(57)【要約】ワクチン組成物ならびにそれを産生および使用する方法が提供され、この組成物は、三量体構成における修飾ＨＡ幹ドメインを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの疎水性アミノ酸の少なくとも１つの極性アミノ酸による置換、（ｂ）幹における疎水性残基およびシステインを含有する領域の削除、によって修飾される、２つ以下のジスルフィド結合を含むインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）幹抗原と、
少なくとも１つの三量体化ドメインと、
を含む融合タンパク質。
【請求項２】
２つ以上の疎水性アミノ酸が、極性アミノ酸で置換される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記三量体化ドメインは、フォールドンである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
規定の位置に少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記非天然アミノ酸は、前記三量体化ドメインの末端、もしくは非らせん構造におけるＨＡ幹ドメイン、またはＨＡ幹ドメインの表面（側面）上の曝露された表面内から選択される規定の位置にある、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記非天然アミノ酸は、ウイルス様粒子に連結される、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
プロテアーゼ切断のための外来性モチーフをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
精製のためのタグをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
図１２に記載される修飾を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１に記載の融合タンパク質を産生する方法であって、プロモーターに作動可能に連結された前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を発現を許容する細胞内に導入することと、前記コードされたタンパク質を発現させることと、を含む、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の融合タンパク質を産生する方法であって、プロモーターに作動可能に連結された前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を無細胞タンパク質合成反応混合物中に導入することと、前記融合タンパク質を合成するのに十分な一定期間にわたってインキュベートすることと、を含む、方法。
【請求項１２】
前記融合タンパク質を前記反応混合物から単離するステップと、前記タンパク質を三量体の形成を許容する条件下でリフォールディングするステップと、をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記許容条件は、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤を０．０１％〜０．１％の濃度で含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、免疫化のための製剤。
【請求項１５】
薬学的に許容されるアジュバントをさらに含む、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１６】
温血動物をインフルエンザに対して免疫する方法であって、請求項１４に記載の薬学的製剤を前記動物に投与することを含む、方法。
【請求項１７】
前記動物は、鳥類動物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記動物は、哺乳動物である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発
本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号Ａ１０５７２２９の下で、政府支援により行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
インフルエンザは、主要な世界的公衆衛生の課題である。インフルエンザを予防および治療するためにいくつかの異なるインフルエンザワクチンおよび薬物が利用可能であるが、米国のみでも毎年、２，５００万〜５，０００万件のインフルエンザの症例および３０，０００〜４０，０００件の死亡が存在する。季節的なインフルエンザＡウイルスを制御することは、急速なウイルス拡散、短い潜伏期間、およびウイルス糖タンパク質の変化する抗原性のために、難題である。
【０００３】
インフルエンザＡウイルスは、オルトミクソウイルス科ファミリーの、マイナスセンス１本鎖の分節ＲＮＡウイルスである。Ｈ番号（ヘマグルチニンの型を表す）およびＮ番号（ノイラミニダーゼの型を表す）に従って分類される、いくつかの亜型が存在する。１６個の異なるＨ抗原（Ｈ１〜Ｈ１６）および９個の異なるＮ抗原（Ｎ１〜Ｎ９）が存在する。各ウイルス亜型は、様々な病原性プロファイルを有する多様な株へと突然変異してきており、あるものは、１つの種に病原性であるが他の種には病原性でなく、あるものは、複数の種に病原性である。
【０００４】
インフルエンザＡゲノムの分節化は、２つ以上の株が同じ細胞に感染するときに、株の間の再集合を容易にする。再集合は、抗原シフトと称される大きな遺伝子変化をもたらし得る。対照的に、抗原ドリフトは、主にＨＡおよびＮＡタンパク質におけるアミノ酸置換である、小さな遺伝子変化を有するウイルス株の蓄積である。ウイルスにコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ複合体による、インフルエンザＡ核酸複製は、比較的誤りがちであり、ＲＮＡゲノムにおけるこれらの点突然変異は、抗原ドリフトの遺伝的変異の主要な源である。選択は、ＨＡおよびＮＡタンパク質を伴う抗原ドリフトおよびシフトを有するヒトインフルエンザＡ株を好むが、これは、これらの株が次いで、以前の感染またはワクチン接種からの中和抗体を回避することが可能となるためである。抗原シフトは、２０世紀において大規模なインフルエンザＡの世界的流行のうちの３つを引き起こした一方で、抗原ドリフトは、インフルエンザ流行の毎年の性質の原因となる。
【０００５】
ヘマグルチニンＡは、宿主細胞の糖タンパク質および糖脂質上の末端シアル酸残基へのウイルス結合に関与する。細胞の酸性エンドソーム区画中へのウイルス侵入後、ＨＡはまた、細胞膜との融合にも関与する。ＨＡは、ウイルス表面上に非共有結合性のホモ三量体を形成するＨＡ０前駆体として合成され、それは、宿主プロテアーゼによって切断されて、単一のジスルフィド結合によって関連付けられた２つのサブユニットを作り出す。成熟ＨＡは、ＨＡ２ドメインに由来するαへリックスの３本鎖コイルドコイルおよびＨＡ１ドメインに由来する球状頭部からなる、長い線維状の幹を有するホモ三量体を形成する。
【０００６】
インフルエンザ感染に対して有効な保護を提供し、急速に進化しているウイルスに対処することができるワクチンは、医学的に非常に興味深い。本発明は、この問題に対処する。
【０００７】
関連文献
インフルエンザワクチンの構築におけるフォールドン（ｆｏｌｄｏｎ）の使用に関連する刊行物には、特に、米国公開特許第２００９／０２０８５３１号が含まれる。インフルエンザワクチンの構築におけるＨＡ幹の使用に関連する刊行物は、例えば、米国公開特許第２０１２／００１４９７２号および米国公開特許第２０１０／０２９７１７４号に見出され得、各々、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【０００８】
ＣＦＰＳ中に非天然アミノ酸を導入する方法は、米国公開特許第２０１０−００９３０２４  Ａ１号の特許公開に記載される。非天然アミノ酸を通じて抗原および他のポリペプチドをウイルス様粒子に直接連結する方法は、米国公開特許第２０１０−０１６８４０２−Ａ１号の特許出願に記載される。カーゴを、ＣＦＰＳによって産生されるウイルス様粒子中へカプシド形成する方法は、米国公開特許第２０１０−０１６７９８１−Ａ１号の特許公開に記載される。これらの文書の各々は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００９】
三量体インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）幹抗原を含む、ワクチン組成物が提供される。ＨＡ抗原の配列は、野生型から、１個以上の疎水性アミノ酸残基の極性アミノ酸との置換、特に、曝露されたドメインにおける疎水性残基の極性アミノ酸との置換によって、修飾される。配列は、疎水性残基およびシステインを含有する幹におけるポリペプチド領域の削除によってさらに修飾される。修飾ＨＡ抗原は、限定なしに、Ｔ４バクテリオファージのフィブリチン（ｆｉｂｒｉｔｉｎ）のフォールドンを含む、三量体化ドメインに融合される。いくつかの実施形態において、配列は、抗原をウイルス様粒子（ＶＬＰ）に連結することにおいて有用な非天然アミノ酸の導入を可能にするように修飾され、ここで規定の非天然アミノ酸は、ＨＡ幹の三量体化ドメインの末端、またはそのらせん構造の外側に位置付けられてもよい。追加の実施形態において、配列は、タンパク質精製において有用なモチーフ、例えば、ヒスチジンタグ、プロテアーゼ切断部位等を含むように修飾される。
【００１０】
本発明の融合タンパク質は、宿主細胞を、この融合物をコードする核酸で形質転換し、宿主細胞を培養し、融合物を培養物から回収することによって、または代替的にこの融合物をコードする核酸構築物を生成し、無細胞合成によってポリペプチドを産生することによって、作製することができ、その合成は、転写と翻訳との共役反応を含んでもよい。ベクター、および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【００１１】
本発明の一実施形態において、本発明の融合タンパク質の無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）のための方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＣＦＰＳ産物は、反応混合物から単離され、製剤化の前にリフォールディング（再折り畳み）される。いくつかの実施形態において、リフォールディングは、界面活性剤、通常は非イオン性界面活性剤の存在下で行われる。界面活性剤は、約０．０１〜０．１％、通常は０．０５％前後の濃度で存在してもよい。対象となる界面活性剤には、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤、例えば、Ｂｒｉｊ  ３５、Ｔｗｅｅｎ  ２０等が含まれる。
【００１２】
融合タンパク質は、患者への投与のために薬理学的に許容されるビヒクルにおいて、精製および製剤化されてもよい。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、製剤化のためにＶＬＰに連結される。いくつかの実施形態においてＶＬＰは、ＨＡ抗原に加えてタンパク質を含み、そのタンパク質には、限定なしに、アジュバント、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ等、追加のインフルエンザ抗原等が含まれてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】６つの異なるＨＡ変異形由来のＨＡ幹ドメインの配列アライメント。Ｈ３幹ドメイン付番を有する残基は、次の通りである：Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０５／２００９（Ｈ１Ｎ１）、１８−５９、２９２−５２０；Ａ／Ｖｉｅｔ  Ｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）、１７−５８、２９０−５１８；Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１／１９６８（Ｈ３Ｎ２）、１８−６８、２９３−５２１；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７（Ｈ２Ｎ２）、１６−５７、２８８−５１６；Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）、１８−５９、２９１−５１９；およびＡ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８（Ｈ１Ｎ１）、１８−５９、２９２−５２０。
【図２】ＨＡ幹ドメインの三量体化。
【図３】ＨＡ幹抗原の最初の設計（ａ）、およびタンパク質リフォールディング後の最初のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果（ｂ）。
【図４】ＨＡ幹ドメインにおいて曝露された疎水性領域（ａ）、および突然変異疎水性残基の５つのグループ（ｂ）。
【図５】５つの異なる突然変異ＨＡ幹タンパク質の三量体化を評価するためのサイズ排除ＨＰＬＣ。
【図６】サイズ排除ＨＰＬＣにおける三量体および単量体の分離に対する界面活性剤の影響。クロマトグラムもまた、Ｍ５突然変異の利点を裏付ける。
【図７】タンパク質リフォールディングに対するジスルフィド結合数の影響。
【図８】抗体Ｃ１７９を使用することによるＨＡ幹構築物のＥＬＩＳＡ分析。
【図９】ＶＬＰベースのワクチンの組み立て。
【図１０】ｎｎＡＡ部位の設計。
【図１１】ＨＡ幹融合タンパク質上の３つの異なる結合位置の使用を示す、クリック反応後のＨＡ幹三量体のＨＢｃ−ＶＬＰへの結合。
【図１２】アミノ酸変化の概要。
【図１３】突然変異体Ｍ６を使用した、３系列のタンパク質リフォールディング実験結果。
【図１４】リフォールディングされたタンパク質の非還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのオートラジオグラム。タンパク質を、次の異なる条件下でリフォールディングした：異なるｐＨ環境（ｐＨ６．０、ｐＨ８．０、ｐＨ１０．５）、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０含有（＋）または不含（−）。フォールドン配列を幹ドメインのＣ末端に融合して、三量体化を誘導した。
【図１５】ＨＡタンパク質断片の等電点（ｐＩ）分析。インフルエンザウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０５／２００９（Ｈ１Ｎ１）（受託番号ＡＣＰ４１９２６）由来のＨＡ外部ドメインを標的として選定した。全ての残基番号は、Ｈ３付番による。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、インフルエンザに対する免疫応答の誘導および／または強化に有用な、免疫原性インフルエンザウイルスＨＡ組成物および方法を対象とする。いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳動物を、本明細書に記載される組成物、複合体、または化合物と接触させることを含む、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、対象に、有効量の本明細書に記載される組成物、複合体、または化合物を投与することを含む、インフルエンザウイルス感染を予防するまたはインフルエンザウイルス感染の病原性を減弱する方法を提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明は、薬の製造における、本明細書の複合体、化合物、または組成物の使用を提供する。ある実施形態において、本発明は、インフルエンザウイルス感染の予防または治療のための薬の製造における、本明細書の複合体、化合物、または組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、インフルエンザウイルス感染の予防または治療のための、本明細書の複合体、化合物、または組成物の使用を提供する。
【００１６】
本発明の抗原性ポリペプチドは、曝露された残基における疎水性を低減するように、およびシステインの数を減少させるように修飾された、インフルエンザＨＡタンパク質、例えば、インフルエンザＡ  ＨＡタンパク質またはその画分の幹ドメインを含む。ＨＡタンパク質は、三量体化ドメインに融合される。ＨＡ１およびＨＡ２ドメインは、示される順序で配列されるであろうが、他のドメインは、融合タンパク質において任意の順序で配列されてもよく、１つ以上の柔軟なリンカー配列、プロテアーゼ切断部位、精製のためのタグ等をさらに含んでもよい。本発明において使用するためのタンパク質は、患者への投与のために薬理学的に許容されるビヒクルにおいて、精製および製剤化されてもよい。
【００１７】
本発明の融合タンパク質は、宿主細胞を、この融合物をコードする核酸で形質転換し、宿主細胞を培養し、融合物を培養物から回収することによって、または代替的にこの融合物をコードする核酸構築物を生成し、無細胞合成によってポリペプチドを産生することによって、作製することができ、その合成は、転写と翻訳との共役反応を含んでもよい。
【００１８】
定義
「ヘマグルチニン」および「ＨＡ」は、当業者に既知の任意のヘマグルチニンを指す。ある特定の実施形態において、ヘマグルチニンは、インフルエンザＡヘマグルチニン、インフルエンザＢヘマグルチニン、またはインフルエンザＣヘマグルチニン等の、インフルエンザヘマグルチニンである。天然のヘマグルチニンタンパク質は典型的に、シグナルペプチド、幹ドメイン、球状頭部ドメイン、内腔ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む。本発明の目的で、修飾ＨＡ幹ドメインが利用される。本明細書で使用されるとき、「ヘマグルチニン」および「ＨＡ」という用語は、シグナルペプチド切断、ジスルフィド結合形成、グリコシル化（例えば、Ｎ結合型グリコシル化）、プロテアーゼ切断、および脂質修飾（例えば、Ｓパルミトイル化）等の翻訳後プロセシングによって修飾される、ヘマグルチニンポリペプチドを包含する。
【００１９】
「ＨＡ１  Ｎ末端幹分節」は、インフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ポリペプチドの幹ドメインのアミノ末端部分に対応する、ポリペプチド分節を指す。ある特定の実施形態において、ＨＡ１  Ｎ末端幹分節は、ＨＡ１ドメインのアミノ酸１８〜５８または１８〜６８におよそ対応するアミノ酸残基からなる。
【００２０】
ＨＡ１  Ｃ末端幹分節は、本明細書に提供される定義に基づいて当業者によって認識される、任意のＨＡ１幹分節であり得る。典型的に、ＨＡ１幹分節は、ＨＡ１のＨＡアミノ酸配列のおよそ２７７番目の残基からＣ末端アミノ酸までの配列に位置するシステイン残基からなるポリペプチドに対応する。この分節は、例えば、残基２９２〜５２０におよそ対応する。
【００２１】
三量体化ドメインは、当業者に知られており、可溶性組換えタンパク質の安定した三量体を促進するために成功裏に使用されてきた。ドメインには、ＧＣＮ４ロイシンジッパー（Ｈａｒｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９３Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：１４０１−１４０７）、肺表面活性タンパク質からの三量体化ドメイン（Ｈｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９４ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ３４４：１９１−１９５）、コラーゲン（ＭｃＡｌｉｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７８：４２２００−４２２０７）、およびファージＴ４フィブリチン「フォールドン」（Ｍｉｒｏｓｈｎｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．１９９８Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ１１：３２９−４１４）が含まれる。
【００２２】
「フォールドン」または「フォールドンドメイン」という用語は、バクテリオファージＴ４フィブリチン配列のＣ末端アミノ酸ペプチド配列、またはフォールドン活性を有するその部分もしくはその断片を指す。フォールドンは、三量体構造を形成することが可能である。フォールドン活性は、三量体を形成するフォールドンの能力を指す。一態様において、フォールドンは、配列番号ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦのアミノ酸配列、またはフォールドン活性を有するその任意の断片もしくは変異形を指す。フォールドンは、βプロペラ立体配座を採用し、自律的な方式で折り畳みして三量体化することができる。
【００２３】
本明細書で使用されるとき、「精製される」および「単離される」という用語は、ポリペプチドの関連において使用される場合、それは、それが得られた物質からの汚染物質、例えば、細胞内に存在する細胞破片、細胞壁物質、膜、細胞小器官、核酸のバルク、炭水化物、タンパク質、および／または脂質等であるが、これらに限定されない細胞物質が実質的に存在しない。故に、単離されるポリペプチドには、約３０％、２０％、１０％、５％、２％、または１％（乾燥重量で）未満の細胞物質および／または汚染物質を有するポリペプチドの調製物が含まれる。本明細書で使用されるとき、「精製される」および「単離される」という用語は、化学合成されるポリペプチドの関連において使用される場合、ポリペプチドの合成に関与する化学的前駆体または他の化学物資が実質的にないポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、本発明のインフルエンザヘマグルチニン幹ドメインポリペプチドは、無細胞タンパク質合成によって産生される。他の具体的な実施形態において、本発明のインフルエンザヘマグルチニン幹ドメインポリペプチドは、細胞内の組換え法によって産生される。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、「対象」または「患者」という用語は、動物（例えば、鳥類、爬虫類、および哺乳動物）を指すように交換可能に使用される。いくつかの実施形態において、対象は、非霊長類（例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス）および霊長類（例えば、サル、チンパンジー、およびヒト）を含む哺乳動物である。ある特定の実施形態において、対象は、非ヒト動物である。いくつかの実施形態において、対象は、家畜またはペットである。別の実施形態において、対象は、ヒト、例えば、未熟児を含むヒト乳児、小児、成人、および／または高齢のヒトである。
【００２５】
本明細書で使用される「免疫原性組成物」または「抗原性組成物」は、三量体化ドメインに融合され、任意に、１つ以上の柔軟なリンカー、プロテアーゼ切断部位、およびまたは精製タグと組み合わせた、修飾インフルエンザＨＡ幹ドメインの組み合わせを指す。かかる組成物は、宿主に投与されるとＨＡ特異的免疫応答を引き出す。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、「エピトープ」という用語は、免疫応答を引き出すことが可能な領域を含有する、および／または抗体との特異的結合が可能な領域を含有する、分子（または分子の会合）を指す。エピトープは、例えば、抗体に特異的に結合することが以前には知られていなかったタンパク質の一部分から選択されてもよい。
【００２７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸の重合型を指し、それは、コードされたアミノ酸およびコードされていないアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。
【００２８】
本明細書における「融合される」または「作動可能に連結される」とは、２つ以上のポリペプチドが一緒に連結されて、連続したポリペプチド鎖を形成することを意味する。実施例に概説されるように、融合ポリペプチド（または融合ポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチド）は、複数のループにおける複数のペプチド、融合パートナー等を含む、さらなる構成要素も同様に含むことができる。融合が行われる正確な部位は、必要不可欠ではないが、特定の部位が周知であり、結合パートナーの生物活性、分泌、または結合特性を最適化するために選択され得る。最適な部位は、日常的な実験によって決定されるであろう。
【００２９】
「免疫応答」という用語は、脊椎動物対象の免疫系による、抗原性または免疫原性化合物への任意の応答を指す。例となる免疫応答には、ＣＤ８＋ＣＴＬの抗原特異的誘導を含む細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答、Ｔ細胞増殖性応答およびサイトカイン放出を含むヘルパーＴ細胞応答、ならびに抗体応答を含むＢ細胞応答等の、局所および全身性の細胞性ならびに体液性免疫が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
「免疫応答の引き出し」という用語は、本明細書で一般に、免疫応答の誘導および／または増強を包含するように使用される。
【００３１】
「免疫応答の誘導」という用語は、刺激される、惹起される、または誘導される、免疫応答を指す。
【００３２】
「免疫応答の増強」という用語は、改善される、推進される、補強される、増幅される、強化される、増加させられる、または延長される、既存の免疫応答を指す。
【００３３】
「強化された免疫応答」という表現または同様の表現は、免疫応答が、宿主の便益のために、以前の免疫応答状態、例えば、本発明の免疫原性組成物の投与前と比べて、亢進される、改善される、または強化されることを意味する。
【００３４】
「体液性免疫」および「体液性免疫応答」という用語は、抗体分子が抗原刺激に応答して産生される、免疫の形態を指す。
【００３５】
「細胞媒介性免疫」および「細胞媒介性免疫応答」という用語は、Ｔ細胞リンパ球がそれらの犠牲となる細胞に近接するときにＴ細胞リンパ球によって提供される防御等の、リンパ球によって提供される免疫学的防御を指すことが意図される。細胞媒介性免疫応答は通常、リンパ球増殖を含む。「リンパ球増殖」が測定されるとき、特定の抗原に応答して増殖するリンパ球の能力が測定される。リンパ球増殖は、Ｂ細胞、Ｔヘルパー細胞、または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の細胞増殖を指すことが意図される。
【００３６】
「免疫原性量」という用語は、主題の免疫原性組成物と共に投与されるときに、追加の材料の不在下で抗原によって引き出される免疫応答と比較して、免疫応答を刺激するのに十分な抗原性化合物の量を指す。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、「ワクチン」は、個体において免疫応答を誘導するために使用される、免疫原性調製物である。ワクチンは、免疫原性である、１つを超える構成物質を有することができる。ワクチンは、予防および／または治療目的に使用することができる。ワクチンは、必ずしもウイルス感染を予防する必要はない。理論に束縛されるものではないが、本発明のワクチンは、本明細書に記載されるワクチンが投与されるときに、ウイルス感染がより少ない量で生じる（全く生じないことを含む）ような、またはウイルス感染の生物学的もしくは生理学的影響が寛解されるような様態で、個体の免疫応答に影響を及ぼすことができる。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、当該技術分野でよく理解されるように、「治療」は、臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的で、有益なまたは所望の臨床結果には、１つ以上の症状の緩和または寛解、感染の程度の縮小、安定化された（すなわち、悪化していない）感染状態、感染状態の寛解または一時緩和、およびウイルス力価の減少（検出可能であれ、検出不可能であれ）が含まれるが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けていない場合に予想される生存率と比較して、生存率を延長させることも意味し得る。ウイルス感染（インフルエンザ感染等）の症状は、当業者に知られており、それには、発熱、咳、鼻水、鬱血、筋肉痛、喘鳴、悪心、および倦怠感が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００３９】
材料の「有効量」または「十分な量」は、臨床結果を含む、有益な結果等の、所望の生物学的効果を引き起こすのに十分な量のことであり、したがって、「有効量」は、それが適用されている文脈に依存する。本発明の関連において、ワクチンの有効量の例は、個体において免疫応答（例えば、抗体産生）を誘導するのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与において投与することができる。
【００４０】
ある特定の実施形態において、有効量は、インフルエンザウイルス疾患に対する完全な保護をもたらさないが、治療されていない対象と比較して、インフルエンザウイルスの力価の低下または数の低減をもたらす。ある特定の実施形態において、有効量は、治療されていない対象と比較して、インフルエンザウイルスの力価の０．５倍、１倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１２５倍、１５０倍、１７５倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、７５０倍、もしくは１，０００倍、またはそれを超える低減をもたらす。いくつかの実施形態において、有効量は、治療されていない対象と比べて、インフルエンザウイルスの力価の、およそ１ｌｏｇ以上、およそ２ｌｏｇ以上、およそ３ｌｏｇ以上、およそ４ｌｏｇ以上、およそ５ｌｏｇ以上、およそ６ｌｏｇ以上、およそ７ｌｏｇ以上、およそ８ｌｏｇ以上、およそ９ｌｏｇ以上、およそ１０ｌｏｇ以上、１〜３ｌｏｇ、１〜５ｌｏｇ、１〜８ｌｏｇ、１〜９ｌｏｇ、２〜１０ｌｏｇ、２〜５ｌｏｇ、２〜７ｌｏｇ、２ｌｏｇ〜８ｌｏｇ、２〜９ｌｏｇ、２〜１０ｌｏｇ、３〜５ｌｏｇ、３〜７ｌｏｇ、３〜８ｌｏｇ、３〜９ｌｏｇ、４〜６ｌｏｇ、４〜８ｌｏｇ、４〜９ｌｏｇ、５〜６ｌｏｇ、５〜７ｌｏｇ、５〜８ｌｏｇ、５〜９ｌｏｇ、６〜７ｌｏｇ、６〜８ｌｏｇ、６〜９ｌｏｇ、７〜８ｌｏｇ、７〜９ｌｏｇ、または８〜９ｌｏｇの低減をもたらす。インフルエンザウイルスの力価、数、または総負荷の低減の便益には、感染の症状の重症度の低下、感染の症状の減少、および感染に関連する疾患の期間の低減が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
融合タンパク質
本発明において、修飾インフルエンザＨＡ幹ドメインおよび三量体化ドメインをコードする第１のポリペプチドが連結されて、融合タンパク質を形成する。本明細書で使用されるとき、本明細書における「融合タンパク質」もしくは「融合ポリペプチド」という用語または文法的同等物は、それらの天然の状態では典型的に連結されていないが、連結されて単一の連続したポリペプチドを形成し得る、複数のタンパク質構成要素から構成されるタンパク質が意図される。ＨＡ抗原の配列は、野生型から、１個以上の疎水性アミノ酸残基の極性アミノ酸との置換、特に、曝露されたドメインにおける疎水性残基の極性アミノ酸との置換によって、修飾される。配列は、疎水性残基およびシステインを含有する幹におけるポリペプチド領域の削除によってさらに修飾される。修飾ＨＡ抗原は、限定なしに、Ｔ４バクテリオファージのフィブリチン（ｆｉｂｒｉｔｉｎ）のフォールドンを含む、三量体化ドメインに融合される。いくつかの実施形態において、配列は、抗原をウイルス様粒子（ＶＬＰ）に連結することにおいて有用な非天然アミノ酸の導入を可能にするように修飾され、ここで規定の非天然アミノ酸は、ＨＡ幹の三量体化ドメインの末端、またはそのらせん構造の外側に位置付けられてもよい。追加の実施形態において、配列は、タンパク質精製において有用なモチーフ、例えば、ヒスチジンタグ、プロテアーゼ切断部位等を含むように修飾される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、図１２に例示される修飾ＨＡ幹ポリペプチドを含む。候補となるＨＡ幹領域は、図１２に記載されるように修飾されてもよい。候補となる幹領域は、配列番号１と少なくとも約６５％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、またはそれを超えて同一であってもよい。候補となる配列は、当業者によって、提供される例となるＨＡ幹ドメイン配列に対して容易にアライメントされ、本明細書に記載され、図１２に描写される特定のアミノ酸変化、例えば、次のうちの１つ以上が、指定される位置において行われる：リンカーの挿入、フォールドンドメインへの融合、特定の疎水性アミノ酸の置換、システイン含有領域の削除およびシステイン残基の置換（かかる変化の全てが行われたポリペプチドを含む）。
【００４３】
いかなる特定の作動の理論にも拘束されることを意図するものではないが、インフルエンザヘマグルチニン幹ドメインポリペプチドは、複数のインフルエンザ株と交差反応することが可能である免疫応答を生じさせるために、１つ以上の保存された抗原性領域を宿主免疫系に提示するのに有用であると考えられる。１つ以上の抗原性領域がインフルエンザヘマグルチニン亜型にわたってよく保存されることから、かかる免疫応答は、完全長インフルエンザヘマグルチニンポリペプチドのいくつかの亜型と交差反応し得る。しかしながら、天然のＨＡ幹ポリペプチドは合成後に凝集し、投与のために製剤化することができる三量体構造へとリフォールディングすることが困難であることが見出されてきた。本発明は、合成、リフォールディング、および製剤化を可能にする、ＨＡ幹ドメインにおいて標的化されたアミノ酸変化を提供し、この合成は、細胞内で、例えば、組換え法によって、またはＣＦＰＳにおいて、行われてもよい。
【００４４】
本明細書に提供されるインフルエンザヘマグルチニン幹ドメイン抗原は、複数のインフルエンザ株に対する免疫応答を生じさせるための投与に有用である。インフルエンザヘマグルチニン幹ドメインポリペプチドは一般に、従来のインフルエンザワクチンポリペプチドの高抗原性で可変の球状頭部ドメインを含まず、したがって、比較的保存されたエピトープを担持する複数のインフルエンザ株に対する宿主の免疫応答を生じさせる。インフルエンザヘマグルチニン幹ドメインポリペプチドは、任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個の既知のインフルエンザＡヘマグルチニン亜型または後に特定されるインフルエンザＡヘマグルチニン亜型に対する宿主の免疫応答を生じさせるのに有用であり得る。インフルエンザヘマグルチニン幹ドメインポリペプチドはまた、未知のまたは後に特定される任意のインフルエンザＢヘマグルチニン亜型に対する宿主の免疫応答を生じさせるのにも有用であり得る。
【００４５】
一般に、本明細書に提供されるインフルエンザヘマグルチニン幹ドメインポリペプチドは、インフルエンザヘマグルチニンポリペプチドの修飾された幹ドメインを含むか、またはそれから本質的になるポリペプチドである、つまり、幹ドメインは、ＨＡの球状頭部ドメインに関連する配列がない。インフルエンザヘマグルチニンポリペプチドの幹ドメインは、当業者によって一般に認識される幹ドメインである。
【００４６】
インフルエンザヘマグルチニン幹ドメインポリペプチドは、最大２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸残基が、アミノ酸残基５２〜６８および残基２８８〜３２１（Ｈ３付番）のいずれかまたは両方から削除される、疎水性配列およびシステイン配列の削除を含む。これらのインフルエンザヘマグルチニン幹ドメインポリペプチドは、アミノ酸残基５６〜６８および残基２８８〜３２３（Ｈ３付番）のいずれかまたは両方からの最大４個または２個のシステインが、任意の他のアミノ酸で置換される、ＨＡ幹ドメインの形態を含む。これらのインフルエンザヘマグルチニン幹ドメインポリペプチドは、アミノ酸残基３０４〜３２５および残基３９２〜４２５（Ｈ３付番）のいずれかまたは両方からの最大１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個の疎水性アミノ酸残基が、極性アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒ）で置換される、ＨＡ幹ドメインの形態を含む。削除したおよび変化したＨＡ１  Ｎ末端幹分節を含む、インフルエンザヘマグルチニン幹ドメインポリペプチドがさらに提供される。
【００４７】
ＨＡ幹ドメインは、Ｃ末端において、三量体化ドメインに、特にフォールドンドメインに連結される。配列は、柔軟なリンカー、プロテアーゼ切断部位等を通じて連結されてもよい。フォールドンドメインは、任意に、精製のためのタグ、例えば、Ｈｉｓタグに連結される。
【００４８】
ＨＡ幹ドメインは、領域／末端において、三量体化ドメインに、特にフォールドンドメインに連結される。配列は、柔軟なリンカー、プロテアーゼ切断部位等を通じて連結されてもよい。フォールドンドメインは、任意に、精製のためのタグ、例えば、Ｈｉｓタグに連結される。
【００４９】
所望される場合、種々の基が、合成中または発現中にペプチドに導入されてもよく、それは他の分子へのまたは表面への連結を可能にする。故に、システインを使用して、チオエーテル、金属イオン錯体に連結するためのヒスチジン、アミドまたはエステルを形成するためのカルボキシル基、アミドを形成するためのアミノ基等を作製することができる。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、タンパク質内の１つ以上の規定の部位で、特にフォールドンドメインの末端で、またはＨＡ幹ドメインのらせん構造の外側で含められる。非天然アミノ酸は、ＨＡ幹ドメインの基部もしくは頂部のいずれかの近く、またはこのドメインの側面上に配置されてもよい。結合部位の最適な配置は、ＶＬＰまたは他の担体の表面上のＨＡ幹ドメインのどの組み込み部位およびどの配向が、動物モデルにおける標準の試験プロトコルによって決定するとき、最も強力なおよび／または最も有効な保護的免疫応答を引き出しながら、許容される複合体化効率を可能にするかを試験して調べることによって、決定することができる。
【００５０】
本発明は、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸をさらに提供する。当業者によって理解されるであろうが、遺伝子コードの縮重に起因して、極めて多数の核酸が作製され得、それらの全てが本発明の融合タンパク質をコードする。故に、特定のアミノ酸配列を特定すれば、当業者は、融合タンパク質のアミノ酸配列を変化させない方式で１つ以上のコドンの配列を単に修飾することによって、任意の数の異なる核酸を作製し得るであろう。
【００５１】
融合タンパク質をコードする本発明の核酸を使用して、多様な発現構築物を作製することができる。発現構築物は、自己複製する染色体外ベクターまたは宿主ゲノムへと組み込むベクターであり得る。代替的に、無細胞発現の目的で、構築物には、所望のポリペプチドの転写および翻訳に必要とされる要素を含むことがあるが、複製起点、選択可能マーカー等の要素は含まないことがある。無細胞構築物は、管内で、例えば、ＰＣＲによって、複製されてもよく、増幅反応のために最適化された末端配列を含んでもよい。
【００５２】
一般に、発現構築物は、融合タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された、転写および翻訳調節核酸を含む。「制御配列」という用語は、特定の発現系、例えば、哺乳類細胞、細菌細胞、無細胞合成等における、作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば、原核生物系に好適である制御配列は、プロモーター、任意にオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞系は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用してもよい。
【００５３】
核酸は、それが別の核酸配列と機能的に関係するように配置されるとき、「作動可能に連結される」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結され、あるいはリボソーム結合部位は、それが翻訳の開始を容易にするように位置付けられる場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結される」とは、連結されているＤＮＡ配列が隣接していること、および分泌リーダーの場合、隣接しておりかつリーディング相にあることを意味する。連結は、ライゲーションによってまたは増幅反応を通じて遂行することができる。合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、従来の実務に従って配列を連結するために使用されてもよい。
【００５４】
一般に、転写および翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびにエンハンサーまたはアクティベーター配列を含み得るが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、調節配列は、プロモーターならびに転写開始および停止配列を含む。
【００５５】
プロモーター配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれかをコードする。プロモーターは、天然に生じるプロモーターまたはハイブリッドプロモーターのいずれであってもよい。１つを超えるプロモーターの要素を組み合わせる、ハイブリッドプロモーターもまた、当該技術分野で知られており、本発明において有用である。好ましい実施形態において、プロモーターは、Ｔ７プロモーター等の、管内発現系における高発現を可能にする、強力なプロモーターである。
【００５６】
加えて、発現構築物は、追加の要素を含んでもよい。例えば、発現ベクターは、１つまたは２つの複製系を有し、故に、それが複数の生物内で維持される、例えば、発現のために哺乳類または昆虫細胞内で維持され、またクローニングおよび増幅のために原核生物宿主内で維持されることを可能にしてもよい。加えて発現構築物は、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含有してもよい。選択遺伝子は、当業者に周知であり、使用される宿主細胞により異なるであろう。
【００５７】
無細胞合成
本発明のいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、無細胞合成、または管内合成によって、生物抽出物および／または規定の試薬を含む反応混合物中で、産生される。反応混合物は、マクロ分子の産生のためのテンプレート、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ等、マクロ分子が合成されるための単量体、例えば、アミノ酸、ヌクレオチド等、ならびに合成に必要であるような補因子、酵素、および他の試薬、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、ポリメラーゼ、転写因子等を含むであろう。かかる合成反応系は、当業者に周知であり、文献に記載されてきた。ポリペプチド合成のためのいくつかの化学反応を、本発明の方法において使用することができる。例えば、化学反応は、２００２年１月８日に発行された米国特許第６，３３７，１９１号、および２００１年１月２日に発行された米国特許第６，１６８，９３１号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５８】
本発明の一実施形態において、化学反応は、２００３年８月１８日に出願された、同時係属中の米国公開特許第１０／６４３，６８３号の特許出願に記載されるようなものであり、参照により本明細書に組み込まれる。酸化的リン酸化が活性化されて、エネルギー源の増加した収率および増大された利用率を提供する。改善された収率は、グルコース含有培地上で成長させられた細菌に由来する生物抽出物の使用、ポリエチレングリコールの不在、および最適化されたマグネシウム濃度を含む、要因の組み合わせによって得られる。これは、合成が二次エネルギー源の不在下であっても生じ得る、［ＰＯ４］およびｐＨにおいて恒常的な系を提供する。
【００５９】
無細胞タンパク質合成のためのテンプレートは、ｍＲＮＡまたはＤＮＡのいずれでもあり得る。安定化されたｍＲＮＡの翻訳または組み合わせた転写および翻訳は、蓄積された情報をタンパク質へと変換する。一般に大腸菌系において利用される、組み合わせた系は、認識可能なプロモーターによりｍＲＮＡをＤＮＡテンプレートから連続的に生成する。内在性ＲＮＡポリメラーゼが使用されるか、または外来性ファージＲＮＡポリメラーゼ、典型的にＴ７もしくはＳＰ６が、反応混合物に直接添加されるかのいずれかである。代替的に、ｍＲＮＡは、メッセージを、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであるＱＢレプリカーゼのテンプレートに挿入することによって、継続的に増幅される。精製されたｍＲＮＡは、一般に、それが反応混合物に添加される前に、化学修飾によって安定化される。ヌクレアーゼを抽出物から除去して、ｍＲＮＡレベルを安定化する一助とすることができる。テンプレートは、対象となる任意の特定の遺伝子をコードすることができる。
【００６０】
他の塩、特に、マンガン等の生物学的に関連性のある塩がまた、添加されてもよい。カリウムが一般に５０〜２５０ｍＭの間で添加され、アンモニウムが０〜１００ｍＭの間で添加される。反応のｐＨは、一般にｐＨ６〜ｐＨ９の間である。反応の温度は、一般に２０℃〜４０℃の間である。これらの範囲は、拡大されてもよい。
【００６１】
所望されない酵素活性に対する代謝阻害剤が、反応混合物に添加されてもよい。代替的に、所望されない活性に関与する酵素もしくは因子が、抽出物から直接除去されてもよく、または所望されない酵素をコードする遺伝子が、不活性化されるかもしくは抽出物の源となる細胞の染色体から削除されてもよい。
【００６２】
宿主生物から精製されるか、または合成のいずれかである、小胞体もまた、この系に添加されてもよい。これらを使用して、タンパク質合成および折り畳みを強化してもよい。このサイトミム（ｃｙｔｏｍｉｍ）技術は、酸化的リン酸化の活性化のために、呼吸鎖構成要素を含有する膜小胞体を利用する過程を活性化することが示されてきた。本方法を無細胞発現に使用して、他の組の膜タンパク質を活性化してもよい。
【００６３】
対象となる合成系には、ＤＮＡの複製が含まれ、それには、ＤＮＡの増幅、ＤＮＡまたはＲＮＡテンプレートからＲＮＡの転写、ポリペプチドへのＲＮＡの翻訳、および単糖からの複合炭水化物の合成が含まれ得る。
【００６４】
反応は、大規模、小規模であってもよく、または多重化して複数の同時合成を行ってもよい。追加の試薬を導入して、活性な合成の一定期間を延長してもよい。合成された産物は、通常は、リアクタ内で蓄積され、次いで、この系の作動の完了後、タンパク質精製のための通常の方法に従って単離および精製される。
【００６５】
ｍＲＮＡを翻訳してタンパク質を産生することが特に対象となり、この翻訳は、ＤＮＡテンプレートからのｍＲＮＡの管内合成と組み合わされてもよい。かかる無細胞系は、ｍＲＮＡの翻訳のために必要な全ての因子、例えば、リボソーム、アミノ酸、ｔＲＮＡｓ、アミノアシルシンテターゼ、伸長因子、および開始因子を含有するであろう。当業者に既知の無細胞系には、大腸菌抽出物等が含まれ、それを好適なヌクレアーゼで処理して、活性な内在性ｍＲＮＡを除去することができる。
【００６６】
無細胞抽出物、遺伝子テンプレート、およびアミノ酸等の上の構成要素に加えて、タンパク質合成に特異的に必要とされる物質が反応に添加されてもよい。これらの物質には、塩、高分子化合物、環状ＡＭＰ、タンパク質または核酸分解酵素の阻害剤、タンパク質合成の阻害剤または調節剤、酸化／還元調整剤、非変性界面活性剤、緩衝液構成成分、プトレシン、スペルミン、スペルミジン等が含まれる。
【００６７】
塩には、好ましくは、酢酸または硫酸のカリウム、マグネシウム、およびアンモニウム塩が含まれ、これらのうちのいくつかは、対アニオンとしてアミノ酸を有してもよい。高分子化合物は、ポリエチレングリコール、デキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン、四級アミノエチル、およびアミノエチル  デキストラン等であってもよい。酸化／還元調整剤は、ジチオトレイトール、アスコルビン酸、グルタチオン、および／またはそれらの酸化物であってもよい。また、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００等の非変性界面活性剤が、０〜０．５Ｍの濃度で使用されてもよい。スペルミンおよびスペルミジン、または任意に、組み合わせて、プトレシンが、タンパク質合成能力を改善するために使用されてもよく、ｃＡＭＰが、遺伝子発現調節因子として使用されてもよい。
【００６８】
反応培地の特定の構成成分の濃度を変更するとき、別の構成成分の濃度が適宜変更されてもよい。例えば、ヌクレオチドおよびエネルギー源化合物等のいくつかの構成成分の濃度は、他の構成要素の濃度の変更に従って同時に制御されてもよい。また、リアクタ内の構成要素の濃度レベルは、経時的に変動させられてもよい。
【００６９】
好ましくは、反応は、ｐＨ５〜１０の範囲および２０℃〜５０℃の温度内で、およびより好ましくは、ｐＨ６〜９の範囲および２５℃〜４０℃の温度内で、維持される。
【００７０】
翻訳反応において産生されるタンパク質の量は、種々の様式で測定することができる。１つの方法は、翻訳されている特定のタンパク質の活性を測定するアッセイの利用可能性に依存する。タンパク質活性を測定するためのアッセイの例としては、ルシフェラーゼアッセイ系、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼアッセイ系がある。これらのアッセイは、翻訳反応から産生される、機能的に活性なタンパク質の量を測定する。活性アッセイは、不適当なタンパク質折り畳み、またはタンパク質活性に必要な他の翻訳後修飾の欠如に起因して不活性である、完全長タンパク質を測定しないであろう。
【００７１】
組み合わせた管内転写および翻訳反応において産生されるタンパク質の量を測定する別の方法は、３５Ｓ−メチオニンまたは１４Ｃ−ロイシン等の既知の量の放射標識アミノ酸を使用して反応を行って、その後、新たに翻訳されたタンパク質に組み込まれた放射標識アミノ酸の量を測定することである。組み込みアッセイは、切頭型タンパク質産物を含む、管内翻訳反応において産生された全てのタンパク質における放射標識アミノ酸の量を測定するであろう。放射標識タンパク質は、タンパク質ゲル上でさらに分離され、またオートラジオグラフィーによって、産物が適正なサイズであること、および二次タンパク質産物が産生されていないことを確認されてもよい。
【００７２】
製剤および使用
本発明の組成物は、本明細書に記載されるポリペプチド集団のうちのいずれかを含み、免疫応答を調節するのに十分な量で製剤化することができる。かかる製剤は、治療薬または予防薬として、インフルエンザウイルス感染の治療において使用することができる。かかる化合物の毒性および治療有効性は、標準の薬学的手順によって、細胞培養物または実験動物において、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するために、決定することができる。毒性作用と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、それは比率ＬＤ５０ＥＤ５０として表すことができる。より大きい治療指数を示す化合物が好ましい。
【００７３】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための様々な投薬量を製剤化する際に使用することができる。かかる化合物の投薬量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全く伴わないＥＤ５０を含む、様々な循環濃度以内にある。投薬量は、この範囲内で、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、異なってもよい。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療上有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量を動物モデルにおいて製剤化して、動物における標準の試験プロトコルを使用して決定される急速なウイルス中和応答を生成するための追加免疫刺激を提供する、循環血漿中濃度を達成してもよい。かかる情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中の引き出された抗体のレベルは、例えば、標準のＥＬＩＳＡ型アッセイによって、または他のアッセイ形式を使用して、測定されてもよい。場合によっては、ＨＡ幹タンパク質は、他のポリペプチドに融合されてもよく、またはより急速で有効な治療応答を提供するために免疫応答刺激物質と共投与されてもよい。
【００７４】
本発明の化合物は、さらに、予防的ワクチンの役割を果たしてもよく、その宿主は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質に対する抗体および／またはＣＴＬ応答を産生し、その応答が次いで、例えば、さらなるインフルエンザ感染を阻害することによって、インフルエンザウイルスを中和するように働く。予防的ワクチンとしての本発明の化合物の投与は、宿主に、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質への抗体および／もしくはＣＴＬ応答を引き出す、ならびに／またはインフルエンザウイルスを、例えば、細胞に感染するウイルスの能力を阻害することによって中和するのに十分な、免疫応答を高めることにおいて有効な抗原性化合物の濃度を投与することを含む。正確な濃度は、投与される具体的な化合物に依存するであろうが、当業者に周知である、免疫応答の発達をアッセイするための標準の技法を使用することによって、決定されてもよい。
【００７５】
化合物は、免疫学的応答を強化するために、好適なアジュバントと共に製剤化されてもよい。かかるアジュバントには、水酸化アルミニウム等の鉱物ゲル；リソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン等の表面活性物質；他のペプチド；油乳剤；ならびにＢＣＧおよびコリネバクテリウム・パルバム等の可能性として有用なヒトアジュバントが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００７６】
本発明による共投与に好適なアジュバントは、ＱＳ−２１、Ｄｅｔｏｘ−ＰＣ、ＭＰＬ−ＳＥ、ＭｏＧＭ−ＣＳＦ、ＴｉｔｅｒＭａｘ−Ｇ、ＣＲＬ−１００５、ＧＥＲＢＵ、ＴＥＲａｍｉｄｅ、ＰＳＣ９７Ｂ、Ａｄｊｕｍｅｒ、ＰＧ−０２６、ＧＳＫ−１、ＧｃＭＡＦ、Ｂ−ａｌｅｔｈｉｎｅ、ＭＰＣ−０２６、Ａｄｊｕｖａｘ、ＣｐＧ  ＯＤＮ、Ｂｅｔａｆｅｃｔｉｎ、Ａｌｕｍ、およびＭＦ５９（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｖａｃｃｉｎｅ，１８：５９７およびその中の参考文献を参照されたい）を含む、人々において可能性として安全で、忍容性が良好で、有効なものであるべきである。
【００７７】
上述の全てのかかる治療について、正確な調合、投与経路、および投薬量は、個々の医師によって、患者の病態を考慮して選定することができる。（例えば、Ｆｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５の「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」を参照されたい）。担当医師であれば、毒性または臓器機能不全に起因して、投与をどのように、またいつ終結、中断、または調整すべきかがわかるであろうことに留意すべきである。逆に、担当医師であれば、臨床応答が十分でなかった場合（毒性を除外する）、治療をより高いレベルに調整することもわかるであろう。対象となるウイルス感染の管理において投与される用量の大きさは、治療される病態の重症度、および投与経路により異なるであろう。用量および恐らくは初回免疫レジメンもまた、個々の患者の年齢、体重、および応答に従って異なるであろう。上に考察されるものと同等のプログラムが獣医学において使用されてもよい。
【００７８】
本発明の薬理学的に活性な化合物を、従来の薬学的製剤化の方法に従って処理して、患者、例えば、ヒトを含む哺乳動物に投与するための、薬品を生産することができる。
【００７９】
一般に、本発明の組成物は好ましくは、薬学的に許容される賦形剤も含み、また、種々の製剤としてのものであってもよい。当業者に周知であるが、薬学的に許容される賦形剤は、薬理学的に有効な材料の投与を安定化させ、容易にする、比較的不活性な材料である。例えば、賦形剤は、形態もしくは稠度を与え得るが、または希釈剤として作用し得る。好適な賦形剤には、安定剤、湿潤剤および乳化剤、様々な浸透圧のための塩、カプセル封入剤、緩衝液、ならびに皮膚浸透促進剤が含まれるが、これらに限定されない。腸管外および非腸管外薬物送達のための賦形剤ならびに製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １９ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９５）に記載される。
【００８０】
他の製剤には、リポソーム等の担体を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の好適な送達形態が含まれる。Ｍａｈａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：８５３−８５９。リポソーム調製物には、サイトフェクチン、多層状小胞、および単層状小胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００８１】
一般に、これらの組成物は、注射または吸入によって、例えば、腹腔内、静脈内、皮下、皮内、筋肉内等に投与するために、製剤化される。従って、これらの組成物は、食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液等の薬学的に許容されるビヒクルと組み合わされてもよい。特定の投薬レジメン、すなわち、用量、タイミング、および反復は、特定の個体およびその個体の病歴に依存するであろう。
【００８２】
いくつかの実施形態において、１つを超える抗原（複数可）が組成物中に存在してもよい。かかる組成物は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれよりも多い異なる抗原（複数可）を含有してもよい。かかる「カクテル」（当該技術分野でしばしばそのように表される）は、異なる変異形において存在する病原体に対して免疫する際に特に有用であり得る。
【００８３】
一般に、これらの組成物のうちのいずれかを投与することの有効性は、本明細書に記載される免疫応答、または他の臨床パラメータの任意の変化を測定することによって調整される。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗原性化合物は、１つ以上の免疫調節促進剤と併せて投与することができる。故に、本発明は、融合タンパク質集団、ＶＬＰＳ等と、免疫調節促進剤とを含む、組成物を提供する。本明細書で使用されるとき、「免疫調節促進剤」という用語は、免疫タンパク質リンカーの免疫調節活性を支持および／または強化する分子を指す。免疫調節促進剤の例としては、サイトカイン等の副刺激分子、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、および／またはアジュバントが挙げられ得る。リンカー−促進剤複合体におけるリンカーおよび促進剤分子の会合は、高親和性および／または低親和性相互作用を含む、共有結合相互作用を通じるおよび／または非共有結合相互作用を通じるものであり得る。免疫タンパク質リンカーおよび促進剤を連結することができる、非共有結合相互作用の例としては、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、およびファンデルワールス引力が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
免疫調節促進剤には、副刺激分子（サイトカイン、ケモカイン、ＤＮＡ配列、標的化タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸を含むペプチド等）、アジュバント（ミョウバン、脂質乳剤等）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
リンカーと共に投与するための好適な免疫調節サイトカインペプチドの中には、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３等）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、コロニー刺激因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）、およびＴＮＦ−αがある。好ましくは、リンカーオリゴヌクレオチドと併用するための免疫刺激ペプチドは、ＩＬ−１２（Ｂｌｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：８８７−８９４）、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、β、およびγ等の、Ｔｈ１型免疫応答を刺激するもの、ならびに／または形質転換成長因子（ＴＧＦ）−αである。
【００８７】
本発明はまた、ミクロスフェア、ビーズ、巨大分子複合体、ナノカプセル等のコロイド状分散系、ならびに水中油乳剤、ミセル、混合ミセル、およびリポソーム等の脂質ベースの系と併せて抗原性組成物を含む、組成物も提供する。コロイド状分散系は、リンカー含有組成物の有効なカプセル封入を提供することができる。カプセル封入組成物は、多種多様な構成成分のうちのいずれかをさらに含む。これらには、ミョウバン、脂質、リン脂質、脂質膜構造（ＬＭＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびにポリペプチド、糖ペプチド、ポリラクチド／プリグリコリドポリグリコライド共重合体、および多糖類等の他の重合体が含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
全ての免疫原性組成物と同様に、特定の抗原性製剤の免疫学的有効量および投与方法は、個体、どの病態が治療されるか、および当業者にとって明らかな他の要因に基づいて異なり得る。考慮されるべき要因には、抗原性、組成物がアジュバントまたは送達分子と複合体化されるまたはそれに共有結合されることになるか否か、投与経路、および投与されるべき免疫化投薬の数が含まれる。かかる要因は、当業者に知られており、かかる決定を過度の実験を伴わずに下すことは、免疫学者の技能の範囲内に十分に入る。好適な投薬量範囲は、抗原への免疫応答の所望の調節を提供するものである。一般に、抗原組成物の投薬量範囲は、例えば、およそ次のうちのいずれかからのものであってもよい：０．０１〜１００μｇ、０．０１〜５０μｇ、０．０１〜２５μｇ、０．０１〜１０μｇ、１〜５００μｇ、１００〜４００μｇ、２００〜３００μｇ、１〜１００μｇ、１００〜２００μｇ、３００〜４００μｇ、４００〜５００μｇ。代替的に、用量は、およそ次のうちのいずれかであり得る：０．１μｇ、０．２５μｇ、０．５μｇ、１．０μｇ、２．０μｇ、５．０μｇ、１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇ、１００μｇ。したがって、用量範囲は、およそ次のうちのいずれかの下限を有するもの：０．１μｇ、０．２５μｇ、０．５μｇ、および１．０μｇ；ならびにおよび次のうちのいずれかの上限を有するものであり得る：２５０μｇ、５００μｇ、および１０００μｇ。これらの組成物において、免疫タンパク質リンカー対抗原のモル比は、異なってもよい。各患者に与えられる絶対量は、生体利用能、クリアランス速度、および投与経路等の薬理学的特性に依存し、また、レシピエントの年齢および／または個体の免疫系の状態にも依存し得る。
【００８９】
抗原への免疫応答の分析（定性および定量の両方）は、当該技術分野で既知の任意の方法によって行うことができ、この方法には、抗原特異的抗体産生（特定の抗体サブクラスを測定することを含む）、ＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞等の特定のリンパ球集団の活性化、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１２等のサイトカインの産生、ならびに／またはヒスタミンの放出を測定することが含まれるが、これらに限定されない。特定の抗体応答を測定するための方法には、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が含まれ、当該技術分野で周知である。ＣＤ４＋Ｔ細胞等のいくつかの特定のリンパ球型の測定は、例えば、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いて達成することができる。サイトカインの血清中濃度は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、測定することができる。免疫原性への免疫応答を評価するためのこれらのおよび他のアッセイは、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９８０）  Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ，ｅｄｓ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．を参照されたい。
【００９０】
本発明は、特定の手法、プロトコル、細胞株、動物種または属、構築物、および試薬等に限定されるものではなく、したがって、当然のことながら、異なり得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のためにすぎず、本発明の範囲を限定するものとしては意図されないこともまた理解されたく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００９１】
別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家にとって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法、デバイス、および物質と同様または同等のいずれの方法、デバイス、および物質を本発明の実践または試験で使用することができるが、好ましい方法および物質が今は記載される。
【００９２】
本明細書で言及される全ての特許および他の刊行物は、刊行物に記載され、記載される本発明に関連して使用され得る、例えば、試薬、細胞、構築物、および手法を説明および開示する目的で、参照により本明細書に組み込まれる。上でおよび本文全体を通じて考察される刊行物は、本出願の出願日より前にそれらを開示するためのみで提供される。本明細書におけるいかなる内容も、発明者らが、先願発明によって、かかる開示に先行する権利がないことを承認するものと解釈されるべきではない。
【００９３】
次の実施例は、当業者に主題の発明の作製および使用方法の完全な開示および説明を提供するために提示されるものであり、本発明者らが何を本発明として見なすかについての範囲を限定するようには意図されない。使用された数値（例えば、量、温度、濃度等）に関する正確性を確実にするための努力がなされたが、幾つかの実験的誤差および偏差が許容されるべきである。別途指定されない限り、部分は質量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
【００９４】
実験
我々は、インフルエンザＡウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０５／２００９（Ｈ１Ｎ１）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣＰ４１９２６）からのＨＡタンパク質の保存された幹領域に基づく、新規のインフルエンザワクチン抗原を記載する。インフルエンザＡウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０５／２００９（Ｈ１Ｎ１）（受託番号ＡＣＰ４１９２６）からのＨＡ幹ドメインの配列を、図１に示されるように、５つの他のインフルエンザＡウイルス、Ａ／Ｖｉｅｔ  Ｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）（受託番号ＡＢＷ９０１３５）、Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１／１９６８（Ｈ３Ｎ２）（受託番号ＡＦＧ７１８８７）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７（Ｈ２Ｎ２）（受託番号ＡＣＦ５４４７７）、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）（受託番号ＡＣＦ４１８３４）、およびＡ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８（Ｈ１Ｎ１）（受託番号ＡＡＤ１７２２９）からのＨＡ幹ドメインの配列に対してアライメントした。幹ドメインは、非常によく保存されている。
【００９５】
抗原は、ＨＡ幹ドメインとＣ末端２９アミノ酸「フォールドン」配列との間の融合物から構成される。フォールドンを使用して、三量体化を誘導した（図２）。フォールドンドメインを、図３（ａ）に示されるように、任意の切断可能なＴＥＶプロテアーゼ部位でＨＡ幹配列から分離し、それはまたＣ末端に任意のＨｉｓ６タグを含有する。タンパク質合成およびリフォールディング後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル結果は、図３（ｂ）におけるより高い分子量のバンドによって示されるように、タンパク質が凝集したことを示した。不正確な分子間ジスルフィド結合が形成された。サイズ排除クロマトグラフィーもまた、三量体形成が非常に少ないことを示した。
【００９６】
凝集の機会を低減するために、幹ドメインにおけるいくつかの曝露された疎水性残基を突然変異させた。図４（ａ）に示されるように、疎水性残基は、完全長外部ドメイン構造における頭部ドメインと緊密に接触するようになるが、恐らく、幹ドメインが単独で発現されるとき曝露される。我々は、図４（ｂ）に示されるように、５つの異なる突然変異の群を試みた。タンパク質を、手順Ｉを使用してリフォールディングした。突然変異タンパク質が野生型よりも良好に折り畳みし、三量体化したかどうかを決定するために、精製し、リフォールディングした突然変異タンパク質を、サイズ排除ＨＰＬＣを使用して野生型タンパク質と比較した（図５）。結果は、突然変異体Ｍ３およびＭ５がより少ない凝集体を形成したことを示した。Ｍ５は、Ｍ３よりも少数の突然変異を有し（図４（ｂ）に示されるように）、また、他の種と比べていくらかより大量の三量体に折り畳むようであった。したがって、我々は、Ｍ５をさらなる研究のために選定した。
【００９７】
タンパク質リフォールディング条件を次に、直交の実験設計(orthogonal experimental design)によって再最適化して、ＨＡ幹タンパク質のための最良のリフォールディング条件を見出した。タンパク質を、手順ＩＩを使用してリフォールディングした。直交の実験設計において、７つの因子および２つのレベルが存在した（表１）。我々は、この設計のためにＬ８（２７）直交配列を使用した。統計分析を、ＩＢＭ  ＳＰＳＳソフトウェアを使用して行った。表２は、統計分析結果を示す。より高い平均値は、この条件が三量体の形成のために好ましかったことを示す。界面活性剤Ｂｒｉｊ  ３５の添加が、三量体の形成のために最も有益な因子であった。
【００９８】
【表１】
2015519348.tif 000002
【００９９】
【表２】
2015519348.tif 000003
【０１００】
界面活性剤が三量体形成のために非常に重要であったことから、我々は、界面活性剤Ｂｒｉｊ  ３５およびＴｗｅｅｎ  ２０をサイズ排除ＨＰＬＣにおいて比較した（図６）。タンパク質を、手順ＩＩＩを使用してリフォールディングした。三量体および単量体は、Ｔｗｅｅｎ  ２０よりもＢｒｉｊ  ３５を使用することによって、流れる緩衝液中でよりよく分離することができる。
【０１０１】
所望されない分子間Ｓ−Ｓ結合の形成を低減するために、疎水性残基および３つのシステインを含有する２つのポリペプチド領域（Ｈ３８〜Ｃ４３およびＣ４９〜Ｎ６１）を削除させ、システイン７７をスレオニンへと突然変異させた（図７）。各単量体におけるジスルフィド結合の数は、それによって４つから２つへと低減された。新たな突然変異体をＭ６と名付けた。タンパク質を、手順ＩＶを使用してリフォールディングした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は、２つの削除が、所望されない分子間Ｓ−Ｓ結合の形成を減少させることを示した。
【０１０２】
３系列の実験結果は、回収率が、手順ＩＶを使用したタンパク質精製およびリフォールディング後に、８０％前後に到達し得ることを示した。三量体の割合は、７４％前後であり、この結果は、３つの別個の調製物中で再現可能であった（表３）。安定化されたＨＡ幹ドメイン三量体の適正な立体配座をさらに確認するために、突然変異体Ｍ６を商用の完全長ＨＡと、ＨＡ幹三量体に結合することによってインフルエンザ感染を遮断する商用抗体（Ｃ１７９）によるそれらの認識について、比較した（図８）。ＥＬＩＳＡ結果は、我々が構築したＨＡ幹三量体が、中和抗体Ｃ１７９によってはるかによりよく（およそ３０倍の差で）認識されることを示した。
【０１０３】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、正２０面体または棒状構造のいずれかへと自己組み立てし、ウイルスのコートタンパク質からなる、非感染性タンパク質構造物である。ＶＬＰの反復する表面エピトープは、強力な抗体応答を引き出すことができ、ＶＬＰのサイズは、典型的に２５〜１００ｎｍであることから、それらはリンパ系へと輸送されてＴ細胞応答を誘導するのに理想的である。故に、ＶＬＰの免疫原性特性により、それらは、有効なワクチンのコアとして魅力的な標的となってきた。無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）系において、非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を、ＣＦＰＳにより産生されるタンパク質に組み込むことができる。アルキン基を有するｎｎＡＡ（ｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニン）およびアジド基を有するｎｎＡＡ（ホモプロパルギルグリシン）を、それぞれ、新たなＨＡ幹抗原およびＢ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃ）ＶＬＰ上のＶＬＰ表面部位に組み込んだ。ＨＡ幹抗原を次いでクリック反応によってＨＢｃ  ＶＬＰに結合させた。ＨＡ幹抗原の他に、フラジェリン、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＣｐＧ  ＤＮＡのような他の免疫刺激種もまた、図９に示されるように、同じＶＬＰの表面に結合させることが可能であった。
【０１０４】
抗体結合のための主要な領域は、ＨＡ幹ドメインの中部にあるため、ｎｎＡＡをＨＡ幹ドメインの頂部、中部、または底部に組み込むことが可能であった（図１０）。ｎｎＡＡのＨＡ幹への部位特異的組み込みのために、ＨＡ幹構築物の頂部（Ｈ１５４およびＤ１５５）および底部（Ｇ３０１）の３つの異なる部位を選定した（図１１（ａ））。還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果（図１１（ｂ））は、ＨＡ幹タンパク質がＨＢｃ  ＶＬＰに成功裏に結合したことを示した。
【０１０５】
物質および方法
ヘマグルチニン（ＨＡ）幹ドメイン構築物の設計および構築。ＨＡ幹ドメインタンパク質を産生するために、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０５／２００９（Ｈ１Ｎ１）ヘマグルチニン（受託番号ＡＣＰ４１９２６）の球状頭部ドメイン（Ｈ３付番における残基６０〜２９１）を、リンカーペプチド（ＧＳＧＳＧ）で置換した。ヘマグルチニンのシグナルペプチド（残基２〜１７）、膜貫通ドメイン（残基５２１〜５５４）、および細胞質側末端（残基５５５〜５６６）もまた削除させた。完全なＨＡ配列が配列番号１として提供される：
【０１０６】
インフルエンザＡウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０５／２００９（Ｈ１Ｎ１）（受託番号ＡＣＰ４１９２６）からのＨＡ幹ドメインの配列を、５つの他のインフルエンザＡウイルス、Ａ／Ｖｉｅｔ  Ｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）（受託番号ＡＢＷ９０１３５）、Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１／１９６８（Ｈ３Ｎ２）（受託番号ＡＦＧ７１８８７）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７（Ｈ２Ｎ２）（受託番号ＡＣＦ５４４７７）、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）（受託番号ＡＣＦ４１８３４）、およびＡ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８（Ｈ１Ｎ１）（受託番号ＡＡＤ１７２２９）からのＨＡ幹ドメインの配列に対してアライメントした。これらの６つの異なる変異形からのＨＡ幹ドメインの配列は、次の通り（また図１に示される通り）であった。
【０１０７】
【表Ａ】
2015519348.tif 000004
【０１０８】
本発明のＨＡ幹ドメイン構築物を次いで、ＨＡ幹ドメイン（例えば、配列番号２〜７に記載されるような）と、Ｃ末端２９アミノ酸「フォールドン」配列との間の融合物を含むように修飾した。フォールドンを使用して、ＨＡ幹ドメインを三量体化した。フォールドンドメインを、任意の切断可能なＴＥＶプロテアーゼ部位でＨＡ幹配列から分離し、それはまたＣ末端に任意のＨｉｓ６タグを含有する。この構築物をコードするＤＮＡを、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩ制限部位を使用してｐＹ７１ベクターにクローニングした。ｐＹ７１は、Ｔ７プロモーターを利用し、ｐＵＣ１９複製起点およびカナマイシン抵抗性要素を含有する、低減されたサイズのプラスミド（１．７６ｋｂ）である（Ｋｕｃｈｅｎｒｅｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。結果として生じる構築物によって発現されるアミノ酸配列は、配列番号８にある次の通りである。配列番号８をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号９として示される。
【０１０９】
曝露された疎水性残基の突然変異。配列番号２を、標的化された変更によって修飾して、次表に示すように、曝露された疎水性残基の異なる突然変異を有する５つの異なる変異形を生成した：
【０１１０】
【表Ｂ】
2015519348.tif 000005
【０１１１】
ジスルフィド数の低減。突然変異体Ｍ５に基づいて、疎水性残基および３つのシステインを含有する２つのポリペプチド領域（Ｈ３８〜Ｃ４３およびＣ４９〜Ｎ６１）を削除させ、システイン７７をスレオニンへと突然変異させた。各単量体におけるジスルフィド結合の数は、それによって４つから２つへと低減された。
【０１１２】
２つのジスルフィド結合を有する幹ポリペプチドの配列は、次の通りである：
【０１１３】
【表Ｃ】
2015519348.tif 000006
【０１１４】
無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）。ＣＦＰＳを、ＰＡＮＯｘ−ＳＰ（ＰＥＰ、アミノ酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、シュウ酸、スペルミジン、およびプトレシン）無細胞系を使用して、いくつかの修正を加えながら以前に記載されたように（Ｊｅｗｅｔｔ  ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ  ２００４）行った。標準のＰＡＮＯｘ−ＳＰ  ＣＦＰＳ反応混合物には、次のものが含まれる：１．２ｍＭのＡＴＰ、各々０．８５ｍＭのＧＴＰ、ＵＴＰ、およびＣＴＰ、３３ｍＭのホスホエノールピルビン酸（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、１７０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１０ｍＭのグルタミン酸アンモニウム、１６ｍＭのグルタミン酸マグネシウム、１．５ｍＭのスペルミジン、１．０ｍＭのプトレシン、０．１７ｍｇ／ｍＬのフォリン酸、１３．３μｇ／ｍＬのプラスミド、およそ１００〜３００μｇ／ｍＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、各々２ｍＭの２０個の未標識アミノ酸、０．３３ｍＭのＮＡＤ、０．２６ｍＭの補酵素Ａ（ＣｏＡ）、２．７ｍＭのシュウ酸カリウム、ならびに０．２８体積の大腸菌ＫＣ６  Ｓ３０抽出物  （Ｇｏｅｒｋｅ  ＆  Ｓｗａｒｔｓ  ２００８，  Ｋｎａｐｐ  ｅｔ  ｔａｌ  ２００７）。別途注記のない限り、全ての試薬をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  （Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。
【０１１５】
ＰＡＮＯｘ  ＳＰ  ＣＦＰＳに対するいくつかの修飾を行って、ジスルフィド結合形成を促進した。最初に、細胞抽出物を室温で１時間、１ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＭ）で前処理した。テンプレートＤＮＡ付加の前に、グルタチオン緩衝液（別途明記されない限り、４ｍＭの酸化グルタチオンおよび１ｍＭの還元グルタチオン）を無細胞反応物に添加して、チオール／ジスルフィド酸化還元電位を安定化させた。最後に、ＤｓｂＣ、周辺質ジスルフィド結合イソメラーゼを１００μｇ／ｍＬの最終濃度に添加した。
【０１１６】
抗原タンパク質を産生するためのＣＦＰＳ反応を、３０℃で６時間行った。小規模のＣＦＰＳ反応を１．５ｍＬの微量遠心管中、２０μＬ体積で行った。分取規模の反応は、６ウェルの組織培養プレート中、１ウェル当たり１ｍＬを有する、６ｍＬ体積を使用した  （ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ番号３０４６、ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）。８．４μＭのＬ−［Ｕ−１４Ｃ］−ロイシン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を、以前に記載されたトリクロロ酢酸のプロトコル（Ｃａｌｈｏｕｎ  ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ  ２００５）およびＢｅｃｋｍａｎ  ＬＳ３８０１液体シンチレーション計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を使用してタンパク質収率を測定するために、小規模の反応物におよび２０μＬの分取規模の反応物のアリコートに添加した。分取規模の反応物の可溶性画分を、さらなる評価および精製のために、２１，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって回収した。
【０１１７】
タンパク質精製およびリフォールディング（再折り畳み）。ＣＦＰＳ反応後、不溶性封入体を洗浄し、変性緩衝液中に溶解させた。純粋な封入体を次いで精製し、リフォールディングした。溶解、精製、およびリフォールディング過程に使用した緩衝液、ならびに過程の流れ図を次のように示した：
【０１１８】
手順Ｉ（野生型および突然変異体Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５のため）
洗浄緩衝液Ｉ：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；１００ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ＝８
洗浄緩衝液ＩＩ：１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；２０ｍＭのイミダゾール；ｐＨ＝８
変性洗浄緩衝液：８Ｍ尿素；１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；２０ｍＭのイミダゾール；１ｍＭのＤＴＴ；ｐＨ＝８
変性溶出緩衝液：８Ｍ尿素；１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；２５０ｍＭのイミダゾール；１ｍＭのＤＴＴ；ｐＨ＝８
リフォールディング緩衝液：６Ｍ→４Ｍ→２Ｍ尿素；５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；５００ｍＭのアルギニン；ＧＳＳＧ／ＧＳＨ（１：４ｍＭ）；４ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ＝１０．５
透析緩衝液：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；５００ｍＭのアルギニン；ＧＳＳＧ／ＧＳＨ（１：４ｍＭ）；４ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ＝１０．５
ＨＰＬＣの流れ緩衝液：透析緩衝液と同じ
【０１１９】
【表Ｄ】
2015519348.tif 000007
【０１２０】
手順ＩＩ（直交の実験設計によるタンパク質リフォールディング条件の最適化のため）
洗浄緩衝液Ｉ：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；１００ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ＝８
洗浄緩衝液ＩＩ：１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；２０ｍＭのイミダゾール；ｐＨ＝８
変性洗浄緩衝液：８Ｍ尿素；１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；２０ｍＭのイミダゾール；１ｍＭのＤＴＴ；ｐＨ＝８
変性溶出緩衝液：８Ｍ尿素；１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；５００ｍＭのイミダゾール；１ｍＭのＤＴＴ；ｐＨ＝８
リフォールディング緩衝液：５０ｍＭのトリスまたはヒスチジン；アルギニン（０ｍＭまたは５００ｍＭ）；ＮａＣｌ（０ｍＭまたは１５０ｍＭ）；スクロース（０％または１０％）；グリセロール（０％または１０％）；尿素（０ｍＭまたは０．５ｍＭ）；Ｂｒｉｊ３５（０％または０．０３％）；２ｍＭのＥＤＴＡ；ＣＳＳＧ／ＧＳＨ（１：４ｍＭ）；ｐＨ＝１０．５
透析緩衝液：ＧＳＳＧ、ＧＳＨ、およびＥＤＴＡを含まないリフォールディング緩衝液
ＨＰＬＣの流れ緩衝液：透析緩衝液と同じ
【０１２１】
【表Ｅ】
2015519348.tif 000008
【０１２２】
手順ＩＩＩ（界面活性剤Ｂｒｉｊ  ３５のＴｗｅｅｎ  ２０との比較のため）
洗浄緩衝液Ｉ：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；１００ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ＝８
洗浄緩衝液ＩＩ：１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；２０ｍＭのイミダゾール；ｐＨ＝８
変性洗浄緩衝液：８Ｍ尿素；１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；２０ｍＭのイミダゾール；１ｍＭのＤＴＴ；ｐＨ＝８
変性溶出緩衝液：８Ｍ尿素；１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；５００ｍＭのイミダゾール；１ｍＭのＤＴＴ；ｐＨ＝８
リフォールディング緩衝液：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；６００ｍＭのアルギニン；２ｍＭのＥＤＴＡ；シスタミン／システアミン（０．５：５ｍＭ）；０．０５％  Ｂｒｉｊ３５または０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０；ｐＨ＝８
透析緩衝液：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；１００ｍＭのアルギニン；０．０５％  Ｂｒｉｊ３５または０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０；ｐＨ＝８
ＨＰＬＣの流れ緩衝液：透析緩衝液と同じ
【０１２３】
【表Ｆ】
2015519348.tif 000009
【０１２４】
手順ＩＶ（突然変異体Ｍ６のため）
洗浄緩衝液Ｉ：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；１００ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ＝８
洗浄緩衝液ＩＩ：１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；２０ｍＭのイミダゾール；ｐＨ＝８
変性洗浄緩衝液：８Ｍ尿素；１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；２０ｍＭのイミダゾール；１ｍＭのＤＴＴ；ｐＨ＝８
変性溶出緩衝液：８Ｍ尿素；１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；５００ｍＭのイミダゾール；１ｍＭのＤＴＴ；ｐＨ＝８
変性緩衝液：８Ｍ尿素；５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；２ｍＭのＥＤＴＡ；１ｍＭのＤＴＴ；ｐＨ＝８
リフォールディング緩衝液：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；６００ｍＭのアルギニン；２ｍＭのＥＤＴＡ；シスタミン／システアミン（０．５：５ｍＭ）；０．０５％  Ｂｒｉｊ３５；ｐＨ＝８
透析緩衝液：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；１００ｍＭのアルギニン；０．０５％  Ｂｒｉｊ３５；ｐＨ＝８
【０１２５】
【表Ｇ】
2015519348.tif 000010
【０１２６】
サイズ排除ＨＰＬＣ。リフォールディングされたタンパク質を、１０μＭの粒子（Ｗａｔｅｒｓ）を含むＵｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ５００  ＨＰＬＣカラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ内径）により試験した。流れ緩衝液は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭのアルギニン、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０またはＢｒｉｊ  ３５であり、０．３ｍＬ／分でポンプ送出した。試料の注射体積は、８０μＬであった。タンパク質吸着を、直列で、２８０ｎｍで６０分間の期間にわたって監視した。
【０１２７】
ＨＡ幹ドメイン構築物およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）の組み立てに使用した構築物。アルキン基を有する非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）の、ＨＡ幹ドメインへの組み込みのための部位を導入するために、単一のＴＡＧコドンを、それぞれ３つの異なる箇所（残基Ｈ１７３、Ｄ１７４、およびＧ３１４）において、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＰＣＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して導入した。
【０１２８】
アジド基を有するｎｎＡＡをＢ型肝炎コア（ＨＢｃ）ＶＬＰに組み込むために、メチオニン部位を、ｎｎＡＡ組み込みのための残基７６において、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＰＣＲを使用して導入した。Ｍ６６をまたセリン残基で置換して、この部位におけるｎｎＡＡ導入を回避した。
【０１２９】
それぞれＨＡ幹ドメイン構築物およびＨＢｃ抗原へのｎｎＡＡ組み込みを容易にするために、直交のｔＲＮＡ配列をかくまう７５〜１００μｇ／ｍＬの線状化プラスミド（Ｃｅｍ  Ａｌｂａｙｒａｋ，Ｐｈ．Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ，２０１２）および２５０μｇ／ｍＬの直交のｔＲＮＡシンテターゼ（Ｐａｔｅｌ  ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ，２０１１）に加えて、５ｍＭのｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニン（ＰＰＦ、アルキン基を有する、ＭｅｄＣｈｅｍ  Ｓｏｕｒｃｅ  ＬＬＰ，Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｗａｙ，ＷＡ）および６ｍＭのアジドホモアラニン（ＡＨＡ、アジド基を有する、ＭｅｄＣｈｅｍ  Ｓｏｕｒｃｅ  ＬＬＰ，Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｗａｙ，ＷＡ）を、それぞれＣＦＰＳ反応物に添加した。ＰＰＦは、チロシンの類似体であり、ＡＨＡは、メチオニンの類似体である。メチオニンの包括的な置換のために、メチオニンをＣＦＰＳ反応混合物から削除した。
【０１３０】
アジド−アルキンクリック化学反応。（３＋２）付加環化クリック反応を、嫌気性グローブボックス（Ｃｏｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｒａｓｓ  Ｌａｋｅ，ＭＩ）中で行って、テトラキス（アセトニトリル）銅（Ｉ）ヘキサフルオロリン酸塩触媒（［（ＣＨ３ＣＮ）４Ｃｕ］ＰＦ６または単純にＣｕ（Ｉ）触媒）の還元状態を保存した（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。０．５ｍＭのエンハンサーリガンドであるトリス（トリアゾリルメチル）アミン（ＴＴＭＡ）（Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｃｈｉｄｓｅｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｔ  Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡから得た）に加えて、Ｃｕ（Ｉ）触媒を１ｍＭで反応物に添加して、クリック反応の速度を改善した。ＨＢｃ  ＶＬＰおよびＨＡ幹ドメイン構築物を、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ８．０）中、Ｃｕ（Ｉ）触媒およびＴＴＭＡエンハンサーと混合した。Ｃｕ（Ｉ）触媒の添加前に、クリック反応構成成分を、嫌気性グローブボックス中の１．５ｍＬの微量遠心管中で１時間、脱酸素化した。ＨＢｃ  ＶＬＰをＨＡ幹ドメイン構築物に結合するためのクリック反応を２時間行った。
【０１３１】
ＨＡ幹構築物のＥＬＩＳＡ結合。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）において、２μｇ／ｍＬ濃度での５０μＬの抗体Ｃ１７９（Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ）（ＴＡＫＡＲ  Ｂｉｏ  ＩＮＣ．）を９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｍｉｃｒｏｌｏｎ、平底、高結合；Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上にコーティングし、４℃で一晩結合させた。商用ＨＡは、２００９  Ｈ１Ｎ１株（ＨＡ（ΔＴＭ）（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）；Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）のアミノ酸１８〜５２９からなる。プレートを次いで洗浄緩衝液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ緩衝液）で３回洗浄し、３％ウシ血清アルブミン（ブロッキング緩衝液）を含むＰＢＳ緩衝液でブロッキングし、３７℃で１時間配置した。洗浄緩衝液で４回洗浄した後、６μｇ／ｍＬの商用ＨＡタンパク質およびリフォールディングされたＨＡ幹ドメインタンパク質の５０μＬ希釈液を次いで、プレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回再び洗浄した後、ブロッキング緩衝液中、１μｇ／ｍＬのモノクローナル抗Ｈｉｓビオチン複合体化抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回再び洗浄した後、ブロッキング緩衝液中、１：１０００希釈のペルオキシダーゼ複合体化抗ビオチン抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを６回再び洗浄した後、５０μＬのＴＭＢ基質（ＫＰＬ）で現像させ、３０μＬの２％  Ｈ２ＳＯ４で急冷処理した。各ウェルをＯＤ４５０で、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて測定した。各データ点は、３系列のアッセイ結果の平均を示し、エラーバーは、標準偏差を表す。
【０１３２】
実施例２
２００９年の世界的に流行したＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスの急速な伝播は、複数の突然変異株に対して幅広く保護するであろう普遍的インフルエンザワクチンに対する必要性を強調した。最近の努力は、高度に保存されたヘマグルチニン（ＨＡ）幹ドメインに集中してきた。可能性のある普遍的インフルエンザワクチン抗原としてのＨＡ幹ドメインの産生が、いくつかのグループ（Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  ＰＮＡＳ  １０７（３１）：１３７０１−１３７０６、Ｓｔｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ｍｂｉｏ  １（１）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  ＰＮＡＳ  １０７（４４）：１８９７９−１８９８４）によって試みられてきたが、これは技術的に困難であることが判明してきた。第１の課題は、ＨＡ幹ドメインが、独立の単位として折り畳みして三量体化するように進化してきていないということである。さらに、頭部ドメインの折り畳みと同時発生の折り畳みが、その幹の最初の部分として同時翻訳的に生じる可能性が最も高く、次いで頭部、および最後に幹ドメインの残りの部分がＥＲ膜から押し出され、この関連によって配向される。この過程中に、ジスルフィド結合が、単量体間連結を回避しながら、各単量体内で形成しなければならない。最後に、頭部ドメインの不在は、今では無秩序化し、疎水性、あるいは安定した可溶性タンパク質のための表面エピトープとして不適切となっている場合のある、内部ＨＡポリペプチドを曝露する。
【０１３３】
これらの複雑な状態のために、体内大腸菌発現は低く、収率はわずか２ｍｇ／Ｌであり、ＨＡ幹ポリペプチドが封入体として蓄積してしまう。いくつかのリフォールディング方法が試みられてきたが（Ｂｉｅｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７（４４）：６２３４−６２３８、Ｃｕｒｔｉｓ−Ｆｉｓｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ６１（２）：２１２−２１９、Ｓｗａｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（１９）：５９０２−５９１１）、可溶性産物の回収率は低くなっており、適正に折り畳まれた安定した三量体構造は確認されていない。
【０１３４】
封入体のリフォールディングを異なるｐＨ条件下で試みた。８モルの尿素を使用して、封入体を可溶化した。酸化（ＧＳＳＧ）および還元グルタチオン（ＧＳＨ）（モル比１：４）を添加して、正しいジスルフィド結合の形成および潜在的な異性化のためにスルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元環境を確立した。Ｌ−アルギニン（０．５Ｍ）および界面活性剤Ｔｗｅｅｎ  ２０もまた添加して、リフォールディングを補助した。３つの異なるｐＨ値（６．０、８．０、および１０．５）を試験し、その結果が図１４に示される。ｐＨ６．０で、タンパク質のほとんどは失われ、見たところ透析膜に付着しているようであった。ｐＨ８．０で、ほとんどが再凝集したが、ｐＨ１０．５では、より少ない凝集が生じた。しかしながら、ｐＨを８．０に低減したとき、ｐＨ１０．５手順からの可溶性画分もまた凝集した。これを受けて、我々は、プログラム、ＰｒｏｔＰａｒａｍを使用して算出したポリペプチドについての局部的なｐＩ値を検査した（図１５）。幹−ＨＡ１−断片１（ｐＩ８．８５）、幹−ＨＡ１−断片２（ｐＩ９．１０）、および幹−ＨＡ２−断片１（ｐＩ８．６０）の理論上のｐＩ値は、８．５を上回ったが、他の幹ドメイン断片のｐＩ値は、５を下回った。これは、ｐＨ１０．５では大部分が回避されるであろう、中性ｐＨでのかなりの分子間イオン引力に対する電位を示唆した。さらに、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ  ２０が凝集を低減したことから、不適切な疎水性相互作用もまた示唆された。
【０１３５】
これらの考慮事項に基づいて、５組の突然変異を設計して（図４）、新たに曝露された疎水性を軽減するか、分子間イオン対形成に対する電位を低減するか、またはその両方を行った。次の５つの異なる突然変異の群を評価した：Ｍ１（Ｉ６９Ｔ＋Ｉ７２Ｅ＋Ｉ７４Ｔ＋Ｃ７７Ｔ）、Ｍ２（Ｉ６９Ｔ＋Ｉ７２Ｅ＋Ｉ７４Ｔ＋Ｃ７７Ｔ＋Ｆ１６４Ｄ）、Ｍ３（Ｉ６９Ｔ＋Ｉ７２Ｅ＋Ｉ７４Ｔ＋Ｃ７７Ｔ＋Ｆ１６４Ｄ＋Ｌ１７４Ｄ）、Ｍ４（Ｆ１６４Ｄ）、およびＭ５（Ｆ１６４Ｄ＋Ｌ１７４Ｄ）。表３は、２つの新たに曝露された幹ドメイン断片（幹−ＨＡ１−断片１および幹−ＨＡ２−断片１）のｐＩに対する突然変異の効果を示す。標的化された突然変異が、広域中和抗体によって認識される表面から離れていたことに留意すべきである。サイズ排除ＨＰＬＣを使用した評価によると（図５）、Ｍ１突然変異群（Ｉ６９Ｔ＋Ｉ７２Ｅ＋Ｉ７４Ｔ＋Ｃ７７Ｔ）は、凝集を低減しないようであったが、突然変異体Ｍ３およびＭ５は、野生型または他の変異形よりもはるかにより少数の凝集体をもたらした。最も影響力の大きい突然変異は、Ｆ１６４Ｄ＋Ｌ１７４Ｄであるようであった。したがって、突然変異体Ｍ５（Ｆ１６４Ｄ＋Ｌ１７４Ｄ）をさらなる開発のために使用した。これらの変更が、新たに曝露されたタンパク質表面の疎水性およびｐＩの両方を低減した（２つ負電荷を導入することによって）ことに留意されたい。
【０１３６】
【表３】
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【０１３７】
所望されない分子間Ｓ−Ｓ結合の形成を回避し、表面疎水性およびリジン残基をさらに低減する（それによってこれらの領域のｐＩを低減する）ため、また、無秩序化された可能性がある構造を有する領域を回避するために、突然変異体Ｍ５を、疎水性残基、２つの正電荷性リジン、および３つのシステインを含有する２つポリペプチド領域（Ｈ３８〜Ｃ４３およびＣ４９〜Ｎ６１）を削除させることによって、さらに修飾した。システイン７７もまたスレオニンへと突然変異させて、不対合システインを除去した（図７）。また、削除された領域は、中和抗体結合領域から遠く離れている。各単量体におけるジスルフィド結合の数は、それによって４つから２つへと減少された。新たな突然変異体をＭ６と名付けた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果（図７）は、これらの修飾が、所望されない分子間ジスルフィド結合の形成を大幅に減少させることを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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