(57)【要約】本発明は、健康上の利益を伴う組成物に一般に関する。特に、本発明は、消化管の炎症性障害、例えば回腸炎、大腸炎、直腸炎症、咽頭炎、腸管壁浸漏症候群、過敏性腸症候群及び炎症性腸疾患の分野に関する。本発明の主題は、消化管の炎症性障害の処置又は予防に使用するための４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
回腸炎、大腸炎、咽頭炎、腸管壁浸漏症候群、過敏性腸症候群、直腸炎症、炎症性腸疾患及びこれらの組合せから成る群より選択される、消化管の炎症性障害の処置又は予防に使用するための４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物であって、医薬として使用されない、組成物。
【請求項２】
４−オキソ−２−ペンテン酸が天然源から得られた、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
４−オキソ−２−ペンテン酸が、ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５又はビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００から得ることができる、請求項１又は２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５又はビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００が、約６０〜１８０℃、好ましくは約８０〜１６０℃で熱処理されたものである、請求項３に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
組成物１ｋｇ当たり少なくとも１ｍｇ、好ましくは組成物１ｋｇ当たり少なくとも１０ｍｇ、例えば組成物１ｋｇ当たり５０ｍｇ〜５０ｇの量で４−オキソ−２−ペンテン酸を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
体重１ｋｇ当たり２μｇ〜２０ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸、好ましくは体重１ｋｇ当たり２０μｇ〜２ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸、例えば体重１ｋｇ当たり４０μｇ〜１ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸に相当する一日量で投与される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
経口投与又は経腸投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
ヒト、ペット又は家畜に投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
ストレスを感じている対象、特に成体に投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
小児又は青年に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
食品組成物、食品添加剤、機能性食品、飲料、栄養製剤、経管製剤、牛乳又は水中で再構成される粉末状組成物、及びペット食品組成物から成る群より選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［説明］
本発明は一般に、健康上の利益を有する組成物に関する。詳細には、本発明は、消化管の炎症性障害、例えば回腸炎、大腸炎、直腸炎症、咽頭炎、腸管壁浸漏症候群、過敏性腸症候群及び炎症性腸疾患の分野に関する。本発明の主題は、消化管の炎症性障害の処置又は予防に使用するための４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物である。
【０００２】
消化管の炎症性障害は、短期的な病気又はずっと続く不快感から一生つきあう主な身体障害及び死亡まで、幅広い範囲の結果をもたらし得る。長期的に反復する胃腸炎は、患者の生活の質に影響するだけでなく、腸管の線維症及び癌腫の危険性をも増大させる。炎症性腸疾患の発生は世界中の発展途上国で増えており、世界中で現在約５百万人が冒されている。
【０００３】
消化管の炎症性障害の現在の処置は、５つの主な部類の薬物：非特異的抗炎症性薬物、例えば、５−アミノサリチル酸若しくはグルココルチコイド；代謝抵抗物質、例えば、アザチオプリン若しくは６−メルカプトプリン；モノクローナル抗体、例えば、インフリキシマブ；又は抗生物質の使用に基づいている。しかしながら、状況によっては、これらの薬物は副作用を示すことがあり、そのため、従来技術で説明した薬物の欠点を有さず消化管の炎症性障害を処置又は予防する更なる組成物を利用できるようにすることが望ましいであろう。特に、天然源から有効成分を得られる有効な組成物を見出すことは、非常に望ましいであろう。
【０００４】
結果として、現況技術を改善すること、特に、消化管の炎症性障害を処置又は予防するために使用することができる代替的組成物を提供することが本発明の目的であった。
【０００５】
本発明者らは、本発明の目的が独立請求項の主題により達成され得ることを見出して驚いた。従属請求項は、本発明の着想をさらに発展させている。
【０００６】
したがって、本発明は、回腸炎、大腸炎、咽頭炎、腸管壁浸漏症候群、過敏性腸症候群、直腸炎症、炎症性腸疾患及びこれらの組合せから成る群より選択される、消化管の炎症性障害の処置又は予防に使用するための４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物を提供する。組成物は、医薬として使用することができない。
【０００７】
本発明は、回腸炎、大腸炎、咽頭炎、腸管壁浸漏症候群、過敏性腸症候群、直腸炎症、炎症性腸疾患及びこれらの組合せから成る群より選択される、消化管の炎症性障害の処置又は予防のための組成物の調製への４−オキソ−２−ペンテン酸の使用も提供する。
【０００８】
本発明の範囲内の「処置」は、低減、阻害、緩和又は回復を指す。
【０００９】
４−オキソ−２−ペンテン酸は、ＣＡＳ番号４７４３−８２−２及び下記の式
【化１】
2015519874.tif 000002
を有する。
【００１０】
ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ２）−ｌｉｋｅ  ２はＮｒｆ２とも呼ばれ、炎症の重要な調節剤である（Ｃ．Ｌ．Ｌ．Ｓａｗら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ、１５、２８１〜２９５（２０１１））。Ｎｒｆ２はサイトゾルに存在し、阻害剤Ｋｅａｐ１に結合している。Ｋｅａｐ１に結合しているとき、Ｎｒｆ２はまた、プロテアソーム、したがってその低い基礎濃度により迅速に分解される。ストレス要因（例えば一酸化窒素、成長因子又は重金属）による活性化の際、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１から放出される。Ｎｒｆ２濃度が増大し、Ｎｒｆ２は核の中に転座する。次いでＮｒｆ２は、多数の抗酸化剤酵素をコードする遺伝子のプロモーター領域に存在する、抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）に結合する（Ｋｅｎｓｌｅｒ  ＴＷら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２００７年、４７：８９〜１１６）。最近の研究は、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ信号伝達が胃炎及び大腸炎等の炎症随伴病理発生を弱めるのに関与していることを実証した。おそらくは、Ｎｒｆ２により標的とされる遺伝子の細胞保護機能は、炎症誘発性遺伝子の誘導を抑制することができる（Ｊ．Ｋｉｍら、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ−Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、６９０、１２〜２３（２０１０年））。
【００１１】
いくつかの化合物によるＮｒｆ２の活性化が説明されてきた。クルクミン（米国特許出願公開第２００９／００４２９８０号）、レスベラトロール（Ｃｈｅｎ  ＣＹら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００５年６月１７日、３３１（４）：９９３〜１０００）、スルフォラファン（Ｆ．Ｅｌｂａｒｂｒｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｌａｎｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５、４７３〜４８４、（２０１１年））及びクェルセチン（Ｔａｎｉｇａｗａ  Ｓら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２００７年６月１日、４２（１１）：１６９０〜７０３）等のポリフェノールは、Ｎｒｆ２を活性化することが報告された。本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸もＮｒｆ２を活性化することを見出して驚いた。クルクミン、レスベラトロール、スルフォラファン及びクェルセチンの非常に低い水溶解度は、それらの生物学的利用能に影響を及ぼす。４−オキソ−２−ペンテン酸は、逆に、良好な水溶解度を有する。
【００１２】
転写因子核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化は、大腸炎及び炎症性腸疾患を含む多くの炎症性状態に関与する。（Ｍ．Ｐａｓｐａｒａｋｉｓ、Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１、Ｓ５４〜Ｓ５７（２００８））。ＮＦ−κＢは、Ｒｅｌタンパク質のホモ二量体及びヘテロ二量体から成る。優勢なトランス活性化形態のＮＦ−κＢは、ｐ６５及びｐ５０ヘテロ二量体から成る。ＮＦ−κＢの活性化は、リン酸化、及び後続する特異的ＩκＢキナーゼによる抑制性タンパク質ＩκＢのタンパク質分解を伴う。遊離したＮＦ−κＢは核に入り込み、炎症に関与する数多の遺伝子のプロモーター領域のκＢ部位に結合する。
【００１３】
グルココルチコイド（Ａｄｃｏｃｋら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２６８、Ｃ３３１〜Ｃ３３８（１９９５年））等、ＮＦ−κＢの阻害剤が同定されてきたが、グルココルチコイドは、全身的に与えられた場合にエンドクリン及び代謝性副作用をもたらす。ヘパリンもＮＦ−κＢを阻害することが報告されたが（国際公開第２００１１９３７６号パンフレット）、ヘパリン誘導血小板減少症を引き起こす、潜在的な副作用を有する。
【００１４】
本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸がＮＦ−κＢ活性化を阻害するかを調査した。ヒト結腸細胞及びヒト単球／マクロファージを用いたとき、本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸が炎症誘発性ストレス（ＬＰＳ及びｒｈＴＮＦ−α）下でＮＦ−κＢ活性化を阻害することを見出した。
【００１５】
本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸を天然源、例えばいくつかの熱処理された細菌菌株から得ることができることを見出して驚いた。例えば、ビフィドバクテリウム・ブレヴェ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）ＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５及びビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）の細菌調製物は両方とも、６時間９０℃で加熱されたときに４−オキソ−２−ペンテン酸を産生した。４−オキソ−２−ペンテン酸は、熱処理された細菌調製物を遠心分離及びろ過した後、可溶性画分の中にあることが見出された。
【００１６】
ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５を、ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ  ＮＡＴＩＯＮＡＬＥ  ＤＥ  ＣＵＬＴＵＲＥＳ  ＤＥ  ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＥＳ（ＣＮＣＭ）、ＩＮＳＴＩＴＵＴ  ＰＡＳＴＥＵＲ、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅ、２００７年１１月１５日によって沈着した。
【００１７】
ビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡから商標ＡＴＣＣ１５７００の下で購入することができる。
【００１８】
結果として、本発明は、回腸炎、大腸炎、咽頭炎、腸管壁浸漏症候群、過敏性腸症候群、直腸炎症、炎症性腸疾患及びこれらの組合せから成る群より選択される、消化管の炎症性障害の処置又は予防に使用するための４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物であって、医薬として使用されない組成物に部分的に関する。医薬は、薬局で調製又は調剤されて医療処置に使用される、薬物又は薬剤である（＜ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｔｈｅｆｒｅｅｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ．ｃｏｍ／ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ／＞［２０１２年７月１７日に検索済み］）。本発明は、消化管の炎症性障害の処置又は予防に使用するための４−オキソ−２−ペンテン酸を含む食品組成物であってよい。消化管は、反芻動物の口、咽喉、食道、前胃（細網、第一胃、葉胃）、すべての種のしわ胃、小腸、大腸、並びに、それらを有するヒト等の種の直腸及び肛門を含む。
【００１９】
回腸炎及び大腸炎は、それぞれ回腸及び大腸の炎症である。咽頭炎は、咽喉又は咽頭の炎症である。
【００２０】
腸管壁浸漏症候群は、腸管透過性の増大とも呼ばれ、統合診療医（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｄｏｃｔｏｒ）の団体の中ではよく認識されており、一般的な診断である（Ｂ．Ｂｒｏｍ、Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５２、３１４〜３１６（２０１０年））。この症候群を診断する医療関係者は、腸炎症が腸管内膜の細胞間の接合部を拡張すると説明している。増大した透過性は、食品と正常な腸管内菌叢の成分とへの古典的過敏症応答を刺激する。細菌内毒素、細胞壁ポリマー及び食物グルテンは、炎症性経路の「非特異的」活性化を引き起こし得る（Ｌ．Ｇａｌｌａｎｄ、（１９９５）、２０１１年１０月２６日視察済み、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｄｈｅａｌ．ｏｒｇ／ｌｅａｋｙｇｕｔ．ｈｔｍ）。微熱、一過性消化管痛及び栄養素吸収能力の喪失感は、別法で診断されていない患者において報告されたいくつかの症状である。
【００２１】
過敏性腸症候群は、検出可能な器質的原因が全く存在しない慢性腹痛、不快感、膨張症及び排便習慣の変調を特徴とする、機能性腸障害である。研究は、過敏性腸症候群患者の粘膜炎症、及び腸内感染との疾患相関を説明した（Ｇ．Ｂａｒｂａｒａら、Ｇｕｔ、５１（ＳＵＰＰＬ．１）、ｉ４１〜ｉ４４（２００２年））。
【００２２】
炎症性腸疾患は、慢性及び周期性炎症と特徴とする、胃腸疾患の群である。炎症性腸疾患の主要な形態は、クローン病及び潰瘍性大腸炎であるが、その他の形態の炎症性腸疾患には、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎、ベーチェット病及び不確定の大腸炎が挙げられる。したがって、世界中でのこのような障害の規模及び重症度により、回腸炎、大腸炎、直腸炎症、咽頭炎、腸管壁浸漏症候群、過敏性腸症候群及び／又は炎症性腸疾患等の消化管の炎症性障害を処置又は予防するための組成物を提供するのに有利である。
【００２３】
本発明では、４−オキソ−２−ペンテン酸を得ることができ、例えば天然源から得ることができる。多数の人々が、化学原料から工業的に合成される材料の安全性について懸念しており、これらの材料が摂取されることになる場合はとりわけであり、天然源から得られた材料を好んでいる。
【００２４】
驚くべきことに、本発明者らは、いくつかの系統の細菌が４−オキソ−２−ペンテン酸の天然源をもたらすことを見出した。特に、本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸をビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５又はビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）（ビフィドバクテリウム・ブレヴェの基準系統）から得ることができることを見出した。大量の４−オキソ−２−ペンテン酸の生成が生物反応器を用いて実現可能であるとき、４−オキソ−２−ペンテン酸の供給源として細菌を使用することは、特に有利である。したがって、本発明では、４−オキソ−２−ペンテン酸が入手可能になり得、例えばビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５又はビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）から得られる。
【００２５】
細菌は、商業的な生成プロセスにより約６０〜１８０℃、好ましくは約８０〜１６０℃、例えば約１１０〜１５０℃で熱処理することができる。本発明者らは、これらの温度での熱処理が、許容される時間内で満足な収率の４−オキソ−２−ペンテン酸をもたらしたことを見出した。理論に拘束されることを望むわけではないが、熱処理の温度を増大させると、４−オキソ−２−ペンテン酸の形成の速度が増大するが、分解の速度も増大すると理解されている。したがって、これらの温度は、４−オキソ−２−ペンテン酸の形成の速度と分解との間に良好なバランスを与える。
【００２６】
４−オキソ−２−ペンテン酸を含む一般的な組成物は、少なくとも１ｍｇ／組成物１ｋｇの量で４−オキソ−２−ペンテン酸を含み得る。一般に、組成物が少なくとも１０ｍｇ／組成物１ｋｇの量で、例えば組成物１ｋｇ当たり５０ｍｇ〜５０ｇの量で４−オキソ−２−ペンテン酸を含むならば好ましい。
【００２７】
投与しようとする４−オキソ−２−ペンテン酸の最適量は、熟練技術者ならば容易に決定することができる。
【００２８】
治療用途では、組成物は、障害及び／又はその合併症の症状を少なくとも部分的に治癒又は停止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療有効用量」と規定されている。この目的に有効な量は、障害の重症度並びに患者の重量及び全身状態等、当業者に知られたいくつかの因子に依存する。予防用途では、本発明による組成物は、障害を進行させる危険性を少なくとも部分的に低減するのに十分な量で、特定の障害の危険性に影響されやすい又は危険性がある患者に投与される。このような量は、「予防有効用量」であると規定されている。さらに、正確な量は、患者の健康状態及び重量等のいくつかの患者特異的因子に依存する。
【００２９】
４−オキソ−２−ペンテン酸は、本発明の枠組みにおいて、治療有効用量及び／又は予防有効用量で投与することができる。本発明の組成物は、体重１ｋｇ当たり２μｇ〜２０ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸、好ましくは体重１ｋｇ当たり２０μｇ〜２ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸、例えば体重１ｋｇ当たり４０μｇ〜１ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸に対応する一日量で投与することができる。
【００３０】
消化管の炎症性障害は、動物並びにヒトに影響を及ぼす。炎症性腸疾患は、イヌの慢性嘔吐及び下痢の最も一般的な原因である。（Ｅ．ｄｅ  Ｐａｐｐ、「Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｄｏｇｓ」、２０１１年１０月２６日に視察済み、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｔｐｌａｃｅ．ｃｏｍ）。慢性下痢の病歴があるイヌの約３分の１は大腸炎を有するとも見積もられている。（ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第９版）。ウマの慢性下痢は、腸に関係する炎症性状態により引き起こされ得る。ウマの結腸及び盲腸の大きな体積のため、大量の流体喪失が短時間で起きることがある。したがって、成体ウマの下痢は、その他の動物及びヒトの下痢性疾患に伴うものを超える罹患率及び死亡率を有する、爆発的事象であり得る（Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第９版）。したがって、ヒト又は動物に投与される消化管の炎症性障害の処置又は予防のための組成物を提供することは利点である。伴侶動物の場合、このような療法は、動物の総合的な生活の質を改善し、所有者の満足を向上する。本発明は、ヒト、ペット又は家畜に投与される組成物を提供する。
【００３１】
４−オキソ−２−ペンテン酸及び本発明で説明した組成物は、ストレスを感じている対象、特に成体に投与することができる。消化管炎症の症状はしばしばストレスによりトリガーされかつストレスは消化管への炎症性刺激の応答を増加させる可能性がある（Ｓ．Ｍ．Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２８０、Ｇ３１５〜Ｇ３１８（２００１年））ので、これは有利である。人々が加齢するにつれて、ストレスの多い出来事の後にくつろぐことがより困難になる。対象は、相対的に成熟した年齢ならば、成体だと考えられる。一般的に、対象は、性的に成熟しており繁殖できる場合、成体だと考えられる。
【００３２】
４−オキソ−２−ペンテン酸及び本発明で説明した組成物は、小児又は青年に投与することができる。「小児」という用語は、ここで、誕生から性成熟の初めの間（思春期）のものを指すが、「青年」は、思春期から成人期の間である。胃腸炎は、小児から青年の間で最も一般的な消化器障害である。約１０億の発病が世界中で毎年、最も一般的には発展途上国の５歳未満の小児の間で起きている。クローン病を進行させる大抵の人々は、３５歳までに進行させ、通常１５歳〜２５歳で進行させる。潰瘍性大腸炎はいかなる年齢でも始まり得るが、通常１５歳〜３０歳で始まる（Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ−第１９版）。したがって、小児又は青年に投与することができる、消化管の炎症性障害の処置又は予防に使用するための組成物をもたらすことは、有利である。
【００３３】
小児は、少なくとも５歳、少なくとも７歳、少なくとも１０歳又は少なくとも１２歳の人々であり得る。
【００３４】
青年は、少なくとも１３歳又は少なくとも１４歳の人々であり得る。
【００３５】
成人は、少なくとも１６歳、少なくとも１８歳又は少なくとも２１歳の人々であり得る。
【００３６】
組成物の性質は特に限定されない。組成物は、経口投与又は経腸投与用の組成物であってよい。組成物は、例えば、食品組成物、食品添加剤、機能性食品、飲料、栄養製剤、経管製剤、牛乳又は水中で再構成すべき粉末状組成物、及びペット食品組成物から成る群より選択することができる。本発明の範囲内では、機能性食品という用語は、健康上の利益をもたらす、強化食品又は栄養補助食品のような食品を指す。
【００３７】
組成物は食品組成物であってよい。本発明による食品組成物は特徴が多様であり、例えば、牛乳、ヨーグルト、チーズ、発酵乳、牛乳を主体とする発酵製品、アイスクリーム、穀類を主体とする製品又は発酵した穀類を主体とする製品、牛乳を主体とする粉末、チルドした飲物又は常温保存可能な飲物、菓子類、動物飼料、特に飼育動物用の動物飼料である。
【００３８】
食品組成物は、タンパク質源、炭水化物源、脂質源、ミネラル源及び／又はビタミン源をさらに含んでいてもよい。タンパク質、炭水化物、脂質、ミネラル及び／又はビタミンの存在は、いくつかの利点を有することがある。これらの化合物は、最終製品の味及び口触りに一般に寄与する。これらの化合物は、身体が消化管障害に冒されたとき、緊急に必要になることがある栄養素を身体に供給することもする。これらの化合物は、完全栄養処方としての本発明の組成物の配合も可能にし、その結果、更なる栄養が必要にならない。
【００３９】
水溶性の化合物には、液剤として又はカプセル若しくは錠剤で経口投与することを含めて、いくつかの方法により好都合に投与されるという利点がある。４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物は、水を主体とすることができ、例えば組成物は、水に溶解した４−オキソ−２−ペンテン酸を含んでいてよい。
【００４０】
当業者ならば、明細書で開示されている本発明のすべての特徴を自由に組み合わせることができることは理解されよう。特に、本発明の異なる実施形態について説明した特徴は、組み合わせることができる。本発明の更なる利点及び特徴は、下記の図及び非限定的な例から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】正規化したビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）の粗調製物のルシフェラーゼ活性（ＯＤ５０、６時間９０℃で加熱）を示す図である。結果は、技術的トリプリケートの平均±ＳＤとしてｙ軸に表されている。ｘ軸値は、試料の最終希釈物である。
【図２】正規化したビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５の粗調製物のルシフェラーゼ活性（ＯＤ５０、６時間９０℃で加熱）を示す図である。結果は、技術的トリプリケートの平均±ＳＤとしてｙ軸に表されている。ｘ軸値は試料の最終希釈物である。
【図３】Ｎｒｆ２誘導倍率（棒）と、０〜２００μＭの４−オキソ−２−ペンテン酸の用量範囲によってインキュベートとしたＡＲＥｃ３２細胞の細胞生存率％（線）とを示す図である。Ｎｒｆ２誘導倍率は、４−オキソ−２−ペンテン酸の存在下でのＡＲＥｃ３２ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）と、さらされなかった細胞の基礎ルシフェラーゼ活性との比である。ＡＴＰ定量化により測定した細胞生存率は、対照（無処理）細胞の相対的な百分率として表されている。結果は、技術的トリプリケートの平均±ＳＤとして表されており、４回の独立した実験の代表である。
【図４】は、Ｎｒｆ２誘導倍率（棒）と、２．５〜５０％ｖ／ｖのビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５の「純粋調製物」の用量範囲によってインキュベートしたＡＲＥｃ３２細胞の細胞生存率％（線）とを示す図である。その他の詳細は図３と同様である。
【図５】ＬＰＳによって刺激されたＨＴ−２９クローン３４細胞の上澄み中で測定した、ＳＥＡＰ（中実な棒）及びＩＬ−８（縞が入った棒）の生成により見積もった、ＮＦ−κＢ活性を示す図である。細胞生存率は、線で示されている。細胞は、ある用量範囲の４−オキソ−２−ペンテン酸にさらされた。結果は、技術的トリプリケートにより実施した、２回の独立した実験の平均±ＳＤとして表されている。
【図６】ある用量範囲の４−オキソ−２−ペンテン酸の存在下での２４時間にわたる、ＬＰＳ刺激した（０．５μｇ／ｍｌ）ＴＨＰ−１青色細胞のＮＦ−κＢ活性（棒）及び細胞生存率（線）を示す図である。結果は、技術的トリプリケートにより実施した、２回の独立した実験の平均±ＳＤとして表されている。
【図７】水に溶解した４−オキソ−２−ペンテン酸標準物質の一般的なクロマトグラムを示す図である。ｍ／ｚ  １１３→６９の遷移反応に伴うＳＲＭが高くなるほど、一方では、ｍ／ｚ  １１３→４１の遷移反応に対応するＳＲＭが低くなる。保持時間は、分により表されている（ｘ軸）。信号強度（ｙ軸）は、Ｃｐｓにより表されている。
【図８】２分、１５分、３０分及び６０分９０℃（円○（円）で示している）、１２０℃（三角△（三角）で示している）及び１４０℃（四角□（四角）で示している）で加熱した、ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５（ＯＤ４０）の粗調製物のＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いた、４−オキソ−２−ペンテン酸定量化を示す図である。
【００４２】
実施例１：４−オキソ−２−ペンテン酸及び細菌画分によるＮｒｆ２活性化
Ｎｒｆ２レポーターアッセイ
Ｎｒｆ２の活性化を、Ｎｒｆ２レポーターアッセイを用いて測定した。このアッセイは、ＡＲＥの制御下のルシフェラーゼ遺伝子構築体を含む安定にトランスフェクションしたＭＣＦ７（乳腺癌）細胞株である、ＣＲＸ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｄｕｎｄｅｅ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）製のＡＲＥｃ３２細胞株に基づいている。ルシフェラーゼは、ルシフェリンを基質として作用して蛍光を生成する酵素である。Ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）等の抗酸化性分子は、ＡＲＥに結合しているＮｒｆ２の活性化によりルシフェラーゼ転写を誘導する。ルシフェラーゼ活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）製のルシフェラーゼキットを用いて測定する。ルシフェラーゼ活性は、Ｎｒｆ２の活性化に比例する。
【００４３】
細菌画分によるＮｒｆ２活性化
３つの細菌菌株を使用して、微生物：ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５（ＮＣＣ２９５０）、ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３９１４（ＮＣＣ４６６）及びビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）（ＮＣＣ２７９１）によるＮｒｆ２の活性化を調査した。ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３９１４を、ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ  ＮＡＴＩＯＮＡＬＥ  ＤＥ  ＣＵＬＴＵＲＥＳ  ＤＥ  ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＥＳ（ＣＮＣＭ）、ＩＮＳＴＩＴＵＴ  ＰＡＳＴＥＵＲ、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅ、２００８年２月５日によって沈着した。
【００４４】
各系統において、０．０５％システインを有する１０ｍｌのＭＲＳ寒天に２０μｌのグリセロールストックを播種し、嫌気性条件下３７℃で一晩インキュベートして、前培養物を形成した。次いで更なる培養物を、１０ｍｌのＭＲＳに０．０５％システインを前培養物と一緒に播種することにより作製した（０．１において最終的ＯＤ６００を調節した）。培養物を嫌気性条件下１６時間３７℃でインキュベートして、Ｐ２培養物を形成した。０．０５％システインを有する２００ｍｌのＭＲＳにＰ２培養物（０．１において最終的ＯＤ６００を調節した）を播種し、ボトルを嫌気性条件下１６時間３７℃でインキュベートした。
【００４５】
ＯＤ６００を測定し、培養物を３３００ｇにおいて１０分遠心分離し、細菌ペレットを冷たい１×  ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で２回洗浄して、１×  ＰＢＳによってＯＤ５０に正規化した。
【００４６】
各細菌菌株について２つの方法により細菌画分：「粗調製物」及び「純粋調製物」を得た。
【００４７】
細菌「粗調製物」を次のようにして得た。５ｍｌのＯＤ５０細菌調製物を、加熱ブロック（Ｔｅｃｈｎｅ、Ｓｔａｆｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ製のＤｒｉ−Ｂｌｏｃｋ  ＤＢ−３加熱ブロック）中で、６時間９０℃で加熱した。加熱した細菌調製物を、３３００ｇにおいて１０分＋４℃で遠心分離し、上澄みを、０．２２μｍシリンジフィルターを用いてろ過し、更なる分析まで＋４℃で貯蔵した。
【００４８】
細菌「純粋調製物」を次のようにして得た。５ｍｌのＯＤ５０細菌調製物を、３３００ｇにおいて１０分＋４℃で遠心分離し、細菌ペレットを、５ｍｌの水によって再懸濁した。細菌細胞を、冷蔵室内でｍｉｎｉ  ｂｅａｄ  ｂｅａｔ（ＭＢＢ）装置を用いて粉砕した（最大速度における９０秒の６サイクル、各サイクル間には１０分の中断）。粉砕した細胞を、１時間３３００ｇにおいて＋４℃で遠心分離し、ペレットを、５ｍｌの１×  ＰＢＳによって再懸濁し、加熱ブロック中で、６時間９０℃で加熱した。加熱した調製物を１０分３３００ｇにおいて＋４℃で遠心分離した。上澄みを、０．２２μｍシリンジフィルターを用いてろ過し、更なる分析まで＋４℃で貯蔵した。
【００４９】
「ＯＤ５０懸濁液」の生存細菌数を、スポット法を用いた平板培養により測定し、乾燥重量を、下記の設定にしたハロゲン水分分析器（Ｍｅｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ、Ｇｒｅｉｆｅｎｓｅｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定した：乾燥温度１６０℃、段階乾燥は作動する。
【００５０】
Ｎｒｆ２活性化を測定するために、試料は、１０個の独立した希釈物（１／２、１／４、１／６、１／１０、１／１５、１／２０、１／２５、１／３０、１／４０及び１／５０）を用いてＡＲＥｃ３２細胞（９６ウェルプレートに蒔いた）において試験し、５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で、２４時間３７℃でインキュベートした。ルシフェラーゼ活性及び細胞生存率（ＡＴＰ測定）を、ルシフェラーゼ及びＰｒｏｍｅｇａ製のＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏキットを用いて測定した。
【００５１】
各試行において、相対発光単位（ＲＬＵ）により測定したすべてのウェルのルシフェラーゼ活性を、すべてのプレートの細胞のみのルシフェラーゼ活性の平均によって正規化した。とりわけ、正規化手順により試験された試料は、データに影響しないことが見出されており、この観察は、異なる試行において測定した試料の比較を可能にしている。
【００５２】
各試料において、Ｎｒｆ２活性化を次のようにして計算した。
【００５３】
１）Ｎｒｆ２誘導倍率
【数１】
2015519874.tif 000003
【００５４】
Ｎｒｆ２誘導倍率は、選別目的に非常に有用である。しかしながら、Ｎｒｆ２誘導倍率は、試料希釈物を考慮に入れていないため定性的測定のみである。
【００５５】
２）試料当たりルシフェラーゼ含量
【数２】
2015519874.tif 000004
【００５６】
「試料当たりルシフェラーゼ含量」は、Ｎｒｆ２活性化も反映するが、この計算が試料希釈物を考慮に入れているため、類似したＮｒｆ２誘導倍率でＮｒｆ２を活性化する２つの試料を区別することができる。試料当たりルシフェラーゼ含量は、Ｎｒｆ２を活性化する分子の量を反映することにより、Ｎｒｆ２活性化の半定量化を可能にする。
【００５７】
【表１】
2015519874.tif 000005
【００５８】
【表２】
2015519874.tif 000006
【００５９】
表Ａ及び表Ｂに示したように、Ｂ．ブレヴェ  ＡＴＣＣ１５７００（商標）とＢ．ブレヴェ  ＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５の粗調製物は両方とも、最大Ｎｒｆ２誘導（Ｎｒｆ２  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）は類似しているが、ルシフェラーゼ含量／試料値は異なる。試料当たりルシフェラーゼ含量値の差異は、それらの対応するＮｒｆ２活性化パターン（図１及び図２を参照されたい）を反映している。
【００６０】
ビフィドバクテリウム・ブレヴェとは著しく異なり、ＣＮＣＭ  Ｉ−３９１４は、Ｎｒｆ２を顕著に活性化しておらず、比較表Ｃを参照されたい。
【００６１】
【表３】
2015519874.tif 000007
【００６２】
【表４】
2015519874.tif 000008
【００６３】
４−オキソ−２−ペンテン酸によるＮｒｆ２活性化
４−オキソ−２−ペンテン酸（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ−照合番号Ｌ０２１８５）を、Ｎｒｆ２レポーターアッセイにより試験した。異なる用量の４−オキソ−２−ペンテン酸を、２４時間かけてＡＲＥｃ３２細胞に施用し、次いでルシフェラーゼ活性を上述したようにして定量化した。細胞生存率も、細胞Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏキット（ＡＴＰ定量化）を用いて測定した。
【００６４】
図３に示したように、４−オキソ−２−ペンテン酸分子は、用量に依存した方法でＮｒｆ２を強く活性化することが見出された。ＡＲＥｃ３２細胞の生存性は、７０μＭ未満の用量の４−オキソ−２−ペンテン酸による影響を受けなかった。Ｎｒｆ２活性化の最適な用量は、約４０〜５０μＭであった。比較用に、図４は、ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５の細菌画分が類似した方法でＮｒｆ２を活性化することを示している。
【００６５】
実施例２：４−オキソ−２−ペンテン酸（抗炎症性効果）によるＮＦ−κＢ活性化の阻害
本発明者らは、炎症誘発性ストレス（ＬＰＳ及びｒｈＴＮＦ−α）下でＮＦ−κＢ活性化を阻害する、４−オキソ−２−ペンテン酸の能力を見積もった。２つのインビトロ系：ヒト結腸細胞（ＨＴ−２９クローン３４）及びヒト単球／マクロファージ（ＴＨＰ−１青色細胞）を使用した。
【００６６】
ＨＴ−２９クローン３４
ヒト結腸腺癌腫ＨＴ−２９クローン３４細胞株（継代４２〜５０）は、ＮＦ−κＢ／ＳＥＡＰレポータープラスミドを安定にトランスフェクションした、粘着細胞である。この粘着細胞を、１％の安定なＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養し、１０％の熱不活性化した（１時間５６℃）Ｆｏｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）及び５００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＰＡＡ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）を５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で、３７℃で追加した。培地は、細胞単層が約９０％集密に到達するまで、２日毎に新しくした。細胞は、１×  Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いて継代培養した。
【００６７】
１００００細胞／ウェルを、平底で縁無しの９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ、Ｋｒｅｍｓｍｕｅｎｓｔｅｒ、Ａｕｓｔｒｉａ）中の２００μｌの培地に蒔いた。培養の３〜４日後（すなわち、細胞が約７０〜８０％集密に到達した後）、培地を除去し、用量範囲の４−オキソ−２−ペンテン酸（３〜４００μＭ）を含む（又は含んでいない）１８０μｌの実験媒体（ＬＰＳ刺激のみのためのｓＣＤ１４及びＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）の供給源として５０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び５％の人乳（ＨＭ）を追加したＤＭＥＭ高グルコース）を細胞に加え、プレートを５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で、４時間３７℃で予備インキュベートした。ＬＰＳ０５５：Ｂ５又はｒｈＴＮＦ−α（それぞれ最終１００ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌ）を含む（又は含んでいない）２０μｌの実験媒体を加え、プレートを５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で、２４時間３７℃でインキュベートした。
【００６８】
次いで細胞培養上澄みを、Ｐｈｏｓｐｈａｌｉｇｈｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＩＬ−８シングルプレックス（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）キットをそれぞれ用いて、ＮＦ−κＢ活性の測定（分泌型アルカリホスファターゼ及びＩＬ−８生成の測定）のために収集した。
【００６９】
細胞生存率を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＡＴＰを測定することにより決定した。簡単に言うと、残留しているＨＴ−２９クローン３４粘着細胞を、１２０μｌのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（１×  ＰＢＳ中に２回予備希釈済み）と一緒に、水平方向に振とうしながら（２５０ｒｐｍ）１０分室温でインキュベートし、発光を、ゲイン値を３５００に設定してＰｏｌａｒｓｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ、Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１０００ミリ秒測定した。
【００７０】
ＬＰＳが存在しないとき、ＮＦ−κＢ活性は、試験した用量の４−オキソ−２−ペンテン酸と一緒にインキュベートしたＨＴ−２９クローン３４細胞の細胞培養上澄み中には観察されなかった（ＳＥＡＰ又はＩＬ−８検出に基づいている）。
【００７１】
ＨＴ−２９クローン３４細胞の細胞生存率の測定は、約５０μＭより高い４−オキソ−２−ペンテン酸の用量における、細胞生存率の減少を示した（図５）。
【００７２】
炎症応答がＬＰＳによりトリガーされる場合、４−オキソ−２−ペンテン酸は、用量に依存した方法でＮＦ−κＢ活性を阻害する（図５）。４−オキソ−２−ペンテン酸は、ＳＥＡＰとＩＬ−８の分泌の両方に影響し、最良の阻害は、５０μＭ  ４−オキソ−２−ペンテン酸）の場合であった。類似した結果は、それほど顕著ではないが、ｒｈＴＮＦ−αによって刺激した細胞にも観察された。
【００７３】
ＴＨＰ−１青色
ヒト単球／マクロファージＴＨＰ−１青色細胞（継代１６〜２０）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を、５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で３７℃において、１０％の熱不活性化ＦＣＳ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）及び５００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を追加した、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミン、４．５ｇ／Ｌのグルコース及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む改変ＲＰＭＩ培地（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中で培養した。
【００７４】
２０００００細胞／ウェルを、９６ウェル平底透明プレート中の１００μｌの培地に蒔いた。５％ＣＯ２／空気インキュベーター中の３７℃でのインキュベーションの２４時間後、用量範囲の４−オキソ−２−ペンテン酸（５〜２００μＭ）を含む（又は含んでいない）８０μｌの培地を細胞に加え、５時間３７℃で予備インキュベートした。ＬＰＳ０５５：Ｂ５（Ｓｉｇｍａ）（最終１００ｎｇ／ｍｌ）を含む（又は含んでいない）２０μｌの培地を加え、プレートを５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で、１６時間３７℃でインキュベートした。
【００７５】
細胞培養上澄みを、分泌型アルカリホスファターゼのレベルに比例するＮＦ−κＢ活性測定のために、９６ウェルプレートに慎重に移した。簡単に言うと、１００μｌの上澄みを、９６ウェルプレート中で１５０μｌのＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合し、３７℃で３時間インキュベートしてから、Ｓｕｎｒｉｓｅマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて６２０ｎｍでＯＤを測定した。細胞生存率を、上述したようにしてＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏキットを用いて測定した。
【００７６】
ＬＰＳによって刺激したとき、強いＮＦ−κＢ阻害が、約４０〜７５μＭの用量の４−オキソ−２−ペンテン酸に応答して得られた。４−オキソ−２−ペンテン酸は、７５μＭより高い用量では細胞に有毒である（図６）。
【００７７】
ＨＴ−２９クローン３４細胞及びＴＨＰ−１青色細胞によって生じたデータは、４−オキソ−２−ペンテン酸が炎症誘発性ストレス下でＮＦ−κＢ活性化を阻害することを指し示している。
【００７８】
実施例３：ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる４−オキソ−２−ペンテン酸の定量化
４−オキソ−２−ペンテン酸を定量化するために、高速液体クロマトグラフィーをエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法（ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）と結びつけるものである、高い処理能力の分析法を開発した。
【００７９】
４−オキソ−２−ペンテン酸標準物質は、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ、ＵＳＡ）から購入した。４−オキソ−２−ペンテン酸は、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌまで水に可溶であることが見出された。４−オキソ−２−ペンテン酸標準物質化合物を水に可溶化して１０ｍｇ／ｍｌの最終的なストック溶液にし、水にさらに希釈して校正曲線を作成した。
【００８０】
ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析を、３２００Ｑ  ＴＲＡＰ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に連結した乱流クロマトグラフィー（ＴＦＣ）システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により実施した。使用した分析カラムは、室温において６００μｌ／分の一定の流量で運転する、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入したＨｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄ  ＡＱ（３×５０ｍｍ、５μｍ）であった。移動相は、０．０５％酢酸を含む水である溶媒Ａと、０．０５％酢酸を含むメタノールである溶媒Ｂとによって構成されていた。グラジエントプログラムは、０分では０％Ｂで、４０秒（０〜０．６７分）間０％Ｂに保持し、１８０秒（０．６７〜３．６７分）で５０％Ｂに増大させ、１０秒（３．６７〜３．８３分）で５０〜９０％Ｂに増大させ、１２０秒（５．８３分）間９０％Ｂに保持し、０％Ｂに戻していく前に、さらに３００秒（５．８３〜１０．８３分）間保持するというものであった。注入体積は５μｌであった。
【００８１】
ＭＳデータ取得は、エレクトロスプレー陰イオン化モードにより実現した。ＭＳ調節は、溶媒Ａ及び溶媒Ｂ（８０／２０のｖ：ｖ、０．６ｍｌ／分）から構成されるＨＰＬＣフローと混合した４−オキソ−２−ペンテン酸標準物質の溶液（５μｇ／ｍｌの水溶液）を、Ｔ型連結器を用いて１０μｌ／分の流量で注入することにより実施した。窒素を、噴霧器及びカーテンガス（ｃｕｒｔａｉｎ  ｇａｓ）のために、それぞれ７０ｐｓｉ、３０ｐｓｉ及び２０ｐｓｉの圧力で使用した。界面加熱器（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｈｅａｔｅｒ）を作動させてブロックソース温度を７００℃に維持し、キャピラリー電圧を−４．５ｋＶに設定した。窒素は、媒体圧力選択における衝突気体としても使用した。ＭＳ／ＭＳ検出を、選択した反応監視（ＳＲＭ）取得モードを用いて実現した。２つの最も強烈なフラグメントイオンを、５０ｍｓの一定の滞留時間（１１０ｍｓの合計走査時間）を用いて、ｍ／ｚ  １１３→６９（１１ｅＶの衝突エネルギー）及びｍ／ｚ  １１３→４１（２６ｅＶの衝突エネルギー）を走査することにより選択した。脱クラスター化電圧を−２９Ｖに設定した。定量的分析は、最も強烈なＳＲＭ信号を用いて実施したが、２回目の遷移は、標準溶液から計算した適当な面積比に基づいた分析物確認のために使用した。データ処理は、Ａｎａｌｙｓｔ  １．５．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。
【００８２】
ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＰＢＳ及び水中の４−オキソ−２−ペンテン酸の検出
４−オキソ−２−ペンテン酸を１×  ＰＢＳ又は水に可溶化し、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる検出を、上記の部分で説明したようにして実施した。ｍ／ｚ  １１３→６９の遷移反応に伴うＳＲＭは、１．２５分の保持時間における遷移ｍ／ｚ  １１３→４１に伴うＳＲＭに比較して、より強烈な信号を明らかにした。両方のＳＲＭに関して類似した保持時間が、分析の妥当性を確認したときに観察された（図７）。分子４−オキソ−２−ペンテン酸を、１×  ＰＢＳ（データは図示せず）と水の両方で検出することに成功した（図７）。
【００８３】
４−オキソ−２−ペンテン酸標準曲線の確立
細菌画分中の４−オキソ−２−ペンテン酸の量を正確に定量化するために、標準曲線を、１×  ＰＢＳ又はＨＰＬＣグレード水等の簡便な媒体中の４−オキソ−２−ペンテン酸に関して確立した。商業的な４−オキソ−２−ペンテン酸を、異なる用量で１×  ＰＢＳ及び水に懸濁した。次いでＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ法を使用して、見積もった用量の４−オキソ−２−ペンテン酸を定量化した。良好な線形性が、４−オキソ−２−ペンテン酸（０．１〜２５μｇ／ｍｌ）の量と、１×  ＰＢＳとＨＰＬＣグレード水の両方で得られた強度（ｃｐｓで表している）との間に観察された。
【００８４】
細菌画分中の４−オキソ−２−ペンテン酸の定量化
４−オキソ−２−ペンテン酸を、実施例１の熱処理した細菌調製物中で定量化した。すべての試料を、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析前にＨＰＬＣグレード水に希釈した（３希釈物／試料）。結果は表Ｅに要約している。
【００８５】
【表５】
2015519874.tif 000009
【００８６】
実施例４：ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５からの４−オキソ−２−ペンテン酸の生成への加熱温度及び時間の影響
熱処理の際のビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５からの４−オキソ−２−ペンテン酸の生成を特性決定するために、様々な温度を用いて速度実験を実施した。この実験に使用したバイオマスの「マスターストック」は、嫌気性のｐＨ調整した条件下で、３７℃の生物反応器中でＭＲＳ培地によって生成した。増殖培養（１６時間）の後、培地を除去し、細胞を１×  ＰＢＳで２回洗浄し、１０％グリセロールを有する１×  ＰＢＳ中でＯＤ１３４（１．５Ｅ＋１０ｃｆｕ／ｍｌ）まで濃縮し、次いで５０ｍｌの一定分量にして−８０℃で貯蔵した。
【００８７】
次いでビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５の「実用バイオマス（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｂｉｏｍａｓｓ）」を、次のようにしてバイオマスマスターストックから調製した。バイオマスを１×  ＰＢＳで２回洗浄し、１×  ＰＢＳ中でＯＤ４０に調節した。
【００８８】
昇温装置（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｈｅａｔｉｎｇ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）（ＴＨＡ）を使用して、異なる加熱時間及び温度の効果を調査した。このシステムは、生成環境中に見出される一般的な装置の小型版である。蒸気を使用して、バイオマスのカートリッジを含む保持管を加熱する。９０℃、１２０℃及び１４０℃の試料温度を、最大６０分の期間をかけて施用した。次いで、熱処理した５ｍｌの各バイオマスを１０分５０００ｇで遠心分離し、上澄みをろ過し（０．２μｍ）、４−オキソ−２−ペンテン酸含量をＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより定量化した。生じた４−オキソ−２−ペンテン酸の量は、図８に示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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2015519874.tif 000019
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