(57)【要約】  本発明は、肝細胞癌（ＨＣＣ）管理の技術分野、より詳しくは、ＨＣＣ悪性度の予測および関連の治療決定に関する。本発明は、遺伝子ＴＡＦ９、ＲＡＭＰ３、ＨＮ１、ＫＲＴ１９、およびＲＡＮを含んでなる発現プロファイルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定および分析に基づくＨＣＣ悪性度の新規な予測方法を提供する。本発明はまた、ＨＣＣ悪性度の予測のためのキット、および対象ＨＣＣ悪性度の事前予測に基づく被験体におけるＨＣＣの治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＣに罹患している被験体において前記被験体の肝臓サンプルからの全生存期間および／または無再発生存期間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ予後の方法であって、
ａ）前記肝臓サンプルからｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて下記の５つの遺伝子：ＴＡＦ９、ＲＡＭＰ３、ＨＮ１、ＫＲＴ１９、およびＲＡＮを含んでなるまたはからなる発現プロファイルを決定すること；および
ｂ）少なくとも１つの参照ＨＣＣ肝臓サンプルで較正されたアルゴリズムを用い、前記発現プロファイルに基づいて全生存期間および／または無再発生存期間を予測すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記発現プロファイルが１以上の内部対照遺伝子をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
全生存期間および無再発生存期間を予測するために使用される１または複数のアルゴリズムを較正するために使用される参照サンプルが、下記のもの：
ｉ）全生存期間予測目的では、腫瘍切除後少なくとも５年生存した患者に由来する少なくとも１つの（好ましくは、複数の）ＨＣＣサンプルおよび腫瘍切除後３年以内に死亡した患者由来の少なくとも１つの（好ましくは、複数の）ＨＣＣサンプル；
ｉｉ）無再発生存期間予測目的では、腫瘍切除後少なくとも４年間再発しなかった患者に由来する少なくとも１つの（好ましくは、複数の）ＨＣＣサンプルおよび腫瘍切除後２年以内に再発した患者に由来する少なくとも１つの（好ましくは、複数の）ＨＣＣサンプル
である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記肝臓サンプルが肝臓生検または部分的もしくは全肝臓腫瘍外科的切除物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記発現プロファイルが核酸レベルで決定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記発現プロファイルが定量的ＰＣＲを用いて決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
全生存期間および／または無再発生存期間を予測するために使用されるアルゴリズムが、ＰＬＳ（部分最小二乗）回帰アルゴリズム、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズム、線形回帰またはその派生アルゴリズム（ＧＬＭと略される一般化線形モデル、ロジスティック回帰を含む）、線形判別分析（ＬＤＡ、対角線形判別分析（ＤＬＤＡ）を含む）アルゴリズム、対角二次判別分析（ＤＱＤＡ）アルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ｋ−ＮＮ（近傍）アルゴリズム、およびＰＡＭ（マイクロアレイ予測分析）アルゴリズムから選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
全生存期間および／または無再発生存期間を予測するために使用されるアルゴリズムが、下式：
【数１】
2015535176.tif 000045
［式中、
・Ｎは、発現プロファイルの遺伝子の数を表し、
・ｘｉ、１≦ｉ≦Ｎ、発現プロファイルに含まれるＮ個の遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された発現値を表し、
・ｍｉおよびｗｉ、１≦ｉ≦Ｎは、少なくとも１つの参照サンプルで較正された固定パラメーターであり、かつ、
・サンプルＸは、スコア（サンプルＸ）が閾値Ｔより低い場合には良好な全生存期間および／または無再発生存期間予測を有し、スコア（サンプルＸ）が閾値Ｔより高い場合には不良な全生存期間および／または無再発生存期間予測を有すると見なされ、ここで、Ｔは、少なくとも１つの参照サンプルで較正されたものである］
を用いた線形回帰である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記発現プロファイルが定量的ＰＣＲを用いて決定され、発現値がΔΔＣｔ値であり、Ｎが５であり、閾値Ｔが０であり、かつ、ｍｉおよびｗｉ、１≦ｉ≦５が下記の値：
【表１】
2015535176.tif 000046
を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）予後に関連する少なくとも１つの他の変数を決定すること、および
ｂ）少なくとも１つの参照ＨＣＣ肝臓サンプルで較正されたアルゴリズムを用い、発現プロファイルと前記１または複数の他の変数に基づいて全生存期間および／または無再発生存期間を予測することをさらに含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記他の変数が、Ｇ１−Ｇ６分類、ＢＣＬＣ(Barcelona Clinic Liver Cancer)、ＣＬＩＰ(Cancer of the Liver Italian Program)、ＪＩＳ(Japan Integrated Staging)、ＴＮＭ(Tumour-Node-Metastasis)臨床病期分類、ミランおよびメトロチケットカリキュレーター判定基準、硬変の存在、術前ＡＦＰ（αフェトタンパク質）血漿レベル、エドモンソングレード、および微小血管侵入から選択され、好ましくは、前記他の変数がＢＣＬＣ臨床病期分類および肝臓サンプルの微小血管侵入である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
多くて６５の異なる遺伝子を含んでなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなるキットであって、前記発現プロファイルが下記の５つの遺伝子：ＴＡＦ９、ＲＡＭＰ３、ＨＮ１、ＫＲＴ１９、およびＲＡＮを含んでなるまたはからなる、キット。
【請求項１３】
前記発現プロファイルが１以上の内部対照遺伝子をさらに含んでなる、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
ａ）特異的な増幅プライマーおよび／もしくはプローブ、または
ｂ）核酸マイクロアレイ
を含んでなる、請求項１２または請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の予後方法を用いて不良な予後を示した被験体におけるＨＣＣの治療に使用するための、治療用細胞傷害性化学療法薬または標的治療薬。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の予後方法によって不良な全生存期間および／または無再発生存期間予測を示した被験体におけるＨＣＣの治療を意図した薬剤の調製のための、治療用細胞傷害性化学療法薬または標的治療薬の使用。
【請求項１７】
被験体の肝臓サンプルからその被験体の全生存期間または無再発生存期間を予測するためのシステム１であって、
ａ）肝臓サンプルを受容し、下記の５つの遺伝子：ＴＡＦ９、ＲＡＭＰ３、ＨＮ１、ＫＲＴ１９、およびＲＡＮを含んでなるまたはからなる発現プロファイルに関する発現レベル情報を決定するように構成された決定モジュール２；
ｂ）前記決定モジュールからの発現レベル情報を保存するように構成された保存デバイス３；
ｃ）前記保存デバイスに保存された発現レベル情報を参照データと比較し、比較結果を提供するように適合された比較モジュール４、ここで、前記比較結果は良好または不良な予後の指標となる；および
ｄ）任意選択の、ユーザー向けに前記分類結果に部分的に基づくコンテント６を表示するための表示モジュール５、ここで、前記コンテントは良好または不良な予後の指標となる信号である、
を含んでなる、システム。
【請求項１８】
前記発現プロファイルが１以上の内部対照遺伝子をさらに含んでなる、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
発現プロファイルデータの解釈に関する請求項１〜１１のいずれか一項に記載の予後方法のコンピューターステップへの実装のためのソフトウエアモジュールを定義するためのコンピューター可読命令が記録されたコンピューター可読媒体７。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞癌（ＨＣＣ）管理の技術分野、より詳しくは、ＨＣＣ悪性度の予測および関連の治療決定に関する。本発明は、遺伝子ＴＡＦ９、ＲＡＭＰ３、ＨＮ１、ＫＲＴ１９、およびＲＡＮを含んでなる発現プロファイルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定および分析に基づくＨＣＣ悪性度の新規な予測方法を提供する。本発明はまた、ＨＣＣ悪性度の予測のためのキット、および対象ＨＣＣ悪性度の事前予測に基づく被験体におけるＨＣＣの治療方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞腫瘍は、悪性（肝細胞癌またはＨＣＣ）および良性（肝細胞腺腫またはＨＣＡ、限局性結節性過形成またはＦＮＨ、および再生性大結節性）腫瘍を含む不均質な腫瘍群から構成される。
【０００３】
ＨＣＣは、アジアおよびアフリカにおいて大きな健康問題となっており、主として慢性Ｂ型肝炎感染の割合が高いことで説明されるが、西洋諸国でもその罹患率は絶えず上昇しており、９０％を超えるＨＣＣが肝硬変へと進行する。西洋諸国では、基礎にある肝疾患の主因は、慢性Ｂ型およびＣ型肝炎ならびにアルコール摂取である。代謝症候群の結果としての非アルコール性脂肪性肝炎もまた、増えてきている慢性肝疾患およびＨＣＣの原因である。稀ではあるが（症例の１０％前後）、ＨＣＣは非硬変性肝へと進行する。
【０００４】
外科的切除は、ＨＣＣの重要な治癒的治療に相当するが、高い再発率（５年で５０％〜７０％）および腫瘍関連死（５年で３０％〜５０％）により問題がある(Ishizawa T Gastroenterology 2008)。
【０００５】
従って、ＨＣＣ患者の全生存期間および早期腫瘍再発を推定または予測することを可能とする簡単なツールの必要がある。
【０００６】
実際に、患者のＨＣＣの悪性度によって、前記患者の臨床管理は異なる。
・低悪性度（すなわち、全生存期間および早期再発の良好な予測）の場合には、経過観察だけが推奨され得る；
・対照的に、高悪性度（すなわち、全生存期間および早期再発の不良な予測）の場合には、細胞傷害性化学療法（ドキソルビシンまたはゲムシタビンおよびオキサリプラチンの併用）または標的療法（ソラフェニブ）を用いた補助療法が推奨され得る。
【０００７】
このような状況にあっては、被験体の肝臓サンプルの分子プロファイリングに基づく簡単な予後ツールが極めて有用となる。
【０００８】
ＥＰＣＡＭ(Yamashita T, et al. 2008; Lee JS, et al. 2006)およびＫＲＴ１９(Lee JS, et al. 2006; Durnez A, et al, 2006)などのいくつかの遺伝子がＨＣＣ予後に関連付けられている。
【０００９】
術後２年以内の腫瘍再発と定義される早期再発は、主として腫瘍の生物学に関連する(Imamura H J hepatol 2003)。本発明者らはこれまでにＨＣＣの６つのサブグループ（Ｇ１〜Ｇ６）への分子的分類を記載しており、Ｇ３サブグループのＨＣＣは予後が不良であることを示した(Boyault S Hepatology 2007; Villanueva A Gastroenterology 2011; WO2007/063118A1)。ＨＣＣ再発および関連死の他の分子シグネチャーも公開されているが、それらの中で外的に妥当性が評価されたものはほとんどない(Villanueva A, clinical cancer res 2010)。妥当性が評価された予後分類の１つが、パラフィン包埋組織において従前に妥当性が認められたＧ３シグネチャーであった(Boyault S Hepatology 2007, Villanueva A, gastroenterology 2011)。さらに、無再発生存期間の予測のための数種のシグネチャー（良好な予後は術後最初の４年間に再発が無いことに関連付けられ、不良な予後は術後最初の２年間の再発に関連付けられる）も、ＷＯ２００７／０６３１１８Ａ１に記載されている。
【００１０】
これに対して、術後３年以降の腫瘍再発と定義される後期再発は、主として周囲の非腫瘍組織の特徴に関連する（「発癌性の場の効果(carcinogenic field effect)」）。非腫瘍性肝臓サンプルに由来する１９６の遺伝子の分子シグネチャーが後期再発および全生存期間に関連付けられ、基礎にある肝硬変の重篤度および発癌能のサロゲートマーカーと考えることができる(Hoshida Y, NEJM, 2008)。さらに、５年全生存期間（再発有りまたは無し）の予測のいくつかのシグネチャーもＷＯ２００７／０６３１１８Ａ１に記載されている。
【００１１】
上記従来技術のツールはＨＣＣ悪性度の予測に有用ではあるが、切除されたＨＣＣの全生存期間および早期再発を推定するために、妥当性が認められたより有力な腫瘍分子シグネチャーの必要がなおある。
【００１２】
特に、予後によって選択される治療管理が異なることを鑑みれば、この種の治療決定を考慮するために使用される予後方法は高感度かつ特異的であって、高い陽性反応的中度（ＰＰＶ）、陰性反応的中度（ＮＰＶ）および精度（ＲＯＣ曲線下面積またはＡＵＣにより評価される）を示すことが重要である。
【００１３】
さらに、全生存期間と早期再発の両方を推定することができたならば、臨床医に極めて有用となろう。この点について、本発明者らは、従来技術に記載されている予後ツールはどれも全生存期間の予測と早期再発の予測に関して異なることを注記しておく。特に、ＷＯ２００７／０６３１１８Ａ１に開示されている全生存期間(global survival)（すなわち、全生存(overall survival)）の最良の予測因子と無再発生存期間の最良の予測因子（早期再発も推定する）は異なり、臨床医にとって実用的ではない。
【００１４】
さらに、ＨＣＣ予後の分子シグネチャーの同定を試みる多くの研究が特定の病因を有する（例えば、ＨＢＶ関連またはＨＣＶ関連ＨＣＣ、Nault JC, semliver dis 2011, Woo HG gastroenterology 2011, Hsu HC Am J pathol 2000参照）患者のコホートに基づいており、このようなコホートで同定された分子シグネチャーの一般適用性には問題のある可能性があり、いずれにせよ、他のＨＣＣ病因を有する患者でのさらなるバリデーションが必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
よって、全生存期間と早期再発の両方の推定を可能とし、高い感度、特異性、ＰＰＶ、ＮＰＶおよび精度を示す、簡単かつ信頼性の高い予後ツールの必要がなお存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
種々のＨＣＣサンプルから得られたマイクロアレイデータの分析の新規な戦略に基づき、本発明者らは、上記の基準を満たす簡単かつ信頼性のある分子予後ツールを構築した：
・本ツールは、全生存期間と早期再発の同時推定を可能とするので極めて簡単である。さらに、予後に必要とされるのは５つの遺伝子の発現レベルの分析だけであり、これも本検査の簡便性に寄与する；また
・腫瘍関連死を推定するための時間依存性曲線下面積（ＡＵＣ）は１１９名の患者のバリデーションコホートで０．８０に達したことから、本ツールは信頼性が高い。含む患者数が多いことならびにそれらのＨＣＣ癌の病因が多様であることが、本検査の信頼性および一般適用性をさらに担保する。特に、本予後は、硬変による根拠、腫瘍サイズおよび病理学的特徴に依存しない。
【００１７】
発明の説明
よって、本発明は、
ＨＣＣに罹患している被験体において前記被験体の肝臓サンプルからの全生存期間および／または無再発生存期間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ予後の方法であって、
ａ）前記肝臓サンプルからｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて下記の５つの遺伝子：ＴＡＦ９、ＲＡＭＰ３、ＨＮ１、ＫＲＴ１９、およびＲＡＮ、ならびに任意選択の１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルを決定すること；および
ｂ）少なくとも１つの参照ＨＣＣ肝臓サンプルで較正されたアルゴリズムを用い、前記発現プロファイルに基づいて全生存期間および／または無再発生存期間を予測すること
を含んでなる方法に関する。
【００１８】
「被験体」とは、性別または年齢を問わず、任意のヒト被験体を意味する。被験体はＨＣＣに罹患しており、好ましくは、外科的肝腫瘍切除を受けている。
【００１９】
本発明によれば、ＨＣＣ進行の「予測」は、特定のＨＣＣ腫瘍の、この特定のＨＣＣ腫瘍に罹患している患者に相対的な将来の進行の推定を意味する。本発明による方法は、全生存期間予測と無再発生存期間予測の両方を同時に可能とする。
【００２０】
「全生存期間予測」とは、再発有りまたは無しの生存期間の予測を意味する。前述のように、ＨＣＣに対する主要な現行治療は、腫瘍の外科的切除である。結果として、「不良な全生存期間予測」は、肝臓切除後３年以内の死亡の発生と定義され、「良好な全生存期間予測」は、術後５年間死亡が無いことと定義される。
【００２１】
「無再発生存期間予測」とは、再発(relapse）または再発(recurrence)の無い生存期間の予測を意味する。「不良な無再発生存期間予測」は、肝臓切除後２年以内の腫瘍再発の存在と定義され、「良好な無再発生存期間予測」は、術後４年間の再発が無いことと定義される。「再発(relapse)」または「再発(recurrence)」とは、一般には腫瘍の外科的切除による初期治療の後に、同じ被験体でＨＣＣが再び増殖することを意味する。
【００２２】
本発明による上記方法では、参照サンプルは、アルゴリズムを較正するために使用され、そのアルゴリズムはその後、全生存期間および／または無再発生存期間を予測するために使用可能である。本発明の方法の有利な実施態様では、全生存期間および無再発生存期間を予測するために使用される１または複数のアルゴリズムを較正するために使用される参照サンプルは、下記のもの：
ａ）全生存期間予測目的では、腫瘍切除後少なくとも５年生存した患者に由来する少なくとも１つの（好ましくは、複数の）ＨＣＣサンプルおよび腫瘍切除後３年以内に死亡した患者由来の少なくとも１つの（好ましくは、複数の）ＨＣＣサンプル；
ｂ）無再発生存期間予測目的では、腫瘍切除後少なくとも４年間再発しなかった患者に由来する少なくとも１つの（好ましくは、複数の）ＨＣＣサンプルおよび腫瘍切除後２年以内に再発した患者に由来する少なくとも１つの（好ましくは、複数の）ＨＣＣサンプル
である。
【００２３】
本発明による方法では、肝臓サンプルが分析される。「肝臓サンプル」とは、被験体の肝臓の一部を採取することによって得られる任意のサンプルを意味する。「ＨＣＣ肝臓サンプル」とは、ＨＣＣに罹患している被験体由来の肝臓サンプルを意味する。このような肝臓サンプルは、特に、肝臓生検または部分的もしくは全肝臓腫瘍外科的切除であり得る。アルゴリズムを較正するために使用される参照サンプルもまた肝臓サンプルであり、好ましくは、分析されるものと同タイプのものである。
【００２４】
本発明による上記方法は、５つの特異的遺伝子を含んでなるまたはからなる特定の発現プロファイルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定に基づく。これら５つの遺伝子に関する情報を下表１に示す。
【００２５】
【表１】
2015535176.tif 000002
【００２６】
本発明による上記方法では、全生存期間および／または無再発生存期間の予測は、５つの特異的遺伝子、および任意選択の１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルに基づいてなされる。「発現プロファイル」とは、発現プロファイルに含まれる遺伝子群の発現レベルを意味する。「含んでなる」とは、発現プロファイルが他の遺伝子をさらに含んでなり得ることを意味するものとする。これに対して、「からなる」とは、分析される発現プロファイルにさらなる遺伝子が存在しないことを意味するものとする。「その等価発現プロファイル」または「ＥＥＰ」とは、それらの遺伝子のうちいくつか（好ましくは、多くて１つまたは２つの遺伝子）の付加、欠失または置換がその診断の信頼性を有意に変化させないオリジナルの発現プロファイル（それと前記ＥＥＰが等価である）を意味するものとする。
【００２７】
好ましい実施態様では、等価発現プロファイルは、選択された遺伝子組合せの遺伝子のうち１つが等価な遺伝子で置き換えられた発現プロファイルを含む。本明細書において、第１の遺伝子（「遺伝子Ａ」）は、発現プロファイル中の「遺伝子Ａ」を「遺伝子Ｂ」で置き換えてもその検査の性能に有意な影響を及ぼさない場合に、別の第２の遺伝子（「遺伝子Ｂ」）と等価と見なすことができる。これは一般に「遺伝子Ａ」が「遺伝子Ｂ」と相関している場合であり、ピアソンの相関係数などの尺度で判定した場合に、「遺伝子Ａ」の発現が「遺伝子Ｂ」の発現レベルと統計学的に相関していることを意味する。相関は正（患者において「遺伝子Ａ」がアップレギュレートされている場合に、同じ患者で「遺伝子Ｂ」もアップレギュレートされていることを意味する）であってもよいし、または負（患者において「遺伝子Ａ」がアップレギュレートされている場合に、同じ患者で「遺伝子Ｂ」はダウンレギュレートされていることを意味する）であってもよい。本発明者らによって定量的ＰＣＲを用いて分析された１０３の遺伝子のうち、予後に必要な５つの遺伝子のそれぞれと最も良く相関し、平均ピアソン相関係数が≧０．３または≦−０．３である最大１０の遺伝子を上記の表１に記載する。
【００２８】
「発現プロファイルを決定する」とは、選択された遺伝子の群の発現レベルの測定を意味する。各遺伝子の発現レベルは、当技術分野で公知の任意の技術を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、タンパク質レベルまたは核酸レベルのいずれかで決定することができる。
【００２９】
例えば、タンパク質レベルでの、特定のタンパク質の発現レベルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定は、限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡまたは質量分析などの、当業者に公知の任意の方法によって行うことができる。これらの技術はいずれの肝臓サンプルにも容易に適合される。実際に、肝臓サンプルのタンパク質は、溶液法でＥＬＩＳＡまたは質量分析に関して当業者に周知の種々の技術を用いて抽出することができる。あるいは、肝臓サンプル中のタンパク質の発現レベルは、直接、組織切片での質量分析を用いて分析してもよい。
【００３０】
本発明による方法の好ましい実施態様では、発現プロファイルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて核酸レベルで決定される。核酸レベルにおいて、ある遺伝子の発現レベルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定は、直接的にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対して、または逆転写した相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に対して行うことができる。限定されるものではないが、マイクロアレイ分析、定量的ＰＣＲ、サザン分析を含め、発現レベルを測定するためのいずれの方法も使用可能である。
【００３１】
本発明による方法の好ましい実施態様では、発現プロファイルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて核酸マイクロアレイ、特に、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて決定される。本発明による方法の別の好ましい実施態様では、発現プロファイルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて定量的ＰＣＲを用いて決定される。いずれにせよ、いずれの遺伝子の発現レベルも正規化されることが好ましい。得られた発現データを正規化するためには、発現の測定に使用される技術によって多くの方法が存在する。このような方法は当業者に周知である。いくつかの実施態様では、正規化は、内部対照遺伝子、一般には、限定されるものではないが、リボソームＲＮＡ（例えば、１８ＳリボソームＲＮＡなど）またはＨＰＲＴ１（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）、ＵＢＣ（ユビキチンＣ）、ＹＷＨＡＺ（チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ゼータポリペプチド）、Ｂ２Ｍ（β−２−ミクログロブリン）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＦＰＧＳ（ホリルポリグルタミン酸シンターゼ）、ＤＥＣＲ１（２，４−ジエノイルＣｏＡレダクターゼ１、ミトコンドリア）、ＰＰＩＢ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＢ（シクロフィリンＢ））、ＡＣＴＢ（アクチンβ）、ＰＳＭＢ２（プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット，βタイプ，２）、ＧＰＳ１（Ｇタンパク質経路サプレッサー１）、ＣＡＮＸ（カルネキシン）、ＮＡＣＡ（新生ポリペプチド関連複合体αサブユニット）、ＴＡＸ１ＢＰ１（Ｔａｘ１（ヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプＩ）結合タンパク質１）、およびＰＳＭＤ２（プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）２６Ｓサブユニット，非ＡＴＰアーゼ，２）などの遺伝子を含む、ハウスホールド遺伝子の発現レベルと比較して行うことができる。
【００３２】
本発明に関して、予後に使用される遺伝子の「発現値」（「発現レベル」とも呼ばれる）は、下記の両方を含む：
・正規化されてない生の発現値、および
・正規化に使用される方法に関わらず、さらに正規化されていてもよい生の発現値の導関数。
【００３３】
特に、予後に使用される遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現値を測定するために定量的ＰＣＲが使用される場合、ΔＣｔ、−ΔＣｔ、ΔΔＣｔ、または−ΔΔＣｔ値から選択される生の発現値の導関数が使用できる。
【００３４】
予後に使用される遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現値を測定するためにマイクロアレイが使用される場合、生の発現値（さらに正規化されていてもされていなくてもよい）の対数導関数（特に、ｌｏｇ２導関数）が通常使用される。
【００３５】
これらの技術もまた、いずれの肝臓サンプルにも容易に適合される。実際に、いくつかの周知の技術が、組織サンプルからｍＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するために当業者に利用可能である。
【００３６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定された発現プロファイルに基づいて全生存期間および／または無再発生存期間を予測するために、多くのアルゴリズムが使用可能である。特に、アルゴリズムは、ＰＬＳ（部分最小二乗）回帰アルゴリズム、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズム、線形回帰またはその派生アルゴリズム（ＧＬＭと略される一般化線形モデル、ロジスティック回帰を含む）、線形判別分析（ＬＤＡ、対角線形判別分析（ＤＬＤＡ）を含む）アルゴリズム、対角二次判別分析（ＤＱＤＡ）アルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ｋ−ＮＮ（近傍）アルゴリズム、およびＰＡＭ（マイクロアレイ予測分析）アルゴリズムから選択することができる。コックスモデルも使用可能である。また、種々のタイプの距離を用いるセントロイドモデルも使用可能である。
【００３７】
参照サンプル群（一般に、トレーニングデータとも呼ばれる）は、良好な予後を不良な予後から最良に分離する最適な統計アルゴリズム（決定則など）を選択するために使用される。最良の分離は通常、分類を誤るサンプルができる限り少なく、異なるデータセットに対しても十分同等に遂行できる可能性が最も高いものである。
【００３８】
良好／不良な予後などの二元転帰では、ロジスティック回帰を含む線形回帰または一般化線形モデル（ＧＬＭと略される）が使用可能である。
【００３９】
線形回帰は、線形回帰関数の決定に基づき、その一般式は、
【数１】
2015535176.tif 000003
として表すことができる。
【００４０】
線形回帰関数の他の表示も使用可能である（下記参照）。
【００４１】
ロジスティック回帰は、ロジスティック回帰関数：
【数２】
2015535176.tif 000004
（式中、ｚは通常、
【数３】
2015535176.tif 000005
と定義される）
の決定に基づく。
【００４２】
上記の線形またはロジスティック回帰関数では、ｘ１〜ｘＮは、シグネチャーのＮ個の遺伝子の発現値（または定量的ＰＣＲの場合にはΔＣｔ、−ΔＣｔ、ΔΔＣｔ、もしくは−ΔΔＣｔ、もしくはマイクロアレイの場合には対数値などのその導関数）であり、β０は切片であり、かつ、β１〜βＮは回帰係数である。
【００４３】
切片および回帰係数の値は、参照サンプルの群（「トレーニングデータ」）に基づいて決定される。次に、線形またはロジスティック回帰関数の値は、検定発現プロファイルが良好または不良な予後を有する確率を定義する（トレーニングデータに基づいて線形またはロジスティック回帰関数を定義する場合、ユーザーが、その確率が良好な予後の確率か不良な予後の確率かを決定する）。その後、検定発現プロファイルは、それが良好な予後または不良な予後を有する確率が特定の閾値（これもまたトレーニングデータに基づいて決定される）より低いか高いかによって、良好な予後または不良な予後を有するとして分類される。場合によっては、未確定領域を画定する２つの閾値が使用される。ロジスティック回帰以外のタイプの一般化線形モデルも使用可能である。
【００４４】
新規なサンプルには、そのサンプルが良好な予後の群に近いか不良な予後の群に近いかに基づく近傍法（ｋ−ＮＮと略される）などの別法も慣用される。「より近い」という概念は、予後に有用なＮ個の遺伝子（従って、正規化目的で使用される潜在的ハウスキーピング遺伝子を除く）からなるシグネチャーにより画定されるｎ次元空間における距離（限定されるものではないが、ユークリッド距離などのメトリック）の選択に基づく。検定発現プロファイルと総ての参照良好または不良予後発現プロファイルの間の距離が計算され、そのサンプルがｋ最近接参照サンプルの解析により分類され（ｋは、少なくとも１、多くても一般に３または５の正の整数である）、分類の規則は、ｋ最近接参照発現プロファイル中の良好または不良予後参照発現プロファイルの数によって予め設定される。例えば、ｋが１であるとき、検定発現プロファイルは、最近接参照発現プロファイルが良好予後発現プロファイルであれば良好な予後として、最近接参照発現プロファイルが不良予後発現プロファイルであれば不良な予後として分類される。ｋが２であるとき、検定発現プロファイルは、その２つの最近接参照発現プロファイルが良好予後発現プロファイルであれば応答として、その２つの最近接参照発現プロファイルが不良予後発現プロファイルであれば不応答として分類され、その２つの最近接参照発現プロファイルが良好予後および不良予後参照発現プロファイルを含むかどうかは判定されない。ｋが３であるとき、検定発現プロファイルは、その３つの最近接参照発現プロファイルのうち少なくとも２つが良好予後発現プロファイルであれば良好な予後として、その３つの最近接参照発現プロファイルのうち少なくとも２つが不良な予後発現プロファイルであれば不良な予後として分類される。より一般には、ｋがｐであるとき、検定発現プロファイルは、そのｐ個の最近接参照発現プロファイルのうち半数を超えるものが良好予後発現プロファイルであれば良好な予後として、そのｐ個の最近接参照発現プロファイルのうち半数を超えるものが不良予後発現プロファイルであれば不良な予後として分類される。良好予後参照発現プロファイルと不良予後参照発現プロファイルの数が等しい場合には、その検定発現プロファイルは未確定として分類される。
【００４５】
統計学、数学または工学分野由来の他の方法論も存在し、例えば、限定されるものではないが、決定木、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ニューラルネットワークおよび線形判別分析（ＬＤＡ）がある。コックスモデルも使用可能である。種々のタイプの距離を用いるセントロイドモデルも使用可能である。これらのアプローチは当業者に周知である。
【００４６】
要約すると、線形回帰またはその派生法、例えば、一般化線形モデル（ＧＬＭ、ロジスティック回帰を含む）、近傍法（ｋ−ＮＮ）、決定木、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ニューラルネットワーク、線形判別分析（ＬＤＡ）、ランダムフォレスト、またはマイクロアレイの推定分析（ＰＡＭ）から選択され得るアルゴリズムは参照サンプルの群（好ましくは、複数の良好予後参照発現プロファイルと複数の不良予後参照発現プロファイルを含む）に基づいて較正された後、検定サンプルに適応される。簡単に言えば、患者は、シグネチャー内の総ての遺伝子が、良好な予後の群（トレーニングデータ）から構築された参照プロファイル由来の総ての遺伝子にいかに匹敵するかに基づいて良好な予後（または不良な予後）として分類される。
【００４７】
発現プロファイルの個々の遺伝子が不良予後サンプルに対して良好予後サンプルで増加しているか減少しているかという概念は科学的に着目される。各個の遺伝子について、良好予後群の遺伝子発現レベルは、スチューデントのｔ検定または同等の方法の使用によって不良予後群と比較することができる。しかしながら、このような二元比較は、シグネチャーが数種の異なる遺伝子を含んでなる場合の予後には、一般に使用されない。
【００４８】
有利な実施態様では、全生存期間および／または無再発生存期間を予測するために使用されるアルゴリズムは、下式：
【数４】
2015535176.tif 000006
［式中、
・Ｎは、発現プロファイルの遺伝子の数を表し、
・ｘｉ、１≦ｉ≦Ｎ、発現プロファイルに含まれるＮ個の遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された発現値を表し（これらの値は特に、場合により正規化後の、定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験ではΔＣｔ、−ΔＣｔ、ΔΔＣｔ、または−ΔΔＣｔ値に相当し、マイクロアレイ実験では対数値、特に、ｌｏｇ２の値に相当する）、
・ｍｉおよびｗｉ、１≦ｉ≦Ｎは、少なくとも１つの参照サンプルで較正された固定パラメーターであり、かつ、
・サンプルＸは、スコア（サンプルＸ）が閾値Ｔより低い場合には良好な全生存期間および／または無再発生存期間予測を有し、スコア（サンプルＸ）が閾値Ｔ以上である場合には不良な全生存期間および／または無再発生存期間予測を有すると見なされ、ここで、Ｔは、少なくとも１つの参照サンプルで較正されたものである］
を用いた線形回帰である。
【００４９】
特に好ましい実施態様では、発現プロファイルは定量的ＰＣＲを用いて決定され、発現値はΔΔＣｔ値であり、Ｎは５であり、閾値Ｔは０であり、かつ、ｍｉおよびｗｉ、１≦ｉ≦５は下表２に示される値を有する。
【００５０】
【表２】
2015535176.tif 000007
【００５１】
本明細書に記載される本発明による予後の方法は、
ａ）予後に関連する少なくとも１つの他の変数を決定すること、および
ｂ）少なくとも１つの参照ＨＣＣ肝臓サンプルで較正されたアルゴリズムを用い、発現プロファイルと前記１または複数の他の変数に基づいて全生存期間および／または無再発生存期間を予測すること
をさらに含んでなり得る。
【００５２】
実際に、予後に独立に関連するさらなる変数を含めると、予後の信頼性をさらに改善することができる。前記他の変数は特に、Ｇ１−Ｇ６分類（ＷＯ２００７／０６３１１８Ａ１に開示、下記参照）、ＢＣＬＣ(Barcelona Clinic Liver Cancer、Llovet, 1999, sem liv dis)、ＣＬＩＰ(Cancer of the Liver Italian Program、CLIP investigators Hepatology, 1998)、ＪＩＳ(Japan Integrated Staging、Kudo m, J Gasterol 2003)、ＴＮＭ(Tumour-Node-Metastasis、AJCC cancer staging Handbook, 7th ed Springer)臨床病期分類、ミラン(Mazzaferro v, New England J Medicine 1996)およびメトロチケットカリキュレーター(Mazzaferro v, lancet Oncol 2009)判定基準、硬変の存在(Hoshida y, NEJM, 2008)、術前ＡＦＰ（αフェトタンパク質）血漿レベル(Chevret S J hepatol 1999)、エドモンソングレード(Edmondson Cancer, 1954)、および肝臓サンプルの微小血管侵入(Mazzaferro v, lancet Oncol 2009) から選択され得る。
【００５３】
Ｇ１−Ｇ６分類は後述する。
【００５４】
ＢＣＬＣ、ＣＬＩＰ、ＪＩＳ、およびＴＮＭ臨床病期分類、ミランおよびメトロチケットカリキュレーター判定基準、およびエドモンソングレードは、上述の刊行物に記載のように、通常の一般知識に基づき任意の肝臓サンプルに対するＨＣＣ診断、予後および管理の熟練者に周知であり、容易に決定される。
【００５５】
他の変数が決定される場合、それらの値は、任意の適当なアルゴリズムを用い、総ての変数（発現プロファイルおよびさらなる変数）に基づく全体的予後を行うために発現プロファイルと併合する。
【００５６】
好ましい実施態様では、他の変数が決定される場合、前記他の変数はＢＣＬＣ臨床病期分類および肝臓サンプルの微小血管侵入である。
【００５７】
好ましい実施態様では、総合スコアは、他の変数（特に、ＢＣＬＣ臨床病期分類および微小血管侵入）の値および本明細書に記載のように計算される発現プロファイルスコアに基づいて決定される。
【００５８】
予後に使用可能な総合スコアの例を図５に示す。
【００５９】
本発明はまた、多くて６５の異なる遺伝子を含んでなる発現プロファイル（前記発現プロファイルは下記の５つの遺伝子：ＴＡＦ９、ＲＡＭＰ３、ＨＮ１、ＫＲＴ１９、およびＲＡＮ、ならびに任意選択の１以上の内部対照遺伝子を含んでなるまたはからなる）、またはその等価発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなるキットに関する。
【００６０】
好ましい実施態様では、本発明によるキットは、上述の発現プロファイルの１つの決定(the determination or one of the above mentioned expression profile)に特化されてもよく、よって、対象とする最大数の遺伝子を含む発現プロファイルが５つの遺伝子と任意選択の１以上の内部対照遺伝子を含んでなることが分かっているので、多くて１０の異なる遺伝子を含んでなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなる。別の好ましい実施態様では、本発明によるキットは、ＨＣＣ診断および／またはサブグループへのＨＣＣ分類に結びつけることができる、対象とする他の発現プロファイルのための試薬をさらに含んでなってもよい。この場合、キットは、対象とする付加的発現プロファイルの発現レベルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定することを可能とするための、多くて６５の異なる遺伝子を含んでなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなる。特に、ＨＣＣサンプルの、下表３に示される臨床的および遺伝的主要特徴により定義される６つのサブグループＧ１からＧ６への分類はＷＯ２００７／０６３１１８Ａ１に記載されており、このような分類に関するその内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【００６１】
【表３】
2015535176.tif 000008
【００６２】
この分類は、有利には下記の１６の遺伝子：ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１を含んでなるまたはからなる発現プロファイルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ決定に基づき、この方法は、特に、
ａ）上述の１６の遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイルを決定すること；
ｂ）前記発現プロファイルから６つのサブグループ距離を計算すること；および
ｃ）前記ＨＣＣ腫瘍を、サブグループ距離が最低であるサブグループに分類すること
を含んでなり得る。
【００６３】
好ましくは、発現プロファイルは定量的ＰＣＲを用いて決定され、サンプルｉから各サブグループｋの距離は下式：
【数５】
2015535176.tif 000009
（式中、各遺伝子ｔおよびサブグループｋに関して、μ（サブグループｋ、遺伝子ｔ）およびσ（遺伝子ｔ）値は下表４に示されるものである）
を用いて計算される。
【００６４】
【表４】
2015535176.tif 000010
【００６５】
Ｎ個の遺伝子を含んでなる発現プロファイルの決定のための試薬としては、前記発現プロファイルに含まれる遺伝子の発現レベルを特異的に定量することを可能とするいずれの試薬も含み得る。例えば、発現プロファイルがタンパク質レベルで決定される場合、このような試薬は、その発現プロファイルに含まれる遺伝子のそれぞれに特異的な抗体を含み得る。好ましくは、発現は、核酸レベルで測定される。この場合、本発明のキット中の試薬は、特に、その発現プロファイルに含まれる遺伝子のそれぞれに特異的なプライマー対（フォワードプライマーとリバースプライマー）および／もしくはプローブ（特に、発現プロファイルの定量的ＰＣＲ決定に有効）または核酸マイクロアレイ、特に、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを含み得る。後者の場合、核酸マイクロアレイは、前段落に定義されるように、最大数の遺伝子の検出のためのプローブを含んでなる専用の核酸マイクロアレイである。
【００６６】
背景技術の節に示したように、本発明による予後方法は、ユニークかつ簡単な検査に基づいて、ＨＣＣ腫瘍の悪性度を評価すること、ひいてはその予後に対する治療を適合させることを可能とするので、臨床医にとって重要である。
【００６７】
よって、本発明はまた、本発明の予後方法を用いて不良な予後が示された被験体におけるＨＣＣの治療に使用するための細胞傷害性化学療法薬または標的治療薬に関する。本発明はまた、本発明による予後方法により不良な全生存期間および／または無再発生存期間予測を示した被験体におけるＨＣＣの治療を意図した薬剤の製造のための、治療用細胞傷害性化学療法薬または標的治療薬の使用に関する。前記被験体のＨＣＣが上記で定義されたようなサブグループＧ１にさらに分類されている場合には、ＩＧＦＲ１阻害剤またはＡｋｔ／ｍＴｏｒ阻害剤が補助療法として好ましい。あるいは、前記被験体のＨＣＣが上記で定義されたようなサブグループＧ２にさらに分類されている場合には、Ａｋｔ／ｍＴｏｒ阻害剤が補助療法として好ましい。あるいは、前記被験体のＨＣＣが上記で定義されるようなサブグループＧ３にさらに分類されている場合には、プロテアソーム阻害剤が補助療法として好ましい。あるいは、前記被験体のＨＣＣが上記で定義されるようなサブグループＧ５またはＧ６にさらに分類されている場合には、ＷＮＴ阻害剤が補助療法として好ましい。しかしながら、現行のＷＮＴ阻害剤は毒性の問題があり、より効果的かつ安全なＷＮＴ阻害剤の必要がなお存在する。
【００６８】
「細胞傷害性化学療法薬」とは、癌細胞を死滅させるのに有用ないずれの好適な化学薬剤も意味する。ＨＣＣの補助療法として現行使用され、かつ、本発明において好ましい細胞傷害性化学療法薬は、ドキソルビシン、ゲムシタビン、オキサリプラチン、およびそれらの組合せである。ドキソルビシンまたはゲムシタビンとオキサリプラチンの併用が特に好ましい。「標的療法」とは、ＨＣＣ悪性化に関与するシグナル伝達経路の酵素を選択的に阻害するいずれの好適な薬剤も意味するものとする。現在、数種のチロシンタンパク質キナーゼ（ＶＥＧＦＲおよびＰＤＧＦＲ）およびＲａｆキナーゼ（Ｂ−ＲａｆよりもＣ−Ｒａｆに注力されている）の小分子阻害剤であるソラフェニブがＨＣＣの補助療法に承認されており、本発明において好ましい。ソラフェニブは、式：
【化１】
2015535176.tif 000011
のビアリール尿素である。
【００６９】
本発明はまた、必要とする被験体においてＨＣＣを治療するための方法であって、
ａ）前記被験体の全生存期間および／または無再発生存期間を、本発明による予後方法を用いて予測すること；
ｂ）前記被験体が不良な予後を示した場合に、前記被験体に、特に、細胞傷害性化学療法（例えば、ドキソルビシンまたはゲムシタビンとオキサリプラチンの併用）または標的療法（例えば、ソラフェニブ）から選択される補助療法を投与すること
を含んでなる方法に関する。
【００７０】
本発明の治療方法は、
ｉ．前記ＨＣＣサンプルを、上記の分類方法を用いてサブグループＧ１からＧ６のうちの１つに分類すること；
ｉｉ．前記ＨＣＣサンプルがＧ１サブグループに分類された場合には、前記被験体に有効量のＩＧＦＲ１阻害剤および／またはＡｋｔ／ｍＴｏｒ阻害剤を投与すること；
ｉｉｉ．前記ＨＣＣサンプルがＧ２サブグループに分類された場合には、前記被験体に有効量のＡｋｔ／ｍＴｏｒ阻害剤を投与すること；
ｉｖ．前記ＨＣＣサンプルがＧ３サブグループに分類された場合には、前記被験体に有効量のプロテアソーム阻害剤を投与すること；
ｖ．前記ＨＣＣサンプルがＧ５またはＧ６サブグループに分類された場合には、前記被験体に有効量のｗｎｔ阻害剤を投与すること
をさらに含んでなり得る。
【００７１】
本発明はまた、本発明による予後方法を遂行するためのシステム（およびコンピューターシステムにそれを遂行させるためのコンピューター可読媒体）に関する。
【００７２】
一つの実施態様において、本発明は、被験体の肝臓サンプルからその被験体の全生存期間または無再発生存期間を予測するためのシステム１であって、
ａ）肝臓サンプルを受容し、下記の５つの遺伝子：ＴＡＦ９、ＲＡＭＰ３、ＨＮ１、ＫＲＴ１９、およびＲＡＮ、ならびに任意選択の１以上の内部対照遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルに関する発現レベル情報を決定するように構成された決定モジュール２；
ｂ）前記決定モジュールからの発現レベル情報を保存するように構成された保存デバイス３；
ｃ）前記保存デバイスに保存された発現レベル情報を参照データと比較し、比較結果を提供するように適合された比較モジュール４、ここで、前記比較結果は良好または不良な予後の指標となる；および
ｄ）任意選択の、ユーザー向けに前記分類結果に部分的に基づくコンテント６を表示するための表示モジュール５、ここで、前記コンテントは良好または不良な予後の指標となる信号である、
を含んでなるシステムに関する。
【００７３】
別の実施態様では、本発明は、発現プロファイルデータの解釈に関する本発明による予後方法のコンピューターステップへの実装のためのソフトウエアモジュールを定義するためにコンピューター可読命令が記録されたコンピューター可読媒体７に関する。好ましくは、前記ソフトウエアモジュールは、
ａ）下記の５つの遺伝子：ＴＡＦ９、ＲＡＭＰ３、ＨＮ１、ＫＲＴ１９、およびＲＡＮ、ならびに任意選択の１以上の内部対照遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルに関する発現レベル情報をユーザーより入力可能とし、さらなる比較のために保存（少なくとも一時的に）可能とするエントリーモジュール８；
ｂ）ユーザーにより入力された発現レベル情報を参照データと比較し、比較結果を提供するように適合された比較モジュール４、ここで、前記比較結果は良好または不良な予後の指標となる；および
ｃ）ユーザー向けに前記分類結果に部分的に基づくコンテント６を表示するための表示モジュール５、ここで、前記コンテントは良好または不良な予後の指標となる信号である、
を含んでなる。
【００７４】
システムおよびコンピューター可読媒体に関する本発明の実施態様はファンクションモジュールによって記述されており、コンピューター可読媒体に記録されているコンピューター実行可能命令により定義され、実行された際にコンピューターにメソッドステップを遂行させる。これらのモジュールは、分かりやすくするために機能によって分離されている。しかしながら、これらのモジュールは個々の(discreet)コードブロックに対応する必要はなく、記載されている機能が様々な媒体に保存され、様々な時点で実行される様々なコード部分の実行によって遂行できると理解されるべきである。さらに、これらのモジュールは他の機能を遂行してもよく、従って、これらのモジュールは任意の特定の機能または機能セットを持つことに限定されないと認識されるべきである。
【００７５】
コンピューター可読媒体は、コンピューターによりアクセス可能な任意の利用可能な有形媒体であり得る。コンピューター可読媒体としては、コンピューター可読命令、データストラクチャー、プログラムモジュールまたは他のデータなどの情報の保存のための任意の方法または技術に実装される揮発性および不揮発性、リムーバブルおよび非リムーバブル有形媒体が含まれる。コンピューター可読媒体としては、限定されるものではないが、ＲＡＭ（ランダム・アクセス・メモリ）、ＲＯＭ（リード・オンリー・メモリ）、ＥＰＲＯＭ（イレイサブル・プログラマブル・リード・オンリー・メモリ）、ＥＥＰＲＯＭ（エレクトリカリー・イレイサブル・プログラマブル・リード・オンリー・メモリ）、フラッシュメモリまたは他のメモリ技術、ＣＤ−ＲＯＭ（コンパクト・ディスク・リード・オンリー・メモリ）、ＤＶＤ（デジタル・バーサタイル・ディスク）または他の光学保存媒体、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク保存または他の磁気保存媒体、他のタイプの揮発性および不揮発性メモリ、および所望の情報を保存するために使用可能であり、かつ、コンピューターによりアクセス可能である任意の他の有形媒体（上記の任意の好適な組合せを含む）が挙げられる。
【００７６】
１以上のコンピューター可読媒体に具現化されたコンピューター可読データは、例えば、コンピューターにより実行される結果として、コンピューターに本明細書に記載される１以上の機能（例えば、システム１、またはコンピューター可読媒体７に関する）、ならびに／または種々の実施態様、変形形態およびそれらの組合せを遂行するように命令する１以上のプログラムの一部としての命令を定義し得る。このような命令は、複数のプログラミング言語、例えば、Ｊａｖａ、Ｊ＃、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ、Ｃ、Ｃ＃、Ｃ＋＋、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｐａｓｃａｌ、Ｅｉｆｆｅｌ、Ｂａｓｉｃ、ＣＯＢＯＬアセンブリ言語など、またはそれらの様々な任意の組合せのいずれで書かれていてもよい。このような命令が具現化されているコンピューター可読媒体は、本明細書に記載のシステム１またはコンピューター可読媒体６のいずれかの１以上の成分に存在してよく、このような成分の１以上にわたって記載されてもよく、その間で移行してもよい。
【００７７】
コンピューター可読媒体は、そこに保存されている命令が、本明細書に述べられている本発明の態様を実施するために任意のコンピューターリソースにロードされ得るように転送可能である。さらに、上記の１または複数のコンピューター可読媒体に保存されている命令は、ホストコンピューター上で実行中のアプリケーションプログラムの一部として具現化された命令に限定されないと認識されるべきである。むしろ、これらの命令は、コンピューターを本発明の態様を実施するようにプログラムするために使用可能な任意のタイプのコンピューターコード（例えば、ソフトウエアまたはマイクロコード）として具現化できる。コンピューター実行可能命令は、好適なコンピューター言語または数種の言語の組合せで書かれてよい。基礎計算生物学法は当業者に公知であり、例えば、Setubal and Meidanis et al., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997, ref 38); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998, ref 39); Rashidi and Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, London, 2000, ref 40)およびOuelette and Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2nd ed., 2001)に記載されている。
【００７８】
本発明の特定の実施態様の機能モジュールは、決定モジュール２、保存デバイス３、比較モジュール４および表示モジュール５を含む。機能モジュールは、１または複数のコンピューターで、または１または複数のコンピューターネットワークを使用することにより実行できる。決定モジュール２は、コンピューター可読形式で発現レベル情報を提供するためのコンピューター実行可能命令を含む。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「発現レベル情報」とは、全長または部分的いずれかの、任意のヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）および／またはアミノ酸配列の発現レベルに関する情報を意味する。好ましい実施態様では、発現レベル情報は、種々の技術により測定されるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの発現レベルを意味する。この情報は、質的（転写産物の有無）であっても量的であってもよい。好ましくは、情報は量的である。
【００８０】
発現レベル情報を決定するための方法、すなわち、決定モジュール２は、タンパク質およびＤＮＡ／ＲＮＡ分析のためのシステム、特に、核酸レベルまたはタンパク質レベルにおける発現プロファイルの決定に関して上記したものを含む。
【００８１】
決定モジュールにおいて決定される発現レベル情報は、保存デバイス３により読み取り可能である。本発明で使用する場合、「保存デバイス」３は、データまたは情報を保存するために構成または適合された、任意の好適な計算もしくは処理装置またはその他のデバイスを含むことを意図する。本発明とともに使用するために好適な電子装置の例としては、スタンドアローン計算装置、データテレコミュニケーションネットワーク（ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、インターネット、イントラネット、およびエクトラネットを含む）、ならびにローカルおよび分散コンピュータープロセシングシステムが挙げられる。保存デバイス３はまた、限定されるものではないが、磁気保存媒体（例えば、フロッピーディスク、ハードディスク保存媒体、磁気テープ）、光学保存媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ）、電子保存媒体（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ）など、一般ハードディスクおよびこれらのカテゴリーのハイブリッド、例えば、磁気／光学保存媒体を含む。保存デバイス３は、発現レベル情報が記録されるように適合または構成される。このような情報は、例えば、インターネット、ディスケット、ＵＳＢ（ユニバーサル・シリアル・バス）またはデバイス間の無線通信を含む任意の他の好適な通信様式を介して伝送および電子読み取り可能なデジタル形式で提供できる。
【００８２】
本発明で使用する場合、「保存」とは、保存デバイス３の情報をコード化するプロセスを意味する。当業者ならば、発現レベル情報を含んでなる製品を作製するために、既知の媒体に情報を記録するために現在知られている方法のいずれかを容易に採用することができる。
【００８３】
発現レベル情報を保存デバイスに保存するためには、様々なソフトウエアプログラムおよびフォーマットを使用することができる。発現レベル情報が記録されている媒体を取得または作出するために、いずれの数のデータプロセッサーストラクチャリングフォーマット（例えば、テキストファイル、スプレッドシートまたはデータベース）を使用してもよい。
【００８４】
発現レベル情報をコンピューター可読形式で提供することにより、比較モジュール４において、発現レベル情報を可読形式で用いて、特異的な発現プロファイルを保存デバイス３内の参照データと比較することができる。比較は特に、上記の種々のアルゴリズムを用いて行うことができる。コンピューター可読形式で行われた比較はコンピューター可読比較結果を提供し、これは種々の手段によって処理することができる。比較結果に基づく内容は比較モジュール４から検索でき、表示モジュール５により表示させて良好または不良な予後を示すことができる。
【００８５】
好ましくは、参照データは、本発明による分類方法によって見られる可能性のあるあらゆるタイプの肝臓サンプルの指標となる発現レベルプロファイルである。
【００８６】
「比較モジュール」４は、すでに上記したものなどの統計アルゴリズムを提供する任意のソフトウエアを直接的または間接的に用い、決定モジュール２で決定された発現レベル情報を参照データと比較するように働く、比較のための様々な利用可能なソフトウエアプログラムおよびフォーマットを使用することができる。
【００８７】
比較モジュール４、または本発明の任意の他のモジュールは、リレーショナルデータベース管理システム、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂアプリケーション、およびＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂサーバーを動かすオペレーティングシステム（例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ、Ｌｉｎｕｘ、Ｍａｃ  ＯＳまたはＵＮＩＸ）を含み得る。Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂアプリケーションは、データベース言語ステートメント（例えば、構造化問合せ言語(Structured Query Language)（ＳＱＬ）ステートメント）の生成に必要な実行可能コードを含む。一般に、実行可能には、埋め込みＳＱＬステートメントを含む。さらに、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂアプリケーションは、サーバーならびにユーザーリクエストに応えるためにアクセスされなければならない種々の外部および内部データベースを含んでなる種々のソフトウエア実体に対するポインターおよびアドレスを含む設定ファイルを含み得る。必要に応じて、サーバーが２以上の分離したコンピューターに分散されていれば、設定ファイルはまた、サーバーリソースに対するリクエストを適当なハードウエアに割り当てる。一つの実施態様では、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂサーバーは、ＴＣＰ／ＩＰプロトコールをサポートする。このようなローカルネットワークは「イントラネット」と呼ばれる場合がある。このようなイントラネットの利点は、それらがＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上に存在するパブリックドメインデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたはＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂサイト）との容易な通信を可能とするということである。従って、本発明の特定の好ましい実施態様では、ユーザーは、ウェブブラウザおよびウェブサーバーによって提供されるＨＴＭＬインターフェースを用い、インターネットデータベース上に存在するデータに直接アクセスすることができる（例えば、ハイパーテキストリンクを介する）。
【００８８】
比較モジュール４は、既定義の判定基準、またはユーザーにより定義される判定基準によりコンピューター可読形式で処理可能なコンピューター可読比較結果を提供し、ユーザーにより要求される場合には、表示モジュール５を用いて保存および出力が可能な比較結果に部分的に基づくコンテント６を提供する。表示モジュール５は、ユーザー向けに、比較結果に部分的に基づくコンテント６の表示を可能とし、このコンテントは良好または不良な予後の指標となる信号である。このような信号は、例えば、コンピューターモニター上への良好または不良な予後の指標となるコンテントの表示、プリンターからの良好または不良な予後を示すコンテントの出力ページもしくは出力レポート、または良好または不良な予後の指標となる光もしくは音であり得る。
【００８９】
比較結果に基づくコンテント６は、比較のために使用されるアルゴリズムによって異なる。
【００９０】
例えば、線形回帰またはその派生法が使用される場合、コンテント６は、良好もしくは不良な予後を持つスコアもしくは確率、または良好もしくは不良な予後を持つ確率と１以上の閾値の両方、または単に良好もしくは不良な予後の指標となる信号を含み得る。近傍法（ｋ−ＮＮ）が使用される場合には、コンテント６は、ｋ最近接プロファイル間の良好予後発現プロファイルと不良予後発現プロファイルの数もしくは割合、または単に良好もしくは不良な予後の指標となる信号を含み得る。さらに、コンテント６は、簡単に、数値、テキストまたはグラフィック的に（例えば、赤、橙または緑などのカラーコードを用いて）レポートされる連続的またはカテゴリースコアであってもよい。
【００９１】
表示モジュール５は、コンピューターからコンピューター可読情報を受容し、ユーザーに対して表示するように構成されたいずれの好適なデバイスであってもよい。限定されない例としては、例えば、Ｉｎｔｅｌ  ＰＥＮＴＩＵＭタイププロセッサー、Ｍｏｔｏｒｏｌａ  ＰｏｗｅｒＰＣ、Ｓｕｎ  ＵｌｔｒａＳＰＡＲＣ、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ＰＡ−ＲＩＳＣプロセッサー、カリフォルニア州サニーベールのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（ＡＭＤ）から、もしくはＡＲＭ  Ｈｏｌｄｉｎｇｓから入手可能な様々なプロセッサーのいずれか、または任意の他のタイプのプロセッサー、フラットパネルディスプレー、カソードレイチューブなどのビジュアルディスプレーデバイス、ならびに種々のタイプのコンピュータープリンターまたは集積デバイス、例えば、ラップトップまたはタブレット、特に、ｉＰａｄに基づくものなどの汎用コンピューターが挙げられる。
【００９２】
一つの実施態様では、比較結果に基づくコンテント６の表示のためのユーザーインターフェースを提供するためにＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂブラウザが使用される。本発明の他のモジュールはウェブブラウザインターフェースを備えるように適合させることができると理解されるべきである。このウェブブラウザを介して、ユーザーは比較モジュールからのデータを検索するためのリクエストを構築することができる。そして、ユーザーは一般に、グラフィックユーザーインターフェースにおいて従来使用されている、ボタン、プルダウンメニュー、スクロールバーなどのユーザーインターフェースエレメントにポインターを置き、クリックする。このようにユーザーのウェブブラウザで作成されたリクエストはＷｅｂアプリケーションに伝送され、ウェブアプリケーションは、適切な情報を抽出するために使用可能なクエリを作成するためにそれらを初期化する。
【００９３】
一つの実施態様では、表示モジュール５は比較結果、およびその比較結果が良好な予後を示すか不良な予後を示すかを表示する。
【００９４】
一つの実施態様では、表示される比較結果に基づくコンテント６は、良好または不良な予後の指標となる信号（例えば、陽性または陰性の信号）であり、従って、陽性または陰性の指標のみが表示され得る。
【００９５】
従って、本発明は、ＨＣＣ被験体において、前記ＨＣＣ被験体の肝臓サンプルからの発現プロファイル情報に基づいて全生存期間および／または無再発生存期間を予測する方法を実施するためのシステム１（およびコンピューターシステムにそれを実施させるためのコンピューター可読媒体７）を提供する。
【００９６】
システム１、およびコンピューター可読媒体７は、単に、ＨＣＣ被験体において、発現プロファイルに基づいて全生存期間および／または無再発生存期間を予測する方法を遂行するための本発明の例示的実施態様であり、本発明の範囲を限定することを意図しない。システム１、およびコンピューター可読媒体７の変形形態も可能であり、本発明の範囲内に入るものとする。
【００９７】
システム１の、またはコンピューター可読媒体で使用されるモジュールは、多くの構成を想定し得る。例えば、機能は単独機に提供されてもよいし、または複数機に分散されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】予後試験のフローチャート。
【図２】トレーニングコホートおよびバリデーションコホートにおける５遺伝子スコアによる予後分析。良好な予後と不良な予後に二分された５遺伝子スコアによる、トレーニングコホートおよびバリデーションコホートにおける全生存期間（ＡおよびＢ）、早期腫瘍無再発生存期間（ＣおよびＤ）ならびに再発後生存期間（Ｅ）。バリデーションコホートにおける５遺伝子スコアの全生存期間に関する時間依存性ＡＵＣ（Ｆ）。不良予後群に分類された患者間の全生存期間に関するサブグループ分析。結果は、全コホート（ｎ＝３１４）におけるハザード比（Ｇ）を用いて表した。
【図３】予後スコアに含まれる５遺伝子の発現。定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いた５遺伝子の発現レベル、５遺伝子スコアにより良好な予後を有する患者および不良な予後を有する患者に階層化。結果は平均値で表し、正常肝臓組織に対して正規化した。統計分析は、ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定を用いて行った。
【図４】５遺伝子スコアによる異なる腫瘍病期分類システムにおける全生存期間。５遺伝子スコアを用いて不良予後群に分類された患者間で全生存期間のサブグループ分析（ＨＣＣ病期分類システム）を行った。結果は、全コホート（ｎ＝３１４）におけるハザード比を用いて表した。
【図５】予後推定を精密化するための総合ノモグラム。臨床分子ノモグラムは５遺伝子スコア、ＢＣＬＣ分類および微小血管侵入を統合した。各成分は点数を与え、それらの点数の合計で線形予測因子および死亡リスクを算定した（Ａ）。このノモグラムで与えられた合計点数に従って全集団を、死亡に関して低リスク患者（＜６０点）、中リスク患者（６０〜１２０点）および高リスク患者（＞１２０点）（Ｂ）の３つのサブグループに分けた。
【実施例】
【００９９】
実施例１．ＨＣＣ患者において全生存期間および無再発生存期間の予測を可能とする分子シグネチャーの同定
患者および方法
患者および組織サンプル
肝臓サンプルは、ボルドー（１９９８〜２００７）およびクレテイユ（２００３〜２００７）の２つのフランス大学病院で、腫瘍に関する肝臓切除の後に系統的に冷凍した。合計５５０サンプルを本研究に含め、本研究は施設内ＩＲＢ委員会(CCPRB Paris Saint Louis, 1997および2004)により承認され、フランス法に従って総ての患者からインフォームド・コンセントを得た。（１）壊死＞８０％の腫瘍、（２）不良な質または不十分な量のＲＮＡを有する腫瘍、（３）非治癒切除のＨＣＣ：Ｒ１またはＲ２切除または手術時に過度な肝転移、（４）肝移植により処置されたＨＣＣが除外された。
【０１００】
一部のＨＣＣ患者（ｎ＝１０）は手術合併症および／または非代償性硬変のために手術の翌月のうちに死亡し、予後分析から除外した（図１の予後の具体的フローチャートを参照）。
【０１０１】
よって、以下のサンプル、すなわち、３２４のＨＣＣ（そのうち３１４が予後分析に適格）、４０の非肝細胞性腫瘍、１５６の良性肝細胞性腫瘍（限局性結節性過形成（ＦＮＨ、ｎ＝２５）、肝細胞腺腫（ＨＣＡ、ｎ＝１１１）、再生性大結節性（異形性を伴うものｎ＝１５、または伴わないものｎ＝５）および３０の非腫瘍サンプルが含まれた。
【０１０２】
予後分析に含んだＨＣＣの臨床データ、組織学的データおよび分子データ  （ｎ＝３１４）を下記の表５および６にまとめる。
【０１０３】
【表５】
2015535176.tif 000012
2015535176.tif 000013
【０１０４】
【表６】
2015535176.tif 000014
【０１０５】
腫瘍および非腫瘍性肝臓サンプルは手術直後に冷凍し、−８０℃で保存した。また、冷凍対応物からの組織サンプルを１０％ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリンおよびエオジンおよびマッソンの三重染色で染色した。ＨＣＡ、ＨＣＣ、ＦＮＨ、粗大再生結節および総ての非肝細胞性腫瘍の診断は、確立された組織学的判定基準に基づいた(International working party Hepatology 1995, international consensus group Hepatology 2009)。腫瘍は総て患者の転帰および初期診断を知らない２名の専門病理学者（ＪＣおよびＰＢＳ）によって独立に評価された。肝細胞性腫瘍のサブタイプ診断に関して、または予後分析に含まれるＨＣＣの病理学的特徴に関して不一致がある場合には、切片を再調査し、一致を見てから試験に用いた。複数の腫瘍の場合は、利用可能な最大結節を本発明者らの予後試験で分析した。
【０１０６】
定量的ＰＣＲによるさらなる分析のための遺伝子の選択
１０３遺伝子を定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析に関して選択した。同じプラットフォームで行ったＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ１３３Ａ遺伝子チップＴＭマイクロアレイハイブリダイゼーションを用い、５７のＨＣＣ（Ｅ−ＴＡＢＭ−３６）、５つのＨＮＦ１Ａ不活性化腺腫（ＧＳＥ７４７３）、７つの炎症性腺腫（ＧＳＥ１１８１９）、４つの限局性結節性過形成（ＧＳＥ９５３６）、９つの非腫瘍性肝臓サンプル（硬変および正常肝臓（Ｅ−ＴＡＢＭ−３６およびＧＳＥ７４７３を含む）を含む８２の肝臓サンプルのｍＲＮＡ発現を分析した。分類目的で、腫瘍の特定のサブグループで差次的に発現される遺伝子を３つの包含基準に従って選択した：
（１）３８の遺伝子が本発明者らによって得られ、Boyault S, et al.2007; Rebouissou S, et al.2007; Rebouissou S, et al.2009 and Rebouissou S, et al.2008に記載されたこれまでのマイクロアレイデータから選択された：ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、ＳＡＥ１、ＮＴＳ、ＨＡＬ、ＳＤＳ、ｃｍｋＯＲ１／ＣＸＣＲ７、ＩＤ２、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＣＤＴ６、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＦＡＢＰ、ＧＬＵＬ、ＬＧＲ５／ＧＰＲ４９、ＴＢＸ３、ＲＨＢＧ、ＳＬＰＩ、ＡＭＡＣＲ、ＳＡＡ２、ＣＲＰ、ＭＭＥ、ＤＨＲＳ２、ＳＬＣ１６Ａ１、ＧＬＳ２、およびＧＮＭＴ；
（２）９つの遺伝子がこれまで文献に記載されている(Odom DT, et al. 2004; Paradis V, et al. 2003; Rebouissou S, et al. 2008; Llovet J, et al. 2006; Capurro M, et al. 2003; Chuma M, et al. 2003; Tsunedomi 2005; Kondoh N 1999)：ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＳＥＲＰＩＮ、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２、ＸＬＫＤ１−ＬＹＶＥ１、ＧＰＣ３、ＨＳＰ７０／ＨＳＰＡ１Ａ、およびＣＹＰ３Ａ７；ならびに
（３）１３の遺伝子が本発明者らのこれまでのマイクロアレイデータの新たな分析から選択された：ＳＴＥＡＰ３、ＲＲＭ２、ＧＳＮ、ＣＹＰ２Ｃ１９、Ｃ８Ａ、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＥＳＲ１、ＧＭＮＮ、ＣＡＰ２、ＤＰＰ８、ＬＣＡＴ、ＮＥＫ７、ＬＡＰＴＭ４Ｂ。
【０１０７】
合計６０の遺伝子を定量的ＰＣＲによりその後の分析のために選択した。
【０１０８】
本発明者らはまた、ＨＣＣの簡単かつ信頼性のある予後のための新規なツールを提供したいと考え、従って、ＨＣＣ予後に関連することが判明した、または既に記載されているさらなる遺伝子もさらなる定量的ＰＣＲ分析に含めた：
（１）根本的に異なる予後によって特徴付けられたＨＣＣ患者間で最も差次的に発現される（有意性および倍率）４１遺伝子のパネルを、治癒的切除により処置された４４のＨＣＣの発現パターンのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイＥ−ＴＡＢＭ−３６分析を用いて得られた新たなマイクロアレイデータにより同定した：ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＰＳＭＤ１、ＡＲＦＧＥＦ２、ＳＰＰ１、ＣＤＣ２０、ＮＲＡＳ、ＥＮＯ１、ＲＲＡＧＤ、ＣＨＫＡ、ＲＡＮ、ＴＲＩＰ１３、ＩＭＰ−３／ＩＧＦ２ＢＰ３、ＫＬＲＢ１、Ｃ１４ｏｒｆ１５６、ＮＰＥＰＰＳ、ＰＤＣＤ２、ＰＨＢ、  ＫＩＡＡ００９０、ＫＰＮＡ２、ＫＩＡＡ０２６８／ＵＮＱ６０７７／ＬＯＣ４４０７５１、Ｇ６ＰＤ、ＳＴＫ６、ＴＦＲＣ、ＧＬＡ、ＡＫＲ１Ｃ１／ＡＫＲ１Ｃ２、ＧＩＭＡＰ５、ＡＤＭ、ＣＣＮＢ１、ＴＫＴ、ＡＧＰＳ、ＮＵＤＴ９、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＮＥＵ１、ＲＡＲＲＥＳ２、ＢＩＲＣ５、ＦＬＪ２０２７３、ＨＭＧＢ３、ＭＰＰＥ１、ＣＣＬ５、およびＤＬＧ７；ならびに
（２）ＨＣＣ  予後に関連するとして文献に記載されている２つの遺伝子（ＫＲＴ１９およびＥＰＣＡＭ）(Lee JS, et al. 2006, Yamashita T, et al.2008)。
【０１０９】
合計４３の遺伝子をＨＣＣ予後との関連に関して選択した。
【０１１０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡ抽出および定量的ＲＴ−ＰＣＲは、従前に記載されているように行った。１０３の選択遺伝子の発現を、ＴａｑＭａｎ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃａｒｄ  ＴＬＤＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）遺伝子発現アッセイを用い、５５０の全サンプルにおいて二反復で分析した。遺伝子発現を、ＲＮＡリボゾーム１８Ｓを用いて正規化し、腫瘍サンプルの発現レベルを正常肝臓組織での対応する遺伝子発現の平均レベルと比較し、ｎ倍率として表した。ＲＮＡの相対量を、２ΔΔＣＴ法を用いて算出した。
【０１１１】
突然変異スクリーニング
ＤＮＡを抽出し、質を評価した。総てのＨＣＡサンプルは、ＣＴＮＮＢ１（エキソン２〜４）、ＨＮＦ１Ａ（エキソン１〜１０）、ＩＬ６ＳＴ（エキソン６および１０）、ＧＮＡＳ（エキソン８）およびＳＴＡＴ３（エキソン２、５および２０）に関して配列決定が行われていた。総てのＨＣＣサンプルは、ＣＴＮＮＢ１（エキソン２〜４）およびＴＰ５３（エキソン２〜１１）に関して配列決定が行われていた。総ての突然変異を、両鎖において、二次的な独立増幅産物を配列決定することにより確認し、生殖細胞系突然変異を検出するために、適合する非腫瘍サンプルにおける突然変異のスクリーニングを行った。
【０１１２】
予後に関するエンドポイント
試験計画は、予後試験ＲＥＭＡＲＫにおけるマーカーに関する報告(McShane LM, et al.2005)およびＥＡＳＬ／ＥＯＲＴＣガイドライン(EASL J, et al.2012)の一般的推奨に従った。手術後、患者を経過観察し、ＨＣＣ再発を血清ＡＦＰの投与およびＣＴスキャン（または肝臓ＭＲＩ）によってスクリーニングした。本試験の主要エンドポイントは、腫瘍関連死を分析することによる疾病特異的な全生存期間であり、本発明者らは別の病因から死亡した患者は打ち切りとした。腫瘍関連死は、肝臓の５０％超を含むＨＣＣ、広範な腫瘍門脈血栓症または肝外転移伴うＨＣＣを有する患者で死亡が見られた場合と定義した。二次的な独立したＨＣＣの出現によるバックグラウンドノイズを制限するために、本発明者らは、生存期間を最初の切除術の後５年で打ち切りとした。最終の経過観察記録受診は２０１１年２月であった。本発明者らはまた、再発する患者の生存期間、すなわち、腫瘍再発から死亡の間と定義される「再発後生存期間」も評価した。
【０１１３】
予後スコアの構築
３１４のＨＣＣは、トレーニングセットＳ１（ボルドーで処置を受けた１８９名の患者）およびバリデーションセットＳ２（クレテイユで処置を受けた１２５名の患者）に分けられた。Ｓ１を基に、評価した１０３の遺伝子それぞれに関して単変量コックスモデルを計算し（生存Ｒパッケージ、ｃｏｘｐｈ関数、ブレスロウ法）、ログランク検定ｐ値が０．０５未満の遺伝子を選択したところ３１遺伝子が得られた。これらの３１遺伝子を、選択基準としてログランク検定ｐ値を用いるステップワイズ法において使用し、Ｓ１に対する多変量コックスモデルを構築した。本発明者らは、改変型ステップワイズフォワード法を用い、ｋ＞２での実施の場合（すなわち、（ｋ−１）個の変数で事前に得られたモデルに基づいてｋ個の変数でのモデルを構築する）、本発明者らは一変数を加え、その後、一変数を除き、再び一変数を加える。加えるまたは除くべき変数は、判定基準を最適化するものの中から選択される。複数の変数が判定基準を最適化している場合には、最初に直面するものが選択される。本発明者らは、１から１０遺伝子の範囲の１０個のモデルを構築する。本発明者らは、次に、最小のモデル、すなわち、判定基準を最適化する変数ができる限り少ないものを選択した。このモデル（ｋ＝５遺伝子）の妥当性を評価するために、それを用いてバリデーションセットＳ２からのサンプルを推定した。
【０１１４】
予後の推定（５遺伝子二分スコア）
あるサンプルが２つの予後クラス０および１（それぞれ好適な転帰および好適でない転帰に相当する）の一方に分類され、Ｎ個の変数、およびこのサンプルの関連評価値Ｘ＝（ｘ１，…，ｘＮ）とすれば、そのサンプルは下記の法則：
予後（Ｘ）＝ＩＲ＋（Λ（Ｘ））、
すなわち、Λ（Ｘ）≧０ならば予後（Ｘ）＝１
Λ（Ｘ）＜０ならば予後（Ｘ）＝０
ここで、
【数６】
2015535176.tif 000015
に基づいてクラス０または１に帰属される。パラメーター（ｍｉ，ｗｉ）は上記表２に示される。
【０１１５】
総合予後スコアにおいて、Λ（Ｘ）の値は、ＢＣＬＣクラスおよび微小血管侵入に加え、インプットとして使用される。
【０１１６】
統計分析
ログランク検定およびカプラン・マイヤー法を用いて、生存期間を評価した。連続変数および離散変数を、それぞれマン・ホイットニーおよびカイ二乗またはフィッシャーの正確確率検定を用いて比較した。単変量および多変量解析はコックスモデルを用いて行った。統計分析はＲ統計ソフトウエアおよびｒｍｓパッケージを用いて行った。
【０１１７】
特定の生存推定に関してシグネチャー精度を検定するための曲線下面積をUno, H., et al.2007に従って求めた。推定規則は、打ち切り回帰モデル(Journal of the American Statistical Association 102, 527-537)で、ｓｕｒｖＡＵＣ  Ｒパッケージを用いてｔ年生存者に関して評価した。ｒｍｓパッケージを使用することにより、ノモグラムを設定した。
【０１１８】
結果
切除ＨＣＣの予後に関連する５遺伝子スコア
切除ＨＣＣの全生存期間および早期腫瘍再発を推定するためのロバストな分子遺伝子スコアの作成と妥当性評価を行うため、１０３遺伝子のセットの発現を予後に適格な３１４のＨＣＣで分析した（図１のフローチャートを参照）。トレーニングセット（ボルドーで処置を受けた１８９名の患者）において、単変量コックス分析およびリーブイン−リーブアウト戦略(leave in-leave out strategy)を用い、最も強い予後連関を示す５遺伝子のパネル（ＴＡＦ９、ＲＡＭＰ３、ＨＮ１、ＫＲＴ１９およびＲＡＮ）を同定した（図２参照）。これらの５遺伝子のうち、４つが不良予後のＨＣＣにおいてアップレギュレートされていた（図３参照）。最後に、トレーニングコホートから、多変量コックスモデルの係数および回帰式を用いて５遺伝子スコアを構成した。次に、この５遺伝子スコアの妥当性を、モンドール病院で処置を受けた１２５名の患者を含む独立したバリデーションコホートにおいて評価した。
【０１１９】
二分化５遺伝子スコアは、トレーニング（ログランクＰ＜０．０００１、図２Ａ）およびバリデーションコホート（ログランクＰ＜０．０００１、図２Ｂ）において全生存期間と有意に関連があった。全特異的生存を推定するための５遺伝子スコアの精度を評価するために、５遺伝子スコアのＡＵＣを、トレーニングコホートでコックス回帰モデルを構築することにより計算し、バリデーションコホートで検定した。種々の期間についてＡＵＣを計算し、図２Ｆに報告する。ＡＵＣの集約尺度を０か月から６０か月までのＡＵＣの積分によって求めたところ０．８０に達した。
【０１２０】
さらに、５遺伝子スコアはまた、トレーニングコホート（ログランクＰ＜０．０００１、図２Ｃ参照）およびバリデーションコホート（ログランクＰ＝０．０００６、図２Ｄ参照）の両方において、早期腫瘍再発とも関連があった。
【０１２１】
次に、本発明者らは、原発腫瘍の分子的予後分類が対応する再発の臨床経過を推定できるかどうかに疑問を持った。結果的に、再発患者のサブグループにおいて、スコア（原発腫瘍に対して遂行）は再発後の死亡リスクを正確に推定した（ログランクＰ＜０．０００１、図２Ｅ参照）。この結果から、術後の患者の早期再発が原発腫瘍に由来することが確認された。結果として、本発明者らにより決定された５遺伝子スコアは、最初の腫瘍および再発の悪性度に関連している。
【０１２２】
完全な除去によって処置された３１４名のＨＣＣ患者のうち、１２９名が５遺伝子スコアによって不良予後群に分類された。分子的不良予後を有するこの群の患者は、これまでにＨＣＣ予後と関連付けられている周知の臨床（ＨＢＶ感染、腫瘍サイズ、術前ＡＦＰ、ＢＣＬＣ病期）、病理学的（大血管および微小血管侵入、腫瘍分化）および分子的特徴（Ｇ３分類、Ｐ５３突然変異）のほとんど総てと有意に関連していた（下表７参照）。これに対し、分子的予後の５遺伝子スコアは、年齢、他の病因、腫瘍数、ＭＥＴＡＶＩＲスコアおよびＣＴＮＮＢ１突然変異とは関連がない。
【０１２３】
【表７】
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【０１２４】
ＨＣＣ患者の予後を評価するための多変量解析
本発明者らはまた、予後を推定するための新たな分子的５遺伝子スコアの独立値を調べることを目的とした。５遺伝子スコアは、トレーニングコホート、バリデーションコホートおよび全コホートにおいて、ＢＣＬＣ病期分類を含む臨床的特徴および病理学的特徴とは独立に全生存期間に関連することが、多変量解析を用いて示された（下表８参照）。
【０１２５】
【表８】
2015535176.tif 000017
【０１２６】
興味深いことに、試験した患者において、ＴＰ５３およびＣＴＮＮＢ１の突然変異は予後に関連が無かった。さらに、Ｇ３分類との関連とともに（下表９参照）、５遺伝子スコアは各患者コホートの予後の推定により寄与が大きかった（下表９参照）。
【０１２７】
【表９】
2015535176.tif 000018
【０１２８】
さらにまた、５遺伝子スコアの性能を、ＷＯ２００７／０６３１１８Ａ１に開示されたいくつかの予後スコアと比較した。この場合にも、５遺伝子スコアは各患者コホートの予後の推定により寄与が大きいことが判明した（下表１０参照）。
【０１２９】
【表１０】
2015535176.tif 000019
【０１３０】
フランスの患者が病期、病因および基礎肝疾患の点でＨＣＣの多様性を示したことから、各条件で５遺伝子スコアの性能を分析した（図２Ｇ参照）。興味深いことに、５遺伝子スコアは、基礎肝疾患、腫瘍の大きさ、腫瘍分化のレベルまたは微小血管侵入の存在とは無関係に、ＨＣＣの各サブタイプにおいて全生存期間と有意に関連していた。さらに、最も慣用されている臨床病期分類であるＢＣＬＣにより分類された患者では、５遺伝子スコアは予後推定を精密化することができた（図２Ｇ参照）。５種類の他の臨床病期分類システム（ＣＬＩＰ、ＪＩＳ、ＴＮＭ分類、ならびにミランおよびメトロチケットカリキュレーター判定基準でも同様の結果が得られた（図３および上の表６参照）。
【０１３１】
これらの結果は総て、ＨＣＣが切除により処置された患者の予後を推定する５遺伝子スコアのロバスト性および強い非依存的能力を強調する。
【０１３２】
最後に、全系列のＨＣＣ患者で、最も関連の大きい臨床変数、病理変数および分子変数を集めて総合予後予測因子を開発した。ＢＣＬＣ分類を微小血管侵入および５遺伝子スコアの統合を行って総合スコアを取得した。図５Ａのノモグラムは、５年における腫瘍関連死を推定するための各変数の寄与を示す。３３および６６パーセンタイルで分けた総合スコア化は、良好な予後、中間の予後および不良な予後を有する患者を正確に区別した（図５Ｂ参照）。
【０１３３】
結論
ＨＣＣ再発の分子推定および関連死は、拡張分野である。１８を超える異なる分子シグネチャーが報告されているが、そのうち外的に妥当性が評価されているものはまだほとんどない(Villanueva A, et al.2010)。これらの妥当性評価済みの分子予後分類の１つが、パラフィン包埋組織で従前に妥当性が評価されたＧ３シグネチャーであった(Boyault S, et al.2007, Villanueva A, et al.2011)。
【０１３４】
この予後シグネチャーに含まれる５遺伝子は、ＴＡＦ９、ＲＡＭＰ３、ＨＮ１、ＫＲＴ１９およびＲＡＮであった。それらは不良予後の腫瘍で、調節を欠いた異なるシグナル伝達経路を示した。ＫＲＴ１９発現に関連した幹細胞／前駆細胞の特徴は不良予後のＨＣＣにおいてすでに記載されている(Lee JS nat med 2006)。同様に、ＴＡＦ９、ＲＡＭＰ３、およびＨＮ１も、ＷＯ２００７／０６３１１８Ａ１でＨＣＣ予後にすでに関連付けられている。これに対し、ＲＡＮは、ＨＣＣ予後における新たな役者である。腫瘍内で確認されたこれらの脱調節は癌の悪性度に関連し、これは術後の早期再発および再発後の生存に関連している。
【０１３５】
本研究において、新たに同定された５遺伝子スコアは、ＨＣＣが切除により処置された患者の予後にＧ３シグネチャーよりも寄与度が高かった。特に、５遺伝子シグネチャーは、Ｇ３サブグループに分類されたほとんどの腫瘍（８６％）を不良な予後を有すると識別したが、非Ｇ３分子サブグループに分類された腫瘍を有する不良予後患者も識別した。
【０１３６】
同様に、単一の新たに同定された５遺伝子スコアはまた、全生存期間または無再発生存期間の予後に関してもＷＯ２００７／０６３１１８Ａ１で開示された種々のシグネチャーよりも寄与度が高いことが判明した。
【０１３７】
本研究で使用した患者の西洋コホートにおいて、２つのフランス大学病院で同様に処置を受けた種々の病因（アルコール、Ｃ型およびＢ型肝炎、代謝疾患）および種々の病期（初期〜浸潤性）のＨＣＣが活用された。主としてＨＢＶ関連ＨＣＣ(Nault JC, et al.2011, Woo HG, et al.2011, Hsu HC, et al.2000)に焦点を当てる他の研究とは対照的に、ＴＰ５３またはＣＴＮＮＢ１突然変異と予後の間の有意な関連は見られなかった。５遺伝子スコア化は、腫瘍病期、病因または硬変の存在とは独立に予後に有意に関連する。
【０１３８】
結論として、本発明者らにより同定された５遺伝子スコアは、ＨＣＣ患者の予後および治療決定を簡単かつ精密にする。
【０１３９】
実施例２．定量的ＰＣＲにより同定されたシグネチャーのマイクロアレイデータへの適用
実施例１に記載の５遺伝子予後予測因子は、ＲＴ定量的ＰＣＲ  ΔΔＣｔ評価用に設計されたプロトコールに基づく。
【０１４０】
同じ５遺伝子予後予測因子（遺伝子ＴＡＦ９、ＲＡＭＰ３、ＨＮ１、ＫＲＴ１９、およびＲＡＮからなる発現プロファイルに基づく）、マイクロアレイデータ専用の１０のさらなるバージョンもまた、５遺伝子シグネチャーの妥当性評価を行うために開発された。
【０１４１】
これらの１０種の「マイクロアレイ」バージョンは、２つの異なるトレーニングセットに基づき、すなわち、一方は定量的ＲＴ−ＰＣＲデータに基づき、他方はマイクロアレイデータに基づき、５つの異なるアルゴリズムを用いて得られた。
【０１４２】
より詳しくは、１０種類の「マイクロアレイ」バージョンは、次のようにして得られた：
・５つの遺伝子ＴＡＦ９、ＲＡＭＰ３、ＨＮ１、ＫＲＴ１９、およびＲＡＮは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ  プローブセット：ＴＡＦ９／２０２１６８＿ａｔ、ＲＡＭＰ３／２０５３２６＿ａｔ、ＨＮ１／２１７７５５＿ａｔ、ＫＲＴ１９／２０１６５０＿ａｔ、ＲＡＮ／２００７５０＿ｓ＿ａｔにマッピングされた。
【０１４３】
・トレーニングセット：２つの択一的トレーニングセットを用いた：
○実施例１に記載のトレーニングセットに対応するＲＴ−ＰＣＲデータを第１のトレーニングコホートとして用いた。発現値はΔΔＣｔ値に相当した；または
○Ｅ−ＴＡＢＭ−３６データセット(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-TABM-36)のうち、全生存期間情報およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ  ＲＭＡ正規化発現プロファイルが利用可能であった４６のＨＣＣを第２のトレーニングコホートとして用いた。この場合、予測因子に用いた値は、生の発現値のｌｏｇ２導関数に相当した。
【０１４４】
・これらの２つの択一的トレーニングセットに基づき、予後予測因子の２×５マイクロアレイバージョンを、下記の５つアルゴリズムを用いて得た：
●二分閾値セットから０までの場合の全生存期間情報を用いたコックスモデル：
【数７】
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式中、
○ｘｉ、１≦ｉ≦５は、発現プロファイルに含まれる５つの遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された発現値を表し、
○ｍｉおよびｗｉ、１≦ｉ≦５は、下記の固定パラメーターであり、
【０１４５】
【表１１】
2015535176.tif 000021
【０１４６】
かつ、患者は、その予後スコアが０より低い場合には良好な予後を示し、その予後スコアが０以上の場合には不良な予後を示す。
【０１４７】
・セントロイドに基づき、推定する変数として非打ち切り全生存期間、および距離として（１−ピアソン相関係数）を、行をセンタリングすることなく使用：
予後スコア(サンプルX)＝Argmin（距離(good);距離(bad))
ここで、
【数８】
2015535176.tif 000022
式中、
○ｘｉ、１≦ｉ≦５は、発現プロファイルに含まれる５つの遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された発現値を表し、
【数９】
2015535176.tif 000023
【数１０】
2015535176.tif 000024
【数１１】
2015535176.tif 000025
【数１２】
2015535176.tif 000026
【０１４８】
【表１２】
2015535176.tif 000027
である。
【０１４９】
・セントロイドに基づき、推定する変数として非打ち切り全生存期間、および距離として（１−ピアソン相関係数）を、中央値行をセンタリングすることなく使用：
予後スコア(サンプルX)＝Argmin（距離(good);距離(bad))
ここで、
【数１３】
2015535176.tif 000028
式中、
○ｘｉ、１≦ｉ≦５は、発現プロファイルに含まれる５つの遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された発現値を表し、
【数１４】
2015535176.tif 000029
【数１５】
2015535176.tif 000030
【数１６】
2015535176.tif 000031
【数１７】
2015535176.tif 000032
【０１５０】
【表１３】
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である。
【０１５１】
・セントロイドに基づき、推定する変数として非打ち切り全生存期間、および距離としてＤＱＤＡを、行をセンタリングすることなく使用：
【数１８】
2015535176.tif 000034
式中、
○ｘｉ、１≦ｉ≦５は、発現プロファイルに含まれる５つの遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された発現値を表し、かつ、
【数１９】
2015535176.tif 000035
【０１５２】
【表１４】
2015535176.tif 000036
である。
○ＣｇｏｏｄおよびＣｂａｄは下記のように定義される。
【数２０】
2015535176.tif 000037
【０１５３】
また
・セントロイドに基づき、推定する変数として非打ち切り全生存期間、および距離としてＤＱＤＡを、中央値行をセンタリングすることなく使用：
【数２１】
2015535176.tif 000038
式中、
○ｘｉ、１≦ｉ≦５は、発現プロファイルに含まれる５つの遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された発現値を表し、かつ、
【数２２】
2015535176.tif 000039
【０１５４】
【表１５】
2015535176.tif 000040
である。
○ＣｇｏｏｄおよびＣｂａｄは下記のように定義される。
【数２３】
2015535176.tif 000041
【０１５５】
上記の結果は、同じ遺伝子に基づくが、別のトレーニングセットおよび／または別の発現レベル測定技術および／または別のアルゴリズムに基づいて異なる較正が行われた予測因子が同等の結果をもたらすことを示す。
【０１５６】
これらの結果はまた、バリデーション群の発現レベルの測定に使用される技術がトレーニング群に使用される技術と同じである必要はないことを示す。
【０１５７】
書誌参照
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【図１】
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【図２Ａ−２Ｅ】
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【図２Ｆ−２Ｇ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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