(57)【要約】本発明は、患者の関節リウマチの状態、または関節リウマチの進行、または関節リウマチ患者に適した治療、を決定する方法であって、以下のステップ：（ａ）該患者由来のサンプル中のテネイシンＣのレベルの決定すること；および（ｂ）ステップ（ａ）で決定したテネイシンＣのレベルを１以上の参照値と比較することを含んでなる方法を提供する。好ましくは、関節リウマチはびらん性関節リウマチを指す。
2015503106.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の関節リウマチの状態を決定する方法であって、以下のステップ：
（ａ）該患者由来のサンプル中のテネイシンＣのレベルの決定すること；および
（ｂ）ステップ（ａ）で決定したテネイシンＣのレベルを１以上の参照値と比較すること
を含んでなる方法。
【請求項２】
患者における関節リウマチの進行または特定の治療に対する関節リウマチの応答を決定する方法であって、以下のステップ：：
（ａ）該患者由来のサンプル中のテネイシンＣのレベルの決定すること；および
（ｂ）ステップ（ａ）で決定したテネイシンＣのレベルを１以上の参照値と比較すること
を含んでなる方法。
【請求項３】
関節リウマチ患者に適した治療を決定するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）該患者由来のサンプル中のテネイシンＣのレベルの決定すること；および
（ｂ）ステップ（ａ）で決定したテネイシンＣのレベルを１以上の参照値と比較すること
（ｃ）（ｂ）の結果を用いて最も適切な治療を決定すること
を含んでなる方法。
【請求項４】
関節リウマチがびらん性関節リウマチである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
関節リウマチ患者がびらん性関節リウマチを有しているかどうかの決定または診断に使用するための請求項１記載の方法。
【請求項６】
サンプルが、全血、血清または血漿などの血液サンプルである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
参照レベルと比較してサンプル中のテネイシンＣの約５０％以上の増加で、炎症性障害、例えば、関節リウマチ、および特にびらん性関節リウマチと診断される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記参照レベルが正常サンプルにおけるレベルである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
テネイシンＣが血清１ｍｌ当たり３３ｎｇを超えるレベルで、関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチと診断される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
テネイシンＣが血清１ｍｌ当たり３１ｎｇを超えるレベルで、関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチと診断される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
正常な被験者におけるレベルと比較して患者からのサンプル中のテネイシンＣのレベルの増加が、抗ＴＮＦ薬を使用することが適当でないことを示す、請求項３記載の方法。
【請求項１２】
正常な被験者におけるレベルと比較して患者からのサンプル中のテネイシンＣのレベルの増加が、抗ＩＬ１７療法かまたは別の非抗ＴＮＦ療法を使用することが適当であることを示す、請求項３記載の方法。
【請求項１３】
サンプル中のテネイシンＣのレベルが、血清中少なくとも３１ng／mLまたは３３ng／mLである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
インビトロで行われる請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
患者が哺乳動物である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物がヒトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
患者によって提供されたサンプル中のテネイシンＣのレベルを決定するための少なくとも１つの薬剤を含む、患者のびらん性関節リウマチの状態の決定に使用するためのキット。
【請求項１８】
前記薬剤が抗体である、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
ラベルまたは折り込みの形態で適切な操作パラメータに関する説明書をさらに含んでなる、請求項１７または１８記載のキット。
【請求項２０】
較正および比較のための標準として用いられる１以上のテネイシンＣのサンプルをさらに含んでなる、請求項１７〜１９のいずれかに記載のキット。
【請求項２１】
びらん性関節リウマチの血清バイオマーカーとしてのテネイシンＣの使用。
【請求項２２】
個人におけるびらん性関節リウマチの状態を評価する手段としての、血液または血清サンプル中のテネイシンＣのレベルの決定の使用。
【請求項２３】
個人における、関節リウマチの状態、特にびらん性関節リウマチの状態を評価する手段としての、血液または血清サンプル中のテネイシンＣのレベルの決定の使用。
【請求項２４】
患者からのサンプル中のテネイシンＣのレベルの決定および炎症性治療の投与、および特に、観察されたテネイシンＣのレベルに基づく関節リウマチまたはびらん性関節リウマチの治療、の投与を含んでなる、リウマチ性関節炎、特にびらん性関節リウマチなどの、患者における炎症状態を治療する方法。
【請求項２５】
関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチを治療する方法であって、患者からのサンプル中のテネイシンＣのレベルの決定、およびテネイシンＣのレベルが参照サンプル中のレベルよりも高いが、３３ng／mL未満、好ましくは３１ng／mL未満である場合、抗ＴＮＦ療法を投与することを含む方法。
【請求項２６】
関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチを治療する方法であって、患者からのサンプル中のテネイシンＣのレベルの決定、およびテネイシンＣのレベルが３１ng／mLを超える、好ましくは３３ng／mLを超える場合、抗ＴＮＦ療法でない療法を投与することを含む方法。
【請求項２７】
実施例および図面を参照して実質的に明細書に記載された方法。
【請求項２８】
実施例および図面を参照して実質的に明細書に記載された使用。
【請求項２９】
実施例および図面を参照して実質的に明細書に記載された使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性疾患のためのバイオマーカーとしての、特に関節リウマチのための血清バイオマーカーとしてのテネイシンＣの使用に関する。特に、本発明は、びらん性関節リウマチ（erosive rheumatoid arthritis）のためのバイオマーカーとしてのテネイシンＣの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
テネイシンＣは、パターン認識受容体TLR4の活性化により初代ヒトマクロファージおよび滑膜線維芽細胞における炎症性サイトカイン合成を誘導する、炎症誘発性細胞外マトリックス糖タンパク質である（Midwood et al (2009) Nat. Med. 15: 774-780）。テネイシンＣは分子量1,500,000Ｄａの大きな六量体のタンパク質である。例えば慢性関節リウマチ患者の滑液や腫瘍間質において高レベルのテネイシンＣがみられる。
【０００３】
関節リウマチは、長期の炎症、腫れ、複数の関節の痛みを特徴とする慢性疾患である。慢性的な炎症が時間とともに関節内の骨の破壊および進行性の障害につながる。関節リウマチの１つの顕著な特徴は、その臨床症状の幅広い多様性である。多様性は、疼痛のレベル、腫脹関節の数と関節の変形の程度にまで及ぶ。同様に、ある特定の医学療法に対する関節リウマチ患者の応答もまた広く様々で、疾患の兆候や症状がほぼなくなる患者もいれば、ほとんど応答しない患者もいる。
【０００４】
関節リウマチの現在の診断法は、米国リウマチ学会によって設立された、以下の項目で構成されるものである：
１）朝のこわばりが１時間以上続く（主に指）；
２）３か所以上の関節の腫れ；
３）手（手首、中手指節関節と近位指節間関節）の関節の腫れ；
４）左右対称の関節（左右の関節）の腫れ；
５）手のＸ線写真の異常所見；
６）皮下結節；および
７）リウマチに関するＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白質）または抗ＣＣＰ（抗環状シトルリン化ペプチド）の血液検査による陽性
上記の４つを超える項目が該当する場合、関節リウマチと診断される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチの同定に便利に用いることができる、代わりとなるマーカー、診断剤および検出方法を提供することである。
【０００６】
びらん性関節リウマチは、関節リウマチ患者における身体障害の主な原因であり、骨量の減少および関節骨の局所的崩壊によって特徴付けられる。
【０００７】
生検による病変の直接的な評価が実用的であることは非常にまれであるので、骨びらんの判定は、ほぼ専らＸ線所見、超音波やドップラー法での試験に基づいている。用語「骨びらん」は一般的に皮質ライニングにおける不連続を伴う傍関節部位でのミネラル組織の喪失を記述するものである。骨びらんは、疾患の初期から始まり、最初の１年で最も急速に進行するので、びらん性関節リウマチを迅速に検出し治療することができれば、非常に有益であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第一の態様によれば、本発明は、以下のステップを含む、患者の炎症性疾患の状態を決定する方法を提供する。 
（ａ）該患者由来のサンプル中のテネイシンＣのレベルの決定し；および
（ｂ）ステップ（ａ）で決定したテネイシンＣのレベルを１以上の参照値と比較する。
【０００９】
炎症性障害は、関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、狼瘡および筋炎の１以上でありうる。好ましくは、炎症性疾患は、関節リウマチであり、特にびらん性関節リウマチである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
好ましい実施形態において、本方法は、患者の関節リウマチ状態、およびより好ましくは、患者のびらん性関節リウマチの状態を決定するために使用される。びらん性関節リウマチは、関節の骨の少なくとも１つのびらん性病変、好ましくは少なくとも５つの病変、好ましくは少なくとも１０個の病変、好ましくは少なくとも２０個の病変が存在する、関節リウマチと定義される。病変の数が多いほどより重度のびらん性関節リウマチである。
【００１１】
本発明の方法は、既に慢性関節リウマチであると診断された患者のびらん性関節リウマチの状態を決定するために使用され得る。好ましくは、本発明の方法は、関節リウマチ患者のびらん性関節リウマチの状態を簡単に非侵襲的にかつ安価に調べる方法を提供する。
【００１２】
サンプルは、全血サンプル、血漿または血清などの血液サンプルであってよい。別の実施形態では、サンプルは尿であってよい。好ましくは、試料は血清サンプルである。
【００１３】
好ましくは、本方法は、患者がびらん性関節リウマチを有するかどうかを決定するために用いられる。
【００１４】
テネイシンＣは、炎症性疾患、特に関節リウマチ、及びより具体的にはびらん性リウマチ性関節炎の新規な血清バイオマーカーである。
【００１５】
ヒトテネイシンＣのタンパク質配列は、アクセッション番号Ｐ２４８２１を用いてＧｅｎＢａｎｋで見つけることができ、アミノ酸配列は図８に示される。
【００１６】
本発明の方法ではテネイシンＣのあらゆる形態を測定しうる。好ましくは、少なくともテネイシンＣの３２０ｋＤａのアイソフォームが測定される。好ましくは、テネイシンＣの３２０ｋＤａアイソフォームのみが測定される。
【００１７】
用語「炎症性障害の状態」には、炎症性障害の任意の識別可能な症状が含まれる。例えば、炎症性疾患の状態には、炎症性疾患の存在または非存在、炎症性疾患を発症する危険性、炎症性疾患のステージ、炎症性疾患の進行、および炎症性疾患の治療に対する患者の有効性または応答が含まれるがこれらに限定されない。
【００１８】
本発明の方法は、例えば、以下の任意の１以上のために用いることができる：患者における炎症性障害を診断すること；患者が炎症性障害を発症する可能性を評価すること；炎症性障害を有する患者の予後について助言すること；疾患の進行をモニターすること；および炎症性障害のための治療に対する患者の有効性または応答をモニターすること。
【００１９】
好ましくは、本方法は、患者が提供するサンプル中のテネイシンＣのレベルの分析から、患者における炎症性障害の診断が可能である。
【００２０】
用語「関節リウマチの状態」には、任意の識別可能な症状が含まれる。例えば、関節リウマチの状態には、関節リウマチの存在または非存在、関節リウマチを発症する危険性、関節リウマチのステージ、関節リウマチの進行、および関節リウマチの治療に対する患者の有効性または応答が含まれるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、関節リウマチの状態は、びらん性関節リウマチの有無を指す。
【００２１】
本発明の方法は、例えば、以下の任意の１以上のために用いることができる：患者における関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチを診断すること；患者が関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチを発症する可能性を評価すること；関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチを有する患者の予後について助言すること；疾患の進行、特にびらん性関節リウマチの進行をモニターすること；および関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチのための治療に対する患者の有効性または応答をモニターすること。
【００２２】
好ましくは、この方法は、患者によって提供されたサンプル中のテネイシンＣのレベルの分析から、患者における関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチの診断が可能である。
【００２３】
サンプル中のテネイシンＣの存在のレベルは、イムノアッセイ、分光分析、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、スロットまたはドットブロットアッセイ、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗体マイクロアレイ免疫組織染色、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ、アビジン−ビオチン又はストレプトアビジン−ビオチン系を用いるイムノアッセイなど、またはそれらの組み合わせを含む群のいずれかの使用を含みうる任意の適切なアッセイによって決定することができる。これらの方法は、当業者に周知である。
【００２４】
あるいは、テネイシンＣのレベルは、サンプル中のテネイシンＣmRNAレベルを決定することによって測定することができる。mRNAレベルは、ＰＣＴまたは任意の他の適当な技術によって測定することができる。
【００２５】
好ましくは、それに対してテネイシンＣの測定されたレベルが比較されるところの参照値は、関節リウマチ等のいかなる検出可能な炎症性疾患、または関節リウマチ等の炎症性障害のいかなる臨床症状も有しない１以上の患者において観察されるテネイシンＣのレベルであり、いわば、バイオマーカーテネイシンＣの「正常値」と呼ばれるものである。
【００２６】
好ましくは、正常な組織サンプルにおけるレベルと比較して、サンプル中のテネイシンＣの約５０％以上の増加は、炎症性疾患、例えば関節リウマチの診断、および特にびらん性関節リウマチと診断される。
【００２７】
好ましくは、血清または血漿の１ｍｌあたりテネイシンＣのレベルが、３１ｎｇ、好ましくは３３ｎｇを超えるレベルは、慢性関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチ、と診断されるかまたは少なくともその指標となる。好ましくは、テネイシンＣのレベルを他のマーカーと組み合わせは、関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチの診断を可能にするものである。
【００２８】
あるいは、参照値は、特定の患者について得られた以前の値であってもよい。この種の参照値は、本方法が特定の処置に対する患者の応答をモニターするために使用される場合に用いることができる。
【００２９】
好ましくは、正常／非疾患参照レベルと比較して、テネイシンＣのレベルの増加は、関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチの指標かまたは診断とされる。
【００３０】
テネイシンＣのレベルは、関節リウマチ患者をびらん性関節リウマチを有する患者とそうでない患者に分類するために用いることができる。
【００３１】
本発明の方法はまた、関節リウマチの進行および特にびらん性関節リウマチの進行および／または患者に投与した治療の有効性をモニターするために使用することができる。これは、最初の診断の後、種々の時点で患者から採取したサンプルを分析し、テネイシンＣのレベルの変化をモニターし、正常および／または参照値とこれらのレベルを比較することによって達成することができる。この場合、参照レベルは、その患者における最初のバイオマーカーレベル、またはその患者の前回試験のバイオマーカーレベル、またはその両方を含み得る。
【００３２】
本発明の方法はまた、患者に適切な治療法を決定するために使用することができる。この方法は、個人向けの薬物療法を提供するために用いることができる。一実施形態では、リウマチ性関節炎などの炎症状態と診断するのに十分なサンプル中の増加したテネイシンＣレベルは、その患者には有効でないとみられる抗ＴＮＦ薬を使用することは適切ではないことを示すのに用いられ得る。別の治療法、例えば、抗ＩＬ１７療法、Ｔ細胞共刺激モジュレーター（例えばOrencia（登録商標）−アバタセプト）：インターロイキン−６（ＩＬ−６）阻害剤（例えばActemra（登録商標）−トシリズマブ）；抗ＣＤ２０抗体（そのようなRituxan（登録商標）−リツキスマブ；またはB細胞活性化因子（例えば抗BAFF）等、を行うことがより適切であるかもしれない。他の代替療法には、janusキナーゼ（JAK）の阻害剤（例えばTofacitinib（登録商標）や脾臓チロシンキナーゼの阻害剤（Syk）（例えばFostamatinib（登録商標））が挙げられる。
【００３３】
一実施形態において、本発明は、抗ＴＮＦ療法が、関節リウマチを有する患者のための適切な治療であるかどうかを決定する方法を提供する。より具体的には、関節リウマチの患者の血漿または血清１ｍｌ中のテネイシンＣのレベルが少なくとも３１ｎｇ、または少なくとも３３ｎｇである場合には、その患者は抗ＴＮＦ療法に応答する可能性は低い。
【００３４】
好ましくは、本発明の方法はインビトロで実施される。
【００３５】
患者は、哺乳類、好ましくはヒトであるが、サル（monkey）、類人猿（ape）、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ウサギまたは齧歯類であってもよい。
【００３６】
さらなる態様によれば、本発明は、関節リウマチ患者のびらん性関節リウマチの状態を決定する方法であって：
（ａ）該患者由来のサンプル中のテネイシンＣのレベルの決定すること；および
（ｂ）ステップ（a）で決定したテネイシンＣのレベルを１以上の参照値と比較すること
を含んでなる方法を提供する。
【００３７】
好ましくは、サンプルは血清サンプルまたは血漿サンプルである。好ましくは、サンプル中のテネイシンＣのレベルは、サンプル１ｍｌ当たり、少なくとも３１ｎｇ、または少なくとも３３ｎｇである。好ましくは、参照値は、関節リウマチを有さない患者からの血漿または血清サンプル中のテネイシンＣの値である。当業者であれば、上記で言及した全ての好ましい特徴はまた、本発明のこの態様およびすべての態様に適用することができることを理解する。
【００３８】
本発明の別の態様によれば、患者によって提供されたサンプル中のテネイシンＣのレベルを決定するための少なくとも１つの薬剤を含む、患者の炎症性疾患の状態の決定に使用するためのキットが提供される。
【００３９】
好ましい実施形態では、本キットは、患者の関節リウマチの状態、特にびらん性関節リウマチ状態の決定において使用するためのものであり、患者によって提供されるサンプル中のテネイシンＣのレベルを決定するための少なくとも１つの薬剤を含む。
【００４０】
本薬剤は、抗体であってもよい。
【００４１】
本キットは、ラベルまたは折り込みの形態で、適切な操作パラメータに関する説明書を含んでいてもよい。説明書は、サンプルの採取方法について消費者に知らせるものであってもよい。
【００４２】
本キットには、較正および比較のための標準として使用する１つ以上のテネイシンＣのサンプルが含まれていてもよい。また、キットには、サンプル中に検出されたテネイシンＣのレベルを校正サンプルと比較するための説明書またはチャートが含まれていてもよい。さらに、キットには、テネイシンＣのどの程度のレベルが、関節リウマチの、特にびらん性関節リウマチの診断となるかを示した説明書が含まれていてもよい。
【００４３】
さらに別の態様によれば、本発明は、個人における炎症性疾患の状態を評価する手段として、血液または血清サンプル中のテネイシンＣのレベルの決定の使用を提供する。
【００４４】
好ましい実施形態において、本発明は、個人における、関節リウマチの状態、特にびらん性関節リウマチの状態を評価する手段として、血液または血清サンプル中のテネイシンＣのレベルの決定の使用を提供する。
【００４５】
別の態様によれば、本発明は、患者からのサンプル中のテネイシンＣのレベルの決定および炎症性治療、および特に、観察されたテネイシンＣのレベルに基づく関節リウマチまたはびらん性関節リウマチの治療、の投与を含んでなる、リウマチ性関節炎や特にびらん性関節リウマチなどの、患者におけるにおける炎症状態を治療する方法を提供する。好ましくは、テネイシンＣのレベルが、参照サンプル中のレベルよりも大きい場合、治療が投与される。参照サンプルは、炎症状態でない正常な患者からのサンプルであってよい。テネイシンＣのレベルが３１ng／mL、好ましくは３３ng／mLより高い場合に治療を投与することができる。テネイシンＣのレベルが３１ng／mL、および好ましくは３３ng／mLよりも大きい場合には、抗ＴＮＦ療法の代替療法が投与されてもよい。代替療法は、前述の治療法の１つであってよい。
【００４６】
さらなる態様によれば、本発明は、関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチを治療する方法であって、患者からのサンプル中のテネイシンＣのレベルの決定、およびテネイシンＣのレベルが参照サンプル中のレベルよりも高いが、３３ng／mL未満、好ましくは３１ng／mL未満である場合、抗ＴＮＦ療法を投与することを含む方法を提供する。
【００４７】
さらなる態様によれば、本発明は、関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチを治療する方法であって、患者からのサンプル中のテネイシンＣのレベルの決定、およびテネイシンＣのレベルが３１ng／mLを超える、好ましくは３３ng／mLを超える場合、抗ＴＮＦ療法でない療法を投与することを含む方法を提供する。
【００４８】
代替療法は、抗ＩＬ−１７療法または前述の任意の代替療法であってよい。当業者は、本発明のいずれか１つの実施形態および／または態様の好ましい特徴が、本発明のその他すべての実施形態および／または態様に適用できることを理解するであろう。
【００４９】
本発明を、以下の図面を参照しながら、単なる例示として、より詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】関節リウマチの患者においてテネイシンＣレベルが有意に増加していることを示す。この試験で５２人の患者を調べ、関節リウマチを有する患者の８６．６％が異常に高い（有意に増加した）テネイシンＣレベルを示した。結果は、関節リウマチ患者についてのテネイシンＣの平均値が８７．８７ng／mL血清であり、正常な集団ではテネイシンＣの平均値が２０．３４ng／mL血清であることを示している。関節リウマチ患者の９５％信頼限界は３１ng／mLであり、即ち、３１ng／mL血清より高いテネイシンＣレベルは関節リウマチと診断される。
【００５１】
【図２】関節リウマチ（RA）の患者におけるテネイシンＣの循環レベルを示すウエスタンブロットである。図２Ａは、RA患者からのベースラインサンプルでは３２０ｋＤａの１本の顕著なＴＮＣバンドが認められた（n =18）ことを示している。ＥＬＩＳＡによって検出された、同サンプルの対応するＴＮＣレベル（pg/ml）をブロットの下に示す。ＴＮＣの低いレベルは、対照の健康な血漿（Ｎ）で検出された。rhTNC=0.05μgヒト組換えＴＮＣ。図２Ｂは、抗テネイシンＣ抗体を用いてウエスタンブロッティングを行ったとき、何人かのRA患者（TNC）の血漿中に、３２０ｋＤａで検出された主バンドに加え、分子量２１９、２０１、１９０および１５６ｋＤａのバンドが存在していたことを示している。同メンブレンのポンソーＳ染色は、各RAサンプルについて等価なタンパク質負荷を示している。
【００５２】
【図３】関節炎に関して、テネイシンＣレベルと現在使用されているＣＲＰおよび抗ＣＣＰマーカーとの間に相関関係はないことを示している。即ち、テネイシンＣは、特に関節リウマチ、および具体的にはびらん性関節リウマチに関しては、代わりとなる改善されたバイオマーカーであることを示している。この試験では５２人の患者を調べ、テネイシンＣの血清レベルを、ＣＲＰおよび抗ＣＣＰの血清レベルと比較した。ＴＮＣのレベルは、ＣＲＰまたは抗ＣＣＰのいずれとも関係性がなく、テネイシンＣは関節リウマチの特有のバイオマーカーであることを示している。
【００５３】
【図４】関節リウマチ患者の血清におけるテネイシンＣ発現レベルと、患者の関節において観察されたびらん（erosion）の程度との相関関係を示す−Ｘ軸は観察された骨びらんの数を表す。示したデータは、血清中のテネイシンＣのレベルは、関節における骨びらんの存在を示すものであり、テネイシンＣのレベルが高いほどより多くのびらんが観察される。
【００５４】
【図５】関節リウマチ患者を、血清中のテネイシンＣのレベルが異常な群（即ち、３１ng／mLより高い）とテネイシンＣのレベルが正常な群（即ち、血清中のテネイシンＣレベルが０〜３１ng／mL）とに分けた場合、テネイシンＣレベルが異常な患者は、びらんスコアが統計的に増加していることを示している。即ち、血清中のテネイシンＣレベルはびらん性関節リウマチに関する優れたバイオマーカーであることを示している。
【００５５】
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、テネイシンＣレベルと、圧痛関節数（ＴＪＣ）および腫脹関節数（ＳＪＣ）（ＧＰにより計数）との間（図６Ａ）、または総合評価スコア（医師の総合評価。患者の疾患活動性をどのように評価したか１〜１０のスコアで評価）（図６Ｂ）、またはバイオマーカーＣＲＰまたは赤血球沈降速度（ＥＳＲ）との間（図６Ｃ）に相関はないことを示している。ＣＲＰは、炎症において上昇する急性期タンパク質であり、炎症の非特異的なメーカーであり、そのレベルはＥＬＩＳＡによって測定される。ＥＳＲは、赤血球が１時間に沈降する速度であり、炎症の非特異的な尺度である。試験を行うには、ウェスターグレン管として知られる直立した試験管に抗凝固処理した血液を入れて、赤血球が沈降する速度を測定し、mm／時間として表する。ＥＳＲは、沈降が亢進する因子（pro-sedimentation factors）（主としてフィブリノゲン）と、沈降に抵抗する因子、即ち赤血球の負電荷（ゼータ電位）とのバランスによって支配される。炎症プロセスが存在する場合、血液中のフィブリノゲンレベルが高くなることで赤血球細胞が互いに引き寄せられる。
【００５６】
【図７】７人の関節リウマチ患者における、テネイシンＣレベルに対する抗ＴＮＦ療法（インフリキシマブ（登録商標）およびメトトレキサート（MTX））の効果を示す。結果は、これらの治療法は、テネイシンＣに対する効果が非常に短い期間であることを示している。
【００５７】
【図８】ヒトテネイシンＣのアミノ酸配列を示す。
【００５８】
【図９】ベースラインのテネイシンＣレベルから、インフリキシマブ（抗ＴＮＦ）療法開始後１６−１８週および５４週での、ＲＡ患者における今後の圧痛関節数が予測されることを示す。ベースライン（治験に入る）でのコホートＡのRA患者由来の血清を、ＥＬＩＳＡによりテネイシンＣレベルについて分析した。テネイシンＣレベルを、インフリキシマブ療法後１６−１８週目（Ａ）および５４週（Ｂ）にこれらの患者において施術者により測定された圧痛関節数とともに示す。有意度をスピアマンの順位相関分析により決定した。コホートＡにはACR1987判断基準に従ってびらん性RAの診断を受け、症状が０．５〜３年続いている患者を含む。コホートＢは、疾患活動性が中程度かそれ以上のRAと診断された患者を含む。
【実施例】
【００５９】
正常／対照被験者と比較した、関節リウマチ患者におけるテネイシンＣレベルの評価
血清を、関節リウマチを有する患者および正常な被験者の血液から得、使用するまで−８０℃で保存した。分析の日に血清を氷上で解凍し、ＥＬＩＳＡで使用するため、典型的にＥＩＡ緩衝液（PBS中、1％BSA、0.05％Tween20）で１：５０に希釈した。ＥＬＩＳＡキットは、IBL（カタログ番号27751）から購入し、ヒトテネイシンＣの高分子量バリアントを検出するために使用した。希釈した血清１００μＬを、非標識の捕捉抗テネイシンＣ抗体で予めコーティングしたＥＬＩＳＡプレートにて６０分間３７℃で２回インキュベートした。プレートを７回洗浄し（0001％Tween20/PBS中）、ＨＲＰ−標識抗ヒトテネイシンＣ抗体（１００μＬ）を各ウェルに加えた。次いで、ウェルを４℃で３０分インキュベートした後、０．００１％のTween20/PBSで９回洗浄した。次いで、色素１００μＬ（TMB溶液）を各ウェルに加え、暗所で３０分間または色の変化が十分であると判断されるまでインキュベートした。反応は１００μＬの1N H2SO4の添加によって停止させた。色の変化を、マルチスキャンプレートアナライザーを使用して４５０ｎｍで読み取り、テネイシンＣの濃度を、Ascent version 2.6を用いて計算した。標準としてＥＬＩＳＡプレートから得られたテネイシンＣ（２４〜０．３８ng／mL）から作成した標準曲線を使用した。
【００６０】
上記のＥＬＩＳＡを、関節リウマチ患者５２人、および関節リウマチの兆候を示さなかった正常対照被験者２０人から得た血清サンプルについて行った。結果を図１に示す。慢性関節リウマチ患者においてテネイシンＣの有意に高いレベルが示され、３１ng／mL、または３３ng／mLより高い血清中レベルのテネイシンＣで、関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチ、の診断が可能であることを示している。
【００６１】
ウエスタンブロット法では、慢性関節リウマチ患者のサンプル中に存在するテネイシンＣの主要な形態は分子量３２０ｋＤａである（図２Ａ）が、何人かの患者ではマイナーな小さい分子量の形態のテネイシンＣも観察された（図２Ｂ）ことが分かった。
【００６２】
図２のウェスタンブロットデータは、以下の方法を用いて得た。血清または血漿１μＬを４〜１２％ビス−トリスプレキャストポリアクリルアミドゲル（Invitrogen, Life Technologies, Paisley, UK）上で電気泳動した。タンパク質をニトロセルロースメンブレン（Amersham, GE Healthcare, Chalfont, UK）上に移し、ポンソーS染色（Sigma Aldrich, Gillingham, UK）を用いて可視化した。TBS/0.01％Tweenで洗浄して汚れを除去した後、メンブレンを、室温で1時間、5％BSA/TBS-Tween中でブロックし、１：１０００希釈のヒトＴＮＣのＮ末端領域を認識する一次抗体（MAB 1908, Merck Millipore, Watford UK）と共に１：１０００希釈で３７℃で１時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG（Dako, Ely, UK）を、１：３０００希釈にて二次抗体として使用した。結合した抗体を、増強化学発光キット（Amersham, GE Healthcare）を用いて検出し、Super RX医療用Ｘ線フィルム（フジ、日本）上に可視化した。
【００６３】
関節リウマチ患者におけるテネイシンＣレベルと骨びらんとの間の相関関係
患者の血清中のテネイシンＣのレベルとびらん性関節リウマチとの間の相関を実証するために、慢性関節リウマチ患者におけるびらんのレベルを、血清中の循環テネイシンＣレベルと比較した。
【００６４】
Rheumatology (Oxford). 2005 Jun;44(6):721-8. Epub 2005 Jan 11. Review.においてTaylor PC によって記載されるように、びらんを超音波およびパワードプラ画像法を用いて測定した。 
【００６５】
図４に示すように、びらんスコアをテネイシンＣレベルに対してプロットしたとき、有意な相関関係が観察される。
【００６６】
図５はさらに、血清におけるテネイシンＣの異常なレベル（即ち、３１ng／mLより高い）を有する関節リウマチ患者のびらんスコアを、テネイシンＣの正常なレベル（血清中のテネイシンＣレベルが０〜３１ng／mLである）を有する関節リウマチ患者と比較することによって、びらん性関節リウマチとのさらに強い相関関係が実証されている。異常なテネイシンＣレベルを有する患者は、統計的にびらんスコアが増大することが示された。したがって、血清中のテネイシンＣ濃度は、びらん性関節リウマチの優れたバイオマーカーであることを示している。
【００６７】
さらに、関節リウマチのその他の測定結果とテネイシンＣのレベルとの間に有意な相関関係は観察されず（図６Ａ〜６Ｃ）、血清中のテネイシンＣが、関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチの優れたバイオマーカーであることをさらに示している。
【００６８】
テネイシンＣレベルに対する関節リウマチ治療の効果
図７に示すように、関節リウマチのための現在用いられている治療法は、テネイシンＣレベルになんらかの影響を及ぼすようにはみられない。
【００６９】
高レベルの血清テネイシンＣは、インフリキシマブ治療を受けた患者における関節の圧痛を予測する
インフリキシマブ等の抗ＴＮＦ薬での治療によってもたらされた大きな進歩にもかかわらず、相当の割合の関節リウマチ患者は抗ＴＮＦ剤で治療を受けても応答せず、関節の崩壊とDAS28スコアの増大が継続する。びらんスコアを有するテネイシンＣレベルと、循環テネイシンＣレベルに対するインフリキシマブの効果との間の相関関係を踏まえ、テネイシンＣのレベルが、インフリキシマブ処置した患者における将来の疾患進行の予測因子として役立つかどうかを判断するため実験を行った。テネイシンＣのベースラインレベルまたは治療開始後１８または５２週でのテネイシンＣレベルの変化と、インフリキシマブに対する応答の間には関係性がなかった。しかし、ベースラインでのテネイシンＣのレベルと治療開始後１６〜１８及び５４週目の両方でのインフリキシマブ処置した患者におけるその後のＴＪＣスコアとの間には有意の相関関係がみとめられた（図９）。したがって、これらのデータは、インフリキシマブ治療の開始前にテネイシンＣのレベルが高い患者は、インフリキシマブ療法にもかかわらず、解決されない関節の圧痛を伴う可能性がより高いということを示唆している。
【００７０】
結果は、１年先立つことに限りにおいて、抗ＴＮＦ治療開始前の血清中のテネイシンＣのレベルは、患者における圧痛関節数の予測因子として役立ち、抗ＴＮＦ治療から恩恵を受ける可能性がある患者と、応答する可能性がない患者とを区別することが可能であることを示している。
【００７１】
さらに、図２に示された結果は、関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチ患者の血清中のテネイシンＣの主なバリアントは、「大きなアイソフォーム」プロセシングを構成する分子量３２０ｋＤａのアイソフォームである。テネイシンＣは、大きな、マルチモジュラー分子である。これは、アッセンブリードメイン、一連の１４半の上皮細胞成長因子様リピート、最大１７のフィブロネクチンＩＩＩ型様リピート（TNIII）、およびフィブリノーゲン様グローブを含む、数多くの個別のドメインを含んでなる。テネイシンＣは、択一的にスプライシングされて１９０から３２０ｋＤａのサイズの範囲の単量体を生じる単一の遺伝子によってコードされる。これは具体的にはTNIIIドメインで生じる。その８個は、構成的に発現し（TNIII1-8）、その９個は、択一的にスプライシングされ得る（A1-4、B、AD2、AD1、CおよびD）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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