(57)【要約】  本発明は、（ａ）膜タンパク質の第１の集団および第２の集団を含むサンプルを提供することを含み、ここで、第１の集団中の膜タンパク質は、ドナー標識で標識され、第２の集団中の膜タンパク質は、アクセプター標識で標識されるか、または第１の集団中の膜タンパク質は、アクセプター標識で標識され、第２の集団中の膜タンパク質は、ドナー標識で標識され、（ｂ）膜タンパク質の第１および第２の集団を、安定性調節物質および／または条件に曝露することと、（ｃ）ドナー標識を活性化して、アクセプター標識との距離依存性相互作用を可能にし、相互作用が検出可能なシグナルを生成することによって、第１および第２の集団の膜タンパク質間の凝集を評価することとを含む、膜タンパク質のコンホメーション安定性を評価するためのアッセイを提供する。
2015519569.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜タンパク質のコンホメーション安定性を評価するためのアッセイであって、
（ａ）膜タンパク質の第１の集団および第２の集団を含み、第１の集団中の膜タンパク質は、ドナー標識で標識され、第２の集団中の膜タンパク質は、アクセプター標識で標識されるか、または第１の集団中の膜タンパク質は、アクセプター標識で標識され、第２の集団中の膜タンパク質は、ドナー標識で標識される、サンプルを提供すること、
（ｂ）膜タンパク質の第１および第２の集団を、安定性調節物質および／または条件に曝露すること、
（ｃ）ドナー標識を活性化して、アクセプター標識との距離依存性相互作用を可能にし、相互作用が検出可能なシグナルを生成することによって、第１および第２の集団の膜タンパク質間の凝集を評価すること
を含む、アッセイ。
【請求項２】
膜タンパク質の第１の集団および第２の集団が、サンプル中に１：１比で存在する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
ドナー標識が、共有結合によって膜タンパク質と結合しており、アクセプター標識が、共有結合によって膜タンパク質と結合している、請求項１または２に記載のアッセイ。
【請求項４】
膜タンパク質のコンホメーション安定性を評価するためのアッセイであって、
（ａ）膜タンパク質集団を含むサンプルを提供することと、
（ｂ）膜タンパク質集団を、安定性調節物質および／または条件に曝露することと、
（ｃ）膜タンパク質のＮ末端またはＣ末端の一方を、ドナー標識を用いて、膜タンパク質のＮ末端またはＣ末端のもう一方を、アクセプター標識を用いて標識することと、
（ｄ）ドナー標識を活性化して、アクセプター標識との距離依存性相互作用を可能にし、相互作用が検出可能なシグナルを生成することによって、集団中の膜タンパク質の凝集を評価することと
を含む、アッセイ。
【請求項５】
ドナー標識およびアクセプター標識間の相互作用が、ドナーフルオロフォアからアクセプターフルオロフォアへのエネルギーの移動を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項６】
ドナーフルオロフォアが、ランタニドである、請求項５に記載のアッセイ。
【請求項７】
ランタニドが、テルビウムである、請求項６に記載のアッセイ。
【請求項８】
アクセプターフルオロフォアが、ＥＧＦＰまたはｄ２である、請求項５から７のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項９】
ドナー標識およびアクセプター標識間の相互作用が、化学発光反応である、請求項１から４のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１０】
ドナー標識およびアクセプター標識間の相互作用が、化学発光反応を誘発する一重項酸素分子の生成を含む、請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１１】
ドナー標識および／またはアクセプター標識が、直接的に膜タンパク質と結合している、請求項１から１０のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１２】
ドナー標識および／またはアクセプター標識が、間接的に膜タンパク質と結合している、請求項１から１０のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１３】
工程（ａ）において提供されるサンプルが、可溶化された形態の膜タンパク質集団を含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１４】
サンプルが、ＤＤＭ、Ｃ１１−、Ｃ１０−、Ｃ９−またはＣ８−マルトシドまたはグルコシド、ＬＤＡＯおよびＳＤＳから選択される１種以上の界面活性剤を含む、請求項１３に記載のアッセイ。
【請求項１５】
安定性調節物質および／または条件が、熱、界面活性剤、カオトロピック物質またはｐＨのうち１種以上から選択される、請求項１から１４のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１６】
膜タンパク質がＧＰＣＲである、請求項１から１５のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１７】
工程（ａ）において提供されるサンプルが、ＧＰＣＲリガンドを含み、リガンドが、ＧＰＣＲが特定のコンホメーションにある場合に、ＧＰＣＲと結合するものである、請求項１６に記載のアッセイ。
【請求項１８】
ＧＰＣＲリガンドが、リガンドのアゴニストクラスに由来し、特定のコンホメーションが、アゴニストコンホメーションであるか、またはＧＰＣＲリガンドが、リガンドのアンタゴニストクラスに由来し、特定のコンホメーションが、アンタゴニストコンホメーションである、請求項１７に記載のアッセイ。
【請求項１９】
コンホメーション安定性が増大した膜タンパク質を選択するための方法であって、
（ａ）請求項１から１８のいずれか１項のアッセイに従って、親膜タンパク質の１種以上の突然変異体のコンホメーション安定性を、親膜タンパク質のコンホメーション安定性と比較することと、
（ｂ）親膜タンパク質と比較してコンホメーション安定性が増大した１種以上の突然変異体を選択することと
を含む、方法。
【請求項２０】
（ａ）親膜タンパク質の１種以上の突然変異体を提供することと、
（ｂ）請求項１から１８のいずれか１項に記載のアッセイに従って、親膜タンパク質の１種以上の突然変異体のコンホメーション安定性を評価することと、
（ｃ）請求項１から１８のいずれか１項に記載のアッセイに従って、親膜タンパク質のコンホメーション安定性を評価することと、
（ｄ）親タンパク質のコンホメーション安定性と比較して、コンホメーション安定性が増大した親膜タンパク質の１種以上の突然変異体を選択することと
を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
膜タンパク質が、熱、界面活性剤、カオトロピック物質または極端なｐＨのいずれかに対して増大した安定性を有する、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｎ末端またはＣ末端の一方が、ドナー標識と結合しており、Ｎ末端またはＣ末端のもう一方が、アクセプター標識と結合している、膜タンパク質。
【請求項２３】
ドナーおよびアクセプター標識が、請求項３および５から１２のいずれか１項に定義の通りである、請求項２２に記載の膜タンパク質。
【請求項２４】
膜タンパク質が、ＧＰＣＲである、請求項１９または２０に記載の方法、請求項２２または２３に記載の膜タンパク質。
【請求項２５】
膜タンパク質のコンホメーション安定性を測定するためのアッセイにおける、請求項２２から２４のいずれか１項に記載の膜タンパク質の使用。
【請求項２６】
突然変異体ＧＰＣＲを調製するための方法であって、
（ａ）請求項１９から２１および２４のいずれか１項に記載の方法を実施することと、
（ｂ）増大された安定性について選択されている突然変異体膜タンパク質（単数または複数）中の突然変異されたアミノ酸残基（単数または複数）の位置（単数または複数）を同定することと、
（ｃ）同定された位置のうち１つ以上に置換アミノ酸を含有する突然変異体膜タンパク質を合成することと
を含む、方法。
【請求項２７】
付随する説明、実施例および／または図面のうち１つ以上に関連して実質的に本明細書に記載されるようなアッセイ、方法または膜タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜タンパク質、特に、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の安定性を評価するためのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
過去２０年にわたって、膜タンパク質構造の決定速度は、徐々に高まったが、多くの成功は、真核生物由来というよりも細菌由来膜タンパク質の結晶化にあった。細菌膜タンパク質は、真核生物膜タンパク質よりも、大腸菌において標準技術を使用して過剰発現させることが容易であったが［１］、細菌タンパク質は、界面活性剤中で、はるかにより安定であることがあり、界面活性剤安定性は、精製および結晶化するための必須の前提条件である。真核生物膜タンパク質を過剰発現することの困難さは別として、それらは、界面活性剤溶液において不十分な安定性しか有さないことが多く、これが、その即時の変性または沈殿を伴わずに調査され得る結晶化条件の範囲を厳しく制限する。理想的には、膜タンパク質は、任意の所与の界面活性剤中で数日間安定であるべきであるが、回折品質の結晶を成長させるのに最適である界面活性剤は、最も不安定化させる界面活性剤、すなわち、短い脂肪鎖および短いまたは電荷を有する頭部基を有するものである傾向がある。また、解き明かしたいと思うものはまたヒト膜タンパク質の構造であるが、これは、これらが、製薬業界による治療薬の開発に役立つために必要であるからである。したがって、結晶化および構造決定のために、潜在的に、薬物スクリーニング、バイオアッセイおよびバイオセンサー適用などのその他の目的のために、界面活性剤安定性真核生物内在性膜タンパク質の製造を可能にする基本戦略を開発することが圧倒的に必要である。
【０００３】
ＧＰＣＲは、多数の生理学的プロセスを制御するタンパク質の極めて大きいファミリーを構成し、多数の有効な薬物の標的である。したがって、それらは、薬理学的にかなり重要である。ＧＰＣＲの一覧が、参照により本明細書に組み込まれる、非特許文献１に示されている。ＧＰＣＲは、一般に、単離されると不安定であり、かなりの努力をもってしても、結晶構造がほとんど存在しない。
【０００４】
ＧＰＣＲは、ドラッガブルな標的であり、現行薬の１／４を超えるものが、標的としてＧＰＣＲを有すると示す、非特許文献２が特に参照される。
【０００５】
ＧＰＣＲは、アゴニストおよびアンタゴニストなどのリガンドの異なる薬理学的クラスと関連する複数の別個のコンホメーションで存在し、機能するためにこれらのコンホメーション間を循環すると考えられている（非特許文献３）。
【０００６】
本発明者らは、ＧＰＣＲを結晶化しようとすることに伴う２つの深刻な問題、すなわち、安定性がないこと（例えば、界面活性剤中で）およびそれらが複数のコンホメーションで存在するという事実があることを理解した。ＧＰＣＲは、機能するために、少なくとも２種の別個のコンホメーション、アゴニスト結合形態およびアンタゴニスト結合形態の間を循環するよう進化し、これら２種のコンホメーション間での変化は、リガンドの不在下で自発的に起こり得る。したがって、任意の精製受容体は、コンホメーションの混合物である可能性が高い。単に、結晶化試験の際にＧＰＣＲにリガンドを加えるだけでは、その構造決定をもたらさなかった。
【０００７】
安定化された受容体（ＳｔａＲ）は、リガンド結合に基づく熱安定性アッセイと組み合わせた、全受容体にわたる系統的な突然変異誘発スキャンによって作製され得ることがわかった。ＳｔａＲ作製の方法は、受容体の特定のコンホメーションの安定化をもたらす。方法の詳細な説明は、他［２、３、４］ならびに特許文献１および特許文献２に見出すことができる。手短には、受容体を特定のコンホメーションで安定化するために、可溶化された受容体を、所望のコンホメーションに応じて過剰量のアゴニストまたはアンタゴニストとともにインキュベートする。そして、受容体／リガンド複合体を、種々の温度で特定の期間加熱する。加熱後、過剰の結合していないリガンドを、受容体／リガンド複合体から分離する。任意の所与の温度でのリガンド結合のパーセンテージを、加熱後に残っているフォールディングしている受容体の量の読み取り値として使用する。このデータを温度に対してプロットすることによって、熱崩壊曲線が得られ、Ｔｍ値は、受容体活性の５０％が保持される温度として定義される。このプロセスは、界面活性剤中で高親和性および都合のよい特性を有する良好なリガンドを入手可能であることに頼っている。しかし、いくつかの場合には、このようなリガンドは、入手可能ではなく、そのため、リガンドの必要性を回避する、すなわち、受容体活性を測定するためにリガンド結合活性が使用されないアッセイが高度に望ましい。
【０００８】
歴史的に、加熱の間のタンパク質の構造変化は、沈降速度、示差走査熱量測定、動的光散乱、円偏光二色性分光法、ＵＶ／ＶＩＳ分光法、電気泳動、蛍光およびＮＭＲなどの種々の分析技術によって研究されてきた。しかし、これらの技術は、多量のタンパク質を必要とすることが多く、ハイスループットスクリーニングに適応することが困難であり、界面活性剤に由来する高いバックグラウンドノイズによる不十分なシグナル・ノイズ比に悩まされることが多い。
【０００９】
リガンドを使用せずに膜タンパク質の熱安定性を測定するための別の方法は、Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖら［５］によって記載されている。これは、アンフォールディングプロセスの読み取り値としての共有結合修飾への天然システイン残基のアクセスに頼るものである。タンパク質のアンフォールディングは、埋もれているシステインの曝露をもたらし、これによって反応性蛍光プローブを用いる修飾を受けやすくなる。既知アッセイでは、著者らは、スルフヒドリル特異的蛍光色素Ｎ−［４−（７−ジエチルアミノ−４−メチル−３−クマリニル）フェニル］マレイミド（ＣＰＭ）を使用するが、これは、その未結合形態ではほとんど蛍光を示さないからである。しかし、このアッセイの大きな不利点は、ハイスループット適用には適していないということである。検出システムが、膜タンパク質に特異的ではないために、かなり多量の高度に純粋な膜タンパク質調製物を必要とする。
【００１０】
非特許文献４には、膜タンパク質安定性を評価するための蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の使用［６］が記載されている。ＦＲＥＴは、ドナーフルオロフォアからアクセプターフルオロフォアへのエネルギーの距離依存性移動に頼るものである。ドナーおよびアクセプターフルオロフォアが十分に分離した発光スペクトルを有さなくてはならないが、ドナーの発光スペクトルは、アクセプターフルオロフォアの励起スペクトルと重ならなくてはならないということが重要である。非特許文献４の方法では、ＦＲＥＴアクセプターで標識されたモノクローナル抗体の結合が、ＧＰＣＲ変性のマーカーとして使用される。ＦＲＥＴシグナルは、ＦＲＥＴアクセプターが、ＧＰＣＲのＣ末端と結合しているＦＲＥＴドナーの近くにある場合に生じる。しかし、この方法の大きな制限は、問題の膜タンパク質に対する特異的な適した抗体が利用可能であることを必要とするということである。また、非特許文献４の方法は、偶然、抗体結合部位中に起こる安定性突然変異を同定する可能性は低いが、これは、これらの突然変異が、抗体結合を低減するか、または無効にするからである。さらに、抗体結合部位中の突然変異は、必ずしもコンホメーション安定性を増大することなく、受容体に対する抗体の親和性を増大することもあり、それによって、偽陽性につながる。非特許文献４の方法の別の不利点は、抗体が、ＧＰＣＲの薬理学に対して特定の効果を有し得るということである。例えば、抗体は、望ましくないＧＰＣＲの特定のコンホメーションであり得る。
【００１１】
したがって、膜タンパク質の安定性を測定するために使用され得る簡単な有効なアッセイが依然として大いに必要である。
【００１２】
アンフォールディングの際のタンパク質凝集は、種々のタンパク質において種々の程度で生じる、すべてのタンパク質の一般的な特徴である。タンパク質の全体的な構造的安定性が、凝集のレベルと反比例することは認められている。膜タンパク質は、可溶化後に高レベルの凝集を、変性後にはさらに示すことがわかっている。
【００１３】
凝集を測定するために利用可能な種々の方法があるが、変性後の膜タンパク質凝集を測定するためのものではそうではない。
【００１４】
例えば、非特許文献５および特許文献３には、ＦＲＥＴを使用する細胞内ポリグルタミンタンパク質凝集を測定するための細胞ベースのアッセイが記載されており、神経変性性疾患において治療的適用を有し得る凝集制御因子のスクリーニングにおけるその使用が論じられている。また、非特許文献６および非特許文献７には、疾患病理の一部として凝集体を形成することがわかっているタンパク質の凝集を評価するためのＦＲＥＴベースの方法が記載されている。
【００１５】
タンパク質凝集はまた、上記の分析技術によって測定され得る。しかしながら、これらの方法のすべてが、高度に精製されたタンパク質を要求する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第２００８／１１４０２０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００９／０７１９１４号パンフレット
【特許文献３】米国特許第ＵＳ７，８０３，５５９号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｆｏｏｒｄら、（２００５年）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．  ５７巻、２７９〜２８８頁
【非特許文献２】Ｏｖｅｒｉｎｇｔｏｎら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ５巻、９９３〜９９６頁
【非特許文献３】Ｋｅｎａｋｉｎ  Ｔ．  （１９９７年）  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１２巻、１１６〜１２５頁
【非特許文献４】Ｋｎｅｐｐら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５０巻（４号）：５０２〜１１頁、２０１１年）
【非特許文献５】Ｐｏｌｌｉｔｔら（Ｎｅｕｒｏｎ  ４０：６８５〜６９４頁、２００３年）
【非特許文献６】Ｒｏｂｅｒｔｉら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４巻（４号）：３４５頁、２００７年）
【非特許文献７】Ｒａｊａｎら（ＰＮＡＳ  ９８巻（２３号）：１３０６０〜１３０６５頁）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上記の進歩にもかかわらず、膜タンパク質の凝集を測定するための方法は、広く利用可能ではない。これは、主に、これらの方法が多量の高度に精製されたタンパク質を必要とし、高度に精製された膜タンパク質を作製することが挑戦的なものであるからである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、ここで、膜タンパク質の凝集を直接的に評価する方法を同定した。このような方法は、タンパク質の全体的な凝集を最小化し得る条件および突然変異を同定することを可能にする。Ｋｎｅｐｐらのものなどの凝集を間接的に測定する方法と比較して、本方法は、より多くの、タンパク質の凝集を最小化し得る突然変異および条件を同定すると考えられる。これは、一部の突然変異および条件が、間接的な方法における凝集の読み取り値として頼られるような、リガンド結合または抗体結合の変化につながる方法でタンパク質の構造を変更することなく、タンパク質凝集を低減し得るためである。
【００２０】
（ａ）膜タンパク質の第１の集団および第２の集団を含むサンプルを提供することを含み、ここで、第１の集団中の膜タンパク質は、ドナー標識で標識され、第２の集団中の膜タンパク質は、アクセプター標識で標識されるか、または第１の集団中の膜タンパク質は、アクセプター標識で標識され、第２の集団中の膜タンパク質は、ドナー標識で標識され、
（ｂ）膜タンパク質の第１および第２の集団を、安定性調節物質および／または条件に曝露することと、
（ｃ）ドナー標識を活性化して、アクセプター標識との距離依存性相互作用を可能にし、相互作用が検出可能なシグナルを生成することによって、第１および第２の集団の膜タンパク質間の凝集を評価することと
を含む、本発明の第１の態様によれば、膜タンパク質のコンホメーション安定性を評価するためのアッセイが提供される。
【００２１】
このアッセイでは、第１および第２の集団に由来する膜タンパク質の凝集は、膜タンパク質が凝集する場合には、ドナー標識およびアクセプター標識が互いに近接するようになり、それによって、検出可能なシグナルを生成することによって検出される。膜タンパク質が安定である場合には、不安定化物質および／または条件に対する曝露の際に凝集は少なく、そのため、シグナルも少ないのに対し、膜タンパク質が不安定である場合には、不安定化物質および／または条件に対する曝露の際により多くの凝集があり、そのためより多くのシグナルがある。
【００２２】
本発明者らは、「コンホメーション安定性」によって、膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）の特定のコンホメーションの安定性という意味を含む。特定のコンホメーションの安定性は、変性剤または変性条件に曝露された場合に、いかに良好にその特定のコンホメーションがその構造を保持し得るかを指す。したがって、高いコンホメーション安定性を有する膜タンパク質は、低いコンホメーション安定性を有する膜タンパク質の特定のコンホメーションの寿命と比較して、特定のコンホメーションの長い寿命を有する。変性剤／変性条件の例として、以下にさらに記載されるような、熱、界面活性剤、カオトロピック物質および極端なｐＨが挙げられる。当技術分野で周囲のように、このような変性剤または変性条件は、タンパク質の二次および三次構造に影響を及ぼし得るが、一次配列には影響を及ぼさない。
【００２３】
本発明者らは、「膜タンパク質」によって、細胞またはオルガネラの膜と結合または会合しているタンパク質を意味する。好ましくは、膜タンパク質は、膜中に常に組み込まれており、脂質二重層を物理的に破壊する界面活性剤、非極性溶媒または変性剤を使用した場合にのみ、除去され得る内在性膜タンパク質である。
【００２４】
最も好ましくは、膜タンパク質は、ＧＰＣＲである。
【００２５】
本発明の実施において使用するための適したＧＰＣＲとして、限定されるものではないが、ケモカイン受容体、（例えば、ＣＣＲ５）、β−アドレナリン受容体、アデノシン受容体（例えば、Ａ２ａ受容体）およびニューロテンシン受容体（ＮＴＲ）が挙げられる。その他の適したＧＰＣＲは、当技術分野で周知であり、前掲のＨｏｐｋｉｎｓおよびＧｒｏｏｍに列挙されるものが挙げられる。さらに、国際薬理学連合（International Union of Pharmacology）によって、ＧＰＣＲの一覧が作製されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｏｏｒｄら（２００５年）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｖ．  ５７巻、２７９〜２８８頁、この一覧は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｕｐｈａｒ−ｄｂ．ｏｒｇ／ＧＰＣＲ／ＲｅｃｅｏｔｏｒＦａｍｉｌｉｅｓＦｏｒｗａｒｄで一定期間ごとに更新される）。なお、ＧＰＣＲは、主にそのアミノ酸配列類似性に基づいて、異なるクラスに分けられる。それらはまた、結合する天然リガンドへの参照によりファミリーに分けられる。すべてのＧＰＣＲは、本発明の範囲中に含まれる。
【００２６】
したがって、ＧＰＣＲは、アデノシン受容体、β−アドレナリン受容体、ニューロテンシン受容体、ムスカリン酸（muscarinic acid）受容体、５−ヒドロキシトリプタミン受容体、アドレナリン受容体、アナフィラトキシン受容体、アンジオテンシン受容体、アペリン受容体、ボンベシン受容体、ブラジキニン受容体、カンナビノイド受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、ドーパミン受容体、エンドセリン受容体遊離脂肪酸受容体、胆汁酸受容体、ガラニン受容体、モチリン受容体、グレリン受容体、糖タンパク質ホルモン受容体、ＧｎＲＨ受容体、ヒスタミン受容体、ＫｉＳＳ１由来ペプチド受容体、ロイコトリエンおよびリポキシン受容体、リゾリン脂質受容体、メラニン濃縮ホルモン受容体、メラノコルチン受容体、メラトニン受容体、ニューロメジンＵ受容体、ニューロペプチド受容体、Ｎ−ホルミルペプチドファミリー受容体、ニコチン酸受容体、オピオド（opiod）受容体、オプシン様受容体、オレキシン受容体、Ｐ２Ｙ受容体、ペプチドＰ５１８受容体、血小板活性化因子受容体、プロキネチシン受容体、プロラクチン放出ペプチド受容体、プロスタノイド受容体、プロテアーゼ活性化受容体、レラキシン受容体、ソマトスタチン受容体、ＳＰＣ／ＬＰＣ受容体、タキキニン受容体、微量アミノ受容体、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体、ウロテンシン受容体、バソプレシン／オキシトシン受容体、オーファンＧＰＣＲ、カルシトニン受容体、コルチコトロピン放出因子受容体、グルカゴン受容体、上皮小体受容体、ＶＩＰ／ＰＡＣＡＰ受容体、ＬＮＢ７ＴＭ受容体、ＧＡＢＡ受容体、代謝型グルタミン酸受容体およびカルシウムセンサー受容体のいずれかであり得る（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｏｏｒｄら（２００５年）  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｖ．  ５７巻、２７９〜２８８頁の表１参照のこと）。
【００２７】
ＧＰＣＲはまた、本明細書において以下の表Ａに列挙されるＧＰＣＲのいずれかから選択され得る。
【００２８】
また、安定性を測定するために本発明の方法が役立つように使用され得るその他の膜タンパク質として、本明細書において以下の表Ｂに列挙されるオーファン受容体が挙げられる。
【００２９】
多数の膜タンパク質  例えば、ＧＰＣＲのアミノ酸配列（およびそれをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋへの参照によって容易に入手可能である。特に、Ｆｏｏｒｄら前掲には、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅに由来するヒト遺伝子記号ならびにヒト、マウスおよびラット遺伝子ＩＤが示されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ）。なお、ヒトゲノムの配列は、実質的に完全であるので、ヒト膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）のアミノ酸配列は、それから推定され得る。
【００３０】
膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）は、任意の供給源に由来し得るが、真核生物供給源由来が特に好ましい。哺乳動物またはトリなどの脊椎動物供給源由来である場合が特に好ましい。膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）は、ラット、マウス、ウサギもしくはイヌもしくは非ヒト霊長類もしくはヒト由来であるか、またはニワトリもしくはシチメンチョウ由来である場合が特に好ましい。誤解を避けるために、本発明者らは、「に由来する」の意味内に、ｃＤＮＡまたは遺伝子は、その供給源から得られた遺伝物質を使用して元々得られたが、その後、タンパク質は、任意の宿主細胞（例えば、原核生物または真核生物宿主細胞）において発現され得るということを含む。したがって、真核生物膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）（鳥類または哺乳動物膜タンパク質など）は、大腸菌などの原核生物宿主細胞において発現され得るが、場合によっては、鳥類または哺乳動物由来であると考えられるということは明白となる。
【００３１】
いくつかの例では、膜タンパク質は、２種以上の異なるサブユニットからなるものであり得る。例えば、カルシトニン遺伝子関連ペプチド受容体は、生理学的リガンド結合特徴を獲得するために、単一膜貫通ヘリックスタンパク質（ＲＡＭＰ１）の結合を必要とする。また、ＧＰＣＲと組み合わさって、機能的複合体を形成または調節する、エフェクター、アクセサリー、補助またはＧＰＣＲ相互作用タンパク質は、当技術分野で周知であり、例えば、受容体キナーゼ、Ｇタンパク質およびアレスチン（Ｂｏｃｋａｅｒｔら（２００４）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ａｎｄ  Ｄｅｖ  ７巻、６４９〜６５７頁）が挙げられる。
【００３２】
膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）は、任意の適した方法によって調製され得る。好都合なことに、膜タンパク質は、適した核酸分子によってコードされ、適した宿主細胞において発現される。膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）をコードする適した核酸分子は、当技術分野で周知であるように、標準クローニング技術、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲを使用して作製され得る。適した発現系として、細菌または酵母における構成的もしくは誘導可能な発現系、バキュロウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびレンチウイルスなどのウイルス発現系または昆虫もしくは哺乳動物細胞における一時的トランスフェクションが挙げられる。適した宿主細胞として、大腸菌、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）およびイラクサギンウワバ（Trichoplusiani）細胞が挙げられる。適した動物宿主細胞として、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、Ｓ２、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＤＴ４０などが挙げられる。いくつかの膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）は、機能するのに特定の脂質（例えば、コレステロール）を必要とするということが知られている。その場合には、脂質を含有する宿主細胞を選択することが望ましい。さらにまたはあるいは、膜タンパク質の単離および精製の間に脂質が添加されてもよい。また、以下にさらに説明されるような膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）のリガンドを添加することが望ましいものであり得る。
【００３３】
遺伝子およびｃＤＮＡをクローニングおよび操作するための、ＤＮＡを突然変異させるための、および宿主細胞においてポリヌクレオチドからポリペプチドを発現させるための分子生物学的方法は、参照によって本明細書に組み込まれる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹに例示されるように、当技術分野で周知である。
【００３４】
膜タンパク質の第１の集団および第２の集団を含むサンプルは、２種の集団を含有する任意の適したサンプルであり得る。本発明者らは、「集団」によって、種々のタンパク質の混合物とは対照的に、膜タンパク質の同一の特定の種類の複数を含む。例えば、集団は、少なくとも、２、５、１０、５０、１００、２００、５００、１０００、５０００、１００００、１０００００、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３または１０１４個のタンパク質分子またはそれ以上を含み得る。当然のことではあるが、タンパク質分子の正確な数は、個々の膜タンパク質の発現レベルに応じて変わり得、これはタンパク質毎に異なり得る。
【００３５】
膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）の集団が、膜タンパク質が構造的完全性を維持して機能的形態（例えば、リガンドと結合できる）である適した可溶化形態で提供される場合が好ましい。当業者によって、個々のタンパク質にとって有効であると選択され得る、適した界面活性剤（またはその他の両親媒性薬剤）およびバッファー系などの適当な可溶化系が使用される。使用され得る通常の界面活性剤として、例えば、ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）またはＣＨＡＰＳまたはオクチルグルコシド（ＯＧ）または多数のその他のものが挙げられる。一実施形態では、サンプルは、ＤＤＭ、Ｃ１１−、Ｃ１０−、Ｃ９−もしくはＣ８−マルトシドまたはグルコシド、ＬＤＡＯおよびＳＤＳから選択される１種以上の界面活性剤を含む。コレステロールヘミスクシネートまたはコレステロール自体またはヘプタン−１，２，３−トリオールなどのその他の化合物を含むことが好都合であり得る。グリセロールまたはプロリンまたはベタインの存在は、有用であり得る。膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）は、ひとたび、存在する膜から可溶化されると、アッセイされるのに十分に安定でなくてはならないことが重要である。いくつかの膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）について、ＤＤＭは十分であるが、グリセロールまたはその他のポリオールが、必要に応じて、アッセイ目的のために安定性を高めるために添加され得る。例えば、所望により、グリセロールの存在下で、ＤＤＭ、ＣＨＡＰＳおよびコレステロールヘミスクシネートの混合物中で可溶化することによって、アッセイ目的のためにさらなる安定性が達成され得る。特に不安定な膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）には、伝統的な界面活性剤の不在下でジギトニンまたはアンフィポール（amphipol）または膜タンパク質を膜から直接的に可溶化し得るその他のポリマーを使用してそれらを可溶化し、通常、相当な数の脂質を膜タンパク質と会合したままにすることを可能にすることによって安定性を維持することが望ましい場合がある。また、極めて不安定な膜タンパク質を機能的形態で可溶化するために、ナノディスクも使用され得る。
【００３６】
通常、膜タンパク質は、粗抽出物（例えば、大腸菌またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの、それが発現されている宿主細胞から得た膜画分の）で提供される。膜タンパク質が、サンプル中に存在するタンパク質の少なくとも７５％または少なくとも８０％または８５％または９０％または９５％または９８％または９９％を含む形態で提供され得る。あるいは、膜タンパク質は、実施例１に記載されるような、対象の膜タンパク質がサンプル中の最も多量な種ではない半精製形態で提供され得る。したがって、膜タンパク質は、サンプル中の総タンパク質の５〜５０％のみ（例えば、サンプル中に存在するタンパク質の少なくとも５％または１０％または１５％または２０％または２５％または３０％または３５％または４０％または４５％）が膜タンパク質であるサンプル中で提供され得る。しかし、本発明の第１の態様のアッセイのために、膜タンパク質のその発現後の何らかの精製が、一般に必要とされ、そのため、粗溶解物は普通使用され得ない。当技術分野で標準的な実施であるように、任意の適したタンパク質精製法が使用され得る。もちろん、上記で論じたように、通常、可溶化され、そして、膜タンパク質は、普通、界面活性剤分子および／または脂質分子と会合する。
【００３７】
好都合には、膜タンパク質の第１および第２の集団は、別個に発現され、標識される。集団はまた、上記で論じたように、別個に可溶化および／または精製され得る。そして、膜タンパク質の第１および第２の集団は、サンプルを得るために一緒に混合される。膜タンパク質の第１の集団および第２の集団は、サンプル中に、１：１のモル比で存在することが好ましい。しかし、小スケールタンパク質精製には、タンパク質の濃度を測定することが困難である場合があり、そして、１：１モル比は、通常、１：１体積比によって近似されるということは理解される。２種の集団間の大きさの相違は小さいと予測され、精製効率は、同一であると考えられるので、近似は精密だと考えられる。好都合なことに、１：１体積比は、膜タンパク質を発現する第１の細胞集団および膜タンパク質を発現する第２の集団から同数の細胞を可溶化すること、各集団に由来する膜タンパク質を完全に同じように精製することおよび精製タンパク質を同体積に溶出することによって達成される。そして、溶出液を、等体積で混合し、従って、例えば、第１の集団の２５０μｌを、第２の集団の２５０μｌと混合するなど。
【００３８】
当然のことではあるが、サンプル中の膜タンパク質の集団の一方は、ドナー標識（アクセプター標識ではない）で標識され、膜タンパク質のもう一方の集団は、アクセプター標識（ドナー標識ではない）で標識される。本発明者らは、「ドナー標識」および「アクセプター標識」によって、標識の任意の対という意味を含み、これでは、ドナー標識の活性化が、アクセプター標識との距離依存性相互作用を可能にし、相互作用が検出可能なシグナルを生成する。このようにして、ドナーおよびアクセプター対の相互作用によって生成した検出可能なシグナルが、第１および第２の集団に由来する膜タンパク質間の凝集のレベル、従って、コンホメーション安定性の読み取り値として使用され得る。
【００３９】
好都合なことに、ドナー標識およびアクセプター標識間の相互作用は、ドナー標識からアクセプター標識へのエネルギーの移動を含む。例えば、共鳴エネルギー移動という用語は、ドナー標識がアクセプター標識と接近している方法に関する。これは、ドナーからアクセプターへのエネルギーの流れを作り出し、シグナルがドナーまたはアクセプターを通してモニタリングされる検出スキームにつながる。このような方法は、例えば、ドナー色素が下方または上方変換標識であり得るルミネッセンス共鳴エネルギー移動系では周知である。ドナーは、励起され、近接性の原理の結果として、アクセプター標識がドナー化合物によって励起され、シグナルがアクセプター化合物の発光波長で検出される。蛍光、燐光、時間分解蛍光、生物発光およびルミネッセンス共鳴エネルギー移動など、いくつかの共鳴エネルギー移動法がある。共鳴エネルギー移動は、シグナル生成法またはシグナルが消光される方法と理解され得る。消光の場合には、任意の要素が、色素または金属などのシグナルを消光するために使用され得る。このような場合には、通常、ドナー分子の発光波長が検出される。時間分解蛍光光度法において使用される通常の金属キレート化または錯体形成剤またはリガンドとして、３−（２−チエノイル）−１，１，１−トリフルオロアセトン、３−ベンゾイル−１，１，１−トリフルオロアセトン、コプロポルフィリン、ポルフィリン、３−ナフトイル−１，１，１−トリフルオロアセトン、２，２−ジメチル−４−ペルフルオロブチオイル−３−ブタノン、２，２’−ジピリジル、フェナントロリン、サリチル酸、フェナントロリンカルボン酸、アミノフェナントロリン、ジフェニルフェナントロリン、ジメチルフェナントロリン、ビピリジルカルボン酸、アザクラウンエーテル、トリオクチルホスフィンオキシド、アザクリプタンド、ジベンゾイルメタン、ジナフトイルメタン、ジビフェノイルメタン、ベンゾイルアセトナト、フェニラゾジベンゾイルメタン、ジチエニルプロパンジオン、４，４’−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ベンゾフェノン、トリス（６，６，７，７，８，８，８−ヘプタフルオロ−２，２−ジメチルオクタン−３，５−ジオン、（アルキルオキシフェニル）ピリジン−２，６−ジカルボン酸およびそれらの誘導体がある。金属イオンは、例えば、ランタニドまたはルテニウムイオンであり得る。（Ｓｅｌｖｉｎ  Ｐ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２０００年：７巻；  ７３０頁；Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｔ．  Ｄｉｓｃｕｓｓ．  Ｆａｒａｄａｙ  Ｓｏｃ．  １９５９年：２７巻；７；  Ｌａｔｖａ  Ｍ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ、１９９７年；Ｍｕｋｋａｌａ  Ｖ．−Ｍ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ、１９９３年；Ｗｏｈｒｌｅ  Ｄ．およびＰｏｍｏｇａｉｌｏ  Ａ．  Ｄ．  Ｍｅｔａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｓ  ｉｎ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、２００３年）。
【００４０】
好ましい実施形態では、ドナーおよびアクセプター標識間の相互作用は、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ドナーおよびアクセプターフルオロフォアが近接している場合に、ドナーフルオロフォアの蛍光エネルギーが、アクセプターフルオロフォアに移動し、アクセプターフルオロフォアのルミネッセンスが観察される現象を含む。ドナーおよびアクセプターフルオロフォアの任意の適した対が、ドナーおよびアクセプター標識として使用され得る。
【００４１】
特に好ましいドナーフルオロフォアは、ユウロピウム、テルビウム、サマリウムまたはジスプロシウムなどのランタニドである。ランタニドは、アクセプター発光の時間分解測定を可能にする長い寿命を有する。これは、生物学的材料からの自己蛍光および可能性ある直接アクセプター励起の効果を大幅に低減するので重要である。また、ランタニドの発光ピークは、十分に離れており、狭く、長いストロークのシフト（最大吸収および発光波長の間の距離）を示す。
【００４２】
アクセプターフルオロフォアは、ドナーの発光ピークの１つと重なる励起波長を有する任意のフルオロフォアであり得る。ランタニドキレートの発光ピークについては、表１を参照のこと。ドミナントピークは、太字で示されている。例えば、テルビウムドナーを用いる場合、励起波長およそ４９０ｎｍ、５４５ｎｍまたは６２０ｎｍを有する任意のフルオロフォアが使用され得る。したがって、フルオレセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒａ  ４８８、Ｄｙｌｉｇｈｔ  ４８８、ｄ２、Ｃｙ３、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０−Ｘ、ＥＧＦＰおよびＧＦＰ−Ｓ６５Ｔに代表される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の赤色シフト変異体などのフルオロフォアが、テルビウムと組み合わせて使用され得る。
【００４３】
【表１】
2015519569.tif 000003
【００４４】
代替実施形態では、ドナー標識およびアクセプター標識間の相互作用は、生物発光エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を含む。これは、ＦＲＥＴ技術のドナーフルオロフォアが、ルシフェラーゼなどの生物発光タンパク質によって置換されるという点でＦＲＥＴとは異なる。基質の存在下で、生物発光タンパク質からの生物発光が、ＦＲＥＴについてと同様のフォスター共鳴エネルギー移動機序によってアクセプター標識を励起する。
【００４５】
ＢＲＥＴのための適した対の決定において考慮させるべき判定基準は、生物発光タンパク質のものと比較したアクセプター標識の相対発光／蛍光スペクトルである。生物発光タンパク質の発光スペクトルは、生物発光タンパク質ルミネッセンス発光からの光エネルギーが、アクセプター標識を励起でき、２種の分子が、互いに関して適切な近接および配向にある場合に、それによってアクセプター標識蛍光を促進する波長にあるよう、アクセプタータンパク質の吸光度スペクトルと重ならなくてはならない。使用され得るＢＲＥＴの２種の一般的な実施は、ＧＦＰ突然変異体、ＹＦＰ（ＢＲＥＴ１；λｅｍ＝約５３０ｎｍ）またはＧＦＰ２（ＢＲＥＴ２；λｅｍ＝約５１０ｎｍ）のいずれかと対をなしているドナー系として、セレンテラジンｈ（ＢＲＥＴ１；λｅｍ＝約４７５ｎｍ）またはセレンテラジン４００ａ（Ｃｌｚ４００ａ）基質（ＢＲＥＴ２；λｅｍ＝約３９５ｎｍ）のいずれかを有するウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）を含む。しかし、当技術分野で公知であり、例えば、ＸｉａおよびＲａｏ（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  ２０巻：１〜８頁、２００９年）において概説されるような、ＢＲＥＴドナーおよびアクセプター標識の任意の適した対が使用され得る。
【００４６】
ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ／ＥＧＦＰの対は、観察可能な発光スペクトルピークに基づいてウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ／ＥＹＥＦの対と比較されてきた（Ｘｕ、１９９９年；Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｐｈｏｔｏｎｓ、Ｈａｓｔｉｎｇｓら編（Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、４１９〜４２２頁中の、Ｗａｎｇら（１９９７年））。可能性ある対を研究するためには、選択された生物発光タンパク質およびアクセプター分子を含有するタンパク質融合物が調製され、適当な基質の存在下で試験される。
【００４７】
好ましくは、ドナーおよびアクセプター標識は、膜タンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかで膜タンパク質と結合している。末端と結合している標識は、膜タンパク質の構造および活性に対して最小の効果しか有さない可能性が高い。しかし、原則として、標識は、膜タンパク質のフォールディングを妨げず、および／または活性に干渉しない限り、膜タンパク質のその他の領域中に置かれてもよい。当業者がこれを評価するのを可能にするための、タンパク質フォールディングおよび活性を評価するための技術は、当技術分野では標準的技法である。
【００４８】
第１および第２の集団の膜タンパク質が、標識が、例えば、膜タンパク質のＮまたはＣ末端で膜タンパク質と共有結合されるように、ドナーおよびアクセプター標識を用いて標識される場合が好ましい。例えば、第１の集団中の膜タンパク質が、ドナー標識と共有結合され得、第２の集団中の膜タンパク質が、アクセプター標識と共有結合され得るか、または第１の集団中の膜タンパク質が、アクセプター標識と共有結合され得、第２の集団中の膜タンパク質が、ドナー標識と共有結合され得る。
【００４９】
ドナーおよびアクセプター標識をタンパク質に共有結合させる技術は、当技術分野で周知であり、化学的コンジュゲーションを含めた任意の適した方法が使用され得る。
【００５０】
例えば、Ｃｉｓｂｉｏによって市販されているＴａｇ−ｌｉｔｅ（商標）システムが使用され得る［７、８、９］。これでは、対象の膜タンパク質が、ＳＮＡＰまたはＣＬＩＰタグの上流または下流に発現ベクター中にクローニングされる。ＳＮＡＰおよびＣＬＩＰタグは、哺乳動物Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡ−アルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）の改変された形態である関連タンパク質である。ＳＮＡＰタグおよびＣＬＩＰタグ基質は、ベンジル基がフルオロフォアなどの官能基と結合している、ベンジルプリンおよびベンジルピリミジンの誘導体である。標識化反応の際に、修飾されたベンジル基が、ＡＧＴ中の自由なシステインと反応し、官能基は共有結合される。このプラスミドからの膜タンパク質の発現の結果、Ｎ末端またはＣ末端にＳＮＡＰまたはＣＬＩＰタグを有する膜タンパク質が製造される。そして、膜タンパク質は、ドナーフルオロフォアとして作用するランタニド（テルビウムまたはユウロピウムなど）で標識され得る。したがって、膜タンパク質は、Ｔａｇ−ｌｉｔｅ（商標）システムを使用して、ＳＮＡＰおよびＣＬＩＰタグなどの末端タグ、例えば、Ｃ末端またはＮ末端タグを介して、ドナーまたはアクセプター標識（例えば、ドナーまたはアクセプターフルオロフォア）で標識され得る。Ｃ末端の正しい標識のために、官能基（例えば、フルオロフォア）と結合しているＳＮＡＰタグまたはＣＬＩＰタグ基質は、細胞膜を通ることができなければならないということは理解されよう。
【００５１】
ポリペプチド（例えば、ＧＦＰ）であるドナーおよびアクセプター標識については、標識は、融合ポリペプチドを形成することによって膜タンパク質と共有結合され得るということは理解されよう。融合ポリペプチドの調製は、当技術分野では日常的な実務であり、化学的コンジュゲーションを含み得るか、または標識された膜タンパク質が単一ポリヌクレオチドによって発現される組換え技術を含み得る。
【００５２】
代替実施形態では、ドナーおよびアクセプター標識は、膜タンパク質と非共有結合によって結合され得る。ただし、非共有結合相互作用は、工程（ｂ）において安定性調節物質および／または条件に耐えるのに十分なほど強い。このような非共有結合は、免疫学的結合またはビオチン／アビジンまたはストレプトアビジンなどによる結合を含み得る。非共有結合相互作用が十分に強いかどうかは、標識された膜タンパク質を安定性調節物質および／または条件に曝露することおよび曝露後に標識が膜タンパク質と結合したままであるかどうかを評価するための適当な分析技術を使用することによって決定され得る。
【００５３】
当然のことではあるが、ドナー標識またはアクセプター標識は、膜と直接的または間接的に結合され得る。「膜タンパク質と直接的に結合される」によって、本発明者らは、標識が共有結合または非共有結合のいずれかによって膜タンパク質と結合しているという意味を含む。「膜タンパク質と間接的に結合される」によって、本発明者らは、標識が、共有結合または非共有結合のいずれかによって更なる部分と結合しており、そして、更なる部分が共有結合または非共有結合によって膜タンパク質と結合しているという意味を含む。
【００５４】
安定性調節物質および／または条件に曝露した後に、ドナー標識は、アクセプター標識との距離依存性相互作用を可能にするよう活性化され、凝集のレベルが評価される。ドナー標識を活性化することによって、本発明者らは、ドナーおよびアクセプター標識間に距離依存性相互作用があるプロセスを開始することという意味を含む。プロセスは、光子のドナーによる発光または共鳴エネルギー移動によるエネルギーの移動をもたらすものまたはその他の方法であり得る。ドナー活性化因子の例として、光子（ＦＲＥＴドナーの場合におけるような）または生物発光タンパク質の基質（ＢＲＥＴドナーの場合におけるような）が挙げられる。したがって、ドナー標識を活性化することは、アクセプター標識との距離依存性相互作用につながるよう、ドナー標識を照射することまたはドナー標識を基質に曝露することを含み得る。
【００５５】
一実施形態では、工程（ｂ）を実施せずに、方法の工程（ａ）および（ｃ）を実施することも望ましいものであり得る。これは、膜タンパク質が安定性調節物質および／または条件に曝露される場合の凝集のレベルと比較され得る、膜タンパク質が、安定性調節物質および／または条件に曝露されない場合のバックグラウンド凝集を示すことを提供する。言い換えれば、アッセイは、安定性調節物質および／または条件に対する曝露を行わずに、第１および第２の集団の膜タンパク質間の凝集が評価される工程が先行する。
【００５６】
本発明の第２の態様は、
（ａ）膜タンパク質集団を含むサンプルを提供することと、
（ｂ）膜タンパク質集団を、安定性調節物質および／または条件に曝露することと、
（ｃ）膜タンパク質のＮ末端またはＣ末端の一方を、ドナー標識を用いて、膜タンパク質のＮ末端またはＣ末端のもう一方をアクセプター標識を用いて標識することと、
（ｄ）ドナー標識を活性化して、アクセプター標識との距離依存性相互作用を可能にし、相互作用が検出可能なシグナルを生成することによって集団中の膜タンパク質の凝集を評価することと
を含む、膜タンパク質のコンホメーション安定性を評価するためのアッセイを提供する。
【００５７】
このアッセイでは、膜タンパク質の凝集は、ドナー標識およびアクセプター標識が、凝集した場合に膜タンパク質の末端を標識できないことによって検出される。膜タンパク質が凝集すると、膜タンパク質上の標識部位は、接近できないようになり、そのため、ドナーおよびアクセプター標識は、互いに近接できず、それによって、検出可能なシグナルを生成できない。膜タンパク質が安定である場合には、不安定化物質および／または条件に対する曝露の際に、凝集は少なく、そのため、シグナルがより多いのに対し、膜タンパク質が不安定である場合には、不安定化物質および／または条件に対する曝露の際に、凝集はより多く、そのため、シグナルは少ない。
【００５８】
膜タンパク質集団、ドナー標識およびアクセプター標識についての優先は、本発明の第１の態様に関連して上記で記載されたものを含む。
【００５９】
好都合なことに、膜タンパク質のＮ末端またはＣ末端の一方は、ドナー標識を用いて非共有結合によって標識され得、膜タンパク質のＮ末端またはＣ末端のもう一方は、アクセプター標識を用いて非共有結合によって標識され得る。したがって、膜タンパク質は、Ｎおよび／またはＣ末端に、非共有結合によって、ドナーまたはアクセプター標識と直接的または間接的に結合し得る部分を含有するよう操作され得る。例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端は、抗体によって認識され、順に、ドナー標識またはアクセプター標識を用いて標識されるｃ−Ｍｙｃタグなどのタグを含有し得る。同様に、Ｎ末端および／またはＣ末端は、結合パートナー対（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン／アビジン）の一方のメンバーによって認識される部分を含有し得、結合パートナー対のもう一方のメンバーが、順に、ドナー標識またはアクセプター標識を用いて標識される。実施例１には、ＧＰＣＲがビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）を用いてＮ末端にタグが付けられ、ｃ−Ｍｙｃタグを用いてＣ末端にタグが付けられるこの原則が例示されている。そして、ＧＰＣＲは、ｄ２を用いて標識されたストレプトアビジンと、テルビウムを用いて標識された抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を混合することによって標識され得る。末端で標識することによって、標識は、膜タンパク質の三次構造を認識できることを必要とせず、そのため、標識がないことは、必ずしも凝集と相関していないリガンドまたは抗体結合部位の変化によって歪められないタンパク質凝集の直接的な尺度である。
【００６０】
標識化が、安定性調節物質および／または条件に耐え得るという条件で、工程（ｂ）に先立って、末端の一方が標識されるということは理解される。
【００６１】
好ましくは、以下にさらに記載されるように、変性剤／変性条件は、末端の一方または両方の標識化の前に除去され、標識化手順に悪影響を及ぼすことを最小化する。
【００６２】
安定性調節物質および／または条件に対する曝露後、膜タンパク質の末端が標識される。Ｎ末端が、ドナー標識で標識され、Ｃ末端がアクセプター標識で標識されるか、Ｃ末端がドナー標識で標識され、Ｎ末端がドナー標識で標識される、のいずれかである。
【００６３】
膜タンパク質に付加される標識の量が、最小量の標識試薬を使用しながら最大の距離依存性相互作用シグナルを与える量である場合が好ましい。量は経験的に容易に決定され得、一般的に、標識の選択および膜タンパク質の発現レベルに応じて変わる。量を最適化することは、対象の膜タンパク質を含有する溶解物ならびに模擬溶解物で種々の量のアクセプターおよびドナー標識の滴定マトリックスを行うことを含み得る。最適量は、最小量の標識化試薬を使用しながら、膜タンパク質を含有する溶解物と模擬溶解物の間のような距離依存性相互作用シグナル（例えば、ＦＲＥＴシグナル）において最大の相違をもたらすものである。本発明者らは、ストレプトアビジン−ｄ２およびＭｙｃ−Ｔｂのこのような最適化を実施し、１ｎＭおよび１００ｎＭのそれぞれの最適濃度を同定した。
【００６４】
アクセプター標識との距離依存性相互作用を可能にするためのドナー標識の活性化後、そして、凝集のレベルが評価される。
【００６５】
一実施形態では、工程（ｂ）を実施せずに、本方法の工程（ａ）および（ｃ）を実施することが望ましいものであり得る。これは、膜タンパク質が安定性調節物質および／または条件に曝露される場合の凝集のレベルと比較され得る、膜タンパク質が、安定性調節物質および／または条件に曝露されない場合のバックグラウンド凝集を示すことを提供する。言い換えれば、アッセイは、安定性調節物質および／または条件に対して曝露せずに、第１および第２の集団の膜タンパク質間の凝集が評価される工程が先行し得る。
【００６６】
当然のことではあるが、本発明はまた、Ｎ末端またはＣ末端の一方が、ドナー標識（例えば、ドナーフルオロフォア）と結合しており、Ｎ末端またはＣ末端のもう一方がアクセプター標識（例えば、アクセプターフルオロフォア）と結合している膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）を提供する。したがって、本発明の第２の態様のアッセイにおいて使用される任意の標識された膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）は、本発明の範囲内に含まれる。膜タンパク質、ドナー標識およびアクセプター標識についての優先は、上記で定義のとおりである。したがって、膜タンパク質は、Ｎ末端と結合しているドナーフルオロフォア（例えば、テルビウム）およびＣ末端と結合しているドナーフルオロフォア（例えば、ＥＧＦＰ）を有するＧＰＣＲであり得る。膜タンパク質の末端との標識の結合は、直接である必要はなく、例えば、順に、膜タンパク質と結合している末端タグなどのさらなる部分と結合している標識によって間接であり得るということは理解されよう。また、標識は、非共有結合または共有結合によって、膜タンパク質の末端と結合され得るということも理解されよう。本発明はまた、膜タンパク質のコンホメーション安定性を測定するためのアッセイにおけるこのような膜タンパク質の使用を提供する。
【００６７】
本発明のアッセイにおける安定性調節物質および／または条件は、好ましくは、変性剤および／または条件、例えば、熱、ｐＨ、界面活性剤またはカオトロピック物質のうち１種以上から選択される１種である。当然のことではあるが、タンパク質の二次および三次構造を調節するが、タンパク質の一次構造は調節しないと知られている、任意の変性剤および／または条件が使用され得る。
【００６８】
熱に対する安定性（すなわち、熱安定性）に関連して、「準Ｔｍ」または「準Ｔａｇｇ」すなわち、記載された条件下で、所与の期間（例えば、３０分）インキュベートした後に、膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）の５０％が凝集される温度を決定することは、好都合であり得る。それらの親と比較して、より高い熱安定性を有する突然変異体膜タンパク質は、より高い準ＴｍまたはＴａｇｇを有する。
【００６９】
界面活性剤に対する、またはカオトロープに対する安定性に関連して、通常、膜タンパク質は、試験界面活性剤または試験カオトロピック物質の存在下で規定の期間インキュベートされ、本発明のアッセイを使用して安定性が決定される。
【００７０】
極端なｐＨに関連して、通常の試験ｐＨは、（例えば、４．５〜５．５（低ｐＨ）の範囲で、または８．５〜９．５（高ｐＨ）の範囲で選択される。
【００７１】
結晶化手順の際に比較的厳しい界面活性剤が使用されるので、膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）が、このような界面活性剤の存在下で安定であることが好ましい。特定の界面活性剤の「厳しさ」の順序は、ＤＤＭ、Ｃ１１→Ｃ１０→Ｃ９→Ｃ８マルトシドまたはグルコシド、ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）およびＳＤＳである。膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）が、Ｃ９マルトシドまたはグルコシド、Ｃ８マルトシドまたはグルコシド、ＬＤＡＯおよびＳＤＳのいずれかに対してより安定である場合が特に好ましく、これらの界面活性剤が、安定性試験のために使用されることが好ましい。
【００７２】
当然のことではあるが、熱は、不安定化条件として作用し、これは、サンプルを冷却することによって、例えば、氷上に置くことによって容易に除去され得る。熱安定性はまた、その他の変性または不安定化物質および／または条件に対する安定性に対する案内であり得ると考えられる。したがって、熱安定性の増大は、不安定化界面活性剤、特に、ＤＤＭよりも不安定化させるもの、例えば、より小さい頭部基および短いアルキル鎖を有し、および／または電荷を有する頭部基を有する界面活性剤における安定性に変換できる可能性が高い。本発明者らは、熱安定性ＧＰＣＲはまた、例えば、厳しい界面活性剤に対してより安定であるということを見出した。
【００７３】
不安定化条件として極端なｐＨが使用される場合には、当然のことではあるが、これは、中和剤を添加することによって迅速に除去され得る。同様に、不安定化剤としてカオトロープが使用される場合には、不安定化効果は、カオトロープが、そのカオトロピック効果を発揮する濃度未満にサンプルを希釈することによって除去され得る。
【００７４】
本発明のアッセイの相当な利点は、標識されたリガンドを回収するための分離工程を含む必要がないということである。これは、放射標識されたリガンドの使用を含む膜タンパク質安定性を測定する既知方法からの重要な相違である。このような既知方法では、結合していない放射標識は、放射標識の検出に先立って洗浄工程で除去されなければならない。この分離工程は、既知方法を骨の折れる、ハイスループット適用に適さないものにする。
【００７５】
本発明のアッセイは、膜タンパク質の安定性の指標としてリガンド結合を使用しないが、工程（ａ）において提供されるサンプル中に膜タンパク質のリガンドを含むことは有益であり得る。リガンドの存在は、特に、膜タンパク質がＧＰＣＲである場合には、安定性を改善し、および／または、望ましいコンホメーションでＧＰＣＲを安定化する確率を増大し得る。同様に、特定のコンホメーション状態は、任意のｐＨ、塩、金属イオン、温度、カオトロピック物質およびグリセロールなどの生理化学的パラメータを変更することまたは添加剤を使用することによって濃縮され得る。種々のパラメータ下で、リガンド結合親和性または機能アッセイなどの標準的な薬理学的特性決定を行うことによって、特定のコンホメーションを支持するよう生理化学的パラメータを最適化し得る。
【００７６】
「リガンド」によって、本発明者らは、ＧＰＣＲなどの膜タンパク質と結合する任意の分子を含む。
【００７７】
膜タンパク質がＧＰＣＲである場合には、リガンドは、通常、ＧＰＣＲの１種のコンホメーションと結合する（ＧＰＣＲにこのコンホメーションを選ばせ得る）が、ＧＰＣＲが選ぶことができる別のコンホメーションとはそれほど強力に結合しない。したがって、リガンドの存在は、ＧＰＣＲが特定のコンホメーションを選ぶことを促すと考えられ得る。好ましくは、リガンドは、リガンドのアゴニストクラスに由来し、特定のコンホメーションは、アゴニストコンホメーションであるか、またはリガンドは、リガンドのアンタゴニストクラスに由来し、特定のコンホメーションは、アンタゴニストコンホメーションである。
【００７８】
多数の適したリガンドが公知である。
【００７９】
通常、リガンドは、完全アゴニストであり、膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲなどの受容体）と結合でき、例えば、Ｇタンパク質共役、下流シグナル伝達事象または血管拡張などの生理学的結果によって測定される、完全な（１００％の）生物学的応答を誘発できる。したがって、通常、生物学的応答は、Ｇタンパク質におけるＧＤＰ／ＧＴＰ交換と、それに続く、連動するエフェクター経路の刺激である。測定値は、通常、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換または経路の最終産物（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰまたはイノシトールホスフェート）のレベルの変化である。リガンドはまた、部分アゴニストであり得、ＧＰＣＲと結合でき、部分的な（＜１００％の）生物学的応答を誘発できる。
【００８０】
リガンドはまた、膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲなどの受容体）と結合し、その基底（すなわち、アゴニストによって刺激されていない）活性を、時には、ゼロにまで低減する分子であるインバースアゴニストであり得る。
【００８１】
リガンドはまた、膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲなどの受容体）と結合し、アゴニストの結合を遮断し、従って生物学的応答を妨げる分子であるアンタゴニストであり得る。インバースアゴニストおよび部分アゴニストは、特定のアッセイ条件下では、アンタゴニストであり得る。
【００８２】
上記のリガンドは、オルソステリックであり得、それによって、本発明者らはそれらが内因性アゴニストと同一部位と結合するという意味を含み、またはそれらはアロステリックもしくはアロトピック（allotopic）であり得、それによって、本発明者らは、それらがオルソステリック部位とは異なる部位と結合するという意味を含む。上記のリガンドは、シントピック（syntopic）であり得、それによって、本発明者らは、それらが、同一または重複する部位でその他のリガンド（複数可）と相互作用するという意味を含む。それらは、可逆性であっても、不可逆性であってもよい。
【００８３】
アンタゴニストとの関連では、それらは、サーマウンタブル（surmoutable）であり得、それによって、本発明者らは、アゴニストの最大効果が、アンタゴニストによる前処理または同時処理のいずれかによって低減されないという意味を含み、またはそれらはインサーマウンタブル（insurmountable）であり得、それによって、本発明者らは、アゴニストの最大効果が、アンタゴニストによる前処理または同時処理のいずれかによって低減されるという意味を含み、またはそれらはニュートラルであり得、それによって、本発明者らは、アンタゴニストがインバースアゴニストまたは部分アゴニスト活性を伴わないものであるという意味を含む。アンタゴニストはまた、通常、インバースアゴニストである。
【００８４】
本発明において使用するためのリガンドはまた、正のアロステリックモジュレーター、ポテンシエーター、負のアロステリックモジュレーターおよび阻害剤などのアロステリックモジュレーターであり得る。それらは、それ自体でアゴニストまたはインバースアゴニストとしての活性を有し得るか、またはそれらはアゴニストまたはインバースアゴニストの存在下でのみ活性を有する場合もあり、この場合には、それらは、膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）と結合するためにこのような分子と組み合わせて使用される。
【００８５】
参照により本明細書に組み込まれるＮｅｕｂｉｇら（２００３年）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｖ．  ５５巻、５９７〜６０６頁には、種々のクラスのリガンドが記載されている。
【００８６】
好ましくは、上記のリガンドは、小さい有機または無機部分であるが、それらはペプチドまたはポリペプチドであり得る。通常、リガンドが小さい有機または無機部分である場合には、１００〜１０００、例えば、１００〜５００などの５０〜２０００のＭｒを有する。
【００８７】
通常、リガンドは、μＭ（マイクロモル）〜ｎＭの範囲などのｍＭ〜ｐＭのＫｄで膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）と結合する。一般に、最低Ｋｄを有するリガンドが好ましい。
【００８８】
小さい有機分子リガンドは、当技術分野で周知である。その他の小さい分子のリガンドとして、５ＨＴ１Ａ受容体での完全アゴニストである５ＨＴ、５ＨＴ１Ａ受容体での部分アゴニストであるエルトプラジン（eltoprazine）が挙げられる（Ｎｅｗｍａｎ−Ｔａｎｃｒｅｄｉら（１９９７年）  Ｎｅｕｒｏｐｈａｍａｃｏｌｏｇｙ  ３６巻、４５１〜４５９頁を参照）；（＋）−ブタクラモールおよびスピペロンはドーパミンＤ２受容体インバースアゴニストである（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＆  Ｓｔｒａｎｇｅ（２００５年）Ｂｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １４５巻、３４〜４２頁を参照のこと）；ＷＩＮ５５２１２−３はＣＢ２のニュートラルアンタゴニストである（Ｓａｖｉｎａｉｎｅｎら（２００５）  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １４５巻、６３６〜６４５頁）。
【００８９】
リガンドは、ペプチド模倣薬、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはアプタマーであり得る。Ｎａ＋またはＺｎ２＋などのイオン、オレアミドなどの脂質またはヘパリンなどの炭水化物であり得る。
【００９０】
リガンドは、膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲなどの受容体）と結合するポリペプチドであり得る。このようなポリペプチド（それによって本発明者らは、オリゴペプチドを含む）は、通常、Ｍｒ５００〜Ｍｒ５０，０００であるが、より長いものであってもよい。ポリペプチドは、特定のコンホメーションのＧＰＣＲと選択的に結合するという条件で、天然に存在するＧＰＣＲと相互作用するタンパク質またはＧＰＣＲもしくはその誘導体もしくは断片と相互作用するその他のタンパク質であり得る。ＧＰＣＲと相互作用するタンパク質として、ＧＰＣＲのＣ末端部分においてＰＤＺドメインを介して作用することが多い、シグナル伝達と関連するものおよび輸送と関連するものが挙げられる。
【００９１】
特定のＧＰＣＲと結合することがわかっているポリペプチドとして、Ｇタンパク質、アレスチン、ＲＧＳタンパク質、Ｇタンパク質受容体キナーゼ、ＲＡＭＰ、１４−３−３タンパク質、ＮＳＦ、ペリプラキン（periplakin）、スピノフィリン、ＧＰＣＲキナーゼ、受容体チロシンキナーゼ、イオンチャンネルまたはそのサブユニット、アンキリンおよびＳｈａｎｋｓまたはＨｏｍｅｒタンパク質のいずれかが挙げられる。その他のポリペプチドとして、ＮＭＤＡ受容体サブユニットＮＲ１またはＮＲ２ａ、カルシオン（calcyon）またはフィブロネクチンドメインフレームワークが挙げられる。ポリペプチドは、フィビュリン−１などのＧＰＣＲの細胞外ドメインと結合するものであり得る。ポリペプチドは、ヘテロオリゴマーで選択されたＧＰＣＲと結合する別のＧＰＣＲであり得る。ＧＰＣＲでのタンパク質間相互作用の概説は、参照により本明細書に組み込まれるＭｉｌｌｉｇａｎおよびＷｈｉｔｅ（２００１年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２２巻、５１３〜５１８頁に、またはＢｏｃｋａｅｒｔら（２００４年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｄｅｖ．  ７巻、６４９〜６５７頁に見られる。
【００９２】
ポリペプチドリガンドは、好都合に、膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）と結合する抗体であり得る。用語「抗体」によって、本発明者らは、天然に存在する抗体、モノクローナル抗体およびその断片を含む。本発明者らはまた、操作された抗体ならびに一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子およびドメイン抗体（ｄＡｂ）を含めた、その結合特徴において抗体様である分子を含む。ラクダ科動物抗体および操作されたラクダ科動物抗体も言及される。ＧＰＣＲと結合するこのような分子は、当技術分野で公知であり、いずれにしても、周知の技術を使用して作製され得る。適した抗体として、ＧＰＣＲのためのラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において現在使用されるものが挙げられるが、これは、それらが、コンホメーションエピトープを認識する傾向があるからである。
【００９３】
ポリペプチドはまた、アンキリンリピートタンパク質、アルマジロリピートタンパク質、ロイシンリッチタンパク質、テトラトリオペプチドリピートタンパク質または設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）またはリポカリンまたはフィブロネクチンドメインをベースとするタンパク質またはヒトγクリスタリンまたはヒトユビキチンのいずれかに基づいたアフィリン骨格などのモジュラーフレームワークに基づいた結合タンパク質であり得る。
【００９４】
当然のことではあるが、抗体またはその他の「万能な」結合ポリペプチド（多数の異なるＧＰＣＲと共役することがわかっているＧタンパク質など）の使用は、天然リガンドおよび小分子リガンドが未知である「オーファン」ＧＰＣＲでの方法の使用において特に有利であり得る。
【００９５】
当然のことではあるが、上記のアッセイは、コンホメーション安定性の増大した膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）を選択する方法において使用され得る。このような方法は、標識されたリガンドを回収するための分離工程が必要ないという既存の方法を上回る利点を有する。また、本方法は、界面活性剤中で高親和性および／または都合のよい特性を有する良好な放射性リガンドが入手可能ではない場合でさえ実施され得る。
【００９６】
したがって、本発明の第３の態様は、
（ａ）本発明の第１または第２の態様のアッセイに従って、親膜タンパク質の１種以上の突然変異体のコンホメーション安定性を、親膜タンパク質のコンホメーション安定性と比較することと
（ｂ）親膜タンパク質と比較してコンホメーション安定性が増大した１種以上の突然変異体を選択することと
を含む、コンホメーション安定性の増大した膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）を選択する方法を提供する。
【００９７】
上記のような本発明のいずれかのアッセイにおいてリガンドを含むことによって、本発明の第３の態様の方法は、生物学的に重要なコンホメーション（例えば、リガンドが結合した状態）で捕捉され、そのコンホメーションに関してより安定である膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）を選択する方法であると考えられ得る。好ましくは、リガンドは、リガンドのアゴニストクラスに由来し、特定のコンホメーションは、アゴニストコンホメーションであるか、またはリガンドは、リガンドのアンタゴニストクラスに由来し、特定のコンホメーションは、アンタゴニストコンホメーションである。
【００９８】
突然変異体膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）は、任意の適した方法によって調製され得る。好都合には、突然変異体タンパク質は、適した核酸分子によってコードされ、適した宿主細胞において発現される。適した核酸分子の調製、発現系および宿主細胞として、上記のものが挙げられる。
【００９９】
本発明の特定の実施形態では、膜タンパク質は、ＣＣＲ５であり、ドナー標識は、テルビウムであり、アクセプター標識は、ＥＧＦＰである。テルビウムは、ＳＮＡＰタグ技術を使用することによってＮ末端と結合され得る。ＥＧＦＰは、Ｃ末端融合物として発現されることによってＣ末端と結合され得る。
【０１００】
本発明のさらに好ましい実施形態では、膜タンパク質は、ＣＣＲ５であり、ドナー標識は、テルビウムであり、アクセプター標識は、ｄ２である。テルビウムは、Ｃ末端のｃ−Ｍｙｃエピトープと結合している抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を標識することによって、Ｃ末端と非共有結合によって結合され得る。ｄ２は、ストレプトアビジンを標識し、ストレプトアビジンがビオチンと結合され、順に、これが、Ｎ末端と融合しているビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）と結合することによって、Ｎ末端と非共有結合によって結合され得る。
【０１０１】
本発明の特定の実施形態では、膜タンパク質は、ＧＬＰ１Ｒ、ＣＭＫＬＲまたはＴＧＲ５（ＧＰＢＡＲ−Ｉ）のいずれかなどのＧＰＣＲであり、ドナー標識は、テルビウムであり、アクセプター標識は、ＥＧＦＰである。テルビウムは、ＳＮＡＰタグ技術を使用することによってＮ末端と結合され得る。ＥＧＦＰは、Ｃ末端融合物として発現されることによってＣ末端と結合され得る。
【０１０２】
本発明のさらに好ましい実施形態では、膜タンパク質は、ＧＬＰ１Ｒ、ＣＭＫＬＲまたはＴＧＲ５（ＧＰＢＡＲ−Ｉ）のいずれかなどのＧＰＣＲであり、ドナー標識は、テルビウムであり、アクセプター標識は、ｄ２である。テルビウムは、Ｃ末端のｃ−Ｍｙｃエピトープと結合している抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を標識することによって、Ｃ末端と非共有結合によって結合され得る。ｄ２は、ストレプトアビジンを標識し、ストレプトアビジンがビオチンと結合され、順に、これが、Ｎ末端と融合しているビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）と結合することによって、Ｎ末端と非共有結合によって結合され得る。
【０１０３】
本発明をここで、以下の図面および実施例を用いて説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】（ａ）分子間凝集アッセイの原理を示す図である。テルビウム標識されたか、またはＥＧＦＰタグを付けられた受容体を可溶化し、精製する。１：１混合されたサンプルを加熱し、ＦＲＥＴを測定する。（ｂ）このアッセイを使用して測定される受容体安定性の一例を示す図であり、値は、Ｔａｇｇを表す。
【図２】（ａ）分子内凝集アッセイの原理を示す図である。インビボビオチン化受容体を、可溶化し、種々の温度でインキュベートする。そして、溶解物を、ｄ２標識されたストレプトアビジンおよびテルビウム標識された抗ｃＭｙｃ抗体と混合し、ＦＲＥＴを測定する。加熱誘導性凝集の際に、ＦＲＥＴのレベルが、受容体を標識するための部位の接近しにくさのために低下する。（ｂ）このアッセイを使用して測定される受容体安定性の一例を示す図であり、値は、Ｔａｇｇを表す。Ｕは、模擬トランスフェクトされた細胞から調製された溶解物において測定されたＦＲＥＴ値を表す。ＦＲＥＴ比は、６２０ｎｍでの発光に対して正規化された６５０ｎｍでの発光を表す。
【図３】分子内凝集アッセイを使用して測定された、野生型および突然変異体（Ｔ３５５Ｆ）ＧＬＰ１Ｒの安定性を示す図である。野生型およびＴ３５５ＦのＧＬＰ１Ｒ構築物（何れもＮ末端にＢＡＰタグが付けられ、Ｃ末端にｃ−Ｍｙｃタグが付けられた）を共発現させた。１％ＤＤＭ中で可溶化した後、サンプルを種々の温度で３０分間インキュベートした。ｄ２標識したストレプトアビジンおよびテルビウム標識された抗ｃＭｙｃ抗体の添加後にＦＲＥＴを測定した。
【実施例１】
【０１０５】
受容体安定化の方法論
受容体安定化のための本発明者らの従来法は、活性受容体のレベルを測定するためにリガンド結合を使用する。手短には、放射標識されたリガンドとともにインキュベートされた可溶化受容体を、種々の温度で一定時間加熱する。そして、過剰の結合していないリガンドを、受容体と結合しているリガンドから分離し、残りの放射能レベルを測定する。このデータを、温度に対してプロットすることによって、熱崩壊曲線が得られ、Ｔｍ値が、受容体活性の５０％が保持される温度として定義される。明らかに、この方法は、界面活性剤中で高親和性および都合のよい特性を有する良好な放射性リガンドを入手できることに頼るものである。したがって、このようなリガンドが入手可能ではない場合に、本発明者らが受容体を安定化できる新規方法論を開発することが必要であった。本発明者らは、これらの方法論を、リガンド非依存法と呼び、これは、リガンドは、安定性を高めるため、または受容体を所望のコンホメーションで安定化する確率を高めるために存在し得るが、受容体のリガンド結合能は、受容体活性を測定するために使用されないことを意味する。
【０１０６】
分子間凝集アッセイ
アンフォールディングの際のタンパク質凝集は、種々のタンパク質において種々の程度で生じる、すべてのタンパク質の一般的な特徴である。膜タンパク質は、可溶化後に高レベルの凝集を、変性後にはさらに示すことがわかっている。したがって、凝集のレベルを、全体的な安定性の尺度として使用することが可能である。
【０１０７】
凝集が、容易な、小型化可能な形式で測定されるのを可能にするアッセイは、安定な受容体を作製するための有用なツールである。上記の生物物理学的方法を含め、凝集が測定され得るいくつかの異なる方法がある。これらの方法のうちほとんどが、多量の極めて純粋なタンパク質を必要とする。
【０１０８】
本発明者らは、受容体凝集が、少量の半精製された調製物から測定されることを可能にする方法を開発した。このアッセイを使用して受容体凝集を測定するために、ＦＲＥＴアクセプター基またはＦＲＥＴドナー基のいずれかを用いて受容体の２種の集団を標識する（図１ａ）。本発明者らは、ＦＲＥＴドナーとして作用するテルビウムを用いて受容体をＮ末端で標識するためにＳＮＡＰタグ技術を使用した。ＦＲＥＴアクセプターは、Ｃ末端融合物として発現されるＥＧＦＰである。これら２種の受容体の集団を発現させ、可溶化し、別個に部分精製する。２セットの半純粋調製物を１：１比で混合し、混合物を種々の温度で一定時間インキュベートする。受容体がアンフォールディングして、凝集体が形成すると、ＦＲＥＴアクセプターおよびドナーが近接し、ＦＲＥＴ発光をもたらす。ＦＲＥＴの増大を温度に対してプロットし、５０％ＦＲＥＴが観察される温度が、Ｔａｇｇと定義される（図１ｂ）。
【０１０９】
分子内凝集アッセイ
このアッセイは、これまでの方法の変法である。このアッセイでは、ＦＲＥＴアクセプターおよびドナーを、同一受容体分子のＮおよびＣ末端に配置する。しかし、重要なことに、受容体は、可溶化され、加熱され、その後、ＦＲＥＴアクセプターおよびドナーを用いて標識化される。そのため、受容体がアンフォールディングし、凝集すると、ＦＲＥＴアクセプターおよびドナー標識の部位が覆い隠され、従って、接近しにくくなる。これが、順に、温度の関数としてＦＲＥＴの喪失をもたらし、Ｔａｇｇは、５０％ＦＲＥＴが観察される温度として定義される（図２ａ）。この実施例では、受容体は、ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）を用いてＮ末端でタグが付けられ、ｃＭｙｃタグを用いてＣ末端でタグが付けられる。受容体は、ビオチンリガーゼＡ（ＢｉｒＡ）酵素と共発現され、これが、Ｎ末端でビオチン化された受容体の発現につながる。可溶化後、粗溶解物を種々の温度で一定期間インキュベートする。そして、溶解物を、ｄ２で標識されたストレプトアビジンおよびテルビウムで標識された抗ｃＭｙｃ抗体と混合する。そして、ＦＲＥＴのレベルを測定し、温度に対してプロットする（図２ｂ）。
【０１１０】
この方法が、熱安定性突然変異を同定できたかどうかを確かめるために、部位特異的突然変異誘発を使用してＧＬＰ１Ｒをコードするプラスミドにおいて、いくつかの突然変異体を作製した。そして、分子内凝集アッセイを使用して、突然変異体の熱安定性を評価し、野生型ＧＬＰ１Ｒと比較した。図３は、ＧＬＰ１Ｒの熱安定性において約６℃の増大を付与するＴ３５５Ｆ突然変異の例示的データを示す。図からわかるように、安定化された突然変異体ＧＬＰ１ＲのＴａｇｇの値は、野生型ＧＬＰ１Ｒのものよりも高い。
【０１１１】
材料および方法
受容体発現
記載されるすべての場合において、受容体は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において一過性に発現された。手短には、細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含有する１０ｃｍペトリ皿に３×１０６個細胞の密度で播種し、３７℃インキュベーター中で一晩インキュベートした。翌日、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅを製造業者の説明書に従って使用して、細胞を、６μｇの、対象の受容体をコードするプラスミドを使用してトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を３７℃のインキュベーターで約４０時間インキュベートした。
【０１１２】
受容体可溶化
トランスフェクション後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水中に回収し、同一バッファーで１回洗浄した。そして、細胞を、１％のｎ−ドデシル−β−マルトシド（ＤＤＭ）およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを補給した、５０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）および１５０ｍＭのｐＨ７．５に調整した塩化ナトリウムを含有する合計１ｍＬの可溶化バッファー中で可溶化した。受容体を徹底的に回転しながら１時間可溶化した。すべての可溶化工程ならびにその後の工程は、４℃で実施した。
【０１１３】
分子間凝集アッセイ
上記のように、ＳＮＡＰタグを付けた、およびＥＧＦＰタグを付けた受容体を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において別個に発現させた。可溶化に先立って、ＳＮＡＰタグを付けた受容体を回収し、２５０ｎＭのＳＮＡＰ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（Ｃｉｓｂｉｏ）を含有するＤＭＥＭ＋ＦＢＳに再懸濁し、３７℃インキュベーターで１時間インキュベートして、Ｎ末端を標識した。そして、細胞を１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄して、過剰な結合していないＳＮＡＰ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂを除去した。最後の洗浄後、細胞を、ＥＧＦＰタグを付けた受容体を発現する細胞とともに並行して１％ＤＤＭ中で可溶化した。粗溶解物を、４℃、１３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって清澄化した。清澄化された溶解物を、２５０μＬの、可溶化バッファーで予め平衡化した５０％スラリーＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂とともにインキュベートし、Ｃ末端１０×Ｈｉｓタグを使用して受容体を精製した。混合物を、徹底的に回転しながら４℃で１．５時間インキュベートし、そして、１ｍＬの、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％ＤＤＭ、２０ｍＭイミダゾールを含有し、ｐＨを７．５に調整した冷却洗浄バッファーを用いて３回洗浄した。最後の洗浄後、受容体を、５００μＬの、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％ＤＤＭおよび１００ｍＭヒスチジンを含有し、ｐＨを７．５に調整した溶出バッファーに溶出した。Ｌｕｍｉ４Ｔｂタグを付けた、およびＥＧＦＰタグを付けたサンプルを、１：１混合し、アリコートを増大する温度で３０分間インキュベートした。そして、サンプルを４℃に戻し、白色９６ウェルプレートに移し、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  Ｐｌｕｓ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）機器を使用して、Ｌｕｍｉ４ＴｂおよびＥＧＦＰ間でＦＲＥＴを測定した。ＦＲＥＴ設定は、製造業者の推奨に従った。
【０１１４】
分子内凝集アッセイ
上記のように、ビオチンアクセプタータグ（ＢＡＰ）を用いてＮ末端に、ｃ−Ｍｙｃタグを用いてＣ末端にタグを付けられた受容体を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において一過性に発現させた。プラスミドがまた、ＢＡＰタグでのビオチン化を媒介するＢｉｒＡ酵素をコードするということは注目すべきである。細胞は、発現の際に１００μＭのビオチンとともにインキュベートした。回収および可溶化後、清澄化された溶解物のアリコートを、増大する温度で３０分間インキュベートした。サンプルを４℃に冷却し、２ｎＭの、テルビウム（Ｃｉｓｂｉｏ）とコンジュゲートしている抗ｃＭｙｃ抗体および２００ｎＭの、ｄ２フルオロフォア（Ｃｉｓｂｉｏ）とコンジュゲートしているストレプトアビジンを含有する白色３８４ウェルプレート中に予め等分された２０μＬのＦＲＥＴ混合物に、各サンプルの２０μＬを加えた。プレートを４℃で一晩インキュベートし、その後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＰｌｕｓでＦＲＥＴシグナルを製造業者の推奨に従って測定した。
【０１１５】
【表２】
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【０１１６】
【表３】
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【０１１７】
【表４】
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【０１１８】
【表５】
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【０１１９】
【表６】
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【０１２０】
【表７】
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【０１２１】
【表８】
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【０１２２】
【表９】
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【０１２３】
【表１０】
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【０１２４】
【表１１】
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【０１２５】
【表１２】
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【０１２６】
【表１３】
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【０１２７】
【表１４】
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【０１２８】
【表１５】
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【０１２９】
参考文献
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７．  Ｈ  Ｂａｚｉｎ、Ｅ  Ｔｒｉｎｑｕｅｔ、Ｇ  Ｍａｔｈｉｓ  （２００２年）  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８２巻、２３３〜２５０頁
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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