(57)【要約】本明細書は、ブタジエン合成の基質中に2つのビニル基を形成することによってブタジエンを生成するための生化学的経路を記載する。本明細書に記載されるこれらの経路は、最終的な酵素的工程に関して、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ、イソプレンシンターゼおよびデヒドラターゼなどの酵素に依存する。2015519083.tif 000003
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタジエン合成の基質中に2つの末端ビニル基を形成する工程を含む、ブタジエンを生合成するための方法。
【請求項２】
2-オキソペンタ-4-エノアート、プロペニルCoA、（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノアート、2,4-ペンタジエノイル-[acp]、2,4-ペンタジエノイルCoA、クロトニルCoAおよび3-ブテン-2-オールからなる群より選択される化合物を生成するために、第一のビニル基が前記ブタジエン合成の基質中に酵素的に形成される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
2-オキソペンタ-4-エノアートが、第一のビニル基を、（i）EC 4.1.1.77に分類される4-オキサロクロトナートデカルボキシラーゼを用いて4-オキサロクロトナート中に形成するか、（ii）EC 3.7.1.9に分類される2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドヒドロラーゼを用いて2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド中に形成するか、または（iii）EC 3.7.1.14に分類される2-ヒドロキシ-6-オキソノナ-2,4-ジエン二酸ヒドロラーゼを用いて2-ヒドロキシ-6-オキソノナ-2,4-ジエン-1,9-二酸中に形成することによって生成される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
2-オキソペンタ-4-エノアートが、EC 1.2.1.32に分類される2-アミノムコン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いて2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドを2-ヒドロキシムコン酸に変換し、EC 5.3.2.6に分類される2-ヒドロキシムコン酸タウトメラーゼを用いて2-ヒドロキシムコン酸を4-オキサロクロトナートに変換し、かつ、EC 4.1.1.77に分類される4-オキサロクロトナートデカルボキシラーゼを用いて4-オキサロクロトナートを2-オキソペンタ-4-エノアートに変換することによって生成される、請求項2または3に記載の方法。
【請求項５】
2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドが、EC 1.13.11.2に分類されるカテコール2,3-ジオキシゲナーゼを用いてカテコールを2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドに変換することによって生成される、請求項3または請求項4に記載の方法。
【請求項６】
カテコールが、EC 1.14.12.1に分類されるアントラニル酸1,2-ジオキシゲナーゼを用いてアントラニル酸を変換するか、またはEC 4.1.1.63に分類されるプロトカテク酸デカルボキシラーゼを用いてプロトカテク酸を変換することによって生成される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
アントラニル酸が、EC 4.1.3.27に分類されるアントラニル酸シンターゼを用いてコリスミン酸を変換することによって生成される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
プロトカテク酸が、EC 4.2.1.118に分類される3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼを用いて3-デヒドロシキミ酸を変換することによって生成される、請求項5に記載の方法。
【請求項９】
2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドが、5-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデカルボキシラーゼを用いて5-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドを変換することによって生成される、請求項3または4に記載の方法。
【請求項１０】
前記5-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデカルボキシラーゼがpraHによってコードされる、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
5-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドが、プロトカテク酸2,3-ジオキシゲナーゼを用いてプロトカテク酸を変換することによって生成される、請求項8または9に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロトカテク酸2,3-ジオキシゲナーゼがpraAによってコードされる、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
2-ヒドロキシ-6-オキソノナ-2,4-ジエン-1,9-二酸が、EC 1.13.11.16に分類される3-カルボキシエチルカテコール2,3-ジオキシゲナーゼを用いて2,3-ジヒドロキシフェニルプロピオン酸を変換することによって生成される、請求項3に記載の方法。
【請求項１４】
2,3-ジヒドロキシフェニルプロピオン酸が、EC 1.3.1.87に分類される3-（シス-5,6-ジヒドロキシシクロヘキサ-1,3-ジエン-1-イル）プロパン酸デヒドロゲナーゼを用いてシス-3-（カルボキシエチル）-3,5-シクロヘキサジエン-1,2-ジオールを変換することによって生成される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
シス-3-（カルボキシエチル）-3,5-シクロヘキサジエン-1,2-ジオールが、EC 1.14.12.19に分類される3-フェニルプロパン酸ジオキシゲナーゼを用いて3-フェニルプロピオン酸を変換することによって生成される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
3-フェニルプロピオン酸が、EC 1.3.1.31に分類される2-エン酸レダクターゼを用いてE-桂皮酸を変換することによって生成される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
E-桂皮酸が、EC 4.3.1.24に分類されるフェニルアラニンアンモニアリアーゼを用いてL-フェニルアラニンを変換することによって生成される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記ブタジエン合成の基質がプロパノイルCoAである、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１９】
プロペノイルCoAが、第一のビニル基を、（i）EC 1.3.8.1に分類されるブチリルCoAデヒドロゲナーゼもしくはEC 1.3.8.7に分類される中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼを用いてプロパノイルCoA中に形成するか、（ii）EC 4.2.1.54に分類されるラクトイルCoAデヒドラターゼを用いてラクトイルCoA中に形成するか、または（iii）EC 4.2.1.116に分類される3-ヒドロキシプロピオニルCoAデヒドラターゼを用いて3-ヒドロキシプロピオニルCoA中に形成することによって生成される化合物である、請求項2または18に記載の方法。
【請求項２０】
プロパノイルCoAが、EC 2.1.3.1に分類されるメチルマロニルCoAカルボキシトランスフェラーゼまたはEC 4.1.1.41に分類されるメチルマロニルCoAデカルボキシラーゼを用いて(2S)-メチルマロニルCoAを変換することによって生成される、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
（2S）-メチルマロニルCoAが、EC 5.1.99.1に分類されるメチルマロニルCoAエピメラーゼを用いて（2R）-メチルマロニルCoAを変換することによって生成される、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
(2R)-メチルマロニルCoAが、EC 5.4.99.2に分類されるメチルマロニルCoAムターゼを用いてスクシニルCoAを変換することによって生成される、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
プロパノイルCoAが、EC 2.3.1.-に分類される2-ケト酪酸ギ酸リアーゼを用いて2-オキソ酪酸を変換することによって生成される、請求項18に記載の方法。
【請求項２４】
前記2-ケト酪酸ギ酸リアーゼがtdcEによってコードされる、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
2-オキソ酪酸が、EC 4.3.1.19に分類されるトレオニンアンモニアリアーゼを用いてL-トレオニンを変換することによって生成される、請求項23または24に記載の方法。
【請求項２６】
プロパノイルCoAが、プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いてプロパノールを変換することによって生成される、請求項18に記載の方法。
【請求項２７】
前記プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼがpduPによってコードされる、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
プロパノールが、EC 4.2.1.28に分類されるプロパンジオールデヒドラターゼを用いて1,2-プロパンジオールを変換することによって生成される、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
プロパノイルCoAが、EC 2.3.1.-に分類されるトランスフェラーゼを用いてレブリニルCoAを変換することによってレブリン酸から生成される、請求項18に記載の方法。
【請求項３０】
レブリニルCoAが、EC 6.2.1.-に分類されるアシルCoAシンテターゼまたはリガーゼを用いてレブリン酸を変換することによって生成される、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
ラクトイルCoAが、EC 2.8.3.1に分類されるプロピオン酸CoAトランスフェラーゼを用いてL-乳酸を変換することによって生成される、請求項19に記載の方法。
【請求項３２】
L-乳酸が、EC 1.1.1.27に分類されるL-乳酸デヒドロゲナーゼを用いてピルビン酸を変換することによって生成される、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
3-ヒドロキシプロピオニルCoAが、EC 3.1.2.4に分類される3-ヒドロキシイソブチリルCoAヒドロラーゼを用いて3-ヒドロキシプロピオン酸を変換することによって生成される、請求項19に記載の方法。
【請求項３４】
3-ヒドロキシプロピオニルCoAが、EC 1.1.1.59に分類される3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼを用いてマロン酸セミアルデヒドを変換することによって生成される、請求項19に記載の方法。
【請求項３５】
マロン酸セミアルデヒドが、EC 1.2.1.75に分類されるマロニルCoAレダクターゼを用いてマロニルCoAを変換することによって生成される、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
プロパノイルCoAが、EC 1.3.8.1に分類されるブチリルCoAデヒドロゲナーゼまたはEC 1.3.8.7に分類される中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼを用いてプロペノイルCoAを変換することによって生成される、請求項2または19に記載の方法。
【請求項３７】
（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートプロペノイルCoAが、デサチュラーゼ/モノオキシゲナーゼまたはシトクロムP450を用いて（R）3-ヒドロキシペンタン酸中に第一のビニルを形成することによって生成される、請求項2に記載の方法。
【請求項３８】
（R）3-ヒドロキシペンタン酸が、EC 3.1.2.-に分類されるチオエステラーゼを用いて（R）3-ヒドロキシペンタノイルCoAを変換することによって生成される、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
（R）3-ヒドロキシペンタノイルCoAが、EC 1.1.1.36に分類されるアセトアセチルCoAレダクターゼを用いて3-オキソペンタノイルCoAを変換することによって生成される、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
3-オキソペンタノイルCoAが、EC 2.3.1.16に分類されるアセチルCoA C-アシルトランスフェラーゼを用いてプロパノイルCoAを変換することによって生成される、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
2,4-ペンタジエノイル-[acp]が、アシル-[acp]デヒドロゲナーゼを用いてペンタ-2-エノイル-acp中に第一のビニル基を形成することによって生成される、請求項2に記載の方法。
【請求項４２】
2,4-ペンタジエノイルCoAが、第一のビニル基を、（i）EC 4.2.1.-に分類される5-ヒドロキシバレリルCoAデヒドラターゼを用いて5-ヒドロキシペンタノイルCoA中に形成するか、または（ii）EC 1.3.1.34に分類される2,4-ジエノイル補酵素Aレダクターゼを用いてペンタ-3-エノイルCoA中に形成することによって生成される、請求項2に記載の方法。
【請求項４３】
前記5-ヒドロキシバレリルCoAデヒドラターゼがクロストリジウム・ビリデ（Clostridium viride）に由来する、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
クロトニルCoAが、第一のビニル基を、（i）EC 4.1.1.70に分類されるグルタコニルCoAデカルボキシラーゼを用いてグルタコニルCoA中に形成するか、（ii）EC 4.2.1.120に分類される4-ヒドロキシブタノイルCoAデヒドラターゼおよびEC 5.3.3.3に分類されるビニルアセチルCoAイソメラーゼを用いて4-ヒドロキシブチリルCoA中に形成するか、または（iii）EC 4.2.1.119に分類されるエノイルCoAヒドラターゼを用いて（R）3-ヒドロキシブタノイルCoA中に形成することによって生成される、請求項2に記載の方法。
【請求項４５】
3-ブテン-2-オールが、デサチュラーゼまたはモノオキシゲナーゼを用いて2-ブタノール中に第一のビニル基を形成することによって生成される、請求項2に記載の方法。
【請求項４６】
第二のビニル基が、（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノアート中に、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（MDD）によって酵素的に形成される、請求項1に記載の方法。
【請求項４７】
第二のビニル基が、2-ブテン-1-オールジホスファート中または3-ブテン-2-オールジホスファート中のいずれかに、イソプレンシンターゼ（ISPS）によって酵素的に形成される、請求項1に記載の方法。
【請求項４８】
第二のビニル基が、3-ブテン-2-オール中または2-ブテン-1-オール中のいずれかに、酵素クラスEC 4.2.1.-のデヒドラターゼによって酵素的に形成される、請求項1に記載の方法。
【請求項４９】
前記デヒドラターゼが、リナロールデヒドラターゼ（EC 4.2.1.127）、キエビトンヒドラーゼ（EC 4.2.1.95）、オレイン酸ヒドラターゼ（EC 4.2.1.53）またはカロテノイド1,2-ヒドラターゼ（EC 4.2.1.131）である、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
ペンタ-2-エノイル-[acp]が、EC 4.2.1.59に分類される3-ヒドロキシアシル-[acp]デヒドラターゼを用いて（R）3-ヒドロキシペンタノイル-[acp]を変換することによって生成される、請求項41に記載の方法。
【請求項５１】
（R）3-ヒドロキシペンタノイル-[acp]が、EC 1.1.1.100に分類される3-オキソアシル-[acp]レダクターゼを用いて3-オキソペンタノイル-[acp]を変換することによって生成される、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
3-オキソペンタノイル-[acp]が、EC 2.3.1.41に分類されるβ-ケトアシル-[acp]シンターゼI、およびtcsAなどのアシルトランスフェラーゼを用いてプロパノイルCoAを変換することによって生成される、請求項18および請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
ペンタ-2-エノイル-[acp]が、アシルトランスフェラーゼを用いてペンタ-2-エノイルCoAを変換することによって生成される、請求項41に記載の方法。
【請求項５４】
ペンタ-2-エノイルCoAが、EC 4.2.1.119に分類されるエノイルCoAヒドラターゼを用いて（R）3-ヒドロキシペンタノイルCoAを変換することによって生成される、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
（R）3-ヒドロキシペンタノイルCoAが、EC 1.1.1.36に分類されるアセトアセチルCoAレダクターゼを用いて3-オキソペンタノイルCoAを変換することによって生成される、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
3-オキソペンタノイルCoAが、EC 2.3.1.16に分類されるアセチルCoA C-アシルトランスフェラーゼを用いてプロパノイルCoAを変換することによって生成される、請求項18および請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
ペンタ-3-エノイルCoAが、EC 5.3.3.8に分類されるイソメラーゼを用いてペンタ-2-エノイルCoAを変換することによって生成される、請求項42および請求項54に記載の方法。
【請求項５８】
5-ヒドロキシペンタノイルCoAが、（i）EC 2.8.3.14に分類される5-ヒドロキシペンタン酸CoAトランスフェラーゼを用いて5-ヒドロキシペンタン酸を変換すること、または（ii）シトクロムP450を用いてペンタノイルCoAを変換することのいずれかによって生成される、請求項42に記載の方法。
【請求項５９】
前記シトクロムP450がCYP153A6の遺伝子産物である、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
5-ヒドロキシペンタン酸が、5-ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼを用いて5-オキソペンタン酸を変換することによって生成される、請求項58に記載の方法。
【請求項６１】
前記5-ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼが、cpnDの遺伝子産物であるか、またはクロストリジウム・ビリデ由来のデヒドロゲナーゼである、請求項60に記載の方法。
【請求項６２】
5-オキソペンタン酸が、EC 2.6.1.48に分類される5-アミノ吉草酸トランスアミナーゼを用いて5-アミノ吉草酸を変換することによって生成される、請求項60に記載の方法。
【請求項６３】
5-アミノ吉草酸が、EC 1.21.4.1に分類されるD-プロリンレダクターゼを用いてD-プロリンを変換することによって生成される、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
D-プロリンが、EC 5.1.1.4に分類されるプロリンラセマーゼを用いてL-プロリンを変換することによって生成される、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
L-プロリンが、EC 1.5.1.2に分類されるピロリン-5-カルボン酸レダクターゼを用いて(S)-1-ピロリン-5-カルボン酸を変換することによって生成される、請求項64に記載の方法。
【請求項６６】
(S)-1-ピロリン-5-カルボン酸が、L-グルタミン酸5-セミアルデヒドの自発的変換によって生成される、請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
L-グルタミン酸5-セミアルデヒドが、EC 1.2.1.41に分類されるグルタミン酸-5-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いてL-グルタミル-5-リン酸を変換することによって生成される、請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
L-グルタミル-5-リン酸が、EC 2.7.2.11に分類されるグルタミン酸5-キナーゼを用いてL-グルタミン酸を変換することによって生成される、請求項67に記載の方法。
【請求項６９】
ペンタノイルCoAが、EC 1.3.1.38に分類されるトランス-2-エノイルCoAレダクターゼを用いてペンタ-2-エノイルCoAを変換することによって生成される、請求項54および請求項58に記載の方法。
【請求項７０】
グルタコニルCoAが、EC 4.2.1.-に分類されるデヒドラターゼを用いて2-ヒドロキシグルタリルCoAを変換することによって生成される、請求項44に記載の方法。
【請求項７１】
2-ヒドロキシグルタリルCoAが、EC 2.8.3.12に分類されるグルタコン酸CoAトランスフェラーゼを用いて2-ヒドロキシグルタル酸を変換することによって生成される、請求項70に記載の方法。
【請求項７２】
2-ヒドロキシグルタル酸が、EC 1.1.99.2に分類される2-ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼを用いて2-オキソグルタル酸を変換することによって生成される、請求項71に記載の方法。
【請求項７３】
3-ヒドロキシブタノイルCoAが、EC 1.1.1.36に分類される3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼを用いてアセトアセチルCoAを変換することによって生成される、請求項44に記載の方法。
【請求項７４】
アセトアセチルCoAが、EC 2.3.1.9に分類されるアセチルCoA C-アセチルトランスフェラーゼを用いてアセチルCoAを変換することによって生成される、請求項73に記載の方法。
【請求項７５】
4-ヒドロキシブチリルCoAが、CoAトランスフェラーゼを用いて4-ヒドロキシ酪酸を変換することによって生成される、請求項44に記載の方法。
【請求項７６】
前記CoAトランスフェラーゼがCk-cat2の遺伝子産物である、請求項75に記載の方法。
【請求項７７】
4-ヒドロキシ酪酸が、EC 1.1.1.61に分類される4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを用いてコハク酸セミアルデヒドを変換することによって生成される、請求項75に記載の方法。
【請求項７８】
コハク酸セミアルデヒドが、EC 1.2.1.76に分類されるコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いてスクシニルCoAを変換することによって生成される、請求項77に記載の方法。
【請求項７９】
2-ブタノールが、EC 1.1.1.B4に分類される（R）特異的第二級アルコールデヒドロゲナーゼを用いてブタノンを変換することによって生成される、請求項45に記載の方法。
【請求項８０】
ブタノンが、EC 4.2.1.28に分類されるプロパンジオールデヒドラターゼを用いて2,3-ブタンジオールを変換することによって生成される、請求項79に記載の方法。
【請求項８１】
2,3-ブタンジオールが、EC 1.1.1.4に分類される(R,R)-ブタンジオールデヒドロゲナーゼを用いて(R)-アセトインを変換することによって生成される、請求項80に記載の方法。
【請求項８２】
（R）-アセトインが、EC 4.1.1.5に分類されるアセト乳酸デカルボキシラーゼを用いて2-アセト乳酸を変換することによって生成される、請求項81に記載の方法。
【請求項８３】
2-アセト乳酸が、EC 2.2.1.6に分類されるアセト乳酸シンターゼを用いてピルビン酸を変換することによって生成される、請求項82に記載の方法。
【請求項８４】
（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートが、EC 3.1.2.-に分類されるチオエステラーゼを用いて3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAを変換することによって生成される、請求項46に記載の方法。
【請求項８５】
3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAが、EC 4.2.1.に分類されるエノイルCoAデヒドラターゼ2を用いて2,4-ペンタジエノイルCoAを変換することによって生成される、請求項84に記載の方法。
【請求項８６】
2,4-ペンタジエノイルCoAが、2-ヒドロキシイソカプロイルCoAデヒドラターゼを用いて2-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAを変換することによって生成される、請求項85に記載の方法。
【請求項８７】
前記2-ヒドロキシイソカプロイルCoAデヒドラターゼが、イニシエータHadIおよびHadBCの遺伝子産物である、請求項86に記載の方法。
【請求項８８】
2-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAが、CoAトランスフェラーゼを用いて2-ヒドロキシペンタ-4-エノアートを変換することによって生成される、請求項86に記載の方法。
【請求項８９】
前記CoAトランスフェラーゼがGctABの遺伝子産物である、請求項88に記載の方法。
【請求項９０】
2-ヒドロキシペンタ-4-エノアートが、(R)-2-ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼを用いて2-オキソペンタ-4-エノアートを変換することによって生成される、請求項88に記載の方法。
【請求項９１】
前記(R)-2-ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼがクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）由来のLdhAの遺伝子産物である、請求項90に記載の方法。
【請求項９２】
(R)-ヒドロキシペンタ-4-エノアートが、EC 3.1.2.-に分類されるチオエステラーゼを用いて（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAを変換することによって生成される、請求項46に記載の方法。
【請求項９３】
（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAが、EC 1.1.1.36に分類されるアセトアセチルCoAレダクターゼを用いて3-オキソペンタ-4-エノイルCoAを変換することによって生成される、請求項92に記載の方法。
【請求項９４】
3-オキソペンタ-4-エノイルCoAが、EC 2.3.1.16に分類されるβ-ケトチオラーゼを用いてプロペノイルCoAを変換することによって生成される、請求項93に記載の方法。
【請求項９５】
(R)-ヒドロキシペンタ-4-エノアートが、EC 3.1.2.-に分類されるチオエステラーゼを用いて（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAを変換することによって生成される、請求項46に記載の方法。
【請求項９６】
（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAが、（R）-3-ヒドロキシアシル-ACP:CoAトランスアシラーゼを用いて（R）-3-ヒドロキシペンタ-4-エノイル-[acp]を変換することによって生成される、請求項95に記載の方法。
【請求項９７】
前記（R）-3-ヒドロキシアシル-ACP:CoAトランスアシラーゼがphaGの遺伝子産物である、請求項96に記載の方法。
【請求項９８】
(R)-3-ヒドロキシペンタ-4-エノイル-[acp]が、EC 4.2.1.59に分類される3-ヒドロキシアシル-[アシルキャリヤータンパク質]デヒドラターゼを用いて2,4-ペンタジエノイル-[acp]を変換することによって生成される、請求項96に記載の方法。
【請求項９９】
（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAが、EC 4.2.1.119に分類されるエノイルCoAデヒドラターゼ2を用いて2,4-ペンタジエノイルCoAを変換することによって生成される、請求項95に記載の方法。
【請求項１００】
2-ブテン-1-オールジホスファートが、EC 2.7.4.2に分類されるホスホメバロン酸キナーゼを用いて、またはEC 2.7.6.-に分類されるジホスホキナーゼを用いて2-ブテン-1-オールホスファートを変換することによって生成される、請求項47に記載の方法。
【請求項１０１】
2-ブテン-1-オールホスファートが、EC 2.7.1.36に分類されるメバロン酸キナーゼを用いて2-ブテン-1-オールを変換することによって生成される、請求項100に記載の方法。
【請求項１０２】
2-ブテン-1-オールが、EC 1.1.1.54に分類されるアリルアルコールデヒドロゲナーゼを用いて2-ブテン-1-アールを変換することによって生成される、請求項101に記載の方法。
【請求項１０３】
2-ブテン-1-アールが、EC 1.2.1.48に分類される長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼを用いてクロトン酸を変換することによって生成される、請求項102に記載の方法。
【請求項１０４】
クロトン酸が、EC 6.2.1.5に分類されるコハク酸CoAリガーゼを用いてクロトニルCoAを変換することによって生成される、請求項103に記載の方法。
【請求項１０５】
2-ブテン-1-オールジホスファートが、EC 2.7.6.-に分類されるジホスホキナーゼを用いて2-ブテン-1-オールを変換することによって生成される、請求項100および102に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ジホスホキナーゼが、EC 2.7.6.2に分類されるチアミンジホスホキナーゼである、請求項100または105に記載の方法。
【請求項１０７】
3-ブテン-2-オールジホスファートが、EC 2.7.6.-に分類されるジホスホキナーゼを用いて3-ブテン-2-オールを変換するか、またはEC 2.7.4.2に分類されるホスホメバロン酸キナーゼを用いて3-ブテン-2-オールホスファートを変換することによって生成される、請求項47に記載の方法。
【請求項１０８】
3-ブテン-2-オールホスファートが、EC 2.7.1.36に分類されるメバロン酸キナーゼを用いて3-ブテン-2-オールを変換することによって生成される、請求項107に記載の方法。
【請求項１０９】
単離された酵素を用いて実施される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記酵素を含む細胞溶解物を用いて実施される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
組換え宿主中で実施される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記組換え宿主が、嫌気的、微好気的、または好気的に培養される、請求項111に記載の方法。
【請求項１１３】
前記組換え宿主細胞が、発酵中に高い細胞密度を維持するためにセラミック中空糸膜中に保持される、請求項112に記載の方法。
【請求項１１４】
発酵に供給される主な炭素源が、生物学的または非生物学的供給原料に由来する、請求項112に記載の方法。
【請求項１１５】
前記生物学的供給原料が、単糖類、二糖類、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、リグニン、たとえばレブリン酸およびフルフラール、リグニン、トリグリセリド類、たとえばグリセロールおよび脂肪酸、農業廃棄物、または一般廃棄物であるかまたはそれらに由来する、請求項114に記載の方法。
【請求項１１６】
前記非生物学的供給原料が、天然ガス、合成ガス、CO2/H2、メタノール、エタノール、シクロヘキサン酸化プロセスからの不揮発性残渣（NVR）または苛性洗浄液の廃液流のいずれかであるかまたはそれらに由来する、請求項114に記載の方法。
【請求項１１７】
EC 4.1.1.33に分類される前記メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列が、触媒クレフトの触媒アルギニン残基の両側5残基の範囲内に最低4つのセリン残基を含む、請求項46に記載の方法。
【請求項１１８】
前記メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼが、レンサ球菌属（Streptococcus属）またはブドウ球菌属（Staphylococcus属）に由来する、請求項46に記載の方法。
【請求項１１９】
前記宿主微生物が、原核生物または真核生物のいずれかである、請求項111に記載の方法。
【請求項１２０】
前記宿主微生物が、大腸菌（Escherichia coli）などのエシェリキア属（Escherichia属）；クロストリジウム・ルジュングダーリ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）もしくはクロストリジウム・クライベリ（Clostridium kluyveri）などのクロストリジウム属（Clostridia属）；コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）などのコリネバクテリウム属（Corynebacteria属）；カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）もしくはカプリアビダス・メタリデュランス（Cupriavidus metallidurans）などのカプリアビダス属（Cupriavidus属）；シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）もしくはシュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleavorans）などのシュードモナス属（Pseudomonas属）；デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）などのデルフチア属（Delftia属）；バシラス・サブティリス（Bacillus subtillis）などのバシラス属（Bacillus属）；デルブリュッキ菌（Lactobacillus delbrueckii）などのラクトバシラス属（Lactobacillus属）；またはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）などのラクトコッカス属（Lactococcus属）のいずれかに由来する原核生物である、請求項119に記載の方法。
【請求項１２１】
前記宿主微生物が、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などのアスペルギルス属（Aspergillus属）；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などのサッカロマイセス属（Saccharomyces属）；ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などのピキア属（Pichia属）；ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）などのヤロウイア属（Yarrowia属）；イサタケンキア・オリエンタリス（Issathenkia orientalis）などのイサタケンキア属（Issatchenkia属）；デバリオマイセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）などのデバリオマイセス属（Debaryomyces属）；アークスラ・アデニニボランス（Arxula adenoinivorans）などのアークスラ属（Arxula属）；またはクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）などのクルイベロミセス属（Kluyveromyces属）のいずれかに由来する真核生物である、請求項119に記載の方法。
【請求項１２２】
プロピオニルCoAおよびアセチルCoAの加水分解を触媒する酵素が、前記宿主生物中で減弱されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１２３】
メチルクエン酸回路を介してプロパノイルCoAを消費する酵素が、前記宿主生物中で減弱されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１２４】
プロパノイルCoAを消費してピルビン酸にする酵素が、前記宿主生物中で減弱されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１２５】
プロパノイルCoAを消費してマロニルCoAにする酵素が、前記宿主生物中で減弱されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１２６】
フィードバック耐性トレオニンデアミナーゼが、前記宿主生物中に遺伝子操作により組み込まれている、請求項119に記載の方法。
【請求項１２７】
アセチルCoAを縮合させてアセトアセチルCoAにするのを触媒するβ-ケトチオラーゼ、たとえばAtoBまたはphaAの遺伝子産物が減弱されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１２８】
ポリヒドロキシアルカノアート類を自然に蓄積する宿主株中のポリマーシンターゼ酵素が減弱されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１２９】
ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子、たとえばptaが減弱されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１３０】
プロパン酸を分解する酢酸キナーゼをコードする遺伝子、たとえばackが減弱されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１３１】
ピルビン酸の乳酸への分解をコードする遺伝子が減弱されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１３２】
ホスホエノールピルビン酸のコハク酸への分解をコードする遺伝子、たとえばfrdBCが減弱されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１３３】
アセチルCoAのエタノールへの分解をコードする遺伝子、たとえばadhEが減弱されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１３４】
クエン酸回路中間体を補充する補充反応を触媒する酵素が増幅されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１３５】
ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子、たとえばUdhAが、前記宿主生物中で過剰発現されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１３６】
グリセルアルデヒド-3P-デヒドロゲナーゼ遺伝子、たとえばGapNが、前記宿主生物中で過剰発現されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１３７】
リンゴ酸酵素遺伝子、たとえばmaeAまたはmaeBが、前記宿主生物中で過剰発現されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１３８】
グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、たとえばzwfが、前記宿主生物中で過剰発現されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１３９】
フルクトース-1,6-ジホスファターゼ遺伝子、たとえばfbpが、前記宿主生物中で過剰発現されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１４０】
ブタジエンが細胞膜を横切って細胞外培地へと流出することが、細胞膜への構造的修飾を遺伝子操作することによって、増強または増大されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１４１】
ブタジエンが細胞膜を横切って細胞外培地へと流出することが、ブタジエンについての任意の関連するトランスポーター活性の増大を遺伝子操作することによって、増強または増大されている、請求項119に記載の方法。
ブタジエンを、1,2-エポキシ-3-ブテンおよび1,2:3,4-ジエポキシブタンなどの毒性中間体へと分解するオキシゲナーゼが、前記宿主生物中で減弱されている、請求項119に記載の方法。
【請求項１４２】
前記チオエステラーゼがtesBの遺伝子産物である、請求項38、84、92または95に記載の方法。
【請求項１４３】
前記アセトアセチルCoAレダクターゼがphaBの遺伝子産物である、請求項39、55または93に記載の方法。
【請求項１４４】
前記アセチルCoA C-アシルトランスフェラーゼがBktBの遺伝子産物である、請求項40または56に記載の方法。
【請求項１４５】
前記エノイルCoAヒドラターゼがphaJの遺伝子産物である、請求項44または54に記載の方法。
【請求項１４６】
前記デサチュラーゼがMdpJの遺伝子産物である、請求項37または45に記載の方法。
【請求項１４７】
前記シトクロムP450がCYP4ファミリーの遺伝子産物である、請求項37または45に記載の方法。
【請求項１４８】
前記β-ケトアシル-[acp]シンターゼIがtcsBの遺伝子産物である、請求項52に記載の方法。
【請求項１４９】
前記アシルトランスフェラーゼがtcsAの遺伝子産物である、請求項52に記載の方法。
【請求項１５０】
3-ブテン-2-オールをリナロールデヒドラターゼと接触させる工程を含み、ここで1,3-ブタジエンが生成される、ブテノールをブタジエンに変換する方法。
【請求項１５１】
前記リナロールデヒドラターゼがEC 4.2.1.127に分類される、請求項150に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2012年11月30日に出願された国際出願PCT/US2012/067463号の優先権を主張し、同出願は、2011年12月2日に出願された米国出願第61/566,085号および2012年10月17日に出願された米国出願第61/714,883号ならびに2012年6月15日に出願された国際出願PCT/US2012/042757号の優先権を主張し、後者出願は、2102年10月17日に出願された米国仮出願第61/714,883号、2011年12月2日に出願された米国仮出願第61/566,085号および2011年6月17日に出願された米国仮出願第61/498,408号の恩典を主張する。これらはすべて参照により全体として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、1,3-ブタジエンを生合成する方法に関し、より具体的には、1つまたは複数の単離された酵素（たとえばデヒドロゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、デサチュラーゼ、デヒドラターゼおよびデカルボキシラーゼ）を用いるか、またはそれらの酵素の1つまたは複数を発現する組換え宿主細胞を用いて、1,3-ブタジエンを生合成する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
1,3-ブタジエン（以下、ブタジエン）は、スチレン・ブタジエンゴム（SBR）、ポリブタジエン（PB）、スチレン・ブタジエンラテックス（SBL）、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン樹脂（ABS）、ニトリルゴム、および（ナイロン66の生成に用いられる）アジポニトリルを含む合成ゴムの生成に重要なモノマーである（White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14（非特許文献1））。
【０００４】
ブタジエンは一般に、水蒸気分解法からの副産物として生成され、粗ブタジエン流へと蒸留され、抽出蒸留によって精製される（White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14（非特許文献1））。
【０００５】
オンパーパスでは、ブタジエンは、とりわけ、n-ブタンおよびn-ブテンの脱水素化（Houdry法）ならびにn-ブテンの酸化的脱水素化（Oxo-DまたはO-X-D法）によって調製されてきた（White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14（非特許文献1））。
【０００６】
全世界のブタジエン生成の95％は、ナフサなどの石油化学ベースの供給原料を用いる水蒸気分解法によって実施されている。高い生成コストおよび低いプロセス収率を考慮すると、オンパーパスでのブタジエン生成は有意義ではない（White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14（非特許文献1））。石油供給原料への依存と、オンパーパスでのブタジエンの場合のエネルギー集約型の触媒工程とを考慮すると、バイオテクノロジーが、生体触媒作用による代替手法を提供する。生体触媒作用とは、有機化合物の生化学的転換を実施するための、酵素などの生物学的触媒の使用である。
【０００７】
したがって、この背景に照らすと、中間体（具体的にはブタジエン）を生成するための、生体触媒ベースの持続可能な方法が必要であることは明らかである（Jang et al., Biotechnology & Bioengineering, 2012, 109(10), 2437-2459（非特許文献2））。
【０００８】
生体由来供給原料および石油化学的供給原料の両方が、生体触媒法に実用可能な出発原料である。
【０００９】
中炭素鎖長の酵素基質中に2つのビニル基を生成することが、生体触媒法によるブタジエン合成における主要な考慮事項である。
【００１０】
原核生物または真核生物におけるブタジエンの合成に通じる酵素経路は知られていない。バイオマス糖から1,3-ブタジエンを生成するための3つの潜在的経路が提案されている:（1）アセチルCoAからクロトニルCoAを経る経路、（2）エリスロース-4-ホスファートからの経路、ならびに（3）マロニルCoAおよびアセチルCoAとの縮合反応を経る経路。しかし、これらの戦略を用いる情報は報告されていない（Jang et al., Biotechnology & Bioengineering, 2012, 109(10), 2437-2459（非特許文献2））。
【００１１】
原核生物または真核生物によって合成される最も近い類似化合物は、短い5炭素鎖長および2つのビニル基を考慮すると、2-メチル-1,3-ブタジエン（イソプレン）である。イソプレンは、前駆体ジメチルビニルPPに通じる2つのルート、すなわちメバロン酸経路および非メバロン酸経路を介して合成され得る（Kuzuyama, Biosci. Biotechnol. Biochem., 2002, 66(8), 1619-1627（非特許文献3））。
【００１２】
メバロン酸経路は、イソプレンに通じる前駆体中に第一のビニル基を生成するデカルボキシラーゼ酵素であるメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（以下、MDD）を含む（Kuzuyama, Biosci. Biotechnol. Biochem., 2002, 66(8), 1619-1627（非特許文献3））。
【００１３】
したがって、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.33）は、非天然基質からのブタジエンの合成における候補酵素として注目され得る。
【００１４】
天然基質メバロン酸二リン酸と関連する3-メチル基の役割を解明する中で、図12（a）に示す3-ヒドロキシ-5-ジホスファートペンタン酸の代謝回転数kcatが、天然基質の公称値8.33±1[s-1]に対して劇的に低い0.23±0.05[s-1]であることが実証されている（Dhe-Paganon et al., Biochemistry, 1994, 33, 13355-13362（非特許文献4））。加えて、基質との反応は、3-ヒドロキシル基のリン酸化までしか進行せず、すなわち、脱炭酸生成物は検出されず、脱炭酸速度が天然基質に比べて少なくとも300倍低下することを暗示した。結論として、3-メチル基は、カルボカチオン遷移状態を安定化するのに不可欠であるとみなされた（Dhe-Paganon et al., Biochemistry, 1994, 33, 13355-13362（非特許文献4））。
【００１５】
サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のMDD酵素は、カルボカチオン遷移状態を安定化する3-メチル基を含む3-ヒドロキシ-3-メチル酪酸を、イソブテンへと変換される基質として受容する（図12（b））ことが実証されている。しかし、その比活性は、天然基質の場合の活性である6.4[μmol/（min・mg）]に対して劇的に低い4.8・10-6[μmol/（min・mg）]である（Gogerty & Bobik, Applied & Environmental Microbiology, 2010, 76(24), 8004-8010（非特許文献5））。
【００１６】
触媒クレフトの周辺のセリン残基およびアルギニン残基と、天然基質であるメバロン酸二リン酸のピロリン酸基との重要な基質結合相互作用が解明されている。したがって、触媒クレフト内の正しい基質配向が酵素活性にとって重要であり、それが、3-ヒドロキシ-3-メチル酪酸を基質として受容する（図14（b））ときのMDDの低い活性の妥当な説明となる（Barta et al., Biochemistry, 2012, 51, 5611-5621（非特許文献6））。
【００１７】
MDDの活性を支える上での天然基質と関連する3-メチル基およびピロリン酸基の重要性は、これらの重要な基を含まない非天然前駆体からのブタジエンの合成においてはMDDを用いないように教示する。
【００１８】
酵素イソプレンシンターゼ（以下、ISPS）が、イソプレン合成の最終前駆体であるジメチルビニル-PP中に第二のビニル基を生成する。
【００１９】
したがって、イソプレンシンターゼ（EC 4.2.3.27）は、非天然基質からのブタジエンの合成における候補酵素として注目され得る。
【００２０】
MDDと同様に、天然基質であるジメチルビニル-PPと関連した3-メチル基は、過渡的中間体として仮定されているカルボカチオンを安定化するのに重要な役割を果たす（Silver & Fall, J. Biol. Chem., 1995, 270(22), 13010-13016（非特許文献7）; Kuzma et al., Current Microbiology, 1995, 30, 97-103（非特許文献8））。
【００２１】
ISPSの活性を支える中での3-メチル基の重要性は、3-メチル基を含まない非天然前駆体からのブタジエンの合成においてはISPSを用いないように教示する。
【００２２】
MDDおよびISPSに加えて、微生物は、一般にはデヒドラターゼ、アンモニアリアーゼ、デサチュラーゼまたはデカルボキシラーゼ活性を介して、代謝産物中にビニル基を生成できる。しかし、これらの酵素活性が末端ビニル基の形成を触媒することはまれである。デヒドラターゼおよびアンモニアリアーゼは一般に、活性化された水素原子を有する脂肪酸類似体または芳香環が電子求引基として働く芳香族化合物を受容する。デサチュラーゼは脂肪酸合成において支配的に作用して、長鎖脂肪酸に沿って一定の非末端位置に不飽和結合を生成する。他方、末端カルボキシル基に作用するデカルボキシラーゼは一般に、触媒作用後、関連するα官能基を末端位置に残す。したがって、これらの酵素の関連する酵素活性は、ブタジエンの合成に通じる短鎖または中鎖炭素代謝産物中の末端ビニル基の生成のためには当該酵素を用いないように教示する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14
【非特許文献２】Jang et al., Biotechnology & Bioengineering, 2012, 109(10), 2437-2459
【非特許文献３】Kuzuyama, Biosci. Biotechnol. Biochem., 2002, 66(8), 1619-1627
【非特許文献４】Dhe-Paganon et al., Biochemistry, 1994, 33, 13355-13362
【非特許文献５】Gogerty & Bobik, Applied & Environmental Microbiology, 2010, 76(24), 8004-8010
【非特許文献６】Barta et al., Biochemistry, 2012, 51, 5611-5621
【非特許文献７】Silver & Fall, J. Biol. Chem., 1995, 270(22), 13010-13016
【非特許文献８】Kuzma et al., Current Microbiology, 1995, 30, 97-103
【発明の概要】
【００２４】
概要
本明細書は、ブタジエンの合成に通じる、2つのビニル基を形成できる、中鎖炭素代謝産物を生成するための生化学的経路を構築可能であるという発見に少なくとも部分的に基づく。本明細書に記載されるこれらの経路は、最終的な酵素的工程に関して、MDD、ISPSおよびデヒドラターゼなどの酵素に依存する。
【００２５】
本発明者らの驚くべき発見の前には、ブタジエン合成のための、中鎖炭素代謝産物中に2つの末端ビニル基を形成できる酵素が存在すること、またはそれを生成できることは知られていなかった。
【００２６】
したがって、1つの局面において、本明細書は、ブタジエン合成の基質をブタジエンに変換できる酵素を提供する。本明細書において用いられる用語「ブタジエン合成の基質」とは、1,3-ブタジエンを直接もたらすか、または、1つもしくは複数の酵素触媒反応ののちに1,3-ブタジエンに変換される生成物をもたらす反応を酵素が触媒できる基質をいう。
【００２７】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第一のビニル基が、4-オキサロクロトナート、2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド、または2-ヒドロキシ-6-オキソノナ-2,4-ジエン-1,9-二酸中に酵素的に形成されて、2-オキソペンタ-4-エノアートが生成される。図2を参照のこと。
【００２８】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第一のビニル基が、プロパノイルCoA、ラクトイルCoA、または3-ヒドロキシプロピオニルCoA中に酵素的に形成されて、プロペノイルCoAが生成される。図3を参照のこと。
【００２９】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第一のビニル基が、（R）3-ヒドロキシペンタン酸中に酵素的に形成されて、3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートが生成される。図4を参照のこと。
【００３０】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第一のビニル基が、ペンタ-2-エノイル-[acp]中に酵素的に形成されて、2,4-ペンタジエノイル-[acp]が生成される。図5を参照のこと。
【００３１】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第一のビニル基が、5-ヒドロキシペンタノイルCoA（中間体として5-ヒドロキシ-ペンタ-2-エノイルCoAを経る）またはペンタ-3-エノイルCoA中に酵素的に形成されて、2,4-ペンタジエノイルCoAが生成される。図6を参照のこと。
【００３２】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第一のビニル基が、4-ヒドロキシブチリルCoA、（R）3-ヒドロキシブタノイルCoA、またはグルタコニルCoA中に酵素的に形成されて、クロトニルCoAが生成される。図7を参照のこと。
【００３３】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第一のビニル基が、2-ブタノール中に酵素的に形成されて、3-ブテン-2-オールが生成される。図8を参照のこと。
【００３４】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第二のビニル基は、EC 4.1.1.33に分類される酵素であるメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（MDD）によって形成される（図9）。たとえば、2-ヒドロキシペンタ-4-エノアートを複数種の酵素によって連続的に変換し、脱炭酸による最後の酵素的変換にてブタジエンを直接生成する（図1、反応X）。
【００３５】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第二のビニル基は、EC 4.2.3.27に分類される酵素であるイソプレンシンターゼ（ISPS）によって形成される（図10）。たとえば、活性化ブテノール類（二リン酸エステル類）をブテノール類からの1種または複数種の酵素によって生成し（図1、反応II）、脱リン酸による最後の酵素的変換にてブタジエンを直接生成し得る（図1、反応III）。
【００３６】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第二のビニル基は、EC 4.2.1.-に分類されるデヒドラターゼ（たとえばリナロールデヒドラターゼ（EC 4.2.1.127）、キエビトンヒドラターゼ（EC 4.2.1.95）、オレイン酸ヒドラターゼ（EC 4.2.1.53）およびカロテノイド1,2-ヒドラターゼ（EC 4.2.1.131））によって形成される（図11）。このようなデヒドラターゼは、ブテノール類などのヒドロキシル化された基質を受容する。たとえば、ブテノール類は、ブタンジオール類、ブタノール類、ブテン類、ブテナール類またはC5アルケノール類から、デヒドラターゼ、ヒドラターゼ、デサチュラーゼ、デヒドロゲナーゼまたはデカルボキシラーゼ活性により、1つまたは複数の酵素的工程にて生成され（図1、反応IV、V、VI、VII、IX）、脱水による最後の酵素的変換にてブタジエンを直接生成し得る（図1、反応I）。ブテノール類は、たとえば、1-ブテン-1-オール、2-ブテン-1-オール、および3-ブテン-2-オールを含む（図1を参照）。
【００３７】
たとえば、本明細書は、ブテノール類をブタジエンに変換する酵素を提供する。この変換は、1種の酵素によって実施されてもよいし、または順次に作用する2種以上の酵素によって実施されてもよい（すなわち、たとえば、第一の酵素が4炭素分子に作用して第一のブテノールを生成したのち、その第一のブテノールが第二の酵素による作用を受けてブタジエンを生成する）（たとえば図1、反応Iを参照）。
【００３８】
本明細書はまた、少なくとも1つの生体触媒工程を含む、ヒドロキシル化された不飽和4炭素分子からブタジエンを生成する方法を提供する。たとえば、ブテノールは、対応するブテノール二リン酸エステルに活性化されたのち、ブタジエンに変換されることができる（たとえば図1、反応IIおよびIIIを参照）。いくつかの態様において、ブテノールは、1-ブテン-2-オール、1-ブテン-3-オール、1-ブテン-4-オール、2-ブテン-1-オール、2-ブテン-2-オール、2-ブテン-3-オール、または2-ブテン-4-オールからなる群より選択される。1-ブテン-1-オール、1-ブテン-2-オール、2-ブテン-2-オール、および2-ブテン-3-オールなどのブテノールの場合、ブテノールは、1-ブタナールまたは2-ブタノンなどの、対応するケトンまたはアルデヒドのエノラートとしてインサイチューで生成できる。
【００３９】
いくつかの態様において、ブテノールは、ブタンジオール（1,4-ブタンジオール、1,3-ブタンジオール、2,3-ブタンジオール）（図1、反応IV）またはブタノール（1-ブタノールまたは2-ブタノール）（図1、反応V）またはブテン（1-ブテンまたは2-ブテン）（図1、反応VI）またはブテナール（たとえば1-ブテナールもしくは2-ブテナール）もしくは2-ケト-ブタ-1-エン（図1、反応VII）からなる群より選択される4炭素分子から酵素の作用によって生成される。
【００４０】
酵素によって実施される反応は、正味の脱水（すなわち、デヒドラターゼ活性を有する酵素による分子からのH2Oの除去、反応IV）、デサチュラーゼ活性を有する酵素または酵素複合体による脱水素（すなわち、酵素によって触媒される反応が分子の炭素主鎖の脱飽和を生じさせる、分子からの水素の除去、反応V）、ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素、たとえばアルケンモノオキシゲナーゼまたはシトクロムP450またはω-ヒドロキシラーゼによるヒドロキシル化（すなわち、水素からヒドロキシル基への置換、反応VI）、あるいはブテナール類またはC4不飽和ケトン類をブテノール類に変換するためのオキシドレダクターゼ/ケトンレダクターゼによる還元であってもよい。脱水工程に関して、酵素は、ブテノールのブタジエンへの脱水に用いられる酵素クラスと同じ酵素クラスであってもよいし、別の酵素クラスであってもよい。ブテノール類中の二重結合の移動がイソメラーゼによって触媒され得る。
【００４１】
本明細書はまた、ブタンジオール類をブテノールに変換する酵素クラス4.2.1.-からの酵素を提供する（図1、反応VIII）。
【００４２】
いくつかの態様において、ブテノール（たとえば1-ブテン-4-オール）は、2-ヒドロキシペンタ-4-エノアートなどの5炭素分子からデカルボキシラーゼ（たとえばEC 4.1.1.-のデカルボキシラーゼ）の作用によって生成される（図1、反応IX）。2-ヒドロキシペンタ-4-エノアートはまた、デカルボキシラーゼまたはGHMPキナーゼにより、中間体ブテノールを形成せずに直接ブタジエンに変換され得る（図1、反応X）。
【００４３】
いくつかの態様において、ブテノールは、1-ブテン-2-オール、1-ブテン-3-オール、1-ブテン-4-オール、2-ブテン-1-オール、2-ブテン-2-オール、2-ブテン-3-オールまたは2-ブテン-4-オールからなる群より選択される。1-ブテン-2-オール、2-ブテン-2-オールおよび2-ブテン-3-オールなどのブテノールの場合、ブテノールは、1-ブタナールまたは2-ブタノンなどの、対応するケトンまたはアルデヒドのエノラートとしてインサイチューで生成できる。
【００４４】
1つの局面において、本明細書はブタジエンの生合成法に焦点を当てる。当該方法は、ブタジエン合成の基質中に2つの末端ビニル基を形成する工程を含む。ブタジエン合成の基質中に第一のビニル基が酵素的に形成されて、2-オキソペンタ-4-エノアート、プロペニルCoA、（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノアート、2,4-ペンタジエノイル-[acp]、2,4-ペンタジエノイルCoA、クロトニルCoA、および3-ブテン-2-オールからなる群より選択される化合物が生成され得る。
【００４５】
1つの局面において、2-オキソペンタ-4-エノアートは、第一のビニル基を、（i）EC 4.1.1.77に分類される4-オキサロクロトナートデカルボキシラーゼを用いて4-オキサロクロトナート中に形成するか、（ii）EC 3.7.1.9に分類される2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドヒドロラーゼを用いて2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド中に形成するか、または（iii）EC 3.7.1.14に分類される2-ヒドロキシ-6-オキソノナ-2,4-ジエン二酸ヒドロラーゼを用いて2-ヒドロキシ-6-オキソノナ-2,4-ジエン-1,9-二酸中に形成することによって生成できる。2-オキソペンタ-4-エノアートは、EC 1.2.1.32に分類される2-アミノムコン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いて2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドを2-ヒドロキシムコン酸に変換し、EC 5.3.2.6に分類される2-ヒドロキシムコン酸タウトメラーゼを用いて2-ヒドロキシムコン酸を4-オキサロクロトナートに変換し、EC 4.1.1.77に分類される4-オキサロクロトナートデカルボキシラーゼを用いて4-オキサロクロトナートを2-オキソペンタ-4-エノアートに変換することによって生成できる。2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドは、EC 1.13.11.2に分類されるカテコール2,3-ジオキシゲナーゼを用いてカテコールを2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドに変換することによって生成できる。カテコールは、EC 1.14.12.1に分類されるアントラニル酸1,2-ジオキシゲナーゼを用いてアントラニル酸を変換するか、またはEC 4.1.1.63に分類されるプロトカテク酸デカルボキシラーゼを用いてプロトカテク酸を変換することによって生成される。アントラニル酸は、EC 4.1.3.27に分類されるアントラニル酸シンターゼを用いてコリスミン酸を変換することによって生成できる。プロトカテク酸は、EC 4.2.1.118に分類される3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼを用いて3-デヒドロシキミ酸を変換することによって生成できる。
【００４６】
1つの局面において、2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドは、5-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデカルボキシラーゼ（たとえばpraHによってコードされる5-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデカルボキシラーゼ）を用いて5-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドを変換することによって生成できる。5-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドは、プロトカテク酸2,3-ジオキシゲナーゼ（たとえばpraAによってコードされるプロトカテク酸2,3-ジオキシゲナーゼ）を用いてプロトカテク酸を変換することによって生成できる。2-ヒドロキシ-6-オキソノナ-2,4-ジエン-1,9-二酸は、EC 1.13.11.16に分類される3-カルボキシエチルカテコール2,3-ジオキシゲナーゼを用いて2,3-ジヒドロキシフェニルプロピオン酸を変換することによって生成できる。2,3-ジヒドロキシフェニルプロピオン酸は、EC 1.3.1.87に分類される3-（シス-5,6-ジヒドロキシシクロヘキサ-1,3-ジエン-1-イル）プロパン酸デヒドロゲナーゼを用いてシス-3-（カルボキシエチル）-3,5-シクロヘキサジエン-1,2-ジオールを変換することによって生成できる。シス-3-（カルボキシエチル）-3,5-シクロヘキサジエン-1,2-ジオールは、EC 1.14.12.19に分類される3-フェニルプロパン酸ジオキシゲナーゼを用いて3-フェニルプロピオン酸を変換することによって生成できる。3-フェニルプロピオン酸は、EC 1.3.1.31に分類される2-エン酸レダクターゼを用いてE-桂皮酸を変換することによって生成できる。E-桂皮酸は、EC 4.3.1.24に分類されるフェニルアラニンアンモニアリアーゼを用いてL-フェニルアラニンを変換することによって生成できる。
【００４７】
1つの局面において、ブタジエン合成の基質はプロパノイルCoAであってもよい。プロペノイルCoAは、第一のビニル基を、（i）EC 1.3.8.1に分類されるブチリルCoAデヒドロゲナーゼまたはEC 1.3.8.7に分類される中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼを用いてプロパノイルCoA中に形成するか、（ii）EC 4.2.1.54に分類されるラクトイルCoAデヒドラターゼを用いてラクトイルCoA中に形成するか、または（iii）EC 4.2.1.116に分類される3-ヒドロキシプロピオニルCoAデヒドラターゼを用いて3-ヒドロキシプロピオニルCoA中に形成することによって生成できる。プロパノイルCoAは、EC 2.1.3.1に分類されるメチルマロニルCoAカルボキシトランスフェラーゼまたはEC 4.1.1.41に分類されるメチルマロニルCoAデカルボキシラーゼを用いて（2S）-メチルマロニルCoAを変換することによって生成できる。（2S）-メチルマロニルCoAは、EC 5.1.99.1に分類されるメチルマロニルCoAエピメラーゼを用いて（2R）-メチルマロニルCoAを変換することによって生成できる。（2R）-メチルマロニルCoAは、EC 5.4.99.2に分類されるメチルマロニルCoAムターゼを用いてスクシニルCoAを変換することによって生成できる。
【００４８】
プロパノイルCoAは、EC 2.3.1.-に分類される2-ケト酪酸ギ酸リアーゼ（たとえばtdcEによってコードされる2-ケト酪酸ギ酸リアーゼ）を用いて2-オキソ酪酸を変換することによって生成できる。2-オキソ酪酸は、EC 4.3.1.19に分類されるトレオニンアンモニアリアーゼを用いてL-トレオニンを変換することによって生成できる。
【００４９】
プロパノイルCoAは、プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ（たとえばpduPによってコードされるプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ）を用いてプロパノールを変換することによって生成できる。プロパノールは、EC 4.2.1.28に分類されるプロパンジオールデヒドラターゼを用いて1,2-プロパンジオールを変換することによって生成できる。
【００５０】
プロパノイルCoAは、EC 2.3.1.-に分類されるトランスフェラーゼを用いてレブリニルCoAを変換することによってレブリン酸から生成できる。レブリニルCoAは、EC 6.2.1.-に分類されるアシルCoAシンテターゼまたはリガーゼを用いてレブリン酸を変換することによって生成できる。
【００５１】
ラクトイルCoAは、EC 2.8.3.1に分類されるプロピオン酸CoAトランスフェラーゼを用いてL-乳酸を変換することによって生成できる。L-乳酸は、EC 1.1.1.27に分類されるL-乳酸デヒドロゲナーゼを用いてピルビン酸を変換することによって生成できる。
【００５２】
3-ヒドロキシプロピオニルCoAは、EC 3.1.2.4に分類される3-ヒドロキシイソブチリルCoAヒドロラーゼを用いて3-ヒドロキシプロピオン酸を変換することによって、またはEC 1.1.1.59に分類される3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼを用いてマロン酸セミアルデヒドを変換することによって生成できる。マロン酸セミアルデヒドは、EC 1.2.1.75に分類されるマロニルCoAレダクターゼを用いてマロニルCoAを変換することによって生成される。
【００５３】
プロパノイルCoAは、EC 1.3.8.1に分類されるブチリルCoAデヒドロゲナーゼまたはEC 1.3.8.7に分類される中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼを用いてプロペノイルCoAを変換することによって生成できる。
【００５４】
（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートプロペノイルCoAは、デサチュラーゼ/モノオキシゲナーゼまたはシトクロムP450を用いて（R）3-ヒドロキシペンタン酸中に第一のビニルを形成することによって生成できる。（R）3-ヒドロキシペンタン酸は、EC 3.1.2.-に分類されるチオエステラーゼを用いて（R）3-ヒドロキシペンタノイルCoAを変換することによって生成できる。（R）3-ヒドロキシペンタノイルCoAは、EC 1.1.1.36に分類されるアセトアセチルCoAレダクターゼを用いて3-オキソペンタノイルCoAを変換することによって生成できる。3-オキソペンタノイルCoAは、EC 2.3.1.16に分類されるアセチルCoA C-アシルトランスフェラーゼを用いてプロパノイルCoAを変換することによって生成できる。
【００５５】
2,4-ペンタジエノイル-[acp]は、アシル-[acp]デヒドロゲナーゼを用いてペンタ-2-エノイル-acp中に第一のビニル基を形成することによって生成できる。2,4-ペンタジエノイルCoAは、第一のビニル基を、（i）EC 4.2.1.-に分類される5-ヒドロキシバレリルCoAデヒドラターゼを用いて5-ヒドロキシペンタノイルCoA中に形成するか、または（ii）EC 1.3.1.34に分類される2,4-ジエノイル補酵素Aレダクターゼを用いてペンタ-3-エノイルCoA中に形成することによって生成できる。5-ヒドロキシバレリルCoAデヒドラターゼはクロストリジウム・ビリデ（Clostridium viride）に由来し得る。
【００５６】
クロトニルCoAは、第一のビニル基を、（i）EC 4.1.1.70に分類されるグルタコニルCoAデカルボキシラーゼを用いてグルタコニルCoA中に形成するか、（ii）EC 4.2.1.120に分類される4-ヒドロキシブタノイルCoAデヒドラターゼおよびEC 5.3.3.3に分類されるビニルアセチルCoAイソメラーゼを用いて4-ヒドロキシブチリルCoA中に形成するか、または（iii）EC 4.2.1.119に分類されるエノイルCoAヒドラターゼを用いて（R）3-ヒドロキシブタノイルCoA中に形成することによって生成できる。
【００５７】
3-ブテン-2-オールは、デサチュラーゼまたはモノオキシゲナーゼを用いて2-ブタノール中に第一のビニル基を形成することによって生成できる。
【００５８】
第二のビニル基は、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（MDD）によって、（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノアート中に酵素的に形成される。MDDはEC 4.1.1.33に分類されることができる。MDDは、触媒クレフトの触媒アルギニン残基の両側5残基の範囲内に最低4つのセリン残基を含むことができる。MDDはレンサ球菌属（Streptococcus属）またはブドウ球菌属（Staphylococcus属）由来であってもよい。
【００５９】
第二のビニル基は、2-ブテン-1-オールジホスファートまたは3-ブテン-2-オールジホスファート中に、イソプレンシンターゼ（ISPS）によって酵素的に形成されることができる。第二のビニル基は、3-ブテン-2-オールまたは2-ブテン-1-オール中に、酵素クラスEC 4.2.1.-のデヒドラターゼ（たとえばリナロールデヒドラターゼ（EC 4.2.1.127）、キエビトンヒドラーゼ（EC 4.2.1.95）、オレイン酸ヒドラターゼ（EC 4.2.1.53）またはカロテノイド1,2-ヒドラターゼ（EC 4.2.1.131））によって酵素的に形成されることができる。
【００６０】
ペンタ-2-エノイル-[acp]は、EC 4.2.1.59に分類される3-ヒドロキシアシル-[acp]デヒドラターゼを用いて（R）3-ヒドロキシペンタノイル-[acp]を変換することによって生成できる。（R）3-ヒドロキシペンタノイル-[acp]は、EC 1.1.1.100に分類される3-オキソアシル-[acp]レダクターゼを用いて3-オキソペンタノイル-[acp]を変換することによって生成できる。
【００６１】
3-オキソペンタノイル-[acp]は、EC 2.3.1.41に分類されるβ-ケトアシル-[acp]シンターゼIおよびアシルトランスフェラーゼ（たとえばtcsA）を用いてプロパノイルCoAを変換することによって生成できる。
【００６２】
ペンタ-2-エノイル-[acp]は、アシルトランスフェラーゼを用いてペンタ-2-エノイルCoAを変換することによって生成できる。ペンタ-2-エノイルCoAは、EC 4.2.1.119に分類されるエノイルCoAヒドラターゼを用いて（R）3-ヒドロキシペンタノイルCoAを変換することによって生成できる。（R）3-ヒドロキシペンタノイルCoAは、EC 1.1.1.36に分類されるアセトアセチルCoAレダクターゼを用いて3-オキソペンタノイルCoAを変換することによって生成できる。
【００６３】
3-オキソペンタノイルCoAは、EC 2.3.1.16に分類されるアセチルCoA C-アシルトランスフェラーゼを用いてプロパノイルCoAを変換することによって生成できる。
【００６４】
ペンタ-3-エノイルCoAは、EC 5.3.3.8に分類されるイソメラーゼを用いてペンタ-2-エノイルCoAを変換することによって生成できる。
【００６５】
5-ヒドロキシペンタノイルCoAは、（i）EC 2.8.3.14に分類される5-ヒドロキシペンタン酸CoAトランスフェラーゼを用いて5-ヒドロキシペンタン酸を変換するか、または（ii）シトクロムP450（たとえばCYP153A6の遺伝子産物）を用いてペンタノイルCoAを変換するかのいずれかによって生成できる。5-ヒドロキシペンタン酸は、5-ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼ、たとえばcpnDの遺伝子産物またはクロストリジウム・ビリデ由来のデヒドロゲナーゼを用いて5-オキソペンタン酸を変換することによって生成できる。5-オキソペンタン酸は、EC 2.6.1.48に分類される5-アミノ吉草酸トランスアミナーゼを用いて5-アミノ吉草酸を変換することによって生成できる。5-アミノ吉草酸は、EC 1.21.4.1に分類されるD-プロリンレダクターゼを用いてD-プロリンを変換することによって生成できる。D-プロリンは、EC 5.1.1.4に分類されるプロリンラセマーゼを用いてL-プロリンを変換することによって生成できる。L-プロリンは、EC 1.5.1.2に分類されるピロリン-5-カルボン酸レダクターゼを用いて（S）-1-ピロリン-5-カルボン酸を変換することによって生成できる。（S）-1-ピロリン-5-カルボン酸は、L-グルタミン酸5-セミアルデヒドの自発的変換によって生成できる。L-グルタミン酸5-セミアルデヒドは、EC 1.2.1.41に分類されるグルタミン酸-5-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いてL-グルタミル-5-リン酸を変換することによって生成できる。L-グルタミル-5-リン酸は、EC 2.7.2.11に分類されるグルタミン酸5-キナーゼを用いてL-グルタミン酸を変換することによって生成できる。
【００６６】
ペンタノイルCoAは、EC 1.3.1.38に分類されるトランス-2-エノイルCoAレダクターゼを用いてペンタ-2-エノイルCoAを変換することによって生成できる。
【００６７】
グルタコニルCoAは、EC 4.2.1.-に分類されるデヒドラターゼを用いて2-ヒドロキシグルタリルCoAを変換することによって生成できる。2-ヒドロキシグルタリルCoAは、EC 2.8.3.12に分類されるグルタコン酸CoAトランスフェラーゼを用いて2-ヒドロキシグルタル酸を変換することによって生成できる。2-ヒドロキシグルタル酸は、EC 1.1.99.2に分類される2-ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼを用いて2-オキソグルタル酸を変換することによって生成できる。3-ヒドロキシブタノイルCoAは、EC 1.1.1.36に分類される3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼを用いてアセトアセチルCoAを変換することによって生成できる。アセトアセチルCoAは、EC 2.3.1.9に分類されるアセチルCoA C-アセチルトランスフェラーゼを用いてアセチルCoAを変換することによって生成できる。
【００６８】
4-ヒドロキシブチリルCoAは、CoAトランスフェラーゼ（たとえばCk-cat2の遺伝子産物）を用いて4-ヒドロキシ酪酸を変換することによって生成できる。4-ヒドロキシ酪酸は、EC 1.1.1.61に分類される4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを用いてコハク酸セミアルデヒドを変換することによって生成できる。コハク酸セミアルデヒドは、EC 1.2.1.76に分類されるコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いてスクシニルCoAを変換することによって生成できる。
【００６９】
2-ブタノールは、EC 1.1.1.B4に分類される（R）特異的第二級アルコールデヒドロゲナーゼを用いてブタノンを変換することによって生成できる。ブタノンは、EC 4.2.1.28に分類されるプロパンジオールデヒドラターゼを用いて2,3-ブタンジオールを変換することによって生成できる。2,3-ブタンジオールは、EC 1.1.1.4に分類される（R,R）-ブタンジオールデヒドロゲナーゼを用いて（R）-アセトインを変換することによって生成できる。（R）-アセトインは、EC 4.1.1.5に分類されるアセト乳酸デカルボキシラーゼを用いて2-アセト乳酸を変換することによって生成できる。2-アセト乳酸は、EC 2.2.1.6に分類されるアセト乳酸シンターゼを用いてピルビン酸を変換することによって生成できる。（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートは、EC 3.1.2.-に分類されるチオエステラーゼを用いて3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAを変換することによって生成できる。3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAは、EC 4.2.1に分類されるエノイルCoAデヒドラターゼ2を用いて2,4-ペンタジエノイルCoAを変換することによって生成できる。2,4-ペンタジエノイルCoAは、2-ヒドロキシイソカプロイルCoAデヒドラターゼ（たとえばイニシエータHadIおよびHadBCの遺伝子産物）を用いて2-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAを変換することによって生成できる。2-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAは、CoAトランスフェラーゼ（たとえばGctABの遺伝子産物）を用いて2-ヒドロキシペンタ-4-エノアートを変換することによって生成できる。2-ヒドロキシペンタ-4-エノアートは、（R）-2-ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼ（たとえばクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）由来のLdhAの遺伝子産物）を用いて2-オキソペンタ-4-エノアートを変換することによって生成できる。
【００７０】
（R）-ヒドロキシペンタ-4-エノアートは、EC 3.1.2.-に分類されるチオエステラーゼを用いて（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAを変換することによって生成できる。（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAは、EC 1.1.1.36に分類されるアセトアセチルCoAレダクターゼを用いて3-オキソペンタ-4-エノイルCoAを変換することによって生成できる。3-オキソペンタ-4-エノイルCoAは、EC 2.3.1.16に分類されるβ-ケトチオラーゼを用いてプロペノイルCoAを変換することによって生成できる。（R）-ヒドロキシペンタ-4-エノアートは、EC 3.1.2.-に分類されるチオエステラーゼを用いて（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAを変換することによって生成できる。（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAは、（R）-3-ヒドロキシアシル-ACP:CoAトランスアシラーゼ（たとえばphaGの遺伝子産物）を用いて（R）-3-ヒドロキシペンタ-4-エノイル-[acp]を変換することによって生成できる。（R）-3-ヒドロキシペンタ-4-エノイル-[acp]は、EC 4.2.1.59に分類される3-ヒドロキシアシル-[アシルキャリヤータンパク質]デヒドラターゼを用いて2,4-ペンタジエノイル-[acp]を変換することによって生成できる。（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAは、EC 4.2.1.119に分類されるエノイルCoAデヒドラターゼ2を用いて2,4-ペンタジエノイルCoAを変換することによって生成できる。
【００７１】
2-ブテン-1-オールジホスファートは、EC 2.7.4.2に分類されるホスホメバロン酸キナーゼを用いて2-ブテン-1-オールホスファートを変換することによって生成でき、またはEC 2.7.6.-に分類されるジホスホキナーゼを用いて生成できる。2-ブテン-1-オールホスファートは、EC 2.7.1.36に分類されるメバロン酸キナーゼを用いて2-ブテン-1-オールを変換することによって生成できる。2-ブテン-1-オールは、EC 1.1.1.54に分類されるアリルアルコールデヒドロゲナーゼを用いて2-ブテン-1-アールを変換することによって生成できる。2-ブテン-1-アールは、EC 1.2.1.48に分類される長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼを用いてクロトン酸を変換することによって生成できる。クロトン酸は、EC 6.2.1.5に分類されるコハク酸CoAリガーゼを用いてクロトニルCoAを変換することによって生成できる。
【００７２】
2-ブテン-1-オールジホスファートは、EC 2.7.6.-に分類されるジホスホキナーゼ（たとえばEC 2.7.6.2に分類されるチアミンジホスホキナーゼ）を用いて2-ブテン-1-オールを変換することによって生成できる。
【００７３】
3-ブテン-2-オールジホスファートは、EC 2.7.6.-に分類されるジホスホキナーゼを用いて3-ブテン-2-オールを変換するか、またはEC 2.7.4.2に分類されるホスホメバロン酸キナーゼを用いて3-ブテン-2-オールホスファートを変換することによって生成できる。3-ブテン-2-オールホスファートは、EC 2.7.1.36に分類されるメバロン酸キナーゼを用いて3-ブテン-2-オールを変換することによって生成できる。
【００７４】
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、方法は、単離された酵素を用いて、酵素を含む細胞溶解物を用いて、または組換え宿主を用いて実施できる。組換え宿主は、嫌気的、微好気的、または好気的に培養されることができる。組換え宿主細胞は、発酵中に高い細胞密度を維持するためにセラミックの中空糸膜中に保持されることができる。発酵に供給される主な炭素源は生物学的または非生物学的供給原料に由来できる。たとえば、生物学的供給原料は、単糖類、二糖類、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、リグニン、たとえばレブリン酸およびフルフラール、リグニン、トリグリセリド類、たとえばグリセロールおよび脂肪酸、農業廃棄物または一般廃棄物であるかまたはそれらに由来する。非生物学的供給原料は、天然ガス、合成ガス、CO2/H2、メタノール、エタノール、シクロヘキサン酸化プロセスからの不揮発性残渣（NVR）または苛性洗浄液の廃液流であるかまたはそれらに由来する。
【００７５】
宿主微生物は、大腸菌（Escherichia coli）などのエシェリキア属（Escherichia属）の原核生物；クロストリジウム・ルジュングダーリ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）もしくはクロストリジウム・クライベリ（Clostridium kluyveri）などのクロストリジウム属（Clostridia属）の原核生物；コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）などのコリネバクテリウム属（Corynebacteria属）の原核生物；カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）もしくはカプリアビダス・メタリデュランス（Cupriavidus metallidurans）などのカプリアビダス属（Cupriavidus属）の原核生物；シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）もしくはシュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleavorans）などのシュードモナス属（Pseudomonas属）の原核生物；デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）などのデルフチア属（Delftia属）の原核生物；バシラス・サブティリス（Bacillus subtillis）などのバシラス属（Bacillus属）の原核生物；デルブリュッキ菌（Lactobacillus delbrueckii）などのラクトバシラス属（Lactobacillus属）の原核生物；またはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）などのラクトコッカス属（Lactococcus属）の原核生物であってもよい。宿主微生物は、アスペルギルス属（Aspergillus属）の真核生物、たとえばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）；サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属（Saccharomyces属）の真核生物；ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などのピキア属（Pichia属）の真核生物；ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）などのヤロウイア属（Yarrowia属）の真核生物；イサタケンキア・オリエンタリス（Issathenkia orientalis）などのイサタケンキア属（Issatchenkia属）の真核生物；デバリオマイセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）などのデバリオマイセス属（Debaryomyces属）の真核生物；アークスラ・アデニニボランス（Arxula adenoinivorans）などのアークスラ属（Arxula属）の真核生物；またはクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）などのクルイベロミセス属（Kluyveromyces属）の真核生物であってもよい。
【００７６】
本明細書に記載される組換え宿主において、プロピオニルCoAおよびアセチルCoAの加水分解を触媒する酵素が減弱されていてもよく、メチルクエン酸回路を介してプロパノイルCoAを消費する酵素が減弱されていてもよく、プロパノイルCoAを消費してピルビン酸にする酵素が減弱されていてもよく、プロパノイルCoAを消費してマロニルCoAにする酵素が減弱されていてもよく、フィードバック耐性トレオニンデアミナーゼが遺伝子操作により宿主生物中に組み込まれていてもよく、アセチルCoAを縮合させてアセトアセチルCoAにするのを触媒するβ-ケトチオラーゼ（たとえばAtoBまたはphaAの遺伝子産物）が減弱されていてもよく、ポリヒドロキシアルカノアート類を自然に蓄積する宿主株中のポリマーシンターゼ酵素が減弱されていてもよく、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子（たとえばpta）が減弱されていてもよく、プロパン酸を分解する酢酸キナーゼをコードする遺伝子（たとえばack）が減弱されており、ピルビン酸の乳酸への分解をコードする遺伝子が減弱されていてもよく、ホスホエノールピルビン酸のコハク酸への分解をコードする遺伝子（たとえばfrdBC）が減弱されており、アセチルCoAのエタノールへの分解をコードする遺伝子（たとえばadhE）が減弱されていてもよく、クエン酸回路中間体を補充する補充反応を触媒する酵素が増幅されていてもよく、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子（たとえばUdhA）が過剰発現されていてもよく、グリセルアルデヒド-3P-デヒドロゲナーゼ遺伝子（たとえばGapN）が宿主生物中で過剰発現されていてもよく、リンゴ酸酵素遺伝子（たとえばmaeAまたはmaeB）が宿主生物中で過剰発現されており、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（たとえばzwf）が宿主生物中で過剰発現されており、フルクトース-1,6-ジホスファターゼ遺伝子（たとえばfbp）が宿主生物中で過剰発現されており、ブタジエンが細胞膜を横切って細胞外培地へと流出することが、細胞膜への構造的修飾を遺伝子操作することによって増強もしくは増大されていてもよく、または、ブタジエンが細胞膜を横切って細胞外培地へと流出することが、ブタジエンの任意の関連するトランスポーター活性の増大を遺伝子操作することによって増強もしくは増大されており、ブタジエンを毒性中間体、たとえば1,2-エポキシ-3-ブテンおよび1,2:3,4-ジエポキシブタンへと分解するオキシゲナーゼが宿主生物中で減弱されている。
【００７７】
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、チオエステラーゼはtesBの遺伝子産物であってもよく、アセトアセチルCoAレダクターゼはphaBの遺伝子産物であってもよく、アセチルCoA C-アシルトランスフェラーゼはBktBの遺伝子産物であってもよく、エノイルCoAヒドラターゼはphaJの遺伝子産物であってもよく、デサチュラーゼはMdpJの遺伝子産物であってもよく、シトクロムP450はCYP4ファミリーの遺伝子産物であってもよく、β-ケトアシル-[acp]シンターゼIはtcsBの遺伝子産物であってもよく、アシルトランスフェラーゼはtcsAの遺伝子産物であってもよい。
【００７８】
同じく本明細書によって提供されるものは、ブテノール類をブタジエンに変換する方法である。当該方法は、1,3-ブタジエンが生成されるように、3-ブテン-2-オールをリナロールデヒドラターゼと接触させる工程を含む。リナロールデヒドラターゼは、EC 4.2.1.127に分類されるものであってもよい。
【００７９】
別段定義されない限り、本明細書において用いられるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似または均等である方法および材料を用いて本発明を実施できるが、適当な方法および材料を以下に記す。本明細書において挙げられるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は参照により全体として本明細書に組み入れられる、矛盾する場合、本明細書が、定義を含め、優先する。加えて、材料、方法および例は例示にすぎず、限定的であることを意図しない。
【００８０】
以下、本発明の1つまたは複数の態様の詳細を添付図面および詳細な説明に述べる。詳細な説明および図面から、ならびに請求項から本発明の他の特徴、目的および利点が明らかになろう。請求項における「含む」とは、特許法における慣例にしたがって「から本質的になる」または「からなる」によって置き換えられてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
図面の説明
【図１】C4アルデヒド類およびケトン類、C4ヒドロキシアルデヒド類およびジケトン類、ブテン類、ブテナール類または不飽和ケトン類、ブテノール類、ブタンジオール類、C5アルケノール類、ならびに活性化ブテノール類から1,3-ブタジエンへと通じる主要な酵素活性の概要図である。
【図２】2-オキソペンタ-4-エノアートを主要な前駆体として用いる、ブタジエンに通じる生化学的経路の略図である。
【図３】プロペノイルCoAを主要な前駆体として用いる、ブタジエンに通じる生化学的経路の略図である。
【図４】3-ヒドロキシ-4-ペンタン酸を主要な前駆体として用いる、ブタジエンに通じる生化学的経路の略図である。
【図５】2,4-ペンタジエノイル-[acp]を主要な前駆体として用いる、ブタジエンに通じる生化学的経路の略図である。
【図６】2,4-ペンタジエノイルCoAを主要な前駆体として用いる、ブタジエンに通じる生化学的経路の略図である。
【図７】クロトニルCoAを主要な前駆体として用いる、ブタジエンに通じる生化学的経路の略図である。
【図８】3-ブテン-2-オールを主要な前駆体として用いる、ブタジエンに通じる生化学的経路の略図である。
【図９】メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼを用いる、ブタジエンを合成するための生化学的経路の略図である。
【図１０】イソプレンシンターゼを用いる、ブタジエンを合成するための生化学的経路の略図である。
【図１１】デヒドラターゼを用いる、ブタジエンを合成するための生化学的経路の略図である。
【図１２】（a）が3-ヒドロキシ-5-ジホスファートペンタン酸であり、（b）が3-ヒドロキシ-3-メチル酪酸である、MDDによって受容される代替基質の構造である。
【図１３】サッカロマイセス・セレビシエ（Uniprotアクセッション番号P32377、配列番号：1）、表皮ブドウ球菌（Staphyloccocus epidermidis）（Uniprotアクセッション番号Q7CCL9、配列番号：2）、および肺炎球菌（Streptococcus pneumonia）（Uniprotアクセッション番号B8ZLF3、配列番号：3）に由来するMDD酵素のアミノ酸配列であり、酵素の触媒クレフト内の保存された残基を太文字で強調したものである。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
詳細な説明
特に、本明細書は、主要な前駆体または主要な代謝産物から1,3-ブタジエン（本明細書においては「ブタジエン」と呼ぶ）の合成へと通じる4および5炭素鎖代謝産物中に2つの末端ビニル基を生成する、酵素、非天然経路、培養戦略、供給原料、宿主微生物および宿主の生化学的ネットワークへの減弱を提供する。本明細書中に用いられる用語「主要な前駆体」は、ブタジエンの合成に通じる経路中の主要な代謝産物を指すために用いられる。本明細書における用語「主要な代謝産物」は、成長を支持するためにすべての微生物において産生される代謝産物を指すために用いられる。
【００８３】
そのようなものとして、本明細書に記載される宿主微生物は、ブタジエンを生成できるように操作できる内在性経路を含むことができる。宿主微生物は、内在性経路において、経路内の反応を触媒する酵素のすべてを自然に発現する。操作された経路を含む宿主微生物は、経路内の反応を触媒する酵素のすべてを自然に発現するわけではないが、経路内の酵素のすべてが宿主中で発現するように操作されたものである。操作された経路内では、酵素は、1つの供給源、すなわち1つの種に由来することもできるし、または複数の供給源、すなわち異なる種に由来することもできる。本明細書に記載される酵素をコードする核酸が様々な生物から同定されており、GenBankまたはEMBLなどの公的に利用可能なデータベースにおいて容易に入手可能である。遺伝子操作された宿主は、本明細書に記載される経路の酵素のいずれをも自然に発現しないこともできるし、またはそれらのいくつか（たとえば1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上または6つ以上）を自然に発現することもできる。また、遺伝子操作された宿主の内在性遺伝子は、望ましくない代謝産物の形成を防ぐために、または中間体に作用する他の酵素を介する経路におけるそのような中間体の損失を防ぐために、破壊されてもよい。遺伝子操作された宿主を、組換え宿主または組換え宿主細胞と呼ぶことができる。したがって、本明細書に記載されるように、組換え宿主は、以下さらに詳細に説明するように、デカルボキシラーゼ、デヒドロゲナーゼ、デサチュラーゼ、モノオキシゲナーゼ、アシル-[アシルキャリヤータンパク質（acp）]デヒドロゲナーゼ、デヒドラターゼ、またはヒドラターゼのうち1つまたは複数をコードする核酸を含むことができる。
【００８４】
加えて、ブタジエンの生成は、本明細書に記載される単離された酵素を用いて、宿主微生物からの溶解産物（例えば細胞溶解物）を酵素供給源として用いて、または様々な宿主微生物からの複数の溶解産物を酵素供給源として用いて、インビトロで実施できる。
【００８５】
図1は、C4アルデヒド類およびケトン類、C4ヒドロキシアルデヒド類およびジケトン類、ブテン類、ブテナール類または不飽和ケトン類、ブテノール類、ブタンジオール類、C5アルケノール類、ならびに活性化ブテノール類を含む様々な4または5炭素分子からブタジエンを生成するために使用できる主要な酵素活性の概要を提供する。
【００８６】
4.1  ブタジエンの生合成における第一の末端ビニル基を生成する酵素
図2〜8に示すように、第一のビニル基は、4-オキサロクロトナート、2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド、2-ヒドロキシ-6-オキソノナ-2,4-ジエン-1,9-二酸、プロパノイルCoA、ラクトイルCoA、3-ヒドロキシプロピオニルCoA、（R）3-ヒドロキシペンタン酸、ペンタ-2-エノイル-[acp]、5-ヒドロキシペンタノイルCoA（5-ヒドロキシ-ペンタ-2-エノイルCoAを経る）、ペンタ-3-エノイルCoA、4-ヒドロキシブチリルCoA、グルタコニルCoA、（R）3-ヒドロキシブタノイルCoA、または2-ブタノール中に形成されて、2-オキソペンタ-4-エノアート、プロペノイルCoA、（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノアート、（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノイル-[acp]、2,4-ペンタジエノイルCoA、クロトニルCoA、および3-ブテン-2-オールなどの化合物を生成できる。
【００８７】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第一のビニル基は、4-オキサロクロトナート、2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド、または2-ヒドロキシ-6-オキソノナ-2,4-ジエン-1,9-二酸中に、4-オキサロクロトナートデカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.77）、2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドヒドロラーゼ（EC 3.7.1.9）、または2-ヒドロキシ-6-オキソノナ-2,4-ジエン二酸ヒドロラーゼ（EC 3.7.1.14）によって酵素的に形成されて、2-オキソペンタ-4-エノアートが生成される。たとえば図2を参照のこと。
【００８８】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第一のビニル基は、プロパノイルCoA、ラクトイルCoA、3-ヒドロキシプロピオニルCoA中に、ブチリルCoAデヒドロゲナーゼ（EC 1.3.8.1）、中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ（EC 1.3.8.7）、ラクトイルCoAデヒドラターゼ（EC 4.2.1.54）または3-ヒドロキシプロピオニルCoAデヒドラターゼ（EC 4.2.1.116）によって酵素的に形成されて、プロペノイルCoAが生成される。たとえば図3を参照のこと。
【００８９】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第一のビニル基は、（R）3-ヒドロキシペンタン酸中に、デサチュラーゼまたはモノオキシゲナーゼ（たとえばMdpJの遺伝子産物）またはシトクロムP450（たとえばCYP4ファミリーの遺伝子産物）によって酵素的に形成されて、（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートが生成される。たとえば図4を参照のこと。
【００９０】
モノオキシゲナーゼMdpJの遺伝子産物は、第二級アルコールに隣接するエチル基の末端を脱飽和させる（Schafer et al., Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(24)）。
【００９１】
シトクロムP450 CYP4ファミリーの遺伝子産物は、C5カルボン酸であるバルプロ酸のω-ヒドロキシル化よりも末端脱飽和に対する特異性を示す（Rettie et al., Biochemistry, 1995, 34, 7889-7895）。
【００９２】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第一のビニル基は、アシル-[acp]デヒドロゲナーゼ（たとえばTcsDの遺伝子産物）によってペンタ-2-エノイル-[acp]中に酵素的に形成されて、2,4-ペンタジエノイル-[acp]が生成される。たとえば図5を参照のこと。
【００９３】
アシル-[acp]デヒドロゲナーゼTcsDの遺伝子産物は、ペンタ-2-エノイル-[acp]の末端メチレンを脱飽和させて2,4-ペンタジエノイル-[acp]にする（Mo et al., J. Am. Chem. Soc, 2011, 133(4), 976-985）。
【００９４】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第一のビニル基は、5-ヒドロキシバレリルCoAデヒドラターゼ（EC 4.2.1.-）によって5-ヒドロキシペンタノイルCoA中に酵素的に形成される（5-ヒドロキシペンタ-2-エノイルCoAを経る）か、または2,4-ジエノイル補酵素Aレダクターゼ（EC 1.3.1.34）によって酵素的に形成されて、2,4-ペンタジエノイルCoAが生成される。たとえば図6を参照のこと。
【００９５】
5-ヒドロキシバレリルCoAデヒドラターゼによる5-ヒドロキシ吉草酸の2,4-ペンタジエノイルCoAへの脱水が、クロストリジウム・ビリデから特徴づけられている（Eikmanns and Buckel, Eur. J. Biochem., 1991, 197, 661-668）。
【００９６】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第一のビニル基は、3-ヒドロキシブタノイルCoA、4-ヒドロキシブチリルCoA、またはグルタコニルCoA中に、エノイルCoAヒドラターゼ（EC 4.2.1.119、たとえばphaJの遺伝子産物）、4-ヒドロキシブタノイルCoAデヒドラターゼ（EC 4.2.1.120）、またはグルタコニルCoAデカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.70）によって酵素的に形成されて、クロトニルCoAが生成される。たとえば図7を参照のこと。
【００９７】
可逆性デヒドラターゼである4-ヒドロキシブタノイルCoAデヒドラターゼは、いくつかのクロストリジウム種（たとえばクロストリジウム・クライベリ）において特性決定されており、主要な代謝産物であるコハク酸を経るクロトニルCoAへのルートを提供する（Scherf et al., Arch. Microbiol, 1994, 161(3), 239-245; Sherf and Buckel, Eur. J. Biochem., 1993, 215, 421-429）。
【００９８】
ビオチン依存性デカルボキシラーゼであるグルタコニルCoAデカルボキシラーゼは、脱炭酸ののち基質のビニル基の位置を維持して、主要な代謝産物である2-オキソグルタル酸を経るクロトニルCoAへのルートを提供する（Kerstin et al., The EMBO Journal, 2003, 22(14), 3493-3502）。
【００９９】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第一のビニル基は、デサチュラーゼまたはモノオキシゲナーゼ（たとえばMdpJの遺伝子産物）またはシトクロムP450（たとえばCYP4ファミリーの遺伝子産物）によって2-ブタノール中に形成されて、3-ブテン-2-オールが生成される。たとえば図8を参照のこと。
【０１００】
4.2  ブタジエンの生合成における第二の末端ビニル基を生成する酵素
図9〜11に示すように、第二の末端ビニル基は、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（MDD）、イソプレンシンターゼ（ISPS）、またはデヒドラターゼを用いて酵素的に形成できる。
【０１０１】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第二のビニル基は、EC 4.1.1.33に分類される酵素であるメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（MDD）によって形成される。たとえば図9を参照のこと。
【０１０２】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第二のビニル基は、4.2.3.27に分類される酵素であるイソプレンシンターゼ（ISPS）によって酵素的に形成される。たとえば図10を参照のこと。
【０１０３】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成に通じる第二のビニル基は、酵素クラスEC 4.2.1.-のデヒドラターゼ、特にリナロールデヒドラターゼ（EC 4.2.1.127）、キエビトンヒドラターゼ（EC 4.2.1.95）、オレイン酸ヒドラターゼ（EC 4.2.1.53）、またはカロテノイド1,2-ヒドラターゼ（EC 4.2.1.131）によって酵素的に形成される。たとえば図11を参照のこと。
【０１０４】
リナロールは、α位置をイソヘキセニルR基で置換された3-ブテン-2-オールとみなされ得る。リナロールのミルセンへの脱水は熱力学的に好都合であり、おそらくは、R基が機械論的役割を有しない脱プロトン化を経て進行する（Bordkorb et al., J. Biol. Chem., 2010, 285(40), 30436-30442）。
【０１０５】
オレイン酸ヒドラターゼは、長鎖不飽和脂肪酸であるオレイン酸を（R）-10-ヒドロキシステアリン酸に変換する。しかし、E. メニンゴセプティカ（E. meningoseptica）のオレイン酸ヒドラターゼ配列に対する165のホモログのスクリーニングにおいて、いくつかは、イソブテンを形成する基質としてイソブタノールを受容した（Bianca et al., Appl. Microbiol Biotechnol., 2012, 93, 1377-1387）。
【０１０６】
4.3  生化学的経路
4.3.1  ブタジエンへの主要な前駆体として2-オキソペンタ-4-エノアートを用いる経路
プロトカテク酸（Kasai et al., J. Bacteriol, 2009, 191(21), 6758-6768）、カテコール（He and Spain, J. Bacteriol, 1998, 180(9), 2502-2506）、アントラニル酸（Muraki et al., Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(3), 1564-1572）、および3-フェニルプロピオン酸（Ferrandez et al., J. Bacteriol, 1997, 179(8), 2573-2581）などの芳香族化合物から2-オキソペンタ-4-エノアートの生成に通じる経路は、十分に特徴づけられている。主要な代謝産物からの炭素フラックスは、これらの分解経路（3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ（EC 4.2.1.118）による3-デヒドロシキミ酸を経る経路、アントラニル酸シンターゼ（EC 4.1.3.27）によるコリスミン酸を経る経路、ならびにフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（EC 4.3.1.24）および2-エン酸レダクターゼ（EC 1.3.1.31）によるL-フェニルアラニンを経る経路）へと送られ得る。
【０１０７】
いくつかの態様において、2-オキソペンタ-4-エノアートは主要な代謝産物であるコリスミン酸から合成され、アントラニル酸シンターゼ（EC 4.1.3.27）によるコリスミン酸からアントラニル酸への変換、次いでアントラニル酸1,2-ジオキシゲナーゼ（EC 1.14.12.1）によるカテコールへの変換、次いでカテコール2,3-ジオキシゲナーゼ（EC 1.13.11.2）による2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドへの変換、次いで2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドヒドロラーゼ（EC 3.7.1.9）による2-オキソペンタ-4-エノアートへの変換によって合成される。加えて、2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドをアミノムコン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.32）によって2-ヒドロキシムコン酸に変換することができ、2-ヒドロキシムコン酸を2-ヒドロキシムコン酸タウトメラーゼ（EC 5.3.2.6）によって4-オキサロクロトナートに変換することができ、4-オキサロクロトナートを4-オキサロクロトナートデカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.77）によって2-オキソペンタ-4-エノアートに変換できる。たとえば図2を参照のこと。
【０１０８】
いくつかの態様において、2-オキソペンタ-4-エノアートは主要な代謝産物である3-デヒドロシキミ酸から合成され、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ（EC 4.2.1.118）による3-デヒドロシキミ酸からプロトカテク酸への変換、次いでプロトカテク酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.63）によるカテコールへの変換、次いでカテコール2,3-ジオキシゲナーゼ（EC 1.13.11.2）による2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドへの変換、次いで、2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドヒドロラーゼ（EC 3.7.1.9）による2-オキソペンタ-4-エノアートへの変換か、またはアミノムコン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.32）、2-ヒドロキシムコン酸タウトメラーゼ（EC 5.3.2.6）、および4-オキサロクロトナートデカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.77）による2-オキソペンタ-4-エノアートへの変換によって合成される。図2を参照のこと。
【０１０９】
いくつかの態様において、2-オキソペンタ-4-エノアートは主要な代謝産物である3-デヒドロシキミ酸から合成され、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ（EC 4.2.1.118）による3-デヒドロシキミ酸からプロトカテク酸への変換、次いでプロトカテク酸2,3-ジオキシゲナーゼ（たとえばpraAの遺伝子産物）による5-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドへの変換、次いで5-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデカルボキシラーゼ（たとえばpraHの遺伝子産物）による2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドへの変換、次いで、2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドヒドロラーゼ（EC 3.7.1.9）による2-オキソペンタ-4-エノアートへの変換か、またはアミノムコン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.32）、2-ヒドロキシムコン酸タウトメラーゼ（EC 5.3.2.6）、および4-オキサロクロトナートデカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.77）による2-オキソペンタ-4-エノアートへの変換によって合成される。たとえば図2を参照のこと。
【０１１０】
いくつかの態様において、2-オキソペンタ-4-エノアートは主要な代謝産物であるL-フェニルアラニンから合成され、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（EC 4.3.1.24）によるL-フェニルアラニンからE-桂皮酸への変換、次いで2-エン酸レダクターゼ（EC 1.3.1.31）による3-フェニルプロピオン酸への変換、次いで3-フェニルプロパン酸ジオキシゲナーゼ（EC 1.14.12.19）によるシス-3-(カルボキシエチル)-3,5-シクロヘキサジエン-1,2-ジオールへの変換、次いで3-(シス-5,6-ジヒドロキシシクロヘキサ-1,3-ジエン-1-イル)プロパン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.3.1.87）による2,3-ジヒドロキシフェニルプロピオン酸への変換、次いで3-カルボキシエチルカテコール2,3-ジオキシゲナーゼ（EC 1.13.11.16）による2-ヒドロキシ-6-オキソノナ-2,4-ジエン-1,9-二酸への変換、次いで2-ヒドロキシ-6-オキソノナ-2,4-ジエン二酸ヒドロラーゼ（EC 3.7.1.14）による2-オキソペンタ-4-エノアートへの変換によって合成される。たとえば図2を参照のこと。
【０１１１】
いくつかの態様において、ブタジエンは2-オキソペンタ-4-エノアートから合成され、（R）-2-ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼ（たとえばLdhAの遺伝子産物）による2-オキソペンタ-4-エノアートから2-ヒドロキシペンタ-4-エノアートへの変換、次いでCoAトランスフェラーゼ（たとえばGctABの遺伝子産物）による2-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAへの変換、次いで2-ヒドロキシイソカプロイルCoAデヒドラターゼ（たとえばイニシエータHadIおよびHadBCの遺伝子産物）による2,4-ペンタジエノイルCoAへの変換、次いでエノイルCoAデヒドラターゼ2（EC 4.1.1.119）による（R）-3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAへの変換、次いでチオエステラーゼ（EC 3.1.2.-）（たとえばtesBの遺伝子産物）による（R）-3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートへの変換、次いでメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.33）によるブタジエンへの変換によって合成される。たとえば図9を参照のこと。
【０１１２】
（R）-2-ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼ（LdhAの遺伝子産物）は2-オキソペンタン酸および2-オキソヘキサン酸を基質として受容する（Kim, On the enzymatic mechanism of 2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase from Clostridium difficile, 2004, Ph.D. dissertation, Philipps-Universitat, Marburg, 2004）。2-オキソペンタン酸は、2-オキソペンタ-4-エノアートに近い基質類似体である。
【０１１３】
グルタコン酸CoAトランスフェラーゼ（GctAB）は、分岐状および非分岐状のα置換および非置換モノカルボン酸およびジカルボン酸である、炭素3〜6個の長さの炭素鎖を受容する非特異的な酵素である（たとえば、Buckel et al., Eur. J. Biochem., 1981, 118, 315-321を参照）。2-ヒドロキシペンタ-4-エン酸は、2-ヒドロキシイソカプロイルCoAデヒドラターゼの活性のためにCoA活性化を必要とする類似の構造および官能基を有する。
【０１１４】
2-ヒドロキシイソカプロイルCoAデヒドラターゼ（HadIおよびHadBC）は、基質類似体2-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAを基質として受容して、2,4-ペンタジエノイルCoAを合成する（Kim et al., Nature Letters, 2008, 452, 239-243）。
【０１１５】
tesBの遺伝子産物を用いて、短および中炭素鎖アシルCoA基質の加水分解が実証されている（Liu et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2007, 76, 811-818）。tesBのチオエステラーゼII遺伝子産物は、（R）-3-ヒドロキシペンタノイルCoAを効率的に加水分解する（Martin and Prather, Journal of Biotechnology, 2009, 139, 61-67）。
【０１１６】
4.3.2  ブタジエンへの主要な前駆体に通じる前駆体としてのプロパノイルCoAへの経路
いくつかの態様において、プロパノイル補酵素A（CoA）が、ブタジエンの合成における主要な前駆体に通じる前駆体である（たとえば図3を参照）。
【０１１７】
いくつかの態様において、プロパノイルCoAは主要な代謝産物であるスクシニルCoAから合成され、メチルマロニルCoAムターゼ（EC 5.4.99.2）によるスクシニルCoAから(2R)-メチルマロニルCoAへの変換、次いでメチルマロニルCoAエピメラーゼ（EC 5.1.99.1）による(2S)-メチルマロニルCoAへの変換、次いでメチルマロニルCoAカルボキシトランスフェラーゼ（EC 2.1.3.1）またはメチルマロニルCoAデカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.41）によるプロパノイルCoAへの変換によって合成される。たとえば図3を参照のこと。
【０１１８】
いくつかの態様において、プロパノイルCoAは主要な代謝産物であるL-トレオニンから合成され、トレオニンアンモニアリアーゼ（EC 4.3.1.19）によるL-トレオニンから2-オキソ酪酸への変換、次いで2-ケト酪酸ギ酸リアーゼ（たとえばtdcEの遺伝子産物（EC 2.3.1.-））によるプロパノイルCoAへの変換によって合成される（Tseng et al., Microbial Cell Factories, 2010, 9:96を参照）。たとえば図3を参照のこと。
【０１１９】
他の産物への前駆体としてのL-トレオニンからのプロパノイルCoAの細胞内蓄積が実証されている（Tseng et al., Microbial Cell Factories, 2010, 9:96）。
【０１２０】
いくつかの態様において、プロパノイルCoAは1,2-プロパンジオールから合成され、プロパンジオールデヒドラターゼ（EC 4.2.1.28）による1,2-プロパンジオールからプロパナールへの変換、次いでCoA依存性プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ（たとえばpduPの遺伝子産物）によるプロパノイルCoAへの変換によって合成される（Luo et al., Bioresource Technology, 2012, 103, 1-6を参照）。たとえば図3を参照のこと。
【０１２１】
1,2-プロパンジオールからのプロパノイルCoAの細胞内蓄積は報告されている（Luo et al., Bioresource Technology, 2012, 103, 1-6）。
【０１２２】
いくつかの態様において、プロパノイルCoAは炭素源であるレブリン酸から合成され、アシルCoAシンテターゼまたはリガーゼ（EC 6.2.1.-）によるレブリン酸からレブリニルCoAへの変換、次いでEC 2.3.1.-のトランスフェラーゼによるプロパノイルCoAへの変換によって合成される（Jaremko and Yu, Journal of Biotechnology, 2011, 155, 2011, 293-298）。たとえば図3を参照のこと。
【０１２３】
いくつかの態様において、プロパノイルCoAは主要な代謝産物であるピルビン酸から合成され、L-乳酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.27）によるピルビン酸からL-乳酸への変換、次いでプロピオン酸CoAトランスフェラーゼ（EC 2.8.3.1）によるラクトイルCoAへの変換、次いでラクトイルCoAデヒドラターゼ（EC 4.2.1.54）によるプロペノイルCoAへの変換、次いでブチリルCoAデヒドロゲナーゼ（EC 1.3.8.1）または中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ（EC 1.3.8.7）によるプロパノイルCoAへの変換によって合成される。たとえば図3を参照のこと。
【０１２４】
いくつかの態様において、プロパノイルCoAは主要な代謝産物であるマロニルCoAから合成され、マロニルCoAレダクターゼ（EC 1.2.1.75）によるマロニルCoAからマロン酸セミアルデヒドへの変換、次いで3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.59）による3-ヒドロキシプロピオン酸への変換、次いで3-ヒドロキシイソブチリルCoAヒドロラーゼ（EC 3.1.2.4）による3-ヒドロキシプロピオニルCoAへの変換、次いで3-ヒドロキシプロピオニルCoAデヒドラターゼ（EC 4.2.1.116）によるプロペノイルCoAへの変換、次いでブチリルCoAデヒドロゲナーゼ（EC 1.3.8.1）または中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ（EC 1.3.8.7）によるプロパノイルCoAへの変換によって合成される。たとえば図3を参照のこと。
【０１２５】
4.3.3  ブタジエンへの主要な前駆体としてプロペノイルCoAを用いる経路
いくつかの態様において、プロペノイルCoAは、プロパノイルCoAからブチリルCoAデヒドロゲナーゼ（EC 1.3.8.1）または中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ（EC 1.3.8.7）によって合成される。たとえば図3を参照のこと。
【０１２６】
いくつかの態様において、プロペノイルCoAは主要な代謝産物であるピルビン酸から合成され、L-乳酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.27）によるピルビン酸からL-乳酸への変換、次いでプロピオン酸CoAトランスフェラーゼ（EC 2.8.3.1）によるラクトイルCoAへの変換、次いでラクトイルCoAデヒドラターゼ（EC 4.2.1.54）によるプロペノイルCoAへの変換によって合成される。たとえば図3を参照のこと。
【０１２７】
いくつかの態様において、プロペノイルCoAは主要な代謝産物であるマロニルCoAから合成され、マロニルCoAレダクターゼ（EC 1.2.1.75）によるマロニルCoAからマロン酸セミアルデヒドへの変換、次いで3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.59）による3-ヒドロキシプロピオン酸への変換、次いで3-ヒドロキシイソブチリルCoAヒドロラーゼ（EC 3.1.2.4）による3-ヒドロキシプロピオニルCoAへの変換、次いで3-ヒドロキシプロピオニルCoAデヒドラターゼ（EC 4.2.1.116）によるプロペノイルCoAへの変換によって合成される。たとえば図3を参照のこと。
【０１２８】
いくつかの態様において、ブタジエンはプロペノイルCoAから合成され、β-ケトチオラーゼ（たとえばEC 2.3.1.16）によるプロペノイルCoAから3-オキソペンタ-4-エノイルCoAへの変換、次いでアセトアセチルCoAレダクターゼ（EC 1.1.1.36）（たとえばphaBの遺伝子産物）による(R)-3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAへの変換、次いでチオエステラーゼ（EC 3.1.2.-）（たとえばtesBの遺伝子産物）による(R)-3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートへの変換、次いでメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.33）によるブタジエンへの変換によって合成される。たとえば図9を参照のこと。
【０１２９】
4.3.4  ブタジエンへの主要な前駆体として（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートを用いる経路
いくつかの態様において、（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートはプロパノイルCoAから合成され、アセチルCoA C-アシルトランスフェラーゼ（EC 2.3.1.16）によるプロパノイルCoAから3-オキソペンタノイルCoAへの変換、次いでアセトアセチルCoAレダクターゼ（EC 1.1.1.36）（たとえばphaBの遺伝子産物）による（R）3-ヒドロキシペンタノイルCoAへの変換、次いでチオエステラーゼ（たとえばtesBの遺伝子産物（EC 3.1.2.-））による（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAへの変換、次いでデサチュラーゼ（たとえばMdpJの遺伝子産物）またはシトクロムP450（たとえばCYP4ファミリーの遺伝子産物）による（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートへの変換によって合成される。たとえば図4を参照のこと。
【０１３０】
CYP4ファミリーのシトクロムP450酵素によるカルボン酸の末端脱飽和は解明されている。CYP4B1は、末端のω-1水素を除去することによって12炭素鎖長脂肪酸であるラウリン酸を脱飽和させる（Guan et al., Chemico-Biology Interactions, 1998, 110, 103-121）。
【０１３１】
いくつかの態様において、ブタジエンは、（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートからメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.33）によって合成される。たとえば図9を参照のこと。
【０１３２】
4.3.5  ブタジエンへの主要な前駆体として2,4-ペンタジエノイル-[acp]を用いる経路
いくつかの態様において、（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノイル-[acp]はプロパノイルCoAから合成され、アセチルCoA C-アシルトランスフェラーゼ（EC 2.3.1.16）によるプロパノイルCoAから3-オキソペンタノイルCoAへの変換、次いで3-ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.36）（たとえばphaBの遺伝子産物）による（R）3-ヒドロキシペンタノイルCoAへの変換、次いでエノイルCoAヒドラターゼ（EC 4.2.1.119）（たとえばphaJの遺伝子産物）によるペンタ-2-エノイルCoAへの変換、次いでアシルトランスフェラーゼ（たとえばtcsAの遺伝子産物）との反応におけるペンタ-2-エノイル-[acp]への変換、次いでアシル-[acp]デヒドロゲナーゼ（たとえばTcsDの遺伝子産物）による（R）2,4-ペンタジエノイル-[acp]への変換によって合成される。たとえば図5を参照のこと。
【０１３３】
いくつかの態様において、（R）3-ヒドロキシペンタ-4-エノイル-[acp]はプロパノイルCoAから合成され、β-ケトアシル-[acp]シンターゼI（EC 2.3.1.41）（たとえばtcsB）およびアシルトランスフェラーゼ（たとえばtcsA）によるプロパノイルCoAから3-オキソペンタノイル-[acp]への変換、次いで3-オキソアシル-[アシルキャリヤータンパク質]レダクターゼ（EC 1.1.1.100）による（R）3-ヒドロキシペンタノイルCoAへの変換、次いで3-ヒドロキシアシル-[acp]デヒドラターゼ（EC 4.2.1.59）によるペンタ-2-エノイル-[acp]への変換、次いでアシル-[acp]デヒドロゲナーゼ（たとえばTcsDの遺伝子産物）による2,4-ペンタジエノイル-[acp]への変換によって合成される。たとえば図5を参照のこと。
【０１３４】
いくつかの態様において、ブタジエンは（R）-3-ヒドロキシペンタ-4-エノイル-[acp]から合成され、(R)-3-ヒドロキシアシル-[acp]:CoAトランスアシラーゼ（たとえばphaGの遺伝子産物）による（R）-3-ヒドロキシペンタ-4-エノイル-[acp]から(R)-3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAへの変換、次いでチオエステラーゼ（たとえばtesBの遺伝子産物）による(R)-3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートへの変換、次いでメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.33）によるブタジエンへの変換によって合成される。たとえば図9を参照のこと。
【０１３５】
phaJ（EC 4.2.1.119）の遺伝子産物は、脂肪酸合成由来の短鎖および中鎖R特異的3-ヒドロキシアシルCoAモノマーをポリヒドロキシアルカン酸シンターゼ酵素に提供するための主要な酵素である（Chung and Rhee, Biosci. Biotechnol. Biochem., 2012, 76(3), 613-616; Tsuge et al., International Journal of Biological Macromolecules, 2003, 31, 195-205）。
【０１３６】
4-ペンタン酸をポリヒドロキシアルカン酸産生細菌に対する炭素源として利用することにより、β酸化を経て（R）-3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートが生成される。したがって、4-ペンタン酸が2,4-ペンタジエノイルCoAに変換され、これが、R特異的エノイルCoAデヒドラーゼ活性による（R）-3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートへの水和ののち、ポリマーシンターゼ酵素に利用可能になる（Ulmer et al., Macromolecules, 1994, 27, 1675-1679）。
【０１３７】
4.3.6  ブタジエンへの主要な前駆体として2,4-ペンタジエノイルCoAを用いる経路
いくつかの態様において、2,4-ペンタジエノイルCoAはプロパノイルCoAから合成され、アセチルCoA C-アシルトランスフェラーゼ（EC 2.3.1.16、たとえばbktBの遺伝子産物）によるプロパノイルCoAから3-オキソペンタノイルCoAへの変換、次いで3-ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.36、たとえばphaBの遺伝子産物）による（R）3-ヒドロキシペンタノイルCoAへの変換、次いでエノイルCoAヒドラターゼ（EC 4.2.1.119、たとえばphaJの遺伝子産物）によるペンタ-2-エノイルCoAへの変換、次いでイソメラーゼ（EC 5.3.3.8）によるペンタ-3-エノイルCoAへの変換、次いで2,4-ジエノイル補酵素Aレダクターゼ（EC 1.3.1.34）による2,4-ペンタジエノイルCoAへの変換によって合成される。たとえば図6を参照のこと。
【０１３８】
いくつかの態様において、2,4-ペンタジエノイルCoAはプロパノイルCoAから合成され、アセチルCoA C-アシルトランスフェラーゼ（EC 2.3.1.16、たとえばbktBの遺伝子産物）によるプロパノイルCoAから3-オキソペンタノイルCoAへの変換、次いで3-ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.36、たとえばphaBの遺伝子産物）による（R）3-ヒドロキシペンタノイルCoAへの変換、次いでエノイルCoAヒドラターゼ（EC 4.2.1.119、たとえばphaJの遺伝子産物）によるペンタ-2-エノイルCoAへの変換、次いでイソメラーゼ（EC 5.3.3.8）によるペンタ-3-エノイルCoAへの変換、次いで2,4-ジエノイル補酵素Aレダクターゼ（EC 1.3.1.34）による2,4-ペンタジエノイルCoAへの変換によって合成される。たとえば図6を参照のこと。
【０１３９】
いくつかの態様において、2,4-ペンタジエノイルCoAはプロパノイルCoAから合成され、アセチルCoA C-アシルトランスフェラーゼ（EC 2.3.1.16、たとえばbktBの遺伝子産物）によるプロパノイルCoAから3-オキソペンタノイルCoAへの変換、次いで3-ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.36、たとえばphaBの遺伝子産物）による（R）3-ヒドロキシペンタノイルCoAへの変換、次いでエノイルCoAヒドラターゼ（EC 4.2.1.119、たとえばphaJの遺伝子産物）による2E-ペンテノイルCoAへの変換、次いでトランス-2-エノイルCoAレダクターゼ（たとえばEC 1.3.1.38）によるペンタノイルCoAへの変換、次いでシトクロムP450モノオキシゲナーゼ（たとえばCYP153A6の遺伝子産物）による5-ヒドロキシペンタノイルCoAへの変換、次いで5-ヒドロキシバレリルCoAデヒドラターゼ（EC 4.2.1.-、たとえばクロストリジウム・ビリデ由来）による2,4-ペンタジエノイルCoAへの変換によって合成される。たとえば図6を参照のこと。
【０１４０】
いくつかの態様において、2,4-ペンタジエノイルCoAは主要な代謝産物であるL-グルタミン酸から合成され、グルタミン酸5-キナーゼ（EC 2.7.2.11）によるL-グルタミン酸からL-グルタミル-5-リン酸への変換、次いでグルタミン酸5-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.41）によるL-グルタミン酸-5-セミアルデヒドへの変換、次いで（S）-1-ピロリン-5-カルボン酸への自発的変換、次いでピロリン-5-カルボン酸レダクターゼ（EC 1.5.1.2）によるL-プロリンへの変換、次いでプロリンラセマーゼ（EC 5.1.1.4）によるD-プロリンへの変換、次いでD-プロリンレダクターゼ（EC 1.21.4.1）による5-アミノ吉草酸への変換、次いで5-アミノ吉草酸トランスアミナーゼ（EC 2.6.1.48）による5-オキソペンタン酸への変換、次いで5-ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼ、たとえばcpnDの遺伝子産物またはクロストリジウム・ビリデ由来のデヒドロゲナーゼによる5-ヒドロキシペンタン酸への変換、次いで5-ヒドロキシペンタン酸CoAトランスフェラーゼ（EC 2.8.3.14）による5-ヒドロキシペンタノイルCoAへの変換、次いで5-ヒドロキシバレリルCoAデヒドラターゼ（EC 4.2.1.-、たとえばクロストリジウム・ビリデ由来）による2,4-ペンタジエノイルCoAへの変換によって合成される。たとえば図6を参照のこと。
【０１４１】
いくつかの態様において、ブタジエンは2,4-ペンタジエノイルCoAから合成され、エノイルCoAデヒドラターゼ2（EC 4.2.1.119、たとえばphaJの遺伝子産物）による2,4-ペンタジエノイルCoAから(R)-3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAへの変換、次いでチオエステラーゼ（たとえばtesBの遺伝子産物）による(R)-3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートへの変換、次いでメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.33）によるブタジエンへの変換によって合成される。たとえば図9を参照のこと。
【０１４２】
phaJ（EC 4.2.1.119）の遺伝子産物は、脂肪酸合成由来の短鎖および中鎖R特異的3-ヒドロキシアシルCoAモノマーをポリヒドロキシアルカン酸シンターゼ酵素に提供するための主要酵素である（Chung and Rhee, Biosci. Biotechnol. Biochem., 2012, 76(3), 613-616; Tsuge et al., International Journal of Biological Macromolecules, 2003, 31, 195-205）。
【０１４３】
4-ペンテン酸をポリヒドロキシアルカノアート産生細菌への炭素源として利用することが、β酸化を経て(R)-3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートを生成する。したがって、4-ペンテン酸が2,4-ペンタジエノイルCoAに変換され、これが、R特異的エノイルCoAデヒドラーゼ活性による(R)-3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートへの水和ののち、ポリマーシンターゼ酵素に利用可能になる（たとえばUlmer et al., Macromolecules, 1994, 27, 1675-1679を参照）。
【０１４４】
4.3.7  ブタジエンへの主要な前駆体としてクロトニルCoAを用いる経路
いくつかの態様において、クロトニルCoAは主要な代謝産物であるアセチルCoAから合成され、アセチルCoA C-アセチルトランスフェラーゼ（EC 2.3.1.9、たとえばatoBまたはphaAの遺伝子産物）によるアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換、次いで3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.36、たとえばphaBの遺伝子産物）による（R）3-ヒドロキシブタノイルCoAへの変換、次いでエノイルCoAヒドラターゼ（EC 4.2.1.119、たとえばphaJの遺伝子産物）によるクロトニルCoAへの変換によって合成される。たとえば図7を参照のこと。
【０１４５】
いくつかの態様において、クロトニルCoAは主要な代謝産物であるスクシニルCoAから合成され、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.76）によるスクシニルCoAからコハク酸セミアルデヒドへの変換、次いで4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.61）による4-ヒドロキシ酪酸への変換、次いでCoAトランスフェラーゼ（たとえばCk-cat2の遺伝子産物）による4-ヒドロキシブチリルCoAへの変換、次いで4-ヒドロキシブタノイルCoAデヒドラターゼ（EC 4.2.1.120）およびビニルアセチルCoAイソメラーゼ（EC 5.3.3.3）によるクロトニルCoAへの変換によって合成される。たとえば図7を参照のこと。
【０１４６】
いくつかの態様において、クロトニルCoAは主要な代謝産物である2-オキソグルタル酸から合成され、2-ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.99.2）による2-オキソグルタル酸から2-ヒドロキシグルタル酸への変換、次いでグルタコン酸CoAトランスフェラーゼ（EC 2.8.3.12）による2-ヒドロキシグルタリルCoAへの変換、次いでデヒドラーゼ（EC 4.2.1.-）によるグルタコニルCoAへの変換、次いでグルタコニルCoAデカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.70）によるクロトニルCoAへの変換によって合成される。たとえば図7を参照のこと。
【０１４７】
いくつかの態様において、ブタジエンはクロトニルCoAから合成され、コハク酸CoAリガーゼ（EC 6.2.1.5）によるクロトニルCoAからクロトン酸への変換、次いで長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.48）による2-ブテン-アールへの変換、次いでアリルアルコールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.54）による2-ブテン-1-オールへの変換、次いでメバロン酸キナーゼ（EC 2.7.1.36）による2-ブテン-1-オールホスファートへの変換、次いでホスホメバロン酸キナーゼ（EC 2.7.4.2）による2-ブテン-1-オールジホスファートへの変換、次いでイソプレンシンターゼ（EC 4.2.3.27）によるブタジエンへの変換によって合成される。たとえば図10を参照のこと。
【０１４８】
いくつかの態様において、ブタジエンはクロトニルCoAから合成され、コハク酸CoAリガーゼ（EC 6.2.1.5）によるクロトニルCoAからクロトン酸への変換、次いで長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.48）による2-ブテン-アールへの変換、次いでアリルアルコールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.54）による2-ブテン-1-オールへの変換、次いでジホスホトランスフェラーゼ、たとえばチアミンジホスホキナーゼ（EC 2.7.6.2）による2-ブテン-1-オールジホスファートへの変換、次いでイソプレンシンターゼ（EC 4.2.3.27）によるブタジエンへの変換によって合成される。たとえば図10を参照のこと。
【０１４９】
いくつかの態様において、ブタジエンはクロトニルCoAから合成され、コハク酸CoAリガーゼ（EC 6.2.1.5）によるクロトニルCoAからクロトン酸への変換、次いで長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.48）による2-ブテン-アールへの変換、次いでアリルアルコールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.54）による2-ブテン-1-オールへの変換、次いで酵素クラスEC 4.2.1.-のデヒドラターゼ（たとえばリナロールデヒドラターゼ（EC 4.2.1.127）、キエビトンヒドラターゼ（EC 4.2.1.95）、オレイン酸ヒドラターゼ（EC 4.2.1.53）またはカロテノイド1,2-ヒドラターゼ（EC 4.2.1.131））によるブタジエンへの変換によって合成される。たとえば図11を参照のこと。
【０１５０】
4.3.8  ブタジエンへの主要な前駆体として3-ブテン-2-オールを用いる経路
いくつかの態様において、3-ブテン-2-オールは主要な代謝産物であるピルビン酸から合成され、アセト乳酸シンターゼ（EC 2.2.1.6）によるピルビン酸から2-アセト乳酸への変換、次いでアセト乳酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.5）による（R）-アセトインへの変換、次いで(R,R)-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.4）による2,3-ブタンジオールへの変換、次いでプロパンジオールデヒドラターゼ（EC 4.2.1.28）によるブタノンへの変換、次いで（R）特異的第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.B4）による2-ブタノールへの変換、次いでデサチュラーゼまたはモノオキシゲナーゼ、たとえばMdpJまたはたとえばCYP4ファミリーのシトクロムP450の遺伝子産物による3-ブテン-2-オールへの変換によって合成される。たとえば図8を参照のこと。
【０１５１】
いくつかの態様において、ブタジエンは3-ブテン-2-オールから合成され、メバロン酸キナーゼ（EC 2.7.1.36）による3-ブテン-2-オールから3-ブテン-2-オールホスファートへの変換、次いでホスホメバロン酸キナーゼ（EC 2.7.4.2）による3-ブテン-2-オールジホスファートへの変換、次いでイソプレンシンターゼ（EC 4.2.3.27）によるブタジエンへの変換によって合成される。たとえば図10を参照のこと。
【０１５２】
いくつかの態様において、ブタジエンは3-ブテン-2-オールから合成され、ジホスホトランスフェラーゼ（たとえばチアミンジホスホキナーゼ（EC 2.7.6.2））による3-ブテン-2-オールから3-ブテン-2-オールジホスファートへの変換、次いでイソプレンシンターゼ（EC 4.2.3.27）によるブタジエンへの変換によって合成される。たとえば図10を参照のこと。
【０１５３】
いくつかの態様において、ブタジエンは3-ブテン-2-オールから合成され、酵素クラスEC 4.2.1.-のデヒドラターゼ（たとえばリナロールデヒドラターゼ（EC 4.2.1.127）、キエビトンヒドラターゼ（EC 4.2.1.95）、オレイン酸ヒドラターゼ（EC 4.2.1.53）またはカロテノイド1,2-ヒドラターゼ（EC 4.2.1.131））によって合成される。たとえば図11を参照のこと。
【０１５４】
4.4  培養戦略
いくつかの態様において、ブタジエンは、組換え宿主中、組換え宿主の嫌気性、微好気性または好気性培養を含むことができる発酵戦略を用いて生合成される。
【０１５５】
分子酸素を要する酵素およびインビトロで酸素感受性であることを特徴とする酵素を含むブタジエン合成の経路は、低い溶存酸素濃度を維持しながらも、基質酸化制御状態を防ぐのに十分な酸素移動を維持する微好気性培養戦略を要する（Chayabatra & Lu-Kwang, Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66(2), 493 0 498）。
【０１５６】
いくつかの態様においては、ブタジエンの合成における流加発酵または連続発酵のいずれかの間に高い細胞密度を達成しかつ維持するために、たとえばセラミック中空糸膜を用いる細胞保持戦略が用いられる。
【０１５７】
いくつかの態様において、ブタジエンの合成における発酵に供給される主要な炭素源は生物学的または非生物学的供給原料に由来する。
【０１５８】
いくつかの態様において、生物学的供給原料は、単糖類、二糖類、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、リグニン、たとえばレブリン酸およびフルフラール、リグニン、トリグリセリド類、たとえばグリセロールおよび脂肪酸、農業廃棄物または一般廃棄物であるか、それらを含むか、またはそれらに由来する。
【０１５９】
バイオディーゼルの生成から生じる粗グリセロールの効率的な異化作用が、大腸菌、カプリアビダス・ネカトール、シュードモナス・オレオボランス、シュードモナス・プチダおよびヤロウイア・リポリティカなどのいくつかの微生物において実証されている（Lee et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 2012, 166, 1801-1813; Yang et al., Biotechnology for Biofuels, 2012, 5:13; Meijnen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 90, 885-893）。
【０１６０】
前駆体プロパノイルCoAを経る3-ヒドロキシ吉草酸の合成において、リグノセルロース由来のレブリン酸の効率的な異化作用が、カプリアビダス・ネカトールおよびシュードモナス・プチダなどのいくつかの生物において実証されている（Jaremko and Yu, Journal of Biotechnology, 2011, 155, 2011, 293-298; Martin and Prather, Journal of Biotechnology, 2009, 139, 61-67）。
【０１６１】
ベンゾアート類似体などのリグニン由来の芳香族化合物の効率的な異化作用が、シュードモナス・プチダ、カプリアビダス・ネカトールなどのいくつかの微生物において実証されている（Bugg et al., Current Opinion in Biotechnology, 2011, 22, 394-400; Perez-Pantoja et al., FEMS Microbiol. Rev., 2008, 32, 736-794）。
【０１６２】
オリーブ精製工場廃水などの農業廃棄物の効率的な利用が、ヤロウイア・リポリティカを含むいくつかの微生物において実証されている（Papanikolaou et al., Bioresour. Technol., 2008, 99(7), 2419-2428）。
【０１６３】
セルロース、ヘミセルロース、サトウキビおよびテンサイ糖蜜、キャッサバ、トウモロコシおよび他の農業的供給源に由来する単糖類または二糖類などの発酵性糖の効率的な利用が、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミクムおよびデルブリュッキ菌およびラクトコッカス・ラクティスなどのいくつかの微生物において実証されている（たとえば、Hermann et al., Journal of Biotechnology, 2003, 104, 155-172; Wee et al., Food Technol. Biotechnol., 2006, 44(2), 163-172; Ohashi et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, 1999, 87(5), 647-654を参照）。
【０１６４】
多様な農業的リグノセルロース供給源に由来するフルフラールの効率的な利用が、カプリアビダス・ネカトールに関して実証されている（Li et al., Biodegradation, 2011, 22, 1215-1225）。
【０１６５】
いくつかの態様において、非生物学的供給原料は、天然ガス、合成ガス、CO2/H2、メタノール、エタノール、シクロヘキサン酸化プロセスからの不揮発性残渣（NVR）または苛性洗浄液の廃液流であるかまたはそれらに由来する。
【０１６６】
メタノールの効率的な異化作用が、メチロトローフ酵母であるピキア・パストリスに関して実証されている。
【０１６７】
エタノールの効率的な異化作用が、クロストリジウム・クライベリに関して実証されている（Seedorf et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2008, 105(6) 2128-2133）。
【０１６８】
天然ガスならびに他の化学的および石油化学的供給源に由来し得るCO2およびH2の効率的な異化作用が、カプリアビダス・ネカトールに関して実証されている（Prybylski et al., Energy, Sustainability and Society, 2012, 2:11）。
【０１６９】
合成ガスの効率的な異化作用が、クロストリジウム・ルジュングダーリおよびクロストリジウム・オートエタノゲナムなどの数多くの微生物に関して実証されている（Kopke et al., Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(15), 5467-5475）。
【０１７０】
シクロヘキサンプロセスからの不揮発性残渣廃液流の効率的な異化作用が、デルフチア・アシドボランスおよびカプリアビダス・ネカトールなどの数多くの微生物に関して実証されている（Ramsay et al., Applied and Environmental Microbiology, 1986, 52(1), 152-156）。
【０１７１】
いくつかの態様において、宿主微生物は原核生物である。たとえば、当該原核生物は、大腸菌などのエシェリキア属；クロストリジウム・ルジュングダーリ、クロストリジウム・オートエタノゲナムもしくはクロストリジウム・クライベリなどのクロストリジウム属；コリネバクテリウム・グルタミクムなどのコリネバクテリウム属；カプリアビダス・ネカトールもしくはカプリアビダス・メタリデュランスなどのカプリアビダス属；シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・プチダもしくはシュードモナス・オレオボランスなどのシュードモナス属；デルフチア・アシドボランスなどのデルフチア属；バシラス・サブティリスなどのBacillus属；デルブリュッキ菌などのラクトバシラス属；またはラクトコッカス・ラクティスなどのラクトコッカス属に由来し得る。そのような原核生物はまた、ブタジエンを生成できる、本明細書に記載される組換え宿主細胞を構成するための遺伝子の供給源であってもよい。
【０１７２】
いくつかの態様において、宿主微生物は真核生物である。たとえば、当該真核生物は、アスペルギルス・ニガーなどのアスペルギルス属；サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属；ピキア・パストリスなどのピキア属；ヤロウイア・リポリティカなどのヤロウイア属；イサタケンキア・オリエンタリスなどのイサタケンキア属；デバリオマイセス・ハンセニイなどのデバリオマイセス属；アークスラ・アデニニボランスなどのアークスラ属；またはクルイベロミセス・ラクチスなどのクルイベロミセス属に由来し得る。そのような真核生物はまた、ブタジエンを生成できる、本明細書に記載される組換え宿主細胞を構成するための遺伝子の供給源であってもよい。
【０１７３】
4.5  代謝工学
本明細書は、上記経路すべてに関して記載した工程の全てより少ない工程を含む方法を提供する。そのような方法は、たとえば、そのような工程の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれらより多くを含むことができる。全工程よりは少ない工程がそのような方法に含まれる場合、第一の工程は上記工程の任意の1つであってもよい。
【０１７４】
さらに、本明細書に記載される組換え宿主は、工程の1つまたは複数、たとえばそのような工程の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれらより多くを組換え宿主内で実施できるような上記酵素の任意の組み合わせを含むことができる。
【０１７５】
加えて、本明細書は、酵素がCoAにより活性化された基質を受容するものとして記載されている場合、必ずしも同じ酵素クラスには属さない、[acp]と結合した基質に関連する類似の酵素活性が存在することを認める。
【０１７６】
また、本明細書は、酵素が基質の（R）エナンチオマーを受容するものとして記載されている場合、必ずしも同じ酵素クラスには属さない、（S）エナンチオマー基質に関連する類似の酵素活性が存在することを認める。
【０１７７】
本明細書はまた、酵素が特定の補因子（たとえばNADPH）または補助基質（たとえばアセチルCoA）を受容するものとして示されている場合、多くの酵素が、特定の酵素活性の触媒について多数の異なる補因子または補助基質を受容するという点で非特異的であることを認める。また、本明細書は、酵素がたとえばNADHなどの特定の補因子に対して高い特異性を有する場合、補因子NADPHに対して高い特異性を有する類似または同一の活性を有する酵素が異なる酵素クラスに属し得ることを認める。
【０１７８】
いくつかの態様において、セクション4.3に概説した経路における酵素は、活性を改善する、特異性を改善する、フィードバック阻害を減らす、抑圧を減らす、酵素可溶性を改善する、立体特異性を変化させる、または補因子特異性を変化させる目的での非直接的または合理的な酵素設計手法による酵素工学の結果である。
【０１７９】
いくつかの態様において、セクション4.3に概説した経路における酵素は、エピソームまたは染色体組込み手法によって得られる遺伝子的に改変された生物中に遺伝子導入される、すなわち過剰発現される。
【０１８０】
いくつかの態様においては、ゲノムスケールのシステム生物学技術、たとえばフラックスバランス解析を利用して、炭素フラックスをブタジエンに向けるためのゲノムスケールの減弱戦略またはノックアウト戦略が考案される。
【０１８１】
減弱戦略は、トランスポゾンの使用、相同組換え（二重交叉手法）、突然変異誘発、酵素阻害体およびRNAi干渉を含むが、これらに限定されない。
【０１８２】
いくつかの態様においては、フラクソーム、メタボロームおよびトランスクリプトームデータを利用して、ゲノムスケールのシステム生物学技術に情報を与えて、またはそれを支援して、それにより、炭素フラックスをブタジエンに向ける上でのゲノムスケールの減弱戦略またはノックアウト戦略が考案される。
【０１８３】
ブタジエン合成のために細胞内でプロパノイルCoAまたはプロペノイルCoAを利用できることを要するいくつかの態様においては、プロピオニルCoAおよびアセチルCoAの加水分解を触媒する酵素が宿主生物中で減弱されていてもよい。
【０１８４】
ブタジエン合成のために細胞内でプロパノイルCoAまたはプロペノイルCoAを利用できることを要するいくつかの態様においては、メチルクエン酸回路を介してプロパノイルCoAを消費する酵素が宿主生物中で減弱されている（Upton and Mckinney, Microbiology, 2007, 153, 3973-3982）。
【０１８５】
ブタジエン合成のために細胞内でプロパノイルCoAまたはプロペノイルCoAを利用できることを要するいくつかの態様においては、プロパノイルCoAを消費してピルビン酸にする酵素が宿主生物中で減弱されている。
【０１８６】
ブタジエン合成のために細胞内でプロパノイルCoAまたはプロペノイルCoAを利用できることを要するいくつかの態様においては、プロパノイルCoAを消費してマロニルCoAにする酵素が宿主生物中で減弱されている。
【０１８７】
ブタジエン合成のために細胞内で（主要な代謝産物としてのL-トレオニンを経て）プロパノイルCoAまたはプロペノイルCoAを利用できることを要するいくつかの態様においては、フィードバック耐性トレオニンデアミナーゼが遺伝子操作により宿主生物中に組み込まれる（Tseng et al., Microbial Cell Factories, 2010, 9:96）。
【０１８８】
ブタジエン合成のためにアセチルCoAおよびプロパノイルCoA/プロペノイルCoAの縮合を要するいくつかの態様においては、アセチルCoAを縮合させてアセトアセチルCoAにするのを触媒するβ-ケトチオラーゼ（たとえばAtoBまたはphaAの遺伝子産物）が減弱されていてもよい。
【０１８９】
ポリヒドロキシアルカノアート類を自然に蓄積する宿主を用いるいくつかの態様においては、ポリマーシンターゼ酵素が宿主株中で減弱されていてもよい。
【０１９０】
ブタジエン合成のために細胞内でアセチルCoAを利用できることを要するいくつかの態様においては、酢酸合成経路において1つまたは複数の酵素を欠損している（たとえばその活性レベルが低下した）宿主を使用できる。たとえば、ホスホトランスアセチラーゼ（pta遺伝子によってコードされる）を欠損している宿主を使用できる（Shen et al., Appl. Environ. Microbio., 2011, 77(9), 2905-2915）。
【０１９１】
ブタジエン合成のために細胞内でアセチルCoAを利用できることを要するいくつかの態様においては、ackなどの酢酸キナーゼをコードする、酢酸合成経路中の遺伝子が減弱されている。
【０１９２】
ブタジエン合成のために細胞内でアセチルCoAを利用できることを要するいくつかの態様においては、ピルビン酸の乳酸への分解をコードする遺伝子（たとえばldhA）が減弱されている（Shen et al., Appl. Environ. Microbio., 2011, 77(9), 2905-2915）。
【０１９３】
ブタジエン合成のために細胞内でアセチルCoAを利用できることを要するいくつかの態様においては、ホスホエノールピルビン酸のコハク酸への分解をコードする遺伝子（たとえばfrdBC）が減弱されている（たとえば、前記Shen et al., 2011を参照）。
【０１９４】
ブタジエン合成のために細胞内でアセチルCoAを利用できることを要するいくつかの態様においては、アセチルCoAのエタノールへの分解をコードする遺伝子、たとえばadhEが減弱されている（前記Shen et al., 2011）。
【０１９５】
ブタジエン合成のために細胞内でL-グルタミン酸を利用できることを要するいくつかの態様においては、クエン酸回路中間体を補充する補充反応を触媒する酵素が増幅される。
【０１９６】
MDDを用いて第二のビニル基を酵素的に形成してブタジエンとするいくつかの態様においては、tesBのチオエステラーゼII遺伝子産物が（R）-3-ヒドロキシペンタ-4-エノイルCoAを（R）-3-ヒドロキシペンタ-4-エノアートへと加水分解する。
【０１９７】
ブタジエンの合成において経路が過剰なNADPH補因子を要するいくつかの態様においては、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子（たとえばUdhA）が宿主生物中で過剰発現される（Brigham et al., Advanced Biofuels and Bioproducts, 2012, Chapter 39, 1065-1090）。
【０１９８】
ブタジエンの合成において経路が過剰なNADPH補因子を要するいくつかの態様においては、グリセルアルデヒド-3P-デヒドロゲナーゼ遺伝子（たとえばGapN）が宿主生物中で過剰発現される（前記Brigham et al., 2012）。
【０１９９】
ブタジエンの合成において経路が過剰なNADPH補因子を要するいくつかの態様においては、リンゴ酸酵素遺伝子（たとえばmaeAまたはmaeB）が宿主生物中で過剰発現される（前記Brigham et al., 2012）。
【０２００】
ブタジエンの合成において経路が過剰なNADPH補因子を要するいくつかの態様においては、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（たとえばzwf）が宿主生物中で過剰発現される（Lim et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002, 93(6), 543-549）。
【０２０１】
ブタジエンの合成において経路が過剰なNADPH補因子を要するいくつかの態様においては、フルクトース1,6-ジホスファターゼ遺伝子（たとえばfbp）が宿主生物中で過剰発現される（Becker et al., Journal of Biotechnology, 2007, 132, 99-109）。
【０２０２】
いくつかの態様においては、ブタジエンが細胞膜を横切って細胞外培地へと流出することが、細胞膜への構造的修飾を遺伝子操作することによって、または、ブタジエンの任意の関連するトランスポーター活性を増大させることによって増強または増大される。
【０２０３】
いくつかの態様においては、ブタジエンを毒性中間体、たとえば1,2-エポキシ-3-ブテンおよび1,2:3,4-ジエポキシブタンへと分解するオキシゲナーゼが宿主生物中で減弱されている（たとえば、Sweeney et al., Carcinogenesis, 1997, 18(4), 611-625を参照）。
【０２０４】
特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定するものではない以下の実施例において本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０２０５】
実施例1
3-ヒドロキシペンタ-4-エン酸を基質として受容するメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼの酵素活性
サッカロマイセス・セレビシエ、表皮ブドウ球菌、および肺炎球菌に由来するhisタグ化MDD遺伝子をクローニングし、ルリアブロス培地を含む振盪フラスコ培養にて大腸菌中で発現させた。
【０２０６】
発現誘導された振盪フラスコ培養物それぞれから遠心分離によってペレットを収集し、次いでそのペレットを再懸濁させて溶解した。遠心分離によって上清みから細胞片を分離し、0.2μmフィルタを用いて濾過した。Niアフィニティークロマトグラフィーを用いて上清みからMDD酵素を精製し、濃縮し、10kDaポリエーテルスルホン膜を用いる限外濾過により、50 mMトリスバッファー（pH=7.5）、100 mM NaClおよび5％（v/v）グリセロール中にバッファー交換した。
【０２０７】
50 mMトリスHCl（pH=7.5）、100 mM NaCl、5％（v/v）グリセロール、10 mM MgCl2、15 mM ATPおよび5 mM 天然基質メバロン酸二リン酸（Sigma Aldrich製）で構成された30℃のバッファー中で天然酵素活性を確認した。基質を含有するアッセイバッファーに各精製MDD酵素10μLを加えることによって酵素活性アッセイ反応を開始した。LC-MSによって確認した通り、3つのMDD酵素すべてがメバロン酸二リン酸を基質として受容した。
【０２０８】
50 mMトリスHCl（pH=7.5）、100 mM NaCl、5％（v/v）グリセロール、10 mM MgCl2、15 mM ATPおよび4 mM 非天然ラセミ基質3-ヒドロキシペンタ-4-エン酸（純度>95％、Epison Chimie製）で構成された30℃のバッファー中で非天然酵素活性アッセイを実施した。2 mLの隔膜封止バイアル中で非天然活性アッセイを実施し、それにより、ブタジエンがヘッドスペース中に蓄積するようにした。基質を含有するアッセイバッファーに各精製MDD酵素バリアント10μLを加えることによって反応を開始した。
【０２０９】
サッカロマイセス・セレビシエ、表皮ブドウ球菌、および肺炎球菌に由来する3つのMDD酵素は、3-ヒドロキシペンタ-4-エン酸を基質として用いる非天然酵素活性アッセイの場合で類似したクロマトグラムおよびスペクトルを示した。[23]ブタジエン標準およびアッセイサンプルについての保持時間は2％以内であった。ブタジエン標準由来のMSイオンピーク面積とサンプルのMSイオンピーク面積との比は20％以内で一致する。また、イオンピーク面積はGC/MSの定量限界よりも上であった。
【０２１０】
サッカロマイセス・セレビシエ、表皮ブドウ球菌、および肺炎球菌に由来するMDD酵素は、3-ヒドロキシペンタ-4-エン酸を基質として受容してブタジエンを合成した。
【０２１１】
実施例2
3-ヒドロキシペンタ-4-エン酸を基質として受容するメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼの活性を高めるアミノ酸残基
図13は、サッカロマイセス・セレビシエ、表皮ブドウ球菌、および肺炎球菌に由来するMDD酵素のアミノ酸配列を示しており、酵素の触媒クレフト内の保存された残基を太字で示している。
【０２１２】
デンシトメトリーからの全タンパク質濃度および純度を用いると、サッカロマイセス・セレビシエに由来する精製MDDの酵素濃度は385μg/mLであり、肺炎球菌に由来する精製MDDの酵素濃度は88μg/mLであった。
【０２１３】
非天然基質としての3-ヒドロキシペンタ-4-エン酸の不完全な変換を考慮すると、サッカロマイセス・セレビシエに由来するMDDの比変換率は809［（m/z 54イオンのピーク面積）/（μg MDD）］であり、肺炎球菌に由来するMDDの比変換率は3200［（m/z 54イオンのピーク面積）/（μg MDD）］であった。したがって、肺炎球菌に由来するMDDの比変換率は、サッカロマイセス・セレビシエに由来するMDDの比変換率の約4倍の大きさである。表皮ブドウ球菌に由来するMDDの比変換率は、肺炎球菌に由来するMDDの比変換率とサッカロマイセス・セレビシエに由来するMDDの比変換率との間である（計算せず）。
【０２１４】
触媒アルギニン残基（サッカロマイセス・セレビシエの場合のR158、表皮ブドウ球菌の場合のR144、および肺炎球菌の場合のR144）の領域中のアミノ酸残基は、5つのアミノ酸残基内でセリン密度が上昇している傾向を明らかにする。サッカロマイセス・セレビシエの場合のR158は5つのアミノ酸残基内に3つのセリン残基（残基153、155および159）を有し、表皮ブドウ球菌の場合のR144は5つのアミノ酸残基内に4つのセリン残基（残基139、141、143および145）を有し、肺炎球菌の場合のR144は5つのアミノ酸残基内に5つのセリン残基（残基139、141、142、143および145）を有する。たとえば図13を参照のこと。
【０２１５】
3-ヒドロキシペンタ-4-エン酸を非天然基質として受容するMDDの活性は、触媒クレフトの触媒アルギニン残基の領域内のセリン密度が高まるとともに増大する。
【０２１６】
実施例3
トランス-2-ブテニルピロリン酸を基質として受容するイソプレンシンターゼの酵素活性
ギンドロ（Populus alba）に由来するhisタグ化イソプレンシンターゼ（ISPS）遺伝子をクローニングし、ルリアブロス培地を含む振盪フラスコ培養にて大腸菌中で発現させた。
【０２１７】
発現誘導された振盪フラスコ培養物それぞれから遠心分離によってペレットを収集し、次いでそのペレットを再懸濁させ、溶解した。遠心分離によって上清みから細胞片を分離し、0.2μmフィルタに通して濾過した。Niアフィニティークロマトグラフィーを用いて上清みからISPS酵素変異体を精製し、濃縮し、10kDaポリエーテルスルホン膜を用いて50 mMトリスバッファー（pH=7.5）、100 mM NaClおよび5％（v/v）グリセロール中にバッファー交換した。
【０２１８】
50 mMトリスHCl（pH=7.5）、100 mM NaCl、5％（v/v）グリセロール、20 mM MgCl2およびSigma Aldrichからの天然基質ジメチルアリル二リン酸5 mMで構成された30℃のバッファー中で天然酵素活性を確認した。2 mLの隔膜封止バイアル中で天然活性アッセイを実施して、それにより、イソプレンがヘッドスペース中に蓄積するようにした。基質を含有するアッセイバッファーに各精製ISPS酵素10μLを加えることによって酵素活性アッセイ反応を開始した。GC-MSによって確認した通り、ギンドロに由来するISPSはジメチルアリル二リン酸を基質として受容した。
【０２１９】
50 mMトリスHCl（pH=7.5）、100 mM NaCl、5％（v/v）グリセロール、20 mM MgCl2およびDALTON Pharma Servicesからの非天然基質トランス-2-ブテニルピロリン酸（純度>90％）5 mMで構成された30℃のバッファー中で非天然酵素活性アッセイを実施した。2mLの隔膜封止バイアル中で非天然活性アッセイを実施して、それにより、ブタジエンがヘッドスペース中に蓄積するようにした。基質を含有するアッセイバッファーに精製ISPS酵素10μLを加えることによって酵素活性アッセイ反応を開始した。
【０２２０】
ブタジエン標準およびアッセイサンプルの場合の保持時間は2％以内であった。ブタジエン標準に由来するMSイオンピーク面積とサンプルのMSイオンピーク面積との比は20％以内で一致する。また、イオンピーク面積はGC/MSの定量限界よりも上であった。
【０２２１】
ギンドロに由来するISPS酵素はトランス-2-ブテニルピロリン酸を基質として受容してブタジエンを合成した。
【０２２２】
実施例4
3-ブテン-2-オールを基質として用いるリナロールデヒドラターゼの酵素活性
カステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）に由来するhisタグ化リナロールデヒドラターゼ（EC 4.2.1.127）をpARZ4ベクター中にクローニングし、大腸菌BL21中に形質転換した。得られた株を、ルリアブロス培地およびカナマイシン選択圧を含む振盪フラスコ培養にて1 [M] IPTG（イソプロピルチオ-β-ガラクトシド）を用いて培養および発現誘導を行った。
【０２２３】
発現誘導された振盪フラスコ培養物それぞれから遠心分離によって細胞を収集およびペレット化した。細胞ペレットを再懸濁させ、細胞を溶解した。遠心分離によって上清みから細胞片を分離し、0.2μmフィルタを用いて濾過した。濾過した上清みからNiアフィニティークロマトグラフィーを用いて酵素を精製し、濃縮し、Vivaspin 15R遠心濃縮器およびHi-trap脱塩カラムを用いて80 mMトリスバッファー（pH=9）中にバッファー交換した。
【０２２４】
11 mMの3-ブテン-2-オールを含む25℃のバッファー中で非天然酵素活性アッセイを実施した。2 mLの隔膜封止バイアル中で活性アッセイを実施して、それにより、ブタジエンがヘッドスペース中に蓄積するようにした。基質を含有するアッセイバッファーに精製酵素1 mLを加えることによって反応を開始した。
【０２２５】
GC-MS（ガスクロマトグラフィー質量分析法）によるブタジエン分析のためにヘッドスペースからサンプルを抽出した。ブタジエン標準およびアッセイサンプルの場合の保持時間は2％以内であった。ブタジエン標準に由来するMSイオンピーク面積とサンプルのMSイオンピーク面積との比は20％以内で一致する。また、イオンピーク面積はGC-MSの定量限界よりも上であった。
【０２２６】
これらの発見は、リナロールデヒドラターゼ（EC 4.2.1.127）が3-ブテン-2-オールを基質として受容し、それによってブタジエンを合成することを示す。
【０２２７】
他の態様
本発明をその詳細な説明に関連して説明したが、前記詳細な説明は、例を示すことを意図したものであり、特許請求の範囲によって決定される本発明の範囲を限定することを意図したものではない。他の局面、利点および変形が以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
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【図２−１】
2015519083.tif 000005
【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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