(57)【要約】  本発明は、免疫媒介性疾患、例えば、自己免疫性疾患、アレルギー性または炎症性の疾患を診断するための方法を提供する。診断は、ハプトグロビン２のヘテロ接合または同型接合の遺伝子型の検出によって、またはプレ−ハプトグロビン２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の検出および定量化によってなされる。診断後、疾患は、経上皮電気抵抗の増加につながる細胞透過性を減少させることによって、例えば、一本鎖ゾヌリンに対して直接、抗体を投与することによって処置され得、それによって、上皮成長因子受容体を阻害し、プロテイナーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ２）を阻害する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫媒介性疾患を診断するための方法であって、該方法は、
生体サンプルおよび健康な対照サンプルにおいてハプトグロビン遺伝子の単一工程の遺伝子型増幅を実行する工程を含み、ここで、健康な対照サンプルと比較した生体サンプルにおけるハプトグロビン２遺伝子型のコピー数の増加は、被験体における免疫媒介性疾患の診断および重症度に相互に関連していることを特徴とする方法。
【請求項２】
単一工程の増幅は、ハプトグロビン２（ＨＰ２）のエキソン２および７に対応する、ハプトグロビン１（ＨＰ１）のエキソン２およびエキソン５における特異的なプライマーを使用して行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プライマー配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４に示されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ハプトグロビン１に対する一卵性の遺伝子型（ＨＰ１−１）は、ゾヌリン遺伝子のコピー数が０であることを暗示しており、疾患がないことと相互に関連していることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ハプトグロビン２に対するヘテロ接合の遺伝子型（ＨＰ２−１）は、ゾヌリン遺伝子のコピー数が１であることを暗示しており、免疫媒介性疾患の診断に相互に関連していることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ハプトグロビン２に対する同型接合体の遺伝子型（ＨＰ２−２）は、ゾヌリン遺伝子のコピー数が２であることを暗示しており、ＨＰ２−１に対する診断よりも重度な疾患に相互に関連していることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
免疫媒介性疾患は、１型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡、セリアック病、強直性脊椎症、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、慢性腎疾患、または統合失調症であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
生体サンプルおよび対照サンプルは、血清、尿、便通、または組織生検であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
セリアック病を診断するための方法であって、該方法は、
遺伝子型を決定するために、生体サンプルおよび健康な対照サンプルからのハプトグロビン１（ＨＰ１）のエキソン２およびエキソン５における特異的なプライマーを使用して、ハプトグロビン遺伝子を増幅させる工程を含み、ここで、健康な対照サンプルと比較した、生体サンプルにおけるハプトグロビン２遺伝子型のコピー数の増加は、被験体における免疫媒介性疾患の診断および重症度に相互に関連していることを特徴とする方法。
【請求項１０】
ハプトグロビン１（ＨＰ１）のエキソン２およびエキソン５における特異的なプライマーは、ハプトグロビン２（ＨＰ２）のエキソン２および７に対応することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
プライマー配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４に示されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ハプトグロビン１に対する一卵性の遺伝子型（ＨＰ１−１）は、ゾヌリン遺伝子のコピー数が０であることを暗示しており、疾患がないことと相互に関連していることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ハプトグロビン２に対するヘテロ接合の遺伝子型（ＨＰ２−１）は、ゾヌリン遺伝子のコピー数が１であることを暗示しており、免疫媒介性疾患の診断に相互に関連していることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
ハプトグロビン２に対する同型接合体の遺伝子型（ＨＰ２−２）は、ゾヌリン遺伝子のコピー数が２であることを暗示しており、ＨＰ２−１に対する診断よりも重度な疾患に相互に関連していることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
生体サンプルおよび対照サンプルは、血清、尿、便通、または組織生検であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願への相互参照＞
本国際出願は、係属中の一部継続出願米国特許第１３／３２３，１００号の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２０の下、優先権の利益を主張し、その全体は、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
＜政府資金の説明文＞
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた、認可番号ＤＫ０４８３７３下での、政府支援によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、細胞生物学および腸透過性の分野に関する。より具体的には、本発明は、腸透過性のＥＧＦＲおよびプロテイナーゼで活性化された受容体２（ＰＡＲ２）の調節に関する。
【０００４】
＜関連技術の説明＞
様々な微生物への曝露の減少につながる衛生の増加は、過去３−４０年間の間に工業先進国において記録された、アレルギー性、炎症性、および自己免疫性の疾患の「流行」の原因として関係付けられてきた（１）。遺伝子構造および環境的要因に対する曝露とは別に、第３の重要な要素、すなわち、増加した腸透過性（ＩＰ）は、これらの疾患の病因において提案されてきた（２−４）。
【０００５】
腸透過性は、腸細胞および管腔の樹状細胞による抗原サンプリングと一緒に、腸管腔と粘膜下組織との間の分子輸送（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を調節し、これは、非自己抗原に対する耐性または免疫のいずれかにつながる（５）。しかしながら、傍細胞空間の大きさ（１０〜１５Ａ）は、１５Å（〜３．５ｋＤａ）を超過する分子半径を有する溶質（タンパク質を含む）が、通常、この取込み経路から排除されることを示唆している。細胞間密着結合（ＴＪ）は、傍細胞の抗原輸送（ａｎｔｉｇｅｎ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を密に調節する。
【０００６】
密着結合は、生理学的および病理学的な環境下の両方で、腸上皮のいくつかの重要な機能において効果のある動的構造である（３）。しかしながら、細胞間密着結合の組成および機能に関する知識の主な進歩にも関わらず、それらが調節される機構は、まだ完全には理解されていない。
【０００７】
密着結合の透過性を増加させる毒素である、ビブリオコレラの閉鎖帯トキシン（Ｚｏｔ）の発見は、細胞間密着結合を調節することによって腸透過性を可逆的に調節すると知られる、唯一の生理学的な伝達物質としての、その真核生物の対応物である、ゾヌリンの特定につながった（６、７）。ヒトゾヌリンは、非ヒトの霊長類の腸管上皮内で腸透過性を増加させる（７）、腸の先天免疫に関係する（８）、〜４７ｋＤａタンパク質であり、密着結合の機能不全が中心である、セリアック病（ＣＤ）（９、１０）および１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）（１１）を含む、自己免疫疾患において過剰発現される。
【０００８】
ハプトグロビン（Ｈｐ）は、主として、肝臓の他に、動脈壁、子宮内膜および腹膜において合成された、急性期反応タンパク質である。ハプトグロビンのコア機能は、主として肝臓の細網状の網内系において、遊離ヘモグロビンの末端プロセシングおよび処分に必要な、ヘモグロビン（Ｈｂ）結合タンパク質としてのコア機能である。この系は、Ｈｂ部分に存在する鉄が保存されることを可能にする。
【０００９】
ハプトグロビンは、ジスルフィド結合によって結合された、２つのａ鎖および２つのｂ鎖を含む、四量体構造を有する。ｂ鎖（２４５のアミノ酸）は、約４０ｋＤａの質量（そのおよそ３０％のｗ／ｗは炭水化物である）を有しており、すべての表現型によって共有される。ａ鎖は、２つの形態で存在し：ａ１（８３のアミノ酸、９ｋＤａ）、およびａ２（１４２のアミノ酸、１７．３ｋＤａ）、それ故、ハプトグロビンは、Ｈｐ１−１、Ｈｐ２−１およびＨｐ２−２と呼ばれる、３つの表現型として生じる。Ｈｐ１−１は２つのａ１鎖を含み、Ｈｐ２−２は２つの２鎖を含み、およびＨｐ２−１は１つのａ１鎖および１つのａ２鎖を含む。Ｈｐ１−１は、Ｈｂと複合化されたときに、１００ｋＤａ、または１６５ｋＤａの分子量を有する。Ｈｐ１−１は、単一のアイソフォームとして存在し、Ｈｐ二量体とも呼ばれる。Ｈｐ２−１は、２２０ｋＤａの平均分子量を有し、線状ポリマーを形成する。Ｈｐ２−２は、４００ｋＤａの平均分子量を有し、環状ポリマーを形成する。各々の異なるポリマー形態は、異なるアイソフォームである。
【００１０】
ハプトグロビンは、溶血によって引き起こされた腎障害のための潜在的な処置である。それは、遊離ヘモグロビンを取り除く手段として、潜在的に、治療上有用である。故に、形成された複合物は、抗炎症剤、抗酸化剤または血管形成剤としての潜在的な追加の利点を有している。しかしながら、ハプトグロビンは、その生物学的活性を保持しながら、大量に単離することが困難であると考えられている。
【００１１】
プレ−ハプトグロビン（ｐｒｅ−ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ）２の機能的な特徴づけの他に、腸透過性を調節する方法の認識された必要性が当該技術分野に存在する。本発明は、当該技術分野におけるこの長年にわたる必要性を満たす。
【発明の概要】
【００１２】
健康および疾患における腸の透過性の修飾因子としてのゾヌリンの役割は、機能的に記載されているが、その生化学的な特徴づけは、わかりにくいままである。本発明は、ヒト血清のプロテオーム解析を通じて、ゾヌリンが、プレ−ハプトグロビン（ＨＰ）２と同一であることを示し、これは、ヒトのプレ−ハプトグロビンの（ＨＰ１と共に）２つの遺伝的変異体のうちの１つである、ＨＰ２のための不活性前駆物質として現在まで唯一見なされている分子である。本発明は、プレ−ハプトグロビン２としてのゾヌリンの機能的な特徴づけを実証し、これは、その無傷の一本鎖の前駆体型で、ＥＧＦＲをＰＡＲ２活性化を介してトランス活性化することによって腸透過性を調節するように見える一方で、その開裂された二本鎖形態で、Ｈｂスカベンジャーとして作用する、多機能タンパク質である。
【００１３】
したがって、本発明の１つの実施形態では、自己免疫性疾患を処置する方法が提供される。該方法は、経上皮電気抵抗の増加につながる細胞透過性を減少させる工程を含む。関連方法は、プロテイナーゼで活性化された受容体２を阻害するさらなる工程を含んで提供される。また別の関連方法は、ＣＸＣＲ３受容体結合を介してグリアジンによってゾヌリン放出を回避するさらなる工程を含んで提供される。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、そのような処置を必要としている個体の自己免疫性疾患を処置する方法が提供される。該方法は、上皮成長因子受容体を阻害し、ＰＡＲ２を阻害する工程を含む。関連方法は、グリアジンを阻害するさらなる工程を含んで提供される。
【００１５】
本発明のまた別の実施形態では、そのような処置を必要としている個体のセリアック病を処置する方法が提供される。該方法は、一本鎖ゾヌリンに対して直接、抗体を投与する工程を含み、それによって、上皮成長因子受容体を阻害し、プロテイナーゼで活性化された受容体２（ＰＡＲ２）を阻害する。関連方法は、グリアジンを阻害するさらなる工程を含んで提供される。
【００１６】
本発明のまた別の実施形態では、被験体において腸透過性の増加に関係する疾患を診断するための方法が提供される。該方法は、被験体から生体サンプルを得て、生体サンプルにおいてプレ−ハプトグロビンまたはそのグリコフォームの発現レベルを測定する工程を含む。生体サンプルにおけるプレ−ハプトグロビンまたはそのグリコフォームの発現レベルは、対照サンプルにおいて発現されたプレ−ハプトグロビンまたはそのグリコフォームの発現レベルと比較される。対照と比較したプレ−ハプトグロビンまたはそのグリコフォームの過剰発現は、自己免疫性疾患の存在を暗示している。
【００１７】
本発明のまた別の実施形態では、被験体において自己免疫性疾患を診断する方法が提供される。該方法は、被験体から生体サンプルを得て、生体サンプルにおいてプレ−ハプトグロビン２ ｍＲＮＡを増幅させる工程を含む。増幅された生成物におけるプレ−ハプトグロビン２が定量化され、ここで、対照と比較した、プレ−ハプトグロビン−２生成物の増加は、自己免疫性疾患の存在を暗示している。
【００１８】
本発明のまた別の実施形態では、被験体において自己免疫性疾患を診断する方法が提供される。該方法は、被験体から生体サンプルを得て、生体サンプルにおいてプレ−ハプトグロビン２タンパク質を検出する工程を含む。検出されたハプトグロビン２タンパク質が定量化され、ここで、対照と比較した、サンプルにおけるプレ−ハプトグロビン−２のレベルの増加は、自己免疫性疾患の存在を暗示している。
【００１９】
本発明のまた別の実施形態では、被験体において免疫媒介性疾患を診断する方法が提供される。該方法は、被験体および健康な対照から生体サンプルを得る工程、および１回の増幅工程において、サンプルおよび対照を含むハプトグロビン遺伝子の遺伝子型増幅を行う工程を含む。対照と比較したハプトグロビン２遺伝子型のコピー数の増加は、被験体における免疫媒介性疾患の診断および重症度に相互に関連する。
【００２０】
本発明の他の及びさらなる態様、特徴および利点は、開示の目的で与えられた本発明の現在の好ましい実施形態の以下の記載から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本発明の上に詳述された特徴、利点および目的の他に、より明らかになる他のものが、達成され、また詳細に、より具体的な記載において理解され得、および上に簡潔に要約された本発明の特定の実施形態が、添付の図面で例証される。これらの図面は、明細書の一部を形成する。しかしながら、添付の図面は、本発明の好ましい実施形態を例証し、それ故、それらの範囲内で限定するものとして考慮されるべきではないことを留意されたい。
【００２２】
【図１】図１は、アルブミンおよび免疫グロブリンを除去された（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ＣＤの患者の血清上で、ゾヌリンの交差反応性の抗Ｚｏｔ多クローン性Ａｂを使用する、ウェスタンブロッティングを示す。３つの主要なパターンが検出された：１８ｋＤａ免疫反応性バンドおよびより弱い（ｆａｉｎｔｅｒ）〜４５ｋＤａバンドを示す血清（レーン１）、９ｋＤａバンドのみを示す血清（レーン２）、および１８ｋＤａおよび９ｋＤａ両方のバンドを示す血清（レーン３）。
【図２Ａ】図２Ａは、未処置の及びＰＧＮａｓｅでの脱グリコシル化後の両方での、精製されたヒトの同型接合体ＨＰ１−１およびＨＰ２−２のクーマシーおよびウェスタン免疫ブロット法（ＷＢ）を示す。未処置のＨＰのクーマシー染色は、ＭＷ 〜５２ｋＤａで遊走する、共有でグリコシル化したｂ鎖を示し、一方で、ＨＰ１−１（ａ１）およびＨＰ２−２（ａ２）のａ鎖は、それぞれ、８および１８ｋＤａの予測されたＭＷで遊走した。ＰＧＮａｓｅでの脱グリコシル化は、〜３６ｋＤａ（完全な脱グリコシル化）またはそれ以上（不完全な脱グリコシル化）のＭＷへのｂ鎖の変化をもたらした。予想通り、グリコシル化しなかったａ１鎖およびａ２鎖において、変化は観察されなかった。
【図２Ｂ】図２Ｂは、未処置の及びＰＧＮａｓｅでの脱グリコシル化後の両方での、精製されたヒトの同型接合体ＨＰ１−１およびＨＰ２−２のクーマシーおよびウェスタン免疫ブロット法（ＷＢ）を示す。未処置の及びＰＧＮａｓｅでの脱グリコシル化後の両方での、精製されたヒトの同型接合体ＨＰ１−１およびＨＰ２−２のＷＢを、単一のゲル上で３回繰り返して処理し（ｒｕｎ）、移動させ、およびその後、多クローン性の抗Ｚｏｔ（左パネル）、単クローン性の抗ＨＰ（中央パネル）、または多クローン性の抗ＨＰ抗体（右パネル）を使用して、別々にＷＢ分析にさらした。試験した３つの抗体は、ａ１およびａ２両方の鎖（すべてのパネル、レーン１および２）を認識し、その反応性のパターンは、ＨＰ１−１およびＨＰ２−２両方のタンパク質製剤（レーン３および４）の脱グリコシル化後に変化しなかった。反対に、脱グリコシル化は、抗ＨＰ単クローン性抗体（中央パネル、レーン３および４）または抗ＨＰ他クローン性抗体（右パネル、レーン３および４）のいずれかによって検出された、ＨＰ１−１およびＨＰ２−２両方におけるβ鎖の予想されたゲル移動の変化を引き起こした。ゾヌリンの交差反応性の抗Ｚｏｔ抗体は、ＨＰ１−１において余剰の〜４５ｋＤａバンドを認識したが、ＨＰ２−２においては、脱グリコシル化後の変化はなかった（矢印）。ＭＳ／ＭＳ分析およびＮ末端配列は、この〜４７ｋＤａバンドをプレ（ｐｒｅ）−ＨＰ２であると特定した。
【図３】図３は、ゾヌリンが、用量および時間依存性の方法で、Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスにおいて腸透過性を増加させたことを示す。ゾヌリンは、５、１０、２５および５０ｇ／ウェルで、Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴの腸セグメントの管腔側面に適用された。トリプシンで開裂されたプレ−ＨＰ２は、５０ｇ／ウェルで適用された。曝露の６０分後に、ゾヌリンは、≧１０ｇ／ウェルの濃度（０．０３乃至０．０３６の範囲のＰ値）で適用されると、ＴＥＥＲの著しい低下を誘発し始めた。データは、４つの独立した実験からの平均値±ＳＥＭである。
【図４Ａ】図４Ａは、インビボでのマウスの胃腸透過性に対するゾヌリンの効果を示す。ゾヌリン（閉じたバー（ｃｌｏｓｅｄ ｂａｒｓ））（１７０ｍｇ／マウス）は、ＢＳＡで処置された対照（開いたバー（ｏｐｅｎ ｂａｒｓ））と比較して、マウスの小腸（図４Ａ）とマウスの胃十二指腸（図４Ｂ）両方の透過性を増加させる。ラクツロース/マンニトール（ｌａｃｍａｎ）比（小さいＩＰ）およびショ糖分画排泄率（胃十二指腸透過性）における違いが、チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）日とチャレンジ３日前の測定の間で透過性の変化のパーセントとして示された。成熟した二本鎖ＨＰ２（点線のバー（ｄｏｔｔｅｄ ｂａｒｓ））（１７０ｍｇ／マウス）は、小腸の透過性の変化をもたらさなかった。小腸（図４Ｃ）および胃十二指腸（図４Ｄ）両方の透過性が、４８時間以内にチャレンジ前の値に戻ったため、ゾヌリンの効果は完全に可逆的であった。ラクツロース/マンニトールまたはショ糖分画排泄率の違いは、断片的な分泌、チャレンジの後の２ｄの値とチャレンジ日の値との間の透過性の変化のパーセントとして示される。＊ＢＳＡ対照および２−鎖ＨＰ２の両方と比較した、Ｌａｃｍａｎ Ｐ＜０．００２４；＊ＢＳＡ対照および２−鎖ＨＰ２（処置の各々の群に対してｎ＝１０）の両方と比較した、スクロースＰ＜０．００４９。
【図４Ｂ】図４Ｂは、インビボでのマウスの胃腸透過性に対するゾヌリンの効果を示す。 ゾヌリン（閉じたバー）（１７０ｍｇ／マウス）は、ＢＳＡで処置された対照（開いたバー）と比較して、マウスの小腸（図４Ａ）とマウスの胃十二指腸（図４Ｂ）両方の透過性を増加させる。 ラクツロース/マンニトール比（小さいＩＰ）およびショ糖分画排泄率（胃十二指腸透過性）における違いが、チャレンジ日とチャレンジ３日前の測定の間で透過性の変化のパーセントとして示された。 成熟した二本鎖ＨＰ２（点線のバー）（１７０ｍｇ／マウス）は、小腸の透過性の変化をもたらさなかった。 小腸（図４Ｃ）および胃十二指腸（図４Ｄ）両方の透過性が、４８時間以内にチャレンジ前の値に戻ったため、ゾヌリンの効果は完全に可逆的であった。 ラクツロース/マンニトールまたはショ糖分画排泄率の違いは、断片的な分泌、チャレンジの後の２ｄの値とチャレンジ日の値との間の透過性の変化のパーセントとして示される。 ＊ＢＳＡ対照および２−鎖ＨＰ２の両方と比較した、Ｌａｃｍａｎ Ｐ＜０．００２４； ＊ＢＳＡ対照および２−鎖ＨＰ２（処置の各々の群に対してｎ＝１０）の両方と比較した、スクロースＰ＜０．００４９。
【図４Ｃ】図４Ｃは、インビボでのマウスの胃腸透過性に対するゾヌリンの効果を示す。 ゾヌリン（閉じたバー）（１７０ｍｇ／マウス）は、ＢＳＡで処置された対照（開いたバー）と比較して、マウスの小腸（図４Ａ）とマウスの胃十二指腸（図４Ｂ）両方の透過性を増加させる。 ラクツロース/マンニトール比（小さいＩＰ）およびショ糖分画排泄率（胃十二指腸透過性）における違いが、チャレンジ日とチャレンジ３日前の測定の間で透過性の変化のパーセントとして示された。 成熟した二本鎖ＨＰ２（点線のバー）（１７０ｍｇ／マウス）は、小腸の透過性の変化をもたらさなかった。 小腸（図４Ｃ）および胃十二指腸（図４Ｄ）両方の透過性が、４８時間以内にチャレンジ前の値に戻ったため、ゾヌリンの効果は完全に可逆的であった。 ラクツロース/マンニトールまたはショ糖分画排泄率の違いは、断片的な分泌、チャレンジの後の２ｄの値とチャレンジ日の値との間の透過性の変化のパーセントとして示される。 ＊ＢＳＡ対照および２−鎖ＨＰ２の両方と比較した、Ｌａｃｍａｎ Ｐ＜０．００２４； ＊ＢＳＡ対照および２−鎖ＨＰ２（処置の各々の群に対してｎ＝１０）の両方と比較した、スクロースＰ＜０．００４９。
【図４Ｄ】図４Ｄは、インビボでのマウスの胃腸透過性に対するゾヌリンの効果を示す。 ゾヌリン（閉じたバー）（１７０ｍｇ／マウス）は、ＢＳＡで処置された対照（開いたバー）と比較して、マウスの小腸（図４Ａ）とマウスの胃十二指腸（図４Ｂ）両方の透過性を増加させる。 ラクツロース/マンニトール比（小さいＩＰ）およびショ糖分画排泄率（胃十二指腸透過性）における違いが、チャレンジ日とチャレンジ３日前の測定の間で透過性の変化のパーセントとして示された。 成熟した二本鎖ＨＰ２（点線のバー）（１７０ｍｇ／マウス）は、小腸の透過性の変化をもたらさなかった。 小腸（図４Ｃ）および胃十二指腸（図４Ｄ）両方の透過性が、４８時間以内にチャレンジ前の値に戻ったため、ゾヌリンの効果は完全に可逆的であった。 ラクツロース/マンニトールまたはショ糖分画排泄率の違いは、断片的な分泌、チャレンジの後の２ｄの値とチャレンジ日の値との間の透過性の変化のパーセントとして示される。 ＊ＢＳＡ対照および２−鎖ＨＰ２の両方と比較した、Ｌａｃｍａｎ Ｐ＜０．００２４； ＊ＢＳＡ対照および２−鎖ＨＰ２（処置の各々の群に対してｎ＝１０）の両方と比較した、スクロースＰ＜０．００４９。
【図５Ａ】図５Ａは、ＥＧＦＲリン酸化に対するゾヌリンの効果を示す。増加する濃度でのゾヌリンは、血清不足のＣａｃｏ−２細胞上でインキュベートされた。細胞は、溶解され、抗ＥＧＦＲ Ａｂを使用して、免疫沈殿され、抗ホスホＥＧＦＲ（ＰＹ Ｐｌｕｓ）Ａｂを使用して、ＷＢに関して処理された。等しい充填を保証するために、ブロットは、取り除かれ（ｓｔｒｉｐｐｅｄ）、ＥＧＦＲに関して再調査された。ゾヌリンは、３ｍｌ／ｍｌでプラトーに達したＥＧＦＲリン酸化の用量依存性の増加をもたらした。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＥＧＦＲリン酸化に対するゾヌリンの効果を示す。１０ｍｌ／ウェルでのゾヌリンは、血清不足のＣａｃｏ−２細胞上で、単独（レーン２）またはＥＧＦＲ選択的なＰＴＫ阻害剤ＡＧ１４７８の５μΜの存在下のいずれかで（レーン３）インキュベートされた。培地（レーン１）またはＡＧ１４７８単独に（レーン４）に曝露された細胞は、さらなる対照として使用された。ゾヌリンは、ＰＴＫ阻害剤ＡＧ１４７８によって完全に排除されたＥＧＦＲリン酸化の増加をもたらした（ｎ＝３の実験）。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＥＧＦＲリン酸化に対するゾヌリンの効果を示す。ゾヌリン１０ｍｇ／ｍｌは、単独または５μΜのＡＧ１４７８の存在下のいずれかで、１０ｇ／ウェルの濃度でＣ５７ＢＬ／６ ＷＴの腸セグメントの管腔の側面に適用され、およびＴＥＥＲはベースラインで測定され（開いたバー）、および９０分後にインキュベートされた（閉じたバー）。ゾヌリンは、ＡＧ １４７８の存在によって防がれたＴＥＥＲの著しい低下をもたらした（各群に対してｎ＝４のマウス）。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＥＧＦＲリン酸化に対するゾヌリンの効果を示す。ゾヌリン誘発性のＥＧＦＲリン酸化は、一本鎖ゾヌリン（レーン２）と比較して、二本鎖の成熟したＨＰ２（１０ｍｌ／ｍｌ）（レーン３）での処置後に、著しく減少した。レーン１は、培地単独で処置された細胞におけるＥＧＦＲリン酸化を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ＥＧＦＲリン酸化およびＩＰに対するゾヌリンの効果を例証する。ゾヌリン誘発性のＥＧＦＲリン酸化は、ＰＡＲ２が静められた（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）ときに減少した。ＰＡＲ２発現は，２の異なるＰＡＲ２ ｓｉＲＮＡを使用して、Ｃａｃｏ−２において静められた。その後、細胞は、ゾヌリン（１０ｍｇ／ｍｌ）または培地の制御（ｍｅｄｉａ ｃｏｎｔｒｏｌ）によって処置され、溶解され、抗ＥＧＦＲ Ａｂを使用して免疫沈殿され、および抗−ホスホ−ＥＧＦＲ ＰＹ−ｐｌｕｓ ＡｂによってＷＢに関して処理された。ゾヌリン媒介性のＥＧＦＲリン酸化は、ＰＡＲ２のサイレンシング（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）によって防がれた。同等のタンパク質の充填および移動は、ＥＧＦＲに関するブロットを取り除き、再調査することによって確認された。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＥＧＦＲリン酸化およびＩＰに対するゾヌリンの効果を例証する。ゾヌリンは、ＰＡＲ２−／−マウスにおいて腸透過性を増加させなかった。Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴおよびＰＡＲ２−／−両方のマウスからの小腸のセグメントは、マイクロスナップウェル（ｍｉｃｒｏｓｎａｐｗｅｌｌ）システム上に載せられ、培地単独または１０ｍｇの精製された組換えゾヌリンを含む培地に３０分間曝露し、および経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を時間０でモニタリングし（開いたバー）、および９０分後にインキュベートした（閉じたバー）。野生型のマウスで観察されたＴＥＥＲのゾヌリン誘発性の低下は、ＰＡＲ２−／−マウスにおいて解消された（ａｂｌａｔｅｄ）（ｎ＝５）。
【図７Ａ】図７Ａは、血清ゾヌリンレベルおよび腸透過性とのそれらの相関性を例証する。ＣＤ患者は、近親者（ｒｅｌａｔｉｖｅｓ）および対照の両方と比較して、より高い血清ゾヌリンレベルを示した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、血清ゾヌリンレベルおよび腸透過性とのそれらの相関性を例証する。同様の結果が、ＴＩ Ｄ患者で得られた。
【図７Ｃ】図７Ｃは、血清ゾヌリンレベルおよび腸透過性とのそれらの相関性を例証する。血清ゾヌリンは、ＬＡ／ＭＡ試験によって評価された腸透過性と相互に関連付けられた。
【図８Ａ】図８Ａは、ハプトグロビン（ＨＰ）の遺伝子型および表現型を例証する。３の潜在的なＨＰ遺伝子型を示す、３人のヒト被験体からの３のアンプリコンのアガロースゲル。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ハプトグロビン（ＨＰ）の遺伝子型および表現型を例証する。多クローン性の抗ＨＰ抗体を使用する、ウェスタン免疫ブロット法。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下の略語は、本明細書で使用されてもよい。ＡＢ：抗体；ＥＧＦＲ：上皮成長因子受容体；ＨＰ：ハプトグロビン；ＩＰ：腸透過性；ＰＡＲ：プロテイナーゼ活性化受容体；ＴＪ：密着結合；ＷＢ：ウェスタンブロットＣＤ：セリアック病。
【００２４】
本明細書で使用されるように、用語「ａ」または「ａｎ］は、請求項及び／又は明細書での用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併用して使用されるときに、「１つ（ｏｎｅ）」を指してもよいが、それはまた、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」、および「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ）」の意味と一致している。本発明の幾つかの実施形態は、本発明の、１つ以上の要素、方法の工程、及び／又は方法から成るか又はそれらから本質的に成り得る。本明細書に記載される、任意のデバイス、化合物、組成物、または方法が、本明細書に記載される、他のデバイス、化合物、組成物、または方法に関して実施され得ることが熟慮される。
【００２５】
本明細書で使用されるように、請求項での用語「または」は、本開示が代替および「及び／又は」のみを指す定義を支持するが、代替のみ又は相いれない代替を指すよう特に明記されない限り、「及び／又は」を指す。
【００２６】
本明細書で使用されてように、用語「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」は、１つ以上の他の治療薬剤を有する又は有さない本明細書に記載される化合物の１つ以上を、１つ以上の細胞と接触させる、任意の適切な方法を指す。インビボでの適用のために、投与の任意の既知の方法は、本明細書に記載されるように適切である。
【００２７】
本明細書で使用されるように、用語「有効な量」、「薬理学的に有効な量」または「治療上有効な量」は、交換可能であり、インビトロでの細胞に対する効果または改善の結果をもたらす量を指す。当業者は、有効な量が、患者または被験体の疾病を改善し得るが、完全治癒ではないかもしれないと理解する。
【００２８】
本明細書に使用されるように、用語「被験体」は、処置の任意の標的を指す。
【００２９】
したがって、本発明は、自己免疫性疾患を処置する方法に向けられ、該方法は、経上皮電気抵抗の増加につながる細胞透過性を減少させる工程を含む。該方法は、細胞透過性の減少が所望される、あらゆる自己免疫性疾患に適用可能であろう。細胞透過性が減少されるであろう代表的な細胞は、限定されないが、小腸細胞または胃十二指腸細胞を含む。１つの態様では、そのような細胞は、ゾヌリンｍＲＮＡの減少した発現を有するであろう。関連する態様では、この方法は、上皮成長因子受容体を阻害する工程をさらに含む。当業者は、この方法で使用するための、上皮成長因子受容体を阻害する既知の技術を容易に認識するであろう。例えば、好ましい実施形態では、上皮成長因子受容体は、一本鎖ゾヌリンに対して直接、抗体を投与することによって阻害される。別の関連する態様では、この方法は、ＰＡＲ２を阻害する工程をさらに含む。当業者は、ＰＡＲ２を阻害するための既知の技術を容易に認識するであろう。
【００３０】
本発明のこの方法の好ましい実施形態では、ＰＡＲ２は、一本鎖ゾヌリンに対して直接、抗体を使用して、またはｓｉＲＮＡを使用して阻害される。別の関連する態様では、この方法は、ＣＸＣＲ３受容体結合を介してグリアジンによってゾヌリン放出を回避する工程をさらに含む。本発明のこの方法を使用して処置し得る代表的な自己免疫性疾患は、限定されないが、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、全身性紅斑性狼瘡、セリアック病、強直性脊椎症、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、慢性腎疾患、または統合失調症を含む。
【００３１】
本発明は、そのような処置を必要としている個体において自己免疫性疾患を処置する方法にさらに向けられ、該方法は、上皮成長因子受容体を阻害する工程；およびＰＡＲ２を阻害する工程を含む。この方法を使用して、細胞透過性は減少され、経上皮電気抵抗の増加につながる。細胞透過性は、限定されないが、小腸細胞または胃十二指腸細胞を含む、任意の細胞で減少され得る。典型的に、そのような細胞は、ゾヌリンｍＲＮＡの発現の減少を示す。上皮成長因子受容体およびＰＡＲ２は、上に記載されるように阻害され得る。さらなる態様では、この方法は、抗グリアジン抗体を含む、当業者に既知の任意の技術を使用して、グリアジンを阻害する工程をさらに含む。本発明のこの方法を使用して処置され得る代表的な疾患は、限定されないが、Ｉ型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡、セリアック病、強直性脊椎症、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、慢性腎疾患、または統合失調症などの、自己免疫性疾患を含む。
【００３２】
本発明は、そのような処置を必要としている個体においてセリアック病を処置する方法にさらに向けられ、該方法は、一本鎖ゾヌリンに対して直接、抗体を投与し、それによって、上皮成長因子受容体を阻害し、およびＰＡＲ２を阻害する工程を含む。本発明のこの方法を使用して、細胞透過性は減少され、経上皮電気抵抗の増加につながる。代表的な細胞は、小腸細胞または胃十二指腸細胞を含むが、この方法は、多くの細胞型に有用であり得る。この方法の関連する態様では、ＰＡＲ２は、ｓｉＲＮＡを使用して、さらに阻害される。さらに、この方法は、グリアジンを阻害する工程をさらに含み得る。
【００３３】
本発明は、被験体において腸透過性の増加に関係する疾患を診断するための方法にさらにまた向けられ、該方法は、被験体から生体サンプルを得る工程；生体サンプルにおいてプレ−ハプトグロビンまたはそのグリコフォームの発現レベルを測定する工程；およびそれのサンプル中のプレ−ハプトグロビンまたはそのグリコフォームの発現レベルを、対照サンプル中のプレ−ハプトグロビンまたはそのグリコフォームの発現レベルと比較する工程、を含み；ここで、対照と比較した、プレ−ハプトグロビンまたはそのグリコフォームの過剰発現は、自己免疫性疾患の存在を暗示している。診断法に有用な生体サンプルの代表的な例は、限定されないが、血清、尿、便通、または組織生検である。特に、プレ−ハプトグロビンは、プレ−ハプトグロビン２でもよい。腸透過性の増加に関係する疾患は、アレルギー性、炎症性または自己免疫性の疾患である。疾患の代表的な例は、上に記載される通りである。
【００３４】
この方法では、プレ−ハプトグロビンの発現レベルは、ｍＲＮＡレベルで測定される。例えば、１つの態様では、プレ−ハプトグロビンは、プレ−ハプトグロビン２であり、その発現レベルの測定は、サンプルからｍＲＮＡを単離すること；サンプルにおいてプレ−ハプトグロビン２ ｍＲＮＡを増幅させ、定量化することを含む。代替的に、プレ−ハプトグロビンおよびそのグリコフォームの発現レベルは、タンパク質レベルで測定される。
本発明の別の態様では、プレ−ハプトグロビンまたはそのグリコフォームの発現レベル測定は、サンプルを、ハプトグロビンのアルファ鎖またはベータ鎖またはそのグリコフォームに向けられた抗体と接触させること；抗体に結合したハプトグロビン鎖または抗体に結合したそのグリコフォームを、プレ−ハプトグロビンまたはプレ−ハプトグロビンのグリコフォームに特異的な別の検出抗体と接触させること；およびサンプルにおいてプレ−ハプトグロビンタンパク質またはプレ−ハプトグロビンのグリコフォームを検出し、定量化することを含む。代替的な態様では、プレ−ハプトグロビンまたはそのグリコフォームの発現レベルの測定は、サンプルを、プレ−ハプトグロビンまたはそのグリコフォームに向けられた多クローン性または単クローン性の抗体と接触させること；およびサンプルにおいてプレ−ハプトグロビンタンパク質またはそのグリコフォームを検出し、定量化することを含む。
【００３５】
本発明は、被験体において自己免疫性疾患を診断するための方法にさらにまた向けられ、該方法は、被験体から生体サンプルを得る工程；生体サンプルにおいてプレ−ハプトグロビン２ ｍＲＮＡを増幅させる工程；および増幅した生成物においてプレ−ハプトグロビン２を定量化する工程を含み；ここで、対照と比較した、プレ−ハプトグロビン−２生成物の増加は、自己免疫性疾患の存在を暗示している。該方法は、上に記載されるような生体サンプルを利用してもよく、上に記載されるような自己免疫性疾患、特に、セリアック病を診断するのに有用である。
【００３６】
本発明は、被験体において自己免疫性疾患を診断するための方法にさらにまた向けられ、該方法は、被験体から生体サンプルを得る工程；生体サンプルにおいてプレ−ハプトグロビン２タンパク質を検出する工程；および検出したプレ−ハプトグロビン２タンパク質を定量化する工程を含み；ここで、対照と比較した、サンプルにおけるプレ−ハプトグロビン−２のレベルの増加は、自己免疫性疾患の存在を暗示している。該方法は、上に記載されるような生体サンプルを利用してもよく、上にも記載されるような、自己免疫性疾患、特に、セリアック病を診断するのに有用である。
【００３７】
１つの態様では、プレ−ハプトグロビン２は、生体サンプルを、ハプトグロビンのアルファ鎖またはベータ鎖に向けられた抗体と接触させることによって；および抗体に結合したハプトグロビンを、プレ−ハプトグロビン２に特異的な別の検出抗体と接触させることによって検出される。代替的な態様では、検出は、生体サンプルを、プレ−ハプトグロビン２に向けられた抗体と接触させることを含む。
【００３８】
本発明は、被験体において免疫媒介性疾患を診断するための方法にさらにまた向けられ、該方法は、被験体および健康な対照から生体サンプルを得る工程；および１回の増幅工程では、サンプルおよび対照を含むハプトグロビン遺伝子の遺伝子型増幅を実行する工程を含み、ここで、対照と比較した、ハプトグロビン２遺伝子型のコピー数の増加は、被験体における免疫媒介性疾患の診断および重症度に相互に関連している。１回の工程の遺伝子型増幅は、ハプトグロビン２（ＨＰ２）のエキソン２および７に対応する、ハプトグロビン１（ＨＰ１）のエキソン２およびエキソン５における特異的なプライマー、特に、限定されないが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のプライマー配列を使用することによって達成され得る。増幅後、ハプトグロビン１に対する一卵性の遺伝子型（ＨＰ１−１）の決定は、ゾヌリン遺伝子のコピー数が０であることを暗示しており、疾患がないことに相互に関連している。ハプトグロビン２に対するヘテロ接合の遺伝子型（ＨＰ２−１）の決定は、ゾヌリン遺伝子のコピー数が１であることを暗示しており、免疫媒介性疾患の診断に相互に関連している。ハプトグロビン２に対する同型接合の遺伝子型（ＨＰ２−２）の決定は、ゾヌリン遺伝子のコピー数が２であることを暗示しており、ＨＰ２−１に対して診断された、より重度な疾患に相互に関連している。上に記載されるようなそれらの生体サンプルは、遺伝子型決定の方法を使用するのに有用である。免疫媒介性疾患の代表的な例は、上に記載される通りである。
【００３９】
増加した腸透過性（ＩＰ）は、アレルギー性、炎症性、および自己免疫性の疾患の病因における共通の、基礎的な機構として現われた。腸透過性を可逆的に調節すると知られる唯一の生理学的な媒介物質である、ゾヌリンの特徴づけは、わかりにくいままである。ヒト血清のプロテオーム解析を通じて、本発明は、ヒトゾヌリンをハプトグロビン−２（プレ−ＨＰ２）に対する前駆体として特定した。成熟したＨＰは、その酸化活性を阻害するために遊離ヘモグロビンを除去すると知られているが、その開裂されていない前駆体型に原因として機能していない。
【００４０】
本発明は、一本鎖ゾヌリンがプロテイナーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）２の活性化によるＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）のトランス活性化につながる、ＥＧＦ様モチーフを含むことを実証している。これらの２つの受容体の活性化は、腸透過性に増加に結びついた。ＰＡＲ２のｓｉＲＮＡ誘発性のサイレンシングまたはＰＡＲ２−／−マウスの使用は、バリア完全性の損失を防いだ。そのａ２とｂのサブユニットへゾヌリンのタンパク質分解開裂は、ＥＧＦＲを活性化し、且つ腸透過性を増加させるその両方の能力を中和した。量的遺伝子の発現は、ゾヌリンが、セリアック病を有する被験体の腸粘膜において過剰発現されることを明らかにした。これは、分子の第１の例であり、分子は、その前駆体型で、その成熟型の機能とは異なる生物学的活性を発揮する。
【００４１】
これらの結果は、それ故、ゾヌリンを、治療上の介入に向けることができるヒトの免疫媒介性疾患の病因に関係する，重要なシグナロソームに結合する（ｅｎｇａｇｅｓ）新しいリガンドとして特徴づける。したがって、本発明は、限定されないが、アレルギー性、炎症性、または自己免疫性の疾患などの、免疫媒介性疾患を診断および処置する方法を提供する。特定の自己免疫性疾患は、１型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡、セリアック病、強直性脊椎症、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、慢性腎疾患、または統合失調症である。好ましくは、診断は、免疫媒介性疾患を有する、それを有する疑いのある、またはその危険性のある被験体において、ハプトグロビン遺伝子の遺伝子型を決定することを含む。代替的に、診断は、発現レベル、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質、あるいはプレ−ハプトグロビンまたはそのグリコフォームの遺伝子産物のレベルを検出および測定する又は定量化すること含み得る。
【００４２】
診断後、細胞透過性を減少させ、付随的に経上皮電気抵抗を増加させる、治療上の方策が、計画され策定され得る。これは、グリアジンをさらに阻害しながら、上皮成長因子受容体及び／又はプロテイナーゼ活性化受容体２を阻害するように設計された１つ以上の治療上の工程を含み得る。例えば、処置は、ゾヌリン、例えば一本鎖ゾヌリンに向けられた抗体を利用することよって、または小型干渉ＲＮＡまたは小分子阻害剤を利用することよって効果的であり得る。
【００４３】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例証する目的で挙げられ、任意の方法で本発明を限定するようには意図されていない。
【００４４】
＜実施例１＞
＜ヒト血清サンプル＞
健康なボランティアおよびＣＤのボランティアからのヒト血清を、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｅｌｉａｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｓｅｒｕｍ ｂａｎｋから得た。すべてのサンプルは、市販のキット（Ｅｎｃｈａｎｔ（商標）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｋｉｔ； Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， Ｍｌ， ＵＳＡ）およびＩｇＧ ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅで固定したＧタンパク質プラス（ＰＩＥＲＣＥ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ， ＵＳ）を使用して、それぞれ、アルブミンおよびＩｇＧを除去された。アルブミンおよびＩｇＧを除去した血清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、２−Ｄ電気泳動、およびＷＢ解析によって分析した。
【００４５】
＜実施例２＞
＜ヒトのハプトグロビン＞
ヒト血漿から抽出されたＨＰ１−１およびＨＰ２−２を、Ｓｉｇｍａ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）から購入した。ＨＰ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、一次元および二次元のゲル電気泳動ＷＢの両方、および質量分析法の分析を行った。ＨＰ脱グリコシル化を、製造業者の指示に従ってＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）の付加によって行った（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）。
【００４６】
＜実施例３＞
＜ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびＷＢ解析＞
アルブミンおよびＩｇＧを除去した血清（１ウェル当たり５０ｍｇ）、ヒトＨＰ１−１（１ウェル当たり１ｍｇ）、およびヒトＨＰ２−２（１ウェル当たり１ｍｇ）を、それぞれ、１８％または１２％のＳＤＳ／ＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅのゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で、変性条件および非変性条件下でＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分解した。変性条件は、サンプルへの３０ｍＬのＬａｅｍｍｌｉ緩衝剤の付加を必要とし、その後、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの前に５分間の沸騰工程を必要とした。タンパク質を、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって染色するか、またはＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に移動させ、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＩｇＧ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎのキット（ＰＩＥＲＣＥ）を使用して、精製したヒトのゾヌリンと交差反応すると以前に示された（１）、５ｍｇ／ｍＬのアフィニティー精製した（ａｆｆｉｎｉｔｙｐｕｒｉｆｉｅｄ）ラビットの多クローン性抗Ｚｏｔ ＩｇＧ Ａｂによって、または主要なＡｂとしての、２ｍｇ／ｍＬのマウスの単クローン性抗ヒトＨＰ（Ｓｉｇｍａ）または１ｍｇ／ｍＬのラビットの多クローン性抗ヒトＨＰ（Ｓｉｇｍａ）によって精査した。ＨＲＰ標識化多クローン性抗ラビットＩｇＧ（１：５，０００；Ａｍｅｒｓｈａｍ）または抗マウスＩｇＧ（１：１０，０００；Ｓｉｇｍａ）を、二次的なＡｂとして使用した。バンドを、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって検出した。
【００４７】
＜実施例４＞
＜２−ＤＥ分析および２−ＤＥ Ｗｂ＞
２−ＤＥを、ＺＯＯＭ Ｉ ＰＧＲｕｎｎｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。簡潔に言うと、アルブミンおよびＩｇＧを除去した血清を、室温（ＲＴ）で１時間、ＺＯＯＭ ＳＴＲＩＰ ｐＨ５．３−６．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再水和するために、１：２の比率で、尿素、洗浄剤、還元剤、両性電解質溶液、および色素（ＲｅａｄｙＰｒｅｐ Ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ／Ｓａｍｐｌｅ緩衝剤；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含む、商用サンプルの再水和緩衝剤に加えた。その後、ＺＯＯＭ ＳＴＲＩＰを、ＺＯＯＭ ＩＰＧＲｕｎｎｅｒ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に充填し、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）を実行した。サンプルを分画するために、２００Ｖの等電点電気泳動法工程の電圧プロトコルを２０分間、４５０Ｖの前記プロトコルを１５分間、７５０Ｖの前記プロトコルを１５分間、および２，０００Ｖの前記プロトコルを１０５分間、使用した。等電点電気泳動法工程後、２−ＤＥ ＳＤＳ／ＰＡＧＥの前に、条片を、ＮｕＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔを含む、ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１５分間平衡化し、および新たに加えたヨードアセトアミド（１２５ｍＭ；ＢｉｏＲａｄ）を含む、ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１５分間アルキル化した。２−ＤＥ ＳＤＳ／ＰＡＧＥを、固定したｐＨ勾配のウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ＮｕＮｏｖｅｘ ４−２０％ Ｔｒｉｓ−ＧｌｙｃｉｎｅＺＯＯＭＧｅｌｓ（１．０ｍｍ）を使用して処理した。タンパク質バンドを、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって視覚化した。タンパク質バンドを、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に移動させ、主要な抗体としての、アフィニティー精製した［Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｕｒｅ ＩｇＧ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット；ＰＩＥＲＣＥ］ラビットの多クローン性ゾヌリンの交差反応性抗Ｚｏｔ ＩｇＧ（５ｍｇ／ｍＬ）、および第２の抗体としての、抗ラビットＩｇＧ（ＥＣＬ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ，ＨＲＰ連結した；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。薄膜（Ｆｉｌｍｓ）を、ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によるＰＶＤＦ膜の曝露後に発達させた。
【００４８】
＜実施例５＞
＜ＭＳ分析＞
タンパク質バンドの特定のためのｌｎ−ゲルのトリプシン消化を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥまたは２−ＤＥから切除されたＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅによって予め染色されたゲルバンド上で行い、ＭＳ／ＭＳによって分析し、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ （Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓｔａｎｆｏｒｄ， ＣＡ）でのタンパク質配列／質量マッピング設備を使用して、タンパク質を特定した。
【００４９】
＜実施例６＞
＜昆虫細胞のゾヌリン／プレ−ＨＰ２の発現＞
ＨＰ２に対してコード化するヒト全長ｃＤＮＡクローンを、ＯｒｉＧｅｎｅから購入した（ＴＣ１ １６９５４；受入番号 ＮＭ＿００５１４３； ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）。Ｃ末端で６ｘＨｉｓタグを有する、ＷＴヒトゾヌリンｃＤＮＡを含む、組換えバキュロウィルスを、製造業者のプロトコルに従って、ｐＤＥＳＴ８およびＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃのバキュロウィルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して構成した。その後、ゾヌリンを、Ｇａｔｅｗａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、組換えを介してｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターからｐＤＥＳＴ８へと移動させた。バクミドＤＮＡを運ぶ、ＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ Ｉ ＯＢａｃ細胞を、ｐＤＥＳＴ８−ゾヌリンによって変換した。組換えバクミドを、ＤＨＩ ＯＢａｃ細胞から分離し、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞へとトランスフェクトし、組換えバキュロウィルスを生成した。Ｓｆ９細胞を、ゾヌリンタンパク質の発現に使用した。ゾヌリンのタンパク質発現のために、Ｓｆ９細胞（３×１０７）を、２７℃でＳＦＭ−９００ ＩＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の懸濁液フラスコ中で成長させた。細胞を、３の感染多重度で組換えバキュロウィルスによって感染させた。感染の７２時間後に、Ｓｆ９細胞を、２，０００ｘｇで１０分間、遠心分離によって集めた。ゾヌリンの精製のために、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）およびＮａＣＩを、それぞれ、２０ｍＭおよび０．５Ｍの終末濃度まで調整培地に加えた（２）。溶液を、Ｎｉ２＋で満たされたキレート化セファロース（Ｈｉｓ−結合樹脂；Ｎｏｖａｇｅｎ）のカラムに適用し、その後、２００ｍＭのイミダゾールによって溶出し、ＰＢＳへと透析した。精製したヒトのゾヌリンを、等分し、使用するまで−８０℃で保存した。
【００５０】
＜実施例７＞
＜マイクロスナップウェルシステムによるエキソビボＩＰ研究＞
エキソビボの腸透過性に対するゾヌリン／プレ−ＨＰ２の効果を、記載されるようなマイクロスナップウェルシステムにおいてモニタリングした（３）。簡潔に言うと、Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスからの小腸のセグメントを、マイクロスナップウェルシステム上に載せ、それらの管腔の側面を、培地単独または精製した組換えゾヌリンの増加する濃度を含む培地に３０分間曝露した。ＴＥＥＲを、平面電極（ＥｖｏｍＧ ＷＰＩアナライザーに付けられたＥｎｄｏｈｍ ＳＮＡＰ電極；Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、時間０で、および正常化の後にΩ／ｃｍ２で発現されて、２時間の間３０分の間隔で測定した。すべてのＴＥＥＲマイクロスナップウェル実験を、７７．９±３．５Ω／ｃｍ２（ｎ＝２３）のベースラインＴＥＥＲ値を用いてマウスの小腸上で行った。選択された実験では、ＴＥＥＲに対するゾヌリンの効果を、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤ＡＧ１４７８を用いて、基本条件下で及び前処理後にモニタリングした。実験の別のセットでは、ゾヌリンを、Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴおよびＰＡＲ２−／―マウスの両方において試験した。
【００５１】
＜実施例８＞
＜インビボでのＩＰ＞
１２９／ＳｖＥｖ ＷＴマウスを、３０匹のマウスの３つの群に無作為化した。それらを、動物を３時間絶食させ、砂糖プローブを動物の胃管に投与し（ｇａｖａｇｉｎｇ）、およびそれらを１週間２回代謝ケージに入れることによって、３週間の間、実験技術に順応させた。タンパク質のチャレンジの日に、動物は、記載されるような砂糖胃管栄養法とともに、６０−ｍＬ溶液中で１７０ｍｇの精製した一本鎖ゾヌリン、または同様の量の精製した二本鎖の開裂したＨＰ２を受けた（４）。マウスを、代謝ケージに入れ、その後２２時間、飲料水を自由に与え；この間に、それらの尿を集め、その後マウスを、従来のケージに戻した。薬物チャレンジの２日後に、マウスを、再び代謝性ケージに入れ、それらの処置からの回復を測定した。
【００５２】
＜実施例９＞
＜ＲＮＡ干渉を介するＰＡＲ２のノックダウン＞
Ｃａｃｏ−２細胞におけるＰＡＲ２発現を、２つの異なるＰＡＲ２ ｓｉＲＮＡ［ＨＳＳ１０３４７１およびＨＳＳ１０３４７３（各々、５０ｎＭ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］を使用して、静めた。細胞を、２４時間、５％のＦＣＳの存在下で、１０ｃｍのプレートにおいて、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴＩトランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して、ＰＡＲ２ ｓｉＲＮＡ製造によって製造業者の指示に従いトランスフェクトした。ＰＡＲ２のノックダウン効率を、ＷＢおよびリアルタイムＰＣＲ分析の両方によって確認した。
【００５３】
＜実施例１０＞
＜腸生検からの合計のＲＮＡ抽出＞
合計のＲＮＡを、ＴＲｉｚｏｌ ＲＮＡ精製プロトコルを使用して抽出した。簡潔に言うと、各腸の組織標本を、Ｐｏｌｙｔｒｏｎのパワーホモジナイザー ＰＴ ３１００（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ ＡＧ）を使用して、１ｍＬのＴＲｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において均質化した。ＲＮＡを、０．２ｍＬのクロロホルムを加えることによって抽出した。１５秒間、手でチューブを活発に振動させた後、サンプルを、５分間ＲＴでインキュベートし、４℃で１５分間、１５，０００のｘｇで遠心分離にかけた（Ｍａｒａｔｈｏｎ ２１０００Ｒの遠心分離機； Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ＲＮＡが豊富な水相を別のチューブに移動させた後、ＲＮＡを、最初の均質化に使用された１ｍＬのＬＴＲｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ当たり０．５ｍのイソプロピルアルコールを加えることによって沈殿された。サンプルを、１０分間ＲＴでインキュベートし、４℃で１０分間、１５，０００のｘｇで遠心分離にかけた。上清を取り除いた後、ＲＮＡペレットを、７５％の氷冷のエタノールによって１回洗浄し、最初の均質化に使用された１ｍＬのＴＲｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ当たり７５％のエタノールの少なくとも１ｍＬを加えた。ペレットを、２分間を超えずに空気乾燥し、２０ｍＬのＲＮａｓｅ遊離水中に溶解し、−８０℃で保存した。ＲＮＡ濃度を、分光光度計（ＤＵ５３０，ＵＶ／ｖｉｓ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって２６０ｎｍで読み出した。２６０：２８０の比率を、各サンプルに対して決定した。
【００５４】
＜実施例１１＞
＜ｃＤＮＡ合成＞
２マイクログラムの合計のＲＮＡを、製造業者の指示（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔにより逆転写した。
【００５５】
＜実施例１２＞
＜ヒト腸生検におけるＨＰのＰＣＲ増幅＞
ｃＤＮＡの一定量を、異なるエキソンを包含するように具体的には設計された、以下のプライマーペアを使用して、ＨＰ２に特異的なフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）のＰＣＲに対して利用した：フォワードプライマー（エキソン５）５’−ＡＴＧＧＣＴＡＴＧＴＧＧＡＧＣＡＣＴＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）およびリバースプライマー（エキソン７）５’−ＴＡＣＡＧＧＧＣＴＣＴＴＣＧＧＴＧＴＣＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）。ＰＣＲを、０．１ｍｇのｃＤＮＡ、２．５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．２ｍＭのｄＴＮＰの組合せ、０．５ｍＭの各プライマー、５ｍＭのＭｇＣＩ２、および１：１０容量の１０ｍｌのＰＣＲ標準緩衝剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって実行した。ＰＣＲを、サーマルサイクラーにおいて処理した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。９４℃での最初の１分間の変性後に、９４℃で３０秒（変性）、５８℃で３０秒（アニーリング）、および７２℃で３０秒（延長）を含む、３０サイクルを完了し、その後７２℃での１０分間の最終的な延長が続いた。その後、ＰＣＲ生成物を、２％のアガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色し、ゲルから切除し、ゲルバンド精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製し、および３７３０ｘ１ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって配列決定した。
【００５６】
＜実施例１３＞
＜ＴａｑＭａｎ手順によるリアルタイムＰＣＲ＞
リアルタイムＰＣＲを、ＨＰ２−２またはＨＰ２−１表現型の被験体のみからｃＤＮＡ上で実行し、ＨＰ２特定遺伝子プライマーおよびプローブ（生成物Ｉ Ｄ： Ｈｓ００９７８３７７＿ｍ １）およびハウスキーピング１８Ｓ（生成物ＩＤ：Ｈｓ９９９９９９０１＿Ｓ１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって実行した。反応を、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｒｏｃｈｅによって製造された）によって行い、７５００Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で処理した。すべての反応を、繰り返して行った。相対的な遺伝子発現を、ハウスキーピング遺伝子として１８Ｓでの比較的なＣｔ方法を使用して計算した。１８Ｓ ｍＲＮＡへの正常化の後に、非ＣＤ対照におけるゾヌリンｍＲＮＡ発現と比較した、ＧＦＤ食事（ｄｉｅｔ）に対する活動性ＣＤ患者およびＣＤ患者におけるゾヌリンｍＲＮＡ発現の倍変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を記録した。
【００５７】
＜実施例１４＞
＜バキュロウィルス発現系におけるヒトのゾヌリン−ｐｒｅＨＰ２クローニング発現およびプロテアーゼによるその開裂＞
バキュロウィルス系を使用する組換えゾヌリン／ｐｒｅＨＰ２タンパク質産生およびその精製は、上に記載される。精製した一本鎖ゾヌリンを、示されるセリンプロテアーゼを使用してタンパク質分解開裂にさらし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、その後、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）で染色した。二本鎖ＨＰ２の生成のために、一本鎖ゾヌリンを、２５℃で２０分間、トリプシン−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｔ−１７６３）に曝露した。ビーズを、遠心分離によって取り除き、トリプシンの除去の有効性が、基質Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ （Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対するトリプシンペプチダーゼ活性のアッセイによって確認された。
【００５８】
＜実施例１５＞
＜エキソビボおよびインビボでのＩＰ研究＞
エキソビボおよびインビボでの腸透過性に対するゾヌリンの効果を、上に記載される（８、１４）および報告されるように、実行した。ゾヌリンがＥＧＦＲを活性化することができるか否かを決定するために、ゾヌリンまたは二本鎖の成熟したＨＰ２のいずれかの増加する濃度を、増加する曝露時間の間、血清不足の、高度なＥＧＦＲ発現のＣａｃｏ−２細胞に加えた。細胞を、報告される（４０）とように、抗ホスホＥＧＦＲ（Ｙ１０６８）Ａｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ｉｎｃ．）によってＷＢのために溶解し、処理した。実験を、５μΜのＥＧＦＲ選択的ＰＴＫ阻害剤 ＡＧ１４７８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ， ＮＪ， ＵＳＡ）の存在下で繰り返した。
【００５９】
＜実施例１６＞
＜セリアック病（ＣＤ）および非ＣＤの患者の腸組織からのゾヌリン遺伝子配列決定および定量化＞
小腸粘膜のサンプルを、診断上の上部胃腸（Ｇｌ）内視鏡検査を受けている被験体の十二指腸の第２／第３の部分から得た。包含された被験体は、１０の健康な対照、診断で活動性ＣＤを有する７人の患者、少なくとも６か月の間のグルテンなしの食事での処置中であるＣＤを有する３人の患者であった。すべての患者は、手順に対して臨床的な徴候を有しており、この研究の目的のためのさらなる生検を受けるためのインフォームドコンセントを提出した。研究プロトコルは、Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄによって認可された。小腸生検を、ＲＮＡ中に／ＲＮＡ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ， ＵＳＡ）の後に、すぐに集め、処理されるまで−２０℃で保存した。合計のＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、およびリアルタイムＰＣＲは、上に記載される。
【００６０】
すべての値は、平均±ＳＥ（標準誤差）として表わされる。差の分析を、対の又は対でない変量（ｖａｒｉｅｔｉｅｓ）のいずれかに対する２つの群間の差を試験するための、両側のＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって行った。必要に応じて、多変量解析を行った。Ｐ≦／０．０５の値を、有意であると見なした。
【００６１】
＜実施例１７＞
＜ＣＤヒト血清からのゾヌリンの特徴づけ＞
ゾヌリンが、ゾヌリンの交差反応性抗Ｚｏｔ Ａｂ（Ａｂ）ベースのＥＬＩＳＡ（７−１０）によってヒト血清において検知され、正常な対照と比較して、ＣＤを有する患者で増加されるため（１０）、ウェスタン解析を、ＣＤの被験体からアルブミンおよびＩｇＧを除去した血清においてタンパク質のゾヌリン免疫反応性を検出するために最初に使用した。これらの血清は、１８および９ｋＤａ（図１）の明白な分子量とともに２つの主要なタンパク質バンドを示した。以下の反応性の３つの異なるパターンを、ＣＤ血清において特定した：１８ｋＤａのタンパク質バンド（図１、レーン１）、９ｋＤａのタンパク質バンド（図１、レーン２）、および９および１８ｋＤａのタンパク質バンド（図１、レーン３）。注意すべきは、〜４５ｋＤａのバンドを、単一の１８ｋＤａのバンド（図１、レーン１）を示した血清においてのみ検出したが、９ｋＤａのバンドまたは両方のバンド（図１、レーン２および３）のいずれにおいても血清において検出されなかったことである。１８ｋＤａのバンドを発現したＣＤ患者からの血清の二次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）は、ＭＳ／ＭＳ質量分析法の分析にさらされた、２つのゾヌリン免疫反応性のスポットを明らかにした。１８ｋＤａのスポットを、ＨＰ２のａ２鎖（受入番号 Ｇｌ：２２３９７６）として、および９ｋＤａスポットを、ＨＰ１のａ１鎖（受入番号 Ｇｌ：３３３７３９０）として特定した。ＣＤ患者からの１４の血清の無作為なスクリーニングは、７％がＨＰ１同型接合体であり、５７％がＨＰ１／ＨＰ２ヘテロ接合体であり、および３６％がＨＰ２同型接合体であることを明らかにした。
【００６２】
＜実施例１８＞
＜ヒトＨＰ調剤からのゾヌリンの特徴づけ＞
ヒトＣＤ血清において、多クローン性ゾヌリン−交差反応性抗Ｚｏｔ ＩｇＧ Ａｂによって認識された、免疫反応性バンドの特定を確認するために、ＨＰ１（ＨＰ１−１）またはＨＰ２（ＨＰ２−２）のいずれかに対する被験体の同型接合体からのヒトＨＰの市販の精製した製剤を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単一のゲル上で同時に分解し、クーマシー染色によって分析した（図２Ａ）。予想通り、ＨＰ１−１のａ１−鎖は、〜９ｋＤａのＭＷを示し（図２Ａ、レーン１）、一方で、ＨＰ２−２のａ２−鎖は、〜１８ｋＤａ（図２Ａ、レーン２）であった。そのグリコシル化によって、ｂ鎖は、ＨＰ１−１およびＨＰ２−２両方の調剤において〜５２ｋＤａのＭＷを示した（図２Ａ、レーン１および２）。Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＧＮａｓｅ Ｆ）との３時間の脱グリコシル化反応後に、ＨＰ１−１およびＨＰ２−２両方のｂ鎖を、推測上、変化する脱グリコシル化の程度が原因で、５２ｋＤａより下の複数のバンドとして処理した（図２Ａ、レーン３および４）。予測されたように、グリコシダーゼ処置後、ＨＰ１−１のａ１−鎖（図２Ａ、レーン１および３を比較する）またはＨＰ２−２のａ２鎖（図２Ａ、レーン２および４を比較する）のいずれに対しても、ゲル移動の変化は明らかではなかった。
【００６３】
図２Ｂは、脱グリコシル化の前後の、その脱グリコシルの後に市販で入手可能な精製した同型接合体ＨＰ１−１およびＨＰ２−２タンパク質の免疫ブロット法を提示する。タンパク質を、単一のゲル上で同時に処理し、多クローン性のゾヌリン交差反応性抗Ｚｏｔ Ａｂ（図２Ｂ、左パネル）、単クローン性の抗グリコシル化したｂ鎖ＨＰ（図２Ｂ、中央パネル）、または多クローン性の抗ＨＰ Ａｂ（図２Ｂ、右パネル）によって免疫ブロットした。抗Ｚｏｔ Ａｂは、ＨＰ１−１のａ１鎖およびＨＰ２−２のａ２鎖の両方に強く反応し、ＨＰ２−２調剤において存在する〜４５ｋＤａでの追加のバンドを明らかにしたが、ＨＰ１−１調剤ではそうではなかった（図２Ｂ、左パネル、それぞれ、レーン２および１）。
【００６４】
予想通り、〜５２ｋＤａのＨＰ ｂ グリコシル化したサブユニットに対する、単クローン性抗ＨＰ抗体は、ＨＰ１−１またはＨＰ２−２いずれかのｂ鎖のみを認識したが（図２Ｂ、中央パネル、それぞれ、レーン１および２）、一方で、多クローン性抗ＨＰ Ａｂは、ＨＰ１−１およびＨＰ２−２両方のａ１、ａ２、およびｂ鎖のエピトープを認識した（図２Ｂ、右パネル、それぞれ、レーン１および２）。図２Ｂはまた、同じ３つのＡｂを使用して脱グリコシル化した後の、免疫ブロットされたＨＰ１−１およびＨＰ２−２の調剤を示す。グリコシル化されなかった９ｋＤａのａ１および１８ｋＤａのａ２のサブユニットに対して試験された、３つのＡｂの反応性のパターンは、脱グリコシル化後に変化しなかった（図２Ｂ、すべての３つのパネル、それぞれ、レーン３および４）。しかしながら、脱グリコシル化は、ＨＰ１−１およびＨＰ２−２両方におけるβ鎖の予測されたゲル移動の変化をもたらした。単クローン性抗ＨＰ Ａｂ（図２Ｂ、中央パネル、レーン３および４）は、２つの不完全な脱グリコシル化したβ鎖バンドのみを認識したが、一方で、多クローン性抗ＨＰ Ａｂは、完全な脱グリコシル化した〜３６ｋＤａのβ鎖も認識した（図２Ｂ、右パネル、レーン３および４）。ＨＰ２−２調剤のみに存在した、および抗Ｚｏｔ Ａｂによって認識された、４５ｋＤａのバンドは、脱グリコシル後のゲル移動の任意の変化を示さなかったが、それは、それほど強くはないように見えた（図２Ｂ、左パネル、レーン４）。異なる時間で分析された２つの別々のサンプル上で行われた、この４５ｋＤａタンパク質バンドのＭＳ／ＭＳ分析およびＮＨ２−末端の配列決定は、このタンパク質を、ヒトＨＰ２前駆体（プレ−ＨＰ２、受入番号 Ｐ００７３８）として特定した。組み合わさったＭＳ／ＭＳの分析は、タンパク質配列全体に及ぶ、重複しないタンパク質および１３の特有のペプチドの４９．８％の合計を含有した。それ故、ａ１鎖およびａ２鎖に加えて、抗Ｚｏｔ Ａｂは、開裂された一本鎖のプレ−ＨＰ２を認識したが、ｂ鎖はそうではなかった。
【００６５】
これらの結果は、ＥＬＩＳＡによって血清ゾヌリンを測定するために使用される抗Ｚｏｔ Ａｂが、恐らく、高度に豊富なＨＰ１およびＨＰ２のタンパク質に加えて、プレ−ＨＰ２も同様に検出するはずであることを示唆している。しかしながら、ＥＬＩＳＡによって検出された血清ゾヌリンの量は、ｎｇ／ｍｌ範囲内にある（１１）が、一方で、血清中のＨＰプール全体は、ｍｇ／ｍｌ範囲内にある（１２）。この明白な不一致に対処するために、両方のヒト血清および精製したＨＰの両方のＷＢ解析を、抗Ｚｏｔ Ａｂを使用して非変性条件下で繰り返した。ＷＢは、ＨＰ２−２表現型の血清において及び市販の精製したＨＰ２−２において一連のバンドを示したが、一方で、ＨＰ１−１表現型の血清または市販の精製したＨＰ１−１のいずれにおいてもバンドは検出されなかった。反対に、開裂されたプレ−ＨＰ２を認識しなかった、抗ＨＰ多クローン性のＡｂは、市販の精製したＨＰ１−１およびＨＰ２−２の調剤の両方においてバンドを検出した。組み合わさった、これらのデータは、非変性条件下で、抗Ｚｏｔ Ａｂが、一本鎖プレ−ＨＰ２のみを検出するが、二本鎖の成熟したＨＰではそうではないことを示しており、これはさらに、その開裂された二本鎖の成熟型ではなく、一本鎖のプレ−ＨＰ２が、ゾヌリン分子に対応するという考えを支持している。
【００６６】
＜実施例１９＞
＜組換えゾヌリンの機能分析＞
哺乳類のＨＰ２ ｍＲＮＡの転写の主要な翻訳産物は、同時翻訳で二量化する、およびセリンプロテアーゼ、ＣｒＩ ＬＰによって小胞体にいる間でも、タンパク分解性に開裂される、ポリペプチドである（１３）。反対に、ゾヌリンは、開裂されないプレ−ＨＰ２としてヒト血清において検出可能である（上記参照）。開裂した成熟の二本鎖ＨＰ２でなく、一本鎖プレ−ＨＰ２としてのゾヌリンの特定を確認するために、プレ−ＨＰ２ ｃＤＮＡを昆虫細胞のベクターに挿入することによって、組換えプレ−ＨＰ２を発現し、バキュロウィルス発現系を使用して発現した。図２Ｂに類似して抗Ｚｏｔの多クローン性Ａｂによって認識され、Ｃ末端に付けられた６ｘＨｉｓタグが原因で、〜５３ｋＤａの明白なＭＷで遊走した、高度に精製した組換えプレ−ＨＰ２を得た。その後、一本鎖プレ−ＨＰ２を、一連のセリンプロテアーゼを使用して、タンパク質分解性の開裂にさらした。マトリプターゼ、ウロキナーゼ、トロンビン、および血漿カリクレインは、プレ−ＨＰ２を開裂しなかったが、一方で、プラスミンは、タンパク質の完全な分解をもたらした。対照的に、腸のセリンプロテアーゼトリプシンによる処置は、ゾヌリンのａ２およびｂのサブユニットとの適合性のある分子量を有して遊走した、２つの主要なバンドの出現につながった。これらの２つのバンドのＮＨ２末端の配列決定は、２つのタンパク質が、予測されたＡｒｇ１６１の開裂部位で開裂された、プレ−Ｈ２のａ２鎖およびｂ鎖と同一となることを示した。トリプシン消化後に得られた、無傷の一本鎖プレ−ＨＰ２および開裂された二本鎖の成熟したＨＰ２を、両方とも、以下の研究においてそれらの生物学的活性に関して試験した。
【００６７】
＜実施例２０＞
＜マイクロスナップウェルシステムにおいて取り付けたマウスの小腸中のＴＥＥＲに対する組換えゾヌリンのエキソビボ効果＞
組換えプレ−ＨＰ２（以後、ゾヌリンとして定義される）を、マイクロスナップウェルにおいて取り付けたＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスの小腸セグメントに適用した。マウスの腸セグメントの粘膜（管腔）の側面に適用された組換え一本鎖ゾヌリンは、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を減少させた、すなわち、濃度≧４０ｇ／ｍｌで適用されたときに、透過性を増加させた（図３）。対照的に、２つのトリプシン開裂した二本鎖ＨＰ２が試験されたときに、一貫したＴＥＥＲ変化は検出されなかった（図３）。
【００６８】
＜実施例２１＞
＜マウスの胃腸透過性に対する組換えゾヌリンのインビボでの効果＞
ゾヌリンが腸透過性をインビボで変更し得るか否かを確証するために、マウスを、一本鎖組換え型のプレ−ＨＰ２タンパク質（１７０ｍｇ／マウス）によって胃管に投与し、胃十二指腸および小腸の透過性を、記載されるように、特異的な砂糖プローブ（それぞれ、スクロースおよびラクツロース／マンニトール）を使用して試験した（１４）。ゾヌリン／ｐｒｅＨＰ２は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で処置された対照と比較して、小腸（図４Ａ）および胃十二指腸（図４Ｂ）の両方の透過性を増加させた。胃十二指腸および小腸の透過性は、各々、ゾヌリン／ｐｒｅＨＰ２への曝露後４８時間以内に、ベースラインに戻された（図４Ｃおよび４Ｄ）。
【００６９】
二本鎖の成熟したＨＰ２が、腸透過性に影響を与えたか否かを決定するために、上に記載されるインビボでの実験を、二本鎖のタンパク分解性に開裂されたタンパク質を投与することによって繰り返した。一本鎖ゾヌリンとは対照的に、二本鎖ＨＰ２（１７０ｍｇ／マウス）は、ＢＳＡで処置された対照と比較して、胃十二指腸および小腸の透過性のいずれかを変更することに失敗した（図４Ａおよび４Ｂ）。組み合わさった、これらのデータは、タンパク分解性の開裂によって生じたその二本鎖の成熟したＨＰ２形態ではなく、一本鎖ゾヌリンが、ゾヌリンに対して報告された、可逆的な浸透活性を保持することを示している。
【００７０】
＜実施例２２＞
＜ヒトの腸粘膜におけるゾヌリンｍＲＮＡ発現および定量化＞
特異的なプライマーおよびゾヌリン陽性の被験体からのヒトの腸生検のｃＤＮＡを使用して、６８６ｂｐのフラグメントを増幅させ、１４４ｂｐのフラグメントはａ−鎖に属し、５４２ｂｐのフラグメントはＨＰ１およびＨＰ２の遺伝子両方のｂ−鎖に属する。このフラグメントの配列決定は、ＨＰとしてのその特定を確認したが、ＨＰ１は、増幅した領域における共通配列のために、ＨＰ２と識別することができないかもしれない。これを克服するために、およびヒトの腸においてゾヌリン遺伝子の発現を特異的に定量化するために、健康な個体（ｎ＝１０）、セリアック病の患者（急性期の疾患（ｎ＝７））、およびグルテンなしの食事（ＧＦＤ）（ｎ＝３）に従うＣＤ患者の疾病寛解の腸粘膜から得たｃＤＮＡを、ａ２鎖には特異的なプライマーおよびプローブを使用して、リアルタイムＰＣＲによって分析した。健康な個体と比較して、ゾヌリンｍＲＮＡ発現は、活動性疾患を有するセリアック病の被験体の腸粘膜で増加した（３倍の増加、Ｐ＜０．０５）。グルテンなしの食事を順守する、３人のセリアック病の被験体の腸粘膜は、対照と比較して、１．５倍だけ、ゾヌリン発現を増加させたことを示した。
【００７１】
＜実施例２３＞
＜組換えゾヌリンは、ＥＧＦＲのチロシンリン酸化を増加させる＞
小麦および幾つかの他の穀物に存在し、セリアック病に典型的な小腸の自己免疫性の損傷の原因である環境的要因に存在する糖タンパク質であるグリアジンは（１５）、ゾヌリンに非常に類似した効果（７、１０、１６）である、アクチン細胞骨格に対するＥＧＦの効果を十分に再生する（１６）。さらに、構造分析は、プレ−ＨＰ−２ｂ鎖が、ＥＧＦ様の活性に必要な３つの分子内のジスルフィド結合を形成する、６つの空間的に保存されたシステイン残基を含有する、ＥＧＦモチーフを含むことを明らかにした。
【００７２】
ゾヌリンがＥＧＦＲを活性化することができるか否かを決定するために、バキュロウィルス由来の、組換えゾヌリンの増加する濃度を、Ｃａｃｏ−２の腸の上皮細胞に加えた。細胞を、溶解し、抗ＥＧＦＲ Ａｂによって免疫沈殿させ、およびフォスフォチロシンの免疫ブロット（ＰＹ Ｐｌｕｓ）のために処理した。濃度≧３ｍｇ／ｍｌで、ゾヌリンは、ＥＧＦＲのチロシンリン酸化を増加させた（図５Ａ）。ＴＥＥＲ中のゾヌリン誘発性の変化におけるＥＧＦＲの役割をさらに確立するために、上に記載される、インビトロおよびエキソビボ両方での実験を、ＥＧＦＲ選択的ＰＴＫ阻害剤、ＡＧ１４７８の存在下で行った。ＥＧＦＲ選択的タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤、ＡＧ１４７８（５ｍＭ）による２時間のＣａｃｏ−２細胞のプレ−インキュベーションは、Ｙ１０６８に対するゾヌリン／ｐｒｅＨＰ２誘発性のＥＧＦＲリン酸化を防いだ（図５Ｂ）。同様に、ＡＧ１４７８による前処置は、ゾヌリンの反応のＴＥＥＲ低下を排除した（図５Ｃ）。最終的に、ゾヌリンのトリプシン消化は、ＥＧＦＲを活性化するその能力を劇的に減少させた（図５Ｄ）。組み合わさった、これらのデータは、一本鎖ゾヌリンが、ＥＧＦＲを活性化させ、ＴＥＥＲのＥＧＦＲ誘導性の減少を誘発するが、開裂した二本鎖ＨＰ２が、ＥＧＦＲを活性化させ、ＩＰを増加させることに失敗することを示唆している。
【００７３】
＜実施例２４＞
＜組換えゾヌリン誘発性のＥＧＦＲ活性化およびＴＥＥＲの変化は、ＰＡＲ２依存性である＞
Ｚｏｔ活性ペプチドＦＣＩＧＲＬ（ＡＴ１００２）は、ＰＡＲ２−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＡＰ）、ＳＬＩＧＲＬとの構造類似性を有し、ＷＴで実証された発見ではあるが、ＰＡＲ２−／−マウスではそうではなかった、ＴＥＥＲのＰＡＲ２依存性の変化をもたらす（１７）。さらに、ＰＡＲ２を含む、幾つかのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、ＥＧＦＲをトランス活性化する（１８）。Ｚｏｔおよびゾヌリンが、作用の同様の機構を共有し（６）、ゾヌリンのタンパク質配列が、そのｂ鎖（ＦＣＡＧＭＳ）において、Ｚｏｔ様およびＰＡＲ２ ＡＰ様のモチーフを含むため、ゾヌリン誘発性のＥＧＦＲ活性化がＰＡＲ２依存性であるかどうかを決定した。
【００７４】
Ｃａｃｏ−２細胞におけるＰＡＲ２のｓｉＲＮＡ誘発性のサイレンシングは、ＥＧＦＲのＰＡＲ２依存性のトランス活性化に適合性のある、組換えゾヌリン（１０ｍｇ／ｍｌ）に反応する、ＥＧＦＲ Ｙ１０６８のリン酸化を縮小した（図６Ａ）。
【００７５】
ゾヌリンに反応するＥＧＦＲ活性化におけるＰＡＲ２に対する役割をさらに確立するために、小腸のバリア機能を、５７ＢＬ／６ ＷＴまたはＰＡＲ２−／−いずれかのマウスから単離したセグメントを使用して、マイクロスナップウェルシステムにおいて研究した。予測したように、組換えゾヌリンは、ＰＡＲ２−／−マウスからの小腸セグメントにおけるＴＥＥＲを減少させるのに失敗したが、Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスからの腸セグメントにおけるＴＥＥＲを減少させ（図６Ｓ）、それによって、ＥＧＦＲのゾヌリン誘発性のＰＡＲ２依存性のトランス活性化を、バリア機能の調節と連結させる。
【００７６】
本発明は、ゾヌリンをＨＰ２の前駆体として特定した。成熟したヒトＨＰは、ジスルフィド結合によって共有結合される、ａ鎖およびｂ鎖のポリペプチド鎖から構成される、異種ダイマー性の血漿糖タンパク質であり、ここで、ｂ鎖のみがグリコシル化される（１９）。ｂ鎖（３６ｋＤａ）と異なり、ａ鎖は，２つの形態、すなわち、ａ１（〜９ｋＤａ）およびａ２（〜１８ｋＤａ）で存在する。２つの鎖の１つまたは両方の存在は、結果的に、３つの表現型、ＨＰ１−１、ＨＰ２−１、およびＨＰ２−２をもたらす。これらのＨＰ変異体は、マンノースを結合するレクチンに関連したセリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）から発展し（１２、２０）、ａ鎖は、補体制御タンパク質を含み、ｂ鎖は、触媒的に死亡したキモトリプシン様のセリンプロテアーゼドメインを含む（２１−２４）。ＭＡＳＰファミリーの他のメンバーは、細胞の成長、増殖、分化、移動、および細胞間結合の破壊に関係する、一連のプラスミノーゲン関連性の成長因子（ＥＧＦ、ＨＧＦなど）を含む。このマルチドメイン構造にもかかわらず、現在までにＨＰに割り当てられた唯一の機能は、Ｈｂに結合して、安定したＨＰ−Ｈｂ複合物を形成し、それによって、Ｈｂ誘発性の酸化組織損傷を防ぐことである（２５）。それらの前駆体型のために機能が記載されることは今までになかった。
【００７７】
ＨＰは、それらの前駆体タンパク質が、トランス−ゴルジ複合体において開裂される代わりに、小胞体において補体Ｃ１ ｒ様のプロテアーゼ（ＣｒＩ ＬＰ）によってタンパク分解性に処理されるという点で、普通でない分泌タンパク質である（１３）。興味深いことに、小胞体画分は、最も高いゾヌリン濃度が検出された細胞画分であった（９）。
【００７８】
ゾヌリンの重要な生物学的作用が、細胞間のＴＪ機能を調節することであるため（７、９−１１）、組換えプレ−ＨＰ２を、腸透過性アッセイで検査した（ｅｘａｎｕｂｅｄ）。プレ−ＨＰ２は、エキソビボおよびインビボ両方で、ネズミの小腸粘膜にわたって、ＴＥＥＲを用量依存的に及び時間依存的に減少させた。ゾヌリンが、その２つのａ２およびｂのサブユニットへと開裂された後にその浸透する活性を失ったという観察は、ゾヌリン／プレ−ＨＰ−２および成熟した２−鎖のＨＰ２が、別々の生物学的機能を発揮するという考えをさらに支持している。ＨＰタンパク質機能を決定づける（ｄｉｃｔａｔｉｎｇ）タンパク質立体配座の重要性は、ゾヌリン−交差反応性の抗Ｚｏｔ Ａｂが、非変性条件下でＨＰ１ ａ１鎖を認識したが（図１Αおよび２Ｂ）、非変性のＨＰ１を認識することに失敗したという発見によってさらに支持される。組み合わさった、これらのデータは、プレ−ＨＰ２としてのゾヌリンの特定を確証している。
【００７９】
ゾヌリンのＮＨ２末端のアミノ酸配列は、ＨＰに対しても示される類似性である（２６）、ヒトｇグロブリンの軽鎖との著しい類似性を有している（７）。ＨＰ−Ｈｂ複合物のクリアランスは、単球／マクロファージのスカベンジャー受容体、ＣＤ１６３によって媒介され得る（２５）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗのデンドログラム（ｄｅｎｄｏｇｒａｍ）分析は、以下のガンマグロブリン様のコンセンサスモチーフ（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｍｏｔｉｆ）とのＣＤ１６３結合部位のちょうど上流の、ゾヌリンｂ鎖での領域を示した：ＱＬＶＥ‐‐‐Ｖ‐‐‐Ｐ。以前に報告されたゾヌリン配列とこのプレ−ＨＰ２コンセンサスモチーフとの間の相違は、種内の差が原因であり得る。
【００８０】
ゾヌリンは、成長因子のような反復を含む。ゾヌリンのように、成長因子は、細胞間の密着結合の完全性に影響を与える（２７、２８）。本発明は、その開裂された成熟型ではない、一本鎖ゾヌリンが、ＰＡＲ２を介してＥＧＦＲをトランス活性化し、ＴＥＥＲに対するその効果が、ＥＧＦＲまたはｓｉＲＮＡ誘発性のＰＡＲ２のサイレンシングの薬理学的な阻害によって防がれる。これは、成熟した２‐鎖ＨＰ２ではなく、一本鎖ゾヌリンにおける成長因子モチーフが、ＰＡＲ２を介する間接的なトランス活性化によって密着結合の分解を誘発するのに必要な、分子の立体配座を有していることを示している。
【００８１】
ＣＤの環境的要因である、グリアジンは、伝えられるところによると、アクチン細胞骨格に対するＥＧＦの効果を再生する（１６）。これらの効果は、ゾヌリンに対して報告された効果に非常に類似している（７）。グリアジンは、ＣＸＣＲ３ケモカイン受容体に結合し（２９）、この相互作用は、腸細胞（９）および全体的な腸組織（１０）の両方からのゾヌリン−プレ−ＨＰ２放出に連結している。故に、グリアジン関連性のＥＧＦ効果は、ゾヌリン放出を介して媒介されるようである。腸内細菌のコロニー形成もまた、ゾヌリン放出に対する刺激となる（８）。グリアジンおよび微生物は両方とも、ゾヌリンの極性化した、管腔の分泌を引き起こす（８）。それ故、研究は、初期のゾヌリン作用、すなわち、腸の管腔の側面でのその活性に焦点を当てた。この手法は、ＥＧＦＲおよびＰＡＲ２の両方が、側底に発現されるという観察を考慮すると、反直感的であるように見える（３、３０）。しかしながら、それらが頂端でも発現されるという証拠が存在する（３１）。ゾヌリンが、腸粘膜の管腔の側面に適用されたときに、エキソビボおよびインビボの両方で、浸透効果を発揮したという事実は、タンパク質が側底でも作用するという可能性を疑わない。環境的要因（すなわち細菌、グルテン）が腸管腔に存在するときに、ゾヌリンは、ＣＸＣＲ３によって、少なくともグリアジンに対して、腸細胞から放出される（媒介される過程）（２９）。ゾヌリン放出および続く腸透過性の増加の後に、これらの要因は、粘膜下組織に達することができ、ここで、ゾヌリンを発現する免疫細胞は、ゾヌリンを基底外側に提示することができる。管腔および漿膜の側面の両方からから作用する腸透過性を制御する別のセリンプロテアーゼである、粘膜のマスト細胞プロテアーゼＩＩに対して、類似した両側性の作用が報告された（３２）。
【００８２】
上皮の透過性を調節するＥＧＦＲおよびＰＡＲ２両方の役割は、以前に報告した（３３、３４）。しかしながら、本発明は、２つの受容体が、小さな腸透過性を調節するために協力的に作動するという第１の証拠を提供する。
【００８３】
ゾヌリンが、セリアック病の急性期の間にアップレギュレートされることが報告された（９、１０）。ＨＰ特異的なプライマーを使用して、本発明は、初めて、ヒトの腸におけるゾヌリンｍＲＮＡの発現を報告する。さらに、リアルタイムＰＣＲ実験は、ゾヌリン発現が、正常な対照と比較して、セリアック病患者において増加したことを示した。グルテンなしの食事をとっているセリアック病患者としての疾患活性に関連付けられたゾヌリンの増強した発現は、活動性のセリアック病患者および正常な対照に対する中間値であるゾヌリン発現に対する平均値を示した。興味深いことに、Ｐａｐおよび同僚は、ＨＰ遺伝子中の多型性が、セリアック病の進行およびその臨床徴候に対する新しい遺伝的リスク因子を表わすと最近報告した（３５）。
【００８４】
プレ−ＨＰのヒト血漿レベルは、１００かた３００ｍｇ／１００ｍｌの間であり、
ＨＰ２−２の範囲は、１００−２６０ｍｇ／１００ｍｌの間である（３６）。ＨＰのほぼ８％は、その代用形で分泌され、これは、生理学的環境下で、８０−２０８ｍｇ／ｍｌのプレ−ＨＰ２がヒト血漿に存在することを示唆している（３７）。それ故、本明細書に使用されるゾヌリンの濃度は、生理学的範囲内にあり、ゾヌリンが病理学的過程の間にアップレギュレートされるときに活性化されたシグナル伝達経路を示唆している可能性が高い。
セリアック病を除いて、ゾヌリンの高まったレベルは、Ｉ型糖尿病（１１）、全身性紅斑性狼瘡（３８）、および強直性脊椎炎（３９）を含む、他の自己免疫性疾患で報告されており、これはさらに、自己免疫性疾患の病因におけるゾヌリン経路の重要性をさらに描写している。ゾヌリンが幾つかの免疫媒介性疾患の急性期の間に過剰発現され、その遮断が自己免疫反応の発症を予防するという観察とともに、これらの結果は、ゾヌリンが、これらの疾病の病因に寄与し、免疫媒介性疾患の病理生物学における新しいパラダイムおよび処置オプションを切り開くことを示唆している。
【００８５】
＜実施例２４＞
＜セリアック病（ＣＤ）および１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）におけるゾヌリン表現型およびその腸透過性との相関性＞
この認可の支持とともに発達された血清ゾヌリンのＥＬＩＳＡを使用して、ＣＤおよびＴ１Ｄ両方の患者、その近親者、および年齢および性別が一致した健康な対照において、血清ゾヌリンレベルを測定した。ＣＤ ＣＤ患者は、その近親者（１．７５±０．２７ｎｇ／ｍｇのタンパク質、ｐ＝０．０５）および対照被験体（０．３１±０．０３ｎｇ／ｍｇのタンパク質、ｐ＜０．００００１）と比較して、統計的により高い血清ゾヌリンレベル（２．３７±０．１７ｎｇ／ｍｇのタンパク質）を示した（図７Ａ）。ＣＤ患者の８１パーセント（１５４／１９０）およびそれらの第一度近親者の５０％（３３／６５）は、年齢が一致した健康な対照において検出された平均ゾヌリンレベルを超える、２ ＳＤの血清ゾヌリンレベルを有していた。対照の４．９％だけ（５／１０１）が、平均（ｐ＜０．０１）を超えるゾヌリンレベル２ ＳＤを有していた。血清ゾヌリンは、その近親者（ｐ＜０．００００１）と比較して、ＣＤにおいて高かった。Ｔ１Ｄ患者において同様の結果を得、そこで、その近親者（０．６２±０．０７ｎｇ／ｍｇのタンパク質、ｐ＝０．０１１）および対照被験体（０．２１±０．０２ｎｇ／ｍｇのタンパク質、ｐ＜０．００００１）と比較して、増加した血清ゾヌリンレベル（０．８３±０．０５ｎｇ／ｍｇのタンパク質）を検出した（図７Ｂ）。Ｔ１Ｄ患者の４２％（１４１／３３９）およびその第一度近親者の２９％（２６／８９）は、年齢が一致した健康な対照において検出された、平均ゾヌリンを超える２ ＳＤの血清ゾヌリンレベルを有していた。対照の４％のだけ（４／９７）が、平均（ｐ＜０．０１）を超えるゾヌリンレベル２ ＳＤを有していた。その近親者（ｐ＝０．０１）と比較して、血清ゾヌリンは、Ｔ１Ｄにおいてより高かった。血清ゾヌリンレベルが腸透過性に相互に関連するか否かを確証するために、ラクツロース（ＬＡ）／マンニトール（ＭＡ）尿の比率を、文書化したゾヌリンのアップレギュレーション（Ｎ＝３６）を有するＴ１Ｄ被験体の亜群およびそれらの近親者（Ｎ＝５６）の両方において決定した。腸透過性は、血清ゾヌリンに相互に関連した（図７Ｃ）。
【００８６】
＜実施例２５＞
＜ＨＰ遺伝子型決定のための新しい方法＞
大量のサンプル中でＨＰ２、すなわち、ゾヌリンの遺伝子の存在およびコピー数を確立する、高スループット方法を発達させるために、新しい単一工程の増幅方法を、ＨＰ２のエキソン２および７に対応するＨＰ１のエキソン２およびエキソン５に以前に記載されたようなＰｒｉｍｅｒ３によって計画されたプライマーを使用して発展させた。簡潔に言うと、遺伝子型決定は、ＨＰ２のエキソン２および７に対応するＨＰ１のエキソン２およびエキソン５におけるＰｒｉｍｅｒ３によって計画された以下のようなプライマーとともになされた：フォワード：ＴＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣＴＡＡＧＴＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３）およびリバース：ＡＡＴＧＴＣＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４）。
【００８７】
ＰＣＲを、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ ＳｃｉｅｎｃｅからのハイファイＰＣＲ系を使用して、５０μｌの反応物中でセットアップする。反応物は、１μｌのヌクレオチド１０ｍＭの組合せ、２．５μｌの各プライマー３００ｎＭ、５μｌのＤＮＡ５Ｏｎｇ／μｌ、１．５ｍＭのＭｇＣＬ２を有する５μｌの緩衝剤、１つの反応物当たり２．６Ｕの０．７５μｌ酵素の組合せ、および３３．２５μｌのヌクレアーゼの遊離したＨ２０を含む。ＰＣＲは、以下のプロトコルによって処理される：１ ． ９４℃ − ２ｍ， ２， ３０サイクルの９４°Ｃ − １５ｓ， ６０℃ − ９０ｓ， ６８℃ − ２ｍ， ３． ７２℃ − ７ｍ。ＰＣＲの後、アンプリコンを、１％のアガロースゲル上で処理し、ＵＶバルブ下で読む。ＨＰ２における重複および大きさの差は、２つの遺伝子型の分化を可能にする。ＨＰ１遺伝子型は、２．５ｋｂの大きさで処理され、一方で、ＨＰ２は４．３ｋｂで処理される。この手法を使用して、対応する表現型と一致した３つの潜在的な遺伝子型を特定した（図２）。
【００８８】
＜実施例２６＞
＜ＨＰ２（ゾヌリン）アレルは、免疫媒介性疾患では過剰に表わされる＞
ＣＤ患者および一致した制御部の間のＨＰ１とＨＰ２の遺伝子の分布を確立するために、シングル・ステップＲＴ−ＰＣＲプロトコルは、ＨＰ２のエキソン２および７に対応するＨＰ１のエキソン２およびエキソン５の中で特異的なプライマーを使用するので発達された。ＰＣＲ後、アンプリコンを、１％のアガロースゲル上で処理し、ＵＶバルブ下で読んだ。ＨＰ１遺伝子型を、２．５ｋｂの予測された大きさで処理し、一方で、ＨＰ２を４．３ｋｂで処理した。結果は、ＣＤ患者において、ＨＰ１−１遺伝子型（ゾヌリン遺伝子のコピー数が０）が減少し、一方で、ＨＰ２−２遺伝子型（ゾヌリン遺伝子のコピー数が２）が、健康な対照と比較して、増加したたことを示した（表１）。興味深いことに、ＨＰ１−１のＣＤ患者（ゾヌリン遺伝子のコピー数が０）のパーセンテージは、ゾヌリンのＥＬＩＳＡによって陰性と試験されたＣＤ患者のパーセントの同じ範囲内にあった。ＨＰ遺伝子の同様の分布は、クローン病、統合失調症、および慢性腎疾患（ＣＫＤ）を含む、他の免疫媒介性疾患における他の研究者によって報告されてきた（表１）。
【００８９】
【表１】
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【００９０】
以下の参考文献を本明細書で引用した：
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４． Ｗａｐｅｎａａｒ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｇｕｔ ５７：４６３−４６７．
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６． Ｆａｓａｎｏ Ａ （２０００） Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１５：２１４−２２２．
７． Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １ １３ Ｐｔ ２４：４４３５−４４４０．
８． Ｅｌ ｅｔ ａｌ．， （２００２） Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２３：１６０７−１６１５．
９． Ｄｒａｇｏ ｅｔ ａｌ．， （２００６） Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ４１ ：４０８−４１９．
１０． Ｆａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｌａｎｃｅｔ ３５５：１５１８−１５１９．
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１２． Ｂｏｗｍａｎ ＢＨ， Ｋｕｒｏｓｋｙ Ａ （１９８２） Ａｄｖ Ｈｕｍ ＧｅｎｅＭ２：１８９−４．
１３． Ｗｉｃｈｅｒ ＫＢ， Ｆｒｉｅｓ Ｅ （２００４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１ ：１４３９０−１４３９５．
１４． Ｍｅｄｄｉｎｇｓ ＪＢ， Ｓｗａｉｎ ＭＧ （２０００） Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １ １９：１０１９−１０２８．
１５． Ｓｏｌｌｉｄ ＬＭ （２００２） Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：６４７−６５５．
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１８． ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｒｗｅ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９４：Ｇ４４１ − Ｇ４５１．
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２０． Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３０９：１３１ −１３５．
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２２． Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， （２００７） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：１０７２−１０７９．
２３． Ｐｏｌｔｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， （２００８） ＦＥＢＳ Ｊ ２７５：５６４８−５６５６．
２４． Ｗｉｃｈｅｒ ＫＢ， Ｆｒｉｅｓ Ｅ （２００６） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３：４１６８−４１７３．
２５． Ａｓｌｅｈ ｅｔ ａｌ．， （２００３） Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ９２：１ １９３−１２００．
２６． Ｈｕｎｔ ｅｔ ａｌ．， （１９７２） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ４７：６９９−７０４．
２７． Ｈｏｌｌａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．， （２００１ ） Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏ．
Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓ． ２８０：Ｇ９１０−Ｇ９２１．
２８． Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， （２００２） Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４３：２７８２−２７９０．
２９． Ｌａｍｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３５：１９４−２０４．
３０． Ｐｌａｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｇｕｔ ３９：２６２−２６６．
３１ ．Ｂａｒｎａｒｄ ＪＡ， ＭｃＨｕｇｈ ＫＭ （２００６） Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔｒａｃｔ．１ ｅｄ．ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔｒａｃｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ ＩＶ， ｅｄｓ Ｊｏｈｎｓｏｎ ＬＲ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２００６：１８３−２４６．
３２． Ｊａｃｏｂ ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０：３１９３６−３１９４８．
３３． Ｂｕｅｎｏ Ｌ， Ｆｉｏｒａｍｏｎｔｉ Ｊ （２００８） Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｍｏｔｉｌ ２０：５８０−５８７．
３４． Ｒａｉｍｏｎｄｉ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏ．Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓ． ２９４：Ｇ９０６−Ｇ９１３．
３５． Ｐａｐｐ （２００８） Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５４：６９７−７０４．
３６． ｓｃｒｉｐｐｓｌａｂｓ．
３７． Ｍｉｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， （１９８３） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １１４：７２９−７３６．
３８． Ｐａｖｏｎ ｅｔ ａｌ．， （２００６） Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ６ Ｓｕｐｐｌ １ ：Ｓ２８２−Ｓ２９２．
３９． Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， （２００７） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３５７：５３１−５３６．
４０． Ｙａｉｓｈ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：９３３−９３５．
【図１】
2015518367.tif 000003
【図８Ａ−８Ｂ】
2015518367.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2015518367.tif 000006
【図３】
2015518367.tif 000007
【図４Ａ】
2015518367.tif 000008
【図４Ｂ】
2015518367.tif 000009
【図４Ｃ】
2015518367.tif 000010
【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2015518367.tif 000015
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2015518367.tif 000017
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2015518367.tif 000019
【図７Ｃ】
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【国際調査報告】
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2015518367.tif 000022
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