(57)【要約】本発明は、ヘム酵素を用いて、オレフィンの、1つまたは複数のシクロプロパン官能基を含む任意の化合物への変換を触媒する方法を提供する。ある局面において、本発明は、シクロプロパン化生成物を生成する方法であって、オレフィン基質、ジアゾ試薬、およびヘム酵素を提供する段階；ならびに反応中の成分を、シクロプロパン化生成物を生成するのに十分な時間混合する段階を含む、方法を提供する。他の局面において、本発明は、インビボおよびインビトロでオレフィンシクロプロパン化反応を実行しうる、その変異体および断片を含むヘム酵素を提供する。ヘム酵素を発現する発現ベクターおよび宿主細胞も、本発明によって提供される。2015534464.tif 000206
2015534464.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロプロパン化生成物を生成する方法であって：
（a）オレフィン基質、ジアゾ試薬、およびヘム酵素を提供する段階；および
（b）反応中の段階（a）の成分を、シクロプロパン化生成物を生成するのに十分な時間混合する段階
を含む、方法。
【請求項２】
シクロプロパン化生成物が式Iの化合物である、請求項1に記載の方法：
2015534464.tif 000193
式中：
R1は、H、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよい6〜10員ヘテロアリール、ハロ、シアノ、C(O)OR1a、C(O)N(R7)2、C(O)R8、C(O)C(O)OR8、およびSi(R8)3からなる群より独立に選択され；
R2は、H、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよい6〜10員ヘテロアリール、ハロ、シアノ、C(O)OR2a、C(O)N(R7)2、C(O)R8、C(O)C(O)OR8、およびSi(R8)3からなる群より独立に選択され；
R1aおよびR2aは、H、置換されていてもよいC1-18アルキル、および-L-RCからなる群より独立に選択され；
各Lは、結合、-C(RL)2-、および-NRL-C(RL)2-からなる群より選択され；
各RLは、H、C1-6アルキル、ハロ、-CN、および-SO2からなる群より独立に選択され；
各RCは、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよい6〜10員ヘテロルアリール、および置換されていてもよい6〜10員ヘテロシクリルからなる群より選択され； 
R3、R4、R5、およびR6は、H、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、C2-18アルキニル、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよいC1-C6アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、C(O)N(R7)2、NR7C(O)R8、C(O)R8、C(O)OR8、およびN(R9)2からなる群より独立に選択され；
各R7およびR8は、H、置換されていてもよいC1-12アルキル、置換されていてもよいC2-12アルケニル、および置換されていてもよいC6-10アリールからなる群より独立に選択され；
各R9は、H、置換されていてもよいC6-10アリール、および置換されていてもよい6〜10員ヘテロアリールからなる群より独立に選択されるか、または2つのR9部分は、それらが結合している窒素原子と一緒に6〜18員ヘテロシクリルを形成することができ；
またはR3はR4と共に、置換されていてもよい3〜18員環を形成し；
またはR5はR6と共に、置換されていてもよい3〜18員環を形成し；
またはR3もしくはR4はR5もしくはR6と共に、二重結合を形成し；
またはR3もしくはR4はR5もしくはR6と共に、置換されていてもよい5〜6員環を形成する。
【請求項３】
R1がC(O)O-LRcであり；
R2が、Hおよび置換されていてもよいC6-10アリールからなる群より選択され；
R3、R4、R5、およびR6が、H、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC2-6アルケニル、置換されていてもよいC2-6アルキニル、置換されていてもよいC6-10アリール、およびハロからなる群より独立に選択され；
またはR3がR4と共に、置換されていてもよい3〜18員環を形成し；
またはR5がR6と共に、置換されていてもよい3〜18員環を形成する、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
シクロプロパン化生成物が式IIの化合物である、請求項2に記載の方法：
2015534464.tif 000194
式中、R1aはC1-6アルキルであり、R2はHおよび置換されていてもよいC6-10アリールからなる群より選択される。
【請求項５】
R2がHである、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
シクロプロパン化生成物が下記からなる群より選択される、請求項4に記載の方法：
2015534464.tif 000195
式中：
X1は、H、置換されていてもよいC1-6アルキル、ハロC1-6アルキル、置換されていてもよいC1-6アルコキシ、置換されていてもよいC1-6アルキルチオ、C1-6アルキルシリル、ハロ、およびシアノからなる群より選択され；
X2は、H、クロロ、およびメチルからなる群より選択され；
X3は、H、メチル、ハロ、およびCNからなる群より選択され；
各X4は、独立にハロであり；
各X5は、メチルおよびハロからなる群より独立に選択され；
X6は、ハロ、置換されていてもよいC1-6アルキル、および置換されていてもよいC1-6アルコキシからなる群より選択され；
X7は、H、メチル、およびハロからなる群より選択され；
X8は、H、ハロ、および置換されていてもよいC1-6アルキルからなる群より選択され；
X9は、H、ハロ、置換されていてもよいC1-6アルキル、C(O)O-(C1-6アルキル)、C(O)-N(C1-6アルキル)2、およびシアノからなる群より選択され； 
Z1、Z2、およびZ3は、H、ハロ、置換されていてもよいC1-6アルキル、および置換されていてもよいC6-10アリールからなる群より独立に選択されるか、または
Z1およびZ2は一緒になって、置換されていてもよい5〜6員シクロアルキルもしくはヘテロシクリル基を形成する。
【請求項７】
シクロプロパン化生成物を式IIIの化合物に変換する段階をさらに含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法：
2015534464.tif 000196
式中：
Lは、結合、-C(RL)2-、および-NRL-C(RL)2-からなる群より選択され；
各RLは、H、-CN、および-SO2からなる群より独立に選択され；
R1cは、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよい6〜10員ヘテロルアリール、および置換されていてもよい6〜10員ヘテロシクリルからなる群より選択される。
【請求項８】
Lが、結合、-CH2-、-CH(CN)-、および-N(SO2)-CH2からなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
部分L-R1cが、下記からなる群より選択される構造を有する、請求項7に記載の方法：
2015534464.tif 000197
2015534464.tif 000198
式中：
各Y1は、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC2-6アルケニル、置換されていてもよいC2-6アルキニル、フェニル、および(フェニル)C1-6アルコキシからなる群より独立に選択され；
各Y2は、ハロ、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC2-6アルケニル、置換されていてもよいC1-6アルコキシ、およびニトロからなる群より独立に選択され；
各Y3は、独立に置換されていてもよいC1-6アルキルであり；
各Y4は、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC2-6アルケニル、置換されていてもよいC2-6アルキニル、C6-10アリール-C1-6アルキル、フルフリル、C1-6アルコキシ、(C2-6アルケニル)オキシ、C1-12アシル、およびハロからなる群より独立に選択され；
Y5は、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC1-6アルコキシ、およびハロからなる群より選択され；
下付き文字mは1〜3の整数であり；
下付き文字nは1〜5の整数であり；
下付き文字pは1〜4の整数であり；
下付き文字qは0〜3の整数であり；
かつ構造の左の波線は部分-L-R1cと式IIIの化合物の残部との間の連結点を表す。
【請求項１０】
式IIIの化合物がレスメトリンである、請求項7に記載の方法。
【請求項１１】
シクロプロパン化生成物が以下の式の構造を有する化合物である、請求項2に記載の方法：
2015534464.tif 000199
式中：
R1aは、置換されていてもよいC1-6アルキルであり；
R5およびR6は、H、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC6-10アリール、C(O)N(R7)2、C(O)OR8、およびNR7C(O)R8からなる群より独立に選択される。
【請求項１２】
シクロプロパン化生成物が下記からなる群より選択される構造を有する、請求項11に記載の方法：
2015534464.tif 000200
。
【請求項１３】
シクロプロパン化生成物を、ミルナシプラン、レボミルナシプラン、ビシファジン、および1-(3,4-ジクロロフェニル)-3-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンからなる群より選択される化合物に変換する段階をさらに含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
オレフィン基質が、アルケン、シクロアルケン、およびアリールアルケンからなる群より選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
オレフィン基質がアリールアルケンである、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
アリールアルケンがスチレンである、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
スチレンが以下の式を有する、請求項16に記載の方法：
2015534464.tif 000201
式中、
R3は、H、置換されていてもよいC1-C6アルキル、置換されていてもよいC1-C6アルコキシ、C(O)N(R7)2、C(O)OR8、N(R9)2、ハロ、ヒドロキシ、およびシアノからなる群より選択され；
R5およびR6は、H、置換されていてもよいC1-6アルキル、およびハロからなる群より独立に選択され；
R10は、置換されていてもよいC1-C6アルキル、置換されていてもよいC1-C6アルコキシ、ハロ、およびハロアルキルからなる群より選択され；
下付き文字rは0〜2の整数である。
【請求項１８】
ジアゾ試薬が以下の式の構造を有する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法：
2015534464.tif 000202
式中：
R1は、H、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよい6〜10員ヘテロアリール、ハロ、シアノ、C(O)OR1a、C(O)N(R7)2、C(O)R8、C(O)C(O)OR8、およびSi(R8)3からなる群より独立に選択され；
R2は、H、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよい6〜10員ヘテロアリール、ハロ、シアノ、C(O)OR2a、C(O)N(R7)2、C(O)R8、C(O)C(O)OR8、およびSi(R8)3からなる群より独立に選択され；
R1aおよびR2aは、H、置換されていてもよいC1-18アルキルおよび-L-RCからなる群より独立に選択され；
各Lは、結合、-C(RL)2-、および-NRL-C(RL)2-からなる群より選択され；
各RLは、H、C1-6アルキル、ハロ、-CN、および-SO2からなる群より独立に選択され；
各RCは、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよい6〜10員ヘテロルアリール、および置換されていてもよい6〜10員ヘテロシクリルからなる群より選択され；
各R7およびR8は、H、置換されていてもよいC1-12アルキル、置換されていてもよいC2-12アルケニル、および置換されていてもよいC6-10アリールからなる群より独立に選択される。
【請求項１９】
ジアゾ試薬が、α-ジアゾエステル、α-ジアゾアミド、α-ジアゾニトリル、α-ジアゾケトン、α-ジアゾアルデヒド、およびα-ジアゾシランからなる群より選択される、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
ジアゾ試薬が下記からなる群より選択される式を有する、請求項19に記載の方法：
2015534464.tif 000203
式中：
R1aは、Hおよび置換されていてもよいC1-C6アルキルからなる群より選択され；
各R7およびR8は、H、置換されていてもよいC1-12アルキル、置換されていてもよいC2-12アルケニル、および置換されていてもよいC6-10アリールからなる群より独立に選択される。
【請求項２１】
ジアゾ試薬がジアゾメタン、ジアゾ酢酸エチル、および(トリメチルシリル)ジアゾメタンからなる群より選択される、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
ジアゾ試薬が以下の式を有する、請求項19に記載の方法：
2015534464.tif 000204
。
【請求項２３】
シクロプロパン化生成物が下記からなる群より選択される式を有する、請求項17〜22のいずれか一項に記載の方法：
2015534464.tif 000205
。
【請求項２４】
インビトロで実施する、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
反応が還元剤をさらに含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
ヘム酵素がホールセル内に局在し、前記方法がインビボで実施される、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
嫌気性条件下で実施される、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
複数のシクロプロパン化生成物を生成する、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
複数のシクロプロパン化生成物が、1：99〜99：1のZ：E比を有する、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
複数のシクロプロパン化生成物が、約-90％〜約90％の％eeZを有する、請求項28または29に記載の方法。
【請求項３１】
複数のシクロプロパン化生成物が、約-90％〜約90％の％eeEを有する、請求項28〜30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
反応が、少なくとも30％〜少なくとも90％、ジアステレオ選択的である、請求項28〜31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
反応が、少なくとも30％〜少なくとも90％、エナンチオ選択的である、請求項28〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ヘム酵素が、細菌、古細菌、または真菌宿主生物において発現される、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ヘム酵素が、ヘムドメインを含むその断片である、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ヘム酵素が、ヘム配位部位である軸位置に突然変異を含むその変異体である、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ヘム酵素が、チトクロムP450酵素またはその変異体である、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
チトクロムP450酵素が、P450 BM3酵素またはその変異体である、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
P450 BM3酵素が、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
チトクロムP450酵素変異体が、ヘム配位部位である軸位置に突然変異を含む、請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
突然変異が、軸位置におけるCysの、Ala、Asp、Arg、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、またはValによる置換である、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
突然変異が、軸位置におけるCysの、Serによる置換である、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
P450 BM3酵素変異体が、SEQ ID NO:1における以下のアミノ酸置換：
V78A、F87V、P142S、T175I、A184V、S226R、H236Q、E252G、T268A、A290V、L353V、I366V、およびE442K
のうち少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、または13個すべてを含む、請求項39〜42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
P450 BM3酵素変異体が、SEQ ID NO:1における以下のアミノ酸置換：
I263A、A328G、およびT438の突然変異
のうち少なくとも1個、2個、または3個すべてを含む、請求項39〜43のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
T438の突然変異が、T438A、T438S、またはT438Pである、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
P450 BM3酵素変異体が、SEQ ID NO:1の活性部位における1〜5個のアラニン置換を含む、請求項39〜45のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
活性部位のアラニン置換が、L75A、M177A、L181A、I263A、L437A、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
P450 BM3酵素変異体がSEQ ID NO:1における突然変異T268Aおよび/または突然変異C400Xを含み、ここでXがCys以外の任意のアミノ酸である、請求項39に記載の方法。
【請求項４９】
ヘム酵素が、チトクロムP450酵素またはその変異体の断片を含む、請求項37〜48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
断片が、チトクロムP450酵素またはその変異体のヘムドメインを含む、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
ヘム酵素が、2種、3種、またはそれ以上の異なるヘム酵素に由来するアミノ酸の組換え配列またはブロックを含むその変異体である、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
ヘム酵素が、表4、5A、および5Bから選択されるP450酵素変異体である、請求項1〜51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
オレフィン基質をシクロプロパン化することができる、ヘム酵素変異体またはその断片。
【請求項５４】
単離および/または精製されている、請求項53に記載のヘム酵素変異体。
【請求項５５】
チトクロムP450酵素変異体である、請求項53または54に記載のヘム酵素変異体。
【請求項５６】
チトクロムP450酵素変異体が、P450 BM3酵素変異体である、請求項55に記載のヘム酵素変異体。
【請求項５７】
P450 BM3酵素突然変異体が、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列における少なくとも1つの突然変異を含む、請求項56に記載のヘム酵素変異体。
【請求項５８】
ヘム酵素変異体が、ヘム配位部位である軸位置に突然変異を含む、請求項53〜57のいずれか一項に記載のヘム酵素変異体。
【請求項５９】
突然変異が、軸位置におけるCysの、Ala、Asp、Arg、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、またはValによる置換である、請求項58に記載のヘム酵素変異体。
【請求項６０】
突然変異が、軸位置におけるCysの、Serによる置換である、請求項59に記載のヘム酵素変異体。
【請求項６１】
P450 BM3酵素変異体が、SEQ ID NO:1における以下のアミノ酸置換：
V78A、F87V、P142S、T175I、A184V、S226R、H236Q、E252G、T268A、A290V、L353V、I366V、およびE442K
のうち少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、または13個すべてを含む、請求項57〜60のいずれか一項に記載のヘム酵素変異体。
【請求項６２】
P450 BM3酵素変異体が、SEQ ID NO:1における以下のアミノ酸置換：
I263A、A328G、およびT438の突然変異
のうち少なくとも1個、2個、または3個すべてを含む、請求項57〜61のいずれか一項に記載のヘム酵素変異体。
【請求項６３】
T438の突然変異が、T438A、T438S、またはT438Pである、請求項62に記載のヘム酵素変異体。
【請求項６４】
P450 BM3酵素変異体が、SEQ ID NO:1の活性部位における1〜5個のアラニン置換を含む、請求項57〜63のいずれか一項に記載のヘム酵素変異体。
【請求項６５】
活性部位のアラニン置換が、L75A、M177A、L181A、I263A、L437A、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項64に記載のヘム酵素変異体。
【請求項６６】
P450 BM3酵素変異体がSEQ ID NO:1における突然変異T268Aおよび/または突然変異C400Xを含み、ここでXがCys以外の任意のアミノ酸である、請求項57に記載のヘム酵素変異体。
【請求項６７】
ヘム酵素変異体断片がそのヘムドメインを含む、請求項53〜66のいずれか一項に記載のヘム酵素変異体。
【請求項６８】
2種、3種、またはそれ以上の異なるヘム酵素に由来するアミノ酸の組換え配列またはブロックを含む、請求項53〜67のいずれか一項に記載のヘム酵素変異体。
【請求項６９】
表4、5A、および5Bから選択されるP450酵素変異体である、請求項53〜68のいずれか一項に記載のヘム酵素変異体。
【請求項７０】
野生型配列と比べて、より高いトータルターンオーバー数（TTN）を有する、請求項53〜69のいずれか一項に記載のヘム酵素変異体。
【請求項７１】
約100を超えるTTNを有する、請求項70に記載のヘム酵素変異体。
【請求項７２】
1：99〜99：1のZ：E比を有する複数のシクロプロパン化生成物を生成する、請求項53〜71のいずれか一項に記載のヘム酵素変異体。
【請求項７３】
少なくとも-90％〜少なくとも90％の％eeZを有する複数のシクロプロパン化生成物を生成する、請求項53〜72のいずれか一項に記載のヘム酵素変異体。
【請求項７４】
少なくとも-90％〜少なくとも90％の％eeEを有する複数のシクロプロパン化生成物を生成する、請求項53〜73のいずれか一項に記載のヘム酵素変異体。
【請求項７５】
少なくとも30％〜少なくとも90％のジアステレオ選択性を有する複数のシクロプロパン化生成物を生成する、請求項53〜74のいずれか一項に記載のヘム酵素変異体。
【請求項７６】
少なくとも30％〜少なくとも90％のエナンチオ選択性を有する複数のシクロプロパン化生成物を生成する、請求項53〜75のいずれか一項に記載のヘム酵素変異体。
【請求項７７】
凍結乾燥した形態である、請求項53〜76のいずれか一項に記載のヘム酵素変異体。
【請求項７８】
請求項53〜76のいずれか一項に記載のヘム酵素変異体を発現する細胞。
【請求項７９】
細菌細胞または酵母細胞である、請求項78に記載の細胞。
【請求項８０】
請求項53〜76のいずれか一項に記載のヘム酵素変異体をコードする核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項８１】
請求項80に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項８２】
細菌細胞または酵母細胞である、請求項81に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2012年10月9日提出の米国特許仮出願第61/711,640号、2012年12月20日提出の米国特許仮出願第61/740,247号、2013年3月14日提出の米国特許仮出願第61/784,917号、2013日6月21日提出の米国特許仮出願第61/838,167号、2013年4月25日提出の米国特許仮出願第61/815,997号、2013年5月1日提出の米国特許仮出願第61/818,329号、および2013年7月19日提出の米国特許仮出願第61/856,493号に対する優先権を主張する。本出願は、2013年10月4日提出の国際出願第PCT/US2013/63428号に対しても優先権を主張する。これらの出願それぞれの開示はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府により支援を受けた研究開発のもとで行った発明に対する権利についての記載
本発明は、エネルギー省により授与された第DE-FG02-06ER15762/T-105789号および第1F32EB015846-01号の政府支援により行った。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
現代の合成化学におけるかなりの難題は、活性化されていない炭素-水素（C-H）結合および炭素-炭素（C=C）二重結合（例えば、オレフィン）の、選択的な直接官能基化である（R. G. Bergman, Nature 446, 391 (2007)（非特許文献1）；H. Pellissier, Tetrahedron 64, 7041 (2008)（非特許文献2））。これらの反応に不斉触媒法を適合させることは、天然物および薬剤合成のための分子の立体選択的および位置選択的加工における重要な意義を有する。近年、酸素を分子に選択的に付加するための触媒の開発において多くの成功が達成されている（M. S. Chen et al., Science 318, 783 (2007)（非特許文献3））。より興味深いのは、新しい炭素-炭素中心を複雑な構造に直接導入することである。現代の触媒アプローチはメタロカルベノイド中間体を用いており、反応性カルベンを、選択したC-HおよびC=C結合に移動させて、それぞれ新しい不斉高度置換炭素中心および不斉シクロプロパンを創製する（H. M. L. Davies et al., Chemical Reviews 103, 2861 (2003)（非特許文献4））。しかし、今日までに最も成功した触媒は、高価でおそらくは有毒な遷移金属錯体を使用することが多く、ジ-ロジウム種が代表例である。特に、これらのシステムにおいて高収率、位置選択性および立体選択性はいまだに達成が難しいままで、これらの触媒の多くは、高温および有機溶媒を含む過酷な反応条件によって妨害される。
【０００４】
オレフィンの高エネルギーカルベン前駆体による不斉シクロプロパン化は、多くの天然物および治療薬の特徴である、重要なシクロプロパンモティーフを作製するために最大3つのステレオジェン中心を1つの段階で生成する、という際だった特徴のある反応である（H. Lebel et al., Chemical Reviews 103, 977 (2003)（非特許文献5））。自然界では、生理的に利用できる試薬を用いることに限定されるため、典型的にはS-アデノシルメチオニンのメチルカチオンへのオレフィン付加を含むまったく異なる戦略により、またはピロリン酸ジメチルアリル由来のアリルカルベニウムイオンの環化により、分子間シクロプロパン生成が触媒される（L. A. Wessjohann et al., Chemical Reviews 103, 1625 (2003)（非特許文献6））。その結果、メタロカルベン化学により生成しうる多様なシクロプロパン化生成物は、天然シクロプロパン化酵素を操作することでは容易に入手できない。したがって、高収率、位置選択性、および立体選択性を伴うが、毒性および現行のアプローチに関連する過酷な反応条件なしで、シクロプロパンモティーフを創製しうる、新規試薬および触媒スキームが、当技術分野において必要とされている。本発明は、インビトロおよびインビボでシクロプロパン化生成物を生成するための新規鉄-ヘム含有酵素触媒を提供することによってこの必要性を満たし、関連する利点も提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】R. G. Bergman, Nature 446, 391 (2007)
【非特許文献２】H. Pellissier, Tetrahedron 64, 7041 (2008)
【非特許文献３】M. S. Chen et al., Science 318, 783 (2007)
【非特許文献４】H. M. L. Davies et al., Chemical Reviews 103, 2861 (2003)
【非特許文献５】H. Lebel et al., Chemical Reviews 103, 977 (2003)
【非特許文献６】L. A. Wessjohann et al., Chemical Reviews 103, 1625 (2003)
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ヘム酵素を用いて、オレフィンの、1つまたは複数のシクロプロパン官能基を含む任意の化合物（例えば、任意の中間体または最終化合物）への変換を触媒する方法を提供する。
【０００７】
ある局面において、本発明は、シクロプロパン化生成物を生成する方法であって：
（a）オレフィン基質、ジアゾ試薬、およびヘム酵素を提供する段階；および
（b）反応中の段階（a）の成分を、シクロプロパン化生成物を生成するのに十分な時間混合する段階を含む方法を提供する。
【０００８】
いくつかの態様において、シクロプロパン化生成物は式Iの化合物である：
2015534464.tif 000003
式中：
R1は、H、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよい6〜10員ヘテロアリール、ハロ、シアノ、C(O)OR1a、C(O)N(R7)2、C(O)R8、C(O)C(O)OR8、およびSi(R8)3からなる群より独立に選択され；
R2は、H、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよい6〜10員ヘテロアリール、ハロ、シアノ、C(O)OR2a、C(O)N(R7)2、C(O)R8、C(O)C(O)OR8、およびSi(R8)3からなる群より独立に選択され；
R1aおよびR2aは、H、置換されていてもよいC1-18アルキルおよび-L-RCからなる群より独立に選択され、
各Lは、結合、-C(RL)2-、および-NRL-C(RL)2-からなる群より選択され、
各RLは、H、C1-6アルキル、ハロ、-CN、および-SO2からなる群より独立に選択され、
各RCは、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよい6〜10員ヘテロアリール、および置換されていてもよい6〜10員ヘテロシクリルからなる群より選択され；
R3、R4、R5、およびR6は、H、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、C2-18アルキニル、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよいC1-C6アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、C(O)N(R7)2、NR7C(O)R8、C(O)R8、C(O)OR8、およびN(R9)2からなる群より独立に選択され、
各R7およびR8は、H、置換されていてもよいC1-12アルキル、置換されていてもよいC2-12アルケニル、および置換されていてもよいC6-10アリールからなる群より独立に選択され；
各R9は、H、置換されていてもよいC6-10アリール、および置換されていてもよい6〜10員ヘテロアリールからなる群より独立に選択されるか、または2つのR9部分は、それらが結合している窒素原子と一緒に6〜18員ヘテロシクリルを形成することができ；
またはR3はR4と共に、置換されていてもよい3〜18員環を形成し；
またはR5はR6と共に、置換されていてもよい3〜18員環を形成し；
またはR3もしくはR4はR5もしくはR6と共に、二重結合を形成し；
またはR3もしくはR4はR5もしくはR6と共に、置換されていてもよい5〜6員環を形成する。
【０００９】
ある態様では、R1はC(O)O-LRcであり；R2はHおよび置換されていてもよいC6-10アリールからなる群より選択され；R3、R4、R5、およびR6はH、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC2-6アルケニル、置換されていてもよいC2-6アルキニル、置換されていてもよいC6-10アリールおよびハロからなる群より独立に選択され、またはR3はR4と共に置換されていてもよい3〜18員環を形成し；またはR5はR6と共に置換されていてもよい3〜18員環を形成する。
【００１０】
他のある態様において、シクロプロパン化生成物は式IIの化合物である：
2015534464.tif 000004
式中、R1aはC1-6アルキルであり、R2はHおよび置換されていてもよいC6-10アリールからなる群より選択される。
【００１１】
いくつかの場合に、R2はHである。他の場合に、シクロプロパン化生成物は下記からなる群より選択される：
2015534464.tif 000005
式中：
X1は、H、置換されていてもよいC1-6アルキル、ハロC1-6アルキル、置換されていてもよいC1-6アルコキシ、置換されていてもよいC1-6アルキルチオ、C1-6アルキルシリル、ハロ、およびシアノからなる群より選択され；
X2は、H、クロロ、およびメチルからなる群より選択され；
X3は、H、メチル、ハロ、およびCNからなる群より選択され；
各X4は、独立にハロであり；
各X5は、メチルおよびハロからなる群より独立に選択され、
X6は、ハロ、置換されていてもよいC1-6アルキル、および置換されていてもよいC1-6アルコキシからなる群より選択され；
X7は、H、メチル、およびハロからなる群より選択され；
X8は、H、ハロ、および置換されていてもよいC1-6アルキルからなる群より選択され；
X9は、H、ハロ、置換されていてもよいC1-6アルキル、C(O)O-(C1-6アルキル)、C(O)-N(C1-6アルキル)2、およびシアノからなる群より選択され；
Z1、Z2、およびZ3は、H、ハロ、置換されていてもよいC1-6アルキル、および置換されていてもよいC6-10アリールからなる群より独立に選択されるか、または
Z1およびZ2は一緒になって、置換されていてもよい5〜6員シクロアルキルもしくはヘテロシクリル基を形成する。
【００１２】
ある態様では、方法は、シクロプロパン化生成物を式IIIの化合物に変換する段階をさらに含む：
2015534464.tif 000006
式中：
Lは、結合、-C(RL)2-、および-NRL-C(RL)2-からなる群より選択され、
各RLは、H、-CN、および-SO2からなる群より独立に選択され、
R1cは、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよい6〜10員ヘテロルアリール、および置換されていてもよい6〜10員ヘテロシクリルからなる群より選択される。
【００１３】
いくつかの場合に、Lは、結合、-CH2-、-CH(CN)-、および-N(SO2)-CH2からなる群より選択される。他の場合に、部分L-R1cは下記からなる群より選択される構造を有する：
2015534464.tif 000007
2015534464.tif 000008
式中：
各Y1は、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC2-6アルケニル、置換されていてもよいC2-6アルキニル、フェニル、および(フェニル)C1-6アルコキシからなる群より独立に選択され；
各Y2は、ハロ、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC2-6アルケニル、置換されていてもよいC1-6アルコキシ、およびニトロからなる群より独立に選択され；
各Y3は、独立に置換されていてもよいC1-6アルキルであり；
各Y4は、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC2-6アルケニル、置換されていてもよいC2-6アルキニル、C6-10アリール-C1-6アルキル、フルフリル、C1-6アルコキシ、(C2-6アルケニル)オキシ、C1-12アシル、およびハロからなる群より独立に選択され；
Y5は、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC1-6アルコキシ、およびハロからなる群より選択され、
下付き文字mは1〜3の整数であり、
下付き文字nは1〜5の整数であり、
下付き文字pは1〜4の整数であり、
下付き文字qは0〜3の整数であり、
かつ構造の左の波線は部分-L-R1cと式IIIの化合物の残部との間の連結点を表す。
【００１４】
さらに他の場合に、式IIIの化合物はレスメトリンである。
【００１５】
ある態様では、シクロプロパン化生成物は以下の式の構造を有する化合物である：
2015534464.tif 000009
式中：
R1aは、置換されていてもよいC1-6アルキルであり、
R5およびR6は、H、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC6-10アリール、C(O)N(R7)2、C(O)OR8およびNR7C(O)R8からなる群より独立に選択される。
【００１６】
いくつかの場合に、シクロプロパン化生成物は下記からなる群より選択される構造を有する：
2015534464.tif 000010
。
【００１７】
ある場合には、本方法は、シクロプロパン化生成物を、ミルナシプラン、レボミルナシプラン、ビシファジン、および1-(3,4-ジクロロフェニル)-3-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンからなる群より選択される化合物に変換する段階をさらに含む。
【００１８】
いくつかの態様において、オレフィン基質は、アルケン、シクロアルケン、およびアリールアルケンからなる群より選択される。ある場合には、オレフィン基質はアリールアルケンを含む。いくつかの場合に、アリールアルケンはスチレンである。他の場合に、スチレンは以下の式を有する：
2015534464.tif 000011
式中、
R3は、H、置換されていてもよいC1-C6アルキル、置換されていてもよいC1-C6アルコキシ、C(O)N(R7)2、C(O)OR8、N(R9)2、ハロ、ヒドロキシ、およびシアノからなる群より選択され；
R5およびR6は、H、置換されていてもよいC1-6アルキル、およびハロからなる群より独立に選択され；
R10は、置換されていてもよいC1-C6アルキル、置換されていてもよいC1-C6アルコキシ、ハロ、およびハロアルキルからなる群より選択され；
下付き文字rは0〜2の整数である。
【００１９】
いくつかの態様において、ジアゾ試薬は以下の式の構造を有する：
2015534464.tif 000012
式中：
R1は、H、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよい6〜10員ヘテロアリール、ハロ、シアノ、C(O)OR1a、C(O)N(R7)2、C(O)R8、C(O)C(O)OR8、およびSi(R8)3からなる群より独立に選択され；
R2は、H、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよい6〜10員ヘテロアリール、ハロ、シアノ、C(O)OR2a、C(O)N(R7)2、C(O)R8、C(O)C(O)OR8、およびSi(R8)3からなる群より独立に選択され；
R1aおよびR2aは、H、置換されていてもよいC1-18アルキルおよび-L-RCからなる群より独立に選択され、
各Lは、結合、-C(RL)2-、および-NRL-C(RL)2-からなる群より選択され、
各RLは、H、C1-6アルキル、ハロ、-CN、および-SO2からなる群より独立に選択され、
各RCは、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよい6〜10員ヘテロルアリール、および置換されていてもよい6〜10員ヘテロシクリルからなる群より選択され；
各R7およびR8は、H、置換されていてもよいC1-12アルキル、置換されていてもよいC2-12アルケニル、および置換されていてもよいC6-10アリールからなる群より独立に選択される。
【００２０】
ある態様では、ジアゾ試薬はα-ジアゾエステル、α-ジアゾアミド、α-ジアゾニトリル、α-ジアゾケトン、α-ジアゾアルデヒド、およびα-ジアゾシランからなる群より選択される。
【００２１】
ある態様では、ジアゾ試薬は下記からなる群より選択される式を有する：
2015534464.tif 000013
式中
R1aは、Hおよび置換されていてもよいC1-C6アルキルからなる群より選択され；
各R7およびR8は、H、置換されていてもよいC1-12アルキル、置換されていてもよいC2-12アルケニル、および置換されていてもよいC6-10アリールからなる群より独立に選択される。
【００２２】
ある場合には、ジアゾ試薬はジアゾメタン、ジアゾ酢酸エチル、および(トリメチルシリル)ジアゾメタンからなる群より選択される。さらに他の場合に、ジアゾ試薬は以下の式：
2015534464.tif 000014
を有する。
【００２３】
特定の態様において、シクロプロパン化生成物は下記からなる群より選択される式：
2015534464.tif 000015
を有する。
【００２４】
いくつかの態様において、方法をインビトロで実施する。ある場合には、反応は還元剤をさらに含む。他の態様において、ヘム酵素はホールセル（全細胞）内に局在し、方法はインビボで実施される。いくつかの態様において、方法は嫌気性条件下で実施される。
【００２５】
いくつかの態様において、本方法は複数のシクロプロパン化生成物を生成する。ある場合には、複数のシクロプロパン化生成物は1：99〜99：1のZ：E比を有する。いくつかの場合に、複数のシクロプロパン化生成物は約-90％〜約90％の％eeZを有する。他の場合に、複数のシクロプロパン化生成物は約-90％〜約90％の％eeEを有する。いくつかの場合に、シクロプロパン化反応は、少なくとも30％〜少なくとも90％、ジアステレオ選択的である。他の場合に、シクロプロパン化反応は、少なくとも30％〜少なくとも90％、エナンチオ選択的である。
【００２６】
いくつかの態様において、ヘム酵素は細菌、古細菌、または真菌宿主生物において発現される。
【００２７】
ある態様では、ヘム酵素はヘムドメインを含むその断片である。特定の態様において、ヘム酵素は、ヘム配位部位である軸位置に突然変異を含むヘム酵素変異体などの、改変ヘム酵素である。いくつかの場合に、突然変異は、軸位置における天然残基の、Ala、Asp、Arg、Asn、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、またはValによる置換である。ある場合には、突然変異は、軸位置におけるCysの、Serによる置換である。他の態様において、ヘム酵素変異体は、2種、3種、またはそれ以上の異なるヘム含有タンパク質からのアミノ酸の組換え配列またはブロックを含むキメラタンパク質である。
【００２８】
特定の態様において、ヘム酵素は、チトクロムP450酵素またはその変異体である。好ましい態様において、チトクロムP450酵素は、P450 BM3酵素またはその変異体である。
【００２９】
ある態様では、チトクロムP450酵素変異体は、ヘム配位部位である軸位置に突然変異を含む。いくつかの場合に、突然変異は、軸位置におけるCysの、Ala、Asp、Arg、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、またはValによる置換である。ある場合には、突然変異は、軸位置におけるCysの、Serによる置換である。他の態様において、チトクロムP450変異体は、少なくとも2種、3種、またはそれ以上の異なるP450酵素（例えば、CYP102A1（P450 BM3）、CYP102A2、およびCYP102A3）からのアミノ酸の組換え配列またはブロックを含むキメラタンパク質である。
【００３０】
いくつかの態様において、P450 BM3酵素は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む。特定の態様において、P450 BM3酵素変異体はSEQ ID NO:1の軸位置に突然変異C400Xを含み、ここでXはCys以外の任意のアミノ酸である。他の態様において、P450 BM3酵素変異体は、SEQ ID NO:1における以下のアミノ酸置換：V78A、F87V、P142S、T175I、A184V、S226R、H236Q、E252G、T268A、A290V、L353V、I366V、およびE442K、のうち少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、または13個すべてを含む。
【００３１】
いくつかの態様において、P450 BM3酵素変異体は、SEQ ID NO:1における以下のアミノ酸置換：I263A、A328G、およびT438の突然変異、のうち少なくとも1個、2個、または3個すべてを含む。ある場合には、T438の突然変異は、T438A、T438S、またはT438Pである。
【００３２】
いくつかの態様において、P450 BM3酵素変異体は、SEQ ID NO:1の活性部位における1〜5個のアラニン置換を含む。ある場合には、活性部位のアラニン置換は、L75A、M177A、L181A、I263A、L437A、およびその組み合わせからなる群より選択される。
【００３３】
特定の態様において、P450 BM3酵素変異体はSEQ ID NO:1における突然変異T268Aおよび/または突然変異C400Xを含み、ここでXはCys以外の任意のアミノ酸である。
【００３４】
いくつかの態様において、ヘム酵素は、チトクロムP450酵素またはその変異体の断片を含む。ある場合には、断片は、チトクロムP450酵素またはその変異体のヘムドメインを含む。
【００３５】
特定の態様において、ヘム酵素は、表4、5A、および5Bから選択されるP450酵素変異体である。
【００３６】
他の局面において、本発明は、オレフィン基質をシクロプロパン化することができる、ヘム酵素またはその断片を提供する。
【００３７】
特定の態様において、ヘム酵素は、ヘム配位部位である軸位置に突然変異を含むヘム酵素変異体などの、改変ヘム酵素である。いくつかの場合に、突然変異は、軸位置における天然残基の、Ala、Asp、Arg、Asn、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、またはValによる置換である。ある場合には、突然変異は、軸位置におけるCysの、Serによる置換である。他の態様において、ヘム酵素変異体は、2種、3種、またはそれ以上の異なるヘム含有タンパク質からのアミノ酸の組換え配列またはブロックを含むキメラタンパク質である。
【００３８】
いくつかの態様において、ヘム酵素変異体は、単離および/または精製されている。他の態様において、ヘム酵素変異体はチトクロムP450酵素変異体である。好ましい態様において、チトクロムP450酵素変異体はP450 BM3酵素変異体である。
【００３９】
ある態様では、チトクロムP450酵素変異体は、ヘム配位部位である軸位置に突然変異を含む。いくつかの場合に、突然変異は、軸位置におけるCysの、Ala、Asp、Arg、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、またはValによる置換である。ある場合には、突然変異は、軸位置におけるCysの、Serによる置換である。他の態様において、チトクロムP450変異体は、少なくとも2種、3種、またはそれ以上の異なるP450酵素（例えば、CYP102A1、CYP102A2、およびCYP102A3）からのアミノ酸の組換え配列またはブロックを含むキメラタンパク質である。
【００４０】
ある態様では、P450 BM3酵素は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列における少なくとも1つの突然変異を含む。特定の態様において、P450 BM3酵素変異体はSEQ ID NO:1の軸位置に突然変異C400Xを含み、ここでXはCys以外の任意のアミノ酸である。他の態様において、P450 BM3酵素変異体は、SEQ ID NO:1における以下のアミノ酸置換：V78A、F87V、P142S、T175I、A184V、S226R、H236Q、E252G、T268A、A290V、L353V、I366V、およびE442K、のうち少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、または13個すべてを含む。
【００４１】
いくつかの態様において、P450 BM3酵素変異体は、SEQ ID NO:1における以下のアミノ酸置換：I263A、A328G、およびT438の突然変異、のうち少なくとも1個、2個、または3個すべてを含む。ある場合には、T438の突然変異は、T438A、T438S、またはT438Pである。
【００４２】
いくつかの態様において、P450 BM3酵素変異体は、SEQ ID NO:1の活性部位における1〜5個のアラニン置換を含む。ある場合には、活性部位のアラニン置換はL75A、M177A、L181A、I263A、L437A、およびその組み合わせからなる群より選択される。
【００４３】
特定の態様において、P450 BM3酵素変異体は、SEQ ID NO:1における突然変異T268Aおよび/または突然変異C400Xを含み、ここでXはCys以外の任意のアミノ酸である。
【００４４】
いくつかの態様において、ヘム酵素変異体断片はそのヘムドメインを含む。特定の態様において、ヘム酵素変異体は表4、5A、および5Bから選択されるP450酵素変異体である。
【００４５】
他の態様において、ヘム酵素変異体は野生型配列と比べて、より高いトータルターンオーバー数（TTN）を有する。ある場合には、ヘム酵素変異体は約100を超えるTTNを有する。
【００４６】
いくつかの場合に、ヘム酵素変異体は、1：99〜99：1のZ：E比を有する複数のシクロプロパン化生成物を生成する。いくつかの場合に、ヘム酵素変異体は、少なくとも-90％〜少なくとも90％の％eeZを有する複数のシクロプロパン化生成物を生成する。他の場合に、ヘム酵素変異体は、少なくとも-90％〜少なくとも90％の％eeEを有する複数のシクロプロパン化生成物を生成する。いくつかの場合に、ヘム酵素変異体は、少なくとも30％〜少なくとも90％のジアステレオ選択性を有する複数のシクロプロパン化生成物を生成する。他の場合に、ヘム酵素変異体は、少なくとも30％〜少なくとも90％のエナンチオ選択性を有する複数のシクロプロパン化生成物を生成する。さらに他の場合に、ヘム酵素変異体は凍結乾燥した形態である。
【００４７】
さらなる局面において、本発明は、本明細書に記載のヘム酵素を発現する細胞を提供する。ある態様では、細胞は細菌細胞または酵母細胞である。
【００４８】
さらに他の局面において、本発明は、本明細書に記載のヘム酵素をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。関連する局面において、本発明は、発現ベクターを含む細胞を提供する。ある態様では、細胞は細菌細胞または酵母細胞である。
【００４９】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および図面から、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】チトクロムP450の反応性の標準的な様式を例示する。（左）：フェリルポルフィリンラジカル中間体（化合物I）によって触媒されるオレフィンおよびC-H結合のエポキシドおよびアルコールへの一酸素添加。（右）：カルベン前駆体としてジアゾエステル試薬を用いての、チトクロムP450の形式に従ったカルベン移動活性の人工的な様式。
【図２】選択したP450BM3シクロプロパン化触媒の絶対立体選択性を例示する。反応条件：20μM触媒、30mMスチレン、10mM EDA、10mM Na2S2O4、アルゴン雰囲気下、リン酸カリウム緩衝水溶液（pH8.0）および5％MeOH共溶媒中、298Kで2時間。酵素負荷はEDAに対して0.2モル％である。各生成物の立体異性体の構造を、反応ガスクロマトグラムの上に示す。
【図３】シクロプロパン収率に対するスチレン濃度の影響を例示する。
【図４】シクロプロパン収率に対するP450（H2A10）濃度の影響を例示する。
【図５】変異体9-10A-TS-F87V-T268A（C3C）ヘムの初速度プロットを例示する。（A）スチレンの飽和濃度（30mM）でEDA濃度を変動させた。（B）EDAの固定濃度（20mM）でスチレン濃度を変動させた。初速度は独立の反応からの3つの異なる時点のゼロ切片線形フィットの傾きとして計算した。エラーバーは傾きの1-σ（68.3％）信頼区間に対応する。
【図６】変異体9-10A-TS-F87V-T268A（BM3-CISまたはP450BM3-CISとも呼ぶ）およびBM3-CIS-C400S（ABC-CISまたはP411BM3-CISとも呼ぶ）の、嫌気性および好気性条件下、亜ジチオン酸ナトリウムが推進するシクロプロパン化活性を例示する。測定は三つ組で行い、エラーバーは平均値からの標準偏差を表す。
【図７】変異体9-10A-TS-F87V-T268A（BM3-CISまたはP450BM3-CISとも呼ぶ）およびBM3-CIS-C400S（ABC-CISまたはP411BM3-CISとも呼ぶ）の、嫌気性および好気性条件下、NADPHが推進したシクロプロパン化およびエポキシ化活性を例示する。測定は三つ組で行い、エラーバーは平均値からの標準偏差を表す。反応条件： 20μM触媒、30mMスチレン、10mM EDA、0.5mM NADPH、25mMグルコース、2U ml-1グルコースデヒドロゲナーゼ、アルゴン（または大気）雰囲気下、リン酸カリウム緩衝水溶液（pH8.0）および5％MeOH共溶媒中、298Kで2時間。測定は三つ組で行い、エラーバーは測定値の標準偏差を表す。
【図８】BM3-CIS-C400S（ABC-CISまたはP411BM3-CISとも呼ぶ）ヘムの初速度プロットを例示する。（A）スチレンの飽和濃度（30mM）でEDA濃度を変動させた。（B）EDAの固定濃度（20mM）でスチレン濃度を変動させた。初速度は独立の反応からの3つの異なる時点のゼロ切片線形フィットの傾きとして計算した。エラーバーは傾きの1-σ（68.3％）信頼区間に対応する。
【図９】変異体9-10A-TS-F87V-T268A（BM3-CISまたはP450BM3-CISとも呼ぶ）とBM3-CIS-C400S（ABC-CISまたはP411BM3-CISとも呼ぶ）および野生型P450BM3とのヘムドメイン活性部位およびタンパク質アラインメントを例示する。上図はP450BM3-CIS（緑）およびP411BM3-CIS（ピーチ）のアラインメントを示し、左、中央および右の図はそれぞれ活性部位残基、活性部位I-ヘリックス、および全体のタンパク質折りたたみを示す。有意な構造変化は観察されなかった（RMSD 0.52Å）。中段の図：P411BM3-CISを野生型P450BM3のオープン（配位子なし）型（紫、PDB# 2IJ2から取得、RMSD 1.2Å）と比較すると、大きい変動が観察される。活性部位側鎖残基（左）ならびにI-ヘリックス内の回転において顕著な再編成が観察される。N末端ベータドメインならびにF-およびG-ヘリックスでも全体の動きが観察される（右、両端に矢尻のある矢印で示す）。これらの動きは、基質結合後に起こる周知の移行と一致し、天然の一酸素添加触媒にとって重要である。下図： P450BM3-CISの配位子に結合したP450BM3構造とのアラインメント（水色、PDB# 1JPZから取得、RMSD 0.52Å）は、P450BM3-CISおよびP411BM3-CISが基質非存在下でもクローズ型のタンパク質立体配座を模倣することを示す。タンパク質アラインメントはPyMol（PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.3 Schroedinger, LLC.）のアラインツールを用いて実施した。
【図１０】ホールセルシクロプロパン化触媒が好気性条件下で阻害されることを例示する。変異体9-10A-TS-F87V-T268A＝BM3-CISおよびABC＝BM3+C400S。反応条件：20mMスチレン、10mM EDA、アルゴン（または大気）雰囲気下、無窒素培地および5％MeOH共溶媒中、298Kで2時間（OD600＝約24）。トータルターンオーバー＝シクロプロパンの濃度（mM）/細胞密度（g cdw/L）、単位はmmol/g cdw。
【図１１】スチレンのインビボシクロプロパン化に対するグルコース添加の影響を例示する。反応条件：20mMスチレン、10mM EDA、アルゴン雰囲気下、無窒素培地および5％MeOH共溶媒中、298Kで2時間（OD600＝約24）。トータルターンオーバー＝シクロプロパンの濃度（mM）/細胞密度（g cdw/L）、単位はmmol/g cdw。変異体9-10A-TS-F87V-T268A＝BM3-CISおよびABC＝BM3+C400S。
【図１２】スチレンのインビボシクロプロパン化に対する培地の影響およびBM3-CIS-C400Sのホロ型とヘム型との比較を例示する。反応条件：20mMスチレン、10mM EDA、2mMグルコース、アルゴン雰囲気下、無窒素培地および5％MeOH共溶媒中、298Kで2時間（OD600＝約24）。変異体9-10A-TS-F87V-T268A＝BM3-CISおよびABC＝BM3+C400S。
【図１３】ABC触媒負荷（細胞密度）の増大はシクロプロパンの収率をOD600＝50で最大約80％まで高めることを例示する。ABC（BM3-C400SまたはP411BM3）。
【図１４】1、2、3、4および5当量のスチレンを用いることの反応収率に対する影響を例示する。過剰のスチレンは収率のわずかな改善をもたらすにすぎない。測定は三つ組で行い、エラーバーは平均値からの標準偏差を表す。ABC（BM3-C400SまたはP411BM3）。
【図１５】ABC触媒シクロプロパン化の制御を例示する。変異体9-10A-TS-F87V-T268A＝BM3-CISおよびABC＝BM3-C400S。
【図１６】ABC触媒が3時間、活性であることを例示する。OD600＝25で、TTN＞8,000となるような、P450濃度0.85μM。変異体9-10A-TS-F87V-T268A＝BM3-CISおよびABC＝BM3-C400S。
【図１７】P450触媒シクロプロパン化の基質範囲案を例示する。（a）カルベノイド前駆体として用いることができるジアゾ化合物。（b）反応のオレフィンパートナー。（c）アンスロプラロン（anthroplalone）およびノルアンスロプロン（noranthroplone）の合成のためのゲラニルアセトンのシクロプロパン化。（d）ピレスロイド殺虫剤の合成における2,5-ジメチルヘキサ-2,4-ジエンのシクロプロパン化。
【図１８】精製したBM3-CISヘム（3μM、赤線）およびBM3-CIS-C400Sヘム（2μM、緑線）のUV-Vis吸収スペクトルを例示する。挿入図は両方のタンパク質の約1mMの溶液を示す。
【図１９】（A）低スピン休止状態のFeIII/FeII酸化還元電位（EO'Fe-cys＝-430mV）はNAD(P)+/NAD(P)Hのもの（EO'1＝-320mV）よりも低いため、チトクロムP450はNAD(P)Hを還元剤として用いてシクロプロパン化を非効率的に触媒することを例示する。ヘム-システイン配位子（Fe-Cys）の、セリン（Fe-Ser）による置換は、休止状態還元電位を高め、インビボでのNAD(P)Hによる活性FeII種への還元を可能にした。（B）結合したヘムおよび突然変異C400Sに対応する電子密度（緑色メッシュ）を示す、3σの等高線のFo-Fcシミュレーテッドアニーリングオミットマップを重ねたABC-CIS活性部位（PDB：4H24）のクローズアップ。C400Sとヘム鉄との間の相互接続密度は、C400S側鎖ヒドロキシルによる近位ヘム連結と一致する。ヘム、C400Sおよび追加の活性部位アミノ酸側鎖をスティックで示す。（C）一電子ネルンスト曲線を重ねたBM3（緑の丸）およびABC（青の三角）の電位差酸化還元滴定。挿入図は第二鉄（点線）状態と第一鉄（実線）状態との間のスペクトル変化を示す。450〜470nm（BM3）および420〜440（ABC）付近の吸光度の変化を用いて、亜ジチオン酸塩による還元後のFeII/FeIII比をもとめた。還元は可逆的で、フェリシアン化カリウムによる再酸化はヒステリシスをほとんど、またはまったく示さない。セリン連結変異体の中間電位（-293mV）はWT（-420mV）に比べて127mVプラスにシフトしている。
【図２０】BM3-CIS-C400S（ABC-CISまたはP411BM3-CISとも呼ぶ）のヘム電子密度を例示する。P411BM3-CISにおけるセリン連結ヘムの最尤加重電子密度マップ。（A）活性部位のヘムの上から見たP411BM3-CISに結合したヘムの立体画像。（B）A図から約90°回転させたP411BM3-CISに結合したヘムの立体画像は、C400Sの側鎖ヒドロキシルによるヘム-鉄連結を明らかに示している。すべての原子をスティックで示す。すべての電子密度マップで等高線σ＝1.0であった。透視のために、B図において、残基399および401の主鎖原子もスティックで示す。
【図２１】第二鉄（青）、亜ジチオン酸塩還元第一鉄（赤）および一酸化炭素結合第一鉄（緑）ABC-CISヘムの絶対スペクトルを例示する。ソーレー帯（nm）：FeIII、404；FeII、410、425；FeII-CO、411。FeII-COは532および565nmにαおよびβ帯を示す。挿入図は、タンパク質濃度4.5μMの一酸化炭素第一鉄（ピンク）および亜ジチオン酸還元第一鉄（黄）酵素を示す。
【図２２】第二鉄（青）、亜ジチオン酸塩還元第一鉄（赤）および一酸化炭素結合第一鉄（緑）ABC-CISホロの絶対スペクトルを例示する。ソーレー帯（nm）：FeIII、404；FeII、410、422；FeII-CO、411。FeII-COは533および566nmにαおよびβ帯を示す。第二鉄スペクトルは465nmに幅広ピークを示す。
【図２３】（A）ABC-CISヘムおよび（B）ABC-CISホロについての第一鉄に対する第一鉄カルボニルの差スペクトルを例示する。
【図２４】EO'＝-420mVにあてはめたネルンスト曲線を重ねた、P450BM3-ヘムの電位差酸化還元滴定を例示する。挿入図は、それぞれ亜ジチオン酸ナトリウムの準化学量論的添加後のスペクトル変化（点線：完全第二鉄；実線：完全第一鉄）を示す。
【図２５】EO'＝-293mVにあてはめたネルンスト曲線を重ねた、P411BM3-ヘムの電位差酸化還元滴定を例示する。挿入図は、それぞれ亜ジチオン酸ナトリウムの準化学量論的添加後のスペクトル変化（点線：完全第二鉄；実線：完全第一鉄）を示す。
【図２６】EO'＝-360mVにあてはめたネルンスト曲線を重ねた、P450BM3-ヘム-CISの電位差酸化還元滴定を例示する。挿入図は、それぞれ亜ジチオン酸ナトリウムの準化学量論的添加後のスペクトル変化（点線：完全第二鉄；実線：完全第一鉄）を示す。
【図２７】EO'＝-265mVにあてはめたネルンスト曲線を重ねた、P411BM3-ヘム-CISの電位差酸化還元滴定を例示する。挿入図は、それぞれ亜ジチオン酸ナトリウムの準化学量論的添加後のスペクトル変化（点線：完全第二鉄；実線：完全第一鉄）を示す。
【図２８】変異体9-10A-TS-F87V-T268A（BM3-CISまたはP450BM3-ヘム-CISとも呼ぶ）およびBM3-CIS-C400S（ABC-CISまたはP411BM3-ヘム-CISとも呼ぶ）における亜ジチオン酸塩による嫌気性および好気性条件下でのシクロプロパン化活性を例示する。測定は三つ組で行い、エラーバーは測定値の標準偏差を表す。
【図２９】9-10A-TS-F87V-T268A（BM3-CISおよびP450BM3-CISとも呼ぶ）またはBM3-CIS-C400S（ABC-CISおよびP411BM3-CISとも呼ぶ）を発現する大腸菌（E. coli）ホールセルにより触媒される、オレフィンシクロプロパン化に対する外因性グルコース（2mM）添加の影響を例示する。
【図３０】BM3-CIS（P450BM3-CIS、青）およびABC-CIS（P411BM3-CIS、赤）のヘムドメインの熱安定性を例示する。突然変異C400Sはヘムドメインを+1.7℃安定化する。T50は、酵素集団の半分が折りたたまれていない温度である。エラーバーはT50に対する1-σ（68.3％）信頼区間に対応する。
【図３１】ホールセル触媒シクロプロパン化に対する二酸素曝露の影響を例示する。ABC-CIS（P411BM3-CIS）はインビボで二酸素によって強力に阻害される。すべての反応はOD600＝25に相当する細胞密度を有していた。反応は外因性グルコース非存在下で行った。測定は三つ組で行い、エラーバーは平均値からの標準偏差を表す。生成物の生成は、触媒の質量（gcdw）あたり生成したシクロプロパン生成物の量（mmol）と定義される。
【図３２】空のプラスミド、非誘導対照、およびホールセルへの亜ジチオン酸塩添加を例示する。ABC-CIS（P411BM3-CIS）遺伝子を有するが、IPTGを添加せずに増殖させた大腸菌細胞（ABC-CIS非誘導）；pCWoriプラスミドを有するが、ABC-CIS遺伝子は有していない大腸菌細胞（空のpCWori）；グルコースの代わりに外因性亜ジチオン酸塩を加えたABC-CIS反応（ABC-CIS+亜ジチオン酸塩）。反応は298Kで2時間放置した。測定は三つ組で行い、エラーバーは平均値からの標準偏差を表す。生成物の生成は、触媒の質量（gcdw）あたり生成したシクロプロパン生成物の量（mmol）と定義される。
【図３３】細胞密度の増大はシクロプロパンの収率を最大約80％まで高めることを例示する。トータルターンオーバーはOD600＝20よりも高い細胞密度では増大しない。測定は三つ組で行い、エラーバーは平均値からの標準偏差を表す。生成物の生成は、触媒の質量（gcdw）あたり生成したシクロプロパン生成物の量（mmol）と定義される。
【図３４】1.6μMのP411負荷でのインビボおよびインビトロABC-CIS（P411BM3-CIS）触媒反応の時間経過を例示する［第一鉄-CO錯体のε411-490＝103mM-1 cm-1（K. P. Vatsis et al., J. Inorg. Biochem. 91, 542 (2002)）］。反応条件は以下のとおりであった：40mMスチレン、20mM EDA、2mMグルコース、10.2gcdw L-1ホールセルABC-CIS（インビボ）、1.6μM精製ABC-CIS（インビトロ）、水性無窒素M9最少培地および5％MeOH共溶媒中、嫌気性条件下、298K。各時点での収率は2つの独立の反応の平均で報告する。
【図３５】対照的なP450およびP411仲介性シクロプロパン化を例示する。（A）低スピン休止状態のFeIII/FeII酸化還元電位（EO'Fe-cys＝-430mV）はNAD(P)+/NAD(P)Hのもの（EO'1＝-320mV、右）よりも低いため、チトクロムP450はNAD(P)Hを還元剤として用いてシクロプロパン化を非効率的に触媒することを例示する。ヘム連結CysのSerへの突然変異は、NAD(P)Hが推進するシクロプロパン化を可能にするが、天然の一酸素添加を起こさない（左）。（B）結合したヘムおよび突然変異C400Sに対応する電子密度（緑色メッシュ）を示す、3σの等高線のFo-Fcシミュレーテッドアニーリングオミットマップを重ねたP411BM3-ヘム-CIS活性部位（PDB：4H24）のクローズアップ。ヘム、C400Sおよび追加の活性部位アミノ酸側鎖をスティックで示す。（C）嫌気性および好気性条件下でP450BM3-CISおよびP411BM3-CISにより触媒される、スチレンのインビトロシクロプロパン化およびエポキシ化。反応条件は以下のとおりであった：30mMスチレン、10mM EDA、0.5mM NADPH、25mMグルコース、2U ml-1グルコースデヒドロゲナーゼおよび20μg酵素、リン酸カリウム緩衝水溶液および5％MeOH共溶媒中、25℃で6時間。エラーバーは3つの独立した測定の標準偏差を表す。
【図３６】ミルナシプランのラセミ合成を例示する。（A）鍵となる中間体1の合成。（B）1のミルナシプランへの変換の経路A〜C。（C）5の選択的脱プロトン化に基づくミルナシプランへの経路。
【図３７】（A）Rh触媒による分子内シクロプロパン化、または（B）テトラアミンキラル補助剤を用いる不斉アルキル化を用いての、レボミルナシプランのエナンチオ選択的合成を例示する。
【図３８】チトクロムP450BM3変異体によるカルベンシクロプロパン化を介してのレボミルナシプランの合成を例示する。
【図３９】Agilent cycloSil-Bカラム、30m×0.25um×0.32mm、方法：90℃（維持2分）、90〜110（6℃/分）、110〜190（40℃/分）、および190〜280（20℃/分）を用いての、9bおよびEDAのBM3-CIS-AxHにより仲介される反応のガスクロマトグラフィの記録を例示する。4.8分の内部標準、10.4分の出発原料、ならびに14.8分（E-異性体）および15.4分（Z-異性体）の生成物。
【図４０】P450触媒によるシクロプロパン化を用いての、ビシファジン、DOV-216,303および誘導体の、提唱される合成を例示する。
【図４１】休止大腸菌細胞（425μL）をアルゴンでパージした後、グルコース（50μL）、2,5-ジメチル-2,4-ヘキサジエン（12.5μL）、およびEDA（12.5μL）を加えた場合を例示する。反応を無窒素M9最少培地および5％メタノール共溶媒中、298Kで24時間実施した。
【図４２】BM3-T268A-C400Sにより生成した2つのクリサンテム酸エチルジアステレオマーを示すGC-FIDクロマトグラムを例示する。オーブン温度：90℃で2分間、次いで2℃/分で110℃まで、次いで30℃/分で230℃まで。HP-5カラム（Agilent）30m×0.32mm×0.25μm。
【図４３】BM3-T268A-C400Sにより生成した2つのクリサンテム酸エステルジアステレオマーを示すGC-MSイオンクロマトグラム（m＝123）を例示する。上の挿入図は、m＝123の分子イオンを生じる、クリサンテム酸エチルの断片化パターンを示す。オーブン温度：90℃で2分間、次いで2℃/分で110℃まで、次いで30℃/分で230℃まで。HP-5カラム（Agilent）30m×0.32mm×0.25μm。
【図４４】クリサンテム酸エチルのピレスロイドおよびピレスリン殺虫剤への化学的または酵素的変換を例示する。(a)加水分解；（b）酸塩化物への活性化；（c）ピレスロロンアルコール（ROH）の酸塩化物へのカップリング；（d）エステル交換。
【図４５Ａ】チトクロムP450 BM3とCYP2D7との間の配列アラインメントを示す。P450 BM3における軸配位子C400は、CYP2D6におけるC461に対応する。
【図４５Ｂ】チトクロムP450 BM3とP4502C7との間の配列アラインメントを示す。P450 BM3における軸配位子C400は、P4502C7におけるC478に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
発明の詳細な説明
I. 序論
本発明は、ヘム酵素を用いて、オレフィンの、1つまたは複数のシクロプロパン官能基を含む任意の生成物への変換を触媒しうるという、驚くべき発見に基づいている。いくつかの局面において、チトクロムP450酵素（例えば、P450 BM3（CYP102A1））およびその変異体は、カルベン等価物であるジアゾ試薬から様々なオレフィン基質への形式に従った移動を触媒し、それにより高い位置選択性および/または立体選択性でシクロプロパン生成物を作製する、予想外に改善された能力を有すると確認された。特定の態様において、本発明者らは、軸配位子のアミノ酸置換C400X（例えば、C400S）および/またはT268Aなどの、少なくとも1つまたは複数のアミノ酸突然変異を有するP450BM3の変異体は、シクロプロパン化反応を効率的に触媒して、トータルターンオーバー数（TTN）の増大を示し、野生型酵素に比べて高度に位置選択的およびエナンチオ選択的生成物生成を示しうることを発見した。
【００５２】
非限定例として、チトクロムP450における軸セリン-ヘム連結（BM3におけるC400S）は相同の「チトクロムP411」ファミリーを創製し、これはホールセルにおけるインビボでのシクロプロパン化反応を触媒して、高い立体選択性、光学純度および収率で、10,000を超えるトータルターンオーバーを提供し、20g L-1を超える力価のシクロプロパン生成物を作製する。したがって、チトクロムP411ファミリーは、チトクロムP450とは分光学的、電気化学的、および触媒的に異なり、直交型ヘム酵素触媒作用を操作するための骨格を提供する。したがって、このインビボでの非天然C-C結合形成反応を触媒する能力は、微生物の有機合成を可能にする変換の範囲を有利に拡大し、シクロプロパンを作製するための自然の既存戦略を補足する人工的代謝経路を提供する。
【００５３】
II. 定義
以下の定義および略語を本発明の解釈のために用いる。本明細書において用いられる「発明」または「本発明」なる用語は、非限定的用語であり、任意の単一の態様を意味する意図はなく、すべての可能な態様を含む。
【００５４】
本明細書において用いられる「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含む（contains）」、「含む（containing）」、またはその任意の他の変形は、非排他的包含を対象とすることが意図される。一連の要素を含む組成物、混合物、工程、方法、物品、または器具は、必ずしもそれらの要素のみに限定されず、そのような組成物、混合物、工程、方法、物品、または器具に対して明白に列記されていない、または固有でない他の要素も含みうる。さらに、そうではないことが明白に記載されない限り、「または」とは包含的「または」を意味し、排他的「または」を意味しない。
【００５５】
「シクロプロパン化（酵素）触媒」または「シクロプロパン化活性を有する酵素」なる用語は、それによって少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む基質が、カルベン前駆体としてジアゾ試薬を用いることによりシクロプロパン生成物へと変換されうる、酵素によって触媒される任意の、およびすべての化学的工程を意味する。
【００５６】
「改変ヘム酵素」および「ヘム酵素変異体」なる用語は、野生型に対して少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含む任意のヘム含有酵素を含み、また2種、3種、またはそれ以上の異なるヘム含有酵素に由来するアミノ酸の組換え配列またはブロックを含む、任意のキメラタンパク質も含む。
【００５７】
「改変チトクロムP450」および「チトクロムP450変異体」なる用語は、野生型に対して少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含む任意のチトクロムP450酵素を含み、また2種、3種、またはそれ以上の異なるチトクロムP450酵素に由来するアミノ酸の組換え配列またはブロックを含む任意のキメラタンパク質も含む。
【００５８】
「ホールセル触媒」なる用語は、シクロプロパン化活性を示す、ヘム含有酵素を発現する微生物細胞を含む。
【００５９】
本明細書において用いられる「ポルフィリン」および「金属置換ポルフィリン」なる用語は、ヘム酵素またはその変異体によって結合されうる、任意のポルフィリンを含む。特定の態様において、これらのポルフィリンは、Fe、Mn、Co、Cu、Rh、およびRuを含むが、それらに限定されるわけではない、金属を含みうる。
【００６０】
「カルベン等価物」および「カルベン前駆体」なる用語は、金属（または酵素）触媒存在下で、少なくとも1つの二価炭素およびわずかに6つの価電子殻電子を含み、C=C結合に移されてシクロプロパンを生成するか、またはC-Hもしくはヘテロ原子-H結合に移されて様々な炭素連結生成物を生成しうる構造に分解されうる分子を含む。
【００６１】
本明細書において用いられる「カルベン移動」および「形式に従ったカルベン移動」なる用語は、カルベン等価物がC=C結合、炭素-ヘテロ原子二重結合に付加されるか、またはC-Hもしくはヘテロ原子-H基質に挿入される、任意の化学的変換を含む。
【００６２】
本明細書において用いられる「微生物の（microbial）」、「微生物（microbial organism）」および「微生物（microorganism）」なる用語は、古細菌、細菌または真核生物のドメイン内に含まれる、微視的細胞として存在する任意の生物を含む。したがって、この用語は原核細胞もしくは真核細胞または顕微鏡サイズを有する生物を含むことが意図され、すべての種の細菌、古細菌および真正細菌ならびに酵母および真菌などの真核微生物を含む。同様に、化学物質の生成のために培養しうる、任意の種の細胞培養物も含まれる。
【００６３】
本明細書において用いられる「非天然」なる用語は、微生物または本発明の酵素活性に関して使用される場合、微生物または酵素が、参照種の野生型株を含む、参照種の天然株では通常見られない、少なくとも1つの遺伝子の変更を有することを意味することが意図される。遺伝子の変更には、例えば、代謝ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を導入する改変、他の核酸付加、核酸欠失および/または微生物の遺伝物質の他の機能的崩壊が含まれる。そのような改変には、例えば、参照種の非相同、相同、または非相同および相同両方のポリペプチドの、コード領域およびその機能的断片が含まれる。さらなる改変には、例えば、改変が遺伝子またはオペロンの発現を変更する、非コード制御領域が含まれる。例示的な非天然微生物または酵素活性には、前述のシクロプロパン化活性が含まれる。
【００６４】
本明細書において用いられる「嫌気性」なる用語は、反応、培養または増殖条件に関して使用される場合、酸素の濃度が約25μM未満、好ましくは約5μM未満、さらにより好ましくは1μM未満であることを意味することが意図される。この用語は、酸素約1％未満の雰囲気に維持された、液体または固体培地の密封チャンバーを含むことも意図される。好ましくは、嫌気性条件は反応混合物に窒素またはアルゴンなどの不活性ガスを注入することによって達成される。
【００６５】
本明細書において用いられる「外因性」なる用語は、参照分子または参照活性が宿主微生物に導入されることを意味することが意図される。この用語は、コードされた核酸の発現に関して使用される場合、発現可能な形のコードされた核酸の微生物への導入を意味する。生合成活性に関して使用される場合、この用語は宿主参照生物に導入される活性を意味する。
【００６６】
分子、特に酵素およびポリヌクレオチドに関して本明細書において用いられる「異種」なる用語は、天然の微生物における分子の発現レベルよりも低い、等しい、または高くてもよい、発現のレベルとは無関係に、それらが生じた、または天然に見られる生物以外の生物において発現される分子を示す。
【００６７】
その一方で、分子、特に酵素およびポリヌクレオチドに関して本明細書において用いられる「天然」または「内因性」なる用語は、天然の微生物における分子の発現レベルよりも低い、等しい、または高くてもよい、発現のレベルとは無関係に、それらが生じた、または天然に見られる生物において発現される分子を示す。天然酵素またはポリヌクレオチドの発現は組換え微生物中で改変されうることが理解される。
【００６８】
第一のファミリーまたは種の元の酵素または遺伝子に関して本明細書において用いられる「ホモログ」なる用語は、第二のファミリーまたは種の異なる酵素または遺伝子を意味し、これらは機能、構造またはゲノム解析によって、第一のファミリーまたは種の元の酵素または遺伝子に対応する第二のファミリーまたは種の酵素または遺伝子であると判定される。ホモログはほとんどの場合、機能、構造、またはゲノム上の類似性を有する。酵素または遺伝子のホモログを、遺伝子プローブおよびPCRを用いて容易にクローニングしうる技術が公知である。クローニングした配列のホモログとしての同一性は、機能的検定の使用および/または遺伝子のゲノムマッピングにより確認することができる。
【００６９】
遺伝子によってコードされるアミノ酸配列が第二の遺伝子のものと類似のアミノ酸配列を有する場合、タンパク質は第二のタンパク質と「相同性」を有するか、または「相同」である。または、2つのタンパク質が「類似」のアミノ酸配列を有する場合、タンパク質は第二のタンパク質と相同性を有する。したがって、「相同タンパク質」なる用語は、2つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味することが意図される。特定の態様において、2つのタンパク質の間の相同性は、進化によって関係づけられる、共通の祖先の指標である。
【００７０】
「類縁体」および「類縁」なる用語は、機能においてのみ互いに関係している核酸もしくはタンパク質配列またはタンパク質構造を含み、共通の系統由来ではなく、または共通の祖先配列を共有していない。類縁体は、収束進化により、配列が異なっていてもよいが、類似の構造を共有していてもよい。例えば、2つの酵素が基質の生成物への変換の同じ反応を触媒し、配列は無関係で、かつ2つの酵素の構造が関係しているかどうかに関係がない場合、これらの酵素は類縁体または類縁である。
【００７１】
本明細書において用いられる「アルキル」なる用語は、示された数の炭素原子を有する、直鎖または分枝、飽和、脂肪族基を意味する。アルキルは、C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C1-7、C1-8、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6およびC5-6などの、任意の数の炭素を含みうる。例えば、C1-6アルキルには、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。アルキルは、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどであるが、それらに限定されるわけではない、最大20個までの炭素原子を有するアルキル基も意味しうる。アルキル基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００７２】
本明細書において用いられる「アルケニル」なる用語は、少なくとも2つの炭素原子および少なくとも1つの二重結合を有する、直鎖または分枝炭化水素を意味する。アルケニルは、C2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、C2-9、C2-10、C3、C3-4、C3-5、C3-6、C4、C4-5、C4-6、C5、C5-6、およびC6などの、任意の数の炭素を含みうる。アルケニル基は、1個、2個、3個、4個、5個またはそれ以上を含むが、それらに限定されるわけではない、任意の適切な数の二重結合を有しうる。アルケニル基の例には、ビニル（エテニル）、プロペニル、イソプロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、イソブテニル、ブタジエニル、1-ペンテニル、2-ペンテニル、イソペンテニル、1,3-ペンタジエニル、1,4-ペンタジエニル、1-ヘキセニル、2-ヘキセニル、3-ヘキセニル、1,3-ヘキサジエニル、1,4-ヘキサジエニル、1,5-ヘキサジエニル、2,4-ヘキサジエニル、または1,3,5-ヘキサトリエニルが含まれるが、それらに限定されるわけではない。アルケニル基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００７３】
本明細書において用いられる「アルキニル」なる用語は、少なくとも2つの炭素原子および少なくとも1つの三重結合を有する、直鎖または分枝いずれかの炭化水素を意味する。アルキニルは、C2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、C2-9、C2-10、C3、C3-4、C3-5、C3-6、C4、C4-5、C4-6、C5、C5-6、およびC6などの、任意の数の炭素を含みうる。アルキニル基の例には、アセチレニル、プロピニル、1-ブチニル、2-ブチニル、イソブチニル、sec-ブチニル、ブタジイニル、1-ペンチニル、2-ペンチニル、イソペンチニル、1,3-ペンタジイニル、1,4-ペンタジイニル、1-ヘキシニル、2-ヘキシニル、3-ヘキシニル、1,3-ヘキサジイニル、1,4-ヘキサジイニル、1,5-ヘキサジイニル、2,4-ヘキサジイニル、または1,3,5-ヘキサトリイニルが含まれるが、それらに限定されるわけではない。アルキニル基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００７４】
本明細書において用いられる「アリール」なる用語は、任意の適切な数の環原子および任意の適切な数の環を有する、芳香族炭素環系を意味する。アリール基は、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16個の環原子、ならびに6〜10、6〜12、または6〜14個の環メンバーなどの、任意の適切な数の炭素環原子を含みうる。アリール基は、単環式である、縮合して二環式もしくは三環式基を形成する、または結合により連結されてビアリール基を形成することができる。代表的なアリール基には、フェニル、ナフチルおよびビフェニルが含まれる。他のアリール基には、メチレン連結基を有するベンジルが含まれる。フェニル、ナフチル、またはビフェニルなどの、いくつかのアリール基は、6〜12個の環メンバーを有する。フェニルまたはナフチルなどの、他のアリール基は、6〜10個の環メンバーを有する。フェニルなどの、いくつかの他のアリール基は、6個の環メンバーを有する。アリール基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００７５】
本明細書において用いられる「シクロアルキル」なる用語は、3〜12個の環原子、または示された数の原子を含む、飽和または部分不飽和、単環式、縮合二環式または架橋多環式環集合を意味する。シクロアルキルは、C3-6、C4-6、C5-6、C3-8、C4-8、C5-8、およびC6-8などの、任意の数の炭素を含みうる。飽和単環式シクロアルキル環には、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロオクチルが含まれる。飽和二環式および多環式シクロアルキル環には、例えば、ノルボルナン、[2.2.2]ビシクロオクタン、デカヒドロナフタレンおよびアダマンタンが含まれる。シクロアルキル基は、環内に1つまたは複数の二重または三重結合を有する、部分不飽和でもありうる。部分不飽和である代表的なシクロアルキル基には、シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロヘキサジエン（1,3-および1,4-異性体）、シクロヘプテン、シクロヘプタジエン、シクロオクテン、シクロオクタジエン（1,3-、1,4-および1,5-異性体）、ノルボルネン、およびノルボルナジエンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。シクロアルキル基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００７６】
本明細書において用いられる「ヘテロシクリル」なる用語は、3〜12個の環メンバーならびにN、OおよびSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する、飽和環系を意味する。B、Al、SiおよびPを含むが、それらに限定されるわけではない、さらなるヘテロ原子も、ヘテロシクロアルキル基に存在しうる。ヘテロ原子は酸化されて、-S(O)-および-S(O)2-などであるが、それらに限定されるわけではない、部分を形成しうる。ヘテロシクリル基は、3〜6、4〜6、5〜6、4〜6、または4〜7個の環メンバーなどの、任意の数の環原子を含みうる。1、2、3、もしくは4、または1〜2、1〜3、1〜4、2〜3、2〜4、もしくは3〜4などの、任意の適切な数のヘテロ原子がヘテロシクリル基に含まれうる。ヘテロシクリル基の例には、アジリジン、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、アゼパン、アゾカン、キヌクリジン、ピラゾリジン、イミダゾリジン、ピペラジン（1,2-、1,3-および1,4-異性体）、オキシラン、オキセタン、テトラヒドロフラン、オキサン（テトラヒドロピラン）、オキセパン、チイラン、チエタン、チオラン（テトラヒドロチオフェン）、チアン（テトラヒドロチオピラン）、オキサゾリジン、イソキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ジオキソラン、ジチオラン、モルホリン、チオモルホリン、ジオキサン、またはジチアンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。ヘテロシクリル基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００７７】
本明細書において用いられる「ヘテロアリール」なる用語は、5〜16個の環原子を含み、ここで環原子の1〜5個はN、OまたはSなどのヘテロ原子である、単環式または縮合二環式もしくは三環式芳香環集合を意味する。B、Al、SiおよびPを含むが、それらに限定されるわけではない、さらなるヘテロ原子も、ヘテロアリール基に存在しうる。ヘテロ原子は酸化されて、-S(O)-および-S(O)2-などであるが、それらに限定されるわけではない、部分を形成しうる。ヘテロアリール基は、3〜6、4〜6、5〜6、3〜8、4〜8、5〜8、6〜8、3〜9、3〜10、3〜11、または3〜12個の環メンバーなどの、任意の数の環原子を含みうる。1、2、3、4、もしくは5、または1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、2〜3、2〜4、2〜5、3〜4、もしく3〜5などの、任意の適切な数のヘテロ原子がヘテロアリール基に含まれうる。ヘテロアリール基は、5〜8個の環メンバーおよび1〜4個のヘテロ原子、または5〜8個の環メンバーおよび1〜3個のヘテロ原子、または5〜6個の環メンバーおよび1〜4個のヘテロ原子、または5〜6個の環メンバーおよび1〜3個のヘテロ原子を有しうる。ヘテロアリール基の例には、ピロール、ピリジン、イミダゾール、ピラゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、トリアジン（1,2,3-、1,2,4-および1,3,5-異性体）、チオフェン、フラン、チアゾール、イソチアゾール、オキサゾール、およびイソキサゾールが含まれるが、それらに限定されるわけではない。ヘテロアリール基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００７８】
本明細書において用いられる「アルコキシ」なる用語は、アルキル基を結合点に連結する酸素原子を有するアルキル基：すなわち、アルキル-O-を意味する。アルキル基に関して、アルコキシ基は、C1-6またはC1-4などの、任意の適切な数の炭素原子を有しうる。アルコキシ基には、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、2-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシなどが含まれる。アルコキシ基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００７９】
本明細書において用いられる「アルキルチオ」なる用語は、アルキル基を結合点に連結する硫黄原子を有するアルキル基：すなわち、アルキル-S-を意味する。アルキル基に関して、アルキルチオ基は、C1-6またはC1-4などの、任意の適切な数の炭素原子を有しうる。アルキルチオ基には、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、2-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシなどが含まれる。アルキルチオ基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００８０】
本明細書において用いられる「ハロ」および「ハロゲン」なる用語は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を意味する。
【００８１】
本明細書において用いられる「ハロアルキル」なる用語は、少なくとも1つのハロゲン原子で置換された、前述の定義のアルキル部分を意味する。
【００８２】
本明細書において用いられる「アルキルシリル」なる用語は、部分-SiR3を意味し、ここで少なくとも1つのR基はアルキルであり、他のR基はHまたはアルキルである。アルキル基は1つまたは複数のハロゲン原子で置換されうる。
【００８３】
本明細書において用いられる「アシル」なる用語は、部分-C(O)Rを意味し、ここでRはアルキル基である。
【００８４】
本明細書において用いられる「オキソ」なる用語は、化合物に二重結合で結合されている酸素原子（すなわち、O=）を意味する。
【００８５】
本明細書において用いられる「カルボキシ」なる用語は、部分-C(O)OHを意味する。カルボキシ部分はイオン化されて、カルボン酸アニオンを形成しうる。
【００８６】
本明細書において用いられる「アミノ」なる用語は、部分-NR3を意味し、ここで各R基はHまたはアルキルである。
【００８７】
本明細書において用いられる「アミド」なる用語は、部分-NRC(O)Rまたは-C(O)NR2を意味し、ここで各R基はHまたはアルキルである。
【００８８】
III. 態様の説明
いくつかの局面において、本発明は、ヘム酵素を用いて、オレフィンの、1つまたは複数のシクロプロパン官能基を含む任意の化合物（例えば、任意の中間体または最終化合物）への変換を触媒する方法を提供する。ある局面において、本発明は、シクロプロパン化生成物を生成する方法であって：
（a）オレフィン基質、ジアゾ試薬、およびヘム酵素を提供する段階；および
（b）段階（a）の成分を、反応中に、シクロプロパン化生成物を生成するのに十分な時間混合する段階を含む方法を提供する。
【００８９】
ある場合には、シクロプロパン化生成物を、別々の異なる基質としてのオレフィン基質とジアゾ試薬との間の分子間シクロプロパン化反応を介して生成する。他の場合に、シクロプロパン化生成物を、分子内シクロプロパン化反応を介して生成し、例えば、ここでオレフィン基質およびジアゾ試薬は同じ基質の一部である。
【００９０】
本発明の方法を用いて、多数のシクロプロパン化生成物を提供することができる。シクロプロパン化生成物には、殺虫剤（例えば、ピレスロイド化合物）、キラルおよび/またはアキラルシクロプロパン部分を有する活性薬学的作用物質（例えば、ミルナシプラン、レボミルナシプラン、および抗生物質、抗ウイルス剤などの他の活性成分）、日用品およびファインケミカル、植物ホルモン、香料および香水、ならびに脂肪酸などであるが、それらに限定されるわけではない、化合物のクラスが含まれる。シクロプロパン化生成物は、これらおよび他のクラスに属する化合物の合成のための中間体（例えば、ピレスロイド化合物の合成のためのクリサンテム酸エステル）としても役立ちうる。
【００９１】
他の局面において、本発明は、本明細書に記載のシクロプロパン化反応を実行することができる、その変異体および断片（例えば、切断型）を含むヘム酵素ならびにキメラヘム酵素を提供する。ヘム酵素を発現する発現ベクターおよび宿主細胞も、本発明によって提供される。
【００９２】
以下の項は、ヘム酵素、発現ベクター、宿主細胞、例えば、1つまたは複数のシクロプロパン官能基を含む化合物などのシクロプロパン化生成物、例えば、オレフィン基質およびジアゾ試薬などの出発原料、ならびに本明細書に記載のインビトロおよびインビボシクロプロパン化反応のための特徴および反応条件を含む、例示的かつ好ましい態様の説明を提供する。
【００９３】
A. ヘム酵素
ある局面において、本発明は、オレフィン基質の、1つまたは複数のシクロプロパン官能基を含む生成物への変換を触媒する、1つまたは複数のヘム酵素を含む組成物を提供する。特定の態様において、本発明は、カルベン等価物のジアゾ試薬（例えば、ジアゾエステル）からオレフィン基質への形式に従った移動を触媒して、高い立体選択性でシクロプロパン生成物を作製する、少なくとも1つまたは複数のアミノ酸突然変異をその中に含むヘム酵素変異体を提供する。好ましい態様において、本発明のヘム酵素変異体は、対応する野生型酵素に比べて、シクロプロパン化反応を効率的に触媒し、トータルターンオーバー数の増大を示し、かつ/または高度にレジオおよび/もしくはエナンチオ選択的生成物生成を示す能力を有する。
【００９４】
「ヘム酵素」および「ヘムタンパク質」なる用語は、本明細書において、補欠分子族としてヘムを含むタンパク質群の任意のメンバーを含むために用いられる。ヘム酵素の非限定例には、グロビン、チトクロム、オキシドレダクターゼ、補欠分子族としてヘムを含む任意の他のタンパク質、およびその組み合わせが含まれる。ヘム含有グロビンには、ヘモグロビン、ミオグロビン、およびその組み合わせが含まれるが、それらに限定されるわけではない。ヘム含有チトクロムには、チトクロムP450、チトクロムb、チトクロムc1、チトクロムc、およびその組み合わせが含まれるが、それらに限定されるわけではない。ヘム含有オキシドレダクターゼには、カタラーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、およびその組み合わせが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００９５】
ある場合には、ヘム酵素は、コバルト、ロジウム、銅、ルテニウム、およびマンガンを含むが、それらに限定されるわけではない、鉄以外の金属を含むプロトポルフィリンIXまたは他のポルフィリン分子を含む、金属置換ヘム酵素であり、これらは活性シクロプロパン化触媒である。
【００９６】
いくつかの態様において、ヘム酵素は表1に示す酵素クラスの1つのメンバーである。他の態様において、ヘム酵素は表1に示す酵素クラスの1つのメンバーの変異体またはホモログである。さらに他の態様において、ヘム酵素は、本明細書に記載のシクロプロパン化反応を実行することができる、表1に示す酵素クラスの1つのメンバーのヘムドメインまたはその断片（例えば、切断されたヘムドメイン）を含む、またはそれからなる。
【００９７】
（表１）酵素分類番号（EC番号）および分類名によって同定されたヘム酵素
2015534464.tif 000016
2015534464.tif 000017
2015534464.tif 000018
【００９８】
特定の態様において、ヘム酵素は、例えば、ヘム配位部位である軸位置の突然変異などの、少なくとも1つの突然変異を含む、変異体またはその断片（例えば、ヘムドメインを含む切断された変異体）である。いくつかの場合に、突然変異は軸位置における天然残基の、Ala、Asp、Arg、Asn、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、またはValによる置換である。ある場合には、突然変異は軸位置におけるCysの、Serなどの任意の他のアミノ酸による置換である。
【００９９】
ある態様では、シクロプロパン化生成物を生成するインビトロ法は、ヘム酵素、変異体、またはそのホモログを、NADPHまたは亜ジチオン酸塩（例えば、Na2S2O4）などの還元剤と共に提供する段階を含む。他のある態様において、シクロプロパン化生成物を生成するインビボ法は、ヘム酵素、変異体、またはそのホモログを発現する、大腸菌細胞などのホールセルを提供する段階を含む。
【０１００】
いくつかの態様において、ヘム酵素、変異体、またはそのホモログを、本発明のインビトロシクロプロパン化反応を実行するために、組換えにより発現させ、任意に単離および/または精製する。他の態様において、ヘム酵素、変異体、またはそのホモログを、大腸菌細胞などのホールセルにおいて発現させ、これらの細胞を、本発明のインビボシクロプロパン化反応を実行するために用いる。
【０１０１】
ある態様では、ヘム酵素、変異体、またはそのホモログは、野生型酵素（例えば、全長ポリペプチド）と同じ数のアミノ酸残基を含むか、またはそれらからなる。いくつかの場合に、ヘム酵素、変異体、またはそのホモログは、最初のメチオニンを除くアミノ酸配列（例えば、SEQ ID NO:1のP450 BM3アミノ酸配列）を含むか、またはそれらからなる。他の態様において、ヘム酵素は、レダクターゼドメインに融合したヘムドメインを含むか、またはそれからなる。さらに他の態様において、ヘム酵素はレダクターゼドメインを含まず、例えば、ヘム酵素はヘムドメインのみ、または切断されたヘムドメインなどのその断片を含む。
【０１０２】
いくつかの態様において、ヘム酵素、変異体、またはそのホモログは、対応する野生型ヘム酵素に比べて、少なくとも約1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100倍の増強されたシクロプロパン化活性を有する。
【０１０３】
いくつかの態様において、ヘム酵素、変異体、またはそのホモログは、NADHまたはNADPHのものよりも高い休止状態還元電位を有する。
【０１０４】
特定の態様において、ヘム酵素はチトクロムP450酵素を含む。チトクロムP450酵素は、多様な外因性および内因性化合物両方の代謝に関与するヘム-チオラートタンパク質の大きいスーパーファミリーを構成する。通常、これらは、P450含有モノオキシゲナーゼ系などの、多成分電子移動連鎖における末端オキシダーゼとして作用する。チトクロムP450酵素ファミリーのメンバーは、例えば、ヒドロキシル化、エポキシ化、酸化的環カップリング、ヘテロ原子遊離、およびヘテロ原子酸素化を含む、無数の酸化的変換を触媒する（E. M. Isin et al., Biochim. Biophys. Acta 1770, 314 (2007)）。これらの酵素の活性部位は、保存されたシステインチオラートによって近位に連結されたFeIII-プロトポルフィリンIX補助因子（ヘム）を含む（M. T. Green, Current Opinion in Chemical Biology 13, 84 (2009)）。残りの軸-鉄配位部位は休止酵素では水分子によって占有されているが、天然の触媒作用中は、この部位は分子酸素を結合することができる。典型的には隣接する融合レダクターゼドメインまたは補助的チトクロムP450レダクターゼ酵素からNADHまたはNADPHによって供給される、電子供給源の存在下で、チトクロムP450のヘム中心は分子酸素を活性化し、高原子価の鉄(IV)-オキソポルフィリンカチオンラジカル種中間体（化合物I、図1）および水分子を生じる。
【０１０５】
当業者であれば、チトクロムP450酵素スーパーファミリーが、P450ホームページ（http://drnelson.uthsc.edu/CytochromeP450.htmlで利用可能；D. R. Nelson、Hum. Genomics 4、59 (2009)も参照されたい）、チトクロムP450酵素改変データベース（http://www.cyped.uni-stuttgart.de/cgi-bin/CYPED5/index.plで利用可能；D. Sirim et al.、BMC Biochem 10、27 (2009)も参照されたい）、およびSuperCypデータベース（http://bioinformatics.charite.de/supercyp/で利用可能；S. Preissner et al.、Nucleic Acids Res. 38、D237 (2010)も参照されたい）を含むが、それらに限定されるわけではない、様々なデータベースにまとめられていることを理解すると思われ、これらの開示はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０６】
ある態様では、本発明のチトクロムP450酵素は、表2に示すクラスの1つのメンバーである（http://www.icgeb.org/〜p450srv/P450enzymes.htmlを参照されたく、その開示はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【０１０７】
（表２）EC番号、推奨名、およびファミリー/遺伝子名によって分類されたチトクロムP450酵素
2015534464.tif 000019
【０１０８】
以下の表3は、本発明のシクロプロパン化反応において使用するのに適したさらなるチトクロムP450酵素を列挙する。表3のアクセッション番号はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。以下の特許文書：
2015534464.tif 000020
2015534464.tif 000021
において開示されるチトクロムP450遺伝子および/またはタンパク質配列は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０９】
（表３）本発明のさらなるチトクロムP450酵素
2015534464.tif 000022
最初のメチオニン（「M」）はこれらの配列に存在してもしなくてもよい。
*M.Z. Lv et al., Plant Cell Physiol., 53(6):987-1002 (2012)参照。
【０１１０】
ある態様では、本発明は、チトクロムP450酵素から、一酸素を添加する化学作用を効率的になくすアミノ酸置換を提供する。このシステムにより、天然のP450触媒作用によって仲介される副反応と競合することなく、選択的な、酵素が推進するシクロプロパン化化学が可能となる。本発明は、シクロプロパン化化学のために適格であるが、伝統的なP450仲介性一酸素添加反応を実行することができない、「直交型」P450触媒作用としてのP450仲介性触媒作用および「直交型」P450としてのそれぞれの酵素変異体も提供する。いくつかの場合に、直交型P450変異体は、近位ヘム配位環境を変える、ヘム配位部位である軸位置における単一アミノ酸突然変異（例えば、P450 BM3酵素における突然変異C400S）を含む。したがって、本発明は、軸-ヘム突然変異を本明細書に記載の1つまたは複数のさらなる突然変異との組み合わせで含んで、ジアステレオ選択的および/またはエナンチオ選択的が強化された生成物の分配を示す直交型P450変異体を提供する、P450変異体も提供する。本発明は、NAD(P)Hまたは亜ジチオン酸ナトリウムを含むが、それらに限定されるわけではない、直交型P450シクロプロパン化触媒作用のための適合性還元剤をさらに提供する。
【０１１１】
特定の態様において、チトクロムP450酵素は、P450酵素または表2もしくは3に示す酵素クラスの1つである。いくつかの態様において、チトクロムP450酵素は、P450酵素または表2もしくは3に示す酵素クラスの1つの変異体またはホモログである。好ましい態様において、P450酵素変異体は、プロトポルフィリンIXの鉄が結合するヘム-軸配位子として役立つ、対応する野生型配列の保存されたシステイン（CysまたはC）残基において突然変異を含む。非限定例として、表2または3に示す任意のP450酵素の軸突然変異体は、ヘム配位部位である軸位置（「AxX」）に突然変異を含むことができ、ここで「X」はAla、Asp、Arg、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、およびValから選択される。
【０１１２】
ある態様では、ヘム-軸配位子として役立ち、プロトポルフィリンIXの鉄に結合する、関心対象のチトクロムP450酵素の保存されたシステイン残基を、保存されたシステイン残基をコードする、対応するチトクロムP450遺伝子におけるDNA配列セグメントを位置づけることによって同定することができる。いくつかの場合に、このDNAセグメントを、タンパク質の保存領域における詳細な突然変異誘発試験を通じて同定する（例えば、Shimizu et al., Biochemistry 27, 4138-4141, 1988参照）。他の場合に、保存されたシステインを、結晶学的試験を通じて同定する（例えば、Poulos et al., J.Mol.Biol 195:687-700, 1987参照）。
【０１１３】
関心対象のチトクロムP450酵素について詳細な突然変異誘発試験および結晶学的データが利用できない場合、軸配位子を、系統学的試験を通じて同定してもよい。P450酵素間のアミノ酸配列が類似しているため、標準のタンパク質アラインメントアルゴリズムは、結晶学的または突然変異誘発データが存在するP450酵素とそのようなデータが存在しない新しいP450酵素との間で系統学的類似性を示すことがある。したがって、ヘム-軸配位子が公知の本発明のポリペプチド配列を、関心対象の具体的な新しいチトクロムP450酵素またはチトクロムP450配列を含むデータベースに対する検索を実施するための「クエリー配列」として用いて、ヘム-軸配位子を同定することができる。そのような解析はBLASTプログラムを用いて実施することができる（例えば、Altschul et al., J Mol Biol. 215(3):403-10(1990)参照）。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（http://ncbi.nlm.nih.gov）から入手可能である。BLASTPはアミノ酸配列に対して用いる。
【０１１４】
BLASTPアルゴリズムを用いて関心対象のP450酵素におけるヘム-軸配位子を同定するために、アミノ酸配列アラインメントを実施するための例示的パラメーターには、E value＝10、word size＝3、Matrix＝Blosum62、Gap opening＝11、gap extension＝1、およびconditional compositional score matrix adjustmentが含まれる。当業者であれば、例えば、比較の厳密性を上げる、もしくは下げるため、および/または複数の配列の関連性を判定するために、前述のパラメーターにどのような改変を行いうるかを知っているであろう。
【０１１５】
好ましい態様において、チトクロムP450酵素は、チトクロムP450 BM3酵素またはその変異体、ホモログ、もしくは断片である。バチルス メガテリウム由来の細菌チトクロムP450 BM3は水溶性の長鎖脂肪酸モノオキシゲナーゼである。天然P450 BM3タンパク質は1048アミノ酸の単一ポリペプチド鎖からなり、2つの機能サブドメインに分けることができる（L. O. Narhi et al., J. Biol. Chem. 261, 7160 (1986)参照）。N末端ドメインのアミノ酸残基1〜472は、ヘム結合活性部位を含み、一酸素添加触媒作用の部位である。残りのC末端アミノ酸は、NADPHからの必須の電子等価物を提供してヘム補助因子を還元し、触媒作用を推進する、レダクターゼドメインを含む。P450 BM3における融合レダクターゼドメインの存在は自己充足的モノオキシゲナーゼを生じ、酸素活性化のための外因性補助タンパク質の必要がなくなる（同上参照）。N末端ヘムドメインは、適切な条件下、末端酸化剤としての過酸化水素存在下で活性を保持する、個別の正しく折りたたまれた溶解性タンパク質として単離しうることが明らかにされている（P. C. Cirino et al., Angew. Chem., Int. Ed. 42, 3299 (2003)）。
【０１１６】
ある場合には、チトクロムP450 BM3酵素は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。他のある場合には、チトクロムP450 BM3酵素は、例えば、J. Y. Kang et al.、AMB Express 1:1 (2011)に記載のとおり、その天然の変異体であり、ここで天然変異体は野生型チトクロムP450 BM3酵素配列（SEQ ID NO:1）とは、アミノ酸配列が最大約5％異なる（例えば、SEQ ID NOS:2〜11）。
【０１１７】
特定の態様において、P450 BM3酵素変異体は、野生型P450 BM3酵素配列のヘムドメイン（例えば、SEQ ID NO:1のアミノ酸1〜463）および任意に少なくとも1つの本明細書に記載の突然変異を含むか、またはそれらからなる。他の態様において、P450 BM3酵素変異体は、野生型P450 BM3酵素配列（SEQ ID NO:1）のヘムドメインの断片を含むか、またはそれからなり、ここで断片は本発明のシクロプロパン化反応を実行することができる。いくつかの場合に、断片はヘム-軸配位子および活性部位残基の少なくとも1、2、3、4、または5個を含む。
【０１１８】
ある態様では、P450 BM3酵素変異体は、ヘム配位部位である軸位置（「AxX」）に突然変異を含み、ここで「X」はAla、Asp、Arg、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、およびValから選択される。野生型P450 BM3酵素の保存されたシステイン（CysまたはC）残基は、SEQ ID NO:1の400位に位置する。本明細書において用いられる「AxX」および「C400X」なる用語は、野生型P450 BM3酵素（すなわち、SEQ ID NO:1）の軸位置（すなわち残基400）に位置するアミノ酸置換「X」の存在を意味する。いくつかの場合に、XはSer（S）である。他の場合に、XはAla（A）、Asp（D）、His（H）、Lys（K）、Asn（N）、Met（M）、Thr（T）、またはTyr（Y）である。いくつかの態様において、P450 BM3酵素変異体は、野生型P450 BM3酵素配列のヘムドメイン（例えば、SEQ ID NO:1のアミノ酸1〜463）またはその断片およびAxXの突然変異（すなわち、「WT-AxXヘム」）を含むか、またはそれらからなる。
【０１１９】
他の態様において、P450 BM3酵素変異体は、SEQ ID NO:1において以下のアミノ酸置換：V78A、F87V、P142S、T175I、A184V、S226R、H236Q、E252G、T268A、A290V、L353V、I366V、およびE442K、のうち少なくとも1つまたは複数（例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13すべて）を含む。ある場合には、P450 BM3酵素変異体は、SEQ ID NO:1において突然変異T268Aを単独で、または突然変異C400X（例えば、C400S）などの1つまたは複数のさらなる突然変異との組み合わせで含む。他の場合に、P450 BM3酵素変異体は、SEQ ID NO:1においてこれらのアミノ酸置換13個すべて（すなわち、V78A、F87V、P142S、T175I、A184V、S226R、H236Q、E252G、T268A、A290V、L353V、I366V、およびE442K；「BM3-CIS」）を突然変異C400X（例えば、C400S）との組み合わせで含む。いくつかの場合に、P450 BM3酵素変異体は、BM3-CIS酵素配列のヘムドメイン（例えば、これらのアミノ酸置換13個すべてを含むSEQ ID NO:1のアミノ酸1〜463）またはその断片および「AxX」の突然変異（すなわち、「BM3-CIS-AxXヘム」）を含むか、またはそれらからなる。
【０１２０】
いくつかの態様において、P450 BM3酵素変異体は、SEQ ID NO:1において以下のアミノ酸置換：I263A、A328G、およびT438の突然変異、のうち少なくとも1つまたは複数（例えば、少なくとも2つ、または3つすべて）をさらに含む。ある場合には、T438の突然変異は、T438A、T438S、またはT438Pである。いくつかの場合に、P450 BM3酵素変異体は、SEQ ID NO:1またはヘムドメインもしくはその断片においてT438A、T438S、またはT438Pなどの、T438の突然変異を単独で、あるいは突然変異C400X（例えば、C400S）などの1つまたは複数のさらなる突然変異との組み合わせで含む。他の場合に、P450 BM3酵素変異体は、SEQ ID NO:1においてBM3-CIS主鎖のT438A、T438S、もしくはT438Pなどの、T438の突然変異を単独で、または突然変異C400X（例えば、C400S）との組み合わせで含む（すなわち、「BM3-CIS-T438S-AxX」）。さらに他の場合に、P450 BM3酵素変異体は、BM3-CIS酵素配列のヘムドメインまたはその断片をT438の突然変異および「AxX」の突然変異との組み合わせ（例えば、「BM3-CIS-T438S-AxXヘム」）で含むか、またはそれらからなる。
【０１２１】
他の態様において、P450 BM3酵素変異体は、SEQ ID NO:1の活性部位において1〜5個（例えば、1、2、3、4、または5個）の活性部位のアラニン置換をさらに含む。ある場合には、活性部位のアラニン置換はL75A、M177A、L181A、I263A、L437A、およびその組み合わせからなる群より選択される。
【０１２２】
さらなる態様において、P450 BM3酵素変異体は、SEQ ID NO:1において以下のアミノ酸置換：R47C、L52I、I58V、L75R、F81（例えば、F81L、F81W）、A82（例えば、A82S、A82F、A82G、A82Tなど）、F87A、K94I、I94K、H100R、S106R、F107L、A135S、F162I、A197V、F205C、N239H、R255S、S274T、L324I、A328V、V340M、およびK434E、のうち少なくとも1つまたは複数（例えば、少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22個）を含む。特定の態様において、P450 BM3酵素変異体は、これらの突然変異の任意の1つまたは複数を単独で、あるいは前述のものなどの1つもしくは複数のさらなる突然変異、例えば、「AxX」の突然変異ならびに/またはV78A、F87V、P142S、T175I、A184V、S226R、H236Q、E252G、T268A、A290V、L353V、I366V、およびE442Kを含む少なくとも1つもしくは複数の突然変異との組み合わせで含む。
【０１２３】
以下の表4は、本発明のチトクロムP450 BM3変異体の非限定例を提供する。各P450 BM3変異体は、列挙した突然変異の1つまたは複数を含み（変異体No. 1〜31）、ここで「+」は変異体におけるその特定の突然変異の存在を示す。表4に挙げる任意の変異体は、P450 BM3酵素活性部位に、突然変異I263Aおよび/もしくはA328G、ならびに/または以下のアラニン置換：L75A、M177A、L181A、I263A、およびL437A、のうち少なくとも1、2、3、4、もしくは5個を、任意の組み合わせでさらに含みうる。特定の態様において、P450 BM3変異体は、表4に挙げる変異体No. 1〜31の任意の1つのヘムドメインまたはその断片を含むか、またはそれからなり、ここで断片は本発明のシクロプロパン化反応を実行することができる。
【０１２４】
（表４）本発明の例示的チトクロムP450 BM3酵素変異体
2015534464.tif 000023
野生型P450BM3アミノ酸配列（SEQ ID NO:1）に対する突然変異；「X」はAla、Asp、Arg、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、およびValから選択され；「Z」はAla、Ser、およびProから選択され；「9-10A-TS」はSEQ ID NO:1における以下のアミノ酸置換を含む：V78A、P142S、T175I、A184V、S226R、H236Q、E252G、A290V、L353V、I366V、およびE442K。
【０１２５】
当業者であれば、ヘム-軸配位子として役立つ関心対象のチトクロムP450酵素の保存されたシステイン残基を同定するために、前述の保存されたシステイン残基をコードする対応するチトクロムP450遺伝子におけるDNA配列のセグメントを位置づけることによって、表4に挙げる突然変異をいずれも、関心対象の任意のチトクロムP450酵素に導入しうることを理解するであろう。ある場合には、このDNAセグメントを、タンパク質の保存領域における詳細な突然変異誘発試験を通じて同定する（例えば、Shimizu et al., Biochemistry 27, 4138-4141, 1988参照）。他の場合に、保存されたアミノ酸残基を、結晶学的試験を通じて同定する（例えば、Poulos et al., J.Mol.Biol 195:687-700, 1987参照）。さらに他の場合に、タンパク質配列アラインメントアルゴリズムを用いて、保存されたアミノ酸残基を同定することができる。非限定例として、他のチトクロムP450酵素においてヘム-軸配位子部位および/または等価のT268残基を同定するための、BLASTアラインメントおよびクエリー配列としてのP450 BM3アミノ酸配列の使用を、実施例3および9に例示する。
【０１２６】
以下の表5Aは、本発明の好ましいチトクロムP450 BM3変異体の非限定例を提供する。以下の表5Bは、本発明の好ましいキメラチトクロムP450酵素の非限定例を提供する。
【０１２７】
（表５Ａ）例示的な本発明の好ましいチトクロムP450 BM3酵素変異体
2015534464.tif 000024
【０１２８】
（表５Ｂ）例示的な本発明の好ましいキメラチトクロムP450酵素
2015534464.tif 000025
【０１２９】
特定の態様において、例えば、アミノ酸置換C400X（AxX）、BM3-CIS、T438、および/またはT268Aなどの、1つまたは複数のアミノ酸突然変異を有するチトクロムP450 BM3変異体は、シクロプロパン化反応を効率的に触媒して、トータルターンオーバー数の増大を示し、野生型酵素に比べて高度に位置選択的および/またはエナンチオ選択的生成物の生成を示す。
【０１３０】
非限定例として、本発明のチトクロムP450 BM3変異体は、少なくとも野生型P450 BM3に匹敵するジアステレオマー比、例えば、少なくとも37：63のシス：トランス、少なくとも50：50のシス：トランス、少なくとも60：40のシス：トランス、または少なくとも95：5のシス：トランスを示す、シス選択的触媒である。シス選択的触媒作用を改善するための特定の突然変異は、T268A、C400X、およびT438Sを含む少なくとも1つの突然変異を含むが、好ましくはこれらの突然変異の1、2、または3つすべてをP450 BM3変異体9-10A-TS由来のV78A、P142S、T175I、A184V、S226R、H236Q、E252G、A290V、L353V、I366V、E442K、およびF87Vを含むさらなる突然変異との組み合わせで含む。これらの突然変異は、P450 BM3のヘムドメインにて特定され、活性部位および周辺を含むヘムドメイン構造の様々な領域に位置する。
【０１３１】
別の非限定例として、本発明のチトクロムP450 BM3変異体は、少なくとも野生型P450 BM3に匹敵するジアステレオマー比、例えば、少なくとも37：63のシス：トランス、少なくとも20：80のシス：トランス、または少なくとも1：99のシス：トランスを示す、トランス選択的触媒である。トランス選択的触媒作用を改善するための特定の突然変異は、T268AおよびC400Xを含む少なくとも1つの突然変異を含むが、好ましくはこれらの突然変異の1つまたは両方を野生型P450 BM3の主鎖中に含む。ある態様では、V78A、P142S、T175I、A184V、S226R、H236Q、E252G、A290V、L353V、I366V、E442K、およびF87V（9-10-A-TS由来）などのさらなる突然変異と組み合わせてのトランス優先的突然変異も、I263A、L437A、L181Aおよび/またはL75Aを含むが、それらに限定されるわけではない、さらなる突然変異の存在下では耐容される。これらの突然変異は、P450 BM3のヘムドメインにて特定され、活性部位および周辺を含むヘムドメイン構造の様々な領域に位置する。
【０１３２】
ある態様では、本発明は、好ましい生成物ジアステレオマーについて少なくとも30％（野生型P450 BM3に匹敵）であるが、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも＞95％の鏡像体過剰率で、エナンチオ選択的シクロプロパン化を触媒するP450変異体も提供する。
【０１３３】
他の局面において、本発明は、野生型P450 BM3および高度に活性なP450 BM3変異体と類似の条件を用いて、適格なシクロプロパン化触媒である、例えば、P450 BM3および枯草菌または任意の他の生物からの少なくとも1種、2種、またはそれ以上の遠い関連のあるP450酵素からの組換え配列からなるキメラP450タンパク質などの、キメラヘム酵素を提供する。非限定例として、3つの細菌チトクロムP450の部位特異的組換えを、タンパク質構造内で崩壊した接触部の数を最小化するように選択した配列交差部位で実施することができる。いくつかの態様において、7つの交差部位を選ぶことができ、8つの配列ブロックが生じる。当業者であれば、交差部位の数は、所望の数の配列ブロックを生じるように、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の配列ブロックに対してそれぞれ1、2、3、4、5、6、7、8、または9個の交差部位を選択しうることを理解するであろう。他の態様において、キメラP450に対して用いる番号付けは、各ブロックにおける親配列の同一性を意味する。例えば、「12312312」とは、P450 #1からのブロック1、P450 #2からのブロック2、P450 #3からのブロック3、P450 #1からのブロック4、P450 #2からのブロック5などを含む配列を意味する。本発明のキメラヘム酵素を生じるために有用なキメラライブラリを、IIｂ型制限エンドヌクレアーゼBsaXIを用いてSISDC法（Hiraga et al., J. Mol. Biol., 330:287-96 (2003)参照）に従い、例えば、Otey et al., PLoS Biology, 4(5):e112 (2006)に記載のとおりに構築することができ、全長ライブラリをpCWoriベクターに連結し、カタラーゼ欠失大腸菌株SN0037に転換する（Nakagawa et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 60:415-420 (1996)参照）；これらの参照文献の開示はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３４】
非限定例として、CYP102A1（アクセッション番号J04832）、CYP102A2（アクセッション番号CAB12544）、およびCYP102A3（アクセッション番号U93874）からのアミノ酸の組換え配列またはブロックを含むキメラP450タンパク質を構築することができる。ある場合には、CYP102A1親配列は「1」と割り当て、CYP102A2親配列は「2」と割り当て、かつCYP102A3は「3」と割り当てられた親配列である。いくつかの場合に、各親配列は以下のアミノ酸（aa）を含む8つの配列ブロックに分けられる：ブロック1：aa 1〜64；ブロック2：aa 65〜122；ブロック3：aa 123〜166；ブロック4：aa 167〜216；ブロック5：aa 217〜268；ブロック6：aa 269〜328；ブロック7：aa 329〜404；およびブロック8：aa 405〜末端。したがって、この例において、8つのアミノ酸ブロックがあり、各ブロックで3つの断片が可能である。例えば、「12312312」とは、CYP102A1からのブロック1（aa 1〜64）、CYP102A2からのブロック2（aa 65〜122）、CYP102A3からのブロック3（aa 123〜166）、CYP102A1からのブロック4（aa 167〜216）、CYP102A2からのブロック5（aa 217〜268）などを含む、本発明のキメラP450タンパク質を意味する。例えば、Otey et al., PLoS Biology, 4(5):e112 (2006)参照。キメラP450タンパク質の非限定例には、表5B（C2G9、X7、X7-12、C2E6、X7-9、C2B12、TSP234）および表13に示すものが含まれる。いくつかの態様において、本発明のキメラヘム酵素は、本明細書に記載の突然変異の少なくとも1つまたは複数を含むことができる。
【０１３５】
いくつかの態様において、本発明は、シクロプロパン化活性を付与する、または増強するために、他のチトクロムP450酵素およびヘム酵素におけるC400X（AxX）および/またはT268Aへの、相同または類似の突然変異の組み込みを提供する。
【０１３６】
非限定例として、チトクロムP450は、突然変異C357X（例えば、C357S）、突然変異T252A、もしくは突然変異C357X（例えば、C357S）およびT252Aの組み合わせを含むCYP101A1（SEQ ID NO:25）の変異体でありえ、ここで「X」はCys以外の任意のアミノ酸であるか、またはチトクロムP450は、突然変異C436X（例えば、C436S）、突然変異T302A、もしくは突然変異C436X（例えば、C436S）およびT302Aの組み合わせを含むCYP2B4（SEQ ID NO:28）の組み合わせでありえ、ここで「X」はCys以外の任意のアミノ酸であるか、またはチトクロムP450は、突然変異C461X（例えば、C461S）を含むCYP2D7（SEQ ID NO:26）の変異体でありえ、ここで「X」はCys以外の任意のアミノ酸であるか、またはチトクロムP450は、突然変異C478X（例えば、C478S）を含むP450C27（SEQ ID NO:27）の変異体でありえ、ここで「X」はCys以外の任意のアミノ酸である。
【０１３７】
酵素のトータルターンオーバー数（またはTTN）とは、酵素が不活化する前に変換しうる基質分子の最大数を意味する。一般に、本発明のヘム酵素のTTNは約1〜約100,000またはそれ以上の範囲である。例えば、TTNは約1〜約1,000、または約1,000〜約10,000、または約10,000〜約100,000、または約50,000〜約100,000、または少なくとも約100,000でありうる。特定の態様において、TTNは約100〜約10,000、または約10,000〜約50,000、または約5,000〜約10,000、または約1,000〜約5,000、または約100〜約1,000、または約250〜約1,000、または約100〜約500、または少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000、100,000、もしくはそれ以上でありうる。ある態様では、本発明の変異体またはキメラヘム酵素は野生型配列に比べて高いTTNを有する。いくつかの場合に、変異体またはキメラヘム酵素は、インビトロシクロプロパン化反応を実行する際に、約100より大きい（例えば、少なくとも約100、150、200、250、300、325、350、400、450、500、またはそれ以上）TTNを有する。他の場合に、変異体またはキメラヘム酵素は、インビボホールセルシクロプロパン化反応を実行する際に、約1000より大きい（例えば、少なくとも約1000、2500、5000、10,000、25,000、50,000、75,000、100,000、またはそれ以上）TTNを有する。
【０１３８】
シクロプロパン化反応を実行するためにヘム酵素を発現するホールセルを用いる場合、ターンオーバーは所与の量の細胞材料によって生成物へと変換される基質の量で表すことができる。一般に、インビボシクロプロパン化反応は、少なくとも約0.01〜少なくとも約10mmol・gcdw-1のターンを示し、ここでgcdwは細胞の乾燥重量のグラムでの質量である。例えば、ターンオーバーは約0.1〜約10mmol・gcdw-1、または約1〜約10mmol・gcdw-1、または約5〜約10mmol・gcdw-1、または約0.01〜約1mmol・gcdw-1、または約0.01〜約0.1mmol・gcdw-1、または約0.1〜約1mmol・gcdw-1、または1mmol・gcdw-1よりも大きくてもよい。ターンオーバーは約0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、または約10mmol・gcdw-1でありうる。
【０１３９】
シクロプロパン化反応を実行するためにヘム酵素を発現するホールセルを用いる場合、活性はさらに比生産性、例えば、単位時間につき所与の濃度の細胞材料によって生成される生成物の濃度、例えば、1時間あたりの細胞材料g/Lあたりの生成物g/L（g gcdw-1 h-1）で表すことができる。一般に、インビボシクロプロパン化反応は、少なくとも約0.01〜少なくとも約0.5g・gcdw-1 h-1の比生産性を示し、ここでgcdwは細胞の乾燥重量のグラムでの質量である。例えば、比生産性は約0.01〜約0.1g gcdw-1 h-1、または約0.1〜約0.5 g gcdw-1 h-1、または0.5 g gcdw-1 h-1よりも大きくてもよい。比生産性は約0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、または約0.5g gcdw-1 h-1でありうる。
【０１４０】
ある態様では、突然変異を標的遺伝子に、標準のクローニング技術（例えば、部位特異的突然変異誘発）を用いて、または遺伝子合成により導入して、本発明のヘム酵素（例えば、チトクロムP450変異体）を生成することができる。突然変異遺伝子は、宿主細胞（例えば、細菌細胞）中、発現ベクターを用いて誘導性プロモーターの制御下で、または染色体組込みにより構成性プロモーターの制御下で、発現させることができる。シクロプロパン化活性は、本明細書に記載のGCまたはHPLCで生成物生成を追跡することにより、インビボまたはインビトロでスクリーニングすることができる。
【０１４１】
本発明のヘム酵素をコードする核酸配列を含む発現ベクターは、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージ（例えば、バクテリオファージP1由来ベクター（PAC））、バキュロウイルスベクター、酵母プラスミド、または人工染色体（例えば、細菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）、哺乳動物人工染色体（MAC）、およびヒト人工染色体（HAC））でありうる。発現ベクターは染色体、非染色体、および合成DNA配列を含みうる。本明細書に記載のものと等価の発現ベクターは、当技術分野において公知で、当業者には明白であろう。
【０１４２】
発現ベクターは、プロモーターに機能的に連結されたヘム酵素をコードする核酸配列を含むことができ、ここでプロモーターはウイルス、細菌、古細菌、真菌、昆虫、または哺乳動物プロモーターを含む。ある態様では、プロモーターは構成性プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは誘導性プロモーターである。他の態様において、プロモーターは組織特異的プロモーターまたは環境的に調節された、もしくは発生的に調節されたプロモーターである。
【０１４３】
タンパク質精製を容易にするために、発現ベクターを用いて発現させたヘム酵素のNおよび/またはC末端にアフィニティタグを付加してもよいことが理解される。アフィニティタグの非限定例には、His6-タグなどの金属結合タグおよびグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）などの他のタグが含まれる。
【０１４４】
細菌宿主細胞において用いるための非限定的発現ベクターには、pCWori、pET22（EMD Millipore）などのpETベクター、pBR322（ATCC37017）、pQE(商標)ベクター（Qiagen）、pBluescript(商標)ベクター（Stratagene）、pNHベクター、ラムダ-ZAPベクター（Stratagene）；ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T（Pharmacia）、pRSET、pCR-TOPOベクター、pETベクター、pSyn_1ベクター、pChlamy_1ベクター（Life Technologies、Carlsbad、CA）、pGEM1（Promega、Madison、WI）、およｂpMAL（New England Biolabs、Ipswich、MA）が含まれる。真核生物宿主細胞において用いるための発現ベクターの非限定例には、pXT1、pSG5（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40（Pharmacia）、pcDNA3.3、pcDNA4/TO、pcDNA6/TR、pLenti6/TR、pMTベクター（Life Technologies）、pKLAC1ベクター、pKLAC2ベクター（New England Biolabs）、pQE(商標)ベクター（Qiagen）、BacPakバキュロウイルスベクター、pAdeno-X(商標)アデノウイルスベクター（Clontech）、およびpBABEレトロウイルスベクターが含まれる。
【０１４５】
宿主細胞は細菌細胞、古細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞でありうる。
【０１４６】
適切な細菌宿主細胞には、BL21大腸菌、DE3株大腸菌、大腸菌M15、DH5α、DH10β、HB101、T7発現コンピテント大腸菌（NEB）、枯草菌細胞、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）細胞、ならびにコナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）細胞およびシネココッカス エロンガテス（Synechococcus elongates）細胞などのラン藻細胞が含まれるが、それらに限定されるわけではない。古細菌宿主細胞の非限定例には、パイロコッカス フリオサス（Pyrococcus furiosus）、メタッロスパエラ セドゥラ（Metallosphera sedula）、テルモコッカス リトラリス（Thermococcus litoralis）、メタノバクテリウム サーモオートトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）、メタノコッカス ヤナシイ（Methanococcus jannaschii）、パイロコッカス アビシ（Pyrococcus abyssi）、スルホロブス ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、パイロコッカス ヴェッセイ（Pyrococcus woesei）、スルホロブス シバテ（Sulfolobus shibatae）、およびその変異体が含まれる。真菌宿主細胞には、サッカロミセス属（Saccharomyces）（例えば、出芽酵母（S. cerevisiae））、ピキア属（Pichia）（P.パストリス（P. Pastoris））、クリベロミセス属（Kluyveromyces）（例えば、K.ラクティス（K. lactis））、ハンゼヌラ属（Hansenula）およびヤロウイア属（Yarrowia）由来酵母細胞、ならびにアスペルギルス属（Aspergillus）、トリコデルマ属（Trichoderma）、およびマイセリオフトラ属（Myceliophthora）由来糸状菌細胞が含まれるが、それらに限定されるわけではない。適切な昆虫宿主細胞には、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）由来Sf9細胞、ヨトウガ由来Sf21細胞、Hi-Five細胞、BTI-TN-5B1-4イラクサギンウワバ（Trichophusia ni）細胞、ならびにキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）由来Schneider 2（S2）細胞およびSchneider 3（S3）細胞が含まれるが、それらに限定されるわけではない。哺乳動物宿主細胞の非限定例には、HEK293細胞、HeLa細胞、CHO細胞、COS細胞、ジャーカット細胞、NS0ハイブリドーマ細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、MDCK細胞、NIH-3T3線維芽細胞、および哺乳動物細胞由来の任意の他の不死化細胞株が含まれる。
【０１４７】
ある態様では、本発明は、生細胞内で活性シクロプロパン化触媒である、本明細書に記載のP450変異体などのヘム酵素を提供する。非限定例として、細菌細胞（例えば、大腸菌）を、本発明のインビボシクロプロパン化反応のためのホールセル触媒として用いることができる。いくつかの態様において、等価の突然変異C400Xを有するP450酵素を含むホールセル触媒は、単離P450酵素を用いてのインビトロ反応に比べて、トータルターンオーバー数（TTN）を有意に増強することが判明している。
【０１４８】
B.化合物
本発明の方法を用いて、多数のシクロプロパン化生成物を提供することができる。シクロプロパン化生成物には、日用品およびファインケミカル、香料および香水、殺虫剤、ならびに薬学的組成物中の活性成分を含むが、それらに限定されるわけではない、化合物のいくつかのクラスが含まれる。シクロプロパン化生成物は、これらおよび他のクラスに属する化合物の合成のための出発原料または中間体としても役立ちうる。
【０１４９】
いくつかの態様において、シクロプロパン化生成物は式Iの化合物：
2015534464.tif 000026
である。
【０１５０】
式Iの化合物について、R1は、H、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよい6〜10員ヘテロアリール、ハロ、シアノ、C(O)OR1a、C(O)N(R7)2、C(O)R8、C(O)C(O)OR8、およびSi(R8)3から独立に選択され；R2は、H、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよい6〜10員ヘテロアリール、ハロ、シアノ、C(O)OR2a、C(O)N(R7)2、C(O)R8、C(O)C(O)OR8、およびSi(R8)3から独立に選択される。R1aおよびR2aは、H、置換されていてもよいC1-18アルキルおよび-L-RCから独立に選択される。
【０１５１】
部分-L-RCが存在する場合、Lは、結合、-C(RL)2-、および-NRL-C(RL)2-から選択される。各RLは、H、C1-6アルキル、ハロ、-CN、および-SO2から独立に選択され、各RCは、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよい6〜10員ヘテロルアリール、および置換されていてもよい6〜10員ヘテロシクリルから選択される。
【０１５２】
式Iの化合物について、R3、R4、R5、およびR6は、H、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、C2-18アルキニル、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよいC1-C6アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、C(O)N(R7)2、NR7C(O)R8、C(O)R8、C(O)OR8、およびN(R9)2から独立に選択される。各R7およびR8は、H、置換されていてもよいC1-12アルキル、置換されていてもよいC2-12アルケニル、および置換されていてもよいC6-10アリールから独立に選択される。各R9は、H、置換されていてもよいC6-10アリール、および置換されていてもよい6〜10員ヘテロアリールから独立に選択される。または、2つのR9部分は、それらが結合している窒素原子と一緒に6〜18員ヘテロシクリルを形成することができる。
【０１５３】
またはR3はR4と共に、置換されていてもよい3〜18員環を形成し、またはR5はR6と共に、置換されていてもよい3〜18員環を形成する。R3またはR4はR5またはR6と共に、二重結合を形成することもできる。R3またはR4はR5またはR6と共に、置換されていてもよい5〜6員環を形成する。
【０１５４】
いくつかの態様において、シクロプロパン化生成物は前述の式Iの化合物であり、式中、R1はC(O)O-LRcであり；R2はHおよび置換されていてもよいC6-10アリールから選択され；R3、R4、R5、およびR6は、H、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC2-6アルケニル、置換されていてもよいC2-6アルキニル、置換されていてもよいC6-10アリール、およびハロから独立に選択される。または、R3はR4と共に、置換されていてもよい3〜18員環を形成することができ、またはR5はR6と共に、置換されていてもよい3〜18員環を形成することができる。そのような態様において、シクロプロパン化生成物はピレスロイドまたはピレスロイド前駆体でありうる。
【０１５５】
一般に、ピレスロイドは式IIIの構造：
2015534464.tif 000027
を有するエステル中核によって特徴付けられる。
【０１５６】
式IIIは、LR1c部分（「B」）でエステル化されたシクロプロピルカルボン酸部分（「A」）として上に示され、R1cはRCと同様に定義される。本発明の方法を用いて、任意の様々な「B」部分に連結された様々な「A」部分を有するピレスロイドおよびピレスロイド中間体を調製することもできる。例えば、ピレスロイドは下記：
2015534464.tif 000028
2015534464.tif 000029
から選択される「A」部分を有しうる。
【０１５７】
上に挙げたA部分について、X1は、H、置換されていてもよいC1-6アルキル、ハロC1-6アルキル、置換されていてもよいC1-6アルコキシ、ハロC1-6アルキル、置換されていてもよいC1-6アルキルチオ、C1-6アルキルシリル、ハロ、およびシアノから選択される。X2は、H、クロロ、およびメチルから選択される。X3は、H、メチル、ハロ、およびCNから選択される。各X4は、独立にハロである。各X5は、メチルおよびハロから独立に選択される。X6は、ハロ、置換されていてもよいC1-6アルキル、および置換されていてもよいC1-6アルコキシから選択される。X7は、H、メチル、およびハロから選択される。X8は、H、ハロ、および置換されていてもよいC1-6アルキルから選択される。X9は、H、ハロ、置換されていてもよいC1-6アルキル、C(O)O-(C1-6アルキル)、C(O)-N(C1-6アルキル)2、およびシアノから選択される。Z1、Z2、およびZ3は、H、ハロ、置換されていてもよいC1-6アルキル、および置換されていてもよいC6-10アリールから独立に選択されるか、またはZ1およびZ2は一緒になって、置換されていてもよい5〜6員シクロアルキルもしくはヘテロシクリル基を形成する。各構造の右の波線はA部分とB部分との間の連結点を表す。
【０１５８】
ピレスロイドは下記：
2015534464.tif 000030
2015534464.tif 000031
から選択される「B」部分を有しうる。
【０１５９】
上に挙げたB部分について、各Y1は、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC2-6アルケニル、置換されていてもよいC2-6アルキニル、フェニル、および(フェニル)C1-6アルコキシから独立に選択される。各Y2は、ハロ、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC2-6アルケニル、置換されていてもよいC1-6アルコキシ、およびニトロから独立に選択される。各Y3は、独立に置換されていてもよいC1-6アルキルである。各Y4は、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC2-6アルケニル、置換されていてもよいC2-6アルキニル、C6-10アリール-C1-6アルキル、フルフリル、C1-6アルコキシ、(C2-6アルケニル)オキシ、C1-12アシル、およびハロから独立に選択される。Y5は、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC1-6アルコキシ、およびハロからなる群より選択される。下付き文字mは1〜3の整数であり、下付き文字nは1〜5の整数であり、下付き文字pは1〜4の整数であり、下付き文字qは0〜3の整数である。各構造の左の波線はB部分とA部分との間の連結点を表す。
【０１６０】
本発明の方法を用いて、任意のB部分に連結された任意のA部分を有するピレスロイドを調製することができる。所与のピレスロイドは以下：
2015534464.tif 000032
2015534464.tif 000033
2015534464.tif 000034
2015534464.tif 000035
2015534464.tif 000036
から選択される構造を有しうる。A部分をB部分に連結して、上の式IIIに示すエステル結合を形成する。
【０１６１】
本発明の方法に従って調製したピレスロイドは、例えば、下記：
2015534464.tif 000037
から選択される構造を有しうる。Z1、Z2、およびZ3は、H、ハロ、置換されていてもよいC1-6アルキル、および置換されていてもよいC6-10アリールから独立に選択される。Z1およびZ2は一緒になって、置換されていてもよい5〜6員シクロアルキルまたはヘテロシクリル基を形成することもできる。
【０１６２】
いくつかの態様において、本発明の方法を用いて、前述のピレスロイド化合物に変換しうるピレスロイド中間体化合物を調製することができる。シクロプロパンカルボン酸およびシクロプロパンカルボン酸誘導体のアルキルエステルを、適切なアルコールとの反応を介して、様々なピレスロイド化合物に変換することができる。
【０１６３】
したがって、本発明のいくつかの態様は、シクロプロパン化生成物が式IIの化合物：
2015534464.tif 000038
である方法を提供する。式IIの化合物について、R1aはC1-6アルキルであり、R2はHおよび置換されていてもよいC6-10アリールから選択される。いくつかの態様において、R2はHである。いくつかの態様において、式IIの化合物は下記：
2015534464.tif 000039
から選択される。
【０１６４】
そのような態様において、X1は、H、置換されていてもよいC1-6アルキル、ハロC1-6アルキル、置換されていてもよいC1-6アルコキシ、置換されていてもよいC1-6アルキルチオ、C1-6アルキルシリル、ハロ、およびシアノから選択される。X2は、H、クロロ、およびメチルから選択される。X3は、H、メチル、ハロ、およびCNから選択される。各X4は、独立にハロである。各X5は、メチルおよびハロから独立に選択される。X6は、ハロ、置換されていてもよいC1-6アルキル、および置換されていてもよいC1-6アルコキシから選択される。X7は、H、メチル、およびハロから選択される。X8は、H、ハロ、および置換されていてもよいC1-6アルキルから選択される。X9は、H、ハロ、置換されていてもよいC1-6アルキル、C(O)O-(C1-6アルキル)、C(O)-N(C1-6アルキル)2、およびシアノから選択される。Z1、Z2、およびZ3は、H、ハロ、置換されていてもよいC1-6アルキル、および置換されていてもよいC6-10アリールから独立に選択される。Z1およびZ2は一緒になって、置換されていてもよい5〜6員シクロアルキルまたはヘテロシクリル基を形成することもできる。
【０１６５】
いくつかの態様において、本発明の方法は、式IIのシクロプロパン化生成物を式IIIの化合物：
2015534464.tif 000040
に変換する段階を含む。
【０１６６】
式IIIの化合物について、Lは、結合、-C(RL)2-、および-NRL-C(RL)2-から選択される。各RLは、H、-CN、および-SO2から独立に選択される。R1cは、置換されていてもよいC6-10アリール、置換されていてもよい6〜10員ヘテロルアリール、および置換されていてもよい6〜10員ヘテロシクリルから選択される。いくつかの態様において、式IIIの化合物におけるLは、結合、-CH2-、-CH(CN)-、および-N(SO2)-CH2から選択される。
【０１６７】
いくつかの態様において、式IIIの化合物における部分L-R1cは下記：
2015534464.tif 000041
から選択される構造を有する。
【０１６８】
そのような態様において、各Y1は、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC2-6アルケニル、置換されていてもよいC2-6アルキニル、フェニル、および(フェニル)C1-6アルコキシから独立に選択される。各Y2は、ハロ、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC2-6アルケニル、置換されていてもよいC1-6アルコキシ、およびニトロから独立に選択される。各Y3は、独立に置換されていてもよいC1-6アルキルである。各Y4は、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC2-6アルケニル、置換されていてもよいC2-6アルキニル、C6-10アリール-C1-6アルキル、フルフリル、C1-6アルコキシ、(C2-6アルケニル)オキシ、C1-12アシル、およびハロから独立に選択される。Y5は、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC1-6アルコキシ、およびハロからなる群より選択される。下付き文字mは1〜3の整数であり、下付き文字nは1〜5の整数であり、下付き文字pは1〜4の整数であり、下付き文字qは0〜3の整数である。各構造の左の波線は部分-L-R1cと式IIIの化合物の残部との間の連結点を表す。
【０１６９】
いくつかの態様において、式IIIの化合物は下記：
2015534464.tif 000042
から選択される。
【０１７０】
いくつかの態様において、式IIIの化合物はレスメトリンである。
【０１７１】
本明細書において論じるピレスロイドに関して、多数の他の化合物を、シクロプロパン化生成物を含む工程を介して合成することができる。そのような工程を、オレフィン基質およびジアゾ試薬からのシクロプロパン化生成物の酵素触媒による生成と、続く薬剤などの最終生成物への化学的変換を示す、スキーム1に概括する。特定の最終生成物に依存して、工程は、最終生成物の調製の前に、シクロプロパン化生成物の1つまたは複数の合成中間体への変換を含みうる。そのような工程において有用なシクロプロパン化生成物の非限定例を表6にまとめる。
スキーム1
2015534464.tif 000043
【０１７２】
（表６）生物活性化合物への途中の中間体合成のためのシクロプロパン化
2015534464.tif 000044
2015534464.tif 000045
2015534464.tif 000046
【０１７３】
いくつかの態様において、シクロプロパン化生成物は以下の式の構造を有する化合物：
2015534464.tif 000047
である。式中、R1aは、置換されていてもよいC1-6アルキルであり、R5およびR6は、H、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていてもよいC6-10アリール、C(O)N(R7)2、C(O)OR8およびNR7C(O)R8から独立に選択される。
【０１７４】
いくつかの態様において、シクロプロパン化生成物は下記：
2015534464.tif 000048
から選択される構造を有する。そのような態様において、本発明の方法は、シクロプロパン化生成物を、ミルナシプラン、レボミルナシプラン、ビシファジン、および1-(3,4-ジクロロフェニル)-3-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンから選択される化合物に変換する段階を含みうる。
【０１７５】
本発明の方法を用いて、シクロプロパン官能基を有するいくつかの異なる型の化合物を調製することができる。化合物には、キラルシクロプロパン部分を有する薬剤、アキラルシクロプロパン部分を有する薬剤、殺虫剤、植物ホルモン、香料、香水、および脂肪酸が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１７６】
いくつかの態様において、本発明の方法を用いて、下記：
2015534464.tif 000049
2015534464.tif 000050
から選択される化合物を調製する。
【０１７７】
タンパク質キナーゼC活性化因子であるプロストラチンの合成を、スキーム2に非限定例として示す。プロストラチンのシクロプロパン部分を、ヘム酵素が触媒する分子内または分子間シクロプロパン化反応によって導入することができる。
スキーム2
2015534464.tif 000051
【０１７８】
本発明のいくつかの態様は、前述の方法を提供し、ここでオレフィン基質はアルケン、シクロアルカン、およびアリールアルケンからなる群より選択される。いくつかの態様において、オレフィン基質はアリールアルケンである。いくつかの態様において、アリールアルケンはスチレンである。
【０１７９】
いくつかの態様において、スチレンは以下の式：
2015534464.tif 000052
を有する。R3は、H、置換されていてもよいC1-C6アルキル、置換されていてもよいC1-C6アルコキシ、C(O)N(R7)2、C(O)OR8、N(R9)2、ハロ、ヒドロキシ、およびシアノから選択される。R5およびR6は、H、置換されていてもよいC1-6アルキル、およびハロから独立に選択される。R10は、置換されていてもよいC1-C6アルキル、置換されていてもよいC1-C6アルコキシ、ハロ、およびハロアルキルから選択され、下付き文字rは0〜2の整数である。
【０１８０】
一般に、本発明の方法において有用なジアゾ試薬は以下の構造：
2015534464.tif 000053
を有する。式中、R1およびR2は、シクロプロパン化生成物と同様に定義される。任意のジアゾ試薬を反応に試薬自体として加えることもでき、またはジアゾ試薬をインサイチューで調製することもできる。
【０１８１】
いくつかの態様において、ジアゾ試薬は、α-ジアゾエステル、α-ジアゾアミド、α-ジアゾニトリル、α-ジアゾケトン、α-ジアゾアルデヒド、およびα-ジアゾシランから選択される。いくつかの態様において、ジアゾ試薬は下記：
2015534464.tif 000054
から選択される式を有する。式中、R1aは、Hおよび置換されていてもよいC1-C6アルキルから選択され；各R7およびR8は、H、置換されていてもよいC1-12アルキル、置換されていてもよいC2-12アルケニル、および置換されていてもよいC6-10アリールから独立に選択される。
【０１８２】
いくつかの態様において、ジアゾ試薬はジアゾメタン、ジアゾ酢酸エチル、および(トリメチルシリル)ジアゾメタンからなる群より選択される。
【０１８３】
いくつかの態様において、ジアゾ試薬はα-ジアゾエステルである。いくつかの態様において、ジアゾ試薬は以下の式：
2015534464.tif 000055
を有する。
【０１８４】
いくつかの態様において、シクロプロパン化生成物は下記から選択される式：
2015534464.tif 000056
を有する。
【０１８５】
当業者であれば、シクロプロパン化生成物の立体化学的配置は、シクロプロパン化段階におけるスチレンなどのオレフィン基質の位置に対するジアゾ試薬の配向によって部分的に決定されることを理解するであろう。例えば、オレフィン基質起源の任意の置換基は、シクロプロピル環に対してジアゾ試薬起源の置換基と同じ側に位置しうる。この配置を有するシクロプロパン化生成物は「シス」化合物または「Z」化合物と呼ぶ。オレフィン基質起源の任意の置換基およびジアゾ試薬起源の任意の置換基は、シクロプロピル環の反対側にあってもよい。この配置を有するシクロプロパン化生成物は「トランス」化合物または「E」化合物と呼ぶ。そのような配置の一例を図29の反応スキームに示す。
【０１８６】
図29に示すとおり、2つのシス異性体および2つのトランス異性体は、オレフィン基質とジアゾ試薬との反応から生じうる。2つのシス異性体は、構造が互いに重ね合わせできない鏡像であるため、互いに鏡像異性体である。同様に、2つのトランス異性体は鏡像異性体である。当業者であれば、シクロプロパン化生成物の絶対立体化学、すなわち、所与のキラル中心が右手の「R」配置または左手の「S」配置のいずれを示すかは、反応に用いる特定のオレフィン基質およびジアゾ試薬の構造ならびに酵素の同一性を含む因子に依存することを理解するであろう。これは、相対立体化学、すなわち、シクロプロパン化生成物がシスまたはトランス配置のいずれを示すか、ならびにシクロプロパン化生成物混合物の分布についても同じで、そのような因子に依存することになる。
【０１８７】
一般に、シクロプロパン化生成物混合物は、約1：99〜約99：1の範囲のシス：トランス比を有する。シス：トランス比は、例えば、約1：99〜約1：75、または約1：75〜約1：50、または約1：50〜約1：25、または約99：1〜約75：1、または約75：1〜約50：1、または約50：1〜約25：1でありうる。シス：トランス比は約1：80〜約1：20、または約1：60〜約1：40、または約80：1〜約20：1または約60：1〜約40：1でありうる。シス：トランス比は約1：5、1：10、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40、1：45、1：50、1：55、1：60、1：65、1：70、1：75、1：80、1：85、1：90、または約1：95でありうる。シス：トランス比は約5：1、10：1、15：1、20：1、25：1、30：1、35：1、40：1、45：1、50：1、55：1、60：1、65：1、70：1、75：1、80：1、85：1、90：1、または約95：1でありうる。
【０１８８】
シクロプロパン化生成物混合物の分布を、混合物の鏡像体過剰率、または「％ee」に関して評価することができる。鏡像体過剰率とは、混合物中の2つの鏡像体のモル分率の差を意味する。例えば、図29の反応スキームを非限定例として、「E」またはトランス（R,R）および（S,S）鏡像体の鏡像体過剰率は以下の式を用いて計算することができる：％eeE＝[(χR,R-χS,S)/(χR,R+χS,S)]×100％、ここでχは所与の鏡像体のモル分率である。「Z」またはシス鏡像体の鏡像体過剰率（％eeZ）を同じ様式で計算することができる。
【０１８９】
一般に、シクロプロパン化生成物混合物は、約1％〜約99％、または約-1％〜約-99％の範囲の％ee値を示す。所与の％ee値が99％（または-99％）に近いほど、反応混合物は純粋である。％eeは、例えば、約-90％〜約90％、または約-80％〜約80％、または約-70％〜約70％、または約-60％〜約60％、または約-40％〜約40％、または約-20％〜約20％でありうる。％eeは約1％〜約99％、または約20％〜約80％、または約40％〜約60％、または約1％〜約25％、または約25％〜約50％、または約50％〜約75％でありうる。％eeは約-1％〜約-99％、または約-20％〜約-80％、または約-40％〜約-60％、または約-1％〜約-25％、または約-25％〜約-50％、または約-50％〜約-75％でありうる。％eeは約-99％、-95％、-90％、-85％、-80％、-75％、-70％、-65％、-60％、-55％、-50％、-45％、-40％、-35％、-30％、-25％、-20％、-15％、-10％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、または約95％でありうる。任意のこれらの値は％eeE値または％eeZ値でありうる。
【０１９０】
したがって、本発明のいくつかの態様は、約-90％〜約90％の％eeZを有する複数のシクロプロパン化生成物を生成する方法を提供する。いくつかの態様において、％eeZは少なくとも90％である。いくつかの態様において、％eeZは少なくとも-99％である。いくつかの態様において、％eeEは約-90％〜約90％である。いくつかの態様において、％eeEは少なくとも90％である。いくつかの態様において、％eeEは少なくとも-99％である。
【０１９１】
関連する局面において、本発明のある態様では、本明細書に記載の式I、II、IIIのいずれかのシクロプロパン含有化合物を提供する。化合物を、本発明の方法を用いて調製する。いくつかの態様において、本発明は、本発明の方法に従って調製したピレスロイドを提供する。いくつかの態様において、本発明は、本発明の方法に従って調製したミルナシプラン、レボミルナシプラン、ビシファジン、または1-(3,4-ジクロロフェニル)-3-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンを提供する。いくつかの態様において、本発明は、表6に例示する化合物のいずれかを提供し、これらの化合物は本発明の方法に従って調製する。本発明は、本明細書に記載の方法に従って調製した他の化合物を提供しうる。
【０１９２】
C. 反応条件
本発明の方法は、本明細書に記載のヘム酵素を含む反応混合物を生成する段階を含む。ヘム酵素は、例えば、反応混合物に加える前に精製することができ、または反応混合物中に存在する細胞によって分泌されてもよい。反応混合物は、酵素を含む細胞溶解物、ならびに他のタンパク質および他の細胞材料を含みうる。または、ヘム酵素は、ヘム酵素を発現する細胞内で反応を触媒しうる。本明細書の方法において、任意の適切な量のヘム酵素を用いることができる。一般に、シクロプロパン化反応混合物は、ジアゾ試薬および/またはオレフィン基質に対して、約0.01mol％〜約10mol％のヘム酵素を含む。反応混合物は、例えば、約0.01mol％〜約0.1mol％のヘム酵素、または約0.1mol％〜約1mol％のヘム酵素、または約1mol％〜約10mol％のヘム酵素を含みうる。反応混合物は、約0.05mol％〜約5mol％のヘム酵素、または約0.05mol％〜約0.5mol％のヘム酵素を含みうる。反応混合物は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、または約1mol％のヘム酵素を含みうる。
【０１９３】
オレフィン基質およびジアゾ試薬の濃度は、典型的には約100μM〜約1Mの範囲である。濃度は、例えば、約100μM〜約1mM、または約1mM〜約100mM、または約100mM〜約500mM、または約500mM〜1Mでありうる。濃度は、約500μM〜約500mM、500μM〜約50mM、または約1mM〜約50mM、または約15mM〜約45mM、または約15mM〜約30mMでありうる。オレフィン基質またはジアゾ試薬の濃度は、例えば、約100、200、300、400、500、600、700、800、または900μMでありうる。オレフィン基質またはジアゾ試薬の濃度は、約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、または500mMでありうる。
【０１９４】
反応混合物はさらなる試薬を含みうる。非限定例として、反応混合物は緩衝剤（例えば、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（MES）、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸（HEPES）、3-モルホリノプロパン-1-スルホン酸（MOPS）、2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-プロパン-1,3-ジオール（TRIS）、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸緩衝化食塩水、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、およびホウ酸ナトリウム）、共溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、エタノール、メタノール、イソプロパノール、グリセロール、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、および酢酸）、塩（例えば、NaCl、KCl、CaCl2、ならびにMn2+およびMg2+の塩）、変性剤（例えば、尿素および塩酸グアニジン）、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウムおよびトリトン-X 100）、キレート剤（例えば、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、2-({2-[ビス(カルボキシメチル)アミノ]エチル}(カルボキシメチル)アミノ)酢酸（EDTA）、および1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA））、糖（例えば、グルコース、スクロースなど）、および還元剤（例えば、亜ジチオン酸ナトリウム、NADPH、ジチオスレイトール（DTT）、β-メルカプトエタノール（BME）、およびトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（TCEP））を含みうる。緩衝剤、共溶媒、塩、変性剤、界面活性剤、キレート剤、糖、および還元剤は、任意の適切な濃度で用いることができ、これは当業者であれば容易に決定することができる。一般に、緩衝剤、共溶媒、塩、変性剤、界面活性剤、キレート剤、糖、および還元剤は、存在する場合には、反応混合物中に約1μM〜約1Mの範囲の濃度で含まれる。例えば、緩衝剤、共溶媒、塩、変性剤、界面活性剤、キレート剤、糖、または還元剤は、反応混合物中に約1μM、または約10μM、または約100μM、または約1mM、または約10mM、または約25mM、または約50mM、または約100mM、または約250mM、または約500mM、または約1Mの濃度で含まれうる。いくつかの態様において、還元剤はオレフィン基質およびジアゾ試薬に対して準化学量論量で用いる。特に、共溶媒は反応混合物中に約1体積％〜約75体積％の範囲、またはそれ以上の量で含まれうる。共溶媒は反応混合物中に、例えば、約5、10、20、30、40、または50体積％の量で含まれうる。
【０１９５】
反応は、シクロプロパン化生成物の生成を触媒するのに十分な条件下で行う。反応は、任意の適切な温度で行いうる。一般に、反応は、約4℃〜約40℃の温度で行う。反応は、例えば、約25℃または約37℃で行いうる。反応は、任意の適切なpHで行いうる。一般に、反応は約6〜約10のpHで行う。反応は、例えば、約6.5〜約9のpHで行いうる。反応は、任意の適切な時間行いうる。一般に、反応混合物を適切な条件下、約1分から約数時間の間の任意の時間インキュベートする。反応は、例えば、約1分間、または約5分間、または約10分間、または約30分間、または約1時間、または約2時間、または約4時間、または約8時間、または約12時間、または約24時間、または約48時間、または約72時間行いうる。反応は、好気性条件下または嫌気性条件下で行いうる。反応は、窒素雰囲気またはアルゴン雰囲気などの、不活性雰囲気下で行いうる。いくつかの態様において、溶媒を反応混合物に加える。いくつかの態様において、溶媒は第二の層を形成し、シクロプロパン化は水層において起こる。いくつかの態様において、ヘム酵素は水層に位置するが、基質および/または生成物は有機層に出現する。特定のヘム酵素、オレフィン基質、またはジアゾ試薬の同一性に依存して、本発明の方法において他の反応条件を用いてもよい。
【０１９６】
反応は、本発明のヘム酵素を発現する無傷の細胞によりインビボで行いうる。インビボ反応は、本明細書に記載の、ヘム酵素の発現に用いる任意の宿主細胞で行いうる。細胞の懸濁液を、栄養素（ミネラル微量栄養素、グルコースおよび他の燃料源など）を補足した適切な培地中で生成する。インビボでの反応からのシクロプロパン化収率は、部分的には、反応混合物中の細胞密度を制御することによって制御しうる。600nmで約0.1〜約50の範囲の光学密度を示す細胞懸濁液を、シクロプロパン化反応に使用しうる。細胞の種類、具体的なヘム酵素、または他の因子に依存して、他の密度も有用でありうる。
【０１９７】
本発明の方法を、シクロプロパン化反応のジアステレオ選択性および/またはエナンチオ選択性、すなわち、ジアステレオマーまたは鏡像異性体のいずれかにかかわらず、反応が特定の異性体を生じる程度について、評価することができる。完全に選択的な反応は、異性体が生成物の100％を構成するような、単一の異性体を生成する。別の非限定例として、全生成物の90％を構成する特定の鏡像異性体を生成する反応は、90％エナンチオ選択的と言うことができる。一方で、全生成物の30％を構成する特定のジアステレオマーを生成する反応は、30％ジアステレオ選択的と言うことができる。
【０１９８】
一般に、本発明の方法は、約1％〜約99％ジアステレオ選択的な反応を含む。反応は約1％〜約99％エナンチオ選択的である。反応は、例えば、約10％〜約90％ジアステレオ選択的、または約20％〜約80％ジアステレオ選択的、または約40％〜約60％ジアステレオ選択的、または約1％〜約25％ジアステレオ選択的、または約25％〜約50％ジアステレオ選択的、または約50％〜約75％ジアステレオ選択的でありうる。反応は、約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、または約95％ジアステレオ選択的でありうる。反応は、約10％〜約90％エナンチオ選択的、約20％〜約80％エナンチオ選択的、または約40％〜約60％エナンチオ選択的、または約1％〜約25％エナンチオ選択的、または約25％〜約50％エナンチオ選択的、または約50％〜約75％エナンチオ選択的でありうる。反応は約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、または約95％エナンチオ選択的でありうる。したがって、本発明のいくつかの態様は、反応が少なくとも30％〜少なくとも90％、ジアステレオ選択的である方法を提供する。いくつかの態様において、反応は少なくとも30％〜少なくとも90％エナンチオ選択的である。
【実施例】
【０１９９】
IV. 実施例
本発明を具体例によってより詳細に記載する。以下の実施例は例示のために提供するものであり、いかなる様式でも本発明を限定することを意図するものではない。当業者であれば、変更または改変して本質的に同じ結果を得ることができる様々な不可欠ではないパラメーターを容易に認識するであろう。
【０２００】
実施例1. 酵素触媒カルベノイド挿入によるC=C官能基化
本実施例は、生物学的に対応する反応が知られていない、高度に立体選択的なカルベンのアリール置換オレフィンへの移動を触媒するように操作された細菌チトクロムP450を例示する。
【０２０１】
進化の特徴の1つである、新規反応を触媒する酵素を創製することは、タンパク質工学における非常に大きい挑戦であり、ほとんど未開拓の最前線である。カルベンのC=C結合への移動は、生物学的対応物のない強力な触媒法である。これらの変換の立体制御は現在のところ、有毒な有機溶媒を必要とし、系統的に改変または最適化することが難しい、高価な遷移金属触媒に頼っている。本実施例は、このモノオキシゲナーゼに対して以前には知られていなかった重要な反応：精巧なエナンチオおよびジアステレオ制御を伴うジアゾエステル試薬からのスチレンのシクロプロパン化を触媒する、チトクロムP450BM3の変異体を例示する。したがって、本実施例は、既存の酵素を、天然ではこれまで観察されていない合成的に重要な反応の触媒作用のために適合させうることを示す。
【０２０２】
序論
生物学の世界で進化したC=C結合を官能基化するための多くの戦略は、「生物模倣」触媒の開発を試みる化学者の想像力を魅了した（J. T. Groves, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 3569 (2003)；R. Breslow, J. Biol. Chem. 284, 1337 (2009)）。この逆で、合成化学によって着目された新しい生体触媒の開発は、主に我々がタンパク質配列において所望の機能をどのようにコードするかをよく理解していないために、あまり注目されていない。天然の全触媒レパートリーが、生理学的に利用可能な試薬により構築され、それらを利用している。同じ制限を受けることなく、合成化学者は、天然物中間体および人工薬物の合成において広く用いられる反応の、遷移金属触媒カルベノイド挿入に基づく直接C=C官能基化の強力な方法を開発した（H. M. L. Davies et al., Nature 451, 417 (2008)）。典型的には、受容体置換ジアゾ試薬の形の高エネルギー前駆体を用いて、これらの合成系は、二窒素押出し後に、C=C結合に挿入されて新しい炭素-炭素中心を形成する、金属カルベノイド中間体を生成する。しかし、合成触媒は、立体制御のために高価な遷移金属および精巧な配位子デザインを必要とし；また、有毒な有機溶媒を必要とすることも多い。本実施例は、酵素によって提供される高いレベルの選択性および「グリーン」な工程条件と遷移金属触媒作用によって可能となるカルベン移動戦略の合成力との組み合わせを示す。
【０２０３】
結果
多様なチトクロムP450酵素ファミリーのメンバーは、ヒドロキシル化、エポキシ化、酸化的環カップリング、ヘテロ原子遊離、およびヘテロ原子酸素化を含む、無数の酸化的変換を触媒する（E. M. Isin et al., Biochim. Biophys. Acta 1770, 314 (2007)）。この広い触媒範囲に含まれる変換の大多数は、同じ高原子価の鉄-オキセン中間体（化合物I、図1）を示すものである。チトクロムP450が酸素原子をC=C結合に挿入しうる、高度な化学、位置および立体選択性に着目し、これらの酵素を操作して、高原子価の鉄-エノイド種を介しての等電子カルベン移動反応についてこの化学を模倣しうるかどうかを調べた（図1）。本実施例は、バチルス メガテリウム由来のチトクロムP450の変異体（CYP102A1、またはP450BM3）が、スチレンの不斉メタロカルベン仲介性シクロプロパン化の効率的触媒であることを示す。
【０２０４】
鉄ポルフィリンはカルベンに基づくシクロプロパン化を触媒することが公知である（J. R. Wolf et al., J. Am. Chem. Soc. 117, 9194 (1995)）ため、いくつかの一般的なヘムタンパク質が測定可能なレベルの「シクロプロパナーゼ」活性を示すかどうかをまず調べた。新しいシクロプロパン化触媒の有効性を確認するための詳細に認知されたモデル系である、スチレンとジアゾ酢酸エチル（EDA）との間の反応（図2）を調査した。最初の実験は、水中、還元剤（例えば、亜ジチオン酸ナトリウム）存在下、嫌気性条件下で、所望のシクロプロパン化生成物の最適な生成が起こることを示した（表7〜10）。西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）、チトクロムc（cyt c）、ミオグロビン（Mb）およびP450BM3はすべてシクロプロパン生成物に対する多様なターンオーバーを示し、そのうちHRP、cyt cおよびMbは無視できるエナンチオ誘導を示し、トランスシクロプロパンを90％を超える選択性で生じたが、これは遊離ヘミンによって誘導されるジアステレオ選択性に匹敵する（表7）。興味深いことに、P450BM3は、シクロプロパン生成物を低収率で生成したにもかかわらず、異なるジアステレオ選択性（シス：トランス37：63）およびわずかなエナンチオ誘導を伴って反応を触媒し（表11）、カルベン移動および選択性は、タンパク質から遊離されたヘミンではなく、活性部位に結合したヘム補助因子によって規定されることを示していた。
【０２０５】
（表７）嫌気性条件下、亜ジチオン酸ナトリウム（Na2S2O4）存在下でのヘム触媒
2015534464.tif 000057
aジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析によりもとめた。b(R,S)-(S,R)。c(R,R)-(S,S)。d生物変換は0.1Mクエン酸緩衝液、pH＝4.0で行った。
【０２０６】
（表８）嫌気性条件下、Na2S2O4非存在下でのヘム触媒
2015534464.tif 000058
aジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析によりもとめた。b(R,S)-(S,R)。c(R,R)-(S,S)。d生物変換は0.1Mクエン酸緩衝液、pH＝4.0で行った。
【０２０７】
（表９）好気性条件下、Na2S2O4存在下でのヘム触媒
2015534464.tif 000059
aジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析によりもとめた。b(R,S)-(S,R)。c(R,R)-(S,S)。d生物変換は0.1Mクエン酸緩衝液、pH＝4.0で行った。
【０２０８】
（表１０）好気性条件下、Na2S2O4非存在下でのヘム触媒
2015534464.tif 000060
aジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析によりもとめた。b(R,S)-(S,R)。c(R,R)-(S,S)。d生物変換は0.1Mクエン酸緩衝液、pH＝4.0で行った。
【０２０９】
（表１１）立体選択的P450BM3シクロプロパナーゼ
反応をリン酸緩衝液（pH8.0）中、室温、アルゴン雰囲気下で、30mMスチレン、10mM EDA、0.2mole％触媒（EDAに対して）、および10mM亜ジチオン酸ナトリウムと行った。収率、ジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析によりもとめた。aEDAに基づく。b(R,S)-(S,R)。c(R,R)-(S,S)。変異体9-10A-TS-F87V-T268AはC3Cと示す。他の配列同一性は表12に記載する。
2015534464.tif 000061
【０２１０】
ヘム触媒シクロプロパン化の活性および選択性を、タンパク質配列を操作することによって増強しうるかどうかを調べた。P450BM3は詳細に試験された、溶解性、自己充足的（ヘムおよびジフラビンレダクターゼドメインが単一のポリペプチド中で融合されている）、長鎖脂肪酸モノオキシゲナーゼである。10年以上のタンパク質改変により、この生体触媒の機能的柔軟性が証明されている（C. J. C. Whitehouse et al., Chem. Soc. Rev. 41, 1218 (2012)）。広範な基質に対してモノオキシゲナーゼ活性を示す何千もの変異体が、合成適用のためにチトクロムP450BM3を操作するための指向性進化を用いて蓄積されている（J. C. Lewis et al., Chimia 63, 309 (2009)）。これらの変異体のいくつかを、変更されたシクロプロパン化ジアステレオおよびエナンチオ選択性について、キラルガスクロマトグラフィで試験した。活性およびタンパク質配列の多用性で選択した、92種のP450BM3変異体の一団を、好気性条件下、亜ジチオン酸ナトリウム存在下でのスチレンおよびEDAの反応について、大腸菌溶解物中でスクリーニングした（表12および13）。10種の最も有望なヒットを選択して、精製し、続いて標準化嫌気性反応条件下で特徴付けを行った（表11および14）。
【０２１１】
（表１２）P450BM3の編集プレートスクリーンからの生データ
ジアステレオおよびエナンチオ選択性を、キラルβ-CDXカラムを固定相として用いるガスクロマトグラフィにより調べた。
2015534464.tif 000062
2015534464.tif 000063
2015534464.tif 000064
2015534464.tif 000065
キラルβ-CDXカラムでのガスクロマトグラフィにより調べた。a内部標準の面積を上回るシクロプロパンピークの面積の合計で報告した。bジアステレオマー過剰率＝([シス]-[トランス])/([シス]+[トランス])。c(R,S)-(S,R)。1P. Meinhold et al., Adv. Synth. Catal. 348, 763 (2006)。2J. C. Lewis et al., Chembiochem : a European journal of chemical biology 11, 2502 (2010)。3J. C. Lewis et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 16550 (2009)。4M. W. Peters et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 13442 (2003)。5A. Glieder et al., Nat. Biotechnol. 20, 1135 (2002)。6R. Fasan et al., Angew. Chem., Int. Ed. 46, 8414 (2007)。
【０２１２】
（表１３）編集プレートにおけるキメラP450に対する生GCスクリーニングデータ
2015534464.tif 000066
a内部標準の面積を上回るシクロプロパンピークの面積の合計で報告した。bジアステレオマー過剰率＝([シス]-[トランス])/([シス]+[トランス])。c(R,S)-(S,R)。1C. R. Otey et al., PLoS Biol. 4, 789 (2006)。2M. Landwehr et al., Chem. Biol. 14, 269 (2007)。3つの細菌チトクロムP450の部位特異的組換えを、タンパク質構造内で崩壊した接触部の数を最小化するように選択した配列交差部位で実施した。7つの交差部位を選び、8つの配列ブロックが生じた。番号付けとは、各ブロックにおける親配列の同一性を意味する。例えば、「12312312」とは、P450 1からのブロック1、P450 2からのブロック2、P450 3からのブロック3などを含む配列を意味する。
【０２１３】
（表１４）立体選択的P450BM3に基づくシクロプロパナーゼ
2015534464.tif 000067
aEDAに基づく。bジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析によりもとめた。c(R,S)-(S,R)。d(R,R)-(S,S)。
【０２１４】
選択した10種のP450のうち5種は活性の改善（＞100TTN）、シス：トランス比が9：91〜60：40まで変動する広い範囲のジアステレオ選択性、および高度なエナンチオ選択性（最大95％ee、表14）を示した。例えば、野生型からの16個のアミノ酸置換を含む、変異体H2-5-F10は、294TTNを触媒し、これらの条件下で約58％の収率（EDAに対して）に等しい。これは野生型P450BM3に対するTTNの50倍の改善を意味する。さらに、突然変異はシクロプロパン化のジアステレオおよびエナンチオ選択性の両方に影響を及ぼす：H2-5-F10はトランスシクロプロパン化生成物に選択的（シス：トランス 16：84）でeeトランスは63％である一方、最大167TTNを触媒する変異体H2A10は、逆のジアステレオ選択性（シス：トランス 60：40）および高いエナンチオ選択性（95％eeシス）を示す。
【０２１５】
変異体H2A10を用いて、触媒作用における酵素の役割を検証し、最適な条件を特定した（表15、図3および4）。熱不活化により、遊離ヘミンを用いて得たものと類似のジアステレオおよびエナンチオ選択性が得られ、これはタンパク質変性および補助因子の遊離に一致していた。還元P450ヘムに不可逆的に結合する、一酸化炭素による生物変換物を前保温することにより完全な阻害が達成され、触媒作用が活性部位で起こることが確認された。空気はシクロプロパン化反応を約50％阻害し、二酸素およびEDAが還元FeIIに対して競合することを示していた。シクロプロパン化は還元剤としてのNADPHでも達成され、新規活性がジフラビン含有レダクターゼドメインの内因性電子輸送機構によっても推進されうることが確認された。準化学量論量の還元剤の存在はシクロプロパン化にとって必須であることが判明し（表16）、活性種は休止状態のFeIIIではなく、FeIIであることを暗示している。
【０２１６】
（表１５）変異体H2A10を用いてのP450に基づくシクロプロパン化の制御
2015534464.tif 000068
aジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析によりもとめた。b(R,S)-(S,R)。c(R,R)-(S,S)。
【０２１７】
（表１６）シクロプロパン収率に対する亜ジチオン酸ナトリウムの濃度の影響
2015534464.tif 000069
【０２１８】
高度に活性な変異体H2A10、H2-5-F10、およびH2-4-D4は、それ自体は無視できるシクロプロパナーゼ活性を示す9-10A-TS-F87V（野生型から12個の突然変異）に対して、3〜5個の活性部位のアラニン置換を有する。これらの変異体は、TTN、ジアステレオ選択性、およびエナンチオ選択性における有意な差を示す（表11）。タンパク質配列がP450仲介性シクロプロパン化をいかに制御するかをより良く理解するために、12種類の新しい変異体を構築して、個々のアラニン突然変異の触媒作用および安定性への貢献を評価した（表17）。T268Aは高レベルのシクロプロパン化活性を達成するための鍵であり、この突然変異は単独で不活性9-10A-TS-F87Vを活性シクロプロパナーゼへと変換する。変異体9-10A-TS-F87V-T268A（C3Cと示す）は適格なシクロプロパナーゼであり（199TTN）、シス生成物に関して強い優先度を示し（シス：トランス 71：29）、両方のジアステレオマーを、90％を超えるeeで生成し、かつ野生型P450BM3と同等に安定である。他の活性部位のアラニン突然変異は生成物の分布を調整する。特に、I263AのC3Cへの付加はジアステレオ選択性を逆転させる（シス：トランス 19：81）。活性が低い野生型P450BM3に導入された類似の突然変異の影響も同様に調査した（表18）。印象的なことに、1つの突然変異を有するP450BM3-T268Aは活性シクロプロパナーゼであり（323TTN、表11）、精巧なトランス選択性（シス：トランス 1：99）および主なジアステレオマーに対する高いエナンチオ選択性（-96％eeトランス、図2）を有する。C3Cはシス選択的シクロプロパナーゼであるが、野生型P450BM3における同じ活性部位突然変異はトランス選択的酵素を生じ（表18）、活性部位外の突然変異も立体化学的結果に影響をおよぼしうることを示している。
【０２１９】
（表１７）9-10A TS F87Vに対するアラニン置換の突然変異分析
2015534464.tif 000070
aジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析によりもとめた。b(R,S)-(S,R)。c(R,R)-(S,S)。
【０２２０】
（表１８）野生型P450BM3における変異体9-10A-TS-F87V-T268A関連の活性部位突然変異の導入
2015534464.tif 000071
aジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析によりもとめた。b(R,S)-(S,R)。c(R,R)-(S,S)。
【０２２１】
ジアゾカルボニル仲介性シクロプロパン化のためのシス選択的小分子触媒のデザインは、そのトランス型よりも難しいことが明らかにされている（A. Caballero et al., European Journal of Inorganic Chemistry, 1137 (2009)）ため、P450BM3のさらなる活性部位改変が、既存の有機金属系を補完するための強固なシス選択的水適合性触媒を提供しうるかどうかを調べた。5個の活性部位残基（L181、I263、A328、L437、T438）を個々の部位飽和突然変異誘発のために選択した（材料および方法参照）。置換A328G、T438A、T438S、およびT438Pはすべて、シス選択性の増強を示した（表19）。特に、A328Gは、シス-ジアステレオマーのエナンチオ選択性の逆転も示した（表11）。C3C-T438Sは最も高いジアステレオおよびエナンチオ選択性を示し（シス：トランス 92：8および-97％eeシス）、C3Cに匹敵する活性を維持した（表11）。
【０２２２】
（表１９）選択したC3Cヘム活性部位変異体のシクロプロパン化活性
2015534464.tif 000072
aEDに基づく。bジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析によりもとめた。c(R,S)-(S,R)。d(R,R)-(S,S)。変異体9-10A-TS-F87V-T268AはC3Cと示す。
【０２２３】
C3Cは、オレフィン（約1.5mM）およびジアゾカルベン（約5mM）に対するKM値が類似のミカエリス・メンテン速度式（図5および表20）を示す。比較的高いKM値はこれらの酵素がこれらの基質に結合するための進化ストレスの欠如を反映している。C3Cは100分-1のシクロプロパン化に対する注目すべきkcatを示し、これは多くの天然P450のヒドロキシル化に対するkcatに匹敵するが、P450BM3が触媒する脂肪酸ヒドロキシル化の約50分の1の速度である（表21）。0.1mol％当量で用いた場合、C3C触媒シクロプロパン化は30分後に完了に達した。より多くのEDA当量を加えることにより、C3Cの立体選択性は保存されたままシクロプロパンに対するターンオーバーが増強されて（表22）、触媒の完全性が確認され、機械的不活化によるのではなく、EDA欠乏により反応が停止することを示している。
【０２２４】
（表２０）P450シクロプロパナーゼ変異体9-10A-TS-F87V-T268A（本明細書においてC3Cと呼ぶ）のミカエリス・メンテンパラメーター
2015534464.tif 000073
【０２２５】
（表２１）その天然基質に作用する野生型チトクロムP450および非天然基質プロパンに作用するP450BM3の改変変異体（プロパンモノオキシゲナーゼ）の動態学的パラメーター
2015534464.tif 000074
1M. M. Chen et al., Advanced Synthesis & Catalysis 354, 964 (2012)。2M. A. Noble et al., Biochemical Journal 339 (Pt 2), 371 (1999)。3R. Fasan et al.,. J.mol. Biol. 383, 1069 (2008)。
【０２２６】
（表２２）変異体9-10A-TS-F87V-T268A触媒シクロプロパン化に対するt＝30分でのEDA添加の影響
2015534464.tif 000075
TTN値は三つ組の平均±標準偏差で報告する。aジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析によりもとめた。b(R,S)-(S,R)。c(R,R)-(S,S)。
【０２２７】
P450BM3触媒シクロプロパン化の基質範囲を評価するために、7つの変異体の様々なオレフィンおよびジアゾ化合物に対する活性を調べた（表23〜27）。P450シクロプロパン化はスチレンにおける電子供与性（p-ビニルアニソール、p-ビニルトルエン）および電子吸引性（p-トリフルオロメチルスチレン）置換の両方に対して強固で、7-11Dはこれらの基質に対する一貫したシス選択性を示した。P450は1,1-二置換オレフィン（例えば、α-メチルスチレン）においても活性で、キメラP450 C2G9R1はシクロプロパンを収率77％（EDAに対して）で生成した。P450は基質としてジアゾ酢酸t-ブチルでは中等度の活性しかなく（＜30TTN）、トランス生成物を＞87％の選択性で生成し、遊離ヘミンを超える利点は提供しなかった（表27）。しかし、EDAおよびアリール置換オレフィンを含む反応について、P450は活性および立体選択性の両方において遊離補助因子よりも一貫して優れていた。
【０２２８】
（表２３）P450シクロプロパナーゼの基質範囲：p-メチルスチレン+EDA
2015534464.tif 000076
GC（cyclosil-Bカラム30m×0.32mm、0.25μmフィルム）：オーブン温度＝100℃で5分間、5℃/分で200℃まで、20℃/分で250℃まで、250℃で5分間。溶出時間：シス-シクロプロパン（21.03および21.18分）、トランス-シクロプロパン（22.71分）。 aトランス鏡像体は分割しなかった。
【０２２９】
（表２４）P450シクロプロパナーゼの基質範囲：p-ビニルアニソール+EDA
2015534464.tif 000077
GCオーブン温度＝110℃で8分間、2℃/分で180℃まで、次いで180℃で30分間、175kPa。Cyclosil-Bカラム（30m×0.25mm、0.25μmフィルム）。溶出時間：シス-シクロプロパン（38.74および39.52分）、トランス-シクロプロパン（43.07分）。a基準線分割はトランス鏡像体については達成しえなかった。
【０２３０】
（表２５）P450シクロプロパナーゼの基質範囲：p-(トリフルオロメチル)スチレン
2015534464.tif 000078
a2-(4-メチルフェニル)シクロプロパン-1-カルボン酸エチルと同じ検出器応答因子を想定。GC（cyclosil-Bカラム30m×0.25mm、0.25μmフィルム）：オーブン温度＝110℃で8分間、2℃/分で180℃まで、次いで180℃で30分間、175kPa。溶出時間：シス-シクロプロパン（27.26および28.11分）、トランス-シクロプロパン（30.78および30.99分）。
【０２３１】
（表２６）P450シクロプロパナーゼの基質範囲：α-メチルスチレン
2015534464.tif 000079
GCオーブン温度＝100℃で5分間、1℃/分で135℃まで、135℃で10分間、10℃/分で200℃まで、200℃で5分間。Cyclosil-Bカラム（30m×0.32mm、0.25μmフィルム）。溶出時間：Z-シクロプロパン（34.96および35.33分）、E-シクロプロパン（39.34および39.61分）。aトランス鏡像体は基準線分割で分離しなかった。
【０２３２】
（表２７）P450シクロプロパナーゼの基質範囲：ジアゾ酢酸t-ブチル
2015534464.tif 000080
a2-(4-メチルフェニル)シクロプロパン-1-カルボン酸エチルと同じ検出器応答因子を想定。GC（cyclosil-Bカラム30m×0.32mm、0.25μmフィルム）：オーブン温度＝100℃で5分間、5℃/分で200℃まで、20℃/分で250℃まで、250℃で5分間。溶出時間：シス-シクロプロパン（21.66分）、トランス-シクロプロパン（23.31分）。シスおよびトランス鏡像体は分割しなかった。
【０２３３】
天然で観察されない反応を触媒する酵素をデザインすることは、タンパク質改変における現代の難問である（J. B. Siegel et al., Science 329, 309 (2010)）。種々の反応性を有する天然の酵素から作業して、本実施例は、事前に活性化した試薬を用いてではあるが、天然の酵素に匹敵する動態を示すシクロプロパナーゼの構築を示す。化学的直感に基づいて選択した合成試薬に対して天然酵素をスクリーニングすることにより非天然結合切断のための触媒を発見することは、基礎レベルの新規活性を有する酵素を同定するための単純な戦略を提供する。本明細書において示すとおり、新しい活性を促進し、合成的に有用な立体選択性を達成するためには、単一の突然変異で十分でありうる。天然酵素の反応の多様さが確立されており（U. T. Bornscheuer et al., Angew. Chem. Int. Ed. 43, 6032 (2004)）、シクロプロパナーゼ活性をP450BM3に容易に組み込みうることから、このアプローチは、生物学的対応物がまだ存在しない他の合成的に重要な変換のために有用であろうと考えられる。
【０２３４】
材料および方法
特に記載がないかぎり、化学反応のためのすべての化学物質および試薬は商業的供給業者（Sigma-Aldrich、Acros）から入手し、それ以上精製せずに用いた。以下のヘムタンパク質はすべてSigma-Aldrichから購入した：ミオグロビン（ウマ心臓由来）、ペルオキシダーゼII（西洋わさび由来）、チトクロムc（ウシ心臓由来）、カタラーゼ（コリネバクテリウム グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）由来）およびクロロペルオキシダーゼ（カルダリオミセス フマゴ（Caldariomyces fumago）由来）。シリカゲルクロマトグラフィ精製はAMD Silica Gel 60、230-400メッシュを用いて行った。1Hおよび13C NMRスペクトルはVarian Mercury 300分光計（それぞれ300MHzおよび75MHz）、またはVarian Inova 500MHz（それぞれ500MHzおよび125MHz）のいずれかを用いて記録し、残存溶媒ピークを内部標準とした。1H NMRのデータは通常の形式で報告する：化学シフト（δppm）、多重度（s＝一重線、d＝二重線、t＝三重線、q＝四重線、m＝多重線、br＝広幅）、カップリング定数（Hz）、積分。13Cのデータは化学シフト（δppm）および多重度に関して報告する。高分解能質量スペクトルはJEOL JMS-600H High Resolution Mass Spectrometerにより、California Institute of Technology Mass Spectral Facilityで得た。反応は薄層クロマトグラフィ（Merck 60シリカゲルプレート）を用い、UVランプで可視化してモニターした。旋光度はJASCO P-2000 Polarimeterを用いて測定した。
【０２３５】
ガスクロマトグラフィ（GC）分析は、Shimadzu GC-17Aガスクロマトグラフ、FID検出器、およびJ&W scientific cyclosil-Bカラム（30m×0.32mm、0.25μmフィルムおよび30m×0.25mm、0.25μmフィルム）を用いて行った。高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）はAgilent 1200シリーズ、UV検出器、およびAgilent XDB-C18カラム（4.6×150mm、5μm）を用いて行った。ジアゾ酢酸エチル（EDA）のスチレン（2-フェニルシクロプロパン-1-カルボン酸エチル）およびα-メチルスチレン（2-メチル-2-フェニルシクロプロパン-1-カルボン酸エチル）との反応のためのシクロプロパン生成物標準は、報告されたとおりに調製した（A. Penoni et al., European Journal of Inorganic Chemistry, 1452 (2003)）。これらの標準を同時注入実験で用いて、酵素触媒シクロプロパンが正しいことを判定した。P450触媒シクロプロパンの標品も以下に記載するとおりに調製し、NMR（1Hおよび13C）および質量分析により特徴付けた。アジド5および8、ならびにベンゾスルタム標準6および9は、報告されたとおりに調製した（J. V. Ruppel et al., Org. Lett. 9, 4889 (2007)）。ベンゾスルタム11はSigmaから購入した。これらの標準を同時注入実験で用いて、P450触媒ベンゾスルタムが正しいことを判定した。P450触媒ベンゾスルタムの標品も以下に記載するとおりに調製し、NMR（1Hおよび13C）および質量分析により特徴付けた。
【０２３６】
プラスミドpCWori[BM3]およびpET22をクローニングベクターとして用いた。部位特異的突然変異誘発を、所望の突然変異を有するプライマー（IDT、San Diego、CA）を用いての標準重複突然変異誘発によって達成した。エレクトロコンピテント大腸菌細胞を、Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual.（Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989）、第2巻のプロトコルに従って調製した。制限酵素BamHI、EcoRI、XhoI、Phusionポリメラーゼ、およびT4リガーゼはNew England Biolabs（NEB、Ipswich、MA）から購入した。アルカリ性ホスファターゼはRoche（Nutley、NJ）から入手した。発現培養において用いた1,000×微量金属混合物は下記を含んでいた：50mM FeCl3、20mM CaCl2、10mM MnSO4、10mM ZnSO4、2mM CoSO4、2mM CuCl2、2mM NiCl2、2mM Na2MoO4、および2mM H3BO3。
【０２３７】
酵素ライブラリスクリーニング。ライブラリを96穴プレート中、グリセロール保存溶液として（Luria-Bertani培地（LBamp）、150μL、25体積％グリセロールおよび0.1mg/mLアンピシリン）-78℃で保存する。これらの保存溶液を用いて、300μLのLBamp培地を含む浅型96穴プレートに96ピンスタンプを用いて接種した。部位飽和ライブラリからの単コロニーを爪楊枝で取り、300μLのLBampへの接種に用いた。細胞を37℃、250rpm、および80％相対湿度で終夜インキュベートした。16時間後、これらの終夜培養物の50μL量を、テリッフィク培地（TBamp）（800μL、0.1mg/mLアンピシリン、1μL/mL微量金属混合物および20mg L-1アミノレブリン酸含有）を含む2mL深型ウェルプレートに、Multimek 96チャンネルピペッティングロボット（Beckman Coulter、Fullerton、CA）を用いて移した。培養物を37℃で3時間30分間、その後インキュベーション温度を25℃に下げて30分間インキュベートし（250rpm、80％相対湿度）、50μLのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG、TBamp中4.5mM）を加え、培養を25℃（250rpm、80％相対湿度）でさらに24時間続けた。次いで、細胞をペレット化し（3,000×g、15分、4℃）、さらなる使用までであるが、少なくとも2時間、-20℃で保存した。細胞溶解のために、プレートを室温で30分間解凍し、次いで細胞ペレットを275μLのリン酸緩衝液（0.1M、pH＝8.0、0.65mg/mLリゾチーム、10mM塩化マグネシウムおよび40U/mL DNアーゼI）に再懸濁した。溶解中の細胞を37℃で1時間インキュベートした。細胞デブリを5,000×g、4℃で15分間の遠心沈降により分離した。次いで、得られた粗製溶解物を、CO検定用に96穴マイクロタイタープレートおよび生物変換用に2mL深型ウェルプレートに移した。
【０２３８】
CO結合検定。細胞溶解物（40μL）中のP450BM3変異体を60μLのリン酸緩衝液（0.1M、pH＝8.0）で希釈した。この溶液に160μLの亜ジチオン酸ナトリウム（リン酸緩衝液、0.1M、pH＝8.0中0.1M）を加えた。450および490nmの吸光度をTecan M1000 UV/Visプレート読み取り器を用いて記録し、マイクロタイタープレートを減圧チャンバーに入れた。チャンバーを密封し、約-15inHgまで排気し、COガスをパージし、30分間インキュベートした。次いで、プレートを取り出し、450および490nmの吸光度を、プレート読み取り器を用いて再度記録した。次いで、以前に記載されたとおり、差スペクトルを用いて各ウェルのP450濃度を定量することができた（C. R. Otey, in Methods in Molecular Biology: Directed Enzyme Evolution, F. H. Arnold, G. Georgiou, Eds. (Humana Press, Totowa, NJ, 2003), vol. 230）。
【０２３９】
P450発現および精製。酵素変換のために、P450BM3変異体を精製した形で用いた。酵素バッチを以下のとおりに調製した。1リットルのTBampに、tacプロモーター制御下のP450変異体をコードするpCWoriプラスミドを有する組換え大腸菌DH5α細胞の終夜培養物（100mL、LBamp）を接種した。37℃、250rpmの振盪で3.5時間インキュベートした後（OD600＝約1.8）、インキュベーション温度を25℃に下げ（30分）、IPTGを最終濃度0.5mMまで加えることにより培養を誘導した。培養をこの温度でさらに24時間続けた。細胞を遠心沈降（4℃、15分、3,000×g）により回収した後、細胞ペレットをさらなる使用までであるが、少なくとも2時間、-20℃で保存した。細胞ペレットを25mMトリスHCl緩衝液（pH7.5、25℃）に再懸濁し、細胞を音波処理（2×1分、出力コントロール5、50％デューティーサイクル；Sonicator、Heat Systems - Ultrasonic、Inc.）により溶解した。細胞デブリを4℃、27,000×gで20分間の遠心沈降により除去し、上清をQ Sepharoseカラム（HiTrapTM Q HP、GE Healthcare、Piscataway、NJ）でAKTAxpress purifier FPLCシステム（GE healthcare）を用いてアニオン交換クロマトグラフィにかけた。P450をQカラムから、カラムの10倍量で0〜0.5M NaClの勾配により溶出した（P450は0.35M NaClで溶出する）。P450分画を回収し、30kDa分子量カットオフの遠心ろ過器を用いて濃縮し、0.1Mリン酸緩衝液（pH＝8.0）で緩衝液交換した。精製したタンパク質をドライアイスで急速凍結し、-20℃で保存した。P450濃度を三つ組で前述のCO結合検定を用いて定量した（ウェルごとに10μL P450および190μL 0.1Mリン酸緩衝液、pH8.0）。
【０２４０】
熱安定性測定。表17および18に報告したすべての値について、二つ組の測定を行った。精製したP450溶液（4μM、200μL）をサーモサイクラー（Eppendorf）中、38℃〜65℃の温度範囲で10分間加熱し、続いて1分間で4℃まで急速冷却した。沈澱を遠心沈降により除去した。上清中に残存する折りたたまれたP450の濃度をCO差スペクトロスコピー（前述のとおり）により測定した。データを以下の式に当てはめることにより、タンパク質の半分が変性する温度（T50）をもとめた：f(T)＝100/(1+exp(a*(T-T50)))。
【０２４１】
嫌気性条件下での小規模シクロプロパン化生物変換のための典型的手順。小規模反応（400μL）を2mLクリンプバイアル（Agilent Technologies、San Diego、CA）中で行った。P450溶液（80μL、100μM）を、小さい撹拌子を含むバイアルに加えた後、シリコーンセプタムでクリンプをシールした。リン酸緩衝液（260μL、0.1M、pH＝8.0）および40μLの還元剤溶液（100mM亜ジチオン酸ナトリウム、または20mM NADPH）を、クリンプシールした、より大きいバイアル中で混合し、アルゴンを溶液に少なくとも5分間通気することにより脱気した（図3）。一方、P450溶液を含む2mL反応バイアルの、タンパク質溶液上にアルゴンを流す（通気なし）ことにより、ヘッドスペースを嫌気性にした。複数の反応を並行で行う場合、最大8つの反応バイアルを、カニューレを介して連続で脱気した。緩衝液/還元剤溶液（300μL）を反応バイアルに、アルゴン雰囲気下でシリンジにより注入した。ガスラインを反応バイアルからはずした後、バイアルをプレート撹拌機上に設置した。40×スチレンMeOH溶液（10μL、典型的には1.2M）を反応バイアルにガラスシリンジを介して加え、約30秒間撹拌した。次いで、40×EDA MeOH溶液を加え（10μL、典型的には400mM）、反応混合物を適切な時間撹拌した。試薬の最終濃度は典型的には以下のとおりであった：30mMスチレン、10mM EDA、10mM亜ジチオン酸ナトリウム、20μM P450。
【０２４２】
30μL HCl（3M）をシリンジで密封反応バイアルに加えることにより、反応を停止した。バイアルを開け、20μLの内部標準（20mM 2-フェニルエタノール/MeOH）、続いて1mLの酢酸エチルを加えた。この混合物を1.8mLのエッペンドルフチューブに移し、これをボルテックス処理して遠心沈降した（16,000×g 1分）。上部有機層を無水硫酸ナトリウムプラグで乾燥し、キラル相GCで分析した。
【０２４３】
わずかに変更した後処理を、動態実験のために実行した。設定した時間の後、1mL EtOAcを密封バイアルにシリンジで注入し、混合物をただちにボルテックス処理することにより、反応を停止した。次いで、バイアルを開け、20μLの内部標準を加えた。混合物を1.8mLのエッペンドルフチューブに移し、ボルテックス処理して遠心沈降した（16,000×g 1分）。上部有機層を無水硫酸ナトリウムプラグで乾燥し、GCで分析した。
【０２４４】
嫌気性条件下での調製規模シクロプロパン化生物変換のための典型的手順。P450溶液を、撹拌子を含むシュレンク管に加えた。フラスコを氷上に置いたまま、ヘッドスペースを排気し、タンパク質溶液を泡立てないよう注意しながら、アルゴンを逆充填した（4×）。リン酸緩衝液および還元剤をあらかじめ混合し、別の丸底フラスコ中でアルゴンを溶液に20分間通気することにより、一緒に脱気した。緩衝液/還元剤溶液をシュレンク管にシリンジで移した。スチレンをアルゴン雰囲気下で加え、1分間混合した。EDAをアルゴン雰囲気下で滴加した。溶液をアルゴン雰囲気下で反応完了まで撹拌した。アルゴン雰囲気下で塩酸（3M）を加えてpHを4に調節することにより反応を停止した後、シュレンク管を開けた。反応混合物を塩化ナトリウムおよびジクロロメタン（CH2Cl2）と共に撹拌した。次いで、合わせた乳濁層を、セライトを通してろ過して乳濁を解消し、セライトパッドを3×20mLのCH2Cl2で洗浄した。得られた二層混合物を分液漏斗に移し、有機層を取り出した。残った水層を3×40mLのCH2Cl2で再抽出した。合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮した。得られた残渣をSiO2クロマトグラフィで精製した。
【０２４５】
P450シクロプロパナーゼおよびアミナーゼの突然変異（野生型P450BM3に対して）の概要。
2015534464.tif 000081
【０２４６】
補足データ
ヘムタンパク質による予備実験
以下の6つのへムタンパク質をまず「シクロプロパナーゼ」活性についてスクリーニングした：カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ（CPO）、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）、チトクロムC（cyt c）、ミオグロビン（Mb）およびP450BM3。小規模（400μL）反応をセクションIIに記載のとおりに行い、GC（cyclosil-B 30m×0.25mm×0.25μm）：オーブン温度＝130℃により分析した。表7は亜ジチオン酸ナトリウム（Na2S2O4）存在下、嫌気性条件下でのヘム触媒を示す。表8はNa2S2O4非存在下、嫌気性条件下でのヘム触媒を示す。表9はNa2S2O4存在下、好気性条件下でのヘム触媒を示す。表10はNa2S2O4非存在下、好気性条件下でのヘム触媒を示す。
【０２４７】
シクロプロパン化活性についてのP450BM3変異体のスクリーニング
好気性条件下での溶解物スクリーニング。編集プレートにおける92種類のP450BM3変異体（表12）は、短鎖アルカンヒドロキシル化、保護単糖の脱メチル化、およびリード薬物化合物の酸化を含むが、それらに限定されるわけではない、様々な基質に対するモノオキシゲナーゼ活性について以前に操作されているP450BM3骨格の多様な選択を示す。これらのP450BM3変異体は、標的基質に対する活性のための操作努力を連続して行うことにより蓄積された様々な突然変異を有する（表12）。編集プレートを、前述のとおりに発現させ、溶解した（酵素ライブラリスクリーニング）。150μLの溶解物を、50μLの120mM Na2S2O4/0.1M KPi（pH＝8.0）を含む2mL深型ウェルプレートに移した（Multimek 96チャンネルピペッティングロボット、Beckman Coulter、Fullerton、CA）。100μLの30mMスチレン、60mM EDA混合溶液/15％MeOH/0.1M KPi（pH＝8.0）をプレートに加えて、反応を開始した。プレートを密封し、4時間振盪（300rpm）した。プラスティックシールを除去し、30μL HCl（3M）を加えて反応停止し、続いて20μLの内部標準溶液（20mM α-メチルスチレン/メタノール）を加えた。反応混合物を、500μL EtOAcを加え、プレートを注意深くボルテックス処理することにより、抽出した。プレートを遠心沈降（1,700×g）して二層混合物を分離した。上部有機層を別の深型ウェルプレートに移した（2×150μL）。92種類の反応それぞれの抽出物を、92個の別々の無水硫酸ナトリウムプラグを通して乾燥した。乾燥した抽出物をGC（cyclosil-B 30m×0.32mm×0.25μm）により分析した：オーブン温度＝60℃で3分間、7.5℃/分で160℃まで、20℃/分で250℃まで、250℃で2分間、シス-シクロプロパン（20.3分および20.45分）、トランス-シクロプロパン（21.8分）。
【０２４８】
表12〜13の上位10ヒットの、嫌気性条件下でのシクロプロパン化活性の判定。小規模反応（全量400μL）を前述のとおりに行い、GC（cyclosil-B 30m×0.32mm×0.25μm）により分析した：オーブン温度＝100℃で5分間、1℃/分で135℃まで、135℃で10分間、10℃/分で200℃まで、200℃で5分間、シス-シクロプロパン（39.40分および40.20分）、トランス-シクロプロパン（44.69分および45.00分）。表14は、立体選択的P450BM3に基づくシクロプロパナーゼを示す。
【０２４９】
P450BM3シクロプロパナーゼの実験的特徴付け
変異体H2A10の酵素的シクロプロパン化活性を確認するための制御。小規模反応（全量400μL）を前述のとおりに設定し、後処理した。一酸化炭素（CO）阻害実験のために、反応バイアルおよび緩衝液/還元剤バイアルを、アルゴンでパージした後、COでパージした。煮沸P450実験のために、変異体H2A10の100μM溶液を60℃で10分間加熱した。ヘミン実験のために、ヘミン（80μL）を50％DMSO-H2O中1mM溶液から、反応混合物中のその最終濃度が200μMとなるように加えた。完全系＝嫌気性条件下、10mMスチレン、20mM EDA、20mM Na2S2O4、20μM P450（H2A10）。乾燥した酢酸エチル抽出物を、2-フェニルエタノールを内部標準として用いて、キラル相GCにより分析した（注入口温度＝300℃、オーブン温度＝100℃で5分間、1℃/分の傾きで135℃まで、135℃で10分間、10℃/分の傾きで200℃まで、200℃で5分間）。溶出時間：シス-シクロプロパン（39.40分および40.20分）、トランス-シクロプロパン（44.69分および45.00分）。表15は変異体H2A10を用いてのP450に基づくシクロプロパン化のための制御を示す。
【０２５０】
変異体H2A10のシクロプロパン化反応条件の最適化。小規模反応（全量400μL）を前述のとおりに設定し、後処理した。乾燥した酢酸エチル抽出物を、2-フェニルエタノールを内部標準として用いて、キラル相GCにより分析した（注入口温度＝300℃、オーブン温度＝100℃で5分間、5℃/分の傾きで200℃まで、20℃/分の傾きで250℃まで、250℃で5分間）。溶出時間：シス-シクロプロパン（19.20分および19.33分）、トランス-シクロプロパン（20.44分）。シクロプロパンの最適収率（EDAに対して）を与える反応条件は：30mMスチレン、10mM EDAおよび20μM P450であり、これをこの後の実験において用いた。
【０２５１】
スチレン濃度。図3は、シクロプロパン収率に対するスチレン濃度の影響を例示する。
【０２５２】
P450濃度。図4は、シクロプロパン収率に対するP450（H2A10）濃度の影響を例示する。
【０２５３】
亜ジチオン酸塩濃度。表16は、シクロプロパン収率に対するNa2S2O4の濃度の影響を示す。
【０２５４】
9-10A TS F87Vにおける活性部位のアラニン置換の突然変異分析。表17は、9-10A TS F87Vに対するアラニン置換の突然変異分析を示す。
【０２５５】
野生型P450BM3におけるBM3-CIS活性部位突然変異の配列導入。表18は、野生型P450BM3におけるBM3-CIS関連の活性部位突然変異の導入を示す。
【０２５６】
C3Cヘムの活性部位飽和突然変異誘発
ライブラリ構築。ライブラリの構築およびスクリーニングを単純化するために、残基1〜462を含むC3Cヘムドメインだけを用いた。この切断された酵素はP450天然レダクターゼを欠き、NADPHではなく亜ジチオン酸を還元剤として用いて、ホロ酵素と類似の活性および立体化学制御を示す。P450部位特異的突然変異誘発および部位飽和ライブラリを、20種類のアミノ酸すべてをコードする所望のコドン突然変異または変性NNK（または逆プライマーに対しては、逆相補体MNN；ここでN＝A、T、G、C、K＝G、TおよびM＝A、C）コドンおよびTAG停止コドンを含むオリゴヌクレオチドから生成したPCR断片から組み立てた。PCR断片は、適宜に標準のオーバーラップ伸長PCRまたはIIS型制限酵素、BsaIを用いての制限クローニングのいずれかを用いて組み立てた。
【０２５７】
好気性条件下での溶解物スクリーニング。編集プレートを、前述のとおりに発現させ、溶解した（酵素ライブラリスクリーニング）。150μLの溶解物を、50μLの120mM Na2S2O4/0.1M KPi（pH＝8.0）を含む2mL深型ウェルプレートに移した（Multimek 96チャンネルピペッティングロボット、Beckman Coulter、Fullerton、CA）。100μLの90mMスチレン、30mM EDA混合溶液/15％MeOH/0.1M KPi（pH＝8.0）をプレートに加えて、反応を開始した。プレートを密封し、4時間振盪（300rpm）した。プラスティックシールを除去し、30μL HCl（3M）を加えて反応停止し、続いて20μLの内部標準溶液（20mM 2-フェニルエタノール/メタノール）を加えた。アセトニトリル（400μL）を加えた後、プレートを注意深くボルテックス処理した。プレートを遠心沈降（1,700×g）し、上清をろ過し（1μmガラス、96穴フィルタープレート、Pall）、96穴マイクロタイタープレート（Agilent）に移した（150μL）。反応混合物を逆相HPLC（210nm）によって分析した：50％アセトニトリル-水、1.0mL分-1、シス-シクロプロパン（7.6分）、トランス-シクロプロパン（9.7分）。親C3Cに比べてのシス選択性の増強に基づいてヒットを選択した。
【０２５８】
部位飽和ライブラリからのヒットの、嫌気性条件下でのシクロプロパン化活性の判定。小規模反応（全量400μL）を前述のとおりに行い、GC（cyclosil-B 30m×0.25mm×0.25μm）により分析した：オーブン温度＝130℃、175kPa、シス-シクロプロパン（39.40分および40.20分）、トランス-シクロプロパン（44.69分および45.00分）。表19は、選択したC3Cヘム活性部位変異体のシクロプロパン化活性を示す。
【０２５９】
C3Cの動態学的特徴付け
初速度の判定。スチレンおよびEDA両方の濃度を、ヘムドメインとして発現させたP450（0.5または1.0μM C3Cヘム）存在下で変動させた。反応を、還元剤として亜ジチオン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液（pH＝8.0）中、298Kで設定し、前述のとおりに後処理した。3つの時点を取り、GC（cyclosil-B 30m×0.32mm×0.25μm）：オーブン温度＝100℃で5分間、5℃/分で200℃まで、20℃/分で250℃まで、250℃で5分間により生成物の生成速度を判定するために用いた。溶出時間：シス-シクロプロパン（19.20分および19.33分）、トランス-シクロプロパン（20.44分）。データを標準のミカエリス・メンテンモデルに当てはめることにより、動態学的パラメーターをもとめた。
【０２６０】
図5は、C3Cヘムの初速度プロットを例示する。（A）スチレンの飽和濃度（30mM）でEDA濃度を変動させた。（B）EDAの固定濃度（20mM）でスチレン濃度を変動させた。表20は、P450シクロプロパン化触媒のミカエリス・メンテンパラメーターを示す。表21は、その天然基質に作用する野生型チトクロムP450および非天然基質プロパンに作用するP450BM3の改変変異体（プロパンモノオキシゲナーゼ、PMO）の動態学的パラメーターを示す。表22は、C3C触媒シクロプロパン化に対するt＝30分でのEDA添加の影響を示す。
【０２６１】
P450シクロプロパナーゼの基質範囲
小規模反応。選択したP450触媒を小規模（全量400μL）で、試薬（オレフィンおよびジアゾエステル）の各組み合わせについて調査した。小規模嫌気性生物変換を前述のとおりに行い、GCにより分析した。表23は、P450シクロプロパン化触媒の基質範囲：p-メチルスチレン+EDAを示す。表24は、P450シクロプロパン化触媒の基質範囲：p-ビニルアニソール+EDAを示す。表25は、P450シクロプロパン化触媒の基質範囲：p-(トリフルオロメチル)スチレンを示す。表26は、P450シクロプロパン化触媒の基質範囲：α-メチルスチレンを示す。表27は、P450シクロプロパン化触媒の基質範囲：ジアゾ酢酸t-ブチルを示す。
【０２６２】
調製規模生物変換。これらの反応は、前述のとおり嫌気的に行った。
【０２６３】
スチレンのEDAによるシクロプロパン化。
2015534464.tif 000082
1.5mmolスチレン（3当量）、0.5mmol EDA（1当量）および1μmol C3Cヘム（0.002当量）を用いて調製した。生成物をSiO2クロマトグラフィ（9：1ヘキサン-ジエチルエーテル）により精製して、シス-シクロプロパン（1）25mgおよびトランス（2）がシスに対して5：1過剰のシクロプロパンの混合物8mgを得た（C. J. Sanders et al., Tetrahedron: Asymmetry 12, 1055 (2001)；M. Lenes Rosenberg et al., Organic Letters 11, 547 (2009)；Y. Chen et al., Journal of Organic Chemistry 72, 5931 (2007)）。
シス-シクロプロパン1であることの特徴的なデータ：
2015534464.tif 000083
トランス-シクロプロパン2であることの特徴的なデータ：
2015534464.tif 000084
化合物1および2の絶対配置を、それらの旋光性の符号を報告されているものと比較することにより判定した（N. Watanabe et al., Heterocycles 42, 537 (1996)）。鏡像体過剰率は、GCによりシス-シクロプロパンについては92％およびトランス-シクロプロパンについては88％と判定した。
【０２６４】
p-メチルスチレンのEDAによるシクロプロパン化。
2015534464.tif 000085
1.5mmolスチレン（3当量）、0.5mmol EDA（1当量）および1μmol C3Cヘム（0.002当量）を用いて調製した。生成物をSiO2クロマトグラフィ（9：1ヘキサン-ジエチルエーテル）により精製して、シス-シクロプロパン（3）10mgおよびトランス（4）：シス/2：1のシクロプロパンの混合物16mgを得た（Y. Chen et al., Journal of Organic Chemistry 72, 5931 (2007)）。
シス-シクロプロパン3であることの特徴的なデータ：
2015534464.tif 000086
トランス-シクロプロパン4であることの特徴的なデータ：
2015534464.tif 000087
鏡像体過剰率は、GCによりシス-シクロプロパンについて82％と判定した。トランス-鏡像体の基準線分割は達成しえなかった。
【０２６５】
p-メトキシスチレンのEDAによるシクロプロパン化。
2015534464.tif 000088
1.5mmolスチレン（3当量）、0.5mmol EDA（1当量）および1μmol C3Cヘム（0.002当量）を用いて調製した。生成物をSiO2クロマトグラフィ（9：1ヘキサン-ジエチルエーテル）により精製して、トランス-シクロプロパン（6）16mgおよびシス：トランス/5：1のシクロプロパンの混合物3mgを得た（Y. Chen et al., Journal of Organic Chemistry 72, 5931 (2007)）。
トランス-シクロプロパン6であることの特徴的なデータ：
2015534464.tif 000089
鏡像体過剰率は、GCによりシス-シクロプロパンについて38％と判定した。トランス-鏡像体は基準線まで分割しなかった。
【０２６６】
スチレンのジアゾ酢酸t-ブチルによるシクロプロパン化。
2015534464.tif 000090
0.75mmolスチレン（3当量）、0.24mmol t-BuDA（1当量）および0.5μmol C3Cヘム（0.002当量）を用いて調製した。生成物をSiO2クロマトグラフィ（9：1ヘキサン-ジエチルエーテル）により精製して、トランス-シクロプロパン（8）9mgを得た（C. J. Sanders et al., Tetrahedron: Asymmetry 12, 1055 (2001)；Y. Chen et al., Journal of Organic Chemistry 72, 5931 (2007)）。
トランス-シクロプロパン4であることの特徴的なデータ：
2015534464.tif 000091
【０２６７】
実施例2. インビボおよびインビトロでのヘム酵素により触媒されるオレフィンシクロプロパン化
本実施例は、オレフィンの、1つまたは複数のシクロプロパン官能基を含む様々な生成物への変換を触媒するための、ヘム含有酵素の使用を例示する。ある局面において、本実施例は、チトクロムP450BM3（CYP102A1）の新規変異体を示す。これらの変異体は、ジアゾエステルをカルベン前駆体として使用し、様々なオレフィンをシクロプロパン化する、改善された能力を有する。好ましい変異体には、アミノ酸置換C400SおよびT268Aを有するチトクロムP450BM3突然変異体、ならびに等価の置換を有する他のP450の改変変異体が含まれる。軸セリン配位を有する変異体は、ホールセルにおいてシクロプロパン化反応を効率的に触媒し、10,000を超えるトータルターンオーバーを維持する。
【０２６８】
序論
自然界で進化したC=CおよびC-H結合を官能基化するための多くの戦略は、化学者の想像力を魅了し、生物模倣化学の基礎を形成する（J. T. Groves, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100, 3569 (2003)；R. Breslow, Journal of Biological Chemistry 284, 1337 (2009)）。この逆で、新しい生体触媒を発見し、開発するための、合成化学からの着想を用いることは、分子工学における始まったばかりの最前線であり、その最近のハイライトには、人工ロジウム酵素によるC-H活性化（T. K. Hyster et al., Science 338, 500 (2012)）およびディールス・アルダラーゼの新規デザイン（T. K. Hyster et al., Science 338, 500 (2012)；J. B. Siegel et al., Science 329, 309 (2010)）が含まれる。合成化学者は、天然物中間体および薬剤を合成するために広く用いられる反応の、遷移金属触媒カルベノイドおよびナイトレノイド移動に基づく直接C=CおよびC-H官能基化の強力な方法を開発した（H. M. L. Davies et al., Nature 451, 417 (2008)）。オレフィンの、高エネルギーカルベン前駆体（例えば、受容体置換ジアゾ試薬）による不斉シクロプロパン化は、多くの天然物および治療薬の特徴である、重要なシクロプロパンモティーフを作製するために最大3つのステレオジェン中心を1つの段階で生成する、顕著な特徴となる反応である（H. Lebel et al., Chemical Reviews 103, 977 (2003)）。生理的に利用できる試薬を用いることに限定されるため、自然では、典型的にはS-アデノシルメチオニンのメチルカチオンへのオレフィ付加を含む、まったく異なる戦略により、またはピロリン酸ジメチルアリル由来のアリルカルベニウムイオンの環化により、分子間シクロプロパン生成が触媒される（L. A. Wessjohann et al., Chemical Reviews 103, 1625 (2003)）。その結果、メタロカルベン化学により生成しうる多様なシクロプロパン化生成物は、天然シクロプロパン化酵素を操作することでは容易に入手できない。本実施例は、形式に従ったカルベノイド移動を触媒するように操作され、それにより酵素の高レベルの位置および立体選択性と、カルベンに基づく戦略の合成的汎用性とを組み合わせた、天然メタロ酵素である鉄-ヘム含有チトクロムP450を記載する。酵素は非毒性で、主に水性媒質中、周囲温度で使用することができ、現行の遷移金属触媒に比べて著しく安価に調製できるであろう。
【０２６９】
結果
チトクロムP450酵素ファミリーのメンバーは、ヒドロキシル化、エポキシ化、酸化的環カップリング、ヘテロ原子遊離、およびヘテロ原子酸素化を含む、無数の酸化的変換を触媒する（E. M. Isin et al., Biochim. Biophys. Acta, 1770, 314 (2007)）。この広い触媒範囲に含まれるほとんどの変換は、同じ高原子価の鉄-オキセン中間体（化合物I、図1）の反応性を明示する。チトクロムP450が酸素原子をC-HおよびC=C結合に挿入しうる、高度な化学、位置および立体選択性に着目し、本発明者らはこれらの酵素を操作して、高原子価の鉄-カルベノイド種を介しての等電子カルベン移動反応について、この化学を模倣しうるかどうかを調べた（図1）。本実施例は、バチルス メガテリウム由来のチトクロムP450の変異体（CYP102A1、またはP450BM3）が、スチレンおよび他のオレフィンの不斉シクロプロパン化の効率的触媒であることを示す。
【０２７０】
鉄ポルフィリンはカルベンに基づくシクロプロパン化を触媒すると報告されている（J. R. Wolf et al., J. Am. Chem. Soc. 117, 9194 (1995)；B. Morandi et al., Science 335, 1471 (2012)）ため、いくつかの一般的なヘムタンパク質が水性媒質（リン酸緩衝液、5％メタノール共溶媒）中で測定可能なレベルのシクロプロパナーゼ活性を示すかどうかをまず調べた。新しいシクロプロパン化触媒の有効性を確認するための詳細に認知されたモデル系である、スチレンとジアゾ酢酸エチル（EDA）との間の反応を選択した（図2）。実験は、還元剤（例えば、亜ジチオン酸ナトリウム、Na2S2O4）存在下、嫌気性条件下で、所望のシクロプロパン化生成物の最適な生成が起こることを示した（表7〜10）。西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）、チトクロムc（cyt c）、ミオグロビン（Mb）およびP450BM3はすべてシクロプロパン生成物に対する複数回のターンオーバーを示し、そのうちHRP、cyt cおよびMbは無視できるエナンチオ誘導を示し、トランスシクロプロパンを、90％を超えるジアステレオ選択性で生じたが、これは遊離ヘミンによって誘導されるジアステレオ選択性に匹敵する（表7）。P450BM3は、シクロプロパン生成物を低収率で生成したにもかかわらず、異なるジアステレオ選択性（シス：トランス37：63）およびわずかなエナンチオ誘導を伴って反応を触媒し（表28）、カルベン移動および選択性は、酵素活性部位に結合したヘム補助因子によって規定されることを示していた。
【０２７１】
（表２８）立体選択的P450BM3シクロプロパン化触媒
反応を水性リン酸緩衝液（pH8.0）および5％メタノール共溶媒中、室温、アルゴン雰囲気下で、30mMスチレン、10mM EDA、0.2mole％触媒（EDAに対して）、および10mM Na2S2O4と行った。収率、ジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析によりもとめた。収率はEDAに基づく。TTN＝トータルターンオーバー数。*(R,S)-(S,R)。†(R,R)-(S,S)。野生型P450BM3からの突然変異を示すタンパク質配列については下記を参照されたい。変異体9-10A-TS-F87V-T268A（本明細書においてBM3-CISと呼ぶ）。
2015534464.tif 000092
【０２７２】
試験した天然タンパク質によって示される活性レベルは、実用的な合成適用には適していない。したがって、ヘム触媒シクロプロパン化の活性および選択性を、タンパク質配列を操作することによって増強しうるかどうかを調べた。P450BM3は詳細に試験された、溶解性、自己充足的（ヘムおよびジフラビンレダクターゼドメインが単一のポリペプチド中で融合されている、約120KDa）、長鎖脂肪酸モノオキシゲナーゼである。10年以上のタンパク質改変により、この生体触媒の機能的柔軟性が証明されている（C. J. C. Whitehouse et al., Chemical Society Reviews 41, 1218 (2012)）。広範な基質に対してモノオキシゲナーゼ活性を示す何千もの変異体が、合成適用のために操作されたチトクロムP450BM3の使用から蓄積されている（J. C. Lewis et al., Chimia 63, 309 (2009)）。これらの変異体のいくつかを、変更されたシクロプロパン化ジアステレオおよびエナンチオ選択性について、キラル固定相によるガスクロマトグラフィ（GC）を用いての生成物分布の分析により試験した。活性およびタンパク質配列の多用性で選択した、92種のP450BM3変異体の一団を、好気性条件下、Na2S2O4存在下でのスチレンおよびEDAの反応について、大腸菌溶解物中でスクリーニングした（表12および13）。10種の最も有望なヒットを選択して、精製し、標準化嫌気性反応条件下で特徴付けを行った（表14および28）。
【０２７３】
選択した10種のP450のうち5種は、野生型に比べて活性の改善（トータルターンオーバー数（TTN）＞100）、シス：トランス比が9：91〜60：40まで変動する広い範囲のジアステレオ選択性、および最大95％のエナンチオ選択性（表14）を示した。例えば、16個のアミノ酸置換を含む、変異体H2-5-F10は、294のトータルターンオーバーを触媒し、これらの条件下（EDAに対して0.2％の酵素負荷）で約58％の収率に等しい。これは野生型P450BM3に対する50倍の改善を意味する。さらに、突然変異はシクロプロパン化のジアステレオおよびエナンチオ選択性の両方に影響を及ぼす：H2-5-F10はトランスシクロプロパン化生成物に選択的（シス：トランス 16：84）で63％eeトランスである一方、TTNが167の変異体H2A10は、逆のジアステレオ選択性（シス：トランス 60：40）および高いエナンチオ選択性（95％eeシス）を示す。
【０２７４】
H2A10を用いて、触媒作用における酵素の役割を検証し、より良い反応条件を特定した（表15、図3および4）。熱不活化により、遊離ヘミンを用いて得たものと類似のジアステレオおよびエナンチオ選択性が得られ、これはタンパク質変性および補助因子の遊離に一致していた。還元P450ヘムに不可逆的に結合する、一酸化炭素による反応混合物を前保温することにより完全な阻害が達成され、触媒作用が活性部位で起こることが確認された。空気はシクロプロパン化反応を約50％阻害し、二酸素およびEDAが還元FeIIに対して競合することを示していた。シクロプロパン化は還元剤としてのNADPHでも達成され、活性がジフラビン含有レダクターゼドメインの内因性電子輸送機構によっても推進されうることが確認された。準化学量論量の還元剤の存在はシクロプロパン化にとって必須であることが判明し（表16）、活性種は休止状態のFeIIIではなく、FeIIであることを暗示している。
【０２７５】
高度に活性なP450BM3変異体H2A10、H2-5-F10、およびH2-4-D4は、それ自体は無視できるシクロプロパナーゼ活性を示す9-10A-TS-F87V（P450BM3から12個の突然変異）に対して、3〜5個の活性部位のアラニン置換を有する。これらの変異体は、様々なTTN、ジアステレオ選択性、およびエナンチオ選択性を示す（表28）。タンパク質配列がP450仲介性シクロプロパン化をいかに制御するかをより良く理解するために、12種類の変異体を構築して、個々のアラニンの触媒作用および安定性への貢献を評価した（表17）。T268Aは高いシクロプロパン化活性を達成するための鍵であり、この突然変異は単独で不活性9-10A-TS-F87Vを活性シクロプロパン化触媒へと変換する。変異体9-10A-TS-F87V-T268A（本明細書においてBM3-CISと呼ぶ）は適格なシクロプロパン化触媒であり（199TTN）、シス生成物に関して強い優先度を示し（シス：トランス 71：29）、両方のジアステレオマーを、90％を超えるeeで生成し、かつ野生型P450BM3と同等に安定である。他の活性部位のアラニン突然変異は生成物の分布を調整する。特に、I263AのBM3-CISへの付加はジアステレオ選択性を逆転させる（シス：トランス 19：81）。活性が低い野生型P450BM3に導入された類似の突然変異の影響も同様に調査した（表18）。印象的なことに、1つの突然変異を有するP450BM3-T268Aは活性シクロプロパン化触媒であり（323TTN、表28）、精巧なトランス選択性（シス：トランス 1：99）および主なジアステレオマーに対する高いエナンチオ選択性（-96％eeトランス、表28）を有する。BM3-CISはシス選択的シクロプロパン化触媒であるが、野生型P450BM3における同じ活性部位突然変異はトランス選択的酵素を生じ（表18）、活性部位外の突然変異も立体化学的結果に影響をおよぼすことを示している。
【０２７６】
ジアゾカルボニル仲介性シクロプロパン化のためのシス選択的小分子触媒のデザインは、そのトランス型よりも難しいことが明らかにされている（A. Caballero et al., European Journal of Inorganic Chemistry, 1137 (2009)）ため、P450BM3の活性部位改変が、既存の有機金属系を補完するための強固なシス選択的水適合性触媒を提供しうるかどうかを調べた（I. Nicolas et al., Coordination Chemistry Reviews 252, 727 (2008)）。5個の活性部位残基（L181、I263、A328、L437、T438）を個々の部位飽和突然変異誘発のために選択した。A328G、T438A、T438S、およびT438P変異体は、シス選択性の増強を示した（表19）。特に、A328Gは、シス-ジアステレオマーのエナンチオ選択性の逆転も示した（表28）。BM3-CIS-T438Sは最も高いジアステレオおよびエナンチオ選択性を示し（シス：トランス 92：8および-97％eeシス）、BM3-CISに匹敵するTTNを維持した（表28）。
【０２７７】
変異体9-10A-TS-F87V-T268A（BM3-CIS）は、オレフィン（約1.5mM）およびジアゾエステル（約5mM）に対するKM値が比較的高いミカエリス・メンテン速度式（図5および表20）を示し、これらの酵素がこれらの基質に結合するための進化ストレスの欠如を反映している。BM3-CISは100分-1のシクロプロパン化に対する注目すべきkcatを示し、これは多くの天然P450のヒドロキシル化に対するkcatに匹敵するが、P450BM3が触媒する脂肪酸ヒドロキシル化の約50分の1である（表21）。遊離ヘミンは飽和速度式を示さず、BM3-CISよりも遅い初速度を示し（10mMスチレンおよび15mM EDAでわずか30分-1）、タンパク質骨格が溶液中の遊離補助因子に比べてkcatを増強することを示している。0.2mol％当量で用いた場合、BM3-CIS触媒シクロプロパン化は30分後に完了に達した。より多くのEDA当量を加えることにより、シクロプロパンに対するターンオーバーは増強され、かつ変異体9-10A-TS-F87V-T268A（BM3-CIS）の立体選択性は保存され（表22）、触媒の完全性が確認され、タンパク質不活化によるのではなく、EDA欠乏により反応が停止することを示している。
【０２７８】
本実施例は、この酵素の異なる変異体がシクロプロパン化のための広範な基質を受容することを示す。P450BM3触媒シクロプロパン化の基質範囲の評価を始めるために、6つの変異体の活性をオレフィンおよびジアゾ化合物の一団に対して調査した（表29〜34）。
【０２７９】
（表２９）スチレン基質のP450触媒シクロプロパン化の範囲
Ar＝p-X-C6H4。反応条件：20μM触媒、30mMオレフィン、10mMジアゾエステル、10mM Na2S2O4、アルゴン雰囲気下、水性リン酸カリウム緩衝液（pH8.0）および5％MeOH共溶媒中、298Kで2時間。酵素負荷はジアゾエステルに対して0.2mol％。N/A＝鏡像体が基準線分割で分離しなかった場合に入手不可。変異体9-10A-TS-F87V-T268A（本明細書においてBM3-CISと呼ぶ）。
2015534464.tif 000093
【０２８０】
（表３０）P450シクロプロパン化触媒の基質範囲：p-メチルスチレン+EDA
2015534464.tif 000094
GC（cyclosil-Bカラム30m×0.32mm、0.25μmフィルム）：オーブン温度＝100℃で5分間、5℃/分で200℃まで、20℃/分で250℃まで、250℃で5分間。溶出時間：シス-シクロプロパン（21.03および21.18分）、トランス-シクロプロパン（22.71分）。*トランス鏡像体は分割しなかった。
【０２８１】
（表３１）P450シクロプロパン化触媒の基質範囲：p-ビニルアニソール+EDA
2015534464.tif 000095
GCオーブン温度＝110℃で8分間、2℃/分で180℃まで、次いで180℃で30分間、175kPa。Cyclosil-Bカラム（30m×0.25mm、0.25μmフィルム）。溶出時間：シス-シクロプロパン（38.74および39.52分）、トランス-シクロプロパン（43.07分）。*基準線分割はトランス鏡像体については達成しえなかった。
【０２８２】
（表３２）P450シクロプロパン化触媒の基質範囲：p-(トリフルオロメチル)スチレン
2015534464.tif 000096
*2-(4-メチルフェニル)シクロプロパン-1-カルボン酸エチルと同じ検出器応答因子を想定。GC（cyclosil-Bカラム30m×0.25mm、0.25μmフィルム）：オーブン温度＝110℃で8分間、2℃/分で180℃まで、次いで180℃で30分間、175kPa。溶出時間：シス-シクロプロパン（27.26および28.11分）、トランス-シクロプロパン（30.78および30.99分）。
【０２８３】
（表３３）P450シクロプロパン化触媒の基質範囲：α-メチルスチレン
2015534464.tif 000097
GCオーブン温度＝100℃で5分間、1℃/分で135℃まで、135℃で10分間、10℃/分で200℃まで、200℃で5分間。Cyclosil-Bカラム（30m×0.32mm、0.25μmフィルム）。溶出時間：Z-シクロプロパン（34.96および35.33分）、E-シクロプロパン（39.34および39.61分）。*トランス鏡像体は基準線分割で分離しなかった。
【０２８４】
（表３４）P450シクロプロパン化触媒の基質範囲：ジアゾ酢酸t-ブチル
2015534464.tif 000098
*2-(4-メチルフェニル)シクロプロパン-1-カルボン酸エチルと同じ検出器応答因子を想定。GC（cyclosil-Bカラム30m×0.32mm、0.25μmフィルム）：オーブン温度＝100℃で5分間、5℃/分で200℃まで、20℃/分で250℃まで、250℃で5分間。溶出時間：シス-シクロプロパン（21.66分）、トランス-シクロプロパン（23.31分）。シスおよびトランス鏡像体は分割しなかった。
【０２８５】
P450シクロプロパン化はスチレンにおける電子供与性（p-ビニルアニソール、p-ビニルトルエン）および電子吸引性（p-トリフルオロメチルスチレン）置換の両方に対して強固で、変異体7-11Dはこれらの基質に対する一貫したシス選択性を示した。P450は1,1-二置換オレフィン（例えば、α-メチルスチレン）においても活性で、キメラP450 C2G9R1はシクロプロパンを収率77％（EDAに対して）で生成した。P450は基質としてジアゾ酢酸t-ブチルでは中等度の活性しかなく（収率＜30％）、トランス生成物を＞87％の選択性で生成し、遊離ヘミンを超える利点は提供しなかった（表34）。しかし、EDAおよびアリール置換オレフィンを含む反応について、P450は活性および立体選択性の両方において遊離補助因子よりも一貫して優れていた。所与の基質のための適切な触媒は、前述のとおり、改変または天然P450に対する基質を試験することにより見出すことができる。当業者には周知の指向性進化法を用いて、触媒活性を増強することができる。
【０２８６】
ヘムおよびレダクターゼドメインの両方を含むP450由来シクロプロパナーゼは、適格なモノオキシゲナーゼのままで、大気下、NADPH存在下でスチレンオキシドを優先的に生成する。種々のモノオキシゲナーゼ活性を有していない「スペシャリスト」シクロプロパナーゼを生じる可能性を調査した。近位システイナート連結（P450BM3におけるC400による）が二酸素活性化および一酸素添加中の化合物Iの安定化のために重要であることは公知である（J. H. Dawson, Science 240, 433 (1988)）。遊離ヘミンのシクロプロパン化を触媒する能力によって証明されているとおり、この配位子はカルベン移動反応に必要とされないようであるが、酵素が一酸素添加反応を触媒するために必要である。野生型P450BM3におけるC400の部位飽和突然変異誘発は、等配電子突然変異C400Sだけが、折りたたまれたヘム結合タンパク質を生じることを明らかにした。この突然変異は哺乳動物P450において一酸素添加活性を消失させると報告されている（K. P. Vatsis et al., Journal of Inorganic Biochemistry 91, 542 (2002)）ため、亜ジチオン酸塩（150TTN）またはNADPH（304TTN）いずれかからの電子を利用することにより触媒周期を開始しうる、活性シクロプロパナーゼのままである、BM3-CIS-C400Sを創製した。予想外に、BM3-CIS-C400Sはそのシステインホモログと比べて、かなり改善されたジアステレオ（シス：トランス/亜ジチオン酸塩93：7；NADPH 72：28）およびエナンチオ選択性（亜ジチオン酸塩-99％eeシス：NADPH 94％eeシス）を示し（表35〜36および図6）、はるかに活性な、NADPHが推進するシクロプロパナーゼである（図7）。
【０２８７】
（表３５）Na2S2O4により推進されるBM3-CIS仲介性シクロプロパン化に対する突然変異C400Sの影響
2015534464.tif 000099
aEDAに基づく。bジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析によりもとめた。c(R,S)-(S,R)。d(R,R)-(S,S)。変異体9-10A-TS-F87V-T268A（本明細書においてBM3-CISと呼ぶ）。
【０２８８】
（表３６）NADPHにより推進される精製したP411BM3-CISとP450BM3-CISのインビトロ活性
2015534464.tif 000100
aジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析によりもとめた。b(R,S)-(S,R)。c(R,R)-(S,S)。小規模反応（全量400μL）を、以下の改変を加えて、前述のとおりに行った：グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH、4μL、225U mL-1）を反応バイアルに、P450溶液と共に加えた。グルコース（40μL、250mM）およびNADPH（40μL、5mM）を緩衝溶液と共に脱気した。測定は三つ組で行い、エラーバーは平均値からの標準偏差を表す。嫌気性条件下、P450BM3-CISにより生成した少量のエポキシドは、実験中の小規模反応における二酸素混入によるものである。変異体9-10A-TS-F87V-T268A（本明細書においてBM3-CISと呼ぶ）。
【０２８９】
好気性条件下、NADPH存在下で、BM3-CIS-C400Sは無視できる量のスチレンオキシドを生成し、さらにシクロプロパンも生成可能であり（43TTN）、これはスチレンオキシドを主生成物として生じるBM3-CISと顕著な対照をなす（図7）。しかし、BM3-CIS-C400Sのシクロプロパン化活性は、二酸素によって激しく阻害された（図7）。Vatsis et al.が、セリンに突然変異したその近位システインを同様に有する哺乳動物P450 CYP2B4-C436Sは、NADHからの電子を用いて二酸素を過酸化水素に還元しうると示したことは注目に値する。特に、Vatsis et al.は、セリン-ヘムP450が、NADPHから電子を受容し、二酸素を過酸化水素に還元する、2電子オキシダーゼとして機能しうると示した。この過酸化物生成活性は、したがって、好気性条件下でシクロプロパン化と競合的でありうる。
【０２９０】
BM3-CIS-C400Sは、オレフィン（約1.5mM）および変異体9-10A-TS-F87V-T268A（BM3-CIS）としてのジアゾカルベン（約5mM）に対するKM値が類似のミカエリス・メンテン速度式（図8および表37）を示す。軸チオラート連結のセリンによる置換は、kcatを約20分-1に低下させる。
【０２９１】
（表３７）P450シクロプロパナーゼのミカエリス・メンテンパラメーター
2015534464.tif 000101
【０２９２】
BM3-CIS-C400Sは表30〜34に示す基質に対して一貫したシス選択性を示した。BM3-CIS-C400Sによって触媒されるインビトロシクロプロパン化反応は、準化学量論量のNADHまたはNADPHのいずれかによって推進されうる。
【０２９３】
突然変異C400Sによって起きる立体選択性および触媒速度の差が活性部位構造における変化によって引き起こされたかどうかを調べるために、BM3-CISおよびBM3-CIS-C400Sの結晶構造を、それぞれ2.5および3.3Åで判定した（図9および表38）。
【０２９４】
（表３８）P450BM3結晶のデータ収集および精密化統計値
2015534464.tif 000102
*すべてのデータ組は単結晶から収集した。
**最も高い解像度のシェルをかっこ内に示す。
***ラマチャンドラン異常値は、柔軟であることが公知のタンパク質の領域にあり、文献中のP450BM3構造と類似の異常を示す。
【０２９５】
構造は重ね合わせ可能（RMSD＝0.52Å）で、活性部位側鎖またはヘム配向に顕著な変化は見られない。触媒特性の変化は第一ヘム配位圏を変えることの電子的影響から生じるようである。シス選択的BM3-CISおよびBM3-CIS-C400Sは、P450BM3の配位子に結合した「クローズ」型によく似ている（図9）が、トランス選択的P450BM3-T268Aはオープンアポ型に似ている（J. P. Clark et al., Journal of Inorganic Biochemistry 100, 1075 (2006)）。これらの大規模な配座変化は、ほぼ同じ活性部位配列を共有するタンパク質の間で観察される、異なるジアステレオ選択性に貢献しているのかもしれない。
【０２９６】
還元剤としてNADPHを用いた場合に、インビトロでBM3-CIS-C400Sホロによって達成される高いターンオーバーに着目し（図7）、触媒的シクロプロパン化反応を、チトクロムP450変異体を発現するホールセルを用いて調査した。EDAの安定性を、P450BM3遺伝子を欠く大腸菌細胞存在下（OD600＝30）でまず評価し、2時間の経過を通して分解は見られなかった。BM3-CIS-C400Sホロを発現する大腸菌細胞を以下ABC触媒と呼ぶ。最適条件を特定するための初期実験により、ホールセル反応も二酸素によって著しく阻害されることが判明した（図10）。突然変異C400Sは、ABC触媒をチオラート連結BM3-CISホロを発現するホールセルと比較することにより、図10に見られるとおり、インビボ活性を3〜4倍改善する。ABC触媒は、BM3-CISホロに比べて、より高いジアステレオおよびエナンチオ選択性も提供する（図10）。
【０２９７】
2mMグルコースの添加は、おそらくは、P450触媒を活性Fe(II)第一鉄状態に還元するのに必要な、NADHの細胞内濃度の上昇により、シクロプロパン収率を一貫して上昇させる（図11）。外因性グルコース非存在下であっても、シクロプロパン化を中等度の収率まで触媒するホールセルの能力は、P450の一部は内在量の細胞内NAD(P)Hで還元されることを暗示している。細胞密度について正規化した後、M9Y（M9、1.5％酵母エキス）またはTB培地中で増殖させた細胞で活性の有意な差はない。M9Yはその低コストゆえに好ましい増殖培地である（図12）。ホロ酵素を発現することで、ヘムドメイン単独に比べて、シクロプロパンの収率がわずかに高くなる（図12）。ABC触媒負荷（細胞密度）を高めることで、シクロプロパンの収率がOD600＝50で最大約80％まで上昇する（図13）。EDAを10mMで用いる場合、2：1過剰のスチレンで最適な収率が得られる（図14）。P450遺伝子を含むが、P450誘導は示さないホールセル、およびP450遺伝子を欠くホールセルの制御を図15に示す。
【０２９８】
図16に示すとおり、細胞はP450遺伝子を安定化させるようで、その活性を数時間延長して、反応はEDAが枯渇した場合にのみ終了する。顕著なことに、図16の条件下で、インビボTTNは8,000を超える。高い基質負荷（100mM EDA、200mMスチレン）で、インビボTTNは30,000超に達する。これは、精製した酵素触媒について上で報告したインビトロTTN値よりもおよそ二桁高い。
【０２９９】
本実施例は、ABC触媒を凍結乾燥し、所望の反応条件で再懸濁することができる固体として供給しうることも示す。凍結乾燥工程は触媒活性を損なわないことが観察されている。したがって、このホールセル触媒を凍結乾燥し、長期間都合よく保存することができる。これを包装し、秤量するか、またはそれ以外に反応のために必要な場合は固体の形態で分配することができる。ホールセル中に遺伝子的にコードされているため、これはプラスミド（生細胞中に形質転換するための）として、または生細胞（例えば、細菌穿刺培養中の）として保存または分配し、次いで当業者には周知の方法を用いて、所望の密度および量に増殖させることができる。
【０３００】
インビボ触媒作用は、触媒調製に関連するコスト低減、活性の延長、およびP450シクロプロパン化反応を代謝経路に組み込む能力などの、インビトロでの精製酵素の使用を超えるいくつかの重要な利点を提供する。
【０３０１】
この概念は、バチルス メガテリウム由来の単一のP450酵素、およびバチルス メガテリウムの酵素と枯草菌由来の他の関連するP450とのキメラについて示されている。しかし、当業者であれば、他の生物由来の他のP450を操作してシクロプロパン化を行いうること、およびこれらの酵素を用いてABCホールセル触媒を作製しうることを理解するであろう。特に、突然変異C400Sの等価物は他のP450酵素のシクロプロパン化および他のカルベン移動反応の性能を改善することになる。当業者であれば、配列アラインメントに基づき、他のP450においてC400に等価の残基をいかに同定するかを知っており、その例を以下に示す。部位特異的突然変異誘発または遺伝子合成などの、当技術分野において公知の方法を用いて、任意のP450においてこの残基をセリンに変更することができる。得られた酵素が適切に折りたたまれれば、これはシクロプロパン化の触媒として役立つことになる。精製タンパク質またはホールセル触媒におけるこの突然変異は、この突然変異を含まない親酵素よりも活性を改善することになる。
【０３０２】
例えば、P450BM3（CYP102A1）のアミノ酸配列の、シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）由来のもの（CYP101A1、P450CAM）またはカイウサギ（Oryctolagus cuniculus）由来の哺乳動物酵素（CYP2B4）などの他のP450へのBLASTアラインメント（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）は、以下：
2015534464.tif 000103
に示すとおり、近位システイン残基または等価のT268（太字）の同定を可能にする。
【０３０３】
したがって、CYP101A1における突然変異C357SおよびT252A、またはCYP2B4におけるC436SおよびT302Aは、これらの酵素におけるシクロプロパン化活性を増強すると予想される。突然変異を標的遺伝子に、標準のクローニング技術を用いて、または遺伝子合成によって導入することができる。突然変異遺伝子は、適切な微生物宿主中、誘導性プロモーターの制御下で、または染色体組込みにより構成性プロモーターの制御下で、発現させることができる。シクロプロパン化活性は、GCまたはHPLCで生成物生成を追跡することにより、インビボまたはインビトロでスクリーニングすることができる（材料および方法参照）。
【０３０４】
ABC触媒は遺伝子によりコードされ、ホールセルで非常に良好に機能するため、この触媒を、基質の複数の変換を細胞内部で行う、インビボでの生合成のための多酵素経路に組み込むことができる。EDAまたは他のジアゾ試薬は培地に外因性に提供することもでき、またはインサイチューで生成させることもできる。
【０３０５】
突然変異C400Sを他のP450骨格に拡大することができれば、カルベノイド前駆体としての様々なジアゾ化合物の入手が可能になる。これらには、ジアゾエステル（受容体型）、ジアゾβ-ケトエステルまたはβ-シアノエステル（受容体-受容体型）、およびアルキル、アリール、またはアルケニル置換ジアゾエステル（供与体-受容体）が含まれるが、それらに限定されるわけではない（図17a）。これらのジアゾ化合物を様々なスチレン、脂肪族オレフィン、およびアレンと分子間および分子内反応させて、生物活性化合物またはさらなる反応のための有機ビルディングブロックを提供することができる（図17b）。例えば、ジアゾエステルのアリールまたはアリルシランおよびボロン酸とのP450が触媒する反応は、シクロプロパンを生成し、これは次いで鈴木または檜山クロスカップリング反応において用いることができる。さらに、C9オレフィンにおけるゲラニルアセトンのトランス選択的P450触媒およびEDAによるシクロプロパン化は、B-16黒色腫細胞に対するマイクログラムオーダーの細胞毒性を示す海洋天然物、アンスロプラロンおよびノルアンスロプロンの鍵となる前駆体を提供することになる（図17c）（W. A. Donaldson, Tetrahedron 57, 8589 (2001)）。最後に、2,5-ジメチルヘキサ-2,4-ジエンの類似の触媒およびEDAによる処理は、ピレスロイド殺虫剤の製造における重要な中間体、クリサンテム酸のエチルエステルを提供することになる（図17d）。
【０３０６】
材料および方法
特に記載がないかぎり、化学反応のためのすべての化学物質および試薬は商業的供給業者（Sigma-Aldrich、Acros）から入手し、それ以上精製せずに用いた。以下のヘムタンパク質はすべてSigma-Aldrichから購入した：ミオグロビン（ウマ心臓由来）、ペルオキシダーゼII（西洋わさび由来）、チトクロムc（ウシ心臓由来）、カタラーゼ（コリネバクテリウム グルタミクム由来）およびクロロペルオキシダーゼ（カルダリオミセス フマゴ由来）。シリカゲルクロマトグラフィ精製はAMD Silica Gel 60、230-400メッシュを用いて行った。1Hおよび13C NMRスペクトルはVarian Mercury 300分光計（それぞれ300MHzおよび75MHz）、またはVarian Inova 500MHz（それぞれ500MHzおよび125MHz）のいずれかで記録し、残存溶媒ピークを内部標準とした。1H NMRのデータは通常の形式で報告する：化学シフト（δppm）、多重度（s＝一重線、d＝二重線、t＝三重線、q＝四重線、m＝多重線、br＝広幅）、カップリング定数（Hz）、積分。13Cのデータは化学シフト（δppm）および多重度に関して報告する。高分解能質量スペクトルはJEOL JMS-600H High Resolution Mass Spectrometerにより、California Institute of Technology Mass Spectral Facilityで得た。反応は薄層クロマトグラフィ（Merck 60シリカゲルプレート）を用い、UVランプで可視化してモニターした。旋光度はJASCO P-2000 Polarimeterを用いて測定した。
【０３０７】
ガスクロマトグラフィ（GC）分析は、Shimadzu GC-17Aガスクロマトグラフ、FID検出器、およびJ&W scientific cyclosil-Bカラム（30m×0.32mm、0.25μmフィルムおよび30m×0.25mm、0.25μmフィルム）を用いて行った。高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）はAgilent 1200シリーズ、UV検出器、およびAgilent XDB-C18カラム（4.6×150mm、5μm）を用いて行った。ジアゾ酢酸エチル（EDA）のスチレン（2-フェニルシクロプロパン-1-カルボン酸エチル）およびα-メチルスチレン（2-メチル-2-フェニルシクロプロパン-1-カルボン酸エチル）との反応のためのシクロプロパン生成物標準は、報告されたとおりに調製した（A. Penoni et al., European Journal of Inorganic Chemistry, 1452 (2003)）。これらの標準および酵素により調製したシクロプロパンは、同時注入した場合にガスクロマトグラムで同じ保持時間を示し、生成物の同一性を確認した。シクロプロパン鏡像体の絶対立体配置を、エナンチオ選択的P450-BM3変異体を用いる調製的生物変換反応からの精製したシクロプロパン生成物の旋光度を測定することにより判定し、参照文献から取った値と比較した（N. Watanabe et al., Heterocycles 42, 537 (1996)）。P450触媒シクロプロパンの標品も本明細書に記載するとおりに調製し、NMR（1Hおよび13C）および質量分析により特徴付けた。
【０３０８】
プラスミドpCWori[BM3]およびpET22をクローニングベクターとして用いた。部位特異的突然変異誘発を、所望の突然変異を有するプライマー（IDT、San Diego、CA）を用いての標準重複突然変異誘発によって達成した。エレクトロコンピテント大腸菌細胞を、Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual.（Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989）、第2巻のプロトコルに従って調製した。制限酵素BamHI、EcoRI、XhoI、Phusionポリメラーゼ、およびT4リガーゼはNew England Biolabs（NEB、Ipswich、MA）から購入した。アルカリ性ホスファターゼはRoche（Nutley、NJ）から入手した。発現培養において用いた1,000×微量金属混合物は下記を含んでいた：50mM FeCl3、20mM CaCl2、10mM MnSO4、10mM ZnSO4、2mM CoSO4、2mM CuCl2、2mM NiCl2、2mM Na2MoO4、および2mM H3BO3。
【０３０９】
酵素ライブラリスクリーニング。ライブラリを96穴プレート中、グリセロール保存溶液として（Luria-Bertani培地（LBamp）、150μL、25体積％グリセロールおよび0.1mg mL-1アンピシリン）-78℃で保存する。これらの保存溶液を用いて、300μLのLBamp培地を含む浅型96穴プレートに96ピンスタンプを用いて接種した。部位飽和ライブラリからの単コロニーを爪楊枝で取り、300μLのLBampへの接種に用いた。細胞を37℃、250rpm振盪、および80％相対湿度で終夜インキュベートした。16時間後、これらの終夜培養物の50μL量を、テリッフィク培地（TBamp）（800μL、0.1mg mL-1アンピシリン、1μL mL-1微量金属混合物および20mg L-1アミノレブリン酸含有）を含む2mL深型ウェルプレートに、Multimek 96チャンネルピペッティングロボット（Beckman Coulter、Fullerton、CA）を用いて移した。培養物を37℃で3時間30分間、その後インキュベーション温度を25℃に下げて30分間インキュベートし（250rpm、80％相対湿度）、50μLのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG、TBamp中4.5mM）を加え、培養を25℃（250rpm、80％相対湿度）でさらに24時間続けた。次いで、細胞をペレット化し（3,000×g、15分、4℃）、さらなる使用までであるが、少なくとも2時間、-20℃で保存した。細胞溶解のために、プレートを室温で30分間解凍し、次いで細胞ペレットを275μLのリン酸緩衝液（0.1M、pH＝8.0、0.65mg mL-1リゾチーム、10mM塩化マグネシウムおよび40U mL-1 DNアーゼI）に再懸濁した。溶解中の細胞を37℃で1時間インキュベートした。細胞デブリを5,000×g、4℃で15分間の遠心沈降により分離した。次いで、得られた粗製溶解物を、CO検定用に96穴マイクロタイタープレートおよび生物変換用に2mL深型ウェルプレートに移した。
【０３１０】
CO結合検定。Na2S2O4（160μL、リン酸緩衝液、0.1M、pH＝8.0中0.1M）を細胞溶解物（40μL）中のP450BM3変異体に加えた。450および490nmの吸光度をTecan M1000 UV/Visプレート読み取り器を用いて記録し、マイクロタイタープレートを減圧チャンバーに入れた。チャンバーを密封し、約-15inHgまで排気し、COガスをパージし、30分間インキュベートした。次いで、プレートを取り出し、450および490nmの吸光度を、プレート読み取り器を用いて再度記録した。次いで、以前に記載されたとおり、差スペクトルを用いて各ウェルのP450濃度を定量することができた（C. R. Otey, in Methods in Molecular Biology: Directed Enzyme Evolution, F. H. Arnold, G. Georgiou, Eds. (Humana Press, Totowa, NJ, 2003), vol. 230）。
【０３１１】
P450発現および精製。酵素変換のために、P450BM3変異体を精製した形で用いた。酵素バッチを以下のとおりに調製した。1リットルのTBampに、tacプロモーター制御下のP450変異体をコードするpCWoriプラスミドを有する組換え大腸菌DH5α細胞の終夜培養物（100mL、LBamp）を接種した。37℃、250rpmの振盪で3.5時間インキュベートした後（OD600＝約1.8）、インキュベーション温度を25℃に下げ（30分）、IPTGを最終濃度0.5mMまで加えることにより培養を誘導した。培養をこの温度でさらに24時間続けた。細胞を遠心沈降（4℃、15分、3,000×g）により回収した後、細胞ペレットをさらなる使用までであるが、少なくとも2時間、-20℃で保存した。細胞ペレットを25mMトリスHCl緩衝液（pH7.5、25℃）に再懸濁し、細胞を音波処理（2×1分、出力コントロール5、50％デューティーサイクル；Sonicator、Heat Systems - Ultrasonic、Inc.）により溶解した。細胞デブリを4℃、27,000×gで20分間の遠心沈降により除去し、上清をQ Sepharoseカラム（HiTrapTM Q HP、GE Healthcare、Piscataway、NJ）でAKTAxpress purifier FPLCシステム（GE healthcare）を用いてアニオン交換クロマトグラフィにかけた。P450をQカラムから、カラムの10倍量で0〜0.5M NaClの勾配により溶出した（P450は0.35M NaClで溶出する）。P450分画を回収し、30kDa分子量カットオフの遠心ろ過器を用いて濃縮し、0.1Mリン酸緩衝液（pH＝8.0）で緩衝液交換した。精製したタンパク質をドライアイスで急速凍結し、-20℃で保存した。P450濃度を三つ組で前述のCO結合検定を用いて定量した（ウェルごとに10μL P450および190μL 0.1Mリン酸緩衝液、pH8.0）。
【０３１２】
熱安定性測定。表17および18に報告したすべての値について、二つ組の測定を行った。精製したP450溶液（4μM、200μL）をサーモサイクラー（Eppendorf）中、38℃〜65℃の温度範囲で10分間加熱し、続いて1分間で4℃まで急速冷却した。沈澱を遠心沈降により除去した。上清中に残存する折りたたまれたP450の濃度をCO差スペクトロスコピー（前述のとおり）により測定した。データを以下の式に当てはめることにより、タンパク質の半分が変性する温度（T50）をもとめた：f(T)＝100/(1+exp(a*(T-T50)))。
【０３１３】
嫌気性条件下での小規模シクロプロパン化およびカルベン挿入生物変換のための典型的手順。小規模反応（400μL）を2mLクリンプバイアル（Agilent Technologies、San Diego、CA）中で行った。P450溶液（80μL、100μM）を、小さい撹拌子を含むバイアルに加えた後、シリコーンセプタムでクリンプをシールした。リン酸緩衝液（260μL、0.1M、pH＝8.0）および40μLの還元剤溶液（100mM Na2S2O4、または20mM NADPH）を、クリンプシールした、より大きいバイアル中で混合し、アルゴンを溶液に少なくとも5分間通気することにより脱気した（図3）。一方、P450溶液を含む2mL反応バイアルの、タンパク質溶液上にアルゴンを流す（通気なし）ことにより、ヘッドスペースを嫌気性にした。複数の反応を並行で行う場合、最大8つの反応バイアルを、カニューレを介して連続で脱気した。緩衝液/還元剤溶液（300μL）を反応バイアルに、アルゴン雰囲気下でシリンジにより注入した。ガスラインを反応バイアルからはずした後、バイアルをプレート撹拌機上に設置した。40×スチレンMeOH溶液（10μL、典型的には1.2M）を反応バイアルにガラスシリンジを介して加え、約30秒間撹拌した。次いで、40×EDA MeOH溶液を加え（10μL、典型的には400mM）、反応混合物を適切な時間撹拌した。試薬の最終濃度は典型的には以下のとおりであった：30mMスチレン、10mM EDA、10mM Na2S2O4、20μM P450。
【０３１４】
30μL HCl（3M）をシリンジで密封反応バイアルに加えることにより、反応を停止した。バイアルを開け、20μLの内部標準（20mM 2-フェニルエタノール/MeOH）と、続いて1mLの酢酸エチルを加えた。この混合物を1.8mLのエッペンドルフチューブに移し、これをボルテックス処理して遠心沈降した（16,000×g 1分）。上部有機層を無水硫酸ナトリウムプラグで乾燥し、キラル相GCで分析した。
【０３１５】
わずかに変更した後処理を、動態実験のために実行した。設定した時間の後、1mL EtOAcを密封バイアルにシリンジで注入し、混合物をただちにボルテックス処理することにより、反応を停止した。次いで、バイアルを開け、20μLの内部標準を加えた。混合物を1.8mLのエッペンドルフチューブに移し、ボルテックス処理して遠心沈降した（16,000×g 1分）。上部有機層を無水硫酸ナトリウムプラグで乾燥し、GCで分析した。
【０３１６】
嫌気性条件下での調製規模シクロプロパン化生物変換のための典型的手順。P450溶液を、撹拌子を含むシュレンク管に加えた。フラスコを氷上に置いたまま、ヘッドスペースを排気し、タンパク質溶液を泡立てないよう注意しながら、アルゴンを逆充填した（4×）。リン酸緩衝液および還元剤をあらかじめ混合し、別の丸底フラスコ中でアルゴンを溶液に20分間通気することにより、一緒に脱気した。緩衝液/還元剤溶液をシュレンク管にシリンジで移した。スチレンをアルゴン雰囲気下で加え、1分間混合した。EDAをアルゴン雰囲気下で滴加した。溶液をアルゴン雰囲気下で反応完了まで撹拌した。アルゴン雰囲気下で塩酸（3M）を加えてpHを4に調節することにより反応を停止した後、シュレンク管を開けた。反応混合物を塩化ナトリウムおよびジクロロメタン（CH2Cl2）と共に撹拌した。次いで、合わせた乳濁層を、セライトを通してろ過して乳濁を解消し、セライトパッドを3×20mLのCH2Cl2で洗浄した。得られた二相混合物を分液漏斗に移し、有機相を取り出した。残った水層を3×40mLのCH2Cl2で再抽出した。合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮した。得られた残渣をSiO2クロマトグラフィで精製した。
【０３１７】
補足データ
ヘムタンパク質による予備実験
以下の6つのへムタンパク質をまずシクロプロパン化活性についてスクリーニングした：カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ（CPO）、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）、チトクロムC（cyt c）、ミオグロビン（Mb）およびP450BM3。小規模（400μL）反応を前述のとおりに行い、GC（cyclosil-B 30m×0.25mm×0.25μm）：オーブン温度＝130℃により分析した。表7は亜ジチオン酸ナトリウム（Na2S2O4）存在下、嫌気性条件下でのヘム触媒を示す。表8はNa2S2O4非存在下、嫌気性条件下でのヘム触媒を示す。表9はNa2S2O4存在下、好気性条件下でのヘム触媒を示す。表10はNa2S2O4非存在下、好気性条件下でのヘム触媒を示す。
【０３１８】
シクロプロパン化活性についてのP450BM3変異体のスクリーニング
好気性条件下での溶解物スクリーニング。編集プレートにおける92種類の変異体（表12）は、短鎖アルカンヒドロキシル化、保護単糖の脱メチル化、およびリード薬物化合物の酸化を含むが、それらに限定されるわけではない、様々な基質に対するモノオキシゲナーゼ活性について以前に操作されているP450BM3変異体の多様な選択を示す。これらのP450BM3変異体は、標的基質に対する活性のための操作努力を連続して行うことにより蓄積された様々な突然変異を有する（表12）か、または相同酵素との組換えにより生成したものである（表13）。編集プレートを、前述のとおりに発現させ、溶解した。150μLの溶解物を、50μLの120mM Na2S2O4/0.1M KPi（pH＝8.0）を含む2mL深型ウェルプレートに移した（Multimek 96チャンネルピペッティングロボット、Beckman Coulter、Fullerton、CA）。100μLの30mMスチレン、60mM EDA混合溶液/15％MeOH/0.1M KPi（pH＝8.0）をプレートに加えて、反応を開始した。プレートを密封し、4時間振盪（300rpm）した。プラスティックシールを除去し、30μL HCl（3M）を加えて反応停止し、続いて20μLの内部標準溶液（20mM α-メチルスチレン/メタノール）を加えた。反応混合物を、500μL EtOAcを加え、プレートを注意深くボルテックス処理することにより、抽出した。プレートを遠心沈降（1,700×g）して二相混合物を分離した。上部有機層を別の深型ウェルプレートに移した（2×150μL)。92種類の反応それぞれの抽出物を、92個の別々の無水硫酸ナトリウムプラグを通して乾燥した。乾燥した抽出物をGC（cyclosil-B 30m×0.32mm×0.25μm）により分析した：オーブン温度＝60℃で3分間、7.5℃/分で160℃まで、20℃/分で250℃まで、250℃で2分間、シス-シクロプロパン（20.3分および20.45分）、トランス-シクロプロパン（21.8分）。この報告に関する重要な上位10種のタンパク質変異体を表12および13に強調している。
【０３１９】
上位10ヒット（表12および13に強調）の、嫌気性条件下でのシクロプロパン化活性の判定。小規模反応（全量400μL）を前述のとおりに行い、GC（cyclosil-B 30m×0.32mm×0.25μm）により分析した：オーブン温度＝100℃で5分間、1℃/分で135℃まで、135℃で10分間、10℃/分で200℃まで、200℃で5分間、シス-シクロプロパン（39.40分および40.20分）、トランス-シクロプロパン（44.69分および45.00分）。表14は、立体選択的P450BM3に基づくシクロプロパン化触媒を示す。
【０３２０】
P450BM3シクロプロパン化触媒の実験的特徴付け
変異体H2A10の酵素的シクロプロパン化活性を確認するための制御。小規模反応（全量400μL）を前述のとおりに設定し、後処理した。一酸化炭素（CO）阻害実験のために、反応バイアルおよび緩衝液/還元剤バイアルを、アルゴンでパージした後、COでパージした。煮沸P450実験のために、変異体H2A10の100μM溶液を60℃で10分間加熱した。ヘミン実験のために、ヘミン（80μL）を50％DMSO-H2O中1mM溶液から、反応混合物中のその最終濃度が200μMとなるように加えた。完全系＝嫌気性条件下、10mMスチレン、20mM EDA、20mM Na2S2O4、20μM P450（H2A10）。乾燥した酢酸エチル抽出物を、2-フェニルエタノールを内部標準として用いて、キラル相GCにより分析した（注入口温度＝300℃、オーブン温度＝100℃で5分間、1℃/分の傾きで135℃まで、135℃で10分間、10℃/分の傾きで200℃まで、200℃で5分間）。溶出時間：シス-シクロプロパン（39.40分および40.20分）、トランス-シクロプロパン（44.69分および45.00分）。表15は変異体H2A1を用いてのP450に基づくシクロプロパン化のための制御を示す。
【０３２１】
変異体H2A10のシクロプロパン化反応条件の最適化。小規模反応（全量400μL）を前述のとおりに設定し、後処理した。乾燥した酢酸エチル抽出物を、2-フェニルエタノールを内部標準として用いて、キラル相GCにより分析した（注入口温度＝300℃、オーブン温度＝100℃で5分間、5℃/分の傾きで200℃まで、20℃/分の傾きで250℃まで、250℃で5分間）。溶出時間：シス-シクロプロパン（19.20分および19.33分）、トランス-シクロプロパン（20.44分）。シクロプロパンの最適収率（EDAに対して）を与える反応条件は：30mMスチレン、10mM EDAおよび20μM P450であり、これをこの後の実験において用いた。
【０３２２】
スチレン濃度。図3は、シクロプロパン収率に対するスチレン濃度の影響を例示する。
【０３２３】
P450濃度。図4は、シクロプロパン収率に対するP450（H2A10）濃度の影響を例示する。
【０３２４】
亜ジチオン酸塩濃度。表16は、シクロプロパン収率に対するNa2S2O4の濃度の影響を示す。
【０３２５】
9-10A TS F87Vにおける活性部位のアラニン置換の突然変異分析。表17は、9-10A TS F87Vに対するアラニン置換の突然変異分析を示す。
【０３２６】
野生型P450BM3におけるBM3-CIS活性部位突然変異の配列導入。表18は、野生型P450BM3におけるBM3-CIS関連の活性部位突然変異の導入を示す。
【０３２７】
BM3-CISヘムの活性部位飽和突然変異誘発
ライブラリ構築。ライブラリの構築およびスクリーニングを単純化するために、残基1〜462を含むBM3-CISヘムドメインだけを用いた。この切断された酵素はP450天然レダクターゼを欠き、NADPHではなくNa2S2O4を還元剤として用いて、全長酵素と類似の活性および立体化学制御を示す。P450部位特異的突然変異誘発および部位飽和ライブラリを、20種類のアミノ酸すべてをコードする所望のコドン突然変異または変性NNK（または逆プライマーに対しては、逆相補体MNN；ここでN＝A、T、G、C、K＝G、TおよびM＝A、C）コドンおよびTAG停止コドンを含むオリゴヌクレオチドから生成したPCR断片から組み立てた。PCR断片は、適宜に標準のオーバーラップ伸長PCRまたはIIS型制限酵素、BsaIを用いての制限クローニングのいずれかを用いて組み立てた。
【０３２８】
好気性条件下での溶解物スクリーニング。編集プレートを、前述のとおりに発現させ、溶解した。150μLの溶解物を、50μLの120mM Na2S2O4/0.1M KPi（pH＝8.0）を含む2mL深型ウェルプレートに移した（Multimek 96チャンネルピペッティングロボット、Beckman Coulter、Fullerton、CA）。100μLの90mMスチレン、30mM EDA混合溶液/15％MeOH/0.1M KPi（pH＝8.0）をプレートに加えて、反応を開始した。プレートを密封し、4時間振盪（300rpm）した。プラスティックシールを除去し、30μL HCl（3M）を加えて反応停止し、続いて20μLの内部標準溶液（20mM 2-フェニルエタノール/メタノール）を加えた。アセトニトリル（400μL）を加えた後、プレートを注意深くボルテックス処理した。プレートを遠心沈降（1,700×g）し、上清をろ過し（1μmガラス、96穴フィルタープレート、Pall）、96穴マイクロタイタープレート（Agilent）に移した（150μL）。反応混合物を逆相HPLC（210nm）によって分析した：50％アセトニトリル-水、1.0mL分-1、シス-シクロプロパン（7.6分）、トランス-シクロプロパン（9.7分）。親BM3-CISに比べてのシス選択性の増強に基づいてヒットを選択した。
【０３２９】
部位飽和ライブラリからのヒットの、嫌気性条件下でのシクロプロパン化活性の判定。小規模反応（全量400μL）を前述のとおりに行い、GC（cyclosil-B 30m×0.25mm×0.25μm）により分析した：オーブン温度＝130℃、175kPa、シス-シクロプロパン（39.40分および40.20分）、トランス-シクロプロパン（44.69分および45.00分）。表19は、選択したBM3-CISヘム活性部位変異体のシクロプロパン化活性を示す。
【０３３０】
BM3-CISの動態学的特徴付け
初速度の判定。スチレンおよびEDA両方の濃度を、ヘムドメインとして発現させたP450（0.5または1.0μM BM3-CISヘム）存在下で変動させた。反応を、還元剤としてNa2S2O4を含むリン酸緩衝液（pH＝8.0）中、298Kで設定し、前述のとおりに後処理した。3つの時点を取り、GC（cyclosil-B 30m×0.32mm×0.25μm）：オーブン温度＝100℃で5分間、5℃/分で200℃まで、20℃/分で250℃まで、250℃で5分間により生成物の生成速度を判定するために用いた。溶出時間：シス-シクロプロパン（19.20分および19.33分）、トランス-シクロプロパン（20.44分）。データを標準のミカエリス・メンテンモデルに当てはめることにより、動態学的パラメーターをもとめた。
【０３３１】
図5は、BM3-CISヘムの初速度プロットを例示する。（A）スチレンの飽和濃度（30mM）でEDA濃度を変動させた。（B）EDAの固定濃度（20mM）でスチレン濃度を変動させた。初速度は独立の反応からの3つの異なる時点のゼロ切片線形フィットの傾きとして計算した。エラーバーは傾きの1-σ（68.3％）信頼区間に対応する。表20は、P450シクロプロパン化触媒のミカエリス・メンテンパラメーターを示す。表21は、その天然基質に作用する野生型チトクロムP450および非天然基質プロパンに作用するP450BM3の改変変異体（プロパンモノオキシゲナーゼ、PMO）の動態学的パラメーターを示す。表22は、BM3-CIS触媒シクロプロパン化に対するt＝30分でのEDA添加の影響を示す。
【０３３２】
P450シクロプロパン化触媒の基質範囲
小規模反応。選択したP450触媒を小規模（全量400μL）で、試薬（オレフィンおよびジアゾエステル）の各組み合わせについて調査した。小規模嫌気性生物変換を前述のとおりに行い、GCにより分析した。表30は、P450シクロプロパン化触媒の基質範囲：p-メチルスチレン+EDAを示す。表31は、P450シクロプロパン化触媒の基質範囲：p-ビニルアニソール+EDAを示す。表32は、P450シクロプロパン化触媒の基質範囲：p-(トリフルオロメチル)スチレンを示す。表33は、P450シクロプロパン化触媒の基質範囲：α-メチルスチレンを示す。表34は、P450シクロプロパン化触媒の基質範囲：ジアゾ酢酸t-ブチルを示す。
【０３３３】
調製規模生物変換。これらの反応は、前述のとおり嫌気的に行った。
【０３３４】
スチレンのEDAによるシクロプロパン化。
2015534464.tif 000104
1.5mmolスチレン（3当量）、0.5mmol EDA（1当量）および1μmol BM3-CISヘム（0.002当量）を用いて調製した。生成物をSiO2クロマトグラフィ（9：1ヘキサン-ジエチルエーテル）により精製して、シス-シクロプロパン（1）25mgおよびトランス（2）がシスに対して5：1過剰のシクロプロパンの混合物8mgを得た（Y. Chen et al., Journal of Organic Chemistry 72, 5931 (2007)；C. J. Sanders et al., Tetrahedron: Asymmetry 12, 1055 (2001)；M. Lenes Rosenberg et al., Organic Letters 11, 547 (2009)）。
シス-シクロプロパン1であることの特徴的なデータ：
2015534464.tif 000105
トランス-シクロプロパン2であることの特徴的なデータ：
2015534464.tif 000106
化合物1および2の絶対配置を、それらの旋光性の符号を報告されているものと比較することにより判定した（N. Watanabe et al., Heterocycles 42, 537 (1996)）。鏡像体過剰率は、GCによりシス-シクロプロパンについては92％およびトランス-シクロプロパンについては88％と判定した。
【０３３５】
p-メチルスチレンのEDAによるシクロプロパン化。
2015534464.tif 000107
1.5mmolスチレン（3当量）、0.5mmol EDA（1当量）および1μmol BM3-CISヘム（0.002当量）を用いて調製した。生成物をSiO2クロマトグラフィ（9：1ヘキサン-ジエチルエーテル）により精製して、シス-シクロプロパン（3）10mgおよびトランス（4）：シス/2：1のシクロプロパンの混合物16mgを得た（Y. Chen et al., Journal of Organic Chemistry 72, 5931 (2007)）。
シス-シクロプロパン3であることの特徴的なデータ：
2015534464.tif 000108
トランス-シクロプロパン4であることの特徴的なデータ：
2015534464.tif 000109
鏡像体過剰率は、GCによりシス-シクロプロパンについて82％と判定した。トランス-鏡像体の基準線分割は達成しえなかった。
【０３３６】
p-メトキシスチレンのEDAによるシクロプロパン化。
2015534464.tif 000110
1.5mmolスチレン（3当量）、0.5mmol EDA（1当量）および1μmol BM3-CISヘム（0.002当量）を用いて調製した。生成物をSiO2クロマトグラフィ（9：1ヘキサン-ジエチルエーテル）により精製して、トランス-シクロプロパン（6）16mgおよびシス：トランス/5：1のシクロプロパンの混合物3mgを得た（Y. Chen et al., Journal of Organic Chemistry 72, 5931 (2007)）。
トランス-シクロプロパン6であることの特徴的なデータ：
2015534464.tif 000111
鏡像体過剰率は、GCによりシス-シクロプロパンについて38％と判定した。トランス-鏡像体は基準線まで分割しなかった。
【０３３７】
スチレンのジアゾ酢酸t-ブチルによるシクロプロパン化。
2015534464.tif 000112
0.75mmolスチレン（3当量）、0.24mmol t-BuDA（1当量）および0.5μmol BM3-CISヘム（0.002当量）を用いて調製した。生成物をSiO2クロマトグラフィ（9：1ヘキサン-ジエチルエーテル）により精製して、トランス-シクロプロパン（8）9mgを得た（Y. Chen et al., Journal of Organic Chemistry 72, 5931 (2007)；C. J. Sanders et al., Tetrahedron: Asymmetry 12, 1055 (2001)）。
トランス-シクロプロパン4であることの特徴的なデータ：
2015534464.tif 000113
【０３３８】
シクロプロパン化および一酸素添加活性の直交化
図18は、精製したBM3-CISヘム（3μM、上の線）およびBM3-CIS-C400Sヘム（2μM、下の線）のUV-Vis吸収スペクトルを例示する。挿入図は両方のタンパク質の約1mMの溶液を示す。
【０３３９】
BM3-CIS-C400Sの濃度を、標準としてBM3-CISを用いて、micro BCA(商標)検定（Thermo Scientific）によりもとめた。セリン連結チトクロムP450は低い吸光係数（約5分の1）および14nm青色シフトしたソーレー帯を示す。基質なしの第二鉄、第一鉄およびCO結合第一鉄-セリン連結P450の磁気円二色性および電子吸収スペクトルは、他所に報告されている（R. Perera et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 507, 119 (2011)）。
【０３４０】
還元剤として亜ジチオン酸ナトリウムを用いての嫌気性および好気性条件下での活性。表35は、Na2S2O4により推進されるBM3-CIS仲介性シクロプロパン化に対する突然変異C400Sの影響を示す。図6は、BM3-CISおよびBM3-CIS-C400Sの、嫌気性および好気性条件下、亜ジチオン酸ナトリウムにより推進されるシクロプロパン化活性を示す。測定は三つ組で行い、エラーバーは平均値からの標準偏差を表す。
【０３４１】
還元剤としてNADPHを用いての嫌気性および好気性条件下での活性。小規模反応（全量400μL）を前述のとおりであるが、以下の改変を加えて行った：グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH、4μL、225U mL-1）を反応バイアルにP450溶液と一緒に加えた。グルコース（40μL、250mM）およびNADPH（40μL、5mM）を緩衝溶液と一緒に脱気した。測定は三つ組で行い、エラーバーは平均値からの標準偏差を表す。表36は、NADPHにより推進されるBM3-CIS仲介性シクロプロパン化に対する突然変異C400Sの影響を示す。
【０３４２】
初速度の判定。スチレンおよびEDA両方の濃度をヘムドメインとして発現させたP450（3.5μM BM3-CIS-C400Sヘム）存在下で変動させた。反応を、還元剤として亜ジチオン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液（pH＝8.0）中、298Kで設定し、前述のとおりに後処理した。3つの時点を取り、GC（cyclosil-B 30m×0.32mm×0.25μm）：オーブン温度＝100℃で5分間、5℃/分で200℃まで、20℃/分で250℃まで、250℃で5分間により生成物の生成速度を判定するために用いた。溶出時間：シス-シクロプロパン（19.20分および19.33分）、トランス-シクロプロパン（20.44分）。データを標準のミカエリス・メンテンモデルに当てはめることにより、動態学的パラメーターをもとめた。図8は、BM3-CIS-C400Sヘムの初速度プロットを示す。（A）スチレンの飽和濃度（30mM）でEDA濃度を変動させた。（B）EDAの固定濃度（20mM）でスチレン濃度を変動させた。表37は、P450シクロプロパナーゼのミカエリス・メンテンパラメーターを示す。
【０３４３】
X線結晶学統計
図9は、BM3-CISとBM3-CIS-C400Sおよび野生型P450BM3との活性部位およびタンパク質アラインメントを示す。
【０３４４】
BM3-CIS-C400Sにおける増強された立体選択性の特性を調査するために、両方のタンパク質の結晶構造を調べて、軸Cys→Serの突然変異によって起こった可能性がある任意の構造変化を評価した。上図はBM3-CIS（緑）およびBM3-CIS-C400S（ピーチ）のアラインメントを示し、左、中央および右の図はそれぞれ活性部位残基、活性部位I-ヘリックス、および全体のタンパク質折りたたみを示す。有意な構造変化は観察されなかった（RMSD 0.52Å）。中段の図：BM3-CISを野生型BM3のオープン（配位子なし）型（紫、PDB# 2IJ2から取得、RMSD 1.2Å）と比較すると、大きい変動が観察される。活性部位側鎖残基（左）ならびにI-ヘリックス内の回転において顕著な再編成が観察される。N末端が多いベータドメインならびにF-およびG-ヘリックスでも全体の動きが観察される（右、両端に矢尻のある矢印で示す）。これらの動きは、基質結合後に起こる周知の移行と一致し、天然の一酸素添加触媒にとって重要である。下図： BM3-CISの配位子に結合したBM3構造とのアラインメント（水色、PDB# 1JPZから取得、RMSD 0.52Å）は、BM3-CISおよびBM3-CIS-C400Sが基質非存在下でもクローズ型のタンパク質立体配座を模倣することを示す。
【０３４５】
表38は、P450BM3結晶のデータ収集および精密化統計値を示す。
【０３４６】
P450BM3変異体における突然変異の概要
変異体P450シクロプロパン化触媒における突然変異を野生型P450BM3に対して報告する。
2015534464.tif 000114
【０３４７】
インビボシクロプロパン化のためのホールセル触媒
培地および細胞培養。大腸菌細胞を、5mlのM9Y培地（1L：31g Na2HPO4、15g KH2PO4、2.5g NaCl、5.0g NH4Cl、0.24g MgSO4、0.01g CaCl2、1.5％酵母エキス、1mL微量栄養素、0.1mg mL-1アンピシリン）中、グリセロール保存液から終夜増殖させた（37℃、250rpm）。前培養物を用いて45mLのM9Y培地に接種し、この培養物を37℃、250rpmで2時間30分インキュベートした。OD600＝1.2で、培養物を25℃まで冷却し、IPTG（0.25mM）およびδ-アミノレブリン酸（0.25mM）で誘導した。20時間後に培養物を回収し、無窒素M9培地（1L：31g Na2HPO4、15g KH2PO4、2.5g NaCl、0.24g MgSO4、0.01g CaCl2、1mL微量栄養素）に再懸濁した（OD600＝30）。微量栄養素溶液は0.15mM (NH4)6Mo7O24、20.0mM H3BO3、1.5mM CoCl2、0.5mM CuSO4、4.0mM MnCl2、および0.5mM ZnSO4を含む。細胞懸濁液の一定量を、細胞乾燥重量（cdw、2mL）およびP450発現レベル（4mL）の判定に用いた。
【０３４８】
小規模ホールセル生物変換。2mLクリンプバイアル中の細胞懸濁液にアルゴンを通気することにより、大腸菌細胞（OD600＝30、425μL）を嫌気性にした。グルコースの脱気溶液（50μL、20mM）を細胞に加えた後、EDA（MeOH中400mM溶液12.5μL）およびオレフィン（MeOH中1.2M溶液12.5μL）を加えた。反応混合物を室温で適切に撹拌し、20μLの内部標準（20mM 2-フェニルエタノール）を加え、1mL酢酸エチルで抽出することにより、後処理した。有機層をNa2SO4で乾燥した後、生成物混合物をキラル相ガスクロマトグラフィで分析した。
【０３４９】
図11は、スチレンのインビボシクロプロパン化に対するグルコース添加の影響を例示する。反応条件：20mMスチレン、10mM EDA、アルゴン雰囲気下、無窒素培地および5％MeOH共溶媒中、298Kで2時間（OD600＝約24）。トータルターンオーバー＝シクロプロパンの濃度（mM）/細胞密度（g cdw/L）、単位はmmol/g cdw。
【０３５０】
図12は、スチレンのインビボシクロプロパン化に対する培地の影響およびBM3-CIS-C400Sのホロ型とヘム型との比較を例示する。反応条件：20mMスチレン、10mM EDA、2mMグルコース、アルゴン雰囲気下、無窒素培地および5％MeOH共溶媒中、298Kで2時間（OD600＝約24）。
【０３５１】
図13は、ABC触媒負荷（細胞密度）の増大はシクロプロパンの収率をOD600＝50で最大約80％まで高めることを例示する。
【０３５２】
図14は、スチレン濃度のシクロプロパン収率に対する影響を例示する。
【０３５３】
図15は、ABC触媒シクロプロパン化の制御を例示する。
【０３５４】
図16は、ABC触媒が3時間活性であることを例示する。OD600＝25で、TTN＞8,000となるような、P450濃度0.85μM。
【０３５５】
実施例3. ヘム酵素触媒によるインビボおよびインビトロでのオレフィンシクロプロパン化
本実施例は、オレフィンの、1つまたは複数のシクロプロパン官能基を含む様々な生成物への変換を触媒するための、ヘム含有酵素の使用を例示する。ある局面において、本実施例は、ジアゾエステルから様々なオレフィンへのカルベン等価物の形式に従った移動を触媒する改善された能力を有し、高い立体選択性でシクロプロパン生成物を作製する、チトクロムP450BM3（CYP102A1またはBM3）の新規変異体を示す。好ましい変異体には、アミノ酸置換C400SおよびT268Aを有するチトクロムP450BM3突然変異体、ならびに等価の置換を有する他のP450の改変変異体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。チトクロムP450における軸セリン-ヘム連結（BM3におけるC400S）は相同の「チトクロムP411」ファミリーを創製する。チトクロムP411は、ホールセルにおいてシクロプロパン化反応を触媒し、高い立体選択性で10,000を超えるトータルターンオーバーを維持し、20g L-1を超える力価のシクロプロパン生成物を作製する。
【０３５６】
序論
遺伝的にプログラムされたホールセル生体触媒は、単純な増殖培地中で容易に産生され、さらなる精製または単離を必要とせず、複雑な分子を加工するために代謝経路により操作することができる（P. K. Ajikumar et al., Science 330, 70 (2010)；P. J. Westfall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E111 (2012)；M. Kataoka et al., Appl Microbiol. Biotechnol. 62, 437 (2003)）。しかし、実行可能な変換の範囲は現在のところ天然酵素の化学的レパートリーに限定されている。インビボでの非天然反応のための酵素をデザインすることは、機能性触媒の組み立て、細胞環境における合成試薬の適合性、ならびに基質流入および生成物放出を可能にする細胞透過性に対する要求のため、困難であった。細胞内の非天然変換の触媒は、天然および人工生成物への代替代謝経路、現在は合成反応を用いて作製される化学物質の生体に基づく生成を可能にし、細胞機能のインビボ試験のために利用可能な化学的ツールボックスを拡大することになる（M. Boyce, C. R. Bertozzi, Nature Methods 8, 638 (2011)）。
【０３５７】
前記実施例は、細菌チトクロムP450モノオキシゲナーゼにおける少数のアミノ酸突然変異がインビトロでの重要なシクロプロパン化活性を解放しうることを示している。バチルス メガテリウム（BM3）由来のP450BM3の変異体は、還元剤存在下でのジアゾエステル（例えば、ジアゾ酢酸エチル、EDA）からオレフィン（例えば、スチレン）への形式に従ったカルベン移動の数百のターンオーバーを触媒して、シクロプロパン生成物を高いレベルのジアステレオおよびエナンチオ選択性で生成する（P. S. Coelho et al., Science 339, 307 (2013)）。オレフィンシクロプロパン化はファインケミカルの合成において広く用いられ（H. Lebel et al., Chem. Rev. 103, 977 (2003)）、最先端の不斉有機金属触媒は数千から数万のターンオーバーを触媒することができる（D. A. Evans et al., J. Am. Chem. Soc. 113, 726 (1991)；H. M. L. Davies, C. Venkataramani, Org. Lett. 5, 1403 (2003)；G. Maas, Chem. Soc. Rev. 33, 183 (2004)）。BM3変異体は、機能的形態で容易に発現され、人工的補助因子または翻訳後改変を必要とせずに非天然カルベン移動を触媒しうるため、インビボでの触媒作用に適切でありうる。細胞内の触媒周期を開始するために、NAD(P)Hなどの内因性還元剤により、酵素を触媒的に活性な第一鉄-P450に還元する必要がある。P450 FeIII/FeII還元電位のヘム連結制御の考察に基づき、無傷の細胞において効率的かつ選択的オレフィンシクロプロパン化を触媒する、遺伝子によりコードされる「ABC」触媒をデザインした。
【０３５８】
結果
チトクロムP450が触媒するシクロプロパン化は、準化学量論的（ジアゾエステルおよびオレフィンに対して）還元剤を必要とし、嫌気性条件下で最適に進行する（P. S. Coelho et al., Science 339, 307 (2013)）。これは、ジアゾエステル活性化およびカルベン移動は、休止状態FeIII-ヘムに対立するものとして還元P450結合FeII-ヘム補助因子に関与することを示す（図19A）。活性P450由来シクロプロパン化触媒は、天然NAD(P)H（EO'＝-320mV）よりも亜ジチオン酸ナトリウム（EO'＝-660mV、すべての電位はvs SHE）などの強力な還元剤に対して顕著な優先性を示す（P. S. Coelho et al., Science 339, 307 (2013)）。これは、P450ヘム鉄の限られた基質誘導性の低スピン（EO' FeIII/II＝-430mV）から高スピン（EO' FeIII/II＝-290mV）への転移を示し（T. W. B. Ost et al., Biochemistry 40, 13421 (2001)）、これは、一酸素添加に対しては必須であるが、この操作した系では、非天然基質に対する親和性が低い（KM約5mM）ため、達成しえないであろう（P. S. Coelho et al., Science 339, 307 (2013)）。NAD(P)H還元を促進するために、休止状態の酵素の還元電位を上げることは、インビボでFeII触媒作用を増強するために重要であるとの仮説が立てられた。ヘムタンパク質の還元電位は軸配位子の突然変異によって調整しうる（D. S. Wuttke, H. B. Gray, Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 555 (1993)；C. J. Reedy et al., Nucleic Acids Res. 36, D307 (2008)）ため、BM3の軸システインチオラートを弱供与性のセリンアルコールで置換することにより、FeIII/II電位を高めた（図19A）。さらに、軸システイナート連結は、一酸素添加中の二酸素活性化および活性フェリル-ポルフィリンカチオンラジカル酸化剤（化合物I、図1）の安定化にとって必須であり（J. H. Dawson, Science 240, 433 (1988)）、軸システインのセリンへの置換は哺乳動物P450における一酸素添加活性を消失させる（K. P. Vatsis et al., J. Inorg. Biochem. 91, 542 (2002)）。遊離ヘミンも（弱い）シクロプロパン化触媒である（P. S. Coelho et al., Science 339, 307 (2013)）ため、軸システインのセリンへの突然変異（BM3におけるC400S）はカルベン移動活性を維持するが、一酸素添加活性を消失させる。
【０３５９】
突然変異C400Sを本発明のシス選択的シクロプロパン化触媒、BM3-CIS（BM3から13個の突然変異；P. S. Coelho et al., Science 339, 307 (2013)）に導入して、鉄-ポルフィリンで観察されるトランス選択性と対比した（J. R. Wolf et al., J. Am. Chem. Soc. 117, 9194 (1995)）。BM3-CISはインビトロで、亜ジチオン酸塩存在下で数百のターンオーバーを触媒し、2-フェニルシクロプロパン-1-カルボン酸エチル生成物を71％シス選択性および-94％鏡像体過剰率（eeシス)で生成する（P. S. Coelho et al., Science 339, 307 (2013)）。BM3-CIS-C400S（以下ABC-CISと呼ぶ）におけるヘム-セリン連結を、BM3-CISおよびABC-CISヘムドメインの結晶構造を、それぞれ2.5および3.3Åで調べることにより確認した（図9および表38、PDB：4H23および4H24）；構造は重ね合わせ可能である（RMSD＝0.52Å、図9）。ABC-CIS構造の限られた解像度にもかかわらず、モデル化したヘムおよびC400S非存在下で生成したシミュレーテッドアニーリングオミットマップは近位アミノ酸側鎖によるヘム配位に一致する密度を示す（図19Bおよび20）。緑-褐色ABC-CISのUV-visスペクトル（図21〜23）は、ヘム-セリン連結のさらなる証拠を提供し、411nmの第一鉄-一酸化炭素結合複合体により特徴付けられる、Ser連結哺乳動物P450について報告されたものと一致する（K. P. Vatsis et al., J. Inorg. Biochem. 91, 542 (2002）；R. Perera et al., Arch. Biochem. Biophys. 507, 119 (2011)）（表39）。
【０３６０】
（表３９）ABC-CISヘムおよびCYP2B4-C436S（Vatsis et al.）のλmaxの比較
2015534464.tif 000115
【０３６１】
野生型BM3、そのC400S変異体（本明細書において「ABC」と呼ぶ）、BM3-CISおよびABC-CIS（図19Cおよび24〜27）の切断されたヘムドメインを用いての電位差酸化還元滴定は、突然変異C400Sが休止状態酵素の還元電位を+127mV高める（ABCおよびABC-CISでそれぞれEO' FeIII/IISer＝-293mVおよび-265mV）ことを示した。このシフトは基質結合後にBM3で起こるものと規模がほぼ同等で（T. W. B. Ost et al., Biochemistry 40, 13421 (2001)）、したがってABC-CISが基質非存在下であってもNAD(P)Hによって還元されることを可能にする。
【０３６２】
ABC-CIS（P411BM3-ヘム-CIS）は、活性な亜ジチオン酸塩がインビトロで推進するシクロプロパン化触媒であり、BM3-CIS（P450BM3-ヘム-CIS）のものに匹敵するミカエリス・メンテンパラメーター（kcat＝82分-1、KM-スチレン＝4.6mM、KM-EDA＝5.7mM、図8）を有する（表40）。
【０３６３】
（表４０）p450シクロプロパン化触媒のミカエリス・メンテンパラメーター
エラーバーは当てはめたパラメーターの99％信頼区間に対応する。
2015534464.tif 000116
【０３６４】
ABC-CISは、そのシステイン相同体（図28）に比べて、かなり改善されたジアステレオ選択性（シス：トランス93：7）およびエナンチオ選択性（-99％eeシス）を示し、2つの触媒の類似する活性部位幾何学的形状（図9）を考慮すると、予想外の結果である。様々なスチレン基質に対し、ABC-CIS（P411BM3-CIS）はBM3-CISに比べて優れたシス選択性を示した（表41）。
【０３６５】
（表４１）BM3-CIS（P450BM3-CIS）に比べてABC-CIS（P411BM3-CIS）の増強されたZ選択性
2015534464.tif 000117
*EDAに基づく。†ジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析によりもとめた。‡鏡像体過剰率は鏡像体が基準線分割で分割された場合にのみ報告する。
【０３６６】
ABC-CISは、嫌気性条件下でNADPHを還元剤として用いる場合、BM3-CISに比べて高い活性を示す（図7および表36）。BM3-CISは、NADPHを用いる場合、少量のシクロプロパンしか生成せず、好気性条件下で一酸素添加を介してスチレンオキシドを主生成物として生成する。これとは対照的に、ABC-CISは無視できる量のスチレンオキシドを生成し、好気性条件下で、酸素阻害のために低収率（43 TTN）ではあるが、なおシクロプロパンを生成することができる（図7）。二酸素阻害は、CYP2B4-C436Sについて報告された2電子オキシダーゼ活性によるものでありうる（K. P. Vatsis et al., J. Inorg. Biochem. 91, 542 (2002)）。NADHはABC-CIS仲介性シクロプロパン化をNADPHと同じくらい効率的に推進し（表42）、ABC-CISが、大腸菌におけるNADPH生合成が起こらない、嫌気性条件下でのインビボ触媒作用のために適切であることを示している。
2015534464.tif 000118
【０３６７】
（表４２）Na2S2O4、NADPHおよびNADHによって推進されるインビトロでのBM3-CIS-C400S（ABC-CISまたはP411BM3-CISとも呼ぶ）シクロプロパン化
2015534464.tif 000119
*EDAに基づく。†ジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析によりもとめた。‡(2R,1S)-(2S,1R)。§(2R,1R)-(2S,1S)。
【０３６８】
変異体9-10A-TS-F87V-T268A（BM3-CISまたはP450BM3-CISとも呼ぶ）およびBM3-CIS-C400S（ABC-CISまたはP411BM3-CISとも呼ぶ）を発現する、M9Y培地［M9、1.5％酵母エキス］中で増殖させた休止大腸菌［BL21(DE3)］細胞を用いてのシクロプロパン化の効率を次に調査した。嫌気性条件下でのグルコースの添加は、生成物収率を有意に増大し（図29）、これはおそらくはNADHの増強された細胞内生成によるものであった。ABC-CISはインビボで数千のターンオーバーを触媒し、ホールセルにおいてBM3-CISよりも約4倍活性が高く、増強されたシス-エナンチオ選択性でシクロプロパン生成物を提供する（表43、項目1および2）。
【０３６９】
（表４３）操作した酵素を発現する無傷の大腸菌細胞に対するシクロプロパン化活性
反応条件は以下のとおりであった：2当量スチレン、1当量EDA、0.2当量グルコース、大腸菌ホールセル、水性無窒素M9最少培地および5％MeOH共溶媒中、嫌気性条件下、298Kで12時間。収率、ジアステレオマー比、および鏡像体過剰率はGC分析により判定した。収率はEDAに基づく。TTN＝トータルターンオーバー。*(2R,1S)-(2S,1R)。†(2R,1R)-(2S,1S)。‡MeOHを加えることなくニート試薬を用いた；反応混合物を24時間放置した。§単離収率（1.63gシクロプロパン）。データは三つ組の実験の平均を示す。標準誤差は報告した平均の20％以内である。
2015534464.tif 000120
P411BM3＝P450BM3-C400S。
【０３７０】
突然変異C400Sはタンパク質発現を損ない、したがってBM3-CISの6％と比べて、ABC-CISは乾燥細胞質量の2％に相当する。C400Sは精製したABC-CISヘムドメインにおける熱安定性の増大に貢献する（ABC-CISヘム、図30）ため、発現低減はタンパク質安定性の低下によるものではない。ヘムおよびジフラビンレダクターゼドメインの両方を含むホロ酵素は、ヘムドメイン単独（表43、項目3）よりもモル濃度ベースで2倍を超えて活性で、インビボでの第一鉄状態への還元が重要であることを確認しているが、同時に細胞内環境を還元することで、レダクターゼドメイン非存在下でも、ヘム還元が達成されることを示している。突然変異C400S（ABC）はBM3のインビボでのシクロプロパン化活性を、2桁を超えて改善する（表43、項目4および5）。精製したABCはインビトロで効率的な、NADHが推進するシクロプロパン化触媒でもあるが、BM3はほとんど活性がない（表44）。
【０３７１】
（表４４）NADHにより推進されるBM3およびABCのインビトロシクロプロパン化活性
2015534464.tif 000121
*EDAに基づく。†ジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析により判定した。‡(2R,1S)-(2S,1R)。§(2R,1R)-(2S,1S)。小規模（500μL）反応を、精製P450BM3およびP411BM3触媒により、本明細書に記載のとおりに行った。測定は三つ組で行い、エラーバーは平均値からの標準偏差を表す。
【０３７２】
ABC-CISおよびBM3-CISホールセルはいずれも二酸素によって有意に阻害される（図31）。ABC-CIS遺伝子を含むが、誘導なしのホールセルおよびABC-CIS遺伝子を欠くホールセルは少量のシクロプロパンを生成しうるが、細胞中に存在する遊離ヘミンおよび他のヘムタンパク質もスチレンシクロプロパン化を低レベルで触媒しうる（P. S. Coelho et al., Science 339, 307 (2013)）ため、遊離ヘミンと類似の立体選択性を示す（図32）。ホールセルABC-CIS触媒はインビトロでの精製ABC-CISと、等価の触媒負荷で同等に立体選択的であり（下記参照）、過剰発現されたP411酵素がバックグラウンド触媒作用を都合よく打ち負かすことを示している。インビボでのシクロプロパン化は、第一鉄ヘムに不可逆的に結合する一酸化炭素によって強力に阻害され（表43、項目6）、触媒作用が酵素活性部位において起こることを確認している。収率は、細胞密度を最大OD600＝50まで高めることによって80％まで高めうる（図33）。反応収率は過剰のスチレンを用いることにより、わずかに改善されるにすぎなかった（図14）。ABC-CISを発現し、NADHを添加した細胞の溶解物は、無傷のホールセルの約30％しか活性を保持しておらず、外因性還元剤非存在下では活性でない（表45）。
【０３７３】
（表４５）インビボ活性に比べての溶解物活性
2015534464.tif 000122
*EDAに基づく。†ジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析により判定した。‡(2R,1S)-(2S,1R)。
【０３７４】
亜ジチオン酸塩の添加はABC-CISホールセル反応を阻害し、細胞溶解物中の反応を推進する上でNADHよりも効率が低かった（図15および表45）。
【０３７５】
インビボとインビトロでの酵素活性を直接比較するために、両方の反応を同じ酵素濃度で8時間にわたってモニターした（図34）。モル濃度ベースで、インビボ触媒は8時間後に精製酵素よりもほぼ6倍高いTTNを示し、同じ立体選択性を保持していた（75：25 シス：トランス、-95％eeシス）。いずれの触媒も6時間にわたって活性のままで、収率およびTTNで観察された差は、インビボでの触媒安定性の増強ではなく活性の改善によることを示している。EDAを徐々に加えても反応収率は改善されなかった。
【０３７６】
高い基質負荷（170mM EDA、400mMスチレン、ニート試薬として加えた）で、ABC-CISによるインビボ反応において60,000を超える触媒ターンオーバーが観察された（表43、項目7）。ABC-CISホールセル反応は容易に規模を変えて、グラム量のシクロプロパンを高い立体選択性、生成物力価（27g L-1）および収率（78％、表46）で作製することができる。有機共溶媒は必要なく、シクロプロパン生成物は、反応終了時に有機溶媒で抽出することにより、容易に得ることができる。さらに、細胞をショ糖などの凍結保護物質と共に凍結乾燥し、触媒活性またはジアステレオおよびエナンチオ選択性を劣化させることなく、粉末として4℃で数週間保存することができる（表47）。
【０３７７】
（表４６）ABC-CIS（P411BM3-CIS）を発現する無傷の大腸菌細胞のシクロプロパン化活性
反応条件は記載がある場合を除いて表43に記載のものである。
2015534464.tif 000123
1収率はカルベン変換に基づいて計算する。
2反応を終夜行った；実際の反応時間はより短い可能性があり、したがって生産性の数字は可能性のある最悪のシナリオである。
【０３７８】
（表４７）凍結乾燥したABC-CIS（P411BM3-CIS）ホールセル触媒のシクロプロパン化活性
2015534464.tif 000124
*EDAに基づく。†ジアステレオマー比および鏡像体過剰率はGC分析により判定した。‡(2R,1S)-(2S,1R)。§(2R,1R)-(2S,1S)。細胞を10％ショ糖（m/V）中で凍結乾燥し、4℃で2週間保存した。得られた粉末の適切な量を2mLガラスバイアルに移し、これをクリンプシールし、アルゴンでパージした。無窒素M9培地およびグルコース（20mM）の脱気溶液をシリンジから加えた。細胞をOD600＝25およびグルコースの最終濃度2mMに再懸濁した。測定は三つ組で行い、エラーバーは平均値からの標準偏差を表す。
【０３７９】
凍結乾燥した細胞は容易に包装し、分配することができる。これらの特徴は、ホールセル法を、容易な机上合成のために魅力的なものにする。
【０３８０】
Ser連結チトクロムP411に基づくABC触媒は、チトクロムP450とは分光学的、電気化学的および触媒的に異なる。ホールセルABC触媒は使用が容易で、1リットルあたり数十グラムでの基質投入のための、高い変換、光学純度および収率を提供する。このインビボで非天然C-C結合生成反応を触媒する能力は、微生物有機合成を可能にする変換の範囲を拡大し、シクロプロパンを作製するための天然の既存の戦略を補足する、人工的代謝経路を提供する（L. A. Wessjohann et al., Chem. Rev. 103, 1625 (2003）。
【０３８１】
この概念は、バチルス メガテリウム由来の単一のP450酵素、およびバチルス メガテリウムの酵素と枯草菌由来の他の関連するP450とのキメラについて示されている。しかし、当業者であれば、他の生物由来の他のP450を操作してシクロプロパン化を行いうること、およびこれらの酵素を用いてABCホールセル触媒を作製しうることを理解するであろう。特に、突然変異C400Sの等価物は他のP450酵素のシクロプロパン化および他のカルベン移動反応の性能を改善することになる。当業者であれば、配列アラインメントに基づき、他のP450においてC400に等価の残基をいかに同定するかを知っており、その例を以下に示す。部位特異的突然変異誘発または遺伝子合成などの、当技術分野において公知の方法を用いて、任意のP450においてこの残基をセリンに変更することができる。得られた酵素が適切に折りたたまれれば、これはシクロプロパン化の触媒として役立つことになる。精製タンパク質またはホールセル触媒におけるこの突然変異は、この突然変異を含まない親酵素よりも活性を改善することになる。
【０３８２】
例えば、P450BM3（CYP102A1）のアミノ酸配列の、シュードモナス プチダ由来のもの（CYP101A1、P450CAM）またはカイウサギ由来の哺乳動物酵素（CYP2B4）などの他のP450へのBLASTアラインメント（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）は、以下：
2015534464.tif 000125
に示すとおり、近位システイン残基または等価のT268（太字）の同定を可能にする。
【０３８３】
したがって、CYP101A1における突然変異C357SおよびT252A、またはCYP2B4におけるC436SおよびT302Aは、これらの酵素におけるシクロプロパン化活性を増強すると予想される。突然変異を標的遺伝子に、標準のクローニング技術を用いて、または遺伝子合成によって導入することができる。突然変異遺伝子は、適切な微生物宿主中、誘導性プロモーターの制御下で、または染色体組込みにより構成性プロモーターの制御下で、発現させることができる。シクロプロパン化活性は、GCまたはHPLCで生成物生成を追跡することにより、インビボまたはインビトロでスクリーニングすることができる（材料および方法参照）。
【０３８４】
ABC触媒は遺伝子によりコードされ、ホールセルで非常に良好に機能するため、この触媒を、基質の複数の変換を細胞内部で行う、インビボでの生合成のための多酵素経路に組み込むことができる。特定の態様において、EDAまたは他のジアゾ試薬を培地に外因性に提供することもでき、および/またはインサイチューで生成させることもできる。
【０３８５】
突然変異C400Sを他のP450骨格に拡大することができれば、カルベノイド前駆体としての様々なジアゾ化合物の入手が可能になる。これらには、ジアゾエステル（受容体型）、ジアゾβ-ケトエステルまたはβ-シアノエステル（受容体-受容体型）、およびアルキル、アリール、またはアルケニル置換ジアゾエステル（供与体-受容体）が含まれるが、それらに限定されるわけではない（図17A）。これらのジアゾ化合物を様々なスチレン、脂肪族オレフィン、およびアレンと分子間および分子内反応させて、生物活性化合物またはさらなる反応のための有機ビルディングブロックを提供することができる（図17B）。例えば、ジアゾエステルのアリールまたはアリルシランおよびボロン酸とのP450が触媒する反応は、シクロプロパンを生成し、これは次いで鈴木または檜山クロスカップリング反応において用いることができる。さらに、C9オレフィンにおけるゲラニルアセトンのトランス選択的P450触媒およびEDAによるシクロプロパン化は、B-16黒色腫細胞に対するマイクログラム細胞毒性を示す海洋天然物、アンスロプラロンおよびノルアンスロプロンの鍵となる前駆体を提供する（図17C）。最後に、2,5-ジメチルヘキサ-2,4-ジエンの類似の触媒およびEDAによる処理は、ピレスロイド殺虫剤の製造における重要な中間体、クリサンテム酸のエチルエステルを提供する（図17D）。
【０３８６】
材料および方法
特に記載がないかぎり、化学反応のためのすべての化学物質および試薬は商業的供給業者（Sigma-Aldrich、Acros）から入手し、それ以上精製せずに用いた。シリカゲルクロマトグラフィ精製はAMD Silica Gel 60、230-400メッシュを用いて行った。1Hおよび13C NMRスペクトルはVarian Mercury 300分光計（それぞれ300MHzおよび75MHz）、またはVarian Inova 500MHz（それぞれ500MHzおよび125MHz）のいずれかで記録し、残存溶媒ピークを内部標準とした。1H NMRのデータは通常の形式で報告する：化学シフト（δppm）、多重度（s＝一重線、d＝二重線、t＝三重線、q＝四重線、m＝多重線、br＝広幅）、カップリング定数（Hz）、積分。13Cのデータは化学シフト（δppm）および多重度に関して報告する。高分解能質量スペクトルはJEOL JMS-600H High Resolution Mass Spectrometerにより、California Institute of Technology Mass Spectral Facilityで得た。反応は薄層クロマトグラフィ（Merck 60シリカゲルプレート）を用い、UVランプで可視化してモニターした。
【０３８７】
ガスクロマトグラフィ（GC）分析は、Shimadzu GC-17Aガスクロマトグラフ、FID検出器、およびAgilent J&W cyclosil-Bカラム（30m×0.25mm、0.25μmフィルム）ならびに内部標準としての2-フェニルエタノールを用いて行った。注入口温度＝300℃、オーブン温度＝130℃で30分間、圧＝175kPa。溶出時間：シス-シクロプロパン［19.7分（2R,1S）および21.0分（2S,1R）］、トランス-シクロプロパン［25.8分（2R,1R）および26.4分（2S,1S）］。ジアゾ酢酸エチル（EDA）のスチレン（2-フェニルシクロプロパン-1-カルボン酸エチル）およびα-メチルスチレン（2-メチル-2-フェニルシクロプロパン-1-カルボン酸エチル）との反応のためのシクロプロパン生成物標準は、報告されたとおりに調製した（A. Penoni et al., Eur. J. Inorg. Chem. 2003, 1452 (2003)）。これらの標準および酵素により調製したシクロプロパンは、同時注入した場合にガスクロマトグラムで同じ保持時間を示し、生成物の同一性を確認した。シクロプロパン鏡像体の絶対立体配置を、エナンチオ選択的BM3変異体を用いる調製的生物変換反応からの精製したシクロプロパン生成物の旋光度を測定することにより判定し、参照文献から取った値と比較した（N. Watanabe et al., Heterocycles 42, 537 (1996)）。P450触媒シクロプロパンの標品も本明細書に記載するとおりに調製し、NMR（1Hおよび13C）および質量分析により特徴付けた。
【０３８８】
プラスミドpCWori[BM3]およびpET22をクローニングベクターとして用いた。部位特異的突然変異誘発を、所望の突然変異を有するプライマー（IDT、San Diego、CA）を用いての標準重複突然変異誘発によって達成した。エレクトロコンピテント大腸菌細胞を、Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual.（Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989）、第2巻のプロトコルに従って調製した。制限酵素BamHI、EcoRI、XhoI、Phusionポリメラーゼ、およびT4リガーゼはNew England Biolabs（NEB、Ipswich、MA）から購入した。アルカリ性ホスファターゼはRoche（Nutley、NJ）から入手した。発現培養において用いた1,000×微量金属混合物は下記を含んでいた：50mM FeCl3、20mM CaCl2、10mM MnSO4、10mM ZnSO4、2mM CoSO4、2mM CuCl2、2mM NiCl2、2mM Na2MoO4、および2mM H3BO3。
【０３８９】
CO結合検定。P450濃度を、システイン連結BM3のε450-490＝91mM-1cm-1（T. Omura, R. Sato, J. Biol. Chem. 239, 2370 (1964)）およびセリン連結ABCのε411-490＝103mM-1cm-1（K. P. Vatsis et al., J. Inorg. Biochem. 91, 542 (2002)）の吸光係数を用いて第一鉄CO結合差スペクトルからもとめた。
【０３９０】
P450発現および精製。インビトロでのシクロプロパン化反応のために、BM3変異体を精製した形で用いた。酵素バッチを以下のとおりに調製した。1リットルのTBampに、tacプロモーター制御下のP450変異体をコードするpCWoriプラスミドを有する組換え大腸菌BL21(DE3)細胞の終夜培養物（100mL、LBamp）を接種した。37℃、250rpmの振盪で3.5時間インキュベートした後（OD600＝約1.8）、インキュベーション温度を25℃に下げ（30分）、IPTGを最終濃度0.5mMまで加えることにより培養を誘導した。培養をこの温度でさらに24時間続けた。細胞を遠心沈降（4℃、15分、3,000×g）により回収した後、細胞ペレットをさらなる使用までであるが、少なくとも2時間、-20℃で保存した。細胞ペレットを25mMトリスHCl緩衝液（pH7.5、25℃）に再懸濁し、細胞を音波処理（2×1分、出力コントロール5、50％デューティーサイクル；Sonicator、Heat Systems - Ultrasonic、Inc.）により溶解した。細胞デブリを4℃、27,000×gで20分間の遠心沈降により除去し、上清をQ Sepharoseカラム（HiTrapTM Q HP、GE Healthcare、Piscataway、NJ）でAKTAxpress purifier FPLCシステム（GE healthcare）を用いてアニオン交換クロマトグラフィにかけた。P450（またはP411）をQカラムから、カラムの10倍量で0〜0.5M NaClの勾配により溶出した（P450は0.35M NaClで溶出する）。P450（またはP411）分画を回収し、30kDa分子量カットオフの遠心ろ過器を用いて濃縮し、0.1Mリン酸緩衝液（pH＝8.0）で緩衝液交換した。精製したタンパク質をドライアイスで急速凍結し、-20℃で保存した。P450およびP411濃度を三つ組で前述のCO結合検定を用いて定量した（ウェルごとに10μL P450および190μL 0.1Mリン酸緩衝液、pH8.0）。
【０３９１】
結晶化実験のために、AKTAxpress purifier FPLCシステムを用いて2段階精製を行った。発現した6XHis標識ヘムドメインを含む凍結細胞ペレットをNi-NTA緩衝液A（25mMトリスHCl、200mM NaCl、25mMイミダゾール、pH8.0、0.5mL/gcw）に再懸濁し、音波処理（2×1分、出力コントロール5，50％デューティーサイクル）により溶解した。溶解物を4℃、27,000×gで20分間遠心沈降して細胞デブリを除去した。回収した上清をまず、Niセファロースカラム（HisTrap-HP、GE healthcare、Piscataway、NJ）を用いてのNi-NTAクロマトグラフィ段階にかけた。P450（またはP411）をNiセファロースカラムから25mMトリスHCl、200mM NaCl、300mMイミダゾール、pH8.0を用いて溶出した。Ni精製タンパク質を25mMトリスHCl pH7.5中に30kDa分子量カットオフの遠心ろ過器を用いて緩衝液交換し、続いてQセファロースカラム（HiTrapTM Q HP、GE healthcare、Piscataway、NJ）にロードし、アニオン交換により精製して均質にした。P450（またはP411）をQカラムから、カラムの10倍量で0〜0.5M NaClの勾配により溶出した。P450（またはP411）分画を回収し、25mMトリスHCl pH7.5、25mM NaCl中に緩衝液交換した。精製タンパク質を30kDa分子量カットオフの遠心ろ過器を用いて約10mg/mLまで濃縮した。50μLの一定量をドライアイスで急速凍結し、必要になるまで-80℃で保存した。
【０３９２】
タンパク質結晶学。BM3-CISおよびABC-CISを蒸気拡散により結晶化した。タンパク質保存液（25mMトリスHCl pH7.5、25mM NaCl中10mg/mL）および母液の1：1混合物を24穴シッティングドロッププレート（Hampton Research）中で混合した。BM3-CISのために最適な結晶化条件を0.1Mカコジル酸ナトリウム、pH5.7、0.14 MgCl2および17％PEG 3350中で見出した。BM3-CIS結晶は典型的には7〜14日の期間で成長した。ABC-CIS結晶は0.1Mビス-トリス、pH5.3、0.2Mギ酸ナトリウムおよび18％PEG 3350中で最適に生成した。最初のABC-CIS液滴はタンパク質沈澱の高密度な層によって特徴付けられるが；36〜48時間後、顕著なタンパク質結晶が沈殿層の下に観察された。
【０３９３】
X線データ収集およびタンパク質構造決定。X線回折データをGeneral Medical Sciences and Cancer Institutes Structural Biology Facility（GM/CA）においてAdvanced Photon Source（APS、Argonne National Laboratory）でビームラインID23-DおよびMAR300 CCD検出器を用いて収集した。データは100Kおよび1.033Åの波長で収集した。データ収集統計値を表38に挙げている。回折データセットをXDSで積分し（W. Kabsch, Acta Crystallogr. D66, 133 (2010)）、SCALAを用いてスケーリングを行った（P. Evans, Acta Crystallogr. D62, 72 (2006)）。初期相は、CCP4結晶学ソフトウェアパッケージ（S. Bailey, Acta Crystallogr. D50, 760 (1994)）の成分である、MOLREPソフトウェア（A. Vagin, A. Teplyakov, J. App. Crystallogr. 30, 1022 (1997)）を用いて、PDB 1JPZ（D. C. Haines et al., Biochemistry 40, 13456 (2001)）、chain Bから取った野生型BM3ヘム構造のクローズ型に対する分子置換によって決定した。精密化を、COOT（P. Emsley, K. Cowtan, Coot: Acta Crystallogr. D60, 2126 (2004)）内の手動モデル構築の反復サイクルおよびCCP4内のREFMAC（G. N. Murshudov, A. A. Vagin, E. J. Dodson, Acta Crystallogr. D53, 240 (1997)）を用いての自動精密化によって達成した。REFMAC精密化の最後のサイクルはTLSパラメーターを含んでいた。精密化中に非結晶学的対称制約は用いなかった。モデル品質をPHENIXソフトウェアパッケージ（P. D. Adams et al., Acta Crystallogr. D66, 213 (2010)）内の「complete validation」ツールを用いて評価した。シミュレーテッドアニーリングオミットマップもPhenixを用いて計算した。ラマチャンドラン異常値は一般にはBM3 FとGヘリックスを連結する構造が不良のループにある。これらの残基は多くの場合、タンパク質データベース内のこれらおよび他のBM3構造において欠如しているか、または低い密度によって特徴付けられる。すべてのタンパク質構造図およびアラインメントはPyMolソフトウェア（The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.3, Schroedinger, LLC.）を用いて生成した。
【０３９４】
熱安定性測定。図30に報告したすべての値について、二つ組の測定を行った。精製したP450（またはP411）溶液（4μM、200μL）をサーモサイクラー（Eppendorf）中、40℃〜70℃の温度範囲で10分間加熱し、続いて1分間で4℃まで急速冷却した。沈澱を遠心沈降により除去した。上清中に残存する折りたたまれたP450（またはP411）の濃度をCO差スペクトロスコピー（前述のとおり）により測定した。データを以下の式：
2015534464.tif 000126
に当てはめることにより、タンパク質の半分が変性する温度（T50）をもとめた
（J. D. Bloom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5869 (2006)）。
【０３９５】
嫌気性条件下でのインビトロ小規模シクロプロパン化生物変換のための典型的手順。小規模反応（400μL）を2mLクリンプバイアル（Agilent Technologies、San Diego、CA）中で行った。P450溶液（80μL、100μM）を、小さい撹拌子を含むバイアルに加えた後、シリコーンセプタムでクリンプをシールした。リン酸緩衝液（260μL、0.1M、pH＝8.0）および40μLの還元剤溶液（100mM Na2S2O4、または20mM NADPH）を、クリンプシールした、より大きいバイアル中で混合し、アルゴンを溶液に少なくとも5分間通気することにより脱気した（図S1）。一方、P450（またはP411）溶液を含む2mL反応バイアルの、タンパク質溶液上にアルゴンを流す（通気なし）ことにより、ヘッドスペースを嫌気性にした。複数の反応を並行で行う場合、最大8つの反応バイアルを、カニューレを介して連続で脱気した。緩衝液/還元剤溶液（300μL）を反応バイアルに、アルゴン雰囲気下でシリンジにより注入した。ガスラインを反応バイアルからはずした後、バイアルをプレート撹拌機上に設置した。40×スチレンMeOH溶液（10μL、典型的には1.2M）を反応バイアルにガラスシリンジを介して加え、約30秒間撹拌した。次いで、40×EDA MeOH溶液を加え（10μL、典型的には400mM）、反応混合物を適切な時間撹拌した。試薬の最終濃度は典型的には以下のとおりであった：30mMスチレン、10mM EDA、10mM Na2S2O4、20μM P450。
【０３９６】
30μL HCl（3M）をシリンジで密封反応バイアルに加えることにより、反応を停止した。バイアルを開け、20μLの内部標準（20mM 2-フェニルエタノール/MeOH）と、続いて1mLの酢酸エチルを加えた。この混合物を1.8mLのエッペンドルフチューブに移し、これをボルテックス処理して遠心沈降した（16,000×g、1分）。上部有機層を無水硫酸ナトリウムプラグで乾燥し、キラル相GCで分析した。
【０３９７】
わずかに変更した後処理を、動態実験のために実行した。設定した時間の後、1mL EtOAcを密封バイアルにシリンジで注入し、混合物をただちにボルテックス処理することにより、反応を停止した。次いで、バイアルを開け、20μLの内部標準を加えた。混合物を1.8mLのエッペンドルフチューブに移し、ボルテックス処理して遠心沈降した（16,000×g、1分）。上部有機層を無水硫酸ナトリウムプラグで乾燥し、GCで分析した。
【０３９８】
インビボシクロプロパン化のための培地および細胞培養。大腸菌［BL21(DE3))］細胞を、5mlのM9Y培地（1L：31g Na2HPO4、15g KH2PO4、2.5g NaCl、5.0g NH4Cl、0.24g MgSO4、0.01g CaCl2、1.5％酵母エキス、1mL微量栄養素、0.1mg mL-1アンピシリン）中、グリセロール保存液から終夜増殖させた（37℃、250rpm）。前培養物を用いて125mLアーレンマイヤーフラスコ中の45mLのM9Y培地に接種し、この培養物を37℃、250rpmで2時間30分インキュベートした。OD600＝1.2で、培養物を25℃まで冷却し、振盪を160rpmに下げた後、IPTG（0.25mM）およびδ-アミノレブリン酸（0.25mM）で誘導した。20時間後に培養物を回収し、無窒素M9培地（1L：31g Na2HPO4、15g KH2PO4、2.5g NaCl、0.24g MgSO4、0.01g CaCl2、1mL微量栄養素）に再懸濁した（OD600＝30）。微量栄養素溶液は0.15mM (NH4)6Mo7O24、20.0mM H3BO3、1.5mM CoCl2、0.5mM CuSO4、4.0mM MnCl2、および0.5mM ZnSO4を含む。細胞懸濁液の一定量を、細胞乾燥重量（cdw、2mL）およびP450（またはP411）発現レベル（4mL）の判定に用いた。
【０３９９】
小規模ホールセル生物変換。2mLクリンプバイアル中の細胞懸濁液にアルゴンを通気することにより、大腸菌細胞（OD600＝30、425μL）を嫌気性にした。グルコースの脱気溶液（50μL、20mM）を細胞に加えた後、EDA（MeOH中400mM溶液12.5μL）およびオレフィン（MeOH中1.2M溶液12.5μL）を加えた。反応混合物を室温で適切に撹拌し、20μLの内部標準（20mM 2-フェニルエタノール）を加え、1mL酢酸エチルで抽出することにより、後処理した。有機層をNa2SO4で乾燥した後、生成物混合物をキラル相ガスクロマトグラフィで分析した。
【０４００】
調製規模ホールセル生物変換。大腸菌［BL21(DE3)］細胞を、50mlのM9Y培地中、グリセロール保存液から終夜増殖させた（37℃、250rpm）。前培養物を用いて2-1Lアーレンマイヤーフラスコ中の2-475mLのM9Y培地に接種し（それぞれ25mLを用いて）、この培養物を37℃、250rpmで2時間30分インキュベートした。OD600＝1.8で、培養物を25℃まで冷却し、振盪を150rpmに下げた後、IPTG（0.25mM）およびδ-アミノレブリン酸（0.25mM）で誘導した。24時間後に培養物を回収し、無窒素M9培地に再懸濁した（OD600＝75）。細胞懸濁液の一定量を、細胞乾燥重量（cdw、2mL）およびP450（またはP411）発現レベル（2mL）の判定に用いた。500mL密封丸底フラスコ中の細胞懸濁液にアルゴンを通気することにより、大腸菌細胞（OD600＝70、53.6mL）を嫌気性にした。グルコースの脱気溶液（1.4mL、500mM）を細胞に加えた後、EDA（Sigma Aldrichにより包装されたDCM中85％EDA 1.36mL）およびスチレン（2.5mL、ニート）を加えた。反応混合物を室温、アルゴン加圧下で24時間撹拌した。粗製混合物を3-50mLコニカルチューブに加え、HCl（1mL、3M）を各チューブに加えることにより反応を停止した。水性混合物を1：1 EtOAc：ヘキサン（各20mL）で抽出し、遠心沈降した（5000rpm、5分）。有機物を回収し、この抽出手順をさらに2回実施した。有機物を合わせ、Na2SO4で乾燥し、次いで濃縮した。過剰のスチレンをH2O/ベンゼンの共沸により除去し、1.85gの粗生成物を単離した。反応のシス/トランス選択性を、この粗製混合物のガスクロマトグラフィにより判定した。粗生成物の8％Et2O/ヘキサンでのカラムクロマトグラフィにより、所望の生成物をシスおよびトランス異性体の混合物で得た（合わせて1.63g、収率78％）。粗製収率と精製収率との比較に基づき、粗生成物はおよそ88％の純度であった。単離生成物のNMRは参照文献中に報告されたものと同じであった（P. S. Coelho et al., Science 339, 307 (2013)）。
【０４０１】
インビボおよびインビトロ反応の時間経過。小規模生物変換の手順にしたがい、一連のインビボおよびインビトロ反応を設定し、EDAを各試料に0時間の時点で加えた。時点を0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、および8時間で取った。報告された各収率は、表示の時間撹拌した2つの個々の反応の平均を反映している。示したエラーバーは2つの平均していないデータ点を反映している。各反応の収率はGCでもとめた。
【０４０２】
電位差滴定。酵素試料を100mM KPO4、100mM KCl、pH7.4中に緩衝液交換し、アルゴンの穏やかな4×20ポンプ充填サイクルにより、発泡しないように注意しながら、脱酸素化した。電位差酸化還元滴定を、嫌気性グローブボックス内で、光路長1mmの石英分光電気化学セル、白金メッシュ作用電極、白金線対電極を用いて実施し、Ag/AgCl電極（Bioanalytical Systems, Inc.）を参照基準として用いた（Ag/AgCl対NHE：+197mV）。タンパク質溶液は約600μLの50〜100μMタンパク質およびタンパク質と電極との間の電気化学的通信を確保するために加えた以下のメディエーターからなっていた：メチルビオローゲン（5μM）、ベンジルビオローゲン（10μM）および2-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン（20μM）。酵素試料を亜ジチオン酸ナトリウム（還元）およびフェリシアン化カリウム（再酸化）を用いて滴定した。細胞の開路電位を10分間の平衡期間の間モニターし（WaveNowポテンシオスタット、Pine Research Instrumentation）、スペクトルをOcean Optics分光計（USB2000+）を用いて記録した。還元電位（Eo'）を、データを1電子ネルンスト式にあてはめることによってもとめた。
【０４０３】
P450由来シクロプロパン化触媒の概要。シクロプロパン化触媒における突然変異を野生型BM3に対して報告する。ヘムドメインはBM3配列における最初の462アミノ酸を含む。
ABC：BM3+C400S
BM3-CIS：V78A、F87V、P142S、T175I、A184V、S226R、H236Q、E252G、T268A A290V、L353V、I366V、E442K
ABC-CIS：BM3-CIS+C400S
【０４０４】
突然変異C400Sの原理。他のヘムタンパク質に比べてチトクロムP450の非常に負のFeIII/II電位は、軸配位子システイナートの強力な供与特性によるとされている。この効果はチトクロムcにおいてモデリングされている：天然の軸のシステインからメチオニンへの置換はFeIII/II電位を652mV、すなわちMet/His連結変異体の262mV vs SHEからCys/His変異体の-390mV vs SHEまで高度に低下させる（A. L. Raphael, H. B. Gray, J. Am. Chem. Soc. 113, 1038 (1991)）。チトクロムP450内でさえ、還元電位はシステイナート配位子の電子供与特性を増大させることによってさらに低下させることができる。システイナートの負電荷を安定化させると提唱されている単一のアミドプロトンの除去は、FeIII/II電位を野生型に比べて35〜45mV負にシフトさせる（S. Yoshioka et al., J. Am. Chem. Soc. 124, 14571 (2002)）。
【０４０５】
インビボでのシクロプロパン化活性を促進するために、還元電位を十分正にシフトさせて、NADPHによる還元を可能にすることが必須であった。チトクロムcでは、弱供与性の水分子による軸連結はHis/H2O連結変異体の還元電位（FeIII/II：-45mV vs SHE）を、Cys/His変異体に比べて345mV上昇させることが観察された（A. L. Raphael, H. B. Gray, J. Am. Chem. Soc. 113, 1038 (1991)）。そのために、P450の軸配位子システイナートの、弱供与性セリンアルコールによる置換は、C400S還元電位を野生型に比べて正にシフトさせるであろうとの仮説が立てられた。セリンのpKa（約15）はシステインのもの（約8）よりも約7pH単位高く、したがってシステインは酵素の第二鉄および第一鉄両方の状態においてシステイナート配位子として脱プロトン化されたままであるが、セリンは少なくとも第一鉄型ではプロトン化されたままであろう。セリン連結哺乳動物P450突然変異体は、吸収スペクトルおよび磁気円二色性の分析に基づき、第二鉄型ではセリナートであり、第一鉄型ではセリンであると示唆されており（R. Perera et al., Arch. Biochem. Biophys. 507, 119 (2011)）、Ser-P450-BM3における類似の連結がより正のFeIII/II電位をもたらすであろうとの仮説が立てられた。
【０４０６】
補足データ
C400S突然変異体の物理的特徴付け
X線結晶学統計。軸C400S突然変異によるヘム配位を確認し、ABC-CISにおいて観察された増強された立体選択性の特性を調査するために、両方のタンパク質の結晶構造を調べて（表38）、軸Cys→Serの突然変異によって起こった可能性がある任意の構造変化を評価した。図9の上図はBM3-CIS（緑）およびABC-CIS（ピーチ）のアラインメントを示し、左、中央および右の図はそれぞれ活性部位残基、活性部位I-ヘリックス、および全体のタンパク質折りたたみを示す。有意な構造変化は観察されなかった（RMSD 0.52Å）。図9、中段の図：BM3-CISを野生型BM3のオープン（配位子なし）型（紫、PDB# 2IJ2から取得、RMSD 1.2Å）と比較すると、大きい変動が観察される。活性部位側鎖残基（左）ならびにI-ヘリックス内の回転において顕著な再編成が観察される。N末端ベータドメインならびにF-およびG-ヘリックスでも全体の動きが観察される（右、両端に矢尻のある矢印で示す）。これらの動きは、基質結合後に起こる周知の移行と一致し、天然の一酸素添加触媒にとって重要である。図9、下図： BM3-CISの配位子に結合したBM3構造とのアラインメント（水色、PDB# 1JPZから取得、RMSD 0.52Å）は、BM3-CISおよびABC-CISが基質非存在下でもクローズ型のタンパク質立体配座を模倣することを示す。タンパク質アラインメントはPyMolのアラインツール（PyMOL Molecular Graphics System、Version 1.3 Schroedinger、LLC.）を用いて行った。
【０４０７】
UV-vis分光学
図21は、第二鉄（青）、亜ジチオン酸塩還元第一鉄（赤）および一酸化炭素結合第一鉄（緑）ABC-CISヘムの絶対スペクトルを例示する。ソーレー帯（nm）：FeIII、404；FeII、410、425；FeII-CO、411。FeII-COは532および565nmにαおよびβ帯を示す。挿入図は、タンパク質濃度4.5μMの一酸化炭素第一鉄（ピンク）および亜ジチオン酸還元第一鉄（黄）酵素を示す。第一鉄スペクトルの410nmの肩は、これらのスペクトルを記録した好気性条件下でのFeIIへの不完全な還元によるものである。チトクロムP411の厳密な嫌気性条件下での還元は、酸化還元滴定の場合と同様に（図25および27）421nmに単一のピークを示す。
【０４０８】
図22は、第二鉄（青）、亜ジチオン酸塩還元第一鉄（赤）および一酸化炭素結合第一鉄（緑）ABC-CISホロの絶対スペクトルを例示する。ソーレー帯（nm）：FeIII、404；FeII、410、422；FeII-CO、411。FeII-COは533および566nmにαおよびβ帯を示す。第二鉄スペクトルは465nmに幅広ピークを示す。
【０４０９】
図23は、（A）ABC-CISヘムおよび（B）ABC-CISホロについての第一鉄に対する第一鉄カルボニルの差スペクトルを例示する。
【０４１０】
酸化還元滴定
図24は、EO'＝-420mVにあてはめたネルンスト曲線を重ねた、P450BM3-ヘムの電位差酸化還元滴定を例示する。挿入図は、それぞれ亜ジチオン酸ナトリウムの準化学量論的添加後のスペクトル変化（点線：完全第二鉄；実線：完全第一鉄）を示す。
【０４１１】
図25は、EO'＝-293mVにあてはめたネルンスト曲線を重ねた、P411BM3-ヘムの電位差酸化還元滴定を例示する。挿入図は、それぞれ亜ジチオン酸ナトリウムの準化学量論的添加後のスペクトル変化（点線：完全第二鉄；実線：完全第一鉄）を示す。
【０４１２】
図26は、EO'＝-360mVにあてはめたネルンスト曲線を重ねた、P450BM3-ヘム-CISの電位差酸化還元滴定を例示する。挿入図は、それぞれ亜ジチオン酸ナトリウムの準化学量論的添加後のスペクトル変化（点線：完全第二鉄；実線：完全第一鉄）を示す。
【０４１３】
図27は、EO'＝-265mVにあてはめたネルンスト曲線を重ねた、P411BM3-ヘム-CISの電位差酸化還元滴定を例示する。挿入図は、それぞれ亜ジチオン酸ナトリウムの準化学量論的添加後のスペクトル変化（点線：完全第二鉄；実線：完全第一鉄）を示す。
【０４１４】
ABC-CISおよびABCのインビトロシクロプロパン化活性
ミカエリス・メンテン速度式
初速度の判定。スチレンおよびEDA両方の濃度をヘムドメインとして発現させた酵素（0.5または1.0μM BM3-CISヘム）存在下で変動させた。反応を、還元剤としてNa2S2O4を含むリン酸緩衝液（pH＝8.0）中、298Kで設定し、前述のとおりに後処理した。3つの時点を取り、GC（cyclosil-B 30m×0.32mm×0.25μm）：オーブン温度＝100℃で5分間、5℃/分で200℃まで、20℃/分で250℃まで、250℃で5分間により生成物の生成速度を判定するために用いた。溶出時間：シス-シクロプロパン（19.20分および19.33分）、トランス-シクロプロパン（20.44分）。データを標準のミカエリス・メンテンモデルに当てはめることにより、動態学的パラメーターをもとめた。
【０４１５】
増強されたシス選択性および基質範囲
図28は、変異体9-10A-TS-F87V-T268A（BM3-CISまたはP450BM3-ヘム-CISとも呼ぶ）およびBM3-CIS-C400S（ABC-CISまたはP411BM3-ヘム-CISとも呼ぶ）の亜ジチオン酸塩による嫌気性および好気性条件下での活性を例示する。
【０４１６】
小規模反応。選択したP450触媒を小規模（全量400μL）で、試薬（オレフィンおよびジアゾエステル）の各組み合わせについて調査した。小規模嫌気性生物変換を前述のとおりに行い、GCにより分析した。これらの生成物に対するGC法は参照文献に報告されている（P. S. Coelho et al., Science 339, 307 (2013)）。表41は、BM3-CIS（P450BM3-CIS）に比べてABC-CIS（P411BM3-CIS）の増強されたZ選択性を示す。
【０４１７】
BM3-CISおよびABC-CISの一酸素添加およびシクロプロパン化活性
還元剤としてのNADPHによる嫌気性および好気性条件下での活性。小規模反応（全量400μL）を、以下の改変を加えて、前述のとおりに行った：グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH、4μL、225U mL-1）を反応バイアルに、P450溶液と共に加えた。グルコース（40μL、250mM）およびNADPH（40μL、5mM）を緩衝溶液と共に脱気した。測定は三つ組で行い、エラーバーは平均値からの標準偏差を表す。表36は、NADPHにより推進される精製したP411BM3-CISとP450BM3-CISのインビトロ活性を例示する。
【０４１８】
還元剤の選択：NADPHとNADH
表42は、Na2S2O4、NADPHおよびNADHによって推進されるインビトロでのABC-CISホロシクロプロパン化を例示する。
【０４１９】
BM3およびABCのインビトロシクロプロパン化活性
小規模（500μL）反応を精製したBM3およびABC触媒により前述のとおりに行った。表44は、NADHにより推進されるBM3およびABCのインビトロシクロプロパン化活性を例示する。
【０４２０】
ホールセルシクロプロパン化触媒
ホールセルを用いるすべての実験は三つ組で行い；エラーバーは測定値の標準偏差を表す。「トータルターンオーバー」は本明細書において、触媒の質量（gcdw）あたり生成したシクロプロパン生成物の量（mmol）と定義される。
【０４２１】
グルコース添加の影響
図29は、9-10A-TS-F87V-T268A（BM3-CISおよびP450BM3-CISとも呼ぶ）またはBM3-CIS-C400S（ABC-CISおよびP411BM3-CISとも呼ぶ）を発現する大腸菌ホールセルにより触媒される、オレフィンシクロプロパン化に対する外因性グルコース（2mM）添加の影響を例示する。
【０４２２】
熱安定性に対するC400Sの影響
図30は、BM3-CIS（P450BM3-CIS、青）およびABC-CIS（P411BM3-CIS、赤）のヘムドメインの熱安定性を例示する。突然変異C400Sはヘムドメインを+1.7℃安定化する。T50は、酵素集団の半分が折りたたまれていない温度である。エラーバーはT50に対する1-σ（68.3％）信頼区間に対応する。
【０４２３】
嫌気性および好気性反応条件
図31は、ホールセル触媒シクロプロパン化に対する二酸素曝露の影響を例示する。ABC-CIS（P411BM3-CIS）はインビボで二酸素によって強力に阻害される。すべての反応はOD600＝25に相当する細胞密度を有していた。反応は外因性グルコース非存在下で行った。測定は三つ組で行い、エラーバーは平均値からの標準偏差を表す。生成物の生成は、触媒の質量（gcdw）あたり生成したシクロプロパン生成物の量（mmol）と定義される。
【０４２４】
空のプラスミド、非誘導対照、およびホールセルへの亜ジチオン酸塩添加
図32は、空のプラスミド、非誘導対照、およびホールセルへの亜ジチオン酸塩添加を例示する。ABC-CIS（P411BM3-CIS）遺伝子を有するが、IPTGを添加せずに増殖させた大腸菌細胞（ABC-CIS非誘導）；pCWoriプラスミドを有するが、ABC-CIS遺伝子は有していない大腸菌細胞（空のpCWori）；グルコースの代わりに外因性亜ジチオン酸塩を加えたABC-CIS反応（ABC-CIS+亜ジチオン酸塩）。反応は298Kで2時間放置した。測定は三つ組で行い、エラーバーは平均値からの標準偏差を表す。生成物の生成は、触媒の質量（gcdw）あたり生成したシクロプロパン生成物の量（mmol）と定義される。
【０４２５】
細胞密度の影響
図33は、細胞密度の増大はシクロプロパンの収率を最大約80％まで高めることを例示する。トータルターンオーバーはOD600＝20よりも高い細胞密度では増大しない。測定は三つ組で行い、エラーバーは平均値からの標準偏差を表す。生成物の生成は、触媒の質量（gcdw）あたり生成したシクロプロパン生成物の量（mmol）と定義される。
【０４２６】
スチレン濃度の影響
図14は、1、2、3、4および5当量のスチレンを用いることの反応収率に対する影響を例示する。過剰のスチレンは収率のわずかな改善をもたらすにすぎない。
【０４２７】
無傷のホールセルに比べての溶解物
表45は、インビボ活性に比べての溶解物活性を例示する。
【０４２８】
ホールセル触媒の凍結乾燥
細胞を10％ショ糖（m/V）中で凍結乾燥し、4℃で2週間保存した。得られた粉末の適切な量を2mLガラスバイアルに移し、これをクリンプシールし、アルゴンでパージした。無窒素M9培地およびグルコース（20mM）の脱気溶液をシリンジから加えた。細胞をOD600＝25およびグルコースの最終濃度2mMに再懸濁した。
【０４２９】
表47は、凍結乾燥したABC-CISホールセル触媒のシクロプロパン化活性を例示する。
【０４３０】
実施例4. セリン置換P450はインビボで高度に効率的なカルベンのオレフィンへの移動を触媒する
非天然化学反応のための遺伝子によりコードされる触媒は、化学物質の持続可能な生産への新しい経路を開くであろう。本実施例は、無傷の大腸菌細胞においてジアゾエステルからオレフィンへの効率的かつ選択的カルベン移動を触媒する、独特のセリン-ヘム連結チトクロム「P411」のデザインを例示する。チトクロムP450BM3における突然変異C400Sは、特徴的な411nmの第一鉄-COソーレーピークを示し、一酸素添加活性を消失させ、休止状態FeIII/II還元電位を高め、かつNAD(P)Hが推進するシクロプロパン化活性を有意に改善する。
【０４３１】
序論
遺伝的にプログラムされたホールセル生体触媒は、単純な増殖培地中で容易に産生され、さらなる精製または単離を必要とせず、複雑な分子を加工するために生合成経路により操作することができる（Ajikumar, P. K. et al. Science 330, 70-74 (2010)；Westfall, P. J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E111-E118 (2012)；Kataoka, M. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 62, 437-445 (2003)）。しかし、実行可能な変換の範囲は現在のところ天然酵素の化学的レパートリーに限定されている。インビボでの非天然反応のための酵素をデザインすることは、機能性触媒の組み立て、細胞環境における合成試薬の適合性、ならびに基質流入および生成物放出を可能にする細胞透過性に対する要求のため、困難であった。細胞内の非天然変換の触媒は、天然および人工生成物への代替生合成経路、現在は合成反応を用いて作製される化学物質の生体触媒による生成を可能にし、細胞機能のインビボ試験のために利用可能な化学的ツールボックスを拡大することになる（Boyce, M. & Bertozzi, C. R. Nature Methods 8, 638-642 (2011)）。
【０４３２】
前記実施例は、細菌チトクロムP450モノオキシゲナーゼにおける少数のアミノ酸突然変異がインビトロでの重要なシクロプロパン化活性を解放しうることを示している。バチルス メガテリウム由来のP450BM3の変異体は、還元剤存在下でのジアゾエステル（例えば、ジアゾ酢酸エチル、EDA）からオレフィン（例えば、スチレン）への形式に従ったカルベン移動の数百のターンオーバーを触媒して、シクロプロパン生成物を高いレベルのジアステレオ選択性およびエナンチオ選択性で生成する（Coelho, P. S. et al. Science 339, 307-310 (2013)）。オレフィンシクロプロパン化はファインケミカルの合成において広く用いられ（Lebel, H. et al. Chem. Rev. 103, 977-1050 (2003)）、最先端の不斉有機金属触媒は数千から数万のターンオーバーを触媒することができる（Evans, D. A. et al. J. Am. Chem. Soc. 113, 726-728 (1991)； Davies, H. M. L. & Venkataramani, C. Org. Lett. 5, 1403-1406 (2003)；Maas, G. Chem. Soc. Rev. 33, 183-190 (2004)）。P450BM3変異体は、機能的形態で容易に発現され、人工的補助因子または翻訳後改変を必要とせずに非天然カルベン移動を触媒しうるため、この系はインビボでの触媒作用に適切でありうる。細胞内の触媒周期を開始するために、NAD(P)Hなどの内因性還元剤により、酵素を触媒的に活性な第一鉄-P450に還元する必要がある。P450 FeIII/FeII還元電位のヘム連結制御の考察に基づき、無傷の細胞において効率的かつ選択的オレフィンシクロプロパン化を触媒する、遺伝子によりコードされるチトクロムP411酵素をデザインした。
【０４３３】
結果
チトクロムP450BM3が触媒するシクロプロパン化は、準化学量論的（ジアゾエステルおよびオレフィンに対して）還元剤を必要とし、嫌気性条件下で最適に進行する（Coelho, P. S. et al. Science 339, 307-310 (2013)）。これは、ジアゾエステル活性化およびカルベン移動は、休止状態FeIII-ヘムに対立するものとして還元P450結合FeII-ヘム補欠分子族に関与することを示唆する（図35A）。NADPHが推進するP450-レダクターゼドメインに融合した触媒性ヘムドメインを含む全長P450BM3、または単離したヘムドメイン（P450BM3-ヘム）のいずれか由来の、活性シクロプロパン化触媒は、天然NAD(P)H（EO'＝-320mV）よりも亜ジチオン酸塩（EO'＝-660mV、すべての電位はvs SHE）などの強力な還元剤に対して顕著な優先性を示す（Coelho, P. S. et al. Science 339, 307-310 (2013)）。NAD(P)H存在下での活性低下は、P450ヘム鉄の限られた基質誘導性の低スピン（EO' FeIII/II＝-430mV）から高スピン（EO' FeIII/II＝-290mV）への転移を示唆し（Ost, T. W. B. et al. Biochemistry 40, 13421-13429 (2001)）、これは、一酸素添加に対しては必須であるが、この操作した系では、非天然基質に対する親和性が低い（KM約5mM）ため、達成しえないであろう（Coelho, P. S. et al. Science 339, 307-310 (2013)）。NAD(P)Hが推進する還元を促進するために、休止状態の酵素の還元電位を上げることは、インビボでFeII触媒作用を増強するであろうとの仮説が立てられた。ヘムタンパク質の還元電位は軸配位子の突然変異によって調整しうる（Wuttke, D. S. & Gray, H. B. Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 555-563 (1993)；Reedy, C. J. et al. Nucleic Acids Research 36, D307-D313 (2008)）ことに気づいて、P450BM3の軸システインチオラートを弱供与性のセリンアルコールで置換することにより、FeIII/II電位が高まるはずであると推論した（図35A）。さらに、軸システイナート連結は、一酸素添加中の二酸素活性化および活性フェリル-ポルフィリンカチオンラジカル酸化剤（図1、化合物I）の安定化にとって必須であり（Dawson, J. H. Science 240, 433-439 (1988)）、軸システインのセリンへの置換は哺乳動物P450における一酸素添加活性を消失させると報告されている（Vatsis, K. P. et al. J. Inorg. Biochem. 91, 542-553 (2002)）。遊離ヘミンも（弱い）シクロプロパン化触媒である（Coelho, P. S. et al. Science 339, 307-310 (2013)）ため、軸システインのセリンへの突然変異（P450BM3におけるC400S）はカルベン移動活性を維持するが、一酸素添加活性を消失させる。
【０４３４】
突然変異C400Sを前記実施例からのシス選択的シクロプロパン化触媒、P450BM3-CIS（P450BM3から13個の突然変異）に導入して、鉄-ポルフィリンで観察されるトランス選択性と対比した（Wolf, J. R. et al. J. Am. Chem. Soc. 117, 9194-9199 (1995)）。P450BM3-CISはインビトロで、亜ジチオン酸塩存在下で数百のターンオーバーを触媒し、2-フェニルシクロプロパン-1-カルボン酸エチル生成物を71％シス選択性および-94％鏡像体過剰率（eeシス)で生成する（Coelho, P. S. et al. Science 339, 307-310 (2013)）。緑-褐色P450BM3-CIS-C400S（P411BM3-CIS）のUV-visスペクトル（図21〜23）は、411nmの第一鉄-一酸化炭素結合複合体により特徴付けられ、これはSer連結哺乳動物P450について報告されたものと一致した（Vatsis, K. P. et al. J. Inorg. Biochem. 91, 542-553 (2002）； Perera, R. et al. Arch. Biochem. Biophys. 507, 119-125 (2011)）（表39）。この特徴的な411nmのFeII-COバンドのため、これらの新しいP450由来Ser連結酵素チトクロムを「P411」と呼ぶ。C400S P450BM3変異体は以下「P411BM3」酵素と呼ぶ。P411BM3-CISにおけるヘム-セリン連結を、P450BM3-CISおよびP411BM3-CISヘムドメインの結晶構造を、それぞれ2.5および3.3Åで調べることによりさらに確認した（図9および表38；PDB：4H23および4H24）；構造は重ね合わせ可能である（RMSD＝0.52Å、図9）。P411BM3-CIS構造の限られた解像度にもかかわらず、モデル化したヘムおよびC400S非存在下で生成したシミュレーテッドアニーリングオミットマップは近位アミノ酸側鎖によるヘム配位に一致する密度を示した（図35Bおよび図20）。
【０４３５】
野生型P450BM3、そのC400S変異体（P411BM3）、P450BM3-CISおよびP411BM3-CIS（図24〜27）の切断されたヘムドメインを用いて電位差酸化還元滴定を行った。突然変異C400Sは休止状態野生型P450BM3-ヘムの還元電位を+127mV高め（P411BM3-ヘムでEO' FeIII/IISer＝-293mV）、このシフトは基質結合後にP450BM3で起こるものと規模がほぼ同等であった（Ost, T. W. B. et al. Biochemistry 40, 13421-13429 (2001)）。P450BM3-ヘム-CISにおける13アミノ酸の突然変異は、還元電位を野生型P450BM3-ヘムに対して+60mV高めた（P450BM3-ヘム-CISでEO' FeIII/IICys＝-360mV）が、P450BM3-ヘム-CISはNAD(P)+/NAD(P)Hよりも還元電位が低いままであった。P450BM3-ヘム-CISにおける突然変異C400Sの導入は、その還元電位をさらに+95mV高めた（P411BM3-ヘム-CISでEO' FeIII/IISer＝-265mV）。2つのC400S酵素がNAD(P)+/NAD(P)Hのものよりも正の休止状態還元電位を有することは、全長P411が基質非存在下であってもNAD(P)Hによって還元されることを可能にする。
【０４３６】
切断されたP411BM3-ヘム-CISは活性な亜ジチオン酸塩がインビトロで推進するシクロプロパン化触媒であり、P450BM3-ヘム-CISのものに匹敵するミカエリス・メンテンパラメーター（kcat＝82分-1、KM-スチレン＝4.6mM、KM-EDA＝5.7mM、図8）を有する（表40）。P411BM3-ヘム-CISは、そのシステイン相同体（図28）に比べて、かなり改善されたジアステレオ選択性（シス：トランス93：7）およびエナンチオ選択性（-99％eeシス）を示し、2つの触媒の類似する活性部位幾何学的形状（図9）を考慮すると、予想外の結果である。様々なスチレン基質に対し、P411BM3-ヘム-CISはP450BM3-ヘム-CISに比べて優れたシス選択性を示した（表41）。全長、レダクターゼ融合P411BM3-CISは、嫌気性条件下でNADPHを還元剤として用いる場合、ホロP450BM3-CISに比べて高い活性を示した（図35Cおよび表36）。P450BM3-CISは、NADPHを用いる場合、少量のシクロプロパンしか生成せず、好気性条件下で一酸素添加を介してスチレンオキシドを主生成物として生成した。これとは対照的に、P411BM3-CISは無視できる量のスチレンオキシドを生成し、これはモノオキシゲナーゼ活性が無いことを示し、好気性条件下で、酸素阻害のために低収率（43 TTN）ではあるが、なおシクロプロパンを生成することができた（図35C）。二酸素阻害は、CYP2B4-C436Sについて報告された2電子オキシダーゼ活性によるものでありうる（Vatsis, K. P. et al. J. Inorg. Biochem. 91, 542 (2002)）。NADHはP411BM3-CIS仲介性シクロプロパン化をNADPHと同じくらい効率的に推進し（表42）、P411BM3-CISが、大腸菌におけるNADPH生合成が起こらない、嫌気性条件下でのインビボ触媒作用のために適切であることを示していた。シクロプロパン化TTNに対する準化学量論的補助因子の優先性の明らかな欠如は、P450BM3の報告されたNADPH特異性と対称をなすものである（（Dunford、A. J. et al. Biochim. Bioph. Acta, Proteins and Proteomics 1794, 1181-1189 (2009)）。
【０４３７】
全長P450BM3-CISおよびP411BM3-CISを発現する、M9Y培地（M9、1.5％酵母エキス）中で増殖させた休止大腸菌［BL21(DE3)］細胞を用いてのシクロプロパン化の効率を次に調査した。嫌気性条件下でのグルコースの添加は、生成物収率を有意に増大し（図29）、これはおそらくはNADHの増強された細胞内生成によるが、他の細胞性還元剤もインビボでの酵素の還元に関与すると考えられた。P411BM3-CISはインビボで数千のターンオーバーを触媒し、ホールセル系においてP450BM3-CISよりも約4倍活性が高く、増強されたシス-エナンチオ選択性でシクロプロパン生成物を提供した（表43、項目1および2）。突然変異C400Sはタンパク質発現を損ない、したがってBM3-CISの6％と比べて、P411BM3-CISは乾燥細胞質量の2％に相当する（項目1および2）。C400Sは精製したP411BM3-CISヘムドメインにおける熱安定性の増大に貢献した（P411BM3-ヘム-CIS、図10）ため、発現低減はタンパク質安定性の低下によるものではなかった。ヘムおよびジフラビンレダクターゼドメインの両方を含む全長P411BM3-CIS（項目2）は、切断されたヘムドメイン（P411BM3-ヘム-CIS、項目3）よりもモル濃度ベースで2倍を超えて活性で、インビボでの第一鉄状態への還元が重要であることを確認したが、同時に細胞内環境を還元することで、レダクターゼドメイン非存在下でも、ヘム還元が達成されることを示した。P411BM3における単一の突然変異C400S（項目4）は野生型P450BM3（項目5）のインビボでのシクロプロパン化活性を、2桁を超えて改善した。精製した全長P411BM3はインビトロで効率的なNADHが推進するシクロプロパン化触媒でもあったが、P450BM3はほとんど活性がなかった（表44）。
【０４３８】
P411BM3-CISおよびP450BM3-CISホールセルはいずれも二酸素によって有意に阻害された（図31）。P411BM3-CIS遺伝子を含むが、誘導なしのホールセルおよびP411BM3-CIS遺伝子を欠くホールセルは少量のシクロプロパンを生成することができたが、遊離ヘミンと類似の立体選択性を示した（図32）。これは、細胞中に存在する遊離ヘミンおよび他のヘムタンパク質もスチレンシクロプロパン化を低レベルで触媒しうる（Coelho, P. S. et al. Science 339, 307-310 (2013)）ため、驚くことではない。ホールセルP411BM3-CIS触媒はインビトロでの精製P411BM3-CISと、等価の触媒負荷で同等に立体選択的であり（下記参照）、過剰発現されたP411酵素がバックグラウンド触媒作用を都合よく打ち負かすことを示していた。インビボでのシクロプロパン化は、第一鉄ヘムに不可逆的に結合する一酸化炭素によって強力に阻害され（表43、項目6）、触媒作用が酵素活性部位において起こることを確認した。収率は、細胞密度を最大OD600＝50まで高めることによって80％まで高めることができた（図33）。過剰のスチレンを用いても、反応収率はわずかに改善されるにすぎなかった（図14）。全長P411BM3-CISを発現し、NADHを添加した細胞の溶解物は、無傷のホールセルの約30％しか活性を保持しておらず、外因性還元剤非存在下では活性でなかった（表45）。亜ジチオン酸塩の添加はP411BM3-CISホールセル反応を阻害し、細胞溶解物中の反応を推進する上でNADHよりも効率が低かった（図32および表45）。
【０４３９】
インビボとインビトロでの全長P411BM3-CIS活性を直接比較するために、両方の反応を同じ酵素濃度で8時間にわたってモニターした（図34）。モル濃度ベースで、インビボ触媒は6時間後に精製酵素よりもほぼ6倍高いTTNを示し、同じ立体選択性を保持していた（75：25 シス：トランス、-95％eeシス）。いずれの触媒もこの期間中活性のままで、収率およびTTNで観察された差は、インビボでの触媒安定性の増強ではなく活性の改善によることを示している。EDAを徐々に加えても反応収率は改善されなかった。
【０４４０】
高い基質負荷（170mM EDA、400mMスチレン、ニート試薬として加えた）で、P411BM3-CISによるインビボ反応において60,000を超える触媒ターンオーバーが観察された（表43、項目7）。P411BM3-CISホールセル反応は容易に規模を変えて、グラム量のシクロプロパンを高い立体選択性、生成物力価（27g L-1）および収率（78％、項目8）で作製することができた。有機共溶媒は必要なく、シクロプロパン生成物は、反応終了時に有機溶媒で抽出することにより、容易に得られた。さらに、細胞をショ糖などの凍結保護物質と共に凍結乾燥し、触媒活性またはジアステレオおよびエナンチオ選択性を劣化させることなく、粉末として4℃で数週間保存することができた（表47）。凍結乾燥した細胞は容易に包装し、分配することができる。これらの特徴は、ホールセルP411触媒を、容易な机上合成のために魅力的なものにする。
【０４４１】
チトクロムP411は、チトクロムP450とは分光学的、電気化学的および触媒的に異なり、直交型ヘム酵素触媒作用を操作するための骨格を提供する。セリン-ヘム連結P411に基づくホールセル触媒は使用が容易で、1リットルあたり数十グラムでの基質投入のための、高い変換、光学純度および収率での酵素的シクロプロパン化を提供する。このインビボで非天然C-C結合生成反応を触媒する能力は、微生物有機合成を可能にする変換の範囲を拡大し、シクロプロパンを作製するための天然の既存の戦略を補足する、人工的代謝経路を提供する（Wessjohann, L. A. et al. Chem. Rev. 103, 1625-1647 (2003)）。
【０４４２】
材料および方法
すべての試薬は商業的供給業者（Sigma-Aldrich）から入手し、それ以上精製せずに用いた。1Hおよび13C NMRスペクトルはVarian Mercury 300分光計（それぞれ300MHzおよび75MHz）、またはVarian Inova 500MHz（それぞれ500MHzおよび125MHz）のいずれかで記録し、残存溶媒ピークを内部標準とした。高分解能質量スペクトルはJEOL JMS-600H High Resolution Mass Spectrometerにより得た。ガスクロマトグラフィ（GC）分析は、GC-17Aガスクロマトグラフ（Shimadzu）、FID検出器、およびJ&W cyclosil-Bカラム（30m×0.25mm、0.25μmフィルム、Agilent）ならびに内部標準としての2-フェニルエタノールを用いて行った。注入口温度＝300℃、オーブン温度＝130℃で30分間、圧＝175kPa。溶出時間：シス-シクロプロパン［19.7分（2R,1S）および21.0分（2S,1R）］、トランス-シクロプロパン［25.8分（2R,1R）および26.4分（2S,1S）］。ジアゾ酢酸エチル（EDA）のスチレン（2-フェニルシクロプロパン-1-カルボン酸エチル）およびα-メチルスチレン（2-メチル-2-フェニルシクロプロパン-1-カルボン酸エチル）との反応のためのシクロプロパン生成物標準は、報告されたとおりに調製した（Penoni, A. et al. Eur. J. Inorg. Chem., 1452-1460 (2003)）。これらの標準および酵素により調製したシクロプロパンは、同時注入した場合にガスクロマトグラムで同じ保持時間を示し、生成物の同一性を確認した。シクロプロパン鏡像体の絶対立体配置を、エナンチオ選択的P450BM3変異体を用いる調製的生物変換反応からの精製したシクロプロパン生成物の旋光度を測定することにより判定し、参照文献から取った値と比較した（Watanabe, N. et al. Heterocycles 42, 537-542 (1996)）。P450触媒シクロプロパンの標品も調製し、NMR（1Hおよび13C）および質量分析により特徴付け、これは文献値と一致した。
【０４４３】
プラスミドpCWori[P450BM3]およびpET22をクローニングベクターとして用いた。突然変異C400Sを、所望の突然変異を有するプライマー（IDT、San Diego、CA）を用いての標準重複突然変異誘発によって導入した。
順方向プライマー：
2015534464.tif 000127
それぞれの逆方向プライマー：
2015534464.tif 000128
【０４４４】
エレクトロコンピテント大腸菌細胞を、Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. Vol. 2（Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989）)のプロトコルに従って調製した。制限酵素BamHI、EcoRI、XhoI、Phusionポリメラーゼ、およびT4リガーゼはNew England Biolabs（NEB、Ipswich、MA）から購入した。アルカリ性ホスファターゼはRoche（Nutley、NJ）から入手した。発現培養において用いた1,000×微量金属混合物は下記を含んでいた：50mM FeCl3、20mM CaCl2、10mM MnSO4、10mM ZnSO4、2mM CoSO4、2mM CuCl2、2mM NiCl2、2mM Na2MoO4、および2mM H3BO3。
【０４４５】
CO結合検定。P450濃度を、システイン連結P450BM3のε450-490＝91mM-1cm-1（Omura, T. & Sato, R. J. Biol. Chem. 239, 2370-2378 (1964)）およびセリン連結P411BM3のε411-490＝103mM-1cm-1（Vatsis, K. P. et al. J. Inorg. Biochem. 91, 542-553 (2002)）の吸光係数を用いて第一鉄CO結合差スペクトルからもとめた。インビボP450（またはP411）の濃度は、ホールセル反応に用いたものと同じ細胞密度の細胞アリコートの溶解物において、CO検定を実施することによって測定した。
【０４４６】
P450発現および精製。インビトロでのシクロプロパン化反応のために、P450BM3変異体を精製した形で用いた。酵素バッチを以下のとおりに調製した。1リットルのTBampに、tacプロモーター制御下のP450変異体をコードするpCWoriプラスミドを有する組換え大腸菌BL21(DE3)細胞の終夜培養物（100mL、LBamp）を接種した。37℃、250rpmの振盪で3.5時間インキュベートした後（OD600＝約1.8）、インキュベーション温度を25℃に下げ（30分）、IPTGを最終濃度0.5mMまで加えることにより培養を誘導した。培養をこの温度でさらに24時間続けた。細胞を遠心沈降（4℃、15分、3,000×g）により回収した後、細胞ペレットをさらなる使用までであるが、少なくとも2時間、-20℃で保存した。細胞ペレットを25mMトリスHCl緩衝液（pH7.5、25℃）に再懸濁し、細胞を音波処理（2×1分、出力コントロール5、50％デューティーサイクル；Sonicator、Heat Systems - Ultrasonic、Inc.）により溶解した。細胞デブリを4℃、27,000×gで20分間の遠心沈降により除去し、上清をQ Sepharoseカラム（HiTrapTM Q HP、GE Healthcare、Piscataway、NJ）でAKTAxpress purifier FPLCシステム（GE healthcare）を用いてアニオン交換クロマトグラフィにかけた。P450（またはP411）をQカラムから、カラムの10倍量で0〜0.5M NaClの勾配により溶出した。P450（またはP411）分画を回収し、30kDa分子量カットオフの遠心ろ過器を用いて濃縮し、0.1Mリン酸緩衝液（pH＝8.0）で緩衝液交換した。精製したタンパク質をドライアイスで急速凍結し、-20℃で保存した。
【０４４７】
結晶化実験のために、AKTAxpress purifier FPLCシステムを用いて2段階精製を行った。発現した6XHis標識ヘムドメインを含む凍結細胞ペレットをNi-NTA緩衝液A（25mMトリスHCl、200mM NaCl、25mMイミダゾール、pH8.0、0.5mL/gcw）に再懸濁し、音波処理（2×1分、出力コントロール5，50％デューティーサイクル）により溶解した。溶解物を4℃、27,000×gで20分間遠心沈降して細胞デブリを除去した。回収した上清をまず、Niセファロースカラム（HisTrap-HP、GE healthcare、Piscataway、NJ）を用いてのNi-NTAクロマトグラフィ段階にかけた。P450（またはP411）をNiセファロースカラムから25mMトリスHCl、200mM NaCl、300mMイミダゾール、pH8.0を用いて溶出した。Ni精製タンパク質を25mMトリスHCl pH7.5中に30kDa分子量カットオフの遠心ろ過器を用いて緩衝液交換し、続いてQセファロースカラム（HiTrapTM Q HP、GE healthcare、Piscataway、NJ）にロードし、アニオン交換により精製して均質にした。P450（またはP411）をQカラムから、カラムの10倍量で0〜0.5M NaClの勾配により溶出した。P450（またはP411）分画を回収し、25mMトリスHCl pH7.5、25mM NaCl中に緩衝液交換した。精製タンパク質を30kDa分子量カットオフの遠心ろ過器を用いて約10mg mL-1まで濃縮した。一定量（50μL）をドライアイスで急速凍結し、必要になるまで-80℃で保存した。
【０４４８】
シクロプロパン化触媒における突然変異を野生型P450BM3に対して報告する。ヘムドメインはP450BM3配列における最初の462アミノ酸を含む。P411BM3＝P450BM3+C400S。P450BM3-CIS＝P450BM3+V78A、F87V、P142S、T175I、A184V、S226R、H236Q、E252G、T268A A290V、L353V、I366V、E442K。P411BM3-CIS＝P450BM3-CIS+C400S。
【０４４９】
タンパク質結晶学。P450BM3-ヘム-CISおよびP411BM3-ヘム-CISを蒸気拡散により結晶化した。タンパク質保存液（25mMトリスHCl pH7.5、25mM NaCl中10mg/mL）および母液の1：1混合物を24穴シッティングドロッププレート（Hampton Research）中で混合した。P450BM3-ヘム-CISのために最適な結晶化条件を0.1Mナトリウムカカドライト（sodium cacadolyte）、pH5.7、0.14 MgCl2および17％PEG 3350中で見出した。P450BM3-ヘム-CIS結晶は典型的には7〜14日の期間で成長した。P411BM3-ヘム-CIS結晶は0.1Mビス-トリス、pH5.3、0.2Mギ酸ナトリウムおよび18％PEG 3350中で最適に生成した。最初のP411BM3-ヘム-CIS液滴はタンパク質沈澱の高密度な層によって特徴付けられるが；36〜48時間後、顕著なタンパク質結晶が沈殿層の下に観察された。
【０４５０】
X線データ収集およびタンパク質構造決定。X線回折データをGeneral Medical Sciences and Cancer Institutes Structural Biology Facility（GM/CA）においてAdvanced Photon Source（APS、Argonne National Laboratory）でビームラインID23-DおよびMAR300 CCD検出器を用いて収集した。データは100Kおよび1.033Åの波長で収集した。データ収集統計値を表38に挙げている。回折データセットをXDSで積分し（Kabsch, W. Acta Crystallogr., Sect D: Biol. Crystallogr. D 66, 133-144 (2010)）、SCALAを用いてスケーリングを行った（Evans, P. Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr. D 62, 72-82 (2006)）。初期相は、CCP4結晶学ソフトウェアパッケージ（Bailey, S. Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr. D 50, 760-763 (1994)）の成分である、MOLREPソフトウェア（Vagin, A. & Teplyakov, A. Journal of Applied Crystallographyc 30, 1022-1025 (1997)）を用いて、PDB 1JPZ（Haines, D. C. et al. Biochemistry 40, 13456-13465 (2001)）、chain Bから取った野生型P450BM3-ヘム構造のクローズ型に対する分子置換によって決定した。精密化を、COOT（Emsley, P. & Cowtan, K. Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr. D 60, 2126^2132 (2004)）内の手動モデル構築の反復サイクルおよびCCP4内のREFMAC（Murshudov, G. N. et al. Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr. D 53, 240-255 (1997)）を用いての自動精密化によって達成した。REFMAC精密化の最後のサイクルはTLSパラメーターを含んでいた。精密化中に非結晶学的対称制約は用いなかった。モデル品質をPHENIXソフトウェアパッケージ（Adams, P. D. et al. Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr. D 66, 213-221 (2010)）内の「complete validation」ツールを用いて評価した。シミュレーテッドアニーリングオミットマップもPhenixを用いて計算した。ラマチャンドラン異常値は一般にはP450BM3-ヘム FとGヘリックスを連結する構造が不良のループにある。これらの残基は多くの場合、タンパク質データベース内のこれらおよび他のP450BM3-ヘム構造において欠如しているか、または低い密度によって特徴付けられる。すべてのタンパク質構造図およびアラインメントはPyMolソフトウェア（The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.3, Schroedinger, LLC.）を用いて生成した。
【０４５１】
電位差滴定。酵素試料を100mM KPO4、100mM KCl、pH7.4中に緩衝液交換し、アルゴンの穏やかな4×20ポンプ充填サイクルにより、発泡しないように注意しながら、脱酸素化した。電位差酸化還元滴定を、嫌気性グローブボックス内で、光路長1mmの石英分光電気化学セル、白金メッシュ作用電極、白金線対電極を用いて実施し、Ag/AgCl電極（Bioanalytical Systems, Inc.）を参照基準として用いた（Ag/AgCl対NHE：+197mV）。タンパク質溶液は約600μLの50〜100μMタンパク質およびタンパク質と電極との間の電気化学的通信を確保するために加えた以下のメディエーターからなっていた：メチルビオローゲン（5μM）、ベンジルビオローゲン（10μM）および2-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン（20μM）。酵素試料を亜ジチオン酸ナトリウム（還元）およびフェリシアン化カリウム（再酸化）を用いて滴定した。細胞の開路電位を10分間の平衡期間の間モニターし（WaveNowポテンシオスタット、Pine Research Instrumentation）、スペクトルをOcean Optics分光計（USB2000+）を用いて記録した。還元電位（Eo'）を、データを1電子ネルンスト式にあてはめることによってもとめた。
【０４５２】
嫌気性条件下でのインビトロ小規模シクロプロパン化生物変換のための典型的手順。小規模反応（400μL）を2mLクリンプバイアル（Agilent Technologies、San Diego、CA）中で行った。P450溶液（80μL、100μM）を、小さい撹拌子を含むバイアルに加えた後、シリコーンセプタムでクリンプをシールした。リン酸緩衝液（260μL、0.1M、pH＝8.0）および40μLの還元剤溶液（100mM Na2S2O4、または20mM NADPH）を、クリンプシールした、より大きいバイアル中で混合し、アルゴンを溶液に少なくとも5分間通気することにより脱気した。一方、P450（またはP411）溶液を含む2mL反応バイアルの、タンパク質溶液上にアルゴンを流す（通気なし）ことにより、ヘッドスペースを嫌気性にした。複数の反応を並行で行う場合、最大8つの反応バイアルを、カニューレを介して連続で脱気した。緩衝液/還元剤溶液（300μL）を反応バイアルに、アルゴン雰囲気下でシリンジにより注入した。ガスラインを反応バイアルからはずした後、バイアルをプレート撹拌機上に設置した。40×スチレンMeOH溶液（10μL、典型的には1.2M）を反応バイアルにガラスシリンジを介して加え、約30秒間撹拌した。次いで、40×EDA MeOH溶液を加え（10μL、典型的には400mM）、反応混合物を適切な時間撹拌した。試薬の最終濃度は典型的には以下のとおりであった：30mMスチレン、10mM EDA、10mM Na2S2O4、20μM P450。30μL HCl（3M）をシリンジで密封反応バイアルに加えることにより、反応を停止した。バイアルを開け、20μLの内部標準（20mM 2-フェニルエタノール/MeOH）と、続いて1mLの酢酸エチルを加えた。この混合物を1.8mLのエッペンドルフチューブに移し、これをボルテックス処理して遠心沈降した（16,000×g、1分）。上部有機層を無水硫酸ナトリウムプラグで乾燥し、キラル相GCで分析した。
【０４５３】
初速度の判定。わずかに変更した後処理を、動態実験のために実行した。設定した時間の後、1mL EtOAcを密封バイアルにシリンジで注入し、混合物をただちにボルテックス処理することにより、反応を停止した。次いで、バイアルを開け、20μLの内部標準を加えた。混合物を1.8mLのエッペンドルフチューブに移し、ボルテックス処理して遠心沈降した（16,000×g、1分）。上部有機層を無水硫酸ナトリウムプラグで乾燥し、GCで分析した。スチレンおよびEDA両方の濃度をヘムドメインとして発現させた酵素（0.5または1.0μM BM3-CISヘム）存在下で変動させた。反応を、還元剤としてNa2S2O4を含むリン酸緩衝液（pH＝8.0）中、298Kで設定し、本明細書における記載のとおりに後処理した。3つの時点を取り、GC（cyclosil-B 30m×0.32mm×0.25μm）：オーブン温度＝100℃で5分間、5℃/分で200℃まで、20℃/分で250℃まで、250℃で5分間により生成物の生成速度を判定するために用いた。溶出時間：シス-シクロプロパン（19.20分および19.33分）、トランス-シクロプロパン（20.44分）。データを標準のミカエリス・メンテンモデルに当てはめることにより、みかけの速度定数をもとめた。
【０４５４】
インビボシクロプロパン化のための培地および細胞培養。大腸菌［BL21(DE3))］細胞を、5mlのM9Y培地［1Lの5×M9培地は31g Na2HPO4、15g KH2PO4、2.5g NaCl、5.0g NH4Cl、0.24g MgSO4、および0.01g CaCl2を含む。1LのM9Yは200mL 5×M9、800mL脱イオン水、15g酵母エキス、1mL微量栄養素、および0.1mg mL-1アンピシリンを含む）中、グリセロール保存液から終夜増殖させた（37℃、250rpm）。前培養物を用いて125mLアーレンマイヤーフラスコ中の45mLのM9Y培地に接種し、この培養物を37℃、250rpmで2時間30分インキュベートした。OD600＝1.2で、培養物を25℃まで冷却し、振盪を160rpmに下げた後、IPTG（0.25mM）およびδ-アミノレブリン酸（0.25mM）で誘導した。20時間後に培養物を回収し、無窒素M9培地（1L：31g Na2HPO4、15g KH2PO4、2.5g NaCl、0.24g MgSO4、0.01g CaCl2、1mL微量栄養素）に再懸濁した（OD600＝30）。微量栄養素溶液は0.15mM (NH4)6Mo7O24、20.0mM H3BO3、1.5mM CoCl2、0.5mM CuSO4、4.0mM MnCl2、および0.5mM ZnSO4を含む。細胞懸濁液の一定量を、細胞乾燥重量（cdw、2mL）およびP450（またはP411）発現レベル（3mL）の判定に用いた。
【０４５５】
小規模ホールセル生物変換。反応条件は以下のとおりであった：2当量スチレン、1当量EDA、0.2当量グルコース、大腸菌ホールセル、水性無窒素M9最少培地および5％MeOH共溶媒中、嫌気性条件下、298Kで12時間。2mLクリンプバイアル中の細胞懸濁液にアルゴンを通気することにより、大腸菌細胞（OD600＝30、425μL）を嫌気性にした。グルコースの脱気溶液（50μL、20mM）を細胞に加えた後、EDA（MeOH中400mM溶液12.5μL）およびオレフィン（MeOH中800mM溶液12.5μL）を加えた。反応混合物を室温で適切に撹拌し、20μLの内部標準（20mM 2-フェニルエタノール）を加え、1mL酢酸エチルで抽出することにより、後処理した。有機層をNa2SO4で乾燥した後、生成物混合物をキラル相GCで分析した。収率、ジアステレオマー比、および鏡像体過剰率はGC分析により判定した。収率はEDAに基づく。
【０４５６】
調製規模ホールセル生物変換。大腸菌［BL21(DE3)］細胞を、50mlのM9Y培地中、グリセロール保存液から終夜増殖させた（37℃、250rpm）。前培養物を用いて2つの1Lアーレンマイヤーフラスコ中の2つの475mLのM9Y培地に接種し（それぞれ25mLを用いて）、この培養物を37℃、250rpmで2時間30分インキュベートした。OD600＝1.8で、培養物を25℃まで冷却し、振盪を150rpmに下げた後、IPTG（0.25mM）およびδ-アミノレブリン酸（0.25mM）で誘導した。24時間後に培養物を回収し、無窒素M9培地に再懸濁した（OD600＝75）。500mL密封丸底フラスコ中の細胞懸濁液にアルゴンを通気することにより、大腸菌細胞（OD600＝70、53.6mL）を嫌気性にした。グルコースの脱気溶液（1.4mL、500mM）を細胞に加えた後、EDA（Sgma Aldrichにより包装されたDCM中85％EDA 1.36mL）およびスチレン（2.5mL、ニート）を加えた。反応混合物を室温、アルゴン加圧下で24時間撹拌した。粗製混合物を3つの50mLコニカルチューブに加え、HCl（1mL、3M）を各チューブに加えることにより反応を停止した。水性混合物を1：1 EtOAc：ヘキサン（各20mL）で抽出し、遠心沈降した（5000rpm、5分）。有機物を回収し、この抽出手順をさらに2回実施した。有機物を合わせ、Na2SO4で乾燥し、次いで濃縮した。過剰のスチレンをH2O/ベンゼンの共沸により除去し、1.85gの粗生成物を単離した。反応のシス/トランス選択性を、この粗製混合物のガスクロマトグラフィにより判定した。粗生成物の8％Et2O/ヘキサンでのカラムクロマトグラフィにより、所望の生成物をシスおよびトランス異性体の混合物で得た（合わせて1.63g、収率78％）。粗製収率と精製収率との比較に基づき、粗生成物はおよそ88％の純度であった。単離生成物のNMRは参照文献中に報告されたものと同じであった（Coelho, P. S. et al. Science 339, 307-310 (2013)）。
【０４５７】
インビボおよびインビトロ反応の時間経過。小規模生物変換の手順にしたがい、一連のインビボおよびインビトロ反応を設定し、EDAを各試料に0時間の時点で加えた。時点を0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、および8時間で取った。報告された各収率は、表示の時間撹拌した2つの個々の反応の平均を反映している。示したエラーバーは2つの平均していないデータ点を反映している。各反応の収率はGCでもとめた。
【０４５８】
熱安定性測定。図30に報告したすべての値について、二つ組の測定を行った。精製したP450（またはP411）溶液（4μM、200μL）をサーモサイクラー（Eppendorf）中、40℃〜70℃の温度範囲で10分間加熱し、続いて1分間で4℃まで急速冷却した。沈澱を遠心沈降により除去した。上清中に残存する折りたたまれたP450（またはP411）の濃度をCO差スペクトロスコピーにより測定した。データを以下の式：
2015534464.tif 000129
に当てはめることにより、タンパク質の半分が変性する温度（T50）をもとめた。
【０４５９】
アクセッションコード：原子座標および構造因子はPDBにより寄託されている（アクセッションコード：4H23および4H24）。
【０４６０】
実施例5. ミルナシプランおよびレボミルナシプランの酵素的合成
チトクロムP450BM3（CYP102A1またはBM3）の変異体およびこれらの酵素を発現するホールセルは以前、アルファ置換スチレンのジアゾ酢酸エチル（EDA）によるシクロプロパン化のために用いられていた（Coelho, P. S. et al. Science 339:307-310 (2013)；Coelho, P. S. et al., Nat. Chem. Bio., 9:485-487 (2013)）。本実施例は、ミルナシプラン［ラセミZ-2-(アミノメチル)-N,N-ジエチル-1-フェニルシクロプロパンカルボキサミド］およびレボミルナシプラン［(1S,2R)-ミルナシプラン］の分子間および分子内両方のオレフィンシクロプロパン化を介しての簡潔かつ立体選択的合成への、この方法の適用を例示する。本実施例は、レボミルナシプランのアリールおよびアミド誘導体ならびにビシファジンおよびDOV-216,303などの類似の化学構造を有する他の薬物を調製するための、本明細書に記載の方法の使用も例示する。
【０４６１】
背景
ミルナシプランは、大うつ病性障害（MDD）および線維筋痛症（疼痛、筋肉の硬直および圧痛、疲労、ならびに寝付きおよび睡眠持続困難を引き起こしうる長期持続状態）を処置するために用いられる薬物である。ミルナシプランは、セロトニン（5-HT）およびノルエピネフリン（NE）輸送体を遮断し、したがって脳内のこれら2つのモノアミン神経伝達物質の細胞外レベルを増大させることによって作用する、選択的5-HTおよびNE再取り込み阻害剤（SSNRI）である。ミルナシプランの最も神経賦活性立体異性体であるレボミルナシプランは現在、大うつ病性障害の処置のための臨床試験第III相に入っている。
【０４６２】
ミルナシプランの合成のためにいくつかの戦略が開発された（Pineiro-Nunez, M. in The Art of Drug Synthesis (ed J. J. Li D. S. Johnson) Ch. 14, 205-207 (Wiley, 2007)）。市販の薬物はラセミ体であるため、合成経路は単純にシクロプロパン環のまわりの相対的立体化学に関わるものである。ミルナシプランの最初の合成は、2-フェニルアセトニトリルおよび2-(クロロメチル)オキシランから出発してのアルキル化およびエポキシド開環の一連の反応を用いており（図36A）（Bonnaud, B. et al.、欧州特許第0200638B1号；Bonnaud, B. et al., J. Medicinal Chemistry 30, 318-325 (1987)）、ZおよびEシクロプロパンの混合物を生じた。得られた生成物を加熱条件下でラクトン化して鍵となる中間体1（(1S,5R)-1-フェニル-3-オキサビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-オン）を得、これは立体中心1および2において必要なZ-幾何学を含んでいた。この中間体は、図36Bに概要を示す3つの経路を用いてミルナシプランに変換された。経路Aでは、フタルイミド開環により2を得、これはアミド化およびフタルイミド脱保護の後に容易にミルナシプランに変換された。経路Bでは、1を臭化水素酸により開環し、塩化チオニルで処理して、二重に官能基化された中間体3が生成した（Mouzin, G. et al., Synthesis, 4, 304-305 (1978)）。ジエチルアミンおよびフタルイミドカリウムにより段階的に処理して、経路Aの合成と共通の中間体を得た。経路Cでは、n-BuLiおよびHNEt2を用いての直接アミド生成により4を得、アジド求核置換と、続く水素添加後に、ミルナシプランに変換することができた（Shuto, S. et al., J. Med. Chem. 38, 2964-2968 (1995)）。図36Cは、ミルナシプラン合成へのまったく異なるアプローチを示す。一般的戦略は市販のシクロプロパンカルボキサミド5の位置選択的脱プロトン化に基づいている（Zhang, M.-X. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 41, 2169-2170 (2002)）。
【０４６３】
レボミルナシプランのエナンチオ選択的合成は、鍵となる中間体1の生成のための不斉法に焦点を合わせていた。図37Aは、6の分子内シクロプロパン化のためのキラルテトラキス[2-オキサアゼチジン-4(S)-カルボン酸メチル]ジロジウム(II)、Rh2(4S-MEAZ)4錯体を用いる第一の経路を示し、1を68％のエナンチオ選択性で生成した（Doyle, M. P. et al., Org Lett. 2, 1145 (2000)）。より最近、Alliot et al.は1を2-フェニル酢酸から、キラルテトラミン補助剤を用いての不斉アルキル化により調製した（Alliot, J. et al., Chem. Commun. 48, 8111-8113 (2012)）（図37B）。アルキル化生成物をI2で処理することにより、マスクされたハロヒドリン7を得、これは塩基性条件下でエステル化およびエポキシド環形成を起こした。一連の反応全体で、1を収率41％および88％eeで生成した。
【０４６４】
結果
ある局面において、本実施例は、N,N-ジエチル-2-フェニルアクリルアミドのジアゾアセトニトリルまたはジアゾ酢酸エチル（EDA）による直接のエナンチオ選択的シクロプロパン化を介してのレボミルナシプランの形式に従った合成を記載する。次いで、選択的ニトリル水素添加またはエステルからアルコールへの還元によりレボミルナシプランまたは、以前に報告されたアミノ化プロトコルに従ってレボミルナシプランに変換される生成物8を得る（図38）（Alliot, J. et al., Chem. Commun. 48, 8111-8113 (2012)）。または、図37Aに示すものなどの、分子内シクロプロパン化経路を、P450酵素を用いての中間体1の合成のために使用する。いずれの戦略においても、最終生成物のすべての立体中心は酵素的シクロプロパン化を介して構築されることになる。
【０４６５】
提唱される経路はミルナシプランの神経賦活性異性体をより有利に提供するため、これらの方法は以前のラセミ合成に比べて改善されている。さらに、図38において提唱される分子間経路は、ミルナシプラン合成のために後半の段階でのシクロプロパン化を用いる最初の経路で、アミノ部分をシクロプロパン化の前に設置するため、高度に収束性である。分子内経路は簡潔で、高価なロジウム錯体および高度に設計された合成配位子の代わりに、P450BM3またはこれらのタンパク質を発現するホールセルの使用を可能にするため、この経路は以前に報告された経路よりも有利である。
【０４６６】
前述の実施例は、P450がシクロプロパンを生成するためのジアゾ化合物からオレフィンへのカルベン移動の優れた触媒であることを示している。この反応は様々な置換オレフィンについて調査されており、特に、本実施例はシクロプロパン化を一および二置換スチレンに対して実施しうることを示している。加えて、メトキシなどの電子供与基およびトリフルオロメチルなどの電子吸引基を含む、スチレンのアリール環上の官能基および置換は、この反応によってよく許容される。本実施例は、1）アミドおよびエステル官能基はP450仲介性シクロプロパン化と適合性であること、および2）かなりの立体的かさ高さがスチレンのアルファ位で許容されうることを示す。
【０４６７】
本実施例は、P450が、R＝エステルまたはアミドである一般式9の置換スチレンのシクロプロパン化に対する適格な触媒であることを示す。アクリル酸エステル9a（20mM）およびEDA（8.5mM）をWT-T268A-C400S（野生型BM3からの2個の突然変異、本明細書においてP411-T268Aと呼ぶ、10μM、ここで「P411」は突然変異C400Sを示す）および亜ジチオン酸ナトリウム（10mM）で処理することにより、かなりの量の対応する生成物10aを得た。BM3-CIS-C400S（野生型からの14個の突然変異、本明細書においてP411-CISと呼ぶ）も、アクリルアミド9bのシクロプロパン化を触媒することができたが、非常に低変換率（＜1％）であった。BM3-CISにおけるC400位での軸突然変異体のスクリーニングにより、変異体BM3-CIS-AxH（ここで「AxH」はBM3の400位におけるCysからHisへの置換を示す）を得、これは9bおよびEDAの反応において高い活性を示し、25℃で16時間後に、91％の収率、93：7のZ：Eジアステレオ選択性、および42％のエナンチオ選択性で10bを得た（表48）。
【０４６８】
（表４８）ミルナシプラン前駆体のシクロプロパン化のためのP450スクリーニング
「P411」は突然変異C400Sを示し、「Ax」は軸位置（BM3の400位）におけるすべての他のアミノ酸への突然変異を示す。反応は8.5mM EDA、20mM 9aまたは10mM 9b、10μM P450、および10mM Na2S2O4により、嫌気性条件下で実施した。
2015534464.tif 000130
【０４６９】
BM3-CIS-AxHを発現する無傷のホールセルも、9bのシクロプロパン化のために用いることができる。P450を発現する大腸菌細胞をHyperbroth中で増殖させ、次いでpH7の無窒素M9最小培地中にOD600＝30（7.8gCDW/L）まで再懸濁した。これらの細胞およびグルコース存在下、嫌気性条件下での9bおよびEDAの反応により、10bを収率82％で得た。BM3-CIS-AxDのT438位における部位飽和突然変異誘発による最適化はBM3-CIS-AxH-T438Wを生じ、これは反応を、インビボで52％の収率および78％のエナンチオ選択性で触媒した。
【０４７０】
前述の実施例は、スチレンにおけるアリール置換およびアルファ置換はP450シクロプロパン化によってよく許容されることを示している。したがって、本明細書に記載の方法を、レボミルナシプランのアリールおよびアミド誘導体ならびにビシファジンおよびDOV-216,303などの類似の化学構造を有する他の薬物を調製するために用いてもよい（図40）。例えば、ビシファジンおよびDOV-216,303はいずれも、本明細書において示す基質と類似のアルファ-スチレニルアミドおよびエステルを用いて調製することができる。ここでも、シクロプロパン化は両方の立体中心を構築し、続く官能基操作および環化はビシファジンおよびDOV-216,303を生成することになる。
【０４７１】
材料および方法
単離酵素による反応の手順：小規模反応（400μL）を2mLクリンプバイアル（Agilent Technologies、San Diego、CA）中で行った。P450溶液（60μL、67μM）をバイアルに加えた後、シリコーンセプタムでクリンプをシールした。リン酸緩衝液（0.1M、pH＝8.0）中のNa2S2O4（12.5mM）の溶液を調製し、クリンプシールした、より大きいバイアル中で密封し、アルゴンを溶液に5分間通気することにより脱気した。一方、タンパク質溶液を含む2mL反応バイアルのヘッドスペースにアルゴンを流す（通気なし）ことにより、ヘッドスペースを嫌気性にした。複数の反応を並行で行う場合、最大8つの反応バイアルを、カニューレを介して連続で脱気した。緩衝液/還元剤溶液（320μL）を反応バイアルに、アルゴン雰囲気下でシリンジにより注入した。40×スチレンEtOH溶液（10μL、400mM）を反応バイアルにガラスシリンジを介して加え、続いて40×EDA EtOH溶液（10μL、400mM）を加えた。反応混合物を振盪プレート上、350rpmで16〜20時間振盪した。試薬の最終濃度は典型的には以下のとおりであった：10mMスチレン、8.5mM EDA、10mM Na2S2O4、10μM タンパク質。30μL HCl（3M）をシリンジで密封反応バイアルに加えることにより、反応を停止した。バイアルを開け、20μLの内部標準（20mM 2-フェニルエタノール/EtOH）と、続いて1mLのシクロヘキサンを加えた。この混合物をエッペンドルフチューブに移し、これをボルテックス処理して遠心沈降した（13,000×g、1分）。上部有機層を無水硫酸ナトリウムプラグで乾燥し、収率およびエナンチオ選択性について分析した。
【０４７２】
ホールセル反応の手順。2mLクリンプバイアル中の細胞懸濁液にアルゴンを通気することにより、大腸菌細胞（OD600＝30、425μL）を嫌気性にした。グルコースの脱気溶液（50μL、200mM）を細胞に加えた後、EDA（EtOH中400mM溶液12.5μL）およびオレフィン（EtOH中400mM溶液12.5μL）を加えた。試薬の最終濃度は典型的には以下のとおりであった：10mMスチレン、8.5mM EDA、および20mMグルコース。反応混合物を室温で16〜20時間振盪し、20μLの内部標準（20mM 2-フェニルエタノール）を加え、1mLシクロヘキサンで抽出することにより、後処理した。有機層をNa2SO4で乾燥し、次いで収率およびエナンチオ選択性について分析した。
【０４７３】
収率、エナンチオ選択性および絶対キラリティの判定：精製酵素およびホールセル反応の収率を、内部標準としてのフェネチルアルコールに対して、水素炎イオン化検出器を用いてのガスクロマトグラフィにより判定した（図39）。ガスクロマトグラフィをAgilent cycloSil-Bカラム、30m×0.25μm×0.32mmを用いて行い、方法：90℃（維持2分）、90〜110（6℃/分）、110〜190（40℃/分）、および190〜280（20℃/分）：内部標準4.8分、出発原料10.4分、ならびに生成物14.8分（E異性体）および15.4分（Z異性体）であった。独立に合成した生成物10bを用いて、GC較正曲線を作成した。生成物の同一性をプロトンNMRによって確認し、主要ジアステレオマーの相対立体化学を核オーバーハウザー効果分光法（NOESY）によって判定した。エナンチオ選択性は、キラルHPLC（ChiralPak ASカラム、4％IPA/超臨界CO2で溶出）により、標準として9bから調製した10bのラセミ試料、EDA、およびヘミンを用いて確立した。10bの絶対立体化学は、LiBH4を用いての10bの8への還元後に、旋光分析によって確立した。生成物の旋光度と報告された8の比旋光度（Alliot, J. et al., Chem. Commun. 48, 8111-8113 (2012)）との比較により、1位および2位の立体中心（図38）を1S、2Rと割り当てることができ、レボミルナシプランと一致した。
【０４７４】
アミノ酸配列：BM3-CISは野生型からの以下の突然変異を含む：V78A F87V P142S T175I A184V S226R H236Q E252G T268A A290V L353V I366V E442K。P411-CISはBM3-CISおよびBM3の400位にCysからSerへの突然変異を含む。BM3-CIS-AxX（X＝H、D、A、Mなど）突然変異体はBM3の400位にCysからXへの突然変異を含む。完全P450BM3配列をSEQ ID NO：1に示す。
【０４７５】
実施例6. ピレスロイドおよびピレスリン殺虫剤の酵素的合成
本実施例は、本発明のチトクロムP450触媒を用いてのクリサンテム酸エチルの合成を例示する。得られたクリサンテム酸エチルを化学的または酵素的に変換してピレスロイドおよびピレスリン殺虫剤とすることができる。
【０４７６】
チトクロムP450由来シクロプロパン化触媒は、ジアゾ酢酸エチル（EDA）およびジオレフィンからのピレスリン酸の合成に対する測定可能で多様な活性を示す。本実施例は、P450触媒がEDAおよび2,5-ジメチル-2,4-ヘキサジエンからクリサンテム酸エチルを作製しうることを例示する。野生型チトクロムP450BM3（CYP102A1）の二重突然変異体、BM3-T268A-C400Sを発現する無傷の大腸菌細胞は、図41に示すとおり、クリサンテム酸エチルの合成に対する測定可能な活性を示した。精製したBM3-T268A-C400Sも、インビトロでクリサンテム酸エステルを作製することができた。
【０４７７】
反応溶液を酸（最終濃度1％HCL）で反応停止し、酢酸エチルで抽出した。2-フェニルエタノールをガスクロマトグラフィによる分析のための内部標準として用いた。クリサンテム酸エチルの標品はSigma-Aldrichから購入した。クリサンテム酸エステルの酵素的生成はGC-FIDおよびGC-MSによって確認した（図42および43）。
【０４７８】
得られたクリサンテム酸エチルを、図44に示すとおり、化学的または酵素的に変換してピレスロイドおよびピレスリン殺虫剤とすることができる。例えば、リパーゼ酵素を用いて、図44（d）に示すエステル交換反応を触媒することができる。
【０４７９】
実施例7. スチレンのチトクロムP450-Cam触媒シクロプロパン化
本実施例は、チトクロムP450-Cam（Cyp101A1、SEQ ID NO：25）およびそのシス-軸C357S変異体（P411-Cam、ここで変異体はSEQ ID NO：25における軸位置にC357S置換を有する）が、カルベン前駆体としてジアゾ酢酸エチル（EDA）を用いてのスチレンのシクロプロパン化を触媒し、それにより2-フェニルシクロプロパン-1-カルボン酸エチルを生成しうることを例示する。
【０４８０】
プラスミドpET22からのチトクロムP450-CamおよびP411-Camを発現する大腸菌BL21(DE3)細胞を、5mlのHyperbroth培地（Athena Enzyme Systemsから購入した54.0g/L Hyperbrothミックス、0.1μg/Lアンピシリン）中、グリセロール保存液から終夜増殖させた（37℃、250rpm）。前培養物を用いて125mLアーレンマイヤーフラスコ中の45mLのM9Y培地（1Lあたり：31g Na2HPO4、15g KH2PO4、2.5g NaCl、5.0g NH4Cl、0.24g MgSO4、0.01g CaCl2、1.5％酵母エキス、1mL微量栄養素（0.15mM (NH4)6Mo7O24、20.0mM H3BO3、1.5mM CoCl2、0.5mM CuSO4、4.0mM MnCl2、および0.5mM ZnSO4）、0.1mg mL-1アンピシリン）に接種し、この培養物を37℃、250rpmで2時間30分インキュベートした。OD600＝約1.2で、培養物を25℃まで冷却し、振盪を160rpmに下げた後、IPTG（0.25mM）およびδ-アミノレブリン酸（0.25mM）で誘導した。20時間後に培養物を回収し、無窒素M9培地（1Lあたり：31g Na2HPO4、15g KH2PO4、2.5g NaCl、0.24g MgSO4、0.01g CaCl2、1mL微量栄養素（0.15mM (NH4)6Mo7O24、20.0mM H3BO3、1.5mM CoCl2、0.5mM CuSO4、4.0mM MnCl2、および0.5mM ZnSO4））に再懸濁した（OD600＝30）。微量栄養素溶液は0.15mM (NH4)6Mo7O24、20.0mM H3BO3、1.5mM CoCl2、0.5mM CuSO4、4.0mM MnCl2、および0.5mM ZnSO4を含む。細胞懸濁液の一定量を、細胞乾燥重量（2mL）およびP450（またはP411）発現レベル（4mL）の判定に用いた。
【０４８１】
カルベン前駆体としてジアゾ酢酸エチルを用いてのスチレンのシクロプロパン化の前に、2mLクリンプバイアル中の細胞懸濁液にアルゴンを通気することにより、指定の細胞密度の細胞（表49参照）を嫌気性にした。グルコースの脱気溶液（50μL、20mM）を細胞に加えた後、EDA（MeOH中400mM溶液12.5μL）およびスチレン（MeOH中1.2M溶液12.5μL）を加えた。反応混合物を室温で16時間振盪し、20μLの内部標準（20mM 2-フェニルエタノール）を加え、1mLシクロヘキサンで抽出することにより、後処理した。有機層をキラル相GCで分析した。
【０４８２】
ガスクロマトグラフィ（GC）分析は、Shimadzu GC-17Aガスクロマトグラフ、FID検出器、およびAgilent J&W cyclosil-Bカラム（30m×0.25mm、0.25μmフィルム）ならびに内部標準としての2-フェニルエタノールを用いて行った。注入口温度＝300℃、オーブン温度＝130℃で30分間、圧＝175kPa。溶出時間：シス-シクロプロパン［19.7分（2R,1S）および21.0分（2S,1R）］、トランス-シクロプロパン［25.8分（2R,1R）および26.4分（2S,1S）］。ジアゾ酢酸エチル（EDA）のスチレンとの反応のための2-フェニルシクロプロパン-1-カルボン酸エチル生成物標準は、報告されたとおりに調製した（A. Penoni et al., Eur. J. Inorg. Chem. 2003, 1452 (2003)）。これらの標準および酵素により調製したシクロプロパンは、同時注入した場合にガスクロマトグラムで同じ保持時間を示し、生成物の同一性を確認した。シクロプロパン鏡像体の絶対立体配置を、エナンチオ選択的BM3変異体を用いる調製的生物変換反応からの精製したシクロプロパン生成物の旋光度を測定することにより判定し、参照文献から取った値と比較した（N. Watanabe et al., Heterocycles 42, 537 (1996)）。
【０４８３】
チトクロムP450濃度を、システイン連結P450-Camのε450-490＝91mM-1cm-1（T. Omura, R. Sato, J. Biol. Chem. 239, 2370 (1964)）およびセリン連結P411-Camのε411-490＝103mM-1cm-1（K. P. Vatsis et al., J. Inorg. Biochem. 91, 542 (2002)）の吸光係数を用いて、溶解物の第一鉄CO結合差スペクトルからもとめた。
【０４８４】
結果を表49に示し、P450-CamおよびP411-CamはいずれもスチレンのEDAによるシクロプロパン化を触媒することを示している。
【０４８５】
（表４９）P450-CamおよびP411-Camはスチレンのシクロプロパン化を触媒した
2015534464.tif 000131
【０４８６】
実施例8. P450-BM3の軸突然変異体によるシクロプロパン化
本実施例は、軸-ヘム配位部位である400位にCysからAla、Asp、His、Lys、Asn、Met、Thr、またはTyrへの突然変異を含む、P450-BM3のチトクロム変異体が、カルベン前駆体としてジアゾ酢酸エチル（EDA）を用いてのスチレンのシクロプロパン化を触媒し、2-フェニルシクロプロパン-1-カルボン酸エチルを生成しうることを例示する。Xが軸位置のアミノ酸の一文字アミノ酸コードである「AxX」なる表記は、この一連の酵素を記載するために用いることができる。
【０４８７】
P450を単離または精製したタンパク質として用いた。1リットルのTBampに、tacプロモーターの制御下でhis6標識P450変異体をコードするpET22プラスミドを有する組換え大腸菌BL21細胞の終夜培養物（25mL、TBamp）を接種した。培養物を37℃、200rpmで約3.5時間、または光学密度1.2〜1.8に達するまで振盪した。温度を25℃に下げ、振盪速度を180rpmに下げて20分間置き、次いでIPTGおよびアミノレブリン酸を最終濃度0.5mMまで加えることにより培養を誘導した。培養をこの温度でさらに20時間続けた。細胞を遠心沈降（4℃、15分、3,000×g）により回収し、細胞ペレットを少なくとも2時間、-20℃で保存した。
【０４８８】
his6標識P450の精製のために、解凍した細胞ペレットをNi-NTA緩衝液A（25mMトリスHCl、200mM NaCl、25mMイミダゾール、pH8.0、0.5mL/gcw）に再懸濁し、音波処理（2×1分、出力コントロール5、50％デューティーサイクル）により溶解した。溶解物を4℃、27,000×gで20分間遠心沈降して細胞デブリを除去した。回収した上清をまずNiセファロースカラム（HisTrap-HP、GE healthcare、Piscataway、NJ）を用いてNi-NTAクロマトグラフィ段階にかけた。P450をNiセファロースカラムから25mMトリスHCl、200mM NaCl、300mMイミダゾール、pH8.0を用いて溶出した。Ni精製タンパク質を0.1Mリン酸緩衝液（pH＝8.0）中に30kDa分子量カットオフの遠心ろ過器を用いて緩衝液交換した。タンパク質濃度を前述のCO検定により判定した。保存のために、タンパク質を300uLの一定量に分け、-80℃で保存した。
【０４８９】
反応（400μL）を2mLクリンプバイアル（Agilent Technologies、San Diego、CA）中で行った。P450溶液（80μL、100μM）を、小さい撹拌子を含むバイアルに加えた後、シリコーンセプタムでクリンプをシールした。リン酸緩衝液（260μL、0.1M、pH＝8.0）および40μLの還元剤溶液（100mM Na2S2O4）を、クリンプシールした、より大きいバイアル中で混合し、アルゴンを溶液に少なくとも5分間通気することにより脱気した。一方、P450溶液を含む2mL反応バイアルのタンパク質溶液上にアルゴンを流す（通気なし）ことにより、ヘッドスペースを嫌気性にした。複数の反応を並行で行う場合、最大8つの反応バイアルを、カニューレを介して連続で脱気した。緩衝液/還元剤溶液（300μL）を反応バイアルに、アルゴン雰囲気下でシリンジにより注入した。ガスラインを反応バイアルからはずした後、バイアルをプレート撹拌機上に設置した。スチレンMeOH溶液（10μL、800mM）を反応バイアルにガラスシリンジを介して加え、約30秒間撹拌した。次いで、EDA MeOH溶液を加え（10μL、340mM）、反応混合物を室温で16時間振盪した。試薬の最終濃度は典型的には以下のとおりであった：20mMスチレン、8.5mM EDA、10mM Na2S2O4、20μM P450。
【０４９０】
16時間後、バイアルを開け、20μLの内部標準（20mM 2-フェニルエタノール/MeOH）と、続いて1mLのシクロヘキサンを加えた。この混合物を1.8mLのエッペンドルフチューブに移し、これをボルテックス処理して遠心沈降した（16,000×g、1分）。上部有機層をキラル相GCで分析した。
【０４９１】
ガスクロマトグラフィ（GC）分析は、Shimadzu GC-17Aガスクロマトグラフ、FID検出器、およびAgilent J&W cyclosil-Bカラム（30m×0.25mm、0.25μmフィルム）ならびに内部標準としての2-フェニルエタノールを用いて行った。注入口温度＝300℃、オーブン温度＝130℃で30分間、圧＝175kPa。溶出時間：シス-シクロプロパン［19.7分（2R,1S）および21.0分（2S,1R）］、トランス-シクロプロパン［25.8分（2R,1R）および26.4分（2S,1S）］。ジアゾ酢酸エチル（EDA）のスチレンとの反応のための2-フェニルシクロプロパン-1-カルボン酸エチル生成物標準は、報告されたとおりに調製した（A. Penoni et al., Eur. J. Inorg. Chem. 2003, 1452 (2003)）。これらの標準および酵素により調製したシクロプロパンは、同時注入した場合にガスクロマトグラムで同じ保持時間を示し、生成物の同一性を確認した。シクロプロパン鏡像体の絶対立体配置を、エナンチオ選択的BM3変異体を用いる調製的生物変換反応からの精製したシクロプロパン生成物の旋光度を測定することにより判定し、参照文献から取った値と比較した（N. Watanabe et al., Heterocycles 42, 537 (1996)）。
【０４９２】
チトクロムP450濃度を、ヘモクロム錯体のε418＝196mM-1cm-1（J. E. Falk, Porphyrins and Metalloporphyrins, Elsevier: Amsterdam, 1975. p 801-807）の吸光係数を用いて、精製タンパク質のヘモクロム検定からもとめた。
【０４９３】
結果を表50に示し、軸突然変異体が活性シクロプロパン化触媒であることを示している。
【０４９４】
（表５０）P450-BM3軸突然変異体（5uM）によって触媒されるスチレンのシクロプロパン化
2015534464.tif 000132
「（ヘム）」なる用語は、SEQ ID NO：1のアミノ酸1〜463および軸-ヘム配位部位であるアミノ酸400位における表示の点突然変異を含む、野生型（WT）P450-BM3の切断変異体を意味する。「BM3-CIS-T438S」なる用語は、SEQ ID NO：1における以下のアミノ酸置換を含む、WT P450-BM3の全長変異体を意味する：V78A、F87V、P142S、T175I、A184V、S226R、H236Q、E252G、T268A、A290V、L353V、I366V、T438S、およびE442K。
【０４９５】
実施例9. チトクロムP450におけるCYS軸配位子の同定
本実施例は、配列アラインメントを介して、ヘム-軸配位子として役立つチトクロムP450酵素における保存されたシステイン残基をいかに同定するかを例示する。
【０４９６】
公知のチトクロムP450-BM3軸配位子を用いて、新しいP450、ヒト由来CYP2D7、GenBankアクセッション番号AAO49806.1における軸配位子を同定した。この酵素における軸配位子を同定するために、米国立衛生研究所のNCBI blastpパッケージ、バージョン2.2.28+（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi：S. F. Altschul, et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402；S. F. Altschul, et al. (2005) FEBS J. 272:5101-5109）によって提供されるタンパク質アラインメントアルゴリズムを、以下のパラメーターを用いて使用した：E value＝10、word size＝3、Matrix＝Blosum62、ならびにGap opening＝11およびgap extension＝1、ならびにconditional compositional score matrix adjustment。対象としてP450-BM3（SEQ ID NO：1）およびクエリーとしてCYP2D7のタンパク質配列を入力し、2つの配列間のアラインメントをリクエストすると、blastpはBM3 C400部位を含む推奨アラインメントを返した（図45A）。このアラインメントの最後の列に、システインを含む半保存領域が明らかであった。下の対象ライン上のシステインはBM3のC400軸配位子である。したがって、クエリーラインの上のC461はCYP2D7タンパク質における軸配位子として同定することができる。
【０４９７】
第二の例として、公知のP450-BM3軸配位子を用いて、P450C27、ラット由来ミトコンドリアP450、GenBankアクセッション番号AAB02287.1における軸配位子を同定した。前述のパラメーターを用いて、対象としてP450-BM3（SEQ ID NO：1）およびクエリーとしてP450C27のタンパク質配列をblastpに入力し、2つの配列間のアラインメントをリクエストすると、BM3 C400部位を含む推奨アラインメントが返された（図45B）。
【０４９８】
このアラインメントの最後から二番目の列に、システインを含む半保存領域が明らかであった。下の対象ライン上のシステインはBM3のC400軸配位子である。したがって、クエリーラインの上のC478はP450C27タンパク質における軸配位子として同定することができる。
【０４９９】
前述の発明は、理解を明確にするための例示および実例として幾分詳細に記載してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲内で一定の変更および改変を実施しうることを理解するであろう。加えて、本明細書において提供する各参照文献は、各参照文献が個別に参照により本明細書に組み入れられるのと同程度に、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０５００】
略式の配列表
SEQ ID NO：1
CYP102A1
チトクロムP450（BM3）
バチルス メガテリウム
GenBankアクセッション番号AAA87602
>gi|142798|gb|AAA87602.1|チトクロムP-450：NADPH-P-450レダクターゼ前駆体[バチルス メガテリウム]
2015534464.tif 000133
SEQ ID NO：2
CYP102A1
バチルス メガテリウム
>gi|281191140|gb|ADA57069.1|NADPH-チトクロムP450レダクターゼ102A1V9[バチルス メガテリウム]
2015534464.tif 000134
SEQ ID NO：3
CYP102A1
バチルス メガテリウム
>gi|281191138|gb|ADA57068.1|NADPH-チトクロムP450レダクターゼ102A1V10[バチルス メガテリウム]
2015534464.tif 000135
SEQ ID NO：4
CYP102A1
バチルス メガテリウム
>gi|281191126|gb|ADA57062.1|NADPH-チトクロムP450レダクターゼ102A1V4[バチルス メガテリウム]
2015534464.tif 000136
SEQ ID NO：5
CYP102A1
バチルス メガテリウム
>gi|281191124|gb|ADA57061.1|NADPH-チトクロムP450レダクターゼ102A1V8[バチルス メガテリウム]
2015534464.tif 000137
SEQ ID NO：6
CYP102A1
バチルス メガテリウム
>gi|281191120|gb|ADA57059.1|NADPH-チトクロムP450レダクターゼ102A1V3[バチルス メガテリウム]
2015534464.tif 000138
SEQ ID NO：7
CYP102A1
バチルス メガテリウム
>gi|281191118|gb|ADA57058.1|NADPH-チトクロムP450レダクターゼ102A1V7[バチルス メガテリウム]
2015534464.tif 000139
SEQ ID NO：8
CYP102A1
バチルス メガテリウム
>gi|281191112|gb|ADA57055.1|NADPH-チトクロムP450レダクターゼ102A1V2[バチルス メガテリウム]
2015534464.tif 000140
SEQ ID NO：9
CYP102A1
バチルス メガテリウム
>gi|269315992|gb|ACZ37122.1| チトクロムP450：NADPH P450レダクターゼ[バチルス メガテリウム]
2015534464.tif 000141
SEQ ID NO：10
CYP102A1
バチルス メガテリウム
>gi|281191116|gb|ADA57057.1|NADPH-チトクロムP450レダクターゼ102A1V6[バチルス メガテリウム]
2015534464.tif 000142
SEQ ID NO：11
CYP102A1
バチルス メガテリウム
>gi|281191114|gb|ADA57056.1|NADPH-チトクロムP450レダクターゼ102A1V5[バチルス メガテリウム]
2015534464.tif 000143
SEQ ID NO：12
CYP153A6
マイコバクテリウム属HXN-1500
GenBankアクセッション番号：CAH04396
>gi|51997117|emb|CAH04396.1|チトクロムP450アルカンヒドロキシラーゼ[マイコバクテリウム属HXN-1500]
2015534464.tif 000144
SEQ ID NO：13
CYP5013C2
テトラヒメナ サーモフィラ
GenBankアクセッション番号：ABY59989
>gi|164519863|gb|ABY59989.1|チトクロムP450モノオキシゲナーゼCYP5013C2[テトラヒメナ サーモフィラ]
2015534464.tif 000145
SEQ ID NO：14
ノノムラエ ディエチアエ
>gi|445067389|gb|AGE14547.1|チトクロムP450ヒドロキシラーゼsb8[ノノムラエ ディエチアエ]
GenBankアクセッション番号：AGE14547
2015534464.tif 000146
SEQ ID NO：15
CYP2R1
ヒト
GenBankアクセッション番号：NP 078790
>gi|45267826|ref|NP_078790.2|ビタミンD 25-ヒドロキシラーゼ[ヒト]
2015534464.tif 000147
SEQ ID NO：16
CYP2R1
アカゲザル
GenBankアクセッション番号：NP 001180887
>gi|302565346|ref|NP_001180887.1|ビタミンD 25-ヒドロキシラーゼ[アカゲザル]
2015534464.tif 000148
SEQ ID NO：17
CYP2R1
イヌ
GenBankアクセッション番号：XP_854533
>gi|73988871|ref|XP_854533.1|PREDICTED：ビタミンD 25-ヒドロキシラーゼ[イヌ（Canis lupus familiaris）]
2015534464.tif 000149
SEQ ID NO：18
CYP2R1
マウス
GenBankアクセッション番号：AAI08963
>gi|80477959|gb|AAI08963.1|Cyp2r1タンパク質[マウス]
2015534464.tif 000150
SEQ ID NO：19
CYP152A6
バチルス ハロデュランスC-125
GenBankアクセッション番号：NP_242623
>gi|15614320|ref|NP_242623.1|脂肪酸アルファヒドロキシラーゼ[バチルス ハロデュランスC-125]
2015534464.tif 000151
SEQ ID NO：20
aryC
ストレプトマイセス パルブス
GenBankアクセッション番号：AFM80022
>gi|392601346|gb|AFM80022.1|チトクロムP450[ストレプトマイセス パルブス]
2015534464.tif 000152
SEQ ID NO：21
CYP101A1
シュードモナス プチダ
Uniprotアクセッション番号：P00183
>sp|P00183|CPXA_PSEPUカンファー5-モノオキシゲナーゼOS=シュードモナス プチダGN=camC PE=1 SV=2
2015534464.tif 000153
SEQ ID NO：22
ヒト
CYP2D7
GenBankアクセッション番号：AAO49806
>gi|37901459|gb|AAO49806.1|チトクロムP450[ヒト]
2015534464.tif 000154
SEQ ID NO：23
ラット
CYPC27
GenBankアクセッション番号：AAB02287
>gi|1374714|gb|AAB02287.1|チトクロムP450[ラット]
2015534464.tif 000155
SEQ ID NO：24
CYP2B4
ウサギ
GenBankアクセッション番号AAA65840
>gi|164959|gb|AAA65840.1|チトクロムP-450[ウサギ]
2015534464.tif 000156
SEQ ID NO：25
CYP102A2
枯草菌
Uniprotアクセッション番号O08394
>sp|O08394|CYPD_BACSU高可能性二機能性P-450/NADPH-P450レダクターゼ1 OS=枯草菌（168株）GN=cypD PE=3 SV=1
2015534464.tif 000157
SEQ ID NO：26
CYP102A3
枯草菌
Uniprotアクセッション番号O08336
>sp|O08336|CYPE_BACSU高可能性二機能性P-450/NADPH-P450レダクターゼ2 OS=枯草菌（168株）GN=cypE PE=2 SV=1
2015534464.tif 000158
SEQ ID NO：27
CYP102A1
バチルス メガテリウムDSM 32
Uniprotアクセッション番号P14779
>sp|P14779|CPXB_BACME二機能性P-450/NADPH-P450レダクターゼOS=バチルス メガテリウム GN=cyp102A1 PE=1 SV=2
2015534464.tif 000159
SEQ ID NO：28
CYP102A5
B.セレウスATCC14579
GenBankアクセッション番号AAP10153
>gi|29896875|gb|AAP10153.1|NADPH-チトクロムP450レダクターゼ[バチルス セレウスATCC 14579]
2015534464.tif 000160
SEQ ID NO：29
CYP102A7
B.リケニフォルミスATTC1458
GenBankアクセッション番号YP 079990
>gi|52081199|ref|YP_079990.1|チトクロムP450/NADPH-フェリヘモプロテインレダクターゼ[バチルス リケニフォルミスDSM 13 = ATCC 14580]
2015534464.tif 000161
SEQ ID NO：30
CYPX
B.チューリンゲンシス血清型konkukian
str.97-27
GenBankアクセッション番号YP 037304
>gi|49480099|ref|YP_037304.1|NADPH-チトクロムP450レダクターゼ[バチルス チューリンゲンシス血清型konkukian str. 97-27]
2015534464.tif 000162
SEQ ID NO：31
CYP102E1
R.メタリデュランスCH34
GenBankアクセッション番号YP 585608
>gi|94312398|ref|YP_585608.1|推定二機能性P-450：NADPH-P450レダクターゼ2[クプリアヴィドゥス メタリデュランスCH34]
2015534464.tif 000163
SEQ ID NO：32
CYP505X
A.フミガーツス Af293
GenBankアクセッション番号EAL92660
>gi|66852335|gb|EAL92660.1|P450ファミリー脂肪酸ヒドロキシラーゼ、推定[アスペルギルス フミガーツスAf293]
2015534464.tif 000164
SEQ ID NO：33
CYP505A8
A.ニデュランス FGSC A4
GenBankアクセッション番号EAA58234
>gi|40739044|gb|EAA58234.1|仮定的タンパク質AN6835.2[アスペルギルス ニデュランスFGSC A4]
2015534464.tif 000165
SEQ ID NO：34
CYP505A3
コウジカビATCC42149
Uniprotアクセッション番号Q2U4F1
>gi|121928062|sp|Q2U4F1|Q2U4F1_ASPORチトクロムP450
2015534464.tif 000166
SEQ ID NO：35
CYPX
コウジカビATCC42149
Uniprotアクセッション番号Q2UNA2
>gi|121938553|sp|Q2UNA2|Q2UNA2_ASPORチトクロムP450
2015534464.tif 000167
SEQ ID NO：36
CYP505A1
F.オキシスポルム
Uniprotアクセッション番号Q9Y8G7
>gi|22653677|sp|Q9Y8G7.1|C505_FUSOX RecName：Full=Bifunctional P-450：NADPH-P450レダクターゼ；AltName：Full=チトクロムP450foxy；AltName：Full=脂肪酸オメガ-ヒドロキシラーゼ；Includes：RecName：Full=チトクロムP450 505；Includes：RecName：Full=NADPH--チトクロムP450レダクターゼ
2015534464.tif 000168
SEQ ID NO：37
CYPX
G.モニリホルミス
GenBankアクセッション番号AAG27132
>gi|11035011|gb|AAG27132.1|Fum6p[フザリウム バーチシリオイデス(Fusarium verticillioides)]
2015534464.tif 000169
SEQ ID NO：38
CYP505A7
G.ゼアエPH1
GenBankアクセッション番号EAA67736
>gi|42544893|gb|EAA67736.1|C505_FUSOX二機能性P-450：NADPH-P450レダクターゼ（脂肪酸オメガ-ヒドロキシラーゼ）（P450foxy）[ジベレラ ゼアエPH-1]
2015534464.tif 000170
SEQ ID NO：39
CYP505C2
G.ゼアエPH1a
GenBankアクセッション番号EAA77183
>gi|42554340|gb|EAA77183.1|仮定的タンパク質FG07596.1[ジベレラ ゼアエPH-1]
2015534464.tif 000171
SEQ ID NO：40
CYP505A5
イネいもち病菌70-15 syn
GenBankアクセッション番号XP 365223
>gi|145601517|ref|XP_365223.2|仮定的タンパク質 MGG_01925[イネいもち病菌（Magnaporthe oryzae）70-15]
2015534464.tif 000172
SEQ ID NO：41
CYP505A2
アカパンカビOR74 A
GenBankアクセッション番号XP 961848
>gi|85104987|ref|XP_961848.1|二機能性P-450：NADPH-P450レダクターゼ[アカパンカビOR74A]
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SEQ ID NO：42 
CYP97C
イネ
GenBankアクセッション番号ABB47954
>gi|78708979|gb|ABB47954.1|チトクロムP450ファミリータンパク質、発現[ジャポニカイネ]
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SEQ ID NO：43
キメラヘム酵素C2G9
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SEQ ID NO：44
キメラヘム酵素X7
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SEQ ID NO：45
キメラヘム酵素X7-12
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SEQ ID NO：46
キメラヘム酵素C2E6
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SEQ ID NO：47
キメラヘム酵素X7-9
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SEQ ID NO：48
キメラヘム酵素C2B12
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SEQ ID NO：49
キメラヘム酵素TSP234
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SEQ ID NO：50 
WT-AxA（ヘム）
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SEQ ID NO：51 
WT-AxD（ヘム）
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SEQ ID NO：52 
WT-AxH（ヘム）
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SEQ ID NO：53 
WT-AxK（ヘム）
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SEQ ID NO：54 
WT-AxM（ヘム）
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SEQ ID NO：55 
WT-AxN（ヘム）
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SEQ ID NO：56 
BM3-CIS-T438S-AxA
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SEQ ID NO：57 
BM3-CIS-T438S-AxD
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SEQ ID NO：58 
BM3-CIS-T438S-AxM
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SEQ ID NO：59 
BM3-CIS-T438S-AxY
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SEQ ID NO：60 
BM3-CIS-T438S-AxT
2015534464.tif 000192
【図１】
2015534464.tif 000207
【図２】
2015534464.tif 000208
【図３】
2015534464.tif 000209
【図４】
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【図５】
2015534464.tif 000211
【図６】
2015534464.tif 000212
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2015534464.tif 000223
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
2015534464.tif 000241
【図３６】
2015534464.tif 000242
【図３７】
2015534464.tif 000243
【図３８】
2015534464.tif 000244
【図３９】
2015534464.tif 000245
【図４０】
2015534464.tif 000246
【図４１】
2015534464.tif 000247
【図４２】
2015534464.tif 000248
【図４３】
2015534464.tif 000249
【図４４】
2015534464.tif 000250
【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
2015534464.tif 000252
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年6月26日(2015.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2015534464000001.app
【国際調査報告】
2015534464.tif 000313
2015534464.tif 000314
2015534464.tif 000315