(57)【要約】癌を有する対象において、化学療法耐性の可能性を判定し、化学療法に対する応答を予測するためのプロセス、アッセイ、および方法に関する。一実施形態において、該対象は、肺癌を有している。2015529808.tif 000011
2015529808.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）化学療法耐性の可能性を知ることを望んでいる癌患者から腫瘍細胞を含む試料を得ることと、
（ｉｉ）ＧａｌＮａｃ−Ｔ１３またはその変異体のレベルを決定するために、前記試料をアッセイすることと、
（ｉｉｉ）基準試料と比較してＧａｌＮａｃ−Ｔ１３もしくはその変異体のレベルが増加している場合に、前記対象の化学療法耐性の可能性が増大していると判定すること、または前記基準試料と比較してＧａｌＮａｃ−Ｔ１３もしくはその変異体のレベルが同じであるか、もしくは減少している場合に、前記対象の化学療法耐性の可能性が減少していると判定することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記試料をアッセイすることが、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１３もしくはその変異体をコードする核酸のレベルを検出すること、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１３タンパク質もしくはその変異体のレベルを決定すること、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体をコードする核酸のレベルを検出することが、前記試料中に存在するＧａｌＮａｃ−Ｔ１３またはその変異体をコードするｍＲＮＡの量を決定することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３タンパク質またはその変異体のレベルを検出することが、ｐｐＧａｌＮａｃ−Ｔ１３またはその変異体に特異的な抗体を用いて、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１３またはその変異体のレベルを検出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体のエピトープＬＬＰＡＬＲに結合する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記対象がネオアジュバント化学療法を受けたことがある、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記癌が肺癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
肺癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＮＳＣＬＣが腺癌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が、組織、血液、血漿、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料が、癌治療前、癌治療中、または癌治療後に得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
基準値が、癌を有していない対象の集団におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現レベルの平均または中央値である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
基準値が、癌を有しており、かつ化学療法に応答する対象の集団におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現レベルの平均または中央値である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
基準値が、異なる時点から得られた試料における、前記対象からのＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現レベルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象の化学療法耐性の可能性が減少している場合に、前記対象に第１の治療法を処方すること、または前記対象の化学療法耐性の可能性が増大している場合に、前記対象に第２の治療法を処方することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の治療法が、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の治療法が、外科手術、放射線照射、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の治療法が、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上であり、化学療法が、前記対象に、前記対象を治療するためにこれまでに使用されていない１種以上の化学療法剤を投与すること、または前記対象にこれまでに投与された化学療法剤を、これまでに投与された用量よりも高い用量で投与することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
化学療法耐性の可能性の増大の判定を、それを必要とする対象において行うためのアッセイであって、
（ｉ）癌を有している対象からの生体試料を提供することと、
（ｉｉ）ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体に特異的に結合する抗体を提供することと、
（ｉｉｉ）前記生体試料を前記抗体と接触させることと、
（ｉｖ）イムノアッセイを使用して、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体に結合している抗体のレベルを検出することであって、基準試料と比較して前記対象からの前記生体試料中の結合の存在が、前記対象における化学療法耐性の可能性の増大を示す、ことと、を含む、アッセイ。
【請求項２２】
癌を有している対象に対する治療法を選択する、および任意で前記治療法を施行するためのアッセイであって、
（ｉ）癌を有している対象からの生体試料を提供することと、
（ｉｉ）ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体に特異的に結合する抗体を提供することと、
（ｉｉｉ）前記生体試料を前記抗体と接触させることと、
（ｉｖ）イムノアッセイを使用して、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体に結合している抗体のレベルを検出することであって、基準試料と比較して前記対象からの前記生体試料中の結合の増加が、前記対象におけるｐｐＧａｌＮＡｃの発現の増大および化学療法耐性の可能性の増大を示す、ことと、
（ｖ）前記対象の化学療法耐性の可能性が減少している場合に、前記対象に第１の治療法を処方すること、または前記対象の化学療法耐性の可能性が増大している場合に、前記対象に第２の治療法を処方することを含む、治療法を選択することと、を含む、アッセイ。
【請求項２３】
前記第１の治療法が、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上である、請求項２２に記載のアッセイ。
【請求項２４】
前記第２の治療法が、外科手術、放射線照射、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上、請求項２２に記載のアッセイ。
【請求項２５】
前記第２の治療法が、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上であり、化学療法が、前記対象に、前記対象を治療するためにこれまでに使用されていない１種以上の化学療法剤を投与すること、または前記対象にこれまでに投与された化学療法剤を、これまでに投与された用量よりも高い用量で投与することを含む、請求項２２に記載のアッセイ。
【請求項２６】
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体に対して反応性がある抗体のレベルを検出することが、
（ｉ）前記癌患者からの前記試料を、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体に特異的に結合する抗体またはその断片と接触させることと、
（ｉｉ）前記抗体と、前記試料中に存在するＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体との抗体−タンパク質複合体を形成することと、
（ｉｉｉ）非結合抗体を除去するために前記試料を洗浄することと、
（ｉｖ）前記試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体に結合した前記抗体に対して反応性があり、かつ標識された検出抗体を添加することと、
（ｖ）非結合の標識された検出抗体を除去するために洗浄することと、
（ｖｉ）前記標識を検出可能なシグナルに変換することであって、前記検出可能なシグナルが、前記患者からの前記試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体のレベルを示す、ことと、を含む、請求項２１または２２に記載のアッセイ。
【請求項２７】
前記試料が、組織、血液、血漿、またはそれらの組み合わせである、請求項２１または２２に記載のアッセイ。
【請求項２８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２１または２２に記載のアッセイ。
【請求項２９】
前記抗体が、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体のエピトープＬＬＰＡＬＲに結合する、請求項２８に記載のアッセイ。
【請求項３０】
前記対象が、ネオアジュバント化学療法を受けたことがある、請求項２１または２２に記載のアッセイ。
【請求項３１】
前記癌が肺癌である、請求項２１または２２に記載のアッセイ。
【請求項３２】
前記肺癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項３１に記載のアッセイ。
【請求項３３】
ＮＳＣＬＣが腺癌である、請求項３２に記載のアッセイ。
【請求項３４】
前記試料が、癌治療前、癌治療中、または癌治療後に得られる、請求項２１または２２に記載のアッセイ。
【請求項３５】
基準値が、癌を有していない対象の集団からのＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３発現レベルの平均または中央値である、請求項２１または２２に記載のアッセイ。
【請求項３６】
基準値が、癌を有しており、かつ化学療法に応答する対象の集団からのＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３発現レベルの平均または中央値である、請求項２１または２２に記載のアッセイ。
【請求項３７】
前記抗体が、エフェクター成分にさらに結合されている、請求項２１または２２に記載のアッセイ。
【請求項３８】
前記エフェクター成分が、蛍光標識、放射性化合物、酵素、基質、エピトープタグ、高電子密度試薬、ビオチン、ジゴニゲニン（digonigenin）、ハプテン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される検出可能な部分である、請求項３７に記載のアッセイ。
【請求項３９】
前記検出抗体が、酵素に共有結合することによって標識される、蛍光化合物または金属で標識される、化学発光化合物で標識される、請求項２６に記載のアッセイ。
【請求項４０】
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の前記レベルが、前記試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３と前記抗体との反応によって形成される抗体−タンパク質複合体の形成から生じる光散乱強度を測定することによって得られ、対照の光散乱強度を少なくとも１０％上回る光散乱強度が化学療法耐性の可能性を示す、請求項２６に記載のアッセイ。
【請求項４１】
結合の存在が、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体への前記抗体の結合の増加である、請求項２１または２２に記載のアッセイ。
【請求項４２】
癌を有している対象を治療する、および任意で前記治療法を施行するための方法であって、
（ｉ）癌を有している対象からの生体試料を提供することと、
（ｉｉ）ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体に結合する抗体を提供することと、
（ｉｉｉ）前記生体試料を前記抗体と接触させることと、
（ｉｖ）イムノアッセイを使用して、前記抗体がＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に結合しているかどうかを検出することであって、基準試料と比較して前記対象からの前記生体試料中の結合の増加が、前記対象におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現の増大および化学療法耐性の可能性の増大を示す、ことと、
（ｖ）前記対象の化学療法耐性の可能性が減少している場合に、前記対象に第１の治療法を処方すること、または前記対象の化学療法耐性の可能性が増大している場合に、前記対象に第２の治療法を処方することと、を含む、方法。
【請求項４３】
前記第１の治療法が、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記第２の治療法が、外科手術、放射線照射、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記第２の治療法が、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上であり、化学療法が、前記対象に、前記対象を治療するためにこれまでに使用されていない１種以上の化学療法剤を投与すること、または前記対象にこれまでに投与された化学療法剤を、これまでに投与された用量よりも高い用量で投与することを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記対象が、ネオアジュバント化学療法を受けたことがある、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記癌が非小細胞肺癌である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＮＳＣＬが腺癌である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体が、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体のエピトープＬＬＰＡＬＲに結合する、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
化学療法耐性が、化学療法剤のうちのいずれか１種以上に対する耐性である、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体に特異的に結合する抗体。
【請求項５２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５１に記載の抗体。
【請求項５３】
前記抗体が、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体中のエピトープに結合し、前記エピトープが配列ＬＬＰＡＬＲを含む、請求項５１に記載の抗体。
【請求項５４】
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体中のＬＬＰＡＬＲエピトープに結合する、請求項５１に記載の抗体。
【請求項５５】
化学療法に対する癌細胞の反応性を判定するためのシステムであって、前記癌細胞が癌患者から得られ、前記システムが、
（ｉ）前記癌患者から得られた前記癌細胞中に存在するＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３をコードするｍＲＮＡに対するシグナルを生成するように設定されている試料分析器と、
（ｉｉ）前記ｍＲＮＡに基づいて、前記シグナルが基準値よりも大きいかまたは大きくないかを計算するようにプログラムされたコンピュータサブシステムと、を備える、システム。
【請求項５６】
化学療法に対する癌細胞の反応性を判定するためのシステムであって、前記癌細胞が癌患者から得られ、前記システムが、
（ｉ）ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に特異的な抗体が、癌患者から得られた前記癌細胞中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に結合するときに、シグナルを生成するように設定されている試料分析器と、
（ｉｉ）前記抗体結合に基づいて、前記シグナルが基準値よりも大きいかまたは大きくないかを計算するようにプログラムされたコンピュータサブシステムと、を備える、システム。
【請求項５７】
前記コンピュータサブシステムが、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現が増大している場合に、化学療法を含む治療法に応答する見込みのある患者として、および前記ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３が増大していない場合に、化学療法を含む治療法に応答する見込みのない患者として、前記患者を分類するアルゴリズムに基づいて、前記ｍＲＮＡを比較して、化学療法に対する前記癌細胞の反応性の可能性を判定するようにプログラムされている、請求項５５または５６に記載のシステム。
【請求項５８】
前記基準値が、癌を有していない対象の集団からのＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３発現レベルの平均もしくは中央値であるか、または前記基準値が、癌を有しており、かつ化学療法に応答する対象の集団からのＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３発現レベルの平均もしくは中央値である、請求項５５または５６に記載のシステム。
【請求項５９】
コンピュータで実行されたときに、
（ｉ）癌患者から得られた癌細胞を含む試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現を検出することと、
（ｉｉ）前記ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現を基準値と比較することと、
を含むステップを行う、コンピュータ可読媒体において具現化されたコンピュータプログラム製品。
【請求項６０】
前記基準値が、癌を有しており、かつ化学療法に応答する対象の集団からのＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３発現レベルの平均または中央値である、請求項６０に記載のコンピュータプログラム。
【請求項６１】
化学療法に応答する癌患者の可能性を検出するための診断キットであって、
（ｉ）検出可能な標識プローブの組み合わせを含む１０種以下のプローブ、またはＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のためのプライマーと、
（ｉｉ）請求項５９に記載のコンピュータプログラム製品と、を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、化学療法に対する腫瘍細胞の耐性におけるＯグリコシル化経路の酵素の役割に関する。具体的には、本発明は、肺腺癌の化学療法耐性の診断マーカーとして、新規の分子標的、すなわちＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３（ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３としても知られている）を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、米国および世界中で癌に関連した死亡率の主な原因であり続けている。ＮＳＣＬＣは、組織型によって、腺癌、扁平上皮癌、および大細胞癌に分類される（Ｂｅａｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。腺癌は、米国では、ＮＳＣＬＣの最も一般的な型として、扁平上皮細胞の組織型を上回っている。化学療法により治療されたほとんどの癌患者は、抗癌薬による単一療法への反応率が、他の疾患に対する治療法への反応率よりもはるかに低く、また、有効用量レベルの抗癌薬が毒性用量レベルにほぼ近い、またはそれと重なる場合があるため、激しい毒性に苦しむ。それ故に、抗癌薬による治療に応答する見込みのある患者を特定することは重要である。バイオマーカーの開発は、関連標的におけるこれらの薬剤の効果を予測するために必要である。バイオマーカーの開発の目的は、反応率、無増悪生存率（ＰＦＳ）、および全体生存率（ＯＳ）を含む分子を標的とする薬剤の有効性を予測するための方法を設計することである。もし、バイオマーカーにより良好な治療応答を示し得る患者集団を選択することができるのであれば、患者および医師の両方に有益であろう（Ｓａｉｊｏ，２０１２）。
【０００３】
糖複合体は、癌生物学において関連機能を果たすことが証明されている。グリコシル化改変の検出に基づいたいくつかの診断手順が開発され、ケア医療に組み込まれている（Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。Ｏグリコシル化改変は、ほとんどの癌腫に生じ、診断および予後において（Ｒｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、ならびに癌ワクチン（Ｔａｒｐ  ａｎｄ  Ｃｌａｕｓｅｎ，２００８）の開発のために利用され得る有用な標的を構成し得る分子の発現をもたらす。Ｏ結合型グリコシル化の合成は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アシルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ、ＥＣ  ２．４．２．４１）により触媒される反応において、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ残基のヒドロキシル基へのα−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃ）の共有結合によって、ゴルジ装置内で開始される。ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔは、アイソザイムの複雑なファミリーであり（Ｔｅｎ  Ｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、この中で、２０個のメンバーが、これまでに特徴付けられている（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。それらは、正常な組織と比較して悪性組織において差次的に発現することが見出されている（Ｍａｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、Ｂｅｒｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ｂ）。ＧＡＬＮＴ３遺伝子の過剰発現が、膵臓癌細胞の増殖を促進し（Ｔａｎｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、ＧＡＬＮＴ１２（正常な結腸細胞において高度に発現する遺伝子）の体細胞および生殖細胞変異体の不活性化は、結腸癌の発症と関連している（Ｇｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）ことを見出した。増大する証拠は、これらの酵素が有用な腫瘍マーカーであり得ることを示唆している。例えば、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３の発現は、胆嚢癌を有する患者において不良な臨床転帰と相関し（Ｍｉｙａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、骨髄試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ６の発現は、リンパ節陰性乳癌患者において不良な臨床転帰と相関する（Ｆｒｅｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）ことを示している。肺癌に関しては、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３の低い発現は、腺癌を有しており、第１病期にある患者において不良な予後および早期再発を予測するのに有用なマーカーであり得る（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。本発明者らは、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３アイソザイムをコードする遺伝子ＧＡＬＮＴ１３が、原発腫瘍と比較して転移性神経芽細胞中で最も上方調節された遺伝子であったことをこれまでに示しており、診断での骨髄中のＧＡＬＮＴ１３の発現が、神経芽細胞腫患者において、不良な臨床転帰の強力な予測子であったことを見出した（Ｂｅｒｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ａ）。本明細書で、本発明者らは、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３がヒト肺癌細胞において発現することを示している。
【発明の概要】
【０００４】
以下の実施形態およびその態様は、範囲を限定することなく、例示および説明であることが意図されるシステム、組成物、および方法と併せて、記載および説明される。
【０００５】
本明細書では、化学療法耐性の可能性を知ることを望んでいる癌患者から腫瘍細胞を含む試料を得ることと、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１３またはその変異体のレベルを決定するために、試料をアッセイすることと、基準試料と比較してＧａｌＮａｃ−Ｔ１３もしくはその変異体のレベルが増加している場合に、対象の化学療法耐性の可能性が増大していると判定すること、または該基準試料と比較してＧａｌＮａｃ−Ｔ１３もしくはその変異体のレベルが同じであるか、もしくは減少している場合に、対象の化学療法耐性の可能性が減少していると判定することと、を含む、プロセス、アッセイ、および方法が記載されている。
【０００６】
本明細書に記載されるプロセス、アッセイ、および方法の様々な実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、ネオアジュバント療法を受けたことがある。いくつかの実施形態において、対象から得られた試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体のレベルの分析は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体をコードする核酸レベル、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体のタンパク質レベルを測定すること、あるいはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、対象からの試料は、癌治療前、癌治療中、または癌治療後に得られる。一実施形態において、対象は、癌、例えば、肺癌を有している。一実施形態において、肺癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。特定の実施形態において、ＮＳＣＬＣは腺癌である。様々な実施形態において、対象からの試料は、組織、血液、血漿、またはそれらの組み合わせから得られる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
例示的な実施形態は、参照される図に図示される。本明細書に開示される実施形態および図は、制限的なものではなく例示的なものであるとみなされることが意図される。
【図１】本発明の一実施形態に従って、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡＢ  Ｔ１３．５）の産生および特徴を示す。
【図２】本発明の一実施形態に従って、ヒト肺癌細胞株におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現を示す。（Ａ）ＧＡＬＮＴ１３に対するＲＴ−ＰＣＲ：（１）分子量マーカー（１００ｂｐ）、（２）陰性対照、（３）ＮＣＩ−Ｈ１７０３細胞株、（４）ＮＣＩ−Ｈ５２６細胞株、（５）ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞株、（６）ＳＫ−ＭＥＳ−１細胞株、（７）Ｈ６９ＡＲ細胞株、（８）Ｈ２Ｏ陰性対照、（９）ＮＣＩ−Ｈ１７５５細胞株、（１０）Ａ５４９細胞株、（１１）ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株、（１２）ＮＣＩ−Ｈ１６５０細胞株、（１３）ＮＬ−２０細胞株、（１４）陽性対照、ＢＭ細胞株、（１５）分子量マーカー（１００ｂｐ）。（Ｂ）Ａ５４９肺癌細胞株におけるｍＡｂ  Ｔ１３．５による間接免疫蛍光法。（Ｃ）ｍＡｂ  Ｔ１３．５を用いたウェスタンブロット：（１）分子量マーカー、（２）ＢＭ細胞株、（３）Ｈｅｌａ細胞株、（４）Ａ５４９細胞株、（５）ＮＣＩ−Ｈ１７０３細胞株。
【図３】本発明の一実施形態に従って、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のいくつかのスプライス変異体の略図を示す。ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の選択的スプライシングによって生成された８つの新規の転写物を見出した。スプライス変異体の配列は、配列番号１〜１４に記載される。
【図４】本発明の一実施形態に従って、モノクローナル抗体Ｔ１３．５を用いたヒト肺癌の原発腫瘍における免疫組織化学を示す。
【図５】本発明の一実施形態に従って、（Ａ）原発腫瘍においてＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現を有するネオアジュバント療法を受けた肺腺癌を有する患者におけるカプランマイヤー生存推定、（Ｂ）原発腫瘍においてＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現を有するネオアジュバント療法を受けた進行性肺腺癌を有する患者におけるカプランマイヤー生存率推定、（Ｃ）原発腫瘍においてＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現を有するネオアジュバント療法を受けた早期肺腺癌を有する患者におけるカプランマイヤー生存率推定を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本明細書に参照される全ての参照文献は、それらの全体が参照により本明細書に完全に記載されているものとして組み込まれる。
【０００９】
特に定義されない限り、本明細書に使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００１）、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５ｔｈ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００１）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２００１）は、当業者に、本出願に使用される用語の多くの一般指針を提供する。
【００１０】
当業者は、本発明の実施に使用され得る、本明細書に記載されているものと類似または同等の多くの方法および材料を認識するであろう。実際には、本発明は、記載される方法および材料にいかようにも限定されない。本発明のために、以下の用語が下記で定義される。
【００１１】
「有益な結果」には、疾患状態の重症度を減少または軽減すること、疾患状態が悪化するのを防ぐこと、疾患状態を治癒すること、疾患状態が発生するのを防ぐこと、疾患状態を発生する患者の確率を低減すること、および患者の生命または平均余命を延長することが含まれるが、これらに決して限定されない。いくつかの実施形態において、疾患状態は癌である。
【００１２】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後、または治療が望まれるいずれかの対象、特に、哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、家畜、農場動物、動物園動物、競技用動物、愛玩動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、ウシ；霊長類、例えば、類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジー；イヌ科の動物、例えば、イヌおよびオオカミ；ネコ科の動物、例えば、ネコ、ライオン、およびトラ；ウマ科の動物、例えば、ウマ、ロバ、およびシマウマ；食用動物、例えば、ウシ、ブタ、およびヒツジ；有蹄動物、例えば、シカおよびキリン；げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット等が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態において、哺乳動物はヒト対象である。この用語は、特定の年齢または性別を表さない。それ故に、オスであれメスであれ、成体および新生の対象、ならびに胎児がこの用語の範囲内に包含されることが意図される。
【００１３】
本明細書に使用される「治療」および「治療すること」は、治療的処置および予防的または防御的な手段の両方を指し、その目的は、標的とする病的状態を予防する、もしくは遅らせる（軽減する）、病的状態を予防する、有益な結果を追求する、もしくは得る、またはその処置が最終的に失敗に終わったとしても状態を発症する個体の確率を低減することである。治療を必要とするものには、既に状態を有しているもの、ならびに状態を有する傾向があるもの、または状態が予防されるべきものが含まれる。癌治療の例には、積極的監視、観察、外科的介入、化学療法、免疫療法、放射線療法（外部ビーム放射線照射、定位放射線手術（ガンマナイフ）、および分画定位的放射線療法（ＦＳＲ）等）、局所療法、全身療法、ワクチン療法、ウイルス療法、分子標的療法、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００１４】
本明細書に使用される「腫瘍」は、悪性または良性に関わらず、全ての新生細胞成長および増殖、ならびに全ての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。
【００１５】
「癌」および「癌性」は、調節されていない細胞増殖により一般的に特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すか、または記載する。癌の例には、Ｂ細胞リンパ腫（ホジキンリンパ腫および／または非ホジキンリンパ腫）、脳癌、乳癌、結腸癌、肺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、脳癌、ならびに、アンドロゲン依存性前立腺癌およびアンドロゲン非依存性前立腺癌を含むがこれらに限定されない前立腺癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００１６】
本明細書で使用される「化学療法耐性」は、化学療法薬に対して部分的または完全な耐性を指す。例えば、対象は、化学療法薬に応答しないか、または部分的にのみ応答する。当業者は、対象が化学療法に対する耐性を示しているかどうかを判定することができる。
【００１７】
本明細書で使用される「化学療法薬」または「化学療法剤」とは、アルブミン結合パクリタキセル（ｎａｂ−パクリタキセル）、アクチノマイシン、アリトレチノイン、オールトランス型レチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ベバシズマブ、ベキサトテン（Ｂｅｘａｔｏｔｅｎｅ）、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、セツキシマブ、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オクレリズマブ、オファツムマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツマブ、ペメトレキセド、リツキシマブ、タフルポシド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、トレチノイン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリノスタット、ロミデプシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、クラドリビン、クロファラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ペントスタチン、マイトマイシン、イキサベピロン、エストラムスチン、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない、癌を治療するために使用される薬物を指す。
【００１８】
「患者の転帰」とは、患者が治療の結果、生存または死亡するかどうかを指す。本発明に提供される患者に対するより正確な予後が、患者の生存の確率を増大させる。
【００１９】
「不良な予後」とは、癌（例えば、肺癌）の治療に対して標準的な治療、すなわち、外科手術、放射線照射、化学療法にもかかわらず、生存および疾患の回復の見込みがないことを意味する。不良な予後は、生存率が生存率中央値のものよりも低い患者の分類である。
【００２０】
「良好な予後」とは、疾患の治療に対して標準的な治療、例えば、外科手術、放射線照射、化学療法により、生存および疾患の回復の見込みがあることを意味する。良好な予後は、生存率が生存率中央値のものよりも低くない患者の分類である。
【００２１】
「再発」とは、癌が初期治療後に再来したことを意味する。
【００２２】
本明細書で使用される「変異体」とは、突然変異体ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のスプライス変異体、またはそれらの組み合わせを指す。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の突然変異体は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３をコードする遺伝子における挿入、欠失、ミスセンス、ナンセンス、および／または切断突然変異の結果であり得る。
【００２３】
「再発しない」または「無再発」とは、癌が寛解期にあることを意味し、再発は、癌が増殖する、および／または転移することを意味し、死亡率の可能性を低下させるために、いくつかの外科手術、治療的介入、および／または癌治療が必要である。「再発しない対象」は、再発しないまたは無再発の疾患を有する対象であり、再発疾患または再発している再発の対象の対照として使用することができる。
【００２４】
Ｏグリコシル化改変は、ほとんどの癌腫に生じ、診断および治療法のために有用な標的を構成し得る分子の発現をもたらす。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３酵素は、Ｏグリコシル化の開始時に重要なステップを触媒する。それは、転移性神経芽細胞腫において過剰発現し、この腫瘍を有する患者の予後と相関している。切除した肺癌標本においては、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現についての情報がない。
【００２５】
本明細書に記載されるように、出願者らは、ネオアジュバント化学療法を受けている（ＷＮＡ）対象とネオアジュバント化学療法を受けていない（ＷＯＮＡ）対象との間に有意な差異がない、ＮＳＣＬＣにおける増大したＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現を観察した。ＧａＩＮＡｃ−Ｔ１３は、ＮＳＣＬＣにおいて発現し、ネオアジュバント化学療法を受けた腺癌（ＡＤＣＡ）を有する患者における不良な予後と関連がある。出願者らのデータは、ＧａＩＮＡｃ−Ｔ１３がＮＳＣＬＣにおいて化学耐性と関連する新規のマーカーであることを示唆した。
【００２６】
したがって、本発明は、少なくとも一部がこれらの所見に基づいている。本発明は、癌患者における化学療法耐性を判定するために、および癌患者における治療選択を誘導するために、肺癌等の癌の兆候に対する分子指標の必要性に取り組む。本発明は、癌治療の最適化を、それを必要とする対象において行うために、癌患者における化学療法耐性の可能性を判定するためのプロセス、アッセイ、および方法を提供する。
【００２７】
具体的には、本発明は、化学療法耐性の可能性を知ることを望んでいる癌患者から癌細胞を含む試料を得ることと、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１３またはその変異体のレベルを決定するために、試料を分析することと、基準試料と比較してＧａｌＮａｃ−Ｔ１３もしくはその変異体のレベルが増加している場合に、対象の化学療法耐性が増大していると判定すること、または該基準試料と比較してＧａｌＮａｃ−Ｔ１３もしくはその変異体のレベルが同じであるか、もしくは減少している場合に、対象の化学療法耐性の可能性が減少していると判定することと、を含む、方法を提供する。一実施形態において、該対象は、肺癌を有している。
【００２８】
いくつかの実施形態において、この方法は、対象の化学療法耐性の可能性が減少している場合に、対象に第１の治療法を処方すること、または対象の化学療法耐性の可能性が増大している場合に、対象に第２の治療法を処方することをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、第１の治療法は、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上であり得る。いくつかの実施形態において、第２の治療法は、化学療法を含まない治療法であり得、多くは、外科手術、放射線照射、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上であり得る。さらなる実施形態において、第２の治療法は、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上であり得、化学療法は、対象に、対象を治療するためにこれまでに使用されていない１種以上の化学療法剤を投与すること、または対象にこれまでに投与されたことがあるが、これまでに投与された用量よりも高い用量で、化学療法剤を投与することを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現が増大している癌対象において化学療法が有効でない場合があるという認識に基づいて、基準試料と比較して対象からの試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現が増大している場合、第２の治療法は、対象に対して化学療法を含まない癌治療法を選択することを含み得る。さらなる実施形態において、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現が減少している癌対象において化学療法が有効であり得るという認識に基づいて、基準試料と比較して対象からの試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現が同じであるか、または減少する場合、第２の治療法は、化学療法を含む癌治療法を選択することを含み得る。
【００３０】
本発明はまた、化学療法耐性の可能性を知ることを望んでいる癌患者から癌細胞を含む試料を得ることと、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１３またはその変異体のレベルを決定するために、試料を分析することと、基準試料と比較してＧａｌＮａｃ−Ｔ１３もしくはその変異体のレベルが増加している場合に、対象の化学療法耐性の可能性が増大していると判定すること、または該基準試料と比較してＧａｌＮａｃ−Ｔ１３もしくはその変異体のレベルが同じであるか、もしくは減少している場合に、対象の化学療法耐性の可能性が減少していると判定することと、を含む、アッセイも提供する。一実施形態において、該対象は、肺癌を有している。
【００３１】
本発明は、化学療法耐性の可能性の判定を、それを必要とする対象において行うためのアッセイをさらに提供する。このアッセイは、癌を有している対象からの生体試料を提供することと、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体に特異的に結合する抗体を提供することと、生体試料を抗体と接触させることと、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体に結合している抗体のレベルを（例えば、イムノアッセイを使用して）検出することと、を含み、基準試料と比較して対象からの生体試料中の結合の増加が、対象における化学療法耐性の可能性の増大を示す。一実施形態において、癌は肺癌である。一実施形態において、抗体は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体において配列ＬＬＰＡＬＲを有するエピトープに結合する本明細書に記載されるＴ１３．５抗体である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、対象における化学療法耐性の可能性を判定するためのアッセイは、癌を有している対象からの生体試料を提供することと、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体をコードする対象から得られた試料中に存在するｍＲＮＡのレベルを決定することと、を含み得る。基準試料と比較して対象から得られた試料中のｍＲＮＡレベルの増加は、対象における化学療法耐性の可能性の増大を示す。一実施形態において、癌は肺癌である。
【００３３】
本発明のアッセイは、対象における癌を治療する、減少させる、抑制する、または癌の重症度を減少させるために、治療法を選択すること、および／または施行することをさらに含み得る。治療法の選択は、対象の化学療法耐性の可能性が減少している場合に、対象に第１の治療法を処方すること、または対象の化学療法耐性の可能性が増大している場合に、対象に第２の治療法を処方することを含む。いくつかの実施形態において、第１の治療法は、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上である。いくつかの実施形態において、第２の治療法は、化学療法を含まない治療法であり得、外科手術、放射線照射、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上であり得る。さらなる実施形態において、第２の治療法は、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上であり、化学療法は、対象に、対象を治療するためにこれまでに使用されていない１種以上の化学療法剤を投与すること、または対象にこれまでに投与されたことがあるが、これまでに投与された用量よりも高い用量で、化学療法剤を投与することを含む。いくつかの実施形態において、癌は肺癌である。
【００３４】
いくつかの実施形態において、第２の治療法は、対象における癌の治療のために化学療法を含まない癌治療法を選択することを含み得る。いくつかの実施形態において、アッセイは、さらに、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現が増大している癌対象において化学療法が有効でない場合があるという認識に基づいて、基準試料と比較して対象からの試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現が増大している場合、対象に対して化学療法を含まない癌治療法を選択することを含む。さらなる実施形態において、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現を減少している癌対象において化学療法が有効であり得るという認識に基づいて、基準試料と比較して対象からの試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現が同じであるか、または減少する場合、第２の治療法は、化学療法を含む癌治療法を選択することを含み得る。
【００３５】
本発明はまた、化学療法耐性の可能性を知ることを望んでいる癌患者から癌細胞を含む試料を得ることと、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１３またはその変異体のレベルを決定するために、試料を分析することと、基準試料と比較してＧａｌＮａｃ−Ｔ１３もしくはその変異体のレベルが増加している場合に、対象の化学療法耐性の可能性が増大していると判定すること、または該基準試料と比較してＧａｌＮａｃ−Ｔ１３もしくはその変異体のレベルが同じであるか、もしくは減少している場合に、対象の化学療法耐性の可能性が減少していると判定することと、を含む、方法も提供する。一実施形態において、該対象は、肺癌を有している。
【００３６】
本発明は、さらに、癌を有している対象のための治療を選択するための方法、および任意で治療／治療法を施行するための方法を提供し、本方法は、癌を有している対象からの生体試料を提供することと、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に特異的に結合する抗体を提供することと、生体試料を抗体と接触させることと、抗体がＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に結合しているかどうかを（例えば、イムノアッセイを使用して）検出することと、治療法を選択することと、を含む。本方法は、さらに、選択された治療法を施行することを含む。方法の一実施形態において、基準試料と比較して対象からの生体試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３への抗体の結合の存在は、対象におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現の増大および化学療法耐性の可能性の増大を示す。一実施形態において、癌は肺癌である。一実施形態において、抗体は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体において配列ＬＬＰＡＬＲを有するエピトープに結合する本明細書に記載されるＴ１３．５抗体である。
【００３７】
本発明はまた、癌を有している対象のために治療を選択するための方法、および任意で治療／治療法を施行するための方法も提供し、本方法は、癌を有している対象からの生体試料を提供することと、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体をコードする対象から得られた試料中に存在するｍＲＮＡのレベルを決定することと、を含む。基準試料と比較して対象から得られた試料中のｍＲＮＡレベルの増加は、対象における化学療法耐性の可能性の増大を示す。一実施形態において、癌は肺癌である。
【００３８】
いくつかの実施形態において、治療法の選択は、対象の化学療法耐性の可能性が減少している場合に、対象に第１の治療法を処方すること、または対象の化学療法耐性の可能性が増大している場合に、対象に第２の治療法を処方することを含む。いくつかの実施形態において、第１の治療法は、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上である。いくつかの実施形態において、第２の治療法は、化学療法を含まない治療法であり得、外科手術、放射線照射、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上であり得る。さらなる実施形態において、第２の治療法は、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上であり、化学療法は、対象に、対象を治療するためにこれまでに使用されていない１種以上の化学療法剤を投与すること、または対象にこれまでに投与された化学療法剤を、これまでに投与された用量よりも高い用量で投与することを含む。
【００３９】
本発明は、異常なレベルのＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３を含むヒト対象から得られた単離された試料をさらに提供する。いくつかの実施形態において、試料は、組織、血液、血漿、尿、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上である。
【００４０】
本発明はまた、異常なレベルのＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３を含むヒト対象から得られた単離された試料とＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３と反応する試薬との組み合わせも提供する。一実施形態において、試薬は、単離された試料中の異常なレベルのＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の存在を示すシグナルを生成する標識を含む。いくつかの実施形態において、この標識は、放射性標識、発色団、フルオロフォア、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上である。様々な実施形態において、試薬は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に特異的な核酸、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に特異的なモノクローナル抗体、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３酵素に特異的な基質、小分子、脂質、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上である。
【００４１】
本発明はまた、異常なレベルのＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３を含むヒト対象から得られた単離された試料とＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３と反応する試薬とを含むシステムも提供する。一実施形態において、試薬は、単離された試料中の異常なレベルのＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の存在を示すシグナルを生成する標識を含む。いくつかの実施形態において、この標識は、放射性標識、発色団、フルオロフォア、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上である。様々な実施形態において、試薬は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に特異的な核酸、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に特異的なモノクローナル抗体、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３酵素に特異的な基質、小分子、脂質、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上である。
【００４２】
本明細書に記載されるプロセス、アッセイ、および方法の様々な実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、ネオアジュバント療法（例えば、カルボプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、ドセタキセル、ゲムシタビン、エトポシド、ペメトレキセド、セツキシマブ、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上を使用するネオアジュバント療法）を受けたことがある。いくつかの実施形態において、対象から得られた試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体のレベルの分析は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体をコードする核酸レベル、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体のタンパク質レベルを測定すること、あるいはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、対象からの試料は、癌治療前、癌治療中、または癌治療後に得られる。一実施形態において、対象は、癌、例えば、肺癌を有している。一実施形態において、肺癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。特定の実施形態において、ＮＳＣＬＣは腺癌である。様々な実施形態において、対象からの試料は、組織、血液、血漿、またはそれらの組み合わせから得られる。
【００４３】
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現の分析
本明細書に記載されるプロセス、アッセイ、および方法の様々な実施形態において、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体のアッセイは、試料中に存在するＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体をコードする核酸の量を測定すること、試料中に存在するＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３タンパク質またはその変異体のタンパク質の量を測定すること、あるいはそれらの組み合わせを含む。
【００４４】
本明細書に記載されるプロセス、アッセイ、および方法の様々な実施形態において、試料の分析は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体に特異的な抗体を用いてＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体のレベルを検出することを含む。様々な実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体またはその断片、ポリクローナル抗体またはその断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および一本鎖抗体のうちのいずれか１つ以上である。一実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。使用され得るモノクローナル抗体の一例は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の配列ＬＬＰＡＬＲに結合するＴ１３．５モノクローナル抗体である。
【００４５】
本明細書に記載されるプロセス、アッセイ、および方法のいくつかの実施形態において、試料の分析は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体に特異的なｍＲＮＡとハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドを含む試料中に存在するＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体をコードするｍＲＮＡレベルを測定することを含む。
【００４６】
試料中に存在するｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体をコードする核酸の量を評価するために使用され得る技術は、原位置ハイブリダイゼーション（例えば、Ａｎｇｅｒｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５２：６４９）を含むが、これに限定されない。好ましいハイブリダイゼーションをベースとするアッセイには、サザンブロット法または原位置ハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨおよびＦＩＳＨ＋ＳＫＹ）等の従来の「直接プローブ」法、ならびに比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、例えば、ｃＤＮＡをベースとする、またはオリゴヌクレオチドをベースとするＣＧＨ等の「比較プローブ」法が含まれるが、これらに限定されない。方法は、基質（例えば、膜もしくはガラス）結合法またはアレイをベースとするアプローチを含むが、これらに限定されない多種多様のフォーマットにおいて使用することができる。核酸分析のために使用され得るプローブは、典型的には、例えば、放射性同位体または蛍光レポーターを用いて標識される。好ましいプローブは、ストリンジェントな条件下で、標的核酸（複数を含む）と特異的にハイブリダイズするために十分に長い。好ましいサイズ範囲は、約２００塩基〜約１０００塩基である。本発明の方法に使用するのに適したハイブリダイゼーションプロトコルは、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ（１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１２２７−１２３４、Ｐｉｎｋｅｌ（１９８８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：９１３８−９１４２、欧州特許庁公開公報（ＥＰＯ  Ｐｕｂ．）第４３０，４０２号、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３３：Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃｈｏｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．（１９９４）、Ｐｉｎｋｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０：２０７−２１１、および／またはＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：５３２１−５３２５（１９９２）に記載されている。
【００４７】
「定量的」増幅の方法は、当業者によく知られている。例えば、定量的ＰＣＲは、同じプライマーを用いて既知量の対照配列を同時に共増殖することに関する。このことは、ＰＣＲ反応を較正するために使用することができる内部標準を提供する。定量的ＰＣＲのための詳細なプロトコルは、Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．）に提供されている。定量的ＰＣＲ分析を用いたマイクロサテライト座でのＤＮＡコピー数の測定は、Ｇｉｎｚｏｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６０：５４０５−５４０９に記載されている。遺伝子についての既知の核酸配列は、当業者が日常的にプライマーを選択して、遺伝子のいずれかの部分を増幅するのを可能とするのに十分である。発蛍光性定量的ＰＣＲは、本発明の方法で使用することもできる。発蛍光性定量的ＰＣＲにおいて、定量は、蛍光シグナル、例えば、ＴａｑＭａｎおよびｓｙｂｒグリーンの量に基づいている。
【００４８】
他の好適な増幅方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７、およびＢａｒｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｇｅｎｅ  ８９：１１７を参照のこと）、転写増幅（Ｋｗｏｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３）、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４）、ドットＰＣＲ、およびリンカーアダプターＰＣＲ等を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
不均等な変動の下での両側スチューデントｔ検定は、患者のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現と正常な血液試料、または患者自身の血液（一致対照）、または本明細書に記載される、多くの対照試料をプールするコンピュータアルゴリズムによって生じる参照との間の差異を測定するために使用され得る。有意な差異は、ｐ値が０．０５以下であるとき、達成され得る。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のｍＲＮＡの発現はまた、患者の予後および化学療法に対する応答を判定するために使用され得、ここで、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のｍＲＮＡの発現は、２つの群：高いｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現を有するものと、低いまたは検出可能でないＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現を有するものとに分けられる。これらの群は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現の中央値によって分けられ、カプランマイヤー曲線を用いて経時的にプロットされ得る。
【００５０】
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現レベルをアッセイするために好適な方法には、ＤＮＡ塩基配列決定法、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、アレイＣＧＨ（ａＣＧＨ）、ＳＮＰ分析、ｍＲＮＡ発現アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。様々な実施形態において、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３をコードする核酸またはそのタンパク質レベルを検出するためのアッセイは、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ウェスタンブロット分析、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上である。いくつかの実施形態において、対象におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のレベルは、基質がＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に対して代理マーカーとして作用するように、酵素ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３が作用する基質を測定することによって確認され得る。
【００５１】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はともに、よく知られている方法を用いて当業者自身で生成することができるか、または既知のタンパク質配列に基づいて抗体を作製することを専門とするサービスプロバイダーによって製造することができる。本発明では、タンパク質配列が知られており、そのため、それらの対する抗体の生成は、通常のことである。
【００５２】
例えば、モノクローナル抗体の生成は、従来のハイブリドーマ方法を用いて、まず、最適な単離されたタンパク質またはその断片（例えば、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその断片もしくはその変異体）であり得る抗原を用いてマウスを免疫化し、それぞれが特異的なモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞株を作製することによって行うことができる。次いで、異なるクローンによって分泌された抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡまたは抗原マイクロアレイアッセイ、またはイムノドットブロット技術を用いて、抗原に結合するそれらの能力についてアッセイする。対象となるタンパク質の検出に最も特異的な抗体は、常法を使用して、ならびに免疫化に使用される抗原および対照として他の抗原を使用して選択することができる。所望の抗原およびタンパク質を最も特異的に検出する抗体が本明細書に記載されるプロセス、アッセイ、および方法のために選択され、それ以外の抗原またはタンパク質は選択されない。
【００５３】
次いで、最良のクローンが、好適な細胞培養培地中で無限に増殖され得る。それらはまた、抗体リッチな腹水を生成する（腸を取り囲む腹膜腔内に）マウスに注入され得、これにより、抗体が単離され、精製され得る。抗体は、当業者によく知られている技術を使用して精製され得る。
【００５４】
本発明の方法およびアッセイにおいて、任意のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその断片の存在は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３タンパク質またはその断片もしくはその変異体に特異的な抗体を使用し、それぞれの同族マーカーに対する各抗体の免疫特異的な結合を検出して、判定する。
【００５５】
本発明に従って測定されたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体のレベルを決定するために市販されているものを含む任意の好適なイムノアッセイ法が、利用され得る。知られているイムノアッセイの広範囲にわたる考察は、当業者には、これらが知られているため、ここでは必要ない。一般的な好適なイムノアッセイ法には、サンドイッチ酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合的結合アッセイ、同種アッセイ、異種アッセイ等が含まれる。様々な既知のイムノアッセイは、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７０，ｐｐ．３０−７０および１６６−１９８（１９８０）に概説されている。
【００５６】
本発明のアッセイにおいて、「サンドイッチ型」アッセイフォーマットが使用され得る。そのようなサンドイッチ型アッセイのいくつかの例は、Ｇｒｕｂｂらの米国特許第４，１６８，１４６号およびＴｏｍらの米国特許第４，３６６，２４１号に記載されている。代替の技術は、「競合型」アッセイである。競合的アッセイにおいて、標識プローブは、一般に、検体と同一である分子または検体の類似体に結合される。それ故に、標識プローブは、利用可能な受容材料に関して対象となる検体と競合する。競合的アッセイは、一般的に、ハプテンのような検体を検出するのに使用され、各ハプテンは一価であり、かつ１つの抗体分子とのみ結合することができる。競合的イムノアッセイデバイスの例は、Ｄｅｕｔｓｃｈらの米国特許第４，２３５，６０１号、Ｌｉｏｔｔａの米国特許第４，４４２，２０４号、Ｂｕｅｃｈｌｅｒらの米国特許第５，２０８，５３５号に記載されている。
【００５７】
抗体を標識することができる。いくつかの実施形態において、検出抗体は、酵素に共有結合的に連結させること、蛍光化合物もしくは金属による標識、または化学発光化合物による標識によって標識される。例えば、検出抗体をカタラーゼにより標識することができ、変換は、ヨウ化カリウム、過酸化水素、およびチオ硫酸ナトリウムを含む比色基質組成物を使用し、酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼであり得、変換は、アルコール、ｐＨ指示薬、およびｐＨ緩衝液を含む比色基質組成物を使用し、ｐＨ指示薬は、ニュートラルレッドであり、ｐＨ緩衝液は、グリシン−水酸化ナトリウムであり、酵素はまた、ヒポキサンチンオキシダーゼであり得、変換は、キサンチン、テトラゾリウム塩、および４，５−ジヒドロキシ−１，３−ベンゼンジスルホン酸を含む比色基質組成物を使用する。一実施形態において、検出抗体は、酵素に共有結合的に連結させること、蛍光化合物もしくは金属による標識、または化学発光化合物による標識によって標識される。
【００５８】
直接および間接標識をイムノアッセイで使用することができる。直接標識は、天然状態で、裸眼または光学フィルターの補助でおよび／または蛍光を促進する刺激、例えば、紫外線の適用で可視である実体と定義することができる。使用することができる着色標識の例には、金属ゾル粒子、金ゾル粒子、色素ゾル粒子、染色ラテックス粒子、またはリポゾーム中に封入された色素が含まれる。他の直接標識には、放射性核種および蛍光または発光部分が含まれる。また、酵素等の非直接標識を、本発明に従って使用することもできる。例えば、アルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、リゾチーム、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびウレアーゼ等の標識として使用するための様々な酵素が、知られている。イムノアッセイにおける酵素の詳細な考察に関しては、Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ＥＬＩＳＡ  ａｎｄ  ＥＭＩＴ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７０，４１９−４３９（１９８０）を参照のこと。
【００５９】
抗体を表面に結合させることができる。所望の抗原を検出するために、抗体を結合させることができる有用な表面の例には、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ポリスチレン、およびナイロンが含まれる。表面または支持体はまた、多孔性支持体であってもよい（例えば、米国特許第７，９３９，３４２号を参照のこと）。ＰＢ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃの米国特許第４，９０６，４３９号、第５，０５１，２３７号、および第５，１４７，６０９号に記載されるものを含む様々なアッセイデバイスのフォーマットで、アッセイを行うことができる。
【００６０】
本明細書に記載されるプロセス、アッセイ、および方法のいくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体に対して応答性がある抗体のレベルの検出には、癌患者からの試料をＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体に特異的に結合する抗体またはその断片と接触させることと、抗体と試料中に存在するＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体との抗体−タンパク質複合体を形成することと、非結合抗体を除去するために試料を洗浄することと、試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体に結合した抗体に対して反応性があり、かつ標識された検出抗体を添加することと、非結合の標識された検出抗体を除去するために洗浄することと、標識を検出可能なシグナルに変換することと、を含み、検出可能なシグナルは、患者からの試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体のレベルを示す。いくつかの実施形態において、エフェクター成分は、蛍光標識、放射性化合物、酵素、基質、エピトープタグ、高電子密度試薬、ビオチン、ジゴニゲニン（digonigenin）、ハプテン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される検出可能な部分である。いくつかの実施形態において、検出抗体は、酵素に共有結合的に連結させること、蛍光化合物もしくは金属による標識、または化学発光化合物による標識によって標識される。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のレベルは、抗体との試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の反応により形成された抗体−タンパク質複合体の形成から生じる光散乱強度を測定することによって得られ得、対照の光散乱強度を少なくとも１０％上回る光散乱強度が化学療法耐性の可能性を示す。
【００６１】
本発明のプロセス、アッセイ、および方法の様々な実施形態において、化学療法耐性の可能性の増大は、不良な予後をもたらし得、この不良な予後は、生存の可能性の減少、平均余命の短縮、または腫瘍の幹性の強化を含む。
【００６２】
本発明のプロセス、アッセイ、および方法の様々な実施形態において、本明細書に記載される方法は、対象が良好な予後を有する場合に、対象に第１の治療法を処方すること、または対象が不良な予後を有する場合に、対象に、第２の治療法、あるいは第１の治療法および第２の治療法の両方を処方することをさらに含む。
【００６３】
基準値
本明細書に記載されるプロセス、アッセイ、および方法の様々な実施形態において、基準値は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現レベルに基づいている。一実施形態において、発現レベルは、癌細胞中にある。別の実施形態において、発現レベルは、非癌細胞中にある。さらなる一実施形態において、発現レベルは、あらゆる細胞中にある。いくつかの実施形態において、基準値は、癌を有していない対象集団におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現レベルの平均または中央値である。他の実施形態において、基準値は、癌を有しており、かつ化学療法に応答する対象の集団におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現レベルの平均または中央値である。いくつかの実施形態において、癌を有しており、かつ化学療法に応答する対象の集団を含む基準値は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の検出不能な発現を示すか、またはＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の減少した発現を示す。さらなる実施形態において、基準値は、異なる（例えば、早期）時点から、例えば、診断中、治療前、治療後、またはそれらの組み合わせからの対象から得られた試料におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現レベルである。いくつかの実施形態において、癌は肺癌である。
【００６４】
様々な実施形態において、基準値と比較して癌対象におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現レベルは、少なくともまたは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％増加する。様々な実施形態において、基準値と比較して癌対象におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現レベルは、少なくともまたは約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、またはそれらの組み合わせで増加する。
【００６５】
治療法
本発明の様々な実施形態に従って、癌患者（例えば、肺癌患者）を治療するために、本明細書に記載される治療法が、選択、使用、および／または施行され得る。様々な実施形態において、第１の治療法は、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上であり得る。様々な実施形態において、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３もしくはその変異体が対象中に存在するか、またはＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３もしくはその変異体のレベルが対象において増大している場合、第２の治療法が施行され、癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）患者における化学療法耐性を示す。第２の治療法には、外科手術、放射線照射、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態において、化学療法は、第２の治療法において、より高い投与量の化学療法薬を投与すること、化学療法薬の組み合わせを投与すること、およびそれらの組み合わせを含み得る。
【００６６】
いくつかの実施形態において、化学療法剤は、細胞毒性抗生物質、代謝拮抗物質、抗有糸分裂剤、アルキル化剤、ヒ素化合物、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、タキサン、ヌクレオチド類似体、植物アルカロイド、および毒素、ならびにそれらの誘導体のうちのいずれか１つ以上から選択され得る。例示的な化合物には、アルキル化剤：トレオスルファンおよびトロフォスファミド；植物アルカロイド：ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキセル；ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤：ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、カンプトセシン、トポテカン、イリノテカン、テニポシド、クリスナトール、およびマイトマイシン；抗葉酸：メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびヒドロキシウレア；ピリミジン類似体：５−フルオロウラシル、ドキシフルリジン、およびシトシンアラビノシド；プリン類似体：メルカプトプリンおよびチオグアニン；ＤＮＡ代謝拮抗物質：２'−デオキシ−５−フルオロウリジン、アフィジコリングリシナート、およびピラゾロイミダゾール；ならびに抗有糸分裂剤：ハリコンドリン、コルヒチン、およびリゾキシンが含まれるが、これらに限定されない。１種以上の化学療法剤（例えば、ＦＬＡＧ、ＣＨＯＰ）を含む組成物も使用され得る。ＦＬＡＧには、フルダラビン、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、およびＧ−ＣＳＦが含まれる。ＣＨＯＰには、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびプレドニゾンが含まれる。別の実施形態において、ＰＡＲＰ（例えば、ＰＡＲＰ−１および／またはＰＡＲＰ−２）阻害剤が使用され、そのような阻害剤は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｏｌａｐａｒｉｂ、ＡＢＴ−８８８、ＢＳＩ−２０１、ＢＧＰ−１５（Ｎ−Ｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；ＩＮＯ−１００１（Ｉｎｏｔｅｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）；ＰＪ３４（Ｓｏｒｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｐａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｂ）；３−アミノベンズアミド（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；４−アミノ−１，８−ナフタルイミド；（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；６（５Ｈ）−フェナントリジノン（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；ベンズアミド（米国特許再発行第３６，３９７号）；ならびにＮＵ１０２５（Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００６７】
様々な実施形態において、第１および／または第２の治療法には、肺癌を治療するための化学療法剤の使用が含まれる。そのような薬剤には、アビトレキサート（Ａｂｉｔｒｅｘａｔｅ）、アブラキサン（パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤）、アファチニブ、アファチニブ、アリムタ（ペメトレキセド二ナトリウム）、アバスチン（ベバシズマブ）、ベバシズマブ、カルボプラチン、シスプラチン、クリゾチニブ、エルロチニブ塩酸塩、フォレックス（Ｆｏｌｅｘ）（メトトレキサート）、フォレックスＰＦＳ（Ｆｏｌｅｘ  ＰＦＳ）（メトトレキサート）、ゲフィチニブ、ギロトリフ（Ｇｉｌｏｔｒｉｆ）（アファチニブ）、ゲムシタビン塩酸塩、ジェムザール（ゲムシタビン塩酸塩）、イレッサ（ゲフィチニブ）、メトトレキサート、メトトレキサートＬＰＦ、メキサート（Ｍｅｘａｔｅ）、メキサート−ＡＱ（Ｍｅｘａｔｅ−ＡＱ）、ニボルマブ、ネシツムマブ、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤、パラプラット（Ｐａｒａｐｌａｔ）（カルボプラチン）、パラプラチン（カルボプラチン）、ペメトレキセド二ナトリウム、プラチノール（シスプラチン）、プラチノール−ＡＱ（シスプラチン）、タルセバ（エルロチニブ塩酸塩）、タクソール（パクリタキセル）、ザーコリ（クリゾチニブ）、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
様々な実施形態において、治療法には、例えば、放射線療法が含まれる。放射線療法に使用される放射線は、イオン化放射線であり得る。放射線療法はまた、ガンマ線、Ｘ線、または陽子ビームであり得る。放射線療法の例には、外部ビーム放射線療法、放射性同位体（Ｉ−１２５、パラジウム、イリジウム）の組織内移植、ストロンチウム−８９等の放射性同位体、胸部放射線療法、腹腔内Ｐ−３２放射線療法、ならびに／または全腹腔および骨盤放射線療法が含まれるが、これらに限定されない。放射線療法の総括については、Ｈｅｌｌｍａｎ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １６：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照のこと。放射線療法を、外部ビーム放射線照射または遠隔療法として施行され得、放射線を遠隔光源から向ける。放射線治療はまた、内部治療法または近接照射療法として施行され得、放射性活性供給源を癌細胞または腫瘤の近くの体内に入れる。ヘマトポルフィリンおよびその誘導体、ベルトポルフィン（ＢＰＤ−ＭＡ）、フタロシアニン、光増感剤Ｐｃ４、デメトキシ−ハイポクレリンＡ、および２ＢＡ−２−ＤＭＨＡのような光増感剤の投与を含む光線力学療法の使用も包含される。
【００６９】
様々な実施形態において、治療法には、例えば、免疫療法が含まれる。免疫療法には、例えば、癌ワクチンおよび／または感作抗原提示細胞の使用を含み得る。免疫療法は、癌抗原または疾患抗原に指向される予め形成された抗体の投与（例えば、腫瘍抗原への、化学療法剤または毒素に結合していてもよいモノクローナル抗体の投与）によって達成される、宿主の短期防御に対して受動免疫を含むことができる。免疫療法はまた、癌細胞株の細胞傷害性リンパ球により認識されるエピトープを使用することに焦点を合わせることもできる。
【００７０】
様々な実施形態において、治療法には、例えば、ホルモン療法が含まれ、ホルモン治療的処置には、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト（例えば、フルタミド、ビカルタミド、タモキシフェン、ラロキシフェン、ロイプロリド酢酸塩（ＬＵＰＲＯＮ）、ＬＨ−ＲＨアンタゴニスト）、ホルモン生合成およびプロセッシングの阻害剤、およびステロイド（例えば、デキサメタゾン、レチノイド、デルトイド、ベタメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、鉱質コルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン）、ビタミンＡ誘導体（例えば、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ））；ビタミンＤ３類似体；抗ゲスターゲン（例えば、ミフェプリストン、オナプリストン）、または抗アンドロゲン（例えば、シプロテロン酢酸塩）を含むことができる。
【００７１】
抗癌剤治療法による治療の継続期間および／または用量は、特定の抗癌剤またはそれらの組み合わせにより変化し得る。特定の癌治療剤に対する適切な治療時間は、当業者によって理解されよう。本発明は、各癌治療剤に対する最適な治療スケジュールの継続した評価を企図し、本発明の方法によって判定される、対象の癌の遺伝子シグネチャーは、最適な治療用量およびスケジュールを決定する際の一要素である。
【００７２】
様々な実施形態において、抗癌剤治療法の予測される有効性が判定される対象は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、霊長類、非ヒト哺乳動物、家畜、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ）であり、好ましくは、ヒトである。本発明の方法の別の実施形態において、対象は、化学療法も放射線療法も受けたことがない。代替の実施形態において、対象は、化学療法または放射線療法（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、および／またはタキサン等を用いた）を受けたことがある。関連した実施形態において、対象は、一種の対象によって、概してまたは平均して遭遇するものを上回る放射線または化学毒性薬のレベルまで曝露されたことがない。ある実施形態において、対象は、癌または前癌組織を除去するための外科手術を受けたことがある。他の実施形態において、癌組織は、除去されていない、例えば、癌組織は、身体の手術不可能な領域内、例えば、生命に不可欠な組織中、または外科的処置が患者に有害になるかなりの危険を生じる領域内に位置する場合があり、または例えば、対象は、癌組織の除去前に抗癌治療を与えられる。
【００７３】
試料
試料、例えば、癌細胞、癌組織、血漿、および／または血液は、好ましくは、癌の診断のための生検時に回収され得る。これは、患者に最良の待遇であり得る治療コースを設計するための絶好の機会を与え得る。例えば、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体の発現が増大している場合、この患者は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現が増大していない癌を有する別の患者と比較してより積極的な治療コースを必要とし得る。癌治療（例えば、外科手術）後、または癌治療（例えば、放射線照射、化学療法等）中に、癌組織、血漿、および／または血液を得ることも可能である。これにより、再発を見込んだ治療コースの変更、または治療コースの決定が可能である。様々な実施形態において、癌は肺癌である。いくつかの実施形態において、肺癌は、非小細胞肺癌である。一実施形態において、ＮＳＣＬＣは、腺癌である。
【００７４】
本発明に関与するステップは、外科的生検または外科的切除のいずれかによって、患者の肺腫瘍の試料を得ることと、患者からの血液試料を適合することと、を含む。代替として、試料は、一次患者から採取した肺腫瘍幹細胞、一次患者の肺腫瘍由来の細胞株、またはＦＦＰＥ（ホルマリンで固定したパラフィン包埋した）の形態の保管された患者試料、または新鮮な冷凍された肺腫瘍試料を通して得られ得る。本発明はまた、本発明の上記の部分を遡及的に評価する可能性（すなわち、生存の可能性、推定平均余命、および将来この突然変異体を獲得する潜在力）を計算に入れる。
【００７５】
次いで、患者の腫瘍試料を使用して、「ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉキット」と表記される標準プロトコル、またはＦＦＰＥ試料については、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）から市販されている「ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ  Ｔｉｓｓｕｅキット」を使用して、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を抽出する。上記および以下の手順は、患者からのインフォームドコンセントを必要とする。
【００７６】
本発明は、化学療法に対する癌細胞の反応性を判定するためのシステムを提供し、この癌細胞は癌患者から得られる。このシステムは、癌患者から得られた癌細胞中に存在するＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３をコードするｍＲＮＡに対するシグナルを生成するように設定されている試料分析器と、ｍＲＮＡに基づいて、このシグナルが基準値よりも大きいかまたは大きくないかを計算するようにプログラムされたコンピュータサブシステムと、を備える。
【００７７】
本発明はまた、化学療法に対する癌細胞の反応性を判定するためのシステムも提供し、この癌細胞は癌患者から得られる。システムは、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に特異的な抗体が、癌患者から得られた癌細胞中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に結合するときに、シグナルを生成するように設定されている試料分析器と、抗体結合に基づいて、このシグナルが基準値よりも大きいかまたは大きくないかを計算するようにプログラムされたコンピュータサブシステムと、を備える。
【００７８】
いくつかの実施形態において、コンピュータサブシステムは、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現が増大している場合に、化学療法を含む療法に応答する見込みのある患者として、およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３が増大していない場合に、化学療法を含む療法に応答する見込みのない患者として、患者を分類するアルゴリズムに基づいて、ｍＲＮＡを比較して、化学療法に対する前記癌細胞の反応性の可能性を判定するようにプログラムされる。
【００７９】
本発明は、さらに、コンピュータで実行されたときに、癌患者から得られた癌細胞を含む試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現を検出することと、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現を基準値と比較することと、を含むステップを行う、コンピュータ可読媒体において具現化されたコンピュータプログラム製品を提供する。検出可能な標識プローブの組み合わせを含む１０種以下のプローブ、またはＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のためのプライマーと、本明細書に記載されるコンピュータプログラム製品とを含む、化学療法に応答する癌患者の可能性を検出するための診断キット。
【実施例】
【００８０】
以下の実施例は、本請求の発明をより良好に説明するために提供され、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。特定の材料が言及される限り、それは単に説明を目的とし、本発明を限定することを意図するものではない。当業者は、本発明の能力を行使することなく、および本発明の範囲から逸脱することなく等価の手段または反応物を開発してよい。
【００８１】
Ｏグリコシル化改変体は、ほとんどの癌腫に生じ、診断および治療法のために有用な標的を構成し得る分子の発現をもたらす。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３酵素は、Ｏグリコシル化の開始時に重要なステップを触媒する。それは、転移性神経芽細胞腫において過剰発現し、この腫瘍を有する患者の予後と相関している。切除した肺癌標本においては、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現についての情報がない。
【００８２】
以下に詳述されるように、出願者らは、２４９個の腺癌（ＡＤＣＡ）および１２２個の扁平上皮癌（ＳＣＣ）を含む４４３個のＮＳＣＬＣを含む腫瘍組織マイクロアレイを使用した。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に対して特異的なモノクローナル抗体を使用して、免疫組織化学を行った。酵素の細胞質発現は、４つの値の強度スコア（０、１＋、２＋、および３＋）および各組織コアにおける反応性の程度のパーセンテージ（０〜１００％）を用いて定量化した。次いで、強度と反応性の拡張値（範囲、０〜３００）を乗算することによって、最終スコアを得た。患者を、ネオアジュバント化学療法を受けている（ｎ＝７２、ＷＮＡ）、およびネオアジュバント化学療法を受けていない（ｎ＝３７１、ＷＯＮＡ）、２つの群に分けた。
【００８３】
下記のように、出願者らは、ＷＮＡ群とＷＯＮＡ（ｐ＝０．２０）群との間に有意な差異がなく、ＮＳＣＬＣにおいて頻繁なＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現を見出した。ＡＤＣＡは、両群（ＷＮＡ、ｐ＝０．０２、およびＷＯＮＡ、ｐ＜０．０００１）において、ＳＣＣよりもより高いレベルの酵素を発現した。ネオアジュバントを受けている、または受けていないＡＤＣＡ患者において、組織学的パターン（ＷＮＡ：ｐ＝０．００２およびＷＯＮＡ：ｐ＝０．０４４）により、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現が異なり、充実型組織学的パターンの存在下でより高い値を示し、鱗状組織学的パターンにおいてより低いことを示した。Ｓｐｅａｒｍａｎ相関試験を使用して、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３は、ＥｐＣＡＭ（ｐ＜０．００１）およびＴＴＦ−１（ｐ＜０．０１）の発現と有意に相関し、ＡＤＣＡでは、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現とＥＧＦＲおよびＫＲＡＳ突然変異状態とＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の存在との間に相関関係がないことを見出した。ＡＤＣＡ−ＷＮＡサブセットにおいて、高いＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現レベルが、より不良なＯＳ（ｐ＜０．０１、ＨＲ＝５．２）と関連し、ＲＦＳ（ｐ＝０．１５、ＨＲ＝１．８）においては、有意でなかった。対照的には、患者のＡＤＣＡＷＯＮＡサブセットにおいて、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現と転帰との間の関連性は見出されなかった。ＧａＩＮＡｃ−Ｔ１３は、ＮＳＣＬＣにおいて頻繁に発現し、ネオアジュバント化学療法を受けたＡＤＣＡを有する患者において、不良な予後と関連がある。本明細書中のデータは、ＧａＩＮＡｃ−Ｔ１３がＮＳＣＬＣにおいて化学耐性と関連する新規のマーカーであることを示唆する。
【００８４】
実施例１
実験方法
細胞株
疾患の異なる組織型、段階および状態を提示するヒト肺癌細胞株（ＳＫ−ＭＥＳ−１、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ８３８、ＮＣＩ−Ｈ１７５５、ＮＣＩ−Ｈ５２６、ＮＣＩ−Ｈ１６５０、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、Ｈ６９ＡＲ、およびＮＬ−２０）は、ＡＴＣＣから購入し、供給業者の取扱説明書に従って、インビトロで培養した。
【００８５】
抗ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３モノクローナル抗体の産生（Ｔ１３．５ハイブリドーマ産生プロトコル）
免疫化
ＧａｌＮＡｃ−Ｔファミリーメンバーの中で極めて高い変動性を示す領域内のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の合成ペプチド（
2015529808.tif 000003
、受託番号ＢＡＣ５４５４５）（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を、選択した。Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＤＩ．ＬＡ．ＶＥ．，Ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ，Ｕｒｕｇｕａｙ）からの８週齢の４匹のＢａｌｂ／ｃ雌マウスを使用した。
【００８６】
２週間間隔で（０日目、腹腔内、および１４日目、２１日目、皮下注射）、マウスを免疫化した。免疫混合物は、１００μｌの総体積中に、ＰＢＳ中のＫＬＨによって担持される５０％  ｖ／ｖ  １００μｇの合成ペプチドおよびフロイントアジュバント（第１の免疫化については完全、以下については不完全）を含んだ。
【００８７】
第１の免疫化前、および２４日目および３１日目に、血清収集のためにマウスを採血した（約１００μｌ）。血清抗体力価は、３１日目の試料採取後、ＥＬＩＳＡによって決定した。この力価は、１／３０００に達した。同様の混合物（１００μｇのＰＢＳ中のＫＬＨ合成ペプチドおよび不完全フロイントアジュバント）により、選ばれたマウスを、融合前の３日間、皮下注射によりブーストした。
【００８８】
融合プロトコル
骨髄腫細胞
ＳＰ２／Ｏ骨髄腫細胞株を、融合する１０日前に解凍し、５％ＣＯ２の加湿した雰囲気中で、ＤＭＥＭ  ２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％ＳＢＦ中で、３７℃で培養した。融合する前日、骨髄腫細胞を、２０％ＳＢＦを添加した培養培地が入った未使用の瓶に分けた。全ての培地（２ｍＭのグルタミンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加し、ＳＢＦ２０％を含む、およびそれを含まないＤＭＥＭ）ならびにＰＥＧ１，４５０（Ｓｉｇｍａ）を、使用前に、３７℃まで予め温めた。骨髄腫細胞をプールし、計数し、次いで、脾臓細胞回復中、インキュベーター内のＳＢＦを含まない完全ＤＭＥＭにおいて、５０ｍｌの管中に残留させた。
【００８９】
脾臓細胞
マウスを頸椎脱臼により殺処分し、７０％エタノールが入ったビーカー内に置いた。無菌法を使用して、層流フード内で脾臓を取り出し、これを３ｍｌの血清を含まない完全ＤＭＥＭが入ったＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ（Ｓｉｇｍａ）に移した。脾臓を均質化し、脾細胞を、ＳＢＦを含まない完全ＤＭＥＭにおいて、５０ｍｌの管に移し、計数した。脾細胞および骨髄腫細胞を、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いで、１０ｍｌのＳＢＦを含まない完全培地中で再懸濁した。骨髄腫細胞および脾細胞を、１／２の割合で、未使用の５０ｍｌの管中にプールし、同じ条件下で遠心分離した。
【００９０】
融合
細胞混合物から上清を捨て、残りの液体中で、指で弾くことによりペレットを緩やかに再懸濁した。１．５ｍｌの３７℃で予め温めたＰＥＧを、管を１分３０秒間緩やかに回転させることによって、ゆっくりと添加し、次いで、２０ｍｌの血清を含まない培地を、３分間ゆっくりと添加した。細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、９６ウェル培養プレート（２００μｌ／ウェル）中でＨＡＴ培地２０％ＳＢＦ中で蒔種し、次いで、５％ＣＯ２の加湿した雰囲気下で、３７℃でインキュベーター中に置いた。４日目および７日目に、培地を、新たに予め温めたＨＡＴ培地で５０％置き換えた。
【００９１】
クローン試験
１０〜１４日後、クローンが裸眼で可視されたとき、試験されるべきウェルを選択するために、倒立顕微鏡によって、プレートをスクリーニングした。ＢＳＡによって担持される特定のペプチドでコーティングしたマイクロタイタープレートを用いて、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングを行った。ＥＬＩＳＡ陽性ウェルからの細胞を、２４ウェル培養プレートに移し、計数し、直前に、Ｂａｌｂ／ｃ脾細胞で調製した支持細胞層を含む９６ウェル培養プレートに限界希釈法によってクローン化した。１０〜１５日後、固有のクローンを有する全てのウェルを、ＥＬＩＳＡにより再試験し、陽性クローンを２４ウェルプレート、次いで、２５ｃｍ２の瓶中に拡張させ、液体窒素中ＳＢＦ  １０％  ＤＭＳＯ中に保存した。
【００９２】
表面プラズモン共鳴によるモノクローナル抗体の特異性の分析
ｍＡｂ  １３．５と合成ペプチドの間の相互作用を、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）にて表面プラズモン共鳴実験を行うことによって分析した。精製したｍＡｂを、活性カルボキシメチル化デキストランＣＭ−５センサー表面（ＳＡセンサーチップ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）と結合した。ペプチドをＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．００５％  界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中で希釈し、センサーチップ上を通過させた。全ての実験を、２５℃で自動調温されたバイオセンサー装置を用いて、３０μＬ／分の流速、１８０秒の接触時間、３６０秒の解離時間で二重に行った。解離後、各実験の終了時に、１０ｍＭ  グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）を注入することによって、センサーチップを再生した。全てのデータ処理は、ＢＩＡｃｏｒｅによって提供されるＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアを用いて行った。
【００９３】
ＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡを、製造業者の取扱説明書に従って、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、肺癌細胞株から抽出した。２０μｌの総反応体積中２μｌの１０ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸塩（ｄＮＴＰ）および２００ｎｇのランダム六量体（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）の存在下で２００単位のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用することによる第一鎖ｃＤＮＡ合成のために、２μｇの総ＲＮＡを含んだ。３７℃で１時間インキュベートした後、混合物を７０℃まで加熱し、急速冷却し、−２０℃で保存した。特定のプライマー：
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（受託番号ＡＪ５０５９９１）を用いて、４２５ｂｐのＧＡＬＮＴ１３転写物の増幅を行った。ＰＣＲ混合物（２５μｌの総反応体積）は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ  ｄＮＴＰ、３００ｎＭ  各プライマー、および１単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を含む。９５℃で４５秒間、６２℃で１分、および７２℃で１分という条件下で、３５サイクルの増幅を行った。ＰＣＲ産物（１５μｌ）を、２％アガロースゲル上で電気泳動し、エチジウムブロマイドの染色後、直接可視化によって分析した。
【００９４】
免疫蛍光顕微鏡検査法
ガラスカバースリップ上に蒔種した細胞を、ＰＢＳで洗浄し、メタノール−アセトン５０％で１０分間固定し、使用するまで−２０℃で保存した。次いで、カバースリップを解凍し、ＰＢＳ中で再水和し、３０％ヤギ血清中で２０分間遮断した。次いで、一次抗体Ｔ１３．５を室温で１時間インキュベートし、それぞれ、ＰＢＳ中で５分間３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８  Ｄｙｅと結合した二次抗体を室温で１時間インキュベートした。単層をＤＡＰＩで対比染色し、ＰＢＳ−グリセロール５０％中でマウントし、通常の落射蛍光顕微鏡法によって、またはＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０共焦点顕微鏡を使用する共焦点免疫蛍光顕微鏡法によって分析した。
【００９５】
患者および免疫組織化学的分析
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ）で、２００３年から２００５年の間に治癒目的のため、外科的切除術を受けた患者からの外科的に切除された原発性肺腺癌の腫瘍組織を回収した。臨床病理情報は、全ての症例において電子カルテから検索され、それには、年齢、性別、喫煙歴および喫煙状態（現在、以前、もしくは一度もなし）、国際肺癌学会（ＩＡＳＬＣ）［Ｄｅｔｔｅｒｂｅｃｋ，２００９  分類系］による腫瘍のサイズ、腫瘍段階、ネオアジュバントおよびアジュバント治療、ＲＦＳおよびＯＳ率についての追加情報が含まれる。
【００９６】
組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）は、外科的に切除された４４３人のＮＳＣＬＣ患者からのホルマリン固定パラフィン包埋組織で構築された。５ｕＭ厚のＴＭＡの切片上にｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ  Ｔ１３．５）を用いて免疫組織化学を行った。組織切片を脱パラフィン処理し、水和し、デクローキング（ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ）チャンバ内のｐＨ６．０のクエン酸塩緩衝液中で抗原回復を行い（１２１℃×３０分、９０℃×１０分）、トリス緩衝液で洗浄した。メタノール中３％  Ｈ２Ｏ２で、室温で１５分間ペルオキシダーゼのブロッキングを行った。Ｄａｋｏ無血清タンパク質ブロックで３０分間タンパク質のブロッキングを行った。スライドを、一次抗体で、室温で９０分間インキュベートし、トリス緩衝液で洗浄し、続いて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｄｕａｌ−Ｌｉｎｋ系西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ）で３０分間インキュベートした。
【００９７】
過酸化水素および抗菌剤（Ｄａｋｏ）を含有する新たにイミダゾールＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５で調製した、０．５％  ３，３'−ジアミノベンジジンを用いて、染色を５分間顕色化し、次いで、ヘマトキシリンと対比染色し、脱水し、マウントした。
【００９８】
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に対する細胞質免疫染色を、４つの値の強度スコア（０、１＋、２＋、および３＋）および各コアにおける反応性の程度のパーセンテージ（０〜１００％）を用いて定量化した。次いで、強度と反応性の拡張値（範囲、０〜３００）を乗算し、定量化することによって、最終スコアを得た。本発明者らの集団中の分布により、中央値がカットオフ値４０と見なされた。この集団を、ネオアジュバント療法を受けたか、または受けなかったかで、ネオアジュバントを受けた（ＷＮＡ）７２人の患者およびネオアジュバントを受けなかった（ＷＯＮＡ）３７１人の患者の２つの群に分け、個々の群として、腺癌（ＡＤＣＡ）および扁平上皮（ＳＱＭ）を分析した。
【００９９】
実施例２
パラフィン包埋組織における免疫組織化学的研究に有用なＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に特異的なモノクローナル抗体の生成。
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３がＧａｌＮＡｃ−Ｔ１と比較して８４％の相同性を示すことを考慮して、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１配列を有する相同性のないＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のＫＬＨを結合させた特異的モチーフ
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を有するマウスを免疫化した（図１Ａ）。ＥＬＩＳＡによって特定のハイブリドーマの選択を行い、ＢＳＡを結合させたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３ペプチドに対してスクリーニングを行った。合成ペプチドに対して強く反応する、ｍＡｂのうちの１つであるＴ１３．５を、さらなる特徴付けのために使用した。バキュロウイルスに発現したＧａｌＮＡｃ−Ｔ１および−Ｔ１３を使用して、ウェスタンブロットにおけるｍＡｂのＴ１３．５反応性を評価した。抗体がＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３と反応するが、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１とは反応せず（図１Ｂ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に対するこの抗体の特異性を確認し、変形型のタンパク質と結合することを見出した。どのアミノ酸残基がｍＡｂ  Ｔ１３．５結合に不可欠であるのかを判定するために、配列
2015529808.tif 000006
を網羅する重複ペプチドを使用して、エピトープをマップした。固定化抗体へのペプチド結合を、ＢＩＡｃｏｒｅを用いて評価した（図１Ｃ）。得られた結果は、ｍＡｂ  Ｔ１３．５のエピトープが残基ＬＬＰＬＡＲにマッピングされ得ることを示す。ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現が神経芽細胞腫においてこれまでに報告されたことを考慮して（Ｂｅｒｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ａ）、ＩＭＲ−３２細胞株にＭＡｂ  Ｔ１３．５を使用する免疫細胞化学的分析を行った（図１Ｄ）。ゴルジ装置に局在化されたグリコシルトランスフェラーゼに対して期待されるように、強力な染色が、核周辺領域内に優勢に検出することを見出した。神経芽細胞腫腫瘍における免疫組織化学的評価（図１Ｅ）は、ｍＡｂ  Ｔ１３．５が病理学的な日常の診断に使用されるパラフィン包埋組織においてＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３を検出することができることを示す。
【０１００】
実施例３
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３が、ヒト肺癌細胞中に発現される。
局所進行性疾患を示す７２人の肺癌患者は、術前にネオアジュバント療法を受けた。カルボプラチンおよびパクリタキセル、またはカルボプラチンおよびドセタキセル、またはカルボプラチンおよびゲムシタビン、またはカルボプラチンおよびペメトレキセド、またはカルボプラチンおよびエトポシド、またはシスプラチンおよびドセタキセル、またはシスプラチンおよびエトポシド、またはシスプラチンおよびゲムシタビン、またはパクリタキセルおよびセツキシマブのうちの１つにより患者を治療した。
【０１０１】
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３は、神経組織で特異的に発現するグリコシルトランスフェラーゼであることが、報告された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ここで、ＲＴ−ＰＣＲによりヒト肺癌細胞株のパネルを評価して、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ１７５５、ＮＣＩ−Ｈ５２６、ＮＣＩ−Ｈ１６５０、Ｈ６９ＡＲ、およびＮＬ−２０細胞株でＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３をコードするｍＲＮＡを見出した（図２Ａ）。対照的に、ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＮＣＩ−Ｈ８３８、およびＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株において陰性であった。免疫蛍光顕微鏡検査法（図２Ｂ）およびウェスタンブロット（図２Ｃ）を使用して、タンパク質レベルでのヒト肺癌細胞中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現を確認する。ＲＴ−ＰＣＲ（図２Ａ）およびウェスタンブロット（図２Ｃ）により得られた結果は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のスプライス変異体がヒト肺癌で発現することを示唆している。
【０１０２】
コロニーＰＣＲおよびヌクレオチド配列決定に基づいた戦略を用いて、初めて、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のスプライス変異体の大きなファミリーを示す（図３）。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３野生型は、配列番号１および２に記載される配列によってコードされる。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のエクソン９の欠失を有するスプライス変異体ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３ΔＥｘ９は、配列番号３および４に記載される配列によってコードされる。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のエクソン９の３９ヌクレオチドの欠失を有するスプライス変異体ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３Δ３９ｂｐＥｘ９は、配列番号５および６に記載される配列によってコードされる。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のエクソン１０Ｂの欠失を有するスプライス変異体ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３ΔＥｘ１０Ｂは、配列番号７および８に記載される配列によってコードされる。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のエクソン２〜７の欠失を有するスプライス変異体ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３ΔＥｘ２〜７は、配列番号９および１０に記載される配列によってコードされる。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のエクソン６の欠失を有するスプライス変異体ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３ΔＥｘ６は、配列番号１１および１２に記載される配列によってコードされる。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のエクソン８の欠失を有するスプライス変異体ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３ΔＥｘ８は、配列番号１３および１４に記載される配列によってコードされる。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のエクソン６およびエクソン８の欠失を有するスプライス変異体ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３ΔＥｘ６ΔＥｘ８は、配列番号１５および１６に記載される配列によってコードされる。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のエクソン６、エクソン８、エクソン９の３９ヌクレオチド、およびエクソン１０Ｂの欠失を有するスプライス変異体ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３ΔＥｘ６ΔＥｘ８Δ３９ｂｐＥｘ９ΔＥｘ１０Ｂは、配列番号１７および１８に記載される配列によってコードされる。
【０１０３】
実施例４
ＮＳＣＬＣにおいて化学耐性と関連する新規の免疫組織化学マーカーとしてのＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３
ＭＡｂ  Ｔ１３．５の免疫染色は、肺癌患者からの４４３個の原発腫瘍において評価された。患者および腫瘍の特徴を、表１に示す。ｍＡｂ  Ｔ１３．５は、常に、びまん性細胞質染色パターンを示した（図４）。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現が扁平上皮細胞腫瘍における発現よりも腺癌において有意に高いことを見出した（ｐ＜０．００１）。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現とＥＧＦＲおよびＫＲＡＳ突然変異状態とＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の存在との間に相関関係がないことを見出した。ネオアジュバント治療を受けている腺癌を有する患者において、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の高い発現レベルは、より不良な全体生存率と関連した（ｐ＜０．０１、ＨＲ＝５．２）（図５Ａ）。同様の結果が、進行性腫瘍を有する患者（図５Ｂ）、ならびに早期腺癌患者（図５Ｃ）において観察された。対照的に、ネオアジュバント治療を受けていない腺癌患者において、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現と転帰との間にいかなる関連性も見出さなかった。これらのデータは、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３が肺腺癌患者において化学耐性と関連する新規のマーカーであることを強く示唆している。
【０１０４】
（表１）肺癌原発腫瘍におけるＧａｌＮＡｃＴ１３の発現に伴う研究対象集団の特徴
2015529808.tif 000007
１  ＧａｌＮＡｃＴ１３の高い発現
２  ＧａｌＮＡｃＴ１３の低い発現または非発現
【０１０５】
参考文献
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2015529808.tif 000009
2015529808.tif 000010
【０１０６】
上記の様々な方法および技法は、本出願を実行するための多くの方法を提供する。もちろん、必ずしも記載される目的または利点の全てを、本明細書に記載される任意の特定の実施形態に従って達成され得るわけではないことは理解されよう。したがって、例えば、当業者は、本明細書で教示された１つまたは１群の利点を本明細書で教示または提示された他の目的および利点を必ずしも達成することなく達成または最適化するように、本方法を実行することができることを認識できるであろう。様々な代替物が、本明細書中で記述されている。いくつかの好ましい実施形態は、具体的には、１つの、別のまたはいくつかの特徴を包含するが、一方、他の実施形態は、具体的には、１つの、別のまたはいくつかの特徴を除外し、一方、さらに他の実施形態は、１つの、別のまたはいくつかの特徴の包含により特定の特徴を軽減することは理解されよう。
【０１０７】
さらに、当業者は、異なる実施形態から様々な特徴の適用可能性を認識するであろう。同様に、上記の様々な要素、特徴、およびステップ、ならびに各々のこのような要素、特徴、およびステップに関するその他の既知の等価物は、本明細書に記載される原理に従って方法を実施し得るように当業者に様々な組み合わせで使用される。様々な要素、特徴、およびステップの中で、多様な実施形態に特定的に包含されるものもあれば、特定的に除外されるものもある。
【０１０８】
ある実施形態および実施例に関連して本出願を開示してきたが、本出願の実施形態は具体的に開示された実施形態を越えて他の代替的実施形態および／またはその使用、修正、および等価物にまで広がることが当業者に理解されよう。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語、ならびに本出願の特定の実施形態を記述する文脈で（特に、以下の特許請求の範囲のうちの一部の文脈で）使用される同様の言及は、単数および複数の両方を包含するように解釈され得る。本明細書中の値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に入る各々の別個の値に個別に言及することの略記法として役立つよう意図される。本明細書中で別途指示されていない限り、各々の個々の値は、それが本明細書中で個別に列挙されるかのように、本明細書中に組み込まれる。本明細書中で記載される方法は全て、本明細書中で別途指示されていない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書中のある実施形態に関連して提供される任意のおよび全ての実施例、または例示的言語（例えば「等」）の使用は、単に、本出願をより明らかにすることを意図し、別途特許請求される本出願の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本出願の実施に不可欠ないかなる非特許請求要素を示すものとして解釈されるべきでない。
【０１１０】
本出願の好ましい実施形態は、本出願を実行するために本発明者らに知られている最良の方式を含めて、本明細書中に記載されている。それらの好ましい実施形態における変形例は、前述の説明を読めば、当業者には明らかであろう。当業者は、適宜、このような変形例を用い得、本出願は、本明細書中に具体的に記載されたものとは別の方法で実行され得ることが企図される。したがって、本出願の多数の実施形態は、適用可能な規則により許される場合、本明細書に添付される特許請求の範囲で列挙される対象の全ての修正および等価物を包含する。さらに、その全ての可能な変形例における上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書中に別記しない限り、あるいはそうでない場合は、文脈により明らかに矛盾しない限り、本出願に包含される。
【０１１１】
本明細書中で参照される特許、特許出願、特許出願の刊行物、および他の資料、例えば、論文、書物、仕様書、刊行物、文書、事柄等および／またはその他は全て、全ての目的のために、それらの全体が本参照により本明細書中で組み込まれるが、但し、それらに関連した任意の審査履歴、本発明の文書と一致しないかまたは矛盾するそれらのいずれか、あるいは本発明の文書にここでまたは後に関連する特許請求の最も広い範囲に関して限定的影響を及ぼし得るそれらのいずれかは除外する。例として、組み込まれたもののいずれかと関連する記述、定義、および／または用語の使用と、本発明の文書と関連するものとの間に何らかの不一致または矛盾が存在する場合、本発明の文書における記述、定義、および／または用語の使用が優位に立つ。
【０１１２】
本明細書中に開示される本出願の実施形態は、本出願の実施形態の原理の例証であることが理解されよう。用いられ得る他の修正は、本出願の範囲内であり得る。したがって、例として、本出願の実施形態の代替的構成が本明細書中の教示に従って利用され得るが、しかしそれらに限定されない。したがって、本出願の実施形態は、明確に示され、記載されたようなものに限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年7月28日(2015.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
実施例２
パラフィン包埋組織における免疫組織化学的研究に有用なＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に特異的なモノクローナル抗体の生成。
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３がＧａｌＮＡｃ−Ｔ１と比較して８４％の相同性を示すことを考慮して、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１配列を有する相同性のないＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のＫＬＨを結合させた特異的モチーフ
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を有するマウスを免疫化した（図１Ａ）。ＥＬＩＳＡによって特定のハイブリドーマの選択を行い、ＢＳＡを結合させたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３ペプチドに対してスクリーニングを行った。合成ペプチドに対して強く反応する、ｍＡｂのうちの１つであるＴ１３．５を、さらなる特徴付けのために使用した。バキュロウイルスに発現したＧａｌＮＡｃ−Ｔ１および−Ｔ１３を使用して、ウェスタンブロットにおけるｍＡｂのＴ１３．５反応性を評価した。抗体がＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３と反応するが、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１とは反応せず（図１Ｂ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に対するこの抗体の特異性を確認し、変形型のタンパク質と結合することを見出した。どのアミノ酸残基がｍＡｂ  Ｔ１３．５結合に不可欠であるのかを判定するために、配列
2015529808.tif 000018
を網羅する重複ペプチドを使用して、エピトープをマップした。固定化抗体へのペプチド結合を、ＢＩＡｃｏｒｅを用いて評価した（図１Ｃ）。得られた結果は、ｍＡｂ  Ｔ１３．５のエピトープが残基ＬＬＰＡＬＲにマッピングされ得ることを示す。ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現が神経芽細胞腫においてこれまでに報告されたことを考慮して（Ｂｅｒｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ａ）、ＩＭＲ−３２細胞株にＭＡｂ  Ｔ１３．５を使用する免疫細胞化学的分析を行った（図１Ｄ）。ゴルジ装置に局在化されたグリコシルトランスフェラーゼに対して期待されるように、強力な染色が、核周辺領域内に優勢に検出することを見出した。神経芽細胞腫腫瘍における免疫組織化学的評価（図１Ｅ）は、ｍＡｂ  Ｔ１３．５が病理学的な日常の診断に使用されるパラフィン包埋組織においてＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３を検出することができることを示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本明細書に記載されるプロセス、アッセイ、および方法の様々な実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、ネオアジュバント療法を受けたことがある。いくつかの実施形態において、対象から得られた試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体のレベルの分析は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体をコードする核酸レベル、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３またはその変異体のタンパク質レベルを測定すること、あるいはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、対象からの試料は、癌治療前、癌治療中、または癌治療後に得られる。一実施形態において、対象は、癌、例えば、肺癌を有している。一実施形態において、肺癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。特定の実施形態において、ＮＳＣＬＣは腺癌である。様々な実施形態において、対象からの試料は、組織、血液、血漿、またはそれらの組み合わせから得られる。
[本発明1001]
（ｉ）化学療法耐性の可能性を知ることを望んでいる癌患者から腫瘍細胞を含む試料を得ることと、
（ｉｉ）ＧａｌＮａｃ−Ｔ13またはその変異体のレベルを決定するために、前記試料をアッセイすることと、
（ｉｉｉ）基準試料と比較してＧａｌＮａｃ−Ｔ13もしくはその変異体のレベルが増加している場合に、前記対象の化学療法耐性の可能性が増大していると判定すること、または前記基準試料と比較してＧａｌＮａｃ−Ｔ13もしくはその変異体のレベルが同じであるか、もしくは減少している場合に、前記対象の化学療法耐性の可能性が減少していると判定することと、
を含む、方法。
[本発明1002]
前記試料をアッセイすることが、ＧａｌＮａｃ−Ｔ13もしくはその変異体をコードする核酸のレベルを検出すること、ＧａｌＮａｃ−Ｔ13タンパク質もしくはその変異体のレベルを決定すること、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体をコードする核酸のレベルを検出することが、前記試料中に存在するＧａｌＮａｃ−Ｔ13またはその変異体をコードするｍＲＮＡの量を決定することを含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
ｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ13タンパク質またはその変異体のレベルを検出することが、ｐｐＧａｌＮａｃ−Ｔ13またはその変異体に特異的な抗体を用いて、ＧａｌＮａｃ−Ｔ13またはその変異体のレベルを検出することを含む、本発明1002の方法。
[本発明1005]
前記抗体がモノクローナル抗体である、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記モノクローナル抗体が、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体のエピトープＬＬＰＡＬＲに結合する、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記対象がネオアジュバント化学療法を受けたことがある、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記癌が肺癌である、本発明1001の方法。
[本発明1009]
肺癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、本発明1008の方法。
[本発明1010]
ＮＳＣＬＣが腺癌である、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記試料が、組織、血液、血漿、またはそれらの組み合わせである、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記試料が、癌治療前、癌治療中、または癌治療後に得られる、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記対象がヒトである、本発明1001の方法。
[本発明1014]
基準値が、癌を有していない対象の集団におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体の発現レベルの平均または中央値である、本発明1001の方法。
[本発明1015]
基準値が、癌を有しており、かつ化学療法に応答する対象の集団におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体の発現レベルの平均または中央値である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
基準値が、異なる時点から得られた試料における、前記対象からのＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体の発現レベルである、本発明1001の方法。
[本発明1017]
前記対象の化学療法耐性の可能性が減少している場合に、前記対象に第1の治療法を処方すること、または前記対象の化学療法耐性の可能性が増大している場合に、前記対象に第2の治療法を処方することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記第1の治療法が、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つ以上である、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記第2の治療法が、外科手術、放射線照射、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちの1つ以上、本発明1017の方法。
[本発明1020]
前記第2の治療法が、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つ以上であり、化学療法が、前記対象に、前記対象を治療するためにこれまでに使用されていない1種以上の化学療法剤を投与すること、または前記対象にこれまでに投与された化学療法剤を、これまでに投与された用量よりも高い用量で投与することを含む、本発明1017の方法。
[本発明1021]
化学療法耐性の可能性の増大の判定を、それを必要とする対象において行うためのアッセイであって、
（ｉ）癌を有している対象からの生体試料を提供することと、
（ｉｉ）ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体に特異的に結合する抗体を提供することと、
（ｉｉｉ）前記生体試料を前記抗体と接触させることと、
（ｉｖ）イムノアッセイを使用して、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体に結合している抗体のレベルを検出することであって、基準試料と比較して前記対象からの前記生体試料中の結合の存在が、前記対象における化学療法耐性の可能性の増大を示す、ことと、を含む、アッセイ。
[本発明1022]
癌を有している対象に対する治療法を選択する、および任意で前記治療法を施行するためのアッセイであって、
（ｉ）癌を有している対象からの生体試料を提供することと、
（ｉｉ）ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体に特異的に結合する抗体を提供することと、
（ｉｉｉ）前記生体試料を前記抗体と接触させることと、
（ｉｖ）イムノアッセイを使用して、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体に結合している抗体のレベルを検出することであって、基準試料と比較して前記対象からの前記生体試料中の結合の増加が、前記対象におけるｐｐＧａｌＮＡｃの発現の増大および化学療法耐性の可能性の増大を示す、ことと、
（ｖ）前記対象の化学療法耐性の可能性が減少している場合に、前記対象に第1の治療法を処方すること、または前記対象の化学療法耐性の可能性が増大している場合に、前記対象に第2の治療法を処方することを含む、治療法を選択することと、を含む、アッセイ。
[本発明1023]
前記第1の治療法が、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つ以上である、本発明1022のアッセイ。
[本発明1024]
前記第2の治療法が、外科手術、放射線照射、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちの1つ以上、本発明1022のアッセイ。
[本発明1025]
前記第2の治療法が、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つ以上であり、化学療法が、前記対象に、前記対象を治療するためにこれまでに使用されていない1種以上の化学療法剤を投与すること、または前記対象にこれまでに投与された化学療法剤を、これまでに投与された用量よりも高い用量で投与することを含む、本発明1022のアッセイ。
[本発明1026]
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体に対して反応性がある抗体のレベルを検出することが、
（ｉ）前記癌患者からの前記試料を、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体に特異的に結合する抗体またはその断片と接触させることと、
（ｉｉ）前記抗体と、前記試料中に存在するＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体との抗体−タンパク質複合体を形成することと、
（ｉｉｉ）非結合抗体を除去するために前記試料を洗浄することと、
（ｉｖ）前記試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体に結合した前記抗体に対して反応性があり、かつ標識された検出抗体を添加することと、
（ｖ）非結合の標識された検出抗体を除去するために洗浄することと、
（ｖｉ）前記標識を検出可能なシグナルに変換することであって、前記検出可能なシグナルが、前記患者からの前記試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体のレベルを示す、ことと、を含む、本発明1021または1022のアッセイ。
[本発明1027]
前記試料が、組織、血液、血漿、またはそれらの組み合わせである、本発明1021または1022のアッセイ。
[本発明1028]
前記抗体がモノクローナル抗体である、本発明1021または1022のアッセイ。
[本発明1029]
前記抗体が、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体のエピトープＬＬＰＡＬＲに結合する、本発明1028のアッセイ。
[本発明1030]
前記対象が、ネオアジュバント化学療法を受けたことがある、本発明1021または1022のアッセイ。
[本発明1031]
前記癌が肺癌である、本発明1021または1022のアッセイ。
[本発明1032]
前記肺癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、本発明1031のアッセイ。
[本発明1033]
ＮＳＣＬＣが腺癌である、本発明1032のアッセイ。
[本発明1034]
前記試料が、癌治療前、癌治療中、または癌治療後に得られる、本発明1021または1022のアッセイ。
[本発明1035]
基準値が、癌を有していない対象の集団からのＧａｌＮＡｃ−Ｔ13発現レベルの平均または中央値である、本発明1021または1022のアッセイ。
[本発明1036]
基準値が、癌を有しており、かつ化学療法に応答する対象の集団からのＧａｌＮＡｃ−Ｔ13発現レベルの平均または中央値である、本発明1021または1022のアッセイ。
[本発明1037]
前記抗体が、エフェクター成分にさらに結合されている、本発明1021または1022のアッセイ。
[本発明1038]
前記エフェクター成分が、蛍光標識、放射性化合物、酵素、基質、エピトープタグ、高電子密度試薬、ビオチン、ジゴニゲニン（digonigenin）、ハプテン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される検出可能な部分である、本発明1037のアッセイ。
[本発明1039]
前記検出抗体が、酵素に共有結合することによって標識される、蛍光化合物または金属で標識される、化学発光化合物で標識される、本発明1026のアッセイ。
[本発明1040]
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13の前記レベルが、前記試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ13と前記抗体との反応によって形成される抗体−タンパク質複合体の形成から生じる光散乱強度を測定することによって得られ、対照の光散乱強度を少なくとも10％上回る光散乱強度が化学療法耐性の可能性を示す、本発明1026のアッセイ。
[本発明1041]
結合の存在が、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体への前記抗体の結合の増加である、本発明1021または1022のアッセイ。
[本発明1042]
癌を有している対象を治療する、および任意で前記治療法を施行するための方法であって、
（ｉ）癌を有している対象からの生体試料を提供することと、
（ｉｉ）ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体に結合する抗体を提供することと、
（ｉｉｉ）前記生体試料を前記抗体と接触させることと、
（ｉｖ）イムノアッセイを使用して、前記抗体がＧａｌＮＡｃ−Ｔ13に結合しているかどうかを検出することであって、基準試料と比較して前記対象からの前記生体試料中の結合の増加が、前記対象におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体の発現の増大および化学療法耐性の可能性の増大を示す、ことと、
（ｖ）前記対象の化学療法耐性の可能性が減少している場合に、前記対象に第1の治療法を処方すること、または前記対象の化学療法耐性の可能性が増大している場合に、前記対象に第2の治療法を処方することと、を含む、方法。
[本発明1043]
前記第1の治療法が、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つ以上である、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記第2の治療法が、外科手術、放射線照射、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちの1つ以上、本発明1042の方法。
[本発明1045]
前記第2の治療法が、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ワクチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つ以上であり、化学療法が、前記対象に、前記対象を治療するためにこれまでに使用されていない1種以上の化学療法剤を投与すること、または前記対象にこれまでに投与された化学療法剤を、これまでに投与された用量よりも高い用量で投与することを含む、本発明1042の方法。
[本発明1046]
前記対象が、ネオアジュバント化学療法を受けたことがある、本発明1042の方法。
[本発明1047]
前記癌が非小細胞肺癌である、本発明1042の方法。
[本発明1048]
前記ＮＳＣＬが腺癌である、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記抗体が、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体のエピトープＬＬＰＡＬＲに結合する、本発明1042の方法。
[本発明1050]
化学療法耐性が、化学療法剤のうちのいずれか1種以上に対する耐性である、本発明1042の方法。
[本発明1051]
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体に特異的に結合する抗体。
[本発明1052]
前記抗体がモノクローナル抗体である、本発明1051の抗体。
[本発明1053]
前記抗体が、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体中のエピトープに結合し、前記エピトープが配列ＬＬＰＡＬＲを含む、本発明1051の抗体。
[本発明1054]
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13またはその変異体中のＬＬＰＡＬＲエピトープに結合する、本発明1051の抗体。
[本発明1055]
化学療法に対する癌細胞の反応性を判定するためのシステムであって、前記癌細胞が癌患者から得られ、前記システムが、
（ｉ）前記癌患者から得られた前記癌細胞中に存在するＧａｌＮＡｃ−Ｔ13をコードするｍＲＮＡに対するシグナルを生成するように設定されている試料分析器と、
（ｉｉ）前記ｍＲＮＡに基づいて、前記シグナルが基準値よりも大きいかまたは大きくないかを計算するようにプログラムされたコンピュータサブシステムと、を備える、システム。
[本発明1056]
化学療法に対する癌細胞の反応性を判定するためのシステムであって、前記癌細胞が癌患者から得られ、前記システムが、
（ｉ）ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13に特異的な抗体が、癌患者から得られた前記癌細胞中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ13に結合するときに、シグナルを生成するように設定されている試料分析器と、
（ｉｉ）前記抗体結合に基づいて、前記シグナルが基準値よりも大きいかまたは大きくないかを計算するようにプログラムされたコンピュータサブシステムと、を備える、システム。
[本発明1057]
前記コンピュータサブシステムが、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13の発現が増大している場合に、化学療法を含む治療法に応答する見込みのある患者として、および前記ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13が増大していない場合に、化学療法を含む治療法に応答する見込みのない患者として、前記患者を分類するアルゴリズムに基づいて、前記ｍＲＮＡを比較して、化学療法に対する前記癌細胞の反応性の可能性を判定するようにプログラムされている、本発明1055または1056のシステム。
[本発明1058]
前記基準値が、癌を有していない対象の集団からのＧａｌＮＡｃ−Ｔ13発現レベルの平均もしくは中央値であるか、または前記基準値が、癌を有しており、かつ化学療法に応答する対象の集団からのＧａｌＮＡｃ−Ｔ13発現レベルの平均もしくは中央値である、本発明1055または1056のシステム。
[本発明1059]
コンピュータで実行されたときに、
（ｉ）癌患者から得られた癌細胞を含む試料中のＧａｌＮＡｃ−Ｔ13の発現を検出することと、
（ｉｉ）前記ＧａｌＮＡｃ−Ｔ13の発現を基準値と比較することと、
を含むステップを行う、コンピュータ可読媒体において具現化されたコンピュータプログラム製品。
[本発明1060]
前記基準値が、癌を有しており、かつ化学療法に応答する対象の集団からのＧａｌＮＡｃ−Ｔ13発現レベルの平均または中央値である、本発明1060のコンピュータプログラム。
[本発明1061]
化学療法に応答する癌患者の可能性を検出するための診断キットであって、
（ｉ）検出可能な標識プローブの組み合わせを含む10種以下のプローブ、またはＧａｌＮＡｃ−Ｔ13のためのプライマーと、
（ｉｉ）本発明1059のコンピュータプログラム製品と、を含む、キット。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2015529808000001.app
【国際調査報告】
2015529808.tif 000019
2015529808.tif 000020
2015529808.tif 000021
2015529808.tif 000022