(57)【要約】  本発明は、インビボイメージング剤として使用するのに適した標識化合物を提供する。本発明のインビボイメージング剤は線維症、特に線維症の生体内診断及び撮像に有用である。また、本発明により、本発明の標識化合物の製造方法並びに方法に有用な前駆体化合物及び方法を実施するのに有用なキットも提供される。加えて、本発明は、本発明の標識化合物を含む医薬組成物並びに本発明の標識化合物、好ましくは本発明の医薬組成物を使用するインビボイメージング方法を提供する。【選択図】    図１ａ【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物又はその塩若しくは溶媒和物。
【化１】
2015526402.tif 000017
式中、
Ａは、−（ＣＨ2）o−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−（ＣＨ2）p−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であって、ｏ及びｐは各々０〜４の整数であり、
Ｌは、アミノ酸残基、炭水化物残基、−Ｃ（ＯＨ）−、−（ＣＲ′2）−、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲ′2）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ′−、−（ＣＲ′2−Ｏ−ＣＲ′2）−、−ＣＲ′2−ＮＲ′−、ＣＲ′2−Ｓ（Ｏ2）−ＣＲ′2、−（ＣＲ′2）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ′−から選択される１〜５０の二価リンカー単位を有する二価リンカー基であり、ここでＲ′は水素又はＣ1-4アルキルであり、
ｍ及びｎは、いずれも１であるか、又はいずれも２であり、
Ｒ1-4は、すべて水素であるか、又はすべてメチルであり、
Ｍは、99mＴｃ、186Ｒｅ及び188Ｒｅから選択される金属イオンであり、
Ｘ1及びＸ2は、いずれも−ＣＨ2−ＮＨであって、各ＮはＭに配位し、Ｒ5は存在しないか、又は
−Ｘ1−Ｒ5−Ｘ2−は、−Ｃ（ＣＨ3）＝Ｎ−Ｏ−Ｈ−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ3）−であって、各ＮはＭに配位する。
【請求項２】
ｍ及びｎがいずれも１である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ｍ及びｎがいずれも２である、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ1及びＸ2がいずれも−ＣＨ2−ＮＨ2であって、各ＮはＭに配位し、Ｒ5は存在しない、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の化合物。
【請求項５】
−Ｘ1−Ｒ5−Ｘ2−が−Ｃ（ＣＨ3）＝Ｎ−Ｏ−Ｈ−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ3）−であって、各ＮはＭに配位する、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ1-4の各々が水素である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ1-4の各々がメチルである、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の化合物。
【請求項８】
金属イオンが99mＴｃである、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の化合物。
【請求項９】
式IIの前駆体化合物。
【化２】
2015526402.tif 000018
式中、
Ａ及びＬは、請求項１で定義した通りであり、
ｍ及びｎは、請求項１乃至請求項３のいずれかで定義した通りであり、
Ｒ1-4は、請求項１、請求項６又は請求項７のいずれかで定義した通りであり、
Ｘ3及びＸ4は、いずれも−ＣＨ2−ＮＨ2であるか、又はいずれも−Ｃ（ＣＨ3）＝Ｎ−ＯＨである。
【請求項１０】
Ｘ3及びＸ4がいずれも−ＣＨ2−ＮＨ2である、請求項９記載の前駆体化合物。
【請求項１１】
Ｘ3及びＸ4がいずれも−Ｃ（ＣＨ3）＝Ｎ−ＯＨである、請求項９記載の前駆体化合物。
【請求項１２】
請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の式Ｉの化合物の製造方法であって、請求項９乃至請求項１１のいずれか１項記載の前駆体化合物と、請求項１又は請求項８に記載の金属イオンＭの適切な供給源との反応を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の化合物を、哺乳類への投与に適した生体適合性の担体と共に含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法を実施するためのキットであって、請求項９乃至請求項１１のいずれか１項記載の前駆体化合物を含む、キット。
【請求項１５】
（ｉ）請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の化合物を被験体に投与し、
（ｉｉ）化合物を被験体内の生物学的標的と結合させ、
（ｉｉｉ）化合物の金属イオンにより放出された信号をインビボイメージング法により検出し、
（ｉｖ）信号の位置及び／又は量を表す画像を生成する
ことを含む、インビボイメージング方法。
【請求項１６】
化合物を請求項１４記載の医薬組成物として投与する、請求項１５記載のインビボイメージング方法。
【請求項１７】
生物学的標的が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、請求項１５又は請求項１６記載のインビボイメージング方法。
【請求項１８】
被験体におけるＦＡＰ発現の分布及び程度を決定するという後の段階（ｖ）を含み、発現が信号と直接関連する、請求項１７記載のインビボイメージング方法。
【請求項１９】
被験体に対する処置計画の間繰り返して行う、請求項１５乃至請求項１８のいずれか１項記載のインビボイメージング方法。
【請求項２０】
ＦＡＰがアップレギュレートされている状態の診断方法であって、請求項１８記載のインビボイメージング方法を、ＦＡＰ発現の分布及び程度を特定の臨床状態に帰属させるという後の段階（ｖｉ）と共に含む、方法。
【請求項２１】
前記状態が線維症を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記状態が肝線維症、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化症又は不安定プラークである、請求項２１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボイメージング（生体内撮像）に関し、特にインビボイメージングに適した新規な標識化合物に関する。また、本発明の標識化合物の製造方法、及びその方法に有用な前駆体化合物も本発明により提供される。本発明の標識化合物は、線維症を含む病的状態の診断に有用である。
【背景技術】
【０００２】
線維形成は、炎症、感染又は傷害の結果起こる組織損傷に応答して引き起こされ、組織のあらゆる修復過程の一部を形成する。進行中の炎症、感染及び繰り返される傷害の場合、線維症瘢痕組織が形成され、機能性細胞に交換されず、そのため異常な臓器機能、最終的には臓器不全を生じる。
【０００３】
線維症の臨床的徴候は大きく変化する。線維形成は医療における主要な典型的病理過程の１つであり、例えば以下に挙げるものを含めて世界の数百万の人々に影響を及ぼす多様な病気の重要な要因である。
ａ）特発性肺線維症（原因不明の肺線維症）、喘息及び慢性閉塞性肺疾患のような肺疾患、
ｂ）皮膚硬化症、すなわち、身体の結合組織（すなわち、皮膚及び内臓）内の過度の細胞外マトリックス沈着を特徴とする異質の命にかかわる病気、
ｃ）移植の後の手術後瘢痕化、
ｄ）糖尿病性網膜症及び加齢性黄斑変性（盲目の主因である目の線維性疾患）、
ｅ）アテローム性動脈硬化症及び不安定プラークをはじめとする心血管疾患、
ｆ）糖尿病に関連する腎線維症−糖尿病性腎障害及び糸球体硬化、
ｇ）ＩｇＡ腎障害（腎不全並びに透析及び再移植の必要性の原因）、
ｈ）硬変及び胆管閉鎖（肝線維症及び肝不全の主因）、
ｉ）関節リウマチ、
ｊ）皮膚筋炎のような自己免疫疾患、
ｋ）うっ血性心不全。
【０００４】
硬変を例にとると、臨床的徴候は全く症状なしから肝不全まで変化し、根底にある肝臓病の種類及び重症度と肝線維症の程度との両方によって決まる（Ｚｈｏｕ  ＆  Ｌｕ  ２００９  Ｊ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ；１０：７−１４の概観参照）。肝線維症と肝硬変に共通した原因には、免疫媒介損傷、遺伝的異常、及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）があり、これは特に糖尿病及びメタボリックシンドロームと関連している。西欧人はメタボリックシンドロームの発生率が高い。この症候群は通例、肥満で高脂血症かつ高血圧の個人で見られ、II型糖尿病の発症に至ることが多い。肝臓のメタボリックシンドローム症状は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）であり、米国における罹患率は人口の２４％と見積もられている。脂肪肝は、ＮＡＳＨへ、そして最終的には肝硬変へと進行し得る一連のＮＡＦＬＤの重症度の低い方の端に当たる。線維症の発生はかかる進行のリスクを示し、現在は肝生検によって評価されている。しかし、肝生検はかなりの不快感を伴い、リスクがないわけではなく、費用がかかり、しかもサンプリングのばらつき及び相反する解釈が生ずる（Ｖｕｐｐａｌａｎｃｈｉ  ＆  Ｃｈａｌａｓａｎｉ  ２００９  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ；４９（１）：３０６−３１７）。
【０００５】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ、セプラーゼともいう）は、優先的にプロリン残基の後で生物活性ペプチダーゼを開裂するセリンプロテアーゼを含むプロリルペプチダーゼファミリーに属する。プロリルペプチダーゼファミリーにはジペプチダーゼ−IV（ＤＰＰ−IV）、ＤＰＰ−II、ＤＰＰ７、ＤＰＰ８、及びＤＰＰ９のような酵素が含まれ、このファミリーは幾つかの病気に関与するとされて来た。ＦＡＰは、活性化された線維芽細胞上に選択的かつ高度に発現されるホモ二量体の膜貫通型セリンプロテアーゼである。ＦＡＰはまた腫瘍関連線維芽細胞のマーカーでもある。ＦＡＰ発現の後にα−ＳＭＡのような他の線維症マーカーの発現がある。
【０００６】
既に幾つかのＮ−及びαＣ−置換Ｇｌｙ−ボロ−Ｐｒｏ誘導体がＦＡＰ阻害剤として開発されている。Ｇｌｙ−ボロ−プロの放射性標識された誘導体がＺｉｍｍｅｒｍａｎら（国際公開第２０１０／０３６８１４号）によって報告されている。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎらはプロリンボロン酸の新規な99mＴｃ−及び／又はＲｅ−標識錯体の合成を開示している。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎらの化合物１０１４、１０１８及び１０２０はそれぞれＩＣ50値２１、２０及び４ｎＭを有すると報告されている。
【０００７】
【化１】
2015526402.tif 000002
理想的には、低いナノモル濃度の親和性に加えて、放射性標識されたＦＡＰ阻害剤はＤＰＰ−IVと比べて少なくとも４倍のＦＡＰに対する選択性であるべきである。上記化合物の選択性に関するデータがＺｉｍｍｅｒｍａｎらによって示されている。これらの化合物は、ＳＰＥＣＴイメージング、特にＦＡＰの過剰発現により特徴付けられる疾患、特に癌の放射性イメージング及び放射線療法で使用するのに有用であると記載されている。しかし、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎらにより99mＴｃ−及びレニウム−標識化合物に関して挙げられた生体内分布データ（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎらの図６及び７）は活性の大部分が肝臓又は小腸若しくは大腸にあることを示しており、これはインビボイメージングの点で、特に肝臓内の病巣の検出のためには望ましくない。本発明者は比較の目的で化合物１０２０を得ることを試みたが、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎらの合成に関する記載は充分な詳細を欠いていることを見出した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／１０００７２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、線維症を含む状態の診断に有用な改良された方法、及びキレートを介して標識されインビボイメージングに適切な改良されたボロン酸化合物に対するニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、公知の化合物と比較してインビボイメージング剤として使用するために改良された性質を有する化合物を提供する。本発明の化合物の結合特性、生体内分布及び代謝プロフィールは、線維症のためのインビボ診断及びイメージング剤としてのその使用を支持する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】生体内分布を示す図。
【図２】化合物２の反応混合物（上のトレース）及び製剤化後３時間の精製化合物２（下のトレース）のＨＰＬＣ分析結果を示す図。
【図３】化合物２の注射後６０分で採取した血漿試料中の化合物２のＨＰＬＣ分析結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
第１の態様では、本発明は、式Ｉの化合物又はその塩若しくは溶媒和物を提供する。
【００１３】
【化２】
2015526402.tif 000003
式中、
Ａは、−（ＣＨ2）o−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−（ＣＨ2）p−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であって、ｏ及びｐは各々０−４の整数であり、
Ｌは、アミノ酸残基、炭水化物残基、−Ｃ（ＯＨ）−、−（ＣＲ′2）−、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲ′2）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ′−、−（ＣＲ′2−Ｏ−ＣＲ′2）−、−ＣＲ′2−ＮＲ′−、ＣＲ′2−Ｓ（Ｏ2）−ＣＲ′2、−（ＣＲ′2）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ′−から選択される１〜５０個の二価リンカー単位を有する二価リンカー基であり、ここでＲ′は水素又はＣ1-4アルキルであり、
ｍ及びｎは共に１であるか又は共に２であり、
Ｒ1-4はすべて水素であるか又はすべてメチルであり、
Ｍは、99mＴｃ、186Ｒｅ及び188Ｒｅから選択される金属イオンであり、
Ｘ1及びＸ2は共に−ＣＨ2−ＮＨであって、各ＮはＭに配位し、Ｒ5は存在しないか、又は
−Ｘ1−Ｒ5−Ｘ2−は、−Ｃ（ＣＨ3）＝Ｎ−Ｏ−Ｈ−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ3）−であって、各ＮはＭに配位する。
【００１４】
用語「その塩又は溶媒和物」による適切な塩には、（ｉ）鉱酸、例えば塩化水素酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸及び硫酸に由来するか、並びに有機酸、例えば酒石酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、及びパラ−トルエンスルホン酸に由来するもののような生理学的に許容できる酸付加塩、また（ｉｉ）アンモニウム塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム及びカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム及びマグネシウムの塩）、トリエタノールアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ピペリジン、ピリジン、ピペラジン、及びモルホリンのような有機塩基との塩、並びにアルギニン及びリシンアミノ酸との塩のような生理学的に許容できる塩基塩がある。用語「その塩又は溶媒和物」による適切な溶媒和物には、エタノール、水、生理的食塩水、生理学的緩衝剤及びグリコールと形成されるものがある。
【００１５】
用語「二価」とは、２の原子価を有するイオン又は分子をいい、他のイオン又は分子と２つの結合を形成することができる。
【００１６】
用語「アミノ酸残基」とは、天然起源でも純粋に合成起源でもよいＬ−又はＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体（例えばナフチルアラニン）又はアミノ酸模倣体の残基を意味し、光学的に純粋、すなわち単一のエナンチオマー、従ってキラルであり得、又はエナンチオマーの混合物であり得る。好ましくは、本発明のアミノ酸は光学的に純粋である。
【００１７】
用語「炭水化物残基」は、多価アルコールのアルデヒド又はケトン誘導体を指す。果糖若しくはブドウ糖のような単量体（単糖）でもよいし、又は２つの糖が互いに結合して二糖を形成してもよい。二糖には、ブドウ糖と果糖から形成されたショ糖のような糖が含まれる。用語「糖」には、置換された糖と置換されてない糖、及び糖の誘導体が含まれる。好ましくは、糖は、ブドウ糖、グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、マンノース、ラクトース、フコース、及びこれらの誘導体、例えばシアル酸、グルコサミンの誘導体から選択される。糖は好ましくはα又はβである。糖は殊にマンノ−又はガラクトースピラノシドであり得る。糖のヒドロキシル基は、例えば１以上のアセチル基で保護されていてもよい。糖部分は好ましくはＮ−アセチル化される。かかる糖の好ましい例としては、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルガラクトース、及びＮ−アセチルグルコサミンがある。
【００１８】
用語「アルキル」は、好ましくは１〜４個の炭素原子を含有する直鎖又は分枝鎖のアルキル基を意味する。かかる基の例としてはメチル、エチル、及びプロピルがある。
【００１９】
本発明において、用語「配位する」（「錯化する」ともいう）は、１以上の原子が一対の電子を金属イオンに供与して配位共有結合を形成する過程をいう。
【００２０】
式Ｉの化合物は、金属イオンの適切な供給源と式IIの前駆体化合物との反応によって製造される。式IIの前駆体化合物は本発明の第２の態様を形成し、以下でより詳細に説明する。本発明の化合物を製造する方法は本発明の第３の態様を形成し、以下でより詳細に説明する。
【００２１】
一実施形態では、Ａは好ましくは−（ＣＨ2）o−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−であって、ｏは１〜３の整数、最も好ましくは２である。
【００２２】
別の実施形態では、Ａは−（ＣＨ2）p−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、ここでｐは１〜３の整数、最も好ましくは２である。
【００２３】
一実施形態では、ｍとｎはいずれも１である。
【００２４】
別の実施形態では、ｍとｎはいずれも２である。
【００２５】
一実施形態では、Ｒ1-4はすべて水素である。
【００２６】
別の実施形態では、Ｒ1-4はすべてメチルである。
【００２７】
一実施形態では、Ｍは99mＴｃである。
【００２８】
別の実施形態では、Ｍは186Ｒｅである。
【００２９】
さらなる実施形態では、Ｍは188Ｒｅである。
【００３０】
一実施形態では、Ｘ1とＸ2はいずれも−ＣＨ2−ＮＨであって、各ＮはＭに配位しており、Ｒ5は存在しない。
【００３１】
別の実施形態では、−Ｘ1−Ｒ5−Ｘ2−は−Ｃ（ＣＨ3）＝Ｎ−Ｏ−Ｈ−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ3）−であって、各ＮはＭに配位している。
【００３２】
二価リンカー基Ｌは好ましくは１〜３０個の二価リンカー単位、最も好ましくは１〜２０個のリンカー単位、殊に好ましくは１〜１０個の二価リンカー単位を有する。二価リンカー単位に対して規定されているＲ′は好ましくは水素である。好ましい二価リンカー単位は−ＣＨ2−、−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）−、及び−ＣＨ2−ＮＨ−から選択される。一実施形態では、二価リンカー基Ｌは−ＣＨ2−である。
【００３３】
第１の好ましい実施形態では、
Ａは−（ＣＨ2）2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−であり、
Ｌは−ＣＨ2−であり、
ｍとｎはいずれも１であり、
Ｘ1とＸ2はいずれも−ＣＨ2−ＮＨであって、各ＮはＭに配位しており、Ｒ5は存在しない。
【００３４】
第２の好ましい実施形態では、
Ａは−（ＣＨ2）2−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｌは−ＣＨ2−であり、
ｍとｎはいずれも２であり、
−Ｘ1−Ｒ5−Ｘ2−は−Ｃ（ＣＨ3）＝Ｎ−Ｏ−Ｈ−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ3）−であって、各ＮはＭに配位している。
【００３５】
本発明の好ましい化合物の例は、レニウムで標識された（Ｒ）−（１−（２−（６−（４−（（２−アミノエチル）アミノ）−３−（（（２−アミノエチル）アミノ）メチル）ブタンアミド）ヘキサンアミド）アセチル）ピロリジン−２−イル）ボロン酸（化合物１）、及び99mＴｃで標識された（Ｒ）−（１−（２−（６−（４−（（２−アミノエチル）アミノ）−３−（（（２−アミノエチル）アミノ）メチル）ブタンアミド）ヘキサンアミド）アセチル）ピロリジン−２−イル）ボロン酸（化合物２）である。これらの化合物の合成及び試験は下記実施例に記載する。レニウム−標識化合物１をインビトロアッセイで試験したところ、ＦＡＰに対して高くて選択的な親和性を有することが判明した。99mＴｃ−標識化合物２はインビボイメージング目的のために良好な生体内分布を有し、良好なインビボ代謝プロフィールを有することが立証された。これらの化合物は従来技術のレニウム−及び99mＴｃ−標識化合物と同程度である。
【００３６】
第２の態様では、本発明は、式IIの前駆体化合物を提供する。
【００３７】
【化３】
2015526402.tif 000004
式中、
Ａ、Ｌ、ｍ、ｎ、及びＲ1-4は本明細書中で式Ｉに対して定義された通りであり、
Ｘ3及びＸ4はいずれも−ＣＨ2−ＮＨ2であるか、又はいずれも−Ｃ（ＣＨ3）＝Ｎ−ＯＨである。
【００３８】
本発明の前駆体化合物の第１の好ましい実施形態では、Ｘ3とＸ4はいずれも−ＣＨ2−ＮＨ2である。本発明の前駆体化合物のこの好ましい実施形態に対しても、２つの態様で共通の特徴について本発明の化合物の第１の好ましい実施形態に対して既に記載した好ましい選択が当て嵌まる。
【００３９】
本発明の前駆体化合物の第２の好ましい実施形態では、Ｘ3とＸ4はいずれも−Ｃ（ＣＨ3）＝Ｎ−ＯＨである。本発明の前駆体化合物のこの好ましい実施形態に対しても、２つの態様で共通の特徴について本発明の化合物の第２の好ましい実施形態に対して既に記載した好ましい選択が当て嵌まる。
【００４０】
本発明の式IIの前駆体化合物は、下記スキーム１に示されているように、式IIのキレートリンカー部分の場合により保護されていてもよいカルボン酸誘導体１をグリシン−ボロノプロリン中間体２と結合させることによって得られる。
【００４１】
【化４】
2015526402.tif 000005
基Ｌ、Ａ、ｍ、ｎ、Ｒ1-4、Ｘ3及びＸ4は本明細書中で式IIに対して定義した通りである。中間体１が「保護されている」とされる場合、これは不必要な副反応を回避するためにカルボン酸以外のあらゆる反応性の基に対する適切な保護基を含んでいることをいう。特に保護基は１のアミン基を保護するために含ませ得る。
【００４２】
用語「保護基」は、望ましくない化学反応を阻害又は抑制するが、分子の残りの部分を変化させることのない十分穏やかな条件下で当の官能基から開裂することができるように充分反応性に設計されている基を意味する。脱保護後目的とする生成物が得られる。保護基は当業者に周知である。アミンに対して適切な保護基にはＢｏｃ（すなわちｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）、Ｆｍｏｃ（すなわちフルオレニルメトキシカルボニル）、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄｄｅ（１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル）又はＮｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）があり、カルボキシル基に対してはメチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル又はベンジルエステルがある。保護基に関するさらなる情報は‘Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’，Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（第四版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２００６）に見ることができる。
【００４３】
グリシンボロノプロリン中間体２は、スキーム２に示されているように、Ｃｏｕｔｔｓら（１９９６  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ；３９：２０８７）の文献の手順に従うＺｉｍｍｅｒｍａｎら（国際公開第２０１０／０３６８１４号）の実施例１に記載の方法に従って得ることができる。
【００４４】
【化５】
2015526402.tif 000006
式IIの化合物のキレート部分（すなわち、スキーム１の中間体１に由来する部分）は、Ｔｃ及びＲｅイオンの配位として特に適切な四座配位子である。４つのドナー原子は、（金属ドナー原子を結合する炭素原子又は非配位性ヘテロ原子の非配位性の骨格を有することによって）５又は６員のキレート環が得られるように配列される。このキレート部分と金属イオンで形成される金属錯体は、「キレート交換(transchelatｉon)に対して耐性である」、すなわち、当該金属配位位置に対して競合する可能性がある他の配位子との配位子交換を容易には受けない。競合する可能性がある配位子は、前駆体化合物自身内に、又はインビトロでの製造におけるその他の添加剤（例えば製造時に使用する放射線防護体又は抗微生物性（抗菌性）保存剤）内に、又は生体内の内因性化合物（例えばグルタチオン、トランスフェリン又は血漿タンパク質）内にあり得る。本発明の前駆体化合物に含ませられる好ましいキレート部分はＮ4配位子（テトラアミン、アミドトリアミン又はジアミドジアミンドナーセットを有する開鎖状又は大環状の配位子）又はジアミンジオキシム配位子である。Ｊｕｒｉｓｓｏｎら（１９９９  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ；９９：２２０５−２２１８）はこれらの配位子系についてより詳細に記載している。
【００４５】
本発明の前駆体化合物に含ませられる特に好ましい１つのキレート部分は国際公開第２００６／００８４９６号に開示されているテトラアミン配位子系である。国際公開第２００６／００８４９６号の実施例１は次のカルボン酸誘導体の合成について記載している。
【００４６】
【化６】
2015526402.tif 000007
上記化合物の合成は、上記スキーム１に示した他の中間体１を得るために当業者に公知の手段により容易に適合させることができる。
【００４７】
本発明の前駆体化合物に含ませられる別の特に好ましいキレート部分は国際公開第２００３／００６０７０号に開示されているジアミンジオキシム配位子系である。国際公開第２００３／００６０７０号の実施例６は、上記スキーム１に示されている中間体１として使用することができるジアミンジオキシム配位子系のカルボン酸誘導体の合成について記載している。
【００４８】
【化７】
2015526402.tif 000008
上記化合物の合成は他の中間体１を得るために当業者に公知の手段により容易に適合させることができる。
【００４９】
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様について上で定義された式Ｉの化合物の製造方法を提供し、本方法は、本発明の第２の態様の前駆体化合物と、本発明の第１の態様について上で定義された金属イオンＭの適切な供給源との反応を含む。本発明の第１及び第２の態様の特徴について記載したあらゆる好ましい実施形態は、等価な特徴に関して本発明のこの第３の態様に等しく当て嵌まる。
【００５０】
金属イオンの「適切な供給源」は、一般に、金属イオンがテクネチウムの場合過テクネチウム酸イオン（ＴｃＯ4-）であり、金属イオンがレニウムの場合過レニウム酸イオン（ＲｅＯ4-）であり、いずれもそれぞれの金属イオンが＋７の酸化状態にあることを特徴とする。過テクネチウム酸も過レニウム酸も容易には金属錯体を形成しないので、これらの金属錯体の製造では、第一スズイオンのような適切な還元剤を添加して、金属イオンの酸化状態をより低い酸化状態、通常＋１〜＋５に還元することにより配位を容易にする必要がある。レニウムは還元するのがテクネチウムより困難であり、テクネチウムより苛酷な反応条件とより長い反応時間を必要とする。使用する溶媒は有機若しくは水性、又はこれらの混合物であり得る。溶媒が有機溶媒を含む場合、有機溶媒は好ましくはエタノール又はＤＭＳＯのような生体適合性の溶媒である。好ましくは溶媒は水性であり、最も好ましくは等張の生理的食塩水である。99mＴｃ、186Ｒｅ及び188Ｒｅによる標識方法のより詳しい詳細については、Ｒｏｇｅｒ  Ａｌｂｅｒｔｏによる「Ｍｅｔａｌ−ｂａｓｅｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」（Ｃｈａｐｔｅｒ  ９  ｏｆ  「Ｂｉｏｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」２０１１  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ；Ｅｎｚｏ  Ａｌｅｓｓｉｏ、Ｅｄ．）を参照されたい。
【００５１】
第４の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の化合物を哺乳類への投与に適した生体適合性の担体と共に含む医薬組成物を提供する。
【００５２】
「生体適合性の担体」は、化合物を懸濁又は溶解させる流体、殊に液体であって、組成物が「哺乳類への投与に適切な」もの、すなわち毒性又は過度の不快感を伴うことなく哺乳類の身体に投与することができるようなものである。生体適合性の担体媒体は好適には注射可能な担体液体であり、例えば、無菌で発熱物質を含まない注射用水、生理的食塩水のような水溶液（これは、注射用の最終産物が等張であるか又は低張でないように好都合に平衡させることができる）、１以上の張度調節物質（例えば血漿陽イオンと生体適合性の対イオンとの塩）、糖（例えばブドウ糖又はショ糖）、糖アルコール（例えばソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えばグリセロール）、又はその他の非イオン性ポリオール材料（例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液である。生体適合性の担体媒体はまたエタノールのような生体適合性の有機溶媒を含んでいてもよい。かかる有機溶媒はより脂溶性の高い化合物又は製剤を可溶化するのに有用である。好ましくは生体適合性の担体媒体は発熱物質を含まない注射用水、等張の生理的食塩水又は水性エタノール溶液である。静脈内注射用の生体適合性担体媒体のｐＨは好適には４．０〜１０．５の範囲である。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、好適には、無菌状態を維持したまま皮下注射針で一回又は複数回穿刺するのに適したシール（例えばクリンプオン式隔膜シールクロージャ）を備えた容器に入れて供給される。かかる容器は単一又は複数の患者用量を含有し得る。好ましい複数用量容器は複数の患者用量を含有する単一のバルクバイアル（例えば１０〜３０ｃｍ3の容積）からなり、従って臨床状況に適合するように製剤の有効な寿命中様々な時間間隔で単一の患者用量を臨床グレードの注射器内に抜き出すことができる。予め充填済の注射器は単一のヒト用量（すなわち「単位用量」）を含有するように設計され、従って好ましくは使い捨て式その他臨床用途に適した注射器である。予め充填済の注射器は好適には、オペレーターを放射線量から保護するために注射器シールドを備えている。適切なかかる放射性医薬用注射器シールドは当技術分野で公知であり、好ましくは鉛又はタングステンを含む。
【００５４】
本発明の医薬組成物はキットから製造することができる。或いは、医薬組成物は無菌製造条件下で製造して目的とする滅菌生成物を得てもよい。医薬組成物はまた非滅菌条件下で製造した後、例えばガンマ線照射、オートクレーブ処理、乾燥加熱又は化学的処理（例えば酸化エチレンによる）を用いて最終的に殺菌してもよい。好ましくは、本発明の医薬組成物はキットから製造される。
【００５５】
第５の態様では、本発明は、本発明の第３の態様の方法を実施するためのかかるキットを提供し、このキットは本発明の第２の態様の前駆体化合物を含む。前駆体化合物は好ましくは無菌の非発熱性形態で提供され、その結果本発明の第１の態様について定義された金属イオンＭの無菌の供給源との反応によって目的とする医薬組成物が最小数の操作で生ずる。かかる考察は取扱いの容易さ、従って放射性薬剤師に対する放射線量の低減のために特に重要である。それ故、かかるキットの再構成のための反応媒体は好ましくは上で定義した生体適合性の担体であり、最も好ましくは水性である。キット内の前駆体化合物は、無菌製造条件下で使用して、目的とする無菌で非発熱性の物質を得ることができる。また前駆体化合物は、非滅菌条件下で使用した後、上に記載したように最終の滅菌で使用することもできる。好ましくは、前駆体化合物は無菌で非発熱性の形態で使用する。
【００５６】
キットは、場合によりさらに、放射線防護体、抗菌性保存剤、ｐＨ調節剤又は賦形剤のような追加の構成成分を含み得る。
【００５７】
用語「放射線防護体」とは、水の放射線分解によって生ずる酸素含有フリーラジカルのような反応性の高いフリーラジカルを捕捉することにより酸化還元過程のような分解・減成反応を阻害する化合物を意味する。適切な放射線防護体は、アスコルビン酸、パラ−アミノ安息香酸（すなわち４−アミノ安息香酸）、ゲンチジン酸（すなわち２，５−ジヒドロキシ安息香酸）及びこれらと生体適合性の陽イオンとの塩から選ばれる。
【００５８】
用語「抗菌性保存剤」とは、細菌、酵母又はカビのような潜在的に有害な微生物の増殖を阻害する作用剤を意味する。抗菌性保存剤はまた用量に応じて幾らかの殺菌特性も示し得る。本発明の抗菌性保存剤の主要な役割は再構成後の医薬組成物、すなわちイメージング剤産物自体の中のかかる微生物の増殖を阻害することである。しかし、抗菌性保存剤は、場合により、再構成前のキットの１以上の構成成分内の潜在的に有害な微生物の増殖を阻害するのにも使用し得る。適切な抗菌性保存剤としては、パラベン類、すなわちメチル、エチル、プロピル若しくはブチルパラベン又はこれらの混合物、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオメルサールがある。
【００５９】
用語「ｐＨ調節剤」とは、再構成されたキットのｐＨがヒト又は哺乳類への投与の許容できる限界（およそｐＨ４．０〜１０．５）内に確実に入るようにするのに有用な化合物又は化合物の混合物を意味する。適切なかかるｐＨ調節剤には、トリシン、リン酸塩又はＴＲＩＳ（すなわちトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）のような医薬として許容できる緩衝剤、及び炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はこれらの混合物のような医薬として許容できる塩基がある。
【００６０】
用語「賦形剤」とは、生産及び凍結乾燥中の物質の取扱いを容易にし得る医薬として許容できる増量剤を意味する。適切な賦形剤には、塩化ナトリウムのような無機塩、及びショ糖、マルトース、マンニトール又はトレハロースのような水溶性の糖又は糖アルコールがある。
【００６１】
第６の態様では、本発明は、
（ｉ）本発明の第１の態様の化合物を対象の被験体に投与し、
（ｉｉ）化合物を被験体内の生物学的標的に結合させ、
（ｉｉｉ）化合物の金属イオンにより放出された信号をインビボイメージング法によって検出し、
（ｉｖ）信号の位置及び／又は量を表す画像を生成する
ことを含む、インビボイメージング方法を提供する。
【００６２】
「対象の被験体」はあらゆる人間又は動物の被験体であることができる。好ましくは、対象の被験体は哺乳類である。最も好ましくは、対象の被験体はインビボの完全な哺乳類の身体である。殊に好ましい実施形態では、本発明の対象の被験体はヒトである。
【００６３】
化合物を「投与する」段階は好ましくは非経口的に、最も好ましくは静脈内に行う。静脈内経路は、被験体の身体全体に化合物を送達し、被験体のＦＡＰを発現する組織と接触させるのに最も効率的な方法である。本発明の化合物は好ましくは上に定義した本発明の医薬組成物として投与する。好ましくは、本発明のインビボイメージング方法に使用する本発明の化合物は99mＴｃで標識される。
【００６４】
本発明のインビボイメージング方法はまた、本発明の化合物が既に投与されている対象の被験体を準備するという別の段階（ｉ）で始めるとも理解することができる。
【００６５】
投与段階の後、かつ検出段階の前に、被験体内の生物学的標的に化合物を結合させる。好適には、生物学的標的はＦＡＰである。化合物は被験体の身体中を移動し、その様々な組織と接触する。化合物がＦＡＰと接触すると、特異的な相互作用が起こり、ＦＡＰを有する組織からの化合物のクリアランスが、ＦＡＰのない、又はその発現が少ない組織からのクリアランスより長くなる。ＦＡＰを有する組織に結合した化合物と、ＦＡＰの発現が少ない（又はない）組織に結合した化合物との比の結果としてＦＡＰに特異的に結合した化合物の検出が可能になるある特定の時点に到達する。
【００６６】
「信号を検出する」段階では、単一光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）カメラによって、99mＴｃにより放出されたガンマ線を検出する。
【００６７】
「画像を生成する」段階は、得られた信号データに再構成アルゴリズムを適用してデータセットを作成するコンピューターによって行われる。次にこのデータセットを処理して、99mＴｃにより放出された信号の位置及び／又は量を示す画像を生成する。
【００６８】
等価な特徴故に、本発明の他の態様について記載した好ましい態様は本発明の第６の態様にも同様に当て嵌まる。
【００６９】
好ましい実施形態では、本発明のインビボイメージング方法は、被験体におけるＦＡＰ発現の分布及び程度を決定するというその後の段階（ｖ）を含み、発現は信号と直接関連している。
【００７０】
さらなる好ましい実施形態では、本発明のインビボイメージング方法は被験体に対する処理計画の間中繰り返して行われる。こうして、処理の進行をモニターすることができ、被験体の最も適当な処理に関する決定を容易にすることができる。
【００７１】
第７の態様では、本発明は、ＦＡＰがアップレギュレートされている状態の診断方法を提供する。方法は、段階（ｉ）〜（ｖ）を含む本発明のインビボイメージング方法と共に、さらにその後の、ＦＡＰ発現の分布及び程度を、以後ＦＡＰ状態と称する特定の臨床状態に帰属させる段階（ｖｉ）を含む。
【００７２】
「ＦＡＰ状態」とは、ＦＡＰの異常な発現、通例ＦＡＰの過剰発現により特徴付けられる病的状態をいう。本発明のインビボイメージング方法が有用なかかる状態の例には、線維形成を含むあらゆる状態が含まれる。ＦＡＰの発現が他の線維症マーカーの発現より先に起これば、本発明のインビボイメージング方法は線維症の早期段階の診断に特に適している。ＦＡＰ状態の例には、特発性肺線維症（原因不明の肺線維症）、喘息及び慢性閉塞性肺疾患のような肺疾患、皮膚硬化症：身体の結合組織（すなわち皮膚及び内臓器官）内の過度の細胞外マトリックス沈着を特徴とする異質の命にかかわる病気、移植後の手術後瘢痕化、糖尿病性網膜症及び加齢性黄斑変性（盲目の主因となる目の線維性疾患）、アテローム性動脈硬化症及び不安定プラークをはじめとする心血管疾患、糖尿病に関連する腎線維症−糖尿病性腎障害及び糸球体硬化、ＩｇＡ腎障害（腎不全並びに透析及び再移植の必要性の原因）、硬変及び胆管閉鎖（肝線維症及び肝機能不全の主因）、関節リウマチ、皮膚筋炎のような自己免疫疾患、並びにうっ血性心不全がある。
【００７３】
好ましくは、ＦＡＰがアップレギュレートされている状態の診断方法について、前記状態は肝線維症、アテローム性動脈硬化症、不安定プラーク又はうっ血性心不全である。
【００７４】
本発明はまた、本発明の第６の態様のインビボイメージング方法又は本発明の第７の態様の診断方法で使用される本発明の化合物を提供する。ここで、これらの態様に関する広範で適切な定義は等しく適用される。
【００７５】
さらにまた、本発明は、本発明の第１の態様の化合物の、本発明の第６の態様のインビボイメージング方法又は本発明の第７の態様の診断方法に使用されるインビボイメージング剤の製造における使用も提供し、ここでこれらの態様に対する広範で適切な定義は等しく適用される。本発明のこの態様におけるインビボイメージング剤は好ましくは上で定義した本発明の第４の態様の医薬組成物である。
【実施例】
【００７６】
以下の非限定実施例で本発明をより詳細に説明する。
【００７７】
実施例の簡単な説明
実施例１は、本発明の化合物、（Ｒ）−（１−（２−（６−（４−（（２−アミノエチル）アミノ）−３−（（（２−アミノエチル）アミノ）メチル）ブタンアミド）ヘキサンアミド）アセチル）ピロリジン−２−イル）ボロン酸、ジオキソレニウム（Ｖ）キレート（化合物１）の合成について記載する。
【００７８】
実施例２は、化合物１のインビトロスクリーニングについて記載する。
【００７９】
実施例３は、（Ｒ）−（１−（２−（６−（４−（（２−アミノエチル）アミノ）−３−（（（２−アミノエチル）アミノ）メチル）ブタンアミド）ヘキサンアミド）アセチル）ピロリジン−２−イル）ボロン酸（化合物２）の99mＴｃ標識について記載する。
【００８０】
実施例４は、ナイーブラットにおける化合物２の生体内分布について記載する。
【００８１】
実施例５は、ナイーブラットにおける化合物２の代謝研究について記載する。
【００８２】
実施例で使用する略語のリスト
ＡＭＣ＝アミノメチルクマリン
Ｂｏｃ＝ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ＤＰＰ−IV＝ジペプチジルペプチダーゼIV
ＥＤＣ＝１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＦＡＰ＝線維芽細胞活性化タンパク質
ＨＯＢｔ＝ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＫＨＳＯ4＝硫酸水素カリウム
ＭｇＳＯ4＝硫酸マグネシウム
Ｎ2＝窒素（ガス）
Ｎａ2ＣＯ3＝炭酸ナトリウム。
【００８３】
実施例１ （Ｒ）−（１−（２−（６−（４−（（２−アミノエチル）アミノ）−３−（（（２−アミノエチル）アミノ）メチル）ブタンアミド）ヘキサンアミド）アセチル）ピロリジン−２−イル）ボロン酸、ジオキソレニウム（Ｖ）キレート（化合物１）の合成
合成は、部分的に、Ｃｏｕｔｔｓら（１９９６  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ；３９：２０８７−２０９４）、Ｇｉｂｓｏｎら（２００２  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；６：８１４−８１６）及びＫｅｌｌｙら（１９９３  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ；４９（５）：１００９−１０１６）の開示に基づいている。
【００８４】
ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（２，２，１２，１２−テトラメチル−４，１０−ジオキソ−７−（２−オキソ−２−（（６−オキソ−６−（（２−オキソ−２−（（２Ｒ）−２−（（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ）−３ａ，５，５−トリメチルヘキサヒドロ−４，６−メタノベンゾ［ｄ］［１，３，２］ジオキサボロル−２−イル）ピロリジン−１−イル）エチル）アミノ）ヘキシル）アミノ）エチル）−３，１１−ジオキサ−５，９−ジアザトリデカン−５，９−ジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル））ジカルバメート
【００８５】
【化８】
2015526402.tif 000009
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エチル）アミノ）−３−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エチル）アミノ）メチル）ブタノエート（９０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、６−アミノ−Ｎ−（２−オキソ−２−（（２Ｒ）−２−（（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ）−３ａ，５，５−トリメチルヘキサヒドロ−４，６−メタノベンゾ［ｄ］［１，３，２］ジオキサボロル−２−イル）ピロリジン−１−イル）エチル）ヘキサンアミド（５８ｍｇ、０．１３ｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍｌ）に加えた。４−メチルモルホリンを加え、得られた溶液を１時間アルゴン下で撹拌し続けた。反応溶液をＫＨＳＯ4（１Ｍ、１０ｍｌ）、水（１０ｍｌ）及びＮａ2ＣＯ3（１Ｍ、１０ｍｌ）で洗浄した後、ＭｇＳＯ4で乾燥し、ろ過し、濃縮乾固して標記化合物を白色の泡として得た（１０３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、８０％）。
【００８６】
この物質は、それ以上精製せずに次の段階に使用した。
【００８７】
６−（４−（（２−アミノエチル）アミノ）−３−（（（２−アミノエチル）アミノ）メチル）ブタンアミド）−Ｎ−（２−オキソ−２−（（２Ｒ）−２−（（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ）−３ａ，５，５−トリメチルヘキサヒドロ−４，６−メタノベンゾ［ｄ］［１，３，２］ジオキサボロル−２−イル）ピロリジン−１−イル）エチル）ヘキサンアミド塩酸塩
【００８８】
【化９】
2015526402.tif 000010
ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（２，２，１２，１２−テトラメチル−４，１０−ジオキソ−７−（２−オキソ−２−（（６−オキソ−６−（（２−オキソ−２−（（２Ｒ）−２−（（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ）−３ａ，５，５−トリメチルヘキサヒドロ−４，６−メタノベンゾ［ｄ］［１，３，２］ジオキサボロル−２−イル）ピロリジン−１−イル）エチル）アミノ）ヘキシル）アミノ）エチル）−３，１１−ジオキサ−５，９−ジアザトリデカン−５，９−ジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル））ジカルバメート（２００ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）をジエチルエーテル（２ｍｌ）に溶解させ、ジエチルエーテル（２Ｍ、４．８ｍｌ、８．０ｍｍｏｌ）中のＨＣｌを加えると瞬時に沈殿が生じた。得られた懸濁液を１時間撹拌し続けた後、濃縮乾固して粗製の６−（４−（（２−アミノエチル）アミノ）−３−（（（２−アミノエチル）アミノ）メチル）ブタンアミド）−Ｎ−（２−オキソ−２−（（２Ｒ）−２−（（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ）−３ａ，５，５−トリメチルヘキサヒドロ−４，６−メタノベンゾ［ｄ］［１，３，２］ジオキサボロル−２−イル）ピロリジン−１−イル）エチル）ヘキサンアミドテトラ塩酸塩（１５０ｍｇ）を得た。
【００８９】
この物質をそれ以上精製せずに次の段階に用いた。
【００９０】
６−（４−（（２−アミノエチル）アミノ）−３−（（（２−アミノエチル）アミノ）メチル）ブタンアミド）−Ｎ−（２−オキソ−２−（（２Ｒ）−２−（（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ）−３ａ，５，５−トリメチルヘキサヒドロ−４，６−メタノベンゾ［ｄ］［１，３，２］ジオキサボロル−２−イル）ピロリジン−１−イル）エチル）ヘキサンアミド
６−（４−（（２−アミノエチル）アミノ）−３−（（（２−アミノエチル）アミノ）メチル）ブタンアミド）−Ｎ−（２−オキソ−２−（（２Ｒ）−２−（（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ）−３ａ，５，５−トリメチルヘキサヒドロ−４，６−メタノベンゾ［ｄ］［１，３，２］ジオキサボロル−２−イル）ピロリジン−１−イル）エチル）ヘキサンアミド、テトラ塩酸塩（４０ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）をジエチルエーテル（５ｍｌ）及びＣＨ2Ｃｌ2（２ｍｌ）に溶解させた。１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（７．２５μｌ、０．０５８ｍｍｏｌ）を加えると瞬時に曇った。懸濁液が均一なミルク状になるまで懸濁液を撹拌した。
【００９１】
反応懸濁液をろ過し、濃縮乾固した。得られた黄色の油をＤＣＭに再溶解させて透明な溶液を得た後、再び濃縮乾固して６−（４−（（２−アミノエチル）アミノ）−３−（（（２−アミノエチル）アミノ）メチル）ブタンアミド）−Ｎ−（２−オキソ−２−（（２Ｒ）−２−（（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ）−３ａ，５，５−トリメチルヘキサヒドロ−４，６−メタノベンゾ［ｄ］［１，３，２］ジオキサボロル−２−イル）ピロリジン−１−イル）エチル）ヘキサンアミドを遊離の塩基として得た。この物質をそれ以上精製せずに次の段階に使用した。
【００９２】
６−（４−（（２−アミノエチル）アミノ）−３−（（（２−アミノエチル）アミノ）メチル）ブタンアミド）−Ｎ−（２−オキソ−２−（（２Ｒ）−２−（（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ）−３ａ，５，５−トリメチルヘキサヒドロ−４，６−メタノベンゾ［ｄ］［１，３，２］ジオキサボロル−２−イル）ピロリジン−１−イル）エチル）ヘキサンアミド、ジオキソレニウム（Ｖ）塩
【００９３】
【化１０】
2015526402.tif 000011
６−（４−（（２−アミノエチル）アミノ）−３−（（（２−アミノエチル）アミノ）メチル）ブタンアミド）−Ｎ−（２−オキソ−２−（（２Ｒ）−２−（（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ）−３ａ，５，５−トリメチルヘキサヒドロ−４，６−メタノベンゾ［ｄ］［１，３，２］ジオキサボロル−２−イル）ピロリジン−１−イル）エチル）ヘキサンアミド（９０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（２ｍｌ）に溶解させて透明な溶液を得た。トリクロロオキソビス（トリフェニルホスフィン）レニウム（Ｖ）（１２１ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を加えて緑色の懸濁液を得、これを２分かけて溶解させると緑色から褐色に変色した。
【００９４】
アルゴン下で２４時間撹拌した後、反応液を濃縮乾固して褐色の粗製生成物を得た。この物質をそれ以上精製せずに次の段階に使用した。
【００９５】
（Ｒ）−（１−（２−（６−（４−（（２−アミノエチル）アミノ）−３−（（（２−アミノエチル）アミノ）メチル）ブタンアミド）ヘキサンアミド）アセチル）ピロリジン−２−イル）ボロン酸、ジオキソレニウム（Ｖ）塩（化合物１）
【００９６】
【化１１】
2015526402.tif 000012
フェニルボロン酸（１７．７５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、水（３ｍｌ）及びＴＢＭＥを粗製の６−（４−（（２−アミノエチル）アミノ）−３−（（（２−アミノエチル）アミノ）メチル）ブタンアミド）−Ｎ−（２−オキソ−２−（（２Ｒ）−２−（（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ）−３ａ，５，５−トリメチルヘキサヒドロ−４，６−メタノベンゾ［ｄ］［１，３，２］ジオキサボロル−２−イル）ピロリジン−１−イル）エチル）ヘキサンアミド、ジオキソレニウム（Ｖ）塩（１２２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）に加え、得られた２相の反応懸濁液を室温で２４時間撹拌し続けた後、相を分離し、水性相を低温で濃縮乾固して黒色の油を得た。
【００９７】
黒色の粗製生成物を分取用ＨＰＬＣで精製して、凍結乾燥後白色の固体として化合物１（６．２ｍｇ）を得た。分取用ＨＰＬＣにはＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ−ＴＯＦ質量分析計を使用し、分取用ＨＰＬＣ系はＢｅｃｋｍａｎ  Ｇｏｌｄ  Ｓｏｌｖｅｎｔ送達モジュール１２６  ｗからなっていた。カラムはＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ（５ｍ  Ｃ１８（２）２５０×２１．２０ｍｍ）であった。ＵＶ−ＶＩＳ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒモデル１６６及びＦｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ，ＩＳＣＯ  Ｆｏｘｙ  ２２００を使用した。用いた方法は、５〜４０％Ｂで４０ｍｉｎであり、Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＡＣＮ、流量：１０ｍＬ／ｍｉｎ、ＵＶ検出２１４ｎｍ。
【００９８】
同一性はＭＳ−ＴＯＦで確認した。予想ｍ／ｚ［Ｍ+］＝７０４．２９  実測［Ｍ+−Ｈ2Ｏ］＝６８６．０４、［（（Ｍ+−Ｈ２Ｏ）＋Ｈ+）／２］＝３４３．５２。
【００９９】
実施例２ インビトロスクリーニング
ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅにより供給されたＦＡＰ及びＤＰＰ−ＩＶアッセイキットを用いて、化合物１並びに基準のＦＡＰ及びＤＰＰ−ＩＶ化合物が組換えヒトＦＡＰ及びＤＰＰ−ＩＶ酵素の酵素活性を阻害する能力を測定した。
【０１００】
Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅにより提供されたＮＶＰ  ＤＰＰ  ７２８塩酸塩を基準のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤として用いた。公知の化合物（Ｒ）−（１−（２−（１−ナフタミド）アセチル）ピロリジン−２−イル）ボロン酸を基準のＦＡＰ阻害剤として用いた。
【０１０１】
このアッセイは蛍光発生基質Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−アミノメチルクマリン（ＡＭＣ）を用いてＦＡＰ又はＤＰＰ−ＩＶの活性を測定する。ＦＡＰ又はＤＰＰ−ＩＶによるペプチド結合の解裂により遊離のＡＭＣ基が放出され、その結果励起波長３５０−３８０ｎｍ（３２５ｎｍを使用した）及び放射波長４４０−４６０ｎｍ（４５０ｎｍを使用した）を用いて分析することができる蛍光が発生する。
【０１０２】
酵素活性は、総容積１００ｕＬにおいて１０ｍｉｎ（ＤＰＰ−ＩＶ）及び３０ｍｉｎ（ＦＡＰ）２２℃でアッセイした。阻害剤はＤＭＳＯに溶解させた。ＩＣ50値はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４を用いて計算した。
【０１０３】
【表１】
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実施例３ （Ｒ）−（１−（２−（６−（４−（（２−アミノエチル）アミノ）−３−（（（２−アミノエチル）アミノ）メチル）ブタンアミド）ヘキサンアミド）アセチル）ピロリジン−２−イル）ボロン酸（化合物２）の99mＴｃ−放射性標識
（Ｒ）−（１−（２−（６−（４−（（２−アミノエチル）アミノ）−３−（（（２−アミノエチル）アミノ）メチル）ブタンアミド）ヘキサンアミド）アセチル）ピロリジン−２−イル）ボロン酸（化合物２）
【０１０４】
【化１２】
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フェニルボロン酸（６．８ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）、水（３ｍＬ）及びＤＣＭ（３ｍＬ）を、粗製の化合物６−（４−（（２−アミノエチル）アミノ）−３−（（（２−アミノエチル）アミノ）メチル）ブタンアミド）−Ｎ−（２−オキソ−２−（（２Ｒ）−２−（（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ）−３ａ，５，５−トリメチルヘキサヒドロ−４，６−メタノベンゾ［ｄ］［１，３，２］ジオキサボロル−２−イル）ピロリジン−１−イル）エチル）ヘキサンアミド塩酸塩（１５ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）に加え、得られた２相反応懸濁液を室温で２４時間撹拌し続けた後、相を分離し、水性相を凍結乾燥して化合物２を得た。この物質はそれ以上精製せずに粗製のまま使用した。同一性はＭＳ−ＴＯＦで確認した。予想ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ+］＝４８６．３７  実測［Ｍ＋Ｈ+］＝４８６．３６。
【０１０５】
99mＴｃ−化合物２
次の製剤を含有する凍結乾燥キット（バイアル１）を調製した。
【０１０６】
【表２】
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１００μＬのメタノール中に１００μｇの化合物２を含有するバイアル２をバイアル１に加えた。その後、Ｄｒｙｔｅｃ（商標）ジェネレーターからの99mＴｃ−過テクネチウム酸溶出液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１ｍＬ、４８４ＭＢｑ）をバイアルに加え、溶液を室温で２０ｍｉｎ放置した後ＨＰＬＣで精製した。ＲＣＰ＞９５％。
【０１０７】
99mＴｃ−化合物２を、ＨＰＬＣ（ＲT＝８．８ｍｉｎ）により、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ１８（１５０×４．６ｍｍ）、５μｍ  Ｌｕｎａカラムで、流量１ｍＬ／分の移動相としてＨ2Ｏ／アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを用いて、５７％の収率で精製した。
【０１０８】
99mＴｃ標識化合物２を直接０．５ｍＬの５０ｍＭリン酸塩緩衝剤溶液中に精製した。２０ＭＢｑ／ｍＬで１０％エタノール／５０ｍＭリン酸塩緩衝剤溶液中に製剤化後、99mＴｃ−化合物２は３ｈｒにわたって非常に安定であることが判明した。図２は、化合物２の反応混合物（上のトレース）及び製剤化後３時間の精製化合物２（下のトレース）を示す。
【０１０９】
実施例４ ナイーブラットにおける99mＴｃ−化合物２の生体内分布
雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２３１±１０ｇ）を１群４匹として収容し、食餌及び水を自由に摂取させた。動物（ｎ＝１２）に、静脈内ボーラスとして尾静脈から99mＴｃ−化合物２（０．３ｍＬ、４−５ＭＢｑ／動物）を注射下。注射後様々な時間（２、３０、６０及び１２０分）に、動物を安楽死させ（時点毎にｎ＝３）、解剖した。データを下記表に示す。
【０１１０】
【表３】
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上記データは％注射用量として表した（平均±ＳＤ；１時点に付きｎ＝３動物）。
【０１１１】
実施例５ ナイーブラットにおける化合物２の代謝研究
雄ラットへの静脈内投与後の化合物２の生体内代謝プロフィールを測定した。注射後６０分に死後の血液を得、遠心して血漿を分離した。
【０１１２】
分析は、固相抽出（ＨＬＢカートリッジ；Ｗａｔｅｒｓ）を用いて予め化合物２を血漿から抽出しＨＰＬＣにより行った。簡単にいうと、カートリッジを５ｍＬのアセトニトリル、次いで２×５ｍＬの水で調節した。血漿をカートリッジ上に載せた後、水（２％アセトニトリル）で洗浄した。化合物２を、５０：５０の比の７．５ｍＬの水（０．１％ＴＦＡ）及びアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）でカートリッジから溶出した。
【０１１３】
抽出物を蒸発乾固させ、２ｍＬの出発移動相（４％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）及び水（０．１％ＴＦＡ）で再構成した。
【０１１４】
０．５ｍＬの再構成した抽出物を、化合物２に対して実施例３で上述したのと同じ分析条件を用いてＨＰＬＣで分析した。
【０１１５】
化合物２の注射後６０分で採取した血漿試料中にはまだおよそ８０％の化合物２が存在していた（図３参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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