(57)【要約】  本発明は、コバラミン非依存性メチオニンシンターゼＭｅｔＥの活性が減弱された、メチオニンの発酵生産のために最適化された組換え微生物に関する。本発明はまた、発酵によりメチオニンを生産するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチオニンの発酵生産のために最適化された組換え微生物であって、該微生物においてコバラミン非依存性メチオニンシンターゼＭｅｔＥの活性が減弱されている、微生物。
【請求項２】
コバラミン非依存性メチオニンシンターゼＭｅｔＥが、発現が減弱されたｍｅｔＥ遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
ｍｅｔＥ遺伝子の少なくとも一部が欠失された、請求項１または２に記載の微生物。
【請求項４】
ＭｅｔＥタンパク質が突然変異ｍｅｔＥ遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の微生物。
【請求項５】
ｍｅｔＥ遺伝子の突然変異が、４１７位〜４２９位の間に含まれる塩基の欠失である、請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
以下の遺伝子：ｐｔｓＧ、ｐｙｃ、ｐｎｔＡＢ、ｃｙｓＰ、ｃｙｓＵ、ｃｙｓＷ、ｃｙｓＡ、ｃｙｓＭ、ｃｙｓＪ、ｃｙｓＩ、ｃｙｓＨ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｇｃｖＰ、ｌｐｄ、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣ、ｃｙｓＥ、ｍｅｔＦ、ｍｅｔＨ、ｔｈｒＡ、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／もしくはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ対立遺伝子（ｍｅｔＡ＊）、ｔｈｒＡ、またはトレオニンに対するフィードバック阻害が低減された酵素をコードするｔｈｒＡ対立遺伝子（ｔｈｒＡ＊）の少なくとも１つの発現が増大されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項７】
少なくとも１つの遺伝子が誘導プロモーターの制御下にある、請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
以下の遺伝子：ｍｅｔＪ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｐｕｒＵ、ｙｂｄＬまたはｙｎｃＡの少なくとも１つの発現が減弱されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項９】
ａ．遺伝子ｍｅｔＥが欠失され、
ｂ．遺伝子ｍｅｔＡ＊、ｍｅｔＨ、ｃｙｓＰＵＷＡＭ、ｃｙｓＪＩＨ、ｇｃｖＴＨＰ、ｍｅｔＦ、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣ、ｃｙｓＥ、ｔｈｒＡ＊およびｐｙｃの発現が増大され、かつ
ｃ．遺伝子ｍｅｔＪ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｐｕｒＵおよびｙｎｃＡの発現が減弱されている、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１０】
前記微生物が腸内細菌(Enterobacteriaceae)科またはコリネバクテリウム(Corynebacteriaceae)科細菌由来のものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１１】
前記微生物が大腸菌(Escherichia coli)である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１２】
ａ．請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え微生物を、発酵性炭素源と、硫黄源とを含んでなる適当な培養培地中で培養し、かつ
ｂ．該培養培地からメチオニンまたはその誘導体を回収する工程
を含んでなる、メチオニンの発酵生産のための方法。
【請求項１３】
前記組換え微生物の増殖が、前記培養培地において、１つまたは複数の無機基質、特に、リン酸塩および／またはカリウムの制限または欠乏を受ける、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチオニンの生産のための組換え微生物、および該組換え微生物を炭素源と硫黄源とを含んでなる適当な培養培地中で培養することにより、メチオニンを生産する方法に関する。該微生物は、コバラミン非依存性メチオニンシンターゼの活性を減弱させることによってメチオニン／炭素源収率が増加するように改変されている。特に、該組換え微生物では遺伝子ｍｅｔＥが欠失している。
【背景技術】
【０００２】
システイン、ホモシステイン、メチオニン、またはＳ−アデノシルメチオニンなどの硫黄含有化合物は細胞代謝にとって重要であり、食品または飼料添加物および医薬品として使用されるべく工業的に製造される。特に、動物が合成することのできない必須アミノ酸であるメチオニンは、多くの身体機能において重要な役割を果たす。タンパク質生合成におけるその役割とは別に、メチオニンは、メチル基転移ならびにセレニウムおよび亜鉛のバイオアベイラビリティに関与している。メチオニンはまた、アレルギーやリウマチ熱のような障害の治療法として直接用いられる。しかしながら、生産されるメチオニンの大部分は動物飼料に添加されている。
【０００３】
ＢＳＥおよび鳥インフルエンザの結果として動物由来タンパク質の使用が減少するに伴い、純粋なメチオニンに対する需要が高まっている。通常、Ｄ，Ｌ−メチオニンは、アクロレイン、メチルメルカプタン、およびシアン化水素から化学的に生産される。しかしながら、ラセミ混合物は、純粋なＬ−メチオニンほど良好には機能しない（Saunderson, 1985）。また、純粋なＬ−メチオニンは、ラセミ体メチオニンから、例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニンのアシラーゼ処理によって生産することができるが、これにより生産コストは劇的に増加する。従って、環境問題に関連して純粋なＬ−メチオニンに対する需要が高まりつつあることから、微生物によるメチオニンの生産は魅力的な展望を持つ。
【０００４】
微生物からの化学製品の生産の最適化には、一般に、生合成経路に関与するタンパク質の過剰発現、生合成経路の抑制に関与するタンパク質の減弱、または望ましくない副産物の産生に関与するタンパク質の減弱が必要である。微生物におけるＬ−メチオニン生産の最適化に向けたこれら総てのアプローチはこれまでに記載されている（例えば、特許または特許出願、米国特許第７，７９０，４２４号、米国特許第７，６１１，８７３号、ＷＯ２００２／０１０２０９号、ＷＯ２００５／０５９０９３号およびＷＯ２００６／００８０９７号参照）、しかしながら、微生物からのＬ−メチオニンの工業生産にはさらなる改善が必要である。
【０００５】
大腸菌(Escherichia coli)、およびコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)のような他の微生物では、２つの異なる酵素がメチオニンのデノボ生合成の最終段階を触媒する(Foster et al., 1961; Gonzalez et al., 1992)。コバラミン依存性メチオニンシンターゼ（ＭｅｔＨ、ＥＣ  ２．１．１．１３）は、ｍｅｔＨ遺伝子によってコードされ、活性に必要な補欠分子族を含む。コバラミン非依存性メチオニンシンターゼ（ＭｅｔＥ、ＥＣ  ２．１．１．１４）は、ｍｅｔＥ遺伝子によってコードされ、ビタミン由来の補欠分子族の要件は知られていない。
【０００６】
数多くの特許出願は、メチオニン生合成の最終段階を促進するための酵素ＭｅｔＨおよびＭｅｔＥの過剰生産に関するものであり、例えば、
・ＢＡＳＦ社のＷＯ２００７／０１２０７８号およびＷＯ２００７／１３５１８８号には、遺伝子ｍｅｔＨおよび／またはｍｅｔＥの過剰発現をもたらす遺伝子変化が記載されており、
・ＥＶＯＮＩＫ社のＷＯ２００９／１４４２７０号には、Ｃｏｂ（Ｉ）アラミン依存性ＭｅｔＨ再活性化系の量および／または活性の増加を示す微生物を用いた、メチオニンを生産するための方法が記載されている。
【０００７】
本発明者らは、驚くべきことに、意外にも、コバラミン非依存性メチオニンシンターゼ（ＭｅｔＥ）の量および／または活性の減弱によってメチオニンの生産の向上がもたらされることを見出した。メチオニン生合成経路に属する酵素の１つの活性の喪失がメチオニン生産に有益であると提示されたのはこれが初めてである。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、コバラミン非依存性メチオニンシンターゼＭｅｔＥの活性が減弱されている、メチオニンの生産のために最適化された組換え微生物に関する。好ましくは、ＭｅｔＥ酵素をコードする遺伝子ｍｅｔＥは欠失または突然変異している。該組換え微生物は、
・以下の遺伝子の少なくとも１つの発現の増加：ｐｔｓＧ、ｐｙｃ、ｐｎｔＡＢ、ｃｙｓＰ、ｃｙｓＵ、ｃｙｓＷ、ｃｙｓＡ、ｃｙｓＭ、ｃｙｓＪ、ｃｙｓＩ、ｃｙｓＨ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｇｃｖＰ、ｌｐｄ、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣ、ｃｙｓＥ、ｍｅｔＦ、ｍｅｔＨ、ｔｈｒＡ、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／もしくはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ対立遺伝子（ｍｅｔＡ＊）、ｔｈｒＡ、またはトレオニンに対するフィードバック阻害が低減された酵素をコードするｔｈｒＡ対立遺伝子（ｔｈｒＡ＊）、かつ／あるいは
・以下の遺伝子の１つの発現の減弱：ｍｅｔＪ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｐｕｒＵ、ｙｂｄＬまたはｙｎｃＡ
などの他の遺伝子修飾を含んでなってもよい。
【０００９】
特定の実施形態では、本発明は、ａ）遺伝子ｍｅｔＥが欠失され、かつｂ）遺伝子ｍｅｔＡ＊、ｍｅｔＨ、ｃｙｓＰＵＷＡＭ、ｃｙｓＪＩＨ、ｇｃｖＴＨＰ、ｍｅｔＦ、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣ、ｃｙｓＥ、ｔｈｒＡ＊およびｐｙｃの発現が増大され、かつｃ）遺伝子ｍｅｔＪ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｐｕｒＵおよびｙｎｃＡの発現が減弱されている微生物に関する。
【００１０】
本発明はまた、発酵プロセスによるメチオニンまたはメチオニン誘導体の生産のための方法に関し、その方法は、ａ）本発明による組換え微生物を、グルコースを含有する発酵性炭素源と硫黄源とを含んでなる適当な培養培地中で培養すること、およびｂ）該培養培地からメチオニンまたはメチオニン誘導体を回収することを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特に例示した方法に限定されず、当然のことながら、変更し得るものと理解されるべきである。また、本明細書において用いられる用語は単に本発明の特定の実施形態を記載することを目的とするにすぎず、限定されるものではなく、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものと理解されるべきである。
【００１２】
本明細書において引用される総ての刊行物、特許および特許出願は、前掲または後掲を問わず、引用することにより本明細書の一部とされる。しかしながら、本明細書において記述される刊行物は、それらの刊行物の中で報告されておりかつ本発明に関連して使用される可能性があるプロトコール、試薬およびベクターの記載および開示を目的として引用される。本明細書中のいかなる記載も、本発明が先行発明に基づいてかかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきでない。
【００１３】
さらに、本発明の実施には、特に断りのない限り、当技術分野の技術の範囲内である通常の微生物学的技術および分子生物学的技術を用いる。そのような技術は当業者によく知られており、文献において十分に説明されている。例えば、Prescott et al. (1999); およびSambrook et al., (1989) (2001)参照。
【００１４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、「１つの(a)」、「１つの(an)」および「その(the)」という単数形は、特に明示されていない限り、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。従って、例えば、「一微生物」という場合には、そのような微生物の複数が包含され、「一内在性遺伝子」という場合には、１つまたは複数の内在性遺伝子を表すなどである。特に定義されない限り、本明細書において用いられる総ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の熟練者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の材料および方法を使用して、本発明の実施または試験を行うことができるが、好ましい材料および方法を次に記載する。
【００１５】
以下の特許請求の範囲および本発明の一貫した記載では、明示された言語または必然的な関連性から文脈上他の意味に解釈すべき場合を除いて、「含んでなる(comprise)」、「含む(contain、involveもしくはinclude)」という用語または変化形（comprises、comprising、containing、involved、includes、includingなど）は、包含の意味で、すなわち、述べられた特徴の存在を具体的に示すだけでなく、本発明の様々な実施形態におけるさらなる特徴の存在または追加を排除しないように用いられる。
【００１６】
定義
用語「メチオニン」とは、化学式ＨＯ２ＣＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３およびＣＡＳ番号５９−５１−８または特定のＬ−異性体については６３−６８−３を有する硫黄含有必須アミノ酸を表す。
【００１７】
「メチオニンの誘導体」とは、同じ化学骨格を示すが少なくとも１つの化学基に関してメチオニンと異なる、メチオニンの分子類似体を意味する。本発明において、好ましいメチオニン誘導体はＮ−アセチルメチオニン（ＮＡＭ）、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）およびヒドロキシメチオニンである。
【００１８】
本明細書において用語「微生物」とは、人為的に改変されていない細菌、酵母または真菌を意味する。好適には、微生物は腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、バチルス科(Bacillaceae)、ストレプトミセス科(Streptomycetaceae)およびコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)の中から選択される。より好適には、微生物は、エシェリキア属(Escherichia)、クレブシェラ属(Klebsiella)、パンテア属(Pantoea)、サルモネラ菌属(Salmonella)またはコリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種である。いっそうより好適には、微生物は、大腸菌（Escherichia coli)またはコリネバクテリウム・グルタミクム種（Corynebacterium glutamicum)のいずれかである。
【００１９】
本明細書において「組換え微生物」または「遺伝的に改変された微生物」とは、自然界には見られず、かつ自然界に見られるその同等のものと遺伝的に異なる細菌、酵母または真菌を意味する。微生物は、遺伝エレメントの導入または欠失または修飾のいずれかにより改変されるということである。また、微生物は、指示された突然変異誘発と特定の選択圧下での進化の組合せによって新規代謝経路の発生および進化を促すことにより形質転換することもできる（例えば、ＷＯ２００４／０７６６５９号参照）。
【００２０】
外来遺伝子が、宿主微生物におけるそれらの遺伝子の発現を可能にする総てのエレメントとともに微生物に導入されるならば、微生物は、外来遺伝子を発現するように改変し得る。外来ＤＮＡでの微生物の改変または「形質転換」は、当業者にとって常法である。
【００２１】
微生物は、内在性遺伝子の発現レベルを調整するように改変し得る。
【００２２】
「内在性遺伝子」とは、野生型株において、いかなる遺伝子修飾の前にも該遺伝子が微生物中に存在していたことを意味する。内在性遺伝子は、内在性調節エレメントに加えて、もしくは内在性調節エレメントの代わりとなるように異種配列を導入することにより、または該遺伝子の１つもしくは複数の追加のコピーを染色体もしくはプラスミドに導入することにより、過剰発現させ得る。内在性遺伝子はまた、それらの発現および／または活性を調節するために改変されていてよい。例えば、遺伝子産物を改変するためにコード配列に突然変異が導入されていてよく、または内在性調節エレメントに加えて、もしくは内在性調節エレメントの代わりとなるように異種配列が導入されていてよい。内在性遺伝子の調節は、遺伝子産物の活性のアップレギュレーションおよび／または増強をもたらし得るし、あるいは、内在性遺伝子産物の活性をダウンレギュレートおよび／または低減し得る。
【００２３】
内在性遺伝子の発現を調整するための別の方法は、遺伝子の内在性プロモーター（例えば、野生型プロモーター）をより強いまたはより弱いプロモーターと交換して、内在性遺伝子の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることである。これらのプロモーターは同種でも異種でもよい。適当なプロモーターを選択することは十分に当業者の能力の範囲内である。
【００２４】
「外来遺伝子」とは、該遺伝子が、当業者によく知られている手段によって、微生物に導入され、微生物においてこの遺伝子が自然に存在しないことを意味する。外来遺伝子は、宿主染色体に組み込まれ得るし、またはプラスミドもしくはベクターによって染色体外で発現され得る。複製起点および細胞内でのコピー数が異なる様々なプラスミドは当技術分野で周知である。これらの遺伝子は異種でも同種でもよい。
【００２５】
「異種遺伝子」とは、該遺伝子が、それを発現するレシピエント微生物とは異なる微生物種由来であることを意味する。異種遺伝子とは、微生物において自然に存在しない遺伝子を意味する。
【００２６】
本願において、総ての遺伝子は、大腸菌(E.coli)由来の共通する名称を用いて参照される。それらのヌクレオチド配列は、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geneまたはhttp://www.ebi.ac.uk/embl/上で入手可能である。
【００２７】
当業者ならば、ＧｅｎＢａｎｋに示されている既知の遺伝子に関する参照番号を用いて他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳類、植物などにおける等価な遺伝子を決定することができる。この常法は、有利には、コンセンサス配列を使用して行われ、このコンセンサス配列は、他の微生物由来の遺伝子との配列アラインメントを行い、縮重プローブを設計して、他の生物における対応する遺伝子をクローニングすることにより決定することができる。これらの分子生物学の常法は当業者によく知られており、例えば、Sambrook et al, (1989)および(2001)に記載されている。
【００２８】
本明細書において「メチオニン生産の向上」、「メチオニン生産を向上させる」という用語、およびその文法的同義語は、メチオニン／炭素源収率（消費された炭素源のｇ数／ｍｏｌ数当たりの生産されたメチオニンのｇ数／ｍｏｌ数の割合、この割合はパーセントで表すことができる）の増加を意味する。消費された炭素源の量および生産されたメチオニンの量を決定するための方法は当業者によく知られている。組換え微生物では、上記収率は、対応する未改変微生物と比べて高い。
【００２９】
用語「メチオニンの発酵生産のために最適化された微生物」とは、対応する野生型微生物の体内生産と比べてメチオニン生産の向上を示すように進化および／または遺伝的改変を受けた微生物を意味する。メチオニン生産のために「最適化された」上記微生物は当技術分野で周知であり、特に、特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２号、ＷＯ２００７／０７７０４１号およびＷＯ２００９／０４３８０３号に開示されている。
【００３０】
本発明によれば、用語「発酵生産」、「培養」または「発酵」とは、細菌の増殖を表すために用いられる。この増殖は一般に、少なくとも１つの単純炭素源を、必要な場合には、補助基質とともに含有する、使用する微生物に適合した適当な培養培地の入った発酵槽で行われる。
【００３１】
「適当な培養培地」とは、細胞の維持および／または増殖に不可欠または有益な栄養、例えば、炭素源または炭素基質、窒素源、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム；リン源、例えば、リン酸一カリウムまたはリン酸二カリウム；微量元素（例えば、金属塩）、例えば、マグネシウム塩、コバルト塩および／またはマンガン塩；ならびに増殖因子（例えば、アミノ酸およびビタミン）などを含んでなる培地（例えば、滅菌液体培地）を表す。
【００３２】
本発明による用語「炭素源(carbon source)」または「炭素基質」または「炭素源(source of carbon)」とは、微生物の正常な増殖を助けるために当業者が使用可能ないずれの炭素源も表し、単糖類（グルコース、ガラクトース、キシロース、フルクトースまたはラクトースなど）、オリゴ糖類、二糖類（スクロース、セロビオースまたはマルトースなど）、糖蜜、デンプンまたはその誘導体、ヘミセルロースおよびそれらの組合せが含まれる。特に好ましい単純炭素源はグルコースである。別の好ましい単純炭素源はスクロースである。炭素源は再生可能な供給原料に由来するものであってよい。再生可能な供給原料は、短期のうちに、目的生成物へのその変換を可能とするに十分な量で再生され得る、特定の工業プロセスに必要とされる原料と定義される。処理したまたは未処理の植物バイオマスは、興味深い再生可能な炭素源である。
【００３３】
本発明による用語「硫黄源」とは、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化水素、ジチオン酸塩、亜ジチオン酸塩、亜硫酸塩、メチルメルカプタン、硫化ジメチルおよび他の末端メチル化硫化物または種々の供給源の組合せを意味する。より好適には、培養培地中の硫黄源は硫酸塩またはチオ硫酸塩またはそれらの混合物である。
【００３４】
用語「窒素源」とは、アンモニウム塩またはアンモニアガスのいずれかに相当する。窒素源は、アンモニウムまたはアンモニアの形で供給される。
【００３５】
用語「減弱」または「減弱された発現」とは、本明細書において、遺伝子または酵素の発現が、改変されていない微生物と比べて低減または抑制されていることを意味する。酵素の発現の低減または抑制は、該酵素をコードする遺伝子の発現の減弱により得られる。
【００３６】
遺伝子の減弱は、当業者に知られている手段および方法によって達成することができる。一般に、遺伝子発現の減弱は、
・コード領域もしくはプロモーター領域を突然変異させること、または
・該遺伝子発現に必要なプロモーター領域の総てもしくは一部を欠失させること、または
・相同組換えにより該遺伝子のコード領域を欠失させること、または
・外部エレメントをコード領域もしくはプロモーター領域へ挿入すること、または
・弱いプロモーターの制御下で該遺伝子を発現させること
によって達成することができる。
【００３７】
当業者は、種々の強度を示す様々なプロモーターを知っており、弱い遺伝子発現のためにどのプロモーターを使用すべきかを知っている
【００３８】
酵素の「活性」という用語は、「機能」という用語と互換的に用いられ、本発明に関連しては、酵素により触媒される反応を表す。当業者は、該酵素の酵素活性を測定する方法を知っている。特に、タンパク質ＭｅｔＥの活性の測定については、実施例５を参照。
【００３９】
酵素の「活性の減弱」または「活性の低減」という用語は、アミノ酸配列における突然変異により得られる該タンパク質の比触媒活性の低減および／またはヌクレオチド配列の突然変異もしくは遺伝子のコード領域の欠失により得られる、細胞中の該タンパク質の濃度の低下のいずれかを意味する。
【００４０】
酵素の「活性の増大」または「活性の増加」という用語は、例えば、該酵素をコードする遺伝子を過剰発現させることにより得られる、該酵素の比触媒活性の増加、および／または細胞中の該酵素の量／アベイラビリティーの増加のいずれかを表す。
【００４１】
「発現の増加」、「発現の増大」または「過剰発現」という用語、およびその文法的同義語は、本書において互換的に用いられ、同様の意味を有する。これらの用語は、改変されていない微生物と比べて遺伝子または酵素の発現が増大されることを意味する。酵素の発現の増加は、該酵素をコードする遺伝子の発現を増加させることにより得られる。
【００４２】
遺伝子の発現を増加させるために、当業者は種々の技術を知っている：
・微生物における該遺伝子のコピー数の増加。該遺伝子は染色体上または染色体外にコードされる。該遺伝子が染色体上に位置する場合、当技術分野の専門家に知られている組換え法（遺伝子置換を含む）によって該遺伝子の複数のコピーを染色体上に導入することができる。該遺伝子が染色体外に位置する場合、該遺伝子は、複製起点と、それによる細胞内でのコピー数が異なる種々のタイプのプラスミドによって担持され得る。これらのプラスミドは微生物中に１〜５コピー、または約２０コピー、または最大５００コピーで存在し、プラスミドの性質によって異なる：厳格な複製を行う低コピー数プラスミド（ｐＳＣ１０１、ＲＫ２）、低コピー数プラスミド（ｐＡＣＹＣ、ｐＲＳＦ１０１０）または高コピー数プラスミド（ｐＳＫ  ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ）。
・該遺伝子の高レベル発現を誘導するプロモーターの使用。当業者はどのプロモーターが最も便宜なプロモーターであるかを知っており、例えば、プロモーターＰｔｒｃ、Ｐｔａｃ、Ｐｌａｃ、またはλプロモーターｃＩが広く用いられている。これらのプロモーターは、特定の化合物または、温度もしくは光のような特定の外的条件による「誘導性」であり得る。これらのプロモーターは同種でも異種でもよい。
・該遺伝子の特異的または非特異的転写レプレッサーの活性または発現の減弱。
・対応するメッセンジャーＲＮＡを安定させるエレメント(Carrier and Keasling, 1998)またはタンパク質を安定させるエレメント(例えば、ＧＳＴタグ, GE Healthcare)の使用。
【００４３】
用語「コードする(encoding)」または「コード(coding)」とは、ポリヌクレオチドが、転写および翻訳の機構を通じて、アミノ酸配列を生み出すプロセスを意味する。酵素（単数または複数）をコードする遺伝子（単数または複数）は外来性でも内在性でもよい。
【００４４】
用語「フィードバック感受性」または「フィードバック阻害」とは、細胞内での特定の物質の生産を触媒する１つまたは複数の酵素が、その物質が一定のレベルまで蓄積したときに抑制されるまたはその活性が低下する細胞機構制御を意味する。従って、「フィードバック感受性の低減」または「フィードバック阻害の低減」とは、そのような機構の活性が、改変されていない微生物と比べて低減または抑制されることを意味する。当業者は、この結果を得るために酵素を修飾する方法を知っている。そのような修飾は、特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２号または米国特許第７，６１１，８７３号に記載されている。
【００４５】
本発明は、コバラミン非依存性メチオニンシンターゼＭｅｔＥの活性が減弱された、メチオニンの発酵生産のために最適化された組換え微生物に関する。
【００４６】
当業者は、タンパク質突然変異、遺伝子突然変異または遺伝子発現減弱のような、酵素活性を減弱させるための多くの手段および方法を知っている。タンパク質突然変異は、該酵素の触媒部位に存在する特異的アミノ酸を置き換えること、または追加のアミノ酸を導入すること、またはある特定のアミノ酸を欠失させることによって達成することができる。
【００４７】
本発明の第１の面において、コバラミン非依存性メチオニンシンターゼＭｅｔＥをコードするｍｅｔＥ遺伝子の発現は減弱されている。大腸菌ｍｅｔＥ遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号２０に示す。
【００４８】
遺伝子の減弱は、外来ＤＮＡを遺伝子に導入して、それを不活性化することによりまたは弱いプロモーターもしくは誘導プロモーターの制御下で遺伝子を発現させることにより達成することができる。当業者は、種々の発現強度および／または種々の誘導パラメーターを示す種々様々なプロモーターならびにその発現強度を低減するようにプロモーターを改変する方法を知っており、その方法は、野生型プロモーターを、例えば、そのコンセンサス配列、リボソーム結合部位または開始コドン…において改変することによる。よって、当業者は、ｍｅｔＥの減弱発現を導くプロモーターを選択することができる。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様では、ｍｅｔＥ遺伝子の少なくとも一部は欠失している。好ましくは、この欠失部分は、コード配列の少なくとも１０％、より好ましくは、コード配列の少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％に相当する。より好ましくは、コード配列の少なくとも８０％が欠失している。本発明の特定の実施形態では、ｍｅｔＥ遺伝子は完全に欠失している。当業者は、相同組換えなどの、遺伝子の一部を欠失させるための多くの技術を知っている。
【００５０】
本発明の第２の面では、ｍｅｔＥ遺伝子は、活性の減弱を示す改変タンパク質をコードするように突然変異している。本発明の好ましい実施態様では、遺伝子ｍｅｔＥにおける突然変異は、不活性な末端切断型ＭｅｔＥタンパク質の翻訳を導く。より好ましくは、上記突然変異は、フレームシフト突然変異を導く、配列番号２０にヌクレオチド配列を示している大腸菌遺伝子の４１７番〜４２９番塩基の１３塩基対（ｂｐ）部分の欠失である。その結果として、該タンパク質の翻訳が短くなり（フレームシフトにより停止コドンが導入される）、配列番号２１に示している野生型配列の７５３アミノ酸の代わりに、配列番号２２）に示している１５２アミノ酸の末端切断型タンパク質が生じる。あらゆる微生物種由来のｍｅｔＥ遺伝子への停止コドンの導入を可能にするいかなる同等の突然変異もまた、本発明の一部である。
【００５１】
メチオニン生合成経路の最適化
本発明による組換え微生物は、メチオニンの生産を向上させるために改変される。メチオニン生産に関与する遺伝子は当技術分野で周知であり、メチオニン特異的生合成経路に関与する遺伝子、ならびに前駆体供給経路に関与する遺伝子およびメチオニン消費経路に関与する遺伝子を含んでなる。
【００５２】
メチオニンの効率的生産には、メチオニン特異的経路および複数の前駆体供給経路の最適化が必要である。メチオニン生産株は特に、特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２号、ＷＯ２００７／０７７０４１号およびＷＯ２００９／０４３８０３号に既に記載されている。これらの出願は引用することにより本願の一部とされる。
【００５３】
本発明の特定の実施形態では、前記組換え微生物は、以下に記載するように改変される：以下の遺伝子の少なくとも１つの発現が増大される：ｐｔｓＧ、ｐｙｃ、ｐｎｔＡＢ、ｃｙｓＰ、ｃｙｓＵ、ｃｙｓＷ、ｃｙｓＡ、ｃｙｓＭ、ｃｙｓＪ、ｃｙｓＩ、ｃｙｓＨ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｇｃｖＰ、ｌｐｄ、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣ、ｃｙｓＥ、ｍｅｔＦ、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／もしくはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｔｈｒＡ対立遺伝子（ＭｅｔＡ＊）、ｔｈｒＡ、およびトレオニンに対するフィードバック阻害が低減された酵素をコードするｔｈｒＡ対立遺伝子（ｔｈｒＡ＊）。
・特許出願ＥＰ１１３０５８２９号に記載されているように、ｐｔｓＧは、ＰＴＳ酵素ＩＩＣＢＧｌｃをコードする。
・特許出願ＥＰ１１３０５８２９号に記載されているように、ｐｙｃは、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする。好ましい実施態様は、ｐｙｃ遺伝子は異種であり、インゲン根粒菌(Rhizobium etli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)またはコリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種由来のｐｙｃ遺伝子から選択される。
・特許出願ＷＯ２０１２／０５５７９８号に記載されているように、ｐｎｔＡＢは、膜結合型トランスヒドロゲナーゼのサブユニットをコードする。
・ＷＯ２００７／０７７０４１号およびＷＯ２００９／０４３８０３号に記載されているように、ｃｙｓＰは、ペリプラズム硫酸結合タンパク質をコードする。
・ＷＯ２００７／０７７０４１号およびＷＯ２００９／０４３８０３号に記載されているように、ｃｙｓＵは、硫酸ＡＢＣ輸送体の構成要素をコードする。
・ＷＯ２００７／０７７０４１号およびＷＯ２００９／０４３８０３号に記載されているように、ｃｙｓＷは、膜結合型硫酸輸送タンパク質をコードする。
・ＷＯ２００７／０７７０４１号およびＷＯ２００９／０４３８０３号に記載されているように、ｃｙｓＡは、硫酸パーミアーゼをコードする。
・ＷＯ２００７／０７７０４１号およびＷＯ２００９／０４３８０３号に記載されているように、ｃｙｓＭは、Ｏ−アセチルセリンスルフヒドララーゼ(O-acetyl serine sulfhydralase)をコードする。
・ＷＯ２００７／０７７０４１号およびＷＯ２００９／０４３８０３号に記載されているように、ｃｙｓＩおよびｃｙｓＪは、それぞれ、亜硫酸レダクターゼのαサブユニットおよびβサブユニットをコードする。ｃｙｓＩおよびｃｙｓＪは同時に過剰発現されることが好ましい。
・ＷＯ２００７／０７７０４１号およびＷＯ２００９／０４３８０３号に記載されているように、ｃｙｓＨは、アデニリル硫酸レダクターゼをコードする。
【００５４】
Ｃ１代謝の増加もまた、メチオニン生産の向上をもたらす改変である。Ｃ１代謝の増加は、ＧｃｖＴＨＰ、Ｌｐｄ、ＭｅｔＦまたはＭｅｔＨの中から選択される、Ｃ１代謝に関与する少なくとも１つの酵素の活性の増加に関係している。本発明の好ましい実施形態では、一炭素代謝は、以下の少なくとも１つの発現および／または活性を増大させることにより増加する：
・特許出願ＷＯ２００７／０７７０４１号に記載されている、グリシン開裂複合体をコードするｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｇｃｖＰ、およびｌｐｄ。グリシン開裂複合体（ＧＣＶ）は、グリシンの酸化を触媒し、二酸化炭素、アンモニア、メチレン−ＴＨＦおよび還元型ピリジンヌクレオチドを生成する多酵素複合体である。ＧＣＶ複合体は、４つのタンパク質成分、Ｐ−タンパク質と呼ばれるグリシンデヒドロゲナーゼ（ＧｃｖＰ）、Ｈ−タンパク質と呼ばれるリポイル−ＧｃｖＨ−タンパク質（ＧｃｖＨ）、Ｔ−タンパク質と呼ばれるアミノメチルトランスフェラーゼ（ＧｃｖＴ）、およびＬ−タンパク質と呼ばれるジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＧｃｖＬまたはＬｐｄ）で構成されている。Ｐ−タンパク質は、グリシンからのＣＯ２のピリドキサールリン酸依存性遊離を触媒し、メチルアミン部分を脱離させる。メチルアミン部分は、Ｈ−タンパク質のリポ酸基に移動し、これはＰ−タンパク質と結合した後、グリシンを脱炭酸する。Ｔ−タンパク質は、メチルアミン基からのＮＨ３の放出を触媒し、残るＣ１単位をＴＨＦへ移動させ、メチレン−ＴＨＦを形成する。次に、Ｌタンパク質は、Ｈ−タンパク質のリポ酸成分を酸化し、電子をＮＡＤ＋へ移動させ、ＮＡＤＨを形成する；
・特許出願ＷＯ２００７／０７７０４１号に記載されている、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードするＭｅｔＦ；
・メチルトランスフェラーゼをコードするＭｅｔＨ（Ｂ１２−依存性ホモシステイン−Ｎ５−メチルテトラヒドロ葉酸トランスメチラーゼ）。
【００５５】
また、セリン生合成に関与する以下の遺伝子の少なくとも１つの過剰発現は、副産物であるイソロイシンの生産を減少させる：
・ＷＯ２００７／０７７０４１号およびＷＯ２００９／０４３８０３号に記載されている、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードするｓｅｒＡ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１号およびＷＯ２００９／０４３８０３号に記載されている、ホスホセリンホスファターゼをコードするｓｅｒＢ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１号およびＷＯ２００９／０４３８０３号に記載されている、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードするｓｅｒＣ。
【００５６】
以下の遺伝子の過剰発現は、メチオニンの生産を向上させることが既に示されている：
・ＷＯ２００７／０７７０４１号に記載されているように、ｃｙｓＥは、セリンアシルトランスフェラーゼをコードし、その過剰発現はメチオニン生産の増加を可能にする。
・ｍｅｔＡは、ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼをコードする。対立遺伝子ＭｅｔＡ＊は、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードする。特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２号に記載されている対立遺伝子ＭｅｔＡ＊を使用することが好適である。
・ＷＯ２００５／１１１２０２号に記載されているように、ｔｈｒＡは、アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードし、ｔｈｒＡ＊対立遺伝子は、トレオニンに対するフィードバック阻害が低減された酵素をコードする。
【００５７】
本発明の特定の実施態様では、遺伝子は誘導プロモーターの制御下にあり得る。本発明の好ましい実施態様では、これらの遺伝子の少なくとも１つは温度誘導プロモーターの制御下にある。好ましくは、遺伝子：ｔｈｒＡ、ｃｙｓＥ、ｍｅｔＡの少なくとも１つの発現は、誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にある。より好ましくは、遺伝子ｔｈｒＡ、ｃｙｓＥおよびｍｅｔＡは、誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にある。本発明の好ましい実施態様では、ｔｈｒＡ遺伝子の発現は誘導プロモーターの直接的制御下にあり、ｃｙｓＥ遺伝子の発現はｔｈｒＡ遺伝子の誘導発現の極性効果下にある。本発明の別の好ましい実施態様では、ｔｈｒＡ遺伝子の発現は誘導プロモーターの直接的制御下にあり、遺伝子ｃｙｓＥおよびｍｅｔＡの発現はｔｈｒＡ遺伝子の誘導発現の極性効果下にある。
【００５８】
最も好ましい実施態様では、温度誘導プロモーターはＰＲプロモーターファミリーに属する。誘導プロモーターの制御下に遺伝子を置いているメチオニン生産株は、特許出願ＷＯ２０１１／０７３１２２号に記載されている。
【００５９】
本発明の別の特定の実施態様では、前記微生物はさらに改変されており、以下の遺伝子の少なくとも１つの発現が減弱されている：ｍｅｔＪ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｐｕｒＵ、ｙｂｄＬまたはｙｎｃＡ。
・特許出願ＪＰ２０００／１５７２６７号に示されたように、遺伝子ｍｅｔＪは、メチオニンレギュロンのダウンレギュレーションに関与するレプレッサータンパク質ＭｅｔＪをコードする（ＧｅｎＢａｎｋ  １７９０３７３）。
・遺伝子ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦは、酵素「ピルビン酸キナーゼ」をコードする。ピルビン酸キナーゼの少なくとも一方または両方の発現の減弱は、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の消費を減少させる。ＷＯ２００７／０７７０４１号およびＷＯ２００９／０４３８０３号に記載されているように、ＰＥＰのアベイラビリティーの増加は、アスパラギン酸の重要な前駆体であるオキサロ酢酸（これは次にメチオニンの前駆体となる）の生産を増加させることができる。
・ｐｕｒＵは、ホルミル−ＴＨＦデホルミラーゼ反応を触媒する酵素であるホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼをコードする。デホルミラーゼ活性の減弱は、ホモシステインのメチル化に必要なメチル−ＴＨＦの生産を増加させる。脱ホルミル化によるＣ１代謝産物の欠如により、メチオニンへ変換できないホモシステインの生産増加に至る。ＷＯ２００７／０７７０４１号およびＷＯ２００９／０４３８０３号に記載されているように、ホモシステインは、次に、ホモランチオニンの生産をもたらすＯ−スクシニルホモセリンとホモシステインとの間の反応を触媒し得る酵素シスタチオニンγシンターゼ（ＭｅｔＢ）の基質となり得る。
・特許出願ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０５２９３７号に記載されているように、ｙｂｄＬは、アミノトランスフェラーゼをコードする。
・特許出願ＷＯ２０１０／０２０６８１号に記載されているように、ｙｎｃＡは、Ｎ−アシルトランスフェラーゼをコードする。
【００６０】
本発明のより好ましい実施形態では、コバラミン非依存性メチオニンシンターゼＭｅｔＥの活性が減弱されている組換え微生物による、主要な炭素源としてのグルコースからのメチオニンの発酵生産は、該微生物における上述の改変の組合せによって達成され得る、例えば：
・遺伝子ｍｅｔＪの発現が減弱され、かつ、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ対立遺伝子（ＭｅｔＡ＊）の発現が増大される；
・遺伝子ｍｅｔＪの発現が減弱され、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ対立遺伝子（ＭｅｔＡ＊）の発現が増大され、かつ、トレオニンに対するフィードバック阻害が低減された酵素をコードするｔｈｒＡ対立遺伝子（ｔｈｒＡ＊）の発現が増大される；
・遺伝子ｍｅｔＪの発現が減弱され、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ対立遺伝子（ＭｅｔＡ＊）の発現が増大され、トレオニンに対するフィードバック阻害が低減された酵素をコードするｔｈｒＡ対立遺伝子（ｔｈｒＡ＊）の発現が増大され、かつ、遺伝子ｃｙｓＥの発現が増大される；
・遺伝子ｍｅｔＪの発現が減弱され、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ対立遺伝子（ＭｅｔＡ＊）の発現が増大され、トレオニンに対するフィードバック阻害が低減された酵素をコードするｔｈｒＡ対立遺伝子（ｔｈｒＡ＊）の発現が増大され、遺伝子ｃｙｓＥの発現が増大され、かつ、遺伝子ｍｅｔＦおよび／またはｍｅｔＨの発現が増大される。
【００６１】
本発明の特定の面では、前記組換え微生物は以下の遺伝子修飾を含んでなる：
・遺伝子ｍｅｔＥが欠失され、
・遺伝子ｍｅｔＡ＊、ｍｅｔＨ、ｃｙｓＰＵＷＡＭ、ｃｙｓＪＩＨ、ｇｃｖＴＨＰ、ｍｅｔＦ、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣ、ｃｙｓＥ、ｔｈｒＡ＊およびｐｙｃの発現が増大され、かつ
・遺伝子ｍｅｔＪ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｐｕｒＵおよびｙｎｃＡが減弱される。
【００６２】
本発明の特定の実施態様では、前記微生物は腸内細菌科(Enterobacteriaceae)またはコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)細菌由来のものである。
【００６３】
好適には、前記微生物は大腸菌(Escherichia coli)またはコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)である。
【００６４】
培養条件
本発明はまた、メチオニンの生産方法に関し、その方法は、以下の工程：
・組換え微生物を、発酵性炭素源と硫黄源とを含んでなる適当な培養培地中で培養し、かつ
・該培養培地からメチオニンまたはその誘導体を回収すること
を含む。
【００６５】
当業者は、本発明による微生物に対する培養条件を定義することができる。特に、細菌は２０℃〜５５℃の間、好適には、２５℃〜４０℃の間、より具体的には、Ｃ．グルタミクム(C. glutamicum)では約３０℃、大腸菌(E. coli)では約３７℃の温度で発酵される。
【００６６】
大腸菌(E. coli)については、培養培地は、Ｍ９培地(Anderson, 1946)、Ｍ６３培地(Miller, 1992);またはSchaefer et al., (1999)により定義されているものなどの培地と同一または類似の組成のものであり得る。
【００６７】
Ｃ．グルタミクム(C. glutamicum)については、培養培地は、ＢＭＣＧ培地(Liebl et al., 1989)またはRiedel et al., (2001)により記載されているものなどの培地と同一または類似の組成のものであり得る。
【００６８】
本発明のある実施態様では、培養物は、１つまたは複数の無機基質の制限または欠乏を受ける。それは、微生物の増殖が、供給された無機化学物質の量により支配され、それでもなお弱い増殖が認められる条件を意味する。微生物増殖におけるそのような制限は、特許出願ＷＯ２００９／０４３３７２号に記載されている。本発明の好ましい実施態様では、培養物はリン酸塩の制限を受ける。
【００６９】
「培養培地からメチオニンまたはその誘導体を回収する」という行為は、Ｌ−メチオニンおよび／またはその誘導体の１つ、特に、Ｎ−アセチルメチオニン（ＮＡＭ）およびＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）ならびに有用であり得る他の総ての誘導体を回収する行為を表す。生産された化合物の回収および精製のための方法は、当業者によく知られている（特に、ＷＯ２００５／００７８６２号、ＷＯ２００５／０５９１５５号参照）。
【００７０】
発酵培地中の産物の量は、当技術分野で公知の複数の方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて決定することができる。例えば、培地中に得られたメチオニンの量は、ＯＰＡ／Ｆｍｏｃ誘導体化後にＨＰＬＣにより、標準としてＬ−メチオニン（Fluka、参照番号６４３１９）を用いて測定される。ＮＡＭの量は、屈折率検出器によるＨＰＬＣ(refractometric HPLC)を用い、標準としてＮＡＭ（Sigma、参照番号０１３１０）を用いて決定される。
【実施例】
【００７１】
以下の実施例において本発明をさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、単に例示として示されると理解されるべきである。上の開示およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な手段を変更することなく、本発明の様々な変更を行って、それを様々な使用および条件に適合させることができる。
【００７２】
特に、例では改変大腸菌(Escherichia coli(E.coli))株を示しているが、これらの改変は同じ科の他の微生物でも容易に行うことができる。
【００７３】
大腸菌(Escherichia coli)は、腸内細菌(Enterobacteriaceae)科に属し、この科には、芽胞形成しない、典型的には長さ１〜５μｍのグラム陰性桿菌のメンバーが含まれる。ほとんどのメンバーは鞭毛を有し、鞭毛を用いて動き回るが、いくつかの属は非運動性である。この科の多くのメンバーが、ヒトおよび他の動物の腸内で見られる腸管菌叢の正常な部分であるが、水または土壌中で見られるものや、様々な異なる動植物に寄生するものもある。大腸菌は最も重要なモデル生物の一つであるが、腸内細菌科の他の重要なメンバーとして、クレブシェラ属(Klebsiella)、特に、クレブシエラ・テリゲナ(Klebsiella terrigena)、クレブシエラ・プランティコラ(Klebsiella planticola)またはクレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、およびサルモネラ菌属(Salmonella)も挙げられる。
【００７４】
さらに、複数の特許出願により、メチオニン生産のための最適化は、過度の実験を行うことなく、大腸菌(E. coli)およびコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)で容易に適用することができると指摘されている。
【００７５】
実施例１：プロトコール
下記の実施例に記載するメチオニン生産株を構築するために、複数のプロトコールを用いた。
【００７６】
プロトコール１：相同組換えによる染色体修飾および組換え体の選択（Datsenko, & Wanner, (2000)）。
【００７７】
特定の染色体遺伝子座における対立遺伝子置換または遺伝子挿入は、Datsenko & Wanner (2000)により記載されているように、相同組換えによって行った。Ｆｌｐ認識部位が隣接した、カナマイシン（Ｋｍ）耐性ｋａｎを、ＰＣＲにより、鋳型としてｐＫＤ４プラスミドを用いることで増幅した。得られたＰＣＲ産物を用いて、λＲｅｄ（γ、β、ｅｘｏ）リコンビナーゼを発現するプラスミドｐＫＤ４６を保持するレシピエント大腸菌(E. coli)株を形質転換した。次に、抗生物質耐性形質転換体を選択し、修飾遺伝子座の染色体構造を、表３に記載の適当なプライマーを用いたＰＣＲ解析により確認した。
【００７８】
ｋａｎ耐性遺伝子は、Datsenko & Wanner (2000)により記載されているように、Ｆｌｐリコンビナーゼをコードする遺伝子を有するプラスミドｐＣＰ２０を用いることで除去することができる。ｐＣＰ２０を目的の株に導入し、形質転換体を、アンピシリンを添加したＬＢ上で３０℃で培養した。ｆｌｐ遺伝子を発現させる目的およびカナマイシンカセットを除去する目的で、形質転換体を３７℃で培養した後、単離後、抗生物質感受性クローンを、表３に記載のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより確認した。
【００７９】
プロトコール２：ファージＰ１の形質導入
Ｐ１形質導入により、所与の大腸菌レシピエント株に染色体修飾を移入した。このプロトコールは、（ｉ）耐性関連の染色体修飾を含むドナー株におけるファージ溶解液の調製と、（ｉｉ）このファージ溶解液によるレシピエント株の感染との２段階を含む。
【００８０】
ファージ溶解液の調製
・１０ｍｌのＫｍ ５０μｇ／ｍｌ＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２ ５ｍＭ中に、目的の染色体修飾を有するＭＧ１６５５株の一晩培養物１００μｌを植菌する。
・振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。
・ドナー株ＭＧ１６５５で調製したＰ１ファージ溶解液１００μｌを添加する（約１×１０９ファージ／ｍｌ）。
・細胞が完全に溶解するまで３７℃で３時間振盪する。
・２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・４５００ｇで１０分間遠心分離して細胞残屑を除去する。
・上清を滅菌試験管に移す。
・溶解液を４℃で保存する。
【００８１】
形質導入
・ＬＢ培地中で培養した大腸菌レシピエント株の一晩培養物５ｍｌを１５００ｇで１０分間遠心分離する。
・２．５ｍｌのＭｇＳＯ４ １０ｍＭ、ＣａＣｌ２ ５ｍＭに細胞ペレットを懸濁する。
・１００μｌの細胞に、染色体に修飾を有するＭＧ１６５５株のＰ１ファージ１００μｌ（供試試験管）を感染させ、対照試験管として、Ｐ１ファージを含まない細胞１００μｌと、細胞を含まないＰ１ファージ１００μｌとを感染させる。
・振盪せずに３０℃で３０分間インキュベートする。
・各試験管に１００μｌの１Ｍクエン酸ナトリウムを加え、ボルテックスにかける。
・１ｍＬのＬＢを加える。
・振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。
・７０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。
・ＬＢ＋Ｋｍ ５０μｇ／ｍｌに播種する。
・３７℃で一晩インキュベートする。
【００８２】
【表１】
2015519917.tif 000002
【００８３】
【表２】
2015519917.tif 000003
【００８４】
【表３】
2015519917.tif 000004
2015519917.tif 000005
【００８５】
実施例２：株５、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ０１＊２／ＲＢＳ０８＊１−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ０１−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  Ｐｔｒｃ０１−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ９４−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＲＮ／ＰＲＭ−ＣＩ８５７−ＴＴａｄｃｃａ−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊４−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＲＮ／ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍ（ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７）（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａ）の構築
【００８６】
１．株１
メチオニン生産株１（表１の遺伝子型）は、特許出願ＥＰ１０３０６１６４号に記載されており、これは引用することにより本願の一部とされる。
【００８７】
２．株２の構築
細胞内へのメチレン−テトラヒドロ葉酸プールを増加させるために、ｇｃｖＴＨＰオペロンによってコードされるグリシン開裂複合体を、このオペロンの１コピーをｙｊｂＩ遺伝子座において染色体上に付加することにより過剰生産させた。ｇｃｖＴＨＰのこの付加的コピーを、人工誘導性ｔｒｃプロモーターおよび最適リボソーム結合部位を用いて発現させ、ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍ染色体組込みを得た。
【００８８】
ｙｊｂＩ遺伝子を欠失させ、それをＰｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７領域により置き換えるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットだけでなく追加のＤＮＡを挿入することを可能とする。この目的で、以下のプラスミドを構築した、ｐＵＣ１８−ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍ。
【００８９】
このｐＵＣ１８−ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍプラスミドは、ｐＵＣ１８ベクター(Norrander et al., 1983)から誘導され、Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７領域と結合したカナマイシン耐性カセットを保持し、それらはどちらもｙｊｂＩの上流領域と下流領域の間にクローニングされている。
【００９０】
ｐＵＣ１８−ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍの構築のために、まず、ｐＵＣ１８−ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＳＭＣプラスミドを構築した。このプラスミドは、ｙｊｂＩの上流領域と下流領域を有し、これらの領域の間には、転写ターミネーター（大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子のＴ１、ＴＴ０２と呼称される）および多重クローニング部位（ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＡｐａＩおよびＰａｃＩ制限部位からなり、ＳＭＣと呼称される）が存在する。この最後の領域を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【００９１】
ＹｊｂＩｕｐ−Ｆ（配列番号１）
【化１】
2015519917.tif 000006
この配列は以下の領域を有する。
・ｙｊｂＩ領域の配列（４２４７９８７〜４２４８００９）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（小文字）、
・ＳｆｏＩおよびＫｐｎＩ制限部位および余分な塩基に関する領域（大文字）
【００９２】
ＹｊｂＩｕｐ−Ｒ（配列番号２）
【化２】
2015519917.tif 000007
この配列は以下の領域を有する。
・ｙｊｂＩ領域の配列（４２４８９３１〜４２４８９８０）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（小文字）、
・大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子の転写ターミネーターＴ１(Orosz et al, 1991)に関する領域（太字の大文字）、
・多重クローニング部位のＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位およびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の一部に関する領域（大文字）
【００９３】
ＹｊｂＩｄｏｗｎ−Ｆ（配列番号３）
【化３】
2015519917.tif 000008
この配列は以下の領域を有する。
・ｙｊｂＩ領域の配列（４２５０２８６〜４２５０３３５）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（小文字）、
・大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子の転写ターミネーターＴ１(Orosz et al., 1991)の一部に関する領域（太字の大文字）、
・多重クローニング部位全体に関する領域（大文字）
【００９４】
ＹｊｂＩｄｏｗｎ−Ｒ（配列番号４）
【化４】
2015519917.tif 000009
この配列は以下の領域を有する。
・ｙｊｂＩ領域の配列（４２５１２２４〜４２５１２４９）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（小文字）、
・ＳｆｏＩおよびＫｐｎＩ制限部位および余分な塩基に関する領域（大文字）
【００９５】
第一に、「ｕｐＹｊｂＩ」および「ｄｏｗｎＹｊｂＩ」断片を、それぞれ、オリゴヌクレオチドＹｊｂＩｕｐ−Ｆ／ＹｊｂＩｕｐ−ＲおよびＹｊｂＩｄｏｗｎ−Ｆ／ＹｊｂＩｄｏｗｎ−Ｒを用いて、ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。第二に、「ｕｐＹｊｂＩ−ｄｏｗｎＹｊｂＩ」断片を、ＹｊｂＩｕｐ−Ｆ／ＹｊｂＩｄｏｗｎ−Ｒオリゴヌクレオチドを用いて、「ｕｐＹｊｂＩ」および「ｄｏｗｎＹｊｂＩ」ＰＣＲ断片（大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子の転写ターミネーターＴ１の一部および多重クローニング部位の一部を含むオーバーラッピング領域を有する）から増幅した。「ｕｐＹｊｂＩ−ｄｏｗｎＹｊｂＩ」ＰＣＲ断片を制限酵素ＳｆｏＩで切断し、ｐＵＣ１８ベクターの平滑末端化したＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ｐＵＣ１８−ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＳＭＣプラスミドを得た。
【００９６】
次に、カナマイシン耐性カセットを、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ｐＫＤ４ベクターからＰＣＲ増幅した。
Ｋｍ−Ｆ（配列番号５）
【化５】
2015519917.tif 000010
この配列は以下の領域を有する。
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（小文字）(Datsenko & Wanner, 2000に参照配列、
・ＳｍａＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位および余分な塩基に関する領域（大文字）
【００９７】
Ｋｍ−Ｒ（配列番号６）
【化６】
2015519917.tif 000011
この配列は以下の領域を有する。
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域(小文字)(Datsenko & Wanner, 2000に参照配列
・ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位および余分な塩基に関する領域（大文字）
【００９８】
ＰＣＲ断片を制限酵素ＢｓｔＺ１７ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＵＣ１８−ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＳＭＣプラスミドのＢｓｔＺ１７Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ｐＵＣ１８−ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＳＭＣ：：Ｋｍプラスミドを得た。
【００９９】
最後に、Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７断片を、オリゴヌクレオチドＰｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ＧｃｖＴＨＰ−Ｆ／ＧｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７−Ｒ（下記）を用いて、株１のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片を制限酵素ＡｐａＩおよびＰａｃＩで切断し、ｐＵＣ１８−ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０７−ＳＭＣ：：ＫｍプラスミドのＡｐａＩ／ＰａｃＩ部位にクローニングし、ｐＵＣ１８−ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍプラスミドを得た。
組換えプラスミドをＤＮＡ配列決定法により確認した。
【０１００】
Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ＧｃｖＴＨＰ−Ｆ（配列番号７）
【化７】
2015519917.tif 000012
この配列は以下の領域を有する。
・株１においてｇｃｖＴＨＰオペロンの上流に位置する人工誘導性ｔｒｃプロモーターの一部と相同な領域（小文字）、
・ＳｔｕＩおよびＡｐａＩ制限部位および余分な塩基に関する領域（大文字）。
【０１０１】
ＧｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７−Ｒ（配列番号８）
【化８】
2015519917.tif 000013
この配列は以下の領域を有する。
・ｇｃｖＰ遺伝子の配列（３０４４１９０〜３０４４２１４）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（小文字）、
・ＴＴ０７と呼称される、Ｔ７ｔｅ転写ターミネーター配列(Harrington et al., 2001)に関する領域（太字の大文字）、
・ＰａｃＩ、ＳｔｕＩ制限部位および余分な塩基に関する領域。
【０１０２】
最後に、ｐＵＣ１８−ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：ＫｍプラスミドをＫｐｎＩ制限酵素で切断することによりΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍ断片を得、その断片を、プロトコール１に従って、エレクトロポレーションによりＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６株に導入した。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍ断片の挿入を、オリゴヌクレオチドｙｊｂＩ−ｇｃｖＴＨＰ−ＦおよびｙｊｂＩ−ｇｃｖＴＨＰ−Ｒを用いたＰＣＲ解析により確認した。確認済みの選択株をＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６  ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍと呼称した。
【０１０３】
ｙｊｂＩ−ｇｃｖＴＨＰ−Ｆ（配列番号９）
【化９】
2015519917.tif 000014
この配列は、ｙｊｂＩ領域の配列（４２４７７５４〜４２４７７７４）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１０４】
ｙｊｂＩ−ｇｃｖＴＨＰ−Ｒ（配列番号１０）
【化１０】
2015519917.tif 000015
この配列は、ｙｊｂＩ領域の配列（４２５１４８９〜４２５１５０８）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１０５】
次に、ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍ染色体修飾を、プロトコール２に従って、株１に形質導入した。
【０１０６】
カナマイシン耐性形質導入体を選択し、ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍ染色体修飾の存在を、プライマーｙｊｂＩ−ｇｃｖＴＨＰ−ＦおよびｙｊｂＩ−ｇｃｖＴＨＰ−Ｒを用いたＰＣＲにより確認した。
【０１０７】
得られた株、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ０１＊２／ＲＢＳ０８＊１−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ０１−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  Ｐｔｒｃ０１−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ９４−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＲＮ／ＰＲＭ−ＣＩ８５７−ＴＴａｄｃｃａ−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊４−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＲＮ／ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｙｊｂＩ：：  ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍを株２と呼称した。
【０１０８】
３．株３の構築
株３の構築のために、株２の染色体組込みΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍと結合した耐性カセットを、プロトコール１に従って除去した。
【０１０９】
カナマイシン感受性クローンを選択し、カナマイシンカセットが存在しないことを、プライマーｙｊｂＩ−ｇｃｖＴＨＰ−ＦおよびｙｊｂＩ−ｇｃｖＴＨＰ−Ｒを用いたＰＣＲにより確認した。
【０１１０】
得られた株、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ０１＊２／ＲＢＳ０８＊１−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ０１−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  Ｐｔｒｃ０１−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ９４−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＲＮ／ＰＲＭ−ＣＩ８５７−ＴＴａｄｃｃａ−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊４−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＲＮ／ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｙｊｂＩ：：  ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７を株３と呼称した。
【０１１１】
４．株４の構築
特許出願ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０５２９３７号（これは引用することにより本願の一部とされる）に記載されているプラスミドｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７を株２に導入し、以下の株、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ０１＊２／ＲＢＳ０８＊１−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ０１−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  Ｐｔｒｃ０１−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ９４−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＲＮ／ＰＲＭ−ＣＩ８５７−ＴＴａｄｃｃａ−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊４−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＲＮ／ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍ（ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７）を得、株４と呼称した。
【０１１２】
５．株５の構築
セリン経路への流れを増加させるために、ｓｅｒＣおよびｓｅｒＡ遺伝子を、人工プロモーターおよび最適リボソーム結合部位により、細菌人工染色体ｐＣＣ１ＢＡＣ(Epicentre)を用いて過剰発現させた。この目的で、以下のプラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａを構築した。
【０１１３】
ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａの構築のために、領域「ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２」および「Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａ」をＰＣＲ増幅した。
【０１１４】
「ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２」領域については、最初に、転写ターミネーター（ｒｒｎＢのＴ１、ＴＴ０２と注釈付けされる）、人工プロモーター（Ｐｔｒｃ３０）、最適リボソーム結合部位（ＲＢＳ０１）およびｓｅｒＣ遺伝子の開始点を保持するメガプライマーを、ショートＰＣＲにより、オリゴヌクレオチドＰｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ＦおよびＰｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−Ｒ（下記）を用いて、鋳型を加えずに合成した。次に、「ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２」断片を、ＰＣＲにより、鋳型としての大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡ、合成したメガプライマーおよびｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｒオリゴヌクレオチド（下記）を用いて増幅した。
【０１１５】
Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−Ｆ（配列番号１１）
【化１１】
2015519917.tif 000016
この配列は以下の領域を有する。
・大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子の転写ターミネーターＴ１(Orosz et al.,1991)に関する領域（太字の大文字）、
・人工誘導性ｔｒｃプロモーターと相同な領域（下線の大文字）、
・最適リボソーム結合部位と相同な領域（斜体の大文字）、
・ＮａｒＩ、ＰａｃＩ制限部位および余分な塩基に関する領域（小文字）。
【０１１６】
Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−Ｒ（配列番号１２）
【化１２】
2015519917.tif 000017
この配列は以下の領域を有する。
・人工誘導性ｔｒｃプロモーターと相同な領域（下線の大文字）、
・最適リボソーム結合部位と相同な領域（斜体の大文字）、
・ｓｅｒＣ遺伝子の配列（９５６８７６〜９５６９０４）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（小文字）。
【０１１７】
ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｒ（配列番号１３）
【化１３】
2015519917.tif 000018
この配列は以下の領域を有する。
・２９位に塩基欠失を有するＴ７ｔｅ転写ターミネーター配列（ＴＴ０７＊２と呼称される）(Harrington et al., 2001)に関する領域（太字の大文字）、
・ｓｅｒＣ遺伝子の配列（９５７９４６〜９５７９６４）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（小文字）、
・ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳａｃＩおよびＮｈｅＩ制限部位および余分な塩基に関する領域（大文字）。
【０１１８】
同じように、「Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａ」断片を、ＰＣＲにより、鋳型としての大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡと、オリゴヌクレオチドＰｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＦおよびｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａ−Ｒ（下記）を用いて増幅した。
【０１１９】
Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−Ｆ（配列番号１４）
【化１４】
2015519917.tif 000019
この配列は以下の領域を有する。
・人工誘導性ｔｒｃプロモーターと相同な領域（下線の大文字）、
・最適リボソーム結合部位と相同な領域（斜体の大文字）、
・ｓｅｒＡ遺伝子の配列（３０５６４０８〜３０５６４３２）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（小文字）、
・ＮｈｅＩ制限部位および余分な塩基に関する領域（大文字）。
【０１２０】
ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａ−Ｒ（配列番号１５）
【化１５】
2015519917.tif 000020
・ＴＴａｄｃ転写ターミネーター配列（ｐＳＬＯ１メガプラスミドの１７９８４７〜１７９８０７と相同な、クロストリジウム・アセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)由来ａｄｃ遺伝子の転写ターミネーター）に関する領域（太字の大文字）、
・ｓｅｒＡ遺伝子の配列（３０５５２００〜３０５５２２０）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（小文字）、
・ＡｖｒＩＩ、ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位および余分な塩基に関する領域（大文字）。
【０１２１】
ＰＣＲ断片、「ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２」および「Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａ」をそれぞれ、制限酵素ＮａｒＩ／ＮｈｅＩ、およびＮｈｅＩ／ＳｐｈＩで切断し、どちらもｐＣＣ１ＢＡＣプラスミドのＮａｒＩ／ＳｐｈＩ部位にクローニングし、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａプラスミドを得た。
組換えプラスミドをＤＮＡ配列決定法により確認した。
【０１２２】
最後に、プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａを株４に導入し、以下の株、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ０１＊２／ＲＢＳ０８＊１−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ０１−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  Ｐｔｒｃ０１−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ９４−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＲＮ／ＰＲＭ−ＣＩ８５７−ＴＴａｄｃｃａ−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊４−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＲＮ／ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍ（ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７）（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａ）を得、株５と呼称した。
【０１２３】
６．株５におけるｍｅｔＥ突然変異の同定
株５のメチオニンシンターゼ活性（ＭＥＴＥ）を測定することによって、本発明者らは、末端切断型ＭｅｔＥタンパク質をもたらすいくつかの突然変異によりｍｅｔＥ遺伝子が機能しないことを確認した。
【０１２４】
それらの突然変異は、フレームシフト突然変異を導く、ｍｅｔＥ遺伝子の１３ｂｐ（該遺伝子の４１７番〜４２９番塩基）の欠失である。その結果として、該タンパク質の翻訳が短くなり（フレームシフトにより停止コドンが導入される）、７５３アミノ酸の代わりに１５２アミノ酸の末端切断型タンパク質が生じる。
【０１２５】
以下はＷＴ  ＭｅｔＥタンパク質の配列（配列番号２１）である：
【化１６】
2015519917.tif 000021
【０１２６】
以下は末端切断型ＭｅｔＥ＊タンパク質の配列（配列番号２２）である：
【化１７】
2015519917.tif 000022
【０１２７】
実施例３：株７、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｍｅｔＥ：：Ｋｍ  Ｐｔｒｃ０１＊２／ＲＢＳ０８＊１−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ０１−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  Ｐｔｒｃ０１−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ９４−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＲＮ／ＰＲＭ−ＣＩ８５７−ＴＴａｄｃｃａ−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊４−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＲＮ／ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７（ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７）（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａ）の構築
【０１２８】
１．株６の構築
機能性ＭｅｔＥタンパク質の再生によって株５のメチオニン生産を改変し得るかどうかを研究するために、本発明者らは、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いて、末端切断型ｍｅｔＥ遺伝子を野生型のものにより置き換えた。
【０１２９】
この目的で、ｍｅｔＥ領域と相同な断片が隣接したカナマイシンカセット、「ｍｅｔＥ：：Ｋｍ」断片を、オリゴヌクレオチドｍｅｔＥ−Ｋｍ−ＦおよびｍｅｔＥ−Ｋｍ−Ｒ（下記）を用いてＰＣＲ増幅した。「ｍｅｔＥ：：Ｋｍ」断片を、機能型ｍｅｔＥ遺伝子を有するＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６株に導入した。
【０１３０】
ｍｅｔＥ−Ｋｍ−Ｆ（配列番号１６）
【化１８】
2015519917.tif 000023
この配列は以下の領域を有する。
・ｍｅｔＥ領域の配列（４０１３２７７〜４０１３３７６）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（小文字）、
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（大文字）（Datsenko & Wanner, 2000に参照配列。
【０１３１】
ｍｅｔＥ−Ｋｍ−Ｒ（配列番号１７）
【化１９】
2015519917.tif 000024
この配列は以下の領域を有する。
・ｍｅｔＥ領域の配列（４０１３３７７〜４０１３４４２）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（小文字）、
・Ｔ７ｔｅ転写ターミネーター配列(Harrington et al., 2001)に関する領域（太字の大文字）、
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（大文字）（Datsenko & Wanner, 2000に参照配列。
【０１３２】
カナマイシン耐性組換え体を選択し、ｍｅｔＥ遺伝子の下流にＫｍカセットが存在することを、オリゴヌクレオチドｍｅｔＥ−ＦおよびｍｅｔＥ−Ｒ（下記）を用いたＰＣＲにより確認した。確認済みの選択株をＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６  ｍｅｔＥ：：Ｋｍと呼称した。
【０１３３】
ｍｅｔＥ−Ｆ（配列番号１８）
【化２０】
2015519917.tif 000025
この配列は、ｍｅｔＥ領域の配列（４０１２４９５〜４０１２５１６）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１３４】
ｍｅｔＥ−Ｒ（配列番号１９）
【化２１】
2015519917.tif 000026
この配列は、ｍｅｔＥ領域の配列（４０１３６７２〜４０１３６９１）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１３５】
次に、ｍｅｔＥ：：Ｋｍ染色体修飾を、プロトコール２に従って、株３に形質導入した。
【０１３６】
カナマイシン耐性組換え体を選択し、ｍｅｔＥ遺伝子の下流にＫｍカセットが存在することを、オリゴヌクレオチドｍｅｔＥ−ＦおよびｍｅｔＥ−Ｒ（上記）を用いたＰＣＲにより確認した。野生型配列を有するｍｅｔＥ遺伝子が存在することをＤＮＡ配列決定法により確認した。
【０１３７】
得られた株、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｍｅｔＥ：：Ｋｍ  Ｐｔｒｃ０１＊２／ＲＢＳ０８＊１−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ０１−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  Ｐｔｒｃ０１−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ９４−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＲＮ／ＰＲＭ−ＣＩ８５７−ＴＴａｄｃｃａ−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊４−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＲＮ／ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７を株６と呼称した。
【０１３８】
２．株７の構築
プラスミドｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７（特許出願ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０５２９３７号に記載されている）およびプラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａ（上記）を株６に導入し、株ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｍｅｔＥ：：Ｋｍ  Ｐｔｒｃ０１＊２／ＲＢＳ０８＊１−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ０１−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  Ｐｔｒｃ０１−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ９４−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＲＮ／ＰＲＭ−ＣＩ８５７−ＴＴａｄｃｃａ−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊４−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＲＮ／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＲＮ／ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７（ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７）（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａ）を得、株７と呼称した。
【０１３９】
株６のコバラミン非依存性メチオニンシンターゼ（ＭＳ、ＭｅｔＥ）活性の測定によって、ＭｅｔＥタンパク質が機能することを確認した。
【０１４０】
実施例４:バイオリアクターにおける発酵によるＬ−メチオニンの生産
続いて、十分な量のメチオニンを生産した株を、フェドバッチ(fedbatch)法を用い、０．５Ｌ発酵槽(GX, GPC)において生産条件下で試験した。
【０１４１】
簡単に述べると、２．５ｇ．Ｌ−１グルコースを添加したＬＢ培地１０ｍＬで増殖させた２４時間培養物を用いて、最少培地（Ｂ１ａ）に２４時間前培養物を植菌した。これらのインキュベーションは、４０ｍＬの最少培地（Ｂ１ａ）の入った５００ｍＬバッフル付フラスコで、回転式振盪培養機（２００ＲＰＭ）に入れて行った。１回目の前培養は３０℃の温度で達成し、２回目の前培養は３４℃の温度で達成した。
【０１４２】
３回目の前培養工程はバイオリアクター(Sixfors)で行い、バイオリアクターには２００ｍＬの最少培地（Ｂ１ｂ）を充填し、濃縮前培養物５ｍＬをバイオマス濃度１．２ｇ．Ｌ−１に植菌した。前培養温度は３４℃で一定に保ち、ｐＨは１０％ＮＨ４ＯＨ溶液を用いて６．８の値に自動調整した。溶存酸素濃度は、空気供給および／または撹拌により大気分圧飽和の３０％の値に連続的に調整した。バッチ培地のグルコース枯渇後、フェドバッチを初期流速０．７ｍＬ．ｈ−１で開始し、増殖速度０．１３ｈ−１で２４時間、指数関数的に増加させ、最終細胞濃度約２０ｇ．Ｌ−１を得た。
【０１４３】
【表４】
2015519917.tif 000027
【０１４４】
【表５】
2015519917.tif 000028
【０１４５】
【表６】
2015519917.tif 000029
【０１４６】
【表７】
2015519917.tif 000030
【０１４７】
続いて、ＧＸ  ０．５Ｌ発酵槽(GPC)に２２０ｍＬの最少培地（Ｂ２）を充填し、２０〜３０ｍＬの間の範囲の前培養物量をバイオマス濃度２．１ｇ．Ｌ−１に植菌した。
【０１４８】
培養温度は３７℃で一定に保ち、ｐＨはＮＨ４ＯＨ溶液の自動添加（ＮＨ４ＯＨ １０％）により作業値（６．８）に維持した。バッチ段階中、初期撹拌速度は２００ＲＰＭに設定し、フェドバッチ段階中は１０００ＲＰＭまで速めた。バッチ段階中、初期気流速度は０．３Ｌ．ｍｉｎ−１に設定し、フェドバッチ段階開始時に０．７Ｌ．ｍｉｎ−１まで速めた。溶存酸素濃度は撹拌回数を増やすことにより２０〜４０％の間の値、好適には、３０％飽和に維持した。
【０１４９】
細胞塊が５ｇ．Ｌ−１に近い濃度に達したら、フェドバッチを初期流速１．９ｍＬ．ｈ−１で開始した。供給溶液は、流速が上昇し２６時間後には８．８ｍＬ．ｈ−１に達するＳ字状プロフィールで注入した。正確な供給条件は式：
【数１】
2015519917.tif 000031
（式中、Ｑ（ｔ）はバッチ容量６００ｍＬの場合の供給流速（ｍＬ．ｈ−１）であり、ｐ１＝０．６６、ｐ２＝８．２１、ｐ３＝０．２７、ｐ４＝６．５０である）
により算出した。
【０１５０】
２６時間のフェドバッチ後、供給溶液ポンプを止め、グルコース枯渇後に培養を終えた。
【０１５１】
細胞外アミノ酸を、ＯＰＡ／Ｆｍｏｃ誘導体化後にＨＰＬＣにより定量し、他の関連代謝産物を、屈折率検出によるＨＰＬＣ（有機酸およびグルコース）およびシリル化後のＧＣ−ＭＳを用いて分析した。
【０１５２】
【表８】
2015519917.tif 000032
【０１５３】
上の表８で分かるように、メチオニン生産の収率は、ｍｅｔＥ遺伝子の突然変異により有意に上昇した。突然変異ｍｅｔＥ遺伝子を含む株５は、機能性ＭｅｔＥタンパク質を含む株７と比べて４ポイント高い収率を有する。
【０１５４】
発酵槽容量は、リアクターの初期容量に、ｐＨ調節および培養物供給のために加える溶液の量を加算し、サンプリングに用いる容量と蒸発により損失する容量を減算することにより算出した。
【０１５５】
フェドバッチ容量は、供給ストックを秤量することにより連続的に追跡した。次に、注入重量、溶液の密度およびＢｒｉｘ法により決定されたグルコース濃度（［グルコース］）に基づいて、グルコース注入量を計算した。メチオニン収率は次のように表した。
【数２】
2015519917.tif 000033
各株について培養中に得られた最終収率を本明細書に示した。
【０１５６】
この場合、メチオニン０およびメチオニンｔはそれぞれ、初期メチオニン濃度および最終メチオニン濃度であり、Ｖ０およびＶｔは初期容量および最終容量である。
【０１５７】
消費グルコースは次のように計算した：
【数３】
2015519917.tif 000034
注入グルコースｔ＝供給容量ｔ(fed volumet)＊［グルコース］
消費グルコースｔ＝［グルコース］０＊Ｖ０＋注入グルコース−［グルコース］残留＊Ｖｔ
この場合、［グルコース］０、［グルコース］、［グルコース］残留はそれぞれ、初期グルコース濃度、供給グルコース濃度および残留グルコース濃度である。
【０１５８】
実施例５：コバラミン非依存性メチオニンシンターゼ（ＭｅｔＥ）活性の測定
コバラミン非依存性メチオニンシンターゼ（ＭＳ、ＭｅｔＥ）活性のin vitro決定のために、野生型または突然変異型のｍｅｔＥ遺伝子をそれぞれ有する大腸菌株７および大腸菌株５を、上の実施例３に記載したように、最少培地中で培養し、対数期終了時に遠心分離により回収した。ＥＤＴＡを含むプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する冷２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．２にペレットを再懸濁した。その後、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓシステム（Bertin Technologies；６５００ｒｐｍで２×１０秒）を用いたビーズ破砕により細胞を破壊した後、１２０００ｇ、４℃で３０分間の遠心分離を行った。上清を脱塩し、それを酵素分析に用いた。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ試薬(Bradford, 1976)を用いて、タンパク質濃度を決定した。
【０１５９】
ＭＳ活性の決定のために、４０μｇの粗細胞抽出物を、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．２、５ｍＭ  ＭｇＳＯ４中で１ｍＭ  ＤＬ−ホモシステインおよび０．２５ｍＭメチル−テトラヒドロプテロイル−トリグルタメートとともに３７℃で１５分間インキュベートした。コバラミン非依存性メチオニンシンターゼ酵素によって生産されたメチオニンを、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＴＢＤＭＳＴＦＡ）による誘導体化後にＧＣ−ＭＳにより定量した。内部標準としてアスパルテートおよびノルロイシンを含めた。
【０１６０】
コバラミン非依存性メチオニンシンターゼ活性の結果を下の表９に示している。
【０１６１】
【表９】
2015519917.tif 000035
【０１６２】
表９で分かるように、株５（ΔｍｅｔＥ）は、そのＭＳ活性を完全に喪失していたが、一方、株７はかなりの活性を維持した。この活性喪失は、メチオニン生産の有意な改善と相関があった。
【０１６３】
実施例６：Ｌ−メチオニンの生産におけるｍｅｔＥ遺伝子の欠失の効果
Ｌ−メチオニンの生産におけるｍｅｔＥ遺伝子の完全欠失の効果を評価するために、本発明者らは、株５の突然変異ｍｅｔＥ遺伝子を欠失させた。本発明者らは、前述の相同組換えを用い、Datsenko & Wanner (2000)によって提供されている方法を用いて、ｍｅｔＥ遺伝子の完全欠失をその株に導入した。
【０１６４】
カナマイシンカセットによる突然変異ｍｅｔＥ遺伝子の置換後に、カナマイシン耐性組換え体を選択し、ＤＮＡ配列決定法により確認する。
【０１６５】
それらの１つを実施例４に記載するように培養し、生産されたＬ−メチオニンをＨＰＬＣにより定量する。
【０１６６】
ｍｅｔＥの完全欠失を有する株は、機能性ＭｅｔＥタンパク質を有する株７より多くのメチオニンを生産する：ｍｅｔＥの欠失は、１５％を超えるメチオニン収率の増加をもたらした。
【０１６７】
参考文献
2015519917.tif 000036
【配列表】
2015519917000001.app
【国際調査報告】
2015519917.tif 000037
2015519917.tif 000038
2015519917.tif 000039