(57)【要約】  人工多能性幹細胞、及びヒト腎臓由来細胞から人工多能性幹細胞を作製する方法を開示する。より具体的には、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の系列の細胞へ分化することができるヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞を開示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ−Ｉ及びＣＤ  ４４の発現が陽性、かつＯｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、Ｐａｘ−２、カドヘリン−１１、ＦｏｘＤ１、ＷＴ１、Ｅｙａ１、ＨＮＦ３Ｂ、ＣＸＣ−Ｒ４、Ｓｏｘ−１７、ＥｐｏＲ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、又はＧＤＦ５のうちの少なくとも１つの発現が陽性；並びに、ＣＤ１３３及びＥ−カドヘリンの発現が陰性、かつＳｏｘ２、ＦＧＦ４、ｈＴｅｒｔ、Ｗｎｔ−４、ＳＩＸ２、又はＧＡＴＡ−４のうちの少なくとも１つの発現が陰性である、初期化したヒト腎臓由来細胞を含む、人工多能性幹細胞。
【請求項２】
ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、及びＮＡＮＯＧを発現する、請求項１に記載の人工多能性幹細胞。
【請求項３】
アルカリホスファターゼ染色に陽性である、請求項１に記載の人工多能性幹細胞。
【請求項４】
外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の系列の細胞に分化する、請求項１に記載の人工多能性幹細胞。
【請求項５】
肝細胞の細胞、血液内皮の細胞、及び完全な内胚葉細胞に分化する、請求項１に記載の人工多能性幹細胞。
【請求項６】
ＨＬＡ−Ｉ及びＣＤ  ４４の発現が陽性、かつＯｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、Ｐａｘ−２、カドヘリン−１１、ＦｏｘＤ１、ＷＴ１、Ｅｙａ１、ＨＮＦ３Ｂ、ＣＸＣ−Ｒ４、Ｓｏｘ−１７、ＥｐｏＲ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、又はＧＤＦ５のうちの少なくとも１つの発現が陽性；並びに、ＣＤ１３３及びＥ−カドヘリンの発現が陰性、かつＳｏｘ２、ＦＧＦ４、ｈＴｅｒｔ、Ｗｎｔ−４、ＳＩＸ２、又はＧＡＴＡ−４のうちの少なくとも１つの発現が陰性である、ヒト腎臓由来細胞を提供する工程と、
ヒト転写因子ＯＣＴ４を発現するＶＳＶｇマウスレトロウイルス、ヒト転写因子ＳＯＸ２を発現するＶＳＶｇマウスレトロウイルス、ヒト転写因子ＫＬＦ４を発現するＶＳＶｇマウスレトロウイルス、及びヒト転写因子ｃ−ＭＹＣを発現するＶＳＶｇマウスレトロウイルス、のそれぞれ１つで前記ヒト腎臓由来細胞をトランスフェクトする工程と、
前記トランスフェクトされたヒト腎臓由来細胞を培養する工程と、
人工多能性幹細胞を識別する工程と、
前記ヒト腎臓由来ＩＰＳ細胞を単離する工程と、
前記人工多能性幹細胞を継代培養する工程と、
人工多能性幹細胞を提供する工程と、を含む、方法によって作製される、人工多能性幹細胞。
【請求項７】
前記方法が、ヒト転写因子ｐ５３−ｓｈＲＮＡを発現するＶＳＶｇマウスレトロウイルスで前記ヒト腎臓由来細胞をトランスフェクトすることを更に含む、請求項６に記載の人工多能性幹細胞。
【請求項８】
ヒト腎臓由来細胞を提供し、Ｏｃｔ−４タンパク質をコードするｍＲＮＡ、Ｓｏｘ２タンパク質をコードするｍＲＮＡ、Ｋｌｆ４タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ｃ−ｍｙｃタンパク質をコードするｍＲＮＡ、及びＬｉｎ２８タンパク質をコードするｍＲＮＡ、のそれぞれ１つで前記ヒト腎臓由来細胞をトランスフェクトする工程と、
前記トランスフェクトされたヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞を培養する工程と、
人工多能性幹細胞を識別する工程と、
前記人工多能性幹細胞を単離する工程と、
前記人工多能性幹細胞を継代培養する工程と、
人工多能性幹細胞を提供する工程と、を含む、方法によって作製される、人工多能性幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は人工多能性幹細胞に関する。より具体的には、本発明はヒト腎臓由来細胞（ｈＫＤＣ）を人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に初期化することに関する。
【背景技術】
【０００２】
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、細胞療法のための潜在的価値を有する患者特異的な前駆体をインビトロで生成できるようにするため（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ  １２６，６６３〜７６（２００６））、再生医療への応用の関心が高まっている。しかしながら、多くの場合において、急性疾患の細胞療法のため、又は慢性疾患若しくは加齢の帰結として患者の体細胞が変化した場合等はすぐに使える手段が望ましい。組込みウイルスの方法を用いた多能性因子および癌遺伝子の異所性発現は、マウス及びヒト線維芽細胞の両方において多能性を誘導するのに十分である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ  １２６，６６３〜７６（２００６）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １３１，８６１〜７２（２００７）；Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｋ．ａｎｄ  Ｐｌａｔｈ，Ｋ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３６，５０９〜２３（２００９）；Ｌｏｗｒｙ，Ｗ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  ＮａｔｌＡｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５，２８８３〜８（２００８））。しかしながら、この過程は時間がかかり、非効率的で、ゲノム中へのベクターの恒久的な組込みは、治療への適用のためのｉＰＳ細胞の使用を制限する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ  １２６，６６３〜７６（２００６））。更なる研究によって、使用される年齢、起源、および細胞型が初期化の効率に重大な影響を有することが示されている。最近、レトロウイルスによるヒト角化細胞への形質導入によって、線維芽細胞に比べて１００倍も効率が高く、２倍速い多能性への再初期化がもたらされることが示された。これらの相違は、出発物の角化細胞集団におけるＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣの内因性の発現、及び／又は初期化をより受け入れやすいというエピジェネティックな状態を示す未分化前駆細胞のプールの存在に起因し得るという仮説が立てられた（Ｌｏｗｒｙ，Ｗ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  ＮａｔｌＡｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５，２８８３〜８（２００８））。この後者の仮説は、マウスにおける他の研究によって更に裏付けられている。（Ｓｉｌｖａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ６，ｅ２５３（２００８）；及びＥｍｉｎｌｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２６，２４６７〜７４（２００８）。しかしながら、幹細胞は通常は稀であり、大量に入手および単離することは困難である（例えば、神経幹細胞）（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３６，４１１〜９（２００９）；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５４，６４６〜５０（２００８））。
【０００３】
ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞は、いくつかの応用に多能性細胞の実行可能な供給を表している。例えば、遺伝性腎疾患又は他の腎疾患を患う患者から得たｉＰＳ細胞を、その疾患の発達を理解するために疾患のモデル化に使用することができる。ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞を、腎疾患及び肝疾患の細胞置換療法及び細胞移植療法にそれぞれ、腎細胞及び肝細胞へと分化することができる。更に、ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞から分化した腎細胞及び肝細胞は、腎疾患及び肝疾患の特定の状態に対する化合物の効能及び毒性学を評価する化合物のスクリーニングに理想的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、本明細書に、ＨＬＡ−Ｉ及びＣＤ  ４４の発現が陽性、かつＯｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、Ｐａｘ−２、カドヘリン−１１、ＦｏｘＤ１、ＷＴ１、Ｅｙａ１、ＨＮＦ３Ｂ、ＣＸＣ−Ｒ４、Ｓｏｘ−１７、ＥｐｏＲ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、又はＧＤＦ５のうちの少なくとも１つの発現が陽性；ＣＤ１３３及びＥ−カドヘリンの発現が陰性、かつＳｏｘ２、ＦＧＦ４、ｈＴｅｒｔ、Ｗｎｔ−４、ＳＩＸ２、又はＧＡＴＡ−４のうちの少なくとも１つの発現が陰性である、ヒト腎臓由来細胞を初期化することによって作製した人工多能性幹細胞を記載する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】ヒトＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣで形質導入したｈＫＤＣから得たヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞の形態。放射線照射したマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）支持細胞層上の１継代のクローンを示す。
【図２】ヒトＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣ、並びにｐ５３  ｓｈＲＮＡで形質導入したｈＫＤＣから得たヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞の形態。放射線照射したマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）支持細胞層上の１継代のクローンを示す。
【図３】ＭＡＴＲＩＧＥＬ上に培養しアルカリホスファターゼ染色したヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞（クローンＲＶ４−５）（４ｘ倍率）。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
ｐ５３ダウンレギュレーション有り無しで、４つ（ＯＳＫＭ）の転写因子をレトロウイルスで導入することでヒト腎臓由来細胞（ｈＫＤＣ）を多能性に初期化することを開示する。本明細書で説明する方法及び組成物を用いて、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣをレトロウイルスで導入することによってｈＫＤＣを多能性に初期化する。結果として生じる初期化されたｈＫＤＣは、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の特性を有する。
【０００７】
一実施形態では、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、本明細書でヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞と呼ぶ、ヒト腎臓由来細胞から作製される。ｈＫＤＣは、ｐ５３  ｓｈＲＮＡ有り無しで初期化因子を強制発現させることで初期化した。初期化された細胞は、形態、アルカリホスファターゼ染色、多能性マーカーの発現、特定のプロモーターのメチル化、及び特定の胚葉マーカーの発現の特徴を有した。
【０００８】
ｈＫＤＣは、ヒト死体の腎臓組織から単離した独特の細胞集団である。ｈＫＤＣを単離する方法は、係属中の米国特許公報第２００８／０１１２９３９号に記載され、上記刊行物の全ての開示を参照により本明細書の開示に含める。簡潔には、これらの細胞は哺乳類の腎臓の被膜下、皮質、又は髄質の領域の組織を採取して単離した。腎臓組織の断片をメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、又は粘液溶解酵素の存在下でインキュベートし、細胞を組織培養器に播種した。
【０００９】
単離した又は精製したヒト腎臓由来細胞集団は、培地で自己再生及び増殖することが可能である。細胞集団は、ＨＬＡ−Ｉ及びＣＤ  ４４の発現が陽性、かつＯｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、Ｐａｘ−２、カドヘリン−１１、ＦｏｘＤ１、ＷＴ１、Ｅｙａ１、ＨＮＦ３Ｂ、ＣＸＣ−Ｒ４、Ｓｏｘ−１７、ＥｐｏＲ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、又はＧＤＦ５のうちの少なくとも１つの発現が陽性；並びに、ＣＤ１３３及びＥ−カドヘリンの発現が陰性、かつＳｏｘ２、ＦＧＦ４、ｈＴｅｒｔ、Ｗｎｔ−４、ＳＩＸ２、又はＧＡＴＡ−４のうちの少なくとも１つの発現が陰性である。
【００１０】
更に、発現が陽性である細胞は、細胞表面マーカーＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、又はＳＳＥＡ−４のうちの少なくとも１つについて陽性；並びに、細胞表面マーカーＨＬＡ  ＩＩ、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３８、及びＣＤ１４１のうちの少なくとも１つについて陰性である。
【００１１】
ヒト腎臓由来細胞集団は、栄養因子ＦＧＦ２、ＨＧＦ、ＴＧＦα、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−２又はＶＥＧＦのうちの少なくとも１つを分泌する；及び、栄養因子ＰＤＧＦ−ｂｂ又はＩＬ１２ｐ７０のうちの少なくとも１つを分泌しない。
【００１２】
ｈＫＤＣは、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス等のウイルス；小分子模倣等の化学物質；組換蛋白質等の蛋白質；ミクロＲＮＡ及びメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）等のＲＮＡ；及びベクトルを含む従来の初期化手法を使用して初期化することができる。
【００１３】
一実施形態では、ウイルスリプログラミング方法を使用してｈＫＤＣを初期化した。一実施形態では、ｈＫＤＣを、恒常的に発現させたヒト転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣをそれぞれ保有するＶＳＶｇマウスレトロウイルスでトランスファクトした。簡潔には、ｈＫＤＣを、腎上皮増殖培地（ＲＥＧＭ）でウェル当たり１×１０５細胞を６ウェルプレートに播種し、５％  ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。ウイルストランスフェクション用に４つのＶＳＶｇマウスレトロウイルス構築物（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣ）を有する形質導入培地、及びトランスフェクションの効率を上げるための薬剤を各ウェル用に調製した。培地をウェルからアスピレートし、形質導入培地を添加し、５％  ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。この形質導入のステップを翌日繰り返し、一晩インキュベートした後で、形質導入培地をＲＥＧＭへ培地交換した。細胞を更に４日間インキュベートした（２日毎にＲＥＧＭ交換を行う）。
【００１４】
任意選択で、形質導入培地はｐ５３−ｓｈＲＮＡを保有するＶＳＶｇマウスレトロウイルスも含まれた。ｐ５３の抑制は、おそらく細胞の増殖を遅らせることで特定の種類の細胞の初期化の効率を高めることが示されている（Ｚｈａｏ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３：４７５〜４７９；Ｓａｒｉｇ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０７：２１２７〜２１４０（２０１０））。次にトランスファクトされたｈＫＤＣを培養し、典型的なｉＰＳ細胞の形態の外観が見られた。典型的なｉＰＳ細胞の形態とは、光学顕微鏡下で屈折する又は「光沢がある」非常にはっきりした境界明瞭な端部を有する、密に詰まった細胞のコロニー形成のことを指す。典型的なＩＰＳ細胞の形態を示す細胞を単離し、継代培養し増殖して、ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞が提供された。
【００１５】
別の実施形態では、ｈＫＤＣは、転写因子ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、Ｃ−ＭＹＣ、及びＬＩＮ２８をコードするｍＲＮＡを使って初期化した。簡潔には、ｈＫＤＣをＲＥＧＭで６ウェルプレートに播種し、５％  ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。ｍＲＮＡトランスフェクション用に５つのヒトｍＲＮＡ（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、及びＬＩＮ２８）を含有するｍＲＮＡトランスフェクション複合体、及びトランスフェクションの効率を上げるための薬剤を調製した。ＲＥＧＭ培地をウェルからアスピレートし、形質導入培地を添加し、４後、形質導入培地をリプログラミング培地と交換し、５％  ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。この形質導入のステップを１日一回１６日間繰り返した。細胞は、１日一回の培地の交換でｉＰＳ細胞コロニーをモニターした。
【００１６】
ｉＰＳ細胞が完全に初期化したかを評価するために用いるいくつかの基準としては、形態（上記に説明）アルカリホスファターゼ染色、多能性マーカーの発現、特定のプロモーターのメチル化、及び特定の胚葉マーカーの発現が挙げられる。重要な多能性因子（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ）の発現、及び胚性幹細胞特異表面抗原（ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１）は、完全に初期化されたヒト細胞を識別するのに通常使用される。機能のレベルで、ｉＰＳ細胞は更に、胚の三胚葉すべてから系列に分化する能力を示す。
【００１７】
本明細書に記載した方法で作製したヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞は、多能性の特徴を有する。典型的なｉＰＳ細胞の形態を呈するこれらの細胞は、自己再生が可能で、重要な多能性マーカー（ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、及びＮＡＮＯＧ）を発現し、三胚葉から系列に分化を明示し、正常核型を示す。
【００１８】
ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞は、再生医療のための多能性細胞の好適な供給源を表す。この技術を用いて今や多能性細胞を多数生成することが可能である。もう１つの重要な利点は、多発性嚢胞腎疾患（ＰＫＤ）やアルポート症候群等の遺伝性腎疾患の患者から疾患特異的ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞を得る潜在能力である。疾患の遺伝子型及び表現型を不確定に維持するＰＫＤ及びアルポート症候群患者から誘導した初期化した細胞は、疾患のモデリング、並びにこれらの遺伝性疾患の重要な制御因子である後成的異常及び／又は転写異常を修飾することを目標とする化合物のスクリーニングに使用することができる。更に、ＰＫＤやアルポートの患者から誘導したそのようなｉＰＳ系は、細胞中に識別した遺伝的欠陥を修正するために生成することができる。
【００１９】
肝細胞様の細胞に分化された初期化ｈＫＤＣは、再生医療及び肝疾患の療法のための大きな潜在的価値を有する。急性肝不全（ＡＬＦ）は、米国で年間発症件数およそ２０００件の壊滅的な臨床症候群であり、８０％に近い死亡率に関与する。現在、同所性肝移植が唯一可能な治療であり、生存率は７０％〜８５％である。初代培養肝細胞を用いた細胞移植は、げっ歯動物及びヒトのモデルでの使用に成功しており、細胞療法は潜在的解決策であり得る。ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞誘導の肝細胞は、病的肝臓に正常肝臓の機能を促進させるための移植可能な細胞として潜在的供給源を表す。
【００２０】
本発明の異なる実施形態を非限定的な例として示した図面を参照しながら、以下の説明文において本発明を更に説明する。
【実施例】
【００２１】
実施例１．ｈＫＤＣをｉＰＳ細胞へとウイルスリプログラミングする
米国特許公報第２００８／０１１２９３９号に記載された方法によって得たｈＫＤＣに、ｐ５３−ｓｈＲＮＡを含有するＶＳＶｇマウスレトロウイルス有り無しで、恒常的に発現させたヒト転写因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣ）をそれぞれ保有する特異的ＶＳＶｇマウスレトロウイルスのレトロウイルス構築物（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））で形質導入した。
【００２２】
マウスレトロウイルスを、トランスフェクション１日前に６センチメートルディッシュ上にディッシュ当たり３×１０６細胞密度で播種し、５％  ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした、２９３−ｇｐ２レトロウイルスパッケージング細胞を使用して調製した。次に、各ディッシュを、製造者の標準プロトコルにより、３マイクログラムの単一ｐＭＸベクトル（Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、ｃＭｙｃ若しくはＫｌｆ４、又はｐ５３−ｓｈＲＮＡ）、１マイクログラムのＶＳＶ−ｇ、及び１６マイクロリットルのトランスフェクション剤（商標名ＦＵＧＥＮＥ  ＨＤ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、カタログ番号０４７０９７０５００１）でトランスファクトした。次に、トランスフェクション後４８時間でウイルスを収集し、使用前に０．４５マイクロメートルのフィルターを通して濾過した。
【００２３】
ｈＫＤＣを解凍し、形質導入前に１継代培養した。形質導入１日前、ｈＫＤＣをトリプシン処理し、ウェル当たり２ｍＬの腎上皮増殖培地（ＲＥＧＭ、Ｌｏｎｚａ  ＬＴＤ．Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））にウェル当たり１×１０５細胞で６ウェルプレートの２つのウェルに播種した。細胞を５％  ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。１日目、それぞれ新たに調整したウイルス（ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、及びＣ−ＭＹＣ）５００マイクロリットル及び４ナノグラム／ｍＬのポリブレンを含有する各ウェルに２．５ｍＬの形質導入培地を調製した。培養培地をウェルからアスピレートし、形質導入培地を添加し、５％  ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。２日目、ウイルスの形質導入ステップを繰り返した。３日目、形質導入培地を除去し、ＲＥＧＭと交換した。培地交換を７日目まで２日毎に行った。
【００２４】
培養培地（商標名Ｓｔｅｍｅｄｉｕｍ  ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）カタログ番号０１−０００５）に、更に２０ナノグラム／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（ｉＰＳ−Ｎｕ培地）、又は２０ナノグラム／ｍＬのｂＦＧＦでヒトＥＳ培地を含有する標準ノックアウト血清リプレースメント（ＫＳＲ）（ｉＰＳ−ＫＳＲ培地）を補充したもので再懸濁し、次に、６ウェルプレートにウェル当たり１×１０４細胞密度で、基底膜マトリックス（商標名ＭＡＴＲＩＧＥＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、カタログ番号３５４２７７）コーティング済み、又はマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダープレートに播種した。培地を新たなｉＰＳ細胞培地と交換した（１週間目２日毎及び２〜６週間目１日一回）。プレートはｉＰＳ細胞コロニーの有無を１日一回調べた。
【００２５】
「典型的な」初期化又はｉＰＳ細胞の形態を示すコロニーを手作業でＭＥＦフィーダープレートから拾い、１２ウェルＭＥＦフィーダープレートの単一ウェル上に播種した。培養培地を１日一回交換した。４〜６日後、コロニーを手作業で１２ウェルプレートから拾い、６ウェルプレートに拡大した。培養培地を１日一回交換し、４〜６日毎に手作業で１：３に分割した。各ウェルからの細胞を様々な段階で凍結保存液（商標名ＣＲＹＯＳＴＥＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．、カタログ番号０１−００１３）を用いて凍結した。
【００２６】
結果
４つの初期化因子を発現するレトロウイルスを用いたｈＫＤＣの初期化は、ｉＰＳ細胞の形態を示すコロニーを生じた。４つの初期化因子を用いたウイルス形質導入から得た１２の初期化されたコロニー（ＲＶ４続いてコロニー番号で表わす）を手作業で拾い、これらのコロニーのうちの６つを拡大して凍結した（図１）。初期化因子及びｐ５３  ｓｈＲＮＡを用いたｈＫＤＣの初期化（ＲＶ５続いてコロニー番号で表わす）には、１２つのコロニーを手作業で拾い、６つを拡大して凍結した（図２）。
【００２７】
実施例２．多能性マーカーの発現
実施例１で作製したヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞を、多能性マーカーの発現について免疫細胞化学で評価した。コロニーを４％パラホルムアルデヒドで固定した後、多能性マーカーの免疫蛍光染色を表１に示す抗体試薬（抗体はすべてＳｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．から入手）を使用して行った。
【００２８】
【表１】
2015506168.tif 000003
【００２９】
結果
２つの代表的なヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞クローンを、多能性マーカーの発現について評価した。評価したヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞クローンＲＶ４−５及びＲＶ５−１は両者とも、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、及びＮＡＮＯＧのマーカーを発現している。これらのマーカーは親のｈＫＤＣで検出されなかった。これらのマーカーの発現は、ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞の多能性を意味する。
【００３０】
実施例３．Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ２プロモーターのメチル化分析
実施例１で作製したヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞クローンＲＶ４−５及びＲＶ５−１を、亜硫酸水素塩シーケンシング方法を使用してＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ２のプロモーター領域のメチル化状態を分析し、Ｓｅｑｗｒｉｇｈｔ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）で分析を行った。亜硫酸水素塩方法は、ＤＮＡサンプル中の特定のメチル化パターンを識別するために最も一般に用いられる手法である。その手法はＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理することからなり、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換するがメチル化されたシトシンは変化しない。座特定又はゲノム全体の分析の両方に使用される。
【００３１】
Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ２のおよそ１００〜５００ｂｐ長さのプロモーター領域のメチル化のパターンを調べた。ＤＮＡ抽出キット（商標名ＤＮｅａｓｙ、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）カタログ番号６９５０６）を用いてＤＮＡ（表２を参照）を調製し、Ｓｅｑｗｒｉｇｈｔ，Ｉｎｃ．に送り分析を行った。
【００３２】
【表２】
2015506168.tif 000004
【００３３】
結果：
表３はプロモーター領域のメチル化分析から得た結果をまとめたものである。検査を行った領域内で、Ｎａｎｏｇ及びＳｏｘ２のプロモーター領域内でメチル化した部位は検出されなかった。Ｏｃｔ４のプロモーター領域では、メチル化した部位が７つ検出された。ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞のクローン両者で、親細胞に比べてこれら７つの部位のメチル化の変化が示された。親細胞に比べてメチル化パターンの変化はｉＰＳ細胞の特性である。
【００３４】
【表３】
2015506168.tif 000005
【００３５】
実施例４．アルカリホスファターゼ染色
実施例１で作製したヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞クローンＲＶ４−５の多能性をアルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色で更に評価した。アルカリホスファターゼ検出キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）カタログ番号ＳＣＲ００４）を使用して行った。ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞を２４ウェルプレートに播種し３７℃のインキュベータで保持した。３〜５日後、培地培養をウェルからアスピレートし、細胞を４％パラホルムアルデヒドで１〜２分間固定した。固定液を除去し細胞を１ｍＬの１ｘすすぎ緩衝液で洗浄した。その後、すすぎ緩衝液を０．５ｍＬの染色試薬混合液と交換し、１５分間室温でインキュベートした。染色試薬は、アルミ箔で覆われた管の中でキットの成分のｆａｓｔ  ｒｅｄ  ｖｉｏｌｅｔ（ＦＲＶ）及びナフトールＡＳ−ＢＩリン酸塩溶液を水と２：１：１の割合（ＦＲＶ：ナフトール：水）で混ぜることによって調製した。染色試薬液を除去し、細胞を１ｍＬの１ｘすすぎ緩衝液で一回洗浄してから０．５ｍＬのＰＢＳでインキュベートした。染色した細胞の画像を顕微鏡写真機で撮影した。ＡＰ活性を示す細胞は紫色に見える。
【００３６】
結果
図３に示すように、ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞クローンＲＶ４−５は、アルカリホスファターゼ染色に陽性を示し、これは多能性の状態を示唆している。
【００３７】
実施例５．三胚葉の系列への分化
実施例１で調整したヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞クローンＲＶ５−１が、外胚葉系、中胚葉系、及び内胚葉系に分化する能力を、胚様体形成誘導、及び三胚葉に特異のマーカーの染色によって評価した。
【００３８】
クラスタープレート（商標名ＡＧＧＲＥＷＥＬＬ  ４００、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）カタログ番号２７９４０）を使用して胚様体を生成した。細胞を細胞剥離液（商標名ＡＣＣＵＴＡＳＥ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して酵素解離し、１００ナノグラム／ｍＬのｂＦＧＦで補充したＭＥＦ馴化培養液（ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）カタログ番号ＧＳＭ−９１００）で再懸濁し、血球計数器を使用してトリパンブルー染色で数えた。胚様体形成を誘導するために、０．５〜１００万の細胞をＡＧＧＲＥＷＥＬＬ  ４００プレートの各ウェルに添加し、プレートを１０００毎分回転数で５分間遠心分離して細胞をマイクロウェルに捕捉した。５％  ＣＯ２、９５％湿度中３７℃で２４時間インキュベートした後、胚様体をアスピレートして採取し５０ｍＬの円錐管の上に倒立した４０マイクロメートルのセルストレーナーを通して懸濁液を通過させて単細胞を除去した。集合体が倒立したセルストレーナーの上に残り、ＭＥＦ馴化培養液を使用して該集合体を洗浄してセルストレーナーから離させて収集した。次に、胚様体を低クラスタープレートに播種した。２４時間後培地をＭＥＦ馴化培養液とＤＭＥＭ／Ｆ１２との１：１混合液に交換し、胚葉分化のマーカーを染色する前に７日間培養した。
【００３９】
分化したヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞の免疫細胞化学を室温で１５〜２０分間ｐＨ  ７．４燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定させて氷冷のＰＢＳで洗浄することで行った。細胞を室温で１時間１０％の正常ロバ血清又は正常ヤギ血清のＰＢＳでインキュベートして抗体の非特異性の結合を阻止した。その後、細胞をＰＢＳ中１０％ヤギ血清中の特異抗体（表４）中で、加湿室において室温で２時間、又は４℃で一晩インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄してから、暗所において室温で１．５〜２時間二次抗体と共にインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞を０．１〜１マイクログラム／ｍＬのＡＰＩ（ＤＮＡ着色、１：１００００希釈）中で２分間インキュベートして細胞核を視覚化した。ＰＢＳで最終洗浄を行った後、細胞を免疫蛍光顕微鏡検査法で処理した。
【００４０】
【表４】
2015506168.tif 000006
【００４１】
結果
ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞をネスチン、α平滑筋アクチン（αーＳＭＡ）、及びα胎児蛋白質１（ＡＦＰ１）に対する抗体で染色し、それぞれ外胚葉系、中胚葉系、内胚葉系への分化の評価を行った。ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞クローンＲＶ５−１は、胚様体形成後にこれらの胚葉マーカーを発現しており、該細胞がこれらの胚葉から細胞に分化する能力を有することが示唆された。
【００４２】
実施例６．肝臓系列への分化
実施例１で作製したヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞の肝細胞系列への分化を、刊行されたプロトコル（Ｈａｙ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０５（３４）：１２３０１〜６（２００８））へ少し修正を加えた方法で行った。
【００４３】
ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞クローンＲ４〜５、を支持細胞層から引き離し、ＭＡＴＲＩＧＥＬ上で培養し、１００ナノグラム／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）カタログ番号ＧＦ００３）を含有するマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）馴化培養液（ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、カタログ番号ＧＳＭ−９１００）で維持した。１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビター（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）カタログ番号６６８０００）が継代後の１日目のみに培養培地に含まれた。
【００４４】
ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞が約５０〜７０％コンフルエントに達すると、ＭＥＦ馴化培養液を１ｘ濃度の無血清補充液（商標名Ｂ２７  ＳＵＰＰＬＥＭＥＮＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号１７５０４０４４）、２ｍＭのＬ−グルタミン代替（商標名ＧＬＵＴＡＭＡＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号３５０５０〜０６１）、１００ナノグラム／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）カタログ番号３３８−ＡＣ−０５０）、及び５０ナノグラム／ｍＬのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号５０３６−ＷＮ−０１０）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号２１８７００９２）に交換して７２時間培養した。
【００４５】
次に、細胞を新しいＭＡＴＲＩＧＥＬコーティングプレートに１：２で分割し、分化培養液：２０％血清代替物（ＳＲ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号１０８２８０１０）、１ミリモルのＧＬＵＴＡＭＡＸ  Ｌ−グルタミン代替、１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号１１１４００５０）、０．１ミリモルのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ７５２２）、及び１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ２６５０）を含有する、ノックアウト−Ｄｕｌｂｅｃｃｏ修正Ｅａｇｌｅ培養液（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号１０８２９−０１８）で７日間培養した。最後に、細胞を成熟培地：８．３％ウシ胎仔血清（商標名ＨＹＣＬＯＮＥ  ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）カタログ番号ＳＨ３００７０．０３１）で補充したＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ１５培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号１１４１５）、８．３％トリプトースリン酸ブロス（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ８１５９）、１０マイクロモルのヒドロコルチゾン２１−ヘミスクシナート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｈ２８８２）、１マイクロモルのインシュリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｉ９２７８）、２ミリモルのＧＬＵＴＡＭＡＸ  Ｌ−グルタミン代替、１０ナノグラム／ｍＬの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号２９４−ＨＧ−００５）、及び２０ナノグラム／ｍＬのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号２９５−ＯＭ−０１０）で７日間培養した。分化中、培地を１日一回交換した。
【００４６】
肝臓マーカーの発現をｑＰＣＲによって評価した。ＲＮＡを、ＲＮＡ及びタンパク質抽出キット（商標名ＡｌｌＰｒｅｐ  ＲＮＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カタログ番号８０４０４）を使用して製造業者の説明書に従って調製した。６ウェルプレートで増殖させた細胞に使用した溶解緩衝液の量を適宜に増やした。
【００４７】
ｑＰＣＲのサンプルを調製するために、ゲノムＤＮＡ除去を製造業者の説明書に従って行った。ｃＤＮＡ合成を、ｃＤＮＡ合成キット（商標名ＱＵＡＮＴＩＴＥＣＴ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カタログ番号２０５３１３）を使用して２０マイクロリットルの全容積でヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞又は分化した細胞から単離した全ＲＮＡ  ０．５マイクログラムで行った。７３００リアルタイムＰＣＲシステムで、光学９６ウェル反応プレート（商標名ＭＩＣＲＯＡＭＰ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、カタログ番号４３０６７３７）で２０マイクロリットルの最終容積で、ＰＣＲを行った。ヒト転写物を、１０マイクロリットルの２ｘ  ＰＣＲ反応混合液（商標名ＴＡＱＭＡＮユニバーサルＰＣＲマスターミックス、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、カタログ番号、４３６４３３８）、１マイクロリットルの２０Ｘプライマー対（商標名ＴＡＱＭＡＮ遺伝子発現アッセイ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、カタログＮｏ．４３３１１８２）、１マイクロリットルのテンプレートＤＮＡ、及び８マイクロリットルのＲＮａｓｅフリー水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｗ４５０２）で検出した。使用した特定遺伝子発現アッセイキットは、ＦｏｘＡ２（アッセイＩＤ：Ｈｓ  ００２３２７６４＿ｍ１）、Ｓｏｘ１７（アッセイＩＤ：Ｈｓ  ００７５１７５２＿ｍ１）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ、アッセイＩＤ：Ｈｓ  ００１７３４９０＿ｍ１）、トランスサイレチン（ＴＴＲ、アッセイＩＤ：Ｈｓ  ００１７４９１４＿ｍ１）、アルブミン（アッセイＩＤ：Ｈｓ  ００９１０２２５＿ｍ１）、肝細胞核因子（ＨＮＦ）４α（アッセイＩＤ：Ｈｓ  ００２３０８５３＿ｍ１）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ、アッセイＩＤ：Ｈｓ  ００３５６９３０＿ｍ１）、チトクロムＰ（ＣＹＰ）３ａ（アッセイＩＤ：Ｈ  ００６０４５０６＿ｍ１）及び正規化遺伝子としてＧＡＰＤＨ（アッセイＩＤ：Ｈｓ  ９９９９９９０５＿ｍ１）である。増幅をＵＮＧ活性化ステップから始めて５０℃で２分間行い、続いて９５℃で１０分テンプレート熱変性を行った。９５℃で１５秒間変性、及び６０℃で１分間プライマーアニーリング／伸長の組み合わせを４０サイクル行った。
【００４８】
誘導した肝細胞に肝マーカーの免疫染色の処理も行った。簡潔には、１２ウェルプレート上に培養した分化した細胞をＰＢＳで洗浄し、室温で２０分間２．２％パラホルムアルデヒドで固定した。固定した細胞をＰＢＳで２回洗浄してからブロッキング／透過化緩衝液（０．３％トリトンＸ−１００及び３％ヤギ血清を含有するＰＢＳ）中で一次抗体と共に１時間室温でインキュベートした。適切な蛍光色素を結合した二次抗体と共にインキュベートする前に、染色した細胞をブロッキング／透過化緩衝液で３回洗浄した。最終洗浄後（洗浄緩衝液で５回）、染色した細胞を蛍光倒立顕微鏡で検査した。
【００４９】
結果
ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞クローンＲＶ４−５を、アクチビンＡ及びＷｎｔ３ａの存在下で培養した。３日間アクチビン及びＷｎｔ３ａで処理した後、ＲＮＡを抽出し、様々な肝細胞マーカーをｑＲＴ−ＰＣＲで判定した。
【００５０】
異なる段階（０日目、３日目、９日目及び１７日目）の細胞から、内胚葉（ＦｏｘＡ２及びＳｏｘ１７）、初代培養肝細胞（ＡＦＰ及びＴＴＲ）、中間肝細胞（アルブミン及びＨＮＦ４α）、及び成熟肝細胞（ＴＡＴ及びＣｙｐ７ａ）のマーカーの転写レベルが示された。転写レベルを、対照細胞（０日目の未分化ｉＰＳ細胞）と比較した倍増として表わす。米印（＊）が付いた値は、この遺伝子の平均閾値サイクルが未分化対照で高く、実験用サンプルで低いことを示している。これは、実際の倍率変化値は計算した倍率変化結果と少なくとも同じくらい大きいことを示唆している。ハッシュマーク（＃）が付いた値は、この遺伝子の平均閾値サイクルは高いが、未分化対照サンプル及び実験用サンプルの両者で相対的発現レベルが低いことを示している。
【００５１】
表５に示すように、誘導細胞は、ｑＲＴ−ＰＣＲ測定によってＳｏｘ１７及びＦｏｘ２ａの転写において著しい増加を示した。興味深いことに、（タンパク質ではなく）ＨＮＦ４α転写もこの段階で検出可能である。これらの結果は、ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞は完全な内胚葉系列へ誘導されたことを示している。
【００５２】
【表５】
2015506168.tif 000007
【００５３】
完全な内胚葉細胞へ誘導されたヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞は、肝細胞になるために２つの異なる培養液処方でそれぞれ７日間更に誘導された。６日間分化培養液で処理した後、細胞は初期中間体肝細胞に分化した。この段階で細胞は高いレベルのＡＦＰ、ＴＴＲ、およびＨＮＦ４α転写を発現した。その一方で、Ｓｏｘ１７及びＦｏｘＡ２の転写は減少し始めた（表５）。免疫染色では、６日目でα−ｆｅｔｏタンパク質（〜２０％）、ＴＴＲ（およそ〜４０％）及びＨＮＦ４α（およそ４０％）について細胞が陽性染色を示した。１７日目、細胞はより高いレベルのα−ｆｅｔｏタンパク質を発現し、ＴＴＲがやや増加した。興味深いことに、ＨＮＦ  ４α転写（表３）及びＨＮＦ  ４αで陽性染色を示した細胞数の減少がある。
【００５４】
実施例７．ＯＰ９共培養でヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞の血液内皮分化
細胞培養
ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞（クローンＲＶ４−５、２８継代）を、フィーダー非依存性培養培地（商標名ＭＴＥＳＲ１培地、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号０５８５０）で、ヒト胚性幹細胞に適した基底膜マトリックス（商標名ＧＥＬＴＲＥＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号Ａ１０４８００１）上に、週ごとに継代し未分化状態で維持した。ＯＰ９マウス骨髄間質細胞系列をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、カタログ番号ＣＲＬ２７４９）から得た。この細胞系列を、ゼラチンコーティング済みのフラスコ（商標名ＥＳＧＲＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号ＳＦ００８）に入れ、２０％非熱不活性化定義グレードのウシ胎児血清、ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号１６０００−０４４）で補充したα−変性最小必須培地（α−ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号Ａ１０４９００１）からなるＯＰ９増殖培地に維持した。
【００５５】
ＯＰ９細胞と共培養でヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞の血液生成（hematopoietic）分化
細胞を分化させるために、ＯＰ９細胞をＥＳＧＲＯゼラチン溶液でコーティングしたフラスコ（商標名ＣＥＬＬＢＩＮＤ  ＳＵＲＦＡＣＥ  ＨＹＰＥＲＦＬＡＳＫ  Ｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｖｅｓｓｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．（Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）カタログ番号１００２０）にＯＰ９増殖培地に播種した。４日目、コンフルエントになった後、培地の半分を交換し、細胞を更に４日間培養した。ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞を１ミリグラム／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号１７１０４−０１９）で処理して採取し、引掻いて分散させて細胞を小さな塊で維持した。同時に、同じ条件で培養したヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞の培養を使用して計数用の単細胞浮遊液を得た。ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞を、１０％  ＦＢＳ（ＨＹＣＬＯＮＥ  ＦＢＳ）、５０ミリグラム／ｍＬのアスコルビン酸溶液、及び１００マイクロモルのモノチオグリセロール（ＭＴＧ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で補充したα−ＭＥＭで４．７×１０４細胞／ｃｍ２の密度でＯＰ９培養に添加した。ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞／ＯＰ９の共培養を、５％  ＣＯ２正常酸素圧の条件で３７℃で１０日間インキュベートし、培地の半分を４日目、６日目、及び８日目に交換した。細胞を１０日目で採取し、ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞／ＯＰ９の共培養をコラゲナーゼＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；α−ＭＥＭ中１ミリグラム／ｍＬ）で３７℃で２０分間処理し、続いて０．０５％トリプシン−０．５ミリモルＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で３７℃  １５分間処理することで単細胞浮遊液を調製した。細胞を２％  ＦＢＳ含有のリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１００マイクロメートルのセルストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）カタログ番号３５２３６０）を通してろ過し、計数を行い、流動細胞計測法に使用した。
【００５６】
流動細胞計測法による表現型分析
細胞を細胞生存能染色（商標名ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号Ｌ１０１１９）で予め染色して生細胞のみの分析を行った。細胞を０．０５％アジ化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、２％  ＦＢＳ、Ｆｃ受容体遮断溶液（商標名ＨＵＭＡＮ  ＴＲＵＳＴＡＩＮ  ＦＣＸ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、カタログ番号４２２３０１）及び２％正常マウス血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｌ２２８０）を含有するＰＢＳで調製し、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の組み合わせで標識した。ＦＡＣＳ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ［ＢＤＩＳ］（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いてＦＡＣＳＤＩＶＡ取得ソフトウェア（ＢＤＩＳ）でサンプルを分析した。リストモードファイルをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ（Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ））で分析した。下記のｍＡｂｓを使用した：ＣＤ４３−ＦＩＴＣ、ＴＲＡ−１−８５−ＰＥ、ＣＤ１１７−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、ＣＤ３４−ＰＥ／Ｃｙ７、ＣＤ３１−ＡＰＣ、ＣＤ４５−ＡｍＣｙａｎ、ＦＬｋ−１−Ｖ４５０。アイソタイプ適合対照ｍＡｂｓ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した対照が陽性染色の閾値を確立するために含まれた。
【００５７】
結果
未分化状態を厳密に維持したヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞は、抗体アイソタイプ対照に比べて、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４３、又はＣＤ４５を発現しなかった。原始の造血前駆細胞に発現すると知られているＦｌｋ−１及びＣＤ１１７の両者は、未分化ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞に発現することが分かった。ＯＰ９共培養において、およそ１１％の実行可能なヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞（ＴＲＡ−１−８５陽性）はＣＤ３４＋細胞であった。内皮細胞へ分化したヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞及び造血前駆細胞は、共通の血液内皮マーカー、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）の発現によって識別することができる。１０日間共培養した後、１１．４４％のヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞はＣＤ３１＋であり、８９％のＣＤ３４＋細胞はＣＤ３１＋（血液内皮マーカー）であった。これはｈＥＳがＣＤ３４＋細胞に分化する際に一般に見られる（Ｖｏｄｙａｎｉｋ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓｌｕｖｉｎ，Ｉｌ，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２３：Ｕｎｉｔ  ２３〜２６（２００７）。造血前駆細胞は、ＣＤ４３（ロイコシアリン；全血球増殖性マーカー）発現によって内皮細胞と区別された。１０日間共培養した後、ＣＤ４３は８％のヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞で存在し、４％がＣＤ３１＋ＣＤ４３−（内皮の可能性）、及び７％がＣＤ３１＋ＣＤ４３＋（血液生成の可能性）であった。更に、５％のＯＰ９細胞と共培養したヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞は、多系列の血液生成の可能性を有し、Ｂリンパ系細胞のみならず全血液系列への分化が可能であるＣＤ３４＋ＣＤ４３＋であった。一般に用いられるＣＤ４５全血球増殖性マーカーは、ＣＤ３４＋細胞上に発現せず、ＣＤ１１７及びＦｌｋ−１もＣＤ３４＋細胞において低かった。
【００５８】
実施例８．ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞の内胚葉分化
ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞の内胚葉分化
単細胞（実施例１で調整したヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞クローンＲＶ４−５）を１０５，０００ｖｃ／ｃｍ２でＧＥＬＴＲＥＸコーティング済み１２ウェルプレートに播種した。ＭＴＥＳＲ１培地で３日培養した後、細胞を０．１％脂肪酸なしウシ血清アルブミン（ＦＡＦ−ＢＳＡ，Ｐｒｏｌｉａｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ａｎｋｅｎｙ，ＩＡ）カタログ番号６８７００）及びＣＨＩＲ９９０２１（グリコーゲン合成酵素キナーゼ３インヒビター、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．カタログ番号０４−０００４）を加えたＲＰＭＩ  １６４０培地で３日間連続してＴＧＦβスーパーファミリータンパク質で処理した。
【００５９】
分化したヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞の表現型分析
細胞をＡＣＣＵＴＡＳＥで１２ウェルプレートから除去し、内胚葉分化の代表的な表現型マーカーを分析した。生細胞のみ分析できるように、細胞を生／死近赤外（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で予め染色した。細胞を０．０５％アジ化ナトリウム、１ミリモルのＥＤＴＡ、２％  ＦＢＳ、ＨＵＭＡＮ  ＴＲＵＳＴＡＩＮ  ＦＣＸ（Ｆｃ受容体遮断溶液）、及び２％正常マウス血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳで調製した。細胞をフィコエリトリン（ＰＥ）を結合した抗体でＣＸＣＲ４（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ，Ｉｎｃ．カタログ番号３０６５０６）に表面染色した。細胞を固定し、透過処理し、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）を結合した抗体でＳＯＸ１７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、カタログ番号ＩＣ１９２４Ａ）に染色した。ＣＸＣＲ４（中内胚葉マーカー）及びＳＯＸ１７（完全な内胚葉マーカー）は多能性細胞中の完全な内胚葉分化の解明に使用されている（Ｄ’Ａｍｏｕｒ，Ｋ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３（１２）：１５３４〜１５４１（２００５）；Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７０（７３３２）：１０５〜１０９（２０１１））ので、これらのマーカーを選択した。アイソタイプ適合対照抗体で染色した対照が陽性染色の閾値を確立するために含まれた。サンプルをフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ））を使用して分析し流動細胞計測ソフトウェア（商標名ＦＡＣＳＤＩＶＡ取得ソフトウェア、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して取得した。リストモードファイルを流動細胞計測分析ソフトウェア（商標名ＦＬＯＷＪＯ、Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．（Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ））で分析した。
【００６０】
結果
完全な内胚葉へ分化したヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞は、８０％の生細胞がＳＯＸ１７（完全な内胚葉マーカー）に陽性である結果が得られた。ＳＯＸ１７は、他の細胞系列（中胚葉、外胚葉、栄養外胚葉）に発現しない；したがって、ＳＯＸ１７タンパク質を発現する細胞は完全な内胚葉系列である。３６％の細胞はＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４（中内胚葉マーカー）にダブルポジティブであった。ＣＸＣＲ４が中胚葉で報告されているが、ＣＸＣＲ４＋ＳＯＸ１７−細胞は存在せず、細胞が完全な内胚葉細胞であることを更に実証している。未分化ｉＰＳ細胞は、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４に発現陰性のため完全な内胚葉分化の証拠を示さなかった。
【００６１】
実施例９．ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞から分化した肝細胞のＦａｈ−／−Ｒａｇ２−／−マウスへの移植
Ｆａｈ−／−マウスはチロシン代謝が欠損しており、生存するためには２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチルベンジオール）−１，３−シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）の供給を必要とする。ＮＴＢＣ中止（ＮＴＢＣ−オフ）後、Ｆａｈ−／−マウスは肝不全を起こして死んだ。野生型の初代培養肝細胞の移植によって救命できることは、生体内での再増殖及びヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞から分化した肝細胞の役割を特徴付ける有用なモデルを表わしている。免疫拒絶の可能性を減少させるために免疫不全のＦａｈ−／−Ｒａｇ２−／−マウスを移植に使用した（Ｈｕａｎｇ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７５：３８６〜３８９（２０１１））。
【００６２】
Ｆａｈ−／−Ｒａｇ２−／−マウスを飲料水中７．５ミリグラム／リットルのＮＴＢＣで飼育する。週齢８〜１２週のＦａｈ−／−Ｒａｇ２−／−マウスの脾臓にヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞から分化した肝細胞を移植した。細胞移植後にＮＴＢＣを飲料水に入れるのを止めた。移植なしのＦａｈ−／−Ｒａｇ２−／−マウスも対照としてＮＴＢＣを中止した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ方法を使用してウィンドウズ用のＳＰＳＳで生存曲線を生成した。移植後８週間経過後に、生存している細胞移植したＦａｈ−／−Ｒａｇ２−／−の後方眼窩洞から採血し、１５分間１２，０００毎分回転数で遠心分離した。生化学分析するまで血清を−８０℃で凍結した。全ビリルビン、アルブミン、血中尿素窒素、及びクレアチニンを測定した。採血後、マウスを頸椎脱臼で安楽死させ肝臓を採取して固定し、ヘマトキシリンとエオシンとで染色した。対照ＮＴＢＣ−オフのＦａｈ−／−Ｒａｇ２−／−の血液及び肝臓のサンプルを２０％体重減少後に採取した。
【００６３】
実施例１０．ｍＲＮＡ媒介によるｈＫＤＣのｉＰＳ細胞への初期化
米国特許公報第２００８／０１１２９３９号に記載された方法によって得たｈＫＤＣを、ｍＲＮＡ構築物（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、カタログ番号００−００６７））、具体的にはヒト転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、及びＬＩＮ２８をコードするｍＲＮＡで形質導入した。
【００６４】
ｈＫＤＣを解凍し、形質導入前に１継代培養した。形質導入１日前、ｈＫＤＣをトリプシン処理し６ウェルプレート（不活性化ヒト新生児包皮由来線維芽細胞（Ｇｌｏｂａｌｓｔｅｍ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、カタログ番号ＧＳＣ−３００１Ｇ又はＧＳＣ−３００１Ｍ）が予め播種された）にウェル当たり２．５×１０４細胞で、ウェル当たり２ｍＬの腎上皮増殖培地（ＲＥＧＭ、Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））に播種した。細胞を５％  ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。ヒト新生児包皮由来線維芽細胞（ＮｕＦＦ）フィーダープレートは、使用２４時間前に０．１％ゼラチンで予めコーティングした６ウェルプレートにＮｕＦＦ培養培地中２．５×１０５の密度でＮｕＦＦを播種して調製した。
【００６５】
１日目、ＲＥＧＭをアスピレートし、２００ナノグラム／ｍＬのＢ１８Ｒ（タイプＩインターフェロン受容体、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）カタログ番号３４−８１８５−８５）を含有する１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号１５０７０−０６３）で補充した２ｍＬの最適化されたリプログラミング培地（商標名ＰｌｕｒｉｔｏｎｍＲＮＡリプログラミング培養液、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．、カタログ番号００−００７０）に交換し、５％  ＣＯ２、３７℃で４時間インキュベートした。２００マイクロリットルの還元型血清培養培地（商標名Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号３１９８５−０７０）を５０マイクロリットルのｍＲＮＡカクテルが入ったバイアルに添加しｍＲＮＡトランスフェクション複合体を調製し、穏やかに混合した。２２５マイクロリットルのＯｐｔｉ−ＭＥＭと２５マイクロリットルのトランスフェクション試薬（商標名ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ＲＮＡＩＭＡＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号１３７７８０７５）とを穏やかに混合することで別の管を調製した。２本の管の中身を混合し、室温で１５分間インキュベートして、ｍＲＮＡをトランスフェクション試薬と複合させた。ｈＫＤＣをトランスファクトするために、１２０マイクロリットルのｍＲＮＡトランスフェクションを液滴で各ウェルに添加した。ｍＲＮＡトランスフェクション複合体を分布させるためにプレートを穏やかに揺り動かしてから、プレートを５％  ＣＯ２、３７℃で４時間インキュベートした。その後、ｍＲＮＡトランスフェクション複合体を含有する培養培地をアスピレートし、２００ナノグラム／ｍＬのＢ１８Ｒを含有する２ｍＬのＰｌｕｒｉｔｏｎリプログラミング培地に交換し、５％  ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。
【００６６】
トランスフェクションのステップを２日目〜５日目に更に４回繰り返した。６日目〜１７日目にトランスフェクションを更に１２回繰り返し、同じく６日目〜１７日目に細胞をＮｕＦＦ−馴化培養液に維持した。ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号１１９６５−０９２）、１０％  ｄｅｆｉｎｅｄグレードのＦＢＳ（Ａｔｌａｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）、カタログ番号Ｆ−０５００−Ａ）、ＧＬＵＴＡＭＡＸ、及びペニシリンストレプトマイシンを含有する培養液２５ｍＬ中４×１０６細胞の密度で、Ｔ７５組織培養フラスコ（０．１％ゼラチン溶液であらかじめコーティングした）に不活性化ＮｕＦＦを播種することによって、ＮｕＦＦ−馴化培養液を生成し、５％  ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。培養液をアスピレートし、細胞を１０ｍＬのＰＢＳで一回洗浄し、４ナノグラム／ｍＬのｂＦＧＦ（商標名Ｓｔｅｍｆａｃｔｏｒ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ、カタログ番号０３−０００２）及び１ｘペニシリン／ストレプトマイシンで補充した２５ｍＬのＰＬＵＲＩＴＯＮリプログラミング培地（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  Ｉｎｃ．、カタログ番号０１−００１５）に培地を交換した。５％  ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした後、ＮｕＦＦ馴化培養液を採取し−２０℃で保管した。４ナノグラム／ｍＬのＳｔｅｍｆａｃｔｏｒ塩基性ＦＧＦ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．、カタログ番号０３−０００２）及び１ｘペニシリン／ストレプトマイシンで補充した新しいＰＬＵＲＩＴＯＮ培地を加え、一晩インキュベートし、更に５日間採取し、１５０ｍＬのＮｕＦＦ馴化培養液を得た。採取した部分標本をプールし、０．２２マイクロメートルのフィルターを用いてフィルター除菌し、使用するまで−２０℃で保管した。使用前に、ＰＬＵＲＩＴＯＮ添加物（２５００Ｘ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  Ｉｎｃ．、カタログ番号０１−００１６）を１ｘ濃度に加えた。
【００６７】
トランスフェクションの期間中、コンフルエントの細胞を継代培養して、更に増殖させｉＰＳ細胞のコロニーを形成させた。これを行うために、細胞をＰＢＳで洗浄し、ウェル当たり０．５ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ  ｆｏｒ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＰＣＳ−９９９−００３）を加えて採取し、５％  ＣＯ２、３７℃で５分間インキュベートした。解離させ細胞がリリースするのを助けるためにウェルの側面を穏やかにタップして、０．５ｍＬのトリプシン中和剤（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＰＣＳ−９９９−００４）を各ウェルに加えた。細胞を１５ｍＬの円錐管に移して採取し、１ｍＬのＰＬＵＲＩＴＯＮリプログラミング培地でウェルを洗浄し、２００ｘ  ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを１ｍＬのＰＬＵＲＩＴＯＮリプログラミング培地で再懸濁し、２００ナノグラム／ｍＬのＢ１８Ｒ及び１０マイクロモルのＹ２７６３２（ＲＯＣＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  Ｉｎｃ．、カタログ番号０４−００１２）で補充した２ｍＬのＰＬＵＲＩＴＯＮリプログラミング培地を含有する新しいＮｕＦＦフィーダープレートに播種した。
【００６８】
初期化又はｉＰＳ細胞コロニーの形成を観察するために、トランスファクトされたｈＫＤＣをＮｕＦＦ馴化培養液中にＢ１８Ｒなしで３日間インキュベートし、コロニーを増殖させた。一次ｉＰＳ細胞コロニーを、形態、及び抗体（商標名ＳＴＡＩＮＡＬＩＶＥ  ＤＹＬＩＧＨＴ  ４８８  Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＴＲＡ１−８１、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．、カタログ番号０９−００６８）で無菌、ライブ染色することで識別した。「典型的な」初期化又はｉＰＳ細胞の形態を示すコロニーを手作業で拾い、１２ウェルＮｕＦＦフィーダープレートの単一ウェルに播種した。培養培地を１日一回交換した。４〜６日後、コロニーを手作業で１２ウェルプレートから拾い、６ウェルプレートに拡大した。培養培地を１日一回交換し、４〜６日毎に手作業で１：３に分割した。各ウェルからの細胞をＣＲＹＯＳＴＥＭ凍結保存液で凍結した。
【００６９】
結果
５つの初期化因子をコードするｍＲＮＡを用いたｈＫＤＣの初期化は、ｉＰＳ細胞の形態及びＴＲＡ１−８１に染色陽性を示す初期化されたコロニーの結果が得られた。
【００７０】
（概要）
全体的に、本発明者らは、結合（ウイルス性）及び非結合（非ウイルス性）方法を用いてヒト転写因子を過剰発現させることでヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞の生成を示した。これらの結果は、ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞が多能性マーカーＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、及びＮＡＮＯＧを発現し、アルカリホスファターゼに陽性染色を示すことを明示している。Ｏｃｔ４プロモーターの１００〜５００塩基対領域を調べると、ヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞は、ｈＫＤＣ親系列と比較して７つのメチル化部位にメチル化の変化を示している。
【００７１】
これらの細胞は、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の系列から誘導した細胞のタンパク質マーカーを更に呈しており、これらの初期化された細胞が分化する潜在能力を示している。特定の細胞特異性マーカーの発現は、分化プロトコルを用いた後、これらの細胞が肝細胞様の血液内皮系列へ分化し、完全な内胚葉細胞へ分化することが可能であることが示唆された。
【００７２】
本発明を特定の実施形態及び実施例を参照して説明し示してきたが、本発明は、必ずしも本明細書で示されない様々な改変並びに修飾ができることが当業者に理解されるであろう。そのため、発明の真の範囲を決定する目的では添付の特許請求の範囲のみに拠るべきである。
【００７３】
〔実施の態様〕
（１）  ＨＬＡ−Ｉ及びＣＤ  ４４の発現が陽性、かつＯｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、Ｐａｘ−２、カドヘリン−１１、ＦｏｘＤ１、ＷＴ１、Ｅｙａ１、ＨＮＦ３Ｂ、ＣＸＣ−Ｒ４、Ｓｏｘ−１７、ＥｐｏＲ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、又はＧＤＦ５のうちの少なくとも１つの発現が陽性；並びに、ＣＤ１３３及びＥ−カドヘリンの発現が陰性、かつＳｏｘ２、ＦＧＦ４、ｈＴｅｒｔ、Ｗｎｔ−４、ＳＩＸ２、又はＧＡＴＡ−４のうちの少なくとも１つの発現が陰性である、初期化した（reprogrammed）ヒト腎臓由来細胞を含む、人工多能性幹細胞。
（２）  ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、及びＮＡＮＯＧを発現する、実施態様１に記載の人工多能性幹細胞。
（３）  アルカリホスファターゼ染色に陽性である、実施態様１に記載の人工多能性幹細胞。
（４）  外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の系列の細胞に分化する、実施態様１に記載の人工多能性幹細胞。
（５）  肝細胞の細胞（hepatocyte cell）、血液内皮の細胞、及び完全な内胚葉細胞（definitive endoderm cell）に分化する、実施態様１に記載の人工多能性幹細胞。
【００７４】
（６）  ＨＬＡ−Ｉ及びＣＤ  ４４の発現が陽性、かつＯｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、Ｐａｘ−２、カドヘリン−１１、ＦｏｘＤ１、ＷＴ１、Ｅｙａ１、ＨＮＦ３Ｂ、ＣＸＣ−Ｒ４、Ｓｏｘ−１７、ＥｐｏＲ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、又はＧＤＦ５のうちの少なくとも１つの発現が陽性；並びに、ＣＤ１３３及びＥ−カドヘリンの発現が陰性、かつＳｏｘ２、ＦＧＦ４、ｈＴｅｒｔ、Ｗｎｔ−４、ＳＩＸ２、又はＧＡＴＡ−４のうちの少なくとも１つの発現が陰性である、ヒト腎臓由来細胞を提供する工程と、
ヒト転写因子ＯＣＴ４を発現するＶＳＶｇマウスレトロウイルス、ヒト転写因子ＳＯＸ２を発現するＶＳＶｇマウスレトロウイルス、ヒト転写因子ＫＬＦ４を発現するＶＳＶｇマウスレトロウイルス、及びヒト転写因子ｃ−ＭＹＣを発現するＶＳＶｇマウスレトロウイルス、のそれぞれ１つで前記ヒト腎臓由来細胞をトランスフェクトする工程と、
前記トランスフェクトされたヒト腎臓由来細胞を培養する工程と、
人工多能性幹細胞を識別する工程と、
前記ヒト腎臓由来ＩＰＳ細胞を単離する工程と、
前記人工多能性幹細胞を継代培養する工程と、
人工多能性幹細胞を提供する工程と、を含む、方法によって作製される、人工多能性幹細胞。
（７）  前記方法が、ヒト転写因子ｐ５３−ｓｈＲＮＡを発現するＶＳＶｇマウスレトロウイルスで前記ヒト腎臓由来細胞をトランスフェクトすることを更に含む、実施態様６に記載の人工多能性幹細胞。
（８）  ヒト腎臓由来細胞を提供し、Ｏｃｔ−４タンパク質をコードするｍＲＮＡ、Ｓｏｘ２タンパク質をコードするｍＲＮＡ、Ｋｌｆ４タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ｃ−ｍｙｃタンパク質をコードするｍＲＮＡ、及びＬｉｎ２８タンパク質をコードするｍＲＮＡ、のそれぞれ１つで前記ヒト腎臓由来細胞をトランスフェクトする工程と、
前記トランスフェクトされたヒト腎臓由来ｉＰＳ細胞を培養する工程と、
人工多能性幹細胞を識別する工程と、
前記人工多能性幹細胞を単離する工程と、
前記人工多能性幹細胞を継代培養する工程と、
人工多能性幹細胞を提供する工程と、を含む、方法によって作製される、人工多能性幹細胞。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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