(57)【要約】  糞便試料を用いて、大流行株リボタイプ０２７を、他のありうるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（Ｃ．ディフィシル）株から正確にそして迅速に区別すると、治療オプションに関する意志決定が容易になる。細胞壁タンパク質Ｖ（ＣｗｐＶ）は、Ｃ．ディフィシル株間で保存される細胞壁結合ドメインおよびＣ．ディフィシル株間で抗原性が異なる可変ドメインを含有する。態様において、ＣｗｐＶにおける０２７特異的領域に対する抗体を診断試験で用いて、培養物または糞便試料において、リボタイプ０２７を検出する。
2015517658.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボタイプ０２７  Ｃ．ディフィシル（Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株に感染した患者の診断法であって：患者から糞便試料を得て；患者がＣ．ディフィシル感染を有することを決定し；そして糞便試料において、リボタイプ０２７特異的ＣｗｐＶ抗体の存在を決定することによって、患者がリボタイプ０２７  Ｃ．ディフィシル株感染を有するかどうかを決定する、前記診断法。
【請求項２】
ＣｗｐＶ抗原の存在を決定する工程が、ＣｗｐＶ抗原に対するイムノアッセイを用いて、ＣｗｐＶ抗原の存在を決定する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
イムノアッセイが酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または膜上での免疫化学反応である、請求項２の方法。
【請求項４】
イムノアッセイが、捕捉抗体として、モノクローナル、ポリクローナルまたは組換え抗リボタイプ０２７特異的ＣｗｐＶ抗体の１またはそれより多くを利用する、請求項１の方法。
【請求項５】
イムノアッセイが、検出抗体として、ＨＲＰ−コンジュゲート化ポリクローナルまたはモノクローナル抗リボタイプ０２７特異的ＣｗｐＶ抗体を利用する、請求項１の方法。
【請求項６】
イムノアッセイが、Ｃ．ディフィシルによって産生される天然ＣｗｐＶまたは大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）における組換えＤＮＡ発現によって得られるＣｗｐＶに対して作製される、ＣｗｐＶに対する１またはそれより多い抗体を含む、請求項２の方法。
【請求項７】
リボタイプ０２７  Ｃ．ディフィシルの存在を決定する工程が、核酸増幅アッセイを用いて、リボタイプ０２７特異的ＣｗｐＶをコードするＤＮＡ断片の存在を同定する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項８】
リボタイプ０２７  Ｃ．ディフィシル株感染の存在を決定する診断法であって：患者から糞便試料を得て；糞便試料からＣ．ディフィシル・コロニーを単離し；単離コロニーからＣ．ディフィシル培養を増殖させ；Ｃ．ディフィシル培養からバイオマーカーの存在を決定する工程を含み、バイオマーカーの存在が、リボタイプ０２７株に特異的なＣｗｐＶ抗原の存在を示し、リボタイプ０２７株に特異的なＣｗｐＶ抗原の存在が、糞便試料におけるリボタイプ０２７  Ｃ．ディフィシル株の存在を示す、前記診断法。
【請求項９】
バイオマーカーの存在を決定する工程がイムノアッセイを用いる工程を含む、請求項８の方法。
【請求項１０】
イムノアッセイが、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または膜上の免疫化学反応である、請求項９の方法。
【請求項１１】
イムノアッセイが、捕捉抗体として、モノクローナル、ポリクローナルまたは組換え抗リボタイプ０２７特異的ＣｗｐＶ抗体の１またはそれより多くを利用する、請求項１０の方法。
【請求項１２】
イムノアッセイが、検出抗体として、ＨＲＰ−コンジュゲート化モノクローナルまたはポリクローナル抗リボタイプ０２７特異的ＣｗｐＶ抗体を利用する、請求項１０の方法。
【請求項１３】
イムノアッセイが、Ｃ．ディフィシルによって産生される天然ＣｗｐＶまたは大腸菌において組換え的に発現されるＣｗｐＶに対して作製される、ＣｗｐＶに対する１またはそれより多い抗体を含む、請求項１０の方法。
【請求項１４】
バイオマーカーの存在を決定する工程が、核酸増幅アッセイを用いて、リボタイプ０２７特異的ＣｗｐＶをコードするＤＮＡ断片の存在を同定する工程を含む、請求項９の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（Ｃ．ディフィシル）は、米国において、院内下痢の最も一般的な既知の原因であり、そして年間約３００万例の下痢の主要因である。Ｃ．ディフィシル感染（ＣＤＩ）のリスク要因には、抗生物質への曝露、高齢、および病院または長期ケア施設における居住が含まれる。ＣＤＩの症状は、軽度の下痢から、偽膜性大腸炎および中毒性巨大結腸の範囲に渡る。治療の平均コストは、症例あたり約１万ドルである。ＣＤＩの死亡率は、非常に病原性である（ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｔ）大流行株の出現によって、１９９９年の１００万人人口あたり５．７人の死亡から、２００４年の１００万人人口あたり２３．７人の死亡に増加した。リボタイプ０２７株は、ＣＤＩ発生率増加に有意に寄与した。大流行株リボタイプ０２７をＣ．ディフィシルの他の株と正確に区別すると、治療オプションに関する意志決定が容易になりうる。
【図面の簡単な説明】
【０００２】
本発明の例示的な態様を、付随する図に関連して以下に詳細に記載する：
【図１】図１は、本発明の態様にしたがった、抗ＣｗｐＶ  ＥＬＩＳＡおよびＰＣＲリボタイプ決定法の間の比較を示す；
【図２】図２は、本発明の態様にしたがって、ＣｗｐＶの０２７特異的領域に対して生成された抗体が、Ｃ．ディフィシル・リボタイプ０２７しか認識しないことを示す；
【図３】図３は、抗ＣｗｐＶ  ＱＵＩＫ  ＣＨＥＫ（登録商標）の結果の解釈を示す；そして
【図４】図４は、本発明の態様にしたがった、抗ＣｗｐＶ  ＱＵＩＫ  ＣＨＥＫ（登録商標）およびＰＣＲリボタイプ決定法の間の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００３】
本発明の態様は、リボタイプ特異的新規抗原マーカー、細胞壁タンパク質Ｖ（ＣｗｐＶ）の存在に基づいて、患者におけるＣ．ディフィシル株を区別するための試験法に関する。リボタイプ特異的ＣｗｐＶを、Ｃ．ディフィシル・リボタイプ、特に大流行株０２７の検出のためのイムノアッセイにおいて用いてもよい。態様において、抗株特異的ＣｗｐＶ抗体を、Ｃ．ディフィシル株０２７の高感度同定のためのイムノアッセイにおいて用いる。
【０００４】
Ｃ．ディフィシル株間の遺伝的関連性、ならびにＣ．ディフィシル株および疾患重症度の間の関連を研究するため、いくつかのタイプ決定法が開発されてきている。これらの方法には、血清型決定、毒素型決定（ｔｏｘｉｎｏｔｙｐｉｎｇ）、パルスフィールド電気泳動（ＰＦＧＥ）およびＰＣＲリボタイプ決定が含まれる。ＰＣＲリボタイプ決定は、実行が比較的容易であり、再現性があり、そしてＣ．ディフィシル株を区別する最も特徴的な方法の１つである。
【０００５】
９０年代後半に始まって、ＣＤＩの５倍の増加が観察されてきており、そして非常に病原性である株の蔓延が大流行に寄与していることが推測されている。この大流行株は、毒性型ＩＩＩ、北米パルスフィールドゲル電気泳動型１（ＮＡＰ１）、制限エンドヌクレアーゼ分析群Ｉ（ＢＩ）およびＰＣＲリボタイプ０２７として特徴付けられた。リボタイプ０２７のいくつかの特性は、リボタイプ０２７株の病原性増進に寄与する。毒素ＡおよびＢに加えて、０２７株は、さらなる二成分毒素を発現し、これが疾患の重症度に寄与している可能性もある。０２７株はまた、毒素産生のリプレッサーであるｔｃｄＣ遺伝子において、１８塩基対欠失およびフレームシフト突然変異も含有する。該フレームシフト突然変異は、毒素産生増加を引き起こしうる。１９８８年、フランスで単離された歴史的な０２７株は、フルオロキノロンおよびエリスロマイシンに感受性であったが、最近の大流行におけるリボタイプ０２７は、ｇｙｒＡ／Ｂおよび２３ｓ  ＲＮＡ遺伝子における突然変異によって、どちらの抗生物質に対しても耐性になった。ヒト腸上皮細胞に対するより高いアフィニティを持つように改変された表面タンパク質もまた、病原性増進に寄与している可能性もある。
【０００６】
０２７株感染は、いくつかの研究において、より重症の転帰と関連付けられた。０２７株による腸微生物叢の劇的な改変は、その高い病原性に寄与している可能性が高い。しかし、他の研究は、感染株のリボタイプおよび患者転帰の間には相関がないことを示した。この論争は、研究した集団および統計分析に用いた方法から生じている可能性もある。
【０００７】
ＣＤＩ治療のために選択される伝統的な抗生物質は、メトロニダゾールおよびバンコマイシンである。軽度から中程度のＣＤＩ患者に関しては、メトロニダゾールおよびバンコマイシンは同等に有効である。非０２７株によって引き起こされる重症ＣＤＩの患者に関しては、バンコマイシンがより優れた転帰を生じた。メトロニダゾールまたはバンコマイシンのいずれかで治療された患者において、高い再発率が観察された。２０１０年５月、フィダキソマイシン（ディフィシド；  Ｏｐｔｉｍｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）と称される新規薬剤が、成人におけるＣ．ディフィシル関連下痢の治療のため、米国医薬品局によって認可された。フィダキソマイシンは、グラム陽性嫌気性菌に対する、狭域性抗生物質である。バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、好気性および通性グラム陰性桿菌ならびに嫌気性グラム陰性桿菌において、フィダキソマイシンに対する耐性が見出された。フィダキソマイシンは、Ｃ．ディフィシルの０２７および非０２７株に対して同等に有効である。広域性抗生物質の使用は、腸フロラを乱し、これはＣ．ディフィシル感染の再発に寄与する可能性もある。最近の研究によって、フィダキソマイシン治療は、バンコマイシン治療に比較して、非０２７株に感染した患者において、再発率低下を生じたことが示されている。したがって、０２７および非０２７株の間の区別は、治療オプションに関して医師の意志決定を容易にする可能性もある。
【０００８】
ＰＣＲリボタイプ決定法は、Ｃ．ディフィシル・コロニーの単離、純粋なコロニーから生じる培養からのＤＮＡ単離、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅およびゲル電気泳動を必要とする。複雑で、そして時間が掛かる方法は、臨床実験室では現実的でない。商業的に入手可能な分子試験は、ｔｃｄＣ遺伝子における配列変動を利用する。ＰＣＲに基づく試験は高価であり、そしてｔｃｄＣ遺伝子における突然変異は他のリボタイプにもまた存在するため、非特異的である。抗体に基づく試験、例えば酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および側方流動アッセイは、病原体特異的抗原の検出のための、迅速であり、そして費用効率的な試験法である。態様において、イムノアッセイにおける０２７株の検出のため、０２７株特異的抗原（単数または複数）を診断マーカー（単数または複数）として用いる。
【０００９】
Ｃ．ディフィシル細胞は、ペプチドグリカン層の外側に表面層（Ｓ層）を所持する。Ｓ層は、栄養細胞およびＣ．ディフィシル胞子の両方に存在する。Ｓ層内のタンパク質は、宿主−病原体相互作用を仲介する。いくつかのＣ．ディフィシル表面タンパク質は、胃腸組織に結合し、そして潜在的なコロニー形成因子である。Ｓ層に関連するタンパク質は、２つのドメイン：保存された細胞壁結合ドメイン、およびその特定のタンパク質の機能を特定する可変ドメインを含有する。配列決定された株６３０のゲノムにおいて、２８の細胞壁タンパク質（ＣＷＰ）が予測されている。特定のＣＷＰの可変ドメインは、Ｃ．ディフィシル株同定のための潜在的な抗原マーカーと見なされる。
【００１０】
ＣｗｐＶ（ＣＤ０５１４）は、ＣＷＰのメンバーであり、そして推定上の細胞壁結合ドメインを含むＮ末端領域、および凝集を促進しうるＣ末端ドメインからなる。ＣｗｐＶは、多様な０２７株によって培地内に分泌される。ＣｗｐＶのＣ末端ドメインは、Ｃ．ディフィシル・リボタイプ間で非常に可変である。リボタイプ０２７において、ＣｗｐＶタンパク質中に見られるＣ末端反復の特異的アミノ酸配列は、今日まで、いかなる他の配列決定された株のゲノムにも示されていない。態様において、ＣｗｐＶのリボタイプ特異的領域は、０２７株の診断マーカーとして使用可能である。
【００１１】
以下は、本発明の態様にしたがって、好ましいアッセイを確立するために利用されてきている方法の例である。以下の例は単に例示であり、そして限定のために提示されていない。
【実施例】
【００１２】
実施例１
組換えＤＮＡ技術を用いて、ＣｗｐＶのリボタイプ０２７特異的Ｃ末端ペプチドを大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）において発現させた。組換えＣｗｐＶに対するポリクローナル抗体をヤギ（ｇｏａｔ）において生成した。捕捉抗体としてポリクローナル抗ＣｗｐＶ抗体を、そして検出抗体として西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）・コンジュゲート化ポリクローナル抗ＣｗｐＶ抗体を用いて、ＥＬＩＳＡを発展させた。
【００１３】
この抗ＣｗｐＶ  ＥＬＩＳＡを用いて、Ｃ．ディフィシルに関して陽性である７２の臨床的ヒト糞便試料を試験した。代表的な判断基準としてＰＣＲリボタイプ決定法を用いて、Ｃ．ディフィシル０２７株の検出のための抗ＣｗｐＶ  ＥＬＩＳＡの感受性および特異性を計算した。このＥＬＩＳＡのカットオフは、二重波長（ＯＤ４５０／６２０ｎｍ）上での０．０８０読み取り値の吸光度に設定された。
【００１４】
結果
図１に関連して、７２のヒト糞便試料に関する抗ＣｗｐＶ  ＥＬＩＳＡの結果を、ＰＣＲリボタイプ決定法の結果に比較した。抗ＣｗｐＶ  ＥＬＩＳＡは、ＰＣＲリボタイプ決定法によって決定された３５の０２７陽性試料のうち、３０において、Ｃ．ディフィシル０２７株の存在を検出した。抗ＣｗｐＶ  ＥＬＩＳＡの感受性および特異性は、各々８６％である。
【００１５】
実施例２
ＣｗｐＶのリボタイプ０２７特異的Ｃ末端ペプチドを大腸菌において発現させた。組換えＣｗｐＶに対するポリクローナル抗体をヤギにおいて生成した。捕捉抗体としてポリクローナル抗ＣｗｐＶ抗体を、そして検出抗体として西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）・コンジュゲート化ポリクローナル抗ＣｗｐＶ抗体を用いて、ＥＬＩＳＡを発展させた。
【００１６】
３４のＣ．ディフィシル株を脳心臓注入ブロス（ＢＨＩ；  Ｏｘｏｉｄ）内に接種した。嫌気性条件下で、培養を３７℃で一晩増殖させた。ＢＨＩ培養中のＣ．ディフィシル株を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１：２０に希釈し、そして上述のＥＬＩＳＡ上で試験した。
【００１７】
結果
図２に示すように、３４の異なるリボタイプに相当するＣ．ディフィシル培養を、抗０２７特異的抗体を用いた抗ＣｗｐＶ  ＥＬＩＳＡ上で試験した。リボタイプ０２７株は、このＥＬＩＳＡ上で検出された唯一のリボタイプであった。３３の非０２７Ｃ．ディフィシル培養は、このＥＬＩＳＡによっては検出されなかった。このＥＬＩＳＡのカットオフは、二重波長（ＯＤ４５０／６２０ｎｍ）上での０．０８０読み取り値の吸光度に設定された。
【００１８】
実施例３
ＣｗｐＶのリボタイプ０２７特異的Ｃ末端ペプチドを大腸菌において発現させた。組換えＣｗｐＶに対するポリクローナル抗体をヤギにおいて生成した。捕捉抗体としてマイクロファイバーガラス膜上に試験ラインとして固定されたポリクローナル抗ＣｗｐＶ抗体、および検出抗体として西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）・コンジュゲート化ポリクローナル抗ＣｗｐＶ抗体を用いて、ＱＵＩＫ  ＣＨＥＫ（登録商標）デバイスを発展させた。ウサギ（ｒａｂｂｉｔ）抗ＨＲＰポリクローナル抗体をマイクロファイバーガラス膜上に固定して、陽性対照ラインを形成した。
【００１９】
この抗ＣｗｐＶ  ＱＵＩＫ  ＣＨＥＫ（登録商標）を用いて、１９５の試料を試験した。臨床的糞便試料を試料希釈剤中で希釈し、ＨＲＰコンジュゲート化ポリクローナル抗ＣｗｐＶ抗体と混合し、そして試料ウェルを通じて、固定された捕捉抗体を含むマイクロファイバーガラス膜に適用した。毛細管現象を通じて、試料−コンジュゲート混合物を、マイクロファイバーガラス膜を渡って流動させた。デバイスを室温で１５分間インキュベーションして、試料中のＣｗｐＶ抗原が、試験ライン上に固定された抗ＣｗｐＶ抗体によって捕捉されることを可能にした。過剰なＨＲＰコンジュゲート化ポリクローナル抗ＣｗｐＶ抗体は、対照ライン上に固定されたウサギ抗ＨＲＰ抗体によって捕捉された。膜を簡単に洗浄し、そして反応ウィンドウを通じてＨＲＰ基質を添加した後、結果を記録する前に、デバイスを室温で１０分間インキュベーションした。
【００２０】
図３に関連して、２つの青いライン：対照ライン（「Ｃ」）および試験ライン（「Ｔ」）によって、抗ＣｗｐＶ  ＱＵＩＫ  ＣＨＥＫ（登録商標）上に陽性結果が示される。抗ＣｗｐＶ  ＱＵＩＫ  ＣＨＥＫ（登録商標）上の陰性結果は、反応ウィンドウの対照（「Ｃ」）側上に１つの青いラインがあり、反応ウィンドウの「Ｔ」側に試験ラインが見えないことによって示される。対照ライン（「Ｃ」）が見えない場合、結果は無効と解釈される。
【００２１】
結果
抗ＣｗｐＶ  ＱＵＩＫ  ＣＨＥＫ（登録商標）、組織培養細胞傷害性アッセイ上で、１９５の糞便試料を試験し、そして毒素産生性Ｃ．ディフィシルを含有する試料から単離したＣ．ディフィシルのリボタイプを、ＰＣＲリボタイプ決定法によって決定した。図４に示すように、試験した１９５の糞便試料の中で、１７３の試料が、組織培養細胞傷害性アッセイによって、毒素産生性Ｃ．ディフィシルを含有しないと決定された。組織培養法によって陰性であった試料はすべて、抗ＣｗｐＶ  ＱＵＩＫ  ＣＨＥＫ（登録商標）上で陰性であった。組織培養細胞傷害性法によってＣ．ディフィシルを含有すると決定された２２の試料の中で、１２は、ＰＣＲリボタイプ決定によってリボタイプ０２７と同定された。１２の試料のうち１０は、抗ＣｗｐＶ  ＱＵＩＫ  ＣＨＥＫ（登録商標）上では陽性反応を示した。抗ＣｗｐＶ  ＱＵＩＫ  ＣＨＥＫ（登録商標）によっては、非０２７  Ｃ．ディフィシル試料はまったく検出されなかった。代表的な判断基準としてＰＣＲリボタイプ決定法を用いると、抗ＣｗｐＶ  ＱＵＩＫ  ＣＨＥＫ（登録商標）の感受性および特異性は、それぞれ、８３％および１００％と計算された。
【００２２】
要約すると、本発明の態様は、糞便試料において、そして培養において、Ｃ．ディフィシル・リボタイプ０２７を検出するための診断マーカーとして、ＣｗｐＶを提供する。本発明は特定の態様に関連して記載され、これは、あらゆる点で、制限的であるよりも例示的であることを意図される。別の態様は、本発明の範囲から逸脱することなく、本発明が関連する技術分野の当業者に明らかとなるであろう。
【００２３】
前述から、本発明が、明らかであり、そして方法に本質的である他の利点とともに、本明細書に上述するすべての目的および目標を達成するためによく適合したものであることがわかるであろう。本発明の特定の特徴およびサブコンビネーションは実用的であり、そして他の特徴およびサブコンビネーションと関係なく、使用可能であることが理解されるであろう。これは請求項によって予期され、そして請求項の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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