(57)【要約】  本発明は、生体分子の精製のための新規の改善された方法に関する。詳細には、本発明は、荷電フルオロカーボン組成物で変性された多孔質固体支持体を使用するタンパク質精製の方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から標的生体分子を取り除く方法であって、
（ｉ）標的生体分子を含む試料を提供する段階；および
（ｉｉ）荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する多孔質固体支持体と試料を接触させる段階であり、標的生体分子が変性された固体支持体に結合する段階
を含み、これによって試料から標的生体分子を取り除く、方法。
【請求項２】
標的生体分子が、可溶性不純物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
可溶性不純物が、宿主細胞タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
標的生体分子が、ウイルスまたはウイルス粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
結合標的生体分子を回収する段階をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
標的タンパク質および１種以上の不純物を含む試料中の１種以上の不純物の濃度を低減する方法であって、
（ｉ）標的タンパク質および１種以上の不純物を含む試料を提供する段階；
（ｉｉ）荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する多孔質固体支持体と試料を接触させる段階；ならびに
（ｉｉｉ）溶出液を得る段階
を含み、溶出液が、（ｉ）における試料中の１種以上の不純物のレベルと比較してより低いレベルの１種以上の不純物を含む、方法。
【請求項７】
試料が、細胞培養供給材料を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
試料が、少なくとも１００ｍＭの塩濃度を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
試料が、少なくとも１００ｍＭの塩濃度を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
荷電フルオロカーボン組成物が、構造
【化１】
2015517990.tif 000017
（式中、Ｒ１は、スルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸およびカルボン酸残基からなる群から選択され；Ｒ２は、短鎖飽和および不飽和炭化水素基からなる群から選択される任意の連結単位であり、Ｒ３は、Ｆ、ＣｌまたはＣ１からＣ１０のペルフルオロアルキル基であり、Ｆはフッ素基である。）
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
荷電フルオロカーボン組成物が、構造
【化２】
2015517990.tif 000018
（式中、Ｒ１は、スルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸およびカルボン酸残基からなる群から選択され；Ｒ２は、短鎖飽和および不飽和炭化水素基からなる群から選択される任意の連結単位であり、Ｒ３は、Ｆ、ＣｌまたはＣ１からＣ１０のペルフルオロアルキル基であり、Ｆはフッ素基である。）
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ２が、アルコキシ基、エステル、アミドなどのＣｘＨｙ基であり、ｘが１から約１０の範囲にわたり、およびｙが０から約２０の範囲にわたる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ２が、アルコキシ基、エステル、アミドなどのＣｘＨｙ基であり、ｘが１から約１０の範囲にわたり、およびｙが０から約２０の範囲にわたる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
試料から標的分子を精製するためのフロースルー方法であって、
（ａ）標的分子および１種以上の不純物を含む試料を、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィープロセスにかける段階；
（ｂ）段階（ａ）からのタンパク質Ａ溶出液を、活性炭媒体を通して流す段階；
（ｃ）（ｂ）からのアウトプットを、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体を通して流す段階；
（ｄ）（ｃ）からのアウトプットを、陽イオン交換クロマトグラフィー媒体を通して流す段階；
（ｅ）（ｄ）からのアウトプットを、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する多孔質固体支持体を通して流す段階；
（ｆ）（ｅ）からのアウトプットを、ウイルス濾過媒体を通して流す段階；ならびに
（ｇ）（ｆ）からのアウトプットを回収し、これによって標的分子を精製する段階
を含む、方法。
【請求項１５】
標的分子が、抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年３月２６日に出願された米国特許仮出願第６１／６１５，６０９号、および２０１２年６月２９日に出願された米国特許仮出願第６１／６６６，５０６号の優先権の利益を主張し、これらのそれぞれは、参照によりこの全体を本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は、生体分子の精製のための新規の改善された方法に関する。詳細には、本発明は、例えば、スルホン化フッ素化組成物などの荷電フルオロカーボン組成物を使用するタンパク質精製の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
生体分子、例えば標的タンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質および抗体）の製造のための一般的方法は、２つの主要な段階：（１）宿主細胞における標的タンパク質の発現、および（２）標的タンパク質の精製を一般的に含む。第１の段階は、標的タンパク質の発現を促進するためにバイオリアクター中で所望の宿主細胞を培養する段階を一般的に含む。標的タンパク質が所望のレベルで発現され次第、タンパク質を宿主細胞から取り除き採取する。懸濁物質、例えば細胞、細胞片、脂質および他の不溶性物質を、濾過または遠心分離によって標的タンパク質含有流体流れから一般的に取り除き、種々の可溶性不純物と一緒に溶解状態で標的タンパク質を含む浄化流体を得る。可溶性不純物の例には、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰと一般的に呼ばれ、これらは、所望のまたは標的タンパク質以外の細胞タンパク質である。）、核酸、エンドトキシン、ウイルス、タンパク質変異体およびタンパク質凝集体が含まれる。
【０００４】
第２の段階は、１つ以上の精製段階およびそれに続く１つ以上の仕上げ（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）段階を一般的に含む。精製段階は、浄化溶液において種々の可溶性不純物のレベルを低減し、濃縮された標的タンパク質を提供するよう一般的に意図されている。精製段階は、いくつかのクロマトグラフィー段階を一般的に含み、これらは、結合および溶出クロマトグラフィー技術、例えばアフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、陰イオン交換および陽イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィーの１つ以上を含むことができ、ＰｒｏＳｅｐ−ｖＡ  Ｕｌｔｒａ、ＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｕｌｔｒａ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｅｓｈｍｕｎｏ  Ｓ、Ｅｓｈｍｕｎｏ  Ｑ、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ、ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、ＰＰＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌなどの樹脂を使用することができる。
【０００５】
標的タンパク質含有流体流れを１つ以上の精製段階にかけた後、次いで、通常、標的タンパク質を含む画分（溶出液と呼ばれる）を１つ以上の仕上げ段階にかける。仕上げ段階は、標的タンパク質を含む溶出液中の種々の可溶性不純物のレベルをさらに低減するよう一般的に意図されている。種々のクロマトグラフィー媒体が、可溶性不純物に結合することが報告されており、仕上げ段階において一般的に使用される。例えば、簡単な陰イオン交換クロマトグラフィー媒体（ＡＥＸ）、例えば、第四級アンモニウムリガンドを含むものは、負に荷電したＨＣＰ、ＤＮＡ、エンドトキシンおよびいくらかのウイルスを結合することが報告されている（例えば、Ｕ．Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ編、Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００９、１４７ページを参照されたい。）。クロマトグラフィー樹脂または膜は、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｅｓｈｍｕｎｏ  Ｑ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ、Ｐａｌｌ  Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑなどを含めて、この段階において使用することができる。さらに、陰イオン交換および陽イオン交換基の両方を含む特定の「混合モード」クロマトグラフィー媒体が開発されており、仕上げ段階において使用され得る。例えば、Ｆ．Ｏｅｈｍｅ、Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓ、Ｍｉｘｅｄ−Ｍｏｄｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ＢｉｏＰｈａｒｍ  Ｉｎｔ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ、Ｍａｒｃｈ  ２、２０１０を参照されたい。
【０００６】
スルホン化フルオロポリマーは、卓越した耐化学性および高いプロトン伝導性を必要とする用途のために設計された巨大分子の独特のクラスである。例えば、モノマーＣＦ２＝ＣＦＣＦ２ＣＦ２ＳＯ２Ｆに基づいたスルホン化フルオロポリマーを記載している米国特許第３，７１８，６２７号を参照されたい。スルホン化フルオロポリマーは、米国特許第６，２７３，２７１号によって教示されたように、これらの水湿潤性を改善するため、ディウェッティングへの耐性を増すため、および腐食性の強い流体の濾過におけるこれらの使用を可能にするためのポリマー性微多孔膜の表面変性のために以前に使用された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第３，７１８，６２７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２７３，２７１号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｕ．Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ編、Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００９、１４７ページ
【非特許文献２】Ｆ．Ｏｅｈｍｅ、Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓ、Ｍｉｘｅｄ−Ｍｏｄｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ＢｉｏＰｈａｒｍ  Ｉｎｔ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ、Ｍａｒｃｈ  ２、２０１０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、生体分子の精製のための改善された方法であって、荷電フルオロカーボン組成物、限定はされないが、フッ素化および荷電したポリマー、例えば、スルホン化フルオロポリマー（本明細書で「ＳＦＰ」と呼ばれる）で変性された表面を有する固体支持体を使用する、方法を提供する。
【００１０】
本明細書に記載された種々の実施形態において、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する多孔質固体支持体が、対象の生体分子を結合するために使用される。荷電フルオロカーボン組成物で変性された固体支持体に結合する対象の生体分子は、例えば、宿主細胞タンパク質などの可溶性不純物であってもよく、これは、標的タンパク質含有流体流れから除去されるよう意図されている。別法として、対象の生体分子は、回収されるよう意図された分子、例えば、ワクチン生産において使用され得るウイルスまたはウイルス粒子であってもよく、ここで、ウイルスまたはウイルス粒子は、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する固体支持体に結合する。
【００１１】
種々の実施形態において、本発明は、試料から生体分子を取り除く方法であって、（ｉ）生体分子を含む試料を提供する段階；（ｉｉ）荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を含む固体支持体に、流れを通す方法で試料を接触させる段階であり、固体支持体が生体分子に結合する、段階；および（ｉｉｉ）溶出液を回収し、これによって生体分子を取り除く段階を含む、方法に関する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、生体分子は、望ましくない実体、例えば、可溶性不純物である。他の実施形態において、生体分子は、望ましい実体、例えば、ワクチン生産において有用であるウイルスまたはウイルス粒子である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本発明は、試料中の１種以上の可溶性不純物のレベルを低減する方法であって、（ｉ）標的タンパク質および１種以上の可溶性不純物を含む試料を提供する段階；（ｉｉ）荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を含む多孔質固体支持体に、流れを通す方法で試料を接触させる段階であり、固体支持体が１種以上の可溶性不純物に結合する、段階；（ｉｉｉ）溶出液を回収する段階であり、溶出液が、（ｉ）におけるレベルに比べて減少したレベルの不純物を含む、段階を含む、方法に関する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、１種以上の可溶性不純物のレベルは、それが荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する多孔質固体支持体と接触する前の試料中に存在したレベルと比べて、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、またはこれ以上に低減される。
【００１５】
さらに別の実施形態において、本発明は、試料から生体分子を回収する方法であって、（ｉ）生体分子を含む試料を提供する段階；（ｉｉ）荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を含む多孔質固体支持体に、流れを通す方法で試料を接触させる段階であり、固体支持体が、生体分子に結合する、段階；および（ｉｉｉ）固体支持体から結合分子を溶出し、これにより生体分子を回収する段階を含む、方法に関する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、荷電フルオロカーボン組成物は、スルホン化フルオロポリマーである。
【００１７】
いくつかの実施形態において、荷電フルオロカーボン組成物は、固体支持体に結合している。
【００１８】
いくつかの実施形態において、固体支持体は多孔質である。例示的な多孔質固体支持体の構成には、限定はされないが、膜、多孔質モノリス、織布または不織布、通常のクロマトグラフィー樹脂および材料が含まれる。
【００１９】
本発明による種々の実施形態において、上記方法は、約１００ｍＭより高い塩濃度において実施することができる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する多孔質固体支持体を使用した１種以上の可溶性不純物の除去に続いて、標的タンパク質を含む溶出液を、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーからなる群から選択される１種以上のクロマトグラフィーまたは連続クロマトグラフィー段階にさらにかける。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された組成物は、試料（例えば、細胞培養供給材料）からタンパク質を精製するための連続方法において使用される。特定の実施形態において、本明細書に記載された組成物は、フロースルー精製（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）プロセス段階の一部として使用される。フロースルー精製プロセス段階は、より大きなタンパク質精製方法の一部であり得、これらは、限定はされないが、例えば、バイオリアクター中でタンパク質を発現する細胞を培養する段階；沈殿、遠心分離および／または深層濾過の１つ以上を使用し得る浄化に細胞培養物をかける段階；浄化した細胞培養物を結合および溶出クロマトグラフィー捕捉段階（例えば、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー）に移す段階；タンパク質Ａ溶出液を（例えば、１つ以上の静的ミキサーおよび／またはサージタンクを使用する。）ウイルス不活化にかける段階；ウイルス不活化からのアウトプットを、活性炭、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体、陽イオン交換クロマトグラフィー媒体およびウイルス濾過媒体から選択される２種以上のマトリックスを使用するフロースルー精製プロセスにかける段階；ならびにダイアフィルトレーション／濃縮および無菌濾過を使用してフロースルー精製からのフロースルー中のタンパク質を製剤化する段階を含むいくつかの段階を含み得る。このようなプロセスの追加の詳細は、例えば、同時に出願された参照番号Ｐ１２／１０７を有する同時係属出願に見いだすことができ、この全体の内容を参照により本明細書に組み込む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたＣＦＣ組成物は、フロースルー精製中に陽イオン交換媒体の前に使用される。別の実施形態において、本明細書に記載されたＣＦＣ組成物は、フロースルー精製段階中に陽イオン交換媒体の後に使用される。
【００２２】
いくつかの実施形態において、流体試料は、１つの段階から次へ、上記に記載されたように、全体のプロセスを通って連続的に流れる。
【００２３】
例示的な標的タンパク質には、限定はされないが、組換えタンパク質、モノクローナル抗体および機能性断片、ヒト化抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体、免疫接着分子およびＣＨ２／ＣＨ３領域含有タンパク質が含まれる。標的タンパク質は、哺乳類発現系（例えば、ＣＨＯ細胞）または非哺乳類発現系（例えば、細菌、酵母もしくは昆虫細胞）に発現され得る。本明細書に記載された方法は、哺乳類発現系および非哺乳類発現系を使用して発現されたタンパク質との関連で使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】荷電フルオロカーボン組成物中に存在する基の一般化学構造の概略図である。ここで、Ｒ１は、スルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸、およびカルボン酸残基を含む群から選択され；Ｒ２は、短鎖飽和および不飽和炭化水素基、例えば、ＣｘＨｙ（ここで、ｘは１から約１０の範囲にわたり、ｙは０から約２０の範囲にわたる。）、アルコキシ基、エステル、アミドなどを含む群から選択される任意の連結単位であり；Ｒ３は、Ｆ、ＣｌまたはＣ１からＣ１０のペルフルオロアルキル基である。
【図２】ポリマー性荷電フルオロカーボン組成物の前駆体を得るために重合または共重合し得る例示的な過フッ素化モノマーの概略図である。
【図３】例示的なフッ素化有機酸を示した図である。
【図４Ａ】ｐＨ５で測定した非変性膜と比較したＣＦＣ変性膜（ＥＷ８３０、ＥＷ１０００およびＥＷ１１００）の静的リゾチーム能力を測定するための例示的実験の結果に基づくグラフである。
【図４Ｂ】ｐＨ８で測定した非変性膜と比較したＣＦＣ変性膜（ＥＷ８３０、ＥＷ１０００およびＥＷ１１００）の静的リゾチーム能力を測定するための例示的実験の結果に基づくグラフである。
【図５Ａ】ｐＨ５で測定した非変性膜と比較したＣＦＣ変性膜（ＥＷ８３０、ＥＷ１０００およびＥＷ１１００）の静的ＢＳＡ能力を測定するための例示的実験の結果に基づくグラフである。
【図５Ｂ】ｐＨ８で測定した非変性膜と比較したＣＦＣ変性膜（ＥＷ８３０、ＥＷ１０００およびＥＷ１１００）の静的ＢＳＡ能力を測定するための例示的実験の結果に基づくグラフである。
【図６】０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝溶液中のｐＨ５および８で測定したＣＦＣ変性膜の静的ＩｇＧ能力を測定するための例示的実験の結果に基づくグラフである。
【図７】非変性膜と比較したＣＦＣ変性膜の静的宿主細胞タンパク質能力を測定するための例示的実験の結果に基づくグラフである。
【図８Ａ】低導電率（２５ｍＭ緩衝液）における宿主細胞タンパク質減少のモノクローナル抗体収率およびＬＲＶを測定するための例示的実験の結果に基づくグラフである。
【図８Ｂ】高導電率（２５ｍＭ緩衝液＋２５０ｍＭ  ＮａＣｌ）における宿主細胞タンパク質減少のモノクローナル抗体収率およびＬＲＶを測定するための例示的実験の結果に基づくグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、少なくとも部分的に、タンパク質精製のための方法における荷電フルオロカーボン組成物（ＣＦＣ）で変性された表面を有する固体支持体を使用すると、使用され得る仕上げ段階の数が低減されるという発見に基づく。さらに、本明細書に記載された方法における仕上げ段階は、仕上げ段階における使用のために設計された他の市販製品で望ましくない結果をもたらす条件（例えば、高塩濃度）下で実施することができる。最後に、タンパク質精製方法における使用のための本明細書に記載された分子は、類似的に使用し得る現在利用可能な製品と比べて使用するのにより安価であり得る。
【００２６】
スルホン酸基、および過フッ素化基から明らかに物理的に分離されているスルホン酸基を組み込んでいるクロマトグラフィー樹脂組成物が、当技術分野に記載されている（例えば、米国特許第８，０９２，６８３号を参照されたい。）。しかし、このような樹脂は、標的タンパク質（即ち、インスリン）の実質的な結合を示すようには思われない。
【００２７】
対照的に、本発明による組成物は、図１に示されたように、フッ素化基（例えば、フルオロカーボン基）にごく接近して荷電基（例えば、スルホン酸基）を含む。言い換えれば、本明細書に記載された組成物の場合、荷電基およびフッ素化基は、当技術分野に記載された組成物の場合のように離れた別個の基ではない。
【００２８】
本開示がより容易に理解され得るために、特定の用語を最初に定義する。追加の定義が、詳細な説明全体を通して記載されている。
【００２９】
Ｉ．定義
本明細書で使用される用語「荷電フルオロカーボン組成物」は、炭素およびフッ素原子ならびに、限定はされないが、カルボン酸、スルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸を含めた１種以上の荷電基を含む化合物を意味する。このようなフルオロカーボン組成物には、特に、飽和、不飽和、および環状ペルフルオロカーボンが含まれる。
【００３０】
１種の例示的な荷電フルオロカーボン組成物は、スルホン酸基で停止された、テトラフルオロエチレンおよびペルフルオロビニルエーテルのコポリマーのクラスを表す。これらのコポリマーの化学構造は、以下の図に示されたように、過フッ素化ポリマーバックボーンおよび強い陽イオン交換側基を含む。側基および過フッ素化バックボーンの間のリンカーは、コポリマーグレードおよび製造者に応じて長さが異なる。例えば、ＤｕＰｏｎｔ  Ｎａｆｉｏｎ（登録商標）コモノマーは、化学構造：ペルフルオロ−３．６−ジオキサ−４−メチル−７−オクテンスルホニルフルオリド（ＭＷ＝４４６）：ＣＦ２＝ＣＦ−Ｏ−ＣＦ２−ＣＦ（ＣＦ３）ＯＣＦ２ＣＦ２−ＳＯ２Ｆを有するが、Ｓｏｌｖａｙ  Ｓｏｌｅｘｉｓ  Ａｑｕｉｖｉｏｎ（登録商標）モノマーは、化学構造：ペルフルオロ−３−オキサ−４−ペンテンスルホニルフルオリド（ＭＷ＝２８０）：ＣＦ２＝ＣＦ−Ｏ−ＣＦ２ＣＦ２−ＳＯ２Ｆを有する。
【００３１】
【化１】
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【００３２】
これらのコポリマーは、塩素および塩基の塩素アルカリ生産における電解膜に使用されることが報告されている。これらは、燃料電池膜、センサー（例えば、一酸化炭素およびメタノール）、アクチュエータ、ドナン透析法、有機化学触媒、ならびにガスおよび蒸気拡散（ガスの乾燥／加湿）に使用されることも報告されている。さらに、これらは、これらの水湿潤性を改善しディウェッティングへの耐性を増すためのポリマー微多孔膜の表面変性のために使用されている。例えば、参照により本明細書に組み込む米国特許第６，２７３，２７１号に記載されたように、これらは、腐食性の強い流体の濾過のためのＰＴＦＥ膜の表面のコーティングとして塗布することができる。
【００３３】
本明細書で使用される用語「固体支持体」は、それに対して荷電フルオロカーボン組成物が接着または共有結合し得る多孔質または非多孔質材料を一般的に意味する。荷電フルオロカーボン組成物が結合または接着している固体支持体は、「変性された固体支持体」と呼ばれる。このような変性された固体支持体は、試料中の生体分子を結合するために有用である。変性し得る例示的な固体支持体には、限定はされないが、例えば、アガロース、多糖、デキストラン、シリカゲル、合成ポリマー（ポリスチレン−ジビニルベンゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリビニルエーテルおよびこれらの対応するコポリマー）、無機ならびにセラミック材料およびガラスビーズなどの通常のクロマトグラフィー樹脂材料が含まれる。固体支持体は、限定はされないが、精製カラム、バラバラの粒子の不連続相、充填層カラム、および膨張層カラムを含むいずれの好適な構成をしていてもよい。固体支持体は、微多孔膜および限外濾過膜などの多孔質膜も含み得る。限外濾過膜および微多孔膜は、板、管、および中空糸を含めたいくつかの形態のいずれでもあってもよい。さらに、固体支持体は、繊維性材料、例えば、繊維または布を含んでいてもよく、これらは、織られていても織られていなくてもよい。
【００３４】
本明細書で互換的に使用される用語「変性する」、「変性された」、および「変性」は、固体支持体の元の表面特性を変えるプロセスを意味する。例えば、いくつかの実施形態において、固体支持体は、支持体を、下塗り、コーティングまたは化学もしくは放射線処理などの処理にかけることによって変性することができる。
【００３５】
本明細書で使用される用語「現場重合」は、同一プロセス作業中に官能化された材料上で実施される重合反応を含むプロセスを意味する；即ち、官能化および重合反応の間で、材料は反応器から取り出されない。
【００３６】
本明細書で使用される用語「モノマー」は、同一種類の他のものと結合してポリマーを形成し得る分子を意味する。モノマーは、同一種類の他のモノマーと結合して「ホモポリマー」を形成することができる。別法として、モノマーは、同一種類ではないモノマーと結合して「コポリマー」を形成することができる。本明細書で使用される用語「モノマー」は、他のモノマーまたはオリゴマーと結合または重合してポリマーを形成し得る２個以上のモノマー（「オリゴマー」と呼ばれる）の出発原料も使用するよう意図されている。本明細書で使用される用語「二量体」は、一緒に結合した２個のモノマーを意味する。同様に、用語「三量体」、「四量体」、および「五量体」は、それぞれ、３、４および５個のモノマーの結合を意味する。
【００３７】
本明細書で使用される用語「グラフト」は、その中で新規に生成されたポリマーブロックの１種以上が、主鎖中のものと異なる構成的または立体配置的特徴を有する側鎖として、巨大分子の主鎖に結合する重合反応を意味する。
【００３８】
本明細書で使用される用語「架橋」は、それから少なくとも４本の鎖が発する、巨大分子中の小領域の形成をもたらす、既存巨大分子上の部位もしくは基を巻き込む反応、または既存巨大分子間の相互作用を意味する。このような相互作用は、共有結合の形成、水素結合の形成、疎水性、親水性、イオン性または静電気相互作用を含めた多くの異なる方法で起こり得る。
【００３９】
本明細書で使用される用語「吸着」は、その中で分子が物理的相互作用を通して固体支持体の表面に結合するようになるプロセスを意味する。このような相互作用は、水素結合の形成、疎水性、親水性、イオン性または静電気相互作用を含めた多くの異なる方法で起こり得る。
【００４０】
本明細書で互換的に使用される用語「生体分子」または「対象の生体分子」または「標的生体分子」は、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する多孔質固体支持体に結合するまたはこれに結合し得る任意の生物学的実体を意味するよう意図されている。いくつかの実施形態において、生体分子は、例えば、宿主細胞タンパク質などの標的タンパク質を含む試料から取り除かれることが望ましい分子である。他の実施形態において、生体分子は、例えば、ワクチン生産のために使用され得るウイルスまたはウイルス粒子などの試料から回収されることが望ましい分子である。
【００４１】
本明細書で互換的に使用される用語「標的タンパク質」、「所望の生成物」、「対象のタンパク質」、または「対象の生成物」は、対象のポリペプチドまたは生成物を含む試料に存在し得る１種以上の望ましくない実体、例えば、１種以上の可溶性不純物から精製または分離することが望ましい対象のポリペプチドまたは生成物を一般的に意味する。本明細書で互換的に使用される用語「標的タンパク質」、「対象のタンパク質」、「所望の生成物」および「対象の生成物」は、本明細書に記載された方法を使用して精製されるべき、限定はされないが、抗体を含めた治療用タンパク質またはポリペプチドを一般的に意味する。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する多孔質固体支持体に結合せず、したがって、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する多孔質固体支持体を使用した１種以上の可溶性不純物の除去後に回収される溶出液になる。
【００４２】
本明細書で互換的に使用される用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、約１０個より多いアミノ酸を有するペプチドおよびタンパク質を一般的に意味する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された小分子が、タンパク質またはポリペプチドに加えて試料中に存在する１種以上の望ましくない実体からタンパク質またはポリペプチドを分離するために使用される。いくつかの実施形態において、１種以上の実体は、精製されるタンパク質またはポリペプチドに加えて試料中に存在し得る１種以上の不純物である。上記に論じられたように、本明細書に記載された方法によるいくつかの実施形態において、固体支持体に結合した荷電フルオロカーボン組成物は、標的タンパク質を含む試料中の１種以上の不純物（例えば、可溶性不純物）を結合するために使用される。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法を使用して精製されるタンパク質またはポリペプチドは、哺乳類タンパク質、例えば、治療用タンパク質または治療において使用され得るタンパク質である。例示的なタンパク質には、限定はされないが、例えば、レニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、およびフォンヴィレブランド因子などの凝固因子；タンパク質Ｃなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性物質；ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲンアクチベーター；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（通常はＴ細胞から発現および分泌され、活性化の際に調節される）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミューラー阻害物質；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮＡアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４などの細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子の受容体；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）などの神経栄養因子、またはＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；αＦＧＦおよびβＦＧＦなどの線維芽細胞成長因子；表皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦβ４、またはＴＧＦ−β５を含む）などのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合性タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、およびＣＤ４０などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−アルファ、−ベータ、および−ガンマなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（Ｉｌ）、例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭなどのインテグリン；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥ��４受容体などの腫瘍関連抗原；ならびに、上に挙げられたポリペプチドのいずれかの断片および／または変異体が含まれる。
【００４４】
さらに、いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法を使用して精製されたタンパク質またはポリペプチドは、抗体、この機能性断片または変異体である。いくつかの実施形態において、対象のタンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む組換えタンパク質である。
【００４５】
（本明細書で互換的に使用される）用語「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」または「ＩｇＧ」または「抗体」は、２本の重鎖および２本の軽鎖からなる基本的な４本のポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を意味し、前記鎖は、例えば、鎖間ジスルフィド結合によって安定化されており、このタンパク質は、抗原に特異的に結合する能力を有する。（本明細書で互換的に使用される）用語「一本鎖免疫グロブリン」または「一本鎖抗体」は、１本の重鎖および１本の軽鎖からなる２本のポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を意味し、前記鎖は、例えば、鎖間ペプチドリンカーによって安定化されており、このタンパク質は、抗原に特異的に結合する能力を有する。用語「ドメイン」は、例えば、βプリーツシートおよび／または鎖内ジスルフィド結合によって安定化されたペプチドループを含む（例えば、３から４個のペプチドループを含む）重鎖または軽鎖ポリペプチドの球状領域を意味する。ドメインは、「定常」ドメインの場合に種々のクラスメンバーのドメイン内の配列変異の相対的欠如、または「可変」ドメインの場合に種々のクラスメンバーのドメイン内の著しい変異に基づいて本明細書で「定常」または「可変」とさらに呼ばれる。抗体またはポリペプチド「ドメイン」は、当技術分野で互換的に、抗体またはポリペプチド「領域」としばしば呼ばれる。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域または「ＣＬ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体重鎖の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域または「ＶＬ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体重鎖の「可変」ドメインは、「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域または「ＶＨ」ドメインと互換的に呼ばれる。
【００４６】
免疫グロブリンまたは抗体は、モノクローナル（「ＭＡｂ」と呼ばれる）またはポリクローナルであってよく、モノマーまたはポリマー形態、例えば、五量体形態で存在するＩｇＭ抗体および／またはモノマー、二量体または多量体形態で存在するＩｇＡ抗体で存在してよい。免疫グロブリンまたは抗体は、これらが、リガンド特異的結合ドメインを保持する、またはこれを含むよう変性されている限り、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含むこともできる。用語「断片」は、無傷のまたは完全な抗体または抗体鎖に比べてより少ないアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の一部または一部分を意味する。断片は、無傷のまたは完全な抗体または抗体鎖の化学的または酵素的処理によって得ることができる。断片は、組換え手段によっても得ることができる。組換えによって産生される場合、断片は、単独でまたは融合タンパク質と呼ばれるより大きなタンパク質の一部として発現され得る。例示的な断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃおよび／またはＦｖ断片が含まれる。例示的な融合タンパク質には、Ｆｃ融合タンパク質が含まれる。
【００４７】
一般的に、免疫グロブリンまたは抗体は、対象の「抗原」に対して向けられている。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または障害に罹患している哺乳類への抗体の投与は、この哺乳類における治療的利益をもたらし得る。しかし、非ポリペプチド抗原（例えば、腫瘍関連糖脂質抗原；米国特許第５，０９１，１７８号を参照されたい。）に対して向けられた抗体も企図される。抗原がポリペプチドである場合、これは、膜貫通分子（例えば、受容体）または成長因子などのリガンドであり得る。
【００４８】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」または「ＭＡｂ」は、実質的に均一な抗体の個体群から得られた抗体を意味する、即ち、該個体群を構成する個別の抗体は、少量存在し得る起こり得る自然発生の突然変異体を別にすれば同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられている。さらに、様々な決定基（エピトープ）に対して向けられた様々な抗体を一般的に含む通常の（ポリクローナル）抗体製剤と対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられている。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な個体群から得られるという抗体の特性を示しており、特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。）によって作ることができる。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００４９】
モノクローナル抗体は、それらが所望の生物活性を示す限りにおいて、それらの中で、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であり、該鎖（複数可）の残りが、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにこのような抗体の断片をさらに含むことができる（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【００５０】
本明細書で使用される場合に用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」もしくは「ＣＤＲ」（即ち、軽鎖可変ドメインにおける残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）および重鎖可変ドメインにおける３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））からのアミノ酸残基ならびに／または「超可変ループ」（即ち、軽鎖可変ドメインにおける残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）および重鎖可変ドメインにおける２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））からの残基を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義された超可変領域以外の可変ドメイン残基である。
【００５１】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分、ヒト化抗体は、それらの中でレシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種からの超可変領域残基（ドナー抗体）によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合に、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中またはドナー抗体中に見いだされない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、これらの中で、超可変ループの全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にヒト免疫グロブリンのこれの少なくとも一部分も含む。さらなる詳細について、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法を使用して分離または精製される抗体は、治療用抗体である。例示的な治療用抗体には、例えば、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５−４２８９；米国特許第５，７２５，８５６号）；抗ＣＤ２０抗体、例えばキメラ抗ＣＤ２０「Ｃ２Ｂ８」米国特許第５，７３６，１３７号）；リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標））、オクレリズマブ、２Ｈ７抗体のキメラまたはヒト化変異体（米国特許第５，７２１，１０８号；ＷＯ  ０４／０５６３１２）またはトシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ．（商標））；抗ＩＬ−８（Ｓｔ  Ｊｏｈｎら（１９９３）Ｃｈｅｓｔ、１０３：９３２、およびＷＯ  ９５／２３８６５）；抗ＶＥＧＦ抗体（ヒト化および／または親和性成熟抗ＶＥＧＦ抗体、例えばヒト化抗ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｋｉｍら（１９９２）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ７：５３−６４、ＷＯ  ９６／３００４６、ＷＯ  ９８／４５３３１）を含む）；抗ＰＳＣＡ抗体（ＷＯ  ０１／４０３０９）；抗ＣＤ４０抗体（Ｓ２Ｃ６およびこのヒト化変異体を含む）（ＷＯ  ００／７５３４８）；抗ＣＤ１１ａ（米国特許第５，６２２，７００号；ＷＯ  ９８／２３７６１；Ｓｔｅｐｐｅら（１９９１）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｉｎｔｌ．４：３−７；Ｈｏｕｒｍａｎｔら（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５８：３７７−３８０）；抗ＩｇＥ（Ｐｒｅｓｔａら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３−２６３２；ＷＯ  ９５／１９１８１）；抗ＣＤ１８（米国特許第５，６２２，７００号；ＷＯ  ９７／２６９１２）；抗ＩｇＥ（Ｅ２５、Ｅ２６およびＥ２７を含む）（米国特許第５，７１４，３３８号；米国特許第５，０９１，３１３号；ＷＯ  ９３／０４１７３；米国特許第５，７１４，３３８号）；抗Ａｐｏ−２受容体抗体（ＷＯ  ９８／５１７９３）；抗ＴＮＦ−アルファ抗体（ｃＡ２（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、ＣＤＰ５７１およびＭＡＫ−１９５を含む）（米国特許第５，６７２，３４７号；Ｌｏｒｅｎｚら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６（４）：１６４６−１６５３；Ｄｈａｉｎａｕｔら（１９９５）Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２３（９）：１４６１−１４６９）；抗組織因子（ＴＦ）（ＥＰ  ０  ４２０  ９３７  Ｂ１）；抗ヒトアルファ４ベータ７インテグリン（ＷＯ  ９８／０６２４８）；抗ＥＧＦＲ、キメラ化またはヒト化２２５抗体（ＷＯ  ９６／４０２１０）；抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３（米国特許第４，５１５，８９３号）；抗ＣＤ２５または抗ｔａｃ抗体、例えばＣＨＩ−６２１  ＳＩＭＵＬＥＣＴ（商標）およびＺＥＮＡＰＡＸ（商標）（米国特許第５，６９３，７６２号）；抗ＣＤ４抗体、例えばｃＭ−７４１２抗体（Ｃｈｏｙら（１９９６）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ３９（１）：５２−５６）；抗ＣＤ５２抗体、例えばＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３３７）；Ｇｒａｚｉａｎｏら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１０）：４９９６−５００２におけるような、抗Ｆｃ受容体抗体、例えばＦｃガンマＲＩに対して向けられたＭ２２抗体；抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体、例えばｈＭＮ−１４（Ｓｈａｒｋｅｙら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３Ｓｕｐｐｌ）：５９３５ｓ−５９４５ｓ；乳房上皮細胞に対して向けられた抗体（ｈｕＢｒＥ−３、ｈｕ−Ｍｃ  ３およびＣＨＬ６を含む）（Ｃｅｒｉａｎｉら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３）：５８５２ｓ−５８５６ｓ；およびＲｉｃｈｍａｎら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３  Ｓｕｐｐ）：５９１６ｓ−５９２０ｓ）；結腸癌細胞に結合する抗体、例えばＣ２４２（Ｌｉｔｔｏｎら（１９９６）Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１）：１−９）；抗ＣＤ３８抗体、例えばＡＴ  １３／５（Ｅｌｌｉｓら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（２）：９２５−９３７）；抗ＣＤ３３抗体、例えばＨｕＭ１９５（Ｊｕｒｃｉｃら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５（２３  Ｓｕｐｐｌ）：５９０８ｓ−５９１０ｓおよびＣＭＡ−６７６またはＣＤＰ７７１；抗ＣＤ２２抗体、例えばＬＬ２またはＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（Ｊｕｗｅｉｄら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５（２３  Ｓｕｐｐｌ）：５８９９ｓ−５９０７ｓ）；抗ＥｐＣＡＭ抗体、例えば１７−１Ａ（ＰＡＮＯＲＥＸ（商標））；抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、例えばアブシキシマブまたはｃ７Ｅ３  Ｆａｂ（ＲＥＯＰＲＯ（商標））；抗ＲＳＶ抗体、例えばＭＥＤＩ−４９３（ＳＹＮＡＧＩＳ（商標））；抗ＣＭＶ抗体、例えばＰＲＯＴＯＶＩＲ（商標））；抗ＨＩＶ抗体、例えばＰＲ０５４２；抗肝炎抗体、例えば抗Ｈｅｐ  Ｂ抗体  ＯＳＴＡＶＩＲ（商標））；抗ＣＡ  １２５抗体  ＯｖａＲｅｘ；抗イディオタイプＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２；抗アルファｖベータ３抗体ＶＩＴＡＸＩＮ（商標）；抗ヒト腎細胞癌抗体、例えばｃｈ−Ｇ２５０；ＩＮＧ−１；抗ヒト１７−１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）；抗ヒト大腸腫瘍抗体（Ａ３３）；ＧＤ３ガングリオシドに対して向けられた抗ヒトメラノーマ抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮細胞癌（ＳＦ−２５）；ならびに抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体、例えばＳｍａｒｔ  ＩＤ  １０および抗ＨＬＡ  ＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ−１）が含まれる。
【００５３】
本明細書で互換的に使用される用語「混入物質」、「不純物」、および「残屑」は、本明細書に記載された荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する多孔質固体支持体を使用して、１種以上の異質または好ましくない分子から分離される、対象のタンパク質またはポリペプチド（例えば、抗体）を含む試料に存在し得る、ＤＮＡ、ＲＮＡ、１種以上の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰまたはＣＨＯＰ）、全細胞、細胞残屑および細胞片、エンドトキシン、ウイルス、脂質などの生体巨大分子ならびに１種以上の添加物を含めた任意の異物または好ましくない物質を一般的に意味する。
【００５４】
本明細書で使用される用語「不溶性不純物」は、標的生体分子を含む試料中に存在する任意の望ましくないまたは好ましくない実体を意味し、ここで、該実体は、懸濁した粒子または固体である。例示的な不溶性不純物には、全細胞、細胞片および細胞残屑が含まれる。
【００５５】
本明細書で使用される用語「可溶性不純物」は、標的生体分子（例えば、標的タンパク質）を含む試料中に存在する任意の望ましくないまたは好ましくない実体を意味し、ここで、該実体は、不溶性不純物ではない。実例的な可溶性不純物には、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス、エンドトキシン、細胞培養培地成分、脂質などが含まれる。いくつかの実施形態において、可溶性不純物は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）である。
【００５６】
本明細書に記載された様々な実施形態において、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する多孔質固体支持体が、可溶性不純物を結合するために使用される。
【００５７】
理論に縛られることを望まないが、特定の場合に、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する固体支持体に結合する生体分子は、回収されることが望ましい生体分子（例えば、ワクチン生成に使用されるウイルスまたはウイルス粒子）であることが企図される。
【００５８】
本明細書で使用される用語「組成物」、「溶液」または「試料」は、１種以上の望ましくない実体または不純物（例えば、可溶性タンパク質）と共に精製されるべき標的タンパク質または対象の生成物の混合物を一般的に意味する。いくつかの実施形態において、試料は、その中に、標的タンパク質または所望の生成物が分泌されている流れ、例えば、供給原料または細胞培養培地を含む生体物質を含む。いくつかの実施形態において、試料は、１種以上の可溶性不純物（例えば、宿主細胞タンパク質）と一緒に標的生体分子（例えば、治療用タンパク質または抗体）を含む。いくつかの実施形態において、試料は、細胞培養培地中に分泌されている標的生体分子を含む。他の実施形態において、試料は、ウイルスまたはウイルス粒子である標的生体分子を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された組成物と接触したまたはこれらを通して流れた試料は、精製方法における前段階からのアウトプットである。例えば、特定の一実施形態において、上記試料は、陽イオン交換フロースルークロマトグラフィー段階からのアウトプットまたは陰イオン交換フロースルークロマトグラフィー段階からのアウトプットを構成する。
【００５９】
本明細書で互換的に使用される用語「プロセス段階」または「単位操作」は、精製方法において特定の結果を達成するための１種以上の方法または装置の使用を意味する。精製方法において使用し得るプロセス段階または単位操作の例には、限定はされないが、浄化、結合および溶出クロマトグラフィー、ウイルス不活化、フロースルー精製および製剤化が含まれる。プロセス段階または単位操作のそれぞれは、このプロセス段階または単位操作の意図した結果を達成するために２つ以上の段階または方法または装置を使用し得ることは理解されたい。いくつかの実施形態において、プロセス段階または単位操作を実施するために使用される１種以上の装置は、使い捨ての装置であり、プロセスにおける任意の他の装置を置き換える必要なしに、またはプロセス運転を停止することさえ必要なしに、取り外しおよび／または置き換えすることができる。
【００６０】
本明細書で使用される用語「サージタンク」は、任意のコンテナーまたは容器またはバッグを意味し、これは、プロセス段階の間で、またはプロセス段階内（例えば、単一のプロセス段階が２つ以上の段階を含む場合）で使用され、ここで、１つの段階からのアウトプットは、サージタンクを通って次段階へ流れる。したがって、それが、段階からのアウトプットの全体量を保持するまたは集めるよう意図されてなく、むしろ、１つの段階から次の段階へのアウトプットの連続的な流れを可能にするという点において、サージタンクは、プールタンクと異なる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法もしくはシステムにおける、２つのプロセス段階の間で、または１つのプロセス段階内で使用されるサージタンクの容積は、プロセス段階からのアウトプットの全体積のわずか２５％である。別の実施形態において、サージタンクの容積は、プロセス段階からのアウトプットの全体積のわずか１０％である。いくつかの他の実施形態において、サージタンクの容積は、それから標的分子が精製されるべき出発原料を構成する、バイオリアクター中の細胞培養物の全体積の３５％未満、または３０％未満、または２５％未満、または２０％未満、または１５％未満、または１０％未満である。
【００６１】
本明細書で使用される用語「連続方法」は、標的分子を精製するための方法を意味し、これは、１つのプロセス段階からのアウトプットが、中断されることなく、プロセス中の次のプロセス段階中に直接流れるような２つ以上のプロセス段階（または単位操作）を含み、ここで、２つ以上のプロセス段階が、少なくともこれらの継続の一部分の間、同時に実施され得る。言い換えれば、本明細書に記載された連続方法の場合、次のプロセス段階が開始される前に、１つのプロセス段階を完了することは必要ではなく、試料の一部分は、複数のプロセス段階を通って常に動いている。用語「連続方法」は、１つのプロセス段階内の段階にも当てはまり、この場合、複数段階を含む１つのプロセス段階の実施の間、試料は、プロセス段階を実施するために必要である複数段階を通って連続的に流れる。本明細書に記載されたこのようなプロセス段階の一例は、連続的に実施される複数段階、例えば、フロースルー活性炭、これに続くフロースルーＡＥＸ培地、これに続くフロースルーＣＥＸ培地、これに続くフロースルーウイルス濾過を含むフロースルー精製段階である。本明細書に記載された組成物は、このようなフロースルー精製段階において使用することができる。
【００６２】
用語「静的ミキサー」は、２種の流体物質、典型的に脂質を混合するための装置を意味する。上記装置は、円筒形（管）筺体に収容されたミキサーエレメントから一般的に構成される。全体のシステム設計は、流体の２つの流れを静的ミキサー中に供給するための方法を組み込んでいる。流れがミキサーを通って動く時、動かないエレメントが、物質を連続的にブレンドする。完全な混合は、流体の性質、管の内径、ミキサーエレメントの数およびこれらの設計などを含む多数の変数に依存する。いくつかの実施形態において、１つ以上の静的ミキサーが、精製方法を通して使用される。
【００６３】
本明細書で互換的に使用される用語「チャイニーズハムスター卵巣細胞タンパク質」および「ＣＨＯＰ」は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞培養物に由来する宿主細胞タンパク質（「ＨＣＰ」）の混合物を意味する。ＨＣＰまたはＣＨＯＰは、細胞培地または可溶化物（例えば、対象のタンパク質またはポリペプチド（例えば、ＣＨＯ細胞中に発現された抗体または免疫付着因子）を含む採取された細胞培養液）中に可溶性不純物として一般的に存在する。一般的に、対象のタンパク質を含む混合物中に存在するＣＨＯＰの量は、対象のタンパク質の純度の尺度を提供する。典型的に、タンパク質混合物中のＣＨＯＰの量は、混合物中の対象のタンパク質の量に対する１００万分率で表される。
【００６４】
宿主細胞が、別の哺乳類の細胞タイプ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母細胞、昆虫細胞、または植物細胞である場合、ＨＣＰは、宿主細胞の可溶化物中に見いだされる標的タンパク質以外のタンパク質を意味することは理解されたい。一般に、本明細書に記載された荷電フルオロカーボン組成物は、該組成物と反対の電荷を有する任意の分子を結合するために使用することができる。
【００６５】
本明細書で互換的に使用される用語「百万分の一」または「ｐｐｍ」は、本明細書に記載された方法を使用して精製された所望の標的分子（例えば、標的タンパク質または抗体）の純度の尺度を意味する。したがって、この尺度は、精製方法後に存在する標的分子の量を測るため、または望ましくない実体の量を測るためのいずれかで使用することができる。
【００６６】
本明細書で互換的に使用される用語「対数低減値」、または「ＬＲＶ」は、特定のプロセスにおける不純物濃度の低減の尺度を意味する。不純物濃度は、体積単位当たりの重量、例えばｍｇ／ｍｌ、ｎｇ／ｍｌ、ｇ／Ｌなど、ならびに体積単位当たりの粒子数、例えばＣＦＵ／ｍｌおよびＰＦＵ／ｍｌ（それぞれ、「コロニー形成単位」および「プラーク形成単位」）で表すことができる。一般に、ＬＲＶは、以下のとおり定義することができる。ＬＲＶ＝Ｌｏｇ［（供給材料中の不純物濃度）／（溶出液中の不純物濃度）］。
【００６７】
用語「単離すること」、「精製すること」および「分離すること」は、スルホン化および荷電した分子で変性された表面を有する多孔質固体支持体を使用して、標的生体分子および１種以上の不純物（例えば、宿主細胞タンパク質）を含む組成物または試料から標的生体分子（例えば、対象のタンパク質）を精製することとの関連で、本明細書で互換的に使用される。いくつかの実施形態において、試料中の標的生体分子の純度を、本明細書で記載された、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する固体支持体を使用することによって、試料から１種以上の可溶性不純物（例えば、宿主細胞タンパク質）を（完全にまたは部分的に）除去することによって増加する。別の実施形態において、試料中の標的生体分子（例えば、ワクチン生成のために有用なウイルス）の純度を、本明細書で記載された、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する固体支持体を使用して標的生体分子を結合し、試料中の１種以上の可溶性不純物から離すことによって増加する。続いて、結合した標的生体分子は、当技術分野で知られている好適な条件を使用して、固体支持体から、これを溶出することによって回収することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態において、精製方法は、１つ以上の「クロマトグラフィー段階」を追加的に使用する。典型的に、これらの段階は、本明細書で記載された、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する固体支持体を使用した、１種以上の望ましくない実体からの標的生体分子の分離後に、必要ならば、実施することができる。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する多孔質固体支持体を使用して、対象のポリペプチドまたはタンパク質を単離、分離または精製するための「精製段階」は、「均一な」または「純粋な」組成物または試料をもたらす全体の精製方法の一部であってよく、この用語は、対象のタンパク質を含む組成物中に１００ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または９０ｐｐｍ未満、８０ｐｐｍ未満、７０ｐｐｍ未満、６０ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、４０ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満、もしくは３ｐｐｍ未満のＨＣＰを含む組成物または試料を意味するために本明細書で使用される。
【００７０】
本明細書で使用される用語「浄化」、または「浄化段階」は、生体分子の精製における１つ以上の初期段階を一般的に意味する。浄化段階は、以下のもの、例えば、遠心分離および深層濾過、沈殿、凝集および沈降の、単独またはこれらの種々の組合せのいずれかを含む１つ以上の段階を使用する全細胞および／または細胞残屑の除去を一般的に含む。浄化段階は、１種以上の望ましくない実体の除去を一般的に含み、典型的に、精製方法中に実施される１つまたは最初の段階である。浄化の別の重要な態様は、後に精製方法における無菌フィルターの付着物をもたらし得る試料中の不溶性成分の除去であり、これにより全体の精製方法がより経済的になる。いくつかの実施形態において、本発明による方法は、試料からの１種以上の生体分子の除去のために荷電フルオロカーボン組成物で変性された固体支持体を使用する前に、一般的に使用される通常の浄化段階、例えば、深層濾過および遠心分離の１つ以上を使用する。
【００７１】
本明細書で使用される用語「クロマトグラフィー」は、混合物中に存在する他の分子から対象の検体（例えば、標的生体分子）を分離する任意の種類の技術を意味する。通常、対象の検体は、混合物の個々の分子が、移動相の影響下でまたは結合および溶出プロセスにおいて、固定媒体を移動する速度の差の結果として他の分子から分離される。
【００７２】
用語「クロマトグラフィー樹脂」または「クロマトグラフィー媒体」は、本明細書で互換的に使用され、混合物中に存在する他の分子から対象の検体（例えば、標的生体分子）を分離する任意の種類の相または材料を意味する。通常、対象の検体は、混合物の個々の分子が、移動相の影響下でまたは結合および溶出プロセスにおいて、一般的に固体の状態である固定相を移動する速度の差の結果として他の分子から分離される。クロマトグラフィー媒体の様々なタイプの例には、例えば、陽イオン交換樹脂、アフィニティー樹脂、陰イオン交換樹脂、陰イオン交換膜、疎水性相互作用樹脂およびイオン交換モノリスが含まれる。
【００７３】
本明細書で使用される用語「捕捉段階」または「捕捉」は、標的生体分子を結合するために使用される方法を一般的に意味する。いくつかの実施形態において、捕捉段階は、荷電フルオロカーボン組成物の分子で変性された表面を有する固体支持体を使用して標的生体分子を結合する段階を含み、ここで、標的生体分子は、回収すべき所望の分子である。いくつかの実施形態において、捕捉段階は、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する固体支持体を使用する１種以上の不純物の除去に続いて実施し、ここで、標的分子は、不純物の除去に続いて、溶出液から捕捉される。他の実施形態において、捕捉段階は、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する固体支持体を使用する１種以上の不純物の除去の前に実施され、ここで、標的分子は、捕捉段階に続いて、さらに精製される。
【００７４】
ＩＩ．例示的な荷電フルオロカーボン組成物
本発明による方法は、タンパク質精製方法において荷電フルオロカーボン組成物を使用する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本発明は、試料中の１種以上の可溶性不純物から標的生体分子を分離する方法に関し、荷電フルオロカーボン組成物で変性された固体支持体を使用する。したがって、標的生体分子（例えば、標的タンパク質または抗体）および１種以上の可溶性不純物を含む試料を、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する多孔質固体支持体と接触させ、ここで、可溶性不純物は、固体支持体に結合し、標的分子は、溶出液中に回収される。
【００７６】
いくつかの他の実施形態において、本発明は、１種以上の望ましくない実体から標的生体分子を分離する方法に関し、ここで、標的生体分子は、これ自体、その表面に荷電フルオロカーボン組成物を有する多孔質固体支持体に結合する。
【００７７】
荷電フルオロカーボン組成物の限定されない例には、限定はされないが、ポリマー組成物、例えばホモポリマーまたはコポリマー、例えばＮＡＦＩＯＮ（登録商標）の名称でＥ．Ｉ．Ｄｕｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．によって、Ａｑｕｉｖｉｏｎ（商標）ＰＦＳＡの名称でＳｏｌｖａｙ  Ｓｏｌｅｘｉｓによって、またはＦＬＥＭＩＯＮ（商標）の名称でＡｓａｈｉ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｉｍｉｔｅｄによって市販されているもの、フルオロカーボンコポリマー、例えば少なくとも２種のモノマーを含むもの（一種のモノマーは、フッ化ビニル、ヘキサフルオロプロピレン、フッ化ビニリデン、トリフルオロエチレン、クロロトリフルオロエチレン、ペルフルオロ（アルキルビニルエーテル）、テトラフルオロエチレンおよびこれらの混合物などのフッ素含有モノマーの群から選択され、第２のモノマーは、ＭがＨ、アルカリ金属、またはアルカリ土類金属である（ＳＯ３Ｍ）基であるまたはこれに変換され得る官能基を含むフッ素含有モノマーの群から選択され得る。）が含まれる。このような第２のモノマーの例は、式ＣＦ２＝ＣＦＲｆ−Ｘによって一般的に表すことができる。一般式中のＲｆは、エーテル結合を含むものを含む任意の好適なまたは通常の配置の１から８個の炭素原子を含む直鎖または分岐二官能性過フッ素化基であり、炭素−炭素結合を介して直接または、好ましくはエーテル結合を介してビニル基ＣＦ２＝ＣＦ基に結合している。Ｘは、（ＳＯ３Ｍ）であるまたはこれに変換され得る官能基であり、ここで、Ｍは、Ｈ、アルカリ金属、またはアルカリ土類金属である。一般式の１つの制限は、Ｘ基に隣接する炭素原子上に少なくとも１個のフッ素原子が存在する必要があることである。
【００７８】
典型的に、第二のモノマーは、スルホニルベースのイオン交換基に変換され得るフッ化スルホニル基を含み、これらの例は、参照により本明細書に組み込む米国特許第３，２８２，８７５号；３，０４１，３１７号；３，５６０，５６８号；および３，７１８，６２７号に見いだすことができる。ペルフルオロカーボンポリマーの調製の方法は、参照により本明細書に組み込む米国特許第３，０４１，３１７号；２，３９３，９６７号；２，５５９，７５２号および２，５９３，５８３号に記載されている。これらのペルフルオロカーボンコポリマーは、（ＳＯ３Ｍ）基に変換され得るペンダントＳＯ２Ｆベースの官能基を一般的に有する。いくつかの実施形態において、本発明による組成物は、カルボニルベースのイオン交換基に変換され得るペンダントカルボニルベースの官能基を含む。
【００７９】
ペンダントカルボニルベースのイオン交換官能基を有するフルオロカーボンコポリマーは、参照により本明細書に組み込む米国特許第４，４６５，５３３号および４，３４９，４２２号によるものなどの任意の好適な通常の方法で調製することができる。フッ化カルボニル含有モノマーの代表例には、次のモノマー式が含まれる。
【００８０】
【化２】
2015517990.tif 000004
【００８１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたフルオロカーボンコポリマーは、式−−ＯＣＦ２ＣＦ２Ｘ’および／または−−ＯＣＦ２ＣＦ２Ｃ−−Ｆ２Ｙ−−Ｂ−−ＹＣＦ２ＣＦ２Ｏ−−によって表されるカルボニルおよび／またはスルホニルベースの官能基を含み、式中、Ｘ’は、フッ化スルホニル（ＳＯ２Ｆ）、フッ化カルボニル（ＣＯＦ）、スルホン酸メチルエステル（ＳＯ３ＣＨ３）、カルボキシル酸メチルエステル（ＣＯＯＣＨ３）、イオン性カルボキシレート（ＣＯＯ−−Ｚ＋）またはイオン性スルホネート（ＳＯ３−−Ｚ＋）であり、Ｙは、スルホニル（ＳＯ２）またはカルボニル（ＣＯ）であり、Ｂは、−−Ｏ−−、−−Ｏ−−Ｏ−−、−−Ｓ−−Ｓ−−などの結合であり、Ｚは、水素、リチウム、セシウム、ルビジウム、カリウムおよびナトリウムなどのアルカリ金属またはバリウム、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウムおよびラジウムなどのアルカリ土類金属または第四級アンモニウムイオンである。
【００８２】
フルオロカーボンコポリマーのスルホニル形態は、一般的に、それに対して、同様に官能基を担持している、官能基またはペンダント側鎖が結合している、フッ素化炭化水素バックボーン鎖を有するポリマーである。ペンダント側鎖は、以下の構造：
【００８３】
【化３】
2015517990.tif 000005
（式中、Ｒ’ｆは、Ｆ、Ｃｌ、またはＣ１からＣ１０のペルフルオロアルキル基であり、Ｗは、ＦまたはＣｌ、好ましくはＦである。）を含み得る。通常、ポリマーの側鎖における官能基は、エーテル結合を介して側鎖に結合し得る基に存在する。この種類のペルフルオロカーボンコポリマーの例は、参照により本明細書に組み込む米国特許第３，２８２，８７５号；３，５６０，５６８号および３，７１８，６２７号に開示されている。
【００８４】
ポリマーの追加の例は、一般式ＣＦ２＝ＣＦ−−Ｔｋ−−ＣＦ２ＳＯ２Ｆで表すことができ、ここで、Ｔは、１から８個の炭素原子を含む二官能性フッ素化基であり、ｋは、０または１である。Ｔにおける置換基原子には、フッ素、塩素、または水素が含まれる。いくつかの実施形態において、ペルフルオロカーボンコポリマーは、炭素に結合した水素および塩素の両方とも含まず、即ち、これらは、過フッ素化されており、このことが、過酷な環境で最大の安定性を可能にしている。上式のＴ基は、分岐または非分岐、即ち直鎖のいずれであってもよく、１個以上のエーテル結合を有してよい。いくつかの実施形態において、フッ化スルホニル含有コモノマーのこの基におけるビニル基は、エーテル結合を介してＴ基に結合しており、即ち、コモノマーは、式：ＣＦ２＝ＣＦ−−Ｏ−−Ｔ−−ＣＦ２−−ＳＯ２Ｆを含む。例示的なフッ化スルホニル含有コモノマーは、以下の構造によって表すことができる。
【００８５】
【化４】
2015517990.tif 000006
【００８６】
いくつかの実施形態において、フッ化スルホニル含有コモノマーは、以下の構造を有するペルフルオロ（３，６−ジオキサ−４−メチル−７−オクテンスルホニルフルオリド）である。
【００８７】
【化５】
2015517990.tif 000007
【００８８】
スルホニル含有モノマーは、参照により本明細書に組み込む米国特許第３，２８２，８７５号、３，０４１，３１７号および米国特許第３，５６０，５６８号などの文献に開示されている。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本発明において使用されるペルフルオロカーボンコポリマーのクラスは、以下に示された繰り返し単位を有するポリマーによって表され、
【００９０】
【化６】
2015517990.tif 000008
【００９１】
ここで、ｈは、３から１５であり、ｊは、１から１０であり、ｐは、０、１または２であり、「Ｘ”」は、４個のフッ素または３個のフッ素および１個の塩素を表し、Ｙは、ＦまたはＣＦ３であり、Ｒ’ｆは、Ｆ、ＣｌまたはＣ１からＣ１０のペルフルオロアルキル基である。
【００９２】
スルホニルまたはカルボニルベースの官能基を含む任意のフルオロカーボンポリマーおよびコポリマーは、官能基の両方のタイプを含むコポリマーおよび異なる官能基を有するコポリマーの混合物を含めて、本明細書に記載された方法において使用することができる。１つのこのような例は、テトラフルオロエチレンおよびペルフルオロ（３，６−ジオキサ−４−メチル−７−オクテンスルホニルフルオリド）のコポリマーであり、これから、スルホン酸形態または塩形態を得ることができる。別の例は、テトラフルオロエチレンおよびメチルペルフルオロ（４，７−ジオキサ−５−メチル−８−ノネノエート）のコポリマーであり、これから、カルボン酸形態または塩形態を得ることができる。
【００９３】
一般的に、ペルフルオロカーボンコポリマーのスルホニル、カルボニル、スルホン酸およびカルボン酸エステル；ならびにスルホニルおよびカルボニルベースのアミド形態は、加水分解反応によってイオン交換形態に容易に変換される。例えば、塩形態は、ＮａＯＨなどの強アルカリによる処理によって得ることができ、酸形態は、ＨＣｌなどの酸による処理によって生成することができる。ペルフルオロカーボンコポリマーのスルホニル、カルボニル、スルホン酸およびカルボン酸エステルならびにスルホニルおよびカルボニルベースのアミド形態によって固体支持体が変性される前または後に、この変換段階は、実施することができる。
【００９４】
別の実施形態において、フルオロカーボン組成物は、上記に記載されたフルオロカーボンモノマーを含み、これらを、現場で重合または共重合させて固体支持体表面をコーティングする。
【００９５】
それから多孔質固体支持体表面の変性が導かれる反応体フルオロカーボン溶液を形成するために使用される溶媒には、参照により本明細書に組み込む米国特許第４，３８６，９８７号に開示された溶媒が含まれる。これらの溶媒には、ハロカーボン油、ペルフルオロオクタノイックオイル（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｏｃｔａｎｏｉｃ  ｏｉｌ）、Ｎ−アルキルアセトアミドおよびデカフルオロビフェニルが含まれる。別法として、参照により本明細書に組み込む米国特許第４，３４８，３１０号に開示されたハロゲン化飽和炭化水素を使用することができる。いくつかの実施形態において、溶媒は、参照により本明細書に組み込む米国特許第４，４３３，０８２号および４，４５３，９９１号に開示されたアルコール溶媒である。アルコール溶媒には、含水または無水の、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、２−メトキシエタノール、２−エトキシエタノール、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、ジオキサンおよびアセトニトリルならびに、これらの混合物が含まれる。特定の一実施形態において、溶媒は、水およびイソプロパノールなどの低級アルコールの混合物である。ペルフルオロカーボンコポリマーの溶液は、密閉容器中において、高温で、典型的には１８０℃から３００℃で、溶媒の臨界温度未満で、高圧で形成される。これらの溶液は、ペルフルオロカーボンコポリマーのための溶媒または希釈剤、例えばイソプロパノール、エタノール、水などと混和性であり、ペルフルオロカーボンコポリマーを沈殿させない。溶液が基材細孔に完全に入ることが一般的に求められる。
【００９６】
ＩＩＩ．例示的な固体支持体
好適な媒体材料には、クロマトグラフィービーズに一般的に使用されるものが含まれ、これらは、ガラス、例えばホウケイ酸ガラス、耐アルカリ性ガラスおよび細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）、天然および合成ポリマー、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンおよびポリプロピレンのブレンド、多層ポリエチレン／ポリプロピレンビーズ、アクリル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ＰＶＤＦまたはＰＴＦＥ、スチレン−ジビニルベンゼンコポシマー、アガロース、アガロース誘導体、寒天、アルギン酸塩、セルロース、セルロース誘導体、デキストラン、デンプン、カラギーナン、グアーゴム、アラビアゴム、ガティガム、トラガカントゴム、カラヤゴム、イナゴマメ、キサンタンガム、ペクチン、ムチン、ヘパリン、およびゼラチン、金属、例えばステンレス鋼、ニッケル、チタン、パラジウムおよびコバルトまたは種々の鉄、鉄含有または他の磁性を持つ金属アロイおよびブレンド；ならびにセラミック、例えばケイ酸塩材料、ジルコニアおよび種々のセラミックブレンドを含む。固体支持体がビーズの形態をしている場合、ビーズは、全て同一材料で形成されていてもよく、または２種以上の材料、好ましくは多孔質材料の複合体であってもよい。例えば、ビーズは、内側にガラスまたは合成ポリマーコアを含み、外側に天然および合成ポリマー層を含むことができる。
【００９７】
特定の一実施形態において、本発明による組成物および方法において使用される固体支持体は、多孔質膜である。一般に、多孔質膜は、１種以上のポリマーを含む任意の好適な材料からなってよい。多孔質膜を形成するために好適な代表的なポリマーには、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテンなどのポリオレフィン；ポリスチレンまたは置換ポリスチレン；ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリビニリデンフルオリドなどを含むフッ素化ポリマー；ポリスルホン、ポリエーテルスルホンなどのポリスルホン；ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレートなどを含むポリエステル；ポリアクリレートおよびポリカーボネート；ポリビニルクロリドおよびポリアクリロニトリルなどのビニルポリマー；セルロース、ニトロセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロース；ポリアミドが含まれる。コポリマーは、ブタジエンおよびスチレンのコポリマー、フッ素化エチレン−プロピレンコポリマー、エチレン−クロロトリフルオロエチレンコポリマーなどを含めて、同様に、多孔質材料のバルクマトリックスを形成するために使用することができる。
【００９８】
一般的に、本明細書に記載された方法および組成物において使用される多孔質膜は、０．００１から５０ミクロン、０．１から５ミクロン、または０．０１から１ミクロンの範囲の平均細孔径を有する。いくつかの実施形態において、平均細孔径は、０．２ミクロンである。特定の一実施形態において、膜の平均細孔径は、０．４５ミクロンである。他の実施形態において、平均細孔径は、０．６５ミクロンである。膜の深さ、即ち、膜の２つの外表面、または上面および底面の間の距離は、１から１０００ミクロン、５０から５００ミクロン、７５から２００ミクロンまたは９０から１５０ミクロンの範囲にわたり得る。
【００９９】
ＩＶ．荷電フルオロカーボン組成物で固体支持体を変性する例示的な方法
種々の実施形態において、固体支持体を、荷電フルオロカーボン組成物で変性する。固体支持体は、当業者に知られている様々な表面変性技術を使用して変性することができる。
【０１００】
いくつかの実施形態において、表面変性のよく使われる方法である吸着が使用される。本明細書に記載されたフルオロカーボン組成物の溶液を、例えば、溶液中の固体支持体の浸漬によって、または固体支持体に溶液を通すことによって、または圧力下で固体支持体の細孔に溶液を貫入させることによって、多孔質固体支持体と接触させる。本明細書で溶液は、溶媒、希釈剤または分散剤媒体中に完全に溶解および／または部分的に溶解したフルオロカーボン組成物を含む液体組成物を意味する。これらの溶液には、分散剤媒体中の溶解されていないフルオロカーボンポリマー組成物の懸濁液が含まれる。上記溶液は、固体支持体を完全に濡らすまたは、これが固体支持体を濡らさない場合、溶液が細孔に入るもしくは溶液が細孔に貫入するように膜を予め濡らす、フルオロカーボンポリマー組成物のための溶媒、希釈剤または分散剤媒体である液体組成物を含む。溶液が、固体支持体の細孔に完全に入ることが一般的に求められる。固体支持体を、所要の期間、溶液と接触させ、この期間は、１秒から２４時間、または１分および６０分の間の範囲にわたり得る。種々の実施形態において、固体支持体を溶液と接触させる時間は、１秒または５秒または１０秒または２０秒または３０秒または４０秒または５０秒または１分または５分または１０分または１５分または２０分または２５分または３０分または３５分または４０分または４５分または５０分または５５分または１時間または５時間または１０時間または１５時間または２０時間または２４時間またはこれ以上である。続いて、溶液を、機械的手段、例えば、はさみ取ること、スキージをかけること、または溝付きダイをあてることによって除去する。
【０１０１】
別の実施形態において、溶液の余剰分を、機械的手段によって除去せず、代わりに、乾燥および続いての抽出のために細孔中に残す。固体支持体に結合したフルオロカーボン組成物の除去を回避しながら、例えば溶媒和または希釈によって、結合していないフルオロカーボンポリマー組成物を選択的に除去する希釈剤または分散剤が、一般的に使用される。
【０１０２】
続いて、得られる表面変性固体支持体を、膜基材および結合した荷電フルオロカーボン組成物の間の結合強度を改善するために、乾燥および熱処理する。
【０１０３】
使用されるフルオロカーボンポリマー組成物が、フッ化スルホニルまたはフッ化カルボニルタイプのものである場合、追加の加水分解段階が、表面をイオン交換形態に変換するために求められ得る。
【０１０４】
熱処理された表面変性固体支持体は、結合していない溶媒和した荷電ペルフルオロカーボンポリマー組成物を溶媒和および／または希釈する溶媒または希釈剤中において、驚くべきことに、実質的に不溶性である、吸着されたフルオロカーボンポリマー組成物を含む組成物で変性されたこの表面を有する。
【０１０５】
加えて、表面変性用組成物は、固体支持体が、実質的に塞がれないまたは埋められないような量および濃度で使用される。固体支持体が膜である場合、閉塞は、精製水の濾過中の膜を超えた圧力低下の増加によって測定することができる。
【０１０６】
以下の手順は、固体支持体をフルオロカーボン組成物でコーティングするための一般的方法を記載している。
【０１０７】
好適な固体支持体基材を、メタノールで予め濡らし、水中ですすぎ、完全な交換を確実にするために、数分間、フルオロカーボン組成物を含む反応体溶液に浸す。反応体溶液が、直接基材を濡らすことができる場合、予備湿潤交換段階は必要ではない。次いで、表面変性された固体支持体を、例えば、機械的圧縮、エアーナイフ、または当技術分野で知られている任意の他の好適な手段による、結合していないフルオロカーボン組成物の余剰分の除去にかける。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、余剰な結合していないフルオロカーボン組成物を、機械力および／または、多孔質支持体に結合しているフルオロカーボン組成物の除去を回避しながら、例えば溶媒和もしくは希釈によって、結合していないフルオロカーボン組成物を選択的に除去する溶媒、希釈剤もしくは分散剤による処理の１つまたは両方を使用して除去する。続いて、得られる表面変性された多孔質支持体を、基材および結合したフルオロカーボン組成物の間の結合力を改善するために乾燥および熱処理する。
【０１０９】
使用されるフルオロカーボン組成物が、本質的に荷電していない、例えば、ハロゲン化スルホニル基を含んでいる場合、表面をイオン交換形態に変換するために、追加の加水分解段階が必要である。
【０１１０】
親フッ素性相互作用を使用することは、荷電フルオロカーボン組成物で変性された固体支持体を生成するための、さらなる別の吸着技術である。例えば、固定相上の過フッ化（ＰＦ）化合物の固有の相互作用が報告されている。例えば、Ｄｅ  Ｍｉｇｕｅｌら、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ、２４巻、８４９−８５３ページ、１９８７年を参照されたい。強い共同効果が、分岐したフッ素化化合物で観察される。フルオロカーボン組成物が、重合性官能基を欠くリガンドである場合、これは、特に有用である。好適な支持体材料には、種々のフルオロカーボンポリマー、例えば、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）（例えば、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙの登録商標）、ポリビニルフルオリドおよびポリビニリデンジフルオリドおよびペルフルオロデカリンが含まれる。好適なリガンドフルオロカーボン組成物には、限定はされないが、図３に描かれた化合物が含まれ、これらの化合物は、参照により本明細書に組み込むＷｅｉｓｓ  Ｊ．Ｍ．ら  ＴＯＸＩＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ  １０９（２）、２０６−２１６ページ、２００９年に開示されている。
【０１１１】
次の手順は、親フッ素性相互作用を使用して荷電フルオロカーボン組成物で固体支持体をコーティングするための一般的方法を記載している。
【０１１２】
固体支持体基材をメタノール中で濡らし、水中ですすぎ、完全な交換を確実にするために、数分間、リガンドフルオロカーボン組成物を含む反応体溶液中に浸漬する。反応体溶液が、直接基材を濡らすことができる場合、予備湿潤交換段階は必要ではない。次いで、表面変性された固体支持体を、結合していないフルオロカーボン組成物の余剰分の機械的除去にかける。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、機械力および／または、多孔質支持体に結合しているフルオロカーボン組成物の除去を回避しながら、結合していないフルオロカーボン組成物を、例えば溶媒和または希釈によって、選択的に除去する溶媒、希釈剤または分散剤での処理の１つまたは両方を使用することによって、余剰な結合していないフルオロカーボン組成物を除去する。続いて、得られる表面変性された多孔質支持体を、基材および結合したフルオロカーボン組成物の間の結合力を改善するために乾燥および熱処理する。
【０１１４】
使用される小分子フルオロカーボン組成物が、フッ化スルホニルまたはフッ化カルボニルタイプのものである場合、追加の加水分解段階が、イオン交換形態に表面を変換するために必要である。
【０１１５】
別の実施形態において、多孔質固体支持体の表面変性を、内側細孔表面および外側の幾何学的表面上のフルオロカーボン組成物を架橋することによって実施する。
【０１１６】
多孔質固体支持体を、好ましくは、重合性フルオロカーボン組成物、および好適な架橋剤、例えば、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡｍ）を含む反応体溶液で変性することができる。一般的に、荷電フルオロカーボン組成物は、反応体溶液の重量に対して、約１重量％および約２０重量％の間、または約３重量％および約６重量％の間の濃度で反応体溶液中に存在する。架橋剤は、フルオロカーボン組成物の重量に対して、好ましくは、約５重量％および約１００重量％の間の濃度で反応体溶液中に存在する。
【０１１７】
反応体溶液を、電子線放射への暴露によって、任意の化学重合フリーラジカル開始剤の非存在下で、多孔質基材、および内側細孔壁の表面上で現場重合させる。好ましくは、重合した架橋フルオロカーボン組成物は、多孔質基材の全体の外側および内側表面を覆う。重合は、フルオロカーボン組成物の重合を実施するために、少なくとも約０．１Ｍｒａｄから約６Ｍｒａｄの線量で、基材の内側および外側表面を飽和させている反応体溶液を電子線放射に暴露する段階に依存する。
【０１１８】
次の手順は、電子線放射を使用して、フルオロカーボン組成物で多孔質基材をコーティングするための一般的な方法を記載している。基材をメタノール中で濡らし、水中ですすぎ、完全な交換を確実にするために、数分間、重合性フルオロカーボン組成物およびＭＢＡｍ架橋剤を含む反応体溶液中に浸漬する。反応体溶液が、直接基材を濡らすことができる場合、予備湿潤交換段階は、必要ではない。
【０１１９】
基材の表面上の反応体溶液の重合を開始するために使用される電子線技術には、例えば、Ｓｔｅｕｃｋの米国特許第４，９４４，８７９号に記載された方法が含まれ、この特許の開示を、参照により本明細書に組み込む。前述の特許は、例えば、電子線処理装置により生成された電子のカーテンを通して通過される膜の連続ロール（ウェブと呼ばれる）または個別試料を論じている。処理装置は、約１００ｋＶから約２００ｋＶの所望の線量を供給する。動くウェブまたは試料は、カーテン下で所望の暴露時間を与えるために適した速度で移動される。線量と組み合わされた暴露時間が、線量率を決定する。典型的な暴露時間は、約０．５秒から約１０秒である。線量率は、一般的に、０．０１ｋＧｙ（キログレイ）から約６ｋＧｙ（即ち、０．１から約６Ｍｒａｄ）である。放射の所望の線量が電子線によって供給された後、未反応材料およびオリゴマー材料を除去するために、処理された多孔質基材を、水および／またはメタノール中ですすぐ。次いで、基材を乾燥し、再湿潤、流れおよび他の性質について試験する。
【０１２０】
さらなる別の代わりの実施形態において、イオン化放射の代わりにフリーラジカル化学開始剤を使用することによって、重合を開始することができる。フリーラジカル開始剤が使用される場合、一般的に０．０１から１％の範囲の量で、多孔質基材を濡らす前に、これを反応体溶液に添加することができる。フリーラジカル開始剤の化学的性質に応じて、熱によってまたはＵＶ照射によって、重合反応を開始することができる。ＵＶ活性化開始剤（即ち、光開始剤）の一例は、１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）−フェニル］−２−ヒドロキシ−２−メチル−１−プロパン−１−オン（Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９の商品名でＣｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｂａｓｅｌ、スイスから市販されている）である。
【０１２１】
別法として、熱的に開始される重合を実施することができる。好適な熱的開始剤、即ち、加熱によりフリーラジカルを生成する化合物を使用することができる。例示的な熱的開始剤は、過硫酸塩、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）などのアゾ開始剤、過酸化ベンゾイルなどの過酸化物などである。
【０１２２】
以下の手順は、光開始剤を使用してフルオロカーボン組成物で多孔質固体支持体をコーティングするための一般的方法を記載している。基材をメタノール中で濡らし、水中ですすぎ、完全な交換を確実にするために、数分間、重合性フルオロカーボン組成物、ＭＢＡｍ架橋剤およびフリーラジカル光開始剤を含む反応体溶液中に浸漬する。反応体溶液が、直接基材を濡らすことができる場合、予備湿潤交換段階は、必要ではない。基材の表面上の反応体溶液の重合を開始するために使用される光開始剤には、例えば、Ｊ．−Ｐ．Ｆｏｕａｓｓｉｅｒ、Ｐｈｏｔｏｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ，Ｐｈｏｔｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｃｕｒｉｎｇ：Ｃａｒｌ  Ｈａｎｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ、１９９５年、２０−９３ページ、および表３−１、２１ページに記載されたものが含まれる。
【０１２３】
光開始剤の分解およびフリーラジカルの生成を実施するために十分な線量で、紫外線、可視光、または赤外線放射に、重合性フルオロカーボン組成物／架橋剤／光開始剤溶液で濡らした多孔質基材を暴露する段階によって、反応体溶液の重合を実施する。紫外線放射の好適な供給源は、Ｆｕｓｉｏｎ  ＵＶ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）によって製造されている、１つは上部およびもう１つは下部の２つのＵＶ光供給源を有するＵＶコンベヤーを含むことができる。放射の所望の線量が光源によって供給された後、未反応材料およびオリゴマー材料を除去するために、処理された微多孔質基材を、水および／またはメタノール中ですすぐ。次いで、基材を乾燥し、再湿潤、流れおよび他の性質について試験する。
【０１２４】
使用されるフルオロカーボン組成物がフッ化スルホニルまたはフッ化カルボニルタイプのものである場合、追加の加水分解段階が、イオン交換形態に表面を変換するために必要である。
【０１２５】
別の実施形態において、内側細孔表面および外側幾何学的表面上のフルオロカーボン組成物をグラフト化することによって、多孔質固体支持体の表面変性を実施する。
【０１２６】
一例において、反応体溶液は、好ましくは、架橋剤を含まない重合性フルオロカーボン組成物を含む。このような場合、例えば、電子線放射供給源などの放射のイオン化供給源が、その上にフルオロカーボンモノマーがグラフト化され得る基材の表面上にフリーラジカルの生成をもたらす十分な線量を供給するために使用される。当業者は、フリーラジカルが、多孔質基材の表面上に生成され、フルオロカーボンモノマーが重合し、分解することなく、表面にグラフトする好適な放射線量を、通常の実験と共に当技術分野の知識を用いて選択することができる。
【０１２７】
別の例において、化学的に不活性なフルオロカーボン固体支持体上に導入された反応基に直接荷電分子を結合することによって、荷電フルオロカーボン組成物を得ることができる。例えば、不溶性材料にタンパク質、例えば抗体を共有結合する方法を開示している米国特許第４，６４２，２８５号を参照されたい。前述の特許に開示された不溶性材料は、ＰＲＯＴＡＰＯＬ  ＤＩ／１としてＩｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  ｏｆ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ（ＩＣＩＡＮＺ）から市販されている材料である。上記材料は、ディスク形態で入手可能であり、イソチオシアノポリスチレン基を、その表面に均一にグラフトさせたポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）バクボーンを含む。求核末端荷電分子（例えば、アミン、チオールなど）は、イソチオシアノ基と反応して共有結合をもたらす。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＭａｌｌｉａおよびＳｍｉｔｈ、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９２年を参照されたい。
【０１２８】
別の一実施形態において、フルオロカーボン組成物を使用する多孔質固体支持体の表面変性を、層ごとのアプローチを使用することによって実施する。最近、基材上に互い違いに堆積された多価電解質を使用する多価電解質錯体の薄膜の調製が記載された。ＤｅｃｈｅｒおよびＳｃｈｌｅｎｏｆｆ編、Ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ  Ｔｈｉｎ  Ｆｉｌｍｓ−−Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（２００３）；Ｄｅｃｈｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７、１２３２（１９９７）を参照されたい。さらに、米国特許第５，２０８，１１１号は、ディッピングを交互に行うこと、即ち、各浸漬に続いて、場合により、ポリマーを含まない溶液中のすすぎ段階を伴って、反対の電荷の多価電解質の水溶液を入れた２つの貯蔵器の間で基材を循環させることによる多層の積層のための方法を開示している。各循環は、逆に荷電した表面に対するイオン対相関力によってポリマーの一層を添加し、これにより表面電荷を逆転し、次の層の添加のための薄膜を下塗りする。このように調製された薄膜は、均一になり、多孔質固体支持体の内側細孔表面および外側幾何学的表面を被覆する傾向がある。この方法に従って、負に荷電した表面は、正に荷電したフルオロカーボンポリマーを該表面に吸着することによって、荷電フルオロカーボン組成物に変換することができる。
【０１２９】
別法として、正に荷電した表面は、負に荷電したフルオロカーボンポリマーを該表面に吸着することによって、荷電フルオロカーボン組成物に変換することができる。例えば、本明細書に記載された方法および組成物に使用し得る、正に荷電および負に荷電したフッ素化ポリマーおよびコポリマーの例を提供している米国特許出願公開第２０１００１７３２２４  Ａ１号を参照されたい。
【０１３０】
Ｖ．荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する固体支持体を使用する方法
同様に本明細書に記載されるのは、本発明によるフルオロカーボン組成物を使用する方法である。いくつかの実施形態において、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する固体支持体を、対象の分子および１種以上の可溶性不純物を含む水溶液からの可溶性不純物の選択的除去のために使用することができる。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する固体支持体を、精製方法において使用し得る好適な装置に組み込む。
【０１３２】
一実施形態において、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する固体支持体は、入口および出口を有する多層装置中に封入された微多孔膜である。別の実施形態において、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する固体支持体は、カラムに充填された多孔質クロマトグラフィー樹脂である。さらなる別の実施形態において、荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する固体支持体は、流れの入口および出口を提供する好適な装置中に封入された多孔質モノリスである。
【０１３３】
以下の手順は、本明細書に記載された荷電フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する固体支持体を含む装置を使用する一般的な方法を記載する。
【０１３４】
固体支持体を、水または好適な水性緩衝液で完全に濡らす。続いて、特定の量の好適な水性緩衝液を、抽出可能な化合物のレベルを低減するために、固体支持体を通して流す（フラッシする）。フラッシ体積は、通常、充填された固体支持体の１および１，０００体積の間、または充填された固体支持体の５から１００体積の間である。次いで、対象の分子および除去すべき不純物を含む緩衝液と実質的に類似している水性緩衝液で、固体支持体を平衡化する。続いて、対象の分子および不純物を含む溶液を、溶液成分および固体支持体の間の接触を確実にするように、固体支持体を含む装置を通して流し、溶出液を集め、対象の分子および不純物の濃度について分析する。投入量、即ち、溶液が通って流れる固体支持体の体積に対する出発溶液中の対象の分子の量は、有効な不純物除去（上記に定義された最高のＬＲＶ）および対象の分子の最高収率の両方を達成するために適切に選択する。固体支持体の体積当たりの対象の分子の重量として通常表される投入量の許容される範囲を、実験の専用セットにおける予備分離の前に決める。許容される投入量の範囲は、０．０１から１０ｋｇ／Ｌの間、または０．５および５ｋｇ／Ｌの間であってよい。固体支持体のより経済的な使用、表面への非特異的結合ならびに装置および配管の死容積における残存量による対象の分子のより低い損失、および溶出液中の固体支持体からの潜在的抽出可能物の濃度を低減することのために、より大きな投入量が一般的により望ましい。
【０１３５】
本明細書に記載された荷電フルオロカーボン組成物ＣＦＣで変性された表面を有する固体支持体を含む装置（ＣＦＣ装置）は、タンパク質精製方法、例えば、抗体精製方法の任意の位置に配置できる。表１は、下線で示された、１つ以上の中間段階としてＣＦＣ装置を組み込んでいるタンパク質精製方法の例を示している。これらの方法の多数の変形が使用され得ることは理解されたい。表１に現れる種々の段階は、以下に記載される。
【０１３６】
本明細書に記載された「タンパク質捕捉」または「抗体捕捉」段階は、少なくとも次の２つの段階：ｉ）細胞培養液を、クロマトグラフィー樹脂、膜、モノリス、織られたまたは織られていない媒体上における対象のタンパク質の吸着；沈殿、凝集、結晶化、可溶性小分子またはポリマーリガンドへの結合の１つ以上から選択される段階にかけて、これにより、例えば、抗体などの対象のタンパク質を含むタンパク質相を得る段階；ならびに（ｉｉ）好適な緩衝液へのタンパク質の溶出または溶解によって対象のタンパク質を再構成する段階を実施することによって、浄化されたまたは浄化されていない細胞培養液試料から、対象のタンパク質を単離することを含むタンパク質精製方法における段階を意味する。
【０１３７】
結合／溶出精製は、対象のタンパク質を好適なクロマトグラフィー媒体に結合させる段階、任意に結合したタンパク質を洗浄する段階、および適切な緩衝液でこれを溶出する段階から構成される、任意のプロセス段階である。
【０１３８】
フロースルーＡＥＸ仕上げは、対象のタンパク質の溶液を、対象のタンパク質を媒体に著しく結合することなく、好適なＡＥＸクロマトグラフィー媒体を通して流す段階から構成される任意のプロセス段階である。
【０１３９】
活性炭フロースルーは、参照により本明細書に組み込む同時係属仮特許出願第６１／５７５，３４９号に記載された、種々の方法に関連した不純物を除去するよう設計された任意の精製段階である。
【０１４０】
フロースルー凝集体除去は、参照により本明細書に組み込む同時係属仮出願第６１／６０９，５３３号に記載された、標的タンパク質の様々な凝集種を除去するよう設計された任意の精製段階である。
【０１４１】
ウイルス濾過は、実質的に全ての対象のタンパク質を通過させながら、高度のＬＲＶでウイルス粒子を保持する平板または中空繊維の形態をしていてよい多孔質膜を通して、タンパク質溶液を流す段階から構成される。
【０１４２】
【表１】
2015517990.tif 000009
【０１４３】
上記の表１において、抗体捕捉、および結合／溶出精製の段階は、３つのモード：（１）捕捉媒体を、標的タンパク質と共に投入し、投入を停止し、媒体を洗浄および溶出し、プールを集めるバッチモード；（２）一般的に、試料の投入を連続的に、即ち、流体の流れを止めることなく実施するが、溶出は断続的に実施する半連続モード；（３）投入および溶出の両方とも連続的に実施する完全連続モードのいずれかで操作することができることは理解されたい。
【０１４４】
制限と解釈されるべきではない以下の実施例によって、本発明をさらに例示する。本出願を通して引用された全ての参考文献、特許および特許出願公開の内容、ならびに図面を、参照により本明細書に組み込む。
【実施例】
【０１４５】
［実施例１］  フルオロカーボン組成物で変性された表面を有する微多孔膜の調製
１つの代表的な実験において、表２からの荷電フルオロカーボン組成物（ＣＦＣ）の５％水性分散液を、希釈またはアルコールを水に交換することによって調製する。５％分散液を、ｐＨ計および２Ｍ水性水酸化リチウムを使用してｐＨ７に中和する。超高分子量ポリエチレン（ＵＨＭＷＰＥ、またはＵＰＥ）から作られた０．６５ミクロンの細孔等級の親水性微多孔膜を、多孔質基材として本明細書に記載した実験を通して使用し、本明細書で「非変性膜」と呼ぶ。非変性膜を、５．２５×５．２５インチの正方形に切断し、６×８インチのポリエチレン袋に入れる。分散液の３ｍＬアリコートを、袋中の膜の中心にピペットで移す。ハンドインクローラーを使用して、分散液を注意深く拡げ、細孔の空気を置き換える。次いで、ローラーを使用して、余剰な液体をしっかりと押し出す。袋を切り開き、膜を室温で乾燥し、次いで、９０℃で１５分間乾燥する。膜を室温に冷却し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で注意深く濡らし、新しいＭｉｌｌｉ−Ｑ水で３回すすぐ。次いで、ＣＦＣコート膜を室温で乾燥する。本明細書に記載される静的タンパク質結合実験の前に、膜をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で濡らし、次いで、１ｍＬの対応する緩衝液中に入れる。
【０１４６】
水性分散液からのＣＦＣで変性された膜は、水で濡らすことが可能な状態に留まり、７２ダイン／センチメートル超の臨界湿潤表面張力（ＣＷＳＴ）を有する。変性膜の典型的な純水の流動は、非変性膜についての２，０００ＬＭＨ／ｐｓｉから約５００−８００ＬＭＨ／ｐｓｉに減少する。表２は、各当量についての典型的なＣＦＣ含浸量の百分率を示している。
【０１４７】
「マイクロ」装置を、予め成形されたポリプロピレン部品を使用して製作する。コート膜を２５ｍｍディスクに打ち抜く。１２５ミクロンＣＦＣ変性膜の４層を各装置中に入れ、オーバーモールドする。有効濾過径は、約２０ｍｍであり、これは、４層では装置当たり０．１５７ｍＬの体積に相当する。この装置構造の内側の有効な流量分布は、正に荷電した染料、メチレンブルーの希釈溶液を通し、続いて目視検査のために装置を開くことによって確かめる。
【０１４８】
【表２】
2015517990.tif 000010
【０１４９】
【表３】
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【０１５０】
［実施例２］  ＣＦＣ変性膜は、低および高塩濃度の両方においてリゾチームに結合する
本実施例は、ＣＦＣ変性膜は、低塩濃度（塩が添加されていない２５ｍＭ緩衝液）および高塩濃度（０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２５ｍＭ緩衝液）の両方において、標的分子、例えば、この場合、リゾチームに結合し得ることを例示する。
【０１５１】
静的能力測定を、実施例１において調製された膜の２５ｍｍディスクを使用して実施する。最初に、ディスクを対応する緩衝液に浸漬し、次いで、１６時間、１ｇ／Ｌのリゾチーム中に沈める。残りのタンパク質濃度を、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収を使用して測定する。図４に示されたように、結合能力が、特にｐＨ５で高塩濃度において、わずかに減少し、ＣＦＣ変性膜による非常に強い耐塩性を示していることが示されている。
【０１５２】
［実施例３］  ＣＦＣ変性膜は、低塩濃度および高塩濃度の両方において、ＢＳＡに結合することができる
別の実験において、ＣＦＣ変性膜は、低塩濃度（塩が添加されていない２５ｍＭ緩衝液）および高塩濃度（０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２５ｍＭ緩衝液）の両方において、別の標的分子、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合することができることが示された。
【０１５３】
静的能力測定を、実施例１において調製された膜の２５ｍｍディスクを使用して実施する。最初に、ディスクを、対応する緩衝液に浸漬し、次いで、１６時間、１ｇ／ＬのＢＳＡ中に沈める。残りのタンパク質濃度を、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収を使用して測定する。図５において示されたように、ｐＨ５において、塩添加によって能力のいくらかの低下が観察されるが、かなりの能力が依然として保持されている。ｐＨ８において、反対に、塩が添加されると結合能力は増加している。
【０１５４】
この驚くべき現象は、本明細書に記載された荷電フルオロカーボン組成物の独特な予想外の性質、即ち、低および高塩濃度の両方において、生体分子のための実際的に機能するｐＨ範囲の極限の両方において、低等電点（ＢＳＡ）および高等電点（リゾチーム）の両方のタンパク質について高い結合能力を維持することを示している。
【０１５５】
［実施例４］  ＣＦＣ変性膜は、ヒトポリクローナルＩｇＧへの静的結合能力を示す
この代表的な実験は、ＣＦＣ変性膜は、ヒトポリクローナルＩｇＧへの静的結合能力を示すことを例示する。
【０１５６】
ＳｅｒａＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡからのポリクローナルヒトＩｇＧの１ｇ／Ｌ溶液を使用して、実施例３における手順に従った。図６におけるデータは、０．５Ｍ  ＮａＣｌで両方とも実施された、ｐＨ８と比較したｐＨ５におけるＩｇＧ結合能力に対する塩の非常にわずかな影響を示している。
【０１５７】
［実施例５］  ＣＦＣ変性膜は、宿主細胞タンパク質への静的結合能力を示す
この代表的な実験は、ＣＦＣ変性膜は、宿主細胞タンパク質への静的結合能力を示すことを例示する。宿主細胞タンパク質（ｐＩ３−１０）、またはＨＣＰは、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）によって生成され、通常、対象のタンパク質（例えば、治療用抗体）と共に現れる主要な混入物質である１００種より多い異なるタンパク質の混合物である。
【０１５８】
一実験において、ＨＣＰ混合物を、ヌル哺乳類細胞培養物ＣＨＯ−Ｓから生成した。遠心分離および続いての無菌濾過を使用して、これを浄化し、陽イオン交換結合／溶出クロマトグラフィー段階を使用してさらに精製した。図７は、ＣＦＣ変性膜は、非変性膜と比較して著しい量のＨＣＰに結合することを示している。
【０１５９】
［実施例６］  ＣＦＣ変性膜は、浄化した細胞培養液からのＨＣＰの選択的除去を示す
この代表的な実験は、ＣＦＣ変性膜は、浄化した細胞培養液からの宿主細胞タンパク質の選択的除去のために使用することができることを示している。
【０１６０】
一実験において、出発細胞培養物は、Ｍａｂ０４と呼ばれるモノクローナル抗体を産生するＣＨＯ−Ｓ細胞株である。培養物を、遠心分離および続いての無菌濾過を使用して投入前に浄化する。合計約２０ｍＬ（１２５の膜カラム体積、またはＣＶ）の浄化した細胞培養物を、ＣＦＣ変性膜媒体に投入し、溶出液を集め、ｍＡｂ、ＨＣＰおよびＤＮＡ濃度について分析する。結果は表４に示されている。
【０１６１】
この実験によって示されたように、ＣＦＣ変性膜は、宿主細胞タンパク質およびＤＮＡの両方について選択性を示す。
【０１６２】
【表４】
2015517990.tif 000012
【０１６３】
［実施例７］  ＣＦＣ変性膜は、タンパク質Ａ溶出液プールからのＨＣＰの除去のために使用することができる
１つの代表的な実験において、ＣＦＣ変性膜は、タンパク質Ａ溶出液プールからの宿主細胞タンパク質の除去のために使用することができることが示される。
【０１６４】
供給材料としてタンパク質Ａクロマトグラフィー溶出液プールを使用して、実施例６に類似した実験を実施する。この供給材料は、約７ｇ／ＬのＭＡｂ０４濃度の酢酸ナトリウム緩衝液中でｐＨ５である。この供給材料の不純物レベル（ＨＣＰおよびＤＮＡ）は、実施例６の浄化した供給材料中と比べて著しく低いと予想される。３２ｍＬ（２００ＣＶ）のタンパク質Ａ溶出液を媒体に投入する。結果は表５に示されており、これは、タンパク質Ａ溶出液プールを使用して、ＣＦＣ変性膜が、ＨＣＰおよびＤＮＡの両方に選択性を示すことを示している。
【０１６５】
【表５】
2015517990.tif 000013
【０１６６】
［実施例８］  ＡＥＸフロースルー段階を使用してさらに精製されたタンパク質Ａ溶出液プールからの宿主細胞タンパク質の除去のために、ＣＦＣ変性膜を使用することができる
１つの代表的な実験において、ＡＥＸフロースルー段階を使用してさらに精製されたタンパク質Ａ溶出液プールからの宿主細胞タンパク質の除去のために、ＣＦＣ変性膜を使用することができることが示された。
【０１６７】
実施例７におけるものと同一のタンパク質Ａ溶出液を、陰イオン交換膜吸着剤、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐから市販されているＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）を使用して最初に精製する。ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ装置を、製造者の指示に従って、ｐＨ８で２．５ｋｇ／Ｌ（３７５ＣＶ）投入する。ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ段階に続いて、ＣＦＣ変性膜への投入のためにフロースループールを処理する。プールのｐＨを、氷酢酸を使用してｐＨ５に下げる。別の１５ｍＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５を、導電率を下げるために、約３０ｍＬのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）フロースルー溶液に添加する。３．７ｍＳ／ｃｍの導電率で、最終ＰＨは５．０７である。この材料の約４０ｍＬを、１．６ｍＬ／分でＣＦＣ変性膜に投入する。本実験の結果は、表６に示されており、これは、ＣＦＣ変性膜は、ＨＣＰへの選択性を有することを示している。
【０１６８】
【表６】
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【０１６９】
［実施例９］  ＣＦＣ変性膜は、低および高塩濃度の両方において、抗体供給材料からＨＣＰを除去する
この代表的な実験において、ＣＦＣ変性膜は、低および高塩濃度の両方において、抗体供給材料からＨＣＰを除去することができることが示される。
【０１７０】
実施例７におけるものと類似のタンパク質Ａ溶出液を、陰イオン交換膜吸着剤、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐから市販されているＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）を使用して最初に精製する。ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）装置を、製造者の指示に従って、ｐＨ７で２ｋｇ／Ｌ（３２０ＣＶ）まで投入する。溶出液プールを集め、１７５．４ｐｐｍのＨＣＰを含むことを見いだした。ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）段階に続いて、プールのｐＨを、氷酢酸を使用してｐＨ５に下げ、フロースループールを、ＣＦＣ変性膜、ならびに市販のベンチマーク：Ｐａｌｌ  Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡから市販されている）、およびＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｃａｒｅ）ＨｉＴｒａｐ（商標）カラムに投入する。ＣＦＣ変性膜およびＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓを、２００ＣＶまで投入し、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣを１５０ＣＶまで投入した。溶出液を集め、ＭＡｂ０４収率およびＨＣＰ濃度について分析した。結果は、表８Ａに示されている。
【０１７１】
別の実験において、実施例７におけるものと類似のタンパク質Ａ溶出液を、陰イオン交換膜吸着剤、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐから市販されているＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）を使用して最初に精製する。ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）装置を、製造者の指示に従って、ｐＨ７において３．１ｋｇ／Ｌ（３２０ＣＶ）まで投入する。溶出液プールを集め、３４７ｐｐｍのＨＣＰを含むことを見いだした。ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）段階に続いて、プールのｐＨを、氷酢酸を使用してｐＨ５に下げ、２５０ｍＭの最終濃度まで塩化ナトリウムを添加することによって、導電率を増加する。フロースループールを、ＣＦＣ変性膜、ならびに市販のベンチマーク：Ｐａｌｌ  Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡから市販されている）、およびＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｃａｒｅ）ＨｉＴｒａｐ（商標）カラムに投入する。ＣＦＣ変性膜およびＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓを、２００ＣＶまで投入し、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣを１５０ＣＶまで投入した。溶出液を集め、ＭＡｂ０４収率およびＨＣＰ濃度について分析した。結果は、表８Ｂに示されている。
【０１７２】
ＣＦＣ変性膜は、かなりの割合のＨＣＰを首尾良く除去することが観察される。低塩濃度における性能は、市販の陽イオン交換膜、Ｐａｌｌ  Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓに匹敵するが、これは、高塩濃度において劣化することなく（実際、ＨＣＰ  ＬＲＶは、わずかにより高い。）、したがって、ＣＦＣ変性膜は、本明細書でベンチマークとして使用された市販の陽イオン交換膜より著しく優れていることを示すことも観察される。
【０１７３】
［実施例１０］  ＣＦＣ変性膜は、精製された抗体供給材料からの宿主細胞タンパク質の除去のために使用することができる。
【０１７４】
１つの代表的な実験において、モノクローナル抗体を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から回収された細胞培養液を、公開された米国特許出願公開第２００９０２３２７３７号に開示されている手順に従って浄化および精製する。溶液緩衝液を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に交換し、抗体濃度を、純粋な抗体の添加によって２．０ｇ／Ｌに調節する。溶液を、４０ｇ／Ｌの合計投入量でＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）膜吸着剤装置に、これを通すことによって最初に精製し、ｐＨを５．０に下げ、ＣＦＣ変性膜を含むマイクロ装置に通すことによって、溶出液をさらに精製した。
【０１７５】
表７に示したように、ＣＦＣ変性膜は、ＨＣＰへの選択性を示す。
【０１７６】
【表７】
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【０１７７】
［実施例１２］  ＣＦＣ変性膜は、耐塩性ウイルス除去のために使用することができる
１つの代表的な実験において、ＣＦＣ変性膜は、耐塩性ウイルス除去のために使用することができることが示される。
【０１７８】
実施例１からのＣＦＣ変性膜を、上記に記載された０．１６ｍＬ「マイクロ」装置中に封入する。上記装置を水で濡らす。１０ｇ／ＬにおけるＭａｂ０４のタンパク質Ａ溶出液を、ＸＭｕＬＶウイルスを添加し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｂａｓｅおよび５．５Ｍ  ＮａＣ原液を使用して必要なＰＨおよび導電率に調節する。ｐＨ７．０および１００ｍＭ  ＮａＣｌの場合、抗体の沈殿が観察され、この条件についてのウイルスの定量は実施しなかった。上記装置に１ｋｇ／Ｌの抗体を投入し、プールを残りのＸＭｕＬＶについて分析する。驚くべきことに、低塩濃度および１００ｍＭ  ＮａＣｌの両方においてウイルスの強い保持が観察される。
【０１７９】
【表８】
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【０１８０】
参照により本明細書に組み込む、本明細書内に引用された参考文献の教示を踏まえると、本明細書は、最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明における実施形態の例示を提供するものであり、この範囲を制限するものと解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明によって包含されることを容易に理解する。全ての刊行物および発明は、これらの全体を参照により組み込まれている。参照により組み込んだ資料が、本明細書と矛盾するまたは整合しない範囲において、本明細書は、いずれのこのような資料にも優先する。本明細書における任意の参考文献の引用は、このような参考文献が、本発明の先行技術であることの承認ではない。
【０１８１】
他に指示がない限り、特許請求の範囲を含めて本明細書において使用された成分、細胞培養物、処理条件などの量を表している全ての数字は、用語「約」によって全ての場合において変更されるものと理解されるべきである。したがって、特に逆の指示がない限り、数値パラメーターは、概数であり、本発明が得ようとする所望の性質に応じて変わり得る。他に指示がない限り、一連の要素の前に置く「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素を意味するものと理解されるべきである。当業者は、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態の多くの同等物を理解する、または単に通常の実験を使用して確かめることができる。このような同等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるよう意図されている。
【０１８２】
当業者に明らかであるように、本発明の多くの変更形態および変形形態が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書に記載された特定の実施形態は、例示の目的でのみ提供されたものであり、決して限定することを意図したものではない。本明細書および実施例は、単に例示として考えられるよう意図されており、本発明の真実の範囲および精神は、以下の特許請求の範囲によって示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
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