(57)【要約】本発明は、Hippo経路およびHippo経路シグナル伝達を調節する作用物質、例えば、抗体、可溶性受容体、ポリペプチド、ペプチド、および低分子に関する。本発明は、このような作用物質をスクリーニングおよび／または特定する方法、ならびに癌などの疾患の治療のためにこれら作用物質を使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
1つまたは複数の免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞接着分子（IgCAM）の細胞外ドメインに特異的に結合する作用物質であって、IgCAMが、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択される、作用物質。
【請求項２】
可溶性受容体である、請求項1記載の作用物質。
【請求項３】
可溶性受容体が：
(a)IgCAMの細胞外ドメインまたはその断片；
(b)SEQ ID NO:33〜64からなる群より選択される配列；または
(c)SEQ ID NO:33〜64からなる群より選択される配列の断片
を含む、請求項2記載の作用物質。
【請求項４】
可溶性受容体が、CADM1、CADM3、PVRL1、PVRL2もしくはPVRL3の細胞外ドメイン、またはその一部を含む、請求項2または請求項3記載の作用物質。
【請求項５】
可溶性受容体がFc領域を含む、請求項2〜4のいずれか一項記載の作用物質。
【請求項６】
抗体である、請求項1記載の作用物質。
【請求項７】
抗体が、モノクローナル抗体、組み換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、抗原結合部位を含む抗体断片、または二重特異性抗体である、請求項6記載の作用物質。
【請求項８】
(a)Hippo経路を調節する；
(b)Hippo経路シグナル伝達を活性化するもしくは増加させる；
(c)YAP活性を低下させる；
(d)リン酸化YAPを増加させる；
(e)YAP依存性遺伝子の発現を減少させる；および／または
(f)CD44、CD47、CD133、TDGF1、EPHB2、CA12、LRP4、GPC4、CLDN2、CTGF、PAG1、SEMA4D、RHEB、MAGI1、ITPR3、CD168、NRP2、Gli2、Birc2、Birc5、FGF1、IL33、GRB2、IGFBP3、およびAREGからなる群より選択される遺伝子のうちの少なくとも1つの発現を減少させる、
請求項1〜7のいずれか一項記載の作用物質。
【請求項９】
(a)アポトーシスを調節する；
(b)細胞増殖を調節する；および／または
(c)上皮間葉転換（EMT）を調節する、
請求項1〜8のいずれか一項記載の作用物質。
【請求項１０】
腫瘍または腫瘍細胞の成長を阻害する、請求項1〜8のいずれか一項記載の作用物質。
【請求項１１】
腫瘍が、結腸直腸腫瘍、結腸腫瘍、膵腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝腫瘍、乳房腫瘍、腎腫瘍、前立腺腫瘍、メラノーマ、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、脳腫瘍、胃腸腫瘍、および頭頸部腫瘍からなる群より選択される腫瘍である、請求項10記載の作用物質。
【請求項１２】
請求項1〜7のいずれか一項記載の作用物質および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項1〜7のいずれか一項記載の作用物質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項13記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１５】
(a)請求項1〜7のいずれか一項記載の作用物質を産生する；
(b)請求項13記載のポリヌクレオチドを含む；または
(c)請求項13記載のベクターを含む、
単離された細胞。
【請求項１６】
腫瘍成長を阻害するための請求項1〜7のいずれか一項記載の作用物質の使用。
【請求項１７】
腫瘍が、結腸直腸腫瘍、結腸腫瘍、膵腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝腫瘍、乳房腫瘍、腎腫瘍、前立腺腫瘍、メラノーマ、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、脳腫瘍、胃腸腫瘍、および頭頸部腫瘍からなる群より選択される腫瘍である、請求項16記載の作用物質の使用。
【請求項１８】
癌を治療するための請求項1〜7のいずれか一項記載の作用物質の使用。
【請求項１９】
癌が、結腸直腸癌、結腸癌、膵癌、肺癌、卵巣癌、肝癌、乳癌、腎癌、前立腺癌、メラノーマ、子宮頸部癌、膀胱癌、脳癌、胃腸癌、および頭頸部癌からなる群より選択される、請求項18記載の作用物質の使用。
【請求項２０】
Hippo経路を調節するための請求項1〜7のいずれか一項記載の作用物質の使用。
【請求項２１】
少なくとも1つのさらなる治療剤の有効量を投与することをさらに含む、請求項16〜20のいずれか一項記載の作用物質の使用。
【請求項２２】
さらなる治療剤が、化学療法剤、抗体、血管新生阻害剤、または免疫応答を調節する分子である、請求項20記載の使用。
【請求項２３】
少なくとも1つのIgCAMの細胞外ドメインに特異的に結合する作用物質を細胞に接触させる工程を含む、Hippo経路を調節する方法。
【請求項２４】
Hippo経路を調節する作用物質をスクリーニングする方法であって、
(a)少なくとも1つのIgCAMの細胞外ドメインに特異的に結合する試験薬を細胞に接触させる工程、ならびに
(b)二分子蛍光補完（BiFC）アッセイを使用してYAPおよび／またはTAZの細胞局在を測定する工程
を含む、方法。
【請求項２５】
Hippo経路を調節する作用物質をスクリーニングする方法であって、
(a)少なくとも1つのIgCAMの細胞外ドメインに特異的に結合する試験薬を、第1の細胞セットであって第2の細胞セットではない細胞セットに接触させる工程、ならびに
(b)第2の細胞セットと比較しての第1の細胞セット中のリン酸化YAPおよび／またはリン酸化TAZの量を測定する工程
を含む、方法。
【請求項２６】
Hippo経路を調節する作用物質をスクリーニングする方法であって、
(a)少なくとも1つのIgCAMの細胞外ドメインに特異的に結合する試験薬を、第1の細胞セットであって第2の細胞セットではない細胞セットに接触させる工程、ならびに
(b)第2の細胞セットと比較しての第1の細胞セット中の非リン酸化YAPおよび／または非リン酸化TAZの量を測定する工程
を含む、方法。
【請求項２７】
Hippo経路を調節する作用物質をスクリーニングする方法であって、
(a)少なくとも1つのIgCAMの細胞外ドメインに特異的に結合する試験薬を、第1の細胞セットであって第2の細胞セットではない細胞セットに接触させる工程、ならびに
(b)第2の細胞セット中のYAP依存性遺伝子および／またはTAZ依存性遺伝子の発現と比較しての第1の細胞セット中の少なくとも1つのYAP依存性遺伝子および／または少なくとも1つのTAZ依存性遺伝子の発現を測定する工程
を含む、方法。
【請求項２８】
請求項24〜27のいずれか一項記載の方法によって特定された作用物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2012年6月6日に出願された米国仮出願第61/656,249号、2012年12月14日に出願された米国仮出願第61/737,390号、および2013年3月14日に出願された米国仮出願第61/783,190号の優先権の恩典を主張し、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は概して、Hippo経路およびHippo経路シグナル伝達を調節する作用物質、例えば、抗体および可溶性受容体、ならびに癌などの疾患の治療のためにこれら作用物質を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
Hippo経路は、細胞増殖および細胞死を調節し、器官サイズを決定するシグナル伝達経路である。この経路は哺乳動物において腫瘍抑制因子としての役割を果たすと考えられており、この経路の障害がヒト癌においてしばしば検出される。この経路は、自己複製ならびに幹細胞および前駆細胞の分化に関与するおよび／またはこれらを調節し得る。さらに、Hippo経路は、創傷治癒および組織再生に関与し得る。さらに、Hippo経路は、Wnt、NotchおよびHedgehogなどの他のシグナル伝達経路とクロストークするので、それは多種多様の生物学的事象に影響を与え得、その機能不全は、癌に加えて多くのヒト疾患に関与し得ると考えられている。レビューについては、例えば、Haider et al., 2011, Development 138:9-22（非特許文献1）; Zhao et al., 2011 , Nature Cell Biology 13:877-883（非特許文献2）; Bao et al., 2011, J. Biochem. 149:361-379（非特許文献3）; Zhao et al., 2010, J. Cell Sci. 123:4001-4006（非特許文献4）を参照のこと。
【０００４】
Hippo経路は、ショウジョウバエおよび哺乳動物系間で高度に保存されているキナーゼカスケードから構成される。ショウジョウバエにおいて、非定型カドヘリン、Dachsous（Ds）およびFat（Ft）が、Hippo経路についての受容体として機能することが報告された（例えば、Bennett et al., 2006, Curr. Biol, 16:2101-2110（非特許文献5）; Matakatsu et al., 2006, Development, 133:2315-2324（非特許文献6）を参照のこと）。最近になって、ショウジョウバエ細胞接着分子Echinoid（Ed）がSalvador（Sav）と相互作用し、Hippoシグナル伝達に関与し得ることが報告された（Yue et al., 2012, Dev. Cell, 22:255-267（非特許文献7））。しかし、細胞表面受容体は、哺乳動物Hippo経路について特定されていない。
【０００５】
哺乳動物Hippo経路のコア成分のうちの2つはLats1およびLats2であり、これらは、ショウジョウバエWarts（Wts）と相同の核Dbf2関連（NDR）ファミリープロテインキナーゼである。Lats1/2タンパク質は、ショウジョウバエMatsと相同である足場タンパク質Mob1A/B（Mpsワンバインダーキナーゼアクチベーター様1Aおよび1B）との会合によって活性化される。Lats1/2タンパク質はまた、ショウジョウバエHippoと相同であるSTE20ファミリープロテインキナーゼMst1およびMst2によるリン酸化によって活性化される。Lats1/2キナーゼは、ショウジョウバエYorkieと相同である下流エフェクター、YAP（Yes関連タンパク質（Yes-associated protein））およびTAZ（PDZ結合モチーフを有する転写コアクチベーター（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif）；WWTR1）をリン酸化する。Lats1/2によるYAPおよびTAZのリン酸化はHippoシグナル伝達経路内の非常に重要な事象である。Lats1/2は複数の部位でYAPをリン酸化するが、Ser127のリン酸化がYAP阻害のために重要である。YAPのリン酸化は、14-3-3ファミリーのタンパク質についてのタンパク質結合モチーフを生じさせ、これは、14-3-3タンパク質が結合すると、細胞質中でのYAPの保持および／または隔離をもたらす。同様に、Lats1/2は複数の部位でTAZをリン酸化するが、Ser89のリン酸化がTAZ阻害のために重要である。TAZのリン酸化は細胞質中でのTAZの保持および／または隔離をもたらす。YAPと同様に、TAZのリン酸化も14-3-3結合部位を生じさせる。さらに、YAPおよびTAZのリン酸化は、YAPまたはTAZユビキチン化によって触媒されるリン酸化依存性分解を活性化することによって、これらのタンパク質を不安定化すると考えられている。従って、Hippo経路が「オン」である場合、YAPおよび／またはTAZはリン酸化されており、不活性であり、かつ一般に細胞質中に隔離されており；対照的に、Hippo経路が「オフ」である場合、YAPおよび／またはTAZは、リン酸化されておらず、活性であり、かつ一般に核中に見られる。
【０００６】
非リン酸化活性化YAPは細胞核中へ移行し、ここで、その主要な標的転写因子は、TEAドメイン含有ファミリーの4つのタンパク質（TEAD1〜TEAD4、集合的に「TEAD」）である。YAPは、TEAD（または他の転写因子、例えば、Smad1、RUNX、ErbB4およびp73）と一緒に、結合組織成長因子（CTGF）、Gli2、Birc5、Birc2、線維芽細胞成長因子1（FGF1）、およびアンフィレギュリン（AREG）を含む、様々な遺伝子の発現を誘導することが示された。YAPと同様に、非リン酸化TAZは細胞核中へ移行し、ここで、それは、多数のDNA結合転写因子、例えば、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ（PPARγ）、甲状腺転写因子-1（TTF-1）、Pax3、TBX5、RUNX、TEAD1およびSmad2/3/4と相互作用する。YAP/TAZ-転写因子複合体によって活性化される遺伝子の多くは、細胞生存および増殖を媒介する。従って、ある条件下で、YAPおよび／またはTAZは癌遺伝子として作用し、Hippo経路は腫瘍抑制因子として作用する。従って、Hippo経路を標的化することは、癌および他の疾患についての治療的介入のためのもう1つの領域であり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Haider et al., 2011, Development 138:9-22
【非特許文献２】Zhao et al., 2011 , Nature Cell Biology 13:877-883
【非特許文献３】Bao et al., 2011, J. Biochem. 149:361-379
【非特許文献４】Zhao et al., 2010, J. Cell Sci. 123:4001-4006
【非特許文献５】Bennett et al., 2006, Curr. Biol, 16:2101-2110
【非特許文献６】Matakatsu et al., 2006, Development, 133:2315-2324
【非特許文献７】Yue et al., 2012, Dev. Cell, 22:255-267
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、Hippo経路を調節する、抗体、可溶性受容体、および低分子などの結合剤を提供する。本発明はまた、結合剤を含む、薬学的組成物などの組成物を提供する。ある態様において、Hippo経路を調節する結合剤は、新規のポリペプチド、例えば、抗体および融合タンパク質である。ある態様において、Hippo経路を調節する結合剤は、新規の低分子ペプチドまたは低分子である。ある態様において、結合剤は、免疫グロブリンスーパーファミリーのヒト細胞接着分子（IgCAM）に特異的に結合する抗体またはその断片である。本発明はさらに、腫瘍を有する対象へHippo経路を調節する結合剤を投与することによって腫瘍の成長を阻害する方法を提供する。本発明はさらに、その必要がある対象へHippo経路を調節する結合剤を投与することによって癌を治療する方法を提供する。本発明はさらに、その必要がある対象へHippo経路を調節する結合剤を投与することによって腫瘍または癌転移を阻害する方法を提供する。いくつかの態様において、癌を治療する方法、腫瘍成長を阻害する方法、または転移を阻害する方法は、Hippo経路を活性化または刺激する工程を含む。いくつかの態様において、癌を治療する方法、腫瘍成長を阻害する方法、または転移を阻害する方法は、YAP活性を阻害する工程を含む。いくつかの態様において、癌を治療する方法、腫瘍成長を阻害する方法、または転移を阻害する方法は、TAZ活性を阻害する工程を含む。ある態様において、癌を治療する方法、腫瘍成長を阻害する方法、または転移を阻害する方法は、腫瘍の腫瘍形成性を低下させる工程を含む。
【０００９】
一局面において、本発明は、1つまたは複数のヒトIgCAMに特異的に結合する結合剤、例えば、抗体または可溶性受容体を提供する。これらの結合剤は、本明細書において「IgCAM結合剤」と呼ばれる。いくつかの態様において、結合剤は、少なくとも1つのヒトIgCAMの細胞外ドメインに特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、JAM（接合部接着分子）ファミリー、PVR（ポリオウイルス受容体）ファミリー、および／またはCADM（細胞接着分子）ファミリーより選択される少なくとも1つのヒトIgCAMの細胞外ドメインに特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択される1つまたは複数のIgCAMの細胞外ドメインに特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、CLMP、VSIG4、VSIG8、JAM2、JAM3、CADM1、CADM3、CADM4、PVRL1、PVRL3、PVRL4、TIGIT、TMIGD1、および／またはTMEM25の細胞外ドメインに特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、CADM1、CADM3、PVRL1および／またはPVRL3の細胞外ドメインに特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、CADM3、PVRL1および／またはPVRL3の細胞外ドメインに特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、CADM3の細胞外ドメインに特異的に結合する。
【００１０】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤はHippo経路活性を調節する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はHippo経路シグナル伝達を増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路活性のアゴニストであり、および／またはHippo経路シグナル伝達を増強する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はYAP活性を阻害し、YAPのリン酸化を増強し、YAPの分解を増強し、および／またはYAPの活性化を阻害する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、TAZ活性を阻害し、TAZのリン酸化を増強し、TAZの分解を増強し、および／またはTAZの活性化を阻害する。
【００１１】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤はHippo経路シグナル伝達を阻害する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路活性のアンタゴニストであり、および／またはHippo経路シグナル伝達を減少させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、YAP活性を増加させ、YAPのリン酸化を減少させ、YAPの分解を減少させ、および／またはYAPの活性化を増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、TAZ活性を増加させ、TAZのリン酸化を減少させ、TAZの分解を減少させ、および／またはTAZの活性化を増加させる。
【００１２】
ある態様において、IgCAM結合剤はポリペプチドである。ある態様において、IgCAM結合剤は単離される。ある態様において、IgCAM結合剤は実質的に純粋である。
【００１３】
前述の局面および態様ならびに本明細書に記載の他の局面および態様の各々のいくつかの態様において、IgCAM結合剤は抗体である。いくつかの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗体は一価抗体である。いくつかの態様において、抗体は二重特異性抗体である。いくつかの態様において、抗体は抗体断片である。いくつかの態様において、抗体は少なくとも1つのヒトIgCAMに結合する。いくつかの態様において、抗体は少なくとも1つのヒトIgCAMおよび少なくとも1つのマウスIgCAMに結合する。いくつかの態様において、抗体は、10nM未満のKDで少なくとも1つのIgCAMに結合する。
【００１４】
前述の局面および態様ならびに本明細書に記載の他の局面および態様の各々のある態様において、IgCAM結合剤は可溶性受容体である。いくつかの態様において、可溶性受容体はIgCAMの細胞外ドメインを含む。いくつかの態様において、可溶性受容体はIgCAMの細胞外ドメインの一部または断片を含む。いくつかの態様において、可溶性受容体は融合タンパク質である。いくつかの態様において、可溶性受容体はヒトFc領域を含む。いくつかの態様において、可溶性受容体は少なくとも1つのヒトIgCAMに結合する。いくつかの態様において、可溶性受容体は少なくとも1つのヒトIgCAMおよび少なくとも1つのマウスIgCAMに結合する。いくつかの態様において、可溶性受容体は、10nM未満のKDで少なくとも1つのIgCAMに結合する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、本発明の結合剤をコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、これらのポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびに発現ベクターおよび／またはポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。いくつかの態様において、細胞はハイブリドーマ細胞株である。
【００１６】
他の局面において、本発明は、本明細書に記載の結合剤の各々を含む、Hippo経路を調節する有効量のIgCAM結合剤と腫瘍とを接触させる工程を含む、腫瘍の成長を阻害する方法を提供する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路活性のアゴニストであり、Hippo経路シグナル伝達を増強し、YAP活性を阻害し、YAPのリン酸化を増強し、YAPの分解を増強し、YAPの活性化を阻害し、TAZ活性を阻害し、TAZのリン酸化を増強し、TAZの分解を増強し、および／またはTAZの活性化を阻害する。
【００１７】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の結合剤の各々を含む、Hippo経路を調節する治療有効量のIgCAM結合剤を対象へ投与する工程を含む、対象において腫瘍の成長を阻害する方法を提供する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路活性のアゴニストであり、Hippo経路シグナル伝達を増強し、YAP活性を阻害し、YAPのリン酸化を増強し、YAPの分解を増強し、YAPの活性化を阻害し、TAZ活性を阻害し、TAZのリン酸化を増強し、TAZの分解を増強し、および／またはTAZの活性化を阻害する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載のもののいずれかを含む、有効量のIgCAM結合剤と細胞とを接触させる工程を含む、細胞においてHippo経路シグナル伝達を調節する方法を提供する。いくつかの態様において、細胞は腫瘍細胞である。いくつかの態様において、腫瘍は結腸直腸腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は乳房腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は卵巣腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は膵腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は肺腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍はメラノーマ腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇したレベルのYAPを発現する。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇したレベルの非リン酸化YAPを発現する。いくつかの態様において、腫瘍は、細胞核中に上昇したレベルのYAPを含有する。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのYAP依存性遺伝子を有する。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇したレベルのTAZを発現する。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇したレベルの非リン酸化TAZを発現する。いくつかの態様において、腫瘍は、細胞核中に上昇したレベルのTAZを含有する。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのTAZ依存性遺伝子を有する。ある態様において、IgCAM結合剤は腫瘍の成長を阻害する。
【００１９】
別の局面において、本発明は、対象において癌を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、本明細書に記載のHippo経路シグナル伝達を調節する治療有効量の結合剤のいずれかを対象へ投与する工程を含む。いくつかの態様において、結合剤は、Hippo経路活性のアゴニストであり、Hippo経路シグナル伝達を増強し、YAP活性を阻害し、YAPのリン酸化を増強し、YAPの分解を増強し、および／またはYAPの活性化を阻害する。いくつかの態様において、結合剤は、TAZ活性を阻害し、TAZのリン酸化を増強し、TAZの分解を増強し、および／またはTAZの活性化を阻害する。いくつかの態様において、癌は膵癌である。いくつかの態様において、癌は結腸直腸癌である。いくつかの態様において、癌は乳癌である。いくつかの態様において、癌は肺癌である。いくつかの態様において、癌はメラノーマである。いくつかの態様において、癌は卵巣癌である。いくつかの態様において、癌は、上昇したレベルのYAPを発現する。いくつかの態様において、癌は、上昇したレベルの非リン酸化YAPを発現する。いくつかの態様において、癌は、上昇した発現レベルのYAP依存性遺伝子を有する。いくつかの態様において、癌は、上昇したレベルのTAZを発現する。いくつかの態様において、癌は、上昇したレベルの非リン酸化TAZを発現する。いくつかの態様において、癌は、上昇した発現レベルのTAZ依存性遺伝子を有する。
【００２０】
別の局面において、本発明は、対象において疾患を治療する方法を提供し、ここで、疾患は、YAPの活性化および／または異常なYAP活性と関連し、ここで、方法は、本明細書に記載の結合剤のいずれかを含む、Hippo経路を調節する治療有効量の結合剤を投与する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、Hippo経路シグナル伝達を増加させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、YAPリン酸化を増加させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、YAP分解を増加させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、細胞質中のYAPの保持を増加させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、核へのYAP移行を低下させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、YAP依存性遺伝子の発現を低下させることを含む。
【００２１】
別の局面において、本発明は、対象において疾患を治療する方法を提供し、ここで、疾患は、TAZの活性化および／または異常なTAZ活性と関連し、ここで、方法は、本明細書に記載の結合剤の各々を含む、Hippo経路を調節する治療有効量の結合剤を投与する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、Hippo経路シグナル伝達を増加させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、TAZリン酸化を増加させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、TAZ分解を増加させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、細胞質中のTAZの保持を増加させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、核へのTAZ移行を低下させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、TAZ依存性遺伝子の発現を低下させることを含む。
【００２２】
いくつかの態様において、本発明は、Hippo経路シグナル伝達を阻害する有効量のIgCAM結合剤と細胞とを接触させる工程を含む、細胞においてHippo経路シグナル伝達を調節する方法を提供する。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、Hippo経路シグナル伝達を減少させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、YAPリン酸化を減少させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、YAP分解を減少させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、細胞質中のYAPの保持を減少させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、核へのYAP移行を増加させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、YAP依存性遺伝子の発現を増加させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、TAZリン酸化を減少させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、TAZ分解を減少させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、細胞質中のTAZの保持を減少させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、核へのTAZ移行を増加させることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路の調節は、TAZ依存性遺伝子の発現を増加させることを含む。
【００２３】
別の局面において、本発明は、創傷を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、対象において創傷治癒を促進および／または増強する。いくつかの態様において、方法は、本明細書に記載の結合剤などの、Hippo経路シグナル伝達を調節する治療有効量の結合剤を対象へ投与する工程を含む。いくつかの態様において、投与される結合剤は、Hippo経路活性のアンタゴニストであり、Hippo経路シグナル伝達を抑制し、YAP活性を増加させ、YAPのリン酸化を抑制し、YAPの分解を抑制し、および／またはYAPの活性化を促進する。いくつかの態様において、投与される結合剤は、TAZ活性を増加させ、TAZのリン酸化を抑制し、TAZの分解を抑制し、および／またはTAZの活性化を促進する。いくつかの態様において、創傷は急性皮膚創傷である。いくつかの態様において、創傷は慢性皮膚創傷である。いくつかの態様において、創傷は外科的創傷である。
【００２４】
別の局面において、本発明は、組織再生を増強する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、本明細書に記載の結合剤などの、Hippo経路シグナル伝達を調節する有効量の結合剤と細胞とを接触させる工程を含む。いくつかの態様において、方法は、本明細書に記載の結合剤などの、Hippo経路シグナル伝達を調節する治療有効量の結合剤を対象へ投与する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路シグナル伝達の調節は、Hippo経路をアンタゴナイズすることを含む。いくつかの態様において、Hippo経路シグナル伝達の調節は、Hippo経路のシグナル伝達を低下させることを含む。いくつかの態様において、方法は、免疫関連障害（例えば自己免疫障害）；炎症（急性および慢性炎症障害の両方を含む）；虚血（例えば、心筋梗塞）；外傷性損傷（例えば、熱傷、裂傷、および擦過傷）；感染症（例えば、細菌、ウイルス、および真菌感染症）；ならびに慢性損傷（例えば、肝硬変）によって引き起こされる組織損傷の治療を含む。
【００２５】
前述の局面ならびに本明細書の他の箇所に記載の他の局面および／または態様の各々のある態様において、方法は、腫瘍または癌の細胞中のYAPおよび／またはTAZの位置（例えば、核または細胞質）を測定する工程を含む。前述の局面ならびに本明細書の他の箇所に記載の他の局面および／または態様の各々のある態様において、方法は、YAP依存性遺伝子またはこれらの遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定する工程を含む。ある態様において、方法は、TAZ依存性遺伝子またはこれらの遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定する工程を含む。
【００２６】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の結合剤の各々を含むがこれらに限定されない、Hippo経路シグナル伝達を調節する結合剤での治療のためのヒト対象を特定するかまたはヒト対象を選択する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、対象が、参照サンプル中のYAPの発現と比較して上昇した発現レベルのYAPを有する腫瘍を有するかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、対象が、YAPの所定レベルと比較して上昇した発現レベルのYAPを有する腫瘍を有するかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、対象が、正常組織中のYAPの発現と比較して上昇した発現レベルのYAPを有する腫瘍を有するかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、対象が、正常組織由来の細胞の核中のYAPのレベルと比較して腫瘍細胞の核中の上昇したレベルのYAPを有する腫瘍を有するかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、対象が、正常組織由来の細胞中の非リン酸化YAPのレベルと比較して腫瘍細胞中の上昇したレベルの非リン酸化YAPを有する腫瘍を有するかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、対象が、正常組織中のTAZの発現と比較して上昇した発現レベルのTAZを有する腫瘍を有するかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、対象が、正常組織由来の細胞の核中のTAZのレベルと比較して腫瘍細胞の核中の上昇したレベルのTAZを有する腫瘍を有するかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、対象が、正常組織由来の細胞中の非リン酸化TAZのレベルと比較して腫瘍細胞中の上昇したレベルの非リン酸化TAZを有する腫瘍を有するかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、「正常組織」は、腫瘍と同一タイプの組織である；例えば、肺腫瘍および正常肺組織。
【００２７】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の作用物質などのIgCAM結合剤で腫瘍細胞を標的化する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、有効量のIgCAM結合剤を対象へ投与する工程を含む。いくつかの態様において、結合剤は抗体である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は可溶性受容体を含む。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は可溶性受容体である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、細胞傷害剤へ結合されているかまたは細胞傷害剤と複合体化されている。
【００２８】
本明細書に記載のIgCAM結合剤を含む組成物、および結合剤を産生する細胞株を提供する。さらに、本明細書に記載のIgCAM結合剤および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物をさらに提供する。本明細書に記載のIgCAM結合剤などの結合剤を含む有効量の組成物を対象へ投与する工程を含む、対象において癌を治療するおよび／または腫瘍成長を阻害する方法をさらに提供する。本明細書に記載のIgCAM結合剤などの結合剤を含む有効量の組成物を対象へ投与する工程を含む、対象において創傷治癒および／または組織再生を増強する方法をさらに提供する。
【００２９】
別の局面において、本発明は、Hippo経路を調節する作用物質をスクリーニングおよび／または特定する方法を提供する。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する作用物質をスクリーニングする方法は、IgCAMの細胞外ドメインに特異的に結合する作用物質であって、Hippo経路を調節する作用物質を、スクリーニングする工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する作用物質をスクリーニングおよび／または特定する方法は、細胞と試験薬とを接触させる工程、および二分子蛍光補完（BiFC）アッセイを使用してYAPおよび／またはTAZの細胞局在を測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する作用物質をスクリーニングおよび／または特定する方法は、(a)第2細胞セットではなく、第1細胞セットと、試験薬とを接触させる工程、ならびに(b)第2細胞セットと比較しての第1細胞セット中のリン酸化YAPおよび／またはリン酸化TAZの量を測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する作用物質をスクリーニングおよび／または特定する方法は、(a)第2細胞セットではなく、第1細胞セットと、試験薬とを接触させる工程、ならびに(b)第2細胞セットと比較しての第1細胞セット中の非リン酸化YAPおよび／または非リン酸化TAZの量を測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する作用物質をスクリーニングおよび／または特定する方法は、(a)第2細胞セットではなく、第1細胞セットと、試験薬とを接触させる工程、ならびに(b)第2細胞セット中のYAP依存性遺伝子および／またはTAZ依存性遺伝子の発現と比較しての第1細胞セット中の少なくとも1つのYAP依存性遺伝子および／または少なくとも1つのTAZ依存性遺伝子の発現を測定する工程を含む。いくつかの態様において、少なくとも1つのYAP依存性遺伝子または少なくとも1つのTAZ依存性遺伝子は、CD44、CD47、CD133、TDGF1、EPHB2、CA12、LRP4、GPC4、CLDN2、CTGF、PAG1、SEMA4D、RHEB、MAGI1、ITPR3、CD168、NRP2、GLI2、BIRC2、BIRC5（サバイビン）、FGF1、IL33、GRB2、IGFBP3、AREG、FN1、ADAMTS1、AXL、ADAMTS5、MET、CYR61、IL8、ZEB1、FOXC2、N-カドヘリン、およびSNAILからなる群より選択される。いくつかの態様において、試験薬は、抗体、可溶性受容体、低分子、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、または薬物化合物である。
【００３０】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれかによって特定された作用物質を提供する。
【００３１】
本発明の局面または態様がマーカッシュ群または他の選択肢のグループ化によって記載される場合、本発明は、全体として列挙される群全体を包含するだけでなく、群の各メンバーを個々に、ならびに主要群の全ての可能なサブ群、および群メンバーのうちの1つまたは複数を欠いている主要群も包含する。本発明は、特許請求される発明において群メンバーのいずれかの1つまたは複数の明示的な排除も意図する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】OncoMed腫瘍バンクからの患者由来腫瘍中のYAPのマイクロアレイ遺伝子発現分析。
【図２Ａ】dnYAPの発現による腫瘍成長の阻害。腫瘍細胞にdnYAP-レンチウイルス（−○−）またはGFP-レンチウイルス（−●−）を形質導入し、72時間インキュベートした。GFP陽性かつDAPI陰性（GFP+/DAPI-）と確認された形質導入細胞を、フローサイトメトリーによって選別し、NOD/SCIDマウスへ皮下注射した。腫瘍成長を3ヶ月間モニターし、データを腫瘍体積（mm3）として示す。（A）OMP-M6メラノーマ腫瘍。
【図２Ｂ】dnYAPの発現による腫瘍成長の阻害。腫瘍細胞にdnYAP-レンチウイルス（−○−）またはGFP-レンチウイルス（−●−）を形質導入し、72時間インキュベートした。GFP陽性かつDAPI陰性（GFP+/DAPI-）と確認された形質導入細胞を、フローサイトメトリーによって選別し、NOD/SCIDマウスへ皮下注射した。腫瘍成長を3ヶ月間モニターし、データを腫瘍体積（mm3）として示す。（B）OMP-C18結腸腫瘍。
【図２Ｃ】dnYAPの発現による腫瘍成長の阻害。腫瘍細胞にdnYAP-レンチウイルス（−○−）またはGFP-レンチウイルス（−●−）を形質導入し、72時間インキュベートした。GFP陽性かつDAPI陰性（GFP+/DAPI-）と確認された形質導入細胞を、フローサイトメトリーによって選別し、NOD/SCIDマウスへ皮下注射した。腫瘍成長を3ヶ月間モニターし、データを腫瘍体積（mm3）として示す。（C）OMP-C37結腸腫瘍。
【図２Ｄ】dnYAPの発現による腫瘍成長の阻害。腫瘍細胞にdnYAP-レンチウイルス（−○−）またはGFP-レンチウイルス（−●−）を形質導入し、72時間インキュベートした。GFP陽性かつDAPI陰性（GFP+/DAPI-）と確認された形質導入細胞を、フローサイトメトリーによって選別し、NOD/SCIDマウスへ皮下注射した。腫瘍成長を3ヶ月間モニターし、データを腫瘍体積（mm3）として示す。（D）OMP-PN7膵腫瘍。
【図２Ｅ】dnYAPの発現による腫瘍成長の阻害。腫瘍細胞にdnYAP-レンチウイルス（−○−）またはGFP-レンチウイルス（−●−）を形質導入し、72時間インキュベートした。GFP陽性かつDAPI陰性（GFP+/DAPI-）と確認された形質導入細胞を、フローサイトメトリーによって選別し、NOD/SCIDマウスへ皮下注射した。腫瘍成長を3ヶ月間モニターし、データを腫瘍体積（mm3）として示す。（E）OMP-C11結腸腫瘍。
【図２Ｆ】dnYAPの発現による腫瘍成長の阻害。腫瘍細胞にdnYAP-レンチウイルス（−○−）またはGFP-レンチウイルス（−●−）を形質導入し、72時間インキュベートした。GFP陽性かつDAPI陰性（GFP+/DAPI-）と確認された形質導入細胞を、フローサイトメトリーによって選別し、NOD/SCIDマウスへ皮下注射した。腫瘍成長を3ヶ月間モニターし、データを腫瘍体積（mm3）として示す。（F）OMP-L2肺腫瘍。
【図２Ｇ】dnYAPの発現による腫瘍成長の阻害。腫瘍細胞にdnYAP-レンチウイルス（−○−）またはGFP-レンチウイルス（−●−）を形質導入し、72時間インキュベートした。GFP陽性かつDAPI陰性（GFP+/DAPI-）と確認された形質導入細胞を、フローサイトメトリーによって選別し、NOD/SCIDマウスへ皮下注射した。腫瘍成長を3ヶ月間モニターし、データを腫瘍体積（mm3）として示す。（G）OMP-OV22卵巣腫瘍。
【図２Ｈ】dnYAPの発現による腫瘍成長の阻害。腫瘍細胞にdnYAP-レンチウイルス（−○−）またはGFP-レンチウイルス（−●−）を形質導入し、72時間インキュベートした。GFP陽性かつDAPI陰性（GFP+/DAPI-）と確認された形質導入細胞を、フローサイトメトリーによって選別し、NOD/SCIDマウスへ皮下注射した。腫瘍成長を3ヶ月間モニターし、データを腫瘍体積（mm3）として示す。（H）OMP-LU52肺腫瘍。
【図２Ｉ】dnYAPの発現による腫瘍成長の阻害。腫瘍細胞にdnYAP-レンチウイルス（−○−）またはGFP-レンチウイルス（−●−）を形質導入し、72時間インキュベートした。GFP陽性かつDAPI陰性（GFP+/DAPI-）と確認された形質導入細胞を、フローサイトメトリーによって選別し、NOD/SCIDマウスへ皮下注射した。腫瘍成長を3ヶ月間モニターし、データを腫瘍体積（mm3）として示す。（I）マイクロアレイ分析によって測定された腫瘍中のYAP発現。
【図３】YAP活性に対するdnYAPの発現の効果。
【図４】ウエスタンブロット分析によって測定されたHippo経路成分に対する細胞分離の効果。
【図５】候補Hippo経路受容体のファミリーツリー。
【図６】候補Hippo経路受容体、膜結合型デコイ受容体、および可溶性受容体の図。
【図７】膜固定型デコイ受容体の発現。（A）蛍光顕微鏡法によって観察されたGFPタグ化IgCAMデコイ受容体の細胞表面発現。（B）GFPタグ化IgCAMデコイ受容体のフローサイトメトリーヒストグラム。
【図８】ウエスタンブロット分析によって測定されたHippo経路成分に対するIgCAMデコイ受容体の効果。
【図９Ａ】YAP核移行の測定についての二分子蛍光補完アッセイ。（A）YAP、TEAD2およびTEAD3を有するYFP構築物の図。
【図９Ｂ】YAP核移行の測定についての二分子蛍光補完アッセイ。（B）蛍光顕微鏡法および位相コントラストによって観察された低密度細胞の核内YFP蛍光。
【図９Ｃ】YAP核移行の測定についての二分子蛍光補完アッセイ。（C）形質導入されたHeLa細胞のFACS分析。
【図１０】GFP-YAPを発現するテトラサイクリン誘導性HeLa細胞株NC12。（A）Tet活性化に応答してのGFP-YAPの発現。（B）Tet活性化に応答してのGFP-YAP発現のウエスタンブロット分析。
【図１１】YAP核移行の測定に使用するためのCre依存性EmGFP発現構築物およびYAP-Cre構築物の図。
【図１２Ａ】結腸腫瘍OMP-C18中の膜固定型IgCAMデコイ受容体の過剰発現による腫瘍成長に対する効果。（A）CADM2、CADM4、CD226、PVR。
【図１２Ｂ】結腸腫瘍OMP-C18中の膜固定型IgCAMデコイ受容体の過剰発現による腫瘍成長に対する効果。（B）CADM3、TMEM25、JAM3、TIGIT。
【図１２Ｃ】結腸腫瘍OMP-C18中の膜固定型IgCAMデコイ受容体の過剰発現による腫瘍成長に対する効果。（C）CADM3、TMEM25、JAM3、TIGIT。
【図１２Ｄ】結腸腫瘍OMP-C18中の膜固定型IgCAMデコイ受容体の過剰発現による腫瘍成長に対する効果。（D）JAM2、PVRL1、ESAM。
【図１２Ｅ】結腸腫瘍OMP-C18中の膜固定型IgCAMデコイ受容体の過剰発現による腫瘍成長に対する効果。（E）VSIG1、VSIG4、PVRL4、CD200。
【図１２Ｆ】結腸腫瘍OMP-C18中の膜固定型IgCAMデコイ受容体の過剰発現による腫瘍成長に対する効果。（F）PVRL3、JAM1、CADM1、VSIG2。
【図１２Ｇ】結腸腫瘍OMP-C18中の膜固定型IgCAMデコイ受容体の過剰発現による腫瘍成長に対する効果。（G）CLMP、VSIG8、TMIGD1、VSIG3。
【図１３】結腸腫瘍OMP-LU2中の膜固定型IgCAMデコイ受容体の過剰発現による腫瘍成長に対する効果。（A）CADM2；（B）CADM3、PVRL4、VSIG4；（C）CD226、JAM2、JAM3、CADM1；（D）CADM4、TIGIT、PVRL1、PVRL3。
【図１４】結腸腫瘍OMP-LU40中の膜固定型IgCAMデコイ受容体の過剰発現による腫瘍成長に対する効果。（A）CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CD226、PVR；（B）PVRL4、VSIG4、CD226；（C）PVRL3、ESAM、VSIG2。
【図１５Ａ】FLAGタグ化全長CADM1、CADM3、PVR、PVRL1、およびPVRL3がトランスフェクトされた細胞を使用してのIgCAMタンパク質複合体のウエスタンブロット分析。CADM3-CD4TM-GFPおよびLGR5-CD4TM-GFP構築物を陰性対照として使用した。タンパク質複合体を、アファディン、DCAF7、DLG1、INADL、LIN7、LIN7Cについて分析した。チューブリンおよびアクチンを対照として使用した。
【図１５Ｂ】FLAGタグ化全長CADM1、CADM3、PVR、PVRL1、およびPVRL3がトランスフェクトされた細胞を使用してのIgCAMタンパク質複合体のウエスタンブロット分析。CADM3-CD4TM-GFPおよびLGR5-CD4TM-GFP構築物を陰性対照として使用した。タンパク質複合体を、MPDZ、MPP5?、PARD3、FLAG対照について分析した。チューブリンおよびアクチンを対照として使用した。
【図１５Ｃ】FLAGタグ化全長CADM1、CADM3、PVR、PVRL1、およびPVRL3がトランスフェクトされた細胞を使用してのIgCAMタンパク質複合体のウエスタンブロット分析。CADM3-CD4TM-GFPおよびLGR5-CD4TM-GFP構築物を陰性対照として使用した。タンパク質複合体を、YAP、phospho-YAPについて分析した。チューブリンおよびアクチンを対照として使用した。
【図１６】FLAGタグ化全長CADM1およびc-mycタグ化YAPがトランスフェクトされた細胞を使用してのIgCAM1タンパク質複合体のウエスタンブロット分析。タンパク質複合体をmycタグ化YAPおよびFLAGタグ化CADM1について分析した。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明は、Hippo経路を調節するポリペプチド、例えば、抗体および可溶性受容体を含むがこれらに限定されない、新規の作用物質を提供する。作用物質は、Hippo経路シグナル伝達のアゴニストおよびアンタゴニストを含む。関連するポリペプチドおよびポリヌクレオチド、上記作用物質を含む組成物、ならびに上記作用物質の製造方法も提供する。Hippo経路を調節する作用物質をスクリーニングする方法を提供する。新規の作用物質を使用する方法、例えば、腫瘍成長を阻害する方法、癌を治療する方法、Hippo経路シグナル伝達を活性化および／もしくは増強する方法、Hippo経路シグナル伝達を阻害するもしくは低下させる方法、ならびに／または治療のための対象を特定および／または選択する方法をさらに提供する。
【００３４】
I．定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および語句を以下に定義する。
【００３５】
本明細書で用いる「アゴニスト」および「アゴニストの」という用語は、標的および／またはシグナル伝達経路（例えば、Hippo経路）の生物学的活性を、直接的にまたは間接的に、実質的に誘導する、活性化する、促進する、増加させる、または増強することができる作用物質を指すまたは記述する。「アゴニスト」という用語は、タンパク質の活性を部分的にまたは完全に誘導する、活性化する、促進する、増加させる、または増強する任意の作用物質を含むように本明細書において用いられる。適切なアゴニストとしては、具体的には、アゴニスト抗体またはその断片、可溶性受容体、および他の融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本明細書で用いる「アンタゴニスト」および「アンタゴニストの」という用語は、標的および／またはシグナル伝達経路（例えば、Hippo経路）の生物学的活性を、直接的にまたは間接的に、部分的にまたは完全に遮断する、阻害する、低下させる、または中和することができる作用物質を指すまたは記述する。「アンタゴニスト」という用語は、タンパク質の活性を部分的にまたは完全に遮断する、阻害する、低下させる、または中和する任意の作用物質を含むように本明細書において用いられる。適切なアンタゴニスト薬としては、具体的には、アンタゴニスト抗体またはその断片、可溶性受容体、および他の融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書で用いる「調節」および「調節する」という用語は、生物学的活性の変化または改変をいう。調節は、活性の刺激または阻害を含むが、これらに限定されることはない。調節は、活性の増加もしくは減少（例えば、Hippo経路シグナル伝達の減少；Hippo経路シグナル伝達の増加）、結合特性の変化、またはタンパク質の活性、経路もしくは関心対象の他の生物学的要点（biological point）と関連した生物学的、機能的もしくは免疫学的特性の任意の他の変化でありうる。
【００３８】
本明細書で用いる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原認識部位によって、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または上記の組合せなどの標的を認識しかつこれに特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。本明細書で用いる場合、この用語は、抗体が所望の生物学的活性を示す限り、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、抗体断片（例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片）、一本鎖Fv（scFv）抗体、少なくとも2つのインタクトな抗体から生成された二重特異性抗体などの多重特異性抗体、二重特異性抗体、単一特異性抗体、一価抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原結合部位を含む融合タンパク質、および抗原結合部位を含む任意の他の修飾された免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれるその重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、5つの主要なクラスの免疫グロブリン：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、またはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2）のいずれかであり得る。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造および三次元構造を有する。抗体は、裸であっても、または毒素、放射性同位体を含むがこれらに限定されない他の分子に結合していてもよい。
【００３９】
「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体の一部をいい、インタクトな抗体の抗原決定可変領域をいう。抗体断片の例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片、直鎖状抗体、一本鎖抗体、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されることはない。本明細書で用いる「抗体断片」は、抗原結合部位またはエピトープ結合部位を含む。
【００４０】
抗体の「可変領域」という用語は、単独または組み合わせのいずれかの、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域をいう。重鎖および軽鎖の可変領域は各々、「超可変領域」としても知られる、3つの相補性決定領域（CDR）によって連結された、4つのフレームワーク領域（FR）からなる。各鎖中のCDRは、フレームワーク領域によって近接してともに保持され、そして他の鎖由来のCDRとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。CDRを決定するには少なくとも2つの技術がある：(1) 種間配列変動に基づくアプローチ（即ち、Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, National Institutes of Health, Bethesda, MD）、および(2) 抗原-抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948）。さらに、CDRを決定するために当技術分野においてこれらの2つのアプローチの組み合わせが用いられることもある。
【００４１】
本明細書で用いる「モノクローナル抗体」という用語は、単一の抗原決定基、即ちエピトープの極めて特異的な認識および結合に関与する、均一な抗体集団を指す。これは、異なる抗原決定基を対象とした異なる抗体の混合物を典型的に含むポリクローナル抗体とは対照的である。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクトでありかつ全長であるモノクローナル抗体、ならびに抗体断片（例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv）、一本鎖（scFv）抗体、抗体の一部もしくは断片を含む融合タンパク質、および抗原認識部位（抗原結合部位）を含む任意の他の修飾された免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ産生、ファージ選択、組み換え体発現、およびトランスジェニック動物を含むがこれらに限定されない、多数の技術によって作製される抗体を指す。
【００４２】
本明細書で用いる「ヒト化抗体」という用語は、最小の非ヒト配列を含む、特異的な免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、またはそれらの断片である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。典型的には、ヒト化抗体は、CDRの残基が、所望の特異性、親和性、および／または結合能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはハムスター）のCDR由来の残基により置き換えられている、ヒト免疫グロブリンである（Jones et al., 1986, Nature, 321 :522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239: 1534-1536）。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域残基が、所望の特異性、親和性、および／または結合能力を有する非ヒト種由来の抗体中の対応する残基で置き換えられる。ヒト化抗体を、Fvフレームワーク領域中および／または置き換えられた非ヒト残基中の別の残基の置換によってさらに修飾して、抗体の特異性、親和性、および／または結合能力を、改良し、最適化することができる。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するすべてまたは実質的にすべてのCDR領域を含む、少なくとも1つ、典型的には2つまたは3つの可変ドメインの実質的にすべてを含みうる。しかし一方で、すべてまたは実質的にすべてのフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Fc）、通常はヒト免疫グロブリンのそれの、少なくとも一部もしくは断片を含むことができる。
【００４３】
本明細書で用いる「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって産生された抗体、または当技術分野で公知の任意の技術を用いて作製された、ヒトによって産生された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
【００４４】
本明細書で用いる「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が2つまたはそれ以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、所望の特異性、親和性、および／または結合能力を有する1つの哺乳動物種（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）由来の抗体の可変領域に対応し、一方、定常領域は、別の種（通常ヒト）に由来する抗体中の配列と相同であり、その種において免疫応答を誘発することを回避する。
【００４５】
本明細書で用いる「親和性成熟抗体」という語句は、抗体の1つまたは複数のCDRにおける1つまたは複数の改変を有する抗体であって、それらの改変を保有していない親抗体と比べて、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす抗体をいう。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモルまたはさらにピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当技術分野において公知の手順によって産生される。例えば、Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783には、VHおよびVLドメインシャッフリングによる親和性成熟が記述されている。CDRおよび／またはフレームワーク残基のランダム変異導入法は、Barbas et al., 1994, PNAS, 91:3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169: 147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol, 154:3310-9; およびHawkins et al., 1992, J. Mol. Biol, 226:889-896によって記述されている。
【００４６】
本明細書で用いる場合、「可溶性受容体」という用語は、可溶性形態で細胞から分泌され得る受容体タンパク質の細胞外断片を指す。用語「可溶性受容体」は、細胞外ドメイン全体、または細胞外ドメインの一部もしくは断片を含む分子を包含する。
【００４７】
「エピトープ」および「抗原決定基」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、特定の抗体により認識され特異的に結合されうる抗原のその一部をいう。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは連続的なアミノ酸からも形成され、タンパク質の三次元的折り畳みによって近接して並べられた非連続的なアミノ酸からも形成されうる。連続的なアミノ酸から形成されたエピトープ（直鎖状エピトープともいわれる）は、タンパク質が変性した場合にも典型的には維持されるが、三次元的折り畳みによって形成されたエピトープ（立体配座エピトープともいわれる）は、タンパク質が変性すると典型的には失われる。エピトープは、典型的には、独特の空間的配置の中に少なくとも3アミノ酸、より一般的には、少なくとも5、6、7、または8〜10アミノ酸を含む。
【００４８】
「選択的に結合する」または「特異的に結合する」という用語は、結合剤が、関連のないタンパク質を含む別の物質とよりも、エピトープ、タンパク質または標的分子と、より高頻度に、より迅速に、より長い持続時間で、より高い親和性で、または前記のいくつかの組み合わせで反応または結合することを意味する。ある態様において、「特異的に結合する」とは、例えば、結合剤が約0.1mMまたはそれ以下、しかし、より通常には、約1μM未満のKDでタンパク質または標的に結合することを意味する。ある態様において、「特異的に結合する」とは、結合剤が、少なくとも約0.1μMまたはそれ以下、少なくとも約0.01μMまたはそれ以下、または少なくとも約1nMまたはそれ以下のKDで標的に結合することを意味する。異なる種における相同タンパク質間の配列同一性のため、特異的結合は、2種以上の種におけるタンパク質または標的を認識する結合剤を含むことができる。同様に、異なるタンパク質のポリペプチド配列のある領域内の相同性のため、特異的結合は、2種以上のタンパク質または標的を認識する結合剤を含むことができる。ある態様において、第1の標的に特異的に結合する結合剤は、第2の標的に特異的に結合してもしなくてもよいことが理解される。従って、「特異的結合」とは、排他的な結合、すなわち単一の標的への結合を（含むことができるが）必ずしも必要としない。従って、結合剤は、ある態様において、2種以上の標的に特異的に結合してもよい。ある態様において、複数の標的が結合剤上の同じ抗原結合部位によって結合されうる。例えば、抗体は、場合によっては、それぞれが2種またはそれ以上のタンパク質上の同一のエピトープに特異的に結合する2つの同一の抗原結合部位を含んでもよい。ある代替的な態様において、抗体は二重特異性であることができ、異なる特異性を有する少なくとも2つの抗原結合部位を含むことができる。非限定的な例として、二重特異性抗体は、一つのタンパク質上のエピトープを認識する一つの抗原結合部位を含むことができ、第2のタンパク質上の異なるエピトープを認識する第2の、異なる抗原結合部位をさらに含むことができる。一般的に、しかし必ずというわけではないが、結合への言及は特異的結合を意味する。
【００４９】
「ポリペプチド」および「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸の重合体をいう。この重合体は直鎖または分岐鎖であってよく、修飾アミノ酸を含んでよく、非アミノ酸によって中断されてよい。これらの用語は同様に、天然によりあるいは介入により、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合などの、その他任意の操作もしくは修飾により改変されたアミノ酸重合体を包含する。例えば、1つまたは複数のアミノ酸類似体（例えば、非天然アミノ酸を含む）、ならびに当技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも、この定義のなかに含まれる。本発明のポリペプチドは、ある態様において、抗体に基づきうるので、ポリペプチドは一本鎖または結合した鎖として生じてもよいことが理解される。
【００５０】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」および「核酸分子」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、任意の長さのヌクレオチドの重合体をいい、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはその類似体、あるいはDNAポリメラーゼもしくはRNAポリメラーゼによって重合体に組み込むことができる任意の基質でもよい。
【００５１】
「高ストリンジェンシーの条件」は、(1) 洗浄のために低いイオン強度および高い温度、例えば50℃で15mM塩化ナトリウム/1.5mMクエン酸ナトリウム（1×SSC）および0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを利用する；(2) ハイブリダイゼーションの間に5×SSC (0.75 M NaCl、75mMクエン酸ナトリウム)中、変性剤、例えばホルムアミド、例えば、50% (v/v)ホルムアミド＋0.1%ウシ血清アルブミン/0.1% Ficoll/0.1%ポリビニルピロリドン/50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.5を42℃で利用する；または(3) 50%ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム(pH 6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5×デンハルト溶液、超音波処理済みサケ精子DNA (50μg/ml)、0.1% SDS、および10%硫酸デキストランを42℃で利用し、55℃で50%ホルムアミドを含有する0.2×SSC中にて洗浄し、その後、EDTAを含有する0.1×SSCからなる高ストリンジェンシー洗浄を55℃で行うものによって特定されうる。
【００５２】
2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチドの文脈において、「同一の」または「同一性」の割合という用語は、保存的アミノ酸置換を配列同一性の一部として全く考慮することなく、最大一致を得るように比較されアライメントされた場合に（必要であれば、ギャップを導入して）、同じであるか、または特定の割合の同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有するかの、2つまたはそれ以上の配列または部分配列をいう。同一性の割合は、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを用いて、または目視検査によって測定することができる。アミノ酸またはヌクレオチド配列のアライメントを得るために使用できる様々なアルゴリズムおよびソフトウェアが当技術分野において周知である。これらにはBLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Packageおよびそのバリエーションが含まれるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、本発明の2つの核酸またはポリペプチドは実質的に同一であり、それらが、最大一致を得るように比較されアライメントされ、配列比較アルゴリズムを用いてまたは目視検査によって測定された場合に、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、およびいくつかの態様において少なくとも95%、96%、97%、98%、99%のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有することを意味する。いくつかの態様において、同一性は、長さが少なくとも約10残基、少なくとも約20残基、少なくとも約40〜60残基、少なくとも約60〜80残基またはその間の任意の整数値である配列の領域にわたって存在する。いくつかの態様において、同一性は、少なくとも約80〜100残基のような、60〜80残基よりも長い領域にわたって存在し、いくつかの態様において、配列は、ヌクレオチド配列のコード領域のような、比較されている配列の全長にわたって実質的に同一である。
【００５３】
「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換されるものである。塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野において定義されている。例えば、チロシンをフェニルアラニンで置換するのが保存的置換である。本発明のポリペプチドおよび／または抗体の配列における保存的置換は、アミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体と、抗原、即ち、ポリペプチドまたは抗体が結合する1つまたは複数のIgCAMタンパク質との結合を阻止しないことが好ましい。抗原結合を妨げない、ヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を特定する方法は当技術分野において周知である。
【００５４】
本明細書で用いる「ベクター」という用語は、宿主細胞において関心対象の1つまたは複数の遺伝子または配列を送達できる、通常は、発現できる構築物を意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、裸のDNAまたはRNA発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と結合したDNAまたはRNA発現ベクター、およびリポソーム中にカプセル封入されたDNAまたはRNA発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００５５】
「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は、天然では見られない形態にあるポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物には、天然で見られる形態にはない程度まで精製されたものが含まれる。いくつかの態様において、単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は実質的に純粋である。
【００５６】
本明細書で用いる「実質的に純粋な」という用語は、少なくとも50%純粋である（すなわち、夾雑物を含まない）、少なくとも90%純粋である、少なくとも95%純粋である、少なくとも98%純粋である、または少なくとも99%純粋である材料をいう。
【００５７】
本明細書で用いる「癌」および「癌性」という用語は、無秩序な細胞増殖を特徴とする細胞集団を含む哺乳動物における生理的状態をいい、または記述する。癌の例としては、癌腫、芽細胞腫、肉腫、ならびにリンパ腫および白血病のような血液がんが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００５８】
本明細書で用いる「腫瘍」および「新生物」という用語は、過度の細胞成長または増殖に起因する、前癌病変を含む良性（非癌性）病変または悪性（癌性）病変の任意の組織塊をいう。
【００５９】
本明細書で用いる「転移」という用語は、身体の出現部位から他の領域に癌が拡散または移動し、新たな場所での類似の癌性病変の発生を伴う過程をいう。「転移」または「転移性」細胞は、隣接する細胞との接着性接触を失い、疾患の原発部位から血流またはリンパを介して移動し、隣接する身体構造に浸潤する細胞である。
【００６０】
「癌幹細胞」および「CSC」ならびに「腫瘍幹細胞」および「腫瘍開始細胞」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、(1) 高い増殖能を有し；2) 非対称細胞分裂を行って、増殖能力または発生能力の低下した1つまたは複数のタイプの分化した細胞子孫を作出でき；かつ(3) 自己複製または自己維持のための対称細胞分裂を行うことができる、癌または腫瘍由来の細胞をいう。これらの特性によって、癌幹細胞には、免疫不全宿主（例えば、マウス）に累代移植されると、腫瘍を形成できない大多数の腫瘍細胞と比較して腫瘍または癌を形成または樹立する能力が付与される。癌幹細胞は、分化に対して無秩序な様式で自己複製を起こし、変異が生じるにつれて経時変化しうる異常細胞型を含む腫瘍を形成する。
【００６１】
「癌細胞」および「腫瘍細胞」という用語は、癌細胞集団の大部分を構成する非腫瘍形成性細胞および腫瘍形成性幹細胞（癌幹細胞）の両方を含む、癌または腫瘍または前癌病変に由来する細胞の全集団をいう。本明細書で用いる場合、「癌細胞」または「腫瘍細胞」という用語は、再生および分化する能力が無い細胞のみをいう場合に、腫瘍細胞と癌幹細胞を区別するために「非腫瘍形成性の」という用語で修飾される。
【００６２】
本明細書で用いる「腫瘍形成性の」という用語は、（さらなる腫瘍形成性癌幹細胞を生じる）自己複製の特性、および（分化した、従って、非腫瘍形成性の腫瘍細胞を生じる）他の全ての腫瘍細胞を発生する増殖の特性を含む、癌幹細胞の機能的特徴をいう。
【００６３】
本明細書で用いる「腫瘍形成性」という用語は、腫瘍由来細胞の無作為サンプルが、免疫不全宿主（例えば、マウス）に累代移植されると、触診可能な腫瘍を形成する能力をいう。
【００６４】
「対象」という用語は、特定の処置のレシピエントとなるべき、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類などを含むが、これに限定されない任意の動物（例えば、哺乳動物）をいう。典型的には、ヒト対象に関して、本明細書では「対象」および「患者」という用語が互換的に用いられる。
【００６５】
「薬学的に許容される」という用語は、ヒトを含めて、動物での使用が、連邦政府もしくは州政府の監督官庁によって承認された（もしくは承認可能な）または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載されている製品もしくは化合物をいう。
【００６６】
「薬学的に許容される賦形剤、担体もしくは補助剤」または「許容される薬学的な担体」という用語は、少なくとも1つの本開示の結合剤（例えば、抗体）とともに、対象に投与でき、かつその結合剤の薬理活性を破壊せず、かつ、治療効果を送達するのに十分な用量で投与された場合に無毒である、賦形剤、担体または補助剤をいう。
【００６７】
「有効量」または「治療的有効量」または「治療的効果」という用語は、哺乳動物などの対象における疾患または障害を「治療する」のに有効な、結合剤、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機低分子または他の薬物の量をいう。癌の場合、薬物（例えば、抗体）の治療的有効量は、治療的効果を有し、従って癌細胞の数を減らす；腫瘍形成性、腫瘍形成頻度もしくは腫瘍形成能を下げる；癌幹細胞の数もしくは頻度を減らす；腫瘍サイズを減らす；癌細胞集団を減らす；例えば、軟組織もしくは骨への癌の拡散を含む末梢臓器への癌細胞の浸潤を阻むまたは止める；腫瘍もしくは癌細胞転移を阻むおよび止める；腫瘍もしくは癌細胞成長を阻むおよび止める；癌と関連する症状の1つもしくは複数をある程度まで和らげる；有病率および死亡率を減らす；生活の質を良くする；またはこのような効果の組み合わせをもたらすことができる。作用物質、例えば抗体が既存の癌細胞の成長を抑止する、かつ／または既存の癌細胞を死滅化する程度まで、それを、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性ということができる。
【００６８】
「治療する」もしくは「治療」もしくは「治療するため」または「緩和する」もしくは「緩和するため」という用語は、(1) 診断された病理学的状態もしくは障害の症状を治癒する、減速する、軽減する、および／または診断された病理学的状態もしくは障害の進行を食い止める治療的手段、ならびに(2) 標的化された病理学的状態または障害の発生を阻止するまたは遅延する予防的または防止的手段の両方をいう。従って、治療を必要とする者には、障害を既に有する者；障害を有する傾向がある者；および障害が予防されるべき者が含まれる。いくつかの態様において、患者が以下の1つまたは複数を示すなら、対象は本発明の方法によって成功裏に「治療されて」いる：癌細胞の数の低下もしくは癌細胞の完全な非存在；腫瘍サイズの低下；軟組織および骨への癌細胞の拡散を含む末梢臓器への癌細胞浸潤の阻害もしくは非存在；腫瘍もしくは癌細胞転移の阻害もしくは非存在；癌成長の阻害もしくは非存在；特定の癌と関連する1つもしくは複数の症状の緩和；有病率および死亡率の低下；生活の質の改善；腫瘍形成性の低下；癌幹細胞の数もしくは頻度の低下；またはこのような効果のいくつかの組み合わせ。
【００６９】
本開示および特許請求の範囲において用いられる場合、「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」という単数形は、文脈上明らかに他の指示がない限り、複数形を含む。
【００７０】
本明細書において「含む」という言い回しで態様が記述された場合はいつでも、「からなる」および／または「から本質的になる」によって記述される他の類似する態様も提供されることが理解される。本明細書において「から本質的になる」という言い回しで態様が記述された場合はいつでも、「からなる」によって記述される他の類似する態様も提供されることも理解される。
【００７１】
本明細書において「Aおよび／またはB」のような語句において用いられる「および／または」という用語は、AおよびBも；AまたはBも；A（のみ）も；およびB（のみ）も含むことが意図される。同様に、「A、Bおよび／またはC」のような語句において用いられる「および／または」という用語は、以下の態様のそれぞれを含むことが意図される：A、BおよびC；A、BまたはC；AまたはC；AまたはB；BまたはC；AおよびC；AおよびB；BおよびC；A（のみ）；B（のみ）；ならびにC（のみ）。
【００７２】
II．Hippo経路を調節する作用物質
本発明は、Hippo経路を調節する作用物質を提供する。Hippo経路は細胞間接触によって調節され、このことは、Hippo経路シグナル伝達事象を指示および／または制御する細胞表面受容体が存在することを示唆している。哺乳動物細胞中のこれらの受容体のアイデンティティーは解明されていない。上皮細胞生物学の中心的特徴は、上皮細胞は単細胞層中に存在するということである。そのようなものとして、それらは、管腔へ露出された先端表面、基底膜と相互作用する側底膜、および隣接している細胞間の相互作用領域を形成する「細胞間表面」という、3つの異なる表面を有する。本発明者らは、細胞間表面は直接的な細胞間連絡を可能にする有望な領域であるため、推定Hippo経路受容体は、一般に、この第3の表面である細胞間表面に限定されると仮定した。細胞接着分子（CAM）を含む、多くのタンパク質が、細胞と互いとのおよびそれらの微小環境との相互作用に関与する。これらのタンパク質のうちのいくつかは、細胞間膜領域内に存在することが公知であり、これらとしては、アドヘレンスジャンクションに寄与するカドヘリン、ギャップジャンクションに寄与するコネキシン、ならびにタイトジャンクションに寄与するクローディンおよびオクルディンが挙げられる。これらのタンパク質に加えて、他のタンパク質は、タイトジャンクションおよびアドヘレンスジャンクションによって作製された先端接合部複合体中に存在すると考えられている。
【００７３】
興味深いことに、これらの細胞間表面タンパク質の多くが、様々なウイルスについての受容体として特定された。ウイルスは、細胞間界面内のこれらの受容体の局在を利用するように進化した可能性があり、このことは、免疫系による攻撃および除去に対してより脆弱である管腔へウイルスが曝露されることなく、細胞間でのウイルス拡散の増強を可能にし得る。これらのタンパク質の中には、コクサッキーウイルスおよびアデノウイルスについての受容体であるCAR（またはCXAR）、ポリオウイルス受容体であるPVR、ヘルペスウイルスについての受容体であるPVRL1、麻疹ウイルスについての受容体であるPVRL4、およびレオウイルスについての受容体である接合部接着分子（JAM1またはJAM-A）がある。例えば、Barton et al., 2001, Cell 104:441-451; Gonzalez-Mariscal et al., 2009, Front. Biosci., 14:731-768; Muhlebach et al., 2011, Nature 480:530-533を参照のこと。
【００７４】
細胞間表面受容体の多くは、細胞接着分子の免疫グロブリンスーパーファミリー（IgCAM）のメンバーであり、一般に、構造および機能の両方に関連している。これらのタンパク質の大部分はI型膜貫通タンパク質であり、これらは、典型的に、1つまたは複数のIg様ドメインを含有する細胞外ドメイン（ECD）と、1回膜貫通ドメインと、細胞質尾部とからなる。IgCAMメンバーは、向かい合っている細胞表面上の他のIg様ドメインに一般に結合するそれらのN末端Ig様ドメインを介して相互作用を媒介し（同種親和性接着）、さらにインテグリンおよび炭水化物と相互作用する（異種親和性接着）（Wong et al., 2012, Int. J. Cell Biol.; epub）。興味深いことに、IgCAM分子の多くが免疫細胞上でも発現され、このことは、細胞間界面内のそれらの正常な局在が変化した場合、免疫学的監視機構が誘発され得ることを示唆している。Hippo経路を調節する受容体を特定しようとして、本発明者らは、免疫グロブリンスーパーファミリーのこの特定のサブセットが、Hippo経路において細胞間シグナル伝達を媒介するように良い位置にあると仮定した。
【００７５】
従って、いくつかの態様において、Hippo経路を調節する作用物質は、免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞接着分子（IgCAM）の細胞外ドメインに特異的に結合する。これらの作用物質は、本明細書において「IgCAM結合剤」と呼ばれる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は抗体である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は可溶性受容体である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は可溶性受容体を含む。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はポリペプチドである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は融合タンパク質である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は低分子である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は低分子ペプチドである。ある態様において、IgCAM結合剤は、JAMファミリー、PVRファミリー、および／またはCADMファミリーより選択される少なくとも1つのIgCAMに結合する。ある態様において、IgCAM結合剤は、JAMファミリーより選択される少なくとも1つのIgCAMに結合する。ある態様において、IgCAM結合剤は、PVRファミリーより選択される少なくとも1つのIgCAMに結合する。ある態様において、IgCAM結合剤は、CADMファミリーより選択される少なくとも1つのIgCAMに結合する。ある態様において、IgCAM結合剤は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択される少なくとも1つのIgCAMに結合する。ある態様において、IgCAM結合剤は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択される少なくとも1つのIgCAMに結合する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、CLMP、VSIG4、VSIG8、JAM2、JAM3、CADM1、CADM3、CADM4、PVRL1、PVRL3、PVRL4、TIGIT、TMIGD1、および／またはTMEM25に結合する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、CADM1、CADM3、PVRL1および／またはPVRL3に結合する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、CADM3、PVRL1および／またはPVRL3に結合する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はCADM3に結合する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はCADM1に結合しない。ある態様において、IgCAM結合剤は、2つ以上のIgCAMに特異的に結合する。多くのヒトIgCAMについての全長アミノ酸(aa)配列が当技術分野において公知であり、SEQ ID NO:1 (AMICA)、SEQ ID NO:2 (CAR)、SEQ ID NO:3 (CLMP)、SEQ ID NO:4 (ESAM)、SEQ ID NO:5 (GPA33)、SEQ ID NO:6 (JAM1)、SEQ ID NO:7 (JAM2)、SEQ ID NO:8 (JAM3)、SEQ ID NO:9 (VSIG1)、SEQ ID NO:10 (VSIG2)、SEQ ID NO:11 (VSIG3)、SEQ ID NO:12 (VSIG4)、SEQ ID NO:13 (VSIG8)、SEQ ID NO:14 (CADM1)、SEQ ID NO:15 (CADM2)、SEQ ID NO:16 (CADM3)、SEQ ID NO:17 (CADM4)、SEQ ID NO:18 (CRTAM)、SEQ ID NO:19 (TMIGD1)、SEQ ID NO:20 (CD96)、SEQ ID NO:21 (CD200)、SEQ ID NO:22 (CD200R1)、SEQ ID NO:23 (CD200R1L)、SEQ ID NO:24 (CD226)、SEQ ID NO:25 (PVRIG)、SEQ ID NO:26 (PVR)、SEQ ID NO:27 (PVRL1)、SEQ ID NO:28 (PVRL2)、SEQ ID NO:29 (PVRL3)、SEQ ID NO:30 (PVRL4)、SEQ ID NO:31 (TIGIT)、およびSEQ ID NO:32 (TMEM25)としていくつかを本明細書に提供する。
【００７６】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤は少なくとも1つのIgCAMのアゴニストである。ある態様において、IgCAM結合剤は、JAMファミリー、PVRファミリー、および／またはCADMファミリーより選択される少なくとも1つのIgCAMのアゴニストである。ある態様において、IgCAM結合剤は、JAMファミリーより選択される少なくとも1つのIgCAMのアゴニストである。ある態様において、IgCAM結合剤は、PVRファミリーより選択される少なくとも1つのIgCAMのアゴニストである。ある態様において、IgCAM結合剤は、CADMファミリーより選択される少なくとも1つのIgCAMのアゴニストである。ある態様において、IgCAM結合剤は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択される少なくとも1つのIgCAMのアゴニストである。ある態様において、IgCAM結合剤は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択される少なくとも1つのIgCAMのアゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、CLMP、VSIG4、VSIG8、JAM2、JAM3、CADM3、CADM4、PVRL1、PVRL3、PVRL4、TIGIT、TMIGD1、および／またはTMEM25のアゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、CADM1、CADM3、PVRL1および／またはPVRL3のアゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、CADM3、PVRL1および／またはPVRL3のアゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はCADM3のアゴニストである。
【００７７】
ある態様において、IgCAM結合剤はHippo経路のアゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はHippo経路シグナル伝達を活性化する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はHippo経路シグナル伝達を誘導する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はHippo経路シグナル伝達を増強する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はYAP活性化を阻害する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は核へのYAP移行を阻害する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、YAPリン酸化を増強するまたは増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、YAP分解を増強するまたは増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、細胞質中のYAP保持または隔離を増強するまたは増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、YAP依存性遺伝子またはYAP依存性遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を低下させる。用語「YAP依存性遺伝子」は、その発現がYAPによって調節される（例えば、増加または減少する）遺伝子を指す。この用語は、その発現がYAPおよび転写因子の組み合わせによって調節される、遺伝子の集合的グループ、サブセット、または個々の遺伝子のいずれかを示すために使用される。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はTAZ活性化を阻害する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は核へのTAZ移行を阻害する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、TAZリン酸化を増強するまたは増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、TAZ分解を増強するまたは増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、細胞質中のTAZ保持を増強するまたは増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、TAZ依存性遺伝子またはTAZ依存性遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を低下させる。用語「TAZ依存性遺伝子」は、その発現がTAZによって調節される（例えば、増加または減少する）遺伝子を指す。この用語は、その発現がTAZおよび転写因子の組み合わせによって調節される、遺伝子の集合的グループ、サブセット、または個々の遺伝子のいずれかを示すために使用される。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、CD44、CD47、CD133、TDGF1、EPHB2、CA12、LRP4、GPC4、CLDN2、CTGF、PAG1、SEMA4D、RHEB、MAGI1、ITPR3、CD168、NRP2、GLI2、BIRC2、BIRC5（サバイビン）、FGF1、IL33、GRB2、IGFBP3、AREG、FN1、ADAMTS1、ADAMTS5、AXL、MET、CYR61、IL8、ZEB1、FOXC2、N-カドヘリン、およびSNAILからなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を低下させる。
【００７８】
ある態様において、IgCAM結合剤は、接触依存性増殖阻害を増強する。ある態様において、IgCAM結合剤は細胞増殖を低下させる。ある態様において、IgCAM結合剤は、足場非依存性増殖を阻害する。
【００７９】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも1つのIgCAMのアンタゴニストである。ある態様において、IgCAM結合剤は、JAMファミリー、PVRファミリー、および／またはCADMファミリーより選択される少なくとも1つのIgCAMのアンタゴニストである。ある態様において、IgCAM結合剤は、JAMファミリーより選択される少なくとも1つのIgCAMのアンタゴニストである。ある態様において、IgCAM結合剤は、PVRファミリーより選択される少なくとも1つのIgCAMのアンタゴニストである。ある態様において、IgCAM結合剤は、CADMファミリーより選択される少なくとも1つのIgCAMのアンタゴニストである。ある態様において、IgCAM結合剤は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択される少なくとも1つのIgCAMのアンタゴニストである。ある態様において、IgCAM結合剤は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択される少なくとも1つのIgCAMのアンタゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、CLMP、VSIG4、VSIG8、JAM2、JAM3、CADM3、CADM4、PVRL1、PVRL3、PVRL4、TIGIT、TMIGD1、および／またはTMEM25のアンタゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、CADM1、CADM3、PVRL1および／またはPVRL3のアンタゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、CADM3、PVRL1および／またはPVRL3のアンタゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はCADM3のアンタゴニストである。
【００８０】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路のアンタゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路シグナル伝達を減少させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はHippo経路シグナル伝達を阻害する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はHippo経路シグナル伝達を抑制する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はYAP活性化を増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は核へのYAP移行を促進する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、YAPリン酸化を抑制するまたは減少させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、YAP分解を抑制するまたは減少させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、細胞質中のYAP保持を抑制するまたは減少させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、TAZ活性化を増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は核へのTAZ移行を促進する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、TAZリン酸化を抑制するまたは減少させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、TAZ分解を抑制するまたは減少させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、細胞質中のTAZ保持を抑制するまたは減少させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippoシグナル伝達経路によって抑制される遺伝子の発現を増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、CD44、CD47、CD133、TDGF1、EPHB2、CA12、LRP4、GPC4、CLDN2、CTGF、PAG1、SEMA4D、RHEB、MAGI1、ITPR3、CD168、NRP2、GLI2、BIRC2、BIRC5（サバイビン）、FGF1、IL33、GRB2、IGFBP3、AREG、FN1、ADAMTS1、AXL、ADAMTS5、MET、CYR61、IL8、ZEB1、FOXC2、N-カドヘリン、およびSNAILからなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を増加させる。
【００８１】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも1つのIgCAMに結合し、IgCAMと第2のタンパク質との相互作用を妨げる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも1つのIgCAMに結合し、IgCAMと第2のIgCAMとの相互作用を妨げる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも1つのIgCAMと少なくとも1つの第2のIgCAMとの相互作用を妨げる抗体である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも1つのIgCAMと少なくとも1つの第2のIgCAMとの相互作用を妨げる抗体を含む。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも1つのIgCAMと少なくとも1つの第2のIgCAMとの相互作用を妨げる可溶性受容体である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも1つのIgCAMと少なくとも1つの第2のIgCAMとの相互作用を妨げる可溶性受容体を含む。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも1つのIgCAMと少なくとも1つの第2のIgCAMとの相互作用を妨げる低分子である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも1つのIgCAMと少なくとも1つの第2のIgCAMとの相互作用を妨げる低分子ペプチドである。
【００８２】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下、または約0.1nM以下の解離定数（KD）で、少なくとも1つのIgCAMタンパク質に結合する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、約1nM以下のKDでIgCAMに結合する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、約0.1nM以下のKDでIgCAMに結合する。ある態様において、本明細書に記載のIgCAM結合剤は、少なくとも1つのさらなるIgCAMに結合する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、約0.1nM以下のKDでヒトIgCAMに結合する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、約10nM以下のKDでヒトIgCAMおよびマウスIgCAMの両方に結合する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、約1nM以下のKDでヒトIgCAMおよびマウスIgCAMの両方に結合する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、約0.1nM以下のKDでヒトIgCAMおよびマウスIgCAMの両方に結合する。いくつかの態様において、IgCAMに対する結合剤の解離定数は、Biacoreチップ上に固定化されたIgCAMの少なくとも一部または断片を含むIgCAM融合タンパクを使用して測定された解離定数である。
【００８３】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下、または約0.1nM以下の半最大有効濃度（EC50）で、ヒトIgCAMに結合する。ある態様において、IgCAM結合剤はまた、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下または約0.1nM以下のEC50で、少なくとも1つのさらなるIgCAMに結合する。
【００８４】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤は抗体である。いくつかの態様において、抗体は組み換え抗体である。いくつかの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗体はキメラ抗体である。いくつかの態様において、抗体はヒト化抗体である。いくつかの態様において、抗体はヒト抗体である。ある態様において、抗体はIgG1抗体である。ある態様において、抗体はIgG2抗体である。ある態様において、抗体は、抗原結合部位を含む抗体断片である。いくつかの態様において、抗体は一価である。いくつかの態様において、抗体は二価である。いくつかの態様において、抗体は単一特異性である。いくつかの態様において、抗体は二重特異性または多重特異性である。いくつかの態様において、抗体は細胞傷害性部分に結合される。いくつかの態様において、抗体は単離される。いくつかの態様において、抗体は実質的に純粋である。
【００８５】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤はポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は任意の公知の方法によって作製することができる。いくつかの態様において、ポリクローナル抗体は、複数回の皮下注射または腹腔内注射により関連の抗原（例えば、精製されたペプチド断片、完全長組み換えタンパク質または融合タンパク質）で動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、またはロバ）を免疫することによって産生される。抗原は任意で、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）または血清アルブミンのような担体に結合されてもよい。抗原（担体タンパク質ありまたはなしの）を滅菌食塩水中に希釈し、通常、アジュバント（例えば、完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバント）と組み合わせて安定な乳濁液を形成させる。十分な時間の後、免疫した動物の血液または腹水などからポリクローナル抗体を回収する。ポリクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および透析を含むが、これらに限定されない、当技術分野において標準的な方法に従って血清または腹水から精製することができる。
【００８６】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は当業者に公知のハイブリドーマ法を用いて作製することができる（例えば、Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497を参照のこと）。いくつかの態様において、ハイブリドーマ法を用いて、マウス、ハムスターまたは他の適切な宿主動物を上述のように免疫して、免疫用の抗原に特異的に結合する抗体のリンパ球による産生を誘発させる。いくつかの態様において、リンパ球はインビトロで免疫することができる。いくつかの態様において、免疫用の抗原はヒトタンパク質またはその一部もしくは断片であることができる。いくつかの態様において、免疫用の抗原はマウスタンパク質またはその一部もしくは断片であることができる。
【００８７】
免疫の後、リンパ球を単離し、例えば、ポリエチレングリコールを用いて適当な骨髄腫細胞株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成し、次いでこれを融合していないリンパ球および骨髄腫細胞から選択することができる。選択された抗原に対して特異的に向けられたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、免疫沈降法、免疫ブロッティング法およびインビトロ結合アッセイ法（例えば、フローサイトメトリー、FACS、ELISAおよびラジオイムノアッセイ法）を含むが、これらに限定されない、様々な方法によって特定することができる。ハイブリドーマは標準的な方法（J.W. Goding, 1996, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 3rd Edition, Academic Press, San Diego, CA）を用いるインビトロ培養で、またはインビボで動物中の腹水腫瘍として増殖することができる。モノクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および透析を含むが、これらに限定されない、当技術分野において標準的な方法に従って培養培地または腹水から精製することができる。
【００８８】
ある態様において、モノクローナル抗体は、当業者に公知の組み換えDNA技術（例えば、米国特許第4,816,567号を参照のこと）を使用して作製することができる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、成熟B細胞またはハイブリドーマ細胞から、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるRT-PCRによって単離し、それらの配列を、標準的な技術を用いて決定する。重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを次いで、トランスフェクションされていなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（E. coli）、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞または骨髄腫細胞のような宿主細胞へトランスフェクトされた場合にモノクローナル抗体を産生する適当な発現ベクターへクローニングする。他の態様において、組み換えモノクローナル抗体またはその断片を、所望の種のCDRおよび／または可変領域を発現するファージディスプレイライブラリーから単離することができる（例えば、McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; およびMarks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597を参照のこと）。
【００８９】
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、組み換えDNA技術を用いて多数の異なる様式でさらに改変し、代わりの抗体を作製することができる。いくつかの態様において、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインを、例えば、ヒト抗体のそれらの領域に置き換えてキメラ抗体を作製することができ、または非免疫グロブリンポリペプチドに置き換えて融合抗体を作製することができる。いくつかの態様において、定常領域を切断または除去してモノクローナル抗体の望ましい抗体断片を作製する。可変領域の部位特異的変異誘発または高密度変異誘発を用いて、モノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化することができる。
【００９０】
いくつかの態様において、ヒトIgCAMに対するモノクローナル抗体はヒト化抗体である。典型的には、ヒト化抗体は、CDR由来の残基が当業者に公知の方法を用いて、所望の特異性、親和性および／または結合能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど）のCDR由来の残基により置き換えられている、ヒト免疫グロブリンである。いくつかの態様において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域残基が、所望の特異性、親和性および／または結合能力を有する非ヒト種由来の抗体における対応残基で置き換えられる。いくつかの態様において、ヒト化抗体を、Fvフレームワーク領域中および／または置き換えられた非ヒト残基内のさらなる残基の置換によりさらに改変して、抗体の特異性、親和性および／または能力を改良および最適化することができる。ヒト化抗体は、フレームワーク領域の全て、または実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものであるのに対して、非ヒト免疫グロブリンに対応するCDRの全て、または実質的に全てを含んだ少なくとも1つ、および典型的には2つまたは3つの可変ドメイン領域の実質的に全てを含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Fc）の少なくとも一部もしくは断片、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含むことができる。ある態様において、そのようなヒト化抗体は、ヒト対象に投与された時に抗原性およびHAMA（ヒト抗マウス抗体）反応を低減しうるので治療的に用いられる。当業者は、公知の技術に従って免疫原性の低下した機能的なヒト化抗体を得ることができるであろう（例えば、米国特許第5,225,539号；同第5,585,089号；同第5,693,761号；および同第5,693,762号を参照のこと）。
【００９１】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤はヒト抗体である。ヒト抗体は当技術分野において公知の様々な技術を用いて直接作製することができる。いくつかの態様において、標的抗原に対して向けられた抗体を産生する、免疫された固体から単離されたかまたはインビトロで免疫された不死化ヒトBリンパ球を作製することができる（例えば、Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77; Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147:86-95; ならびに米国特許第5,750,373号; 同第5,567,610号; および同第5,229,275号を参照のこと）。いくつかの態様において、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから、ヒト抗体を選択することができる（Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol, 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581）。あるいは、ファージディスプレイ技術を用いて、非免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体および抗体断片を産生してもよい。抗体ファージライブラリーの作出および使用のための技術は同様に、米国特許第5,969,108号; 同第6,172,197号; 同第5,885,793号; 同第6,521,404号; 同第6,544,731号; 同第6,555,313号; 同第6,582,915号; 同第6,593,081号; 同第6,300,064号; 同第6,653,068号; 同第6,706,484号; および同第7,264,963号; ならびにRothe et al., 2008, J. Mol. Bio., 376: 1182-1200に記述されている。鎖シャッフリング（Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783）および部位特異的突然変異誘発法を含むが、これらに限定されない、親和性成熟戦略が当技術分野において公知であり、高親和性ヒト抗体を作製するために用いてもよい。
【００９２】
いくつかの態様において、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む遺伝子導入マウスにおいて作出することができる。免疫によって、これらのマウスは、内因性免疫グロブリンを産生せずに、ヒト抗体の全レパートリーを産生することができる。このアプローチは、米国特許第5,545,807号; 同第5,545,806号; 同第5,569,825号; 同第5,625,126号; 同第5,633,425号; および同第5,661,016号に記述されている。
【００９３】
本発明はまた、少なくとも1つのヒトIgCAMタンパク質を特異的に認識する二重特異性抗体を包含する。二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープを特異的に認識し、結合することができる。異なるエピトープは、同じ分子内に存在してもよく（例えば、1つのヒトIgCAM上に2つのエピトープ）、あるいは異なる分子の上に存在してもよい（例えば、ヒトIgCAM上に1つのエピトープ、および第2分子上に1つのエピトープ）。いくつかの態様において、二重特異性抗体はモノクローナルヒトまたはヒト化抗体である。いくつかの態様において、抗体は、第1抗原標的（例えば、IgCAM）ならびに第2抗原標的、例えば、白血球（例えば、CD2、CD3、CD28、CD80、もしくはCD86）またはFc受容体（例えば、CD64、CD32、もしくはCD16）上のエフェクター分子を特異的に認識し結合することができ、その結果、第1抗原標的を発現する細胞に細胞防衛機構を集中させることができる。いくつかの態様において、抗体を用いて、特定の標的抗原を発現する細胞に細胞傷害剤を向けることができる。これらの抗体は、抗原結合性アーム、および細胞傷害剤または放射性核種キレート剤、例えばEOTUBE、DPTA、DOTAもしくはTETAに結合するアームを保有する。
【００９４】
二重特異性抗体を作製するための技術は、当業者に公知であり、例えば、Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science, 229:81 ; Suresh et al., 1986, Methods in Enzymol, 121 : 120; Traunecker et al., 1991, EMBO J., 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med., 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J, Immunol, 148: 1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol, 152:5368; 米国特許第5,731,168号；および米国特許出願公開第2011/0123532号を参照のこと。二重特異性抗体は、インタクトな抗体または抗体断片であることができる。三価以上の結合価を有する抗体も企図される。例えば、三重特異性抗体を作製することができる（Tutt et al., 1991, J. Immunol., 147:60）。従って、ある態様において、IgCAMに対する抗体は多重特異性である。
【００９５】
ある態様において、本明細書に記載の抗体（または他のポリペプチド）は単一特異性であってもよい。例えば、ある態様において、抗体が含む1つまたは複数の抗原結合部位のそれぞれが、2つ以上のIgCAM上の相同なエピトープに結合することができる（または結合する）。ある態様において、本明細書に記載の単一特異性抗体の抗原結合部位は、例えば、PVRおよびPVRL1に結合することができる（または結合する）（即ち、同一のエピトープがPVRおよびPVRL1タンパク質の両方において見られる）。
【００９６】
ある態様において、IgCAM結合剤は抗体断片である。抗体断片はインタクトな抗体とは異なる機能または能力を有することができ；例えば、抗体断片は増大した腫瘍浸透性を有することができる。インタクトな抗体のタンパク質分解消化を含むが、これに限定されない、様々な技術が抗体断片の産生について公知である。いくつかの態様において、抗体断片は抗体分子のペプシン消化によって産生されるF(ab')2断片を含む。いくつかの態様において、抗体断片は、F(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することによって作出されたFab断片を含む。他の態様において、抗体断片はパパインおよび還元剤による抗体分子の処理によって作出されたFab断片を含む。ある態様において、抗体断片は組み換えにより産生される。いくつかの態様において、抗体断片はFvまたは一本鎖Fv (scFv)断片を含む。Fab、FvおよびscFv抗体断片は大腸菌または他の宿主細胞内で発現させ、大腸菌または他の宿主細胞から分泌させることができ、従って、これらの断片の大量産生が可能である。いくつかの態様において、抗体断片は、本明細書において論じられるように抗体ファージライブラリーから単離される。例えば、Fab発現ライブラリーの構築（Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281）のための方法を用いて、IgCAM、またはその誘導体、断片、類似体もしくは相同体に対する所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ有効な特定を可能にすることができる。いくつかの態様において、抗体断片は直鎖状の抗体断片である。ある態様において、抗体断片は単一特異性または二重特異性である。ある態様において、IgCAM結合剤はscFvである。1つまたは複数のヒトIgCAMに特異的な一本鎖抗体の作製のために様々な技術を用いることができ、これらは当業者に公知である。
【００９７】
さらに、とりわけ抗体断片の場合には、その血清中半減期を増加させる（または減少させる）ために抗体を改変することが望ましい場合がある。これは、例えば、抗体断片中の適切な領域の変異による、抗体断片中へのサルベージ受容体結合エピトープの組み込みにより、またはペプチドタグにエピトープを組み込み、これを次いで抗体断片のいずれかの端にもしくは真ん中に（例えば、DNAもしくはペプチド合成によって）融合することにより行うことができる。
【００９８】
ヘテロ結合体抗体も本発明の範囲内である。ヘテロ結合体抗体は2種類の共有結合した抗体から構成される。例えば、免疫細胞を不必要な細胞に標的化するために、そのような抗体が提案されている（米国特許第4,676,980号）。ヘテロ結合体抗体は、架橋剤が関与する方法を含む、合成タンパク質化学における公知の方法を用いてインビトロで作製できることも企図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いてまたはチオエーテル結合を形成させることによって構築することができる。この目的に適した試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル-4-メルカプトブチリミデートが挙げられる。
【００９９】
本発明の目的のためには、改変抗体が、抗体と標的（すなわち、ヒトIgCAM）との会合を提供する任意のタイプの可変領域を含みうることを理解されたい。この点で、可変領域は、液性反応の開始および所望の腫瘍関連抗原に対する免疫グロブリンの作出を誘導できる、任意のタイプの哺乳動物のものを含んでもまたはそれに由来してもよい。従って、改変抗体の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、マカクなど）またはウサギ由来であってよい。いくつかの態様において、改変された免疫グロブリンの可変領域および定常領域の両方がヒトのものである。他の態様において、結合特性を改善するように、または分子の免疫原性を低減するように、適合性を有する抗体（通常、非ヒト供給源に由来する）の可変領域を遺伝子操作することができ、または特異的に調整することができる。この点に関して、移入アミノ酸配列を含めることにより、本発明において有用な可変領域をヒト化することができ、または他の方法で改変することができる。
【０１００】
ある態様において、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインを、1つまたは複数のCDRの少なくとも一部の置き換えによって、必要な場合には、部分的なフレームワーク領域の置き換えならびに配列の変更および／または改変によって改変する。CDRは、フレームワーク領域が得られた抗体と同じクラス、さらには同じサブクラスの抗体に由来しうるが、CDRが、異なるクラスの抗体、好ましくは、異なる種からの抗体に由来することが想定される。ある可変ドメインの抗原結合能を別の可変ドメインに移すためには、CDRの全てを、供与側の可変領域からのCDRの全てで置き換えることは必要でない場合がある。むしろ、抗原結合部位の活性を維持するのに必要な残基を移すことのみが必要な場合がある。
【０１０１】
可変領域への変化にもかかわらず、当業者であれば、本発明の改変抗体は、天然のまたは変化していない定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較して、望ましい生化学的特徴が得られるように、例えば、腫瘍局在性が増大または血清中半減期が増大するように、定常領域ドメインの1つまたは複数の少なくとも一部が欠失されている、または他の方法で変えられている抗体（例えば、完全長抗体またはその免疫反応性断片）を含むことを理解するだろう。いくつかの態様において、改変抗体の定常領域はヒト定常領域を含む。本発明に適合する定常領域への改変は、1つまたは複数のドメイン内の1つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失または置換を含む。本明細書において開示された改変抗体は、3つの重鎖定常ドメイン（CH1、CH2もしくはCH3）の1つまたは複数へのおよび／または軽鎖定常ドメインへの改変または修飾を含んでもよい。いくつかの態様において、1つまたは複数のドメインが改変抗体の定常領域から部分的または全体的に欠失される。いくつかの態様において、改変抗体は、CH2ドメイン全体が除去されているドメイン欠失構築物または変異体（ΔCH2構築物）を含む。いくつかの態様において、除かれた定常領域ドメインは、典型的には、存在しない定常領域によって付与される、ある程度の分子可撓性をもたらす短いアミノ酸スペーサー（例えば、10アミノ酸残基）により置換される。
【０１０２】
いくつかの態様において、改変抗体は、CH3ドメインを抗体のヒンジ領域へ直接融合するように遺伝子操作される。他の態様において、ヒンジ領域と改変されたCH2および／またはCH3ドメインの間にペプチドスペーサーが挿入される。例えば、CH2ドメインが欠失され、かつ残りのCH3ドメイン（改変または未改変）がヒンジ領域に5〜20個のアミノ酸スペーサーを用いて連結された、構築物を発現させることができる。このようなスペーサーを付加して、定常ドメインの調節エレメントを遊離状態でアクセス可能に保つこと、またはヒンジ領域の可撓性を保つことを確実にすることができる。しかしながら、アミノ酸スペーサーは、場合によっては、免疫原性を有することが判明しており、構築物に対する望ましくない免疫反応を誘発しうることに留意すべきである。従って、ある態様において、構築物に付加されるどのスペーサーも、改変抗体の望ましい生化学的特質を維持するように、比較的、非免疫原性であろう。
【０１０３】
いくつかの態様において、改変抗体は定常ドメインの部分的欠失または少数のもしくは単一のアミノ酸の置換だけを有することができる。例えば、CH2ドメインの選択域における単一のアミノ酸の変異は、Fc結合を大幅に低減し、それによって腫瘍局在性および/または腫瘍浸透性を増大させるのに十分でありうる。同様に、調節しようとする特定のエフェクター機能（例えば、補体C1q結合）を制御する1つまたは複数の定常領域ドメインの部分を単純に欠失させることが望ましい場合がある。定常領域のこのような部分的欠失は、この定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能をそのままにしておく一方で、抗体の選択される特徴（例えば、血清中半減期）を改善しうる。さらに、上にも示唆したように、開示された抗体の定常領域は、得られる構築物の機能を増強する、1つまたは複数のアミノ酸の変異または置換によって改変されてもよい。この点で、改変抗体の構成および免疫原性プロファイルを実質的に維持する一方で、保存された結合部位（例えば、Fc結合）によって提供される活性を妨害することが可能な場合がある。ある態様において、改変抗体は、エフェクター機能の減少もしくは増加などの望ましい特徴を増強するように、またはさらに多くの細胞毒素もしくは糖鎖の付着部位をもたらすように、定常領域への1つまたは複数のアミノ酸の付加を含む。
【０１０４】
定常領域がいくつかのエフェクター機能を媒介することが当技術分野において公知である。例えば、IgGまたはIgM抗体のFc領域への補体のC1成分の結合は（抗体が抗原へ結合される場合）、補体系を活性化する。補体活性化は、オプソニン化および細胞病原体の溶解において重要である。補体活性化はまた炎症反応を刺激し、自己免疫過敏にも関与する場合がある。さらに、抗体のFc領域は、Fc受容体（FcR）を発現している細胞に結合することができる。IgG（γ受容体）、IgE（ε受容体）、IgA（α受容体）およびIgM（μ受容体）を含む、異なるクラスの抗体に特異的ないくつかのFc受容体がある。抗体と、細胞表面上のFc受容体が結合すると、貪食および抗体コーティング粒子の破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体コーティング標的細胞の溶解（抗体依存性細胞傷害またはADCCと呼ばれる）、炎症メディエータの放出、胎盤通過および免疫グロブリン産生の制御を含む、いくつかの重要かつ多様な生物学的反応が誘発される。
【０１０５】
ある態様において、IgCAM結合性抗体は、変化したエフェクター機能をもたらし、これが、今度は、投与された抗体の生物学的プロファイルに影響を与える。例えば、いくつかの態様において、定常領域ドメインの（点変異または他の手段を通じた）欠失または不活性化は、血中改変抗体のFc受容体結合を低減し、それによって癌細胞局在性および／または腫瘍浸透性を増大しうる。他の態様において、定常領域の修飾は抗体の血清中半減期を増大または低減する。いくつかの態様において、定常領域を修飾して、ジスルフィド結合またはオリゴサッカライド部分を除去する。本発明による定常領域に対する修飾は、当業者に知られる周知の生物化学工学または分子工学の技術を用いて容易に行われうる。
【０１０６】
ある態様において、抗体であるIgCAM結合剤は、1つまたは複数のエフェクター機能を有さない。例えば、いくつかの態様において、抗体はADCC活性および／または補体依存性細胞傷害（CDC）活性を有さない。ある態様において、抗体はFc受容体および／または補体因子に結合しない。ある態様において、抗体はエフェクター機能を有さない。
【０１０７】
本発明は、本明細書において記載される、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体、またはその抗体断片に実質的に相同な変異体および等価体をさらに包含する。これらは、例えば、保存的置換変異、すなわち、類似のアミノ酸による1つまたは複数のアミノ酸の置換を含みうる。例えば、保存的置換は、例えば、もう1つの酸性アミノ酸での1つの酸性アミノ酸の置換、もう1つの塩基性アミノ酸での1つの塩基性アミノ酸の置換、またはもう1つの中性アミノ酸による1つの中性アミノ酸の置換のような、同じ一般的クラス内の別のアミノ酸でのアミノ酸の置換をいう。保存的アミノ酸置換によって意図されているものは、当技術分野において周知であり、本明細書において記述されている。
【０１０８】
従って、本発明は、少なくとも1つのIgCAMに結合する抗体を製造するための方法を提供する。いくつかの態様において、少なくとも1つのIgCAMに結合する抗体を製造するための方法は、ハイブリドーマ技術を使用する工程を含む。いくつかの態様において、ヒトIgCAMの細胞外ドメインに結合する抗体を製造する方法を提供する。いくつかの態様において、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択されるヒトIgCAMの細胞外ドメインに結合する抗体を製造する方法を提供する。いくつかの態様において、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択されるヒトIgCAMの細胞外ドメインに結合する抗体を製造する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:33またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:34またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:35またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:36またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:37またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:38またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:39またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:40またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:41またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:42またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:43またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:44またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:45またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:46またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:47またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:48またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:49またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:50またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:51またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:52またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:53またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:54またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:55またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:56またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:57またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:58またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:59またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:60またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:61またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:62またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:63またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、免疫原としてSEQ ID NO:64またはその一部もしくは断片を使用する工程を含む。
【０１０９】
いくつかの態様において、少なくとも1つのヒトIgCAMに結合する抗体を製造する方法は、ヒトファージライブラリーをスクリーニングする工程を含む。本発明はさらに、少なくとも1つのIgCAMに結合する抗体を特定する方法を提供する。いくつかの態様において、IgCAMまたはその一部もしくは断片への結合についてFACSを使用してスクリーニングするによって、抗体を特定する。いくつかの態様において、IgCAMまたはその一部もしくは断片への結合についてELISAを使用してスクリーニングするによって、抗体を特定する。いくつかの態様において、クローン形成能アッセイ（clonogenic assay）において細胞形態に対する効果をスクリーニングすることによって、抗体を特定する。いくつかの態様において、クローン形成能アッセイにおいて細胞成長および／または増殖に対する効果をスクリーニングすることによって、抗体を特定する。いくつかの態様において、Hippo経路シグナル伝達の活性化または増強をスクリーニングすることによって、抗体を特定する。いくつかの態様において、YAP活性化の阻害をスクリーニングすることによって、抗体を特定する。いくつかの態様において、YAPの移行をスクリーニングすることによって、抗体を特定する。いくつかの態様において、YAPリン酸化をスクリーニングすることによって、抗体を特定する。いくつかの態様において、TAZ活性化の阻害をスクリーニングすることによって、抗体を特定する。いくつかの態様において、TAZの移行をスクリーニングすることによって、抗体を特定する。いくつかの態様において、TAZリン酸化をスクリーニングすることによって、抗体を特定する。
【０１１０】
いくつかの態様において、ヒトIgCAMに対する抗体を製造する方法は、ヒトIgCAMの細胞外ドメインを含むポリペプチドで哺乳動物を免疫化する工程を含む。いくつかの態様において、ヒトIgCAMに対する抗体を製造する方法は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、またはTMEM25由来の細胞外ドメインの少なくとも一部もしくは断片を含むポリペプチドで哺乳動物を免疫化する工程を含む。いくつかの態様において、ヒトIgCAMに対する抗体を製造する方法は、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、またはSEQ ID NO:64の少なくとも一部もしくは断片を含むポリペプチドで哺乳動物を免疫化する工程を含む。いくつかの態様において、方法はさらに、哺乳動物から抗体または抗体産生細胞を単離する工程を含む。
【０１１１】
いくつかの態様において、ヒトIgCAMに結合するモノクローナル抗体を製造する方法は、(a)AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、またはTMEM25由来の細胞外ドメインの少なくとも一部もしくは断片を含むポリペプチドで哺乳動物を免疫化する工程；(b)免疫化された哺乳動物から抗体産生細胞を単離する工程；(c)抗体産生細胞を骨髄腫細胞株の細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する工程を含む。いくつかの態様において、方法はさらに、(d)少なくとも1つのIgCAMに結合する抗体を発現するハイブリドーマ細胞を選択する工程を含む。
【０１１２】
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、Hippo経路アゴニストである。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、Hippo経路シグナル伝達を活性化し、増加させ、および／または増強する。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、YAPリン酸化を増加させる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、YAP分解を増加させる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、細胞質中のYAPの保持を増加させる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、YAP活性化を阻害する。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、核へのYAP移行を阻害する。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、TAZリン酸化を増加させる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、TAZ分解を増加させる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、細胞質中のTAZの保持を増加させる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、TAZ活性化を阻害する。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、核へのTAZ移行を阻害する。
【０１１３】
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、Hippo経路アンタゴニストである。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、Hippo経路シグナル伝達を阻害する、減少させる、および／または抑制する。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、YAPリン酸化を減少させる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、YAP分解を減少させる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、細胞質中のYAPの保持を減少させる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、YAP活性化を増加させるまたは増強する。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、核へのYAP移行を増加させるまたは増強する。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、TAZリン酸化を減少させる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、TAZ分解を減少させる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、細胞質中のTAZの保持を減少させる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、TAZ活性化を増加させるまたは増強する。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、核へのTAZ移行を増加させるまたは増強する。
【０１１４】
いくつかの態様において、少なくとも1つのヒトIgCAMに対する抗体を製造する方法は、単一の抗原結合部位を含む膜結合型ヘテロ二量体分子を使用して抗体を特定する工程を含む。いくつかの非限定的な態様において、国際公開公報第WO2011/100566号に記載の方法およびポリペプチドを使用して抗体を特定し、これは参照により本明細書中にその全体が組み入れられる。
【０１１５】
いくつかの態様において、少なくとも1つのヒトIgCAMに対する抗体を製造する方法は、少なくとも1つのヒトIgCAMに結合する抗体について抗体発現ライブラリーをスクリーニングする工程を含む。いくつかの態様において、抗体発現ライブラリーはファージライブラリーである。いくつかの態様において、抗体発現ライブラリーは哺乳動物細胞ディスプレイライブラリーである。いくつかの態様において、スクリーニングはパニングを含む。いくつかの態様において、ヒトIgCAMの細胞外ドメインの少なくとも一部または断片を使用して、抗体発現ライブラリーをスクリーニングする。いくつかの態様において、以下からなる群より選択されるヒトIgCAMの細胞外ドメインの少なくとも一部または断片を使用して、抗体発現ライブラリーをスクリーニングする：AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25。いくつかの態様において、第1のスクリーニングにおいて特定された抗体を、異なるIgCAMを使用して再度スクリーニングし、それによって、2つ以上のIgCAMに結合する抗体を特定する。
【０１１６】
ある態様において、本明細書に記載の抗体は単離される。ある態様において、本明細書に記載の抗体は実質的に純粋である。
【０１１７】
ある態様において、IgCAM結合剤は可溶性受容体である。ある態様において、IgCAM結合剤は、IgCAMの細胞外ドメインを含む。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、IgCAMの細胞外ドメインの断片（例えば、IgCAMのN末端ドメイン）を含む。いくつかの態様において、IgCAMの細胞外ドメインの断片を含む可溶性受容体は、IgCAM ECD全体を含む可溶性受容体と比較して改変された生物学的活性（例えば、増加したタンパク質半減期）を示し得る。タンパク質半減期は、ポリエチレングリコール（PEG）またはポリエチレンオキシド（PEO）での共有結合修飾によってさらに増加させることができる。ある態様において、IgCAMはヒトIgCAMである。ある態様において、IgCAM ECDまたはIgCAM ECDの断片は、JAMファミリー、PVRファミリー、またはCADMファミリーより選択されるヒトIgCAM ECDである。ある態様において、IgCAM ECDは、JAMファミリーより選択されるヒトIgCAM ECDである。ある態様において、IgCAM ECDは、PVRファミリーより選択されるヒトIgCAM ECDである。ある態様において、IgCAM ECDは、CADMファミリーより選択されるヒトIgCAM ECDである。ある態様において、ヒトIgCAM ECDは、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、またはTMEM25由来のIgCAM ECDである。ある態様において、ヒトIgCAM ECDは、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、またはTMEM25由来のIgCAM ECDである。いくつかの態様において、ヒトIgCAM ECDは、CLMP、VSIG4、VSIG8、JAM2、JAM3、CADM3、CADM4、PVRL1、PVRL3、PVRL4、TIGIT、TMIGD1、および／またはTMEM25由来のIgCAM ECDである。いくつかの態様において、ヒトIgCAM ECDは、CADM1、CADM3、PVRL1および／またはPVRL3由来のIgCAM ECDである。いくつかの態様において、ヒトIgCAM ECDは、CADM3、PVRL1および／またはPVRL3由来のIgCAM ECDである。いくつかの態様において、ヒトIgCAM ECDは、CADM3由来のIgCAM ECDである。いくつかの態様において、ヒトIgCAM ECDはCADM1に由来しない。
【０１１８】
AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25についての予測ECDドメインをSEQ ID NO:33〜64として提供する。当業者は、様々なECDドメインに対応する正確なアミノ酸の理解において異なってもよい。従って、本明細書に記載のECDのN末端および／またはC末端は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上のアミノ酸だけ延長されても短縮されてもよい。
【０１１９】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、およびSEQ ID NO:64からなる群より選択される配列を含む。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、およびSEQ ID NO:64からなる群より選択される配列の断片を含む。
【０１２０】
ある態様において、IgCAM結合剤は、1つまたは複数（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10など）の保存的置換を含みかつIgCAMに結合することができる、前述のIgCAM ECD配列のいずれか1つの変異体を含む。
【０１２１】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤、例えば、ヒトIgCAMのECDを含む可溶性受容体は、融合タンパク質である。本明細書で用いる場合、「融合タンパク質」は、少なくとも2つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されたハイブリッドタンパク質である。ある態様において、IgCAM結合剤、例えば、ヒトIgCAMのECDを含む可溶性受容体は、非IgCAMポリペプチドをさらに含む。いくつかの態様において、IgCAM可溶性受容体は、ヒトFc領域、タンパク質タグ（例えば、myc、FLAG、GST）、他の内因性タンパク質もしくはタンパク質断片、またはIgCAM ECDと第2ポリペプチドとの間の任意のリンカー領域を含む任意の他の有用なタンパク質配列を含むがこれらに限定されない、他の非IgCAM機能的および構造的ポリペプチドへ連結されたIgCAM ECDを含んでもよい。ある態様において、非IgCAMポリペプチドはヒトFc領域である。Fc領域は、免疫グロブリンIgG、IgA、IgM、IgDおよびIgEの任意のクラスから得ることができる。いくつかの態様において、Fc領域はヒトIgG1 Fc領域である。いくつかの態様において、Fc領域はヒトIgG2 Fc領域である。いくつかの態様において、Fc領域は野生型Fc領域である。いくつかの態様において、Fc領域は、野生型Fc領域の天然変異体である。いくつかの態様において、Fc領域は、突然変異したFc領域である。いくつかの態様において、Fc領域は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸だけN末端で切断されている（例えば、ヒンジドメイン中）。いくつかの態様において、Fc領域はC末端で切断されている（例えば、リジンが存在しない）。いくつかの態様において、ヒンジドメイン中のアミノ酸を変更し、望ましくないジスルフィド結合形成を妨げる。いくつかの態様において、システインを異なるアミノ酸で置き換え、望ましくないジスルフィド結合形成を妨げる。いくつかの態様において、システインをセリンで置き換え、望ましくないジスルフィド結合形成を妨げる。ある態様において、非IgCAMポリペプチドは、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、またはSEQ ID NO:67を含む。ある態様において、非IgCAMポリペプチドは、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、またはSEQ ID NO:67から本質的になる。
【０１２２】
ある態様において、IgCAM結合剤は、IgCAM ECDの少なくとも断片（at least a or fragment）およびFc領域を含む融合タンパク質である。いくつかの態様において、IgCAM ECDのC末端を免疫グロブリンFc領域のN末端へ連結する。いくつかの態様において、IgCAM ECDをFc領域へ直接連結する（即ち、介在ペプチドリンカー無し）。いくつかの態様において、IgCAM ECDを、ペプチドリンカーを介してFc領域へ連結する。
【０１２３】
本明細書で用いる場合、用語「リンカー」は、第1ポリペプチド（例えば、IgCAM ECDまたはその一部もしくは断片）と第2ポリペプチド（例えば、Fc領域）との間に挿入されたリンカーを指す。いくつかの態様において、リンカーはペプチドリンカーである。リンカーは、融合タンパク質の発現、分泌、または生物活性に悪影響を与えるべきでない。リンカーは、抗原性であるべきでなく、免疫応答を誘発すべきでない。適切なリンカーは、当業者に公知であり、グリシンおよびセリン残基の混合物をしばしば含み、立体障害のないアミノ酸をしばしば含む。有用なリンカー中へ組み込むことができる他のアミノ酸としては、トレオニンおよびアラニン残基が挙げられる。リンカーの長さは、例えば1〜50アミノ酸長、1〜22アミノ酸長、1〜10アミノ酸長、1〜5アミノ酸長、または1〜3アミノ酸長の範囲とすることができる。リンカーとしては、SerGly、GGSG、GSGS、GGGS、S(GGS)n（ここでnは1〜7である）、GRA、ポリ(Gly)、ポリ(Ala)、ESGGGGVT（SEQ ID NO:74）、LESGGGGVT（SEQ ID NO:75）、GRAQVT（SEQ ID NO:76）、WRAQVT（SEQ ID NO:77）、およびARGRAQVT（SEQ ID NO:78）が挙げられ得るが、これらに限定されない。本明細書で用いる場合、リンカーは、第1ポリペプチド（例えば、IgCAM ECD）のC末端または第2ポリペプチド（例えば、Fc領域）のN末端のいずれかに由来するアミノ酸残基を含まない介在ペプチド配列である。
【０１２４】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、またはSEQ ID NO:64を含む第1ポリペプチド；およびSEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、またはSEQ ID NO:67を含む第2ポリペプチドを含み、ここで、第1ポリペプチドは第2ポリペプチドへ直接連結されている。
【０１２５】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、またはSEQ ID NO:64を含む第1ポリペプチド；およびSEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、またはSEQ ID NO:67を含む第2ポリペプチドを含み、ここで、第1ポリペプチドはリンカーによって第2ポリペプチドへ連結されている。
【０１２６】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、またはSEQ ID NO:64の一部または断片を含む第1ポリペプチド；およびSEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、またはSEQ ID NO:67を含む第2ポリペプチドを含み、ここで、第1ポリペプチドは第2ポリペプチドへ直接連結されている。
【０１２７】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、またはSEQ ID NO:64の一部または断片を含む第1ポリペプチド；およびSEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、またはSEQ ID NO:67を含む第2ポリペプチドを含み、ここで、第1ポリペプチドはリンカーによって第2ポリペプチドへ連結されている。
【０１２８】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、またはSEQ ID NO:64と少なくとも80%同一である第1ポリペプチド；およびSEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、またはSEQ ID NO:67を含む第2ポリペプチドを含み、ここで、第1ポリペプチドは第2ポリペプチドへ直接連結されている。いくつかの態様において、第1ポリペプチドは、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、またはSEQ ID NO:64と少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%同一である。
【０１２９】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、またはSEQ ID NO:64と少なくとも80%同一である第1ポリペプチド；およびSEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、またはSEQ ID NO:67を含む第2ポリペプチドを含み、ここで、第1ポリペプチドはリンカーによって第2ポリペプチドへ連結されている。いくつかの態様において、第1ポリペプチドは、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、またはSEQ ID NO:64と少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%同一である。
【０１３０】
IgCAMは、タンパク質の輸送を指示するシグナル配列を一般に含有する。シグナル配列（シグナルペプチドまたはリーダー配列とも呼ばれる）は、新生ポリペプチドのN末端に配置される。それらはポリペプチドを小胞体へ標的化し、タンパク質はそれらの目的地へ、例えば、細胞小器官の内空間へ、内膜へ、細胞外膜へ、または分泌によって細胞外部へ、選別される。大部分のシグナル配列は、タンパク質が小胞体へ輸送された後に、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。ポリペプチドからのシグナル配列の切断は、通常、アミノ酸配列中の特定の部位で生じ、シグナル配列内のアミノ酸残基に依存する。通常は1つの特定の切断部位が存在するが、2つ以上の切断部位がシグナルペプチダーゼによって認識および／または使用されてもよく、ポリペプチドの不均一なN末端が生じる。例えば、シグナル配列内の異なる切断部位の使用は、異なるN末端アミノ酸を伴って発現されるポリペプチドをもたらし得る。従って、いくつかの態様において、本明細書に記載のポリペプチドは、異なるN末端を有するポリペプチドの混合物を含んでもよい。いくつかの態様において、N末端は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上のアミノ酸だけ長さが異なる。いくつかの態様において、N末端は、1、2、3、4、または5アミノ酸だけ長さが異なる。いくつかの態様において、ポリペプチドは実質的に均一であり、即ち、ポリペプチドは同一のN末端を有する。いくつかの態様において、ポリペプチドのシグナル配列は、1つまたは複数（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10など）のアミノ酸置換および／または欠失を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドのシグナル配列は、一つの切断部位がドミナントとなることを可能にするアミノ酸置換および／または欠失を含み、それによって、一つのN末端を有する実質的に均一なポリペプチドが生じる。いくつかの態様において、ポリペプチドのシグナル配列は、天然IgCAMシグナル配列ではない。
【０１３１】
ある態様において、IgCAM結合剤は免疫グロブリンのFc領域を含む。当業者であれば、本発明の結合剤は、天然のまたは変化していない定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の融合タンパク質と比較して、望ましい生化学的特徴が得られるように、例えば、癌細胞局在性が増大するように、腫瘍浸透性が増大するように、血清中半減期が低減するように、または血清中半減期が増大するように、Fc領域の少なくとも一部が欠失されている、または他の方法で変えられている融合タンパク質を含むことを理解するだろう。Fc領域への改変は、1つまたは複数のドメイン内の1つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失または置換を含み得る。本明細書において開示された改変融合タンパク質は、2つの重鎖定常ドメイン（CH2もしくはCH3）の1つまたは複数へのまたはヒンジ領域への改変または修飾を含んでもよい。他の態様において、CH2ドメイン全体が除去され得る（ΔCH2構築物）。いくつかの態様において、除かれた定常領域ドメインは、典型的には、存在しない定常領域ドメインによって付与される、ある程度の分子可撓性をもたらす短いアミノ酸スペーサー（例えば、10 aa残基）により置換される。
【０１３２】
いくつかの態様において、改変融合タンパク質は、CH3ドメインを抗体のヒンジ領域または第1ポリペプチドへ直接融合するように遺伝子操作される。他の態様において、ヒンジ領域または第1ポリペプチドと改変されたCH2および／またはCH3ドメインの間にペプチドスペーサーが挿入される。例えば、CH2ドメインが欠失され、かつ残りのCH3ドメイン（改変または未改変）がヒンジ領域または第1ポリペプチドに5〜20個のアミノ酸スペーサーを用いて連結された、構築物を発現させることができる。このようなスペーサーを付加して、定常ドメインの調節エレメントを遊離状態でアクセス可能に保つこと、またはヒンジ領域の可撓性を保つことを確実にすることができる。しかしながら、アミノ酸スペーサーは、場合によっては、免疫原性を有することが判明しており、構築物に対する望ましくない免疫反応を誘発しうることに留意すべきである。従って、ある態様において、構築物に付加されるどのスペーサーも、融合タンパク質の望ましい生化学的特質を維持するように、比較的、非免疫原性であろう。
【０１３３】
いくつかの態様において、改変融合タンパク質は定常ドメインの部分的欠失または少数のもしくは単一のアミノ酸の置換だけを有することができる。例えば、CH2ドメインの選択域における単一のアミノ酸の変異は、Fc結合を大幅に低減し、それによって癌細胞局在性および／または腫瘍浸透性を増大させるのに十分でありうる。同様に、特定のエフェクター機能（例えば、補体C1q結合）を制御する1つまたは複数の定常領域ドメインの部分を単純に欠失させることが望ましい場合がある。定常領域のこのような部分的欠失は、この定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能をそのままにしておく一方で、結合剤の選択される特徴（例えば、血清中半減期）を改善しうる。さらに、上にも示唆したように、開示された融合タンパク質の定常領域は、得られる構築物のプロファイルを増強する、1つまたは複数のアミノ酸の変異または置換によって改変されてもよい。この点で、改変融合タンパク質の構成および免疫原性プロファイルを実質的に維持する一方で、保存された結合部位（例えば、Fc結合）によって提供される活性を妨害することが可能な場合がある。ある態様において、改変融合タンパク質は、エフェクター機能の減少もしくは増加などの望ましい特徴を増強するように、またはさらに多くの細胞毒素もしくは糖鎖の付着部位をもたらすように、定常領域への1つまたは複数のアミノ酸の付加を含む。
【０１３４】
定常領域がいくつかのエフェクター機能を媒介することが当技術分野において公知である。例えば、補体のC1成分と（抗原に結合した）IgGまたはIgM抗体のFc領域が結合すると補体系が活性化される。補体活性化は、オプソニン化および細胞病原体の溶解において重要である。補体活性化はまた炎症反応を刺激し、自己免疫過敏にも関与する場合がある。さらに、Fc領域は、Fc受容体（FcR）を発現している細胞へ結合することができる。IgG（γ受容体）、IgE（ε受容体）、IgA（α受容体）およびIgM（μ受容体）を含む、異なるクラスの抗体に特異的ないくつかのFc受容体がある。
【０１３５】
いくつかの態様において、改変融合タンパク質は、変化したエフェクター機能をもたらし、これが次に、投与された作用物質の生物学的プロファイルに影響を与える。例えば、いくつかの態様において、定常領域ドメインの（点変異または他の手段を通じた）欠失または不活性化は、血中を循環している改変物質のFc受容体結合を低減し、それによって癌細胞局在性および／または腫瘍浸透性を増大しうる。他の態様において、定常領域の修飾は作用物質の血清中半減期を増大または低減する。いくつかの態様において、定常領域を修飾して、ジスルフィド結合またはオリゴサッカライド部分付着部位を除去する。
【０１３６】
ある態様において、改変融合タンパク質は、Fc領域と通常は関連する1つまたは複数のエフェクター機能を有さない。いくつかの態様において、作用物質はADCC活性および／またはCDC活性を有さない。ある態様において、作用物質はFc受容体および／または補体因子へ結合しない。ある態様において、作用物質はエフェクター機能を有さない。
【０１３７】
本発明のIgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）は、当技術分野において公知の任意の方法により特異的結合についてアッセイすることができる。使用できるイムノアッセイ法には、Biacore分析、FACS分析、免疫蛍光、免疫細胞化学、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ法、ELISA法、「サンドイッチ」イムノアッセイ法、免疫沈降アッセイ法、沈殿反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ法、凝集アッセイ法、補体固定アッセイ法、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ法、およびプロテインAイムノアッセイ法などの技術を用いた、競合的アッセイ系および非競合的アッセイ系が含まれるが、これらに限定されることはない。このようなアッセイ法は日常的なものであり、当技術分野において周知である（例えば、Ausubel et al., Editors, 1994-present, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NYを参照のこと）。
【０１３８】
例えば、PVRなどのヒトIgCAMへのIgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）の特異的結合は、ELISA法を用いて測定されうる。ELISAアッセイ法には、抗原を作製する段階、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングする段階、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）基質などの検出可能な化合物へ結合されたIgCAM結合剤をウェルに添加する段階、一定時間インキュベートする段階、および抗原へ結合された抗体の存在を検出する段階が含まれる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤を検出可能な化合物へ結合させないが、その代わりに、IgCAM結合剤を認識する第2の結合された抗体がウェルに添加される。いくつかの態様において、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、IgCAM結合剤をウェルにコーティングしてもよく、コーティングされたウェルに抗原を添加した後に、検出可能な化合物へ結合された第2の抗体を添加してもよい。当業者であれば、検出されたシグナルを増加させるために変えることができるパラメータ、および当技術分野において公知のELISAの他のバリエーションに精通しているであろう。
【０１３９】
別の例において、ヒトIgCAMへのIgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）の特異的結合は、FACSを用いて測定されうる。FACSスクリーニングアッセイ法には、融合タンパク質（例えば、PVR-CD4TM）として抗原を発現するcDNA構築物を作出する段階、構築物を細胞にトランスフェクションする段階、細胞の表面に抗原を発現させる段階、IgCAM結合剤とトランスフェクトされた細胞とを混合する段階、および一定時間インキュベートする段階が含まれうる。IgCAM結合剤によって結合された細胞は、検出可能な化合物へ結合された二次抗体（例えば、PE結合抗Fc抗体）およびフローサイトメーターを用いることによって特定されうる。当業者であれば、検出されたシグナルを最適化するために変えることができるパラメータ、およびスクリーニング（例えば、ブロッキング抗体のスクリーニング）を増強しうるFACSの他のバリエーションに精通しているであろう。
【０１４０】
抗原／標的（例えば、IgCAM）に対するIgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）の結合親和性および結合剤-抗原／標的相互作用のオフ速度は、競合的結合アッセイ法によって測定することができる。競合的結合アッセイ法の一例は、漸増量の非標識抗原／標的の存在下で、標識された抗原／標的（例えば、3Hもしくは125I）またはその断片もしくは変異体と関心対象の結合剤とをインキュベーションした後に、標識された抗原／標的に結合した抗体を検出する段階を含む、ラジオイムノアッセイ法である。抗原／標的（例えば、IgCAM）に対する結合剤の親和性および結合オフ速度は、スキャッチャードプロット分析によってデータから決定することができる。いくつかの態様において、Biacore動態解析を用いて、抗原／標的（例えば、IgCAM）に結合する結合剤の結合オンオフ速度を決定する。Biacore動態解析は、チップ表面に固定化された抗原／標的（例えば、IgCAM）を有するチップからの結合剤の結合および解離を解析する段階を含む。
【０１４１】
ある態様において、本明細書に記載のIgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）は、少なくとも1つのヒトIgCAMに結合し、Hippo経路活性を調節する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路のアゴニストであり、Hippo経路シグナル伝達を活性化するおよび／または増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はHippo経路のアゴニストであり、YAPリン酸化を増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路のアゴニストであり、YAP分解を増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路のアゴニストであり、YAP依存性遺伝子および／またはYAP依存性遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を低下させる。いくつかの態様において、YAP依存性遺伝子の発現は、YAPと、TEAD1、TEAD2、TEAD3、TEAD4、Smad1、Smad4、RUNX、ErbB4、およびp73からなる群より選択される転写因子との組み合わせによって調節される。本明細書に記載されるように、YAP依存性遺伝子の例としては、CD44、CD47、CD133、TDGF1、EPHB2、CA12、LRP4、GPC4、CLDN2、CTGF、PAG1、SEMA4D、RHEB、MAGI1、ITPR3、CD168、NRP2、Gli2、BIRC2、BIRC5、FGF1、IL33、GRB2、IGFBP3、およびAREGが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路のアゴニストであり、TAZリン酸化を増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路のアゴニストであり、TAZ分解を増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路のアゴニストであり、TAZ依存性遺伝子の発現を低下させる。いくつかの態様において、TAZ依存性遺伝子の発現は、TAZと、TEAD1、TEAD2、TEAD3、TEAD4、RUNX、ERBB4、SMAD2/3/4、PAX3、TBX5、TTF-1、PPARγ、およびp73からなる群より選択される転写因子との組み合わせによって調節される。TAZ依存性遺伝子の例としては、CTGF、CD44、FN1、BIRC5（サバイビン）、ADAMTS1、GLI2、AXL、ADAMTS5、MET、CYR61、IL8、ZEB1、FOXC2、N-カドヘリン、およびSNAILが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路のアゴニストであり、CD44、CD47、CD133、TDGF1、EPHB2、CA12、LRP4、GPC4、CLDN2、CTGF、PAG1、SEMA4D、RHEB、MAGI1、ITPR3、CD168、NRP2、GLI2、BIRC2、BIRC5（サバイビン）、FGF1、IL33、GRB2、IGFBP3、AREG、FN1、ADAMTS1、AXL、ADAMTS5、MET、CYR61、IL8、ZEB1、FOXC2、N-カドヘリン、およびSNAILからなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を調節する（例えば、増加または減少させる）。
【０１４２】
ある態様において、IgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）は、少なくとも1つのヒトIgCAMのアゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも1つのIgCAMのアゴニストであり、Hippo経路活性を活性化するおよび／または増加させる。ある態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または約100%、Hippo経路活性を増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、1、2、3、4、またはそれ以上のIgCAMの活性を増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、またはTMEM25のうちの少なくとも1つの活性を増加させる。
【０１４３】
ある態様において、IgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）は細胞成長または細胞増殖を阻害する。ある態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または約100%、細胞成長または細胞増殖を阻害する。ある態様において、IgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）は、クローン形成能アッセイにおいて細胞成長または細胞形態に影響を与える。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、またはTMEM25からなる群より選択される。
【０１４４】
ある態様において、IgCAM結合剤はHippo経路のアンタゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路シグナル伝達を減少させる。いくつかの態様において、IgCAM結合は、Hippo経路シグナル伝達を阻害する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路シグナル伝達を抑制する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はYAP活性化を増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は核へのYAP移行を増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、YAPリン酸化を抑制するまたは減少させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、YAP分解を抑制するまたは減少させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、細胞質中のYAP保持を抑制するまたは減少させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はTAZ活性化を増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は核へのTAZ移行を増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、TAZリン酸化を抑制するまたは減少させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、TAZ分解を抑制するまたは減少させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、細胞質中のTAZ保持を抑制するまたは減少させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippoシグナル伝達経路における遺伝子の発現を低下させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路のアンタゴニストであり、CD44、CD47、CD133、TDGF1、EPHB2、CA12、LRP4、GPC4、CLDN2、CTGF、PAG1、SEMA4D、RHEB、MAGI1、ITPR3、CD168、NRP2、GLI2、BIRC2、BIRC5（サバイビン）、FGF1、IL33、GRB2、IGFBP3、AREG、FN1、ADAMTS1、AXL、ADAMTS5、MET、CYR61、IL8、ZEB1、FOXC2、N-カドヘリン、およびSNAILからなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を調節する（例えば、増加または減少させる）。
【０１４５】
ある態様において、IgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）は、少なくとも1つのヒトIgCAMのアンタゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも1つのIgCAMのアンタゴニストであり、Hippo経路活性を抑制および／または阻害する。ある態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または約100%、Hippo経路活性を減少させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、1、2、3、4、またはそれ以上のIgCAMの活性を減少させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、またはTMEM25のうちの少なくとも1つの活性を減少させる。
【０１４６】
ある態様において、IgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）は細胞成長または細胞増殖を増加させる。ある態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または約100%、細胞成長または細胞増殖を増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、またはTMEM25からなる群より選択される。
【０１４７】
ある態様において、IgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）はYAP活性のアンタゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、YAPのリン酸化を増加させることによる、YAP活性のアンタゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、YAPの細胞質保持または隔離を増加させることによる、YAP活性のアンタゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、YAPの核移行を減少させることによる、YAP活性のアンタゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、YAPの分解を増加させることによる、YAP活性のアンタゴニストである。ある態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または約100%、YAP活性を阻害する。
【０１４８】
ある態様において、IgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）はTAZ活性のアンタゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、TAZのリン酸化を増加させることによる、TAZ活性のアンタゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、TAZの細胞質保持または隔離を増加させることによる、TAZ活性のアンタゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、TAZの核移行を減少させることによる、TAZ活性のアンタゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、TAZの分解を増加させることによる、TAZ活性のアンタゴニストである。ある態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または約100%、TAZ活性を阻害する。ある態様において、IgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）はHippo経路シグナル伝達を増加させる。ある態様において、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択される1つまたは複数のIgCAMによるHippo経路シグナル伝達が増加する。ある態様において、IgCAM結合剤によるHippo経路シグナル伝達の増加は、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%のHippo経路シグナル伝達のレベルの増加をもたらす。ある態様において、IgCAM結合剤によるHippo経路シグナル伝達の増加は、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%のリン酸化YAPの量の増加をもたらす。ある態様において、IgCAM結合剤によるHippo経路シグナル伝達の増加は、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%の非リン酸化YAPの量の減少をもたらす。
【０１４９】
ある態様において、IgCAM結合剤によるHippo経路シグナル伝達の増加は、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%のリン酸化TAZの量の増加をもたらす。ある態様において、IgCAM結合剤によるHippo経路シグナル伝達の増加は、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%の非リン酸化TAZの量の減少をもたらす。
【０１５０】
ある態様において、IgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）は、YAPおよび／またはTAZの活性化を阻害する。YAPおよび／またはTAZの活性化を阻害するIgCAM結合剤は、ある態様において、1つまたは複数のIgCAMによってYAPおよび／またはTAZの活性化を阻害し得、しかし必ずしも全てのIgCAMによってYAPおよび／またはTAZの活性化を阻害するとは限らないことが理解される。ある態様において、YAPおよび／またはTAZの活性化は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択される1つまたは複数のIgCAMによって阻害される。ある態様において、IgCAM結合剤によるYAPの活性化の阻害は、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%の、YAPおよび／またはTAZの活性化のレベルの低下をもたらす。ある態様において、IgCAM結合剤によるYAPおよび／またはTAZの活性化の阻害は、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%の、リン酸化YAPおよび／またはTAZの量の増加をもたらす。ある態様において、IgCAM結合剤によるYAPおよび／またはTAZの活性化の阻害は、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%の、非リン酸化YAPの量の減少をもたらす。
【０１５１】
ある態様において、IgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）は、少なくとも1つのYAP依存性遺伝子の発現を低下させる。ある態様において、IgCAM結合剤は、YAP依存性遺伝子によってコードされる少なくとも1つのタンパク質の発現を低下させる。ある態様において、IgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）は、少なくとも1つのTAZ依存性遺伝子の発現を低下させる。ある態様において、IgCAM結合剤は、TAAZ依存性遺伝子によってコードされる少なくとも1つのタンパク質の発現を低下させる。ある態様において、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択される1つまたは複数のIgCAMは、少なくとも1つのYAP依存性遺伝子の発現を低下させるか、または少なくとも1つのTAZ依存性遺伝子の発現を低下させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、CD44、CD47、CD133、TDGF1、EPHB2、CA12、LRP4、GPC4、CLDN2、CTGF、PAG1、SEMA4D、RHEB、MAGI1、ITPR3、CD168、NRP2、GLI2、BIRC2、BIRC5（サバイビン）、FGF1、IL33、GRB2、IGFBP3、およびAREG、FN1、ADAMTS1、AXL、ADAMTS5、MET、CYR61、IL8、ZEB1、FOXC2、N-カドヘリン、およびSNAILからなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を低下させる。ある態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%の、少なくとも1つのYAP依存性遺伝子の発現のレベルの低下をもたらす。ある態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%の、少なくとも1つのTAZ依存性遺伝子の発現のレベルの低下をもたらす。
【０１５２】
IgCAM結合剤（または候補IgCAM結合剤）がHippo経路シグナル伝達を調節するかどうかを決定するためのインビボおよびインビトロアッセイは、当技術分野において公知であるかまたは開発中である。いくつかの態様において、Hippo経路シグナル伝達に対する作用物質の効果をYAPおよび／またはTAZ活性によって評価する。Hippo経路が阻害される場合、活性化非リン酸化YAPおよび／またはTAZは細胞の核へ移行し、ここで、それはDNA結合転写因子、例えばTEADと結合し、様々な標的遺伝子の転写を引き起こす。従って、例えば、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流にTEAD結合部位として役立つ、SV40エンハンサー由来の複数コピーのGT-IICモチーフを含有するレポーターベクター（TBS-Lucレポーター）を利用する、細胞に基づくルシフェラーゼレポーターアッセイ法を用いて、インビトロでYAPおよび／またはTAZ活性を測定してもよい。IgCAM結合剤がHippo経路を活性化し、それによってYAPおよび／またはTAZ活性が阻害される場合、ルシフェラーゼ活性は阻害される。TBS-Lucレポーターアッセイに加えて、Hippo経路シグナル伝達に対するIgCAM結合剤（または候補薬）の効果は、CD44、CD47、CD133、TDGF1、EPHB2、CA12、LRP4、GPC4、CLDN2、CTGF、PAG1、SEMA4D、RHEB、MAGI1、ITPR3、CD168、NRP2、GLI2、BIRC2、BIRC5、FGF1、IL33、GRB2、IGFBP3、およびAREGなどの、YAP依存性遺伝子および／またはTAZ依存性遺伝子の発現のレベルに対する作用物質の効果を測定することによって、インビトロまたはインビボで測定してもよい。ある態様において、Hippo経路シグナル伝達に対するIgCAM結合剤の効果はまた、Mst1、Mst2、Lats1、Lats2、YAP、および／またはTAZのリン酸化状態に対する作用物質の効果を測定することによって評価してもよい。
【０１５３】
いくつかの態様において、Hippo経路シグナル伝達の調節をYAPの移行によって評価する。上述したように、Hippo経路が阻害される場合、活性化非リン酸化YAPは核へ移行する。YAPタンパク質を例えばGFPでタグ化することによって、YAPの位置を測定することができる。従って、例えば、YAP-GFP融合タンパク質を使用する細胞ベースアッセイを用いて、作用物質での処理後にYAPの位置を観察することによってYAP活性化を測定してもよい。YAP活性化を測定するための別のアッセイは、Cre依存性蛍光タンパク質を有するYAP-Cre融合タンパク質の使用を含む。例えば、蛍光タンパク質DsRedの単量体形態を緑色蛍光タンパク質の5'にloxP部位によってフランキングさせ、これはレポータータンパク質として役立つ。YAPをCreのコード領域へ融合する。YAPが不活性でありかつ細胞質内にある場合、蛍光タンパク質DsRedが核中で発現され；しかし、YAPが活性されると、YAP-Creタンパク質は細胞核へ移行し、DsRedはCre/loxP組み換えによって除去され、緑色蛍光タンパク質が核中で発現される。
【０１５４】
いくつかの態様において、Hippo経路シグナル伝達の調節をTAZの移行によって評価する。YAPと同様に、Hippo経路が阻害される場合、活性化非リン酸化TAZは核へ移行する。TAZタンパク質を例えばGFPでタグ化することによって、TAZの位置を測定することができる。従って、例えば、TAZ-GFP融合タンパク質を使用する細胞ベースアッセイを用いて、作用物質での処理後にTAZの位置を観察することによってTAZ活性化を測定してもよい。TAZ活性化を測定するための別のアッセイは、Cre依存性蛍光タンパク質を有するTAZ-Cre融合タンパク質の使用を含む。例えば、蛍光タンパク質DsRedの単量体形態を緑色蛍光タンパク質の5'にloxP部位によってフランキングさせる。TAZをCreのコード領域へ融合する。TAZが不活性でありかつ細胞質内にある場合、蛍光タンパク質DsRedが核中で発現され；しかし、TAZが活性されると、TAZ-Creタンパク質は細胞核へ移行し、DsRedはCre/loxP組み換えによって除去され、緑色蛍光タンパク質が核中で発現される。
【０１５５】
いくつかの態様において、YAPまたはTAZ移行を、新しい二分子蛍光補完（BiFC）アッセイを使用して評価する。BiFCアッセイは、蛍光タンパク質の2つの非蛍光性断片は会合して蛍光性複合体を形成することができ、互いと相互作用する2つのタンパク質へそれらを融合させることによって断片の会合を促進させることができるという発見に基づく。いくつかの態様において、YAP（またはTAZ）のC末端を黄色蛍光タンパク質（YFP）のC末端へ融合し、YAP-YFPCを作製する。YFPのN末端をTEAD2またはTEAD3のN末端へ融合し、YFPN-TEAD2またはYFPN-TEAD3を作製する。これらの構築物を細胞へトランスフェクションする。Hippo経路が阻害される条件下では、YAP-YFPC構築物は細胞核中へ移行し、ここで、それは、YFPN-TEAD構築物と複合体を形成し、機能性蛍光タンパク質が生じ、これは落射蛍光顕微法によって検出することができる。
【０１５６】
ある態様において、IgCAM結合剤は、以下の効果のうちの1つまたは複数を有する：腫瘍細胞の増殖を阻害する、腫瘍成長を阻害する、腫瘍の腫瘍形成性を低下させる、腫瘍中の癌幹細胞の頻度を低下させることによって腫瘍の腫瘍形成性を低下させる、腫瘍細胞の細胞死を誘発する、細胞接触依存性増殖阻害を増加させる、腫瘍細胞アポトーシスを増加させる、上皮間葉転換（EMT）を低下させる、または腫瘍細胞の生存を減少させる。
【０１５７】
ある態様において、IgCAM結合剤は腫瘍成長を阻害することができる。ある態様において、IgCAM結合剤は、インビボで（例えば、異種移植マウスモデルにおいて、および／または癌を有するヒトにおいて）腫瘍成長を阻害することができる。
【０１５８】
ある態様において、IgCAM結合剤は、腫瘍の腫瘍形成性を低減することができる。ある態様において、IgCAM結合剤は、マウス異種移植モデルのような、動物モデルにおいて腫瘍の腫瘍形成性を低減することができる。ある態様において、IgCAM結合剤は、マウス異種移植モデルのような、動物モデルにおいて癌幹細胞を含む腫瘍の腫瘍形成性を低減することができる。ある態様において、腫瘍中の癌幹細胞の数または頻度は、少なくとも約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約50倍、約100倍、または約1000倍だけ低減される。ある態様において、癌幹細胞の数または頻度の低減は、動物モデルを用いた限界希釈アッセイ法によって測定される。腫瘍内の癌幹細胞の数または頻度の低減を測定するために限界希釈アッセイ法を用いることに関するさらなる例および手引きは、例えば、国際公開公報第WO 2008/042236号；米国特許出願公開第2008/0064049号；および米国特許出願公開第2008/0178305号において見出すことができる。
【０１５９】
ある態様において、IgCAM結合剤は、細胞の増殖を増加させ、創傷治癒を増加させ、および／または組織再生を増加させる。
【０１６０】
ある態様において、本明細書に記載のIgCAM結合剤は、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間の、マウス、カニクイザルまたはヒトでの循環血中半減期を有する。ある態様において、IgCAM結合剤は、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間の、マウス、カニクイザルまたはヒトでの循環血中半減期を有するIgG（例えば、IgG1またはIgG2）抗体である。ポリペプチドおよび抗体のような作用物質の半減期を増加させる（または減少させる）方法は、当技術分野において公知である。例えば、IgG抗体の循環血中半減期を増加させる公知の方法には、pH 6.0で抗体と新生児型Fc受容体（FcRn）とのpH依存的な結合を増加させるFc領域における変異の導入が含まれる（例えば、米国特許出願公開第2005/0276799号、同第2007/0148164号および同第2007/0122403号を参照のこと）。Fc領域を欠く抗体断片の循環血中半減期を増加させる公知の方法には、PEG化のような技術が含まれる。
【０１６１】
本発明のいくつかの態様において、IgCAM結合剤はポリペプチドである。本発明のいくつかの態様において、IgCAM結合剤は低分子ペプチドである。ポリペプチドは、少なくとも1つのヒトIgCAMに結合する、組み換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであることができる。タンパク質の構造または機能にほとんど影響を与えずに本明細書のいくつかのアミノ酸配列を変化させることができることが当技術分野において認識されよう。従って、本発明は、ヒトIgCAMに対する実質的な活性を示すポリペプチドのバリエーションをさらに含む。いくつかの態様において、IgCAM結合性ポリペプチドのアミノ酸配列バリエーションは、欠失、挿入、逆位、繰り返し、および／または他のタイプの置換を含む。
【０１６２】
ポリペプチド、その類似体および変異体は、通常はポリペプチドの部分ではない、さらなる化学的部分を含有するようにさらに改変することができる。誘導体化部分は、ポリペプチドの溶解度、生物学的半減期および／または吸収を改善することができる。この部分はまた、ポリペプチドおよび変異体の望ましくない副作用を低減または除外することもできる。化学的部分の概説は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, 2005, University of the Sciences, Philadelphia, PAにおいて見出すことができる。
【０１６３】
本明細書において記述されるポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の適当な方法によって産生することができる。そのような方法は、直接的なタンパク質合成法から、ポリペプチド配列をコードするDNA配列の構築と、適当な宿主におけるこれらの配列の発現に及ぶ。いくつかの態様において、DNA配列は、組み換え技術を用いて、関心対象の野生型タンパク質をコードするDNA配列を単離または合成することによって構築される。任意で、この配列は、その機能的類似体を得るために、部位特異的変異誘発によって変異誘発されてもよい。例えば、Zoeller et al., 1984, PNAS, 81:5662-5066および米国特許第4,588,585号を参照されたい。
【０１６４】
いくつかの態様において、関心対象のポリペプチドをコードするDNA配列は、オリゴヌクレオチド合成機を用いた化学合成によって構築されうる。オリゴヌクレオチドは、望ましいポリペプチドのアミノ酸配列と、関心対象の組み換えポリペプチドが産生される宿主細胞に好ましいコドンを選択することに基づいて設計することができる。標準的な方法を適用して、関心対象の単離ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を用いて、逆翻訳（back-translate）した遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するDNAオリゴマーを合成することができる。例えば、望ましいポリペプチドの一部をコードする、いくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、連結することができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的なアセンブリのための5'または3'突出部を含有する。
【０１６５】
アセンブル（合成、部位特異的変異誘発、または別の方法によって）されたら、関心対象の特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、望ましい宿主におけるタンパク質の発現に適した発現制御配列に機能的に連結することができる。適切なアセンブリは、ヌクレオチド配列決定、制限酵素マッピング、および／または適当な宿主での生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確認することができる。当技術分野において周知のように、宿主におけるトランスフェクトされた遺伝子の高い発現レベルを得るために、遺伝子は、選択された発現宿主において機能する転写および翻訳発現制御配列に機能的に連結されなければならない。
【０１６６】
ある態様において、少なくとも1つのヒトIgCAMに対する結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）をコードするDNAを増幅および発現するために、組み換え発現ベクターが用いられる。例えば、組み換え発現ベクターは、哺乳動物遺伝子、微生物遺伝子、ウイルス遺伝子または昆虫遺伝子に由来する適当な転写調節エレメントおよび／または翻訳調節エレメントに機能的に連結された、IgCAM結合剤、抗IgCAM抗体、またはその断片の、ポリペプチド鎖をコードする合成DNA断片またはcDNAに由来するDNA断片を有する複製可能なDNA構築物であることができる。転写単位は、一般的に、(1) 遺伝子発現において調節的な役割を果たす遺伝的エレメント、例えば、転写プロモーターまたはエンハンサー、(2)mRNAに転写され、タンパク質に翻訳される構造配列またはコード配列、ならびに(3) 適切な転写および翻訳の開始配列および終結配列のアセンブリを含む。調節エレメントは、転写を制御するためのオペレーター配列を含むことがある。通常、複製起点によって付与される、宿主において複製する能力、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子をさらに組み込むことができる。DNA領域は、それらが互いに機能的に関連している場合に、「機能的に連結され」ている。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のDNAは、ポリペプチド分泌に関与する前駆体としてポリペプチドが発現されるのであれば、ポリペプチドについてのDNAに機能的に連結されており；プロモーターは、コード配列の転写を制御すれば、コード配列に機能的に連結されており；またはリボソーム結合部位は、コード配列が翻訳されるように配置されていれば、コード配列に機能的に連結されている。いくつかの態様において、酵母発現系における使用を目的とした構造エレメントには、宿主細胞により翻訳されるタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列が含まれる。他の態様において、組み換えタンパク質がリーダー配列も輸送配列もなく発現される状況では、N末端メチオニン残基を含むことがある。この残基は任意で、最終産物を得るために、発現された組み換えタンパク質から後に切断されてもよい。
【０１６７】
発現制御配列および発現ベクターの選択は宿主の選択に依る。多種多様の発現宿主／ベクターの組み合わせを利用することができる。真核生物宿主に有用な発現ベクターには、例えば、SV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を含んだベクターが含まれる。細菌宿主に有用な発現ベクターには、公知の細菌プラスミド、例えば、pCR1、pBR322、pMB9およびその誘導体を含む大腸菌に由来するプラスミド、さらに広い宿主域のプラスミド、例えば、M13、ならびに他の繊維状一本鎖DNAファージが含まれる。
【０１６８】
IgCAM結合性ポリペプチドまたはIgCAM結合性抗体（または抗原として使用するIgCAMタンパク質）の発現に適した宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下にある、原核生物、酵母細胞、昆虫細胞または高等真核細胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌または杆菌（Bacillus）が含まれる。高等真核細胞には、下記に記述の哺乳動物に由来する樹立細胞株が含まれる。無細胞翻訳系も利用されうる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物の細胞宿主で用いるのに適したクローニングおよび発現ベクターは、Pouwels et al., 1985, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, NYに記述されている。抗体産生を含む、タンパク質産生の方法に関するさらなる情報は、例えば、米国特許出願公開第2008/0187954号；米国特許第6,413,746号および同第6,660,501号；ならびに国際特許公開公報第WO 2004/009823号において見出すことができる。
【０１６９】
組み換えポリペプチドを発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系または昆虫細胞培養系が用いられる。哺乳動物細胞における組み換えタンパク質の発現は、これらのタンパク質がおおむね正しく折り畳まれ、適切に修飾され、かつ生物学的に機能するので望ましいこともある。適当な哺乳動物宿主細胞株の例としては、COS-7（サル腎臓由来）細胞株、L-929（マウス線維芽細胞由来）細胞株、C127（マウス乳腺腫瘍由来）細胞株、3T3（マウス線維芽細胞由来）細胞株、CHO（チャイニーズハムスター卵巣由来）細胞株、HeLa（ヒト子宮頸癌由来）細胞株、BHK（ハムスター腎臓線維芽細胞由来）細胞株、およびHEK-293（ヒト胎児腎臓由来）細胞株ならびにこれらの細胞株の変種が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、発現させようとする遺伝子に連結される適当なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の5'または3'隣接非転写配列、ならびに5'または3'非翻訳配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、ならびに転写終結配列を含んでもよい。昆虫細胞において異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系は、当業者には周知である（例えば、Luckow and Summers, 1988, Bio/Technology, 6:47を参照のこと）。
【０１７０】
従って、本発明は、本明細書に記載のIgCAM結合剤を含む細胞を提供する。いくつかの態様において、細胞は本明細書に記載のIgCAM結合剤を産生する。ある態様において、細胞は抗体を産生する。ある態様において、細胞は融合タンパク質を産生する。いくつかの態様において、細胞は可溶性受容体を産生する。
【０１７１】
形質転換宿主により産生されたタンパク質は、任意の適当な方法に従って精製することができる。標準的な方法には、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質精製のための他の任意の標準的な技術が含まれる。適切なアフィニティーカラム上での通過による容易な精製を可能にするために、アフィニティータグ、例えば、ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼをタンパク質に付着させることができる。単離されたタンパク質はまた、タンパク質分解、質量分析（MS）、核磁気共鳴（NMR）、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）、およびx線結晶構造解析のような技術を用いて物理的に特徴付けることができる。
【０１７２】
いくつかの態様において、最初に、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて、組み換えタンパク質を培養培地に分泌する発現系からの上清を濃縮することができる。濃縮段階後に、濃縮物を適当な精製マトリックスに適用することができる。いくつかの態様において、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（DEAE）基を有するマトリックスまたは基材を利用することができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製において一般に利用される他のタイプでもよい。いくつかの態様において、陽イオン交換段階を利用することができる。適当な陽イオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性のマトリックスが含まれる。いくつかの態様において、セラミックハイドロキシアパタイト（CHT）を含むがこれに限定されない、ハイドロキシアパタイト媒体を利用することができる。ある態様において、IgCAM結合剤をさらに精製するために、疎水性RP-HPLC媒体、例えば、ペンダントメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲルを利用した、1つまたは複数の逆相HPLC段階を利用することができる。均一な組み換えタンパク質を得るために、前記の精製段階の一部または全部を、様々な組み合わせで、利用することができる。
【０１７３】
いくつかの態様において、細菌培養において産生された組み換えタンパク質は、例えば、最初に、細胞ペレットから抽出し、その後に、1回または複数回の濃縮、塩析、水性イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィー段階を行うことによって単離することができる。最後の精製段階にはHPLCを利用することができる。組み換えタンパク質の発現において利用される微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含む任意の従来法によって破壊することができる。
【０１７４】
抗体および他のタンパク質を精製するための当技術分野において公知の方法としてはまた、例えば、米国特許出願公開第2008/0312425号、同第2008/0177048号、および同第2009/0187005号に記載されるものが挙げられる。
【０１７５】
ある態様において、IgCAM結合剤は、抗体ではないかまたは抗体Fc領域を含まないポリペプチドである。ある態様において、ポリペプチドは、プロテインA、プロテインG、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサス反復ドメインおよびチオレドキシンからなる群より選択されるタイプのタンパク質足場を含む。タンパク質標的へ高親和性で結合する非抗体ポリペプチドを特定および製造するための様々な方法が当技術分野において公知である。例えば、Skerra, 2007, Curr. Opin. Biotechnol, 18:295-304; Hosse et al., 2006, Protein Science, 15:14-27; Gill et al., 2006, Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658; Nygren, 2008, FEBS J., 275:2668-76;およびSkerra, 2008, FEBS J., 275:2677-83を参照のこと。ある態様において、IgCAM結合性ポリペプチドを製造および／または特定するために、ファージディスプレイ技術を使用してもよい。ある態様において、IgCAM結合性ポリペプチドを製造および／または特定するために、哺乳動物細胞ディスプレイ技術を使用してもよい。
【０１７６】
ある態様において、IgCAM結合剤は、多数の結合型（例えば、免疫結合体もしくは放射性結合体）または非結合型のいずれか1つで用いることができる。ある態様において、抗体は、悪性細胞または癌細胞を排除するために、CDCおよびADCCを含む対象の天然の防御機構を生かすために非結合型で用いることができる。
【０１７７】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤（例えば、抗体、可溶性受容体、またはポリペプチド）を細胞傷害剤へ結合する。いくつかの態様において、細胞傷害剤は、メトトレキセート、アドリアマイシン、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤を含むが、これらに限定されない、化学療法剤である。いくつかの態様において、細胞傷害剤は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンシンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPIIおよびPAP-S）、ニガウリ（Momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（Sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン（enomycin）、ならびにトリコテセンを含むが、これらに限定されない、細菌、真菌、植物もしくは動物に由来する酵素活性を有する毒素、またはその断片である。いくつかの態様において、細胞傷害剤は、放射性結合体または放射性結合（radioconjugated）結合剤を製造するための放射性同位体である。放射性結合結合剤の製造のために、90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Reおよび212Biを含むが、これらに限定されない、様々な放射性核種を利用することができる。結合剤と1つまたは複数の低分子毒素、例えばカリケアマイシン、マイタンシノイド、トリコテンおよびCC1065、ならびにこれらの毒素の毒素活性を有する誘導体との結合体も用いることができる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤（例えば、抗体、可溶性受容体、またはポリペプチド）はマイタンシノイドへ結合される。結合剤と細胞傷害剤の結合体は、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジジチオール（pyridyidithiol）)プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能基誘導体（例えば、ジメチルアジプイミダートHCL）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド（glutareldehyde））、ビス-アジド化合物（例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン2,6-ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）などの、様々な二官能基性タンパク質カップリング剤を用いて作出される。
【０１７８】
III．ポリヌクレオチド
ある態様において、本発明は、少なくとも1つのヒトIgCAMに特異的に結合するポリペプチドまたそのようなポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを包含する。「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドについてのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコードおよび／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNAの形態であり得る。DNAは、cDNA、ゲノムDNA、および合成DNAを含み；二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖である場合、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。
【０１７９】
ある態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、およびSEQ ID NO:64からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１８０】
ある態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、およびSEQ ID NO:64からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一であり、いくつかの態様において、少なくとも96%、97%、98%または99%同一である、ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、およびSEQ ID NO:64からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドへハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをさらに提供する。ある態様において、ハイブリダイゼーションは高ストリンジェンシーの条件下である。
【０１８１】
ある態様において、ポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を補助するポリヌクレオチド（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）と同じ読み枠で融合した、成熟ポリペプチドのコード配列を含む。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、成熟型のポリペプチドを形成させるために宿主細胞によって切断されるリーダー配列を有する場合がある。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質とさらなる5'アミノ酸残基であるプロタンパク質をコードすることもできる。プロ配列を有する成熟タンパク質がプロタンパク質であり、不活性型のタンパク質である。プロ配列が切断されると、活性のある成熟タンパク質が残る。
【０１８２】
ある態様において、ポリヌクレオチドは、例えば、コードされるポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列と同じ読み枠で融合した、成熟ポリペプチドのコード配列を含む。例えば、細菌宿主の場合、マーカー配列は、マーカーと融合した成熟ポリペプチドを精製するための、pQE-9ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグでもよく、または哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が用いられる場合、マーカー配列は、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来する血球凝集素（HA）タグでもよい。いくつかの態様において、マーカー配列はFLAGタグ、つまり配列DYKDDDDK（SEQ ID NO:73）のペプチドであり、これを他のアフィニティータグとともに用いてもよい。
【０１８３】
本発明はさらに、例えば、断片、類似体、および／または誘導体をコードする、本明細書で上述したポリヌクレオチドの変異体に関する。
【０１８４】
ある態様において、本発明は、本明細書に記載のIgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約80%同一の、少なくとも約85%同一の、少なくとも約90%同一の、少なくとも約95%同一の、いくつかの態様において、少なくとも約96%、97%、98%または99%同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
【０１８５】
本明細書で用いる場合、参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、95%「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドという語句は、参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドあたり点変異を5個までポリヌクレオチド配列が含むことができる以外は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意味するように意図される。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95%同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列のヌクレオチドの5%までが欠失されても、または別のヌクレオチドで置換されてもよく、あるいは参照配列における全ヌクレオチドの5%までのいくつかのヌクレオチドが参照配列中に挿入されてもよい。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端の位置または末端位置間の任意の場所で行われてもよく、参照配列の中のヌクレオチドの間に個々に、あるいは参照配列内の1つもしくは複数の近接するグループの中に分散されてもよい。
【０１８６】
ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、またはその両方の変化を含有してもよい。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド変異体は、サイレントな置換、付加、または欠失を生じるが、コードされるポリペプチドの性質または活性を変えない変化を含有する。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド変異体は、遺伝暗号の縮重によるサイレントな置換によって作製される。ポリヌクレオチド変異体は、様々な理由で、例えば、特定の宿主に向けてコドン発現を最適化する（すなわち、ヒトmRNAのコドンを大腸菌のような細菌宿主に好まれるコドンに変える）ように作製することができる。
【０１８７】
ある態様において、ポリヌクレオチドは単離される。ある態様において、ポリヌクレオチドは実質的に純粋である。
【０１８８】
本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞も提供する。いくつかの態様において、発現ベクターはポリヌクレオチド分子を含む。いくつかの態様において、宿主細胞は、ポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターを含む。いくつかの態様において、宿主細胞はポリヌクレオチド分子を含む。
【０１８９】
IV．使用方法および薬学的組成物
本発明のIgCAM結合剤（例えば、抗体および可溶性受容体）は、癌の治療などの、治療的処置方法を含むがこれらに限定されない様々な適用において有用である。ある態様において、結合剤は、Hippo経路シグナル伝達を活性化および／または増強するのに、細胞接触依存性増殖阻害を増加させるのに、YAP活性化を阻害するのに、TAZ活性化を阻害するのに、腫瘍成長を阻害するのに、腫瘍体積を低下させるのに、腫瘍細胞アポトーシスを増加させるのに、および／または腫瘍の腫瘍形成性を低下させるのに有用である。使用方法は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ方法であってよい。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はHippo経路のアゴニストである。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はYAP活性を阻害する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はTAZ活性を阻害する。
【０１９０】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）を、YAPの活性化、TAZの活性化、減少したHippo経路シグナル伝達、および／または異常なHippo経路シグナル伝達と関連する疾患の治療において使用する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤を、IgCAMの異常な発現または異常な露出と関連する疾患の治療において使用する。いくつかの態様において、疾患は、YAP活性化に依存する疾患である。いくつかの態様において、疾患は、TAZ活性化に依存する疾患である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤を、増加したレベルの幹細胞および／または前駆細胞を特徴とする障害の治療において使用する。いくつかの態様において、方法は、治療有効量のIgCAM結合剤を対象へ投与する工程を含む。いくつかの態様において、対象はヒトである。
【０１９１】
本発明は、本明細書に記載のIgCAM結合剤を使用して腫瘍の成長を阻害するための方法を提供する。ある態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、インビトロで細胞とIgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）とを接触させる工程を含む。例えば、不死化細胞株または癌細胞株を培地中に培養し、ここへIgCAM結合剤を添加し、腫瘍成長を阻害する。いくつかの態様において、腫瘍細胞を、患者サンプル、例えば、組織生検、胸水、または血液サンプルから単離し、培地中に培養し、ここへIgCAM結合剤を添加し、腫瘍成長を阻害する。
【０１９２】
いくつかの態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、インビボで腫瘍または腫瘍細胞とIgCAM結合剤（例えば、抗体または可溶性受容体）とを接触させる工程を含む。ある態様において、腫瘍または腫瘍細胞とIgCAM結合剤とを接触させる工程は、動物モデルにおいて行われる。例えば、IgCAM結合剤は、異種移植片を有する免疫不全マウス（例えば、NOD/SCIDマウス）へ投与されうる。いくつかの態様において、腫瘍細胞を、患者サンプル、例えば、組織生検、胸水、または血液サンプルから単離し、免疫不全マウスに注射し、次いで、腫瘍細胞成長を阻害するようにこのマウスにIgCAM結合剤を投与する。いくつかの態様において、腫瘍成長を抑止するように、IgCAM結合剤は、動物への腫瘍形成性細胞の導入と同時に、またはその直後に投与される（「予防モデル」）。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、腫瘍が特定の大きさに成長した後に、治療用物質として投与される（「治療モデル」）。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は抗体である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は可溶性受容体である。 
【０１９３】
ある態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、治療有効量のIgCAM結合剤を対象へ投与する工程を含む。ある態様において、対象はヒトである。ある態様において、対象は、腫瘍を有するか、または除去された腫瘍を有していた。いくつかの態様において、対象は、上昇した発現レベルのYAPを有する腫瘍を有する。いくつかの態様において、「上昇した」発現レベルは、同一の組織タイプの正常組織中のYAPの発現レベルと比較した場合である。いくつかの態様において、「上昇した」発現レベルは、同一の組織タイプの他の腫瘍中のYAPの発現レベルと比較した場合である。いくつかの態様において、「上昇した」発現レベルは、参照サンプル中のYAPの発現レベルと比較した場合である。いくつかの態様において、「上昇した」発現レベルは、YAPの所定レベルと比較した場合である。これらの比較は、用語「増加した」、「減少した」、および同様の用語へも適用され得る。いくつかの態様において、対象は、増加したレベルの非リン酸化YAPを有する腫瘍を有する。いくつかの態様において、対象は、減少したレベルのリン酸化YAPを有する腫瘍を有する。いくつかの態様において、対象は、YAP依存性遺伝子の増加した発現を有する腫瘍を有する。いくつかの態様において、対象は、上昇した発現レベルのTAZを有する腫瘍を有する。いくつかの態様において、対象は、増加したレベルの非リン酸化TAZを有する腫瘍を有する。いくつかの態様において、対象は、減少したレベルのリン酸化TAZを有する腫瘍を有する。いくつかの態様において、対象は、TAZ依存性遺伝子の増加した発現を有する腫瘍を有する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は抗体である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は可溶性受容体である。
【０１９４】
さらに、本発明は、治療有効量のIgCAM結合剤を対象へ投与する工程を含む、対象において腫瘍の成長を阻害する方法を提供する。ある態様において、腫瘍は癌幹細胞を含む。ある態様において、腫瘍中の癌幹細胞の頻度をIgCAM結合剤の投与によって低下させる。本発明はまた、腫瘍と有効量のIgCAM結合剤とを接触させる工程を含む、腫瘍中の癌幹細胞の頻度を低下させる方法を提供する。いくつかの態様において、治療有効量のIgCAM結合剤を対象へ投与する工程を含む、対象において腫瘍中の癌幹細胞の頻度を低下させる方法を提供する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は抗体である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は可溶性受容体である。
【０１９５】
いくつかの態様において、腫瘍は充実性腫瘍である。ある態様において、腫瘍は、結腸直腸腫瘍、膵腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝腫瘍、乳房腫瘍、腎腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、メラノーマ、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、膠芽腫、および頭頸部腫瘍からなる群より選択される腫瘍である。ある態様において、腫瘍は結腸直腸腫瘍である。ある態様において、腫瘍は卵巣腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は肺腫瘍である。ある態様において、腫瘍は膵腫瘍である。ある態様において、腫瘍はメラノーマ腫瘍である。
【０１９６】
ある態様において、腫瘍は、Hippo経路シグナル伝達が不活性であるかまたは低レベルである腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、Hippo経路シグナル伝達が異常である腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍または腫瘍細胞は、接触依存性増殖阻害を失っている。いくつかの態様において、腫瘍または腫瘍細胞は、足場非依存性増殖を増強している。いくつかの態様において、腫瘍または腫瘍細胞は細胞増殖を増加させた。
【０１９７】
ある態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのYAPを有するかまたはYAPを過剰発現する。一般に、語句「腫瘍は上昇した発現レベルのタンパク質を有する」（または同様の語句）は、正常組織中の同一のタンパク質の発現レベルと比較しての腫瘍中のタンパク質の発現レベルを指す。ある態様において、腫瘍は、上昇したレベルの非リン酸化YAPを有する。いくつかの態様において、腫瘍は、核中において上昇したレベルのYAPを有する。一般に、語句「腫瘍は上昇したレベルのタンパク質を有する」（または同様の語句）は、正常組織中の同一のタンパク質のレベルと比較しての腫瘍中のタンパク質のレベルを指す。ある態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのTAZを有するかまたはTAZを過剰発現する。ある態様において、腫瘍は、上昇したレベルの非リン酸化TAZを有する。いくつかの態様において、腫瘍は、核中において上昇したレベルのTAZを有する。
【０１９８】
本発明はさらに、治療有効量のIgCAM結合剤を対象へ投与する工程を含む、癌を治療するための方法を提供する。ある態様において、癌は、正常組織中の発現レベルと比較して上昇したレベルのYAPを発現する細胞を特徴とする。ある態様において、癌は、正常組織中の発現レベルと比較して上昇したレベルの非リン酸化YAPを発現する細胞を特徴とする。ある態様において、癌は、正常組織中の発現レベルと比較して減少したレベルのリン酸化YAPを発現する細胞を特徴とする。いくつかの態様において、癌は、増加したレベルの少なくとも1つのYAP依存性遺伝子を発現する細胞を特徴とする。ある態様において、癌は、正常組織中の発現レベルと比較して上昇したレベルのTAZを発現する細胞を特徴とする。ある態様において、癌は、正常組織中の発現レベルと比較して上昇したレベルの非リン酸化TAZを発現する細胞を特徴とする。ある態様において、癌は、正常組織中の発現レベルと比較して減少したレベルのリン酸化TAZを発現する細胞を特徴とする。いくつかの態様において、癌は、増加したレベルの少なくとも1つのTAZ依存性遺伝子を発現する細胞を特徴とする。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択される少なくとも1つのヒトIgCAMの細胞外ドメインに結合し、癌の成長を阻害するかまたは低下させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択される少なくとも1つのヒトIgCAMの細胞外ドメインに結合し、核へのYAPおよび／またはTAZ移行を阻害し、癌の成長を阻害するかまたは低下させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択される少なくとも1つのヒトIgCAMの細胞外ドメインに結合し、YAPおよび／またはTAZのリン酸化を増強し、癌の成長を阻害するかまたは低下させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択される少なくとも1つのヒトIgCAMの細胞外ドメインに結合し、細胞質中のYAPおよび／またはTAZ保持を増強し、癌の成長を阻害するかまたは低下させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択される少なくとも1つのヒトIgCAMの細胞外ドメインに結合し、YAPおよび／またはTAZ分解を増強し、癌の成長を阻害するかまたは低下させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択される少なくとも1つのヒトIgCAMの細胞外ドメインに結合し、YAPおよび／またはTAZ活性化を阻害し、癌の成長を阻害するかまたは低下させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、AMICA、CAR、CLMP、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、VSIG8、JAM1、JAM2、JAM3、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、TMIGD1、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、TIGIT、およびTMEM25からなる群より選択される少なくとも1つのヒトIgCAMの細胞外ドメインに結合し、YAPおよび／またはTAZ活性化を阻害し、少なくとも1つのYAP依存性遺伝子または少なくとも1つのTAZ依存性遺伝子の発現を低下させるかまたは阻害する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は抗体である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は可溶性受容体である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はCADM1に結合しない。
【０１９９】
本発明は、治療有効量のIgCAM結合剤を対象（例えば、治療の必要がある対象）へ投与する工程を含む、癌を治療する方法を提供する。ある態様において、対象はヒトである。ある態様において、対象は癌性腫瘍を有する。ある態様において、対象は、除去された腫瘍を有していた。いくつかの態様において、癌を治療する方法は、治療有効量のIgCAM結合剤を対象へ投与する工程を含み、ここで、対象は、YAPおよび／またはTAZの上昇した発現を有する腫瘍を有する。
【０２００】
ある態様において、癌は、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、卵巣癌、肝癌、乳癌、腎癌、前立腺癌、胃腸癌、メラノーマ、子宮頸部癌、膀胱癌、膠芽腫、および頭頸部癌からなる群より選択される癌である。ある態様において、癌は膵癌である。ある態様において、癌は卵巣癌である。ある態様において、癌は結腸直腸癌である。ある態様において、癌は乳癌である。ある態様において、癌は前立腺癌である。ある態様において、癌は肺癌である。ある態様において、癌はメラノーマである。
【０２０１】
さらに、本発明は、治療有効量のIgCAM結合剤を対象へ投与する工程を含む、対象において腫瘍の腫瘍形成性を低下させる方法を提供する。ある態様において、腫瘍は癌幹細胞を含む。いくつかの態様において、腫瘍中の癌幹細胞の頻度を低下させることによって、腫瘍の腫瘍形成性を低下させる。いくつかの態様において、方法は、本明細書に記載のIgCAM結合剤を使用する工程を含む。ある態様において、腫瘍中の癌幹細胞の頻度をIgCAM結合剤の投与によって低下させる。
【０２０２】
ある態様において、方法はさらに、腫瘍または癌中のYAP発現のレベルを測定する工程を含む。いくつかの態様において、腫瘍または癌中のYAP発現のレベルを測定する工程は、細胞質および／または核YAPの発現のレベルを測定することを含む。いくつかの態様において、腫瘍または癌中のYAPの発現のレベルを、参照サンプル中のYAPの発現のレベルと比較する。本明細書で用いる場合、「参照サンプル」は、正常組織、同一の組織タイプの非癌性組織、同一の組織タイプの腫瘍組織、および異なる組織タイプの腫瘍組織を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、腫瘍または癌中のYAPの発現のレベルを、YAPの所定レベルと比較する。いくつかの態様において、腫瘍または癌中のYAPの発現のレベルを、YAPの発現の所定レベルと比較する。いくつかの態様において、腫瘍または癌中の細胞の核中のYAPの発現のレベルを、参照サンプル中の細胞の核中のYAPの発現のレベルまたはYAPの所定レベルと比較する。いくつかの態様において、腫瘍または癌中の細胞中のリン酸化YAPの発現のレベルを、参照サンプル中のリン酸化YAPの発現のレベルまたはリン酸化YAPの所定レベルと比較する。いくつかの態様において、腫瘍または癌中の細胞中の非リン酸化YAPの発現のレベルを、参照サンプル中の非リン酸化YAPの発現のレベルまたは非リン酸化YAPの所定レベルと比較する。いくつかの態様において、YAP発現のレベルの測定を治療前に行う。いくつかの態様において、腫瘍または癌が参照サンプル中のYAPの発現またはYAPの所定レベルと比較して上昇したレベルのYAP発現を有する場合、本明細書に記載のIgCAM結合剤を対象に投与する。いくつかの態様において、腫瘍または癌が参照サンプル中の非リン酸化YAPの発現または非リン酸化YAPの所定レベルと比較して上昇したレベルの非リン酸化YAP発現を有する場合、本明細書に記載のIgCAM結合剤を対象に投与する。
【０２０３】
ある態様において、方法はさらに、腫瘍または癌中のTAZ発現のレベルを測定する工程を含む。いくつかの態様において、腫瘍または癌中のTAZ発現のレベルを測定する工程は、細胞質および／または核TAZの発現のレベルを測定することを含む。いくつかの態様において、腫瘍または癌中のTAZの発現のレベルを、参照サンプル中のTAZの発現のレベルと比較する。いくつかの態様において、腫瘍または癌中のTAZの発現のレベルを、TAZの所定レベルと比較する。いくつかの態様において、腫瘍または癌中の細胞の核中のTAZの発現のレベルを、参照サンプル中の細胞の核中のTAZの発現のレベルまたはTAZの所定レベルと比較する。いくつかの態様において、腫瘍または癌中の細胞中のリン酸化TAZの発現のレベルを、参照サンプル中のリン酸化TAZの発現のレベルまたはリン酸化TAZの所定レベルと比較する。いくつかの態様において、腫瘍または癌中の細胞中の非リン酸化TAZの発現のレベルを、参照サンプル中の非リン酸化TAZの発現のレベルまたは非リン酸化TAZの所定レベルと比較する。いくつかの態様において、TAZ発現のレベルの測定を治療前に行う。いくつかの態様において、腫瘍または癌が参照サンプル中のTAZの発現またはTAZの所定レベルと比較して上昇したレベルのTAZ発現を有する場合、本明細書に記載のIgCAM結合剤を対象に投与する。いくつかの態様において、腫瘍または癌が参照サンプル中の非リン酸化TAZの発現または非リン酸化TAZの所定レベルと比較して上昇したレベルの非リン酸化TAZ発現を有する場合、本明細書に記載のIgCAM結合剤を対象に投与する。
【０２０４】
ある態様において、方法はさらに、腫瘍または癌中のYAP依存性遺伝子の発現のレベルを測定する工程を含む。いくつかの態様において、腫瘍または癌中のYAP依存性遺伝子の発現のレベルを、参照サンプル中のYAP依存性遺伝子の発現のレベルとまたは所定レベルと比較する。いくつかの態様において、方法はさらに、CD44、CD47、CD133、TDGF1、EPHB2、CA12、LRP4、GPC4、CLDN2、CTGF、PAG1、SEMA4D、RHEB、MAGI1、ITPR3、CD168、NRP2、GLI2、BIRC2、BIRC5（サバイビン）、FGF1、IL33、GRB2、IGFBP3、AREG、FN1、ADAMTS1、AXL、ADAMTS5、MET、CYR61、IL8、ZEB1、FOXC2、N-カドヘリン、およびSNAILからなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現のレベルを測定する工程を含む。
【０２０５】
ある態様において、方法はさらに、腫瘍または癌中のTAZ依存性遺伝子の発現のレベルを測定する工程を含む。いくつかの態様において、腫瘍または癌中のTAZ依存性遺伝子の発現のレベルを、参照サンプル中のTAZ依存性遺伝子の発現のレベルとまたは所定レベルと比較する。いくつかの態様において、方法は、CD44、CD47、CD133、TDGF1、EPHB2、CA12、LRP4、GPC4、CLDN2、CTGF、PAG1、SEMA4D、RHEB、MAGI1、ITPR3、CD168、NRP2、GLI2、BIRC2、BIRC5（サバイビン）、FGF1、IL33、GRB2、IGFBP3、AREG、FN1、ADAMTS1、AXL、ADAMTS5、MET、CYR61、IL8、ZEB1、FOXC2、N-カドヘリン、およびSNAILからなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現のレベルを測定する工程を含む。
【０２０６】
さらに、本発明は、参照サンプル中の非リン酸化YAPの発現とまたは非リン酸化YAPの所定レベルと比較して上昇したレベルの非リン酸化YAPを有する腫瘍を対象が有するかどうかを測定する工程を含む、IgCAM結合剤での治療についてのヒト対象を特定する方法を提供する。いくつかの態様において、腫瘍が上昇したレベルの非リン酸化YAPを有する場合、対象が、少なくとも1つのIgCAMに特異的に結合するIgCAM結合剤での治療について選択される。いくつかの態様において、治療について選択された場合、対象に本明細書に記載のIgCAM結合剤を投与する。ある態様において、対象は、除去された腫瘍を有していた。いくつかの態様において、参照サンプル中のYAP活性の発現とまたはYAP活性の所定レベルと比較して上昇したレベルのYAP活性を有する腫瘍を対象が有するかどうかを測定する工程を含む、IgCAM結合剤での治療についてのヒト対象を特定する方法を提供する。いくつかの態様において、参照サンプル中のYAP依存性遺伝子の発現とまたは所定レベルと比較してYAP依存性遺伝子の増加した発現を有する腫瘍を対象が有するかどうかを測定する工程を含む、IgCAM結合剤での治療についてのヒト対象を特定する方法を提供する。
【０２０７】
さらに、本発明は、参照サンプル中の非リン酸化TAZの発現とまたは非リン酸化TAZの所定レベルと比較して上昇したレベルの非リン酸化TAZを有する腫瘍を対象が有するかどうかを測定する工程を含む、IgCAM結合剤での治療についてのヒト対象を特定する方法を提供する。いくつかの態様において、腫瘍が上昇したレベルの非リン酸化TAZを有する場合、対象が、少なくとも1つのIgCAMに特異的に結合するIgCAM結合剤での治療について選択される。いくつかの態様において、治療について選択された場合、対象に本明細書に記載のIgCAM結合剤を投与する。ある態様において、対象は、除去された腫瘍を有していた。いくつかの態様において、参照サンプル中のTAZ活性の発現とまたはTAZ活性の所定レベルと比較して上昇したレベルのTAZ活性を有する腫瘍を対象が有するかどうかを測定する工程を含む、IgCAM結合剤での治療についてのヒト対象を特定する方法を提供する。いくつかの態様において、参照サンプル中のTAZ依存性遺伝子の発現とまたは所定レベルと比較してTAZ依存性遺伝子の増加した発現を有する腫瘍を対象が有するかどうかを測定する工程を含む、IgCAM結合剤での治療についてのヒト対象を特定する方法を提供する。本発明はまた、(a)上昇したレベルの非リン酸化YAPを有するおよび／または上昇したレベルの非リン酸化TAZを有する癌を対象が有することに少なくとも一部分は基づいて、治療についての対象を選択する工程、ならびに(b)治療有効量の本明細書に記載のIgCAM結合剤を対象へ投与する工程を含む、ヒト対象において癌を治療する方法を提供する。
【０２０８】
細胞、腫瘍、または癌中のYAPおよび／またはTAZ発現のレベルを測定するための方法は、当業者に公知である。核酸発現について、これらの方法としては、PCRベースのアッセイ、マイクロアレイ分析、およびヌクレオチド配列決定（例えば、NextGen配列決定）が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質発現について、これらの方法としては、ウエスタンブロット分析、タンパク質アレイ、免疫組織化学（IHC）アッセイ、ELISA、およびFACSが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０９】
腫瘍または癌が上昇したレベルのYAPおよび／またはTAZ発現を有するかどうかを決定するための方法は、様々なサンプルを使用することができる。いくつかの態様において、サンプルは、腫瘍または癌を有する対象から採取される。いくつかの態様において、サンプルは新鮮な腫瘍／癌サンプルである。いくつかの態様において、サンプルは凍結腫瘍／癌サンプルである。いくつかの態様において、サンプルは、ホルマリン固定パラフィンパラフィン包埋サンプルである。いくつかの態様において、サンプルを細胞溶解物へ処理する。いくつかの態様において、サンプルをDNAまたはRNAへ処理する。
【０２１０】
疾患または障害が異常な（例えば、減少したレベル）Hippo経路シグナル伝達と関連する、対象において疾患または障害を治療する方法をさらに提供する。いくつかの態様において、治療方法は、治療有効量のIgCAM結合剤を対象へ投与する工程を含む。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は抗体である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は可溶性受容体である。
【０２１１】
本発明はまた、細胞と有効量のIgCAM結合剤とを接触させる工程を含む、細胞においてHippo経路シグナル伝達を活性化または増強する方法を提供する。ある態様において、細胞は腫瘍細胞である。ある態様において、方法は、細胞とIgCAM結合剤とを接触させる工程が治療有効量のIgCAM結合剤を対象へ投与することを含む、インビボ方法である。いくつかの態様において、方法は、インビトロまたはエクスビボ方法である。ある態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路シグナル伝達を活性化する、誘導する、増強する、および／または増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はYAPの活性化を阻害する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はTAZの活性化を阻害する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は抗体である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は可溶性受容体である。
【０２１２】
本発明はまた、細胞と有効量のIgCAM結合剤とを接触させる工程を含む、細胞においてHippo経路シグナル伝達を不活性化または阻害する方法を提供する。ある態様において、方法は、細胞とIgCAM結合剤とを接触させる工程が治療有効量のIgCAM結合剤を対象へ投与することを含む、インビボ方法である。いくつかの態様において、方法は、インビトロまたはエクスビボ方法である。ある態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路シグナル伝達を阻害し、抑制し、および／または減少させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はYAPの活性化を増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤はTAZの活性化を増加させる。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は抗体である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は可溶性受容体である。
【０２１３】
別の局面において、本発明は、創傷を治療する方法、および／または対象において創傷治癒を促進もしくは増強する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、Hippo経路シグナル伝達を調節する治療有効量のIgCAM結合剤を対象へ投与する工程を含む。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路活性のアンタゴニストであり、Hippo経路シグナル伝達を抑制し、YAP活性を増加させ、YAPのリン酸化を抑制し、YAPの分解を抑制し、および／またはYAPの活性化を促進する。いくつかの態様において、投与される結合剤は、TAZ活性を増加させ、TAZのリン酸化を抑制し、TAZの分解を抑制し、および／またはTAZの活性化を促進する。いくつかの態様において、創傷は急性創傷である。いくつかの態様において、創傷は外科的創傷である。いくつかの態様において、創傷は慢性皮膚創傷である。
【０２１４】
別の局面において、本発明は、組織を再生させる方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、Hippo経路シグナル伝達を調節する有効量のIgCAM結合剤と細胞とを接触させる工程を含む。いくつかの態様において、方法は、Hippo経路シグナル伝達を調節する治療有効量のIgCAM結合剤を対象へ投与する工程を含む。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、Hippo経路活性のアンタゴニストであり、Hippo経路シグナル伝達を抑制し、YAP活性を増加させ、YAPのリン酸化を抑制し、YAPの分解を抑制し、および／またはYAPの活性化を促進する。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、TAZ活性を増加させ、TAZのリン酸化を抑制し、TAZの分解を抑制し、および／またはTAZの活性化を促進する。いくつかの態様において、方法は、免疫関連障害（例えば自己免疫障害）；炎症（急性および慢性炎症障害の両方を含む）；虚血（例えば、心筋梗塞）；外傷性損傷（例えば、熱傷、裂傷、および擦過傷）；感染症（例えば、細菌、ウイルス、および真菌感染症）；ならびに慢性疾患（例えば、肝硬変）によって引き起こされる組織損傷の治療を含む。
【０２１５】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の作用物質などの、IgCAM結合剤で腫瘍細胞を標的化する方法を提供する。腫瘍細胞上のIgCAMの過剰発現または腫瘍細胞上のIgCAMの異常な露出は、本明細書に記載の結合剤による監視または免疫学的監視についての標的としてIgCAMが役に立つことを可能にし得る。例えば、大部分の正常な細胞構造内では、IgCAMは細胞間表面で発現され、IgCAM結合剤によって検出されないだろう。しかし、正常な細胞構造を失った腫瘍は、IgCAMの異常な露出を有する細胞を含み得、このため、これらの細胞はIgCAM結合剤での監視によって検出可能となる。IgCAM結合剤は細胞傷害剤へ結合され得るので、腫瘍細胞上のIgCAMの異常な露出および／または発現はまた、腫瘍細胞への細胞毒素の標的化送達を可能にし得る。従って、いくつかの態様において、方法は、有効量のIgCAM結合剤を対象へ投与する工程を含む。いくつかの態様において、結合剤は抗体である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は可溶性受容体である。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は細胞傷害剤へ結合されているかまたは細胞傷害剤と複合体化されている。
【０２１６】
本発明はさらに、本明細書に記載のIgCAM結合剤を含む薬学的組成物を提供する。ある態様において、薬学的組成物は、薬学的に許容されるビヒクルをさらに含む。これらの薬学的組成物は、対象（例えば、ヒト患者）における腫瘍成長の阻害および癌の治療に用途がある。
【０２１７】
ある態様において、本発明の精製された結合剤と薬学的に許容されるビヒクル（例えば、担体または賦形剤）を組み合わせることによって、保管および使用のための製剤が作製される。適当な薬学的に許容されるビヒクルには、無毒の緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、および他の有機酸緩衝液；塩、例えば、塩化ナトリウム；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤、例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノールおよびm-クレゾール；低分子量ポリペプチド（例えば、約10未満のアミノ酸残基）；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；炭水化物、例えば、単糖、二糖、グルコース、マンノース、またはデキストリン；キレート剤、例えば、EDTA；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体、例えばZn-タンパク質錯体；および非イオン界面活性剤、例えばTWEENまたはポリエチレングリコール（PEG）が含まれるが、これらに限定されることはない。（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, 2005, University of the Sciences, Philadelphia, PA）。
【０２１８】
本発明の薬学的組成物は、局所治療または全身治療のための多様な手法で投与することができる。投与は、表皮パッチもしくは経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレイ、液剤および散剤による局所投与；噴霧器による投与を含む、散剤もしくはエアロゾル剤の吸入もしくはガス注入による肺投与、気管内投与および鼻腔内投与；経口投与；または静脈内投与、動脈内投与、腫瘍内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与（例えば、注射もしくは注入）もしくは頭蓋内投与（例えば、くも膜下腔内投与もしくは脳室内投与）を含む、非経口投与でもよい。
【０２１９】
治療用製剤は単位剤形でもよい。このような製剤には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、水もしくは非水性媒体中の液剤もしくは懸濁剤、または坐剤が含まれる。錠剤などの固形組成物では、主要な有効成分が薬学的担体と混合されている。従来の錠剤化成分には、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはゴム、および希釈剤（例えば、水）が含まれる。本発明の化合物またはその無毒な薬学的に許容される塩の均一混合物を含む固体の予備処方組成物を形成するために、これらを用いることができる。次いで、固体予備処方組成物を、上述の型の単位剤形へ細分する。持効性の長所を与える剤形を提供するために、製剤または組成物の錠剤、丸剤などをコーティングするか、他の方法で調合することができる。例えば、錠剤または丸剤は、外部成分によって覆われた内部組成物を含むことができる。さらに、崩壊に抵抗するよう働いて、内部成分にそのまま胃を通過させるかまたはその放出を遅らせることができる腸溶層によって、二つの成分を分離することができる。このような腸溶層またはコーティングには様々な材料を用いることができ、このような材料としては、多数のポリマー酸、ならびにポリマー酸と、セラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースのような材料との混合物が挙げられる。
【０２２０】
本明細書に記載のIgCAM結合剤をマイクロカプセル中に封入することもできる。このようなマイクロカプセルは、例えば、コアセルベーション技術または界面重合法によって、それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセルが、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, 2005, University of the Sciences in Philadelphia, PAに記述されているマクロエマルジョン中に作製される。
【０２２１】
ある態様において、薬学的製剤は、リポソームと複合体化された本発明のIgCAM結合剤を含む。リポソームの製造方法は、当業者に公知である。例えば、いくつかのリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発によって生成することができる。規定の孔径のフィルタに通してリポソームを押し出すことにより、所望の直径を有するリポソームを得ることができる。
【０２２２】
ある態様において、徐放性調製物を製造することができる。徐放性調製物の適当な例には、IgCAM結合剤を含む、固体疎水性重合体の半透性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは、成形された物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形をしている。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール)などのヒドロゲル、ポリラクチド、L-グルタミン酸と7エチル-L-グルタメートの共重合体、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT（商標）（乳酸-グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフェア）などの分解性乳酸-グリコール酸共重合体、ショ糖酢酸イソ酪酸エステル、およびポリD-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【０２２３】
ある態様において、IgCAM結合剤を投与する工程に加えて、方法または治療は、少なくとも1つのさらなる治療剤を投与する工程をさらに含む。さらなる治療剤はIgCAM結合剤の投与の前に、IgCAM結合剤の投与と同時に、および／またはIgCAM結合剤の投与の後に投与することができる。IgCAM結合剤およびさらなる治療剤を含む薬学的組成物も提供される。いくつかの態様において、少なくとも1つのさらなる治療剤は1種、2種、3種またはそれ以上のさらなる治療剤を含む。
【０２２４】
2種またはそれ以上の治療剤による併用療法では、必須ではないが、異なる作用機序によって働く薬剤を用いることが多い。異なる作用機序を有する薬剤を用いた併用療法は、相加効果または相乗効果をもたらしうる。併用療法は単剤療法において用いられるよりも各薬剤の用量を低くすることを可能にし、それによって毒性副作用を低減しおよび／または薬剤の治療指数を増大しうる。併用療法は、耐性癌細胞が発現する可能性を減らしうる。いくつかの態様において、併用療法は、非腫瘍形成性細胞に影響を与える（例えば、阻害または死滅化する）治療剤、および腫瘍形成性CSCに影響を与える（例えば、阻害または死滅化する）治療剤を含む。
【０２２５】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤と少なくとも1つのさらなる治療剤との組み合わせは、相加効果または相乗結果をもたらす。いくつかの態様において、併用療法は、IgCAM結合剤の治療指数の増加をもたらす。いくつかの態様において、併用療法は、さらなる薬剤の治療指数の増加をもたらす。いくつかの態様において、併用療法は、IgCAM結合剤の毒性および／または副作用の減少をもたらす。いくつかの態様において、併用療法は、さらなる薬剤の毒性および／または副作用の減少をもたらす。
【０２２６】
治療剤の有用なクラスには、例えば、抗チューブリン剤、アウリスタチン、DNA副溝結合剤、DNA複製阻害剤、アルキル化剤（例えば、白金錯体、例えば、シスプラチン、モノ(白金)、ビス(白金)およびトリ-核白金錯体、ならびにカルボプラチン）、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソ尿素、プラチノール、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどが含まれる。ある態様において、第2の治療剤は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗有糸分裂剤、トポイソメラーゼ阻害剤または血管新生阻害剤である。いくつかの態様において、第2の治療剤は、カルボプラチンまたはシスプラチンのような白金錯体である。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、白金錯体およびタキサンである。
【０２２７】
IgCAM結合剤と組み合わせて投与されうる治療剤には、化学療法剤が含まれる。従って、いくつかの態様において、方法または治療は、化学療法剤と組み合わせたまたは化学療法剤のカクテルと組み合わせた本発明の抗IgCAM結合剤の投与を伴う。IgCAM結合剤による治療は、化学療法を施す前に、化学療法と同時に、または化学療法を施した後に行ってもよい。併用投与は、1種類の薬学的製剤での、もしくは別個の製剤を用いた同時投与を含んでもよく、またはどちらの順番でもよいが、活性剤の全てがその生物学的活性を同時に発揮できるように、一般的にある期間内で行われる、連続投与を含んでもよい。そのような化学療法剤の作製および投薬計画は、製造業者の指示に従ってまたは当業者により実験的に決定されるように用いられうる。そのような化学療法剤の作製および投薬計画はまた、The Chemotherapy Source Book, 4th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PAに記述されている。
【０２２８】
本発明において有用な化学療法剤には、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（シトキサン（CYTOXAN））；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）、およびウレドーパ（uredopa）；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（triethylenethiophosphaoramide）、およびトリメチローロメラミン（trimethylolomelamime）を含む、エチレンイミンおよびメチルアメラミン（methylamelamine）；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン（carabicin）、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（marcellomycin）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ユベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えば、メトトレキセートおよび5-フルオロウラシル（5-FU）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン（thiamiprine）、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シトシンアラビノシド、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5-FU；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジクオン；エルフォルミチン（elformithine）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリニック酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK；ラゾキ���ン；シゾフラン（sizofuran）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポプロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（Ara-C）；タキソイド、例えば、パクリタキセル（タキソール）およびドセタキセル（タキソテール）；クロランブシル；ゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；白金類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（VP-16）；イホスファミド；マイトマイシンC；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；CPT11；トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン（ゼローダ）；および前記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が含まれるが、これらに限定されることはない。化学療法剤にはまた、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように働く抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（trioxifene）、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェン（フェアストン）を含む抗エストロゲン；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびに前記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体も含まれる。ある態様において、さらなる治療剤はシスプラチンである。ある態様において、さらなる治療剤はカルボプラチンである。
【０２２９】
ある態様において、化学療法剤は、トポイソメラーゼ阻害剤である。トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼ酵素（例えば、トポイソメラーゼIまたはII）の作用を妨害する化学療法剤である。トポイソメラーゼ阻害剤には、ドキソルビシンHCl、クエン酸ダウノルビシン、ミトキサントロンHCl、アクチノマイシンD、エトポシド、トポテカンHCl、テニポシド（VM-26）およびイリノテカン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が含まれるが、これらに限定されることはない。ある態様において、さらなる治療剤はイリノテカンである。
【０２３０】
ある態様において、化学療法剤は、代謝拮抗物質である。代謝拮抗物質は、正常な生化学反応に必要な代謝産物に似ているが、細胞の1つまたは複数の正常機能、例えば、細胞分裂を妨害するのに十分に異なる構造を有する化学物質である。代謝拮抗物質には、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキセートナトリウム、ラリトレキセド、ペメトレキセド、テガフール、シトシンアラビノシド、チオグアニン、5-アザシチジン、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、6-チオグアニン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、およびクラドリビン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が含まれるが、これらに限定されることはない。ある態様において、さらなる治療剤はゲムシタビンである。
【０２３１】
ある態様において、化学療法剤は、チューブリンに結合する薬剤を含むが、これに限定されない、抗有糸分裂剤である。いくつかの態様において、この薬剤はタキサンである。ある態様において、この薬剤は、パクリタキセルもしくはドセタキセル、またはパクリタキセルもしくはドセタキセルの薬学的に許容される塩、酸もしくは誘導体である。ある態様において、この薬剤は、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルブミン結合パクリタキセル（アブラキサン）、DHA-パクリタキセル、またはPG-パクリタキセルである。ある代替的な態様において、抗有糸分裂剤は、ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、もしくはビンデシン、またはその薬学的に許容される塩、酸もしくは誘導体を含む。いくつかの態様において、抗有糸分裂剤は、キネシンEg5の阻害剤、または有糸分裂キナーゼ、例えば、Aurora AもしくはPlk1の阻害剤である。ある態様において、さらなる治療剤はパクリタキセルである。
【０２３２】
いくつかの態様において、さらなる治療剤は、低分子などの作用物質を含む。例えば、治療は、本発明のIgCAM結合剤と、EGFR、HER2（ErbB2）および／またはVEGFを含むが、これらに限定されない、腫瘍関連抗原に対する阻害剤として作用する低分子との併用投与を伴ってもよい。いくつかの態様において、本発明のIgCAM結合剤は、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロチニブ（タルセバ）、スニチニブ（スーテント）、ラパタニブ（lapatanib）、バンデタニブ（ザクティマ（ZACTIMA））、AEE788、CI-1033、セディラニブ（レセンチン（RECENTIN））、ソラフェニブ（ネクサバール）、およびパゾパニブ（GW786034B）からなる群より選択されるプロテインキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与される。いくつかの態様において、さらなる治療剤はmTOR阻害剤を含む。
【０２３３】
ある態様において、さらなる治療剤は、癌幹細胞経路を阻害する低分子である。いくつかの態様において、さらなる治療剤はNotch経路の阻害剤である。いくつかの態様において、さらなる治療剤はWnt経路の阻害剤である。いくつかの態様において、さらなる治療剤はBMP経路の阻害剤である。いくつかの態様において、さらなる治療剤はmTOR/AKR経路の阻害剤である。
【０２３４】
いくつかの態様において、さらなる治療剤は、生体分子、例えば、抗体を含む。例えば、治療は、本発明のIgCAM結合剤と、EGFR、HER2/ErbB2および／またはVEGFに結合する抗体を含むがこれらに限定されない腫瘍関連抗原に対する他の抗体との併用投与を伴ってもよい。ある態様において、さらなる治療剤は、癌幹細胞マーカーに特異的な抗体である。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、Notch経路の成分に結合する抗体である。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、Wnt経路の成分に結合する抗体である。ある態様において、さらなる治療剤は、癌幹細胞経路を阻害する抗体である。いくつかの態様において、さらなる治療剤はNotch経路の阻害剤である。いくつかの態様において、さらなる治療剤はWnt経路の阻害剤である。いくつかの態様において、さらなる治療剤はBMP経路の阻害剤である。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、β-カテニンシグナル伝達を阻害する抗体である。ある態様において、さらなる治療剤は、血管新生阻害剤である抗体（例えば、抗VEGF抗体または抗VEGF受容体抗体）である。ある態様において、さらなる治療剤は、ベバシズマブ（アバスチン（AVASTIN））、ラムシルマブ、トラスツズマブ（ハーセプチン（HERCEPTIN））、ペルツズマブ（オムニターグ（OMNITARG））、パニツムマブ（ベクチビックス（VECTIBIX））、ニモツズマブ、ザルツムマブ、またはセツキシマブ（エルビタックス（ERBITUX））である。
【０２３５】
さらに、本明細書に記載のIgCAM結合剤での治療は、1つまたは複数のサイトカイン（例えば、リンホカイン、インターロイキン、腫瘍壊死因子および／または増殖因子）のような、他の生体分子による併用治療を含んでもよく、あるいは腫瘍の外科的除去、癌細胞の除去によって、または治療を行っている医師により必要とみなされた他の任意の療法によって達成されてもよい。
【０２３６】
いくつかの態様において、例えば、組織再生について、IgCAM結合剤は、アドレノメデュリン（AM）、アンギオポエチン（Ang）、BMP、BDNF、EGF、エリスロポエチン（EPO）、FGF、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GDF9、HGF、HDGF、IGF、遊走刺激因子、ミオスタチン（GDF-8）、NGF、ニューロトロフィン、PDGF、トロンボポエチン、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、PlGF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6およびIL-7からなる群より選択される成長因子と組み合わせることができる。
【０２３７】
ある態様において、治療は、放射線療法と組み合わせた本発明のIgCAM結合剤の投与を伴う。IgCAM結合剤による治療は、放射線療法を施す前に、放射線療法と同時に、または放射線療法を施した後に行ってもよい。当業者は、このような放射線療法の投薬計画を決定することができる。
【０２３８】
併用投与は、1種類の薬学的製剤での、もしくは別個の製剤を用いた同時投与を含んでもよく、またはどちらの順番でもよいが、活性剤の全てがその生物学的活性を同時に発揮できるように、一般的にある期間内で行われる、連続投与を含んでもよい。
【０２３９】
IgCAM結合剤と少なくとも1つのさらなる治療剤との組み合わせを、任意の順番で、または同時に投与できることが理解されよう。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、第2の治療剤による治療を以前に受けたことがある患者に投与される。ある他の態様において、IgCAM結合剤および第2の治療剤は、実質的に同時にまたは時を同じくして投与される。例えば、対象は、第2の治療剤（例えば、化学療法）による一連の治療を受けると同時に、IgCAM結合剤（例えば、抗体）を投与されることができる。ある態様において、IgCAM結合剤は、第2の治療剤による治療の1年以内に投与される。ある代替的な態様において、IgCAM結合剤は、第2の治療剤による任意の治療の10ヶ月以内、8ヶ月以内、6ヶ月以内、4ヶ月以内または2ヶ月以内に投与される。ある他の態様において、IgCAM結合剤は、第2の治療剤による任意の治療の4週間以内、3週間以内、2週間以内または1週間以内に投与される。いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、第2の治療剤による任意の治療の5日以内、4日以内、3日以内、2日以内または1日以内に投与される。さらに、数時間または数分のうちに（すなわち、実質的に同時に）、2種（またはそれ以上）の薬剤または治療を対象に施すことできることが理解されよう。
【０２４０】
疾患の治療のために、本発明のIgCAM結合剤の適切な投与量は、治療される疾患のタイプ、疾患の重篤度および経過、疾患の応答性、IgCAM結合剤が治療目的または予防目的で投与されているかどうか、以前の療法、患者の病歴などに依り、全て、治療を行っている医師の自由裁量で決まる。IgCAM結合剤は、一回で投与されてもよく、または数日〜数ヶ月に及ぶ一連の治療として投与されてもよく、あるいは治癒が達成され、または疾患状態の減退が達成される（例えば、腫瘍のサイズが縮小する）まで投与されてもよい。最適な投薬計画は、患者の体内の薬物蓄積の測定から計算することができ、個々の薬剤の相対効力に依って変化するであろう。投与を行っている医師は、最適な投与量、投薬方法および反復率を容易に決定することができる。ある態様において、投与量は、0.01μg〜100mg/kg体重、0.1μg〜100mg/kg体重、1μg〜100mg/kg体重、1mg〜100mg/kg体重、1mg〜80mg/kg体重、10mg〜100mg/kg体重、10mg〜75mg/kg体重、または10mg〜50mg/kg体重である。ある態様において、IgCAM結合剤の投与量は、約0.1mg〜約20mg/kg体重である。ある態様において、投与量は、1日に、1週間に、1ヶ月にまたは1年に1回または複数回与えることができる。ある態様において、IgCAM結合剤は、週に1回、2週間に1回、または3週間に1回与えられる。
【０２４１】
いくつかの態様において、IgCAM結合剤は、初回の、より高い「負荷」用量で投与され、その後に1回または複数回の、より低い用量で投与されうる。いくつかの態様において、投与の頻度は変化してもよい。いくつかの態様において、投薬レジメンは、初回用量の投与、その後に週に1回、2週間に1回、3週間に1回または月に1回のさらなる用量（または「維持」用量）の投与を含みうる。例えば、投薬レジメンは、初回負荷用量の投与、その後に、例えば初回用量の2分の1の、週1回の維持用量の投与を含みうる。あるいは投薬レジメンは、初回負荷用量の投与、その後に、例えば隔週に初回用量の2分の1の、維持用量の投与を含みうる。あるいは投薬レジメンは、3週間3回の初回用量の投与、その後に、例えば隔週に同量の、維持用量の投与を含みうる。
【０２４２】
当業者には公知であるように、いずれかの治療剤の投与は、副作用および／または毒性をもたらしうる。場合によっては、副作用および／または毒性は、治療的に有効な用量での特定の薬剤の投与を妨げるほど重篤である。場合によっては、薬物治療を中断しなければならず、他の薬剤を試してもよい。しかしながら、同じ薬効分類内の多くの薬剤は、類似の副作用および／または毒性を示すことが多く、このことは、患者が治療を止めるか、または可能なら、治療剤に関連した不快な副作用に苦しむのを止めるかしなければならないことを意味している。
【０２４３】
従って、本発明は、IgCAM結合剤、化学療法剤などの投与に関連した副作用および／または毒性を低減しうる、1つまたは複数の薬剤を投与するための間欠投与戦略を用いる工程を含む、対象において癌を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、ヒト対象において癌を治療する方法は、治療有効量の化学療法剤と組み合わせて治療有効量のIgCAM結合剤を対象へ投与する工程を含み、ここで、薬剤の一方または両方を間欠投与戦略に従って投与する。いくつかの態様において、間欠投与戦略は、対象にIgCAM結合剤の初回用量を投与すること、および約2週間に1回、IgCAM結合剤の後続用量を投与することを含む。いくつかの態様において、間欠投与戦略は、対象にIgCAM結合剤の初回用量を投与すること、および約3週間に1回、IgCAM結合剤の後続用量を投与することを含む。いくつかの態様において、間欠投与戦略は、対象にIgCAM結合剤の初回用量を投与すること、および約4週間に1回、IgCAM結合剤の後続用量を投与することを含む。いくつかの態様において、IgCAM結合剤を間欠投与戦略で投与し、化学療法剤を毎週投与する。
【０２４４】
V．スクリーニング
本発明は、Hippo経路を調節する作用物質を特定するためのスクリーニング方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、Hippo経路活性を調節する、タンパク質、抗体、可溶性受容体、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子、化合物、または他の薬物を含むがこれらに限定されない、候補薬をスクリーニングするための方法を提供する。
【０２４５】
いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングおよび／または特定する方法は、薬剤がHippo経路成分に対する効果を有するかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する作用物質をスクリーニングする方法は、IgCAMの細胞外ドメインに特異的に結合する作用物質であって、Hippo経路を調節する作用物質を、スクリーニングする工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、薬剤がYAP活性に対する効果を有するかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、薬剤がTAZ活性に対する効果を有するかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、薬剤がYAPおよび／またはTAZ活性を減少させるかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、薬剤がYAPおよび／またはTAZ活性を増加させるかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、薬剤がYAP依存性遺伝子またはTAZ依存性遺伝子の発現を減少させるかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、薬剤がYAP依存性遺伝子またはTAZ依存性遺伝子の発現を増加させるかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、薬剤が、CD44、CD47、CD133、TDGF1、EPHB2、CA12、LRP4、GPC4、CLDN2、CTGF、PAG1、SEMA4D、RHEB、MAGI1、ITPR3、CD168、NRP2、GLI2、BIRC2、BIRC5（サバイビン）、FGF1、IL33、GRB2、IGFBP3、AREG、FN1、ADAMTS1、AXL、ADAMTS5、MET、CYR61、IL8、ZEB1、FOXC2、N-カドヘリン、およびSNAILからなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を減少または増加させるかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、薬剤がYAPおよび／またはTAZリン酸化に対する効果を有するかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、薬剤がYAPおよび／またはTAZリン酸化を増加させるかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、薬剤がYAPおよび／またはTAZリン酸化を減少させるかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、薬剤が非リン酸化YAPおよび／または非リン酸化TAZを減少させるかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、薬剤が非リン酸化YAPおよび／または非リン酸化TAZを増加させるかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、薬剤が細胞質中のYAPおよび／またはTAZのレベルを増加させるかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様���おいて、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、薬剤が細胞質中のYAPおよび／またはTAZのレベルを減少させるかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、薬剤がYAPおよび／またはTAZ分解を増加させるかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、薬剤がYAPおよび／またはTAZ分解を減少させるかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、薬剤が核中のYAPおよび／またはTAZのレベルを減少させるかどうかを測定する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、薬剤が核中のYAPおよび／またはTAZのレベルを増加させるかどうかを測定する工程を含む。
【０２４６】
いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、第2細胞セットではなく、第1細胞セットと、候補または試験薬とを接触させる工程、ならびに第1細胞セット中のYAP依存性遺伝子および／またはTAZ依存性遺伝子の発現を第2細胞セット中のYAP依存性遺伝子および／またはTAZ依存性遺伝子の発現と比較する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、第2細胞セットではなく、第1細胞セットと、候補または試験薬とを接触させる工程、ならびに第2細胞セット中のYAP依存性遺伝子および／またはTAZ依存性遺伝子の発現と比較しての第1細胞セット中の少なくとも1つのYAP依存性遺伝子および／または少なくとも1つのTAZ依存性遺伝子の発現を測定する工程を含む。いくつかの態様において、少なくとも1つのYAP依存性遺伝子または少なくとも1つのTAZ依存性遺伝子は、CD44、CD47、CD133、TDGF1、EPHB2、CA12、LRP4、GPC4、CLDN2、CTGF、PAG1、SEMA4D、RHEB、MAGI1、ITPR3、CD168、NRP2、GLI2、BIRC2、BIRC5（サバイビン）、FGF1、IL33、GRB2、IGFBP3、AREG、FN1、ADAMTS1、AXL、ADAMTS5、MET、CYR61、IL8、ZEB1、FOXC2、N-カドヘリン、およびSNAILからなる群より選択される。いくつかの態様において、第1細胞セット中の少なくとも1つのYAP依存性遺伝子および／または少なくとも1つのTAZ依存性遺伝子の発現が、第2細胞セット中のYAP依存性遺伝子および／またはTAZ依存性遺伝子の発現と比較して増加した場合、薬剤はHippo経路を阻害した。いくつかの態様において、第1細胞セット中の少なくとも1つのYAP依存性遺伝子および／または少なくとも1つのTAZ依存性遺伝子の発現が、第2細胞セット中のYAP依存性遺伝子および／またはTAZ依存性遺伝子の発現と比較して減少した場合、薬剤はHippo経路を活性化した。
【０２４７】
いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、第2細胞セットではなく、第1細胞セットと、候補または試験薬とを接触させる工程、ならびに第1細胞セット中のMst1、Mst2、Lats1、Lats2、YAPおよび／またはTAZのリン酸化状態と、第2細胞セット中のMst1、Mst2、Lats1、Lats2、YAPおよび／またはTAZのリン酸化状態とを比較する工程を含む。いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、第2細胞セットではなく、第1細胞セットと、候補または試験薬とを接触させる工程、ならびに第2細胞セット中のMst1、Mst2、Lats1、Lats2、YAPおよび／またはTAZのリン酸化状態と比較しての、第1細胞セット中のMst1、Mst2、Lats1、Lats2、YAPおよび／またはTAZのリン酸化状態をを測定する工程を含む。
【０２４８】
いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、第2細胞セットではなく、第1細胞セットと、候補または試験薬とを接触させる工程、ならびに第2細胞セットと比較しての第1細胞セット中のリン酸化YAPおよび／またはリン酸化TAZの量を測定する工程を含む。いくつかの態様において、第1細胞セット中のリン酸化YAPおよび／またはリン酸化TAZの量が第2細胞セットと比較して増加した場合、薬剤はHippo経路を活性化した。いくつかの態様において、第1細胞セット中のリン酸化YAPおよび／またはリン酸化TAZの量が第2細胞セットと比較して減少した場合、薬剤はHippo経路を阻害した。
【０２４９】
いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、第2細胞セットではなく、第1細胞セットと、候補または試験薬とを接触させる工程、ならびに第2細胞セットと比較しての第1細胞セット中の非リン酸化YAPおよび／または非リン酸化TAZの量を測定する工程を含む。いくつかの態様において、第1細胞セット中の非リン酸化YAPおよび／または非リン酸化TAZの量が第2細胞セットと比較して増加した場合、薬剤はHippo経路を阻害した。いくつかの態様において、1細胞セット中の非リン酸化YAPおよび／または非リン酸化TAZの量が第2細胞セットと比較して減少した場合、薬剤はHippo経路を活性化した。
【０２５０】
いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、第2細胞セットではなく、第1細胞セットと、候補または試験薬とを接触させる工程、ならびに第1細胞セット中のYAPおよび／またはTAZの位置（核または細胞質）と第2細胞セットとを比較する工程を含む。いくつかの態様において、候補薬がHippo経路を刺激または活性化する場合、第1細胞セットは、第2細胞セットよりも高いレベルの細胞質中YAPおよび／またはTAZを有する。
【０２５１】
いくつかの態様において、Hippo経路を調節する候補または試験薬をスクリーニングする方法は、(a)細胞と候補または試験薬とを接触させる工程、ならびに(b)二分子蛍光補完（BiFC）アッセイを使用してYAPおよび／またはTAZの細胞局在を測定する工程を含む。方法のいくつかの態様において、YAPおよび／またはTAZが主に細胞質中に局在化される場合、Hippo経路は活性化される。方法のいくつかの態様において、YAPおよび／またはTAZが主に細胞核中に局在化される場合、Hippo経路は阻害される。
【０２５２】
本発明はまた、本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれかによって特定されたHippo経路を調節する作用物質を提供する。
【０２５３】
VI．IgCAM結合剤を含むキット
本発明は、本明細書に記載のIgCAM結合剤を含み、かつ、本明細書に記載の方法を実施するために使用することができる、キットを提供する。ある態様において、キットは、1つまたは複数の容器中に少なくとも1つの精製されたIgCAM結合剤を含む。いくつかの態様において、キットは、全ての対照を含む、検出アッセイを行うのに必要および／または十分な成分の全て、アッセイを行うための説明書、ならびに分析および結果の表示に必要な任意のソフトウェアを含む。当業者であれば、開示される本発明のIgCAM結合剤を、当技術分野において周知の確立されたキット形式の1つに容易に組み込むことができることを容易に認識するであろう。
【０２５４】
さらに、IgCAM結合剤および少なくとも1つのさらなる治療剤を含むキットを提供する。ある態様において、第2（またはそれ以上）の治療剤は化学療法剤である。ある態様において、第2（またはそれ以上）の治療剤は、血管新生阻害剤である。
【０２５５】
本開示の態様を、以下の非限定的な実施例を参照してさらに明確にすることができ、実施例は、本開示のある抗体の製造および本開示の抗体を使用するための方法を詳述する。本開示の範囲から逸脱することなく、材料と方法の両方に多くの変更を加えることができることは当業者には明らかであろう。
【実施例】
【０２５６】
実施例1
OMP腫瘍中におけるYAPの発現
OncoMed腫瘍バンク中の患者由来腫瘍のマイクロアレイ遺伝子発現分析を行い、YAP発現のレベルを測定した。膀胱（2）、脳（2）、乳房（15）、結腸（25）、肝臓（1）、肺（19）、メラノーマ（11）、卵巣（9）および膵臓（17）を含む101個の腫瘍を評価した。NOD/SCIDマウスへ連続的に移植されていたこれらの腫瘍から、全RNAを単離した。Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara CA)を使用して、RNA品質をモニターした。確立されたAffymetrixプロトコルを使用して、精製RNAを処理した。製造業者の技術マニュアルに概説されるように、サンプルをAffymetrix HG-U133 plus 2.0マイクロアレイ(Affymetrix, Santa Clara, CA)へハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを洗浄し、スキャンし、分析した。GCRMAアルゴリズム（Bioconductor,www.bioconductor.org）を使用して、スキャンされたアレイのバックグラウンド調整およびシグナル強度正規化を行った。図1に示されるように、腫瘍のおよそ80%が中間から高レベルのYAP発現を示した。
【０２５７】
実施例2
ドミナントネガティブYAPによる腫瘍成長の阻害
ドミナントネガティブヒトYAP（dnYAP）をコードする突然変異YAP遺伝子を設計し、合成した。dnYAPタンパク質は、YAP TEAD結合ドメイン、2つのWWドメイン、およびPDZドメイン（SEQ ID NO:68）を含む。YAP活性化ドメインを欠失させ、アミノ酸127でのセリンをアラニン残基で置き換えた（S127A）。この置換は、重要なリン酸化部位を除去し、dnYAPが細胞質から核へ移行することを可能にする。
【０２５８】
インビトロおよびインビボの両方で腫瘍細胞中においてdnYAPを発現させるために、dnYAP遺伝子を、最初期CMVプロモーターを含有するレンチウイルスベクター中へクローニングした。レンチウイルスベクターはまた、形質導入細胞の視覚化および選択を可能にするIRES-GFP部分を含有する。レンチウイルスベクターは、HIV-1由来・複製欠損性・tat独立性・自己不活性化「第3世代」ベクターである（例えば、Durand et al., Viruses, 2011, 3:132-159を参照のこと）。dnYAP発現レンチウイルスベクターをpOM420と命名した。dnYAP発現レンチウイルスベクターおよび3つのヘルパープラスミドをHEK-293T細胞中へ一過性にトランスフェクトし、dnYAPレンチウイルスを作製した。3つのヘルパープラスミドは、ウイルス産生に必要な補足機能を提供した。多種多様のヒト腫瘍細胞中へのウイルス侵入を媒介するために、ウイルスを水疱性口内炎ウイルスエンベロープGタンパク質（VSV-G）で偽型化した。
【０２５９】
分離したメラノーマOMP-M6細胞（5 x 105細胞／ウェル）を6ウェルPrimaria（商標）プレート（BD Biosciences, San Jose CA）中へ播種し、これらにdnYAP-レンチウイルス（LOM420、CMV-dnYAP-IRES-GFP）または対照としてのGFP-レンチウイルス（LOM92、CMV-IRES-GFP）を形質導入した。平板培養時（t＝0）に1細胞当たり2.5感染粒子の感染多重度（MOI）で、レンチウイルスを細胞へ添加した。細胞をレンチウイルスと共に一晩インキュベートし、洗浄し、培養培地中で再インキュベートした。培養培地は、DMEM低グルコース、F12培地、B27培地、インスリン-トランスフェリン-セレン-サプリメント、ヘパリン、rhEGF、rhFGF-2、および抗生物質であった。72時間後、細胞を収集し、トリプシン処理し、洗浄し、2% FBSおよび4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI、Molecular Probes/Invitrogen, Grand Island NY）を含有するHBSS中に再懸濁させた。GFP陽性かつDAPI陰性（GFP+/DAPI-）と確認された、形質導入されたメラノーマOMP-M6細胞を、FACSAriaフローサイトメーター（BD Biosciences, San Jose CA）を使用するフローサイトメトリーによって選別した。細胞集団純度を、選別した細胞のほんの一部の再分析によって確認し、細胞を50% Matrigel（商標）（BD Biosciences, San Jose CA）と混合した。対照レンチウイルス-形質導入GFP+/DAPI-細胞を、NOD/SCIDマウスの側腹部へ皮下注射した（200細胞/マウス、n＝10）。dnYAPレンチウイルス-形質導入GFP+/DAPI-細胞を、NOD/SCIDマウスの側腹部へ皮下注射した（200細胞/マウス、n＝8）。腫瘍成長を3ヶ月間モニターした。
【０２６０】
GFPのみを発現するメラノーマOMP-M6細胞が注射されたマウスは、注射のおよそ40日後、注射部位に明白な腫瘍を有した。これらの腫瘍は、2.5ヶ月で2000mm3の平均体積に達した。対照的に、dnYAPを発現するメラノーマOMP-M6細胞が注射されたマウスは、非常に遅く成長したまたは全く成長しなかった腫瘍を有した。dnYAP発現メラノーマOMP-M6細胞の成長速度は、対照群と比較しておよそ17倍より遅かった（それぞれ、2.8mm3/日対47.5mm3/日）。この効果は、顕著であり、全ての測定で統計的に有意であった。図2Aに示されるように、注射後75日目に、dnYAPを発現するメラノーマOMP-M6腫瘍の成長は、GFP対照を発現するOMP-M6腫瘍と比較して有意に低下した（93%低下、それぞれ、平均腫瘍体積2669mm3と比較して平均腫瘍体積186mm3）。これらの結果は、YAPはメラノーマ中において癌遺伝子として作用し得、dnYAPは腫瘍成長の阻害に非常に有効であったことを示唆している。
【０２６１】
結腸腫瘍OMP-C18、OMP-C11、OMP-C37、膵腫瘍OMP-PN7、肺腫瘍OMP-LU52およびOMP-LU2、ならびに卵巣腫瘍OMP-OV22を含むさらなる腫瘍を用いて、同様の実験を行った。形質導入腫瘍細胞およびマウス数を、各サンプルの腫瘍形成性特性に基づいて変更した。図2Bに示されるように、dnYAPが形質導入された結腸腫瘍OMP-C18細胞は、腫瘍を生じさせず（0/5）、一方、GFP対照を発現する細胞は、9/10マウスにおいて腫瘍を生じさせ、47日目において平均体積は323mm3であった。図2Cに示されるように、dnYAPが形質導入された結腸腫瘍OMP-C37細胞は、たった1つの腫瘍を生じさせ（1/10）、この腫瘍はGFP陰性であることが示され、従って、dnYAPを発現しない細胞から腫瘍が発生した。対照的に、GFP対照を発現するOMP-C37腫瘍細胞は、9/10マウスにおいて腫瘍を生じさせ、67日目において平均体積は342mm3であった。図2Dに示されるように、dnYAPが形質導入された膵腫瘍OMP-PN7細胞は、4/10マウスにおいて腫瘍を生じさせた。OMP-C37で見られたように、最大の腫瘍はGFP陰性であることが示され、一方、他の3つの腫瘍は、わずか7%GFP陽性、15% GFP陽性、および41% GFP陽性であることが示され、このことは制限量のdnYAP発現を示している。対照的に、GFP対照を発現するOMP-PN7腫瘍細胞は、8/9マウスにおいて腫瘍を生じさせ、80日目において平均体積は766mm3であった。図2Eに示されるように、dnYAPが形質導入された結腸腫瘍OMP-C11細胞は、腫瘍を生じさせたが（7/10）、全てが非常に小さく、53日目において平均体積は65mm3であった。対照的に、GFP対照を発現するOMP-C11腫瘍細胞は、10/10マウスにおいて腫瘍を生じさせ、53日目において平均体積は945mm3であった。図2Fに示されるように、dnYAPが形質導入された肺腫瘍OMP-LU2細胞は、4/10マウスにおいて腫瘍を生じさせ、87日目において平均体積は251mm3であり、一方、GFP対照を発現する細胞は、9/10マウスにおいて腫瘍を生じさせ、87日目において平均体積は1023mm3であった。図2Gに示されるように、dnYAPが形質導入された卵巣腫瘍OMP-OV22細胞は、8/9マウスにおいて腫瘍を生じさせ、しかし、腫瘍は対照よりも小さく、平均体積は268mm3であった。GFP対照を発現するOMP-OV22腫瘍細胞は、8/8マウスにおいて腫瘍を生じさせ、108日目において平均体積は416mm3であった。図2Hに示されるように、dnYAPを発現するOMP-LU52腫瘍の成長は、62日目において、GFP対照を発現するOMP-LU52腫瘍と比較して低下した（腫瘍体積の53%低下、平均腫瘍体積1041mm3と比較して平均腫瘍体積490mm3）。
【０２６２】
これらの結果は、メラノーマ腫瘍OMP-M6で観察された結果と同様であり、即ち、dnYAPによるYAP活性の阻害は腫瘍成長を低下させまたは妨げ、YAPは、結腸癌、膵癌および肺癌中において、ならびにメラノーマ中において癌遺伝子として作用している可能性があることを示唆した。肺腫瘍OMP-LU52および卵巣腫瘍OMP-OV22中のdnYAPの発現による腫瘍成長の阻害は、研究した他の腫瘍におけるものよりも低かった。興味深いことに、マイクロアレイ分析によって示されたように、OMP-LU52は、他の腫瘍と比較した場合、非常に低レベルのYAP発現を有した（図2I）。これは、dnYAPは、研究した腫瘍の大部分においてYAP活性に対する直接効果を有しており、肺腫瘍LU52においては、LU52細胞中には少量のYAPしか存在しなかったために、dnYAPはより限定的な効果を有したという考えを支持している。
【０２６３】
実施例3
dnYAPを発現する腫瘍細胞のマイクロアレイ分析
実施例2に記載したように、結腸腫瘍OMP-C18、結腸腫瘍OMP-C37、膵腫瘍OMP-PN7、および肺腫瘍OMP-LU52由来の腫瘍細胞に、dnYAP-レンチウイルス（LOM420、CMV-dnYAP-IRES-GFP）または対照としてのGFP-レンチウイルス（LOM92、CMV-IRES-GFP）を形質導入した。形質導入細胞を3日間培養し、GFP発現についてFACS選別した。これらの形質導入された腫瘍細胞の遺伝子発現プロフィールをマイクロアレイ分析によって測定した。RNAを形質導入細胞から単離し、確立されたAffymetrixプロトコルを使用して処理した。製造業者の技術マニュアルに概説されるように、サンプルをAffymetrix HG-U 133 plus 2.0マイクロアレイ（Affymetrix, Santa Clara, CA）へハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを洗浄し、スキャンし、分析した。GCRMAアルゴリズム（Bioconductor, www.bioconductor.org）を使用して、スキャンされたアレイのバックグラウンド調整およびシグナル強度正規化を行った。dnYAPを発現する腫瘍細胞について確立された遺伝子発現プロフィールを、GFP発現腫瘍細胞について確立された遺伝子発現プロフィールと比較し、IPAソフトウェア（Ingenuity Systems, Redwood City CA）を使用して分析した。dnYAPを発現する結腸腫瘍OMP-C18およびOMP-C37ならびに膵腫瘍OMP-PN7からの遺伝子発現プロフィールは、対照腫瘍細胞と比較して少なくとも2倍、有意に下方制御された（p値≦0.05）208個の遺伝子の重複を示した。dnYAPの発現によって下方制御された遺伝子は、細胞接着、極性、癌幹細胞、膜および分泌輸送、DNA修復、RNA代謝、有糸分裂、細胞死、ならびにユビキチン化を含む多くの細胞経路および／または機能に関与することが、分析によって示された。腫瘍のうち少なくとも2つにおいて下方制御されたいくつかの膜タンパク質には、CA12、CLDN2、PAG1、SEMA4D、GPC4、CD44、CD47、CD133、RHEB、MAGI1、ITPR3、CD168、NRP2、EPHB2およびTDGF1が含まれ、腫瘍のうち少なくとも2つにおいて下方制御されたいくつかの成長因子およびサイトカインは、AREG-B、IL33、GRB2およびIGFBP3であった（表1）。特定された遺伝子のいくつかは、癌幹細胞遺伝子であるおよび／または癌幹細胞マーカーをコードすると報告された；例えば、CD133、CD44、TDGF1、CD47、およびEPHB2。
【０２６４】
【表１】
2015520192.tif 000002
【０２６５】
実施例4
YAP活性に対するdnYAPの効果
HEK-293T細胞に、プラスミドの異なる組み合わせを一過性にトランスフェクトし、YAP活性に対するdnYAPの効果を評価した。TEAD結合部位として役立つSV40エンハンサーのGT-IICモチーフを6コピー含有するプロモーターを含むルシフェラーゼレポーター（TBS-Lucレポーター）を、細胞にトランスフェクトした。さらに、TEAD、YAPもしくはGFP-YAP、および／またはdnYAPもしくはGFP-dnYAPを発現するプラスミドの様々な組み合わせを細胞にトランスフェクトした。全てのトランスフェクションは、内部対照としてウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼを発現するプラスミドを含んだ。1.5 x 105 HEK-293T細胞／ウェルを、96ウェルプレート（BD Biosciences, San Jose CA）中へ播種し、製造業者の指示に従って、FuGENE 6トランスフェクション試薬（Roche Applied Science, Indianapolis IN）を使用して、プラスミドの等モルミックス250ngをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を48〜72時間インキュベートし、製造業者の指示（Promega, Madison WI）に従ってDual-Glo（登録商標）Luciferase Assay Systemを使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。活性をウミシイタケルシフェラーゼ活性に対するホタルルシフェラーゼ活性の比率として表した。
【０２６６】
YAPおよびGFP-YAPは両方とも、TBS-LucレポーターのTEAD媒介転写を強力に誘導した（図3、#4）。dnYAPおよびGFP-dnYAPは両方とも、ルシフェラーゼ活性の有意な低下によって実証されたように、YAP活性を強力に阻害した（図3、#5および#6）。さらに、インビボ腫瘍研究において使用した、dnYAPを発現するレンチウイルスベクター（pOM420）も、ルシフェラーゼ活性の有意な低下によって実証されたように、YAP活性を強力に阻害したことが実証された（図3、#7）。これらの結果は、ルシフェラーゼベースのアッセイが、YAP活性に対する効果について分子を評価および／またはスクリーニングするために使用できることを実証した。従って、このアッセイは、Hippo経路に対する効果について分子を評価および／またはスクリーニングするために使用できる。
【０２６７】
アッセイを単純化し、複数のプラスミドでのトランスフェクションを避けるために、HEK-293T細胞にTBS-Lucレポーターベクターを安定にトランスフェクトし、ハイグロマイシンBを使用してクローンを選択した。クローンにYAPを一過性にトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性を測定した。YAP発現後にルシフェラーゼ活性の強力な誘導を示した2つのクローンを特定した。これらの安定なレポーター細胞株は、Hippo経路に対する効果について分子を評価および／またはスクリーニングするために使用できる。
【０２６８】
実施例5
Hippo経路成分に対する細胞分離の効果
細胞分離は、MCF10A乳房細胞株においてHippo経路成分のリン酸化の変化を誘導することが報告された（Zhao et al., 2012, Genes Dev., 26:54-68）。細胞分離がHEK-293T細胞において同様の効果を有するかどうかを調べるために、研究を行った。HEK-293T細胞をおよそ80%コンフルエンスへ培地中で増殖させ、トリプシン処理し、PBSで洗浄し、3つの実験群に分割した。第1群の細胞を、組織抽出試薬バッファー（Invitrogen, Grand Island NY）で直接溶解させた。第2群および第3群の細胞を、1 x 106細胞／ウェルの細胞密度で6ウェルPrimaria（商標）プレート（BD Biosciences, San Jose CA）中へ播種し、それぞれ、1時間および20時間インキュベートした。インキュベーション後、付着した細胞をPBSで洗浄し、組織抽出試薬バッファーでプレート中において直接溶解させた。タンパク質Lats1、Lats2、およびYAPを、タンパク質のリン酸化形態およびタンパク質の全ての形態を認識する抗体を使用するウエスタンブロット分析によって分析した。全細胞タンパク質抽出物を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Roche Molecular, Pleasanton CA）を含有する組織抽出試薬バッファーを用いて調製した。タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって分離し、ニトロセルロース膜へ移した。5%脱脂乳を含有するTBS-T（トリス緩衝生理食塩水および0.1% Tween 20）中で膜をインキュベートし、非特異的結合をブロックした。3% BSAを含有するTBS-T中で4℃にて一晩、一次抗体と共に膜をインキュベートした。結合された一次抗体を適切なHRP結合二次抗体で検出し、5%ミルクを含有するTBS-T中で室温にて1時間インキュベートし、SuperSignal West Chemiluminescent Substrate（Pierce-Thermo Fisher Scientific, Rockford IL）で視覚化した。使用した一次抗体は、ウサギ抗-リン酸化YAP (pYAP) (Ser127)抗体、ウサギ抗-YAP抗体、ウサギ抗-リン酸化Lats1 (pLats1) (Thr1079)抗体、ウサギ抗-pLats1 (Ser909)抗体、ウサギ抗-Lats1抗体（全てCell Signaling, Danvers MA製）、およびウサギ抗-Lats2抗体（Abcam, Cambridge MA）であった。使用した二次抗体は、HRP結合Affinipureロバ抗-ウサギ抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove PA）であった。続いて、膜をストリップし（Restore Plus Stripping Buffer、Pierce-Thermo Fisher Scientific, Rockford IL）、マウス抗-アクチン抗体（Millipore, Billerica MA）およびHRP結合Affinipureロバ抗-マウス抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove PA）で再プローブし、各サンプルについての等価タンパク質ロードを評価および確認した。
【０２６９】
図4に示されるように、pLats1（S909またはT1079）およびLats2タンパク質の量は、第3群細胞（t＝20時間インキュベーション／付着）と比較して、第1群細胞（t＝0）および第2群細胞（t＝1時間インキュベーション／付着）において有意に低かった。全Lats1タンパク質の検出可能な低下はいずれの群においても観察されなかった。さらに、pYAPタンパク質の量は、第3群細胞（t＝20時間インキュベーション／付着）と比較して、第1群細胞（t＝0）において低下し、第2群細胞（t＝1時間インキュベーション／付着）において検出不可能であった。Lats1で観察された結果と同様に、いずれの群においても全YAPの低下は存在しなかった。これらの結果は、Hippo経路はHEK-293T細胞中においてインビトロで実験的に調節され得ること、およびHippo経路の成分のリン酸化状態での修飾（例えば、pLats1、pYAP）が検出され得ることを実証している。
【０２７０】
実施例6
IgCAM構築物
可能性のあるHippo経路受容体を特定するために、ヒトゲノムによってコードされるIgCAMタンパク質の相同性ベースのバイオインフォマティクス分析を行った。候補Hippo経路受容体のファミリーツリーまたはデンドログラムを図5に示す。タンパク質は、一般に3つの群に入る：1）JAM1、JAM2、JAM3、CAR、CLMP、AMICA、ESAM、GPA33、VSIG1、VSIG2、VSIG3、VSIG4、およびVSIG8を含む「JAM様」ファミリー；2）CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CRTAM、およびTMIGD1を含む「CADM様」ファミリー；ならびに3）PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVRIG、CD200、CD200R1、CD200R1L、CD226、CD96、およびTIGITを含む「PVR様」ファミリー。
【０２７１】
Hippo経路シグナル伝達におけるこれらの分子の可能性のある機能を調べるために、膜固定型タンパク質および可溶性「デコイ」受容体を含むIgCAM構築物を作製した（図6）。膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをヒトCD4タンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインで置き換えたように、各々の膜固定型デコイ受容体をシグナル伝達に関して非機能性となるように設計した。標準組み換えDNA技術を使用して、ヒトIgCAMタンパク質の細胞外ドメイン（ECD）領域をCD4の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインならびにC末端GFPタンパク質タグへ連結するによって、膜固定型IgCAMタンパク質構築物を作製した。これらの構築物を「IgCAM」-CD4TM-GFP、例えば、CAR-CD4TM-GFPと呼ぶ。免疫グロブリンFcドメインへ連結されたIgCAMのECDを含むように、可溶性デコイ受容体を設計した。標準組み換えDNA技術を使用して、ヒトIgCAMタンパク質のECD領域をヒトIgG1のFcドメインへ連結するによって、可溶性受容体IgCAMタンパク質構築物を作製した。これらの構築物を「IgCAM」-Fc、例えば、CAR-Fcと呼ぶ。当業者に公知であるように、構築物に使用される任意の所定のIgCAMタンパク質のECD領域は、ECDを含んでもよく、またはECDの一部もしくは断片を含んでもよい。さらに、ECDであると考えられるものは、ECDのアミノ末端、カルボキシル末端、または両方の末端で、1、2、3、またはそれ以上のアミノ酸だけ異なってもよい。これらの融合タンパク質を使用して、Hippo経路におけるIgCAMタンパク質の役割を調べてもよい。
【０２７２】
作製した構築物は、表2中のIgCAMタンパク質由来のECD領域、またはその一部もしくは断片を含む。
【０２７３】
【表２】
2015520192.tif 000003
2015520192.tif 000004
【０２７４】
実施例7
Hippo経路成分に対するIgCAMタンパク質の効果
HEK-293T細胞に、実施例6に記載のIgCAM構築物を一過性にトランスフェクトした。3.5 x 105 HEK-293T細胞／ウェルを6ウェルPrimaria（商標）プレート（BD Biosciences, San Jose CA）へ播種した。およそ18時間後、製造業者の指示に従って、FuGENE 6トランスフェクション試薬（Roche Applied Science, Indianapolis IN）を使用して、1 ugのIgCAM-CD4TM-GFP構築物（上述した）を細胞中へトランスフェクトした。使用したIgCAM-CD4TM-GFP構築物は、CAR-CD4TM-GFP、CLMP-CD4TM-GFP、VSIG1-CD4TM-GFP、VSIG2-CD4TM-GFP、VSIG3-CD4TM-GFP、VSIG8-CD4TM-GFP、ESAM-CD4TM-GFP、JAM1-CD4TM-GFP、JAM2-CD4TM-GFP、JAM3-CD4TM-GFP、CADM1-CD4TM-GFP、CADM2-CD4TM-GFP、CADM3-CD4TM-GFP、CADM4-CD4TM-GFP、CD226-CD4TM-GFP、CD200-CD4TM-GFP、CD200R1-CD4TM-GFP、CD200R1L-CD4TM-GFP、PVR-CD4TM-GFP、PVRL1-CD4TM-GFP、PVRL2-CD4TM-GFP、PVRL3-CD4TM-GFP、PVRL4-CD4TM-GFP、TIGIT-CD4TM-GFP、TMIGD1-CD4TM-GFP、およびTMEM25-CD4TM-GFPを含んだ。対照としてFLAG-mIgG1-CD4TM-GFP、LGR5-CD4TM、CD4TM、およびRSPO4-CD4TM-GFPを使用した。
【０２７５】
細胞培養物増殖およびGFP局在を分析するために、Nikon水銀灯およびカメラへ接続されたNikon Eclipse TS 100組織培養倒立顕微鏡を使用して、一過性トランスフェクションの間、細胞培養物をモニターした。トランスフェクトされた細胞の代表例を示す図7Aにおいて実証されるように、IgCAM-CD4TM-GFPタンパク質は細胞表面で発現され、蛍光顕微鏡法によって検出可能であった。
【０２７６】
28時間後、いくつかのトランスフェクトされた細胞をトリプシン処理し、単一細胞懸濁液を得、洗浄し、FBSおよびDAPIを含有するHBSS（Molecular Probes/Invitrogen, Grand Island, NY）中に再懸濁させた。GFP発現レベルによって測定されるような、トランスフェクション効率、および、DAPI染色によって測定されるような、生存能を、FACSCanto（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences, San Jose CA）において分析した。図7Bは、IgCAM-CD4TM-GFPがトランスフェクトされた細胞の代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを示し、細胞の98%がGFP陽性であったことを実証している。26のIgCAM-CD4TM-GFP構築物がトランスフェクトされた細胞について、GFP陽性細胞のパーセンテージは、およそ75%〜99.5%の範囲であった（平均値93%±6.8%）。これらの結果は、IgCAM-CD4TM-GFP構築物を使用するトランスフェクションは非常に効率的であったことを実証した。
【０２７７】
他の細胞を組織培養プレート中において直接溶解させた。全細胞タンパク質抽出物を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Roche Molecular, Pleasanton CA）を含有する組織抽出試薬バッファー（Invitrogen, Grand Island NY）を用いて調製した。タンパク質をSDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜へ移した。5%脱脂乳を含有するTBS-T中で膜をインキュベートし、非特異的結合をブロックした。3% BSAを含有するTBS-T中で4℃にて一晩、一次抗体と共に膜をインキュベートした。結合された一次抗体を適切なHRP結合二次抗体で検出し、5%ミルクを含有するTBS-T中で室温にて1時間インキュベートし、SuperSignal West Chemiluminescent Substrate（Pierce-Thermo Fisher Scientific Inc. Rockford, IL）で視覚化した。使用した一次抗体は、ウサギ抗-pYAP (Ser127)抗体、ウサギ抗-YAP抗体、ウサギ抗-pLats1 (Thr1079)抗体、ウサギ抗-pLats1 (Ser909)抗体、およびウサギ抗-Lats1抗体（全てCell Signaling, Danvers MA製）であった。使用した二次抗体は、HRP結合Affinipureロバ抗-ウサギ抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove PA）であった。続いて、Restore Plus Stripping Buffer（Pierce-Thermo Fisher Scientific, Rockford IL）を使用して膜をストリップし、マウス抗-アクチン抗体（Millipore, Billerica MA）およびHRP結合Affinipureロバ抗-マウス抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove PA）で再プローブし、各サンプルについての等価タンパク質ロードを評価および確認した。
【０２７８】
タンパク質発現定量化のために、ウエスタンブロットをスキャンし、得られた画像のバンド強度をデンシトメトリーソフトウェア（ImageJソフトウェア、NIH）を使用して解析した。各タンパク質バンドの強度シグナルを、同一のサンプルのアクチンシグナルに対して正規化した。表3中の数は、FLAG-mIgG1対照に対しての相対的タンパク質量に対応する。プラスの結果は、対照に対しての増加した倍変化を示し、マイナスの結果は、対照に対しての減少した倍変化を示す。
【０２７９】
【表３】
2015520192.tif 000005
【０２８０】
図8および表3に示されるように、IgCAM-ECD構築物の発現は、Hippo経路のいくつかの成分に影響を与えるようであった。例えば、pLats1およびpYAPは、対照と比較してCD200-ECDの発現によって増加した。対照的に、pLats1およびpYAPは、対照と比較してCADM3-ECDの発現によって減少した。これらの結果は、CD200およびCADM3などのいくつかのIgCAMタンパク質のECDの過剰発現は、インビトロでHippo経路の成分（Lats1およびYAP）に影響を与えることができたことを実証しており、Hippo経路を調節するためにIgCAM-結合剤を使用することができることを示唆している。
【０２８１】
実施例8
YAP核移行の測定のための二分子蛍光補完アッセイ
YAP局在は、Hippo経路の活性についての読み出しとして役立ち得る。ヒトYAP1、TEAD2、およびTEAD3を有する二分子蛍光補完（BiFC）構築物を作製した（図9A）。具体的には、黄色蛍光タンパク質のC末端（YFP、アミノ酸156-239）をリンカー配列
2015520192.tif 000006
によってYAP1のC末端へ融合し、pcDNA3.1(+)ベクター中の構築物YAP1-YFPCを作製した。YFPのN末端（アミノ酸1-155）をリンカー配列
2015520192.tif 000007
によってTEAD2またはTEAD3のN末端へ融合し、pcDNA3.1/hygroベクター中の構築物YFPN-TEAD2およびYFPN-TEAD3を作製した。YAPl-YFPC構築物およびYFPN-TEAD2、またはYAPl-YFPC構築物およびYFPN-TEAD3を、HeLa細胞中へ安定にトランスフェクトし、G-418およびハイグロマイシンBを使用してダブルトランスフェクタントを選択した。YAPの活性化は、YAP-YFPCタンパク質の優勢な核局在をもたらし、YFPN-TEADタンパク質との相互作用を可能にし、YFP蛍光を生じさせる。安定したクローンからのトリプシン処理された細胞を、低密度で再平板培養し（YAPが活性化される）、YFP蛍光を広視野落射蛍光顕微法によって評価した（図9B）。さらなる細胞株を作製し、YAP1-YFPC構築物をHeLa細胞中へ安定にトランスフェクトし、G-418を使用してトランスフェクタントを選択した。HeLa YAP1-YFPC細胞株を、YFPN-TEAD2またはYFPN-TEAD3を発現するレンチウイルスで形質導入することができる。
【０２８２】
YAP1およびTEAD2の同起源の結合ドメインを構成する切断構築物を使用するBiFCアッセイのバリエーションを、Vassilev et al., 2001, Genes and Development, 15:1229-1241およびLi et al., 2010, Genes and Development, 24:235-240からのアッセイに基づいて作製した。特に、ヒトYAP1のアミノ酸47-154および50-171を、それらのC末端でYFPC（aa 156-239）へ融合し、それぞれ、YAP1(47-154)-YFPCおよびYAP1(50-171)-YFPCを作製した。さらに、ヒトTEAD2のアミノ酸115-447および221-447を、それらのN末端でYFPN（aa 1-115）へ融合し、ここでYFPNドメインの前に核局在化配列が置かれており、NLS-YFPN-TEAD2(115-447)およびNLS-YFPN-TEAD2(221-447)を作製した（図9A）。上述したように、これらの構築物を、HeLa細胞またはMCF10A細胞中へレンチウイルス感染によって安定にトランスフェクトまたは安定に形質導入し、得られた細胞株をBiFCアッセイにおいて使用し、広視野落射蛍光顕微法またはフローサイトメトリーによってYAP1局在を観察する。YAP1局在を使用して、Hippo経路シグナル伝達状態を測定する。
【０２８３】
YAP1(50-171)-YFPCおよびNLS-YFPN-TEAD2(221-447)の発現を形質導入するようにレンチウイルスに感染したHeLa細胞を、YFP陽性（BiFC陽性）細胞についてFACSによって選別し、続いて広視野顕微法によって画像化した（図9Bおよび9C）。
【０２８４】
これらの細胞株を使用し、YAP活性化／不活性化および潜在的にHippo経路に影響を与える分子（例えば、抗体、タンパク質、または低分子）をスクリーニングおよび特定する。
【０２８５】
実施例9
YAP核移行の測定のためのアッセイ
個々の細胞中のYAP局在はまた、YAP-GFP融合タンパク質を使用して評価することができる。GFPはYAPの直接モニタリングを可能にし、何故ならば、YAPの活性化はYAP-GFPの優勢な核局在をもたらすだろうためである。YAP-GFP構築物をpLenti6.3/TO/V5-DESTベクター（Invitrogen/Life Technologies, Grand Island NY）中へクローニングし、pLenti6.3-TO-YAPGFP-DEST（pOM1017）を作製した。このベクターは、YAP-GFP融合タンパク質のテトラサイクリン（Tet）調節発現を可能にする。HeLa細胞にpLenti3.3/TRリプレッサープラスミド（Invitrogen/Life Technologies, Grand Island NY）をトランスフェクトし、これは、CMVプロモーターの制御下で高レベルのTetリプレッサーを構成的に発現する。安定にトランスフェクトされた細胞を500μg/mlのG418で選択した。トランスフェクトされたHeLa細胞へTet誘導性YAP-GFP構築物pOM1017を一過性にトランスフェクトし、細胞をテトラサイクリンで処理することによって、クローンをスクリーニングした。1μg/mlテトラサイクリンの存在下でのみYAP-GFP発現を示したいくつかのクローンを特定した。クローンのうちの1つ、HeLaB5に、YAP-GFP構築物pOM1017を安定にトランスフェクトした。ダブルトランスフェクタントを500μg/ml G418および4μg/mlブラストサイジンで選択した。クローンをテトラサイクリンの非存在および存在下でGFPの発現についてFACSによって分析した。1μg/mlテトラサイクリンの添加でGFP-YAP発現の厳密な調節を示した、1つのクローン、NC12を得た（図10A）。Tet誘導での、YAP-GFPの発現をウエスタンブロット分析によって確認した（図10B）。生細胞のリアルタイムイメージングを可能にするBD Pathwayシステムにおいて行われるアッセイにおいて、NC12細胞株を使用することができる。このアッセイを使用し、YAP活性化／不活性化および潜在的にHippo経路に影響を与える分子（例えば、抗体、タンパク質、または低分子）をスクリーニングおよび特定する。
【０２８６】
実施例10
YAP核移行の測定のためのアッセイ
個々の細胞中のYAP局在は、Cre依存性エメラルド（Emerald）緑色蛍光タンパク質（EmGFP）発現構築物と同時発現されるYAP-Cre融合タンパク質を使用して評価することができる（図11）。具体的には、蛍光タンパク質DsRedの単量体形態、mCherryを、EmGFPの5'にloxP部位によってフランキングさせ、ベクターpcDNA3.1(+)（Life Technologies, Grand Island NY）中の構築物、loxP導入（floxed）mCherry/EmGFPを作製した。YAPを、ベクターpLenti6.3/TO/V5-DEST（Life Technologies, Grand Island NY）中のTetオペレーターの制御下で、Creのコード領域に対してN末端またはC末端のいずれかへ融合し、それぞれ、構築物Cre-YAPまたはYAP-Creを作製する。mCherry/EmGFP構築物およびCre-YAP、またはmCherry/EmGFP構築物およびYAP-Creを、HeLa細胞中へ安定にトランスフェクトし、ダブルトランスフェクタントをG-418およびブラストサイジンで選択した。不活性な細胞質YAP-CreもしくはCre-YAPから生じるmCherry蛍光、または活性な核YAP-CreもしくはCre-YAPから生じるEmGFP蛍光を、広視野落射蛍光顕微法またはフローサイトメトリーによってアッセイする。これらの細胞株を使用し、YAP活性化／不活性化およびHippo経路の活性に影響を与える分子（例えば、抗体、タンパク質、または低分子）をスクリーニングおよび特定する。
【０２８７】
実施例11
結腸腫瘍OMP-C18中の膜固定型IgCAMデコイ受容体の過剰発現による腫瘍成長に対する効果
分離した結腸OMP-C18細胞（1 x 106細胞／ウェル）を、6ウェルPrimaria（商標）プレート（BD Biosciences, San Jose CA）中へ播種し、膜固定型デコイ受容体、CADM2-CD4TM-GFP、CADM4-CD4TM-GFP、CD226-CD4TM-GFP、PVR-CD4TM-GFP、または対照としてのGFPのみを発現するRRLベースのレンチウイルスで形質導入した。RRLベースのレンチウイルスは、CMVプロモーターの制御下でGFP遺伝子を発現する。さらに、第2の対照は、形質導入されなかった細胞の群であった。レンチウイルスを、OMP-C18細胞の20%〜60%の感染をもたらしたMOIで、平板培養時（t＝0）に細胞へ添加した。培養培地は、DMEM低グルコース、F12培地、B27培地、インスリン-トランスフェリン-セレン-サプリメント、ヘパリン、rhEGF、rhFGF-2、および抗生物質であった。72時間後、細胞を収集し、トリプシン処理し、洗浄し、2% FBSおよびDAPIを含有するHBSS（Molecular Probes/Invitrogen, Grand Island, NY）中に再懸濁させた。形質導入された結腸OMP-C18細胞（GFP+/DAPI-）を、FACSAriaフローサイトメーター（BD Biosciences, San Jose CA）を使用するフローサイトメトリーによって選別した。細胞集団純度を、選別した細胞のほんの一部の再分析によって確認した。選別した細胞を50% Matrigel（商標）（BD Biosciences, San Jose CA）と混合した。対照レンチウイルス-形質導入されたGFP+/DAPI-細胞を、NOD/SCIDマウスの側腹部へ皮下注射した（300細胞/マウス、n＝10）。IgCAMデコイ受容体レンチウイルス-形質導入されたGFP+/DAPI-細胞を、NOD/SCIDマウスの側腹部へ皮下注射した（300細胞/マウス、n＝10）。非形質導入細胞を、NOD/SCIDマウスの側腹部へ皮下注射した（300細胞/マウス、n＝5）。腫瘍成長を毎週モニターし、最も成長の速い腫瘍が約1500mm3に達した時に実験を終了した。
【０２８８】
図12Aに示されるように、45日目に、OMP-C18腫瘍中のCADM4およびCD226デコイ受容体の過剰発現は、対照と比較して腫瘍成長を増加させるようであった。CADM2デコイ受容体の過剰発現も、対照と比較して腫瘍成長を増加させるようであったが、CADM4およびCD226よりも明白でないレベルであった。
【０２８９】
同様の研究を、OMP-C18結腸腫瘍と、膜固定型デコイ受容体、CADM3-CD4TM-GFP、TMEM25-CD4TM-GFP、JAM3-CD4TM-GFP、およびTIGIT-CD4TM-GFP（図12Bおよび12C）、JAM2-CD4TM-GFP、JAM2FL-GFP、PVRL1-CD4TM-GFP、およびESAM-CD4TM-GFP（図12D）、VSIG1-CD4TM-GFP、VSIG4-CD4TM-GFP、PVRL4-CD4TM-GFP、およびCD200-FL-GFP（図12E）、PVRL3-CD4TM-GFP、JAM1-CD4TM-GFP、CADM1-CD4TM-GFPおよびVSIG2-CD4TM-GFP（図12F）、ならびにCLMP-CD4TM-GFP、VSIG8-CD4TM-GFP、TMIGD1-CD4TM-GFPおよびVSIG3-CD4TM-GFP（図12G）を発現するRRLベースのレンチウイルスとを用いて行った。
【０２９０】
図12Bに示されるように、34日目に、CADM3デコイ受容体の過剰発現は、対照と比較して、OMP-C18腫瘍細胞の成長を有意に阻害した。さらに、JAM3およびTIGITは、ある程度、腫瘍成長を阻害するようであった。48日目に、対照と比較してのCADM3による腫瘍成長の阻害は、34日目よりもさらに大きかった（図12C）。さらに、48日目に、TEMEM25、JAM3およびTIGITデコイ受容体の過剰発現は、CADM3で観察された程度ではなかったが、対照と比較して腫瘍成長を有意に阻害した。49日目に、VSIG4、PVRL4およびCD200デコイ受容体の過剰発現は、対照と比較してOMP-018腫瘍細胞の成長を有意に阻害した（図12E）。49日目に、VSIG8およびTIMIGD1の過剰発現は、対照と比較してOMP-018腫瘍細胞の成長を有意に阻害した（図12G）。
【０２９１】
実施例12
肺腫瘍OMP-LU2およびOMP-LU40中の膜固定型IgCAMデコイ受容体の過剰発現による腫瘍成長に対する効果
分離した結腸OMP-LU2細胞（1 x 106 細胞／ウェル）を、6ウェルPrimaria（商標）プレート（BD Biosciences, San Jose CA）中へ播種し、膜固定型デコイ受容体、CADM2-CD4TM-GFP、CADM4-CD4TM-GFP、PVRL4-CD4TM-GFP、VSIG4-CD4TM-GFP、CADM1-CD4TM-GFP、CD226-CD4TM-GFP、JAM3-CD4TM-GFP、JAM2-CD4TM-GFP、JAM2FL-GFP、CADM4-CD4TM-GFP、TIGIT-CD4TM-GFP、PVRL1-CD4TM-GFP、PVRL3-CD4TM-GFP、陽性対照としてのdnYAP、または陰性対照としてのGFPのみを発現するRRLベースのレンチウイルスで形質導入した。RRLベースのレンチウイルスは、CMVプロモーターの制御下でGFP遺伝子を発現する。さらに、第2の対照は、形質導入されなかった細胞の群であった。レンチウイルスを、OMP-LU2細胞の20%〜60%の感染をもたらしたMOIで、平板培養時（t＝0）に細胞へ添加した。培養培地は、DMEM低グルコース、F12培地、B27培地、インスリン-トランスフェリン-セレン-サプリメント、ヘパリン、rhEGF、rhFGF-2、および抗生物質であった。72時間後、細胞を収集し、トリプシン処理し、洗浄し、2% FBSおよびDAPIを含有するHBSS（Molecular Probes/Invitrogen, Grand Island, NY）中に再懸濁させた。形質導入された肺OMP-LU2細胞（GFP+/DAPI-）を、FACSAriaフローサイトメーター（BD Biosciences, San Jose CA）を使用するフローサイトメトリーによって選別した。細胞集団純度を、選別した細胞のほんの一部の再分析によって確認した。選別した細胞を50% Matrigel（商標）（BD Biosciences, San Jose CA）と混合した。対照レンチウイルス-形質導入されたGFP+/DAPI-細胞を、NOD/SCIDマウスの側腹部へ皮下注射した（300細胞/マウス、n＝10）。IgCAMデコイ受容体レンチウイルス-形質導入されたGFP+/DAPI-細胞を、NOD/SCIDマウスの側腹部へ皮下注射した（300細胞/マウス、n＝10）。非形質導入細胞をNOD/SCIDマウスの側腹部へ皮下注射した（300細胞/マウス、n＝5）。腫瘍成長を毎週モニターし、最も成長の速い腫瘍が約1500mm3に達した時に実験を終了した。
【０２９２】
108日目に、CADM3およびVSIG4デコイ受容体の過剰発現は、対照と比較してOMP-LU2肺腫瘍細胞の成長を有意に阻害した（図13B）。71日目に、JAM3デコイ受容体の過剰発現は、対照と比較してOMP-LU2肺腫瘍細胞の成長を有意に阻害した（図13C）。さらに、70日目または71日目に、JAM2、CADM4、およびPVRL1デコイ受容体の過剰発現は、対照と比較してOMP-LU2腫瘍細胞の成長を阻害した（図13Cおよび13D）。
【０２９３】
同様の研究を、OMP-LU40肺腫瘍と、膜固定型デコイ受容体、CADM1-CD4TM-GFP、CADM2-CD4TM-GFP、CADM3-CD4TM-GFP、CADM4-CD4TM-GFP、CD226-CD4TM-GFP、およびPVR-CD4TM-GFP（図14A）、PVRL4-CD4TM-GFP、VSIG4-CD4TM-GFP、およびCD226FL-GFP（図14B）、PVRL3-CD4TM-GFP、ESAM-CD4TM-GFP、およびVSIG2-CD4TM-GFP（図14C）を発現するRRLベースのレンチウイルスとを用いて行った。
【０２９４】
118日目に、CADM2およびCADM3デコイ受容体の過剰発現は、対照と比較してOMP-LU40肺腫瘍細胞の成長を有意に阻害した（図13A）。120日目に、PVRL4デコイ受容体の過剰発現は、対照と比較してOMP-LU2肺腫瘍細胞の成長を有意に阻害した（図13B）。
【０２９５】
実施例11および12に記載の研究におけるデコイ受容体による阻害を表4に要約する。数字は、対照腫瘍と比較しての腫瘍サイズの倍変化減少を示す。
【０２９６】
【表４】
2015520192.tif 000008
ND＝測定せず
【０２９７】
膜固定型デコイとして使用した14個のIgCAMは、結腸および／または肺腫瘍において腫瘍成長を低下させ、阻害は1.5〜56倍の範囲であった。14個のIgCAMのうち、CADM3、JAM3およびPVRL4が最大効果を示した。
【０２９８】
実施例13
プロテオミクス研究
IgCAMの下流のシグナル伝達経路を調べるために、プロテオミクスアプローチを行い、腫瘍成長および／またはHippo経路に関与する候補IgCAMのセットを含有するタンパク質複合体を特定した。HEK-293T細胞に、FLAGタグ化全長IgCAM、CADM1、CADM3、CD200、JAM2、PVR、PVRL1、およびPVRL3を独立して一過性にトランスフェクトした。FLAGタグ化YFP（黄色蛍光タンパク質）を対照として使用した。トランスフェクション後4日目に、採取した細胞ペレットから作製した溶解物を、遠心分離によって清澄にし、マウスIgG-アガロース（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）でプレクリアし（pre-clear）、次いで抗FLAGアガロース（Sigma-Aldrich）と共にインキュベートした。抗FLAG免疫沈降物を(2x)非還元性Tris-Glycine SDS Sample Buffer（Life Technologies/Invitrogen, Grand Island, NY）で溶出した。溶出液を質量分析のためにMSBioworks（Michigan, USA, IP-Worksサービス）へ提出し、トランスフェクトされた「ベイト（bait）」IgCAMと共に免疫共沈降するタンパク質を特定した。
【０２９９】
トランスフェクトされた「ベイト」IgCAMと共に免疫共沈降したタンパク質を、先ず、内因性IgCAMとのヘテロタイプ相互作用について分析した。例えば、内因性JAM3はJAM2と共に免疫共沈降し、このことは、FACS結合アッセイで観察された結果を確証する。FACS結合アッセイは、質量分析によっては見られなかったいくつかの相互作用（即ち、JAM2およびCADM3間の相互作用）を検出した一方で、反対も真実である（即ち、PVRおよびCD200間の相互作用）。
【０３００】
次に、1039個の特定されたタンパク質のリストに、機能について注釈をつけ；関心対象のカテゴリーは、1）細胞骨格／運動、2）転写、3）キナーゼ／ホスファターゼ／シグナル伝達カスケード、4）種々雑多な酵素活性、5）低分子量／ヘテロ三量体Gタンパク質、6）足場／タンパク質複合体、および7）受容体／表面タンパク質／接着／IgCAM関連を含んだ。g:Profilerデータベース（http://biit.cs.ut.ee/gprofiler）を使用し、Hippo経路のタンパク質成分と上記の7つのカテゴリーにおいて特定された125個のタンパク質の選択されたリストとのタンパク質-タンパク質相互作用ネットワークを分析した。125個のタンパク質をさらにPearson相関によって分析し、同一セットのタンパク質と複合体を形成する「ベイト」IgCAMの集団を特定した。これらの2つの分析に基づいて、CADM1、CADM3、PVRL1、およびPVRL3を、膜および／または細胞間結合へ局在化されるタンパク質のセットと共に免疫共沈降したIgCAMと特定した。一部がアンギオモチン（Angiomotin）またはマーリンなどのHippo成分と相互作用することができる、これらのタンパク質は、DCAF7、DDB1、DLG1、INADL、LIN7C、MPDZ、MPP5、MPP7、PARD3、およびPRKCIを含む。
【０３０１】
これらのタンパク質複合体を確認するために、FLAGタグ化全長CADM1、CADM3、PVR、PVRL1、およびPVRL3が、内部陰性対照としてのCADM3-CD4TM-GFPおよびLGR5-CD4TM-GFP構築物が、一過性にトランスフェクトされたHEK-293T細胞から、免疫沈降物（上述の方法を参照のこと）を作製した。簡単に記載すると、トランスフェクション後4日目に、採取した細胞ペレットから作製された溶解物を、遠心分離によって清澄にし、マウスIgG-アガロース（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）でプレクリアし、次いで抗FLAGアガロース（Sigma-Aldrich）と共にインキュベートした。抗FLAG免疫沈降物を(2x)非還元性Tris-Glycine SDS Sample Buffer（Life Technologies/Invitrogen, Grand Island, NY）で溶出した。全細胞溶解物および免疫沈降物溶出液を、4-12% Tris-Glycine Midi Gels（Life Technologies/Invitrogen, Grand Island, NY）において泳動し、iBlotによってPVDF膜（Life Technologies/Invitrogen）上へ転写した。ブロットを、以下のタンパク質に対する抗体でプローブした：アファディン/MLLT4 (#6492; Cell Signaling Technology, Danvers, MA)；DCAF7 (#ab138490; Abcam, Cambrige, MA)；DLG1 (#ab134156)；INADL (#ab151257; Abcam)；LIN7 (Abcam, ab127049; Abcam)；LIN7C (#ab82646; Abcam)；MPDZ (#ab101277; Abcam)；MPP5 (#ab155132; Abcam)；PARD3 (#ab64646; Abcam)；YAP1 (#ab52771; Abcam)；phospho-YAP1 (#4911; Cell Signaling Technologies)、ならびに対照としてのチューブリンおよびアクチン。ウエスタンブロットを図15A〜15Cに示し、IgCAMを含有する陽性に特定された複合体を表5に要約する。
【０３０２】
【表５】
2015520192.tif 000009
【０３０３】
特に注目すべきことに、YAP1は、CADM1、CADM3、PVRL1、およびPVRL3と共に免疫共沈降し、このことは、IgCAMがHippo経路に関与するという仮定を支持している。
【０３０４】
さらなる実験を行い、ここで、HEK-293細胞に、FLAGタグ化全長CADM1およびc-mycタグ化YAPを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション後4日目に、採取した細胞ペレットから作製された溶解物を、遠心分離によって清澄にし、抗c-mycアガロース（Sigma-Aldrich）と共にインキュベートした。抗c-myc免疫沈降物を、(2x)非還元性Tris-Glycine SDS Sample Buffer（Life Technologies/Invitrogen, Grand Island, NY）で溶出した。全細胞溶解物および免疫沈降物溶出液を、4-12% Tris-Glycine Midi Gels（Life Technologies/Invitrogen, Grand Island, NY）において泳動し、iBlotによってPVDF膜（Life Technologies/Invitrogen）上へ転写した。ブロットを抗myc抗体または抗FLAG抗体でプローブした。
【０３０５】
図16に示されるように、YAP1はCADM1と共に免疫共沈降した。
【０３０６】
本明細書において記述された実施例および態様は例示する目的のためだけのものであると、ならびにそれらを踏まえてさまざまな修正または変更が当業者に示唆されるであろうが、それらは本出願の精神および範囲内に含まれるものと理解される。
【０３０７】
本明細書において引用された、全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、ならびにアクセッション番号／ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の両方を含むデータベース配列は、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、またはアクセッション番号／データベース配列が参照により本明細書に組み入れられるように詳細かつ個々に示されるのと同じ程度に、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０３０８】
本出願に開示される配列は以下の通りである：
【０３０９】
JAMファミリー
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトAMICA（SEQ ID NO:1）
2015520192.tif 000010
【０３１０】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトCAR（SEQ ID NO:2）
2015520192.tif 000011
【０３１１】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトCLMP（SEQ ID NO:3）
2015520192.tif 000012
【０３１２】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトESAM（SEQ ID NO:4）
2015520192.tif 000013
【０３１３】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトGP A33（SEQ ID NO:5）
2015520192.tif 000014
【０３１４】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトJAM1（SEQ ID NO:6）
2015520192.tif 000015
【０３１５】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトJAM2（SEQ ID NO:7）
2015520192.tif 000016
【０３１６】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトJAM3（SEQ ID NO:8）
2015520192.tif 000017
【０３１７】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトVSIG1（SEQ ID NO:9）
2015520192.tif 000018
【０３１８】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトVSIG2（SEQ ID NO:10）
2015520192.tif 000019
【０３１９】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトVSIG3（SEQ ID NO:11）
2015520192.tif 000020
【０３２０】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトVSIG4（SEQ ID NO:12）
2015520192.tif 000021
【０３２１】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトVSIG8（SEQ ID NO:13）
2015520192.tif 000022
【０３２２】
CADMファミリー
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトCADM1（SEQ ID NO:14）
2015520192.tif 000023
【０３２３】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトCADM2（SEQ ID NO:15）
2015520192.tif 000024
【０３２４】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトCADM3（SEQ ID NO:16）
2015520192.tif 000025
【０３２５】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトCADM4（SEQ ID NO:17）
2015520192.tif 000026
【０３２６】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトCRTAM（SEQ ID NO:18）
2015520192.tif 000027
【０３２７】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトTMIGD1（SEQ ID NO:19）
2015520192.tif 000028
【０３２８】
PVRファミリー
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトCD96（SEQ ID NO:20）
2015520192.tif 000029
【０３２９】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトCD200（SEQ ID NO:21）
2015520192.tif 000030
【０３３０】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトCD200R1（SEQ ID NO:22）
2015520192.tif 000031
【０３３１】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトCD200R1L（SEQ ID NO:23）
2015520192.tif 000032
【０３３２】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトCD226（SEQ ID NO:24）
2015520192.tif 000033
【０３３３】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトPVRIG（SEQ ID NO:25）
2015520192.tif 000034
【０３３４】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトPVR（SEQ ID NO:26）
2015520192.tif 000035
【０３３５】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトPVRL1（SEQ ID NO:27）
2015520192.tif 000036
【０３３６】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトPVRL2（SEQ ID NO:28）
2015520192.tif 000037
【０３３７】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトPVRL3（SEQ ID NO:29）
2015520192.tif 000038
【０３３８】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトPVRL4（SEQ ID NO:30）
2015520192.tif 000039
【０３３９】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトTIGIT（SEQ ID NO:31）
2015520192.tif 000040
【０３４０】
下線が引かれた予測シグナル配列を有するヒトTMEM25（SEQ ID NO:32）
2015520192.tif 000041
【０３４１】
JAMファミリー
予測シグナル配列を有さないヒトAMICA-ECD（SEQ ID NO:33）
2015520192.tif 000042
【０３４２】
予測シグナル配列を有さないヒトCAR-ECD（SEQ ID NO:34）
2015520192.tif 000043
【０３４３】
予測シグナル配列を有さないヒトCLMP-ECD（SEQ ID NO:35）
2015520192.tif 000044
【０３４４】
予測シグナル配列を有さないヒトESAM-ECD（SEQ ID NO:36）
2015520192.tif 000045
【０３４５】
予測シグナル配列を有さないヒトGP A33-ECD（SEQ ID NO:37）
2015520192.tif 000046
【０３４６】
予測シグナル配列を有さないヒトJAM1-ECD（SEQ ID NO:38）
2015520192.tif 000047
【０３４７】
予測シグナル配列を有さないヒトJAM2-ECD（SEQ ID NO:39）
2015520192.tif 000048
【０３４８】
予測シグナル配列を有さないヒトJAM3-ECD（SEQ ID NO:40）
2015520192.tif 000049
【０３４９】
予測シグナル配列を有さないヒトVSIG1-ECD（SEQ ID NO:41）
2015520192.tif 000050
【０３５０】
予測シグナル配列を有さないヒトVSIG2-ECD（SEQ ID NO:42）
2015520192.tif 000051
【０３５１】
予測シグナル配列を有さないヒトVSIG3-ECD（SEQ ID NO:43）
2015520192.tif 000052
【０３５２】
予測シグナル配列を有さないヒトVSIG4-ECD（SEQ ID NO:44）
2015520192.tif 000053
【０３５３】
予測シグナル配列を有さないヒトVSIG8-ECD（SEQ ID NO:45）
2015520192.tif 000054
【０３５４】
CADMファミリー
予測シグナル配列を有さないヒトCADM1-ECD（SEQ ID NO:46）
2015520192.tif 000055
【０３５５】
予測シグナル配列を有さないヒトCADM2-ECD（SEQ ID NO:47）
2015520192.tif 000056
【０３５６】
予測シグナル配列を有さないヒトCADM3-ECD（SEQ ID NO:48）
2015520192.tif 000057
【０３５７】
予測シグナル配列を有さないヒトCADM4-ECD（SEQ ID NO:49）
2015520192.tif 000058
【０３５８】
予測シグナル配列を有さないヒトCRTAM-ECD（SEQ ID NO:50）
2015520192.tif 000059
【０３５９】
予測シグナル配列を有さないヒトTMIGD1-ECD（SEQ ID NO:51）
2015520192.tif 000060
【０３６０】
PVRファミリー
予測シグナル配列を有さないヒトCD96-ECD（SEQ ID NO:52）
2015520192.tif 000061
【０３６１】
予測シグナル配列を有さないヒトCD200-ECD（SEQ ID NO:53）
2015520192.tif 000062
【０３６２】
予測シグナル配列を有さないヒトCD200R1-ECD（SEQ ID NO:54）
2015520192.tif 000063
【０３６３】
予測シグナル配列を有さないヒトCD200R1L-ECD（SEQ ID NO:55）
2015520192.tif 000064
【０３６４】
予測シグナル配列を有さないヒトCD226-ECD（SEQ ID NO:56）
2015520192.tif 000065
【０３６５】
予測シグナル配列を有さないヒトPVRIG-ECD（SEQ ID NO:57）
2015520192.tif 000066
【０３６６】
予測シグナル配列を有さないヒトPVR-ECD（SEQ ID NO:58）
2015520192.tif 000067
【０３６７】
予測シグナル配列を有さないヒトPVRL1-ECD（SEQ ID NO:59）
2015520192.tif 000068
【０３６８】
予測シグナル配列を有さないヒトPVRL2-ECD（SEQ ID NO:60）
2015520192.tif 000069
【０３６９】
予測シグナル配列を有さないヒトPVRL3-ECD（SEQ ID NO:61）
2015520192.tif 000070
【０３７０】
予測シグナル配列を有さないヒトPVRL4-ECD（SEQ ID NO:62）
2015520192.tif 000071
【０３７１】
予測シグナル配列を有さないヒトTIGIT-ECD（SEQ ID NO:63）
2015520192.tif 000072
【０３７２】
予測シグナル配列を有さないTMEM25-ECD（SEQ ID NO:64）
2015520192.tif 000073
【０３７３】
ヒトIgG1 Fc領域（SEQ ID NO:65）
2015520192.tif 000074
【０３７４】
ヒトIgG1 Fc領域（SEQ ID NO:66）
2015520192.tif 000075
【０３７５】
ヒトIgG1 Fc領域（SEQ ID NO:67）
2015520192.tif 000076
【０３７６】
dnYAP（SEQ ID NO:68）
2015520192.tif 000077
【０３７７】
YFP（SEQ ID NO:69）
2015520192.tif 000078
【０３７８】
ヒトTEAD2（SEQ ID NO:70）
2015520192.tif 000079
【０３７９】
ヒトTEAD3（SEQ ID NO:71）
2015520192.tif 000080
【０３８０】
リンカー（SEQ ID NO:72）
2015520192.tif 000081
【０３８１】
FLAGタグ（SEQ ID NO:73）
2015520192.tif 000082
【０３８２】
リンカー（SEQ ID NO:74）
2015520192.tif 000083
【０３８３】
リンカー（SEQ ID NO:75）
2015520192.tif 000084
【０３８４】
リンカー（SEQ ID NO:76）
2015520192.tif 000085
【０３８５】
リンカー（SEQ ID NO:77）
2015520192.tif 000086
【０３８６】
リンカー（SEQ ID NO:78）
2015520192.tif 000087
【０３８７】
ヒトIgG2重鎖定常領域（SEQ ID NO:79）
2015520192.tif 000088
【図１】
2015520192.tif 000089
【図２Ａ】
2015520192.tif 000090
【図２Ｂ】
2015520192.tif 000091
【図２Ｃ】
2015520192.tif 000092
【図２Ｄ】
2015520192.tif 000093
【図２Ｅ】
2015520192.tif 000094
【図２Ｆ】
2015520192.tif 000095
【図２Ｇ】
2015520192.tif 000096
【図２Ｈ】
2015520192.tif 000097
【図２Ｉ】
2015520192.tif 000098
【図３】
2015520192.tif 000099
【図４】
2015520192.tif 000100
【図５】
2015520192.tif 000101
【図６】
2015520192.tif 000102
【図７】
2015520192.tif 000103
【図８】
2015520192.tif 000104
【図９Ａ】
2015520192.tif 000105
【図９Ｂ】
2015520192.tif 000106
【図９Ｃ】
2015520192.tif 000107
【図１０】
2015520192.tif 000108
【図１１】
2015520192.tif 000109
【図１２Ａ】
2015520192.tif 000110
【図１２Ｂ】
2015520192.tif 000111
【図１２Ｃ】
2015520192.tif 000112
【図１２Ｄ】
2015520192.tif 000113
【図１２Ｅ】
2015520192.tif 000114
【図１２Ｆ】
2015520192.tif 000115
【図１２Ｇ】
2015520192.tif 000116
【図１３】
2015520192.tif 000117
【図１４】
2015520192.tif 000118
【図１５Ａ】
2015520192.tif 000119
【図１５Ｂ】
2015520192.tif 000120
【図１５Ｃ】
2015520192.tif 000121
【図１６】
2015520192.tif 000122
【手続補正書】
【提出日】平成27年2月6日(2015.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2015520192000001.app
【国際調査報告】
2015520192.tif 000123
2015520192.tif 000124
2015520192.tif 000125
2015520192.tif 000126