(57)【要約】化学的二量体を使用してアデノウイルスを細胞に再標的化するための組成物および方法が提供される。具体的には、カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートおよびリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む核酸を含む組換えアデノウイルスが提供される。別の態様では、カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換えアデノウイルスが提供される。別の態様では、その実施形態を含めた本明細書において提供される組換えアデノウイルスを含む細胞が提供される。
2015511822.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートおよびリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートをコードする組換え核酸。
【請求項２】
前記カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートが、カプシドタンパク質および二量体形成剤結合剤を含む、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項３】
前記カプシドタンパク質が前記二量体形成剤結合剤に作動可能に連結している、請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項４】
前記カプシドタンパク質がアデノウイルスのカプシドタンパク質である、請求項３に記載の組換え核酸。
【請求項５】
前記アデノウイルスのカプシドタンパク質が線維タンパク質である、請求項４に記載の組換え核酸。
【請求項６】
前記二量体形成剤結合剤がＦＲＢタンパク質である、請求項３に記載の組換え核酸。
【請求項７】
前記リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートが、リガンドおよび二量体形成剤結合剤を含む、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項８】
前記リガンドが、前記二量体形成剤結合剤に作動可能に連結している、請求項７に記載の組換え核酸。
【請求項９】
前記リガンドが、細胞に結合することができる、請求項７に記載の組換え核酸。
【請求項１０】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項９に記載の組換え核酸。
【請求項１１】
前記リガンドが抗体である、請求項７に記載の組換え核酸。
【請求項１２】
前記抗体が単一ドメイン抗体である、請求項１１に記載の組換え核酸。
【請求項１３】
前記二量体形成剤結合剤がイムノフィリンタンパク質である、請求項７に記載の組換え核酸。
【請求項１４】
前記イムノフィリンタンパク質がＦＫＢＰタンパク質である、請求項１３に記載の組換え核酸。
【請求項１５】
前記ＦＫＢＰタンパク質がヒトＦＫＢＰタンパク質である、請求項１４に記載の組換え核酸。
【請求項１６】
前記ヒトＦＫＢＰタンパク質がＦＫＢＰ１２である、請求項１５に記載の組換え核酸。
【請求項１７】
請求項１から１６までの一項に記載の組換え核酸を含む組換えアデノウイルス。
【請求項１８】
前記アデノウイルスが複製する能力のないアデノウイルスである、請求項１７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１９】
前記アデノウイルスが複製する能力のあるアデノウイルスである、請求項１７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２０】
カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換えアデノウイルス。
【請求項２１】
前記カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートが二量体形成剤と結合する、請求項２０に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２２】
前記二量体形成剤が化合物である、請求項２１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２３】
前記化合物がラパマイシンである、請求項２２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２４】
前記二量体形成剤が抗がん薬である、請求項２１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２５】
前記二量体形成剤が、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートとさらに結合する、請求項２１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２６】
請求項２０から２５までのいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを含む細胞。
【請求項２７】
アデノウイルスがん細胞標的化構築物を形成する方法であって、
（ｉ）細胞に、請求項１７に記載の組換えアデノウイルスを感染させ、それにより、アデノウイルス感染細胞を形成するステップと、
（ｉｉ）該アデノウイルス感染細胞に前記組換え核酸を発現させ、それにより、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲート、およびカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換えアデノウイルスを形成するステップと、
（ｉｉｉ）該組換えアデノウイルスおよび該リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを二量体形成剤と接触させるステップと、
（ｉｖ）該組換えアデノウイルスおよび該リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを該二量体形成剤に結合させ、それにより、該アデノウイルスがん細胞標的化構築物を形成するステップと
を含む方法。
【請求項２８】
細胞を標的化する方法であって、細胞を、請求項２０から２５までのいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスと接触させるステップを含む方法。
【請求項２９】
前記細胞ががん細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
がん患者におけるがん細胞を標的化する方法であって、
（ｉ）がん患者に請求項１７に記載の組換えアデノウイルスを投与するステップと、
（ｉｉ）該組換えアデノウイルスを該がん患者における細胞に感染させ、それにより、アデノウイルス感染細胞を形成するステップと、
（ｉｉｉ）該アデノウイルス感染細胞に前記組換え核酸を発現させ、それにより、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲート、およびカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換えアデノウイルスを形成するステップと、
（ｉｖ）該がん患者に二量体形成剤を投与するステップと、
（ｖ）該組換えアデノウイルスおよび該リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを該二量体形成剤に結合させ、それにより、アデノウイルスがん細胞標的化構築物を形成するステップと、
（ｖｉ）該アデノウイルスがん細胞標的化構築物をがん細胞に結合させ、それにより、該がん患者における該がん細胞を標的化するステップと、
を含む方法。
【請求項３１】
前記細胞ががん細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が非がん細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
細胞を標的化する方法であって、
（ｉ）第１の細胞を請求項１７に記載の組換えアデノウイルスと接触させるステップと、
（ｉｉ）該組換えアデノウイルスを該第１の細胞に感染させ、それにより、アデノウイルス感染細胞を形成するステップと、
（ｉｉｉ）該アデノウイルス感染細胞に前記組換え核酸を発現させ、それにより、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲート、およびカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換えアデノウイルスを形成するステップと、
（ｉｖ）該リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートおよび該組換えアデノウイルスを二量体形成剤と接触させるステップと、
（ｖ）該組換えアデノウイルスおよび該リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを該二量体形成剤に結合させ、それにより、アデノウイルス細胞標的化構築物を形成するステップと、
（ｖｉ）該アデノウイルス細胞標的化構築物を第２の細胞に結合させ、それにより、該細胞を標的化するステップと
を含む方法。
【請求項３４】
前記第１の細胞および前記第２の細胞が生物体の一部を形成する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の細胞および前記第２の細胞が組織培養容器の一部を形成する、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出された、「配列表」、表、またはコンピュータプログラム一覧表の付録への参照
２０１３年３月１３日に作成された７８０，８５４バイト、機械形式ＩＢＭ−ＰＣ、ＭＳ−ウインドウズオペレーティングシステムのファイル９２１５９−８６８１４８＿ＳＴ２５．ＴＸＴに記載されている配列表は、これによって参照により組み込まれる。
【０００２】
アデノウイルスおよび化学二量体を用いる選択細胞の標的化
関連出願への相互参照
本願は、２０１２年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／６１０，４１６号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
がんは、毎年５０万件超の死亡の原因となっている消耗性疾患である。がんに対するより有効な選択的かつ安全な処置が深刻に必要性とされている。この蔓延した、命に関わる疾患に対する現存する処置、例えば、化学療法および外科手術では、全ての悪性細胞が排除されることはまれであり、また、多くの場合、治療的利益にまさる恐れがある有害な副作用が示される。
【０００４】
現行のがん処置の欠点の多くに対処する潜在性がある１つの手法は、腫瘍退縮性アデノウイルス療法である［Ｐｅｓｏｎｅｎ，  Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、８巻（１号）：１２〜２８頁（２０１０年）］。これらのウイルスは、がん細胞において特異的に複製するが、正常な細胞は無傷のままになるように設計される。腫瘍選択性を工学的に作製する（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）１つのやり方は、アデノウイルス感染を、腫瘍細胞において上方制御されている受容体、例えば、ＥＧＦＲファミリーメンバー（Ｚｈａｎｇ  Ｈ、Ｂｅｒｅｚｏｖ  Ａ、Ｗａｎｇ  Ｑ、Ｚｈａｎｇ  Ｇ、Ｄｒｅｂｉｎ  Ｊ、Ｍｕｒａｌｉ  Ｒら、ＥｒｂＢ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  ｆｒｏｍ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００７年；１１７巻（８号）：２０５１〜８頁、ＰＭＣＩＤ：  １９３４５７９）、ＣＥＡＣＡＭ（Ｌｉ  ＨＪ、Ｅｖｅｒｔｓ  Ｍ、Ｐｅｒｅｂｏｅｖａ  Ｌ、Ｋｏｍａｒｏｖａ  Ｓ、Ｉｄａｎ  Ａ、Ｃｕｒｉｅｌ  ＤＴら、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｕｎｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｙ  ａ  ｃｏｘｓａｃｋｉｅ／ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉ−ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｄａｐｔｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００７年；６７巻（１１号）：５３５４〜６１頁）、ＥｐＣＡＭ（Ｈａｉｓｍａ  ＨＪ、Ｐｉｎｅｄｏ  ＨＭ、Ｒｉｊｓｗｉｊｋ  Ａ、ｄｅｒ  Ｍｅｕｌｅｎ−Ｍｕｉｌｅｍａｎ  Ｉ、Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ  ＢＡ、Ｙｉｎｇ  Ｗら、Ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｉａ  ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐａｎ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＥｐＣＡＭ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １９９９年；６巻（８号）：１４６９〜７頁）、およびＨＬＡ−Ａ１／ＭＡＧＥ−Ａ１（ｄｅ  Ｖｒｉｊ  Ｊ、Ｕｉｌ  ＴＧ、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｅｎｇｅｌ  ＳＫ、Ｃｒａｍｅｒ  ＳＪ、Ｋｏｐｐｅｒｓ−Ｌａｌｉｃ  Ｄ、Ｖｅｒｗｅｉｊ  ＭＣら、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｏ  ＨＬＡ−Ａ１／ＭＡＧＥ−Ａ１−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｆｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｍｉｎｏｒ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＸ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００８年；１５巻（１３号）：９７８〜８９頁）に標的化することである。アデノウイルス標的化の種々の戦略についての総説に関しては、（Ｎｏｕｒｅｄｄｉｎｉ  ＳＣ、Ｃｕｒｉｅｌ  ＤＴ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．  ２００５年；２巻（５号）：３４１〜７頁；Ｎｉｃｋｌｉｎ  ＳＡ、Ｗｕ  Ｅ、Ｎｅｍｅｒｏｗ  ＧＲ、Ｂａｋｅｒ  ＡＨ．  Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｆｉｂｅｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００５年；１２巻（３号）：３８４〜９３頁）を参照されたい。
アデノウイルス（Ａｄ）は、自己複製する生物学的機械である。Ａｄは、タンパク質外被に包まれた３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡゲノムからなる。Ａｄは、複製するためにヒト宿主細胞を必要とする。Ａｄは、浸潤し、細胞の複製に関わる機構を乗っ取って再生し、構築されると溶解性細胞死を誘導して細胞から脱出し、周囲の細胞に拡散し、浸潤する（図１）。発端のシステムに、Ａｄの自律性および効率を模倣することに近づいたものはないが、出願人らは、Ａｄゲノムを系統的に操作して、新規のアデノウイルスを創製するための新しい戦略を開発した。今後は、Ａｄゲノムを操作することができることで、ウイルスを角で捕まえ、腫瘍に特異的な感染、複製、および細胞致死（ｃｅｌｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ）の機能がなされるように再設計することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐｅｓｏｎｅｎ，  Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、８巻（１号）：１２〜２８頁（２０１０年）
【非特許文献２】Ｚｈａｎｇ  Ｈ、Ｂｅｒｅｚｏｖ  Ａ、Ｗａｎｇ  Ｑ、Ｚｈａｎｇ  Ｇ、Ｄｒｅｂｉｎ  Ｊ、Ｍｕｒａｌｉ  Ｒら、ＥｒｂＢ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  ｆｒｏｍ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００７年；１１７巻（８号）：２０５１〜８頁、ＰＭＣＩＤ：  １９３４５７９
【非特許文献３】Ｌｉ  ＨＪ、Ｅｖｅｒｔｓ  Ｍ、Ｐｅｒｅｂｏｅｖａ  Ｌ、Ｋｏｍａｒｏｖａ  Ｓ、Ｉｄａｎ  Ａ、Ｃｕｒｉｅｌ  ＤＴら、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｕｎｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｙ  ａ  ｃｏｘｓａｃｋｉｅ／ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉ−ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｄａｐｔｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００７年；６７巻（１１号）：５３５４〜６１頁
【非特許文献４】Ｈａｉｓｍａ  ＨＪ、Ｐｉｎｅｄｏ  ＨＭ、Ｒｉｊｓｗｉｊｋ  Ａ、ｄｅｒ  Ｍｅｕｌｅｎ−Ｍｕｉｌｅｍａｎ  Ｉ、Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ  ＢＡ、Ｙｉｎｇ  Ｗら、Ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｉａ  ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐａｎ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＥｐＣＡＭ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １９９９年；６巻（８号）：１４６９〜７頁
【非特許文献５】ｄｅ  Ｖｒｉｊ  Ｊ、Ｕｉｌ  ＴＧ、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｅｎｇｅｌ  ＳＫ、Ｃｒａｍｅｒ  ＳＪ、Ｋｏｐｐｅｒｓ−Ｌａｌｉｃ  Ｄ、Ｖｅｒｗｅｉｊ  ＭＣら、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｏ  ＨＬＡ−Ａ１／ＭＡＧＥ−Ａ１−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｆｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｍｉｎｏｒ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＸ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００８年；１５巻（１３号）：９７８〜８９頁
【非特許文献６】Ｎｏｕｒｅｄｄｉｎｉ  ＳＣ、Ｃｕｒｉｅｌ  ＤＴ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．  ２００５年；２巻（５号）：３４１〜７頁
【非特許文献７】Ｎｉｃｋｌｉｎ  ＳＡ、Ｗｕ  Ｅ、Ｎｅｍｅｒｏｗ  ＧＲ、Ｂａｋｅｒ  ＡＨ．  Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｆｉｂｅｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００５年；１２巻（３号）：３８４〜９３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、アデノウイルスベクターは、その取り込みについて単一の細胞受容体に依拠しており、これによりその治療的潜在性が著しく限定されている。Ａｄ５の感染は、主に外側のウイルスカプシド上の線維タンパク質とヒト上皮細胞上のコクサッキー・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）の間の相互作用を通じて媒介される。残念ながら、間葉系の致命的な転移性腫瘍細胞などの多くのがん細胞はＣＡＲを発現しない。ウイルス複製／致死は細胞に感染する能力によって限定されるので、ＣＡＲ以外の受容体、理想的には、腫瘍細胞において特異的に上方制御されるものを介して腫瘍細胞に感染するウイルスが必要とされている。本発明は、ウイルスカプシドを、化学的アダプターを介して広範な細胞受容体に化学的に連結するウイルス性組成物および方法を提供することにより、当技術分野におけるこれらおよび他の必要性に対処する。本明細書では、感染を多数の細胞型に再標的化し、ウイルス複製に際して失われない、新規の、誘導性の、遺伝子によりコードされた化学的アダプターシステムが提供される。本明細書において提供される組成物を使用して、腫瘍退縮性ウイルスを、感染の間に種々の細胞受容体を標的化するようにカスタマイズすることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
一態様では、カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートおよびリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートをコードする組換え核酸が提供される。
【０００８】
別の態様では、その実施形態を含めた本明細書において提供される組換え核酸を含む組換えアデノウイルスが提供される。
【０００９】
別の態様では、カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換えアデノウイルスが提供される。
【００１０】
別の態様では、その実施形態を含めた本明細書において提供される組換えアデノウイルスを含む細胞が提供される。
【００１１】
別の態様では、アデノウイルスがん細胞標的化構築物を形成する方法が提供される。当該方法は、細胞に、本明細書において提供される組換えアデノウイルスを感染させ、それにより、アデノウイルス感染細胞を形成するステップを含む。アデノウイルス感染細胞に組換え核酸を発現させ、それにより、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲート、およびカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換えアデノウイルスを形成する。組換えアデノウイルスおよびリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを二量体形成剤と接触させる。組換えアデノウイルスおよびリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを二量体形成剤に結合させ、それにより、アデノウイルスがん細胞標的化構築物を形成する。
【００１２】
別の態様では、細胞を標的化する方法が提供される。当該方法は、細胞を、その実施形態を含めた本明細書において提供される組換えアデノウイルスと接触させるステップを含む。
【００１３】
別の態様では、がん患者におけるがん細胞を標的化する方法が提供される。当該方法は、がん患者に、本明細書において提供される組換えアデノウイルスを投与するステップを含む。組換えアデノウイルスをがん患者の細胞に感染させ、それにより、アデノウイルス感染細胞を形成する。アデノウイルス感染細胞に組換え核酸を発現させ、それにより、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲート、およびカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換えアデノウイルスを形成する。がん患者に二量体形成剤を投与する。組換えアデノウイルスおよびリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを二量体形成剤に結合させ、それにより、アデノウイルスがん細胞標的化構築物を形成する。アデノウイルスがん細胞標的化構築物をがん細胞に結合させ、それにより、がん患者におけるがん細胞を標的化する。
【００１４】
別の態様では、細胞を標的化する方法が提供される。当該方法は、第１の細胞を本明細書において提供される組換えアデノウイルスと接触させるステップを含む。組換えアデノウイルスを第１の細胞に感染させ、それにより、アデノウイルス感染細胞を形成する。アデノウイルス感染細胞に組換え核酸を発現させ、それにより、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲート、およびカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換えアデノウイルスを形成する。リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートおよび組換えアデノウイルスを二量体形成剤と接触させる。組換えアデノウイルスおよびリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを二量体形成剤に結合させ、それにより、アデノウイルス細胞標的化構築物を形成する。アデノウイルス細胞標的化構築物を第２の細胞に結合させ、それにより、細胞を標的化する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、腫瘍退縮性ウイルスがん療法の一般的な理論的根拠を示す図である。
【００１６】
【図２】図２は、アデノウイルスの構造的特徴およびアデノウイルスゲノムのマップを示す図であり、転写単位が枠内にあり、遺伝子が標識されている。
【００１７】
【図３Ａ】図３は、出願人らが開発したＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄ−ＳｌｉｃＲアデノウイルスゲノム操作戦略の概略を示す図である。図３Ａの上のパネル：Ａｄゲノムは、代替スプライシングによって複数の遺伝子を発現する初期転写ユニット（Ｅ１〜４）および後期転写ユニット（Ｌ１〜５）に組織化されている。矢印は、オペロンによく似た機能的組織化を伴うアデノウイルスによって使用される複数遺伝子転写単位を示す。ゲノムを転写単位および機能単位（「部分」）に分割し、プラスミドにクローニングする（図３Ａの下のパネル）。部分のライブラリーは、変異体、代替の血清型および導入遺伝子を含む。系統的な多部位特異的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再構築（ＡｄｓｅｍｂｌｙまたはＡｄ−ＳＬＩＣ）およびウイルスの再構成を実施する。図３Ｂ：アデノウイルスゲノム（図３Ｂの上のパネル）を構成成分に分離する（図３Ｂの上から２番目のパネル）。変異誘発を個々のベクターに対して実施して、ライブラリー部分を組み立てて（図３Ｂの上から３番目のパネル）、ウイルスをｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブルして（図３Ｂの下のパネル）新規のアデノウイルスを生成する。
【図３Ｂ】図３は、出願人らが開発したＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄ−ＳｌｉｃＲアデノウイルスゲノム操作戦略の概略を示す図である。図３Ａの上のパネル：Ａｄゲノムは、代替スプライシングによって複数の遺伝子を発現する初期転写ユニット（Ｅ１〜４）および後期転写ユニット（Ｌ１〜５）に組織化されている。矢印は、オペロンによく似た機能的組織化を伴うアデノウイルスによって使用される複数遺伝子転写単位を示す。ゲノムを転写単位および機能単位（「部分」）に分割し、プラスミドにクローニングする（図３Ａの下のパネル）。部分のライブラリーは、変異体、代替の血清型および導入遺伝子を含む。系統的な多部位特異的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再構築（ＡｄｓｅｍｂｌｙまたはＡｄ−ＳＬＩＣ）およびウイルスの再構成を実施する。図３Ｂ：アデノウイルスゲノム（図３Ｂの上のパネル）を構成成分に分離する（図３Ｂの上から２番目のパネル）。変異誘発を個々のベクターに対して実施して、ライブラリー部分を組み立てて（図３Ｂの上から３番目のパネル）、ウイルスをｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブルして（図３Ｂの下のパネル）新規のアデノウイルスを生成する。
【００１８】
【図４】図４は、アデノウイルス線維タンパク質三量体のリボン表示である。Ｎ末端（左側）はカプシドの表面に結合しており、Ｃ末端にウイルスコアから最も遠く離れたノブドメイン（ｋｎｏｂ  ｄｏｍａｉｎ）がある。ノブドメインの柔軟なＨ１ループが線維に新しい性質を与えるためのペプチド挿入のために使用されている。
【００１９】
【図５】図５は、免疫抑制性抗腫瘍薬であり抗生物質であるラパマイシンおよびラパログＡＰ２１９６７の構造を示す図である。
【００２０】
【図６】図６は、構成成分の組み立ておよび組合せを利用して新規のアデノウイルスにおける組合せ変異を系統的に創製するゲノムアセンブリ戦略を示す図である。
【００２１】
【図７】図７は、Ａｄ１２２が、ＦＲＢが挿入された線維を発現している生存可能なアデノウイルスであることを示す図である。Ａｄ−１２２は、ＦＲＢが挿入された線維を発現している生存可能なアデノウイルスである。図７Ａ：感染の４８時間後の、Ａｄ−１２２を感染させた２９３Ｅ４細胞および野生型Ａｄ５を感染させた２９３Ｅ４細胞からの溶解物に対する、抗線維抗体４Ｄ２（Ａｂｃａｍ）を使用したウエスタンブロットである。図７Ｂ：有意なＣＰＥを示す、Ａｄ−１２２を感染させた２９３Ｅ４細胞の感染の４８時間後の明視野およびＧＦＰ蛍光画像である。
【００２２】
【図８】図８は、Ａｄ５  Ｅ３領域からＦＲＢ−線維およびＦＫＢＰを発現させるための遺伝子配置を示す図である。図８Ａ）野生型Ａｄ５  Ｅ３領域を示す。図８Ｂ）線維遺伝子へのＦＲＢ挿入を示す。図８Ｃ）Ｆｕｒｉｎ−２Ａ自己切断（ａｕｔｏ−ｃｌｅａｖａｇｅ）配列を使用したＦＫＢＰの共翻訳発現を示す。図８Ｄ）線維転写物上のＩＲＥＳエレメントを使用したＦＫＢＰの共転写発現を示す。図８Ｅ）Ｅ３Ｂにコードされるタンパク質（ＲＩＤα、ＲＩＤβ、１４．７ｋ）のＦＫＢＰへの置換えを示す。
【００２３】
【図９】図９は、ＡＤ−１７８が感染の間にＦＫＢＰを発現することを示す図である。感染させた２９３Ｅ４細胞から感染の２４時間後および６０時間後に溶解物を採取し、抗線維抗体（図９の上のパネル）および抗ＦＫＢＰ抗体ａｂ２９１８（Ａｂｃａｍ；図９の下のパネル）を用いてプローブした。
【００２４】
【図１０】図１０は、ラパマイシン／ＶＨＨ−ＦＫＢＰおよびＶＨＨ標的と複合体を形成したＦＲＢ−線維ノブドメインのリボンモデルを示す図である。Ａｄ５ノブ三量体（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＫＮＢ）では、ＦＲＢドメインがＶＨＨのＣ末端融合としてＦＫＢＰ（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＮＳＧ）と複合体を形成し、その標的（ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＥＢＡ）と結合している。図１０Ａ）「上から下に」見たモデルである。図１０Ｂ）「横から」見たモデルであり、ＶＨＨがＦＫＢＰのＮ末端と融合している場合、ＶＨＨの結合境界面がウイルス粒子に対して外を向くことが示されている。
【００２５】
【図１１】図１１は、感染させた２９３Ｅ４細胞における線維およびＣＥＡＶＨＨ−ＦＫＢＰの局在化を検出するための免疫蛍光法を示す図である。２９３Ｅ４細胞をＡｄ−１７７（ＣＥＡＶＨＨ−ＦＫＢＰ、ＦＲＢ−線維）またはＡｄ−１９９（ＣＥＡＶＨＨ−ＦＫＢＰ、野生型線維）のいずれかで感染させ、感染の３０時間後に５００ｎＭのラパマイシンまたは溶媒のみ（ＥｔＯＨ）を添加した。細胞を３６時間固定し、抗線維抗体４Ｄ２または抗ＦＢＫＰ抗体ａｂ２９１８（Ａｂｃａｍ）を用いて染色した。
【００２６】
【図１２】図１２は、ＦＫＢＰ融合タンパク質が、線維遺伝子上の５’ＩＲＥＳによって制御されると検出可能に蓄積しないことを示す図である。２９３Ｅ４細胞に組換えアデノウイルスを感染させた。細胞を回収し、可溶性タンパク質を、免疫ブロットによって線維およびＦＫＢＰの発現についてプローブした。（図１２の上のパネル）感染の間にＦＲＢ−線維が蓄積する。（図１２の下のパネル）ＶＨＨ−ＦＫＢＰ（約３２ｋＤａ）は検出できない。
【００２７】
【図１３】図１３は、ＭＤＡ  ＭＢ  ４６８のラパマイシン誘導性ＥＧＦＲ再標的化Ａｄ５による感染の代表的なＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ画像である。ＧＦＰレポーター発現Ａｄ−１７８を、５００ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で、２９３Ｅ４細胞に感染させることによって調製し、上清を使用して培養液中のＭＤＡ  ＭＢ  ４６８に感染させた。図１３の左側のパネルは、希釈していないウイルス上清を用いた感染を示し、図１３の右側のパネルは、ウイルス上清の１／１６希釈物を用いた感染を示す。
【００２８】
【図１４】図１４は、ＭＤＡ  ＭＢ  ４５３のラパマイシン誘導性ＥＧＦＲ再標的化Ａｄ５による感染の代表的なＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ画像である。ＧＦＰレポーター発現Ａｄ−１７８を、５００ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で、２９３Ｅ４細胞に感染させることによって調製し、上清を使用して培養液中のＭＤＡ  ＭＢ  ４５３に感染させた。図１４の左側のパネルは、希釈していないウイルス上清を用いた感染を示し、図１４の右側のパネルは、ウイルス上清の１／８希釈物を用いた感染を示す。
【００２９】
【図１５】図１５は、ＭＤＡ  ＭＢ  ２３１のラパマイシン誘導性ＥＧＦＲ再標的化Ａｄ５による感染の代表的なＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ画像である。ＧＦＰレポーター発現Ａｄ−１７８を、５００ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で、２９３Ｅ４細胞に感染させることによって調製し、上清を使用して培養液中のＭＤＡ  ＭＢ  ２３１に感染させた。図１５の左側のパネルは、希釈していないウイルス上清を用いた感染を示し、図１５の右側のパネルは、ウイルス上清の１／８希釈物を用いた感染を示す。
【００３０】
【図１６】図１６は、ＨＳ５７８Ｔのラパマイシン誘導性ＥＧＦＲ再標的化Ａｄ５による感染の代表的なＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ画像である。ＧＦＰレポーター発現Ａｄ−１７８を、５００ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で、２９３Ｅ４細胞に感染させることによって調製し、上清を使用して培養液中のＨＳ５７８Ｔに感染させた。図１６の左側のパネルは、希釈していないウイルス上清を用いた感染を示し、図１６の右側のパネルは、ウイルス上清の１／４希釈物を用いた感染を示す。
【００３１】
【図１７】図１７は、Ｕ８７のラパマイシン誘導性ＥＧＦＲ再標的化Ａｄ５による感染の代表的なＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ画像である。ＧＦＰレポーター発現Ａｄ−１７８を、５００ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で、２９３Ｅ４細胞に感染させることによって調製し、上清を使用して培養液中のＵ８７に感染させた。図１７の左側のパネルは、希釈していないウイルス上清を用いた感染を示し、図１７の右側のパネルは、ウイルス上清の１／８希釈物を用いた感染を示す。
【００３２】
【図１８】図１８は、ラパマイシン誘導性ＥＧＦＲ再標的化アデノウイルスによる乳がん細胞系のパネルの感染を示す図である。ＧＦＰレポーター発現Ａｄ−１７８を、５００ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で、２９３Ｅ４細胞に感染させることによって調製し、上清を５０倍に希釈して、培養液中の細胞に感染させるために使用した。％感染細胞を、感染の２４時間後にＧＦＰ陽性核をＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ分析することによって決定した。ヒストグラムにおけるカラムの対のそれぞれは、ラパマイシンの非存在下（左側のカラム）または存在下（右側のカラム）で調製したＧＦＰレポーター発現Ａｄ−１７８を用いた乳がん細胞系の感染を示す。ヒストグラムは、左から右に、それぞれＭＤＡ  ＭＢ４６８細胞の感染（ラパマイシンなし、９０％；＋ラパマイシン、９６％）、ＭＤＡ  ＭＢ４１５細胞の感染（ラパマイシンなし、６９％；＋ラパマイシン、５５％）、ＭＤＡ  ＭＢ４５３の感染（ラパマイシンなし、１６％；＋ラパマイシン、７３％）、ＭＤＡ  ＭＢ２３１の感染（ラパマイシンなし、１６％；＋ラパマイシン、７８％）、ＢＴＳ４９の感染（ラパマイシンなし、３７％；＋ラパマイシン、７４％）、およびＨＳ５７８の感染（ラパマイシンなし、０％；＋ラパマイシン、２８％）を示す。
【００３３】
【図１９】図１９は、ラパマイシン誘導性ＥＧＦＲ再標的化アデノウイルスによるがん細胞系のパネルの感染を示す図である。ＧＦＰレポーター発現Ａｄ−１７８を、５００ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で、２９３Ｅ４細胞に感染させることによって調製し、上清を５０倍に希釈して、培養液中の種々のがん細胞に感染させるために使用した。％感染細胞を、感染の２４時間後にＧＦＰ陽性核をＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ分析することによって決定した。ヒストグラムにおけるカラムの対のそれぞれは、ラパマイシンの非存在下（左側のカラム）または存在下（右側のカラム）で調製したＧＦＰレポーター発現Ａｄ−１７８を用いたがん細胞系の感染を示す。ヒストグラムは、左から右に、それぞれＵ２ＯＳ骨肉腫細胞系の感染（ラパマイシンなし、５２％；＋ラパマイシン、２４％）、Ｈ１２９９肺癌細胞系の感染（ラパマイシンなし、７８％；＋ラパマイシン、７８％）、Ａ５４９肺癌細胞系の感染（ラパマイシンなし、３７％；＋ラパマイシン、６６％）、およびＵ８７神経膠芽腫細胞系の感染（ラパマイシンなし、１１％；＋ラパマイシン、５０％）を示す。
【００３４】
【図２０】図２０は、Ａｄ−１７８を用いてＥＧＦＲ再標的化してＭＤＡ  ＭＢ  ４５３を感染させるためのラパマイシン濃度最適化を示す図である。２９３Ｅ４細胞の感染の間に種々のラパマイシン濃度の存在下または非存在下でＧＦＰレポーター発現Ａｄ−１７８を調製し、上清を使用して培養液中のＭＤＡ  ＭＢ  ４５３細胞を感染させた。％感染細胞を、感染の２４時間後にＧＦＰ陽性細胞をＦＡＣＳ分析することによって決定した。パーセントＧＦＰ陽性細胞は、それぞれ、０ｎＭのラパマイシンで５４．１３％、１０ｎＭのラパマイシンで５８．９６％、２５ｎＭのラパマイシンで６８．２３％、５０ｎＭのラパマイシンで７６．７５％、１００ｎＭのラパマイシンで７０．７３％、および５００ｎＭのラパマイシンで７１．７６％であった。
【００３５】
【図２１Ａ】図２１は、Ａｄ−１７８のＥＧＦＲ依存性感染を示す図である。感染を、ＦＡＣＳにより、アデノウイルスにより送達されたＧＦＰ遺伝子を発現している細胞、それぞれ＞３０ｋ事象を計数して定量化した。図２１Ａ：線維における遺伝子によりコードされたＦＲＢドメインの挿入およびＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰ融合タンパク質を有するアデノウイルスを、５０ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で調製し、ｓｈＲＮＡ媒介性ＥＧＦＲノックダウンを伴って、または伴わずにＭＤＡ  ＭＢ  ４５３細胞に感染させるために使用した。図２１Ｂ：線維における遺伝子によりコードされたＦＲＢドメインの挿入のみを有するアデノウイルスを５０ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で調製し、ｓｈＲＮＡ媒介性ＥＧＦＲノックダウンを伴って、または伴わずにＭＤＡ  ＭＢ  ４５３細胞に感染させるために使用した。図２１Ｃ：タンパク質免疫ブロットによる、ＭＤＡ  ＭＢ  ４５３細胞における安定なｓｈＲＮＡ媒介性ＥＧＦＲノックダウンの検証。
【図２１Ｂ】図２１は、Ａｄ−１７８のＥＧＦＲ依存性感染を示す図である。感染を、ＦＡＣＳにより、アデノウイルスにより送達されたＧＦＰ遺伝子を発現している細胞、それぞれ＞３０ｋ事象を計数して定量化した。図２１Ａ：線維における遺伝子によりコードされたＦＲＢドメインの挿入およびＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰ融合タンパク質を有するアデノウイルスを、５０ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で調製し、ｓｈＲＮＡ媒介性ＥＧＦＲノックダウンを伴って、または伴わずにＭＤＡ  ＭＢ  ４５３細胞に感染させるために使用した。図２１Ｂ：線維における遺伝子によりコードされたＦＲＢドメインの挿入のみを有するアデノウイルスを５０ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で調製し、ｓｈＲＮＡ媒介性ＥＧＦＲノックダウンを伴って、または伴わずにＭＤＡ  ＭＢ  ４５３細胞に感染させるために使用した。図２１Ｃ：タンパク質免疫ブロットによる、ＭＤＡ  ＭＢ  ４５３細胞における安定なｓｈＲＮＡ媒介性ＥＧＦＲノックダウンの検証。
【図２１Ｃ】図２１は、Ａｄ−１７８のＥＧＦＲ依存性感染を示す図である。感染を、ＦＡＣＳにより、アデノウイルスにより送達されたＧＦＰ遺伝子を発現している細胞、それぞれ＞３０ｋ事象を計数して定量化した。図２１Ａ：線維における遺伝子によりコードされたＦＲＢドメインの挿入およびＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰ融合タンパク質を有するアデノウイルスを、５０ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で調製し、ｓｈＲＮＡ媒介性ＥＧＦＲノックダウンを伴って、または伴わずにＭＤＡ  ＭＢ  ４５３細胞に感染させるために使用した。図２１Ｂ：線維における遺伝子によりコードされたＦＲＢドメインの挿入のみを有するアデノウイルスを５０ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で調製し、ｓｈＲＮＡ媒介性ＥＧＦＲノックダウンを伴って、または伴わずにＭＤＡ  ＭＢ  ４５３細胞に感染させるために使用した。図２１Ｃ：タンパク質免疫ブロットによる、ＭＤＡ  ＭＢ  ４５３細胞における安定なｓｈＲＮＡ媒介性ＥＧＦＲノックダウンの検証。
【００３６】
【図２２】図２２は、Ａｄ−１７８のラパマイシン誘導性ＥＧＦＲ再標的化によりＨＳ５７８Ｔの細胞致死が増強されることを示す図である。感染の９日後の感染していない細胞に対する％代謝活性についてのＷＳＴ−１試薬を使用したＣＰＥアッセイを示す。図の凡例に示されている時点で５０ｎＭのラパマイシンを細胞に添加した。示されているデータ点は３連の試料の平均である。
【００３７】
【図２３−１】図２３は、対照Ａｄ、またはＦＫＢＰと融合したリガンドをコードするＡｄによる細胞系の標的化感染を示す図である。ウイルスは、ＦＫＢＰと融合したＣＥＡＣＡＭ単一ドメイン抗体断片（ＣＥＡＶＨＨ−ＦＫＢＰ）、ＦＫＢＰと融合したＥＧＦＲ単一ドメイン抗体断片（ＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰ）、またはＦＫＢＰと融合した防御抗原のドメイン４（Ｄ４−ＦＫＢＰ）のいずれかをコードした。アデノウイルスを、１００ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で、２９３Ｅ４細胞に感染させることによって調製し、上清を使用して、標的とする細胞系を感染させた：図２３Ａは、ＭＤＡ  ＭＢ２３１の感染を示す。図２３Ｂは、ＭＤＡ  ＭＢ４５３の感染を示す。図２３Ｃは、ＭＤＡ  ＭＢ４６８の感染を示す。図２３Ｄは、ＨＳ５７８Ｔの感染を示す。図２３Ｅは、ＢＴ４７４の感染を示す。図２３Ｆは、ＭＣＦ７の感染を示す。図２３Ｇは、ＣＨＯ  Ｋ１の感染を示す。図２３Ｈは、ＣＨＯ  Ｒ１．１の感染を示す。カラムの上の数字は、ＧＦＰ（すなわち感染した）細胞の％を示す。
【図２３−２】図２３は、対照Ａｄ、またはＦＫＢＰと融合したリガンドをコードするＡｄによる細胞系の標的化感染を示す図である。ウイルスは、ＦＫＢＰと融合したＣＥＡＣＡＭ単一ドメイン抗体断片（ＣＥＡＶＨＨ−ＦＫＢＰ）、ＦＫＢＰと融合したＥＧＦＲ単一ドメイン抗体断片（ＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰ）、またはＦＫＢＰと融合した防御抗原のドメイン４（Ｄ４−ＦＫＢＰ）のいずれかをコードした。アデノウイルスを、１００ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で、２９３Ｅ４細胞に感染させることによって調製し、上清を使用して、標的とする細胞系を感染させた：図２３Ａは、ＭＤＡ  ＭＢ２３１の感染を示す。図２３Ｂは、ＭＤＡ  ＭＢ４５３の感染を示す。図２３Ｃは、ＭＤＡ  ＭＢ４６８の感染を示す。図２３Ｄは、ＨＳ５７８Ｔの感染を示す。図２３Ｅは、ＢＴ４７４の感染を示す。図２３Ｆは、ＭＣＦ７の感染を示す。図２３Ｇは、ＣＨＯ  Ｋ１の感染を示す。図２３Ｈは、ＣＨＯ  Ｒ１．１の感染を示す。カラムの上の数字は、ＧＦＰ（すなわち感染した）細胞の％を示す。
【図２３−３】図２３は、対照Ａｄ、またはＦＫＢＰと融合したリガンドをコードするＡｄによる細胞系の標的化感染を示す図である。ウイルスは、ＦＫＢＰと融合したＣＥＡＣＡＭ単一ドメイン抗体断片（ＣＥＡＶＨＨ−ＦＫＢＰ）、ＦＫＢＰと融合したＥＧＦＲ単一ドメイン抗体断片（ＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰ）、またはＦＫＢＰと融合した防御抗原のドメイン４（Ｄ４−ＦＫＢＰ）のいずれかをコードした。アデノウイルスを、１００ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で、２９３Ｅ４細胞に感染させることによって調製し、上清を使用して、標的とする細胞系を感染させた：図２３Ａは、ＭＤＡ  ＭＢ２３１の感染を示す。図２３Ｂは、ＭＤＡ  ＭＢ４５３の感染を示す。図２３Ｃは、ＭＤＡ  ＭＢ４６８の感染を示す。図２３Ｄは、ＨＳ５７８Ｔの感染を示す。図２３Ｅは、ＢＴ４７４の感染を示す。図２３Ｆは、ＭＣＦ７の感染を示す。図２３Ｇは、ＣＨＯ  Ｋ１の感染を示す。図２３Ｈは、ＣＨＯ  Ｒ１．１の感染を示す。カラムの上の数字は、ＧＦＰ（すなわち感染した）細胞の％を示す。
【００３８】
【図２４−１】図２４は、ＡＰ２１９６７および変異体ＦＲＢドメイン含有Ａｄを使用した細胞系の標的化感染を示す図である。アデノウイルスを、１００ｎＭのラパマイシンまたは１００ｎＭのＡＰ２１９６７の存在下または非存在下で、２９３Ｅ４細胞に感染させることによって調製し、上清を使用して、標的とする細胞系を感染させた。図２４Ａは、ＭＤＡ  ＭＢ４５３の感染を示す。図２４Ｂは、ＭＤＡ  ＭＢ４６８の感染を示す。図２４Ｃは、ＭＤＡ  ＨＳ５７８Ｔの感染を示す。図２４Ｄは、ＭＤＡ  ＭＣＦ７の感染を示す。カラムの上の数字は、ＧＦＰ（すなわち感染した）細胞の％を示す。
【図２４−２】図２４は、ＡＰ２１９６７および変異体ＦＲＢドメイン含有Ａｄを使用した細胞系の標的化感染を示す図である。アデノウイルスを、１００ｎＭのラパマイシンまたは１００ｎＭのＡＰ２１９６７の存在下または非存在下で、２９３Ｅ４細胞に感染させることによって調製し、上清を使用して、標的とする細胞系を感染させた。図２４Ａは、ＭＤＡ  ＭＢ４５３の感染を示す。図２４Ｂは、ＭＤＡ  ＭＢ４６８の感染を示す。図２４Ｃは、ＭＤＡ  ＨＳ５７８Ｔの感染を示す。図２４Ｄは、ＭＤＡ  ＭＣＦ７の感染を示す。カラムの上の数字は、ＧＦＰ（すなわち感染した）細胞の％を示す。
【００３９】
【図２５】図２５は、ＡＰ２１９６７および変異体ＦＲＢドメイン含有Ａｄを使用した細胞系の標的化感染を示す図である。カプシドにＦＲＢ変異体を含有するＥＧＦＲ標的化アデノウイルスを、さまざまな濃度のＡＰ２１９６７または１００ｎＭのラパマイシンを用いて、２９３Ｅ４細胞に感染させることによって調製し、上清を使用してＭＤＡ  ＭＢ  ４５３を感染させた。カラムの上の数字は、ＧＦＰ（すなわち感染した）細胞の％を示す。
【００４０】
【図２６】図２６は、リガンド−ＦＫＢＰ融合体であるＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰを異所性に発現させた細胞系の標的化感染を示す図である。リガンド−ＦＫＢＰ融合体（または対照としてＧＦＰ）を２９３Ｅ４細胞において一過性に発現させ、Ａｄ−１２２を感染させた。ウイルスを１００ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で調製し、上清を使用してＭＤＡ  ＭＢ  ２３１に感染させた。カラムの上の数字は、ＧＦＰ（すなわち感染した）細胞の％を示す。
【００４１】
【図２７Ａ】図２７Ａ〜Ｃは、対照Ａｄ、またはＦＫＢＰと融合したリガンドをコードするＡｄによる細胞系の標的化感染を示す図である。アデノウイルスを、１００ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で、２９３Ｅ４細胞に感染させることによって調製し、上清を使用して、標的とする細胞系を感染させた。図２７Ａの上のパネルは、ＭＤＡ  ＭＢ２３１の感染を示す。図２７Ａの中央のパネルは、ＭＤＡ  ＭＢ４５３の感染を示す。図２７Ａの下のパネルは、ＭＤＡ  ＭＢ４６８の感染を示す。図２７Ｂの上のパネルは、ＨＳ５７８Ｔの感染を示す。図２７Ｂの中央のパネルは、ＢＴ４７４の感染を示す。図２７Ｂの下のパネルは、ＭＣＦ７の感染を示す。図２７Ｃの上のパネルは、ＣＨＯ  Ｋ１の感染を示す。図２７Ｃの下のパネルは、ＣＨＯ  Ｒ１．１の感染を示す。カラムの上の数字は、ＧＦＰ（すなわち感染した）細胞の％を示す。
【図２７Ｂ】図２７Ａ〜Ｃは、対照Ａｄ、またはＦＫＢＰと融合したリガンドをコードするＡｄによる細胞系の標的化感染を示す図である。アデノウイルスを、１００ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で、２９３Ｅ４細胞に感染させることによって調製し、上清を使用して、標的とする細胞系を感染させた。図２７Ａの上のパネルは、ＭＤＡ  ＭＢ２３１の感染を示す。図２７Ａの中央のパネルは、ＭＤＡ  ＭＢ４５３の感染を示す。図２７Ａの下のパネルは、ＭＤＡ  ＭＢ４６８の感染を示す。図２７Ｂの上のパネルは、ＨＳ５７８Ｔの感染を示す。図２７Ｂの中央のパネルは、ＢＴ４７４の感染を示す。図２７Ｂの下のパネルは、ＭＣＦ７の感染を示す。図２７Ｃの上のパネルは、ＣＨＯ  Ｋ１の感染を示す。図２７Ｃの下のパネルは、ＣＨＯ  Ｒ１．１の感染を示す。カラムの上の数字は、ＧＦＰ（すなわち感染した）細胞の％を示す。
【図２７Ｃ】図２７Ａ〜Ｃは、対照Ａｄ、またはＦＫＢＰと融合したリガンドをコードするＡｄによる細胞系の標的化感染を示す図である。アデノウイルスを、１００ｎＭのラパマイシンの存在下または非存在下で、２９３Ｅ４細胞に感染させることによって調製し、上清を使用して、標的とする細胞系を感染させた。図２７Ａの上のパネルは、ＭＤＡ  ＭＢ２３１の感染を示す。図２７Ａの中央のパネルは、ＭＤＡ  ＭＢ４５３の感染を示す。図２７Ａの下のパネルは、ＭＤＡ  ＭＢ４６８の感染を示す。図２７Ｂの上のパネルは、ＨＳ５７８Ｔの感染を示す。図２７Ｂの中央のパネルは、ＢＴ４７４の感染を示す。図２７Ｂの下のパネルは、ＭＣＦ７の感染を示す。図２７Ｃの上のパネルは、ＣＨＯ  Ｋ１の感染を示す。図２７Ｃの下のパネルは、ＣＨＯ  Ｒ１．１の感染を示す。カラムの上の数字は、ＧＦＰ（すなわち感染した）細胞の％を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のそのポリマー、ならびにその相補物を指す。この用語は、公知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基または結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を含有する核酸、合成核酸、天然に存在する核酸、天然に存在しない核酸、参照核酸と同様の結合特性を有する核酸、および参照ヌクレオチドと同様に代謝される核酸を包含する。そのような類似体の例としては、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
【００４３】
「Ａｄ５」および「アデノウイルスゲノム」という用語は、本明細書で使用される場合、配列番号１０８に記載の核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を指す。
【００４４】
別段の指定のない限り、特定の核酸配列は、明確に示される配列だけでなく、保存的に修飾されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補配列も暗黙のうちに包含する。詳細には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって実現することができる（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９巻：５０８１頁（１９９１年）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０巻：２６０５〜２６０８頁（１９８５年）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ  ８巻：９１〜９８頁（１９９４年））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換的に使用される。
【００４５】
特定の核酸配列は、「スプライスバリアント」も暗黙のうちに包含する。同様に、核酸にコードされる特定のタンパク質は、その核酸のスプライスバリアントにコードされる任意のタンパク質を暗黙のうちに包含する。「スプライスバリアント」は、その名称が示すように、遺伝子の代替スプライシングの産物である。転写後に、最初の核酸転写物は、異なる（代替の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライシングされ得る。スプライスバリアントが産生される機構は変動するが、エキソンの代替スプライシングを含む。その同じ核酸から、読み通し（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）転写によって生じる代替のポリペプチドもこの定義に包含される。この定義には、上記スプライス産物の組換え型を含めたスプライシング反応の任意の産物が含まれる。カリウムチャネルスプライスバリアントの例がＬｅｉｃｈｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３巻（５２号）：３５０９５〜３５１０１頁（１９９８年）において考察されている。
【００４６】
所望の治療的な遺伝子のコード配列および制御配列を含有する適切なベクターの構築には、当技術分野においてよく理解されている標準のライゲーション技法および制限技法を用いることができる（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２年）を参照されたい）。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドは、所望の形態に切断すること、調整すること、および再ライゲーションすることができる。
【００４７】
核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結している」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結している；プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、その配列に作動可能に連結している；またはリボソーム結合部位は、それが、翻訳が容易になるように位置している場合、コード配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結している」とは、連結しているＤＮＡ配列が互いに近くにあり、また、分泌リーダーの場合では、近接しており、読み取り相（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。連結は、都合のよい制限部位におけるライゲーションによって実現される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の実施に従って使用する。
【００４８】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関して、「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを下記の初期状態のパラメータで用いて、または手動のアラインメントおよび目視検査（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトなどを参照されたい）によって測定したところ、同じである２つ以上の配列またはサブシーケンス、または同じアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の百分率（すなわち、比較ウィンドウまたは示された領域にわたり最大の対応について比較しアラインメントした場合、特定の領域にわたって約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性）を有する２つ以上の配列またはサブシーケンスを指す。そのような配列はそこで「実質的に同一」といわれる。この定義は、試験配列の相補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）も指す、またはそれに適用することができる。この定義は、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列も包含する。下記の通り、好ましいアルゴリズムはギャップなどを説明することができる。少なくとも約２５アミノ酸またはヌクレオチドの長さの領域にわたって同一性が存在することが好ましい、または５０〜１００アミノ酸またはヌクレオチドの長さの領域にわたって同一性が存在することがより好ましい。
【００４９】
配列比較のために、一般には、１つの配列が、試験配列を比較するための参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要であればサブシーケンス座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期状態のプログラムパラメータを使用することができる、あるいは、代替のパラメータを指定することができることが好ましい。次いで上記配列比較アルゴリズムにより、上記プログラムパラメータに基づいて、上記参照配列と比較した上記試験配列についてのパーセント配列同一性が算出される。
【００５０】
「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用される場合、配列を、同じ数の連続した位置の参照配列と、その２つの配列を最適にアラインメントした後に比較することができる、２０から６００まで、通常約５０〜約２００、より通常には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続した位置の数のうちの任意の１つのセグメントを参照することを含む。比較するために配列をアラインメントする方法は当技術分野で周知である。比較するための最適な配列のアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２巻：４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８巻：４４３頁（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動のアラインメントおよび目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５年、追補）を参照されたい）によって行うことができる。
【００５１】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９７７年）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）に記載されている。本発明の核酸およびタンパク質についてのパーセント配列同一性を決定するために、本明細書に記載のパラメータを用いてＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を使用する。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、当技術分野で公知の通り、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列内の同じ長さのワードとアラインメントした際にいくらかの正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満たすかのいずれかの、クエリ配列内の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。これらの最初の近傍ワードヒット（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｈｉｔ）は、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するための種としての機能を果たす。累積アラインメントスコアが増加し得る限りは上記ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（残基の一致する対についてのリワード（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して上記累積スコアを算出する。各方向へのワードヒットの伸長は、上記累積アラインメントスコアが、その最大達成値から数量Ｘまで低下するとき；上記累積スコアが、１つまたは複数のネガティブスコアリング（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｃｏｒｉｎｇ）残基アラインメントが蓄積したことによってゼロ以下になるとき；または、いずれかの配列の末端に到達するときに停止する。上記ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、およびＸにより、上記アラインメントの感度およびスピードが決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）では、初期状態としてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムで、初期状態としてワード長３、および期待値（Ｅ）１０、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：１０９１５頁（１９８９年）を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を用いる。
【００５２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が天然に存在するアミノ酸に対応する人工的な化学的模倣物であるアミノ酸のポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸のポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸のポリマーにあてはまる。
【００５３】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに上記天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号にコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化合物を指す。
【００５４】
アミノ酸は、本明細書ではそれらの一般に公知の３文字記号によってまたはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されている１文字記号のいずれかによって称することができる。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般に認められている１文字コードによって称することができる。
【００５５】
「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方にあてはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾されたバリアントとは、同一または基本的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または上記核酸が基本的に同一の配列に対するアミノ酸配列をコードしない場合の核酸を指す。遺伝暗号の縮重が原因で、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによりアラニンが特定される全ての位置で、コードされるポリペプチドを変化させることなく、上記コドンを、記載されているその対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は、保存的に修飾された変異の１つの種である「サイレント変異」である。本明細書におけるポリペプチドをコードする核酸配列の全ても同様に、上記核酸の可能性のあるサイレント変異の全てを説明する。核酸の各コドン（普通はメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および普通はトリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除いて）を改変して機能的に同一の分子をもたらすことができることは、当業者には理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異のそれぞれは、記載されている配列のそれぞれに、発現産物に関しては、潜在的に含まれるが、実際のプローブ配列に関しては、そうではない。
【００５６】
アミノ酸配列に関して、コードされる配列における単一のアミノ酸または低百分率のアミノ酸を変化させる、付加するまたは欠失させる核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、その変更によりアミノ酸が化学的に同様のアミノ酸で置換される「保存的に修飾されたバリアント」であることが当業者には理解される。機能的に同様のアミノ酸をもたらす保存置換の表は当技術分野で周知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間ホモログ、および対立遺伝子に追加され、それを排除するものではない。
【００５７】
以下の８群はそれぞれ、互いに保存置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４年）を参照されたい）。
【００５８】
「組換え」という用語は、例えば、細胞、ウイルス、核酸、タンパク質、またはベクターを参照して使用される場合、その細胞、ウイルス、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸またはタンパク質の導入またはネイティブな核酸またはタンパク質の変更によって改変されていること、またはその細胞が、そのように改変された細胞に由来する細胞であることを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、ネイティブな（非組換え）形態の細胞においては見いだされない遺伝子を発現する、または別の方法で異常に発現される、低発現である、もしくは全く発現されないネイティブな遺伝子を発現する。
【００５９】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という句は、プローブが、一般には核酸の複合混合物（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｉｘｔｕｒｅ）中のその標的サブシーケンスとハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況では異なる。より長い配列は、特により高い温度でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ」（１９９３年）に見いだされる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義済みのイオン強度、ｐＨにおける特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択する。上記Ｔｍは、上記標的と相補的な上記プローブの５０％が平衡状態（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、上記プローブの５０％が平衡状態で占有される）でその標的配列とハイブリダイズする温度（定義済みのイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度において）である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することによって実現することもできる。選択的ハイブリダイゼーションまたは特異的ハイブリダイゼーションについて、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍であり、バックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍であることが好ましい。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下の通りであってよい：５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％のＳＤＳ、４２℃でインキュベートすること、または、５×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ、６５℃でインキュベートし、０．２×ＳＳＣ、および０．１％のＳＤＳ中、６５℃で洗浄すること。
【００６０】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、それでも実質的に同一である。これは、例えば、上記遺伝暗号により許容される最大のコドンの縮重を用いて核酸のコピーを創製する場合に生じる。そのような場合では、上記核酸は、一般には中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」としては、４０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳの緩衝液中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣ中、４５℃での洗浄が挙げられる。陽性のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも２倍である。同様のストリンジェンシーの条件をもたらすために代替のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を利用することができることは、当業者には容易に理解される。ハイブリダイゼーションのパラメータを決定するための追加の手引きは多数の参照、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓにおいて提供される。
【００６１】
ＰＣＲに関して、低ストリンジェンシーの増幅のためには約３６℃の温度が典型的であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに応じて約３２℃から４８℃の間で変動し得る。高ストリンジェンシーのＰＣＲ増幅のためには、約６２℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーのアニーリング温度は、上記プライマーの長さおよび特異性に応じて約５０℃から約６５℃までの範囲であり得る。高ストリンジェンシーの増幅および低ストリンジェンシーの増幅の両方に対する典型的なサイクル条件は、９０℃〜９５℃で３０秒間〜２分間の変性相、３０秒間〜２分間続くアニーリング相、および約７２℃で１〜２分間にわたる伸長相を含む。低ストリンジェンシーの増幅反応および高ストリンジェンシーの増幅反応についてのプロトコールおよび手引きは、例えば、Ｉｎｎｉｓら（１９９０年）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎ．Ｙ．）において提供される。
【００６２】
「トランスフェクション」、「形質導入」、「トランスフェクトすること」または「形質導入すること」という用語は、互換的に使用することができ、核酸分子またはタンパク質を細胞に導入するプロセスと定義される。ウイルスによらない方法またはウイルスに基づく方法を使用して核酸を細胞に導入する。核酸分子は、完全なタンパク質またはその機能性部分をコードする配列であってよい。一般には、核酸ベクターはタンパク質の発現（例えば、プロモーター、転写開始部位など）に必要なエレメントを含む。ウイルスによらないトランスフェクションの方法としては、核酸分子を細胞に導入するための送達系としてウイルスＤＮＡまたはウイルス粒子を使用しない任意の適切な方法が挙げられる。例示的なウイルスによらないトランスフェクションの方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、熱ショックによるトランスフェクション、マグネトフェクション（ｍａｇｎｅｔｉｆｅｃｔｉｏｎ）および電気穿孔が挙げられる。ウイルスに基づく方法については、任意の有用なウイルスベクターを本明細書に記載の方法において使用することができる。ウイルスベクターの例としては、これだけに限定されないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。いくつかの態様では、アデノウイルスベクターを当技術分野で周知の標準の手順に従って使用して、核酸分子を細胞に導入する。「トランスフェクション」または「形質導入」という用語は、外部環境由来の細胞にタンパク質を導入することも指す。一般には、タンパク質の形質導入またはトランスフェクションは、細胞膜を横断することができるペプチドまたはタンパク質を対象のタンパク質に付着させることに依拠する。例えば、Ｆｏｒｄら（２００１年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８巻：１〜４頁およびＰｒｏｃｈｉａｎｔｚ（２００７年）Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４巻：１１９〜２０頁を参照されたい。
【００６３】
トランスフェクトされた遺伝子の発現は、宿主細胞において一過性にまたは安定に起こり得る。「一過性の発現」の間、トランスフェクトされた核酸は宿主細胞のゲノムには組み込まれず、細胞分裂の間に娘細胞に伝達されない。その発現はトランスフェクトされた細胞に限られるので、遺伝子の発現は時間と共に失われる。対照的に、トランスフェクトされた遺伝子の安定な発現は、遺伝子を、トランスフェクトされた細胞に選択における利点を付与する別の遺伝子と共トランスフェクトした場合に起こり得る。そのような選択における利点は、細胞に提示されている特定の毒素に対する抵抗性であってよい。トランスフェクトされた遺伝子の発現は、さらに、宿主ゲノムへのトランスポゾン媒介性挿入によって達成することができる。トランスポゾン媒介性挿入の間、遺伝子は、宿主ゲノムへの挿入ならびにその後の切除を可能にする２つのトランスポゾンリンカー配列の間に、予測可能な様式で置かれる。
【００６４】
「ＦＫＢＰ」または「ＦＫＢＰタンパク質またはポリペプチド」とは、本明細書で言及される場合、ＦＫＢＰタンパク質の天然に存在する形態、またはＦＫＢＰタンパク質の活性（例えば、ＦＫＢＰと比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％以内の活性）を維持するそのバリアントのいずれをも包含する。一部の実施形態では、バリアントは、配列全体または配列の一部（例えば、５０個、１００個、１５０個または２００個の連続的なアミノ酸部分）にわたって、配列番号６６に記載の天然に存在するＦＫＢＰタンパク質と比較して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００６５】
「ＦＲＢ」または「ＦＲＢタンパク質またはポリペプチド」とは、本明細書で言及される場合、ＦＲＢタンパク質の天然に存在する形態、またはＦＲＢタンパク質の活性（例えば、ＦＲＢと比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％以内の活性）を維持するそのバリアントのいずれをも包含する。一部の実施形態では、バリアントは、配列全体または配列の一部（例えば、５０個、１００個、１５０個または２００個の連続的なアミノ酸部分）にわたって、配列番号６９に記載の天然に存在するＦＲＢタンパク質と比較して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００６６】
「ＥＧＦＲ」とは、配列番号２１に記載のアミノ酸配列に対応する上皮増殖因子受容体を指す。
【００６７】
「ＶＨＨ」とは、特異的な抗原（例えば、ＥＧＦＲ）に選択的に結合することができる単一の単量体可変性抗体ドメインからなる単一ドメイン抗体を指す。ＶＨＨ単一ドメイン抗体は、ラクダ科の動物に見いだされる重鎖抗体から工学的に作製することができる。ＶＨＨまたはＶＨＨという用語は、全体を通して互換的に使用され、当技術分野におけるそれらの一般的な意味に従って使用される。「ＥＧＦＲ  ＶＨＨ」または「ＥＧＦＲ  ＶＨＨタンパク質」とは、本明細書において提供される場合、ＥＧＦＲに特異的に結合するＶＨＨ単一ドメイン抗体を指す。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ  ＶＨＨは、配列番号４に記載の配列を有する。さらなる実施形態では、ＥＧＦＲ  ＶＨＨは、ＦＫＢＰに作動可能に連結して、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを形成する。一部のさらなる実施形態では、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは配列番号６に記載の配列を有する。
【００６８】
「ＣＥＡ」または「ＣＥＡＣＡＭ５」とは、本明細書において提供される場合、当技術分野でＣＤ６６としても公知の癌胎児性抗原関連細胞接着分子５を指す。「ＣＥＡ  ＶＨＨ」または「ＣＥＡ  ＶＨＨタンパク質」とは、本明細書において提供される場合、ＣＥＡに特異的に結合するＶＨＨ単一ドメイン抗体を指す。一部の実施形態では、ＣＥＡ  ＶＨＨは配列番号１に記載の配列を有する。さらなる実施形態では、ＣＥＡ  ＶＨＨは、ＦＫＢＰに作動可能に連結してリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを形成する。一部のさらなる実施形態では、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する。
【００６９】
「防御抗原ドメイン４（Ｄ４）タンパク質」とは、本明細書において提供される場合、配列番号９４に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ防御抗原ドメイン４を指す。一部の実施形態では、Ｄ４は、ＦＫＢＰに作動可能に連結して、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを形成する。一部のさらなる実施形態では、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する。
【００７０】
「対照」試料または値とは、試験試料と比較するための参照、通常は既知の参照としての機能を果たす試料を指す。例えば、試験試料を試験状態から、例えば、試験化合物の存在下で取得し、既知の状態から、例えば、試験化合物の非存在下（陰性対照）で、または既知化合物の存在下（陽性対照）での試料と比較することができる。対照は、いくつかの試験または結果から収集された平均値を表してもよい。対照は、任意の数のパラメータを評価するために設計することができることが当業者には理解されよう。例えば、対照は、治療的利益を、薬理学的データ（例えば、半減期）または治療上の尺度（例えば、副作用の比較）に基づいて比較するために考案することができる。当業者は、いずれの対照が所与の状況において有益であるかを理解し、対照値との比較に基づいてデータを解析することができる。対照は、データの有意性を決定するためにも有益である。例えば、対照において所与のパラメータについての値が広範に異なる場合、試験試料における変動は有意であるとみなされない。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、白血病、癌腫および肉腫を含めた、哺乳動物に見いだされる全種類のがん、新生物、または悪性腫瘍を指す。例示的ながんとしては、脳がん、乳がん、子宮頸部がん、結腸がん、頭頸部がん、肝がん、腎がん、肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、肉腫、胃がん、子宮がんおよび髄芽腫が挙げられる。さらなる例としては、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、がん、悪性膵臓インスリノーマ（ｉｎｓｕｌａｎｏｍａ）、悪性カルチノイド、膀胱がん、前癌皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、神経芽細胞腫、食道がん、泌尿生殖器がん、悪性高カルシウム血症、子宮体がん、副腎皮質がん、膵内分泌腺および膵外分泌腺の新生物、ならびに前立腺がんが挙げられる。
【００７２】
「白血病」という用語は、広範には造血臓器の進行性の悪性疾患を指し、一般に、血液および骨髄における白血球およびそれらの前駆体の増殖および発生の変形を特徴とする。白血病は、一般に、（１）疾患の持続時間および特性−急性または慢性；（２）関与する細胞の種類；骨髄系（ｍｙｅｌｏｉｄ）（骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ））、リンパ系（リンパ性）、または単球性；および（３）血液中の異常な細胞の数が増加するか増加しないか−白血病性または無白血病性（亜白血病性）に基づいて臨床的に分類される。Ｐ３８８白血病モデルは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗白血病活性を予測するものとして広範に認められている。Ｐ３８８アッセイにおいて試験陽性の化合物は、一般に、処置されている白血病の種類にかかわらずｉｎ  ｖｉｖｏでいくらかのレベルの抗白血病活性を示すと考えられている。したがって、本発明は、白血病を処置する方法、および好ましくは、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、無白血病性白血病、白血球血症性白血病（ｌｅｕｋｏｃｙｔｈｅｍｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、好塩基球性白血病、芽細胞白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、好酸球性白血病、グロス白血病（Ｇｒｏｓｓ’  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、有毛細胞白血病、血球母細胞性白血病（ｈｅｍｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、血球芽細胞性白血病（ｈｅｍｏｃｙｔｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、組織球性白血病（ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄顆粒球性白血病（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病（Ｎａｅｇｅｌｉ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ’ｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、および未分化細胞性白血病（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）を処置する方法を包含する。
【００７３】
「肉腫」という用語は、概して、胚の結合組織のような物質でできている腫瘍を指し、一般に、線維状物質または均一な物質に埋め込まれた密に固まった（ｐａｃｋｅｄ）細胞で構成される。抗新生物性チオール結合性ミトコンドリアオキシダントと抗がん剤の組み合わせを用いて処置することができる肉腫としては、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アバーネシー肉腫（Ａｂｅｍｅｔｈｙ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ  ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、胞状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫（ｃｈｌｏｒｏｍａ  ｓａｒｃｏｍａ）、絨毛癌、胎生期肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫（Ｗｉｌｍｓ’ｔｕｍｏｒ  ｓａｒｃｏｍａ）、子宮内膜肉腫、間質肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫（ｆａｓｃｉａｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、線維芽細胞肉腫（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ）、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ）、Ｂ細胞の免疫芽球肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球肉腫、イエンセン肉腫（Ｊｅｎｓｅｎ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ）、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫（Ｋｕｐｆｆｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｏｍａ  ｓａｒｃｏｍａ）、傍骨性肉腫（ｐａｒｏｓｔｅａｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、網状赤血球肉腫（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ）、ラウス肉腫、漿液嚢腫性肉腫（ｓｅｒｏｃｙｓｔｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ）、滑膜肉腫、および毛細血管拡張性肉腫（ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｌｔｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ）が挙げられる。
【００７４】
「黒色腫」という用語は、皮膚および他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を意味すると解釈される。抗新生物性チオール結合性ミトコンドリアオキシダントと抗がん剤の組み合わせを用いて処置することができる黒色腫としては、例えば、末端部黒子黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫（Ｃｌｏｕｄｍａｎ’ｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、Ｓ９１黒色腫、ハーディングパッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫（ｓｕｂｕｎｇａｌ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、および表在拡大型黒色腫が挙げられる。
【００７５】
「癌腫」という用語は、周囲の組織に浸潤し、転移を生じさせる傾向がある、上皮細胞でできている悪性の新しい成長物を指す。抗新生物性チオール結合性ミトコンドリアオキシダントと抗がん剤の組み合わせを用いて処置することができる例示的な癌腫としては、例えば、細葉癌腫（ａｃｉｎａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、細葉状癌腫（ａｃｉｎｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌腫、腺腫様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｕｍ）、副腎皮質癌腫、肺胞癌腫、肺胞細胞癌腫、基底細胞癌腫（ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、類基底細胞癌腫、基底有棘細胞癌腫、細気管支肺胞癌腫、細気管支癌腫、気管支原性癌腫、大脳様癌腫（ｃｅｒｅｂｒｉｆｏｒｍ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆管細胞癌腫、絨毛癌腫、膠様癌腫、面皰癌腫、体癌腫（ｃｏｒｐｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、篩状癌腫（ｃｒｉｂｒｉｆｏｒｍ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、鎧状癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｅｎ  ｃｕｉｒａｓｓｅ）、皮膚癌腫、円柱状癌腫（ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、円柱細胞癌腫、腺管癌腫、緻密癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｄｕｒｕｍ）、胎生期癌腫、脳様癌腫、類表皮癌腫（ｅｐｉｅｒｍｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮腺様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｅ  ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、外方増殖性癌腫（ｅｘｏｐｈｙｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、潰瘍癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｅｘ  ｕｌｃｅｒｅ）、線維性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｆｉｂｒｏｓｕｍ）、ゼラチン状癌（ｇｅｌａｔｉｎｉｆｏｒｎｉ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膠様癌腫（ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌腫（ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、腺癌（ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、顆粒膜細胞癌腫、毛母癌腫（ｈａｉｒ−ｍａｔｒｉｘ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、血液様癌腫（ｈｅｍａｔｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝細胞癌腫、ヒュルトレ細胞癌腫、ヒアリン癌腫（ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、副腎様癌腫（ｈｙｐｅｍｅｐｈｒｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳児胎生期癌腫（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮内癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）、表皮内癌腫、上皮内癌腫（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロンペシェール癌腫（Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ’ｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クルチツキー細胞癌腫、大細胞癌腫、レンズ状癌腫（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫性癌腫（ｌｉｐｏｍａｔｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、リンパ上皮癌（ｌｙｍｐｈｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、髄様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌腫（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌腫、モール癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｏｌｌｅ）、粘液性癌腫、粘液分泌性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液細胞癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、粘液性類表皮癌腫、粘液癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液性癌腫、粘液腫性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｙｘｏｍａｔｏｄｅｓ）、鼻咽腔癌腫、燕麦細胞癌腫、骨化性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ）、類骨癌腫（ｏｓｔｅｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳頭状癌腫、門脈周囲性癌腫（ｐｅｒｉｐｏｒｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前浸潤癌、有棘細胞癌（ｐｒｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粥状癌腫（ｐｕｌｔａｃｅｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎臓の腎細胞癌腫、予備細胞癌腫（ｒｅｓｅｒｖｅ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肉腫様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｓａｒｃｏｍａｔｏｄｅｓ）、シュナイダー癌（ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、硬性癌腫、陰嚢癌腫、印環細胞癌腫、単純癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、小細胞癌腫、ソラノイド癌腫（ｓｏｌａｎｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、球状細胞癌腫（ｓｐｈｅｒｏｉｄａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、紡錘体細胞癌腫、海綿様癌腫、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ストリング癌腫（ｓｔｒｉｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、毛細血管拡張性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃｕｍ）、毛細血管拡張様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移行上皮癌、結節癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節癌腫（ｔｕｂｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣状癌腫、および絨毛癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｖｉｌｌｏｓｕｍ）が挙げられる。
【００７６】
「治療有効用量または量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ  ｏｒ  ａｍｏｕｎｔ）」とは、本明細書では、それが投与されるものに効果を生じる用量を意味する。その正確な用量および処方は処置の目的に依存し、当業者は公知の技法を使用して確かめることができる（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（１〜３巻、１９９２年）；Ｌｌｏｙｄ、Ｔｈｅ  Ａｒｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９年）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｇｅｎｎａｒｏ編（２００３年）、およびＰｉｃｋａｒ、Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９年）を参照されたい）。
【００７７】
「薬学的に許容される塩」または「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、本明細書に記載の化合物に見いだされる特定の置換基に応じて、比較的非毒性の酸または塩基を用いて調製される活性化合物の塩を含むことを意味するする。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を有する場合、中性の形態のそのような化合物を十分な量の所望の塩基と、そのままで、または適切な不活性溶媒中で接触させることによって塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、有機アミノ塩、またはマグネシウム塩、または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を有する場合、中性の形態のそのような化合物を、十分な量の所望の酸と、そのままで、または適切な不活性溶媒中で接触させることによって酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｃａｒｂｏｎｉｃ）、リン酸、一水素リン酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ）、二水素リン酸（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ）、硫酸、一水素硫酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｓｕｌｆｕｒｉｃ）、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などのような無機酸に由来する酸付加塩、ならびに、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸（ｐ−ｔｏｌｙｌｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、クエン酸、酒石酸、およびメタンスルホン酸などのような比較的非毒性の有機酸に由来する塩が挙げられる。アルギン酸塩（ａｒｇｉｎａｔｅ）などのようなアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸（ｇａｌａｃｔｕｎｏｒｉｃ）のような有機酸の塩も包含される（例えば、Ｂｅｒｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６６巻：１〜１９頁（１９７７年）を参照されたい）。ある特定の本発明の化合物は、その化合物を塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに変換することを可能にする塩基性および酸性の官能基を含有する。当業者に公知の他の薬学的に許容されるキャリアは、本発明に適している。
【００７８】
「被験体」、「個体」または「患者」とは、本明細書では互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物としては、これだけに限定されないが、マウス、サル、ヒト、農場動物、競技動物、および愛玩動物が挙げられる。組織、細胞およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて得られるまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されたそれらの生物学的実体の後代も包含される。
ＩＩ．組成物
【００７９】
本明細書では、とりわけ、広範な異なる細胞型（例えばがん細胞）を感染させるために有用なアデノウイルス組成物が提供される。例えば、本明細書において提供される組成物を使用して、アデノウイルス感染を腫瘍細胞において上方制御されている受容体（例えば、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＥｒｂＢ）に再標的化することができる。その実施形態を含めた本明細書において提供される組成物を使用して、２種以上の受容体を通じて腫瘍細胞に感染することができる組換えアデノウイルスを設計することによって、腫瘍の不均一性を克服することができる。本明細書において提供されるウイルス組成物は、化学的二量体形成剤（例えば、ラパマイシン）の存在下で二量体形成し、それにより、三元複合体を形成することができるポリペプチド結合対（表２において列挙されている通り、例えば、ＦＫＢＰおよびＦＲＢ）を発現する。三元複合体により、ウイルスが特異的な細胞表面受容体に結合することが可能になる。三元複合体の構成成分は、完全にまたは部分的にアデノウイルスゲノムによりコードされ得、したがって、ウイルス複製の間に失われず、ウイルスのその後の再感染の能力がもたらされる。したがって、一態様では、カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートおよびリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートをコードする組換え核酸が提供される。カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは、ウイルスカプシドタンパク質（例えば、線維）に作動可能に連結した二量体形成剤結合剤（例えば、ＦＲＢ）を含む。本明細書で提供される二量体形成剤結合剤は、二量体形成剤に結合することができる作用剤である。二量体形成剤結合剤としては、これだけに限定することなく、タンパク質、化合物または小分子が挙げられる。一部の実施形態では、二量体形成剤結合剤は、ＦＲＢタンパク質である。二量体形成剤結合剤の非限定的な例は、本明細書において提供される表２に記載されている。二量体形成剤結合剤と二量体形成剤の結合は、水素結合、静電相互作用、疎水性力およびファンデルワールス力などの非共有結合性の分子間相互作用を通じて起こり得る。カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは、ウイルスカプシドタンパク質を含む。カプシドという用語は、ウイルスの殻を形成する任意の構成成分（例えば、カプシドタンパク質またはポリペプチド）を指し、カプシドは、これらの構成成分の１つまたは複数を含んでよい。カプシドは、ウイルスの殻の任意の適切な構造的な構成要素を含む。一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、アデノウイルスのカプシドタンパク質である。カプシドタンパク質の非限定的な例は、Ｌ３  ＩＩ（ヘキソン）（例えば、カプシドの三角面を形成する主要な構造タンパク質をコードする）、Ｌ１  ＩＩＩａ（例えば、カプシドの安定化を補助する副次的な構造タンパク質をコードする）、Ｌ２  ＩＩＩ（ペントン）（例えば、線維が突出するカプシドの頂点を形成する主要な構造タンパク質をコードする）、Ｌ２  ｐＶＩＩ（例えば、ヒストンＨ３との相同性を有し、カプシド内のウイルスＤＮＡと会合するコア構造タンパク質をコードする）、およびＬ５  ＩＶ（線維）（例えば、ペントンベースから伸長し、受容体の結合に関与する主要な構造タン��ク質をコードする）である。一部の実施形態では、アデノウイルスのカプシドタンパク質は、線維タンパク質である。
【００８０】
細胞において発現すると、二量体形成剤結合剤とウイルスカプシドタンパク質がカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを形成し、これは、二量体形成剤結合剤（例えば、ＦＲＢ）を通じて二量体形成剤（例えば、ラパマイシン）に結合することができ、カプシドタンパク質（例えば、線維）によってウイルスカプシドに組み入れられる。したがって、一部の実施形態では、カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは、カプシドタンパク質および二量体形成剤結合剤を含む。他の実施形態では、カプシドタンパク質は、二量体形成剤結合剤に作動可能に連結している。二量体形成剤との結合を通じて、カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートと接続することができる。リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは、第２の二量体形成剤結合剤（例えば、ＦＫＢＰ）に作動可能に連結した細胞表面受容体に特異的なリガンド（例えば、ＥＧＦＲ  ＶＨＨ）を含む。本明細書で提供されるリガンドは、細胞の表面で発現する分子と結合する能力を有するタンパク質である。リガンドおよび対応する細胞受容体の非限定的な例は表３に記載されている。一部の実施形態では、リガンドはＥＧＦＲ  ＶＨＨタンパク質である。さらなる実施形態では、二量体形成剤結合剤はＦＫＢＰである。一部の実施形態では、リガンドはＣＥＡ  ＶＨＨタンパク質である。さらなる実施形態では、二量体形成剤結合剤はＦＫＢＰである。一部の実施形態では、リガンドは、防御抗原ドメイン４（Ｄ４）タンパク質である。さらなる実施形態では、二量体形成剤結合剤はＦＫＢＰである。一部の実施形態では、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは、リガンドおよび二量体形成剤結合剤を含む。一部の実施形態では、リガンドは、二量体形成剤結合剤に作動可能に連結している。一部の実施形態では、リガンドは抗体である。一部のさらなる実施形態では、抗体は、単一ドメイン抗体である。一部の実施形態では、複数のリガンドが二量体形成剤結合剤に作動可能に連結しており、複数のリガンドは個別に異なる。複数のリガンドは、二量体形成剤結合剤の一方または両方の末端に作動可能に連結していてよい。一部の実施形態では、複数のリガンドは、二量体形成剤結合剤の一方または両方の末端にタンデムに作動可能に連結している。一部の実施形態では、二量体形成剤結合剤は、イムノフィリンタンパク質である。一部のさらなる実施形態では、イムノフィリンタンパク質は、ＦＫＢＰタンパク質である。一部のさらなる実施形態では、ＦＫＢＰタンパク質は、ヒトＦＫＢＰタンパク質である。一部のさらなる実施形態では、ヒトＦＫＢＰタンパク質はＦＫＢＰ１２である。他の実施形態では、リガンドは、細胞に結合することができる。他の実施形態では、細胞は、腫瘍細胞である。
【００８１】
本明細書では、とりわけ、上記の組換え核酸を発現している組換えアデノウイルスが提供される。したがって、別の態様では、その実施形態を含めた本明細書において提供される組換え核酸を含む組換えアデノウイルスが提供される。一部の実施形態では、アデノウイルスは、複製する能力のない（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）アデノウイルスである。他の実施形態では、アデノウイルスは、複製する能力のある（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）アデノウイルスである。アデノウイルスが複製する能力のあるアデノウイルスである場合、アデノウイルスは、特異的な細胞表面受容体（例えば、ＥＧＦＲ）に結合することによって細胞に感染し、前記細胞の内側で複製し、それにより、さらなる細胞に感染することができる新しいウイルスの後代を産生することができる。対照的に、複製する能力のないアデノウイルスは、特異的な細胞受容体に結合することによって細胞に進入し、前記細胞の内側でアデノウイルスゲノムを発現することができる。しかし、複製する能力のないウイルスは、新しいウイルスの後代を産生するために必要な遺伝子を欠き、したがって、その後のさらなる細胞への感染を行うことができない。
【００８２】
別の態様では、カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換えアデノウイルスが提供される。上記の通り、カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは、二量体形成剤結合剤（例えば、ＦＲＢ）に作動可能に連結したカプシドタンパク質（例えば、線維）を含む。したがって、二量体形成剤結合剤（例えば、ＦＲＢ）と二量体形成剤（例えば、ラパマイシン）の結合により、組換えアデノウイルスが二量体形成剤に接続される。したがって、カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換えアデノウイルスは、二量体形成剤に結合することができる。本明細書で提供される二量体形成剤は、カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートの二量体形成剤結合剤およびリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートの二量体形成剤結合剤に結合することができる作用剤である。一部の実施形態では、二量体形成剤は、カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートの二量体形成剤結合剤に結合する。二量体形成剤は、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートの二量体形成剤結合剤およびリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートの二量体形成剤結合剤に結合することができる。したがって、一部の実施形態では、二量体形成剤は、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートとさらに結合している。二量体形成剤は、水素結合、静電相互作用、疎水性力およびファンデルワールス力などの非共有結合性の分子間相互作用を通じて二量体形成剤結合剤に結合することができる。一部の実施形態では、二量体形成剤は、共有結合により二量体形成剤結合剤に結合する。本明細書において提供される二量体形成剤は、天然に存在する物質（例えば、ラパマイシン、アブシジン酸）または合成物質（例えば、小分子、化合物）であってよい。本明細書で提供される本発明による二量体形成剤の例は表２に列挙されている。一部の実施形態では、二量体形成剤は化合物である。一部のさらなる実施形態では、化合物はラパマイシンである。ラパマイシンとは、通例の意味では、ＣＡＳ登録番号５３１２３−８８−９を指す。ラパマイシンは、ｍＴＯＲキナーゼを阻害し、免疫抑制剤および抗がん処置として使用される。一部のさらなる実施形態では、二量体形成剤はラパログである。本明細書で提供されるラパログは、細胞のｍＴＯＲキナーゼ活性を阻害しないラパマイシン類似体である。いくつかの別の実施形態では、ラパログはＡＰ２１９６７である。一部の実施形態では、二量体形成剤は抗がん薬である。
【００８３】
上記の通り、本明細書において提供される組成物は、カプシド−二量体形成剤結合剤およびリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換え核酸を含む組換えアデノウイルスを含む。したがって、組換えアデノウイルスは、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートをさらに含んでよい。他の実施形態では、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを異所性に発現させる。リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを異所性に発現させる場合、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートをコードする核酸は、組換えアデノウイルスに含まれる組換え核酸の一部を形成しない。リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを異所性に発現させる場合、これは、組換えアデノウイルスで感染させた細胞のゲノムによりコードされることができる。
【００８４】
一部の実施形態では、組換えアデノウイルスは、複数のリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含み、各リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは異なってよい。例えば、組換えアデノウイルスが複数のリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む場合、組換えアデノウイルスは、第１のリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲート、第２のリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートおよび第３のリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含んでよく、各リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは異なるものである。したがって、第１のリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは、第１のリガンドおよび第１の二量体形成剤結合剤を含んでよく、第２のリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは、第２のリガンドおよび第２の二量体形成剤結合剤を含んでよく、第１のリガンドは第２のリガンドとは異なり、第１の二量体形成剤結合剤は第２の二量体形成剤結合剤と同じである、または異なる。例えば、第１のリガンド−ＥＧＦＲ  ＶＨＨは第１の二量体形成剤結合剤ＦＫＢＰに作動可能に連結していてよく、第２のリガンドＣＥＡ  ＶＨＨは、第２の二量体形成剤結合剤ＡＢ１またはＦＫＢＰに作動可能に連結していてよい。
【００８５】
さらに、組換えアデノウイルスは、複数のカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含んでよく、各カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは異なってよい。例えば、組換えアデノウイルスが複数のカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む場合、組換えアデノウイルスは、第１のカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲート、第２のカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートおよび第３のカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含んでよく、各カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは異なるものである。したがって、第１のカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは第１のカプシドタンパク質および第１の二量体形成剤結合剤を含んでよく、第２のカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは第２のカプシドタンパク質および第２の二量体形成剤結合剤を含んでよく、第１のカプシドタンパク質および第２のカプシドタンパク質は同じであっても異なってもよく、第１の二量体形成剤結合剤および第２の二量体形成剤結合剤は同じであっても異なってもよい。例えば、第１のカプシドタンパク質線維は第１の二量体形成剤結合剤ＦＲＢに作動可能に連結していてよく、第２のカプシドタンパク質線維は第２の二量体形成剤結合剤ＰＹＬ１に作動可能に連結していてよい。したがって、一実施形態では、組換えアデノウイルスは、第１のカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲート（例えば、線維／ＦＲＢ）、第１のリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲート（例えば、ＥＧＦＲ  ＶＨＨ／ＦＫＢＰ）、第２のカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲート（例えば、線維／ＰＹＬ１）および第２のリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲート（例えば、ＣＥＡ  ＶＨＨ／ＡＢ１）を含む。第１の二量体形成剤（すなわちラパマイシン）の存在下で、第１のカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートおよび第１のリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは、ＦＲＢおよびＦＫＢＰとラパマイシンの結合を通じて接続される。第２の二量体形成剤（すなわちアブシジン酸）の存在下で、第２のカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートおよび第２のリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートは、ＡＢ１およびＰｙｌ１とアブシジン酸の結合を通じて接続される。したがって、ラパマイシンの存在下では、組換えアデノウイルスはＥＧＦ受容体を発現している細胞に感染し、アブシジン酸の存在下では、同じウイルスが、ＣＥＡを発現している細胞に感染することができる。したがって、同じ組換えアデノウイルスが、投与される二量体形成剤の存在に応じて異なる細胞型に感染することができる。
【００８６】
別の態様では、その実施形態を含めた本明細書において提供される組換えアデノウイルスを含む細胞が提供される。一部の実施形態では、細胞は、がん患者におけるがん細胞である。他の実施形態では、細胞は、がん患者における非がん細胞である。一部の実施形態では、細胞は、生物体の細胞である。一部のさらなる実施形態では、生物体は、哺乳動物である。一部のさらなる実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。他の実施形態では、細胞は、培養容器中の細胞である。一部のさらなる実施形態では、細胞は、形質転換された細胞である。
ＩＩＩ．方法
【００８７】
別の態様では、アデノウイルスがん細胞標的化構築物を形成する方法が提供される。当該方法は、細胞に、本明細書において提供される組換えアデノウイルスを感染させ、それにより、アデノウイルス感染細胞を形成するステップを含む。アデノウイルス感染細胞に組換え核酸を発現させ、それにより、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲート、およびカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換えアデノウイルスを形成する。組換えアデノウイルスおよびリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを二量体形成剤と接触させる。組換えアデノウイルスおよびリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを二量体形成剤に結合させ、それにより、アデノウイルスがん細胞標的化構築物を形成する。上記の通り、組換え核酸は、複数のカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートおよびリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含んでよく、それにより、組換え核酸を発現しているアデノウイルスが複数の異なる細胞表面受容体に結合することが可能になる。
【００８８】
別の態様では、細胞を標的化する方法が提供される。当該方法は、細胞を、その実施形態を含めた本明細書において提供される組換えアデノウイルスと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、細胞は、がん細胞である。
【００８９】
別の態様では、がん患者におけるがん細胞を標的化する方法が提供される。当該方法は、がん患者に、本明細書において提供される組換えアデノウイルスを投与するステップを含む。組換えアデノウイルスをがん患者の細胞に感染させ、それにより、アデノウイルス感染細胞を形成する。アデノウイルス感染細胞に組換え核酸を発現させ、それにより、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲート、およびカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換えアデノウイルスを形成する。がん患者に二量体形成剤を投与する。組換えアデノウイルスおよびリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを二量体形成剤に結合させ、それにより、アデノウイルスがん細胞標的化構築物を形成する。アデノウイルスがん細胞標的化構築物をがん細胞に結合させ、それにより、がん患者におけるがん細胞を標的化する。一部の実施形態では、細胞は、がん細胞である。他の実施形態では、細胞は、非がん細胞である。
【００９０】
別の態様では、細胞を標的化する方法が提供される。当該方法は、第１の細胞を本明細書において提供される組換えアデノウイルスと接触させるステップを含む。組換えアデノウイルスを第１の細胞に感染させ、それにより、アデノウイルス感染細胞を形成する。アデノウイルス感染細胞に組換え核酸を発現させ、それにより、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲート、およびカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換えアデノウイルスを形成する。リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートおよび組換えアデノウイルスを二量体形成剤と接触させる。組換えアデノウイルスおよびリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを二量体形成剤に結合させ、それにより、アデノウイルス細胞標的化構築物を形成する。アデノウイルス細胞標的化構築物を第２の細胞に結合させ、それにより、前記細胞を標的化する。一部の実施形態では、第１の細胞および第２の細胞は生物体の一部を形成する。
ＩＶ．特定の実施形態
【００９１】
がんは、毎年５０万件超の死亡の原因となっている消耗性疾患である。がんに対するより有効な選択的かつ安全な処置が深刻に必要性とされている。この蔓延した、命に関わる疾患に対する現存する処置、例えば、化学療法および外科手術などでは、全ての悪性細胞が排除されることはまれであり、また、多くの場合、治療的利益にまさる恐れがある有害な副作用が示される。本発明は、異なる受容体を介して腫瘍細胞に感染することができる有力な組換えウイルスを提供する。これらのウイルスにより、がんに対する全身性遺伝毒性処置のパラダイムを破壊する有効な自己増幅性療法の新しい安全な形態が可能になる。
【００９２】
現行のがん処置の欠点の多くに対処する潜在性がある１つの手法は、腫瘍退縮性アデノウイルス療法である［Ｐｅｓｏｎｅｎ，  Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、８巻（１号）：１２〜２８頁（２０１０年）］。これらのウイルスは、がん細胞において特異的に複製するが、正常な細胞は無傷のままになるように設計される。この選択性は、Ｅ１Ａなどのアデノウイルスの初期腫瘍性タンパク質と、調節解除された細胞周期進入および病理学的ＤＮＡ複製を駆動するＲｂ腫瘍抑制因子経路における腫瘍変異の間の機能的重複を利用することによって工学的に作製することができる［Ｐｏｚｎｉｃ，  Ｍ．、Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ、３４巻（２号）：３０５〜１２頁（２００９年）］。
【００９３】
アデノウイルス（Ａｄ）は、自己複製する生物学的機械である。Ａｄは、タンパク質外被に包まれた３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡゲノムからなる。Ａｄは、複製するためにヒト宿主細胞を必要とする。Ａｄは、浸潤し、細胞の複製に関わる機構を乗っ取って再生し、アセンブルすると溶解性細胞死を誘導して細胞から脱出し、周囲の細胞に拡散し、浸潤する（図１）。発端の系に、Ａｄの自律性および効率を模倣することに近づいたものはないが、出願人らは、その全体があらゆる目的について本明細書に組み込まれる公開出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４８００６に記載されている、Ａｄゲノムを系統的に操作して、新規のアデノウイルスを創製するための２つの新しい戦略を開発した。今後は、Ａｄゲノムを操作することができることで、ウイルスを角で捕まえ、腫瘍に特異的な感染、複製、および細胞致死の機能がなされるようにウイルスを再設計することができる。
【００９４】
現在、アデノウイルスベクターは、その取り込みについて単一の細胞受容体に依拠しており、これによりその治療的潜在性が著しく限定されている。Ａｄ５の感染は、主に外側のウイルスカプシド上の線維タンパク質とヒト上皮細胞上のコクサッキー・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）の間の相互作用によって媒介される。残念ながら、間葉系の致命的な転移性腫瘍細胞などの多くのがん細胞はＣＡＲを発現しない。ウイルス複製／致死は、細胞に感染する能力に限定されるので、出願人らは、ＣＡＲ以外の受容体を介して腫瘍細胞に感染するウイルス、理想的には、腫瘍細胞において特異的に上方制御されるものを必要としている。本明細書では、Ａｄ５ががん細胞にそれらのＣＡＲ発現にかかわらず感染することを可能にする、遺伝子によりコードされる切り換え可能な標的化部分が提供される。出願人らは、制がん剤であるラパマイシン（ｒａｐ）の、ＦＫＢＰドメインを有する、およびＦＲＢドメインを有する異種タンパク質の二量体を形成する公知の性質を使用し、ＦＫＢＰに融合する再標的化リガンドとともにＦＲＢ−線維カプシドタンパク質融合物を発現するウイルスを工学的に作製した。ｒａｐ処置により、これらのウイルスを、複数の再標的化リガンドを介して任意の細胞型に感染するように誘導する。これにより、新規のがん療法として化学的武器およびウイルス性武器の合理的かつ有力な組合せが表される。さらに、主要な目標は、２つ以上の機構および受容体を通じて腫瘍細胞に感染することができるウイルスを工学的に作製することによって腫瘍不均一性を克服することである。出願人らは、制がん剤であるラパマイシン（ｒａｐ）の、ＦＫＢＰドメインを有する、およびＦＲＢドメインを有する異種タンパク質の二量体を形成する公知の性質を使用することによってこれを実現した。ラパマイシンは、ｍＴＯＲキナーゼを阻害し、免疫抑制剤および抗がん処置として使用される。ＦＲＢ変異を工学的に作製することにより、細胞のｍＴＯＲキナーゼ活性を阻害しないラパマイシンのラパログも使用して、ラパログを投与した際に任意の細胞型への感染を誘導することができる。ｒａｐ処置の際に、これらのウイルスを、複数の再標的化リガンドを介して任意の細胞型に感染するように誘導することができる。
【００９５】
がんは、安全かつ確実に有効な処置がなければ難治性の疾患であり続ける。前世紀において、がんの起源およびがん生物学に関する出願人らの知見は著しく進歩した。しかし、遺伝病としてのがんに関する出願人らの新しい理解にもかかわらず、切除不可能な播種性疾患に対する標準治療は、化学療法および放射線照射などの遺伝毒性療法のままであり、これには、多くの場合、耐え難い毒性の副作用がある。発がん性のタンパク質を標的とする薬物が開発されてきたが、腫瘍抑制因子の遺伝的喪失を処置するためのものが何もない。これらのがんを処置する１つの手法は、腫瘍退縮性ウイルスがん療法である（図１）［Ｐｅｓｏｎｅｎ，  Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、８巻（１号）：１２〜２８頁（２０１０年）］。
【００９６】
アデノウイルス（Ａｄ）は、半世紀超にわたって研究されており、哺乳動物の細胞生物学の中心の重要な機構、例えば、スプライシング、重大な成長調節性ハブ（ｈｕｂ）、転写、および細胞周期に関する出願人らの理解に著しく寄与した。Ａｄは、タンパク質カプシド外被に包まれた３６ｋｂの小二本鎖ＤＮＡウイルスである（図２）。Ａｄ粒子は、主に、宿主細胞と、カプシドの表面上の線維のノブドメインと細胞表面分子の間のタンパク質相互作用を通じて相互作用する（図２）。アデノウイルス種Ｃの血清型５（Ａｄ５）は、主に上皮細胞接合部において見いだされるコクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）との線維相互作用を介して細胞に感染する。全てのウイルスと同様に、Ａｄは、その増殖に関して宿主細胞に完全に依存する。そのゲノムを宿主細胞核に入れた後、ウイルスタンパク質によってプログラムが調和されて、ウイルスＤＮＡを複製するために、休止した細胞における細胞周期が活性化される。Ａｄ５生活環の最後に、細胞核において後代ビリオンがアセンブルされた後、細胞の膜が溶解され、次世代のウイルスが放出される。
【００９７】
アデノウイルストロピズムの操作
【００９８】
Ａｄ５の感染は、大部分は、上皮細胞タイトジャンクションにおいてカドヘリンと一緒に発現するＣＡＲを有する細胞に限定される［Ｔｏｍｋｏ，  Ｒ．Ｐ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、９４巻（７号）：３３５２〜３３５６頁（２００９年）；Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，  Ｊ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７５巻（５３０４号）：１３２０〜１３２３頁（１９９７年）］。残念ながら、大部分のがん患者は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）によりカドヘリンおよびＣＡＲが下方制御され、それにより遠位の部位への浸潤および拡散を開始させる（ｉｎｓｔｉｇａｔｉｎｇ）転移により死亡する［Ａｎｄｅｒｓ，  Ｍ．ら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１００巻（２号）：３５２〜９頁（２００９年）］。したがって、多くの悪性細胞はＣＡＲを発現せず、Ａｄ５が感染しにくい［Ａｎｄｅｒｓ，  Ｍ．ら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１００巻（２号）：３５２〜９頁（２００９年）；Ｄｉｅｔｅｌ，  Ｍ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、８９巻（６号）：６２１〜６３０頁（２０１１年）；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｋ．ら、Ｕｒｏｌｏｇｙ、６６巻（２号）：４４１〜４４６頁（２００５年）］。Ａｄ５を種々の細胞受容体に再標的化するために、精製したアデノウイルス粒子を化学修飾すること、および線維と受容体との間の複合体を形成するために組換え二価「架橋」タンパク質を用いて感染させること（［Ｒｅｉｎ，  Ｄ．Ｔ．、Ｍ．  Ｂｒｅｉｄｅｎｂａｃｈ、およびＤ．Ｔ．  Ｃｕｒｉｅｌ，  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２巻（１号）：１３７〜１４３頁（２００６年）］に概説されている）を含めたいくつかの手法がとられてきた。これらの手法の不都合は、ウイルス複製の後に化学／組換え標的化部分が失われるので、感染が最初のラウンドに制限されることである。この欠点は、標的化配列をコードするように線維遺伝子を直接改変することによって克服することができるが、この手法は、新規の配列のフォールディングおよびウイルス粒子の正しいアセンブリを予測することができないので、系統的ではない。現在まで、この手法が、小ペプチドを挿入するために唯一有用なものになっている。
【００９９】
ＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣにより、ゲノムビルディングブロックおよび異種部分のライブラリーから新しい最適化されたアデノウイルスを系統的に設計する技術が可能になる。
【０１００】
いくつかの適用におけるアデノウイルスベクターの潜在性は、複数の遺伝子改変を迅速かつ系統的に操作し（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）、組み合わせる能力によって妨げられてきた。アデノウイルスを腫瘍退縮性作用剤として系統的に再設計するために、その構成成分の正確な改変を可能にするツールが必要である。３６ｋｂのＡｄ５ゲノムは、そのサイズおよび制限酵素認識（ＲＥＲ）部位の存在量に起因して、操作する（ｍａｎｉｐｕｌａｔｅ）ことが難しい。現在まで、大多数の組換えＡｄが、１９８０年代にわずかなＲＥＲ部位について消化、選択され、シャトルベクターの遺物に起因して残り続けている骨格に限定されている。これらの骨格には、野生型配列から遠く離れたいくつかの変異が蓄積されている。複合配列を用いた従来のクローニング技法は今でも時間がかかり、系統的ではない。
【０１０１】
Ａｄ５および現行の方法体系の限界を克服するために、出願人らは、ゲノム構成要素の部分および異種エレメントから、１時間でアデノウイルスゲノムをｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて迅速にデノボアセンブルすることを可能にする「Ａｄｓｅｍｂｌｙ」および「ＡｄＳｌｉｃＲ」と称される２つの新しい技術を開発した。バイオインフォマティクスの手法を使用して、出願人らは、アデノウスゲノム（３６ｋｂ）を、種間で進化的に保存された配列、転写モジュールおよび機能的モジュールに基づいて５つの単位に分割した。これらの５つの単位の各々はゲノムを組み立てる「部分ライブラリー」の適合する区画（ｓｅｃｔｉｏｎ）を含み、その機能および多様性は、変異または異種エレメントを工学的に作製することによって変更することができ、異なるアデノウイルス血清型、変異体および種由来の同等の単位を付加することによってさらに拡張することができる。独特の性質を有する新しいアデノウイルスを創製するために、上記単位の各々のうちの１つをライブラリーから選択し、ＡｄｓｅｍｂｌｙまたはＡｄ−ＳｌｉｃＲを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで完全なゲノムへと迅速に再アセンブルする。Ａｄｓｅｍｂｌｙを使用して、多部位特異的組換えによって、トランスフェクションするとプラスミド骨格から自己切除され、複製して新規のウイルスを産生する新規のゲノムを（１時間で）アセンブルすることができる。同じライブラリーゲノムビルディングブロックを利用するＡｄ−ＳｌｉｃＲは、より強力なウイルス複製（必要であれば）および臨床使用のために、挿入された組換え配列を消去するための相補的な戦略である。複数のゲノム断片を小モジュラープラスミド単位として操作することが容易であること、およびこれらの技術の系統的手法により、今や新規のアデノウイルスの迅速かつ正確な構築が可能になる。
【０１０２】
アデノウイルス標的化：遺伝子によりコードされた切り換え
【０１０３】
腫瘍退縮性ウイルス療法には、無制限のサイズの腫瘍塊を破壊する潜在性があるが、これは、ウイルスが腫瘍の脈管構造を横断し、感染がある細胞から別の細胞に拡散する場合のみである。Ａｄ５の線維は上皮細胞接合分子ＣＡＲを認識し［Ｔｏｍｋｏ，  Ｒ．Ｐ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、９４巻（７号）：３３５２〜３３５６頁（２００９年）；Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，  Ｊ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７５巻（５３０４号）：１３２０〜１３２３頁（１９９７年）］、これは腫瘍において多様なレベルで発現し［Ｒｅｉｎ，  Ｄ．Ｔ．、Ｍ．  Ｂｒｅｉｄｅｎｂａｃｈ、およびＤ．Ｔ．  Ｃｕｒｉｅｌ，  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２巻（１号）：１３７〜１４３頁（２００６年）；Ｄｍｉｔｒｉｅｖ，  Ｉ．ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７２巻（１２号）：９７０６〜９７１３頁（１９９８年）；Ｂａｕｅｒｓｃｈｍｉｔｚ，  Ｇ．Ｊ．、Ｓ．Ｄ．  Ｂａｒｋｅｒ、およびＡ．  Ｈｅｍｍｉｎｋｉ，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ、２１巻（６号）：１１６１〜７４頁（２００２年）；Ｂｒｅｉｄｅｎｂａｃｈ，  Ｍ．ら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１５巻（５号）：５０９〜１８頁（２００４年）；Ｃｒｉｐｅ，  Ｔ．Ｐ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６１巻（７号）：２９５３〜６０頁（２００１年）；Ｆｅｃｈｎｅｒ，  Ｈ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、７巻（２２号）：１９５４〜６８頁（２０００年）；Ｈｅｍｍｉ，  Ｓ．ら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、９巻（１６号）：２３６３〜７３頁（１９９８年）；Ｈｅｍｍｉｎｋｉ，  Ａ．およびＲ．Ｄ．  Ａｌｖａｒｅｚ，  ＢｉｏＤｒｕｇｓ、１６巻（２号）：７７〜８７頁（２００２年）；Ｋａｎｅｒｖａ，  Ａ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、８巻（１号）：２７５〜８０頁（２００２年）；Ｌｉ，  Ｙ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５９巻（２号）：３２５〜３０頁（１９９９年）；Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｃ．Ｒ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５８巻（２４号）：５７３８〜４８頁（１９９８年）；Ｒｅｉｎ，  Ｄ．Ｔ．ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１１１巻（５号）：６９８〜７０４頁（２００４年）］、これが失われることは、転移の増加に関連する［Ａｎｄｅｒｓ，  Ｍ．ら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１００巻（２号）：３５２〜９頁（２００９年）；Ｄｉｅｔｅｌ，  Ｍ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、８９巻（６号）：６２１〜６３０頁（２０１１年）；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｋ．ら、Ｕｒｏｌｏｇｙ、６６巻（２号）：４４１〜４４６頁（２００５年）］。Ａｄ５は、天然の血液媒介性ウイルスではなく、脈管構造を盛んに標的とし横断することはない。これらの因子の両方により、遺伝子発現および治療に対するアデノウイルスベクターの潜在性が限定される。
【０１０４】
アデノウイルスの取り込みを再標的化するための試みは、ウイルスカプシドを再標的化リガンドと連結する化学的アダプターの使用を含む。１つの例は、アビジン−再標的化リガンドとの高親和性結合のための化学的リンカーをもたらすための線維ビオチン化である［Ｌｉｕ，  Ｙ．、Ｐ．  Ｖａｌａｄｏｎ、およびＪ．  Ｓｃｈｎｉｔｚｅｒ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ、７巻（１号）：３１６頁（２０１０年）］。しかし、化学修飾はウイルス複製の際に失われるので、再標的化は外因性ウイルスを用いてのみ達成される。ウイルスコートタンパク質への、遺伝子によりコードされる再標的化アダプターの融合物が望ましいが、同様に難しい。残念ながら、大きなリガンドをカプシドタンパク質に組み入れることにより、それらのフォールディング／アセンブリが妨害される［Ｂｅｌｏｕｓｏｖａ，  Ｎ．ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７６巻（１７号）：８６２１〜８６３１頁（２００２年）］。ミスフォールディングを回避するために、より小さなポリペプチドを線維Ｈ１ループに挿入することができる（図６）［Ｂｅｌｏｕｓｏｖａ，  Ｎ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７６巻（１７号）：８６２１〜３１頁（２００２年）］。例えば、ＲＧＤペプチドにより、インテグリンに補助される取り込みが増強されるが、ウイルストロピズムを変更するためには不十分である。単鎖抗体（ｓｃＦＶ）との線維融合物も同様に魅力的であるが、前者は、ＥＲ／細胞質ゾルでのプロセシングが必要であるが、線維は核内で構築される［Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，  Ｒ．Ｅ．、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、１２巻（２号）：１７６〜８３頁（２０１０年）］。したがって、感染を再標的化するために行われている試みにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける試験および収穫は期待を裏切るものになっている［Ｗａｅｈｌｅｒ，  Ｒ．、Ｓ．Ｊ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ、およびＤ．Ｔ．  Ｃｕｒｉｅｌ，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ、８巻（８号）：５７３〜８７頁（２００７年）］。
【０１０５】
理想的なウイルスは血液／内皮層を横断し、異なる受容体を介して腫瘍細胞に感染する。理想的な系は、ウイルス複製および安全性を損なうことなく、任意の複数の再標的化部分を介して体内でウイルストロピズムを切り換えるために使用することができる、遺伝子によりコードされた化学的アダプターである。本明細書では、感染を複数の細胞型に再標的化し、ウイルス複製に際して失われない、新規の、誘導性の、遺伝子によりコードされた化学的アダプター系が提供される。したがって、本発明は、以前の手法の限定を克服し、いくつかの有利な点を有する。受容体再標的化に関連する予期しない毒性はいずれも、薬物を中止することによって止めることができる。さらに、複数の再標的化リガンドを単一のウイルス内で発現させて、腫瘍細胞受容体（例えば、ＥＧＦＲ）および脈管構造（例えば、フォン・ヴィルブランド因子／トランスフェリン）を標的化することができる。
【０１０６】
出願人らは、免疫抑制剤および抗腫瘍薬であるラパマイシン（ｒａｐ；図７）の公知の性質を使用して、アデノウイルスのウイルスコートタンパク質の線維を代替の細胞受容体に再標的化した。ラパマイシンを使用して、一方がＦＫＢＰドメイン（例えば、再標的化リガンド）と融合しており、他方（例えば、線維）がｍＴＯＲのＦＲＢドメインと融合している場合に、異種タンパク質のヘテロ二量体を誘導することができる［Ｃｈｅｎ，  Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、９２巻（１１号）：４９４７〜５１頁（１９９５年）］。ｒａｐを用いて処理すると、線維は再標的化リガンドとヘテロ二量体を形成し、ウイルスが選択された細胞型に感染することが可能になる。ラパマイシンは、ＦＤＡに承認されており、哺乳動物において理想的な薬物動態プロファイルを有するマクロライド抗生物質である。受容体−リガンド複合体のファージディスプレイ［ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ，  Ｒ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、９９巻（１３号）：８５３０〜５頁（２００２年）］、二機能性タンパク質の転写活性化および再構成［Ｃｌａｃｋｓｏｎ，  Ｔ．、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ、６７巻（６号）：４４０〜２頁（２００６年）］を含めたいくつかの適用においてｒａｐ誘導性ヘテロ二量体形成の高親和性および安定性が使用されており、大きく成功している。この系の新規の適用が提供され、これは、腫瘍退縮性ウイルスとの合理的な組合せとしてのｒａｐに関する出願人らの以前の試験も活用する［Ｏ’Ｓｈｅａ，  Ｃ．ら、Ｅｍｂｏ  Ｊ、２４巻（６号）：１２１１〜２１頁（２００５年）］。
【０１０７】
アデノウイルスを腫瘍細胞受容体に再標的化するための、遺伝子によりコードされた小分子制御系を開発する。
【０１０８】
単一の細胞受容体における現行のアデノウイルスベクターの、その取り込みについての信頼性により、全身送達によるその治療的潜在性が限定される。この問題を克服するために、出願人らは、アデノウイルスが腫瘍細胞受容体に再標的化することが可能となるように、ラパマイシンに誘導される、遺伝子によりコードされたＦＲＢ／ＦＫＢＰヘテロ二量体を有する新規のＡｄを設計した。最終的に、この系により、侵襲性の腫瘍（例えば、ＴＥＭ、ＴＶＭ）を排除するための脈管形成性腫瘍の脈管構造における受容体、および乳がんなどの高リスクの腫瘍において上方制御されるマーカー（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＴｆＲ）を標的化することが可能になる。
【０１０９】
線維Ｈ１ループへのＦＲＢドメインの挿入
【０１１０】
アデノウイルスのトロピズムを表す線維タンパク質は、一般に、アデノウイルス粒子への線維三量体の正しいフォールディングおよびアセンブリが生存可能な後代にとって重大であるので、大きな挿入または修飾を許容できない。現在まで、Ｃ末端Ａｄ５線維ノブドメインにおける配列の挿入は、ペプチドに効果的に限定されている［Ｂｅｌｏｕｓｏｖａ，  Ｎ．ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７６巻（１７号）：８６２１〜８６３１頁（２００２年）］。Ａｄｓｅｍｂｌｙ（図５に記載されている）を使用して、９０アミノ酸のＦＲＢドメインが、有害作用を伴わずに最大１００アミノ酸までの挿入に適合する線維の柔軟なＨ１ループに挿入された［Ｂｅｌｏｕｓｏｖａ，  Ｎ．ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７６巻（１７号）：８６２１〜８６３１頁（２００２年）］。
【０１１１】
実験手法
【０１１２】
出願人らが設計したゲノム部分ライブラリーからの野生型Ｅ３構成成分プラスミド、Ｅ３−００１、（表１）を、ＦＲＢ配列を線維遺伝子に挿入するための鋳型として使用した。Ｅ３−００１をＰＣＲ増幅して、線維のＴｈｒ５４６とＰｒｏ５６７の間に挿入するためのＳＬＩＣ適合性末端を有する産物を生成した。ｍＴＯＲの９０アミノ酸のＦＲＢドメイン（Ｇｌｕ２０２５〜Ｇｌｎ２１１４）をｍＴＯＲ  ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＳＬＩＣによって組み合わせてＥ３−００２を生成した（図８）。Ａｄｓｅｍｂｌｙ戦略を使用して野生型のＥ２構成成分、Ｌ３構成成分、およびＥ４構成成分をＥ３−００２およびＥ１−００９（ＣＭＶにより駆動されるＧＦＰ遺伝子を含有する）と組み合わせてＡｄ−１２２ゲノムを生成した（図８）。出願人らは、Ａｄ−１２２ゲノムを２９３Ｅ４細胞にトランスフェクトし、ウイルスを回収した。ＴｆＲなどの多くの大きなリガンドの挿入とは異なり、ＦＲＢでは、Ｅ１レポーターからのＧＦＰ蛍光および観察される細胞変性効果（ＣＰＥ）によって証明される通り、ウイルス複製またはアセンブリおよびロバストな感染は阻害されなかった。ＦＲＢ−線維（７２．４ｋＤａ）対野生型線維（６１．６ｋＤａ；図９）の予測された移動によって示されるように、ウエスタンブロットにより、ＦＲＢ−線維の発現が確認された。
【０１１３】
アデノウイルスゲノムからのＦＫＢＰ再標的化部分の発現
【０１１４】
ウイルスゲノムからのＦＫＢＰの発現は、ｒａｐの存在下で線維との効率的な二量体形成が可能になるように、線維の発現と調和した同様のタイミングおよびレベルであることが理想的である。出願人らは、図１０に要約されている通り、ゲノムからＦＫＢＰを発現させるためにいくつかの戦略を採用した。
【０１１５】
実験手法
【０１１６】
線維にＦＲＢが挿入されたＥ３−００２プラスミドを、図１０に要約されている戦略に必要な配列を導入するための鋳型として使用した。第１の手法は、線維転写物からＦＫＢＰを共翻訳で発現させることによってアデノウイルスゲノムからＦＫＢＰを発現させることであった（図１０Ｃ）。ＦＫＢＰ配列を線維コード配列の下流、挿入されたＦｕｒｉｎ−２ａ配列の後に置いた。Ｆｕｒｉｎ−２ａ配列は、最適化されたＦｕｒｉｎプロテアーゼ認識部位であり、その後に口蹄疫ウイルス２ａ自己切断部位が続く［Ｆａｎｇ，  Ｊ．ら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、１５巻（６号）：１１５３〜１１５９頁（２００７年）］。Ｃ末端にアルギニン残基を有するＦＲＢ−線維分子、およびＮ末端にプロリン残基を有するＦＫＢＰタンパク質の２つの別個のポリペプチドが等モル量で生成されるはずである。
【０１１７】
配列を首尾よくクローニングし、Ｅ３−０１６を生成し、Ａｄｓｅｍｂｌｙ戦略を使用して、Ｅ１−００９、Ｅ３−０１６および野生型Ｅ２、Ｌ３、およびＥ４を用いて全長のゲノムを創製した。Ａｄ−１２２の調製と同様に、単離された上清を２９３Ｅ４細胞に適用したが、蛍光またはＣＰＥのいずれによっても増殖性ウイルス複製は示されなかった。したがって、代替の手法にとりかかり、線維遺伝子の３’末端で、線維転写物のために使用されるポリＡ配列の前に挿入されたＩＲＥＳエレメントを使用してＦＫＢＰを発現させた（図１０Ｄ）。Ｅ３構成成分（Ｅ３−０１５）を首尾よくクローニングし、Ｅ１−００９、Ｅ３−０１５および野生型Ｅ２、Ｌ３、およびＥ４を使用して完全なゲノムを生成した（図８）。このウイルスは２９３Ｅ４細胞において複製することができたが、感染の６０時間後でもウエスタンブロットによってＦＫＢＰ発現を検出することはできず（データは示していない）、これにより、線維転写物に対するＩＲＥＳの効率が、ＦＫＢＰを発現させるためには理想的ではないことが示される。最終の手法は、アデノウイルス転写構築様式を利用してＦＫＢＰを発現させることであった。アデノウイルスのＥ３転写単位内の遺伝子は細胞培養物中におけるウイルス複製には必ずしも必要なものではないので、Ｅ３Ｂ転写物におけるＲＩＤα、ＲＩＤβ、および１４．７ｋをコードする配列をＦＫＢＰで置き換えた。Ｅ３構成成分（Ｅ３−０４８）をクローニングし、Ａｄｓｅｍｂｌｙを使用し、Ｅ１−００９、野生型Ｅ２、Ｌ３、およびＥ４を用いてＡｄ−１７８を生成した（図８）。このウイルスは、蛍光およびＣＰＥによって証明される通り、２９３Ｅ４細胞において複製することができた。感染細胞溶解物のウエスタンブロット分析により、感染した２９３Ｅ４細胞にＦＫＢＰタンパク質が蓄積したことが明らかになった（図１１）。したがって、この戦略を使用して、ＦＲＢ−線維およびＦＫＢＰ再標的化部分を発現する新規のウイルスを創製した。
【０１１８】
ＦＫＢＰとの融合のための標的化部分
【０１１９】
ＦＫＢＰと融合するための理想的な標的化タンパク質は、特異的ながん細胞表面分子に対して強力な親和性を有する安定な分子である。ＢＮペプチド、ＥＧＦペプチド、ＴＧＦα、炭疽毒素ＰＡ、Ｔｆ、Ｆ３ペプチド、およびＶＥＧＦを含めたいくつかの手法を調査した（表３）。原理の証明として、ＶＨＨを最初に下記の通り調査した。同様の実験手法が表３に列挙されている他の再標的化部分に適応する。これらの基準に最も適合するタンパク質のクラスは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）由来の重鎖ドメイン（ＶＨＨ）である。ラクダ科の動物およびサメは、他の大多数の哺乳動物（例えば、げっ歯類、ヒト）が有する２つ（慣習的）ではなく、１つの可変鎖ドメインに由来する、それらの特異的な標的に対する特異性を有するｓｄＡｂをコードする［Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，  Ｒ．Ｅ．、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、１２巻（２号）：１７６〜８３頁（２０１０年）］。小単鎖可変性断片（ｓｃＦＶ）が広く使用されているが、より小さくより安定なＶＨＨには、機能するために翻訳後のジスルフィド結合の形成を必要としないという別個の利点がある。理想的なアデノウイルス標的化を与えるために、ＦＫＢＰを、がん細胞受容体に対する特異性を有するＶＨＨと融合した。ｒａｐ誘導性再標的化系を用いてこの効果を実証するために、乳がん、頭頸部がん、前立腺がん、肺がん、および皮膚がんなどの多くの上皮起源のがんにおいて上方制御される、最近同定された、癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡ、同様にＣＥＡＣＡＭ５）に対する特異性を有するＶＨＨ［Ｖａｎｅｙｃｋｅｎ，  Ｉ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５１巻（７号）：１０９９〜１１０６頁（２０１０年）；Ｂｅｈａｒ，  Ｇ．ら、ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２７６巻（１４号）：３８８１〜３８９３頁（２００９年）］、胃腸癌、乳癌、肺癌および卵巣癌についてのバイオマーカー［Ｄｕｆｆｙ，  Ｍ．Ｊ．、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４７巻（４号）：６２４〜６３０頁（２００１年）］、および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）［Ｇａｉｎｋａｍ，  Ｌ．Ｏ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、４９巻（５号）：７８８〜９５頁（２００８年）］を使用する。構造モデリングに基づいて（図１３）、ＶＨＨ／標的相互作用およびＦＫＢＰ／ｒａｐ／ＦＲＢ二量体形成境界面に対する立体障害を最小にするために、ＶＨＨドメイン（ＣＥＡＶＨＨ、ＥＧＦＲＶＨＨ）をＦＫＢＰのＮ末端に融合する。
【０１２０】
ＣＥＡＶＨＨおよびＥＧＦＲＶＨＨをコードする遺伝子配列が、それぞれＢｅｈａｒらおよびＲｏｏｖｅｒｓらによって同定されたタンパク質配列に基づいて、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによりヒトコドン最適化され、合成された［Ｂｅｈａｒ，  Ｇ．ら、ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２７６巻（１４号）：３８８１〜３８９３頁（２００９年）；Ｒｏｏｖｅｒｓ，  Ｒ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、５６巻（３号）：３０３〜３１７頁（２００７年）］。ＳＬＩＣを使用して、挿入したＧＳＧＳＧＳＴリンカー配列を用いてＶＨＨ配列をＦＫＢＰのＮ末端と融合した。これらの融合タンパク質を、本明細書に記載の手法を用いてＥ３構成成分にクローニングして、Ａｄ−１７７およびＡｄ−１７８を生成した（表１）。図１１は、Ａｄ−１７８感染細胞からのＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰ融合タンパク質の発現を示し、これはＡｄ−１７７からのＣＥＡＶＨＨ−ＦＫＢＰ発現と同様である（データは示していない）。ＰＡドメイン４をコードする遺伝子配列が、  Ｕｎｉｐｒｏｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｐ１３４２３に基づいてＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによりヒトコドン最適化され、合成された。ＳＬＩＣを使用して、挿入したＧＳＧＳＧＳＴリンカー配列を用いてＰＡドメイン４をＦＫＢＰのＮ末端と融合した。この融合タンパク質を、本明細書に記載の手法を用いてＥ３構成成分にクローニングして、Ａｄ−２８１を生成した（表１）。
【０１２１】
ＦＲＢ−線維融合タンパク質およびＶＨＨ−ＦＫＢＰ融合タンパク質のラパマイシン誘導性共局在を検出するための免疫蛍光法
【０１２２】
細胞におけるタンパク質の共局在を免疫蛍光法によって、または蛍光性タグを付けたタンパク質を介して検出することは、タンパク質が相互作用の潜在性を有するかどうかを評価するための１つの手法である。ｒａｐの存在下と非存在下でのＦＲＢ−線維に対するＦＫＢＰの局在化（または逆もまた同じ）の差異により、ｒａｐがそれらの会合を誘導したことが示唆される。アデノウイルスにより発現されたタンパク質を直接画像化するために顕微鏡スライド上で成長させた２９３Ｅ４細胞を感染させた。ＦＲＢ−線維融合タンパク質およびＶＨＨ−ＦＫＢＰ融合タンパク質を、５００ｎＭのｒａｐを有する細胞、それに対して溶媒対照を有する細胞において評価して、この薬物が存在することに起因する局在化の任意の差異を評価する。対照として、Ａｄｓｅｍｂｌｙ戦略を用いて、ＦＫＢＰのＦＲＢ依存性ｒａｐ誘導性共局在の対照としてＣＥＡＶＨＨ−ＦＫＢＰおよび野生型線維を発現するウイルス（Ａｄ−１９９）を構築する。感染した２９３Ｅ４細胞における非共焦点ＩＦ画像化により、ｒａｐの存在下でのＦＲＢ−線維およびＶＨＨ−ＦＫＢＰシグナルの共局在が示されている（図１４）。
【０１２３】
ＦＲＢ−線維融合タンパク質およびＶＨＨ−ＦＫＢＰ融合タンパク質のラパマイシン誘導性ヘテロ二量体形成による免疫共沈降（ＣｏＩＰ）
【０１２４】
感染した２９３Ｅ４細胞の溶解物からのＦＫＢＰのＩＰによるＦＲＢ−線維のＣｏＩＰ（逆もまた同じ）を実施した。使用したウイルスは、実験群、ｒａｐ誘導性ＦＲＢ−ＦＫＢＰ会合を評価するためのＡｄ−１７７またはＡｄ−１７８；内在性ＦＫＢＰヘテロ二量体形成の任意のバックグラウンドを評価するためのＡｄ−１２２（ＦＫＢＰ、ＦＲＢ−線維なし）、および陰性対照としてＡｄ−１９９（ＣＥＡＶＨＨ−ＦＫＢＰ、野生型線維）である（完全なウイルス一覧については表１を参照されたい）。２９３Ｅ４細胞に感染多重度（ＭＯＩ）１０で感染させ、ウイルスを添加した４時間後に培地を交換する。感染の２４時間後に細胞を５００ｎＭのｒａｐまたは溶媒対照（ＥｔＯＨ）で処理し、感染の３６時間後に、溶解させるために採取する。細胞抽出物全体をＩＰのために使用する。
【０１２５】
ＦＲＢ／ＦＫＢＰ相互作用が生物学的に関連し、アデノウイルス粒子の表面上で起こることを実証するために、感染した２９３Ｅ４細胞の溶解物からの非線維アデノウイルスカプシドタンパク質によるＶＨＨ−ＦＫＢＰのＣｏＩＰを実施する。さらに、ｒａｐを伴う、およびｒａｐを伴わないＣｓＣｌ勾配超遠心分離および陰イオン交換によるＡｄ−１７７およびＡｄ−１７８の精製を実施して、ＶＨＨ−ＦＫＢＰが、ｒａｐの存在下でこれらのプロセスによって（非免疫）沈殿した／保持されたかどうかを確かめる。
【０１２６】
ウイルストロピズムのラパマイシン誘導性再標的化
【０１２７】
ＦＫＢＰ再標的化ウイルスにおいてｒａｐによって誘導される二量体形成により、ウイルスがその標的化部分の親和性に基づいて異なる受容体を介して細胞受容体に感染することが可能になるはずである。この原理は、それぞれＣＥＡおよびＥＧＦＲを対象とするＡｄ−１７７ウイルス、Ａｄ−１７８ウイルスを用いて実証される。Ａｄ−１７７およびＡｄ−１７８を使用して２９３Ｅ４細胞に感染させ、５００  １５ｎＭのｒａｐまたは溶媒対照で処理する。感染の４８時間後にウイルスを培地から回収し、がん細胞系のパネルに感染させるために直接使用する。細胞に２連で、種々の希釈度の感染性培地（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｍｅｄｉｕｍ）（すなわち、希釈なし、２倍、４倍など）で感染させる。感染を、ＦＡＣＳおよびハイスループット画像化によってＧＦＰ陽性細胞の数を定量化することによって決定する。
【０１２８】
カプシドにおいてＦＲＢ−ドメインが挿入された組換えアデノウイルスの標的化を可能にするために、ＦＫＢＰ−リガンド融合物を感染細胞において異所性に発現させることもできる。ＦＫＢＰ−リガンドおよび二量体形成剤が組換えアデノウイルスと一緒に存在する場合、ＦＫＢＰ−リガンドがアデノウイルスゲノムから発現されなかったばあいでも、標的化された複合体がアセンブルするはずである。本発明者らは、ＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰを異所性に一過性に発現させ（プラスミドから）、次いで、細胞にＡｄ−１２２を感染させる。ラパマイシンの存在下で、Ａｄ−１２２単独では、標的化されないが、さらにＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰが存在すると、感染が増強された（図２６）。ＦＫＢＰ−リガンドを異所性に発現させることができることにより、新しい組換えアデノウイルスゲノムをアセンブルする必要なく、リガンド候補またはライブラリー内のリガンドを迅速にスクリーニングすることが可能になる。例えば、多ウェル形式では、細胞のウェルそれぞれがリガンド−ＦＫＢＰのプールを一過性に発現することができ、そのそれぞれにＡｄ−１２２を感染させ、生じたウイルス上清を培養液中の細胞に適用して、標的化の増強を定量化することができる。リガンド−ＦＫＢＰプール内のメンバーの同一性を個別にさらに試験することができる。さらに、有効なリガンド−ＦＫＢＰクローンを変異誘発し、再スクリーニングして、標的化アデノウイルス感染の有効性を増強することができる。
【０１２９】
再標的化特異性を検証する
ウイルスのラパマイシンによる調製から観察された効果により、相互作用がＶＨＨ−標的化部分との相互作用によって増大して、この系を確実にすることが確認されるはずである。再標的化および異なるトロピズムを示すウイルスの場合では、特異性は、異なるＶＨＨ融合物を使用することにより、ＣＡＲおよびＶＨＨの細胞標的をｓｈＲＮＡによってノックダウンすること（例えば、Ａｄ−１７８についてはＥＧＦＲノックダウン）、または外因性の抗体またはＶＨＨを用いて細胞標的を遮断すること（例えば、Ａｄ−１７８感染の前に過剰な外因性のＥＧＦＲＶＨＨを添加して遮断する）によって検証される。内在性ｍＴＯＲまたはＦＫＢＰがウイルス構成成分のアセンブルに干渉する場合には、代替の化学的に誘導された二量体系、例えば、ｒａｐ類似体（ラパログ）を利用する直交性ＦＲＢ／ＦＫＢＰ変異体も必要であり得る。あるいは、他の二量体形成系を調査することができる［Ｈｕｂｂａｒｄ，  Ｋ．Ｅ．ら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２４巻（１６号）：１６９５〜１７０８頁（２０１０年）］。
【０１３０】
ウイルストロピズムのラパログ誘導性再標的化
【０１３１】
ラパマイシンは、成長および増殖の静止などの望ましくない生物学的効果を示し得るので（Ｊａｃｉｎｔｏ  Ｅ、Ｈａｌｌ  ＭＮ．  Ｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｂｕｇｓ，  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｂｒａｗｎ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００３年；４巻（２号）：１１７〜２６頁）、同じヘテロ二量体形成能を有する生物学的に直交性の分子を使用して、アデノウイルス感染を再標的化する。ラパログＡＰ２１９６７（図７）は、ＦＫＢＰおよび変異体ＦＲＢドメイン（ｍＴＯＲ変異Ｔ２０９８Ｌ）とは安定なヘテロ二量体を形成することができるが、野生型ＦＲＢドメインとは安定なヘテロ二量体を形成することができない（Ｂａｙｌｅ  ＪＨ、Ｇｒｉｍｌｅｙ  ＪＳ、Ｓｔａｎｋｕｎａｓ  Ｋ、Ｇｅｓｔｗｉｃｋｉ  ＪＥ、Ｗａｎｄｌｅｓｓ  ＴＪ、Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ＧＲ．  Ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｐｅｒｍｉｔ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  ２００６年；１３巻（１号）：９９〜１０７頁）。ＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰおよび変異体ＦＲＢ−改変線維をコードする組換えアデノウイルス（Ａｄ−２２０）をアセンブルし、ラパマイシンまたはＡＰ２１９６７のいずれかを使用して標的化について試験した。ラパマイシンおよびＡＰ２１９６７の両方がＡｄ−２２０を再標的化することができたが、対照ウイルスは、ラパマイシンでのみ標的化され、ＡＰ２１９６７では標的化されなかった。
Ｖ．材料および方法
【０１３２】
Ａｄｓｅｍｂｌｙ
【０１３３】
下で参照されている構成成分を用いて改変アデノウイルスを作製した。ゲートウェイＤＯＮＲベクターを使用した。ヒトＡｄ５の例では、ＰＣＲによってＥ１モジュールを得、ＳＬＩＣを用いてベクターｐＤＯＮＲ  Ｐ１Ｐ４に挿入した。ａｔｔＬ１組換え部位およびａｔｔＬ４組換え部位を含むｐＤＯＮＲ  Ｐ１Ｐ４ベクター骨格を、ＰＣＲを使用して増幅し、ＳＬＩＣによってＡｄ５のＥ１モジュールと組み合わせた。代替の対抗選択カセットを生成するために、ベクターｐＤＯＮＲ  Ｐ１Ｐ４を改変した。ａｔｔＰ１組換え部位およびａｔｔＰ４組換え部位を含むこのベクター骨格を、ＰＣＲを使用して増幅し、ＰｈｅＳＡ２９４Ｇ変異およびテトラサイクリン抵抗性カセット（ｐＥＮＴＲ  Ｌ３−ｐＬａｃ−Ｔｅｔ−Ｌ２由来のｐＬａｃ−Ｔｅｔカセット）と組み合わせて、新しいＤＯＮＲベクターを創製した。次いで、新しいＤＯＮＲベクター由来のａｔｔＲ１−ＰｈｅＳＡ２９４ＧＴｅｔ（ｒ）−ａｔｔＲ４断片をＰＣＲによって増幅し、Ａｄｓｅｍｂｌｙ  ＤＥＳＴベクターに挿入した。「ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ  Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ」、カタログ番号１２５３７−１００；およびＳｏｎｅ、Ｔ．ら  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８年９月１０日；１３６巻（３〜４号）：１１３〜２１頁を参照されたい。
【０１３４】
ヒトＡｄ５の例では、Ｅ３モジュールをゲートウェイＢＰ反応によってｐＤＯＮＲ  Ｐ５Ｐ３ｒベクターに挿入した。上記Ｅ４モジュールをゲートウェイＢＰ反応によってｐＤＯＮＲ  Ｐ３Ｐ２ベクターに挿入した。ｐＤＯＮＲ  Ｐ５Ｐ２ベクター由来のａｔｔＲ５−ｃｃｄＢ−Ｃｍ（ｒ）−ａｔｔＲ２断片をＰＣＲによって増幅し、Ａｄｓｅｍｂｌｙ  ＤＥＳＴベクターに挿入した。「ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ  Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ」、カタログ番号１２５３７〜１００；およびＳｏｎｅ、Ｔ．ら  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８年９月１０日；１３６巻（３〜４号）：１１３〜２１頁を参照されたい。
【０１３５】
上記Ａｄｓｅｍｂｌｙ  ＤＥＳＴベクターのベクター骨格は、３種の異なる供給源由来の部分で構成される。Ａｍｐ（ｒ）カセットおよびｌａｃＺ遺伝子をプラスミドｐＵＣ１９から増幅した。これを、ＢｉｏＢｒｉｃｋｓｉＧＥＭ２００７年のパーツ配布の一部である、プラスミドｐＳＢ３Ｋ５−Ｉ５２００２から入手したｐ１５Ａ複製開始点と組み合わせた。Ｅ１毒性を低下させるために、プラスミドをより少ないコピー数（１０〜１２）で維持するｐ１５Ａ  ｏｒｉが必要である。最後に、自己除去性ウイルスを創製するために、上記酵素ＩＳｃｅＩに対する哺乳動物発現カセットについて、プラスミドｐＡｄＺ５−ＣＶ５−Ｅ３＋からＰＣＲを行なった。このカセットを上記ベクターの骨格にクローニングして、ｐ１５Ａ−ＳｃｅＩと称されるベクターを創製した。これは、ゲノム構築を開始するために使用するベクターである。ヒトＡｄ５の例では、その遺伝子モジュールは、全て、野生型Ａｄ５ウイルスから精製したＤＮＡまたはプラスミドｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかから得た。
【０１３６】
上記ＤＥＳＴベクターに関して、ヒトＡｄ５の例では、上記Ｅ２モジュールおよび上記Ｌ３モジュールをプラスミドｐ１５Ａ−ＳｃｅＩに３断片ＳＬＩＣによって挿入した。ａｔｔＲ５部位およびａｔｔＲ２部位が隣接するｃｃｄＢおよびＣｈｌｏｒ（ｒ）を発現している対抗選択マーカーを、プラスミドｐＤＯＮＲ  Ｐ５Ｐ２からＰＣＲによって得た。その第２の対抗選択マーカー（ＰｈｅＳ−Ｔｅｔ）を、ベクターｐＤＯＮＲ  Ｐ１Ｐ４  ＰｈｅＳＡ２９４Ｇ−ＴｅｔからＰＣＲによって得た（上記を参照されたい）。上記ＤＥＳＴベクターを創製するために上記Ｅ２モジュールおよび上記Ｌ４モジュールの末端に工学的に作製した独特の制限酵素で切断した後、ｐ１５Ａ−ＳｃｅＩ  Ｅ２−Ｌ４の右側（ｃｃｄＢ／Ｃｍ）および左側（ＰｈｅＳ／Ｔｅｔ）に２つの対抗選択マーカーをＳＬＩＣによって挿入した（ｐＤＥＳＴ  Ｅ２−Ｌ５）。
【０１３７】
アデノウイルス遺伝子モジュールを含有するマルチサイトゲートウェイエントリーベクターに関して、ヒトＡｄ５の例では、上記Ｅ１モジュールをｐＤＯＮＲ  Ｐ１Ｐ４にＳＬＩＣによって挿入した。上記Ｅ３モジュールをｐＤＯＮＲ  Ｐ５Ｐ３ＲにゲートウェイＢＰ反応によって挿入した。上記Ｅ４モジュールをｐＤＯＮＲ  Ｐ３Ｐ２にゲートウェイＢＰ反応によって挿入した。
【０１３８】
Ａｍｐ（ｒ）カセット：プラスミドｐＵＣ１９に関しては、ｐ１５Ａ  ｏｒｉ：プラスミドｐＳＢ３Ｋ５−Ｉ５２００２は、ＢｉｏＢｒｉｃｋｓｉＧＥＭの２００７年パーツ配布の一部であった。上記アデノウイルス遺伝子モジュールに関しては、Ａｄ５粒子から精製したＤＮＡ、またはプラスミドｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれか。ＤＯＮＲベクターｐＤＯＮＲ  Ｐ１Ｐ４、Ｐ５Ｐ２、Ｐ５Ｐ３Ｒ、Ｐ３Ｐ２は、Ｊｏｎ  Ｃｈｅｓｎｕｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手した。ＰｈｅＳ遺伝子は、ＤＨ５アルファ細菌ゲノムＤＮＡから得、その後、クイックチェンジによって変異させてＰｈｅＳＡ２９４Ｇ変異体を創製した。Ｔｅｔ（ｒ）遺伝子に関しては、プラスミドｐＥＮＴＲ  Ｌ３−ｐＬａｃ−Ｔｅｔ−Ｌ２をＪｏｎ  Ｃｈｅｓｎｕｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手した。
【０１３９】
上記Ａｄｓｅｍｂｌｙ法の実施形態に関しては、一般には２つの対抗選択カセットが隣接するコアモジュールを含有する二重ＤＥＳＴベクター２０ｆｍｏｌを、遺伝子モジュールを含有する残りのエントリーベクターのそれぞれ１０ｆｍｏｌと組み合わせる。Ａｄ５の例では、これは、Ｅ２−Ｌ３二重ＤＥＳＴベクター２０ｆｍｏｌを、Ｅ１モジュールエントリーベクター、Ｅ３モジュールエントリーベクター、およびＥ４モジュールエントリーベクターのそれぞれ１０ｆｍｏｌと組み合わせることを含む。いくつかの場合では、上記エントリーベクターのうちの１種または複数種の量が増加することにより効率が上昇し得る（例えば、Ａｄ５について上記Ｅ１モジュールエントリーベクター５０ｆｍｏｌを使用する）。これらのベクターを、最終の体積１０μｌ中２μｌのＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と組み合わせる。その反応物を２５℃で一晩インキュベートする（１２〜１６時間）。その反応を、プロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μｌを添加することによって停止させ、３７℃で１０分インキュベートする。次いで、上記反応物５μｌを、ｃｃｄＢ遺伝子産物に対して感受性である高コンピテンス細菌（＞１×１ｅ９  ｃｆｕ／μｇ）に形質転換し、ＹＥＧ−Ｃｌ寒天プレート（Ｋａｓｔ、Ｐ．  Ｇｅｎｅ、１３８巻（１９９４年）１０９〜１１４頁に記載の通り；ＰｈｅＳＡ２９４Ｇ対抗選択を用いる場合）または上記ベクターにおいて使用する対抗選択のための他の適切な培地に播いた。その後、コロニーを単離し、完全なゲノムについてスクリーニングする。完全なゲノムを２９３Ｅ４細胞に直接トランスフェクトし、トランスフェクトした５〜９日後に感染性粒子が生じた。
【０１４０】
ＰＣＲに関しては、全てのＰＣＲを、Ｐｈｕｓｉｏｎ酵素（ＮＥＢ）を使用して実施した。Ａｄ５からアデノウイルス遺伝子（ＡＤＥＮＯＶＩＲＡＬ  ＧＥＮＥ）モジュールを得るためのＰＣＲは、１×ＨＦ緩衝液、各ｄＮＴＰ２００μＭ、各プライマー０．５μＭ、および鋳型１０ｎｇを用いて実施した。Ｅ２−Ｌ２モジュールについては、３％のＤＭＳＯも加えた。鋳型は、プラスミドｐＡｄ／ＰＬ−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュール、およびＥ４モジュールについて）またはＡｄ５ゲノムＤＮＡ（Ｅ１モジュールおよびＥ３モジュールについて）であった。ＰＣＲ条件は以下の通りであった。Ｅ２−Ｌ２およびＬ３−Ｌ４：９８℃で３０秒間−９８℃で１０秒間、６５℃で３０秒間（２サイクルごとに温度を１℃低下）、７２℃で７分間を１０サイクル−９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で８分間を２９サイクル−７２℃で１０分間−４℃で保持。Ｅ３：９８℃で３０秒間−９８℃で１０秒間、７０℃で３０秒間（サイクルごとに温度を０．５℃低下）、７２℃で２分３０秒間を１０サイクル−９８℃で１０秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で２分３０秒間を２５サイクル−７２℃で１０分間−４℃で保持。Ｅ４：９８℃で３０秒間−９８℃で１０秒間、６３℃で３０秒間（サイクルごとに温度を０．５℃低下）、７２℃で２分間を６サイクル−９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間を２９サイクル−７２℃で５分間−４℃で保持。精製したウイルスからウイルスゲノムＤＮＡを得ることに関して、精製したウイルス最大１００μｌを、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌ、および０．２％のＳＤＳを含有する溶解緩衝液３００μｌに加える。混合物を６０℃で５分間インキュベートし、その後、プロテイナーゼＫストック（約２０ｍｇ／ｍＬ）５μｌを加え、６０℃で１時間さらにインキュベートする。次いで、試料を氷上に５分間置き、その後１５Ｋ×ｇで１５分間回転させる。上清を取り出し、等体積のイソプロパノールに加え、よく混合し、４℃、１５Ｋ×ｇで１５分間回転させる。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、４℃で１５分間、再度回転させる。そのペレットを乾燥させ、使用するために再懸濁させる。
【０１４１】
ＳＬＩＣに関しては、線状の断片を、以下の反応物２０μｌ中、室温で２０分間エキソヌクレアーゼ処理する：５０ｍＭのトリス、ｐＨ８、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、２００ｍＭの尿素、５ｍＭのＤＴＴ、および０．５μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ。その反応を、０．５ＭのＥＤＴＡを１μｌ添加することによって停止させ、その後７５℃で２０分間インキュベートする。次いで、等量のＴ４処理したＤＮＡを混合して新しいチューブ中の体積をおよそ２０μｌにする。２断片を組み合わせるＳＬＩＣのために各反応物１０μｌを使用する。３断片を組み合わせるＳＬＩＣのために各反応物７μｌを使用する。
【０１４２】
断片を、１０分間６５℃まで加熱することによってアニーリングさせ、その後、その温度を５秒ごとに０．５℃低下させて２５℃に至るまでゆっくり冷却する。アニーリング後、その反応物５μｌを形質転換し、クローンをスクリーニングする。
【０１４３】
再標的化ウイルス調製
【０１４４】
ウイルスの産生、濃縮および精製に関しては、２９３Ｅ４細胞に感染性粒子を感染させ、ＣＰＥが明らかであるトランスフェクトしたおよそ４８時間後に細胞を採取し、５００×ｇで５分遠心分離することによって単離する。細胞を３回凍結／解凍することによってＴＭＮ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解させ、細胞残屑を、３Ｋ×ｇおよび３．５Ｋ×ｇで１５分間の２ラウンドの遠心分離によって除去した。塩化セシウム勾配（０．５ｇ／ｍＬ）を使用して、３７Ｋ×ｇで１８〜２４時間超遠心分離することによってウイルス粒子をバンドにする。バンドを採取し、１０ｋのＭＷＣＯ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において１０％グリセロールを伴うＴＭＮ中、４℃で一晩（１２〜１８時間）透析し、次いで−８０℃で保管する。精製したウイルスの力価を、力価を決定した野生型標準物質に対して、抗アデノウイルス５型一次抗体（ａｂ６９８２、Ａｂｃａｍ）、およびＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ抗ウサギアルカリホスファターゼ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた細胞に基づく段階希釈感染ＥＬＩＳＡによって決定した。
【０１４５】
ｍＴＯＲのＦＲＢドメインをアデノウイルス線維に挿入することに関しては、ＦＲＢドメインを、ＡｄｓｅｍｂｌｙエントリーベクターｐＥＮＴＲ  Ｅ３−Ｌ５における線維遺伝子のＨ１ループ領域にＳＬＩＣによって挿入した。ｍＴＯＲである９０アミノ酸のＦＲＢドメイン（アミノ酸Ｇｌｕ２０２５〜Ｇｌｎ２１１４）をｐＲＫ５  ｍＴＯＲ−ｍｙｃ（Ｒ．Ｓｈａｗ）からＰＣＲ増幅して、アデノウイルス線維Ｈ１ループに隣接した（ｆｌａｎｋｉｎｇ）末端を有するＰＣＲ増幅したｐＥＮＴＲ  Ｅ３−Ｌ５へと挿入し、それをＴｈｒ５４６とＰｒｏ５４７の間に挿入して、結果生じるベクター、ｐＥＮＴＲ  Ｅ３−Ｌ５（ＦＲＢ−線維）を生成した。
【０１４６】
ＡＰ２１９６７との結合に対して特異的にするためにｍＴＯＲのＦＲＢドメインを変異させることに関しては、標準の技法を使用して、ＡｄｓｅｍｂｌｙエントリーベクターｐＥＮＴＲ  Ｅ３−Ｌ５（ＦＲＢ−線維）およびｐＥＮＴＲ  Ｅ３−Ｌ５（ΔＲＩＤ、ＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰ、ＦＲＢ−線維）においてＦＲＢドメインを変異させた。残基Ｔｈｒ２０９８（ｍＴＯＲ番号付け）をＬｅｕに変異させた。この結果、ＡｄｓｅｍｂｌｙエントリーベクターｐＥＮＴＲ  Ｅ３−Ｌ５（ＦＲＢ＊−線維）およびｐＥＮＴＲ  Ｅ３−Ｌ５（ΔＲＩＤ、ＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰ、ＦＲＢ＊−線維）が生じた。
【０１４７】
感染用のアデノウイルスにコードされる蛍光レポーターに関しては、ＧＦＰの配列をアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の５’に挿入して、Ｚｈａｏ，  Ｌ．Ｊ．ら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００６年１２月１日；２８１巻（４８号）：３６６１３〜２３頁に記載されている融合物を生成した。アデノウイルスＥ１Ａの開始コドンに隣接した末端を有するＰＣＲ増幅したｐＥＮＴＲ  Ｅ１へと挿入して結果生じるプラスミド、ｐＥＮＴＲ  Ｅ１（ＧＦＰ−Ｅ１Ａ）を生成するために、ＧＦＰ遺伝子を、記載のＣ−リンカー配列を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１４８】
ウイルスゲノムからのＦＫＢＰの発現に関しては、ＦＫＢＰ配列をＳＬＩＣによってｐＥＮＴＲ  Ｅ３−Ｌ５へと挿入し、アデノウイルスのＲＩＤα遺伝子、ＲＩＤβ遺伝子、および１４．７Ｋ遺伝子を置き換えた。ＰＣＲ増幅したｐＥＮＴＲ  Ｅ３−Ｌ５およびＲＩＤαの開始コドンから１４．７の終止コドンまでの配列を欠くｐＥＮＴＲ  Ｅ３−Ｌ５（ＦＲＢ−線維）に挿入して、結果として生じるベクター、ｐＥＮＴＲ  Ｅ３−Ｌ５（ΔＲＩＤ、ＦＫＢＰ）およびｐＥＮＴＲ  Ｅ３−Ｌ５（ΔＲＩＤ、ＦＫＢＰ、ＦＲＢ−線維）を生成するために、ＦＫＢＰ遺伝子をｐｃＤＮＡ−ＦＫＢＰ１２−Ｃｒｌｕｃ（Ｓ．Ｇａｍｂｈｉｒ）からＰＣＲ増幅した。代替のＦＫＢＰ挿入位置を構築したが、免疫ブロット（Ｅ１転写物におけるＣ末端ＩＲＥＳにより駆動される発現、線維転写物におけるＣ末端ＩＲＥＳにより駆動される発現、またはＦｉｂｅｒ−Ｆｕｒｉｎ２Ａ−ＦＫＢＰ自己切断配列）により、感染の間にＦＫＢＰの蓄積が導かれないようであった。
【０１４９】
ＦＫＢＰとの再標的化部分遺伝子融合に関しては、ＦＫＢＰとのラパマイシン依存性複合体におけるＦＲＢ−線維のＰｙＭｏｌにおける３Ｄモデリングにより、標的化部分をＦＫＢＰのＮ末端と融合することの利点が明らかになった。ＥＧＦＲとの結合特異性を有するラクダ科の動物の抗体可変重鎖（ＶＨＨ）（ＥＧＦＲＶＨＨ）の場合では、ＥＧＦＲＶＨＨは、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈによって合成された遺伝子であり、これをｐＥＮＴＲ  Ｅ３−Ｌ５（ΔＲＩＤ、ＦＫＢＰ）およびｐＥＮＴＲ  Ｅ３−Ｌ５（ΔＲＩＤ、ＦＫＢＰ、ＦＲＢ−線維）において、ＧＳＧＳＧＳＴリンカー配列を用いてＳＬＩＣによってＦＫＢＰのＮ末端に挿入し、プラスミドｐＥＮＴＲ  Ｅ３−Ｌ５（ΔＲＩＤ、ＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰ）およびｐＥＮＴＲ  Ｅ３−Ｌ５（ΔＲＩＤ、ＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰ、ＦＲＢ−線維）を生成した。
【０１５０】
再標的化実験
【０１５１】
ＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰによるＥＧＦＲを介したラパマイシン誘導性再標的化アデノウイルス感染に関しては、Ａｄｓｅｍｂｌｙを使用し、ｐＥＮＴＲ  Ｅ１（ＧＦＰ−Ｅ１Ａ）、ｐＥＮＴＲ  Ｅ３−Ｌ５（ΔＲＩＤ、ＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰ、ＦＲＢ−線維）、ｐＥＮＴＲ  Ｅ４、およびｐＤＥＳＴ  Ｅ２−Ｌ５を用いて、以降Ａｄ−１７８と称される、がん細胞系のパネルに感染させるためのウイルスを構築した。Ａｄ−１７８を使用して、ＭＯＩ１０で２９３Ｅ４細胞に感染させた。感染の２４時間後に５０ｎＭのラパマイシンを培地に添加した。ＭＤＡ  ＭＢ  ４５３に感染させるためにＡｄ−１７８を使用して、種々のラパマイシン濃度を試験することによってラパマイシンの濃度を最適化した。感染の４８時間後に、感染性粒子を含有する培地を採取し、０．２２μｍ孔フィルターによって濾過した。濾過した培地を段階希釈で使用して、黒壁の９６ウェルプレートまたは６ウェルプレートにおいてがん細胞系のパネルに感染させ、ラパマイシンの添加を伴わずに同様に調製したウイルスを使用して、同一の細胞のセットに対照として並行して感染させた。感染の３時間後に培地を交換した。
【０１５２】
ＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰによるＥＧＦＲを介したラパログ誘導性再標的化アデノウイルス感染に関しては、Ａｄｓｅｍｂｌｙを使用して、ｐＥＮＴＲ  Ｅ１（ＧＦＰ−Ｅ１Ａ）、ｐＥＮＴＲ  Ｅ３−Ｌ５（ΔＲＩＤ、ＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰ、ＦＲＢ＊−線維）、ｐＥＮＴＲ  Ｅ４、およびｐＤＥＳＴ  Ｅ２−Ｌ５を用いて、以降Ａｄ５−２２０と称されるウイルスを構築した。Ａｄ５−２２０を使用して、ＭＯＩ１０で２９３Ｅ４細胞に感染させた。感染の２４時間後に１００ｎＭのＡＰ２１９６７を培地に添加した。感染の４８時間後に、感染性粒子を含有する培地を採取し、０．２２μｍ孔のフィルターによって濾過した。濾過した培地を使用して１２ウェルプレートにおいてがん細胞系に感染させ、ラパマイシンの添加を伴って、またはＡＰ２１９６７の添加を伴わずに同様に調製したウイルスを使用して、同一の細胞のセットに対照として並行して感染させた。感染の１時間後に培地を交換した。
【０１５３】
異所性に発現させたリガンド−ＦＫＢＰを用いたラパマイシン誘導性再標的化アデノウイルス感染に関しては、２９３Ｅ４細胞に、ＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰ（または対照としてＧＦＰ）を一過性にトランスフェクトし、トランスフェクトした２４時間後に、Ａｄ−１２２をＭＯＩ１０で感染させた。感染の２４時間後に１００ｎＭのラパマイシンを培地に添加した。感染の４８時間後に、感染性粒子を含有する培地を採取し、０．２２μｍ孔のフィルターによって濾過した。濾過した培地を使用して、１２ウェルプレートに播種したＭＤＡ  ＭＢ  ２３１細胞に感染させた。感染の１時間後に培地を交換した。
【０１５４】
感染効率の定量化に関しては、２５ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  ＭｉｃｒｏのＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して％ＧＦＰ陽性細胞を計数することにより、ハイコンテントイメージングによって９６ウェルプレートについて定量化した。６ウェルプレートまたは１２ウェルプレートの感染効率を、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＦＡＣＳによって％ＧＦＰ陽性細胞を計数することによって定量化した。
【０１５５】
ＥＧＦＲＶＨＨ再標的化アデノウイルスのＥＧＦＲに対する特異性に関しては、Ｅｎｇｅｌｍａｎ，  Ｊ．Ａ．ら  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖ．  ２００６年１０月２日；１１６巻（１０号）：２６９５〜７０６頁からの有効なｓｈＲＮＡ  Ｂ配列を、ｐＬｅｎｔｉＸ２  ｐｕｒｏベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）においてＨ１プロモーターの制御下でクローニングし、ＭＤＡ  ＭＢ  ４５３乳がん細胞におけるＥＧＦＲノックダウンを媒介するためのレンチウイルスを生成するために使用した。ＭＤＡ  ＭＢ  ４５３に、抗ＥＧＦＲ  ｓｈＲＮＡ構築物またはルシフェラーゼ遺伝子を対象とするｓｈＲＮＡをコードする対照レンチウイルスを用いて形質導入し、２μｇ／ｍＬのピューロマイシンの下で選択した。ノックダウン効率を、タンパク質全体におけるＥＧＦＲについての免疫ブロッティングによって定量化した。再標的化アッセイを、選択されたＭＤＡ  ＭＢ  ４５３に対して６ウェルプレートにおいて繰り返し、感染効率を、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＦＡＣＳによって定量化した。
ＶＩ．表
【０１５６】
表１：設計した新規のアデノウイルスの要約
【表１】
2015511822.tif 000003
【０１５７】
表２．二量体形成剤（ＤＡ）、カプシド二量体形成剤結合剤コンジュゲートの二量体形成剤結合剤（ＤＡＢＣ）およびリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートの二量体形成剤結合剤（ＤＡＢＬ）の例
【表２】
2015511822.tif 000004
【０１５８】
表３．リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートに含まれるリガンドおよびそのようなリガンドが結合する対応する細胞表面受容体の例
【表３−１】
2015511822.tif 000005
【表３−２】
2015511822.tif 000006
【表３−３】
2015511822.tif 000007
【表３−４】
2015511822.tif 000008
【０１５９】
ＶＩＩ．実施形態
（実施形態１）
カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートおよびリガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートをコードする組換え核酸。
（実施形態２）
前記カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートが、カプシドタンパク質および二量体形成剤結合剤を含む、実施形態１に記載の組換え核酸。
（実施形態３）
前記カプシドタンパク質が前記二量体形成剤結合剤に作動可能に連結している、実施形態２に記載の組換え核酸。
（実施形態４）
前記カプシドタンパク質がアデノウイルスのカプシドタンパク質である、実施形態３に記載の組換え核酸。
（実施形態５）
前記アデノウイルスのカプシドタンパク質が線維タンパク質である、実施形態４に記載の組換え核酸。
（実施形態６）
前記二量体形成剤結合剤がＦＲＢタンパク質である、実施形態３に記載の組換え核酸。
（実施形態７）
前記リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートが、リガンドおよび二量体形成剤結合剤を含む、実施形態１に記載の組換え核酸。
（実施形態８）
前記リガンドが、前記二量体形成剤結合剤に作動可能に連結している、実施形態７に記載の組換え核酸。
（実施形態９）
前記リガンドが、細胞に結合することができる、実施形態７に記載の組換え核酸。
（実施形態１０）
前記細胞が腫瘍細胞である、実施形態９に記載の組換え核酸。
（実施形態１１）
前記リガンドが抗体である、実施形態７に記載の組換え核酸。
（実施形態１２）
前記抗体が単一ドメイン抗体である、実施形態１１に記載の組換え核酸。
（実施形態１３）
前記二量体形成剤結合剤がイムノフィリンタンパク質である、実施形態７に記載の組換え核酸。
（実施形態１４）
前記イムノフィリンタンパク質がＦＫＢＰタンパク質である、実施形態１３に記載の組換え核酸。
（実施形態１５）
前記ＦＫＢＰタンパク質がヒトＦＫＢＰタンパク質である、実施形態１４に記載の組換え核酸。
（実施形態１６）
前記ヒトＦＫＢＰタンパク質がＦＫＢＰ１２である、実施形態１５に記載の組換え核酸。
（実施形態１７）
実施形態１から１６までの一項に記載の組換え核酸を含む組換えアデノウイルス。
（実施形態１８）
前記アデノウイルスが複製する能力のないアデノウイルスである、実施形態１７に記載の組換えアデノウイルス。
（実施形態１９）
前記アデノウイルスが複製する能力のあるアデノウイルスである、実施形態１７に記載の組換えアデノウイルス。
（実施形態２０）
カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換えアデノウイルス。
（実施形態２１）
前記カプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートが二量体形成剤と結合する、実施形態２０に記載の組換えアデノウイルス。
（実施形態２２）
前記二量体形成剤が化合物である、実施形態２１に記載の組換えアデノウイルス。
（実施形態２３）
前記化合物がラパマイシンである、実施形態２２に記載の組換えアデノウイルス。
（実施形態２４）
前記二量体形成剤が抗がん薬である、実施形態２１に記載の組換えアデノウイルス。
（実施形態２５）
前記二量体形成剤が、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートとさらに結合する、実施形態２１に記載の組換えアデノウイルス。
（実施形態２６）
実施形態２０から２５までのいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを含む細胞。
（実施形態２７）
アデノウイルスがん細胞標的化構築物を形成する方法であって、
（ｉ）細胞に、実施形態１７に記載の組換えアデノウイルスを感染させ、それにより、アデノウイルス感染細胞を形成するステップと、
（ｉｉ）該アデノウイルス感染細胞に前記組換え核酸を発現させ、それにより、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲート、およびカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換えアデノウイルスを形成するステップと、
（ｉｉｉ）該組換えアデノウイルスおよび該リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを二量体形成剤と接触させるステップと、
（ｉｖ）該組換えアデノウイルスおよび該リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを該二量体形成剤に結合させ、それにより、該アデノウイルスがん細胞標的化構築物を形成するステップと
を含む方法。
（実施形態２８）
細胞を標的化する方法であって、細胞を、実施形態２０から２５までのいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスと接触させるステップを含む方法。
（実施形態２９）
前記細胞ががん細胞である、実施形態２８に記載の方法。
（実施形態３０）
がん患者におけるがん細胞を標的化する方法であって、
（ｉ）がん患者に実施形態１７に記載の組換えアデノウイルスを投与するステップと、
（ｉｉ）該組換えアデノウイルスを該がん患者における細胞に感染させ、それにより、アデノウイルス感染細胞を形成するステップと、
（ｉｉｉ）該アデノウイルス感染細胞に前記組換え核酸を発現させ、それにより、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲート、およびカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換えアデノウイルスを形成するステップと、
（ｉｖ）該がん患者に二量体形成剤を投与するステップと、
（ｖ）該組換えアデノウイルスおよび該リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを該二量体形成剤に結合させ、それにより、アデノウイルスがん細胞標的化構築物を形成するステップと、
（ｖｉ）該アデノウイルスがん細胞標的化構築物をがん細胞に結合させ、それにより、該がん患者における該がん細胞を標的化するステップと、
を含む方法。
（実施形態３１）
前記細胞ががん細胞である、実施形態３０に記載の方法。
（実施形態３２）
前記細胞が非がん細胞である、実施形態３０に記載の方法。
（実施形態３３）
細胞を標的化する方法であって、
（ｉ）第１の細胞を実施形態１７に記載の組換えアデノウイルスと接触させるステップと、
（ｉｉ）該組換えアデノウイルスを該第１の細胞に感染させ、それにより、アデノウイルス感染細胞を形成するステップと、
（ｉｉｉ）該アデノウイルス感染細胞に前記組換え核酸を発現させ、それにより、リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲート、およびカプシド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを含む組換えアデノウイルスを形成するステップと、
（ｉｖ）該リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートおよび該組換えアデノウイルスを二量体形成剤と接触させるステップと、
（ｖ）該組換えアデノウイルスおよび該リガンド−二量体形成剤結合剤コンジュゲートを該二量体形成剤に結合させ、それにより、アデノウイルス細胞標的化構築物を形成するステップと、
（ｖｉ）該アデノウイルス細胞標的化構築物を第２の細胞に結合させ、それにより、該細胞を標的化するステップと
を含む方法。
（実施形態３４）
前記第１の細胞および前記第２の細胞が生物体の一部を形成する、実施形態３３に記載の方法。
（実施形態３５）
前記第１の細胞および前記第２の細胞が組織培養容器の一部を形成する、実施形態３３に記載の方法。
【図２】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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