(57)【要約】  本発明は、部位特異的変異アルギナーゼおよびその調製方法、アルギナーゼ関連疾患を治療する薬剤を調製する際に上記部位特異的変異アルギナーゼを使用する方法を提供する。本発明は、ＰＥＧ化アルギナーゼおよびその調製方法、アルギナーゼ関連疾患を治療する薬剤を調製する際に上記ＰＥＧ化アルギナーゼを使用する方法も提供する。【選択図】図１
2015503912.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギナーゼであって、
上記アルギナーゼがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列を含み、
上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置４５、１６８および３０３のシステインのうちいずれか１つ、２つまたは全部が非極性アミノ酸に変異しているアルギナーゼ。
【請求項２】
位置４５、１６８または３０３の上記システインが、独立してアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、好ましくは上記システインがアラニンに変異している、請求項１に記載のアルギナーゼ。
【請求項３】
（１）位置４５、１６８および３０３の上記システインのうちいずれか１つが変異し、好ましくは、位置３０３の上記システインが変異し、さらに好ましくは、上記システインがアラニンに変異し、または
（２）位置４５、１６８および３０３の上記システインのうちいずれか２つが変異し、例えば、位置４５および位置３０３の上記システイン、または位置１６８および位置３０３の上記システイン、または位置４５および位置１６８の上記システインが変異し、好ましくは、上記システインがアラニンに変異し、または、
（３）位置４５、１６８および３０３の上記システインが変異し、好ましくは、上記システインがアラニンに変異している、
請求項１または２に記載のアルギナーゼ。
【請求項４】
上記アルギナーゼが少なくともおよそ５００Ｕ／ｍｇの活性を有し、好ましくは、その活性が少なくともおよそ７００Ｕ／ｍｇであり、さらに好ましくは、その活性が少なくともおよそ８００Ｕ／ｍｇである、請求項１〜３のいずれかに記載のアルギナーゼ。
【請求項５】
ＰＥＧ化アルギナーゼであって、
上記アルギナーゼが請求項１〜４のいずれかに規定したものであって、
上記アルギナーゼがＰＥＧ化修飾によりポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合している、ＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項６】
上記アルギナーゼ分子それぞれと結合するＰＥＧ分子の全分子量がおよそ２０〜７０Ｋ、好ましくは、全分子量がおよそ３０から６０Ｋである、請求項５に記載したＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項７】
ＰＥＧ分子が、およそ２〜４０Ｋの平均分子量であり、好ましくは、平均分子量がおよそ５〜２０ｋであり、さらに好ましくは、平均分子量がおよそ５Ｋである、請求項５または６に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項８】
ＰＥＧ化が、ＰＥＧ化試薬を用いてＰＥＧ分子が上記アルギナーゼの半量と共有結合することによりなされ、
上記ＰＥＧ化試薬が、リジン表面のε−ＮＨ２またはタンパク質のＮ末端α−ＮＨ２と結合し、タンパク質におけるアミノ酸のチオール基またはカルボキシル基と結合しているＰＥＧ化試薬を含み、好ましくは、上記ＰＥＧ化試薬がメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルブチラート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルスクシナート（ｍＰＥＧ−ＳＳ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルカーボナート（ｍＰＥＧ−ＳＣ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルグルタラート（ｍＰＥＧ−ＳＧ）、ｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシル−スクシンイミド（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）、ｍＰＥＧ−トレシラートおよびｍＰＥＧ−アルデヒドから選択され、さらに好ましくは、上記ＰＥＧ化試薬がメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナートであり、好ましくは、上記ＰＥＧ化試薬がメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート５０００である、請求項５〜７のいずれかに記載のＰＥＧ化試薬。
【請求項９】
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の上記アミノ酸配列における位置４５、１６８および３０３の上記システインのうちいずれか２つが、独立してアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、好ましくは、上記システインがアラニンに変異し、
アルギナーゼ分子に結合するＰＥＧ分子がおよそ５Ｋの平均分子量を有し、アルギナーゼ分子はそれぞれおよそ４〜１３個のＰＥＧ分子と結合し、好ましくは、アルギナーゼ分子はそれぞれ６〜１２分子と結合する、
または、
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の上記アミノ酸配列における位置４５、１６８および３０３の上記システインが、独立してアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、好ましくは、上記システインがアラニンに変異し、
アルギナーゼ分子に結合するＰＥＧ分子がおよそ５Ｋの平均分子量を有し、アルギナーゼ分子はそれぞれおよそ４〜１３個のＰＥＧ分子と結合し、好ましくは、アルギナーゼ分子はそれぞれ６〜１２分子と結合する、
請求項５〜７のいずれかに記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項１０】
上記アルギナーゼが、血液または血清中で、少なくとも０．５日間の半減期を有し、好ましくは、上記アルギナーゼが少なくとも２．５日間の半減期を有し、さらに好ましくは、上記アルギナーゼが少なくとも３．５日間の半減期を有する、請求項５〜９のいずれかに記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載のアルギナーゼまたは請求項５〜１０のいずれかに記載のＰＥＧ化アルギナーゼの調製方法。
【請求項１２】
アルギナーゼ関連疾患を治療するための薬剤の調製における請求項１〜４のいずれかに記載のアルギナーゼまたは請求項５〜１０のいずれかに記載のＰＥＧ化アルギナーゼの使用方法であって、好ましくは、上記疾患が高アルギニン血症、アルギニン依存性過形成または、肝臓癌、黒色腫、乳癌、肺小細胞癌、前立腺癌、リンパ腫または白血病のような腫瘍から選択される、使用方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに記載のアルギナーゼまたは請求項６〜１０のいずれかに記載のＰＥＧ化アルギナーゼを含むアルギナーゼ関連疾患を治療するための医薬組成物であって、
上記疾患が、高アルギニン血症、アルギニン依存性過形成または、肝臓癌、黒色腫、乳癌、肺小細胞癌、前立腺癌、リンパ腫または白血病のような腫瘍から選択される、医薬組成物。
【請求項１４】
アルギニン関連疾患を治療するための方法であって、請求項１〜５のいずれかに記載のアルギナーゼまたは請求項６〜１０のいずれかに記載のＰＥＧ化アルギナーゼを投与することを含み、好ましくは、上記疾患が、高アルギニン血症、アルギニン依存性過形成または、肝臓癌、黒色腫、乳癌、肺小細胞癌、前立腺癌、リンパ腫または白血病のような腫瘍から選択される、治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願の特許請求の範囲は、中国特許出願番号２０１１１０４４５９６８．８、出願日２０１１年１２月２７日、発明の名称「ヒトアルギナーゼおよびＰＥＧ化ヒトアルギナーゼとその使用方法」、および中国特許出願番号２０１２１００６９６２６．９、出願日２０１２年３月１６日、発明の名称「ヒトアルギナーゼおよびＰＥＧ化ヒトアルギナーゼとその使用方法」を優先権主張の基礎とし、それら全体を参照して本願に取り入れている。
【０００２】
（配列表に関して）
添付した配列表のハードコピーおよび対応するコンピューターで読み取り可能形式は、それら全体を参照して双方とも本願に取り入れている。
【０００３】
本発明は、アルギナーゼ、その調製方法、およびアルギナーゼ関連疾患の治療におけるその使用方法を提供する。特に、本発明は、部位特異的変異アルギナーゼ、その調製方法、およびアルギナーゼ関連疾患の治療におけるその使用方法を提供する。本発明は、ＰＥＧ化アルギナーゼ、その調製方法、およびその使用方法も提供する。
【背景技術】
【０００４】
アルギニンは、ヒトを含む哺乳動物において重要なアミノ酸であり、細胞の増殖や成長を含む、さまざまな生理的プロセスに関与している。例えば、アルギニンは、ポテンシャルシグナル分子である一酸化窒素（ＮＯ）の合成のための即時前駆体である。ＮＯは、神経伝達物質、機能筋弛緩薬または血管拡張薬として機能する。ＮＯの生合成は、Ｃａ＋＋を触媒とする一酸化窒素合成酵素およびＮＡＤＰＨ依存性反応を含む。アルギニンの他の機能は、ポリアミン、スペルミジンまたはスペルミンの前駆体となること、および他の生理的プロセスに関与することである。
【０００５】
研究では、アルギニンが８μＭより少ない場合、癌細胞は不可逆的な死に至る（非特許文献１）。細胞の成長における影響について研究によれば、アルギニンを除去すると、細胞周期のＧ０期にある通常の細胞は、休止期に入り、重大な損傷なしに数週間は生存し続ける。アルギニンの濃度を通常の水準まで戻すと、細胞は通常の細胞周期に戻る。ある腫瘍細胞は、細胞周期Ｇ１期のＲ点からアルギニンが欠乏するＳ期まで進行すると、すぐにアポトーシスを起こす。アルギニンが欠乏する結果としての腫瘍細胞のアポトーシスは、不可逆的である。したがって、科学者は、特に、肝臓癌や黒色腫のような栄養要求性腫瘍に関しては、体内のアルギニンの量を制御することによって癌を治療しようと考え始めている。このアプローチは、乳癌、肺小細胞癌、前立腺癌、リンパ腫および白血病を含む、さまざまな腫瘍の抑制についての研究に使われている。
【０００６】
アルギナーゼは、Ｌ−アルギニンの加水分解を触媒してオルニチンと尿素にする酵素である。一般的に、アルギナーゼは、尿素を生産する動物（哺乳動物、軟骨魚類、両生類、カメ類）の肝臓、腎臓および精巣において、尿素周期の酵素の１つとして発現する。アルギナーゼは、哺乳動物の尿素周期の最終段階を触媒し、アルギニンをオルニチンおよび尿素に変える。ヒトを含む多くの哺乳動物では、アルギナーゼのファミリーは、アルギナーゼＩとアルギナーゼＩＩを含む。アルギナーゼＩは主に肝臓細胞で発現し、アルギナーゼＩＩは主に腎臓および赤血球で発現する。
【０００７】
アルギナーゼを製造する方法は２つある。１つは、アルギナーゼを作り出す有機体から分離する方法であり、もう１つは、組み換え遺伝子工学技術によるものである。後者には有利な点がある。例えば、実験では、大量のアルギナーゼが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により生産できることが示された。しかしながら、組み換え遺伝子工学技術によりアルギナーゼを製造することには、酵素活性が低いまたは安定性に乏しい、および生体内での半減期が短いなどの技術的な問題があり、臨床実験への応用が制限される。
【０００８】
特許文献１では、Ｈｉｓタグを有する組み換えヒトアルギナーゼＩを用いたアルギニンの除去による、ヒト悪性腫瘍に対する医薬組成物および治療方法が開示されており、この中で、アルギナーゼの表面のＮ末端またはアミン基で、分子量５０００（ＭＷ５０００）のポリエチレングリコールと、共有結合することにより、アルギナーゼを修飾している。修飾したヒトアルギナーゼは、ヒト血清中で３日間の半減期を有しており、安定性が増加した。
【０００９】
特許文献２では、Ｈｉｓタグを有する修飾ヒトアルギナーゼが開示されており、この中で、１６８および３０３システインはセリンに置き換えられ、アルギナーゼは分子量２０ＫＤａのポリエチレングリコールでＰＥＧ化されている。特許文献１で開示された組み換えヒトアルギナーゼと同様に、付加的なペプチド断片であるＨｉｓタグには、アルギナーゼのアミノ酸配列が含まれる。多くの国々の薬剤規制機関は、これらのペプチド断片を使用することを推奨しない。例えば、中国食品薬品監督管理局は、「人への使用に関する組み換えＤＮＡ製品の品質管理の技術的ガイドライン」において、製造工程を簡便化する目的で導入されるＨｉｓタグのような付加的なペプチド断片は、最終製品から可能な限り除去すべきだと指摘している。
【００１０】
特許文献３では、部位特異的に修飾したアルギナーゼが開示されおり、このアルギナーゼにおいて、３つのシステインが保持され、別のシステイン残基はＮ末端の３番目のアミノ酸残基を置換するために導入され、分子量２０ＫＤａのメトキシポリエチレングリコールマレイミドでＰＥＧ化される。上記ヒトアルギナーゼは、元からある３つのシステイン残基を担持しているので、ＰＥＧ化生成物は不均質なる傾向があり、歩留まりが低く、さらに精製も困難である。
【００１１】
本発明の技術分野では、アルギニンに関する病気や疾患を治療するための、より良いアルギナーゼおよびその誘導体への需要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】US7951366B2
【特許文献２】US20100247508A1
【特許文献３】WO 2011/008495A2
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Srorr & Burton, 1974, The effects of arginine deficiency on lymphoma cells.Br.J.Cancer 30, 50
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明では、単離した、実質的に純粋なアルギナーゼを提供する。アルギナーゼは、哺乳動物の尿素合成における尿素再循環経路の最終段階にある酵素であり、アルギニンをオルニチンおよび尿素に変換する。ヒトと含む多くの哺乳動物では、アルギナーゼのファミリーに、アルギナーゼＩおよびアルギナーゼＩＩを含む。さまざまな由来のアルギナーゼＩについての研究では、異なる由来のアルギナーゼＩは、多くの保存配列と活性部位を有するが、その配列は異なるだろうということが示されている。原口らの報告（1987, Proc. Natl. Acad. Sc1. 84, 412-415）のように、野生型ヒトアルギナーゼＩは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸配列を有しており、アミノ酸位置４５、１６８および３０３に３つのシステインを含む。野生型ヒトアルギナーゼＩは、ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２を有する。
【００１５】
本発明において、「単離した」の語は、非天然の形態をいう。「実質的に純粋」の語は、生成物が、生成やタンパク質修飾に由来する他の成分を含むことがあるが、そのような他の成分は実質的に存在しないか存在しても非常にわずかであることを意味する。
【００１６】
本発明において、アミノ酸部位の位置についての記述は、当業者が通常使用するものである。例えば、「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．ｘの配列の位置４５」または「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．ｘの配列の位置４５のＣｙｓ（システイン）」または「Ｃｙｓ４５」は、すべて、アミノ酸配列の４５番目のアミノ酸残基または位置４５のシステインを示す。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
１つの態様において、本発明はアルギナーゼが、
（１）位置４５、１６８および３０３にあるシステインのうちの１つ、２つまたは３つが変異している、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列、または
（２）１つ以上のアミノ酸を置換、除去、挿入、付加、または転置した（１）に規定するアミノ酸配列
を含むヒトアルギナーゼＩであって、アルギナーゼ活性を有する、変異アルギナーゼを提供する。
【００１８】
１つの態様では、本発明のアルギナーゼにおけるシステインは、独立して非極性アミノ酸に変異する。その側鎖の特性により、アミノ酸は、極性または非極性のアミノ酸に区別することができる。非荷電の、またはわずかに極性化された側鎖を有するアミノ酸は、非極性アミノ酸とよばれ、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびプロリンが挙げられる。
【００１９】
１つの態様では、本発明のアルギナーゼにおけるシステインは、独立してグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異する。システインは、独立してアラニンに変異することが好ましい。本発明では、非イオン極性のアミノ酸であるシステインが非極性アミノ酸（例えばアラニン）に変異する場合に、ヒトアルギナーゼＩの酵素活性は著しく増加することを、図らずも発見した。変異アルギナーゼと基質との間の結合が強化されることが理由の１つとして考えられる。
【００２０】
１つの態様では、本発明のアルギナーゼにおける位置４５、１６８および３０３のシステインのうちの１つが、変異する。本発明ではさらに、位置３０３のシステインが変異する。好ましくは、上記システインは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、さらに好ましくは、上記システインはアラニンに変異する。
【００２１】
１つの態様では、本発明のアルギナーゼにおける位置４５、１６８および３０３のシステインのうちのいずれか２つが、変異する。さらに本発明では、位置４５および３０３のシステインが変異する。好ましくは、上記システインは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、さらに好ましくは、上記システインがアラニンに変異する。
【００２２】
１つの態様では、本発明のアルギナーゼにおけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸配列の位置１６８および３０３のシステインが、変異する。好ましくは、上記システインは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、さらに好ましくは、上記システインがアラニンに変異する。
【００２３】
１つの態様では、本発明のアルギナーゼにおけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸配列の位置４５および３０３のシステインが、変異する。好ましくは、上記システインは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、さらに好ましくは、上記システインがアラニンに変異する。
【００２４】
１つの態様では、本発明のアルギナーゼにおけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸配列の位置４５、１６８および３０３のシステインが、変異する。好ましくは、上記システインは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、さらに好ましくは、上記システインがアラニンに変異する。
【００２５】
本発明のアルギナーゼは、野生型アルギナーゼよりも高い酵素活性を有する。本発明のアルギナーゼは、通常、少なくともおよそ５００Ｕ／ｍｇの比活性を有し、好ましくは、活性は少なくともおよそ７００Ｕ／ｍｇであり、さらに好ましくは、活性は少なくともおよそ８００Ｕ／ｍｇである。本発明のアルギナーゼは、通常、野生型アルギナーゼよりも高い酵素活性を有する。
【００２６】
本発明における１つの態様では、アルギナーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２のヌクレオチド配列を有しており、その中で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸配列における位置４５、１６８および３０３のアミノ酸残基システインに対する少なくとも１つのコドンが置換さていれる。アミノ酸は、ポリヌクレオチドによってコード化される。メッセンジャーＲＮＡにおける３つのヌクレオチドコドンは、１つのアミノ酸を定義づける。本発明における１つの態様では、ヌクレオチドの置換は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンをコード化するコドンによって置換されるコドンＴＧＴである。コドンＴＧＴは、アラニンをコード化するコドンによって置換されるのが好ましい。
【００２７】
本発明における１つの態様では、アラニンをコード化する上記コドンは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧであり、好ましくはＧＣＴである。
【００２８】
１つの態様において、本発明では、タンパク質を発現できる宿主におけるアルギナーゼまたは変異アルギナーゼの遺伝子を発現することを含む、上述したアルギナーゼの調製方法を提供する。本発明のアルギナーゼの調製方法は、通常、以下の主な工程を含む。所望の遺伝子またはヌクレオチド断片は、ＰＣＲまたは合成方法により得られる。所望の遺伝子を有するＤＮＡ断片は、独立して複製でき、組み換えＤＮＡ分子を形成する選択マーカーを有する、プラスミド、ファージまたはウィルスのような、ベクターと結合している。ＤＮＡ断片のベクターとの連結は、主にホモポリマーの末端、相補末端、ブラントエンド、または人工のリンカーによってなされる。組み換えＤＮＡは、増殖して発現されるように、宿主細胞に導入されなければならない。組み換えＤＮＡ分子が宿主細胞に導入されて増殖するように、ベクターのさまざまな性質により、形質移入、形質転換、形質導入が行われる。適切な遺伝子工学的宿主は、当該分野で知られており、大腸菌、イースト菌、昆虫細胞などを含む。
【００２９】
本発明は、単離した、実質的に純粋なＰＥＧ化アルギナーゼも提供する。上記ＰＥＧ化アルギナーゼにおけるアルギナーゼは、既に定義づけた。１つの態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸配列における本発明の上記アルギナーゼの位置４５、１６８および３０３のシステインのうちの１つ、２つまたは３つが変異する。好ましくは、上記システインは非極性アミノ酸に変異し、さらに好ましくは、上記システインはアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、特に好ましくは、上記システインはアラニンに変異する。本発明のＰＥＧ化アルギナーゼは、上記アルギナーゼをＰＥＧ化することで得られる。上記ＰＥＧ化アルギナーゼにおいて、ポリエチレングリコール分子は、アルギナーゼのアミノ酸残基と共有結合している。本発明において、アルギナーゼは、それぞれ、少なくとも１つのポリエチレングリコール分子と結合して、ＰＥＧ化アルギナーゼを形成する。
【００３０】
１つの態様において、本発明は、アルギナーゼが、
（１）位置４５、１６８および３０３にあるシステインのうちのいずれか１つ、２つまたは３つが変異している、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸配列、または
（２）１つ以上のアミノ酸における置換、除去、挿入、付加または転置が（１）に規定するアミノ酸配列に導入されたアミノ酸配列
を含むヒトアルギナーゼＩであって、アルギナーゼ活性を有する、ＰＥＧ化アルギナーゼを提供する。
【００３１】
１つの態様において、本発明のＰＥＧ化アルギナーゼにおけるシステインは、独立して非極性アミノ酸に変異する。２０個のアミノ酸の構造は、その側鎖の相違によって異なる。非荷電またはわずかに極性化された側鎖を有するアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびプロリンのような、非極性アミノ酸に属す。
【００３２】
１つの態様において、ＰＥＧ化アルギナーゼＩは、ＣまたはＮ末端に付加されるＨｉｓタグ配列のような、精製において用いられるタグ配列を含まない。Ｈｉｓタグ融合タンパク質は、タンパク質発現のもっとも一般的な手段であり、容易に精製できる利点を有し、タンパク質の活性に重大な影響を与えない。可溶型または封入体のいずれかのタンパク質発現生成物は、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィにより精製され得る。一方、潜在的な免疫原性の特性により、中国食品薬品監督管理局は、「人への使用に関する組み換えＤＮＡ製品の品質管理の技術的ガイドライン」において、製造工程を簡便化する目的で導入されるＨｉｓタグのような付加的なペプチド断片は、最終製品から可能な限り除去されるべきだと指摘している。
【００３３】
本発明において、アルギナーゼのＰＥＧ化は、化学装飾によって行うことができ、上記化学装飾は、カップリング剤（ＰＥＧ化試薬ともいう）を有するポリエチレングリコール誘導体を用いて、ポリエチレングリコール分子をアルギナーゼと共有結合することにより行うことができる。一般的なポリエチレングリコール分子は、それぞれの末端に水酸基を有する。メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）は、一方の末端がメトキシ基でブロックされているポリエチレングリコールである。もっとも一般的に研究されているペプチドまたはタンパク質の修飾において用いられるＰＥＧ化試薬は、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）の誘導体である。修飾は、主に、アミノ基、カルボキシル基またはチオール基に対するものを含む。一般的なＰＥＧ化方法の１つは、ポリエチレングリコールまたはＰＥＧ化試薬を、リジン表面のε-ＮＨ２またはタンパク質のＮ末端α−ＮＨ２と共有結合することであり、例えばメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルブチラート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオナート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルスクシナート（ｍＰＥＧ−ＳＳ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルカーボナート（ｍＰＥＧ−ＳＣ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルグルタラート（ｍＰＥＧ―ＳＧ）、ｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシル−スクシンイミド（ｍＰＥＧ―ＮＨＳ）、ｍＰＥＧ―トレシラートおよびｍＰＥＧ―アルデヒドが挙げられる。チオール基の高い求核性の特性によれば、他の一般的なＰＥＧ化方法は、特にタンパク質のチオール基と結合する、ポリエチレングリコールまたはＰＥＧ化試薬を選択的に使用することであり、例えばｍＰＥＧ−マレイミド、ｍＰＥＧ−オルト−ピリジル−ジスルフィド、ｍＰＥＧ−ビニルスルホンおよびｍＰＥＧ−ヨードアセトアミドを用いてペプチドまたはタンパク質のチオール基を修飾する。ヒトアルギナーゼは、アミノ酸配列の位置４５、１６８または３０３に位置する３つのシステイン残基を有し、チオール基を標的とするＰＥＧ分子と共有結合することにより部位特異的に変異させることができる。
【００３４】
本発明のアルギナーゼＩのアミノ酸配列は、アミノ基のＰＥＧ化が可能な部位として、２４個のリジンおよびＮ末端アミノ基を含む。タンパク質の３次元構造における位置が異なるため、それぞれのＰＥＧ化の程度は異なる。ピモール（ＰｙＭＯＬ）または スイスＰＤＶビューアー（Ｓｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ）によるアルギナーゼの３次元構造分析からは、２４個のε−アミノ基のうちの１２個は、立体障害または周囲の基と形成される水素結合により、ＰＥＧ化するのは難しいことがわかった。Ｋ４、Ｋ３３、Ｋ４１、Ｋ７５、Ｋ８９、Ｋ１５０、Ｋ１５５、Ｋ１９１、Ｋ２２４、Ｋ２８４、Ｋ３１３およびＫ３２２のε−アミノ基は、アミノ基を標的とするＰＥＧ試薬による反応が進行しやすく、Ｋ１９１、Ｋ２２４、Ｋ８９、Ｋ２８４のε−アミノ基は、ＰＥＧ化において最も容易に接近できる部位である。
【００３５】
１つの態様では、上記のＰＥＧ化試薬は、メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルブチラート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルスクシナート（ｍＰＥＧ−ＳＳ）、ｍＰＥＧ-スクシンイミジルカルボナート（ｍＰＥＧ−ＳＣ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルグルタラート（ｍＰＥＧ−ＳＧ）、ｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシル−スクシンイミド（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）、ｍＰＥＧ−トレシラートおよびｍＰＥＧ−アルデヒドから選択される。さらに本発明では、上記ＰＥＧ化試薬はメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナートであり、好ましくは、上記ＰＥＧ化試薬は平均分子量５Ｋのメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート５０００である。
【００３６】
ＰＥＧの分子量の選択は、生体活性および薬物動態学的特性を総合的に勘案して行う。研究では、体内での修飾タンパク質薬剤の動作時間は、結合したＰＥＧの数と分子量と相関関係があることが示された。タンパク質は、修飾するＰＥＧ分子が大きすぎると、その活性を失うことがある。本発明で用いるＰＥＧは、３〜４０Ｋの範囲の分子量を有し、直線型または分岐型である。本発明で用いるＰＥＧは、当該技術分野で用いられるＰＥＧ誘導体とすることができる。本発明で用いるＰＥＧは、特定の種類に限定されない。
【００３７】
１つの態様において、上記アルギナーゼの分子それぞれと結合するＰＥＧ分子の全分子量は、およそ２０〜７０Ｋであり、好ましくは、全分子量はおよそ３０〜６０Ｋである。
【００３８】
１つの態様において、ＰＥＧ化において用いられるＰＥＧ分子はそれぞれ、およそ２〜４０Ｋの平均分子量を有し、好ましくは、平均分子量はおよそ５〜２０Ｋであり、さらに好ましくは、平均分子量はおよそ５Ｋである。
【００３９】
１つの態様において、ＰＥＧ化において用いられるＰＥＧ分子はそれぞれ、およそ５Ｋの平均分子量を有する。アルギナーゼ分子はそれぞれ、およそ４〜１３個のＰＥＧ分子と結合する。好ましくは、アルギナーゼ分子はそれぞれ、６〜１２個のＰＥＧ分子と結合する。
【００４０】
アルギナーゼ分子のそれぞれと結合するＰＥＧ分子の数は、タンパク質／ＰＥＧ試薬の割合、反応時間、温度など、ＰＥＧ化反応に影響を与えるパラメータを調整することで制御することができる。例えば、アルギナーゼ分子のそれぞれが、４〜１３個のＰＥＧ分子と、好ましくは６〜１２個の分子と結合するように制御することができる。
【００４１】
１つの態様において、本発明のＰＥＧ化アルギナーゼは、アミノ反応性ＰＥＧ試薬を、Ｋ１９１、Ｋ２２４、Ｋ８９、Ｋ２８４のアミノ基、またはＮ末端のα−アミノ基のような、アルギナーゼ表面のリジンのε−アミノ基と共有結合することによって形成され、またはＫ４、Ｋ３３、Ｋ４１、Ｋ７５、Ｋ１５０、Ｋ１５５、Ｋ３１３およびＫ３２２の位置でさらにＰＥＧ化される。アルギナーゼの分子それぞれと結合するＰＥＧ分子の数は、タンパク質／ＰＥＧ試薬の割合、反応時間または温度のような、ＰＥＧ化反応に影響を与えるパラメータを調整することにより、およそ４〜１３個のＰＥＧ分子、好ましくは６〜１２個の分子に制御することができる。
【００４２】
１つの態様において、ＰＥＧ化アルギナーゼのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸配列における位置４５、１６８および３０３の３つのシステインのうちの１つ（例えば、システイン４５、システイン１６８またはシステイン３０３）は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異する。好ましくは、上記システインはアラニンに変異し、その場合、上記ＰＥＧ化アルギナーゼのＰＥＧ分子はそれぞれ、およそ５Ｋの平均分子量を有し、上記ＰＥＧ化アルギナーゼのアルギナーゼ分子はそれぞれ、およそ４〜１３個のＰＥＧ分子、好ましくは６〜１２個の分子と結合している。本発明のさらなる態様では、上記ＰＥＧ化は、メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート５０００を用いて行われる。
【００４３】
１つの態様において、ＰＥＧ化アルギナーゼのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列における位置１６８および３０３のシステインは、独立して、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異する。好ましくは、上記システインはアラニンに変異し、この場合、上記ＰＥＧ化アルギナーゼのＰＥＧ分子のそれぞれは、およそ５Ｋの平均分子量を有し、上記ＰＥＧ化アルギナーゼのアルギナーゼ分子はそれぞれ、およそ４〜１３個のＰＥＧ分子と、好ましくは６〜１２個の分子と結合している。本発明のさらなる態様では、上記ＰＥＧ化は、メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート５０００を用いて行う。
【００４４】
１つの態様において、ＰＥＧ化アルギナーゼのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列における位置４５および３０３のシステインは、独立して、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異する。好ましくは、上記システインはアラニンに変異し、この場合、上記ＰＥＧ化アルギナーゼのＰＥＧ分子のそれぞれは、およそ５Ｋの平均分子量を有し、上記ＰＥＧ化アルギナーゼのアルギナーゼ分子はそれぞれ、およそ４〜１３個のＰＥＧ分子と、好ましくは６〜１２個の分子と結合している。本発明のさらなる態様では、上記ＰＥＧ化は、メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート５０００を用いて行う。
【００４５】
１つの態様において、ＰＥＧ化アルギナーゼＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列における位置４５および１６８のシステインは、独立して、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異する。好ましくは、上記システインはアラニンに変異し、この場合、上記ＰＥＧ化アルギナーゼのＰＥＧ分子のそれぞれは、およそ５Ｋの平均分子量を有し、上記ＰＥＧ化アルギナーゼのアルギナーゼ分子はそれぞれ、およそ４〜１３個のＰＥＧ分子と、好ましくは６〜１２個の分子と結合している。本発明のさらなる態様では、上記ＰＥＧ化は、メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート５０００を用いて行う。
【００４６】
１つの態様において、ＰＥＧ化アルギナーゼのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列における位置４５、１６８および３０３のシステインは、独立して、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異する。好ましくは、上記システインはアラニンに変異し、この場合、上記ＰＥＧ化アルギナーゼのＰＥＧ分子のそれぞれは、およそ５Ｋの平均分子量を有し、上記ＰＥＧ化アルギナーゼのアルギナーゼ分子はそれぞれ、およそ４〜１３個のＰＥＧ分子と、好ましくは６〜１２個の分子と結合している。本発明のさらなる態様では、上記ＰＥＧ化は、メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート５０００を用いて行う。
【発明の効果】
【００４７】
本発明のＰＥＧ化アルギナーゼは、実質的に均質である。実質的に均質であるとは、生成物はＰＥＧ化アルギナーゼを実質的に含むが、未反応の（すなわち、ＰＥＧ化していない）タンパク質や重合体のＰＥＧ化アルギナーゼをわずかに含み得ることを意味する。本発明は、純度が９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上のＰＥＧ化アルギナーゼを提供する。本発明において、「ＰＥＧ化アルギナーゼの純度」とは、全アルギナーゼ（ＰＥＧと共有結合したアルギナーゼ、ＰＥＧと共有結合していないアルギナーゼ、および重合体のＰＥＧ化アルギナーゼ）のうち、ＰＥＧ化アルギナーゼ（すなわち、ＰＥＧと共有結合したアルギナーゼ）の百分率を意味する。一般に、生成物には、ＰＥＧと共有結合していないアルギナーゼや重合体のアルギナーゼを含むので、さらなる精製が要求される。精製技術として一般に用いられる方法は、当該技術分野で知られており、陽イオン交換クロマトグラフィおよびタンゲンシャルフロー濾過を含む。
【００４８】
本発明のＰＥＧ化アルギナーゼは、血液または血清において、少なくとも０．５日の半減期を有し、好ましくは、上記アルギナーゼは少なくとも２．５日の半減期を有し、さらに好ましくは、上記アルギナーゼは少なくとも３．５日の半減期を有する。アルギナーゼの半減期は、当該分野で公知の通常用いられる方法により測定することができる。血液または血清中のアルギナーゼと使用した動物モデルでのアルギナーゼとの半減期を測定したデータには確かに関連性がある。代謝率の高い動物（たとえば、ラット）において得られた半減期のデータは、通常、代謝率の低い動物（たとえば、ヒト）よりも短い。
【００４９】
本発明は、ＰＥＧ化アルギナーゼの調製方法を提供する。上記ＰＥＧ化は、ＰＥＧ分子をアルギナーゼのアミノ酸残基に結合することで達成される。本発明のＰＥＧ化アルギナーゼにおいて、アルギナーゼ分子はそれぞれ、ＰＥＧ分子と結合してＰＥＧ化アルギナーゼを形成している。
【００５０】
本発明において、部位特異的なＰＥＧ化は化学修飾によってなされるが、この場合、化学修飾は、アルギナーゼ上の基をＰＥＧ試薬と共有結合することで行われる。上記化学修飾は特異的であって、つまり、ＰＥＧ分子は、特定の基と結合する試薬を用いて、アルギナーゼの特定のアミノ酸残基のみと結合する。
【００５１】
本発明は、上述したアルギナーゼまたはＰＥＧ化アルギナーゼの応用／使用方法、またはアルギナーゼに関連疾患を治療する際の、それらを含む医薬組成物も提供する。当該分野において公知である上記アルギナーゼ関連疾患には、哺乳動物の体内におけるアルギニン量に関連する体調／病気／疾患が含まれる。そのような体調／病気／疾患には、高アルギニン血症が含まれる。アルギナーゼが欠乏することにより、患者の体内のアルギニンは尿素に分解することもオルニチン代謝周期に加わることもできず、血液中のアルギニン量は、通常の血液の値よりも７〜１０倍も高くなり、脳脊髄液または尿におけるアルギニン量と同時に排泄物における尿素排泄も増加する。さらに、上記体調／病気／疾患には、アルギニン依存増殖または腫瘍が含まれる。細胞の成長における影響についての研究では、アルギニンを除去した場合に、細胞周期のＧ０期にある通常の細胞は休止期に入り、重大な損傷なしに数週間は生存し続けることがわかった。アルギニンの濃度が通常の水準まで戻ると、細胞は通常の細胞周期に戻る。増殖中の細胞や腫瘍は、しかしながら、細胞周期のＧ１期のＲ点を経て、アルギニンが欠乏するＳ期に入って、すぐにアポト―シスをおこす。アルギニンの欠乏による過形成細胞または腫瘍細胞のアポトーシスは、不可逆的である。そのため、科学者は、体内のアルギニン量を制御することによって、過形成または腫瘍を治療することを考え始めた。
【００５２】
本発明は、医薬組成物も提供し、この場合、本発明の上記医薬組成物の有効成分は、上述したアルギナーゼまたはＰＥＧ化アルギナーゼである。上記医薬組成物の剤型は、固形体、液剤、乳剤、分散剤、ミセル、リポソームの形態をとり得るが、この場合、処方には、有効成分として本発明のヒトアルギナーゼまたはＰＥＧ化アルギナーゼのうちの１つ以上含まれており、有機または無機のキャリアー、または非経口の使用法に適切な医薬品添加物と混合される。さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤、着色剤および香料を添加できる。本発明の単離した実質的に純粋なヒトアルギナーゼまたはＰＥＧ化アルギナーゼのうちの１つ以上は、有効成分として、体調や病気に対して所望の効果を奏するのに十分な量が含まれる。医薬組成物は、錠剤、丸薬、トローチ剤、水和または油性の懸濁剤、分散した粉剤または粒剤、または乳剤、硬いまたは柔らかいカプセル、またはシロップのような、経口投与に適する形態で処方される。経口投与の処方は、当該分野で公知の技術にしたがって、消化管のなかでゆっくりと分解し吸収されるようにカプセル化することで、長時間効果が持続する。処方は、無菌の注射可能な液剤また懸濁剤の形態でもよい。上記懸濁剤は、当該分野において公知の方法により、分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を用いて調製することができる。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、さらに、固形体、液剤、懸濁剤、ミセル、またはリポソームの形態で処方され得る。１つの態様では、医薬組成物は、経口投与または注射可能な形態に処方される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、野生型アルギナーゼＩのヌクレオチド配列を示す。
【図２】図２は、還元条件におけるヒトアルギナーゼＩのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
【図３】図３は、高圧液体クロマトグラフィ分析によるヒトアルギナーゼの発現を示す。
【図４】図４は、還元条件および非還元条件でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による野生型および変異アルギナーゼＩの試験結果を示す。
【図５】図５は、還元条件および非還元条件における精製した変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
【図６ａ】図６は、還元条件および非還元条件における精製した変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。図６ａは、精製した変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３）の非還元条件のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
【図６ｂ】図６ｂは、精製した変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３）の還元条件でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
【図７】図７は、ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩの非還元条件でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
【図８ａ】図８は、ＰＥＧ化アルギナーゼＩの質量分析を示す。図８ａは、ＰＥＧ化アルギナーゼＩ：Ａ１６８／３０３−Ｙ４０Ｋの質量分析を示す。
【図８ｂ】図８ｂは、ＰＥＧ化アルギナーゼＩ：Ａ４５／３０３−Ｙ４０Ｋの質量分析を示す。
【図８ｃ】図８ｃは、ＰＥＧ化アルギナーゼＩ：ＲＰ−Ｖ−Ｊ５Ｋの質量分析を示す。
【図８ｄ】図８ｄは、ＰＥＧ化アルギナーゼＩ：ＲＰ−Ｍ２−Ｊ５Ｋの質量分析を示す。
【図８ｅ】図８ｅは、ＰＥＧ化アルギナーゼＩ：ＲＰ−Ｍ３−Ｊ５Ｋの質量分析を示す。
【図８ｆ】図８ｆは、ＰＥＧ化アルギナーゼＩ：ＲＰ−Ｍ４−Ｊ５Ｋの質量分析を示す。
【図８ｇ】図８ｇは、ＰＥＧ化アルギナーゼＩ：ＲＰ−Ｍ７−Ｊ５Ｋの質量分析を示す。
【図９】図９は、ＰＥＧ化アルギナーゼの質量分析の連結した数値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
この発明を、以下に述べる実施例を用いてさらに説明する。これらの実施例は本発明の好ましい実施態様を説明しており、説明する実施例に限定されない。上述の記載および実施例を参考にすれば、当業者は本発明の重要な特質を決定することができ、発明の意図および範囲を逸脱することなく、他の使用方法や条件に適用する場合にさまざまな方法で本発明を変更し修正することができる。つまり、本発明に対する前述のいかなる変更／修正によれば、ここで示しまた説明したこと以外でも、当業者には明白であり、それらの修正は、付加した請求項の範囲の一部を形成することが意図されている。
【００５６】
例１：Ｈｉｓタグを有さない組み換えヒトアルギナーゼＩプラスミドｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈアルギナーゼ−Ｖの発現および構築。
【００５７】
ヒトアルギナーゼＩ遺伝子配列は、１９８７年に公表された（Haraguchi. Y. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci, 84, 412-415）。ヒトアルギナーゼ遺伝子は、テンプレートとしてヒト肝臓５’ストレッチプラスｃＤＮＡライブラリ（クロンテック社）、および前述のアルギナーゼＩ配列により設計されたプライマーＡＲＧ−Ｖ（＋）およびＡＲＧ−Ｖ（−）を用いて、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって増大した。プライマーＡＲＧ−Ｖ（＋）は、ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、ＡＲＧ−Ｖ（−）プライマーは、ＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。分子生物学の通常の検査技法を用いれば、ヒトアルギナーゼＩのＰＣＲ生成物が得られ、アルガロースゲル電気泳動により確認された。上記増大したヒトアルギナーゼＩのＰＣＲ生成物および商業的に入手可能な発現ベクターｐＥＴ３０ａ（＋）は、制限エンドヌクレアーゼ、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ（プロメガ社）で、それぞれ３７℃１．５時間で消化された。消化された断片は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより１６℃で一晩連結され、得られた連結組み換えプラスミドは、ＤＨ５α大腸菌コンピテント細胞に形質転換した。その形質転換細胞は、ＬＢ寒天平板を含むカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）上に流し入れ培養することで選択した。正しい挿入断片を含むプラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ消化分析によって同定した。正しい組み換えヒトアルギナーゼＩ発現プラスミドは、以下ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈアルギナーゼ−Ｖとするが、正しい配列およびヒトアルギナーゼＩ遺伝子の挿入を確実にするために、順番に配列することによって分析する。挿入断片の大きさは、長さで９６９個分の塩基対である。図１に示すように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２のヌクレオチド配列を有する。
【００５８】
ARG-V(+): 
5' GGAATTCCATATGAGCGCCAAGTCCAGAACCATAG 3'
NdeI
ARG-V(-): 
5' CCGCTCGAGTTATTACTTAGGTGGGTTAAGGTAGTCAATAGG 3'
XhoI
【００５９】
例２：Ｈｉｓタグを有さない組み換えヒトアルギナーゼＩプラスミドＤＮＡｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈアルギナーゼ−Ｖの発現、および標的タンパク質の精製。
【００６０】
１００μｌのコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細胞は氷上で解凍した。１μｌのｐＥＴ３０ａ（＋）−Ｖ組み換えプラスミドは、そのコンピテント細胞に加えられ、３０分間氷上で培養した。その混合物は、４２℃の水浴中で９０秒間ヒートショック処理をし、その後氷上で２分間培養した。５００μｌのＬＢ培養液を、形質転換細胞に加え、３７℃、１５０ｒｐｍで１時間振とう培養した。培養後、２００μｌの形質転換細胞の懸濁液を、カナミシンＬＢ寒天平板上に平らに流し広げ、逆さまにして３７℃の培養器で１６時間培養した。
【００６１】
組み換えプラスミドで形質転換した１つのコロニーを選択し、２５ｍｌのＬＢ培養液に移して、光学濃度６００ｎｍ（ＯＤ６００ｎｍ）が０．６〜０．８に達するまで、３７℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。最終濃度０．２ｍＭのＩＰＴＧを、標的たんぱく質の発現を３時間で誘発するようにその培養液に加えた。選択したクローンの標的タンパク質発現は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分析した。高度にタンパク質発現するクローンは、遺伝子操作バクテリアとしてグリセロールストックに保管した。
【００６２】
遺伝子操作バクテリア細胞は、１５Ｌの発酵槽で流加培養した。ＯＤ６００ｎｍが１２〜１３に達したとき、最終濃度０．２ｍＭのＩＰＴＧを、標的タンパク質の発現を３〜４時間で誘発するために培養液に加えた。誘発したバクテリア細胞は、集められて溶解された。その後の標的タンパク質の分離および精製のため、細胞ライセートは遠心分離され、その上澄み液は集められた。
【００６３】
標的タンパク質の精製は、ＣＭ陽イオン液体クロマトグラフィを用いて行った。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、サンプルローディングの前にカラムを平衡にするために用いた。バクテリア細胞のライセート上澄み液をカラムにロードして、その後、弱く結合するまたは非特異的に結合する不純物を除去するために、カラム容量３個分の平衡バッファーで洗浄した。安定化したＵＶ２８０ｎｍを読み取るときに、標的タンパク質は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびＮａＣｌを含む溶離バッファーを用いて溶離した。カラムから溶離したタンパク質のピークは、集められて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で分析した。
【００６４】
実験結果は、図２および３に示した。
【００６５】
図２に、ヒトアルギナーゼＩ発現量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。それぞれのレーンの試料は以下のとおりである。
【００６６】
１．タンパク質分子量標準、２．バクテリアライサート上澄み液、３．精製したＨｉｓタグを有さないヒトアルギナーゼＩ、４．ＣＭ陽イオン交換カラムのフロースルー。
【００６７】
図３に、精製したヒトアルギナーゼＩのＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【００６８】
図２および３に示すように、上記のクロマトグラフィの手法により得られたアルギナーゼの純度は、９０％を超える。
【００６９】
例３：ヒトアルギナーゼＩの部位特異的変異形成（ｒｈＡｒｇＩ）。
【００７０】
部位特異的な変異は、クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）部位特異的変異形成キット（ストラタジーン社）を用いて、ヒトアルギナーゼＩのアミノ酸配列における位置４５、１６８および３０３に導入した。野生型ヒトアルギナーゼを含む組み換えプラスミドｐＥＴ３０ａ−ｒｈアルギナーゼＩ−Ｖは、テンプレートとして用いた。位置４５、１６８および３０３におけるシステインをコード化するコドン（ＴＧＴ）は、独立してアラニンをコード化するコドン（ＧＣＴ）に変異し、結果として１つ、２つまたは３つの部位が変異した変異体となった。ヒトアルギナーゼＩの部位４５、１６８および３０３における置換コドンＧＣＴの導入を目的とするプライマーを以下に示す。
【００７１】
ARG-m45(+): 
5' GAGAAACTTAAAGAACAAGAGGCTGATGTGAAGGATTATGGGG 3'
ARG-m45(-): 
5' CCCCATAATCCTTCACATCAGCCTCTTGTTCTTTAAGTTTCTC 3'
ARG-m168(+): 
5' GATTCTCCTGGGTGACTCCCGCTATATCTGCCAAGGATATTG 3'
ARG-m168(-): 
5' CAATATCCTTGGCAGATATAGCGGGAGTCACCCAGGAGAATC 3'
ARG-m303(+): 
5' GTTGCAATAACCTTGGCTGCTTTCGGACTTGCTCGGG 3'
ARG-m303(-): 
5' CCCGAGCAAGTCCGAAAGCAGCCAAGGTTATTGCAAC 3'
【００７２】
ＰＣＲは、変異形成キットで与えられる指示どおりに行った。非変異の親ＤＮＡテンプレートは、制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩで消化した。変異プラスミドは、コンピテント細胞に形質転換し、配列により確認した。システインをコード化するコドン（ＴＧＴ）からアラニンをコード化するコドン（ＧＣＴ）への変異を含む変異アルギナーゼプラスミドで形質転換したクローンを選択し、ＬＢ培養液に広げた。標的とする変異プラスミドは、ウィザードプラスミニ準備キットを用いて分離した。
【００７３】
アミノ酸位置３０３、１６８または４５でアラニン変異体となる１つのシステインを有する変異ヒトアルギナーゼＩは、それぞれｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８またはｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５と表される。アミノ酸位置１６８と３０３、アミノ酸位置４５と３０３、およびアミノ酸位置４５と１６８でアラニン変異体となる２つのシステインを有する変異ヒトアルギナーゼＩは、それぞれｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３、およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８と表される。アミノ酸位置４５、１６８および３０３でアラニン変異体となる３つのシステインを有する変異ヒトアルギナーゼＩは、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３と表される。上記アルギナーゼ変異挿入断片を含むプラスミドは、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３と表される。
【００７４】
１００μｌのコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細胞は、氷上で解凍した。１μｌの変異構成物をＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に加え、３０分間氷上で培養した。その混合物は、４２℃で９０秒間ヒートショック処理をし、その後、２分間氷上で培養した。５００μｌのＬＢ培養液を形質転換細胞に加え、３７℃、１５０ｒｐｍで１時間振とう培養した。培養後、２００μｌの形質転換細胞の懸濁液を、カナミシンＬＢ寒天平板上に平らに流し広げ、逆さまにして３７℃で１６時間培養した。
【００７５】
組み換えプラスミドで形質転換した１つのコロニーを選択し、２５ｍｌのＬＢ培養液に移して、光学濃度６００ｎｍ（ＯＤ６００ｎｍ）が０．６〜０．８に達するまで、３７℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。最終濃度０．２ｍＭのＩＰＴＧを、標的たんぱく質の発現を３時間で誘発するようにその培養液に加えた。選択したクローンの標的タンパク質発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。高度にタンパク質発現するクローンは、遺伝子操作バクテリアとしてグリセロールストックに保管した。
【００７６】
例４：部位特異的変異アルギナーゼＩの発現およびタンパク質精製
【００７７】
変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ）プラスミド（ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３、ｐＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５/１６８またはＥＴ３０ａ（＋）−ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３）で形質転換させた遺伝子操作大腸菌細胞は、１５Ｌの発酵槽で流加培養した。ＯＤ６００ｎｍが１２〜１３に達したとき、最終濃度０．２ｍＭのＩＰＴＧを、標的タンパク質の発現を３〜４時間で誘発するために培養液に加えた。バクテリア細胞は、集めて溶解した。その後のタンパク質の分離および精製のため、細胞ライセートは遠心分離され、その上澄み液は集められた。
【００７８】
標的タンパク質の精製は、ＣＭ陽イオン液体カラムを用いて行った。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、サンプルローディングの前にカラムを平衡にするために用いた。バクテリア細胞のライセート上澄み液をカラムにロードして、その後、弱く結合するまたは非特異的に結合する不純物を除去するために、カラム容量３個分の平衡バッファーで洗浄した。安定化したＵＶ２８０ｎｍを読み取るときに、標的タンパク質は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびＮａＣｌを含む溶離バッファーを用いて溶離した。カラムから溶離したタンパク質のピークは、変異アルギナーゼＩのｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３を得るために集められた。
【００７９】
集めたタンパク質試料の純度は、ＳＤＳ−ＡＰＧＥおよびＨＰＬＣで分析した。上記クロマトグラフィの手法を用いた場合、アルギナーゼの純度は９０％を超えると測定された。
【００８０】
例５：部位特異的変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ）の活性
【００８１】
アルギナーゼの活性は、ウレアーゼおよびグルタミン酸脱水素酵素を組み合わせた分光光度分析によって測定し、それを以下の模式図に示した。ＮＡＤＰＨは、波長３４０ｎｍに光吸収を有する。ＮＡＤＰＨが酸化してＮａＤＰ＋となると、３４０ｎｍにおける吸収は減少する。アルギナーゼの活性は、ＮＡＤＰＨ（ΔＥ３４０＝６２２０Ｍ−１ｃｍ−１）のモル吸光係数とともに、３４０ｎｍにおける吸収の減少量を監視することで、相関付けて測定できる。
【００８２】
【化１】
2015503912.tif 000003
【００８３】
アルギナーゼ活性の１単位（Ｕ）は、３０℃、ｐＨ８．３の条件で、１μｍｏｌの尿素を放出することと定義した。
【００８４】
アルギナーゼの比活性は、下記式を用いて算出した。
【００８５】
比活性 （Ｕ／ｍｇ）＝［（ΔＡ／Δｔ）×（１／ε）×１０６×（１／２）］／［Ｅ］
ΔＡ＝３４０ｎｍにおける吸光度の差
ε＝ＮＡＤＰＨミカエリスメンテン定数（Ｋｍ）（６２２０Ｍ−１ｃｍ−１）
［Ｅ］＝反応混合液における酵素濃度（ｍｇ／ｍＬ）
【００８６】
上記の分析評価を用いると、さまざま変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３）の比活性は、それぞれ、７４７±６３Ｕ／ｍｇ、８１４±９１Ｕ／ｍｇ、７８６±５８Ｕ／ｍｇ、７８２±１９Ｕ／ｍｇおよび７５９±６８ Ｕ/ｍｇと測定された。野生型ヒトアルギナーゼＩの比活性は４９１±４２Ｕ/ｍｇと測定され、位置１６８／３０３、４５／３０３、４５／１６８および４５／１６８／３０３にある非極性非イオン性アミノ酸システインが非極性アミノ酸アラニンに変異した後に、アルギナーゼの活性が著しく増加することを説明している。
【００８７】
例６：野生型および変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
【００８８】
ポリアクリルアミドゲルは、従来の方法を用いて調製した。試料は、分析の前に還元条件（つまり、ジスルフィド分子間の結合またはその分子内結合を壊すために、β−メルカプトエタノールはサンプルローディングバッファーに含有される）または非還元条件件下で処理し、１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、野生型およびさまざまな変異アルギナーゼＩの分子内ジスルフィド架橋構造を解読した（図４、５、６ａ、６ｂ）。
【００８９】
図４に、還元条件および非還元条件下で処理した後の野生型アルギナーゼＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。各レーンの試料は以下のとおりである。レーン１および３：バクテリア細胞ライセートの上澄み液、レーン２：精製したＨｉｓタグを有さないアルギナーゼ（非還元）、Ｍ：タンパク質分子量標準、レーン４：精製したＨｉｓタグを有さないヒトアルギナーゼＩ（還元）。
【００９０】
図５に、還元条件および非還元条件下での、精製した変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。各レーンの試料は以下のとおりである。レーン１：変異アルギナーゼＩ、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３（非還元）、レーン２：変異アルギナーゼＩ、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３（非還元）、レーン３：変異アルギナーゼＩ、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３（非還元）、Ｍ：タンパク質分子量標準、レーン４：変異アルギナーゼＩ、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３（還元）、レーン５：変異アルギナーゼＩ、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３（還元）、レーン６：変異アルギナーゼＩ、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３（還元）。
【００９１】
図６ａに、非還元条件下での精製した変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。各レーンの試料は以下のとおりである。Ｍ：タンパク質分子量標準、レーン１：変異アルギナーゼＩ、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３、レーン２：ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８。
【００９２】
図６ｂに、還元条件下での精製した変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。各レーンの試料は以下のとおりである。Ｍ：タンパク質分子量標準、レーン１：変異アルギナーゼＩ、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３、レーン２：ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８。
【００９３】
還元条件および非還元条件下でのアルギナーゼＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、野生型ヒトアルギナーゼＩは、本発明における所定の実験条件下では、他のコンホメーションを有すること明らかになった。そのような条件下では、位置３０３のシステインが変異してアラニンとなる場合、他のコンホメーションも存在した。しかしながら、アミノ酸の位置４５、１６８および３０３にある３つのシステイン残基のうち２つ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３またはｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８）または全部のいずれかが、アルギナーゼに変異した場合、非還元条件下では１つのコンホメーションのみが検出された（図５および図６ａ）。既知の理論に何ら制限されるものではないが、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける野生型ヒトアルギナーゼＩの多数のコンホメーションの存在は、所定条件下でのシステイン４５、１６８および３０３によりもたらされた分子内ジスルフィド結合の形成によるものだと考えられる。システイン３０３のみがアラニンに変異した場合には、未変異のシステイン４５および１６８間の分子内ジスルフィド結合の形成により、そのようなコンホメーションのアルギナーゼＩ変異も、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出されると発明者は考えている。位置４５、１６８および３０３の３つのシステイン残基のうち２つまたは全部のいずれかが変異した場合（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８またはｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３）、ジスルフィド結合の形成のすべての可能性がなくなり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では１つのコンホメーションのみが検出される。
【００９４】
例７：変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ）のＰＥＧ化およびＰＥＧ化タンパク質の精製
（１）メトキシポリエチレングリコールマレイミドを用いたＰＥＧ化（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ  ４００００）。
【００９５】
部位特異的変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３／１６８またはｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３）は、２０ｍＭのＰＢＳバッファー（ｐＨ７．０）中のモル比の範囲１：５〜１：１０で、メトキシポリエチレングリコールマレイミドとそれぞれ混合した。上記メトキシポリエチレングリコールマレイミドは、分子量４ｋＤａの２つのポリエチレングリコール鎖からなるＹ字状の枝分かれである。ＰＥＧ化反応は、室温で２〜４時間行った。反応の最後には、最終生成物を４℃の冷蔵庫に保管した。
【００９６】
部位特異的ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩは、残存する未反応のタンパク質およびＰＥＧを除去するため、マクロ（Ｍａｃｒｏ）ＳＰマトリックス陽イオン交換カラムを用いて分離、精製した。リン酸バッファーおよびリン酸バッファーを含むＮａＣｌ（１Ｍ）は、それぞれ平衡バッファーおよび溶離バッファーとして用いた。サンプルローディングの前に、ＰＥＧ化タンパク質の試料は、試料の電気伝導度が平衡バッファーと同じになるまで蒸留水で希釈し、カラムは、カラム容量の５倍の平衡バッファーで平衡にした。サンプルローディングの後、カラムはさらにカラム容量の５倍の平衡バッファーで洗浄し、３５％溶離バッファーで溶離した。タンパク質ピークを含む溶離液は、集めてＧ２５カラムを用いて脱塩した。標的とするタンパク質は集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００９７】
（２）メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ  ５０００）を用いたタンパク質のＰＥＧ化およびＰＥＧ化タンパク質の精製。
【００９８】
野生型およびさまざまな部位特異的変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３／１６８、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ３０３／４５、ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８およびｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３）のＰＥＧ化修飾を行った。反応条件は以下のとおりである。野生型またはさまざまな部位特異的変異アルギナーゼＩは、タンパク質濃度は８ｍｇ／ｍｌであり、それぞれ、２０ｍＫのＰＢＳバッファー（ｐＨ８．５〜９．０）中のモル比の範囲が１：２０〜１：３０となるように、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ  ５０００）を室温で２時間混合した。最終生成物は４℃の冷蔵庫で保管した。
【００９９】
上記ＰＥＧ化生成物は、１００ＫＤａの限外濾過膜で限外濾過することで精製し、未反応のメトキシポリ（エチレングリコール）スクシンイミジルプロピオナートを除去した。ＰＥＧ化生成物は、１：１の体積比で１０ｍＭのＰＢＳバッファー（ＰＨ７．５）を混合し、元の体積になるように限外濾過した。この工程は１５回繰り返し、標的タンパク質を集めて電気泳動により分析した。
【０１００】
（３）ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび酵素活性分析
【０１０１】
精製したｍＰＥＧ−ＭＡＬ−４０ＫのＰＥＧ化アルギナーゼＩおよびｍＰＥＧ−ＳＰＡ−５ＫのＰＥＧ化アルギナーゼＩは、溶解して、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１０２】
その結果を図７に示す。
【０１０３】
図７：ＰＥＧ化アルギナーゼＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。各レーンの試料は以下のとおりである。
【０１０４】
Ｍ：タンパク質分子量標準
【０１０５】
ＲＰ−Ｖ−Ｊ５Ｋ：組み換え野生型アルギナーゼＩは、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ  ５０００）と反応させた。ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩ（ＲＰ−Ｖ−Ｊ５Ｋ）は、１００ｋＤａの限外濾過膜を用いて精製し、純度は９５％を超える。
【０１０６】
ＲＰ−Ｍ２−Ｊ５Ｋ：部位特異的変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３）は、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ  ５０００）と反応させた。ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩ（ＲＰ−Ｍ２−Ｊ５Ｋ）は、１００ｋＤａの限外濾過膜を用いて精製し、純度は９５％を超える。
【０１０７】
ＲＰ−Ｍ３−Ｊ５Ｋ：部位特異的変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３）は、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナート（ｍＰＥＧ―ＳＰＡ  ５０００）と反応させた。ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩ（ＲＰ−Ｍ３−Ｊ５Ｋ）は、１００ｋＤａの限外濾過膜を用いて精製し、純度は９５％を超える。
【０１０８】
ＲＰ−Ｍ４−Ｊ５Ｋ：部位特異的変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８／３０３）は、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ  ５０００）と反応させた。ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩ（ＲＰ−Ｍ４−Ｊ５Ｋ）は、１００ｋＤａの限外濾過膜を用いて精製し、純度は９５％を超える。
【０１０９】
ＲＰ−Ｍ７−Ｊ５Ｋ：部位特異的変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／１６８）は、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ  ５０００）と反応させた。ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩ（ＲＰ−Ｍ７−Ｊ５Ｋ）は、１００ｋＤａの限外濾過膜を用いて精製し、純度は９５％を超える。
【０１１０】
Ａ１６８／３０３−Ｙ４０Ｋ：部位特異的変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ１６８／３０３）は、Ｙ字状に枝分かれしたポリエチレングリコールマレイミド４０Ｋ（Ｙ−ＭＡＬ−４０Ｋ）と反応させた。ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩは、マクロキャップ（Ｍａｃｒｏｃａｐ）ＳＰマトリックス陽イオン交換カラムで精製した。システイン４５における１つのＰＥＧ鎖Ｙ−ＭＡＬ−４０Ｋと結合したＰＥＧ化アルギナーゼＩタンパク質（Ａ１６８／３０３−Ｙ４０Ｋ）は、全反応生成物の８５％を超える。
【０１１１】
Ａ４５／３０３−Ｙ４０Ｋ：部位特異的変異アルギナーゼＩ（ｒｈＡｒｇＩ−Ａ４５／３０３）は、Ｙ字状に枝分かれしたポリエチレングリコールマレイミド４０Ｋ（Ｙ−ＭＡＬ−４０Ｋ）と反応させた。ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩは、マクロキャップ（Ｍａｃｒｏｃａｐ）ＳＰマトリックス陽イオン交換カラムで精製した。システイン１６８における１つのＰＥＧ鎖Ｙ−ＭＡＬ−４０Ｋと結合したＰＥＧ化アルギナーゼＩタンパク質（Ａ４５／３０３−Ｙ４０Ｋ）は、全反応生成物の８５％を超える。
【０１１２】
前述した２つの分光光度分析を用いて、異なるＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩの活性を、ＮＡＤＰＨの吸収の変化により測定し決定した。試験結果は、ＰＥＧ化生成物がアルギナーゼ活性を維持することを示しており、この中で、Ａ１６８／３０３−Ｙ４０ＫおよびＡ４５／３０３−Ｙ４０Ｋの比活性は、それぞれ５５１±６８Ｕ／ｍｇおよび５９５±４１Ｕ／ｍｇであり、一方で、ＲＰ−Ｍ２−Ｊ５Ｋ、ＲＰ−Ｍ３−Ｊ５Ｋ、ＲＰ−Ｍ４−Ｊ５ＫおよびＲＰ−Ｍ７−Ｊ５Ｋの比活性は、それぞれ、７２６±６６Ｕ／ｍｇ、７４７±７２  Ｕ／ｍｇ、７１２±６９Ｕ／ｍｇおよび８３８±８Ｕ／ｍｇであった。ＰＥＧ化野生型ヒトアルギナーゼＩ（ＲＰ−Ｖ−Ｊ５Ｋ）の比活性は、５３７±５５Ｕ／ｍｇと測定された。
【０１１３】
（４）ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩの分子量分布分析
【０１１４】
異なるＰＥＧ化方法を用いて異なる部位をＰＥＧ化したヒトアルギナーゼＩは、試験試料の分子量分布を測定するために、マトリックス支援レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）により分析した。すべての実験は、飛行時間に基づき、試料を脱離させてイオン化する窒素レーザーを備えた、ブルカーダルトニクス社オートフレックス（商標）ＴＯＦ／ＴＯＦシステムにより行った。この装置は、加速電位＋２０ｋＶの陽イオン線型モードで操作した。
【０１１５】
実験結果は図８および９に示した。
【０１１６】
図８ａは、ＰＥＧ化アルギナーゼＩのＡ１６８／３０３−Ｙ４０Ｋの質量分析の結果を示しており、Ａ１６８／３０３−Ｙ４０Ｋの分子量は、およそ７７ｋＤａである。
【０１１７】
図８ｂは、ＰＥＧ化アルギナーゼＩのＡ４５／３０３−Ｙ４０Ｋの質量分析の結果を示しており、Ａ４５／３０３−Ｙ４０Ｋの分子量は、およそ７７ｋＤａである。
【０１１８】
図８ｃに、ＰＥＧ化アルギナーゼＩのＲＰ−Ｖ−Ｊ５Ｋの質量分析の結果を示す。
【０１１９】
図８ｄに、ＰＥＧ化アルギナーゼＩのＲＰ−Ｍ２−Ｊ５Ｋの質量分析の結果を示す。
【０１２０】
図８ｅに、ＰＥＧ化アルギナーゼＩのＲＰ−Ｍ３−Ｊ５Ｋの質量分析の結果を示す。
【０１２１】
図８ｆに、ＰＥＧ化アルギナーゼＩのＲＰ−Ｍ４−Ｊ５Ｋの質量分析の結果を示す。
【０１２２】
図８ｇに、ＰＥＧ化アルギナーゼＩのＲＰ−Ｍ７−Ｊ５Ｋの質量分析の結果を示す。
【０１２３】
図９は、ＰＥＧ化アルギナーゼＩのＲＰ−Ｖ−Ｊ５Ｋ、ＲＰ−Ｍ２−Ｊ５Ｋ、ＲＰ−Ｍ３−Ｊ５Ｋ、ＲＰ−Ｍ４−Ｊ５ＫおよびＲＰ−Ｍ７−Ｊ５Ｋの連結したグラフを示しており、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ５０００を用いたアルギナーゼＩのＰＥＧ化は、分子量範囲６５〜９５ｋＤａの生成物を生成し、すなわち、いずれのアルギナーゼＩ分子も、それぞれ分子量は５０００の６〜１２個のＰＥＧ分子と結合した。
【０１２４】
例８：部位特異的ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩの生体内の薬物動態学的および薬力学的分析
【０１２５】
異なるＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩの薬物動態学的および薬力学的特性は、ＳＰ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）系ラットに対する投与量３ｍｇ／ｋｇの１回の静脈内投与の後で評価する。これらの研究は、ファーマレガシーラボラトリーズ有限会社（上海）で行った。血清アルギナーゼおよびアルギニンの分析のために、血液試料は投与前、投与後２分、１時間、４時間、２４時間、７２時間、１２０時間、１６８時間および２４０時間後に採取した。およそ０．４ｍｌの血液試料は、イソフルランによる麻酔後それぞれの時点における眼窩の静脈を採取し、２ｍｌの遠心管に移した。試料は、４０００ｇ、１５分間、４℃で遠心分離するまで、室温に３０分間放置した。
【０１２６】
アルギナーゼＩの血清濃度は、シャンハイエクセルバイオロジー社製の定量的サンドイッチ酵素免疫測定キッドにより測定した。抗ヒトアルギナーゼＩモノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡプレートのウェルの表面に塗布した。ヒトアルギナーゼＩの試料またはタンパク質標準は、それぞれＥＬＩＳＡプレートのウェルの中に添加し（１００μｌ／ウェル）、密封テープで覆い、３７℃で９０分間培養して、モノクローナル抗体とヒトアルギナーゼＩとの間に免疫複合体が形成されるようにした。培養後、プレートは５回洗浄し、ウェルにウサギ抗ヒトアルギナーゼＩポリクロナール抗体を添加した（１００μｌ／ウェル）。再び密封テープで覆い、さらに３７℃で６０分間培養した。２回目の培養後、再びプレートを５回洗浄し、各ウェルにＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧを添加し（１００μｌ／ウェル）、３０分間共培養した。さらに５回洗浄した後、発色基質をウェルに添加し、暗所で１０〜１５分間培養した。停止液を各ウェルに添加し、よく混合した。４５０ｎｍにおける光学濃度を、停止液を添加後１０分以内に測定した。標準曲線は、回帰方程式における二次的な適切な方法を用いて作成し、各試料のアルギナーゼＩの濃度は、測定したＯＤ値を用いて算出した。ＰＫパラメータは、ウィンノリン（ＷｉｎｎｏＬｉｎ）の無区画分析法を用いて導き出した。さまざまな構造の部位特異的ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩ、Ａ１６８／３０３−Ｙ４０Ｋ、Ａ４５／３０３−Ｙ４０Ｋ、ＲＰ−Ｍ２−Ｊ５Ｋ、ＲＰ−Ｍ３−Ｊ５Ｋ、ＲＰ−Ｍ４−Ｊ５ＫおよびＲＰ−Ｍ７−Ｊ５Ｋの半減期（Ｔ１／２）の値は、それぞれ、２７．２±３．８時間、１５．１±０．６時間、４０．７±１３．２時間、５３．５±１４．２時間、５９．５±９．９時間および５０．５±１３．０時間であった。ＰＥＧ化野生型ヒトアルギナーゼＩのＲＰ−Ｖ−Ｊ５Ｋの半減期（Ｔ１／２）は、４３．８±４．４時間であった。
【０１２７】
表１：ラットにＰＥＧ化ヒトアルギナーゼＩを１回投与したときの薬物動態的パラメータ（平均±標準偏差、ｎ＝６）
【０１２８】
【表１】
2015503912.tif 000004
【０１２９】
血清アルギニン濃度は、ＨＰＬＣ−質量分析（アジレント製、ＡＰＩ４０００の三連四重極ＭＳと組み合わせた１２００ＨＰＬＣ）を用いて測定した。ラット血清の一定分量を４９０μｌの脱イオン水で希釈した。アセトニトリル（３８０μｌ）を添加して、２０μｌの希釈した血清試料と混合した。その混合物を１４，０００ｒｐｍで１４分間遠心分離し、その上澄み液をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにロードし分析した。ＨＰＣＬは、ベヌシル（Ｖｅｎｕｓｉｌ）社製ＨＩＬＩＣ／ＶＨ９５１００２−０カラムで、移動相Ａとして０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂとして９５％アセトニトリルを用いて、流量０．３ｍＬ／分で測定した。血清アルギナーゼ濃度は、投与前、投与後２分、１時間、４時間、２４時間、７２時間、１２０時間、１６８時間および２４０時間後に測定した。結果は、試験試料は異なる方法でＰＥＧ化されているのだが、すべての試験動物における血清アルギニン濃度は、非常に短い時間（５分以内）で検出限界（０．５μｌ／ｍｌ）より低い濃度まで落ち、ある時間内は持続可能な低いアルギニン濃度を維持する。その後、血清アルギニン濃度は徐々に増加するが、その増加率は異なる。ＲＰ−Ｍ２−Ｊ５Ｋ、ＲＰ−Ｍ３−Ｊ５Ｋ、ＲＰ−Ｍ４−Ｊ５Ｋ、またはＲＰ−Ｍ７−Ｊ５Ｋを扱う研究群と比較すると、１６８／３０３−Ｙ４０ＫまたはＡ４５／３０３−Ｙ４０Ｋを扱う研究群は、血清アルギニン濃度はより速く上昇した。投与後７２時間では、１６８／３０３−Ｙ４０ＫまたはＡ４５／３０３−Ｙ４０Ｋを１回投与した動物において、血清アルギニン濃度は、投与前の濃度の１５〜２０％まで回復した。投与後１２０時間では、Ａ４５／３０３−Ｙ４０Ｋを投与した動物において、血清アルギニン濃度は、ほぼ投与前の濃度まで回復した。一方、ＲＰ−Ｍ２−Ｊ５Ｋ、ＲＰ−Ｍ３−Ｊ５Ｋ、ＲＰ−Ｍ４−Ｊ５ＫまたはＲＰ−Ｍ７−Ｊ５Ｋを投与した動物の血清アルギニン濃度は、長時間、持続可能な低い濃度を維持していた。投与後７２時間では、血清アルギニンは、投与前の濃度の５％より低い濃度を維持し続けていた。
【０１３０】
本発明は、高い比活性を有するヒトアルギナーゼを得るために、ヒトアルギナーゼＩの位置４５、１６８および３０３の３つのシステイン残基のうち、１つ、２つまたは全部のいずれかを変異させて、他のアミノ酸、特に、アラニンにする部位特異的変異形成を用いる。本発明におけるヒトアルギナーゼは、潜在的に免疫原性のＨｉｓタグを有するタンパク質配列を含まない。さらに、本発明は、アミン反応性ポリ（エチレングリコール）を用いてＰＥＧ化したヒトアルギナーゼを提供し、リジン表面のＮ末端α−ＮＨ２またはε−ＮＨ２を修飾する。そのような修飾は哺乳動物における半減期を著しく増加させ、ラットの血清では４０〜６０時間とすることができる。
【図１】
2015503912.tif 000005
【図２】
2015503912.tif 000006
【図３】
2015503912.tif 000007
【図４】
2015503912.tif 000008
【図５】
2015503912.tif 000009
【図６ａ】
2015503912.tif 000010
【図６ｂ】
2015503912.tif 000011
【図７】
2015503912.tif 000012
【図８ａ】
2015503912.tif 000013
【図８ｂ】
2015503912.tif 000014
【図８ｃ】
2015503912.tif 000015
【図８ｄ】
2015503912.tif 000016
【図８ｅ】
2015503912.tif 000017
【図８ｆ】
2015503912.tif 000018
【図８ｇ】
2015503912.tif 000019
【図９】
2015503912.tif 000020
【配列表】
2015503912000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年8月28日(2014.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギナーゼであって、
上記アルギナーゼがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むヒトアルギナーゼIであり、
（１）上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置４５、１６８および３０３のシステインのうちいずれか１つ、２つまたは全部がアラニンに変異しており、または、
（２）上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１において１つ以上のアミノ酸の置換、除去、挿入、付加または転置が導入されており、
上記アルギナーゼが活性を有する、アルギナーゼ。
【請求項２】
上記アルギナーゼが少なくともおよそ５００Ｕ／ｍｇの活性を有する、請求項１に記載のアルギナーゼ。
【請求項３】
請求項１に記載の上記アルギナーゼを含むＰＥＧ化アルギナーゼであって、
上記アルギナーゼがＰＥＧ化修飾によりポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合している、ＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項４】
上記ＰＥＧ化アルギナーゼ分子それぞれと結合している上記ＰＥＧ分子の全分子量がおよそ２０〜７０Ｋである、請求項３に記載したＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項５】
上記ＰＥＧ分子がおよそ２〜４０Ｋの平均分子量を有する、請求項３に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項６】
ＰＥＧ化が、ＰＥＧ化試薬を用いてＰＥＧ分子が上記アルギナーゼの半量と共有結合することにより成し遂げられ、
上記ＰＥＧ化試薬がメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルブチラート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルスクシナート（ｍＰＥＧ−ＳＳ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルカーボナート（ｍＰＥＧ−ＳＣ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルグルタラート（ｍＰＥＧ−ＳＧ）、ｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシル−スクシンイミド（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）、ｍＰＥＧ−トレシラートおよびｍＰＥＧ−アルデヒドから選択される、請求項３に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項７】
上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置４５、１６８および３０３の上記システインのうちいずれか１つがアラニンに変異している、
請求項３に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項８】
上記アルギナーゼ分子と結合している上記ＰＥＧ分子がおよそ５Ｋの平均分子量を有し、上記アルギナーゼ分子がそれぞれおよそ６〜１２個のＰＥＧ分子と結合している、請求項７に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項９】
上記ＰＥＧ化アルギナーゼ分子がそれぞれおよそ４〜１３個のＰＥＧ分子と結合している、請求項３に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項１０】
上記ＰＥＧ化アルギナーゼ分子がそれぞれおよそ６〜１２個のＰＥＧ分子と結合している、請求項９に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項１１】
上記ＰＥＧ化アルギナーゼの純度が９０％を超える、請求項３に記載のＰＥＧ化アルギナーゼ。
【請求項１２】
アルギナーゼ関連疾患を治療するための薬剤の調製における請求項３に記載の上記ＰＥＧ化アルギナーゼの使用方法。
【請求項１３】
上記疾患が、高アルギニン血症、アルギニン依存性過形成または腫瘍から選択される、請求項１２に記載の使用方法。
【請求項１４】
請求項３に記載のＰＥＧ化アルギナーゼを含むアルギナーゼ関連疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項１５】
上記疾患が、高アルギニン血症、アルギニン依存性過形成または腫瘍から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2015503912.tif 000021
2015503912.tif 000022
2015503912.tif 000023
2015503912.tif 000024
2015503912.tif 000025
2015503912.tif 000026
2015503912.tif 000027
2015503912.tif 000028
2015503912.tif 000029
2015503912.tif 000030
2015503912.tif 000031
2015503912.tif 000032