(57)【要約】  本発明は、トラスツズマブによる治療に不応性の乳癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、治療有効量の化合物Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−７−（｛［（３ａＲ，６ａＳ）−２−メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メチル｝オキシ）−６−（メチルオキシ）キナゾリン−４−アミン、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。【選択図】図１
2015503568.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トラスツズマブによる治療に不応性の乳癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、治療有効量の式１の化合物
【化１】
2015503568.tif 000008
またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項２】
トラスツズマブによる治療に不応性の乳癌の治療に使用するための、式１の化合物
【化２】
2015503568.tif 000009
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
トラスツズマブによる治療に不応性の乳癌を治療するための薬物の製造のための、式１の化合物
【化３】
2015503568.tif 000010
またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項４】
前記化合物またはその薬学的に許容される塩は、Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−７−（｛［（３ａＲ，５ｒ，６ａＳ）−２−メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メチル｝オキシ）−６−（メチルオキシ）キナゾリン−４−アミンおよびＮ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−７−（｛［（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−２−メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メチル｝オキシ）−６−（メチルオキシ）キナゾリン−４−アミンからなる群から選択される立体異性体、または前記立体異性体の薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記薬学的に許容される塩は、ｐ−トルエンスルホン酸の塩である、請求項１または４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記対象は、ヒトであり、前記乳癌は、トラスツズマブで治療されたことがない、請求項１、４、または５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記対象は、ヒトであり、前記乳癌は、トラスツズマブで治療されたことがある、請求項１、４、または５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記式１の化合物とトラスツズマブとを併用投与することを含む、請求項１、４、または５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記対象は、ヒトであり、前記乳癌は、ＰＴＥＮ陰性である、請求項１、４、または５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象は、ヒトであり、前記乳癌は、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の変異が陽性である、請求項１、４、または５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象は、ヒトであり、前記乳癌は、トラスツズマブが結合する細胞外ドメインを欠損した切断型ＥｒｂＢ２受容体を発現する、請求項１、４、または５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象は、ヒトであり、前記乳癌は、ＥＧＦＲファミリーメンバー、ＩＧＦ−１Ｒ、およびＨＧＦＲからなる群から選択される１つ以上のＲＴＫを過剰発現する、請求項１、４、または５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−７−（｛［（３ａＲ，６ａＳ）−２−メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メチル｝オキシ）−６−（メチルオキシ）キナゾリン−４−アミン、またはその薬学的に許容される塩を、そのような治療を必要とする対象に投与することによって乳癌を治療するための方法に関する。本発明は、特に、乳癌がトラスツズマブによる治療に不応性である場合の方法に関する。
【０００２】
関連案件の相互参照
本出願は、２０１１年１２月２７日に出願された米国特許出願第６１／５８０，５４３号に対する優先権を主張するものであり、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
乳癌は、乳房の組織、通常、乳管および小葉に形成する癌の種類である。男性および女性の両方に発症するが、男性の乳癌は稀である。米国では、２０１１年に約２３０，０００件の新しい乳癌の症例が発生し、この形態の癌に起因する約４０，０００件の死亡が発生すると推定されている。国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ））のウェブサイトｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖを参照のこと。
【０００４】
ＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ）癌遺伝子は、ヒト乳癌の２０〜３０％に過剰発現され、この過剰発現は、予後不良および化学療法に対する反応性不良と関連している。ＥｒｂＢ２は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーである１８５ｋＤａのＩ型膜貫通型チロシンキナーゼ受容体である。このファミリーは、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、Ｈｅｒ３、およびＨｅｒ４を含む。ＥｒｂＢ２の既知のリガンドは存在しないが、この受容体は、ＥＧＦの増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−β、およびヘレグリンファミリーに結合する他のＥｒｂＢファミリーメンバーの優先的なヘテロ二量体化パートナーであることが分かっている。ＥｒｂＢ２経路は、正常に機能している場合、細胞の成長および分化を促進する。ＥｒｂＢ２を過剰発現する細胞におけるＥｒｂＢ２経路活性化の正確な機構は完全に理解されていないが、過剰発現が細胞増殖の増加を引き起こす可能性が高い。Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，９１：１８７−２０１を参照のこと。
【０００５】
トラスツズマブ（ＧｅｎｅｎｔｅｃｈからＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）という名称で市販されている）は、ＥｒｂＢ２受容体の細胞外セグメントに結合する組換えヒト化モノクローナル抗体である。トラスツズマブは、ＥｒｂＢ２を過剰発現する乳癌に罹患する患者を治療するために、単一の薬剤として、または化学療法および他の標的治療と組み合わせて使用される。トラスツズマブは、大きな臨床効果を示しており、ＥｒｂＢ２を過剰発現する乳癌に罹患する特定の患者の全体的な生存を延長することが分かっている。Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，９１：１８７−２０１を参照のこと。
【０００６】
約５０％の反応性というトラスツズマブの一般的な臨床効果にもかかわらず、多くの患者は、トラスツズマブ治療に全く反応を示さない（デノボ不応性）か、または治療の過程においてトラスツズマブ治療に対する不応性を獲得する。トラスツズマブ不応性の過程機序は、例えば、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の突然変異に起因する、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路の活性化；腫瘍抑制因子ＰＴＥＮ（ホスファターゼおよびテンシン相同体）の欠如または不活性；通常トラスツズマブが結合する細胞外ドメインを欠損しているため、トラスツズマブによって不活性化することができない切断型ＥｒｂＢ２受容体（ｐ９５ＨＥＲ２）の蓄積；およびトラスツズマブによって誘導されるＥｒｂＢ２の阻害を相殺する他のＲＴＫの過剰発現を含む。そのようなＲＴＫの例として、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバー、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、および肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）が挙げられる。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１７（４）：４６１−４６８、またＣｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，９１：１８７−２０１を参照のこと。
【０００７】
最近、ＳＲＣキナーゼが、トラスツズマブに対してデノボ不応性であるかまたは獲得された不応性を有する腫瘍を生じる複数経路の下流にある共通のノードであることが証明された。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，１７（４）：４６１−４６８を参照のこと。非受容体チロシンキナーゼＳＲＣは、Ｎ末端のＳＨ３ドメイン、中央のＳＨ２ドメイン、およびチロシンキナーゼドメインの３つのドメインからなる細胞質タンパク質である。ＳＲＣは、そのＳＨ２ドメインを介して複数のＲＴＫと相互作用することにより、およびリン酸化し、ひいては下流の標的を活性化することにより、細胞内シグナル伝達を促進する。ＳＲＣキナーゼによって活性化される経路およびタンパク質の例として、ＡＫＴおよびＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）経路、ＦＡＫ（接着斑キナーゼ）、ＳＴＡＴ３（シグナル伝達性転写因子３）、ならびにｃ−ＭＹＣが挙げられる。これらのシグナル伝達経路およびタンパク質は、腫瘍細胞の生存および転移を制御する上で多様な役割を有する。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１７（４）：４６１−４６８を参照のこと。
【０００８】
培養細胞がＥＧＦＲまたはＩＧＦ−１Ｒを過剰発現する、獲得されたトラスツズマブ不応性のモデルにおいてＳＲＣが活性化される（すなわち、リン酸化される）ことが分かった。さらに、デノボトラスツズマブ不応性モデルのＰＴＥＮ欠損細胞においてＳＲＣを活性化し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＳＴプルダウンアッセイにより、ＳＲＣがＰＴＥＮのホスファターゼ活性の直接的な標的であることを証明した。その一方で、ＳＲＣは、例えば、ＥＧＦＲの発現が低下すると、または元々ＰＴＥＮを欠損する細胞が野生型ＰＴＥＮで再構成されると、不活性化される（すなわち、脱リン酸化される）。さらに、恒常活性型ＳＲＣ変異体を安定に発現する特定の細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでトラスツズマブによって媒介される増殖阻害に対する耐性が高いことが分かり、ＳＲＣの活性化は、トラスツズマブ不応性を付与するのに十分であることが示唆される。同じ研究により、ヒト癌標本におけるＳＲＣ活性が、トラスツズマブ治療に対する臨床的奏効率の低さと正に相関すること、およびサラカチニブによるＳＲＣの阻害がトラスツズマブに対する腫瘍の反応性を増加させることが示された。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１７（４）：４６１−４６８を参照のこと。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、細胞外ＨＥＲ２アンタゴニストによる治療に不応性の乳癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、治療有効量の式１の化合物
【化１】
2015503568.tif 000003
またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、トラスツズマブによる治療に不応性の乳癌の治療に使用するための式１の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、トラスツズマブによる治療に不応性の乳癌を治療するための薬物の製造のための、式１の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【００１２】
本発明はまた、細胞外ＨＥＲ２アンタゴニストによる治療に不応性のＨＥＲ２陽性癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、治療有効量の式１の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法も提供する。
【００１３】
本発明はまた、細胞外ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療に不応性のＥＧＦＲ依存性癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、治療有効量の式１の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法も提供する。
【００１４】
本発明の特定の実施形態において、式１の化合物は、Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−７−（｛［（３ａＲ，５ｒ，６ａＳ）−２−メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メチル｝オキシ）−６−（メチルオキシ）キナゾリン−４−アミン、またはＮ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−７−（｛［（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−２−メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メチル｝オキシ）−６−（メチルオキシ）キナゾリン−４−アミンである。本発明の別の実施形態において、薬学的に許容される塩は、ｐ−トルエンスルホン酸の塩である。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態において、対象は、ヒトであり、乳癌は、以前にトラスツズマブで治療されたことがない。本発明の他の実施形態において、対象は、ヒトであり、乳癌は、以前にトラスツズマブで治療されたことがある。本発明の他の実施形態において、方法は、式１の化合物とトラスツズマブとを併用投与することを含む。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態において、対象は、ヒトであり、乳癌は、ＰＴＥＮ陰性である。本発明の他の実施形態において、対象は、ヒトであり、乳癌は、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子変異が陽性である。他の実施形態において、対象は、ヒトであり、乳癌は、通常トラスツズマブが結合する細胞外ドメインを欠損した切断型ＥｒｂＢ２受容体を発現する。本発明の他の実施形態において、対象は、ヒトであり、乳癌は、ＲＴＫ、例えば、ＥＧＦＲファミリーのメンバー、ＩＧＦ−１Ｒ、およびＨＧＦＲを過剰発現する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＥＸＥＬ−７６４７がＳＲＣファミリータンパク質ＦＡＫ（接着斑キナーゼ）のＳＲＣキナーゼ活性およびリン酸化に与える影響を示す。
【図２】ＥＸＥＬ−７６４７がマウスにおけるＢＴ４７４腫瘍異種移植片のＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）−リン酸化に与える影響を示す。
【図３】ＥＸＥＬ−７６４７がマウスにおけるＡ４３１腫瘍異種移植片のＥＧＦＲ−リン酸化に与える影響を示す。
【図４】ＥＸＥＬ−７６４７がマウス肺におけるＫＤＲリン酸化に与える影響を示す。
【図５】ＥＸＥＬ−７６４７がマウスにおけるＨＣＴ１１６／ＥｐｈＢ４異種移植片のＥｐｈＢ４−リン酸化に与える影響を示す。
【図６】ＥＸＥＬ−７６４７が血管新生に与える影響を示す。
【図７】ＥＸＥＬ−７６４７がマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍異種移植片の増殖に与える影響を示す。
【図８−１】他のＥｒｂＢファミリー阻害剤によってではなく、ＥＸＥＬ−７６４７による、トラスツズマブ耐性細胞におけるＳｒｃの阻害を示す。Ａ）ＥＸＥＬ−７６４７は、Ｓｒｃを用量依存様式で阻害する。Ｂ）１８時間の処理後の、ラパチニブ、エルロチニブ、ＥＸＥＬ−７６４７、およびトラスツズマブによる処理後のＪＩＭＴ−１およびＨＣＣ１９５４細胞におけるＳｒｃのリン酸化。
【図８−２】他のＥｒｂＢファミリー阻害剤によってではなく、ＥＸＥＬ−７６４７による、トラスツズマブ耐性細胞におけるＳｒｃの阻害を示す。ＥＸＥＬ−７６４７で処理したＪＩＭＴ−１（Ｃ）およびＨＣＣ１９５４（Ｄ）細胞の細胞増殖アッセイ。指示された濃度で７２時間細胞を処理し、細胞生存率を決定した。
【図９】ＥＸＥＬ−７６４７、トラスツズマブ、およびＥＸＥＬ−７６４７とトラスツズマブとの組み合わせが、トラスツズマブ耐性ＪＩＭＴ−１異種移植片腫瘍の増殖に与える影響を示す。
【図１０−１】ＥＸＥＬ−７６４７が、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、およびＭｅｔの活性化に与える影響を示す。Ａ）ＪＩＭＴ−１およびＨＣＣ１９５４細胞を指示された化合物で１８時間処理した。ＨｅｒｃｅｐｔｉｎはＨｅｒ２の発現に影響を及ぼしたが、いずれの小分子阻害剤も影響を及ぼさなかった。Ｂ）Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎではなく、小分子阻害剤がＨｅｒ２のリン酸化を阻害する。
【図１０−２】ＥＸＥＬ−７６４７が、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、およびＭｅｔの活性化に与える影響を示す。Ｃ）ＥＸＥＬ−７６４７は、ＨＣＣ１９５４およびＪＩＭＴ−１細胞におけるＥＧＦＲのリン酸化を阻害する。Ｄ）ＥＸＥＬ−７６４７は、ＨＣＣ１９５４細胞におけるＭｅｔのリン酸化を阻害する。
【図１１】ＥＸＥＬ−７６４７およびＡＺＤ０５３０（サラカチニブ）が、Ｓｒｃのリン酸化およびその標的パキシリンのリン酸化、ならびにＪＩＭＴ−１細胞の増殖に与える影響を示す。Ａ）濃度を上昇させたＫＤ０１９またはＡＺＤ０５３０で１８時間処理したＪＩＭＴ−１におけるＳｒｃおよびパキシリンのリン酸化。Ｂ）指示された濃度のＫＤ０１９またはＡＺＤ０５３０で処理したＪＩＭＴ−１細胞の細胞増殖アッセイ。７２時間後に、ＭＴＳアッセイにより細胞生存率を測定した。エラーバーは、３つのウェルの平均の標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、細胞外ＨＥＲ２アンタゴニストによる治療に不応性の乳癌を含むＨＥＲ２陽性癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、治療有効量の式１の化合物
【化２】
2015503568.tif 000004
またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。式１の化合物の化学名は、Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−７−（｛［（３ａＲ，６ａＳ）−２−メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メチル｝オキシ）−６−（メチルオキシ）キナゾリン−４−アミンである。
【００１９】
式１の化合物、およびその薬学的に許容される塩は、立体異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、およびそれらのラセミ混合物または非ラセミ混合物、ならびに前記立体異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、およびラセミ混合物または非ラセミ混合物の任意の薬学的に許容される塩を含む。
【００２０】
本発明の一実施形態において、式１の化合物は、Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−７−（｛［（３ａＲ，５ｒ，６ａＳ）−２−メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メチル｝オキシ）−６−（メチルオキシ）キナゾリン−４−アミン、またはＮ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−７−（｛［（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−２−メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メチル｝オキシ）−６−（メチルオキシ）キナゾリン−４−アミン、またはその薬学的に許容される塩である。本発明の別の実施形態において、薬学的に許容される塩は、ｐ−トルエンスルホン酸の塩である。
【００２１】
本明細書において用いられる場合、薬学的に許容される塩（複数可）という用語は、薬学的に許容される酸付加塩を含む。薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等、および有機酸、例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、リンゴ酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、ステアリン酸等とともに形成される、遊離塩基の生物学的効果を保持し、かつ生物学的にまたは別様に好ましい塩である。好ましい薬学的に許容される酸付加塩は、ｐ−トルエンスルホン酸の塩である。
【００２２】
式１の化合物およびその薬学的に許容される塩は、当該技術分野で一般的に知られた技術を用いて製造することができる。例えば、前記化合物およびその薬学的に許容される塩、ならびにそれらを製造する方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５７６，０７４号に記載されている。米国特許第７，５７６，０７４号は、２００９年６月１０日にＥｘｅｌｉｘｉｓ，Ｉｎｃ．からＳｙｍｐｈｏｎｙ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された。Ｋａｄｍｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＬＬＣは、後述する実施形態に提供されるデータを含む式１の化合物（ＸＬ６４７、ＥＸＥＬ−７６４７、およびＫＤ−０１９としても知られる）に対する特定の権利を獲得している。
【００２３】
Ｇｅｎｄｒｅａｕらは、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ，Ｉｎｃ．によって実施された、ＸＬ６４７の薬理学的特性に関する特定の調査研究について記載している。具体的には、この研究により、ＸＬ６４７が、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＢ４、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ）、Ｆｌｔ４（ＶＥＧＦＲ３）、およびＥｒｂＢ２を含むいくつかの受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害剤であることが示された。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験により、ＸＬ６４７が、Ａ４３１表皮癌細胞に由来する異種移植片腫瘍においてＥＧＦＲの活性を阻害すること、およびＶＥＧＦＲを過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞に由来する異種移植片腫瘍の増殖を阻害することが示された。Ｇｅｎｄｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３：３７１３−３７２３を参照のこと。
【００２４】
後に記載する実施例は、式１の化合物が、いくつかの受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の阻害剤であることに加えて、ＥｒｂＢ２を過剰発現する腫瘍のトラスツズマブに対する不応性を引き起こす複数の経路に関与するＳＲＣキナーゼの阻害剤でもあることを証明した。したがって、本発明は、乳癌、例えば、トラスツズマブを含むがこれに限定されない細胞外ＨＥＲ２アンタゴニストによる治療に不応性の乳癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、治療有効量の式１の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を次に提供する。
【００２５】
細胞外ＨＥＲ２アンタゴニストは、ＨＥＲ２の細胞外部分に結合し、その機能を低下させるかまたは阻害する薬剤である。一実施形態において、ＨＥＲ２アンタゴニストは、ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する抗体もしくは抗原結合断片、またはそのコンジュゲートである。本発明の一実施形態において、ＨＥＲ２アンタゴニストはトラスツズマブである。トラスツズマブによる治療がＨＥＲ２のリン酸化を増加させることが観察されている一方で、トラスツズマブ治療はまた、ＨＥＲ２の内部移行および分解、ならびにＨＥＲ２シグナル伝達の減少も引き起こす。よって、トラスツズマブは、本発明によるＨＥＲ２アンタゴニストであると考えることができる。本発明の別の実施形態において、ＨＥＲ２アンタゴニストは、トラスツズマブエムタンシン（トラスツズマブ−ＤＭ１；Ｔ−ＤＭ１）である。別の実施形態において、ＨＥＲ２アンタゴニストはペルツズマブである。
【００２６】
ＨＥＲ２の増幅または過剰発現は、特定の種類の乳癌だけではなく、他の種類の癌の病因および進行においても重要な役割を果たすことが分かっている。したがって、本明細書に開示される方法は、限定されないが、乳癌、卵巣癌、例えば、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞性腫瘍、非小細胞肺癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、食道癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮癌、子宮内膜癌、前立腺癌、膀胱癌、神経膠芽腫、Ｈｅｒ２の発現によって特徴付けられる転移性固形腫瘍、またはＨＥＲ２を発現する任意の他の癌を含むＨＥＲ２陽性癌を治療するのに有用である。治療される癌は、初期および後期の癌を含む。
【００２７】
本発明はまた、細胞外ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療に不応性の癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象に治療有効量の式１の化合物を投与することを含む方法も提供する。本発明の一実施形態において、ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する抗体もしくは抗原結合断片、またはそのコンジュゲートである。一実施形態において、ＥＧＦＲアンタゴニストはセツキシマブである。別の実施形態において、ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲおよび切断型ＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体に結合するｍＡＢ８０６である。別の実施形態において、ＥＧＦＲアンタゴニストはパニツムマブである。別の実施形態において、ＥＧＦＲアンタゴニストはザルツムマブである。さらに別の実施形態において、ＥＧＦＲアンタゴニストはニモツズマブである。別の実施形態において、ＥＧＦＲアンタゴニストはマツズマブである。ＥＧＦＲが関与する癌は、限定されないが、結腸直腸癌、頭頸部癌、および非小細胞肺癌を含む。
【００２８】
不応性の、ＥｒｂＢ２を過剰発現する癌は、デノボ不応性であるか、またはトラスツズマブによる治療に対する不応性を獲得しているかのいずれかである。デノボ不応性とは、ＥｒｂＢ２を過剰発現する乳癌が、トラスツズマブによる治療の過程において、部分寛解期もしくは完全寛解期に入らないこと、または代替として、この癌が、トラスツズマブ治療に応じて部分寛解期もしくは完全寛解期に入ることを不可能にする１つ以上の分子欠損によって特徴付けられることのいずれかを意味する。そのような分子欠損の非限定的な例として、例えば、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の突然変異に起因するホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路の活性化；腫瘍抑制因子ＰＴＥＮの欠如または不活性化；切断型ＥｒｂＢ２受容体の蓄積；ヘレグリン媒介性自己分泌シグナル伝達の増加；ならびに上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバー、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、および肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）等の他のＲＴＫの過剰発現を挙げることができる。後にさらに提供されるように、これらの全ての分子欠損は、当該技術分野で一般的に知られている標準的な分子生物学的技術によって検出することができる。獲得された不応性は、本明細書において用いられる場合、ＥｒｂＢ２を過剰発現する乳癌が、トラスツズマブによる治療の過程において、最初は寛解期に入るが、次いで再発することを意味する。トラスツズマブに対する低い反応性を獲得したか、またはトラスツズマブに対する不応性を獲得した乳癌等の癌はまた、トラスツズマブ耐性と称されてもよい。
【００２９】
ＥＧＦＲ依存性癌も、ＨＥＲ２について上述したものを含むいくつかの機構によって、セツキシマブまたは他の治療用ＥＧＦＲ抗体に対して低い反応性を獲得するかまたは不応性になる。例えば、ＥＧＦＲ依存性癌は、ＨＥＲ２シグナル伝達機構によって迂回された場合に不応性となり得る。デノボまたは獲得された不応性は、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、およびＮＲＡＳの突然変異からも生じ得る。
【００３０】
寛解とは、癌の兆候および症状の減少または消失である。部分寛解期には、全てではないが、いくつかの癌の兆候および症状が消失する。完全寛解期には、癌の全ての兆候および症状が消失するが、癌は依然として体内に存在する可能性がある。乳房が寛解期にあるかどうかを判定するために、対象は一般に、早期乳癌の検出および診断に一般的に使用されるのと同じ技術、例えば、マンモグラフィ、超音波検査、ダクトグラフィ、陽電子放出マンモグラフィ（ＰＥＭ）、および磁気共鳴画像（ＭＲＩ）等を用いて評価される。そのようにして得られたデータを、次いで、最初に乳癌が診断された時に得られた対応するデータと比較し、標準的な腫瘍学診療に基づいて、乳癌の兆候および症状が部分的にまたは完全に消失したかどうか、すなわち、乳癌が部分寛解期または完全寛解期にあるかどうかを結論付ける。当業者は、例えば、最初に乳癌が診断された時の乳癌のサイズと比較して乳癌のサイズが縮小しているため、その乳癌は部分寛解期にあると知ることができる。代替として、当業者は、癌が安定化されているため、または癌の増殖が抑制されているために、その乳癌は部分寛解期にあると知ることができる。乳癌は、乳癌の兆候および症状が、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％軽減されていることから、寛解期にあると考えられてもよい。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態において、対象は、ヒトであり、乳癌は、以前にトラスツズマブで治療されたことがある。本発明の他の実施形態において、対象は、ヒトであり、乳癌は、以前にトラスツズマブで治療されたことがない。上述のように、乳癌がトラスツズマブ治療に不応性になるかどうかは、乳癌における特定の分子欠損の有無に基づいて決定することができる。
【００３２】
本発明の一実施形態において、式１の化合物またはその薬学的に許容される塩は、ＨＥＲ２アンタゴニストと併用投与される。そのＳｒｃ阻害活性を考慮すると、式１の化合物は、ＨＥＲ２アンタゴニストの有効性を増加させることができる。代替として、または付加的に、式１の化合物とＨＥＲ２アンタゴニストとの併用投与は、いずれかの薬剤に対する耐性の発生を遅延させるかまたは防止することができる。ＨＥＲ２アンタゴニストは、限定されないが、細胞外アンタゴニスト、例えば、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ）およびそのコンジュゲート等、ならびに細胞内アンタゴニスト（例えば、ラパチニブ、カネルチニブ、ネラチニブ、アファチニブ）を含む。式１の化合物またはその薬学的に許容される塩と、第２の薬剤とは、単一の製剤中に、または別々の製剤として投与することができる。特定の実施形態において、例えば、式１の化合物またはその薬学的に許容される塩は、経口投与されてもよく、およびトラスツズマブが静脈内投与されてもよい。他の投与経路もまた可能である。式１の化合物またはその薬学的に許容される塩は、トラスツズマブの前もしくは後に投与されるように、または同時に投与されるように、トラスツズマブと併用投与することができる。
【００３３】
本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩はまた、ＨＥＲ２アンタゴニストとの併用投与について上述した様式において、様々な他の薬物とも併用投与することができる。本明細書において用いられる薬物という用語は、治療に有益な特性を有する任意の化合物を指す。本発明の特定の実施形態において、治療方法はさらに、トラスツズマブ、または癌に対して効果的なもしくは癌を治療するために開発されている他の抗体治療薬、例えば、セツキシマブまたはニモツズマブ（抗ＥＧＦＲ抗体）、シクスツムマブ（ＩＭＣ−Ａ１２）、ガニツマブ（ＡＭＧ−４７９）、ダロツズマブ（ＭＫ−０６４６）、ＭＥＤＩ−５７３、ＲＧ−１５０７、およびＡＶＥ−１６４２（臨床開発中の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体）を対象に投与することを含む。本発明の特定の実施形態において、方法はさらに、限定されないが、エルロチニブ、ゲフィチニブ（ＥＧＦＲ阻害剤）、ＡＰ２６１１３（ＥＧＦＲとＡＬＫの二重阻害剤）、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、ＣＰ−７５１，８７１、およびＢＭＳ−５３６９２４（ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤）を含む小分子チロシンキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含む。
【００３４】
本発明の特定の実施形態において、治療方法はさらに、Ｃｏｍｏｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｊｕｎｅ  ２００８，ｖｏｌ．７，ｐｐ．５０４−５１６、参照により本明細書に組み込まれる）に開示される肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはＭＥＴチロシンキナーゼのアンタゴニスト（ＮＫ２（アミノ末端のヘアピンドメインおよび最初の２つのクリングルドメインを含有するＨＧＦの断片）、ＮＫ４（β鎖は含有しないがα鎖を含有するＨＧＦ断片）、非切断型ＨＧＦ、デコイＭＥＴ、ＭＥＴの単離されたＳｅｍａドメイン、Ｂｕｒｇｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６：１７２１−１７２９，２００６）に開示されるＨＧＦの種々の完全ヒトモノクローナル抗体、フィクラツズマブ、ＴＡＫ−７０１（Ｌ２Ｇ７）、オナルツズマブ、ＡＬＤ−８０５、ＡＬＤ−８０６、リロツムマブ（ＡＭＧ１０２）（抗ＨＧＦモノクローナル抗体）、ＬＹ−２８７５３５８、ＨｕＭａｘ−ｃＭｅｔ、ＬＡ−４８０、ＯＡ−５Ｄ５、およびＤＮ３０等のＭＥＴに対する抗体、ならびに小分子ＭＥＴ阻害剤、例えば、Ｋ２５２、ＳＵ１１２７４、ＰＨＡ６６５７５２、クリゾチニブ（ＰＦ２３４１０６６）、フォレチニブ（ＸＬ８８０）、ＡＲＱ１９７、ＭＫ２４６１、ＭＰ４７０、ＳＧＸ５２３、およびＪＮＪ３８８７７６０５）を対象に投与することを含む。本発明に従って併用投与することができるさらなる薬剤は、カボザンチニブ（ＸＬ１８４）、ＭＧＣＤ−２６５、ＳＡＲ−１２５８４４、Ｅ−７０５０、ＩＮＣＢ−０２８０６０、ＥＭＤ−９４２８３、ＥＭＤ−１２１４０６３、ＥＭＤ−１２０４８３１、ＬＹ−２８０１６５３、ＬＹ−２８７５３５８、ＭＫ８０３３、およびＡＭＧ−２０８を含む。
【００３５】
本発明の特定の実施形態において、治療方法はさらに、限定されないが、ダサチニブ、ボスチニブ、サラカチニブ、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ベムラフェニブ、およびソラフェニブを含む、ＰＩ３Ｋ／ＡｋｔまたはＭＥＫ経路を調節する薬剤を対象に投与することを含む。
【００３６】
本発明の方法において、式１の化合物は、当該技術分野で一般的に知られている経路により投与することができる。これは、経口投与または任意の他の適した経路を含む。式１の化合物はまた、別の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与されてもよい。投与は、全身的または局所的であり得る。例えば、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセル、カプセルへの封入等の種々の送達系が知られており、化合物およびその薬学的に許容される塩を投与するために使用することができる。
【００３７】
投与の方法は、限定されないが、特に耳、鼻、目、または皮膚に対する、非経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、経鼻、脳内、腟内、経皮、経粘膜、直腸内、吸入による、または局所的な方法を含む。投与の方法は、施術者の裁量に委ねられる。ほとんどの場合、投与は、化合物の血流中への放出をもたらす。
【００３８】
具体的な実施形態において、化合物を局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、制限としてではなく、局所注入、局所適用によって、注射によって、カテーテルを用いて、坐剤を用いて、または移植片によって達成することができ、前記移植片は、シラスティック膜等の膜もしくは繊維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状材料である。そのような場合、投与は、血流中に化合物を実質的に放出することなく、局所組織を選択的に標的とすることができる。
【００３９】
例えば、吸入器もしくは噴霧器、およびエアロゾル剤を含む製剤の使用によって、またはフッ化炭素もしくは合成肺表面活性物質への灌流による経肺投与も用いることができる。特定の実施形態において、化合物は、従来の結合剤およびトリグリセリド等のビヒクルを用いて、坐剤として製剤化される。
【００４０】
別の実施形態において、化合物は、小胞、特にリポソームにおいて送達される（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７-１５３３；Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ  Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、同書ｐｐ．３１７-３２７を参照のこと。一般的に同書を参照されたい）。
【００４１】
別の実施形態において、化合物は、制御放出系において送達される（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、上記ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照のこと）。Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７-１５３３による考察において論じられている制御放出系の例が使用されてもよい。一実施形態において、ポンプが使用されてもよい（上記Ｌａｎｇｅｒ；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照のこと）。別の実施形態において、ポリマー材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照のこと。また、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照のこと）。
【００４２】
本発明は、対象における乳癌を治療する方法を提供する。対象という用語は、本明細書において用いられる場合、治療を受ける動物を指し、動物は、ヒト等の哺乳動物であり得る。
【００４３】
式１の化合物の治療有効量は、癌の治療もしくは管理において治療効果を提供する、癌に関連する１つ以上の症状を遅延させるかもしくは最小限に抑える、または癌の治療もしくは管理に用いられる別の治療剤の治療有効性を増強する、この化合物またはその薬学的に許容される塩の用量である。治療有効量は、乳癌の増殖を減少させるかまたは阻害する量であってもよい。当業者は、特定の活性成分の薬力学的特性とその投与方法および経路；レシピエントの年齢、性別、健康、および体重；症状の性質および程度；併用療法の種類、治療の頻度、および所望の効果等の既知の要因に応じて治療有効量が変化し得ることを理解するであろう。また当業者は、式１の化合物の治療有効量または用量は、本特許出願の開示および当該技術分野で一般的な知識に基づいて決定され得ることを理解するであろう。
【００４４】
癌の治療および／または管理において効果的であろう化合物の量または化合物を含む組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。最適な投与量範囲を特定するのに役立つよう、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイが任意選択的に用いられてもよい。
【００４５】
いくつかの場合において、化合物の投薬量は、動物試験において決定された無毒性量（ＮＯＡＥＬ）から外挿することによって決定されてもよい。この外挿された投薬量は、ヒト臨床試験の最大推奨出発用量を決定する際に有用である。例えば、ＮＯＡＥＬは、ヒト等価用量（ＨＥＤ）を決定するために外挿することができる。典型的には、ＨＥＤは、体表面積に対して正規化された用量（すなわち、ｍｇ／ｍ2）に基づいて非ヒト動物投薬量から外挿される。具体的に実施形態において、ＮＯＡＥＬは、マウス、ハムスター、ラット、フェレット、モルモット、ウサギ、イヌ、霊長類、霊長類（サル、マーモセット、リスザル、ヒヒ）、マイクロブタ、またはミニブタにおいて決定される。ヒト等価用量を決定するためのＮＯＡＥＬの使用およびそれらの外挿に関する考察については、Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｄｏｓｅ  ｉｎ  Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ），Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌｙ  ２００５を参照されたい。一実施形態において、化合物またはその組成物は、ＮＯＡＥＬのヒト等価用量（ＨＥＤ）よりも少ない用量で、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４か月、６ヶ月、９ヶ月、１年、２年、３年、４年、またはそれ以上の期間にわたって投与される。
【００４６】
ヒト対象のための投与計画は、動物の１０％が死亡する用量（ＬＤ10）を使用した動物モデル実験から外挿することができる。一般に、第一相臨床試験の出発用量は、前臨床試験に基づいている。前臨床試験における薬物の毒性の基準尺度は、治療のために死亡する動物の割合である。出発ヒト用量を外挿するための基礎として、動物試験におけるＬＤ10を、体表面積に合わせて調整したヒトの最大耐用量（ＭＴＤ）と相関させることは、十分に当該技術分野の範囲内である。いくつかの実施形態において、ある動物モデルについての投薬量の相互関係は、例えば、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．，１９６６，５０：２１９−２４４に記載されるような換算因子（体表１平方メートル当たりのミリグラム数に基づく）を用いて、ヒトを含む別の動物における使用のために換算することができる。体表面積は、患者の身長および体重から大体決定することができる。例えば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅｓ，  Ｇｅｉｇｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａｒｄｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．，１９７０，５３７を参照のこと。特定の実施形態において、体表面積に関する調整は、例えば、表面積、体重、代謝、組織分布、吸収速度および排泄速度等の宿主因子を含む。それに加えて、投与経路、賦形剤の使用、および標的とする具体的な疾患または癌も、考慮される因子である。一実施形態において、標準的な保守的出発用量は、マウスのＬＤ10の約１／１０であるが、他の種（すなわち、イヌ）が化合物に対してより感受性が高い場合は、さらに少なくてもよい。他の実施形態において、標準的な保守的出発用量は、マウスのＬＤ10の約１／１００、１／９５、１／９０、１／８５、１／８０、１／７５、１／７０、１／６５、１／６０、１／５５、１／５０、１／４５、１／４０、１／３５、１／３０、１／２５、１／２０、１／１５、２／１０、３／１０、４／１０、または５／１０である。他の実施形態において、ヒトにおける化合物の出発用量は、動物モデル試験から外挿される用量よりも少ない。別の実施形態において、ヒトにおける化合物の出発用量は、動物モデル試験から外挿される用量よりも多い。最小限の毒性で所望の効果を達成するために、活性組成物の用量を比較的低いレベルから開始して、必要に応じて投薬量を増加または減少させることは、十分に当該技術分野の範囲内である。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態において、式１の化合物またはその薬学的に許容される塩は、約０．０１ｍｇ／患者の体重１ｋｇ／日〜約１０ｍｇ／患者の体重１ｋｇ／日、好ましくは約０．０５ｍｇ／患者の体重１ｋｇ／日〜約５ｍｇ／患者の体重１ｋｇ／日の用量で使用されてもよい。したがって、１日用量は、限定されないが、１０００ｍｇ／日、７５０ｍｇ／日、５００ｍｇ／日、３００ｍｇ／日、２５０ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、および５０ｍｇ／日を含む。
【００４８】
本発明の化合物およびその薬学的に許容される塩は、薬学的組成物に製剤化されてもよい。本明細書に提供される特定の実施形態において、組成物は、前記化合物と、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤とを含んでもよい。本明細書に提供される薬学的組成物は、その組成物が、限定されないがヒトを含む対象に投与されることを可能にする任意の形態であり得、企図される投与経路に適合するように製剤化される。
【００４９】
本明細書に提供される組成物の成分は、別個に、または単位剤形中に一緒に混合されて、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたは小袋等の密封容器内の凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給されてもよい。組成物が点滴によって投与される場合、滅菌された医薬品グレードの水または食塩水を収容する点滴ボトルを用いて組成物を分注することができる。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用滅菌水または食塩水のアンプルが提供されてもよい。
【００５０】
薬学的に許容される担体、賦形剤、および希釈剤は、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されているもの、または動物、より具体的にはヒトにおける使用に関する米国薬局方もしくは他の一般的に認識された薬局方に列挙されるものを含む。そのような薬学的担体は、水および油等の滅菌液であってもよく、これには、例えば、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等の、石油、動物、植物、または合成起源のものが含まれる。薬学的組成物が静脈内に投与される場合、水が好ましい担体である。食塩溶液およびブドウ糖水溶液およびグリセロール溶液も、特に、注射用液のための液体担体として用いることができる。好適な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。
【００５１】
典型的な組成物および投薬形態は、１つ以上の賦形剤を含む。好適な賦形剤は、薬学の当業者に周知であり、好適な賦形剤の非限定的な例として、デンプン、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。特定の賦形剤が薬学的組成物または剤形に組み込まれるのに好適であるかどうかは、限定されないが、剤形が患者に投与される方法および剤形中の特定の活性成分を含む、当該技術分野で周知の様々な要因に依存する。組成物または単回単位剤形は、所望の場合、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤を含むこともできる。
【００５２】
乳糖を含まない組成物は、当該技術分野で周知の賦形剤を含むことができ、例えば、米国薬局方（ＵＳＰ）ＳＰ（ＸＸＩ）／ＮＦ（ＸＶＩ）に列挙されている。一般に、乳糖を含まない組成物は、薬学的に適合する量および薬学的に許容される量の、活性成分、結合剤／増量剤、および滑沢剤を含む。乳糖を含まない好ましい剤形は、化合物、結晶セルロース、アルファ化デンプン、およびステアリン酸マグネシウムを含む。
【００５３】
水は特定の化合物の分解を促進し得るため、１つ以上の化合物を含む無水薬学的組成物および剤形が本明細書にさらに提供される。例えば、水の添加（例えば、５％）は、製剤の有効期間または経時的な安定性等の特徴を決定するために長期保存をシミュレートする手段として、薬学の分野で広く容認されている。例えば、Ｊｅｎｓ  Ｔ．Ｃａｒｓｔｅｎｓｅｎ，Ｄｒｕｇ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，ＮＹ，１９９５，ｐｐ．３７９  ８０を参照のこと。事実上、水および熱は、特定の化合物の分解を加速する。したがって、製剤の製造、取扱い、包装、保存、輸送、および使用中、頻繁に水分および／または湿気に曝されるため、水が製剤に与える影響は非常に重要であり得る。
【００５４】
本明細書に提供される無水組成物および剤形は、無水または含水率の低い成分、および低水分または低湿度条件を用いて調製することができる。製造、包装、および／または保存中に水分および／または湿度との実質的な接触が予想される場合、乳糖と、一級または二級アミンを含む少なくとも１つの化合物とを含む組成物および剤形は、無水であることが好ましい。
【００５５】
無水組成物は、その無水性が維持されるように調製および保存されるべきである。したがって、無水組成物は、水への曝露を防止することが分かっている材料を用いて包装することが好ましく、そうすることで好適な処方集キットに含めることができる。好適な包装の例として、限定されないが、密封されたホイル、プラスチック、単位用量容器（例えば、バイアル）、ブリスターパック、およびストリップパックが挙げられる。
【００５６】
化合物が分解する速度を低下させる１つ以上の薬剤を含む組成物および剤形が、さらに本明細書に提供される。そのような薬剤は、本明細書において「安定剤」と称され、限定されないが、アスコルビン酸等の抗酸化剤、ｐＨ緩衝剤、または塩緩衝剤を含む。
【００５７】
組成物および単回単位剤形は、溶剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤等の形態をとることができる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含むことができる。そのような組成物および剤形は、患者への適切な投与のための形態を提供するように、好適な量の担体と一緒に、好ましくは精製された形態で治療有効量の化合物を含有する。
【００５８】
それらの投与の容易性のために、錠剤およびカプセル剤が最も有利な経口投薬単位形態であり、その場合、固体賦形剤が用いられる。所望の場合、錠剤は、標準的な水性または非水性技術によってコーティングすることができる。そのような剤形は、薬学の方法のいずれかによって調製することができる。一般に、薬学的組成物および剤形は、活性成分を、液体担体、微粉化された固体担体、またはその両方と均一かつ緊密に混合し、次いで、必要に応じて、生成物を所望の体裁に成形することによって調製される。例えば、錠剤は、圧縮または成形によって調製することができる。圧縮錠は、好適な機械の中で、任意選択的に賦形剤と混合された、粉末または顆粒等の自由流動形態の活性成分を圧縮することによって調製することができる。成形錠は、好適な機械の中で、不活性な液体希釈剤で湿潤させた粉末化合物の混合物を成形することによって作製することができる。
【００５９】
本明細書に提供される経口剤形中で使用することができる賦形剤の例として、限定されないが、結合剤、増量剤、崩壊剤、および滑沢剤が挙げられる。薬学的組成物および剤形中に使用するのに好適な結合剤は、限定されないが、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、または他のデンプン、ゼラチン、天然および合成ゴム（例えば、アカシア）、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸、他のアルギン酸塩、粉末トラガカント、グアーガム、セルロースおよびその誘導体（例えば、エチルセルロース、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、アルファ化デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、番号２２０８、２９０６、２９１０）、結晶セルロース、ならびにこれらの混合物を含む。
【００６０】
本明細書に提供される薬学的組成物および剤形に使用するのに好適な増量剤の例として、限定されないが、滑石、炭酸カルシウム（例えば、顆粒または粉末）、結晶セルロース、粉末セルロース、デキストレート、カオリン、マンニトール、ケイ酸、ソルビトール、デンプン、アルファ化デンプン、およびこれらの混合物が挙げられる。本明細書に提供される薬学的組成物中の結合剤または増量剤は、典型的には、薬学的組成物または剤形の約５０〜約９９重量パーセントで存在する。
【００６１】
結晶セルロースの好適な形態は、限定されないが、ＡＶＩＣＥＬ  ＰＨ  １０１、ＡＶＩＣＥＬ  ＰＨ  １０３、ＡＶＩＣＥＬ  ＲＣ  ５８１、ＡＶＩＣＥＬ  ＰＨ  １０５  （ＦＭＣ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｉｓｃｏｓｅ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｖｉｃｅｌ  Ｓａｌｅｓ，Ｍａｒｃｕｓ  Ｈｏｏｋ，ＰＡから入手可能）として販売されている材料、およびこれらの混合物を含む。具体的な結合剤は、ＡＶＩＣＥＬ  ＲＣ  ５８１として販売されている、結晶セルロースとナトリウムカルボキシメチルセルロースとの混合物である。好適な無水または含水率の低い賦形剤もしくは添加剤は、ＡＶＩＣＥＬ  ＰＨ  １０３（商標）およびＳｔａｒｃｈ  １５００  ＬＭを含む。
【００６２】
崩壊剤は、水性環境に曝露された時に崩壊する錠剤を提供するために、本明細書に提供される組成物中に用いられる。過剰な崩壊剤を含有する錠剤は、保存中に崩壊する場合があり、一方、少な過ぎる崩壊剤を含有する錠剤は、所望の速度でまたは所望の条件下で崩壊しない場合がある。したがって、活性成分の放出を有害に変化させるほど多過ぎも少な過ぎもしない十分な量の崩壊剤を用いて、本明細書に提供される固体経口剤形を形成するべきである。使用される崩壊剤の量は、製剤の種類に基づいて変化し、当業者に容易に認識される。典型的な薬学的組成物は、約０．５〜約１５重量パーセントの崩壊剤、具体的には、約１〜約５重量パーセントの崩壊剤を含む。
【００６３】
本明細書に提供される薬学的組成物および剤形中で使用することができる崩壊剤は、限定されないが、寒天、アルギン酸、炭酸カルシウム、結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポラクリリンカリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルファ化デンプン、他のデンプン、粘土、他のアルギン、他のセルロース、ゴム、およびこれらの混合物を含む。
【００６４】
本明細書に提供される薬学的組成物および剤形中で使用することができる滑沢剤は、限定されないが、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油、軽鉱物油、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール、他のグリコール、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、滑石、水素化植物油（例えば、落花生油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油）、ステアリン酸亜鉛、オレイン酸エチル、ラウリル酸エチル、寒天、およびこれらの混合物を含む。さらなる滑沢剤は、例えば、Ｓｙｌｏｉｄシリカゲル（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤのＷ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ  Ｃｏ．によって製造されているＡＥＲＯＳＩＬ  ２００）、合成シリカの凝集エアロゾル（Ｐｌａｎｏ，ＴＸのＤｅｇｕｓｓａ  Ｃｏ．から市販されている）、ＣＡＢ  Ｏ  ＳＩＬ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡのＣａｂｏｔ  Ｃｏ．によって販売されている発熱性二酸化ケイ素）、およびこれらの混合物を含む。たとえ使用されるとしても、滑沢剤は、典型的には、それらが組み込まれる薬学的組成物または剤形の約１重量パーセント未満の量で使用される。
【００６５】
化合物は、制御放出手段によって、または当業者に周知の送達デバイスによって投与することができる。例として、限定されないが、米国特許第３，８４５，７７０号；第３，９１６，８９９号；第３，５３６，８０９号；第３，５９８，１２３号；ならびに第４，００８，７１９号、第５，６７４，５３３号、第５，０５９，５９５号、第５，５９１，７６７号、第５，１２０，５４８号、第５，０７３，５４３号、第５，６３９，４７６号、第５，３５４，５５６号、および第５，７３３，５６６号に記載されているものが挙げられ、その各々が、参照により本明細書に組み込まれる。そのような剤形を用いて１つ以上の活性成分の持続放出または制御放出を提供することができ、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過膜、浸透圧系、多層コーティング、微粒子、リポソーム、ミクロスフェア、またはこれらの組合せを用いて、様々な割合の所望の放出プロファイルを提供する。本明細書に記載されるものを含む、当業者に既知の好適な制御放出製剤は、本発明の活性成分とともに使用するために容易に選択することができる。したがって、本発明は、限定されないが、制御放出に適した錠剤、カプセル剤、ゲルキャップ剤、およびカプレット剤等の経口投与に好適な単回単位剤形を包含する。
【００６６】
全ての制御放出医薬品は、それらの非制御対応物によって達成されるものを超えるように薬物療法を改善するという共通の目的を有する。理想的には、医学的処置における最適に設計された制御放出調製物の使用は、最小限の時間で状態を治癒または制御するために最小限の原薬が用いられることを特徴とする。制御放出製剤の利点は、薬物活性の延長、投薬頻度の低下、および患者コンプライアンスの改善を含む。さらに、制御放出製剤は、作用開始時間または薬物の血中濃度等の他の特性に影響を与えるように使用することができ、したがって、（例えば、有害な）副作用の発生に影響を及ぼすことができる。
【００６７】
ほとんどの制御放出製剤は、所望の治療効果を迅速にもたらす薬物（活性成分）の量を最初に放出し、長期間にわたってこのレベルの治療効果を維持するために、他の量の薬物を徐々にかつ継続的に放出するように設計される。体内でこの一定レベルの薬物を維持するために、薬物は、代謝されて体から排泄される薬物の量を補充する速度で剤形から放出されなければならない。活性成分の制御放出は、限定されないが、ｐＨ、温度、酵素、水、または他の生理的条件もしくは薬剤を含む、種々の条件によって刺激することができる。
【００６８】
本発明のいくつかの実施形態において、乳癌はＰＴＥＮ陰性である。ＰＴＥＮ陰性という用語は、少なくともいくつかの癌細胞が、検出可能な量のあらゆるヒトＰＴＥＮタンパク質を欠損するかまたは著しく少ない量を含有する乳癌、あるいは少なくともいくつかの癌細胞が、ヒトＰＴＥＮ遺伝子を欠損するか、ヒトＰＴＥＮ遺伝子に無発現変異を保有するか、またはヒトＰＴＥＮタンパク質の発現および／もしくは機能を著しく減少させる突然変異を保有する乳癌を指す。ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子遺伝子は、広範に研究されてきた。例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１９４３−１９４７；Ｓｔｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１５：３５６−３６２を参照のこと。腫瘍組織においてヒトＰＴＥＮタンパク質またはその非存在を検出するため、およびヒトＰＴＥＮ遺伝子において突然変異を検出するための、分子生物学的方法、免疫組織化学的方法、および他の方法は、当該技術分野で一般的に知られており、例えば、米国特許第７，９８１，６１６号（参照により、その開示が本明細書に組み込まれる）に開示されている。例えば、乳癌生検標本を採取し、ＰＴＥＮ特異的抗体および適切な二次検出試薬を使用することにより、ヒトＰＴＥＮの発現について免疫組織化学的に分析することができる。ＰＴＥＮ特異的抗体は、Ａｂｃａｍ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを含む多くの供給源から市販されている。このように測定されたヒトＰＴＥＮタンパク質の発現は、例えば、内部分子マーカー、例えば、アクチンおよび他の遍在的に発現されるタンパク質の発現との比較によって、腫瘍を取り囲む正常組織におけるＰＴＥＮの発現との比較によって、または米国特許第７，９８１，６１号に記載されるように、非存在または低下に分類することができる。ヒトＰＴＥＮ遺伝子の突然変異は、例えば、ヒトＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の分析について以下に記載するように検出することができる。
【００６９】
本発明の他の実施形態において、乳癌は、ヒトＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の突然変異が陽性である。ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の突然変異が陽性である乳癌は、ヒトＰＩＫ３ＣＡ遺伝子に突然変異を保有するか、またはこの遺伝子の２つより多くの対立遺伝子を保有する、少なくともいくつかの細胞を含む。ヒトＰＩＫ３ＣＡ遺伝子は、クラスＩホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）の触媒サブユニットであるｐ１１０αタンパク質をコードする。例えば、Ｂａｓｅｌｇａ，２０１１，Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，１６（Ｓｕｐｐｌ．１）：１２−１９およびその中の参考文献を参照のこと。
【００７０】
そのような突然変異および遺伝子増幅を検出するための分子生物学的方法および他の方法は、当該技術分野で一般的に知られており、例えば、米国特許第８，０２６，０５３号（参照により、その開示が本明細書に組み込まれる）に開示されている。例えば、乳癌生検標本を採取することができ、そこからゲノムおよび／またはＲＮＡを抽出することができる。次いで、例えば、ヒトＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における／の点突然変異、より大きな再編成、または遺伝子増幅を検出するために、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定法、およびサザンブロット法によってゲノムＤＮＡを分析することができる。代替として、ＲＮＡを逆転写して、得られたｃＤＮＡをそのような突然変異について分析することもできる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，２００１を参照のこと。循環腫瘍細胞や、腫瘍細胞を起源とし、血清または血漿、尿、および唾液中を循環する核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を含む体液バイオマーカーも調べることができる。
【００７１】
本発明の他の実施形態において、乳癌の少なくともいくつかの癌細胞は、通常トラスツズマブが結合する細胞外ドメインを欠損した切断型ＥｒｂＢ２受容体を発現する。ＥｒｂＢ２受容体およびその遺伝子は、広範に研究されてきた。切断型ＥｒｂＢ２受容体タンパク質、または切断型ＥｒｂＢ２受容体を生じる遺伝子の突然変異を検出するための分子生物学的方法、免疫学的方法、および他の方法は、当該技術分野で一般的に知られている。
【００７２】
本発明の他の実施形態において、乳癌は、ＲＴＫ、例えば、ＥＧＦＲファミリーのメンバー、ＩＧＦ−１Ｒ、およびＨＧＦＲを過剰発現する。ＥＧＦＲファミリー、ＩＧＦ−１Ｒ、およびＨＧＦＲは、広範に研究されてきた。乳癌におけるこれらの受容体のうちのいずれかの過剰発現または増幅を検出するための分子生物学的方法、免疫学的方法、および他の方法は、当該技術分野で一般的に知られている。
【００７３】
本出願を通して種々の刊行物が参照される。これらの刊行物は、本発明が関連する技術の現状をより完全に説明するために、参照により、それらの全体が本出願に組み込まれる。以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、決して本発明の範囲を限定すると見なされるべきではない。
【実施例】
【００７４】
実施例１  ＥＸＥＬ−７６４７はＳＲＣキナーゼ活性を阻害する
【００７５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを用いて、ＥＸＥＬ−７６４７によるＳＲＣキナーゼ活性の阻害を測定した。これらの実験は、ＥＸＥＬ−７６４７が、１０．３ｎＭ±２．０のＩＣ50でＳＣＲキナーゼ活性を阻害したことを示した（データは図示せず）。さらに、ＥＸＥＬ−７６４７がＳＲＣファミリータンパク質ＦＡＫ（接着斑キナーゼ）のリン酸化に与える影響を細胞培養物中で測定した（図１）。具体的には、無血清ＤＭＥＭ中、ＤＬＤ１−ＰＴＫ２細胞を１．６、４．７、１４、４１、１２３、３７０、１１１１、３３３３、または１０，０００ｎＭの濃度のＥＸＥＬ−７６４７で１時間処理して回収した。次いで、図１に示すように、処理した細胞中のＦＡＫタンパク質（「ＦＡＫ−ＰＹ８６１」）のアミノ酸位置８６１におけるチロシンのリン酸化状態を、リン酸化特異的抗体を用いた標準的なウエスタンブロット法により決定した。Ｔｙｐｈｏｏｎ走査画像およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを使用してウエスタンブロットを定量化し、ＥＸＥＬ−７６４７によって媒介されたＦＡＫリン酸化の阻害のＩＣ50値を算出した。ＥＸＥＬ−７６４７は、アミノ酸位置８６１でチロシンにおけるＦＡＫのリン酸化を約１μＭのＩＣ50で阻害した。キナーゼ阻害剤スタウロスポリン（ＥＸＥＬ００８７８１２８）を陽性対照として使用した。図１に示されるように、アミノ酸位置３９７（「ＦＡＫ−ＰＹ３９７」）におけるチロシンのＦＡＫ自己リン酸化の阻害についてもアッセイしたが、さらに定量化は行わなかった。図１の識別子ＥＸＥＬ−０２３７７６４７：９は、化合物ＥＸＥＬ−７６４７を指す。
実施例２  ＥＸＥＬ−７６４７は乳癌異種移植片の増殖を阻害する
【００７６】
ヒト乳癌細胞株ＢＴ４７４は、高レベルのＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）を発現し、そのかなりの割合が、たとえ外因性リガンドの非存在下であっても構成的にリン酸化される。ＥｒｂＢ２のリン酸化は、その活性の尺度である。ヒト乳癌細胞株ＢＴ４７４に由来する腫瘍異種移植片を有する胸腺欠損ヌードマウスに、３、１０、３０、または１００ｍｇ／ｋｇのＥＸＥＬ−７６４７を３日間連続して経口投与した。最後の用量が投与されてから１時間後に腫瘍を採取し、それらの重量を測定した。ＥＸＥＬ−７６４７が媒介した腫瘍増殖の阻害について算出されたＥＤ50は、体重１ｋｇ当たり３０ｍｇのＥＸＥＬ−７６４７であった（データは図示せず）。
実施例３  ＥＸＥＬ−７６４７はＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）のリン酸化を阻害する
【００７７】
上記実施例２に記載されるように作製した腫瘍を、標準的なウエスタンブロット法により、全ＥｒｂＢ２およびホスホ−ＥｒｂＢ２のレベルについて、個別にまたは処理群ごとにアッセイした（図２、左上パネル）。ビヒクルのみで処理したマウスからの腫瘍が、陰性対照としての役割を果たした。アクチンの検出が、タンパク質の完全性および濃度についての対照としての役割を果たした。ＸＬ６４７が全ＥｒｂＢ２およびホスホ−ＥｒｂＢ２のレベルに用量依存性の減少を誘導したことは容易に分かる。減少は、ビヒクル対照を参照することにより算出した。例えば、３日間連続して投与された１００ｍｇ／ｋｇの用量のＥＸＥＬ−７６４７が、ホスホ−ＥｒｂＢ２の約７０％の減少をもたらした。
【００７８】
分析した腫瘍を有するマウス（上記参照）におけるＥＸＥＬ−７６４７の血漿中濃度も決定し、対応するホスホ−ＥｒｂＢ２レベルと相関させた（図２、右上パネル）。これらの測定により、ＥＸＥＬ−７６４７が、腫瘍におけるホスホ−ＥｒｂＢ２の蓄積を３．５８μＭのＩＣ50で阻害したこと、および約５．３７μＭのＥＸＥＬ−７６４７の血漿中濃度が、ホスホ−ＥｒｂＢ２の約６９％の減少をもたらしたことが明らかになった。
【００７９】
単回用量のＥＸＥＬ−７６４７に応じた腫瘍におけるホスホ−ＥｒｂＢ２の減少の動態も決定した（図２、左下パネル）。上述のように腫瘍を作製した。腫瘍を有するマウスを単回用量のＥＸＥＬ−７６４７（３０または１００ｍｇ／ｋｇ）に曝露し、腫瘍を切除し、投与後４、２４、または４８時間後に溶解物を調製した。溶解物中の全ＥｒｂＢ２およびホスホ−ＥｒｂＢ２の含有量を決定し、ＥｒｂＢ２レベルの減少を上述のように算出した。全体として、全ＥｒｂＢ２およびホスホ−ＥｒｂＢ２の量は、ＥＸＥＬ−７６４７の３０ｍｇ／ｋｇの用量に応じて有意に減少することはなかった。しかしながら、特に２４および４８時間後に、１００ｍｇ／ｋｇの用量に応じた有意な減少が見られた。図２、右下パネルのヒストグラムは、１００ｍｇ／ｋｇの用量のＥＸＥＬ−７６４７に応じたホスホ−ＥｒｂＢ２の減少の動態を示す。見て分かるように、ホスホ−ＥｒｂＢ２の減少は統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
実施例４  ＥＸＥＬ−７６４７はＥＧＦＲのリン酸化を阻害する
【００８０】
ＥＸＥＬ−７６４７が、ＥＧＦによって誘導されるＥＧＦＲのリン酸化を阻害する能力を、次にように検証した。ヒト上皮癌細胞株Ａ４３１に由来する腫瘍異種移植片を有する胸腺欠損ヌードマウスに、３、１０、３０、または１００ｍｇ／ｋｇのＥＸＥＬ−７６４７を経口投与した。ＥＸＥＬ−７６４７処理の３．５時間後に、ＥＧＦを静脈内投与してＥＧＦによるリン酸化を誘導した。次いで、腫瘍を採取し、それらのホスホ−ＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ）含有量を測定した。ビヒクルのみで処理したマウスからの腫瘍が、陰性対照としての役割を果たし、ビヒクルおよびＥＧＦＲで処理したマウスからの腫瘍が、陽性対照としての役割を果たした。図３、左パネルのヒストグラムは、投与された異なる用量のＥＸＥＬ−７６４７に応じた、腫瘍においてＥＧＦによって誘導されたＥＧＦＲのリン酸化の減少を示す。例えば、１００ｍｇ／ｋｇの用量のＥＸＥＬ−７６４７は、陽性対照と比較して、ＥＧＦによって誘導されたＥＧＦＲのリン酸化の約９０％の減少をもたらした。見て分かるように、投与された異なるＥＸＥＬ−７６４７の用量に応じてＥＧＦによって誘導されたＥＧＦＲ−リン酸化の減少は、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【００８１】
分析した腫瘍を有するマウス（上記参照）におけるＥＸＥＬ−７６４７の血漿中濃度も決定し、対応するホスホ−ＥＧＦＲレベルの減少と相関させた（図３、右パネル）。これらの測定により、ＥＸＥＬ−７６４７が、腫瘍におけるＥＧＦＲのリン酸化を０．７２μＭのＩＣ50血漿中濃度で阻害したことが明らかになった。
実施例５  ＥＸＥＬ−７６４７はＫＤＲのリン酸化を阻害する
【００８２】
マウスの肺等の血管に富んだ組織は、著しいレベルのＫＤＲを含有するが、リン酸化形態にはほんのわずかしか存在しない。マウスにＫＤＲのリガンドであるＶＥＧＦを１０μｇ静脈内投与したところ、３０分後、それらの肺のホスホ−ＫＤＲ（ｐＫＤＲ）の量が約１．５倍増加した。ＥＸＥＬ−７６４７がＶＥＧＦによって誘導されるＫＤＲ受容体の活性化（受容体のリン酸化レベルを測定することによって決定される）を阻害する能力を、次のように検証した。マウスに単回用量の１０、３０、または１００ｍｇ／ｋｇのＥＸＥＬ−７６４７を経口投与した。ＥＸＥＬ−７６４７処理の３．５時間後に、１０μｇのＶＥＧＦを静脈内投与した。次いで、肺を採取し、各投薬群（ｎ＝５）からの溶解物をプールした。溶解物を標準的なウエスタンブロット法により、全ＫＤＲおよびｐＫＤＲのレベルについてアッセイした（図４、左パネル）。ビヒクルのみで処理したマウスからの肺が、陰性対照としての役割を果たし、ビヒクルおよびＶＥＧＦで処理したマウスからの肺が、陽性対照としての役割を果たした。ＥＸＥＬ−７６４７の投与がＶＥＧＦによって誘導されたＫＤＲリン酸化の用量依存性の減少を誘導したことは容易に分かる。減少は、ビヒクル対照を参照することにより算出した。例えば、単回用量１００ｍｇ／ｋｇのＥＸＥＬ−７６４７は、ＶＥＧＦによって誘導されたＫＤＲ受容体のリン酸化を、ベースラインレベルまで完全に抑制した。個々のマウスからの溶解物中のｐ−ＫＤＲの定量化によって、ＶＥＧＦによって誘導されたＫＤＲリン酸化の統計的有意性（ｐ＜０．０００５）と、１００ｍｇ／ｋｇのＥＸＥＬ−７６４７の投与によるこの誘導の完全阻害の統計的有意性（ｐ＜０．００１）の両方を確認した（データは図示せず）。
【００８３】
処理したマウス（上記参照）におけるＥＸＥＬ−７６４７の血漿中濃度も決定し、溶解物プールにおいて測定された、ＶＥＧＦによって誘導されたＫＤＲのリン酸化の対応する減少と相関させた（図４、右パネル）。これらの測定により、ＥＸＥＬ−７６４７が、ＶＥＧＦによって誘導されるＫＤＲ受容体のリン酸化を約１．２３μMのＩＣ50で減少させたこと、およびＥＸＥＬ−７６４７の約３．３６μＭの血漿中濃度が、ＶＥＧＦ処理に応じたＫＤＲ−リン酸化の完全な阻害をもたらしたことが明らかになった。
実施例６  ＥＸＥＬ−７６４７はＥｐｈＢ４のリン酸化を阻害する
【００８４】
ＥＸＥＬ−７６４７がＥｐｈＢ４受容体の活性（受容体のリン酸化レベルを測定することによって決定される）を阻害する能力を、次のように検証した。薬物選択マーカー、およびＥｐｈＢ４をコードする発現ベクターでヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６をトランスフェクトすることにより、高レベルのＥｐｈＢ４を発現する細胞株を誘導した。結果として得られたＥｐｈＢ４を発現する細胞（ＨＣＴ１１６／ＥｐｈＢ４）は、免疫低下マウスにおいて異種移植片として成長する。これらの異種移植片の溶解物の分析は、細胞中のかなりの量のＥｐｈＢ４がチロシン残基で構成的にリン酸化されることを示した。Ｅｐｈ  Ａ２の静脈内または腫瘍内注射によってＥｐｈＢ４−リン酸化をさらに刺激する試みは失敗に終わった（データは図示せず）。
【００８５】
ＨＣＴ１１６／ＥｐｈＢ４異種移植片を有するマウスに、３、１０、３０、または１００ｍｇ／ｋｇのＥＸＥＬ−７６４７を３日間連続して経口投与した。最終投与の１時間後に腫瘍を採取し、標準的なウエスタンブロット法により、全ＥｐｈＢ４およびホスホ−ＥｐｈＢ４のレベルについて、個別にまたは処理群ごとにアッセイした（図５、左パネル）。ビヒクルのみで処理したマウスからの腫瘍が、陰性対照としての役割を果たした。アクチンの検出が、タンパク質の完全性および濃度についての対照としての役割を果たした。ＥＸＥＬ−７６４７は、ホスホ−ＥｐｈＢ４レベルに用量依存性の減少を誘導した。具体的には、３日連続して投与された１００ｍｇ／ｋｇの用量のＥＸＥＬ−７６４７が、ホスホ−ＥｐｈＢ４の約７０％の減少をもたらした。
【００８６】
分析した腫瘍を有するマウス（上記参照）におけるＥＸＥＬ−７６４７の血漿中濃度も決定し、対応するホスホ−ＥＰＨＢ４レベルの減少と相関させた（図５、右パネル）。これらの測定により、約３μＭのＥＸＥＬ−７６４７の血漿中濃度が、腫瘍におけるＥｐｈＢ４のリン酸化を約７０％減少させたことが明らかになった。ＥｐｈＢ４−リン酸化の５０％阻害は、約２．４μＭのＥＸＥＬ−７６４７血漿中濃度で起こることが予測された。
実施例７  ＥＸＥＬ−７６４７は血管新生を阻害する
【００８７】
ＥＸＥＬ−７６４７が血管新生を阻害する能力を、以下に示すようにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ実験によって検証した（図６、表２）。内皮管形成および細胞遊走アッセイを行い、ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生に寄与すると考えられる内皮細胞機能の側面を反映するｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにＥＸＥＬ−７６４７が与える影響を調べた。ヒト正常二倍体線維芽細胞のコンフルエント層にプレーティングすると、ヒト毛細血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）は、ＶＥＧＦに反応して、７〜１０日間の期間にわたって大規模な細管のネットワークを形成した。細管を染色し、内皮細胞マーカーＣＤ３１を認識する抗体を用いて図６の左パネルに示すように定量化した。ＥＸＥＬ−７６４７は、ＶＥＧＦによって誘導される細管形成を約０．２２μＭのＩＣ50で阻害し、これは、実施例３〜６で上述した受容体リン酸化アッセイを用いて得られたＩＣ50値と同様であった。Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ染色によって決定されたＨＭＶＥＣに対するＥＸＥＬ−７６４７の細胞毒性効果のＩＣ50は約１．３μＭであり、ＥＸＥＬ−７６４７がＶＥＧＦによって誘導される細管形成を阻害するＩＣ50よりも約５倍高かった（データは図示せず）。
【００８８】
２番目のアッセイは、いわゆる「スクラッチアッセイ」と呼ばれ、ＥＸＥＬ−７６４７がマウス内皮細胞に与える影響を調べるために用いられた（図６、右パネル）。このアッセイでは、無細胞領域に創傷を作製して細胞の単層を形成し、ＥＸＥＬ−７６４７が、ＶＥＧＦによって刺激されたマウスＭＳ１内皮細胞の無細胞領域への遊走を阻害する能力を測定した。ＶＥＧＦの非存在下では、実験の２４時間が経過する間、創傷に隣接する無細胞空間への細胞の遊走は最小限であった。ＶＥＧＦは遊走を著しく刺激し、その時間枠内に創傷のほぼ完全な閉鎖をもたらした。ＥＸＥＬ−７６４７は、６点用量反応から決定されるように、約０．１２μＭのＩＣ50で創傷への細胞遊走を阻害した（図６、右パネル）。これは、ＥＸＥＬ−７６４７がマウスＫＤＲ受容体およびヒトＫＤＲ受容体を同程度まで阻害したことと一致していた。このアッセイでは、１．１μＭ未満の濃度ではＥＸＥＬ−７６４７の細胞毒性の証拠は認められなかった。
【００８９】
ＥＸＥＬ−７６４７の抗血管新生効果についてもｉｎ  ｖｉｖｏで試験を行った。ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に由来する腫瘍異種移植片を胸腺欠損メスマウスにおいて確立し、総重量が１００ｍｇに達するようにした。次いで、マウスに１０、３０、または１００ｍｇ／ｋｇの用量のＥＸＥＬ−７６４７を１４日間連続して経口投与した。最後の用量が投与された後に腫瘍を採取し、それらの重量を測定した。ビヒクルのみで処理したマウスに由来する腫瘍が、陰性対照としての役割を果たした。腫瘍増殖は、３つ全ての投与計画によって有意に阻害された（データは図示せず）。具体的には、１００ｍｇ／ｋｇの投薬量が、腫瘍増殖の完全な停止を引き起こした（試験開始時の腫瘍重量＝１００．６±８．７ｍｇ、試験終了時の腫瘍重量１１２±１６．２ｍｇ）。３０および１００ｍｇ／ｋｇの計画も、ビヒクルのみで処理した対照腫瘍における壊死と比較すると、腫瘍の全壊死の割合を有意に増加させた（下の表２）。このモデルにおいて、１０ｍｇ／ｋｇという低用量では、腫瘍壊死における統計的に有意な増加は観察されなかった。さらに、調べた３つの投与計画のいずれかに供されたマウスに由来するこれらの腫瘍の生組織で、ＣＤ３１陽性血管の量が有意に減少した（下の表２）。最後に、調べた３つの投与計画のいずれかに供されたマウスに由来する腫瘍において、細胞増殖のマーカーであるＫｉ６７を発現する細胞の割合が有意に減少した（表２）。このことから、これらの腫瘍がより少ない増殖細胞を含有していたことが示唆された。
【表１】
2015503568.tif 000005
実施例８  ＥＸＥＬ−７６４７は乳癌異種移植片の増殖を阻害する
【００９０】
ＥＸＥＬ−７６４７がヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に由来する腫瘍の増殖を阻害する能力を、次のように検証した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に由来する腫瘍異種移植片を胸腺欠損メスマウスにおいて確立し、総重量が１００ｍｇに達するようにした。次いで、マウスに１０、３０、または１００ｍｇ／ｋｇの用量のＥＸＥＬ−７６４７を最大２８日間連続して経口投与した。ＸＬ６４７による処理開始後の特定の日に腫瘍を採取し、図７に示すようにそれらの重量を測定した。ビヒクルのみで処理したマウスに由来する腫瘍が、陰性対照としての役割を果たした。腫瘍増殖は、３０および１００ｍｇ／ｋｇのＥＸＥＬ−７６４７投薬量の投与によって有意に阻害された（図７）。具体的には、１００ｍｇ／ｋｇの投薬量が、腫瘍増殖の完全な停止を引き起こした（腫瘍の出発重量９４±９ｍｇ、腫瘍の最終重量１１７±３３ｍｇ）。ＥＸＥＬ−７６４７によって媒介された腫瘍増殖の阻害について算出されたＥＤ50は、体重１ｋｇ当たり２２．９ｍｇのＸＬ６４７であった。
実施例９  ＥＸＥＬ−７６４７はトラスツズマブ耐性細胞増殖を抑制する
【００９１】
かなりの割合のＥＲＢＢ２陽性乳癌患者は、トラスツズマブ治療に反応を示さないか、または耐性を持つようになる。耐性は、主に、受容体の下流のＲＴＫおよび他のシグナル伝達分子における遺伝子変化によって、または代償機構としての他のＲＴＫの活性の上方制御によって生じる。ＪＩＭＴ−１およびＨＣＣ１９５４トラスツズマブ耐性癌細胞株の増殖阻害によって示されるように、ＥＸＥＬ−７６４７は、トラスツズマブ耐性モデルにおいて強力に活性である。
【００９２】
ＪＩＭＴ−１およびＨＣＣ１９５４細胞を、１０％ウシ胎仔血清（熱失活ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種した。播種から１８時間後、細胞を化合物で７２時間処理した。各化合物の濃度につき３つのウェルを使用した。対照ウェルを０．２％ＤＭＳＯ培地で処理した。培養物を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、「ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して増殖細胞の量を決定した。基質溶液によるインキュベーションの後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用してプレートを読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアによる分析に基づいてＩＣ50値を算出した。細胞増殖の阻害率を［１−（処理細胞／対照細胞）×１００］として算出した。
【００９３】
上昇する濃度のトラスツズマブによるいずれの細胞株の処理も、細胞増殖の速度に影響を及ぼさなかったことから、ＪＩＭＴ−１およびＨＣＣ１９５４細胞株がトラスツズマブ治療に不応性であることが確認された。しかしながら、ＥＸＥＬ−７６４７は、これらの細胞の増殖を強力に阻害した（表３および４）。
【表２】
2015503568.tif 000006
【表３】
2015503568.tif 000007
【００９４】
２つの細胞株を直接比較するために、ＳＲＣファミリーキナーゼの全体的なタンパク質レベル、およびこれらのタンパク質のリン酸化を活性化するレベルを、両方の細胞株において分析した。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液（ｐＨ８．０の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０％ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含有する）に溶解した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分）後に細胞可溶化物を回収し、ＢＣＡ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してタンパク質濃度を測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で等しい量のタンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に移した。０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳ中５％の牛乳で膜を１時間ブロックし、次いで一次抗体で一晩４℃でプローブした。ＰＢＳＴで膜を洗浄し、二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、製造者（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の指示に従って高感度化学発光試薬でブロットを可視化した。
【００９５】
Ｓｒｃのキナーゼドメインの活性化ループ内のチロシン４１６におけるリン酸化は、パキシリンを含む標的タンパク質のより高いリン酸化レベルによって証明されたより高い活性と相関する。ＪＩＭＴ−１細胞は、ＨＣＣ１９５４細胞よりも有意に多い量のＳＲＣタンパク質を有すると考えられた（図８）。これと一致して、ＥＸＥＬ−７６４７による処理は、ＨＣＣ１９５４細胞中のｐＳＲＣレベルに有意に大きな影響を及ぼし、わずか０．１μＭ程のＥＸＥＬ−７６４７の処理によってホスホ−Ｓｒｃ（Ｔｙｒ４１６）の著しい減少が達成された（図８Ａ）。重要なのは、１．０μＭのＥＸＥＬ−７６４７による４時間の処理がＳｒｃの活性化を有意に減少させた一方で、５または１０μＭのＥＸＥＬ−７６４７による両方の細胞の処理はＴｙｒ４１６のリン酸化を完全に無効にしたことから、完全なＳｒｃの阻害が示唆されたことである（図８ＡおよびＢ）。Ｓｒｃ活性の阻害は、パキシリン（Ｔｙｒ１１８）のリン酸化の低下によってさらに裏付けられた（図８Ａ）。Ｓｒｃの阻害が直接的であったことを確認するために、ＥＸＥＬ−７６４７処理細胞におけるＳＲＣのリン酸化を、他のＥＲＢＢファミリー阻害剤で処理した細胞と比較した。（図８Ｂ）。ラパチニブまたはエルロチニブではなく、ＥＸＥＬ−７６４７のみが、両方の細胞株においてＳＲＣ活性を阻害することができた。さらに、ＥＸＥＬ−７６４７は、他の小分子ＥＲＢＢ阻害剤と比較して、両方の細胞株の増殖にはるかに大きな影響を及ぼした（図８ＣおよびＤ）ことから、ＲＴＫの遮断に反応を示さない細胞を処理するその能力が示唆される。
実施例１０  ＥＸＥＬ−７６４７はトラスツズマブ耐性ＪＩＭＴ−１腫瘍異種移植片を阻害する
【００９６】
試験の１日目に、メスの重症複合免疫不全マウス（Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ（登録商標）、Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−Ｐｒｋｄｃscid、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は１０週齢であり、体重は１７．６〜２０．８グラムの範囲であった。進行した皮下ＪＩＭＴ−１腫瘍（１９６〜４０５ｍｍ3）を有する４群のマウス（ｎ＝１２）において１日目に治療を開始した。トラスツズマブ（２０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与を隔週×５）を用いておよび用いずに、マウスにＥＸＥＬ−７６４７（経口で８０ｍｇ／ｋｇを毎日×３５）を投与するように計画を立てた。実験は、ビヒクル処理対照群およびトラスツズマブ単独療法群を含んでいた。試験中、ＥＸＥＬ−７６４７の投与計画は、毒性のために、１〜１９、２８、２９、３２〜３６、および３９〜４２日目に１日１回に変更された。４２日目に試験を終了するまで、週２回腫瘍を測定した。毎日の投与終了時（１８日目）および試験終了時（４２日目）の処理マウスと対照マウスとの間の腫瘍体積の中央値（ＭＴＶ）におけるパーセント差を評価した腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）から治療成績を判定し、群間差は、マンホイットニーのＵ検定を用いてＰ＜０．０５を統計的に有意であると見なした。６０％以上のＴＧＩをもたらした計画は、潜在的な治療活性を有すると考えられた。１日目から、完全寛解（ＣＲ）および部分寛解（ＰＲ）反応、ならびに３０％の腫瘍体積（ＴＶ）縮小の頻度についてもマウスをモニタリングした。３０％のＴＶ縮小は、カイ二乗検定を用いてＰ＜０．０５を統計的に有意であると見なした。体重測定および治療関連副作用の臨床兆候を頻繁に観察することにより、治療の認容性を評価した。
【００９７】
ＪＩＭＴ−１腫瘍は、一旦確立されると、トラスツズマブ治療に対して完全に耐性を示し、ビヒクル対照動物と同様の速度で増殖した。対照的に、単独で、またはトラスツズマブ（２０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与を週２回×５）と組み合わせて、１日１回のスケジュールで経口投与された８０ｍｇ／ｋｇの用量のＥＸＥＬ−７６４７は、腫瘍増殖を防止した（図９）。
実施例１１  ＥＸＥＬ−７６４７はＨｅｒ２、ＥＧＦＲを標的とし、Ｍｅｔの活性化を間接的に阻害する
【００９８】
最近の研究により、トラスツズマブは、Ｈｅｒ２のリン酸化を活性化する一方で、同時にその内部移行および分解を増加させることが示されている。一貫して、トラスツズマブによる治療は、ＪＩＭＴ−１細胞における全ＥＲＢＢ２レベルの有意な下方制御を引き起こす（図１０Ａ、右パネル）。他のＥＲＢＢファミリー小分子阻害剤と同様に、ＥＸＥＬ−７６４７は、これらの細胞におけるＥＲＢＢ２の全体的なレベルに影響を及ぼさなかったことから、受容体の代謝回転は、薬物の抗増殖性の品質を説明するものではないことが示唆される。ＨＣＣ１９５４において、恐らくは、これらの細胞における受容体の極めて高い発現レベルに起因して、いずれの治療を用いてもＥＲＢＢ２のレベルに対する影響は観察されなかった。トラスツズマブ治療後に両方の細胞株においてＥＲＢＢ２のリン酸化が上昇し、ＥＸＥＬ−７６４７を含む小分子阻害剤によって阻害された（図１０Ｂ）。
【００９９】
ＥＧＦＲの活性化についても同様の結果が得られた。トラスツズマブも小分子も、調べた細胞株のいずれにおいても受容体の全体的なレベルを変化させなかったが、ＥＧＦＲのリン酸化の活性化に対する顕著な影響が観察された。ここでも同様に、ＨＣＣ１９５４は、ＪＩＭＴ−１細胞よりもはるかに高いレベルで受容体を発現し、トラスツズマブによる治療がＥＧＦＲのリン酸化にほとんど影響を及ぼさなかったのに対し、ラパチニブ、エルロチニブ、およびＥＸＥＬ−７６４７は、ＥＧＦＲの活性を同程度まで阻害した（Ｔｙｒ１０６８のリン酸化によってモニタリングされた）。上記結果に基づいて、我々は、ＥＲＢＢ２もしくはＥＧＦＲ活性の阻害、または受容体の代謝回転の影響のいずれも、ＥＸＥＬ−７６４７の抗増殖活性を完全に説明することはできないと結論付けた。
【０１００】
チロシン部位１２３４および１２３５でリン酸化された高レベルの活性Ｍｅｔも、ＨＣＣ１９５４には観察されたが（図１０Ｄ）、ＪＩＭＴ−１細胞には観察されなかった（データは図示せず）。Ｍｅｔ受容体チロシンキナーゼの異常は活性化が、トラスツズマブ耐性と関連付けられている。Ｍｅｔは分子の直接的な標的ではないが、ＥＸＥＬ−７６４７は、ＨＣＣ１９５４細胞におけるＭｅｔの活性化を効率的に阻害した（図１０Ｄ）。直接的なＭｅｔ阻害活性を有しないラパチニブで同様のレベルの阻害が観察されたため、これらの細胞におけるＭｅｔの阻害は、受容体のヘテロオリゴマー形成に起因し得る。
実施例１２  ＥＸＥＬ−７６４７は複数のキナーゼを効果的に標的とする
【０１０１】
ＥＸＥＬ−７６４７の活性を、選択的ＳＲＣ阻害剤（ＡＺＤ０５３０、サラカチニブ）と比較した。ＳＲＣを阻害するそれらの能力を比較した時、ＡＺＤ０５３０は、より強力な用量依存性反応を示した。ＪＩＭＴ−１細胞において、１．０μＭ  ＡＺＤ０５３０による処理はＳｒｃ活性を抑制し、１．０μＭ  ＥＸＥＬ−７６４７ではいくらかの阻害が観察されたが、同等の阻害にはより高い濃度が必要であった（図１１Ａ）。しかしながら、ＪＩＭＴ−１細胞において、ＳＲＣのより強力な阻害は、直接的に細胞増殖の阻害にはならなかった。細胞増殖アッセイにおいて、ＡＺＤ０５３０は、ＪＩＭＴ−１細胞に対してＥＸＥＬ−７６４７よりも効果が低かった（図１１Ｂ）。ＥＸＥＬ−７６４７の有効性は、複数のキナーゼを阻害するその能力の結果である可能性が高い。
【０１０２】
ＪＩＭＴ−１およびＨＣＣ１９５４細胞は、トラスツズマブ耐性の２つの例であり、トラスツズマブ治療のエスケープ機構を意味する。提示した実験は、ＳＲＣ活性が耐性の発生に重要な役割を果たすことを証明するものである。ＥＸＥＬ−７６４７は、ＥＲＢＢ２陽性のトラスツズマブ不応性乳癌細胞の増殖を効果的に阻害した。
【図１】
2015503568.tif 000011
【図２】
2015503568.tif 000012
【図３】
2015503568.tif 000013
【図４】
2015503568.tif 000014
【図５】
2015503568.tif 000015
【図６】
2015503568.tif 000016
【図７】
2015503568.tif 000017
【図８−１】
2015503568.tif 000018
【図８−２】
2015503568.tif 000019
【図９】
2015503568.tif 000020
【図１０−１】
2015503568.tif 000021
【図１０−２】
2015503568.tif 000022
【図１１】
2015503568.tif 000023
【国際調査報告】
2015503568.tif 000024
2015503568.tif 000025