(57)【要約】  本発明は、ヒトＨＥＲ１、ヒトＨＥＲ２、及びヒトＨＥＲ３に結合する、二価、多重特異性抗体、特に二価、三重特異性抗体、及びそれらの製造及び使用に関する。
2015520168.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｂ）ａ）第一抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第二抗原及び第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｃ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原及び第四抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖
を含み、
抗体は二価、三重又は四重特異性抗体である、多重特異性抗体。
【請求項２】
抗体は三重特異性抗体であり、
Ａ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｂ）ａ）第一抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第二抗原及び第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の多重特異性抗体。
【請求項３】
Ａ）のもとで、第一抗原はヒトＨＥＲ１、第二抗原はヒトＨＥＲ３及び第三抗原はヒトＨＥＲ２であり；又は
Ｂ）のもとで、第一抗原はヒトＨＥＲ２、第二抗原はヒトＨＥＲ１及び第三抗原はヒトＨＥＲ３である、請求項２に記載の多重特異性抗体。
【請求項４】
抗体は二価、三重特異性抗体であり、
ａ）ヒトＨＥＲ１及びヒトＨＥＲ３に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、ヒトＨＥＲ２に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖
を含む請求項１に記載の多重特異性抗体。
【請求項５】
抗体は、配列番号４、９、１３及び１８のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載の多重特異性抗体。
【請求項６】
Ａ）のもとで、第一抗原はヒトＨＥＲ１、第二抗原はヒトＨＥＲ３及び第三抗原はヒトｃＭＥＴであり；又は
Ｂ）のもとで、第一抗原はヒトｃＭＥＴ、第二抗原はヒトＨＥＲ１及び第三抗原はヒトＨＥＲ３である、請求項３に記載の多重特異性抗体。
【請求項７】
抗体は四重特異性抗体であり、
ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原及び第四抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の多重特異性抗体。
【請求項８】
ｂ）のもとで修飾された軽鎖及び修飾された重鎖において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており；及び定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、請求項１から４、６及び７の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項９】
ｂ）のもとで修飾された軽鎖及び修飾された重鎖において、可変ドメインＶＬ及びＶＨ（のみ）が互いに置換されている、請求項１から４、６及び７の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１０】
ｂ）のもとで修飾された軽鎖及び修飾された重鎖において、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１（のみ）が互いに置換されている、請求項１から４、６及び７の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１１】
ａ）の完全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメイン及びｂ）の完全長抗体の修飾された重鎖のＣＨ３ドメインの各々は抗体のＣＨ３ドメイン間の元のインターフェイスを含むインターフェイス接触することを特徴とし；
前記インターフェイスは三重特異性又は四重特異性抗体の形成を促進するように改変され、その改変は：
ｉ）三重又は四重特異性抗体内の他の重鎖のＣＨ３ドメインの元のインターフェイスで接触する一重鎖のＣＨ３ドメインの元のインターフェイス内で、
アミノ酸残基はより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それによって、他の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内のキャビティの中に置くことができる、一重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内の隆起を作成するように一重鎖のＣＨ３ドメインが改変され、
及び
ｉｉ）三重又は四重特異性抗体内の第一ＣＨ３ドメインの元のインターフェイスで接触する第二ＣＨ３ドメインの元のインターフェイス内で、
アミノ酸残基はより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それによって、その中に第一ＣＨ３ドメインのインターフェイス内の隆起を置くことができる、第二ＣＨ３ドメインのインターフェイス内のキャビティを作成するように他の重鎖のＣＨ３ドメインが改変されることを特徴とする
請求項１から１０の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１２】
より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群から選択され、及びより小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の多重特異性抗体。
【請求項１３】
両方のＣＨ３ドメインの間にジスルフィド架橋を形成することができるように、各ＣＨ３ドメインの対応する位置のアミノ酸としてシステイン（Ｃ）を導入することにより、両方のＣＨ３ドメインが更に改変されることを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の多重特異性抗体。
【請求項１４】
請求項１から１３に記載の多重特異性抗体の調製のための方法であって、
ａ）
Ａ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｂ）ａ）第一抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第二抗原及び第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｃ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原及び第四抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖をコードする核酸分子を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程；
ｂ）前記抗体分子の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養する工程；及び
ｃ）前記培養物から前記抗体分子を回収する工程
を含む方法。
【請求項１５】
請求項１から１３に記載の多重特異性抗原結合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１から１３に記載の多重特異性抗原結合タンパク質をコードする核酸を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１から１３に記載の抗体の組成物、好ましくは薬学的又は診断用組成物。
【請求項１９】
請求項１から１３に記載の抗体及び少なくとも一の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項２０】
癌の治療における使用のための、請求項１から１３の何れか一に記載の抗体。
【請求項２１】
癌の治療のための医薬の製造のための、請求項１から１３の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２２】
請求項１から１３に記載の抗体の治療的有効量を患者に投与することを特徴とする、治療を必要とする患者の治療のための方法。
【請求項２３】
請求項１から１３に記載の抗体の治療的有効量を患者に投与することを特徴とする、癌に罹患した患者の治療のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＨＥＲ１、ヒトＨＥＲ２、及びヒトＨＥＲ３に結合する、新規な二価、多重特異性抗体、特に三重又は四重特異性抗体、特に二価、三重特異性抗体及びそれらの製造及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
二つの異なる抗原に結合することができる二重特異性抗体などの操作されたタンパク質は、当該分野で公知である。そのような二重特異性結合タンパク質は、細胞融合、化学的接合、又は組換えＤＮＡ技術を用いて生成することができる。
【０００３】
組換え二重特異性抗体の様々なフォーマット、例えばの融合による四価二重特異性抗体、例えばＩｇＧ抗体フォーマット及び一本鎖ドメインの融合による四価二重特異性抗体が最近開発されている（例えば、Coloma, M.J., et al., Nature Biotech. 15 (1997) 159-163；国際公開第２００１／０７７３４２号；及びMorrison, S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234を参照）。
【０００４】
また、抗体のコア構造（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ）はもはや保持されない、二以上抗原に結合することが可能である、他の幾つかの新しいフォーマット、例えば、ダイアボディ、トリアボディ又はテトラボディ、ミニボディ、幾つかの一本鎖フォーマット（ｓｃＦｖ、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ）などが開発されている（Holliger, P., et al., Nature Biotech. 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et al., J. Immunol. Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297)。
【０００５】
全てのそのようなフォーマットは、抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ）を更なる結合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ）に融合させるか、又は例えば２つのＦａｂ断片又はｓｃＦｖを融合させるか何れかのためにリンカーを使用する（Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14）。リンカーが二重特異性抗体の操作のための利点があることは明らかであるが、それらはまた、治療設定において問題を生じる場合がある。実際に、これらの外来ペプチドはリンカーそれ自体、又はタンパク質とリンカーとの間の接合部に対して免疫応答を誘発するかもしれない。更に、これらのペプチドの柔軟な性質は、それらのタンパク質分解切断をより受けやすくし、潜在的に抗体安定性の悪化、凝集及び免疫原性の増加につながる。更に、天然に生じる抗体に対して高度の類似性を維持することによってＦｃ−部分を介して媒介される、例えば補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を保持することを望む場合もある。
【０００６】
従って、理想的には、ヒト配列からの偏差が最小であって、天然に生じる抗体（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭなど）に対して一般的な構造が非常に似ている二重特異性抗体の開発を目指すべきである。
【０００７】
国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号及びSchaefer, et al., PNAS 108 (2011) 11187-11192 は、二重特異性二価抗体に関する。
【０００８】
国際公開第２００８／０２７２３６号；国際公開第２０１０／１０８１２７号及びBostrom, J., et al., Science 323 (2009) 1610-1614 は、二重特異性を導入する可変重鎖及び軽鎖ドメインのＶＨ及びＶＬを多様化する方法に関する。国際公開第２０１０／１３６１７２号は、三価又は四価であるが三重又は四重特異性抗体に関し、国際公開第２００７／１４６９５９号はパン（pan）細胞表面受容体特異的治療薬に関する。
【０００９】
この技術は、ＩｇＧ様構造及びＩｇＧ様分子量を有し、３つ又は４つ抗原に対する、組換え、多重特異性抗体を容易に開発するための基礎として適切ではない。これまでのところ、さらに融合した結合ドメインを持たず、天然に生じる二価抗体に類似する構造を持つ、二価、三重又は四重特異性抗体を生成することは不可能であった。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、
Ａ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｂ）ａ）第一抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第二抗原及び第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｃ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原及び第四抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
を含む、多重特異性抗体に関する。
【００１１】
一実施態様において、多重特異性抗体は、抗体は二価、三重又は四重特異性抗体であることを特徴とする。
【００１２】
一実施態様において、多重特異性抗体は、抗体は三重特異性抗体であり、
Ａ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｂ）ａ）第一抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第二抗原及び第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖
を含むことを特徴とする。
【００１３】
一実施態様において、多重特異性抗体は、
Ａ）のもとで、第一抗原はヒトＨＥＲ１、第二抗原はヒトＨＥＲ３及び第三抗原はヒトＨＥＲ２であり；又は
Ｂ）のもとで、第一抗原はヒトＨＥＲ２、第二抗原はヒトＨＥＲ１及び第三抗原はヒトＨＥＲ３であることを特徴とする。
【００１４】
一実施態様において、多重特異性抗体は、
Ａ）のもとで、第一抗原はヒトＨＥＲ１、第二抗原はヒトＨＥＲ３及び第三抗原はヒトｃＭＥＴであり；又は
Ｂ）のもとで、第一抗原はヒトｃＭＥＴ、第二抗原はヒトＨＥＲ１及び第三抗原はヒトＨＥＲ３であることを特徴とする。
【００１５】
一実施態様において、多重特異性抗体は、抗体は四重特異性抗体であり、
ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原及び第四抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖
を含むことを特徴とする。
【００１６】
一実施態様において、多重特異性抗体は、ｂ）のもとで修飾された軽鎖及び修飾された重鎖において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており；及び定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されていることを特徴とする。
【００１７】
一実施態様において、多重特異性抗体は、ｂ）のもとで修飾された軽鎖及び修飾された重鎖において、可変ドメインＶＬ及びＶＨ（のみ）が互いに置換されていることを特徴とする。
【００１８】
一実施態様において、多重特異性抗体は、ｂ）のもとで修飾された軽鎖及び修飾された重鎖において、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１（のみ）が互いに置換されていることを特徴とする。
【００１９】
一実施態様において、多重特異性抗体は、
ａ）の完全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメイン及びｂ）の完全長抗体の修飾された重鎖のＣＨ３ドメインの各々は抗体のＣＨ３ドメイン間の元のインターフェイスを含むインターフェイスで接触することを特徴とし；
前記インターフェイスは三重特異性又は四重特異性抗体の形成を促進するように改変され、その改変は
ｉ）三重又は四重特異性抗体内の他の重鎖のＣＨ３ドメインの元のインターフェイスで接触する一重鎖のＣＨ３ドメインの元のインターフェイス内で、
アミノ酸残基はより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それによって、他の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内のキャビティの中に置くことができる、一重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内の隆起を作成するように一重鎖のＣＨ３ドメインが改変され、
及び
ｉｉ）三重又は四重特異性抗体内の第一ＣＨ３ドメインの元のインターフェイスで接触する第二ＣＨ３ドメインの元のインターフェイス内で、
アミノ酸残基はより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それによって、その中に第一ＣＨ３ドメインのインターフェイス内の隆起を置くことができる、第二ＣＨ３ドメインのインターフェイス内のキャビティを作成するように他の重鎖のＣＨ３ドメインが改変されることを特徴とする。
【００２０】
一実施態様において、多重特異性抗体は、
より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群から選択され、及びより小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群から選択されることを特徴とする。
【００２１】
一実施態様において、多重特異性抗体は、両方のＣＨ３ドメインの間にジスルフィド架橋を形成することができるように、各ＣＨ３ドメインの対応する位置のアミノ酸としてシステイン（Ｃ）を導入することにより、両方のＣＨ３ドメインが更に改変されることを特徴とする。
【００２２】
本発明の更なる実施態様は、
ａ）
Ａ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｂ）ａ）第一抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第二抗原及び第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｃ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原及び第四抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖
をコードする核酸分子を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程；
ｂ）前記抗体分子の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養する工程；及び
ｃ）前記培養物から前記抗体分子を回収する工程
を含む、本発明の多重特異性抗体を調製するための方法である。
【００２３】
本発明は更に、本発明の多重特異抗原結合タンパク質をコードする核酸を更に含む。
【００２４】
本発明は更に、本発明の多重特異抗原結合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを更に含む。
【００２５】
本発明の更なる態様は、
Ａ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｂ）ａ）第一抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第二抗原及び第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｃ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原及び第四抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖
をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞である。
【００２６】
本発明の更なる実施態様は、本発明の抗体の組成物、好ましくは本発明の抗体の薬学的組成物又は診断用組成物である。
【００２７】
本発明の更なる実施態様は、本発明の抗体及び少なくとも一の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物である。
【００２８】
本発明の更なる実施態様は、患者に本発明による抗体の治療的有効量を投与することを特徴とする、治療を必要とする患者の治療方法である。
【００２９】
ＩｇＧ様構造及びＩｇＧ様分子量を有する３つ又は４つの抗原に対する多特異性抗体が提供されるのはこれが初めてである。
【００３０】
本発明によれば、所望されない副生成物と比較して、所望の多重特異性抗体の比率は、２つの完全長抗体アームの重鎖及び軽鎖の一対（ＨＣ／ＬＣ）のみにおける特定のドメインの置換（例えばＶＨドメイン及びＶＬドメインの置換／交換、又はＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインの置換／交換；又はＶＨ及びＣＨ１ドメインとＶＨ及びＶＬドメインの両方の置換／交換）によって改善することができる。この方法では、生成物による所望されない機能不全につながる間違った重鎖との軽鎖の望ましくない誤対合（ＶＨ１とＶＨ２及び／又はＶＨ２とＶＨ１の誤対合）は減少させることができる（図３参照）。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】可変及び定常ドメインを典型的な順序で含む重鎖及び経鎖の２つの対により第一抗原１に特異的に結合する、ＣＨ４ドメインを持たない完全長抗体の模式構造。
【図２ａ−ｄ】経鎖と重鎖の誤対合を防ぐための、完全長抗体軽鎖／重鎖のＶＬ／ＶＨドメイン及び／又はＣＬ／ＣＨドメインの置換により特徴づけられる、（ＣＨ３ドメインの更なるノブ・イントゥー・ホール（knob into hole）修飾を含まない又は含む）本発明による異なる三重又は四重特異性抗体の模式構造。  図２ａ：  ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖（例えば、多様化したＶＨ１とＶＬ１を含む）；及び  ｂ）定常ドメインＣＬ及びＣＨ１はお互いに置換されている、第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖（ＶＨ２とＶＬ２を含む）を含む三重特異性抗体。  図２ｂ：  ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖（例えば、多様化したＶＨ１とＶＬ１を含む）；及び  ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖（ＶＨ２とＶＬ２を含む）を含み、例示的なＣＨ３修飾（「ノブ・イントゥー・ホール」）を両方の重鎖に含む三重特異性抗体。図２ｃ：  ａ）第一抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖（ＶＨ１とＶＬ１を含む）；及び  ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨはお互いに置換されている、第二抗原及び第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖（多様化したＶＨ２とＶＬ２を含む）を含み、例示的なＣＨ３修飾（「ノブ・イントゥー・ホール」）を両方の重鎖に含む三重特異性抗体。  図２ｄ：  ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖（例えば、多様化したＶＨ１とＶＬ１を含む）；及び  ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原及び第四抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖（例えば、多様化したＶＨ２とＶＬ２を含む）、を含む四重特異性抗体。
【図３】Ａ：デュアル親和性の模式的概要−ｃｒｏｓｓｍａｂの原理。一のＦａｂアーム上で一つの抗原を認識する重鎖、軽鎖の組合せのために、クロスオーバー技術が使用された。Ｂ：一のＦａｂアーム上で二つの抗原を認識する重鎖、軽鎖の組合せのために、クロスオーバー技術が使用された。ジスルフィド安定化を含むノブ・イントゥー・ホールの技術（重鎖１：Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、重鎖２：Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ３４９Ｃ）がどちらかの組合せのために使用することができる。
【図４】軽鎖と重鎖の誤対合（誤対合されたＶＨ１とＶＨ２及び／又はＶＨ２とＶＨ１を生じる）に起因する所望されない機能不全副生成物の模式的構造
【図５】Ａ：重鎖コンストラクトのクローニングのために使用される真核細胞発現ベクターの模式図。Ｂ：軽鎖コンストラクトのクローニングのために使用される真核細胞ベクターの模式図。
【図６】Ａ：ＶＥＧＦ−Ｈｅｒ２−ＤＡＦの試験発現の分析用ＨＰＬＣの結果プロテインＡ免疫沈降物質の生物学的反復１（Ａ、Ｃ、Ｅ）及び生物学的反復２（Ｂ、Ｄ、Ｆ）（Ｋ：Ｈ＝トランスフェクトされたプラスミドのノブのホールに対する比率）。Ｂ：ＶＥＧＦ−Ｈｅｒ２−ＤＡＦの発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。２つの等価なサンプルはプロテインＡ免疫沈降物質の技術的反復の分析を表す（ＮＲ、非還元条件；赤、還元条件）。Ｃ：分析用ＨＰＬＣにおいて溶出時間とサイズの相関を示すマーカータンパク質。
【図７】Ａ：ＶＥＧＦ−Ｈｅｒ２−ＤＡＦ−ｘＡｎｇ２の試験発現の分析用ＨＰＬＣの結果プロテインＡ免疫沈降物質の生物学的反復１（Ａ、Ｃ、Ｅ）及び生物学的反復２（Ｂ、Ｄ、Ｆ）（Ｋ：Ｈ＝トランスフェクトされたプラスミドのノブのホールに対する比率）。Ｂ：ＶＥＧＦ−Ｈｅｒ２−ＤＡＦ−ｘＡｎｇ２の発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。２つの等価なサンプルはプロテインＡ免疫沈降物質の技術的反復の分析を表す（ＮＲ、非還元条件；赤、還元条件）。
【図８】Ａ：ＶＥＧＦ−Ｈｅｒ２−ＤＡＦ−ｘＨｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦの試験発現の分析用ＨＰＬＣの結果（Ａ、Ｂ）生物学的反復１及び２Ｂ：ＶＥＧＦ−Ｈｅｒ２−ＤＡＦ−ｘＨｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦの発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ａ、Ｂ）はＡに示された分析用ＨＰＬＣの反復分析である。
【図９】ＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮＲ、非還元条件；赤、還元条件）。
【図１０】三重特異性抗体ＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２による増殖アッセイ。（Ａ）Ａ４３１は、三重特異性抗体又はコントロールＩｇＧ抗体の３０μｇ／ｍｌとインキュベートした。抗体の添加後の５日後に、ＡＴＰ放出アッセイを実施した（Cell Titer Glow, Promega）。（Ｂ）Ａ４３１は、示された抗体の３０μｇ／ｍｌとインキュベートした。抗体の添加後の５日後に、ＡＴＰ放出アッセイを実施した（Cell Titer Glow, Promega）。
【図１１】三重特異性抗体ＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２による増殖アッセイ。ＭＤＡ−ＭＢ−１７５ ＶＩＩ細胞は、三重特異性抗体ＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２又はコントロールＩｇＧ抗体の希釈系列でインキュベートした。抗体の添加後の５日後に、ＡＴＰ放出アッセイを実施した（Cell Titer Glow, Promega）。
【図１２】ＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２又はそれぞれの親抗体の結合反応速度論。（Ａ、Ｂ、Ｃ）１回目と２回目のの注入は、ＥｒｂＢ受容体外部ドメインの追加の順序を示す。
【図１３】Ａ４３１類表皮癌細胞における三重特異性Ｈｅｒ１−ＨＥＲ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２抗体によるＡＤＣＣの誘導。単一パネルの画像幅は１７０．８３μｍである。上段はＣＭＦＤＡ標識腫瘍細胞に対応する（通常は緑チャンネルに表示される）。下段はＰＫＨ２６標識ナチュラルキラー細胞に対応する（通常は赤チャンネルに表示される）。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明は、
Ａ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｂ）ａ）第一抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第二抗原及び第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｃ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原及び第四抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖
を含む、多重特異性抗体に関する。
【００３３】
一実施態様において、多重特異性抗体は、抗体は三重特異性抗体であり、
Ａ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｂ）ａ）第一抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第二抗原及び第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖
を含むことを特徴とする。
【００３４】
一実施態様において、多重特異性抗体は、抗体は四重特異性抗体であり、
ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原及び第四抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖
を含むことを特徴とする。
【００３５】
一実施態様において、多重特異性抗体は、ｂ）のもとで修飾された軽鎖及び修飾された重鎖において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており；及び定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されていることを特徴とする。
【００３６】
一実施態様において、多重特異性抗体は、ｂ）のもとで修飾された軽鎖及び修飾された重鎖において、可変ドメインＶＬ及びＶＨ（のみ）が互いに置換されていることを特徴とする。
【００３７】
一実施態様において、多重特異性抗体は、ｂ）のもとで修飾された軽鎖及び修飾された重鎖において、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１（のみ）が互いに置換されていることを特徴とする。
【００３８】
本発明によれば、所望されない副生成物（他の抗原に特異的に結合する抗体の「誤った」重鎖と軽鎖の誤対合に起因する（図３参照））に比べて所望される多重特異性抗体の比率は、重鎖及び軽鎖の一対（ＨＣ／ＬＣ）のみにおいて特定のドメインを置換することによって改善することができる。２つの完全長ＨＣ／ＬＣの対の第一は、基本的に変更されないが、２つの完全長ＨＣ／ＬＣの対Ｏの第二は、以下の置換によって修飾される：
−  軽鎖：第二抗原に特異的に結合する前記抗体の可変重鎖ドメインＶＨによる可変軽鎖ドメインＶＬの置換、及び／又は第二抗原に特異的に結合する前記抗体の定常重鎖ドメインＣＨ１による定常軽鎖ドメインＣＬの置換、及び
−  重鎖：第二抗原に特異的に結合する前記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬによる可変重鎖ドメインＶＨの置換、及び／又は第二抗原に特異的に結合する前記抗体の定常軽鎖ドメインＣＬによる定常重鎖ドメインＣＨ１の置換。
【００３９】
従って、本発明に従って得られた多重特異性抗体は、人工抗体であり、
Ａ）ａ）第一及び第二抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）第三抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖及び重鎖であって、
（第三抗原に特異的に結合する抗体の）前記軽鎖はＶＬの代わりに可変ドメインＶＨを含み、及び／又はＣＬの代わりに定常ドメインＣＨ１を含み、
（第三抗原に特異的に結合する抗体の）前記重鎖はＶＨの代わりに可変ドメインＶＬを含み、及び／又はＣＨ１の代わりに定常ドメインＣＬを含み、
又は
Ｂ）ａ）第一抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）第二及び第三抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖及び重鎖であって、
（第二及び第三抗原に特異的に結合する抗体の）前記軽鎖はＶＬの代わりに可変ドメインＶＨを含み、及び／又はＣＬの代わりに定常ドメインＣＨ１を含み、
（第二及び第三抗原に特異的に結合する抗体の）前記重鎖はＶＨの代わりに可変ドメインＶＬを含み、及び／又はＣＨ１の代わりに定常ドメインＣＬを含み、
又は
Ｃ）ａ）第一及び第二抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）第三及び第四抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖及び重鎖であって、
（第三及び第四抗原に特異的に結合する抗体の）前記軽鎖はＶＬの代わりに可変ドメインＶＨを含み、及び／又はＣＬの代わりに定常ドメインＣＨ１を含み、
（第三及び第四抗原に特異的に結合する抗体の）前記重鎖はＶＨの代わりに可変ドメインＶＬを含み、及び／又はＣＨ１の代わりに定常ドメインＣＬを含む、
人工抗体である。
【００４０】
本発明の更なる態様において、所望されない副生成物と比較して所望される二価、多重特異性抗体の改善された比率は、三重又は四重特異性抗体内で第一及び第二抗原に特異的に結合する前記完全長抗体のＣＨ３ドメインの修飾により更に改善することができる。
従って、本発明の好ましい一実施態様において、本発明による（重鎖及び修飾された重鎖の）前記三重又は四重特異性抗体のＣＨ３ドメインは、例えば、国際公開第９６／０２７０１１号、Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621;及びMerchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681に幾つかの例を挙げて詳細に説明されるノブ・イントゥ・ホール技術により改変することができる。この方法において、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面は、これら二つのＣＨ３ドメインを含有する両方の重鎖のヘテロダイマー化を増加させるために改変された。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインの各々は、「ノブ」することができ、他方は「ホール」となる。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロダイマーを更に安定化し(Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)、収率を増加させる。
【００４１】
従って、本発明の一態様は、三重特異性又は四重特異性抗体は、
ａ）の完全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメイン及びｂ）の完全長抗体の修飾された重鎖のＣＨ３ドメインの各々は抗体のＣＨ３ドメイン間の元のインターフェイスを含むインターフェイスで接触することを更に特徴とし；
前記インターフェイスは三重特異性又は四重特異性抗体の形成を促進するように改変され、その改変は、
ｉ）三重又は四重特異性抗体内の他の重鎖のＣＨ３ドメインの元のインターフェイスで接触する一重鎖のＣＨ３ドメインの元のインターフェイス内で、
アミノ酸残基はより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それによって、他の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内のキャビティの中に置くことができる、一重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内の隆起を作成するように、一重鎖のＣＨ３ドメインが改変され、
及び
ｉｉ）
三重又は四重特異性抗体内の第一ＣＨ３ドメインの元のインターフェイスで接触する第二ＣＨ３ドメインの元のインターフェイス内で、
アミノ酸残基はより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それによって、その中に第一ＣＨ３ドメインのインターフェイス内の隆起を置くことができる、第二ＣＨ３ドメインのインターフェイス内にキャビティを作成するように、他の重鎖のＣＨ３ドメインが改変されることを特徴とする。
【００４２】
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）から選択される。
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）から選択される。
【００４３】
本発明の一態様において、両方のＣＨ３ドメインの間にジスルフィド架橋を形成することができるように、各ＣＨ３ドメインの対応する位置のアミノ酸としてシステイン（Ｃ）を導入することにより、両方のＣＨ３ドメインが更に改変される。
【００４４】
好ましい一実施態様では、三重特異性又は四重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｗ変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む。例えば「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ変異を、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＥ３５６Ｃ変異又はＳ３５４Ｃ変異を導入することにより、ＣＨ３ドメイン間に付加的鎖間ジスルフィド架橋を使用することもできる（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681）。従って、別の好ましい実施態様において、前記三重特異性又は四重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方でＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異を、及び２つのＣＨ３ドメインの他方でＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含み、又は前記三重特異性又は四重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方でＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異を、及び２つのＣＨ３ドメインの他方でＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む（一方のＣＨ３ドメインにおける付加的なＹ３４９Ｃ、及び他方のＣＨ３ドメインにおける付加的なＥ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃ変異は鎖間ジスルフィド架橋を形成する）（番号付けはカバットのＥＵインデックスに常に従う）。しかしまた、欧州特許第１８７０４５９号（Ａ１）に記載されているように、他のノブ・イン・ホール技術を代替的あるいは追加的に使用することができる。前記三重特異性又は四重特異性抗体のための好ましい例は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ変異である（番号付けはカバットのＥＵインデックスに常に従う）。
別の好ましい実施態様において、三重特異性又は四重特異性抗体は「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｗ突然変異を、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を、そして更に「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ変異を、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ変異を含む。
【００４５】
別の好ましい実施態様において、前記三重特異性又は四重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方でＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異を、及び２つのＣＨ３ドメインの他方でＥ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含み、又は前記三重特異性又は四重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方でＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異を、及び２つのＣＨ３ドメインの他方でＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含み、及び追加的に「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ変異を、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む。
【００４６】
一実施態様において、多重特異性抗体は、
Ａ）のもとで、第一抗原は、ヒトＨＥＲ１であり、第二抗原はヒトＨＥＲ３であり、及び第三抗原はヒトＨＥＲ２であり；又は
Ｂ）のもとで、第一抗原は、ヒトＨＥＲ２であり、第二抗原はヒトＨＥＲ１であり、及び第三抗原はヒトＨＥＲ３である
ことを特徴とする。
【００４７】
一実施態様において、多重特異性抗体は、配列番号４、９、１３及び１８のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００４８】
一実施態様では、多重特異性抗体は、二価、三重特異性抗体であり、
ａ）ヒトＨＥＲ１及びヒトＨＥＲ３に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、ヒトＨＥＲ２に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖
を含む。
【００４９】
一実施態様において、ヒトＨＥＲ１、ヒトＨＥＲ３、及びヒトＨＥＲ２に特異的に結合するそのような二価、三重特異性抗体は、配列番号４、９、１３、１８のアミノ酸配列を含む。
【００５０】
一実施態様において、ヒトＨＥＲ１、ヒトＨＥＲ３、及びヒトＨＥＲ２に特異的に結合するそのような二価、三重特異性抗体は、配列番号４、９、１３、１８のアミノ酸配列を含み、抗体は以下の特性により特徴づけられる：
ｉ）抗体は、３７℃で表面プラズモン共鳴によって測定されたＫＤ１．７Ｅ−０８［Ｍ］の親和性でヒトＨＥＲ１（外部ドメインＥＣＤ）に結合し；及び
ｉｉ）抗体は、３７℃で表面プラズモン共鳴によって測定されたＫＤ  ４．４Ｅ−０９［Ｍ］の親和性でヒトＨＥＲ２（外部ドメインＥＣＤ）に結合し；及び  
ｉｉｉ）抗体は、３７℃で表面プラズモン共鳴によって測定されたＫＤ１．８Ｅ−０９  ［Ｍ］の親和性でヒトＨＥＲ２（外部ドメインＥＣＤ）に結合し；及び
ｉｖ）抗体は、ヒトＨｅｒ１及びヒトＨｅｒ２に同時に結合することができ、又はヒトＨｅｒ３及びヒトＨｅｒ２に同時に結合することができる。
【００５１】
一実施態様において、ヒトＨＥＲ１、ヒトＨＥＲ３、及びヒトＨＥＲ２に特異的に結合するそのような二価、三重特異性抗体は、配列番号４、９、１３、１８のアミノ酸配列を含み、抗体は以下の特性の一以上により特徴づけられる：
ｉ）抗体は、５０μｇ／ｍＬの濃度で８５％以上ＭＤＡ−ＭＢ−１７５乳癌細胞の増殖を阻害する；
ｉｉ）抗体は、３０μｇ／ｍＬの濃度で５０％以上Ａ４３１類表皮癌細胞（ＨＥＲ１を発現する）の増殖を阻害する；及び
ｉｉｉ）抗体はＡ４３１類表皮癌細胞でＡＤＣＣを誘導し、それによって２．５時間以内におよそ１００％の癌細胞を除去する。
【００５２】
一実施態様において、ヒトＨＥＲ１、ヒトＨＥＲ３、及びヒトＨＥＲ２に特異的に結合するそのような二価、三重特異性抗体は、配列番号４、９、１３、１８のアミノ酸配列を含み、及び抗体はＡｓｎ２９７（番号づけはカバットによる）で、糖鎖内のフコースの量が６５％以下である（別の実施態様において、糖鎖内のフコースの量が５％から６５％の間であり、一実施態様では２０％と４０％の間である）糖鎖によりグリコシル化される。
【００５３】
一実施態様において、多重特異性抗体は、Ａ）のもとで、第一抗原はヒトＨＥＲ１、第二抗原はヒトＨＥＲ３及び第三抗原はヒトｃＭＥＴであり；又はＢ）のもとで、第一抗原はヒトｃＭＥＴ、第二抗原はヒトＨＥＲ１及び第三抗原はヒトＨＥＲ３であることを特徴とする。
【００５４】
一実施態様において、多重特異性抗体は、配列番号４、９、１３及び１９のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００５５】
用語「完全長抗体」は、２本の抗体重鎖及び２本の抗体軽鎖からなる抗体を意味する（図１参照）。完全長抗体の重鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）から成るポリペプチドであり（ＶＨ−ＣＨ１−ＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３と略される）、及びサブクラスのＩｇＥ抗体の場合、任意で抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）から成るポリペプチドである。好ましくは、完全長抗体の重鎖はＮ末端からＣ末端の方向にＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２及びＣＨ３からなるポリペプチドである。完全長抗体の軽鎖は、ＶＬ−ＣＬと略される、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）から成るポリペプチドである。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）はκ（カッパ）又はλ（ラムダ）とすることができる。完全長抗体鎖は、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインとの間の（即ち、軽鎖と重鎖の間の）及び完全長抗体重鎖のヒンジ領域間ポリペプチド間のジスルフィド結合を介して一緒に連結される。典型的な完全長抗体の例は、ＩｇＧ（例えばＩｇＧの１及びＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）のような天然の抗体である。本発明の完全長抗体は、単一の種、例えば、ヒトとすることができ、又はそれらはキメラ化抗体又はヒト化抗体とすることができる。
【００５６】
本発明の完全長抗体は、各々がＶＨ及びＶＬの対によって形成される、２つの抗原結合部位を含み、その両方ともａ）一つの単一抗原又はｂ）２つの異なる抗原のどちらかに特異的に結合する（下記参照）。前記完全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端は、前記重又は軽鎖のＣ末端の最後のアミノ酸を表す。
【００５７】
二つの異なる抗原（例えば、第一及び第二抗原、又は第三及び第四抗原）に特異的に結合する完全長抗体（又は完全長抗体の軽鎖及び重鎖）は、例えば、二重特異性を導入するように完全長抗体の可変重鎖及び軽鎖ドメインのＶＨ及びＶＬを多様化することによって得られ、その技術は、国際公開第２００８／０２７２３６号；国際公開第２０１０／１０８１２７号及びBostrom, J., et al., Science 323 (2009) 1610-161（それらは全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。例えば第一抗原及び第二抗原に結合する二重特異性を持つ得られたＶＨ及びＶＬは本発明に係る多重特異性抗体の一方のアームに使用することができ、一方他方のアームは、第三抗原（又は第三及び第四抗原）に特異的である。多様化したＶＬ及びＶＨは、同時又は互いに排他的に第一エピトープ及び二エピトープに結合することができ、そして、ＶＥＧＦ／ＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−Ａ／ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ＤＲ５、ＶＥＧＦ−Ａ／ＰＤＧＦ、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２、ＣＤ２０／ＢＲ３、ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｃ／ＶＥＧＦ−Ｄ、ＴＮＦアルファ／ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦアルファ／ＩＬ−２、ＴＮＦアルファ／ＩＬ−３、ＴＮＦアルファ／ＩＬ−４、ＴＮＦアルファ／ＩＬ−５、ＴＮＦアルファ／ＩＬ６、ＴＮＦアルファ／ＩＬ８、ＴＮＦアルファ／ＩＬ−９、ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１０、ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１１、ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１２、ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１３、ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１４、ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１５、ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１６、ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１７、ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１８、ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１９、ＴＮＦアルファ／ＩＬ−２０、ＴＮＦアルファ／ＩＦＮアルファ、ＴＮＦアルファ／ＣＤ４、ＶＥＧＦ／ＩＬ−８、ＶＥＧＦ／ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ／ＭＥＴｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＨＥＲ２／Ｆｃ、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３；ＨＥＲ１／ＨＥＲ２、ＨＥＲ１／ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ４、ＴＮＦアルファ／ｌＬ−３、ＴＮＦアルファ／ＩＬ−４、ＩＬ−１３／ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ４／ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦアルファ／ＩＣＡＭ−１、ＴＮＦＲｌＡＬ−ＩＲ、ＴＮＦＲ１／ＩＬ−６Ｒ、及びＴＮＦＲ１／ＩＬ−１８からなる群から例えば選択することができる。
【００５８】
本明細書で使用される用語「結合部位」又は「抗原結合部位」は、リガンド（例えば抗原又はその抗原断片）が実際に結合し、抗体から由来する（又は二重特異性完全長抗体の場合、２つのリガンド、例えば第一及び第二抗原が結合する）抗体分子の領域を意味する。抗原結合部位は、ＶＨ／ＶＬの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の対を含む。
【００５９】
所望の抗原に特異的に結合する抗原結合部位は、（ａ）その抗原に対する既知の抗体に由来してもよいし、又は（ｂ）とりわけ、抗原タンパク質もしくは抗原核酸もしくはそれらの断片の何れかを使用したデノボ免疫感作法により、もしくはファージディスプレイにより入手された新たな抗体もしくは抗体断片に由来してもよい。例えば第一及び第二抗原に特異的に結合する、所望される二重特異性抗体のケースでは、第一抗原に結合する得られた抗体のＶＨ及びＶＬは、国際公開第２００８／０２７２３６号；国際公開第２０１０／１０８１２７号及びBostrom, J., et al., Science 323 (2009) 1610-1614（それらは全て参照により本明細書に組み込まれる）で説明したように修飾され／多様化するする必要がある。
本発明の抗原結合部位は、様々な程度に、抗原に対する結合部位の親和性に寄与する、６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有している。３個の重鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）並びに３個の軽鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）が存在する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）の範囲は、これらの領域が配列間の可変性に従って定義されている、アミノ酸配列のコンパイルされたデータベースとの比較により決定される。また本発明の範囲内に含まれるものは、より少ないＣＤＲ（即ち、結合特異性は３つ、４つ又は５つのＣＤＲにより決定される）で構成される機能性抗原結合部位である。
【００６０】
抗体特異性は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。天然の抗体は、例えば、単一特異性である。二重特異性抗体は、２つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。従って三重特異性抗体は、３つの異なる抗原結合特異性を有する本発明による抗体である。本発明による四重特異性抗体は、４つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。
【００６１】
抗体が一以上の特異性を有する場合、認識されるエピトープは、単一の抗原又は一以上の抗原に関連付けることができる。
【００６２】
本明細書で使用する用語「単一特異性」抗体は、各々が同じ抗原の同じエピトープに結合する一以上の結合部位を有する抗体である。
【００６３】
本出願の中で使用する用語「価」は、抗体分子における指定された数の結合部位の存在を示す。例えば天然抗体又は本発明の完全長抗体は、２つの結合部位を有し二価である。一実施態様では、本発明による多重特異性抗体は二価である。一実施態様では、本発明による多重特異性抗体は二価、三重特異性又は二価、四重特異性である。
【００６４】
本発明の完全長抗体は、一以上の免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン定常領域を含む。免疫グロブリンクラスには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥアイソタイプが含まれ、ＩｇＧ及びＩｇＡの場合には、それらのサブタイプが含まれる。好ましい実施態様において、本発明の全長抗体は、ＩｇＧタイプの抗体の定常ドメイン構造を有する。
【００６５】
本明細書において使用される場合の「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物をさす。
【００６６】
用語「キメラ抗体」とは、一般的には、組換えＤＮＡ技術により調製される、一起源又は種に由来する可変領域、即ち、結合領域と、異なる起源又は種に由来する定常領域の少なくとも一部とを含む抗体をさす。マウス可変領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明に包含される「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、特にＣ１ｑの結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）の結合に関して、本発明に係る特性を生成するために、定常領域が元の抗体のものから修飾又は変更されたものである。そのような「キメラ」抗体はまた「クラススイッチ抗体」と称される。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメント及び免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の生成物である。キメラ抗体を生産するための方法は、今は当該技術分野においてよく知られている一般的な組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術を含む。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；米国特許第５，２０２，２３８号及び第５，２０４，２４４号を参照。
【００６７】
用語「ヒト化抗体」は、フレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンのものと比較して、異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含むように修飾された抗体を意味する。好ましい実施態様では、マウスＣＤＲが、「ヒト化抗体」を調製するためのヒト抗体のフレームワーク領域に移植される。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327;及び Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照。
【００６８】
本発明に包含される「ヒト化抗体」の別の形態は、特にＣ１ｑの結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）の結合に関して、本発明に係る特性を生成するために、定常領域が元の抗体のものから更に修飾又は変更されたものである。
本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から由来する可変及び定常領域を有する抗体を含むことを意図している。ヒト抗体は当技術分野において周知である（van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374）。またヒト抗体は、免疫時に、内在性免疫グロブリン産生の欠損下において、ヒト抗体の選択、又は全レパートリーを生成可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）で産生可能である。このような生殖系列変異マウスにおける、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移動により、抗原曝露でヒト抗体が産生される（例えば、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40を参照）。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーで産生することができる（Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597）。ヒトモノクローナル抗体の調製について、ColeらとBoernerらの技術も利用可能である（Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985) p. 77;及びBoerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95）。本発明に係るキメラ及びヒト化抗体について既に述べたように、本発明で使用される「ヒト化抗体」はまた、とりわけＣ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関して、例えば「クラススイッチ」即ちＦｃ部分の変化又は変異（例えばＩｇＧ１からＩｇＧ４及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異）によって、本発明に係る特性を生み出すために、定常領域で修飾された抗体を含む。
【００６９】
本発明で使用される場合、用語「組換えヒト抗体」は、宿主細胞に形質移入された組換え発現ベクターを使用して発現したヒト免疫グロブリン遺伝子又は抗体用にトランスジェニックである動物（例えばマウス）から、又はＮＳ０又はＣＨＯ細胞等の宿主細胞から単離された抗体等、組換え手段により調製、発現、生成又は単離された全てのヒト抗体を含むことを意図している。このような組換えヒト抗体は、再配列された形態で、可変及び定常領域を有する。本発明の組換えヒト抗体は、インビボ体細胞突然変異を受ける。よって、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列から誘導され、関連しているが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しないであろう配列である。
【００７０】
本明細書で使用される「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、抗体を抗原に結合させることに直接関与する軽鎖及び重鎖の対のそれぞれを示す。可変軽鎖及び重鎖のドメインは、同じ一般構造を有し、各ドメインは、配列が広く保存され、３個の「高頻度可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）によって連結される、４個のフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションをとり、ＣＤＲは、βシート構造を連結するループを形成しうる。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によって三次元構造に保持され、もう一方の鎖由来のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明に係る抗体の結合特異性／親和性に特に重要な役割を果たし、よって本発明の更なる目的を提供する。
【００７１】
用語「超可変領域」又は「抗体の抗原−結合部分」とは、本明細書において使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含んでなる。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書において定義されるように超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含んでなる。各々の鎖上のＣＤＲはそのようなフレームワークアミノ酸により分離される。特に、重鎖のＣＤＲ３は、ほとんど抗原結合に寄与する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health Publication No. 91-3242, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義に従って決定される。
【００７２】
本明細書において使用される場合、用語「結合」又は「特異的に結合」とは、インビトロにおけるアッセイ、好ましくは精製した野生型抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ（BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden）における抗体のエピトープへの抗原結合タンパク質の結合を指す。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体結合に関する速度定数）、ｋＤ（解離定数）、及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）によって定義される。一実施態様において、結合又は特異的に結合は、１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは１０−９Ｍから１０−１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫＤ）を意味する。
【００７３】
従って、本発明による抗原タンパク質は、１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは１０−９Ｍから１０−１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫＤ）で、特異的である各抗原に対して特異的に結合している。
【００７４】
用語「エピトープ」とは、抗原結合タンパク質に対して特異的に結合できるいずれかのポリペプチド決定基を包含する。ある実施態様においては、エピトープ決定基は、分子、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリン又はスルホニルなどの化学的活性表面群を包含し、そしてある実施態様においては、特定の三次元構造特性及び／又は比電荷特性を有することができる。エピトープは、抗原結合タンパク質により結合される抗原の領域である。
【００７５】
ある実施態様において、抗体は、それがタンパク質及び／又は高分子の複雑な混合物中のその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合すると言われる。
【００７６】
更なる実施態様において、本発明の多重特異性抗体は、前記完全長抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものであり、又は変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする。更なる実施態様において、本発明の多重特異性抗体は、前記完全長抗体は、ヒトＩｇＧ２サブクラスのものであることを特徴とする。更なる実施態様において、本発明の多重特異性抗体は、前記完全長抗体は、ヒトＩｇＧ３サブクラスのものであることを特徴とする。更なる実施態様において、本発明の多重特異性抗体は、前記完全長抗体は、ヒトＩｇＧ４サブクラスのものであり、又は更なる変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４サブクラスのものであることを特徴とする。一実施態様において、本発明の多重特異性抗体は、前記完全長抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものであり、又は更なる変異Ｓ２２８Ｐを有するヒトＩｇＧ４サブクラスのものであることを特徴とする。
【００７７】
現在では、本発明の多重特異性抗体は、生物学的又は薬理学的活性、薬物動態学的特性又は毒性などの特性が改善されていることが見出されているこれらは、例えば、癌などの疾患の治療のために使用することができる。
【００７８】
用語「定常領域」は、本明細書中で使用される場合、可変領域以外の抗体のドメインの和を意味する。定常領域は、抗原の結合に直接的にかかわらないが、様々なエフェクター機能を示す。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体は以下のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分類され、そしてそのいくつか、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２などは、サブクラスに更に分類されることもできる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。全部で５つの抗体クラスで見ることができる軽鎖定常領域（ＣＬ）は、κ（カッパ）及びλ（ラムダ）と呼ばれる。
【００７９】
用語「ヒト起源由来の定常領域」は、本願で使用される場合、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のヒト抗体の定常重鎖領域及び／又は定常軽鎖カッパ又はラムダ領域を意味する。そのような定常領域は、当技術分野の現状において周知であり、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．によって説明されている（例えばJohnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-278８を参照のこと）。
【００８０】
ＩｇＧ４サブクラスの抗体はＦｃ受容体（ＦｃγＲＩＩＩａ）結合の減少を示すが、別のＩｇＧサブクラスの抗体は強い結合を示す。しかしながら、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７（Ｆｃ糖鎖の喪失）、Ｐｒｏ３２９、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４、又は／及びＨｉｓ４３５は、変更される場合には、Ｆｃγ受容体結合の減少も与える残基である（Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324；欧州特許第０３０７４３４号）。
【００８１】
一実施態様において、本発明による抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較してＦｃＲ結合が低減されている。従って、全長親抗体は、ＦｃＲ結合に関して、ＩｇＧ４サブクラスのもの、あるいはＳ２２８、Ｌ２３４、Ｌ２３５及び／又はＤ２６５に突然変異を伴う、及び／又はＰＶＡ２３６突然変異を含むＩｇＧ１又はＩｇＧ２サブクラスのものである。一実施態様では、全長親抗体内の突然変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、及び／又は、ＰＶＡ２３６である。他の実施態様では、全長親抗体内の突然変異は、ＩｇＧ４ではＳ２２８ＰそしてとＩｇＧ１ではＬ２３４ＡとＬ２３５Ａにある。
【００８２】
抗体の定常領域は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞毒性）及びＣＤＣ（補体依存性細胞毒性）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、大部分のＩｇＧ抗体サブクラスの定常領域への補体Ｃ１ｑ因子の結合により開始する。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位で所定のタンパク質‐タンパク質相互作用により起きる。そのような定常領域の結合部位は、当技術分野の現状において公知であり、例えばLukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Bunkhouse, R. and Cobra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thomason, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idiocies, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hearer, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324；及び欧州特許第０３０７４３４号により記載されている。そのような定常領域の結合部位は、例えばアミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、及びＰ３２９（付番は常にＫａｂａｔのＥＵインデックスに準じる）を特徴とする。
「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵ指標（カバットによる）」は、免疫グロブリン重鎖定常領域の残基を参照するときに通常使用される（例えばKabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health Publication No. 91-3242, Bethesda, MD (1991に報告されたＥＵ指標は参照により本明細書に明示的に援用される）。
【００８３】
用語「抗体依存性細胞傷害性性（ＡＤＣＣ）」は、エフェクター細胞の存在下、本発明の抗体によるヒト標的細胞の溶解を意味する。ＡＤＣＣは、エフェクター細胞の存在下、例えば新鮮に単離されたＰＢＭＣ又はバフィーコートからの精製エフェクター細胞、例えば単球又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は永続的に増殖するＮＫ細胞株の存在下で本発明の抗体で抗原発現細胞の調製物を処理することにより好ましくは測定される。
【００８４】
用語「補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）」は、ほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ領域への補体因子Ｃ１ｑの結合により開始されるプロセスを示す。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位で所定のタンパク質‐タンパク質相互作用により起きる。このようなＦｃ部分の結合部位は最先端の技術で知られている（上記参照）。このようなＦｃ部分の結合部位は、例えば、アミノ酸Ｌ２３４，Ｌ２３５，Ｄ２７０，Ｎ２９７，Ｅ３１８，Ｋ３２０，Ｋ３２２，Ｐ３３１，及びＰ３２９により特徴付けられている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．ＡのＥＵ指標に従い番号付け）。通常、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体は、Ｃ１ｑ及びＣ３結合を含む補体活性を示すが、ＩｇＧ４は補体系を活性化させず、Ｃ１ｑ及び／又はＣ３に結合しない。
【００８５】
モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能は、Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 及び米国特許第６，６０２，６８４号において説明したように、それらのオリゴ糖成分を操作することによって高めることができるＩｇＧ１型抗体は、最も一般的に使用される治療用抗体であり、各ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７で保存されたＮ−結合型糖鎖付加部位を持つ糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に付着した２つの複雑な二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメインの間に埋葬され、ポリペプチド主鎖との広範な接触を形成し、そしてそれらの存在は、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を媒介するために抗体にとって必須である（Lifely, M., R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., and Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32）。Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び国際公開第９９／５４３４２号は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、二分オリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧＮＴＩＩＩ」）の過剰発現が、抗体のインビトロＡＤＣＣ活性を有意に増加させることを示した。Ａｓｎ２９７の糖鎖の変化又はその除去は、ＦｃγＲととＣ１ｑの結合にも影響を及ぼす（Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev, S., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, L.C., et al., J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147）。
【００８６】
モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能を増強する方法は、例えば、国際公開第２００５／０１８５７２号、国際公開第２００６／１１６２６０号、国際公開第２００６／１１４７００号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００５／０１１７３５号、国際公開第２００５／０２７９６６号、国際公開第１９９７／０２８２６７号、米国特許出願公開第２００６／０１３４７０９号、米国特許出願公開第２００５／００５４０４８号、米国特許出願公開第２００５／０１５２８９４号、国際公開第２００３／０３５８３５号、国際公開第２０００／０６１７３９で報告されている。
【００８７】
本発明の好ましい一実施態様において、三重又は四重特異性抗体は（それがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブクラスの、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスのＦｃ部分を含む場合）Ａｓｎ２９７で、糖鎖の中のフコースの量が６５％未満である糖鎖によりグリコシル化されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）。別の実施態様において、前記糖鎖の中のフコースの量は５％から６５％の間、好ましくは２０％から４０％の間である。別の実施態様において、前記糖鎖の中のフコースの量は０％の間である。本発明による「Ａｓｎ２９７」はＦｃ領域の位置がおよそ２９７に位置したアミノ酸のアスパラギンを意味する。抗体の軽微な配列多様性に基づいて、Ａｓｎ２９７はまた、位置２９７の上流又は下流の幾つかのアミノ酸で、即ち、位置２９４と３００の間に配置することができる（通常は＋３以下のアミノ酸）。本発明によるグリコシル化抗体の一実施態様において、ＩｇＧサブクラスはヒトＩｇＧ１サブクラスのもの、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを持つヒトＩｇＧ１サブクラスのもの又はＩｇＧ３サブクラスのものである。更なる実施態様において、前記糖鎖の内部において、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）は１％以下であり、及び／又はＮ末端のα−１，３−ガラクトースの量は１％以下である。糖鎖は、好ましくはＣＨＯ細胞において組換え発現される抗体のＡｓｎ２９７に付着したＮ結合型グリカンの特性を示す。
【００８８】
「糖鎖がＣＨＯ細胞で組換え的に発現した抗体のＡｓｎ２９７に結合したＮ−結合グリカンの特徴を示す」なる用語は、本発明の完全長親抗体のＡｓｎ２９７の糖鎖が、フコース残基を除き、未修飾のＣＨＯ細胞で発現した同様の抗体のもの、例えば国際公開第２００６／１０３１００号で報告されているものと同様の構造及び糖残基配列を有することを示す。
【００８９】
この出願で使用される「ＮＧＮＡ」なる用語は、糖残基Ｎ−グリコシル−ノイラミン酸を示す。
【００９０】
ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３のグリコシル化は、コアフコシル化された二分岐複合オリゴ糖のグリコシル化が最大２つのＧａｌ残基で終結している場合、Ａｓｎ２９７で生じる。ＩｇＧ１又はＩｇＧ３のサブクラスのヒト定常重鎖領域は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health Publication No. 91-3242, Bethesda, MD (1991), and by Brueggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527により詳しく報告されている。これらの構造は、末端Ｇａｌ残基の量に応じて、Ｇ０、Ｇ１（α−１，６−又はα−１，３−）、又はＧ２グリカン残基と命名される（Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53）。抗体のＦｃ部分のＣＨＯ型グリコシル化は、例えば、Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207により記載されている。非糖修飾されたＣＨＯ宿主細胞で組換えにより発現している抗体は、通常、少なくとも８５％の量で、Ａｓｎ２９７でフコシル化されている。完全長親抗体の修飾されたオリゴ糖は、ハイブリッド又は複合体であり得る。好ましくは二分された、還元され／フコシル化されていないオリゴ糖はハイブリッドである。別の実施態様において、還元され／フコシル化されていないオリゴ糖は複合体である。
【００９１】
本発明によれば、「フコースの量」は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定され平均値として計算される、Ａｓｎ２９７に結合した全糖鎖構造（例えば複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）の総和に関連した、Ａｓｎ２９７での前記糖の量を意味する。フコースの相対量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理した試料（例えば、複合体、ハイブリッド、及びオリゴ及び高マンノース構造のそれぞれ）において同定された全ての糖構造に関連したフコース含有構造の割合である。
【００９２】
本発明に係る抗体は、組換え手段によって生成される。従って、本発明の一態様は、本発明による抗体をコードする核酸であり、更なる態様は、本発明による抗体をコードする前記核酸を含む細胞である。組換えによる産生のための方法が広く先端技術で知られており、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質の発現を含み、その後の抗体の単離、及び通常は薬学的に許容される純度までの精製を伴う。宿主細胞で前述のように抗体を発現するために、それぞれの修飾された軽鎖と重鎖が、標準的な方法により発現ベクターに挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、又は大腸菌細胞などの適当な原核生物又は真核生物宿主細胞中で行われ、抗体は細胞（上清又は溶解後の細胞）から回収される。抗体の組換えによる生成のための一般的な方法は、最新技術分野において周知であり、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説に記載されている。
【００９３】
本発明による三重又は四重抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどによって培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは容易に単離され、従来の手順を用いて配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、ＤＮＡとＲＮＡの供給源として機能することができる。一度単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに挿入することができ、これらは次いで、本来ならば免疫グロブリンタンパク質を生成しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又はミエローマ細胞などの宿主細胞中にトランスフェクトされ、宿主細胞中で組換えモノクローナル抗体の合成を得る。
【００９４】
抗原結合タンパク質のアミノ酸配列変異体（又は変異体）は、抗体のＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することによって、又はヌクレオチド合成によって調製される。しかしながら、そのような修飾は、例えば、ごく限られた範囲で上述したように行うことができる。例えば、修飾は、例えば、ＩｇＧのアイソタイプ及び抗原結合など上述したような抗体の特性を変化させないが、組換えによる生成収率、タンパク質安定性を改善したり、精製を容易にすることができる。
【００９５】
本出願で使用される用語「宿主細胞」は、本発明に係る抗体を生成するように操作することができる細胞性システムの任意の種類を意味する。一実施態様において、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞が宿主細胞として使用される。本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は互換的に使用され、すべてのそのような名称は子孫を含む。よって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」なる用語には、初代被験体細胞、及び移動の回数に関係なくそこから得られた培養物も含まれる。また、全ての子孫は、意図的な又は不慮の突然変異により、ＤＮＡ量において、厳密には同一でない可能性もあると理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされた場合、同じ機能又は生物活性を有する変異子孫も含まれる。区別される標記を意図している場合は、文脈から明らかなはずである。
【００９６】
ＮＳ０細胞における発現は、例えば、Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270により説明される。一過性発現は、例えばDurocher,Y.,et al.,Nucl.Acids.Res.30(2002)E9により説明される。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及びNorderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87により説明される。好適な一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Schlaeger, E.-J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83 and by Schlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199により説明される。
【００９７】
原核生物に適している制御配列は、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【００９８】
核酸は、それは、他の核酸配列と機能的な関係で配置されたとき、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結されている；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に操作可能に連結されている；又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に操作可能に連結されている。一般に、「作動可能に結合」とは、連結するＤＮＡ配列が近接しており、及び分泌リーダーの場合には、近接しておりかつリーディングフレームにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【００９９】
抗体の精製は、細胞成分又は他の汚染物質、例えば他の細胞の核酸又はタンパク質を、アルカリ／ＳＤＳ処理、塩化セシウムバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野で周知のその他を含む標準的な技術によって除去するために行われる。Ausubel, F., et al., (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照。タンパク質精製のために異なる方法、例えば微生物のタンパク質による親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧ親和性クロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）及び混合モード交換）、チオフィリック吸着（β−メルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドによるなど）、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（フェニル−セファロース、アザアレノフィリック樹脂、又はｍ−アミノフェニルボロン酸によるなど）、金属キレート親和性クロマトグラフィー（Ｎｉ（ＩＩ）−及びＣｕ（ＩＩ）親和性材料によるなど）、サイズ排除クロマトグラフィー、及び電気泳動的方法（例えばゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）が十分に確立され広範に使用されている（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）。
【０１００】
本発明の一つの態様は、本発明に係る抗原結合タンパク質を含む薬学的組成物である。本発明の別の態様は、薬学的組成物の製造のための、本発明に係る抗原結合タンパク質の使用である。本発明の更なる態様は、本発明に係る抗原結合タンパク質を含む薬学的組成物の製造のための方法である。別の態様において、本発明は、例えば、薬学的担体と共に調製される本発明に係る抗原結合タンパク質を含む薬学的組成物を含む組成物を提供する。
【０１０１】
本発明の一実施態様は、癌の治療のための、本発明に係る抗原結合タンパク質である。
【０１０２】
本発明の別の態様は、癌の治療のための前記薬学的組成物である。
【０１０３】
本発明の別の態様は、癌の治療のための医薬の製造のための、本発明に係る抗原結合タンパク質の使用である。
【０１０４】
本発明の別の態様は、治療を必要とする患者に、本発明に係る抗原結合タンパク質を投与することによる、癌に罹患している患者の治療方法である。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「薬学的担体」には、任意及び全ての溶媒、分散用媒体、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延化剤で、生理学的に適合性であるものが含まれる。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、大脳内、皮下、非経口、脊髄、又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に適している。
【０１０６】
本発明の組成物は、当該技術で知られているの種々の方法で投与することができる。当業者に理解されているように、投与の経路及び／又は方式は、所望する結果に応じて変えられるであろう。投与のある種の経路により、本発明の化合物を投与するため、その不活性化を防止するための物質で化合物をコーティングする、又はその不活性化を防止するための物質と化合物とを一緒に投与する必要があるかもしれない。例えば、化合物は適切な担体、例えばリポソーム、又は希釈剤において、被験者に投与されてもよい。薬学的に許容可能な希釈剤には、生理食塩水又は水性緩衝液が含まれる。薬学的担体には、滅菌水溶液又は分散液、及び無菌の注射可能な溶液又は分散液を即時調製するための滅菌パウダーが含まれる。薬学的に活性な物質のためのこうした媒体及び薬剤の使用は、当該技術で知られている。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「非経口投与」及び「非経口的に投与」なる語句は、経腸及び局所投与以外の投与方式、通常は注射による投与を意味し、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入が含まれる。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「癌」なる用語は、増殖性疾患、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、気管支肺胞上皮細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部又は頸部の癌、皮膚又は眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、胃腸癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、随芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、及びユーイング肉腫を指し、上述した任意の癌の抵抗性バージョン、又は上述した癌の一又は複数の組合せを含む。
【０１０９】
これらの組成物は、アジュバント、例えば保存料、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤をさらに含有可能である。微生物存在の防止は、上掲の滅菌手段、及び種々の抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、スコルビン酸等により確実になる。また、等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウムなどを、組成物に含有せしめることもまた望ましい。加えて、注射可能な薬学的形態の長時間にわたる吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有せしめることによりもたらすことができる。
【０１１０】
選択された投与経路にかかわらず、適切な水和形態、及び／又は本発明の薬学的組成物で使用される本発明の化合物は、当業者に知られている一般的な方法により、薬学的に許容可能な剤形に処方される。
【０１１１】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与レベルは、患者に対して毒性がなく、特定の患者に対する所望する治療的応答、組成物、及び投与方式を達成するのに効果的な活性成分の量が得られるように変えうる。選択された投与レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、処置時間、他の薬剤、使用される特定の組成物と組合せて使用される化合物及び／又は物質、年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態、処置される患者の以前の病歴、及び医療でよく知られている要因を含む、種々の薬物動態学的要因に依存するであろう。
【０１１２】
組成物は滅菌されていなければならず、組成物がシリンジにより送達可能である程度に、流動的でなければならない。水に加えて、担体は、好ましくは等張の緩衝生理食塩水である。
【０１１３】
適切な流動性は、例えばレシチン等のコーティング剤を使用することにより、又は分散液の場合は必要な粒径を維持することにより、そして界面活性剤を使用することにより、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、多価アルコール類、例えばマンニトール又はソルビトール、及び塩化ナトリウムを、組成物に含有せしめることが好ましい。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、用語「形質転換」は、宿主細胞へのベクター／核酸の転写のプロセスを指す。手ごわい細胞壁障壁が無い細胞を宿主細胞として用いる場合には、トランスフェクションは、例えば、Graham and Van der Eh,Virology 52(1978)546により説明されるようにリン酸カルシウム沈殿法により行われる。しかし、核注入による、又はプロトプラスト融合によるなど、細胞にＤＮＡを導入するための他の方法を用いてもよい。実質的な細胞壁構造を含む原核細胞又は細胞が使用される場合、例えばトランスフェクションの一つの方法は、Cohen,F.N,et al.,PNAS 69(1972)7110)によって記述された塩化カルシウムを用いたカルシウム処理である。
【０１１５】
本明細書で使用される「発現」とは、核酸がｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡ（これも転写産物とも呼ばれる）が、その後、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、遺伝子産物と総称して呼ばれる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来した場合、真核細胞における発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【０１１６】
「ベクター」は、核酸分子で、特に自己複製し、これにより、挿入された核酸分子を宿主細胞へ及び／又は宿主細胞間で転送する。その用語は、主にＤＮＡ又はＲＮＡを細胞へ挿入するため（例えば、染色体の統合）に機能するベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製のために主に機能するベクターの複製、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクターを含む。また含まれるのは、説明したように一以上の機能を提供するベクターである。
【０１１７】
「発現ベクター」は、適当な宿主細胞に導入されると、転写されてポリペプチドに翻訳することができるポリヌクレオチドである。「発現系」は、通常、所望の発現産物を生じるために機能することができる発現ベクターからなる適切な宿主細胞を指す。
【０１１８】
本発明の更なる態様は、
Ａ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）重鎖のＮ末端はペプチドリンカーを介して軽鎖のＣ末端に連結される、第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；
又は
Ｂ）ａ）第一抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）重鎖のＮ末端はペプチドリンカーを介して軽鎖のＣ末端に連結される、第二抗原及び第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；
又は
Ｃ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）重鎖のＮ末端はペプチドリンカーを介して軽鎖のＣ末端に連結される、第三抗原及び第四抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖
を含む多重特異性抗体である。
【０１１９】
本発明で使用される用語「ペプチドリンカー」は、好ましくは合成起源のものであるアミノ酸配列を持つペプチドを意味する。本発明に係るこれらのペプチドリンカーは、（第二抗原に特異的に結合する）第二完全長抗体の軽鎖のＣ末端を重鎖のＮ末端にペプチドリンカーを介して連結するために使用される。第二完全長抗体重及び軽鎖内のペプチドリンカーは、少なくとも３０アミノ酸の長さ、好ましくは３２〜５０アミノ酸の長さを有するアミノ酸配列のペプチドである。一つでは、ペプチドリンカーは、３２〜４０アミノ酸の長さを有するアミノ酸配列のペプチドである。一実施態様では、前記リンカーは（ＧｘＳ）ｎであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝８、９又は１０及びｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４及びｎ＝６、７又は８及びｍ＝０、１、２又は３）、好ましくはｘ＝４、ｎ＝６又は７及びｍ＝０、１、２又は３、より好ましくはｘ＝４、ｎ＝７及びｍ＝２である。一実施態様では、前記リンカーは（Ｇ４Ｓ）６Ｇ２である。
【０１２０】
そのような多重特異性抗体の一実施態様は、実施例の表１：配列番号４、１１及び１３のアミノ酸配列を含む三重特異性Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ３−ｓｃＦａｂ−ＩＧＦ１Ｒに与えられる。
【０１２１】
以下の実施例、配列表及び図面は、本発明、添付の特許請求の範囲に記載されている真の範囲の理解を助けるために提供される。変更は、本発明の精神を逸脱することなく、記載された手順で行うことができることが理解される。
【０１２２】
アミノ酸配列の説明
配列番号１：ＨＣ／ノブ／Ｈｅｒ２／ＶＥＧＦ
配列番号２：ＨＣ／ホール／Ｈｅｒ２／ＶＥＧＦ
配列番号３：ＨＣ／ノブ／Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ３
配列番号４：ＨＣ／ホール／Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ３
配列番号５：ＨＣ／ホール／ｘＡｎｇ２
配列番号６：ＨＣ／ノブ／ｘＡｎｇ２
配列番号７：ＨＣ／ホール／ｘＩＧＦ１Ｒ
配列番号８：ＨＣ／ホール／ｘＨｅｒ３
配列番号９：ＨＣ／ホール／ｘＨｅｒ２
配列番号１０：ＨＣ／ホール／ｘｃＭｅｔ
配列番号１１：ＨＣ／ホール／ｓｃＦａｂＩＧＦ１Ｒ
配列番号１２：ＨＣ／ホール／ｘＨｅｒ１／Ｈｅｒ３
配列番号１３：ＬＣ／Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ３
配列番号１４：ＬＣ／Ｈｅｒ２／ＶＥＧＦ
配列番号１５：ＬＣ／ｘＡｎｇ２
配列番号１６：ＬＣ／ｘＩＧＦ１Ｒ
配列番号１７：ＬＣ／ｘＨｅｒ３
配列番号１８：ＬＣ／ｘＨｅｒ２
配列番号１９：ＬＣ／ｘｃＭｅｔ
配列番号２０：ＬＣ／ｘＨｅｒ１／Ｈｅｒ３
【０１２３】
以下に、本発明の実施態様が一覧表示される：
１．Ａ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｂ）ａ）第一抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第二抗原及び第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｃ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原及び第四抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖
を含む多重特異性抗体。
２．抗体は二価、三重又は四重特異性抗体であることを特徴とする、実施態様１に記載の多重特異性抗体。
３．抗体は三重特異性抗体であり、
Ａ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｂ）ａ）第一抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第二抗原及び第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖
を含むことを特徴とする、実施態様１に記載の多重特異性抗体。
４．Ａ）のもとで、第一抗原はヒトＨＥＲ１、第二抗原はヒトＨＥＲ３及び第三抗原はヒトＨＥＲ２であり；又は
Ｂ）のもとで、第一抗原はヒトＨＥＲ２、第二抗原はヒトＨＥＲ１及び第三抗原はヒトＨＥＲ３である、実施態様３に記載の多重特異性抗体。
５．抗体は二価、三重特異性抗体であり、
ａ）ヒトＨＥＲ１及びヒトＨＥＲ３に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、ヒトＨＥＲ２に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖
を含む実施態様１に記載の多重特異性抗体。
６．抗体は、配列番号４、９、１３及び１８のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、実施態様５に記載の多重特異性抗体。
７．Ａ）のもとで、第一抗原はヒトＨＥＲ１、第二抗原はヒトＨＥＲ３及び第三抗原はヒトｃＭＥＴであり；又は
Ｂ）のもとで、第一抗原はヒトｃＭＥＴ、第二抗原はヒトＨＥＲ１及び第三抗原はヒトＨＥＲ３である、実施態様３に記載の多重特異性抗体。
８．抗体は四重特異性抗体であり、
ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原及び第四抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖
を含むことを特徴とする、実施態様１に記載の多重特異性抗体。
９．ｂ）のもとで修飾された軽鎖及び修飾された重鎖において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており；及び定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、実施態様１から５、７及び８の何れか一に記載の多重特異性抗体。
１０．ｂ）のもとで修飾された軽鎖及び修飾された重鎖において、可変ドメインＶＬ及びＶＨ（のみ）が互いに置換されている、実施態様１から５、７及び８の何れか一に記載の多重特異性抗体。
１１．ｂ）のもとで修飾された軽鎖及び修飾された重鎖において、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１（のみ）が互いに置換されている、実施態様１から５、７及び８の何れか一に記載の多重特異性抗体。
１２．ａ）の完全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメイン及びｂ）の完全長抗体の修飾された重鎖のＣＨ３ドメインの各々は抗体のＣＨ３ドメイン間の元のインターフェイスを含むインターフェイスで接触することを特徴とし；
前記インターフェイスは三重特異性又は四重特異性抗体の形成を促進するように改変され、その改変は
ｉ）三重又は四重特異性抗体内の他の重鎖のＣＨ３ドメインの元のインターフェイスで接触する一重鎖のＣＨ３ドメインの元のインターフェイス内で、
アミノ酸残基はより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それによって、他の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内のキャビティの中に置くことができる、一重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内の隆起を作成するように一重鎖のＣＨ３ドメインが改変され、
及び
ｉｉ）三重又は四重特異性抗体内の第一ＣＨ３ドメインの元のインターフェイスで接触する第二ＣＨ３ドメインの元のインターフェイス内で、
アミノ酸残基はより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それによって、その中に第一ＣＨ３ドメインのインターフェイス内の隆起を置くことができる、第二ＣＨ３ドメインのインターフェイス内のキャビティを作成するように他の重鎖のＣＨ３ドメインが改変されることを特徴とする、実施態様１から１１の何れか一に記載の多重特異性抗体。
１３．より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群から選択され、及びより小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群から選択されることを特徴とする、実施態様１２に記載の多重特異性抗体。
１４．両方のＣＨ３ドメインの間にジスルフィド架橋を形成することができるように、各ＣＨ３ドメインの対応する位置のアミノ酸としてシステイン（Ｃ）を導入することにより、両方のＣＨ３ドメインが更に改変されることを特徴とする、実施態様１２又は１３に記載の多重特異性抗体。
１５．ａ）
Ａ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｂ）ａ）第一抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第二抗原及び第三抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖；
又は
Ｃ）ａ）第一抗原及び第二抗原に特異的に結合する完全長抗体の軽鎖及び重鎖；及び
ｂ）可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている、第三抗原及び第四抗原に特異的に結合する完全長抗体の修飾された軽鎖及び修飾された重鎖
をコードする核酸分子を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程；
ｂ）前記抗体分子の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養する工程；及び
ｃ）前記培養物から前記抗体分子を回収する工程
を含む、実施態様１から１４に記載の多重特異性抗体の調製のための方法。
１６．実施態様１から１４に記載の多重特異性抗原結合タンパク質をコードする核酸。
１７．実施態様１から１４に記載の多重特異性抗原結合タンパク質をコードする核酸を含むベクター。
１８．実施態様１７に記載のベクターを含む宿主細胞。
１９．実施態様１から１４に記載の抗体の組成物、好ましくは薬学的又は診断用組成物。
２０．実施態様１から１４に記載の抗体及び少なくとも一の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
２１．癌の治療において使用のための、実施態様１から１４の何れか一に記載の抗体。
２２．癌の治療のための医薬の製造のための、実施態様１から１４の何れか一に記載の抗体の使用。
２３．実施態様１から１４に記載の抗体の治療的有効量を患者に投与することを特徴とする、治療を必要とする患者の治療のための方法。
２４．実施態様１から１４に記載の抗体の治療的有効量を患者に投与することを特徴とする、癌に罹患した患者の治療のための方法。
【実施例】
【０１２４】
材料と方法
組換えＤＮＡ技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に既述されるように、標準的な方法がＤＮＡを操作するために使用された。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。
【０１２５】
ＤＮＡ及びタンパク質配列分析及び配列データ管理
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の塩基配列に関する一般情報については、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health Publication No 91-3242, Bethesda (1991)に与えられる。抗体鎖のアミノ酸はＥＵ番号付けに従って番号付けされる(Edelman, G.M., et al., PNAS 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版, NIH Publication No 91-3242 (1991))。ＧＣＧ（Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin）ソフトウェアパッケージバージョン１０．２及びインフォマックスのベクターNTIアドバンススイート（Infomax's Vector NTI Advance suite）のバージョン８．０が配列の作成、マッピング、解析、注解及び図解のために使用された。
【０１２６】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ（Vaterstetten,Germany）とＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Regensburg,Germany）で行った二本鎖配列決定により決定した。
【０１２７】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から、Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Regensburg,Germany）により調製された。特異な制限酵素切断部位に隣接する遺伝子セグメントがｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミドにクローニングされた。プラスミドＤＮＡを形質転換した細菌から精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニング遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１２８】
発現プラスミドの構築
ロシュ発現ベクターを、すべての抗体鎖の構築のために使用した。ベクターは、以下の要素からなる：
−  選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、
−  エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点、ｏｒｉＰ、
−  大腸菌でこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点
−  大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子、
−  ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−  ヒト免疫グロブリン１ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列。
ＣＨ−ＣＬクロスオーバーによる重鎖又は軽鎖並びにｃｒｏｓｓｍａｂコンストラクトを含む免疫グロブリンは遺伝子合成により調製され、上記のようにｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミドにクローニングされた。可変重鎖コンストラクトは、ｃｄｓの上流の５’ＢａｍＨＩ及びＣＨ１ドメインに位置する３’ＫｐｎＩ制限部位を使用して方向性クローニングにより構築された。可変軽鎖コンストラウトはＶＬ及びＣＬを含む遺伝子合成として発注され、ｃｄｓの上流の５’ＢａｍＨＩ及びストップコドンの下流に位置する３’ＸｂａＩＩ制限部位を使用して方向性クローニングにより構築された。Ｃｒｏｓｓｍａｂ抗体は完全なコード配列（ＶＬ−ＣＨ１又はＶＨ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３）により、又はコード配列中のユニークな制限部位を有する部分的な遺伝子合成としての何れかで構築された。交差した軽鎖（ＶＬ−ＣＨ１）の場合、５’ＢａｍＨＩ及び３’ＸｂａＩ制限部位を有するｃｄｓ全体をカバーする遺伝子合成のみが発注された。また重鎖コンストラウトにおいては、重鎖ベクターのＣＨ２ドメインの３’ＸｈｏＩ制限部位が５’ＢａｍＨＩ制限部位による方向性クローニングのために用いられた。最終的な発現ベクターは、大腸菌細胞に形質転換し、発現プラスミドＤＮＡを単離し（ミニプレップ）、制限酵素分析及びＤＮＡ配列決定に供した。正しいクローンを１５０ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地中で増殖させ、再びプラスミドＤＮＡを単離し（マキシプレップ）、配列の完全性をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１２９】
ＨＥＫ２９３細胞における免疫グロブリン変異体の一過性発現
組換え免疫グロブリン変異体は、製造業者（Invitrogen,USA）の指示に従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３発現システムを使用して、ヒト胎児腎臓２９３−Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。小規模試験発現のため、０．５×１０６のＨＥＫ２９３Ｆ細胞／ｍｌの３０ｍｌをトランスフェクションの一日前に播種した。翌日、プラスミドＤＮＡ（培養体積のｍｌ当たり１μｇのＤＮＡ）が、１．２ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ低血清培地（Reduced Serum Medium ）（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）と混合され、続いて、４０μｌの２９３ＦｅｃｔｉｎＴＭトランスフェクション試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）が添加された。混合物を室温で１５分間インキュベートし、細胞に滴下した。トランスフェクションの一日後、各フラスコに、３００μｌのＬ−グルタミン（２００ｍＭ、Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany）及びｆｅｅｄ７（Ｌ−アスパラギン、ＨｙＰｅｐ１５１０、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム、エタノールアミン、微量元素、Ｄ−グルコース、ＲＤＭＩを含まないフリースタイル培地を含む）の６００μｌが供給された。トランスフェクションの三日後、細胞濃度、培地中の細胞濃度、生存能力及びグルコース濃度を、自動化された細胞生存率分析器（Ｖｉ−ＣＥＬＬＴＭ ＸＲ、Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA）及びグルコースメーター（Ａｃｃｕ−ＣＨＥＫ（登録商標）Sensor comfort, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を用いて測定した。加えて、各フラスコに、Ｌ−グルタミンを３００μｌ、非必須アミノ酸溶液（ＰＡＮＴＭ Biotech, Aidenbach, Germany）を３００μｌ、ピルビン酸ナトリウムを３００μｌ（１００ｍＭ、Gibco, Invitrogen）、ｆｅｅｄ７を１．２ｍｌ及びグルコース（Ｄ−（＋）−グルコース溶液４５％、シグマ）を５ｇ／Ｌ、供給した。最後に、トランスフェクションの６日後、抗体は、周囲温度で１５分間、Ｘ３Ｒ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ（Heraeus, Buckinghamshire, England）で３５００ｒｐｍで遠心分離により回収し、上清を滅菌Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルターユニット（０．２２ｍｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ ＰＥＳメンブラン、Millipore, Bedford, MA）を通して濾過し、さらに使用するまで−２０℃で保存した。
【０１３０】
二重特異性抗体及びコントロール抗体の精製
二価の三重特異性抗体は、プロテインＡ−セファロースＴＭ（GE Healthcare,Sweden）を使用する親和性クロマトグラフィー及びスーパーデックス２００サイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製された。簡潔には、無菌ろ過した細胞培養上清を、ＰＢＳバッファー（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４，１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４，１３７ｍＭのＮａＣｌ及び２．７ｍＭのＫＣｌ，ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＴｒａｐプロテインＡＨＰ（５ｍｌ）カラムに適用した。非結合タンパク質は、平衡バッファーを用いて洗浄した。抗体及び抗体変異体は、０．１Ｍクエン酸バッファー、ｐＨ２．８で溶出し、タンパク質を含む画分は、０．１ｍｌの１Ｍトリス、ｐＨ８．５で中和した。次いで、溶出したタンパク質画分をプールし、アミコンウルトラ遠心濾過装置（ＭＷＣＯ：３０Ｋ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で３ｍｌの体積まで濃縮し、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化した、スーパーデックス２００ ＨｉＬｏａｄ １２０ｍｌ １６／６０又は２６／６０ゲル濾過カラムにロードした。５％未満の高分子量凝集体を含有する精製二重特異性抗体及びコントロール抗体を含む画分がプールされ、−８０℃で１．０ｍｇ／ｍｌの一定分量として保存した。
【０１３１】
タンパク質の定量
タンパク質は、プレパックされたポロス（登録商標）ＡプロテインＡカラム（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を装着し、自動化されたＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００システム（Dionex, Idstein, Germany）を使用して、アフィニティークロマトグラフィーにより定量した。全てのサンプルはバッファーＡ（０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ４・［２Ｈ２Ｏ］、ｐＨ７．４）にロードされ、バッファーＢ（０．１Ｍのクエン酸、０．２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．５）で溶出した。タンパク質濃度を決定するために、吸光係数１．６２を全てのサンプルに使用した。
【０１３２】
精製タンパク質の分析
精製されたタンパク質サンプルのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定した。二重特異性抗体及びコントロール抗体の純度及び分子量は、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びクーマシーブリリアントブルーによる染色により分析された。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Invitrogen, USA）を、製造業者の取扱説明書に従って使用した（４−２０％のトリスグリシン・ゲル）。二重特異性抗体とコントロール抗体サンプルの凝集体含量は、２５℃で２００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４，２５０ｍＭのＫＣｌ，ｐＨ７．０のランニングバッファー中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００分析的サイズ排除カラムを使用して高性能ＳＥＣにより分析された。２５μｇのタンパク質が流速０．５ｍｌ／分でカラムに注入され、５０分間にわたり均一濃度で溶出された。還元された二重特異性抗体軽鎖と重鎖のアミノ酸主鎖の完全性は、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Roche Molecular Biochemicals）による酵素処理によるＮ−グリカンの除去後にナノエレクトロスプレーＱ−ＴＯＦ質量分析法により検証された。
【０１３３】
小規模分析のための免疫沈降
３０μｇのタンパク質を、５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を補充したＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ、ｐＨ７．４、Fluka Analytical, Steinheim, Germany）で、すべてのサンプルについて同じ総反応容量に希釈した。１２６μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＡ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）当たり０．２４μｇのヒトＩｇＧ結合能力、Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）が加えられ、そしてその溶液を、磁気ビーズに結合されたプロテインＡへのヒトＩｇＧ Ｆｃの結合を可能にするために室温で２０ｒｐｍで９０〜１２０分間インキュベートした（１．４ｍｌの総反応容量）。ビーズを１ｍｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、チューブの底の溶液を回収するために０．４×ｇで３０秒間遠心分離した。上清を廃棄し、タンパク質を溶出させるために、ダイナビーズは、１００ｍＭのクエン酸、ｐＨが３（クエン酸一水和物、Sigma）の３０μｌと共にインキュベートした。その後、溶液を、２Ｍのトリス、ｐＨ９（Fisher Scientific）の３μＬで中和した。
【０１３４】
分析用ＨＰＬＣ
抗体は、ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷゲル濾過カラム（７．５ｍｍ ＩＤｘ３０ｃｍ， TosoHaas Corp., Montgomeryville, PA, USA）を装着したＡｇｉｌｅｎｔ１１００ ＨＰＬＣ（Agilent Technologies, Paulo Alto, CA, USA）を用いて分析した。１８μｌの溶出したタンパク質をバッファーＡ ３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５中の（０．０５ＭのＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４）中でカラムにロードし、サイズに基づいて分離した。
【０１３５】
還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
溶出したタンパク質の７μｌを２×サンプルバッファー（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳサンプルバッファー、 Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）と混合し、別の７μｌは１０％の還元剤（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）サンプル還元剤、Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を含む２×サンプルバッファーと混合した。サンプルは１０分間、７０℃まで加熱し、プレキャストＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４−１２％のＢｉｓＴｒｉｓゲル（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）上でロードした。ゲルは、２００Ｖで１２５ｍＡで４５分間流した。その後、ゲルは、ミリポア水で３回洗浄し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅＴＭ ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）。ゲルを、ミリポア水で一晩脱色した。
【０１３６】
細胞株
Ａ４３１は、４ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸及び１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（Gibco）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco）中に維持された。ＭＤＡ−ＭＢ１７５ ＶＩＩ細胞は、グルタマックス（ＧｌｕｔａＭａｘ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Gibco）中に維持された。細胞株の増殖は、標準的な細胞培養プロトコルに従った。
【０１３７】
表面プラズモン共鳴
全ての実験はビアコアＴ１００ (GE Healthcare)で行った。実験結果は、Ｔ１００のコントロール及び評価ソフトウェアパッケージ (GE Healthcare, v2.03)を用いて分析した。アッセイフォーマットはＣＭ−５チップ上での「マルチサイクルカイネティクス」測定であった。分析される抗体は、アミン結合抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体 (GE Healthcare BR-1008-39)を介して捕捉された。ＤＡＦ及びペルツズマブを、基準対照として用いた。濃度系列を用いて、それぞれの抗原（ヒトＨｅｒ１、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ３外部ドメイン）の７つの漸増濃度を別々に注入した。３７℃で各ＭＡｂｓ＜ＨｅｒＸ＞に結合するＨｅｒＸの動力学的特性評価：標準的な動力学は、ビアコア評価ソフトウェアによる（Ｃ＝０ｎｍ及びＦＣ１＝空白面に対する）二重参照によるラングミュア１：１結合モデルを用いた、観測された会合相及び解離相の表面プラズモン共鳴シグナルの時間経過のフィッティングによって評価した。ランニングバッファーはＰＢＳ−Ｔであった。希釈バッファーは、ＢＳＡを含有するＰＢＳＴ（ｃ＝１ｍｇ／ｍＬ）であった。
【０１３８】
フローセル２、３、及び４上でのＭＡｂ＜ＨｅｒＸ＞の捕捉は、濃度はおよそｃ＝１ｎＭで、５μｌ／分、時間は７２秒であった。分析物サンプル：ＨｅｒＸの７つの漸増濃度は１８０秒の結合時間のために５０μｌ／分の流速で注入した（ｃ＝１．２３−９００ｎＭ、希釈係数３）。解離時間：１８００秒。各濃度は重複して分析した。
【０１３９】
最終的な再生は、各サイクル後に（ベンダーが推奨する）３ＭのＭｇＣｌ２を使用して、１２０秒の接触時間及び５０μｌ／分の流速で実施した。同時結合の分析：Ｈｅｒ２／Ｈｅｒ３、Ｈｅｒ３／Ｈｅｒ２又はＨｅｒ１／Ｈｅｒ２は、それぞれ１８０秒の接触時間で二重注入モードを使用して連続的に注入した。抗原濃度は、それぞれの抗原において、動力学実験において観察された飽和状態で選択された。コントロールとして、同一の抗原の第二回目の注入は応答レベルを上げず、平衡に達したことを示している。２５℃の温度が解離を最小化するために選択された。各組み合わせにおいて三重に測定された。流速は３０ｍＬ／分、２回の注入による二重注入で、各々は１８０秒。
【０１４０】
本発明の様々な多重特異性抗体は、概念を評価するために設計された（下記表１参照）。典型的にはそれらはノブ・イントゥー・ホール修飾をＣＨ３ドメイン内に（それぞれの配列に見られるように）含む。
【０１４１】
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【０１４２】
実施例１：
ノブ・イントゥー・ホールＶＥＧＦ−Ｈｅｒ２ ＤＡＦ（二重親和性抗体）の分析
ＶＥＧＦ−Ｈｅｒ２−ＤＡＦは以前に記載されている（Bostrom, J., et al., Science 323 (2009) 1610-1614）。ノブ・イントゥー・ホール技術はＶＥＧＦ−Ｈｅｒ２−ＤＡＦの発現を妨害しないという証拠を提供するため、我々は、この抗体の重鎖の「ノブ・イントゥー・ホール」（ＫＩＨ）のアミノ酸交換を設計した（重鎖１：Ｔ３６６Ｗ、重鎖２：Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）。更に、ジスルフィド架橋が、この抗体のＣＨ３ドメインに導入された（重鎖１：Ｓ３５４Ｃ、重鎖２：Ｙ３４９Ｃ）。
【０１４３】
最初の実験では、ホール重鎖に対する三つの異なるノブ重鎖の比率（Ｋ：Ｈ比率）がトランスフェクトされた（配列番号：１、２、１４）：Ｋ：Ｈ＝１：１、Ｋ：Ｈ＝１．２：１及びＫ：Ｈ＝１．５：１。表２において、試験発現の上清中のＩｇＧの収量が示されている。
【０１４４】
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【０１４５】
ＶＥＧＦ−のＨｅｒ２−ＤＡＦの場合、親のＫ：Ｈ＝１．５：１の比率が最高のＩｇＧ濃度を示し、その後に比率Ｋ：Ｈ＝１：１及びＫ：Ｈ＝１．２：１（ホール重鎖に対するノブ重鎖）が続いた。Ｋ：Ｈ＝１．２：１の比では、第二の反復が非常に低いＩｇＧ濃度を含有していた。これは恐らく、発現の第一の反復で使用した細胞と比較して、細胞のこのバッチの低い生存能力によるものであった。ＶＥＧＦ−のＨｅｒ２−ＤＡＦの試験発現の分析用ＨＰＬＣ（表２、図６ａ）及び還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６ｂ）は、ノブ重鎖が増加したＫ：Ｈの比に比べてＫ：Ｈ＝１：１の比において最少の副産物及び所望される完全抗体の最大量を示した。ノブ鎖の増加は不完全抗体の増加と相関する。試験発現の分析を加速するたじめに、全てのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、滅菌ろ過及び免疫沈降によって精製されただけの上清を用いて行った。サイズ排除クロマトグラフィーは省略した。完全抗体のサイズは、１４６ｋＤａであり、重鎖グリコシル化に起因して見かけ上高い分子量が観察される。分析ＨＰＬＣにおいて、主要ピークは約８．８分で溶出し、完全抗体の予想サイズに対応する（図６ｃ）。従って、我々は、ノブ・イントゥー・ホールを持つＶＥＧＦ−のＨｅｒ２−ＤＡＦを成功裏に作り出すことができる。
【０１４６】
実施例２：
ＫｉＨ ＶＥＧＦ−Ｈｅｒ２ ＤＡＦ−ｘＡｎｇ２の分析
ＶＥＧＦ−Ｈｅｒ２−ＤＡＦの分析は「ノブ・イントゥー・ホール」（ＫｉＨ）の概念は、ＶＥＧＦ−Ｈｅｒ２−ＤＡＦフォーマットを妨害しなかったことを示した後で、我々は、一つの抗体中にＤＡＦとｃｒｏｓｓｍａｂフォーマットを取り入れることにより三重特異性抗体を作成することを目的とした（図３ａ、ｂ）。３つのノブ重鎖のホール重鎖に対する比率（Ｋ：Ｈ比率）が１：１、１．２：１及び１．５：１（配列番号１、５、１４、及び１５）で発現されるＶＥＧＦ−Ｈｅｒ２−ＤＡＦ−ｘＡｎｇ２抗体は、この目的を達成するためであった。漸増するノブ鎖により、上清中のＩｇＧの収率は減少する傾向を示した（表３）。
【０１４７】
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【０１４８】
分析用ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析は、Ｋ：Ｈ＝１．５：１が、副生成物に対する生成物の最良の比率を与えることを明らかにした。分析用ＨＰＬＣで観察されるように、ノブ鎖をコードするプラスミドの量が増加すると、より少ない不完全抗体をもたらした（図７ａ及び表３）。Ｋ：Ｈ＝１：１及びＫ：Ｈ＝１．２：１の比率の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて（図７ｂ）、５つのバンドは、完全抗体、一つの軽鎖が欠けている抗体、対をなす２つの重鎖、半分の抗体、及び恐らく二つの対合した軽鎖（それぞれ１４６ｋＤａ、１２２ｋＤａ、１００ｋＤａ、７３ｋＤａ及び４６ｋＤａであり、グリコシル化を含まない）を示す。特徴付けは、理論的分子量に基づいている。分析ＨＰＬＣは、凝集体（６．６分）、完全抗体（８．８分）及び推定される軽鎖二量体（１０．５分及び図７ａ）に対応するピークによりこの知見を確認する。発現されたＶＥＧＦ−Ｈｅｒ２−ＤＡＦ並びにＶＥＧＦ−Ｈｅｒ２−ＤＡＦ−ｘＡｎｇ２は、一過性の表現にあり、通常の抗体の範囲内の収量を与えた（表４）。
【０１４９】
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【０１５０】
実施例３：
ＫｉＨ Ｈｅｒ２−ＶＥＧＦ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦの分析
更に、一つの抗体フォーマット内に２つの二重親和性抗体を組み合わせることが可能である。このアプローチで、２つのＦａアームと通常のＩｇＧ主鎖を持つ四重特異性抗体を生成することが本質的に可能である。ノブ・イントゥー・ホール技術が重鎖を区別するために使用され、Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３二重親和性Ｆａｂアームは、重鎖と軽鎖の間のＣＨ１−ＣＬ交換によって交差された（配列番号：１、１２、１４、２０）。Ｋ：Ｈの固定比率１．２：１が重鎖のために、１：１の比率が軽鎖のために使用された。還元ゲルにおいて、二つの異なる軽鎖を区別することができる（約２５ｋＤａ）。重鎖は、還元条件下でおよそ５０ｋＤａに一緒に移動する。非還元条件下で、僅かな染みが完全長抗体のバンドで観察可能であり（約１５０ｋＤａ）、第二の顕著なバンドが約１１０ｋＤａで見える（図８ａ、ｂ）。分析用ＨＰＬＣは均質なバンドを明らかにしたので、これは不完全なジスルフィド架橋形成を示すかもしれない。さらに、これは、事前のサイズ排除精製を伴わない、上清の免疫沈降であったことは注目すべきである。生の発現値の平均は、二つの独立した生物学的発現において、５９．７及び１１１．５μｇ／ｍｌであった。
【０１５１】
実施例４：
ＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２の分析
別の例で、我々は、ＥｒｂＢファミリーのメンバーＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）及びＨＥＲ３（Ｈｅｒ３）に結合することができる三重特異性抗体を生成した。ノブ・イントゥー・ホール技術が重鎖を区別するために使用され、Ｈｅｒ２のＦａｂアームは、重鎖と軽鎖の間のＣＨ１−ＣＬ交換によって交差された（配列番号：４、９、１３、１８）。Ｋ：Ｈの固定比率１．２：１が重鎖のために、１：１の比率が軽鎖のために使用された。還元ゲルにおいて、二つの異なる軽鎖を区別することができる（約２５ｋＤａ）。二つの独立した発現における、この抗体の発現収量の平均は、９１．７及び９９．１μｇ／ｍｌであった。
【０１５２】
実施例５：
ＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２による増殖アッセイ
類表皮癌細胞株Ａ４３１は、高レベルのＥＧＦＲを発現するだけでなく、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３もＡ４３１類表皮癌細胞で発現される。とりわけＥＧＦＲの阻害は、この細胞株における増殖に影響を与えることが知られている。三重特異性抗体ＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２（配列番号：４、９、１３、１８）のとりわけＥＧＦＲの部分の有効性を評価するため、治療用抗体又はコントロールＩｇＧ（ＪＩ、＃０１５−０００−００３）抗体の存在下又は非存在下で、この細胞株を用いて増殖アッセイを行った。９６ウェル細胞培養プレートのウェルあたり４０００細胞を、１％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充した１００μＬの増殖培地中に播種した。翌日、治療用抗体を含む２０μＬの低血清（１％ＦＣＳ）培地を加え、３０μｇ／ｍｌの抗体の最終濃度を得た。細胞を更に５日間増殖させ、その際にＡＴＰ放出アッセイ（Cell Titer Glow, Promega）を行った。発光はプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）で記録した。三重特異性抗体は、この細胞株で５３．６＋／−２．７％の顕著な抗増殖効果を有していた（図１０）。
実施例６：
ＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２による増殖アッセイ
乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１７５ ＶＩＩは、ＥｒｂＢファミリーメンバーのＨｅｒ２及びＨＥＲ３を発現し、自己分泌ヘレグリンループを保有する。三重特異性抗体のＨｅｒ２及びＨｅｒ３部分の有効性を評価するために、この細胞株を用いて増殖アッセイを行った。９６ウェル細胞培養プレートのウェルあたりに２００００細胞を、１０％のＦＣＳを補充した１００μＬの増殖培地中に播種した。翌日、治療用抗体を含む完全増殖培地２０μＬが、最終抗体濃度が希釈系列に匹敵する方法で添加された（図１１）。更に５日間の継続増殖の後に、ＡＴＰ放出アッセイを実施した（Cell Titer Glow, Promega）。発光はプレートリーダー（Tecan）で記録した。三重特異性抗体は用量依存的に増殖を阻害し、５０μｇ／ｍＬで９２．１＋／−０．３％の最大阻害に達した。
【０１５３】
実施例７（図１２ａ、ｂ、ｃも参照）：
ＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２の結合反応速度論
三重特異性抗体ＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２（配列番号：４、９、１３、及び１８）又はそれぞれの親抗体の結合反応速度論は表面プラズモン共鳴によって測定した。この目的のために、ＨＥＫ−２９３Ｆで生成されたＥｒｂＢ受容体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を精製し、親和性及び同時結合特性を決定するための分析物として使用した。親和性データは、Ｈｅｒ１ ＥＣＤ、Ｈｅｒ２ ＥＣＤ及びＨｅｒ３ ＥＣＤへの結合において、ＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２及び親のＤＡＦ及びペルツズマブで同等の速度論的プロファイルを示した（表５）。
【０１５４】
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【０１５５】
次に我々は、抗原は、受容体外部ドメインの連続した注入によって同時に拘束されることができるかどうかという問に対処した。要約すると、我々はＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２が、Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ２又はＨｅｒ３／Ｈｅｒ２の抗原の組合せに同時に結合できることを実証する。逆の順序で注入された場合、Ｈｅｒ２とＨｅｒ３との組み合わせにおいて、ＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２はまた、抗原注入の順序から独立して両方の抗原に結合することができることが示された。ペルツズマブは、予想通り、Ｈｅｒ２のみに結合する。ＤＡＦ抗体は、予想通り、Ｈｅｒ１又はＨｅｒ３の何れかに結合する（図１２ａ、ｂ、ｃ）。
【０１５６】
実施例８（図１３も参照）：
Ａ４３１類表皮癌細胞におけるＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２抗体による腫瘍細胞の死滅及びＡＤＣＣの誘導。
三重特異性ＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２抗体（配列番号：４、９、１３、及び１８）のＡＤＣＣのプロセスと腫瘍細胞死滅をイメージングするため、Ａ４３１類表皮癌細胞を、ガラスカバーガラス上で増殖させ、緑色の生存率マーカー（ＣＭＦＤＡ）で標識した。次に、赤の膜染色（ＰＫＨ２６）で染色したＮＫ９２ナチュラルキラー細胞が、ＨｅｒのメンバーであるＨｅｒ１、Ｈｅｒ２及びＨｅｒ３に対して指向される抗体ＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２と共に腫瘍細胞上に添加された。イメージングは、ＣＯ２と湿度を供給する加熱されたステージ上で、６３×／１．２ＮＡ水浸レンズを使用するＬＥＩＣＡ ＳＰ５ｘ白色光レーザー共焦点顕微鏡で実施した。抗体／ＮＫ細胞を添加して数分以内に、キラー細胞が腫瘍を攻撃し始める。これは、ＦｃΥＲＩＩＩ（ＣＤ１６）受容体を介して腫瘍結合した抗体と相互作用することによって媒介される。緑色蛍光（＝生存率マーカー）の喪失によって証明されるように、腫瘍細胞の急速な溶解をもたらす細胞溶解性顆粒（パーフォリン及びグランザイムを放出する）がいかにして腫瘍細胞表面に向けて動員されるかをはっきりと見ることができる。注目すべきは、抗体の三重結合形態によって媒介される激しく急速な攻撃である。２．５時間以内に、実質的に全ての腫瘍塊が除去されている。結果を図１３に示す。
【０１５７】
実施例９
糖操作型、アフコシル化された三重特異性ＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２抗体（フコースの量は５％と６５％との間）及び１μｇ／ｍｌのｓｐｅｃＬｙｓｉｓ％によるＫＰＬ−４又はＡ４３１腫瘍細胞のインビトロのＡＤＣＣ
抗体ＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２（配列番号：４、９、１３、１８）の糖操作型、アフコシル化バージョンが、ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞において、幾つかのプラスミド、あるものは抗体発現のため、一つは融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現のため（ＧｎＴ−ＩＩＩ発現ベクター）、そして一つはマンノシダーゼＩＩ発現のため（ゴルジマンノシダーゼＩＩ発現ベクター）による、４（抗体ベクター）：１（ＧｎＴ−ＩＩＩ発現ベクター）：１（ゴルジマンノシダーゼＩＩ発現ベクター）の比率での同時トランスフェクションにより調製される。
【０１５８】
完全抗体の重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列は、哺乳動物発現ベクター（重鎖及び軽鎖について１つずつ）に、ＭＰＳＶプロモーターの制御下及び合成ポリＡ部位の上流にサブクローニングされ、各ベクターは、ＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を有した。抗体は、リン酸カルシウムトランスフェクション法を使用して抗体の重鎖及び軽鎖の発現ベクターを用いて、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞又はＣＨＯ細胞を同時トランスフェクトすることによって産生された。指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞は、リン酸カルシウム法によりトランスフェクトされる。糖鎖操作抗体の産生において、細胞は、幾つかのプラスミド、あるものは抗体発現のため、一つは融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現のため（ＧｎＴ−ＩＩＩ発現ベクター）、そして一つはマンノシダーゼＩＩ発現のため（ゴルジマンノシダーゼＩＩ発現ベクター）による、４（抗体ベクター）：１（ＧｎＴ−ＩＩＩ発現ベクター）：１（ゴルジマンノシダーゼＩＩ発現ベクター）の比率での同時トランスフェクションにより調製される。細胞を、１０％のＦＣＳを補填したＤＭＥＭ培養培地を使用してＴフラスコ中で付着単層培養として増殖させ、それらが５０及び８０％集密になったときにトランスフェクトした。Ｔ１５０フラスコのトランスフェクションでは、ＦＣＳ（最終１０％ｖ／ｖで）を補填した２５ｍｌのＤＭＥＭ培養培地に形質移入の２４時間前に１５００万細胞を播種し、細胞を５％ＣＯ２大気のインキュベーター中に３７°Ｃで一晩置く。産生される全ての抗体において、ＤＮＡ、ＣａＣｌ２及び水の溶液は、１８８μｇの総プラスミドベクターＤＮＡ（幾つかのプラスミド、あるものは抗体発現のため、一つは融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現のため（ＧｎＴ−ＩＩＩ発現ベクター）、そして一つはマンノシダーゼＩＩ発現のため（ゴルジマンノシダーゼＩＩ発現ベクター）を４（抗体ベクター）：１（ＧｎＴ−ＩＩＩ発現ベクター）：１（ゴルジマンノシダーゼＩＩ発現ベクター）の比率で）、最終容積が９３８μｌまでの水及び９３８μｌの１ＭのＣａＣｌ２溶液を混合することによって調製されるこの溶液に、１８７６μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ７．０５）を加え、直ぐに１０秒間混合し、室温で２０秒間静置した。懸濁液を、２％のＦＣＳを補充した４６ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、既存の培地の代わりに２つのＴ１５０フラスコに分けた。
【０１５９】
細胞を約１７から２０時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、ついで培地を２５ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳに置換する。条件培養培地を２１０×ｇでの１５分の遠心分離によってトランスフェクションから７日後に収集し、溶液を滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度のアジ化ナトリウムを加え、４℃に維持した。
【０１６０】
分泌されたアフコシル化抗体は、精製され、抗体のＦｃ領域に結合したオリゴ糖を例えばＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより分析した（例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載される）。この分析のためにオリゴ糖が酵素的にＰＮＧアーゼＦ消化によって抗体から放出され、抗体はＰＶＤＦ膜上に固定化されるか又は溶液中のどちらかである。放出オリゴ糖を含む得られた消化溶液は、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析のために直接調製されるか、又はＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析のためのサンプル調製に先立ち、ＥｎｄｏＨグリコシダーゼで更に消化される。Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの分析した量は６５−５％の間にある。
【０１６１】
標的細胞（ＫＰＬ４乳癌細胞又はＡ４３１類表皮癌細胞、ＲＰＭＩ１６４０＋２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン＋１０％ＦＣＳで培養）は指数増殖期にトリプシン／ＥＤＴＡ（Gibco # 25300-054）により収集される。洗浄工程及び細胞数と生存率をチェックした後に、必要なアリコートは、カルセインを用いて、細胞インキュベーター中で３７℃で３０分間標識される（Invitrogen #C3100MP；１バイアルを、５ｍｌの培地に、５ミオ細胞に対して５０μｌのＤＭＳＯに再懸濁させた）。その後、ＡＩＭ−Ｖ培地で細胞を３回洗浄し、細胞数及び生存率をチェックし、細胞数を０．３Ｍｉｏ／ｍｌに調節した。
【０１６２】
その間に、エフェクター細胞としてのＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を、製造者のプロトコル（洗浄工程を４００ｇで１×、３５０ｇで２×、各１０分）に従い、密度勾配遠心分離（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７、Sigma # H8889）により調製した。細胞数及び生存率をチェックし、細胞数を１５Ｍｉｏ／ｍｌに調節した。
【０１６３】
１００μｌのカルセイン染色された標的細胞を、丸底９６ウェルプレートに配し、５０μｌに希釈し、アフコシル化抗体（Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、Ｍａｂ ２０５．１０．３、以下を参照）を添加し、５０μｌのエフェクター細胞を添加した。いくつかの実施態様では、標的細胞をＲｅｄｉｍｕｎｅ（登録商標）ＮＦリキッド（ZLB Behring）と、１０ｍｇ／ｍｌのＲｅｄｉｍｕｎｅ濃度で混合した。
【０１６４】
抗体なしに標的とエフェクター細胞を同時培養することにより決定される自発的な溶解がコントロールとなり、最大溶解が、標的細胞のみの１％のトリトン−Ｘ−１００溶解により決定される。プレートを、加湿された細胞インキュベーターにおいて３７℃で４時間インキュベートした。
【０１６５】
標的細胞の死滅を、製造者の使用説明書に従い、細胞傷害検出キット（ＬＤＨ検出キット、Roche # 1 644 793）を使用し、ダメージを受けた細胞から放出されるＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）を測定することにより評価した。簡単に述べると、各ウェルからの１００μｌの上清を、透明な平底の９６ウェルプレートにおいて、キットからの１００μｌの基質と混合した。基質の色調反応のＶｍａｘ値を、少なくとも１０分、４９０ｎｍにてＥＬＩＳＡリーダーで測定した。特定の抗体媒介性死滅のパーセンテージを、次のようにして算出した：（（Ａ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００、ここでＡは特定の抗体濃度におけるＶｍａｘの平均であり、ＳＲは自然放出のＶｍａｘの平均であり、ＭＲは最大放出のＶｍａｘの平均である。
【０１６６】
付加的な読み取りとして、インタクトな標的細胞のカルセイン保持を、ホウ酸塩バッファー（５ｍＭのホウ酸ナトリウム＋０．１％のトリトン）において、残存している標的細胞を溶解させ、蛍光プレートリーダーにおけるカルセイン蛍光を測定することによって評価した。
【０１６７】
実施例１０：
インビボ抗腫瘍効果
抗体ＫｉＨ Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ ＤＡＦ−ｘＨｅｒ２（配列番号４、９、１３及び１８）のインビボでの抗腫瘍効果は、ＳＣＩＤベージュ又はヌードマウスに移植した様々な腫瘍起源（例えば、肺癌、ＳＣＣＨＮ、乳房及び膵臓癌）の細胞及びフラグメントベースモデルで検出することができる。一例は、Ａ４３１類表皮癌細胞異種移植モデルである。
【０１６８】
Ａ４３１類表皮癌細胞は、細胞表面上でＨＥＲ１及びまたＨＥＲ２及びＨＥＲ３を発現する。Ａ４３１細胞は、対数増殖期に標準的な細胞培養条件下で維持される。１０００万個の細胞がＳＣＩＤベージュマウスに移植される。腫瘍が確立され、１００−１５０ｍｍ３のサイズに達した後に治療が開始される。マウスは、例えば、２０ｍｇ／ｋｇの抗体／マウスの負荷用量、その後、１０ｍｇ／ｋｇの抗体／マウスを毎週一回により治療される。腫瘍体積は週に２回測定され、平行して動物の体重がモニターされる。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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