(57)【要約】  本発明は、リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）の欠損を特徴とする病理学的状態の治療に使用するためのリソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）のアロステリック非阻害性シャペロン、その医薬組成物、対象におけるGAAの活性を増加させる方法、およびGAAのためのアロステリック非阻害性シャペロンの同定方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）の欠損を特徴とする病理学的状態の治療に使用するためのリソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）のアロステリック非阻害性シャペロン。
【請求項２】
N-アセチル化アミノ酸である、請求項１に記載のアロステリック非阻害シャペロン。
【請求項３】
N-アセチルシステイン（NAC）、N-アセチルセリン（NAS）およびN-アセチルグリシン（NAG）からなる群より選択される、請求項１または２に記載のアロステリック非阻害シャペロン。
【請求項４】
病理学的状態はリソソーム蓄積症である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアロステリック非阻害シャペロン。
【請求項５】
リソソーム蓄積症は、ポンペ病（PD）である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも一つのリソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）のアロステリック非阻害シャペロンおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項７】
リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）の少なくとも一つのアロステリック非阻害性シャペロン、組換えGAAおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項８】
さらに、「活性部位指向型」シャペロンを含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）の少なくとも一つのアロステリック非阻害性シャペロン、「活性部位特異的指向」シャペロンおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１０】
アロステリック非阻害シャペロンは、N-アセチル化アミノ酸である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
アロステリック非阻害性シャペロンは、N-アセチルシステイン（NAC）、N-アセチルセリン（NAS）およびN-アセチルグリシン（NAG）からなる群から選択される、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
「活性部位特異的」シャペロンは、N-ブチル-デオキシノジリマイシン（NB-DNJ）および1-デオキシノジリマイシン（DNJ）からなる群から選択される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
経口または静脈内投与のためのものである、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
リソソーム酸アルファグルコシダーゼ（GAA）のアロステリック非阻害性シャペロンの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）の欠損を特徴とする病理学的状態の治療方法。
【請求項１５】
α-グルコシダーゼリソソーム酸（GAA）の欠損を特徴とする病理学的状態はリソソーム蓄積症である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
リソソーム蓄積症は、ポンペ病（PD）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
アロステリック非阻害シャペロンは、N-アセチル化アミノ酸である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
アロステリック非阻害シャペロンは、N-アセチルシステイン（NAC）、N-アセチルセリン（NAS）およびN-アセチルグリシン（NAG）からなる群から選択される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
さらに、外因性GAAの有効量の投与および/または「活性部位指向型」シャペロンの有効量の投与を含む、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
「活性部位指向型」シャペロンは、N-ブチル-デオキシノジリマイシン（NB-DNJ）および1-デオキシノジリマイシン（DNJ）からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
個体における内因性および/または外因性のGAAの活性を増大させるのに有効な量のリソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）のアロステリック非阻害性シャペロンを個体に投与することを含む、リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）の欠損を特徴とする病理学的状態を患っているか、または患っている疑いのある個体における内因性および/または外因性のGAAの活性を増大させるための方法。
【請求項２２】
内因性GAAは、野生型または変異形態であり、外因性のGAAは、組換えGAAである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）の欠損を特徴とする病理学的状態は、リソソーム蓄積症、さらに好ましくは、ポンペ病である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
アロステリック非阻害シャペロンは、N-アセチル化アミノ酸である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
アロステリック非阻害性シャペロンは、N-アセチルシステイン（NAC）、N-アセチルセリン（NAS）およびN-アセチルグリシン（NAG）からなる群から選択される、請求項２１〜２４に記載の方法。
【請求項２６】
アロステリック非阻害シャペロンは非リソソームのpH、好ましくは、pH7.0で野生型リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）を安定化し、および/または突然変異GAAの残存活性を増強し、および/または非リソソームpHで、好ましくはpH7.0で外因性GAAを安定化し、および/または外因性GAAの有効性を向上させる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のアロステリック非阻害シャペロン、医薬組成物または方法。
【請求項２７】
GAAのためのアロステリック非阻害性シャペロンを同定するためのマーカーで標識された、NACおよび/またはNASおよび/またはNAGシャペロンの使用。
【請求項２８】
以下の工程：
a）フルオロフォアでNACおよび/またはNASおよび/またはNAGシャペロンをラベルする工程；
b）ある量のrhGAAを該標識されたNACおよび/またはNASおよび/またはNAGに添加して基礎的なrhGAAの蛍光を得る工程；
c）基礎的なrhGAAの蛍光を測定する工程；
d）試験剤を添加する工程；
e）rhGAAの蛍光を測定する工程；
f）c）およびe）で測定したrhGAAの蛍光を比較する工程；
を含み、
ここで、蛍光の強度の変化や蛍光の波長の変化が観察された場合には、試験薬剤は、GAAのためのアロステリック非阻害性シャペロンである、
GAAためのアロステリック非阻害性シャペロンを同定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リソソーム酸性α-グルコシダーゼ（GAA）の欠損によって特徴付けられる病理学的状態の治療に使用するための、リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）のアロステリック非阻害シャペロン、その医薬組成物、対象におけるGAAの活性を増加させるための方法およびGAAのためのアロステリック非阻害性シャペロンを同定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポンペ病（PD）は、リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）の欠乏に起因する遺伝性代謝性疾患である。病気の症状は、原因グリコーゲン蓄積により、高度に衰弱し、重度の肥大型心筋症をともなう心臓の合併症、および進行性の運動障害を伴う骨格筋の衰弱、に主に関連している。
【０００３】
ポンペ病（PD、OMIM 232300）は、α-グルコシダーゼ（GAA、酸マルターゼ、EC3.2.1.20）、グリコーゲンのリソソーム分解に関与する酸糖質加水分解酵素の機能不全によって引き起こされる先天性代謝性疾患である。GAA欠乏は、十分に理解されていないメカニズムによって、リソソームにおけるグリコーゲン蓄積および二次的な細胞損傷という結果になる。[van der Ploeg および Reuser 2008; Shea および Raben, 2009; Parenti および Andria, 2011]
【０００４】
PDにおけるGAA欠損は一般化されるが、筋肉はグリコーゲン貯蔵を特に受けやすい。病気の症状は、このように、主に心臓および骨格筋の合併症に関連している。表現型のスペクトルは広く、深刻な心筋症、摂食困難、呼吸器感染症、早期致死性を特徴とする疾患の壊滅的な古典的な乳児発症型から、後期（幼年、少年や成人）の発症により、存在しないか、または穏やかな心臓病の併発に特徴づけられるによって特徴づけられる、弱められた表現型まで変動する。症状は進行性の筋緊張低下に関連し、重度の運動障害、最終的には呼吸不全を引き起こし、PD患者の健康に深刻な影響を与える。[van der Ploeg および Reuser, 2008]
【０００５】
PDのための唯一の認可された治療である、組換えヒトGAA（rhGAAの）を用いた酵素補充療法（ERT）は、一部の患者において限定された治療効果しか示さず、PD患者の治療のためのさらなる革新的なアプローチが望ましいであろうことを示唆している。これらの中でも、薬理学的シャペロン療法（PCT）は、有望な戦略を表す。しかし、特に標的酵素、GAAに対するそれらの潜在的阻害効果のため、これまでに同定されたシャペロンは限界がある。
【０００６】
組換えヒトグルコシダーゼアルファ（rhGAAの）を有する酵素補充療法（ERT）は、現在、この疾患の治療のための治療の標準と考えられている。いくつかの研究は、生存および機能を改善するか、疾患の経過を安定にするこのアプローチの有効性を支持する［van den Houtら、2000；van den Houtら、2004; Kishnaniら、2007; Strothotteら、2010；van der Ploegら、2010]。しかし、他のレポートは、PDでのERTは限界に苦しんでいることを示唆している[Schoserら、2008]。治療にもかかわらず、一部の患者は臨床的利益を経験することがほとんどないか、疾患進行の兆候を示している。骨格筋において組換え酵素が治療濃度に到達することは特に困難であることも明らかである。
【０００７】
いくつかの要因がERTの治療の成功が制限されることに同意する。いくつかの要因がERTの治療の成功が制限されることに同意する。それらのいくつかは、そのような治療を開始する年齢〔Chienら、2009 ；Kishnaniら、2009]、細胞および組織の不可逆的な損傷の有無、免疫学的および交差反応性物質（CRIM）の患者のステータス[Kishnaniら、2010]、酵素投与のための侵襲的処置の必要性（頻繁な静脈内注入または永久的な静脈内デバイス）、および治療の高コスト[Beutlerら、2006] 等の、疾患の臨床的な側面に関連している。その他の要因は、病気の細胞生物学並びに組み換え酵素の標的および輸送に関連している。これらは、肝臓によるrhGAAの優先的な取り込み及び骨格筋への酵素の不十分な標的 [Rabenら、2003]、筋細胞内のカチオン非依存性マンノース-6-リン酸受容体（CI-MPR）の相対的欠乏［Wenk氏ら、1991; Koeberlら、2011]、およびその異常な細胞分布[Cardoneはら、2008]、筋細胞で観察される自食コンパートメントの「ビルドアップ」［Fukudaら、2006; Fukudaら、2006; Rabenら、2009]が含まれる。
【０００８】
加えて、（ベータグルコセレブロシダーゼ、GBAの欠乏による）ゴーシェ病などのERTによって治療可能な他のLSDでの研究は、ERTのために用いられる組換え酵素に本質的に関連する因子の役割に向けられ、リソソームへの輸送中の非酸性のpHのようなストレスにさらされたとき、これらの酵素は比較的不安定になるのではないかと提案する［Xuら、1996；Shenら、2008; Benjaminら、2012]。
【０００９】
すべてのこれらの理由のために、PDにおけるERTの治療作用の改善に向けた、又はこの疾患の治療のための代替アプローチの同定に向けた戦略が非常に望ましいであろう。
【００１０】
近年、提案されたアプローチは、薬理学的シャペロン療法（PCT）である。このアプローチは、タンパク質の誤った折り畳みに起因する疾患の治療のために設計されており、変異タンパク質の安定性を高め、分解を防止する小分子リガンドを使用することによる。 [Fan 2008；Parenti、2009； Valenzanoら、2011]。最近の研究は、しかし、シャペロンは、ミスフォールドタンパク質の不良を救済することができるだけでなく、ERTに使用する、野生型組換え酵素の作用を増強し得ることも示している。著者ら及び他の者らは、すなわち最も一般的なリソソーム障害、PD[ポルトら、2009]とファブリー病[Portoら、2011;Benjaminら、2012]間の二つにおいてシャペロンとERTの間の相乗効果を示す研究において、この概念をサポートする前臨床証拠を提供している。両方の疾病において、組換え酵素がそれぞれシャペロン分子N-ブチル-デオキシノジリマイシン（B-DNJ）および1-デオキシガラクトノジリマイシン（DGJ）と組み合わせて突然変異線維芽細胞に投与された場合に、リソソーム輸送、成熟および細胞内活性酵素が増加した。rhGAAの改善された安定性はまた、PD線維芽細胞で観察された [Portoら、2009]。同様の効果は、シャペロンのイソファゴミン（IFG）の存在下で、組換えGBA（ゴーシェ病でERTのために使用される酵素）で処理した培養マクロファージでも得られた［Shenら、2008]。
【００１１】
ERTと比較して、小分子シャペロンは生体内分布、経口利用および患者の生活の質への影響が減少されている面で重要な利点を持っている。しかし、彼らの行動のいくつかの側面は、特徴付けが乏しいままである。具体的には、まだそれらの細胞内分布、特定の細胞区画における内在酵素の阻害、および特異性について情報が欠けている。
【００１２】
これらの薬剤の臨床使用についての大きな関心の理由は、それらがアクティブに結合するように、これまでLSDの治療のために同定された全てのシャペロンは、標的酵素の活性部位に結合する「活性部位指向型」とも呼ばれる標的酵素の可逆的競合阻害剤だからである[Valenzanoら、2011]。
【００１３】
この点で、第二世代のシャペロンの同定は有利であり得る。理想的シャペロンは、その活性を妨害することなく、酵素を分解から保護すべきであり、組織や臓器において大部分は生物学的に利用可能であり、その治療作用が必要とされる細胞区画で治療レベルに到達することができるべきであり、標的酵素に対して高い特異性を示す、他の酵素に無視できる影響しか与えず、および良好な安全性プロファイルを有するべきである。すでにヒトの治療のために承認された薬物は、（第I相臨床試験を必要とせずに）迅速な臨床への転換のために最も有利であろう。新しいシャペロンのための広範な検索が、現在、化学ライブラリとハイスループットスクリーニングによって行われている。[Tropakら、2007；Zhengら、2007;Urbanら、2008]。
【００１４】
US2006115376は、放射線に感受性である一つ以上の消化酵素の調製物を滅菌するための方法における安定剤としてのNACの使用を開示している。
【００１５】
WO97/16170は以下：
a）第一の治療薬の治療有効量を含む第1の医薬組成物を提供すること、及び
b）患者の心膜腔へ第1の医薬組成物を投与すること
を含む冠状症状の治療または予防の方法を開示している。第一の治療剤は、NFkBの阻害剤としての活性より、NAC金属キレート剤および抗酸化剤であってもよい。
【００１６】
WO2004/093995は、ヒトまたは非ヒト動物において骨量減少障害を治療または予防するための医薬の製造における、ヒトまたは非ヒト動物において酸化防御のレベルおよび/または、少なくとも1つの酸化防止剤のレベルを増加させる薬剤としてのNACの使用を記載している。
【００１７】
NACが、リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）のためのアロステリック非阻害シャペロンとして働くことができ、したがって薬理学的シャペロン療法（PCT）に有用であることは、従来技術では知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許出願公開第US2006115376号
【特許文献２】国際公開公報第WO2004/093995号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明において、著者らは、GAAにリソソーム酸性α-グルコシダーゼ（GAA）の新規なアロステリック非阻害性シャペロンの作用を特徴づけた。具体的には、N-アセチルシステイン（NAC）と二つの関連化合物（N-アセチルセリン、NAS; N-アセチルグリシン、NAG）を検討した。著者らは、これらの薬剤は、突然変異GAAの残存活性を増強するため、および組み換えGAA、特に、ポンペ病などの、リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）の欠乏によって特徴付けられる病理学的状態でのERTのために使用されるrhGAAの有効性を改善するために、非リソソームのpHで野生型GAAを安定化することができることを発見した。これらの新規シャペロンはGAA触媒ドメインと相互作用せず、その結果、前記酵素の競合阻害剤ではなかった。この点において、および既に臨床使用が承認された分子であるNAC、これらの薬物は著しい進歩を表し、PDの治療のための新しいツールを提供し得るものである。
【００２０】
分子はまた、その触媒活性を破壊することなく、酵素の熱安定性を向上させることができ、そのためGAA触媒ドメインと相互作用しない。したがって、GAA N-ブチル-デオキシノジリマイシン（NB-DNJ）および1-デオキシノジリマイシン（DNJ）のための既知のシャペロンとは異なり、NACは、酵素の競合的阻害剤ではない。NACはまた、5人のPD患者由来の培養線維芽細胞中および突然変異GAA遺伝子構築物を過剰発現しているCOS7細胞中の両方において、変異GAAの残存活性を増強した。驚くべきことに、シャペロン、および組換え酵素と一緒にインキュベートされたPD線維芽細胞において、NACは組換えGAA、特にrhGAAの有効性を非常に改善し、rhGAA単独で得られた活性の3.7から13.0倍に増加した。ACおよびrhGAAの効果のこの相乗効果は、PDでERTの改善された治療効果につながる可能性を秘めている。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
したがって、本発明の目的は、リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）の欠損を特徴とする病理学的状態の治療に使用するためのリソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）のアロステリック非阻害性シャペロンである。
【００２２】
好ましくは、アロステリック非阻害シャペロンは、N-アセチル化アミノ酸である。さらに、好ましくは、アロステリック非阻害シャペロンは、以下：N-アセチルシステイン（NAC）、N-アセチルセリン（NAS）またはN-アセチルグリシン（NAG）からなる群より選択される。
【００２３】
好ましい実施形態において、病理学的状態はリソソーム蓄積症である。
【００２４】
さらに、好ましくは、リソソーム蓄積症は、ポンペ病（PD）である。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、少なくとも一つのリソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）のアロステリック非阻害シャペロンおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）の少なくとも一つのアロステリック非阻害性シャペロン、組換えGAAおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
【００２７】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、さらに、「活性部位指向型」シャペロンを含む。
【００２８】
本発明のさらなる目的は、リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）の少なくとも一つのアロステリック非阻害性シャペロン、「活性部位特異的指向」シャペロンおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
【００２９】
好ましくは、アロステリック非阻害シャペロンは、N-アセチル化アミノ酸である。
【００３０】
さらに、好ましくは、アロステリック非阻害性シャペロンは、N-アセチルシステイン（NAC）、N-アセチルセリン（NAS）またはN-アセチルグリシン（NAG）からなる群から選択される。
【００３１】
好ましい実施形態では、「活性部位特異的」シャペロンは、以下：N-ブチル-デオキシノジリマイシン（NB-DNJ）および1-デオキシノジリマイシン（DNJ）からなる群から選択される。
【００３２】
好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、経口または静脈内投与のためのものである。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、リソソーム酸αグルコシダーゼ（GAA）のアロステリック非阻害性シャペロンの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）の欠損を特徴とする病理学的状態の治療方法である。
【００３４】
好ましくは、α-グルコシダーゼリソソーム酸（GAA）の欠損を特徴とする病理学的状態はリソソーム蓄積症である。
【００３５】
より好ましくは、リソソーム蓄積症は、ポンペ病（PD）である。
【００３６】
上記方法において、好ましくはアロステリック非阻害シャペロンは、N-アセチル化アミノ酸である。より好ましくは、アロステリック非阻害シャペロンは、以下：N-アセチルシステイン（NAC）、N-アセチルセリン（NAS）またはN-アセチルグリシン（NAG）からなる群から選択される。
【００３７】
上記方法は、好ましくは、さらに、外因性GAAの有効量の投与および/または「活性部位指向型」シャペロンの有効量の投与を含む。
【００３８】
好ましくは、「活性部位指向型」シャペロンは、以下；N-ブチル-デオキシノジリマイシン（NB-DNJ）および1-デオキシノジリマイシン（DNJ）からなる群から選択される。
【００３９】
本発明のさらなる目的は、個体における内因性および/または外因性のGAAの活性を増大させるのに有効な量のリソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）のアロステリック非阻害性シャペロンを個体に投与することを含む、リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）の欠損を特徴とする病理学的状態を患っているか、または患っている疑いのある個体における内因性および/または外因性のGAAの活性を増大させるための方法である。
【００４０】
好ましくは、内因性GAAは、野生型または変異形態であり、外因性のGAAは、組換えGAAである。内因性GAAは、対象の体内に存在する酵素であるのに対し、外因性のGAAは、被験者の外側で調製し、被験体に投与される。
【００４１】
上記方法において、好ましくは、リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）の欠損を特徴とする病理学的状態は、リソソーム蓄積症、さらに好ましくは、ポンペ病である。
【００４２】
上記方法において、好ましくはアロステリック非阻害シャペロンは、N-アセチル化アミノ酸である。
【００４３】
さらに、好ましくは、アロステリック非阻害性シャペロンは、以下：N-アセチルシステイン（NAC）、N-アセチルセリン（NAS）およびN-アセチルグリシン（NAG）からなる群から選択される。
【００４４】
好ましい実施形態では、アロステリック非阻害シャペロンは非リソソームのpH、好ましくは、pH7.0で野生型リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）を安定化し、および/または突然変異GAAの残存活性を増強し、および/または非リソソームpHで、好ましくはpH7.0で外因性GAAを安定化し、および/または外因性GAAの有効性を向上させる。
【００４５】
本発明のさらなる目的は、GAAのためのアロステリック非阻害性シャペロンを同定するためのマーカーで標識された、NACおよび/またはNASおよび/またはNAGシャペロンの使用である。
【００４６】
マーカーは、マーカーは蛍光または発光マーカーであってもよい。
【００４７】
本発明のさらなる目的は、以下の工程：
a）フルオロフォアでNACおよび/またはNASおよび/またはNAGシャペロンをラベルする工程；
b）ある量のrhGAAを該標識されたNACおよび/またはNASおよび/またはNAGに添加して基礎的なrhGAAの蛍光を得る工程；
c）基礎的なrhGAAの蛍光を測定する工程；
d）試験剤を添加する工程；
e）rhGAAの蛍光を測定する工程；
f）（c）およびe）で測定したrhGAAの蛍光を比較する工程；
を含み、
ここで、蛍光の強度の変化や蛍光の波長の変化が観察された場合には、試験薬剤は、GAAのためのアロステリック非阻害性シャペロンである、
GAAためのアロステリック非阻害性シャペロンを同定するための方法である。
【００４８】
本発明では、リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）のアロステリック非阻害性シャペロンは、非リソソームpH（リソソームのpHは約5.2であり、非リソソームpHはpH5.0とは異なるpH、例えば、pH7.0である）で、野生型GAAを安定化させる分子であり、および/または突然変異GAAの残存活性を増強する、および/または非リソソームpH（すなわち、pH5.0とは異なるpH、例えば、pH7.0である）で組換えGAAを安定化し、および/または組換えGAAの有効性を改善する。さらに、該分子はGAA触媒ドメインと相互作用せず、その結果、前記酵素の競合的阻害剤ではない。分子はまた、その触媒活性を破壊することなく、酵素の熱安定性を向上することができ、それによりGAA触媒ドメインと相互作用しない。
【００４９】
本発明において、N-アセチル化アミノ酸は、任意のDまたはL Nアセチル化アミノ酸である。N-アセチル化したアミノ酸は、任意のタンパク質原生（天然）D/LのN-アセチル化アミノ酸または非天然のD/LのN-アセチル化アミノ酸であってもよい。天然アミノ酸の例を表Iに示す。
【００５０】
【表１−１】
2015518872.tif 000002
【表１−２】
2015518872.tif 000003
【表１−３】
2015518872.tif 000004
【表１−４】
2015518872.tif 000005
【００５１】
非タンパク質原生 D/Lアミノ酸は、例えば、2-アミノイソ酪酸、オルニチン、シトルリン、ランチオニン、ジエンコル酸、ジアミノピメリン酸、ノルバリン、ノルロイシン、ホモノルロイシン、ヒドロキシプロリンである。N-アセチル化非タンパク質原生アミノ酸の例を表IIに示す。
【００５２】
【表２−１】
2015518872.tif 000006
【表２−２】
2015518872.tif 000007
【００５３】
このような非天然のアミノ酸はまた、Unnatural Amino Acids, Methods and Protocols Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 794, Pollegioni, Loredano; Servi, Stefano (Eds. 2012, XIV, 409p. 123 illus., Humana Press)に開示されおり、本発明の一部である。
【００５４】
さらに、当業者は、それらの生物学的活性に基づいて、他の非天然アミノ酸を特定してもよいし、それらも本発明の一部である。
【００５５】
したがって、本発明の目的は、上で定義したような少なくとも1つのアロステリック非阻害性シャペロンの治療有効量および適切な希釈剤および/または賦形剤および/またはアジュバントおよび/または皮膚軟化剤を含む医薬組成物である。前記医薬組成物は、上記で定義されたリソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）の欠損によって特徴付けられる病理学的状態の予防および/または治療のために使用される。これらの医薬組成物は、対象への投与に適した薬学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、希釈剤または生物学的に適合性のビヒクル（例えば、生理食塩水）と組み合わせて製剤化することができる。本発明の医薬組成物は、治療有効量、すなわち、処置された対象において医学的に望ましい結果を達成するのに有効な量の当該化合物を含有しているすべての組成物を含む。医薬組成物は、投与様式の必要性を満たす任意の許容可能な方法で製剤化することができる。投与の特定のモードを有効にするための、薬物送達のための生体材料及び他のポリマーの使用並びに異なる技術及びモデルが、文献に開示されている。任意の許容される投与のモードが使用され、当業者は決定することができる。例えば、投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮、経口、または頬側の経路のような種々の非経口経路によることができる。非経口投与は、ボーラス注射又は時間をかけた緩やかな灌流によることができる。
【００５６】
非経口投与のための製剤は、当該技術分野で既知の助剤または賦形剤を含むことができ、日常的な方法に従って調製することができる、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンを含む。さらに、適切な油性注射懸濁液としての活性化合物の懸濁液を投与してもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、例えばゴマ油または合成脂肪酸エステル、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド脂肪油、が含まれる。懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでいてもよい水性注射懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランが挙げられる。任意選択的に、懸濁液はまた安定剤を含み得る。医薬組成物は、注射による投与に適した溶液を含み、約0.01から99パーセント、そして好ましくは約20〜75パーセントの活性化合物を賦形剤と一緒に含有する。直腸投与することができる組成物は、坐剤が挙げられる。投与される用量は、受容者の年齢、性別、健康状態および体重、併用治療の種類、もしあれば、処置の頻度、ならびに所望の効果の性質に依存するであろうことが理解される。投与量は、当業者によって理解され、決定されるように、個々の対象に合わせて調整される。各治療に必要な総用量は、複数回投与または単回用量で投与することができる。本発明の医薬組成物は、単独で、またはその症状に向けられた、またはその状態の他の症状に向けられた他の治療薬と併用して投与してもよい。本発明の化合物は、生理食塩水などの薬学的に許容される担体中で、患者に静脈内投与することができる。ペプチドの細胞内送達のための標準的な方法は、例えばポソームを経由した送達を使用することができる。そのような方法は当業者によく知られている。本発明の製剤は、静脈内、皮下、筋肉内、および腹腔内などの非経口投与のために有用である。医学分野で周知のように、任意の患者のための投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与時間および経路、一般的な健康状態、および同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因に依存する。
【００５７】
上記で定義されたリソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）のアロステリック非阻害性シャペロンの投与を含む治療のために、当業者は本発明の方法において使用される化合物の有効量は日常的な実験によって決定することができることを理解するであろうが、5および10mMの間の血清レベルをもたらす量であることが期待される。化合物の有効投与量は、100〜1000 mg/kg体重/日であると予想される。化合物は、予め処方された投与量で、単独で、または薬学的に許容される担体および賦形剤と一緒に、必要に応じて投与することができる。化合物の有効量の投与は、患者の細胞および組織中のリソソーム酵素活性の、疾患の症状を改善するのに十分な増加をもたらす。
【００５８】
上記で定義したリソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）及びGAA好ましくは組換えGAAのアロステリック非阻害性シャペロンの投与を含む併用療法について、本発明の併用療法における化合物の好ましい用量はまた、当業者によって容易に決定される。このような投与量は、100〜1000 mg / kg体重/日の範囲であり得る。化合物の有効量の投与により、疾患の症状を改善するのに十分な、患者の細胞および組織中の組換えヒトアルファ-グルコシダーゼによる酵素補充療法によってアルファ-グルコシダーゼ活性の改善された修正がもたらされる。
【００５９】
好ましい実施形態において、併用療法は、1週間に1回または2週間に1回投与することを含む。
【００６０】
アロステリックシャペロンおよび活性部位指向型シャペロンについて、本発明の併用療法における化合物の好ましい投薬量も、当業者により容易に決定される。このような投与量は、併用療法における各化合物について、100〜1000mg/kg体重/日の範囲であり得る。N-ブチルデオキシノジリマイシンの場合には、用量は既にヒトの治療のために承認されており250mg/m2の体表面に対応する。
【００６１】
本発明において、分子標識は当業者に知られた方法、例えば、化学的方法または方法は、チオール、アミン、N末端-およびC末端標識化を含み、商業的に入手可能な異なる蛍光体を使用することによって、行うことができる。
【００６２】
推定上のアロステリック部位への結合リガンドの保護効果は、酵素標識の蛍光を比較することによって分析される。
【００６３】
アロステリック部位のためのリソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）のアロステリック非阻害シャペロンと競合するリガンドの結合の後、リガンドの存在下および非存在下で特定のフルオロフォアで標識されたリソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）の非阻害性シャペロンをアロステリックに結合した蛍光GAAとの比較が行われる。
【００６４】
リソソーム酸α-グルコシダーゼ（GAA）のアロステリック非阻害シャペロンは、好ましくは、N-アセチルシステイン（NAC）、N-アセチルセリン（NAS）またはアセチルグリシン（NAG）である。
【００６５】
上記の方法の例示的な例には、以下が含まれる：特定のフルオロフォアで標識されたNAC/NAS/NAGを利用した蛍光アッセイ、および/または異なるフルオロフォアで標識されたrhGAAチオール-、アミン-、N-末端、およびC末端。これらのアッセイでは、rhGAAの熱/pH安定性が、異なるプローブで標識された酵素の蛍光に従って、変性の速度論および平衡によって分析される。アロステリック部位（単数または複数）に推定される結合リガンドのこれらの条件下での保護効果は、酵素標識の蛍光を比較することによって分析される。
【００６６】
また、NAC/NAS/NAGアロステリック部位への推定上の結合リガンドの結合の後、リガンドの存在下および非存在下で特定のフルオロフォアで標識されたNAC/NAS/NAGの蛍光を比較する。これらの薬物は、中性pH（7.0）で野生型GAAを安定化し、その触媒活性を破壊することなく、酵素の熱安定性を向上させることができ、それによりGAA触媒ドメインと相互作用しない。このように、GAA N-ブチル-デオキシノジリマイシン（NB-DNJ）と1-デオキシノジリマイシン（DNJ）のための既知のシャペロンとは異なり、NACは、酵素の競合的阻害剤ではない。
【００６７】
本発明における、リソソーム蓄積症は以下：活性欠乏/ GM2ガングリオシドーシス、アルファ-マンノシドーシス、aspartylglucosaminuria、コレステリルエステル蓄積症、慢性ソサミニダーゼ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラク、ゴーシェ病、GM1ガングリオシド（乳児、後半幼児/若年成人/慢性含む）、I細胞病/ムコリピドーシスII、乳児遊離シアル酸蓄積症/ ISSD（タイプI、タイプII、タイプIIIを含む）、少年は欠乏をミニダーゼ、（乳児発症、遅発性を含む）クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、擬似ハーラーpolydystrohpy/ムコリピドーシスIIIA、MPS Iハーラー症候群、MPS Iシャイエ症候群、MPS Iハーラー・シャイエ症候群、MPS IIハンター症候群、サンフィリポ症候群型A / MPS IIIA、サンフィリポ症候群B型/ MPS IIIB、モルキオ型A / MPS IVA族、モルキオタイプB / MPS RVB、MPS DCヒアルロニダーゼ欠損症、ニーマン・ピック病（タイプAを含む、タイプB、およびタイプC）、神経ceroidlipofuscinoses（CLN6病、非定型後半乳児、遅発性の変異体、早期の若年バテン・ピールマイアー・フォークト/少年NCL / CLN3病、フィンランドのバリアント後半乳児CLN5、ジャンスキー-Bielschowsky病/後期乳児CLN2 / TPP1病、クッフス/成人期発症NCL含む/ CLN4病、北部てんかん/バリアント後半乳児CLN8、およびSantavuori-Haltia /乳児CLN1 / PPT病）、β-マンノシドーシス、ポンペ病/ポンペ病、濃化異骨症、サンドホフ病/大人の発症/ GM2ガングリオシドーシス、サンドホフ病/ GM2ガングリオシド乳児、サンドホフ病/ GM2ガングリオシドの少年、シンドラー病、サラ病/シアル酸蓄積症、テイ・サックス/ GM2ガングリオシドーシス、ウォルマン病、多発スルファターゼ欠損症、であってもよい。
【００６８】
本発明は、以下の図面を参照しながら非限定的な実施例によって説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】rhGAAの上のpHの効果。 rhGAAは、酸性pH（3.0、4.0、5.0、6.0）および中性pH（7.0）の両方に種々の時間（0〜24時間）37℃に維持した。rhGAAの残存活性は、同じ時間だけ貯蔵緩衝液中でインキュベートし、標準的な条件下でアッセイした。
【図２】rhGAAの安定性に対するNACの効果。（A）NAC構造。 （B）NACは、rhGAAと3つの濃度（0、0.1、1、10ミリモル）でインキュベートし、10 mMの濃度で最も高い安定化効果が観察された。（C）10 mMの濃度では、活性の約90％は、インキュベーションの48時間後であっても検出可能であった。（D）rhGAAの熱安定性：SYPROオレンジの蛍光の変化は、pH 7.4での温度の関数としてモニターした。
【図３】rhGAA上のNAS、NAGおよび非アセチル化アミノ酸の効果。異なる濃度（0、0.1、1、10mM）および48時間までのインキュベーションでのrhGAA活性の効果は、（A、B）アセチル化アミノ酸NASおよびNAG、（D-F）非アセチル化ホモログCys、SerおよびGly（C）2-メルカプトエタノール。
【図４】3つの濃度でのGAA活性上のNAC、NAS、およびNAGの効果の比較。
【図５】線維芽細胞およびCOS7細胞における変異したGAAの残存活性に対するNACの効果。（A）、PD患者からの五つの線維芽細胞株は24時間、10mMのNACと共にインキュベートし、そして活性を、細胞ホモジネート中でアッセイした。NACは、（患者1,3および4由来）検討した5細胞株のうち3つの残留GAA活性を増強した。（B）NACへの突然変異GAAの応答はまた、COS7細胞における突然変異GAA遺伝子構築物のパネルを発現させることによって評価した。突然変異p.L552P、p.A445P、p.Y455F、E579KがGAA活性の増加を示したことは、NACは、突然変異したGAAの残存活性を部分的に救うことができることを示す。 （C）NACの存在下でウエスタンブロットによって分析した76および70kDaの活性なGAAアイソフォームの量が応答性の（p.L552P、p.A445P）突然変異構築物を過剰発現しているCOS7細胞からの細胞抽出物中で増加した。（D）NACは、活性部位指向型シャペロンDNJと比較して異なるシャペロンプロファイルを有する。
【図６】PD線維芽細胞におけるNACとrhGAAの間の相乗効果。（A）rhGAAの有効性は、患者3のNACの異なる濃度（0.02〜10ミリモル）で増強され、用量依存的効果を示している。（B）５つのPD線維芽細胞株を、10mMのNACの非存在下および存在下で50μΜのrhGAAとインキュベートした。全ての細胞株においてシャペロンとのrhGAAの共インキュベーションは、GAA欠損の改善された修正と、rhGAA単独で処理した細胞の活性の約3.7から13.0倍までの範囲のGAA活性の増加をもたらした。（C）NACの存在下でも、蛍光色素標識GAAの量（薄い灰色）は、、蛍光GAA単独とインキュベートした細胞と比較して増加した。（D）NACおよびrhGAAで処理した細胞におけるGAAポリペプチドの量も、、組換え酵素単独で処理した細胞と比較して、増加した。（E）76、および70 kDaの成熟した活性GAAアイソフォームの相対量は、NACの存在下で増加した。
【図７】培養されたPD線維芽細胞（患者3）中のrhGAAの有効性に関する抗酸化エピガロカテキンガレート（EGCG）とレスベラトロールの効果。二つの薬剤のいずれも、rhGAAの増強を示さなかった。
【図８】in vivoでのNACとrhGAAの間の相乗効果。（A）マウスを5日間経口NACで処理し、3日目にrhGAAの注射を受けた。単独のrhGAAで処理された動物は、対照として使用した。（B）調べた全ての組織（肝臓、心臓、横隔膜および腓腹筋）において、NACおよびrhGAAのとの組み合わせ（黒いバー）では、単独のrhGAA（灰色のバー）と比較して高いGAA酵素活性をもたらした。
【図９】NB-DNJとNACの効果の比較。の（A）NACまたはNB-DNJの存在下および非存在下で実施した、rhGAAの熱安定性スキャン。どちらのシャペロンもrhGAAの熱安定性を増加させ、NB-DNJは酵素のTm（65.9±0.3℃）で最高のシフトの結果になった。（B）患者2及び4からのPD線維芽細胞をrhGAA 、rhGAAプラスNACまたはNB-DNJのいずれかで、およびrhGAAのプラス2シャペロンの組み合わせで処理した。両方の細胞株においてNACおよびNB-DNJの組み合わせは、rhGAAによりGAA活性の最高の増強をもたらした。
【図１０】rh-α-GalAのNACの効果。（A）rh-α-Gal Aは10mM NACの存在下または非存在下で、中性pH 7.0の50mMクエン酸ナトリウム/リン酸緩衝液中でインキュベートした。48時間後、シャペロンは、rh-α-Gal Aに影響を及ぼさなかった。（B）３つのファブリー病細胞株は、NACの非存在および存在下で、公知のシャペロンDGJの存在下で、rh-α-Gal Aとインキュベートした。 NACは、研究された細胞内でのrh-α-Gal Aによるアルファ欠損の修正には増強効果がなかった。予想されたようにDGJはh-α-Gal Aの効果を大きく増強した。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
材料および方法
線維芽細胞培
PDおよびファブリー病患者由来の線維芽細胞は、患者のインフォームドコンセントを得た後、皮膚生検から得た。年齢をマッチさせたノーマル対照線維芽細胞は、、ナポリのフェデリコII大学の小児科研究室で入手可能であった。全ての細胞株は、100 U/mlペニシリンおよび100mg/mlストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（Invitrogen社、グランドアイランド、NY）および10％ウシ胎児血清（シグマアルドリッチ、セントルイス、MO）、5％CO2、37℃で増殖させた。
【００７１】
試薬
rhGAAの（alglucosidase、Myozyme）とrh-α-Gal A（アガルシダーゼ-β、Fabrazyme）はジェンザイム社（ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）からのものであった。酵素は、NAC、NAS、NAG、Cys、Ser、Gly、2-メルカプトエタノール、4-ニトロフェニル-a-グルコピラノシド（4NP-GLC）に製造業者の指示従って調製し、希釈し、NB-DNJとDGJはシグマアルドリッチから購入した。
【００７２】
エピガロカテキンガレート（カタログ第93894）とレスベラトロール（カタログ第34092）は、シグマアルドリッチから購入した。
【００７３】
免疫蛍光およびウェスタンブロット分析のために使用されたウサギ抗GAA一次抗体は、Abnova社（ハイデルベルク、ドイツ）から購入した。抗β-アクチンマウスモノクローナル抗体は、シグマアルドリッチ社から入手した。アレクサフルオロ488または596に結合した抗ウサギおよび抗マウス二次抗体はMolecular Probes社（ユージーン、OR）から入手した。 HRP結合抗ウサギまたは抗マウスIgGは、Amersham社（フライブルク、ドイツ）から入手した。rhGAAの標識は、製造業者の説明書に従ってアレクサフルオロ546標識キット（Molecular Probes）を用いて行った。
【００７４】
rhGAAの熱安定性
[フラナガンら2009]に記載されているようにrhGAAの熱安定性スキャンを行った。簡単に説明すると、酵素2.5μgを、それぞれ、10mMのおよび0.1mMのNACおよびDNJの不在および存在下で、SYPROオレンジ染料、およびリン酸ナトリウム25mM緩衝液、pH7.4の150mMのNaCl、または酢酸ナトリウム25mM緩衝液、pH5.2の150mMのNaCl、でインキュベートした。熱安定性スキャンは、リアルタイムライトサイクラー（Bio-Rad）で範囲25〜95°Cにおいて1℃/分で行った。SYPROオレンジ蛍光は、相対的な蛍光を得るために、各スキャン内で最大蛍光値に対して正規化した。融解温度は、（ニーセンら、2007）に従って計算した。
【００７５】
酵素特性評価
rhGAAの標準活性アッセイは、pH4.0の100mM酢酸ナトリウムおよび20mMの4NP-Glcにおいて、37℃で酵素5μgを用いて、200μｌで行った。反応は、酵素を添加することによって開始した。適切なインキュベーション時間（1〜2分）後に反応物をpH10.2の1M炭酸ナトリウムの800 μｌを添加することによりブロックした。吸光度は、室温で420nmで測定し、酵素単位を算出する吸光係数は17.2mM-1cm-1であった。一酵素単位は、指示された条件下で、1分間で1μmolの基質から生成物への変換を触媒する酵素の量として定義される。
【００７６】
rhGAAの安定性に対する異なるpHの効果を、特定のpHで50mMのクエン酸/リン酸（pH3.0〜7.0）の存在下での酵素0.75mg mL-1を含む反応混合物を調製することにより測定した。37℃でインキュベーション後に、アリコートを、示された時間で回収し、残留α-グルコシダーゼ活性は、標準的なアッセイを用いて測定した。化学シャペロン及び他の分子のrhGAAのpH安定性に対する影響を試験するために、上述したような実験を、本文中に示された異なる化合物の量の混合物を反応物に添加することにより、行った。
【００７７】
rhGAAと線維芽細胞のインキュベーションおよびGAAアッセイ
PD線維芽細胞におけるrhGAAの取り込みおよびGAA活性の修正を研究するために、細胞を、10mMのNACの非存在下または存在下で、24時間、50マイクロモル/ｌのrhGAAとインキュベートした。未処理の細胞または比較のために使用した。インキュベーション後、細胞をトリプシン処理により回収し、凍結と融解の5サイクルによって破壊した。
【００７８】
GAA活性は、公開された手順[ポルトら、2009]に記載の蛍光発生基質4-メチルウンベリフェリル-α-D-グルコピラノシド（シグマアルドリッチ）を使用してアッセイした。簡単に説明すると、タンパク質の25マイクログラムを100μｌのインキュベーション混合物中で60分間、pH4.0の0.2M酢酸緩衝液中の蛍光基質（2ミリモル）と共にインキュベートした。反応は、pH10.7のグリシン-炭酸塩バッファー700μｌを添加することによって停止させた。蛍光は、ターナー・バイオシステムズモジュラスfiuorometerで波長365nm（励起）および450 nm（発光）で読み取った。細胞ホモジネート中のタンパク質濃度をBradfordアッセイ（Biorad社、ヘラクレス、CA）によって測定した。
【００７９】
ウエスタンブロット分析
GAA免疫反応性物質を研究するために、線維芽細胞抽出物をウエスタンブロット分析に供した。細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、水に再懸濁し、凍結融解の5サイクルによって破壊した。線維芽細胞抽出物の等量（タンパク質20μg）を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、タンパク質をPVD膜（Millipore、ビルリカ、MA）に移した。GAAポリペプチドを検出するために、抗ヒトGAA抗血清を一次抗体として使用した。 βアクチンを検出するために、モノクローナルマウス抗体を使用した。免疫反応性タンパク質を、化学発光（ECL、アマシャム、フライブルク、ドイツ）によって検出した。
【００８０】
免疫蛍光分析および共焦点顕微鏡
AlexaFluor546 で標識した GAAの分布を研究するために、カバースリップ上で増殖させたPD線維芽細胞をメタノールで固定し、0.1％サポニンを用いて透過処理し、0.01％サポニン、リン酸緩衝生理食塩水で希釈した1％ウシ胎児血清、で1時間固定した。細胞を、一次抗体で、ブロッキング溶液中で二次抗体と共にインキュベートし、次いで、ベクタシールド封入剤（Vector Laboratories社、バーリンゲーム、CA）でマウントした。試料は、ツァイスLSM 5 10レーザー走査型共焦点顕微鏡で観察した。著者らは、アルゴン/2（458、477、488、および514ナノメートル）およびHeNel（543ナノメートル）の励起レーザを使用し、2種の蛍光色素のクロストークを低減するため、別々にスイッチオンした。緑と赤の発光は、ダイクロイックスプリッタ（FT 560）によって分離され、（緑色用の515〜540 nmのバンドパスフィルターおよび赤色発光用の> 610 nmのロングパスフィルタ）で濾過した。閾値は、対照画像に見られるシグナルの〜99％を除外するために画像に適用した。
【００８１】
インビボ研究
動物実験は、実験目的のために使用される動物の保護に関する欧州連合指令86/609に従って実施した。PD [ラーベンら、1993]の動物、マウスモデルは、5日間、水中の138 mMのNACを自由に（4.2g/kg/日）飲ませた。3日目には、尾静脈に単一のrhGAA注射（100mg/kg）を受けた。5日目に動物を屠殺し、組織をGAA活性について分析した。
【００８２】
結果
NACは、インビトロでrhGAAの安定性を改善する
以前の研究は、温度およびpHの変更のような物理的な環境の変化は、リソソーム酵素の立体構造における摂動を誘導し、それらの安定性に影響を与えることを示した。[リーバーマンら、2007；シェンら、2008]。これらの物理的ストレスへの野生型酵素の抵抗は、一般に、薬理学的シャペロンの有効性をモニターするための指標とされる[Valenzanoら、2011]。rhGAAの安定性に対するpHの影響は、図1に示されている。
【００８３】
rhGAAはpH5.0で、24時間まで安定であった。非リソソームのpH、酸性（3.0）または中性（7.0、非リソソーム細胞区画の代表）のどちらかで、酵素は不安定であり、急速に4時間後に約50％の残存活性までその活性を失い、16時間後には完全な不活性化に近くなった（10％未満の残存活性）。
【００８４】
中性pHでのrhGAAの安定性は、NACとの共インキュベーションによって救われた（図2A）。rhGAAでのNACの安定化効果は、用量依存的であり（図2B）に、さらに48時間インキュベートした後でも維持された（図2C）。
【００８５】
NACはまた、rhGAAの熱安定性を増加する：10 mMの濃度でrhGAAの融解温度（Tm）は10.5±0.5℃（Tm60.7±0.5℃対50.2±0.1℃）上昇された（図2D）。
【００８６】
NACの安定化効果がsulfidryl群から生じたかどうかを試験するために、関連するアミノ酸のN-アセチルセリン（NAS）とN-アセチルグリシン（NAG）も試験した。両方の化合物とも、酵素の活性に影響しないpH7.0でのrhGAAの著しい安定化（図3Aおよび3B）を誘導することにより、NACとして挙動した（図4）。
【００８７】
従って、これらの分子、タンパク質の活性部位とは異なるアロステリック部位での結合GAAは、アロステリック非阻害性シャペロンの新しいクラスに属する。
【００８８】
非アセチル化同族体のCys、SerおよびGlyおよび2-メルカプトエタノール、SH基を含有する構造的に無関係の化合物は、酵素不活性化を防止しなかった（図3C-F）。これらのデータは、安定化効果はむしろsulfidryl群よりアセチル基の存在によるものであったことを示している。したがって、-SH基は、酵素の小分子の結合を抑止することなく、異なる機能によって置換されていてもよい。
【００８９】
NACは、PD線維芽細胞でおよびトランスフェクトしたCOS細胞における突然変異GAAを救う
著者は異なる変異を有する５人のPD患者（PT）からの、異なる表現型（表II参照）で培養された線維芽細胞におけるNACの効果を調べた。これらの研究では、著者らは、この分子が既に臨床使用が承認されているので、したがって、NASおよびNAGと比較して臨床変換のための大きな可能性を秘めているNACに着目した。
【００９０】
【表３】
2015518872.tif 000008
*患者の遺伝子型は、ポンペ病の診断を確認するために日常的な診断手順として得た。患者やその法的保護者は、GAA遺伝子の分子解析のためのインフォームドコンセントを提供した。一つの対立遺伝子上のPt 2は、アミノ酸残基612（ヒスチジン）から616位（アスパラギン酸）の欠失及びRGI（アルギニン-グリシン-イソロイシン）の挿入を有する。第二の対立遺伝子変異はアルギニン375ロイシン。
Pt4：3つの突然変異スプライシングC-32-13T> Gとp。p.S619N(シスで）；第２のアレルでp.L5552P
PER FAVORE INSERIRE INFO PER GENOTIPO PT 2 e PT 3
**活性は、線維芽細胞で測定され、解放された4-メチル-α-D-グルコピラノシド（4MU）のナノモル/ mgタンパク質/時間として表現される（対照値58.5±28.1ナノモル4MU/mgタンパク質/時間）。
【００９１】
NACは、患者3および4からの線維芽細胞において変異GAAの残存活性を増強した（図5A）。患者3は、異常なスプライシングを引き起こす突然変異と関連して突然変異L552Pを持っていた。患者4は、3つの突然変異（一つのアレル上のc.-32-13Tおよびp.S619N、もう一つのアレル上のp.L552P変異）を持っていた。L552Pは、DNJに反応することが以前から報告されている。[Parentiら、2007；フラナガンら、2009]。
【００９２】
NACの個々の変異の応答はさらに、以前の研究に報告された方法に従って、COS7細胞における突然変異GAA遺伝子構築物のパネルを発現させることによって評価した。[Parentiら、2007年；フラナガンら、2009]（図5B）。突然変異した構築物は、イミノ糖のそれとNACのシャペロンプロファイルを比較するために、両方のイミノ糖応答性および非応答性変異を代表するように選択した。細胞は、突然変異した構築物でトランスフェクトし、10mMのNACの存在下、または非存在下のいずれかでインキュベートし、トランスフェクションの72時間後に回収した。突然変異p.L552P, p.A445P, およびp.Y455FはNACの存在下でのGAA活性の増強に有意（L552Pについて並びにA445P及びY455Fについてそれぞれp <0.01およびp <0.05）であった。突然変異pG377Rの活性の増加は統計的に有意ではなかった。
【００９３】
応答性の突然変異における酵素活性の増強は、ウェスタンブロット分析上で、76 KDaの中または70kDaのいずれかのGAAの活性なアイソフォームの増加と平行していた。図5Cは、応答性（p.L552P、p.A445P）の2つを過剰発現しているCOS7細胞のウエスタンブロットを示す。非応答性（p.G549R）突然変異のウェスタンブロット分析の結果を比較のために示す。すでに検出可能なNACの非存在下で、この後者の突然変異のために、GAAアクティブアイソフォームの量には何の変化も見られなかった（以前にフラナガンら、2009年に報告されているように）。これらの結果は、NACは、活性部位指向型シャペロンDGJおよびNB-DNJ（図5D）と比較して異なるシャペロンプロファイルを有することを示唆している。
【００９４】
NACは、PD線維芽細胞におけるrhGAAの効力を増強する
著者は以前にシャペロンは、PDとファブリー病における野生型組換え酵素の有効性を高めることを示している。[ポルトら、2009；ポルトら、2011]。PD線維芽細胞におけるイミノ糖NB-DNJはrhGAAの有効性を約1.3から2倍高めた。この効果は、PDにおける、およびおそらく他のLSDにおける、ERTの有効性を改善するための可能な戦略として非常に興味深い。
【００９５】
著者は、アロステリックシャペロンNACも同じ相乗効果を示しているかどうかをテストした。患者3からの線維芽細胞では、rhGAAとNAC（0.02〜10ミリモル）の共投与は、用量依存性の効果を有する改良されたGAAの活性をもたらした（図6A）。著者らは、NACの非存在下および存在下で50マイクロMのrhGAAと一緒に5つのPD線維芽細胞株をインキュベートした。すでに以前の論文に報告されているように、酵素欠損症の修復におけるrhGAAの有効性は、おそらく取り込みに関与する個々の要素や各細胞株における組換え酵素の細胞内輸送の結果、異なる細胞株の間で変化する [Cardoneら、2008年；ポルトら、2009]。
【００９６】
しかし、試験された全ての細胞株において、NACとrhGAAの供インキュベーションによって、単独のrhGAAで処理した細胞の活性に対して約3.7〜13.0倍の範囲のGAA活性の増加とともに、GAA欠損の改善された修正をもたらした（図6B）。
【００９７】
増強効果は、天然の突然変異酵素（患者3および4）の助けによるものを大きく超え、非応答性細胞株（患者2及び5）においても観察された。著者らはまた、蛍光GAA単独と共にインキュベートした細胞と比較して、シャペロンNACの存在下で蛍光標識GAAの量の増加も観察した（図6C）。このアプローチによって、蛍光外因性酵素だけが検出可能であり、蛍光強度の変化は、組換え酵素の唯一の影響を反映している。これらの結果の組み合わせは、シャペロンの増強効果は、野生型組換え酵素に向けられており、以前のシャペロンNB-DNJで報告されたデータ[ポルトら、2009]と一致しているというコンセプトをサポートしている。
【００９８】
ウエスタンブロット分析（図6D）および各バンドの定量分析（図6E）は、組換え酵素単独で処理した細胞と比較して、NACおよびrhGAAを用いて処理した細胞におけるGAA関連ポリペプチドの量の増加を示した。成熟活性アイソフォームへのrhGAA（つまり、110kDaの前駆体として臨床使用のために市販製剤で提供されている）の処理も、NACの存在下で改善された。 GAAバンド密度の分析は110kDa前駆体と比較して、NACの存在下で中間体（95 kDa）および成熟した（76から70 kDa）GAA分子形態の相対的な増加を示した。GAA前駆体は後期エンドソーム/リソソーム区画に活性な形態に変換されるので[Wisselaarら、1993]、これは酵素の改良されたリソソーム輸送を示している。
【００９９】
他の抗酸化剤の薬（レスベラトロール、エピガロカテキンガレート）は、PD培養線維芽細胞中でのrhGAAを増強しなかった（図７）。これらの結果は、一緒にNAC-GAA相互作用の解析とし、無細胞システム内のデータともに、NACの効果はその抗酸化特性によるものであることを排除する。著者はまた、PDのマウスモデル[レーベンら、1993]において、NACとrhGAAの組み合わせをテストした。マウスを5日間経口NACと組み合わせた高用量（100mg/kg）のrhGAAの単回注射で処置した（図８A）。組換え酵素単独で処理したマウスを対照として用いた。rhGAA注入48時間後に動物を安楽死させ、GAA活性は、異なる組織においてアッセイした。統計的に有意ではないとはいえ、試験した全ての組織（肝臓、心臓、横隔膜および腓腹筋）において、NACおよびrhGAAの組み合わせは修正した酵素活性においてrhGAA単独よりも優れていた（図８B）。
【０１００】
イミノ糖シャペロンNB-DNJとNACの比較、および特異性ofNACの効果
rhGAAの熱変性に対するNACの効果を、イミノ糖DNJの効果と比較するために、著者らは2つのシャペロンの不在および存在下でのrhGAAの熱安定性スキャンを行った。どちらのシャペロンもDNJがTm（65.9±0.3℃）で最高のシフトを起こすと、rhGAAの熱安定性を増加させた。この結果は、明らかに、図7に示したデータとは対照的であり、NACは、PDの線維芽細胞でのrhGAAの有効性を高めるのに糖ミノよりも優れていることを示している。しかしながら、これらの結果の不一致は、細胞内での組換え酵素に対するNACの阻害効果の欠如によって説明することができる。
【０１０１】
NACおよびイミノ糖シャペロンが異なるタンパク質ドメインと相互作用するという事実の帰結は、その効果が累積され得ることである。これは、rhGAAの最良の安定化およびERTとの最も高い相乗効果を得るための、患者の治療のための付加的な利点を表す場合がある。この仮説は、NACおよびDNJ（Tm = 75.9±0.3）（図9A）の組み合わせで酵素の最高の安定性を示す、rhGAAの熱変性の結果によって、および（患者２および４からの）PD細胞株における研究により、支持された。これらの細胞は、rhGAAと、rhGAAのプラスNACまたはNB-DNJのいずれかと、およびrhGAAプラス2つのシャペロンの組み合わせと一緒に、インキュベートした。両方の細胞株において、NACおよびNB-DNJの組み合わせは、rhGAAによるGAA活性の最高の増強をもたらした（図9B）。
【０１０２】
薬理学的シャペロンの使用に関する重要な問題は、それらの作用の特異性および他の酵素との相互作用の可能性である。GAAは、グリコシドヒドロラーゼのファミリーGH31に属し、興味深いことに、このファミリーはファミリーGH36とGH27と一緒にグリコシドヒドロラーゼのGH-Dスーパーファミリーに含まれていた [エルンストら2006]。後者のファミリーはリソソームアルファ-ガラクトシダーゼA（α-Gal A）を含み、それは別のLSD、ファブリー病において欠陥がある [Germain、2010] 。組換えヒトα-Gal A（rh-α-Gal A）の2つの調製物は、ファブリー病患者におけるERTのために承認されている。NACがこの酵素にアクティブであるかどうかをテストするために、著者は、pH7.0の50 mMのクエン酸ナトリウム/リン酸緩衝液中でRH-α-Gal Aと10 mMのNACをインキュベートした。NACは、48時間後rh-α-GalAに影響を及ぼさなかった（図10A）。
【０１０３】
著者がNACの非存在下および存在下でrh-α-Gal Aを有する3つのファブリー病細胞株を培養し、そして既知のシャペロンDGJ（図10B）の存在下で、添加では、NACはrh-α-Gal Aによるα欠損の修正の増強作用を有しなかった。同じ細胞株を用いた以前の研究で予想されたように、のと示されるように、[ポルトら、2011] DGJはrh-α-Gal Aの効果を大きく増強した。
【０１０４】
ディスカッション
欠損変異酵素の救済に向けた治療戦略は、ERT、遺伝子療法および造血幹細胞の移植などの野生型酵素の供給に基づく治療に対する魅力的な代替物である。変異酵素のレスキューは、様々なアプローチにより得ることができる。一つは、タンパク質の合成、フォールディング、輸送、凝集、および分解を制御する細胞ネットワークの容量を小分子薬物で調整し、こうして小胞体からの変異タンパク質の排出を容易にする、とすることを目的とするものである。［ムーら、2008；パワーズら、2009；オングとケリー、2011； Wangら、2011]。
【０１０５】
あるいは、小分子薬剤、いわゆる薬理学的シャペロンは、これらのタンパク質の最も安定な構造（単数または複数）を好む、欠陥酵素に直接作用し、品質管理および分解システムに関連する小胞体によるそれらの認識および廃棄を防止することができる。
【０１０６】
魅力的かつ迅速に臨床変換に向かって進化するとはいえ、PCTの生化学のいくつかの側面は、完全には理解されていないか、または最適化を必要としている。この点で重要な問題は、標的酵素の潜在的な阻害である。最近の検討によると、LSDの治療のために提案または使用されるすべてのシャペロンは、標的酵素の可逆的競合阻害剤であり、原理的には、これらの酵素の活性を妨害することができる[Valenzanoら、2011]。このように、（一般的には、より長い半減期を有する）変異体酵素を救出する（短い血漿半減期を有する）シャペロンのパルス投与に基づく治療プロトコールは、これまでのLSDマウスモデルで開発され、試験されている[カンナら、2010;ベンジャミンら、2012]。
【０１０７】
シャペロンの他の制限は、これらは主に特定の酵素のドメインに存在するいくつかの疾患を引き起こすミスセンス変異だけを救出するのに有効であり、限られた数の患者だけに潜在的に有効であることである。PDについては、約10〜15％の患者は、イミノ糖DNJにPCTが適用可能であり得ると推測することが可能である[フラナガンら、2009]。
【０１０８】
これらの問題は、新規かつアロステリック非阻害性シャペロンを同定することによって対処することができる。この研究において、著者らは、ACおよび関連化合物NASとNAGは、これらの特徴を有し、既知のシャペロンと比較して、異なるシャペロンプロファイルを有し、その活性を妨害しなくても、GAAを安定化することができることを示している。NACはrhGAAの細胞内輸送上の可能性のある影響のためのPD線維芽細胞において一緒に関連する他の薬（レスベラトロール、エピガロカテキンガレート）と共に、著者らの研究室で評価された既知の抗酸化剤である。しかし、NACの、rhGAAでの作用メカニズムの特徴付けは、酵素との分子相互作用が、抗酸化効果よりも、rhGAAの安定化の原因であり、および研究した他の抗酸化剤は、酵素を安定化しなかったことを示した。NACは構造的に、これまでに唯一の既知のGAAの薬理学的シャペロンであるイミノ糖とは非常に異なっており、酵素の天然の基質/製品に似ているので、これはやや意外であった。
【０１０９】
著者らは、NACは、物理的ストレスに応答して、GAAの安定性を改善することを示した。例えば、pH変化に対する耐性の増加は、特に興味深い。しばしばシャペロンの効果の尺度として使用される温度の変性に基づく方法に比べて、中性pHは、血漿中の組換え酵素によって特定の細胞区画において遭遇する環境条件のいくつかの、より代表的なものであり得る。pHは、リソソーム酵素の立体構造変化を誘導することが示されている。これはGBAについて詳細に研究されている[リーバーマンら、2007；リーバーマンら、2009]。GBAの安定性およびコンフォメーションを、中性および酸性のpH環境で、および薬理学的シャペロンIFGとの複合体において分析した。 pHの変化は、活性部位の口に局在する２つのループにおける小さいながらも重要な違いと共に、酵素の異なる立体構造をもたらした。IFGの結合は、酵素の最も安定な立体構造を好む[リーバーマンら、2007]。
【０１１０】
無細胞アッセイにおいて、NACは、pHの関数としてGAA活性の損失を防止し、酵素の熱安定性を増加させた。NACと共に、変異したGAAを過剰発現するCOS7細胞をのインキュベーションすると、研究した7つの突然変異のうちの4つについて残留GAA活性の増加をもたらした。注目すべきは、NACのシャペロニングプロファイルはNB-DNJとDGJのそれに比べて差が認められたことである。以前にイミノ糖シャペロンに対する非応答として報告された突然変異p.A445Pは、NACに応答するように見えた。これはシャペロン応答性の突然変異の数の拡大につながり得るものであり、さらにGAA遺伝子の76種類の変種で行われ、さらに大規模な研究で調査する必要がある[フラナガンら、2009]。一定数のシャペロンのin vitroでの予備スクリーニングは、異なるPD患者における最大の有益な効果を得ることを目的とした治療プロトコルのパーソナライズを可能にするであろうことを想定することができる。これらの点で、構造的にPDで識別される他の既知の薬理学的シャペロンとは非常に異なっているNACおよび誘導体の同定は、非常に有望である。実際には、そのシャペロン活性が単にそれらの構造から推測することができない他の分子は、いくつかのLSDにおいて有効であり得、それによって、新規治療薬の同定のための新しい、より広い機会を開いている。
【０１１１】
NACはまた、PD線維芽細胞中の酵素の欠陥の修正において、組換えGAA、特にrhGAAの有効性を増加させた。NACの効果と比較して、一般的なシャペロンの効果と比較して、突然変異した酵素で、この効果は、PDに罹患した患者の、場合によっては他のLSDの治癒のための大きな可能性を秘めている。ほとんどの場合、シャペロンによる内因性欠陥のある酵素の増強は、残存活性の面で若干の変更（患者の転帰にささやかな影響を持つ可能性が高い）をもたらす一方で、ERTとこれらの薬剤の相乗効果は、（少なくとも細胞系において）比活性の著しい増加を引き起こしたことは考慮されるべきである。この研究で、NACおよび組換えGAA、特にrhGAAの同時投与は、酵素欠損の完全な修復をもたらした。
【０１１２】
シャペロンとERTの間の相乗効果は、既にPD及びファブリー病において既知のシャペロンを用いて説明した。[シェンら、2008；ポルトら、2009；ポルトら、2011；ベンジャミンら、2012]。この相乗効果の分子基盤は、しかし、まだ完全には理解されていない。ERTにおけるシャペロンの増強効果は、組換え酵素の実質的な断片は、リソソームへのトラフィック時に、劣化する傾向があり、その最終的な行き先に到達できないことを意味し得る。ゴーシェ病でERTのために使用される組換えヒトGBAについて、標的組織に注入された組換え酵素の大部分を回収することができないのは、リソソームに輸送中に発生した損失に起因することが示唆された。[Xuら、1996；シェンら、2008]。また、精製工程に関連する要因、体温、血液の中性pHは、その循環を介する移動および組織液中の酵素に対するストレスをもたらし、プロテアーゼの作用または変性に対してより感受性につながる可能性が推測されている。ファブリー病のマウスモデルでのrh-α-Gal Aの同時投与に関する最近の研究では、血液中の組換え酵素のインキュベーションは、安定性の減少という結果になることが示されている[ベンジャミンら、2012]。
【０１１３】
原理的には、組換え酵素に対するシャペロンの増強効果は、エンドサイトーシス経路を介して、またはリソソーム区画内のいずれかに、細胞培地中での酵素の安定化、細胞による取り込みの改善、または細胞内の酵素の安定化によるであろう。培養線維芽細胞および突然変異した酵素を過剰発現するCOS7細胞における変異型酵素に対するNACの増強効果を示すこの結果は、少なくとも部分的には、細胞内に安定化が発生する、という仮説を好むだろう。
【０１１４】
この結果は、シャペロンとの組換え酵素間の相乗効果を支持し、重要な臨床的意味を有し、PDマウスのインビボ実験に示すように、ERTの改善された臨床的有効性に変換することができる。
【０１１５】
[参考文献]
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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