(57)【要約】  ＴＡＬＥＮを使用して遺伝子改変家畜および他の動物を作製するための組成物および方法について記載する。本発明の実施形態の一部は、計画されていない遺伝子改変はまったく含まないファウンダー動物の作製を提供する。一部の実施形態は、ゲノムに他の変化を与えずに、確立した品種の遺伝子欠陥を除去することに関する。他の実施形態は、好ましく短縮されているＴＡＬＥＮなどの特定のツールまたはプロセスに関する。
2015519923.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変動物を作製する方法であって、
胚または細胞の標的染色体部位に特異的に結合するＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡに前記胚または細胞を曝露する工程と、
代理母において前記細胞をクローニングする工程または代理母に前記胚を移植する工程であって、
前記代理母が、それによって、レポーター遺伝子を含むことなく、かつ前記ＴＡＬＥＮ標的化染色体部位でのみ遺伝子改変されている動物を妊娠する工程と
を含む方法。
【請求項２】
レポーター遺伝子を含まない前記ＴＡＬＥＮに前記胚を曝露する工程であって、約１％超の前記胚において前記標的化染色体部位に改変が組み込まれる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一連の形質を発現できることが公知の遺伝的性質を有する胚を準備し、レポーター遺伝子を含まない前記ＴＡＬＥＮに前記胚を曝露し、前記改変のためにかつ前記一連の形質の発現のために、前記妊娠動物をスクリーニングする工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
レポーター遺伝子を含まない前記ＴＡＬＥＮに前記細胞を曝露し、前記細胞をクローニングする工程であって、１％超の前記クローニング細胞により、前記標的化染色体部位に前記改変が組み込まれた動物が提供される工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
レポーター遺伝子を含まない前記ＴＡＬＥＮに前記細胞を曝露し、クローン細胞のコロニーを作製し、前記コロニーのメンバーのサブセットを試験して、前記標的化染色体部位に前記改変が組み込まれたコロニーを同定する工程を含む、請求項１または３に記載の方法。
【請求項６】
前記コロニーのメンバーの前記サブセットの試験が破壊的プロセスである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試験プロセスが、核酸分解アッセイ、シーケンシング、ＰＡＧＥ、ＰＣＲ、プライマー伸長、またはハイブリダイゼーションからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子改変が、挿入、欠失、逆位、または転座からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＡＬＥＮが第１のＴＡＬＥＮであり、前記標的化染色体部位が第１の部位であって、第２の標的化染色体部位に向けられた第２のＴＡＬＥＮをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
外来性配列を含有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に前記胚または細胞を曝露する工程であって、前記遺伝子改変が前記外来性配列を含む工程をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記外来性配列が、前記ＴＡＬＥＮ標的化染色体部位の代替アレルを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記代替アレルが、量的形質または質的形質に関連する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記代替アレルが、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅウシに存在するミオスタチンアレルを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞または胚が第１の品種に属し、前記アレルが動物の第２の品種に属する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の品種がＷａｇｙｕまたはＮｅｌｏｒｅのウシであり、前記第２の品種がＢｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅウシであり、その子孫がＷａｇｙｕまたはＮｅｌｏｒｅの子ウシである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アレルが、挿入、欠失、多型、および一塩基多型からなる群から選択される、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記代替アレルが、
家畜形質を増強し、かつ無角遺伝子座、受胎能欠損の劣勢遺伝子、食肉生産を増強するための遺伝子、乳製品生産を増強するための遺伝子、アフリカブタコレラに対する耐性遺伝子、およびそれらの組合せからなる群から選択されるか；または
動物モデルを提供し、かつ動物サイズ低減のための遺伝子、腫瘍増殖を増強する遺伝子、癌遺伝子、高コレステロール血症遺伝子、炎症性腸疾患遺伝子、二分脊椎遺伝子、肺高血圧症遺伝子、心臓欠陥の原因遺伝子、および小児脂肪便症遺伝子からなる群から選択される、
請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的化染色体部位が、遺伝子の破壊のために選択され、前記遺伝子の破壊が、前記遺伝子をコードする配列および／またはそのシス調節エレメントの中の１つまたは複数の塩基の挿入、欠失、または置換を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子改変が、挿入、欠失、外来性核酸配列への変化、逆位、転座、天然アレルへの遺伝子変換、合成アレルへの遺伝子変換、異種間のアレル移動、同一種のアレル移動、および新規アレルへの遺伝子変換からなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞または胚にリコンビナーゼを送達する工程をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡとして前記細胞に直接導入される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞の中への前記直接導入が、エレクトロポレーション、トランスフェクション、リポフェクション、リポソーム、ヌクレオフェクション、遺伝子銃粒子、ナノ粒子、脂質トランスフェクション、電気融合、および直接インジェクションからなる群から選択される方法を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡが、前記ｍＲＮＡをコードするプラスミドとして前記細胞に導入される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＴＡＬＥＮをコードするベクターが前記細胞に導入された後に、前記ｓｓＤＮＡが前記細胞に導入される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２５】
ＴＡＬＥＮを発現する前記ベクターが前記細胞に導入された後、約８時間〜約３日の間に、ｓｓＤＮＡが前記細胞に導入される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡが、前記ｓｓＤＮＡとほぼ同時に前記細胞に直接導入される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が初代細胞または幹細胞であり、前記方法が正または負のいずれかの生存選択基準を必要とする選択ステップを含むことなく実施される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記妊娠動物が、ブタ、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、魚類、ゼブラフィッシュ、イヌ、マウス、ネコ、マウス、ラット、および実験動物からなる群から選択される、請求項１〜２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、家畜細胞、偶蹄目動物細胞、培養細胞、初代細胞、初代体細胞、接合体、始原生殖細胞、幹細胞、および接合体からなる群から選択されるか、または前記胚が胚盤胞である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＴＡＬＥＮが、ｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮであり、前記ｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮと共に導入されるｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮをさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が、初代体細胞または幹細胞である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が、体細胞核移植またはクロマチン移植によりクローニングされる、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記妊娠動物が、前記改変についてホモ接合型である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記妊娠動物がファウンダー動物である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法に従って調製された遺伝子改変動物。
【請求項３６】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法により作製されたファウンダー動物。
【請求項３７】
遺伝子改変された非ヒト動物細胞または胚を作製する方法であって、
前記胚または細胞の標的化染色体部位に特異的に結合するＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡに前記動物の胚または細胞をインビトロで曝露する工程であって、前記細胞または胚が前記標的化染色体部位でのみ遺伝子改変される工程を含み、かつ前記方法がレポーター遺伝子を含むことなく実施される方法。
【請求項３８】
前記細胞を含み、かつ前記細胞を培養し、前記細胞のコロニーを単離する工程をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
遺伝子改変細胞を選択するための正または負の選択圧をかける添加物質を含むことなく実施される、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
外来性配列を含有する一本鎖ＤＮＡに、インビトロで前記動物の前記胚または細胞を曝露させる工程をさらに含む、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞を含み、かつ前記細胞を培養し、前記細胞のコロニーを単離する工程であって、試験細胞が単離されたコロニーから採取され、前記細胞がどのように改変されているかを決定するために前記細胞を試験する工程をさらに含む、請求項３７または３９〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記試験が、前記試験細胞を破壊する破壊プロセスである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が初代細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記初代細胞が、ブタ、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、魚類、ゼブラフィッシュ、イヌ、マウス、ネコ、マウス、ラット、および実験動物からなる群から選択される細胞である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＴＡＬＥＮをコードし、配列番号１３２に対して少なくとも８０％の相同性を有するＮ末端リーダー部分をコードする核酸に、インビトロ培養物中の非ヒト初代細胞または非ヒト胚を曝露する工程を含む、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
レポーター遺伝子を含まない前記ＴＡＬＥＮに前記細胞を曝露する工程であって、１％超の前記細胞において前記標的化染色体部位に前記改変が組み込まれる工程を含む、請求項３７〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
レポーター遺伝子を含まない前記ＴＡＬＥＮに前記細胞を曝露し、クローン細胞のコロニーを作製し、前記コロニーのメンバーのサブセットを試験して、前記標的化染色体部位に前記改変が組み込まれたコロニーを同定する、請求項３７〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記遺伝子改変が、挿入、欠失、逆位、または転座からなる群から選択される、請求項３７〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＴＡＬＥＮが第１のＴＡＬＥＮであり、前記標的化染色体部位が第１の部位であり、前記方法が第２の標的化染色体部位に向けられた第２のＴＡＬＥＮをさらに含む、請求項３７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
外来性配列を含有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に前記胚または細胞を曝露する工程であって、前記遺伝子改変が前記外来性配列を含む工程をさらに含む、請求項３７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記外来性配列が、前記ＴＡＬＥＮ標的化染色体部位の代替アレルを含む、請求項３７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記代替アレルが、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅウシに存在するミオスタチンアレルを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記アレルが、挿入、欠失、多型、および一塩基多型からなる群から選択される、請求項３７〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的化染色体部位が、遺伝子の破壊のために選択され、前記遺伝子の破壊が、前記遺伝子をコードする配列および／またはそのシス調節エレメントの中の１つまたは複数の塩基の挿入、欠失、または置換を含む、請求項３７〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞または胚にリコンビナーゼを送達する工程をさらに含む、請求項３７〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡとして前記細胞に直接導入される、請求項３７〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡが、前記ｍＲＮＡをコードするプラスミドとして前記細胞に導入される、請求項３７〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
ＴＡＬＥＮをコードするベクターが前記細胞に導入された後に、前記ｓｓＤＮＡが前記細胞に導入される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
ＴＡＬＥＮを発現する前記ベクターが前記細胞に導入された後、約８時間〜約３日の間に、ｓｓＤＮＡが前記細胞に導入される、請求項５０または５８に記載の方法。
【請求項６０】
ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡが、前記ｓｓＤＮＡとほぼ同時に前記細胞に直接導入される、請求項５０、５８、または５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が、初代体細胞または幹細胞である、請求項３７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
目的の部位に外来性核酸配列を含み、かつ他の遺伝子改変をまったく含まないファウンダーである、遺伝子改変動物。
【請求項６３】
前記外来性核酸配列がアレルであり、かつ前記目的の部位が前記アレルの相同体である、請求項６２に記載の動物。
【請求項６４】
前記動物が前記アレルについてホモ接合型である、請求項６１または６２に記載の動物。
【請求項６５】
遺伝子改変を作製する方法であって、
ＴＡＬＥＮをコードし、配列番号１３２に対して少なくとも８０％の相同性を有するＮ末端リーダー部分をコードする核酸に、インビトロ培養物中の非ヒト初代細胞または非ヒト胚を曝露する工程を含む方法。
【請求項６６】
前記Ｎ末端リーダー部分が、配列番号１３２の２２残基配列部分に対して８０％の相同性を有し、かつ合計約３０残基以下を有する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記核酸が、配列番号１３２に対して少なくとも９０％の相同性を有する、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
請求項１〜６７のいずれか一項に記載の方法で作製または使用される細胞。
【請求項６９】
請求項１〜３４、３７〜６１、または６５〜６７のいずれかに一項に従って調製された動物、細胞、または胚。
【請求項７０】
動物を処置して所望の形質を有する子孫、耐病性を有する子孫、疾患に罹患する子孫、または遺伝子欠陥のない子孫を作製するために調製された、請求項６９に記載の動物、細胞、または胚。
【請求項７１】
動物を処置して、生産形質、体型形質、ワーカビリティー形質、繁殖形質、マザリング形質、食肉生産の増強、無角、乳製品生産の増強、動物サイズ、および動物サイズの低減からなる群から選択される所望の形質を有する子孫を作製するための、請求項６９または７０に記載の動物、細胞、または胚。
【請求項７２】
動物を処置して、アフリカブタコレラ、癌、高コレステロール血症、炎症性腸疾患、および心臓病に対する耐性遺伝子からなる群から選択される耐病性を有する子孫を作製するための、請求項６９または７０に記載の動物、細胞、または胚。
【請求項７３】
請求項６９または７０に記載の動物、細胞、または胚が、動物を処置して、癌、高コレステロール血症、炎症性腸疾患、二分脊椎、肺高血圧症、心障害、および小児脂肪便症からなる群から選択される疾患に対する耐性を獲得する子孫を作製する。
【請求項７４】
動物を処置して、受胎能を低下させる遺伝子欠陥を有さない子孫を作製するための、請求項６９または７０に記載の動物、細胞、または胚。
【請求項７５】
請求項３７〜６１または６５〜６７のいずれか一項に記載の方法に従って作製された細胞または胚の使用。
【請求項７６】
所望の形質を有する子孫、耐病性を有する子孫、疾患に罹患する子孫、または遺伝子欠陥のない子孫を作製するための、請求項７５に記載の細胞または胚の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１２年８月２４日に出願された米国特許出願第１３／５９４，６９４号明細書および２０１２年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／６６２，７６７号明細書に対する優先権を主張するものであり、これらの出願は両方とも参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
連邦政府支援研究に関する記載
特定の本発明実施形態の一部は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）が交付する助成金番号１Ｒ４１ＨＬ１０８４４０−０１「アテローム性動脈硬化症の遺伝的モデルブタの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）」による政府支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本技術分野は、遺伝子改変動物、たとえば機能形質を有する家畜動物の作製に関し、また改変細胞を作製するためのインビトロの方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
反復可変２残基（ＲＶＤ：ｒｅｐｅａｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ−ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）の配列を構築することにより、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター配列をＤＮＡ標的に特異的に結合するように構築することができる。ＴＡＬエフェクターとヌクレアーゼとの融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）は、細胞ＤＮＡの標的二本鎖切断を行うことが可能であり、これを用いて細胞に特異的遺伝子改変を行うことができる。ＴＡＬＥＮについては、安定に改変されたヒト胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞クローンの作製ならびにノックアウトＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）およびノックアウトゼブラフィッシュの作製に有用であると報告されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター（ＴＡＬＥ）とヌクレアーゼとの融合体（ＴＡＬＥＮ）は、細胞の遺伝子改変に使用されることが報告されている。これらの報告は全般的に、植物細胞、形質転換（不死化）動物細胞株、またはマウス胚性幹細胞に焦点を当てている。図１に、ＴＡＬＥＮをベースとする遺伝子工学系の特徴の一部を図示する。
【０００６】
本発明の第１の実施形態は、遺伝子改変動物を作製する方法であって、胚または細胞の標的染色体部位に特異的に結合するＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡに胚または細胞を曝露する工程と、代理母において細胞をクローニングする工程または代理母に胚を移植する工程であって、代理母が、レポーター遺伝子を含むことなく、かつＴＡＬＥＮ標的化染色体部位でのみ遺伝子改変されている動物を妊娠する工程とを含む方法である。
【０００７】
本発明の第２の実施形態は、遺伝子改変された非ヒト動物細胞または胚を作製する方法であって、胚または細胞の標的化染色体部位に特異的に結合するＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡに動物の胚または細胞をインビトロで曝露する工程であって、この細胞または胚が標的化染色体部位でのみ遺伝子改変される工程を含み、かつこの方法がレポーター遺伝子を含むことなく実施される方法である。
【０００８】
本発明の第３の実施形態は、遺伝子改変を作製する方法であって、ＴＡＬＥＮをコードし、配列番号１３２に対して少なくとも８０％の相同性を有するＮ末端リーダー部分をコードする核酸に、インビトロ培養物中の非ヒト初代細胞または非ヒト胚を曝露する工程を含む方法である。
【０００９】
さらなる実施形態は、これらの方法の１つまたは複数、または以下の１つまたは複数を含む本明細書中の他の材料および方法に関する：レポーター遺伝子を含まないＴＡＬＥＮに胚を曝露する工程であって、胚の約１％超において、標的化染色体部位に改変が組み込まれる工程；一連の形質を発現できることが公知の遺伝的性質を有する胚を準備し、レポーター遺伝子を含まないＴＡＬＥＮにこの胚を曝露し、改変および一連の形質の発現のために、妊娠動物をスクリーニングする工程；レポーター遺伝子を含まないＴＡＬＥＮに細胞を曝露し、細胞をクローニングする工程であって、クローニングされた細胞の１％超において、標的化染色体部位に改変が組み込まれた動物が提供される工程を含み、レポーター遺伝子を含まないＴＡＬＥＮに細胞を曝露し、クローン細胞のコロニーを作製し、コロニーメンバーのサブセットを試験して、標的化染色体部位に改変が組み込まれたコロニーを同定する工程であって、コロニーメンバーのサブセットの試験が破壊的プロセスであり；この試験プロセスが、核酸分解アッセイ、シーケンシング、ＰＡＧＥ、ＰＣＲ、プライマー伸長、またはハイブリダイゼーションからなる群から選択され；遺伝子改変が、挿入、欠失、逆位、または転座からなる群から選択され；ＴＡＬＥＮは第１のＴＡＬＥＮであり、標的化染色体部位は第１の部位であり、この方法が第２の標的化染色体部位に向けられた第２のＴＡＬＥＮをさらに含む工程を含み；外来性配列を含有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に胚または細胞を曝露する工程であって、遺伝子改変が外来性配列を含み；外来性配列が、ＴＡＬＥＮ標的化染色体部位の代替アレルを含み；代替アレルが、量的形質または質的形質に関連し；代替アレルが、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅウシに存在するミオスタチンアレルを含み；細胞または胚が第１の品種に属し、アレルが動物の第２の品種に属し；第１の品種がＷａｇｙｕまたはＮｅｌｏｒｅのウシであり、第２の品種がＢｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅウシであり、子孫がＷａｇｙｕまたはＮｅｌｏｒｅの子ウシであり；アレルが、挿入、欠失、多型、および一塩基多型からなる群から選択され；標的化染色体部位が遺伝子の破壊のために選ばれ、遺伝子の破壊が遺伝子をコードする配列および／またはそのシス調節エレメントの中の１つまたは複数の挿入、欠失、または置換を含み；遺伝子改変が、挿入、欠失、外来性核酸配列への変化、逆位、転座、天然アレルへの遺伝子変換、合成アレルへの遺伝子変換、異種間のアレル移動、同一種内のアレル移動、および新規アレルへの遺伝子変換からなる群から選択される工程を含み；細胞または胚にリコンビナーゼを送達する工程であって、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡが細胞にｍＲＮＡとして直接導入され、細胞への直接導入が、エレクトロポレーション、トランスフェクション、リポフェクション、リポソーム、ヌクレオフェクション、遺伝子銃粒子、ナノ粒子、脂質トランスフェクション、電気融合、および直接インジェクションからなる群から選択される方法を含み；ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡが、このｍＲＮＡをコードするプラスミドとして細胞に導入され；ＴＡＬＥＮをコードするベクターが細胞に導入された後に、ｓｓＤＮＡが細胞に導入され；ＴＡＬ���Ｎを発現するベクターが細胞に導入された後、約８時間〜約３日の間に、ｓｓＤＮＡが細胞に導入され；ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡが、ｓｓＤＮＡとほぼ同時に細胞に直接導入され；細胞が初代細胞または幹細胞であり、この方法が正または負のいずれかの生存選択基準を必要とする選択ステップを含むことなく実施され；妊娠動物が、ブタ、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、魚類、ゼブラフィッシュ、イヌ、マウス、ネコ、マウス、ラット、および実験動物からなる群から選択され；細胞が、家畜細胞、偶蹄目動物細胞、培養細胞、初代細胞、初代体細胞、接合体、始原生殖細胞、幹細胞、および接合体からなる群から選択され、または胚が胚盤胞であり；ＴＡＬＥＮが、ｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮであり、ｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮと共に導入されるｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮをさらに含み；細胞が、初代体細胞または幹細胞であり；細胞が、体細胞核移植またはクロマチン移植によりクローニングされ；妊娠動物が改変についてホモ接合型であり；妊娠動物がファウンダー動物である工程。
【００１０】
さらなる実施形態は、これらの方法の１つまたは複数に従って調製された生物（遺伝子改変動物、遺伝子改変ファウンダー動物、または遺伝子改変細胞）に関する。
【００１１】
以下の特許出願は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれ；矛盾が生じた場合には、本明細書が優先される：米国特許出願公開２０１０／０１４６６５５、米国特許出願公開２０１０／０１０５１４０号明細書、米国特許出願公開２０１１／００５９１６０号明細書、および米国特許出願公開２０１１／０１９７２９０号明細書。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＴＡＬＥＮおよびＴＡＬＥＮによる遺伝子改変の図である。
【図２】複数のＤＮＡ遺伝子座で作用するＴＡＬＥＮの図である。
【図３】ウシ胚におけるＴＡＬＥＮ活性を示す図である。図（ａ）に実験の概要を示す。ＴＡＬＥＮを、ＦｏｋＩヌクレアーゼホモ２量体の単量体が２量体を形成し、２つの単量体の間のＤＮＡを切断できるように、ＤＮＡ標的の対向する鎖に合わせて設計する。１日目（Ｄ１）に、インビトロで作製されたウシ接合体にＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡをインジェクトし、胚盤胞が形成されるまでインビトロで培養する。８日目に各胚盤胞（ｂｌａｓｔ：胚盤胞）を集め、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）に供し、ＰＣＲ増幅およびＣｅｌ−Ｉ（ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）処理によりインデルについて解析する。図ｂ）ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ処理して、ＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮにより媒介されたウシ胚のインデルを解析した図である。単位複製配列の長さ、およびインデルを示唆する、予想されるＳＵＲＶＥＹＯＲ切断産物を上に示す。図ｃ）ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ処理して、ｐ６５  ＴＡＬＥＮにより媒介されたブタ接合体のインデルを解析した図である。
【図４Ａ】ＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮで処理したウシ胚から配列決定された欠失および挿入を示す図である。ＴＡＬＥＮ結合部位を下線で示した野生型配列を示す。欠失および挿入の両方の現象が同定された。
【図４Ｂ】ＴＡＬＥＮで処理したブタ胚から配列決定された欠失および挿入を示す図である。ＴＡＬＥＮ結合部位を下線で示した野生型配列を示す。欠失および挿入の両方の現象が同定された。
【図５】家畜線維芽細胞において遺伝子編集するためのＴＡＬＥＮスキャフォールドを比較する図である。図ａ）この実験で試験したＴＡＬＥＮスキャフォールドの図である。各スキャフォールド（＋２３１、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ．ａｌ．２０１０，およびＣａｒｌｓｏｎ  ＋６３、（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ．ａｌ．２０１１に比較して））は、ＳＶ４０核移行シグナル（ＮＬＳ）を含有し、ＦｏｋＩホモ２量体ドメインがＣ末端に融合している。番号はＤＮＡ結合ドメインに対するものである。第１の反復可変２残基反復（ＲＶＤ）の前のアミノ酸を「−１」と標記し、最後のＲＶＤ反復の後のアミノ酸を「＋１」と標記する。図ｂ）ＤＭＤＥ７．１  ＴＡＬＥＮペアまたはＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮペアのいずれかをトランスフェクトした線維芽細胞について、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを行った。スキャフォールドおよび処理温度をゲルの上に示し、ＮＨＥＪの割合を下に示す。略語ＮＴ＝無処理。図ｃ）＋２３１またはＣａｒｌｓｏｎ  ＋６３スキャフォールドのいずれかを有する４つのさらなるＴＡＬＥＮペアの活性を示す図である。
【図６】ＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮで処理した細胞から配列決定された欠失および挿入を示す図である。野生型ＡＣＡＮ１２配列をイタリック体で示し、ｌｅｆｔおよびｒｉｇｈｔ（相補）ＴＡＬＥＮ認識配列を下線で示す。挿入されたヌクレオチドを灰色でハイライトし、ミスマッチヌクレオチドを小文字で表示する。
【図７】インデル濃縮のためのトランスポゾン共選択を示す図である。実験スケジュールを図（ａ）に示す。０日目（Ｄ０）に、各ＴＡＬＥＮの発現カセット、選択マーカーをコードするトランスポゾン、およびトランスポザーゼ発現カセットを含むプラスミドの混合物を細胞にトランスフェクトする。ＴＡＬＥＮのプラスミドが各トランスフェクションの主要な成分である（４倍過剰量）。トランスフェクト細胞を分割前に３０℃または３７℃で３日間培養し、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイのためのサンプルを採取し、拡大培養してトランスポゾン組み込みを＋／−選択するために再播種する。３日目以降、全細胞を３７℃で培養する。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイのために１４日間以上培養した細胞を集め、下流用途、すなわち、単一細胞核移植のために凍結保存する。図ｂ）カチオン性脂質を使用して線維芽細胞にトランスフェクトした。３日目では活性が観察されなかったため（低トランスフェクション効率のため）、１４日目以降の集団のデータのみを示す。処理温度、選択、およびＴＡＬＥＮ  ｉｄ（図（ｃ）に示したＡ〜Ｃの文字により識別）をゲルの上に示す。図ｃ）線維芽細胞にヌクレオフェクションによりトランスフェクトし、３日目、および１４日目以降の非選択（ＮＳ）および選択（Ｓ）集団におけるＮＨＥＪの割合を測定した。処理温度を各マトリックスの上に示す。略語：ｎｄ＝検出されず；ｗｔ＝野生型単位複製配列、ＳＵＲＶＥＹＯＲ処理済み。
【図８Ａ】インデルを同定するための直接ＰＣＲシーケンシングの図である。各線維芽細胞コロニー由来のＰＣＲ単位複製配列を精製し、配列決定し、野生型配列と比較した。１つのアレルの突然変異、または両方のアレルの非重複突然変異が起こると、ＴＡＬＥＮ認識部位近傍が２重の配列になる（上部）。突然変異部位の両側にある２重のピークにより各アレル間の相違が同定できる場合、重複両アレル突然変異を同定することができる。ホモ接合型突然変異を有するコロニーは、インデル部位近傍に２重ピークを示さない。
【図８Ｂ】野生型クローンおよび図８Ａに示したようなホモ接合型インデルを有する両アレルクローンの配列比較を示す図である。
【図９Ａ】ＤＭＤの両アレル性改変アレルを示す図である。ホモ接合型改変アレル（すなわち、両方のアレルが同じ突然変異を包含する）または各アレルに異なる突然変異を有する両アレル突然変異を有するコロニーを示す。２つのインデルを有するコロニーでは、各アレルの配列決定の回数を右側に示す。一部の場合では、第３の突然変異または単一の野生型アレルが配列決定され、すべてのコロニーが１００％クローンであるとは限らないことが示された。フレームシフトアレルを示し、またミスマッチヌクレオチドを小文字で表示する。
【図９Ｂ】ＬＤＬＲの両アレル性改変アレルを示す図であり、図９Ａと同様の表記法を用いる。
【図１０】ＴＡＬＥＮにより誘導された欠失および逆位を示す図である。ＤＭＤ遺伝子座の模式図を図（ａ）に示す。ＤＮＡの配向を黒い山形模様で示す。雄ブタ線維芽細胞にコトランスフェクトされた、エクソン６および７（黒の矢頭）を標的とするＴＡＬＥＮにより、エクソン６とエクソン７との間でＮＨＥＪによる融合現象が起こり得る。これは、プライマー（黒い矢印）を用いて約５００ｂｐの単位複製配列を得ることにより確認することができる。図ｂ）エクソン６および７を標的とするＴＡＬＥＮを同時にトランスフェクトした細胞のＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイから、両部位でのＮＨＥＪによるインデルが明らかにされる。ＮＨＥＪの割合を下に示す。図ｃ）エクソン６  ＴＡＬＥＮおよびエクソン７  ＴＡＬＥＮを同時に導入すると、推定される欠失部位を挟むプライマーを用いたＰＣＲにより、約５００塩基対の産物が得られるのに対し、単独でトランスフェクトすると、得られない。図ｄ）ＴＡＬＥＮ標的部位間の配列の逆位現象の予想される結果を示す。ＤＮＡの配向を黒い山形模様で示す。逆位遺伝子座の５’および３’末端の推定されるフランキング部位の外側のプライマー（黒い矢印）を、予想される産物の大きさと共に示す。エクソン６  ＴＡＬＥＮおよびエクソン７  ＴＡＬＥＮの両方を同時に導入したときのみ、５’および３’接合部の両方でＰＣＲ産物が観察された。
【図１１】ＤＭＤの欠失配列を示す図である。複製トランスフェクションで得られたＤＭＤ欠失接合部を示す。上方のエクソン６および７配列に陰影を付け、ＴＡＬＥＮ認識部位に下線を付す。挿入されたヌクレオチドに陰影を付す。
【図１２】ＤＭＤの逆位配列を示す図である。ＤＭＤの逆位アレルの模式図を、シーケンシングにより解析した５’および３’接合部（枠で囲む）と共に示す。下方に、各融合の予想される配列を示し、対応する融合は、ＴＡＬＥＮペアの各スペーサーの中央にある。ＴＡＬＥＮ認識部位を下線で示す。トランスフェクトされた集団に由来する、配列決定された逆位アレルを示す。各アレルの配列決定の回数を右側に示し、挿入されたヌクレオチドを下線で示す。ミスマッチヌクレオチドを小文字で示す。
【図１３】ウシ線維芽細胞におけるＨＤＲの誘導を示す図である。図ａ）二本鎖切断誘導性相同組換えにより、ウシＧＤＦ８のエクソン３に１１塩基対の欠失（Ｂｅｌｇｉｕｍ  Ｂｌｕｅ突然変異）を導入するように、ＴＡＬＥＮ（ｂｔＧＤＦ８３．１、矢印）およびｄｓＤＮＡ鋳型（ＢＢ−ＨＤＲ）を設計した。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型ではｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮの結合部位の半分が欠損しているため、ＴＡＬＥＮ切断に対して抵抗性を示すはずである。図ｂ）ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイから、３７℃および３０℃の両方でｂｔＧＤＦ８３．１  ＴＡＬＥＮの活性が実証される。このアッセイで使用したＰＣＲ産物は、プライマーｂおよびｂ’を使用して生成させた（図ａに示す）。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型は、ｂｔＧＤＦ８３．１活性の評価を混乱させると考えられるため、これらの複製物に含めなかった。図ｃ）アレル特異的ＰＣＲにより、ＨＤＲの誘導は、ＴＡＬＥＮとＢＢ−ＨＤＲ鋳型とのコトランスフェクションに依存することが実証される。ＰＣＲアッセイは、ＨＤＲにより改変されたＧＤＦ８アレルを、プライマーｃおよびｃ’を使用して特異的に検出するように開発した（図ａに示す）。プライマーｃ’の３’末端は１１塩基対の欠失にまたがり、野生型アレル（ｗｔ）を増幅することができない。陽性対照「Ｃ」を含む各ＰＣＲ反応に５００細胞相当量を加えた。ＨＤＲ率は、実験反応と対照反応との比較デンシトメトリーにより判定した。
【図１４】シーケンシングによる、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ遺伝子移入の確認を示す図である。Ｗａｇｙｕ野生型ＧＤＦ８およびＢｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ鋳型（ＢＢ−ＨＤＲ）の模式図を示す。５つのＰＣＲ陽性コロニーについて、ホモロジーアームの外側に位置するプライマー（ｃおよびｄ）を使用してＰＣＲを行った後、プライマーｂ’を用いてクローニングおよびシーケンシングを行った。野生型配列との比較から、５つのコロニーのうち４つのコロニーでＢｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅアレル（ヘテロ接合型）に特徴的な予想された１１塩基対の欠失が明らかにされる。
【図１５】ＴＡＬＥＮを介したＨＤＲの模式図およびゲルを示す図である。ブタ低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の第４エクソンを標的とするＴＡＬＥＮペア（ＬＤＬＲ２．１）をスーパーコイルプラスミドＬｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐとコトランスフェクトした。Ｌｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐは、ブタＬＤＬＲ遺伝子に対応するホモロジーアーム、およびＨＤＲ時にネオマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を可能にする遺伝子トラップを含む。
【図１６】図５のＣａｒｌｓｏｎ  ＋６３スキャフォールドに関する詳細な配列情報およびＳａｎｇａｍｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより使用される別のスキャフォールドとの比較を示す図である。
【図１７】非翻訳部分を含む、図５のＣａｒｌｓｏｎ  ＋６３スキャフォールドを作製するために使用したベクターに関する詳細な核酸配列を示す図である。
【図１８】ウシＧＤＦ８遺伝子座での相同組換えのためのＡＡＶ送達一本鎖ＤＮＡ鋳型の使用について示す図である。ａ）相同組換えにより、ウシＧＤＦ８遺伝子のエクソン３に１１ｂｐの欠失（Ｂｅｌｇｉｕｍ  Ｂｌｕｅ突然変異）を導入するように、ＴＡＬＥＮ（ｂｔＧＤＦ８３．１、青の矢印）およびｒＡＡＶ相同組換え鋳型（ＡＡＶ−ＢＢ−ＨＤＲ）を設計した。ｂ）アレル特異的ＰＣＲから、ＨＲ誘導がトランスフェクションｂｔＧＤＦ８３．１  ＴＡＬＥＮおよびＡＡＶ−ＢＢ−ＨＤＲ鋳型を含有する欠陥ＡＡＶによる感染に依存することが実証される。ＰＣＲアッセイは、ＨＤＲにより改変されたＧＤＦ８アレルを、プライマーｃおよびｃ’を使用して特異的に検出するように開発した（図ａに示す）。プライマーｃ’の３’末端は１１ｂｐの欠失にまたがり、野生型アレル「ＷＴ」を増幅することができない。１，０００細胞相当量を各ＰＣＲ反応に含み、表示コピー数の対照鋳型による陽性対照反応を、相同組換えの比較定量に使用した。
【図１９】ウシＧＤＦ８遺伝子座での相同組換えのための鋳型としての一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯｌｉｇｏ）の使用について示す図である。相同組換えにより、ウシＧＤＦ８遺伝子のエクソン３に１１ｂｐの欠失（Ｂｅｌｇｉｕｍ  Ｂｌｕｅ突然変異）を導入するように、ＴＡＬＥＮ（ｂｔＧＤＦ８３．１、矢印）および２つのｓｓＯＤＮを設計した。各ｓｓＯＤＮは、長さが７６塩基対であり、同じ標的部位のセンス鎖およびアンチセンス鎖であった。アレル特異的ＰＣＲから、ＨＤＲ誘導がトランスフェクションｂｔＧＤＦ８３．１  ＴＡＬＥＮ、およびその２４時間後のリポフェクタミンＬＴＸを使用するｓｓＯＤＮのトランスフェクションに依存することが実証される。ＰＣＲアッセイは、ＨＤＲにより改変されたＧＤＦ８アレルを、プライマーｃおよびｃ’を使用して特異的に検出するように開発した（図ａに示す）。プライマーｃ’の３’末端は１１ｂｐの欠失にまたがり、野生型アレル「ＷＴ」を増幅することができない。１，０００細胞相当量を各ＰＣＲ反応に含み、表示コピー数の対照鋳型による陽性対照反応を、相同組換えの比較定量に使用した。ＢＢ−ＨＤＲセンス（Ｓ）は配列番号１３３を有し、ＢＢ−ＨＤＲアンチ（ＡＳ）は配列番号１３４を有する。
【図２０】家畜細胞にＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトすると、効率的な標的切断が生じることを示す図である。図ａ：表示量のｍＲＮＡをブタ線維芽細胞にトランスフェクトし、３０℃または３７℃のいずれかで３日間、トランスフェクト細胞を培養した後、インデル解析を行った。図ｂ：ＮＨＥＪの割合を決定した。ＤＭＤ７．１  ＴＡＬＥＮをコードする４マイクログラムのプラスミドＤＮＡのトランスフェクションによる平均のＮＨＥＪの割合を、３０℃または３７℃で培養した細胞について点線で示した。
【図２１】ｍＲＮＡにコードされたＴＡＬＥＮのトランスフェクションは、ｓｓＯＤＮ  ＨＤＲを増強することを示す図である。ｂｔＧＤＦ８３．１  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡおよびＢＢ−ＨＤＲセンスｓｓＯＤＮ（配列番号１３３）を、指定の機序によりＷａｇｙｕ細胞に導入し、上記のＰＣＲアッセイによりＨＤＲを測定した。ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡおよびｓｓＯＤＮの両方がヌクレオフェクションにより同時に送達された細胞集団から、コロニーを単離した。
【図２２】ｍＲＮＡにコードされたＴＡＬＥＮおよびｓｓＯＤＮを使用する、種内天然アレルの移入を示す図である。ＰｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅミオスタチンアレルＣ３１３Ｙを、図２１の方法によりＷａｙｇｕ線維芽細胞に移入した。「ｏｌｉｇｏ」と標記した配列は、配列番号１３５を有する。
【図２３】図２２のプロセスを、異なる温度（３７℃）で繰り返した。
【図２４】ｍＲＮＡにコードされたＴＡＬＥＮおよびｓｓＯＤＮを使用して、ある種に由来する天然アレルを他の種に移入することを示す図である。ＰｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅミオスタチンアレルＣ３１３Ｙを、図２５の方法によりＯｓｓａｂａｗ線維芽細胞に移入した。次のｓｓＯＤＮを使用した：ｇｇｃｃａａｔｔａｃｔｇｃｔｃｔｇｇａｇａｇｔａｔｇａａｔｔｃｇｔａｔｔｔｔｔａｃａａａａａｔａｃｃｃｔｃａｃａｃｔｃａｔｃｔｔｇ（配列番号１４６）。
【図２５】ｍＲＮＡにコードされたＴＡＬＥＮおよびｓｓＯＤＮを使用して、特定のフレームシフトアレルをブタＬＤＬＲに導入することを示す図である。ブタＬＤＬＲ遺伝子のエクソン２に４塩基対の挿入を導入するために、９０ｂｐのｏｌｉｇｏを作製した。この挿入により、新規ＢａｍＨ１部位が生成し、フレームシフトアレルが誘発されることが予想される。ｓｓＬＤＬＲ２．１  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ（マイクログラム単位の表示用量で）および０．３ｎＭｏｌのｓｓＯＤＮのコトランスフェクションの後、細胞を３０℃で３日間培養し、次いで３７℃でさらに１日培養した。４および２０日目に、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによりＮＨＥＪを測定した。ブタＬＤＬＲのエクソン２を含むＰＣＲ産物のＢａｍＨ１消化、ならびにデンシトメトリーによる、制限フラグメント（ＨＤＲを示す）の定量および野生型産物（上段産物、ＨＤＲなし）との比較により、ＨＤＲの割合を決定した。各処理からのコロニーを単離し、ＰＣＲおよびＢａｍＨ１消化により解析した。「Ｗｔ」と標記した配列は配列番号１３６を有し、「センス」と標記した配列は配列番号１３７を有する。
【図２６】ＤＮＡおよびｍＲＮＡにコードされたＴＡＬＥＮが、幹細胞で活性であることを示す図である。上段の図は、ブタ雄性生殖細胞系幹細胞（ＧＳＣ）にプラスミドＤＮＡとしてトランスフェクトしたＤＭＤ７．１  ＴＡＬＥＮのＮＨＥＪの割合を示す。ヌクレオフェクション溶液Ｌ、Ｖ、またはＢを評価した。下段の図は、ＤＭＤ７．１  ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされたブタＧＳＣのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す。ｍＲＮＡの量（マイクログラム）を示す。
【図２７】ＴＡＬＥＮは、ニワトリ細胞においてＤＳＢを媒介し、ニワトリ始原生殖細胞（ＰＧＣ）における相同組換えを促進することができる。図ａ）ＴＡＬＥＮ活性は、ＤＦ１不死化ニワトリ細胞株トランスフェクションおよびＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイで最初に測定した。図ｂ）ニワトリｄｄｘ４遺伝子座のターゲティング戦略の模式図である。ＧＦＰ／ピューロマイシンレポーター遺伝子を、標的化細胞の第２エクソンにおける内因性コード配列と置き換える。図ｃ）相同組換えコンストラクト、ＴＡＬＥＮ（Ｔａｌ  １．１またはＴａｌ  ７．１のいずれか、空ベクター）、およびピューロマイシン選択トランスポゾンで、ＰＧＣにトランスフェクトした。ピューロマイシンで選択した後、Ｔａｌ  ７．１トランスフェクションでも空ベクタートランスフェクションでもなく、Ｔａｌ  １．１  ＴＡＬＥＮを使用した場合（右写真、左は明視野である）に、ＧＦＰ＋細胞を単離することができた。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
動物交尾または人工生殖技術に基づいた従来の繁殖プログラムには、望ましい形質を生成または結合させる遺伝子の良好な組合せを最終的に生み出すことを望んで、多くの遺伝子を混合することが含まれる。トランスジェニック技術には、従来の繁殖プロセスを加速する見込みがある。トランスジェニック法の欠点の一部は、このプロセスが、改善はあるけれども、相変わらず時間がかかり、高価で、大きな労力を必要とすることである。低効率および結果の予測不可能性が通常である。さらに、目的とするゲノム部位のみを変化させるプロセスは利用できない。
【００１４】
目的とする部位のみに変化を有するトランスジェニック動物を作製するプロセスを本明細書に開示する。加えて、このプロセスは目的とする部位で目的とする変化を特異的に作製することができる。連結レポーター遺伝子または連結正および負の選択遺伝子の使用のような問題をもたらす他の変化を除去することは必要がない。あるいはランダムな導入遺伝子組み込みが回避される。さらに、このプロセスは、ファウンダー生殖に使用して、目的とする部位で目的とする変化のみを有する遺伝子改変動物を作製することができる。非連結マーカー遺伝子等を含む他のプロセスも開示する。好ましい技術はＴＡＬＥＮを使用する。
【００１５】
ＴＡＬＥＮを使用してブタまたは雌ウシなどの高等動物の遺伝子改変に成功することは、大きな課題である。本明細書では、このような動物を作製する組成物および方法について記載する。これらの方法の一部には、偶蹄目動物または他の家畜の初代細胞からのクローニングが含まれ、これもまた、大きな課題となっている。さらに、ＴＡＬＥＮで改変された細胞または胚を同定するための方法、ならびにＴＡＬＥＮ処理された細胞または胚の割合を高めるためのプロセスを提供する。意外にも、一方の染色体をＴＡＬＥＮにより遺伝子改変すると、多くの場合、他方の染色体の相補的遺伝子座も細胞機構により改変されることが観察された。
【００１６】
さらに、ＴＡＬＥＮを使用して複数の部位で大きな染色体欠失（ＧＣＤ）を引き起こすことができることも発見された。図２はこのアプローチを図示したもので、このアプローチには、第１の遺伝子座に向けられた第１のＴＡＬＥＮペア、および第２の遺伝子座に向けられた第２のＴＡＬＥＮペアが含まれる。さらに驚くべきことに、ＴＡＬＥＮのペアを使用して大きな染色体配列の逆位を引き起こすことができることも発見された。逆位の１つの使用法は、固定した遺伝形質を有する偶蹄目動物もしくは他のファウンダー動物の作製、または欠失系統の作製である。
【００１７】
ＴＡＬＥＮ技術による遺伝子改変家畜の作製；ＴＡＬＥＮ改変の検証；改変細胞を選択するためのコトランスフェクションおよび共選択；遺伝子改変家畜からのレポーター遺伝子の除去
ＴＡＬＥＮ改変の家畜または他の動物を作製する際の障壁の１つは、従来のベストプラクティスを用いても動物細胞の改変効率が数パーセントであることにある。目的とする部位で欠失または挿入を達成しても、実際には外来性タンパク質の発現または内在性タンパク質の発現の停止など目的とする作用を発揮しないこともあるため、必ずしも成功を意味するとは限らない。低効率でも、ミバエまたはマウスなどの下等動物の遺伝子改変動物の作製には有用な場合もある。このような下等動物は生殖周期が短いうえ多く繁殖することから、数百の動物の作製、試験、およびスクリーニングを行い、改変に成功した少数の動物が存在するかどうかを判定できるためである。しかしながら、これらの従来法で達成される効率のレベルは、妊娠期間が非常に長く、妊娠当たりの子孫が比較的少数である家畜の偶蹄目動物には適さない。
【００１８】
ＴＡＬＥＮを使用して家畜または他の動物を改変する際のもう１つの障壁は、初代細胞においてＴＡＬＥＮを介してＤＮＡを改変することが難しいことである。初代細胞が不安定であるためである。実際、ＴＡＬＥＮ改変細胞の頻度は、濃縮法または選択法を行わない場合、経時的に著しく低下することが本明細書に示される。特定の理論に拘泥するものではないが、目的としていない部位でのＤＮＡ切断は、アポトーシスの誘導または非標的遺伝子の機能破壊により細胞の安定性を低下させ得ると推定される。初代細胞という用語は、生きている動物から単離された細胞であって、組織から単離されて以来０〜２回の複製が行われた細胞を意味する。
【００１９】
このため、形質転換細胞を作製し、遺伝子改変の成功を調べるために通常使用される技術は、その老化しやすさから初代細胞に使用することができない。ＴＡＬＥＮ改変細胞は通常、その遺伝子改変をアッセイするために破壊されることも、または単一の親に由来する多くの同一細胞を有するクローン株を増殖させるために単離されることもある。しかしながら、初代細胞は本質的に不安定であり、それらを遺伝子改変し、クローン増殖させようとすると、典型的には遺伝子変化、老化、および／または細胞死が起こる。本明細書で初めて実証されるように、ＴＡＬＥＮ改変細胞はさらに一層安定性が低下している。このため、体細胞核移植または他の動物クローニング技術のために、初代細胞を改変することを含む従来のアプローチを使用するとき、高率の成功を期待することは合理的でない。一方、本明細書に報告したように、ＴＡＬＥＮは、偶蹄目動物の遺伝子改変初代細胞を作製するために使用されてきた。これらの改変は、クローニングによる遺伝子改変動物系統のファウンダーの作製に適している。さらに本明細書には、接合体の改変に使用した、胚への直接インジェクションも記載されており、改変された接合体は、ファウンダー動物系統の妊娠および出産を目的とした代理雌への移植に適している。
【００２０】
ＴＡＬＥＮを介した実際の挿入／欠失現象について調べる典型的なアプローチは、改変された細胞または接合体の配列を決定するものであり、これは、破壊プロセスである。したがって接合体または胚を改変してから代理母に移植する場合、その改変は、利便性の程度に関係なく、動物が生まれるまで検証することができない。クローニングにより遺伝子改変動物を作製する実際の作製プロセスが、遺伝子改変の存在について調べるプロセスから恩恵を受けることは、従来認識されていない。本明細書に提示される本発明は、単一の細胞、接合体、または卵母細胞の段階で遺伝子改変の指標を提供する。本明細書で示すように、ＴＡＬＥＮ改変に連結しないレポーター遺伝子の発現からは、レポーター遺伝子発現カセットの一部ではないものの、それでも所望の遺伝子改変が予測されるのが一般的である。さらに詳しくは、レポーター遺伝子の発現からは、核酸が効率的に送達され、細胞または胚で発現したことが示され、レポーターを発現する細胞または胚がＴＡＬＥＮに基づく改変を受けた可能性が高い。
【００２１】
改変生物を作製するもう１つの技術は、コトランスフェクション共選択技術の使用であった。遺伝子改変動物を作製するためにレポーターを発現する細胞を選択し、これを、遺伝子改変動物を作製するために使用することができる。レポーターは、トランスポザーゼ活性を必要とするように選択してもよい。特定の理論に拘泥するものではないが、転位を起こした細胞は、１）トランスフェクトされており、かつ２）二本鎖ＤＮＡ修復の能力があるので、選択されたクローンではＴＡＬＥＮに基づく改変の可能性が高いと推定される。これはさらに、転位を起こした細胞（さらにひいては、ＴＡＬＥＮ改変細胞）を濃縮／選択しやすくする。トランスポゾンが、ＴＡＬＥＮ改変に作動可能に連結しているが、物理的には連結していない事実から、繁殖によりそれらを互いから離して分離することができる。コトランスフェクション戦略の利点は、ＴＡＬＥＮにより改変される染色体と同じでない染色体上に１つまたは複数のレポーターを組み込めることである。このプロセスにより、レポーター遺伝子を有さないファウンダー動物の作製が可能になる。たとえば、一部の動物は、細胞に独立して組み込まれた、遺伝子改変と無関係であるレポーター遺伝子を有するプラスミドを用いて作製した。このスキームは、新しいレポーター遺伝子を組み込んだ細胞は、遺伝子改変も組み込むという作用論に基づくものであった。たとえば、本明細書に提供したデータは、独立した４つのプラスミドを細胞にトランスフェクトすることが可能であり、１つのプラスミドの遺伝子産物の組み込みが成功すると、他のプラスミド遺伝子産物の組み込みにも成功すること、さらにＴＡＬＥＮを介した変化にも成功することが予測されることを示す。定説では、非常に多くのプラスミドによるトランスフェクションは成功するものではなく、不健全な細胞がもたらされることになる。しかしながら、予想外にも、これらの技術は有効であった。
【００２２】
家畜の胚におけるＴＡＬＥＮの機能については、インビトロで調製した（ＩＶＰ）ウシおよびブタの胚を使用して検討した。実施例１は、ＴＡＬＥＮ（ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮおよびｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮ）をウシ胚に直接インジェクトして、ＴＡＬＥＮが特異的に結合した部位に改変を含む遺伝子改変動物を作製したことについて記載する。改変には、ホモ接合型およびヘテロ接合型（両アレル）の改変が含まれた。ＴＡＬＥＮのｍＲＮＡを胚に直接インジェクトしたところ、遺伝子改変の成功が観察された。実施例２は、レポーターｍＲＮＡをＴＡＬＥＮのｍＲＮＡとコインジェクトした追加実験について記載する。胚の約３５％がレポーターを発現し、これらの動物の約３０％がＴＡＬＥＮに基づくインデルを有したため、レポーターの発現は遺伝子改変の成功を予測するものであった。インデルを含む動物うち、約３５％がホモ接合型またはヘテロ接合型の両アレル性突然変異体であった（図４）。したがって、ＴＡＬＥＮを使用した直接的な胚改変は、家畜ゲノム改変の実行可能なアプローチであることが示された。このようにして、周知のプロセスを使用して、動物ファウンダー系統の妊娠および出産のための胚を調製し、代理雌に移植することができる。さらに、その後クローニングまたは他のプロセスに使用するために、レポーターを用いて細胞（たとえば、初代細胞、接合体、卵母細胞、胚盤胞）を選択することも可能である。
【００２３】
また、クローニングによるＴＡＬＥＮを介した家畜（またはゼブラフィッシュ、イヌ、マウス、ラット、鳥類、ニワトリ、もしくは実験動物）の遺伝子改変の方法も開発した。実施例３は、ブタおよび雌ウシの初代体細胞に好適なＴＡＬＥＮおよびＴＡＬＥＮ改変の開発について記載する。成功した改変の効率は幾分低く、改変の成功を測るためのレポーターは使用しなかった。外来核酸を高効率で細胞に導入する手段としてヌクレオフェクションがあるが、ヌクレオフェクションは費用がかかるうえ細胞毒性が高レベルであり、多くの研究者には利用できない。したがって、一般的なカチオン性脂質のトランスフェクション試薬を遺伝子改変のビヒクルとして使用した。実施例４に示すように、カチオン性脂質によるトランスフェクション効率は５％未満であったものの、改変レベルはトランスポゾン共選択により顕著に高まった。３日目の集団（データ示さず）、およびトランスポゾンによる選択を用いない１４日目の集団では遺伝子改変は検出未満であったのに対し、ＤＭＤ７．１、ＤＭＤ６、およびＬＤＬＲ２．１の選択集団の改変レベルは、それぞれ３１パーセント、１３パーセント、および２０パーセントに達した（図７）。次いで、９０％超のトランスフェクション効率が通例であるヌクレオフェクションによりトランスフェクトした細胞にトランスポゾン共選択を適用した。トランスポゾン共選択は、ヌクレオフェクションによりトランスフェクトされた改変細胞の維持には効果的であったが、ＡＣＡＮ１２を除いて、ヌクレオフェクションは、３日目のレベルと比較して改変細胞をあまり増加させなかった（図７）。したがって、トランスポゾン共選択は、トランスフェクション効率が低い場合には効果的な改善方法であり、トランスフェクション効率が高い場合には効果的な維持方法である。共選択プロセスはまた、実施例５に示すようにフィーダー細胞を使用したときも効果的であった。意外にも高い両アレル改変率（ＴＡＬＥＮペアによって約１７％〜約３５％）が観察された。
【００２４】
本発明の実施形態は、偶蹄目動物などの家畜、またはゼブラフィッシュ、イヌ、マウス、ラット、魚類、鳥類、ニワトリ、もしくは実験動物を遺伝子改変するための組成物およびＴＡＬＥＮの使用方法である。従来のプロセスを使用してこのような動物を作製する際の問題の多くは、上記で論じた。遺伝子改変は、たとえば、挿入、欠失、外来性核酸フラグメントの挿入もしくは外来性核酸フラグメントへの変化、逆位、転座、異種間のアレル移動、同一種内のアレル移動、天然、合成、または新規のアレルへの遺伝子変換からなるリストから選択することができる。たとえば、染色体または染色体対の望ましくない突然変異は、正常な配列と置換することができる。一般に、標的ＤＮＡ部位を同定し、その部位に特異的に結合するＴＡＬＥＮペアを作製する。ＴＡＬＥＮは、たとえば、タンパク質、ｍＲＮＡとして、またはＴＡＬＥＮをコードするベクターにより細胞または胚に送達される。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡを切断して二本鎖切断を起こし、その後これが修復され、多くの場合、インデルが生成するか、または改変された配列と共に、切断修復の鋳型として挿入されるかもしくは鋳型として働く、付随する外来性核酸に含まれる配列または多型が組み込まれる。外来性核酸という用語は、核酸が細胞に天然にある核酸配列と同一かまたは異なるかにかかわらず、細胞または胚に導入される核酸を意味する。外来性配列は、その配列が染色体ＤＮＡに実際に挿入される核酸であるかまたはそれが細胞内ＤＮＡを変化させる鋳型として使用されるかにかかわらず、標的細胞を変化させるために使用される核酸を指す。核酸フラグメントという用語は広義であり、染色体、発現カセット、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはこれらの一部を含む。ｓｓＤＮＡという用語は、ｓｓ−オリゴヌクレオチドを含む。細胞または胚は、たとえば、家畜、偶蹄目動物、雌ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、鳥類、ニワトリ、ウサギ、および魚類からなる群から選択することができる。家畜という用語は、食物または生物材料のため商品として飼育される飼い慣らされた動物を意味する。偶蹄目動物という用語は、偶蹄目（ｏｒｄｅｒ  Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）の有蹄哺乳動物を意味し、各肢に偶数の指、通常２本または任意選択で４本の指があるウシ、シカ、ラクダ、カバ、ヒツジ、およびヤギを含む。
【００２５】
一実施形態は、遺伝子改変の家畜および／または偶蹄目動物、またはゼブラフィッシュ、イヌ、マウス、鳥類（ｂｉｒｄ）、魚類、鳥類（ａｖｉａｎ）、ニワトリ、ラット、または実験動物を作製する組成物または方法であって、ＴＡＬＥＮペアが特異的に結合する部位で細胞または胚のＤＮＡに対して遺伝子改変を行うＴＡＬＥＮペアを細胞または胚に導入すること、およびその細胞から家畜動物／偶蹄目動物／その他の動物を作製することを含む組成物または方法に関する。細胞または胚について、たとえば、接合体、胚盤胞、または胚への直接インジェクションを使用することができる。あるいは、タンパク質、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、またはベクターを導入する多くの公知の技術のいずれかを使用して、ＴＡＬＥＮおよび／または他の因子を細胞に導入してもよい。遺伝子改変動物は、公知のプロセス、たとえば、胚の妊娠宿主への移植または様々なクローニング方法によって胚または細胞から作製することができる。「ＴＡＬＥＮが特異的に結合する部位での細胞のＤＮＡの遺伝子改変」または「標的化染色体部位での」という語句等は、ＴＡＬＥＮがその標的部位に特異的に結合しているときに、ＴＡＬＥＮ上のヌクレアーゼにより切断される部位で遺伝子改変が行われることを意味する。ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮペアが結合する部位で正確に切断するものではなく、むしろ２つの結合部位の間の決められた部位で切断する。
【００２６】
別のこのような実施形態には、動物のクローニングに使用される組成物または細胞の処理が含まれる。細胞は、家畜、偶蹄目動物の細胞、魚類、ゼブラフィッシュ、イヌ、マウス、ラット、実験動物、鳥類、魚類、ニワトリ、培養細胞、不死化細胞、初代細胞、初代体細胞、接合体、生殖細胞、始原生殖細胞、胚盤胞、または幹細胞とすることができる。たとえば、一実施形態は、遺伝子改変を作製する組成物、または遺伝子改変を作製する方法であって、複数の初代培養細胞をＴＡＬＥＮタンパク質または１つまたは複数のＴＡＬＥＮをコードする核酸に曝露する工程を含む方法である。ＴＡＬＥＮは、タンパク質として導入しても、または、たとえば、ベクター中のｍＲＮＡまたはＤＮＡ配列によりコードされる核酸フラグメントとして導入してもよい。
【００２７】
動物の遺伝子改変はまた、レポーターを含むトランスフェクションを含んでもよい。上記で論じたように、初代細胞は、ＴＡＬＥＮおよび／またはＴＡＬＥＮ導入により媒介される細胞の改変の結果として不安定になることが観察された。このため当然ながら、従来の手段を用いて初代細胞（いくつかの細胞型の中で特に）の改変、および／またはこのような細胞から新しい系統の家畜を作製することに成功するとは、予想できない。特定の理論に拘泥するものではないが、第１のベクターの遺伝子カセットを発現する細胞は、ｍＲＮＡまたは別のベクターにより独立に送達されるＴＡＬＥＮによる改変にも成功する可能性が高いと推定される。レポーターを発現させることにより、レポーターを発現しない細胞の排除が可能になる。あるいは、レポーターを発現させることにより、レポーターを発現する細胞を、クローニングまたは他のトランスジェニック動物技術による動物での使用のために培養物から取り出すこと、または、さらなる培養および／もしくは増殖のために、かつ／もしくはさらなるベクターおよび／もしくは核酸および／もしくはＴＡＬＥＮの添加のために、かつ／もしくは他の遺伝子改変のために、第２の培養物に移すことが可能になる。目的の遺伝子に依存しないレポーターの発現に基づいて細胞を選択することは、一種の共選択プロセスである。
【００２８】
レポーターという用語は、本明細書で使用する場合、レポーターおよび選択マーカーを含む。選択マーカーという用語は、本明細書で使用する場合、正または負のいずれかの生存選択基準により単離することを可能にする形質を付与する遺伝子発現生体分子を指す。レポーターは、たとえば、蛍光マーカー、たとえば、緑色蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質とすることができる。レポーターは、選択マーカー、たとえば、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、またはキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）とすることができる。動物を選択するために他の表現型マーカーを使用することができ、そのようなマーカーは、識別可能な物理的形質（たとえば、エピトープまたは色）、増殖速度、および／または生存率に基づいている。
【００２９】
本発明の実施形態は、レポーター（たとえばベクターの使用により）およびＴＡＬＥＮ（たとえば、独立のベクターまたはｍＲＮＡにより）を細胞または胚に導入することを含む。細胞は、家畜または偶蹄目動物、ウシ、鳥類、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、イヌ、マウス、ラット、または実験動物に由来するものにすることができる。ＴＡＬＥＮおよび／またはレポーターは、たとえば、インジェクション、またはたとえば細胞培養を含む他の手段により直接導入することができる。培養細胞（初代細胞、接合体、卵母細胞、不死化細胞、生殖細胞、始原生殖細胞、幹細胞）、ＴＡＬＥＮをコードする第１の核酸、たとえばｍＲＮＡ、またはＴＡＬＥＮをコードするＤＮＡを含むベクター、およびレポーターをコードするＤＮＡ配列を有する独立したベクターを含む細胞培養物を作製することができる。ｍＲＮＡまたは第１のベクターはいかなるレポーターもコードせず、第２のベクターはいかなるＴＡＬもコードせず、かついかなるＴＡＬＥＮもコードしない。
【００３０】
レポーター、選択マーカー、および／または１つもしくは複数のＴＡＬＥＮに対するベクターは、たとえば、本明細書に詳述するように、プラスミド、トランスポゾン、トランスポザーゼ、ウイルスベクター、または他のベクターとすることができる。トランスポザーゼを使用することができる。トランスポザーゼを含む一実施形態は、トランスポザーゼをコードするベクターを提供する。他のベクターは、トランスポザーゼにより認識され、かつ目的の核酸フラグメント、たとえば、レポーター、選択マーカー、挿入のためのもしくは改変の鋳型としての外来性核酸、または１つもしくは複数のＴＡＬＥＮを有するトランスポゾンをコードする。したがって、細胞または胚に、いくつかの、たとえば１〜約６個のベクターをトランスフェクトしてもよい。当業者であれば、明記された範囲内の範囲および値、たとえば、２、３、４、５、および６をすべて意図していることをすぐに理解するであろう。より多くのベクターを使用してもよい。レポーターは、ＴＡＬＥＮにより改変がなされた可能性のある細胞を同定するために使用することができる。あるいは、選択マーカーは、選択マーカーを発現しない細胞または胚を破壊することによって、ＴＡＬＥＮ改変細胞の比率を高めるために使用することができる。
【００３１】
本発明の一実施形態は、複数のベクターに曝露させたまたはそれらをインジェクトした細胞または胚の培養物である。第１のベクターは、ＴＡＬＥＮまたはＴＡＬＥＮペアを含む。あるいは、ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮおよびｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮを独立に供給する２つのＴＡＬＥＮベクターが存在する。第２のベクターはレポーターを含む。レポーターは、非破壊的同定を可能にするものであってもよく、選択マーカーであってもよい。選択マーカーをコードするベクターは、レポーターベクターの代替手段として使用しても、レポーターベクターに加えて使用してもよい。さらなるベクターが外来性核酸をコードしてもよい。
【００３２】
ＴＡＬＥＮにより改変された細胞、胚、または動物を作製するプロセスは、ＴＡＬＥＮに曝露された細胞または胚についてレポーターの発現をアッセイすること、および遺伝子改変の家畜および／もしくは偶蹄目動物、または他の動物（魚類、ゼブラフィッシュ、イヌ、マウス、鳥類、ニワトリ、ラット、もしくは実験動物）を作製するための方法または組成物において、その細胞または胚を使用することを含む。たとえば、初代細胞を細胞培養物から採取し、クローニングに使用することができる。あるいは、初代細胞を培養物から採取し、クローン系統を作製するためにまたはその後のプロセスのために第２の培養物に加えることができる。あるいは、レポーターを発現する胚または接合体を代理母動物への移植に使用することも、クローニングに使用することもできるが、レポーターを発現しない他の胚または接合体をクローニングに使用することはできない。一部の実施形態では、レポーターは、マーカーを発現する細胞または胚の選択に使用する選択マーカーである。
【００３３】
大規模な染色体欠失および逆位；遺伝子改変動物
複数のＤＮＡ部位を対象とするＴＡＬＥＮを用いて実験を実施した。これらの部位は、数千塩基対離れていた。ＤＮＡは、部位間の全領域を欠失して再結合することができることが観察された。実施形態には、たとえば、１〜５メガベースの間、または染色体の５０％〜８０％の間、または約１００〜約１，０００，０００塩基対の間の距離離れた部位が含まれる。当業者であれば、明記された範囲内の範囲および値、たとえば、約１，０００〜約１０，０００塩基対、または約５００〜約５００，０００塩基対をすべて意図していることをすぐに理解するであろう。あるいは、外来性ＤＮＡの挿入、またはこれらの部位間のＤＮＡ鋳型による修復のために、外来性ＤＮＡを細胞または胚に加えることができる。複数の部位での改変を使用して、遺伝子改変された細胞、胚、偶蹄目動物、および家畜を作製することができる。実施例６は、末端の再結合が生化学的に確認された、数千塩基対のＤＮＡの欠失について記載する。
【００３４】
意外にも、離れた部位でＴＡＬＥＮ切断が起こると、ＴＡＬＥＮ標的間の全領域において高頻度の逆位も起きた。さらに驚いたことに、実施例６に詳述するように、これらの逆位は大きな忠実度で生じた。試験した逆位の４３のうち４１が５’接合部および３’接合部の両方で陽性であった。さらに、ＰＣＲ産物のシーケンシングから、欠失現象および逆位現象は両方とも、その接合部で付加または欠失されるヌクレオチドがごくわずかであることが確認された（図１１、１２）。この結果は極めて驚くべきことで、前例もないことであった。これらの欠失または逆位を含む細胞または胚には、遺伝学のアッセイツールとして多くの用途がある。
【００３５】
これらの細胞は、動物、家畜、および動物モデルの作製にも有用である。動物モデルという用語には、たとえば、ゼブラフィッシュ、イヌ、マウス、ラット、または他の実験動物が含まれる。大きな欠失は、遺伝子不活性化を引き起こす。さらに、たとえば、細胞、家畜、または動物モデルから欠失系統を作製することができる。突然変異を有する生物と欠失系統を交雑して野生型と比較すると、突然変異の遺伝子座の位置を迅速かつ手軽に特定し同定することが容易になる。欠失系統は、このような技術分野では周知であり、遺伝子の一連の欠失から作製される生物のセットを含む。欠失マッピングでは、遺伝子に点突然変異がある系統を欠失系統と交雑させることが含まれる。２つの系統間で組換えが起こり、野生型（＋）遺伝子が生じる場合には、この突然変異が欠失の領域内に存在することはありえない。組換えによりいかなる野生型遺伝子も生じない場合には、点突然変異および欠失が同じ一続きのＤＮＡ内に認められると結論するのが妥当である。これを用いて、たとえば、原因突然変異を同定することも、または量的形質遺伝子座の中にある多型を同定することも可能である。
【００３６】
逆位を有する細胞、胚、家畜、偶蹄目動物、および動物モデルは、生物または動物系統もしくは動物品種の子孫の遺伝形質を固定するのにも有用である。組換えは典型的には減数分裂期に対応する染色体の相同領域間で起こる。染色体領域の逆位は相同性を破壊し、減数分裂組換えを抑制する。本明細書に記載の方法および組成物を使用して、このような生物または動物を作製することができる。たとえば、ウシまたはブタの体細胞のＤＮＡをＴＡＬＥＮにより複数の遺伝子座で切断することができ、そして逆位を有する細胞を単離することも、またはレポーターを発現する細胞を、成功した逆位の有力な候補として使用することもできる。この細胞を使用して、減数分裂組換えが起こり得ない染色体領域を有する動物をクローン化することができる。あるいは、逆位は、複数のＴＡＬＥＮペアで複数の部位を処理した胚においても合理的頻度で起こると予想される。
【００３７】
本方法の一実施形態は、遺伝形質をコードするＤＮＡ領域を同定し、複数のＴＡＬＥＮを使用して各部位にコードされた形質の両側で細胞または胚のＤＮＡを切断することである。改変された細胞または胚は、遺伝子改変動物の作製に使用することができる。本方法は、逆位を有する遺伝子改変動物を単離する工程を含むことができる。
【００３８】
アレルの移動
家畜形質の一部は、多型（大または小）、一塩基多型、欠失、挿入、または他の変異など、アレルに関連している。たとえば、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅウシ由来のミオスタチンアレル（１１ｂｐ欠失）は、ウシ筋肉肥大表現型を引き起こすことでよく知られている。実施例７は、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅアレルを用いて、相同性依存型修復（ＨＤＲ）により特定のアレルをある家畜品種から別の家畜品種に正確に移す方法を示す。アレルを導入されたウシ線維芽細胞は、トランスジェニックウシの作製に直ちに使用することができる。このアレルは、正常な発生を妨害するものではなく、本明細書に教示された方法は、他の遺伝子を破壊することも、外来性遺伝子を組み込むこともなくアレルを正確に導入する。既に論じられているように、本明細書に示した結果から、姉妹染色分体をＨＤＲ鋳型に使用した場合、家畜線維芽細胞のアレル変換の頻度は高くなり、したがってアレルが一方の姉妹染色分体に移入されると、多くの場合、ホモ接合になると予測され得ることが示される。
【００３９】
本発明の一実施形態は、アレルを第１の家畜系統または品種から第２の家畜系統または品種に移す方法であって、第１の家畜系統／品種のアレルを含有する核酸の存在下で一対のＴＡＬＥＮにより第２の家畜系統／品種の細胞または胚のＤＮＡを切断することを含む方法である。第１の系統／品種のアレルを有する第２の系統／品種の動物を作製するために、胚または細胞を使用することができる。アレルを含有するＤＮＡは、相同性依存型修復の鋳型となる。このＤＮＡは、鋳型として、切片の両側のＤＮＡ部分と相同性があり、さらに所望のアレルを含有する。
【００４０】
本発明の実施形態は、複数のアレルをある品種から別の品種に移動させることを含む。たとえば、アレルを、ＷａｇｙｕまたはＮｅｌｏｒｅのウシからＢｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅウシに、またはその逆に移動させることができる。本明細書の他の箇所に記載したように、ＴＡＬＥＮは、タンパク質として送達しても、または、核酸、たとえば、ｍＲＮＡもしくはベクターによりコードされていてもよい。さらに、レポーターを細胞または胚にトランスフェクトして、ＴＡＬＥＮ改変細胞を選択する根拠として使用することができる。レポーターは、非破壊的にアッセイすることも、かつ／または、選択マーカーを含むこともできる。品種という用語は、同種の外観、行動、および同じ種の他の動物または植物と区別する他の特徴を有する家畜または植物のグループを意味する。特定の品種に属する動物は、当業者に公知である。同様に、アレル移動は動物モデルで実施することもできる。
【００４１】
生物の集団または種は、典型的には、様々な個体の中で各遺伝子座に複数のアレルを含む。遺伝子座のアレルの変化は、存在するアレルの数（多型）、または集団におけるヘテロ接合体の比率として測定可能である。たとえば、古典的遺伝学では、ヒトのＡＢＯ式血液型糖鎖抗原の遺伝子座で輸血の適合性を決定する３つのアレルＩＡ、ＩＢ、およびＩＯが知られている。アレルとは、２つ以上の遺伝子形態のうちの１つを意味する用語である。
【００４２】
家畜の場合、多くのアレルが様々な形質、たとえば生産形質、体型形質、ワーカビリティー（ｗｏｒｋａｂｉｌｉｔｙ）形質、および他の機能形質に関連することが知られている。当業者は、これらの形質のモニタリングおよび定量に慣れている。たとえば、Ｖｉｓｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４０（１９９４）１２３−１３７、米国特許第７，７０９，２０６号明細書、米国特許出願公開第２００１／００１６３１５号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００２３１４０号明細書、および米国特許出願公開第２００５／０１５３３１７号明細書を参照されたい。したがって、移されるアレルは、ある形質に関連したものでも、生産形質、体型形質、ワーカビリティー形質、繁殖形質、マザリング（ｍｏｔｈｅｒｉｎｇ）形質、および耐病形質からなる群の形質から選択したものでもよい。
【００４３】
遺伝子改変の文脈における天然アレルという用語は、改変される生物と同じ種の、自然界に見出されるアレルを意味する。新規アレルという用語は、非天然のアレルを意味する。ヤギに導入されたヒトアレルは新規アレルである。合成アレルという用語は、自然界に見出されないアレルを意味する。したがって、天然アレルは、交配可能な種内に既に存在する変異である。さらに新規アレルとは、交配可能な種内に存在しないアレルである。異種間のアレル移動は、ある種から別の種への移動を意味し、同一種内の移動は、同種の動物間の移動を意味する。
【００４４】
従来の繁殖プロセスによりアレルをある品種から別の品種に移動させるには、品種間で多くのアレルを交換することが含まれる。減数分裂期の組換えでは、必然的に品種間で遺伝子座が交換される。これに対して、ＴＡＬＥＮ改変の家畜および他の動物では、細胞がもっぱら有糸分裂にあるときに、細胞または胚が改変されるので、減数分裂性組換え現象に起因する遺伝子変化は含まれない。このため、ＴＡＬＥＮ改変動物は、有性生殖により誕生した動物と容易に区別することができる。
【００４５】
本明細書のプロセスは、既存の動物のゲノムを編集することを可能にする。動物は固定した表現型を有しており、たとえば体細胞クローニングによりその動物をクローニングすると、その表現型が効果的に保存される。クローニング中に細胞ゲノムに１つまたは複数の特定の変化を生じさせれば、既知の表現型を変化させることが可能になる。あるいは、本明細書のプロセスにより、固定した形質を有する動物へとまだ発育していない胚のゲノムを改変することができる。健全な遺伝的性質を有する胚は、それでも、その遺伝的性質の遺伝的能力の範囲内にあるすべての形質を発現できるわけではない。すなわち、動物はその系統が育んでいる形質を常に発現するとは限らない。実施形態は、一連の形質を発現できることが公知の遺伝的性質を有する胚を準備する工程と、ＴＡＬＥＮに胚を曝露する工程と（任意選択で、レポーター遺伝子および／または選択マーカーを含むことなく）、改変のためにかつ一連の形質の発現のために、妊娠動物をスクリーニングする工程とを含む。したがって、所望のアレルの家畜への移入は、体細胞改変およびクローニングにより重要な遺伝的価値があると以前に判定された動物のゲノムを編集することによって、または胚の処置／注入によりそれらの潜在する遺伝的価値が判定される前に、動物のゲノムを編集することによって達成することができる。クローニングの場合には、遺伝学的に優れた動物を同定し、機能アレルの喪失を補正するために、またはまだ存在しない所望のアレルを移入するために遺伝子編集に供することができる。このアプローチでは、所望の変化を包含する細胞のみがクローニングされることになるので、このプロセスの全段階で制御されかつ特徴づけられたアウトカムが得られる。
【００４６】
胚の直接処置により編集を適用することもできる。未知の遺伝的利点を有する胚を処置した場合、子孫のスクリーニングは、所望の変化の分析および動物の遺伝的利点の分析、たとえば、変化の分析および動物が発現する様々な形質の分析からなり得る。このアプローチの有益な態様は、マーカー利用選択によって、このアプローチを遺伝的改善と同時に適用することができることであり、これに対してクローニングでは一世代以上の期間の損失が生じる。このような改変の効率は、胚処置により発生する繁殖率のいかなる低下も相殺するのに十分高いものでなければならない。単純な遺伝子不活性化の場合には、成功頻度は極めて高いが（７５％）、ホモ接合型の場合でも改変の成功は胚の１０〜２０％である（実施例１および９）。実施形態は、胚（または細胞）をＴＡＬＥＮ（任意選択で、レポーター遺伝子を含むことなく、かつ／またはマーカー遺伝子を含むことなく）に曝露することを含み、胚の約１％超がＴＡＬＥＮ標的化染色体部位（ヘテロ接合型またはホモ接合型）に改変を組み込む。当業者であれば、明記された範囲内の範囲および値、たとえば、約１％〜約８５％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％をすべて意図していることをすぐに理解するであろう。細胞も同様に、極めて高効率にＴＡＬＥＮの導入に成功する可能性があり、同じ範囲、すなわち、約１％超が意図される。従来のプロセスによる達成率は低い。さらに、高精度ゲノム編集を使用して、相同性によるアレル置換により種内に現在存在しないアレルを導入することもできる。
【００４７】
いかなるレポーターも含むことなく遺伝子改変された動物；ＴＡＬＥＮ技術；アレル移動
本発明の特定の実施形態は、レポーターおよび／または選択マーカーを使用することなく、細胞または胚を改変するプロセスに関する。一般に、ＴＡＬＥＮ改変細胞の頻度は、レポーター遺伝子の使用など濃縮または選択の方法を使用しないと、経時的に顕著に低下することが観察された。この観察により、本明細書に報告される、レポーター遺伝子を含むコトランスフェクション、共選択技術などのアプローチに至った。
【００４８】
しかしながら、ＴＡＬＥＮ改変は、レポーターを必要としないほど高い効率で実施することができること、またレポーターの使用がトランスジェニック動物系統の作製を遅らせるだけであることが発見された。特定の理論に拘泥するものではないが、幾つかの要因が独立して、レポーターを含まない実施形態の発明に寄与した。一つは、ＴＡＬＥＮが迅速かつ高効率に作用する傾向があるという認識である。しかしながら、ＴＡＬＥＮ改変は、数日の期間内で不安定になる傾向があるので、効率はサンプリングの時間に依存して低下すると考えることができる。さらに、安定に改変された生物のみが、トランスジェニック動物の作製に使用されるべきであるので、短期間の改変を考える動機はないというのが一般通念である。他の系で従来行われているように、安定な組み込みを選択するために細胞生存遺伝子を使用する動機はある。別の要因は、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡがＴＡＬＥＮを発現するベクターに比較して、意外にも効果的であることである。ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡの直接導入は、概ね有用であり、実施例１３〜１８で使用した。
【００４９】
別の要因は、実施例１２で実証されるように、ＨＤＲ鋳型が望ましい場合に、ｓｓＤＮＡ、たとえば一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドの直接導入が有用であることである。交絡効果は、ｓｓＤＮＡの送達のタイミングが重要であったことである。実施例１２では、プラスミドＤＮＡにコードされたＴＡＬＥＮと同時にｓｓオリゴヌクレオチドを送達することは効果的でなかったが、ｓｓオリゴヌクレオチドの２４時間遅れの導入は高効率をもたらした。一方、実施例１６は、ｓｓオリゴヌクレオチド鋳型とＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡの同時導入が効果的であることを示した。実施例１２では、ＴＡＬＥＮをプラスミドＤＮＡ発現カセットとして導入したため、トランスフェクションと標的を切断し始めるのに十分なＴＡＬＥＮタンパク質の蓄積との間に、１２時間以上の遅れがあった可能性がある。実施例１２において、ＴＡＬＥＮと共に導入されたオリゴヌクレオチドは、細胞によって分解されたか、またはＴＡＬＥＮが標的を活発に切断しているその時に、ＨＲの鋳型として機能するように利用できなかった（コンパートメント内に閉じ込められているか、またはタンパク質と複合体を形成している）可能性がある。別の交絡要因は、驚くべきことに、ｓｓヌクレオチドが二相性の効果を示すことであった（実施例１６）。すなわち、極めて微量または極めて多量のｓｓオリゴヌクレオチドが低頻度のＨＤＲをもたらす。本発明の実施形態は、ＴＡＬＥＮをコードするベクターが細胞に導入された後、たとえば約８時間〜約７日の間の後に、ｓｓＤＮＡが細胞に導入される実施例を含む。当業者であれば、明記された範囲内の範囲および値、たとえば、約１〜約３日、時間をすべて意図していることをすぐに理解するであろう。本発明の実施形態は、ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡを直接導入するのとほぼ同時にｓｓＤＮＡを細胞に導入する実施形態を含む。ここで、「ほぼ同時」という用語は、互いが約７時間未満の時間内にあることを意味する。
【００５０】
レポーターを含まない実施形態の発見に寄与した別の要因は、ｓｓＤＮＡ（ｓｓオリゴヌクレオチド）鋳型とＴＡＬＥＮ活性との間に予期しない相乗作用があることであった。この相乗作用の基礎となるものはわかっていない。たとえば、ＴＡＬＥＮをコードする、０．５〜１０マイクログラムのｍＲＮＡを５００，０００〜７５０，０００細胞にヌクレオフェクションにより送達した後、３０℃で３日間培養すると、一貫したレベルの改変が得られる。しかし、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによりアッセイすると、ＮＨＥＪの増加が観察されたように、０．２〜１．６ｎＭｏｌのｓｓＯＤＮを同じ条件で補給すると、ＴＡＬＥＮ活性の増加がもたらされた（実施例１６）。典型的には、トランスフェクションは、１〜４マイクログラムのＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡと０．２〜０．４ｎＭｏｌのｓｓＤＮＡからなる。実施形態は、５００，０００細胞当たり約０．０５μｇ超、または５００，０００細胞当たり約０．０５μｇ〜約１００μｇの範囲にあるＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ量を、細胞または胚に導入することを含む。当業者であれば、明記された範囲内の範囲および値をすべて意図していることをすぐに理解するであろう。実施形態はさらに、約０．０２ｎＭｏｌ超の濃度のｓｓＤＮＡ、または約０．０１〜約１０ｎＭｏｌの範囲にあるｓｓＤＮＡを導入することを含む。
【００５１】
直接導入、たとえば直接ｍＲＮＡ導入という用語は、ｍＲＮＡ物質の導入を指す。これに対して、ｍＲＮＡをコードするベクターによる導入は、間接導入と称される。直接導入の多くのプロセス、たとえば、エレクトロポレーション、トランスフェクション、リポフェクション、リポソーム、ヌクレオフェクション、遺伝子銃粒子、ナノ粒子、脂質トランスフェクション、電気融合、および直接インジェクションが公知である。
【００５２】
ファウンダー動物は、改変された細胞または胚から直ちに作製することができ、改変しその後繁殖させて新規のトランスジェニック系統の基礎を形成させる動物を最初に作製する必要がない。ファウンダーまたはファウンダー動物という用語は、改変されている、クローニングされた細胞または処置／インジェクションされた胚から直接発生する第一世代（「Ｆ０」）トランスジェニック動物を指すために使用する。本明細書に報告する方法は、染色体の標的部位でのみ遺伝子改変されたファウンダーの作製を可能にし、繁殖および／または近親交配の中間段階を含まない。さらに、実施形態は、改変についてホモ接合型であるファウンダーを含む。ファウンダーは、レポーター遺伝子（および／または選択マーカー遺伝子）に細胞および／または胚をまったく曝露させることなく調製することができる。
【００５３】
実施形態は、遺伝子改変動物を作製する方法であって、胚または細胞の染色体標的部位に特異的に結合するＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡに胚または細胞を曝露する工程と、代理母において細胞をクローニングする工程または代理母に胚を移植する工程であって、代理母が、レポーター遺伝子を含むことなく、かつＴＡＬＥＮが結合する染色体標的部位でのみ遺伝子改変されている動物を妊娠する工程とを含む方法を含む。動物は、レポーター遺伝子をまったく含まなくても、または選択マーカーを含まなくてもよく、たとえば、選択マーカーを含まないが、蛍光タンパク質などのレポーターを含む。選択肢には、ｍＲＮＡとしてのＴＡＬＥＮおよび／または遺伝子改変のための鋳型、たとえばアレルを提供するｓｓオリゴヌクレオチドを直接導入することが含まれる。
【００５４】
遺伝子改変動物を作製する方法であって、ＴＡＬＥＮおよび／またはベクターを培養細胞、たとえば初代家畜細胞に導入する工程を含む方法。ＴＡＬＥＮは特定の染色体部位を対象とし、その部位で遺伝子変化を引き起こす。ＨＤＲ鋳型も、たとえば二本鎖ベクターとして、一本鎖ＤＮＡとして、またはｓｓヌクレオチドとして直接細胞に導入することができる。次いで、培養細胞を培養してクローン細胞のコロニーを形成させる。このコロニーをＰＣＲおよび／もしくは配列決定により検査するか、または遺伝子改変についてアッセイする。ここで、レポーター遺伝子を含まず、かつ／または選択マーカーを含まないことが好ましい。目的とする部位で遺伝子改変されているコロニーから細胞を採取し、クローニングに使用する。たとえば、１０〜５０，０００個の細胞を使用して、代理母に移植する１０〜５０，０００個の胚（たとえば、代理母当たり１〜５００個の胚のセット）を作製する。当業者であれば、明記された範囲内の範囲および値をすべて意図していることをすぐに理解するであろう。実施形態は、レポーター遺伝子を含まないＴＡＬＥＮに細胞を曝露し、クローン細胞のコロニーを作製し、コロニーメンバーのサブセットを試験して、染色体標的部位に改変が組み込まれたコロニーを同定する工程を含む。
【００５５】
培養細胞からクローン細胞のコロニーを作製するプロセスは公知である。このような方法の１つは、第１の培養物に由来する細胞を、第２の培養物に分散させる工程であって、たとえば、マルチウェルプレートまたはその中に播種される細胞の数に対して相対的に大きい表面積を有するプレートに細胞を希釈することによって、種々の細胞を相互に接触させない工程を含む。細胞が増殖できるようになる期間、細胞を培養する。細胞がその元の位置から離れて遠くに移動する可能性が低い条件下で、増殖細胞を培養する。その結果、使用者は、その期間後、細胞を観察し、すべてが単一細胞とその子孫からなる種々のコロニーを見ることができる。コロニー中の細胞のサブセットをコロニー中の他の細胞を破壊することなくサンプリングすることができる。
【００５６】
遺伝子改変に対するアッセイには、試験する細胞を破壊して細胞が特定の性質を有するか否かを判定するアッセイを意味する、破壊的アッセイが含まれ得る。破壊的アッセイでは、薬物について、迅速に、徹底的に、かつ直接的に試験する機会が与えられる。破壊的アッセイは、クローンコロニーのサンプルを採取することにより実用的になる。特に目的とする改変がわかっている場合には、多くのこのようなアッセイは高度に効率的である。たとえば、ＰＣＲを実施して、既存の配列中のインデルまたはミスマッチを同定すること、またはＨＤＲ鋳型の配列を検出することが可能になる。あるいは、細胞ＤＮＡを核酸分解によりアッセイして、たとえば、新規のヌクレアーゼ標的配列の導入またはノックアウトに成功したか否かを判定することができる。実施例１８では、核酸分解による破壊的アッセイを使用する。たとえばシーケンシングまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥを含む他のプロセスを使用して、改変を示すバンドを見出すことができる。たとえばシーケンシングまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥを含む他のプロセスを使用して、改変を示すバンドを見出すことができる。試験プロセスは、たとえば、核酸分解アッセイ、シーケンシング、ＰＡＧＥ、ＰＣＲ、プライマー伸長、またはハイブリダイゼーションからなる群から選択することができる。
【００５７】
アレル移動には多くの重要な用途がある。以下のアレル移動の表に、特定の遺伝子およびその用途について記載する。この用途を読む当業者は、移動ならびにその結果得られる細胞および動物を作製し、使用することができる。当業者は、鋳型または破壊の標的としてこれらのアレルを使用するための、本明細書に示すプロセスを容易に適用することができる。実施形態は、たとえば挿入または鋳型によるアレル移動によって、表の遺伝子を導入されたゲノムを有する、遺伝子改変された細胞または動物（たとえば、実験動物、Ｆ０ファウンダー、または動物系統）を作製する工程を含む。一部の遺伝子に対するアレルは、家畜生産に有利であると報告されているが、一部の品種または種では、極めて低頻度であるか存在しない（項目１〜９）。これらのアレルの移入は、生産形質にとって重要な価値となり得る。たとえば、肉用品種由来の無角（Ｐｏｌｌｅｄ）アレル（項目１）は、角のない動物を生み出すが、乳用品種は、このアレルがないため角を有し、生産を実施する上で角をとる必要がある。肉用品種から有角（乳用）品種にアレルを移動させると、生産および動物福祉にとって価値がある無角乳牛が得られることになる。他の実施例は、食肉（項目４〜６）およびミルク（項目７〜８）などの農産物の特性を増大または強化することができるアレルに関するものである。項目９は耐病性に有用である。
【００５８】
商業的に、また一般に使用される多くの動物品種は、所望の形質を確立するために注意深い繁殖が行われているが、その繁殖のプロセスにおいて、受胎能の喪失のため、または流産の増加により繁殖成功を減少させる遺伝子エラーが蓄積されてきた。遺伝子の一部について有害なアレルが動物集団の中に存在する。本明細書の他の箇所で説明したように、本発明の技術は、遺伝子ツールまたは減数分裂性組換えに起因する他の改変を起こさずに、標的動物の目的とする位置でのみアレルを変化させることを可能にする。したがって、動物のゲノムを破壊し、その結果形質を破壊するかまたは意図しない結果を引き起こすということなく、家畜および動物品種に蓄積した遺伝子エラーをクリーンアップすることが初めて可能になる。一部の遺伝子に対するアレルは、動物の受胎能を制御して種畜の遺伝制御のために使用することができる（項目２〜３）。
【００５９】
多くの有用な動物モデルを作製ことができる。特定のアレルが有用であり、項目１０〜３９を参照されたい。これらのうちの一部は、動物で確立されている。遺伝子の中にはヒト疾患を引き起こすものが知られている。したがって、家畜、実験動物、または他の動物にこれらのアレルを移入することはヒト疾患の生物医学的モデルを作製するのに有用である。
【００６０】
本発明の実施形態は、遺伝子改変動物を作製する方法であって、胚または細胞の標的染色体部位に特異的に結合するＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡに胚または細胞を曝露する工程と、代理母において細胞をクローニングする工程または代理母に胚を移植する工程であって、それによって代理母が、レポーター遺伝子を含むことなく、かつＴＡＬＥＮ標的化染色体部位でのみ遺伝子改変されている動物を妊娠する工程とを含み、アレルが、（ａ）無角遺伝子座（ｂ）受胎能欠損の劣勢遺伝子、たとえばＣＷＣ１５および／またはＡｐａＦ１、（ｃ）家畜形質、たとえば食肉生産（ＧＤＦ８、ＩＧＦ２、ＳＯＣＳ２、またはそれらの組合せ）および／またはミルク生産（ＤＧＡＴ１および／またはＡＢＣＧ２）を増強するための遺伝子、（ｄ）アフリカブタコレラに対する耐性遺伝子（Ｐ６５／ＲＥＬＡ）、（ｅ）動物サイズ低減のための遺伝子（ＧＨＲＨＲ）、（ｆ）腫瘍増殖を増強する遺伝子（たとえば、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、Ｓｍａｄ４、ＢＵＢ１Ｂ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＳＴ１４、またはそれらの組合せ）、（ｇ）癌の動物モデルのためのヒト癌遺伝子（たとえば、ＡＫＴ１、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ／Ｂ、またはそれらの組合せ）、（ｈ）高コレステロール血症の動物モデルにおける遺伝子（アテローム性動脈硬化症、脳卒中、およびアルツハイマー病モデルを誘発させる）、たとえば、ＬＤＬＲ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＢ、またはそれらの組合せ、（ｉ）炎症性腸疾患、たとえば、ＮＯＤ２、（ｊ）二分脊椎、たとえば、ＶＡＮＧＬ１および／またはＶＡＮＧＬ２、（ｋ）肺高血圧症、たとえば、ｍｉＲ−１４５、（ｌ）心臓欠陥に対する遺伝子（たとえば、ＢＭＰ１０、ＳＯＳ１、ＰＴＰＮ１１、Ｎｒｇ１、Ｋｉｒ６．２、ＧＡＴＡ４、Ｈａｎｄ２、またはそれらの組合せ、ならびに（ｌ）小児脂肪便症遺伝子、たとえばＨＬＡ−ＤＱＡ１からなる群のメンバーである方法を含む。
【００６１】
【表１】
2015519923.tif 000003
【００６２】
【表２】
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【００６３】
【表３】
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【００６４】
組成物およびキット
本発明はまた、たとえば、ＴＡＬＥＮをコードする核酸分子、ＴＡＬＥＮポリペプチド、このような核酸分子もしくはポリペプチドを含む組成物、またはＴＡＬＥＮにより操作された細胞株を含む組成物およびキットを提供する。このような品目は、たとえば、研究ツールとして使用することも、治療に使用することもできる。
【００６５】
リコンビナーゼ
本発明の実施形態は、１つまたは複数のＴＡＬＥＮを、リコンビナーゼまたはＤＮＡ組換えに関連した他のＤＮＡ結合タンパク質と共に投与することを含む。リコンビナーゼは、核酸フラグメントとフィラメントを形成し、事実上、細胞ＤＮＡを探索してその配列と実質的に相同なＤＮＡ配列を見出す。ＴＡＬＥＮ−リコンビナーゼ実施形態の一実施形態は、ＨＤＲの鋳型として働く核酸配列とリコンビナーゼを組み合わせることを含む。ＨＤＲ鋳型配列は、ＴＡＬＥＮ／ＴＡＬＥＮペアによる切断の標的となる部位と実質的な相同性がある。本明細書に記載するように、ＨＤＲ鋳型は、アレルの導入、インデルの作製、外来性ＤＮＡの挿入、または他の変化によりネイティブＤＮＡを変化させる。ＴＡＬＥＮは、タンパク質、ｍＲＮＡとして、またはベクターを使用して、本明細書に記載の方法により細胞または胚に導入される。リコンビナーゼは、ＨＤＲ鋳型と一緒になってフィラメントを形成し、細胞に導入される。リコンビナーゼおよび／またはリコンビナーゼと一緒になったＨＤＲ鋳型は、タンパク質、ｍＲＮＡとして、またはリコンビナーゼをコードするベクターを用いて、細胞または胚に導入することができる。米国特許出願公開第２０１１／００５９１６０号明細書（米国特許出願第１２／８６９，２３２号明細書）の開示内容は、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。矛盾が生じた場合、本明細書を優先する。リコンビナーゼという用語は、細胞において比較的長い２つのＤＮＡ鎖の間で比較的短いＤＮＡ断片の連結を酵素的に触媒する遺伝子組換え酵素をいう。リコンビナーゼとしては、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、ＲｅｃＡ、ＲＡＤ５１、Ｃｒｅ、およびＦＬＰが挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位間でＤＮＡの部位特異的組換えを触媒するＰ１バクテリオファージ由来のＩ型トポイソメラーゼである。Ｈｉｎリコンビナーゼは、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）細菌に見られる１９８個のアミノ酸からなる２１ｋＤのタンパク質である。Ｈｉｎは、活性部位セリンに依存してＤＮＡの切断および組換えを惹起するＤＮＡインベルターゼのセリンリコンビナーゼファミリーに属する。ＲＡＤ５１はヒト遺伝子である。この遺伝子がコードするタンパク質は、ＤＮＡ二本鎖切断の修復を支援するＲＡＤ５１タンパク質ファミリーのメンバーである。ＲＡＤ５１ファミリーメンバーは、細菌のＲｅｃＡおよび酵母のＲａｄ５１遺伝子と相同である。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位で挟まれた特定配列を欠失させるために実験で使用される酵素である。ＦＬＰは、パン酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μのプラスミドに由来するフリッパーゼ組換え酵素（ＦＬＰまたはＦｌｐ）を指す。
【００６６】
ＲｅｃＡは、相同組換えによる二本鎖切断の修復において鎖交換を触媒するそのリコンビナーゼ活性で知られている（ＭｃＧｒｅｗ，２００３）Ｒａｄｄｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９８１；Ｓｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＲｅｃＡはまた、たとえば、ＬｅｘＡおよびλリプレッサータンパク質のタンパク質分解を触媒すること、およびＤＮＡ依存性ＡＴＰアーゼ活性を有することが示されている。電離放射線または他の何らかの損傷から二本鎖切断が起きた後、エキソヌクレアーゼがＤＮＡを５’末端から３’末端方向に分解し、それによりＤＮＡの一方の鎖が曝露される（ＭｃＧｒｅｗ，２００３；Ｃｏｘ，１９９９）。一本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）により安定化する。ＳＳＢの結合後、ＲｅｃＡは、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡに結合し、らせん状ヌクレオプロテインフィラメント（フィラメントまたはシナプス前フィラメントと呼ばれる）を形成する。ＤＮＡ修復において、ＲｅｃＡの相同性探索機能によりフィラメントは相同ＤＮＡに誘導され、相同塩基対合および鎖交換が触媒される。この結果、ＤＮＡヘテロ二本鎖が形成される。ストランドインベージョンの後、ＤＮＡポリメラーゼは、相同ＤＮＡ鋳型に基づきｓｓＤＮＡを伸長させてＤＮＡ切断を修復し、クロスオーバー構造、すなわちホリデイジャンクションが形成される。ＲｅｃＡは、クロスオーバー構造の移動に関与する運動機能も示す（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９９９）。
【００６７】
リコンビナーゼ活性は、いくつかの異なる機能を有する。たとえば、リコンビナーゼ活性を有するポリペプチド配列は、一本鎖ＤＮＡに配列非特異的に結合してヌクレオプロテインフィラメントを形成することができる。このようなリコンビナーゼ結合ヌクレオプロテインフィラメントは、二本鎖ＤＮＡ分子と配列非特異的に相互作用し、フィラメントの配列と相同な二本鎖分子の配列を探索し、このような配列を見つけると、二本鎖分子の鎖の一方を置き換えてフィラメントの配列と二本鎖分子の鎖の一方の相補配列との間で塩基対合を形成させることができる。このようなステップは、「シナプシス」と総称される。
【００６８】
ＲｅｃＡおよびＲｅｃＡ様タンパク質（多くの真核生物種ではＲａｄ５１と呼ばれる）について、種々の真核生物系で遺伝子ターゲティングおよび相同組換えが調べられてきた。タバコ細胞では、核移行シグナル（ＮＬＳ）を含有する細菌ＲｅｃＡの発現が、相同組換えおよび体細胞染色体内組換え（相同染色体間の組換え）による、マイトマイシンＣ誘導性ＤＮＡ損傷の修復を３〜１０倍促進する（Ｒｅｉｓｓ，１９９６）。さらに、タバコでＮＬＳＲｅｃＡが発現すると、姉妹染色分体交換が野生型レベルより２．４倍刺激され得る（Ｒｅｉｓｓ，２０００）。哺乳動物体細胞では、ＮＬＳＲｅｃＡの過剰発現が、相同組換えによる遺伝子ターゲティングを１０倍刺激する（Ｓｈｃｈｅｒｂａｋｏｖａ，２０００）。しかしながら、ヒト細胞では、ＲｅｃＡのヒトホモログ、ｈＲＡＤ５１の過剰発現は、抗生物質選択下、組換えを野生型レベルより２〜３倍刺激するにとどまる（Ｙａｎｅｚ，１９９９）。ゼブラフィッシュでは、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の突然変異形態が、ｓｓＤＮＡ−ＲｅｃＡフィラメントを直接インジェクトすることにより低頻度で修正された（Ｃｕｉ，２００３）。また、Ｒａｄ５１エピスタシスグループのメンバーであるＲａｄ５２は、変異オリゴヌクレオチドを用いて、ゼブラフィッシュの一本鎖アニーリングおよび低レベル遺伝子破壊を促進する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，２００５）。総合すると、これらの研究から、ＲｅｃＡまたはＲａｄ５１の異所性発現は、相同組換えを適度に刺激するものの、遺伝子ターゲティングに十分に有用であるようにはレベルを上昇させないことが示される。
【００６９】
以上のように、リコンビナーゼ活性には、以下に限定されるものではないが、一本鎖ＤＮＡ結合、シナプシス、相同性探索、一本鎖ＤＮＡによる二本鎖侵入、ヘテロ二本鎖形成、ＡＴＰ加水分解、およびタンパク質分解が含まれる。原型リコンビナーゼは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＲｅｃＡタンパク質である。たとえば、米国特許第４，８８８，２７４号明細書を参照されたい。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、およびプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）種の原核生物ＲｅｃＡ様タンパク質も記載されている。サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来の耐熱性ＲｅｃＡタンパク質は、米国特許第５，５１０，４７３号明細書に記載されている。ＲｅｃＡのバクテリオファージＴ４ホモログ、ＵｖｓＸタンパク質も記載されている。リコンビナーゼ活性の変化したＲｅｃＡ突然変異体は、たとえば、米国特許第６，７７４，２１３号明細書；同第７，１７６，００７号明細書、および同第７，２９４，４９４号明細書に記載されている。植物ＲｅｃＡホモログは、たとえば、米国特許第５，６７４，９９２号明細書；同第６，３８８，１６９号明細書、および同第６，８０９，１８３号明細書に記載されている。リコンビナーゼ活性を含有するＲｅｃＡフラグメントは、たとえば、米国特許第５，７３１，４１１号明細書に記載されている。リコンビナーゼ活性の増強された突然変異体ＲｅｃＡタンパク質、たとえば、ＲｅｃＡ８０３も記載されている。たとえば、Ｍａｄｉｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６５９２−６５９６を参照されたい。
【００７０】
リコンビナーゼ活性も有する、ＲｅｃＡの真核生物ホモログは、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で最初に同定されたＲａｄ５１タンパク質である。Ｂｉｓｈｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：４３９−５６およびＳｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）Ｃｅｌｌ：４５７−７０．Ａｂｏｕｓｓｅｋｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７２，３２２４−３２３４．Ｂａｓｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，３２３５−３２４６を参照されたい。植物Ｒａｄ５１の配列は、米国特許第６，５４１，６８４号明細書；同第６，７２０，４７８号明細書；同第６，９０５，８５７号明細書、および同第７，０３４，１１７号明細書に記載されている。ＲｅｃＡと相同な別の酵母タンパク質にＤｍｃ１タンパク質がある。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）以外の生物のＲｅｃＡ／Ｒａｄ５１ホモログも記載されている。Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６５７７−６５８０；Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．４：２３９−２４３；Ｈｅｙｅｒ（１９９４）Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ５０：２２３−２３３；Ｍａｅｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６０：１９５−２００；米国特許第６，５４１，６８４号明細書および同第６，９０５，８５７号明細書。
【００７１】
本明細書では、「ＲｅｃＡ」または「ＲｅｃＡタンパク質」は、同じ機能、特に：（ｉ）その後のＤＮＡポリメラーゼによる伸長のために、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをその相同な標的に適切に配置する能力；（ｉｉ）ＤＮＡ合成のために二本鎖核酸を形態的に用意する能力；および（ｉｉｉ）ＲｅｃＡ／オリゴヌクレオチドまたはＲｅｃＡ／ポリヌクレオチド複合体が効率的に相補配列を見つけて結合する能力、の基本的に全部または大部分を有するＲｅｃＡ様組換えタンパク質のファミリーを指す。最も研究の進んでいるＲｅｃＡタンパク質は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のものである。このタンパク質の最初のアレル型に加えて、いくつかの突然変異体ＲｅｃＡ様タンパク質、たとえば、ＲｅｃＡ８０３が同定されている。さらに、多くの生物、たとえば、酵母、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ヒトを含む哺乳動物、および植物もＲｅｃＡ様鎖転移タンパク質を有する。これらのタンパク質としては、たとえば、Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５１Ｅ、ＸＲＣＣ２、およびＤＭＣ１が挙げられる。組換えタンパク質の一実施形態は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質である。あるいは、ＲｅｃＡタンパク質は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異体ＲｅｃＡ−８０３タンパク質、別の細菌源由来のＲｅｃＡタンパク質、または別の生物由来の相同組換えタンパク質であってもよい。
【００７２】
リコンビナーゼ活性を有するタンパク質に関するさらなる説明は、たとえば、参照により本明細書に組み込まれるＦｕｇｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：７４７３；Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４４：８８５；Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５０８９；Ｆｉｓｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３６８３；Ｃａｓｓｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０８：１０；Ｇａｎｅａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：３１２４；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．：１１１０８；Ｋｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３０５７；Ｋｉｍｉｅｃ（１９８４）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．４８：６７５；Ｋｉｍｅｉｃ（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４４：５４５；Ｋｏｌｏｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５５６０；Ｓｕｇｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３６８３；Ｈａｌｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２１４０３；Ｅｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７４８１；ＭｃＣａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８５４；およびＬｏｗｅｎｈａｕｐｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２０５６８に見られる。さらにＢｒｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４４：５２８も参照されたい。
【００７３】
リコンビナーゼ活性を有するタンパク質の例としては、ｒｅｃＡ、ｒｅｃＡ８０３、ｕｖｓＸ、および他のｒｅｃＡ突然変異体、およびｒｅｃＡ様リコンビナーゼ（Ｒｏｃａ（１９９０）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２５：４１５），（Ｋｏｌｏｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：５５６０；Ｔｉｓｈｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５９３）、ＲｕｖＣ（Ｄｕｎｄｅｒｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：５０６）、ＤＳＴ２、ＫＥＭ１、およびＸＲＮ１（Ｄｙｋｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５８３）、ＳＴＰａ／ＤＳＴ１（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５７６）、ＨＰＰ−１（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：９０６７）、他の真核生物のリコンビナーゼ（Ｂｉｓｈｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：４３９；ａｎｄ  Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：４５７）が挙げられる。参考文献については参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
リコンビナーゼ活性を有するインビトロ進化したタンパク質が、米国特許第６，６８６，５１５号明細書に記載されている。さらにリコンビナーゼに関する公報には、たとえば、米国特許第７，７３２，５８５号明細書；同第７，３６１，６４１号明細書、および同第７，１４４，７３４号明細書がある。リコンビナーゼの概説については、Ｃｏｘ（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：８１７３−８１８０を参照されたい。
【００７５】
ヌクレオプロテインフィラメントまたは「フィラメント」を形成させることができる。リコンビナーゼと構造体を形成させる文脈では、フィラメントという用語は、このような分野の当業者に公知の用語である。そのように形成させたヌクレオプロテインフィラメントは、次いで、たとえば、別の核酸と接触させることも、細胞に導入することもできる。フィラメントがリコンビナーゼ活性を有するポリペプチド配列および核酸を含むヌクレオプロテインフィラメントを形成させる方法は、当技術分野で周知である。たとえば、Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：１７４−１８４、ならびに米国特許第４，８８８，２７４号明細書；同第５，７６３，２４０号明細書；同第５，９４８，６５３号明細書、および同第７，１９９，２８１号明細書を参照されたい。これらの開示内容は、リコンビナーゼを核酸に結合させてヌクレオプロテインフィラメントを形成させる例示的な技術を開示することを目的として参照により組み込まれる。
【００７６】
一般に、リコンビナーゼ活性を有する分子を、線状一本鎖核酸と接触させる。線状一本鎖核酸はプローブであってもよい。このような一本鎖核酸の調製方法は公知である。反応混合物は、典型的には、マグネシウムイオンを含有する。任意選択で、反応混合物は緩衝化され、さらに任意選択でＡＴＰ、ｄＡＴＰ、または非加水分解性ＡＴＰアナログ、たとえば、γ−チオ−ＡＴＰ（ＡＴＰ−γ−Ｓ）もしくはγ−チオ−ＧＴＰ（ＧＴＰ−γ−Ｓ）を含有する。反応混合物は、任意選択でＡＴＰ産生系も含有することができる。二本鎖ＤＮＡ分子は、フィラメント形成の前、またはその最中に変性させることができる（たとえば、熱またはアルカリにより）。リコンビナーゼと核酸とのモル比の最適化は、当技術分野の技術の範囲内である。たとえば、一定量の核酸に一連の異なる濃度のリコンビナーゼを加え、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲルにおける移動度によりフィラメントの形成をアッセイすることができる。結合したタンパク質は、ポリヌクレオチドの電気泳動移動度を遅延させるため、核酸の移動度の遅延によりフィラメントの形成が証明される。最大の遅延度、または移動度の遅延した状態で移動した最大量の核酸を使用すれば、最適なリコンビナーゼ：核酸比を示すことができる。タンパク質−ＤＮＡ結合はまた、ポリヌクレオチドがニトロセルロースに結合する能力を測定することにより定量することができる。
【００７７】
ＴＡＬＥＮ
ＴＡＬＥＮという用語は、本明細書で使用する場合、広義であり、別のＴＡＬＥＮの援助なしに二本鎖ＤＮＡを切断できる単量体ＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語は、協働して同じ部位でＤＮＡを切断するように操作されたＴＡＬＥＮのペアの一方または両方を指すのにも使用される。協働するＴＡＬＥＮは、ＤＮＡの左右方向を参照してｌｅｆｔ−ＴＡＬＥＮおよびｒｉｇｈｔ−ＴＡＬＥＮと呼ぶことも、ＴＡＬＥＮ−ペアと呼ぶこともある。
【００７８】
Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９：１４３）は、ＴＡＬ短縮変異体をＦｏｋＩヌクレアーゼの触媒ドメインに連結することにより部位特異的ヌクレアーゼ構築物のＴＡＬＥＮを作製したことを報告した。得られたＴＡＬＥＮは、不死化ヒト細胞において真核生物の２つの主要なＤＮＡ修復経路、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え修復により遺伝子改変を誘導することが示された。ＴＡＬＥＮは、特異的に結合するように操作することができる。特異的結合とは、生物学の技術分野で一般に用いられているように、非標的組織と比較して相対的に高い親和性で分子が標的に結合することを指し、その結合には、一般に複数の非共有結合性相互作用、たとえば静電的相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合等が含まれる。特異的結合相互作用は、抗体−抗原結合、酵素−基質結合、および特異的に結合したタンパク質−受容体相互作用を特徴づける。
【００７９】
ＴＡＬのコードが報告されており（国際公開第２０１１／０７２２４６号パンフレット）、そこでは各ＤＮＡ結合反復が標的ＤＮＡ配列において１つの塩基対の認識に関わっている。ＤＮＡ配列を標的とするように、残基を、以下を用いて構築することができる：（ａ）Ｃ／Ｇの認識にはＨＤ；（ｂ）Ａ／Ｔの認識にはＮＩ；（ｃ）Ｔ／Ａの認識にはＮＧ；（ｄ）Ｃ／ＧまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃの認識にはＮＳ；（ｅ）Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔの３０認識にはＮＮ；（ｆ）Ｔ／Ａの認識にはＩＧ；（ｇ）Ｃ／Ｇの認識にはＮ；（ｈ）Ｃ／ＧまたはＴ／Ａの認識にはＨＧ；（ｉ）Ｔ／Ａの認識にはＨ；および（ｊ）Ｇ／Ｃの認識にはＮＫ。手短に言えば、ＴＡＬＥＮが結合する標的部位を決定し、ヌクレアーゼと標的部位を認識する一連のＲＶＤとを含む融合分子を作製する。結合すると、ヌクレアーゼはＤＮＡを切断し、その結果細胞修復機構が作動して切断末端で遺伝子改変が行われる。ＴＡＬＥＮという用語は、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含むタンパク質を意味し、それ自体で機能する単量体ＴＡＬＥＮのほか、別の単量体ＴＡＬＥＮとの２量体化を必要とする他のＴＡＬＥＮも含む。２量体化により、両方の単量体ＴＡＬＥＮが同一の場合におけるホモ２量体ＴＡＬＥＮの生成、または単量体ＴＡＬＥＮが異なる場合におけるヘテロ２量体ＴＡＬＥＮの生成が可能である。
【００８０】
一部の実施形態では、単量体ＴＡＬＥＮを使用することができる。ＴＡＬＥＮは、典型的には、２つのＴＡＬエフェクタードメインがそれぞれＦｏｋＩ制限酵素の触媒ドメインに融合し、得られる各ＴＡＬＥＮのＤＮＡ認識部位がスペーサー配列により分離されるように、スペーサーを含む２連認識部位にわたる２量体として機能し、各ＴＡＬＥＮ単量体が認識部位に結合すると、ＦｏｋＩが２量体化し、スペーサー内で二本鎖切断が起こり得る。しかしながら、単量体ＴＡＬＥＮはまた、機能するのに２量体化を必要としないヌクレアーゼに１つのＴＡＬエフェクターを融合するように構築することもできる。このようなヌクレアーゼの１つは、たとえば、２つの単量体が単一のポリペプチドとして発現するＦｏｋＩの単鎖変異体である。他の天然または操作された単量体ヌクレアーゼもこの役割を果たすことができる。単量体ＴＡＬＥＮに使用されるＤＮＡ認識ドメインは、天然ＴＡＬエフェクターから得ることができる。あるいは、ＤＮＡ認識ドメインは、特定のＤＮＡ標的を認識するように操作することができる。操作された単鎖ＴＡＬＥＮは、操作されたＤＮＡ認識ドメインを１つしか必要としないので、構築および配置が容易になり得る。２量体のＤＮＡ配列特異的ヌクレアーゼは、２つの異なるＤＮＡ結合ドメイン（たとえば、ＴＡＬエフェクター結合ドメイン１つと、別の種類の分子由来の結合ドメイン１つ）を使用して作製することができる。ＴＡＬＥＮは、スペーサーを含む２連認識部位にわたる２量体として機能することができる。このヌクレアーゼ構築物はまた、たとえば、１つのＴＡＬＥＮ単量体および１つのジンクフィンガーヌクレアーゼ単量体から作製される標的特異的ヌクレアーゼにも使用することができる。このような場合には、ＴＡＬＥＮ単量体およびジンクフィンガーヌクレアーゼ単量体のＤＮＡ認識部位は、適切な長さのスペーサーにより分離することができる。２つの単量体の結合により、ＦｏｋＩが２量体化してスペーサー配列内で二本鎖切断を行うことができる。また、ジンクフィンガー以外のＤＮＡ結合ドメイン、たとえばホメオドメイン、ｍｙｂリピート、またはロイシンジッパーを、ＦｏｋＩに融合して、機能的ヌクレアーゼを作製するためにＴＡＬＥＮ単量体のパートナーとして提供することができる。
【００８１】
一部の実施形態では、ＴＡＬエフェクターを使用して、特定のヌクレオチド配列に対して他のタンパク質ドメイン（たとえば、非ヌクレアーゼタンパク質ドメイン）をターゲティングすることができる。たとえば、ＴＡＬエフェクターは、以下に限定されるものではないが、ＤＮＡ２０相互作用酵素（たとえば、メチラーゼ、トポイソメラーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ、またはリガーゼ）、転写アクチベーターもしくはリプレッサー、またはヒストンなど他のタンパク質と相互作用するか、もしくはそれを改変するタンパク質に由来するタンパク質ドメインに連結することができる。このようなＴＡＬエフェクター融合体の用途には、たとえば、エピジェネティックな調節エレメントの作製または改変、ＤＮＡにおける部位特異的挿入、欠失、または修復の作製、遺伝子発現の制御、およびクロマチン構造の改変がある。
【００８２】
標的配列のスペーサーは、ＴＡＬＥＮの特異性および活性を調節するように選択することも、または変化させることもできる。スペーサー長は融通が利くため、高い特異性で特定の配列を標的とするようにスペーサー長を選択することができることが示される。さらに、様々なスペーサー長で活性の変動が観察されてきたことから、ＴＡＬＥＮ活性の所望のレベルを達成するようにスペーサー長を選択することができることが示される。
【００８３】
Ｃａｒｌｓｏｎ  ＋６３として本明細書に記載するＴＡＬＥＮは、驚くべきことに、極めて使用効率が高いことが見出された。最も類似したＴＡＬＥＮとの比較を図１６および１８に示す。図１６を参照し、そこでの位置番号を使用すると、約１〜約４２にリーディングＮ末端部分、約４３〜約１７８に５’部分、約１７９〜約１９７にＲＶＤ部分、約１９８〜約２６１に＋６３ドメイン、および約２６２〜約４００の末端にＦｏｋＩ部分が存在する。いくつかの残基、たとえば、図１６Ａで枠づけされた約１０個の位置にある残基が配列間で異なっている。Ｎ末端リーダー部分も異なっており、Ｃａｒｌｓｏｎ  ＋６３  ＴＡＬＥＮは、約２０残基短く、さらに別に約１６個の相違がある。Ｎ末端リーダー部分の実施形態は、約１０〜約３０残基の間の配列である。当業者であれば、明記された範囲内の範囲および値をすべて意図していることをすぐに理解するであろう。
【００８４】
図１７に、Ｃａｒｓｏｎ  ＋６３配列を含む、使用したベクターに関する配列を示す。ベクターの以下のいくつかの部分について図に示す：Ｔ３プライマー結合部位、５’ＵＴＲ、Ｃａｒｌｓｏｎ  ＋６３のＴＡＬＥＮ  ５’、ＬａｃＺ−スタッファーフラグメント（クローンの青白スクリーニングについてＣｅｒｍａｋ  ｅｔ．ａｌ．２０１１を参照のこと）、ＦｏｋＩホモ２量体、３’ＴＡＬＥＮ  ＋１８〜＋６３（３’ＴＡＬＥＮ  ＋１〜１７が最終クローニングステップにおいて最後のＴＡＬＥＮ反復により提供されることに留意されたい）、３’ＵＴＲ−ポリＡ、および分解からｍＲＮＡを保護する可能性のあるポリＣ。使用においては、当業者に公知のように、特異的結合を提供するアミノ酸は、５’部分と標記された部分とｈａｌｆ  ＲＶＤ配列との間に挿入される。図１７に、ｍＲＮＡ産生のための様々な特徴を有するＣａｒｌｓｏｎ  ＋６３  ＴＡＬＥＮスキャフォールドを示す。このベクターは、以前に記載されたｐＴ３ＴＳプラスミドと共通したいくつかの特徴を有する（Ｈｙａｔｔ，Ｔ．Ｍ．＆  Ｅｋｋｅｒ，Ｓ．Ｃ．Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｅｃｔｏｐｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ５９，１１７−１２６（１９９９））。図１７に示すＴ３プロモーター配列の５’に以前位置していたＬａｃＺプロモーターを除去することにより、Ｈｙａｔｔ等のベクターに対して顕著な改良がなされた。ＬａｃＺプロモーターの除去は、遺伝子特異的ＴＡＬＥＮの信頼できるクローニングおよびプラスミドの増殖に必要であることが見出された。Ｃａｒｌｓｏｎ  ＋６３ベクターは、Ｔ３  ｍＲＮＡポリメラーゼによるｍＲＮＡ転写のためのＴ３部位を有する。これらの特徴には、転写が開始され得るＴ３プロモーター結合部位、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）のβ−グロビン遺伝子由来の５’および３’ＵＴＲ、ならびにポリＣストレッチが含まれる。ＴＡＬＥＮスキャフォールドの５’および３’部分は、Ｃｅｒｍａｋ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｃｕｓｔｏｍ  ＴＡＬＥＮ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３９，ｅ８２（２０１１）に記載されるように、遺伝子特異的ＲＶＤ配列がクローニングされるときに除去されるＬａｃＺスタッファーフラグメントに隣接している。
【００８５】
代替実施形態は、Ｔ７またはＳＰ６などの代替ｍＲＮＡポリメラーゼおよび同族の結合部位を使用する。他の実施形態は、ＵＴＲ配列のいくつかの代替物のうちのいずれかを使用することに関する。これらは、ｍＲＮＡの翻訳に役立つ可能性がある。例の一部として、以下のものがある：３’ＵＴＲにおける細胞質ポリアデニル化エレメント結合部位の付加、またはヒト、ブタ、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ゼブラフィッシュ由来のＵＴＲ、Ｂ−グロビンを含む遺伝子由来のＵＴＲによるアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）β−グロビンＵＴＲの交換。遺伝子由来のＵＴＲは、胚発生または細胞での発現を調節するように選択することができる。有用となり得るＵＴＲの例の一部として、β−アクチン、ＤＥＡＨ、ＴＰＴ１、ＺＦ４２、ＳＫＰ１、ＴＫＴ、ＴＰ３、ＤＤＸ５、ＥＩＦ３Ａ、ＤＤＸ３９、ＧＡＰＤＨ、ＣＤＫ１、Ｈｓｐ９０ａｂ１、Ｙｂｘ１  ｆ  Ｅｉｆ４ｂ  Ｒｐｓ２７ａ  Ｓｔｒａ１３、Ｍｙｃ、Ｐａｆ１およびＦｏｘｏ１、またはＣＨＵＫが挙げられる。このようなベクターまたはｍＲＮＡの改良を使用して、所望の発生段階における遺伝子喪失の研究のために、異所性ＴＡＬＥＮの特別または一時的な発現を導くことができる。これらのベクターにより産生されるＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡは、たとえば、疾患モデルを作製するためのノックアウトもしくはノックインの細胞株または動物の作製、環境刺激（例；薬剤、熱、冷気、紫外線、増殖因子、ストレス）と相互作用する遺伝子に関する動物の改良またはスクリーニングを含めて、一般に、本明細書に記載するように有用である。
【００８６】
実施形態には、Ｃａｒｌｓｏｎ  ＋６３ベクターまたはＴＡＬＥＮと８５％〜１００％の同一性を有する配列を含むベクターが含まれる。当業者であれば、明記された範囲内の範囲および値、たとえば、８５％、９０％、および９５％をすべて意図していることをすぐに理解するであろう。実施形態には、１〜５０の範囲のいくつかの保存的置換を有するＣａｒｌｓｏｎ  ＋６３  ＴＡＬＥＮが含まれる。当業者であれば、明記された範囲内の範囲および値、たとえば、５〜１０、１〜２０、または約１２をすべて意図していることをすぐに理解するであろう。当業者であれば、ＲＶＤ配列が使用者の意図する標的に応じて変化することになるため、これらの配列のＲＶＤ部分がこれらの比較から除外されるべきであることをすぐに理解するであろう。実施形態には、Ｎ末端リーダー部分、５’部分、および＋６３ドメイン（ならびにその％変異体／置換体）からなる群から選択されるＣａｒｌｓｏｎ  ＋６３  ＴＡＬＥＮの少なくとも一部を含むＴＡＬＥＮが含まれる。Ｃａｒｌｓｏｎ  ＋６３  ＴＡＬＥＮは、ＭＡＳＳＰＰＫＫＫＲＫＶＳＷＫＤＡＳＧＷＳＲ（配列番号１３２）の２２残基のＮ末端リーダー配列を有する。実施形態には、３’プライマー結合部位、５’ＵＴＲ、ｌａｃｚスタッファーフラグメント、３’ＴＡＬＥＮ、３’ＵＴＲ、ポリＣ、およびＣａｒｌｓｏｎ  ＋６３  Ｎ末端リーダー部分、５’部分、または＋６３ドメインをコードする核酸（ならびにその変異体／置換体）からなる群から選択されるＣａｒｌｓｏｎ  ＋６３  ＴＡＬＥＮベクターの少なくとも一部を含むＴＡＬＥＮベクターまたはｍＲＮＡが含まれる。あるいは、上記に示した代替物、たとえばたとえば、Ｔ７もしくはＳＰ６の代替物または種々の代替ＵＴＲの１つまたは複数を使用して配列を組み立てることができる。実施形態には、それに８５％〜１００％の間の同一性を有する配列だけでなく、０〜５０の範囲のいくつかの保存的置換を有する配列も含まれる。
【００８７】
ヌクレアーゼという用語は、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含む。エンドヌクレアーゼという用語は、ＤＮＡ分子内またはＲＮＡ分子内、好ましくはＤＮＡ分子内の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒できる任意の野生型または変異体酵素を指す。エンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、たとえばＦｏｋＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｂｖＣｌ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＡｌｗＩが挙げられる。エンドヌクレアーゼは、典型的には約１２〜４５塩基対（ｂｐ）長、より好ましくは１４〜４５ｂｐのポリヌクレオチド認識部位を有する場合のレアカットエンドヌクレアーゼをさらに含む。レアカットエンドヌクレアーゼは、規定の遺伝子座でＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する。レアカットエンドヌクレアーゼは、たとえばホーミングエンドヌクレアーゼ、操作されたジンクフィンガードメインとＦｏｋＩなどの制限酵素の触媒ドメインとの融合により生じるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または化学エンドヌクレアーゼであってもよい。化学エンドヌクレアーゼでは、化学切断剤またはペプチド性切断剤を核酸のポリマーまたは特異的標的配列を認識する別のＤＮＡにコンジュゲートすることにより、切断活性を特異的配列にターゲティングする。化学エンドヌクレアーゼはまた、特異的ＤＮＡ配列に結合することが知られている、オルトフェナントロリンのコンジュゲートのような合成ヌクレアーゼ、ＤＮＡ切断分子、および三本鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を包含する。このような化学エンドヌクレアーゼは、本発明による「エンドヌクレアーゼ」という用語に包含される。このようなエンドヌクレアーゼの例としては、Ｉ−Ｓｅｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｈｕ  Ｌ  Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｅｅ  Ｌ  ＰＩ−Ｔｔｉ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｓｅｅ  ＩＬ  １−  Ｓｅｅ  ＩＩＩ、ＨＯ、ＰＩ−Ｃｉｖ  Ｉ、ＰＩ−Ｃｔｒ  Ｌ  ＰＩ−Ａａｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｂｓｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｈａ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｒａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍａｖ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｅｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｕ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｆｌ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｇａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｇｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｉｎ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｋａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｌｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｍａ  Ｉ、ＰＩ−  ３０  Ｍｓｈ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｘｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｎｐｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｆｕ  Ｌ  ＰＩ−Ｒｍａ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｐｂ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｓｐ  Ｌ  ＰＩ−Ｆａｅ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｊａ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｈｏ  Ｌ  ＰＩ−Ｔａｇ  Ｌ  ＰＩ−Ｔｈｙ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｋｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｓｐ  Ｉ、Ｉ−ＭｓｏＩが挙げられる。
【００８８】
細胞または胚へのＴＡＬＥＮ導入およびそれに由来する動物の形成に関する多くの実施例を本明細書に提供する。ＴＡＬＥＮ処理のための細胞には、培養細胞、不死化細胞、初代細胞、初代体細胞、接合体、生殖細胞、始原生殖細胞、胚盤胞、または幹細胞が含まれる。実施例１９（図２６）に、精原幹細胞の改変に関する実験結果を詳述する。この細胞は、動物、たとえば家畜の遺伝子改変のための別の方法を提供する。遺伝子改変または遺伝子編集は、ドナーの精巣から単離された精原幹細胞（雄性生殖細胞系幹細胞、本明細書ではＧＳＣと略す）において、インビトロで実行することができる。生殖細胞が枯渇した、レシピエントの精巣に改変細胞を移植する。移植された精原幹細胞は、人工授精（ＡＩ）または体外受精（ＩＶＦ）を介して繁殖させてファウンダー動物を得るために使用できる遺伝子改変を担持する精子を産生する。この方法は、遺伝子改変ファウンダーの世代を超えた利点を有する。特定の疾患モデルに対するファウンダーが不健全で、生殖可能年令まで成長するのに適していない場合、このような利点の１つが明らかである。ＧＳＣに導入された同じ改変を健全な個体の精巣に移植することができるため、健全な動物からの系統を繁殖させて新生子ブタにおいて疾患モデルを作製することが可能になる。
【００８９】
精原幹細胞においてＴＡＬＥＮによるインデルを作製できる可能性および効率は、ブタのＤｕｃｈｅｎｅ筋ジストロフィー症遺伝子座（ＤＭＤ）のエクソン７を標的とするＴＡＬＥＮをコードするプラスミドのトランスフェクションにより最初に探索された。図２６に示すように、いくつかのヌクレオフェクション条件、プラスミド量、およびインキュベーション温度での試験により、生殖細胞トランスフェクション率が２５％にもかかわらず、最大効率１９％のＮＨＥＪが得られた。ＴＡＬＥＮ活性は、３０℃で培養した複製物で最大であった。ＧＳＣは３０℃で５日間を超えて培養した後でも生存していたが、全体的には、生殖細胞の生存率は３７℃の方が高かった。ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡのトランスフェクションでは、プラスミドＤＮＡに比較して、活性も家畜体細胞およびＧＳＣの生存率も高かった。注目すべきことには、この実験では、ｍＲＮＡトランスフェクションにおけるピーク活性は、プラスミドＤＮＡトランスフェクションを超えなかったが、同レベルの改変を実現するのに必要とされるｍＲＮＡ量は著しく低いものであった。実施例２０に、始原生殖細胞（鳥類）において成功したＴＡＬＥＮ刺激ＨＤＲについて詳述する。
【００９０】
遺伝子改変動物
核酸コンストラクトを非ヒト動物に導入して、核酸コンストラクトがゲノムに組み込まれたファウンダー動物を作製するために、当技術分野において公知の種々の技術を使用することができる。このような技術には、以下に限定されるものではないが、前核へのマイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号明細書）、レトロウイルスによる生殖系列への遺伝子導入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，６１４８−１６５２）、胚性幹細胞への遺伝子ターゲティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５６，３１３−３２１）、胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，１８０３−１８１４）、経精巣遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，１４２３０−１４２３５；Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１８，１９−２３）、および体細胞、たとえば卵丘もしくは乳腺細胞または成体、胎生もしくは胚性幹細胞のインビトロ形質転換後の核移植（Ｗｉｌｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５，８１０−８１３；ａｎｄ  Ｗａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９４，３６９−３７４）がある。前核へのマイクロインジェクション、経精巣遺伝子導入、および体細胞核移植、ならびに細胞質インジェクション、始原生殖細胞移植（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ）、および生殖細胞が胚で増殖することになる胚盤胞キメラ生成は、特に有用な技術である。
【００９１】
典型的には、前核へのマイクロインジェクションでは、核酸コンストラクトを受精卵に導入する。精子頭部および卵由来の遺伝子材料を含有する前核は原形質内で見えるため、１または２細胞期の受精卵を使用する。前核期の受精卵は、インビトロまたはｉｎ  ｖｉｖｏ（すなわち、ドナー動物の卵管から回収する）で採取することができる。インビトロ受精卵は、以下のとおりに作製することができる。たとえば、ブタ卵巣を屠殺場で採取し、輸送中２２〜２８℃に維持することができる。卵巣は、卵胞吸引のために洗浄および単離することができ、１８ゲージ針を用いて真空下で４〜８ｍｍの範囲の卵胞を５０ｍＬのコニカル遠心管に吸引することができる。卵胞液および吸引した卵母細胞は、市販のＴＬ−ＨＥＰＥＳ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）でプレフィルターに通してリンスすることができる。緻密な卵丘細胞塊に囲まれた卵母細胞を選択し、０．１ｍｇ／ｍＬのシステイン、１０ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子、１０％ブタ卵胞液、５０μＭの２−メルカプトエタノール、０．５ｍｇ／ｍｌのｃＡＭＰ、それぞれ１０ＩＵ／ｍＬの妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を補充したＴＣＭ−１９９  ＯＯＣＹＴＥ  ＭＡＴＵＲＡＴＩＯＮ  ＭＥＤＩＵＭ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）に３８．７℃、５％ＣＯ２で加湿空気中、約２２時間置くことができる。その後、卵母細胞を、ｃＡＭＰ、ＰＭＳＧ、またはｈＣＧを含有しない新鮮なＴＣＭ−１９９  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍに移し、さらに２２時間インキュベートすることができる。０．１％ヒアルロニダーゼ中、１分間ボルテックスすると、成熟した卵母細胞からその卵丘細胞を取り除くことができる。
【００９２】
ブタの場合、成熟卵母細胞を、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ製５ウェル受精用ディッシュを用いて５００μｌのＭｉｎｉｔｕｂｅ  ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ  ＭＥＤＩＵＭ  ＳＹＳＴＥＭ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）で受精させることができる。インビトロ受精（ＩＶＦ）の準備では、新たに採取したまたは凍結した雄ブタ精液を洗浄し、ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ  Ｍｅｄｉｕｍ中に４×１０５精子になるように再懸濁することができる。精子濃度は、コンピューター支援精液解析（ＳＰＥＲＭＶＩＳＩＯＮ，Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）により解析することができる。最終的なインビトロ授精は、雄ブタに応じて約４０運動精子／卵母細胞の最終濃度にて、１０μｌの量で実施することができる。授精卵母細胞をすべて３８．７℃、５．０％ＣＯ２雰囲気で６時間インキュベートする。授精から６時間後、推定される接合体をＮＣＳＵ−２３で２回洗浄し、０．５ｍＬの同じ培地に移すことができる。この系では通常、大部分の雄ブタにおいて２０〜３０％胚盤胞を作製することができ、多精受精率は１０〜３０％である。
【００９３】
線状核酸コンストラクトを前核の１つにインジェクトしてもよく、または、たとえば、トランスポゾンまたは細胞質インジェクションを使用することもできる。次いで、インジェクトされた卵をレシピエント雌に（たとえば、レシピエント雌の卵管に）移し、レシピエント雌で発育させ、トランスジェニック動物を作製することができる。特に、インビトロ受精胚は、１５，０００×ｇで５分間遠心して脂質を沈降させ、前核を可視化することができる。胚は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＦＥＭＴＯＪＥＴ注射器を用いてインジェクトすることができ、胚盤胞になるまで培養することができる。胚の卵割および胚盤胞形成の割合ならびに品質を記録することができる。
【００９４】
胚は、非同調性レシピエントの子宮に外科的に移植することができる。典型的には、５．５インチＴＯＭＣＡＴ（登録商標）カテーテルを使用して１００〜２００（たとえば、１５０〜２００）個の胚を卵管の膨大部−峡部接合部に注入することができる。手術後、妊娠のリアルタイム超音波検査を実施することができる。
【００９５】
体細胞核移植では、上記の核酸コンストラクトを含むトランスジェニック偶蹄目動物細胞（たとえば、トランスジェニックブタ細胞またはウシ細胞）、たとえば胚割球、胎仔線維芽細胞、成体耳部線維芽細胞、または顆粒膜細胞腫を除核卵母細胞に導入して融合細胞を樹立することができる。卵母細胞は、極体近傍の透明帯部分切開後、切開部から細胞質を押し出すことにより除核することができる。典型的には、面取り加工を施した先端の鋭いインジェクションピペットを使用して、トランスジェニック細胞を第２減数分裂時で停止した除核卵母細胞にインジェクトする。慣習として、第２減数分裂時で停止した卵母細胞は「卵」と呼ばれる。ブタまたはウシ胚の作製後（たとえば、卵母細胞を融合および活性化することにより）、活性化から約２０〜２４時間後、胚をレシピエント雌の卵管に移植する。たとえば、Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０，１２５６−１２５８および米国特許第６，５４８，７４１号明細書を参照されたい。ブタの場合、胚の移植から約２０〜２１日後にレシピエント雌の妊娠を確認することができる。
【００９６】
標準的な繁殖技術を用いて、最初のヘテロ接合型ファウンダー動物から標的核酸のホモ接合体である動物を作製することができる。しかしながら、ホモ接合型を必要としない場合がある。本明細書に記載のトランスジェニックブタは、関心を持つ他のブタと交配してもよい。
【００９７】
一部の実施形態では、目的の核酸および選択可能なマーカーは、別々のトランスポゾン上にあり、選択可能なマーカーを含有するトランスポゾンの量が目的の核酸を含有するトランスポゾンを大きく上回る（５〜１０倍過剰）同等でない量で胚または細胞のいずれかに供給することができる。目的の核酸を発現するトランスジェニック細胞または動物は、選択可能なマーカーの存在および発現に基づいて単離することができる。これらのトランスポゾンは正確かつ非連結的（独立した転位現象）にゲノムに組み込まれるため、目的の核酸および選択可能なマーカーは遺伝的に連鎖しておらず、標準的な繁殖を介した遺伝的分離により容易に分離することができる。このため、その後の世代において選択可能なマーカーを保持すること（公共の安全の立場からある程度懸念される問題）を強いられないトランスジェニック動物を作製することができる。
【００９８】
トランスジェニック動物が作製されれば、標準的な技術を用いて標的核酸の発現をアッセイすることができる。最初のスクリーニングは、サザンブロット解析によりコンストラクトが組み込まれたか否かを判定することにより達成することができる。サザン解析の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ；ＮＹのセクション９．３７〜９．５２を参照されたい。さらに最初のスクリーニングには、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用してもよい。ＰＣＲとは、標的核酸を増幅する手順または技術を指す。一般に、目的の領域または目的の領域を超える領域の末端の配列情報を利用して、増幅する鋳型の逆鎖と配列が同一または類似しているオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ＰＣＲを使用すれば、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡの配列を含むＤＮＡおよびＲＮＡの特定の配列を増幅することができる。プライマーは、典型的には、１４〜４０ヌクレオチド長であるが、１０ヌクレオチド長から数百ヌクレオチド長の範囲であってもよい。ＰＣＲについては、たとえばＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ編，Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載されている。核酸はまた、リガーゼ連鎖反応法、鎖置換増幅法、自己保持配列複製法、またはｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄによっても増幅することができる。たとえば、Ｌｅｗｉｓ（１９９２）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  １２：１；Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４；およびＷｅｉｓｓ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１２９２を参照されたい。胚は、胚盤胞期に、たとえばＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション、およびｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ  ＰＣＲによる解析用に個々に処理することができる（たとえば、Ｄｕｐｕｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００２）９９：４４９５を参照されたい）。
【００９９】
トランスジェニックブタの組織のポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、たとえば、動物から採取した組織サンプルのノーザンブロット解析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析、ウエスタン解析、酵素免疫測定法などのイムノアッセイ、および逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む技術を用いて評価することができる。
【０１００】
ベクターおよび核酸
ノックアウトのために、または他の目的で遺伝子の発現を得るために、種々の核酸を偶蹄目動物細胞または他の細胞に導入することができる。トランスジェニック動物の作製に使用することができる核酸コンストラクトは、標的核酸配列を含む。本明細書で使用する場合、核酸という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸アナログ、ならびに二本鎖または一本鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖）の核酸を含む。核酸アナログは、たとえば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を向上させるために塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格を修飾することができる。塩基部分の修飾としては、デオキシチミジンに対するデオキシウリジン、ならびにデオキシシチジンに対する５メチル−２’−デオキシシチジンおよび５−ブロモ−２’−デオキシシチジンが挙げられる。糖部分の修飾としては、２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリル糖を形成するためのリボース糖の２’ヒドロキシルの修飾が挙げられる。デオキシリボースリン酸骨格は、塩基部分がそれぞれ６員のモルホリノ環に連結されたモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸骨格が偽ペプチド骨格で置換され、４つの塩基が保持されたペプチド核酸が得られるように修飾することができる。Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７（３）：１８７；およびＨｙｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４：５を参照されたい。さらに、デオキシリン酸骨格は、たとえば、ホスホロチオエートもしくはホスホロジチオエート骨格、ホスホロアミダイト、またはアルキルホスホトリエステル骨格で置換することができる。
【０１０１】
標的核酸配列は、プロモーターなどの調節領域に作動可能に連結することができる。調節領域は、ブタの調節領域であっても、または他の種由来のものであってもよい。本明細書で使用する場合、作動可能に連結されたとは、核酸配列に対して調節領域が、標的核酸の転写を可能にするまたは促進するように配置されていることを指す。
【０１０２】
いかなる種類のプロモーターも標的核酸配列に作動可能に連結することができる。プロモーターの例としては、以下に限定されるものではないが、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、および特定の刺激に応答するまたは応答しないプロモーターが挙げられる。好適な組織特異的プロモーターは、β細胞で核酸転写物を優先的に発現することができるもので、たとえば、ヒトインスリンプロモーターが挙げられる。他の組織特異的プロモーターは、たとえば、肝実質細胞または心臓組織で優先的に発現することができるもので、それぞれアルブミンプロモーターまたはα−ミオシン重鎖プロモーターを挙げることができる。他の実施形態では、組織または時期特異性をあまり持たずに核酸分子の発現を促進するプロモーター（すなわち、構成的プロモーター）を使用することができる。たとえば、β−アクチンプロモーター、たとえばニワトリβ−アクチン遺伝子プロモーター、ユビキチンプロモーター、ｍｉｎｉＣＡＧｓプロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、または３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターのほか、ウイルスプロモーター、たとえば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを使用することができる。一部の実施形態では、ニワトリβアクチン遺伝子プロモーターとＣＭＶエンハンサーとの融合体をプロモーターとして使用する。たとえば、Ｘｕｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：５６３；およびＫｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：８２１を参照されたい。
【０１０３】
誘導性プロモーターの例には、核酸の転写の制御に使用することができるテトラサイクリン（ｔｅｔ）−ｏｎプロモーター系がある。この系では、変異型Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）を単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６トランス活性化因子タンパク質の活性化ドメインに融合して、ｔｅｔまたはドキシサイクリン（ｄｏｘ）により調節されるテトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）を作製する。抗生物質の非存在下では転写が最小限であるのに対して、ｔｅｔまたはｄｏｘの存在下では転写が誘導される。別の誘導系としては、エクジソンまたはラパマイシン系が挙げられる。エクジソンは、エクジソン受容体のヘテロ２量体およびｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ遺伝子（ＵＳＰ）の産生によりその産生が制御される昆虫の脱皮ホルモンである。発現は、エクジソンまたはエクジソンのアナログ、たとえばムリステロンＡにより処理することで誘導される。動物に投与して誘導系を誘発する作用物質は、誘導剤という。
【０１０４】
核酸コンストラクトに有用であり得る他の調節領域には、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列（たとえば、配列内リボソーム進入部位、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、誘導エレメント、またはイントロンがあるが、これらに限定されるものではない。このような調節領域は、必要でない場合もあるが、ｍＲＮＡの転写、安定性、翻訳効率等に影響を与えることにより発現を増強することがある。このような調節領域は、１つまたは複数の細胞内で核酸の最適な発現を得るのに望ましいように核酸コンストラクトに組み込むことができる。しかしながら、このような追加エレメントを用いずに十分な発現が得られることもある。
【０１０５】
シグナルペプチドまたは選択可能なマーカーをコードする核酸コンストラクトを使用してもよい。シグナルペプチドは、コードされたポリペプチドが特定の細胞部位（たとえば、細胞表面）に移行するように使用することができる。選択可能なマーカーの非限定的な例としては、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスフトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。このようなマーカーは、培養における安定な形質転換体の選択に有用である。他の選択可能なマーカーとしては、蛍光ポリペプチド、たとえば緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質が挙げられる。
【０１０６】
一部の実施形態では、選択可能なマーカーをコードする配列を、たとえば、ＣｒｅまたはＦｌｐなどのリコンビナーゼの認識配列で挟むことができる。たとえば、選択可能なマーカーは、選択可能なマーカーがコンストラクトから切り出されるように、ｌｏｘＰ認識部位（Ｃｒｅリコンビナーゼにより認識される３４ｂｐの認識部位）またはＦＲＴ認識部位で挟むことができる。Ｃｒｅ／ｌｏｘ技術の概説には、Ｏｒｂａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）８９：６８６１、およびＢｒａｎｄ  ａｎｄ  Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ（２００４）６：７を参照されたい。また、選択可能なマーカー遺伝子を間に挟んだＣｒｅまたはＦｌｐ活性化導入遺伝子を含有するトランスポゾンを使用して、導入遺伝子の条件発現によりトランスジェニック動物を得ることもできる。たとえば、マーカー／導入遺伝子の発現を誘導するプロモーターは、Ｆ０動物（たとえば、ブタ）においてマーカーがユビキタスにまたは組織特異的に発現するのであれば、ユビキタスプロモーターまたは組織特異的プロモーターのどちらでもよい。導入遺伝子の組織特異的活性化は、たとえば、マーカーを間に挟んだ導入遺伝子をユビキタスに発現するブタを、ＣｒｅまたはＦｌｐを組織特異的に発現するブタと交配するか、またはマーカーを間に挟んだ導入遺伝子を組織特異的に発現するブタをＣｒｅまたはＦｌｐリコンビナーゼをユビキタスに発現するブタと交配することにより達成することができる。導入遺伝子の制御された発現またはマーカーの制御された切り出しにより、導入遺伝子の発現が可能になる。
【０１０７】
一部の実施形態では、標的核酸はポリペプチドをコードする。ポリペプチドをコードする核酸配列は、コードされたポリペプチドのその後の操作が容易になるように（たとえば、位置決定または検出が容易になるように）設計された「タグ」をコードするタグ配列を含むことができる。タグ配列は、コードされるタグがポリペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端のどちらかに位置するようにポリペプチドをコードする核酸配列に挿入することができる。コードされるタグの非限定的な例としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）が挙げられる。
【０１０８】
他の実施形態では、標的核酸配列は、標的核酸の発現を抑制するように標的核酸に対してＲＮＡ干渉を誘導する。たとえば、標的核酸配列は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ：ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）ポリペプチドをコードする核酸に対してＲＮＡ干渉を誘導することができる。たとえば、ＣＦＴＲ  ＤＮＡと相同な二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用して、このＤＮＡの発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡのコンストラクトは、たとえば、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６；Ｒｏｍａｎｏ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３３４３；Ｃｏｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：３１５３；Ｃｏｇｏｎｉ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９９：１６６；Ｍｉｓｑｕｉｔｔａ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１４５１；およびＫｅｎｎｅｒｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｈｅｗ（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９５：１０１７に記載されているように作製することができる。ｓｈＲＮＡのコンストラクトは、ＭｃＩｎｔｙｒｅ  ａｎｄ  Ｆａｎｎｉｎｇ（２００６）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１により記載されているように作製することができる。一般に、ｓｈＲＮＡは、アニールして低分子ヘアピンを形成することができる相補領域を含有する一本鎖ＲＮＡ分子として転写される。
【０１０９】
核酸コンストラクトは、ＳｓｓＩ  ＣｐＧメチラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用してメチル化することができる。一般に、核酸コンストラクトは、緩衝液中、３７℃でＳ−アデノシルメチオニンおよびＳｓｓＩ  ＣｐＧ−メチラーゼとインキュベートすることができる。過剰メチル化は、コンストラクトを１単位のＨｉｎＰ１Ｉエンドヌクレアーゼと３７℃で１時間インキュベートし、アガロースゲル電気泳動によりアッセイすることにより確認することができる。
【０１１０】
核酸コンストラクトは、種々の技術を用いて、たとえば、生殖細胞、たとえば卵母細胞または卵、前駆細胞、成熟または胚性幹細胞、始原生殖細胞、腎細胞、たとえばＰＫ−１５細胞、島細胞、β細胞、肝細胞、または線維芽細胞、たとえば皮膚線維芽細胞など、いかなる種類の胚細胞、胎仔細胞、または偶蹄目動物の成熟細胞にも導入することができる。技術の非限定的な例としては、トランスポゾン系、細胞に感染できる組換えウイルス、もしくはリポソーム、または核酸を細胞に送達することができる他の非ウイルス法、たとえばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、もしくはリン酸カルシウム沈殿が挙げられる。
【０１１１】
トランスポゾン系では、核酸コンストラクトの転写単位、すなわち、標的核酸配列に作動可能に連結された調節領域がトランスポゾンの逆方向反復配列に挟まれる。たとえば、マウス、ヒト、およびブタの細胞などの細胞に核酸を導入するために、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（米国特許第６，６１３，７５２号明細書および米国特許出願公開第２００５／０００３５４２号明細書を参照されたい）；Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：６８７３）；Ｔｏｌ２（Ｋａｗａｋａｍｉ（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ７；Ｍｉｎｏｓ（Ｐａｖｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２）；Ｈｓｍａｒ１（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７））Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２７：４５８９）；およびＰａｓｓｐｏｒｔなど、いくつかのトランスポゾン系が開発されている。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙおよびＰａｓｓｐｏｒｔトランスポゾンは、特に有用である。トランスポザーゼは、標的核酸と同じ核酸コンストラクトにコードされたタンパク質として送達することも、別の核酸コンストラクトに導入することも、またはｍＲＮＡ（たとえば、インビトロ転写およびキャップ化ｍＲＮＡ）として供給することもできる。
【０１１２】
また、インスレーター配列を核酸コンストラクトに組み入れて標的核酸の発現を維持し、宿主遺伝子の望ましくない転写を阻害することもできる。たとえば、米国特許出願公開第２００４／０２０３１５８号明細書を参照されたい。典型的には、インスレーター配列は、転写単位の両側にあり、かつトランスポゾンの逆方向反復配列内にある。インスレーター配列の非限定的な例としては、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）型インスレーター配列および境界型インスレーター配列が挙げられる。たとえば、米国特許第６，３９５，５４９号明細書、同第５，７３１，１７８号明細書、同第６，１００，４４８号明細書、および同第５，６１０，０５３号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００４／０２０３１５８号明細書を参照されたい。
【０１１３】
核酸をベクターに組み込むことができる。ベクターは、キャリアから標的ＤＮＡに移動するように設計された任意の特定のＤＮＡセグメントを含む広義の用語である。ベクターは、エピソーム、プラスミド、またはさらにはウイルス／ファージのＤＮＡセグメントなど、ゲノムまたは他の標的化ＤＮＡ配列にＤＮＡを挿入するのに必要な一連の要素である発現ベクターまたはベクター系を指すことができる。ベクター系、たとえば動物の遺伝子送達に使用されるウイルスベクター（たとえば、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、および組み込みファージウイルス）および非ウイルスベクター（たとえば、トランスポゾン）は、２つの基本的な成分：１）ＤＮＡ（またはｃＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ）からなるベクター、および２）ベクターおよびＤＮＡ標的配列の両方を認識し、ベクターを標的ＤＮＡ配列に挿入するトランスポザーゼ、リコンビナーゼ、または他のインテグラーゼ酵素、を有する。ベクターは、ほとんどの場合、それぞれ１つまたは複数の発現制御配列を含む１つまたは複数の発現カセットを含有し、発現制御配列は、別のＤＮＡ配列またはｍＲＮＡの転写および／または翻訳を制御または調節するＤＮＡ配列である。
【０１１４】
多様な種類のベクターが知られている。たとえば、プラスミドおよびウイルスベクター、たとえば、レトロウイルスベクターが知られている。哺乳動物の発現プラスミドは、典型的には、複製起点、好適なプロモーター、および任意選択のエンハンサー、さらには必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位およびスプライス受容部位、転写終結配列、ならびに５’隣接非転写配列を有する。ベクターの例としては、プラスミド（別の種類のベクターのキャリアであってもよい）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（たとえば、ＨＩＶ−１、ＳＩＶ、またはＦＩＶ）、レトロウイルス（たとえば、ＡＳＶ、ＡＬＶ、またはＭｏＭＬＶ）、およびトランスポゾン（たとえば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｐ−エレメント、Ｔｏｌ−２、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ、ｐｉｇｇｙＢａｃ）が挙げられる。
【０１１５】
本明細書で使用する場合、核酸という用語は、たとえば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（たとえば、化学合成）ＤＮＡのほか、天然および化学修飾核酸、たとえば、合成塩基または別の骨格などのＲＮＡおよびＤＮＡの両方を指す。核酸分子は、二本鎖でもまたは一本鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖）でもよい。トランスジェニックという用語は、本明細書では広義に使用され、遺伝子工学技術を用いてその遺伝子材料を変化させた遺伝子改変生物または遺伝子操作生物を指す。したがって、ノックアウト偶蹄目動物は、外来の遺伝子または核酸が動物またはその子孫に発現するか否かに関わらずトランスジェニックである。
【０１１６】
本明細書に示す核酸配列は、略語「Ｔ」が、ＤＮＡまたはＲＮＡの場合に応じて、「Ｔ」または「Ｕ」を表すことができる慣例に従って、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方の配列を示すことを意図する。ポリヌクレオチドは、少なくとも３つのヌクレオチドサブユニットからなる核酸分子である。ポリヌクレオチドアナログまたはポリ核酸は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリ核酸である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドアナログは、ポリヌクレオチドの糖‐リン酸骨格部分を代替官能基で置換することにより作製することができる。本明細書で「モルホリノ」と呼ばれるモルホリノ修飾ポリヌクレオチドは、モルホリノ−ホスホロジアミデート骨格に塩基が連結しているポリヌクレオチドアナログである（たとえば、米国特許第５，１４２，０４７号明細書および同第５，１８５，４４４号明細書を参照のこと）。モルホリノに加えて、ポリヌクレオチドアナログの他の例としては、塩基がポリビニル骨格に連結しているアナログ、擬似ペプチドの２−アミノエチル−グリシン基により形成されるアミド結合に塩基が連結しているペプチド核酸（ｐＮＡ）、ヌクレオシドサブユニットがメチルホスホネート基に連結しているアナログ、ヌクレオシドサブユニットを連結するリン酸残基がホスホロアミデート基で置換されているアナログ、およびホスホロチオエートＤＮＡ、２’Ｏ−メチル基を有する糖部分を含有するアナログが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、ルーチン的に使用される周知の固相合成技術によって生成することができる。あるいは、このような合成に適した他の方法も使用することができる（たとえば、一般的な分子クローニングおよび化学核酸合成技術）。また、同様の技術を使用して、モルホリノまたはホスホロチオエート誘導体などのポリヌクレオチドアナログを調製することもできる。加えて、ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドアナログは市販品として入手することもできる。オリゴヌクレオチドの場合、薬学的に許容される組成物の例として、たとえば、（ａ）カチオン、たとえばナトリウム、カリウム、アンモニウム等と共に形成される塩；（ｂ）無機酸、たとえば塩酸、臭化水素酸と共に形成される酸付加塩；（ｃ）有機酸、たとえば酢酸、シュウ酸、酒石酸と共に形成される塩；および（ｄ）元素アニオン、たとえば塩素、臭素、およびヨウ素から形成される塩、を含む塩がある。
【０１１７】
ポリペプチド
活性を変化させることなく、アミノ酸配列に一般になされ得る種々の保存的変化がある。これらの変化は保存的な置換または突然変異と称される；すなわち、特定のサイズまたは特性を有する一群のアミノ酸に属するアミノ酸は、その群の別のアミノ酸に置換することができる。代わりのアミノ酸配列は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。たとえば、無極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正に荷電する（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが含まれる。負に荷電する（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。このような変化では、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定される見かけの分子量または等電点に実質的に影響が及ぶとは考えられない。例示的な保存的置換としては、以下に限定されるものではないが、正電荷を維持するためにＡｒｇの代わりにＬｙｓおよびその逆；負電荷を維持するためにＡｓｐの代わりにＧｌｕおよびその逆；遊離−ＯＨを維持するようにＴｈｒの代わりにＳｅｒ；遊離ＮＨ２を維持するためにＡｓｎの代わりにＧｌｎが挙げられる。さらに、ポリペプチド配列または対応する核酸配列の点突然変異、欠失、および挿入が、任意選択で、ポリペプチドまたは核酸フラグメントの機能を喪失させることなく行われることがある。置換には、たとえば、１つ、２つ、または３つ以上の残基が含まれることがある。本明細書に記載のアミノ酸残基には、一文字アミノ酸表記または３文字略語のいずれかが使用される。本明細書で使用する略語は、標準ポリペプチド命名法、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９６９），２４３，３５５２−３５５９に合わせたものである。アミノ酸残基配列はすべて、本明細書では、アミノ末端からカルボキシ末端への慣用的な方向に沿った左から右への配列形式によって示される。
【０１１８】
任意選択で、本明細書に示す配列に対するペプチドの同一性の割合の決定が必要になることがある。そのような場合には、同一性の割合は、特定の数のペプチド残基、またはペプチドの一部について測定される。たとえば９０％同一性のポリペプチドは、より大きなペプチドの一部であることもある。実施形態は、本明細書に示す配列について指定の同一性および／または保存的置換を有するようなポリペプチドを含む。
【０１１９】
ポリペプチドに関連して本明細書で使用する精製されたという用語は、天然に相当物がないポリペプチド（たとえば、ペプチド模倣体）、または化学合成され、そのため他のポリペプチドによる汚染が実質上ないポリペプチド、または天然では伴われる他の大部分の細胞成分（たとえば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチド、または細胞成分）から分離または精製されているポリペプチドのいずれかを指す。精製されたポリペプチドの一例は、天然では結合しているタンパク質および天然有機分子を含まない、乾燥重量基準で少なくとも７０％あるポリペプチドである。したがって、精製されたポリペプチドの調製物は、たとえば、乾燥重量基準で、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％のポリペプチドとすることができる。ポリペプチドはまた、ポリペプチドの精製または標識を容易にする（たとえば、親和性マトリックス上での捕捉、顕微鏡での可視化）タグ配列（たとえば、ポリヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、またはＦＬＡＧ（登録商標）タグ）を含有するように操作することができる。したがって、ポリペプチドを含む精製された組成物は、別に記載がない限り、精製されたポリペプチドを指す。
【０１２０】
ポリペプチドは、化学修飾（この文脈では、アミノ酸の天然化学構造の変化を指す用語）を含むことができる。このような修飾は、側鎖または末端に対して行うことができ、たとえば、アミノ末端またはカルボキシル末端を変化させる。一部の実施形態では、修飾は、ポリペプチドを他の物質に連結させるかまたは治療薬を結合させるために便利に使用することができる化学基を作製するのに有用である。
【０１２１】
研究ツールおよび研究
本明細書における、細胞および胚を改変する方法は、多種多様な研究ツールに適用することができる。細胞または胚それ自体も研究に有用である。たとえば、従来の繁殖プログラムは、繁殖される動物の遺伝成分の理解に非常に頼ることが多い。望ましい形質を有する動物を、その品種を育成するように繁殖させる。これらの形質は、動物の遺伝子および遺伝子の組合せに強く依存する。細胞または胚への遺伝子の導入またはその遺伝子の改変は、目的とする形質をもたらすような遺伝子の相互作用についての有益な情報を提供する。細胞または胚は、適切な時間培養した後、試験することができる。胚は、何らかの意味のある発生段階に達する前に破壊される可能性があるが、それでも有用な洞察が得られる。
【０１２２】
そこで、本発明の種々の実施形態を以下のように記述する。
１．遺伝子改変された非ヒト動物細胞または胚を作製する方法であって、胚または細胞の標的化染色体部位に特異的に結合するＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡに動物の胚または細胞をインビトロで曝露する工程であって、この細胞または胚が標的化染色体部位でのみ遺伝子改変される工程を含み、かつこの方法がレポーター遺伝子を含むことなく実施される方法。２．細胞を含み、かつこの細胞を培養し、この細胞のコロニーを単離する工程をさらに含む、１に記載の方法。３．遺伝子改変細胞を選択するための正または負の選択圧をかける添加物質を含むことなく実施される、１または２に記載の方法。４．外来性配列を含有する一本鎖ＤＮＡに、インビトロで動物の胚または細胞を曝露させる工程をさらに含む、１〜３のいずれかに記載の方法。４．細胞を含み、かつこの細胞を培養し、この細胞を単離する工程であって、試験細胞が単離されたコロニーから採取され、この試験細胞がどのように改変されているかを決定するためにこの細胞を試験する工程を含む、１または３〜４のいずれかに記載の方法。５．試験が試験細胞を破壊する破壊プロセスである、４に記載の方法。６．細胞が初代細胞である、１に記載の方法。７．初代細胞が、ブタ、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、魚類、ゼブラフィッシュ、イヌ、マウス、ネコ、マウス、ラット、および実験動物からなる群から選択される細胞である、６に記載の方法。８．ＴＡＬＥＮをコードし、配列番号１３２に対して少なくとも８０％の相同性を有するＮ末端リーダー部分をコードする核酸に、インビトロ培養物中の非ヒト初代細胞または非ヒト胚を曝露する工程を含む、１〜７のいずれかに記載の方法。９．レポーター遺伝子を含まないＴＡＬＥＮに細胞を曝露する工程であって、１％超の細胞において標的化染色体部位に改変が組み込まれる工程を含む、１〜８のいずれかに記載の方法。１０．レポーター遺伝子を含まないＴＡＬＥＮに細胞を曝露し、クローン細胞のコロニーを作製し、コロニーメンバーのサブセットを試験して、標的化染色体部位に改変が組み込まれたコロニーを同定する、１〜９のいずれかに記載の方法。１１．遺伝子改変が、挿入、欠失、逆位、または転座からなる群から選択される、１〜１０のいずれかに記載の方法。１２．ＴＡＬＥＮが第１のＴＡＬＥＮであり、標的化染色体部位が第１の部位であって、第２の標的化染色体部位に向けられた第２のＴＡＬＥＮをさらに含む、１〜１１のいずれかに記載の方法。１３．外来性配列を含有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に胚または細胞を曝露する工程であって、遺伝子改変が外来性配列を含む工程をさらに含む、１〜１２のいずれかに記載の方法。１４．外来性配列がＴＡＬＥＮ標的化染色体部位の代替アレルを含む、１〜１３のいずれかに記載の方法。１５．代替アレルがＢｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅウシに存在するミオスタチンアレルを含む、１４に記載の方法。１６．アレルが、挿入、欠失、多型、および一塩基多型からなる群から選択される、１〜１５のいずれかに記載の方法。１７．標的化染色体部位が遺伝子の破壊のために選ばれ、遺伝子の破壊が遺伝子をコードする配列および／またはそのシス調節エレメントの中の１つまたは複数の塩基の挿入、欠失、また���置換を含む、１〜１６のいずれかに記載の方法。１８．細胞または胚にリコンビナーゼを送達する工程をさらに含む、１〜１７のいずれかに記載の方法。１９．ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡがｍＲＮＡとして細胞に直接導入される、１〜１８のいずれかに記載の方法。２０．ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡをコードするプラスミドとして細胞に導入される、１〜１９のいずれかに記載の方法。２１．ＴＡＬＥＮをコードするベクターが細胞に導入された後に、ｓｓＤＮＡが細胞に導入される、２０に記載の方法。２２．ＴＡＬＥＮを発現するベクターが細胞に導入された後、約８時間〜約３日の間に、ｓｓＤＮＡが細胞に導入される、２０または２１に記載の方法。２３．ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡが、ｓｓＤＮＡとほぼ同時に細胞に直接導入される、２０、２１、または２２のいずれかに記載の方法。２４．細胞が初代体細胞または幹細胞である、１〜２３のいずれかに記載の方法。２５．遺伝子改変を作製する方法であって、ＴＡＬＥＮをコードし、配列番号１３２に対して少なくとも８０％の相同性を有するＮ末端リーダー部分をコードする核酸に、インビトロ培養物中の非ヒト初代細胞または非ヒト胚を曝露する工程を含む方法。２６．Ｎ末端リーダー部分が、配列番号１３２の２２残基配列部分に対して８０％の相同性を有し、かつ合計約３０残基以下を有する、２５に記載の方法。２７．核酸が、配列番号１３２に対して少なくとも９０％の相同性を有する、２５または２６に記載の方法。２８．本出願内に示された任意のプロセスで作製または使用される細胞。
【実施例】
【０１２３】
実施例１  ＴＡＬＥＮの直接インジェクションにより作製された遺伝子改変偶蹄目動物家畜（ウシ）
Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ．ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９：ｅ８２に記載されているように３つのＴＡＬＥＮペアを設計および構築し（図３）、授精から約１９時間後にウシ胚の細胞質にｍＲＮＡをインジェクトした。インジェクトされた胚をインビトロで培養し、胚盤胞期に採取した（図３）。個々の胚盤胞のゲノムＤＮＡを全ゲノム増幅（ＷＧＡ）（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｔｒａｎｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．２０：２９）により増幅し、ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイを用いてインデルについてスクリーニングした（図３、４Ａ、および４Ｂ）。ＴＡＬＥＮ活性が示唆される切断産物が、インジェクトされた胚の１０％で観察された（たとえば、図３、４Ａ、および４Ｂ）。予想された領域の突然変異が、ＡＣＡＮ１１のＴＡＬＥＮペアまたはＡＣＡＮ１２のＴＡＬＥＮペアのいずれかをインジェクトされた２つの胚盤胞で確認された（図３）。ＴＡＬＥＮをインジェクトされた胚の発生能の著しい低下は、観察されなかった。次いで、ＡＣＡＮ１２のＴＡＬＥＮペアを用いて１０〜１００ｎｇ／μｌの範囲のｍＲＮＡ用量で２回目のインジェクションを行った。１回目（３３％）と２回目（５％）（１０ｎｇ／μｌの条件）との胚盤胞形成率の比較から、胚の品質が不十分であることが明らかになった。胚の品質は不十分であるものの、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを用いて１２個の推定突然変異体（インジェクトされたうちの２７％）を同定した。ＳＵＲＶＥＹＯＲ陽性胚の遺伝子型をそれぞれ、クローン化したＰＣＲ産物由来の１４個のシーケンシングリードを用いて解析した。シーケンシングから、遺伝子改変においてモザイク現象が明らかになった。インデルは４個のＳＵＲＶＥＹＯＲ陽性胚で同定され、これらのうち、インデル陽性配列リードは胚ごとに全リードの７〜２９％を占めた。胚移植に基づく動物ファウンダー系の作製プロセスは、周知である。ＴＡＬＥＮ処理胚を、代理雌ウシに移植して妊娠を成立させるのに成功した。これらの結果から、ＴＡＬＥＮが偶蹄目動物胚で機能することが実証された。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびＴＡＬＥＮを用いた胚の遺伝子改変は、ヌクレアーゼペアをコードするＺＦＮまたはＴＡＬＥＮのｍＲＮＡの直接インジェクションによるモデル生物で報告されている、Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５：４３３；Ｃａｒｂｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８６：４５１；Ｍａｓｈｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５：ｅ８８７０；Ｔｅｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：６９５。
【０１２４】
実施例２  ＴＡＬＥＮの直接インジェクションにより作製された遺伝子改変偶蹄目動物家畜（ブタ）
また、アフリカブタコレラ耐性アレルとして提唱された（Ｐａｌｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８５：６００８）ブタＲＥＬＡ遺伝子（ｐ６５）を標的とするＴＡＬＥＮを使用して、ブタのＩＶＰ胚に一連のインジェクションを行った。ネイティブなＴＡＬＥスキャフォールドの短縮型変異体を用いてＴＡＬＥＮ活性が増強されることを２つのグループが報告した（Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９：９２８３；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：１４３）。したがって、＋２３１スキャフォールド（ＢａｍＨＩフラグメント、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ．ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８６：７５７）を使用した上記の実験とは異なり、ｐ６５ＴＡＬＥＮスキャフォールドを選択して、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ．ａｌ．２０１１（前掲）に記載された＋６３型に配列が近くなるように短縮した（図５も参照）。ｌｅｆｔおよびｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮをそれぞれ１０ｎｇ／μｌを含むｍＲＮＡの混合物と共に５ｎｇ／μｌのＥＧＦＰのｍＲＮＡをインジェクションの成功の指標として接合体にインジェクトした。７５個のＥＧＦＰ陽性接合体（インジェクトした２１４個のうち、３５％）が同定され、ＷＧＡによるインデル解析に供した。ＥＧＦＰ陽性胚のうち５６個のＰＣＲ増幅に成功し、これらのうち１６個（２９％）から、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（図３）または配列解析によりインデルが明らかになった。ウシと比較してブタの接合体ではモザイク現象が減少するようであり、実際、突然変異体の３分の１（６／１６）は、ホモ接合型またはヘテロ接合型の両アレル突然変異体であった（図４）。これらの結果から、ＴＡＬＥＮが偶蹄目動物胚で機能することが実証された。胚移植に基づく動物ファウンダー系の作製プロセスは、周知である。ＴＡＬＥＮ処理胚を、代理雌ブタに移植し、妊娠を成立させた。
【０１２５】
実施例３  ウシおよびブタの体細胞の遺伝子改変により作製された遺伝子改変偶蹄目動物家畜
生物医学または農業のいずれかに関連するものとして選択したブタおよびウシの標的に対して、いくつかの追加のＴＡＬＥＮペアを構築した。前述の２つのＴＡＬＥＮスキャフォールド（＋２３１、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ．ａｌ．２０１０（前掲）およびＣａｒｌｓｏｎ  ＋６３、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ．ａｌ．２０１１（前掲））（図５）の文脈で、６つのＴＡＬＥＮペアの結合ドメインを配置した。各ＴＡＬＥＮペアを初代家畜線維芽細胞にトランスフェクトし、３日目にＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（Ｇｕｓｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６４９：２４７によりゲノム改変を測定した。最も活性なＴＡＬＥＮペアであるＤＭＤＥ７．１およびＡＣＡＮ１２はそれぞれ、染色体の３８％および２５％を切断することを示し、サンガーシーケンシングから、ＮＨＥＪによるＤＮＡ修復の特徴である様々なインデルが明らかになった（図５および図６）。ＴＡＬＥＮスキャフォールドは、線維芽細胞の活性に大きな影響を与えた。全体で、＋６３アイソフォームの標的となる６つの遺伝子座のうち４つが３．５％以上切断されたのに対し、＋２３１スキャフォールドでは、ＤＭＤＥ７．１ＴＡＬＥＮペアのみが１％超切断した（図５）。これまでの研究（Ｄｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８：７４；Ｍｉｌｌｅｒ，２０１１前掲）に記載されているように、トランスフェクション後３０℃で７２時間インキュベートすると、活性に正の影響があり、３つのＴＡＬＥＮペアの活性には、このようなインキュベーションが必要とされた。活性Ｃａｒｌｓｏｎ  ＋６３  ＴＡＬＥＮペアの作製の成功率は高いものとなっている。出願時までに収集したデータでは、常染色体ならびにＸ染色体とＹ染色体の両方に関し、ブタおよび雌ウシのゲノムに散在する１５個の遺伝子において３６ＴＡＬＥＮペアのうち２３（６４％）が検出可能な程度に活性（＞１．０％ＮＨＥＪ）であったことが示される。活性ペアの４分の３が高効率（１９〜４０％）で切断し、平均の改変率は２５％であった。改変線維芽細胞に基づき動物ファウンダー系を作製するためのクローン法は、周知である。
【０１２６】
実施例４  トランスポゾンのコトランスフェクションによる拡大培養およびインデル濃縮
ＴＡＬＥＮペアを線維芽細胞にトランスフェクトし、トランスポゾン共選択を用いてまたは用いずに細胞を１４日間以上培養してから改変レベルを測定した。結果を図７にまとめてある。０日目（Ｄ０）に、各ＴＡＬＥＮの発現カセット（２つのプラスミド）、選択マーカーをコードするトランスポゾン（ピューロマイシンをコードする第３のプラスミド、およびトランスポザーゼ−発現カセット（第４のプラスミド）を含むプラスミドの混合物を細胞にトランスフェクトする。ＴＡＬＥＮのプラスミドが各トランスフェクションの主要な成分である（４倍過剰量）。トランスフェクト細胞を分割前に３０℃または３７℃で３日間培養し、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイのためのサンプルを採取し、拡大培養してトランスポゾン組み込みを＋／−選択するために再播種する。３日目以降、全細胞を３７℃で培養する。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイのために１４日間以上培養した細胞を集め、下流用途、すなわち、ＳＣＮＴのために凍結保存する。比較のために、ヌクレオフェクションにより他の線維芽細胞にもトランスフェクトし、３日目、および１４日目以降の非選択（ＮＳ）および選択（Ｓ）集団におけるＮＨＥＪの割合を測定した。比較のために、カチオン性脂質による線維芽細胞のトランスフェクションも行った。
【０１２７】
実施例５  片アレルおよび両アレルのＫＯクローンの単離
トランスジェニック初代線維芽細胞は、標準的な密度（＞１５０細胞／ｃｍ２）で非トランスジェニック線維芽細胞（フィーダー細胞）と一緒に播種し、上記で使用したトランスポゾン共選択技術を使用して薬剤選択に供すると、効率的に増殖し、コロニーとして単離することができる（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．２０：１１２５）。このアプローチを評価するために、６つのＴＡＬＥＮペアで処理した細胞のピューロマイシン耐性コロニーを単離し、それらの遺伝子型を、標的部位をまたぐＰＣＲ産物のＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイまたは直接シーケンシングにより評価した（図８Ａおよび８Ｂ）。一般に、インデル陽性クローンの比率は、３日目の改変レベルに基づき行った予測と同様であった。両アレルノックアウトクローンは、７つのＴＡＬＥＮペアのうちの６つで同定され、インデル陽性細胞の最大３５パーセントで生じた（表１）。過半数の例では、インデルは各アレルに特有のインデルではなく、同型（各アレルで同じインデル）であったことから、姉妹染色分体を鋳型とした修復が一般的であることが示唆された（図９）。注目すべきことは、染色体切断を独立した現象として処理する場合、改変されたクローンのうち、過半数のＴＡＬＥＮペアで両アレル改変の頻度（１７〜６０％）が３日目の改変レベルに基づく予測（１０〜１７％）を上回ることである。ＺＦＮを用いたこれまでの研究（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９：１２７９；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０：８１；Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：８０８））は、これらの結果を裏付けるものである。こうしたこれまでの研究から、両アレル改変は、ヌクレアーゼ活性のレベルに関係なく、改変された細胞のほぼ３分の１で起こることが示唆される。
【０１２８】
【表４】
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【０１２９】
実施例６  ＴＡＬＥＮによる染色体欠失および逆位
同一染色体を標的とする２つのＴＡＬＥＮペアを同時送達すると、大きな染色体欠失が誘導できるとの仮説を立てた。これらは実現され、さらには、大きな逆位が偶発的に発見された。ＴＡＬＥＮペアであるＤＭＤＥ６およびＤＭＤＥ７．１の高い活性と、ブタモデルがヒトの状態に合うように高い割合のデュシェンヌ型筋ジストロフィーが大規模欠失により引き起こされる（Ｂｌａｋｅ，２００２）という事実とのため、ＤＭＤＥ６およびＤＭＤＥ７．１を試験した。結果を図１０にまとめてある。各ＴＡＬＥＮペアの３日目の遺伝子改変レベルは、ＴＡＬＥＮペアのどちらかを個別にトランスフェクトしたときより若干低いものの、高レベルであった（ＤＭＤＥ６で２４％およびＤＭＤＥ７．１で２３％）（図１０）。２つのＴＡＬＥＮペアの間の配列が欠失されたかどうかを判定するため、ＴＡＬＥＮの標的部位をまたぐプライマーを用いてＰＣＲを試みた。６．５ｋｂの配列が除去された場合、選択したＰＣＲ条件では、約５００ｂｐのバンドが予想される一方、７ｋｂの野生型バンドは増幅されないと考えられた。ＴＡＬＥＮペアの両方を導入した複製物ではほぼ５００ｂｐのバンドが観察されたが、ＴＡＬＥＮペアの一方のみを導入した場合には存在しなかった（図１０）。
【０１３０】
次に、推定される新たな５’および３’接合部の両側からのＰＣＲにより細胞集団の逆位現象をアッセイした。産物は、推定される逆位の５’接合部も３’接合部も、両方のＴＡＬＥＮペアを導入したときのみ、予想された大きさで観察された（図１０）。さらに逆位を確認するため、トランスポゾン共選択戦略を用いてコロニーを作製し、欠失および逆位現象をスクリーニングした。欠失および逆位現象は、どちらも高頻度で回復されていた（それぞれ１０．３％および４．１％；ｎ＞１０００）。欠失および逆位現象は、非常に高い忠実度で生じた。４３の逆位陽性コロニーのうち４１のコロニーが５’接合部および３’接合部の両方で陽性であった。最後に、ＰＣＲ産物のシーケンシングから、欠失現象および逆位現象はどちらも、その接合部で付加または欠失されるヌクレオチドがごくわずかであることが確認された（図１１、１２）。
【０１３１】
実施例７  ＴＡＬＥＮ誘導性相同組換えは、選択マーカーを連結する必要がない
Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅウシ由来の突然変異体ミオスタチンアレル（１１ｂｐ欠失）を野生型Ｗａｇｙｕウシのゲノムに導入した（Ｇｒｏｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１７：７１）（図１３）。ｂｔＧＤＦ８．１  ＴＡＬＥＮペアを単独でトランスフェクトした場合、標的遺伝子座で染色体の最大１６％を切断した（図１３）。ＴＡＬＥＮ（ｂｔＧＤＦ８３．１）およびｄｓＤＮＡ鋳型（ＢＢ−ＨＤＲ）は、ウシＧＤＦ８のエクソン−３に１１ｂｐの欠失（Ｂｅｌｇｉｕｍ  Ｂｌｕｅ突然変異）をＤＳＢ誘導性相同組換えにより導入するように設計した。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型ではｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮの結合部位の半分が欠損していたため、ＢＢ−ＨＤＲ鋳型はＴＡＬＥＮ切断に対して抵抗性があった。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイから、３７℃および３０℃の両方でｂｔＧＤＦ８３．１  ＴＡＬＥＮの活性が実証された。本アッセイで使用したＰＣＲ産物は、プライマーｂおよびｂ’を使用して作製した（図１３の図ａに示す）。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型は、ｂｔＧＤＦ８３．１活性の評価を混乱させると考えられるため、これらの複製物に含めなかった。アレル特異的ＰＣＲから、ＨＤＲの誘導は、ＴＡＬＥＮとＢＢ−ＨＤＲ鋳型とのコトランスフェクションに依存することが実証された。ＰＣＲアッセイは、ＨＤＲにより改変されたＧＤＦ８アレルを、プライマーｃおよびｃ’を使用して特異的に検出するように開発した（図１３の図ａに示す）。プライマーｃ’の３’末端は１１ｂｐの欠失にまたがり、野生型アレル「ＷＴ」を増幅することができない。陽性対照「Ｃ」を含む各ＰＣＲ反応に５００細胞相当量を加えた。ＨＤＲ率は、実験反応と対照反応との比較デンシトメトリーにより判定した。Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅウシ由来の１６２３ｂｐのＤＮＡフラグメントを有するスーパーコイルＤＮＡ鋳型とコトランスフェクションを行ったところ、所望の現象に対する選択を行わずに３日目の半定量ＰＣＲにより示唆されたように、遺伝子変換頻度（ＨＤＲ）が０．５％〜５％となった（図１３）。これらの結果から、マーカーを用いずにＴＡＬＥＮを使用して、アレルを含む外来性核酸配列を家畜に効率的に組み込むことができることが実証された。個々のコロニーにおける組み込み頻度を評価するために、トランスポゾン共選択戦略を実施し、個々のコロニーを単離し増殖させてＤＮＡシーケンシングを行った。ＰＣＲにより調べた３６６コロニーのうち５つのコロニーにおいて、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅウシ由来の鋳型を使用した遺伝子変換が検出された。Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ  ＨＤＲ鋳型の外側のプライマーで増幅し、シーケンシングを行ったところ、予想された１１ｂｐの欠失の存在が４つのコロニーで確認された（図１４）。第２の反復実験を実施し、一致した結果を得た。試験した全コロニーのうち約１％が両アレル変換について陽性であり、試験した全コロニーのうち約０．５％〜約１％がアレル変換についてヘテロ接合型であった。
【０１３２】
実施例８  家畜細胞におけるＨＤＲの標的としての、ＴＡＬＥＮによるＤＮＡ切断
ブタ低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の第４エクソンを標的とするＴＡＬＥＮペア（ＬＤＬＲ４．２）をスーパーコイルプラスミドＬｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐとコトランスフェクトした。Ｌｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐは、ブタＬＤＬＲ遺伝子に対応するホモロジーアーム、およびＨＤＲ時にネオマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を可能にする遺伝子トラップを含む（図１５）。培養から３日後、ＰＣＲ解析により、抗生物質選択を行わなくても、３０℃で標的遺伝子座（レーン４）にてＨＤＲ現象に対応するバンドを検出し得ることが明らかになった。ジェネティシン（Ｇ４１８）による１４日間の培養細胞集団の選択の結果、ＨＤＲ細胞が顕著に濃縮された（レーン１１および１３）。
【０１３３】
実施例９  ウシ接合体におけるＴＡＬＥＮ活性
この実施例では、Ｃａｒｌｓｏｎ  ＋６３  ＴＡＬＥＮで得られた結果を、以前から公知の＋２３１スキャフォールドと比較する。実施例１に記載の方法に従った。Ｃａｒｌｓｏｎ  ＋６３スキャフォールドに基づく、ウシＧＤＦ８遺伝子座のエクソン３を標的とするＧＤＦ８３．１  ＴＡＬＥＮペアを使用した結果を表２にまとめる。ＣＡＲＬＳＯＮ  ＋６３  ＴＡＬＥＮを使用した場合の突然変異頻度は、これまでのインジェクションを大幅に上回った。低用量のｍＲＮＡ（２ｎｇ／μｌ）でインジェクトされた１４個の胚盤胞のうち６個（４３％）が、発生率の顕著な低下を伴わずにインデルを示した。高用量群（１０ｎｇ／μｌ）の４個の胚盤胞のうち３個がインデルを示し、３個の突然変異体胚盤胞のうち２個で両アレル改変が生じた（表３）。
【０１３４】
【表５】
2015519923.tif 000007
【０１３５】
【表６】
2015519923.tif 000008
【０１３６】
実施例１０  ＴＡＬＥＮ改変細胞のクローニング
ＬＤＬＲ２  ＴＡＬＥＮペアで改変した、実施例５の細胞をクローンとして増殖させた。ＬＤＬＲ遺伝子のクラスＡドメイン１の片アレルおよび両アレル改変を有する、トランスポゾン共選択によるＯｓｓａｂａｗブタコロニーを不均等にプールし（プールＡ−４遺伝子型、Ｂ−３遺伝子型、およびＣ−５遺伝子型）、クロマチン移植によりクローニングした。妊娠は、７／９移植で成立した（プールＡについて１／２、プールＢについて２／３、およびプールＣについて４／４）。９匹の雌ブタのうち７匹が妊娠し、７匹の妊娠した雌ブタのうち６匹が出産した。１７匹の子ブタが誕生し、それらは成熟するまで育てる目的に適した良好な健康状態にみえた。これらの子ブタには、以下の表４に示すＢ１、Ｂ２、Ｃ１、およびＣ２と呼ばれる種々の遺伝子型があった。遺伝子型のうち２つは欠失であり、１つは１塩基挿入であり、１遺伝子型は両アレルの改変、すなわち一方のアレルに挿入、他方のアレルに欠失を有していた。
【０１３７】
【表７】
2015519923.tif 000009
【０１３８】
実施例１１  アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ＴＡＬＥＮにより刺激される相同組換え（ＨＲ）の有効な鋳型である
実施例７と同様の別の試験では、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅウシ由来の突然変異体ミオスタチンアレル（１１ｂｐ欠失）を野生型Ｗａｇｙｕウシ（Ｇｒｏｂｅｔ，１９９７，Ｋａｍｂａｄｕｒ，１９９７）に移入する実験的な試みが行われた（図１８）。ＴＡＬＥＮをコードする４マイクログラムのプラスミドを、Ｗａｇｙｕ細胞にトランスフェクトし、２４時間後に、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅウシ由来の１，６２３ｂｐのＤＮＡフラグメントを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ−ＢＢ−ＨＤＲ）を加えた。３日目の半定量ＰＣＲから、ＧＤＦ８  ＴＡＬＥＮおよびＡＡＶベクターの両方を加えた場合に限り、最大５％のアレル変換頻度が示された。個々のコロニーの遺伝子移入頻度を評価するために、トランスポゾン共選択戦略を実施し、個々のコロニーを単離し増殖させてＤＮＡシーケンシングを行った。単離されたコロニーの１３パーセントが、ＢＢアレルの移入についてＰＣＲ陽性であった。これらの結果から、ＴＡＬＥＮおよびＡＡＶ相同組換え鋳型は、家畜における標的アレル移入のための有効な方法であることが実証され、同じ遺伝子座に対するスーパーコイルプラスミド相同組換え鋳型（実施例７）よりも大幅に改善されていることがわかる。
【０１３９】
実施例１２  鋳型のための一本鎖ＤＮＡ
図１９に結果をまとめてある。一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）が、ＴＡＬＥＮにより刺激されたＨＲのための有効な鋳型になることが見出された。ジンクフィンガーヌクレアーゼに誘発された二本鎖切断が高頻度でｓｓＯＤＮを刺激し得ることが最近実証された｛Ｃｈｅｎ，２０１１｝。ＴＡＬＥＮが、任意の細胞、特に初代細胞、さらには特に初代家畜細胞で、ＨＲ鋳型としてｓｓＯＤＮを用いた相同組換えを刺激できるか否かは知られていなかった。１１塩基対のＢｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅウシ突然変異をＷａｇｙｕ細胞に遺伝子移入するために、上記（実施例７および１１）と同じ遺伝子座を標的とした。１１塩基対の欠失を含むＢＢ  ＧＤＦ８遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを模倣するように、２つの７６塩基対ｓｓＯＤＮを設計した。ＴＡＬＥＮをコードする４マイクログラムのプラスミドを、Ｗａｇｙｕ細胞にトランスフェクトし、０．３ｎＭｏｌのｓｓＯＤＮをＴＡＬＥＮ（Ｎ）とコトランスフェクトするか、またはＴＡＬＥＮヌクレオフェクションの２４時間後に、ＭｉｒｕｓＬＴ１（Ｍ）試薬もしくはリポフェクタミンＬＴＸ試薬（Ｌ）のいずれかにより送達した。３日目の半定量ＰＣＲから、ＴＡＬＥＮトランスフェクションの２４時間後にリポフェクタミンＬＴＸ試薬でｓｓＯＤＮを送達した条件で、最大５％のアレル変換頻度が示された。標的に対して設計されたセンスｓｓＯＤＮとアンチセンスｓｓＯＤＮとの間で、ＰＣＲシグナルの差は観察されなかった。
【０１４０】
実施例１３  ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡによる家畜細胞のトランスフェクションは効率的な標的切断をもたらす
図２０に結果をまとめてある。ＴＡＬＥＮ  ｃＤＮＡ（ＴＡＬＥＮペアｐ６５１１．１およびＤＭＤ７．１）を、以前に記載された（Ｃａｒｌｓｏｎ，２０１０）ように、転写されるｐＴ３ＴＳクローニングベクター中のＴ３プロモーターの下流にクローニングし、ＭＩＮＥＬＵＴＥ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した後、ＭＭＥＳＳＡＧＥ  ＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ３キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、製造業者のプロトコールに従いｍＲＮＡ合成を行った。修飾ｍＲＮＡを、３’−０−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  ＲＮＡキャップアナログ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、５−メチルシチジントリホスフェートプソイドウリジントリホスフェート（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ならびに２つの標準リボヌクレオチドであるアデノシン三リン酸およびグアノシン三リン酸からなるリボヌクレオチドカクテルを代わりに使用するＭＭＥＳＳＡＧＥ  ＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ３キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて同じベクターから合成した。ｍＲＮＡ合成反応は、ＤＮＡ分解酵素処理した後、ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＣＬＥＡＮＵＰキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。ａ）表示量のｐ６５１１．１  ＴＡＬＥＮを、以下の設定：１パルス、１８００ｖ；２０ｍｓ幅、および１００ｕｌチップを用いたＮＥＯＮヌクレオフェクション系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ブタ線維芽細胞（１複製物当たり５００，０００〜７５０，０００細胞）にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を３０℃または３７℃で３日間培養した後、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）によりインデル解析を行った。Ｇｕｉｓｃｈｉｎ  ｅｔ．ａｌ．，２０１０に記載のように、ＮＨＥＪの割合を計算し、グラフにプロットした。ｐ６５１１．１  ＴＡＬＥＮをコードする４マイクログラムのプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）も、同じ条件下でトランスフェクトし、％ＮＨＥＪを比較した。ｂ）ｍＲＮＡの構造、組成物、またはインビトロ合成反応スキームにより、ＴＡＬＥＮ活性はほとんど影響を受けない。ＤＭＤ７．１  ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡを、標準リボヌクレオチドもしくは修飾リボヌクレオチドを使用して、個々に（「Ｉ」、個別の反応でｌｅｆｔおよびｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮ）または同じ反応中（デュアルの「Ｄ」）で合成した。次いで、反応物を２つの複製物に分割し、その一方に、製造業者プロトコールに従い、Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｔａｉｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して追加のポリＡ尾部を加えた。
【０１４１】
プラスミドＤＮＡからのＴＡＬＥＮの発現は、家畜細胞におけるＴＡＬＥＮによるインデルの誘導のための有効な方法であった。しかしながら、ＴＡＬＥＮをコードするプラスミドが細胞のゲノムに組み込まれる可能性がある。これに対して、ｍＲＮＡが宿主細胞のゲノムに組み込まれることはない。ＴＡＬＥＮをコードするプラスミドの組み込みを回避するために、同等レベルのＴＡＬＥＮ活性がＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡのトランスフェクションにより達成できるか否かを判定するための実験を行った。ｐ６５１１．１  ＴＡＬＥＮペアをコードする、ＴＡＬＥＮのｍＲＮＡを、標準リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドを使用して作製した。各ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡの調製物の２つの量を、ヌクレオフェクションによりブタ線維芽細胞にトランスフェクトし、３０℃または３７℃で３日間培養した後、インデルの分析を行った。ＮＨＥＪの割合は、３０℃でインキュベートされたすべてのｍＲＮＡトランスフェクションについて同様であったが、３７℃でインキュベートされたトランスフェクト細胞については、用量応答が観察された。ＮＨＥＪの割合における、修飾リボヌクレオチドと標準リボヌクレオチドとの間の顕著な差は、この複製物では検出することができなかった。ただし、等量を使用するものではなかった。特に、３０℃でインキュベートされたすべての群におけるｍＲＮＡトランスフェクションは、同じ条件下でプラスミドＤＮＡとしてトランスフェクトされたｐ６５１１．１  ＴＡＬＥＮよりも顕著に優れていた。
【０１４２】
第２の遺伝子座、ブタＤＭＤにおける、修飾ヌクレオチド対標準ヌクレオチドにより合成されたｍＲＮＡの影響を調べるために、別の実験を行った。この実験ではまた、ポリＡ尾部の付加がＴＡＬＥＮ活性に影響を及ぼすか否か、また各ＴＡＬＥＮ単量体（ｌｅｆｔおよびｒｉｇｈｔ単量体）を同じ転写反応（デュアル）で合成することができるか否か、または各単量体を個々に合成し、トランスフェクション前に混合しなければならないのか否かも調べた。１または４マイクログラムのＤＭＤ７．１  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡをブタ線維芽細胞にトランスフェクトし、３０℃または３７℃で３日間培養した。ｐ６５１１．１  ＴＡＬＥＮの場合のように、３０℃で培養された細胞におけるＴＡＬＥＮ活性には、ほとんど差は観察されなかったため、修飾ヌクレオチド、ｍＲＮＡのインビトロポリアデニル化、またはｍＲＮＡのデュアル転写のいずれも活性に影響を及ぼさないことが示唆された。４μｇのｍＲＮＡが１μｇトランスフェクションよりも優れていたので、用量応答が再び３７℃で培養された複製物で観察された。また、ポリアデニル化ｍＲＮＡは、３７℃の複製において、非ポリアデニル化ｍＲＮＡよりも優れているように見えた。
【０１４３】
特に、ＤＭＤ７．１  ＴＡＬＥＮをコードするプラスミドＤＮＡをブタ線維芽細胞にトランスフェクトした場合、３日目に測定された％ＮＨＥＪのレベルが、１４日目まで培養された細胞に対して顕著に（４０〜６０％）低下していることが認められた（実施例４）。％ＮＨＥＪのそのような低下は、ここに示すｍＲＮＡトランスフェクト複製物のいずれについても観察されなかった。１４日目の改変レベルについてのデータは示していない。したがって、ｍＲＮＡトランスフェクションは、ＴＡＬＥＮ活性に関してだけでなく、長期間の培養後に改変細胞を高率に維持することに関しても、ＤＮＡトランスフェクションよりも優れているように見える。特定の理論に拘泥するものではないが、この結果は、プラスミドＤＮＡに比較して、ｍＲＮＡでトランスフェクトされた場合、細胞生存率が改善されることによると考えられる。
【０１４４】
実施例１４  選択することなくｍＲＮＡトランスフェクションにより作製されたコロニーの解析
この実施例の結果を表５にまとめてある。実施例１３のように、ＴＡＬＥＮをコードする１〜４マイクログラムのｍＲＮＡを、ウシまたはブタの初代線維芽細胞に加えた。ＴＡＬＥＮに暴露後３日間、細胞を３０℃で増殖させ、細胞数を数えて、１０ｃｍのディッシュに、１〜２０細胞／ｃｍ２の密度範囲で播種した。直径が３〜４ｍｍの個々のコロニーが観察されるまで、細胞を１０〜１５日間培養した。ｐ−２００ピペッターを用いて、穏やかな吸引の下でコロニーを吸引し、５００μｌの増殖培地（Ｃａｒｌｓｏｎ，２０１１）を含む２４ウェルプレートに排出した。明確に画定されたコロニーがあるプレート（約１０〜３０／プレート）をコロニー吸引のために選んで、複数のコロニーから細胞を吸引する可能性を抑えた。２４ウェルディッシュ中で、コロニーが７０〜９０パーセントコンフルエントに達したならば、インデル解析のために一部を採取し、残りを凍結保存した。インデル解析の結果を表５の最後の５列に示す。これらの結果から、選択マーカーを使用せずに、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡをトランスフェクトされた線維芽細胞からコロニーを容易に単離できることが実証される。解析されたクローンの突然変異頻度は、３日目のソース集団の改変レベルにより正確に予測された。両アレル改変を有するクローンも容易に同定することができた。
【０１４５】
【表８】
2015519923.tif 000010
【０１４６】
実施例１５  ｍＲＮＡによりコードされたＴＡＬＥＮとｓｓＯＤＮのコトランスフェクションは、ＨＤＲを増強する
図２１に、ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡと一本鎖オリゴヌクレオチドとの組合せを用いる、Ｗａｇｙｕ細胞の改変についての実験結果のまとめを示す。細胞をＷａｙｇｕ細胞とし、アレルをＢｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅとした。実験方法、細胞型、およびアッセイする遺伝子座は実施例１２と同じとした。ただし、ＤＮＡにコードされたＴＡＬＥＮの代わりにＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡ（２ｕｇ）（指定の場合）とセンスｓｓＯＤＮのみとを使用した。選択マーカーは、いかなる段階においてもこれらの細胞に導入しなかった。ＴＡＬＥＮの２４時間後にｓｓＯＤＮを導入した場合、ＤＮＡトランスフェクト細胞およびｍＲＮＡトランスフェクト細胞の両方におけるＨＤＲが、３日目のポピュレーション解析により明らかになった。ピーク活性（約１０％）が、ｓｓＯＤＮおよびＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡを用いて、ヌクレオフェクションによりコトランスフェクトされた細胞で観察された。この結果は、前の結果と対照的であり、前の結果では、ＴＡＬＥＮをコードするＤＮＡは、測定可能な頻度でＨＤＲを刺激することができなかった。実施例１３のように調製された個々のコロニーの間で、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅアレルのヘテロ接合型およびホモ接合型の両方の移入をそれぞれ、５および２パーセント観察することができた。
【０１４７】
実施例１６  ｓｓＯＤＮおよびＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡを使用する一塩基変化の導入
図２２および２３に、一塩基多型が複製された別の試験の結果を示す。この遺伝子多型は、Ｐｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅウシに筋肉増強を誘導することが知られているウシＧＤＦ８遺伝子座、Ｃ３１３Ｙにコーディング変化を誘発することが知られている（Ｋａｍｂａｄｕｒ，１９９７；Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９９７  ７：９１０−９１５）。ＨＤＲのスクリーニングおよび／または定量を支援するために、追加のＳＮＰをｓｓＯＤＮに導入して、サイレントＥｃｏＲＩ部位を作製した。ｍＲＮＡおよびｓｓＯＤＮを、表示の相対量を用いて、実施例１２および１４に示すように、ヌクレオフェクションにより同時に導入した。図２２および２３に、トランスフェクト細胞を３０℃および３７℃で３日間インキュベートした場合の結果を示す。相同組換えのピークレベルは、ＴＡＬＥＮの活性が同様であるにもかかわらず、３７℃（１．７％）よりも３０℃（１１．３％）で顕著に高かった。このデータから、約０．２〜約０．４ｎｍｏｌのｓｓＤＮＡが、３０℃および３７℃の両方において相同組換えに有効であることが示される。驚くべきことに、二相性の効果が観察され、オリゴヌクレオチド濃度／量が多すぎると組換えが消失する。選択マーカーは、いかなる段階においてもこれらの細胞に使用しなかった。
【０１４８】
実施例１７  ｏｌｉｇｏ  ＨＤＲを使用して、ブタ（Ｏｓｓａｂａｗ）細胞に導入されたアレル
図２４に、ｍＲＮＡにコードされたＴＡＬＥＮと一本鎖オリゴヌクレオチドとの組合せを用いて細胞を改変して、ある種に天然に存在するアレルを別の種に導入した（異種間移動）実験結果のまとめを示す。実施例１６のように、Ｐｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅ  ＧＦＤ８  ＳＮＰ  Ｃ３１３Ｙを例として選び、Ｏｓｓａｂｏｗブタ細胞に導入した。Ｗａｇｙｕ細胞の代わりにＯｓｓａｂａｗブタ細胞を用いて、実施例１６のように、実験を行った。マーカーは、いかなる段階においてもこれらの細胞に使用しなかった。ブタおよびウシの細胞の間で、ＨＤＲの同様のピークが、０．４ｎｍｏｌのｓｓＯＤＮで観察されたが（図２２および２３）、Ｏｓｓａｂａｗ線維芽細胞では、高濃度のｓｓＯＤＮによりＨＤＲが消失することはなかった。
【０１４９】
実施例１８  ｏｌｉｇｏ  ＨＤＲを使用して細胞に導入されたアレルのクローニング
図２５に、ｍＲＮＡにコードされたＴＡＬＥＮと一本鎖オリゴヌクレオチドとの組合せを用いて細胞を改変して、細胞にアレルを導入し、動物をクローニングした実験結果のまとめを示す。フレームシフトアレルを生成するだけでなく、新規のＢａｍＨ１部位を導入することになる４塩基対の挿入を導入するように設計したＯｓｓａｂａｗブタ細胞に新規アレル（ＢａｍＨ１）を導入した。実施例１２および１４のように、２または１マイクログラムのｓｓＬＤＬＲ２．１  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡおよび０．３ｎｍｏｌのｓｓＯＤＮをＯｓｓａｂａｗ細胞に導入した。驚くべきことに、ｓｓＯＤＮを伴わないＴＡＬＥＮペアのこれまでの最大値が２５％のＮＨＥＪであったので、ｓｓＯＤＮとＴＡＬＥＮ活性との間には相乗作用があった。関連する分子機序に関する現在の理解に基づくと、この相乗作用は予測されず、また予測可能でもない。ＢａｍＨ１によるＰＣＲ単位複製配列の制限消化によりＨＤＲを検出した。ＨＤＲレベルがＮＨＥＪレベルと同等であるため、ＴＡＬＥＮ誘導切断の過半数は、ｓｓＯＤＮを用いて修復されることが示唆された。実施例１４のように作製された個々のコロニーの解析により、ヘテロ接合型およびホモ接合型の改変がそれぞれ最大３０および２．５パーセントであることが明らかになった。選択マーカーは、いかなる段階においてもこれらの動物に使用しなかった。ＴＡＬＥＮ処理細胞を、クロマチン移植によりクローニングし、代理雌ブタに移植し、妊娠を成立させた。
【０１５０】
実施例１９  ＤＮＡおよびｍＲＮＡにコードされたＴＡＬＥＮは、精原幹細胞で活性である
結果を図２６にまとめてある。ブタの生殖細胞を１０週齢雄ブタから単離し、ディファレンシャルにより濃縮した。ｅＧＦＰおよびＤＭＤ特異的ＴＡＬＥＮをコードするプラスミドを、プログラムＸ−００１およびＸ−００５を用いるＡＭＡＸＡ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ系Ａｍａｘａ溶液「Ｖ」−および「Ｌ」および「Ｂ」を使用して、生殖細胞にトランスフェクトした。各トランスフェクション反応は、１０６の濃縮生殖細胞および表示ミリグラムのＴＡＬＥＮをコードするプラスミドＤＮＡを用いて行った。同じ方法をＤＭＤ７．１  ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡを送達するために使用した。ヌクレオフェクション後、それらを５％のＣＯ２雰囲気中、３７℃または３０℃で５日間培養した。トランスフェクション効率は、ＧＦＰおよびＵＣＨ−Ｌ１の発現の共局在化についての免疫蛍光解析により評価した。細胞生存率はトリパンブルー色素排除試験により評価した。
【０１５１】
実施例２０  ＴＡＬＥＮは、始原生殖細胞においてＨＤＲを刺激した
ＴＡＬＥＮに刺激されたＨＤＲを、ニワトリのＤｄｘ４遺伝子座について、ニワトリ始原生殖細胞（ＰＧＣ）でも試験した。２つのＴＡＬＥＮペアをイントロン１（Ｔａｌ１．１）およびエクソン７（Ｔａｌ７．１）の上に構築し、それらの機能をＤＦ１ニワトリ細胞で確認した。図２７を参照のこと。実施例８も参照されたい。続いて、各ＴＡＬＥＮペアを、Ｄｄｘ４遺伝子のエクソン２とＧＦＰを融合させるように設計したドナーターゲティングベクターとコトランスフェクトした（図ｂ）。予測されるように、Ｔａｌ  １．１による切断は、相同組換えを刺激したが（図ｃ）、ドナーターゲティングベクター中の相同配列の外側に存在するＴａｌ  ７．はＨＤＲを刺激しなかった。
【０１５２】
参考文献
本明細書に記載した特許出願、特許、刊行物、および学術論文は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。矛盾が生じた場合、本明細書を優先する。
Ｍ．ＣＨＲＩＳＴＩＡＮ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ｗｉｔｈ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，１８６  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）．
Ｊ．Ｃ．ＭＩＬＬＥＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ＴＡＬＥ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ，２９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）．
Ｄ．Ａ．ＭＣＧＲＥＷ  ＆  Ｋ．Ｌ．ＫＮＩＧＨＴ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲｅｃＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ，３８  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２００３）．
Ｍ．Ｍ．ＣＯＸ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＲｅｃＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ，６３  Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９９）．
Ｂ．ＲＥＩＳＳ，ｅｔ  ａｌ．，ＲｅｃＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ，９３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ（１９９６）．
Ｂ．ＲＥＩＳＳ，ｅｔ  ａｌ．，ＲｅｃＡ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｓｉｓｔｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｉｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，９７  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ（２０００）．
Ｏ．Ｇ．ＳＨＣＨＥＲＢＡＫＯＶＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＲｅｃＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，４５９  Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ（２０００）．
Ｒ．Ｊ．ＹＡＮＥＺ  ＆  Ａ．Ｃ．ＰＯＲＴＥＲ，Ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｈＲＡＤ５１，６  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ（１９９９）．
Ｚ．ＣＵＩ，ｅｔ  ａｌ．，ＲｅｃＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ，ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ，５  Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（ＮＹ）（２００３）．
Ｎ．ＴＡＫＡＨＡＳＨＩ  ＆  Ｉ．Ｂ．ＤＡＷＩＤ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  Ｒａｄ５２  ａｎｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，３３  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２００５）．
Ｔ．ＣＥＲＭＡＫ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｃｕｓｔｏｍ  ＴＡＬＥＮ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，（ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１１）．
Ｄ．Ｆ．ＣＡＲＬＳＯＮ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ  ｓｗｉｎｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，２０  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ（２０１１）．
Ａ．Ｍ．ＧＥＵＲＴＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｒａｔｓ  ｖｉａ  ｅｍｂｒｙｏ  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，３２５  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）．
Ｉ．Ｄ．ＣＡＲＢＥＲＹ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｕｓｉｎｇ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，１８６  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）．
Ｔ．ＭＡＳＨＩＭＯ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｒａｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（Ｘ−ＳＣＩＤ）  ｕｓｉｎｇ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，５  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１０）．
Ｌ．ＴＥＳＳＯＮ，ｅｔ  ａｌ．，Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｒａｔｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｅｍｂｒｙｏ  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＡＬＥＮｓ，２９  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１１）．
Ｃ．Ｊ．ＰＡＬＧＲＡＶＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＲＥＬＡ  ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ａｃｔｉｖｉｔｙ：  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，８５  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２０１１）．
Ｃ．ＭＵＳＳＯＬＩＮＯ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ＴＡＬＥ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｈｉｇｈ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２０１１）．
Ｄ．Ｙ．ＧＵＳＣＨＩＮ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，６４９  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２０１０）．
Ｙ．ＤＯＹＯＮ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｃｏｌｄ  ｓｈｏｃｋ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ，７  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１０）．
Ｈ．Ｊ．ＫＩＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ  ｖｉａ  ｍｏｄｕｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ，１９  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．（２００９）．
Ｈ．Ｊ．ＬＥＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，２０  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ（２０１０）．
Ｅ．Ｅ．ＰＥＲＥＺ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，２６  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００８）．
Ｄ．Ｊ．ＢＬＡＫＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ａｎｄ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ，８２  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ（２００２）．
Ｌ．ＧＲＯＢＥＴ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｏｖｉｎｅ  ｍｙｏｓｔａｔｉｎ  ｇｅｎｅ  ｃａｕｓｅｓ  ｔｈｅ  ｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｓｃｌｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ，１７  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ（１９９７）．
Ｒ．ＫＡＭＢＡＤＵＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｙｏｓｔａｔｉｎ（ＧＤＦ８）  ｉｎ  ｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｓｃｌｅｄ  Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ  ａｎｄ  Ｐｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅ  ｃａｔｔｌｅ，７  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ（１９９７）．
【図１】
2015519923.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2015519923.tif 000015
【図５】
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【図６】
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【図７】
2015519923.tif 000018
【図８Ａ】
2015519923.tif 000019
【図８Ｂ】
2015519923.tif 000020
【図９Ａ】
2015519923.tif 000021
【図９Ｂ】
2015519923.tif 000022
【図１０】
2015519923.tif 000023
【図１１】
2015519923.tif 000024
【図１２】
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【図１３】
2015519923.tif 000026
【図１４】
2015519923.tif 000027
【図１５】
2015519923.tif 000028
【図１６】
2015519923.tif 000029
【図１７−１】
2015519923.tif 000030
【図１７−２】
2015519923.tif 000031
【図１８】
2015519923.tif 000032
【図１９】
2015519923.tif 000033
【図２０】
2015519923.tif 000034
【図２１】
2015519923.tif 000035
【図２２】
2015519923.tif 000036
【図２３】
2015519923.tif 000037
【図２４】
2015519923.tif 000038
【図２５】
2015519923.tif 000039
【図２６】
2015519923.tif 000040
【図２７】
2015519923.tif 000041
【配列表】
2015519923000001.app
【国際調査報告】
2015519923.tif 000042
2015519923.tif 000043
2015519923.tif 000044
2015519923.tif 000045