(57)【要約】【解決手段】本発明は、異種細胞培養物からニューロンを直接同定して精製する方法及びシステムを開示する。様々な細胞接着分子の発現を多能性幹細胞で調べた。これらの分子の一又は複数の発現の変化は、神経細胞に関係付けられていない系統からの細胞の進行と相関している。これらの分子に対する一又は複数の抗体とＣＤ２００に特異的な抗体とを用いることにより、集団細胞からニューロンを同定して単離することが可能になる。
2015517665.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物中のニューロンを識別する方法であって、
ＣＤ２００に特異的に結合する第１抗体、及びＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１及びＣＤ３４０からなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合する少なくとも第２抗体と、前記細胞培養物を接触させるステップ、並びに
ＣＤ２００+ 細胞であって、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１及びＣＤ３４０の一又は複数の低発現〜陰性発現を示す細胞を検出するステップ
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記細胞培養物は、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、神経堤細胞、線維芽細胞、神経幹細胞又はこれらの任意の組合せを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞培養物は、細胞の異種集団から得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞培養物は、神経前駆細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞培養物は、神経上皮を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＤ２００+ 細胞は、ＣＤ２００med 及び２００highであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞培養物は、神経幹細胞濃縮ステップを経ていないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞を検出するステップを、フローサイトメータを用いて行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１抗体及び前記第２抗体は、蛍光体との直接結合により検出可能且つ識別可能に標識されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光体は、フルオレセインイソチオシアネート、アロフィコシアニン、ペリジニンクロロフィルタンパク質、フィコエリトリン、シアニン５及びＢＶ４２１からなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤ２００++細胞であって、ＨＬＡ−Ａ- 、ＨＬＡ−Ｂ- 、ＨＬＡ−Ｃ- 、ＣＤ４９ｆ- 、ＣＤ１５１- 又はＣＤ３４０- の一若しくは複数である細胞の集団を濃縮するステップを更に有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
細胞培養物中のニューロンの内容物を濃縮する方法であって、
神経上皮を含む細胞培養物に神経分化を生じさせることにより、ニューロン及びグリアを形成するステップ、
ＣＤ２００に特異的に結合する第１抗体、及びＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１及びＣＤ３４０からなるタンパク質の群から選択されるタンパク質に特異的に結合する少なくとも第２抗体と、前記細胞培養物を接触させるステップ、並びに
ＣＤ２００+ であって、ＨＬＡ−Ａ- 、ＨＬＡ−Ｂ- 、ＨＬＡ−Ｃ- 、ＣＤ４９ｆ- 、ＣＤ１５１- 又はＣＤ３４０- の一若しくは複数である細胞をフローサイトメトリーにより選択するステップ
を有することを特徴とする方法。
【請求項１３】
ニューロンの形成を、神経上皮から直接生じさせることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＤ２００+ である前記細胞は、２００low ではないことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞培養物は、神経幹細胞濃縮ステップを経ていないことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１抗体及び前記第２抗体は、蛍光体との直接結合により検出可能且つ識別可能に標識されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記蛍光体は、フルオレセインイソチオシアネート、アロフィコシアニン、ペリジニンクロロフィルタンパク質、フィコエリトリン、ＢＶ４２１及びシアニン５からなる群から選択されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ニューロンの内容物の濃縮は、
ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１及びＣＤ３４０からなる群の少なくとも１つに選択的であって、磁場に引き付けられ得る又は反発し得る表面に結合している抗体と、細胞培養物からの前記細胞を接触させることにより、抗体−細胞複合体を形成するステップ、及び
前記細胞に磁場を印加することにより、前記細胞培養物から前記抗体−細胞複合体を選択的に分離するステップ
を有することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１抗体及び前記第２抗体は、蛍光標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
４倍を超えて濃縮することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２抗体は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ又はＨＬＡ−Ｃ- に結合し、
第２細胞培養物をＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１又はＣＤ３４０を含む第３抗体と接触させるステップ、及び
ＣＤ２００+ であって、ＨＬＡ−Ａ- 、ＨＬＡ−Ｂ- 又はＨＬＡ−Ｃ- であり、更にＣＤ４９ｆ- 、ＣＤ１５１- 又はＣＤ３４０- である細胞を選択するステップ
を更に有することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
細胞培養物からニューロンを単離又は濃縮するためのシステムであって、
ＣＤ２００に特異的に結合する第１抗体、
ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１及びＣＤ３４０からなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合する第２抗体、
ニューロンを含む細胞培養物、並びに
ＣＤ２００+ であって、ＨＬＡ−Ａ- 、ＨＬＡ−Ｂ- 、ＨＬＡ−Ｃ- 、ＣＤ４９ｆ- 、ＣＤ１５１- 又はＣＤ３４０- の一若しくは複数である細胞を選別するように構成されたフローサイトメータ
を含むことを特徴とするシステム。
【請求項２３】
前記第１抗体及び前記第２抗体は、蛍光標識された抗体であることを特徴とする請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記第２抗体は、フェラスメタル材料で標識されることを特徴とする請求項２２に記載のシステム。
【請求項２５】
細胞の集団内のニューロンを同定するためのシステムであって、
ＣＤ２００に特異的に結合する第１抗体、
ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃからなるタンパク質の群から選択されるタンパク質に特異的に結合する第２抗体、
ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１及びＣＤ３４０からなるタンパク質の群から選択されるタンパク質に特異的に結合する第３抗体、
細胞サンプル、並びに
ＣＤ２００+ であって、ＨＬＡ−Ａ- 、ＨＬＡ−Ｂ- 又はＨＬＡ−Ｃ- の一若しくは複数であり、更にＣＤ４９ｆ- 、ＣＤ１５１- 又はＣＤ３４０- の一若しくは複数である細胞を同定するように構成されたフローサイトメータ
を含むことを特徴とするシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニューロンを単離するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の両方は、体細胞に分化する能力を有する。従って、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣの分化により、治療法の開発、薬剤スクリーニング、疾患モデリング、及び組織移植の機会が提供される。しかし、特定の細胞型の純粋な集団を作製するための明確な条件の開発が、これらの目標を達成する上で重要である。自然分化、化学的誘発又はマウス間質フィーダ細胞を用いて細胞培養物を誘導することにより、神経幹細胞（ＮＳＣ）を形成する複数の神経誘導方法がある。ＮＳＣは、手作業で単離されて、多継代のための単層培養物として増殖され得る。原則として、これらの細胞は、ニューロン及びグリアに分化して、インビトロアッセイ及びインビボアッセイのための無限の細胞供給源を提供し得る。残念なことに、これらの方法の頑健性は、単離されたＮＳＣのバッチ毎のばらつきによって妨げられる。更に、ＮＳＣの分化によって、ニューロン、グリア及び未分化細胞の可変性且つ不均質な培養物が得られることが多く、これらは、インビトロアッセイ、移植及びミクロアッセイなど、精製された細胞集団又は確定された細胞集団を要する下流での適用を妨げる恐れがある。この問題に対する一解決法は、異なる細胞型を確定して精製するために、ＮＳＣ、グリア及びニューロンに発現する細胞表面マーカを同定することである。
【０００３】
複数の種に由来する胚性成体組織からの、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による様々な神経細胞型の同定及び単離を目的とする、細胞表面マーカ発現が説明されている。糖タンパク質ＣＤ１３３は、様々な組織における既知の幹／前駆細胞マーカであり、ヒト脳からＮＳＣを単離するのに用いられている。（発生段階特異的胎児性抗原−１又はＬｅＸとしても知られている）炭水化物部分ＣＤ１５は、マウスの脳室下帯（ＳＶＺ）からＮＳＣ及び放射状グリアを単離するのに用いられている。Ｇタンパク質共役型受容体であるＣＤ１８４をＣＤ１５と組み合わせて用いることにより、マウス胚前脳・成体ＳＶＺからＮＳＣを単離するのに成功している。ＣＤ２４は、ＦＡＣＳによりマウス脳からＮＳＣを単離するのに用いられている細胞接着分子である。更に、神経幹細胞マーカの遺伝子プロモータ−レポータを用いて、神経幹細胞及び神経前駆細胞がヒト脳組織から単離されている。
【０００４】
同様に、ＦＡＣＳによるｈＥＳＣ由来の神経細胞の同定及び単離も進歩している。Ｐｒｕｓｚａｋらは、神経系統に分化するｈＥＳＣの培養物を、細胞表面マーカを用いて様々な発生段階でアッセイし得ること、及び、ＣＤ５６に対する抗体（ＮＣＡＭ）を用いてニューロンを濃縮できることを報告している（「Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」，２５，p.２２５７−２２６８，２００７年）。ＣＤ１８４+ ／ＣＤ３２６- マーカが、分化するｈＥＳＣからニューロンへの分化が可能な神経前駆細胞を精製するために用いられている。更に、Ｐｅｈらは、ＣＤ１３３、ＣＤ１５及びＧＣＴＭ−２の発現に基づく、ｈＥＳＣの神経誘導培養物からのニューロスフェア形成ＮＳＣの濃縮を報告している（「Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ」，１８，p.２６９−２８２，２００９年）。同様の手法を用いて、Ｇｏｌｅｂｉｅｗｓｋａらは、分化するｈＥＳＣからＮＳＣを単離するために、ＣＤ１３３+ ／ＣＤ４５- ／ＣＤ３４０- を使用している（「Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」，２７，p.１２９８−１３０８，２００９年）。Ｐｒｕｓｚａｋらは、ｈＥＳＣの神経誘導培養物から、ＮＳＣ並びに神経芽細胞及びニューロンの混合集団などの個別の細胞集団を単離するための表面マーカコードとして、ＣＤ２４、ＣＤ１５及びＣＤ２９の有用性を実証している（２００９年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yuan等著，「Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells」，PLoS One，第６巻，第３号，2011年３月，No. e17540，p.１−16
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
参照として本明細書に組み込まれるＹｕａｎ等著，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１１年３月，２，６（３）：ｅ１７５４０には、ＦＡＣＳにより多能性幹細胞の神経分化培養物から神経幹細胞（ＮＳＣ）を単離するための、細胞表面特性に基づく方法が記載されている。このような方法は、ｈＥＳＣ及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の神経誘導培養物から、ＣＤ１８４+ ／ＣＤ２７１- ／ＣＤ４４- ／ＣＤ２４+ であるＮＳＣの集団を単離するのに用いられた。細胞表面特性に基づく方法は、複数の通常の神経誘導培養系からＮＳＣを濃縮するのにも用いられた。Ｙｕａｎらは更に、単離したＮＳＣ培養物の単離した培養物からニューロン及びグリアを単離するための細胞表面特性を同定した。次に、ＣＤ１８４+ ／ＣＤ４４- ／ＣＤ１５ＬＯＷ／ＣＤ２４+ であるニューロンの集団とＣＤ１８４+ ／ＣＤ４４+ であるグリアの集団とを、分化するＮＳＣの単離培養物から精製した。ＢＤ  Ｓｔｅｍｆｌｏｗ（商標）Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）は、ヒト多能性幹細胞由来の神経幹細胞（ＮＳＣ）の単離、又は分化ＮＳＣからのニューロン及びグリア細胞の単離を可能にするように設計された試薬キットである。この方法は、手作業での単離のような従来の方法とは対照的に、ＮＳＣ単離間のばらつきの量を低減するが、培養物中のニューロンの単離及び濃縮の前にＮＳＣの誘導及び単離を必要とする。異種細胞集団由来のニューロンの同定及び単離を可能にし、更に、ニューロンの同定、単離及び濃縮に必要なステップを減らす方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、細胞表面特性、並びに細胞の異種集団からニューロンを単離又は濃縮するための方法及びシステムを提供する。これらの方法は、新たな１組の細胞表面タンパク質（細胞表面特性）の発現パターンからニューロンを同定するのに用いられ得る。本発明の方法は、分化する多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）、例えば、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及びヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、又はｈＰＳＣ由来の神経幹細胞の細胞培養物、並びにニューロン（誘導ニューロン）に分化形質転換するように遺伝的に形質導入された線維芽細胞培養物などの様々なタイプの細胞培養物からのニューロンの単離又は濃縮を可能にする。
【０００８】
ある実施形態では、ニューロン及びグリアを含む細胞培養物中でニューロンを識別する方法が提供されており、この方法は、ＣＤ２００に特異的に結合する第１抗体、並びにＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される第２タンパク質に特異的に結合する少なくとも第２抗体と、細胞培養物を接触させるステップと、ＣＤ２００+ 細胞であって、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１及びＣＤ３４０の一又は複数の低発現〜陰性発現を示す細胞を検出するステップとを有する。ある実施形態では、細胞培養物は、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、線維芽細胞培養物、神経幹細胞、神経上皮、神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｒｏｓｅｔｔｅ）、神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）又は神経堤細胞を含む。ある実施形態では、細胞培養物は、細胞の異種混合物から得られる。ＣＤ２００+ 細胞である細胞は、ＣＤ２００med 及びＣＤ２００highであってもよいが、ＣＤ２００low ではない。ある実施形態では、細胞培養物は、神経幹細胞濃縮ステップを経ていない神経前駆細胞を含む。細胞を検出するステップを、フローサイトメータを用いて行ってもよい。ある実施形態では、第１抗体及び第２抗体は、フルオレセインイソチオシアネート、アロフィコシアニン、ペリジニンクロロフィルタンパク質、フィコエリトリン、シアニン５又はＢＶ４２１などの蛍光体との直接結合により検出可能且つ識別可能に標識される。ニューロンは、ＣＤ２００med 又はＣＤ２００high細胞であって、更にＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ- 、ＣＤ４９ｆ- 、ＣＤ１５１- 又はＣＤ３４０- である細胞の集団を単離又は濃縮することにより単離又は濃縮され得る。ある実施形態では、細胞培養物中のニューロンの内容物を濃縮する方法は、細胞培養物中で神経分化を生じさせることにより、ニューロン及びグリアを形成するステップと、ＣＤ２００に特異的に結合する第１抗体、並びにＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される第２タンパク質に特異的に結合する少なくとも第２抗体と細胞培養物を接触させるステップと、ＣＤ２００+ であって、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１及びＣＤ３４０の一若しくは複数について陰性又は低レベルである細胞をフローサイトメトリーにより選択するステップとを有する。ある実施形態では、ニューロンの形成を、神経前駆細胞から直接生じさせる。ある実施形態では、ＣＤ２００+ である細胞は、ＣＤ２００low ではない。ある実施形態では、細胞培養物は、神経幹細胞濃縮ステップを経ていない。第１抗体及び第２抗体は、フルオレセインイソチオシアネート、アロフィコシアニン、ペリジニンクロロフィルタンパク質、フィコエリトリン、ＢＶ４２１又はシアニン５などの蛍光体との直接結合により、検出可能且つ識別可能に標識されてもよい。ある実施形態では、ニューロンの内容物の濃縮は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１及びＣＤ３４０からなる群の少なくとも１��に選択的であって、磁場に引き付けられ得る又は反発し得る表面に結合している抗体と、細胞培養物からの細胞を接触させることにより、抗体−細胞複合体を形成するステップと、細胞に磁場を印加することにより細胞培養物から抗体−細胞複合体を選択的に分離するステップとを有する。４倍を超えて濃縮してもよい。
【０００９】
ある実施形態では、細胞培養物を、ＣＤ２００に結合する第１抗体、及びＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ又はＨＬＡ−Ｃに結合する第２抗体（すなわち、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ抗体）と接触させ、この方法は、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１又はＣＤ３４０を含む第３の抗体と細胞培養物を接触させるステップと、ＣＤ２００+ であって、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ- であり、更にＣＤ４９ｆ- 、ＣＤ１５１- 又はＣＤ３４０- である細胞を選択するステップとを更に有する。ある実施形態では、多能性幹細胞由来のニューロンを単離又は濃縮するためのシステムは、ＣＤ２００に特異的に結合する第１抗体、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０及びこれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合する少なくとも第２抗体、ニューロンを含む細胞培養物、並びにＣＤ２００+ であって、更にＨＬＡ−Ａ- 、ＨＬＡ−Ｂ- 、ＨＬＡ−Ｃ- 、ＣＤ４９ｆ- 、ＣＤ１５１- 及びＣＤ３４０- の内の一若しくは複数である細胞を選別するように構成されたフローサイトメータを含む。第１抗体及び第２抗体は、蛍光標識された抗体であってよい。ある実施形態では、第２抗体は、磁気標識された抗体であってもよい。
【００１０】
一実施形態では、神経分化培養物中のニューロンの同定に用いる細胞表面マーカ特性は、ＣＤ２００++又はＣＤ２００highなどのＣＤ２００の高発現であり、これらは本明細書において、ＣＤ２００+ 細胞であって、平均より高いＣＤ２００シグナルを有する細胞を示すのに置換え可能に用いられる。他の実施形態では、細胞はＣＤ２００（ＣＤ２００low ）細胞の低発現の排除により選択されてもよい。ある実施形態では、ニューロンの同定に用いられる細胞表面マーカ特性は、ＨＬＡ−Ａ- ／ＨＬＡ−Ｂ- ／ＨＬＡ−Ｃ- ／ＣＤ１５１- ／ＣＤ４９ｆ- ／ＣＤ３４０- ／ＣＤ２００+ である。ある実施形態では、細胞の集団内のニューロンを同定するためのシステムは、ＣＤ２００に特異的に結合する第１抗体、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃを含むタンパク質の群の少なくとも１つに特異的に結合する第２抗体、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１及びＣＤ３４０を含むタンパク質の群の少なくとも１つに特異的に結合する第３抗体、細胞サンプル、並びにＣＤ２００+ であって、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ- であり、更にＣＤ４９ｆ- 、ＣＤ１５１- 又はＣＤ３４０- である細胞を同定するように構成されたフローサイトメータを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】グリア及びニューロンを濃縮するための従来の細胞選別方法を示す図である。
【図２】本発明の実施形態におけるステップを示すフローチャートである。
【図３】神経幹細胞（ＮＳＣ）を濃縮するための中間ステップを含まない、ニューロンを濃縮するための細胞選別方法である本発明の実施形態を示す図である。
【図４】分化する多能性幹細胞培養物由来のニューロンを単離するための細胞表面特性を同定すべく用いられる免疫表現型スクリーニング手法を示すフローチャートである。
【図５Ａ】図４のスクリーニング手法のスクリーンで同定された細胞内マーカ及び候補細胞表面マーカの蛍光プロファイルを示す図である。
【図５Ｂ】図４のスクリーニング手法のスクリーンで同定された細胞内マーカ及び候補細胞表面マーカの蛍光プロファイルを示す図である。
【図６】細胞を選別するためにニューロンを同定すべく用いられるゲーティング手法を示す図である。
【図７】選別前の神経分化培養物の画像であり、細胞培養物の不均質性を示す図である。
【図８】本発明の細胞−表面マーカ特性を用いて異種細胞培養物から選別されたニューロンの画像を示す図である。
【図９Ａ】ニューロンマーカβＩＩＩ−チューブリン及びＮＳＣマーカＮｅｓｔｉｎについて染色した選別ニューロンの画像であり、細胞が高度に純粋であることを示す図である。
【図９Ｂ】選別前及び選別後のニューロン培養物の半定量的流れ解析を示す図である。
【図１０Ａ】細胞を培養して分化する処理の概要を示す図である。
【図１０Ｂ】分化ニューロンのフローサイトメトリー解析中に作成された２Ｄプロットを示す図である。
【図１０Ｃ】分化ニューロンのフローサイトメトリー解析中に作成されたヒストグラムを示す図である。
【図１０Ｄ】分化ニューロンのフローサイトメトリー解析中に作成された２Ｄプロットを示す図である。
【図１１Ａ】分化ニューロンのフローサイトメトリー解析中に作成された２Ｄプロットを示す図である。
【図１１Ｂ】蛍光活性化細胞選別前の分化ニューロンのフローサイトメトリー解析中に作成された２Ｄプロットを示す図である。
【図１１Ｃ】蛍光活性化細胞選別後の分化ニューロンのフローサイトメトリー解析中に作成された２Ｄプロットを示す図である。
【図１１Ｄ】蛍光活性化細胞選別後の分化ニューロンのフローサイトメトリー解析中に作成された２Ｄプロットを示す図である。
【図１２Ａ】磁気枯渇前の分化ニューロンのフローサイトメトリー解析中に作成された画像を示す図である。
【図１２Ｂ】磁気枯渇後の分化ニューロンのフローサイトメトリー解析中に作成された画像を示す図である。
【図１２Ｃ】分化ニューロンのフローサイトメトリー解析中に作成された２Ｄプロットを示す図である。
【図１２Ｄ】磁気枯渇前の分化ニューロンのフローサイトメトリー解析中に作成された２Ｄプロットを示す図である。
【図１２Ｅ】磁気枯渇後の分化ニューロンのフローサイトメトリー解析中に作成された２Ｄプロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者らは、神経前駆細胞を含む培養物などの任意の異種細胞集団から直接得られるニューロンを単離して精製する方法及びシステムを開示する。神経前駆細胞は、人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、又は線維芽細胞培養物などの幹細胞集団から得られる。
【００１３】
本方法及び本システムは、多能性幹細胞、神経前駆細胞、上皮及びニューロンで調べた様々な細胞接着分子の発現プロファイルに基づくものである。検査した分子の内、ＣＤ２００の正の選択と組み合わせてＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３４０又はＣＤ１５１の一若しくは複数の負の選択を行うことにより、細胞培養物からニューロンの集団を同定、単離又は濃縮できることを明らかにする。一又は複数のこれらの分子の発現における特定の変化は、神経系統に関係付けられていない細胞から神経系統に関係付けられている細胞への細胞の進行と相関している可能性がある。ある実施形態では、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３４０又はＣＤ１５１のこれらの分子に対する一若しくは複数の抗体とＣＤ２００に対する抗体との併用により、多能性幹細胞の神経分化培養物からのニューロンの同定、単離及び／又は濃縮を達成する。ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃに対する抗体は、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃと総称される３つのタンパク質すべてに選択的に結合する単一の抗体であってよい。
【００１４】
当技術分野では公知であり、本発明を理解して実施する上で有用な定義及び他の情報（プロトコル及び試薬など）は、全体を通して引用される参考文献、特に、Ｙｕａｎ等著，「Ｃｅｌｌ−Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ｇｌｉａ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｎｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．」，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１１年３月，２，６（３）：ｅ１７５４０に記載されており、この参考文献では、天然のヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の細胞表面マーカに対する抗体を用いたＦＡＣＳ及び画像に基づく免疫表現型解析によって、単離された神経幹細胞からグリア及びニューロンを単離するための有望な細胞表面特性が同定された。
【００１５】
図１は、Ｙｕａｎ等著の参考文献に記載されている幹細胞からニューロンを誘導して単離するための従来技術の方法を概略的に示す。天然のヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の集団を培養して処理し、ＳＭＡＤ阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２、Ｎｏｇｇｉｎ）を用いた処理により神経前駆細胞を誘導する。次いで、増殖培地中の神経幹細胞（ＮＳＣ）を同定して単離するための１組のマーカを用い、手作業又はフローサイトメトリーのいずれかにより神経幹細胞を上記の細胞から単離する。選別したＮＳＣを多くの継代に亘って増殖させ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及びグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含むニューロン分化培地による処理後、ニューロン及びグリアの混合培養物に分化させた。その後、ＣＤ１８４+ ／ＣＤ４４- ／ＣＤ１５low ／ＣＤ２４+ であるニューロンの集団とＣＤ１８４+ ／ＣＤ４４+ であるグリアの集団とを、単離したＮＳＣ由来の培養物から精製した。
【００１６】
図２は、神経幹細胞の精製又は単離無しに、ニューロンの形成に関係付けられている神経前駆細胞をフローサイトメトリー法を用いて同定して単離することができる本発明の実施形態におけるステップを示す。本発明の態様は、神経分化が可能な細胞（例えば、多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）又は線維芽細胞培養物）を培養するステップ１００を有する。ステップ１１０では、当技術分野では公知の任意の手段、例えばＳＭＡＤ阻害剤による処理、間質由来誘導活性又は無血清胚様体法により、これらの細胞を誘導して、神経前駆細胞などの神経上皮を形成することができる。上記の方法又は他の方法により形成された神経上皮を更に処理することにより、ニューロン、グリア、アストロサイトなどへの更なる分化を生じさせることもできる。この異種混合物からニューロン分化を生じさせるステップ１２０は、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ及びアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む培地中での培養を含んでもよい。ステップ１３０では、ニューロンなどの細胞は、ＣＤ２００、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０又はこれらの任意の組合せなどの選択したマーカに対する抗体との接触により同定及び／又は単離され得る。ステップ１４０では、フローサイトメトリーアッセイにより、細胞を選択又は単離することができる。
【００１７】
本方法で有用な生物学的マーカは、一般に、神経分化の誘発に応答する神経発達系の状態についての情報を与えるマーカであり、異種細胞集団由来の細胞培養物に用いられるのが有利である。神経発達経路の状態についての情報を与える生物学的マーカの例として、限定するものではないが、ＣＤ２００、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１及びＣＤ３４０などの細胞表面タンパク質が挙げられる。生物学的マーカには、前述したタンパク質マーカをコードするか、又はタンパク質マーカを示すＲＮＡ分子及びＤＮＡ分子が更に含まれる。ある実施形態では、細胞培養物中のニューロンは、例えば、ＣＤ２００に特異的に結合する蛍光標識抗体との接触により、サンプル中のＣＤ２００を検出することによって同定され得る。特定の実施形態では、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１及びＣＤ３４０並びにこれらの組合せ、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及び／又はＨＬＡ−Ｃを含む群からの一若しくは複数のマーカの存在に加えて、ＣＤ２００の存在を測定する。ある実施形態では、ＣＤ２００+ 、及びＨＬＡ−Ａ- 、ＨＬＡ−Ｂ- 、ＨＬＡ−Ｃ- 、ＣＤ４９ｆ- 、ＣＤ１５１- 又はＣＤ３４０- の一若しくは複数として分類される細胞に基づき、ニューロンを選択する。ある実施形態では、ＣＤ２００+ であって、ＨＬＡ−Ａ- 、ＨＬＡ−Ｂ- 、ＨＬＡ−Ｃ- 、ＣＤ４９ｆ- 、ＣＤ１５１- 又はＣＤ３４０- の１つ若しくは複数である細胞を選択する。ここで、ＣＤ２００+ は、ＣＤ２００low である細胞を排除し、ＣＤ２００+ 及びＣＤ２００highとして分類される細胞である。ある実施形態では、ＣＤ２００に特異的に結合する第１抗体、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃからなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合する少なくとも第２抗体、並びにＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１及びＣＤ３４０からなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合する少なくとも第３抗体と細胞培養物を接触させるステップと、ＣＤ２００+ であって、ＨＬＡ−Ａ- 、ＨＬＡ−Ｂ- 、ＨＬＡ−Ｃ- の一若しくは複数であり、更にＣＤ４９ｆ- 、ＣＤ１５１- 又はＣＤ３４０- である細胞を検出するステップとにより、ニューロンを同定することができる。また、ＣＤ２００+ であって、更にＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１又はＣＤ３４０の一若しくは複数の検出可能であるが低発現を示す細胞を選択することによってニューロンを検出することも可能である。
【００１８】
ある態様では、対象とする細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ２００、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０など）に特異的なプローブ（例えば、抗体）で染色した細胞の染色強度を検出することによって、細胞表面上の一又は複数のタンパク質の発現レベルにより、サンプル中の細胞を同定する（例えば、ある態様では、サンプル中のＣＤ２００+ 細胞を同定する）。当業者であれば、前述した発現レベルは、細胞表面上のマーカタンパク質の検出可能な量を表すことが理解される。染色に対し陰性の（例えば、ＣＤ２００- ）細胞（マーカ特異的試薬の結合レベルは、イソタイプ整合対照と検出可能な差はない）は、微量のマーカをまだ発現する可能性があり、及び／又はタンパク質の存在によってではなく、微量の染色強度（例えば、「バックグラウンド」染色）が存在する可能性がある。当技術分野では、特定のマーカについて細胞を「陽性」（＋）又は「陰性」（−）と呼ぶのが一般的であるが、実際の発現レベルは量的形質である。細胞表面上の分子の数は、数ｌｏｇ変動し得るが、それでもやはり「陽性」として特性決定され得る。例えば、本明細書で用いる「ＣＤ２００+ 」という用語は、ＣＤ２００med 及びＣＤ２００highを含み得るが、ＣＤ２００low 又はＣＤ２００- を含まない。
【００１９】
細胞の染色強度は、レーザが（特定の試薬、例えば抗体が結合する細胞表面マーカの量に比例する）蛍光色素の量的レベルを検出するフローサイトメトリーによりモニターされ得る。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）は、特定の試薬との結合強度、並びに細胞サイズ及び光散乱などの他のパラメータに基づいて細胞集団を分離するのに用いられ得る。染色の絶対値は、特定の蛍光色素及び試薬製剤に応じて変動し得るが、データは対照に対して正規化され得る。
【００２０】
分布を対照に対して正規化するために、各細胞は、特定の染色強度を有するデータ点として記録される。これらのデータ点は、尺度の単位が任意の染色強度である対数目盛に従い表示されてもよい。一例において、サンプル内で最も明るい染色細胞は、非染色（すなわち、「陰性」）細胞より４ｌｏｇ高い強度となり得る。このように表示される場合、最も高いｌｏｇの染色強度の細胞が「陽性」（「高レベル」）であり、最も低い強度の細胞が「陰性」又は「低レベル」であることは明らかである。「低レベル」の陽性染色細胞は、イソタイプ整合対照より明るい染色レベルを有するが、集団に通常認められる明るい染色細胞ほどの強度ではない。最低の強度から最高の強度まで、細胞は、「陰性」、「低レベル」、「中レベル」（すなわち中間）又は「高レベル」であり得る。「中レベル」又は「高レベル」の細胞は、「陽性」とみなされる。ある態様では、「高レベル」を示すために「＋＋」を使用し、「中レベル」を示すために「＋」を使用するが、いずれの強度も「陽性」であるとみなされる。
【００２１】
別の対照は、表面上のマーカの規定密度及び／又は強度を有する一又は複数の基質、例えば、一又は複数の強度レベルについての陽性対照を提供する調製ビーズ又は細胞株を使用してもよい。
【００２２】
生物学的マーカの測定は、従来の任意の技術により行われてもよい。生物学的マーカ分子の測定としては、例えば、マーカ分子の存在、濃度、発現レベル、又はマーカ分子に関連するその他の任意の値の測定が含まれ得る。紫外分光法、可視分光法及び赤外分光法など、生物学的マーカ分子を測定するための様々な分光技術が利用可能である。マーカ分子の測定を補助するために、蛍光標識、放射性標識、又は他の容易に識別可能且つ定量可能な標識を用いてもよい。細胞結合したマーカの発現レベルは、フローサイトメトリー技術により測定されてもよい。複数の種に由来する胎児性組織及び成体組織から、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などのイメージング技術により多くの神経細胞型を同定して単離するための細胞表面マーカ発現が説明されている。好ましい実施形態では、本発明の方法を用いて細胞を同定して選別するために、フローサイトメトリーを用いてよい。フローサイトメトリーは、細胞などの微小な粒子を流体流に懸濁させ、各細胞がレーザビームを通過する際に各細胞が発する光を捕捉することにより、これらの粒子を計数して検査する技術である。「白血球分化抗原（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」（ＣＤ）分子と称されることが多い細胞表面分子をフローサイトメトリーに利用して、細胞集団を特性決定することもできる。例えば、蛍光活性化細胞選別において、（蛍光体で標識された）診断用抗体を使用するが、この診断用抗体は、対象の細胞集団に存在して対象の細胞集団に特有の表面分子（例えば、ＣＤ分子）に結合する。その後、（抗体に結合している）蛍光体をレーザビームで活性化し、蛍光シグナルをフローサイトメトリーにより検出する。このようにして、蛍光標識した抗体を用いて、特定のＣＤ分子（又は１組のＣＤ分子）を呈する細胞を検出して選別することができる。上記の検出方法又はその他の検出方法で使用する蛍光体の例としては、限定するものではないが、フルオレセインイソチオシアネート、アロフィコシアニン、ペリジニンクロロフィルタンパク質、フィコエリトリン及びシアニン５、ＢＶ４２１、又は抗体に共有結合し得る他の任意の蛍光体が挙げられる。本発明のシステムは、フローサイトメータ、ＣＤ２００に特異的な検出可能に標識した抗体、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ又はＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３４０又はＣＤ１５１の１つ若しくは任意の組合せに特異的な検出可能に標識した一又は複数の抗体、並びにニューロンを含む細胞培養物を含んでよく、このため、上記のタンパク質の一又は複数を検出できる。本明細書に記載されている方法及びシステムに使用されるフローサイトメータは、蛍光標識抗体からの低レベル、中レベル及び高レベルのシグナルを検出するように構成され得る。シグナルの強度と共に用いられる特定の抗体によって、異種細胞集団を含んでいる可能性がある細胞培養物由来のニューロンを同定するための特定の認識パターンが提供され得る。
【００２３】
本発明の細胞表面マーカは、既知のタンパク質ファミリーに関連している。糖タンパク質ＣＤ２００は、多様な細胞型によって発現する膜タンパク質である。ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ（置換え可能なＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）を構成するＨＬＡタンパク質分子である。ＭＨＣは、全ての脊椎動物において大きな遺伝子ファミリーによりコードされる細胞表面分子である。ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに対する抗体は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ又はＨＬＡ−Ｃのいずれかに結合する抗体である。ＭＨＣ分子は、免疫細胞である白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ（ＷＢＣ））とも称される白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）と、他の白血球又は体細胞との相互作用を媒介する。ＣＤ４９ｆに対する抗体は、インテグリンα鎖α６であるＩＴＧＡ６タンパク質産物に結合する。インテグリンは、α鎖及びβ細胞から構成される一体の細胞表面タンパク質である。ＣＤ３４０に対する抗体は、受容体チロシンキナーゼの上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーのメンバーに結合する。ＣＤ１５１に対する抗体は、インテグリン及び他の膜貫通４スーパーファミリータンパク質と複合体を形成することがわかっている細胞表面糖タンパク質に結合する。
【００２４】
図３は、Ｙａｕｎらと同様の方法で、ＳＦＥＢによるＳＭＡＤ阻害により、天然ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の集団を誘導して神経前駆細胞を形成する本発明の実施形態を概略的に示す。ある実施形態では、神経前駆細胞、又はニューロンになる細胞を含み得る任意の細胞培養物を本発明の方法及びシステムで処理することができる。本発明の方法又はシステムに組み合わせられ得る細胞型としては、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、線維芽細胞培養物、神経前駆細胞、ニューロン及びグリアがある。誘導用の細胞が、図３のように神経前駆細胞である場合、ニューロン又はグリアの形成などの神経分化を生じさせる培地（例えば、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ及び／又はｄｂｃＡＭＰ）で細胞を処理してもよい。培地は、Ｎ２若しくはＢ２７などの試薬、又は神経分化を生じさせるための当技術分野で公知の他の任意の試薬若しくはプロトコルを含んでもよい。本発明の方法及びシステムでは、神経幹細胞の精製、単離又は分離の中間ステップを必要としない。分化を生じさせる処理の後、ＣＤ２００に選択的に結合する抗体と細胞培養物を接触させることにより、ニューロンを同定及び／又は単離することができる。ある実施形態では、ＣＤ２００に選択的に結合する抗体、及びＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０又はこれらの任意の組合せに選択的に結合する一若しくは複数の抗体と細胞を接触させることにより、ニューロンを選択することができる。ある実施形態では、上記の抗体を蛍光体との直接結合により検出可能且つ識別可能に標識する。同定は、蛍光シグナルを識別することができる任意のイメージング技術（例えば、フローサイトメトリー）により行われてもよい。ニューロンの同定及び／又は単離を確実にするために、神経分化を生じさせた後の任意の時点、例えば２０日後、２５日後、３０日後若しくは４０日後に、細胞培養物を本発明のシステムで処理してよい。本方法は、ＮＳＣを単離するステップを省くことができるため、細胞培養物内のニューロンが濃縮した集団を得るのに要する時間を短縮することが有利である。
【００２５】
ニューロンが濃縮した細胞培養物を調製するために、本発明の方法及びシステムを従来の細胞分離技術と組み合わせて用いることも可能である。濃縮は、ＣＤ２００+ 若しくはＣＤ２００highである細胞又はＣＤ２００med 及びＣＤ２００highである細胞の選択（すなわち、ＣＤ２００low である細胞の排除）に基づいて行われ得る。ある実施形態では、選択基準は、ＣＤ２００+ 又はＣＤ２００++であって、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ- 、ＣＤ４９ｆ- 、ＣＤ１５１- 又はＣＤ３４０- である細胞集団、例えば、ＣＤ２００++／ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ- である細胞集団の選択に基づくものでよい。選択は、フローサイトメトリーによる細胞選別などの任意の手段により行われてもよい。ある実施形態では、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ+ 、ＣＤ４９ｆ+ 、ＣＤ１５１+ 又はＣＤ３４０+ である細胞を細胞サンプルから磁気により選別することができる。磁気選択は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０又はこれらの任意の組合せに選択的であって、磁場に引き付けられ得る又は反発し得る表面、例えば磁気ビーズなどに結合している抗体と細胞培養物を接触させることを含み得る。ある実施形態では、本発明のマーカに特異的な抗体は、フェラスメタル材料などの磁気ビーズを更に含む。磁気ビーズは超常磁性微粒子であるが、あらゆるタイプの磁気ビーズを用いることができることが好ましい。磁気ビーズは、任意の手段により抗体に結合してもよい。磁気ビーズは、抗体の対象のマーカとの結合前に結合してもよいし、又は細胞−抗体複合体の形成後に結合してもよい。ある態様では、磁気ビーズは複合体の形成前に結合する。細胞−抗体複合体が磁気ビーズを有し、抗体がＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０又はこれらの任意の組合せに特異的である実施形態では、磁気ビーズを有する細胞−抗体複合体が磁場により実質的に保持されて、ニューロンが磁場により実質的に保持されないように、ニューロンを含む細胞培養物からの上記の複合体の分離は、細胞培養物を磁場と接触させるステップを有することが好ましい。磁場の一例は、磁化スチールウール又はフローサイトメトリーにおける磁場であってよい。次に、ＣＤ２００に選択的な抗体を用いることにより、残りの細胞を選択的に選別することができる。本発明は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０又はこれらの任意の組合せについて陽性である細胞を実質的に含まない第１細胞集団と、ニューロンが濃縮した集団を有する第２細胞集団とに細胞培養物を分離する実施形態を更に含む。続いて、更なる濃縮のために、第２細胞集団をＣＤ２００+ 細胞又はＣＤ２００++細胞について選択してもよい。本発明の方法は、約２倍、４倍、６倍又は１０倍の濃縮値を与える。
【００２６】
本発明のシステムは、ニューロン又は神経前駆細胞を含む細胞培養物、ＣＤ２００に特異的に結合する抗体、及びＣＤ２００+ である細胞を選別するように構成されたフローサイトメータを含み得る。本発明のシステムは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１及びＣＤ３４０からなるタンパク質の群から選択される少なくともタンパク質に特異的に結合する第２抗体を更に含んでよく、本システムは、これらのタンパク質の２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、並びに６つ全部（例えば、システムはこれら６つの異なるタンパク質の各々について特異的な抗体を含む）に特異的な抗体を含んでもよく、フローサイトメータは、ＣＤ２００+ であって、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ- 、ＣＤ４９ｆ- 、ＣＤ１５１- 又はＣＤ３４０- の一若しくは複数である細胞を選別するように構成されている。ある実施形態では、本発明のシステムは、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１及びＣＤ３４０からなるタンパク質の群から選択される少なくともタンパク質に特異的に結合する第３抗体を更に含んでよく、フローサイトメータは、ＣＤ２００+ であってＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ- であり、更にＣＤ４９ｆ- 、ＣＤ１５１- 又はＣＤ３４０- の一若しくは複数である細胞を選別するように構成されている。本発明の他のシステムは、ｈＰＳＣの神経分化培養物及び線維芽細胞由来の誘導ニューロン培養物から神経細胞型を単離又は濃縮するための試薬、キット及びアッセイを含む。本発明の方法及びシステムは、患者の細胞由来の神経細胞型の解析を目的とする診断ツールのために用いられてもよい。神経細胞型を濃縮して、神経前駆細胞、ｈＰＳＣ又は患者の細胞などの異種細胞培養組成物由来の神経細胞型について薬剤（又は小分子）候補をスクリーニングする。以下の非制限的実施例により、本発明を更に詳しく説明する。
【００２７】
［実施例］
実施例１
Ｈ９ｈＥＳＣの培養物をＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から得て増殖させた後、細胞を以下のようにして分化させた。
【００２８】
１日目：胚様体（ＥＢ）をディスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ）での処理により作製し、１０μｍのＹ−２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤）、２．５μｍのドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）及び１０μｍのＳＢ４３１５２を含有するノックアウト血清代替（ＫＯＳＲ）培地（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＷｉＣｅｌｌ  ｈＥＳＣ培地ｗ／ｏ  ｂＦＧＦ）内に置いた。低接着６ウェルプレートを用いて、ウェル当たり４ｍｌの培地を添加した。
【００２９】
２日目：Ｒｏｃｋ阻害剤を除去した後、２．５μｍのドルソモルフィン及び１０μｍのＳＢ４３１５２を含有するＫＯＳＲ培地に細胞を移した。
【００３０】
４／５日目：ＩＴＳ培地［Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２ｗ／Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））＋１Ｘ  ＩＴＳ（ＢＤ（商標））］＋２．５μｍのドルソモルフィン＋１０μｍのＳＢ４３１５２を含むマトリゲルコートプレート上でＥＢを平板培養した。４ｍｌのＥＢをウェル内で平板培養し、１０ｍｌのＩＴＳ培地を１０ｃｍのコートプレートに添加した。２〜３日毎にＥＢを供給した。
【００３１】
１０／１１日目：細胞培地をＩＴＳに交換した。
【００３２】
１５／１８+ 日目：培地をＩＴＳ培地＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦに２４〜４８時間に亘って交換した。細胞死及びニューロン分化を観察した。
【００３３】
１８／２０日目：Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＥＺＰａｓｓａｇｅ（商標）通過ツールを用いて培養物を正方形に切断した。正方形の培養物を擦り取り、ペレット化した。１０ｃｍ片の１つの培養物を、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２ｗ／Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）培地を含みポリオルニチン及びラミニンでコーティングした２つのＴ１５０フラスコ内で平板培養した。培地は、１μｍのｄｂｃＡＭＰ＋１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ＋１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦを更に含有した。
【００３４】
４０日目：培養物を選別した後解析した。図４は、使用するニューロン単離免疫表現型発見ワークフローを示す。神経誘導培養物は、表面マーカを選別するためにＢＤ  Ｌｙｏｐｌａｔｅ（商標）ヒト細胞表面マーカスクリーニングパネルで染色し、その後、細胞内マーカを用いてニューロンを選別するためにＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＰＡＸ６及びＤＣＸで染色した。最後に、細胞の異種集団からニューロンの新たな細胞表面マーカを決定するために、細胞表面マーカ発現集団を解析した。２Ｄプロット（図５Ａ）は、ニューロンとして同定されたＤＣＸ+ Ｓｏｘ１- 及びＤＣＸ+ Ｓｏｘ１+ の集団を示す。ニューロンを単離／濃縮することができるように、分化培養物を解析した。図５Ｂに示す４つのヒストグラムは、他の集団と比較して、ニューロンに特異的に発現する、スクリーンで同定された様々なマーカのサンプリングを示す。
【００３５】
約２０ｐｓｉの１００μｍノズルを用いてニューロンを選別した。細胞を基礎培地中で染色し、基礎培地中で収集した。図６は、神経誘導培養物からニューロンを選別するために用いるゲーティング手法を示す。ニューロンゲートを以下のように同定した。左上側から時計回りに、Ｐ１- 細胞が光散乱に基づきニューロンとして同定され、Ｐ２+ 単細胞及びＰ３- 単細胞が光散乱に基づきニューロンとして同定され、Ｐ４細胞が、ＣＤ２００及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの発現に基づきニューロンとして同定された。更に、ニューロンゲートＰ４（ＣＤ２００++／ＨＬＡ−Ａ- 、ＨＬＡ−Ｂ- 、ＨＬＡ−Ｃ- ）における細胞のＣＤ３４０及びＣＤ１８４の発現を示す２つの追加プロットが示されている。
【００３６】
図７及び８は、選別前の光学顕微鏡画像及び選別から２日後の光学顕微鏡画像を夫々示す。選別後の画像で画像化したニューロンは、外観から質的に極めて純粋であることが分かる。図７に認められる丸いドーナッツ様構造は、ＮＳＣを含む神経上皮である。神経コロニーから発生するニューロン突起が認められる。
【００３７】
図９Ａは、選別から７日後の、選別されたＣＤ２００++／ＨＬＡ−Ａ- 、ＨＬＡ−Ｂ- 、ＨＬＡ−Ｃ- の蛍光顕微鏡画像である。細胞を選別した後、約５０，０００細胞／ウェルで９６ウェルイメージングプレートで平板培養し、１Ｘ  Ｎ２及び１Ｘ  Ｂ２７を含有するＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２ｗ／Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）培地中で７日間培養した。ニューロンはβチューブリン染色により同定され、混入している「非ニューロン」はＮｅｓｔｉｎ染色により同定され、全ての細胞核はＤＡＰＩ染色により同定される。
【００３８】
図９Ｂに示す２Ｄプロットは、細胞選別の直前及び細胞選別の直後の神経細胞培養物の解析を表す。左上のゲートは、Ｎｅｓｔｉｎ++／ＤＣＸ- 染色によって認められる「非ニューロン」から構成されている。右上のゲートは、Ｎｅｓｔｉｎ+ ／ＤＣＸ+ 染色により認められる「ニューロン」から構成されている。これらのプロットから、選別されたニューロン培養物が約６０％純粋であることがわかる。
【００３９】
実施例２
図１０Ａは、細胞を培養して分化する処理の概要を示す。Ｈ９ｈＥＳＣをＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から得た細胞から培養して増殖させ、その後、以下のようにして分化させた。
【００４０】
７日目：胚様体（ＥＢ）をディスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ）で作製し、１０μｍのＹ−２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤）、２．５μｍのドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）及び１０μｍのＳＢ４３１５２を含有するＫＯＳＲ培地（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＷｉＣｅｌｌ  ｈＥＳＣ培地ｗ／ｏ  ｂＦＧＦ）内に置いた。低接着６ウェルプレートを用いて、ウェル当たり４ｍｌの培地を添加した。
【００４１】
８日目：Ｒｏｃｋ阻害剤を除去した後、２．５μｍのドルソモルフィン及び１０μｍのＳＢ４３１５２を含有するＫＯＳＲ培地に細胞を移した。
【００４２】
１０／１１日目：ＩＴＳ培地［Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２ｗ／Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １０５６５５０１８）＋１Ｘ  ＩＴＳ（ＢＤカタログ番号３５４３５１）］＋２．５μｍのドルソモルフィン＋１０μｍのＳＢ４３１５２を含むマトリゲルコートプレート上でＥＢを平板培養した。４ｍｌのＥＢをウェル中で平板培養し、１０ｍｌのＩＴＳ培地を１０ｃｍのコートプレートに添加した。２〜３日毎にＥＢを供給した。
【００４３】
１１／１５日目：細胞培地をＩＴＳに交換した。
【００４４】
２０／２３日目：培地をＩＴＳ培地＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦに２４〜４８時間に亘って交換した。細胞死及びニューロン分化を観察した。
【００４５】
２３／２５日目：Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＥＺＰａｓｓａｇｅ（商標）継代用ツールを用いて培養物を正方形に切断した。１μｍのｄｂｃＡＭＰ＋１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ＋１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦと共に１Ｘ  Ｎ２及び１Ｘ  Ｂ２７を含有するＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２ｗ／Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）培地を含みポリオルニチン及びラミニンでコーティングした２つのＴ１５０フラス内で、１０ｃｍ片の１つの培養物を平板培養した。
【００４６】
４５日目：培養物を選別した後、解析した。
【００４７】
神経分化の細胞内対照を提供するために、神経誘導培養物をＤＣＸ及びＳｏｘ１で染色した。図１０Ｂは、ゲーティング手法を説明する２Ｄプロットを示す。ＤＣＸ+ Ｓｏｘ１- 及びＤＣＸ+ Ｓｏｘ１+ の集団をニューロンとして確定した。スクリーンで同定したマーカのオーバーレイヒストグラムを図１０Ｃに示す。ＣＤ２００は、ニューロンの正のマーカとして同定された。ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０及びＣＤ４９ｆは、培地中の混入細胞の負のマーカとして同定された。これらのマーカの発現差異はニューロンの単離を可能にし得る。選別するためのマーカの組合せを同定するためのＣＤ２００と、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ又はＣＤ３４０若しくはＣＤ４９ｆとの共染色の結果を図１０Ｄの２Ｄプロットに示す。
【００４８】
図１１Ａ〜Ｄは、神経誘導培養物からニューロンを選別するのに用いられるゲーティング解析の結果を示す。図１１Ａに示したプロットは、単細胞が光散乱に基づいて解析されることを確実にするようにダブレット除去の原因を明らかにするために、光散乱に基づいた細胞の選別に用いられる散乱識別を示す。ＣＤ２００++／ＨＬＡ−Ａ- ／ＨＬＡ−Ｂ- ／ＨＬＡ−Ｃ- のプロットを用いて、ＣＤ２００及びＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ又はＨＬＡ−Ｃの発現に基づきニューロンを同定し、ＤＣＸ／ＳＯＸ２／Ｋｉ６７解析を用いて確認する。図１１Ｂは、選別前の神経培養物の流れ解析を示す。ニューロンは、ＤＣＸの発現、並びにＳｏｘ２及びＫｉ−６７の発現の欠如（ＤＣＸ+ ／Ｓｏｘ２- ／ｋｉ６７- ）により同定される。図１１Ｃは、神経培養物の細胞選別後のＣＤ２００++／ＨＬＡ−Ａ- ／ＨＬＡ−Ｂ- ／ＨＬＡ−Ｃ- 細胞の流れ解析を示す。ニューロンは、ＤＣＸの発現、並びにＳｏｘ２及びＫｉ- ６７の発現の欠如（ＤＣＸ+ ／Ｓｏｘ２- ／ｋｉ６７- ）により同定される。図１１Ｄは、神経培養物の細胞選別後のＣＤ２００++／ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ+ 細胞の流れ解析を示す。ニューロンは、ＤＣＸの発現、並びにＳｏｘ２及びＫｉ６７の発現の欠如（ＤＣＸ+ ／Ｓｏｘ２- ／ｋｉ６７- ）により同定される。
【００４９】
実施例３
ニューロンの形成を前述のように生じさせた。細胞培養物をＰＥ  ＣＤ３４０、ＰＥ  ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ及びＰＥ  ＣＤ４９ｆの抗体と接触させた。次に、細胞に磁気枯渇を施した。細胞培養物に用いたＰＥ結合抗体に結合するために、ＰＥに結合する抗体と結合した磁気ナノ粒子を用いた。次に、細胞溶液を磁場の隣りに置くことにより、磁気ナノ粒子を細胞溶液から分離した。続いて、フローサイトメトリー及び画像解析により、濃縮して枯渇した画分を解析した。磁気枯渇前（図１２Ａ）及び磁気枯渇後（図１２Ｂ）の神経培養物の画像解析を図１２Ａ及び１２Ｂに示す。神経培養物を分離して結合抗体で染色した後、９６ウェルイメージングプレートに塗布して、７日間培養した。ニューロンは、Ｔｕｊ１の発現、並びにＮｅｓｔｉｎ及びｋｉ６７の発現の欠如（Ｔｕｊ１+ ／Ｎｅｓｔｉｎ- ／ｋｉ６７- ）により同定される。核をＤＡＰＩで染色する。枯渇画分の流れ解析（図１２Ｃ）は、ＤＣＸの発現、並びにＳｏｘ２及びＫｉ−６７の発現の欠如により同定されるニューロン集団を示す。枯渇前（図１２Ｄ）及び枯渇後（図１２Ｅ）のサンプルの２Ｄプロットを示す。ニューロンは、ＤＣＸの発現、並びにＳｏｘ２及びＫｉ６７の発現の欠如（ＤＣＸ+ ／Ｓｏｘ２- ／ｋｉ６７- ）により同定される。データ解析から、ＰＥ  ＣＤ３４０、ＰＥ  ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ及びＰＥ  ＣＤ４９ｆに特異的な磁気標識抗体と共にニューロンを含む細胞培養物中での細胞の枯渇により、細胞培養物中でニューロンが濃縮されることがわかる。
【００５０】
本明細書に述べられている全ての特許、特許公報及びその他の公開された参考文献は、個々が、具体的に且つ個別に参照によって本明細書に組み込まれると示されているかのように参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。参考文献本発明の好ましい例示的な実施形態を記載しているが、本発明から逸脱することなく、様々な変更及び調整を本発明になし得ることは当業者にとって明らかである。また、本発明の真の趣旨及び範囲に含まれるこのような変更及び調整の全てが添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。
【００５１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119 条(e) に従って、２０１２年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／６４７，９５１号明細書の優先権を主張しており、この出願の開示内容は、参照として本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図６】
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【国際調査報告】
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