(57)【要約】  本発明は、植物のマイクロリボ核酸の抽出、製造およびその応用を公開する。具体的に、本発明は、ある植物由来の内在性microRNAで、且つ前述植物の水溶性および/または脂溶性の抽出物に存在し、且つ非植物標的遺伝子を調節する機能を有する、分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む抽出物およびその用途を公開する。
2015526080.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物由来の内在性microRNAで、且つ前述植物の水溶性および/または脂溶性の抽出物に存在し、且つ非植物標的遺伝子を調節する機能を有することを特徴とする分離された植物機能性microRNA、または前述植物機能性microRNAを含む抽出物。
【請求項２】
前述植物機能性microRNAは、MIR2911を含み、
且つ前述分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む抽出物において、全microRNAの量で計算すると、MIR2911の含有量が≧70％である、
ことを特徴とする、請求項1に記載の分離された植物機能性microRNA、または前述植物機能性microRNAを含む抽出物。
【請求項３】
前述の非植物標的遺伝子は、細菌遺伝子、ウイルス遺伝子、クラミジア遺伝子、酵母遺伝子、動物遺伝子を含むことを特徴とする、請求項1に記載の分離された植物機能性microRNA、または前述植物機能性microRNAを含む抽出物。
【請求項４】
前述の植物は、薬用植物、果物や野菜の植物、鑑賞植物を含むことを特徴とする、請求項1に記載の分離された植物機能性microRNA、または前述植物機能性microRNAを含む抽出物。
【請求項５】
前述の植物抽出物は、植物の水溶性および/または脂溶性の抽出物を含むことを特徴とする、請求項1に記載の分離された植物機能性microRNA、または前述植物機能性microRNAを含む抽出物。
【請求項６】
（a）非植物標的遺伝子を調節する組成物の製造のため、あるいは（b）非植物標的遺伝子関連疾患を治療する薬物の製造のためであることを特徴とする、請求項1または2に記載の分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む抽出物の使用。
【請求項７】
（a）薬学的に許容される担体または食品学的に許容される担体と、
（b）請求項1または2に記載の分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む植物抽出物と、
を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項８】
体外で非植物標的遺伝子の発現を非治療的に調節する方法であって、非植物標的遺伝子は、細菌遺伝子、ウイルス遺伝子、クラミジア遺伝子、酵母遺伝子、動物遺伝子を含み、請求項1または2に記載の分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む抽出物の存在下で、前述標的遺伝子を含む生物材料を培養し、前述非植物標的遺伝子の発現を調節する工程を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項９】
非植物標的遺伝子を調節機能を有する植物機能性microRNAの同定方法であって、
（1）ある植物の抽出物を提供する工程と、
（2）前述抽出物における植物内在性microRNAの種類またはレベルを測定する工程と、
（3）測定された植物microRNAの配列を非植物標的遺伝子と比較して分析し、非植物標的遺伝子を調節機能を有する植物機能性microRNAを同定する工程と、
を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項１０】
ウイルス性感冒を治療する薬物の製造のためであることを特徴とする、microRNA分子MIR2911またはMIR2911を含む抽出物の使用。
【請求項１１】
前述の抽出物（未濃縮または濃縮）には、0.01〜100nM（好ましくは0.1〜20nM）のMIR2911を含み、
前述の抽出物（未濃縮または濃縮）では、MIR2911の含有量は、全microRNAの量で計算すると、≧70％、好ましくは≧80％、より好ましくは≧90％、最も好ましくは100％である、
ことを特徴とする、請求項10に記載の使用。
【請求項１２】
非植物標的遺伝子に関連する疾患を予防または治療する方法であって、
必要な対象に請求項1または2に記載の分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む抽出物、あるいは請求項7に記載の組成物を投与し、前述の疾患を予防または治療する工程を含み、前述植物機能性microRNAは、非植物標的遺伝子を調節する機能を有することを特徴とする、前記方法。
【請求項１３】
抗ウイルス活性成分の候補物質を選別する方法であって、
（a）分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む抽出物を提供する工程と、
（b）前述植物機能性microRNAのうちの各microRNAの安定性を測定し、高安定性のmicroRNAの種類を選択する工程と、
（c）前の工程で選択された前述高安定性のmicroRNAを非植物標的遺伝子と比較し、前述の高安定性のmicroRNAが非植物標的遺伝子とマッチするかどうか、あるいは結合するかどうか、確認し、
比較の結果から、前述の高安定性のmicroRNAが非植物標的遺伝子とマッチする、あるいは結合することがわかった場合、当該microRNAの種類を抗ウイルス活性成分の候補物質として選出する工程と、
を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項１４】
請求項13に記載の方法によって選別された抗ウイルス活性成分の候補物質である、植物機能性microRNA分子を人工的に合成する工程と、
前述の植物機能性microRNA分子を薬学的にもしくは食品学的に許容される担体と混合し、前述の組成物を調製する工程と、
を含むことを特徴とする、組成物を製造する方法。
【請求項１５】
（a）植物機能性microRNAを含む抽出物であって、前述の植物機能性microRNAはn種類のmicroRNAを含み、nは≧2（好ましくは≧5または≧10）の正整数で、且つそのうちの一種類のmicroRNAはMIR2911である抽出物を提供する工程と、
（b）前述抽出物を熟成処理（例えば静置）し、熟成した抽出物を得、且つ前述熟成した抽出物におけるMIR2911の存在度を測定し、所定値と比較し、且つMIR2911の存在度≧所定値の場合、熟成処理を中止し、MIR2911の存在度が上がった抽出物を得る工程と、
を含むことを特徴とする、MIR2911の存在度を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物の分野に属する。具体的に、本発明は、植物のmicroRNAを抽出する方法およびその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロリボ核酸（microRNA、miRNAまたはmiR）は、長さ19〜23ヌクレオチドの小さいノンコーディング一本鎖リボ核酸分子である。動植物の細胞に幅広く存在し、進化の上では高度に保存的である。microRNAは、標的伝令RNA（mRNA）の3'末端の非翻訳配列を識別し、それと不完全に対合することで、相応のタンパク質の翻訳を抑制する。mRNAの強力な調節因子として、microRNAは、生理活動と密接に関係し、生物の個体発育、組織分化、アポトーシスおよびエネルギー代謝などの生命活動に関与する。同時に、microRNAは、多くの疾患の発生と発展にも密接に関係する。
【０００３】
現在、植物のmicroRNAに対する研究は、植物の生長・発育、シグナル伝達およびストレス応答に対する作用を含む、microRNAの植物自身に対する調節作用に集中している。研究成果の応用は、植物品種の改良、例えば農作物の食用部分における栄養元素の発現の調節に集中している。
【０００４】
特許PCT/CN2010/000677では、イネ由来のMIR164の植物根系に対する調節作用が公開され、MIR164配列を含む核酸断片を構築し、且つイネの株に導入することで、根系が通常のイネよりも強い遺伝子組換えイネを得ることが開示された。特許PCT/IB2010/055600では、MIR156を含むいくつかのmicroRNAを上方調節することで、植物の環境ストレス要素に対する耐性を向上させ、さらに植物のバイオマス、活力および生産量を向上させることができることが公開された。
【０００５】
現在、既存の研究は、植物のmicroRNAの植物自身の生理活動に対する調節作用に限られているが、植物のmicroRNAの動物の生理活動に対する調節作用および植物のmicroRNAの抽出にさらなる研究が必要である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的の一つは、非植物標的遺伝子を調節する機能を有する植物のmicroRNAまたは前述microRNAを含む植物抽出物ならびにその製造方法および用途を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、植物機能性microRNAを同定する方法を提供することである。
本発明の第一は、ある植物由来の内在性microRNAで、且つ前述植物の水溶性および/または脂溶性の抽出物に存在し、且つ非植物標的遺伝子を調節する機能を有する、分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む抽出物を提供する。
【０００７】
もう一つの好適な例において、前述植物機能性microRNAは、MIR2911を含み、且つ前述分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む抽出物において、全microRNAの量で計算すると、MIR2911の含有量が≧70％である。
もう一つの好適な例において、MIR2911の含有量が≧80％、好ましくは≧90％、より好ましくは100％である。
もう一つの好適な例において、全microRNAの量とは、18-24ntのmicroRNAの量の合計である。
もう一つの好適な例において、前述の調節は、標的遺伝子の発現に対する抑制（下方調節）、標的遺伝子の発現に対する促進（上方調節）を含む。
【０００８】
もう一つの好適な例において、前述の非植物標的遺伝子は、細菌遺伝子、ウイルス遺伝子、クラミジア遺伝子、酵母遺伝子、動物遺伝子を含む。
もう一つの好適な例において、前述の植物は、薬用植物、果物や野菜の植物、鑑賞植物、より好適に、スイカズラ、タイセイ、チンタイ、リュウキュウアイ、コトカケヤナギ、ササゲ、ワタ、ハクサイまたはバレイショを含む。好ましくは、前述植物は、スイカズラ、タイセイ、チンタイ、リュウキュウアイまたはコトカケヤナギ、より好ましくは、前述植物は、スイカズラである。
もう一つの好適な例において、前述の植物機能性microRNAは、前述植物の水溶性および/または脂溶性の抽出物に豊富に含まれるmicroRNAの種類（例えば存在度が上位20位、好ましくは上位10位のmicroRNAの種類）である。
【０００９】
もう一つの好適な例において、前述の植物機能性microRNAは、さらに、MIR156h、MIR166f、MIR396a、MIR166a、MIR168a、MIR1440、MIR2910、MIR2915、MIR2916、MIR818d、MIR159e、MIR159c、MIR156j、MIR1432、MIR166k、MIR167b、MIR396c、MIR156e、MIR169k、MIR167c、MIR160d、MIR399a、MIR156d、MIR160e、MIR169n、MIR166l、MIR159f、MIR166c、MIR159b、MIR166j、MIR167i、MIR169c、MIR164c、MIR167j、MIR167g、MIR160c、MIR399e、MIR399b、MIR529b、MIR164e、MIR166d、MIR166h、MIR164b、MIR156f、MIR164a、MIR169l、MIR166m、MIR164f、MIR156k、MIR166g、MIR166b、MIR160b、MIR166e、MIR159d、MIR818e、MIR172a、MIR156b、MIR399g、MIR169b、MIR399f、MIR167a、MIR394、MIR156a、MIR166i、MIR167f、MIR319a、MIR156g、MIR166n、MIR399c、MIR160a、MIR159a.1、MIR156c、MIR319b、MIR169o、MIR167h、MIR156i、MIR167d、MIR169a、MIR172d、MIR818b、MIR164d、MIR167e、MIR396b、MIR2914からなる群から選ばれる一種または複数種を含む(表1)。
もう一つの好適な例において、前述の植物抽出物は、植物の水溶性および/または脂溶性の抽出物を含む。
もう一つの好適な例において、前述の植物抽出物は、植物の枝、葉、根、花、実および/または茎の抽出物を含む。
【００１０】
本発明の第二は、（a）非植物標的遺伝子を調節する組成物の製造のため、あるいは（b）非植物標的遺伝子関連疾患を治療する薬物の製造のための、本発明の第一に係る分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む抽出物の用途を提供する。
もう一つの好適な例において、前述の非植物標的遺伝子は、細菌遺伝子、ウイルス遺伝子、クラミジア遺伝子、酵母遺伝子、動物遺伝子を含む。
もう一つの好適な例において、前述の非植物標的遺伝子は、病原体（細菌、ウイルス、クラミジアなどを含む）の遺伝子である。
【００１１】
もう一つの好適な例において、前述非植物標的遺伝子関連疾患は、腫瘍（例えば肝臓癌、肺癌）、急性・慢性伝染病（例えばウイルス性インフルエンザ、ウイルス性肝炎、エイズ、SARSなどのウイルス性疾患、例えば結核、細菌性肺炎などの細菌性疾患、および病原微生物による急性・慢性伝染病）、他の急性・慢性疾患（例えば呼吸系疾患、免疫系疾患、血液・造血系疾患、例えば心脳血管疾患などの循環系疾患、内分泌系代謝性疾患、消化系疾患、神経系疾患、泌尿系疾患、生殖系疾患および運動系疾患）を含む。
もう一つの好適な例において、前述の植物機能性microRNAは、MIR2911を含む。好ましくは、前述の薬物は、ウイルス性感冒を治療するためのものである。
【００１２】
本発明の第三は、（a）薬学的に許容される担体または食品学的に許容される担体と、（b）本発明の第一に係る分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む植物抽出物とを含む、組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前述の組成物は、成分（a）および成分（b）で構成され、あるいはほとんど成分（a）および成分（b）で構成される。
もう一つの好適な例において、成分（b）の含有量は、組成物の全重量の0.01〜99wt％、好ましくは0.1〜90wt％である（microRNAで計算する）。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前述組成物は、薬物組成物、食品組成物または健康食品組成物を含む。
もう一つの好適な例において、前述組成物の製造方法は、前述植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む植物抽出物を薬学的に、もしくは食品学的に許容される担体と混合し、前述の組成物を調製する工程を含む。
もう一つの好適な例において、前述の植物機能性microRNAは、薬用植物、果物や野菜の植物、鑑賞植物から選ばれる植物由来のもので、且つ細菌遺伝子、ウイルス遺伝子、クラミジア遺伝子、酵母遺伝子、動物遺伝子から選ばれる非植物標的遺伝子を調節する。
もう一つの好適な例において、前述の植物機能性microRNAは、スイカズラ、タイセイ、チンタイ、リュウキュウアイまたはコトカケヤナギ由来のものである。より好ましくは、植物機能性microRNAは、MIR2911を含む。
【００１４】
本発明の第四は、体外で非植物標的遺伝子の発現を非治療的に調節する方法であって、非植物標的遺伝子は、細菌遺伝子、ウイルス遺伝子、クラミジア遺伝子、酵母遺伝子、動物遺伝子を含み、本発明の第一に係る分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む抽出物の存在下で、前述標的遺伝子を含む生物材料を培養し、前述非植物標的遺伝子の発現を調節する工程を含む、方法を提供する。
【００１５】
もう一つの好適な例において、前述の標的遺伝子は、病原体（細菌、ウイルス、クラミジアなどを含む）の遺伝子である。
もう一つの好適な例において、前述の生物材料は、ウイルス、細胞、組織を含む。
もう一つの好適な例において、前述の植物機能性microRNAは、薬用植物、果物や野菜の植物、鑑賞植物から選ばれる植物由来のものである。
もう一つの好適な例において、前述の植物機能性microRNAは、スイカズラ、タイセイ、チンタイ、リュウキュウアイまたはコトカケヤナギ由来のものである。より好ましくは、植物機能性microRNAは、MIR2911を含む。
【００１６】
本発明の第五は、植物機能性microRNAの同定方法であって、前述植物機能性microRNAは、非植物標的遺伝子を調節機能を有し、
（1）ある植物の抽出物を提供する工程と、
（2）前述抽出物における植物内在性microRNAの種類またはレベルを測定する工程と、
（3）測定された植物microRNAの配列を非植物標的遺伝子と比較して分析し、非植物標的遺伝子を調節機能を有する植物機能性microRNAを同定する工程と、
を含む方法を提供する。
【００１７】
もう一つの好適な例において、前述の非植物標的遺伝子は、遺伝子データベースにおける遺伝子を含む。
もう一つの好適な例において、前述の非植物標的遺伝子は、細菌遺伝子、ウイルス遺伝子、クラミジア遺伝子、酵母遺伝子、動物遺伝子を含む。
もう一つの好適な例において、前述の非植物標的遺伝子は、病原体の遺伝子である。
もう一つの好適な例において、前述の植物は、薬用植物、果物や野菜の植物を含む。
【００１８】
もう一つの好適な例において、工程（3）では、抽出物における存在度が上位20位（好ましくは上位10位）のmicroRNAの種類を選択し、比較と分析を行う。
もう一つの好適な例において、工程（3）では、Lm/La比≧130％（好ましくは≧150％、より好ましくは200％）のmicroRNAの種類を選択し、比較と分析を行い、ここで、Lmはある植物のmicroRNAの抽出物における存在度（またはレベル）で、Laは前述植物の全microRNAの平均存在度（またはレベル）である。
【００１９】
本発明の第六は、本発明の第五に係る方法によって同定された植物機能性microRNA分子を提供する。
もう一つの好適な例において、前述のmicroRNA分子は、MIR2911を含む。
【００２０】
本発明の第七は、組成物を製造する方法であって、
本発明の第六に係る植物機能性microRNA分子を人工的に合成する工程と、
前述の植物機能性microRNA分子を薬学的にもしくは食品学的に許容される担体と混合し、前述の組成物を調製する工程と、
を含む方法を提供する。
【００２１】
本発明の第八は、ウイルス性感冒を治療する薬物の製造のためのmicroRNA分子MIR2911またはMIR2911を含む抽出物の用途を提供する。
もう一つの好適な例において、前述の抽出物（未濃縮または濃縮）には、0.01〜100nM（好ましくは0.1〜20nM）のMIR2911を含み、あるいは
前述の抽出物（未濃縮または濃縮）では、MIR2911の含有量は、全microRNAの量で計算すると、≧70％、好ましくは≧80％、より好ましくは≧90％、最も好ましくは100％である。
【００２２】
本発明の第九は、疾患を予防または治療する方法であって、前述疾患は、非植物標的遺伝子に関連する疾患で、必要な対象に本発明の第一に係る分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む抽出物、あるいは本発明の第三に係る組成物を投与し、前述の疾患を予防または治療する工程を含み、前述植物機能性microRNAは、非植物標的遺伝子を調節する機能を有する方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前述の対象は、哺乳動物（例えばヒト）を含む。
もう一つの好適な例において、前述の非植物標的遺伝子は、細菌遺伝子、ウイルス遺伝子、クラミジア遺伝子、酵母遺伝子、動物遺伝子を含む。
もう一つの好適な例において、前述の非植物標的遺伝子は、病原体の遺伝子である。
【００２３】
本発明の第十は、抗ウイルス活性成分の候補物質を選別する方法であって、
（a）分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む抽出物を提供する工程と、
（b）前述植物機能性microRNAのうちの各microRNAの安定性を測定し、高安定性のmicroRNAの種類を選択する工程と、
（c）前の工程で選択された前述高安定性のmicroRNAを非植物標的遺伝子と比較し、前述の高安定性のmicroRNAが非植物標的遺伝子とマッチするかどうか、あるいは結合するかどうか、確認し、
比較の結果から、前述の高安定性のmicroRNAが非植物標的遺伝子とマッチする、あるいは結合することがわかった場合、当該microRNAの種類を抗ウイルス活性成分の候補物質として選出する工程と、
を含む方法を提供する。
【００２４】
もう一つの好適な例において、前述方法は、さらに、
（d）体外試験または動物試験で、抗ウイルス活性成分の候補物質が抗ウイルス活性を有するかどうか検証する工程を含む。
もう一つの好適な例において、前述の高安定性のmicroRNAは、
（i）前述植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む抽出物では、安定性が上位5種類、好ましくは上位3種類、より好ましくは最上位の種類のmicroRNAと、
（ii）安定性が下述式を満足するmicroRNAと、
C12/C0≧80％
（式中で、C0は静置時間0時間の濃度で、
C12は静置時間12時間の濃度で、
好ましくは、C0は0ではない。）
から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前述の非植物標的遺伝子は、ウイルス遺伝子である。
もう一つの好適な例において、工程（a）では、前述miRNAのフレッシュな植物における存在度の高い順で、第5位以降、好ましくは第10位以降の種類である。
【００２５】
本発明の第十一は、組成物を製造する方法であって、
本発明の第十に係る方法によって選別された抗ウイルス活性成分の候補物質である、植物機能性microRNA分子を人工的に合成する工程と、
前述の植物機能性microRNA分子を薬学的にもしくは食品学的に許容される担体と混合し、前述の組成物を調製する工程と、
を含む方法を提供する。
【００２６】
本発明の第十二は、MIR2911の存在度を向上させる方法であって、
（a）植物機能性microRNAを含む抽出物であって、前述の植物機能性microRNAはn種類のmicroRNAを含み、nは≧2（好ましくは≧5または≧10）の正整数で、且つそのうちの一種類のmicroRNAはMIR2911である抽出物を提供する工程と、
（b）前述抽出物を熟成処理（例えば静置）し、熟成した抽出物を得、且つ前述熟成した抽出物におけるMIR2911の存在度を測定し、所定値と比較し、且つMIR2911の存在度≧所定値の場合、熟成処理を中止し、MIR2911の存在度が上がった抽出物を得る工程と、
を含む方法を提供する。
【００２７】
もう一つの好適な例において、前述の抽出物は、水抽出物またはアルコール抽出物である。
もう一つの好適な例において、前述の熟成処理は、20〜50℃で、2時間〜10日静置することである。
もう一つの好適な例において、前述の方法は、さらに、得られたMIR2911の存在度が上がった抽出物を製薬に使用する、あるいは低温（例えば0℃〜-4℃またはより低い温度）で保存することを含む。
もう一つの好適な例において、前述の所定値は、60％、70％、80％、90％、95％、または99％である。
【００２８】
もう一つの好ましい例において、前述の存在度は、下述式で計算される。
【数１】
2015526080.tif 000003
（式中で、S1はMIR2911の量（または濃度）で、i=1〜n、Siは第i種類のmicroRNAの量（または濃度）で、ここで、microRNAは長さ18〜26ntのRNAである。）
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上述の各技術特徴および下述（例えば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好ましい技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図1は、植物microRNAのスイカズラの水抽出液におけるSolexa配列決定の結果を示す。
【図２Ａ】図2Aは、マウスにスイカズラの水抽出液を胃内注入した後、スイカズラのmicroRNAの異なる時点における血清中発現量のReal-time PCRの結果である。検出時点は、0 h（0時間）、2 h（2時間）、4 h（4時間）、6 h（6時間）である。
【図２Ｂ】図2Bは、マウスにスイカズラの水抽出液を胃内注入した後、スイカズラのmicroRNAの異なる時点における肝臓・肺中発現量のReal-time PCRの結果である。検出時点は、0 h（0時間）、5 h（5時間）、10 h（10時間）、15 h（15時間）、20 h（20時間）、25 h（25時間）である。
【００３０】
【図３】図3は、MIR2911予想標的遺伝子の配列分析の結果を示す。mfeは、候補標的遺伝子の最小フォールディング自由エネルギーを表し、mfeの絶対値が大きいほど、候補標的遺伝子とPeu-MIR2911の配列マッチ度が高い。
【図４】図4は、ルシフェラーゼによって予想標的遺伝子を測定した結果を示す。予想遺伝子は、ADV遺伝子、HPIV遺伝子、H1N1遺伝子、H5N1遺伝子を含む。
【図５Ａ】図5Aは、Real-time PCR技術によって測定されたウイルス遺伝子ADV5のMDCK細胞における含有量である。図5A、図5Bおよび図5Cでは、「未感染」とはインフルエンザウイルスに感染していない細胞で、「感染未処理」とはインフルエンザウイルスに感染したが、どんな薬物処理もされていない細胞で、「MIR2911」とはインフルエンザウイルスに感染し、且つMIR2911で処理された細胞で、「NC」とはインフルエンザウイルスに感染し、且つMIR2911の非コード配列RNAで処理された細胞で、「タミフル」とは、インフルエンザウイルスに感染し、且つタミフル（オセルタミビル、特異性インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害薬）で処理された細胞である。
【図５Ｂ】図5Bは、Real-time PCR技術によって測定されたウイルス遺伝子H1N1のMDCK細胞における含有量である。図5A、図5Bおよび図5Cでは、「未感染」とはインフルエンザウイルスに感染していない細胞で、「感染未処理」とはインフルエンザウイルスに感染したが、どんな薬物処理もされていない細胞で、「MIR2911」とはインフルエンザウイルスに感染し、且つMIR2911で処理された細胞で、「NC」とはインフルエンザウイルスに感染し、且つMIR2911の非コード配列RNAで処理された細胞で、「タミフル」とは、インフルエンザウイルスに感染し、且つタミフル（オセルタミビル、特異性インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害薬）で処理された細胞である。
【図５Ｃ】図5Cは、Real-time PCR技術によって測定されたウイルス遺伝子H5N1のMDCK細胞における含有量である。図5A、図5Bおよび図5Cでは、「未感染」とはインフルエンザウイルスに感染していない細胞で、「感染未処理」とはインフルエンザウイルスに感染したが、どんな薬物処理もされていない細胞で、「MIR2911」とはインフルエンザウイルスに感染し、且つMIR2911で処理された細胞で、「NC」とはインフルエンザウイルスに感染し、且つMIR2911の非コード配列RNAで処理された細胞で、「タミフル」とは、インフルエンザウイルスに感染し、且つタミフル（オセルタミビル、特異性インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害薬）で処理された細胞である。
【００３１】
【図６】図6は、MIR2911のMIR2911をトランスフェクトされたHEK 293T細胞に分泌されたMIR2911を担持した細胞微粒子におけるReal-time PCRの結果を示す。MIR2911をトランスフェクトされていないHEK 293T細胞に分泌された細胞微粒子を対照MVとする。
【図７Ａ】図7Aは、インフルエンザウイルスADVのMIR2911を担持した細胞微粒子で処理されたHEK 293T細胞における発現量である。図7Aおよび図7Bでは、インフルエンザウイルスに感染した後処理されなかったものをブランクと、MIR2911を担持していない細胞微粒子で処理されたHEK 293T細胞を陰性対照とする。
【図７Ｂ】図7Bは、インフルエンザウイルスH1N1のMIR2911を担持した細胞微粒子で処理されたHEK 293T細胞における発現量である。図7Aおよび図7Bでは、インフルエンザウイルスに感染した後処理されなかったものをブランクと、MIR2911を担持していない細胞微粒子で処理されたHEK 293T細胞を陰性対照とする。
【００３２】
【図８Ａ】図8Aは、マウスがスイカズラ水抽出液、スイカズラ水抽出液+anti-MIR2911を飲んだ（経口投与群）後、スイカズラ水抽出液+anti-MIR2911を肺内注入した（肺内注入群）後、インフルエンザウイルスADVの肺における発現のReal-time PCRの結果を示す。
【図８Ｂ】図8Bは、マウスがスイカズラ水抽出液、スイカズラ水抽出液+anti-MIR2911を飲んだ（経口投与群）後、スイカズラ水抽出液+anti-MIR2911を肺内注入した（肺内注入群）後、インフルエンザウイルスH1N1の肺における発現のReal-time PCRの結果を示す。
【図９】図9は、スイカズラ水抽出液を服用した後、ヒト血液におけるMIR2911のReal-time PCRの結果を示す。検出時点は、0 h（0時間）、1 h（1時間）、2 h（2時間）、3 h（3時間）、4 h（4時間）、5 h（5時間）、6 h（6時間）である。
【００３３】
【図１０】図10は、植物miRNAsのフレッシュなスイカズラにおけるSolexa配列決定の結果を示す。
【図１１】図11は、植物miRNAsのスイカズラ水抽出液におけるSolexa配列決定の結果を示す。
【図１２】図12は、スイカズラ水抽出液におけるMIR2911または合成されたMIR2911のReal-time PCRの結果を示す。
【図１３】図13は、MIR2911またはMIR167の血清または水における発現量のReal-time PCRの結果を示す。
【００３４】
【図１４Ａ】図14Aは、マウスに合成されたMIR2911を胃内注入した後、MIR2911の異なる時点における血清中発現量のReal-time PCRの結果を示す。検出時点は、0 h（0時間）、0.5 h（0.5時間）、1 h（1時間）、3 h（3時間）、6 h（6時間）、12 h（12時間）、24 h（24時間）である。
【図１４Ｂ】図14Bは、マウスにスイカズラ水抽出液を胃内注入した後、MIR2911の器官における分布を示す。
【図１５】図15は、MIR2911予想標的遺伝子の配列分析の結果を示す。mfeは、候補標的遺伝子の最小フォールディング自由エネルギーを表し、mfeの絶対値が大きいほど、候補標的遺伝子とPeu-MIR2911の配列マッチ度が高い。
【００３５】
【図１６】図16は、ルシフェラーゼによって予想標的遺伝子を測定した結果を示す。予想遺伝子は、H3N2遺伝子、H71N9遺伝子、H1N1遺伝子、H5N1遺伝子を含む。
【図１７】図17は、MIR2911をAGO2複合体と結合させてMDCK細胞に導入した後、MIR2911のMDCK細胞におけるReal-time PCRの結果を示す。
【図１８】図18は、インフルエンザウイルスH1N1のMIR2911とAGO2複合体でトランスフェクトされたMDCK細胞におけるウイルスの力価を示す。
【図１９】図19は、インフルエンザウイルスH5N1のMIR2911とAGO2複合体でトランスフェクトされたMDCK細胞におけるウイルスの力価を示す。
【図２０】図20は、インフルエンザウイルスH7N9のMIR2911とAGO2複合体でトランスフェクトされたMDCK細胞におけるウイルスの力価を示す。
【００３６】
【図２１】図21は、H1N1ウイルスに感染したマウスがMIR2911溶液を飲んだ後、異なる時点における肺部のウイルス力価EID50の変化を示す。
【図２２】図22は、H1N1ウイルスに感染したマウスがスイカズラ煎じ薬+anti-MIR2911溶液を飲んだ後、異なる時点における肺部のウイルス力価EID50の変化を示す。
【図２３】図23は、H1N1ウイルスに感染したマウスがMIR2911溶液を飲んだ後、異なる時点における肺部のウイルス力価EID50の変化を示す。
【図２４】図24は、H1N1ウイルスに感染したマウスがスイカズラ煎じ薬+anti-MIR2911溶液を飲んだ後、異なる時点における肺部のウイルス力価EID50の変化を示す。
【図２５】図25は、フレッシュなスイカズラ、乾燥スイカズラ、マウス餌料におけるMIR2911のReal-time PCRの結果を示す。
【００３７】
具体的な実施形態
本発明者らは、長期間の深い研究を経て、植物抽出物に安定して存在する分離可能な植物内在性microRNAまたは前述microRNAを含む植物抽出物は、動物体内における前述内在性microRNAの標的遺伝子の発現の調節に、さらに動物の生理・病理的活動の調節に使用することができることを意外に見出した。そのため、薬物または機能性食品などの製造に使用することができる。これに基づき、本発明者らが本発明を完成した。
【００３８】
本発明者らは、さらに、MIR2911などのmicroRNAの種類は、尋常ではない高安定性を有し（通常のmicroRNAよりも遥かに高い）、長期間に安定して存在することが可能であるため、特に活性成分として薬物や他の製品に使用することに好適であることを見出した。
ここで用いられるように、「osa」はイネを、「peu」はコトカケヤナギを表す。
【００３９】
分離された植物機能性microRNA
本発明に係る植物機能性microRNAは、前述植物内在性のmicroRNAで、当該植物の水溶性および/または脂溶性の抽出物に安定して存在することが可能である。前述の植物機能性microRNAは、前述植物の水溶性および/または脂溶性の抽出物に豊富に含まれるmicroRNAの種類（例えば存在度が上位20位、好ましくは上位10位のmicroRNAの種類）であることが好適である。また、本発明のmicroRNAは、例えばpri-microRNA、pre-microRNAやmicroRNA成熟体など、種々の様態を含む。
【００４０】
前述植物機能性microRNAの例は、表1から選ばれる一種または複数種のmicroRNA、特にMIR156h、MIR166f、MIR396a、MIR166a、MIR168a、MIR1440、MIR2910、MIR2911、MIR2915、MIR2916から選ばれる一種または複数種を含むが、これらに限定されない。
もう一つの好適な例において、前述の植物は、薬用植物、果物や野菜の植物、鑑賞植物、より好ましくは、スイカズラ、タイセイ、チンタイ、リュウキュウアイ、コトカケヤナギ、ササゲ、ワタ、ハクサイまたはバレイショを含み、さらに好ましくは、前述植物は、スイカズラ、タイセイ、チンタイ、リュウキュウアイまたはコトカケヤナギで、最も好ましくは、前述植物は、スイカズラである。
本発明に係る前述植物機能性microRNAを含む抽出物は、植物の水溶性および/または脂溶性の抽出物、例えば植物の枝、葉、根、花、実および/または茎の抽出物を含む。
【００４１】
抽出方法（植物抽出物の製造方法）
本発明に係る植物microRNAの抽出方法は、主に溶媒抽出法を使用し、即ち、溶媒で植物からそのmicroRNAを抽出する。ここで、前述の溶媒は、水、親水性溶媒、またはその組み合わせを含む。前述組み合わせは、水に適量の親水性溶媒を入れたものまたは親水性溶媒に適量の水を入れたものを含む。もちろん、溶媒には、さらに適量の助剤、例えばpH調整剤（例えば酸または塩基）などを添加してもよい。
【００４２】
抽出は、任意の適切な温度（例えば常温〜溶媒の還流温度）で行われ、好ましくは浸漬法、浸出法、煎出法、還流抽出法、連続抽出法などを使用する。
抽出の過程において、植物に対して例えば粉砕や酵素処理（例えばセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、中性プロテアーゼ、パパイン、グルカナーゼや酵素複合体）などの前処理を行ってもよい。抽出された混合物を後処理し、例えば植物を水で抽出した後、抽出された混合物に親水性溶媒（例えばエタノールなど）を入れ、混合物を熟成して沈殿させてもよい。
抽出された液体物は、そのまま使用してもよく、ろ過、濃縮、乾燥（例えば凍結乾燥）などの処理をして固形物を得た後使用してもよい。
【００４３】
本発明に係る植物microRNAの抽出方法は、水抽出法であることが好ましい。
例えば、適量のスイカズラを取り、粉砕後、所定温度（例えば室温〜還流）で、スイカズラ粉末を水浴で数回加熱し（例えば1〜5回）、毎回温度を所定時間で維持し（例えば0.1〜10時間）、液体を収集し、使用に備える工程を含む。
あるいは、適量のスイカズラを取り、粉砕後、所定温度（例えば室温〜還流）で、スイカズラ粉末を水浴で数回加熱し（例えば1〜5回）、毎回温度を所定時間で維持し（例えば0.1〜10時間）、抽出液を所定体積に濃縮した後、適量のエタノールを入れ、粘液質の大半が沈殿し、ろ過し、ろ液を収集し、使用に備える工程を含む。
【００４４】
測定
植物を抽出した後、植物抽出物を収集し、抽出物における植物microRNAの種類およびその含有量を測定する。使用される測定方法は、本分野の通常の方法、例えば、Solexa配列決定技術、Real-time PCR、RT-PCR、マイクロアレイチップ、インサイチューハイブリダイゼーション、Northern Blotting、等温ローリングサークル増幅、共役重合物に基づいたmicroRNA測定などにでもよいが、これらに限定されない。
【００４５】
前述Solexa配列決定技術は、
スイカズラの組織または煎じ薬のサンプルを収集する工程と、
Trizol試薬でサンプルの全RNAを抽出する工程と、
PAGE電気泳動を行って17〜27ntのRNA分子を回収する工程と、
アダプタープライマー(adaptor primer)を小分子RNAの3'と5'末端に酵素結合させる工程と、
精製したDNAをそのままクラスター形成に使用し、Illumina Genome Analyzerで配列決定分析を行う工程と、
を含むことが好ましい。
【００４６】
Real-time PCR方法は、
サンプルにおける全RNAを抽出し、RNA逆転写反応によってcDNAサンプルを得る工程と、
植物microRNAでプライマーを設計する工程と、
TaqManプローブまたは蛍光色素を入れてPCR反応を行う工程と、
サンプルにおける植物microRNAの量の変化を測定する工程と、
を含むことが好ましい。
【００４７】
同定
本発明は、植物機能性microRNAの同定方法であって、前述植物機能性microRNAは、非植物標的遺伝子を調節機能を有し、
（1）ある植物（薬用植物、果物や野菜の植物を含む）の抽出物を提供する工程と、
（2）前述抽出物における植物内在性microRNAの種類またはレベルを測定する工程と、
（3）測定された植物microRNAの配列を非植物標的遺伝子と比較して分析し、非植物標的遺伝子を調節機能を有する植物機能性microRNAを同定する工程と、
を含む方法を提供する。
【００４８】
もう一つの好適な例において、前述の非植物標的遺伝子は、遺伝子データベースにおける遺伝子を含む。前述の非植物標的遺伝子は、細菌遺伝子、ウイルス遺伝子、クラミジア遺伝子、酵母遺伝子、動物遺伝子を含み、あるいは前述の非植物標的遺伝子は、病原体の遺伝子であることが好適である。
もう一つの好適な例において、工程（3）では、抽出物における存在度が上位20位（好ましくは上位10位）のmicroRNAの種類を選択し、比較と分析を行う。
もう一つの好適な例において、工程（3）では、Lm/La比≧130％（好ましくは≧150％、より好ましくは200％）のmicroRNAの種類を選択し、比較と分析を行い、ここで、Lmはある植物のmicroRNAの抽出物における存在度（またはレベル）で、Laは前述植物の全microRNAの平均存在度（またはレベル）である。
前述方法によって同定された植物機能性microRNA分子は、MIR2911を含む。
【００４９】
用途
本発明に係る植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む植物抽出物は、以下のような多くの応用を有する。
一．機能性組成物の開発または製造の指導
本発明に係る組成物の活性成分は、前述植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む植物抽出物である。ここで、前述の植物機能性microRNA（例えばMIR2911など）は、非植物標的遺伝子を調節する機能を有する。（a）非植物標的遺伝子を調節する組成物の製造、あるいは（b）非植物標的遺伝子関連疾患を治療する薬物の製造に使用することができる。ここで、前述の調節は、標的遺伝子の発現に対する抑制（下方調節）、標的遺伝子の発現に対する促進（上方調節）を含む。
【００５０】
もう一つの好適な例において、前述の非植物標的遺伝子は、細菌遺伝子、ウイルス遺伝子、クラミジア遺伝子、酵母遺伝子、動物遺伝子を含み、あるいは前述の非植物標的遺伝子は、病原体（細菌、ウイルス、クラミジアなどを含む）の遺伝子である。
もう一つの好適な例において、前述非植物標的遺伝子関連疾患は、腫瘍（例えば肝臓癌、肺癌）、急性・慢性伝染病（例えばウイルス性インフルエンザ、ウイルス性肝炎、エイズ、SARSなどのウイルス性疾患、例えば結核、細菌性肺炎などの細菌性疾患、および病原微生物による急性・慢性伝染病）、他の急性・慢性疾患（例えば呼吸系疾患、免疫系疾患、血液・造血系疾患、例えば心脳血管疾患などの循環系疾患、内分泌系代謝性疾患、消化系疾患、神経系疾患、泌尿系疾患、生殖系疾患および運動系疾患）を含む。
【００５１】
組成物
本発明に係る組成物（薬物組成物、食品組成物または健康食品組成物）は、（a）薬学的に許容される担体または食品学的に許容される担体と、（b）活性成分とを含んでもよい。
前述の組成物は、成分（a）および成分（b）で構成され、あるいはほとんど成分（a）および成分（b）で構成されることが好適である。
もう一つの好適な例において、成分（b）の含有量は、組成物の全重量の0.01〜99wt％、好ましくは0.1〜90wt％である（microRNAで計算する）。
前述組成物の製造方法は、前述植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む植物抽出物を薬学的にもしくは食品学的に許容される担体と混合し、前述の組成物を調製する工程を含む。
【００５２】
薬物組成物を例として、組成物をさらに説明するが、本発明の医薬品組成物は、安全有効量の範囲内の活性成分と薬理的に許容される賦形剤または担体を含む。ここで、「安全有効量」とは、活性成分の量が病状の顕著な改善に十分で、重度な副作用が生じないことを指す。通常、薬物組成物は、1単位製剤あたりに、1〜2000mg、好ましくは10〜200mgの活性成分を含む。あるいは、1単位製剤あたりに、0.01〜100μmol、好ましくは0.1〜10μmolの活性成分を含む。好ましくは、前述「1単位製剤」は、1単位の経口投与液である。
【００５３】
「薬学的に許容される担体」とは、ヒトに適用でき、且つ十分な純度および十分に低い毒性を持たなければならない、一種または複数種の相溶性固体または液体フィラーまたはゲル物質を指す。ここで、「相溶性」とは、組成物における各成分が本発明の化合物と、またそれら同士の間で配合することができ、化合物の効果を顕著に低下させないことを指す。薬学的に許容される担体の一部の例として、セルロースおよびその誘導体(例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースナトリウム、セルロースアセテートなど)、ゼラチン、タルク、固体潤滑剤(例えばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム)、硫酸カルシウム、植物油(例えば大豆油、ゴマ油、落花生油、オリーブオイルなど)、多価アルコール(例えばプロピレングリコール、グリセリン、マンニトール、ソルビトールなど)、乳化剤(例えばツイン（登録商標）)、湿潤剤(例えばドデシル硫酸ナトリウム)、着色剤、調味剤、安定剤、酸化防止剤、防腐剤、発熱性物質除去蒸留水などがある。
【００５４】
本発明組成物の投与形態は、経口、気道、注射、経皮、粘膜または管腔による投与を含む。
本発明組成物の剤形は、錠剤、カプセル剤、粉末剤、丸剤、顆粒剤、シロップ剤、溶液、懸濁液、乳剤、懸濁剤、噴霧剤、エアゾール剤、粉末吸入剤、揮発性液体、注射液、注射用粉末剤、外用溶液剤、ローション剤、ポアオン剤、リニメント剤、パップ剤、膏薬、絆創膏剤、軟膏剤、硬膏剤、ペースト剤、点眼剤、点鼻剤、眼科用軟膏剤、うがい剤、トローチ剤または坐剤を含む。
好ましくは、本発明は、ウイルス性感冒を治療する薬物の製造のためのmicroRNA分子MIR2911またはMIR2911を含む抽出物の用途を提供する。前述の抽出物（未濃縮または濃縮）には、0.01〜100nM（好ましくは0.1〜20nM）のMIR2911を含むことが好適である。
【００５５】
二．植物機能性microRNAの人工合成の指導
本発明に係る方法によって同定された植物（特に植物抽出物）に存在する植物機能性microRNAは、技術者に直接前述microRNAの人工合成の指導を与えることができるため、前述のmicroRNAの生産を向上させる。そして、合成された植物機能性microRNA分子を薬学的にもしくは食品学的に許容される担体と混合し、前述の組成物を調製する。
microRNAの人工合成方法は、本分野の技術者が熟知する方法でもよい。例えば、MIR2911の人工合成は、以下の方法が好ましい。
【００５６】
1．MIR2911の化学合成方法は、以下の具体的な工程を含む。
（1）4種類のデオキシヌクレオシド（デオキシアデノシンdA、デオキシグアノシンdG、デオキシシチジンdC、チミジンdT）のメトキシジイソプロピルアミノホスフィン単量体を調製する。
（2）で活性化した後、デオキシヌクレオシドを保護して担体相と連結させる。
（3）固定相ホスホラミダイト法によって、担体に一つずつヌクレオチドを伸長させ、MIR2911を合成する。
【００５７】
2．他のMIR2911の合成方法は、以下の具体的な工程を含む。
（1）MIR2911のプライマーの設計・合成：
MIR2911の鋳型プラスミド配列に基づいて二つの汎用プライマーA、Bを合成し、MIR2911の配列に沿って4つの特異的なオリゴヌクレオチドプライマー配列(I、II、III、IV)を設計する。
（2）一回目のPCR増幅
MIR2911を含むプラスミドを鋳型とし、それぞれAとIV、IIIとII、IとBをプライマー対としてPCR増幅を行い、PCR反応の条件は、95℃、2分間×1サイクル→95℃、30秒、55℃、30秒、72℃、40秒×24サイクル→72℃、7分間である。それぞれ産物1、産物2、産物3を得る。
（3）二回目のPCR増幅
一回目のPCR増幅で得られた産物1、産物2、産物3を鋳型とし、AとBをプライマーとしてPCR増幅を行い、PCR反応の条件は、95℃、2分間×1サイクル→95℃、30秒、55℃、30秒、72℃、1分30秒×24サイクル→72℃、7分間で、PCR産物をアガロペクチンで回収し、合成されたMIR2911を得る。
（4）合成されたMIR2911をメチル化し、安定したメチル化産物のMIR2911を形成する。
【００５８】
三．非植物標的遺伝子の発現の体外での非治療的な調節
本発明に係る分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む抽出物の存在下で、非植物標的遺伝子（例えば細菌遺伝子、ウイルス遺伝子、クラミジア遺伝子、酵母遺伝子、動物遺伝子）を含む生物材料（ウイルス、細胞、組織を含む）を培養し、前述非植物標的遺伝子の発現の調節を実現させる。
もう一つの好適な例において、前述の標的遺伝子は、病原体（細菌、ウイルス、クラミジアなどを含む）の遺伝子である。
もう一つの好適な例において、前述の植物機能性microRNAは、薬用植物、果物や野菜の植物、鑑賞植物から選ばれる植物由来のもので、好ましくはスイカズラ、タイセイ、チンタイ、リュウキュウアイまたはコトカケヤナギ由来のもので、より好ましくは、前述植物機能性microRNAは、MIR2911を含む。
【００５９】
四．疾患を予防・治療する方法
必要な対象（例えば哺乳動物またはヒト）に本発明に係る分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む抽出物、あるいは本発明に係る組成物を投与し、非植物標的遺伝子に関連する疾患の予防または治療を実現させ、ここで、前述の植物機能性microRNAは、非植物標的遺伝子（細菌遺伝子、ウイルス遺伝子、クラミジア遺伝子、酵母遺伝子、動物遺伝子を含む）を調節する機能を有する。
もう一つの好適な例において、前述の非植物標的遺伝子は、病原体の遺伝子である。
【００６０】
本発明者らは、植物機能性microRNAおよびその動物体内に入った後の存在形態、デリバリー経路と機能などに対する一連の研究を通じ、1．効率的に安定して植物機能性microRNAを抽出する方法を確立し、植物機能性microRNAを含む植物抽出物を提供した。2．多くの経路（例えば摂食または静脈注射など）で、植物（例えばスイカズラなど）機能性microRNAが動物体内に入って血液に蓄積し、且つ非植物標的遺伝子を調節し、そして動物体（例えばヒト）の生理・病理的活動に関与することができることを見出した。3．植物機能性microRNAを同定する方法を確立し、選択的に植物機能性microRNAを合成する方法の指導に用いられ、当該microRNAの生産の向上に有利である。
【００６１】
さらに、植物機能性microRNAを豊富に含有する薬材の選別の指導に用いられ、薬材の優劣の選別に有利である。4．機能性食品または薬物の製造を指導する方法を確立した。4.1 前述方法は、分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む植物抽出物または選別された植物機能性microRNAを豊富に含有する植物を利用し、機能性食品または薬物などの組成物の製造に有用である。4.2 前述方法は、植物microRNAを抽出して植物機能性microRNAを同定し、且つ前述植物機能性microRNAの人工合成を行い、さらに人工的に合成されたmicroRNAを機能性食品または薬物の製造に使用する。
【００６２】
本発明の主な利点は以下の通りである。
1．分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む植物抽出物およびその用途を提供する。前述microRNAは、非植物標的遺伝子の発現を調節することができ、多くの用途がある（例えば生薬の有効成分の基準として、機能性組成物の開発と製造などに有利である）。
2．分離された植物機能性microRNAまたは前述植物機能性microRNAを含む植物抽出物を活性成分とする組成物を提供する。前述活性成分の作用機序は明確で、効果が顕著で、中医学の科学的機序の探求に有利で、且つ製造方法が簡単で、コストが低く、工業化生産に適する。
3．植物機能性microRNAを同定する方法を提供する。
【００６３】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下述実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、例えばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に断らない限り、％と部は、重量で計算される。
【００６４】
実施例1  Solexa配列決定技術によるスイカズラ水抽出液に安定して存在する植物microRNAの測定
まず、水抽出法でスイカズラのmicroRNAを抽出した。適量（50g）の乾燥スイカズラ薬材を取り、500 ml（スイカズラの質量と水の体積の比が1：10）の水の100℃水浴で0.5時間加熱し、抽出液を60℃で減圧で元の体積の1/10に濃縮した。濃縮および未濃縮のスイカズラ水抽出液を収集し、後の実験に使用した。
次に、Solexa配列決定技術で上述工程で調製されたスイカズラ水抽出液に安定して存在する植物microRNAを測定し、Solexaの仕込量は10 μgのRNAであった。測定したところ、未濃縮の水抽出液における全microRNAの濃度が約1 nMで、濃縮の水抽出液における全microRNAの濃度が約10 nMであった。
【００６５】
測定結果から、スイカズラ水抽出液に数種類の植物microRNAが安定して存在することが示され、測定できたものは表1に示された85種類のmicroRNAを含み、その具体的な配列を表1に示す。ここで、MIR156h、MIR166f、MIR396a、MIR166a、MIR168a、MIR1440、MIR2910、MIR2911、MIR2915、MIR2916の含有量が比較的に高く、MIR2911の含有量が一番高かった。具体的な結果を図1に示す。表1では、他の75種類のmiRNAは、抽出物に測定されたコピー数がいずれも低かった（いずれも2〜1000の間にある）。
【００６６】
【表１−１】
2015526080.tif 000004
【００６７】
【表１−２】
2015526080.tif 000005
【００６８】
【表１−３】
2015526080.tif 000006
【００６９】
実施例2  Real-time PCR方法による摂食で動物体内に入って且つ安定して存在するスイカズラmicroRNAの測定
本実施例では、スイカズラmicroRNAは、摂食で動物体内に入って、且つ安定して存在することが可能であることが証明された。
マウスにスイカズラ水抽出液（実施例1で調製された濃縮水抽出液）を胃内注入し、スイカズラmicroRNAの血清、肝臓および肺における発現レベルを測定した。
具体的な工程は、まず、マウスを12時間禁食させた後、マウスに10 ml/kgマウス体重のスイカズラ濃縮水抽出液を胃内注入し、Real-time PCRによって0 h（0時間）、2 h（2時間）、4 h（4時間）、6 h（6時間）などで、スイカズラmicroRNAのMIR2911のマウスの血清、肝臓および肺における発現レベルを測定した。
【００７０】
Real-time PCRによるMIR2911の測定に用いられたプライマーの配列は、以下の通りである。
フォワードプライマー：ACACTCCAGCTGGGGGCCGGGGGACGGG (配列番号：86)、
リバースプライマー：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCCCAGCC (配列番号：87)、
プローブ配列：TCCCAGCCCGTCCCCCGGCC (配列番号：88)。
【００７１】
具体的な結果を図2Aと図2Bに示す。
図2Aは、マウスにスイカズラの水抽出液を胃内注入した後、異なる時点におけるスイカズラmicroRNAの血清中発現量のReal-time PCRの結果である。結果から、マウスにスイカズラ水抽出液を胃内注入した後、血清におけるMIR2911の含有量が顕著に増加したことがわかる。スイカズラ水抽出液を胃内注入して1.5時間後、血清におけるMIR2911の含有量が最高値になり、6時間後、血清におけるMIR2911の含有量が最初のレベルに降下した。
図2Bは、マウスにスイカズラの水抽出液を胃内注入した後、異なる時点におけるスイカズラmicroRNAの肝臓・肺中発現量のReal-time PCRの結果である。結果から、マウスにスイカズラ水抽出液を胃内注入した後、MIR2911の肝臓・肺における発現レベルが向上したことがわかる。マウスにスイカズラ水抽出液を胃内注入して6時間後、MIR2911の肝臓における発現が最大値になり、スイカズラ水抽出液を胃内注入して12時間後、MIR2911の肺における発現が最大値になった。
結果から、スイカズラmicroRNAは、摂食で動物体内に入って、且つ安定して存在することが可能であることが示された。
【００７２】
実施例3  スイカズラmicroRNAは生理・病理的活動を調節することができる
本実施例では、スイカズラmicroRNAは動物体内における生理・病理的活動を調節することができることが証明された。
3.1  生命情報学によるスイカズラmicroRNAの標的遺伝子の予想
生命情報学によってMIR2911配列とマッチする気道伝染病ウイルスのゲノムにおける数個の標的遺伝子を予想した。具体的な結果を図3に示す。図3は、MIR2911予想標的遺伝子の配列分析の結果である。mfeは、候補標的遺伝子の最小フォールディング自由エネルギーを表し、mfeの絶対値が大きいほど、候補標的遺伝子とPeu-MIR2911の配列マッチ度が高い。結果から、ADV遺伝子、HPIV1遺伝子、H1N1遺伝子、H5N1遺伝子はスイカズラmicroRNAの潜在の標的遺伝子であることが示された。
【００７３】
3.2  ルシフェラーゼ測定方法によって標的遺伝子を検証した。具体的な工程は以下の通りである。
（1）予想されたMIR2911標的遺伝子配列の特定の断片をルシフェラーゼ発現プラスミドの3'-UTR領域に挿入したものを構築した。
（2）陽性クローンを選別し、配列決定を行い、クローンを増幅してプラスミドを精製し、使用に備えた。
（3）予想された標的遺伝子のプラスミドを増幅し、精製して使用に備え、同時に相応のブランクのプラスミドを準備し、精製して使用に備えた。
（4）関連細胞を培養し、且つ24ウェルプレートに接種し、10〜24時間生長させた。
【００７４】
（5）測定しようとする予想標的遺伝子を担持したルシフェラーゼ発現プラスミドをMIR2911と細胞にコトランスフェクトした。
（6）ルシフェラーゼ基質を入れ、ルシフェラーゼが基質と反応し、フルオレセインが生成し、蛍光の強度を測定することによってルシフェラーゼの活性を測定した。
（7）ブランク（NC）と比較し、予想標的がMIR2911に抑制されたか判断した。
具体的な結果を図4に示す。図4は、ルシフェラーゼによって予想標的遺伝子を測定した結果である。NC（即ち、等量のMIR2911のミスマッチ対照配列を含有するRNA）を対照とする。結果から、予想された標的遺伝子の大半が成熟MIR2911と結合し、二本鎖構造を形成することができたことが示された。これは、MIR2911は、ADV遺伝子、HPIV遺伝子、H1N1遺伝子、H5N1遺伝子などの遺伝子を結合によって調節作用を果たすことができることを示唆した。
【００７５】
3.3  メイディン・ダービー・イヌ腎臓（MDCK）細胞におけるMIR2911のウイルス遺伝子ADV、H1N1、H5N1に対する影響を測定した。具体的な工程は以下の通りである。
（1）24ウェル細胞培養プレートにおいてMDCK細胞を培養した。
（2）MIR2911（20 pmol/106細胞）を市販トランスフェクション試薬lipofectamine2000でMDCK細胞にトランスフェクトし（MIR2911群）、同時にMIR2911の非コード配列RNAを同じ量でMDCK細胞にトランスフェクトして対照（NC）とし、且つ陽性薬物（タミフル）を使用した。
（3）H1N1、H5N1およびアデノウイルスADVを感染多重度（MOI）が0.001の条件で上述細胞を感染させた。
（4）ウイルス感染の24時間後、real-time PCRによって細胞におけるウイルス遺伝子ADV、H1N1、H5N1の含有量を測定し、対照群と比較し、MiR2911がウイルス複製に対して抑制作用があるかどうか判断した。
【００７６】
ウイルス遺伝子測定の具体的な工程は、細胞を消化して収集した後、PBS緩衝液で3回洗浄し、タンパク質変性試薬で全RNAを抽出し、そしてreal-time PCR方法でウイルスマーカーのPB1 mRNAの含有量を測定し、標準曲線と対照し、ウイルスの含有量を計算した。
具体的な結果を図5A、図5Bおよび図5Cに示す。図5Aは、Real-Time PCR技術によって測定されたウイルス遺伝子ADVのMDCK細胞における含有量である。図5Bは、Real-Time PCR技術によって測定されたウイルス遺伝子H1N1のMDCK細胞における含有量である。図5Cは、Real-Time PCR技術によって測定されたウイルス遺伝子H5N1のMDCK細胞における含有量である。結果から、MIR2911はADV5、H1N1およびH5N1に対して顕著な抑制および遮断作用を有することが示された。
【００７７】
実施例4  スイカズラmicroRNAが腸管上皮細胞Caco-2の細胞微粒子（MVs）を通じて他の細胞に入り、且つ他の細胞内で調節作用を発揮する
本実施例では、スイカズラmicroRNAが腸管上皮細胞Caco-2の細胞微粒子に包まれて動物体に入り、且つ細胞微粒子でデリバリーされて他の細胞に入り、他の細胞の生理・病理状況に影響を与え、例えば感冒ウイルスを抑制することができることが証明された。
4.1  スイカズラmicroRNAを腸管上皮細胞Caco-2に導入した。具体的な工程は以下の通りである。
（1）腸管上皮細胞Caco-2を12ウェルプレートまたは10mmシャーレに接種し、一晩培養した。
（2）次の日にリポソーム2000を使用してトランスフェクトした。
（3）Caco-2細胞にMIR2911をトランスフェクトした。
（4）トランスフェクション後、細胞を24または48時間培養した後、Real-time PCR分析に使用した。
【００７８】
4.2  分画遠心法によって腸管上皮細胞Caco-2が放出した細胞微粒子を分離した。
（1）まず培養した腸管上皮細胞Caco-2を300 gで5分間遠心し、上清を取った。
（2）上清を1200 gで20分間遠心し、上清を取った。
（3）上清を10000 gで30分間遠心し、上清を取った。
（4）上清を110000 gで2時間遠心し、すべての操作は4℃で行われ、FBS-free媒質で沈殿を収集し、全細胞微粒子を得た。
【００７９】
4.3  Caco-2細胞が放出した細胞微粒子におけるMIR2911のレベルを測定した。
MIR2911がCaco-2細胞が放出した細胞微粒子に包まれたことが証明された。微粒子におけるRNAを抽出し、絶対定量real-time PCR技術によってその中のMIR2911の含有量を測定した。
【００８０】
4.4  MIR2911を担持した細胞微粒子を収集し、それでHEK 293T細胞を処理し、スイカズラmicroRNAが細胞微粒子にデリバリーされて他の細胞に入ることが証明された。
MIR2911を担持した細胞微粒子でHEK 293T細胞を処理した後、Real-time PCR実験によってMIR2911のHEK 293T細胞における発現レベルを測定した。Real-time PCR実験の具体的な工程は、実施例2に記載された通りである。
【００８１】
具体的な結果を図6に示す。図6は、MIR2911を担持したCaco-2細胞に分泌された細胞微粒子で処理された後、HEK 293T細胞に分泌された細胞微粒子におけるReal-time PCRの結果である。MIR2911を担持したCaco-2細胞に分泌された細胞微粒子（対照MV）で処理されていないHEK 293T細胞に分泌された細胞微粒子を対照とする。結果から、対照と比較すると、MIR2911のMIR2911を担持した細胞微粒子で処理されたHEK 293T細胞における発現が顕著に増加したことがわかる。
結果から、スイカズラmicroRNAは、Caco-2に分泌される細胞微粒子に包まれて動物体に入り、且つ他の細胞にデリバリーすることができることが示された。
【００８２】
4.5  スイカズラmicroRNAが細胞微粒子によってデリバリーされて他の細胞に入った後、細胞の生理/病理状況に対する影響
MIR2911を担持した細胞微粒子（調製方法は本実施例の4.2部分の分画遠心法と同様である）でインフルエンザウイルスADVまたはH1N1に感染されたHEK 293T細胞を処理した。具体的な工程は以下の通りである。
（1）24ウェルプレートにおいてHEK 293T細胞を培養した。
（2）本実施例の4.4部分で得られた微粒子を細胞培地に0.1 pmol MIR2911/106細胞で入れた。
（3）工程（2）の処理の6時間後、MOI=0.001の条件でアデノウイルスADVまたはH1N1感冒ウイルスに感染させた。
（4）ウイルス感染の24時間後、Real-time PCRによってウイルスの含有量を測定した。Real-time PCR方法によってHEK 293T細胞におけるインフルエンザウイルスADVまたはH1N1の含有量を測定した。具体的な工程は、実施例3に記載された通りである。
【００８３】
具体的な結果を図7に示す。図7Aは、インフルエンザウイルスADVのMIR2911を担持した細胞微粒子で処理されたHEK 293T細胞における発現量である。図7Bは、インフルエンザウイルスH1N1のMIR2911を担持した細胞微粒子で処理されたHEK 293T細胞における発現量である。図7Aおよび図7Bでは、インフルエンザウイルスに感染した後処理されなかったHEK 293T細胞（ブランク）とMIR2911を担持していない細胞微粒子（陰性対照）で処理されたHEK 293T細胞を対照とする。
結果から、MIR2911を担持した細胞微粒子で処理されたHEK 293T細胞において、インフルエンザウイルスADVおよびH1N1の発現が顕著に低下したことがわかる。結果から、MIR2911は、インフルエンザウイルスADVおよびH1N1に対して顕著な抑制作用を有することが示された。
本実施例では、スイカズラmicroRNAが経口投与などの経路によって動物体に入り、細胞微粒子にデリバリーされて他の細胞に入り、且つ細胞において作用を発揮し、例えば感冒ウイルスを抑制することができることが証明された。このように、スイカズラmicroRNAが経口投与などの経路によって動物の組織、器官に入り、且つ動物の生理・病理状況を調節することができる。
【００８４】
実施例5  スイカズラmicroRNAは動物体内で顕著に感冒ウイルスを抑制することができる
本実施例では、感冒ウイルスを抑制する有効成分は、ほかではなく、スイカズラmicroRNAであることが証明された。
マウスを自由に未濃縮スイカズラ水抽出液（実施例1で調製された）を3日飲ませた後、ADVまたはH1N1ウイルスを接種し、続いて未濃縮スイカズラ水抽出液を3日飲ませた後、real-time PCRによってマウス肺部のウイルス含有量を測定した。結果から、スイカズラの煎じ薬は、ADVおよびH1N1ウイルスの増殖に対して強い抑制作用を有することが示された。
ウイルス抑制作用を発揮するのがスイカズラmicroRNAのMIR2911であることを検証するため、以下の対照群を使用した。
【００８５】
1．マウスにスイカズラ水抽出液+anti-MIR2911（経口投与群）およびスイカズラ水抽出液+anti-MIR2911（肺内注入群）を含む、anti-MIR2911（使用量がMIR2911の使用量に相当する）を含有するスイカズラの煎じ薬を飲ませた。ここで、anti-MIR2911は、MIR2911のアンチセンス核酸で、MIR2911と完全に相補的である。
マウスの肺内注入の具体的な工程は以下の通りである。
（1）マウスを麻酔して固定し、クリーンベンチにセットした。
（2）頸部の毛を除去して消毒した。
（3）無菌条件で気管を露出させ、挿管して固定した。
（4）使い捨て注射器でスイカズラ水抽出液+anti-MIR2911を吸引して肺内に注入し、吸引と注入を繰り返した。
【００８６】
2．マウスにスイカズラの煎じ薬と等体積の純水を飲ませ、ブランク群とした。そして、Real-time PCR方法によって各群のマウスの肺部における感冒ウイルスADVまたはH1N1の含有量を測定した。
Real-time PCRによる感冒ウイルスADVの測定に用いられたプライマーの配列は、以下の通りである。
フォワードプライマー配列：5’-CAAAGACTTCTCATCGGTTGC-3’ (配列番号：89)、
リバースプライマー配列：5’-AATGCAACACTCGGTTCACA-3’ (配列番号：90)、
プローブ配列：TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA(配列番号：91)。
Real-time PCRによる感冒ウイルスH1N1の測定に用いられたプライマーの配列は、以下の通りである。
フォワードプライマー配列：5’-CCCAAAGTGAGGGATCAAGA-3’ (配列番号：92)、
リバースプライマー配列：5’-CCCTTGGGTGTCTGACAAGT-3’ (配列番号：93)、
プローブ配列：TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA(配列番号：94)。
【００８７】
具体的な結果を図8Aと図8Bに示す。
図8Aは、マウスにスイカズラ水抽出液、スイカズラ水抽出液+anti-MIR2911を飲ませた（経口投与群）後、スイカズラ水抽出液+anti-MIR2911を肺内注入した（肺内注入群）後、感冒ウイルスADVの肺における発現のReal-time PCRの結果である。
結果から、等体積の水を与えたマウスをブランクとし、スイカズラ水抽出液を飲ませた後、ADVのマウスの肺部における発現が顕著に低下したことがわかり、スイカズラmicroRNAが感冒ウイルスADVの発現を抑制することが示された。スイカズラ水抽出液を飲んだ群と比較すると、マウスにスイカズラ水抽出液+anti-MIR2911を飲ませた後、ADVのマウスの肺部における発現が増加し、anti-MIR2911がMIR2911の感冒ウイルスADVに対する抑制作用を破壊することが示された。結果から、スイカズラmicroRNAが直接の抗ウイルス作用を有することが示された。
図8Bは、マウスにスイカズラ水抽出液、スイカズラ水抽出液+anti-MIR2911を飲ませた（経口投与群）後、スイカズラ水抽出液+anti-MIR2911を肺内注入した（肺内注入群）後、感冒ウイルスH1N1の肺における発現のReal-time PCRの結果である。
【００８８】
結果から、純水を飲ませたブランク群のマウスと比較すると、スイカズラ水抽出液を飲ませたマウスの肺部におけるH1N1の発現が顕著に低下したことがわかり、スイカズラmicroRNAが感冒ウイルスH1N1の発現を抑制することが示された。一方、スイカズラ水抽出液+anti-MIR2911を飲ませた後、マウスの肺部におけるH1N1no発現が増加した。それは、、anti-MIR2911がMIR2911を破壊するためである。結果から、スイカズラmicroRNAが直接の抗ウイルス作用を有することが示された。
【００８９】
実施例6  スイカズラmicroRNAが消化管を通じて人体に入る
本実施例では、スイカズラmicroRNAが消化管を通じて人体に吸収され、循環系に入ることが証明された。
まず、乾燥スイカズラを水で30 min煮て1000 mlの水抽出液を調製し、MIR2911の水抽出液における含有量が約0.4 nmol/Lであった。そして、健康のボランティアを20名集め、それぞれ調製された水抽出液を1000 mlずつ飲ませ、0 h（0時間）、1 h（1時間）、2 h（2時間）、3 h（3時間）、4 h（4時間）、5 h（5時間）、6 h（6時間）でボランティアの血液を収集し、Real-time PCRによってその中のMIR2911の含有量を測定し、Real-time PCR実験の具体的な工程は実施例2に記載された通りである。
【００９０】
具体的な結果を図9に示す。図9は、スイカズラ水抽出液を服用した後、ヒト血液におけるMIR2911のReal-time PCRの結果である。結果から、スイカズラ水抽出液を服用した後、ヒット血液におけるMIR2911の含有量が顕著に増加したことがわかる。スイカズラ水抽出液を服用して1.5時間後、ヒト血液におけるMIR2911の含有量が最大値になり、3時間後、ヒト血液におけるMIR2911の含有量が最初のレベルに降下した。これらの結果は実施例2におけるマウスの実験結果と一致する（図2A）。結果から、スイカズラmicroRNAは、摂食で人体に入り、消化管に吸収され、循環系に入ることが可能であることが示された。
【００９１】
実施例7  スイカズラmicroRNAは人体内における感冒ウイルスを顕著に抑制することができる
本実施例では、人体の感冒ウイルスを抑制する有効成分は、ほかではなく、スイカズラmicroRNAであることが証明された。
まず、ADVウイルスに感染したウイルス性感冒患者を15名と、H1N1ウイルスに感染したウイルス性感冒患者を15名集めた後、上述ウイルス性感冒患者を5人ずつ、6群に分け、群1〜3はADVウイルスに感染したウイルス性感冒患者で、群4〜6はH1N1ウイルスに感染したウイルス性感冒患者である。
【００９２】
群1：スイカズラ水抽出液（実施例6で調製された）を1000 mL服用する。
群2：スイカズラ水抽出液1000 mL+anti-MIR2911（使用量がMIR2911の使用量に相当する）を服用する。ここで、anti-MIR2911は、MIR2911のアンチセンス核酸で、MIR2911と完全に相補的で、MIR2911を特異的に分解することができる。
群3：水抽出液と等体積の純水を服用する。
群4：スイカズラ水抽出液（実施例6で調製された）を1000 mL服用する。
群5：スイカズラ水抽出液1000 mL+anti-MIR2911（使用量がMIR2911の使用量に相当する）を服用する。ここで、anti-MIR2911は、MIR2911のアンチセンス核酸で、MIR2911と完全に相補的で、MIR2911を特異的に分解することができる。
群6：水抽出液と等体積の純水を服用する。
服用して6日後、Real-time PCRによってヒト血液における感冒ウイルスADVまたはH1N1の含有量を測定した。具体的な工程は、実施例5に記載された通りである。
【００９３】
結果から以下のことがわかる。
1．水を服用する感冒患者（群3、群6）を対照とし、スイカズラ水抽出液を服用した後、ADVまたはH1N1のヒト血液における発現が顕著に低下し、スイカズラmicroRNAが人体における感冒ウイルスADVまたはH1N1の発現を抑制することが示された。
2．スイカズラ水抽出液を服用する感冒患者（群1、群4）を対照とし、感冒患者がスイカズラ水抽出液+anti-MIR2911を服用した後、ADVまたはH1N1のヒト血液における発現が増加した。anti-MIR2911がMIR2911の感冒ウイルスADVまたはH1N1に対する抑制作用を破壊することがわかる。結果から、スイカズラmicroRNAが直接の抗ウイルス作用を有することが示された。
【００９４】
実施例8  MIR2911の安定性の研究およびMIR2911のヒトとマウスにおける吸収と組織分布状況
8.1  フレッシュなスイカズラとスイカズラ水抽出液に存在する植物miRNAs
実験方法：
まず、水抽出法でスイカズラのmicroRNAを抽出した。適量（100g）の乾燥スイカズラ薬材を取り、1000 ml（スイカズラの質量と水の体積の比が1：10）の水の100℃水浴で0.5時間加熱し、抽出液を60℃で減圧で元の体積の1/10に濃縮した。スイカズラ水抽出液を収集し、後の実験に使用した。
適量（1g）のフレッシュなスイカズラ薬材を取り、液体窒素の条件下で研磨し、Trizol法によって全RNAを抽出し、後の実験に使用した。
次に、Solexa配列決定技術で上述工程で調製されたフレッシュなスイカズラとスイカズラ水抽出液に安定して存在する植物microRNAを測定し、Solexaの仕込量は10 μgのRNAであった。
【００９５】
実験結果：
a．植物miRNAsのフレッシュなスイカズラにおけるSolexa配列決定の結果
フレッシュなスイカズラに数種のmicroRNAが安定して存在し、中でも、MIR167a、MIR166f、MIR166b、 MIR164a、MIR168a、MIR156h、MIR172a、MIR162b、MIR159d、MIR827b、MIR396b、MIR2911、MIR2916の含有量が比較的に高い。結果を図10に示す。
b．植物miRNAsのスイカズラ水抽出液におけるSolexa配列決定の結果
スイカズラ水抽出液に数種のmicroRNAが安定して存在し、MIR167a、MIR166f、MIR166b、 MIR164a、MIR168a、MIR156h、MIR172a、MIR162b、MIR159d、MIR827b、MIR396b、MIR2911、MIR2916を含むが、中でも、MIR2911の含有量が最も高い。結果を図11に示す。
【００９６】
8.2  抽出されたまたは合成されたMIR2911の安定性分析
実験方法：
水抽出法でスイカズラのmicroRNAを抽出した。具体的な工程は、実施例8.1に記載された通りである。そして、通常の方法でMIR2911を人工的に合成した。
Real-time PCR方法によってスイカズラ抽出液におけるMIR2911または合成されたMIR2911の濃度を測定したが、具体的な操作工程は実施例2に記載された通りである。
Real-time PCR方法によって血清、水におけるMIR2911およびMIR167の濃度を測定したが、具体的な操作工程は実施例2に記載された通りである。
【００９７】
実験結果：
図12から、MIR2911突然変異体（一つの点突然変異がある）と比較すると、合成されたMIR2911もスイカズラから抽出したMIR2911も分解せず、安定性が高いことがわかる。MIR2911突然変異体は、一時間後濃度が急速に低下し、分解速度が速いことが示された。このように、スイカズラから抽出したMIR2911または合成したMIR2911は安定性が高い。薬物として作用を発揮する基礎を有する。
図13から、MIR167と比較すると、合成されたMIR2911もスイカズラから抽出したMIR2911も、各時点で水、血清中で分解せず、安定性が高いことがわかる。MIR167の分解速度が比較的に速く、一時間後含有量がすでに大幅に低下した。このように、MIR2911は水、血清中で比較的に安定している。
【００９８】
8.3  マウスに合成されたMIR2911を胃内注入した後、MIR2911のマウスの血清における動態学研究結果
マウスに2 nmolの合成されたMIR2911を胃内注入した後、血清におけるMIR2911の含有量が顕著に増加した。図14Aに示す。胃内注入して0.5時間後、血清におけるMIR2911の含有量が最高値になり、24時間後、血清におけるMIR2911の含有量が最初のレベルに降下した。
結果から、合成されたMIR2911は、動物体内に入り、正常の代謝経路を通り、薬物代謝動態学の規律に応じ、潜在の治療薬になれることが示された。
【００９９】
8.4  マウスにスイカズラ水抽出液を胃内注入した後、MIR2911の器官における分布
マウスにスイカズラ水抽出液を胃内注入して3時間後、蛍光標識された合成MIR2911が特異的にマウスの肺部にデリバリーされた。図14Bに示すように、標識されたMIR2911（赤色）がマウスの肺部に快速に蓄積した。MIR2911が血液に入った後、作用を発揮するべき部位に到達し、即ち順調に標的器官に到達し、作用を発揮することが示された。
【０１００】
実施例9  MIR2911は生理・病理的活動を調節することができる
本実施例では、MIR2911がウイルスに感染した細胞において各種のインフルエンザウイルスを標的とし、その複製を抑制することが証明された。
9.1  MIR2911予想ウイルス標的遺伝子の配列分析の結果
生命情報学によってウイルス遺伝子H1N1、H3N2、H5N1、H7N9がMIR2911とマッチすることが予想された。具体的な結果を図15に示す。図15は、MIR2911予想標的遺伝子の配列分析の結果である。結果から、ウイルス遺伝子H1N1、H3N2、H5N1、H7N9がスイカズラmicroRNAの潜在の標的遺伝子であることが示された。
【０１０１】
9.2  ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を利用して予想されたMIR2911ウイルス標的ゲノム配列を検証する
実験方法：
ルシフェラーゼ測定方法によって標的遺伝子を検証した。具体的な操作工程は、実施例3.2に記載された通りである。
実験結果：
結果を図16に示す。検証分析したところ、H1N1、H3N2、H5N1、H7N9がスイカズラMIR2911の潜在の標的遺伝子である。
【０１０２】
9.3  MDCK細胞において、植物MIR2911がAGO2複合体と結合し、AGO2でMIR2911が細胞に輸送される
実験方法：具体的な工程は以下の通りである。
（1）植物MIR2911をAGO2複合体と結合させた。
（2）24ウェル細胞培養プレートにおいてMDCK細胞を培養した。
（3）MIR2911とAGO2複合体を使用して上述細胞に導入した。
（4）24時間後、Real-time PCRによって細胞におけるMIR2911の発現レベルを測定した。
実験結果：結果を図17に示す。研究によって、MIR2911がAGO2複合体と結合し、AGO2でMIR2911が細胞に輸送されることが見出された。
【０１０３】
9.4  MIR2911のMDCK細胞における抗A型H1N1インフルエンザウイルス遺伝子（Anti-H1N1）に対する影響
実験方法：
具体的な操作工程は、実施例3.3に記載された通りである。相違点は、MIR2911がMIR2911とAGO2複合体でMDCK細胞にトランスフェクトしたことである。トランスフェクション時間は、それぞれ12時間、24時間であった。
【０１０４】
実験結果：
結果を図18に示す。研究によって、異なる作用時間で（12時間または24時間の投与時間）、MIR2911がH1N1ウイルスに対して顕著な抑制作用を有することが見出された。
【０１０５】
9.5  MIR2911のMDCK細胞における抗H5N1トリインフルエンザウイルス遺伝子（Anti-H5N1）に対する影響
実験方法：
具体的な操作工程は、実施例3.3に記載された通りである。相違点は、MIR2911がMIR2911とAGO2複合体でMDCK細胞にトランスフェクトしたことである。トランスフェクション時間は、それぞれ12時間、24時間であった。
実験結果：
結果を図19に示す。研究によって、異なる作用時間で（12時間または24時間の投与時間）、MIR2911がH5N1ウイルスに対して顕著な抑制作用を有することが見出された。
【０１０６】
9.6  MIR2911のMDCK細胞における抗H7N9トリインフルエンザウイルス遺伝子（Anti-H7N）に対する影響
実験方法：
具体的な操作工程は、実施例3.3に記載された通りである。相違点は、MIR2911がMIR2911とAGO2複合体でMDCK細胞にトランスフェクトしたことである。トランスフェクション時間は、それぞれ12時間、24時間であった。トリインフルエンザウイルス遺伝子H7N9でMDCK細胞を感染させた。
実験結果：
結果を図20に示す。研究によって、異なる作用時間で（12時間または24時間の投与時間）、MIR2911がH7N9ウイルスに対して顕著な抑制作用を有することが見出された。
【０１０７】
実施例10  MIR2911のマウスIAVs(即ち、A型インフルエンザウイルス)の複製に対する抑制
マウスは、接種の前に3種類の異なるサブタイプのインフルエンザウイルスで処理された。ウイルスに感染して3、5、7日後、毎日体重の変化を記録した。マウスを殺処分し、肺部のウイルスの量を測定した。
10.1  H1N1ウイルス
1．MIR2911のH1N1ウイルスを接種したマウスの体重に対する影響の研究
研究によって、H1N1ウイルスを接種したマウスは、MIR2911を含有する溶液またはスイカズラの煎じ薬を飲んだ後、体重に顕著な変化がなく、MIR2911を含有ない溶液を飲んだ場合、マウスの体重が顕著に低下したことが見出された。このように、MIR2911はH1N1ウイルスに対して顕著な抑制作用を有し、マウスの体重のバランスを維持し、マウスの生理状況を改善する。
【０１０８】
2．H1N1ウイルスに感染したマウスが異なる時点で感染が確認された後、肺部のウイルス力価EID50の変化
実験方法：
具体的な操作工程は、以下の通りである。
（1）ウイルスを10倍段階希釈し、それぞれ1週齢のマウスに摂取した。
（2）各希釈度でマウス6匹に接種して一つの群とし、37〜38℃で培養した。
（3）それぞれ感染して3日、5日、7日後、マウスを殺処分し、肺部の血液を取って血球凝集試験を行った。
（4）血球凝集活性を測定し、Reed-Muench法によって肺部EID50を計算した。
実験結果を図21と図22に示す。
H1N1は、直接投与H1N1ウイルス感染群で、
H1N1+NCは、H1N1ウイルスに感染し、且つ陰性対照（非コード配列）を入れ、
H1N1+MIR2911は、H1N1ウイルスに感染し、且つ直接MIR2911を与えた。
【０１０９】
図21では、感染して3日後、二つの対照群（H1N1、H1N1+NC）の間に顕著な差がなく、非コード配列にウイルスを殺滅する作用がなく対照群（H1N1+NC）と比較すると、投与群（H1N1+MIR2911）の肺部におけるウイルスの含有量が大幅に低下し、顕著な差があり、薬物が肺部のウイルスに対して非常に顕著な殺滅作用を有することが示された。
図22では、感染して3日と5日後、対照群（スイカズラの煎じ薬を投与するH1N1に感染したマウス、H1N1+LJ soup）と比較すると、実験群（スイカズラの煎じ薬+anti-MIR2911を投与するH1N1に感染したマウス、H1N1+LJ soup+MIR2911 soup）は、肺部におけるウイルスの含有量が遥かに高く、顕著な差があることが示された。anti-MIR2911がスイカズラの煎じ薬におけるMIR2911を分解させた後、スイカズラの煎じ薬が抗ウイルス作用を失くしたため、作用するのはMIR2911であることが示された。
【０１１０】
10.2  H5N1ウイルス
1．MIR2911のH5N1ウイルスを接種したマウスの体重に対する影響の研究
研究によって、H5N1ウイルスを接種したマウスは、MIR2911を含有する溶液またはスイカズラの煎じ薬を飲んだ後、体重に顕著な変化がなく、MIR2911を含有ない溶液を飲んだ場合、マウスの体重が顕著に低下したことが見出された。このように、MIR2911はH5N1ウイルスに対して顕著な抑制作用を有し、マウスの体重のバランスを維持し、マウス体内の生理状況を改善する。
2．H5N1ウイルスに感染したマウスが異なる時点で感染が確認された後、肺部のウイルス力価EID50の変化
具体的な操作工程は、実施例10.1に記載された通りである。実験結果から、薬物が肺部のウイルスに対して殺滅作用を有することが示された。
【０１１１】
10.3  H7N9ウイルス
1．MIR2911のH7N9ウイルスを接種したマウスの体重に対する影響の研究
研究によって、H7N9ウイルスを接種したマウスは、MIR2911を含有する溶液またはスイカズラの煎じ薬を飲んだ後、その体重に顕著な変化がなく、MIR2911を含有ない溶液を飲んだ実験群では、マウスの体重が顕著に低下したことが見出された。このように、MIR2911はH7N9ウイルスに対して顕著な抑制作用を有し、マウスの体重のバランスを維持し、マウス体内の生理状況を改善する。
【０１１２】
2．H7N9ウイルスに感染したマウスが異なる時点で感染が確認された後、肺部のウイルス力価EID50の変化
具体的な操作工程は、実施例10.1に記載された通りである。
実験結果を図23と図24に示す。
H7N9は、直接投与H7N9ウイルス感染群で、
H7N9+NCは、H7N9ウイルスに感染し、且つ陰性対照（非コード配列）を入れ、
H7N9+MIR2911は、H7N9ウイルスに感染し、且つ直接MIR2911を与えた。
【０１１３】
図23では、感染して3日後、二つの対照群（H7N9、H7N9+NC）の間に顕著な差がなく、非コード配列にウイルスを殺滅する作用がなく対照群（H7N9+NC）と比較すると、投与群（H7N1+MIR2911）の肺部におけるウイルスの含有量が大幅に低下し、顕著な差があり、薬物が肺部のウイルスに対して非常に顕著な殺滅作用を有することが示された。
図24では、感染後、対照群（スイカズラの煎じ薬を投与するH7N9に感染したマウス、H7N9+LJ soup）と比較すると、実験群（スイカズラの煎じ薬+anti-MIR2911を投与するH7N9に感染したマウス、H7N9+LJ soup+MIR2911 soup）は、肺部におけるウイルスの含有量が遥かに高く、顕著な差があることが示された。anti-MIR2911がスイカズラの煎じ薬におけるMIR2911を分解させた後、スイカズラの煎じ薬が抗ウイルス作用を失くしたため、作用するのはMIR2911であることが示された。
【０１１４】
実施例11  フレッシュなスイカズラ、乾燥スイカズラ、マウス餌料におけるMIR2911の含有量の比較
測定方法：
Real-time PCR方法によってフレッシュなスイカズラ、乾燥スイカズラ、マウス餌料におけるMIR2911の含有量濃度を測定したが、具体的な操作工程は実施例2に記載された通りである。
実験結果：
結果は、図25に示すように、上述実験では、マウスを飼育する餌料にほとんどMIR2911が含まれず、実験結果にほとんど影響しないことがわかる。
【０１１５】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０−１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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