(57)【要約】本発明は、配列タグを使用して、関連する配列のアンプリコン、特に大きくて複雑なアンプリコン、例えば、免疫受容体分子をコードする組換え核酸を含むアンプリコンの配列決定を改善することに関する。一態様では、同じ配列タグを有する配列リードが整列させられ、次いで、最終ベースコールが、各位置における配列リードのベースコールからの（重み付けされる場合もある）平均ベースコールから決定される。同様に、別の態様では、一連の取り込みシグナルを含む配列リードが、共通の配列タグによって整列させられて、ホモポリマー領域内のベースコールが、各「流れ」位置における取り込みシグナル値の関数として生成される。
2015519081.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫レパートリのクローン型を決定する方法であって：
（ａ）Ｔ細胞およびＢ細胞の少なくとも一方を含む、個体由来サンプルを得るステップ；（ｂ）前記Ｔ細胞およびＢ細胞の少なくとも一方のＴ細胞受容体遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の組換え核酸分子に配列タグを付着させてタグ−分子コンジュゲートを形成するステップであって、前記タグ−分子コンジュゲートの実質的に全ての分子がユニークな配列タグを有する、ステップ；
（ｃ）前記タグ−分子コンジュゲートを増幅するステップ；
（ｄ）前記タグ−分子コンジュゲートをシークエンシングするステップ；および
（ｅ）同様の配列タグの配列リードを整列させて、前記レパートリの同じクローン型に一致する配列リードを決定するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記整列させるステップが、前記同様の配列タグの前記クローン型の各ヌクレオチド位置における大部分のヌクレオチドを決定することによって、前記タグ−分子コンジュゲートのそれぞれの前記クローン型のそれぞれのヌクレオチド配列を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記付着させるステップが、前記組換え核酸分子をサンプリングによって標識化するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記配列タグが前記組換え核酸分子の濃度の少なくとも１００倍の濃度で反応混合物に存在するように、前記付着させるステップが前記反応混合物で行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記配列タグが、前記組換え核酸分子に特異的なプライマーに取り込まれる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記配列タグがモザイクタグである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
サンプル中のリンパ球の数を決定する方法であって：
（ａ）リンパ球を含む、個体由来サンプルを得るステップ；
（ｂ）前記リンパ球のＴ細胞受容体遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の組換え核酸分子に配列タグを付着させてタグ−分子コンジュゲートを形成するステップであって、前記タグ−分子コンジュゲートの実質的に全ての分子がユニークな配列タグを有する、ステップ；
（ｃ）前記タグ−分子コンジュゲートを増幅するステップ；
（ｄ）前記タグ−分子コンジュゲートをシークエンシングするステップ；
（ｅ）異なる配列タグの数を計数して前記サンプル中の前記リンパ球の数を決定するステップを含む、方法。
【請求項８】
前記組換え核酸がＤＮＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記リンパ球がＴ細胞であり、前記組換え核酸が、Ｔ細胞受容体遺伝子またはその断片である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記リンパ球がＢ細胞であり、前記組換え核酸が、免疫グロブリン遺伝子またはその断片である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
免疫レパートリのクローン型を決定する方法であって：
（ａ）Ｔ細胞およびＢ細胞の少なくとも一方を含む、個体由来サンプルを得るステップ；（ｂ）前記Ｔ細胞およびＢ細胞の少なくとも一方からの分子をサンプリングによって標識化してタグ−分子コンジュゲートを形成するステップであって、各タグが配列を有し、前記各分子が、Ｔ細胞受容体遺伝子または免疫グロブリン遺伝子からの組換え核酸を含む、ステップ；
（ｃ）前記タグ−分子コンジュゲートをシークエンシングするステップ；
（ｄ）同様のタグの配列リードを整列させて、同様のクローン型を決定するステップを含む、方法。
【請求項１２】
前記整列させるステップが、前記同様の配列タグの前記クローン型の各ヌクレオチド位置における大部分のヌクレオチドを決定することによって、前記タグ−分子コンジュゲートのそれぞれの前記クローン型のそれぞれのヌクレオチド配列を決定するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記配列タグが前記組換え核酸分子の濃度の少なくとも１００倍の濃度で反応混合物に存在するように、前記付着させるステップが前記反応混合物で行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
微小残留病変について監視される患者におけるクローン型の持越し汚染を検出する方法であって：
（ａ）請求項１に記載の方法に従って、患者のクローン型プロファイルを定期的に測定することによって前記患者を微小残留病変について監視するステップ；および
（ｂ）クローン型プロファイルの各測定の前記配列タグのそれぞれの前記配列を記録するステップ；および
（ｃ）任意の前のクローン型プロファイルの配列タグが後のクローン型プロファイルで検出された場合にクローン型の持越し汚染を検出するステップを含む、方法。
【請求項１５】
１つ以上の合成反応によるシークエンシングにおいて１つ以上のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって：
（ａ）配列タグを前記１つ以上のポリヌクレオチドのそれぞれに付着させてタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートを形成するステップであって、前記タグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートの実質的に全てのポリヌクレオチドがユニークな配列タグを有する、ステップ；
（ｂ）前記タグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートを増幅するステップ；
（ｃ）前記増幅されたタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートを合成によってシークエンシングするステップであって、少なくとも１つのｄＮＴＰの流れを含む、ステップ；および
（ｄ）同じ配列タグを有するタグとポリヌクレオチドのそれぞれについて、各ｄＮＴＰの流れに対するヌクレオチドの取り込み数を、このような各ｄＮＴＰの流れに対して測定された取り込みシグナルの関数として決定するステップを含む、方法。
【請求項１６】
前記１つ以上のポリヌクレオチドが複数のポリヌクレオチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数が少なくとも１０４である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｄＮＴＰの流れのそれぞれについての前記ヌクレオチドの取り込み数が、前記測定された取り込みシグナルの平均に最も近い整数である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記合成によるシークエンシングのステップが：
（ａ）前記タグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートのそれぞれに対して、シークエンシングプライマー、核酸ポリメラーゼ、およびタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートを含む複合体を、前記シークエンシングプライマーのこのようなタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートに対するアニーリングを可能にし、かつこのようなシークエンシングプライマーの、ヌクレオシド三リン酸の存在下での前記核酸ポリメラーゼによる前記タグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートに沿った伸長を可能にする条件下で形成するステップ；
（ｂ）ｄＮＴＰをｄＮＴＰの流れによって前記複合体に導入するステップ；
（ｃ）取り込みシグナルを測定するステップ；
（ｄ）前記複合体を洗浄するステップ；および
（ｅ）前記ステップ（ｂ）から前記ステップ（ｄ）を繰り返すステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｄＮＴＰが、伸長ブロックｄＮＴＰであり、前記洗浄するステップが、続く導入するステップで、さらなる伸長ブロックｄＮＴＰが取り込まれ得るように、取り込まれた伸長ブロックｄＮＴＰのブロックを解除するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
異なるタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートがそれぞれ、異なる反応区画にある、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記付着させるステップが、前記１つ以上のポリヌクレオチドをサンプリングによって標識化して前記タグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートを形成するステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記配列タグが、１〜５ヌクレオチドの範囲の長さの可変領域を有するモザイクタグである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記配列タグが、各交互領域が１〜５ヌクレオチドの範囲の長さを有するように、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴの互いに素なサブセットから選択されるヌクレオチドを有する交互領域を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記シークエンシングするステップが、前記増幅されたタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートのサンプルをシークエンシングするステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、Ｔ細胞受容体遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の組み換え核酸分子である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列タグを用いた配列決定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的サンプルまたは医学的サンプルの分析は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの大きくて複雑な集団の核酸配列の決定を必要とする場合が多い。例えば、（非特許文献１）；（非特許文献２）；（非特許文献３）。特に、免疫分子、例えば、Ｔ細胞受容体もしくはＢ細胞受容体、または他の成分をコードする核酸のプロファイルは、生物の健康もしくは疾患の状態についての豊富な情報を含むため、このようなプロファイルの診断指標もしくは予後指標としての使用が様々な状態に対して提案されてきた。例えば、（特許文献１）；（非特許文献４）；（非特許文献５）；（非特許文献６）。このような配列ベースのプロファイルは、増幅された標的核酸のサイズ分布、マイクロアレイによる逐次サンプリング、ＰＣＲアンプリコンからのハイブリダイゼーション反応速度曲線に基づいたアプローチ、または他のアプローチよりも格段に高い感度を有し得る。例えば、（特許文献２）；（非特許文献７）；（非特許文献８）；（非特許文献９）；（非特許文献１０）。しかしながら、配列データからのクローン型およびクローン型プロファイルの効率的な決定は、分析される集団のサイズ、このような集団における配列の類似性、配列間の自然の多様性の限定された予測可能性、ならびに宿主のサンプルの調製ステップおよび測定ステップによるノイズのデータへの混入のため困難を伴う。例えば、（非特許文献１１）。
【０００３】
配列タグまたはバーコードは、標識化、汚染の監視、稀な突然変異の検出、物理的分類、および分子の計数などを含む核酸集団の分析に役立てるために様々な方法で使用されている。例えば、（非特許文献１２）；（特許文献３）；（特許文献４）；（特許文献５）；（非特許文献１３）；（特許文献６）；（非特許文献１４）；（特許文献７）；（特許文献８）。近年、（非特許文献１２）（前掲）は、シークエンシングエラーおよび増幅エラーと基準配列における稀な突然変異とを区別するために配列タグをどのように使用できるかを示した。
【０００４】
医学的適用および診断的適用における正確なシークエンシングの重要性から、このような適用における配列決定の効率および精度を高めるために配列タグの使用を拡大できると非常に有利であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ファハム（Ｆａｈａｍ）およびウィリス（Ｗｉｌｌｉｓ）による米国特許出願公開第２０１０／０１５１４７１号明細書
【特許文献２】モーレイ（Ｍｏｒｌｅｙ）らによる米国特許第５，４１８，１３４号明細書
【特許文献３】カスボン（Ｃａｓｂｏｎ）らによる米国特許出願公開第２０１２／００７１３３１号明細書
【特許文献４】ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）による米国特許第５，６３５，４００号明細書
【特許文献５】ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）およびマチェビッツ（Ｍａｃｅｖｉｃｚ）による米国特許第７，５３７，８９７号明細書
【特許文献６】チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）らによる欧州特許第０３０３４５９号明細書
【特許文献７】モーリス（Ｍｏｒｒｉｓ）らによる欧州特許出願公開第０７９９８９７Ａ１号明細書
【特許文献８】ワレス（Ｗａｌｌａｃｅ）による米国特許第５，９８１，１７９号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】グロアー（Ｇｌｏｏｒ）ら著、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、２０１０年、第５巻、第１０号、ｅｌ５４０６
【非特許文献２】ペトロシノ（Ｐｅｔｒｏｓｉｎｏ）ら著、クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００９年、第５５巻、第５号、ｐ．８５６〜８６６
【非特許文献３】アスティラ（Ａｒｓｔｉｌａ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９９年、第２８６巻、ｐ．９５８〜９６１
【非特許文献４】フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）ら著、ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００９年、第１９巻、ｐ．１８１７〜１８２４
【非特許文献５】ボイド（Ｂｏｙｄ）ら著、サイエンス・トランスレーショナル・メディスン（Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．）、２００９年、第１巻、第１２号、１２ｒａ２３
【非特許文献６】ヒ（Ｈｅ）ら著、オンコターゲット（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ）（２０１１年３月８日）
【非特許文献７】ファン・ドンゲン（ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ）ら著、ルーキミア（Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、２００３年、第１７巻、ｐ．２２５７〜２３１７
【非特許文献８】オグル（Ｏｇｌｅ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３年、第３１巻、ｐ．ｅｌ３９
【非特許文献９】ワン（Ｗａｎｇ）ら著、ＢＭＣゲノミクス（ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、２００７年、第８巻、ｐ．３２９
【非特許文献１０】ボーム（Ｂａｕｍ）ら著、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２００６年、第３巻、第１１号、ｐ．８９５〜９０１
【非特許文献１１】ワーレン（Ｗａｒｒｅｎ）ら著、ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１１年、第２１巻、第５号、ｐ．７９０〜７９７
【非特許文献１２】キンデ（Ｋｉｎｄｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、２０１１年、第１０８巻、第２３号、ｐ．９５３０〜９５３５
【非特許文献１３】ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）ら著、国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、２０００年、第９７巻、ｐ．１６６５〜１６７０
【非特許文献１４】シューメーカ（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ）ら著、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、１９９６年、第１４巻、ｐ．４５０〜４５６
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】サンプリングによってユニークな配列タグを核酸分子に付着させる標識化の例を例示している。
【図１Ｂ】サンプリングによってユニークな配列タグを核酸分子に付着させる標識化の例を例示している。
【図１Ｃ】ＩｇＨ転写物およびこのＩｇＨ転写物内の自然の多様性の原因を例示している。
【図２Ａ】組換え核酸分子を増幅するための２段階ＰＣＲスキームを示している。
【図２Ｂ】組換え核酸分子を増幅するための２段階ＰＣＲスキームを示している。
【図２Ｃ】組換え核酸分子を増幅するための２段階ＰＣＲスキームを示している。
【図３】同じ配列タグに関連する配列リードからクローン型の配列を決定するステップの１つの実施を例示している。
【図４Ａ】合成操作によるシークエンシングでのホモポリマー領域の決定に関する本発明の一実施形態を例示している。
【図４Ｂ】合成操作によるシークエンシングでのホモポリマー領域の決定に関する本発明の一実施形態を例示している。
【図４Ｃ】合成操作によるシークエンシングでのホモポリマー領域の決定に関する本発明の一実施形態を例示している。
【図４Ｄ】合成操作によるシークエンシングでのホモポリマー領域の決定に関する本発明の一実施形態を例示している。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、複雑な核酸集団、特に免疫分子のレパートリまたはその一部をコードする組換え核酸集団の配列ベースのプロファイルを作成する方法に関する。本発明は、一部が以下で概説される多数の実施および適用例、ならびに本出願全体で例示される。
【０００９】
一態様では、本発明は、次のステップを含む、免疫レパートリのクローン型を決定する方法に関する：（ａ）Ｔ細胞およびＢ細胞の少なくとも一方を含む個体由来サンプルを得るステップ；（ｂ）Ｔ細胞およびＢ細胞の少なくとも一方のＴ細胞受容体遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の組換え核酸分子に配列タグを付着させてタグ−分子コンジュゲートを形成するステップであって、タグ−分子コンジュゲートの実質的に全ての分子がユニークな配列タグを有する、ステップ；（ｃ）タグ−分子コンジュゲートを増幅するステップ；（ｄ）タグ−分子コンジュゲートをシークエンシングするステップ；および（ｅ）同様の配列タグの配列リードを整列させて、レパートリの同じクローン型に一致する配列リードを決定するステップ。
【００１０】
別の態様では、本発明は、次のステップを含む、微小残留病変について監視される患者におけるクローン型の持越し汚染を検出する方法に関する：（ａ）請求項Ａ１に記載の方法に従って、患者のクローン型プロファイルを定期的に測定することによって患者を微小残留病変について監視するステップ；（ｂ）クローン型プロファイルの各測定の前記配列タグを記録するステップ；および（ｃ）任意の前のクローン型プロファイルの配列タグが後のクローン型プロファイルで検出された場合にクローン型の持越し汚染を検出するステップ。
【００１１】
別の態様では、本発明は、次のステップを含む、サンプル中のリンパ球の数を決定する方法に関する：（ａ）リンパ球を含む個体由来サンプルを得るステップ；（ｂ）リンパ球のＴ細胞受容体遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の組換え核酸分子に配列タグを付着させてタグ−分子コンジュゲートを形成するステップであって、タグ−分子コンジュゲートの実質的に全ての分子がユニークな配列タグを有する、ステップ；（ｃ）タグ−分子コンジュゲートを増幅するステップ；（ｄ）タグ−分子コンジュゲートをシークエンシングするステップ；（ｅ）異なる配列タグの数を計数してサンプル中のリンパ球の数を決定するステップ。
【００１２】
別の態様では、本発明は、次のステップを含む、１つ以上の合成反応によるシークエンシングにおいて１つ以上のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法に関する：（ａ）配列タグを１つ以上のポリヌクレオチドのそれぞれに付着させてタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートを形成するステップであって、タグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートの実質的に全てのポリヌクレオチドがユニークな配列タグを有する、ステップ；（ｂ）タグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートを増幅するステップ；（ｃ）増幅されたタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートを合成によってシークエンシングするステップであっ
て、少なくとも１つのｄＮＴＰの流れを含む、ステップ；および（ｄ）同じ配列タグを有するタグとポリヌクレオチドのそれぞれについて、各ｄＮＴＰの流れに対するヌクレオチドの取り込み数を、このような各ｄＮＴＰの流れに対して測定された取り込みシグナルの関数として決定するステップ。
【００１３】
本発明は、免疫分子をコードする体細胞的に組み換えられた核酸の高スループットシークエンシングによって得られる配列データの大きいセットからクローン型およびクローン型プロファイルを決定する方法を提供する。一態様では、本発明は、サンプル中の体細胞的に組み換えられた核酸分子のそれぞれをユニークな配列タグで標識し、これを使用してサンプルの同じクローン型配列のコピーを含む配列リードを分類することによって、上記の方法を実施する。
【００１４】
本発明のこれらの上記特徴付けられた態様および他の態様は、一部が図面に示され、添付の特許請求の範囲によって特徴付けられた多数の例示的な実施および適用例で例示される。しかしながら、上記の概要は、本発明の各例示された実施形態または全ての実施を説明することを意図するものではない。
【００１５】
本発明の新規な特徴は、特に添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の原理が利用される、例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば、本発明の特徴および利点のより良い理解が得られる。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、特段の記載がない限り、当業者の技術の範囲内である、分子生物学（組み換え技術を含む）、バイオインフォマティクス、細胞生物学、および生物化学の従来の技術および記述を利用することができる。このような従来の技術としては、限定されるものではないが、血液細胞のサンプリングおよび分析、ならびに核酸のシークエンシングおよび分析などが挙げられる。適切な技術の特定の例示では、以下の例を参照しなければならないことがある。しかしながら、他の同等の従来の手順も、もちろん使用することができる。このような従来の技術および記述は、標準的な実習マニュアル、例えば、ゲノム解析（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）：実習マニュアルシリーズ（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ）（第Ｉ巻〜第ＩＶ巻）；ＰＣＲプライマー（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ）：実習マニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）；および分子クローニング：実習マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実習マニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（全て、コールド・スプリング・ハーバ研究所の出版局（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）から）などで確認することができる。
【００１７】
一態様では、本発明は、免疫分子のレパートリ、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）もしくはＢ細胞受容体（ＢＣＲ：Ｂ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）またはそれらの定義された断片から配列データを得て分析して、クローン型プロファイルを迅速かつ効率的に決定する方法に関する。配列データは、典型的には、免疫分子を分析するために使用されるＤＮＡシーケンサからの多数の配列リード、即ち、ベースコールの配列および関連する品質スコアを含む。クローン型プロファイルを作成する上での大きな課題は、真の差異を含む配列リードと、非生物学的起源由来のエラー、例えば、抽出ステップ、シークエンシング化学、または増幅化学などに由来のエラーを含む配列リードとを迅速かつ正確に区別することである。本発明の一態様は、サンプル中の各クローン型にユニークな配列タグを付着させて、このようなコンジュゲートの配列リードが同じ起源のクローン型に由来するか否かの決定に役立てることを含む。本発明の一態様によると、配列タグを、体細胞的に組み換えられた核酸分子に付着させてタグ−分子コンジュゲートを形成し、このようなコンジュゲートの各組換え核酸は、ユニークな配列タグを有
する。通常、このような付着は、核酸分子がＴ細胞およびＢ細胞の少なくとも一方を含むサンプルから抽出されてから行われる。好ましくは、このようなユニークな配列タグは、互いに可能な限り大きく異なり、この差異は、従来の配列の距離指標、例えば、ハミング距離などによって決定される。たとえシークエンシングエラーおよび増幅エラーが高率でも、タグ−分子コンジュゲートの配列タグ間の距離を最大にすることにより、コンジュゲートの配列タグが、異なるコンジュゲートの他のタグ配列よりも、祖先のタグ配列に遥かに近いままである。例えば、１６−ｍｅｒの配列タグが利用され、クローン型のセットに対するこのような各タグが、そのクローン型のどの配列タグからも少なくとも５０％、または８ヌクレオチドのハミング距離を有する場合は、１つのこのようなタグを、配列タグのミスリード（ｍｉｓ−ｒｅａｄ）（および、クローン型の配列リードの誤った配列タグでの不正確な分類）によって別のタグに変換するには、少なくとも８つのシークエンシングエラーまたは増幅エラーが必要であろう。一実施形態では、配列タグは、組換え核酸分子に付着させてタグ−分子コンジュゲートを形成した後に、タグ−分子コンジュゲートのタグ間のハミング距離が、このような配列タグの全長の少なくとも２５％の数値となる（即ち、各配列タグは、このような他のどのタグの配列ともヌクレオチドが少なくとも２５％異なる）ように選択され；別の実施形態では、このような配列タグ間のハミング距離は、このような配列タグの全長の少なくとも５０％の数値である。
【００１８】
一態様では、本発明は、次のステップによって実施される：（ａ）Ｔ細胞およびＢ細胞の少なくとも一方を含む個体由来サンプルを得るステップ；（ｂ）Ｔ細胞およびＢ細胞の少なくとも一方のＴ細胞受容体遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の組換え核酸分子に配列タグを付着させてタグ−分子コンジュゲートを形成するステップであって、このタグ−分子コンジュゲートの実質的に全ての分子がユニークな配列タグを有する、ステップ；（ｃ）タグ−分子コンジュゲートを増幅するステップ；（ｄ）タグ−分子コンジュゲートをシークエンシングするステップ；および（ｅ）同様の配列タグの配列リードを整列させて、同じクローン型のレパートリに対応する配列リードを決定するステップ。Ｂ細胞またはＴ細胞を含むサンプルは、以下により十分に説明される従来の技術を用いて得られる。配列タグを付着させるステップでは、好ましくは、配列タグは、単にユニークであるだけではなく、たとえ多数のシークエンシングエラーまたは増幅エラーがあったとしても１つの配列タグを別の配列タグに変換する可能性がほぼゼロであるように互いに十分異なっている。配列タグを付着させた後に、タグ−分子コンジュゲートの増幅が、ほとんどのシークエンシング技術には必要である；しかしながら、１分子シークエンシング技術が利用される場合は常に、増幅ステップは任意選択的である。１分子シークエンシング技術としては、限定されるものではないが、１分子リアルタイム（ＳＭＲＴ：ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）シークエンシング、またはナノ細孔シークエンシングなどが挙げられる。例えば、米国特許第７，３１３，３０８号明細書；同第８，１５３，３７５号明細書；同第７，９０７，８００号明細書；同第７，９６０，１１６号明細書；同第８，１３７，５６９号明細書；およびマンラオ（Ｍａｎｒａｏ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２０１２年、第４巻、第８号、ｐ．２６８５〜２６９３など。
【００１９】
別の態様では、本発明は、ユニークな配列タグを計数することによってサンプル中のリンパ球の数を決定する方法を含む。たとえ配列タグがなくても、ＴＣＲβまたはＩｇＨ遺伝子のクローン型、特にＶ（Ｄ）Ｊ領域を含むクローン型では、リンパ球およびそのクローンがユニークなマーカとなる。組換え核酸がゲノムＤＮＡから得られる場合は常に、サンプル中のリンパ球の数を、シークエンシング後に計数されるユニークなクローン型の数によって推定することができる。このアプローチは、同じクローン型に関連した同一のリンパ球のかなりのクローン集団が存在する場合（または、組換え核酸が、サンプルのｍＲＮＡから得られ、その個々の配列の量が、発現率および細胞数に反映し得る、または発現率および細胞数に依存し得る場合）は常に機能しない。配列タグの使用は、この欠点を克
服し、多くのリンパ障害、例えば、リンパ腫または白血病に罹患している患者のリンパ球の数を得るのに特に有用である。本発明の一態様によると、配列タグを使用して、例えば、白血病でのように大きい優勢クローンが存在するしないにかかわらず、サンプル中のリンパ球の絶対数を得ることができる。このような方法は、次のステップで実施することができる：（ａ）リンパ球を含む個体由来サンプルを得るステップ；（ｂ）リンパ球のＴ細胞受容体遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の組換え核酸分子に配列タグを付着させてタグ−分子コンジュゲートを形成するステップであって、タグ−分子コンジュゲートの実質的に全ての分子がユニークな配列タグを有する、ステップ；（ｃ）タグ−分子コンジュゲートを増幅するステップ；（ｄ）タグ−分子コンジュゲートをシークエンシングするステップ；および（ｅ）異なる配列タグの数を計数してサンプル中のリンパ球の数を決定するステップ。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、ゲノムＤＮＡ由来である。
【００２０】
本発明の一実施形態では、例えば、参照により本明細書に組み入れられるブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）らによる米国特許第５，８４６，７１９号明細書；ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）らによる米国特許第７，５３７，８９７号明細書；およびマチェビッツ（Ｍａｃｅｖｉｃｚ）による国際公開第２００５／１１１２４２号などに開示されているように、配列タグが、サンプリングによる標識化によってサンプルの組換え核酸分子に付着される。サンプリングによる標識化では、標識化されるべき（またはユニークにタグが付けられるべき）ポリヌクレオチドの集団は、より大きい集団の配列タグを（付着または連結などによって）サンプリングするために使用される。即ち、ポリヌクレオチドの集団がＫメンバー（同じポリヌクレオチドの複製を含む）を有し、かつ配列タグの集団がＮメンバーを有する場合は、Ｎ＞＞Ｋである。一実施形態では、本発明に使用される配列タグの集団のサイズは、サンプル中のクローン型の集団のサイズの少なくとも１０倍であり；別の実施形態では、本発明に使用される配列タグの集団のサイズは、サンプル中のクローン型の集団のサイズの少なくとも１００倍であり；別の実施形態では、本発明に使用される配列タグの集団のサイズは、サンプル中のクローン型の集団のサイズの少なくとも１０００倍である。他の実施形態では、配列タグの集団のサイズは、サンプル中の実質的に全てのクローン型が、このようなクローン型が、例えば、付着反応、例えば、ライゲーション反応または増幅反応でこのような配列タグの集団に結合されると必ず、ユニークな配列タグを有するように選択される。一部の実施形態では、実質的に全てのクローン型とは、このようなクローン型の少なくとも９０％がユニークな配列タグを有することを意味し；他の実施形態では、実質的に全てのクローン型とは、このようなクローン型の少なくとも９９％がユニークな配列タグを有することを意味し；他の実施形態では、実質的に全てのクローン型とは、このようなクローン型の少なくとも９９．９％がユニークな配列タグを有することを意味する。多くの組織サンプルまたは生検では、Ｔ細胞またはＢ細胞の数は、最大１００万または約１００万の細胞であり得；従って、このようなサンプルを利用する本発明の一部の実施形態では、サンプリングによる標識化に利用されるユニークな配列タグの数は、少なくとも１０８であり、他の実施形態では、少なくとも１０９である。
【００２１】
最大１００万のクローン型がサンプリングによって標識化されるこのような実施形態では、配列タグの多くのセットを、例えば、参照により本明細書に組み入れられるチャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）による米国特許第５，１４９，６２５号明細書に開示されているように、合成反応の各追加のステップで４つ全てのヌクレオチド前駆体の混合物を反応させることにより、コンビナトリアル合成によって効率的に作製することができる。その結果、「Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｋ」の構造を有する配列タグのセットが得られ、各Ｎｉ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴであり、ｋは、タグ中のヌクレオチドの数である。このようなコンビナトリアル合成によって作製される配列タグのセットにおける配列タグの数は４ｋである。従って、ｋが少なくとも１４またはｋが１４〜１８の範囲であるこのような配列タグのセットは、サンプリングによる標識化によって配列タグを分子の１０６のメンバーの集団に付着させるのに適している。上記の構造を有する配列タグのセットは、本発明の方法の実施中に困
難またはエラーをもたらし得る多数の配列を含む。例えば、上記のコンビナトリアル合成された配列タグのセットは、一部のシークエンシングアプローチ、例えば、合成によるシークエンシングアプローチが特定の長さを超えると高精度での決定が困難となる、ホモポリマーセグメントを有する多数のメンバーのタグを含む。従って、本発明は、特定の方法のステップ、例えば、シークエンシングに効率的な構造を有するコンビナトリアル合成された配列を含む。例えば、合成によるシークエンシング化学に効率的ないくつかの配列タグ構造は、４つの天然ヌクレオチドを、コンビナトリアル合成で代替的に使用される互いに素なサブセットに分割することによって作製し、これにより、所与の長さを超えるポリマーセグメントを防止することができる。例えば、ｚをＡまたはＣとし、かつｘをＧまたはＴとして、次の配列タグ構造が得られ
［（ｚ）１（ｚ）２．．．（ｚ）ｉ］［（ｘ）１（ｘ）２．．．（ｘ）ｊ］．．．
式中、ｉおよびｊは、同じでも異なっても良く、任意のホモポリマーセグメントのサイズを制限するために選択される。一実施形態では、ｉおよびｊは、１〜６の範囲である。このような実施形態では、配列タグは、１２〜３６ヌクレオチドの範囲の長さを有し得；他の実施形態では、このような配列タグは、１２〜２４ヌクレオチドの範囲の長さを有し得る。他の実施形態では、ヌクレオチドの他の対を使用することができ、例えば、ｚはＡもしくはＴであり、ｘはＧもしくはＣであり；または、ｚはＡもしくはＧであり、ｘはＴもしくはＣである。あるいは、ｚ’を、４つの天然ヌクレオチドの３つの任意の組み合わせとし、ｘ’を、ヌクレオチドがｚ’のヌクレオチドではないようにする（例えば、ｚ’がＡ、Ｃ、またはＧであり、ｘ’がＴである）。これにより、次の配列タグ構造が得られる：
［（ｚ’）１（ｚ’）２．．．（ｚ’）ｉ］ｘ’［（ｚ’）１（ｚ’）２．．．（ｚ’）ｉ］ｘ’．．．
式中、ｉは、上記のように選択され、ｘ’の存在は、あらゆる望ましくないホモポリマーを終了させる中断として機能する。
【００２２】
さらなる配列タグ
本発明は、増幅およびシークエンシングの前に、「モザイクタグ」を含み得るユニークな配列タグを用いて核酸、例えば、ゲノムＤＮＡの断片を標識化する方法を使用する。このような配列タグは、増幅エラーおよびシークエンシングエラーの識別に有用である。モザイクタグは、従来技術の完全にランダムな配列タグで起こり得る、不適切なアニーリング、プライミング、またはヘアピン形成などによるシーケンシングアーチファクトおよび増幅アーチファクトを最小限にする。一態様では、モザイクタグは、交互する定常領域と可変領域を有する配列タグであり、各定常領域は、モザイクタグにおける位置を有し、かつ所定のヌクレオチド配列を含み、各可変領域は、モザイクタグにおける位置を有し、かつ所定数のランダムに選択されたヌクレオチドを含む。単なる例示として、２２−ｍｅｒのモザイクタグ（配列番号４）は、次の形を有し得る。
ヌクレオチド位置：
【００２３】
【化１】
2015519081.tif 000003
領域位置
９つの定常領域および可変領域が存在し、領域１（ヌクレオチド１〜３）、領域３（ヌクレオチド９）、領域５（ヌクレオチド１２〜１４）、領域７（ヌクレオチド１８〜１９
）、および領域９（ヌクレオチド２１〜２２）が可変であり（２本の下線が引かれたヌクレオチド）、領域２（ヌクレオチド４〜８）、領域４（ヌクレオチド１０〜１１）、領域６（ヌクレオチド１５〜１７）、および領域８（ヌクレオチド２０）が定常である。Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのセットからランダムに選択されたヌクレオチドを表し；従って、この例のモザイクタグの数は、４１１＝４，１９４，３０４のタグである。ｂは、指定位置での所定のヌクレオチドを表す。一部の実施形態では、ｂの配列、「＊＊＊ｂｂｂｂｂ＊ｂｂ＊＊＊ｂｂｂ＊＊ｂ＊＊」は、サンプルを構成する生物のゲノムで完全な一致を有する可能性を最小限にするように選択される。
【００２４】
一態様では、本発明の方法の特定の実施形態のモザイクタグでは、同じ位置を有する全ての定常領域は同じ長さを有し、同じ位置を有する全ての可変領域は同じ長さを有する。これにより、従来の化学および器具を用いて、部分コンビナトリアル合成によりモザイクタグを合成することができる。
【００２５】
一態様では、モザイクタグは、１０〜１００ヌクレオチド、１２〜８０ヌクレオチド、または１５〜６０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、モザイクタグは、ランダムに選択されたヌクレオチドを有する少なくとも８つのヌクレオチド位置を含み；他の実施形態では、モザイクタグが、少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する場合は常に、これらのモザイクタグは、ランダムに選択されたヌクレオチドを有する少なくとも１２ヌクレオチド位置を含む。別の態様では、モザイクタグ内の非可変領域は、７ヌクレオチドよりも長い長さを有し得る。
【００２６】
別の態様では、モザイクタグは、次のステップで使用することができる：（ｉ）サンプル中の核酸からＤＮＡ鋳型を調製するステップ；（ｉｉ）ＤＮＡ鋳型をサンプリングによって標識化して多数のタグ−鋳型コンジュゲートを形成するステップであって、タグ−鋳型コンジュゲートの実質的に全てのＤＮＡ鋳型が、交互する定常領域と可変領域を含むユニークなモザイクタグを有し、各定常領域が、同じ位置を有する定常領域が同じ長さを有するように、モザイクタグにおける位置および所定の配列の１〜１０ヌクレオチドの長さを有し、かつ各可変領域が、同じ位置を有する可変領域が同じ長さを有するように、モザイクタグにおける位置および１〜１０のランダムに選択されたヌクレオチドの長さを有する、ステップ；（ｉｉｉ）多数のタグ−鋳型コンジュゲートを増幅するステップ；（ｉｖ）増幅されたタグ−鋳型コンジュゲートのそれぞれに対して複数の配列リードを形成するステップ；および（ｖ）同一のモザイクタグを有する複数の配列リードのそれぞれの各ヌクレオチド位置におけるコンセンサスヌクレオチドを決定することによって、各核酸のヌクレオチド配列を決定するステップ。別の態様では、モザイクタグは、次のステップに使用することができる：（ａ）サンプル中の核酸から一本鎖ＤＮＡ鋳型を調製するステップ；（ｂ）一本鎖ＤＮＡ鋳型をサンプリングによって標識化してタグ−鋳型コンジュゲートを形成するステップであって、タグ−鋳型コンジュゲートの実質的に全ての一本鎖ＤＮＡ鋳型が、少なくとも１５ヌクレオチドの長さおよび次の形を有するユニークな配列タグ（即ち、モザイクタグ）を有し：
［（Ｎ１Ｎ２．．．ＮＫｊ）（ｂ１ｂ２．．．ｂＬｊ）］Ｍ
式中、各Ｎｉは、ｉ＝１、２、．．．Ｋｊで、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴからなる群からランダムに選択されたヌクレオチドであり；Ｋｊは、各ｊがＭ以下の場合は１〜１０の範囲の整数であり（即ち、領域Ｎ１Ｎ２．．．ＮＫｊが可変領域）；ｉ＝１、２、．．．Ｌｊである各ｂｉはヌクレオチドであり；Ｌｊは、各ｊがＭ以下の場合は１〜１０の範囲の整数であり；従って、全ての配列タグが、（ｉ）全てのｊに対して同じＫｊを有し、かつ（ｉｉ）全てのｊに対して同じ配列ｂ１ｂ２．．．ｂＬｊを有し（即ち、領域ｂ１ｂ２．．．ｂＬｊが定常領域である）；そしてＭが２以上の整数である、ステップ；（ｃ）タグ−鋳型コンジュゲートを増幅するステップ；（ｄ）増幅されたタグ−鋳型コンジュゲートのそれぞれに対して複数の配列リードを形成するステップ；および（ｅ）同一の配列タグを有
する複数の配列リードのそれぞれの各ヌクレオチド位置におけるコンセンサスヌクレオチドを決定することによって、核酸のそれぞれのヌクレオチド配列を決定するステップ。一部の実施形態では、複数の配列リードは、少なくとも１０４であり；他の実施形態では、複数の配列リードは、少なくとも１０５であり；なお他の実施形態では、複数の配列リードは、少なくとも１０６である。一部の実施形態では、上記の配列タグの全長は、１５〜８０ヌクレオチドの範囲である。
【００２７】
様々な付着反応を使用して、ユニークなタグをサンプル中の実質的に全てのクローン型に付着させることができる。一実施形態では、このような付着は、組換え核酸分子（クローン型配列を含む）を含むサンプルを配列タグの集団またはライブラリと混合することにより、分子の２つの集団の分子のメンバーがランダムに組み合わせられて、例えば、共有結合によって結合または連結されることによって達成される。このようなタグ付着反応では、クローン型配列は、線状の一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドを含み、配列タグは、試薬、例えば、増幅プライマー、例えば、ＰＣＲプライマー、ライゲーションアダプター、環状化可能なプローブ、またはプラスミドなどによって保持される。配列タグ集団を保持できるいくつかのこのような試薬は、参照により本明細書に組み入れられる、マチェビッツ（Ｍａｃｅｖｉｃｚ）による米国特許第８，１３７，９３６号明細書；ファハム（Ｆａｈａｍ）らによる米国特許第７，８６２，９９９号明細書；ランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）らによる米国特許第８，０５３，１８８号明細書；ウンラウ（Ｕｎｒａｕ）およびデウガウ（Ｄｅｕｇａｕ）著、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１９９４年、第１４５巻、ｐ．１６３〜１６９；チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）による米国特許第号５，１４９，６２５号明細書に開示されている。
【００２８】
図１Ａおよび図１Ｂは、配列タグ（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３．．．Ｔｊ、Ｔｊ＋１．．．Ｔｋ、Ｔｋ＋１．．．Ｔｎ−１、Ｔｎ）の集団がプライマー（１００）に取り込まれるＰＣＲを含む付着反応を例示している。配列タグの集団は、組換え核酸分子（１０２）のサイズよりも遥かに大きいサイズを有する。配列タグは、ＰＣＲの最初のサイクルでプライマーを核酸分子にアニーリングして、プライマーをＤＮＡポリメラーゼで伸長させることによって組換え核酸分子に付着される。この図は、組換え核酸分子が、例えば、Ｖ領域（１０８）にある、それらの共通のプライマー結合領域（１０４）によってプライマーにランダムにアニーリングすることにより、配列タグの全集団のほんの一部をどのように選択するか、またはサンプリングするかを示している。プライマー（従って配列タグ）が、組換え核酸配列分子にランダムに結合するため、同じ配列タグが異なる核酸分子に付着し得る可能性は少し存在する；しかしながら、配列タグの集団が、本明細書で教示されるように大きいと、このような可能性は、無視できるほど小さいため、実質的に全ての組換え核酸分子が、付着されたユニークな配列タグを有する。順方向と逆方向のプライマー対の他方のプライマー（１０６）が、Ｃ領域（１１０）にアニーリングするため、アニーリング、伸長、および融解の複数のサイクルの後に、アンプリコン（１１２）が形成され、従って、ユニークな配列タグが、クローン型の集団（１０２）を含むＶ（Ｄ）Ｊ領域に付着する。即ち、アンプリコン（１１２）は、付着反応から得られるタグ−分子コンジュゲートを含む。
【００２９】
このような免疫分子は、典型的には、免疫レパートリを形成し、この免疫レパートリは、比較的長さが短い（例えば、通常は３００ｂｐ未満である）非常に類似したポリヌクレオチドの非常に大きいセット（例えば、１０００よりも大きいが、より一般的には１００，０００〜１，０００，０００以上である）を含む。本発明の一態様では、本発明者らは、これらの特徴により、大きく異なる配列タグを使用して非常に類似したクローン型の配列リードを効率的に比較し、これらの配列リードが同じ起源の配列に由来するか否かを決定できること分かり、これを歓迎した。
【００３０】
免疫レパートリの複合体は周知である。例えば、アスティラ（Ａｒｓｔｉｌａ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９９年、第２８６巻、ｐ．９５８〜９６１およびワーレン（Ｗａｒｒｅｎ）ら著（前掲）。図１Ｃは、本発明の一部の実施形態に従ってクローン型プロファイルが得られるＩｇＨ分子（１２０）の典型的な転写物を図式的に例示している。天然の配列の多様性の原因には、ゲノムによって保持される多数のセットからのＣセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント、およびＶセグメントのモジュール組換え、いわゆる「ＮＤＮ」領域を形成するＤセグメントの末端に対するヌクレオチドの付加および欠失、ならびに、曲線（１２８）によって大まかに示されているような相対頻度で転写物（１２２）の長さに対して置換がランダムに行われる体細胞超変異が含まれる。本発明の一態様では、このようなＩｇＨおよびＴＣＲ転写物の複合集団が増幅され、シークエンシングされる。一態様では、ＩｇＨ分子に対する一方または両方の操作が、Ｖ領域の異なる部位にアニーリングする重複プライマーを用いて行われる（以下により詳細に説明される）。これは、エラー率が比較的高いシークエンシング化学が利用される場合、またはこのような配列の多様性を事前に知ることが困難もしくは不可能な場合に特に有利である。後者の場合、たとえ、（例えば）１つ以上の体細胞変異によるミスマッチのために１つ以上のプライマー結合部位が機能しない、または実質的に機能しなくても、配列リードの増幅または形成のためのプライマーの伸長は起こる。曲線（１２８）によって示されている相対頻度は、プロモータＰ（１２２）から始まり、リーダ領域（１２４）で上昇し、転写のＶ（Ｄ）Ｊ領域（１２６）で最大となり、以降は下降してゼロに近づいていく。本発明の一態様では、ファハム（Ｆａｈａｍ）およびウィリス（Ｗｉｌｌｉｓ）による米国特許出願公開第２０１１／０２０７１３４号明細書に開示されているように、組換えＢ細胞核酸のセグメントが、鋳型のネステッドセット（ｎｅｓｔｅｄ  ｓｅｔ）を得るために複数の順方向プライマーまたは複数の逆方向プライマーを用いてＰＣＲによって増幅される。このようなセットからの鋳型は、ある表面でさらに増幅して別個のアンプリコンを形成することができる（例えば、ｃＢｏｔインストゥルメント（ｃＢｏｔ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）、イリノイ州、サンディエゴ、カリフォルニア州を用いるブリッジＰＣＲによって）。同じネステッドセットからの鋳型は、共通の末端で形成される配列リードによって互いに関連し得る。鋳型のネステッドセットにより、エラー率が比較的高いシークエンシング化学を使用して、他の場合には可能であろうより長い配列を分析することができると同時に、配列の全長に対して高い平均品質スコアを維持することができる。また、ネステッドセットにより、少なくとも１つの配列リードが、たとえ体細胞超変異を受けたとしてもＶ領域から得られる。
【００３１】
ＩｇＨ分子の体細胞変異は、塩基の変化がシークエンシングエラーもしくは増幅エラーによるものであるか、または自然の変異プロセスによるものであるかの決定が困難であるため、配列リードデータからのクローン型の再構築をより困難にする。本発明に従った配列タグの使用は、ＩｇＨをコードする全ての核酸が異なるユニークな配列タグを受け取るため、このような困難さを大幅に緩和する。図３に例示されているように、本発明による配列リード（３００）はそれぞれ、配列タグ（３０２）のコピーおよびクローン型（３０４）（配列番号１）のコピーを含む。同じ配列タグを有する全ての配列リードは、クローン型部分における各位置のヌクレオチドを比較できるように構築される（例えば、配列番号２および配列番号３）。従って、たとえＩｇＨをコードする配列が僅か１つの塩基しか異なっていなくても、これらの配列は、異なる配列タグを受け取るため、サンプル中の密接に関連したＩｇＨをコードする核酸は、クローン型決定プロセスで互いに比較されない。上述のように、配列タグにおけるエラーは、クローン型に関連した配列タグの配列が配列空間で非常に離れていて、１つの配列タグが他のどの配列タグに対しても配列空間で近づくことなく、非常に多数の塩基の変化を維持できるため、それほど重要ではない。
【００３２】
配列リードのデータからのクローン型の構築は、異なる方法は異なる予測リード長さおよびデータの質を有するため、このようなデータを生成するために使用されるシークエン
シング法に一部依存する。１つのアプローチでは、Ｓｏｌｅｘａシーケンサが利用されて、分析用の配列リードデータが生成される。一実施形態では、少なくとも１００万の鋳型分子を作製するために少なくとも０．５〜１．０×１０６のリンパ球を提供するサンプルが得られ、任意選択の増幅後に、対応する鋳型分子（クラスター）の１００万以上のクローン集団を作製することができる。Ｓｏｌｅｘａアプローチを含む最高のスループットのシークエンシングアプローチでは、クラスターレベルでのこのような過剰サンプリングは、各鋳型配列がかなりの重複性で決定されて配列決定の精度が上がるため望ましい。Ｓｏｌｅｘａベースの実施では、好ましくは、独立した各鋳型の配列は、１０回以上決定される。異なる予測リード長さおよびデータの質を用いる他のシークエンシングアプローチでは、異なるレベルの重複性を、配列決定の同等の精度を得るために使用することができる。当業者であれば、上述のパラメータ、例えば、サンプルのサイズおよび重複性などが、特定の適用例に関連する設計上の選択であることを理解されよう。
【００３３】
図２Ａ〜図２Ｃは、２段階ＰＣＲでユニークな配列タグを組換え核酸分子に付着させる例示的なステップを例示している。Ｔ細胞またはＢ細胞を含むサンプルからの組換え核酸分子の集団（２５０）が、ＰＣＲ混合物中で順方向プライマー（２０２）および逆方向プライマー（２６２）と混合される。プライマー（２６２）はそれぞれ、３つの領域：標的アニーリング領域（２６３）（この例示では、Ｖ領域（２０６）である）；配列タグ（２６４）；および２段階ＰＣＲの第２の段階用のプライマー結合領域（２６５）を含む。この例示では、プライマー（２６２）は、Ｖ領域の配列の多様性を考慮した標的アニーリング領域の混合物を含む。従って、全ての異なるプライマーが、配列タグ領域を用いて調製される。あるいは、配列タグ要素は、第２のＰＣＲ段階用のプライマー結合領域と共にＣ領域プライマー（２０２）に付着させることができる。前述のように、組換え核酸分子（２５０）は、定常またはＣ領域（２０３）、Ｊ領域（２１０）、Ｄ領域（２０８）、およびＶ領域（２０６）を含み、これらの領域は、ＴＣＲまたは免疫グロブリンのＣＤＲ３領域をコードするＶ（Ｄ）Ｊセグメントを表し得る。数サイクル、例えば、４〜１０回のサイクル後に、第１段階のアンプリコン（２６６）が、配列タグ（２７０）を含む各メンバーのポリヌクレオチドを用いて作製される。第２段階のＰＣＲでは、アンプリコン（２６６）のポリヌクレオチドが、新たな順方向プライマーＰ５（２２２）および逆方向プライマーＰ７（２２０）を用いて再増幅され、これらのプライマーは、Ｓｏｌｅｘａ／ＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサでのブリッジＰＣＲを用いたクラスター形成用のさらなるプライマー結合部位（２２４）および（２２３）を追加する。プライマーＰ７は、１回のシークエンシングの実施中にサンプルの任意選択のマルチプレックス化のための二次配列タグ（２２１）も含む。二次ＰＣＲアンプリコン（２８０）が、組み込まれたＰ５およびＰ７で作製されたら、ブリッジＰＣＲを実施することができる。
【００３４】
配列データからのクローン型の決定
本発明の一態様によると、サンプルのクローン型は、それらの配列タブに基づいた配列リードの第１の分類によって決定される。このような分類は、従来のシークエンシングアラインメント法によって達成することができる。アラインメント法を選択するための案内は、参照により本明細書に組み入れられるバツゾグロウ（Ｂａｔｚｏｇｌｏｕ）著、ブリーフィング・イン・バイオインフォマティクス（Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）、２００５年、第６巻、ｐ．６〜２２に記載されている。配列リードが、ユニークな配列タグに従って群に分けられたら、関連するクローン型の配列を分析して、サンプル由来のクローン型の配列を決定することができる。図３は、ユニークな配列タグに関連したクローン型の配列（配列番号１）の決定からの例示的なアラインメントおよび方法を例示している。この例では、１１の配列リードが、それぞれの各配列タグ（３０２）によって整列され、この後に、１、２、３、４、．．．ｎとして示されている配列リードのクローン型部分の各位置におけるヌクレオチドが比較される。例えば、位置６（３０６）のヌクレオチドは、ｔ、ｔ、ｇ、ｔ、ｔ、ｔ、ｔ、ｔ、ｔ、ｃ、ｔ；即ち、９
つのベースコールがｔであり、１つが「ｇ」（３０８）であり、１つが「ｃ」（３１０）である（それぞれ、配列番号２および配列番号３）。一実施形態では、ある位置におけるクローン型配列の正しいベースコールとは、何であれ大多数の塩基が同じものである。位置６（３０６）の例では、ベースコールは、「ｔ」がこの位置にある配列リードの大多数のヌクレオチドであるたため、「ｔ」である。他の実施形態では、クローン型配列の正しいベースコールを決定する際は、他の因子、例えば、配列リードのベースコールの品質スコアまたは隣接する塩基が同じであることなどを考慮することができる。
【００３５】
クローン型が上記のように決定されたら、サンプルの各異なるクローン型の存在量または頻度を含むクローン型プロファイルを作成することができる。
合成によるシークエンシング法でのホモポリマーの決定
本発明の一態様によると、配列タグを、合成によるシークエンシング（ＳＢＳ）法で生成されるシグナルからホモポリマー領域のヌクレオチド数の決定に使用することができる。即ち、標的ポリヌクレオチドが複製されて、複数の複製が、別々のＳＢＳ反応を受けると、各複製は、同じ配列タグで標識されている可能性があるため、別個の複製の同様の領域への塩基の取り込みから生じるＳＢＳシグナルが、異なる取り込みシグナルを共通の配列タグを通じて連結することによって分析されることができる。ＳＢＳ法は、様々な実施を有する。例えば、フラー（Ｆｕｌｌｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２００９年、第２７巻、ｐ．１０１３〜１０２３；ロナギ（Ｒｏｎａｇｈｉ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９８年、第２８１巻、ｐ．３６３〜３６５；マーグリース（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００５年、第４３７巻、ｐ．３７６〜３８０；ロスバーグ（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１１年、第４７５巻、ｐ．３４８〜３５２；クマー（Ｋｕｍａｒ）ら著、サイエンティフィック・リポーツ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ）、２０１２年、第２巻、ｐ．６８４；シム（Ｓｉｍｓ）ら著、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２０１１年、第８巻、ｐ．５７５〜５８０；ポアーマンド（Ｐｏｕｒｍａｎｄ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、２００６年、第１０３巻、ｐ．６４６６〜６４７０；およびセオ（Ｓｅｏ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、２００５年、第１０２巻、ｐ．５９２６〜５９３１など。ＳＢＳを用いる市販のＤＮＡシーケンサには、４５４  ＧＳシーケンサ（４５４ライフサイエンシス（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））、ＰＧＭおよびＰｒｏｔｏｎ  Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンサ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、およびＰｙｒｏＭａｒｋシーケンサ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））などが含まれる。ＳＢＳ法の多数の変法の共通の特徴は、一連のシグナル（「取り込みシグナル」）の生成であり、各シグナルは、鋳型主導性合成反応における伸長ヌクレオチド鎖に取り込まれたヌクレオチド数に比例する（または、少なくとも単調に関連する）。ＳＢＳのこのような変法の共通の課題は、ホモポリマー領域の長さが５〜６ヌクレオチドを超える場合に鋳型のホモポリマー領域に組み込まれたヌクレオチド数を決定することである。本発明の一態様では、この問題は、配列タグの使用によって対応する。上記のように、このような実施形態における配列タグの配列は、互いに十分に離れているため、これらの配列タグは、たとえ複数の増幅エラーおよび／またはシークエンシングエラーが起きた後でも、それらの祖先配列または親配列に容易に関連付けられる。このようにして、これらの配列タグは、シークエンシングに頻繁に利用されるタグ、例えば、ベースコーリングソフトウェアを校正するためのタグ（例えば、いわゆる「キー」配列）、サンプルもしくは標本の起源を指定するタグ、または持越し汚染を低減するタグとは異なる。一部の実施形態では、鋳型は、モザイクタグを用いてサンプリングによって標識化されるため、配列タグ自体は、タグの最も長い可変領域の長さよりも長いホモポリマー領域を用いずに選択することができる。一部の実施形態では、モザイクタグは、５ヌクレオチド以下の可変領域と共に使用され；他の実施形態では、モザイクタグは、４ヌクレオチド以下の可変領域と共に使用さ
れる。あるいは、ＳＢＳに適した配列タグは、参照により本明細書に組み入れられるブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）による米国特許第７，５３７，８９７号明細書に開示されているように構築することができる。
【００３６】
図４Ａは、ヌクレオチドの付加および洗浄のサイクルを含むＳＢＳ法の一変法を例示し、シグナル生成は典型的には追加されるヌクレオチドの取り込みの最中または後で起こる。言い換えれば、例示されている変法は、異なるヌクレオシド三リン酸のそれぞれを連続的に付加するサイクルおよび洗浄するサイクルを含み、例えば、次の順序である：（ａ）成長する鋳型結合鎖へのｄＡＴＰの付加および洗浄；（ｂ）成長する鋳型結合鎖へのｄＧＴＰの付加および洗浄；（ｃ）成長する鋳型結合鎖へのｄＣＴＰの付加および洗浄；および（ｄ）成長する鋳型結合鎖へのｄＴＴＰの付加および洗浄。このようなサイクルの多くの追加の実施形態および変形形態も可能であり、例えば、シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）らによる米国特許出願公開第２０１２／００３５０６２号明細書に開示され、合成によるシークエンシングの範囲内である。典型的には、伸長は、核酸ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。図４Ａに戻ると、ＳＢＳの一変法が示されており、プライマー結合部位（４０４）に隣接した配列領域（４０２）を有する一本鎖鋳型（４００）が、固相支持体（４０８）、例えば、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）半導体シークエンシングチップのマイクロウェルのＳＮＡＰＰに固定される。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、ノバイル（Ｎｏｂｉｌｅ）らによる米国特許出願公開第２０１０／０３００８９５号明細書；ハインツ（Ｈｉｎｚ）らによる米国特許出願公開第２０１１／０１９５２５３号明細書。固定された鋳型（４００）は、シークエンシングプライマー（４０６）のプライマー結合部位（４０４）へのアニーリング、およびヌクレオシド三リン酸の付加時にポリメラーゼ（４１０）によるシークエンシングプライマー（４０６）の伸長を可能にする条件下で、シークエンシングプライマー（４０６）およびポリメラーゼ（４１０）と混合される。図４Ａの変法では、鋳型（４００）、シークエンシングポリマー（４０６）、およびポリメラーゼ（４１０）を含む複合体が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰの流れ（フロー）に別々かつ連続的に曝露される。ｄＡＴＰの流れ（４１２）に曝露されると、シークエンシングプライマー（４０６）が、１つのｄＡ（４１３）によって伸長される。残った全てのｄＡＴＰを除去または破壊する洗浄（４１４）の後で、ｄＧＴＰの流れ（４１６）が導入され、これにより、ポリメラーゼ（４１０）がｄＧＴＰを取り込んで、１つのｄＧ（４１５）によってシークエンシングプライマー（４０６）を伸長させる。洗浄（４１８）後に、ｄＣＴＰの流れ（４２０）が導入されるが、鋳型の次の塩基がｄＣに相補的でないため、ヌクレオチドが取り込まれず、シークエンシングプライマー（４０６）が伸長しない。このサイクルは、洗浄ステップ（４２２）およびｄＴＴＰの流れ（４２４）で完了する。
【００３７】
このＳＢＳ変法および他のＳＢＳ変法における各取り込み事象の最中または後で、取り込みシグナルが生成され、この取り込みシグナルは、特性が非常に多様であり得、同時に２つ以上の物理的または化学的表示、例えば、光および／または電気を含み得る。例示的な取り込みシグナルの例として、限定されるものではないが、ｐＨの変化、蛍光の変化、化学発光の変化、および抵抗の変化などが挙げられる。図４Ｂは、図４ＡのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰの上記の各流れの最中または後で記録される典型的な取り込みシグナル（４２６、４２８、４３０）をそれぞれ例示している。このようなデータを分析して、プライマー（４０６）に付加されたヌクレオチドの数またはその伸長に比例する、または単調に関連する各ピークの数を得ることができる。このような分析で得られる数は、特定の実施形態によって異なり得、例えば、このような数は、このようなピークの面積、ピーク高さ、半値ピーク幅の関数、または当分野で公知の同様の関数であり得る。図４Ｃおよび図４Ｄは、ホモポリマー領域（４３２）の存在下でのＳＢＳプロセス、および取り込みシグナルを決定するための配列タグの使用を例示している。支持体（４３６、４３８、４４０）はそれぞれ、別々のＳＢＳ反応１、ＳＢＳ反応２、およびＳＢＳ反応Ｋに対応
しており、これらは、付着された同じ配列タグ−鋳型コンジュゲートの複製を有する（配列番号５）。プライマー４０６、４０６’、および４０６’’はそれぞれ、別々のポリメラーゼ４１０、４１０’、および４１０’’によって別々の反応で伸長される。このような別々の反応は、別々の反応区画で行われ、これらの反応区画は、様々な形態、例えば、様々な規模のマイクロウェルのアレイを有する。例えば、参照により本明細書に組み入れられるロスバーグ（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１１年、第４７５巻、ｐ．３４８〜３５２；リーモン（Ｌｅａｍｏｎ）らによる米国特許第８，１５８，３５９号明細書；ロスバーグ（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ）らによる米国特許第８，３１３，６２５号明細書。反応区画は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、ボールス（Ｂｏｌｅｓ）らによる米国特許第６，３００，０７０号明細書；バラスブラマニアン（Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ）らによる米国特許第６，７８７，３０８号明細書に開示されているブリッジＰＣＲによって作製される、ビーズもしくは表面上またはゲル内の鋳型核酸のクラスターによって画定することもできる。ＳＢＳ法の一部の実施形態によると、異なるｄＮＴＰの流れが、それぞれの反応に連続的に導入される。必ずしも必要ではないが、典型的には、各異なる反応は、例えば、適切な流動システムと共に使用されるＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体シークエンシングチップの異なるマイクロウェルで行われるＳＢＳ反応の場合と同様に、ほぼ同じ時間に同じ流れに曝露することができる。例えば、ノバイル（Ｎｏｂｉｌｅ）（前掲）；参照により本明細書に組み入れられるデイビー（Ｄａｖｅｙ）らによる米国特許出願公開第２０１２／０１４３５３１号明細書。各ｄＮＴＰの流れの最中または後で、取り込みシグナル（ｉ１、ｉ２、．．．ｉｋ）が得られる。図４Ｃは、第２のｄＡＴＰの流れ（４４２）の取り込みシグナルを例示している。５〜６塩基を超えるホモポリマーでは、最後の方に取り込まれるヌクレオチドの全シグナルに対する寄与は次第に小さくなり、従って、取り込まれたヌクレオチドからのシグナルとノイズとを区別することが困難になる。本発明によると、複数の複製鋳型からの取り込みシグナルは、共通の配列タグによって識別できるため一緒に分析することができる。上述のように、配列タグが選択されるため（例えば、サンプリングプロセスによる標識化によって）、たとえ複数の増幅エラーまたはシークエンシングエラーが存在しても、タグとポリヌクレオチドの各コンジュゲートの配列タグおよびその複製は、他のタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートの配列タグおよびその各複製と区別可能である。
【００３８】
図４Ｄは、取り込みシグナル（４５０）の大きさの複数（１、２、．．．Ｋ）の配列であり、各配列は、共通の配列タグ（４５２）および鋳型ＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＣＴＴ（配列番号５）に結合されている。例示されたデータセットの形式は、図３に例示されている形式に類似し、どのように塩基測定の列を使用して最終的なベースコールを決定できるかを例示している。図４Ｄは、どのように取り込みシグナルの列を使用してヌクレオチド取り込み数の最終決定をできるかを例示している。このような決定は、別個のモデルを使用して、別個の反応からの取り込みシグナルからヌクレオチド取り込みの測定値を求めた後で行ってもよいし、または、同じ親タグを有するタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートからの全てもしくは複数の取り込みシグナルにモデルを適用して行っても良い。上記のように、図４Ｄに示されている数字は、ピーク、例えば、（４２６、４２８、および４３０）によって例示されるデータセットの関数の値である（取り込みシグナルの時間に対する生成率を示し、その積分または面積は、ヌクレオチド取り込みの１つの指標である）。「ｆ１ａ、ｆ１ｇ、ｆ１ｃ、ｆ１ｔ、ｆ２ａ、ｆ２ｇ」などと標識された図４Ｄの列は、ｄＮＴＰの流れのサイクルを表し、第１のサイクル（ｆ１ａ、ｆ１ｇ、ｆ１ｃ、ｆ１ｔ）は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰのＳＢＳ反応への連続的な導入を含み、以下同様である。
【００３９】
上述のように、本発明のこの態様は、次のステップを有する方法によって行うことができる：（ａ）配列タグを１つ以上の各ポリヌクレオチドに付着させてタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートを形成するステップであって、タグ−ポリヌクレオチドコンジュゲー
トの実質的に全てのポリヌクレオチドがユニークな配列タグを有する、ステップ；（ｂ）このタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートを増幅するステップ；（ｃ）増幅されたタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートを合成によってシークエンシングするステップであって、少なくとも１つのｄＮＴＰの流れを含む、ステップ；および（ｄ）同じ配列タグを有するタグ−ポリヌクレオチドのそれぞれについて、各ｄＮＴＰの流れでのヌクレオチドの取り込み数を、このような各ｄＮＴＰの流れに対して測定された取り込みシグナルの関数として決定するステップ。典型的には、増幅されたタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートは、様々なステップを行うのに役立つ隣接する配列を含む。例えば、タグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートは、二次増幅、シークエンシングプライマーのアニーリングおよび伸長、ならびにハイブリダイゼーションベースの捕捉などの工程が可能となるように、各末端に１つ以上の隣接プライマー結合部位を含み得る。上述のように、ｄＮＴＰの流れは、様々な流体送達装置および制御システム、例えば、最も市販されているＤＮＡシークエンシングシステムに対して実施されるシステムによって実施することができる。例えば、参照により本明細書に組み入れられるシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）らによる米国特許出願公開第２０１２／００７３６６７号明細書。ｄＮＴＰの流れは、ｄＮＴＰ含有試薬の反応部位を通る移動である。好ましくは、ｄＮＴＰの流れは、連続的な流れと流れとの間に流体の明確な境界が存在するように実施される。一部の実施形態では、洗浄ステップは、ｄＮＴＰ含有試薬とｄＮＴＰの存在を除き実質的に同一の試薬で実施される。一部の実施形態では、洗浄ステップを実施するための試薬は、前の流れのｄＮＴＰを破壊する、または変性させる試薬、例えば、アピラーゼを含み得る。殆どの実施形態では、ｄＮＴＰの流れは、複合体中のポリメラーゼが、鋳型主導性反応における流れの中のｄＮＴＰの取り込みによってシークエンシングプライマーをタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートに沿って伸長させるのに十分な全ての試薬、塩濃度、およびｐＨなどを含む。上述のように、様々な関数またはアルゴリズムを使用して、タグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートが同じ配列タグを有するようにすることによって関連した別々の反応からのシグナル（例えば、取り込みシグナル値）をモデル化することができる。一部の実施形態では、同じ配列タグを有するタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートからの取り込みシグナルの関数は、別々のＳＢＳ反応から測定されるこのような取り込みシグナルの平均に最も近い整数である。この平均は、算術平均または重み付け平均とすることができ、例えば、重み付け平均は、使用される特定のシークエンシングシステム、例えば、使用される特定のシークエンシング化学、標識が使用されるか否か、どんな種類のシグナルが生成されるか（例えば、光、抵抗パルス、ｐＨなど）、およびｄＮＴＰの流れにおけるＳＢＳ反応部位の位置などの特徴に依存し得る。ＳＢＳ反応からのシグナルを取り込まれたヌクレオチドに関連付ける代替のモデルの案内は、共に参照により本明細書に組み入れられる、リアーリック（Ｒｅａｒｉｃｋ）による米国特許出願公開第２０１２／０１７２２４１号明細書；およびハッベル（Ｈｕｂｂｅｌｌ）による米国特許出願公開第２０１２／０１７３１５８号明細書に開示されている。
【００４０】
上述のように、合成によるシークエンシングは、様々なプロセスステップおよび試薬によって行うことができる。一部の実施形態では、合成によるシークエンシングは、次のステップで行うことができる：（ａ）複数のタグとヌクレオチドのコンジュゲートのそれぞれに対して、シークエンシングプライマー、核酸ポリメラーゼ、およびタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートを含む複合体を、シークエンシングプライマーのこのようなタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートに対するアニーリングを可能にし、かつシークエンシングプライマーの、ヌクレオシド三リン酸の存在下での核酸ポリメラーゼによるこのタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートに沿った伸長を可能にする条件下で形成するステップ；（ｂ）ｄＮＴＰをｄＮＴＰの流れによって複合体に導入するステップ；（ｃ）各複合体からの取り込みシグナルを測定するステップ；（ｄ）複合体を洗浄するステップ；および（ｅ）ステップ（ｂ）からステップ（ｄ）を繰り返すステップ。一部の実施形態では、タグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートが増幅されたら、得られたアンプリコンのサンプルが
、合成ステップによるシークエンシングに使用される。一部の実施形態では、このようなサンプルは、少なくとも１０２を超える数のタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートを含み；他の実施形態では、このようなサンプルは、１０２〜１０１５の範囲、または他の実施形態では１０２〜１０１２の範囲、または他の実施形態では１０２〜１０９の範囲の数のタグ−ポリヌクレオチドコンジュゲートを含む。他の実施形態では、このようなサンプルは、０．００１以上の頻度を有する全てのポリヌクレオチドが９９％の確率で存在する；または０．０００１以上の頻度を有する全てのポリヌクレオチドが９９％の確率で存在するように十分に大きい。
【００４１】
本発明のこの態様に利用されるｄＮＴＰは、非ブロックｄＮＴＰまたは伸長ブロックｄＮＴＰとすることができる。前者（非ブロックｄＮＴＰ）の場合は、１回のｄＮＴＰの流れの最中に、鋳型がホモポリマー領域を含む場合は、ホモポリマーの長さに等しい数の取り込みが起こり得る。（取り込みを少なくする因子（例えば、処理能力の低いポリメラーゼ）が存在し得るが、非ブロックｄＮＴＰでは、このような数をホモポリマーの長さに等しくすることが可能である）。例えば、合成化学によるＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシークエンシングは、非ブロックｄＮＴＰを利用する。伸長ブロックｄＮＴＰの場合は、通常は、取り込まれるヌクレオチド上に化学ブロック基が存在するため、各流れで１つのｄＮＴＰの取り込みしか起こり得ない。従って、ｄＮＴＰの取り込みのサイクルは、伸長されたシークエンシングプライマーの伸長可能な末端を再生するために、ブロックを解除するステップをさらに含む。例えば、合成化学によるイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）シークエンシングは、伸長ブロックｄＮＴＰを利用する。例えば、ベントレイ（Ｂｅｎｔｌｅｙ）ら（後述）。一部の実施形態では、ブロックを解除するステップは、洗浄ステップの一部として行うことができる。
【００４２】
配列タグを使用する持越し汚染の検出
持越し汚染（キャリーオーバーコンタミネーション）は、核酸の増幅を含む技術では大きな問題である。例えば、ボースト（Ｂｏｒｓｔ）ら著、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー・アンド・インフェクシャス・ディジーズ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）、２００４年、第２３巻、第４号、ｐ．２８９〜２９９；アスランザデ・アン（Ａｓｌａｎｚａｄｅｈ，Ａｎｎ．）、クリニカル・ラボラトリー・サイエンス（Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．）、２００４年、第３４巻、第４号、ｐ．３８９〜３９６など。このような汚染は、サンプル外の微量の核酸がサンプルのアッセイで意図せずに増幅された場合に起こり、測定結果に変化をもたらす、または悪影響を与える。最悪の場合には、患者由来の医学的サンプル中の持越し汚染により、アッセイの結果が疑陽性と見なされることも起こり得る。外来核酸は、特定の患者に無関係の起源に由来し得る；例えば、外来核酸は、別の患者のサンプルに由来し得る。あるいは、外来核酸は、患者に関連した起源に由来し得る；例えば、外来核酸は、過去に同じ研究室で取り扱われた同じ患者からの異なるサンプル、または過去に同じ研究室で処理された同じ患者からの異なるサンプルに対するアッセイ反応に由来し得る。
【００４３】
持越し汚染は、関連する核酸の非常に複雑な集団、例えば、免疫分子、例えば、Ｔ細胞受容体または免疫グロブリンをコードする組換え核酸の集団を測定する場合に臨床現場で特に問題である。この問題は、配列リードもしくはクローン型が、目的のサンプルの真の多様性の一部であるか否か、または配列リードもしくはクローン型が、同じ研究室で同じ種類のアッセイで処理される、核酸の外部起源、例えば、別の患者のサンプルもしくは同じ患者の前のサンプルに由来するか否かを決定するのが困難であるために生じる。本発明の一態様では、このような持越し汚染は、配列タグを用いて、配列リードからクローン型を決定するだけではなく、配列タグが現在のサンプルまたは別のサンプルに由来するか否かを決定することによって検出することができる。これは、各患者のサンプルから決定される配列タグの記録を保存して、次の測定が行われる度に現在の測定の配列タグを前の測
定の配列タグと比較することによって達成される。クローン型に関連した配列タグのこのような記録は、各測定からのタグの数が多く、従来のアルゴリズムを用いた電子記録の検索および比較が容易であるため、電子記録として大容量記憶装置に便利に保存される。一致が検出された場合、測定に利用された配列タグの集団が十分に大きいとすると、最も可能性が高い原因は持越し汚染である。上記のサンプリングによる標識化のためのクローン型の集団に対する配列タグの集団のサイズの同じ例示的な比を、持越し汚染の検出に適用可能である。一実施形態では、このような比は１００：１以上である。
【００４４】
サンプル
クローン型プロファイルは、様々な組織に存在する免疫細胞のサンプルから得られる。目的の免疫細胞は、Ｔ細胞およびＢ細胞の少なくとも一方を含む。Ｔ細胞（Ｔリンパ球）は、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞を含む。Ｂ細胞（Ｂリンパ球）は、例えば、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現する細胞を含む。Ｔ細胞は、細胞表面マーカによって区別することができる、ヘルパーＴ細胞（エフェクターＴ細胞またはＴｈ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ）、記憶Ｔ細胞、および制御性Ｔ細胞を含む。一態様では、Ｔ細胞のサンプルは、少なくとも１，０００のＴ細胞を含むが；より典型的には、サンプルは、少なくとも１０，０００のＴ細胞、より典型的には、少なくとも１００，０００のＴ細胞を含む。別の態様では、サンプルは、１０００〜１，０００，０００細胞の範囲の数のＴ細胞を含む。免疫細胞のサンプルは、Ｂ細胞も含み得る。Ｂ細胞は、例えば、プラズマＢ細胞、記憶Ｂ細胞、Ｂ１細胞、Ｂ２細胞、辺縁帯Ｂ細胞、および濾胞Ｂ細胞を含む。Ｂ細胞は、免疫グロブリン（抗体またはＢ細胞受容体とも呼ばれる）を発現し得る。上記のように、一態様では、Ｂ細胞のサンプルは、少なくとも１，０００のＢ細胞を含むが；より典型的には、サンプルは、少なくとも１０，０００のＢ細胞、より典型的には、少なくとも１００，０００のＢ細胞を含む。別の態様では、サンプルは、１０００〜１，０００，０００Ｂ細胞の範囲の数のＢ細胞を含む。
【００４５】
本発明の方法に使用されるサンプル（「組織」サンプルとも呼ばれることもある）は、例えば、腫瘍組織含む様々な組織、血液および血漿、リンパ液、脳および脊髄を取り囲む脳脊髄液、ならびに骨関節を取り囲む滑液などに由来し得る。一実施形態では、サンプルは、血液サンプルである。血液サンプルは、約０．１ｍＬ、約０．２ｍＬ、約０．３ｍＬ、約０．４ｍＬ、約０．５ｍＬ、約０．６ｍＬ、約０．７ｍＬ、約０．８ｍＬ、約０．９ｍＬ、約１．０ｍＬ、約１．５ｍＬ、約２．０ｍＬ、約２．５ｍＬ、約３．０ｍＬ、約３．５ｍＬ、約４．０ｍＬ、約４．５ｍＬ、または約５．０ｍＬとすることができる。サンプルは、腫瘍生検標本とすることができる。腫瘍生検標本は、例えば、脳、肝臓、肺、心臓、結腸、腎臓、または骨髄の腫瘍に由来し得る。当業者によって使用される任意の生検技術を、対象からサンプルを採取するために使用することができる。例えば、生検は、全身麻酔が使用される直視下生検とすることができる。生検は、直視下生検で形成される切開部よりも小さい切開部が形成される経皮的生検とすることができる。生検は、組織の一部が除去されるコア生検または切開生検とすることができる。生検は、病変全体を除去しようとする切除生検とすることができる。生検は、組織または液体のサンプルが針で除去される微細針吸引生検とすることができる。
【００４６】
サンプルまたは組織サンプルは、核酸、例えば、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ）を含む。核酸は、例えば、循環系から抽出される無細胞ＤＮＡまたはＲＮＡとすることができる。ウラソフ（Ｖｌａｓｓｏｖ）ら著、カレント・モレキュラー・メディスン（Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．）、２０１０年、第１０巻、ｐ．１４２〜１６５；スワラップ（Ｓｗａｒｕｐ）ら著、ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）、２００７年、第５８１巻、ｐ．７９５〜７９９。本発明の方法では、分析することができる対象由来のＲＮＡまたはＤＮＡの量は様々である。例えば、１つの細胞のＤＮＡまたはＲＮＡが、校正試験（即ち、ある疾患の相関するクローン型を決
定する最初の測定）に必要な全てであり得る。クローン型プロファイルを作成するためには、個々の免疫受容体レパートリの有用な表現を得るために十分な核酸がサンプル中に存在しなければならない。より具体的には、ゲノムＤＮＡからクローン型プロファイルを作成するためには、Ｔ細胞またはＢ細胞からの少なくとも１ｎｇの全ＤＮＡ（即ち、約３００の２倍体ゲノム当量）がサンプルから抽出され；別の実施形態では、少なくとも２ｎｇの全ＤＮＡ（即ち、約６００の２倍体ゲノム当量）がサンプルから抽出され；そして別の実施形態では、少なくとも３ｎｇの全ＤＮＡ（即ち、約９００の２倍体ゲノム当量）がサンプルから抽出される。当業者であれば、サンプル中のリンパ球の割合が減少すると、約１０００を超える独立したクローン型を含むクローン型プロファイルを作成するために、前述の最小量のＤＮＡを増加させなければならないことを理解されよう。ＲＮＡからクローン型プロファイルを作成するためには、一実施形態では、異なるＴＣＲ、ＢＣＲ、またはそれらの断片をコードする少なくとも１０００の転写物が得られるように十分な量のＲＮＡが抽出される。この範囲に対応するＲＮＡの量は、サンプル中のリンパ球の割合およびリンパ球の分化段階などによってサンプルごとに大きく異なる。一実施形態では、少なくとも１００ｎｇのＲＮＡが、クローン型プロファイルの作成のためのＢ細胞および／またはＴ細胞を含む組織サンプルから抽出され；別の一実施形態では、少なくとも５００ｎｇのＲＮＡが、クローン型プロファイルの作成のためのＢ細胞および／またはＴ細胞を含む組織サンプルから抽出される。本発明の方法に使用されるＲＮＡは、組織サンプルから抽出される全ＲＮＡ、組織サンプルから直接抽出されるポリＡ  ＲＮＡ、または組織サンプルから抽出される全ＲＮＡであり得る。上記の核酸の抽出は、例えば、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カールスバッド、カリフォルニア州）、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（サンディエゴ、カリフォルニア州）、または同様の業者が市販するキットを用いて行うことができる。ＲＮＡ抽出の案内は、リートケ（Ｌｉｅｄｔｋｅ）ら著、ＰＣＲメソッズ・アンド・アプリケーションズ（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、１９９４年、第４巻、ｐ．１８５〜１８７および同様の文献に記載されている。
【００４７】
より完全に後述されるように（定義）、リンパ球を含むサンプルは、異なるクローン型を有する実質的に全てのＴ細胞またはＢ細胞がサンプル中に存在し、レパートリ（本明細書で使用される用語として）を形成できるように十分に大きい。一実施形態では、９９％の確率で集団のどのクローン型も０．００１以上の頻度で存在するサンプルが採取される。別の実施形態では、９９％の確率で集団のどのクローン型も０．０００１以上の頻度で存在するサンプルが採取される。一実施形態では、Ｂ細胞またはＴ細胞のサンプルは、少なくとも５０万の細胞を含み、別の実施形態では、このようなサンプルは、少なくとも１００万の細胞を含む。
【００４８】
サンプルが採取される材料の供給源が十分でない場合、例えば、臨床試験のサンプルなどの場合は、この材料に由来するＤＮＡを、偏りのない技術、例えば、全ゲノム増幅（ＷＧＡ：ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、複数変位増幅（ＭＤＡ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、または同様の技術によって増幅することができる。例えば、ホーキンス（Ｈａｗｋｉｎｓ）ら著、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、２００２年、第１３巻、ｐ．６５〜６７；ディーン（Ｄｅａｎ）ら著、ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００１年、第１１巻、ｐ．１０９５〜１０９９；ワン（Ｗａｎｇ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００４年、第３２巻、ｐ．ｅ７６；およびホソノ（Ｈｏｓｏｎｏ）ら著、ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３年、第１３巻、ｐ．９５４−９６４など。
【００４９】
血液サンプルは、特に興味深く、従来の技術を用いて得ることができる。例えば、イニ
ス（Ｉｎｎｉｓ）ら編、ＰＣＲプロトコル（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９０年など。例えば、白血球は、従来の技術、例えば、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）キット（ステムセル・テクノロジーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、バンクーベイカーナダ）を用いて血液サンプルから分離することができる。同様に、全血の他の分画、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、市販のキット、例えば、ミルテニー・バイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃ）、オーバーン、カリフォルニア州などを用いて本発明の方法で使用するために単離することができる。血液サンプルは、１００μＬ〜１０ｍＬの範囲の量とすることができ；一態様では、血液サンプルの量は、２００  １００μＬ〜２ｍＬの範囲である。次いで、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを、本発明の方法に使用される従来の技術、例えば、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、バレンシア、カリフォルニア州）を用いてこのような血液サンプルから抽出することができる。任意選択で、白血球、例えば、リンパ球のサブセットを、従来の技術、例えば、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、サンノゼ、カリフォルニア州）、または磁気活性化細胞分類（ＭＡＣＳ）（ミルテニー・バイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、オーバーン、カリフォルニア州）などを用いてさらに単離することができる。
【００５０】
一部の実施形態では、組換え核酸が、各個人の適応免疫細胞のＤＮＡ中およびそれらの関連するＲＮＡ転写物中に存在し、これにより、ＲＮＡまたはＤＮＡを提供される本発明の方法でシークエンシングすることができる。Ｔ細胞受容体または免疫グロブリン分子、またはそれらの一部をコードする、Ｔ細胞またはＢ細胞由来の組換え配列がクローン型と呼ばれる。このＤＮＡまたはＲＮＡは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子または抗体をコードする免疫グロブリン（Ｉｇ：ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）遺伝子由来の配列に一致し得る。例えば、このＤＮＡおよびＲＮＡは、ＴＣＲのα鎖、β鎖、γ鎖、またはδ鎖をコードする配列に一致し得る。大部分のＴ細胞では、ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖からなるヘテロ二量体である。ＴＣＲα鎖は、ＶＪ組換えによって形成され、β鎖は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えによって形成される。ＴＣＲβ鎖の場合、ヒトでは、４８のＶセグメント、２つのＤセグメント、および１３のＪセグメントが存在する。２つの接合部のそれぞれにおいて、いくつかの塩基を欠失させ、他の塩基を付加することができる（ＮヌクレオチドおよびＰヌクレオチドと呼ばれる）。少数のＴ細胞では、ＴＣＲはγ鎖およびδデルタ鎖からなる。ＴＣＲγ鎖は、ＶＪ組換えによって形成され、ＴＣＲδ鎖は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えによって形成される（参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる、ケネス・マーフィ（Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｍｕｒｐｈｙ）、ポール・トラバース（Ｐａｕｌ  Ｔｒａｖｅｒｓ）、およびマーク・ウォルポート（Ｍａｒｋ  Ｗａｌｐｏｒｔ）著、ジェンウェイズ・イムノロジー（Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第７版、ガーランド・サイエンス（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００７年）。
【００５１】
本発明の方法で分析されるＤＮＡおよびＲＮＡは、定常領域（α、δ、ε、γ、もしくはμ）を有する重鎖免疫グロブリン（ＩｇＨ）または定常領域λもしくはκを有する軽鎖免疫グロブリン（ＩｇＫもしくはＩｇＬ）をコードする配列に一致し得る。各抗体は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖を有する。各鎖は、定常（Ｃ）領域および可変領域を有する。重鎖の場合、可変領域は、可変（Ｖ）セグメント、多様性（Ｄ）セグメント、および接合（Ｊ）セグメントから構成されている。これらのセグメントの各タイプをコードするいくつかの異なる配列がゲノムに存在する。特定のＶＤＪ組換え事象が、Ｂ細胞の分化中に起こり、細胞が特定の重鎖を形成することを示している。軽鎖の多様性は、Ｄ領域が存在せず、ＶＪ組換えのみが存在する点を除き、同様に形成される。体細胞変異は、組換え部位の近傍で起こる場合が多く、いくつかのヌクレオチドの付加または欠失を引き起こし、Ｂ細胞によって産生される重鎖および軽鎖の多様性をさらに高める。従って、Ｂ細胞によって産生される抗体の可能な多様性は、異なる重鎖と軽鎖の積である。重鎖お
よび軽鎖の可変領域は、抗原認識（または結合）領域または部位の形成に寄与する。この多様性に、特定の応答が一部のエピトープで生じた後に起こり得る体細胞超変異のプロセスが加えられる。
【００５２】
本発明によると、プライマーは、リンパ球から抽出された組換え核酸のアンプリコンのサブセットを形成するために選択することができる。このようなサブセットは、本明細書では「体細胞的に再配列された領域」と呼ぶこともある。体細胞的に再配列された領域は、分化中のリンパ球または完全に分化したリンパ球由来の核酸を含み得、分化中のリンパ球は、免疫遺伝子の再配列が完了せず、完全なＶ（Ｄ）Ｊ領域を有する分子が形成されていない細胞である。例示的な不完全な体細胞的に再配列された領域は、不完全なＩｇＨ分子（例えば、Ｄ−Ｊ領域のみを含む分子）、不完全なＴＣＲδ分子（例えば、Ｄ−Ｊ領域のみを含む分子）、および不活性なＩｇＫ（例えば、Ｋｄｅ−Ｖ領域を含む）を含む。
【００５３】
細胞の十分なサンプリングは、「クローン型」および「レパートリ」の定義で以下にさらに説明されるレパートリデータを解釈する上で重要な点である。例えば、１，０００の細胞で開始すると、いくつのシークエンシングリードが得られるかに関わらずアッセイが高感度である最小頻度が得られる。従って、本発明の一態様は、入力免疫受容体分子の数を定量する方法の開発である。これは、ＴＣＲβ配列およびＩｇＨ配列に対して実施された。いずれの場合も、異なる配列全てを増幅することができる同じプライマーのセットが使用される。コピーの絶対数を得るために、複数のプライマーを用いるリアルタイムＰＣＲが、既知の数の免疫受容体コピーで標準に沿って行われる。このリアルタイムＰＣＲ測定は、後にシークエンシングされる増幅反応から行っても良いし、または同じサンプルの別個のアリコートに対して行っても良い。ＤＮＡの場合は、再配列免疫受容体分子の絶対数を、細胞数に容易に変換することができる（一部の細胞が、評価された特定の免疫受容体の２つの再配列コピーを有し、他が１つを有するため２倍以内）。ｃＤＮＡの場合は、リアルタイムサンプルにおける再配列分子の測定総数を外挿して、同じサンプルの別の増幅反応に使用されたこれらの分子の総数を決定することができる。加えて、この方法は、ＲＮＡの総量を決定する方法と組み合わせて、特定の効率のｃＤＮＡ合成と仮定して、ＲＮＡの単位量（例えば、１μｇ）中の再配列免疫受容体分子の数を決定することができる。ｃＤＮＡの総量が測定されると、ｃＤＮＡ合成の効率を考慮する必要がない。細胞数も分かる場合は、１細胞当たりの再配列免疫受容体コピーを計算することができる。細胞数が分からない場合は、特定の種類の細胞が通常は同量のＲＮＡを産生するため、全ＲＮＡから細胞数を推定することができる。従って、１μｇ当たりの再配列免疫受容体分子のコピーから、１細胞当たりのこれらの分子の数を推定することができる。
【００５４】
シークエンシングのために実施され得る反応とは別のリアルタイムＰＣＲを行う１つの不都合な点は、異なる酵素、入力ＤＮＡ、および他の条件を利用し得るため、リアルタイムＰＣＲで他の反応とは異なる阻害効果が存在し得ることである。シークエンシングのためにリアルタイムＰＣＲの産物を処理することにより、この問題を改善することができる。しかしながら、リアルタイムＰＣＲを用いた低いコピー数は、コピーの数が少ないか、または反応中の阻害効果もしくは他の最適以下の条件が原因であろう。
【００５５】
ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに対する既知の量の１つ以上の内部標準をアッセイ反応に加えて、未知の量のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡサンプルの絶対量または絶対濃度を決定することができる。内部標準の分子数を計数して、これを同じサンプルの残りの配列と比較することによって、最初のｃＤＮＡサンプル中の再配列免疫受容体分子の数を推定することができる。（分子を計数するこのような技術は周知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられるブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）らによる米国特許第７，５３７，８９７号明細書）。
【００５６】
核酸集団の増幅
核酸の標的集団のアンプリコン、特に組換え免疫分子を、様々な増幅技術によって作製することができる。本発明の一態様では、マルチプレックスＰＣＲを使用して、組換え免疫分子、例えば、Ｔ細胞受容体もしくはその一部、またはＢ細胞受容体もしくはその一部の混合物のメンバーが増幅される。このような免疫分子のマルチプレックスＰＣＲを行うための案内は、参照により本明細書に組み入れられる次の文献に記載されている：ファハム（Ｆａｈａｍ）およびウィリス（Ｗｉｌｌｉｓ）による米国特許第８，２３６，５０３号明細書；モーレイ（Ｍｏｒｌｅｙ）による米国特許第５，２９６，３５１号明細書；ゴルスキー（Ｇｏｒｓｋｉ）による米国特許第５，８３７，４４７号明細書；ダウ（Ｄａｕ）による米国特許第６，０８７，０９６号明細書；ヴァン・ドンゲン（Ｖｏｎ  Ｄｏｎｇｅｎ）らによる米国特許出願公開第２００６／０２３４２３４号明細書；欧州特許第１５４４３０８Ｂ１号明細書など。本発明の一部の実施形態では、クローン型プロファイルを作成するステップは、（ａ）Ｔ細胞受容体遺伝子の一部および／またはＢ細胞受容体遺伝子の一部を増幅するステップ、および（ｂ）得られるアンプリコンの核酸をシークエンシングするステップを含む。他の部分で説明されるように、シークエンシングされたアンプリコンの核酸の数は、適用例によって異なり得る。例えば、白血病患者がなお寛解期にあるか否かを決定するクローン型プロファイルは、任意の腫瘍クローンの検出限界が非常に低いため大きくなる。一部の実施形態では、シークエンシングされたアンプリコンの核酸の数は、少なくとも１０００であり；他の実施形態では、シークエンシングされたアンプリコンの核酸の数は、少なくとも１０４であり；他の実施形態では、シークエンシングされたアンプリコンの核酸の数は、少なくとも１０５である。このような作成ステップはまた、配列リードを合体させてクローン型にするステップ、クローン型を列挙する、または表にするステップ、クローン型の度数分布を作成するステップ、クローン型の関連するサブセットを識別するステップ、およびクローン型の頻度の情報を表示するステップなどのさらなるステップも含み得る。
【００５７】
ゲノム由来のＤＮＡの増幅（またはＲＮＡの逆転写によるｃＤＮＡの形態の核酸の増幅）の後に、個々の核酸分子を単離し、任意選択で再増幅し、そして個々にシークエンシングすることができる。例示的な増幅プロトコルは、参照により本明細書に組み入れられる、バン・ドンゲン（ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ）らによるルーキミア（Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、２００３年、第１７巻、ｐ．２２５７〜２３１７またはバン・ドンゲン（ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ）らによる米国特許出願公開第２００６／０２３４２３４号明細書に記載されている。簡単に述べると、例示的なプロトコルは次の通りである：反応バッファー：ＡＢＩ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩまたはＡＢＩ  Ｇｏｌｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  （ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）；５０μｌの最終反応量；１００ｎｇのサンプルＤＮＡ；１０ｐモルの各プライマー（後述されるように増幅をバランスさせるために調整される）；２００μＭの最終濃度のｄＮＴＰ；１．５ｍＭの最終濃度のＭｇＣｌ２（標的配列およびポリメラーゼによっては最適化される）；Ｔａｑポリメラーゼ（１〜２Ｕ／管）；サイクリング条件：９５℃で７分の前活性化；６０℃でのアニーリング；サイクリング時間：３０秒の変性；３０秒のアニーリング；３０秒の伸長。本発明の方法の増殖に使用できるポリメラーゼは、市販されており、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅポリメラーゼ、またＰｆｕを含む。使用するポリメラーゼの選択は、忠実度または効率のどちらが優先されるかに基づくことができる。
【００５８】
リアルタイムＰＣＲ、ピコグリーン（ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ）染色、ナノ流体電気泳動法（例えば、ＬａｂＣｈｉｐ）、またはＵＶ吸収測定を最初のステップで使用して、増幅可能な材料の機能的な量を見積もることができる。
【００５９】
一態様では、開始集団の配列の相対量が、増幅された集団またはアンプリコンの相対量
と実質的に同じであるように、マルチプレックス増幅が行われる。即ち、マルチプレックス増幅は、サンプル集団のメンバーの配列の間で最小の増幅バイアスで行われる。一実施形態では、このような相対量は、アンプリコンの各相対量が、開始サンプルの相対量の値の５倍以内である場合は実質的に同じである。別の実施形態では、このような相対量は、アンプリコンの各相対量が、開始サンプルの相対量の値の２倍以内である場合は実質的に同じである。以下にさらに十分に説明されるように、ＰＣＲの増幅バイアスは、従来の技術を用いて検出して修正することができ、これにより、ＰＣＲプライマーのセットを所定のレパートリのために選択して、あらゆるサンプルのバイアスのない増幅を実現することができる。
【００６０】
ＴＣＲ配列またはＢＣＲ配列に基づいた多くのレパートリに関して、マルチプレックス増幅は、任意選択で全てのＶセグメントを使用する。この反応は、異なるＶセグメントプライマーによって増幅される配列の相対存在量を維持する増幅が得られるように最適化される。プライマーの一部は関連し、従って、プライマーの多くはクロストークして、プライマーに完全には一致していない鋳型を増幅し得る。各鋳型が、どのプライマーが鋳型を増幅するかにかかわらず同様の方式で増幅できるように条件が最適化される。言い換えれば、２つの鋳型が存在する場合、１，０００倍の増幅後に、両方の鋳型を約１，０００倍に増幅することができ、一方の鋳型のために、増幅産物の半分が、クロストークのために異なるプライマーを有していても問題ない。シークエンシングデータの後の分析では、プライマー配列が分析から排除されるため、鋳型が等しく増幅されれば、増幅にどのプライマーが使用されるかは問題ではない。
【００６１】
一実施形態では、増幅バイアスは、２段階増幅（前掲のファハム（Ｆａｈａｍ）およびウィリス（Ｗｉｌｌｉｓ）に記載されている）を行うことによって回避することができ、この増幅では、少数の増幅サイクルが、標的配列に相補的ではない尾部を有するプライマーを用いて第１の段階または一次段階で行われる。この尾部は、一次アンプリコンの配列の末端に付加されたプライマー結合部位を含むため、このような部位が、１つの順方向プライマーと１つの逆方向プライマーのみを用いる第２段階増幅で使用され、これにより、増幅バイアスの主な原因が排除される。好ましくは、一次ＰＣＲは、異なるプライマーによる差動増幅を最小限にするために十分に少ない数のサイクル（例えば、５〜１０回）を有する。二次増幅は、一対のプライマーで行われるため、差動増幅の問題は最小限である。一次ＰＣＲの１パーセントが、二次ＰＣＲに直接使用される。２つの増幅の間に使用される３５のサイクル（１００倍の希釈ステップを用いない約２８のサイクルに等しい）が、サイクルの詳細：１サイクルの一次と３４の二次または２５の一次と１０の二次、にかかわらず強い増幅を示すのに十分であった。理想的には、一次ＰＣＲでの１サイクルのみの実施で、増幅バイアスを減少できることであるが、他の考えも存在する。この一態様はレプリゼンテーション（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）である。これは、開始入力量が、最終的に得られるリード数を超えていない場合に役割を果たす。例えば、１，０００，０００のリードが得られ、１，０００，０００の入力分子で開始される場合、二次増幅に対する１００，０００の分子のレプリゼンテーション（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）のみをとると、元のサンプルにおける異なる種の相対存在量の推定の精度が低下し得る。２つのステップの間の１００倍の希釈とは、一次ＰＣＲが１００を大幅に超える分子を作製しない限り、レプリゼンテーション（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）が減少することを意味する。これは、最少で８サイクル（２５６倍）、より快適には１０サイクル（約１，０００倍）を使用することができることを示す。これに対する代替は、一次ＰＣＲの１％超を二次ＰＣＲに使用するが、一次ＰＣＲに使用される高濃度のプライマーのため、これらのプライマーが増幅を妨げず、配列間の増幅バイアスを悪化させないように大きい希釈倍数を使用することができる。別の代替は、精製ステップまたは酵素的ステップを加えて一次ＰＣＲのプライマーを除去して、より小さい希釈を可能にする。この例では、一次ＰＣＲが１０サイクル、二次ＰＣＲが２５サイクルであった。
【００６２】
組換え核酸の集団のシークエンシング
核酸シークエンシングの任意の高スループット技術を、本発明の方法に使用することができる。好ましくは、このような技術は、少なくとも１０００のクローン型を決定することができ、好ましくは、少なくとも１０，０００〜１，０００，０００のクローン型を決定することができる量の配列データをコスト効率の良い方法で作製する能力を有する。ＤＮＡシークエンシング技術としては、標識ターミネータまたはプライマーを用いた古典的ジデオキシシークエンシング反応（サンガー法）およびスラブまたは毛細管でのゲル分離、可逆的に終端された標識ヌクレオチドを用いた合成によるシークエンシング、パイロシークエンシング、４５４シークエンシング、標識オリゴヌクレオチドプローブのライブラリに対する対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、後にライゲーションされる標識クローンのライブラリに対する対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを用いた合成によるシークエンシング、重合ステップ中の標識ヌクレオチドの取り込みのリアルタイム監視、ポロニー（ｐｏｌｏｎｙ）シークエンシング、およびＳＯＬｉＤシークエンシングが挙げられる。分離された分子のシークエンシングは、最近になって、ポリメラーゼまたはリガーゼを用いた連続または単一伸長反応、およびプローブのライブラリを用いた単一または連続差動ハイブリダイゼーションによって実証された。これらの反応は、１億を超える平行の配列の現在の市販アプリケーションでの実証を含め、多数の平行のクローン配列に対して行われた。従って、これらのシークエンシングアプローチを使用して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）のレパートリを研究することができる。本発明の一態様では、シークエンシングの高スループット法が利用され、この方法は、個々の分子を固体表面上で空間的に分離して、これらの分子を平行にシークエンシングするステップを含む。このような固体表面としては、無孔表面（例えば、Ｓｏｌｅｘａシークエンシング、例えば、ベントレイ（Ｂｅｎｔｌｅｙ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００８年、第４５６巻、ｐ．５３〜５９またはＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓシークエンシング、例えば、ドルマナック（Ｄｒｍａｎａｃ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０１０年、第３２７巻、ｐ．７８〜８１）、ビーズ結合鋳型もしくは粒子結合鋳型を含み得るウェルのアレイ（例えば、４５４シークエンシングを用いる、例えば、マーグリース（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００５年、第４３７巻、ｐ．３７６〜３８０またはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシークエンシング、米国特許出願公開第２０１０／０１３７１４３号明細書または同第２０１０／０３０４９８２号明細書）、微細加工膜（例えば、ＳＭＲＴシークエンシングと同様、例えば、エイド（Ｅｉｄ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００９年、第３２３巻、ｐ．１３３〜１３８）、またはビーズアレイ（ＳＯＬｉＤシークエンシングまたはポロニー（ｐｏｌｏｎｙ）シークエンシングと同様、例えば、キム（Ｋｉｍ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００７年、第３１６巻、ｐ．１４８１〜１４１４）を挙げることができる。別の態様で��、このような方法は、単離された分子を、これらの分子が固体表面上で空間的に単離される前または後で増幅するステップを含む。前増幅は、エマルジョンをベースとした増幅、例えば、エマルジョンＰＣＲ、またはローリングサークル増幅を含み得る。特に興味深いのはＳｏｌｅｘａベースのシークエンシングであり、このシークエンシングでは、個々の鋳型分子が、固体表面上で空間的に分離された後に、これらの分子が、ブリッジＰＣＲによって平行に増幅されて、別個のクローン集団またはクラスターが形成され、次いで、ベントレイ（Ｂｅｎｔｌｅｙ）（前掲）ならびに製造者の取扱説明書（例えば、ＴｒｕＳｅｑ（商標）サンプル精製キットおよびデータシート、イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）、サンディエゴ、カリフォルニア州、２０１０年）；および参照により本明細書に組み入れられる次の文献：米国特許第６，０９０，５９２号明細書；同第６，３００，０７０号明細書；同第７，１１５，４００号明細書；および欧州特許第０９７２０８１Ｂ１号明細書に記載されているようにシークエンシングされる。一実施形態では、個々の分子が、固定表面に配置されて増幅され、少なくとも１０５クラスター／ｃｍ２の密度；または少なくとも５×１０５／ｃｍ２の密度；または１０６クラスター／ｃ
ｍ２の密度でクラスターが形成される。一実施形態では、比較的エラー率の高いシークエンシング化学が利用される。このような実施形態では、このような化学によって生成される平均品質スコアは、配列リードの長さの単調に減少する関数である。一実施形態では、このような減少は、配列リードの０．５％が、位置１〜７５に少なくとも１つのエラーを有すること；配列リードの１％が、位置７６〜１００に少なくとも１つのエラーを有すること；配列リードの２％が、位置１０１〜１２５に少なくとも１つのエラーを有することに一致する。
【００６３】
一態様では、個体の配列ベースのクローン型プロファイルが、次のステップを用いて得られる：（ａ）個体のＴ細胞およびＢ細胞の少なくとも一方から核酸サンプルを得るステップ；（ｂ）このような核酸サンプルから得られる個々の分子を空間的に分離するステップであって、個々の分子が、サンプル中の核酸から作製された少なくとも１つの鋳型を含み、この鋳型が、体細胞的に再配列された領域またはその一部を含み、各個々の分子が、少なくとも１つの配列リードを形成することができる、ステップ；（ｃ）前記空間的に分離された個々の分子をシークエンシングするステップ；および（ｄ）核酸サンプルからの核酸分子の異なる配列の存在量を決定してクローン型プロファイルを作成するステップ。一部の実施形態では、この方法は、Ｔ細胞受容体遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の組み換え核酸を含む個々の分子を増幅する１つ以上のステップをさらに含む。例えば、このような１つ以上の増幅ステップは、多段階ＰＣＲを含み得る。別の実施形態では、シークエンシングするステップは、空間的に分離された個々の分子のそれぞれを二方向シークエンシングして、少なくとも１つの順方向配列リードおよび少なくとも１つの逆方向配列リードを形成するステップを含む。別の実施形態では、上記の方法は、次のステップを含む：（ａ）個体のＴ細胞およびＢ細胞の少なくとも一方から核酸サンプルを得るステップ；（ｂ）このような核酸サンプルから得られる個々の分子を空間的に分離するステップであって、個々の分子が、それぞれサンプル中の核酸から作製された、それぞれ体細胞的に再配列された領域またはその一部を有する鋳型のネステッドセットを含み、各ネステッドセットが、それぞれ同じ方向に伸長した、それぞれネステッドセットが形成された核酸の異なる位置から開始する複数の配列リードを形成することができる、ステップ；（ｃ）前記空間的に分離された個々の分子をシークエンシングするステップ；および（ｄ）核酸サンプルからの核酸分子の異なる配列の存在量を決定してクローン型プロファイルを作成するステップ。一実施形態では、シークエンシングするステップは、ネステッドセットのそれぞれに対して複数の配列リードを形成するステップを含む。別の実施形態では、体細胞的に再配列された領域はそれぞれ、Ｖ領域およびＪ領域を含み、複数の配列リードはそれぞれ、Ｖ領域の異なる位置から開始し、かつその関連するＪ領域の方向に伸長する。
【００６４】
一態様では、個体からの各サンプルに対して、本発明の方法に使用されるシークエンシング技術は、１回に最も少ない１０００のクローン型の配列を形成し；別の態様では、このような技術は、１回に少なくとも１０，０００のクローン型の配列を形成し；別の態様では、このような技術は、１回に少なくとも１００，０００のクローン型の配列を形成し；別の態様では、このような技術は、１回に少なくとも５００，０００のクローン型の配列を形成し；別の態様では、このような技術は、１回に少なくとも１，０００，０００のクローン型の配列を形成する。なお別の態様では、このような技術は、個々のサンプル当たり、１回に１００，０００〜１，０００，０００のクローン型の配列を形成する。
【００６５】
提供される発明の方法に使用されるシークエンシング技術は、１リードに付き約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約６０ｂｐ、約７０ｂｐ、約８０ｂｐ、約９０ｂｐ、約１００ｂｐ、約１１０、約１２０ｂｐ、約１５０ｂｐ、約２００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約３００ｂｐ、約３５０ｂｐ、約４００ｂｐ、約４５０ｂｐ、約５００ｂｐ、約５５０ｂｐ、または約６００ｂｐを形成することができる。
【００６６】
本発明は、いくつかの特定の実施形態の例を参照して説明されたが、当業者であれば、本発明の概念および範囲から逸脱することなく本発明の様々な変更が可能であることを理解されよう。本発明は、上記説明されたものに加えて、様々なセンサの実施および他の主題に適用可能である。
【００６７】
定義
本明細書に特段の記載がない限り、本明細書で使用される核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語および記号は、その分野の標準的な論文または教科書の意味である。例えば、コーンバーグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）およびベイカー（Ｂａｋｅｒ）著、ＤＮＡ複製（ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、第２版（Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ）、ニューヨーク、１９９２年）；レインガー（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ）著、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２版（ワース・パブリシャー（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、ニューヨーク、１９７５年）；ストラカン（Ｓｔｒａｃｈａｎ）およびリード（Ｒｅａｄ）著、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第２版（ワイリー−リス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）、ニューヨーク、１９９９年）；アバス（Ａｂｂａｓ）ら著、セルラー・アンド・モレキュラー・イムノロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第６版（サウンダーズ（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）、２００７年）。
【００６８】
２つ以上の配列、例えば、配列リードについての「アライニング」とは、２つ以上の配列を比較して、ある配列の距離の測定に基づいてこれらの配列がどの程度類似しているかを決定する方法のことである。核酸配列をアライニングする例示的な方法は、スミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムである。距離の測定は、ハミング距離またはレーベンシュタイン距離などを含み得る。距離の測定は、比較される配列のヌクレオチドの品質値に関連した要素を含み得る。
【００６９】
「アンプリコン」とは、ポリヌクレオチド増幅反応の産物；即ち、一本鎖または二本鎖であり得、かつ１つ以上の開始配列から複製されるポリヌクレオチドのクローン集団のことである。１つ以上の開始配列は、同じ配列の１つ以上のコピーでも良いし、または異なる配列の混合物でも良い。好ましくは、アンプリコンは、１つの開始配列の増幅によって形成される。アンプリコンは、１つ以上の開始核酸または標的核酸の複製を含む産物が作製される様々な増幅反応によって作製することができる。一態様では、アンプリコンを作製する増幅反応は、ヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドである反応物の塩基対が、反応産物の生成に必要な鋳型ポリヌクレオチドに相補体を有するという点で「鋳型主導性」である。一態様では、鋳型主導性反応は、核酸ポリメラーゼを用いるプライマーの伸長、または核酸リガーゼを用いるオリゴヌクレオチドのライゲーションである。このような反応としては、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、線状ポリメラーゼ反応、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ：ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、およびローリングサークル増幅などが挙げられ、これらは、参照により本明細書に組み入れられる次の参照文献に開示されている：マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らによる米国特許第４，６８３，１９５号明細書；同第４，９６５，１８８号明細書；同第４，６８３，２０２号明細書；同第４，８００，１５９号明細書（ＰＣＲ）；ゲルファント（Ｇｅｌｆａｎｄ）らによる米国特許第５，２１０，０１５号明細書（「ｔａｑｍａｎ」プローブを用いるリアルタイムＰＣＲ）；ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）らによる米国特許第６，１７４，６７０号明細書；カシャン（Ｋａｃｉａｎ）らによる米国特許第５，３９９，４９１号明細書（「ＮＡＳＢＡ」）；リザルディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）による米国特許第５，８５４，０３３号明細書；およびアオノ（Ａｏｎｏ）らによる特開平４−２６２７９９号公報（ローリングサークル増幅）など。一態様では、本発明の
アンプリコンは、ＰＣＲによって作製される。増幅反応は、反応産物の増幅反応の進行としての測定を可能にする検出化学が利用可能である場合は「リアルタイム」増幅とすることができる。例えば、以下に記載される「リアルタイムＰＣＲ」、またはレオン（Ｌｅｏｎｅ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９８年、第２６巻、ｐ．２１５０〜２１５５などに記載される「リアルタイムＮＡＳＢＡ」。本明細書で使用される「増幅する」という語は、増幅反応を行うことを意味する。「反応混合物」とは、限定されるものではないが、反応中にｐＨを選択されたレベルに維持する緩衝剤、塩、補助因子、およびスカベンジャなどを含み得る、反応を行うために必要な全ての反応物を含む溶液のことである。
【００７０】
本明細書で使用される「クローン性」という語は、レパートリのクローン型の中のクローン型の存在量の分布が１つまたは少数のクローン型に偏っている程度を表す指標のことである。大雑把に言えば、クローン性は、クローン型多様性の逆の指標である。多数の指標または統計を、本発明に従ってクローン性指標として使用することができる種と存在量の関係を説明する生態学から借用することができる。例えば、ピール（Ｐｉｅｌｏｕ）著、数理生態学入門（Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ
Ｅｃｏｌｏｇｙ）の第１７章および第１８章、（ワイリー−インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、１９６９年）。一態様では、本発明に使用されるクローン性指標は、クローン型プロファイル（即ち、検出された異なるクローン型の数およびその存在量）の関数であるため、クローン型プロアファイルが測定された後に、クローン性をこの測定値から計算して単数を得ることができる。１つのクローン性指標は、シンプソンの指数（Ｓｉｍｐｓｏｎ’ｓ  ｍｅａｓｕｒｅ）であり、この指数は単純に、無作為に選択されたクローン型が同じである確率である。他のクローン性指標としては、情報をベースとする指標およびマッキントッシュの多様性指数が挙げられ、ピール（Ｐｉｅｌｏｕ）（前掲）に開示されている。
【００７１】
「クローン型」とは、免疫受容体またはその一部をコードするリンパ球の組換えヌクレオチド配列のことである。より具体的には、クローン型とは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）、またはその一部をコードするＴ細胞またはＢ細胞の組換えヌクレオチド配列のことである。様々な実施形態では、クローン型は、ＩｇＨのＶＤＪ再配列、ＩｇＨのＤＪ再配列、ＩｇＫのＶＪ再配列、ＩｇＬのＶＪ再配列、ＴＣＲβのＶＤＪ再配列、ＴＣＲβのＤＪ再配列、ＴＣＲαのＶＪ再配列、ＴＣＲγのＶＪ再配列、ＴＣＲδのＶＤＪ再配列、ＴＣＲδのＶＤ再配列、またはＫｄｅ−Ｖ再配列などの全てまたは一部をコードし得る。クローン型は、免疫受容体遺伝子、例えば、Ｂｃｌ１−ＩｇＨまたはＢｃｌ１−ＩｇＨに関与する転座切断点領域もコードし得る。一態様では、クローン型は、クローン型が由来する免疫分子の多様性を表す、または反映するのに十分な長い配列を有し；結果として、クローン型は、様々な長さであり得る。一部の実施形態では、クローン型は、２５〜４００ヌクレオチドの範囲の長さを有し；他の実施形態では、クローン型は、２５〜２００ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
【００７２】
「クローン型プロファイル」とは、リンパ球の集団に由来する異なるクローン型のリストおよびその相対存在量のことである。典型的には、リンパ球の集団は、組織サンプルから得られる。「クローン型プロファイル」という語は、文献、例えば、次の文献：アスティラ（Ａｒｓｔｉｌａ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９９年、第２８６巻、ｐ．９５８〜９６１；ヤッサイ（Ｙａｓｓａｉ）ら著、イムノジェネティクス（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、２００９年、第６１巻、ｐ．４９３〜５０２；ケンジェルスカ（Ｋｅｄｚｉｅｒｓｋａ）ら著、モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）、２００８年、第４５巻、第３号、ｐ．６０７〜６１８などに記載されている免疫「レパートリ」の免疫学的概念に関連するが、この概念よりも一般的である。「クローン型プロファイル」という語は、再配列免疫受容体をコードする核酸の様々なリストおよび存
在量を含み、この核酸は、選択されたリンパ球のサブセット（例えば、組織浸潤性リンパ球または免疫表現性サブセットなど）に由来し得る、または完全な免疫受容体と比較すると多様性が低減された免疫受容体の一部をコードし得る。一部の実施形態では、クローン型プロファイルは、少なくとも１０３の異なるクローン型を含み得；他の実施形態では、クローン型プロファイルは、少なくとも１０４の異なるクローン型を含み得；他の実施形態では、クローン型プロファイルは、少なくとも１０５の異なるクローン型を含み得；クローン型プロファイルは、少なくとも１０６の異なるクローン型を含み得る。このような実施形態では、このようなクローン型プロファイルは、異なるクローン型のそれぞれの存在量または相対頻度をさらに含み得る。一態様では、クローン型プロファイルは、個体のリンパ球の集団中のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）、またはその断片をそれぞれコードする異なる組換えヌクレオチド配列（その存在量を含む）のセットであり、このセットのヌクレオチド配列は、実質的に全てのリンパ球の集団の異なるリンパ球またはそれらのクローン亜集団と１対１の対応を有する。一態様では、クローン型を決定する核酸セグメントは、それらの多様性（すなわち、セット中の異なる核酸セグメントの数）が、個体における実質的に全てのＴ細胞またはＢ細胞、またはそのクローンが、このようなレパートリのユニークな核酸配列を有する十分な長さであるように選択される。即ち、好ましくは、サンプルの各異なるクローンは、異なるクローン型を有する。本発明の他の態様では、レパートリに対応するリンパ球の集団は、循環Ｂ細胞であり得る、循環Ｔ細胞であり得る、または、限定されるものではないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞を含むいずれかの上記の集団の亜集団、または細胞表面マーカなどによって定義される他の亜集団であり得る。このような亜集団は、特定の組織、例えば、骨髄もしくはリンパ節などからサンプルを採取することによって、または１つ以上の細胞の表面マーカ、サイズ、もしくは形態などに基づいてサンプル（例えば、末梢血）から細胞を選別もしくは濃縮することによって得ることができる。なお他の態様では、レパートリに対応するリンパ球の集団は、病変組織、例えば、腫瘍組織または感染組織などから得ることができる。一実施形態では、ヒトＴＣＲβ鎖またはその断片を含むクローン型プロファイルは、０．１×１０６〜１．８×１０６の範囲、０．５×１０６〜１．５×１０６の範囲、または０．８×１０６〜１．２×１０６の範囲の数の異なるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ヒトＩｇＨ鎖またはその断片を含むクローン型プロファイルは、０．１×１０６〜１．８×１０６の範囲、０．５×１０６〜１．５×１０６の範囲、または０．８×１０６〜１．２×１０６の範囲の数の異なるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、本発明のクローン型プロファイルは、ＩｇＨ鎖のＶ（Ｄ）Ｊ領域の実質的に全てのセグメントをコードするヌクレオチド配列のセットを含む。一態様では、本明細書で使用される「実質的に全ての」とは、０．００１％以上の相対存在量を有する全てのセグメントのことである；ま���は、別の態様では、本明細書で使用される「実質的に全ての」とは、０．０００１％以上の相対存在量を有する全てのセグメントのことである。別の特定の実施形態では、本発明のクローン型プロファイルは、ＴＣＲβ鎖のＶ（Ｄ）Ｊ領域の実質的に全てのセグメントをコードするヌクレオチド配列のセットを含む。別の実施形態では、本発明のクローン型プロファイルは、２５〜２００ヌクレオチドの範囲の長さを有し、かつＴＣＲβ鎖のＶ領域、Ｄ領域、およびＪ領域のセグメントを含むヌクレオチド配列のセットを含む。別の実施形態では、本発明のクローン型プロファイルは、２５〜２００ヌクレオチドの範囲の長さを有し、かつＩｇＨ鎖のＶ領域、Ｄ領域、およびＪ領域のセグメントを含むヌクレオチド配列のセットを含む。別の実施形態では、本発明のクローン型プロファイルは、異なるＩｇＨ鎖を発現するリンパ球の数に実質的に等しい数の異なるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、本発明のクローン型プロファイルは、異なるＴＣＲβ鎖を発現するリンパ球の数に実質的に等しい数の異なるヌクレオチド配列を含む。なお別の実施形態では、「実質的に等しい」とは、９９％の確率で、クローン型プロファイルが、０．００１％以上の頻度で個体のリンパ球の全ての集団によって保持または発現されるＩｇＨまたはＴＣＲβ、またはその一部をコードするヌクレオチド配列を含むことである。なお別の実施形態では、「実質的に等しい」とは、９９％の確率で、ヌクレオチ
ド配列のレパートリが、０．０００１％以上の頻度で存在する全てのリンパ球によって保持または発現されるＩｇＨまたはＴＣＲβ、またはその一部をコードするヌクレオチド配列を含むことである。一部の実施形態では、クローン型プロファイルは、１０５〜１０７のリンパ球を含むサンプルから得られる。このような数のリンパ球は、１〜１０ｍＬの末梢血サンプルから得ることができる。
【００７３】
「同一にする」とは、配列の差異が、実験誤差または測定誤差によるものであって真の生物学的な差異によるものではないと決定することによって、配列に差異がある２つの候補クローン型を同一として取り扱うことである。一態様では、高頻度の候補クローン型の配列が、低頻度の候補クローン型の配列と比較されて、所定の基準が満たされた場合は、低頻度の候補クローン型の数が、高頻度の候補クローン型の数に加えられ、この後、この低頻度の候補クローン型は無視される。即ち、低頻度候補クローン型に関連したリード数が、高頻度候補クローン型のリード数に加えられる。
【００７４】
「相補性決定領域」（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）とは、分子が抗原の高次構造を補完し、これにより分子の特定の抗原との特異性および接触を決定する免疫グロブリン（即ち、抗体）またはＴ細胞受容体の領域のことである。Ｔ細胞受容体および免疫グロブリンはそれぞれ、３つのＣＤＲを有し、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、可変（Ｖ）ドメインに見られ、ＣＤＲ３は、Ｖドメインの一部、多様性（Ｄ）ドメイン（重鎖のみ）および接合（Ｊ）ドメインの全て、および定常（Ｃ）ドメインの一部を含む。
【００７５】
本明細書で使用される「汚染」とは、ある時点で一個体から採取されたサンプルに、別の個体からの核酸、または別の時点で採取された同じ個体のサンプルからの核酸が存在することである。一態様では、「汚染」とは、本発明のクローン型プロファイルの解釈に影響を与え得る所与の患者の組織サンプルに由来しない核酸が存在することである。
【００７６】
「内部標準」とは、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの絶対定量または相対定量を可能にするために、１つ以上の標的ポリヌクレオチドと同じ反応で処理される核酸配列のことである。一態様では、反応は、増幅反応、例えば、ＰＣＲである。内部標準は、内因性または外因性であり得る。即ち、内部標準は、サンプル中で自然に発生するものでも良いし、または反応の前にサンプルに加えられるものでも良い。一態様では、１つ以上の外因性内部標準配列を、所定の濃度で反応混合物に加えて、増幅された配列を比較してサンプル中の対応する標的ポリヌクレオチドの量を決定する校正を可能にする。外因性内部標準の数、配列、長さ、および他の特性の選択は、当業者にはルーチンの設計上の選択である。外因性内部標準は、本明細書では「基準配列」とも呼ばれ、一定の細胞サイクル依存レベルの転写を示す僅かに調整された遺伝子に対応するサンプルにとって自然な配列である。例えば、セルベイ（Ｓｅｌｖｅｙ）ら著、モレキュラー・アンド・セルラー・プローブス（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ）、２００１年、第１５巻、ｐ．３０７〜３１１。例示的な内部標準としては、限定されるものではないが、次の遺伝子：ＧＡＰＤＨ、β２−ミクログロブリン、１８ＳリボソームＲＮＡ、およびβ−アクチンの配列が挙げられる。
【００７７】
「キット」とは、本発明の方法を行うために材料または試薬を送達するための任意の送達システムのことである。本発明の方法との関連では、このような送達システムは、反応試薬（例えば、適切な容器に入れられたプライマー、酵素、内部標準など）および／または支援材料（例えば、緩衝剤、アッセイなどを行うための取扱説明書）の保存、ある位置から別の位置への移送または送達を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または支援材料を含む１つ以上の容器（例えば、箱）を含む。このような内容物は、目的のレシピエントに一緒にまたは別個に送達することができる。例え
ば、第１の容器は、アッセイに使用される酵素を含み得、第２の容器はプライマーを含む。
【００７８】
「リンパ系腫瘍」とは、悪性または非悪性であり得るリンパ球の異常増殖のことである。リンパ癌は、悪性リンパ系腫瘍である。リンパ系腫瘍は、限定されるものではないが、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ：ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ：ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、有毛細胞白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、移植後リンパ増殖異常、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ：ｍａｎｔｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＢＣＬ：ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、またはＴ細胞リンパ腫などを含むリンパ増殖異常の結果であるか、またはこのようなリンパ増殖異常に関連する。例えば、ジャフィ（Ｊａｆｆｅ）ら著、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、２００８年、第１１２巻、ｐ．４３８４〜４３９９；スウェドレー（Ｓｗｅｒｄｌｏｗ）ら著、造血組織およびリンパ系組織の腫瘍のＷＨＯ分類（ＷＨＯ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｕｒｓ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ）（ｅ．第４版）（ＩＡＲＣプレス（ＩＡＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）、２００８年）。
【００７９】
「微小残留病変」とは、治療後に残る癌細胞のことである。この語は、リンパ腫および白血病の治療に関連して最も頻繁に使用される。
基準配列と別の配列（「比較配列」）の比較に関連して使用される「パーセント相同性」または「パーセント同一」などの語は、２つの配列間の最適なアラインメントでは、比較配列が、示されるパーセンテージに等しい数のサブユニット位置で基準配列と同一であることを意味し、このサブユニットは、ポリヌクレオチドの比較のためのヌクレオチドまたはポリペプチドの比較のためのアミノ酸である。本明細書で使用される、比較される配列の「最適なアラインメント」とは、サブユニット間の一致を最大にし、かつアラインメントの構築に利用されるギャップを最小にするアラインメントのことである。パーセント同一性は、アルゴリズム、例えば、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ）、１９７０年、第４８巻、ｐ．４４３〜４５３（ウイスコンシン配列分析パッケージの「ＧＡＰ」プログラム（“ＧＡＰ”  ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ）、ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、マディソン、ウイスコンシン州）などに記載されている市販のアルゴリズムの実施で決定することができる。アラインメントの構築、およびパーセンテージ同一性または他の類似性の指標の計算に用いられる当分野の他のソフトウェアパッケージは、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）著、アドバンシス・イン・アプライド・マセマティクス（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ）、１９８１年、第２巻、ｐ．４８２〜４８９（ウイスコンシン配列分析パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ）、ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、マディソン、ウイスコンシン州）のアルゴリズムに基づいた、「ＢｅｓｔＦｉｔ」プログラムを含む。言い換えれば、例えば、基準ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、基準配列の最大５％のヌクレオチドを欠失させる、もしくは別のヌクレオチドで置換する、または基準配列のヌクレオチドの総数の最大５％の数のヌクレオチドを基準配列に挿入することができる。
【００８０】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長による特定のＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅反応のことである。言い換えれば、ＰＣＲは、プライマー結合部位に隣接した標的核酸の複数のコピーまたは複製を作製する反
応であり、このような反応は、次のステップの１回以上の反復を含む：（ｉ）標的核酸を変性させるステップ、（ｉｉ）プライマーをプライマー結合部位にアニーリングするステップ、および（ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸の存在下でプライマーを核酸ポリメラーゼによって伸長させるステップ。通常は、この反応は、サーマル・サイクラー装置で各ステップに最適な異なる温度で繰り返される。各ステップでの特定の温度、期間、ステップ間の変化の割合は、例えば、参照文献：マクファーソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）ら編、ＰＣＲ：実践的なアプローチ（ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）およびＰＣＲ２：実践的なアプローチ（ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）（ＩＲＬプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、オックスフォード、それぞれ１９９１年および１９９５年）によって例示されている、当業者に周知の多数の因子によって決まる。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用する従来のＰＣＲでは、二本鎖標的核酸を、９０℃を超える温度で変性させ、プライマーを５０〜７５℃の温度でアニーリングし、そしてプライマーを７２〜７８℃の温度で伸長させることができる。「ＰＣＲ」という語は、限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量ＰＣＲ、およびマルチプレックスＰＣＲなどを含む反応の派生形を包含する。利用される特定の形式のＰＣＲは、本出願との関連から当業者には認識されよう。反応量は、数百ナノリットル、例えば、２００ｎＬ〜数百μＬ、例えば、２００μＬの範囲である。「逆転写ＰＣＲ」または「ＲＴ−ＰＣＲ」とは、標的ＲＮＡを相補的な一本鎖ＤＮＡに変換する逆転写反応が先に起こり、次いで、この一本鎖ＤＮＡが増幅されるＰＣＲのことである。例えば、参照により本明細書に組み入れられるテコット（Ｔｅｃｏｔｔ）らによる米国特許第５，１６８，０３８号明細書。「リアルタイムＰＣＲ」とは、反応産物、即ち、アンプリコンの量が、反応が進行するときに監視されるＰＣＲのことである。様々な形式のリアルタイムＰＣＲが存在し、これらのリアルタイムＰＣＲは主に、反応産物の監視に使用される検出化学が異なる。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、ゲルファント（Ｇｅｌｆａｎｄ）らによる米国特許第５，２１０，０１５号明細書（「ｔａｑｍａｎ」）；ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）らによる米国特許第６，１７４，６７０号明細書および同第６，５６９，６２７号明細書（挿入染料（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ｄｙｅｓ））；チャギ（Ｔｙａｇｉ）らによる米国特許第５，９２５，５１７号明細書（分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ））。リアルタイムＰＣＲの検出化学は、同様に参照により本明細書に組み入れられるマッカイ（Ｍａｃｋａｙ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００２年、第３０巻、ｐ．１２９２〜１３０５に概説されている。「ネステッドＰＣＲ」とは、２段階ＰＣＲのことであり、第１のＰＣＲのアンプリコンが、新たなセットのプライマーを用いる第２のＰＣＲのサンプルとなり、このプライマーの少なくとも１つが、第１のアンプリコンの内部の位置に結合する。ネステッド増幅反応に関連して本明細書で使用される「一次プライマー」とは、第１のアンプリコンを作製するために使用されるプライマーのことであり、「二次プライマー」とは、第２のアンプリコンまたはネステッドアンプリコンを作製するために使用される１つ以上のプライマーのことである。「マルチプレックスＰＣＲ」とは、複数の標的配列（または１つの標的配列と１つ以上の基準配列）が、同じ反応混合物内で同時に増幅されるＰＣＲのことである。例えば、バーナード（Ｂｅｒｎａｒｄ）ら著、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１９９９年、第２７３巻、ｐ．２２１〜２２８（２色リアルタイムＰＣＲ（ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ））。通常は、プライマーの異なるセットが、増幅される各配列に利用される。典型的には、マルチプレックスＰＣＲの標的配列の数は、２〜５０、２〜４０、または２〜３０の範囲である。「定量ＰＣＲ」とは、サンプルまたは標本中の１つ以上の特定の標的配列の存在量を測定するように設計されたＰＣＲのことである。定量ＰＣＲは、このような標的配列の絶対定量および相対定量の両方を含む。定量測定は、標的配列と別個にまたは一緒にアッセイされ得る１つ以上の基準配列または内部標準を用いて行われる。基準配列は、サンプルまたは標本に対して内因性または外因性であり得、後者の場合は、１つ以上の競合鋳型を含み得る。典型的な内因性基準配列は、
次の遺伝子の転写物のセグメントを含む：β−アクチン、ＧＡＰＤＨ、β２−ミクログロブリン、およびリボソームＲＮＡなど。定量ＰＣＲの技術は、当分野で周知であり、参照により本明細書に組み入れられる次の文献に例示されている：フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）ら著、バイオテクニークス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１９９９年、第２６巻、ｐ．１１２〜１２６；ベッカー−アンドレ（Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９８９年、第１７巻、ｐ．９４３７〜９４４７；ジマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ）ら著、バイオテクニークス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１９９６年、第２１巻、ｐ．２６８〜２７９；ディビアッコ（Ｄｉｖｉａｃｃｏ）ら著、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１９９２年、第１２２巻、ｐ．３０１３〜３０２０；ベッカー−アンドレ（Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９８９年、第１７巻、ｐ．９４３７〜９４４６など。
【００８１】
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単量体の線状ポリマーを指し、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ポリヌクレオチドを構成する単量体は、単量体と単量体との相互作用の規定パターン、例えば、ワトソン−クリック型の塩基対合、塩基の積み重ね、またはフーグスティーン型もしくは逆フーグスティーン型の塩基対合などによって天然ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。このような単量体およびそのヌクレオシド間結合は、自然発生し得る、またはそれらの類似体、例えば、天然類似体もしくは非天然類似体であり得る。非天然類似体は、ＰＮＡ、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、および標識、例えば、フルオロフォアまたはハプテンの付着を可能にする連結基を含む塩基などを含み得る。ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結された４つの天然ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡのデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはＲＮＡのそのリボース対応物）を含み得る。しかしながら、ポリヌクレオチドは、例えば、修飾塩基、糖、またはヌクレオシド間結合を含む非天然ヌクレオチド類似体も含み得る。酵素が、活性のために特定のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質の要件（例えば、一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖など）を有することは当業者には明らかであり、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質に適切な組成物の選択は、特に、論文、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、モレキュラー・クローニング（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ）、第２版（コールド・スプリングス・ハーバ研究所（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク、１９８９年）および同様の文献の手引きから、十分に当業者の知識の範囲内である。本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、例えば、３〜６０単量体単位、または一部の実施形態では、１２〜６０の単量体単位を有する小さいポリヌクレオチドを指す。様々な実施形態では、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、文字列（大文字または小文字）、例えば、「ＡＴＧＣＣＴＧ」で表され、ヌクレオチドは、左から右に５’→３’の順であり、特段の記載がなく、文脈から明らかにそうでない場合を除き、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示し、「Ｉ」はデオキシイノシンを示し、「Ｕ」はウリジンを示すことが理解されよう。
【００８２】
「プライマー」とは、ポリヌクレオチド鋳型と二重鎖を形成するときに、核酸合成の開始点として機能し、その３’末端から鋳型に沿って伸長して伸長した二重鎖を形成することができる天然または合成のオリゴヌクレオチドのことである。プライマーの伸長は、通常は、核酸ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼで行われる。伸長プロセス中に付加されるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常は、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは、通常は、１４〜４０ヌクレオチドの範囲、または１８〜３６ヌクレオチドの範囲の長さを有する。プライマーは、様々な核酸増幅反応、例えば、１種類のプライマーを用いる線状増幅反応、または２種類以上のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応に利用される
。特定の適用例に対してプライマーの長さおよび配列を選択する案内は、参照により本明細書に組み入れられる次の参照文献から分かるように当業者には周知である：ディーフェンバッハ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ）編、ＰＣＲプライマー：実習マニュアル（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版（コールド・スプリング・ハーバ・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、２００３年）。
【００８３】
「品質スコア」とは、特定の配列位置での塩基の割り当てが正確である確率の指標のことである。特定の状況、例えば、異なるシークエンシング化学、検出システム、およびベースコーリングアルゴリズムなどの結果としてベースコーリングされた塩基に対する品質スコアを計算する様々な方法が当業者に周知である。一般に、品質スコアの値は、正確なベースコーリングの確率に単調に関連する。例えば、１０の品質スコアまたはＱは、塩基が正確にベースコーリングされる確率が９０％であることを意味し、２０のＱは、塩基が正確にベースコーリングされる確率が９９％であることを意味し、以降同様である。一部のシークエンシングプラットフォーム、特に、合成化学によるシークエンシングを用いるシークエンシングプラットフォームでは、平均品質スコアは、配列リードの長さの関数として低下するため、配列リードの最初の品質スコアは、配列リードの末端の品質スコアよりも高く、このような低下は、現象、例えば、不完全な伸長、繰り越し伸長（ｃａｒｒｙ
ｆｏｒｗａｒｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、鋳型の減少、ポリメラーゼの減少、キャッピングの失敗、および脱保護の失敗などによるものである。
【００８４】
「配列リード」とは、シークエンシング技術によって生成される一連のデータまたはデータのストリームから決定されるヌクレオチド配列のことであり、この決定は、例えば、技術に関連したベースコーリングソフトウェア、例えば、ＤＮＡシークエンシングプラットフォームの供給業者からのベースコーリングソフトウェアによって行われる。配列リードは、通常は、配列の各ヌクレオチドの品質スコアを含む。典型的には、配列リードは、プライマーを、例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼを用いて鋳型核酸に沿って伸長させることによって作製される。データは、このような伸長に関連したシグナル、例えば、光シグナル、化学シグナル（例えば、ｐＨの変化）、または電気シグナルを記録することによって生成される。このような初期データが、配列リードに変換される。
【００８５】
「配列タグ」（もしくは「タグ」）または「バーコード」とは、ポリヌクレオチドまたは鋳型分子に付着されたオリゴヌクレオチドのことであり、１回の反応または一連の反応でポリヌクレオチドまたは鋳型分子を識別し、かつ／または追跡するために使用される。配列タグは、ポリヌクレオチドまたは鋳型の３’末端もしくは５’末端に付着させることができ、または配列タグは、このようなポリヌクレオチドまたは鋳型の内部に挿入して線状コンジュゲートを形成することができ、この線状コンジュゲートは、本明細書では、「タグ付きポリヌクレオチド」、「タグ付き鋳型」、「タグ−ポリヌクレオチドコンジュゲート（タグとポリヌクレオチドのコンジュゲート）」、または「タグ−分子コンジュゲート（タグと分子とのコンジュゲート）」などと呼ばれることもある。配列タグは、サイズおよび組成が非常に多様であり得；参照により本明細書に組み入れられる次の文献が、特定の実施形態に適切な配列タグのセットを選択するための案内を示す：ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）による米国特許第５，６３５，４００号明細書；ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）およびマチェビッツ（Ｍａｃｅｖｉｃｚ）による米国特許第７，５３７，８９７号明細書；ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、２０００年、第９７巻、ｐ．１６６５〜１６７０；チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）らによる欧州特許公開第０３０３４５９号明細書；シューメーカ（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ）ら著、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、１９９６年、第１４巻、ｐ．４５０〜４５６；モーリス（Ｍｏｒｒｉｓ）らによる欧州特許出願公開第０７９９８９７Ａ１号明細書；ワレス（Ｗａｌｌａｃｅ）による米国特
許第５，９８１，１７９号など。配列タグの長さおよび組成は、非常に多様であり得、特定の長さおよび／または組成の選択は、限定されるものではないが、例えば、ハイブリダイゼーション反応または酵素反応、例えば、シークエンシングによってタグがどのように使用されて読出しが生成されるか；例えば、蛍光染料などで配列タグが標識されているか否か；ポリヌクレオチドのセットなどを一義的に識別するために必要な区別可能なオリゴヌクレオチドタグの数、および、例えば、クロスハイブリダイゼーションまたはシークエンシングエラーによる誤認が存在しない、確実な識別を保障するためにタグのセットがどの程度異なっていなければならないかを含め、いくつかの因子によって決まる。一態様では、配列タグはそれぞれ、２〜３６ヌクレオチド、４〜３０ヌクレオチド、８〜２０ヌクレオチド、または６〜１０ヌクレオチドの範囲内の長さを有し得る。一態様では、配列タグのセットが使用され、各配列タグのセットは、同じセットの他のどのタグのヌクレオチド配列とも少なくとも２つの塩基が異なるユニークなヌクレオチド配列を有し；別の態様では、配列タグのセットが使用され、各配列タグのセットは、同じセットの他のどのタグとも少なくとも３つの塩基が異なる。
【００８６】
「配列ツリー」とは、ヌクレオチド配列を表すツリーデータ構造のことである。一態様では、本発明のツリーデータ構造は、循環または循環経路を含まないノードおよびエッジを含む根付き有向木である。本発明のツリーデータ構造のエッジからノードは、通常は順序付けられている。ノードおよび／またはエッジは、値を含み得る構造、または値に関連し得る構造である。木の各ノードは、０以上の子ノードを有し、子ノードは、慣例により、木の中のノードの下に示されている。子を有するノードは、子の親ノードと呼ばれる。ノードは、多くとも１つの親しか有さない。子を一切有してないノードは、葉ノードと呼ばれる。木の最上位ノードは、根ノードと呼ばれる。最上位ノードであると、根ノードは親を有していない。最上位ノードは、木に対する操作が通常始まるノードである（ただし、一部のアルゴリズムは、葉ノードで始まり、根で操作が終了する）。他の全てのノードには、エッジまたはリンクを辿ることによって到達することができる。
【００８７】
配列表
【００８８】
【表１】
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【図１Ａ】
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【図３】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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