(57)【要約】  ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５を含む構築物、およびその突然変異体を提供する。種々の実施形態において、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５を含む構築物、およびその突然変異体は、代謝性障害の治療または緩和における使用に有用であり得る。種々の実施形態において、代謝性疾患または障害は、２型糖尿病、肥満、脂質異常症、高グルコースレベル、高インスリンレベル、および糖尿病性腎症である。
2015506373.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＤＦ１５ポリペプチドおよび１つ以上のＦｃ配列を含む、構築物。
【請求項２】
２つ以上のＦｃ配列を含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
Ｆｃ配列のうちの１つ以上が、独立して、配列番号１８、１９、８５、８６、８９、９０、９１、９９、１００、１０８、１０９、および１１１からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の構築物。
【請求項４】
Ｆｃ配列のうちの２つ以上が、結合される、請求項３に記載の構築物。
【請求項５】
ＧＤＦ１５ポリペプチドとＦｃ配列のうちの１つ以上とが、連続した配列を形成する、請求項４に記載の構築物。
【請求項６】
ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＦｃ配列が、リンカーによって接合される、請求項５に記載の構築物。
【請求項７】
配列番号４４、５０、５７、６１、６５、６９、７４、７９、８４、９５、および１０４からなる群から選択される配列を含む、請求項６に記載の構築物。
【請求項８】
配列番号１８、１９、８５、８６、８９、９０、９１、９９、１００、１０８、１０９、および１１０からなる群から選択される配列をさらに含む、請求項７に記載の構築物。
【請求項９】
請求項８に記載の構築物を含む、二量体。
【請求項１０】
（ａ）  配列番号１８を含む配列および配列番号４４を含む配列、
（ｂ）  配列番号８６を含む配列および配列番号５０を含む配列、
（ｃ）  配列番号１８を含む配列および配列番号５７を含む配列、
（ｄ）  配列番号８６を含む配列および配列番号６１を含む配列、
（ｅ）  配列番号８６を含む配列および配列番号６５を含む配列、
（ｆ）  配列番号８６を含む配列および配列番号６９を含む配列、
（ｇ）  配列番号８６を含む配列および配列番号７４を含む配列、
（ｈ）  配列番号８６を含む配列および配列番号７９を含む配列、
（ｉ）  配列番号８６を含む配列および配列番号８４を含む配列、
（ｊ）  配列番号９１を含む配列および配列番号９５を含む配列、または
（ｋ）  配列番号１００を含む配列および配列番号１０４を含む配列、
からなる群から選択される構築物を含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の構築物を含む二量体を含む、構築物。
【請求項１２】
１つ以上のＦｃ配列が、独立して、配列番号２３、１１０、１１４、および１１５からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の構築物。
【請求項１３】
２つ以上のＦｃ配列が、結合される、請求項１２に記載の構築物。
【請求項１４】
ＧＤＦ１５ポリペプチドとＦｃ配列のうちの１つ以上とが、連続した配列を形成する、請求項１３に記載の構築物。
【請求項１５】
ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＦｃ配列が、リンカーによって接合される、請求項１４に記載の構築物。
【請求項１６】
配列番号１１３を含む、請求項１５に記載の構築物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の構築物を含む、二量体。
【請求項１８】
配列番号１１０を含む配列および配列番号１１３を含む配列を含む、請求項１２に記載の構築物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の構築物を含む、二量体。
【請求項２０】
Ｆｃ配列のうちの１つ以上が、独立して、配列番号２８および３０からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の構築物。
【請求項２１】
Ｆｃ配列のうちの２つ以上が、リンカーによって接合される、請求項２０に記載の構築物。
【請求項２２】
リンカーが、配列番号８７、８８、および１３１からなる群から選択される配列を含む、請求項２１に記載の構築物。
【請求項２３】
第１のＦｃ配列のＣ末端が、第２のＦｃ配列のＮ末端に接合される、請求項２２に記載の構築物。
【請求項２４】
ＧＤＦ１５ポリペプチドとＦｃ配列のうちの１つ以上とが、連続した配列を形成する、請求項２３に記載の構築物。
【請求項２５】
ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＦｃ配列が、リンカーによって接合される、請求項２４に記載の構築物。
【請求項２６】
リンカーが、配列番号３１を含む、請求項２５に記載の構築物。
【請求項２７】
請求項２６に記載の構築物を含む、二量体。
【請求項２８】
配列番号３３、１２３、および１２８からなる群から選択される配列を含む、請求項２０に記載の構築物。
【請求項２９】
請求項２８に記載の構築物を含む、二量体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通じてＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１３年１月２８日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、Ａ１６８２ＷＯＰ．ｔｘｔという名称であり、サイズは２５３，１５５バイトである。
【０００２】
発明の分野
本開示は、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５を含むポリペプチド、ならびにその生成および使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
成長分化因子１５（ＧＤＦ１５）は、ＴＧＦβスーパーファミリーの分岐メンバーである。これは、マクロファージ阻害性サイトカイン１（ＭＩＣ１）（Ｂｏｏｔｃｏｖ  ＭＲ，１９９７，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９４：１１５１４−９．）、胎盤骨形成因子（ＰＬＡＢ）（Ｈｒｏｍａｓ  Ｒ  １９９７，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１３５４：４０−４）、胎盤形質転換成長因子β（ＰＴＧＦＢ）（Ｌａｗｔｏｎ  ＬＮ  １９９７，Ｇｅｎｅ．２０３：１７−２６）、前立腺由来因子（ＰＤＦ）（Ｐａｒａｌｋａｒ  ＶＭ  １９９８，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７３：１３７６０−７）、および非ステロイド性抗炎症薬活性化遺伝子（ＮＡＧ−１）（Ｂａｅｋ  ＳＪ  ２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６：３３３８４−９２）とも称される。
【０００４】
ヒトＧＤＦ１５遺伝子は、染色体１９ｐ１３．２〜１３．１上に位置し、ラットＧＤＦ１５遺伝子は、染色体１６上に位置し、マウスＧＤＦ１５遺伝子は、染色体８上に位置する。ＧＤＦ１５オープンリーディングフレームは、２つのエクソンに及ぶ（Ｂｏｔｔｎｅｒ  Ｍ  １９９９，Ｇｅｎｅ．２３７：１０５−１１およびＮＣＢＩ）。成熟ＧＤＦ１５ペプチドは、他のファミリーメンバーと低い相同性を共有する（Ｋａｔｏｈ  Ｍ  ２００６，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１７：９５１−５．）。
【０００５】
ＧＤＦ１５は、二塩基性切断部位で切断されて、カルボキシ末端成熟ペプチドを放出する、大きな前駆体タンパク質として合成される。マウスおよびラットＧＤＦ１５プレプロペプチドはいずれも、３０３個のアミノ酸を含有する。ヒト全長前駆体は、３０８個のアミノ酸を含有する。齧歯類成熟ペプチドは、ＲＧＲＲ（配列番号１）切断部位でのプロセシング後に、１１５個のアミノ酸を含有する。ヒト成熟ペプチドは、ＲＧＲＲＲＡＲ（配列番号２）切断部位でのプロセシング後に、１１２個のアミノ酸を含有する。ヒト成熟ＧＤＦ１５ペプチドは、ラットおよびマウス成熟ＧＤＦ１５ペプチドと６６．１％および６８．１％の配列類似性を共有する（Ｂｏｔｔｎｅｒ  Ｍ  １９９９，Ｇｅｎｅ．２３７：１０５−１１、Ｂａｕｓｋｉｎ  ＡＲ  ２０００，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：２２１２−２０、ＮＣＢＩ）。成熟ＧＤＦ１５ペプチドにはグリコシル化部位が存在しない。
【０００６】
成熟ＧＤＦ１５ペプチドは、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーに一般的である、システインノットモチーフ（３つの鎖内ジスルフィド結合を有する）および単一の鎖間ジスルフィド結合の形成に必要な７個の保存システイン残基を含有する。成熟ＧＤＦ１５ペプチドは、さらに、第４の鎖内ジスルフィド結合を形成する２つの追加のシステイン残基を含有する。生物学的に活性なＧＤＦ１５は、１つの鎖間ジスルフィド結合によって共有結合された成熟ペプチドの２５ＫＤのホモ二量体である。
【０００７】
ＧＤＦ１５の血液循環レベルは、複数の病理学的および生理学的状態、最も顕著には妊娠（Ｍｏｏｒｅ  ＡＧ  ２０００．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８５：４７８１−４７８８）、βサラセミア（Ｔａｎｎｏ  Ｔ  ２００７，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １３：１０９６−１０１）（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ＭＢ，２００８  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ８８：１０２６−３１）、および先天性赤血球異形成貧血（Ｔａｍａｒｙ  Ｈ  ２００８，Ｂｌｏｏｄ．１１２：５２４１−４）において上昇することが報告されている。ＧＤＦ１５はまた、文献報告において、複数の生物学的活性に関連付けられている。ＧＤＦ１５ノックアウトおよびトランスジェニックマウスの研究は、ＧＤＦ１５が、虚血／再灌流誘発性または過負荷誘発性の心臓損傷に対して保護効果があり（Ｋｅｍｐｆ  Ｔ，２００６，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．９８：３５１−６０）（Ｘｕ  Ｊ，２００６，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．９８：３４２−５０）、加齢関連の運動ニューロンおよび感覚ニューロンの消失に対して保護効果があり（Ｓｔｒｅｌａｕ  Ｊ，２００９，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２９  ：１３６４０−８）、腎臓の代謝性アシドーシスに対して軽度に保護効果がある可能性があり、癌患者の悪液質をもたらす可能性がある（Ｊｏｈｎｅｎ  Ｈ  ２００７  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１１：１３３３−４０）ことを示唆した。また、多数のグループが細胞のアポトーシスおよび増殖におけるＧＤＦ１５の役割を研究し、異なる細胞培養および異種移植モデルを用いて議論の余地のある結果を報告している。トランスジェニックマウスにおける研究は、ＧＤＦ１５が、腸および肺における発癌性物質またはＡｐｃ突然変異に誘発される新生物形成に対して保護効果があることを示した（Ｂａｅｋ  ＳＪ  ２００６，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１３１：１５５３−６０、Ｃｅｋａｎｏｖａ  Ｍ  ２００９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ  ２：４５０−８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｏｏｔｃｏｖ  ＭＲ，１９９７，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９４：１１５１４−９
【非特許文献２】Ｈｒｏｍａｓ  Ｒ  １９９７，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１３５４：４０−４
【非特許文献３】Ｌａｗｔｏｎ  ＬＮ  １９９７，Ｇｅｎｅ．２０３：１７−２６
【非特許文献４】Ｐａｒａｌｋａｒ  ＶＭ  １９９８，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７３：１３７６０−７
【非特許文献５】Ｂａｅｋ  ＳＪ  ２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６：３３３８４−９２
【非特許文献６】Ｂｏｔｔｎｅｒ  Ｍ  １９９９，Ｇｅｎｅ．２３７：１０５−１１
【非特許文献７】Ｋａｔｏｈ  Ｍ  ２００６，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１７：９５１−５
【非特許文献８】Ｂａｕｓｋｉｎ  ＡＲ  ２０００，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：２２１２−２０
【非特許文献９】Ｍｏｏｒｅ  ＡＧ  ２０００．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８５：４７８１−４７８８
【非特許文献１０】Ｔａｎｎｏ  Ｔ  ２００７，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １３：１０９６−１０１
【非特許文献１１】Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ＭＢ，２００８  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ８８：１０２６−３１
【非特許文献１２】Ｔａｍａｒｙ  Ｈ  ２００８，Ｂｌｏｏｄ．１１２：５２４１−４
【非特許文献１３】Ｋｅｍｐｆ  Ｔ，２００６，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．９８：３５１−６０
【非特許文献１４】Ｘｕ  Ｊ，２００６，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．９８：３４２−５０
【非特許文献１５】Ｓｔｒｅｌａｕ  Ｊ，２００９，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２９  ：１３６４０−８
【非特許文献１６】Ｊｏｈｎｅｎ  Ｈ  ２００７  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１１：１３３３−４０
【非特許文献１７】Ｂａｅｋ  ＳＪ  ２００６，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１３１：１５５３−６０
【非特許文献１８】Ｃｅｋａｎｏｖａ  Ｍ  ２００９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ  ２：４５０−８
【発明の概要】
【０００９】
ＧＤＦ１５ポリペプチドおよび１つ以上のＦｃ配列を含む構築物を、本明細書に提供する。一実施形態において、構築物は、２つ以上のＦｃ配列を含む。さらなる実施形態において、Ｆｃ配列のうちの１つ以上は、独立して、配列番号１８、１９、８５、８６、８９、９０、９１、９９、１００、１０８、１０９、および１１１からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態において、Ｆｃ配列のうちの２つ以上は、結合される。なおもさらなる実施形態において、ＧＤＦ１５ポリペプチドとＦｃ配列のうちの１つ以上とが、連続した配列を形成する。さらに別の実施形態において、ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＦｃ配列は、リンカーによって接合される。別の実施形態において、構築物は、配列番号４４、５０、５７、６１、６５、６９、７４、７９、８４、９５、および１０４からなる群から選択される配列を含む。なおもさらなる実施形態において、構築物は、配列番号１８、１９、８５、８６、８９、９０、９１、９９、１００、１０８、１０９、および１１０からなる群から選択される配列をさらに含む。別の実施形態において、本明細書に記載される構築物を含む二量体を提供する。具体的な実施形態において、構築物は、（ａ）配列番号１８を含む配列および配列番号４４を含む配列、（ｂ）配列番号８６を含む配列および配列番号５０を含む配列、（ｃ）配列番号１８を含む配列および配列番号５７を含む配列、（ｄ）配列番号８６を含む配列および配列番号６１を含む配列、（ｅ）配列番号８６を含む配列および配列番号６５を含む配列、（ｆ）配列番号８６を含む配列および配列番号６９を含む配列、（ｇ）配列番号８６を含む配列および配列番号７４を含む配列、（ｈ）配列番号８６を含む配列および配列番号７９を含む配列、（ｉ）配列番号８６を含む配列および配列番号８４を含む配列、（ｊ）配列番号９１を含む配列および配列番号９５を含む配列、または（ｋ）配列番号１００を含む配列および配列番号１０４を含む配列を含み、同様に、その構築物を含む二量体を含む。
【００１０】
さらに、ＧＤＦ１５ポリペプチドおよび２つ以上のＦｃ配列を含む構築物であって、１つ以上のＦｃ配列は、独立して、配列番号２３、１１０、１１４、および１１５からなる群から選択される配列を含む、構築物を、本明細書に提供する。一実施形態において、２つ以上のＦｃ配列は、結合される。さらなる実施形態において、ＧＤＦ１５ポリペプチドとＦｃ配列のうちの１つ以上とが、連続した配列を形成する。さらに別の実施形態において、ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＦｃ配列は、リンカーによって接合される。なおもさらなる実施形態において、構築物は、配列番号１１３を含む。別の実施形態において、本明細書に記載される構築物を含む二量体を提供する。具体的な実施形態において、構築物は、配列番号１１０を含む配列および配列番号１１３を含む配列を含み、同様に、その構築物を含む二量体を含む。
【００１１】
ＧＤＦ１５ポリペプチドおよび２つ以上のＦｃ配列を含む構築物であって、Ｆｃ配列が、配列番号２８および配列番号３０を含む、構築物もまた、本明細書に提供する。一実施形態において、２つのＦｃ配列は、リンカーによって接合される。別の実施形態において、リンカーは、配列番号８７、８８、および１３１からなる群から選択される配列を含む。なおも別の実施形態において、第１のＦｃ配列のＣ末端は、第２のＦｃ配列のＮ末端に接合される。さらに別の実施形態において、ＧＤＦ１５ポリペプチドとＦｃ配列のうちの１つ以上とが、連続した配列を形成する。なおもさらなる実施形態において、ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＦｃ配列は、リンカーによって接合される。別の実施形態において、リンカーは、配列番号３１を含む。なおもさらなる実施形態において、本明細書に記載される構築物の二量体を含む構築物を提供する。具体的な実施形態において、構築物は、配列番号３３、１２３、および１２８からなる群から選択される配列を含み、同様に、その構築物を含む二量体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（図１Ａ）、荷電対構築物ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）（図１Ｂ）、およびヘミ構築物Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（図１Ｃ）の配設を示す一連の図である。図１は、「（Ｇ４Ｓ）４」（配列番号２０）、「ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４」（配列番号３１）、および「（Ｇ４Ｓ）８」（配列番号３４）を開示する。
【図２】次のＧＤＦ１５構築物の二量体について研究した過食ｏｂ／ｏｂマウスにおける食物摂取量アッセイの結果を示す表である：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）２−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（１Ｋ）−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｌ３５１Ｃ）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｌ３５１Ｃ）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｓ３５４Ｃ）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｙ３４９Ｃ）、ＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（−）、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）５−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５、ＧＤＦ１５、およびＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）変異体。
【図３】ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量（食物ｇ／体重（ＢＷ）ｇに対する効果を用量の関数（ｌｏｇ［タンパク質ｇ／ＢＷ  ｋｇ］）として示すプロットである。
【図４】ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）構築物の二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量に対する効果を用量の関数として示すプロットである。
【図５】ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量に対する効果を用量の関数として示すプロットである。
【図６】ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）構築物の二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量に対する効果を用量の関数として示すプロットである。
【図７】ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）構築物の二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量に対する効果を用量の関数として示すプロットである。
【図８】ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）構築物の二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量に対する効果を用量の関数として示すプロットである。
【図９】ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）構築物の二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量に対する効果を用量の関数として示すプロットである。
【図１０】ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）２−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）構築物の二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量に対する効果を用量の関数として示すプロットである。
【図１１】ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）構築物の二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量に対する効果を用量の関数として示すプロットである。
【図１２】ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（１Ｋ）−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）構築物の二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量に対する効果を用量の関数として示すプロットである。
【図１３】ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｌ３５１Ｃ）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｌ３５１Ｃ）構築物の二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量に対する効果を用量の関数として示すプロットである。
【図１４】ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｓ３５４Ｃ）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｙ３４９Ｃ）構築物の二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量に対する効果を用量の関数として示すプロットである。
【図１５】ＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（−）構築物の二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量に対する効果を用量の関数として示すプロットである。
【図１６】Ｆｃ−Ｇ（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量に対する効果を用量の関数として示すプロットである。
【図１７】Ｆｃ−Ｇ（Ｇ４Ｓ）３−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量に対する効果を用量の関数として示すプロットである。
【図１８】Ｆｃ−Ｇ（Ｇ４Ｓ）５−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量に対する効果を用量の関数として示すプロットである。
【図１９】天然の成熟ＧＤＦ１５二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量に対する効果を用量の関数として示すプロットである。
【図２０】天然の成熟ｈＧＤＦ１５二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量に対する効果を用量の関数として示すプロットである。
【図２１】成熟ｈＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）変異体二量体を使用した、ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量に対する効果を用量の関数として示すプロットである。
【図２２】トリグリセリド（ｍｇ／ｄＬ）に対する天然の成熟ＧＤＦ１５二量体（１ｍｇ／ｋｇ、静脈内）、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体（１ｍｇ／ｋｇ、静脈内）、および対照の効果を示す、脂質耐性アッセイの結果の棒グラフである。
【図２３】トリグリセリド（ｍｇ／ｄＬ）に対する効果を用量の関数（ｌｏｇ［構築物ｇ／ＢＷ  ｋｇ］）として示す、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物を使用した脂質耐性アッセイの結果のプロットである。
【図２４】天然の成熟ｈＧＤＦ１５の二量体を使用した脂質耐性アッセイの結果を示すプロットである。
【図２５】成熟ｈＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）変異体の二量体を使用した脂質耐性アッセイの結果を示すプロットである。
【図２６】ＤＩＯ（食事誘発性肥満）マウスにおいて、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、およびロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔｉｚｏｎｅ）（Ｒｏｓｉ）を使用して行った２週間のＯＧＴＴの結果を示すプロットである。
【図２７】ＡＵＣデータの形態で図２６のデータを要約する棒グラフである。
【図２８】ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）を使用して行った５週間のＯＧＴＴの結果を示すプロットである。
【図２９】ＡＵＣデータの形態で図２８のデータを要約する棒グラフである。
【図３０】ＤＩＯマウスの体重（ｇ）に対する、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）の効果を示すプロットである。
【図３１】ＤＩＯマウスの食物摂取量（食物ｇ／動物／日）に対する、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）の効果を示すプロットである。
【図３２】４時間の絶食後のＤＩＯマウスのグルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）に対する、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）の効果を示す棒グラフである。
【図３３】４時間の絶食後のＤＩＯマウスのインスリンレベル（ｎｇ／ｍＬ）に対する、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）の効果を示すプロットである。
【図３４】ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）を投与したＤＩＯマウスの一晩の絶食後のインスリンレベル（ｎｇ／ｍＬ）に対する効果を示す棒グラフである。
【図３５】ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）を投与したＤＩＯマウスの４時間の絶食後のトリグリセリドレベル（ｍｇ／ｄＬ）に対する効果を示すプロットである。
【図３６】ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）を投与したＤＩＯマウスの一晩の絶食後のトリグリセリドレベル（ｍｇ／ｄＬ）に対する効果を示す棒グラフである。
【図３７】ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）を投与したＤＩＯマウスの４時間の絶食後の総コレステロールレベル（ｍｇ／ｄＬ）に対する効果を示すプロットである。
【図３８】ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）を投与したＤＩＯマウスの一晩の絶食後の総コレステロールレベル（ｍｇ／ｄＬ）に対する効果を示す棒グラフである。
【図３９】ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）の二量体を投与したＤＩＯマウスに行った、４時間の絶食後の２週間のＯＧＴＴの結果を示すプロットである。
【図４０】ＡＵＣデータの形態で図３９のデータを要約する棒グラフである。
【図４１】ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）を投与したＤＩＯマウスに行った、一晩の絶食後の５週間のＯＧＴＴの結果を示すプロットである。
【図４２】ＡＵＣデータの形態で図４１のデータを要約する棒グラフである。
【図４３】ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）を投与したＤＩＯマウスの体重に対する効果を示すプロットである。
【図４４】ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）を投与したＤＩＯマウスの食物摂取量に対する効果を示すプロットである。
【図４５】ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）を投与したＤＩＯマウスの４時間の絶食後のグルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）に対する効果を示す棒グラフである。
【図４６】ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）を投与したＤＩＯマウスの４時間の絶食後のインスリンレベル（ｍｇ／ｄＬ）に対する効果を示すプロットである。
【図４７】ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）を使用した、自由給餌させたＤＩＯマウスのインスリンレベルに対する効果を示す棒グラフである。
【図４８】一晩の絶食後のＤＩＯマウスのインスリンレベル（ｍｇ／ｄＬ）に対する、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）の効果を示す棒グラフである。
【図４９】４時間の絶食後のＤＩＯマウスのトリグリセリドレベル（ｍｇ／ｄＬ）に対する、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）の効果を示す棒グラフである。
【図５０】自由給餌させたＤＩＯマウスのトリグリセリドレベル（ｍｇ／ｄＬ）に対する、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）の効果を示す棒グラフである。
【図５１】一晩の絶食後のＤＩＯマウスのトリグリセリドレベル（ｍｇ／ｄＬ）に対する、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）の効果を示す棒グラフである。
【図５２】４時間の絶食後のＤＩＯマウスの総コレステロールレベル（ｍｇ／ｄＬ）に対する、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）の効果を示す棒グラフである。
【図５３】自由給餌させたＤＩＯマウスの総コレステロールレベル（ｍｇ／ｄＬ）に対する、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）の効果を示すプロットである。
【図５４】一晩の絶食後のＤＩＯマウスの総コレステロールレベル（ｍｇ／ｄＬ）に対する、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）の効果を示す棒グラフである。
【図５５】Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体およびＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体を使用して肥満カニクイザルにおいて行った５週間の処置の試験設計を図によって示す図である。
【図５６】カニクイザル研究におけるＦｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体およびＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体の血清レベル（ｎｇ／ｍＬ）を示すプロットである。
【図５７】Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびビヒクルを使用してカニクイザルに行った、一晩の絶食後の順化ＯＧＴＴの結果をグルコースＡＵＣデータの形態で示す棒グラフである。
【図５８】Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびビヒクルの２週間の投与後にカニクイザルに行った、一晩の絶食後のＯＧＴＴの結果をグルコースＡＵＣデータの形態で示す棒グラフである。
【図５９】Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびビヒクルの５週間の投与後にカニクイザルに行った、一晩の絶食後のＯＧＴＴの結果をグルコースＡＵＣデータの形態で示す棒グラフである。
【図６０】Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびビヒクルを使用して、４週間の断薬（ｗａｓｈ  ｏｕｔ）後にカニクイザルに行った、一晩の絶食後のＯＧＴＴの結果をグルコースＡＵＣデータの形態で示す棒グラフである。
【図６１】Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびビヒクルを使用してカニクイザルに行った、一晩の絶食後の順化ＯＧＴＴの結果をインスリンＡＵＣデータの形態で示す棒グラフである。
【図６２】Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびビヒクルの２週間の投与後にカニクイザルに行った、一晩の絶食後のＯＧＴＴの結果をインスリンＡＵＣデータの形態で示す棒グラフである。
【図６３】Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびビヒクルの５週間の投与後にカニクイザルに行った、一晩の絶食後のＯＧＴＴの結果をインスリンＡＵＣデータの形態で示す棒グラフである。
【図６４】Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＦｃ（＋）構築物の二量体、およびビヒクルの４週間の断薬後にカニクイザルに行った、一晩の絶食後のＯＧＴＴの結果をインスリンＡＵＣデータの形態で示す棒グラフである。
【図６５】Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびビヒクルを使用してカニクイザルに行った、３０日間の処置の前、その期間中、および続く断薬期間に収集した、時間（日）の関数としての体重（ｋｇ）のプロットである。
【図６６】Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびビヒクルを使用してカニクイザルに行った、５週間の処置の前、その期間中、および続く４週間の断薬期間に収集した、時間（日）の関数としての１日の食物摂取量（ｇ）のプロットである。
【図６７】Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびビヒクルを使用してカニクイザルに行った、５週間の処置の前、その期間中、および続く４週間の断薬期間に収集した、時間（日）の関数としての絶食時トリグリセリド（ｍｇ／ｄＬ）のプロットである。
【図６８】Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびビヒクルを使用してカニクイザルに行った、５週間の処置の前、その期間中、および続く４週間の断薬期間に収集した、時間（日）の関数としての絶食時インスリン（ｎｇ／ｄＬ）のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示は、ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物を提供する。さらに、本開示の分子の生成、ならびに、例えば、２型糖尿病、高グルコースレベル、高インスリンレベル、脂質異常症、または肥満等、代謝性障害の治療におけるその使用を提供する。
【００１４】
実施例を含む本明細書において使用される組み換えポリペプチドおよび核酸の方法は、概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４）に記載されており、これらはいずれも、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【００１５】
Ｉ．  一般定義
慣例に従って、本明細書に使用される際、「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、別途具体的に示されない限り、「１つ以上の」を意味する。
【００１６】
本明細書に使用される際、「アミノ酸」および「残基」という用語は互換可能であり、ペプチドまたはポリペプチドの文脈で使用される場合、天然および合成の両方のアミノ酸、ならびにアミノ酸類似体、アミノ酸模倣体、および天然のアミノ酸に化学的に類似する非天然のアミノ酸を指す。
【００１７】
「天然のアミノ酸」および「天然にコードされるアミノ酸」という用語は、互換可能に使用され、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸、ならびに合成後に修飾される遺伝子コードによってコードされるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩、およびＯ−ホスホセリンを指す。
【００１８】
「アミノ酸類似体」は、天然のアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合するα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホキシドである。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有し得るが、天然のアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。
【００１９】
「アミノ酸模倣体」とは、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然のアミノ酸と類似の様式で機能する化学的化合物である。例としては、アミド、β−、γ−、δ−イミノ酸（例えば、ピペリジン−４−カルボン酸）等のメタクリロイルまたはアクリロイル誘導体が挙げられる。
【００２０】
「非天然のアミノ酸」および「非天然にコードされるアミノ酸」という用語は、互換可能に使用され、天然のアミノ酸と同じ基本化学構造を有するが、翻訳複合体によって成長するポリペプチド鎖に組み込まれない化合物を指す。「非天然のアミノ酸」にはまた、天然にコードされるアミノ酸（２０種類の一般のアミノ酸を含むがこれらに限定されない）の修飾（例えば、翻訳後修飾）によって生じるが、それ自体は翻訳複合体によって成長するポリペプチドに天然に組み込まれないアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチド配列に挿入され得るか、またはポリペプチド配列中の野生型残基と置換され得る、非天然のアミノ酸の非限定的な例の列挙としては、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、環式アミノ酸、および誘導体化された側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。例としては、（Ｌ型またはＤ型、括弧内に略す）シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモシトルリン（ｈＣｉｔ）、Ｎα−メチルシトルリン（ＮＭｅＣｉｔ）、Ｎα−メチルホモシトルリン（Ｎα−ＭｅＨｏＣｉｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｎα−メチルオルニチン（Ｎα−ＭｅＯｒｎまたはＮＭｅＯｒｎ）、サルコシン（Ｓａｒ）、ホモリジン（ｈＬｙｓまたはｈＫ）、ホモアルギニン（ｈＡｒｇまたはｈＲ）、ホモグルタミン（ｈＱ）、Ｎα−メチルアルギニン（ＮＭｅＲ）、Ｎα−メチルロイシン（Ｎα−ＭｅＬまたはＮＭｅＬ）、Ｎ−メチルホモリジン（ＮＭｅＨｏＫ）、Ｎα−メチルグルタミン（ＮＭｅＱ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸（Ｏｉｃ）、３−（１−ナフチル）アラニン（１−Ｎａｌ）、３−（２−ナフチル）アラニン（２−Ｎａｌ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、２−インダニルグリシン（ＩｇＩ）、パラ−インドフェニルアラニン（ｐＩ−Ｐｈｅ）、パラ−アミノフェニルアラニン（４ＡｍＰまたは４−アミノ−Ｐｈｅ）、４−グアニジノフェニルアラニン（Ｇｕｆ）、グリシルリジン（「Ｋ（Ｎε−グリシル）」または「Ｋ（グリシル）」または「Ｋ（ｇｌｙ）」と略す）、ニトロフェニルアラニン（ニトロｐｈｅ）、アミノフェニルアラニン（アミノｐｈｅまたはアミノ−Ｐｈｅ）、ベンジルフェニルアラニン（ベンジルｐｈｅ）、γ−カルボキシグルタミン酸（γ−カルボキシｇｌｕ）、ヒドロキシプロリン（ヒドロキシｐｒｏ）、ｐ−カルボキシ−フェニルアラニン（Ｃｐａ）、α−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、Ｎα−メチルバリン（ＮＭｅＶａｌ）、Ｎ−α−メチルロイシン（ＮＭｅＬｅｕ）、Ｎα−メチルノルロイシン（ＮＭｅＮｌｅ）、シクロペンチルグリシン（Ｃｐｇ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、アセチルアルギニン（アセチルａｒｇ）、α，β−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α，γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４−メチル−フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、β，β−ジフェニル−アラニン（ＢｉＰｈＡ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４−フェニル−フェニルアラニン（またはビフェニルアラニン；４Ｂｉｐ）、α−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）、β−アラニン、β−アミノプロピオ��酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、４−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、γ−カルボキシグルタミン酸塩、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−メチルアルギニン、４−アミノ−Ｏ−フタル酸（４ＡＰＡ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−スレオニン、Ｏ−ホスホチロシン、および他の類似のアミノ酸、ならびに具体的に列挙されたもののいずれかの誘導体化形態が挙げられる。
【００２１】
また、「非天然のアミノ酸」という定義には、構造
【００２２】
【化１】
2015506373.tif 000003
を有し、式中、Ｒ基が、２０種類の天然のアミノ酸に使用されるもの以外の任意の置換基である、任意のアミノ酸も含まれる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、カルボニル基を含む。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、構造
【００２４】
【化２】
2015506373.tif 000004
を有し、式中、ｎは０〜１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり、Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールであり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、アミノオキシ基を含む。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、ヒドラジド基を含む。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、ヒドラジン基を含む。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸残基は、セミカルバジド基を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸残基は、アジド基を含む。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、構造
【００２７】
【化３】
2015506373.tif 000005
を有し、式中、ｎは０〜１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリール、または不在であり、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、または不在であり、ｍは０〜１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、アルキン基を含む。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、構造
【００２９】
【化４】
2015506373.tif 000006
を有し、式中、ｎは０〜１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、または不在であり、ｍは０〜１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。
【００３０】
「置換された」という用語は、分子上の水素原子または基が、置換基と称される基または原子と置き換えられることを意味する。典型的な置換基には、ハロゲン、Ｃ１−８アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−８アルコキシ、−ＮＲｘＲｘ、ニトロ、シアノ、ハロもしくはペルハロＣ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、−ＳＲｘ、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘが挙げられ、式中、各Ｒｘは、独立して、水素またはＣ１−Ｃ８アルキルである。置換基が−ＮＲｘＲｘである場合、Ｒｘ基は、窒素原子と一緒に接合されて環を形成し得ることに留意されたい。
【００３１】
「アルキル」という用語は、直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。アルキル基の代表的な例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ペンチル、およびヘキシルが挙げられる。典型的なアルキル基は、１〜８個の炭素原子を有するアルキル基であり、この基は一般にＣ１−８アルキルとして表される。
【００３２】
「アルコキシ」という用語は、酸素原子に結合したアルキル基を意味する。アルコキシ基の代表的な例には、メトキシ、エトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、プロポキシ、およびイソブトキシが挙げられる。一般的なアルコキシ基は、Ｃ１−８アルコキシである。
【００３３】
「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、塩素、フッ素、臭素、またはヨウ素を意味する。
【００３４】
「アルケニル」という用語は、１つ以上の炭素−炭素二重結合を有する分岐鎖または直鎖の炭化水素を意味する。アルケニル基の代表的な例には、エテニル、プロペニル、アリル、ブテニル、および４−メチルブテニルが挙げられる。一般的なアルケニル基は、Ｃ２−８アルケニルである。
【００３５】
「アルキニル」という用語は、１つ以上の炭素−炭素三重結合を有する分岐鎖または直鎖の炭化水素を意味する。アルキニル基の代表的な例には、エチニル、プロピニル（プロパルギル）、およびブチニルが挙げられる。一般的なアルキニル基は、Ｃ２−８アルキニルである。
【００３６】
「シクロアルキル」という用語は、環式非芳香族炭化水素を意味する。シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロヘプチルが挙げられる。シクロアルキル基は、１つ以上の二重結合を含有し得る。二重結合を含有するシクロアルキル基の例には、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、およびシクロブタジエニルが挙げられる。一般的なシクロアルキル基は、Ｃ３−８シクロアルキル基である。
【００３７】
「ペルフルオロアルキル」という用語は、水素原子の全てが、フッ素原子で置き換えられているアルキル基を意味する。一般的なペルフルオロアルキル基は、Ｃ１−８ペルフルオロアルキルである。一般的なペルフルオロアルキル基の例は、＿ＣＦ３である。
【００３８】
「アシル」という用語は、ヒドロキシ基（−ＯＨ）の除去により有機酸から誘導される基を意味する。例えば、アシル基ＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）＿は、ＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）ＯＨからヒドロキシ基を除去することにより形成される。
【００３９】
「アリール」という用語は、環式芳香族炭化水素を意味する。アリール基の例には、フェニルおよびナフチルが挙げられる。一般的なアリール基は、６〜１３員環である。
【００４０】
本明細書に使用される「ヘテロ原子」という用語は、酸素、窒素、または硫黄原子を意味する。
【００４１】
「ヘテロアリール」という用語は、アリール基の１つ以上の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられている、環式芳香族炭化水素を意味する。ヘテロアリール基は、１つを上回るヘテロ原子を含有し、このヘテロ原子は、同じかまたは異なり得る。ヘテロアリール基の例には、ピリジル、ピリミジニル、イミダゾリル、チエニル、フリル、ピラジニル、ピロリル、インドリル、トリアゾリル、ピリダジニル、インダゾリル、プリニル、キノリジニル、イソキノリル、キノリル、ナフチリジニル、キノキサリニル、イソチアゾリル、およびベンゾ［ｂ］チエニルが挙げられる。一般的なヘテロアリール基は、１〜４個のヘテロ原子を含有する５〜１３員環である。１〜３個のヘテロ原子を含有する５および６員環であるヘテロアリール基が、特に一般的である。
【００４２】
「ヘテロシクロアルキル」という用語は、炭素原子のうちの１つ以上がヘテロ原子と置き換えられている、シクロアルキル基を意味する。ヘテロシクロアルキル基が、１つを上回るヘテロ原子を含有する場合、このヘテロ原子は、同じかまたは異なってもよい。ヘテロシクロアルキル基の例には、テトラヒドロフリル、モルホリニル、ピペラジニル、ピペリジニル、およびピロリジニルが挙げられる。ヘテロシクロアルキル基が、１つ以上の二重結合を有するが芳香族ではないこともまた、可能である。二重結合を含有するヘテロシクロアルキル基の例には、ジヒドロフランが挙げられる。一般的なヘテロシクロアルキル基は、１〜４個のヘテロ原子を含有する３〜１０員環である。１〜２個のヘテロ原子を含有する５および６員環であるヘテロシクロアルキル基が、特に一般的である。
【００４３】
環式環基、すなわち、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキルは、１つを上回る環を含み得ることにも留意されたい。例えば、ナフチル基は、縮合二環式環系である。本発明は、架橋原子を有する環基またはスピロ配置を有する環基を含むこともまた意図される。
【００４４】
１または２個のヘテロ原子を任意に有する、５〜６員芳香環の代表的な例は、フェニル、フリル、チエニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、ピリジニル、ピリジアジニル、ピリミジニル、およびピラジニルである。
【００４５】
１〜３個のヘテロ原子を任意に有する、部分飽和、完全飽和、または完全不飽和の５〜８員環の代表的な例は、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、およびフェニルである。さらなる例となる５員環は、フリル、チエニル、ピロリル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、ピロリジニル、１，３−ジオキソラニル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、２Ｈ−イミダゾリル、２−イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリル、２−ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、１，２−ジチオリル、１，３−ジチオリル、３Ｈ−１，２−オキサチオリル、１，２，３−オキサジザオリル（ｏｘａｄｉｚａｏｌｙｌ）、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、１，３，４オキサジアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリザオリル（ｔｒｉｚａｏｌｙｌ）、１，３，４−チアジアゾリル、３Ｈ−１，２，３−ジオキサゾリル、１，２，４−ジオキサゾリル、１，３，２−ジオキサゾリル、１，３，４−ジオキサゾリル、５Ｈ−１，２，５−オキサチアゾリル、および１，３−オキサチオリルである。
【００４６】
さらなる例となる６員環は、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ピリジニル、ピペリジニル、１，２−ジオキシニル、１，３−ジオキシニル、１，４−ジオキサニル、モルホリニル、１，４−ジチアニル、チオモルホリニル、ピンダジニル（ｐｙｎｄａｚｉｎｙｌ）、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニル、１，３，５−トリアジニル、１，２，４−トリアジニル、１，２，３−トリアジニル、１，３，５−トリチアニル、４Ｈ−１，２−オキサジニル、２Ｈ−１，３−オキサジニル、６Ｈ−１，３−オキサジニル、６Ｈ−１，２−オキサジニル、１，４−オキサジニル、２Ｈ−１，２−オキサジニル、４Ｈ−１，４−オキサジニル、１，２，５−オキサチアジニル、１，４−オキサジニル、ｏ−イソオキサジニル、ｐ−イソオキサジニル、１，２，５−オキサチアジニル、１，２，６−（３オキサチアジニル、および１，４，２−オキサジアジニルである。
【００４７】
さらなる例となる７員環は、アゼピニル、オキセピニル、チエピニル、および１，２，４−トリアゼピニルである。
【００４８】
さらなる例となる８員環は、シクロオクチル、シクロオクテニル、およびシクロオクタジエニルである。
【００４９】
１〜４個のヘテロ原子を任意に有する、２個の縮合部分飽和、完全飽和、または完全不飽和の５および／または６員環を含有する例となる二環式環は、インドリジニル、インドリル、イソインドリル、インドリニル、シクロペンタ（ｂ）ピリジニル、ピラノ（３，４−ｂ）ピロリル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾ（ｂ）チエニル、ベンゾ（ｃ）チエニル、１Ｈ−インダゾリル、インドキサジニル、ベンゾオキサゾリル、アントラニリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、１，８−ナフチリジニル、プテリジニル、インデニル、イソインデニル、ナフチル、テトラリニル、デカリニル、２Ｈ−１−ベンゾピラニル、ピリド（３，４−ｂ）ピリジニル、ピリド（３，２−ｂ）ピリジニル、ピリド（４，３−ｂ）−ピリジニル、２Ｈ−１，３−ベンゾオキサジニル、２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジニル、１Ｈ−２，３−ベンゾオキサジニル、４Ｈ−３，１−ベンゾオキサジニル、２Ｈ−１，２−ベンゾオキサジニル、および４Ｈ−１，４−ベンゾオキサジニルである。
【００５０】
環式環基が、１つを上回る方式で別の基に結合してもよい。具体的な結合配設が指定されない場合、全ての可能性のある配設が意図される。例えば、「ピリジル」という用語には、２−、３−、または４−ピリジルが含まれ、「チエニル」という用語には、２−または３−チエニルが含まれる。
【００５１】
「単離核酸分子」という用語は、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物、ポリヌクレオチド、または全核酸を供給源細胞から単離する際に核酸が天然に見出される他の物質の、少なくとも約５０パーセントから分離されている、５’から３’末端の方向に読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマー（例えば、本明細書に提供されるＧＤＦ１５核酸配列）またはその類似体を指す。好ましくは、単離核酸分子は、任意の他の混入核酸分子、あるいはポリペプチド生成におけるその使用またはその治療、診断、予防、もしくは研究のための使用を妨げるであろう、その核酸の天然環境に見られる他の分子を、実質的に含まない。
【００５２】
「単離ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物、ポリヌクレオチド、または供給源細胞から単離する際にポリペプチドが天然に見出される他の物質の、少なくとも約５０パーセントから分離されている、ポリペプチド（例えば、本明細書に提供されるＧＤＦ１５ポリペプチド配列）を指す。好ましくは、単離ポリペプチドは、任意の他の混入ポリペプチド、またはその治療、診断、予防、もしくは研究のための使用を妨げるであろう、その天然環境に見られる他の混入物質を、実質的に含まない。
【００５３】
「コードする」という用語は、１つ以上のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を指す。この用語は、開始または終止コドンを必要としない。アミノ酸配列は、ポリヌクレオチド配列によって提供される異なるリーディングフレームのうちのいずれか１つにおいてコードされ得る。
【００５４】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一な」およびパーセント「同一性」という用語は、同じである２つ以上の配列または部分配列を指す。「パーセント同一性」とは、比較される分子のアミノ酸またはヌクレオチド間の同一な残基のパーセントを意味し、比較される分子のうちの最も小さいものの寸法に基づいて計算される。これらの計算については、アライメント中のギャップ（存在する場合）は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処することができる。アライメントされる核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用することができる方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），（１９８８）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されるものが含まれる。
【００５５】
パーセント同一性を計算する際、比較する配列は、配列間に最大の一致が得られる方式でアライメントされる。パーセント同一性を決定するために使用されるコンピュータプログラムは、ＧＡＰを含む、ＧＣＧプログラムパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰを使用して、パーセント配列同一性を決定する２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドをアライメントする。配列は、それらのそれぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最適な一致（アルゴリズムによって判定される「一致範囲」）についてアライメントされる。ギャップ開始ペナルティ（平均対角成分の３倍として計算され、「平均対角成分」とは、使用される比較行列の対角成分の平均であり、「対角成分」とは、特定の比較行列によって、それぞれの完全なアミノ酸一致に割り当てられたスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップ開始ペナルティの１／１０）、ならびにＰＡＭ  ２５０またはＢＬＯＳＵＭ  ６２等の比較行列を、アルゴリズムと併せて使用する。ある特定の実施形態において、標準的な比較行列（ＰＡＭ  ２５０比較行列についてはＤａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２、ＢＬＯＳＵＭ  ６２比較行列についてはＨｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい）もまた、アルゴリズムにより使用される。
【００５６】
ＧＡＰプログラムを使用してポリペプチドまたはヌクレオチド配列のパーセント同一性を決定するための推奨パラメータは、次のものである。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３
比較行列：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２（上記）からのＢＬＯＳＵＭ  ６２
ギャップペナルティ：１２（末端ギャップはペナルティなし）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０
【００５７】
２つのアミノ酸配列をアライメントするためのある特定のアライメントスキームは、２つの配列の短い領域のみの一致をもたらす場合があり、この短いアライメントした領域は、２つの全長配列の間に重大な関係がない場合であっても、非常に高い配列同意性を有し得る。したがって、選択されるアライメント方法（例えば、ＧＡＰプログラム）は、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続したアミノ酸に及ぶアライメントを得ることが望ましい場合には、調整することができる。
【００５８】
「ＧＤＦ１５ポリペプチド」および「ＧＤＦ１５タンパク質」という用語は、互換可能に使用され、ヒトまたはマウスといった哺乳動物に発現される、天然の野生型ポリペプチドを意味する。本開示の目的で、「ＧＤＦ１５ポリペプチド」という用語は、３０８個のアミノ酸残基からなり、配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされる、任意の全長ＧＤＦ１５ポリペプチド、例えば、配列番号４；２７９個のアミノ酸残基からなり、配列番号７のヌクレオチド配列によってコードされ、全長ＧＤＦ１５ポリペプチドのアミノ末端で２９個のアミノ酸残基（すなわち、シグナルペプチドを構築する）が除去されている、ポリペプチドの活性およびプロドメインを含む任意の形態、例えば、配列番号８；ならびに、１１２個のアミノ酸残基からなり、配列番号１１のヌクレオチド配列によってコードされ、シグナル配列およびプロドメインが除去されている、プロドメインおよびシグナル配列が除去されている、活性ドメインを含むポリペプチドの任意の形態、例えば、配列番号１２を指して互換可能に使用され得る。ＧＤＦ１５ポリペプチドは、組み換えによって導入されるか、または細菌発現プロセスの結果として導入され得る、アミノ末端メチオニンを含み得るが、必ずしも含む必要はない。
【００５９】
「ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチド」という用語は、天然のＧＤＦ１５ポリペプチド配列（例えば、配列番号４、８、または１２）が修飾されているＧＤＦ１５ポリペプチドを包含する。このような修飾には、非天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸類似体、およびアミノ酸模倣体との置換を含む、１つ以上のアミノ酸置換が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
一態様において、「ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチド」という用語は、通常は天然のＧＤＦ１５ポリペプチドの所定の位置に見られる少なくとも１つの残基が、欠失しているか、または通常は天然のＧＤＦ１５配列におけるその位置に見られない残基によって置き換えられている、ＧＤＦ１５ポリペプチド配列（例えば、配列番号４、８、または１２）を指す。いくつかの場合において、通常は天然のＧＤＦ１５ポリペプチドの所定の位置に見られる単一の残基を、通常はその位置に見られない１つを上回る残基と置き換えることが望ましく、さらに他の場合においては、天然のＧＤＦ１５ポリペプチド配列を維持し、そのタンパク質の所定の位置に１つ以上の残基を挿入することが望ましい可能性があり、なおも他の場合においては、所定の残基を完全に欠失させることが望ましい可能性があり、これらの構築物のすべては、「ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチド」という用語に包含される。
【００６１】
種々の実施形態において、ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドは、天然のＧＤＦ１５ポリペプチド（例えば、配列番号４、８、または１２）に少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、天然のＧＤＦ１５ポリペプチドアミノ酸配列（例えば、配列番号４、８、または１２）に少なくとも約９０パーセント、または約９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセント同一であるアミノ酸配列を含む。このようなＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドは、好ましくは、血中グルコース、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールレベルを低下させる能力、体重を減少させる能力、またはグルコース耐性、エネルギー消費、またはインスリン感受性を改善する能力といった、野生型ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するが、必ずしも有する必要はない。本発明はまた、このようなＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチド配列をコードする核酸分子を包含する。
【００６２】
本明細書に記載のように、ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドは、シグナル配列（配列番号４の残基１〜２９）を含んでもよく、または、シグナル配列が除去されていてもよい（配列番号８をもたらす）。他の実施形態において、ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドは、シグナル配列が除去されていてもよく、さらに、残基１９６で切断され、プロドメインの主要配列（配列番号４の残基３０〜１９６）を活性ドメインの主要配列から分離してもよい。ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチド天然の生物学的に活性な形態は、プロセシングされた成熟ペプチド（配列番号１２；配列番号４の残基１９７〜３０８）を含むホモ二量体である。ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを含む構築物は、主としてヒトＧＤＦ１５に関して開示されているが、本発明は、それに限定されず、ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドが他の種（例えば、カニクイザル、マウス、およびラット）に由来する、ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを含む構築物にも及ぶ。いくつかの事例において、対象における代謝性障害を治療または緩和するために使用できるＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドは、対象と同じ種に由来するＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドの成熟形態である。
【００６３】
ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドは、好ましくは、生物学的に活性である。様々な個別の実施形態において、ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドは、シグナルペプチドが全長ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチド配列のＮ末端から除去されており、プロドメインが活性ドメインから切断されている（が、除去されていなくてもよい）成熟ＧＤＦ１５タンパク質またはＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドの天然の形態のものと同等、それよりも高い、またはそれよりも低い、生物学的活性を有する。生物学的活性の例には、血中グルコース、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールレベルを低下させる能力、体重を減少させる能力、またはグルコース耐性、脂質耐性、もしくはインスリン感受性を改善する能力、尿中グルコースおよびタンパク質分泌を低下させる能力が挙げられる。
【００６４】
「治療有効用量」および「治療有効量」という用語は、本明細書に使用される際、治療される疾患または障害の症状の軽減または緩和を含む、研究者、医師、または他の臨床医によって求められる、組織系、動物、またはヒトにおける生物学的または医薬的応答を誘起する、ＧＤＦ１５またはＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドの量、すなわち、観察可能なレベルの１つ以上の所望される生物学的または医学的応答、例えば、血中グルコース、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールレベルの低下、体重の減少、またはグルコース耐性、エネルギー消費、もしくはインスリン感受性の改善を支持する、ＧＤＦ１５またはＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドの量を意味する。
【００６５】
ＩＩ．  ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＧＤＦ１５を含む構築物（その突然変異体形態を含む）、ならびにポリヌクレオチド
様々なＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物を、本明細書に提供する。これらの分子のうちのいくつかを、本明細書で以下に提示される実施例に記載のように、種々のアッセイにおいて研究した。本明細書に提供されるＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物には、以下に記載のものが含まれる。
【００６６】
ＩＩ．Ａ．  天然の成熟ＧＤＦ１５およびその変異体
ＩＩ．Ａ．１  天然の成熟ＧＤＦ１５
ＧＤＦ１５の生物学的に活性な形態は、ホモ二量体を含み、本開示において「天然の成熟ＧＤＦ１５二量体」と示される構築物は、それぞれが配列番号１２を含む２つの成熟ＧＤＦ１５単量体を含む、ホモ二量体を指すことに留意されたい。ホモ二量体化して天然の成熟ＧＤＦ１５二量体を形成する単量体は、核酸配列
【００６７】
【化５】
2015506373.tif 000007
によってコードされ、アミノ酸配列：
【００６８】
【化６】
2015506373.tif 000008
を含む。
【００６９】
したがって、「天然の成熟ＧＤＦ１５二量体」は、配列番号１２を含む２つの共有結合される単量体を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態において、リーダーまたはシグナル配列を使用して、ポリペプチドの分泌を指示することができる。シグナル配列は、ポリペプチドコード領域の５’末端内、またはそこに直接位置付けられ得る。多数のシグナル配列、例えば、ＶＨ２１シグナル配列（ＶＨ２１シグナル配列の考察についてはＥＰ２３３０１９７号を参照されたい）が特定されており、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択することができる。
【００７１】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態において、ホモ二量体化して天然の成熟ＧＤＦ１５二量体を形成する単量体は、核酸配列（ＶＨ２１シグナル配列を下線で示す）：
【００７２】
【化７】
2015506373.tif 000009
によってコードされ、アミノ酸配列（切断されるＶＨ２１シグナル配列を下線で示す）：
【００７３】
【化８】
2015506373.tif 000010
を含む
【００７４】
ＩＩ．Ａ．２  成熟ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）変異体
ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）変異体は、Ｃ→Ｇ多型による天然のヒトＧＤＦ１５変異体であり、全長ペプチド（配列番号４）における残基２０２、成熟ペプチド（配列番号１２）における残基６に、ＨｉｓからＡｓｐへの変化をもたらす。
【００７５】
本開示において「成熟ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）二量体」と示される構築物は、それぞれが配列番号３８を含む２つの成熟ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）単量体を含む、ホモ二量体を指す。ホモ二量体化して成熟ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）二量体を形成する単量体は、核酸配列：
【００７６】
【化９】
2015506373.tif 000011
によってコードされ、アミノ酸配列：
【００７７】
【化１０】
2015506373.tif 000012
を含む
【００７８】
したがって、「成熟ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）二量体」は、配列番号３８を含む２つの共有結合される単量体を含む。
【００７９】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態において、ホモ二量体化して成熟ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）二量体を形成する単量体は、核酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【００８０】
【化１１】
2015506373.tif 000013
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【００８１】
【化１２】
2015506373.tif 000014
を含む
【００８２】
ＩＩ．Ａ．３  成熟ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）変異体
ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）変異体は、Ｎ脱アミド化の可能性を回避するために成熟ペプチド（配列番号１２）の残基３におけるＡｓｎがＧｌｎで置き換えられたヒトＧＤＦ１５突然変異体である。
【００８３】
本開示において「成熟ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）二量体」と示される構築物は、それぞれが配列番号４２を含む２つの成熟ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）単量体を含む、ホモ二量体を指す。ホモ二量体化して成熟ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）二量体を形成する単量体は、核酸配列：
【００８４】
【化１３】
2015506373.tif 000015
によってコードされ、アミノ酸配列：
【００８５】
【化１４】
2015506373.tif 000016
を含む
【００８６】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態において、ホモ二量体化して天然の成熟ＧＤＦ１５二量体を形成する単量体は、核酸配列（下線で示される、切断されたＶＨ２１シグナル配列を含む）：
【００８７】
【化１５】
2015506373.tif 000017
によってコードされ、アミノ酸配列（切断されるＶＨ２１シグナル配列を下線で示す）：
【００８８】
【化１６】
2015506373.tif 000018
を含む。
【００８９】
したがって、「成熟ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）二量体」は、配列番号４２を含む共有結合される２つの単量体を含む。
【００９０】
ＩＩ．Ｂ．  荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物
本開示において、「荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）」または「荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）Ｆｃ」と示される構築物は、（ｉ）ヒンジ領域を欠き、荷電対突然変異を含む、「負の電荷を有する」Ｆｃ配列、および（ｉｉ）ヒンジ領域を欠き、荷電対突然変異を含む、「正の電荷を有する」Ｆｃ配列を含む、構築物を指す。「正の電荷を有する」および「負の電荷を有する」という用語の使用は、参照の容易さのため（すなわち、Ｆｃ配列における電荷対の性質を示すため）であり、全体の配列または構築物が、正または負の電荷を有する必要があることを示すものではないことに留意されたい。
【００９１】
アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ）からリジンへの突然変異（Ｅ３５６Ｋ）およびグルタミン酸からリジンへの突然変異（Ｄ３９９Ｋ）の、ヒンジ領域を欠く非修飾Ｆｃ配列への導入は、ヒンジ領域を欠く正の電荷を有するＦｃ配列（本明細書に「ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）」と称される）をもたらす。リジンからアスパラギン酸への２つの突然変異（Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ）の、ヒンジ領域を欠く非修飾Ｆｃ配列への導入は、ヒンジ領域を欠く負の電荷を有するＦｃ配列（本明細書に「ＤｈＣｐｍＦｃ（−）」と称される）をもたらす。場合によっては、Ｃ末端リジン（Ｋ４７７）もまた、負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列、正の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列、またはその両方において欠失していてもよい。例えば、配列番号１８、１９、８５、８６、８９、９０、９１、９９、１００、１０８、１０９、および１１１（ＤｈＣｐｍＦｃ配列）を参照されたい。
【００９２】
一緒にインキュベートすると、アスパラギン酸残基は、静電力を通じてリジン残基と結合し、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列とＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列との間のＦｃヘテロ二量体の形成を促進し、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列間またはＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列間のＦｃホモ二量体の形成を低減または阻止する。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体は、（ｉ）直接またはリンカーを介してＤｈＣｐｍＦｃ（−）のＣ末端に連結された成熟ＧＤＦ１５配列、および（ｉｉ）ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）を含む。他の実施形態において、ヘテロ二量体は、（ｉ）直接またはリンカーを介してＤｈＣｐｍＦｃ（＋）のＣ末端に連結された成熟ＧＤＦ１５配列、および（ｉｉ）ＤｈＣｐｍＦｃ（−）を含む。いずれの場合においても、２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が２つのＧＤＦ１５配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。２つのヒトＧＤＦ１５配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された２つのヘテロ二量体を含む四量体の図による描写については、図１を参照されたく、ここで、各ヘテロ二量体は、本開示において「ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）」と示される荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物である（すなわち、各ヘテロ二量体が、（ｉ）（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２０）リンカーを介してＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列のＣ末端に連結された成熟ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む第１の単量体、および（ｉｉ）ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列を含む第２の単量体を含む）。
【００９４】
ＩＩ．Ｂ．１  ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）
本開示において「ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）」と示される荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物は、（ｉ）（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２０）リンカーを介してＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列のＣ末端に連結された成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドを含む第１の単量体、および（ｉｉ）ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列を含む第２の単量体を含むヘテロ二量体を含む構築物を指す。負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ｈＧＤＦ１５鎖は、負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）鎖と結合して、ヘテロ二量体を形成する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が２つのヒトＧＤＦ１５配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
【００９５】
より具体的には、特定の実施形態において、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物は、
（ａ）配列：
【００９６】
【化１７】
2015506373.tif 000019
を含む、組み換えの正の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）、
（ｂ）配列：
【００９７】
【化１８】
2015506373.tif 000020
を含む、組み換えの負の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖各ヘテロ二量体に１つ）、
および
（ｃ）配列番号１２を含む、天然の成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドの２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）を含む。
【００９８】
ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列：
【００９９】
【化１９】
2015506373.tif 000021
を含むリンカーを介して、
ＧＤＦ１５ポリペプチドのＮ末端で、ペプチド結合によって負の電荷を有するＦｃ配列に融合される。
【０１００】
その最終形態において、ヘテロ二量体（別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する）を構成する第１の単量体は、核酸配列：
【０１０１】
【化２０】
2015506373.tif 000022
によってコードされ、アミノ酸配列（リンカーを二重下線で示す）：
【０１０２】
【化２１】
2015506373.tif 000023
を含む。
【０１０３】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第１の単量体は、核酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０１０４】
【化２２】
2015506373.tif 000024
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を単一の下線で示し、リンカー配列を二重下線で示す）：
【０１０５】
【化２３】
2015506373.tif 000025
を含む。
【０１０６】
ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、核酸配列：
【０１０７】
【化２４】
2015506373.tif 000026
によってコードされ、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【０１０８】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する単量体は、核酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０１０９】
【化２５】
2015506373.tif 000027
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０１１０】
【化２６】
2015506373.tif 000028
を含む。
【０１１１】
第１および第２の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体（ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体）は、配列番号１８を含む２つの単量体および配列番号４４を含む２つの単量体を含む。
【０１１２】
ＩＩ．Ｂ．２  ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）
本開示において「ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）」と示される荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物は、（ｉ）（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２０）リンカーを介してＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列のＣ末端に連結された成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドを含む第１の単量体、および（ｉｉ）ＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列を含む第２の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。正の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ｈＧＤＦ１５鎖は、負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）鎖と結合して、ヘテロ二量体を形成する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が２つのヒトＧＤＦ１５配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
【０１１３】
より具体的には、特定の実施形態において、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）四量体は、
（ａ）配列：
【０１１４】
【化２７】
2015506373.tif 000029
を含む、組み換えの正の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）
（ｂ）配列：
【０１１５】
【化２８】
2015506373.tif 000030
を含む、組み換えの負の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）
および
（ｃ）配列番号１２を含む、天然の成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドの２つの鎖各ヘテロ二量体に１つ）を含む。
【０１１６】
ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列番号２０を含むリンカーを介して、ＧＤＦ１５ポリペプチドのＮ末端で、ペプチド結合によって正の電荷を有するＦｃ配列に融合される。
【０１１７】
その最終形態において、ヘテロ二量体（別のこのようなヘテロ二量体とともに四量体を形成する）を構成する第１の単量体は、核酸配列：
【０１１８】
【化２９】
2015506373.tif 000031
によってコードされ、アミノ酸配列（リンカーを二重下線で示す）：
【０１１９】
【化３０】
2015506373.tif 000032
を含む。
【０１２０】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第１の単量体は、核酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０１２１】
【化３１】
2015506373.tif 000033
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を単一の下線で示し、リンカー配列を二重下線で示す）：
【０１２２】
【化３２】
2015506373.tif 000034
を含む。
【０１２３】
ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、核酸配列：
【０１２４】
【化３３】
2015506373.tif 000035
によってコードされ、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。
【０１２５】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する単量体は、核酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０１２６】
【化３４】
2015506373.tif 000036
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０１２７】
【化３５】
2015506373.tif 000037
を含む。
【０１２８】
第１および第２の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体（ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）構築物の二量体）は、配列番号８６を含む２つの単量体および配列番号５０を含む２つの単量体を含む。
【０１２９】
ＩＩ．Ｂ．３．ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）
本開示において「ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）」と示される荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物は、（ｉ）（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２０）リンカーを介してＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列のＣ末端に連結された成熟ヒトＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）ポリペプチドを含む第１の単量体、および（ｉｉ）ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列を含む第２の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）鎖は、正の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（＋）鎖と結合する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が２つのヒトＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
【０１３０】
より具体的には、特定の実施形態において、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）四量体は、
（ａ）配列番号１８を含む、組み換えの正の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）、
（ｂ）配列番号１９を含む、組み換えの負の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）、および
（ｃ）配列番号３８を含む、成熟ヒトＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）ポリペプチドの２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）を含む。
【０１３１】
ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）ポリペプチドは、配列番号２０を含むリンカーを介して、ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）ポリペプチドのＮ末端で、ペプチド結合によって負の電荷を有するＦｃ配列に融合される。
【０１３２】
その最終形態において、ヘテロ二量体（別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する）を構成する第１の単量体は、核酸配列：
【０１３３】
【化３６】
2015506373.tif 000038
によってコードされ、アミノ酸配列（リンカーを二重下線で示す）：
【０１３４】
【化３７】
2015506373.tif 000039
を含む。
【０１３５】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第１の単量体は、核酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０１３６】
【化３８】
2015506373.tif 000040
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を下線で示し、リンカーを二重下線で示す）：
【０１３７】
【化３９】
2015506373.tif 000041
を含む
【０１３８】
ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、配列番号４６の核酸配列によってコードされ、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【０１３９】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、配列番号１７の核酸配列によってコードされ、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。
【０１４０】
第１および第２の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体（ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体）は、配列番号１８を含む２つの単量体および配列番号５７を含む２つの単量体を含む。
【０１４１】
ＩＩ．Ｂ．４．ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）
本開示において「ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）」と示される荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物は、（ｉ）（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２０）のリンカーを介してＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列のＣ末端に連結された成熟ヒトＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）ポリペプチドを含む単量体、および（ｉｉ）ＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列を含む第２の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。正の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）鎖は、負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）鎖と結合する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が２つのヒトＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
【０１４２】
より具体的には、特定の実施形態において、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）四量体は、
（ａ）配列番号８５を含む、組み換えの正の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）、
（ｂ）配列番号８６を含む、組み換えの負の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）、および
（ｃ）配列番号３８を含む、成熟ヒトＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）ポリペプチドの２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）を含む。
【０１４３】
ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）ポリペプチドは、配列番号２０を含むリンカーを介して、ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）ポリペプチドのＮ末端で、ペプチド結合によって正の電荷を有するＦｃ配列に融合される。
【０１４４】
その最終形態において、ヘテロ二量体（別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する）を構成する第１の単量体は、核酸配列：
【０１４５】
【化４０】
2015506373.tif 000042
によってコードされ、アミノ酸配列（リンカーを二重下線で示す）：
【０１４６】
【化４１】
2015506373.tif 000043
を含む。
【０１４７】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第１の単量体は、核酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０１４８】
【化４２】
2015506373.tif 000044
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を単一の下線で示し、リンカーを二重下線で示す）：
【０１４９】
【化４３】
2015506373.tif 000045
を含む。
【０１５０】
ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、配列番号５３の核酸配列によってコードされ、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。
【０１５１】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、配列番号５１の核酸配列によってコードされ、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。
【０１５２】
第１および第２の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体（ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）構築物の二量体）は、配列番号８６を含む２つの単量体および配列番号６１を含む２つの単量体を含む。
【０１５３】
ＩＩ．Ｂ．５．ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）
本開示において「ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）」と示される荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物は、（ｉ）（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２０）のリンカーを介してＤｈＣｐｍＦｃ（＋）”）配列のＣ末端に連結された成熟ヒトＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）ポリペプチドを含む第１の単量体、および（ｉｉ）ＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列を含む第２の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。正の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）鎖は、負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）鎖と結合する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が２つのヒトＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
【０１５４】
より具体的には、特定の実施形態において、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）四量体は、
（ａ）配列番号８５を含む、組み換えの正の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）、
（ｂ）配列番号８６を含む、組み換えの負の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）、および
（ｃ）配列番号４２を含む、成熟ヒトＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）ポリペプチドの２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）を含む。
【０１５５】
ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）ポリペプチドは、配列番号２０を含むリンカーを介して、ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）ポリペプチドのＮ末端で、ペプチド結合によって正の電荷を有するＦｃ配列に融合される。
【０１５６】
その最終形態において、ヘテロ二量体（別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する）を構成する第１の単量体は、核酸配列：
【０１５７】
【化４４】
2015506373.tif 000046
によってコードされ、アミノ酸配列（リンカー配列を二重下線で示す）：
【０１５８】
【化４５】
2015506373.tif 000047
を含む
【０１５９】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第１の単量体は、核酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０１６０】
【化４６】
2015506373.tif 000048
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を単一の下線で示し、リンカー配列を二重下線で示す）：
【０１６１】
【化４７】
2015506373.tif 000049
を含む
【０１６２】
ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、配列番号５３の核酸配列によってコードされ、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。
【０１６３】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、配列番号５１の核酸配列によってコードされ、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。
【０１６４】
第１および第２の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体（ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）構築物の二量体）は、配列番号８６を含む２つの単量体および配列番号６５を含む２つの単量体を含む。
【０１６５】
ＩＩ．Ｂ．６．  ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）
本開示において「ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）」と示される荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物は、（ｉ）ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列のＣ末端に連結された１つの成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドを含む第１の単量体、および（ｉｉ）ＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列を含む第２の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。正の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−ＧＤＦ１５鎖は、負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）鎖と結合して、ヘテロ二量体を形成する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が２つのヒトＧＤＦ１５配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
【０１６６】
より具体的には、特定の実施形態において、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）四量体は、
（ａ）配列番号８５を含む、組み換えの正の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）、
（ｂ）配列番号８６を含む、組み換えの負の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）、および
（ｃ）配列番号１２を含む、天然の成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドの２つの鎖各ヘテロ二量体に１つ）を含む。
【０１６７】
ＧＤＦ１５ポリペプチドは、ＧＤＦ１５ポリペプチドのＮ末端で、ペプチド結合によって正の電荷を有するＦｃ配列に融合される。
【０１６８】
その最終形態において、ヘテロ二量体（別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する）を構成する第１の単量体は、核酸配列：
【０１６９】
【化４８】
2015506373.tif 000050
によってコードされ、アミノ酸配列：
【０１７０】
【化４９】
2015506373.tif 000051
を含む。
【０１７１】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第１の単量体は、核酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０１７２】
【化５０】
2015506373.tif 000052
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０１７３】
【化５１】
2015506373.tif 000053
を含む。
【０１７４】
ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、配列番号５３の核酸配列によってコードされ、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。
【０１７５】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、配列番号５１の核酸配列によってコードされ、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。
【０１７６】
第１および第２の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体（ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）構築物の二量体）は、配列番号１９を含む２つの単量体および配列番号６９を含む２つの単量体を含む。
【０１７７】
ＩＩ．Ｂ．７．ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）
本開示において「ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）」と示される荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物は、（ｉ）Ｇ４（配列番号７０）リンカーを介してＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列のＣ末端に連結された成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドを含む第１の単量体、および（ｉｉ）ＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列を含む第２の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。正の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−Ｇ４−ＧＤＦ１５鎖は、負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）鎖と結合する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が２つのヒトＧＤＦ１５配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
【０１７８】
より具体的には、特定の実施形態において、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）四量体は、
（ａ）配列番号８５を含む、組み換えの正の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）、
（ｂ）配列番号８６を含む、組み換えの負の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）、および
（ｃ）配列番号１２を含む、天然の成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドの２つの鎖各ヘテロ二量体に１つ）を含む。
【０１７９】
ＧＤＦ１５ポリペプチドは、
【０１８０】
【化５２】
2015506373.tif 000054
を含むリンカーを介して、ＧＤＦ１５ポリペプチドのＮ末端で、ペプチド結合によって正の電荷を有するＦｃ配列に融合される。
【０１８１】
その最終形態において、ヘテロ二量体（別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する）を構成する第１の単量体は、核酸配列：
【０１８２】
【化５３】
2015506373.tif 000055
によってコードされ、アミノ酸配列（リンカー配列を二重下線で示す）：
【０１８３】
【化５４】
2015506373.tif 000056
を含む。
【０１８４】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第１の単量体は、核酸配列（切断されるシグナル配列を下線で示す）：
【０１８５】
【化５５】
2015506373.tif 000057
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を単一の下線で示し、リンカー配列を二重下線で示す）：
【０１８６】
【化５６】
2015506373.tif 000058
を含む。
【０１８７】
ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、配列番号５３の核酸配列によってコードされ、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。
【０１８８】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、配列番号５１の核酸配列によってコードされ、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。
【０１８９】
第１および第２の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体（ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）構築物の二量体）は、配列番号８６を含む２つの単量体および配列番号７４を含む２つの単量体を含む。
【０１９０】
ＩＩ．Ｂ．８．ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）２−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）
本開示において「ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）２−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）」と示される荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物は、（ｉ）（Ｇ４Ｓ）２（配列番号７５）のリンカーを介してＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列のＣ末端に連結された成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドを含む第１の単量体、および（ｉｉ）ＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列を含む第２の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。正の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）２−ＧＤＦ１５鎖は、負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）鎖と結合する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が２つのヒトＧＤＦ１５配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
【０１９１】
より具体的には、特定の実施形態において、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）２−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）四量体は、
（ａ）配列番号８５を含む、組み換えの正の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）、
（ｂ）配列番号８６を含む、組み換えの負の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）、および
（ｃ）配列番号１２を含む、天然の成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドの２つの鎖各ヘテロ二量体に１つ）を含む。
【０１９２】
ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列
【０１９３】
【化５７】
2015506373.tif 000059
を含むリンカーを介して、ＧＤＦ１５ポリペプチドのＮ末端で、ペプチド結合によって正の電荷を有するＦｃに融合される。
【０１９４】
その最終形態において、ヘテロ二量体（別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する）を構成する第１の単量体は、核酸配列：
【０１９５】
【化５８】
2015506373.tif 000060
によってコードされ、アミノ酸配列（リンカー配列を二重下線で示す）：
【０１９６】
【化５９】
2015506373.tif 000061
を含む。
【０１９７】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第１の単量体は、核酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０１９８】
【化６０】
2015506373.tif 000062
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を単一の下線で示し、リンカー配列を二重下線で示す）：
【０１９９】
【化６１】
2015506373.tif 000063
を含む。
【０２００】
ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、配列番号５３の核酸配列によってコードされ、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。
【０２０１】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、配列番号５１の核酸配列によってコードされ、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。
【０２０２】
第１および第２の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体（ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）２−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）構築物の二量体）は、配列番号８６を含む２つの単量体および配列番号７９を含む２つの単量体を含む。
【０２０３】
ＩＩ．Ｂ．９．ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｑ）２−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）
本開示において「ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）」と示される荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物は、（ｉ）（Ｇ４Ｑ）４（配列番号８０）リンカーを介してＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列のＣ末端に連結された成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドを含む第１の単量体、および（ｉｉ）ＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列を含む第２の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物である。正の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５鎖は、負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）鎖と結合する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が２つのヒトＧＤＦ１５配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
【０２０４】
より具体的には、特定の実施形態において、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）四量体は、
（ａ）配列番号８５を含む、組み換えの正の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）、
（ｂ）配列番号８６を含む、組み換えの負の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）、および
（ｃ）配列番号１２を含む、天然の成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドの２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）を含む。
【０２０５】
ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列
【０２０６】
【化６２】
2015506373.tif 000064
を含むリンカーを介して、ＧＤＦ１５ポリペプチドのＮ末端で、ペプチド結合によって正の電荷を有するＦｃに融合される。
【０２０７】
その最終形態において、ヘテロ二量体（別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する）を構成する第１の単量体は、核酸配列：
【０２０８】
【化６３】
2015506373.tif 000065
によってコードされ、アミノ酸配列（リンカー配列を二重下線で示す）：
【０２０９】
【化６４】
2015506373.tif 000066
を含む。
【０２１０】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第１の単量体は、核酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０２１１】
【化６５】
2015506373.tif 000067
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を単一の下線で示し、リンカー配列を二重下線で示す）：
【０２１２】
【化６６】
2015506373.tif 000068
を含む。
【０２１３】
ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、配列番号５３の核酸配列によってコードされ、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。
【０２１４】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、配列番号５１の核酸配列によってコードされ、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。
【０２１５】
第１および第２の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体（ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）構築物の二量体）は、配列番号８６を含む２つの単量体および配列番号８４を含む２つの単量体を含む。
【０２１６】
ＩＩ．Ｂ．１０．ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｌ３５１Ｃ）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｌ３５１Ｃ）
本開示において「ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｌ３５１Ｃ）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｌ３５１Ｃ）」と示される荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物は、（ｉ）Ｇ４（配列番号７０）リンカーを介してヒンジ領域を欠く正の電荷を有するＦｃ単量体（本明細書に「ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｌ３５１Ｃ）」と称される）のＣ末端に連結された成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドを含む第１の単量体、およびヒンジ領域を欠く１つの負の電荷を有するＦｃ単量体（本明細書に「ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｌ３５１Ｃ）」と称される）を含むヘテロ二量体を含む、構築物である。
【０２１７】
上で論じたように、ヒンジ領域を欠く非修飾Ｆｃ配列におけるアスパラギン酸からリジンへの突然変異（Ｅ３５６Ｋ）およびグルタミン酸からリジンへの突然変異（Ｄ３９９Ｋ）の導入は、正の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列をもたらす。２つのリジンからアスパラギン酸への突然変異（Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ）の導入は、負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列をもたらす。Ｃ末端リジン（Ｋ４７７）はまた、場合によって、負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列、正の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列、またはその両方において、欠失していてもよい。一緒にインキュベートすると、アスパラギン酸残基は、静電力を通じてリジン残基と結合し、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列とＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列との間のＦｃヘテロ二量体の形成を促進し、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列間またはＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列間のＦｃホモ二量体の形成を低減または阻止する。
【０２１８】
正の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列におけるロイシンからシステインへの突然変異（Ｌ３５１Ｃ）（本明細書に「ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｌ３５１Ｃ）」と称される）および負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列におけるロイシンからシステインへの突然変異（Ｌ３５１Ｃ）（本明細書に「ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｌ３５１Ｃ）」と称される）の導入は、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｌ３５１Ｃ）配列とＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｌ３５１Ｃ）配列との間のＦｃヘテロ二量体の形成を、それらの間のジスルフィド結合（または「システインクランプ」）の形成によって、さらに強化する。正の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｌ３５１Ｃ）−Ｇ４−ＧＤＦ１５鎖は、負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｌ３５１Ｃ）鎖と結合する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が２つのヒトＧＤＦ１５配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
【０２１９】
より具体的には、特定の実施形態において、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｌ３５１Ｃ）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｌ３５１Ｃ）四量体は、
（ａ）
【０２２０】
【化６７】
2015506373.tif 000069
を含む、組み換えの正の電荷を有するＦｃ（Ｌ３５１）配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）
（ｂ）組み換えの負の電荷を有するＦｃ（Ｌ３５１）配列：
【０２２１】
【化６８】
2015506373.tif 000070
の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）
および
（ｃ）配列番号１２を含む、天然の成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドの２つの鎖各ヘテロ二量体に１つ）を含む。
ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列番号７０を含むリンカーを介して、ＧＤＦ１５ポリペプチドのＮ末端で、ペプチド結合によって正の電荷を有するＦｃ（Ｌ３５１Ｃ）配列に融合される。
【０２２２】
その最終形態において、ヘテロ二量体（別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する）を構成する第１の単量体は、核酸配列：
【０２２３】
【化６９】
2015506373.tif 000071
によってコードされ、アミノ酸配列（リンカー配列を二重下線で示す）：
【０２２４】
【化７０】
2015506373.tif 000072
を含む。
【０２２５】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第１の単量体は、核酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０２２６】
【化７１】
2015506373.tif 000073
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を単一の下線で示し、リンカー配列を二重下線で示す）：
【０２２７】
【化７２】
2015506373.tif 000074
を含む。
【０２２８】
ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、核酸配列：
【０２２９】
【化７３】
2015506373.tif 000075
によってコードされ、配列番号９１のアミノ酸配列を含む。
【０２３０】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する単量体は、核酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０２３１】
【化７４】
2015506373.tif 000076
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０２３２】
【化７５】
2015506373.tif 000077
を含む
【０２３３】
第１および第２の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体（ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｌ３５１Ｃ）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｌ３５１Ｃ）構築物の二量体は、配列番号９１を含む２つの単量体および配列番号９５を含む２つの単量体を含む。
【０２３４】
ＩＩ．Ｂ．１１．  ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｓ３５４Ｃ）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｙ３４９Ｃ）
本開示において「ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｓ３５４Ｃ）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｙ３４９Ｃ）」と示される荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物は、（ｉ）Ｇ４（配列番号７０）リンカーを介して、ヒンジ領域を欠く正の電荷を有するＦｃ単量体（本明細書に「ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｓ３５４Ｃ）」と称される）のＣ末端に連結された成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドを含む第１の単量体、およびヒンジ領域を欠く１つの負の電荷を有するＦｃ単量体（本明細書に「ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｙ３４９Ｃ）」と称される）を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。
【０２３５】
本明細書に記載のように、ヒンジ領域を欠く非修飾Ｆｃ配列におけるアスパラギン酸からリジンへの突然変異（Ｅ３５６Ｋ）およびグルタミン酸からリジンへの突然変異（Ｄ３９９Ｋ）の導入は、正の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列をもたらす。２つのリジンからアスパラギン酸への突然変異（Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ）の導入は、負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列をもたらす。Ｃ末端リジン（Ｋ４７７）はまた、場合によって、負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列、正の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列、またはその両方において、欠失していてもよい。一緒にインキュベートすると、アスパラギン酸残基は、静電力を通じてリジン残基と結合し、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列とＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列との間のＦｃヘテロ二量体の形成を促進し、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列間またはＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列間のＦｃホモ二量体の形成を低減または阻止する。
【０２３６】
正の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（＋）配列におけるロイシンからシステインへの突然変異（Ｓ３５４Ｃ）（本明細書に「ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｓ３５４Ｃ）」と称される）および負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）配列におけるロイシンからシステインへの突然変異（Ｙ３４９Ｃ）（本明細書に「ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｌ３５１Ｃ）」と称される）の導入は、２つのＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｓ３５４Ｃ）配列とＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｙ３４９Ｃ）配列との間のＦｃヘテロ二量体の形成を、それらの間のジスルフィド結合（または「システインクランプ」）の形成によって、さらに強化する。正の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｓ３５４Ｃ）−Ｇ４−ＧＤＦ１５鎖は、負の電荷を有するＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｙ３４９Ｃ）鎖と結合する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が２つのヒトＧＤＦ１５配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
【０２３７】
より具体的には、特定の実施形態において、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｓ３５４Ｃ）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｙ３４９Ｃ）四量体は、
（ａ）配列：
【０２３８】
【化７６】
2015506373.tif 000078
を含む、組み換えの正の電荷を有するＦｃ（Ｓ３５４Ｃ）の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）、
（ｂ）配列：
【０２３９】
【化７７】
2015506373.tif 000079
を含む、組み換えの負の電荷を有するＦｃ（Ｙ３４９Ｃ）の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）、
および
（ｃ）配列番号１２を含む天然の成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドの２つの鎖（それぞれに１つ）を含む。
【０２４０】
ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列番号７０を含むリンカーを介して、ＧＤＦ１５ポリペプチドのＮ末端で、ペプチド結合によって正の電荷を有するＦｃ（Ｓ３５４Ｃ）配列に融合される。
【０２４１】
その最終形態において、ヘテロ二量体（別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する）を構成する第１の単量体は、核酸配列：
【０２４２】
【化７８】
2015506373.tif 000080
によってコードされ、アミノ酸配列（リンカー配列を二重下線で示す）：
【０２４３】
【化７９】
2015506373.tif 000081
を含む。
【０２４４】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第１の単量体は、核酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０２４５】
【化８０】
2015506373.tif 000082
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を単一の下線で示し、リンカー配列を二重下線で示す）：
【０２４６】
【化８１】
2015506373.tif 000083
を含む
【０２４７】
ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、核酸配列：
【０２４８】
【化８２】
2015506373.tif 000084
によってコードされ、配列番号１００のアミノ酸配列を含む。
【０２４９】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する単量体は、核酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０２５０】
【化８３】
2015506373.tif 000085
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０２５１】
【化８４】
2015506373.tif 000086
を含む。
【０２５２】
第１および第２の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体（ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｓ３５４Ｃ）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｙ３４９Ｃ）構築物の二量体）は、配列番号１００を含む２つの単量体および配列番号１０４を含む２つの単量体を含む。
【０２５３】
ＩＩ．Ｃ．  荷電対構築物
本開示において「荷電対」または「荷電対Ｆｃ」と示される構築物は、電荷対突然変異を含む「負の電荷を有する」Ｆｃ配列、および（ｉｉ）荷電対突然変異を含む、正の電荷を有するＦｃ配列を含む、構築物を指す。「正の電荷を有する」および「負の電荷を有する」という用語の使用は、参照の容易さのため（すなわち、Ｆｃ配列における電荷対突然変異の性質を示すため）であり、全体の配列または構築物が、正または負の電荷を有する必要があることを示すものではないことに留意されたい。
【０２５４】
非修飾Ｆｃ配列におけるアスパラギン酸からリジンへの突然変異（Ｅ３５６Ｋ）およびグルタミン酸からリジンへの突然変異（Ｄ３９９Ｋ）の導入は、正の電荷を有するＦｃ配列（本明細書に「ＣｐｍＦｃ（＋）」と称される）をもたらす。非修飾Ｆｃ配列への２つのリジンからアスパラギン酸への突然変異（Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ）の導入は、負の電荷を有するＦｃ配列（本明細書に「ＣｐｍＦｃ（−）」と称される）をもたらす。Ｃ末端リジン（Ｋ４７７）はまた、場合によって、負の電荷を有するＣｐｍＦｃ（−）配列、正の電荷を有するＣｐｍＦｃ（＋）配列、またはその両方において、欠失していてもよい。例えば、配列番号２３、１１０、１１４、および１１５（ＣｐｍＦｃ配列）を参照されたい。一緒にインキュベートすると、アスパラギン酸残基は、リジン残基と結合し、ＣｐｍＦｃ（＋）配列とＣｐｍＦｃ（−）配列都の間のＦｃヘテロ二量体の形成を促進し、ＣｐｍＦｃ（＋）配列間およびＣｐｍＦｃ（−）配列間のＦｃホモ二量体の形成を低減または阻止する。
【０２５５】
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体は、（ｉ）直接またはリンカーを介してＣｐｍＦｃ（−）のＣ末端に連結された成熟ＧＤＦ１５配列、および（ｉｉ）ＣｐｍＦｃ（＋）を含む。他の実施形態において、ヘテロ二量体は、（ｉ）直接またはリンカーを介してＣｐｍＦｃ（＋）のＣ末端に連結された成熟ＧＤＦ１５配列、および（ｉｉ）ＣｐｍＦｃ（−）を含む。いずれの場合においても、２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が２つのＧＤＦ１５配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。２つのヒトＧＤＦ１５配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された２つのヘテロ二量体を含む四量体の図による描写については、図１を参照されたく、そこでは、各ヘテロ二量体は、本開示において「ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５ＣｐｍＦｃ（−）」と示される荷電対構築物である（すなわち、各ヘテロ二量体が、（ｉ）（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２０）リンカーを介してＣｐｍＦｃ（−）配列のＣの末端に連結された成熟ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む第１の単量体、および（ｉｉ）ＣｐｍＦｃ（＋）配列を含む第２の単量体を含む）。
【０２５６】
ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）
本開示において「ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）」と示される荷電対構築物は、（ｉ）（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２０）リンカーを介してＣｐｍＦｃ（−）配列のＣ末端に連結された成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドを含む第１の単量体、および（ｉｉ）ＣｐｍＦｃ（＋）配列を含む第２の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。ヒンジ領域は存在するが、負の電荷を有するＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ｈＧＤＦ１５鎖は、負の電荷を有するＣｐｍＦｃ（−）鎖と結合して、ヘテロ二量体を形成する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が２つのヒトＧＤＦ１５配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
【０２５７】
より具体的には、特定の実施形態において、ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）構築物は、
（ａ）配列（ヒンジ領域を括弧で示す）：
【０２５８】
【化８５】
2015506373.tif 000087
を含む、組み換えの正の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（各ヘテロ二量体に１つ）、
（ｂ）配列（ヒンジ領域を括弧で示す）：
【０２５９】
【化８６】
2015506373.tif 000088
を含む、組み換えの負の電荷を有するＦｃ配列の２つの鎖（それぞれに１つ）、
および
（ｃ）配列番号１２を含む天然の成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドの２つの鎖を含む。
【０２６０】
ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列番号２０を含むリンカーを介して、ＧＤＦ１５ポリペプチドのＮ末端で、ペプチド結合によって負の電荷を有するＦｃ単量体に融合される。
【０２６１】
その最終形態において、ヘテロ二量体（別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する）を構成する第１の単量体は、核酸配列：
【０２６２】
【化８７】
2015506373.tif 000089
によってコードされ、アミノ酸配列（ヒンジ領域を括弧で示し、リンカー配列を下線で示す）：
【０２６３】
【化８８】
2015506373.tif 000090
を含む。
【０２６４】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第１の単量体は、核酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０２６５】
【化８９】
2015506373.tif 000091
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を単一の下線で示し、ヒンジ領域を括弧内に示し、リンカー配列を二重下線で示す）：
【０２６６】
【化９０】
2015506373.tif 000092
を含む。
【０２６７】
ヘテロ二量体を構成する第２の単量体は、核酸配列：
【０２６８】
【化９１】
2015506373.tif 000093
によってコードされ、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む。
【０２６９】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する単量体は、核酸配列（シグナル配列を下線で示す）：
【０２７０】
【化９２】
2015506373.tif 000094
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を下線で示し、ヒンジ領域を括弧内に示す）：
【０２７１】
【化９３】
2015506373.tif 000095
を含む。
【０２７２】
第１および第２の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。２つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体（ＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体）は、配列番号１１０を含む２つの単量体および配列番号１１３を含む２つの単量体を含む。
【０２７３】
ＩＩ．Ｄ．  ヘミＦｃ構築物
本開示において「ヘミ」または「ヘミＦｃ」と示される構築物は、第１のＦｃ配列（例えば、配列番号２８または３０）のＮ末端を第２のＦｃ配列（例えば、配列番号２８または３０）のＣ末端に接続するリンカーによって、タンデムに接合された２つのＦｃ配列を含む構築物を指す。いくつかの実施形態において、単量体は、ＧＤＦ１５配列のＮ末端を第１のＦｃ配列のＣ末端に接続する第１のリンカーによって第１のＦｃ配列に連結された成熟ＧＤＦ１５配列を含み、第１のＦｃ配列は、第１のＦｃ配列のＮ末端を第２のＦｃ配列のＣ末端に接続する第２のリンカーによって第２のＦｃ配列に連結される。第１および第２のＦｃ配列はまた、Ｆｃヒンジ領域によって結合される。２つのこのような単量体が結合して、単量体が２つのＧＤＦ１５配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、二量体を形成する。ヘミ構築物「Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５」の図による描写については、図１を参照されたい（すなわち、それぞれが、ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４リンカーによって第１のＦｃ配列のＣ末端に連結され、そのＮ末端が（Ｇ４Ｓ）８リンカーを介して第２のＦｃ配列のＣ末端に連結された成熟ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む、２つの単量体であり、この２つの成熟ＧＤＦ１５配列が鎖間ジスルフィド結合を介して連結される）。
【０２７４】
ＩＩ．Ｄ．１  Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５
本開示において「Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５」と示されるヘミＦｃ構築物は、ヒトＧＤＦ１５配列のＮ末端を第１のＦｃ配列のＣ末端に接続する配列番号３１を含む第１のリンカーを介して第１のＦｃ配列に連結された成熟ヒトＧＤＦ１５配列、および第１のＦｃ配列のＮ末端を第２のＦｃ配列のＣ末端に接続するアミノ酸配列：
【０２７５】
【化９４】
2015506373.tif 000096
を含む第２のリンカーを含む、単量体を含む構築物を指す。第１および第２のＦｃ配列はまた、Ｆｃヒンジ領域によって結合される。２つのこのような単量体が結合して、単量体が２つのＧＤＦ１５配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、ホモ二量体を形成する。
【０２７６】
より具体的には、特定の実施形態において、ヘミ構築物Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５は、配列（ヒンジ領域を括弧内に示す）：
【０２７７】
【化９５】
2015506373.tif 000097
を含む第２のＦｃ鎖が、
リンカー：
【０２７８】
【化９６】
2015506373.tif 000098
によって
配列（ヒンジ領域を括弧内に示す）：
【０２７９】
【化９７】
2015506373.tif 000099
を含む第１のＦｃ鎖に接合され、
そのＣ末端に、配列番号１２を含むＧＤＦ１５ポリペプチドが、配列：
【０２８０】
【化９８】
2015506373.tif 000100
を有するリンカーによって接合される、単量体を含む。
【０２８１】
その最終形態において、単量体は、核酸配列：
【０２８２】
【化９９】
2015506373.tif 000101
2015506373.tif 000102
によってコードされ、アミノ酸配列（ヒンジ領域を括弧内に示し、リンカー配列を二重下線で示す）：
【０２８３】
【化１００】
2015506373.tif 000103
を含む。
【０２８４】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態にいて、単量体は、核酸（シグナル配列を下線で示す）：
【０２８５】
【化１０１】
2015506373.tif 000104
2015506373.tif 000105
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を下線で示し、ヒンジ領域を括弧内に示し、リンカー配列を二重下線で示す）：
【０２８６】
【化１０２】
2015506373.tif 000106
を含む。
【０２８７】
２つのこのような単量体が結合して、２つのｈＧＤＦ１５ポリペプチドが、２つの天然の（すなわち、組み換えでない）システイン残基間のジスルフィド結合を介して連結された、二量体を形成する。したがって、特定のヘミＦｃ二量体構築物Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５は、配列番号３３を含む２つの単量体を含む。
【０２８８】
ＩＩ．Ｄ．２  Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５
本開示において「Ｆｃ（Ｇ４Ｓ）３−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５」と示されるヘミＦｃ構築物は、ヒトＧＤＦ１５配列のＮ末端を第１のＦｃ配列のＣ末端に接続する、配列番号３１を含む第１のリンカーを介して第１のＦｃ配列に接続された成熟ヒトＧＤＦ１５配列、および第１のＦｃ配列のＮ末端を第２のＦｃ配列のＣ末端に接続する、アミノ酸配列：
【０２８９】
【化１０３】
2015506373.tif 000107
を含む第２のリンカーを含む、単量体を含む構築物を指す。第１および第２のＦｃ配列はまた、Ｆｃヒンジ領域によって結合される。２つのこのような単量体が結合して、単量体が２つのＧＤＦ１５配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、ホモ二量体を形成する。
【０２９０】
より具体的には、特定の実施形態において、ヘミＦｃ構築物Ｆｃ（Ｇ４Ｓ）３−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５は、リンカー：
【０２９１】
【化１０４】
2015506373.tif 000108
によって、配列番号３０の配列を含む第１のＦｃ鎖（そのＣ末端に、配列番号１２を含むＧＤＦ１５ポリペプチドが、配列番号３１の配列を有するリンカーによって接合される）に接合される、配列番号２８の配列を含む第２のＦｃ鎖を含む、単量体を含む。
【０２９２】
その最終形態において、単量体は、核酸配列：
【０２９３】
【化１０５】
2015506373.tif 000109
2015506373.tif 000110
によってコードされ、アミノ酸配列（ヒンジ領域を括弧内に示し、リンカー配列を二重下線で示す）：
【０２９４】
【化１０６】
2015506373.tif 000111
を含む。
【０２９５】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態にいて、単量体は、核酸（シグナル配列を下線で示す）：
【０２９６】
【化１０７】
2015506373.tif 000112
2015506373.tif 000113
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を単一の下線で示し、ヒンジ領域を括弧内に示し、リンカー配列を二重下線で示す）：
【０２９７】
【化１０８】
2015506373.tif 000114
を含む。
【０２９８】
２つのこのような単量体が結合して、２つのｈＧＤＦ１５ポリペプチドが、２つの天然の（すなわち、組み換えでない）システイン残基間のジスルフィド結合を介して連結された、二量体を形成する。したがって、特定のヘミＦｃ二量体構築物Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５は、配列番号１２３を含む２つの単量体を含む。
【０２９９】
ＩＩ．Ｄ．３  Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５
本開示において「Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）５−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５」と示されるヘミＦｃ構築物は、ヒトＧＤＦ１５配列のＮ末端を第１のＦｃ配列のＣ末端に接続する配列番号３１を含む第１のリンカーを介して第１のＦｃ配列に連結された成熟ヒトＧＤＦ１５配列、および第１のＦｃ配列のＮ末端を第２のＦｃ配列のＣ末端に接続するアミノ酸配列：
【０３００】
【化１０９】
2015506373.tif 000115
を含む第２のリンカーを含む単量体を含む、構築物を指す。第１および第２のＦｃ配列はまた、Ｆｃヒンジ領域によって結合される。２つのこのような単量体が結合して、単量体が２つのＧＤＦ１５配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、ホモ二量体を形成する。
【０３０１】
より具体的には、特定の実施形態において、ヘミＦｃ構築物Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）５−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５は、リンカー：
【０３０２】
【化１１０】
2015506373.tif 000116
によって、配列番号３０の配列を含む第１のＦｃ鎖（そのＣ末端に、配列番号１２を含むＧＤＦ１５ポリペプチドが、配列番号３１の配列を有するリンカーによって接合される）に接合される、配列番号２８の配列を含む第２のＦｃ鎖を含む、単量体を含む。
【０３０３】
その最終形態において、単量体は、核酸配列：
【０３０４】
【化１１１】
2015506373.tif 000117
2015506373.tif 000118
によってコードされ、アミノ酸配列（ヒンジ領域を括弧内に示し、リンカー配列を二重下線で示す）：
【０３０５】
【化１１２】
2015506373.tif 000119
を含む。
【０３０６】
ＶＨ２１シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態にいて、単量体は、核酸（シグナル配列を下線で示す）：
【０３０７】
【化１１３】
2015506373.tif 000120
2015506373.tif 000121
によってコードされ、アミノ酸配列（シグナル配列を単一の下線で示し、ヒンジ領域を括弧内に示し、リンカー配列を二重下線で示す）：
【０３０８】
【化１１４】
2015506373.tif 000122
を含む。
【０３０９】
２つのこのような単量体が結合して、２つのｈＧＤＦ１５ポリペプチドが、２つの天然の（すなわち、組み換えでない）システイン残基間のジスルフィド結合を介して連結された、二量体を形成する。したがって、特定のヘミＦｃ二量体構築物Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）５−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５は、配列番号１２８を含む２つの単量体を含む。
【０３１０】
ＩＩＩ．  ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＧＤＦ１５を含む構築物（その突然変異体形態を含む）
本明細書に開示されるように、標準的な分子生物学の方法を使用して、本開示に記載されるＧＤＦ１５ポリペプチド（ヒトＧＤＦ１５の全長および成熟形態を含む）およびＧＤＦ１５を含む構築物を組み換えおよび／または生成して、本明細書に提供されるＧＤＦ１５ポリペプチドおよび構築物の突然変異体形態を形成することができる。種々の実施例において、配列番号４、８、または１２の全てまたは一部を含み得る、本明細書に提供されるＧＤＦ１５ポリペプチドおよび構築物の突然変異体形態をコードする核酸配列は、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡ、またはｃＤＮＡから単離および／または増幅することができる。プライマーは、標準的な（ＲＴ）−ＰＣＲ増幅技術に従って、本明細書に提供される核酸およびアミノ酸配列に基づいて設計され得る。増幅したＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチド核酸を、次いで、好適なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析によって特徴付けることができる。
【０３１１】
本明細書に提供されるＧＤＦ１５ポリペプチドおよび構築物の突然変異体形態の全てまたは一部の単離または増幅の際にプローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、例えば、自動化ＤＮＡ合成装置を使用して設計および生成することができるか、またはより長いＤＮＡ配列から単離することができる。
【０３１２】
ＩＩＩ．Ａ．  ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列
インビボにおいて、ＧＤＦ１５は、シグナル配列、プロドメイン、および活性ドメインを含む、連続的なアミノ酸配列として発現する。
【０３１３】
全長ヒトＧＤＦ１５の３０８個のアミノ酸配列は、
【０３１４】
【化１１５】
2015506373.tif 000123
であり、ＤＮＡ配列：
【０３１５】
【化１１６】
2015506373.tif 000124
によってコードされる。
【０３１６】
全長マウスＧＤＦ１５の３０３個のアミノ酸配列は、
【０３１７】
【化１１７】
2015506373.tif 000125
であり、ＤＮＡ配列：
【０３１８】
【化１１８】
2015506373.tif 000126
によってコードされる。
【０３１９】
２９残基のシグナル配列の切断後のヒトＧＤＦ１５のアミノ酸配列は、
【０３２０】
【化１１９】
2015506373.tif 000127
であり、ＤＮＡ配列：
【０３２１】
【化１２０】
2015506373.tif 000128
によってコードされる。
【０３２２】
３２残基のシグナル配列の切断後のマウスＧＤＦ１５のアミノ酸配列は、
【０３２３】
【化１２１】
2015506373.tif 000129
であり、ＤＮＡ配列：
【０３２４】
【化１２２】
2015506373.tif 000130
によってコードされる。
【０３２５】
各単量体中に１つの鎖間ジスルフィド結合および４つの鎖内ジスルフィド結合を形成する９個のシステインを含むホモ二量体を構成する、ヒトＧＤＦ１５の組み換え活性形態のアミノ酸配列（任意のＮ末端メチオニン残基を括弧内に示す）は、
【０３２６】
【化１２３】
2015506373.tif 000131
であり、ＤＮＡ配列（任意のＮ末端メチオニンコドンを括弧内に示す）：
【０３２７】
【化１２４】
2015506373.tif 000132
によってコードされる。
【０３２８】
各単量体中に１つの鎖間ジスルフィド結合および４つの鎖内ジスルフィド結合を形成する９個のシステインを含むホモ二量体を構成する、マウスＧＤＦ１５の組み換え活性形態のアミノ酸配列は、
【０３２９】
【化１２５】
2015506373.tif 000133
であり、ＤＮＡ配列：
【０３３０】
【化１２６】
2015506373.tif 000134
によってコードされる。
【０３３１】
本明細書に記載される際、「ＧＤＦ１５ポリペプチド」という用語は、配列番号４、８、および１２のヒトアミノ酸配列を含む、ＧＤＦポリペプチドを指す。「ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチド」という用語は、しかしながら、１つ以上のアミノ酸が天然のＧＤＦポリペプチド配列、例えば、配列番号４、８、および１２のアミノ酸配列とは異なり、結果としてその配列が配列番号４、８、および１２と少なくとも８５％同一となる、アミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。ＧＤＦ１５ポリペプチドは、天然もしくは非天然のアミノ酸を使用して、保存的もしくは非保存的のいずれかである１つ以上のアミノ酸置換を、ＧＤＦ１５ポリペプチドの特定の位置に導入することによって、または特定の残基もしくは一連の残基を欠失させることによって、生成することができる。
【０３３２】
「保存的アミノ酸置換」は、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷への影響がほとんどないかまたは全くないように、天然のアミノ酸残基（すなわち、野生型ＧＤＦ１５ポリペプチド配列の所定の位置に見られる残基）を、非天然の残基（すなわち、野生型ＧＤＦ１５ポリペプチド配列の所定の位置には見られない残基）と置換することを含み得る。保存的アミノ酸置換はまた、典型的には生体系における合成によってではなく化学的ペプチド合成によって組み込まれる、非天然のアミノ酸残基（本明細書に定義される）を包含する。これらには、ペプチド模倣体、およびアミノ酸部分の他の逆転または逆位形態が含まれる。
【０３３３】
天然の残基は、共通の側鎖特性に基づくクラスに分類することができる：
（１）  疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）  中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ
（３）  酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）  塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）  鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および
（６）  芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０３３４】
さらなる群のアミノ酸もまた、例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ（２ｄ  Ｅｄ．１９９３），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載される原理を使用して、形成することができる。いくつかの事例において、このような特性のうちの２つ以上に基づいて、置換をさらに特徴付けることが有用であり得る（例えば、Ｔｈｒ残基等の「極性の小さい」残基との置換は、適切な文脈において、高度に保存的な置換を表し得る）。
【０３３５】
保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーと同じクラスの別のメンバーとの交換を伴い得る。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーと別のクラスからのメンバー都の交換を伴い得る。
【０３３６】
既知の上述の分類のものに類似する生理化学特性を有する、合成、希少、または修飾のアミノ酸残基を、配列内の特定のアミノ酸残基の「保存的」置換として用いることができる。例えば、Ｄ−Ａｒｇ残基は、典型的なＬ−Ａｒｇ残基の置換として機能し得る。特定の置換は、上述のクラスのうちの２つ以上に関して記載され得る場合もあり得る（例えば、小さな疎水性残基による置換は、１つのアミノ酸を、上述のクラスの両方に見られる残基（複数可）、または両方の定義を満たす残基に類似する生理化学特性を有することが当該技術分野で既知である他の合成、希少、もしくは修飾残基と置換することを意味する）。
【０３３７】
配列番号３、７、１１、および１５に変性するもの、ならびに配列番号４、８、および１２のポリペプチド変異体をコードするものを含む、本明細書に提供されるＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドをコードする核酸配列は、本開示の他の態様を形成する。
【０３３８】
ＩＩＩ．Ｂ．  ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＧＤＦ１５を含む構築物（その突然変異体形態を含む）を発現するのに有用なベクター
本明細書に記載されるＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＧＤＦ１５を含む構築物をコードする核酸配列を発現させるため、適切なコード配列、例えば、配列番号３、７、１１、１５、１７、２１、２４、２６、および３２を、好適なベクターにクローニングすることができ、好適な宿主に導入した後に、この配列を、標準的なクローニングおよび発現技術に従って、発現させて、コードされたポリペプチドを生成することができ、これらは、当該技術分野で既知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９に記載される）。本発明はまた、本発明による核酸配列を含む、このようなベクターにも関する。
【０３３９】
「ベクター」とは、（ａ）ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を促進する、（ｂ）そこからのポリペプチドの生成を促進する、（ｃ）標的細胞へのそれのトランスフェクション／形質転換を促進する、（ｄ）核酸配列の複製を促進する、（ｅ）核酸の安定性を促進する、（ｆ）核酸および／もしくは形質転換／トランスフェクトした細胞の検出を促進する、ならびに／または（ｇ）別様に有益な生物学的および／もしくは生理化学的機能をポリペプチドをコードする核酸配列に与える、送達ビヒクルを指す。ベクターは、染色体、非染色体、および合成核酸のベクター（発現制御要素の好適なセットを含む核酸配列）を含む、任意の好適なベクターであり得る。このようなベクターの例には、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、ならびにウイルス核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ベクターが挙げられる。
【０３４０】
組み換え発現ベクターは、原核生物（例えば、大腸菌）または真核生物（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用する昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞）におけるＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドの発現のために設計され得る。代表的な宿主細胞には、大腸菌株ＴＯＰ１０Ｆ′、ＴＯＰ１０、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ５ａ、ＨＢ１０１、Ｗ３１１０、ＢＬ２１（ＤＥ３）、およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、哺乳動物細胞系ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＨＥＫ２９３、２９３−ＥＢＮＡ  ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９（１９８９）、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）を含む、クローニングおよび発現に典型的に使用される宿主が含まれる。あるいは、組み換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼ、ならびにインビトロ翻訳系を使用して、インビトロで転写および翻訳してもよい。好ましくは、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列を含有するクローニング部位の上流にプロモーターを含有する。スイッチのオンおよびオフが可能なプロモーターの例には、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、およびｔｒｐプロモーターが挙げられる。
【０３４１】
このように、目的のポリペプチドまたは構築物の発現を促進する、ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物（その突然変異体形態を含む）をコードする核酸配列を含むベクターを、本明細書に提供する。種々の実施形態において、ベクターは、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の発現を制御する、操作可能に連結されたヌクレオチド配列を含む。ベクターは、任意の好適なプロモーター、エンハンサー、および他の発現促進要素を含むか、またはそれと結合し得る。このような要素の例には、強力な発現プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶ  ＩＥプロモーター／エンハンサー、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＬ３−３プロモーター、ＭＭＴＶプロモーター、もしくはＨＩＶ  ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター）、有効なポリ（Ａ）末端配列、大腸菌におけるプラスミド生成物の複製起源、選択可能マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、および／または簡便なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）が挙げられる。ベクター−はまた、ＣＭＶ  ＩＥ等の構成的プロモーターとは逆の誘導的プロモーターを含み得る。一態様において、肝臓または膵臓組織等の代謝関連組織において配列の発現を促進する、組織特異的プロモーターに操作可能に連結される、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態をコードする配列を含む核酸を、提供する。
【０３４２】
ＩＩＩ．Ｃ．  宿主細胞
本開示の別の態様において、本明細書に開示される核酸およびベクターを含む宿主細胞を提供する。種々の実施形態において、ベクターまたは核酸は、宿主細胞ゲノムに統合されるが、他の実施形態においては、ベクターまたは核酸は、染色体外にある。
【０３４３】
このような核酸、ベクター、またはそれらのいずれかもしくは両方の組み合わせを含む、酵母、細菌（例えば、大腸菌）、および哺乳動物細胞（例えば、不死化哺乳動物細胞）等の組み換え細胞を提供する。種々の実施形態において、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはそれに由来する突然変異体の発現をコードする配列を含む、プラスミド、コスミド、ファージミド、または線形発現要素等、非統合核酸を含む細胞を、提供する。
【０３４４】
本明細書に提供されるＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを、形質転換またはトランスフェクションによって、宿主細胞に導入することができる。発現ベクターを用いて細胞を形質転換する方法は、周知である。
【０３４５】
ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはそれに由来する突然変異体をコードする核酸を、ウイルスベクターを介して宿主細胞または宿主動物に位置付ける、および／またはそこに送達することができる。任意の好適なウイルスベクターを、この役割で使用することができる。ウイルスベクターは、所望の宿主細胞において本発明の核酸の送達、複製、および／または発現を促進する、任意の数のウイルスポリヌクレオチドを単独でか、または１つ以上のウイルスタンパク質と組み合わせて含み得る。ウイルスベクターは、ウイルス核酸およびＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドコード核酸を含む、ウイルスゲノム、ウイルスタンパク質／核酸抱合体、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、インタクトウイルス粒子のうちの全てまたは一部を含む、ポリヌクレオチドであり得る。ウイルス粒子ウイルスベクターは、野生型ウイルス粒子または修飾ウイルス粒子を含み得る。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターアンプリコン等、複製および／または発現に別のベクターまたは野生型ベクターの存在を必要とするベクターであってもよい（例えば、ウイルスベクターは、ヘルパー依存性ウイルスであってもよい）。典型的に、このようなウイルスベクターは、野生型ウイルス粒子、またはトランス遺伝子の能力を増加させるか、もしくはそのタンパク質および／もしくは核酸のトランスフェクションおよび／もしくは発現を補助するように核酸含量が改変されたウイルス粒子からなる（このようなベクターの例には、ヘルペスウイルス／ＡＡＶアンプリコンが含まれる）。典型的に、ウイルスベクターは、通常ヒトに感染するウイルスに類似である、および／またはそれに由来する。この態様において好適なウイルスベクター粒子には、例えば、アデノウイルスベクター粒子（アデノウイルス科またはそのウイルスに由来する全てのウイルスを含む）、アデノ随伴ウイルスベクター粒子（ＡＡＶベクター粒子）、または他のパルボウイルスおよびパルボウイルスベクター粒子、パピローマウイルスベクター粒子、フラビウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクターが挙げられる。
【０３４６】
ＩＩＩ．Ｄ．  ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の単離
本明細書に記載のように発現されるＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態は、標準的なタンパク質精製方法を使用して単離することができる。ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態は、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を発現するように組み換えられている細胞、例えば、天然のＧＤＦ１５を自然には発現しない細胞から、単離することができる。
【０３４７】
ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドを単離するために利用することができるタンパク質精製方法、ならびに関連する材料および試薬は、当該技術分野で既知である。ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を精製する例となる方法を、本明細書において以下の実施例に提供する。ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体を単離するのに有用であり得るさらなる精製方法は、Ｂｏｏｔｃｏｖ  ＭＲ，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１５１４−９，Ｆａｉｒｌｉｅ  ＷＤ，２０００，Ｇｅｎｅ  ２５４：６７−７６等の文献に見出す事ができる。
【０３４８】
ＩＶ．  ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む薬学的組成物
ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む薬学的組成物を提供する。このようなポリペプチドの薬学的組成物は、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の治療有効量を、投与形態との適合性で選択される薬学的または生理学的に許容される配合剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）との混合で含み得る。本明細書に使用される「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という用語は、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の、ヒトまたは非ヒト対象の体内への送達の達成または強化に好適な１つ以上の配合剤を指す。これらの用語には、生理学的に適合される、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に許容される担体の例には、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等のうちの１つ以上、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの場合において、等張剤、例として、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを薬学的組成物中に含むことが好ましい。ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態ポリペプチドの保存可能期間または有効性を強化する、湿潤剤または少量の補助剤、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、または緩衝液といった、薬学的に許容される物質もまた、担体として機能し得るか、またはその構成成分を形成し得る。許容される薬学的に許容される担体は、好ましくは、用いられる投薬量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。
【０３４９】
薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭い、滅菌性、分解もしくは放出の速度、吸収、または浸透性の改変、維持、または保存のために配合剤（複数可）を含有してもよい。好適な配合剤には、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン等）、抗菌剤、抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム等）、緩衝液（ホウ酸、重炭酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸、または他の有機酸等）、増量剤（マンニトールまたはグリシン等）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等）、充填剤、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン等）、タンパク質（遊離血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等）、着色剤、香味剤、および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン等）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（ナトリウム等）、保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素等）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール等）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトール等）、懸濁化剤、界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０、Ｔｒｉｔｏｎ、トロメタミン、レシチン、コレステロール、またはチロキサパル等）、安定性強化剤（スクロースまたはソルビトール等）、張性強化剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、またはマンニトールソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤、および／または薬学的アジュバントが含まれるが、これらに限定されない（例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９９５）、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６６１），１−１９（１９７７）を参照されたい。さらなる関連する原理、方法、および薬剤は、例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ−ＤＩＳＰＥＲＳＥ  ＳＹＳＴＥＭＳ（２ｎｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．  ３，１９９８）、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＆  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ（７ｔｈ  ｅｄ．２０００）、Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ，ＴＨＥ  ＥＸＴＲＡ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＰＥＩＡ（３１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（１６ｔｈ−２０ｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎｓ）、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，Ｅｄｓ．（９ｔｈ  ｅｄ．−−��９９６）、Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｉｓｖｏｌｄｓ’ＴＥＸＴＢＯＯＫ  ＯＦ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＭＥＤＩＣＩＮＡＬ  ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｄｅｌｇａｄｏ  ａｎｄ  Ｒｅｍｅｒｓ，Ｅｄｓ．（１０ｔｈ  ｅｄ．，１９９８）に記載されている。薬学的に許容される組成物を製剤化する原理はまた、例えば、Ａｕｌｔｏｎ，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＳ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＯＦ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭ  ＤＥＳＩＧＮ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９８８），ＥＸＴＥＭＰＯＲＡＮＥＯＵＳ  ＯＲＡＬ  ＬＩＱＵＩＤ  ＤＯＳＡＧＥ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ，ＣＳＨＰ（１９９８）に記載されており、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる）。
【０３５０】
最適な薬学的組成物は、例えば、意図される投与の経路、送達形式、および所望される投薬量に応じて、当業者によって決定される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（上記）を参照されたい）。このような組成物は、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を及ぼし得る。
【０３５１】
薬学的組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、水溶性または非水溶性の性質のいずれであっても良い。例えば、注射に好適なビヒクルまたは担体は、場合によっては非経口投与用組成物に一般的な他の材料を補充した、水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であり得る。中性緩衝食塩水または遊離血清アルブミンと混合した食塩水は、さらなる例となるビヒクルである。他の例となる薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、これらは、ソルビトールまたは好適な代替物をさらに含み得る。本発明の一実施形態において、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む組成物は、所望される程度の純度を有する選択された組成物を、最適な配合剤と混合することによって、保管用に凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で調製することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（上記））。さらに、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む生成物は、スクロース等の適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物として製剤化することができる。
【０３５２】
ポリペプチド薬学的組成物を、非経口送達用に選択することができる。あるいは、組成物は、吸入、または経口等、消化管を通じた送達用に選択することができる。このような薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の技能の範囲内である。
【０３５３】
配合成分は、投与の部位に許容される濃度で存在する。例えば、緩衝液を使用して、生理的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内に、組成物を維持する。
【０３５４】
非経口投与が企図される場合、本発明で使用するための治療組成物は、所望されるＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を薬学的に許容されるビヒクル中に含む、発熱物質不含の非経口で許容される水溶液の形態であり得る。非経口注射に特に好適なビヒクルは、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態が、適正に保存された滅菌の等張水溶液として製剤化される、滅菌蒸留水である。さらに別の調製物には、所望される分子と、後にデポー注射を介して送達することができる、生成物の制御または持続放出を提供する注射可能なマイクロスフェア、生体浸食性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸等）、ビーズ、またはリポソームといった薬剤との配合物が含まれ得る。ヒアルロン酸もまた使用可能であり、これは、血液循環の持続期間を促進する効果を有し得る。所望される分子の導入のための他の好適な手段には、埋め込み可能な薬物送達デバイスが含まれる。
【０３５５】
一実施形態において、薬学的組成物は、吸入用に製剤化することができる。例えば、ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドは、吸入用の乾燥粉末として製剤化することができる。ＧＤＦ１５ポリペプチド吸入溶液はまた、エアロゾル送達のために噴射剤とともに製剤化することができる。さらに別の実施形態において、溶液は、噴霧されてもよい。肺内投与は、化学修飾されたタンパク質の肺内送達について記載した国際公開第ＷＯ９４／２００６９号に、さらに記載されている。
【０３５６】
ある特定の製剤は経口投与可能であることもまた、企図される。本発明の一実施形態において、この様式で投与されるＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態は、錠剤およびカプセル等の固形剤形を形成する際に通例的に使用される担体を用いて、または用いずに、製剤化することができる。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティが最大となり全身循環前の分解が最小となる消化管内の地点で、製剤の活性部分を放出するように設計され得る。ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の吸収を促進するために、さらなる薬剤が含まれてもよい。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた、用いることができる。
【０３５７】
別の薬学的組成物は、錠剤の製造に好適な非毒性賦形剤との混合物中に、有効量のＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含み得る。錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクル中に溶解することによって、溶液を、単位用量形態に調製することができる。好適な賦形剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、もしくは重炭酸塩、ラクトース、またはリン酸カルシウム等の不活性希釈剤；またはデンプン、ゼラチン、もしくはアカシア等の結合剤；またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルク等の滑沢剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５８】
持続または制御送達製剤中にＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む製剤を含む、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含むさらなる薬学的組成物が、当業者には明らかであろう。様々な他の持続または制御送達手段、例えば、リポソーム担体、生体浸食性マイクロ粒子、または多孔質ビーズおよびデポー注射剤を製剤化するための技術もまた、当業者に既知である（例えば、薬学的組成物の送達のための多孔質ポリマーマイクロ粒子の制御放出について記載した国際公開第ＷＯ９３／１５７２２号、ならびにマイクロスフェア／マイクロ粒子の調製および使用について考察したＷｉｓｃｈｋｅ＆Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎ，２００８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．３６４：２９８−３２７およびＦｒｅｉｂｅｒｇ＆Ｚｈｕ，２００４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２８２：１−１８を参照されたい）。本明細書に記載のように、ヒドロゲルは、持続または制御送達製剤の例である。
【０３５９】
持続放出調製物のさらなる例には、成形物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスが挙げられる。持続放出マトリクスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０  ０５８  ４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．上記）、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第０  １３３  ９８８号）が挙げられる。持続放出組成物にはまた、リポソームが含まれ得、これは、当該技術分野で既知の複数の方法のうちのいずれかによって調製することができる。例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−９２、ならびに欧州特許第０  ０３６  ６７６号、同第０  ０８８  ０４６号、および同第０  １４３  ９４９号を参照されたい。
【０３６０】
インビボ投与で使用されるであろうＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む薬学的組成物は、典型的に、滅菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通じた濾過によって達成することができる。組成物を凍結乾燥する場合、この方法を使用した滅菌は、凍結および再構成の前または後に行われ得る。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態または溶液で保存することができる。さらに、非経口組成物は、一般に、滅菌のアクセスポート、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静注バッグまたはバイアルに入れられる。
【０３６１】
薬学的組成物が製剤化されると、それを、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアル中に保管することができる。このよう製剤は、すぐに使用可能な形態または投与前に再構成が必要な形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保管され得る。
【０３６２】
特定の実施形態において、本発明は、単回用量の投与単位を生成するためのキットを対象とする。キットは、それぞれ、乾燥タンパク質を有する第１の容器および水性配合物を有する第２の容器の両方を含み得る。単一または複数チャンバの事前充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジまたは分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０３６３】
治療的に用いられるであろうＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の内容および目的に依存することになる。当業者であれば、治療に適切な投薬量レベルが、したがって、送達される分子、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態が使用される適応症、投与の経路、ならびに患者の寸法（体重、体表面、もしくは器官寸法）および状態（年齢および一般的な健康）に部分的に応じて多様であろうことを理解するであろう。したがって、臨床医は、最適な治療効果が得られるように、投薬量を滴定し、投与経路を修正することができる。典型的な投薬量は、上述の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ〜最大で約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲に及び得る。他の実施形態において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または１μｇ／ｋｇ〜最大で約１００ｍｇ／ｋｇ、または５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、または最大で約１０ｍｇ／ｋｇの範囲に及び得る。
【０３６４】
投薬の頻度は、使用される製剤中のＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の薬物動態パラメータに依存する。典型的に、臨床医は、所望される効果を達成する投薬量に達するまで、組成物を投与する。組成物は、したがって、単回用量として、経時的な２回以上の用量として（同じ量の所望される分子を含んでもよく、もしくは含まなくてもよい）、または埋め込みデバイスもしくはカテーテルを介した連続的注入として、投与され得る。適切な投薬量のさらなる微調整は、当業者によって日常的に行われ、当業者が日常的に行う業務の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量応答データの使用を通じて確定することができる。
【０３６５】
薬学的組成物の投与経路は、例えば、経口；静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、もしくは病巣内経路による注射を通じて；持続放出系（注射もまた可能である）による；または埋め込みデバイスによる、既知の方法に従う。所望される場合、組成物は、ボーラス注射によって、もしくは注入によって連続的に、または埋め込みデバイスによって、投与されてもよい。
【０３６６】
代替または追加として、組成物は、所望される分子が吸収または封入されている膜、スポンジ、または他の適切な材料の埋め込みを介して局所的に投与されてもよい。埋め込みデバイスを使用する場合、デバイスは、任意の好適な組織または器官に埋め込むことができ、所望される分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス、または連続的投与を介して行われ得る。
【０３６７】
薬物濃度を長期にわたって所望される治療有効レベルに維持することができるように、薬物、例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を所定の速度で送達するために、種々の異なるアプローチが用いられ得る。一実施例において、ゼラチン（例えば、ウシゼラチン、ヒトゼラチン、もしくは別の源からのゼラチン）または天然もしくは合成して生成されたポリマー等のポリマーを含むヒドロゲルを用いることができる。５、１０、１５、または２０％等、任意の割合のポリマー（例えば、ゼラチン）を、ヒドロゲルにおいて用いることができる。適切な濃度の選択は、所望される治療プロファイルおよび治療分子の薬物動態プロファイルといった種々の要因に依存し得る。
【０３６８】
ヒドロゲルに組み込むことができるポリマーの例には、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド−コ−ポリプロピレンオキシド、コ−ポリエチレンオキシドブロックまたはランダムコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリ（ビニルピロリジノン）、ポリ（アミノ酸）、デキストラン、ヘパリン、多糖類、ポリエーテル等が含まれる。
【０３６９】
ヒドロゲル製剤を生成する際に考慮され得る別の要因は、ヒドロゲルの架橋度と架橋剤である。一実施形態において、架橋は、メタクリル無水物が関与するメタクリル化反応を介して達成することができる。いくつかの状況においては高度の架橋が望ましいが、他の状況においては、低度の架橋が好ましい。いくつかの場合において、高度の架橋は、より長い持続放出をもたらす。高度の架橋は、より堅固なヒドロゲルおよびより長い薬物送達期間をもたらし得る。
【０３７０】
任意の比率のポリマーおよび架橋剤（例えば、メタクリル無水物）を用いて、所望される特性を有するヒドロゲルを生成することができる。例えば、ポリマーと架橋剤との比率は、例として、８：１、１６：１、２４：１、または３２：１であり得る。例えば、ヒドロゲルポリマーがゼラチンであり、架橋剤がメタクリル酸塩である場合、８：１、１６：１、２４：１、または３２：１の比率のメタクリル酸無水物：ゼラチンが用いられ得る。
【０３７１】
Ｖ．ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の治療的使用
ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を使用して、代謝性状態または障害を治療、診断、または緩和することができる。一実施形態において、治療される代謝性障害は、糖尿病、例えば、２型糖尿病である。別の実施形態において、代謝性状態もしくは障害は、肥満である。他の実施形態において、代謝性状態または障害は、脂質異常症、高グルコースレベル、高インスリンレベル、または糖尿病性腎症である。例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を使用して治療または緩和することができる代謝性状態または障害には、ヒト対象が、１２５ｍｇ／ｄＬまたはそれ以上、例えば、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、または２００ｍｇ／ｄＬを上回る絶食時血中グルコースレベルを有する状態が含まれる。血中グルコースレベルは、摂食または絶食状態、またはランダムに判定することができる。代謝性状態または障害は、対象が代謝性状態を発症する危険性にある状態もまた含まれる。ヒト対象については、このような状態には、１００ｍｇ／ｄＬの絶食時血中グルコースレベルが含まれる。ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドを含む薬学的組成物を使用して治療することができる状態はまた、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ−２０１１，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，Ｓ１１−Ｓ６１，２０１０に見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０３７２】
適用において、２型糖尿病、高グルコースレベル、高インスリンレベル、脂質異常症、肥満、または糖尿病性腎症等の代謝性障害または状態は、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の治療有効用量を、それを必要とする患者に投与することによって治療することができる。投与は、静脈内注射、腹腔内（ＩＰ）注射、皮下注射、筋肉内注射によって、または錠剤の形態もしくは液体形態において経口によって等、本明細書に記載されるように行うことができる。いくつかの状況において、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の治療有効用量または好ましい用量は、臨床医によって決定され得る。ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の治療有効用量は、とりわけ、投与スケジュール、投与される薬剤の単位用量、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態が他の治療剤と組み合わせて投与されるかどうか、免疫状態、ならびにレシピエントの健康に依存する。「治療有効用量」という用語は、本明細書に使用される際、治療される疾患または障害の症状の軽減または緩和を含む、研究者、医師、または他の臨床医によって求められる、組織系、動物、またはヒトにおける生物学的または医学的応答を誘起する、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の量、すなわち、観察可能なレベルの１つ以上の所望される生物学的または医学的応答、例えば、血中グルコース、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールレベルの低下、体重の減少、またはグルコース耐性、エネルギー消費、もしくはインスリン感受性の改善を支持する、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の量を意味する。
【０３７３】
ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の治療有効容量はまた、所望される結果によって多様であり得ることに留意されたい。したがって、例えば、低い血中グルコースレベルが示されている状況では、ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドの用量は、それに応じて、比較的低い血中グルコースレベルが所望される場合の用量よりも、高くなる。対照的に、高い血中グルコースレベルが示されている状況では、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の用量は、比較的高い血中グルコースレベルが所望される場合の用量よりも、低くなる。
【０３７４】
種々の実施形態において、対象は、１００ｍｇ／ｄＬまたはそれ以上の血中グルコースレベルを有するヒトであり、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態で治療することができる。
【０３７５】
一実施形態において、本開示の方法は、まず、対象におけるグルコース、インスリン、コレステロール、脂質等、１つ以上の代謝関連化合物のベースラインレベルを測定することを含む。次いで、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む薬学的組成物を、対象に投与する。所望される期間の後に、対象における１つ以上の代謝関連化合物（例えば、血中グルコース、インスリン、コレステロール、脂質）のレベルを、再度測定する。次いで、対象における代謝関連化合物における相対変化を判定するために、２つのレベルを比較する。この比較の結果に応じて、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む薬学的組成物のさらなる用量を、１つ以上の代謝関連化合物の所望されるレベルを達成するために投与してもよい。
【０３７６】
ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む薬学的組成物は、別の化合物と同時投与してもよいことに留意されたい。ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドと同時投与される化合物が何であるか、および特性は、治療または緩和される状態の性質に依存する。ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む薬学的組成物と組み合わせて投与することができる化合物の非限定的な例の列挙としては、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔｉｚｏｎｅ）、レパグリニド、ナテグリチニド（ｎａｔｅｇｌｉｔｉｎｉｄｅ）、メトホルミン、エクセナチド、シタグリプチン（ｓｔｉａｇｌｉｐｔｉｎ）、プラムリンチド、グリピジド、グリメピリドアカルボース（ｇｌｉｍｅｐｒｉｒｉｄｅａｃａｒｂｏｓｅ）、およびミグリトールが挙げられる。
【０３７７】
ＶＩ．  キット
本開示の方法を実施するためのキットもまた提供する。そのようなキットは、本明細書に提供されるペプチドまたはタンパク質をコードする核酸、このような核酸を含むベクターおよび細胞、ならびにこのような核酸含有化合物を含む薬学的組成物を含む、本明細書に記載されるもの等の薬学的組成物を含み得、これらは滅菌容器中に提供され得る。場合によっては、提供される薬学的組成物を代謝性障害の治療に用いる方法についての説明もまた、含まれ得るか、または患者もしくは医療従事者に利用可能であり得る。
【０３７８】
一態様において、キットは、（ａ）ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の治療有効量を含む薬学的組成物、および（ｂ）薬学的組成物のための１つ以上の容器を含む。このようなキットはまた、その使用のための説明を含み得、この説明は、治療されている正確な代謝性障害に合わせて作成することができる。説明には、キットに提供される材料の使用および性質が記載され得る。ある特定の実施形態において、キットは、高グルコースレベル、高インスリンレベル、肥満、２型糖尿病、脂質異常症、または糖尿病性腎症等、代謝性障害を治療するために投与を実行するための患者に対する説明を含む。
【０３７９】
説明は、紙またはプラスチック等の基材に印刷されてもよく、添付文書としてキット内に、キットまたはその構成要素の容器のラベル（例えば、パッケージ関連）に存在してもよい。他の実施形態において、説明は、好適なコンピュータ可読媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット等に存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態において、実際の説明はキット内に存在しないが、インターネットを介して等、遠隔源から説明を得るための手段が提供される。この実施形態の例は、説明を確認することができる、および／または説明をダウンロードすることができる、ウェブアドレスを含むキットである。
【０３８０】
しばしば、キットの構成要素の一部または全てを、好適なパッケージ中に入れて、滅菌性を維持することが望ましい。キットの構成要素を、キット格納要素にパッケージ化して、単一の取り扱いが容易なユニットを形成することができ、ここで、例えば、箱または類似の構造であるキット格納要素は、例えば、キットの構成要素の一部または全ての滅菌性をさらに保つための気密容器であり得るが、そうでなくてもよい。
【実施例】
【０３８１】
行った実験および得られた結果を含む、以下の実施例は、例示のみの目的で提供され、本発明を制限すると見なされるものではない。
【０３８２】
［実施例１］
天然のＧＤＦ１５ポリペプチドの調製
ＣＨＯ−Ｓ安定細胞系の成長およびトランスフェクションを、トランスフェクション培地（ＣＤ−ＣＨＯ、４×Ｌ−グルタミン、１×ＨＴ、１×Ｐ／Ｓ／Ｇ）を含有する６ウェルプレートを使用して実行した。トランスフェクションの前日に、培養細胞を、５ｅ５生存細胞（ｖｃ）／ｍｌの濃度に分割した。トランスフェクション複合体の形成を、４μｇの線状ＤＮＡ／５００  Ｏｐｔｉｍｅｍ、１０μｌのＬＦ−ＬＴＸ／５００μｌのＯｐｔｉｍｅｍ、および２０分間のインキュベーション期間を用いて行った。次いで、細胞を、１ｅ６ｖｃ／ウェルでの遠心分離によって調製し、ＤＰＢＳ中で洗浄し、１ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ中に再懸濁させた。続いて、１ｍｌのトランスフェクション複合体を、６ウェルプレート中の１ｅ６の細胞に添加し、振盪させながら６時間インキュベートした後、２ｍｌのＭＩＸ−６培地（抗生物質不含）を添加した。６μｇ／ｍｌのピューロマイシンを有するＭＩＸ−６培地を使用して、２日目に選択を開始し、細胞を遠心分離し、培地中に再懸濁することによって、培地の置き換えを２〜３日毎に１０〜１２日間行った。
【０３８３】
親和性タグとともに構築したＧＤＦ１５発現ベクターによって形質転換した細胞を６００ｎｍで９の光学密度まで成長させ、次いで、６時間後に遠心分離によって６３の光学密度で誘導し、採取した。凍結細胞ペーストを解凍し、スラリーが均質になるまで低剪断力のホモジナイザーを用いて１５％（重量／体積）で緩衝液中に再懸濁した。細胞を、次いで、高剪断力のホモジナイゼーションに供して破壊し、生成物を含有する封入体を放出させた。結果として得られたホモジネートを、次いで、５，０００×ｇにおいて５Ｃで１時間遠心分離して、封入体をペレットとして採取し、細胞質の混入物質は廃棄上清中に残した。冷水および低剪断力のホモジナイザーを使用してペレットを元のホモジネート体積まで均質に再懸濁することによって、残留細胞質を封入体から洗い流した後、前述のように遠心分離した。結果として得られたペレット、すなわち洗浄した封入体（ＷＩＢＳ）を、次いで、−８０Ｃで凍結させた。
【０３８４】
ＷＩＢＳおよび塩酸グアニジン（ＧｎＨＣｌ）の十分な量を、ｐＨ８．５で還元−可溶化に使用して、おおよそ２５ｍｇ／ｍｌの還元生成物および６ＭのＧｎＨＣｌ最終濃度を得た。可溶化物を、次いで、アルカリ性ｐＨでレドックス試薬、カオトロープ、および共溶媒を含有するリフォールディング緩衝液中に、撹拌しながら２５倍に急速希釈した。リフォールディング溶液を、ゆっくりと撹拌させ、６Ｃで７２時間または溶液がエルマン試薬に対して陰性となるまで、空気酸化させた。次いで、５Ｃのリフォールディング溶液を、深層濾過によって浄化させて、１０倍の限外濾過濃度にし、続いて５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含有する緩衝液に透析濾過し、ｐＨ８．５の低カオトロープ濃度にした。続く残余液を２５Ｃに温め、次いで、ｐＨを酸性範囲に低下させて混入物質を沈殿させた。沈殿物を、２５Ｃで３０分間、５，０００×ｇでの遠心分離によって除去し、結果として得られた上清を、０．４５μｍの濾過によってさらに浄化させた。次いで、濾液（ＡＰ）をｐＨ８．５および低塩濃度に調整して、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を含む精製の第１のステップを可能にした。
【０３８５】
タンパク質フォールディングおよびＡＰに続いて、ＧＤＦ１５を、２ステップのクロマトグラフィートレインを用いて精製した。調整したＡＰを、ｐＨ  ８．５で低塩濃度を有する緩衝カオトロープで平衡させたＩＭＡＣカラムに適用した。次いで、カラムを、ベースラインの紫外線（ＵＶ）レベルが得られるまで、平衡緩衝液で洗浄した。生成物および混入物質を、ディスプレーサー濃度を段階的に増加させる事によって溶出し、溶出物を回収し、続いてクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）によってアッセイして、どの溶出画分が、予測されたＧＤＦ１５の分子量で移動するポリペプチドを含有したかを特定した。ＩＭＡＣが完了した後、プールした生成物含有画分を、２５ＣでｐＨ７．２および５ｍＭ  ＥＤＴＡに調整する。生成物を、２５Ｃで数時間、低濃度の酵素を添加して親和性タグを切断することによって、成熟長ＧＤＦ１５に変換させた。切断反応混合物を、酢酸および有機溶媒の添加によって有機改質剤および酸性ｐＨで調整した。これにより、２５Ｃで行われる逆相カラムからの生成物の線形勾配溶出からなる最終クロマトグラフィーステップが可能となった。クロマトグラフィーからの溶出物を、画分として回収し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、均質な生成物のプールに適切な画分を決定した。結果として得られたプールに、弱酸性緩衝液への透析濾過による緩衝液交換を行い、限外濾過によって濃縮し、滅菌濾過し、最終的に５Ｃまたは凍結させて保管した。
【０３８６】
［実施例２］
Ｆｃ融合ＧＤＦ１５タンパク質による過食ｏｂ／ｏｂマウスにおける食物摂取の抑制
ＧＤＦ１５は過食ｏｂ／ｏｂマウスにおける食物摂取を低減させるため、食物摂取量アッセイを使用して、異なる形態のＧＤＦ１５類似体の有効性を評価した。マウスにおけるヒトＧＤＦ１５ポリペプチドの半減期がおおよそ３時間であることが観察されたため、Ｆｃ融合の戦略を用いてタンパク質の半減期を延長させた。異なるＦｃ融合ＧＤＦ１５ポリペプチドを生成し、Ｆｃ融合ＧＤＦ１５および野生型ＧＤＦ１５ポリペプチドを過食レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに導入し、特定のＦｃ融合ＧＤＦ１５ポリペプチドがこれらの動物において食物摂取を抑制する能力を測定することによって、インビボでのＧＤＦ１５活性について分析した。試験するＦｃ融合ＧＤＦ１５ポリペプチドを、０日目の午後４〜５時の間に、７〜８週齢のｏｂ／ｏｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に皮下注射した。注射後に、動物を、食物が事前に測定されているケージに移し、食物摂取量を翌日の午前９〜１０時の間に測定した。
【０３８７】
野生型ＧＤＦ１５および各Ｆｃ融合ＧＤＦ１５ポリペプチドについての代表的な実験の結果を、図３〜２１に提供し、これらは、荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−Ｇ４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｓ）２−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）−（１Ｋ）−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）、ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｌ３５１Ｃ）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｌ３５１Ｃ）、およびＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｓ３５４Ｃ）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｙ３４９Ｃ）の二量体；荷電対構築物ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）（Ｓ３５４Ｃ）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（−）（Ｙ３４９Ｃ）の二量体；ヘミＦｃ構築物Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５、および  Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）５−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５の二量体；天然の成熟ｈＧＤＦ１５のホモ二量体；ならびに成熟ｈＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）変異体のホモ二量体の食物摂取量アッセイにおける用量応答曲線を示す。
【０３８８】
これらの実験は、荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）、荷電対、およびヘミＦｃ構築物の二量体が、天然の成熟ｈＧＤＦ１５のホモ二量体のものよりも優れた効力で、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて食物摂取量の減少を呈したことを示した。食物摂取量の測定値は、ポリペプチドの単回注射の１７時間後に取得され、より強い効力および有効性は、Ｆｃ融合ポリペプチドのより長い半減期の結果であり得る。
【０３８９】
［実施例３］
Ｆｃ融合ＧＤＦ１５構築物による脂質耐性の改善
荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）およびヘミＦｃ構築物の二量体を、これらの構築物ならびに天然の成熟ｈＧＤＦ１５ホモ二量体を肥満Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウス（肥満は、６０％高脂肪食をマウスに与える事によって誘発した）に導入し、それぞれの特定のポリペプチドまたは構築物がこれらの動物において経口脂質耐性を改善する能力を測定することによって、インビボでのＧＤＦ１５の活性について分析した。
【０３９０】
雄のＢ６Ｄ２Ｆ１マウスに、５週齢で６０％高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｄ１２４９２ｉ）を６〜１０週間与え、研究の２〜４日前に、体重および３時間絶食時血清トリグリセリドレベルによって分類割り当てした。試験日に、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体（節ＩＩ．Ｂ．１を参照されたい）、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体（節ＩＩ．Ｄ．１を参照されたい）、および天然の成熟ｈＧＤＦ１５のホモ二量体を、３時間絶食させたマウスに静脈内注射した。天然の成熟ｈＧＤＦ１５またはまたは成熟ｈＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）変異体の用量応答試験においては、タンパク質を皮下注射した。タンパク質注射の３時間後に、２０％Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄを、２０ｍｌ／ｋｇで経口投与した。さらに９０分後に、血液試料を、尾出血により採取し、血清トリグリセリドレベルを測定した。
【０３９１】
天然の成熟ｈＧＤＦ１５のホモ二量体、成熟ｈＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）変異体のホモ二量体、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体、およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体を含む代表的な実験の結果を、図２２〜２５に示す。図２３〜２５において、天然の成熟ｈＧＤＦ１５のホモ二量体、成熟ｈＧＤＦ１５（Ｈ６Ｄ）の変異体、およびＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体は、用量依存性様式で、脂質耐性を改善した。図２２において、天然の成熟ｈＧＤＦ１５のホモ二量体およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体が、１ｍｇ／ｋｇの静脈内投与で同じアッセイにおいて有効であることを示す。
【０３９２】
［実施例４］
ＤＩＯマウスにおけるｈＧＤＦ１５およびｈＧＤＦ１５を含む構築物の長期的有効性
ＧＤＦ１５は、血中グルコース、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールのレベルを低下させる、体重を減少させる、またはグルコース耐性およびインスリン感受性を改善する。ｈＧＤＦ１５および種々のＦｃ融合ＧＤＦ１５構築物がこれらのパラメータを改善する能力を評価するために、長期試験を行った。
【０３９３】
実施例４．１  試験の設計
２つの別個の試験を行って、異なるＦｃ融合ＧＤＦ１５ポリペプチドの長期的有効性を評価した。第１の試験（試験＃１）は、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体（節ＩＩ．Ｂ．１を参照されたい）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体（節ＩＩ．Ｄ．１を参照されたい）を含んだ。この試験において、荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物の二量体およびヘミＦｃ構築物の二量体を、６０Ｋｃａｌ％の高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）を与えた４週齢の雄のＣ５７Ｂｌ／６マウス（ＨＡＲ）に、１６週間、長期的に皮下投与した。動物を、６週間、個室収容条件に順化させた。あらゆる試験化合物の投与の前に、週１回の処置および生理食塩水の皮下注射を、３週間行った。マウスを、１回目のタンパク質注射の２日前に、週間食物摂取量、ならびに体重、４時間絶食時血中グルコースレベル、４時間絶食時血清インスリンレベル、トリグリセリド、およびコレステロールレベルに基づいて１２匹ずつ７つの群および６匹の１つの群に分割した。荷電対（ｄｅｌｈｉｎｇｅ）構築物の二量体では１．２９、０．１２９、０．０１２９ｍｇ／ｋｇ、またはヘミＦｃ構築物の二量体では１．３５、０．１３５、０．０１３５ｍｇ／ｋｇに相当する、１０、１、０．１ｎｍｏｌ／ｋｇの３つの異なる用量レベルを選択した。週１回の投与の投薬レジメンを、マウスＰＫデータに基づいて選択した。１２匹の動物の１つの群に、対照としてビヒクル緩衝液を週１回皮下注射した。６匹の動物の１つの群に、ビヒクル緩衝液を皮下注射し、陽性対照として、１０ｍｇ／ｋｇの経口１日用量を目標とする０．０１４％のロシグリタゾンを含有する食餌を与えた。研究は、５週間行い、最終投与は２８日目に行った。結果を、図２６〜３８に示す。
【０３９４】
第２の試験（試験＃２）は、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体（節ＩＩ．Ｂ．１を参照されたい）およびＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体（節ＩＩ．Ｃを参照されたい）を含んだ。この試験において、荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物の二量体および荷電対構築物の二量体を、６０Ｋｃａｌ％の高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）を与えた４週齢の雄のＣ５７Ｂｌ／６マウス（ＨＡＲ）に、１５週間、長期的に皮下した。動物を、５週間、個室収容条件に順化させた。あらゆる試験化合物の投与の前に、週１回の処置および生理食塩水の皮下注射を、３週間行った。マウスを、１回目のタンパク質注射の４日前に、週間食物摂取量、ならびに体重、４時間絶食時血中グルコースレベル、４時間絶食時血清インスリン、トリグリセリド、およびコレステロールレベルに基づいて、１２匹ずつの群に分割した。荷電対構築物の二量体では１．２５、０．１２５、０．０１２５ｍｇ／ｋｇに相当する、１０、１、０．１ｎｍｏｌ／ｋｇの３つの異なる用量を選択した。荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物の二量体では１．２９および０．１２９ｍｇ／ｋｇに相当する、１０および１ｎｍｏｌ／ｋｇの２つの異なる用量レベルを選択した。週１回の投与の投薬レジメンを、マウスＰＫデータに基づいて選択した。１２匹の動物の１つの群に、対照としてビヒクル緩衝液を週１回皮下注射した。６匹の動物の１つの群に、ビヒクル緩衝液を皮下注射し、陽性対照として、１０ｍｇ／ｋｇの経口１日用量を目標とする０．０１４％のロシグリタゾンを含有する食餌を与えた。研究は、５週間行い、最終投与は２８日目に行った。結果を、図３９〜５４に示す。
【０３９５】
体重および食物摂取量を、試験を通じて週１回測定した。１回目のタンパク質注射を行った２週間後に、４時間絶食させた動物において、経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）を１回行った。１回目のタンパク質注射を行った５週間後に、１６時間絶食させた動物において、経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）を１回行った。血液試料を、１回目のタンパク質注射の２週間後および４週間後に４時間絶食させた動物、１回目のタンパク質注射の３週間後に自由に給餌させた動物、および１回目のタンパク質注射の５週間後に１６時間絶食させた動物から、採取した。血清試料を使用して、インスリン、トリグリセリド、およびコレステロールレベル、ならびに試験化合物のレベルを測定した。
【０３９６】
実施例４．２  体重に対する試験化合物の効果
体重を、試験の間、試験化合物の投与の前後両方に調べた。ビヒクル動物のベースラインからの体重は、時間とともに増加したが、１０または１ｎｍｏｌ／ｋｇの荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミＦｃ構築物の二量体で処置した動物の体重は、図３０および４３に示されるように、５週間の処置期間の間に減少し、化合物の断薬期間中に回復し始めた。１ｎｍｏｌ／ｋｇの荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミＦｃ構築物の二量体で処置した動物における体重の変化は、統計学的有意性には達しなかった。
【０３９７】
実施例４．３．  食物摂取量に対する試験化合物の効果
食物摂取量を、週１回測定した。平均の１日食物摂取量は、週間食物摂取量を７で除すことによって計算した。図３１および４４に示されるように、１０ｎｍｏｌ／ｋｇにおいて、荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミＦｃ構築物の二量体は食物摂取量を低下させ、ほとんどの週間測定値において統計学的有意性を有した。１ｎｍｏｌ／ｋｇの用量での効果は、有意性が低かったが、傾向は明らかであった。１ｎｍｏｌ／ｋｇの３つの構築物のそれぞれ（すなわち、荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミＦｃ構築物の二量体）で処置した動物における食物摂取量は、ビヒクル緩衝液で処置した動物における食物摂取量と比較して低かった。
【０３９８】
実施例４．４  グルコースおよびＯＧＴＴに対する試験化合物の効果
ＯＧＴＴ（ＯＧＴＴ１およびＯＧＴＴ２）を、処置を開始した後に行った。ＯＧＴＴ１は、１回目のタンパク質注射の１４日後に、午前６時から４時間絶食させた動物において行った。経口グルコースチャレンジの前の４時間絶食時グルコースレベルを、タンパク質注射の２日前または４日前に測定したベースラインの４時間絶食時グルコースレベルと比較した（図３２および４５）。ＯＧＴＴ１のグルコースプロファイルを、図２６、２７、３９、および４０に示す。１０および１ｎｍｏｌ／ｋｇの荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物の二量体、荷電対Ｆｃ−ｈＧＤＦ１５構築物の二量体、またはヘミＦｃ構築物の二量体で処置した動物は、ＯＧＴＴの前および最中のグルコースレベル、ならびにＯＧＴＴ中のＡＵＣによって示されるように、ビヒクル処置動物と比較して、改善されたグルコースレベルおよび経口グルコース耐性を示した。０．１ｎｍｏｌ／ｋｇの荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミＦｃ構築物の二量体で処置した動物は、改善されたグルコース耐性を示したが、これらの動物におけるグルコースレベルの改善は、それほど有意ではなかった。１回目のタンパク質注射の２週間後、０．１ｎｍｏｌ／ｋｇのヘミＦｃ構築物の二量体で処置した動物における改善されたグルコース耐性は、これらの動物が、ビヒクル処置動物と類似の体重および食物摂取量を有することから、体重または食物摂取量の変化からは独立してグルコース耐性の改善を示す。
【０３９９】
ＯＧＴＴ２を、１回目のタンパク質注射の３５日後、すなわち最終タンパク質注射の７日後に、経口グルコースチャレンジの前日の午後５時から１６時間絶食させた動物に行った。ＯＧＴＴ２のグルコースプロファイルを、図２８、２９、４１、および４２に示す。１０、１、または０．１ｎｍｏｌ／ｋｇの３つの構築物のそれぞれ（すなわち、荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミＦｃ構築物の二量体）での５週間の処置は、ＯＧＴＴ中のグルコースレベルおよびグルコース曲線のＡＵＣによって示されるように、経口グルコース耐性を有意に改善した。
【０４００】
実施例４．５．  インスリンに対する試験化合物の効果
インスリンレベルを、４日目、１４日目、および２８日目に４時間絶食させた動物、２１日目に自由に給餌させた動物、ならびに３５日目に１６時間絶食させた動物から採取した血液試料において測定した。マウスは、暗サイクル中に食物の大半を消費する。午前６時から４時間絶食させるプロトコルを同じ群内の縦断的比較に使用して、明サイクル中の食物の摂取によって誘発される変動を排除した。観察されたインスリンレベルを、図３３、３４、および４６〜４８に示す。
【０４０１】
４時間絶食させたビヒクル処置動物におけるインスリンレベルは、これらの動物においてインスリン耐性がさらに進行するにつれて、経時的に増加した。１０または１ｎｍｏｌ／ｋｇの荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、またはヘミＦｃ構築物の二量体での処置は、インスリンレベルを、処置を始める前の動物の開始点よりも低下させ、高脂肪食に誘発されるインスリン耐性の逆転を示した。０．１ｎｍｏｌ／ｋｇの投薬量は、経時的なインスリンレベルの増加を阻止した。．
【０４０２】
全ての３つのＦｃ融合ＧＤＦ１５構築物はまた、３５日目に一晩絶食させた動物において、類似の用量依存性改善をインスリンレベルに示した。試験＃２で収集されたデータは、荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物の二量体および荷電対構築物の二量体が、自由に給餌させた動物においてインスリンレベルを低下させることを示した。
【０４０３】
実施例４．６  トリグリセリドレベルに対する試験化合物の効果
トリグリセリドレベルを、−４日目、１４日目、および２８日目に４時間絶食させた動物、２１日目に自由に給餌させた動物、ならびに３５日目に１６時間絶食させた動物から採取した血液試料において測定した。マウスは、暗サイクル中に食物の大半を消費する。午前６時から４時間絶食させるプロトコルを同じ群内の縦断的比較に使用して、明サイクル中の食物の摂取によって誘発される変動を排除した。
【０４０４】
４時間または１６時間絶食させた動物におけるトリグリセリドレベルに対する荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミＦｃ構築物の二量体の効果は、図３５、３６、４９、および５１に示されるように、強力ではないが統計学的に有意であった。１０ｎｍｏｌ／ｋｇにおいて、荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）Ｆｃ構築物の二量体は、一貫して、２８日目および３５日目の血清トリグリセリドレベルを低下させた。試験＃２から収集したデータは、自由に給餌させた動物において、１０および１ｎｍｏｌ／ｋｇの荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物の二量体および荷電対構築物の二量体のいずれの効果も、図５０に示されるように、統計学的に有意であったことを示した。ＧＤＦ１５が経口脂質耐性を改善することは、前述の節において示されている。自由に給餌させた動物において血清トリグリセリドレベルを低下させることにおけるより強力な有効性の観察は、食後の脂質プロファイルの改善を示し得、また、経口／食事脂質耐性の改善から結果としてもたらされた可能性がある。
【０４０５】
実施例４．７  コレステロールレベルに対する試験化合物の効果
総コレステロールレベルを、−４日目、１４日目、および２８日目に４時間絶食させた動物から、２１日目に自由に給餌させた動物から、ならびに３５日目に１６時間絶食させた動物から採取した血液試料において測定した。マウスは、暗サイクル中に食物の大半を消費する。午前６時から４時間絶食させるプロトコルを同じ群内の縦断的比較に使用して、明サイクル中の食物の摂取によって誘発される変動を排除した。
【０４０６】
全ての３つの構築物（すなわち、荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、ヘミＦｃ構築物の二量体）は、図３７、３８、および５２〜５４に示されるように、総コレステロールレベルを用量依存的に低下させ、この効果は、動物の給餌状態によって影響を受けた。
【０４０７】
実施例４からの結論
全ての３つの構築物、すなわち、荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミＦｃ構築物の二量体は、体重、血中グルコースレベルおよびグルコース耐性、血清インスリンレベル、血清コレステロールレベル、血清トリグリセリドレベル、ならびに経口脂質耐性を含む、種々の代謝パラメータの改善に有効性を示した。ポリペプチドは１週間に１回注射し、有効性は用量依存性であり、１０ｎｏｍ／ｋｇの投薬量が、最も強い有効性を示した。
【０４０８】
［実施例５］
肥満カニクイザルにおけるｈＧＤＦ１５およびｈＧＤＦ１５を含む構築物の長期的有効性
荷電対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）構築物「ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）」およびヘミＦｃ構築物「Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５」を、これらの構築物ならびにビヒクル（Ａ４．５Ｓｕ）を肥満カニクイザルに導入することによって、インビボでのＧＤＦ１５１５活性について分析した。
【０４０９】
実施例５．１  試験の設計
この試験は、カニクイザルにおいて行った。サルは、年齢が１１〜１４歳であった。体重は、７〜１０ｋｇの範囲に及び、ＢＭＩは、３８〜５８ｋｇ／ｍ２の範囲に及んだ。４０匹のサルを、化合物投与を開始する前に６週間順化させた。順化期間中、サルに、椅子への拘束、皮下注射（ＰＢＳ、０．１ｍｌ／ｋｇ）、強制給餌（水、１０ｍｌ／ｋｇ）、非ＯＧＴＴおよびＯＧＴＴ試料のための採血を含む、手順に慣れるように、１週間に４回６週間訓練を行った。６週間の訓練中、ベースラインＯＧＴＴおよび血漿代謝パラメータを測定した。４０匹中３０匹のサルを選択し、類似するベースラインレベルの体重、ＯＧＴＴ  ＡＵＣ応答、ならびに血漿グルコース、インスリン、およびトリグリセリドレベルを達成するように、３つの処置群に無作為割り当てした。
【０４１０】
試験は、盲検方式で行った。ビヒクル（ｎ＝１０）、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体（ｎ＝１０）、およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体（ｎ＝１０）を、化合物Ａ、Ｂ、およびＣとしてラベル付けし、１週間に１回、皮下注射によって投与した。化合物は、１．５ｍｇ／ｋｇ／週で与えた。６週間の化合物処置の後、動物を、化合物の断薬および処置からの回復について、さらに５週間観察した。食物摂取量、体重、臨床化学、およびＯＧＴＴを、試験を通じて監視した。食物摂取量は、毎食測定した。体重は、週１回測定した。血液試料を、週１回、各注射の６日後に採取して、グルコース、トリグリセリドを測定した。ＯＧＴＴは、処置開始後１３日目、３４日目、および５５日目に行った。処置を開始する日を０日目として指定し、詳細な試験の設計を、図５５に示す。
【０４１１】
この実施例に示される結果は、６週間の処置の終了時、および断薬期間中に収集されたデータである。
【０４１２】
実施例５．２  化合物の暴露
化合物（ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体）の暴露測定を、一晩絶食後およびその翌日に非絶食マウスにおいて採取した試料に行った。これらの測定は、処置および断薬期間の間、毎週行った。ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体は、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体よりも高い暴露を示した。ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体群の１０匹中２匹の動物が、抗体を示したが、１０匹中５匹の動物は、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体群に特定された。抗体を有する疑いのある動物における薬力学的応答の消失は、薬物暴露の消失と相関する。各化合物の暴露レベルを、図５６に示す。
【０４１３】
実施例５．３  経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）に対する試験化合物の効果
ＯＧＴＴは、処置開始の前および後に行った。図５７〜６４は、ＯＧＴＴの前および後のＯＧＴＴ曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。順化ＯＧＴＴを処置開始の前に行い、投与後のＯＧＴＴを２週目および５週目に行い、断薬ＯＧＴＴを８週目（最終投与の３週間後）に行った。グルコースおよびインスリン（ＡＵＣ）を、グルコース（図５７〜６０）およびインスリン（図６１〜６４）について測定した。ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体は、２週目にＯＧＴＴグルコースＡＵＣを有意に改善し、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体は、５週目に改善した。ＯＧＴＴグルコースＡＵＣは、８週目（断薬期間中にもＦｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５）構築物の二量体により依然として改善されたＯＧＴＴインスリンＡＵＣは、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体では２週目および５週目、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体では２週目のみに有意に改善された。
【０４１４】
実施例５．４  絶食時インスリンレベルに対する試験化合物の効果
血液を、一晩絶食させた動物から採取した。採血は、週１回、各注射の６日後に行った。ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体のいずれも、絶食時血中インスリンレベルを低減させた。この効果は、断薬期間中には見られなかった。図６８は、研究期間中の絶食時インスリンレベルを示す。
【０４１５】
実施例５．５  食物摂取量に対する試験化合物の効果
動物は、１日２回給餌させ、食物摂取量を毎食記録した。給餌時間は、午前８：００〜午前９：００（±３０分間）、次いで午後４：００〜午後５：００（±３０分間）であった。リンゴ（１５０ｇ）を、毎日午後１：３０〜２：３０（±３０分間）に、各動物に与えた。
【０４１６】
ビヒクルと比較して、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体のいずれも、サルにおいて食物摂取量を低減させた（図６６）。しかしながら、約３０日間の処置の後、効果は減少し、食物摂取量はベースラインまたは対照レベル付近に戻った。
【０４１７】
実施例５．６  トリグリセリド（ｔｒｉｇｙｌｃｅｒｉｄｅ）レベルに対する試験化合物の効果
血液を、一晩絶食させた動物から採取した。採血は、週１回、各注射の６日後に行った。トリグリセリドレベルは、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体で処置した動物において、処置期間を通して有意に低減された。この効果は、断薬期間中に減少した。図６７は、試験期間中の絶食時血漿トリグリセリドレベルを示す。
【０４１８】
実施例５．７  体重に対する試験化合物の効果
体重を、試験を通じて週１回監視した。６週間の処置期間にわたって、ビヒクルで処置した動物の体重は、一定して留まったか、またはわずかに増加したが、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体で処置した動物の体重は、図６５に示されるように徐々に減少した。
【０４１９】
実施例５からの結論
雄の肥満カニクイザルに行った研究では、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５
：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体で処置した動物は、代謝パラメータの改善を示した。体重は減少した。食物摂取量の短期間の減少が観察され、この効果は、試験の中間で減少し、ベースラインまたは対照レベルに回復した。絶食時トリグリセリドレベルもまた、ＤｈＣｐｍＦｃ（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＤｈＣｐｍＦｃ（＋）構築物の二量体およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）８−Ｆｃ−ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５構築物の二量体の両方の化合物によって低減された。ＯＧＴＴグルコースおよびインスリンＡＵＣは、改善された。
【０４２０】
本発明は、種々の実施形態に関して記載されたが、変形および修正が当業者に想起されることを理解されたい。したがって、添付の特許請求の範囲が、全てのこのような同等の変化形を含み、それらは特許請求される本発明の範囲内に含まれることが意図される。さらに、本明細書に使用される節の見出しは、構成目的のみであり、記載される主題を制限するものと見なされるものではない。
【０４２１】
本出願に引用される全ての参考文献は、あらゆる目的で参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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