(57)【要約】  本発明は肝線維症に関連する疾患の治療用薬剤の製造におけるラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ（タンジン）又はその製剤の使用に関する。
2015503572.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝線維症に関連する疾患の治療用医薬品の製造におけるラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ又はその製剤の使用。
【請求項２】
前記製剤がラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ錠剤、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエカプセル剤、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ滴丸剤を含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記製剤がラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ滴丸剤であることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記肝線維症に関連する疾患が、肝硬変、肝炎、肝がんを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
肝細胞の損傷により引き起こされる血清中のＡＬＴ、ＡＳＴレベルの増加を減少する肝臓の損傷の阻害を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
肝機能が損傷された場合のＴＰ及びＡＬＢの合成を増加する肝機能の保護を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
肝星細胞の増殖の活性化の阻害、肝臓組織中のα−ＳＭＡ発現の減少を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
肝星細胞の活性化を阻害すべく、肝臓組織中のＳＯＤの活性の増加、ＭＤＡ発現の減少を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
肝細胞の細胞外マトリクスの過剰堆積の阻害、及びコラーゲンの増加、血清中のＩＶ型コラーゲン含有量の減少、肝臓組織中のＨｙｐレベルの減少を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
肝機能の損傷の阻害、血清中のＮＡＧレベルの増加、肝細胞の細胞外マトリクス中におけるコラーゲン分解の促進を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学の分野に関し、具体的には肝線維症に関連する疾患の治療におけるラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ（Radix Salviae Miltiorrhizae）又はその製剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝線維症は、肝硬変において避けることのできない段階とされ、したがって肝線維症の予防が非常に重要な治療方法となっている。現在、有効な肝線維症予防薬は、臨床においてまだ不足している。サイトカイン及び抗酸化剤を含むいくつかの薬剤が臨床研究のもと検討されてきたが、それらの臨床効果は不十分であった。近年、漢方薬（Traditional Chinese Medicine：ＴＣＭ）が肝線維症予防においてますます注目を集めており、有望な適用可能性を示している。
【０００３】
苦味があり、微寒性であるラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ（タンジン）は、うっ血を解消することによって血液を活性化し、精神を鎮静化することによって血液に栄養分を与え、ようを除去することによって血液を冷却し、生肌を促進し毒素を一掃する治療効果を有する。タンジンは、頻用される血液活性化及びうっ血解消の医薬とされている。タンジンは、脂溶性ジテルペノイド及び水溶性フェノール酸を含有するのみならず、他の成分、例えばフラボノイド、トリテルペン及びステロールも含有する。ここで、キノン及びケトンの構造を有するジテルペノイドは、タンシノンＩ、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩＩＲ、タンシノンＶ、タンシノンＶＩ、クリプトタンシノン、イソタンシノンＩ、イソタンシノンＩＩ、イソタンシノンＩＩＢ及びジヒドロタンシノンンＩ等を含む。水溶性フェノール酸は、ダンシェンス（Danshensu）、プロトカテクアルデヒド、プロトカテク酸、コーヒー酸及び誘導体、又はダンシェンス及びコーヒー酸と共に濃縮されたデプシド（例えば、サルビアノール酸Ａ、サルビアノール酸Ｂ、サルビアノール酸Ｃ、サルビアノール酸Ｄ、サルビアノール酸Ｅ、サルビアノール酸Ｇ、リトスペルミン酸Ｂ、ロスマリン酸及びロスマリン酸メチル等）を含む。上述のタンシノンＩＩＡは、血液活性化及びうっ血解消ジテルペノイドにおける典型的な成分の一つである。近代の薬理的研究によって確認されたように、タンジンは、冠状動脈の拡張、心筋虚血の防止、抗凝血、血栓の形成防止、鎮静作用、疼痛緩和、血液脂質の低下、さらにアテローム性動脈硬化症予防の機能を有する。
【０００４】
本発明では、ＣＣｌ４を用いた複合因子によって誘発された肝線維症モデルを確立し、７週間に亘って、高用量、中用量及び低用量のラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ（Radix Salviae Miltiorrhizae：ＲＳＭ））製剤の試験薬剤を用いて胃内投与した。血清中において、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）の生理活性、並びに総タンパク質（ＴＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）及びＩＶ型コラーゲンの含有量を測定した。肝臓におけるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、Ｈｙｐの生理活性を測定した。肝臓における病理形態学的な変化をＨＥ及びマッソン染色法により観察した。α−ＳＭＡの発現を免疫組織化学により測定した。結果に示されるように、ＲＳＭ製剤は、ＡＬＴ、ＡＳＴ及びＮＡＧの生理活性を阻害する効果、血清中のＩＶ型コラーゲンの含有量を低下する効果、血清中のＴＰ及びＡＬＢの含有量を増加する効果；肝臓組織中のＨｙｐ及びＭＤＡのレベルを減少する効果、肝臓組織中のＳＯＤの生理活性を増加する効果、肝臓組織におけるコラーゲン線維の増殖を制限する効果、並びに肝臓組織中のα−ＳＭＡの発現を減少する効果を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、肝線維症の治療用医薬品の製造におけるＲＳＭ又はその製剤の使用を提供することである。
【０００６】
本発明の別の目的は、肝線維症に関連する疾患、例えば肝硬変、肝炎又は肝がん等の治療用医薬品の製造におけるＲＳＭ又はその製剤の使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、上記ＲＳＭは新鮮なＲＳＭ医用材料、加工されたＲＳＭ医用材料又はＲＳＭ医用材料から製造された製品を含み得る。例えば、ＲＳＭを粉に挽くか又は抽出して製品を得る。ここで抽出方法としては水抽出法、エタノール抽出法又は水抽出及びエタノール沈殿法が挙げられる。さらに、精製工程、例えば樹脂精製が含まれ得る。
【０００８】
本発明によれば、上記ＲＳＭ製剤は、ＲＳＭ医用材料から製造される医薬を含む。これまで、既に商業的に入手可能な上記ＲＳＭ製剤は、サルビア錠剤、サルビアカプセル剤及びサルビア滴丸剤を含む。
【０００９】
本発明によれば、上記ＲＳＭ製剤は、以下の工程、すなわち初めに医用材料を加工し、さらに製剤へと製造される生理活性成分を得る工程を含む方法により調製される。
【００１０】
本発明によれば、ＲＳＭ製剤の調製方法は従来技術に属し、中国特許公報又は発行された薬剤規格より得ることができる。
【００１１】
本発明によれば、上記ＲＳＭ製剤はＲＳＭ滴丸剤から選択されるのが好ましい。
【００１２】
本発明によれば、上記ＲＳＭ製剤は、ＲＳＭから製造される医薬組成物である。上記組成物は、０．１重量％〜９９．９重量％の薬学的に許容可能な担体を含む。上記医薬組成物は単位用量の形態で調製され、この単位用量は、個々の製剤、例えば錠剤類の各錠剤、カプセル剤類の各カプセル剤、経口溶液類の各ボトル、顆粒類の各包み及び注射剤類の各注射剤を指す。
【００１３】
本発明によれば、糖衣錠、フィルムコート錠及び腸溶錠等の錠剤、軟カプセル剤及び硬カプセル剤等のカプセル剤、経口液剤溶液、バッカル錠、顆粒、即席粉末、丸剤、散剤、軟膏及びペースター等のペースト、丹剤（Dan）、懸濁液、粉末、注射剤等の溶液、坐剤、クリーム、噴霧剤、滴剤、滴丸剤及びパッチを含む、任意の薬学的に許容可能な投与形態で、上記ＲＳＭ製剤を調製することができる。
【００１４】
本発明によれば、上記経口投与の投与形態は、通常使用される賦形剤、例えば、接着剤、充填剤、希釈剤、錠剤成形剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、香味剤、湿潤剤を含むことができる。必要であれば上記タブレットはコートすることができる。
【００１５】
本発明によれば、好適な充填剤としては、セルロース、マンニトール、ラクトース及びその他の類似の充填剤が挙げられる。好適な崩壊剤としては、デンプン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びデンプン誘導体（例えばヒドロキシエチルデンプンナトリウム）が挙げられる。好適な潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウムが挙げられる。薬学的に許容される好適な湿潤剤としては、ドデシル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【００１６】
本発明によれば、通常使用される方法、例えば、混合、充填及び打錠により上記組成物の経口固形製剤を調製することができる。繰り返し混合することにより、生理活性成分（ＡＰＩ）を多量の充填剤中へと均一に分散させることができる。
【００１７】
本発明によれば、経口液体製剤は、水溶性又は油溶性のいずれかの懸濁液、溶液、乳剤、シロップ若しくはエリキシル剤、又は臨床での使用の前に水若しくは他の好適な溶媒によっていつでも再構成される乾燥粉末の投与形態である。この液体製剤は、従来の添加剤、例えば、懸濁剤、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル又は硬化食用脂；乳化剤、例えばレシチン、ソルビタンモノオレエート又はアラビアゴム；非水系担体（食用油を含む）、例えばアーモンド油、分留ヤシ油、エステル油（グリセリド等）、プロピレングリコール又はエタノール；並びに防腐剤、例えばメチルパラベン、ニパゾール、ソルビン酸を含有し得る。必要であれば、従来の香味剤又は着色剤を含むことができる。
【００１８】
本発明によれば、上記注射剤は、生理活性成分及び無菌担体を含有する。上記生理活性成分を、担体の種類及び濃度に応じて溶解又は懸濁することができる。一般的に、溶液は、担体中に生理活性成分を溶解し、滅菌し、好適なバイアル又はアンプルに充填して密封することにより調製される。一部のアジュバント、例えば局所麻酔剤、防腐剤及び緩衝剤を担体中に溶解することができる。その安定性を改善するため、バイアル中に充填した後、この本発明の組成物を真空下で凍結乾燥して水を除去することができる。
【００１９】
本発明によれば、上記ＲＳＭ製剤を、任意に、薬学的に許容可能な担体を添加することにより調製することができる。上記キャリアは、糖アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、キシリトール；アミノ酸、例えば、塩酸システイン、メチオニン、グリシン；ビタミンＣ；ＥＤＴＡ二ナトリウム、ＥＤＴＡカルシウム二ナトリウム塩；無機塩、例えば、１価アルカリの炭酸塩、１価アルカリの酢酸塩及び１価アルカリのリン酸塩又はその水溶液、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム；炭酸カルシウム、重炭酸カルシウム；ステアリン酸塩、例えば、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム；無機酸、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸；有機酸、例えば、酢酸、メルカプト酢酸；有機酸、例えば、酪酸ナトリウム；オリゴ糖、多糖、セルロース及びその誘導体、例えば、マルトース、グルコース、フルクトース、デキストラン、スクロース、ラクトース、シクロデキストリン（β−シクロデキストリン）、デンプン；シリコーン（silicon）誘導体；アルギン酸塩；ゼラチン；ＰＶＰ；グリセロール；Ｔｗｅｅｎ−８０、寒天ゲル；界面活性剤；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；カオリン；及びタルカムパウダー等から選ばれる物質を含むが、これらに限定されない。
【００２０】
本発明によれば、上記ＲＳＭ製剤のプロトコル及び投与量は、診療所の患者の状態に依存する。例えば、実施例１の方法により調製されたＲＳＭ滴丸剤を、一連の治療として１日３回、毎回２０錠を２４〜３２週間に亘って患者に投与する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ラットのＣＣｌ４誘発性肝線維症におけるＲＳＭ滴丸剤によるα−ＳＭＡ発現の影響を説明する図である（１０×２０）。
【図２】ラットのＣＣｌ４誘発性肝線維症におけるＲＳＭ滴丸剤による病理形態学の影響を説明する図である（ＨＥ染色、１０×１０）。
【図３】ラットのＣＣｌ４誘発性肝線維症におけるＲＳＭ滴丸剤による病理形態学の影響を説明する図である（マッソン染色、１０×１０）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の範囲を制限することを何ら意図するものではなく、単なる例示の目的で以下の実施例が提供される。
【実施例】
【００２３】
実施例１  ＲＳＭ滴丸剤の調製
処方：
ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ１００ｇを使用して１０００個の滴丸剤を得た。
【００２４】
調製方法：
粗く挽いたラディックス・サルビア・ミルチオルヒザエを抽出タンクに入れ、その中にラディックス・サルビア・ミルチオルヒザエ粗医薬の重量の７倍の水を注いで、各回２時間に亘って２回煎じた。煎じたものを組み合わせた後、溶液を濾過し、容量対重量の比率が１Ｌ：１ｋｇになるまで濃縮して抽出物を得た。抽出物の上清を遠心分離によって回収し、マクロ多孔質樹脂に通した。樹脂を水で洗浄してエタノールで溶出し、溶出物を濃縮して相対密度が１.３１〜１．３８（５０℃〜６０℃）であり、抽出物１ｇ中のダンシェンスが１０ｍｇ以上の濃度のＲＳＭ抽出物を得た。上述のＲＳＭ抽出物に適切な量のＰＥＧを添加し、よく撹拌し、水浴上で溶解させ、滴下機のタンク内に移した。温度を７５℃〜８５℃に保持した。丸剤の重量に照らして好適なドリッパーを選択した。上述のＲＳＭ抽出物を、氷浴で冷却した液体パラフィンに１分当たり６０錠〜８０錠の速度で滴下した。形成後、丸剤を取り出し、ブロッティング紙で拭き取り表面の液体パラフィンを除去した。製品を得た。
【００２５】
実施例２  ＲＳＭ錠剤の調製
処方：
１０００個の錠剤を調製するため、ＲＳＭ抽出物２６２ｇ、デンプン４０ｇ、軽質酸化マグネシウム６０ｇ、ステアリン酸マグネシウム７ｇ、タルカムパウダー８０ｇ。
【００２６】
調製方法：
粗く挽いたラディックス・サルビア・ミルチオルヒザエを９５％エタノールで、各回２時間に亘って３回抽出した。エタノール回収の後、抽出物を濃縮して高濃度の抽出物を得た。得られた薬剤残渣を水で各回１時間に亘って２回煎じ、更に濾過した。濾過物を適切な容量まで濃縮し、上述の高濃度抽出物と混合してＲＳＭ抽出物を得た。
【００２７】
上述のＲＳＭ抽出物を、６０℃〜７０℃まで（直火を使用せずに）加熱し、撹拌により溶解させ、軽質酸化マグネシウム、タルカムパウダー（６０ｇ）及びデンプンをそれぞれ添加し、よく混合して乾燥プレート上に置いた。得られた材料を、６０℃のもとでわずか３％の水分含有量まで乾燥し、１４メッシュ篩のもとで挽いて顆粒（ブロック）にした。最後に、ステアリン酸マグネシウム及びタルカムパウダー（２０ｇ）を添加し、１２メッシュ篩を用い、よく混合して顆粒化し、打錠し、検査して糖衣した。
【００２８】
実施例３  ＲＳＭカプセル剤の調製
処方：
１０００個のカプセルを調製するため、ＲＳＭ抽出物４０６ｇ、デンプン４０ｇ、及び１０％デンプンスラリー。
【００２９】
調製方法：
粗く挽いたラディックス・サルビア・ミルチオルヒザエを９５％エタノールで、各回２時間に亘って３回抽出した。エタノール回収の後、抽出物を濃縮して高濃度の抽出物を得た。得られた薬剤残渣を水で各回１時間に亘って２回煎じ、更に濾過した。濾過物を適切な容量まで濃縮し、上述の高濃度抽出物と混合してＲＳＭ抽出物を得た。
【００３０】
上述のＲＳＭ抽出物を粉砕し、８０メッシュ篩を通し、１０％デンプンスラリーを添加して、軟質材料を製造し１４メッシュナイロン篩により顆粒化した。得られた顆粒をわずか３％の水分含有量まで７０℃で乾燥させた。これらの顆粒を混合し、＃１カプセルシェルに充填して製品を得た。
【００３１】
実施例４  ＲＳＭ顆粒の調製
処方：
１０００個の顆粒を調製するため、ＲＳＭ１００ｇ。
【００３２】
調製方法：
粗く挽いたラディックス・サルビア・ミルチオルヒザエを抽出タンクに入れ、その中にラディックス・サルビア・ミルチオルヒザエ粗医薬の重量の７倍の水を注いで、各回２時間に亘って２回煎じた。煎じたものを組み合わせた後、溶液を濾過し、容量対重量の比率が１Ｌ：１ｋｇになるまで濃縮して抽出物を得た。抽出物の上清を遠心分離によって回収し、マクロ多孔質樹脂に通した。樹脂を水で洗浄してエタノールで溶出し、溶出物を濃縮して相対密度が１.３１〜１．３８（５０℃〜６０℃）であり、抽出物１ｇ中のダンシェンスが１０ｍｇ以上の濃度のＲＳＭ抽出物を得た。上述のＲＳＭ抽出物に５倍の砂糖粉末を添加し、よく混合して、７０％エタノールを添加し、軟質材料を製造した。この軟質材料を１４メッシュナイロン篩により顆粒化した。得られた湿顆粒（wet granules）を６０℃で乾燥した。乾燥した顆粒を初めに１４メッシュ篩、更にＮｏ．４篩（６５メッシュ）により篩過させて微細粉末を取り除き、別々に充填し、密封して製品を得た。
【００３３】
治験例５：ＲＳＭ製剤の有効性試験
ＨＳＣ（肝星細胞）の活性化及び細胞外マトリクス（ＥＣＭ）過剰堆積は、いずれも肝線維症に重要な事象と考えられている。常に、活性化されたＨＳＣは増殖し、筋線維芽細胞へと転換されて多量のＥＣＭを生じる。その機構が肝細胞膜を直接的に加水分解する場合があり、肝細胞の変性壊死をもたらすことから、本実験ではＣＣｌ４誘発性肝線維症を使用した。ＣＣｌ４の毒性は、主にその活性な代謝産物に関連する。ＣＣｌ４は、肝細胞中の混合機能オキシダーゼによって、活性なクロロホルムフリーラジカル及び塩素ラジカルへと代謝される。これらのフリーラジカルは、最終的に肝細胞の酵素の機能を失わせ、膜脂質過酸化及びカルシウム濃度の増加を起こして、肝細胞の傷害による壊死及び線維症を引き起こす。しかしながら、この線維症モデルには、自己治癒傾向がある。そのため、研究は予防的投与の手法で行われた。ＡＬＴ及びＡＳＴの活性は、肝細胞の傷害に対して高感度のバイオマーカーである。ＴＰ及びＡＬＢの減少は、肝細胞の合成機能の傷害に比例する。
【００３４】
肝線維症の重要な因子の一つは、ＥＣＭの過剰堆積である。コラーゲンはＥＣＭの主な構成成分であり、Ｈｙｐはコラーゲンの主な構成成分である。線維症の進行の間のコラーゲンの増減に伴って変化する肝細胞のＨｙｐは、コラーゲン含有量及び肝線維症の程度の評価のための重要なマーカーとして同定されている。リソソームのタンパク質分解酵素であるＮＡＧは、結合組織マトリクスの加水分解代謝に関与する。血清中のその活性は肝線維症と相関すると考えられており、結合組織コラーゲンの分解を表す。同様に、血清中のＩＶ型コラーゲン含有量の変化は、肝線維症の程度を判定するうえで非常に実用的なマーカーであることが確認されている。
【００３５】
正常な条件下では、ＨＳＣは定常状態に維持される。病理的条件下では、ＨＳＣは活性化され、α−ＳＭＡ（α−平滑筋アクチン）を発現する。ＨＳＣによるＳＭＡ発現は、その顕著な特徴の一つとして見られる。医薬の効果を示すため、免疫組織化学技法及び画像解析ソフトウェアを使用してα−ＳＭＡを分析した。
【００３６】
上述の因子に基づいて、ＲＳＭ製剤に対する薬理学的試験を以下のように計画した。
【００３７】
１．材料
１．１  動物
体重１４０ｇ〜１６０ｇのＷｉｓｔａｒ雄ラットをTianjin Shanchuanhong Animal Co., Ltd.（認定番号：ＳＣＸＫ（ＪＩＮ）２００９−０００１）から購入した。
【００３８】
１．２  試薬
ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＰ及びＡＬＢのキットをBioSino Bio-technology and Science Inc.から得た。ＳＯＤ、ＭＤＡ、Ｈｙｐ及びＮＡＧのキットをNanjing Jiancheng Biochemical Instituteから購入した。ＩＶ型コラーゲンキットをAdlitteram diagnostic laboratories Inc.から購入した。α−ＳＭＡマウスモノクローナル抗体をabcam Inc.から得た。モノクローナル抗体キット、ＤＡＢ染色キットをBeijing Zhongshanjinqiao Inc.から購入した。ＣＣｌ４をTianjin Tianhe Reagent Factoryから購入した。Ｆｕｚｈｅｎｇｈｕａｙｕ（ＦＺＨＹ）カプセル剤（バッチ番号：１００４０３）をShanghai Huanghai Pharmaceutical Companyから購入し、使用前に蒸留水で溶解して懸濁液を調製した。ＲＳＭ滴丸剤（バッチ番号：１００１０１）は、実施例１の方法に従ってTianjin Tasly Pharmaceutical Co., Ltdにより製造された。
【００３９】
１．３  装置
ＬＸＪ−ＩＩＢ低速大容量マルチチューブ遠心分離機を、Shanghai Anting Apparatus Inc.から購入した。ＳＵＮＲＩＳＥ酵素標識装置をSUNRISE Austriaから購入した。ＰＬ  ２０３電子天秤は、METTLER TOLEDO（上海）Inc.により製造された。Ｈｉｔａｃｈｉ  ７０８０自動化学アナライザーを株式会社日立製作所（日本）から購入した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＨ−２の通常顕微鏡をオリンパス株式会社（日本）から購入した。
【００４０】
２．方法
２．１  モデルの確立
対照群を除き、他の群のラットに最初に５ｍｌ／ｋｇで純ＣＣｌ４を皮下（ｓｃ）注射し、その後、７週間に亘って３日毎に３ｍｌ／ｋｇで４０％純ＣＣｌ４−オリーブオイルを皮下注射した。最初の２週間、ラットに２０％のブタ油及び０．５％のコレステロールの飼料を給餌し、第３週〜第６週は単純なコーンミール飼料を給餌した。
【００４１】
２．２  グループ分け及び投与
体重１４０ｇ〜１６０ｇの９０匹の健康な雄ラットを無作為に６群：対照群（ｎ＝１０）、モデル群（ｎ＝１６）、ＦＺＨＹ群（１５００ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１６）、ＲＳＭ滴丸剤の高用量群（７００ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝１６）、中用量群（３５０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝１６）及び低用量群（１７５ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝１６）に分けた。モデル作製の日に、ラットに対応する医薬を胃内投与し、７週間に亘って対照群及びモデル群に蒸留水（１０ｍＬ／ｋｇ）を投与した。最後の投与から１時間後、ペントバルビタールナトリウムの筋肉内注射によりラットを麻酔し、腹部大動脈から採血した。後の使用のため、遠心分離により血清を回収した。同一部位の肝臓組織を迅速に取り出し、ＨＥ染色及びマッソン染色用に１２％ホルマリン液で固定した。他の部位の肝臓組織を免疫組織化学染色用に１０％ホルマリン液で固定し、残りの肝臓組織を通常の生理食塩水により１０％肝臓組織ホモジネートに調製した。
【００４２】
２．３  バイオマーカーの測定
バイオマーカー、例えばＡＬＴ、ＡＳＴの活性、ＴＰ、ＡＬＢ、ＮＡＧ及びＩＶ型コラーゲンの含有量、肝臓ＳＯＤの活性、並びにＭＤＡ及びＨｙｐの含有量、α−ＳＭＡの発現を、パラフィン切片を作製した後に免疫組織化学染色、ＨＥ染色及びマッソン染色により測定した。
【００４３】
２．４  免疫組織化学法により測定された肝臓組織中のα−ＳＭＡの発現
パラフィン切片を通常の方法により脱パラフィンし、水和させてＰＢＳで１５分間洗浄した。内因性のペルオキシダーゼを３％Ｈ２Ｏ２により遮断し、室温にて１０分間インキュベートしてＰＢＳで１５分間洗浄した。さらに、それらを０．０１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウム緩衝溶液におき、電磁気コンロ上で１５分間修復し、自然冷却の後ＰＢＳで１５分間洗浄し、不要な溶液を除去した。α−ＳＭＡモノクローナル抗体（１：１００）を滴下し、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳで１５分間洗浄した。Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｈｅｌｐｅｒを滴下し、３７℃にて２０分間インキュベートし、ＰＢＳで１５分間洗浄した。ポリ−ＨＲＰ抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体を滴下し、３７℃で２０分間インキュベートし、ＰＢＳで１５分洗浄し、ＤＡＢにより染色し、水道水で１０分間洗浄し、ヘマトキシリンにより再染色し、脱水し、透徹して顕微鏡による調査のため密封した。α−ＳＭＡ染色は、褐色がかった黄色であった。画像を画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏｐｌｕｓ  ６．０）により分析し、５視野を無作為に選択して積分光学密度（ＩＯＤ）を記録した。ＩＯＤ値が高いほど、より強い陽性発現性製品である。
【００４４】
２．５  組織病理学的試験
ＨＥ染色及びマッソン染色の後、肝線維症の程度を顕微鏡下で調査し、半定量的に分析した。肝線維症の等級づけ基準を以下に提示する。
【００４５】
「−」は正常な肝臓を表し、門脈域においてごくわずかな線維性結合組織が観察され、これは正常な状態である。
【００４６】
「＋」は、門脈域及び肝小葉中の中心静脈周辺のコラーゲン増殖を表し、線維中隔の形成を伴わず、線維化束の中心静脈及び門脈への拡散及び放射（irradiation）はほとんど観察されず、肝小葉は変化しないままであった。
【００４７】
「＋＋」はコラーゲンの増殖を表し、不完全な間隔で形成された線維化束の中心静脈及び門脈への拡散及び放射が観察され、肝小葉のほとんどが保存された。
【００４８】
「＋＋＋」は、大量のコラーゲン増殖を表し、小葉構造の破壊を伴って少量の偽葉が形成された。
【００４９】
「＋＋＋＋」は中隔の肥厚を表し、偽葉が形成された。
【００５０】
２．６  統計学的解析
ＳＰＳＳ１１．５ソフトウェアパッケージを使用してデータを分析し、ｔ検定を使用して群間の差を分析した。データｘ±ｓとして表した。病理組織の病変度をＳＰＳＳ１１．５ノンパラメトリック検定（NPar Tests）、マン・ホイットニー検定で分析し、Ｅｘｃｅｌにより示した。
【００５１】
３．結果
３．１  肝線維症ラットの血清ＡＬＳ、ＡＳＴ、ＴＰ及びＡＬＢに対する効果
表１に示されるように、対照群と比較して、モデル群の血清ＡＬＴ及びＡＳＴの活性は有意に増加し（Ｐ＜０．０１）、ＴＰ及びＡＬＢの含有量は有意に減少した（Ｐ＜０．０１）。モデル群と比較して、中用量及び低用量のＲＳＭ滴丸剤群におけるＴＰ及びＡＬＢの含有量は有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、血清ＡＬＴ及びＡＳＴの活性は有意に減少した（Ｐ＜０．０５）。
【００５２】
３．２  肝線維症ラットの血清ＮＡＧ及びＩＶ型コラーゲンに対する効果
表２に示されるように、対照群と比較して、モデル群の血清ＮＡＧの活性は有意に増加し（Ｐ＜０．０１）、ＩＶ型コラーゲンは増加した。モデル群と比較して、３種類の用量のＲＳＭ滴丸剤群における血清ＮＡＧの活性は有意に減少し（Ｐ＜０．０１）、ＲＳＭ滴丸剤中用量群及び低用量群におけるＩＶ型コラーゲンの含有量は減少した（Ｐ＜０．０５）。
【００５３】
３．３  肝線維症ラットの肝臓組織におけるＳＯＤの活性化、並びにＭＤＡ及びＨｙｐのレベルに対する効果
表３に示されるように、対照群と比較して、モデルラットの肝臓組織中のＳＯＤの活性は、有意に減少し（Ｐ＜０．０５）、ＭＤＡ及びＨｙｐのレベルは有意に増加した（Ｐ＜０．０１）。モデル群と比較して、３種類の用量のＲＳＭ滴丸剤群におけるＳＯＤの活性は有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、ＲＳＭ滴丸剤低用量群におけるＭＤＡのレベルは有意に減少し（Ｐ＜０．０５）、３種類の用量のＲＳＭ滴丸剤群におけるＨｙｐのレベルは有意に減少した（Ｐ＜０．０１）。
【００５４】
３．４  肝線維症ラットの肝臓組織におけるα−ＳＭＡの発現に対する効果
図１及び表４に示されるように、対照群の血管壁に陽性染色が見られた。対照群と比較して、モデル群におけるα−ＳＭＡの陽性発現は、明らかに強くなっていた。線維中隔、血管壁及び線維症組織増殖領域において、広く陽性染色を発現した。胆管細胞においては発現が見られなかった。３種類の用量のＲＳＭ滴丸剤群におけるα−ＳＭＡ陽性発現の分布は、モデル群のものと類似していたが、黄色染色の領域は幾分減少していた。ＩＯＤ試験により、対照群と比較してモデル群のＩＯＤ値は有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。モデル群と比較して、中用量及び低用量のＲＳＭ滴丸剤群におけるＩＯＤ値は有意に減少した（Ｐ＜０．０５）。結果に示されるように、ＲＳＭ滴丸剤は、肝線維症ラットにおいてα−ＳＭＡ発現の増強に抵抗し、ＨＳＣ増殖を抑制することができる。
【００５５】
３．５  肝線維症ラットの肝臓組織における病理形態学に対する効果
表５、図２及び図３に示されるように、対照群の肝小葉は完全であり、組織は明瞭で、肝臓細胞は中心静脈によって形態学的に正常に肝細胞索に配置され、肝類洞は明瞭であった。より大きな門脈域において、ごくわずかな線維症組織が存在し、これは正常状態である。対照群と比較すると、モデル群のラットの肝小葉は種々のレベルで損傷を受け、肝細胞は不規則に配置され、線維症組織は門脈域、中心静脈及び門脈において種々のレベルで増殖しており、モデル化の成功を示している。投与群のラットにおいて上述の疾患が見出され、これはモデル群に比べて顕著に少なかった。ラットの線維症を病理学的な変化、及び国内外の線維症の等級づけ基準に照らして等級づけをした。有意性検定は等級づけの結果に対するものである。３種類の用量のＲＳＭ滴丸剤は、肝線維症を著しく（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）改善することができる。結果に示されるように、ＲＳＭは、肝線維症ラットに対して顕著な保護効果を有する。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
【表２】
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【００５８】
【表３】
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【００５９】
【表４】
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【００６０】
【表５】
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【００６１】
結果に示されるように、ＲＭＳ滴丸剤は、特に中用量及び低用量でＡＬＴ及びＡＳＴの増加を顕著に阻害し、ＴＰ及びＡＬＢの合成を増強することができる。ＲＳＭ滴丸剤は、肝細胞を保護し、肝臓損傷を阻害する効果を有することが示されている。
【００６２】
結果に示されるように、ＲＳＭ滴丸剤は、特に中用量及び低用量でＨｙｐ及びＩＶ型コラーゲンの増加を阻害し、ＮＡＧの活性を減少することができる。ＲＳＭ滴丸剤は、コラーゲンの分解を促進することによってコラーゲンの沈殿を阻害する効果を有し、肝線維症の程度を顕著に改善することが示されている。ＳＯＤ及びＭＤＡの変化は、肝臓の損傷の程度を直接的又は間接的に表す。結果に示されるように、ＲＳＭ滴丸剤は、特に中用量及び低用量でＳＯＤの活性を増加し、ＭＤＡのレベルを低下することができる。ＲＳＭ滴丸剤は、フリーラジカルを低下し、脂質の過酸化を減少する効果を有することが示されている。
【００６３】
結果に示されるように、ＲＳＭ滴丸剤は、特に中用量及び低用量でα−ＳＭＡのより高い発現を阻害することができる。ＲＳＭ滴丸剤はＨＳＣ増殖の阻害効果を有することが示されている。ＲＳＭ滴丸剤の線維症予防機構は、ＨＳＣによるα−ＳＭＡ発現の阻害と関係がある。病理学的試験の結果に示されるように、ＲＳＭ滴丸剤は、特に中用量及び低用量で肝線維症によって引き起こされる損傷を顕著に改善することができ、肝線維症ラットに対する保護効果を示している。
【００６４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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