(57)【要約】  第１の肺疾患を有する対象対健常な対象又は第２の肺疾患を有する対象における差次的な発現を示すバイオマーカータンパク質を同定する方法が提供される。また、これらのバイオマーカータンパク質を含む組成物、様々な肺疾患を診断し、分類し、監視するために、これらのバイオマーカータンパク質又はバイオマーカータンパク質パネルを用いる方法も提供される。本明細書において提供される方法及び組成物は、肺癌又は非癌性疾患を有する対象を診断又は分類し、種々の癌を（例えば、悪性対良性、ＳＣＬＣ対ＮＳＣＬＣ）を区別するために使用されてもよい。
2015506466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における肺疾患が癌である可能性を決定する方法であって、
（ａ）対象から得られたサンプル中のタンパク質パネルの存在量を測定し、ここで、該パネルは、ＡＬＤＯＡ、ＦＲＩＬ、ＬＧ３ＢＰ、ＩＢＰ３、ＬＲＰ１、ＩＳＬＲ、ＴＳＰＣＯＩＡ１、ＧＲＰ７８、ＴＥＴＮ、ＰＲＸＤ１及びＣＤ１４からなる群から選択される少なくとも４つのタンパク質を含み；
（ｂ）工程（ａ）のタンパク質測定値に基づいて癌スコアの確率を計算し；及び
（ｃ）工程（ｂ）におけるスコアが、予め決定されたスコアよりも低い場合、対象について癌を除外する
ことを含む方法。
【請求項２】
パネルが、ＢＧＨ３、ＦＩＢＡ及びＧＳＬＧ１からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
癌が除外される場合、対象が治療プロトコルを受けない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
治療プロトコルが、肺機能検査（ＰＦＴ）、肺撮像、生検、外科手術、化学療法、放射線療法、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
撮像が、Ｘ線、胸部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、又は陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）スキャンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
対象が肺結節を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
肺結節が３ｃｍ以下の直径を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
肺結節が約０．８ｃｍ〜２．０ｃｍの直径を有する、請求項６記載の方法。
【請求項９】
スコアが、タンパク質測定値に適用されるロジスティック回帰モデルから計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
スコアが
【化１】
2015506466.tif 000167
によって決定され、式中、
【化２】
2015506466.tif 000168
は対数変換され、サンプル（単数又は複数）における遷移ｉの標準化された強度であり、βiは対応するロジスティック回帰係数であり、αはパネル特異的な定数であり、Ｎは該サンプルにおける遷移の総数である、請求項１に記載の方法
【請求項１１】
タンパク質測定値を正規化することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質測定値が、ＰＥＤＦ、ＭＡＳＰ１、ＧＥＬＳ、ＬＵＭ、Ｃ１６３Ａ及びＰＴＰＲＪからなる群から選択される１つ以上のタンパク質によって標準化される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
生物学的サンプルが、組織、血液、血漿、血清、全血、尿、唾液、生殖器分泌物、脳脊髄液、汗及び排泄物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
癌の可能性の決定が、感受性、特異性、スコアと関連した陰性予測値又は陽性予測値によって決定される、請求項１の記載の方法。
【請求項１５】
工程（ａ）において決定されたスコアが、少なくとも約８０％である陰性予測値（ＮＰＶ）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
対象について癌の可能性があると判断を下す方法であって、
（ａ）対象から得られたサンプル中のタンパク質パネルの存在量を測定し、ここで、該パネルは、ＡＬＤＯＡ、ＦＲＩＬ、ＬＧ３ＢＰ、ＩＢＰ３、ＬＲＰ１、ＩＳＬＲ、ＴＳＰＣＯＩＡ１、ＧＲＰ７８、ＴＥＴＮ、ＰＲＸＤ１及びＣＤ１４からなる群から選択される少なくとも４つのタンパク質を含み；
（ｂ）工程（ａ）のタンパク質測定値に基づいて癌スコアの確率を計算し；及び
（ｃ）工程（ｂ）におけるスコアが、予め決定されたスコアよりも高い場合、対象について癌の可能性があると判断を下す
ことを含む方法。
【請求項１７】
パネルが、ＢＧＨ３、ＦＩＢＡ及びＧＳＬＧ１からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
対象における肺疾患の存在の可能性を決定する方法であって、
（ａ）対象から得られたサンプル中のタンパク質パネルの存在量を測定し、ここで、該パネルは、ＡＬＤＯＡ、ＦＲＩＬ、ＬＧ３ＢＰ、ＩＢＰ３、ＬＲＰ１、ＩＳＬＲ、ＴＳＰＣＯＩＡ１、ＧＲＰ７８、ＴＥＴＮ、ＰＲＸＤ１及びＣＤ１４からなる群から選択される少なくとも４つのタンパク質を含み；
（ｂ）工程（ａ）のタンパク質測定値に基づいて癌スコアの確率を計算し；及び
（ｃ）工程（ｂ）におけるスコアが、予め決定されたスコアに等しいか又はそれを超えている場合、癌疾患が存在すると結論付ける
ことを含む方法。
【請求項１９】
肺疾患が肺癌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
測定工程が、検出されるタンパク質に特異的に結合する化合物、又はペプチド遷移を用いて、選択された反応を監視する質量分析法によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
測定されるタンパク質に特異的に結合する化合物が、抗体又はアプタマーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
対象が、肺癌を発症する危険にある、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年１２月２１日に出願された米国仮出願第６１／５７８，７１２号、２０１２年７月２７日に出願された米国仮出願第６１／６７６，８５９号、及び２０１２年１１月１２日に出願された米国仮出願第６１／７２５，１５３号の優先権及び利益を主張する。これらの出願の内容は、全体として参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
肺疾患、特に肺癌は、重大な診断上の課題を示す。多くの無症候性患者では、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンなどの放射線スクリーニングは、診断パラダイムの最初のステップである。肺結節（ＰＮＳ）又は不確定結節が肺にあり、多くの場合、高リスク患者又は偶然にスクリーニング中に発見される。識別されたＰＮ数は、医療にアクセス可能な患者数の増加、スクリーニング技術の急速な普及及び高齢化に起因して増加することが予想される。３００万人を超えるＰＮが米国で毎年識別されていると推定されている。大半のＰＮは良性であるが、中には、追加の介入につながる悪性であるものいる。悪性結節のリスクが低いと考えられる患者については、現在の医療行為は、肺癌を監視するために、少なくとも２年間、３〜６カ月ごとのスキャンを指示する。ＰＮ識別と診断の間の期間は、医学的監視又は「経過観察」の時間であり、患者のストレスを誘導し、繰り返される画像検査により重大なリスクと費用につながる可能性がある。良性結節を有することが判明した患者に生検が実施される場合、コストと患者への損傷の可能性が不必要に増加する。大手術は、組織生検ための標本及び診断を実施するために指示される。これらの手法の全ては、患者へのリスク：病気、怪我及び死亡、並びに高い経済コストと関連している。
【０００３】
多くの場合、ＰＮは、肺における大きさ及び／又は一に起因して良性又は悪性かどうかを決定するために生検することができない。しかしながら、ＰＮは循環系に接続され、そのため、悪性の場合には、癌のタンパク質マーカーが血液に入り、ＰＮが悪性であるかどうかを決定するためのシグナルを提供することができる。
【０００４】
ＰＮを呈する患者のための現在の診断方法を置換するか又は補完することができる診断方法は、診断を改善し、コストを削減し、患者への侵襲的処置及び合併症を最小限に抑えるために必要とされる。本発明は、肺疾患、特に肺癌を同定し、診断し、分類し及び監視するために、タンパク質マーカーを特定するための新規な組成物、方法及びキットを提供する。本発明は、良性肺結節と悪性肺結節を区別し、肺癌を有する患者又は肺癌を有しない患者を分類するための血液ベースの多重アッセイを用いる。本発明は、肺癌の症状を示すが、肺結節を有していない患者に使用することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、対象から得られたサンプル中のタンパク質パネルの存在量を測定し、対象における肺疾患が癌である可能性を決定する方法であって、タンパク質測定値に基づいて癌スコアの確率を計算し、及び該スコアが、予め決定されたスコアよりも低い場合、対象について癌を除外することによって、対象における肺疾患が癌である可能性を決定する方法を提供し、癌が除外される場合、対象は治療プロトコルを受領しない。治療プロトコルには、例えば、肺機能試験（ＰＦＴ）、肺撮像、生検、外科手術、化学療法、放射線療法、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、撮像は、Ｘ線、胸部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、又は陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）スキャンである。
【０００６】
本発明はさらに、対象から得られたサンプル中のタンパク質パネルの存在量を測定し、タンパク質測定値に基づいて癌スコアの確率を計算し、及び該スコアが、予め決定されたスコアよりも高い場合、対象について癌の可能性があると判断を下すことによって、対象について癌の可能性があると判断を下す方法を提供する。
【０００７】
別の局面において、本発明はさらに、対象から得られたサンプル中のタンパク質パネルの存在量を測定し、タンパク質測定値に基づいて癌スコアの確率を計算し、及び該スコアが、予め決定されたスコアに等しいか又はそれを超えている場合、癌疾患が存在すると結論付けることによって、対象における肺疾患の存在の可能性を決定する方法を提供する。肺疾患は、例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの肺癌である。対象は、肺癌を発症するリスクにある。
【０００８】
パネルには、ＡＬＤＯＡ、ＦＲＩＬ、ＬＧ３ＢＰ、ＩＢＰ３、ＬＲＰ１、ＩＳＬＲ、ＴＳＰＣＯＩＡ１、ＧＲＰ７８、ＴＥＴＮ、ＰＲＸＤ１及びＣＤ１４から選択される少なくとも４つのタンパク質を含む。必要に応じて、パネルはさらに、ＢＧＨ３、ＣＯＩＡ１、ＴＥＴＮ、ＧＲＰ７８、ＰＲＤＸ、ＦＩＢＡ及びＧＳＬＧ１から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む。
【０００９】
対象は、肺結節を有するか又は肺結節を有することが疑われる。肺結節は３ｃｍ以下の直径を有する。一実施形態では、肺結節は、約０．８ｃｍ〜２．０ｃｍの直径を有する。
【００１０】
スコアは、タンパク質の測定に適用されるロジスティック回帰モデルから計算される。例えば、スコアは、以下のように決定される。
【００１１】
【化１】
2015506466.tif 000003
【００１２】
式中、
【００１３】
【化２】
2015506466.tif 000004
【００１４】
は対数変換され、サンプル（ｓ）における遷移ｉの標準化された強度であり、βiは対応するロジスティック回帰係数であり、αはパネル特異的な定数であり、Ｎは該サンプルにおける遷移の総数である。
【００１５】
様々な実施形態において、本発明の方法はさらに、タンパク質測定値を標準化することを含む。例えば、タンパク質測定値は、ＰＥＤＦ、ＭＡＳＰ１、ＧＥＬＳ、ＬＵＭ、Ｃ１６３Ａ及びＰＴＰＲＪから選択される１つ以上のタンパク質によって標準化される。
【００１６】
生物学的サンプルには、組織、血液、血漿、血清、全血、尿、唾液、生殖器分泌物、脳脊髄液、汗及び排泄物などがあげられる。
【００１７】
一態様では、癌の可能性を決定することは、感受性、特異性、スコアと関連した陰性予測値又は陽性予測値によって決定される。決定されたスコアは、少なくとも約８０％陰性予測値（ＮＰＶ）を有する。
【００１８】
測定工程は、検出されるタンパク質に特異的に結合する化合物、又はペプチド遷移を用いて、選択された反応を監視する質量分析法によって行われる。一実施形態では、測定されるタンパク質に特異的に結合する化合物は抗体又はアプタマーである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、１５個のタンパク質ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳパネルに関する受診者動作曲線の曲線下面積を示す線グラフである。
【図２】図２は、６つの線グラフであり、各々は、異なる患者集団と大小のＰＮを有する患者についての１５個のタンパク質ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳパネル関する受診者動作曲線の曲線下面積を示す。
【図３】図３は、１５個のタンパク質パネルを評価するために使用した３つの研究間の変動性を示すグラフである。
【図４】図４は、１５個のタンパク質ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳパネルに関する受診者動作曲線の曲線下面積を示す線グラフである。
【図５】図５は、３つの線グラフであり、各々は、異なる患者集団についての１５個のタンパク質ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳパネル関する受診者動作曲線の曲線下面積を示す。
【図６】図６は、「Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ」（登録商標）プログラムを用いて肺癌を同定するために使用した血液タンパク質のクエリーの結果を示す。
【図７】図７は、同じペプチド由来、同じタンパク質由来及び異なるタンパク質由来のペプチドについてのピアソン相関を示す棒グラフである。
【図８】図８は、トレーニングサンプル、検証サンプル、及び合わせた全てのサンプルに関して分類子の性能を示すグラフである。
【図９】図９は、臨床及び分子因子を示すグラフである。
【図１０】図１０は、酸化的ストレス及び肺炎症に対する、１３個の分類子タンパク質（緑色載線）、５個の転写因子（青色の線）及び３個のネットワーク（オレンジ色の線）を含む分子ネットワークを示す図である。
【図１１】図１１は、リスクの観点からの分類子スコアの解釈を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
開示された発明は、肺結節（単数又は複数）を呈する患者において、肺癌を具体的に同定し、分類する血液中のタンパク質マーカーが存在するという驚くべき発見に由来する。したがって、本発明は、患者における肺癌の初期検出と関連して、患者に固有の利益を提供し、例えば、寿命の増大、罹患率及び死亡率の減少、スクリーニング及び繰り返されるスクリーニング中の照射への曝露の減少、最小限の侵襲診断モデルが挙げられる。重要なことに、本発明の方法は、患者にとって侵襲的な処置を避けることができる。
【００２１】
胸部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンの日常的な臨床的使用によって、毎年、数百万個の肺結節を同定する。このうち、ほんの少数が悪性であるが、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であると診断された患者については、悲惨にも１５％の５年生存率に貢献しているに過ぎない。肺結節を有する患者における肺癌の初期診断は、最上位の優先事項であり、これは、臨床所見に基づく意思決定が、胸部ＣＴ及び陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャンなどの現在の非侵襲的な診断オプション、及び他の侵襲性の代替法と併せて、ステージＩのＮＳＣＬＣを有する患者の臨床転帰を変更していないためである。大きさが８ｍｍ〜２０ｍｍの肺結節のサブグループは、８ｍｍを下回る低い悪性度と２０ｍｍを超える高い悪性度と比較して、「中間」であるとして益々認識されている［９］。経胸腔穿刺吸引又は気管支鏡を使用した生検による肺結節の侵襲的サンプリングは、ＮＳＣＬＣの細胞病理学診断を提供することができるが、さらに、偽陰性及び非診断的な結果の両方と関連付けられる。要約すると、肺結節の管理のための重要である、満たされていない臨床上の必要性は、特に大きさ８ｍｍと２０ｍｍ間の中間の肺結節（ＩＰＮ）を有する患者における悪性と良性のプロセス間を区別する非侵襲的な診断テストである。
【００２２】
多かれ少なかれ積極的な治療であるとの臨床判断は、危険因子、主に結節サイズ、喫煙歴、年齢［９］、さらに撮像に基づいている。これらは決定的ではないため、非侵襲的であり、リスク因子及び撮像に補完的な情報を提供する分子ベースの血液検査が大いに必要とされる。
【００２３】
したがって、これらの実施形態と関連する実施形態は、肺疾患、特に肺癌の診断のためのスクリーニング法における使用を見出す。より重要なことに、本発明は、患者の臨床管理の決定における使用を見出す。すなわち、本発明の方法では、個々の対象について、特定の治療プロトコルの受け入れ（ｒｕｌｅ  ｉｎ）又は除外（ｒｕｌｅ  ｏｕｔ）に有用である。
【００２４】
癌生物学は、肺癌リスクを評価するために、満たされていない医療ニーズに対処する分子戦略が必要である。診断薬の分野は、タンパク質の変化を検出するために、高感受性なメカニズムを提供する技術及びアッセイとともに発展している。本明細書に記載の方法は、悪性ＰＮを有する患者において、集合的に変更された血漿タンパク質の濃度を測定するためのＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ技術を使用する。このタンパク質の特徴的性質は肺癌の指標である。ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳは、血漿中の循環タンパク質の定量と同定の両方を提供する１つの方法である。限定されないが、シグナル伝達因子、増殖因子、切断表面タンパク質及び分泌タンパク質などのタンパク質の発現レベルの変化は、癌をアッセイするために、このような感受性技術を用いて検出することができる。本明細書において、肺結節を呈した患者が良性又は悪性である結節を有する可能性を決定するための血液ベースの分類検査が示される。本発明は、ＰＮが良性又は悪性である相対的な可能性を予測する分類アルゴリズムを提示する。
【００２５】
より広範に、ＰＮが良性か又は悪性である可能性について、診断テストでもある本発明には多くのバリエーションがあることが実証されている。これらは、タンパク質、タンパク質標準、測定方法及び／又は分類アルゴリズムのパネル上のバリエーションである。
【００２６】
本明細書に開示されるように、ＰＮを呈する対象からのアーカイブ血漿サンプルを質量分析によって、異なるタンパク質発現について分析した。結果を用いて、種々な肺の状態（癌対非癌）と結びつけた差異的に発現されるバイオマーカータンパク質及びバイオマーカーパネルを同定した。
【００２７】
本発明の一態様では、１６３個のパネルは、良性又は悪性であるとしてＰＮの分類を可能にすることが発見された。これらのパネルは、表１に示すものが挙げられる。いくつかの実施形態において、本発明によるパネルは、ＩＳＬＲ、ＡＬＤＯＡ、ＫＩＴ、ＧＲＰ７８、ＡＩＦＭ１、ＣＤ１４、ＣＯＩＡ１、ＩＢＰ３、ＴＳＰ１、ＢＧＨ３、ＴＥＴＮ、ＦＲＩ、ＬＧ３ＢＰ、ＧＧＨ、ＰＲＤＸ１又はＬＲＰ１から選択される１個、２個、３個、４個、５個又はそれを超えるタンパク質を測定することを含む。他の実施形態では、パネルには、表１に例示した任意のパネル又はタンパク質が含まれている。例えば、パネルは、ＡＬＤＯＡ、ＧＲＰ７８、ＣＤ１４、ＣＯＩＡ１、ＩＢＰ３、ＦＲＩＬ、ＬＧ３ＢＰ、及びＬＲＰ１を含む。
【００２８】
【表１−１】
2015506466.tif 000005
【００２９】
【表１−２】
2015506466.tif 000006
【００３０】
【表１−３】
2015506466.tif 000007
【００３１】
【表１−４】
2015506466.tif 000008
【００３２】
【表１−５】
2015506466.tif 000009
【００３３】
【表１−６】
2015506466.tif 000010
【００３４】
【表１−７】
2015506466.tif 000011
【００３５】
生成された１００万個のうちの１００個の最良の無作為なタンパク質パネルを表２に示す。
【００３６】
【表２−１】
2015506466.tif 000012
【００３７】
【表２−２】
2015506466.tif 000013
【００３８】
【表２−３】
2015506466.tif 000014
【００３９】
【表２−４】
2015506466.tif 000015
【００４０】
対象の治療を支配する好ましいパネルには、表３及び４に記載されているパネルが含まれる。種々の他の実施形態において、本発明のパネルは、表２及び３に列挙されたタンパク質の少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、又はそれ以上を測定することを含む。
【００４１】
【表３】
2015506466.tif 000016
【００４２】
【表４】
2015506466.tif 000017
【００４３】
好ましい標準物質パネルを表５に列挙する。
【００４４】
【表５】
2015506466.tif 000018
【００４５】
用語「肺結節」（ＰＮ）は、Ｘ線撮影技術によって可視化することができる肺病変を指す。肺結節は、直径３ｃｍ以下の任意の結節である。一例では、肺結節は約０．８ｃｍ〜２ｃｍの直径を有する。
【００４６】
用語「腫瘤（ｍａｓｓ）」又は「肺腫瘤」は、最大直径が３ｃｍセンチを超える肺結節を指す。
【００４７】
用語「血液生検」は、結節を呈する患者が、良性又は悪性のいずれかとして分類され得る状態を有するかどうかを決定するための血液の診断調査を指す。
【００４８】
用語「許容基準」とは、アッセイ、試験、診断又は製品は、その意図する用途に許容できると考えることに準拠している必要がある基準セットを指す。本明細書で使用する場合、許容基準は、試験、分析手順への参照、及び適切な測定のリストであり、これらは、診断に使用されるアッセイ又は製品に対して定義される。例えば、分類子の許容基準は、係数の一連の所定の範囲を指す。
【００４９】
用語「平均最大ＡＵＣ」とは、パフォーマンスを計算する手法を指す。本発明では、前方又は後方選択によって、パネルにあるべきタンパク質セットを定義するプロセスにおいて、タンパク質は、一つずつ除去され又は付加される。プロットは、パフォーマンス（Ｙ軸上のＡＵＣ又は部分的ＡＵＣ、Ｘ軸上のタンパク質）を用いて生じさせることができ、パフォーマンスを最大にする点は、最良の結果を与えるタンパク質の数及びセットを指す。
【００５０】
用語「部分的ＡＵＣ因子又はｐＡＵＣ因子」は、無作為な予測によって予期されるよりも大きい。感受性＝０．９０  ｐＡＵＣ係数は０．９〜１．０の特異性／（０．１＊０．１／２）からのＲＯＣ曲線下の台形の面積である。
【００５１】
用語「増分情報」とは、診断精度を向上させるために、他の診断情報とともに使用することができる情報を指す。増分情報は、結節の大きさ、年齢、又は性別などを含む臨床的因子とは独立している。
【００５２】
用語「スコア」又は「スコアリング」とは、サンプルの確率尤度の計算への参照を指す。本発明については、１．０に近い値は、サンプルが癌である可能性を表すために使用され、０．０に近い値は、サンプルが良性である可能性を表わす。
【００５３】
用語「強固な」とは、それが基づいている仮定の違反によっては深刻に妨害されていない試験又は手段を指す。本発明では、強固な試験は、質量分析クロマトグラムのタンパク質又は遷移が手動で観察され、干渉シグナルが一般には「ない」試験である。
【００５４】
用語「係数」とは、サンプルをスコアリングするためのロジスティック回帰式において使用される各タンパク質に割り当てられた量を意味する。
【００５５】
本発明の特定の実施形態では、ＭＣ  ＣＶのロジスティック回帰モデルの観点から、モデル係数及び各タンパク質の変動係数（ＣＶ）が、タンパク質分類子の測定法（又はモデル）に依存して増加又は減少し得ることが意図される。パネル中に列挙されたタンパク質のそれぞれについて、係数及びＣＶの各々に関して、約、少なくとも、少なくとも約、又はせいぜい約２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０倍、又はそこで利用可能な任意の範囲がある。あるいは、本発明の定量的な実施形態は、約、少なくとも、少なくとも約、又はせいぜい約１０、２０、３０、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％以上、又はそこで導き出せる任意の範囲の観点から検討されてもよいことが意図される。
【００５６】
用語「最高のチームプレーヤー」は、ランダムパネル選択アルゴリズムで最高をランク付けするタンパク質を意味し、すなわち、パネルに関して上手く機能する。分類子に組み合わせるとき、これらのタンパク質は、良性サンプルから癌を分離することがでる。「最高のチームプレーヤー」タンパク質は、「協調的タンパク質」と同義である。用語「協調的タンパク質」は、偶然に予想されるよりも、タンパク質の高パフォーマンスパネルでより頻繁に出現するタンパク質を指す。これは、どれくらい頻繁に高パフォーマンスパネルに出現するかを測定する、タンパク質の協調的スコアを生じさせる。例えば、協調的スコアが１．５であるタンパク質は、偶然によってのみ期待されたものよりも、１．５倍超の高いパフォーマンスパネルに出現する。
【００５７】
肺の状態に関して本明細書で使用される用語「分類」とは、肺状態、特に肺癌の診断を支援する分類を提供するための統計的手法を使用するために、発現データをコンパイルし、分析する行為を指す。
【００５８】
本明細書で使用される用語「分類子」は、所定レベルの統計学的有意性を有する疾患状態間を区別するアルゴリズムを指す。２クラスの分類子は、サンプル由来の測定値からのデータポイントを使用し、２つのグループのいずれかにデータを分類するアルゴリズムである。特定の実施形態では、分類子で使用されるデータは、生体サンプル中のタンパク質の相対的発現である。対象におけるタンパク質発現レベルは、疾患がない又は特定された状態を有すると以前に診断された患者におけるレベルと比較することができる。
【００５９】
「分類子」は、ランダムに選択された良性のサンプルからランダムに選択された癌サンプルを区別する確率を最大限にする。つまり、ＲＯＣ曲線のＡＵＣである。
【００６０】
差異的に発現する分類子の構成タンパク質に加えて、それはまた、最小限の生物学的バリエーションを有するか又は生物学的バリエーションを有しないタンパク質を含んでもよく、臨床検体内又はその間で変動性又はその欠如を評価することができる；これらのタンパク質は内因性タンパク質と称することができ、他の分類子タンパク質に対して、内部対照として使用される。
【００６１】
用語「標準化」又は「標準物質」とは、本明細書で使用するとき、サンプル中のタンパク質濃度の生物学的バリエーションというよりはむしろ、サンプル処理、サンプル調製及び質量分析測定に起因して、技術的バリエーションから生じる効果を調整するために、標準値の観点で微分値の発現を指す。例えば、差異的に発現されたタンパク質の発現を測定するとき、タンパク質の発現のための絶対値は、発現において実質的に一定である標準タンパク質の発現に関する絶対値の観点で表すことができる。これは、サンプル調製及び質量分析測定の技術的バリエーションを、サンプル中のタンパク質濃度レベルの測定を妨げるからを防止する。
【００６２】
本明細書において、用語「条件」とは、一般的に、疾患、事象、又は健康状態の変化を指す。
【００６３】
更なる診断試験を含む「治療プロトコル」なる用語は、本明細書において使用するとき、典型的には、肺結節が良性か又は悪性であるかを決定するために行われる。治療プロトコルは、肺結節又は質量を診断するために典型的に使用される診断試験を含む、例えば、ＣＴスキャン、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）スキャン、気管支鏡検査又は組織生検が挙げられる。本明細書において使用される治療プロトコルはまた、典型的には、例えば、化学療法、放射線又は外科手術などの悪性の肺結節及び／又は肺癌を治療するために使用される治療的処置を含むことを意味する。
【００６４】
用語「診断」及び「診断法」もまた、それぞれ用語「予後」や「予後法」を包含し、経時的に診断及び／又は予後を監視するための２つ以上の時間点全体でこのような手法の適用、及びそれらに基づく統計学的モデリングが含まれる。さらに、診断なる用語には、ａ．予測（患者が過剰増殖性疾患を発症するかどうかを判断すること）、ｂ．予後（将来的に予め選択された時間で、患者が良い又は悪い結果を有する可能性があるかどうかを予測すること）、ｃ．治療的選択、ｄ．治療的薬剤を監視すること、ｅ．再発を監視することを含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、例えば、肺状態を有する対象由来の生物学的サンプルの分類は、実験室によって作成された結果及び関連レポートを指すことがあり、一方、診断は、肺状態を同定又は確認するための分類の使用における医療専門家の行為を指すことがある。
【００６６】
生物学的サンプルに関して、「提供すること」という用語は、本明細書で使用するとき、直接的又は間接的に対象からの生体サンプルを得ることをいう。例えば、「提供すること」は、対象から生物学的サンプルを直接得る行為（例えば、採血、組織生検、洗浄）を指す。同様に、「提供すること」は、間接的に生物学的サンプルを得る行為を指すことがある。例えば、提供することは、サンプルを直接得た当事者からサンプルを受領する実験質の行為、又は保管からサンプルを得る行為を指すことがある。
【００６７】
本明細書で使用するとき、「肺癌」は、好ましくは、肺の癌を指すが、ヒト又は他の哺乳動物の呼吸器系の任意の疾患又は障害を含んでもよい。呼吸器腫瘍性疾患としては、例えば、小細胞癌又は小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞癌又は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、扁平上皮癌、腺癌、気管支肺胞細胞癌、混合肺癌、悪性胸膜中皮腫、未分化大細胞癌、巨大細胞癌、同期腫瘍、大細胞神経内分泌癌、腺扁平上皮癌、未分化癌；及び燕麦細胞癌、混合小細胞／大細胞癌、併発した小細胞癌を含む小細胞癌；腺様嚢胞癌、過誤腫、粘表皮腫瘍、典型的カルチノイド肺腫瘍、非定型カルチノイド肺腫瘍、末梢カルチノイド肺腫瘍、中枢カルチノイド肺腫瘍、胸膜中皮腫、生体の他の部分から肺に転移した二次癌などの肺以外に起源がある未分化肺癌腫及ぶ癌が挙げられる。肺癌は、任意のステージ又はグレードのものであってもよい。好ましくは、この用語は、例えば、隣接した健常組織と比較することによって決定されてもよい、タンパク質バイオマーカーが正常レベルを超えて発現した任意の異形成、過形成、新生物、又は転移を総合的に指すために使用されてもよい。
【００６８】
非癌性肺の状態の例としては、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、良性腫瘍又は細胞の腫瘤（例えば、過誤腫、線維腫、神経線維腫）、肉芽腫、サルコイドーシス、及び細菌（例えば、結核）又は真菌（例えば、ヒストプラズマ）病原体によって生じた感染が含まれる。特定の実施形態において、肺の状態は、放射線ＰＮの出現と関連付けてもよい。
【００６９】
本明細書で使用するとき、「肺組織」及び「肺癌」とは、それぞれ肺自体の組織又は癌、並びに、肺の下部にあり、胸膜、肋間筋、肋骨、及び呼吸器系の他の要素などの構造を支持する層に隣接した及び／又は層内の組織を指す。呼吸器系自体は、鼻腔、副鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、肺葉、肺胞、肺胞ダクト、肺胞気嚢、肺胞の毛細血管、細気管支、呼吸細気管支、胸膜、壁側胸膜、胸膜腔、絞り、喉頭蓋、アデノイド、扁桃、口、舌などを表すものとして本文脈において採用される。組織又は癌は哺乳動物由来であってもよく、好ましくはヒト由来であるが、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ウサギは本発明の範囲内である。本明細書で使用する用語「肺状態」は、例えば、肺癌及び種々の非癌性状態を含む肺に関連する疾患、事象、又は健康状態の変化を指す。
【００７０】
「精度」とは、その実際（又は真）の値に対して、測定又は計算された量（試験報告値）の適合度を指す。臨床精度は、真の結果（真陽性（ＴＰ）又は真陰性（ＴＮ）対誤分類の結果（偽陽性（ＦＰ）又は偽陰性（ＦＮ））の割合に関し、他の測定値の中で、感受性、特異性、陽性予測値（ＰＰＶ）又は陰性予測値（ＮＰＶ）として、又は可能性、オッズ比を指す。
【００７１】
本明細書で使用する用語「生物学的サンプル」は、潜在的に１つ以上のバイオマーカータンパク質を含有する生物学的起源の任意のサンプルを指す。生物学的サンプルの例としては、組織、器官、又は全血、血漿、血清、組織、洗浄液若しくは疾患の検出のために使用される任意の他の標本などの体液が含まれる。
【００７２】
本明細書で使用される用語「対象」は、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
【００７３】
本明細書で使用される用語「バイオマーカータンパク質」は、肺状態を有する対象からの生物学的サンプル対対照対象からの生物学的サンプルにおけるポリペプチドを指す。バイオマーカータンパク質は、ポリペプチド自体だけでなく、その小さなバリエーションを含む、例えば、グリコシル化又はリン酸化などの１つ以上のアミノ酸置換又は修飾が挙げられる。
【００７４】
本明細書で使用される用語「バイオマーカータンパク質パネル」は、複数のバイオマーカータンパク質を指す。特定の実施形態では、パネル中のタンパク質の発現レベルは、対象における肺状態の存在と相関させることができる。特定の実施形態では、バイオマーカータンパク質パネルは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０又は１００個のタンパク質を含む。特定の実施形態では、バイオマーカータンパク質パネルは、１００〜１２５個のタンパク質、１２５〜１５０個のタンパク質、１５０〜２００個のタンパク質又はそれ以上から構成される。
【００７５】
「治療すること」又は「治療すること」とは、本明細書で使用するとき、状態を妨げ、状態の発症の開始若しくは速度を遅め、状態が発症するリスクを低下させ、状態に関連した症状の発症を予防若しくは遅延させ、状態と関連した症状を低減若しくは終了させ、又はこれらのいくつかの組合せを指す場合がある。
【００７６】
用語「排除すること（ｒｕｌｉｎｇ  ｏｕｔ）」とは、本明細書で使用するとき、対象が治療プロトコルを受けないように選択されることを意味する。
【００７７】
用語「受け入れること（ｒｕｌｉｎｇ  ｉｎ）」とは、本明細書で使用するとき、対象が治療プロトコルを受けるように選択されることを意味する。
【００７８】
バイオマーカーレベルは、疾患の治療に起因して変更されることがある。バイオマーカーレベルの変化は、本発明により測定することができる。バイオマーカーレベルの変化は、疾患又は治療の進行をモニターするために使用されてもよい。
【００７９】
「変更された」「変化された」又は「著しく異なる」とは、合理的に比較可能な状態、プロファイル、測定などから検出可能な変化又は相違を指す。当業者は、合理的な測定可能な変化を決定することができるべきである。このような変化は、全か無かであってもよい。それらは、増分であってもよいが、直線的である必要はない。それらは、桁違いであってもよい。変化は、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれ以上の増加又は減少であり得て、又は０％と１００％の間の任意の値であってもよい。代替的には、変化は、１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍若しくはそれ以上、又は１倍と５倍の間の任意の値であってもよい。変化は、０．１、０．０５、０．００１、又は０．０００１のｐ値と統計学的に有意であることがあってもよい。
【００８０】
本発明の方法を用いて、患者の臨床的評価が最初に実行される。癌についてより高い可能性が存在する場合、臨床医は、診断の可能性を高める及び／又は裏付けるデータを得る診断試験オプションの追求が必要となる疾患を受け入れる場合がある。疾患の「受け入れ」は、高い特異性で試験を必要とする。
【００８１】
「ＦＮ」は、偽陰性であり、疾患状態試験について、非疾患又は正常として誤って疾患対象を分類することを意味する。
【００８２】
「ＦＰ」は、偽陽性であり、疾患状態試験について、疾患を有するものとして誤って健常対象を分類することを意味する。
【００８３】
用語「受け入れ」とは、臨床的評価と相まって、高い特異性で、癌のより高い可能性を示す診断試験を意味する。臨床評価は、癌のより低い可能性であれば、臨床医は診断の可能性を減少させるデータを得る診断試験を必要とする、疾患を除外するためのスタンスを採用することができる。「除外」とは、高感受性で検査を必要とする。
【００８４】
用語「除外」とは、臨床的評価と相まって、高感受性で、癌のより低い可能性を示す診断試験を指す。
【００８５】
用語「検査の感受性」とは、疾患を有する患者が陽性の検査結果を有する確率を指す。これは、疾患を有する患者の総数によって割った陽性試験結果（真陽性）を有する、疾患を有する患者数から誘導され、真陽性結果を有する患者と陰性結果、すなわち、偽陰性を有する疾患を含む。
【００８６】
用語「試験の特異性」とは、疾患のない患者が陰性検査結果を有する確率を指す。これは、疾患のない全ての患者によって割った陰性試験結果（真陰性）を有する、疾患がない患者数から誘導され、真陰性結果を有する患者と陽性試験結果、すなわち、偽陽性を有する、疾患がない患者を含む。試験の感受性、特異性、真又は偽陽性率、及び真又は偽陰性率は、試験結果に基づく個々の患者についての臨床判断を行うために、例えば、他の試験と対比して、試験性能の指標を提供するが、臨床医は、所定の集団に関して、試験の性能パラメータを必要とする。
【００８７】
用語「陽性予測値」（ＰＰＶ）は、陽性結果が、疾患を有する患者を正確に同定する確率を指し、これは、真陽性及び偽陽性の合計で割った真陽性の数ある。
【００８８】
用語「陰性予測値」又は「ＮＰＶ」は、ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＮ）、又はすべての陰性試験結果の真陰性分画によって計算される。また、本質的に、疾患の有病率、及び試験されることが意図される集団の試験前確率によって本質的に影響される。
【００８９】
用語「疾患有病率」とは、特定の期間中に病気又は事象の発生のすべての新しい及び古い症例の数を指す。有病率は、事象数が分子であり、危険性である集団が分母である比として表される。
【００９０】
疾患発生率なる用語は、特定の期間内にいくつかの新しい状態を発症する危険性の尺度を指す。ある期間中の新たな症例の数は、分母を有する比例又は比として良好に表される。
【００９１】
「国立胚スクリーニング試験（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｕｎｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｔｒｉａｌ）」に従う肺癌リスクは、年齢と喫煙歴におって分類される。高いリスク−年齢≧５５及び≧３０パックイヤーの喫煙歴；中程度リスク−年齢≧５０及び≧２０パックイヤーの喫煙歴；低いリスク−年齢＜５０又は＜２０パックイヤーの喫煙歴。
【００９２】
用語「陰性予測値」（ＮＰＶ）は、陰性試験が、疾患がない患者を正確に同定する確率を指し、真陰性及び偽陰性の合計によって割った真陰性の数である。十分なＰＰＶでの試験からの陽性結果は、患者について疾患を受け入れるために使用され得て、一方、十分なＮＰＶでの試験からの陰性結果は、患者が一部であると考えることができる所定の集団についての疾患有病率が知られている場合、疾患を除外するために使用することができる。
【００９３】
臨床医は、感受性及び特異性を含む固有の性能パラメータ、及び所定集団における疾患の有病率に依存する、陽性予測値及び陰性予測値などの外因性性能パラメータに基づく診断試験を用いて決定しなければならない。
【００９４】
疾患の可能性の臨床的評価に影響を与え得る追加のパラメータは、既知薬剤に対する患者の従前の頻度及び親密性を含む、例えば、曝露危険性（疾患因果関係と直接的に又は間接的に関連付けられる）、例えば、受動喫煙、放射線など、さらに、大きさを除く肺結節のＸ線像又は特徴付けが挙げられる。結節の説明は、ＣＴスキャン技術によって用いられる相対的なグレースケール密度のスペクトルに基づいて、それを特徴付ける固体、半固体又はすりガラスを含むことができる。
【００９５】
「質量分析法」は、プローブの表面を提示する試料上に示される分析物からの気相イオンを生成するイオン化源を用い、質量分析計を用いて気相イオンを検出することを含む。
【００９６】
技術の液体クロマトグラフィー選択反応モニタリング質量分析（ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ）を用いて、疾患の有無と相関し得る個々のタンパク質の差を同定するために、血中の３８８個のタンパク質のコホートの発現レベルをアッセイした。個々のタンパク質は、肺癌の生物学に関与するだけでなく、膜アンカー型又は分泌型タンパク質としてそれらの発現に基づいて血漿中に存在する可能性がある。切除された肺癌組織（腺癌のサブタイプ、扁平、及び大細胞を含む）の上皮細胞膜及び内皮細胞膜の分析は、２１７個組織タンパク質を同定した。肺癌生物学に関連する検索用語を用いた科学文献調査は３１９個のタンパク質を同定した。癌組織分析又は文献調査によって同定されたタンパク質間に１４８個のタンパク質の重なりがあり、候補として全３８８個の固有のタンパク質を得た。多重ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳアッセイに含まれる大多数の候補タンパク質は、新鮮なＮＳＣＬＣ切除物と隣接する非悪性組織から、分泌小胞含有物のプロテオミクス分析後に発見された。腫瘍組織において再現的に上方制御される分泌タンパク質は、広範囲なバイオインフォマティックス及び文献注釈を用いたＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳアッセイにおいて含有物について同定され、優先順位が決定された。また、関連文献中に存在するタンパク質の追加のセットをアッセイに加えた。合計では、肺癌と関連付けられる３８８個のタンパク質は、ＳＲＭアッセイ開発のために優先順位を付けられた。これらのうち、３７１個の候補タンパク質バイオマーカーは、最終的にアッセイに含められた。これらを以下の表６に列挙する。
【００９７】
【表６−１】
2015506466.tif 000019
【００９８】
【表６−２】
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【００９９】
【表６−３】
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【０１００】
【表６−４】
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【０１０１】
【表６−５】
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【０１０２】
【表６−６】
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【０１０３】
【表６−７】
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【０１０４】
【表６−８】
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【０１０５】
【表６−９】
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【０１０６】
【表６−１０】
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【０１０７】
【表６−１１】
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【０１０８】
【表６−１２】
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【０１０９】
【表６−１３】
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【０１１０】
【表６−１４】
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【０１１１】
【表６−１５】
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【０１１２】
【表６−１６】
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【０１１３】
【表６−１７】
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【０１１４】
【表６−１８】
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【０１１５】
【表６−１９】
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【０１１６】
【表６−２０】
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【０１１７】
【表６−２１】
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【０１１８】
【表６−２２】
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【０１１９】
【表６−２３】
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【０１２０】
【表６−２４】
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【０１２１】
【表６−２５】
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【０１２２】
【表６−２６】
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【０１２３】
【表６−２７】
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【０１２４】
【表６−２８】
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【０１２５】
【表６−２９】
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【０１２６】
【表６−３０】
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【０１２７】
【表６−３１】
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【０１２８】
【表６−３２】
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【０１２９】
【表６−３３】
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【０１３０】
【表６−３４】
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【０１３１】
【表６−３５】
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【０１３２】
【表６−３６】
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【０１３３】
【表６−３７】
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【０１３４】
【表６−３８】
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【０１３５】
【表６−３９】
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【０１３６】
【表６−４０】
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【０１３７】
【表６−４１】
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【０１３８】
【表６−４２】
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【０１３９】
【表６−４３】
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【０１４０】
【表６−４４】
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【０１４１】
【表６−４５】
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【０１４２】
【表６−４６】
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【０１４３】
【表６−４７】
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【０１４４】
【表６−４８】
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【０１４５】
【表６−４９】
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【０１４６】
【表６−５０】
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【０１４７】
【表６−５１】
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【０１４８】
【表６−５２】
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【０１４９】
【表６−５３】
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【０１５０】
【表６−５４】
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【０１５１】
【表６−５５】
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【０１５２】
【表６−５６】
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【０１５３】
【表６−５７】
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【０１５４】
【表６−５８】
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【０１５５】
【表６−５９】
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【０１５６】
【表６−６０】
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【０１５７】
【表６−６１】
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【０１５８】
【表６−６２】
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【０１５９】
【表６−６３】
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【０１６０】
【表６−６４】
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【０１６１】
【表６−６５】
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【０１６２】
【表６−６６】
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【０１６３】
【表６−６７】
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【０１６４】
【表６−６８】
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【０１６５】
【表６−６９】
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【０１６６】
【表６−７０】
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【０１６７】
【表６−７１】
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【０１６８】
これらの候補タンパク質バイオマーカーの１９０が、血中で再現可能に測定されることが示された。ＰＮ患者からの２４２の血液サンプルの中程度の駆動されたマルチサイトと無作為研究は、タンパク質の統計学的に有意なサブパネルが、２ｃｍ下のサイズの良性及び悪性結節を区別するために同定され得るかどうかを決定するために設計された。この研究へのサンプル及び臨床データを提供する３つのサイトは、ラバル大学、ペンシルバニア大学、ニューヨーク大学であった。
【０１６９】
本発明の実施形態において、１５タンパク質のパネルは、直径２ｃｍ未満の良性及び悪性結節の患者由来のサンプル間で効果的に区別した。
【０１７０】
バイオインフォマティクス及び生物統計学的分析は、統計学的に有意な発現差異を、個々のタンパク質を同定するために最初に使用し、次に、１つ以上のタンパク質又はタンパク質パネルの組み合わせを導き出すためにこれらのタンパク質を使用し、任意の個々のタンパク質と比較して優れた差別的な性能を総合的に実証した。バイオインフォマティクス及び生物統計学的方法は、他のタンパク質と対比して、相対的発現レベル、すなわち増加又は減少など、及びパネル内の正味の差別的能力に関してその重量又は重要性を反映するパネル内の個々のタンパク質について係数（Ｃ）を導出するために使用される。パネルの定量的差別的能力は、係数及びタンパク質の血漿発現レベル（Ｐ）（ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳによって測定される）の生成物である構成タンパク質のそれぞれについて用語を用いて数学的アルゴリズムとして表すことができる。ｎ個のタンパク質からなるアルゴリズムはＣ１×Ｐ１＋Ｃ２×Ｐ２＋Ｃ３×Ｐ３＋・・・＋Ｃｎ×Ｐｎとして記述される。統計的有意性の所定のレベルと疾患状態とを識別するアルゴリズムは、「疾患分類子」を意味することができる。示差的発現を有する分類子の構成タンパク質に加えて、それはまた、最小限有するタンパク質又は生物学的バリエーションがないタンパク質を含んでもよく、臨床標本内又はその間の変動性評価、又はその欠如の評価を可能にする；これらのタンパク質は、典型的な天然タンパク質と呼ばれ、他の分類子タンパク質について内部対照を提供することができる。
【０１７１】
特定の実施形態において、発現レベルは、ＭＳによって測定される。ＭＳは、その親タンパク質の気化及びその質量電荷比に基づいて他のイオンからの分離によるその生成後にイオンにより生成される質量スペクトルを解析する。ＭＳデータを取得する最も一般的なモードは、１）典型的な全イオン電流プロット（ＴＩＣ）を生じさせるフルスキャン取得、２）選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）、及び３）選択反応モニタリング（ＳＲＭ）である。
【０１７２】
本明細書で提供される方法の特定の実施態様において、バイオマーカータンパク質の発現レベルは、ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳによって測定される。ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳは、効果的にすべての分子と、所望の分析物（単数又は複数）を除いた汚染物を効果的にろ過して除く可能性を有するタンデム質量分析の高度に選択的な方法である。これは、分析サンプルが、画定された分析ウィンドウ内でいくつかの同重体種を含み得る複合混合物である場合に特に有益である。ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ法は、当該技術分野で知られているようにトリプル四重極の質量分析器を利用してもよく、３つの四重極ロッドセットを含む。質量選択の第１段階は、第１四重極ロッドセットで行われ、選択的に透過したイオンが第２の四重極ロッドセットにおいて断片化される。得られた遷移（生成物）イオンは、質量選択の第２段階を行う第３の四重極ロッドセットに搬送される。第３の四重極ロッドセットを透過した生成物イオンを検出器によって測定し、選択的に透過した生成物イオンの数を表すシグナルを生成する。第１及び第３の四重極に適用されたＲＦ及びＤＣ電位は、ｍ／ｚ値が狭い特定の範囲内にあるｍ／ｚ値を有する（それぞれ）前駆体及び生成物イオンを選択するように調整される。適切な遷移（前駆体及び生成物イオンのｍ／ｚ値）を特定することによって、標的タンパク質に対応するペプチドは、高い程度の感受性及び選択性を用いて測定することができる。シグナル対ノイズ比は、従来のタンデム質量分析器（ＭＳ／ＭＳ）実験より優れ、第１の四重極における１つの質量ウィンドウを選択し、次に、イオン検出器において生成されたすべての遷移を測定する。ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ。
【０１７３】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるように、肺癌を診断又はモニタリングに使用するためのＳＲＭ−ＭＳ分析は、表６に記載のタンパク質に由来する１つ以上のペプチド及び／又はペプチドの遷移を利用してもよい。特定の実施形態において、アッセイは、１００以上、１５０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３４５以上、又は３７１以上のバイオマーカータンパク質からのペプチド及び／又はペプチド遷移を利用してもよい。特定の実施形態では、２つ以上のペプチドがバイオマーカータンパク質ごとに使用されてもよく、これらの特定の実施形態において、４つ以上のペプチドのうち３つ以上を利用することができる。同様に、特定の実施形態において、二つ以上の遷移は、ペプチドごとに利用することができ、これらの特定の実施形態において、３つ以上；４つ以上；マラは５つ以上の遷移は、ペプチドごとに使用してもよい。一実施形態では、肺癌の診断に使用するためのＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ分析は、各バイオマーカータンパク質に関連する選択されたペプチドに相当する５つの遷移の強度を測定することができる。達成可能な定量限界（ＬＯＱ）は、この分析中に観察されたシグナル強度に応じて各ペプチドについて推定することができる。例えば、肺癌と関連標的タンパク質のセットについては、表１２を参照されたい。
【０１７４】
バイオマーカータンパク質の発現レベルは、当該技術分野において任意の適切な方法を用いて測定することができ、限定されないが、質量分析（ＭＳ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、マイクロアレイ、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、大規模並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、トランスクリプトミクス、及びプロテオミクスが含まれる。
【０１７５】
ペプチド遷移の特定セットの診断性能を評価するために、ＲＯＣ曲線は、各々お重要な遷移について生成される。
【０１７６】
本明細書で使用する「ＲＯＣ曲線」とは、弁別閾値が変動するため、バイナリー分類子システムについて偽陽性率（特異性）に対する真陽性率（感受性）のプロットを指す。ＲＯＣ曲線は、陽性のうち真陽性の画分（ＴＰＲ＝真陽性率）対陰性のうちの真陰性の画分（ＴＰＲ＝偽陽性率）をプロットすることにより等価的に表すことができる。ＲＯＣ曲線上の各々の点は、特定の判定閾値に対応する感受性／特異性対を表す。図７及び図９は、疾患対象のコホートと非疾患対象のコホートにおけるバイオマーカー又はバイオマーカーパネルの感受性値と特異性値の分布間の機能的関係の図式表現を提供する。
【０１７７】
ＡＵＣは、ＲＯＣ曲線下面積を示す。ＡＵＣは、１）バイオマーカー又はバイオマーカーパネル、及び２）ＲＯＣ曲線、の診断精度の全体的な指標である。ＡＵＣは、「台形公式」によって決定される。所与の曲線について、データポイントは、直線セグメントによって接続され、垂線は各データポイントに横座標から垂直にされ、このように構成された三角形及び台形の面積の和が計算される。本明細書で提供される方法の特定の実施態様において、バイオマーカータンパク質は、約０．７５〜１．０の範囲でＡＵＣを有する。これらの特定の実施形態では、ＡＵＣは、約０．８〜０．８、０．９〜０．９５、又は０．９５〜１．０の範囲である。
【０１７８】
本明細書において提供される方法は低侵襲性であり、副作用のほとんど又はまったくリスクがない。そのようなものとして、それらは、肺状態のいずれの症状も示さない対象、及び肺状態を発症するリスクが低いものとして分類された対象を診断し、監視し、臨床的管理を提供するために使用されてもよい。例えば、本明細書に開示される方法は、ＰＮを示さない、及び／又は過去においてＰＮを示さないが、それにもかかわらずＰＮ及び／又は肺状態の発症のリスクがあるとみなされた対象において、肺癌を診断するために使用され得る。同様に、本明細書に開示される方法は、肺の状態を発症するリスクが低いものとして分類される健康な対象を診断するための厳密な予防措置として使用することができる。
【０１７９】
本発明は、対象における肺の状態は、対象から得られたサンプル中のタンパク質パネルの存在量を測定し、タンパク質の測定に基づいて、癌スコアの確率を算出し、及びスコアが予め決定されたスコアよりも低い場合には、対象について癌を除外することによって癌である可能性を決定する方法を提供する。ここで、対象について癌が除外されると、対象は治療プロトコルを受けない。治療プロトコルは、例えば、肺機能試験（ＰＦＴ）、肺撮像、生検、外科手術、化学療法、放射線療法、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、撮像は、Ｘ線、胸部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、又は陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）スキャンである。
【０１８０】
本発明はさらに、対象から得られたサンプル中のタンパク質パネルの存在量を測定し、タンパク質の測定に基づいて、癌スコアの確率を算出し、及びスコアが予め決定されたスコアよりも高い場合には、対象について癌を受け入れることによって癌である可能性を受け入れる方法を提供する。
【０１８１】
別の局面において、本発明はさらに、癌に基づくスコアの確率を算出し、対象から得られたサンプル中のタンパク質パネルの存在量を測定し、タンパク質の測定に基づいて、癌スコアの確率を算出し、及びスコアが予め決定されたスコアと同等か又はそれよりも大きい場合には、肺の状態の存在を結論付けることによって、対象における癌の状態の存在の可能性を決定する方法を提供する。肺の状態は、肺癌であり、例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が挙げられる。肺癌を発症するリスクのある対象である。
【０１８２】
パネルには、ＡＬＤＯＡ、ＦＲＩＬ、ＬＧ３ＢＰ、ＩＢＰ３、ＬＲＰ１、ＩＳＬＲ、ＴＳＰ  ＣＯＩＡ１、ＧＲＰ７８、ＴＥＴＮ、ＰＲＸＤ１及びＣＤ１４から選択される少なくとも４つのタンパク質を含む。必要に応じて、パネルは、さらにＢＧＨ３、ＣＯＩＡ１、ＴＥＴＮ、ＧＲＰ７８、ＰＲＤＸ、ＦＩＢＡとＧＳＬＧ１から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む。
【０１８３】
対象は、肺結節を有する又は肺結節を有することが疑われる。肺結節は３ｃｍ以下の径を有する。一実施形態では、肺結節は、約０．８ｃｍ〜２．０ｃｍの径を有する。
【０１８４】
スコアは、タンパク質測定に適用されるロジスティック回帰モデルから計算される。例えば、スコアは、
【０１８５】
【化３】
2015506466.tif 000090
【０１８６】
として決定され、式中、
【０１８７】
【化４】
2015506466.tif 000091
【０１８８】
は対数変換され、サンプル（単数又は複数）における遷移ｉの正規化された強度であり、βiは対応するロジスティック回帰係数であり、αはパネル特異的な定数であり、Ｎは該パネルにおける遷移の総数である。
【０１８９】
様々な実施形態において、本発明の方法は、さらに、タンパク質測定の正規化を含む。例えば、タンパク質測定は、ＰＥＤＦ、ＭＡＳＰ１、ＧＥＬＳ、ＬＵＭ、Ｃ１６３Ａ及びＰＴＰＲＪから選択される１つ以上のタンパク質によって正規化される。
【０１９０】
生物学的サンプルが、例えば、組織、血液、血漿、血清、全血、尿、唾液、生殖器分泌物、脳脊髄液、汗及び排泄物などである。
【０１９１】
一態様において、癌の可能性を決定することは、感受性、特異性、スコアと関連付けられた陰性予測値又は陽性予測値によって決定される。決定されたスコアは陰性予測値（ＮＰＶ）が少なくとも約８０％である。
【０１９２】
測定工程は、検出されるタンパク質に特異的に結合する化合物又はペプチド遷移を用いて、選択された反応モニタリング質量分析計によって行われる。一実施形態では、測定されるタンパク質に特異的に結合する化合物は、抗体又はアプタマーである。
【０１９３】
具体的な実施形態において、本明細書に開示される診断方法は、対象について治療プロトコルを除外するために使用され、対象から得られたサンプル中のタンパク質パネルの存在量を測定し、タンパク質測定に基づいて癌スコアの確率を計算し、サンプルにおいて決定されたスコアが予め決定されたスコアよりも低い場合、対象について治療プロトコルを排除することを含む。いくつかの実施形態では、パネルは、ＡＬＤＯＡ、ＦＲＩＬ、ＬＧ３ＢＰ、ＩＢＰ３、ＬＲＰ１、ＩＳＬＲ、ＴＳＰ、ＣＯＩＡ１、ＧＲＰ７８、ＴＥＴＮ、ＰＲＸＤ１及びＣＤ１４から選択される少なくとも４つのタンパク質を含む。
【０１９４】
場合により、パネルは、さらに、ＥＲＯ１Ａ、６ＰＧＤ、ＧＳＴＰ１、ＧＧＨ、ＰＲＤＸ１、ＣＤ１４、ＰＴＰＡ、ＩＣＡＭ１、ＦＯＬＨ１、ＳＯＤＭ、ＦＩＢＡ、ＧＳＬＧ１、ＲＡＰ２Ｂ又はＣ１６３Ａから選択される１以上のタンパク質、あるいはＬＲＰ１、ＣＯＩＡ１、ＴＳＰ１、ＡＬＤＯＡ、ＧＲＰ７８、ＦＲＩＬ、ＬＧ３ＢＰ、ＢＧＨ３、ＩＳＬＲ、ＰＲＤＸ１、ＦＩＢＡ又はＧＳＬＧから選択される１つ以上のタンパク質を含む。好ましい実施形態では、パネルは、少なくともＴＳＰ１、ＬＧ３ＢＰ、ＬＲＰ１、ＡＬＤＯＡ、及びＣＯＩＡ１を含む。より好ましい実施形態では、パネルは、少なくともＴＳＰ１、ＬＲＰ１、ＡＬＤＯＡ及びＣＯＩＡｌ１を含む。
【０１９５】
具体的な実施形態において、本明細書に開示される診断方法は、対象から得られたサンプル中のタンパク質パネルの存在量を測定し、タンパク質測定に基づいて癌スコアの確率を計算し、サンプルにおいて決定されたスコアが予め決定されたスコアより大きい場合、対象について治療プロトコルを受け入れることによって、対象について治療プロトコルを受け入れるために使用される。いくつかの実施形態では、パネルは、ＡＬＤＯＡ、ＦＲＩＬ、ＬＧ３ＢＰ、ＩＢＰ３、ＬＲＰ１、ＩＳＬＲ若しくはＴＳＰ１又はＡＬＤＯＡ、ＦＲＩＬ、ＬＧ３ＢＰ、ＩＢＰ３、ＬＲＰ１、ＩＳＬＲ、ＴＳＰ  ＣＯＩＡ１、ＧＲＰ７８、ＴＥＴＮ、ＰＲＸＤ１及びＣＤ１４から選択される少なくとも４つのタンパク質を含む。場合により、パネルは、さらに、ＥＲＯ１Ａ、６ＰＧＤ、ＧＳＴＰ１、ＣＯＩＡ１、ＧＧＨ、ＰＲＤＸ１、ＳＥＭ３Ｇ、ＧＲＰ７８、ＴＥＴＮ、ＡＩＦＭ１、ＭＰＲＩ、ＴＮＦ１２、ＭＭＰ９若しくはＯＳＴＰ又はＣＯＩＡ１、ＴＥＴＮ、ＧＲＰ７８、ＡＰＯＥ又はＴＢＢ３から選択される１つ以上のタンパク質を含む。
【０１９６】
特定の実施形態において、本明細書に開示される診断方法は、例えば、種々の放射線及び／又は侵襲的な方法を含む、他の臨床的評価法と組み合わせて使用することができる。同様に、特定の実施形態において、本明細書に開示される診断方法は、他の臨床的評価方法について候補を同定するために、又は対象が他の臨床的評価手法の恩恵を受ける可能性を評価するために使用することができる。
【０１９７】
血漿又は血清などの生体サンプル中の特定のタンパク質の高い存在量は、特に、目的のタンパク質が比較的に低い濃度で発現される場合、目的のタンパク質をアッセイする能力を妨げる可能性がある。いくつかの方法は、この問題を回避するために利用可能であり、例えば、濃縮、分離、及び枯渇が挙げられる。濃縮は、分類、例えば、糖捕捉によるグリコシル化タンパク質の除去によって、サンプルからタンパク質を抽出するために親和性薬剤を使用する。分離は、主にタンパク質含有物において重ならない複数の画分にサンプルを分割するための、ゲル電気泳動又は等電点電気泳動などの方法を使用する。枯渇は、一般的に、最も豊富に存在するタンパク質の大部分を除去することを可能にする、ＩｇＹ１４／Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの高度な技術を利用することによって、アルブミンなどの血液中で最も豊富なタンパク質を除去するアフィニティーカラムを使用する。
【０１９８】
本明細書で提供される方法の特定の実施態様において、生体サンプルは、バイオマーカー又は推定バイオマーカータンパク質の発現レベルをアッセイする前に、濃縮、分離、及び／又は枯渇に供されてもよい。これらの特定の実施形態において、血液タンパク質は、最初に、グリコシル化タンパク質タンパク質を富化する糖捕捉法によって処理され、定量化アッセイが高い（ｐｇ／ｍｌ）から低い（ｎｇ／ｍｌ）の範囲でタンパク質を検出できるようにする。糖捕捉の典型的な方法は、当該技術分野において知られている（例えば、米国特許第７，１８３，１８８号；米国特許出願公開第２００７／００９９２５１号；米国特許出願公開第２００７／０２０２５３９号；米国特許出願公開第２００７／０２６９８９５号；及び米国特許出願公開第２０１０／０２７９３８２号参照）。他の実施形態では、血液タンパク質は、最初に、タンパク質枯渇法によって処理され、豊富なタンパク質を除去することによって、サンプル中の一般的に不明瞭なバイオマーカーの検出を可能にする。このような一実施形態では、タンパク質枯渇法は、ＧｅｎＷａｙ枯渇法である。
【０１９９】
特定の実施形態では、バイオマーカータンパク質パネルは、１００個のバイオマーカータンパク質を含む。これらの特定の実施形態では、パネルは、２〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、５〜２５、２６〜３０、３１〜４０、４１〜５０、２５〜５０、５１〜７５、７６〜１００個のバイオマーカータンパク質を含む。特定の実施形態では、バイオマーカータンパク質パネルは、各々、少なくとも２つのバイオマーカータンパク質を含む、バイオマーカータンパク質の１つ以上のサブパネルを含む。例えば、バイオマーカータンパク質パネルは、特定の肺の状態において過剰に発現するバイオマーカータンパク質で構成され第１のサブパネル、及び特定の胚の状態において過少発現するバイオマーカータンパク質で構成される第２のサブパネルを含んでもよい。
【０２００】
本明細書で提供される方法、組成物、及びキットの特定の実施形態において、バイオマーカータンパク質は、肺癌と組み合わせて差次的発現を示すタンパク質であってもよい。例えば、特定の実施形態では、バイオマーカータンパク質は、表６に記載の肺癌に関連するタンパク質の１つであってもよい。
【０２０１】
他の実施形態において、本明細書に開示される診断方法は、２つの異なる肺の状態間を区別するために使用されてもよい。例えば、この方法は、悪性肺癌対良性肺癌、ＮＳＣＬＣ対ＳＣＬＣ、又は肺癌対非癌状態（例えば、炎症状態）として肺の状態を分類するために使用されてもよい。
【０２０２】
特定の実施形態において、キットは、対象における肺の状態を診断するために提供される。これらのキットは、１つ以上のバイオマーカータンパク質の発現レベルを検出するために使用される。場合により、キットは、ラベル又は別個の挿入物の形態で使用のための指示書を含んでもよい。キットは、本明細書に記載のパネル中のタンパク質に特異的に結合する試薬を含むことができる。これらの試薬は、抗体を含むことができる。キットはまた、本明細書に記載のパネル中のタンパク質を発現するｍＲＮＡに特異的に結合する試薬を含むことができる。これらの試薬は、ヌクレオチドプローブを含むことができる。キットはまた、本明細書に記載のパネル中のタンパク質に特異的に結合する試薬を検出するための試薬を含むことができる。これらの試薬は、フルオロフォアを含むことができる。
【０２０３】
以下の実施例は、請求される発明をよりよく説明するために提供され、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。特定の材料が言及される程度まで、それは単に例示の目的のためであり、本発明を限定するものではない。当業者は、創作能力を発揮することなく、本発明の範囲から逸脱することなく、同等の手段又は反応物を開発することができる
【実施例】
【０２０４】
実施例１：肺癌バイオマーカータンパク質の同定
レトロスペクティブ、ケースコントロール研究の設計は、予め定義された対照群と実験群の様々な肺疾患を診断するためのバイオマーカータンパク質及びそのパネルを同定するために使用された。これらの研究の第１の目標は、対照群と実験群間の個々のタンパク質について統計的に有意な示差的発現を実証することであった。第２の目標は、すべて個別に対照群と実験群間の統計的に有意な示差的発現を実証するタンパク質パネルを同定することである。次に、このタンパク質パネルは、二分した疾患状態を区別するために集合的に使用することができる。
【０２０５】
具体的な研究の比較は、１）含対非癌、２）小細胞肺癌対非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、３）癌対炎症性疾患状態（例えば、感染性肉芽腫）、又は４）異なる結節の大きさ、例えば、＜１０ｍｍ対≧１０ｍｍ（あるいはサンプル分布に応じた１０、１５又は２０ｍｍカットオフを使用する）。
【０２０６】
それぞれの対象のデータは以下からなる。治験審査委員会によって承認された研究に以前に登録された研究からの保存された血漿サンプルを用いて、肺の悪性腫瘍と非悪性腫瘍を区別するためのバイオマーカータンパク質及びバイオマーカーパネルを同定した。血漿サンプルは、もともと、日常的な静脈切開術によって得られ、等分し、−８０℃以下で保存された。サンプル調製、対象識別コードの割り当て、初期の対象記録エントリー、及び被検体保存は、ＩＲＢ研究プロトコルに従って実施された。サンプル適格性は、対象、ＰＮ、及び臨床病期分類パラメータを含む臨床パラメータに基づく。包含及び排除に関するパラメータを表７に記載する。
【０２０７】
【表７】
2015506466.tif 000092
【０２０８】
対象群又は実験群に対するサンプルの割り当て、及びこれらの群内及び群間の他のサンプルへのさらなる層別化又はマッチングは、対象についての様々な臨床データに依存している。このデータには、例えば、年齢、性別、病歴（例えば、喫煙状況）などの民族的情報、合併症の状態、ＰＮ特徴付け、切除された病変及び組織の病理学的な解釈が含まれる（表８）。
【０２０９】
【表８】
2015506466.tif 000093
【０２１０】
研究デザインと分析計画は、表９に記載される対照群：実験群の対合の優先順位を付ける。追加の臨床的及び分子的洞察力は、実験群と対照群の割り当てにおける表現型（例えば、喫煙の効果）の選択的包接によって得られてもよい。臨床データベースに利用可能な民族的情報は、臨床パラメータ（例えば、年齢及び結節サイズ）に関して症例対照分析におけるサンプルの層化又はマッチングを経由して、サンプル選択の更なる改良を可能にする。
【０２１１】
【表９】
2015506466.tif 000094
【０２１２】
ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳは、血漿サンプル中の種々の血漿タンパク質を同定及び定量するために行われる。ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ分析前に、各サンプルは、ＩｇＹ１４／Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ）を用いて枯渇され、続いてトリプシン消化される。各対照群又は実験群からのサンプルは、公平な比較のために、ランダムにバッチ処理され、ＱＴｒａｐ５５００装置（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）上で一緒に処理される。各サンプルの分析には、約３０分かかる。２つの遷移（天然と重いラベル）のピーク領域を回収し、すべてのペプチド及びタンパク質について報告される。ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳによって分析される各タンパク質についてのデータ出力は、典型的には、同じタンパク質からの２つのペプチドの各々から２つの遷移の測定値からなる４つの測定値が得られる。これらの測定は、バイオインフォマティクス及び統計分析におけるその発現レベルとして使用される標的タンパク質の相対的存在量の推測を可能にする。
【０２１３】
対照群と実験群間に示差的発現レベルを有するバイオマーカータンパク質の同定により、１つ以上の新規なプロテオミクスプロファイルが得られる。例えば、バイオマーカータンパク質は、ＮＳＣＬＣを有すると診断されるＰＮ対象対ＮＳＣＬＣ診断なしの対象において、又はＮＳＣＬＣを有すると診断されるＰＮ対象対炎症疾患において、異なる発現レベルを用いて同定される。また、二分した疾患状態間を集合的に区別できるバイオマーカータンパク質パネルが同定される。
【０２１４】
分析は、適切に、０．０５で１型及び２型の誤差を調節し、分析あたりコホート間の相違を検出するために（先験的に）動力を与えられてもよい。個々のタンパク質の診断能力は、一般に、２つのコホート間を区別するために評価され、不均衡な対合の非パラメータ試験が使用されることが想定される。これは、実験群と対照群間の差次的発現を実証するために必要なサンプルサイズに下限を提供する。多重検定の効果は、より大きなサンプルサイズを必要とする診断有効性を評価するために、タンパク質パネルの同定に適用される。
【０２１５】
個々のタンパク質の示差的発現に関する統計的有意性を決定するための一連の工程には以下：１）を評価し、単一のタンパク質の遷移の較正された値を評価し相関させること（品質管理指標）；２）統計的有意性を決定するために、マン・ホイットニーＵ検定（順位和）を用いて、他の影響を調節する群の対合分析を比較すること；及び３）予め定義された有意性の閾値に基づいて、その重要性を決定すること、を含む。サンプル全体で相関しないタンパク質内の遷移（例えば、ピアソン相関＜０．５）は信頼できないとみなされ、解析から除外される。
【０２１６】
２つのコホート間、例えば癌と非癌間の較正されたサンプルの比較は、結節サイズ、年齢及び性別などの様々な臨床パラメータを用いた対合及びマッチングを必要とする。実際の比較目的、例えば、癌と非癌におけるこれらの他のパラメータの潜在的影響についてこのような対合対照である。次に、マン・ホイットニーＵ検定（順位和）などの非パラメータ検定は、群間の統計的差異を測定するために適用される。得られたｐ値は、偽発見率などの複数のテスト補正を使用して調整することができる。順列試験はさらに有意性の評価のために使用することができる。
【０２１７】
有意性は、追加のフィルタリングのためのより高い閾値の潜在的な使用により、アッセイをフィルターで除外するために、０．０５などの予め定義された閾値の満足度によって決定される。追加の有意性の基準は、３つの複製アッセイのうちの２つが、個別に、アッセイ（例えば、単一のタンパク質）が重要であるためには重要でなければならないということである。
【０２１８】
上記で定義されるように、個別に、統計学的に有意な異なる発現を実証し、二分された疾患状態を区別するために総合的に使用され得るタンパク質パネルは、本明細書に記載される統計的方法を用いて同定されている。これは、多変量分類子を開発し、パネルの感受性、特異性、及びＲＯＣ  ＡＵＣを評価することが必要である。さらに、最適な差別的性能、例えば、ＲＯＣ  ＡＵＣを有するタンパク質パネルが同定され、疾患状態の識別における臨床使用のために十分であり得る。
【０２１９】
タンパク質パネルの差別的能力の統計的有意性を決定するための工程の順序は、１）タンパク質パネル用の多変量分類子を開発し、２）一連の疾患状態について、最適な差別的性能、例えば、ＲＯＣ  ＡＵＣを用いたタンパク質パネルを同定することを含む。
【０２２０】
多変量分類子（例えば、多数決）が、有意であるとみなされる単一のタンパク質アッセイを含む、タンパク質パネルのために開発される。各分類子の感受性及び特異性が決定され、特定の比較（例えば、癌対非癌）のために所定のパネルの差別的な性能を評価するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線とＡＵＣを生成するために使用される。
【０２２１】
プロトコル
１．肺疾患を呈する一連の対象からの臨床データを見直す。
２．サンプルが良性、癌、ＣＯＰＤ又は他の肺疾患である対象からの血漿サンプルを提供する。
３．結節のサイズによって分離されているＰＮによる良性又は癌性である血漿サンプルを集める。
４．タンパク質あたり少なくとも２つのペプチド及びペプチドあたり少なくとも２つのＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ遷移からなる３７１個の推定肺癌バイオマーカータンパク質のプールを対象とする。ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ質量分光法による合成内部基準と、血漿からのペプチド遷移を比較するために１０個の遷移からなる５個の合成内部基準とともに、各被検体中のＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ遷移を測定する。
５．各遷移の強度を定量。
６．正規化強度を得るために、内部標準に対して定量化遷移を正規化する。
７．不一致の遷移を拒否し、同じペプチドからの相関について、測定したペプチド遷移を見直。
８．良性サンプルと癌と比較することによって、各遷移のＲＯＣを生成する（ＲＯＣは、特異性（真陽性）と（１−感受性）偽陽性を比較する）。
９．各遷移のＡＵＣを定義する（０．５のＡＵＣはランダムな分類子である。１．０は完璧な分類子である）。
１０．統計的に有意である遷移を決定するＡＵＣカットオフポイントを決定する。
１１．ＡＵＣカットオフポイントを超える遷移を定義する。
１２．有意な遷移のすべての対合を結合する。
１３．ロジスティック回帰を用いて各遷移対に対して新しいＡＵＣを定義する。
１４．３重、４重など、対合組み合わせを繰り返す；組み合わせた所望の性能（感受性＆特異性）を有するバイオマーカー遷移パネルが得られるまで、組み合わせた遷移のロジスティック回帰に基づいて新規なＡＵＣを定義する。
１５．バイオマーカー遷移のパネルは、従前使用されていない一連の血漿パネルに対して検証される。
【０２２２】
実施例２：バイオマーカータンパク質を用いた肺疾患の診断／分類
血漿サンプルは、対象が肺の状態を有するかどうかを評価するために、ＰＮを呈する１つ以上の対象から得られる。血漿サンプルは、ＩｇＹ１４／Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ）を用いて枯渇され、必要に応じて、濃縮及び／又は分離の１つ以上のラウンドが行われ、次にトリプシン処理される。肺の状態を有する対象において示差的に発現されるものとして、以前に同定された１つ以上のバイオマーカータンパク質の発現レベルは、ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳアッセイを用いて測定される。ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳアッセイは、各バイオマーカータンパク質について２〜５個のペプチド遷移を利用する。例えば、アッセイは、表６に列挙されたタンパク質のいずれかから生成された１つ以上のペプチド遷移を利用してもよい。バイオマーカータンパク質の１つ以上が、そのタンパク質について予め決定された対照発現レベルと有意に異なる発現レベルを提示する場合、対象は、肺の状態を有するものとして分類される。
【０２２３】
実施例３：肺結節（ＰＮ）が良性又は悪性である可能性を判断するために血液ベースの診断テスト
１５個のタンパク質のパネルを作製した。この場合、６つのタンパク質標準の濃度に対するこれらの１５個のタンパク質の濃度は、癌の可能性を示す。６つのタンパク質標準に対するこれらの１５個のタンパク質の相対濃度を質量分析法を用いて測定した。分類アルゴリズムは、ＰＮが良性又は悪性であるという相対的可能性に、これらの相対濃度を合わせるために使用される。更に、ＰＮが良性又は悪性である可能性について診断試験でもあるこれらのパネル上に多くのバリエーションがあることが実証されている。タンパク質パネル、タンパク質標準、測定方法及び／又は分類アルゴリズムの変形は、本明細書に記載されている。
【０２２４】
研究設計
３４５個の肺癌関連タンパク質から１５５０個の遷移からなる単一の反応モニタリング（ＳＲＭ）質量分析（ＭＳ）アッセイが開発された。ＳＲＭ−ＭＳアッセイ及び方法は上述されている。本研究の目的は、良性又は悪性としての大きさ２ｃｍを下回るＰＮを分類するための血液ベースの診断を開発することであった。研究設計を表１０に表示する。
【０２２５】
【表１０】
2015506466.tif 000095
【０２２６】
研究は、３つのサイト（Ｌａｖａｌ、ＵＰｅｎｎ及びＮＹＵ）から２４２個の血漿サンプルでなっていた。各サイトからの良性及び悪性サンプル数を表１０に示す。研究は、サイズが２ｃｍ以下のＰＮを有する患者からの１４４個の血漿サンプルと、サイズが２ｃｍを超えるＰＮを有する患者からの９８個のサンプルからなっていた。これは、サイズが２ｃｍ以下の良性及び悪性の癌サンプル間で、１．５倍以上の血中濃度を有するタンパク質の発見について９４％の推定動力となった。動力は、２ｃｍよりも大きなサイズのＰＮについて７４％である。
【０２２７】
この研究は、サイト間の変動に堅牢である肺癌のタンパク質バイオマーカーを導くために意図された訴求的マルチサイト研究であった。研究は、サイズが２ｃｍ以下の腫瘍について測定技術（ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ）の検出限界により検出できないタンパク質が依然としてサイズが２ｃｍ以上の腫瘍において検出され得ることを確実にする２ｃｍよりも大きいサンプルを含んだ。
【０２２８】
各サイトからサンプル及び各サイズクラス（２ｃｍの上下）を結節サイズ、年齢及び性別に合致させた。
【０２２９】
サンプル分析
各サンプルは、以下のように、ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ測定法を用いて分析された。
【０２３０】
１．サンプルは、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＩｇＹ１４とスーパーミックス枯渇カラムを用いて高量のタンパク質を枯渇させた。
２．サンプルは、トリプシンを用いて、トリプシンペプチドに消化された。
３．サンプルは、Ｗａｔｅｒｓ  ｎａｎｏａｃｕｉｔｙ  ＬＳシステム上で３０分の勾配を用いてＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳによって分析され、ＡＢ−Ｓｃｉｅｘ  ５５００  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄデバイス上で１５５０個の遷移をＳＲＭ−ＭＳ分析された。
４．生の遷移イオンカウントは、１５５０個の遷移のそれぞれについて得られ、記録された。
【０２３１】
合致したサンプルは、並列で（工程２及び４）又は連続して（工程１及び３）、各工程で処理されたことを気づくことは重要である。これは、分析のばらつきを最小限に抑える。最後に、サンプル分析の工程１及び２は、処理の日に係るサンプルのバッチで行われる。表１０に示すように、「小さな」サンプルの５つのバッチと「大きい」サンプルの４つのバッチがあった。
【０２３２】
タンパク質候補リスト
サイト全体での６８個のタンパク質の再現可能に診断される候補リストを以下のように導出した。各タンパク質は、複数の遷移によって測定され得ることに留意されたい。
【０２３３】
工程１：正規化
研究のすべてのサンプルで検出され、変動係数が低い遷移を有する６つのタンパク質が同定された。各タンパク質について、サンプル全体で最も高い中央値強度の遷移は、タンパク質について代表的な遷移として選択された。これらのタンパク質及び遷移は、表１１に見出される。
【０２３４】
【表１１】
2015506466.tif 000096
【０２３５】
本発明者らは、正規化因子（ＮＦＳ）として、表１１中の遷移に言及する。１５５０個の遷移の各々は、６つの正規化因子の各々によって正規化された。この場合、ＮＦｆによるサンプルｓ中の遷移ｔの新たな強度（Ｎｅｗ（ｓ，ｔ，ｆ）と記される）を以下のように計算する：
Ｎｅｗ（ｓ，ｔ，ｆ）＝Ｒａｗ（ｓ，ｔ）＊中央値（ｆ）／Ｒａｗ（ｓ，ｆ）
ここで、Ｒａｗ（ｓ，ｔ）は、サンプルｓ中の遷移ｔの元々の強度であり；中央値（ｆ）は、全てのサンプル全体でのＮＦｆの中央値強度であり；Ｒａｗ（ｓ，ｆ）はサンプルｓにおけるＮＦｆの元々の強度である。
【０２３６】
それぞれのタンパク質及び正規化遷移について、各バッチのＡＵＣを計算した。９バッチ全体で変動係数を最小限にしたＮＦは、そのタンパク質のＮＦとして、そのタンパク質の全ての遷移について選択された。したがって、すべてのタンパク質（及びその遷移のすべて）について、ここで、単一ＮＦによって正規化される。
【０２３７】
工程２：再現可能な診断タンパク質
各正規化された遷移について、研究における９バッチ各々についてのそのＡＵＣを以下のように計算した。遷移が癌サンプルの半分よりも少なく、良性サンプルの半分よりも少ない場合、バッチＡＵＣは「ＮＤ」である。そうでなければ、バッチＡＵＣが計算され、バッチ中に良性及び癌サンプルを比較される。
【０２３８】
バッチＡＵＣ値は、それぞれの遷移について、ＡＵＣスコアパーセンタイルに変換される。つまり、正規化された遷移が、すべての遷移についてＡＵＣスコアが８２パーセンタイルである場合、そのバッチについて、パーセンタイルＡＵＣ０．８２が割り当てられる。
【０２３９】
再現可能な遷移は、以下の基準のうち少なくとも１つを満たすものである。
１．５つの小さなバッチの少なくとも４つにおいて、パーセンタイルＡＵＣは７５％以上（又は２５％以下）である。
２．５つの小さなバッチの少なくとも３つにおいて、パーセンタイルＡＵＣは８０％以上（又は２０％以下）であり、小さなバッチにおける残りのパーセンタイルＡＵＣは、５０％を上回る（５０％を下回る）。
３．すべての５つの小さなバッチにおいて、パーセンタイルＡＵＣは５０％を上回る（５０％を下回る）。
４．４つの大きなバッチの少なくとも３つにおいて、パーセンタイルＡＵＣは８５％以上（又は１５％以下）である。
５．４つの大きなバッチの少なくとも３つにおいて、パーセンタイルＡＵＣは８０％以上（又は２０％以下）であり、大きなバッチにおける残りのパーセンタイルＡＵＣは、５０％を上回る（５０％を下回る）。
６．すべての４つの大きなバッチにおいて、パーセンタイルＡＵＣは５０％上回る（５０％を下回る）。
【０２４０】
これらの基準は、６７個のタンパク質のリストをもたらし、少なくとも１つの遷移は１つ以上の基準を満たす。これらのタンパク質は表１２に表示される。
【０２４１】
【表１２−１】
2015506466.tif 000097
【０２４２】
【表１２−２】
2015506466.tif 000098
【０２４３】
【表１２−３】
2015506466.tif 000099
【０２４４】
【表１２−４】
2015506466.tif 000100
【０２４５】
【表１２−５】
2015506466.tif 000101
【０２４６】
【表１２−６】
2015506466.tif 000102
【０２４７】
【表１２−７】
2015506466.tif 000103
【０２４８】
【表１２−８】
2015506466.tif 000104
【０２４９】
【表１２−９】
2015506466.tif 000105
【０２５０】
【表１２−１０】
2015506466.tif 000106
【０２５１】
【表１２−１１】
2015506466.tif 000107
【０２５２】
【表１２−１２】
2015506466.tif 000108
【０２５３】
【表１２−１３】
2015506466.tif 000109
【０２５４】
【表１２−１４】
2015506466.tif 000110
【０２５５】
【表１２−１５】
2015506466.tif 000111
【０２５６】
【表１２−１６】
2015506466.tif 000112
【０２５７】
【表１２−１７】
2015506466.tif 000113
【０２５８】
【表１２−１８】
2015506466.tif 000114
【０２５９】
【表１２−１９】
2015506466.tif 000115
【０２６０】
工程３：有意性と発生
高性能パネルを見つけるに各試験は、１，０００回の試行が行われた。この場合、各試行において、表１２から選択される１５個のタンパク質のランダムなパネルを組み合わせたＡＵＣが推定された。１５個のタンパク質のそれぞれのパネルの組み合わせたＡＵＣを計算するために、最高強度の正規化された遷移を利用した。ロジスティック回帰を用いて、全ての小サンプル全体で１５のパネルのＡＵＣを計算した。１５個のタンパク質の１３１パネルは、図１に示すように、０．８０を超える組み合わせたＡＵＣを有した。（小さい（＜２．０ｃｍ）と大きい（＞２．０ｃｍ）ＰＮに分別した研究による有用性を図２に示す）。パネルの回復力は、図３に示すように、サンプルにおけるサイトベースの変動にもかかわらず持続した。パネルを表１３にリストされる。
【０２６１】
【表１３−１】
2015506466.tif 000116
【０２６２】
【表１３−２】
2015506466.tif 000117
【０２６３】
【表１３−３】
2015506466.tif 000118
【０２６４】
【表１３−４】
2015506466.tif 000119
【０２６５】
１５個のタンパク質のそれぞれのパネルの組み合わせたＡＵＣを計算するために、最高強度の正規化された遷移を利用した。ロジスティック回帰を用いて、全ての小サンプル全体で１５個のパネルのＡＵＣを計算した。１５個のタンパク質の５パネルは、０．８０を超える組み合わせたＡＵＣを有した。
【０２６６】
最後に、表１３にリストされた１３１パネル上の６７個のタンパク質のそれぞれの頻度は、生カウント（カラム２）及びパーセント（カラム３）の両方として表１２に提示される。１５のパネルサイズは、診断タンパク質とパネルがあることを証明するために予め選択されたことは重要な観察である。さらに、数々のようなパネルがある。６７個のタンパク質のリストから選択されたより小さなパネルも形成することができ、ここでは同じ方法を用いて生成することができる。
【０２６７】
実施例４：大きさが２ｃｍ以下のＰＮを有する患者からの血液サンプルが良性又は悪性である確率を決定するための１５個のタンパク質の診断パネル
表１４において、すべての小さなサンプルで訓練されたロジスティック回帰分類子が提示される。
【０２６８】
【表１４】
2015506466.tif 000120
【０２６９】
分類子は、以下の構造：
【０２７０】
【化５】
2015506466.tif 000121
【０２７１】
を有し、式中、Ｃ0及びＣiはロジスティック回帰係数であり、Ｐiは対数変換された正規化された遷移強度である。確率≧０．５である場合は癌として、又はそうでなければ良性として予測される。表１４において、係数Ｃiは、最後の行の６列目に見られ、それぞれのタンパク質について正規化された遷移は、カラム２（タンパク質遷移）とカラム４（正規化因子）によって定義される。
【０２７２】
この分類子の性能は、ＲＯＣプロットとして示され、図４に見られる。全体のＡＵＣは０．８１である。性能はまた、個々に、図５に見られる３つのＲＯＣプロットが得られる各研究サイトに分類子を適用することによって評価することができる。得られたＡＵＣは、Ｌａｖａｌ、ＮＹＵ及びＵＰｅｎｎについて、それぞれ０．７９、０．８８及び０．７８である。
【０２７３】
実施例５：プログラム「Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ」（登録商標）は、本発明の方法を用いて同定された結節を有する患者において肺癌を識別するために使用される血液タンパク質についてクエリーを行うために使用した。
診断パネル（表１３）として同定された６７個のタンパク質から３５個のタンパク質（表１５）のサブセットを使用して、逆方向システム分析を行った。同定された３５個のタンパク質を用いて癌ネットワークとして同定される２つのネットワークについてクエリーを行った。結果は、核のレベルまで下げて患者の血液中に見出されるタンパク質についてクエリーが行われる場合、「ヒット」の最高のパーセンテージを有するネットワークが、中でも喫煙または肺癌のいずれかによって制御される転写因子によって開始されることを示す。
【０２７４】
これらの結果は、肺癌の診断として、本発明の方法を用いて同定されたタンパク質が予後であり、関連しているさらなる証拠である。
【０２７５】
【表１５−１】
2015506466.tif 000122
【０２７６】
【表１５−２】
2015506466.tif 000123
【０２７７】
【表１５−３】
2015506466.tif 000124
【０２７８】
【表１５−４】
2015506466.tif 000125
【０２７９】
【表１６】
2015506466.tif 000126
【０２８０】
実施例６：肺結節を診断するための協同タンパク質
協同タンパク質の公平な発見を達成するために、選択された反応モニタリング（ＳＲＭ）質量分析（Ａｄｄｏｎａ，Ａｂｂａｔｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．２００９）を使用した。ＳＲＭは、選択されたタンパク質の特に有益な（プロテオティピックな）ペプチドの所定の特異性の高い大容量の生成物を監視する質量分析の一形態である。これらのペプチドは、質量スペクトル内で特定の遷移として認識される。ＳＲＭは、他の技術、特に抗体ベースの技術は持たない、次の必要な機能を有する：
●高度に多重化されたＳＲＭアッセイは、数十又は数百のタンパク質について迅速かつ費用効果的に開発され得る。
●開発されたアッセイは、選択したタンパク質に対するものであり、既存のアッセイの目録に限定されるものではない。さらに、アッセイは、腫瘍細胞の細胞表面上の膜貫通タンパク質の細胞外部分などのタンパク質の特定領域について、又は特定のアイソフォームについて開発することができる。
●ＳＲＭ技術は、発見から臨床試験まで使用することができる。ペプチドイオン化、質量分析法の基礎は、著しく再現性がある。１つのテクノロジープラットフォームを使用すると、１つの技術プラットフォームから別のものにアッセイを翻訳する一般的な問題を回避できる。
ＳＲＭは、長年の小分子分析物の臨床試験のために使用され、最近では、生物学的な関連アッセイの開発に使用されている［１０］。
【０２８１】
標識及び非標識のＳＲＭペプチドは、ＳＲＭ分析の設計及び実施のためのマススペクトルのオープンソースライブラリーとデータリポジトリとともに市販されている。例外的な公共資源は、ＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓ［１１］とプラズマプロテオームプロジェクト［１２，１３］、ＳＲＭ  Ａｔｌａｓ及びＰＡＳＳＥＬ、ＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓ  ＳＲＭ実験ライブラリー（ｗｗｗ．ｓｙｓｔｅｍｓｂｉｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ｐａｓｓｅｌ）を含むアッセイ開発を加速するために存在する。技術的なパフォーマンスを向上させる
【０２８２】
技術性能を高める２つのＳＲＭ戦略が導入された。第１に、大規模のＳＲＭアッセイ開発は、偽シグナルを監視する可能性を導入する。発現相関技術［１４］の拡張機能を使用して、偽シグナル監視の速度を３％未満に低下させた。これは、ｍＰｒｏｐｈｅｔ（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｒｉｎｎｅｒら、２０１１）によって使用されるアプローチに匹敵し、相補的である。
【０２８３】
第２に、内因性タンパク質パネルを正規化のために使用した。しかしながら、これらのタンパク質は、典型的には、「ハウスキーピング」タンパク質（Ｌａｎｇｅ，Ｐｉｃｏｔｔｉら、２００８）として選択される一方、テクノロジープラットフォームのための強力な正規化因子であったタンパク質を同定した。すなわち、効果的に制御することができるように、技術的な変動の影響をモニターしたタンパク質である。これは、例えば、２３．８％から９．０％までの多量のタンパク質のサンプル枯渇に起因する技術的変動の減少をもたらした。内因性シグナルの正規化の利点は、以前（Ｐｒｉｃｅ，Ｔｒｅｎｔら、２００７）に検討されている。
【０２８４】
戦略の最後の構成要素は、新たに発生した最善の実施を使用して発見と検証の研究を注意深く設計することであった。具体的には、症例（悪性結節）と対照（良性結節）が対になって、年齢、結節の大きさ、性別、臨床現場への関与について合致させた。これは、発見された候補マーカーが、年齢はサイトごとのサンプル回収の変化のマーカーはないことを確実にする。研究は、十分に動力となり、複数のサイト、変動試験に関与される新規サイトを含み、重要なのは、テストの目的とする用途に対応するために設計された。サンプルの注意深い選択とマッチングは、分類子の例外的価値のある機能をもたらした。分類子は、結節の大きさと喫煙状況とは独立したスコアを生成する。これらは、ＩＰＮの臨床管理のための現在使用される危険因子であるため、分類子のＩＰＮ診断に使用するための相補的な分子ツールである。
【０２８５】
アッセイ開発のためのバイオマーカー候補の選択
肺腫瘍細胞を起源とする血液中の肺癌バイオマーカーを同定するために、切除された肺腫瘍切除、及び同じローブの先端正常組織を得た。原形質膜は、内皮及び上皮細胞の両方から単離され、腫瘍細胞上で過剰発現した細胞表面タンパク質を同定するためにタンデム質量分析によって分析された。同様に、ゴルジ装置は、腫瘍細胞からの過剰分泌タンパク質を同定するために単離された。血液中に存在するか又は分泌された証拠を有するタンパク質は、優先順位が付けられ、一連の２１７個のタンパク質をもたらした。詳細については、実施例７：材料及び方法を参照されたい。
【０２８６】
他の実行可能な肺癌バイオマーカーが見落とされなかったことを確認するために、文献調査を実施し、肺癌マーカーを手動で管理した。上記のように、血液中に存在するか又は分泌された証拠を有するタンパク質が優先された。これは、一連の３１９個のタンパク質をもたらした。詳細については、実施例７：材料及び方法を参照されたい。
【０２８７】
組織（２１７）と文献（３１９）の候補は、３８８個のタンパク質候補の最終候補リストをもたらす１４８個のタンパク質によって重複された。実施例７：材料及び方法を参照されたい。
【０２８８】
ＳＲＭアッセイの開発
３８８個のタンパク質のためのＳＲＭアッセイは、標準的な合成ペプチド技術を使用して開発された（実施例７：材料と方法を参照）。３８８個の候補のうち、ＳＲＭアッセイは、３７１個の候補について首尾よく開発された。３７１個のＳＲＭアッセイは、血液中の検出率を評価するために、良性及び肺癌血漿サンプルに適用した。ＳＲＭアッセイの１９０個（５１％成功率）が検出された。この成功率は、血漿中の癌マーカーの検出のための大規模なＳＲＭアッセイを開発するために同様の試みに勝る。最近、一般的な癌マーカーについて１８２個のＳＲＭアッセイは、１１７２個の候補（１６％成功率）から開発されました［１５］。肺癌マーカーにのみ焦点を当てたにもかかわらず、効率の３倍増加は、血液中の存在の従前の証拠を有する癌組織からの調達に起因しているようである。血液における質量分析によって従前検出された３７１個のそれらのタンパク質は、血中における検出の６４％成功率を有し、一方、検出されていないものは３５％成功率を有した。血中において検出された１９０個のタンパク質のうち、１１４個は、組織起源の候補に由来し、１６７個は、文献起源の候補に由来した（９１個のタンパク質が重複する）。実施例７：材料と方法、及び表６を参照されたい。
【０２８９】
典型的には、ＳＲＭアッセイは、アッセイが意図されたペプチドを監視していることを確認するために手動で管理される。しかしながら、これは、この３７１個のタンパク質アッセイなどの大規模なＳＲＭアッセイのために不可能となる。さらに最近では、ｍＰｒｏｐｈｅｔ（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｒｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）などの計算ツールは、ＳＲＭアッセイの自動化された能力を可能にする。ｍＰｒｏｐｈｅｔと相補的な戦略が導入され、これは、各データセットのカスタマイズを必要としない。高い信頼度を有するタンパク質遷移の同一性を確認するために、相関技術（Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｂｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００８）を利用する。図７において、アッセイにおける遷移のすべての対間のピアソン相関のヒストグラムが示される。一対の遷移間の相関は、以下に詳述される発見研究におけるすべての１４３個のサンプル全体でそれらの発現プロファイルから得られる。予期されるように、同じペプチドからの遷移は非常に相関している。同様に、同じタンパク質の異なるペプチド断片からの遷移はまた、高度に相関している。対照的に、異なるタンパク質からの遷移はあまり相関せず、タンパク質のＳＲＭアッセイの品質の統計分析を可能にする。例えば、同じタンパク質からの２つのペプチドからの遷移の相関が０．５を超える場合、アッセイが偽である確率は３％未満である。実施例７、材料と方法を参照されたい。
【０２９０】
分類子発見
分類子の発見に使用される１４３個のサンプルの概要を表１７に示す。サンプルは、単一のサイトに過剰適合を避けるために、３つのサイトから入手した。参加サイトは、Ｌａｖａｌ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ  ｄｅ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｉｅ  Ｐｎｅｕｍｏｌｏｇｉｅ  ｄｅ  Ｑｕｅｂｅｄ）、ＮＹＵ（ニューヨーク大学）とＵＰｅｎｎ（ペンシルバニア大学）であった。サンプルはまた、結節の大きさ（直径）、年齢及び喫煙状態に関して意図された用途の集団を代表するように選択された。
【０２９１】
良性と癌のサンプルは、年齢、性別、サイトと結節のサイズに一致させることによって対合させた（良性と癌のサンプルを放射線学的に同定された結節を持つことが必要とされた）。良性と癌のサンプルは、喫煙（パックイヤー）の偏りを表示するが、良性と癌サンプルの大部分は、現在又は過去の喫煙者であった。悪性と良性サンプルを比較すると、その意図は、肺癌のマーカーだったタンパク質を見つけることだった。年齢、結節サイズ及びサイトサンプル回収における相違ではない。癌サンプルは病理学的に確認され、良性サンプルは、病理学的に確認され、又は放射線学液に確認された（ＣＴスキャン監視の２年を超えて腫瘍増殖は実証されなかった）。
【０２９２】
【表１７】
2015506466.tif 000127
【０２９３】
サンプルの処理をバッチで行った。各バッチは、一連の無作為に選択された癌−良性対と３つの血漿標準からなり、候補と品質管理目的を含めた。
【０２９４】
すべての血漿サンプルは、免疫枯渇され、トリプシン消化され、逆相ＨＰＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳによって分析された。タンパク質遷移は、内因性タンパク質パネルを使用して正規化された。正規化手法は、全体的な変動性を低減させるように設計されたが、特に、枯渇工程によって導入される変動性を低減させるようにした。全体的な技術的な変動性を３２．３％から２５．１％に低減させ、枯渇に起因した技術的変動性を２３．８％から９．０％に低減させた。サンプル分析と正規化手法の詳細は、実施例：材料と方法において利用可能である。
【０２９５】
タンパク質パネルを評価するために、ロジスティック回帰モデルに適合させた。ロジスティック回帰は、特に、測定された変数（遷移）の数が、研究におけるサンプル数と類似するか又はそれよりも大きい場合、非線形モデルを用いて起こり得る過剰適合を回避するために選択された。パネルの性能は、９０％に固定された感受性を有する部分的な曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定された（ＭｃＣｌｉｓｈ  １９８９）。部分的ＡＵＣは、ＲＯＲを最大化しながら、高いＮＰＶ性能と相関する。
【０２９６】
１３個のタンパク質分類子を導出するために、４つの基準を使用した：
●タンパク質は、研究におけるサンプル全体でノイズを超えて確実に検出される遷移を有しなければならない。
●タンパク質は、非常に協力的でなければならない。
●タンパク質は、堅牢である遷移を有しなければならない（ノイズに対する高いシグナル、干渉がないなど）。
●ロジスティック回帰モデル内のタンパク質の係数は、相互検証中に低い変動性を有しなければならず、すなわち、それは安定でなければならない。
これらの基準のそれぞれがどのように適用されたかの詳細は、実施例７：材料と方法に示される。
【０２９７】
最後に、１３個のタンパク質分類子は、Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ相互検証（ＭＣＣＶ）によって、ロジスティック回帰モデルに向けられ、持続率は２０％及び２０，０００反復であった。除外分類子についての１３個のタンパク質は、それらの最高強度の遷移とモデル係数と共に表１８にリストされる。
【０２９８】
【表１８】
2015506466.tif 000128
【０２９９】
除外分類子の検証
５２個の癌と５２個の良性サンプル（表１７を参照）を用いて、１３個のタンパク質分類子の性能を検証した。すべてのサンプルは発見サンプルから独立し、加えて、３６％を超える検証のサンプルは、新しい４番目のサイトから供給された（バンダービルト大学）。サンプルは、意図された試料と一致し、性別、臨床サイト及び結節の大きさの点で合致するように選択された。本発明者らは、僅かな年齢の隔たりに気が付いた。これは、若い患者からの５個の良性サンプルに起因する。９０％のＮＰＶを予想し、９５％信頼区間は±５％である。
【０３００】
この時点で、発見分類子について、１４３個のサンプルに向けられた１３個のタンパク質分類子に言及する。しかしながら、検証が完了すると、分類子について最適な係数を見出すために、２４７個すべてのサンプル（発見及び検証セット）に再試行された。これは、将来の性能を最も予測するためである。本発明者らは、最終分類子としてこの分類子に言及する。最終分類子の係数を表２１に示す。
【０３０１】
発見分類子と最終分類子の性能を図８に要約する。発見セット、検証セットに適合した場合、発見分類子についてＮＰＶとＲＯＲを報告する。最終分類子についてのＮＰＶとＲＯＲは全てのサンプル、さらに結節サイズが８ｍｍ〜２０ｍｍに限定された全てのサンプルについて報告される（１９１サンプル）。
【０３０２】
ＮＰＶとＲＯＲ、それぞれ、０から１の画分として報告される。同様に、分類子は０から１のスコアを生み出し、これは、分類子によって予測された癌の確率である。
【０３０３】
ＮＰＶとＲＯＲについて発見と検証の曲線は、予想通り、優れた発見曲線と類似している。これは、サンプルの独立したセットでの性能の再現性を実証する。０．４０の発見分類子除外閾値は、発見サンプルと検証サンプルのそれぞれについて９６％と９０％のＮＰＶを達成し、一方、ＲＯＲは３３％と２３％である。０．６０の最終分類子除外閾値は、すべてのサンプルと、８ｍｍ〜２０ｍｍに制限されたすべてのサンプルについてそれぞれ、９１％と９０％のＮＰＶであり、一方、ＲＯＲは４５％と４３％である。
【０３０４】
分類子の適用
図９は、発見と検証セットからのすべての２４７個のサンプルに最終分類子の適用を提示する。図９の目的は、各サンプルに割り当てられた分類子スコアと、喫煙の臨床危険因子（パックイヤーで測定される）及び結節の大きさ（各円の大きさに比例する）とを対比することである。
【０３０５】
第１に、高い分類子スコアを有する癌サンプルの密度に注意されたい。分類子は、高い感受性で、血液中の癌のシグネチャーを検出するように設計されている。結果として、除外閾値（０．６０）よりも左側に、癌サンプルの存在は非常に少なく（＜１０％）、２５％の癌の罹患率を仮定する［１６，１７］。
【０３０６】
第３は、結節のサイズは分類子スコアが増加しないようである観察である。大小の結節を分類子スコアスペクトル全体に分散される。同様に、非常に高い分類子スコアを有するいくつかの非常に重い喫煙者があるが、喫煙の増加は、分類スコアとともに増加していないようである。この観察を定量するために、分類子スコアと結節の大きさ間の相関、喫煙と年齢の間の相関を計算し、表１９に示す。すべての場合において、分類子スコアと危険因子の間に有意な関係はない。唯一の例外は、良性の分類子スコアと良性の年齢の間に弱い相関である。しかしながら、この相関は非常に弱いため、分類スコアは、１０年毎にわずかに０．０４増加する。
【０３０７】
【表１９】
2015506466.tif 000129
【０３０８】
この相関の欠如は、臨床的有用性を有する。分類子は、結節サイズ及び喫煙状況などのリスク要因に増分であるＩＰＮの疾患状態に関する分子情報を提供することを意味する。その結果、医師は、ＩＰＮの臨床管理のより多くの情報に基づいた意思決定を行うための臨床ツールである。
【０３０９】
これがどのように達成され得るか視覚化するために、本発明者らは、分類子によって生成された癌の確率スコアを癌リスクにどのように関連するかを実証する（図１１を参照）。
【０３１０】
特定の分類子のスコアで、すべての癌結節のある割合が小さいスコアを有する。これは、分類子の感受性である。たとえば、分類子スコア０．８で、癌患者の４７％が０．７で低いスコアを有し、分類子スコア０．７で、癌患者の２８％が低いスコアを有し、分類子スコア０．５で、癌患者のほんの９％が低いスコアを有し、最後に、スコア０．２５で、ほんの４％が低い。これは、医師が、相対リスクの点で患者の分類子スコアを解釈するようにさせる。
【０３１１】
分類子の分子基盤
目標は、協調的であり、ＳＲＭによって堅牢に検出され、分類子内で安定であるタンパク質を選択することによって、悪性肺結節の分子シグネチャーを同定することであった。誘導された分類子は、どれだけ十分に肺癌と関連しているのか？血液中のこれらの１３個のタンパク質の摂動のための分子基盤があるのか？最後に、他の可能性のあるタンパク質の組み合わせのうち、分類子はどのように固有であるか。
【０３１２】
これらの疑問に答えるために、分類子の１３個のタンパク質は、ＩＰＡ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ）を用いた経路分析について提供された。最初の工程は、これらの１３個のタンパク質の調節を引き起こす可能性が最も高い転写因子を同定するために細胞の外側から内側に作業することであった。５つの最も重要なものは、ＦＯＳ、ＮＲＦ２、ＡＨＲ、ＨＤ及びＭＹＣであった。ＦＯＳは、癌の多くの形態に共通している。しかしながら、ＮＲＦ２とＡＨＲは、肺癌、酸化ストレス及び肺の炎症に対する応答に関連している。ＭＹＣは、肺癌及び酸化ストレスに対する応答に関連し、一方、ＨＤは、肺の炎症及び酸化ストレスに対する応答に関連している。
【０３１３】
１３個の分類子タンパク質はまた、これらの３つのネットワーク（肺癌、酸化ストレスへの応答と肺の炎症）に高度に特異的である。これは、分類子タンパク質（緑色）が、転写因子（青）と３つのマージされたネットワーク（オレンジ色）が描かれている図１０に要約されている。ＩＳＬＲだけは、これらの３つの肺特異的ネットワークを介して、他のタンパク質に接続されないが、癌に特異的でない癌ネットワークを介して接続される。要約すると、１３個の分類子タンパク質の調節は、肺癌、肺の炎症及び酸化ストレスのネットワークに特異的ないくつかの転写因子に戻って追跡することができる。
【０３１４】
分類子の独自性の疑問に対処するために、２１個の堅牢かつ協力的なタンパク質からすべての分類子を形成した（表２０）。コンピュータ計算のオーバーヘッドにより、これらの分類子は、Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ相互検証によって完全には指向されず、その結果、それらの性能の推定のみを得ることができた。５つの高性能の代替分類子が特定され、次に、十分に指向された。分類子と５つの高性能代替物を表２０に示す。各タンパク質の頻度は集計カラムで見られ、具体的には、最初の１１個のタンパク質は、６つの分類子のうち４つに示される。これらの１１個のタンパク質は、残りのタンパク質よりも有意に高い協力的スコアを有する。この分析によって、悪性結節の血液シグネチャーを形成するタンパク質のコアグループが存在すると考えられる。
【０３１５】
【表２０】
2015506466.tif 000130
【０３１６】
この結果は、高性能の分類子を定義するタンパク質のコアグループがあることを示唆しているが、代替のパネルが存在する。しかしながら、パネルのメンバーシップの変化は、ＮＰＶとＲＯＲの間のトレードオフに影響を与える。
【０３１７】
実施例７：材料と方法
組織から供給されたアッセイ開発候補
新鮮な肺腫瘍切除から得られた患者のサンプルは、ＩＲＢ承認の下、患者に同意を得て、Ｃｅｎｔｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｃｅ  ｄｅ  ｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  ｄｅ  ＭｏｎｔｒｅａｌとＭｃＧｉｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｅｎｔｒｅから回収した。サンプルは、腫瘍から、ならびに同一肺葉内の遠位の正常組織から得た。サンプルの各対の原形質膜は、その後、免疫アフィニティープロトコルを用いて、３０患者（１９腺癌、６扁平、５大細胞癌）の上皮細胞、及び３８患者（１３腺癌、１８扁平、７大細胞癌）の内皮細胞から単離した。ゴルジ装置は、等密度遠心分離、続く炭酸アンモニウム抽出用いて３３患者（１８腺癌、１４扁平、１腺扁平上皮）からのサンプルの各ペアから単離した。原形質膜の単離物及びゴルジ単離物は、次いで、原形質膜とゴルジの両方について、正常組織全体で肺癌組織に過剰発現したタンパク質を同定するために、タンデム質量分析によって分析された。
【０３１８】
文献から供給されたアッセイ開発候補
候補肺癌バイオマーカーは、２つの公衆のデータベースとある市販のデータベース：Ｅｎｔｒｅｚ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ３８３６）、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）とＮｅｘｔＢｉｏ（ｗｗｗ．ｎｅｘｔｂｉｏ．ｃｏｍ）から同定された。用語は、ＰＥＲＬスクリプトを使用して自動化されたデータベースクエリーについて予め定義された。検索は、それぞれ、２０１０年５月６日（ＵｎｉＰｒｏｔ）、２０１０年５月１７日（Ｅｎｔｒｅｚ）及び２０１０年７月８日（ＮｅｘｔＢｉｏ）で実施した。バイオマーカーは、その後、組み立てられ、ＵｎｉＰｒｏｔ分類子にマッピングされた。
【０３１９】
血液中に存在する証拠
組織供給源と文献供給源のバイオマーカー候補は、血液中に存在するという証拠があることが必要とされる。質量分析検出による証拠について、３つのデータセットを用いた。ＨＵＰＯ９５０４は、タンデム質量分析法によって同定された９５０４個のヒトタンパク質を含む［１３］。ＨＵＰＱ８８９、ＨＵＰＯ９５０４の高い信頼度サブセットは、８８９個のヒトタンパク質を含む［１８］。ＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓ（２００９年１１月に構築）も使用した。少なくとも１つのＨＵＰ０８８９、又は少なくとも２つのＨＵＰＯ９５０４ペプチド、又は少なくとも２つＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓペプチドが含まれている場合、以前に検出されるようにバイオマーカー候補をマークを付けた。
【０３２０】
質量分析法による血液における検出の直接的な証拠に加えて、分泌タンパク質として、又はシングルパス膜タンパク質としての注釈［１９］はまた、血液中に存在するという証拠として受け入れられた。さらに、ＵｎｉＰｒｏｔのタンパク質又は血漿タンパク質の指定について、タンパク質が血液中に分泌されるか否かを予測するための３つのプログラムを使用した。これらのプログラムは、ＴＭＨＭＭ［２０］、ＳｉｇｎａｌＰ［２１］とＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ［２２］であった。ＴＭＨＭＭが予期したタンパク質が１つの膜貫通ドメインを有し、ＳｉｇｎａｌＰが予期した膜貫通ドメインが切断される場合、あるいはＴＭＨＭＭが予期したタンパク質が膜貫通ドメインを有せず、ＳｉｇｎａｌＰ又はＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰが予期したタンパク質が分泌される場合、タンパク質は分泌されるものとして予測された。
【０３２１】
ＳＲＭアッセイ開発
３８８個の標的タンパク質についてのＳＲＭアッセイは、文献［１５，２３，２４］に記載のものと類似したプロトコルを使用して、合成ペプチドに基づいて開発された。タンパク質あたり最大５個のＳＲＭの適切なペプチドは、ＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓ、ヒト血漿プロテオームデータベースなどの公共の情報源から、又はプロテオティピック予測ツール［２５］によって同定され、合成された。ＳＲＭ誘発されたＭＳ／ＭＳスペクトルは、二重及び三重に帯電した前駆イオンについて、ＡＢＳｃｉｅｘ  ５５００  ＱＴｒａｐに回収された。得られたＭＳ／ＭＳスペクトルは、ＭＡＳＣＯＴ（カットオフスコア＞１５）［２６］を使用して個々のペプチドに割り当てた。前駆イオンあたり最大４つの遷移は、最適化のために選択された。得られた対応する最適な保持時間、デクラスタリング電位と衝突エネルギーは全ての遷移について組み立てられた。最適な遷移は、すべての合成ペプチド、良性の患者のプールしたサンプルと癌患者のプールされたサンプルとの混合物について測定された。遷移は、それぞれ最大１７５０個の遷移を含むバッチで分析された。両方の生物学的サンプルは、免疫枯渇され、トリプシンによって消化され、逆相（ＲＰ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムと結合させたＡＢＳｃｉｅｘ  ５５００  ＱＴｒａｐ上で分析された。取得したＳＲＭデータを手動で見直し、タンパク質当たり２つの最良のペプチド及びペプチドあたり２つの最良の遷移を選択した。他の遷移との干渉を有する遷移は選択されなかった。また、合成ペプチド混合物中のペプチドの２つの最良の遷移の強度間の比率は、生物学的サンプル中の遷移の特異性を評価するために使用された。強度比は、ＳＲＭアッセイを規定する重要な指標として考えられた。
【０３２２】
血漿サンプルの処理
血漿サンプルは、順次、ＳｉｇｍａからのＩｇＹ１４−スーパーミックス樹脂を充填された免疫枯渇カラムを用いて、多量及び中量のタンパク質を枯渇させた。次に、枯渇血漿サンプルは、変性され、トリプシンで消化され、脱塩された。ペプチドサンプルは、キャピラリー逆相ＬＣカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  ＢｉｏＢａｓｉｃ  １８  ＫＡＰＰＡ；カラム径：３２０μｍ×１５０ｍｍ；粒子サイズ：５μｍ；ポアサイズ：３００Å）とナノＨＰＬＣシステム（ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ，Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．）を用いて分離された。移動相は、（Ａ）水中の０．２％ギ酸、及び（Ｂ）アセトニトリル中の０．２％ギ酸であった。サンプルは注入され（８μｌ）、及び直線勾配（１９分かけて９８％Ａから７０％Ａ、５μｌ／分）の勾配を用いて分離した。ペプチドは、スケジュールされたＳＲＭの陽イオンモード（Ｑ１解像度；ユニット；Ｑ３解像度：ユニット；検出窓：１８０秒；サイクル時間：１．５秒）において操作する質量分析計（５５００  ＱＴｒａｐ  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）のエレクトロスプレー源に直接溶出させた。次に、遷移強度は、ソフトウェアＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）により統合された。１０，０００の強度閾値は、ノイズデータ及び未検出遷移を除去するために使用された。
【０３２３】
発見と検証の研究に用いられる血漿サンプル
血漿サンプルのアリコートは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ  ｄｅ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｉｅ  ｄｔ  ｄｅ  Ｐｎｅｕｍｏｌｏｇｉｅ  ｄｅ  Ｑｕｅｂｅｃ（ＩＵＣＰＱ，Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｌａｖａｌ）、ニューヨーク大学、ペンシルベニア大学、バンダービルト大学から提供された（表１７を参照）。対象は、以前に、それぞれ倫理審査委員会（ＥＲＢ）又は治験審査ボード（ＩＲＢ）によって承認された臨床試験に登録された。また、血漿サンプルは、必要に応じて、それぞれの機関のＩＲＢによるスポンサーの研究プロトコルの見直しと承認後、研究者によって提供された。プロテオーム解析のためのサンプル適格性は、対象の民族的情報、胸部コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）による対象の対応する肺結節の放射線特性評価、及び診断的な外科的切除の際に得られた肺結節の組織病理学を含む、研究組み入れ及び除外基準に基づいた。癌サンプルは、腺癌、扁平上皮癌、大細胞、又は気管支肺胞細胞癌及び３０ｍｍ以下の放射線結節を含む、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の組織病理学的診断を有した。肉芽腫、過誤腫及び瘢痕組織を含む良性サンプルもまた、３０ｍｍ以下の放射線結節及び臨床ガイドラインと整合的である非悪性又は放射線の確認である病理組織学的確認のいずれかを有することが要求された。臨床データの精度を確認するために、対象と肺結節と関連付けた臨床データの独立した監視及び検証は、対象のプライバシーを確認するために、１９９６年の医療保険の携行性と責任に関する法律（ＨＩＰＡＡ）によって確立されたガイダンスに従って実施された。
【０３２４】
研究デザイン
研究デザインの目的は、臨床的及び技術的な偏りを排除することであった。臨床的に、癌及び良性サンプルは対合され、そのため、それらは、同じ部位、同じ性別、１０ｍｍ以内の結節サイズ、１０年以内の年齢、２０パックイヤー内の喫煙歴からなっていた。バッチあたり最大１５対の合致した癌と良性サンプルは、年齢、性別又は結節サイズに基づいて、統計学的な偏りが実証されなくなるまで、バッチを繰り返して処理することによって割り当てられた。
【０３２５】
それぞれの処理バッチ内の対合されたサンプルは、位置及び性別、結節の大きさ、年齢間の対応するピアソン相関係数の絶対値が０．１未満になるまで、さらにランダムに繰り返し、処理バッチ内の位置に割り当てられた。その後、癌及び良性サンプルの各対は、それらの相対的な位置に無作為化された。サンプルバッチに対する対照を提供するために、３つの２００μｌアリコートのプールされたヒト血漿標準（ＨＰＳ）（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、Ｈｉｃｋｓｖｉｌｅ、ＮＹ）をそれぞれ、各処理バッチの開始、中間及び終了時に配置された。バッチ内のサンプルを一緒に分析した。
【０３２６】
ロジスティック回帰モデル
ロジスティック回帰分類法［２７］を用いて、分類子に遷移パネルを結合し、各サンプルについて、０と１の間の分類確率スコアを計算した。サンプルの確率スコア（Ｐs）は、
【０３２７】
【化６】
2015506466.tif 000131
【０３２８】
として決定され、式中、
【０３２９】
【化７】
2015506466.tif 000132
【０３３０】
は対数変換され（ベース２）、サンプルｓにおける遷移ｉの標準化された強度であり、βiは対応するロジスティック回帰係数であり、αは分類子特異的な定数であり、Ｎは該分類子における遷移の総数である。サンプルは、Ｐsが決定閾値未満であった場合に良性として分類された。決定閾値は、所望のＮＰＶに応じて増減することができる。分類子を定義するために、遷移（すなわちタンパク質）パネル、それらの係数、正規の遷移、分類子係数αと決定閾値は、発見の研究から学び（つまり、訓練を受け）、その後、検証試験を用いて確認しなければならない。
【０３３１】
除外分類子の発見
分類子発見に使用される１４３個のサンプルの概要を表１７に示し、上記のように処理する。
【０３３２】
タンパク質遷移は、上述のように正規化した。癌サンプルの少なくとも５０％又は良性サンプルの５０％で検出されなかった遷移は、さらなる検討のために、１１７個の遷移を残して除去された。これらの遷移のための欠損値は、その遷移のために全サンプルにわたって半分の最小検出値に置き換えられた。
【０３３３】
次のステップは、ほとんどの協同タンパク質のセットを見つけることであった。タンパク質の協調的スコアは、偶然に見つけることができたこのようなパネルの数で割った、それが関与する高性能パネルの数である。したがって、１を超える協同スコアは良好であり、１を下回るスコアではそうではない。各タンパク質に対する協調的スコアは、以下の手順によって推定される。
【０３３４】
１１７個の候補の中から選択される、１０個のタンパク質それぞれの１００万個のランダムなパネルを生成した。１０個のタンパク質の各パネルは、Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ相互検証（ＭＣＣＶ）法を用いて訓練され、パネルあたり２０％のホールドオフ率と１００個のサンプル置換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を有し、ロジスティック回帰モデルにフィットさせ、部分的ＡＵＣによってその性能を評価した［２８］。
【０３３５】
このような多数のパネルを生成することによって、本発明者らは、偶然にいくつかの高性能を見つけるために十分に良好な分類子の空間をサンプリングする。生成された百万個のうち１００個の最良のランダムパネル（表２参照）を維持し、１１７個のタンパク質の各々について、本発明者らは、それぞれが、どの程度の頻度でこれらのトップパネルで発生するかを決定した。１１７個のタンパク質のうち、３６個は、内因性の正規化因子を除いた後、偶然による予想よりも頻繁であった。（表２２）タンパク質が偶然に見られるパネル数の期待数は、１００×１０／１１７＝８．３３である。タンパク質の協調的スコアは、８．３３で除した際に見られるパネルの数である。
【０３３６】
【表２１−１】
2015506466.tif 000133
【０３３７】
【表２１−２】
2015506466.tif 000134
【０３３８】
【表２１−３】
2015506466.tif 000135
【０３３９】
３６個の最も協調的タンパク質を表２２にリストする。
【０３４０】
【表２２−１】
2015506466.tif 000136
【０３４１】
【表２２−２】
2015506466.tif 000137
【０３４２】
【表２２−３】
2015506466.tif 000138
【０３４３】
３６個の協調的タンパク質のセットは、生のＳＲＭデータを手動で管理し、低いシグナル対ノイズ又は干渉による堅牢なＳＲＭ遷移を有しないタンパク質を排除することによって、２１個のタンパク質セットにさらに減少させた。最適な部分的ＡＵＣを有する分類子が得られるまで、２１個のタンパク質のセットから反復してタンパク質を除外した。除去の基準は、係数の安定性であった。ロジスティック回帰モデルでは、各タンパク質は係数を有する。モデルをトレーニングするプロセスにおいて、各タンパク質の係数が決定される。これは相互検証（ＭＣＣＶ）を用いて行う場合、各タンパク質について係数推定値の何百が誘導される。これらの係数の変動性は、タンパク質の安定性の推定値である。各ステップで、タンパク質は、ロジスティック回帰モデルと測定されたその安定性に対して、ＭＣＣＶ（ホールドアウト率２０％、パネルあたり１万個のサンプル置換）を使用して訓練された。最小の安定なタンパク質を除去した。このプロセスは、最適な部分ＡＵＣを有する１３個のタンパク質分類子が達成されるまで続けた。
【０３４４】
最後に、１３個のタンパク質分類子は、ＭＣＣＶ（ホールドアウト率２０％、２万サンプル置換）によりロジスティック回帰モデルに対して訓練された。除外される分類子について１３個のタンパク質は、その最高強度の遷移とモデル係数と共に表１８にリストされている。
【０３４５】
決定閾値の選択
肺結節の癌罹患率は前述であると仮定すると、肺結節の患者集団に対する分類子（ＮＰＶとＲＯＲ）の性能は、以下のように、感受性（ｓｅｎｓ）と特異性（ｓｐｅｃ）から算出された。
【０３４６】
【化８】
2015506466.tif 000139
【０３４７】
次に、癌又は良性サンプルについての閾値分離要求は、ＮＰＶ≧９０％とＲＯＲ≧２０％の確率スコアとして選択された。本発明者らは、過大評価である発見セットに対して測定される分類子性能を期待しているため、閾値は、性能が、通常、独立した検証セットに低下すうため、範囲となるように選択される。
【０３４８】
除外分類子の検証
５２個の癌と５２個の良性サンプル（表１７参照）は、１３個のタンパク質分類子の性能を検証するために使用された。サンプルの半分は、発見サンプルとサンプルの他の半分が後日解析された直後に分析される予め決定された処理バッチに入れられた。これは、実際に期待した変動性を導入した。より具体的には、各処理バッチで駆動される３つのＨＰＳサンプルは、外部校正物質として使用された。ＨＰＳ較正の詳細については後述する。
【０３４９】
ＨＰＳサンプルによる校正
ラベルフリーのＭＳのアプローチについて、異なる実験間のシグナル強度に対する変動が予想される。この変動を低減するために、本発明者らは、外部標準としてＨＰＳサンプルを利用し、発見と検証の研究間の強度を較正した。
【０３５０】
【化９】
2015506466.tif 000140
【０３５１】
は対数変換され（ベース２）、サンプルｓにおける遷移ｉの標準化された強度であり、
【０３５２】
【化１０】
2015506466.tif 000141
【０３５３】
はそれぞれ発見と検証研究におけるＨＰＳサンプルの対応する中央値であると仮定する。次に、ＨＰＳ補正強度は
【０３５４】
【化１１】
2015506466.tif 000142
【０３５５】
である。結論として、検証研究における臨床サンプルの癌の確率は、分類子によるｐｒｏｂとして予期される。次に、臨床サンプルの癌のＨＰＳ補正確率は、以下：
【０３５６】
【化１２】
2015506466.tif 000143
【０３５７】
のように計算され、式中、
【０３５８】
【化１３】
2015506466.tif 000144
【０３５９】
及び
【０３６０】
【化１４】
2015506466.tif 000145
【０３６１】
である。
【０３６２】
ここで、ＳHPS,disとＳHPS,valは、それぞれ、発見と検証の研究におけるすべてのＨＰＳサンプルのＳの中央値であった。
【０３６３】
統計分析
全ての統計分析は、Ｓｔａｔａ、Ｒ及び／又はＭａｔＬａｂを用いて実施した。
【０３６４】
枯渇カラムドリフト
より多くのサンプルが同じカラムによって枯渇されるように、本発明者らはシグナル強度の増加を観察した。本発明者らは、この技術的変動性を定量するために、ＨＰＣ試料における遷移強度を使用した。Ｉi,sは、ＨＰＳサンプルｓにおける遷移ｉの強度であるとすると、試料のドリフトは、以下：
【０３６５】
【化１５】
2015506466.tif 000146
【０３６６】
として定義され、式中、
【０３６７】
【化１６】
2015506466.tif 000147
【０３６８】
は同じカラムによって枯渇された全てのＨＰＳサンプルのうちＩi,sの平均値であり、サンプルにおいて全ての検出された遷移全体での中央値が採用された。次に、カラムのドリフトは、
【０３６９】
【化１７】
2015506466.tif 000148
【０３７０】
として定義される。
【０３７１】
ここで、カラムによって枯渇されたすべてのＨＰＳサンプル全体での中央値が採用された。サンプルドリフトがゼロより大きいか小さくない場合、対応する中央値を０として採用した。中央値カラムドリフトは、研究に使用された全ての枯渇カラムのドリフトの中央値であった。
【０３７２】
内因性の正規化タンパク質の同定
以下の基準は、正規化因子として遷移を同定するために使用された。
●同じタンパク質からの全ての遷移の最高の中央値強度を有する。
●全てのサンプルにおいて検出される。
●正規化因子として、中央値の技術的なＣＶ（ＨＰＳサンプルについて測定された遷移強度の中央値ＣＶ）の減少において上位にランキングされる。
●サンプル枯渇において観察された中央値のカラムドリフトの減少において上位にランキングされる。
●低い中央値の技術的ＣＶと低い中央値の生物学的ＣＶ（臨床サンプルに対して測定された遷移強度の中央値ＣＶ）を有する。
【０３７３】
【表２３】
2015506466.tif 000149
【０３７４】
データの正規化
６つの正規化遷移のパネル（表２３参照）を用いて、２つの目的で生のＳＲＭを正規化した：（Ａ）同じ研究内でサンプル毎の変動性を減少させること、（Ｂ）異なる研究間で強度変動性を減少させること。第１の目的のために、スケーリング因子を各サンプルについて計算し、そのため、サンプルの６つの正規化遷移の強度は、すべてのＨＧＳサンプルの対応する中央値強度と並べられた。Ｎi,sがサンプルｓにおける正規化遷移ｉの強度であり、
【０３７５】
【化１８】
2015506466.tif 000150
【０３７６】
が全てのＨＧＳサンプルの対応する中央値強度であるとすると、サンプルｓについてのスケーリング因子は、
【０３７７】
【化１９】
2015506466.tif 000151
【０３７８】
によって与えられ、式中、
【０３７９】
【化２０】
2015506466.tif 000152
【０３８０】
は、強度比の中央値であり、Ｓは研究におけるすべてのサンプルにわたるＳsの中央値である。第２の目的について、スケーリング因子は、発見と検証研究間で計算され、そのため、検証研究における全てのＨＧＳサンプルの６つの正規化遷移の中央値強度は、発見研究における対応する値に匹敵する。２つの研究における全てのＨＧＳサンプルの中央値強度が、それぞれ
【０３８１】
【化２１】
2015506466.tif 000153
【０３８２】
であるとすると、検証研究についてのスケーリング因子は
【０３８３】
【化２２】
2015506466.tif 000154
【０３８４】
によって与えられる。最後に、各試料の各遷移について、その正規化された強度は、
【０３８５】
【化２３】
2015506466.tif 000155
【０３８６】
として計算され、式中、Ｉi,sは生の強度であった。
【０３８７】
組織から膜タンパク質の単離
内皮細胞膜タンパク質は、新鮮な肺切除から得られた正常及び腫瘍肺組織サンプルから単離した。簡潔には、組織を緩衝液中で洗浄し、ホモジネートをポリトロンで組織を破壊することにより調製した。ホモジネートは、１８０μｍメッシュを通じてろ過され、ろ過物は、９００×ｇで１０分間、４℃にて遠心分離された。上清は、５０％（ｗ：ｖ）スクロースクッション上で、２１８，０００×ｇで６０分間、４℃にて遠心分離し、膜をペレットにした。ペレットを再懸濁し、ミクロコッカスヌクレアーゼで処理した。内皮細胞からの膜は、抗トロンボモジュリン、抗ＡＣＥ、抗ＣＤ３４及び抗ＣＤ１４４抗体の組合せと共にインキュベートし、次に、５０％（ｗ：ｖ）スクロースクッション上で、２８０，０００×ｇで６０分間、４℃にて遠心分離した。ペレットを再懸濁した後、内皮細胞の原形質膜は、ＭＡＣＳマイクロビーズを用いて単離され、細胞質の周辺タンパク質を除去するために、ヨウ化カリウムで処理された。
【０３８８】
正常及び腫瘍肺組織サンプルから上皮細胞膜タンパク質は、新鮮な肺切除から単離した。組織を洗浄して、内皮細胞膜タンパク質の調製のために上記のようにホモジネートした。上皮細胞からの膜を、抗ＥＳＡ、抗ＣＥＡ、抗ＣＤ６６ｃ及び抗ＥＭＡ抗体の組み合わせで標識し、次いで５０％（ｗ：ｖ）スクロースクッション上で、２１８，０００×ｇで６０分間、４℃にて遠心分離した。上皮細胞原形質膜は、ＭＡＣＳマイクロビーズを用いて単離した。溶出液は、３３％（ｗ：ｖ）スクロースクッション上で、４℃で３０分間、３３７，０００×ｇで遠心分離した。上清及びショ糖クッションを除去後、ペレットをＬａｅｍｍｌｉ／尿素／ＤＴＴに再懸濁した。
【０３８９】
組織から分泌されるタンパク質の単離
分泌されたタンパク質は、新鮮な肺切除から単離した正常及び腫瘍肺組織サンプルから単離した。組織を洗浄し、ポリトロンホモジネート化を使用してホモジネートした。ホモジネートの密度は、濃縮スクロースを用いて１．４Ｍに調製され、その後、０．８Ｍと１．２Ｍの不連続スクロース勾配上で１００，０００×ｇ、２時間、４℃にて等密度遠心分離によって分泌ビヒクルを単離した。０．８／１．２Ｍ界面で濃縮したビヒクルを回収し、さらに、０．５ＭのＫＣｌ（最終濃度）とともに２５分間インキュベートし、緩く結合した末梢タンパク質を除いた。ビヒクルは、１５０，０００×ｇ、１時間、４℃の超遠心分離によって取り戻し、１００ｍＭの炭酸アンモニウム（ｐＨ１１．０）で開放した。分泌タンパク質は上清中に回収され、４℃にて１５０，０００×ｇで１時間の超遠心分離を行った。
【０３９０】
ＩｇＹ１４−ＳｕｐｅｒＭｉｘイムノアフィニティーカラムの調製
イムノアフィニティーカラムは、それぞれ、２：１比のＩｇＹ１４とＳｕｐｅｒＭｉｘ免疫親和性樹脂（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むスラリーを使用して、社内で調製した。簡単に説明すると、混合イムノアフィニティー樹脂のスラリー（１０ｍｌ、５０％）をガラスクロマトグラフィーカラム（Ｔｒｉｃｏｒｎ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に添加し、樹脂を重力流れの下で沈降させ、カラム中の５ｍｌの樹脂量をもたらした。カラムに蓋をし、さらにパッキングするためにＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズのＨＰＬＣシステム上に置いた（２０分、０．１５Ｍ重炭酸アンモニウム、２ｍｌ／分）。次に、研究に使用された各カラムの性能は、ＨＰＳサンプルのアリコートの反復注射によって評価された。カラムの性能は、臨床サンプルの各バッチの免疫親和性分離を開始する前に評価された。
【０３９１】
ＩｇＹ１４−Ｓｕｍｅｒｍｉｘイムノクロマトグラフィー
血漿サンプル（６０μｌ）を希釈し（それぞれ０．１５Ｍ重炭酸アンモニウム、１：２ｖ／ｖ）、濾過し（０．２μｍのＡｃｒｏＰｒｅｐ  ９６ウェルフィルタープレート、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｎｅｃｅ）、その後、免疫親和性分離を行った。希釈された血漿（９０μｌ）は、充填−洗浄−溶出−中和−再平衡サイクル（３６分の全時間）により、３つの緩衝液（充填／洗浄：０．１５Ｍ重炭酸アンモニウム；除去／溶出：０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５；中和：０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣシステムに接続したＩｇＹ１４−ＳｕｐｅｒＭｉｘカラム上で分離された。未結合及び結合した画分はＵＶ吸光度（２８０ｎｍ）を用いてモニターし、分離後にベースライン解決した。少量タンパク質を含有する非結合画分のみが、下流の処理及び分析のために回収された。未結合の画分を凍結乾燥させ、酵素消化した。
【０３９２】
少量タンパク質の酵素消化
低存在量タンパク質は、穏やかな変性条件下（１：１の０．１Ｍ重炭酸アンモニウム／トリフルオロエタノールの２００μｌ  ｖ／ｖ）で再構成され、及びインキュベートした（３０分間、室温、オービタルシェーカー）。次に、サンプルを希釈し（０．１Ｍ重炭酸アンモニウムの８００μｌ）、トリプシンで消化した（プリンストンセパレーション、０．４μｇのサンプル当たりトリプシン、３７℃、１６時間）。消化されたサンプルは、前に固相抽出を凍結乾燥させた。
【０３９３】
固相抽出
質量分析の前に、固相抽出を用いて、サンプル中の塩及び緩衝液濃度を減少させた。トリプシンペプチドを含有する凍結乾燥されたサンプルを再構成した（３５０μｌの０．０１Ｍ重炭酸アンモニウム）及びインキュベートした（１５分間、室温、オービタルシェーカー）。還元剤は、次いで、サンプル（３０μｌの０．０５Ｍ  ＴＣＥＰ）に添加され、サンプルをインキュベートした（６０分、室温）。希酸と低割合の有機溶媒（３７５μｌ、９０％水／１０％アセトニトリル／０．２％トリフルオロ酢酸）を添加し、ペプチドの固相抽出を最適化した。抽出プレート（Ｅｍｐｏｒｅ  Ｃ１８、３Ｍ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、製造業者のプロトコルに従って調整された。サンプルを固相抽出プレート上に充填し、洗浄（５００μｌの９５％水／１０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸）し、及び回収プレートに溶出した（２００μｌの５２％水／４８％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸）。溶出液を２つの等量アリコートに分割し、各アリコートを真空濃縮機で乾燥された。１つのアリコートは、即座に質量分析に使用し、他方は、保存（−８０℃）し、必要に応じて使用した。ＬＣ−ＳＲＭ  ＭＳ分析の直前にサンプルを再構成した（１２μｌの９０％水／１０％アセトニトリル／０．２％ギ酸）。
【０３９４】
組み入れ及び除外基準
血漿サンプルは、（Ａ）ＥＤＴＡチューブに得られ、（Ｂ）参加組織でＩＲｂ承認された研究に従前に登録された対象から得られ、（Ｃ）研究プロトコルによって規定されるように、達成され、例えば、標識され、分割され及び凍結される場合に、研究に適格であった。また、サンプルは、以下の組み入れ及び除外基準を満たしている必要がある。
１）組み入れ基準：
２）サンプルの適格性は、臨床パラメータに基づき、以下の対象、結節及び臨床病期パラメータを含んでいた：
ａ）対象
ｉ）年齢≧４０
ｉｉ）任意の喫煙状況、例えば、現在、過去、又は無し
ｉｉｉ）併発状態、例えば、ＣＯＰＤ
ｉｖ）臨床的寛解にある最小５年の従前悪性
ｖ）皮膚癌の従前病歴−扁平又は基底細胞
ｂ）結節
ｉ）放射線学
（１）サイズ≧４ｍｍ及び≦７０ｍｍ（ステージ２Ｂ資格まで）
（２）任意の突起形成及びすりガラス不透明
ｉｉ）病理学
（１）悪性−腺癌、扁平上皮、又は大細胞
（２）良性−炎症性（例えば肉芽腫、感染）又は非炎症性（例えば過誤腫）
ｃ）臨床病期
ｉ）原発腫瘍：≦Ｔ２（例えば、１Ａ、１Ｂ、２Ａ及び２Ｂ）
ｉｉ）局所リンパ節：Ｎ０又はＮ１のみ
ｉｉｉ）遠隔転移：Ｍ０のみ
３）除外基準
ａ）対象：ＩＰＮ診断の５年以内の従前悪性
ｂ）結節：
ｉ）利用でいないサイズデータ
ｉｉ）癌又は良性ＳＰＮについて、利用可能な病理データなし
ｉｉｉ）病理学−小細胞肺癌
ｃ）臨床段階
ｉ）原発腫瘍：≧Ｔ３
ｉｉ）局所リンパ節：≧Ｎ２
ｉｉｉ）遠隔転移：≧Ｍ１
【０３９５】
発見研究のための検出力（ｐｏｗｅｒ）分析
発見研究についての検出力分析は、以下の仮定に基づいた：１）全体的な偽陽性率（α）を０．０５に設定した。２）複数の試験のためのＳｉｄａｋ補正を用いて、２００個のタンパク質を試験するための有効なαｅｆｆ
【０３９６】
【化２４】
2015506466.tif 000156
【０３９７】
を計算した。３）有効サンプルサイズは、ｔ検定のためよりＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定のための大きなサンプル検定のためのより大きなサンプル要件を考慮するために、０．８６４倍減少された。４）変動の全体的な係数は過去の経験に基づいて０．４３に設定された。５）研究の検出力（１−β）は、効果的αeffと効果的サンプルサイズを用いて、２サンプルの二面ｔ検定のための式に基づいて計算された。発見研究のための検出力は、コホートあたりのサンプルサイズ、及び対照と疾患サンプル間の検出可能な倍数差によって、表２４にまとめられた。
【０３９８】
【表２４】
2015506466.tif 000157
【０３９９】
検証研究のための検出力分析
十分な癌及び良性サンプルは、発見研究から得られた除外分類子の性能を確認するために検証研究において必要とされる。本発明者らは、除外分類子のためにＮＰＶとＲＯＲに関する９５％信頼区間（ＣＩ）を得ることに興味がある。本明細書中の決定閾値セクションの選択における方程式を使用して、ＮＰＶとＲＯＲの関数として感受性（ｓｅｎｓ）と特異性（ｓｐｅｃ）を導き出すことができ、すなわち、
【０４００】
【化２５】
2015506466.tif 000158
【０４０１】
であり、式中、ｐｒｅｖは、意図された用途集団における癌罹患率である。検証研究は、ＮC個の癌サンプルとＮB個の良性サンプルを含むことを想定している。二項分布に基づいて、感受性と特異性の分散は次式で与えられる。
【０４０２】
【化２６】
2015506466.tif 000159
【０４０３】
本明細書中の決定閾値セクションの選択における方程式を使用して、ＮＰＶとＲＯＲの対応する分散は、以下：
【０４０４】
【化２７】
2015506466.tif 000160
【０４０５】
として、大規模なサンプル、正規分布近似下で導くことができる。次に、ＮＰＶとＲＯＲの二面９５％ＣＩは、それぞれ、以下：
【０４０６】
【化２８】
2015506466.tif 000161
【０４０７】
によって与えられ、この場合、ｚα/2＝１．９５９９６４は、正規分布の９７．５％変位値である。検証についての予期された９５％ＣＩは、コホートあたりサンプルサイズ（ＮC＝ＮB＝Ｎ）によって表２４に一覧にされた。
【０４０８】
【表２５】
2015506466.tif 000162
【０４０９】
ペプチドのＱ値及びタンパク質アッセイの計算
偽陽性のアッセイ率を決定するために、ペプチドＳＲＭアッセイのｑ値を以下のように計算した。ヌル分布（図７）として異なるタンパク質からの遷移間のピアソン相関の分布を使用して、経験的ｐ値は、少なくとも５つの共通のサンプルにおいて検出される、同じペプチドからの一対の遷移に割り当てられ、そうでなければ、「ＮＡ」の値が割り当てられる。経験的ｐ値は、バイオコンダクター（ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｒｅｌｅａｓｅ／ｂｉｏｃ／ｈｔｍｌ／ｑｖａｌｕｅ．ｈｔｍｌ）における「ｑ値」パッケージを使用して、ｑ値に変換された。ペプチド−値は、表６に示されるすべてのＳＲＭアッセイについて０．０５を下回った。
【０４１０】
タンパク質ＳＲＭアッセイのｑ値は、同じ方法で計算されたが、ただし、個々のタンパク質のピアソン相関は、タンパク質の異なるペプチドからの２つの遷移間のものとして計算された。５つ以上の共通のサンプルで検出される２つのペプチドを有しないタンパク質について、それらのＱ値は、適切に評価することができず、「ＮＡ」を割り当てた。
【０４１１】
分類交絡因子の影響
【０４１２】
【表２６】
2015506466.tif 000163
【０４１３】
連続交絡因子の影響
【０４１４】
【表２７】
2015506466.tif 000164
【０４１５】
【化２９】
2015506466.tif 000165
【０４１６】
【化３０】
2015506466.tif 000166
【図１】
2015506466.tif 000169
【図２】
2015506466.tif 000170
【図３】
2015506466.tif 000171
【図４】
2015506466.tif 000172
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2015506466.tif 000176
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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