(57)【要約】  本発明は、無機(金属/金属酸化物)ナノ粒子のアジュバント特性の確認に基づく。このように、本発明は、無機ナノ粒子を含むか、無機ナノ粒子からなるか又は本質的に無機ナノ粒子からなるアジュバントを提供する。本発明は、また、無機ナノ粒子を含む組成物及びワクチン並びにアジュバント無機ナノ粒子を利用する方法を提供する。【選択図】図１
2015511624.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無機ナノ粒子を含むか、無機ナノ粒子からなるか又は本質的に無機ナノ粒子からなるアジュバント。
【請求項２】
アジュバントが、ミョウバンを含まない、請求項1に記載のアジュバント。
【請求項３】
アジュバントが、少なくとも1つの金属ナノ粒子及び/又は少なくとも1つの金属酸化物ナノ粒子を含んでいる、請求項1又は2に記載のアジュバント。
【請求項４】
アジュバントが、コバルトナノ粒子及び/又は酸化コバルトナノ粒子を含んでいる、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアジュバント。
【請求項５】
酸化コバルトナノ粒子が、酸化コバルト(II、III)(Co3O4)ナノ粒子を含んでいる、請求項4に記載のアジュバント。
【請求項６】
アジュバントが、酸化第一コバルト(酸化コバルト(II): CoO)ナノ粒子及び/又は酸化第二コバルト(酸化コバルト(III): Co2O3)ナノ粒子を含んでいるか又は更に含んでいる、請求項1〜5のいずれか1項に記載のアジュバント。
【請求項７】
ナノ粒子の直径が、約1nmと約100nmの間にある、請求項1〜6のいずれか1項に記載のアジュバント。
【請求項８】
コバルトナノ粒子が、約18.4±5.0nmの平均直径を有する、請求項4〜7のいずれか1項に記載のアジュバント。
【請求項９】
アジュバントとして無機金属ナノ粒子、コバルトナノ粒子及び/又は酸化コバルトナノ粒子の使用。
【請求項１０】
ナノ粒子が、Co3O4ナノ粒子を含んでいる、請求項9に記載の使用。
【請求項１１】
請求項1〜8のいずれか1項に記載のアジュバント、医薬的に又は生理的に許容され得る賦形剤、溶媒、担体又は希釈剤を含むアジュバント組成物。
【請求項１２】
組成物が、1つ以上の追加のアジュバント成分を含んでいる、請求項11に記載のアジュバント組成物。
【請求項１３】
請求項1〜8のいずれか1項に記載のアジュバントを含むワクチン。
【請求項１４】
ヒト又は動物の被検者において免疫応答を促進するのに用いるための請求項1〜8のいずれか1項に記載のアジュバント又は請求項13に記載のワクチン。
【請求項１５】
ヒト又は動物の被検者において(i)免疫応答を引き上げ且つ/又は(ii)の免疫応答を促進するか、モジュレートするか又は増強する方法であって、請求項1〜8のいずれか1項に記載のアジュバント、又は請求項13に記載のワクチンを、それを必要としているヒト又は動物の被検者に投与する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒト又は動物の被検者において免疫応答を変化させるか、モジュレートするか又は増強するのに用いるための新規なアジュバントを提供する。本発明は、更に、アジュバントを含む組成物及びワクチンを提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ワクチンは、良好な抗体応答を有する長期防御免疫を付与することによる感染症予防の究極の免疫学的ツールであるとみなされている[1;2]。アジュバントの役割は、抗原提示細胞の活性化によって与えられる最低量の抗原に対して免疫系の特異的応答を高めることである[3]。理想的なアジュバントは、それ自体抗原性でなく且つ免疫応答を押し上げるものであるが、患者に害を与え得る免疫系の過剰反応を誘発する(例えば過度の局部炎症、アレルギー又は遅延型過敏症を誘発する)ことがない。
安全性に対する懸念のため、認可されたアジュバントは非常に限られており、注射部位の疼痛及び炎症が臨床ワクチンにおけるアジュバントの使用の一般的な副作用である。ヒトワクチンにおいて最も広く使われているアジュバントは、アルミニウムを含有する[4]、例えばミョウバン、無機塩、通常Al(OH)3又はAl(PO)4として調製されたものである。従って、ミョウバンアジュバントは金属酸化物微粒子である。
マウスにおいて、アルミニウム含有アジュバントは、主にTh2型応答を促進することによって液性免疫を誘導するが、Th1依存性抗体を模倣する能力が不充分である。このタイプのアジュバントは、通常、強い細胞性免疫応答、特に細胞障害性T細胞応答を引き起こさない[4]が、追加の脂質アジュバントの存在下で細胞障害性CD8応答を開始することが報告されている[5]。それ故、ミョウバン含有アジュバントは、タンパク抗原又は不活性化生物体に対する応答に適しているが、細胞内病原体への応答を引き起こすのには最適でない[1-4]。
【０００３】
ナノ粒子(NP)は、バルクケミカルと比較してそのユニークな物理化学的特性のために広範囲にわたる生物医学的応用に拡大している[6]。例えば、NPは、より大きな表面積及び静電相互作用によって高いタンパク質結合親和性を有する[7]。NPは、また、組織に深く侵入することができ且つ細胞取り込みを高めることができるだけでなく、リソソームコンパートメントを逃れることができる[7-9]。これらのユニークな特性は、潜在的アジュバントとみなされるNPにつながっている[10;11]。NPのサイズはアジュバント能力に影響すると思われ、より小さなNPはより大きな抗体及び細胞性免疫応答を生じることを示している[12]。しかしながら、ワクチンアジュバントのNP候補のほとんどが有機物質である[13]。
ネズミ喘息モデルにおいて、多層カーボンナノチューブ[14]、ディーゼル排気微粒子[15]、及びナノサイズ超微細カーボンブラック[16]は、アジュバント様機序によって血清IgEレベルを上昇させることが報告された。ミョウバン含有アジュバントを用いて報告されたデータと比較すると[17;18]、ナノサイズカーボンブラックは、IgG1及びIgE増加を有する同様のアジュバント効果を示した[16]。
酸化ニッケルNP(NiONP)及び酸化コバルトNP(Co3O4NP)が雌ウィスターラットの肺においてTh1関連サイトカイン応答を誘導することができることが示されている[19]。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、先行技術と関連した問題の1つ以上を取り除くとともに細胞性免疫応答が予防又は治癒にとって重要である疾患に対してワクチンと用いるのに適した追加のアジュバントを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明は、無機(金属/金属酸化物)ナノ粒子のアジュバント特性の確認に基づく。
第1の態様において、本発明は、無機ナノ粒子を含むか、無機ナノ粒子からなるか又は本質的に無機ナノ粒子からなるアジュバントを提供する。
一実施態様において、アジュバントはミョウバンを含まなくてもよい。
本発明が提供するアジュバントの無機ナノ粒子は、金属ナノ粒子を含み得る。例えば、金属ナノ粒子は、金属酸化物ナノ粒子を含み得る。
有利には、本発明のアジュバントは、1つ以上のタイプの金属ナノ粒子を含み得る。例えば、本明細書に記載されているアジュバントは、異なるタイプの無機(金属酸化物)ナノ粒子の反応混液又は混合物を含み得る。一実施態様において、本明細書に記載されているアジュバントは、更にミョウバンベースのアジュバントの量を含み得る。
このように、本発明の実施態様は、金属及び/又は金属酸化物ナノ粒子を含むか、金属及び/又は金属酸化物ナノ粒子からなるか又は本質的に金属及び/又は金属酸化物ナノ粒子からなるアジュバントを提供する。
本発明のアジュバントは、コバルトナノ粒子を含むか、コバルトナノ粒子からなるか又は本質的にコバルトナノ粒子からなり得る。一実施態様において、コバルトナノ粒子は酸化コバルトを含んでいる。本発明のアジュバントとして用いるのに適した酸化コバルトナノ粒子は、例えば、酸化コバルト(II、III)(Co3O4)ナノ粒子を含み得る。
【０００６】
上記を考慮して、本発明は、コバルト及び/又は酸化コバルト(II、III)(Co3O4)ナノ粒子を含むか、コバルト及び/又は酸化コバルト(II、III)(Co3O4)ナノ粒子からなるか又は本質的にコバルト及び/又は酸化コバルト(II、III)(Co3O4)ナノ粒子からなるアジュバントを提供する。
技術の1つが、酸化コバルトの他の形が存在し且つこれらがアジュバントと同様に適用し得ることを理解するであろう - 従って、本明細書に記載されているアジュバントは、更に酸化第一コバルト(酸化コバルト(II): CoO)及び/又は酸化第二コバルト(酸化コバルト(III): Co2O3)を含み得るか又は酸化第一コバルト(酸化コバルト(II): CoO)及び/又は酸化第二コバルト(酸化コバルト(III): Co2O3)からなり得るか又は本質的に酸化第一コバルト(酸化コバルト(II): CoO)及び/又は酸化第二コバルト(酸化コバルト(III): Co2O3)からなり得る。
本発明者らは、無機ナノ粒子、特に金属ナノ粒子、例えばコバルトナノ粒子を含むものを含むアジュバントが生体内投与される場合にバランスのとれたTh1及びTh2型応答を誘導することを発見した。これは、Th1又はTh2応答のみを誘導する、例えば、ミョウバンを含むものを含める他のアジュバントとは対照的である。技術の1つが、Th1応答が細胞内病原体のクリアランスを援助するのに効果的であり、ほとんどのアジュバントが細胞外病原体のクリアランスにより効果的であるTh2応答を引き出すことを理解するであろう。このように、本発明の無機又はコバルトのナノ粒子アジュバントが、様々なワクチンと用いることができ、且つ体液性及び/又は細胞性免疫応答が予防又は治癒にとって重要である疾患に対してワクチンと用いるために特に適している。
【０００７】
更に、本発明者らは、ミョウバンベースのアジュバント(主として微粒子のミョウバンを含むか又は微粒子のミョウバンからなる - すなわち0.1μmと100μmの間のミョウバン粒子)とは対照的に、本発明の無機(コバルトベースの)ナノ粒子アジュバントが『アレルギー』IgE免疫グロブリンアイソタイプをほとんど含まない免疫応答を誘導することを見出した。このことは、アジュバント投与後、過敏反応を和らげるので重要である。
更なる利点として、本発明者らは、本明細書に記載されている無機ナノ粒子ベースのアジュバント - 例えば、コバルトナノ粒子アジュバントが感作部位と抗原投与部位双方で炎症を引き起こさないことを発見した。このことは、ミョウバンのようなアジュバントの投与後にしばしば続き得る痛みを伴う腫れを和らげる効果がある。
上記を考慮して、また、理論によって縛られることを望まないが、バランスのとれたTH1及びTH2免疫応答の誘導、ミョウバンベースのアジュバントと比較した低毒性及びアレルギー副作用の相対的な欠如の結果として、無機ナノ粒子(例えばコバルト及び/又は酸化コバルト(詳しくはCo3O4)を含む金属ナノ粒子)は、Th1又はTh2応答又はTh1及びTh2双方の応答が病原体をクリアするために必要であるワクチンと用いるのに適した用途が広いアジュバントを表している。
用語ナノ粒子は、直径が約1nmと約100nmの間にある粒子を包含する。例えば、ナノ粒子は、約1nm、5nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、95nm又は99nmであってもよく(又はこの平均直径を有してもよい)。一実施態様において、本発明が提供するアジュバント組成物のナノ粒子は、約15nm、16nm、17nm、18nm、19nm又は20nmの平均直径を有してもよい。ナノ粒子がコバルトを含む場合には、約17nm、17.5nm、18nm、18.1nm、18.2nm、18.3nm、18.4nm、18.5nm、18.6nm、18.7nm、18.8nm、18.9nm、19nm、19.5nm又は20nmの直径(又は平均直径)を有してもよい。
【０００８】
一実施態様において、本明細書に記載されているアジュバントのコバルトナノ粒子(酸化コバルト(II、III)ナノ粒子を含めて)は、約18.4±5.0nmの平均直径を有する。
第2の態様において、本発明は、アジュバントとして本明細書に記載されているナノ粒子(コバルト/酸化コバルトを含める)無機金属ナノ粒子の使用を提供する。他の実施態様において、本発明は、アジュバントとして用いるための本明細書に記載されているナノ粒子(コバルト/酸化コバルトを含める)無機金属ナノ粒子を提供する。一例として、本発明は、アジュバントとしてCo3O4ナノ粒子の使用及びアジュバントとして用いるためのCo3O4ナノ粒子を提供し得る。
第3の態様において、本発明が提供するアジュバントは、組成物として提供されてもよい。一実施態様において、本発明のアジュバント組成物は:
(i)   1つ以上のタイプの無機金属ナノ粒子;
(ii)  追加のアジュバント成分(例えばミョウバンベースのアジュバント); 及び
(iii) 医薬的に又は生理的に許容され得る賦形剤、溶媒、担体又は希釈剤
からなる群より選ばれる1つ以上の成分を含んでもよい。
適切な賦形剤としては、例えば油を含めてもよく、技術の1つが、用語「油」がアルカン、アルケン、アルキン、及びこれらの対応する酸及びアルコール、これらのエーテル及びエステル、及びこれらの混合物を含めてもよいことを理解するであろう。油の個々の化合物は、軽質炭化水素化合物である。すなわち、このような成分は6〜30個の炭素原子を有する。油は、合成的に調製されるか又は石油製品から精製され得る。「油」は、直鎖又は分枝鎖構造を有してもよい。油は、完全に飽和されてもよく、1つ以上の二重結合又は三重結合を有してもよい。本発明に用いるためのいくつかの非代謝性油には、例えば、鉱油、パラフィン油、及びシクロパラフィンが含まれる。
【０００９】
用語油は、また、「軽油」すなわち、ワセリンの蒸留によって同様に得られるが、白色鉱油よりわずかに低い比重を有する油を含めることを意味する。賦形剤として用いるための他の「油」には、代謝可能な(非毒性)油が含まれてもよい。このタイプの油には、例えば、植物油、魚油、動物油又はアジュバントが投与され且つ非毒性である被検者(ヒト又は動物)の体によって代謝され得る合成的に調製された油が含まれてもよい。植物性油脂のための供給源には、木の実、種子及び穀物が含まれる。
技術の1つが、本明細書に記載されている油賦形剤のいずれもが水中油型、油中水型又は水中油中水型のエマルジョンとして準備し得ることを理解するであろう。
本発明が提供する水中油型エマルジョンは、AMPHIGEN(R)製剤から構成される。この製剤は、水性成分、レシチン、鉱油、及び界面活性剤を含んでいる。製剤の成分を記載している特許には、米国特許第5,084,269号明細書及び同第6,572,861号明細書が含まれる。典型的には、本発明の油成分は、1%〜50容積%の量で; 又は10%〜45%の量で; 又は20%〜40%の量で存在する。
本明細書において記載されているアジュバント組成物の他の成分には、医薬的に許容され得る賦形剤、例えば担体、溶媒、又は希釈剤、等張剤、緩衝剤、安定剤、保存剤、血管収縮剤、抗菌物質、抗真菌剤等が含まれ得る。典型的な担体、溶媒、及び希釈剤には、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール、油が含まれる。代表的な等張剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が含まれる。有効な安定剤には、ゼラチン、アルブミン等が含まれる。
【００１０】
界面活性剤は、アジュバントと抗原用の担体として作用するように選ばれるエマルジョンの安定化を援助するために用いられる。本発明に用いるのに適した界面活性剤には、天然の生物学的に適合する界面活性剤及び非天然の合成界面活性剤が含まれる。生物学的に適合する界面活性剤には、リン脂質化合物又はリン脂質の混合物が含まれる。好ましいリン脂質は、ホスファチジルコリン(レシチン)、例えば大豆又は卵のレシチンである。レシチンは、粗植物油を水洗し、得られた水和ガムを分離及び乾燥することにより、リン脂質とトリグリセリドの混合物として得ることができる。アセトン洗浄によるトリグリセリドと植物油の除去後に残存しているアセトン不溶性リン脂質と糖脂質のために混合物を分別することによって精製物を得ることができる。あるいは、レシチンを種々の商業的供給源から得ることができる。他の適切なリン脂質としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、及びホスファチジルエタノールアミンが含まれる。リン脂質は、天然供給源から分離されてもよく、従来通り合成されてもよい。本発明に用いるのに適した非天然の合成界面活性剤としては、ソルビタンベースの非イオン界面活性剤、例えば脂肪酸置換ソルビタン界面活性剤(名称SPAN(R)又はARLACEL(R)で市販されている)、ポリエトキシル化ソルビトールの脂肪酸エステル(TWEEN(R))、ヒマシ油のような供給源から脂肪酸のポリエチレングリコールエステル(EMULFOR(R)); ポリエトキシル化脂肪酸(例えば、名称SIMULSOL M-53(R)で利用可能なステアリン酸)、ポリエトキシル化イソオクチルフェノール/ホルムアルデヒドポリマー(TYLOXAPOL(R))、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル(BRIJ(R)); ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル(TRITON(R) N)、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル(TRITON(R) X)が含まれる。一般的に言えば、2つ以上の界面活性剤が用いられる場合には、界面活性剤、又は界面活性剤の組み合わせは、エマルジョン中に0.01%〜10容積%、好ましくは0.1%〜6.0%、より好ましくは0.2%〜5.0%の量で存在する。
【００１１】
本明細書に用いられる「医薬的に許容され得る担体」としては、任意の及びすべての溶媒、分散媒、被覆剤、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗菌剤や抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤等が含まれる。担体は、組成物の他の成分と適合し且つ被検者に有害でないという意味において「許容され得る」でなければならない。典型的には、担体は、無菌であり且つ発熱物質を含まず、用いられる投与方法に基づいて選ばれる。医薬的に許容され得る担体のある種の製剤が米国(US)農務省又は米食品医薬品局、又は米国外における同等の政府機関によって公表されたあてはまる規制において承認された担体を含むことは、当業者が周知している。それ故、組成物の商業生産のために医薬的に認められた担体は、米国又は外国において適切な政府機関によってすでに承認されているか又は承認されることになる担体であってもよい。
組成物には、必要により、医薬ベヒクル、賦形剤、又は媒体として役立つ適用できる医薬的に許容され得る(すなわち、無菌又は非毒性)液体、半固体、又は固体の希釈剤が含まれてもよい。希釈剤としては、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等が含まれ得る。等張剤としては、特に、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが含まれ得る。安定剤としては、特に、アルブミンが含まれる。
組成物は、また、例えば、ゲンタマイシン、メルチオレート、又はクロロクレゾールを含める、抗生物質又は他の保存剤を含有し得る。選ぶために様々な種類の抗生物質又は保存剤が当業者に周知である。
【００１２】
一実施態様において、本発明のアジュバント組成物は、1つ以上の追加のアジュバント成分を含み得る。例えば、アジュバント組成物は、本明細書に記載されている無機(コバルト)ナノ粒子に加えて、ミョウバン(水酸化アルミニウム/リン酸アルミニウムを含む); 油ベースのアジュバント及び有機アジュバント(例えばスクアレン)からなる群より選ばれる1つ以上のアジュバントを含んでいる。
一実施態様において、本明細書に記載されているアジュバント及び/又はアジュバント組成物は、凍結乾燥された形で又は凍結乾燥された組成物として準備され得る。技術の1つが、本発明の凍結乾燥されたアジュバント/アジュバント組成物が本明細書に記載されている医薬的に許容され得る担体/希釈剤及び/又は賦形剤のいずれを用いても再構成され得ることを理解するであろう。
有利には、本明細書に記載されているアジュバント及びアジュバント組成物は、更に、1つ以上の保存剤を含んでもよい - 例えば、凍結保存剤を含める。
アジュバントは、ワクチン組成物の成分として - 特にワクチンの抗原が免疫原性の弱い場合にしばしば用いられる。技術の1つが、アジュバントが適切な又は適当な免疫応答 - ヒト又は動物の宿主から病原体のクリアランスを援助するものを刺激するようにワクチンの作用を変化させるか、モジュレートするか、修飾するか又は増強するために用いてもよいことを理解するであろう。このように、更なる態様において、本発明はヒト又は動物の使用のためのワクチンまで拡大し、ここで、前記ワクチンは本明細書に記載されているアジュバントを含むか又はそれと共に製剤化される。
【００１３】
更なる態様において、本発明は、ヒト又は動物の被検者において免疫反応を高めるのに用いるための本発明のアジュバント(すなわち、コバルトベースのアジュバント)を提供する。一実施態様において、本発明のアジュバントは、ワクチンと一緒に又は同時に投与される。典型的には、アジュバントは、ヒト又は動物の被検者に投与するためのワクチンと一緒に製剤化される。他の実施態様において、用いるためのアジュバントは、ワクチンの投与前又は投与後にヒト又は動物の被検者に投与される別個の組成物(適切な医薬担体、希釈剤及び/又は賦形剤と一緒に)として製剤化されてもよい。
技術の1つが、本明細書に用いられる「ワクチン」について述べることがヒト又は動物の宿主における免疫応答を引き上げるのに用いるための任意の抗原製剤を包含してもよいことを理解するであろう。多くの異なるタイプのワクチンが現在使用されており、これらの多くがアジュバントと製剤化/併用又は投与されて(同時に又は別個に)引き上げた免疫応答の種類を改善するか、増強するか又は修飾する。場合によっては、アジュバントは、ヒト又は動物の宿主において免疫応答を改善する手段として利用される。例えば、アジュバントは、低(最適未満)用量の抗原によって引き上げられた免疫応答を改善するために用いてもよい。この点に関しては、本発明のアジュバント/アジュバント組成物は最適未満用量のワクチン又は抗原と併用してもよい - ワクチン又は抗原は最適未満用量によって引き上げられた免疫応答を増加するのに役立つ。本発明のアジュバント又はアジュバント組成物を一緒に投与するか又は本発明のアジュバント又はアジュバント組成物と投与する場合、最適未満のワクチン/抗原用量によって引き上げられた免疫応答は、最適用量のワクチン/抗原のみ(すなわちアジュバントを含まない)の投与によって引き上げられた免疫応答に匹敵し得る。
【００１４】
一実施態様において、ウイルス及び/又は細菌抗原ワクチンは、本明細書に記載されているアジュバント/アジュバント組成物と併用又は投与され得る(同時に又は別個に)。例として、例えば、『インフルエンザ』、ジフテリア、百日咳、はしか、おたふく風邪、風疹、ポリオ、結核、髄膜炎、破傷風、黄熱病、狂犬病の形態に対するワクチンは、本明細書に記載されているアジュバントと併用又は投与されてもよい。
更なる態様において、本発明は、ヒト又は動物の被検者において(i)免疫応答を引き上げ且つ/又は(ii)免疫応答を促進するか、モジュレートするか又は増強する方法であって、ワクチン及び本発明の第1の態様によって示されたアジュバントを、それを必要としているヒト又は動物の被検者に投与する工程を含む、前記方法を提供する。
一実施態様において、アジュバントは、ヒト又は動物の宿主にそれとともに投与されるようなワクチンと共に製剤化され得る。他の実施態様において、アジュバントは、それがワクチンとは別個に又はそれとともに同時に投与され得るような分離した組成物として製剤化される。
【００１５】
詳細な説明
ここで、以下に示す図面によって本発明を詳述する:
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Co3O4NP(A)及びI-ミョウバン(B)の形状とサイズ。粒子を蒸留水に分散させ、透過型電子顕微鏡によって測定した。
【図２】RAW264.7細胞に対するNP又はI-ミョウバンの細胞毒性。粒子を1% OVAの有り無しでRAW264.7細胞に24時間添加した(示した濃度はμg/mlである)。乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)のレベルについて細胞毒性を測定した。I-AlumがCo3O4NPと比較して約6倍以上の細胞毒性を示し、OVAが粒子の毒性を増加させたことに留意されたい。データは、平均±SEM(1グループ当たりn = 4)である。1% OVA有り又はOVA無しで処理された粒子の細胞毒性データをそれぞれの対照と比較した。***P < 0.001。
【図３】二次皮下感作の７日後の血清中のOVA特異的IgG1レベル。他の免疫グロブリン(IgG2a、IgE、IgA及びIgM)は、増加を示さなかった(データは示されていない)。データは、平均±SEMである(1グループ当たりn = 5)。
【図４】OVA特異的免疫グロブリンレベルは、オボアルブミンによる腹腔内抗原投与の７日後の血清中に現れる。試験した免疫グロブリンは、(A) IgG1、(B) IgG2a、(C) IgE、(D) IgA及び(E) IgMであった。データは、平均±SEMである(代表的なデータ、1グループ当たりn = 5)。(F) OVAによる腹腔内抗原投与の７日後の脾臓細胞の増殖。培地のみ又は10μM OVAの存在下で培養した細胞の3H-チミジン取込み。
【図５】オボアルブミンによる抗原投与の7日後の腹腔洗浄液中のOVA特異的IgG1レベル。他の免疫グロブリン(IgG2a、IgE、IgA及びIgM)は、増加を示さなかった(データは示されていない)。データは、平均±SEM(1グループ当たりn = 5)である。
【図６】抗原投与の7日後に集めた腹腔洗浄液中のサイトカインのレベル。(A) IFN-γ; (B) IL-1β。データは、平均±SEM(1グループ当たりn = 5)である。*P < 0.05 PBS処理グループと比較した。
【図７】抗原投与の7日後に集めた腹腔洗浄液中の示差的細胞計数。データは、平均±SEMである(1グループ当たりn = 5)。*P < 0.05、**P < 0.01、及び***P < 0.001 PBS処理グループと比較した。
【図８】抗原投与の7日後の注射部位の代表的な組織。A、PBS; B、NP-OVA; C、I-ミョウバン-OVA; D、NPのみ。NP-OVA及びNPのみグループがNPの付着(黒いスポット)とともに軽度の炎症(矢印)を示し、I-ミョウバン-OVAが広範囲の炎症及び壊死(矢印)を示したことを留意されたい。
【図９】樹状細胞発現特定マーカーの数を示すグラフ。
【図１０】酸化コバルトナノ粒子に対する細胞障害反応を示すグラフ。
【図１１】Imjectミョウバンに対する細胞障害反応を示すグラフ。
【図１２】酸化コバルトNP±1% OVAに応答したDCの細胞障害性を示すグラフ。
【図１３】Imjectミョウバン±1% OVAに応答したDCの細胞障害性を示すグラフ。
【図１４】酸化コバルトNP±1% OVAで処理したDCによるIL-1β産生を示すグラフ。
【図１５】Imjectミョウバン±1% OVAで処理したDCによるIL-1β産生を示すグラフ。
【実施例】
【００１７】
実施例1
アジュバントがTh1応答を引き出すことがほとんどできないので、NPがモデル抗原、オボアルブミン(OVA)に対してTh1免疫を改善するために用いることができると考えた。
我々は、Co3O4NPがNiONPで見られた重篤な遅延型過敏症状のないTh1応答を生じたことから候補アジュバントとしてCo3O4NPを選んだ[19]。目標は、Co3O4NPが雌C57BL/6匹のマウスに皮下投与したモデル抗原OVAに対してバランスのとれたTh1及びTh2応答を誘導することによりアジュバントとして用いるのに適し得るかを求めることであった。
この目標のために、我々は、Co3O4NPによって誘導される抗OVA応答を市販のアルミニウム含有アジュバントよって誘導されるものと比較した。選択されるアジュバントはImjectミョウバン(I-ミョウバン)、ネズミの実験のために広く用いられている金属微粒子アジュバントとし、これは水酸化アルミニウムと水酸化マグネシウムの50/50の混合物及び不活性安定剤を含有する。オボアルブミン特異的応答に加えて、毒性を注射部位でも評価し、マウスマクロファージ細胞系を用いて抗原提示細胞の細胞毒性を評価した。
【００１８】
材料及び方法
すべての化学薬品及び試薬を、特に明記しない限りSigma-Aldrich(プール、英国)から購入した。
【００１９】
粒子の特性決定及び分散.
Co3O4NP(Nanostructural and Amorphous Materials、テキサス、米国)及びImjectミョウバン(Thermo Scientific、クラムリントン、英国)のサイズを透過型電子顕微鏡(JEM-1200EX II、JEOL、東京、日本)を用いて測定した。流体力学的粒度を、種々の濃度の分散媒の存在下に粒径アナライザー(90Plus/BI-MAS; Brookhaven Instruments社、ニューヨーク、米国)を用いて測定した。生体内実験に対して、鶏卵オボアルブミン(グレードV)を分散媒としてCo3O4NP + OVA(NP-OVA)及びI-ミョウバン+ OVA(I-ミョウバン-OVA)に用い、健康なC57BL/6匹のマウスから集めた加熱不活性化した血清(終濃度: 5%)をNPのみに用いた。粒子懸濁液中のエンドトキシンレベルを、カブトガニアメーバ細胞ライセート分析(Cambrex、メリーランド、米国)を用いて測定した。Co3O4NP及びI-ミョウバンの溶解性を、以前に記載された方法に従って酸性人工リソソーム液(pH 5.5)又は塩基性人工組織液(pH 7.4)において試験した[19]。
【００２０】
用量選択のための論理的根拠.
我々の以前の実験に基づいて、マウス1匹につき2.0mgとしてI-ミョウバンの用量を選んだ[17]。対照的に、Co3O4NPの用量を、肺の炎症原性(inflammogenicity)に基づきマウス1匹につき25μgとして選んだ; 419μg/ラットのCo3O4NPの点滴注入によって、肺胞リポタンパク異常症による急性好中球性炎症及び慢性リンパ球性/好中球性炎症が示された[19]。
【００２１】
細胞毒性分析(LDH).
マウスマクロファージ細胞系、RAW264.7を、L-グルタミン、抗生物質(ペニシリン及びストレプトマイシン)及び10%加熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)を有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中で37℃において5% CO2で培養した。細胞をaccutaseを用いて剥離し、実験のために12-ウェルプレート(Corning、ニューヨーク、米国)に5×105で播種した。NP及びミョウバンの細胞毒性作用を、マニュアル指示に従って乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)分析キット(Roche applied Science、サセックス、英国)を用いて測定した。ベンチマーク粒子として、TiO2NP(30.5±1.8nm)(Nanostructural and Amorphous Materials、テキサス、米国)を用いた。OVA(1%)の有り無しでNP又はI-ミョウバン溶液をRAW264.7細胞に24時間処理した。各NPを10、30、100及び500μg/mlの濃度で試験し、I-ミョウバンを80、240、及び800μg/mlの濃度で試験した。インキュベートした後、無細胞培養上清を17000×gで20分間遠心分離して、粒子を取り出した。細胞毒性を陽性対照(0.1%トリトン-X)と比較したパーセントとして算出した。
【００２２】
動物免疫化.
生後6週の雌のC57BL/6匹のマウスをHarlan Laboratory(ヒルクレスト、英国)から入手した。すべての動物実験において苦痛の人道的な扱い及び緩和を確実にする著者(SEMH)の1人に英国内務省によって付与された特定のライセンスの下ですべての動物を維持及し取り扱った。気候順化した1週間後に、マウス(１グループにつき5匹のマウス)を2週間隔で2回免疫化した。25μlのPBS、50μl(100μg)のエンドトキシンを含まないオボアルブミン(Worthington Biochemical社、ニュージャージー、米国)、及び25μlのアジュバント(I-ミョウバン: 2.0mg; Co3O4NP: 25μg)を含有する100μl用量で尾部の付け根に皮下注射することによって各マウスに感作した。PBS(100μl)及びCo3O4NP(5%マウス血清を有するPBS中25μg)を負の対照として用いた。次に、100μlのPBS中50μgのOVAを抗原投与として腹膜内に注入した。二次感作の7日後に、血液を尾静脈から集めた。抗原投与の7日後に、血液は心穿刺によって集め、腹腔洗浄を2mlの0.9%食塩水を用いて3回行った。最初の洗浄液を免疫グロブリン及びサイトカインELISAのために保持し、3回の洗浄からの細胞を計数するためにプールした。また、注射部位を組織学的分析のために10%中性緩衝ホルマリンで固定した。
2.5. 免疫グロブリンELISA. 免疫化の1週間後及び抗原投与の1週間後に集めた血液試料について、IgA、IgE、IgG1、IgG2c(以前はIgG2abとして知られる)及びIgMサブクラスのOVA特異的免疫グロブリンの存在を分析した。血清及び腹腔洗浄試料を適切なように1% BSAを有するPBSに希釈した。ビオチン抱合型二次抗体を以下の通りに希釈した: 抗IgA - 1:1000; 抗IgG1 - 1:8000; 抗IgG2c - 1:1000; 抗IgM - 1:1000; 抗IgE - 1:250。IgEを測定する前に、血清をプロテインGカップリングビーズと1時間インキュベートして、IgGを除去した[17;18]。
【００２３】
サイトカインELISA.
サイトカインプロファイルを評価するために、Th1型サイトカイン(IFN-γ)、Th2型サイトカイン(IL-10及びIL-13)、及びマクロファージ由来炎症性サイトカイン(IL-1β)を腹腔洗浄において試験した。すべてのキットをR&D Systems(アビンドン、英国)から購入し、サイトカインを製造業者の使用説明書に従って測定した。
【００２４】
腹腔洗浄の示差的細胞計数.
洗浄液中の総細胞数を細胞核カウンター(Chemometec、サリー、英国)の使用によって評価した。細胞をガラススライド(Thermo Scientific、クラムリントン、英国)上でサイトスピン処理し、メタノールで固定し、Diff-Quik(Raymond Lamb、イーストボーン、英国)で染色した。スライド当たり約300〜500細胞をその形態学に従って光学顕微鏡下で計数した。
【００２５】
リンパ球増殖分析.
脾臓をマウスから取り出し、40μmのフィルタを通過させることによって単細胞懸濁液をつくった。細胞をlympholyte-MTM(Fisher Scientific、ラフバラー、英国)密度勾配分離培地上に層にし、2000×gで15分間回転させて、死細胞、赤血球及び顆粒球を除去した。境界面の単核細胞層を取り出し、洗浄し、組織培養培地(10% FCS、100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2mM L-グルタミン及び50μM 2-MEで補足したRPMI 1640; Sigma、英国)に再懸濁した。生細胞を計数し、10μMのエンドトキシンを含まないオボアルブミンを含有しない又は含有する200μl中の4×105細胞を含有する3回繰り返しの培養物を96ウェルプレートに平板培養した。培養物を48時間インキュベートし、0.5μCi 3H-チミジンを各ウェルに一晩添加した。培養物を取り出し、取込まれたチミジンをベータプレートシンチレーションカウンター(Wallac UK、ミルトンキーンズ、英国)で計数した。平行な非標識培養物からの上清を72時間でサイトカイン分析のために取り出した。
【００２６】
組織学.
注射部位からパラフィン包埋ホルマリン固定組織を3μm切片に切断し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
【００２７】
統計解析.
データをグラフパッドプリズムソフトウェア(バージョン5、GraphPad Software社、ラホヤ、カリフォルニア、米国)で分析した。処理グループを比較するために、事後チューキーの一対比較による一元配置分散分析法を適用した。P < 0.05を統計的に有意であるとみなした。
【００２８】
結果
粒子の物理化学的特性.
Co3O4NPは球状の形状を示し、一次サイズは18.4±5.0nmであった。I-ミョウバンはより不均一な形状を示し、平均サイズは長さが88.7±32.4nm及び幅が28.9±19.7nmであった(図1)。双方の粒子のエンドトキシンレベルは、検出限界より下であった(0.1EU/ml)。Co3O4NPは、分散媒無しで大きな凝集物を示したが、分散剤としてのオボアルブミンと小さな凝集物を示した(表1)。I-ミョウバンは、分散媒無しでさえ小さな凝集物を示した。ほとんどのI-ミョウバンは、酸性人工リソソーム液(pH 5.5)に3日以内に溶解したが、人工組織液(pH 7.4)には最小限に溶解した(データは示されていない)。Co3O4NPは、双方の状態で最小の溶解を示した(データは示されていない)。
3.2. 生体外細胞毒性. I-ミョウバンは、マウスマクロファージで試験したNPが非常に毒性であった(図2)。粒子をOVAで分散した場合、粒子はより毒性であった。
【００２９】
表1. 分散の24時間後の粒子の流体力学的サイズ及び多分散性(平均±SD).
2015511624.tif 000003
【００３０】
生体内免疫化
感作後の血清中のオボアルブミン特異的免疫グロブリンレベル.
IgG1は、この段階で測定可能な唯一の免疫グロブリンサブクラスであった。図3は、I-ミョウバン-OVA及びNP-OVAがIgG1産生を誘導したが、I-ミョウバン-OVAがNP-OVAより強力であったことを示す図である。NPのみによって誘導されるOVA特異的免疫グロブリンのレベルは、ベヒクル対照(PBS)と同様であった。
【００３１】
抗原投与後の血清中のオボアルブミン特異的免疫グロブリンレベル.
抗原投与後の免疫グロブリンレベルは、より広い配列の応答を示した。NP-OVA及びI-ミョウバン-OVAは共にIgG1応答の増大を生じたが、I-ミョウバン-OVAはまたNP-OVAより高い応答を示した(図4A)。感作後と比較した場合、NP-OVA及びI-ミョウバン-OVA両グループのIgG1レベルは顕著な増加を示した。更に、NP-OVAは、IgG2cレベルが増加した(図4B)。I-ミョウバン-OVAは、NP-OVAより高いIgE、IgM、及びIgAレベルを誘導した(図4C〜図4E)。
【００３２】
抗原投与後の脾細胞増殖.
抗原投与の7日後に脾臓単核細胞にOVAを生体外投与した。図4Fは、マウスに抗原投与したI-ミョウバン及びNP-OVA双方からの脾細胞が増殖したことを示すグラフである。
【００３３】
抗原投与後の腹腔洗浄におけるオボアルブミン特異的免疫グロブリンレベル.
NP-OVA及びI-ミョウバン-OVA双方がIgG1レベルの増加を示した(図5)。I-ミョウバン-OVAは、NP-OVAと比較してより高いIgG1レベルを示した。他の免疫グロブリン(IgG2c、IgE、IgA及びIgM)は、PBSグループと同様の非常に低い濃度でのみ検出された(データは示されていない)。
【００３４】
腹腔洗浄液におけるサイトカイン発現.
マウスから集めた腹腔洗浄液を用いて、サイトカイン発現を測定した。IFN-γレベルはNP-OVAによって著しく増加したが、他のグループはほとんど応答を示さなかった(図6A)。IL-1レベルは、I-ミョウバン-OVAのみによって著しく増加した(図6B)。IL-10及びIL-13は、対照と比較してほとんど変化を示さなかった(データは示されていない)。
【００３５】
腹膜洗浄における示差的細胞計数.
総細胞及びリンパ球の数はNP-OVA及びI-ミョウバン-OVA双方によって著しく増加したが、NPのみはベヒクル対照と同等であった(図7A及び図7B)。総顆粒球の数は、I-ミョウバン-OVAによってのみ著しく増加した(図7C)。
【００３６】
注射部位の炎症.
抗原投与7日後に注射部位から採取した組織試料は、試験した2つの粒子間にはっきりと対照的な結果を示した。Ｉ-ミョウバン-OVA処理グループは明らかな粒子付着なしで顕著な炎症及び壊死を示したが、NP-OVA及びNPのみグループは粒子付着が包囲した最小の炎症を示した(図8)。
【００３７】
実施例2
目標
・乳酸デヒドロゲナーゼ細胞毒性分析を用いてPBMC由来樹状細胞に対する酸化コバルトナノ粒子及びI-Alumの毒性を定量する
・細胞内に毒性を誘導することなくIL-1β、IL-10及びIL-12の良好なサイトカイン反応を誘導することを必要とする用量を定量する
・NP/I-Alum±Ag85の最適濃度でウシPBMC由来樹脂状細胞を処理する。Ag85は高度に保存され、タンパク質はヒト結核(MTb)を引き起こす生物体及びウシのTBを引き起こす関連した生物体(MB)において同一である。このことは、我々がELISAによって細胞が産生した免疫調節サイトカインのプロファイルを確認するとともにフローサイトメトリ分析によって細胞表面成熟マーカー及びMHCクラス11発現を評価することを可能にする
【００３８】
結果
図9〜図15及び下記の表2及び表3(a〜f)を参照のこと。
【００３９】
表2:流体力学的サイズ及び多分散性
2015511624.tif 000004
【００４０】
表3(a〜f): 酸化コバルトナノ粒子及びImject-ミョウバン(n=4)に対するサイトカイン反応.
3A
2015511624.tif 000005
【００４１】
3B
2015511624.tif 000006
【００４２】
3C
2015511624.tif 000007
【００４３】
3D
2015511624.tif 000008
【００４４】
3E
2015511624.tif 000009
【００４５】
3F
2015511624.tif 000010
【００４６】
概要
・静止DCSのための細胞表面マーカープロファイルを求めることに成功した。次に、これを酸化コバルトナノ粒子及びImjectミョウバン±Ag85で処理したDCSと比較して、活性化状態及びMHCクラス11発現の変化を説明した
・乳酸デヒドロゲナーゼ細胞毒性分析を用いて、我々は、増加用量の酸化コバルトナノ粒子とImjectミョウバンに対する毒性レベルを定量した。各々の濃度は、50μg/mlである
・ELISAによって細胞が産生した免疫調節サイトカインのプロファイルを検討した。IL-1βの増加したレベルがImjectミョウバンのより大きな用量に応答して産生される。
・酸化コバルトNP及びI-Alum(±1% OVA)で処理した樹状細胞の細胞毒性レベルに差がない
・酸化コバルトNP及びI-ミョウバンで処理した樹状細胞からの上清におけるIL-1βレベルは、酸化コバルト及びImjectミョウバン処理DC双方に匹敵する
・1% OVAの添加は、酸化コバルトNP + 1% OVAと比較してより高いレベルを示すImjectミョウバン + 1% OVAで産生されるIL-1βのレベル増加につながる。
【００４７】
考察
ヒトに用いられるアジュバントの安全性は、これらの開発の重要問題である。最近の研究は、認可されたアジュバントがヒトの単球及びマクロファージを活性化することを示しており[20]、毒性として考えられるものが機序の一部であり、それによって潜在的にミョウバンアジュバントが働くことを示している。この研究において、我々はCo3O4NPがミョウバンより低い毒性でバランスのとれたTh1及びTh2応答を誘導し得ると仮定し、これらがより安全な選択であり得ることを示した。
Co3O4NPは、粒子の比較的均質な球状の形状を示した。興味深いことに、I-ミョウバンは、より不均一であり、双方の寸法が100nm未満であった。不均一な形状は、水酸化アルミニウムと水酸化マグネシウムの混合物を含むI-ミョウバンの組成に起因するかもしれない。それ故、Co3O4NPとI-ミョウバンは共に、ナノ粒子の定義の範囲内であり、金属酸化物NPとして分類された[21;22]。以前の研究は、サイズがアジュバント活性に問題であり、NPの最適分散が有益かもしれないことを示した[12]。OVAは、双方の粒子に優れた分散剤として作用した。粒子間に反発力を与えるタンパク質コロナを形成するOVAで分散させた場合にCo3O4NPは小さな凝集物を示した[23]。Co3O4NPとは対照的に、I-ミョウバンは食塩水に比較的に充分に分散され、これは安定剤が製造中に添加されたことからであるかもしれない。
アジュバントは抗原提示細胞を活性化することによって働くと考えられるが、該細胞の毒性に対する情報がほとんどない。ネズミマクロファージ細胞系を用いて、LDH細胞毒性実験は、I-ミョウバン自体が等価量のCo3O4NPより約6倍毒性であることを示した。OVAの分散は、Co3O4NP及びミョウバン双方の毒性増加を示し、これはOVA自体の細胞毒性に起因するか又はタンパク質コロナを形成することによる粒子の認識及び食作用を容易にすることに起因するかもしれない。
【００４８】
感作後データは、I-ミョウバン-OVA及びNP-OVA双方が血清OVA特異的IgG1レベルを上昇させた(これはTh2反応のマーカーである[3])が、他の免疫グロブリンが増加しなかったことを示した。しかしながら、I-ミョウバン-OVAによるIgG1産生の可能性は、NP-OVAより約3倍高かった。抗原投与後データは、T細胞応答が生じたことを示し、生体外でOVAと培養した脾臓細胞の増殖によって確認された。更にいずれのアジュバントによっても免疫化されたマウスにおいて高められた免疫グロブリン応答が見られた。血清中の抗原特異的なクラススイッチした免疫グロブリン(IgG及びIgE)の存在は、Th1及びTh2 OVA特異的CD4+ Tリンパ球がアジュバントとしてCo3O4NPを用いて抗原を感作した後にOVAによって活性化されたことを示している。血清においてI-ミョウバン-OVAは主にTh2型(IgG1)及びアレルギー抗体応答(IgE)を生じ、NP-OVAがよりバランスのとれたTh1(IgG2c)及びTh2(IgG1)型応答を生じるがIgEがほとんどない。このことは、アジュバントとしてのCo3O4NPが強い『オールラウンド』免疫を与える可能性が高く、望まれていないアレルギー/副作用を誘導する可能性が低いことを示している。このことは、更に、抗原投与後腹腔洗浄液分析によって支持された。Th2依存的IgG1レベルは、血清に見られるのと同じパターンでNP-OVA及びI-ミョウバン-OVAによって著しく増加した。腹腔洗浄IFN-γTh1型サイトカイン[24]は、NP-OVA免疫化グループにおいてのみ増加した。腹腔洗浄液の示差的細胞係数は、NP-OVA及びミョウバン-OVAがアジュバント活性に重要であるリンパ球性炎症を誘導した[5]が、NP-OVAがはるかにより少ない顆粒球炎症を誘導したことを示した。I-ミョウバン-OVAによるこの顆粒球炎症は、マクロファージ由来炎症性サイトカインの1つである腹腔洗浄において増加したIL-1と一致した。I-ミョウバン-OVAによって誘導される応答パターンは、他の実験において見られるものと一致している[25;26]。
【００４９】
用いられる用量で抗原投与した7日後に、I-ミョウバンは注入された皮膚の皮下層と筋層に長期にわたる広範囲の炎症及び壊死を誘導し、Co3O4NPは軽度の炎症を示した。Co3O4NPと比較してI-ミョウバンによって誘導されるより大きな炎症は、感作部位及び抗原投与部位双方で炎症応答を示しているI-ミョウバンによる腹膜IL-1分泌及び腹膜腔に動員された顆粒球の数の増加と一致した。更に、I-ミョウバンは、よりアレルギーの抗OVA IgE血清抗体を誘導した。このことはTiO2NPがAl(OH)3より高いIgE反応を示した以前の報告よりCo3O4NPで完成された結果を示すが、その場合、Al(OH)3は我々のデータと一致するより高い顆粒球動員を生じた[27]。更に、Co3O4NPは、I-ミョウバンより投与された質量が１/80でさえもバランスのとれたTh1及びTh2応答を示した。NP-OVAグループの注射部位の細胞死及び炎症がないことは、局所的な痛みを引き起こすことがないことを示している。更に食用動物における獣医学的観点から、注射部位でより少ない細胞死及び炎症がより少ないことは食肉腐敗を隠さないことを意味し、経済的利益を改善することができる。
【００５０】
インキュベートした3日以内に、I-ミョウバンのほとんどを肺胞マクロファージのリソソーム液の同じpHである酸性(pH 5.5)溶液に溶解した[28]が、塩基性(pH 7.4)溶液の溶解は最少であった。しかしながら、Co3O4NPは、双方の条件で最小の溶解を示した。酸性リソソーム条件で遊離した組成上のイオンは、CuONP[29]及びZnONP[30]のような高溶解性NPに対して細胞死及び炎症の役割を果たすようである。それ故、食細胞のリソソームに溶解したAl3+は、トロイの木馬型機序によって細胞死及び更なる炎症の一因となったかもしれない[31]。Co3O4NPは溶解性が変化せず、このことは注射部位での持続性と一致した。このことは、Co3O4NPが非常に不溶性で安定であることを示している。コバルトイオンが細胞に非常にゆっくり放出し且つその長期効果が知られていないので、Co3O4NPの溶解性に関して懸念がある[19]。コバルト中毒は一般的でないが、起こり得る。時間とともに腐食し且つ金属イオンを体内に放出して重篤な疾患を引き起こす人工股関節置換手術(コバルト及びクロムを含有する)の報告がある[32]。このことは、その少量の用量及び注射容積及び不溶性のためCo3O4NPに対してここではありそうにない副作用のようである。我々の以前の研究において、肺内部のCo3O4NPの付着は、遅延型過敏症及び肺性の肺胞リポタンパク異常症を引き起こしている[19]。しかしながら肺が皮膚及び筋肉より非常に能動的な免疫応答があると考えると、皮下副作用はより制限されているかもしれず、実際に、2回の注射の5週間後に注射部位において軽度の炎症のみを生じた。しかしながら、複数のワクチン接種の繰り返しが投与される場合には、Co3O4NPの増強及びコバルトイオンの放出が健康問題を引き起こし得る。皮下層及び筋層内のCo3O4NPの蓄積は、Co3O4NPがミョウバンアジュバントのために提案された作用方法の1つである脱着抗原の連続供給源を提供し得ることを示している[33]。
I-ミョウバンとCo3O4NP間の比較は、マウスにおける応答を測定することに適している。Imjectミョウバンは、ヒトに用いるために認可されず、臨床的に承認された製品に対して異なる物理化学を有する[33]。将来のヒトアジュバントとして長期の研究においてCo3O4NPを完全に評価することができるように、更なる研究が必要とされるが、我々はCo3O4NPがTh1及びTh2媒介性応答を誘導するのに大きな見込みを示すと考えている。
【００５１】
結論
結論として、Co3O4NPは、標準用量のミョウバン含有アジュバントImjectミョウバンより少ないアレルギー抗体産生及び生体内炎症(感作部位及び抗原投与部位双方で)を刺激した。Th1及びTh2生体内抗体応答双方を刺激しつつより低い生体外毒性も生じたという証拠と共に、このことはCo3O4NPがワクチンアジュバントとして用いるのに適していることを示している。
【００５２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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