(57)【要約】本発明は部分的に、線維芽細胞を脂肪細胞、骨細胞、又は軟骨細胞に分化させる方法に基づく。更に、本発明は、線維芽細胞を脂肪細胞、骨細胞、又は軟骨細胞に分化させるために有用な作用物質及びキットを提供する。更に、本発明は、複合糖類を用いて増加させた細胞外マトリックス沈着を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞を脂肪細胞に分化させるための方法であって、
（ａ）線維芽細胞培養用培地中で線維芽細胞を標準条件下でコンフルエント状態（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）まで増殖させることと、
（ｂ）第１の分化細胞培養用培地中で該細胞を培養することと、
（ｃ）第２の分化細胞培養用培地中で該細胞を培養することと、
（ｄ）脂肪細胞の存在を確認することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞が、第１の分化細胞培養用培地中で４日間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、第２の分化細胞培養用培地中で１７日間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記線維芽細胞培養用培地が、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２細胞培養用培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の分化細胞培養用培地が、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １細胞培養用培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の分化細胞培養用培地が、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２細胞培養用培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １細胞培養用培地が、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ細胞培養用培地及びＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １補充物を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １補充物が、
（ａ）Ｌ−グルタミン  １〜２００ｍＭ、
（ｂ）プラスマネート  １０〜５０％、
（ｃ）デキサメタゾン  １０〜１０００μＭ、
（ｄ）インシュリン  １０〜３００μｇ／ｍｌ、
（ｅ）アスコルビン酸−２−リン酸  １０〜１０００μｇ／ｍｌ、
（ｆ）インドメタシン  ０．１〜１０ｍＭ、
（ｇ）ＥＧＦ  １０〜３００μｇ／ｍｌ、及び
（ｈ）トログリタゾン  １０〜１０００μＭ
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２細胞培養用培地が、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ細胞培養用培地及びＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２補充物を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２補充物が、
（ａ）Ｌ−グルタミン  １〜１００ｍＭ、
（ｂ）プラスマネート  １０〜５０％、
（ｃ）デキサメタゾン  １０〜１０００μＭ、
（ｄ）インシュリン  １０〜３００μｇ／ｍｌ、
（ｅ）アスコルビン酸−２−リン酸  １０〜１０００μｇ／ｍｌ、
（ｆ）インドメタシン  ０．１〜１０ｍＭ、及び
（ｇ）ＥＧＦ  １０〜３００μｇ／ｍｌ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法によって作製された、脂肪細胞。
【請求項１２】
線維芽細胞を骨細胞に分化させる方法であって、
（ａ）線維芽細胞培養用培地中で線維芽細胞を標準条件下でコンフルエント状態まで増殖させることと、
（ｂ）骨形成細胞培養用培地中で該細胞を培養することと、
（ｃ）骨細胞の存在を確認することと
を含む、方法。
【請求項１３】
前記細胞が、骨形成細胞培養用培地中で３週間培養される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記線維芽細胞培養用培地が、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｓ２細胞培養用培地である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記骨形成細胞培養用培地が、ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ細胞培養用培地である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ細胞培養用培地が、
（ａ）ＤＭＥＭ、
（ｂ）Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ  １〜１００ｍＭ、
（ｃ）ＦＢＳ  １〜５０％、
（ｄ）ＥＧＦ  ０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ、
（ｅ）ｂＦＧＦ  ０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ、
（ｆ）ａＦＧＦ  ０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ、
（ｇ）β−グリセロリン酸  １〜１００ｍＭ、
（ｈ）アスコルビン酸−２−リン酸  １０〜１０００μｇ／ｍｌ、
（ｉ）デキサメタゾン  ０．１〜１００μＭ、
（ｊ）グルコサミン硫酸  １〜１００μｇ／ｍｌ、
（ｋ）ヒアルロン酸  １〜１００μｇ／ｍｌ、及び
（ｌ）ガラクトース  ０．１〜５０ｇ／Ｌ
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の方法によって作製された、骨細胞。
【請求項１８】
線維芽細胞を軟骨細胞に分化させる方法であって、
（ａ）線維芽細胞培養用培地中で線維芽細胞を標準条件下で８０〜９０％コンフルエント状態まで増殖させることと、
（ｂ）該細胞をペレット化することと、
（ｃ）該細胞を１．５％アルギネート溶液中に再懸濁することと、
（ｄ）アルギネート溶液中の該細胞を１００ｍＭ塩化カルシウムに加えて、マイクロビーズを形成することと、
（ｅ）軟骨形成細胞培養用培地中でマイクロビーズ上の細胞を増殖させることと、
（ｆ）軟骨細胞の存在を確認することと
を含む、方法。
【請求項１９】
前記細胞が、軟骨形成細胞培養用培地中で３週間培養される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記線維芽細胞培養用培地が、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｓ２細胞培養用培地である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記軟骨形成細胞培養用培地が、ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ軟骨形成細胞培養用培地である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ軟骨形成細胞培養用培地が、
（ａ）ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ、
（ｂ）グルコース  ０．１〜１０ｇ／Ｌ、
（ｃ）プラスマネート  １〜２５％、
（ｄ）グルタミン  １〜１００ｍＭ、
（ｅ）デキサメタゾン  ０．１〜１００μＭ、
（ｆ）インシュリン  ０．１〜２０μｇ／ｍｌ、
（ｇ）ＰＳ−トランスフェリン  ０．１〜２０μｇ／ｍｌ、
（ｈ）ＥＧＦ  ０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ、
（ｉ）アスコルビン酸−２−リン酸  １０〜１０００μｇ／ｍｌ、
（ｊ）Ｌ−プロリン  １０〜１０００μｇ／ｍｌ、
（ｋ）ＴＧＦβ３  ０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ、
（ｌ）グルクロン酸  １〜１００μｇ／ｍｌ、
（ｍ）ガラクトース  ０．１〜５０ｇ／Ｌ、
（ｎ）グルコサミン硫酸  １〜１００μｇ／ｍｌ、及び
（ｏ）ヒアルロン酸  １〜１００μｇ／ｍｌ
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１８に記載の方法によって作製された、軟骨細胞。
【請求項２４】
線維芽細胞を脂肪細胞に分化させるためのキットであって、
（ａ）ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ細胞培養用培地、
（ｂ）ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １補充物、
（ｃ）ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２補充物、
（ｄ）オイルレッドＯ染色剤、及び
（ｅ）線維芽細胞を脂肪細胞に分化させるための使用説明書
を含む、キット。
【請求項２５】
線維芽細胞を骨細胞に分化させるためのキットであって、
（ａ）ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ細胞培養用培地、
（ｂ）アリザリンレッド染色剤、及び
（ｃ）線維芽細胞を骨細胞に分化させるための使用説明書
を含む、キット。
【請求項２６】
線維芽細胞を軟骨細胞に分化させるためのキットであって、
（ａ）ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ軟骨形成細胞培養用培地、
（ｂ）アルシアンブルー染色剤、及び
（ｃ）線維芽細胞を軟骨細胞に分化させるための使用説明書
を含む、キット。
【請求項２７】
前記細胞が、標準組織培養処理プラスチック上で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つの複合糖類の存在下で細胞を培養することを含む、細胞外マトリックスを生成する方法。
【請求項２９】
複合糖類が、ヒアルロン酸、マンノース、シアル酸、コンドロイチン硫酸、ガラクトース、グルクロン酸、及びグルコサミン硫酸から成る群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、間葉系幹細胞由来の、脂肪細胞、骨細胞、又は軟骨細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が、線維芽細胞由来の、脂肪細胞、骨細胞、又は軟骨細胞である、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１１月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／７２７，０２５号の利益を主張するものであり、当該出願は、全ての表、図面、特許請求の範囲を含めて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般的に体性幹細胞、より具体的には、ヒト線維芽細胞が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）様状態を獲得することを可能にするための方法、及び該ＭＳＣ潜在的ヒト線維芽細胞を誘導して、脂肪細胞、骨細胞、及び軟骨細胞に分化させる方法、並びにその使用方法に関する。本発明は、一般的に、細胞外マトリックスの作製及び亢進された沈着に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
幹細胞は全ての多細胞生物で見出され、該細胞は、多様な特定化された細胞種に分化又は自己再生して、より多くの幹細胞を産生する。幹細胞は、２つの重要な特徴によって他の細胞種とは識別される。第１に、幹細胞は、時には長い不活性期間後に、細胞分割によってそれ自体再生することができる特定化されていない細胞である。第２に、ある特定の生理学又は実験的条件下では、幹細胞は、特殊な機能を有する組織特異的又は臓器特異的細胞になるように誘導され得る。腸及び骨髄等のいくつかの臓器において、幹細胞は、損耗した又は損傷した組織を修復し且つ置き換えるために規則的に分割する。しかしながら、膵臓及び心臓等の他の臓器においては、幹細胞は特定の条件下で分割するにすぎない。
【０００４】
幹細胞の１種は、体性（成体）幹細胞である。体幹細胞は、自己再生及び分化の両方の限定された能力を有する、多くの臓器及び分化組織で見出される比較的未分化の細胞である。かかる細胞はその分化能力が多様であるが、その分化能力は通常、起源の臓器の細胞種に限定される。
【０００５】
幹細胞は、健康の多くの異なった分野及び医薬研究で可能性を有する。癌及び先天性欠損等の最も深刻な医学的状態の中には、細胞が形質変換を受けた時に起こる問題に起因するものがある。正常な細胞発達及び分化の機構を理解することは、これらの状態をより良い理解することを可能にすることになる。
【０００６】
幹細胞の別の潜在的な適用は、医療用に細胞及び組織を作製することである。今日、提供された臓器及び組織が、通常、病気にかかった又は破壊されているものと置換するために使用される。残念なことに、移植を必要としている人の数は、移植用に入手できる臓器の数を遥かに超える。幹細胞は患者から得られるので、患者におそらく適合する組織である体幹細胞は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷、火傷、心臓病、糖尿病、及び関節炎を含む無数の疾患、症状、及び障害を治療する、置換細胞及び組織の再生源の可能性を提供する。
【０００７】
線維芽細胞は、細胞外マトリックス、すなわち動物組織のための構造的枠組み（ストロマ）を合成し、創傷治癒に重大な役割を演じる、細胞種である。細胞外マトリックスの組成が、結合組織の物理的性質を決定する。線維芽細胞は、様々なコラーゲン、グリコサミノグリカン、細網繊維及び弾性繊維、並びに糖タンパク質を生成する。線維芽細胞は、動物における結合組織の最も一般的な細胞であり、原始間葉細胞に由来する。組織損傷は、細胞外マトリックスからのサイトカイン及び成長因子の放出を刺激し、線維芽細胞の有糸分裂を誘導する。
【０００８】
線維芽細胞は、一般に、最終的に分化した細胞種として一般的に理解されている。それらは、限られた増殖能力を有し、他の細胞種を生じさせない。しかしながら、線維芽細胞が他の細胞種に分化することができ得、そのため真の成体体性幹細胞とみなすという証拠がいくつかある。不死化ネズミ細胞種である３Ｔ３Ｌ１は、脂肪細胞に分化するその能力のために研究において広く利用されている。該細胞種は、ネズミ胚線維芽細胞から得られた。脂肪生成を誘導するために、標準的なプロトコールは、該細胞をフィブロネクチン上に播種し、コンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に達し、インシュリン、デキソメタソン、アスコルビン酸、インドメタシン（ＣＯＸ１阻害剤）、及びロシグリタゾン（ＰＰＡＲ−γ架橋剤）の組合せで処理することを必要とする。脂肪細胞になる３Ｔ３Ｌ１細胞の能力は、表現型においてある程度の柔軟性を与えることになる細胞種の胚起源、種、及び不死化の結果であると一般的には推定される。時として、数個の脂質滴を有するランダム胚線維芽細胞が観察された。この観察は、多くの細胞種が、複数の発達経路に指向され得る肝芽細胞等のある程度の多能性を維持するという、及び、いくつかの癌が、限定された増殖能力を維持したが、分化はしない細胞から生じると考えられるという文献での証拠と結び付けられた。所望の細胞種に特異的な好適なシグナルがあれば、いわゆる「最終」分化細胞はその細胞の最終状態の変更を受け得、そのため、従来認知されていなかった限定された能力を証明するとの仮説が立てられた。ラット胚線維芽細胞でない、原始的ネズミ胚線維芽細胞（約２０％）とニワトリ胚線維芽細胞（約５％）との亜群も、３Ｔ３Ｌ１不死化細胞種と同様な方法で処理された場合に、脂肪細胞に分化し得ると決定された。しかしながら、ヒト線維芽細胞は、３Ｔ３Ｌ１細胞と類似の細胞種であるが、異なった組織起源由来の異なった種の細胞であり、不死又は胚性ではないため、ヒト繊維芽細胞が脂肪細胞になり得るとの予測とは必ずしも一致しないと考えられる。そのため、ＭＳＣ様状態を獲得するためにヒト線維芽細胞を誘導するための方法、並びに、これらの細胞の、脂肪細胞、骨細胞、及び軟骨細胞への分化が必要である。
【０００９】
細胞外マトリックスは、引っ張り強度、圧縮抵抗、３次元組織キュー、並びに成長因子及びサイトカインの貯蔵場所を提供する、細胞によって分泌される物質である。肉眼解剖学レベルでの細胞外マトリックスの例は、治癒中の創傷、腱、靭帯、骨、軟骨、血管、角膜、歯、毛髪、及び皮膚である。細胞外マトリックスの小成分は、様々なケラチン、コラーゲン、エラスチン、ネスチン、カルシウムアパタイト、歯の象牙質、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、基底膜、及びあまり定義されていない結合組織である。
【００１０】
プロテオグリカンは複数の機能を提供する。それらは、組織内の水保持を可能にし、成長因子、プロテアーゼ阻害剤、及び酵素を結合させ、シグナル伝達に関与し、かつ、細胞外タンパク質への結合によってマトリックスそれ自体を構成するために役立つ。プロテオグリカンに結合した糖（又は炭水化物）鎖は、グリコサミノグリカンと言われる（ＧＡＧ、ムコ多糖とも称される）。ＧＡＧそれ自体は、そのタンパク質骨格に関して極端に嵩高い。アグリカンは、最も巨大タンパク質の１つであり、９０％糖鎖によって構成される。
【００１１】
歴史的に見ると、一般的な組織培養手法は、細胞培養中の如何なる時点でも細胞外マトリックスを構築する。ほとんどの細胞及び細胞株は、新しいプレートに継代されるまで、２〜５日間プレート上で生存する。任意の所定の細胞による細胞外マトリックスの分泌は、進行しているが、標準的組織培養条件下では特に望ましくない。なぜならば、マトリックス自体は、良好な組織培養手法のため及び更にはプレート上への細胞の分布のために必要である単一細胞懸濁液を作製する際に、問題を来し得るからである。次いで、細胞は、増殖を止め、静止状態になる場合がある。このような結果は、ほとんどの研究者、すなわち実験のため用いられ得る急に分かれる集団の要求に真っ向から対立している。
【００１２】
細胞外マトリックスが組織培養に必要な場合には、プレートは、コラーゲン、ビトロネクチン、又はフィブロネクチン等の組換えタンパク質又は精製タンパク質で被覆され得る。あるいは、細胞は、細胞外マトリックスがほとんど明確に定義されていないとしても、細胞機能に必要な細胞外マトリックスをつくることが知られている別の細胞種で共培養され得る。両方の場合において、研究者は、細胞増殖を探求し続けるが、開発された細胞外マトリックスが与える機能のいずれかについては探求しない。
【００１３】
組織工学については、細胞外マトリックスの存在が必要とされる。組織工学は組織培養と比べて比較的新しい現象である。組織培養と異なり、組織工学は、合成物質、又は、精製されたマトリックスタンパク質とその後に足場上に播種された細胞との組合せを用いる。組織工学は、インビボで移植された時に組織全体を形成するために、細胞外マトリックスを構築するための細胞が必要である。細胞外マトリックスの必要性の別の例は、創傷治癒を研究することにある。しかしながら、上で纏めたように、現在の細胞培養技術は、細胞外マトリックス上での細胞の成長を可能にしない。
【００１４】
細胞を増殖させるため、組織工学及び創傷治癒において使用されるための細胞外マトリックスを作製する方法の必要性がある。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は部分的に、線維芽細胞が、潜在能力のある間葉系幹細胞状態を獲得することを可能にする方法に基づく。更に、本発明は、線維芽細胞を脂肪細胞、骨細胞、及び軟骨細胞に分化させるために有用な物質及びキットを提供する。更に、本発明はまた、特定の糖類を用いて増加させた細胞外マトリックス沈着のための方法を提供する。
【００１６】
従って、１つの実施形態では、本発明は、線維芽細胞を脂肪細胞に分化させるための方法であって、線維芽細胞を線維芽細胞培養用培地（例えば、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２培地，Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ウォーカーズビル，ＭＤ）中で線維芽細胞を標準条件下でコンフルエント状態（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）まで増殖させることと；第１の分化細胞培地（例えば、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １培地）中で該細胞を約４日間培養することと；第２の分化細胞培地（例えば、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２培地）中で該細胞を１７日間培養することと；脂肪細胞の存在を確認することとを含む、方法を提供する。
【００１７】
好ましい態様では、線維芽細胞は、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２細胞培養用培地中でコンフルエント状態まで増殖される。線維芽細胞は、次いで、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １細胞培養用培地中で約４日間増殖される。次いで、該細胞は、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２細胞培養用培地中で１７日間増殖される。１つの態様では、脂肪細胞の存在は、脂肪細胞の主な特徴である蓄積した脂質滴を検出するためにオイルレッドＯ染色剤を用いて確認される。
【００１８】
１つの態様では、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ細胞培養用培地は、Ｄｅｒｍａｌｉｆｅ培地（ＬｉｆｅｌｉｎｅＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ウォーカーズビル，ＭＤ）；Ｌ−グルタミン  １〜２０ｍＭ；プラスマネート  １〜２０％；デキサメタゾン  １〜２０μＭ；インシュリン  １〜１００μｇ／ｍｌ；アスコルビン酸−２−リン酸  １〜１００μｇ／ｍｌ；インドメタシン  ５〜５００μＭ；ＥＧＦ  １〜１０ｎｇ／ｍｌ；グリシン  ０．１〜５ｍＭ；アラニン  ０．１〜５ｍＭ；プロリン  ０．１〜５ｍＭ；ビオチン  ０．０００１〜０．０１ｍＭ；リボフラビン  ０．０００１〜０．０１ｍＭ；ビタミンＢ１２  ０．０００１〜０．０１ｍＭ；及びリポ酸  ０．０００１〜０．０１ｍＭを含む。
【００１９】
好ましい態様では、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ細胞培養用培地は、Ｄｅｒｍａｌｉｆｅ培地；Ｌ−グルタミン  ６ｍＭ；プラスマネート  ２％；デキサメタゾン  ５μＭ；インシュリン  １０μｇ／ｍｌ；アスコルビン酸−２−リン酸  ５０μｇ／ｍｌ；インドメタシン  ５０μＭ；ＥＧＦ  ５ｎｇ／ｍｌ；グリシン  ０．６７ｍＭ；アラニン  ０．２８ｍＭ；プロリン  ０．３５ｍＭ；ビオチン  ０．０００４１ｍＭ；リボフラビン  ０．０００２６６ｍＭ；ビタミンＢ１２  ０．００１０００４ｍＭ；及びリポ酸  ０．０００９７１ｍＭを含む。
【００２０】
別の態様では、ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １補充物は、Ｌ−グルタミン  １〜２００ｍＭ；プラスマネート  １０〜５０％；デキサメタゾン  １０〜１０００μＭ；インシュリン  １０〜３００μｇ／ｍｌ；アスコルビン酸−２−リン酸  １０〜１０００μｇ／ｍｌ；インドメタシン  ０．１〜１０ｍＭ；ＥＧＦ  １０〜３００μｇ／ｍｌ；及びトログリタゾン  １０〜１０００μＭを含む。培地は、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １細胞培養用培地を作製するために使用直前にＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ培地と組み合わされる。
【００２１】
好ましい態様では、ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １補充物は、Ｌ−グルタミン  １０３ｍＭ；プラスマネート  ３４％；デキサメタゾン  ８６μＭ；インシュリン  １７２μｇ／ｍｌ；アスコルビン酸−２−リン酸  ８６０μｇ／ｍｌ；インドメタシン  ８６０μＭ；ＥＧＦ  ８６μｇ／ｍｌ；及びトログリタゾン  ２０２μＭを含み、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １細胞培養用培地を作製するために使用直前にＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ培地と組み合わされる。
【００２２】
更なる態様では、ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２補充物は、Ｌ−グルタミン１〜２００ｍＭ；プラスマネート１０〜５０％；デキサメタゾン１０〜１０００μＭ；インシュリン１０〜３００μｇ／ｍｌ；アスコルビン酸−２−リン酸１０〜１０００μｇ／ｍｌ；インドメタシン０．１〜１０ｍＭ；及びＥＧＦ１０〜３００μｇ／ｍｌを含む。培地は、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２細胞培養用培地を作製するために使用直前にＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ培地と組み合わされる。
【００２３】
好ましい態様では、ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２補充物は、Ｌ−グルタミン  １０３ｍＭ；プラスマネート  ３４％；デキサメタゾン  ８６μＭ；インシュリン  １７２μｇ／ｍｌ；アスコルビン酸−２−リン酸  ８６０μｇ／ｍｌ；インドメタシン  ８６０μＭ；及びＥＧＦ  ８６μｇ／ｍｌを含み、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２細胞培養用培地を作製するために使用直前にＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ培地と組み合わされる。
【００２４】
１つの実施形態では、本発明は、線維芽細胞培養用培地（例えば、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２培地，Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ウォーカーズビル，ＭＤ）中で線維芽細胞を標準条件下でコンフルエント状態まで増殖させることと；第１の分化細胞培地（例えば、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １培地）中で該細胞を約４日間培養することと；第２の分化細胞培地（例えば、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２培地）中で該細胞を１７日間培養することと；脂肪細胞の存在を確認することとを含む方法によって作製された脂肪細胞を提供する。
【００２５】
好ましい態様では、脂肪細胞は、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２細胞培養用培地中で線維芽細胞をコンフルエント状態まで増殖させることを含む方法によって作製される。次いで、該細胞は、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １培地中で約４日間増殖される。次いで、該細胞は、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２細胞培養用培地中で１７日間増殖される。１つの態様では、脂肪細胞の存在は、脂肪細胞の主な特徴である蓄積した脂質滴を検出するためにオイルレッドＯ染色剤を用いて確認される。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、線維芽細胞を骨細胞に分化させる方法であって、線維芽細胞培養用培地（ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２培地，Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ウォーカーズビル，ＭＤ）中で線維芽細胞を標準条件下でコンフルエント状態まで増殖させることと；骨形成細胞培養用培地（ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ培地）中で該細胞を３週間培養することと；骨細胞の存在を確認することとを含む、方法を提供する。
【００２７】
好ましい実施形態では、線維芽細胞は、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ細胞培養用培地中でコンフルエント状態まで増殖される。この線維芽細胞は、次いで、ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ細胞培養用培地中で３週間増殖される。１つの態様では、骨細胞の存在は、骨細胞生成骨の主な特徴であるカルシウム沈着を検出するためにアリザリンレッド染色剤を用いて確認される。
【００２８】
１つの態様では、ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ細胞培養用培地は、ＤＭＥＭ；Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ  １〜１００ｍＭ；ＦＢＳ  １〜５０％；ＥＧＦ  ０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ；ｂＦＧＦ  ０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ；ａＦＧＦ  ０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ；β−グリセロリン酸  １〜１００ｍＭ；アスコルビン酸−２−リン酸  １０〜１０００μｇ／ｍｌ；デキサメタゾン  ０．１〜１００μＭ；ヒアルロン酸  １〜１００μｇ／ｍｌ、グルコサミン硫酸  １〜１００μｇ／ｍｌ、  及びガラクトース０．１〜５０ｇ／ｌを含む。
【００２９】
好ましい態様では、ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ細胞培養用培地は、ＤＭＥＭ；Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ  ６ｍＭ；ＦＢＳ  １％；ＥＧＦ  ５ｎｇ／ｍｌ；ｂＦＧＦ  ５ｎｇ／ｍｌ；ａＦＧＦ  ５ｎｇ／ｍｌ；β−グリセロリン酸  １０ｍＭ；アスコルビン酸−２−リン酸  ５０μｇ／ｍｌ；デキサメタゾン  ０．１μＭ；ヒアルロン酸  １〜１００μｇ／ｍｌ、グルコサミン硫酸  １〜１００μｇ／ｍｌ、及びガラクトース  ０．１〜５０ｇ／ｌを含み、骨細胞の存在は、骨を生成する骨細胞の主な特徴であるカルシウム沈着を検出するためにアリザリンレッド染色剤で染色することによって確認される。
【００３０】
別の実施形態では、本発明は、線維芽細胞培養用培地（ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２培地，Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ウォーカーズビル，ＭＤ）中で線維芽細胞を標準条件下でコンンフルエント状態まで増殖させることと；骨形成細胞培養用培地（ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ培地）中で３週間、該細胞を培養することと；骨細胞の存在を確認することとを含む方法によって作製された骨細胞を提供する。
【００３１】
好ましい実施形態では、骨細胞は、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ細胞培養用培地中で線維芽細胞をコンフルエント状態まで増殖させることを含む方法によって作製される。次いで、線維芽細胞は、ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ細胞培養用培地中で３週間増殖される。１つの態様では、骨細胞の存在は、骨を生成する骨細胞の主な特徴であるカルシウム沈着を検出するために、アリザリンレッド染色剤を用いて確認される。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は、線維芽細胞を軟骨細胞に分化させる方法であって、線維芽細胞培養用培地（ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２培地，Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ウォーカーズビル，ＭＤ）中で線維芽細胞を標準条件下で８０〜９０％コンフルエント状態まで増殖させることと；該細胞をペレット化することと；１．５％アルギネート溶液中に該細胞を再懸濁することと；シリンジを用いてアルギネートの細胞溶液を１００ｍＭ塩化カルシウムに添加して、マイクロビーズを形成することと；マイクロビーズ内部の細胞を軟骨形成細胞培養用培地中（ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ培地，Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ウォーカーズビル，ＭＤ）で３週間増殖させることと；軟骨細胞の存在を確認することとを含む、方法を提供する。
【００３３】
好ましい実施形態では、線維芽細胞は、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２細胞培養用培地中で８０〜９０％コンフルエント状態まで増殖される。次いで、該細胞は、ペレット化され、１．５％アルギネート溶液中に再懸濁される。次いで、アルギネートの細胞溶液は、マイクロビーズを形成するために、シリンジを用いて１００ｍＭ塩化カルシウムに添加される。次いで、該細胞は、マイクロビーズ内部で、ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ細胞培養用培地中で３週間増殖される。１つの態様では、軟骨細胞の存在は、軟骨を分泌する軟骨細胞の主な特徴である硫酸化プロテオグリカンを検出するために、アルシアンブルー染色剤を用いて確認される。
【００３４】
１つの態様では、ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ軟骨形成細胞培養用培地は、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ；グルコース  ０．１〜１０ｇ／Ｌ；プラスマネート  １〜２５％；グルタミン  １〜１００ｍＭ；デキサメタゾン  ０．１〜１００μＭ；インシュリン  ０．１〜２０μｇ／ｍｌ；ＰＳ−トランスフェリン  ０．１〜２０μｇ／ｍｌ；ＥＧＦ  ０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ；アスコルビン酸−２−リン酸  １０〜１０００μｇ／ｍｌ；Ｌ−プロリン  １０〜１０００μｇ／ｍｌ；ＴＧＦβ３  ０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ；グルクロン酸  １〜１００μｇ／ｍｌ；ガラクトース  ０．０１〜５０ｇ／Ｌ；グルコサミン硫酸  １〜１００μｇ／ｍｌ；及びヒアルロン酸  １〜１００μｇ／ｍｌを含む。
【００３５】
好ましい態様では、ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ軟骨形成細胞培養用培地は、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ；グルコース  ４．５ｇ／Ｌ；プラスマネート  ２％；グルタミン  ６ｍＭ；デキソメタソン  ０．１μＭ；インシュリン  ５μｇ／ｍｌ；ＰＳ−トランスフェリン  ５μｇ／ｍｌ；ＥＧＦ  ５ｎｇ／ｍｌ；アスコルビン酸−２−リン酸  ５０μｇ／ｍｌ；Ｌ−プロリン  ４０μｇ／ｍｌ；ＴＧＦβ３  ２ｎｇ／ｍｌ；グルクロン酸  ３．２４μｇ／ｍｌ；ガラクトース  ２ｇ／Ｌ；グルコサミン硫酸  １０μｇ／ｍｌ；及びヒアルロン酸  １０μｇ／ｍｌを含む。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、線維芽細胞培養用培地（ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２培地，Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ウォーカーズビル，ＭＤ）中で線維芽細胞を標準条件下で８０〜９０％コンフルエント状態まで増殖させることと；該細胞をペレット化すること；１．５％アルギネート溶液中に該細胞を再懸濁することと；シリンジを用いてアルギネートの細胞溶液を１００ｍＭ塩化カルシウムに添加して、マイクロビーズを形成することと；マイクロビーズ内部の細胞を軟骨形成細胞培養用培地（ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ培地，Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ウォーカーズビル，ＭＤ）中で３週間増殖させることと；軟骨細胞の存在を確認することとを含む方法によって作製された軟骨細胞を提供する。
【００３７】
好ましい実施形態では、軟骨細胞は、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２細胞培養用培地中で８０〜９０％コンフルエント状態まで増殖することを含む方法によって作製される。次いで、該細胞は、ペレット化され、１．５％アルギネート溶液中に再懸濁される。次いで、アルギネートの細胞溶液は、マイクロビーズを形成するために、シリンジを用いて１００ｍＭ塩化カルシウムに添加される。次いで、該細胞は、マイクロビーズ内部で、ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ細胞培養用培地中で３週間増殖される。１つの態様では、軟骨細胞の存在は、軟骨を分泌する軟骨細胞の主な特徴である硫酸化プロテオグリカンを検出するために、アルシアンブルー染色剤を用いて確認される。
【００３８】
１つの実施形態では、本発明は、線維芽細胞を脂肪細胞に分化させるためのキットであって、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ細胞培養用培地；ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １補充物；ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２細胞補充物；オイルレッドＯ染色剤；及び線維芽細胞を脂肪細胞に分化させるための使用説明書を含む、キットを提供する。
【００３９】
１つの実施形態では、本発明は、線維芽細胞を骨細胞に分化させるためのキットであって、ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ細胞培養用培地；アリザリンレッド染色剤；及び線維芽細胞を骨細胞に分化させるための使用説明書を含む、キットを提供する。
【００４０】
更なる実施形態では、本発明は、線維芽細胞を軟骨細胞に分化させるためのキットであって、１００ｍＭ  塩化カルシウム溶液；ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ軟骨形成細胞培養用培地；アルシアンブルー染色剤；及び、線維芽細胞を軟骨細胞に分化させるための使用説明書を含む、キットを提供する。
【００４１】
１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの複合糖類の存在下で細胞を培養することによって細胞外マトリックスを生成する方法を提供する。１つの態様では、複合糖類は、ヒアルロン酸、マンノース、シアル酸、コンドロイチン硫酸、ガラクトース、グルクロン酸、又はグルコサミン硫酸でよいが、これらに限定されない。別の態様では、細胞は、間葉系幹細胞由来の、脂肪細胞、骨細胞、又は軟骨細胞である。更なる態様では、細胞は、線維芽細胞由来の、脂肪細胞、骨細胞又は軟骨細胞でよいが、これらに限定されない。更なる態様では、細胞は、骨細胞、軟骨細胞、血管細胞、又は創傷治癒中の細胞でよいが、これらに限定されない。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
発明の詳細な説明
本発明は部分的に、線維芽細胞を脂肪細胞、骨細胞、及び軟骨細胞に分化させる方法に基づく。更に、本発明は、線維芽細胞を脂肪細胞、骨細胞、及び軟骨細胞に分化させるために有用な物質及びキットを提供する。
【００４３】
本発明の組成物及び方法を記載する前に、本発明が具体的な組成物、方法、及び記載された実験的条件に限定されないことを理解されたい。かかる組成物、方法、及び条件は変動し得るからである。本発明の範囲は添付のクレームにおいてのみ限定されることになるので、本明細書で使用される専門用語は、具体的な実施形態を記載する目的のためであり、限定を意図するものではないことも理解されたい。
【００４４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形の「1つの（ａ）」、「1つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を指示しない限り、複数形を含む。従って、「その方法」への言及は、１つ又はそれ以上の方法、及び／又は本開示等を参酌した際に当業者に明らかであろう本明細書に記載の種類のステップを含む。
【００４５】
他に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が帰属する当業者によって一般的に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載の方法及び物質と類似又は同等の任意の方法及び物質が本発明の実施又は試験において使用され得るが、好ましい方法及び物質についてはここで記載する。
【００４６】
線維芽細胞は、動物組織の構造枠組み（ストロマ）である細胞外マトリックスを合成する細胞種であり、創傷治癒に重要な役割を果たす。細胞外マトリックスの組成は、結合組織の物理的性質を決定した。線維芽細胞は、様々なコラーゲン、グリコサミノグリカン、細網繊維及び弾性繊維、並びに糖タンパク質を生成する。線維芽細胞は、動物における結合組織の最も一般的な細胞であり、原始間葉細胞に由来する。組織損傷は、細胞外マトリックスからのサイトカイン及び成長因子の放出を刺激し、線維芽細胞の有糸分裂を誘導する。
【００４７】
間葉系幹細胞又はＭＳＣは、様々な細胞種に分化し得る多能性幹細胞である。ＭＳＣがインビトロ又はインビボで分化することが明らかになっている細胞種は、骨芽細胞、軟骨細胞、ミオサイト、脂肪細胞、及び後述するβ−膵島細胞を含む。ＭＳＣは、自己再生し、同時にその多能性を維持する大きな能力を有する。
【００４８】
骨細胞は、骨形成を担う単核細胞であり；本質的に、骨芽細胞は、線維芽細胞産物に加えて骨シアロタンパク質及びオステオカルシンを発現する特定化した線維芽細胞である。
【００４９】
骨細胞は、主にＩ型コラーゲンによって構成される類骨のマトリックスを産生する。骨芽細胞は、このマトリックスの鉱化作用の原因ともなっている。亜鉛、銅、カルシウム、及びナトリウムは、このプロセスの必要なミネラルの一部である。骨は、マトリックス及びミネラルの産生を担う骨芽細胞によって常につくりかえられる動的組織であり、骨芽細胞はこの組織を改造する。骨細胞は、年齢と共に減少する傾向があり、骨組織中の形成と吸収とのバランスに影響を与える。
【００５０】
脂肪細胞は、類洞周囲脂質細胞又は脂質細胞としても知られ、主に脂肪組織を構成し、エネルギー源としての脂肪の合成及び脂肪の貯蔵に特化された細胞である。脂肪細胞は、正常なエネルギーバランスを維持し、ホルモン刺激に応答してエネルギー源を移動させ、及びシグナル分泌によって変化を命令する点で体に重要である。顕微鏡下では、脂肪細胞は脂肪で肥大化したように見える。該細胞の核は、一方の側に移動し、該細胞の血漿膜は脂肪のプールを囲む細い線のように見える。
【００５１】
軟骨細胞は、軟骨に見出される唯一の細胞である。軟骨細胞は、主にコラーゲン及びプロテオグリカンから成る軟骨性マトリックスを産生し、維持する。軟骨内の軟骨細胞の構造は、軟骨の種類及びそれらが見出される組織の場所によって異なる。
【００５２】
従って、１つの実施形態では、本発明は、線維芽細胞を脂肪細胞に分化させるための方法であって、線維芽細胞培養用培地（例えば、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２，Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ウォーカーズビル，ＭＤ）中で線維芽細胞を標準条件下でコンフルエント状態まで増殖させることと、第１の分化細胞培地（例えば、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １）中で該細胞を約４日間培養することと、第２の分化細胞培地（例えば、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２）中で該細胞を１７日間培養することと、脂肪細胞の存在を確認することとを含む、方法を提供する。
【００５３】
好ましい態様では、線維芽細胞は、線維芽細胞は、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２細胞培養用培地（表１）中でコンフルエント状態まで増殖される。次いで、該細胞は、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １細胞培養用培地（ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ培地（表３）及びＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １補充物（表４））中で約４日間増殖される。次いで、該細胞は、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２細胞培養用培地（ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ培地（表３）及びＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２補充物（表５））中で１７日間増殖される。１つの態様では、脂肪細胞の存在は、脂肪細胞の主な特徴である蓄積した脂質滴を検出するためにオイルレッドＯ染色剤を用いて確認される。
【００５４】
（表１）
2015535424.tif 000002
2015535424.tif 000003
【００５５】
（表２）ＤｅｒｍａＬｉｆｅ
2015535424.tif 000004
【００５６】
（表３）ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ細胞培地
2015535424.tif 000005
【００５７】
（表４）ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １補充物
2015535424.tif 000006
【００５８】
（表５）ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２補充物
2015535424.tif 000007
【００５９】
本発明の方法は、標準的なぺトリ皿を使用する。従来の開示は、細胞を接着させるためにフィブロネクチン等の追加のコーティングで標準プレートを被覆する必要性を示している。開示された培地を用いて、細胞は追加のコーティングの必要なく標準的な細胞培養皿上で増殖する。追加のコーティングなしで細胞を増殖させる能力は、本発明の驚くべき態様である。
【００６０】
１つの態様では、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ細胞培養用培地は、Ｄｅｒｍａｌｉｆｅ；Ｌ−グルタミン  １〜２０ｍＭ；プラスマネート  １〜２０％；デキサメタゾン  １〜２０μＭ；インシュリン  １〜１００μｇ／ｍｌ；アスコルビン酸−２−リン酸  １〜１００μｇ／ｍｌ；インドメタシン  ５〜５００μＭ；ＥＧＦ  １〜１０ｎｇ／ｍｌ；グリシン  ０．１〜５ｍＭ；アラニン  ０．１〜５ｍＭ；プロリン  ０．１〜５ｍＭ；ビオチン  ０．０００１〜０．０１ｍＭ；リボフラビン  ０．０００１〜０．０１ｍＭ；ビタミンＢ１２  ０．０００１〜０．０１ｍＭ；及びリポ酸  ０．０００１〜０．０１ｍＭを含む。
【００６１】
好ましい態様では、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ細胞培養用培地は、Ｄｅｒｍａｌｉｆｅ；Ｌ−グルタミン  ６ｍＭ；プラスマネート  ２％；デキサメタゾン  ５μＭ；インシュリン  １０μｇ／ｍｌ；アスコルビン酸−２−リン酸  ５０μｇ／ｍｌ；インドメタシン  ５０μＭ；ＥＧＦ  ５ｎｇ／ｍｌ；グリシン  ０．６７ｍＭ；アラニン  ０．２８ｍＭ；プロリン  ０．３５ｍＭ；ビオチン  ０．０００４１ｍＭ；リボフラビン  ０．０００２６６ｍＭ；ビタミンＢ１２  ０．００１０００４ｍＭ；及びリポ酸  ０．０００９７１ｍＭを含む。
【００６２】
別の態様では、ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １補充物は、Ｌ−グルタミン  １〜２００ｍＭ；プラスマネート  １０〜５０％；デキサメタゾン  １０〜１０００μＭ；インシュリン  １０〜３００μｇ／ｍｌ；アスコルビン酸−２−リン酸  １０〜１０００μｇ／ｍｌ；インドメタシン  ０．１〜１０ｍＭ；ＥＧＦ  １０〜３００μｇ／ｍｌ；及びトログリタゾン  １０〜１０００μＭを含む。培地は、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １細胞培養用培地を作製するために使用直前にＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ培地と組み合わされる。
【００６３】
好ましい態様では、ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １細胞培養用培地は、Ｌ−グルタミン  １０３ｍＭ；プラスマネート  ３４％；デキサメタゾン  ８６μＭ；インシュリン  １７２μｇ／ｍｌ；アスコルビン酸−２−リン酸  ８６０μｇ／ｍｌ；インドメタシン  ８６０μＭ；ＥＧＦ  ８６μｇ／ｍｌ；及びトログリタゾン  ２０２μＭを含み、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １細胞培養用培地を作製するために使用直前にＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ培地と組み合わされる。
【００６４】
更なる態様では、ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２補充物は、Ｌ−グルタミン  １〜２００ｍＭ；プラスマネート  １０〜５０％；デキサメタゾン  １０〜１０００μＭ；インシュリン  １０〜３００μｇ／ｍｌ；アスコルビン酸−２−リン酸  １０〜１０００μｇ／ｍｌ；インドメタシン  ０．１〜１０ｍＭ；及びＥＧＦ  １０〜３００μｇ／ｍｌを含む。培地は、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２細胞培養用培地を作製するために使用直前にＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ培地と組み合わされる。
【００６５】
好ましい態様では、ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２細胞培養用培地は、Ｌ−グルタミン  １０３ｍＭ；プラスマネート  ３４％；デキサメタゾン  ８６μＭ；インシュリン  １７２μｇ／ｍｌ；アスコルビン酸−２−リン酸  ８６０μｇ／ｍｌ；インドメタシン  ８６０μＭ；及びＥＧＦ  ８６μｇ／ｍｌを含み、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２細胞培養用培地を作製するために使用直前にＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ培地と組み合わされる。
【００６６】
トログリタゾン（レズリン、レスリン、又はロモジン）は、抗糖尿病薬及び抗炎症薬であり、チアゾリジンジオンの薬物類のメンバーである。トログリタゾンは、ＰＰＡＲα及びより強力なＰＰＡＲγ受容体の両方に対するリガンドである。ＴＺＤの異なったメンバーは、トログリタゾンよりもＰＰＡＲγ受容体にかなり排他的であるロシグリタゾンであり、ＰＰＡＲγ受容体に架橋する重要なステップを介して３Ｔ３Ｌ１株を脂肪形成に誘発するために使用された最初の薬物であった。ロシグリタゾンは、ネズミ及びニワトリの胚線維芽細胞で機能していたが、ヒト線維芽細胞での試験には使用できない。トログリタゾンは、ＰＰＡＲγ受容体を架橋するための可能な置換物として選択された。トログリタゾンは、ロシグリタゾンほど特異的ではなく、そのＥＣ５０は種間で著しく異なるが、今日までの結果は、トログリタゾンを他の要素と組み合わせて使用した時に、ヒト細胞培養の表面の最小７０％が脂肪蓄積細胞で覆われることを示している。トログリタゾンは、この適用には顕著に短寿命の試薬である（−２０℃で、粉末形態で３ヶ月）。我々の特定の製剤、ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １は、−２０℃で保存した時に、少なくとも２年までの保存寿命の延長が可能である。
【００６７】
１つの実施形態では、本発明は、線維芽細胞培養用培地（例えば、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２培地，Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ウォーカーズビル，ＭＤ）中で線維芽細胞を標準条件下でコンフルエント状態まで増殖させることと；該細胞を第１の分化細胞培地（例えば、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １培地）中で約４日間培養することと；該細胞を第２の分化細胞培地（例えば、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２培地）中で１７日間培養することと；脂肪細胞の存在を確認することとを含む方法によって作製された脂肪細胞を提供する。
【００６８】
好ましい態様では、脂肪細胞は、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２細胞培養用培地中で線維芽細胞をコンフルエント状態まで増殖させることを含む方法によって作製される。次いで、該細胞は、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １細胞培養用培地中で約４日間増殖される。次いで、該細胞は、ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２細胞培養用培地中で１７日間増殖される。１つの態様では、脂肪細胞の存在は、脂肪細胞の主な特徴である蓄積した脂質滴を検出するためにオイルレッドＯ染色剤を用いて確認される。
【００６９】
別の実施形態では、本発明は、線維芽細胞を骨細胞に分化させる方法であって、線維芽細胞培養用培地（ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２培地，Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ウォーカーズビル，ＭＤ）中で線維芽細胞を標準条件下でコンフルエント状態まで増殖させることと；該細胞を骨形成細胞培養用培地（ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ培地）中で３週間培養することと；骨細胞の存在を確認することとを含む、方法を提供する。
【００７０】
好ましい態様では、線維芽細胞は、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２（表１）細胞培養用培地中でコンフルエント状態まで増殖される。次いで、線維芽細胞は、ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ培地（表６）細胞培養用培地中で３週間増殖される。１つの態様では、骨細胞の存在は、骨を生成する骨細胞の主な特徴であるカルシウム蓄積を検出するためにアリザリンレッド染色剤を用いて確認される。
【００７１】
（表６）ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ
2015535424.tif 000008
【００７２】
１つの態様では、ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ細胞培養用培地は、ＤＭＥＭ；Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ  １〜１００ｍＭ；ＦＢＳ  １〜５０％；ＥＧＦ  ０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ；ｂＦＧＦ  ０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ；ａＦＧＦ  ０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ；β−グリセロリン酸  １〜１００ｍＭ；アスコルビン酸−２−リン酸  １０〜１０００μｇ／ｍｌ；デキサメタゾン  ０．１〜１００μＭ；ヒアルロン酸  １〜１００μｇ／ｍｌ；グルコサミン硫酸  １〜１００μｇ／ｍｌ、及びガラクトース  ０．１〜５０ｇ／Ｌを含む。
【００７３】
好ましい態様では、ＯｓｔｅｏＬｉｆｅＣｏｍｐｌｅｔｅ細胞培養用培地は、ＤＭＥＭ；Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ  ６ｍＭ；ＦＢＳ  １％；ＥＧＦ  ５ｎｇ／ｍｌ；ｂＦＧＦ  ５ｎｇ／ｍｌ；ａＦＧＦ  ５ｎｇ／ｍｌ；β−グリセロリン酸  １０ｍＭ；アスコルビン酸−２−リン酸  ５０μｇ／ｍｌ；デキサメタゾン  ０．１μＭ；ヒアルロン酸  １〜１００μｇ／ｍｌ；グルコサミン硫酸  １〜１００μｇ／ｍｌ、及びガラクトース  ０．１〜５０ｇ／Ｌを含む。
【００７４】
別の実施形態では、本発明は、線維芽細胞培養用培地（ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２，Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ウォーカーズビル，ＭＤ）中で線維芽細胞を標準条件下でコンフルエント状態まで増殖させることと；該細胞を骨形成細胞培養用培地（ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ培地）中で３週間培養することと；骨細胞の存在を確認することとを含む方法によって作製された骨細胞を提供する。
【００７５】
別の実施形態では、本発明は、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２細胞培養用培地中で線維芽細胞を標準条件下でコンフルエント状態まで増殖させることと；ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ細胞培養用培地中で該細胞を３週間培養することと；骨を生成する骨細胞の主な特徴であるカルシウム蓄積を検出するためにアリザリンレッド染色剤で染色することによって骨細胞の存在を確認することとを含む方法によって作製された骨細胞を提供する。
【００７６】
別の実施形態では、本発明は、線維芽細胞を軟骨細胞に分化させる方法であって、線維芽細胞培養用培地（ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２，Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ウォーカーズビル，ＭＤ）中で線維芽細胞を標準条件下で８０〜９０％コンフルエント状態まで増殖させることと；該細胞をペレット化することと；１．５％アルギネート溶液中に該細胞を再懸濁することと；シリンジを用いてアルギネートの細胞溶液を１００ｍＭ塩化カルシウムに添加して、マイクロビーズを形成することと；マイクロビーズ内部の細胞を軟骨形成細胞培養用培地（ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ，Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ウォーカーズビル，ＭＤ）中で３週間増殖させることと；軟骨細胞の存在を確認することとを含む、方法を提供する。
【００７７】
好ましい実施形態では、線維芽細胞は、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２細胞培養用培地中で８０〜９０％コンフルエント状態まで増殖される。次いで、該細胞は、ペレット化され、１．５％アルギネート溶液中に再懸濁される。次いで、アルギネートの細胞溶液は、シリンジを用いて１００ｍＭ塩化カルシウムに添加されて、マイクロビーズを形成する。次いで、該細胞は、マイクロビーズ内部で、ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ細胞培養用培地（表７）中で３週間増殖される。１つの態様では、軟骨細胞の存在は、軟骨を分泌する軟骨細胞の主な特徴である硫酸化プロテオグリカンを検出するためにアルシアンブルー染色剤を用いて確認される。
【００７８】
（表７）ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ
2015535424.tif 000009
【００７９】
１つの態様では、ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ軟骨形成細胞培養用培地は、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ；グルコース  ０．１〜１０ｇ／Ｌ；プラスマネート  １〜２５％；グルタミン  １〜１００ｍＭ；デキサメタゾン  ０．１〜１００μＭ；インシュリン  ０．１〜２０μｇ／ｍｌ；ＰＳ−トランスフェリン  ０．１〜２０μｇ／ｍｌ；ＥＧＦ  ０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ；アスコルビン酸−２−リン酸  １０〜１０００μｇ／ｍｌ；Ｌ−プロリン  １０〜１０００μｇ／ｍｌ；ＴＧＦβ３  ０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ；グルクロン酸  １〜１００μｇ／ｍｌ；ガラクトース  ．０１〜５０ｇ／Ｌ；グルコサミン硫酸  １〜１００μｇ／ｍｌ；及びヒアルロン酸  １〜１００μｇ／ｍｌを含む。
【００８０】
好ましい態様では、ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ軟骨形成細胞培養用培地は、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ；グルコース  ４．５ｇ／Ｌ；プラスマネート  ２％；グルタミン  ６ｍＭ；デキサメタゾン  ０．１μＭ；インシュリン  ５μｇ／ｍｌ；ＰＳ−トランスフェリン  ５μｇ／ｍｌ；ＥＧＦ  ５ｎｇ／ｍｌ；アスコルビン酸−２−リン酸  ５０μｇ／ｍｌ；Ｌ−プロリン  ４０μｇ／ｍｌ；ＴＧＦβ３  ２ｎｇ／ｍｌ；グルクロン酸  ３．２４μｇ／ｍｌ；ガラクトース  ２ｇ／Ｌ；グルコサミン硫酸  １０μｇ／ｍｌ；及びヒアルロン酸  １０μｇ／ｍｌを含む。
【００８１】
別の実施形態では、本発明は、線維芽細胞培養用培地（ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２培地，ＬｉｆｅｌｉｎｅＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ウォーカーズビル，ＭＤ）中で線維芽細胞を標準条件下で８０〜９０％コンフルエント状態まで増殖させることと；該細胞をペレット化することと；該細胞を１．５％アルギネート溶液中に再懸濁することと；シリンジを用いてアルギネートの細胞溶液を１００ｍＭ塩化カルシウムに添加して、マイクロビーズを形成することと；マイクロビーズ内部の細胞を軟骨形成細胞培養用培地（ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ培地，ＬｉｆｅｌｉｎｅＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ウォーカーズビル，ＭＤ）中で３週間増殖させることと；軟骨細胞の存在を確認することとを含む方法によって作製された軟骨細胞を提供する。
【００８２】
好ましい実施形態では、軟骨細胞は、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２細胞培養用培地中で線維芽細胞を８０〜９０％コンフルエント状態まで増殖させることを含む方法によって作製される。次いで、該細胞は、ペレット化され、１．５％アルギネート溶液中に再懸濁される。次いで、アルギネートの細胞溶液は、シリンジを用いて１００ｍＭ塩化カルシウムに添加されて、マイクロビーズを形成する。次いで、該細胞は、マイクロビーズ内部で、ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ細胞培養用培地中で３週間増殖される。１つの態様では、軟骨細胞の存在は、軟骨を分泌する軟骨細胞の主な特徴である硫酸化プロテオグリカンを検出するためにアルシアンブルー染色剤を用いて確認される。
【００８３】
１つの実施形態では、本発明は、線維芽細胞を脂肪細胞に分化させるためのキットであって、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ細胞培養用培地；ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １補充物；ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２補充物；オイルレッドＯ染色剤；及び線維芽細胞を脂肪細胞に分化させるための使用説明書を含む、キットを提供する。
【００８４】
１つの実施形態では、本発明は、線維芽細胞を骨細胞に分化させるためのキットであって、ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ細胞培養用培地；アリザリンレッド染色剤；及び線維芽細胞を骨細胞に分化させるための使用説明書を含む、キットを提供する。
【００８５】
さらなる１つの実施形態では、本発明は、線維芽細胞を軟骨細胞に分化させるためのキットであって、ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ軟骨形成細胞培養用培地；アルシアンブルー染色剤；及び線維芽細胞を軟骨細胞に分化させるための使用説明書を含む、キットを提供する。
【００８６】
細胞外マトリックスは、引っ張り強度、圧縮抵抗、３次元組織キュー（ｃｕｅ）、並びに、成長因子及びサイトカインの貯蔵場所を与える、細胞によって分泌される物質である。肉眼解剖学レベルでの細胞外マトリックスの例は、治癒中の創傷、腱、靭帯、骨、軟骨、血管、角膜、歯、毛髪、及び皮膚である。細胞外マトリックスの小成分は、様々なケラチン、コラーゲン、エラスチン、ネスチン、カルシウムアパタイト、歯の象牙質、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、基底膜、及びあまり定義されていない結合組織である。
【００８７】
プロテオグリカンは、結合した複数の糖鎖を有するタンパク質骨格によって構成される。その外観は、むしろ、何千の長い足を有する線維性ヤスデのようである。プロテオグリカンの例は、粘液（ｍｕｃｏｕｓ）、テスティカン（ｔｅｓｔｉｃａｎ）、ルミカン（ｌｕｍｉｃａｎ）、アグレカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）、デコリン（ｄｅｃｏｒｉｎ）、ビグリカン（ｂｉｇｌｙｃａｎ）、ベルシカン（ｖｅｒｓｉｃａｎ）、フィブロモジュリン（ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）、シンデカン（ｓｙｎｄｅｃａｎ）、ニューロカン（ｎｅｕｒｏｃａｎ）、グリピカン（ｇｌｙｐｉｃａｎ）、及びペルレカン（ｐｅｒｌｅｃａｎ）である。
【００８８】
プロテオグリカンに結合された糖（又は炭水化物）鎖は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ、ムコ多糖とも称される）と呼ばれる。該鎖は、１〜６炭素糖（ヘキソース又はヘキサウロン酸とも称される）と窒素を含む１〜６炭素糖（ヘキソサミンと称される）とによって構成される繰り返し二糖単位から成る糖類の長非分岐鎖である。プロテオグリカンに結合されたＧＡＧの長さ及び数は大幅に変化する。それらは、異なった位置及び異なった量で硫酸化されてもよいか又はアセチル化されてもよい。ＧＡＧの例は、ヘパリンサルフェート、ヘパラン硫酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ケラチンサルフェート、コンドロイチン、及びデルマタン硫酸の様々な種である。タンパク質骨格に結合されていない唯一のＧＡＧはヒアルロン酸（又はヒアルウロナン）である。ＧＡＧは、細胞外マトリックス、細胞表面に大量に見出され、グルコシルホスファチジルイノシトール膜に共有結合される。ＧＡＧは、非常に限定された量で細胞内にも見出される。
【００８９】
炭水化物鎖の成分の例は、グルコース、マンノース、シアル酸、ガラクトース、フコース、グルクロン酸、ウロン酸、ヘキサウロン酸、イドウロン酸、ガラクトサミン、及びグルコサミンでよい。上記のように、糖類は様々な位置でアセチル化又は硫酸化される。
【００９０】
プロテオグリカンは複数の機能を提供する。それらは、組織内に水を保持し、成長因子、プロテアーゼ阻害剤、及び酵素を結合させ、シグナル伝達に関与し、かつ細胞外タンパク質に結合することによってマトリックスそれ自体を構成するために役立つ。ＧＡＧそれ自体は、そのタンパク質骨格に関して極端に嵩高い。アグリカンは、最も巨大タンパク質の１つであり、９０％糖鎖によって構成される。
【００９１】
本明細書で使用される「（１つの）複合糖類」及び「（複数の）複合糖類」という用語は、モノマー及びポリマー糖鎖を含む。細胞外マトリックス沈着を亢進する補充物としての糖類の使用は、本発明の特徴的な態様である。それらは、細胞種に特異的でありることができる。一例として、従来の研究は、本発明に開示された類似の製剤を用いて軟骨形成のための間葉系幹細胞であるが、グルコサミン硫酸を有さないことが示されている。この特別な複合糖類は、これまで、間葉系幹細胞からのマトリックス分泌に不利であることが分かっている。同様に、ヒアルロン酸の存在は、線維芽細胞からのマトリックス沈着に不利であることが示されている。驚くべき態様では、本発明は、培地中でのある特定の複合糖類の使用が骨細胞由来のカルシウム蓄積を大規模に増加させるが、他の糖類の使用はカルシウム蓄積を活性に抑制することを開示する。例えば、軟骨形成を経験したＭＳＣは、軟骨形成を大いに増大させる、ガラクトース、グルクロン酸、及びヒアルロン酸の使用を必要とし、グルコサミン硫酸の使用はマトリックス沈着を抑制するだろう。骨形成を経験したＭＳＣの場合には、ガラクトース、グルコサミン硫酸、及びヒアルロン酸が増加したカルシウム沈着量を大いに可能にするが、マンノース又はグルコースはマトリックス形成に不利である。ＭＳＣ様状態を獲得できた線維芽細胞は、軟骨形成のためにガラクトース、グルクロン酸、及びグルコサミン硫酸を必要とするが、ヒアルロン酸はそれを抑制するだろう。糖類の例は、ヒアルロン酸、ガラクトース、グルコサミン硫酸、グルクロン酸、マンノース、シアル酸、コンドロイチン硫酸、及びガラクトサミンである。
【００９２】
１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの複合糖類の存在下で細胞を培養することによって細胞外マトリックスを生成する方法を提供する。１つの態様では、複合糖類は、ヒアルロン酸、マンノース、シアル酸、コンドロイチン硫酸、ガラクトース、グルクロン酸、又はグルコサミン硫酸でよいが、これらに限定されない。別の態様では、細胞は、間葉系幹細胞由来の、脂肪細胞、骨細胞、又は軟骨細胞である。更なる態様では、細胞は、線維芽細胞由来の、脂肪細胞、骨細胞、又は軟骨細胞でよいが、これらに限定されない。線維芽細胞は、脂肪細胞、骨細胞、又は軟骨細胞に分化する前のＭＳＣ様状態を獲得することができる。更なる態様では、細胞は、骨細胞、軟骨細胞、血管細胞、又は創傷治癒細胞でよいが、これらに限定されない。
【００９３】
以下の実施例は、本発明を例証するためのものであるが、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００９４】
実施例１
脂肪細胞への線維芽細胞の分化
線維芽細胞を脂肪細胞に分化させるための方法が開発された。
【００９５】
線維芽細胞は、標準組織培養処理プラスチック上のＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２で増殖させた。線維芽細胞は、２０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、該細胞が約２日間でコンフルエント状態（約８０，０００細胞／ｃｍ２）まで増殖することができた。
【００９６】
細胞がコンフルエント状態に達すると、細胞培養用培地をＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  １培地に換えた。該細胞培養用培地は２日間毎に交換し続けた。４日後に、該細胞培養用培地は、１７日間、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２培地に換えた。ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉｆＦａｃｔｏｒ  ２培地中での５日間培養後に、脂質蓄積が見られた。
【００９７】
培養３週間後に、蓄積した脂質をアッセイするために、オイルレッドＯ染色剤で細胞を染色した。
【００９８】
実施例２
骨細胞への線維芽細胞の分化
線維芽細胞を骨細胞に分化させるための方法が開発された。
【００９９】
線維芽細胞は、標準組織培養処理プラスチック上のＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２で増殖させた。線維芽細胞は、２０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、該細胞が約２日間でコンフルエント状態（約８０，０００細胞／ｃｍ２）まで増殖することができた。
【０１００】
細胞がコンフルエント状態に達すると、細胞培養用培地をＯｓｔｅｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ培地（表６）に換えた。該細胞培養用培地は３〜４日毎に換えた。該細胞はＯｓｔｅｏＬｉｆｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ培地中で３週間増殖した。
【０１０１】
蓄積されたカルシウムを検出するために、上記細胞をアリザンレッドアッセイ法で染色した。Ｏｓｔｅｏ  ＬｉｆｅＣｏｍｐｌｅｔｅ培地中での該細胞の増殖７日後、カルシウム蓄積が見られた（データ非表示）。
【０１０２】
実施例３
軟骨細胞への線維芽細胞の分化
線維芽細胞を軟骨細胞に分化させるための方法が開発された。
【０１０３】
線維芽細胞は、標準組織培養処理プラスチック上のＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｓ２で増殖させた。線維芽細胞は、２０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、該細胞が、活性に増殖している８０〜９０％コンフルエント状態まで増殖することができた。
【０１０４】
細胞を遠心分離し、１．５％のアルギネート溶液中に２．５×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。アルギネート溶液中の細胞をシリンジに入れ、撹拌した１００ｍＭ塩化カルシウム溶液に適用して、マイクロビーズを形成した。１０分後、塩化カルシウム溶液を除き、マイクロビーズを４８ウェルプレートに移した。マイクロビーズを０．５ｍｌＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ軟骨形成培地（表７）で２回洗浄した。３７℃、５％ＣＯ２でプレートをインキュベートした。培地を３週間、２〜３日毎に換えた。
【０１０５】
軟骨細胞の増殖を試験するために、マイクロビーズを固定し、ＯＣＴ化合物中で冷凍し、５μＭ断片に切断し、ガラススライド上に固定した。硫酸化プロテオグリカンの存在を検出するために、アルシアンブルーでマイクロビーズを染色した。
【０１０６】
実施例４
特定の条件下で成長させた線維芽細胞は間葉系幹細胞マーカーを提示する
分化前の実施例１、２、又は３に記載の条件下で増殖させた線維芽細胞を、間葉系幹細胞マーカーについてフローサイトメトリーで試験した。結果を表８に示す。この結果は、これらの実施例に記載の条件下で増殖させた時に、線維芽細胞が、間葉系幹細胞で典型的に見出されるマーカーを発現することを示している。このことは、本明細書に記載の条件下での線維芽細胞の増殖が、間葉系幹細胞の能力を証明するのに必要である該細胞のプロファイルを獲得することを示している。
【０１０７】
（表８）
2015535424.tif 000010
＊直前に解凍した前培養線維芽細胞は、本願の条件パラメータを満たさない。しかし回復する４８時間後には、線維芽細胞は間葉系幹細胞条件プロファイルに適合する。
【０１０８】
本発明を上記実施例に参照しながら記載してきたが、修飾及び変更は本発明の趣旨及び範囲内に含まれることが理解されるだろう。従って、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【国際調査報告】
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