(57)【要約】  この開示では、遺伝子操作された生合成経路、組み換え細胞、及びエステルの生合成に関連する方法を説明している。組み換え細胞は、野生型対照と比較して、増加したエステルの生合成を示すように改変され得る。組み換え細胞は、当該組み換え細胞がエステルを産生するのに有効な条件下、炭素源を含む培地中でインキュベートされ得る。この開示ではまた、概して、炭素源をエステルに変換するステップを触媒する少なくとも１つのポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入することを含む方法であって、ここで前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、改変された宿主細胞が炭素源のエステルへの変換を触媒するように、プロモーターと作動可能に連結される方法も説明している。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型対照と比較して、増加したエステルの生合成を示すように改変された組み換え細胞。
【請求項２】
前記微生物細胞が、真菌細胞である、請求項１に記載の組み換え微生物細胞。
【請求項３】
前記真菌細胞が、サッカロミセス科（Saccharomycetaceae）のメンバーである、請求項２に記載の組み換え細胞。
【請求項４】
前記真菌細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・ルゴーサ（Candida rugosa）、又はカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）である、請求項２に記載の組み換え細胞。
【請求項５】
前記微生物細胞が、細菌細胞である、請求項１に記載の組み換え細胞。
【請求項６】
前記細菌細胞が、プロトバクテリア門（phylum Protobacteria）のメンバーである、請求項５に記載の組み換え細胞。
【請求項７】
前記細菌細胞が、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）のメンバーである、請求項６に記載の組み換え細胞。
【請求項８】
前記細菌細胞が、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）である、請求項７に記載の組み換え細胞。
【請求項９】
前記細菌細胞が、シュードモナス科（Pseudomonaceae）のメンバーである、請求項６に記載の組み換え細胞。
【請求項１０】
前記細菌細胞が、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）である、請求項９に記載の組み換え細胞。
【請求項１１】
前記細菌細胞が、ファーミキューテス門（phylum Firmicutes）のメンバーである、請求項５に記載の組み換え細胞。
【請求項１２】
前記細菌細胞が、バチルス科（Bacillaceae）のメンバーである、請求項１１に記載の組み換え細胞。
【請求項１３】
前記細菌細胞が、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）である、請求項１２に記載の組み換え細胞。
【請求項１４】
前記細菌細胞が、ストレプトコッカス科（Streptococcaceae）のメンバーである、請求項１１に記載の組み換え細胞。
【請求項１５】
前記細菌細胞が、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）である、請求項１４に記載の組み換え細胞。
【請求項１６】
前記細菌細胞が、クロストリジウム科（Clostridiaceae）のメンバーである、請求項１１に記載の組み換え細胞。
【請求項１７】
前記細菌細胞が、クロストリジウム・セルロリチカム（Clostridium cellulolyticum）である、請求項１６に記載の組み換え細胞。
【請求項１８】
前記細菌細胞が、シアノバクテリア門（phylum Cyanobacteria）のメンバーである、請求項５に記載の組み換え細胞。
【請求項１９】
前記微生物細胞が、光合成細胞である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組み換え細胞。
【請求項２０】
前記微生物細胞が、セルロース分解細胞である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組み換え細胞。
【請求項２１】
前記の野生型対照と比較して、増加したエステルの生合成が、イソ酪酸イソブチル、イソ吉草酸イソバレリル、酢酸イソブチル、又は酢酸イソアミルの産生の増加を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組み換え細胞。
【請求項２２】
前記の野生型対照と比較して、増加したエステルの生合成が、野生型対照と比較して、有機酸のアシル−ＣｏＡへの変換の増大、野生型対照と比較して、ケト酸のアシル−ＣｏＡへの変換の増大、野生型対照と比較して、アルデヒドの有機酸への変換の増大、野生型対照と比較して、アルデヒドのアルコールへの変換の増大、又は野生型対照と比較して、エステルを形成するためのアシル−ＣｏＡのアルコールとの組み合わせの増大を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組み換え細胞。
【請求項２３】
前記の野生型対照と比較して、増加したエステルの生合成が、２−ケトイソバレラートのイソブチルアルデヒドへの変換の増大、及びイソブチルアルデヒドのイソブタノールへの変換の増大、イソブタノールとアシル−ＣｏＡからの酢酸イソブチルの合成の増大、２−ケトイソバレラートの２−ケト−４−メチルバレラートへの延長の増大、２−ケト−４−メチルバレラートのイソバレルアルデヒドへの変換の増大、イソバレルアルデヒドのイソペンタノールへの変換の増大、又はイソペンタノールとアシル−ＣｏＡからの酢酸イソアミルの合成の増大を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組み換え細胞。
【請求項２４】
所望のエステルの合成を増大するように改変されたアシルトランスフェラーゼを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組み換え細胞。
【請求項２５】
前記改変されたアシルトランスフェラーゼが、改変される前のアシルトランスフェラーゼによって産生されるより多くの炭素を有するエステルの合成を増大する、請求項２４に記載の組み換え細胞。
【請求項２６】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組み換え細胞を、その組み換え細胞がエステルを産生するのに有効な条件下、炭素源を含む培地中でインキュベートすることを含む方法であって、ここで前記炭素源が：グルコース、ピルバート、ケトバリン、ＣＯ2、セルロース、キシロース、スクロース、アラビノース、グリセロール、アルギナート、グルカラート、又はガラクツロナートのうちの１つ以上を含む、方法。
【請求項２７】
前記培地が、カルボン酸をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記培地が、アルコールをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
炭素源をエステルに変換するステップを触媒する少なくとも１つのポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入することを含む方法であって、ここで前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、当該改変された宿主細胞が炭素源のエステルへの変換を触媒するように、プロモーターと作動可能に連結されている、方法。
【請求項３０】
前記炭素源が：グルコース、ピルバート、ケトバリン、ＣＯ2、セルロース、キシロース、スクロース、アラビノース、グリセロール、アルギナート、グルカラート、又はガラクツロナートのうちの１つ以上を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記宿主細胞が、真菌細胞である、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記真菌細胞が、サッカロミセス科のメンバーである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記真菌細胞が、サッカロミセス・セレビシエ、カンジダ・ルゴーサ、又はカンジダ・アルビカンスである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記宿主細胞が、細菌細胞である、請求項２７又は２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記細菌細胞が、プロトバクテリア門のメンバーである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細菌細胞が、腸内細菌科のメンバーである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細菌細胞が、エシェリキア・コリである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細菌細胞が、シュードモナス科のメンバーである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記細菌細胞が、シュードモナス・プチダである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記細菌細胞が、ファーミキューテス門のメンバーである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記細菌細胞が、バチルス科のメンバーである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細菌細胞が、バチルス・ズブチリスである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細菌細胞が、ストレプトコッカス科のメンバーである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記細菌細胞が、ラクトコッカス・ラクティスである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記細菌細胞が、クロストリジウム科のメンバーである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記細菌細胞が、クロストリジウム・セルロリチカムである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記細菌細胞が、シアノバクテリア門のメンバーである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４８】
前記宿主細胞が、光合成細胞である、請求項２３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記宿主細胞が、セルロース分解細胞である、請求項２３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願の相互参照
本出願は、２０１２年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６５２，５０５号の優先権を主張すると共に、前記文献を参照により本明細書中に援用する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
この開示は、一態様において、野生型対照と比較して、増加したエステルの生合成を示す改変された組み換え細胞を説明している。組み換え細胞は、真核細胞であっても、原核細胞であってもよい。場合によっては、微生物細胞は光合成微生物細胞であってもよい。場合によっては、微生物細胞はセルロース分解微生物細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、組み換え細胞は、野生型対照と比較して、有機酸のアシル−ＣｏＡへの変換の増大、野生型対照と比較して、ケト酸のアシル−ＣｏＡへの変換の増大、野生型対照と比較して、アルデヒドの有機酸への変換の増大、野生型対照と比較して、アルデヒドのアルコールへの変換の増大、又は野生型対照と比較して、エステルを形成するためのアシル−ＣｏＡとアルコールとの組み合わせの増大を示し得る。
【０００３】
もう一つの態様において、この開示は、エステルを産生するために組み換え細胞に有効な条件下、炭素源を含む培地において、野生型対照と比較して、増加したエステルの生合成を示すように改変された組み換え細胞をインキュベートすることを通常含む方法を説明しており、ここで、前記炭素源が：グルコース、ピルバート、ケトバリン、ＣＯ2、セルロース、キシロース、スクロース、アラビノース、又はグリセロールのうちの１つ以上を含む。
【０００４】
もう一つの態様において、この開示は、宿主細胞内に、炭素源をエステルに変換する際のステップを触媒する少なくとも１つのポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを導入することを通常含む方法を説明しており、ここで、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、改変された宿主細胞が炭素源のエステルへの変換を触媒するように、プロモーターと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、炭素源は：グルコース、ピルバート、ケトバリン、ＣＯ2、セルロース、キシロース、スクロース、アラビノース、又はグリセロールのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は光合成細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はセルロース分解細胞である。
【０００５】
本発明の前記概要は、本発明の開示されたそれぞれの実施態様又はすべての実施を説明することを意図するものではない。前記記載は、説明に役立つ実施態様を例示するより具体的な記載に従う。本出願中のいくつかの箇所において、アドバイスを例のリストを通じて提供し、そして例は、さまざまな組み合わせに使用することができる。場合によっては、記載されたリストは、代表的なグループとしてのみ機能し、排他的なリストとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】（Ａ）提案したエステルへの人工的生合成経路。（Ｂ）分子の例。（Ｃ）燃料及び化学物質へのエステルアプローチの利点。
【図２】エステルイソ酪酸イソブチルへの代表的な合成経路。２つの独立した経路がイソブチリルＣｏＡの産生を引き起こし得る。
【図３】イソ酪酸イソブチルの生合成を示す（Ａ）プラスミド及び（Ｂ）ガスクロマトグラフィーデータの結果。
【図４】酢酸イソブチル（ＩＢＡＣ）及び酢酸イソアミル（ＩＶＡＣ）産生のための合成経路。経路のうちの遺伝子操作されたステップは、枠で囲まれた中に示されている。ＮＡＤＰＨ依存酵素は点線の円で示されており、そして、重要な酵素であるアシルトランスフェラーゼは、点線の長方形で示されている。略語：ＰＤＣ（ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体）、ＡＡＴ（アルコールアシルトランスフェラーゼ）；他の酵素は図５で指定されている。
【図５】（Ａ）酢酸イソブチル（ＩＢＡＣ）及び（Ｂ）酢酸イソアミル（ＩＶＡＣ）産生のための合成オペロン。略語：ＡＡＴ（アルコールアシルトランスフェラーゼ）。
【図６】（Ａ）酢酸イソブチル産生及び（Ｂ）酢酸イソアミル産生のための５種類の候補アシルトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）の導入による発酵結果。エラーバーは標準偏差を示す。これらの５種類のＡＡＴ及びそれらの天然基質は、表３中に示されているとおりである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
説明に役立つ実施形態の詳細な説明
以下の代表的な実施形態の説明では、特定の代謝酵素及びそれらの酵素の天然起源が指定されている。これらは、単に好適な酵素及び指定された酵素の好適な起源に関する例である。同様の触媒活性を有する代替酵素は、異なった微生物種又は株から入手可能な相同体なので、それらも可能性がある。従って、本明細書中に記載した代表的な実施形態は、請求項に反映される微生物又は方法の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。石油に代わる再生可能資源の検索は、科学、産業、及び社会が直面している重要な挑戦である。生合成はバイオマス資源からの燃料や化学物質の持続可能な供給を提供することができる。発酵工程の生存率に影響を及ぼし得る要因としては、例えば、原料利用可能性、発酵効率（例えば、収率、力価、生産性）、及び発酵産物を回収するコストが挙げられる。原料開発において大幅な進歩があったが、アルコール又は有機酸の産生に対する現在の発酵アプローチは、理想的ではない。まず、アルコールと有機酸は、細胞に対して非常に毒性であり得、そしてそれらが培養で微生物の生存率に有害な影響を有する前に、これらの産物が発酵培養で蓄積できる濃度を制限し得る。二つ目に、アルコールと酸は、水性媒体（例えば、培地）中に非常に可溶性である傾向があるので、これらの産物を水性発酵培地から回収するために大量のエネルギーを消費する蒸留精製スキームを必要とする。その結果、例えば、エタノールと比較して、例えば、ブタノールなどの高級アルコールは燃料として利点を示すことができるが、低い発酵力価（＜２０ｇ／Ｌ）からの高純度化コストのため、商業的に実行可能なバイオ燃料としてエタノールと競合するのは、高級アルコールにとって難しい。三つ目に、有機酸を産生する発酵には、有機酸が蓄積している培地のｐＨを中和するために、発酵に塩基を加えることを伴うことが多い。有機酸の回収にはその後の硫酸の添加、そして、塩の除去を伴うことが多く、そのそれぞれが多大な費用を必要とすることがある。
【０００８】
全面的な解決策を提供するために、我々はアルコール、有機酸、又は他のバイオ燃料の産生のためのエステルプラットフォームを開発した。図１（Ａ）に示されているように、このアプローチの一実施形態には、３つの構成要素：１）カルボン酸と次のアシル−ＣｏＡの生合成のための代謝経路；２）アルコールの生合成のための並行代謝経路；及び３）アシル−ＣｏＡとアルコールからのエステル産生のための遺伝子操作された経路、がある。このプラットフォームの成功実現が、エステルのバイオベースの製造を可能にした。いくつかの代替実施形態において、前記アプローチはカルボン酸（そして次のアシル−ＣｏＡ）の生合成のための代謝経路、及び生合成されたアシル−ＣｏＡと、（例えば、培地中での）同時反応物として提供されたアルコールからのエステルの産生のための遺伝子操作された経路を含んでもよい。他の代替実施形態において、前記アプローチは、アルコールの生合成のための代謝経路、及び生合成されたアルコールと（例えば、培地中での）同時反応物として提供されたアシル−ＣｏＡからのエステルの産生のための遺伝子操作された経路を含んでもよい。
【０００９】
我々のプラットフォーム技術を使用することによって製造されたエステルは、バイオ燃料、工業化学物質、又は他の化合物の製造のための原料として使用され得る。例えば、エステルは、アルコールや有機酸を作るために容易に加水分解できる。原則として、このアプローチは、我々のプラットフォームに従って遺伝子操作された微生物によって産生された適当なエステルから任意のアルコール及び／又は有機酸を製造するのに使用できる。いくつかの代表的な有機酸及びアルコールが図１（Ｂ）に列挙されている。代表的な有機酸産物としては、例えば、アセタート、イソブチラート、３−ヒドロキシプロピオナート、ブチラート、ラクタート、メタクリラート、アクリラート、及びイソペンタノアートが挙げられる。代表的なアルコール産物としては、例えば、エタノール、メタノール、ブタノール、イソブタノール、プロパノール、イソプロパノール、ペンタノール、イソペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、及びオクタノールが挙げられる。これらのアルコールのいずれかとこれらの酸のいずれかとの組み合わせで、エステル代謝産物を作り出すことができる。
【００１０】
本明細書中に記載したように製造したエステルが、バイオ燃料として使用できる。一般に、エステルは、燃料として、例えばエタノールを超える特定の利点を提供する。表１に示されているように、エステル燃料は、例えば、イソブタノールやイソペンタノールなどの高級アルコールと同様のエネルギー密度を有する。エステルはまた、対応するアルコール化合物と比較して、より低い水中への溶解性しか示さない可能性もあるので、当業者が蒸留よりむしろ相分離を使用することで水性培地からエステルを回収することを可能にする。その結果、エステルの回収は、発酵からアルコールを回収するのに比べて、より簡単で、より効果的で、且つ、より低コストである。脂肪酸やアルカンもまた、非常に低い水溶性を有するので、長鎖脂肪酸は典型的には効率的に細胞外環境に分泌されず、且つ、これらの化合物から調製された燃料は、それらがゲル化の傾向もあり得るため、低温で良好に機能しないこともある。
【００１１】
エステルの生物学的製造は、高級アルコール、アルカン、及び脂肪酸の生物学的製造に比べて、より高い理論収率をもたらすことができる。例えば、Ｅ．コリ（E. coli）では、イソブタノール蓄積は、発酵中の現場回収なしで約２２ｇ／Ｌを達成できる（Baez et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011, 90 (5), 1681-1690）。対照的に、我々は、９０ｇ／Ｌのイソブチラートを産生し、そしてそれは、商業生産において最も有望な再生可能化学物質のうちの２つであるラクタート（Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011, 108 (47), 18920-18925）又はスクシナート（Lin et al., Metab. Eng. 2005, 7 (2), 116-127）の発酵に相当する。また、Ｃ５イソバレラートは３２ｇ／Ｌまで蓄積可能であり、イソペンタノール（４．４ｇ／Ｌ）（Connor et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 86 (4), 1155-1164）や脂肪酸（４．５ｇ／Ｌ）（Liu et al., Metab. Eng. 2010, 12 (4), 378-386）に比べてはるかに高い。最後に、エステルは細胞に対して毒性がないので、他の化合物と比較して、当業者が発酵ブロス中へのより高い蓄積を観察することを可能にする。
【００１２】
表１．各種化合物の生合成プロフィール、物理特性、及び燃料特性の比較
【表１】
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【００１３】
図２には、代表的なエステル化合物であるイソ酪酸イソブチルを産生するための代表的な、汎用の遺伝子操作された経路が示されている。酵素的にエステル化を触媒するために、カルボン酸はアシル−ＣｏＡに活性化される。次に、アシル−ＣｏＡはアルコールと反応して、エステルを生じることができる。エステル化反応はアシルトランスフェラーゼによって触媒される（図２）。我々は２つのＥ．コリのエステル産生株、エステル株１及びエステル株２を作出したが、そのそれぞれがアシル−ＣｏＡ中間体の産生のために独自の経路を利用していた。アシル−ＣｏＡを産生するための１つの経路は、アシル−ＣｏＡシンテターゼ（Ａｃｓ）によってイソブチラートをイソブチリルＣｏＡに変換する。我々は、このようにアシル−ＣｏＡの産生を触媒するために、代表的なアシル−ＣｏＡシンテターゼであるシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）からのＦａｄＤｘをクローニングした（エステル株１、図２に「経路ＩＩ」と示されている）。アシル−ＣｏＡへの別の経路は、シュードモナス・プチダからの分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体ＢＫＤＨを利用するための経路である。我々は、別々の菌株においてこのストラテジーを利用した（エステル株２、図２に「経路Ｉ」と示されている）。
【００１４】
次に、我々は、エステル株１とエステル株２の両方に、クラルキア・ブレウェリ（Clarkia breweri）からのベンゾイル−補酵素Ａ（ＣｏＡ）：ベンジルアルコールベンゾイルトランスフェラーゼ（ＢＥＢＴ又はＬｕｘＥ）（D'Auria et al., Plant Physiol. 2002, 130(1):466）をクローニングした。
ガスクロマトグラフィー分析によると、振盪フラスコ発酵中に、エステル１株では３．５ｍｇ／Ｌ、そして、エステル２株では２００ｍｇ／Ｌのイソ酪酸イソブチルを得た。ＬｕｘＥがなければ、発酵ブロス中にイソ酪酸イソブチルは全く検出されなかった。
【００１５】
この実施形態は、微生物がエステル化合物を産生するように遺伝子操作される基本的なプラットフォームを確立する。我々が使用した特定の酵素は、単に代表的なものであって、前記プラットフォームがエステル化合物の生合成に有効であり得ることを立証している。当業者は、所定の原料から所望のエステル産物を産生するのに、アシル−ＣｏＡ産生酵素−アシル−ＣｏＡシンテターゼ又は分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体ＢＫＤＨ−とアシルトランスフェラーゼの任意の好適な組み合わせを使用することができる。我々のプラットフォームで使用できる代表的なアシル−ＣｏＡシンテターゼとしては、例えば、酵素の一般名又は天然基質にかかわらず、配列番号５〜２８のいずれか１つを反映したものが挙げられる。特定の代表的なアシル−ＣｏＡシンテターゼが、表２に列挙されている。我々のプラットフォームで使用できる代表的な分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ複合酵素としては、例えば、酵素の一般名又は天然機能にかかわらず、配列番号２９及び７８〜８０を反映したアミノ酸配列のうちのいずれか１つ以上が挙げられる。特定の代表的な分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ複合酵素が、表２に列挙されている。我々のプラットフォームで使用できる代表的なアシルトランスフェラーゼとしては、例えば、酵素の一般名又は天然機能にかかわらず、配列番号３０〜７７のいずれか１つを反映したものが挙げられる。特定の代表的なアシルトランスフェラーゼとしては、例えば表２に列挙されたものが挙げられる。
【００１６】
表２．代表的な代替アシル−ＣｏＡシンテターゼ及びアシルトランスフェラーゼ
【表２】
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【００１７】
図４には、エステル生合成のための我々のプラットフォームの代替実施形態が例示されている。この実施形態において、酢酸イソブチル（ＩＢＡＣ）及び／又は酢酸イソアミル（ＩＶＡＣ、バナナ油）が、天然バリン生合成経路が改変された微生物によって産生され得る。アセチル−ＣｏＡは、例えば、Ｅ．コリにおいてＴＣＡサイクルの成分として自然且つ容易に入手可能である。ＩＢＡＣとＩＶＡＣのいずれかを産生するために、微生物はまず、２−ケトイソバレラートの生合成を促進するためにＡｌｓＳ及びＩｌｖＤを過剰発現するように構築される。その微生物はまた、Ｋｉｖｄ及びＹｑｈｄを発現するようにも構築されるが、それらは一緒に、２−ケトイソバレラートをイソブタノールに変換し、そしてそれが、アシルトランスフェラーゼによって触媒される反応において酢酸イソブチルへとエステル化され得る。酢酸イソアミルを産生するために、微生物は、「＋１」経路（ＬｅｕＡＢＣＤ）をさらに発現するように構築されてもよく、そしてそれが、１つの炭素によって２−ケトイソバレラートを延長して、２−ケト−４−メチルバレラートを形成する。これらの実施形態において、ＫｉｖＤ及びＹｑｈｄの組み合わせは、２−ケト−４−メチルバレラートをイソペンタノールに変換することができ、そしてそれは、アシルトランスフェラーゼによって酢酸イソアミルへとエステル化され得る。
【００１８】
我々は、５つの代表的なアルコールアシルトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）、ＬｕｘＥ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＢＰＢＴ、及びＳＡＡＴを特徴づけした（表３に示されているとおり）。分析のために、それぞれクローニングされ、そして、Ｅ．コリ株ＢＷ２５１１３に形質転換された。
【００１９】
表３．中鎖エステル生合成における代表的なアルコールアシルトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）
【表３】
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【００２０】
３つの合成オペロンが、酢酸イソブチル及び酢酸イソアミルを産生するような遺伝子発現のために構築された（図５）。すべてのプラスミドが、ＰLｌａｃＯ１プロモーターの調整下にあるように構築された。酢酸イソブチルを産生するために、第一オペロンには、ＡＴＴの位置が分析される５つの代表的なアシルトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）のうちの１つコード領域によって占められている、転写順序ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ａｌｓＳ−ＡＡＴでカナマイシン耐性マーカーを担持している中コピープラスミド上に４つのコード領域が含まれている（図５（Ａ））。第二オペロンには、転写順序ｋｉｖｄ−ｙｑｈＤでアンピシリン耐性マーカーを含む高コピープラスミド上に２つのコード領域が含まれる。酢酸イソアミルの合成のために、ロイシン生合成にかかわるｌｅｕＡ、ｌｅｕＢ、ｌｅｕＣ、及びｌｅｕＤのコード領域が、第一の中コピープラスミドのａｌｓＳとＡＡＴの間に導入され、そして、同じ第二の高コピープラスミドが使用された（図５（Ｂ））。
【００２１】
我々は、酢酸イソブチルと酢酸イソアミルについて、産生力価に対する５つの代表的なアシルトランスフェラーゼそれぞれの効果を評価した。ＡＴＦ１及びＡＴＦ２のコード領域が、ＰＣＲによってＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ゲノムＤＮＡから増幅された。ＬｕｘＥ、ＢＰＢＴ、及びＳＡＡＴのコード領域が、オリゴヌクレオチドのアニーリングベースの接続によって人工的に合成された。組み換え株は、図２に示されている合成オペロンを用いて構築された。
【００２２】
振盪フラスコ発酵及び産物分析が、実施例２に記載のとおり実施され、そして、標準偏差を得るための植菌用に、３つの独立したコロニーが画線接種された。発現されたアルコールアシルトランスフェラーゼを除いて、全株は同一であった。そのため、同じ発酵条件によって、目標化合物の最も高い産生力価を有する菌株が、最も活性なアルコールアシルトランスフェラーゼを有するであろう。本明細書中で活性とは、動力学的パラメーターとタンパク質発現レベルの組み合わせ効果を表す。
【００２３】
図６（Ａ）では、イソブチル酢酸産生のデータを提供している。ＡＴＦ１は、最も高い力価を生じた（２．１４±０．１７ｇ／Ｌ）。ＡＴＦ２は、１．６９±０．４６ｇ／Ｌの力価を生じた。図６（Ｂ）では、酢酸イソアミルの産生に関するデータが示されており、同様の傾向を明らかにしている。ＡＴＦ１及びＡＴＦ２は、最も高い産生力価を生じた。
【００２４】
宿主細胞内に導入されたあらゆる異種酵素のコード領域は、（例えば、American Type Culture Collection製の）市販のである場合には、天然宿主のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅されることもできる。そうでなければ、当業者は、多重プライマーを使用したＰＣＲアッセンブリによってコード領域を人工的に合成できる。合成コード領域は、例えば、Ｅ．コリ又はＳ．セレビシエなどの宿主細胞における発現のために最適化されたコドンであってもよい。異種酵素のコード領域を担持するプラスミドで形質転換された細胞は、カルボン酸及び／又はアルコール前駆体を含む培地中で培養できる。
【００２５】
これにより一態様において、本発明は、野生型対照と比較して、エステルの増加した生合成を示すように改変された遺伝子組み換え微生物細胞を提供する。場合によっては、野生型対照はエステルを産生することができないでもよいので、従って、エステル生合成の増大は、エステルのあらゆる計測可能な生合成を反映する可能性もある。特定の実施形態において、エステル生合成の増大とは、所定の濃度までエステルを蓄積するのに微生物細胞の培養にとって十分な生合成を含み得る。
【００２６】
所定の濃度とは、所定の適用に好適な産物のあらゆる所定の濃度であり得る。従って、所定の濃度は、例えば、少なくとも３ｍｇ／Ｌ、例えば、少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１．０ｇ／Ｌ、少なくとも２．０ｇ／Ｌ、少なくとも３．０ｇ／Ｌ、少なくとも４．０ｇ／Ｌ、少なくとも５．０ｇ／Ｌ、少なくとも６．０ｇ／Ｌ、少なくとも７．０ｇ／Ｌ、少なくとも８．０ｇ／Ｌ、少なくとも９．０ｇ／Ｌ、少なくとも１０ｇ／Ｌ、少なくとも２０ｇ／Ｌ、少なくとも５０ｇ／Ｌ、少なくとも１００ｇ／Ｌ、又は少なくとも２００ｇ／Ｌといった濃度であってもよい。
【００２７】
組み換え細胞は、例えば、原核生物微生物又は真核生物微生物を含む任意の適切な微生物でもよく、又はそれらに由来してもよい。本明細書で使用する場合、用語「又は由来する（or derived from）」は、微生物と関連して、指示された増加した生合成活性を示すようにさらに改変される前に、１つ以上の遺伝子的な改変を保持する「宿主細胞（host cell）」を単に考慮する。従って、用語「組み換え細胞（recombinant cell）」は、指示された生合成活性を示すように改変される前に、２つ以上の種由来の核酸物質を含み得る「宿主細胞（host cell）」を包含する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、１若しくは複数の天然の生理活性を有するように選択されてもよい。例えば、宿主細胞は、光合成細胞（例えば、シアノバクテリア）であっても、セルロース分解細胞（例えば、クロストリジウム・セルロリチカム（Clostridium cellulolyticum））であってもよい。
いくつかの実施態様において、組み換え細胞は、原核細胞微生物、例えば、真菌細胞でもよく、又はそれらに由来してもよい。これらの実施態様のいくつかでは、真菌細胞は、サッカロミセス科（Saccharomycetaceae）のメンバー、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ（Candida）属のメンバー、例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）でもよく、又はそれらに由来してもよい。
【００２９】
他の実施態様において、組み換え細胞は、原核細胞微生物、例えば、細菌でもよく、由来してもよい。これらの実施態様のいくつかにおいて、細菌は、プロテオバクテリア門のメンバーでもよい。プロテオバクテリア門の典型的なメンバーは、例えば、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）のメンバー（例えば、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、及び例えば、シュードモナス科（Pseudomonaceae）のメンバー（例えば、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida））が挙げられる。他の場合において、細菌は、ファーミキューテス門のメンバーであってもよい。ファーミキューテス門（phylum Firmicutes）の典型的なメンバーは、例えば、バチルス科（Bacillaceae）のメンバー（例えば、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、クロストリジウム科（Clostridiaceae）ファミリーのメンバー（例えば、クロストリジウム・セルロリチカム）、及びストレプトコッカス科（Streptococcaceae）のメンバー（例えば、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis））が挙げられる。他の場合では、細菌はシアノバクテリア門のメンバーであってもよい。
【００３０】
いくつかの実施形態において、野生型対照と比較して、エステルの増加した生合成としては、次の：野生型対照と比較して、有機酸のアシル−ＣｏＡへの変換の増大、野生型対照と比較して、ケト酸のアシル−ＣｏＡへの変換の増大、野生型対照と比較して、アルデヒドの有機酸への変換の増大、野生型対照と比較して、アルデヒドのアルコールへの変換の増大、又は野生型対照と比較して、エステルを形成するためのアシル−ＣｏＡのアルコールとの組み合わせの増大、のうちの１つ以上を挙げてもよい。特定のアシル−ＣｏＡシンテターゼ、（単数若しくは複数の）分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＫＤＨ）複合酵素、及び／又はアシルトランスフェラーゼは、例えば、設計された経路における代謝基質、利用可能な原料、及び／又は酵素が宿主微生物で発現される効率などの１若しくは複数の基準に基づいて選択される。
【００３１】
他の実施形態において、野生型対照と比較して、エステルの増加した生合成としては、次の：２−ケトイソバレラートのイソブチルアルデヒドへの変換の増大、及びイソブチルアルデヒドのイソブタノールへの変換の増大、イソブタノールとアシル−ＣｏＡからの酢酸イソブチルの合成の増大、２−ケト−４−メチルバレラートへの２−ケトイソバレラートの延長の増大、２−ケト−４−メチルバレラートのイソバレルアルデヒドへの変換の増大、イソバレルアルデヒドのイソペンタノールへの変換の増大、又はイソペンタノールとアシル−ＣｏＡからの酢酸イソアミルの合成の増大、のうちの１つ以上を挙げてもよい。
【００３２】
場合によっては、野生型対照と比較して、エステルの増加した生合成としては、所望のエステルの生合成をもたらさない別経路へと設計された経路の中間体を別の方法で変換し得るエステラーゼ及び／又はリパーゼなど、１若しくは複数の酵素の触媒活性の低下を挙げることもできる。
【００３３】
本明細書中に使用される場合、特定の酵素に関する「活性」という用語は、その一般名又は天然の機能にかかわらず、酵素の基質の産物への変換を触媒するポリペプチドの能力を指し、その「活性」が同定された酵素の天然の活性より低いか、同等か、又は高いかに関係しない。細胞の生合成活性、並びにアシル−ＣｏＡシンテターゼ及びアシルトランスフェラーゼの酵素活性を評価する方法は、当業者にとって日常的なものであり、且つ、周知である。遺伝子組み換え細胞との関連において、「活性」という用語は、その「活性」が、細胞の野生型株の天然の活性より低いか、同等であるか、又は高いかにかかわらず、遺伝子組み換え細胞が特定された産物化合物を合成する能力を指す。
【００３４】
本明細書中に使用される場合、酵素の触媒活性の増大又は遺伝子組み換え細胞の生合成活性の増大は、定量的に計測され、そして、適当な野生型対照の触媒活性に対するパーセンテージとして表され得る。遺伝子組み換えポリペプチドによって示される触媒活性又は遺伝子組み換え細胞の生合成活性は、例えば、適当な野生型対照の活性の少なくとも１１０％と、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、少なくとも２００％（２倍）、少なくとも２５０％、少なくとも３００％（３倍）、少なくとも４００％（４倍）、少なくとも５００％（５倍）、少なくとも６００％（６倍）、少なくとも７００％（７倍）、少なくとも８００％（８倍）、少なくとも９００％（９倍）、少なくとも少なくとも１０００％（１０倍）、少なくとも２０００％（２０倍）、少なくとも３０００％（３０倍）、少なくとも４０００％（４０倍）、少なくとも５０００％（５０倍）、少なくとも６０００％（６０倍）、少なくとも７０００％（７０倍）、少なくとも８０００％（８０倍）、少なくとも９０００％（９０倍）、少なくとも１０，０００％（１００倍の）又は少なくとも１００，０００％（１０００倍）であり得る。
【００３５】
あるいは、触媒活性の増加は、ｋcatの増加、例えば、酵素変換のｋcat値の少なくとも２倍増加、少なくとも３倍増加、少なくとも４倍増加、少なくとも５倍増加、少なくとも６倍増加、少なくとも７倍増加、少なくとも８倍増加、少なくとも９倍増加、少なくとも１０倍増加、少なくとも１５倍増加、又は少なくとも２０倍増加として表されてもよい。
【００３６】
触媒活性の増加は、ｋmの低下の観点から、例えば、酵素変換のｋm値の少なくとも２倍低下、少なくとも３倍低下、少なくとも４倍低下、少なくとも５倍低下、少なくとも６倍低下、少なくとも７倍低下、少なくとも８倍低下、少なくとも９倍低下、少なくとも１０倍低下、少なくとも１５倍低下、又は少なくとも２０倍低下として表されてもよい。
【００３７】
酵素の触媒活性の減少又は遺伝子組み換え細胞の生合成活性の増大は、定量的に計測され、そして、適当な野生型対照の触媒活性のパーセンテージとして表され得る。遺伝子組み換えポリペプチドによって示される触媒活性又は遺伝的に改変された細胞の生合成活性は、例えば、適当な野生型対照の９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の活性、又は０％の活性であると示され得る。
【００３８】
あるいは、触媒活性の低下は、触媒定数の適切な変化として表すことができる。例えば、触媒活性の低下は、Ｋcatの低下、例えば、酵素変換のＫcat値の少なくとも２倍低下、少なくとも３倍低下、少なくとも４倍低下、少なくとも５倍低下、少なくとも６倍低下、少なくとも７倍低下、少なくとも８倍低下、少なくとも９倍低下、少なくとも１０倍低下、少なくとも１５倍低下、又は少なくとも２０倍低下として表され得る。
【００３９】
触媒活性の低下は、ｋmの増加の観点から、例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍、少なくとも２３０倍、少なくとも２５０倍、少なくとも３００倍、少なくとも３５０倍、又は少なくとも４００倍のｋmの増加としてまた表され得る。
【００４０】
これにより、もう１つの態様において、我々はエステルの生合成のための方法を本明細書中に記載する。前記エステルは、任意の所望のエステルであり得る。先に述べたように、エステルはバイオ燃料、工業化学物質、又は他の化合物の製造のための原料として使用され得る。我々のアプローチは、任意の有機酸−例えば、図１（Ｂ）で特定した代表的な有機酸−と任意のアルコール−例えば、図１（Ｂ）で特定した代表的なアルコール−の組み合わせからエステルを調製するのに使用できる。任意のこれらの酸と任意のこれらのアルコールの組み合わせで、エステル代謝産物を作り出すことができる。様々な適用において、有機酸、アルコール、又はその両方が細胞によって合成され得る。これらの実施形態のいくつかにおいて、細胞は、有機酸又はアルコールの生合成を促進するように遺伝子を組み換えられてもよい。同様に様々な適用においても、有機酸又はアルコールは、その生合成がエステルを産生するのに不要になるように、培養培地中に提供されてもよい。
【００４１】
場合によっては、エステルは、１２個未満の炭素原子を有する（Ｃ１２）エステル、例えば、Ｃ１１エステル、Ｃ１０エステル、Ｃ９エステル、Ｃ８エステル、Ｃ７エステル、Ｃ６エステル、Ｃ５エステル、Ｃ４エステル、又はＣ３エステルなどである。場合によっては、エステルは、いろいろな数の炭素を有し、且つ、所定の分岐度を有するエステルであり得る。分岐度は、分岐炭素の数及び／又は分岐のうちの１若しくは複数の−又は累積的にすべての−長さを特徴としてもよい。本明細書中に使用される場合、分岐とは、少なくとも３つの他の炭素と共有結合する炭素の数を指す。特定の具体的な実施形態において、エステルとは、例えばイソ酪酸イソブチル、イソ吉草酸イソバレリル、又は乳酸エチルがあってもよい。
【００４２】
概して、前記方法は、本明細書中に記載の組み換え細胞を、その組み換え細胞がエステルを産生するのに有効な条件下、炭素源を含む培地中でインキュベートすることを含む。従って、前記炭素源は：グルコース、ピルバート、又はケトバリン、のうちの１若しくは複数を含み得る。加えて、細胞増殖のための炭素源は、関連する炭素同化経路が遺伝子操作された微生物に導入されている限り、ＣＯ2、セルロース、グルコース、キシロース、スクロース、アラビノース、グリセロール、アルギナート、グルカラート、ガラクツロナートなどであってもよい。また、炭素源としては、所望のエステルを生じるために活性化されるべき有機酸−その有機酸の代謝前駆体−を挙げることができる。図２に示されている代表的な経路では、有機酸はイソ酪酸である。エステルが異なった有機酸から形成される他の経路では、その異なった有機酸は培地成分であってもよい。同様に、炭素源としては、所望のエステルがそれから合成されるアルコール−そのアルコールの代謝前駆体−を挙げることができる。図２に示されている代表的な経路では、アルコールは、イソブタノール及び、例えば、イソブチルアルデヒド及びケトバリンを含めた代謝前駆体である。エステルが異なったアルコールから形成される経路では、その異なったアルコール及び／又はその異なったアルコールの前駆体は培養成分であってもよい。
【００４３】
先に述べたように、エステルは、所望の最終生産物であっても、別の化合物を製造するための前駆体として使用されてもよい。場合によっては、エステルは、それが生合成されたアルコールと有機酸に加水分解されてもよい。このように、当業者は、アルコール及び／又は有機酸が発酵最終産物であった場合に蓄積され得るより大量のアルコール又は有機酸を産生するように本明細書中に記載したプラットフォームを使用できる。エステルは、生合成され、そして、相分離−例えば、蒸留による水性培地からのアルコール及び／又は有機酸の回収に比べて、簡単で、効果的で、及び／又は低コストであり得るプロセス−によって水性培養から回収され得る。回収されたエステルは、ほとんどの場合、追加の酵素的処理又は活性化処理なしに、制御された水量で加水分解されて、構成アルコール及び有機酸を得る。
【００４４】
さらにもう１つの態様において、我々は、宿主細胞が増加した炭素源をエステルに変換する能力を示すように、細胞内に異種ポリヌクレオチドを導入するための方法を本明細書中に記載する。前記異種ポリヌクレオチドは、改変された細胞が炭素源のエステルへの変換を触媒するように、プロモーターと作動可能に連結されたポリペプチドをコードし得る。これらの実施形態のいくつかにおいて、炭素源としては、グルコース、ピルバート、ケトバリン、及び有機酸（若しくはその前駆体）、又はアルコール（若しくはその前駆体）のうちの１若しくは複数を挙げることができる。こうした方法のための宿主細胞としては、例えば、本明細書中に記載した組み換え細胞に関して先に特定された微生物種のいずれをも挙げることができる。
【００４５】
以下の説明で使用される用語「及び／又は（and/or）」は、列挙した要素の１つ又はすべて、或いは列挙した要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味し；用語「含む（comprise）」及びその変形は、これらの用語が明細書及び特許請求の範囲において出現する場所において、限定的な意味を有さず；特別の定めのない限り、「１つ（a）」、「１つ（an）」、「その（the）」、及び「少なくとも１つ（at least one）」は、同義的に使用され、そして１又は２以上を意味し；そしてエンドポントによる数字上の範囲の列挙は、範囲内に包含されるすべての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。
【００４６】
先の説明において、特定の実施形態は明瞭さのために単独で説明され得る。特定の実施形態の特徴が別の実施形態の特徴と両立しないことが明確に別段の指定がない限り、特定の実施形態は、１若しくは複数の実施形態に関して本明細書中に記載された両立できる特徴の組み合わせを含み得る。
個別のステップを含む本明細書で開示された任意の方法に関して、ステップは、任意の実行可能な順で行われてもよい。そして、必要に応じて、２つ以上のステップの任意の組み合わせが、同時に行われてもよい。
【００４７】
本発明は、以下の実施例によって説明される。特定の実施例、材料、量、及び手順が、本明細書に記載されたような本発明の範囲及び趣旨に従って、広く解釈されるべきであることが理解される。
【実施例】
【００４８】
実施例１
プラスミドの構築
ＢＫＤＨ酵素複合体コード領域及びｆａｄＤＸを、それぞれプライマーｂｋｄｈ＿ｅｃｏｆｗｄ（TgcatcgaattcAGGAGAAATT AACTatgAACGAGTACGCCC CCCTGCGTTTGC、配列番号１）とｂｋｄｈ＿ｈｉｎｄｒｅｖ（Tgcatc aagcttTCAGATATGCAAGGCGTGGCCCAG、配列番号２）、ｆａｄＤＸｓａｌｌ−Ｆ（tgtacggtat taatgtcgacAGGAGAAATTAACTATGCTTCAACTCCAAAAACAAGAAAC、配列番号３）とｆａｄＤＸｂａｍ−Ｒ（TGATCATGCGCCATAGTTAATTTCTCCTGGATCCTTAGACGC TGGCAGGGGTGGCCTGTT、配列番号４）を用いて、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０のゲノムＤＮＡから増幅した。ＢＫＤＨのＰＣＲ産物を、次に、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＺＥ１２内に挿入して、ｐＩＢＡ１６を作製した。プラスミドｐＥＳＴＥＲ１を構築するために、クラルキア・ブレウェリからのＢＥＢＴのコード領域を、DNAworks（Hoover and Lubkowski, Nucleic Acids Res 2002, 30 (10), e43）によって合成し、次に、Ｘｂａｌ消化後にｐＩＢＡ７の線状プラスミドを得た。最後に、Gibson et al, Nat Meth 2009, 6(5):343-345に記載のようなｆａｄＤＸ、ＢＥＢＴ、及び線状ｐＩＢＡ７の組み合わせ後に、ｐＥＳＴＥＲ１のプラスミドを形成した。Ａｃｃ６５Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したＢＥＢＴコード領域を、ｐＺＳプラスミドの対応部位に挿入して、プラスミドｐＥＳＴＥＲ２を形成した。
【００４９】
発酵の結果
Ｅ．コリ宿主ＢＷ２５１１３を発酵に使用した。一方のエステル株１が、ｐＩＢＡ１（国際特許出願公開ＷＯ２０１２／１０９５３４）及びｐＥＳＴＥＲ１で形質転換したＢＷ２５１１３であり、そして、もう片方のエステル株２が、ｐＩＢＡ１、ｐＩＢＡ１６、及びｐＥＳＴＥＲ２で形質転換したＢＷ２５１１３であった。
ＬＢ培地でインキュベートした一晩培養物を、１２５ｍＬの三角フラスコにおいて、０．５％酵母抽出物及び４％グルコースを補充した５ｍＬのＭ９培地中に、２５倍に希釈した。抗生物質を、適切に添加した（アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ及びカナマイシン２５ｍｇ／Ｌ）。０．１ｍＭのイソプロピル‐ｂ‐Ｄ‐チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して、タンパク質発現を誘導した。培地を、０．５ｇのＣａＣＯ3の添加によって緩衝した。培養物を３０℃の振盪器（２５０ｒｐｍ）に設置し、そして４８時間インキュベートした。発酵産物を、ＨＰＬＣ分析又はＧＣ分析によって定量した。結果を図２（Ｂ）に示す。
【００５０】
実施例２
以下のプライマーを用いて、クラルキア・ブレウェリからアシルトランスフェラーゼＬｕｘＥ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＢＰＢＴ、及びＳＡＡＴを増幅した：
Ｓ．セレビシエからｌｕｘＥａｌｓＳ−Ｆ（gaaaacgaaagctctctaa GCTGAGCAGG AGAAATTAAC TATGGCGCAT GATCAGAGCCT、配列番号８１）と
ｌｕｘＥｖｅｃ−Ｒ（agcctttcgttttatttgatgcctctaga GCTCAGCTTA CAGGCTGCTC TGGGTGAAATG、配列番号８２）；
Ｓ．セレビシエからＡＴＦ１ａｌｓＳ−Ｆ（cgaaagctctctaa GCTGAGCAGG AGAAATTAAC TATGAATGAA ATCGATGAGAAAAATC、配列番号８３）と
ＡＴＦ１ｖｅｃ−Ｒ（agcctttcgttttatttgatgcctctaga GCTCAGCTTA AGGGCCTAAA AGGAGAGCTTT、配列番号８４）；
Ｐ．ヒブリダからＡＴＦ２ａｌｓＳ−Ｆ（cgaaagctctctaa GCTGAGCAGG AGAAATTAAC TATGGAAGAT ATAGAAGGAT ACGAAC、配列番号８５）と
ＡＴＦ２ｖｅｃ−Ｒ（cctttcgttttatttgatgcctctaga GCTCAGCTTA AAGCGACGCA AATTCGCCGA TGG、配列番号８６）；
イチゴからＢＰＢＴａｌｓＳ−Ｆ（aaacgaaagctctctaa GCTGAGCAGG AGAAATTAAC TATGGACAGC AAACAGAGCA GCG、配列番号８７）と
ＢＰＢＴｖｅｃ−Ｒ（cctttcgttttatttgatgcctctaga GCTCAGCTTA AAGCGCTGGG GTGATGAACG CAT、配列番号８８）；及び
イチゴからＳＡＡＴａｌｓＳ−Ｆ（aaacgaaagctctctaa GCTGAGCAGG AGAAATTAAC TATGGAGAAA ATAGAAGTGA GCA、配列番号８９）と
ＳＡＡＴｖｅｃ−Ｒ（cctttcgttttatttgatgcctctaga GCTCAGCTTA GATCAGCGTC TTTGGACTCG CCA、配列番号９０）。
【００５１】
異なったアシルトランスフェラーゼを、Gibson et al, Nat Meth 2009, 6(5):343-345に記載のように、ｐＩＢＡ１（国際特許出願公開ＷＯ２０１２／１０９５３４）及びｐＩＶＣ１（Xiong et al. Sci Rep 2012, 2:311）のＢｌｐＩで消化したプラスミドと連結して、それぞれ、ｐＺＡ−ｉｌｖＤ−ａｌｓＳ−ＬｕｘＥ、ｐＺＡ−ｉｌｖＤ−ａｌｓＳ−ＡＴＦ１、ｐＺＡ−ｉｌｖＤ−ａｌｓＳ−ＡＴＦ２、ｐＺＡ−ｉｌｖＤ−ａｌｓＳ−ＢＴＢＴ、ｐＺＡ−ｉｌｖＤ−ａｌｓＳ−ＳＡＡＴ、ｐＺＡ−ｌｅｕＡＢＣＤ−ｉｌｖＤ−ａｌｓＳ−ＬｕｘＥ、ｐＺＡ−ｌｅｕＡＢＣＤ−ｉｌｖＤ−ａｌｓＳ−ＡＴＦ１、ｐＺＡ−ｌｅｕＡＢＣＤ−ｉｌｖＤ−ａｌｓＳ−ＡＴＦ２、ｐＺＡ−ｌｅｕＡＢＣＤ−ｉｌｖＤ−ａｌｓＳ−ＢＴＢＴ、及びｐＺＡ−ｌｅｕＡＢＣＤ−ｉｌｖＤ−ａｌｓＳ−ＳＡＡＴから成るプラスミドを形成した。
【００５２】
ｐＺＥ−ＫｉｖＤ−ｙｑｈＤから成るプラスミドを構築するために、ｙｑｈＤを、プライマーｙｑｈＤＳｐｈｌ−Ｆ（GGGCCCgcatgc AGGAGAAATT AACTATGAAC AACTTTAATC TGCACACCCC、配列番号９１）とｙｑｈＤＸｂａｌ−Ｒ（GGGCCCtctaga TTAGCGGGCG GCTTCGTATA TACGGC、配列番号９２）を用いてＰＣＲ増幅し、次に、プラスミドｐＩＢＡ７（国際特許出願公開ＷＯ２０１２／１０９５３４）のｐａｄＡを置き換えて、ｐＺＥ−ＫｉｖＤ−ｙｑｈＤを形成した。
【００５３】
発酵の結果
振盪フラスコ発酵を、組み換え株について実施した。細胞を試験管内に一晩植菌し、２００μＬの細胞を、１５０ｍＬ容のネジ蓋コニカルフラスコ内の１０ｍＬの発酵培地中に移した。発酵培地は、チアミン（１０ｍｇ／Ｌ）、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）、及び中和のための０．５ｇの炭酸カルシウムを補充したＭ９培地（５ｇ／Ｌの酵母抽出物）中の２０ｇ／Ｌのグルコースから構成された。タンパク質の発現を、０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘発した。フラスコをパラフィルムで密封した後、発酵を開始して、微好気的環境を作った。サンプルを、回転振盪培養器（２５０r.p.m.）による３０℃にて４８時間のインキュベーション後に回収した。産生された中鎖エステル化合物を、ＧＣ−ＦＩＤ（ガスクロマトグラフィー−火炎イオン化検出器）分析によって定量化した。それらの副産物及び残留グルコースを、ＨＰＬＣ−ＲＩＤ（高速液体クロマトグラフィー−屈折率検出器）分析によって同定した。結果を図６に示す。
【００５４】
本明細書に挙げられるすべての特許、特許出願、及び刊行物、並びに電子的に入手可能な材料（例えば、GenBank及びRefSeqなどにおけるヌクレオチド配列寄託、及び例えば、SwissProt、PIR、PRF、PDBなどにおけるアミノ酸配列寄託、及びGenBank及びRefSeqにおける注釈付きコーディング領域からの翻訳）の完全な開示は、それらの全体について参照により組み込まれる。万一、本出願の開示と参照により本明細書に組み込まれた（単数若しくは複数の）任意の文献の開示との間になんらかの矛盾が存在する場合には、本出願の開示が適用されるものとする。前述の詳細な説明及び実施例は、理解を明確にするためにのみ与えられる。不必要な限定が、そこから理解されるべきではない。本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれる当業者に明らかな変化に関して、示されそして記載された正確な詳細に限定されない。
【００５５】
特に明記しない限り、明細書及び特許請求の範囲において使用される、化合物、分子量などの量を表すすべての数字は、すべての場合について、用語「約（about）」によって修飾されると理解されるべきである。従って、逆に明記されない限り、明細書及び特許請求の範囲に記載されている数値パラメーターは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、そして特許請求の範囲に対する均等論を制限する試みとしてではないが、それぞれの数値パラメーターは、少なくとも、報告された有効数字の数の観点から、及び通常の四捨五入技術を適用することによって解釈されるべきである。
【００５６】
本発明の広い範囲に示されている数値範囲及びパラメーターが、近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示される数値は、できる限り正確に報告される。すべての数値は、しかしながら、本質的に、それらのそれぞれの試験測定において見られる標準偏差に起因する範囲を必然的に含む。
【００５７】
すべての見出しは、読者の便宜のためであり、そして指定されない限り、見出しに続く本文の意味を限定するために使用されるべきではない。
【配列表フリーテキスト】
【００５８】
【化１】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
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【化３１】
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【化３２】
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【化３３】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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