(57)【要約】本発明は、インターフェロン制御因子ＩＲＦ５に結合し、ＩＲＦ５のホモ二量体化を妨害し、及び／又は下流のシグナル伝達を減弱する細胞透過性ペプチド、並びに、ＩＲＦ５を阻害するペプチドをスクリーニングするための方法を含む。一般的に、本発明の細胞透過性ペプチドは、ヒトインターフェロン制御因子ＩＲＦ５に結合する（ＣＰＰ−ＩＲＦ５）。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロン制御因子ＩＲＦ５に結合する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ−ＩＲＦ５）であって、前記ペプチドは２０〜４０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列はさらに、一部には、
ａ）Ｉ−ｘ−Ｌ−ｘ−Ｉ−Ｓ−ｘ−Ｐ−ｘ−ｘ−Ｋ（配列番号２５）
（式中、
Ｉはイソロイシンであり、
Ｌはロイシンであり、
Ｓはセリンであり、
Ｐはプロリンであり、
Ｋはリジンであり、
ｘは独立して任意のアミノ酸から選択される）；又は
ｂ）Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ８−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ９（配列番号２４）
（式中、
Ｙはチロシンであり、
Ｒ１は、トリプトファン（Ｗ）又はアラニン（Ａ）の群から選択されたアミノ酸であり、
Ｒ２はロイシン（Ｌ）又はトレオニン（Ｔ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ３はロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、フェニルアラニン（Ｆ）又はチロシン（Ｙ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ８はロイシン（Ｌ）又はアラニン（Ａ）であり、
Ｒ４はロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）又はトレオニン（Ｔ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ５はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）又はメチオニン（Ｍ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ９はバリン（Ｖ）又はロイシン（Ｌ）である）；又は
ｃ）Ｋ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）
（式中、
Ｋはリジンであり、
Ｄはアスパラギン酸であり、
Ｒ６は、ロイシン又はアスパラギン酸からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｍはメチオニンであり、
Ｒ７はグルタミン−トリプトファン（Ｑ−Ｗ）及びアルギニン−フェニルアラニン（Ｒ−Ｆ）からなる群より選択され、
Ｆはフェニルアラニンである）
からなる群より選択されたアミノ酸配列モチーフを含む、前記ペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
前記ペプチドが２０〜４０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列がさらに、一部には、
ａ）Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−Ｒ５−Ｖ（配列番号１）
（式中、
Ｙはチロシンであり、
Ｒ１はトリプトファン（Ｗ）又はアラニン（Ａ）の群から選択されたアミノ酸であり、
Ｒ２はロイシン（Ｌ）又はトレオニン（Ｔ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ３はロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）又はフェニルアラニン（Ｆ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｌはロイシンであり、
Ｒ４はロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）又はトレオニン（Ｔ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ５はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）又はメチオニン（Ｍ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｖはバリンである）；又は
ｂ）Ｋ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）
（式中、
Ｋはリジンであり、
Ｄはアスパラギン酸であり、
Ｒ６はロイシン又はアスパラギン酸からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｍはメチオニンであり、
Ｒ７はグルタミン−トリプトファン（Ｑ−Ｗ）及びアルギニン−フェニルアラニン（Ｒ−Ｆ）からなる群より選択され、
Ｆはフェニルアラニンである）
からなる群より選択されたアミノ酸配列モチーフを含む、請求項１記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
前記ペプチドが、２０〜３５アミノ酸のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列モチーフがＩ−ｘ−Ｌ−ｘ−Ｉ−Ｓ−ｘ−Ｐ−ｘ−ｘ−Ｋ（配列番号２５）であり、ｘは請求項１に定義されている通りである、請求項１及び３のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列モチーフがＹ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ８−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ９（配列番号２４）であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８及びＲ９は請求項１に定義されている通りである、請求項１及び３のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項６】
前記アミノ酸配列モチーフがＹ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−Ｒ５−Ｖ（配列番号１）であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は請求項２に定義されている通りである、請求項１〜３のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項７】
前記アミノ酸配列モチーフがＭＡＮＬＧ−Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−Ｒ５−Ｖ（配列番号３）であり、Ｍはメチオニンであり、Ａはアラニンであり、Ｎはアスパラギンであり、Ｌはロイシンであり、Ｇはグリシンであり、Ｙはチロシンであり、Ｖはバリンであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は請求項１に定義されている通りである、請求項１〜３のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項８】
前記アミノ酸配列モチーフがＭＡＮＬＧ−Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−Ｒ５−Ｖ（配列番号３）であり、Ｍはメチオニンであり、Ａはアラニンであり、Ｎはアスパラギンであり、Ｌはロイシンであり、Ｇはグリシンであり、Ｙはチロシンであり、Ｖはバリンであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は請求項２に定義されている通りである、請求項１〜３のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項９】
前記アミノ酸配列モチーフがＫ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）であり、Ｒ６及びＲ７は請求項２に定義されている通りである、請求項１〜３のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項１０】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である第二のペプチドをさらに含む、請求項１〜９のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項１１】
Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾又はその両方をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項１２】
アセチル化から選択されたＮ末端修飾、アミド化から選択されたＣ末端修飾又はその両方をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチドが、
【化５】
2015534568.tif 000010
からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチドが、配列番号１３：IRLQISNPYLKFIPLKRAIWLIKを含む、請求項１及び３のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項１５】
ａ）試験しようとするペプチドを提供する工程、
ｂ）前記ペプチドを溶液中に希釈する工程、
ｃ）ビオチン−ＩＲＦ５及びＨｉｓ−ＩＲＦ５を含む第一の緩衝溶液を調製する工程（各ＩＲＦ−５は単量体及び二量体の混合物である）、
ｄ）工程ｂ）の希釈されたペプチド溶液を工程ｃ）の緩衝溶液と合わせ、室温でインキュベーションする工程、
ｅ）ビオチン−ＩＲＦ５及びＨｉｓ−ＩＲＦ５の二量体形成の検出のために、蛍光ドナーとしてのＥｕをコンジュゲートさせたストレプトアビジン及び蛍光アクセプターとしてのＡＰＣ（アロフィコシアニン）で標識された抗Ｈｉｓ抗体を含む第二の緩衝溶液を調製する工程、
ｆ）工程ｅ）の第二の緩衝溶液を工程ｄ）の合わせた溶液と合わせ、約４℃で約１日間インキュベーションする工程、
ｇ）ＦＲＥＴアッセイを介して二量体形成を決定する工程（対照群と比較して減少したＦＲＥＴシグナルは、前記ペプチドによるＩＲＦ５二量体形成の阻害を示す）
を含むＩＲＦ５を阻害するペプチドをスクリーニングするための方法。
【請求項１６】
ＦＲＥＴアッセイが、均一な時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイである、請求項１５の方法。
【請求項１７】
ＩＲＦ５が、突然変異体Ｓ４３０Ｄ（２２２−４６７）及び野生型ＩＲＦ５（２２２−４６７）からなる群より選択される、請求項１５の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか記載の１つ以上のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩及び１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
治療的に活性な物質として使用するための、請求項１〜１４のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２０】
ＩＲＦ５シグナル伝達が重要な役割を果たしている全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は他の自己免疫疾病の治療又は予防に使用するための請求項１〜１４のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２１】
ＩＲＦ５シグナル伝達が重要な役割を果たしている全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は他の自己免疫疾病の治療又は予防のための方法であって、前記方法は、請求項１〜１４のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩を被験者に投与することを含む、前記方法。
【請求項２２】
ＩＲＦ５シグナル伝達が重要な役割を果たしている全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は他の自己免疫疾病の治療又は予防のための請求項１〜１４のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項２３】
ＩＲＦ５シグナル伝達が重要な役割を果たしている全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は他の自己免疫疾病の治療又は予防のための医薬品の調製のための、請求項１〜１４のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項２４】
ヒトインターフェロン制御因子ＩＲＦ５に結合する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ−ＩＲＦ５）であって、前記ペプチドは配列番号４〜１０及び１３〜１４からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、前記ペプチド。
【請求項２５】
インターフェロン制御因子ＩＲＦ５に結合する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ−ＩＲＦ５）であって、前記ペプチドは少なくとも２０〜約３５アミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列はさらに、一部には、
ａ）Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−Ｒ５−Ｖ（配列番号１）
（式中、Ｙはチロシン（Ｔｙｒ）であり、Ｒ１はトリプトファン（Ｔｒｐ）又はアラニン（Ａｌａ）の群から選択されたアミノ酸であり、Ｒ２はロイシン（Ｌｅｕ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｒ３はロイシン（Ｌｅｕ）、アラニン（Ａｌａ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｌはロイシン（Ｌｅｕ）であり、Ｒ４はロイシン（Ｌｅｕ）、グリシン（Ｇ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｒ５はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）又はメチオニン（Ｍｅｔ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｖはバリン（Ｖａｌ）である）；又は
ｂ）Ｋ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）
（式中、Ｋはリジン（Ｌｙｓ）であり；Ｄはアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、Ｒ６はロイシン（Ｌｅｕ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｍはメチオニン（Ｍｅｔ）であり、Ｒ７はＱ−Ｗ及びＲ−Ｆからなる群より選択され、Ｆはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）である）
からなる群より選択されたアミノ酸配列モチーフを含む、前記ペプチド。
【請求項２６】
前記アミノ酸配列モチーフがＭＡＮＬＧ−Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−Ｒ５−Ｖ（配列番号３）である、請求項２５の細胞透過性ペプチド。
【請求項２７】
前記ペプチドが配列番号４〜７からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、請求項２６の細胞透過性ペプチド。
【請求項２８】
前記ペプチドが、配列番号８〜１０からなる群より選択されたアミノ酸配列を含み、さらにアミノ酸配列モチーフがＫ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）である、請求項２５の細胞透過性ペプチド。
【請求項２９】
第一のペプチドは、
ｉ．少なくとも２０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．インターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）への結合能を有し、
ｉｉｉ．かつ第一のペプチドは、一部には、Ｋ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）のアミノ酸モチーフを含み、
任意選択の第二のペプチドは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である、
第一のポリペプチド及び任意選択の第二のポリペプチドからなる、少なくとも２０から約４０アミノ酸の単離かつ精製されたペプチド。
【請求項３０】
第一のペプチドは、
ｉ．少なくとも２０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．ヒトインターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）への結合能を有し、
ｉｉｉ．かつ第一のペプチドは配列番号８〜１０のアミノ酸配列を含み、
任意選択の第二のペプチドは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である、
第一のポリペプチド及び任意選択の第二のポリペプチドからなる、少なくとも２０から約４０アミノ酸の単離かつ精製されたペプチド。
【請求項３１】
本明細書に記載の本発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、インターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）に結合し、ＩＲＦ５のホモ二量体化を妨害し、及び／又は下流のシグナル伝達を減弱する細胞透過性ペプチド、並びに、ＩＲＦ５を阻害する前記ペプチドをスクリーニングするための方法を含む。
【０００２】
発明の背景
ＩＲＦ５は、自己免疫の病因（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）並びに下流におけるＩＬ６及びＩＬ１２の調節を含む）の重要な成分を調節する推定治療ターゲットである。複数のゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）は、ＩＲＦ５多型がＳＬＥのリスク増加に関連していることを報告し、既存の前臨床文献も共に、ＩＲＦ５の機能の遮断は、ＳＬＥ患者に対して有益であり得るという説得力のある理論的根拠を提供している（Agarwal; Cunninghame et al.; Demirci et al.; Dieude and Dawidowicz）。前臨床文献に提示されたデータは、自己免疫疾病の病因の重要な成分を調節する際のＩＲＦ５の決定的な役割への重要な糸口を提供する。しかしながら、ＩＲＦ５をターゲティングする具体的なツールが存在しないことから、初期のターゲットを評価する努力は、ＩＲＦ５に対するｓｉＲＮＡの使用又はノックアウトＩＲＦ５マウスの使用に限定された（Beal;Feng et al.;Kozyrev and Alarcon;Krausgruber et al.;Lien et al.）。
【０００３】
さらに、ＩＲＦ５機能の遮断は、ＩＲＦ５を発現するＳＬＥに関連した細胞型（単球、マクロファージ、形質細胞様樹状細胞及びＢ細胞）におけるＴｏｌｌ様レセプター７／８／９のシグナル伝達に影響を及ぼすだろう。従って、ＩＲＦ５へのターゲティングは、ＩＲＦ５のシグナル伝達が重要な役割を果たしているＳＬＥ又は他の自己免疫疾病を有する患者に、調節不全のシグナル伝達、例えば、ＴＬＲ７／８／９のシグナル伝達（これによりｐＤＣによるインターフェロンの産生、単球／マクロファージによるＩＬ−１２、ＩＬ６及びＴＮＦαの産生、並びにＢ細胞による自己抗体の産生がもたらされる）を減弱することによってかなりの恩恵をもたらし得る。
【０００４】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、比較的無毒性の様式で、細胞の形質膜を横断して、様々な、さもなくば不透過性である巨大分子を運搬する能力を有するクラスのペプチドである。ＣＰＰペプチドは、典型的には、陽イオン性、両親媒性又は疎水性を示す５〜約３０アミノ酸（ａａ）の長さである。細胞透過性ペプチドの顕著な例としては、Ｔａｔ、ペネトラチン及びトランスポータンが挙げられる。（Fawell, S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, pp 664-668; Theodore, L. et al. J. Neurosci. 1995, pp 7158-7167; Pooga, M. et al. FASEB J. 1998, pp 67-77）。Ｔａｔなどの細胞透過性ペプチドをエフェクターペプチドに付着させても、又は、エフェクターペプチドは内因的に細胞透過性であってもよい。内因的に細胞透過性であるエフェクターペプチドの例としては、とりわけ、Ａｒｆ（１−２２）及びｐ２８が挙げられる（Johansson, H. J. et al. Mol. Ther. 2007, 16(1), pp 115-123; Taylor, B. N. et al. Cancer Res. 2009, 69 (2), pp. 537-546）。
【０００５】
ＩＲＦ５の役割を適切に分析し、ターゲットの二量体化を阻害するために、いわゆるツール分子（小分子又はペプチド）が必要である。ＩＲＦ５の結晶構造は公知であるが（Chen et al.）、ＩＲＦ５をターゲティングしかつホモ二量体化を阻害し、従ってＩＲＦ５の機能を調節する具体的なツール（小分子又はペプチド）はなかった。
【０００６】
本発明は、ターゲットに到達しかつ二量体の形成（核移行及び機能を調節する重要な工程）に決定的な残基を阻害するように設計された新規な細胞透過性ペプチドに焦点を当てる。ＩＲＦ５二量体化をターゲティングするこのような細胞透過性ペプチド及び他のツール分子を生化学的に評価する直接的なアプローチがないので、新規なＦＲＥＴに基づいた生化学的アッセイを確立した。本特許に記載された生化学的アッセイは、ＩＲＦ５の二量体化を阻害するツールを同定する。
【０００７】
従って、本発明は、一般的に、細胞透過性であり、ＩＲＦ５に結合してＩＲＦ５のホモ二量体化を破壊及び／又は下流のシグナル伝達を減弱する能力を有するペプチド、並びに、ＩＲＦ５に結合及び／又は阻害するペプチド、特に細胞透過性ペプチドを試験、スクリーニング及び評価する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図は、本発明の例示的なＦＲＥＴによる二量体アッセイの原理及び検証を示す。図１Ａは、実施例１２に詳述されている生化学的なＦＲＥＴによるＩＲＦ５の二量体アッセイの図解を提供する。グラフ１Ｂ及び１Ｃは、生化学的アッセイの使用を検証するのに役立つ。これらの実験において、ビオチンタグＩＲＦ５タンパク質（２００nM）を、等容量の漸増量の６−Ｈｉｓ（本明細書においては以後Ｈｉｓ）タグＩＲＦ５タンパク質と混合した。横軸はｈｉｓタグ化ＩＲＦ５の濃度を示し、縦軸は生じたＴＲ−ＦＲＥＴの測定値を示す。文献（Royer et al., 2010）において、Ｓ４３０のリン酸化はＩＲＦ５の二量体化を促進することが示唆されている。Ｓ４３０Ｄ突然変異体はリン酸化を模倣していると考えられる。図１Ｂにおいて、Ｋｄ（μM）は、二量体化の順番が、Ｓ４３０Ｄ：Ｓ４３０Ｄ＜Ｓ４３０Ｄ：野生型＜野生型：野生型であることを示し、これらの観察は、文献に報告された数値と一致する。図１Ｃは、ＴＲ＿ＦＲＥＴシグナルが、Ｓ４３０Ｄ＋Ｒ３５３Ｄ突然変異体で有意に減少し、これもまた予想されるＩＲＦ５の二量体化の挙動と合致することを示す。
【図２】この図は、ＩＲＦ５に結合する本発明の標識化されたペプチドを示す。図２Ａは、実施例１３に詳述されている生化学的に直接結合したＦＲＥＴアッセイ（ＩＲＦ５（２２２−４２５）に結合するＦＩＴＣ ＣＰＰ）の図解を提供する。これらの実験において、標識された本発明の細胞透過性ペプチド、特に配列番号１３〜１４及び４〜７のＦＩＴＣ標識形（１００nM）（配列番号１６〜２１）を、漸増濃度のＮ末端Ｈｉｓ（６つのヒスチジン）タグ化ＩＲＦ５（２２２−４２５）配列番号２２と混合した。下のグラフ２Ｂ及び２Ｃの横軸は、ｈｉｓタグ化ＩＲＦ５（２２２−４２５、ヘリックス５を欠失し、ホモ二量体化できない）の濃度（μM）を示し、縦軸は、配列番号１３〜１４及び４〜７のＦＩＴＣ標識形（配列番号１６〜２１）の存在下における、ＴＲ−ＦＲＥＴの測定値を示す。Ｋｄｓは、配列番号１３〜１４及び４〜７の６つ全てのＦＩＴＣ形（配列番号１６〜２１）が、試験されたＩＲＦ５タンパク質に直接結合することを示す。ＩＲＦ５に結合しないように設計された対照のＦＩＴＣで標識されたＣＰＰ（配列番号２３）は、全く親和性を示さない。
【図３Ａ】この図は、ＨｅＬａ細胞中の２時間（ｈ）（図３Ａ）及び２４時間（ｈ）（図３Ｂ）インキュベーションした後の、ＦＩＴＣで標識されたＣＰＰの局在を示し（ＣＰＰは配列番号１３〜１４及び４〜７であり、配列番号１３〜１４及び４〜７のＦＩＴＣ標識形は配列番号１６〜２１である）、従って、試験されたＣＰＰが細胞透過性であることを確認する。使用されたプロトコールは実施例１４に詳述されている。簡潔に言えば、ＨｅＬａ細胞を、２時間及び２４時間の時点で（それぞれパネルＡ及びＢ）、１０μM又は３μMの濃度のＦＩＴＣタグ化ＣＰＰで処理した。画像は４０倍の拡大率で得られた。
【図３Ｂ】この図は、ＨｅＬａ細胞中の２時間（ｈ）（図３Ａ）及び２４時間（ｈ）（図３Ｂ）インキュベーションした後の、ＦＩＴＣで標識されたＣＰＰの局在を示し（ＣＰＰは配列番号１３〜１４及び４〜７であり、配列番号１３〜１４及び４〜７のＦＩＴＣ標識形は配列番号１６〜２１である）、従って、試験されたＣＰＰが細胞透過性であることを確認する。使用されたプロトコールは実施例１４に詳述されている。簡潔に言えば、ＨｅＬａ細胞を、２時間及び２４時間の時点で（それぞれパネルＡ及びＢ）、１０μM又は３μMの濃度のＦＩＴＣタグ化ＣＰＰで処理した。画像は４０倍の拡大率で得られた。
【図４】この図は、対照（Ｖ）と比較した、配列番号１３〜１４及び４〜７によるＴＨＰ−１（ヒト単核球細胞系）におけるＩＬ−６の産生の減弱を示す。ＴＨＰ−１細胞を、５０μMのこれらのＣＰＰ（配列番号１３〜１４及び４〜７）で３０分間処置し、実施例１５に記載されているように１０μMのＲ８４８（ＴＬＲ７／８アゴニスト）を用いて一晩刺激した。横軸は処置条件を示し、縦軸は、ビヒクル（ペプチドを全く含まないが、１０μMのＲ８４８を用いて刺激した）に標準化して産生されたＩＬ６の量、及びcell titer gloによって測定された細胞数を示す。配列番号１３〜１４及び４〜７は全て、Ｒ８４８により刺激されたＩＬ６の産生を減弱する。
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｆ：これらの図は、濃度依存的に配列番号１３〜１４及び４〜７による、ヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）におけるＲ８４８により誘発されたＩＬ−１２の産生の減弱を示す。健康なヒト試験志願者から単離されたＰＢＭＣを、配列番号１３〜１４及び４〜７で３０分間前処置し、実施例１６に記載されているように１μMのＲ８４８（ＴＬＲ７／８アゴニスト）を用いて一晩刺激した。横軸は使用された化合物の濃度を示し、縦軸はＩＬ１２の量を示す。配列番号１３〜１４及び４〜７は全て、濃度依存的にＰＢＭＣからのＲ８４８により刺激されたＩＬ１２の産生を減弱する。作用強度の順番は、配列番号１４＜配列番号４＜配列番号６＜配列番号５＜配列番号７＜配列番号１３である。
【図５Ｂ】図５Ａ−５Ｆ：これらの図は、濃度依存的に配列番号１３〜１４及び４〜７による、ヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）におけるＲ８４８により誘発されたＩＬ−１２の産生の減弱を示す。健康なヒト試験志願者から単離されたＰＢＭＣを、配列番号１３〜１４及び４〜７で３０分間前処置し、実施例１６に記載されているように１μMのＲ８４８（ＴＬＲ７／８アゴニスト）を用いて一晩刺激した。横軸は使用された化合物の濃度を示し、縦軸はＩＬ１２の量を示す。配列番号１３〜１４及び４〜７は全て、濃度依存的にＰＢＭＣからのＲ８４８により刺激されたＩＬ１２の産生を減弱する。作用強度の順番は、配列番号１４＜配列番号４＜配列番号６＜配列番号５＜配列番号７＜配列番号１３である。
【図５Ｃ】図５Ａ−５Ｆ：これらの図は、濃度依存的に配列番号１３〜１４及び４〜７による、ヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）におけるＲ８４８により誘発されたＩＬ−１２の産生の減弱を示す。健康なヒト試験志願者から単離されたＰＢＭＣを、配列番号１３〜１４及び４〜７で３０分間前処置し、実施例１６に記載されているように１μMのＲ８４８（ＴＬＲ７／８アゴニスト）を用いて一晩刺激した。横軸は使用された化合物の濃度を示し、縦軸はＩＬ１２の量を示す。配列番号１３〜１４及び４〜７は全て、濃度依存的にＰＢＭＣからのＲ８４８により刺激されたＩＬ１２の産生を減弱する。作用強度の順番は、配列番号１４＜配列番号４＜配列番号６＜配列番号５＜配列番号７＜配列番号１３である。
【図５Ｄ】図５Ａ−５Ｆ：これらの図は、濃度依存的に配列番号１３〜１４及び４〜７による、ヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）におけるＲ８４８により誘発されたＩＬ−１２の産生の減弱を示す。健康なヒト試験志願者から単離されたＰＢＭＣを、配列番号１３〜１４及び４〜７で３０分間前処置し、実施例１６に記載されているように１μMのＲ８４８（ＴＬＲ７／８アゴニスト）を用いて一晩刺激した。横軸は使用された化合物の濃度を示し、縦軸はＩＬ１２の量を示す。配列番号１３〜１４及び４〜７は全て、濃度依存的にＰＢＭＣからのＲ８４８により刺激されたＩＬ１２の産生を減弱する。作用強度の順番は、配列番号１４＜配列番号４＜配列番号６＜配列番号５＜配列番号７＜配列番号１３である。
【図５Ｅ】図５Ａ−５Ｆ：これらの図は、濃度依存的に配列番号１３〜１４及び４〜７による、ヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）におけるＲ８４８により誘発されたＩＬ−１２の産生の減弱を示す。健康なヒト試験志願者から単離されたＰＢＭＣを、配列番号１３〜１４及び４〜７で３０分間前処置し、実施例１６に記載されているように１μMのＲ８４８（ＴＬＲ７／８アゴニスト）を用いて一晩刺激した。横軸は使用された化合物の濃度を示し、縦軸はＩＬ１２の量を示す。配列番号１３〜１４及び４〜７は全て、濃度依存的にＰＢＭＣからのＲ８４８により刺激されたＩＬ１２の産生を減弱する。作用強度の順番は、配列番号１４＜配列番号４＜配列番号６＜配列番号５＜配列番号７＜配列番号１３である。
【図５Ｆ】図５Ａ−５Ｆ：これらの図は、濃度依存的に配列番号１３〜１４及び４〜７による、ヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）におけるＲ８４８により誘発されたＩＬ−１２の産生の減弱を示す。健康なヒト試験志願者から単離されたＰＢＭＣを、配列番号１３〜１４及び４〜７で３０分間前処置し、実施例１６に記載されているように１μMのＲ８４８（ＴＬＲ７／８アゴニスト）を用いて一晩刺激した。横軸は使用された化合物の濃度を示し、縦軸はＩＬ１２の量を示す。配列番号１３〜１４及び４〜７は全て、濃度依存的にＰＢＭＣからのＲ８４８により刺激されたＩＬ１２の産生を減弱する。作用強度の順番は、配列番号１４＜配列番号４＜配列番号６＜配列番号５＜配列番号７＜配列番号１３である。
【０００９】
定義
特記しない限り、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の技術者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は等価な方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料は以下に記載されている。
【００１０】
本出願において使用される命名法は、特記しない限り、ＩＵＰＡＣの体系的な命名法に基づく。
【００１１】
本明細書に記載された全てのペプチド配列は、通常の慣例に従って書かれており、特記しない限り、Ｎ末端アミノ酸は左に、Ｃ末端アミノ酸は右である。２つのアミノ酸残基の間の短い線は、ペプチド結合を示す。アミノ酸が異性体形を有する場合、特記しない限り、示されるのはＬ型のアミノ酸である。
【００１２】
「アミノ酸」という用語は、一般式ＮＨ２ＣＨＲＣＯＯＨの有機化合物を示し、Ｒは任意の有機基であり得る。特に、アミノ酸という用語は、天然及び非天然（人工）アミノ酸を指し得る。本発明に記載する際には簡便のために、様々なアミノ酸残基の慣用的及び非慣用的な略称が使用される。これらの略称は当業者にはよく知られているが、明瞭にするために、以下に列挙する：
Ａｓｐ＝Ｄ＝アスパラギン酸；Ａｌａ＝Ａ＝アラニン；Ａｒｇ＝Ｒ＝アルギニン；Ａｓｎ＝Ｎ＝アスパラギン；Ｇｌｙ＝Ｇ＝グリシン；Ｇｌｕ＝Ｅ＝グルタミン酸；Ｇｌｎ＝Ｑ＝グルタミン；Ｈｉｓ＝Ｈ＝ヒスチジン；Ｉｌｅ＝Ｉ＝イソロイシン；Ｌｅｕ＝Ｌ＝ロイシン；Ｌｙｓ＝Ｋ＝リジン；Ｍｅｔ＝Ｍ＝メチオニン；Ｎｌｅ＝ノルロイシン；Ｐｈｅ＝Ｆ＝フェニルアラニン；Ｐｒｏ＝Ｐ＝プロリン；Ｓｅｒ＝Ｓ＝セリン；Ｔｈｒ＝Ｔ＝トレオニン；Ｔｒｐ＝Ｗ＝トリプトファン；Ｔｙｒ＝Ｙ＝チロシン；及びＶａｌ＝Ｖ＝バリン。
【００１３】
「アミノ酸モチーフ」という用語は、保存されたアミノ酸配列（例えばY---L--V）を示す。この配列はまた、モチーフの各アミノ酸を隔てる残基数を示すギャップを含んでいてもよい。
【００１４】
本発明の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、２つ以上の非天然アミノ酸の接続によって作られた橋又は環状ペプチドの形にコンフォメーションが拘束されていない約５から約３０アミノ酸のペプチド（すなわちそれは「ステープルペプチド」ではない）を示し、これは細胞膜を透過する（例えば、種々の積荷を細胞中に移行する）ことができる。
【００１５】
「ＩＲＦ５に結合するペプチド（群）」又は「ＩＲＦ５に結合することのできるペプチド（群）」という語句は、ターゲットがＩＲＦ５である生化学的アッセイにおいて陽性である（本明細書においてＩＣ５０＜７５μMと定義される）ペプチド群を示す。
【００１６】
「ＩＲＦ５」（インターフェロン制御因子５）という用語は、一般的にアミノ酸配列
【化１】
2015534568.tif 000002
を含むタンパク質を示す。あるいは、ＩＲＦ５は、少なくともアイソフォーム２、３又は４を含む他のアイソフォームを示す。
【００１７】
「薬学的に許容される塩」という用語は、生物学的に又は別様にも望ましい塩を示す。薬学的に許容される塩は、酸付加塩及び塩基付加塩の両方を含む。
【００１８】
「薬学的に許容される酸付加塩」という用語は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、炭酸、リン酸などの無機酸、並びに、脂肪族、脂環式、芳香族、芳香脂肪族、複素環式、カルボン酸及びスルホン酸のクラスの有機酸から選択された有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、グルタミン酸、アントラニル酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、エンボン酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、及びサリチル酸を用いて形成された薬学的に許容される塩を示す。
【００１９】
「薬学的に許容される塩基付加塩」という用語は、有機塩基又は無機塩基を用いて形成された薬学的に許容される塩を示す。許容される無機塩基の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩及びアルミニウム塩が挙げられる。薬学的に許容される無毒性の有機塩基から得られた塩としては、一級、二級及び三級アミン、置換アミン（天然の置換アミンを含む）、環式アミン、並びに、塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジエチルアミノエタノール、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペリジン（piperizine）、ピペリジン（piperidine）、Ｎ−エチルピペリジン及びポリアミン樹脂の塩が挙げられる。
【００２０】
「薬学的組成物」及び「薬学的製剤」（又は「製剤」）という用語は互換的に使用され、かつ、調製物に含まれる活性成分の生物学的活性が効果的であることを可能とするような剤形であり、薬学的組成物が投与される被験者に許容できないほどに毒性である追加の成分を全く含まない調製物を示す。
【００２１】
「液体組成物」は、大気圧下で少なくとも約２〜約８℃の温度で水性又は液体である組成物を示す。
【００２２】
「凍結乾燥」という用語は、物質を凍結し、その後、生物学的又は化学的反応を支持しないレベルまで昇華及び／又は蒸発によって水の濃度を減少させるプロセスを示す。
【００２３】
「凍結乾燥された組成物」（又は「凍結乾燥組成物」）という用語は、液体組成物の凍結乾燥プロセスによって得られる又は得ることのできる組成物を示す。典型的には、それは５％未満の水分含量を有する固体組成物である。
【００２４】
「復元された組成物」という用語は、凍結乾燥された組成物の溶解を促進する復元媒体と合わせた凍結乾燥組成物を示す。復元媒体の例としては、注射用水（ＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、塩化ナトリウム溶液（例えば０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）、ブドウ糖溶液（例えば５％ブドウ糖）、界面活性剤を含む溶液（例えば０．０１％ポリソルベート２０）、又はｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝溶液）が挙げられるがそれらに限定されない。
【００２５】
「無菌」という用語は、組成物又は賦形剤において、微生物がコンタミしている確率が１０−６未満であることを示す。
【００２６】
「薬学的に許容される」という用語は、一般的に安全で無毒性で、生物学的にも別様にも望ましく、動物並びにヒトへの薬学的使用に許容される、薬学的組成物を調製するのに有用である材料の特質を示す。
【００２７】
「薬学的に許容される賦形剤」、「薬学的に許容される担体」及び「治療的に不活性な賦形剤」という用語は互換的に使用され得、かつ、医薬品を製剤化する際に使用される、治療活性を全く有さず、投与される被験者に対して無毒性である薬学的組成物中の任意の薬学的に許容される成分、例えば崩壊剤、結合剤、充填剤、溶媒、緩衝剤、等張化剤、安定化剤、抗酸化剤、界面活性剤、担体、希釈剤、又は潤滑剤を示す。
【００２８】
「半数阻害濃度」（ＩＣ５０）という用語は、インビトロにおける生物学的プロセスの５０％阻害を得るのに必要とされる具体的な化合物又は分子の濃度を示す。ＩＣ５０値はｐＩＣ５０値（−ｌｏｇ ＩＣ５０）に対数変換することができ、より高い数値は、指数関数的により大きな作用強度を示す。ＩＣ５０値は絶対値ではないが、例えば使用される濃度などの実験条件に依存する。ＩＣ５０値は、チェン・プルソフ式を使用して絶対阻害定数（Ｋｉ）に変換することができる（Biochem. Pharmacol. (1973) 22:3099）。
【００２９】
「自己免疫疾病」は、個体自身の組織から生じ及び個体自身の組織に対して向けられる非悪性疾病又は疾患を指す。自己免疫疾病は本明細書において特に、悪性又は癌性の疾病又は容態を除外し、特にＢ細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病及び慢性骨髄芽球性白血病を除外する。自己免疫疾病又は疾患の例としては、炎症応答、例えば乾癬及び皮膚炎（例えばアトピー性皮膚炎）を含む炎症皮膚疾病；全身性強皮症及び硬化症；炎症性腸疾患（例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎）に関連した応答；呼吸促迫症候群（成人呼吸促迫症候群；ＡＲＤＳを含む）；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；アレルギー容態、例えば湿疹及び喘息、並びにＴ細胞浸潤及び慢性炎症応答を併発する他の容態；アテローム性動脈硬化症；白血球粘着不全症；関節リウマチ；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（ループス腎炎、皮膚エリテマトーデスを含むがそれらに限定されない）；糖尿病（例えばＩ型糖尿病すなわちインスリン依存性糖尿病）；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；橋本甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年発症糖尿病；並びに、結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症及び血管炎に典型的にみられるサイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性型及び遅延型過敏症に関連した免疫応答；悪性貧血（アジソン病）；白血球の血管外漏出を併発する疾病；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性疾患；多発臓器損傷症候群；溶血性貧血（クリオグロブリン血症又はクームス陽性貧血を含むがそれらに限定されない）；重症筋無力症；抗原抗体複合体により媒介される疾病；抗糸球体基底膜抗体病；抗リン脂質抗体症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート・イートン筋無力症症候群；水疱性類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫性多腺性内分泌障害；ライター病；全身硬直症候群；ベーチェット病；巨細胞性動脈炎；免疫複合体性腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性神経炎；免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）又は自己免疫性血小板減少症が挙げられるがそれらに限定されない。
【００３０】
「Ｎ末端修飾」及び「アミノ基修飾」という用語は互換的に使用され、ペプチド又はタンパク質のＮ末端における官能基の付加を示す。特に、Ｎ末端修飾は翻訳後である。Ｎ末端修飾の例は、当技術分野において一般的に知られており、例えばアセチル化、ピログルタメート形成、ミリストイル化、メチル化、カルバミル化、又はホルミル化である。具体的なＮ末端修飾はアセチル化である。
【００３１】
「Ｃ末端修飾」及び「カルボキシル基修飾」という用語は互換的に使用され、ペプチド又はタンパク質のＣ末端における官能基の付加を示す。特に、Ｃ末端修飾は翻訳後である。Ｃ末端修飾の例は、当技術分野において一般的に知られており、例えばアミド化、プレニル化、グリコシルホスファチジルイノシトール化（glypiation）、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、又はメチル／エチル−エステル化である。具体的なＣ末端修飾はアミド化である。
【００３２】
簡便のために、また当業者にはすぐに分かることであるが、本発明に使用及び／又は参照された部分、試薬などを示すために、以下の略称又は記号が使用されている。
μl              マイクロリットル
μM              マイクロモル
Ａｃ              アセチル
Ａｈａ            アミノヘキサン酸
Ａｌｅｘａ        Invitrogen社によって生産された蛍光色素のファミリー
ＡＰＣ            アロフィコシアニン
ＢＯＰ            ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウム−ヘキサフルオロリン酸
ＢＳＡ            ウシ血清アルブミン
ＣＰＰ            細胞透過性ペプチド
ＤＩＰＥＡ        Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ            ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ          ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ            ジチオトレイトール
ＤｙＬｉｇｈｔ    Dyomicsによって生産された蛍光色素のファミリー
ＥＳ−ＭＳ        エレクトロスプレー質量分析
Ｅｔ２Ｏ          ジエチルエーテル
Ｅｕ              ユーロピウム
ＦＡＢ−ＭＳ      高速原子衝撃質量分析
ＦＩＴＣ          フルオレセインイソチオシアネート
ＦＬＡＧ−ｔａｇ  抗体によって認識されるペプチド（DYKDDDDK）（配列番号２４）
Ｆｍｏｃ          ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＦＲＥＴ          フェルスター／蛍光共鳴エネルギー移動
ＧＳＴ            グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ
ＧＷＡＳ          ゲノムワイド関連解析
ｈ                時間
ＨＡ−ｔａｇ      抗体によって認識されるペプチド（YPYDVPDYA）（配列番号２５）
ＨＢＴＵ          ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロリン酸
Ｈｉｓ−ｔａｇ    ヘキサヒスチジンタグ
ＨＯＢＴ          Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ｈｒ（ｓ）        時間
ＩＣ５０          半数阻害濃度
ＩＬ−１２        インターロイキン１２
ＩＬ−１２ｐ４０  インターロイキン１２のサブユニットｐ４０
ＩＬ６            インターロイキン６
ＩＲＢ            治験審査委員会
ＩＲＦ５          インターフェロン制御因子５
ｍｉｎ            分
Ｍｙｃ−ｔａｇ    抗体によって認識される短いペプチド（EQKLISEEDL）（配列番号２６）
ＮａＣｌ          塩化ナトリウム
ＮＦκＢ          活性化Ｂ細胞のκ軽鎖のエンハンサーに結合する核内因子
ｎｍ              ナノメートル
ＮＭＰ            Ｎ−メチル−ピロリドン
ＰＢＭＣ          末梢血単核細胞
ＰＢＳ            リン酸緩衝食塩水
Ｒ８４８          レシキモド、１−［４−アミノ−２−（エトキシメチル）イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール
Ｒｕ              ルテニウム
ＳＢＰ−ｔａｇ    ストレプトアビジンに結合するペプチド（MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP）（配列番号２７）
ｓｉＲＮＡ        低分子干渉ＲＮＡ
ＳＬＥ            全身エリテマトーデス
ＳＳＡ            スクシンイミジルスクシンアミド
ＴＡＭＲＡ        カルボキシテトラメチルローダミン
Ｔｂ              テルビウム
ＴＦＡ            トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ            トリイソプロピルシラン
ＴＬＲ            Ｔｏｌｌ様レセプター
ＴＲ−ＦＲＥＴ    時間分解ＦＲＥＴ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ    トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
Ｖ５−ｔａｇ      抗体によって認識されるペプチド（GKPIPNPLLGLDST）（配列番号２８）
ＷＴ              野生型
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明は、ＩＲＦ５の（ホモ）二量体化をターゲティングすることによって、インターフェロン制御因子ＩＲＦ５を阻害する細胞透過性ペプチドである化合物を提供する。
【００３４】
一般的な態様において、前記化合物は、インターフェロン制御因子ＩＲＦ５に結合する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ−ＩＲＦ５）又はその薬学的に許容される塩であり、前記ペプチドは２０〜４０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸はさらに、
ａ）Ｉ−ｘ−Ｌ−ｘ−Ｉ−Ｓ−ｘ−Ｐ−ｘ−ｘ−Ｋ（配列番号２５）
（式中、
Ｉはイソロイシンであり、
Ｌはロイシンであり、
Ｓはセリンであり、
Ｐはプロリンであり、
Ｋはリジンであり、
ｘは独立して任意のアミノ酸から選択される）；又は
ｂ）Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ８−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ９（配列番号２４）
（式中、
Ｙはチロシンであり、
Ｒ１は、トリプトファン（Ｗ）又はアラニン（Ａ）の群から選択されたアミノ酸であり、
Ｒ２はロイシン（Ｌ）又はトレオニン（Ｔ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ３はロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、フェニルアラニン（Ｆ）又はチロシン（Ｙ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ８はロイシン（Ｌ）又はアラニン（Ａ）であり、
Ｒ４はロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）又はトレオニン（Ｔ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ５はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）又はメチオニン（Ｍ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ９はバリン（Ｖ）又はロイシン（Ｌ）である）；又は
ｃ）Ｋ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）
（式中、
Ｋはリジンであり、
Ｄはアスパラギン酸であり、
Ｒ６は、ロイシン又はアスパラギン酸からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｍはメチオニンであり、
Ｒ７はグルタミン−トリプトファン（Ｑ−Ｗ）及びアルギニン−フェニルアラニン（Ｒ−Ｆ）からなる群より選択され、
Ｆはフェニルアラニンである）
からなる群より選択されたアミノ酸配列モチーフを含む。
【００３５】
１つの態様において、前記化合物は上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５又はその薬学的に許容される塩であり、前記ペプチドは２０〜４０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列はさらに、
ａ）Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−Ｒ５−Ｖ（配列番号１）
（式中、
Ｙはチロシンであり、
Ｒ１はトリプトファン（Ｗ）又はアラニン（Ａ）の群から選択されたアミノ酸であり、
Ｒ２はロイシン（Ｌ）又はトレオニン（Ｔ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ３はロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）又はフェニルアラニン（Ｆ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｌはロイシンであり、
Ｒ４はロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）又はトレオニン（Ｔ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ５はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）又はメチオニン（Ｍ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｖはバリンである）；又は
ｂ）Ｋ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）
（式中、
Ｋはリジンであり、
Ｄはアスパラギン酸であり、
Ｒ６はロイシン又はアスパラギン酸からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｍはメチオニンであり、
Ｒ７はグルタミン−トリプトファン（Ｑ−Ｗ）及びアルギニン−フェニルアラニン（Ｒ−Ｆ）からなる群より選択され、
Ｆはフェニルアラニンである）
からなる群より選択されたアミノ酸配列モチーフを含む。
【００３６】
本発明の具体的な態様は、２０〜３５アミノ酸のアミノ酸配列を含む上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００３７】
１つの態様において、前記化合物は、インターフェロン制御因子ＩＲＦ５に結合する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ−ＩＲＦ５）又はその薬学的に許容される塩であり、前記ペプチドは２０〜４０アミノ酸、特に２０〜３５アミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列はさらに、アミノ酸モチーフ
Ｉ−ｘ−Ｌ−ｘ−Ｉ−Ｓ−ｘ−Ｐ−ｘ−ｘ−Ｋ（配列番号２５）
（式中、
Ｉはイソロイシンであり、
Ｌはロイシンであり、
Ｓはセリンであり、
Ｐはプロリンであり、
Ｋはリジンであり、
ｘは任意のアミノ酸である）
を含む。
【００３８】
本発明の別の具体的な態様は、アミノ酸配列モチーフがＩ−ｘ−Ｌ−ｘ−Ｉ−Ｓ−ｘ−Ｐ−ｘ−ｘ−Ｋ（配列番号２５）であり、ｘは上記で定義した通りである、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００３９】
本発明の具体的な態様において、ｘは独立して任意の天然のアミノ酸から選択される。より具体的には、ｘは独立してアルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｌ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、フェニルアラニン（Ｆ）及びチロシン（Ｙ）の群から選択される。
【００４０】
１つの態様において、前記化合物は、インターフェロン制御因子ＩＲＦ５に結合する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ−ＩＲＦ５）又はその薬学的に許容される塩であり、前記ペプチドは２０〜４０アミノ酸、特に２０〜３５アミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列はさらに、アミノ酸配列モチーフ
Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ８−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ９（配列番号２４）
Ｙはチロシンであり、
Ｒ１はトリプトファン（Ｗ）又はアラニン（Ａ）の群から選択されたアミノ酸であり、
Ｒ２はロイシン（Ｌ）又はトレオニン（Ｔ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ３はロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）又はフェニルアラニン（Ｆ）又はチロシン（Ｙ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ８はロイシン（Ｌ）又はアラニン（Ａ）であり、
Ｒ４はロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）又はトレオニン（Ｔ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ５はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）又はメチオニン（Ｍ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ９はバリン（Ｖ）又はロイシン（Ｌ）である）
を含む。
【００４１】
本発明の別の具体的な態様は、アミノ酸配列モチーフがＹ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ８−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ９（配列番号２４）であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８及びＲ９は上記で定義した通りである、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００４２】
本発明の別の具体的な態様は、アミノ酸配列モチーフがＹ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−Ｒ５−Ｖ（配列番号１）であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は上記で定義した通りである、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００４３】
本発明の別の具体的な態様は、アミノ酸配列モチーフがＭＡＮＬＧ−Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−Ｒ５−Ｖ（配列番号３）であり、Ｍはメチオニンであり、Ａはアラニンであり、Ｎはアスパラギンであり、Ｌはロイシンであり、Ｇはグリシンであり、Ｙはチロシンであり、Ｖはバリンであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は上記で定義した通りである、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００４４】
１つの態様において、前記化合物は、インターフェロン制御因子ＩＲＦ５に結合する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ−ＩＲＦ５）又はその薬学的に許容される塩であり、前記ペプチドは２０〜４０アミノ酸、特に２０〜３５アミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列はさらに、アミノ酸配列モチーフ
Ｋ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）
（式中、
Ｋはリジンであり、
Ｄはアスパラギン酸であり、
Ｒ６はロイシン又はアスパラギン酸からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｍはメチオニンであり、
Ｒ７はグルタミン−トリプトファン（Ｑ−Ｗ）及びアルギニン−フェニルアラニン（Ｒ−Ｆ）からなる群より選択され、
Ｆはフェニルアラニンである）
を含む。
【００４５】
本発明の別の具体的な態様は、アミノ酸配列モチーフがＫ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）であり、Ｒ６及びＲ７は上記で定義した通りである、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００４６】
本発明の別の具体的な態様は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である第二のペプチドをさらに含む、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００４７】
本発明の別の具体的な態様は、Ｎ末端修飾及び／又はＣ末端修飾をさらに含む、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００４８】
本発明の別のより具体的な態様は、アセチル化から選択されたＮ末端修飾及び／又はアミド化から選択されたＣ末端修飾をさらに含む、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００４９】
本発明の別の具体的な態様は、前記ペプチドが、
【化２】
2015534568.tif 000003
からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００５０】
本発明の別の具体的な態様は、前記ペプチドが配列番号１３：IRLQISNPYLKFIPLKRAIWLIKのアミノ酸配列を含む、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００５１】
本発明の別の具体的な態様は、前記ペプチドが配列番号１４：MIILIISFPKHKDWKVILVKのアミノ酸配列を含む、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００５２】
本発明の別の具体的な態様は、前記ペプチドが配列番号４：MANLGYWLLLLFVTMWTDVGLAKKRPKPのアミノ酸配列を含む、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００５３】
本発明の別の具体的な態様は、前記ペプチドが配列番号５：MANLGYWLALLFVTMWTDVGLFKKRPKPのアミノ酸配列を含む、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００５４】
本発明の別の具体的な態様は、前記ペプチドが配列番号６：MANLGYWLLALFVTYWTDLGLVKKRPKPのアミノ酸配列を含む、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００５５】
本発明の別の具体的な態様は、前記ペプチドが配列番号７：MANLGYWLYALFLTMVTDVGLFKKRPKPのアミノ酸配列を含む、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００５６】
本発明の別の具体的な態様は、前記ペプチドが配列番号８：KDLMVQWFKDGGPSSGAPPPSのアミノ酸配列を含む、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００５７】
本発明の別の具体的な態様は、前記ペプチドが配列番号９：IRLQISNPDLKDLMVQWFKDGGPSSGAPPPSのアミノ酸配列を含む、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００５８】
本発明の別の具体的な態様は、前記ペプチドが配列番号１０：PFPPLPIGEEAPKDDMVRFFKDLHQYLNVVのアミノ酸配列を含む、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドに関する。
【００５９】
本発明の別の具体的な態様は、上記のような１つ以上のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩及び１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物に関する。
【００６０】
本発明の別の具体的な態様は、治療的に活性な物質として使用するための、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩に関する。
【００６１】
本発明の別の具体的な態様は、ＩＲＦ５のシグナル伝達が重要な役割を果たしている全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は他の自己免疫疾病の治療又は予防に使用するための、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩に関する。
【００６２】
本発明の別の具体的な態様は、ＩＲＦ５のシグナル伝達が重要な役割を果たしている全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は他の自己免疫疾病の治療又は予防のための方法に関し、前記方法は、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩を被験者に投与することを含む。
【００６３】
本発明の別の具体的な態様は、ＩＲＦ５のシグナル伝達が重要な役割を果たしている全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は他の自己免疫疾病の治療又は予防のための、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩の使用に関する。
【００６４】
本発明の別の具体的な態様は、ＩＲＦ５のシグナル伝達が重要な役割を果たしている全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は他の自己免疫疾病の治療又は予防のための医薬品の調製のための、上記のようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩の使用に関する。
【００６５】
本発明は、ＩＲＦ５の二量体化／シグナル伝達を破壊するための化合物及びこのような化合物の薬学的に許容される塩を提供する。
【００６６】
一般的な態様において、前記化合物は、ＩＲＦ５に結合する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド）である。
【００６７】
１つの態様において、前記化合物は、ＩＲＦ５に結合する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド）であり、前記ペプチドは、配列番号４〜１０及び１３〜１４からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む。
【００６８】
具体的な態様において、アミノ酸配列は、少なくとも２０〜約３５アミノ酸を含む。
【００６９】
場合により、細胞透過性ペプチドはまた、小分子を含んでいても、又は小分子に連結されていてもよい。
【００７０】
具体的な態様において、前記化合物はインターフェロン制御因子ＩＲＦ５に結合する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ−ＩＲＦ５）であり、前記ペプチドは、少なくとも２０〜約３５アミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列はさらに、一部には、
ａ）Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−Ｒ５−Ｖ（配列番号１）
（式中、Ｙはチロシン（Ｔｙｒ）であり、Ｒ１はトリプトファン（Ｔｒｐ）又はアラニン（Ａｌａ）の群から選択されたアミノ酸であり、Ｒ２はロイシン（Ｌｅｕ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｒ３はロイシン（Ｌｅｕ）、アラニン（Ａｌａ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｌはロイシン（Ｌｅｕ）であり、Ｒ４はロイシン（Ｌｅｕ）、グリシン（Ｇ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｒ５はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）又はメチオニン（Ｍｅｔ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｖはバリン（Ｖａｌ）である）；又は
ｂ）Ｋ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）
（式中、Ｋはリジン（Ｌｙｓ）であり、Ｄはアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、Ｒ６はロイシン（Ｌｅｕ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｍはメチオニン（Ｍｅｔ）であり、Ｒ７はＱ−Ｗ及びＲ−Ｆからなる群より選択され、Ｆはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）である）
からなる群より選択されたアミノ酸配列モチーフを含む。
【００７１】
さらに別の具体的な態様において、本発明は、第一のペプチド及び任意選択の第二のペプチドからなる、ヒトインターフェロン制御因子ＩＲＦ５に結合する約８〜約３５アミノ酸の単離及び精製されたポリペプチドを提供し、前記の第一のペプチドは配列番号１２を含み、任意選択の第二のペプチドは、約５〜約２０アミノ酸の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む。より好ましくは、ポリペプチドは配列番号１３であり、細胞透過性である。
【００７２】
代替的な具体的な態様において、本発明は、第一のペプチド及び任意選択の第二のペプチドからなる、約２０〜約４０アミノ酸の単離及び精製されたポリペプチドを提供し、前記の第一のペプチドは、
ｉ．少なくとも２０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．ＩＲＦ５への結合能及び／又はＩＲＦ５の二量体化を阻害する能力を有し、
ｉｉｉ．かつ第一のペプチドはさらに、一部には、アミノ酸配列モチーフＩｘＬｘＩＳｘＰｘｘＫＤｘｘＶｘｘｘＫ（配列番号１５）（ｘは任意のアミノ酸である）を含み、
任意選択の第二のペプチドは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である。
【００７３】
さらに別の具体的な態様において、本発明は、第一及び任意選択の第二のポリペプチドからなる、少なくとも２０〜約４０アミノ酸の単離及び精製されたペプチドを提供し、前記の第一のペプチドは、
ｉ．少なくとも２０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．ヒトインターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）への結合能を有し、
ｉｉｉ．かつ第一のペプチドは、一部には、Ｋ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）を含み、
任意選択の第二のペプチドは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である。
【００７４】
さらに別の具体的な態様において、本発明は、ヒトインターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）に結合する細胞透過性ペプチドである、配列番号４〜７及び１３〜１４を提供する。あるいは、本発明はまた、インターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）への結合能を有する配列番号８〜１０を提供する。
【００７５】
さらに別の具体的な態様において、本発明は、第一及び任意選択の第二のポリペプチドからなる、少なくとも２０〜約４０アミノ酸の単離及び精製されたペプチドを提供し、前記の第一のペプチドは、
ｉ．少なくとも２０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．ヒトインターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）への結合能を有し、
ｉｉｉ．かつ第一のペプチドは、配列番号８〜１０からなる群より選択されたアミノ酸配列を含み、
任意選択の第二のペプチドは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である。
【００７６】
本発明はまた、以下の工程：
ａ）試験しようとするペプチド、小分子、又はペプチド−小分子を準備する工程、
ｂ）前記ペプチド（又は小分子もしくはペプチド−小分子）を溶液中に希釈する工程、
ｃ）ビオチン−ＩＲＦ５及びＨｉｓ−ＩＲＦ５を含む第一の緩衝溶液を調製する工程（各ＩＲＦ−５は単量体及び二量体の混合物である）、
ｄ）工程ｂ）の希釈されたペプチド溶液を工程ｃ）の緩衝溶液と合わせ、室温でインキュベーションする工程、
ｅ）ビオチン−ＩＲＦ５及びＨｉｓ−ＩＲＦ５の二量体形成の検出のために、蛍光ドナー、例えばＥｕ（ユーロピウムで標識された）にコンジュゲートさせたストレプトアビジン、及び蛍光アクセプターとしてのＡＰＣ（アロフィコシアニン）で標識された抗Ｈｉｓ抗体を含む第二の緩衝溶液を調製する工程、
ｆ）工程ｅ）の第二の緩衝溶液を工程ｄ）の合わせた溶液と合わせ、約４℃で約１日間インキュベーションする工程、
及び、ＦＲＥＴアッセイを介して二量体形成を決定する工程（対照群と比較して減少したＦＲＥＴシグナルは、ペプチド（又は小分子もしくはペプチド−小分子）によるＩＲＦ５二量体形成の阻害を示す）（例えば表１、配列番号４〜７、１３〜１４及び１６〜２１のＦＲＥＴアッセイ及びＩＣ５０の結果を参照）
を含む、ＩＲＦ５を阻害する、ペプチドもしくは小分子、又はペプチド−小分子の組合せをスクリーニングするための方法又はアッセイを提供する。
【００７７】
より具体的には、ＩＲＦ５は、突然変異体Ｓ４３０Ｄ（２２２−４６７）及び野生型ＩＲＦ５（２２２−４６７）からなる群より選択される。
【００７８】
本発明は、ＩＲＦ５に結合する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ−ＩＲＦ５）である化合物を開示し、前記ペプチドは、配列番号４〜１０、１３及び１４からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む。
【００７９】
具体的な態様において、アミノ酸配列は、少なくとも２０〜約４０アミノ酸、より具体的には少なくとも約２０〜約３５アミノ酸を含む。
【００８０】
具体的な態様において、前記化合物は、インターフェロン制御因子ＩＲＦ５に結合する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ−ＩＲＦ５）であり、前記ペプチドは、少なくとも２０〜約３５アミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列はさらに、一部には、
ａ）Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−Ｒ５−Ｖ（配列番号１）
（式中、Ｙはチロシン（Ｔｙｒ）であり、Ｒ１はトリプトファン（Ｔｒｐ）又はアラニン（Ａｌａ）の群から選択されたアミノ酸であり、Ｒ２はロイシン（Ｌｅｕ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｒ３はロイシン（Ｌｅｕ）、アラニン（Ａｌａ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｌはロイシン（Ｌｅｕ）であり、Ｒ４はロイシン（Ｌｅｕ）、グリシン（Ｇ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｒ５はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）又はメチオニン（Ｍｅｔ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｖはバリン（Ｖａｌ）である）；又は
ｂ）Ｋ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）
（式中、Ｋはリジン（Ｌｙｓ）であり、Ｄはアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、Ｒ６はロイシン（Ｌｅｕ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｍはメチオニン（Ｍｅｔ）であり、Ｒ７はＱ−Ｗ及びＲ−Ｆからなる群より選択され、Ｆはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）である）
からなる群より選択されたアミノ酸配列モチーフを含む。
【００８１】
より具体的な態様において、本発明の細胞透過性ペプチドは、ＭＡＮＬＧ−Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−Ｒ５−Ｖ（配列番号３）のアミノ酸配列モチーフを有する。より好ましくは、前記ペプチドは、配列番号４〜７からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む。
【００８２】
さらに別の具体的な態様において、本発明は、第一及び任意選択の第二のポリペプチドからなる、少なくとも２０〜約４０のアミノ酸の単離及び精製されたペプチドを提供し、第一のペプチドは、
ｉ．少なくとも２０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．ヒトインターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）への結合能を有し、
ｉｉｉ．かつ第一のペプチドは、一部には、Ｋ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）を含み、
任意選択の第二のペプチドは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である。
【００８３】
さらに別の具体的な態様において、本発明は、ヒトインターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）に結合する細胞透過性ペプチドである配列番号４〜７及び１３〜１４を提供する。あるいは、本発明はまた、インターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）への結合能を有する配列番号８〜１０を提供する。
【００８４】
さらに別の具体的な態様において、本発明は、第一及び任意選択の第二のポリペプチドからなる、少なくとも２０〜約４０アミノ酸の単離及び精製されたペプチドを提供し、第一のペプチドは、
ｉ．少なくとも２０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．ヒトインターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）への結合能を有し、
ｉｉｉ．かつ第一のペプチドは、配列番号８〜１０からなる群より選択されたアミノ酸配列を含み、
任意選択の第二のペプチドは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である。
【００８５】
さらに別の具体的な態様において、本発明は、第一のペプチド及び任意選択の第二のペプチドからなる、ヒトインターフェロン制御因子ＩＲＦ５に結合する約８〜約３５アミノ酸の単離及び精製されたポリペプチドを提供し、前記の第一のペプチドは配列番号１２を含み、任意選択の第二のペプチドは、約５〜約２０アミノ酸の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む。より好ましくは、ポリペプチドは配列番号１３であり、細胞透過性である。
【００８６】
代替的な具体的な態様において、本発明は、第一のペプチド及び任意選択の第二のペプチドからなる、約２０〜約４０アミノ酸の単離及び精製されたポリペプチドを提供し、前記の第一のペプチドは、
ｉ．少なくとも２０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．ＩＲＦ５への結合能及び／又はＩＲＦ５の二量体化を阻害する能力を有し、
ｉｉｉ．かつ第一のペプチドはさらに、一部には、アミノ酸配列モチーフＩｘＬｘＩＳｘＰｘｘＫＤｘｘＶｘｘｘＫ（配列番号１５）（ｘは任意のアミノ酸である）を含み、
任意選択の第二のペプチドは細胞透過性ペプチドである。
【００８７】
より具体的には、本発明のペプチドは、以下の細胞透過性ペプチドからなる：
【化３】
2015534568.tif 000004
【００８８】
あるいは、本発明のペプチドは、インターフェロン制御因子５に結合する以下のペプチドからなる：
【化４】
2015534568.tif 000005
【００８９】
本発明はまた、以下の工程：
ａ）試験しようとするペプチド、小分子、又はペプチド−小分子を準備する工程、
ｂ）前記ペプチド（又は小分子もしくはペプチド−小分子）を溶液中に希釈する工程、
ｃ）ビオチン−ＩＲＦ５及びＨｉｓ−ＩＲＦ５を含む第一の緩衝溶液を調製する工程（各ＩＲＦ−５は単量体及び二量体の混合物である）、
ｄ）工程ｂ）の希釈されたペプチド溶液を工程ｃ）の緩衝溶液と合わせ、室温でインキュベーションする工程、
ｅ）ビオチン−ＩＲＦ５及びＨｉｓ−ＩＲＦ５の二量体形成の検出のために、蛍光ドナー、例えばＥｕをコンジュゲートさせたストレプトアビジン、及び蛍光アクセプターとしてのＡＰＣ（アロフィコシアニン）で標識された抗Ｈｉｓ抗体を含む第二の緩衝溶液を調製する工程。このアッセイは、任意の２つの異なるタグタンパク質（例えばＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＳＢＰタグ、又はＶ５タグ）に使用され得る。さらに、ドナーの蛍光発光スペクトルが、アクセプターの励起スペクトルと重なる限り、任意の蛍光ドナー／アクセプターの対がこのアッセイへの使用に適している。ドナー／アクセプター色素のいくつかの好ましい例は、Ｔｂ／ＦＩＴＣ、Ｒｕ／Ａｌｅｘａ、ＦＩＴＣ／ＴＡＭＲＡ及びＥｕ／ＤｙＬｉｇｈｔである。以下の例は、二量体形成のためにタグタンパク質を使用し、検出のために蛍光にコンジュゲートさせた対応する抗体又はストレプトアビジンを使用するが、このアッセイ法はまた、ドナー色素及びアクセプター色素でタンパク質を直接標識し、ＦＲＥＴシグナルにより二量体形成を測定することによって実施され得る。このフォーマットは、タグ化融合タンパク質又は抗体結合が二量体の相互作用に影響を及ぼすならば特に有用であり得る。
ｆ）工程ｅ）の第二の緩衝溶液を工程ｄ）の合わせた溶液と合わせ、約４℃で約１日間インキュベーションする工程、
及び、ＦＲＥＴアッセイを介して二量体形成を決定する工程（対照群と比較して減少したＦＲＥＴシグナルは、ペプチド（又は小分子もしくはペプチド−小分子）によるＩＲＦ５二量体形成の阻害を示す）（例えば表１、ＩＣ５０の結果を示すＦＲＥＴデータを参照）
を含む、ＩＲＦ５を阻害するペプチドもしくは小分子、又はペプチド−小分子の組合せをスクリーニングするための方法又はアッセイを提供する。
【００９０】
より具体的には、ＩＲＦ５は、突然変異体Ｓ４３０Ｄ（２２２−４６７）及び野生型ＩＲＦ５（２２２−４６７）からなる群より選択される。
【００９１】
本発明の化合物は、アミノ酸間のペプチド結合の形成のための任意の公知の慣用的な手順によって容易に合成され得る。このような慣用的な手順としては、例えば、そのカルボキシル基及び他の反応性基が保護されているアミノ酸又はそのフラグメントの遊離α−アミノ基と、そのアミノ基又は他の反応性基が保護されている別のアミノ酸又はそのフラグメントの遊離一級カルボキシル基との間の縮合を可能とする、任意の液相手順が挙げられる。
【００９２】
本発明の新規化合物を合成するためのこのような慣用的な手順としては、例えば、任意の固相ペプチド合成法が挙げられる。このような方法では、新規化合物の合成は、一般的な固相法の原則に従って、伸張しつつあるペプチド鎖に一回に一つの所望のアミノ酸残基を順次取り込むことによって行なわれ得る。このような方法は、例えば、Merrifield, R. B., J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); Barany et al., The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, Vol. 2, Gross, E. and Meienhofer, J., Eds. Academic Press 1-284 (1980)に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み入れられる。
【００９３】
ペプチド合成中に、アミノ酸上の具体的な反応基、例えばα−アミノ基、ヒドロキシル基、及び／又は反応性側鎖基が、その化学反応を防ぐために保護されていることが望ましくあり得る。これは、例えば、反応性基を保護基（これは後で除去することができる）と反応させることによって行なわれ得る。例えば、アミノ酸又はそのフラグメントのα−アミノ基を保護することによりその化学反応を防ぐことができ、その間にそのアミノ酸又はそのフラグメントのカルボキシル基が別のアミノ酸又はそのフラグメントと反応してペプチド結合を形成する。この後、αアミノ保護基を選択的に除去して、その部位で後続の反応を、例えば別のアミノ酸又はそのフラグメントのカルボキシル基との反応を行なうことが可能となり得る。
【００９４】
αアミノ基は、例えば、芳香族ウレタン型の保護基、例えばアリルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）及び置換ベンジルオキシカルボニル、例えばｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニル−イソプロピルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、及びｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）；及び脂肪族ウレタン型の保護基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメチルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、及びアリルオキシカルボニルから選択された、適切な保護基によって保護され得る。１つの態様において、Ｆｍｏｃがαアミノ保護に使用される。
【００９５】
アミノ酸のヒドロキシル基（ＯＨ）は、例えば、ベンジル（Ｂｚｌ）、２，６−ジクロロベンジル（２，６ｄｉＣｌ−Ｂｚｌ）、及びｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）から選択された適切な保護基によって保護され得る。チロシン、セリン又はトレオニンのヒドロキシル基を保護しようとする態様においては、例えば、ｔ−Ｂｕが使用され得る。
【００９６】
ε−アミノ酸基は、例えば、２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモ−ベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）、アリルカルボニル及びｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）から選択された適切な保護基によって保護され得る。リジンのε−アミノ基を保護しようとする態様においては、例えば、Ｂｏｃが使用され得る。
【００９７】
β−及びγ−アミド基は、例えば、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、２，４，６−トリメトキシベンジル（Ｔｍｏｂ）、４，４’−ジメトキシジチル（Ｄｏｄ）、ビス−（４−メトキシフェニル）−メチル及びトリチル（Ｔｒｔ）から選択された適切な保護基によって保護され得る。アスパラギン又はグルタミンのアミド基を保護しようとする態様においては、例えば、Ｔｒｔが使用され得る。
【００９８】
インドール基は、例えば、ホルミル（Ｆｏｒ）、メシチル−２−スルホニル（Ｍｔｓ）及びｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）から選択された適切な保護基によって保護され得る。トリプトファンのインドール基を保護しようとする態様においては、例えば、Ｂｏｃが使用され得る。
【００９９】
イミダゾール基は、例えば、ベンジル（Ｂｚｌ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、及びトリチル（Ｔｒｔ）から選択された適切な保護基によって保護され得る。ヒスチジンのイミダゾール基を保護しようとする態様においては、例えば、Ｔｒｔが使用され得る。
【０１００】
固相合成は、ペプチドのＣ末端から、保護されたα−アミノ酸を適切な樹脂にカップリングさせることによって開始され得る。このような出発物質は、α−アミノの保護されたアミノ酸を、エステル結合によって、ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール（Ｗａｎｇ）樹脂に付着させることによって、又はＦｍｏｃ−リンカー（例えば、ｐ−（（Ｒ，Ｓ）−α−（１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−メトキシホルムアミド）−２，４−ジメチルオキシベンジル）−フェノキシ酢酸（リンクリンカー））とベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂との間のアミド結合によって調製され得る。ヒドロキシメチル樹脂の調製は当技術分野において周知である。Ｆｍｏｃ−リンカー−ＢＨＡ樹脂担体は市販されており、合成される所望のペプチドが、Ｃ末端に非置換アミドを有する場合に一般的に使用されている。
【０１０１】
１つの態様において、ペプチド合成はマイクロ波でアシストされる。マイクロ波アシストペプチド合成は、固相ペプチド合成を加速するための魅力的な方法である。これは、マイクロ波ペプチド合成装置、例えばLibertyペプチド合成装置（CEM Corporation, Matthews, NC）を使用して実施され得る。マイクロ波アシストペプチド合成は、一定時間、指定の温度で反応を制御する方法を作ることを可能とする。合成装置は自動的に、温度を設定値に維持するために反応に伝えられる電力量を調節する。
【０１０２】
典型的には、Ｆｍｏｃ保護形のアミノ酸又は模倣体（２〜５等量のアミノ酸を含む）及び適切なカップリング試薬と共に使用して、アミノ酸又は模倣体をＦｍｏｃ−リンカー−ＢＨＡ樹脂上にカップリングさせる。カップリング後、樹脂を洗浄し、真空下で乾燥させ得る。樹脂上へのアミノ酸のローディングは、Ｆｍｏｃ−アミノ酸樹脂のアリコートのアミノ酸分析によって、又はＵＶ分析によるＦｍｏｃ基の決定によって決定され得る。塩化メチレン中で無水酢酸及びジイソプロピルエチルアミンと樹脂とを反応させることによって、あらゆる未反応のアミノ基をキャップし得る。
【０１０３】
樹脂にはいくつかの反復サイクルにより、順次アミノ酸が追加される。αアミノＦｍｏｃ保護基は塩基性条件下で除去される。ピペリジン、ピペラジン又はホルモリン（２０〜４０％ｖ／ｖ）のＤＭＦ溶液をこの目的のために使用し得る。１つの態様において、２０％ピペリジンのＤＭＡ溶液が使用される。
【０１０４】
αアミノ保護基の除去後、続いて保護されたアミノ酸を段階的に所望の順序でカップリングすることにより、中間体の保護されたペプチド−樹脂が得られる。ペプチドの固相合成においてアミノ酸のカップリングに使用された活性化試薬は当技術分野において周知である。例えば、このような合成に対して適切な試薬は、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリ−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＢＯＰ）、ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＢｒｏＰ）２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＢＴＵ）、及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）である。１つの態様において、試薬はＨＢＴＵ又はＤＩＣである。他の活性化剤は、Barany及びMerrifield (The Peptides, Vol. 2, J. Meienhofer, ed., Academic Press, 1979, pp 1-284)によって記載されている。様々な試薬、例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）及び３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢＴ）をカップリング混合物に加えて、合成サイクルを最適化し得る。１つの態様において、ＨＯＢＴが添加される。
【０１０５】
ペプチド合成後、遮断基を除去し、ペプチドを樹脂から切断し得る。例えば、ペプチド−樹脂を、樹脂１ｇあたり、１００μLのエタンジチオール、１００μlのジメチルスルフィド、３００μlのアニソール、及び９．５mLのトリフルオロ酢酸で、室温で１８０分間処理し得る。あるいは、ペプチド−樹脂を、樹脂１ｇあたり１．０mLのトリイソプロピルシラン及び９．５mLのトリフルオロ酢酸で、室温で９０分間処理し得る。その後、樹脂をろ別し、ペプチドを、冷却したエチルエーテルの添加によって沈降させ得る。その後、沈降物を遠心分離し、エーテル層をデカントし得る。
【０１０６】
粗ペプチドの精製は、例えば、島津ＬＣ−８Ａシステムで、逆相Ｃ１８カラム（５０×２５０mm、３００Å、１０μm）での高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって実施され得る。ペプチドを、最少量の水及びアセトニトリルに溶かし、カラムに注入し得る。勾配溶出は、一般的に、７０分間かけての２％−９０％のＢで（緩衝液Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、緩衝液Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）、６０ml／分の流速で開始され得る。ＵＶ検出は２２０／２８０nmに設定される。生成物を含む画分を分離し、その純度は島津ＬＣ−１０ＡＴ分析システムで逆相PursuitＣ１８カラム（４．６×５０mm）を流速２．５ml／分で１０分間かけての勾配（２−９０％）［緩衝液Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、緩衝液Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ］で使用して判断し得る。高い純度であると判断された画分をその後プールし、凍結乾燥し得る。
【０１０７】
本発明のペプチドを製造するためのさらに別の可能な方法は、室温での以下のペプチド合成プロトコールであろう。この手順においては、一般的に以下の工程が採用される：
【０１０８】
【表１】
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【０１０９】
全ての洗浄及びカップリングのための溶媒は、樹脂１ｇあたり１０〜２０mlの容量となるように測定される。合成全体を通してのカップリング反応を、カイザーニンヒドリン試験によってモニタリングし、完了の程度を決定し得る（Kaiser et al. Anal.Biochem.34, 595-598 (1970)）。あらゆる不完全なカップリング反応を、新たに調製された活性化アミノ酸と再カップリングさせ得るか、又は上記したように無水酢酸でペプチド樹脂を処理することによってキャップし得る。完全にアセンブルしたペプチド−樹脂を、残っている溶媒の量に依存して、数時間、一般的には一晩かけて真空下で乾燥させる。
【０１１０】
本発明のアミノ酸配列はまた、当業者に公知の方法によって合成され得る。このような方法としては、マイクロ波ペプチド合成（Murray J.K., Aral J., and Miranda L.P. Solid-Phase Peptide Synthesis Using Microwave Irradiation In Drug Design and Discovery. Methods in Molecular Biology, 2011, Volume 716, 73-88, DOI: 10.1007/978-1-61779-012-6_5）及びアミノ酸配列の固体状態合成（Steward and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freemantle, San Francisco, Calif. (1968)）が挙げられるがそれらに限定されない。例示的な固体状態合成法は、メリフィールドプロセスである（Merrifield, Recent Progress in Hormone Res., 23:451 (1967)）。
【０１１１】
本明細書に記載のような本発明の化合物はまた、薬学的に許容される塩の形態で提供され得る。好ましい塩の例は、薬学的に許容される有機酸、例えば酢酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、又はパモ酸、並びに、ポリマー酸、例えばタンニン酸又はカルボキシメチルセルロースを用いて形成された塩、及び、無機酸、例えばハロゲン化水素酸（例えば塩酸）、硫酸、又はリン酸などを用いて形成された塩である。当業者に公知の薬学的に許容される塩を得るための任意の手順を使用することができる。
【０１１２】
本発明に記載のＩＲＦ５ツール分子（小分子又はペプチド、特に細胞透過性ペプチド）あるいはＩＲＦ５に結合及び／又は阻害すると考えられる他の疑われる小分子又はペプチド、前記ツール分子、特に本明細書、及びより具体的には実施例１〜１１に記載の細胞透過性ペプチドの役割を適切に分析するために、生化学的アッセイが提示される。ＩＲＦ５の二量体化をターゲティングするツールを生化学的に評価するための直接的なアプローチが当技術分野にはないので、本発明の新規なＦＲＥＴに基づいた生化学的アッセイを本明細書に記載する。本明細書に記載の生化学的アッセイは、ＩＲＦ５の二量体化を阻害するツールを同定する。
【０１１３】
ＩＲＦ５の（ホモ）二量体化をターゲティングすることによってＩＲＦ５を阻害するツール分子（好ましくはペプチド及びより好ましくは細胞透過性ペプチド）をスクリーニングするための方法を提供する、本発明の生化学的ＦＲＥＴアッセイは、一般的に以下の工程に関与又はこれを含む：
ａ）試験しようとするペプチドを準備する工程、
ｂ）前記ペプチドを溶液中に希釈する工程、
ｃ）ビオチン−ＩＲＦ５及びＨｉｓ−ＩＲＦ５を含む第一の緩衝溶液を調製する工程（各ＩＲＦ−５は単量体及び二量体の混合物である）、
ｄ）工程ｂ）の希釈されたペプチド溶液を工程ｃ）の緩衝溶液と合わせ、室温でインキュベーションする工程、
ｅ）ビオチン−ＩＲＦ５及びＨｉｓ−ＩＲＦ５の二量体形成の検出のために、蛍光ドナー、好ましくはＥｕにコンジュゲートさせたストレプトアビジン、及び蛍光アクセプターとしてのＡＰＣ（アロフィコシアニン）で標識された抗Ｈｉｓ抗体を含む第二の緩衝溶液を調製する工程。より一般的には、標識は、任意の２つの異なるｔａｇタンパク質であり得る（例えばＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＳＢＰタグ及びＶ５タグ）。ドナーの蛍光発光スペクトルが、アクセプターの励起スペクトルと重なる限り、このアッセイは、任意の蛍光ドナー／アクセプターの対に対して使用され得る。ドナー／アクセプター色素のいくつかの好ましい例は、Ｔｂ／ＦＩＴＣ、Ｒｕ／Ａｌｅｘａ、ＦＩＴＣ／ＴＡＭＲＡ及びＥｕ／ＤｙＬｉｇｈｔである。以下の例は、二量体形成のためにタグタンパク質を使用し、検出のために蛍光にコンジュゲートさせた対応する抗体又はストレプトアビジンを使用するが、このアッセイ法はまた、ドナー色素及びアクセプター色素でタンパク質を直接標識し、ＦＲＥＴシグナルによる二量体形成を測定することによって実施され得る。このフォーマットは、タグ融合タンパク質又は抗体結合が二量体の相互作用に影響を及ぼすならば特に有用であり得る。
ｆ）工程ｅ）の第二の緩衝溶液を工程ｄ）の合わせた溶液と合わせ、約４℃で約１日間インキュベーションする工程、
ｇ）ＦＲＥＴアッセイを介して二量体形成を決定する工程（対照群と比較して減少したＦＲＥＴシグナルは、前記ペプチドによるＩＲＦ５二量体形成の阻害を示す）。
【０１１４】
好ましくは、ＦＲＥＴアッセイは、均一な時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイである。より好ましくは、工程ｃ）のＩＲＦ５は、突然変異体Ｓ４３０Ｄ（２２２−４６７）及び野生型ＩＲＦ５（２２２−４６７）からなる群より選択される。
【０１１５】
第一の緩衝溶液は、好ましい態様において、約２０mMのヘペス、１００mMのＮａＣｌ、０．１mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、０．２mg/mlのＢＳＡからなるｐＨ約７．０のアッセイ緩衝液１（ＡＢ１）を含む。
【０１１６】
本発明の方法の好ましい態様において、ペプチド試験溶液は、ＤＭＳＯ中で２〜３倍連続希釈され（約２mM）、１ウェルあたり２．５μlの各溶液を９６ウェルポリプロピレン（ＰＰ）プレートに移す。その後、以下の工程を実施し得る：
１）ＡＢ１中１００nMのビオチン−ＩＲＦ５（Ｓ４３０Ｄ）（０．９６mg/ml又は３２μM）及び２５０nMのＨｉｓ−ＩＲＦ５（Ｓ４３０Ｄ）（１．５１mg/ml又は５１μM）を調製する。
２）１ウェルあたり５０μlの（１）の溶液を、上記のような９６ウェルＰＰプレート中のペプチド溶液に加え、室温で２０分間インキュベーションする。
３）５％ＤＭＳＯを含むＡＢ２（ＤＴＴを含まないＡＢ１）中に１０nMのＥｕで標識されたストレプトアビジン及び８０nMのＡＰＣで標識された抗Ｈｉｓ抗体を調製し、１ウェルあたり１７μlを（４）の溶液に加える。
４）１ウェルあたり３０μlを３８４ウェルＰＰプレート（Matrix）に移し、４０℃で１日間インキュベーションする。
【０１１７】
その後、ＦＲＥＴアッセイを実施し、例えば、３４０nmにおける励起並びに６１５nm（ドナー蛍光）及び６６５nm（アクセプター蛍光）における発光をEnvisionで解読して、ＦＲＥＴシグナルを決定し、対照群と比較して減少したＦＲＥＴシグナルは、前記ペプチドによるＩＲＦ５の二量体形成の阻害を示す。
【０１１８】
アッセイのより具体的な例が、以下の実施例１２〜１３に例示されている。しかしながら、これらの例は、本明細書に記載の本発明の方法の範囲を制限するものではない。
【０１１９】
本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２０】
薬学的組成物
別の局面において、本発明は、薬学的に許容される担体にインターフェロン制御因子ＩＲＦ５に結合する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド）を含む薬学的組成物を提供する。これらの薬学的組成物は、例えば、以下に記載された治療法のいずれかに使用され得る。
【０１２１】
本明細書に記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドの薬学的組成物は、所望の純度を有するこのようなＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチドを、１つ以上の任意選択の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, Mack Printing Company (1990)）と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は、一般的に、使用される投与量及び濃度においてはレシピエントに無毒性であり、これには緩衝液、例えばリン酸、クエン酸、及び他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物、例えばブドウ糖、マンノース、又はデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるがそれらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体はさらに、間質薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Baxter International, Inc.）を含む。具体的に例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法（ｒＨｕＰＨ２０を含む）は、米国特許公開公報第２００５/０２６０１８６号及び第２００６/０１０４９６８号に記載されている。１つの局面において、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと合わせる。
【０１２２】
例示的な凍結乾燥製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性製剤は、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開公報第２００６/０４４９０８号に記載されたものを含み、後者の製剤は、ヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０１２３】
本明細書の薬学的組成物はまた、必要であれば処置される具体的な適応症のための追加の活性成分、特に、互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有するものを含み得る。このような活性成分は、意図する目的に効果的である量で組み合わせて適切に存在する。
【０１２４】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセルに、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システムに（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）、又はマクロエマルションに封入され得る。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, Mack Printing Company (1990)に開示されている。
【０１２５】
持続放出調製物を調製してもよい。持続放出調製物の適切な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。
【０１２６】
インビボにおける投与のために使用される組成物は一般的に無菌である。無菌性は、例えば滅菌ろ過メンブレンを通してのろ過によって容易に達成され得る。
【０１２７】
実施例
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より完全に理解されるだろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を制限するものと捉えるべきではない。
【０１２８】
実施例１
配列番号４〜７及び１３〜１４を有するペプチドは、固体状態合成を介して［CSBio (Menlo Park, California, USA)によって］合成された。（Steward and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freemantle, San Francisco, Calif. (1968)）。前記配列のための一般的で例示的な固体状態合成法は、以下のように記載されている：
【０１２９】
材料：
全ての化学物質及び溶媒、例えばＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＣＭ（塩化メチレン）、ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）及びピペリジンをＶＷＲ及びAldrichから購入し、さらに精製することなく購入したままで使用した。質量スペクトルは、エレクトロスプレーイオン化モードで記録された。自動的で段階的な保護アミノ酸のアセンブリは、ポリマー担体としてリンクアミドＭＢＨＡ樹脂を用いてＣＳ３３６Ｘシリーズペプチド合成装置（C S Bio Company, Menlo Park, California, USA）で構築された。Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学反応を合成に使用した。Ｆｍｏｃアミノ酸（ＡＡ）の保護基は以下の通りであった（Ａｒｇ：（Ｐｂｆ）、Ａｓｎ／Ｇｌｎ／Ｃｙｓ／Ｈｉｓ：（Ｔｒｔ）、Ａｓｐ／Ｇｌｕ：（ＯｔＢｕ）、Ｌｙｓ／Ｔｒｐ：（Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｔｙｒ：（ｔＢｕ））。
【０１３０】
合成：
一般的に、合成経路は、予めローディングされたリンクアミド樹脂の脱Ｆｍｏｃ、及び、全ての順序について所与の配列に従って所望のＡＡをカップリング／脱保護することから開始される。カップリング試薬はＤＩＣ／ＨＯＢｔであり、反応溶媒はＤＭＦ及びＤＣＭであった。ペプチジル樹脂／ＡＡ／ＤＩＣ／ＨＯＢＴの比は１／４／４／４（mol／mol）であった。カップリングプログラム後、脱Ｆｍｏｃを、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液を使用して実施した。例えば、最後のＡＡが付着するまで０．４mmolの合成を実施した。脱Ｆｍｏｃ後、樹脂をＡｃ２Ｏ／ＤＩＥＡを用いてアセチル化してＮ末端Ａｃ配列を得るか、又はアセチル化せずに樹脂から切断してＮ末端アミン配列を得た。
【０１３１】
Ｆｍｏｃ−リンクアミド樹脂（０．８５ｇ、０．４mmol、置換：０．４７mm/g、ロット番号１１０８１０、CS Bio）を、２５mLの反応容器（ＲＶ）中でＤＭＦ（１０mL）と混合し、１０〜３０分間膨潤させた。ＲＶをＣＳ３３６ペプチド自動合成装置にのせ、アミノ酸を所与のペプチド配列に従ってアミノ酸（ＡＡ）ホイール上にローディングした。ＨＯＢｔ（０．５ＭのＤＭＦ溶液）及びＤＩＣ（０．５ＭのＤＭＦ溶液）を、窒素下で、移すことのできる瓶に別々に全て前以て溶かした。Ｆｍｏｃ−アミノ酸（ＡＡ、４等量）を秤量し、ＡＡホイール上に粉末として予め置いた。例えば、０．４mmolの合成には１．６mmolのＡＡが必要とされた。予め設定されたプログラムはＡＡチューブに溶解しているＡＡから始まり、溶液をＭ−ＶＡからＴ−ＶＡまでポンピングした。ＨＯＢｔ溶液を後にＡＡと混合した。窒素の泡立てを使用して混合させた。ＤＩＣ溶液をＡＡ／ＨＯＢｔ溶液と合わせている間、全混合物を、流した樹脂と共に５分以内にＲＶに移し、カップリングを同時に開始した。３〜６時間振とうした後、反応混合物をろ別し、樹脂をＤＭＦで３回洗浄し、その後、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液を使用して予め設定されたプログラムに従って脱Ｆｍｏｃを行なった。次のＡＡを、同じ経路に従って付着させた。７回の洗浄工程を、脱Ｆｍｏｃ後にＤＭＦ／ＤＣＭを交互に使用して実施した。カップリングプロセスを、最後のＡＡがカップリングされるまで、所与の配列に従ってそれぞれの構築ブロックを用いて繰り返した。カップリング時間：各ＡＡの付着について３〜６時間。
【０１３２】
最後のＡＡの脱Ｆｍｏｃ後、樹脂をＡｃ２Ｏ／ＤＩＥＡのＤＭＦ溶液によってアセチル化したか、又はアセチル化せずに樹脂から切断してＮ末端アミン配列を得た。
【０１３３】
切断：
最後のペプチジル樹脂（１〜１．５ｇ）を、ＴＦＡカクテル（ＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ）と混合し、混合物を室温で４時間振とうした。切断されたペプチドをろ過し、樹脂をＴＦＡによって洗浄した。エーテル沈降及び洗浄後、粗ペプチド（２００〜５００mg）が５０〜９０％の収率で得られた。粗ペプチドは、凍結乾燥することなく直接精製された。
【０１３４】
精製：
粗ペプチド、すなわち２００〜５００mgのアセチル化又は非アセチル化ペプチドを水及びアセトニトリル中の緩衝液Ａ０．１％ＴＦＡに溶解し、ペプチド溶液を分取ＨＰＬＣ精製システムを用いてＣ１８カラム（２インチ）にローディングした。２５〜４０mL/分の流速を用いて、６０分間の勾配でＴＦＡ（０．１％）緩衝液系中で精製を完了させた。予想される分子量を含む画分（ペプチド純度９５％超）を収集した。その後、分取ＨＰＬＣカラムを８０％の緩衝液Ｂによって少なくとも３ボイドカラムボリュームについて洗浄し、次のローディング前に５％の緩衝液Ｂとなるまで平衡化した。
【０１３５】
凍結乾燥：
画分（純度９０％超）を合わせ、液体窒素によって非常に凍結させておいた１Ｌの凍結乾燥瓶に移した。凍結後、瓶を凍結乾燥機（Virtis Freezemobile 35EL）に入れ、一晩乾燥させた。真空は５００mT未満であり、チャンバー温度は−６０℃未満であった。凍結乾燥は室温（環境温度）で１２〜１８時間で完了した。
【０１３６】
結果：
各配列について０．４mmの合成から初めて、合成収率は約５０〜９０％であり、粗生成物の純度は３０〜７０％の範囲であった。精製はＴＦＡ系で実施され、最終収率は各配列について約１０％であった。
【０１３７】
実施例２
Ａｃ−ＩＲＬＱＩＳＮＰＹＬＫＦＩＰＬＫＲＡＩＷＬＩＫ−ＮＨ２（配列番号１３）の合成
上記のペプチドを、固体状態の合成を介して上記の実施例１の通りに［CSBio (Menlo Park, CA, USA)によって］合成した。配列番号１３の具体的な調製において、ＦｍｏｃリンクアミドＭＢＨＡ樹脂を、実施例１の手順に従うことによって固相合成及び精製にかけ、１２５mg（収率：１０．２％；純度：９６．９％）が得られた。Ｃ１４０Ｈ２３０Ｎ３６Ｏ２８についての計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳｍ/ｅ（「計算値」）は２８６５．２０と判明した。
【０１３８】
実施例３
Ａｃ−ＭＩＩＬＩＩＳＦＰＫＨＫＤＷＫＶＩＬＶＫ−ＮＨ２（配列番号１４）の合成
上記のペプチドを、固体状態の合成を介して上記の実施例１の通りに［CSBio (Menlo Park, CA, USA)によって］合成した。配列番号１４の具体的な調製において、ＦｍｏｃリンクアミドＭＢＨＡ樹脂を、実施例５の手順に従うことによって固相合成及び精製にかけ、１１８mg（収率：４．８％；純度：９７．４％）が得られた。Ｃ１２１Ｈ２００Ｎ２８Ｏ２４Ｓについての計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳｍ/ｅ（「計算値」）は２４６３．０６と判明した。
【０１３９】
実施例４
Ａｃ−ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＬＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＡＫＫＲＰＫＰ−ＮＨ２（配列番号４）の合成
上記のペプチドを、固体状態の合成を介して上記の実施例１の通りに［CSBio (Menlo Park, CA, USA)によって］合成した。配列番号４の具体的な調製において、ＦｍｏｃリンクアミドＭＢＨＡ樹脂を、実施例５の手順に従うことによって固相合成及び精製にかけ、１４５mg（収率：９．４％；純度：９５．４％）が得られた。Ｃ１５６Ｈ２４５Ｎ３７Ｏ３５Ｓ２についての計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳｍ/ｅ（「計算値」）は３２６２．６６と判明した。
【０１４０】
実施例５
Ａｃ−ＭＡＮＬＧＹＷＬＡＬＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＦＫＫＲＰＫＰ−ＮＨ２（配列番号５）の合成
上記のペプチドを、固体状態の合成を介して上記の実施例１の通りに［CSBio (Menlo Park, CA, USA)によって］合成した。配列番号５の具体的な調製において、ＦｍｏｃリンクアミドＭＢＨＡ樹脂を、実施例５の手順に従うことによって固相合成及び精製にかけ、１１６mg（収率：７．０％；純度：９６．４％）が得られた。Ｃ１５９Ｈ２４３Ｎ３７Ｏ３５Ｓ２についての計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳｍ/ｅ（「計算値」）は３２９６．４０と判明した。
【０１４１】
実施例６
Ａｃ−ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＹＷＴＤＬＧＬＶＫＫＲＰＫＰ−ＮＨ２（配列番号６）の合成
上記のペプチドを、固体状態の合成を介して上記の実施例１の通りに［CSBio (Menlo Park, CA, USA)によって］合成した。配列番号６の具体的な調製において、ＦｍｏｃリンクアミドＭＢＨＡ樹脂を、実施例５の手順に従うことによって固相合成及び精製にかけ、２１０mg（収率：１４．７％；純度：９７．７％超）が得られた。Ｃ１６０Ｈ２４５Ｎ３７Ｏ３６Ｓについての計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳｍ/ｅ（「計算値」）は３２９４．４０と判明した。
【０１４２】
実施例７
Ａｃ−ＭＡＮＬＧＹＷＬＹＡＬＦＬＴＭＶＴＤＶＧＬＦＫＫＲＰＫＰ−ＮＨ２（配列番号７）の合成
上記のペプチドを、固体状態の合成を介して上記の実施例１の通りに［CSBio (Menlo Park, CA, USA)によって］合成した。配列番号７の具体的な調製において、ＦｍｏｃリンクアミドＭＢＨＡ樹脂を、実施例５の手順に従うことによって固相合成及び精製にかけ、１８９mg（収率：５．８％；純度：９６％超）が得られた。Ｃ１５７Ｈ２４２Ｎ３６Ｏ３６Ｓ２についての計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳｍ/ｅ（「計算値」）は３２７４．２６と判明した。
【０１４３】
実施例８
配列番号８〜１０を有するペプチドは、固体状態の合成を介してHYBio (Shenzhen, China)によって合成された。前記配列のための一般的で例示的な合成法は、以下の通りに記載されている。
【０１４４】
配列番号８〜１０のペプチドは、Ｆｍｏｃ化学反応を使用して合成された。合成は、Ｆｍｏｃ−リンカー−リンクアミド樹脂（０．５ｇ、置換＝０．３mmol/g）を使用して０．１５mmolの規模で実施された。０．５ｇの乾燥樹脂をペプチド合成反応装置のカラム（２０×１５０mm）に入れ、膨潤させ、ＤＭＦで洗浄し、その後、２０％ピペリジンを加え、５分間撹拌し、流し、２０％ピペリジンを加え、７分間撹拌し、ＤＭＦで樹脂を洗浄した。０．７５mmol（５等量）のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、０．７５mmolのＨＯＢｔ、０．７５mmolのＨＢＴＵ及び０．７５mmolのＤＩＰＥＡを反応カラムに加え、その後、窒素と共に２時間かけて穏やかに撹拌した。いくつかの樹脂試料を色試験のために採取し、その後にＦｍｏｃ基を脱保護した。上記の工程を、全てのアミノ酸がカップリングするまで繰り返した。合成終了時に、樹脂を切断のために振とう機上の反応容器に移した。前記ペプチドを、２０．０mLの切断カクテル（ＴＦＡ：ＴＩＳ：Ｈ２Ｏ：ＥＤＴ＝９１：３：３：３（ｖ／ｖ））を使用して１２０分間かけて室温で光を避けながら樹脂から切断した。脱保護溶液を、１０００mLの冷Ｅｔ２Ｏに加えてペプチドを沈降させた。前記ペプチドを２５０mLのポリプロピレンチューブ中で遠心分離にかけた。個々のチューブからの沈降物を１つのチューブに合わせ、冷Ｅｔ２Ｏで３回洗浄し、ハウス真空下のデシケーター中で乾燥させた。
【０１４５】
粗物質を、Ｃ１８カラム（２５０×４６mm、１０μmの粒径）での分取ＨＰＬＣによって精製し、５−９５％のＢ（緩衝液Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；緩衝液Ｂ：ＡＣＮ）の線形勾配で３０分間溶出し、流速は１９mL/分で、検出は２２０nmであった。画分を収集し、定性ＨＰＬＣによって確認した。純粋な生成物を含む画分を合わせ、凍結乾燥して、白色の無定形粉末とした。
【０１４６】
実施例９
Ａｃ−ＫＤＬＭＶＱＷＦＫＤＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２（配列番号８）の合成
上記のペプチドを、固体状態の合成を介して上記の実施例８の通りに［Hybio (Shenzhen, China)によって］合成した。配列番号８の具体的な調製において、Ｆｍｏｃ−リンカー−リンクアミド樹脂を、実施例８の手順に従うことによって固相合成及び精製にかけた（収率：２０％；純度：９５％超）。Ｃ１０１Ｈ１５２Ｎ２６Ｏ３０Ｓ１についての計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳｍ/ｅ（「計算値」）は２２４２．５６と判明した。
【０１４７】
実施例１０
Ａｃ−ＩＲＬＱＩＳＮＰＤＬＫＤＬＭＶＱＷＦＫＤＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２（配列番号９）の合成
上記のペプチドを、固体状態の合成を介して上記の実施例８の通りに［Hybio (Shenzhen, China)によって］合成した。配列番号９の具体的な調製において、Ｆｍｏｃ−リンカー−リンクアミド樹脂を、実施例８の手順に従うことによって固相合成及び精製にかけた（収率：２０％；純度：９５％超）。Ｃ１５２Ｈ２３９Ｎ４１Ｏ４５Ｓ１についての計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳｍ/ｅ（「計算値」）は３３９２．９１と判明した。
【０１４８】
実施例１１
Ａｃ−ＰＦＰＰＬＰＩＧＥＥＡＰＫＤＤＭＶＲＦＦＫＤＬＨＱＹＬＮＶＶ−ＮＨ２（配列番号１０）の合成
上記のペプチドを、固体状態の合成を介して上記の実施例８の通りに［Hybio (Shenzhen, China)によって］合成した。配列番号１０の具体的な調製において、Ｆｍｏｃ−リンカー−リンクアミド樹脂を、実施例８の手順に従うことによって固相合成及び精製にかけた（収率：２０％；純度：９５％超）。Ｃ１６７Ｈ２５０Ｎ４０Ｏ４４Ｓ１についての計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳｍ/ｅ（「計算値」）は３５５４．１６と判明した。
【０１４９】
本発明に記載のＩＲＦ５ツール分子（小分子又はペプチド）あるいはＩＲＦ５に結合及び／又は阻害すると考えられる他の疑われる小分子又はペプチド、前記ツール分子、特に実施例２〜１１に上記した細胞透過性分子の役割を適切に分析するために、生化学的アッセイが必要とされる。ＩＲＦ５の二量体化をターゲティングするツールを生化学的に評価するための直接的なアプローチが当技術分野にはないので、新規なＦＲＥＴに基づいた生化学的アッセイを確立した。本明細書に記載の生化学的アッセイは、ＩＲＦ５の二量体化を阻害するツールを同定する。一般的に、上記の実施例２〜１１に記載された合成ペプチドは、まず生化学的アッセイ（ＦＲＥＴ）で試験され、その後、細胞ベースのアッセイでさらに評価された。使用された最初の細胞ベースのアッセイは、ＴＨＰ１細胞におけるＴＬＲ７／８リガンド（Ｒ８４８）により刺激されたＩＬ６の産生であり、これは、本発明者らがｓｉＲＮＡアプローチを使用してＩＲＦ５に依存すると確認した系であった。化合物の選択性は、ＮＦκＢ移行アッセイにおいて測定され、細胞毒性は、本明細書に記載のアッセイを使用して測定された。本発明者らのデータは、本発明者らが、ツール／ペプチドが生化学的アッセイにおいてＩＲＦ５のホモ二量体化を遮断するかどうかを決定するだけでなく、インビトロにおけるＩＲＦ５の機能を調べることも可能とする新規なツールを開発したことを示す。
【０１５０】
実施例１２  −  図１
ＩＲＦ５の二量体化アッセイ
ＩＲＦ５の二量体化は、ＩＲＦ５の核への移行及び機能にとって重要であると報告されている。ＩＲＦ５の二量体化を阻害する化合物の能力を試験するために、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を開発した。組換えビオチンタグ化ＩＲＦ５への組換えＨｉｓタグ化ＩＲＦ５（２２２−４６７構築物）の結合は、ユーロピウムで標識された抗ＧＳＴ抗体と、ストレプトアビジンにコンジュゲートしたアロフィコシアニンとの間のＦＲＥＴによって測定された。ＩＲＦ５構築物が二量体化する能力は、まず、複数の構築物を使用して決定された（図１）。その後、ＩＲＦ５ Ｓ４３０及びＷＴ（２２２−４６７）構築物を使用して、化合物が二量体化を阻害する能力を試験した。典型的には、試験ペプチド（ＤＭＳＯ中２mMのストック）をＤＭＳＯで３倍に連続希釈し、１ウェルあたり２．５μlを、９６ウェルのポリプロピレンプレート（Corning）に加えた。アッセイ緩衝液（５０mMのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００mMのＮａＣｌ、１mMのＤＴＴ及び０．２mg/mlのＢＳＡ）中１００nMのビオチンタグＩＲＦ５（２２２−４６７、Ｓ４３０Ｄ）及び２５０nMのＨｉｓタグＩＲＦ５（２２２−４６７、Ｓ４３０Ｄ）を１ウェルあたり５０μl加えた。試料を室温で２０分間インキュベーションした。アッセイ緩衝液（ＤＴＴを含まない）中１０nMのユーロピウム（Ｅｕ）にコンジュゲートさせたストレプトアビジン及び８０nMのアロフィコシアニン（ＡＰＣ）のコンジュゲートした抗Ｈｉｓ抗体（Columbia Biosciences）を含む検出溶液を１ウェルあたり１７μl加えた。試料を室温で６０分間インキュベーションし、その後、４０℃で一晩インキュベーションし、１ウェルあたり３０μlを二つ組の３８４ウェルのポリスチレンプレート（Matrix, Thermal Scientific）に移した。アッセイシグナルを、３４０nmにおける励起、並びに６１５nm及び６６５nmにおける発光蛍光をEnvisionリーダーで解読することによってモニタリングした。ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルは、両方のブランク及びドナークロストーク値をアクセプターシグナルから差し引くことによって、アクセプターシグナルとドナーシグナルの比によって計算された（Huang, KS及びVassilev, LT, Methods Enzymol., 399, 717-728 (2005)）。データはエクセルXLfitで処理され、ＩＣ５０値は、非線形曲線フィットアルゴリズムを使用して計算された（４つのパラメーター式）。データは、３回の独立した実験の平均を示し（各々３回行う）、報告されたエラーは標準誤差（s.d.）を示す。このアッセイは、任意の２つの異なるタグタンパク質に使用され得る（例えばＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＳＢＰタグ及びＶ５タグ）。
【０１５１】
このアッセイは、ドナーの蛍光発光スペクトルが、アクセプターの励起スペクトルと重なる限り、任意の蛍光ドナー／アクセプターの対に使用され得る。ドナー／アクセプター色素のいくつかの例は、Ｔｂ／ＦＩＴＣ、Ｒｕ／Ａｌｅｘａ、ＦＩＴＣ／ＴＡＭＲＡ及びＥｕ／ＤｙＬｉｇｈｔである。
【０１５２】
本発明者らは、二量体形成についてはタグタンパク質、検出については蛍光にコンジュゲートした対応する抗体を使用して例を示したが、このアッセイはまた、ドナー色素及びアクセプター色素でタンパク質を直接標識し、ＦＲＥＴシグナルにより二量体形成を測定することによっても実施され得る。このフォーマットは、タグ融合タンパク質又は抗体結合が二量体の相互作用に影響を及ぼすならば特に有用であり得る。
【０１５３】
実施例１３  −  図２
ＩＲＦ５とＦＩＴＣペプチドの結合のＫｄの決定
ＦＩＴＣでタグ化されたＣＰＰの配列番号４〜７及び１３〜１４（ＣＰＰの配列番号４〜７及び１３〜１４のＦＩＴＣ標識形は配列番号１６〜２１として列挙される）がＩＲＦ５に直接結合する能力を、改変されたＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを使用して試験した。Ｈｉｓタグ化組換えＩＲＦ５へのＦＩＴＣ ＣＰＰの結合は、ＦＩＴＣと、テルビウムタグ化抗Ｈｉｓ抗体の間のＦＲＥＴによって測定された。ＤＭＳＯ中４μMのＦＩＴＣペプチド溶液のアリコート（１ウェルあたり１．６μl）を９６ウェルポリプロピレンプレート（Corning）に加えた。アッセイ緩衝液（５０mMのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００mMのＮａＣｌ、１mMのＤＴＴ及び０．２mg/mlのＢＳＡ）中の様々な濃度（０〜１０．５μM、２倍連続希釈）のＨｉｓタグＩＲＦ５（２２２−４２５）を１ウェルあたり３０マイクロリットル（３０μl）、ＦＩＴＣペプチドを含むウェルに加えた。試料を室温で３０分間インキュベーションした。アッセイ緩衝液（ＤＴＴを含まない）中の種々の濃度のＴｂで標識された抗Ｈｉｓ抗体を１ウェルあたり１０マイクロリットル（１０μl）、対応する濃度のＩＲＦ５溶液を含むウェルに加えて、ＩＲＦ５とＴｂの同じ比（１０対１）を維持した。試料を４℃で一晩インキュベーションし、１ウェルあたり１８μlを、同じ容量の二つ組の３８４ウェルのポリスチレンプレート（Corning）に移した。アッセイシグナルを、３４０nmにおける励起、並びに４９５nm及び５２５nmにおける蛍光発光をEnvisionリーダーで解読することによってモニタリングした。ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルを、アッセイ緩衝液からバックグラウンドを差し引いた後、５２５nmにおける蛍光強度から計算した。データをPrismソフトウェア（GraphPad）で処理し、１部位特異的結合アルゴリズムを使用してＫｄを計算した。データは３回の実験の平均を示し（各々３回）、報告された誤差は標準誤差を示す。
【０１５４】
実施例１４  −  図３
ＦＩＴＣでタグ化されたＣＰＰの配列番号１６〜２１の細胞透過性
ＦＩＴＣでタグ化されたＣＰＰが細胞を透過する能力は、共焦点顕微鏡によって決定された。ＨｅＬａ細胞（５×１０３個の/ウェル）を、２時間後及び２４時間後におけるＦＩＴＣの取り込みの分析のために、Whatmanガラス底９６ウェルプレートに蒔いた。翌日、ペプチドを様々な濃度で完全培地（ＲＰＭＩ、１０％血清）に加えた。ペプチド添加から２時間後及び２４時間後、培地を除去し、細胞を５０μL／ウェルの酸性食塩水（ｐＨ３）で３回洗浄し、３７℃の固定液（２．２mLのホルムアルデヒドあたり１９．９mLのハンク／ＨＥＰＥＳ）で１５分間固定し、次いでＰＢＳ中で２回濯いだ。ＦＩＴＣで標識されたペプチド配列番号１６〜２１の細胞取り込みを、自動共焦点顕微鏡によって評価し、拡大率４０倍で画像を得た。
【０１５５】
実施例１５  −  図４
ＡＴＣＣから入手したＴＨＰ−１細胞を、９６ウェルプレート（Corning カタログ番号３３４０）に５０×１０３個の細胞/１００μl/ウェルで播種した。ペプチドをストック溶液としてＤＭＳＯに１０mMで溶解し、その後、水中で１：１０で１mMへと溶解し、よく混合した。Ｒ８４８（Enzoカタログ番号ＡＬＸ−４２０−０３８−Ｍ００５）をＤＭＳＯ（Sigmaカタログ番号Ｄ２６５０）に１０mMで溶解した。５μlのＣＰＰストック（１mM）を９６ウェル細胞プレートに加え、ＣＰＰの最終濃度は５０μMであり、その後、３７℃で３０分間インキュベーションした。Ｒ８４８を最終濃度１０μMで９６ウェル細胞プレートに加え、細胞を３７℃で２４時間インキュベーションした。上清を製造業者の説明書の通りにAlphalisa (Perkin Elmer AL233C)によってＩＬ６について試験した。細胞の生存率をcell titer glo（Promega）によって測定した。
【０１５６】
実施例１６  −  図５ａ〜５ｆ
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康な試験志願者の血液から（ＩＲＢによって認可されたプロトコール及びガイドラインを使用して）フィコール密度に基づいた分離を使用して単離した。精製されたＰＢＭＣを、９６ウェル細胞培養適合プレートに１００×１０３個の細胞／ウェルで播種した。細胞を、様々な濃度のペプチドで３７℃で３０分間前処理し、１μMのＲ８４８を用いて３７℃で一晩刺激した。Ｒ８４８により刺激されたヒトＩＬ−１２ｐ４０の分泌を、ＥＬＩＳＡ（BD (Becton Dickinson)、カタログ番号５５５１７１）を使用して製造業者の説明書に従って測定した。
【０１５７】
実施例１７
ＮＦκＢ移行アッセイプロトコール（結果を表３に示す）
ＮＦκＢに対するＣＰＰの選択性を、ハイコンテントスクリーニングアッセイを使用して決定し、ＴＮＦαにより媒介されるＮＦκＢの核移行は、画像撮影によって決定された。
【０１５８】
ＨｅＬａ細胞を、９６ウェルのPerkin Elmer ViewPlatesに５０００個の細胞／ウェルで蒔き、３７℃で一晩インキュベーションした。培地を吸引し、二つ組の０．０５％ＢＳＡハンクス／２０mMのＨＥＰＥＳ中で予め希釈された化合物を様々な濃度で３０分間かけて加えた。ウェルを、２０μlの１５０ng/mlのＴＮＦαで３７℃、３０分間刺激した。ウェルを吸引し、細胞を、３．７％ホルムアルデヒド溶液を用いて室温で１５分間かけて固定した。固定液を除去し、プレートをＰＢＳで洗浄した。ｐ６５（Thermo-Fisher）に対する抗体の検出に基づいたＮＦκＢ移行アッセイを完了し、４０倍率でPerkin Elmer Operettaで解読した。
【０１５９】
Cell Titer Gloアッセイプロトコール
ペプチドの毒性は、細胞数の代理として細胞内ＡＴＰ含量を測定することによって決定された。簡潔に言えば、９６ウェルのPerkin Elmer ViewPlates中のＨｅＬａの３０００個の細胞／ウェルを３７℃で一晩インキュベーションした。培地を吸引し、増殖培地中で予め希釈された化合物を様々な濃度で２４時間かけて二つ組で加えた。Cell Titer-glo試薬（Promega）を、与えられたプロトコール通りに各ウェルに加えた。細胞を振とう機に２分間入れ、さらに１０分間室温でインキュベーションした。プレートを発光についてPerkin Elmer Envisionプレートリーダーで解読した。
【０１６０】
【表２】
2015534568.tif 000007
【０１６１】
この表は、実施例１２に記載のＦＲＥＴアッセイにおける、ＣＰＰの１３〜１４及び４〜７（配列番号１３〜１４及び４〜７）及びそのＦＩＴＣ標識形（配列番号１６〜２１）の作用強度（ＩＣ５０（μM）、縦３列目及び４列目）を示す。ＦＲＥＴアッセイは、ＩＲＦ５のＳ４３０Ｄリン酸化模倣構築物（２２２−４６７）並びにＷＴ（２２２−４６７）を使用して実施された。ＩＲＦ５に結合しないように設計された対照ＣＰＰ（配列番号２３）は全く親和性を示さない。
【０１６２】
【表３】
2015534568.tif 000008
【０１６３】
この表は、実施例１２に記載のＦＲＥＴアッセイにおける配列番号８〜１０の作用強度（ＩＣ５０（μM）、縦３列目及び４列目）を示す。ＦＲＥＴアッセイは、ＩＲＦ５のＳ４３０Ｄリン酸化模倣構築物（２２２−４６７）並びにＷＴ（２２２−４６７）を使用して実施例１２の手順に従って実施された。
【０１６４】
【表４】
2015534568.tif 000009
【０１６５】
ＮＦκＢに対する選択性アッセイ及び細胞毒性アッセイ（cell titer glo, Promega）における配列番号１３〜１４及び４〜７のデータがこの表に要約されている。試験されたＣＰＰは、ＨｅＬａ細胞におけるＴＮＦαにより誘発されたＮＦκＢの移行を有意に減弱せず、ＮＦκＢに対するＩＲＦ５の特異性が確立された。さらに、試験されたＣＰＰは、ペプチドと共に２４時間インキュベーションした後、ＨｅＬａ細胞において細胞毒性がなかった（細胞毒性は、細胞の４０％超の減少として定義される）。
【図３Ａ】
2015534568.tif 000011
【図３Ｂ】
2015534568.tif 000012
【図１】
2015534568.tif 000013
【図２】
2015534568.tif 000014
【図４】
2015534568.tif 000015
【図５Ａ】
2015534568.tif 000016
【図５Ｂ】
2015534568.tif 000017
【図５Ｃ】
2015534568.tif 000018
【図５Ｄ】
2015534568.tif 000019
【図５Ｅ】
2015534568.tif 000020
【図５Ｆ】
2015534568.tif 000021
【配列表】
2015534568000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年6月23日(2014.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロン制御因子ＩＲＦ５に結合する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ−ＩＲＦ５）であって、前記ペプチドは２０〜４０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列はさらに、一部には、
ａ）Ｉ−ｘ−Ｌ−ｘ−Ｉ−Ｓ−ｘ−Ｐ−ｘ−ｘ−Ｋ（配列番号２５）
（式中、
Ｉはイソロイシンであり、
Ｌはロイシンであり、
Ｓはセリンであり、
Ｐはプロリンであり、
Ｋはリジンであり、
ｘは独立して任意のアミノ酸から選択される）；又は
ｂ）Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ８−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ９（配列番号２４）
（式中、
Ｙはチロシンであり、
Ｒ１は、トリプトファン（Ｗ）又はアラニン（Ａ）の群から選択されたアミノ酸であり、
Ｒ２はロイシン（Ｌ）又はトレオニン（Ｔ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ３はロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、フェニルアラニン（Ｆ）又はチロシン（Ｙ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ８はロイシン（Ｌ）であり、
Ｒ４はロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）又はトレオニン（Ｔ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ５はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）又はメチオニン（Ｍ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ９はバリン（Ｖ）又はロイシン（Ｌ）である）；又は
ｃ）Ｋ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）
（式中、
Ｋはリジンであり、
Ｄはアスパラギン酸であり、
Ｒ６は、ロイシン又はアスパラギン酸からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｍはメチオニンであり、
Ｒ７はグルタミン−トリプトファン（Ｑ−Ｗ）及びアルギニン−フェニルアラニン（Ｒ−Ｆ）からなる群より選択され、
Ｆはフェニルアラニンである）
からなる群より選択されたアミノ酸配列モチーフを含む、前記ペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
前記ペプチドが２０〜４０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列がさらに、一部には、
ａ）Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−Ｒ５−Ｖ（配列番号１）
（式中、
Ｙはチロシンであり、
Ｒ１はトリプトファン（Ｗ）又はアラニン（Ａ）の群から選択されたアミノ酸であり、
Ｒ２はロイシン（Ｌ）又はトレオニン（Ｔ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ３はロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）又はフェニルアラニン（Ｆ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｌはロイシンであり、
Ｒ４はロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）又はトレオニン（Ｔ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｒ５はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）又はメチオニン（Ｍ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｖはバリンである）；又は
ｂ）Ｋ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）
（式中、
Ｋはリジンであり、
Ｄはアスパラギン酸であり、
Ｒ６はロイシン又はアスパラギン酸からなる群より選択されたアミノ酸であり、
Ｍはメチオニンであり、
Ｒ７はグルタミン−トリプトファン（Ｑ−Ｗ）及びアルギニン−フェニルアラニン（Ｒ−Ｆ）からなる群より選択され、
Ｆはフェニルアラニンである）
からなる群より選択されたアミノ酸配列モチーフを含む、請求項１記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
前記ペプチドが、２０〜３５アミノ酸のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列モチーフがＩ−ｘ−Ｌ−ｘ−Ｉ−Ｓ−ｘ−Ｐ−ｘ−ｘ−Ｋ（配列番号２５）であり、ｘは請求項１に定義されている通りである、請求項１及び３のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列モチーフがＹ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ８−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ９（配列番号２４）であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８及びＲ９は請求項１に定義されている通りである、請求項１及び３のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項６】
前記アミノ酸配列モチーフがＹ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−Ｒ５−Ｖ（配列番号１）であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は請求項２に定義されている通りである、請求項１〜３のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項７】
前記アミノ酸配列モチーフがＭＡＮＬＧ−Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−Ｒ５−Ｖ（配列番号３）であり、Ｍはメチオニンであり、Ａはアラニンであり、Ｎはアスパラギンであり、Ｌはロイシンであり、Ｇはグリシンであり、Ｙはチロシンであり、Ｖはバリンであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は請求項１に定義されている通りである、請求項１〜３のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項８】
前記アミノ酸配列モチーフがＭＡＮＬＧ−Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−Ｒ５−Ｖ（配列番号３）であり、Ｍはメチオニンであり、Ａはアラニンであり、Ｎはアスパラギンであり、Ｌはロイシンであり、Ｇはグリシンであり、Ｙはチロシンであり、Ｖはバリンであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は請求項２に定義されている通りである、請求項１〜３のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項９】
前記アミノ酸配列モチーフがＫ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）であり、Ｒ６及びＲ７は請求項２に定義されている通りである、請求項１〜３のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項１０】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である第二のペプチドをさらに含む、請求項１〜９のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項１１】
Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾又はその両方をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項１２】
アセチル化から選択されたＮ末端修飾、アミド化から選択されたＣ末端修飾又はその両方をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチドが、
【化５】
2015534568.tif 000022
からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項１４】
インターフェロン制御因子ＩＲＦ５に結合する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ−ＩＲＦ５）であって、前記ペプチドは、
【化６】
2015534568.tif 000023
からなる群より選択された２０〜４０アミノ酸のアミノ酸配列を含む、前記ペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１５】
前記ペプチドが、配列番号１３：IRLQISNPYLKFIPLKRAIWLIKを含む、請求項１及び３のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド。
【請求項１６】
ａ）試験しようとするペプチドを提供する工程、
ｂ）前記ペプチドを溶液中に希釈する工程、
ｃ）ビオチン−ＩＲＦ５及びＨｉｓ−ＩＲＦ５を含む第一の緩衝溶液を調製する工程（各ＩＲＦ−５は単量体及び二量体の混合物である）、
ｄ）工程ｂ）の希釈されたペプチド溶液を工程ｃ）の緩衝溶液と合わせ、室温でインキュベーションする工程、
ｅ）ビオチン−ＩＲＦ５及びＨｉｓ−ＩＲＦ５の二量体形成の検出のために、蛍光ドナーとしてのＥｕをコンジュゲートさせたストレプトアビジン及び蛍光アクセプターとしてのＡＰＣ（アロフィコシアニン）で標識された抗Ｈｉｓ抗体を含む第二の緩衝溶液を調製する工程、
ｆ）工程ｅ）の第二の緩衝溶液を工程ｄ）の合わせた溶液と合わせ、約４℃で約１日間インキュベーションする工程、
ｇ）ＦＲＥＴアッセイを介して二量体形成を決定する工程（対照群と比較して減少したＦＲＥＴシグナルは、前記ペプチドによるＩＲＦ５二量体形成の阻害を示す）
を含むＩＲＦ５を阻害するペプチドをスクリーニングするための方法。
【請求項１７】
ＦＲＥＴアッセイが、均一な時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイである、請求項１６の方法。
【請求項１８】
ＩＲＦ５が、突然変異体Ｓ４３０Ｄ（２２２−４６７）及び野生型ＩＲＦ５（２２２−４６７）からなる群より選択される、請求項１６の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか記載の１つ以上のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩及び１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
治療的に活性な物質として使用するための、請求項１〜１５のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２１】
ＩＲＦ５シグナル伝達が重要な役割を果たしている全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は他の自己免疫疾病の治療又は予防に使用するための請求項１〜１５のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２２】
ＩＲＦ５シグナル伝達が重要な役割を果たしている全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は他の自己免疫疾病の治療又は予防のための方法であって、前記方法は、請求項１〜１５のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩を被験者に投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
ＩＲＦ５シグナル伝達が重要な役割を果たしている全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は他の自己免疫疾病の治療又は予防のための請求項１〜１５のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項２４】
ＩＲＦ５シグナル伝達が重要な役割を果たしている全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は他の自己免疫疾病の治療又は予防のための医薬品の調製のための、請求項１〜１５のいずれか記載のＣＰＰ−ＩＲＦ５ペプチド又はその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項２５】
ヒトインターフェロン制御因子ＩＲＦ５に結合する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ−ＩＲＦ５）であって、前記ペプチドは配列番号４〜１０及び１３〜１４からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、前記ペプチド。
【請求項２６】
インターフェロン制御因子ＩＲＦ５に結合する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ−ＩＲＦ５）であって、前記ペプチドは少なくとも２０〜約３５アミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列はさらに、一部には、
ａ）Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−Ｒ５−Ｖ（配列番号１）
（式中、Ｙはチロシン（Ｔｙｒ）であり、Ｒ１はトリプトファン（Ｔｒｐ）又はアラニン（Ａｌａ）の群から選択されたアミノ酸であり、Ｒ２はロイシン（Ｌｅｕ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｒ３はロイシン（Ｌｅｕ）、アラニン（Ａｌａ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｌはロイシン（Ｌｅｕ）であり、Ｒ４はロイシン（Ｌｅｕ）、グリシン（Ｇ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｒ５はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）又はメチオニン（Ｍｅｔ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｖはバリン（Ｖａｌ）である）；又は
ｂ）Ｋ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）
（式中、Ｋはリジン（Ｌｙｓ）であり；Ｄはアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、Ｒ６はロイシン（Ｌｅｕ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ）からなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｍはメチオニン（Ｍｅｔ）であり、Ｒ７はＱ−Ｗ及びＲ−Ｆからなる群より選択され、Ｆはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）である）
からなる群より選択されたアミノ酸配列モチーフを含む、前記ペプチド。
【請求項２７】
前記アミノ酸配列モチーフがＭＡＮＬＧ−Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−Ｒ５−Ｖ（配列番号３）である、請求項２６の細胞透過性ペプチド。
【請求項２８】
前記ペプチドが配列番号４〜７からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、請求項２７の細胞透過性ペプチド。
【請求項２９】
前記ペプチドが、配列番号８〜１０からなる群より選択されたアミノ酸配列を含み、さらにアミノ酸配列モチーフがＫ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）である、請求項２６の細胞透過性ペプチド。
【請求項３０】
第一のペプチドは、
ｉ．少なくとも２０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．インターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）への結合能を有し、
ｉｉｉ．かつ第一のペプチドは、一部には、Ｋ−Ｄ−Ｒ６−Ｍ−Ｖ−Ｒ７−Ｆ−Ｋ−Ｄ（配列番号２）のアミノ酸モチーフを含み、
任意選択の第二のペプチドは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である、
第一のポリペプチド及び任意選択の第二のポリペプチドからなる、少なくとも２０から約４０アミノ酸の単離かつ精製されたペプチド。
【請求項３１】
第一のペプチドは、
ｉ．少なくとも２０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．ヒトインターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）への結合能を有し、
ｉｉｉ．かつ第一のペプチドは配列番号８〜１０のアミノ酸配列を含み、
任意選択の第二のペプチドは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である、
第一のポリペプチド及び任意選択の第二のポリペプチドからなる、少なくとも２０から約４０アミノ酸の単離かつ精製されたペプチド。
【請求項３２】
本明細書に記載の本発明。
【国際調査報告】
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