なものである。
【図２−２】図２：ＧＳＫ３阻害剤は、Ｔｈ２細胞においてＩＬ−１０産生の増大を誘導する。Ｄ．ＧＳＫ−３阻害は、Ｔｈ１細胞においてＩＬ−１０を増強する。
【図３−１】図３：外因性ＩＬ−１０は、ＧＳＫ３阻害剤誘導性ＩＬ−１０産生に必要ではない。Ａ．ペプチドＭＢＰ  Ａｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１２の存在下でナイーブＴｇ４マウス由来の脾細胞を培養し、培養３日目にＩＬ−２を追加して、ＣＤ４＋細胞をＴｈ１表現型に分極させた。培養７日目に、ＤＭＳＯ（１：１０００；対照）またはＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）の存在下で、Ｂ１０＿ＰＬマウスまたはＢ１０＿ＰＬ  ＩＬ１０−／−マウスのいずれか由来の新鮮照射ＡＰＣを用いてＴｈ１細胞を再刺激した。培養３日目にＩＬ−２を追加し、ＰＭＡおよびイオノマイシン刺激後の再刺激７日目にＩＦＮλおよびＩＬ−１０の細胞内サイトカイン染色を行った。データはＣＤ４＋生細胞でゲーティングしたプロットであり、３回の独立した実験の代表的なものである。Ｂ．再刺激３日目に組織培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−１０について分析した。データは平均＋／−ＳＥＭであり、３回の独立した実験の代表的なものである。
【図３−２】図３：外因性ＩＬ−１０は、ＧＳＫ３阻害剤誘導性ＩＬ−１０産生に必要ではない。Ｃ〜Ｄ．ＧＳＫ−３阻害によって誘導されるＩＬ−１０産生の増強は、ＡＰＣによるＩＬ−１０分泌とは無関係である。
【図３−３】図３：外因性ＩＬ−１０は、ＧＳＫ３阻害剤誘導性ＩＬ−１０産生に必要ではない。Ｅ．ＧＳＫ−３阻害によって誘導されるＩＬ−１０産生の増強は、ＡＰＣによるＩＬ−１０分泌とは無関係である。
【図４】図４：ＧＳＫ３阻害は、Ｔｈ１細胞がＥＡＥをＩＬ−１０依存的に誘導する能力を無効化する。ペプチドＭＢＰ  Ａｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１２の存在下でナイーブＴｇ４マウス由来の脾細胞を培養し、３日目にＩＬ−２を追加して、細胞をＴｈ１表現型に分極させた。７日目に、ＤＭＳＯ（１：５０００；対照）または２μＭのＣＨＩＲ９９０２１の存在下で、Ｂ１０＿ＰＬマウス由来の新鮮照射ＡＰＣ、ＭＢＰのペプチドＡｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）を用いて細胞を再刺激した。再刺激３日目にＩＬ−２を追加し、４日目に腹腔内注射によって１０７個のＴｈ１細胞をＴｇ４マウスに養子移植した。移植日（０日目）および７日目に、抗ＩＬ−１０Ｒ抗体またはアイソタイプ対照（５００μｇ）もレシピエントマウスに注射した。ＥＡＥを毎日スコア化した。３回の類似実験を実施した。Ａ．疾患進行の時間経過。データは、各日からの平均ＥＡＥスコアおよびＳＥＭを示す。各群には５〜６匹のマウスが含まれていた。Ｂ．ＥＡＥ日数の疾患負荷を各マウスについて計算した。対照のメジアンスコア；アイソタイプＩｇＧ群は、ＣＨＩＲ９９０２１のものと有意に異なっていた；アイソタイプＩｇＧ群およびＣＨＩＲ９９０２１；アイソタイプＩｇＧ群は、ＣＨＩＲ９９０２１抗ＩＬ−１０Ｒ群のものと有意に異なっていた（ｐ＜０．０５；マンホイットニー検定）。
【図５】図５：ＩＬ−１０発現の安定性およびＩＬ−１０プロモーターのエピジェネティック分析。Ａ．ペプチドＭＢＰ  Ａｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１２の存在下でナイーブＴｇ４マウス由来の脾細胞を培養し、培養３日目にＩＬ−２を追加して、ＣＤ４＋細胞をＴｈ１表現型に分極させた。培養７日目に、ＤＭＳＯ（１：１０００；対照）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ＳＢ２１６７６３（５μＭ）またはＳＢ６２７７７２（１０μＭ）およびペプチドＭＢＰ  Ａｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、Ｂ１０＿ＰＬマウス由来の新鮮照射ＡＰＣを用いてＴｈ１細胞を再刺激した。培養３日目にＩＬ−２を追加した。再刺激７日目に、ペプチドＭＢＰ  Ａｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）のみの存在下で、Ｂ１０＿ＰＬマウス由来の新鮮照射ＡＰＣを用いてＣＤ４＋細胞を再刺激した。培養３日目にＩＬ−２を追加し、ＰＭＡおよびイオノマイシン刺激後のこの２回目の再刺激ラウンドの７日目にＩＦＮλおよびＩＬ−１０の細胞内サイトカイン染色を行った。データはＣＤ４＋生細胞でゲーティングしたプロットであり、２回の独立した実験の代表的なものである。Ｂ．ＣｈＩＰ実験で使用したプライマーセットの位置を示す概略図。Ｃ、Ｄ、Ｅ．ペプチドＭＢＰ  Ａｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１２の存在下でナイーブＴｇ４マウス由来の脾細胞を培養し、培養３日目にＩＬ−２を追加して、ＣＤ４＋細胞をＴｈ１表現型に分極させた。培養７日目に、ＤＭＳＯ（１：５０００；対照）またはＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）およびペプチドＭＢＰ  Ａｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、Ｂ１０＿ＰＬマウス由来の新鮮照射ＡＰＣを用いてＴｈ１細胞を再刺激した。培養３日目にＩＬ−２を追加した。ＣＤ４＋生細胞を選択し、アセチルヒストンＨ３（Ｃ）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（Ｄ）およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３（Ｅ）に対する抗体を使用してＣｈＩＰ分析を行った。
【図６】図６：ＧＳＫ３阻害は、ナイーブＣＤ４＋細胞においてＩＬ−１０産生に影響を与えない。Ａ．Ｔｇ４の脾細胞からＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞を単離し、ＩＬ−２およびＤＭＳＯ（１：１０００；対照）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ＳＢ２１６７６３（５μＭ）またはＳＢ６２７７７２（１０μＭ）の存在下で、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングビーズと共に培養した。ＰＭＡおよびイオノマイシン刺激後の再刺激７日目にＩＦＮλおよびＩＬ−１０の細胞内サイトカイン染色を行った。データはＣＤ４＋生細胞でゲーティングしたプロットであり、３回の独立した実験の代表的なものである。Ｂ．再刺激３日目に組織培養上清を採取し、蛍光ビーズイムノアッセイによってＩＬ−１０について分析した。データは、３回の独立した実験の平均＋／−ＳＥＭである。
【図７】図７：外因性ＩＬ−１０は、Ｔｈ２細胞におけるＧＳＫ３阻害剤誘導性ＩＬ−１０産生に必要ではない。
【図８】図８：ＧＳＫ３阻害剤処置は、インビボでＩＬ−１０分泌を増大させる。データはＣＤ４＋生細胞でゲーティングしたプロットであり、ＩＬ−１０発現細胞の％をグラフで示す。＊ｐ＜０．０５  。
【図９】図９：ＧＳＫ−３阻害は、Ｔｈ１細胞の脳炎誘発特性を抑制する。
【図１０】図１０：リンパ球における、ＩＬ−１０誘導に対するＧＳＫ−３阻害の示差的効果  対  β−カテニンのターンオーバー。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
詳細な説明
ＧＳＫ−３阻害剤
グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）は、グリコーゲン代謝に関与する酵素として最初に同定された。近年では、それは、多様な範囲の細胞機能を調節する重要な役割を有することが示されている。ＧＳＫ−３は、転写因子および代謝の調節に関与する酵素を含む多数の生理学的基質を有する。
【００３０】
糖尿病および神経変性疾患、例えばアルツハイマー病を処置するために、いくつかの強力なＧＳＫ−３阻害剤が過去１５年間にわたって開発されてきた。
【００３１】
ＧＳＫ−３は、単一のセリン残基（α−アイソフォームにおけるＳｅｒ２１およびβ−アイソフォームにおけるＳｅｒ−９）のリン酸化の結果として様々なアゴニストに応じて阻害される。したがって、ＧＳＫ−３は、タンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴとしても公知である）、Ｓ６キナーゼおよびリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼを含む様々なタンパク質キナーゼによって阻害され得る。
【００３２】
ＧＳＫ−３阻害剤は、マレイミドなどの低分子阻害剤であり得る。阻害剤は、以下の群から選択され得る：ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０２３、ＡＲ  Ａ０１４４１８、１−アザケンパウロン（Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）およびビス−７−インドイルマレイミド。これらの阻害剤の化学構造は、Ｃｏｈｅｎ  ａｎｄ  Ｇｏｅｄｅｒｔ（２００４）（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．３：４７９−４８７、図４を参照のこと）に示されている。ＧＳＫ−３阻害剤は、リチウムイオンまたはチエニルもしくはフェニルα−ハロメチルケトンを含むことができる。
【００３３】
いくつかのＧＳＫ−３阻害剤は発癌性の可能性がある。数種類の癌では、Ｗｎｔシグナル伝達経路の多くの構成要素が過剰発現または変異している。例えば、結腸癌の約１５％は、β−カテニンの開始変異から生じる。ＧＳＫ−３阻害剤は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を模倣するので潜在的に発癌性であると予想され得る。ＳＢ４１５２８６およびリチウムイオンなどのいくつかのＧＳＫ−３阻害剤はすべて、β−カテニンのレベルを上昇させることが示されている。しかしながら、リチウムイオンなどのＧＳＫ−３阻害剤は、気分安定剤として５０年超にわたって使用されており、それらの使用が癌のリスク増大を伴うことは知られていない。
【００３４】
本発明者らは、ＣＨＩＲ９９０２１およびＳＢ２１６７６３が、β−カテニンレベルに対する効果の点で異なることを示した（実施例５を参照のこと）。ＣＨＩＲ９９０２１の存在下では、β−カテニンの分解が阻害されて、β−カテニンタンパク質の蓄積につながると思われる。一方、ＳＢ２１６７６３の存在は、β−カテニンレベルに対する有意な効果を引き起こすとは思われない。安全上の理由により、リンパ球におけるＩＬ−１０レベルを明らかに増大させる濃度で細胞におけるβ−カテニンレベルを有意に増大させないＧＳＫ−３阻害剤を選択することができる。
【００３５】
ペプチド
「ペプチド」という用語は通常の意味で使用され、典型的には隣接アミノ酸のα−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって互いに連結された一連の残基、典型的にはＬ−アミノ酸を意味する。この用語は、改変ペプチドおよび合成ペプチド類似体を含む。
【００３６】
ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドは、典型的には７〜１３、より普通には８〜１０アミノ酸長である。このペプチドの結合は、ペプチドの主鎖内の原子と、すべてのＭＨＣクラスＩ分子のペプチド結合溝内の不変部位との接触によってその両端で安定化されている。ペプチドのアミノおよびカルボキシ末端に結合する溝の両端に不変部位がある。ペプチドの長さの変動は、ペプチド骨格内の、多くの場合には、必要な柔軟性を与えるプロリンまたはグリシン残基におけるよじれによって調整される。
【００３７】
ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドは、典型的には８〜２０アミノ酸長、より普通には１０〜１７アミノ酸長であり、さらに長くてもよい。これらのペプチドは、（ＭＨＣクラスＩペプチド結合溝とは異なり）両端が開いているＭＨＣＩＩペプチド結合溝に沿って伸長コンフォメーションで横たわる。このペプチドは、主に主鎖の原子と、ペプチド結合溝に沿って並ぶ保存残基との接触によって所定位置に保持される。
【００３８】
ペプチドは、化学的方法を使用して作ることができる。例えば、固相技術によってペプチドを合成し、樹脂から切断し、分取高速液体クロマトグラフィーによって精製することができる。自動合成は、例えば、製造業者が提供する説明書にしたがってＡＢＩ  ４３  １  Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して達成することができる。
【００３９】
あるいは、ペプチドは、組換え的手段によって、またはより長いポリペプチドからの切断によって作ることができる。例えば、ペプチドは、標的抗原からの切断によって得ることができる。ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解手順）によって確認することができる。
【００４０】
ペプチドは、標的抗原から誘導することができる。標的抗原は、疾患の経過中に抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってプロセシングされ、Ｔ細胞によって認識される分子（例えば、タンパク質または糖タンパク質）である。当然のことながら、標的抗原は、標的疾患に依存するであろう。ペプチドは、ＡＰＣによる抗原の天然のプロセシングによって生じる抗原断片から誘導することができる。標的抗原は、アレルゲンまたは自己抗原であり得る。ペプチドは、Ｔ細胞エピトープを含むことができる。
【００４１】
ペプチドは、インビボ可溶性形態で投与されると抗原に対する寛容を誘導することができるという意味で「寛容原性」であり得る。ペプチドは、抗原特異的免疫療法（抗原ＳＩＴ）に有用であり得る。
【００４２】
「寛容原性ペプチド」は単独で（ある程度）寛容を誘導することができるものでもよいし、またはＧＳＫ−３阻害剤と組み合わせた場合にのみ相当レベルの寛容を誘導することができるものでもよい。
【００４３】
ペプチドは、ＭＨＣ分子に結合することができる。ペプチドは、ＭＨＣ分子に結合してＴ細胞に提示されることができる。
【００４４】
寛容原性ペプチドは、ＭＨＣ分子に結合して、抗原プロセシングを必要とせずにＴ細胞に提示されることができる。それらは、プロセシングなしでの提示系、例えば固定化抗原提示細胞内のＭＨＣまたはプレート結合ＭＨＣに結合してＴ細胞に提示されることができる。
【００４５】
ペプチドは、疾患の処置および／または予防に有用であり得る。特に、ペプチドは、自己反応性Ｔ細胞によって媒介される疾患の処置および／または予防に有用であり得る。過敏性反応、例えばアレルギー、自己免疫および移植拒絶は、本発明のペプチドを使用する処置／予防に特に適している。
【００４６】
抗原特異的免疫療法
抗原特異的免疫療法（抗原ＳＩＴ）は、可溶性形態のその抗原の１つ以上のペプチドエピトープを投与することによって抗原に対する寛容を誘導することである。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「寛容原性」という用語は、寛容を誘導することができることを意味する。
【００４８】
寛容とは、抗原に対して反応しないことである。自己抗原に対する寛容は免疫系の本質的な特徴であり、これが失われると、自己免疫性疾患が生じ得る。適応免疫系は、それ自身の組織内に含まれる自己抗原の自己免疫性攻撃を回避しつつ、多数の様々な感染性因子に対して反応する能力を維持しなければならない。これは、胸腺におけるアポトーシス細胞死に対する未成熟Ｔリンパ球の感受性によってかなりの程度まで制御されている（中枢性寛容）。しかしながら、すべての自己抗原が胸腺において検出される訳ではないので、自己反応性胸腺細胞の死は不完全なままである。したがって、末梢組織の成熟自己反応性Ｔリンパ球によって寛容が獲得され得る機構も存在する（末梢性寛容）。
【００４９】
寛容は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも一部におけるアネルギーの誘導に起因し得るか、またはこれを特徴とし得る。Ｔ細胞を活性化するためには、ペプチドは、２つのシグナルをＴ細胞に送達することができる「プロフェッショナル」ＡＰＣに結合しなければならない。第１のシグナル（シグナル１）は、ＡＰＣの細胞表面のＭＨＣ−ペプチド複合体によって送達され、ＴＣＲを介してＴ細胞に受け取られる。第２のシグナル（シグナル２）は、ＡＰＣの表面の共刺激分子、例えばＣＤ８０およびＣＤ８６によって送達され、Ｔ細胞の表面のＣＤ２８によって受け取られる。Ｔ細胞は、シグナル２の非存在下でシグナル１を受け取ると、活性化されずに実際にはアネルギー性になると考えられている。アネルギー性Ｔ細胞は、その後の抗原性チャレンジに対して不応性であり、他の免疫応答を抑制することができる場合がある。アネルギー性Ｔ細胞は、Ｔ細胞寛容の媒介に関与すると考えられている。
【００５０】
ペプチド投与によって寛容が誘導されると、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖能が低下することが示されている。また、これらの細胞によるＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の産生はダウンレギュレートされるが、ＩＬ−１０の産生は増大する。ペプチド誘導性寛容状態のマウスにおいてＩＬ−１０を中和すると、疾患に対する感受性が完全に元に戻ることが示されている。寛容状態では、ＩＬ−１０を産生して免疫調節を媒介する調節性細胞集団が存続することが提唱されている（Ｂｕｒｋｈａｒｔら、（１９９９）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１６２５−１６３４）。
【００５１】
したがって、寛容の誘導は、以下を含む様々な技術によってモニタリングすることができる：
（ａ）ペプチドがインビボにおける標的エピトープである疾患に罹患する感受性の低下；
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるアネルギーの誘導（これはその後のインビトロでの抗原によるチャレンジによって検出することができる）；
（ｃ）以下を含むＣＤ４＋Ｔ細胞集団の変化
（ｉ）増殖の低下；
（ｉｉ）ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４産生のダウンレギュレーション；および
（ｉｉｉ）ＩＬ−１０の産生増大  。
【００５２】
抗原特異的免疫療法（ＳＩＴ）は、アレルギーおよび自己免疫性疾患の処置に使用されている。
【００５３】
アレルゲンの皮下または経口／舌下投与は、ハチ毒、牛乳、ピーナッツおよびカバノキ花粉に対するものを含む広範囲のアレルギーの成功的処置に使用されている。
【００５４】
多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスおよびＩ型糖尿病などの自己免疫性疾患の処置について、抗原ＳＩＴを使用した成功例もある程度存在する。
【００５５】
組成物
本発明の第１の態様は、ＧＳＫ−３阻害剤および少なくとも１つのペプチド、例えば少なくとも１つの寛容原性ペプチドを含む組成物に関する。
【００５６】
ペプチドは、抗原ＳＩＴに有用であり得る。ＧＳＫ−３阻害剤は、「寛容原性アジュバント」として作用することができる。したがって、寛容原性（ｔｏｌｅｒｇｅｎｉｃ）アジュバントは、補助として抗原特異的免疫療法と共に使用される。補助療法は、主要な物質、処置もしくは手順の有効性もしくは安全性を高めるために、またはその性能を促進するために使用されるさらなる物質、処置または手順と定義される。
【００５７】
疾患を処置または予防するためには、寛容を有効に誘導するために多数の異なるＴ細胞クローンを標的とする必要があり得る。したがって、疾患を予防または処置するために、複数のペプチドを個体に投与することができる。
【００５８】
したがって、組成物は、１つまたは複数のペプチドを含むことができる。
【００５９】
組成物は、例えば、２〜５０個のペプチド、好ましくは２〜１５個のペプチドを含むことができる。ペプチドは、同じかまたは異なる標的抗原から誘導することができる。
【００６０】
組成物は、ペプチドの一部またはそれぞれが同時投与、別個の投与または逐次的な投与のために個別に提供されるキットの形態であり得る。
【００６１】
あるいは（または加えて）、組成物（またはその任意の一部）を複数の用量で投与する場合、各用量を個別にパッケージすることができる。
【００６２】
組成物は、治療有効量または予防有効量の１つ以上のペプチドと、場合により薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤とを含むことができる。
【００６３】
また、本発明の組成物では、１つ以上のペプチドを任意の適切な結合剤、滑滑剤、懸濁化剤、コーティング剤または可溶化剤と混合することができる。
【００６４】
キット
第３の態様では、本発明は、別個の投与、同時投与または逐次的な投与のための、ペプチドおよびＧＳＫ−３阻害剤を含むキットを提供する。
【００６５】
ペプチドおよびＧＳＫ−３阻害剤は、本発明の第１の態様の組成物に関して定義したとおりである。ペプチドおよびＧＳＫ−３阻害剤を混合してから投与してもよいし、またはそれらを個別に投与してもよい。ペプチドおよびＧＳＫ−３阻害剤は、同じかまたは異なる投与経路によって投与することができる（以下を参照のこと）。
【００６６】
キットは、１つ以上のペプチドを含むことができる。キットが複数のペプチドを含む場合、それらをペプチド「カクテル」の形態で混合してもよいし、または別個の投与、同時投与または逐次的な投与のためにそれらを個別にパッケージしてもよい。
【００６７】
キットはまた、使用説明書を含むことができる。
【００６８】
投与
本発明の組成物は、抗原特異的免疫療法に適切な任意の経路によって投与することができる。例えば、組成物は、粘膜経路によって投与することができる。
【００６９】
組成物は、皮下（ｓ．ｃ．）投与、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与、静脈内（ｉ．ｖ．）投与もしくは鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与してもよいし、または経口／舌下経路によって投与してもよい。
【００７０】
ペプチドおよびＧＳＫ−３阻害剤がキットの形態である場合、それらは、同じかまたは異なる時間に同じかまたは異なる投与経路によって投与することができる。
【００７１】
処置方法
第４の態様では、本発明は、炎症促進性Ｔ細胞に関連する疾患を処置および／または予防するための方法であって、ペプチドおよびＧＳＫ−３阻害剤を被験体に投与する工程を含む方法を提供する。
【００７２】
ペプチドおよびＧＳＫ−３阻害剤を同時に投与しても、逐次的に投与しても別個に投与してもよい。
【００７３】
この方法は、以下の２つの処置段階を含むことができる：
（ｉ）ペプチドおよびＧＳＫ−３阻害剤による最初の処置段階；および
（ｉｉ）ＧＳＫ−３阻害剤の非存在下におけるペプチドによる次の処置期  。
【００７４】
ＧＳＫ−３の広い基質特異性は、このような阻害剤の長期投与が潜在的には合併症につながり得ることを示唆している。しかしながら、２段階処置方法は、あらゆるこのような問題を回避するはずである。自己免疫性疾患またはアレルギーを患っている人々は、自己抗原またはアレルゲンに対して特異的な既存のＴｈ１／Ｔｈ１７またはＴｈ２免疫応答を有するであろう；抗原性ペプチドおよびＧＳＫ−３阻害剤による短期処置は、細胞のサイトカイン産生をシフトさせるので、自己抗原またはアレルゲンに重点的な抗炎症反応を生み出すであろう；抗原性ペプチドのみによる継続的な処置は、抗原特異的な抗炎症性表現型を維持するのに十分なはずである。これにより、ＧＳＫ−３阻害剤の継続的な投与の必要性を回避する。
【００７５】
疾患／状態
疾患または状態は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答によって媒介され得る。例えば、疾患は、不適切なまたは過度のＣＤ４＋Ｔ細胞応答によって確立または維持され得る。
【００７６】
組成物またはキットは、過敏性障害の処置に有用であり得る。過敏性反応としては、
（ｉ）無害な外来物質に対する不適切な応答に起因するアレルギー；
（ｉｉ）自己組織抗原に対する応答に起因する自己免疫性疾患；および
（ｉｉｉ）移植に対する応答に起因する移植片拒絶
が挙げられる。
【００７７】
アレルギーの例としては、限定されないが、枯草熱、外因性喘息、虫による咬傷および刺傷でのアレルギー、食物および薬物アレルギー、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、慢性気管支炎、アナフィラキシー症候群、じんま疹、血管性浮腫、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、結節性紅斑、多形性紅斑、スティーブンス・ジョンソン症候群、鼻結膜炎、結膜炎、皮膚壊死性細静脈炎（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ  ｖｅｎｕｌｉｔｉｓ）、炎症性肺疾患および水疱性皮膚疾患が挙げられる。
【００７８】
自己免疫性疾患の例としては、限定されないが、関節リウマチ（ＲＡ）、重症筋無力症（ＭＧ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、グレーブス病、炎症性腸疾患、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎およびある種の糖尿病、全身性血管炎、多発性筋炎−皮膚筋炎、全身性硬化症（強皮症）、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎および関連脊椎関節症、リウマチ熱、過敏性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、無機塵じん肺症（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｄｕｓｔ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｎｉｏｓｅｓ）、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、免疫学的血小板障害、寒冷症、例えばクリオフィブリノゲン血症および自己免疫性多腺性内分泌障害が挙げられる。
【００７９】
臨床医学では、腎臓、肝臓、心臓、肺、皮膚、角膜および骨髄を含む様々な組織が一般的に移植される。現在のところ、角膜およびいくつかの骨髄移植片を除くすべての移植片は、通常、長期間の免疫抑制を必要とする。
【００８０】
組成物またはキットは、糖尿病の処置および／または予防に使用するためのものであり得、この場合、ペプチドは、標的抗原ＩＡ２から誘導することができる。
【００８１】
組成物またはキットは、多発性硬化症（ＭＳ）の処置および／または予防に使用するためのものであり得る。多発性硬化症（ＭＳ）は、複数の脱髄性病変がＣＮＳの白質全体に散在しており、様々な部位および時期に発症することを特徴とする慢性炎症性疾患である。ＭＳは、自己反応性Ｔ細胞によって媒介されると考えられる。ペプチドは、ＭＳに関連する自己抗原のうちの１つ、特にミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）から誘導することができる。
【００８２】
移植拒絶では、ＧＳＫ−３阻害剤を単独で、または「間接的に提示されたＭＨＣエピトープ」、すなわちドナーＭＨＣアロ抗原由来の１つ以上のペプチドと併せて与えることができる。
【００８３】
脳マラリアでは、ＧＳＫ−３阻害剤を、例えば、スポロゾイト周囲タンパク質またはトロンボスポンジン関連接着タンパク質由来の１つ以上のマラリアＴ細胞エピトープと共に与えることができる。
【００８４】
アテローム性動脈硬化症では、ＧＳＫ−３阻害剤を、例えば、酸化ＬＤＬまたは熱ショックタンパク質由来の１つ以上のＴ細胞エピトープと共に与えることができる。
【００８５】
神経障害性疼痛では、ＧＳＫ−３阻害剤を、例えば、Ｐ０またはＰ２抗原由来の１つ以上の末梢神経Ｔ細胞エピトープと共に与えることができる。
【００８６】
サイトカイン分泌プロファイル
第６の態様では、本発明は、炎症促進性サイトカインから抗炎症性サイトカインへのＴ細胞分泌プロファイルにおけるペプチド媒介性シフトを促進するのに使用するためのＧＳＫ−３阻害剤を提供する。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。
【００８７】
抗原特異的免疫療法は、ＩＬ−１０発現を増大させることによって作用する。インターロイキン−１０はそれ自体が抗炎症性であるが、樹状細胞に対する抗炎症効果のノックも有する。インターロイキン−１０は、樹状細胞におけるＩＬ−１２をダウンレギュレートしてＴｈ１細胞分化を防止する。
【００８８】
したがって、抗原ＳＩＴでは、ペプチドは、Ｔ細胞の分泌プロファイルをＩＬ−１０分泌抑制Ｔ細胞表現型にシフトさせる。
【００８９】
炎症促進性Ｔｈ１細胞はＩＬ−２およびＩＦＮγを産生するのに対して、炎症促進性Ｔｈ２細胞はＩＬ−４を産生する。したがって、「炎症促進性Ｔ細胞サイトカイン分泌プロファイル」は、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよび／またはＩＬ−４の分泌を特徴とし得る。
【００９０】
調節機能を有するＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、ＩＬ−１０を分泌する。したがって、「抗炎症性Ｔ細胞サイトカイン分泌プロファイル」は、ＩＬ−１０の分泌を特徴とする。
【００９１】
本発明者らは、ＧＳＫ−３阻害剤が、抗原ＳＩＴに関連するＴ細胞の増強されたＩＬ−１０プロファイルにおけるペプチド媒介性シフトを促進することができることを見出した。したがって、それらは、補助療法として抗原ＳＩＴと共に使用することができる。
【００９２】
理論に縛られることを望まないが、本発明者らは、ＧＳＫ−３が炎症促進性サイトカイン産生と抗炎症性サイトカイン産生との間のスイッチ機構に関与しているためであると考える。ＧＳＫ−３によるＣＢＰのリン酸化は、ＩＬ−２などの炎症促進性サイトカインのプロモーター配列におけるＮＦＫＢ結合部位にＣＢＰを動員する。したがって、これは、炎症促進性サイトカインのアップレギュレーションを引き起こす。ＧＳＫ−３阻害はこのリン酸化を防止して、ＣＢＰがＩＬ−１０プロモーター配列におけるＣＲＥＢ結合部位に結合するのを可能にし、ＩＬ−１０産生をアップレギュレートする。したがって、ＧＳＫ−３とＣＢＰとの間のこの相互作用は、ＣＤ４＋Ｔ細胞がその発現プロファイルを炎症促進性と抗炎症性との間で変化させるスイッチ機構である。
【００９３】
次に、実施例によって本発明をさらに説明するが、これは当業者が本発明を実施するのを支援するためのものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００９４】
実施例１：ＧＳＫ−３阻害は、ナイーブＴ細胞においてＩＬ−１０を誘導しない
２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、３μＭのＳＢ２１６７６３または０．０２％ＤＭＳＯ（ビヒクル対照）の存在下で、ナイーブＴｇ４の脾臓から精製したＣＤ４＋細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓと共に培養した。刺激後７日目に、ＩＣＣＳによって細胞を分析した。結果を図１Ｈに示す。細胞内ＩＬ−１０レベルは、いずれかのＧＳＫ−３阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１またはＳＢ２１６７６３）による処理によって有意な影響を受けなかった。
【００９５】
実施例２：ＧＳＫ−３阻害は、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞においてＩＬ−１０を増強する
ペプチドＭＢＰ  Ａｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ１２の存在下でナイーブＴｇ４マウス由来の脾細胞を培養し、３日目にＩＬ２を追加して、細胞をＴｈ１表現型に分極させた。７日目に、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓおよび２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、３μＭのＳＢ２１６７６３または０．０２％ＤＭＳＯ（ビヒクル対照）を用いて細胞を再刺激した。刺激後７日目に、ＩＣＣＳによって細胞を分析した。結果を図２Ｄに示す。細胞内ＩＬ−１０レベルは、いずれかのＧＳＫ−３阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１またはＳＢ２１６７６３）による処理後に増大した。
【００９６】
別の実験では、ＭＢＰのペプチドＡｃ［１−９］に対して特異的なＴＣＲを発現するＴｇ４マウス由来のＣＤ４＋細胞をＴｈ１表現型に分極させ、次いで、ＧＳＫ３阻害剤の存在下で培養した。構造的に異なる３つの阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ２１６７６３およびＳＢ６２７７７２を使用して、オフターゲット阻害の効果を最小限に抑えた。ＡＰＣおよびペプチドを用いて再刺激したＣＤ４＋細胞培養物、ならびに抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングビーズを用いて再刺激した培養物における、ＧＳＫ３阻害剤で処理した細胞では、ＩＬ−１０タンパク質が有意に増大していることが見出されたが（図１Ａ〜Ｅ）、これは、ＧＳＫ３阻害剤がＣＤ４＋細胞に直接作用することを示している。ｑＰＣＲ分析によって、アップレギュレーションはｍＲＮＡレベルであることが示された（図１Ｆ）。Ｔｇ４マウスの脾臓から精製してＭＢＰのペプチドＡｃ［１−９］と共に培養したナイーブＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞は、ＧＳＫ３阻害剤の存在下で培養した場合に、ＩＬ−１０産生についていかなる変化も示さなかった（図６）。
【００９７】
Ｔｈ２細胞でも、ＧＳＫ３阻害に応じてＩＬ−１０産生が増大した（図２）。ＩＬ−１０産生細胞の総数が増大しただけではなく、ＩＬ−１０およびＩＬ−４の両方を発現する細胞が特に大きく増大した。
【００９８】
実施例３：ＧＳＫ−３阻害によって誘導されるＩＬ−１０産生の増強は、ＡＰＣによるＩＬ−１０分泌とは無関係である
（ａ）ペプチドＭＢＰ  Ａｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ１２の存在下でナイーブＴｇ４マウス由来の脾細胞を培養し、３日目にＩＬ２を追加して、細胞をＴｈ１表現型に分極させた；または、（ｂ）ＩＬ４および抗ＩＦＮγの存在下でナイーブＴｇ４マウス由来の脾細胞を培養し、３日目にＩＬ２を追加して、細胞をＴｈ２表現型に分極させた。７日目に、野生型（ＷＴ）マウスもしくはＩＬ１０ノックアウトマウス由来の新鮮照射ＡＰＣ、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１または０．０２％ＤＭＳＯ（ビヒクル対照）およびＭＢＰのペプチドＡｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）を用いてＣＤ４＋細胞を再刺激した。結果を図３（Ｃ）および（Ｄ）に示す。３日目に上清を三連で採取し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−１０について分析した（図３（Ｅ））。ＡＰＣにおける細胞内ＩＬ−１０レベルおよびＡＰＣによるＩＬ−１０産生はいずれも提示アッセイ中に増強されなかったが、これは、実施例２のＴｈ１細胞で観察されたＩＬ−１０の増強がＡＰＣによるＩＬ−１０産生の増強に起因する可能性を否定している。
【００９９】
別の実験では、ＧＳＫ３阻害剤の存在下で、Ｔｇ４マウス由来のＴｈ１  ＣＤ４＋細胞をＩＬ−１０−／−マウス由来のＡＰＣと共に培養した（図３ＡおよびＢ）。ＡＰＣからのＩＬ−１０は、ＧＳＫ３阻害によって誘導されるＣＤ４＋からのＩＬ−１０産生の増大に必要ではなかったことが見出され、実際、外因性ＩＬ−１０は、ＣＤ４＋細胞からのＩＬ−１０分泌を部分的に抑制すると思われた。
【０１００】
実施例４：ＧＳＫ−３阻害は、Ｔｈ１細胞の脳炎誘発特性を抑制する
Ａｃ１−９ペプチド＋ＩＬ−１２を用いて、Ｔｇ４の脾細胞を７日間刺激した。ペプチド±ＧＳＫ−３阻害剤を用いて、Ｔｈ１細胞を３日間再刺激した。５×１０６個の細胞を収集し、ＲＡＧ欠損Ｈ−２ｕレシピエントマウスに腹腔内（ｉｐ）／静脈内（ｉｖ）移植し、ＥＡＥについてマウスを等級付けした。結果を図９に示す。ＧＳＫ−３阻害剤と共にペプチドを用いて再刺激したＴｈ１細胞では、ペプチドのみを用いて再刺激したＴｈ１細胞よりもＥＡＥが大きく抑制されている。ＧＳＫ−３阻害は、ＩＬ−１０表現型への細胞の変換を加速することによって、ペプチド療法の有効性を促進する。
【０１０１】
別の実験では、Ｔｇ４マウス由来のＣＤ４＋細胞をＴｈ１表現型に分極させ、ＧＳＫ３阻害剤またはビヒクル対照と共に培養し、Ｔｇ４マウスに養子移植してＥＡＥを誘導した。また、抗ＩＬ−１０Ｒをマウスに投与して、ＩＬ−１０または対照アイソタイプＩｇＧを中和した。Ｔｈ１細胞をＧＳＫ３阻害剤と共に培養したところ、対照アイソタイプＩｇＧで処置したマウスにおける疾患負荷が有意に減少した（図４Ｂ）。この群におけるＥＡＥスコアの減少は、疾患経過全体にわたって持続した（図４Ａ）。しかしながら、ＧＳＫ３阻害剤で処理した細胞および抗ＩＬ−１０Ｒ抗体を投与したマウスは、対照アイソタイプ抗体を投与したものと比較して疾患負荷の有意な増大を示した（図４Ｂ）。これは、ＧＳＫ３阻害剤処理に起因する病原性の減少がＩＬ−１０の作用に依存することを示している。
【０１０２】
実施例５：リンパ球における、ＩＬ−１０誘導に対するＧＳＫ−３阻害の示差的効果  対  β−カテニンのターンオーバー
ペプチドＭＢＰ  Ａｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ１２の存在下でナイーブＴｇ４マウス由来の脾細胞を培養し、３日目にＩＬ２を追加して、細胞をＴｈ１表現型に分極させた。７日目に、新鮮照射ＡＰＣ、ＭＢＰのペプチドＡｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）および指示濃度のＳＢ２１６７６３またはＣＨＩＲ９９０２１を用いて、細胞を再刺激した。再刺激７日目に、細胞をＲＩＰＡ緩衝液に溶解し、ウエスタンブロッティングに供し、βカテニン抗体でプローブした。膜をストリップし、ローディング対照としてのＧＡＰＤＨについて再プローブした。結果を図１０に示す。ＧＳＫ−３はβ−カテニンタンパク質を構成的にリン酸化して、その分解をもたらす。ＣＨＩＲ９９０２１の存在下では、β−カテニンの分解が阻害されて、β−カテニンタンパク質の蓄積につながると思われる。一方、ＳＢ２１６７６３は、β−カテニンレベルに対する有意な効果を引き起こすとは思われない。
【０１０３】
別の実験では、ＩＬ−１０の増大をもたらす濃度のＧＳＫ３阻害剤（２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、５μＭのＳＢ２１６７６３、１０μＭのＳＢ６２７７７２）と共にＣＤ４＋細胞を培養した場合には、ＣＤ４＋細胞のウエスタンブロット分析により、β−カテニンの蓄積は示されなかった（図１Ｇ）。
【０１０４】
実施例６：ＧＳＫ３を阻害すると、Ｔｈ１細胞では、ＩＬ−１０プロモーターがエピジェネティックな変化を受ける
養子移植によってＥＡＥを誘導するのに使用するＴｈ１細胞を阻害剤／ビヒクル対照と共に培養し、続いて、移植前にすべての外因性阻害剤を除去するために数回洗浄した。阻害剤処理によるＥＡＥのＩＬ−１０媒介性抑制は実験の過程を通じて持続されたが、これは、阻害剤によってもたらされた細胞変化が長期的なものであり、数ラウンドの増殖を通じて遺伝可能であったことを示唆している。実際、阻害剤と共に培養したＴｈ１細胞は、培養物から除去した阻害剤による次の再刺激ラウンド後に、増大した量のＩＬ−１０を発現し続けた（図５Ａ）。これを受けて本発明者らは、エピジェネティックな変化は遺伝子発現の長期的変化を引き起こすことができるので、ＩＬ−１０プロモーターのエピジェネティックな状態を調査した。プロモーターにまたがる４つのプライマーセット（図５Ｂ）を使用してＩＬ−１０プロモーターをＣｈＩＰ分析したところ、活性遺伝子転写のマーカーであるヒストンＨ３アセチル化のＧＳＫ３阻害剤誘導性増大が明らかになった（図５Ｃ）。プロモーターにまたがる同じプライマーセットと、さらにはＩＬ−１０コード領域に位置するプライマー対（ＩＬ−１０Ｃ２；図５Ｂを参照のこと）とを使用して、Ｈ３Ｋ４のトリメチル化およびＨ３Ｋ２７のメチル化も調べた。一般に、Ｈ３Ｋ４のトリメチル化は転写活性遺伝子のマーカーとみなされており、Ｈ３Ｋ２７のメチル化は抑制（ＲＥＦＳ）のマーカーとみなされている。Ｔｈ１細胞をＧＳＫ３阻害剤で処理したところ、Ｈ３Ｋ４のトリメチル化が増大し、Ｈ３Ｋ２７のトリメチル化が減少した（図５ＤおよびＥ）。
【０１０５】
実施例７：外因性ＩＬ−１０は、Ｔｈ２細胞におけるＧＳＫ３阻害剤誘導性ＩＬ−１０産生に必要ではない
ペプチドＭＢＰ  Ａｃ１−９（１０μｇ／ｍｌ）、抗ＩＦＮλおよびＩＬ−４の存在下でナイーブＴｇ４マウス由来の脾細胞を培養し、培養３日目にＩＬ−２を追加して、ＣＤ４＋細胞をＴｈ２表現型に分極させた。培養７日目に、ＤＭＳＯ（１：１０００；対照）またはＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）の存在下で、Ｂ１０＿ＰＬマウスまたはＢ１０＿ＰＬ  ＩＬ１０−／−マウス由来の新鮮照射ＡＰＣを用いてＴｈ２細胞を再刺激した。培養３日目にＩＬ−２を追加し、ＰＭＡおよびイオノマイシン刺激後の再刺激７日目にＩＬ−４およびＩＬ−１０の細胞内サイトカイン染色を行った。結果を図７Ａに示す。
【０１０６】
再刺激３日目に組織培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−１０について分析した。結果を図７Ｂに示す。
【０１０７】
実施例８：ＧＳＫ３阻害剤処置は、インビボにおけるＩＬ−１０分泌を増大させる
ペプチドＡｃ［１−９］ＭＢＰによる２回の鼻腔内処置をマウス（１群当たり３匹）に行った。３回目のペプチド処置の２時間前に、０．６ｍｇ／ｋｇのＳＢ２１６７６３またはビヒクル対照のいずれかをマウスに注射した。この３回目のペプチド処置の３日後に、脾臓を採取し、脾細胞をペプチドＡｃ［１−９］ＭＢＰおよびＩＬ−２と共に５日間培養してから、ＰＭＡおよびイオノマイシン刺激後にＩＦＮλおよびＩＬ−１０の細胞内サイトカイン染色を行った。結果を図８に示す。
【０１０８】
上記明細書で言及されているすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。当業者であれば、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、記載されている本発明の方法およびシステムについての様々な改変および変更が明らかであろう。具体的な好ましい実施形態に関して本発明を説明してきたが、特許請求の範囲に記載されている本発明はこのような具体的な実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、本発明を実施するための記載されている形態についての様々な改変であって、抗原特異的免疫療法またはその関連分野の当業者に明らかなものは、以下の特許請求の範囲の範囲内であることを意図する。
【図１−２】
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【図２−２】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図１−１】
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【図２−１】
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【図３−１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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