(57)【要約】  本発明は、感染性および非感染性の腹膜合併症、たとえば、腹膜炎、腹膜の傷害、損傷および不具合、バリア機能障害、ならびに中皮細胞剥離の予防に使用するための、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）−３活性、特に（ＧＳＫ）−３β活性を阻害する化合物を含む、腹膜透析液に関する。
2015506930.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染性および非感染性の腹膜合併症、たとえば、腹膜炎、腹膜の傷害、損傷および不具合、バリア機能障害、ならびに中皮細胞剥離の予防に使用するための、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）−３活性、特に（ＧＳＫ）−３β活性を阻害する化合物を含む、腹膜透析液。
【請求項２】
炭水化物ベースの透析液およびアミノ酸ベースの透析液からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の腹膜透析液。
【請求項３】
腹膜透析液のｐＨ値が、７．３以下、好ましくは７．０以下、最も好ましくは６．０以下であることを特徴とする、請求項１または２に記載の腹膜透析液。
【請求項４】
イコデキストリンをベースとすることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の腹膜透析液。
【請求項５】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）−３活性、特に（ＧＳＫ）−３β活性を阻害する化合物を含む、イコデキストリンをベースとする腹膜透析液。
【請求項６】
腹膜透析液を用いた治療により引き起こされる、感染性および非感染性の腹膜合併症、たとえば、腹膜炎、腹膜の傷害、損傷および不具合、バリア機能障害、ならびに中皮細胞剥離の予防に使用するための、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）−３活性、特に（ＧＳＫ）−３β活性を阻害する化合物。
【請求項７】
腹膜透析治療の過程で腹膜透析液とともに投与されることを特徴とする、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
腹膜透析液が、炭水化物ベースの透析液およびアミノ酸ベースの透析液からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６または７に記載の化合物。
【請求項９】
腹膜透析液のｐＨ値が、７．３以下、好ましくは７．０以下、最も好ましくは６．０以下であることを特徴とする、請求項６から８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
腹膜透析液が、イコデキストリンをベースとすることを特徴とする、請求項６から９のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）−３活性を阻害する化合物が、リチウム、チデグルシブ、ＮＰ−１０３、ＧＳＫ−３β阻害剤Ｉ（ＴＤＺＤ−８、４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＩＩ（２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（１−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール）、ＧＳＫ−３阻害剤ＩＶ（ＳＢ−２１６７６３、３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、ＧＳＫ−３阻害剤ＩＸ（ＢＩＯ、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＶＩ（２−クロロ−１−（４，５−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＶＩＩ（２，４’−ジブロモアセトフェノン）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＶＩＩＩ（ＡＲ  ＡＯ１４４１８、Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）尿素）、ＧＳＫ−３阻害剤Ｘ（ＢＩＯ−アセトキシム、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＩ（３−（１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオン、７ＡＩＰＭ）、ＧＳＫ−３阻害剤ＸＩＩＩ（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−（２−フェニルキナゾリン−４−イル）アミン）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＩＩ（ＴＷＳ１１９、３−［［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシフェノールジトリフルオロアセテート）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＶＩＩＩ（２−（クロロ−４−（４−チオフェン−２−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン）、ＧＳＫ−３β阻害剤Ｘ（ＢＩＯ−アセトキシム、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＩ（３−（１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオン、７ＡＩＰＭ）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＩＸ（ＩＭ−１２、Ｃ22Ｈ20ＦＮ3Ｏ2、インドリルマレイミド誘導体）、ＧＳＫ−３阻害剤ＸＶＩ（６−（２−（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ）エチル−アミノ）−ニコチノニトリル、ＣＨＩＲ９９０２１）、ＧＳＫ−３阻害剤ＸＶＩＩ（５−ベンジルアミノ−３−オキソ−２，３−ジヒドロ−１，２，４−チアジアゾール、ＴＤＺＤ−２０）、ＧＳＫ−３阻害剤ＸＸＩＩ、化合物Ａ（６−メチル−Ｎ−［３−［［３−（１−メチルエトキシ）プロピル］カルバモイル］−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリジン−３−カルボキサミド）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＸＩＩＩ、３Ｆ８（５−エチル−７，８−ジメトキシ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］−イソキノリン−１，３−（２Ｈ）−ジオン）、ＧＳＫ−３βペプチド阻害剤（Ｌ８０３、Ｈ−ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ2）、ＧＳＫ−３βペプチド阻害剤（Ｌ８０３−ｍｔｓ��Ｍｙｒ−Ｎ−ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ2）、ＧＦ−１０９２０３Ｘ（２−［１−（３−ジメチルアミノプロピル）インドール−３−イル］−３−（インドール−３−イル）マレイミド）ならびにこれらの薬学的に許容される塩および混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれかに記載の腹膜透析液または化合物。
【請求項１２】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）−３活性を阻害する化合物が、リチウム塩、特に塩化リチウムまたは炭酸リチウムであることを特徴とする、請求項１１に記載の腹膜透析液または化合物。
【請求項１３】
透析液中のリチウム塩の濃度が、１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは２ｍＭ〜５ｍＭであることを特徴とする、請求項１２に記載の腹膜透析液または化合物。
【請求項１４】
腹膜透析液を用いた治療により引き起こされる、感染性および非感染性の腹膜合併症、たとえば、腹膜炎、腹膜の傷害、損傷および不具合、バリア機能障害、ならびに中皮細胞剥離を予防するための方法であって、前記治療のために用いられる腹膜透析液が、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）−３活性、特に（ＧＳＫ）−３β活性を阻害する化合物を含有する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腹膜透析液（以下、「ＰＤＦ」とも称する）に関する。
【背景技術】
【０００２】
腹膜透析（ＰＤ）は、安全で費用効率の高い腎代替療法であり、血液透析と比較して、より良好な生活の質も提供する。残念なことに、ＰＤ治療では多くの場合、腹膜の組織学的変化および腹膜の完全性の喪失に通常関連して、膜の限外濾過能力が次第に低下する（１）。
【０００３】
現在、３分の２を超える患者は、療法を受けて最初の２年の間に、ＰＤに関係する感染性または非感染性の合併症（たとえば、腹膜炎、腹膜機能低下、または技術的不具合（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ））を患う。
【０００４】
ＰＤには、異なる種類の液が利用可能である。これらの液間の違いは、ＰＤ液中の浸透圧物質のタイプ、その濃度、および緩衝剤のタイプ、およびｐＨ値である。
【０００５】
臨床実務においてすべてのＰＤ液の約８０％にいまだ相当する標準的な液は、その浸透圧物質として、非生理的な高濃度のグルコースを含有する。腹膜の病理学的変化は主に、低ｐＨ値でもある高浸透の高グルコース濃度により生じる（２）。より複雑で慢性的な傷害は、ＰＤ液の加熱滅菌の間に形成される、グルコース分解産物（ＧＤＰ）により誘導される（３）。新規でより生体適合性のグルコースベースのＰＤ液は、より多くのチャンバーのシステム（ｍｏｒｅ−ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）の使用に起因して、通常ｐＨおよび低ＧＤＰ含量を有するが、これらの液は、非常に高価であるため、その臨床使用は、グローバルな状況においていまだ制限されている。
【０００６】
代替の非グルコースベースのＰＤ液、たとえば、イコデキストリンまたはアミノ酸ベースのＰＤ液も市販されているが、その使用は、１日につき１回の交換に制限され、その限外濾過能力は、グルコースベースの溶液のものほど良好ではない。さらに、それらはより低いｐＨ値も有し、腹膜における好ましくない細胞変化を促進する。
【０００７】
したがって、ＰＤ液の毒性を低減するための戦略の探求は、いまだ実験および臨床腎臓病学において実在する分野であり、極めて大きな医学的および社会経済的重要性を有する。
【０００８】
いくつかの研究において、薬理学的方式またはプラスミド媒介性方式のいずれによるＨＳＰの上方調節も、中皮細胞をＰＤ液の毒性の特徴から保護したことから、ＨＳＰは実験的ＰＤにおける中皮細胞生存に対して有意な影響を有することが以前に実証されている（１２、１３、１４）。
【０００９】
しかしながら、興味深いことに、標準的なグルコースベースのＰＤ液とのインキュベーションは、中皮細胞におけるＨＳＰ発現の下方調節を生じ、それは細胞防御機構の弱体化を引き起こす。
【００１０】
ＷＯ２００８／１０６７０２は、
−  グルタミン、好ましくはＬ−グルタミン、
−  グルタミン、Ｌ−グルタミンを遊離形で放出し得るジペプチドであって、好ましくはグルタミニル−グリシン、グリシニル−グルタミン、グルタミニル−アラニン、アラニル−グルタミンからなる群から選択されるジペプチド
−  ２から７個のグルタミン、好ましくはＬ−グルタミン残基からなるオリゴペプチド、および
−  これらの混合物
からなる群から選択される化合物を含有する、炭水化物ベースの腹膜透析液を開示している。
【００１１】
感染性および非感染性の腹膜合併症、たとえば、腹膜炎、腹膜の傷害、損傷および不具合、バリア機能障害、ならびに中皮細胞剥離の発生を、予防するまたは少なくとも阻害することができる腹膜透析液が、いまだ必要とされている。そのような感染性および非感染性の腹膜合併症を予防することによって、ＰＤ治療を受けている患者における技術的不具合を阻害することができる。用語「技術的不具合」は、当業者に周知であり、腹膜透析を打ち切り、血液透析等の代替の腎代替療法へ切り替える必要性を意味する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の目的は、そのような感染性および非感染性の腹膜合併症の発生を、予防するまたは阻害することができる腹膜透析液を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一態様では、本発明は、感染性および非感染性の腹膜合併症、たとえば、腹膜炎、腹膜の傷害、損傷および不具合、バリア機能障害、ならびに中皮細胞剥離の予防に使用するための、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）−３活性、特に（ＧＳＫ）−３β活性を阻害する化合物を含む、腹膜透析液に関する。
【００１４】
さらなる一態様では、本発明は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）−３活性、特に（ＧＳＫ）−３β活性を阻害する化合物を含む、イコデキストリンをベースとする腹膜透析液に関する。
【００１５】
なおさらなる一態様では、本発明は、感染性および非感染性の腹膜合併症、たとえば、腹膜炎、腹膜の傷害、損傷および不具合、バリア機能障害、ならびに中皮細胞剥離の予防に使用するための、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）−３活性、特に（ＧＳＫ）−３β活性を阻害する化合物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】異なる浸透圧物質および毒性の特性を有する異なる市販のＰＤ液で処理された中皮細胞におけるｐ−ＧＳＫ−３β発現を示す図である。
【図２】異なる浸透圧物質および毒性の特性を有する異なる市販のＰＤ液で処理された中皮細胞におけるＬＤＨ放出を示す図である。
【図３】対照細胞と比較した％で表す、ニュートラルレッド取り込みにより評価した細胞生存率を示す図である。
【図４】ルシフェラーゼアッセイにより評価した熱ショック因子−１活性を示す図である。
【図５】ウエスタンブロットにより評価した熱ショックタンパク質−７２（ＨＳＰ−７２）発現を示す図である。
【図６】上清中へのＬＤＨ放出を示す図である。
【図７】ルシフェラーゼアッセイにより評価した熱ショック因子（ＨＳＦ−１）翻訳活性を示す図である。
【図８】ウエスタンブロットにより評価した熱ショックタンパク質−７２（ＨＳＰ−７２）発現を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）は、セリン−スレオニンプロテインキナーゼである。ＧＳＫ−３β自体は、異なる上流のキナーゼによるセリン−９残基におけるリン酸化により調節および阻害され、そのキナーゼの中で、Ａｋｔならびに血清およびグルココルチコイド調節キナーゼ−１（ＳＧＫ−１）がより注目を集めている（４）。ＧＳＫ−３βは当初、異なるレベルのグルコースおよびＧＤＰに反応し、それによってグリコーゲン合成を調節する鍵酵素として同定された（５、６）。しかしながら、その後の研究により、ＧＳＫ−３βは、全体的な細胞生存、細胞周期の進行、および遊走において中心的役割を有することが実証された。
【００１８】
ＧＳＫ−３βについてはほぼ３０年前に記載されたが、潜在的な薬物標的としてのそれに対する関心は、ＧＳＫ−３βがいくつかの生理学的および病理学的プロセスに関与する多面的キナーゼであると発見された今世紀の初頭になって、目立ってきたばかりである。研究により、選択的低分子阻害剤によるまたはリチウムを用いたＧＳＫ−３β阻害は、様々な疾患モデルにおいて保護特性を有することが報告された。ＧＳＫ−３β阻害は、ＩＩ型糖尿病におけるインスリン抵抗性を改善すること（２３、２４）、アルツハイマー病等の神経障害において有益な効果を有すること（２５）、ならびに心肥大および心虚血を低減すること（２６）が証明された。
【００１９】
多くのＧＳＫ−３βの標的は、転写因子（ＨＳＦ−１、β−カテニン、Ｃ−Ｊｕｎ、ＣＲＥＢ）であり、ストレス反応の変容、アポトーシスの増加、および神経伝達の変化をもたらす。ＧＳＫ−３βはまた、細胞骨格要素を調節することもでき（７、８）、それは完全に、ＧＳＫ−３βを、細胞の運命において極めて大きな役割を有する細胞シグナル伝達の中心的メディエーターにするものである。
【００２０】
ＧＳＫ−３βの主要な標的の１つは、細胞保護性熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）発現の鍵となる誘導因子である、熱ショック因子−１（ＨＳＦ−１）である（９、１０）。ストレス条件下で、ＨＳＦ−１は、過剰リン酸化、核への転座、ＨＳエレメント（ＨＳＥ）の結合を包含する多段階方式で活性化され、その後それぞれの遺伝子の転写が起こる。ＨＳＦ−１はＧＳＫ−３βによりリン酸化され、それによって阻害され（１１）、ＨＳＰレベルの低減をもたらす。ＧＳＫ−３βは、セリン−３０３残基においてＨＳＦ−１をリン酸化し、そのＤＮＡに対する結合およびＨＳＦ−１依存性の転写を負に調節し、それらはＨＳＰ−７２産生の抑制をもたらし（２１）、一方で、ＧＳＫ−３β阻害は、細胞防御の改善に寄与する熱ショック応答を増加させる。
【００２１】
ＧＳＫ−３βは、グルコースおよびＧＤＰにより強力に調節される（１５）ことから、本発明の発明者らは、それは、ＰＤに関連する細胞シグナル伝達における関係する分子プレーヤーである可能性があると考えた。しかしながら、ＧＳＫ−３βとＰＤとの直接的関連については、まだ記載されていない。
【００２２】
抗生存（ａｎｔｉ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）ＧＳＫ−３βの活性（ＰＤ液曝露により媒介される可能性がある）の増加は、ＰＤの間に、ＨＳＰ転写の鍵となる調節因子である生存促進（ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）ＨＳＦ−１を阻害すると仮定される。したがって、ＧＳＫ−３β活性を遮断することは、ＨＳＦ−１の活性化の増強、ひいてはＨＳＰ発現の上昇および細胞毒性の低下を生じる可能性がある。
【００２３】
今回、ＧＳＫ−３阻害、特にＧＳＫ−３β阻害は、ＰＤ液で処理された細胞における中皮細胞の傷害および細胞死率を減少させることが見出された。中皮細胞保護と並行して、ＨＳＦ−１活性およびＨＳＰ−７２発現の上昇が見られた。
【００２４】
この効果は、炭水化物ベースの透析液およびアミノ酸ベースの透析液からなる群から選択されるＰＤ液で特に顕著である。その効果は、７．３以下、好ましくは７．０以下、最も好ましくは６．０以下のｐＨ値を有する炭水化物ベースの腹膜透析液でさらに顕著である。
【００２５】
炭水化物ベースの腹膜透析液は、とりわけグルコースまたはイコデキストリンをベースとするものである。最も好ましくは、腹膜透析液は、イコデキストリンをベースとする。
【００２６】
したがって、本発明の特に好ましい一実施形態は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）−３活性、特に（ＧＳＫ）−３β活性を阻害する化合物を含む、イコデキストリンをベースとする腹膜透析液である。
【００２７】
上述のように、本発明のさらなる一態様は、腹膜透析液を用いた治療により引き起こされる、感染性および非感染性の腹膜合併症、たとえば、腹膜炎、腹膜の傷害、損傷および不具合、バリア機能障害、ならびに中皮細胞剥離の予防に使用するための、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）−３活性、特に（ＧＳＫ）−３β活性を阻害する化合物に関する。
【００２８】
化合物は、好ましくは腹膜透析治療の過程で腹膜透析液とともに投与される。ＰＤ液は、好ましくは上で既に論じたＰＤ液から選択される。
【００２９】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）−３活性、特に（ＧＳＫ）−３β活性を阻害する化合物は、好ましくはリチウム、チデグルシブ（ｔｉｄｅｇｌｕｓｉｂ）、ＮＰ−１０３、ＧＳＫ−３β阻害剤Ｉ（ＴＤＺＤ−８、４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＩＩ（２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（１−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール）、ＧＳＫ−３阻害剤ＩＶ（ＳＢ−２１６７６３、３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、ＧＳＫ−３阻害剤ＩＸ（ＢＩＯ、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＶＩ（２−クロロ−１−（４，５−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＶＩＩ（２，４’−ジブロモアセトフェノン）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＶＩＩＩ（ＡＲ  ＡＯ１４４１８、Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）尿素）、ＧＳＫ−３阻害剤Ｘ（ＢＩＯ−アセトキシム、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＩ（３−（１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオン、７ＡＩＰＭ）、ＧＳＫ−３阻害剤ＸＩＩＩ（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−（２−フェニルキナゾリン−４−イル）アミン）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＩＩ（ＴＷＳ１１９、３−［［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシフェノールジトリフルオロアセテート）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＶＩＩＩ（２−（クロロ−４−（４−チオフェン−２−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン）、ＧＳＫ−３β阻害剤Ｘ（ＢＩＯ−アセトキシム、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＩ（３−（１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオン、７ＡＩＰＭ）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＩＸ（ＩＭ−１２、Ｃ22Ｈ20ＦＮ3Ｏ2、インドリルマレイミド誘導体）、ＧＳＫ−３阻害剤ＸＶＩ（６−（２−（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ）エチル−アミノ）−ニコチノニトリル、ＣＨＩＲ９９０２１）、ＧＳＫ−３阻害剤ＸＶＩＩ（５−ベンジルアミノ−３−オキソ−２，３−ジヒドロ−１，２，４−チアジアゾール、ＴＤＺＤ−２０）、ＧＳＫ−３阻害剤ＸＸＩＩ、化合物Ａ（６−メチル−Ｎ−［３−［［３−（１−メチルエトキシ）プロピル］カルバモイル］−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリジン−３−カルボキサミド）、ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＸＩＩＩ、３Ｆ８（５−エチル−７，８−ジメトキシ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］−イソキノリン−１，３−（２Ｈ）−ジオン）、ＧＳＫ−３βペプチド阻害剤（Ｌ８０３、Ｈ−ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ2）、ＧＳＫ−３βペプチド阻害剤（Ｌ８０３−ｍｔｓ、Ｍｙｒ−Ｎ−ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ2）、ＧＦ−１０９２０３Ｘ（２−［１−（３−ジメチルアミノプロピル）インドール−３−イル］−３−（インドール−３−イル）マレイミド）ならびにこれらの薬学的に許容される塩および混合物からなる群から選択される。
【００３０】
好ましい一実施形態では、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）−３活性を阻害する化合物は、リチウム塩、特に塩化リチウムまたは炭酸リチウムである。透析液中のリチウム塩の濃度は、好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭ、最も好ましくは２ｍＭ〜５ｍＭである。
【００３１】
リチウムは、マグネシウムに対する競合によりＧＳＫ−３βを阻害する、周知のＧＳＫ−３β阻害剤である（２７）。リチウムは、双極性気分障害の治療のために１９５０年代から使用されているが、当時はその具体的な作用機序は知られていなかった。１９９６年に、リチウムは、ＧＳＫ−３βの強力な阻害剤であることが発見され、これが、リチウムの知られており利用されている双極性障害における気分安定効果の基礎機構の１つであり得るという証拠が増えつつある（１６、１７、１８、２２）。気分障害に加えて、リチウムは今、筋萎縮性側索硬化症の治療について、およびドナー幹細胞移植後の腸管移植片対宿主病の治療についてフェーズＩＩ臨床試験中である。
【００３２】
リチウムによるＧＳＫ−３β阻害の下流の作用がＨＳＰに直接関与するかどうかに関しては、はるかに知られていない。しかしながら、近年、保護的なリチウムの効果は、虚血性脳損傷等の実験モデルにおけるＨＳＰレベルの改善と関連することが実証され（３０、３１）、リチウムの神経保護効果もまた、誘導されたＨＳＦ−１活性に直接的に起因することが示唆された（３２、３３）。
【００３３】
リチウムは、連続携行式ＰＤを受けている患者の双極性症状を治療するために、臨床状況においてグルコースベースのＰＤ液に添加されているが、この適用様式は当時、日常的投与としては導入されなかった（２８）。この研究では、リチウムを、Ｄｉａｎｅａｌ（登録商標）２．５％溶液に、２Ｌバッグ中０．９ｍＭの最終用量で与え、溶液を１日に３回取り替えることによって、連続的なリチウム曝露を得た。
【００３４】
後に、実験的ラットＰＤモデルにおいて、炭酸リチウムをグルコースベースのＰＤ液とともに投与し、急性限外濾過率（ａｃｕｔｅ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）に対するその効果を調査したが、結果は、リチウムが限外濾過率を減少させるという反対の効果を実証した（２９）。この研究では、５ｍＭ  Ｌｉが適用された。
【００３５】
ＧＳＫ−３β阻害は、代替の特異的薬理学的阻害剤によっても同様に（ＧＳＫ−３またはＧＳＫ−３β阻害剤）達成することができる。いくつかの阻害剤が市販で入手可能である。これらの薬剤の一部は、現在、特別な状態の療法について臨床調査下にあるが、それらのいずれも、ＰＤ溶液においてまたはＰＤが引き起こす腹膜機能の下落の治療のためには、まだ投与されていない。
【００３６】
特異的ＧＳＫ−３阻害剤の中で、チデグルシブ（（Ｚｅｎｔｙｌｏｒ）、非ＡＴＰ競合阻害剤）は、既に臨床使用が認可されている唯一のものである。Ｚｅｎｔｙｌｏｒは、進行性核上まひの治療について２０１０年にＦＤＡから認可を受け、アルツハイマー病の療法についてフェーズＩＩ試験中である。他の特異的阻害剤は、上で挙げたものである。
【００３７】
リチウムまたはリチウム塩以外のＧＳＫ−３阻害剤の場合、それぞれの阻害剤のＰＤ液中への好適な投与量は、当業者が容易に決定することができる。
【実施例】
【００３８】
方法
細胞培養
ヒトＭｅｔ−５ａ細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。すべての細胞は、Ｌ−グルタミン（０．１ｇ／Ｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＭ１９９培養培地で培養し、５％ＣＯ2を含有する加湿空気インキュベーター中、３７℃で増殖させた。
【００３９】
標準化学物質は、別段の記述がない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。Ｆａｌｃｏｎ（商標）組織培養プラスチック（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を、すべての細胞培養手順に使用した。
【００４０】
ＰＤＦ曝露
ＰＤＦとのインキュベーションには、Ｂａｘｔｅｒ  ＡＧ、Ｖｉｅｎｎａ、オーストリア製の、グルコースベースの低ｐＨ（５．５）３．８６％液（Ｄｉａｎｅａｌ  ＰＤ４溶液）、イコデキストリンベースの低ｐＨ（５．５）液（Ｅｘｔｒａｎｅａｌ）、アミノ酸ベースの液（ｐＨ６．７）（Ｎｕｔｒｉｎｅａｌ）、グルコースベースの中性ｐＨ乳酸塩／重炭酸塩緩衝液（Ｐｈｙｓｉｏｎｅａｌ）を使用した。グルコースベースの乳酸塩緩衝中性ｐＨ溶液（Ｂａｌａｎｃｅ）は、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ、オーストリアから入手した。
【００４１】
対照溶液は、ウシ胎仔血清を含まない、Ｌ−グルタミン（０．１ｇ／Ｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補充したＭ１９９培養培地であった。
【００４２】
ＰＤＦ曝露モデル：１２ウェルプレート上のコンフルエントな培養物を、示されている時間（３０分または１時間）、ＰＤ液の溶液に曝露した、または並行して対照培地中で保持した。
【００４３】
ＨＳＦ−１活性アッセイについては、細胞を、曝露時間の直後に収集して溶解し、一方、ＬＤＨの測定およびＨＳＰ−７２、ｐ−ＧＳＫ−３βウエスタンブロット分析については、細胞を、１６時間、１０％ＦＢＳを含有する通常の培養培地とのインキュベーションにより回復させた。
【００４４】
ＬｉＣｌ処理
塩化リチウム（ＬｉＣｌ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入し、示されている用量で適用した。
【００４５】
ＬＤＨ放出
ＬＤＨ分析については、上清の２００μＬのアリコートを、記載された実験設定の後に取り出し、−２０℃で保持して４８時間以内に分析した。測定は、Ｓｉｇｍａ  ＴＯＸ−７  ＬＤＨ  Ｋｉｔを用いて、製造業者の指示に従い、２連で実施した。ＬＤＨ流出は、タンパク質含量に対して正規化した。
【００４６】
ニュートラルレッド取り込み
ニュートラルレッド取り込みにより細胞生存率を評価するため、細胞を、９６ウェルプレートに播種し、前に記載された異なる処理プロトコールに曝露した。ニュートラルレッド取り込みを、標準試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用して、製造業者のプロトコールに従い測定した。
【００４７】
ルシフェラーゼアッセイ
熱ショック因子−１（ＨＳＦ−１）の特異的結合を決定するため、熱ショックエレメント［５’ＣＴＧＧＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＡ３’］を含有する市販のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ（ＬＲ００３８、Ｐａｎｏｍｉｃｓ、イタリア）、ならびに空の対照ベクターを、ＭｅＴ−５ａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間前に、ＭＣを９６ウェル細胞培養プレート上に播種し、トランスフェクションの日に、ほぼ８０〜９０％のコンフルエンスに到達させた。トランスフェクションの前に、１ウェルにつき、０．１５μｌのＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）トランスフェクション試薬および０．１μｌのＨＳＥレポーターベクターまたは対照ベクターを、ＦＣＳを含まない５μｌの通常の成長培地でそれぞれ希釈し、５分間インキュベートした。溶液を、３０分間混合インキュベートした。この混合物の１０μｌを各ウェルに添加し、加湿雰囲気中、５％ＣＯ2および３７℃で２４時間インキュベートした。実験的曝露を前に記載された通りに行い、ルシフェラーゼ酵素のタンパク質合成を容易にするために、細胞を６時間回復させた。細胞を、市販の緩衝液（Ｅ１５３１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して洗浄および溶解した。細胞溶解物を、白色平底マイクロプレート（Ｎｕｎｃ）に移した。ルシフェラーゼ試薬（Ｅ１５００、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、自動ピペットを使用して３秒間隔で添加し、得られたシグナルを、ルミノメータープレートリーダー（Ｆｌｘ８００、ＢｉｏＴｅｋ）を使用して２分後に測定した。
【００４８】
ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロッティングについては、タンパク質含量をブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏrａｄ、Ｖｉｅｎｎａ、オーストリア）により決定し、等量のタンパク質サンプル（２μｇ／レーン）を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒｅ  ＩＩユニットを使用する標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離する。次いで、サイズ分画したタンパク質を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒｅ  ＩＩ  Ｎｏｖａｂｌｏｔユニットで半乾燥移動によりＰＶＤＦ膜に移す。膜を、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）中５％ドライミルクでブロッキングする。膜を、それぞれの一次抗体（ＨＳＰ−７２、ｐ−ＧＳＫ−３β）と１６時間インキュベートする。検出は、ペルオキシダーゼ結合二次抗体（抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ、いずれもＤａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）とのインキュベーション、およびＥＣＬウエスタンブロッティング分析システム（Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ、ＮＥＮ−Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用する増強化学発光（ＥＣＬ）により遂行する。
【００４９】
データ分析
すべての統計分析は、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ  １１．０ソフトウェア（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＧｍｂＨ、Ｅｒｋｒａｔｈ、ドイツ）を使用して実施した。異なる群からの値は、必要に応じてｔ検定またはＡＮＯＶＡを使用して比較した。ＡＮＯＶＡの場合、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定としてテューキーのＨＳＤを使用した。＜０．０５のＰ値を、有意であるとみなした。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する。
【００５０】
結果
従来のＰＤ液とのインキュベーションは、中皮細胞の傷害および死を誘導する
グルコースベースの低ｐＨ乳酸塩緩衝腹膜透析液（ＰＤＦ、Ｄｉａｎｅａｌ）とのおよび低ｐＨのイコデキストリンベースのＰＤＦ（Ｅｘｔｒａｎｅａｌ）中での中皮細胞のインキュベーションは、光学顕微鏡法および生体細胞−死細胞（ｖｉｔａｌ−ｄｅａｄ）染色により実証される細胞の収縮、剥離、および部分的に断片化に反映される、重大な細胞傷害を生じた（データ示さず）。
【００５１】
これと並行して、高ＬＤＨ放出（データ示さず）、細胞生存率の有意な低減、および高い死細胞率が見られた。
【００５２】
ＰＤ液とのインキュベーションは、活性化されたＧＳＫ−３βのレベルを増加させる
ＰＤＦインキュベーションは、免疫蛍光染色により（データ示さず）およびウエスタンブロッティングにより（図１）分析した不活性なＳｅｒ−９リン酸化ＧＳＫ−３β（ｐ−ＧＳＫ−３β）のレベルを減少させたが、総ＧＳＫ−３βのレベルは変化しないままであり（図１）、したがって、対照細胞と比較して、キナーゼ活性なＧＳＫ−３βの正味レベルの上昇をもたらした。
【００５３】
細胞発現および特にｐ−ＧＳＫ−３βの局在を、免疫蛍光染色により分析した。異なるＰＤ液とのインキュベーション後に、全体的なｐ−ＧＳＫ−３βの発現の低下が、とりわけグルコースベースの低ｐＨのＰＤＦおよびイコデキストリンベースの液で処理された細胞において存在し、それと並行して、核の周りに著しい凝縮が見られた（データ示さず）。しかしながら、その他の処理群（乳酸塩緩衝ＰＤ液、乳酸塩／重炭酸塩緩衝ＰＤ液、およびアミノ酸ベースのＰＤ液）でも、対照細胞と比較した減少および凝縮が観察された。
【００５４】
異なる市販のＰＤ液のＳｅｒ−９  ｐ−ＧＳＫ−３βに対する影響は、低ｐＨのイコデキストリンベースのＰＤ液（Ｅｘｔｒａｎｅａｌ）が、グルコースベースの低ｐＨ溶液と同様の効果、すなわちｐ−ＧＳＫ−３βの発現の有意な低下を有することを示した。その効果は、通常ｐＨのグルコースベースの（乳酸塩または乳酸塩／重炭酸塩緩衝、それぞれＢａｌａｎｃｅおよびＰｈｙｓｉｏｎｅａｌ）ＰＤ液および中程度の酸性ｐＨ（ｐＨ６．７）を有するアミノ酸ベースのＰＤ液（Ｎｕｔｒｉｎｅａｌ）ではそれほど顕著ではない（図１）。これらの結果は、グルコースおよびＧＤＰについての以前の観察（１９、２０）と一致している。これらの研究は、ＧＳＫ−３β活性を、高グルコースは減少させる（１９）が、ＧＤＰの最終産物は上方調節する（２０）ことを報告した。
【００５５】
図１の説明：異なる浸透圧物質および毒性の特性を有する異なる市販のＰＤ液で処理された中皮細胞におけるｐ−ＧＳＫ−３β発現。対照細胞は、通常の細胞培養培地で処理し、ＰＤＦ処理細胞は、高ＧＤＰ含量を有するグルコースベースの低ｐＨのＰＤ液（ＰＤＦ、Ｄｉａｎｅａｌ）、イコデキストリンベースのＰＤ液（Ｅｘｔｒａｎｅａｌ）、乳酸塩緩衝低ＧＤＰ、ｐＨ７．４（Ｂａｌａｎｃｅ）、乳酸塩／重炭酸塩緩衝低ＧＤＰ、ｐＨ７．４（Ｐｈｙｓｉｏｎｅａｌ）、アミノ酸ベースの（Ｎｕｔｒｉｎｅａｌ）ＰＤ液で処理した。（１時間曝露、回復なし）。*Ｐ＜０．０１対対照。
【００５６】
リチウムはＧＳＫ−３βを阻害し、ＰＤ液インキュベーション後の中皮細胞における細胞の傷害および死の低減をもたらす
グルコースベースの低ｐＨ高ＧＤＰ含有ＰＤ液および低ｐＨのイコデキストリンベースのＰＤ液は、対照と比較して、著しいＬＤＨ上昇を引き起こし、それと並行して、細胞生存率の有意な低減が見られた（図２）。グルコースベースの通常ｐＨのＰＤ液およびアミノ酸ベースのＰＤ液は、より少ない有意なＬＤＨ放出を引き起こし（図２）、それは、有意な細胞死を伴わなかった（データ示さず）。
【００５７】
これらのＰＤ液曝露系において、１０ｍＭ  ＬｉＣｌの添加によるＧＳＫ−３β活性の阻害は、ＬＤＨ放出の減衰に反映されるように、すべての観察したＰＤ液での処理後の細胞傷害を低減した（図２）。最も目立った保護は、低ｐＨのグルコースベースの溶液およびイコデキストリンベースの溶液とのインキュベーション後に観察された（図２）。
【００５８】
したがって、これらの曝露系におけるＬｉＣｌの保護効果を、生細胞−死細胞（ｌｉｖｅ−ｄｅａｄ）染色およびニュートラルレッド取り込みによる生細胞の測定を使用してさらに調査した。ＬｉＣｌでの処理は、低ｐＨのグルコースベースのＰＤ液またはイコデキストリンベースのＰＤ液のいずれかとのインキュベーション後に、細胞構造の保存（データ示さず）、死細胞率の低減（データ示さず）、および生細胞の数の増加（図３）を生じた。
【００５９】
図２の説明：異なる浸透圧物質および毒性の特性を有する異なる市販のＰＤ液で処理された中皮細胞におけるＬＤＨ放出。対照細胞は、通常の細胞培養培地で処理し、ＰＤＦ処理細胞は、高ＧＤＰ含量を有するグルコースベースの低ｐＨのＰＤ液（Ｄｉａｎｅａｌ）、イコデキストリンベースのＰＤ液（Ｅｘｔｒａｎｅａｌ）、乳酸塩緩衝低ＧＤＰ、ｐＨ７．４（Ｂａｌａｎｃｅ）、乳酸塩／重炭酸塩緩衝低ＧＤＰ、ｐＨ７．４（Ｐｈｙｓｉｏｎｅａｌ）ＰＤ液、アミノ酸ベースの（Ｎｕｔｒｉｎｅａｌ）ＰＤ液で処理した。ＬｉＣｌは、１０ｍＭの用量で適用した。＃Ｐ＜０．０５対対照、*Ｐ＜０．０１対ＬｉＣｌ処理なし。（１時間曝露、１６時間回復）
【００６０】
図３の説明：対照細胞と比較した％で表す、ニュートラルレッド取り込みにより評価した細胞生存率。細胞は、ＰＤＦ（高ＧＤＰ含量を有するグルコースベースの低ｐＨのＰＤ液（Ｄｉａｎｅａｌ））または低ｐＨを有するイコデキストリンベースのＰＤ液（Ｅｘｔｒａｎｅａｌ）のいずれかで処理した。ＬｉＣｌは、１０ｍＭの用量で適用した。＃Ｐ＜０．０１対対照、*Ｐ＜０．０１対ＬｉＣｌ処理なし。（１時間曝露、１６時間回復）。対照細胞は、通常の細胞培養培地で処理した。
【００６１】
ＬｉＣｌは、ＨＳＦ−１活性の上昇をもたらす
ルシフェラーゼアッセイは、ＬｉＣｌ処理が、対照細胞におけるＨＳＦ−１翻訳活性を有意に増加させ、グルコースベースの低ｐＨ高ＧＤＰ含有ＰＤ液および低ｐＨのイコデキストリンベースのＰＤ液とのインキュベーション後いずれもあることを示した（図４）。
【００６２】
図４の説明：ルシフェラーゼアッセイによる熱ショック因子−１活性。対照細胞は、通常の細胞培養培地で処理し、ＰＤＦ処理細胞は、高ＧＤＰ含量を有するグルコースベースの低ｐＨのＰＤ液（Ｄｉａｎｅａｌ）、低ｐＨを有するイコデキストリンベースのＰＤ液（Ｅｘｔｒａｎｅａｌ）で処理した。ＬｉＣｌは、１０ｍＭの用量で適用した。（３０分曝露、６時間回復）、それぞれ、＃Ｐ＜０．０１対対照、*Ｐ＜０．０１対ＬｉＣｌ処理なし。
【００６３】
ＬｉＣｌ処理は、ＨＳＰ−７２発現の上昇を生じる
ＨＳＰ−７２を、ＬｉＣｌ投与ありまたはなしで、高ＧＤＰ含量を有するグルコースベースの低ｐＨのＰＤ液またはイコデキストリンベースのＰＤ液で処理された細胞において、３０分または１時間のインキュベーション後に評価した。
【００６４】
ＨＳＰ−７２発現は、対照細胞と比較して、グルコースベースの低ｐＨ高ＧＤＰ含有液との３０分のインキュベーション後にはわずかに増加し、１時間のインキュベーション後には有意に減少した（図５）。ＨＳＰ−７２の発現は、対照と比較して、イコデキストリンベースのＰＤ液との３０分のインキュベーション後には増加したが、１時間のインキュベーション後には変化しなかった（図５）。ＬｉＣｌでの処理は、それぞれの無処理細胞と比較して、各インキュベーション状況において、ＨＳＰ−７２のレベルを有意に増加させた。
【００６５】
図５の説明：ウエスタンブロットにより評価した熱ショックタンパク質−７２（ＨＳＰ−７２）発現。対照細胞は、通常の細胞培養培地で処理し、ＰＤＦ処理細胞は、高ＧＤＰ含量を有するグルコースベースの低ｐＨのＰＤ液（Ｄｉａｎｅａｌ）、低ｐＨを有するイコデキストリンベースのＰＤ液（Ｅｘｔｒａｎｅａｌ）で処理した。ＬｉＣｌは、１０ｍＭの用量で適用した。（３０分曝露−左図または１時間曝露−右図、１６時間回復）。それぞれ、*Ｐ＜０．０５対対照、％Ｐ＜０．００１対対照、＆Ｐ＜０．０５対ＬｉＣｌ処理なし。
【００６６】
ＬｉＣｌ投与の用量曲線分析
リチウムがどの濃度において中皮細胞傷害を効果的に緩和するかを調べるために、低ｐＨのグルコースベースの（ＰＤＦ）液またはイコデキストリンベースの液のいずれかとのインキュベーションの間に、用量曲線を分析した。１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、および１０ｍＭの用量のＬｉＣｌについて調べた。
【００６７】
低ｐＨのグルコースベースの（ＰＤＦ）液において、１ｍＭ〜５ｍＭの用量のＬｉＣｌは、上清中へのＬＤＨの放出を変容させなかった（図６）が、以前に検出された通り、１０ｍＭ  ＬｉＣｌは、対照と比較して、ＬＤＨ放出を有意に低減した（図６）。イコデキストリンベースの液とのインキュベーションの間には、用量依存性のＬＤＨ応答曲線が存在した：１ｍＭ  ＬｉＣｌは有意に変化しなかったが、２ｍＭ  ＬｉＣｌは既にＬＤＨレベルを減少させ、減少は、５ｍＭおよび１０ｍＭ  ＬｉＣｌを投与したとき、さらに有意であった（図６）。
【００６８】
図６の説明：上清中へのＬＤＨ放出。対照細胞は、通常の細胞培養培地で処理し、ＰＤＦ処理細胞は、高ＧＤＰ含量を有するグルコースベースの低ｐＨのＰＤ液（Ｄｉａｎｅａｌ）、低ｐＨを有するイコデキストリンベースのＰＤ液（Ｅｘｔｒａｎｅａｌ）で処理した。ＬｉＣｌは、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、または１０ｍＭの用量で適用した。（３０分曝露、６時間回復）。それぞれ、＃Ｐ＜０．００１対対照、*Ｐ＜０．０５対ＬｉＣｌ処理なし。
【００６９】
ルシフェラーゼアッセイにより評価したＨＳＦ−１活性は、それぞれの対照細胞と比較して、低ｐＨのグルコースベースのＰＤＦまたはイコデキストリンベースのＰＤＦのいずれかとインキュベートした細胞において、ＨＳＦ−１活性の用量依存性の上方調節が存在したことを示した（図７）。
【００７０】
図７の説明：ルシフェラーゼアッセイにより評価した熱ショック因子（ＨＳＦ−１）翻訳活性。対照細胞は、通常の細胞培養培地で処理し、ＰＤＦ処理細胞は、高ＧＤＰ含量を有するグルコースベースの低ｐＨのＰＤ液（Ｄｉａｎｅａｌ）、低ｐＨを有するイコデキストリンベースのＰＤ液（Ｅｘｔｒａｎｅａｌ）で処理した。ＬｉＣｌは、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、または１０ｍＭの用量で適用した。（３０分曝露、６時間回復）。それぞれ、＃Ｐ＜０．０１対対照、*Ｐ＜０．０１対ＬｉＣｌ処理なし。
【００７１】
グルコースベースの低ｐＨのＰＤＦとインキュベートした細胞において、ＨＳＰ−７２発現は、無処理細胞と比較して、２ｍＭまたは１０ｍＭ  ＬｉＣｌのいずれかの投与後にのみ増加した（図８）。一方で、イコデキストリンベースのＰＤ液とのインキュベーション後には、すべての適用したＬｉＣｌ用量が、ＨＳＰ−７２タンパク質発現を増加させた（図８）。
【００７２】
図８の説明：ウエスタンブロットにより評価した熱ショックタンパク質−７２（ＨＳＰ−７２）発現。対照細胞は、通常の細胞培養培地で処理し、ＰＤＦ処理細胞は、高ＧＤＰ含量を有するグルコースベースの低ｐＨのＰＤ液（Ｄｉａｎｅａｌ）、低ｐＨを有するイコデキストリンベースのＰＤ液（Ｅｘｔｒａｎｅａｌ）で処理した。ＬｉＣｌは、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、または１０ｍＭの用量で適用した。（３０分曝露、１６時間回復）。それぞれ、＃Ｐ＜０．０５対対照、*Ｐ＜０．０５対ＬｉＣｌ処理なし。
【００７３】
概要：
本研究において、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）は、ＬＤＨ放出を減少させ、細胞死率を低減し、細胞生存率を改善した。その効果は、グルコースベースの低ｐＨのＰＤ液およびイコデキストリンベースのＰＤ液、すなわちＧＳＫ−３β活性化に対して最も有意な効果を有する市販のＰＤ液で処理された中皮細胞で最も顕著である。
【００７４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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