(57)【要約】  本発明は、無機コアと電荷を有するポリマーのコーティングを含む生体適合性の超常磁性ナノ粒子の使用に関し、低組織付着性及び低血管付着性を有し、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）における造影剤としての使用に関する。前記ナノ粒子は新規な薬物動態特性及びＴ２＊緩和度特性を有し、イン−ビボでの組織イメージング及びＴ２＊パラメーターに基づく腫瘍灌流ストラテジーへの使用に高いポテンシャルを持つ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１５ｎｍ以下のコアの直径と、表面正味荷電と、イン−ビボでの生理的ｐＨにおける低血管付着性及び低組織付着性とを有する磁気共鳴用のナノ粒子であって、
１）無機のコアと２）水溶性ポリマーのコーティングとを含んでなることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２】
前記無機のコアが、
ａ．常時性又は反磁性の金属及びイオンの中から選択される１以上の元素、
ｂ．常時性又は反磁性の金属及びイオンの中から選択される１以上の元素を含有する合金、又は、
ｃ．常時性または反磁性の金属及びイオンの中から選択される１以上の元素を含有する金属酸化物又はフェライト、を含んでなることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記無機のコアが、鉄、銅、コバルト、マンガン、マグネシウム及びその組合せからなる群から選択される常時性又は反磁性の金属及びイオンを含んでなることを特徴とする請求項２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記無機のコアが、鉄、銅、コバルト、マンガン、マグネシウム及びその組合せからなる群から選択される１以上の元素を含有する合金を含んでなることを特徴とする請求項２に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記無機のコアが、鉄、銅、コバルト、マンガン、マグネシウム及びその組合せからなる群から選択される１以上の元素を含有する金属酸化物又はフェライトを含んでなることを特徴とする請求項２に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記無機のコアが、酸化鉄、コバルトフェライト、マンガンフェライト、マグネシウムフェライト、及びその組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記無機のコアが、磁鉄鉱−Ｆｅ３０４−、磁赤鉄鉱−Ｆｅ２Ｏ３−、又はＣｏＦｅ２０４からなることを特徴とする請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項８】
ポリマー又はコポリマーが−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＳＳ−、−ＣＯＮＨ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＯ２、−ＣＨＯ、−ＣＯＳＨ、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＳＣＮ、−ＮＣＳ、−ＮＣＯ、−ＯＣＮ、−Ｎ−、−ＮＨ−、Ｓ−、−Ｏ−、ＣＯ３及びその組合せからなる群から選択される１以上の官能基を含んでなり、イン−ビボでの生理的ｐＨにおいて低血管付着性及び低組織付着性を生じさせることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項９】
水溶性ポリマーが、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピリジン、ポリビニルピロリドン、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、キトサン、デキストラン、ヒアルロン酸、プルラン、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリル酸及び３−（トリメチルシリル）プロピルメタクリアート、エチルセルロース、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリアミン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアクリレート又はその副生物、及びその組合せからなる群から選択される官能基を有する１以上のポリマー又はコポリマーと、前記官能基を有するポリマー及びコポリマーの組合せを含み、イン−ビボでの生理的ｐＨにおいて低血管付着性及び低組織付着性を有することを特徴とする請求項８に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記無機のコアが酸化鉄であり、水溶性ポリマーがポリアクリル酸であることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１１】
前記ナノ粒子が特定の標的にされる１以上の分子クロモホア又は分子ベクターをさらに含むことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１２】
特定の標的にされるクロモホア又は分子ベクターが、フルオロホア、クロモホア、放射性薬剤、抗体、標的にされるアビジン副生物、標的にされるビオチン副生物、薬物、受容体リガンド、ＲＮＡｉプローブからなる群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
非常に低度の血管付着性、迅速な排除性、肝臓及び脾臓における観測可能な蓄積がないこと、健康な脳組織との極小の相互作用性を含む、非常に適切な薬物動態特性を有することを特徴とする請求項１乃至１２のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１４】
９０ｓ−１ｍＭ−１より大きい血清緩和度ｒ２及びｒ２＊を有することを特徴とする請求項１乃至１３のいずれかに記載の磁性ナノ粒子を含む造影剤。
【請求項１５】
請求項１に記載のナノ粒子を調製する方法であって、
１）磁性ナノ粒子のコアを合成するステップと２）血管付着性と組織付着性を減少させるポリマーコーティングによる磁性ナノ粒子のコアをコーティングするステップとを含むことを特徴とするナノ粒子の調製方法。
【請求項１６】
低血管付着性と低組織付着性を維持するために、前記ナノ粒子のコーティングにクロモホアまたはベクターを結紮させることをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載のナノ粒子の調製方法。
【請求項１７】
動物及びヒトにおけるイン−ビボでの生物組織の磁気共鳴イメージングにおいて、請求項１乃至１２のいずれかに記載の磁性ナノ粒子或いは請求項１３乃至１５のいずれかに記載の造影剤の使用。
【請求項１８】
磁気共鳴イメージングによって動物またはヒトにおける、健康な組織と血管障害をもたらす病変、組織虚血、神経変性、炎症、浮腫又は癌、における灌流測定のため、請求項１乃至１２のいずれかに記載の磁性ナノ粒子或いは請求項１３又は１４に記載の造影剤の使用。
【請求項１９】
薬剤投与において、請求項１乃至１２のいずれかに記載の磁性ナノ粒子或いは請求項１３又は１４に記載の造影剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は磁気共鳴の分野に係り、特に組織灌流または腫瘍灌流の非侵襲性イメージングのための造影剤として超常磁性ナノ粒子を使用することに関する。本発明はまた、生物医学及び診断用イメージングなどの他分野にも適用可能である。
【背景技術】
【０００２】
磁気共鳴イメージングは組織灌流や腫瘍を非侵襲的にモニターするために非常に有用なツールである。（Ｕ．Ｈａｂｅｒｋｏｍ  ａｎｄ  Ａ．Ａｌｔｍａｎｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００１，１（２），ｐ．１６３；Ｔ．Ｉｃｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ２００２，４（６），ｐ．５２３；Ｄ．Ｃ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２００１，１１（１），ｐ．３７）．
【０００３】
この技術は核磁気共鳴現象に基づく。この現象は、異なる原子の核が高周波域において、異なるエネルギーを吸収し、印加される磁場が周期的に変化する時、特定の共鳴周波数で共鳴するために生じる。水素は核磁気共鳴現象のために最も適切な元素のひとつであり、人体に含まれる最も豊富な元素である。これらの理由のため、ＭＲＩは軟組織の高解像度画像を詳細な解剖学的情報とともに提供できる。患者を磁場に置いて、患者の水プロトンの磁気スピンと適用された高周波照射との間の相互作用を観測することによって画像は得られる。画像は、直交した磁場勾配を適用し、最終的に画像の個々のピクセルの３座標を空間的に符号化して解像される。受信コイルに少量の電流を誘起する震動磁場が指数関数的減少で減衰し、サンプルの磁気スピンは励起期間中に獲得されたエネルギーを放出する。プロトン緩和時間と称される２つのパラメータ、すなわち、Ｔ１（縦緩和時間）とＴ２（横緩和時間）は画像生成において非常に重要である。Ｔ１すなわちスピン格子緩和時間は観測されたプロトンスピンと周りのネットワークとの間のエネルギー移動を表わし、Ｔ２すなわちスピンースピン緩和時間は異なるスピンまたはプロトン間のエネルギー移動である。Ｔ２＊緩和時間と称される付加的なパラメータはまた、磁気誘導のトータルな減衰を適切に表現するために必要である。この減衰には、Ｔ２減衰と局所磁化率における変動を引き起こす不可避的な磁場の不均一性により生じる付加的な遅延プロセスの両方が含まれる。このため、Ｔ２＊は必ずＴ２より短い。ゆえに、検出されたＭＲ信号は、緩和時間Ｔ１、Ｔ２、Ｔ２＊の組合せ及びプロトン密度の寄与を含む。
【０００４】
この技術の利点は電離放射線を使用しないことであり、そのためこの技術は患者を有害放射線にさらさずに高品位な画像を提供する。しかしながら、本来的で固有のＭＲＩのコントラストでは、小さな解剖組織上の病変に十分な解像度を与え、組織の生理機能を適切に特徴づけるには多くの場合不十分である。このため、画像の構成要素Ｔ１、Ｔ２、Ｔ２＊をそれぞれ増強するための外来性薬剤の特異的なシリーズが開発されてきた。Ｔ１とＴ２の増強剤においては顕著な進歩が見られたが、組織及び腫瘍灌流のイメージングにおける解像度や感度を大幅に増大することを可能とするＴ２＊の増強剤の研究においてはあまり進展が見られていない（ＣＨ  Ｄｏｄｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００１，２５６，１−２  ８９）。
【０００５】
磁気共鳴イメージング用造影剤は、磁気活性材料の２種類の一般的分類すなわち常時性材料と超常磁性または強磁性材料とに分けられる（ＡＥ  Ｍｅｒｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｔｏｔｈ  Ｅ．  ２００１，Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，２００１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）。常時性造影剤は小さなガドリニウムキレート（ＩＩＩ）に基づいた物質を含み（Ｇｄ−ＤＴＰＡ，  Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＭＡ，  Ｇｄ−ＤＯＴＡ，  Ｇｄ−ＤＯ３Ａ）  （Ｅ．Ｔｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ｐ．４５）、超常磁性造影剤は超小型（＜３０Å超小型超常磁性酸化鉄粒子（ＵＳＰＩＯ））の酸化鉄コア（Ｆｅ３Ｏ４，Ｆｅ２Ｏ３）または小型（＜２００Å超常磁性酸化鉄粒子（ＳＰＩＯ））の酸化鉄コア（Ｆｅ３Ｏ４，Ｆｅ２Ｏ３）を有するナノ粒子に基づいた物質を含む（ＲＮ  Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，２００１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ｐ．４１７）。
【０００６】
常時性造影剤はＴ１強調シークエンスにおけるＭＲ画像強度を増大させ（陽性造影強調）、超常時性造影剤はＴ２強調シークエンスにおける磁気共鳴信号を減少させる（陰性造影強調）。両タイプの造影剤の感度および特異性は非常に異なる。ガドリニウムキレートは標的組織における化合物のミリモル濃縮を必要とする緩和度を有するが、超常磁性ナノ粒子は、その比較的大きな分子量のため、マイクロモルあるいはナノモルの領域で有効である。
【０００７】
超常磁性ナノ構造材料はＭＲＩ造影剤として開発されたが、その理由はその構造がナノスケールレベルでプロトン緩和時間を著しく改変し、そのためＭＲＩによる診断の感度を向上させている。さらに、例えばモノクローナルまたはポリクローナル抗体あるいはアビジン−ビオチン系のような、特定の生物学的に活性なベクターを使用してナノ粒子の表面を修飾することによっても、ＭＲＩによる診断の特異性を向上させることができる。
【０００８】
酸化鉄ナノ粒子ベースの製品は、例えばゲルベ社（Ｇｕｅｒｂｅｔ）によりヨーロッパで販売されているＥｎｄｏｒｅｍ（米国登録商標）とＬｕｍｉｒｅｍ（米国登録商標）は１９９６年に米国での販売が承認され、一方、バイエルシェーリング社（Ｂａｙｅｒ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）により米国で販売されているＲｅｓｏｖｉｓｔ（米国登録商標）は２００１年にヨーロッパでの販売が承認された。これらの製品はガドリニウムベースの製品とは異なって、ＦＤＡやＥＭＥＡによる毒性についての警告の対象となっていない。特にガドリニウムの副生物は、腎不全の患者に使用した後に腎性全身性線維症（ＮＳＦ）の症状が発症したため、２００７年にＦＤＡやヨーロッパの諸機関によって「ブラックボックス」警告（“ｂｌａｃｋ  ｂｏｘ”ｗａｒｎｉｎｇ）を受けた。ＦＤＡは現在、ガドリニウムベースの造影剤を投与後のＮＳＦの発症率を調査するため、潜在的リスクのある患者をモニターするプログラムに着手した。
【０００９】
造影剤として使用される粒子の品質は、材料のコアの磁気特性、粒子サイズの分布、粒子の表面電荷、およびほぼ中性の溶剤あるいは生理食塩水における安定性、さらに表面に固定される分子の化学的・機能的特性によって決定される。加えて、薬物動態挙動は、磁気共鳴イメージングへの適用において重要な決定要因である、というのは、造影剤は理想的にはＭＲＩ検査の間だけ標的組織に留まるべきもので、検査の後は身体のどの部分にも蓄積しないように速やかに排除されるべきものであるからである。
【００１０】
市販製品は水性媒体中で共沈（コアサイズ５〜１０ｎｍ）によって合成される（Ｃｏｒｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００６，５８，ｐ．１４７１）。この単純で持続可能な合成方法により小サイズ（＜１０ｎｍ）で非毒性デキストランコートされた磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）が製造され（Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００９，２０，  １  １５  １０３）、このナノ粒子はコロイド懸濁液中で容易に維持されうるが、著しく大きな分布（＞２０％）を有する。コーティングの流体力学的サイズと化学的性質はＭＮＰの分布に影響し、そのため臓器や組織における蓄積に影響する（Ｔｈｏｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００８，２９，ｐ．３５８３）。１００ｎｍより大きい流体力学的サイズを有するデキストランコートされたＳＰＩＯナノ粒子（Ｆｅｒｉｄｅｘ）及びカルボキシデキストラン（米国登録商標Ｒｅｓｏｖｉｓｔ）は肝臓イメージングに使用され、一方５０ｎｍより小さい流体力学的サイズを有するナノ粒子ＵＳＰＩＯは、血管造影と腫瘍浸透性の用途に使用されてきた（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２００２，３７，ｐ．１６７）。しかしながら、デキストランコーティングあるいはカルボキシデキストランコーティングは血管や組織表面へのこれら粒子の顕著な結合や非特異的吸着を生じさせ、イメージング検査が行われた後で、これらの粒子の効率的な排除を制限し、それらが完全に排除され、その結果再投与ができるまでに比較的長い待ち時間を必要とする。このような理由によって、組織付着・血管付着がなく、迅速な排除が可能で、組織蓄積が少ない磁性ナノ粒子の製造と特徴付けに現在大きな関心が持たれている。
【００１１】
酸化鉄磁性ナノ粒子を製造するための適切なプロトコールは、表面活性剤の有無にかかわらずアルカリ媒体における第二鉄塩及び第一鉄塩の共沈を含む。このようにして得られたナノ粒子は直径が１ｎｍと５０ｎｍの間のコアを有する。
【００１２】
生体適合性ポリマーあるいは生体適合性コポリマーを有する磁性ナノ粒子のコーティングは、カルボジイミドナノ粒子の活性化による共有結合により達成される。コーティングされたコア構造を有するナノ粒子の流体力学的直径は１ｎｍと１５０ｎｍの間にある。
【００１３】
Ｔ２タイプの造影剤の製造方法は以下の文献に記載されている。米国特許公開ＵＳ  ２００７／０１４０９７４号は修飾されたシランポリエチレンイミン（ＰＥＩ）でコートされ、治療的ベクターにリンクされた磁性ナノ粒子により形成されコートされた核構造を有する造影剤を開示している。
【００１４】
米国特許公開ＵＳ  ２００９／０２２０４３１号は水溶性のリガンドでコーティングされたマンガンフェライトナノ粒子からなる造影剤を開示している。これの緩和度係数Ｔ２は、酸化鉄ナノ粒子の緩和度係数Ｔ２より大きい。
【００１５】
米国特許公開ＵＳ  ２０１０／００６１９３７号は血中のナノ粒子の存在により測定される値より低いＴ２＊値を得るため、赤血球内に包まれた酸化鉄ナノ粒子からなる造影剤（米国登録商標Ｒｅｓｏｖｉｓｔ）を開示している。
【００１６】
国際公開ＷＯ  ２００９／１５６４４５は市販品米国登録商標Ｅｎｄｏｒｅｍを上回る信号Ｔ２の増強をもたらすポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）とアルブミンでコーティングされたコバルトフェライトナノ粒子からなる造影剤を開示している。
【００１７】
米国特許７，５９８，３３５号はポリエチレングリコールと葉酸でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子からなる造影剤を開示している。これのＴ２／Ｔ１比は米国登録商標Ｒｅｓｏｖｉｓｔのものを上回る。
【００１８】
国際公開ＷＯ  ２００９／１３６７６４は、アルブミン血清でコーティングされたマンガンフェライトナノ粒子からなるＰＥＴ／ＭＲＩ造影剤を開示しており、その緩和度係数Ｔ２は、従来の酸化鉄ナノ粒子のものより高い。
【００１９】
国際公開ＷＯ２０１１０６２２１７は、水中に分散される磁性酸化鉄粒子とその磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）における利用可能性を開示している。ハイパーサーミアと薬剤投与による治療の相乗効果のための使用も述べられている。本文献によれば、アミノ基及びカルボキシル基を有する分子のような表面が修飾された分子を有する磁性粒子のコーティングは、とりわけ磁性粒子の生体分子への結合を改善する特性として記載されている。しかしながら、イン−ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での組織における特異的蓄積を制限するために、血管付着及び組織付着を減少させるために必要とされる固有の特性についての言及は何もない。
【００２０】
現状技術を開示した特許を検討してみると、いずれの特許も、薬物動態上のあるいは毒性学上のパフォーマンスに対する磁化率、表面電荷、生体段階での低付着性の効果は特には意図されていないことが強調されるべきである。本発明の造影剤はＴ２＊パラメータに対する効果で際立っており、そのうえ、負に帯電した表面はすぐれた薬物動態上及び毒性学上の特性を示し、また生体の血管表面及び組織表面への低付着性を示し、このため顕著な生物蓄積を引き起こさずに特定の組織における一時的滞留を可能とする。こうした有利な特性の集積によって、以下に記載する発明は、腫瘍及び組織のイン−ビボ灌流試験における使用に特に適したものとなる。
【発明の概要】
【００２１】
本発明は磁性ナノ粒子に関し、本磁性ナノ粒子の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）における造影剤としての適用に関する。このナノ粒子はその表面が１以上の水溶性ポリマーでコーティングされた無機のコアを有する。このナノ粒子は優れた薬物動態特性を有して、迅速な全身クリアランス、脳及び脾臓における低度の停留、無視できる程の肝臓蓄積を呈し、組織付着と血管付着が著しく低度であることを示す。このナノ粒子はまた適切なＴ２＊緩和度特性を有し、このためこのナノ粒子は組織及び腫瘍の画像診断での使用に特に適したものとなる。
【００２２】
本発明の別の目的は前述の粒子をＭＲＩ造影剤として調製する方法を提供することである。この方法には以下のステップが含まれる。１）ナノ粒子コアの合成、２）イオン化された官能基を含むポリマーコーティング又はイオン化された官能基を含まないポリマーコーティングによるナノ粒子のコーティング、任意選択的に３）特定のベクター分子またはクロモホアをナノ粒子のコーティングに付着させる、４）イン−ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）及びイン−ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での生物学的活性及び毒性学的活性の検討。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例１において、カルボジイミドによりポリアクリル酸（ＰＡＡ）でＦｅ３Ｏ４  磁性ナノ粒子をコーティングするために使用されるプロセスを表す概念図を示す。負に帯電したカルボン酸基の存在が明らかであり、生理的ｐＨで正味の負電荷を供給する。
【図２】ＰＡＡでコーティングされた金属酸化物ナノ粒子の走査型電子顕微鏡画像を示す。ナノ粒子の無機のコアはＦｅ３Ｏ４からなる。
【図３】０．５テスラから１テスラで、０ｍＭ  Ｆｅと０．０５ｍＭ  Ｆｅ間の範囲の濃度での、水中（Ａ，Ｂ）と牛胎児血清中（Ｃ，Ｄ）のＮａｎｏｔｅｘのＴ１及びＴ２の緩和特性を示す。数値はそれぞれの状態で観測されるピクセルの平均値±標準偏差を示す。
【図４】０ｍＭ  Ｆｅと０．０５ｍＭ  Ｆｅ間の範囲の濃度での、７テスラの水中（Ａ，Ｂ）とＮａｎｏｔｅｘ懸濁液の牛胎児血清中（Ｃ，Ｄ）におけるＴ２及びＴ２＊緩和値を示す。数値はそれぞれの状態で観測されるピクセルの平均値±標準偏差を示す。
【図５】培養１時間後（左側）又は２４時間後（右側）に培養培地に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）により検出されたＣ６細胞の生存可能性に対するＮａｎｏｔｅｘの濃度増加の効果を示す。
【図６】Ｎａｎｏｔｅｘの静脈内投与（体重１ｋｇ当たり１５マイクロモルのＦｅ）１時間後に得られた、４つのマウスの脾臓（Ａ−Ｄ）におけるＴ２＊強調ＭＲＩにより検出された脾臓における蓄積を示す。
【図７】マウスの胸郭と腹部のＴ２＊強調画像例（Ａ）とＮａｎｏｔｅｘ（体重１ｋｇ当たり１５マイクロモルのＦｅ）の静脈内投与２４時間後に得られたＴ２＊マップ例（Ｂ）を示す。
【図８】Ｎａｎｏｔｅｘの１回量（体重１ｋｇ当たり１５マイクロモルのＦｅ）及び２倍量（体重１ｋｇ当たり３０マイクロモルのＦｅ）をマウスの尾部静脈に投与後の、肝臓Ｔ２＊における相対変化を示す。結果は、造影剤の投与後に調べられた４匹の動物の平均と標準偏差として表される。挿入図は０時間から６時間の間の部分の拡大図であり、効果の相乗作用の理解に資するよう示される。図９は、Ｎａｎｏｔｅｘを使用した、Ｃ６グリア細胞腫移植をしたラットにおける「ボーラストラッキング」法を使用した脳灌流の測定を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の造影剤は、生物学的表面への低付着性、良好なＴ２＊緩和度特性などの優れた薬物動態特性を有し、このためこのナノ粒子は磁気共鳴イメージングでの使用に特に適したものとなる。
【００２５】
このようにして、本発明の目的は、磁気共鳴イメージングにおいてこれまでに使用されている市販のナノ粒子に匹敵する改善された薬物動態特性と磁化率特性を有するナノ粒子を提供することである。
【００２６】
本発明の特別な目的は好適な磁気特性を有する１以上のナノ粒子を含む造影剤を提供することであり、本磁性粒子は以下を含む１）無機のコア、２）その排除性が改善され、イオン化された官能基に限定されない水溶性ポリマーのコーティング、３）１以上の分子ベクター。
【００２７】
本発明の別の目的は前述の造影剤の調製方法を提供することであり、この方法は以下のステップを含む。１）ナノ粒子コアの合成、２）デキストランコーティングにおいて認められる結合特性を減少させるポリマーコーティングによるナノ粒子のコーティング、任意選択的に３）分子ベクターのナノ粒子コーティングへの結合。
【００２８】
本発明の１つの実施態様によると、磁性ナノ粒子は１つ以上の以下の構成要素からなる。ｉ）鉄、コバルト、マンガン、銅、マグネシウムを含むがこれに限定されない遷移金属の中から選択される１以上の元素を含む無機のコア、またはｉｉ）鉄、コバルト、マンガン、銅、マグネシウムを含むがこれに限定されない遷移金属の中から選択される元素を含有する合金からなる無機のコア。
【００２９】
本発明の特定の実施態様において、磁性ナノ粒子の無機のコアは、酸化鉄、コバルトフェライト、マンガンフェライト、マグネシウムフェライト、及びその組合せからなる群から選択される。
【００３０】
本発明の別の特定の実施態様においては、ナノ粒子の無機のコアは磁性酸化鉄である。
【００３１】
本発明の実施態様によれば、磁性ナノ粒子の水溶性ポリマーコーティングは、少なくとも１つのポリマー、少なくとも１つのコポリマーによって形成されており、この少なくとも１つのポリマー及びコポリマーは、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピリジン、ポリビニルピロリドン、ＰＬＧＡ、キトサン、デキストラン、ヒアルロン酸、プルラン、ＴＭＳＭＡ−ｒ−ＰＥＧＭＡ、エチルセルロース、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリアミン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアクリレート副生物、及びその組合せからなる群から選択される官能基を有する。
【００３２】
本発明の特定の実施態様において、磁性ナノ粒子の水溶性ポリマーコーティングはポリアクリル酸である。
【００３３】
本発明の磁性ナノ粒子のポリマーまたはコポリマーコーティングは、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＳＳ−、−ＣＯＮＨ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＯ２、−ＣＨＯ、−ＣＯＳＨ、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＳＣＮ、−ＮＣＳ、−ＮＣＯ、−ＯＣＮ、−Ｎ−、−ＮＨ−、Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯ３及びその組合せからなる群から選択される１つ以上の官能基を含むがこれに限定されず、正または負に帯電したナノ粒子の表面を生成する。
【００３４】
本発明のある実施態様によれば、フルオロホア、クロモホア、放射性薬剤、抗体、アビジン−ビオチン抱合体、薬物、受容体に対するリガンド、干渉ＲＮＡ、及びその組合せからなる群から選択される１以上のベクターが、磁性ナノ粒子のポリマーコーティングに付着させられて、磁性ナノ粒子の使用の促進に役立てられてもよい。磁性ナノ粒子のイン−ビボ投与は、磁気共鳴イメージング法を使用した組織灌流または腫瘍灌流の視覚化を可能とする。本発明において開発されたナノ粒子の使用は、前記市販製剤のイン−ビボでの血管表面及び組織表面への非選択的な付着を減少させることにより著しく有利な効果を提供し、これによって組織及び腫瘍のイメージングのための新規で改善された薬物動態特性を提供するものである。
【実施例】
【００３５】
以下実施例は説明のためのものであり、本発明を限定するために記載されるものではない。
【００３６】
〔実施例１：腫瘍灌流において造影剤として使用される磁性酸化鉄ナノ粒子の調製〕
マグネタイト（磁鉄鉱）ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）は、ｐＨが１０までのアンモニア溶液（２９．６％）でＦｅ３＋イオンとＦｅ２＋イオン０．３Ｍ（モル比  ２：１）の共沈によって、２５°Ｃの不活性雰囲気中で調整され、次いで３０分間８０℃で水熱処理される。磁性ナノ粒子は脱イオン水とエタノールで数回洗浄され、次の処理のため乾燥機中にて７０℃で乾燥される。ポリアクリル酸（ＰＡＡ）を結合させるため、１００ｍｇのＦｅ３Ｏ４ナノ粒子はまず２ｍＬの緩衝液Ａ（０．００３Ｍリン酸塩、ｐＨ６）及び０．５ｍＬのカルボジイミド溶液（緩衝液Ａ中０．０２５ｇ・ｍＬ−１）と混合される。１０分間超音波処理された後、２．５ｍＬのＰＡＡ溶液（緩衝液Ａ中６０ｍｇ・ｍＬ−１）が加えられ、この混合液はさらに３０分間超音波処理される。最後に、ＰＡＡによりコートされたＦｅ３Ｏ４ナノ粒子は磁力的に回収され、水で２回洗浄され、緩衝生理食塩水溶液に対して透析される（図１及び図２Ａ）。以下においてこのナノ粒子はＮａｎｏｔｅｘ（ナノテックス）と称される。
【００３７】
〔実施例２：Ｎａｎｏｔｅｘ造影剤の磁気的緩和特性（Ｔ１，Ｔ２及びＴ２＊）の評価〕
実施例１において合成されたナノ粒子から開発された本発明によるＮａｎｏｔｅｘの磁気的緩和特性（Ｔ１，Ｔ２及びＴ２＊）の評価は、磁気共鳴スペクトロメータ  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｍｉｎｉｓｐｅｃ［ブルカーバイオスピン社（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ）、エットリンゲン、ドイツ］を使用して、臨床上の磁場強度１．５テスラで、またＰｈａｒｍａｓｃａｎ  Ｂｒｕｋｅｒ  ｓｃａｎｎｅｒ［ブルカーバイオスピン社（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ）、エットリンゲン、ドイツ］を使用して７テスラで行われた。
【００３８】
１．５テスラでのＴ１値はＴＥ：１０ｍｓ、ＴＲ：７０−１２０００ｍｓ（少なくとも９値）での進行的飽和化によるスピンエコーシークエンスを使用して得られ、７テスラでのＴ１値は、それぞれがＮａｎｏｔｅｘの濃度減少を含む一群の毛細管（直径１ｍｍ）に沿った冠状切片（１．５ｍｍ）を使用して得られた。撮像条件はＦＯＶ（視野：ディスプレイ  ウィンドウ）：３０ｍｍ、マトリクス：２５６×２５６であった。
【００３９】
１．５テスラでのＴ２値はＴＲ：９０００ｓ、ＴＥ：１０−２０００ｍｓ（少なくとも９値）で拡散とは無関係にスピンエコーシークエンス（Ｃａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ）を使用して得られた。７テスラでのＴ２値は、ＦＯＶ：３０ｍｍ，マトリクス：２５６×２５６，冠状切片１．５ｍｍで毛細管（直径１ｍｍ）の冠状切片のＴ２マップにおいて測定された。
【００４０】
図Ｔ２＊マップは、勾配エコーシークエンスＴＲ：３００ｓ，ＴＥ：２．３〜４０ｍｓ（少なくとも９値），ＦＯＶ：３０ｍｍ，マトリクス：２５６×２５６，冠状切片：１．５ｍｍを使用し、Ｎａｎｏｔｅｘの濃度増加を含んだ一群の毛細管（直径１ｍｍ）に沿った７テスラ冠状切片（１．５ｍｍ）から得られた。Ｔ２＊値はＴ２＊マップから計算され、平均値±標準偏差として表される。
【００４１】
図３は、１．５テスラで０ｍＭ  Ｆｅと０．０５ｍＭ  Ｆｅの間の濃度における水及び血清中でのＮａｎｏｔｅｘのＴ１及びＴ２の緩和特性を示しており、水における試験された最も高い濃度からの減少は、Ｔ１は３２００ｍｓから２６００ｍｓ、Ｔ２は２５００ｍｓから６００ｍｓであった。超常磁性ナノ粒子の恩恵としてＴ２の効果はＴ１の効果より著しく大きい。血清の場合は、Ｔ１は１８００ｍｓから１６００ｍｓへと減少し、Ｔ２は１０００ｍｓから７００ｍｓへと減少した。Ｔ２の効果はやはりＴ１の効果より高いが、観測された減少範囲は純水の場合に比べ小さくなっている。
【００４２】
図４は０ｍＭ  Ｆｅと０．０５ｍＭ  Ｆｅとの間の範囲の濃度の、脱イオン水と牛胎児血清で調製されたＮａｎｏｔｅｘ懸濁液における７テスラでのＴ２とＴ２＊の間の関係を示す。Ｎａｎｏｔｅｘは水中のＴ２の値を３００ｍｓから２２０ｍｓへと減少させる。ＮａｎｏｔｅｘによるＴ２＊の減少量は１８ｍｓである。血清が存在する場合には、観測される減少量はわずかであり、ＮａｎｏｔｅｘによるＴ２で１５９ｍｓから１３３ｍｓ、Ｔ２＊では１０ｍｓである。血清中で測定された対応する緩和度値は表１に示されている。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
〔実施例３：培養Ｃ６グリオーマ細胞におけるＮａｎｏｔｅｘ造影剤の細胞毒性の測定〕
Ｃ６グリオーマ細胞（神経膠腫細胞）を使用したＮａｎｏｔｅｘのイン−ビトロ毒性は、細胞膜の完全性を測定する手順である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を試験することにより、研究をおこなった。細胞死は培養培地への酵素の放出を測定することにより検出された。このような条件下では、ＬＤＨ放出は細胞膜の透過性の劇的な改変又は破壊と関連しており、そのためＬＤＨ放出の増大は細胞死の増加と細胞生存可能性（バイアビリティ）の低下を示す。
【００４５】
図５はＮａｎｏｔｅｘの濃度の増加に対応したＣ６細胞のＬＤＨ放出の結果を示す。生存可能性の変化は研究対象の濃度範囲では検出されず、Ｃ６グリオーマ細胞におけるＮａｎｏｔｅｘ毒性の低さを表す。生存可能な細胞が殺される可能性のあることを確認するために、陽性コントロール（ヒドロキシルアミン細胞毒性濃度）が使用されたが、このプロセスはＬＤＨの放出により検出され得る。
【００４６】
〔実施例４：イン−ビボでの毒性の測定、脾臓における造影剤Ｎａｎｏｔｅｘの蓄積〕
脾臓におけるＮａｎｏｔｅｘのイン−ビボでの蓄積は、Ｎａｎｏｔｅｘの静脈内投与（体重１ｋｇ当たり１５マイクロモルのＦｅ）の１時間後に屠殺されたマウスの単離された脾臓におけるＴ２＊の値の測定によって測定される。この投与量は商業的製造者により推奨されているナノ粒子の臨床投与量に対応しており、ここでは基準用量（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｄｏｓｅ）として使用されている。脾臓は頚部脱臼により屠殺されたマウスから単離され、６個のプレキシガラスの皿に置いて対応するＴ２＊マップを再構成させた。図６は、Ｎａｎｏｔｅｘを投与された６匹の動物の単離された脾臓を有する皿上の、このアプローチの代表的な結果を示す。この方法を使用して達成される解像度と感度は、イン−ビボでの脾臓では達成できない生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）での脾臓におけるＴ２＊の非常に正確な測定を可能とする。
【００４７】
表２は、脾臓の単離前とＮａｎｏｔｅｘ（体重１ｋｇ当たり１５マイクロモルのＦｅ）の静脈注射１時間後の脾臓中のＴ２＊の値を示す。Ｎａｎｏｔｅｘは脾臓中でのＴ２の有意な減少を引き起こしてはおらず、これはＮａｎｏｔｅｘが、脾臓への蓄積が極めて少ないか全くないこと、生体への付着性が弱いことを示唆している。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
イン−ビボでの研究で、Ｎａｎｏｔｅｘの投与後、イン−ビボでの明らかな毒性は検出されなかった。Ｎａｎｏｔｅｘはまた使用された麻酔プロトコール（イソフルラン１〜２％）と両立でき、試験された健康な動物（ｎ＝１２）において、ナノ粒子による死亡例はなかった。
【００５０】
特にＮａｎｏｔｅｘの投与は呼吸や心拍数の有意な変化をもたらさず、黄色皮膚のような肝臓毒性の外的徴候は観察されず、Ｎａｎｏｔｅｘは、局所脱毛又は被毛着色、活動亢進または活動低下（傾眠）、攻撃性、片側不全麻痺、または半身不随を引き起こさなかった。
【００５１】
〔実施例５：ＭＲＩ造影剤ＮａｎｏｔｅｘにおけるＮａｎｏｔｅｘのイン−ビボでの薬物動態の測定〕
ＭＲＩ用Ｎａｎｏｔｅｘナノ粒子のイン−ビボでの薬物動態の研究のために、Ｔ２＊強調画像と、ＣＤ１スイスマウスの胸郭及び腹部を通過する冠状断面におけるＴ２＊強調画像に対応するマップが得られた。画像はＮａｎｏｔｅｘの静脈内投与前と、投与後の時間増加時（１，３，６，２４，４８，１６８ｈ）において取得した。Ｎａｎｏｔｅｘナノ粒子は、体重１ｋｇ当たり１５マイクロモル量のＦｅを静脈内に投与した。この投与量は商業的ナノ粒子の製造者により推奨されているナノ粒子の臨床投与量に対応しており、ここでは基準用量として使用されている。
【００５２】
図７は、Ｎａｎｏｔｅｘ投与前の胸郭と腹部を表すＴ２＊強調画像（Ａ）と、Ｎａｎｏｔｅｘ（体重１ｋｇ当たり１５マイクロモルのＦｅ）を静脈内投与の２４時間後に得られたＴ２＊マップの一例（Ｂ）を示す。Ｔ２＊マップ（図７Ｂ）は、Ｎａｎｏｔｅｘで処理された動物の肝臓においてＴ２＊の有意により低い値を示し、前述の結果が確認される。
【００５３】
図８は、Ｔ２＊の測定結果とＮａｎｏｔｅｘの１回量（体重１ｋｇ当たり１５マイクロモルのＦｅ）及び２倍量（体重１ｋｇ  当たり３０マイクロモルのＦｅ）を静脈内投与後の肝臓への蓄積及び肝臓からの排除を要約したものである。Ｎａｎｏｔｅｘは肝臓Ｔ２＊を若干減少させ、その後の肝臓組織からの迅速な排除により急速な減少を示す。Ｎａｎｏｔｅｘの１回量である体重１ｋｇ当たり１５マイクロモルのＦｅは、平均の肝臓からの排除の半減時間（ｔｉ１／２）約１０時間を有して、ほぼ２４時間で完全に排除される。このことは半減時間がデキストランコーティングナノ粒子の半減時間より有意に短く、組織付着性及び血管付着性が低いことを示しており、短い時間間隔で投与プロトコルを繰り返すことを可能とする。推奨される投与量の２倍（体重１ｋｇ当たり３０マイクロモルのＦｅ）を注射した後のＮａｎｏｔｅｘの薬物動態を研究すると、肝臓からの急速な排除率とする改変なしでも、緩和効果が増大することが示された。投与量を２倍にしても有害な症候は見られず、研究中に死んだマウスは一匹もいなかった。
【００５４】
〔実施例６：磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）による、多形性膠芽腫モデル（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ  ｍｏｄｅｌ）における灌流イメージングにおいての、造影剤としてのＮａｎｏｔｅｘの使用可能性の評価〕
微小血管灌流の評価手続は、「ボーラス（ｂｏｌｕｓ）」タイプ造影の通過動態のモニタリングに基づく。つまり、急速注入が行われ、造影剤が脈管系をグループ化したボーラス（大型丸剤）として通過し、それぞれの通過組織において（少なくとも最初の組織を通過中に）、注入溶液の当初の濃度を維持する。ボーラスが、得られるＭＲＩ画像平面（ｐｌａｎｅ）の断面（ｓｅｃｔｉｏｎ）に到達する時、注入される溶質の濃度に比例した画像強度の低下が磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）によって測定され得る。
【００５５】
上記開示の様々な変形例や他の特徴及び機能、それらを代替する特徴・機能が、多くの他画像平面を通過する造影剤の動態は、初期部分を有し、最大強度点に達し、完全に消滅するまで減少する、ガンマ関数に近づく。曲線の下の領域は画像平面における脳血液量（ＣＢＶ，ｍＬ／１００ｇ）を表す。通過の開始と最高濃度の間の時間は平均通過時間（ＭＴＴ）として知られ、造影ボーラスの半分が断面を通過した時間（ｓ）を測定する。最後に、脳血液量（ＣＢＦ）はＣＢＶ／ＭＴＴ比率であり、検査された脳の断面を通過する血流［（ｍＬ／１００ｇ）／ｍｉｎ］を表す。
【００５６】
図９はＮａｎｏｔｅｘを使用した、Ｃ６グリア細胞腫移植をしたラットにおける脳灌流の測定を説明する。つまり、図は、ガンマ関数（赤色）灌流の異なる造影剤（青色）の通過動態への適応を説明する。Ｎａｎｏｔｅｘは迅速な通過時間と注入後の灌流からの実質的に完全な回収を示し、Ｎａｎｏｔｅｘが固着したり付着して残らず、又は内皮血管や脳微小血管と有意な相互作用を行わないことを示す。
【００５７】
表３は、造影剤のガンマ通過関数における補正に基づいて計算された、腫瘍を有するラットの、Ｎａｎｏｔｅｘ（体重１ｋｇ当たり１５マイクロモルのＦｅ）によるＣＢＦ［（ｍＬ／１００ｇ）／ｍｉｎ］、ＣＢＶ（ｍＬ／１００ｇ）及びＭＴＴ（ｓ）の値を示す。健康な脳組織において、Ｎａｎｏｔｅｘは短い平均通過時間を有する。要約すると、Ｎａｎｏｔｅｘは、非常に良好な初期の通過動態及び脳微小血管を介した回収を示す。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
上記開示の様々な変形例や他の特徴及び機能、それらを代替する特徴・機能が、多くの他血管新生（ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）や血管形成誘導（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）のプローブとしての粒子の有効性を探索するために、主として壊死部を含むグリオーマ（コア）の中心部と新生血管成長ゾーンであるその周縁部において、灌流測定が行われた。Ｎａｎｏｔｅｘ（１回量及び２倍量）が比較のために使用された。表４は３つの変数において得られたＮａｎｏｔｅｘによる結果を示す。
【００６０】
【表４】
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【００６１】
Ｎａｎｏｔｅｘの１回量の投与がどのように腫瘍の中心部と周縁部の灌流の不均質性の検出を可能とするかに注意されたい。この投与量は市販ナノ粒子の製造者により推奨されている臨床投与量に対応しており、ここでは基準用量となっている。２倍量を使用すると、動物における有意な毒性作用なしに、画像における音響信号の増大によって、パラメータの信頼性が増加する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年9月26日(2014.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
直径１５ｎｍ未満のコアを有して表面に正味の電荷を持ち、９０Ｓ−１ｍＭ−１より大きい血清緩和値ｒ２＊を有する１以上のナノ粒子を含んでなるＴ２＊強調磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）用の造影剤であって、ナノ粒子は１）無機のコアと２）肝臓または脾臓に蓄積しない水溶性ポリマーコーティングとを含み、
ｉ）無機のコアが磁鉄鉱−Ｆｅ３０４−からなり、
ｉｉ）水溶性ポリマーコーティングがポリアクリル酸であることを特徴とするＴ２＊強調磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）用の造影剤。
【請求項２】
動物及びヒトにおけるイン−ビボでの生物組織のＴ２＊強調磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）用に、請求項１に記載の造影剤の使用。
【請求項３】
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を使用して、動物またはヒトにおける、健康な組織において、および、血管障害、組織阻血、神経変性、炎症、浮腫または癌に冒された病状において、灌流測定のため、請求項２に記載の造影剤の使用。
【国際調査報告】
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