(57)【要約】  複数の細胞型を含む流体サンプルから予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステムは、細胞捕捉流体チップと、動作時において、細胞捕捉流体チップを受容するとともに、細胞捕捉流体チップを実質的に液密シールによって維持するように構成されるチップホルダとを含む。チップホルダは、さらなる処理のために、チップホルダから取り外されるべき細胞捕捉流体チップをさらに解放するように構成される。細胞捕捉流体チップは、基板と、基板上に配置されたレーザマイクロダイセクション膜と、レーザマイクロダイセクション膜上に配置されたチャネル画定層とを含む。レーザマイクロダイセクション膜は、複数の細胞型の中で、予め選択された複数の細胞型を他の複数の細胞型よりも優先的に捕捉するように構成される表面を有する。チャネル画定層は、細胞捕捉流体チップのさらなる処理のために、レーザマイクロダイセクション膜から除去可能である。
2015517825.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細胞型を含む流体サンプルから、予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステムであって、
細胞捕捉流体チップと、
動作時において、前記細胞捕捉流体チップを受容するとともに、実質的に液密シールによって前記細胞捕捉流体チップを維持するチップホルダとを備え、
前記チップホルダは、さらなる処理のために前記チップホルダから取り外されるべき前記細胞捕捉流体チップをさらに解放し、
前記細胞捕捉流体チップは、
基板と、
前記基板上に配置されたレーザマイクロダイセクション膜と、
前記レーザマイクロダイセクション膜上に配置されたチャネル画定層とを備え、
前記レーザマイクロダイセクション膜は、前記複数の細胞型の中で、予め選択された複数の細胞型を、他の複数の細胞型よりも優先的に捕捉する表面を有し、
前記チャネル画定層は、前記細胞捕捉流体チップのさらなる処理のために、前記レーザマイクロダイセクション膜から除去可能であり、
動作時において、前記流体サンプルが、前記レーザマイクロダイセクション膜の前記表面の少なくとも一部の上で、前記チャネル画定層によって画定される流体チャネルを通って流体源から流れるように、前記細胞捕捉流体チップは、前記流体源と接続される流入ポートと、処理された流体を放出する流出ポートとを有する、予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム。
【請求項２】
前記流体チャネルの少なくとも一部が、少なくとも部分的に乱流を発生させるための無秩序な混合構造を有するように、前記チャネル画定層は、前記流体チャネルを画定する、請求項１に記載の予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム。
【請求項３】
前記レーザマイクロダイセクション膜の前記表面は、前記複数の細胞型の中で、予め選択された複数の細胞型を他の複数の細胞型よりも優先的に捕捉するための構造的又は化学的改質の少なくとも１つを有する、請求項１に記載の予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム。
【請求項４】
前記レーザマイクロダイセクション膜の前記表面は、前記複数の細胞型の中で、循環癌細胞（ＣＴＣ）を他の複数の細胞型よりも優先的に捕捉するための化学的改質を含む、請求項３に記載の予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム。
【請求項５】
前記レーザマイクロダイセクション膜の前記表面は、ポリマーを含む、請求項４に記載の予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム。
【請求項６】
前記レーザマイクロダイセクション膜の前記表面の前記ポリマーは、乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）又はキトサン（ポリ−（Ｄ）グルコサミン）の少なくとも１つを含む、請求項５に記載の予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム。
【請求項７】
前記ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む、請求項６に記載の予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム。
【請求項８】
前記ポリマーは、少なくとも部分的にナノ繊維に形成される、請求項５に記載の予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム。
【請求項９】
前記ポリマーは、少なくとも部分的にナノ繊維に形成される、請求項６に記載の予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム。
【請求項１０】
前記ポリマーは、ビオチン又はストレプトアビジン結合の少なくとも１つによって、結合されたＣＴＣ捕捉剤を含む、請求項５から９のいずれか１項に記載の予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム。
【請求項１１】
前記ＣＴＣ捕捉剤は、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１９−９、ＣＤ１４６又はＣＤ１４７抗体の少なくとも１つを含む、請求項１０に記載の予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム。
【請求項１２】
前記レーザマイクロダイセクション膜の前記表面は、前記複数の細胞型の中で、母体血液から胎児の有核赤血球（ｆＮＲＢＣ）を他の複数の細胞型よりも優先的に捕捉するための化学的改質を含む、請求項３に記載の予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム。
【請求項１３】
前記化学的改質は、少なくともＣＤ７１及びＣＤ１４７抗体を、前記レーザマイクロダイセクション膜の前記表面に結合させることを含む、請求項１２に記載の予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム。
【請求項１４】
前記チップホルダによって保存されつつ、前記細胞捕捉流体チップと流体的に接続する流体供給制御部品をさらに備える、請求項１に記載の予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム。
【請求項１５】
前記流体供給制御部品及び前記チップホルダは、前記チップホルダが、前記細胞捕捉流体チップを内部に保持しつつ、前記流体供給制御部品と相互に着脱可能であるように構成される、請求項１４に記載の予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム。
【請求項１６】
前記レーザマイクロダイセクション膜の複数の選択された部分をさらなる処理のために除去するべく、前記レーザマイクロダイセクション膜を複数の選択された部位で切断する波長及びパワーを有するレーザをさらに備える、請求項１に記載の予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム。
【請求項１７】
前記レーザは、紫外線レーザである、請求項１６に記載の予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム。
【請求項１８】
赤外線レーザと、赤外線感受性接着要素とをさらに備え、
前記赤外線感受性接着要素は、前記レーザマイクロダイセクション膜のレーザ切断部分の除去を容易にするべく、前記赤外線感受性接着要素が前記レーザ切断部分に接着するように、前記レーザ切断部分に近接して設けられる、請求項１７に記載の予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム。
【請求項１９】
動作時において、細胞捕捉流体チップを実質的に液密シールにより維持するためのチップホルダであって、
前記細胞捕捉流体チップを内部に受け入れるべく、意図された領域を画定するベース部材と、
前記細胞捕捉流体チップ上に配置される押圧部材と、
動作中に実質的に液密シールを維持するべく、前記ベース部材及び前記押圧部材を共に把持する把持部品とを備え、
前記把持部品は、前記チップホルダからの除去のために、さらに把持を解除することで前記細胞捕捉流体チップを解放する、チップホルダ。
【請求項２０】
前記ベース部材は、選択的に流体供給制御部品と着脱する請求項１９に記載のチップホルダ。
【請求項２１】
ユーザが徐々に圧力を増大させることができる回転固定部品をさらに備える、請求項２０に記載のチップホルダ。
【請求項２２】
前記細胞捕捉流体チップにわたって加わる力を均等にする複数のスプリングをさらに備える、請求項２１に記載のチップホルダ。
【請求項２３】
複数の細胞型を含む流体サンプルから予め選択された複数の細胞型を捕捉するための細胞捕捉流体チップであって、
基板と、
前記基板上に配置されたレーザマイクロダイセクション膜と、
前記レーザマイクロダイセクション膜上に配置されたチャネル画定層とを備え、
前記レーザマイクロダイセクション膜は、前記複数の細胞型の中で、予め選択された複数の細胞型を、他の複数の細胞型よりも優先的に捕捉する表面を有し、
前記チャネル画定層は、前記細胞捕捉流体チップのさらなる処理のために、前記レーザマイクロダイセクション膜から除去可能であり、
前記細胞捕捉流体チップは、動作時において、前記流体サンプルが、前記レーザマイクロダイセクション膜の前記表面の少なくとも一部の上で、前記チャネル画定層によって画定される流体チャネルを通って流体源から流れるように、前記流体源と接続される流入ポートと、処理された流体を放出する流出ポートとを有する、細胞捕捉流体チップ。
【請求項２４】
前記流体チャネルの少なくとも一部が、少なくとも部分的に乱流を発生させるための無秩序な混合構造を有するように、前記チャネル画定層は、前記流体チャネルを画定する、請求項２３に記載の細胞捕捉流体チップ。
【請求項２５】
前記レーザマイクロダイセクション膜の前記表面は、前記複数の細胞型の中で、予め選択された複数の細胞型を他の複数の細胞型よりも優先的に捕捉するための構造的又は化学的改質の少なくとも１つを有する、請求項２３に記載の細胞捕捉流体チップ。
【請求項２６】
前記レーザマイクロダイセクション膜の前記表面は、前記複数の細胞型の中で、循環癌細胞（ＣＴＣ）を他の複数の細胞型よりも優先的に捕捉するための化学的改質を含む、請求項２５に記載の細胞捕捉流体チップ。
【請求項２７】
前記レーザマイクロダイセクション膜の前記表面は、ポリマーを含む、請求項２６に記載の細胞捕捉流体チップ。
【請求項２８】
前記レーザマイクロダイセクション膜の前記表面の前記ポリマーは、乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）又はキトサン（ポリ−（Ｄ）グルコサミン）の少なくとも１つを含む、請求項２７に記載の細胞捕捉流体チップ。
【請求項２９】
前記ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む、請求項２８に記載の細胞捕捉流体チップ。
【請求項３０】
前記ポリマーは、少なくとも部分的にナノ繊維に形成される、請求項２７に記載の細胞捕捉流体チップ。
【請求項３１】
前記ポリマーは、少なくとも部分的にナノ繊維に形成される請求項２８に記載の細胞捕捉流体チップ。
【請求項３２】
前記ポリマーは、ビオチン又はストレプトアビジン結合の少なくとも１つによって、結合されたＣＴＣ捕捉剤を含む、請求項２７から３１のいずれか１項に記載の細胞捕捉流体チップ。
【請求項３３】
前記ＣＴＣ捕捉剤は、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１９−９、ＣＤ１４６又はＣＤ１４７抗体の少なくとも１つを含む、請求項３２に記載の細胞捕捉流体チップ。
【請求項３４】
前記レーザマイクロダイセクション膜の前記表面は、前記複数の細胞型の中で、母体血液から胎児の有核赤血球（ｆＮＲＢＣ）を他の複数の細胞型よりも優先的に捕捉するための化学的改質を含む、請求項２５に記載の細胞捕捉流体チップ。
【請求項３５】
前記化学的改質は、少なくともＣＤ７１及びＣＤ１４７抗体を、前記レーザマイクロダイセクション膜の前記表面に結合させることを含む、請求項３４に記載の細胞捕捉流体チップ。
【請求項３６】
複数の細胞型を含む流体サンプルから、予め選択された複数の細胞型を分離する方法であって、
基板と、
前記基板上に配置されたレーザマイクロダイセクション膜と、
前記レーザマイクロダイセクション膜上に配置されたチャネル画定層とを備える細胞捕捉流体チップを与える段階を含み、
前記レーザマイクロダイセクション膜は、前記複数の細胞型の中で、予め選択された複数の細胞型を、他の複数の細胞型よりも優先的に捕捉する表面を有し、
前記流体サンプルから予め選択された複数の細胞型を捕捉するべく、前記流体サンプルが、前記レーザマイクロダイセクション膜の前記表面の少なくとも一部の上で、前記チャネル画定層によって画定される流体チャネルを通って流れるように、前記流体サンプルを与える段階と、
前記流体サンプルを与える前記段階の後で、前記細胞捕捉流体チップの前記レーザマイクロダイセクション膜及び前記基板から前記チャネル画定層を除去する段階と、
前記チャネル画定層を除去する前記段階の後で、前記流体サンプルから捕捉された予め選択された複数の細胞型を回収するべく、前記細胞捕捉流体チップの前記レーザマイクロダイセクション膜及び前記基板上でレーザマイクロダイセクションを行う段階とをさらに含む、予め選択された複数の細胞型を分離する方法。
【請求項３７】
レーザマイクロダイセクションを行う前記段階は、予め選択された複数の細胞型が結合された前記レーザマイクロダイセクション膜の部位を選択的に切断するべく、紫外線レーザを前記レーザマイクロダイセクション膜に照射することを含む、請求項３６に記載の予め選択された複数の細胞型を分離する方法。
【請求項３８】
前記レーザマイクロダイセクション膜及び前記基板から前記チャネル画定層を除去する前記段階は、液密シールされたチップホルダから前記細胞捕捉流体チップを除去することを含む、請求項３６に記載の予め選択された複数の細胞型を分離する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１２年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６５２，６９０号及び２０１２年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６５２，６８３号に基づく優先権を主張し、これらの全内容を本明細書に援用する。
【技術分野】
【０００２】
現在特許請求の範囲に記載されている本発明の実施形態の分野は、細胞を流体サンプルから分離するためのシステム、方法及び部材に関する。
【０００３】
［関連技術の説明］
患者の癌関連死に最も共通する原因は、固形腫瘍の転移時に発生する。癌転移の分子機構には未知の部分が多いが、悪性進行の最も初期段階で、腫瘍細胞が初期腫瘤から減少することを示す多数の証拠がある(Kaiser, J. Medicine. Cancer's circulation problem. Science 327, 1072-4 (2010); Bernards, R. & Weinberg, R. A. A progression puzzle. Nature 418, 823 (2002); Criscitiello, C, Sotiriou, C. & Ignatiadis, M. Circulating tumor cells and emerging blood biomarkers in breast cancer. Current Opinion in Oncology 22, 552-8 (2010))。これらの「離脱」した癌細胞は、血流に侵入し、転移の細胞起源として体内の異なる組織へと移動する(Pantel, K. & Brakenhoff, R.H. Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer 4, 448-56 (2004))。初期腫瘍から流出した細胞は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）として知られている(Pantel, K. & Alix-Panabieres, C. Circulating tumour cells in cancer patients: challenges and perspectives. Trends in Molecular Medicine 16, 398-406 (2010))。腫瘍状態を判断するための究極の基準は、生検サンプルの病理組織解析によって得られる。初期段階の転移又は再発時には、生検による転移／再発部位の特定は困難である。
【０００４】
ＣＴＣは、腫瘍の「液体細胞診」と見なすことができるため、腫瘍細胞への便利なアクセス及び致命的となり得る転移へのより早期のアクセスを提供する。しかしながら、多数（１０９セル／ｍＬ）の血液細胞の中で、ＣＴＣは非常に希少なため（１ｍＬあたり数個から数百個）、ＣＴＣの検出及び特性評価には、技術的な課題が多い(Racila, E., Euhus, D., Weiss, A.J., Rao, C, McConnell, J., Terstappen, L.W.M.M. & Uhr, J.W. Detection and characterization of carcinoma cells in the blood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 4589-4594 (1998); Zieglschmid, V., Hollmann, C. & Bocher, O. Detection of disseminated tumor cells in peripheral blood. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 42, 155-96 (2005))。治療期間の間のＣＴＣ数値の変化は、固形腫瘍患者の治療結果、無進行生存及び全生存の独立予測因子であるとの知見が認識されている(Cristofanilli, M., Budd, G.T., Ellis, M.J., Stopeck, A., Matera, J., Miller, M.C., Reuben, J.M., Doyle, G.V., Allard, W.J., Terstappen, L.W. & Hayes, D.F. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. The New England journal of medicine 351, 781-91 (2004))。さらに、癌患者から発見されたこれらのＣＴＣの分子解析は、癌患者の有効な治療につながり得る重要なゲノム、プロテオーム又はメタボロミクスの情報を生み出す可能性がある。
【０００５】
ＣＴＣを固定化するために多くの技術が利用可能であるが、これらの技術は、その後の分子及び機能解析（例えば、全ゲノム配列解析、ＲＴ−ＰＣＲ）のために非特異的に捕捉された白血球（ＷＢＣ）のバックグラウンドを使わずにＣＴＣを単離する能力が欠如している。そのため、全血及び／又は他の体液からＣＴＣ等の希少細胞を分離する装置及び方法の改良が、今なお必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の実施形態に係る、複数の細胞型を含む流体サンプルから予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステムは、細胞捕捉流体チップと、動作時において、細胞捕捉流体チップを受容するとともに、実質的に液密シールによって細胞捕捉流体チップを維持するように構成されるチップホルダとを含む。チップホルダは、さらなる処理のために、チップホルダから取り外されるべき細胞捕捉流体チップを解放するようにさらに構成される。細胞捕捉流体チップは、基板と、基板上に配置されたレーザマイクロダイセクション膜と、レーザマイクロダイセクション膜上に配置されたチャネル画定層とを含む。レーザマイクロダイセクション膜は、複数の細胞型の中で、予め選択された複数の細胞型を他の複数の細胞型よりも優先的に捕捉するように構成される表面を有する。チャネル画定層は、細胞捕捉流体チップのさらなる処理のために、レーザマイクロダイセクション膜から除去可能である。細胞捕捉流体チップは、流体源と接続されるように構成される流入ポートと、動作時において、流体サンプルが、レーザマイクロダイセクション膜の表面の少なくとも一部の上で、チャネル画定層によって画定される流体チャネルを通って流体源から流れるように、処理された流体を放出する流出ポートとを有する。
【０００７】
本発明の実施形態に係る、動作時において、細胞捕捉流体チップを実質的に液密シールにより維持するためのチップホルダは、細胞捕捉流体チップを内部に受け入れるべく、意図された領域を画定するベース部材と、細胞捕捉流体チップ上に配置されるように構成される押圧部材と、動作中に実質的に液密シールを維持するべく、ベース部材及び押圧部材を共に把持するように構成される把持部品とを含む。把持部品は、チップホルダからの除去のために、細胞捕捉流体チップを解放するべく把持を解除するようにさらに構成される。
【０００８】
本発明の実施形態に係る、複数の細胞型を含む流体サンプルから予め選択された複数の細胞型を捕捉するための細胞捕捉流体チップは、基板と、基板上に配置されたレーザマイクロダイセクション膜と、レーザマイクロダイセクション膜上に配置されたチャネル画定層とを含む。レーザマイクロダイセクション膜は、複数の細胞型の中で、予め選択された複数の細胞型を他の複数の細胞型よりも優先的に捕捉するように構成される表面を有する。チャネル画定層は、細胞捕捉流体チップのさらなる処理のために、レーザマイクロダイセクション膜から除去可能であり、細胞捕捉流体チップは、動作時において、流体サンプルが、レーザマイクロダイセクション膜の表面の少なくとも一部の上で、チャネル画定層によって画定される流体チャネルを通って流体源から流れるように流体源と接続されるように構成される流入ポートと、処理された流体を放出する流出ポートとを有する。
【０００９】
本発明の実施形態に係る、複数の細胞型を含む流体サンプルから予め選択された複数の細胞型を分離する方法は、基板と、基板上に配置されたレーザマイクロダイセクション膜と、レーザマイクロダイセクション膜上に配置されたチャネル画定層とを含む細胞捕捉流体チップを与える段階を含む。レーザマイクロダイセクション膜は、複数の細胞型の中で、予め選択された複数の細胞型を他の複数の細胞型よりも優先的に捕捉するように構成される表面を有する。方法は、流体サンプルから予め選択された複数の細胞型を捕捉するべく、流体サンプルが、レーザマイクロダイセクション膜の表面の少なくとも一部の上で、チャネル画定層によって画定される流体チャネルを通って流れるように、流体サンプルを与える段階と、流体サンプルを与える段階の後で、細胞捕捉流体チップのレーザマイクロダイセクション膜及び基板からチャネル画定層を除去する段階と、チャネル画定層を除去する段階の後で、流体サンプルから捕捉された予め選択された複数の細胞型を回収するべく、細胞捕捉流体チップのレーザマイクロダイセクション膜及び基板上でレーザマイクロダイセクションを行う段階とをさらに含む。
【００１０】
説明、図面及び例を考慮することで、さらなる目的及び利点が明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の実施形態に係る、複数の細胞型を含む流体サンプルから予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステムを示す。
【００１２】
【図２Ａ】図２Ａは、図１のシステムの斜視図を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図１のシステムの正面図を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、図１のシステムの平面図を示す。
【００１３】
【図３】図３は、本発明の実施形態に係る細胞捕捉流体チップの概略図である。
【００１４】
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の実施形態に係るチップホルダの図である。
【００１５】
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａのチップホルダの他の図であるが、細胞捕捉流体チップを装着する準備ができた構成である。
【００１６】
【図５Ａ】図５Ａは、チップホルダの代替的な実施形態を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、チップホルダの代替的な実施形態を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、チップホルダの代替的な実施形態を示す。
【００１７】
【図６Ａ】図６Ａは、本発明の実施形態の例である、ナノベルクロ（ＮａｎｏＶｅｌｃｒｏ）ＣＴＣチップを通って流れる血液サンプルを補助的に説明する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明の実施形態の例である、重ねられたマイクロ流体無秩序ミキサ及び（エレクトロスピニングされたＰＬＧＡナノ繊維をＬＭＤスライド上に配置することによって調製された）透明なナノベルクロ基板を含む装置を補助的に説明する。
【図６Ｃ】図６Ｃは、本発明の実施形態の例である、水平方向に充填された極めて長い（直径約１００ｎｍの）ＰＬＧＡナノ繊維の形態を示すＳＥＭ画像を補助的に説明する。
【図６Ｄ】図６Ｄは、本発明の実施形態の例である、細胞の単離のために、レーザマイクロダイセクション又はレーザキャプチャマイクロダイセクション器具に結合可能な、固定化されたＣＴＣを有する透明なナノベルクロ基板を補助的に説明する。
【図６Ｅ】図６Ｅは、本発明の実施形態の例である、転移性癌患者から回収された１ｍＬの血液から分離された４５個のＣＴＣを有するナノベルクロＣＴＣチップを補助的に説明する。
【図６Ｆ】図６Ｆは、本発明の実施形態の例である、透明なナノベルクロ基板上に固定化されたＣＴＣを補助的に説明する。
【図６Ｇ】図６Ｇは、本発明の実施形態の例である、ＬＭＤ技術を用いることによって、切断された基板上で単離されたＣＴＣ（挿入図）を補助的に説明する。
【００１８】
【図７】図７は、ａ）透明なナノベルクロ基板に内蔵されたＰＬＧＡナノ繊維にストレプトアビジンコーティングを導入するための共有結合的接合のアプローチ、及びｂ）長期保存及び輸送の便宜のために、ＷＢＣの非特異的な捕捉を抑制するとともに、ナノベルクロ基板の安定性を向上するべく、ナノベルクロ基板に抗生物付着ＰＥＧ基を導入するための、代替的な表面改質アプローチを要約する概略図である。
【００１９】
【図８Ａ】図８Ａは、本発明の実施形態に係る、メラノーマ患者の血液サンプルから捕捉及び単離されたＣＴＣ及びＷＢＣを示す。  ＰＣＲ増幅の後、イントロンにおいてＢＲＡＦＶ６００Ｅの突然変異及びＮＲＡＳの欠失（ＮＲＡＳエクソン２の３７ｂｐ３'、ヌクレオチドＣＣＣＴ欠失）が検出された。ここで、ＷＢＣは、参照サンプル（野生型）として使用された。
【００２０】
【図８Ｂ】図８Ｂは、膵臓癌患者から分離されたＣＴＣを用いたＫＲＡＳの突然変異検出についてのデータを示す。  ＣＴＣ２０個中１９個で、一般に発見されるＫＲＡＳＧ１２Ｖ突然変異が、ＷＢＣでは野生型ＫＲＡＳが検出された。単一のＣＴＣにおけるＢＲＡＦＶ６００Ｅ（メラノーマ）及びＫＲＡＳＧ１２Ｖ（膵臓癌）の突然変異の両方について得られたサンガーシーケンスデータが強い信号対雑音比を示したことは、注目に値する。
【００２１】
【図９】図９は、転移性メラノーマ患者から回収され、１か月を超えて液体窒素中で保存された凍結保存ＰＢＭＣ臨床サンプルから、ナノベルクロチップによって分離されたＣＴＣ（赤及び青のポジティブ）及びＷＢＣ（緑及び青のポジティブ）を示す。  このＰＢＭＣサンプルから分離されたＣＴＣ数値は、処理されたばかりの血液サンプルから観察されたものと非常に近似している。さらに、これらのＣＴＣにおける表面マーカの形態及び蛍光強度は、蛍光免疫染色に関して元の状態を維持する。
【００２２】
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＡｒｃｔｕｒｕｓＸＴＴＭレーザキャプチャマイクロダイセクション（ＬＣＭ）システムを用いたＣＴＣ分離の処理、ｉ）ＣＴＣ特定、ｉｉ）ＩＲ粘着性の指の位置（sticky finger positions）及びＵＶ切断経路の決定、ｉｉｉ）ＵＶレーザ切断、ｉｖ）ＬＣＭキャップ上で固定化された分離ＣＴＣを記録した顕微鏡画像を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、エクソン領域のシーケンスが網羅する領域を表すＣｉｒｃｏｓプロットを示す。  エクソン領域濃縮キットで捕捉された領域の中のシーケンス領域を示す各ドットにより、輪の内側からＷＢＣ、プールＣＴＣ、ＣＴＣ−１及びＣＴＣ−２を示す。最も外側の輪は、赤いセントロメア領域によりヒト参照ゲノム（ｈｇ１９）を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＣＴＣ（ＣＴＣｐ＝プールＣＴＣ）中での共有突然変異と比べたＣＴＣ及びＷＢＣの間での共有突然変異を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態が、以下に詳述される。実施形態を説明するにあたり、明瞭化のために、特定の用語が使用される。しかしながら、本発明は、ここで選択された特定の用語に限定されることを意図するものではない。他の均等な部材が使用されうること、及び他の方法が本発明の広範な概念から逸脱することなく開発され得ることは、当業者であれば、理解されるであろう。背景技術及び詳細な説明の部分を含む本明細書のいずれかの部分において引用された全ての参照文献は、各文献が個別に組み込まれるものとして援用される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態は、ポリマー内蔵マイクロ流体装置上でＣＴＣ細胞を固定化するシステム及び方法を提供する。本発明は、例えば、その後の分子解析のためにＣＴＣを単離するべく、レーザマイクロダイセクション（ＬＭＤ）又はレーザキャプチャマイクロダイセクション（ＬＣＭＤ）技術を用いることをさらに含んでもよい。本発明は、例えば、病院で患者をモニタリングするために、製薬会社が患者における薬剤の有効性を研究するために、学術研究所の研究目的のために、有用となり得る。
【００２５】
図１は、複数の細胞型を含む流体サンプルから予め選択された複数の細胞型を分離するためのシステム１００の図を示す。図２Ａ―２Ｃは、システム１００の追加の図を示す。システム１００は、細胞捕捉流体チップ１０２（図３）と、動作時において、細胞捕捉流体チップ１０２を受容するとともに、実質的に液密シールによって細胞捕捉流体チップを維持するように構成されるチップホルダ１０４（さらに図４を参照）とを含む。チップホルダ１０４は、さらなる処理のためにチップホルダ１０４から除去されるべく、細胞捕捉流体チップ１０２を解放するようにさらに構成される。
【００２６】
システム１００は、第２のチップホルダ１０５をさらに有する。しかしながら、本発明の概念は、あらゆる特定の数のチップホルダを備えるシステムに限定されるものではない。本発明の様々な実施形態によれば、１、２、３、４又はそれ以上のチップホルダを備えることができる。細胞捕捉流体チップ１０２（図３）は、基板１０６と、基板１０６上に配置されたレーザマイクロダイセクション膜１０８と、レーザマイクロダイセクション膜１０８上に配置されたチャネル画定層１１０とを含む。レーザマイクロダイセクション膜１０８は、単一の材料層であってもよく、又は、２又はそれ以上の層を有してもよい。いくつかの実施形態において、レーザマイクロダイセクション膜１０８は、１又は複数の材料層であるか否かに関わらず、複数の細胞型の中で、予め選択された複数の細胞型を、他の複数の細胞型よりも優先的に捕捉するように構成される表面１１１を有する。チャネル画定層１１０は、細胞捕捉流体チップ１０２のさらなる処理のために、レーザマイクロダイセクション膜１０８から除去可能である。
【００２７】
図３の例において、細胞捕捉流体チップ１０２は、ガラス基板１０６を有する。しかしながら、本発明は、ガラス基板のみに限定されるものではない。さらに、本発明のいくつかの実施形態によれば、ガラス基板及びレーザマイクロダイセクション膜を有する従来的なレーザマイクロダイセクションスライドを用いることができる。本事例において、上面（基板から離れる）は、改質されてもよく、及び／又は、１又は複数の材料層は、望ましいレーザマイクロダイセクション膜１０８の表面１１１を与えるべく、上面に配置されてもよい。しかしながら、本発明の広範な概念は、この例に限定されるものではない。
【００２８】
細胞捕捉流体チップ１０２は、流体源（１１４、１１６、１１８及び／又は１２０）と接続されるように構成される流入ポート１１２と、動作時において、流体サンプルが、レーザマイクロダイセクション膜１０８の表面１１１の少なくとも一部の上で、チャネル画定層１１０によって画定される流体チャネル１２４を通って流体源から流れるように、処理された流体を放出する流出ポート１２２とを有する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、チャネル画定層１１０は、これに限定されるものではないが、レーザマイクロダイセクション膜１０８の表面１１１と接触するべく、下方に開口を有する流体チャネル１２４を有するＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）層であってもよい。流体チャネル１２４は、例えば、チャネルの有効長を増大させ、かつ、例えば、表面１１１の利用効率を向上させるべく、蛇行するチャネルであってもよい。チャネル画定層１１０がチップホルダ１０４によって共に押圧されると、サンプルからの流体が流体チャネル１２４を通って流れ、サンプル流体を表面１１１と接触させるべく露出させるように、液密シールが形成される。流体チャネル１２４は、層流を回避するべく、乱流（無秩序ミキサともいう）を発生させる構造を有してもよい。これにより、予め選択された複数の細胞型が表面１１１と接触する可能性が増大する。いくつかの実施形態において、チャネル画定層１１０は、厚さ約５０μｍから５００ｎｍ等の、厚いＰＤＭＳ構造であってもよい。いくつかの実施形態において、チャネル画定層１１０は、流体チャネル１２４を通って流れる流体の観察及び／又は測定が容易となるべく、可視光に対して実質的に透明であってもよい。
【００３０】
レーザマイクロダイセクション膜１０８は、複数の細胞型の中で、予め選択された複数の細胞型を他の複数の細胞型よりも優先的に捕捉するための構造的又は化学的改質の少なくとも１つを有する。いくつかの実施形態において、レーザマイクロダイセクション膜１０８の表面１１１は、複数の細胞型の中で、循環癌細胞（ＣＴＣ）を他の複数の細胞型よりも優先的に捕捉するための化学的改質を含んでもよい。いくつかの実施形態において、レーザマイクロダイセクション膜１０８の表面１１１は、ポリマーを含んでもよい。ポリマーは、レーザマイクロダイセクション層上に配置されてもよく、及び／又は、レーザマイクロダイセクション層の一部であってもよい。いくつかの実施形態において、表面１１１のポリマー乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）又はキトサン（ポリ−（Ｄ）グルコサミン）の少なくとも１つを含んでもよい。いくつかの実施形態において、表面１１１のポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含んでもよい。
【００３１】
いくつかの実施形態において、表面１１１は、ナノ構造表面であってもよい。ナノ構造という用語は、ナノ繊維、ナノワイヤ、ナノ粒子、ナノピラー、ナノディスク及び表面１１１に結合し、配置され、又は一体化される他の同様の構造等の構造を含むことを意図するものである。ナノ構造という用語は、いくつかの実施形態において１μｍ未満、いくつかの実施形態において５００ｎｍ未満、いくつかの実施形態において３００ｎｍ未満、いくつかの実施形態において２００ｎｍ未満、及び約１ｎｍ以上である、少なくとも２の直交する面を有する構造を含むことを意図するものである。例えば、ナノ繊維、ナノワイヤ及びナノピラーは、１０μｍを超える長さ、いくつかの事例では１μｍを大きく超える長さを有してもよく、ただし、これらの断面寸法はナノスケールである。
【００３２】
いくつかの実施形態において、表面１１１は、表面上に配置されたポリマーナノ繊維を含んでもよい。ポリマーナノ繊維は、例えば、エレクトロスピニング又はナノインプリンティングによって表面１１１の少なくとも一部として形成されてもよい。しかしながら、本発明の広範な概念は、これらの例に限定されるものではない。
【００３３】
いくつかの実施形態において、表面１１１は、例えば、ポリマーコーティングに結合された少なくとも１つのＣＴＣ捕捉剤を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＣＴＣ捕捉剤は、例えば、ビオチン又はストレプトアビジン結合の少なくとも１つによって、ポリマーコーティングに結合されてもよい。ＣＴＣ捕捉剤は、これに限定されるものではないが、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１９−９、ＣＤ１４６又はＣＤ１４７抗体の少なくとも１つを含んでもよい。
【００３４】
いくつかの実施形態において、表面１１１は、前記複数の細胞型の中で、母体血液からの胎児の有核赤血球（ｆＮＲＢＣ）を他の複数の細胞型よりも優先的に捕捉するための化学的改質を有してもよい。化学的改質は、少なくともＣＤ７１及びＣＤ１４７抗体を表面１１１に結合させることを含んでもよい。
【００３５】
いくつかの実施形態において、システム１００は、例えば、体液及び解離された組織から希少細胞を分離するために用いられてもよい。抗ＥｐＣＡＭがポリマー基板上に移植される場合、基板は、例えば、転移性乳癌患者の腹水から回収された乳癌細胞を捕捉するために使用されてもよい。抗ＣＡ１９−９がポリマー基板に移植される場合、基板は、例えば、解離膵臓癌組織（癌細胞の約１０％及び間質細胞の９０％を含む）から膵臓癌細胞を捕捉するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、膵臓癌細胞は、その後の分子及び機能解析のために、単離されてもよい。多剤抗体試薬（例えば、抗ＣＤ７１及び抗ＣＤ１４７）がポリマー基板に移植される場合、基板は、例えば、妊娠６から１５週の母体血液から胎児の有核赤血球（ｆＮＲＢＣ）を捕捉するために使用されてもよい。繰り返すと、ｆＮＲＢＣは、下流解析のために、例えば、ＬＣＭ技術によって単離されてもよい。しかしながら、本発明の広範な概念は、これらの例に限定されるものではない。
【００３６】
いくつかの実施形態において、システム１００は、チップホルダ１０４によって保持されつつ、細胞捕捉流体チップ１０２と流体的に接続されるように構成される流体供給制御部品１２２をさらに含んでもよい。流体供給制御部品１２２は、例えば、流体源１１４、１１６、１１８及び／又は１２０を含んでもよい。いくつかの実施形態において、流体供給制御部品１２２は、廃棄容器１２４等の、１又は複数の廃棄容器をさらに含んでもよい。チップホルダ１０４（又は、並行して使用するために望ましい数に応じて、複数のホルダ）は、処理及び取り扱いを容易とするべく、チップホルダ１０４と着脱可能な流体供給制御部品１２２と共にさらに構成されてもよい。
【００３７】
いくつかの実施形態において、流体供給制御部品１２２は、表面１１１上で血液サンプルから希少細胞を捕捉するために、非常に効率的な血液処理装置であってもよい。しかしながら、他の流体サンプルを用いてもよい。いくつかの実施形態において、流体供給制御部品１２２は、チップホルダ１０４における流体サンプルの漏れ、正確な充填及び流れ、及び固定化細胞のレーザマイクロダイセクション膜１０８の表面１１１上における固定を試験するために用いる等の、いくつかの機能をさらに有してもよい。流体供給制御部品１２２の部材は、例えば、２つの８バルブ型ハミルトンＰＳＤ／３シリンジポンプ、４つの上部充填型貯留槽（１１４、１１６、１１８、１２０）、２つの血液サンプル充填用１ｍＬシリンジチューブ、２つの廃棄容器、医療用グレードのバルブコネクタ及びプラスチック管を含んでもよい。しかしながら、本発明の広範な概念は、この例に限定されるものではない。いくつかの実施形態において、流体供給制御部品１２２は、小さい設置面積でありつつ研究台の上部に適合するような寸法を有してもよい。流体供給制御部品１２２のいくつかの利点は、希少細胞の分離の自動化及び血液の取り扱いからのヒューマンエラーの回避を含んでもよい。
【００３８】
図４Ａは、チップホルダ１０４のさらに詳細な図を示す。細胞捕捉流体チップ１０２は、チップホルダ１０４内に装着及び把持された状態で示される。チップホルダは、装置を通って流体サンプルを流す場合に確実に漏れを防止するべく、レーザマイクロダイセクション膜１０８に対してチャネル画定層１１０を均等に押下するように特に設計されている。
【００３９】
チップホルダ１０４は、圧力が徐々に増大し、他の機構が必要とするほどの多くの力を、ユーザが加える必要がないように、回転固定機構１２５を有する。細胞捕捉流体チップ１０２が内部に装着されたチップホルダ１０４の流入口及び流出口も、ユーザに使いやすいように設計されている。流入口及び流出口（１２６、１２８）は、補助コネクタチューブを回すことによって、流体供給制御部品１２２にシールされている。他の実施形態は、コネクタチューブを装置に突出させることを必要とする。さらに、チップホルダ１０４は、チャネル画定層１１０をレーザマイクロダイセクション膜１０８上に正確に配置するべく、位置合わせマーカも含んでもよい。チップホルダ１０４は、チップホルダ１０４の上部部品１３０を底部部品１３４のレール（１３２、１３３）に沿ってスライドさせ、労力をほとんど費やすことなく組み立てられるように、スラインドイン機構を有する。チップホルダ１０４は、チャネル画定層１１０及びレーザマイクロダイセクション膜１０８の間に密なシールが確実に形成されるべく、チャネル画定層１１０の角で押下する４つのスプリング部品（１３６、１３８、１４０、１４２）をさらに有する。
【００４０】
図４Ｂは、図４Ａのチップホルダを示すが、細胞捕捉流体チップ１０２を装着するための構成として、上部及び底部が取り除かれている。この例において、細胞捕捉流体チップ１０２は、ナノベルクロチップと称される。いくつかの実施形態において、チップホルダ１０４は、一度チップホルダ１０４が組み立てられると、操作者が誤ってぶつけても解体されないことを確実にする安全ラッチを有してもよい。底部部品１３４は、ナノベルクロ基板に適合するように特に設計される刻み目をさらに有するとともに、チャネル画定層１１０をナノベルクロ基板上で正確に位置合わせするべく、幅の広い刻み目を有する。上部部品は、ナノベルクロ基板との間で密な漏れ防止シールを確実に形成するべく、スプリングが装着されたねじからチャネル画定層１１０へと等しい圧力がゆっくりと加わるねじ込み機構を用いる。さらに、上部部品１３０は、チップホルダ１０４を流体供給制御部品１２２と迅速に接続させるべく、ニードルロックを利用するコネクタチューブも有してもよい。
【００４１】
図５Ａから５Ｃは、チップホルダ１０４の代替的な実施形態（それぞれ、２０４、３０４、４０４）の図である。しかしながら、チップホルダ２０４では、ユーザは、装置が適切にシールされることを確実にするようにねじを固く締めるために、大きな力を加える必要がある。チップホルダ３０４は、チップホルダ２０４ほどの力を必要としないクリックオン固定機構を有するが、クリック機構は、突然の瞬間的な圧力を加えるためにより、レーザマイクロダイセクション膜１０８及び／又は基板１０６を破損することがある。チップホルダ４０４は、チップホルダ１０４と同様であるが、流体供給制御部品１２２と接続するための改良された流入口及び流出口（１２６、１２８）を含まない。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態は、例えば、赤外線及び／又は紫外線レーザ等の従来的なレーザマイクロダイセクション部材を含んでもよい。
【実施例】
【００４３】
以下の実施例は、本発明のいくつかの概念を補助的に説明するものである。しかしながら、本発明の全般的な概念は、特定の実施例に限定されるものではない。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、その後のＣＴＣの単離のために、レーザマイクロダイセクション器具（すなわち、切断用高出力ＵＶ内蔵レーザの利用）又はレーザキャプチャマイクロダイセクション（すなわち、細胞部材の生体分子の完全性を保持するゲルに、細胞を徐々に埋め込むための固体ＩＲレーザの利用）のいずれか、もしくはこれらの組合せにより、ＣＴＣをポリマー基板上に固定化することができる。現在、その後の分子解析のために、高い効率かつ良好な細胞生存率でＣＴＣの固定化及び分離の両方を達成することができる既存のシステム及び方法はない。本発明のいくつかの実施形態によれば、医師は、例えば、治療の間にＣＴＣを癌患者から回収することにより、腫瘍の進行／進展を動的に記録することができる。腫瘍が薬剤耐性を獲得する過程について、遺伝／転写レベルで詳細な理解及び知識を得ることにより、癌の増殖を抑制するために、より良い薬剤を設計するための識見を得ることができる。
【００４５】
［ＣＴＣのポリマー基板上での固定化］ＣＴＣは、（部分的にはＣＴＣの捕捉性能により）微量しか発見されないことが多く、（ＷＢＣの非特異的な捕捉により）サンプルの純度が低いため、分子解析アプローチでの用途（例えば、シーケンシング及びＲＴ−ＰＣＲ）が限定される。
【００４６】
図６Ａから６Ｃは、本発明の実施形態の実施例を示す。この例において、レーザマイクロダイセクション膜１０８及び基板１０６は、透明なナノベルクロ基板と称される。透明なナノベルクロ基板は、エレクトロスピニングによる乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ポリマーを基礎とし、ＣＴＣの固定化に用いることができるナノ繊維を有する（図６Ｂ及び６Ｃ参照）。結合の化学的性質を用いることにより(Wang, S., Wang, H., Jiao, J., Chen, K.J., Owens, G.E., Kamei, K., Sun, J., Sherman, D.J., Behrenbruch, CP., Wu, H. & Tseng, H.R. Three-dimensional nanostructured substrates toward efficient capture of circulating tumor cells. Angewandte Chemie International Edition 48, 8970-3 (2009); Sekine, J., Luo, S.C., Wang, S., Zhu, B., Tseng, H. R. & Yu, H. H. Functionalized conducting polymer nanodots for enhanced cell capturing: the synergistic effect of capture agents and nanostructures. Advanced Materials 23, 4788-92 (2011))、癌の特定の捕捉剤を、極めて高い効率性で全血サンプルからＣＴＣを捕捉するべく、透明なナノベルクロ基板上に導入してもよい。透明なナノベルクロ基板上で固定化された細胞を並行して染色するための３色のＩＣＣプロトコルにより、ＷＢＣ及び他の細胞の破片のバックグラウンド（図６Ｅ及び６Ｆ参照）から明確にＣＴＣを特定することができる。
【００４７】
［ポリマー濃縮評価］透明なナノベルクロ基板は、文献で報告されているように、エレクトロスピニング設定を用いて、ＰＬＧＡナノ繊維をＬＭＤ膜のスライド上に配置することによって調製される(Zhang, N., Deng, Y., Tai, Q., Cheng, B., Zhao, L., Shen, Q., He, R., Hong, L., Liu, W., Guo, S., Liu, K., Tseng, H.-R., Xiong, B. & Zhao, X.-Z. Electrospun Ti02 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients. Advanced Materials 24, in press (2012); Li, D., Wang, Y.L. & Xia, Y.N. Electrospinning of polymeric and ceramic nanofibers as uniaxially aligned arrays. Nano Letters 3, 1167-1171 (2003))。処理は、始めにアセトニトリルに５％ＰＬＧＡポリマー溶液を調製し、次にエレクトロスピニングのために、ＰＬＧＡポリマー溶液をステンレス鋼の針の中に配置する。エレクトロスピニング配置中に、ＰＬＧＡポリマー溶液がシリンジポンプを介して注入され、高電圧ＤＣパワーが、針と、ＬＭＤ膜のスライドの後ろに位置する金属基板との間に加えられる。ＰＬＧＡナノ繊維の配置のための時間を制御することによって、ＬＭＤ膜のスライド上におけるナノ繊維密度が制御されてもよい。一連の研究を通して(Sekine, J., Luo, S.C., Wang, S., Zhu, B., Tseng, H.R. & Yu, H.H. Functionalized conducting polymer nanodots for enhanced cell capturing: the synergistic effect of capture agents and nanostructures. Advanced Materials 23, 4788-92 (2011))、１０分間の配置時間により、最適なＣＴＣ捕捉性能の実現に適した密度の、水平方向に充填された極めて長いＰＬＧＡナノ繊維が得られることが特定された(Zhang, N., Deng, Y., Tai, Q., Cheng, B., Zhao, L., Shen, Q., He, R., Hong, L., Liu, W., Guo, S., Liu, K., Tseng, H.-R., Xiong, B. & Zhao, X.-Z. Electrospun Ti02 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients. Advanced Materials 24, in press (2012))。表面の化学的性質（すなわち、ＰＬＧＡナノ繊維上へのストレプトアビジンの直接結合）は、先述の手順の後で行われる(Wang, S., Wang, H., Jiao, J., Chen, K.J., Owens, G.E., Kamei, K., Sun, J., Sherman, D.J., Behrenbruch, CP., Wu, H. & Tseng, H.R. Three-dimensional nanostructured substrates toward efficient capture of circulating tumor cells. Angewandte Chemie International Edition 48, 8970-3 (2009) 33)（すなわち、図７参照）。
【００４８】
［レーザマイクロダイセクション及びレーザキャプチャマイクロダイセクション技術］本発明の実施形態に係る我々のレーザマイクロダイセクション技術は、具体的に特定されたＣＴＣを透明なナノベルクロ基板から分離するためにＵＶレーザを用いる。レーザがＣＴＣを含む領域を切断した後、ＣＴＣは、重力の働きにより、小さい容積のチューブに落下する。つまり、この方法は、迅速で信頼性が高く、非接触で汚染されることのないＣＴＣ回収方法を提供する。レーザキャプチャマイクロダイセクション技術は、ＣＴＣのみをゲルのキャップ上で徐々に捕捉するべく、固体ＩＲレーザを利用する。つまり、この捕捉方法は、ＣＴＣの生体分子の完全性を保護することができる緩やかなアプローチである。最後に、レーザマイクロダイセクション及びレーザキャプチャマイクロダイセクション技術は、両立する方法、つまり、必要に応じて共に用いることができる
【００４９】
追加の実施例及びデータは、全内容が参照により本明細書に組み込まれるS. Hou, Q. Shen, L. Zhao, J. Yu, C. Ng, X. Kong, D. Wu, M. Song, X. Shi, X. Xu, W. -H. OuYang, R. He, X.-Z. Zhao, B. Xiong, T. Lee, C. Brunicardi, M. A. Garcia, A. Ribas, R. S. Lo, H.-R. Tseng (2013) Polymer Nanofiber-Embedded Microchips for Detection, Isolation, and Molecular Analysis of Single Circulating Melanoma Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 52: 3379-3383. (Internal Cover Highlight); and L. Zhao, Y.-T. Lu, F. Li, K. Wu, S. Hou, J. Yu, Q. Shen, D. Wu, M. Song, W. -H. OuYang, Z. Luo, T. Lee, C. Shao, X. Xu, M. A. Garcia, L. W. K. Chung, M. Rettig, H. -R. Tseng, E. M. Posadas (2013) High-Purity Prostate Circulating Tumor Cell Isolation by a Polymer Nanofiber-Embedded Microchip for Whole Exome Sequencing, Adv. Mater. 25: in press. (Internal Cover Highlight)に記載されている。
【００５０】
［単一のＣＴＣにおけるシーケンシング点突然変異］透明なナノベルクロ基板アプローチを用いることにより、メラノーマ患者から（ＷＢＣによって汚染されることなく）１２のＣＴＣが単離され、各ＣＴＣは順に、分子解析のために５００−μΕエッペンドルフチューブに移された。ＢＲＡＦｖ６００Ｅ突然変異及びＮＲＡＳの欠失がこれらの単離ＣＴＣにおいて見られたことを確認するべく（図８）、ＰＣＲ及びエクソン領域シーケンシングが、これらのＣＴＣに実行された。さらに面白いことに、これらの突然変異は、同じ患者の生検組織で観察された。
【００５１】
［バイオバンクでの適用のための循環腫瘍細胞の保存方法］［循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）(Pantel, K. & Alix-Panabieres, C. Circulating tumour cells in cancer patients: challenges and perspectives. Trends in Molecular Medicine 16, 398-406 (2010).)］患者の癌関連死に最も共通する原因は、固形腫瘍の転移時に発生する。癌転移の分子機構には未知の部分が多いが、悪性進行の最も初期段階で、腫瘍細胞が初期腫瘤から減少することを示す多数の証拠がある(Kaiser, J. Medicine. Cancer's circulation problem. Science 327, 1072-4 (2010); Bernards, R. & Weinberg, R. A. A progression puzzle. Nature 418, 823 (2002); Criscitiello, C, Sotiriou, C. & Ignatiadis, M. Circulating tumor cells and emerging blood biomarkers in breast cancer. Current Opinion in Oncology 22, 552-8 (2010))。これらの「離脱」した癌細胞は、血流に侵入し、転移の細胞起源として体内の異なる組織へと移動する(Pantel, K. & Brakenhoff, R.H. Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer 4, 448-56 (2004))。初期腫瘍から流出した細胞は、ＣＴＣとして知られている。腫瘍状態を判断するための究極の基準は、生検サンプルの病理組織解析による。初期段階の転移又は再発時には、生検による転移／再発部位の特定は困難である。
【００５２】
ＣＴＣは、腫瘍の「液体細胞診」と見なすことができるため、腫瘍細胞への便利なアクセス及び致命的となり得る転移への早期のアクセスを提供する。しかしながら、多数（１０９セル／ｍＬ）の血液細胞の中で、ＣＴＣは非常に希少なため（１ｍＬあたり数個から数百個）、ＣＴＣの検出及び特性評価には、技術的な課題が多い(Racila, E., Euhus, D., Weiss, A.J., Rao, C, McConnell, J., Terstappen, L.W.M.M. & Uhr, J.W. Detection and characterization of carcinoma cells in the blood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 4589-4594 (1998); Zieglschmid, V., Hollmann, C. & Bocher, O. Detection of disseminated tumor cells in peripheral blood. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 42, 155-96 (2005))。治療期間の間のＣＴＣ数値の変化は、固形腫瘍患者の治療結果、無進行生存及び全生存の独立予測因子であるとの知見が認識されている(Tan, S.J., Yobas, L., Lee, G.Y., Ong, C.N. & Lim, C.T. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomedical Microdevices 11, 883-92 (2009))。さらに、癌患者から発見されたこれらのＣＴＣの分子解析は、癌患者の有効な治療につながり得る重要なゲノム、プロテオーム又はメタボロミクスの情報を生み出す可能性がある。末梢血から得ることができるＣＴＣは、癌の進行の異なる段階を記録することにより、疾病関連の開発をより理解し、新しい治療アプローチの開発を容易にするために、簡便かつ最も低侵襲性のアプローチを構成する。ＣＴＣが回収され、ＣＴＣバンクで保存され得る場合、研究者は、過去に遡って、疾病の異なる進展段階において、ＣＴＣを解析することができる。
【００５３】
多くの組織バンクアプローチが確立されてきたが、ＣＴＣについて示されたこのようなプロトコル及び概念はない。
【００５４】
本発明の実施形態は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を保存し、癌患者からの採血のみを必要とするため、最も低侵襲性である。ＣＴＣへのアクセスは、腫瘤の状態の観察手段を提供し、生検を実行する必要性を打ち消すことができる。つまり、これらのＣＴＣを治療の間に患者から回収することにより、腫瘍の進行／進展を動的に記録することができる。理想的には、腫瘍が薬剤耐性を獲得する過程について、遺伝／転写レベルで詳細な理解及び知識を得ることにより、癌の増殖抑制のためにより良い薬剤を設計するための識見を得ることができる。
【００５５】
ＣＴＣは、癌患者から回収された血液サンプル中に存在する。ＣＴＣ貯蔵への最も直接的なアプローチは、全血を貯蔵することである。しかしながら、所定の血液保存は、クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）、クエン酸−リン酸−デキストロース（ＣＰＤ）又はクエン酸−リン酸−デキストロース２デキストロース（ＣＰ２Ｄ）で処理された場合に、１から６℃で２１日に限定されている。保存は、クエン酸−リン酸−デキストロース−アデニン（ＣＰＤＡ１）で処理され、かつ冷蔵保存される場合は、３５日まで延長することができる（ＷＢＣの場合５週、ＲＢＣの場合６週）。また、ＷＢＣがＣＴＣを攻撃し、ＣＴＣの寿命が短くなることが懸念される。全血の長期保存は比較的珍しく、これらのサンプル中でＣＴＣの生存率を阻害する可能性がある添加物及び溶媒を必要とする。
【００５６】
本発明の実施形態に係るＣＴＣ貯蔵は、低温保存のために、血清及びＲＢＣを除去するとともに、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を回収する。現在、我々は、ＣＴＣの低温保存のために、３つの異なるプロトコルを確立した。
【００５７】
［Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ法］
１．全血を容積２倍の緩衝液で希釈する。
２．５０ｍＬの円錐管において、希釈された細胞懸濁液を１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ上に丁寧に重ねる。
３．ＲＴで３０から４０分、４００ｘｇで遠心分離を行う。
４．界面で単核細胞層をかく乱せずに、上層を吸引する。
５．単核細胞層を、新しい円錐管に丁寧に移す。
６．円錐管を緩衝液で満たし、混合し、ＲＴで１０分、３００ｘｇで遠心分離を行う。上清を除去する。
７．最後に、培地及び１０％ＤＭＳＯの混合物中で細胞を再懸濁し、液体窒素中に配置する。
［Ｂｕｆｆｙ  Ｃｏａｔ法］
１．全血を容積２倍の緩衝液で希釈する。
２．５０ｍＬの円錐管において、希釈された細胞懸濁液を少量の高濃度溶液（すなわち、スクロース−塩化セシウム）上に丁寧に重ねる。
３．希釈された全血サンプルを室温で１０分、２００ｘｇで撹拌する。
４．濃縮された白血球帯を除去する。
５．単核細胞層を、新しい円錐管に丁寧に移す。
６．円錐管を緩衝液で満たし、混合し、ＲＴで１０分、３００ｘｇで遠心分離を行う。上清を除去する。
７．最後に、培地及び１０％ＤＭＳＯの混合物中で細胞を再懸濁し、液体窒素中に配置する。
［赤血球溶解］
１．全血を容積１倍の赤血球溶解緩衝液で希釈する。
２．全血溶液を室温で１０分、３００ｘｇで撹拌する。上清を除去する。
３．緩衝液で細胞を再懸濁し、混合し、ＲＴで１０分、３００ｘｇで遠心分離を行う。上清を除去する。
４．最後に、培地及び１０％ＤＭＳＯの混合物中で細胞を再懸濁し、液体窒素中に配置する。
【００５８】
ＣＴＣの完全性は、低温保存後も変化しなかった。上述のプロトコル下で保存されたＰＢＭＣサンプルは、ＣＴＣ濃縮技術（例えば、ナノベルクロチップ、H.-R. Tseng, S. Wang, H. Wang, K. Liu (2010) Microfluidic Lab-on-a-Chip Device for Capturing Circulating Tumor Cells, and Use for Diagnosis of Metastatic Cancer、全内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０１０８００３号として公開されたＰＣＴ国際出願参照）を用いて、又は上述の方法によって、ＣＴＣ濃縮アプローチの対象としてもよい。
【００５９】
本明細書において説明及び論じられた実施形態は、当業者に本発明の作成及び使用方法を教示することを意図したものに過ぎない。本発明の実施形態の説明において、明瞭化のために特定の用語が使用される。しかしながら、本発明は、このように選択された特定の用語に限定されることを意図するものではない。当業者であれば上述の教示を考慮することで理解されるように、上述した本発明の実施形態は、本発明から逸脱することなく、改良又は変更されてもよい。従って、特許請求の範囲及びこれらの均等物の範囲内で、本発明は、具体的に説明した以外の形態で実施されてもよいことを理解されたい。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【国際調査報告】
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