(57)【要約】本発明は、巣状分節性糸球体硬化症を診断及び処置するための方法に関する。より具体的には、本発明は、被験体が巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を有するか、又はこれを発症するリスクを有するかを決定するための方法であって、該被験体から得られる血液サンプル中のカルシウム／カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ（ＣＡＳＫ）レベルを決定することからなる工程を含む方法に関する。本発明はまた、それを必要とする被験体における巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の予防又は処置における使用のための薬剤であって、有足細胞の表面上に存在するｈＣＤ９８に対するＣＡＳＫの結合を阻害するのに有効な薬剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体が巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を有するか、若しくはこれを発症するリスクを有するか、又は腎移植後のＦＳＧＳ再発リスクを有するかを決定するための方法であって、該被験体から得られる血液サンプル中のカルシウム／カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ（ＣＡＳＫ）レベルを決定することからなる工程を含む、方法。
【請求項２】
被験体から得られる血液サンプル中の決定されたＣＡＳＫレベルを参照レベルと比較することからなる工程をさらに含み、前記決定されたレベルと前記参照レベルとの間の差異が、前記被験体がＦＳＧＳを有するか、若しくはこれを発症するリスクを有するか、又は腎移植後のＦＳＧＳ再発リスクを有するかを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
それを必要とする被験体における巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の予防又は処置における使用のための薬剤であって、有足細胞の表面上に存在するｈＣＤ９８に対するＣＡＳＫの結合を阻害するのに有効な薬剤。
【請求項４】
抗体、有機低分子及びポリペプチドからなる群より選択される、請求項３に記載の薬剤。
【請求項５】
ＣＡＳＫとｈＣＤ９８との間の相互作用を遮断する能力を有する抗体又は抗体フラグメントである、請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
ｈＣＤ９８の細胞外ドメインの全部又は一部に対する抗体又は抗体フラグメントから選択される、請求項５に記載の薬剤。
【請求項７】
ｈＣＤ９８のクラスＩＩ  ＰＤＺ結合ドメイン内に位置するエピトープに結合する抗体である、請求項６に記載の薬剤。
【請求項８】
ＣＡＳＫに対するｈＣＤ９８の結合を阻害することができる抗体であって、ｈＣＤ９８に結合するＣＡＳＫ領域内に位置するエピトープに結合する抗体又はその部分である、請求項４に記載の薬剤。
【請求項９】
ＣＡＳＫのＰＤＺクラスＩＩドメイン内に位置するエピトープに結合する抗体である、請求項５に記載の薬剤。
【請求項１０】
ｈＣＤ９８の細胞外ドメインの全部又は一部を含むポリペプチドである、請求項４に記載の薬剤。
【請求項１１】
ｈＣＤ９８のクラスＩＩ  ＰＤＺ結合ドメイン又はその部分を含むポリペプチドである、請求項１０に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、巣状分節性糸球体硬化症を診断及び処置するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景：
巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）は、子供及び成人の両方で糸球体腎炎の全症例の２０％を占めている。その主な病因は特発性であるが、多数のプロセス（肥満、膀胱尿道逆流、ＨＩＶ感染など）又は腎臓過剰ろ過の任意の状況の結果によるものであり得る。それはまた、ネフリン又はポドシンなどの有足細胞分子の突然変異に起因する遺伝性疾患に関連し得る。いくつかの場合では、この疾患は腎移植後に非常に急速に再発する場合があり、これは、ＦＳＧＳが全身性疾患であり得ることを示唆している。加えて、ワクチン接種後のその発生又は再発、ウイルス感染及び免疫抑制薬に対するその感受性により、ＦＳＧＳがリンパ球機能のレギュレーション異常に相当し得るという仮説が導かれている。
【０００３】
原発性ＦＳＧＳは、ネフローゼ症候群に関係していることが多いタンパク尿を伴う。そのコルチコイド耐性型がこの疾患の主な徴候であり、予後不良につながる。ほとんどのＦＳＧＳ被験体は、３〜７年以内に末期腎不全に進行する。ＦＳＧＳは、腎移植後の被験体で特に深刻である。この手術にとっては移植片の高い再発率が脅威となっており、初回移植では３０％〜５０％、２回目では最大９０％となり、ネフローゼタンパク尿として現れる。
【０００４】
腎生理学における最近の進歩は、有足細胞及び有足細胞間のスリット隔膜が、尿中へのタンパク質漏出に対するろ過障壁の確立において重要な役割（import role）を果たすことを示している。スリット隔膜は、それらが隣接する足突起を互いに結合する糸球体上皮（有足細胞）に見られる特殊な細胞接着構造であり、糸球体ろ過に必須である。ネフローゼ症候群では、成熟有足細胞の足突起構造が失われ、スリット隔膜は、発達中の糸球体に見られるものと同程度の密着結合に置き換わる。
【０００５】
移植直後の再発に関する以前の観察結果は、タンパク尿の再発をもたらす、糸球体ろ過障壁の透過性を変化させる循環因子の存在を提案している。興味深いことに、プロテインＡカラムによる血漿交換及び免疫吸着（immunoabsortion）は、この未知の因子を除去し、タンパク尿を減少させ、ＦＳＧＳ再発の移植片の生存を改善するのに有効であることが報告されている。実際、これらの手当は、ＦＳＧＳに罹患している被験体に最も有効な処置と考えられているが、それらの予後は常に不良である。上記を考慮すると、このような疾患の診断及び処置のための新しいツールを構想するために、当技術分野では、ＦＳＧＳに関与する傾向がある循環因子を同定する（indentifying）ことの必要性が存在する。
【０００６】
ＣＡＳＫは、有足細胞の細胞極性化の確立及び維持に重要なタンパク質−タンパク質相互作用を媒介するマルチドメインモジュールを含有する膜結合グアニル酸キナーゼ（ＭＡＧＵＫ）である。それは、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ様ドメイン、続いてＰＤＺ、ＳＨ３及びグアニル酸キナーゼ様ドメインから構成される。それは普遍的に局在しているが、ＣＡＳＫは、ニューロンのシナプス、リンパ球及び腎臓の有足細胞で主に発現している。ネフリンの結合パートナーとして、ＣＡＳＫは、膜タンパク質及びシグナル伝達分子をアクチン細胞骨格及び核に連結することによって、極性化有足細胞の維持に関与する（Lehtonen S, Lehtonen E, Kudlicka K, Holthoefer H, Farquhar MG. "Nephrin forms a complex with adherens junction proteins and CASK in podocytes and in Madin-Darby canine kidney cells expressing nephrin". Am J Pathol. 165(3):923-36. 2004）。
【０００７】
当初は、ヒトＣＡＳＫ（ｈＣＡＳＫ）は、細胞膜の細胞内側に局在している。それにもかかわらず、最近、ｈＣＡＳＫは、Ｃａｃｏ２−ＢＢＥ腸細胞における細胞外分子に結合すると報告されている。加えて、ｈｈＣＤ９８及びｈＣＡＳＫはin vitro及びin vivoの両方で共沈殿及び共局在すること、並びにｈｈＣＤ９８のＰＤＺ結合ドメインはこの相互作用に直接関与することが実証されている。また、腸上皮細胞の基底外側ドメインと相互作用することができる好中球表面上のエクトキナーゼ機能が同定されている。このレベル、この活性では、それはｈｈＣＤ９８／ｈＣＡＳＫ相互作用のモデュレーターとして示唆されている（Yan Y, Vasudevan S, Nguyen H, Bork U, Sitaraman S, Merlin D. "Extracellular interaction between hhCD98 and the PDZ class II domain of hCASK in intestinal epithelia". J Membr Biol. 215(1):15-26. 2007）。
【０００８】
しかしながら、今までに、巣状分節性糸球体硬化症の発症におけるＣＡＳＫの関与は未だ調査されていない。
【０００９】
発明の概要：
本発明は、被験体が巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を有するか、又はこれを発症するリスクを有するかを決定するための方法であって、該被験体から得られる血液サンプル中のカルシウム／カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ（ＣＡＳＫ）レベルを決定することからなる工程を含む方法に関する。
【００１０】
特定の実施態様では、本発明の方法は、被験体から得られる血液サンプル中の決定されたＣＡＳＫレベルを参照レベルと比較することからなる工程をさらに含み、前記決定されたレベルと前記参照レベルとの間の差異が、前記被験体がＦＳＧＳを有するか、若しくはこれを発症するリスクを有するか、又は腎移植後のＦＳＧＳ再発リスクを有するかを示す。
【００１１】
本発明はまた、被験体が腎移植後のＦＳＧＳ再発リスクを有するかを決定するための方法であって、該被験体から得られる血液サンプル中のカルシウム／カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ（ＣＡＳＫ）レベルを決定することからなる工程を含む方法に関する。
【００１２】
本発明のさらなる態様はまた、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を患っている被験体の処置に対する反応性を決定するための方法であって、該被験体から得られる血液サンプル中のカルシウム／カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ（ＣＡＳＫ）レベルを決定することからなる工程を含む方法に関する。
【００１３】
本発明は、それを必要とする被験体における巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の予防又は処置における使用のための薬剤であって、有足細胞の表面上に存在するｈＣＤ９８に対するＣＡＳＫの結合を阻害するのに有効な薬剤に関する。
【００１４】
発明の詳細な説明：
今回、本発明者らは、ＦＳＧＳに関与する循環因子を同定した。本発明者らは、腎移植後の早期ＦＳＧＳ再発を有する被験体において、プロテインＡカラムに結合した分子を実際に分析した。本発明者らは、自己抗体媒介性疾患を処置した者のものではなく、腎移植後のＦＳＧＳ再発を処置した被験体のプロテインＡカラムに見られたカルシウム／カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ（ＣＡＳＫ）の存在を、質量分析によって同定した。加えて、本発明者らは、この分子がin vitroで有足細胞の構造変化を誘導することができることをその後に示した。従って、ＣＡＳＫはＦＳＧＳに関与する可溶性因子に相当し、そして本発明は、この知見に基づいてＦＳＧＳを診断及び処置するための方法に関する。
【００１５】
本発明の診断方法：
本発明は、被験体が巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を有するか、又はこれを発症するリスクを有するかを決定するための方法であって、該被験体から得られる血液サンプル中のカルシウム／カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ（ＣＡＳＫ）レベルを決定することからなる工程を含む方法に関する。
【００１６】
本発明の文脈における「被験体」は、ヒト（男性又は女性）である。典型的には、前記被験体は、重度のタンパク尿と過去に診断されている。
【００１７】
「血液サンプル」は、一定量の全血又はその画分、例えば血清、血漿などを意味する。
【００１８】
本発明の文脈における「リスク」は、ＦＳＧＳへの転換のように、ある事象が特定の期間にわたって起こるであろう確率に関し、そして被験体の「絶対」リスク又は「相対」リスクを意味し得る。絶対リスクは、関連時間コホートの測定後の実際の観察結果を参照して、又は関連時間期間の間追跡調査された統計的に有効な歴史的コホートから作成された指数値を参照して測定され得る。相対リスクは、低リスクコホートの絶対リスク又は平均集団リスクのいずれかと比較した、被験体の絶対リスクの比を指し、これはどのように臨床的リスク因子が評価されるかによって変化し得る。所定の検査結果に対する否定的な事象に対する肯定的な事象の比率であるオッズ比もまた一般的に無変換（no-conversion）に使用される（オッズは式ｐ／（ｌ−ｐ）（式中、ｐは事象の確率であり、（ｌ−ｐ）は事象が起こらない確率である）に従う）。
【００１９】
血液サンプル中のＣＡＳＫなどのバイオマーカータンパク質のレベルを決定するための方法は、当技術分野で周知である。
【００２０】
特定の実施態様では、本発明の方法は、血液サンプルと、血液サンプル中に存在するバイオマーカータンパク質と選択的に相互作用することができる結合パートナーとを接触させることを含む。結合パートナーは、ポリクローナル又はモノクローナル、好ましくはモノクローナルであり得る抗体であり得る。別の実施態様では、結合パートナーは、アプタマーであり得る。
【００２１】
本発明のポリクローナル抗体又はそのフラグメントは、例えば、とりわけ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ及びマウスから選択される宿主動物に適切な抗原又はエピトープを投与することによって、既知の方法に従って産生することができる。当技術分野で既知の様々なアジュバントを使用し、抗体産生を増強することができる。本発明を実施するのに有用な抗体はポリクローナルであり得るが、モノクローナル抗体が好ましい。
【００２２】
本発明のモノクローナル抗体又はそのフラグメントは、培養液における連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して、調製及び単離することができる。産生及び単離のための技術としては、限定されないが、Kohler and Milstein (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Cote et al., 1983）；及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al. 1985）が挙げられる。
【００２３】
あるいは、一本鎖抗体の産生について記載された技術（例えば、米国特許第4,946,778号を参照のこと）を適応し、抗ＣＡＳＫ一本鎖抗体を産生することができる。本発明を実施するのに有用な抗体としては、抗ＣＡＳＫフラグメント（限定されないが、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを含む）（これは、インタクトな抗体分子のペプシン消化によって生成することができる）及びＦａｂフラグメント（これは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成することができる）も挙げられる。あるいは、Ｆａｂ及び／又はｓｃＦｖ発現ライブラリーを構築し、ＣＡＳＫに対する所望の特異性を有するフラグメントを迅速に同定することができる。例えば、抗体のファージディスプレイを使用し得る。このような方法において、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又はＦａｂフラグメントは、適切なバクテリオファージ（例えば、Ｍ１３）の表面上に発現される。簡潔に言えば、タンパク質で免疫化された適切な宿主（例えば、マウス）の脾臓細胞を取り出す。ＶＬ及びＶＨ鎖のコード領域は、タンパク質に対する所望の抗体を産生している細胞から得られる。次いで、これらのコード領域をファージ配列の末端に融合する。ファージを適切な担体（例えば、細菌）に挿入したら、ファージは抗体フラグメントをディスプレイする。抗体のファージディスプレイも、当業者に既知のコンビナトリアル法によって提供され得る。次いで、ファージによってディスプレイされる抗体フラグメントをイムノアッセイの一部として使用し得る。
【００２４】
ＣＡＳＫに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体は、例えば、J. Neurosci., April 15, 1996, 76(8):2488-2494; J. Cell Biol. 142(1):129-138, (1998). Cell 94:773-782, (1998). Cell 94:761-771, (1998), J Neurosci 22(14):6092-6105, 2002 , J Biol Chem 278(11):9778-9783, 2003及びJ. Neuroscience (2002) 22:6426-6436に記載されている。
【００２５】
別の実施態様では、結合パートナーは、アプタマーであり得る。アプタマーは、分子認識の観点から抗体の代替物に相当する分子クラスである。アプタマーは、高い親和性及び特異性を有する任意のクラスのターゲットを実質的に認識する能力を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、Tuerk C. 1997に記載されているように、ランダム配列ライブラリーの試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）によって単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって入手可能である。このライブラリーでは、各メンバーは、最終的には化学的に改変される固有配列の線形オリゴマーである。このクラスの分子の考えられる改変、使用及び利点が、Jayasena S.D., 1999に概説されている。ペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド方法（Colas et al., 1996）によってコンビナトリアルライブラリーから選択されるプラットフォームタンパク質（例えば、E. coliチオレドキシンＡ）によってディスプレイされるコンフォメーションが制限された抗体可変領域からなる。
【００２６】
別の実施態様では、結合パートナーは、ＣＡＳＫに結合することができるポリペプチドであり得る。例えば、前記ポリペプチドは、ｈＣＤ９８の細胞外ドメインの全部又は一部を含み得る。典型的には、前記機能的等価物は、ｈＣＤ９８のクラスＩＩ  ＰＤＺ結合ドメイン又はその一部を含み得る。
【００２７】
抗体又はアプタマーなどの本発明の結合パートナーは、検出可能な分子又は物質、例えば、蛍光分子、放射性分子、又は当技術分野で既知の任意の他の標識で標識され得る。一般にシグナルを（直接的又は間接的に）提供する標識が、当技術分野で知られている。
【００２８】
抗体に関して本明細書で使用される用語「標識された」は、検出可能な物質、例えば放射性薬剤又はフルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリスリン（ＰＥ）又はインドシアニン（Ｃｙ５））を抗体又はアプタマーにカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによる抗体又はアプタマーの直接的な標識、並びに検出可能な物質との反応性によるプローブ又は抗体の間接的な標識を包含することを意図する。本発明の抗体又はアプタマーは、当技術分野で既知の任意の方法によって放射性分子で標識され得る。例えば、放射性分子としては、限定されないが、シンチグラフィー試験用の放射性原子、例えば、Ｉ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８が挙げられる。
【００２９】
前述のアッセイは、一般に、結合パートナー（すなわち、抗体又はアプタマー）を固体支持体に結合させることを含む。本発明の実施に使用され得る固体支持体としては、基材、例えばニトロセルロース（例えば、膜又はマイクロタイターウェルの形態）；ポリ塩化ビニル（例えば、シート又はマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズ又はマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリデン；ジアゾ化ペーパー；ナイロン膜；活性化ビーズ、磁気反応性ビーズなどが挙げられる。
【００３０】
バイオマーカータンパク質のレベルは、競合、直接反応又はサンドイッチ型アッセイなどのイムノアッセイを含む標準的な免疫診断技術を使用することによって測定することができる。このようなアッセイとしては、限定されないが、凝集試験；酵素標識及び媒介イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動；免疫沈降が挙げられる。
【００３１】
より具体的には、マイクロタイタープレートのウェルを、前記バイオマーカータンパク質を認識する抗体のセットでコーティングするＥＬＩＳＡ法を使用することができる。次いで、前記バイオマーカータンパク質を含有するか又はこれを含有すると疑われる血液サンプルをコーティングウェルに追加する。抗体−抗原複合体を形成させるのに十分なインキュベーション期間後、プレートを洗浄して非結合の部分を除去し、そして検出可能に標識された二次結合分子を追加することができる。二次結合分子を任意の捕捉サンプルマーカータンパク質と反応させ、プレートを洗浄し、当技術分野で周知の方法を使用して二次結合分子の存在を検出することができる。
【００３２】
（イムノアッセイベースの方法によるかにかかわらず）バイオマーカータンパク質のレベルの測定はまた、化合物の分離；化合物の分子量に基づく遠心分離；質量及び電荷に基づく電気泳動；疎水性に基づくＨＰＬＣ；サイズに基づくサイズ排除クロマトグラフィー；及び使用される特定の固相に対する化合物の親和性に基づく固相親和性を含み得る。分離されたら、前記バイオマーカータンパク質は、標準的な技術を使用して測定されるその化合物の既知の「分離プロファイル」（例えば、保持時間）に基づいて同定され得る。
【００３３】
あるいは、分離された化合物は、例えば、質量分析計よって検出及び測定され得る。
【００３４】
本発明はまた、被験体が腎移植後のＦＳＧＳ再発リスクを有するかを決定するための方法であって、該被験体から得られる血液サンプル中のカルシウム／カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ（ＣＡＳＫ）レベルを決定することからなる工程を含む方法に関する。
【００３５】
特定の実施態様では、本発明の方法は、被験体から得られる血液サンプル中の決定されたＣＡＳＫレベルを参照レベルと比較することからなる工程をさらに含み、前記決定されたレベルと前記参照レベルとの間の差異が、前記被験体がＦＳＧＳを有するか、若しくはこれを発症するリスクを有するか、又は腎移植後のＦＳＧＳ再発リスクを有するかを示す。
【００３６】
一実施態様では、参照値は指標値であり得るか、又はＦＳＧＳに関する１つ以上のリスク予測アルゴリズム若しくは算出指数から得られ得る。参照値は、限定されないが、同様の体重指数、総コレステロールレベル、ＬＤＬ／ＨＤＬレベル、収縮期若しくは拡張期血圧、タンパク尿を有する被験体、同一若しくは類似の年齢範囲の被験体、同一若しくは類似の人種群の被験体、又はＦＳＧＳ以外の他の起源からの重度のタンパク尿若しくはネフローゼ症候群を有する被験体を含む集団研究から得られる数又は値に対するものであり得る。
【００３７】
本発明の一実施態様では、参照値は、実質的に健常な１つ以上の被験体から得られるコントロールサンプル中のＣＡＳＫレベルから得られる。実質的に健常なこのような被験体は、ＦＳＧＳの伝統的リスク因子を欠いている：例えば、それらの被験体は、２００mg/dl未満の血清コレステロールレベル、１４０mmHg以下の収縮期血圧、８５mmHg以下の拡張期血圧を有し、非喫煙常習者であり、タンパク尿の病歴がない。別の実施態様では、ＦＳＧの継続的非存在を検証する試験後に、診断関連期間にわたってこのような被験体をモニタリングし、及び／又は定期的に再試験する（「長期試験」）。このような期間は、参照値の決定に関する最初の試験日から１年間、２年間、２〜５年間、５年間、５〜１０年間、１０年間または１０年間以上であり得る。さらに、プロダクトクレームの目的の範囲を通じて介在期間中に被験体が適切に追跡調査されたと仮定して、適切に保存された歴史的被験体サンプル中のＣＡＳＫレベルの遡及的測定を使用してこれらの参照値を確立することにより、必要とされる試験時間を短縮することができる。
【００３８】
典型的には、ＦＳＧＳのリスクを有する被験体におけるＣＡＳＫレベルは、一般集団、又は健常被験体、又はＦＳＧＳ若しくは微小変化型疾患（ＭＣＤ）、例えば真性糖尿病性腎症、アミロイドーシス若しくは膜性腎障害に無関係のネフローゼ症候群を発症した被験体から得られる参照値よりも高いと考えられる。
【００３９】
本発明のさらなる態様はまた、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を患っている被験体の処置に対する反応性を決定するための方法であって、該被験体から得られる血液サンプル中のカルシウム／カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ（ＣＡＳＫ）レベルを決定することからなる工程を含む方法に関する。
【００４０】
典型的には、前記処置は、免疫抑制薬、生物学的薬物（ステロイド、カルシニューリン阻害剤又は後述の薬剤）を投与することからなり得る。
【００４１】
被験体の処置に対する「反応性を決定すること」は、異常な臨床的特徴の解決又は改善を評価することを意味する。例えば、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を患っている被験体であって、処置に反応する被験体では、正常なタンパク尿の回復を観察することができる。より具体的には、被験体の処置に対する「反応性を決定すること」は、前記処置の際に、被験体が完全寛解、部分寛解、高い若しくは低い再発リスクを伴う寛解に達するか、又は前記処置が疾患の異常な臨床的特徴及び／若しくは進行に対して有意な効果を及ぼさないかを決定することを含む。
【００４２】
特定の実施態様では、上記方法は、被験体から得られる血液サンプル中の決定されたＣＡＳＫレベルを参照レベルと比較する工程をさらに含み、前記決定されたレベルと前記参照レベルとの間の差異が、前記被験体が処置に反応するかを示す。典型的には、参照値は、前記処置に反応したか、又はこれに反応しなかった１つ以上の被験体由来のコントロールサンプル中のＣＡＳＫレベルから得られる。
【００４３】
本発明の治療方法：
本発明は、有足細胞に存在するレセプターに対するＣＡＳＫの結合を阻害するのに有効な薬剤に関する。より具体的には、本発明は、それを必要とする被験体における巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の予防又は処置における使用のための薬剤であって、有足細胞の表面上に存在するｈＣＤ９８に対するＣＡＳＫの結合を阻害するのに有効な薬剤に関する。
【００４４】
本明細書で使用される「処置」という用語は、疾患又は症状を抑制すること、すなわちその発症を停止すること；疾患又は症状を緩和すること、すなわち症状の退縮を引き起こすこと；又は、疾患によって引き起こされる症状、すなわち疾患の症候を緩和することを指す。
【００４５】
本明細書で使用される「予防」という用語は、それを有すると未だに診断されていない被験体において、疾患又は症状が発症するのを予防することを指す。
【００４６】
本明細書で使用される「ｈＣＤ９８」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＣＤ９８重鎖といくつかの軽鎖との共有結合によって形成される糖タンパク質関連インテグリンを指す（Chillaron J. et al. Am. J. Physiol. 281:995s1018.）。
【００４７】
典型的には、薬剤としては、限定されないが、抗体、有機低分子、ポリペプチド及びアプタマーが挙げられる。
【００４８】
一実施態様では、薬剤は抗体である。本発明は、ＣＡＳＫとｈＣＤ９８との間の相互作用を遮断する能力を有する抗体又は抗体フラグメントを包含する。抗体は、ＣＡＳＫ又はｈＣＤ９８に対する特異性を有し得る。一実施態様では、抗体又は抗体フラグメントは、ｈＣＤ９８の細胞外ドメインの全部又は一部に指向性を有する。一実施態様では、抗体又は抗体フラグメントは、ｈＣＤ９８の細胞外ドメインに指向性を有する。より具体的には、本発明は、ＣＡＳＫに対するｈＣＤ９８の結合を阻害することができる抗体であって、ＣＡＳＫに結合するｈＣＤ９８領域内に位置するエピトープに結合する抗体又はその部分を提供する。典型的には、前記エピトープは、ｈＣＤ９８のクラスＩＩ  ＰＤＺ結合ドメイン内に位置する（Yan Y, Vasudevan S, Nguyen H, Bork U, Sitaraman S, Merlin D. "Extracellular interaction between hhCD98 and the PDZ class II domain of hCASK in intestinal epithelia". J Membr Biol. 215(1):15-26. 2007）。本発明はまた、ＣＡＳＫに対するｈＣＤ９８の結合を阻害することができる抗体であって、ｈＣＤ９８に結合するＣＡＳＫ領域内に位置するエピトープに結合する抗体又はその部分を提供する。典型的には、前記エピトープは、ＣＡＳＫのＰＤＺクラスＩＩドメイン内に位置する（Yan Y, Vasudevan S, Nguyen H, Bork U, Sitaraman S, Merlin D. "Extracellular interaction between hhCD98 and the PDZ class II domain of hCASK in intestinal epithelia". J Membr Biol. 215(1):15-26. 2007）。
【００４９】
本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体はポリクローナル抗体である。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体はヒト化抗体である。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体はキメラ抗体である。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体の軽鎖を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体の重鎖を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦａｂ部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦ（ａｂ’）２の部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦｃ部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦｖ部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体の可変ドメインを含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体の１つ以上のＣＤＲドメインを含む。
【００５０】
本明細書で使用される「抗体」は、天然に存在する抗体及び天然に存在しない抗体の両方を含む。具体的には、「抗体」は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、並びにそれらの一価及び二価フラグメントを含む。さらに、「抗体」は、キメラ抗体、完全合成抗体、一本鎖抗体及びそれらのフラグメントを含む。抗体は、ヒト抗体又は非ヒト抗体であり得る。非ヒト抗体は、ヒトにおけるその免疫原性を減少させるために、リコンビナント方法によってヒト化され得る。
【００５１】
抗体は、従来方法に従って調製される。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilsteinの方法（Nature, 256:495, 1975）を使用して作製され得る。本発明において有用なモノクローナル抗体を調製するために、マウス又は他の適切な宿主動物を、抗原型のＣＡＳＫ又はｈＣＤ９８を用いて適切な間隔（例えば、１週間に２回、１週間に１回、１カ月に２回又は１カ月に１回）で免疫する。屠殺の１週間以内に最後の抗原の「追加免疫」を動物に行い得る。免疫中に免疫学的アジュバントを使用することが望ましいことが多い。適切な免疫学的アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ｒｉｂｉアジュバント、Hunter's Titermax、サポニンアジュバント、例えばＱＳ２１又はＱｕｉｌ  Ａ又はＣｐＧ含有免疫刺激オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の適切なアジュバントは、当技術分野で周知である。皮下経路、腹腔内経路、筋肉内経路、静脈内経路、鼻腔内経路又は他の経路によって、動物を免疫し得る。複数の経路によって、所定の動物を複数形態の抗原で免疫し得る。
【００５２】
簡潔に言えば、リコンビナントＣＡＳＫは、リコンビナント細胞株による発現によって提供され得る。ｈＣＤ９８は、ｈＣＤ９８をその表面に発現するヒト細胞の形態で提供され得る。リコンビナント型のｈＣＤ９８又はＣＡＳＫは、任意の前記方法を使用して提供され得る。免疫レジメン後、動物の脾臓、リンパ節又は他の器官からリンパ球を単離し、ポリエチレングリコールなどの薬剤を使用して適切な骨髄腫細胞株と融合してハイブリドーマを形成する。融合後、記載されているように（Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3rd edition, Academic Press, New York, 1996）、標準的な方法を使用して、ハイブリドーマの成長を許容するが融合パートナーの成長は許容しない培地中に細胞を置く。ハイブリドーマの培養後、所望の特異性の（すなわち、抗原に選択的に結合する）抗体の存在について細胞上清を分析する。適切な分析技術としては、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降及びウエスタンブロッティングが挙げられる。他のスクリーニング技術は、当技術分野で周知である。好ましい技術は、コンフォメーションがインタクトな、ネイティブでフォールディングされた抗原に対する抗体の結合を確認する技術、例えば、非変性ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー及び免疫沈降である。
【００５３】
重要なことに、当技術分野で周知のように、抗体分子の小部分（パラトープ）のみが、抗体のそのエピトープへの結合に関与する（一般には、Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照のこと）。例えば、Ｆｃ’領域及びＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素切断されたか又はｐＦｃ’領域を有さずに産生された抗体（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと称される）は、インタクトな抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素切断されたか又はＦｃ領域を有さずに産生された抗体（Ｆａｂフラグメントと称される）は、インタクトな抗体分子の抗原結合部位の一方を保持する。さらにいうと、Ｆａｂフラグメントは、共有結合した抗体軽鎖及び抗体重鎖の一部（Ｆｄと称される）からなる。Ｆｄフラグメントは、抗体特異性の主要な決定基であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体特異性を変化させることなく、最大１０個の異なる軽鎖に結合され得る）、Ｆｄフラグメントは、単独でエピトープ結合能を保持する。
【００５４】
当技術分野で周知のように、抗体の抗原結合部分内に、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びパラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）が存在する（一般には、Clark, 1986; Roitt, 1991を参照のこと）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄフラグメント及び軽鎖の両方において、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲＳ）によってそれぞれ分断された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、特にＣＤＲＳ領域、より具体的には重鎖ＣＤＲＳは、抗体特異性の大部分を担う。
【００５５】
元の抗体のエピトープ特異性を維持しながら、哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域を同種特異的又は異種特異的抗体の類似領域で置換し得ることは、現在では当技術分野で十分に確立されている。これは、機能的抗体を生産するために、非ヒトＣＤＲをヒトＦＲ及び／又はＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合する「ヒト化」抗体の開発及び使用において最も明確に認められる。
【００５６】
ある特定の実施態様では、本発明は、抗体のヒト化形態を含む組成物及び方法を提供する。本明細書で使用される「ヒト化」は、ＣＤＲ領域の外側のアミノ酸の一部、大部分又は全部がヒト免疫グロブリン分子由来の対応するアミノ酸で置換された抗体を示す。ヒト化の方法としては、限定されないが、米国特許第4,816,567号、米国特許第5,225,539号、米国特許第5,585,089号、米国特許第5,693,761号、米国特許第5,693,762号及び米国特許第5,859,205号（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。上記米国特許第5,585,089号及び米国特許第5,693,761号並びに国際公開第90/07861号はまた、ヒト化抗体を設計するのに使用することができる４つの可能な基準を提案している。第１の提案は、アクセプターについて、ヒト化するべきドナー免疫グロブリンに対して非常に相同な特定のヒト免疫グロブリン由来のフレームワークを使用するか、又は多くのヒト抗体由来のコンセンサスフレームワークを使用することであった。第２の提案は、ヒト免疫グロブリンのフレームワークのアミノ酸が通常のものではなく、その位置のドナーアミノ酸がヒト配列に典型的なものである場合、アクセプターではなくドナーアミノ酸を選択し得ることであった。第３の提案は、ヒト化免疫グロブリン鎖における３つのＣＤＲに直接隣接する位置において、アクセプターアミノ酸ではなくドナーアミノ酸を選択し得ることであった。第４の提案は、そのアミノ酸が、三次元抗体モデルにおけるＣＤＲの３Ａ内に側鎖原子を有すると予測され、ＣＤＲと相互作用することができると予測されるフレームワーク位置において、ドナーアミノ酸残基を使用することであった。上記方法は、当業者がヒト化抗体を作製するのに用いることができる方法の一部の単なる例示である。当業者であれば、抗体をヒト化するための他の方法を熟知しているであろう。
【００５７】
抗体のヒト化形態の一実施態様では、ＣＤＲ領域の外側のアミノ酸の一部、大部分又は全部をヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸で置換したが、１つ以上のＣＤＲ領域内の一部、大部分又は全部のアミノ酸は変更しない。アミノ酸のわずかな付加、欠失、挿入、置換又は改変は、所定の抗原に結合する抗体の能力を無効化しない限り許容され得る。適切なヒト免疫グロブリン分子としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＭ分子が挙げられる。「ヒト化」抗体は、元の抗体と同様の抗原特異性を保持する。しかしながら、Wu et al., /. Mol. Biol. 294:151, 1999（この内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ある特定のヒト化法を使用して、抗体の結合の親和性及び／又は特異性は、「定向進化」の方法を使用して増加され得る。
【００５８】
完全ヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の大部分がトランスジェニックなマウスを免疫することによって調製され得る。例えば、米国特許第5,591,669号、米国特許第5,598,369号、米国特許第5,545,806号、米国特許第5,545,807号、米国特許第6,150,584号及びそれらで引用されている参照文献を参照のこと（これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。これらの動物は、内因性（例えば、マウス）抗体の産生において機能的欠陥が存在するように遺伝子改変されている。動物は、これらの動物を免疫すると目的の抗原に対する完全ヒト抗体が産生されるように、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するようにさらに改変される。これらのマウス（例えば、XenoMouse (Abgenix)、HuMAbマウス（Medarex/GenPharm））の免疫後、モノクローナル抗体は、標準的なハイブリドーマ技術に従って調製され得る。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有するので、ヒトに投与した場合にヒト抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）応答を誘導しないであろう。
【００５９】
ヒト抗体を生産するためのin vitro方法も存在する。これらとしては、ファージディスプレイ技術（米国特許第5,565,332号及び米国特許第5,573,905号）及びヒトＢ細胞のin vitro刺激（米国特許第5,229,275及び米国特許第5,567,610号）が挙げられる。これらの特許の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
従って、当業者には明らかであるように、本発明はまた、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ及びＦｄフラグメント；Ｆｃ及び／若しくはＦＲ並びに／又はＣＤＲ１及び／若しくはＣＤＲ２及び／若しくは軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒト若しくは非ヒト配列で置換されたキメラ抗体；ＦＲ並びに／又はＣＤＲ１及び／若しくはＣＤＲ２及び／若しくは軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒト若しくは非ヒト配列で置換されたキメラＦ（ａｂ’）２フラグメント抗体；ＦＲ並びに／又はＣＤＲ１及び／若しくはＣＤＲ２及び／若しくは軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒト若しくは非ヒト配列で置換されたキメラＦａｂフラグメント抗体；並びにＦＲ並びに／又はＣＤＲ１及び／若しくはＣＤＲ２領域が相同なヒト若しくは非ヒト配列で置換されたキメラＦｄフラグメント抗体を提供する。本発明はまた、いわゆる一本鎖抗体を含む。
【００６１】
様々な抗体分子及びフラグメントは、限定されないが、ＩｇＡ、分泌性ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを含む一般的に公知の免疫グロブリンクラスのいずれかに由来し得る。ＩｇＧサブクラスも当業者に周知であり、これらとしては、限定されないが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が挙げられる。
【００６２】
別の実施態様では、本発明の抗体は、単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「ＶＨＨ」という用語は、本来的に軽鎖を欠くラクダ科哺乳動物に見られ得る種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このようなＶＨＨは、「nanobody（登録商標）」とも称される。本発明によれば、ｓｄＡｂは、特にラマｓｄＡｂであり得る。
【００６３】
本明細書に記載される薬剤の一実施態様では、薬剤はポリペプチドである。特定の実施態様では、ポリペプチドは、ｈＣＤ９８の機能的等価物である。本明細書で使用される「ｈＣＤ９８の機能的等価物は、ＣＡＳＫに結合し、それによりｈＣＤ９８との相互作用を妨げることができる化合物である。「機能的等価物」という用語は、ｈＣＤ９８のフラグメント、突然変異体及び突然変異タンパク質を含む。従って、「機能的に等価な」という用語は、タンパク質類似体がＣＡＳＫ結合能を保持するように、例えば、１つ以上のアミノ酸の欠失、置換又は付加によってアミノ酸配列を変化させることによって得られる任意のｈＣＤ９８等価物を含む。アミノ酸置換は、例えば、アミノ酸配列をコードするＤＮＡの点突然変異によって行うことができる。
【００６４】
機能的等価物としては、ＣＡＳＫに結合し、ｈＣＤ９８の細胞外ドメインの全部又は一部を含む分子が挙げられる。典型的には、前記機能的等価物は、ｈＣＤ９８のクラスＩＩ  ＰＤＺ結合ドメイン又はその一部を含み得る。
【００６５】
機能的等価物としては、可溶性形態のｈＣＤ９８が挙げられる。適切な可溶性形態のこれらのタンパク質又はその機能的等価物は、例えば、化学的、タンパク質分解又はリコンビナント方法によって膜貫通ドメインが除去された短縮形態のタンパク質を含み得る。
【００６６】
好ましくは、機能的等価物は、対応するタンパク質に少なくとも８０％相同である。好ましい実施態様では、機能的等価物は、任意の従来の分析アルゴリズム、例えば、Pileup配列分析ソフトウェア（Program Manual for the Wisconsin Package, 1996）によって評価した場合に、少なくとも９０％相同である。
【００６７】
本明細書で使用される「機能的に等価なフラグメント」という用語はまた、ＣＡＳＫに結合する任意のｈＣＤ９８フラグメント又はフラグメントアセンブリを意味し得る。従って、本発明は、ＣＡＳＫに対するｈＣＤ９８の結合を阻害することができるポリペプチドであって、ｈＣＤ９８の細胞外ドメインの少なくとも一部であってＣＡＳＫに結合するものの配列に対応する配列を有する連続アミノ酸を含むポリペプチドを提供する。一実施態様では、ポリペプチドは、ｈＣＤ９８の細胞外ドメインに対応する。別の一実施態様では、ポリペプチドは、クラスＩＩ  ＰＤＺ結合ｈＣＤ９８に対応する。別の一実施態様では、ポリペプチドは、ｈＣＤ９８のクラスＩＩ  ＰＤＺ結合ドメインの一部に対応する。
【００６８】
機能的に等価なフラグメントは、本明細書で同定されたヒトｈＣＤ９８と同じタンパク質ファミリーに属し得る。「タンパク質ファミリー」は、共通の機能を共有し、共通の配列相同性を示すタンパク質群を意味する。相同タンパク質は、非ヒト種に由来し得る。好ましくは、機能的に等価なタンパク質配列間の相同性は、完全なタンパク質のアミノ酸配列全体にわたって少なくとも２５％である。より好ましくは、相同性は、タンパク質又はタンパク質フラグメントのアミノ酸配列全体にわたって少なくとも５０％、さらにより好ましくは７５％である。より好ましくは、相同性は、配列全体にわたって８０％超である。より好ましくは、相同性は、配列全体にわたって９０％超である。より好ましくは、相同性は、配列全体にわたって９５％超である。
【００６９】
このような分子はＦＳＧＳの処置に有用であり、これらの分子はＣＡＳＫに特異的に結合し、それにより、ＣＡＳＫによって誘発される有足細胞における細胞骨格再編成を妨げるため、タンパク尿を予防するであろうと想定される。本明細書で使用される「特異的に結合する」は、機能的に等価な類似体が、コントロールタンパク質ではなくＣＡＳＫに対して高い親和性を有することを意味する。特異的結合は、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング又は免疫沈降などの多くの技術によって測定することができる。好ましくは、機能的に等価な類似体は、ナノモル又はピコモルレベルでＣＡＳＫに特異的に結合する。
【００７０】
当業者には明らかであるように、本発明のポリペプチドは、任意の適切な手段によって生産することができる。本発明に従って使用するのに十分な量のｈＣＤ９８又はその機能的等価物を生産するために、本発明のポリペプチドを含有するリコンビナント宿主細胞を適切な条件下で培養することによって、発現を好都合に達成することができる。好ましくは、ポリペプチドは、リコンビナント手段によって、コード核酸分子からの発現によって生産される。様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現のための系が周知である。
【００７１】
リコンビナント形態で発現される場合、ポリペプチドは、好ましくは、宿主細胞におけるコード核酸からの発現によって生成される。特定の系の個々の要件に応じて、任意の宿主細胞を使用することができる。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母及びバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のための当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞及び多くの他のものが挙げられる。また、細菌は容易に操作及び成長させることができるので、リコンビナントタンパク質の生産に好ましい宿主である。一般的な好ましい細菌宿主はE coliである。
【００７２】
具体的な実施態様では、本発明の治療方法において使用されるポリペプチドは、それらの治療有効性を改善するために改変され得ると意図される。治療用化合物のこのような改変は、毒性を減少させ、循環時間を増加させ、又は生体内分布を改変するために使用することができる。例えば、潜在的に重要な治療用化合物の毒性は、生体内分布を改変する様々な薬物担体ビヒクルとの組み合わせによって有意に減少させることができる。例では、ジペプチドを付加することにより、眼内の循環薬剤が内因性トランスポーターを使用して血液網膜関門を通って浸透するのを改善することができる。
【００７３】
薬物バイアビリティーを改善するための戦略は、水溶性ポリマーの利用である。様々な水溶性ポリマーは、生体内分布を改変し、細胞取り込みの様式を改善し、生理学的バリアを通る透過性を変化させ、及び身体からのクリアランス速度を改変することが示されている。ターゲティング効果又は持続放出効果のいずれかを達成するために、末端基として、骨格の一部として、又はポリマー鎖上のペンダント基として薬物部分を含有する水溶性ポリマーが合成されている。
【００７４】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、その高度な生体適合性及び改変容易性を考慮して薬物担体として広く使用されている。様々な薬物、タンパク質及びリポソームに付着させることにより、滞留時間が改善し、毒性が減少することが示されている。ＰＥＧは、鎖の末端のヒドロキシル基を通じて、及び他の化学的方法を介して活性薬剤にカップリングすることができる；しかしながら、ＰＥＧそれ自体は、１分子当たり多くとも２つの活性薬剤に限定される。異なるアプローチでは、ＰＥＧの生体適合特性を保持するが、１分子当たりの付着点が多い（より大きな薬物ローディングを提供する）というさらなる利点を有する新規生体材料であって、様々な用途に適するように合成的に設計され得る新規生体材料として、ＰＥＧとアミノ酸とのコポリマーが探索された。
【００７５】
当業者であれば、薬物の有効な改変のためのＰＥＧ化技術を認識している。例えば、ＰＥＧと三官能性モノマー（例えば、リシンなど）との交互ポリマーからなる薬物送達ポリマーが、VectraMed (Plainsboro, N.J.)によって使用されている。ＰＥＧ鎖（典型的には２０００ダルトン以下）が、安定したウレタン連結を介してリシンのａ及びｅアミノ基に連結されている。このようなコポリマーは、ポリマー鎖に沿って、厳密にコントロールされた既定の間隔で反応性ペンダント基（リシンのカルボン酸基）を提供しながら、ＰＥＧの望ましい特性を保持する。反応性ペンダント基を、誘導体化、架橋又は他の分子とのコンジュゲーションに使用することができる。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量、及び薬物とポリマーとの間の開裂可能な連結を変化させることによって、安定した長期循環プロドラッグを生産するのに有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／連結基複合体の間隔及びコンジュゲートの分子量当たりの薬物の量に影響を与える（より小さいＰＥＧセグメントはより大きな薬物ローディングを提供する）。一般に、ブロックコポリマーコンジュゲートの全分子量を増加させることによって、コンジュゲートの循環半減期が増加するであろう。それにもかかわらず、コンジュゲートは易分解性であるか、又は閾値を限定する糸球体ろ過を下回る分子量（例えば、６０kDa未満）を有しなければならない。
【００７６】
循環半減期及び生体内分布を維持するのに重要なポリマー骨格に加えて、リンカーを使用して、ターゲット組織における特定のトリガー、典型的には酵素活性によって骨格ポリマーから放出されるまで治療剤をプロドラッグ形態に維持し得る。例えば、この型の組織活性化薬物送達は、生体内分布の特定部位への送達が必要とされ、治療剤が病変部位に又はその近くに放出される場合に特に有用である。活性化薬物送達において使用するための連結基ライブラリーは当業者に知られており、酵素反応速度、活性酵素の分布、及び選択された疾患特異的酵素の切断特異性に基づくものであり得る。このようなリンカーは、治療送達のために、本明細書に記載されるタンパク質又はタンパク質部分を改変するのに使用することができる。
【００７７】
一実施態様では、薬剤はアプタマーアプタマーであり、分子認識の観点から抗体の代替物に相当する分子クラスである。アプタマーは、高い親和性及び特異性を有する任意のクラスのターゲットを実質的に認識する能力を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、ランダム配列ライブラリーの試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）によって単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって入手可能である。このライブラリーでは、各メンバーは、最終的には化学的に改変される固有配列の線形オリゴマーである。ペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド方法によってコンビナトリアルライブラリーから選択されるプラットフォームタンパク質（例えば、E. coliチオレドキシンＡ）によってディスプレイされるコンフォメーションが制限された抗体可変領域からなる。
【００７８】
本発明の別の目的は、それを必要とする被験体における巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の処置における使用のためのｈＣＤ９８遺伝子発現阻害剤である。
【００７９】
「発現阻害剤」は、遺伝子発現を阻害する生物学的効果を有する天然又は合成化合物を指す。従って、「ｈＣＤ９８遺伝子発現阻害剤」は、ｈＣＤ９８遺伝子発現を阻害する生物学的効果を有する天然又は合成化合物を表す。
【００８０】
本発明の好ましい実施態様では、前記ｈＣＤ９８遺伝子発現阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムである。
【００８１】
本発明において使用するためのｈＣＤ９８遺伝子発現阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物をベースとするものであり得る。アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｈＣＤ９８  ｍＲＮＡに結合することによってｈＣＤ９８  ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断し、それによりタンパク質の翻訳を妨げるか、又はｍＲＮＡの分解を増加させ、それによりｈＣＤ９８のレベル及び細胞における活性を低下させるように作用する。例えば、ｈＣＤ９８をコードするｍＲＮＡ転写配列の固有領域に相補的な少なくとも約１５塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、従来のホスホジエステル技術によって合成することができ、例えば、静脈内注射又は注入によって投与することができる。その配列が既知の遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技術の使用方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第6,566,135号；米国特許第6,566,131号；米国特許第6,365,354号；米国特許第6,410,323号；米国特許第6,107,091号；米国特許第6,046,321号；及び米国特許第5,981,732号を参照のこと）。
【００８２】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も、本発明において使用するためのｈＣＤ９８遺伝子発現阻害剤として機能することができる。ｈＣＤ９８遺伝子発現が特異的に阻害されるように（すなわち、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉ）腫瘍、被験体又は細胞と、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、又は低分子二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクター若しくは構築物とを接触させることによって、ｈＣＤ９８遺伝子発現を低減することができる。その配列が既知の遺伝子の場合、適切なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡコードベクターを選択するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Tuschi, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許第6,573,099号及び米国特許第6,506,559号；並びに国際公開第01/36646号、国際公開第99/32619号及び国際公開第01/68836を参照のこと）。
【００８３】
リボザイムも、本発明において使用するためのｈＣＤ９８遺伝子発現阻害剤として機能することができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機序は、相補的ターゲットＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、それに続くエンドヌクレアーゼ切断を含む。従って、ｈＣＤ９８  ｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断を特異的及び効率的に触媒する人工的なヘアピン又はハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内において有用である。典型的には、以下の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位についてターゲット分子をスキャンすることによって、任意の潜在的なＲＮＡターゲット内の特定のリボザイム切断部位を最初に同定する。同定したら、切断部位を含有するターゲット遺伝子の領域に対応する約１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切なものにし得る予測構造的特徴（例えば、二次構造）について評価することができる。候補ターゲットの適合性はまた、例えば、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対するアクセシビリティを試験することによって評価することができる。
【００８４】
ｈＣＤ９８遺伝子発現阻害剤として有用なアンチセンスオリゴペプチド及びリボザイムの両方が、既知の方法によって調製することができる。これらとしては、例えば、固相ホスホールアミダイト化学合成などによる化学合成技術が挙げられる。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、そのＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitro又はin vivo転写によって作製することができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み入れる包含する様々なベクターに組み込むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドに対する様々な改変は、細胞内安定性及び半減期を増加させる手段として導入することができる。可能な改変としては、限定されないが、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列を分子の５’及び／若しくは３’末端に付加すること、又はオリゴヌクレオチド骨格内のホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオエート若しくは２’−Ｏ−メチルを使用することが挙げられる。
【００８５】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ及びリボザイムは、単独で又はベクターと併せてin vivo送達され得る。その最も広い意味において、「ベクター」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸を細胞、好ましくはｈＣＤ９８を発現している細胞に輸送するのを促進することができる任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在下で生じる分解程度と比べて軽減された分解で、核酸を細胞に輸送する。一般に、本発明において有用なベクターとしては、限定されないが、プラスミド、ファージミド、ウイルス、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸配列の挿入又は組み込みによって操作されたウイルス又は細菌源由来のビヒクルが挙げられる。ウイルスベクターは好ましい種類のベクターであり、限定されないが、以下のウイルス由来の核酸配列が挙げられる：レトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳房腫瘍ウイルス及びラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；及びＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルス。当業者であれば、当技術分野で既知の名称不明の他のベクターを容易に用いることができる。
【００８６】
好ましいウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子で置換された非細胞変性真核ウイルスに基づくものである。非細胞変性ウイルスとしては、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）が挙げられ、そのライフサイクルは、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写と、それに続く宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルス組込を含む。レトロウイルスは、ヒト遺伝子治療治験で承認されている。複製欠損性の（すなわち、所望のタンパク質の合成を指示することができるが、感染粒子を製造することができない）レトロウイルスが最も有用である。このような遺伝子改変レトロウイルス発現ベクターは、高効率なin vivo遺伝子トランスダクションの一般的有用性を有する。（外因性遺伝物質をプラスミドに組み込む工程、プラスミドでパッケージ細胞株をトランスフェクションする工程、細胞株をパッケージングすることによってリコンビナントレトロウイルスを生産する工程、組織培養培地からウイルス粒子を回収する工程、及びウイルス粒子をターゲット細胞に感染させる工程を含む）複製欠損レトロウイルスを生産するための標準的なプロトコールが、KRIEGLER (A Laboratory Manual," W.H. Freeman C.O., New York, 1990) and in MURRY ("Methods in Molecular Biology," vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991)に示されている。
【００８７】
ある特定の適用に好ましいウイルスはアデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスであり、これらは、ヒトにおける遺伝子治療の使用について既に承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損製性になるように操作され得、広範囲の細胞型及び種に感染することができる。それは、熱及び脂質溶媒安定性；造血細胞を含む多様な細胞系統における高いトランスダクション頻度；及び複数回のトランスダクションを可能にする重複感染阻害の欠如などの利点をさらに有する。報告によると、アデノ随伴ウイルスは、ヒト細胞ＤＮＡに部位特異的に融合し、それにより挿入突然変異の可能性、及びレトロウイルス感染に特徴的な挿入遺伝子発現の変動性を最小限にすることができる。加えて、選択圧の非存在下で、野生型アデノ随伴ウイルス感染を１００継代以上にわたって組織培養液中で追跡したところ、アデノ随伴ウイルスゲノムの組み込みは比較的安定な事象であることが示唆された。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外で機能することができる。
【００８８】
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは当技術分野で広く記載されており、当業者に周知である。例えば、SANBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照のこと。ここ数年では、プラスミドベクターは、抗原をコードする遺伝子をin vivoで細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。それらは、ウイルスベクターの多くと同じ安全上の懸念を有しないので特に有用である。しかしながら、宿主細胞に適合性のプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で作動可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現することができる。いくつかの一般に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドが当業者に周知である。加えて、特定のＤＮＡフラグメントを除去及び付加するために、制限酵素及びライゲーション反応を使用して、プラスミドをカスタム設計することができる。プラスミドは、様々な非経口、粘膜及び局所経路によって送達することができる。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下又は他の経路によって注射することができる。鼻腔内スプレー又は点滴薬、直腸座剤によって、及び経口的にそれを投与することもできる。遺伝子銃を使用して、それを表皮又は粘膜表面に投与することもできる。プラスミドを水溶液に入れ、金粒子上に乾燥させ、又は限定されないが、リポソーム、デンドリマー、コクレート（cochleate）及びマイクロカプセル化を含む別のＤＮＡ送達系と併せることができる。
【００８９】
本発明の別の目的は、ＦＳＧＳの処置又は予防における使用のための方法であって、有足細胞の表面上に存在するｈＣＤ９８に対するＣＡＳＫの結合を阻害するのに有効な少なくとも１つの薬剤又はｈＣＤ９８遺伝子発現阻害剤の治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。
【００９０】
有足細胞の表面上に存在するｈＣＤ９８に対するＣＡＳＫの結合を阻害するのに有効な上記薬剤又は上記ｈＣＤ９８遺伝子発現阻害剤の「治療有効量」は、有足細胞の表面上に存在するｈＣＤ９８に対するＣＡＳＫの結合を阻害するのに有効な薬剤又はｈＣＤ９８遺伝子発現阻害剤の、ＦＳＧＳを処置又は予防するのに十分な量を意味する。しかしながら、本発明の化合物及び組成物の合計１日使用量は、担当医によって健全な医学的判断の範囲内で決定されると理解されよう。任意の特定の被験体のための具体的な治療有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；用いられる具体的な化合物の活性；用いられる具体的な組成物、被験体の年齢、体重、全般的健康、性別及び食事；投与時間、投与経路及び用いられる具体的な化合物の排出速度；処置期間；用いられる具体的なポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに医学分野で周知の類似要因を含む様々な要因に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるレベルよりも低いレベルで化合物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは、十分に当業者の範囲内である。しかしながら、製品の１日投与量は、成人１日当たり０．０１〜１，０００mgの広範囲にわたって変化し得る。好ましくは、組成物は、処置するべき被験体に投与量を症状調整するために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgの有効成分を含有する。医薬品は、典型的には、約０．０１mg〜約５００mgの有効成分、好ましくは１mg〜約１００mgの有効成分を含有する。有効量の薬物は、通常、０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重／日、特に約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重／日の投与量レベルで供給される。
【００９１】
有足細胞の表面上に存在するｈＣＤ９８に対するＣＡＳＫの結合を阻害するのに有効な本発明の薬剤又は本発明のｈＣＤ９８遺伝子発現阻害剤を、薬学的に許容しうる賦形剤、及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせて治療組成物を形成することができる。
【００９２】
「薬学的に」又は「薬学的に許容しうる」は、必要に応じて哺乳動物、特にヒトに投与した場合に、有害な、アレルギー性の又は他の不利な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容しうる担体又は賦形剤は、任意の種類の非毒性固体、半固体若しくは液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料又は製剤化補助剤を指す。
【００９３】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与用の本発明の医薬組成物において、有効成分を単独で又は別の有効成分と組み合わせて、単位投与剤形で、従来の医薬支持体との混合物として動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与剤形は、経口経路剤形、例えば錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒及び経口懸濁液又は溶液、舌下及び口腔投与剤形、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮及び鼻腔内投与剤形、並びに直腸投与剤形を含む。
【００９４】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤用の薬学的に許容しうるビヒクルを含む。これらは、特に、等張滅菌生理食塩水（リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水に追加すると注射溶液を構成することができる乾燥（特に、凍結乾燥）組成物であり得る。
【００９５】
注射使用に適切な医薬剤形としては、滅菌水溶液又は分散液；ごま油、ピーナッツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。すべての場合において、剤形は滅菌されていなければならず、注射容易性が存在する程度に液状でなければならない。それは製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。
【００９６】
遊離塩基又は薬理学的に許容しうる塩として本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することもできる。通常の貯蔵下及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を妨げる保存剤を含有する。
【００９７】
有足細胞の表面上に存在するｈＣＤ９８に対するＣＡＳＫの結合を阻害するのに有効な本発明の薬剤又は本発明のｈＣＤ９８遺伝子発現阻害剤を中性又は塩形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容しうる塩としては、（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）酸付加塩であって、例えば塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、オキサル酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される酸付加塩が挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来し得る。
【００９８】
担体はまた、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散液の場合には必要な粒径を維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。微生物作用の抑制は、様々な抗細菌及び抗ｆｕＣＡＳＫ剤、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖類又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射組成物の長期吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中で使用することによってもたらされ得る。
【００９９】
滅菌注射溶液は、上に列挙した様々な他の成分を含む適切な溶媒に必要な量の活性ポリペプチドを組み込み、必要に応じて続いてフィルター滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、塩基性分散媒と、上に列挙した必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに様々な滅菌有効成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、その予め滅菌ろ過された溶液から有効成分＋任意のさらなる所望成分の粉末が得られる真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
【０１００】
製剤化により、溶液は、投与製剤に適合するように、及び治療有効量で投与される。製剤は、様々な剤形、例えば上記種類の注射溶液で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども用いることができる。
【０１０１】
水溶液での非経口投与では、例えば、必要な場合には溶液を適切に緩衝化するべきであり、液体希釈液を最初に十分な生理食塩水又はグルコースで等張にする。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適切である。これに関連して、用いられ得る滅菌水性媒体は、本開示を考慮して当業者には知られている。例えば、１投与量を１mlの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００mlの皮下注入液に追加し得るか、又は提案される注入部位に注射し得る。処置される被験体の症状に応じて、いくらかの投与量の変動が必然的に生じるであろう。投与責任者は、いずれにせよ、個々の被験体の適切な用量を決定するであろう。
【０１０２】
有足細胞の表面上に存在するｈＣＤ９８に対するＣＡＳＫの結合を阻害するのに有効な本発明の薬剤又は本発明のｈＣＤ９８遺伝子発現阻害剤は、１用量当たり約０．０００１〜１．０ミリグラム、又は約０．００１〜０．１ミリグラム、又は約０．１〜１．０又はさらに約１０ミリグラムを含むように治療混合物内に製剤化され得る。
【０１０３】
静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与用に製剤化された本発明の化合物に加えて、他の薬学的に許容しうる形態としては、例えば、錠剤又は経口投与用の他の固体；リポソーム製剤；徐放性カプセル；及び現在使用されている任意の他の形態が挙げられる。
【０１０４】
本発明のスクリーニング方法：
本発明はまた、ＦＳＧＳの処置又は予防のための薬物をスクリーニングする方法であって、候補化合物が、有足細胞の表面上に存在するｈＣＤ９８に対するＣＡＳＫの結合を阻害するのに効果的かを決定すること、及びｉｉ）有足細胞の表面上に存在するｈＣＤ９８に対するＣＡＳＫの結合を阻害するのに効果的な候補化合物を正に選択することからなる工程を含む方法に関する。
【０１０５】
特定の実施態様では、この方法は、
ａ）ＣＡＳＫを固体支持体上に固定化すること；
ｂ）該固定化ＣＡＳＫと、該固定化ＣＡＳＫ上のすべてのｈＣＤ９８結合部位を飽和するのに十分な検出可能なｈＣＤ９８とを、該固定化ＣＡＳＫに対する該ｈＣＤ９８の結合を可能にする条件下で接触させて複合体を形成させること；
ｃ）非結合のｈＣＤ９８を除去すること；
ｄ）該複合体と化合物とを接触させること；及び
ｅ）任意のｈＣＤ９８が該複合体から離れるかを決定すること
からなる工程を含み、ｈＣＤ９８が該複合体から離れることが、該化合物がＣＡＳＫに結合することを示す。
【０１０６】
別の特定の実施態様では、この方法は、
ａ）ｈＣＤ９８を固体支持体上に固定化すること；
ｂ）該固定化ｈＣＤ９８と、該固定化ｈＣＤ９８上のすべてのＣＡＳＫ結合部位を飽和するのに十分な検出可能なＣＡＳＫとを、ＣＡＳＫに対する該固定化ｈＣＤ９８の結合を可能にする条件下で接触させて複合体を形成させること；
ｃ）非結合のＣＡＳＫを除去すること；
ｄ）該複合体と化合物とを接触させること；
ｅ）任意のＣＡＳＫが該複合体から離れるかを決定すること
からなる工程を含み、ＣＡＳＫが該複合体から離れることが、該化合物が該ｈＣＤ９８に結合することを示す。
【０１０７】
別の特定の実施態様では、この方法は、
（ａ）ＣＡＳＫと、ＣＡＳＫ上のすべてのｈＣＤ９８結合部位を飽和するのに十分な検出可能なｈＣＤ９８とを、ＣＡＳＫに対する該ｈＣＤ９８の結合を可能にする条件下で接触させて複合体を形成させること；
（ｂ）非結合のｈＣＤ９８を除去すること；
（ｃ）該複合体におけるＣＡＳＫに結合しているｈＣＤ９８の量を測定すること；
（ｄ）該複合体と化合物とを接触させてｈＣＤ９８を該複合体から離すこと；
（ｅ）該化合物の存在下で該化合物に結合しているｈＣＤ９８の量を測定すること；及び
（ｆ）工程（ｅ）におけるＣＡＳＫに結合しているｈＣＤ９８の量を、工程（ｃ）で測定した量と比較すること
からなる工程を含み、工程（ｅ）で測定した量の減少が、該化合物がＣＡＳＫに結合することを示す。
【０１０８】
別の特定の実施態様では、この方法は、
（ａ）ＣＡＳＫと、化合物及び検出可能なｈＣＤ９８とを、該化合物の非存在下でＣＡＳＫに対するｈＣＤ９８の結合を可能にする条件下で接触させて複合体を形成させること；
（ｂ）非結合のｈＣＤ９８を除去すること；
（ｃ）該化合物の存在下で該複合体におけるＣＡＳＫに結合している検出可能なｈＣＤ９８の量を、該化合物の非存在下で該化合物に結合する検出可能なｈＣＤ９８の量と比較すること
からなる工程を含み、該化合物の存在下で測定したｈＣＤ９８の量の減少が、該化合物がＣＡＳＫ又はｈＣＤ９８に結合することを示す。
【０１０９】
本明細書に記載される方法では、実体は、検出可能なマーカーでそれを標識することによって検出可能にすることができる。本明細書に記載される方法の一実施態様では、検出可能なｈＣＤ９８は、検出可能なマーカーで標識されている。本明細書に記載される方法の一実施態様では、検出可能なＣＡＳＫ糖タンパク質は、検出可能なマーカーで標識されている。当業者であれば、様々な種類の検出可能なマーカーを知っているだろう。このような検出可能なマーカーとしては、限定されないが、放射性、熱量測定、発光及び蛍光マーカーが挙げられる。
【０１１０】
本明細書に記載される方法の一実施態様では、固体支持体は、マイクロタイタープレートウェルである。別の実施態様では、固体支持体はビーズである。さらなる実施態様では、固体支持体は、表面プラズモン共鳴センサチップである。表面プラズモン共鳴センサチップは、予め固定化されたストレプトアビジンを有し得る。一実施態様では、表面プラズモン共鳴センサチップは、BIAcore（商標）チップである。
【０１１１】
上記方法の一実施態様では、検出可能な分子は、検出可能なマーカーで標識されている。上記方法の別の実施態様では、検出可能な分子は、それと、該検出可能な分子に結合することができる別の検出可能な化合物とを接触させることによって検出される。検出可能なマーカーとしては、上記のものが挙げられる。
【０１１２】
本明細書で使用される「候補化合物」という用語は、タンパク質及び非タンパク質部分の両方を含む。一実施態様では、候補化合物は低分子である。別の実施態様では、候補化合物はタンパク質である。タンパク質は、一例として、ＣＡＳＫの部分に対して指向性を有する抗体であり得る。候補化合物は、低分子量化合物のライブラリー、又は植物若しくは他の生物からの抽出物のライブラリーに由来し得る。一実施態様では、薬剤は既知のものである。別の実施態様では、候補化合物は、既に知られているものではない。本発明の薬剤／化合物としては、限定されないが、化合物又は分子実体、例えばペプチド、ポリペプチド及び他の有機又は無機分子並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１１３】
以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに例証する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、何ら本発明の範囲を限定するものと解するべきではない。
【０１１４】
実施例：ＣＡＳＫ、巣状分節性糸球体硬化症に関与する可溶性因子
１−  可溶性ＣＡＳＫは、再発性ＦＳＧＳに関連する
本研究の主な目的は、ＦＳＧＳの病因に関与する可溶性因子の同定及び特性決定にある。我々は、診断、予後及び治療目的のために、同種移植片におけるその再発を研究することに特に関心がある。
【０１１５】
上述のように、血漿交換／免疫吸着（immunoabsortion）は、この分子を血清から除去し、ＦＳＧＳ患者の症候を劇的に改善する。これらの事実に基づいて、我々は、最初の出発点としてプロテインＡの免疫吸着（immunoabsortion）アプローチ及びさらに質量分析ＭＳ分析を適用した。
【０１１６】
患者から血清を採取し、ＭＳのために加工した。電気泳動（ＰＡＧＥ）によって、十分に識別可能なバンド（約１００kDa）が認められ、これをトリプシン消化した。アルキル化した後、回収したペプチドを分析及び加工して、ナノエレクトロスプレーＬＣ−ＱＴＯＦ（液体クロマトグラフィー−四重極飛行時間型）分析計で質量分析ＭＳ／ＭＳを行った。このような手順を実施した後、我々は、ヒトＣＡＳＫ配列に１００％マッチする８個のペプチドを得た。
【０１１７】
このタンパク質を同定してから、我々は、ＦＳＧＳの病因との関連性の検証を進めた。従って、我々は、健常コントロールに関連する患者由来の血清中のＣＡＳＫの存在を最初に検査した。ドットブロット抗ＣＡＳＫによって、試験を実施した。血清中のＣＡＳＫの存在は、患者のみに見られた。同じ患者で用いた抗ネフリンを使用することによって、同一の実験を行った。結果は、ネフリンがすべての患者の血清中に存在しないことを実証した。これらのデータにより、血清由来のＣＡＳＫは、大規模な糸球体破壊による混入物以外であることが実証された。
【０１１８】
ＦＳＧＳ患者におけるＣＡＳＫの特異性についてのより良い情報を得るために、プロテインＧによる免疫除去、続いて抗ＣＡＳＫによるウエスタンを行った。ＣＡＳＫの全長アイソフォームに対応する１１４kDaのバンドの存在が明確に示された。驚くべきことに、このバンドはＨＳＧＳ患者にしか存在せず、健常コントロールには存在しなかった。
【０１１９】
ＣＡＳＫは、膜間タンパク質といわれている；従って、ＦＳＧＳ患者由来の血清中にそれが予想外に存在することは、広範囲な研究の対象になるはずである。１つの可能性は、異常な発現−分泌機構が血液細胞に存在することである。手掛かりとして、我々は、リンパ系起源の悪性細胞株におけるＣＡＳＫの高発現が、腎明細胞ガン腫から生じたＲＣＣ７細胞ではなくバーキットリンパ腫ＢＬ４１細胞におけるＣＡＳＫの発現を示したことを見出した。同様に、ＣＡＳＫは、ジャーカット白血病Ｔ細胞によっても発現されていた。これらのデータは、血液細胞の潜在的な分泌によって、球体外起源の血清ＣＡＳＫが生成されることを示唆している可能性がある。
【０１２０】
２−  可溶性ＣＡＳＫは、有足細胞の改変、細胞接触の変化及びアルブミン尿を誘導する
ＦＳＧＳの生理病理学における可溶性ＣＡＳＫの関与を決定するために、我々は、ＣＡＳＫと有足細胞との相互作用を試験した。
【０１２１】
有足細胞におけるin vitro実験のために、我々は、in vitro実験（experiences）用のリコンビナントＣＡＳＫをポリヒスチジンタグ付のｐＣＤＮＡ３．１＋及びｐＴＲＣ２にクローニングし、発現させた。
【０１２２】
ＳＶ４０によって不死化した有足細胞株において、リコンビナントＣＡＳＫの潜在的活性を試験した。我々は、膜密着結合の構造に対する潜在的なＣＡＳＫ誘導性の変化を、免疫蛍光抗ＺＯ−１によって調べた。有足細胞の細胞間結合からＺＯ−１が見掛け上消失することが示された（whown）。同様の結果が、膜間ｐ−カドヘリンの分布で見られた。これらの結果により、細胞の膜構成及び極性におけるＣＡＳＫの直接的な効果が示唆された。
【０１２３】
細胞骨格編成は、細胞極性の維持並びに膜タンパク質の分布及び安定性に必須である。本計画下では、アクチンマイクロフィラメントは、重要な役割を果たす。リコンビナントＣＡＳＫによって処理した有足細胞で実施した実験により、現在は形態学的安定性又は接着のような多くの細胞機能に関連するアクチンストレスファイバーの発現が明らかになった。
【０１２４】
糸球体構造に対する可溶性ＣＡＳＫの効果を試験するために、リコンビナントＣＡＳＫ（６０μg／注射）又はコントロールタンパク質（ウシ血清アルブミン６０μg／注射）をマウス（３匹／群）に３日間連続で静脈内注射した。最後の注射の翌日にマウスを屠殺し、腎臓を調製して電子顕微鏡によって分析した。コントロール群（左のパネル）では、有足細胞（Ｐ）は典型的な足突起（オレンジ色の矢印）を示しているのに対して、ＣＡＳＫを注射したマウス（右のパネル）では、有足細胞は足突起の融合を示している（赤色の矢印）。
【０１２５】
我々は、フィルター上で培養した単層の有足細胞について、接触接着の維持及びタンパク質の移行の欠如に対するリコンビナントＣＡＳＫの効果を試験した。マウスアルブミン（Mousse Albumin）を上部チャンバーに追加し、マウスアルブミン（mousse albumin）の存在について、下部チャンバーの培地をＥＬＩＳＡによって試験した。単層上へのＣａｓｋの追加は、マウスアルブミンの移行の増加に関連していた。
【０１２６】
我々はまた、ＣＡＳＫの単回注射がＳＣＩＤマウスにおいてタンパク尿を誘導する能力を試験した。２０μgのＣＡＳＫ又はビヒクルを４匹のマウスに注射した。２４時間後、膀胱圧迫（bladder squize）中に尿を採取した。
【０１２７】
我々はまた、ＣＡＳＫ（２０μg/ml）（２００μl）をＦＶＢマウス（ｎ＝３）に静脈内注射し、尿を１日にわたって代謝チャンバーに採取した。ＥＬＩＳＡ（Bedhyl）によって、マウスアルブミン尿を決定した。ＣＡＳＫの注射は、アルブミン尿の増加に関連している（平均値＋１４０％）。単回注射後、タンパク尿は正常値まで低下し、２回目のＣＡＳＫ注射（２０μg/ml）（２００μl）後に再増加した。
【０１２８】
ビヒクル（ＣＴＲＬ）又はＣＡＳＫ（２０μg）のいずれかを静脈内投与した２つのマウス群を用いて、２セット目のin vivo実験を実施した。ＣＡＳＫ注射後のタンパク尿は、コントロール動物と比較して有意に増加している。
【０１２９】
３−  可溶性ＣＡＳＫは、有足細胞におけるＣＤ９８に結合する
我々は、有足細胞上の潜在的なＣＡＳＫレセプターを調べた。ごく最近、膜タンパク質ＣＤ９８は、腸管上皮におけるＣＡＳＫリガンドといわれている。ＣＤ９８は、ＰＤＺ結合ドメインを含む約５００残基の大きな膜外領域を示す。ＩＰ分析によって、リコンビナントＣＡＳＫとそのレセプターとの架橋後、我々は、ＣＤ９８がＣＡＳＫと共沈したことを示した。我々はＣＤ９８をクローニングし、それを細菌で発現させた。我々は、可溶性ＣＡＳＫがＣＤ９８に結合し、血清中では枯渇している可能性があることを示した。
【０１３０】
これらの結果により、可溶性ＣＤ９８は、ＣＡＳＫとその内因性レセプターとの相互作用を阻害する治療ツールとなり得ることが示された。
【０１３１】
４−  有足細胞におけるＣＡＳＫ誘導性シグナル伝達
導入部分で説明したように、細胞内ＣＡＳＫは、骨格タンパク質として、膜タンパク質の連結及びさらには細胞骨格へのシグナル伝達によって極性細胞構造の維持に関与している。我々は、細胞外ＣＡＳＫがアクチン細胞骨格の再編成に関連していることを観察した。ＣＤ９８は、ＮＦｋＢ経路に関係すると考えられている。我々は、ＮＦｋＢ活性の活性化及びそれによるｐ６５の核構造への移行を試験した。３０分後、ｐ６５分子は核に移行した。これは、ｉｋＢアルファのリン酸化と相関している。これは、ＮＦｋＢ活性の阻害が、ＣＡＳＫによって誘導される有足細胞の変化を軽減することを示唆している。
【０１３２】
ｉｋＢのリン酸化は、その分解、並びに核移行するｐ６５及びｐ５０  ＮＦｋＢの細胞質における放出に関連している。従って、我々は、免疫蛍光によってｐ６５の核への核移行を試験した。抗ＣＤ９８ｍＡｂと共にインキュベーションした細胞では、これらの効果（ｉｋＢのリン酸化及びＮＦｋＢの核移行）の両方が観察されなかった。
【０１３３】
有足細胞をＣＡＳＫと共にインキュベーションすることにより、ＭＡＰＫ経路の活性化も誘導される。この経路は、細胞を抗ＣＤ９８ｍＡｂと共にインキュベーションした場合にも活性化される。
【０１３４】
全体として（Alltogether）、これらの結果は、ＣＡＳＫが、ＺＯ−１の再分布並びに活性化ＮＦｋＢ経路及びＭＡＰＫ経路を好むアクチン骨格の再構成を誘導するが、後者はＮＦｋＢ経路よりも非特異的であることを示している。
【０１３５】
我々はまた、創傷治癒試験を用いて、ＣＡＳＫが、細胞の運動能の改変に関連していたかを決定した。コンフルエントな分化（differenciated）有足細胞をＣＡＳＫの有無の下でインキュベーションした。２４時間後に、創傷スケアのサイズを決定した。細胞外ＣＡＳＫは、細胞の遊走能の低下に関連している。
【０１３６】
参考文献：
本出願を通して、本発明が関係する最先端技術が様々な参考文献記載されている。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み込まれる。
【０１３７】
【表１】
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【国際調査報告】
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