(57)【要約】本発明のいくつかの態様は、標的遺伝子の発現を活性化するための候補オリゴヌクレオチドを選択する方法を提供する。本発明の別の態様は、標的遺伝子の発現を活性化するオリゴヌクレオチドが豊富なオリゴヌクレオチドのセットを選択する方法を提供する。別の態様は、遺伝子発現を調節する一本鎖オリゴヌクレオチド、並びにそれを含む組成物及びキットを提供する。また、前記一本鎖オリゴヌクレオチドを用いて、遺伝子発現を調節する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現を活性化するための候補オリゴヌクレオチドを選択する方法であって、以下：
第１ヌクレオチド配列内のＰＲＣ２関連領域を選択するが、ここで、前記第１ヌクレオチド配列が、第１染色体において、前記標的遺伝子の５’末端の上流５０キロベースから前記標的遺伝子の３’末端の下流５０キロベースの間の位置に位置する、ステップ；
前記ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な第２ヌクレオチド配列を決定するステップ；並びに
前記候補オリゴヌクレオチドとして、前記第２ヌクレオチド配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを選択するが、ここで、前記オリゴヌクレオチドが、以下の特徴：
ａ）配列５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ（Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ヒトミクロＲＮＡのシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、ここで、Ｘは、前記オリゴヌクレオチドの５’末端に固定されている）；
ｂ）３個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない配列；
ｃ）ヌクレオチドの全ての配列に対し閾値レベルに満たない配列同一性を有し、オフターゲット遺伝子の５’末端の上流５０キロベースから前記オフターゲット遺伝子の３’末端の下流５０キロベースの間にある、前記第２ヌクレオチド配列と同等長さの配列；
ｄ）少なくとも２つの一本鎖ループを含む二次構造を形成するＲＮＡをコードするＰＲＣ２関連領域と相補的な配列；並びに
ｅ）６０％を超えるＧ−Ｃ含有率を有する配列
の少なくとも１つを有する、ステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、長さ５０ヌクレオチド以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、長さ８〜３０ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）の少なくとも２つを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）の少なくとも３つを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）の少なくとも４つを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）の各々を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
標的遺伝子の発現を活性化するオリゴヌクレオチドが豊富なオリゴヌクレオチドのセットを選択する方法であって、以下：
第１染色体において、前記標的遺伝子の５’末端の上流５０キロベースから前記標的遺伝子の３’末端の下流５０キロベースの間の位置に位置する第１ヌクレオチド配列内のＰＲＣ２関連領域を選択するステップ；
オリゴヌクレオチドのセットを選択するが、ここで、前記セットの各オリゴヌクレオチドは、前記ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な第２ヌクレオチド配列を含むと共に、以下の特徴：
ａ）配列５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ（Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ミクロＲＮＡのヒトシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、ここで、Ｘは、前記オリゴヌクレオチドの５’末端に固定されている）；
ｂ）３個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない配列；
ｃ）ヌクレオチドの全ての配列に対し閾値レベルに満たない配列同一性を有し、オフターゲット遺伝子の５’末端の上流５０キロベースから前記オフターゲット遺伝子の３’末端の下流５０キロベースの間にある、前記第２ヌクレオチド配列と同等長さの配列；
ｄ）少なくとも２つの一本鎖ループを含む二次構造を形成するＲＮＡをコードするＰＲＣ２関連領域と相補的な配列；並びに
ｅ）６０％を超えるＧ−Ｃ含有率を有する配列
の少なくとも１つを有する、ステップ
を含み、
前記オリゴヌクレオチドのセットは、標的遺伝子の発現を活性化するオリゴヌクレオチドが豊富である、方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドの各々が、長さ５０ヌクレオチド以下である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドの各々が、長さ８〜３０ヌクレオチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記セットのオリゴヌクレオチドの各々が、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）の少なくとも１つを共通して有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記セットのオリゴヌクレオチドの各々が、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）の少なくとも２つを共通して有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記セットのオリゴヌクレオチドの各々が、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）の少なくとも３つを共通して有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記セットのオリゴヌクレオチドの各々が、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）の少なくとも４つを共通して有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記セットのオリゴヌクレオチドの各々が、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）の各々を共通して有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
配列同一性の閾値レベルが、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％配列同一性である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１染色体が、第１種の染色体であり、前記方法が、以下：
前記第２ヌクレオチド配列が、第２種の第２染色体の第２領域と相同性であることを決定するステップであって、前記第２領域は、前記標的遺伝子の相同体の５’末端の上流５０キロベースから前記標的遺伝子の相同体の３’末端の下流５０キロベースの間に位置するステップ
をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２ヌクレオチド配列が、前記第２染色体の第２領域と少なくとも８０％相補的である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１ヌクレオチド配列が、前記標的遺伝子のセンス鎖を含む前記第１染色体の鎖に位置する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１ヌクレオチド配列が、前記標的遺伝子のアンチセンス鎖を含む前記第１染色体の鎖に位置する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰＲＣ２関連領域が、前記標的遺伝子の５’末端の上流にある、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰＲＣ２関連領域が、前記標的遺伝子の３’末端の下流にある、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＰＲＣ２関連領域が、前記標的遺伝子のイントロン内にある、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＲＣ２関連領域が、前記標的遺伝子のエキソン内にある、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＲＣ２関連領域が、前記標的遺伝子のイントロン−エキソン接合部、５’−ＵＴＲ−エキソン接合部又は３’−ＵＴＲ−エキソン接合部を横断する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＰＲＣ２関連領域が、少なくとも２つの一本鎖ループを含む二次構造を形成するＲＮＡをコードする、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記二次構造が、少なくとも２つの一本鎖ループの間に二本鎖ステムを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドが、少なくとも１つの前記ループの少なくとも一部をコードする、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドが、少なくとも２つの前記ループの少なくとも一部をコードする、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドが、前記二本鎖ステムの少なくとも一部をコードする、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
第１染色体において、標的遺伝子の５’末端の上流５０キロベースから前記標的遺伝子の３’末端の下流５０キロベースの間に位置するＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的である相補性の領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチドであって、ここで、前記オリゴヌクレオチドが、以下：
ａ）５’−Ｘ−Ｙ−Ｚを含む配列（Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ミクロＲＮＡのヒトシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列である）；
ｂ）３個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない配列；
ｃ）ヌクレオチドの全ての配列に対し閾値レベルに満たない配列同一性を有し、オフターゲット遺伝子の５’末端の上流５０キロベースから前記オフターゲット遺伝子の３’末端の下流５０キロベースの間にある、第２ヌクレオチド配列と同等長さの配列；
ｄ）少なくとも２つの一本鎖ループを含む二次構造を形成するＲＮＡをコードするＰＲＣ２関連領域と相補的な配列；並びに／又は
ｅ）６０％を超えるＧ−Ｃ含有率を有する配列
の少なくとも１つを有する、一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
前記第１染色体が、第１種の染色体であり、少なくとも８個の連続したヌクレオチドを含む配列が、第２染色体において、前記標的遺伝子の相同体の５’末端の上流５０キロベースから前記標的遺伝子の相同体の３’末端の下流５０キロベースの間に位置し、前記第２染色体は、第２種の染色体である、請求項３１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
前記第１種が、ヒトであり、前記第２種が、マウスである、請求項３２に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドが、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）の少なくとも２つを有する、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドが、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）の少なくとも３つを有する、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチドが、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）の少なくとも４つを有する、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記オリゴヌクレオチドが、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）の各々を有する、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記オリゴヌクレオチドが、長さ５０ヌクレオチド以下である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
前記オリゴヌクレオチドが、長さ８〜３０ヌクレオチドである、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
前記オリゴヌクレオチドが、長さ８〜１０ヌクレオチドであり、前記ＰＲＣ２関連領域の相補的配列のヌクレオチドの１、２、若しくは３個を除く全てが、シトシン又はグアノシンヌクレオチドである、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
前記ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個のヌクレオチドが、前記標的遺伝子のセンス鎖を含む前記染色体の鎖に位置する、請求項３１〜３７のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
前記ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個のヌクレオチドが、前記標的遺伝子のアンチセンス鎖を含む前記染色体の鎖に位置する、請求項３１〜３７のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
前記ＰＲＣ２関連領域が、前記標的遺伝子の５’末端の上流にある、請求項３１〜４２のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
前記ＰＲＣ２関連領域が、前記標的遺伝子の３’末端の下流にある、請求項３１〜４２のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
前記ＰＲＣ２関連領域が、前記標的遺伝子のイントロン内にある、請求項３１〜４２のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
前記ＰＲＣ２関連領域が、前記標的遺伝子のエキソン内にある、請求項３１〜４２のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
前記ＰＲＣ２関連領域が、前記標的遺伝子のイントロン−エキソン接合部、５’−ＵＴＲ−エキソン接合部又は３’−ＵＴＲ−エキソン接合部を横断する、請求項３１〜４２のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
前記ＰＲＣ２関連領域が、少なくとも２つの一本鎖ループを含む二次構造を形成するＲＮＡをコードする、請求項３１〜４７のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
前記二次構造が、少なくとも２つの一本鎖ループの間に二本鎖ステムを含む、請求項４８に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
前記ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドが、少なくとも１つの前記ループの少なくとも一部をコードする、請求項４８又は４９に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５１】
前記ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドが、少なくとも２つの前記ループの少なくとも一部をコードする、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５２】
前記ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドが、前記二本鎖ステムの少なくとも一部をコードする、請求項４８〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドが、ヌクレオチド類似体である、請求項３１〜５２のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５４】
前記少なくとも１個のヌクレオチド類似体が、前記少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含まないオリゴヌクレオチドと比較して、１〜５℃の範囲のオリゴヌクレオチドのＴｍの増加をもたらす、請求項５３に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５５】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドが、２’Ｏ−メチルを含む、請求項３１〜５４のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５６】
前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドが、２’Ｏ−メチルを含む、請求項３１〜５４のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５７】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１個のリボヌクレオチド、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチド、又は少なくとも１個の架橋ヌクレオチドを含む、請求項３１〜５４のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５８】
前記架橋ヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド又はＥＮＡヌクレオチド類似体である、請求項５７に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５９】
前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドである、請求項３１〜５４のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６０】
前記オリゴヌクレオチドの前記ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドと２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを交互に含む、請求項３１〜５４のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６１】
前記オリゴヌクレオチドの前記ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む、請求項３１〜５４のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６２】
前記オリゴヌクレオチドの前記ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドとＥＮＡヌクレオチド類似体を交互に含む、請求項３１〜５４のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６３】
前記オリゴヌクレオチドの前記ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドを交互に含む、請求項３１〜５４のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６４】
前記オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである、請求項６０〜６３のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６５】
前記オリゴヌクレオチドの前記ヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む、請求項３１〜５４のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６６】
前記オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドである、請求項６５に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６７】
前記オリゴヌクレオチドの前記ヌクレオチドが、前記デオキシリボヌクレオチドの前記５’及び３’末端の各々で、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオチドによってフランキングされているデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項３１〜５４のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６８】
少なくとも２個のヌクレオチドの間に、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項３１〜６８のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６９】
全てのヌクレオチドの間に、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項６８に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７０】
前記オリゴヌクレオチドの前記３’位のヌクレオチドが、３’ヒドロキシル基を有する、請求項３１〜６９のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７１】
前記オリゴヌクレオチドの前記３’位のヌクレオチドが、３’チオホスフェートを有する、請求項３１〜６９のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７２】
前記５’ヌクレオチドに結合したビオチン部分をさらに含む、請求項３１〜７１のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７３】
前記５’若しくは３’末端のいずれか又はその両方に、以下のコンジュゲート：コレステロール、ビタミンＡ、葉酸塩、シグマ受容体リガンド、アプタマー、ＣＰＰなどのペプチド、脂質などの疎水性分子、ＡＳＧＰＲ又は動的ポリ抱合体並びにそれらの変異体の１つ又は複数をさらに含む、請求項３１〜７１のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７４】
標的遺伝子の発現を調節する長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有する長さ８〜３０ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの２〜１９ヌクレオチドが、ヌクレオチド類似体である、一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７５】
前記少なくとも１個のヌクレオチド類似体が、前記ヌクレオチド類似体を含まないオリゴヌクレオチドと比較して、１〜５℃の範囲のオリゴヌクレオチドのＴｍの増加をもたらす、請求項７４に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７６】
前記ヌクレオチド類似体が、架橋ヌクレオチド、２’フルオロ、及び２’Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群から選択される、請求項７４に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７７】
前記架橋ヌクレオチドが、ＬＮＡ、ＥＮＡ又はｃＥｔヌクレオチドである、請求項７６に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７８】
前記ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドと２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを交互に含む、請求項７４に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７９】
前記ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む、請求項７４に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項８０】
前記ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドとＥＮＡヌクレオチド類似体を交互に含む、請求項７４に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項８１】
前記ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドを交互に含む、請求項７４に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項８２】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである、請求項７４に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項８３】
前記ヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む、請求項７４に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項８４】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドである、請求項７４に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項８５】
前記ヌクレオチドが、前記デオキシリボヌクレオチドの前記５’及び３’末端の各々で、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオチドによってフランキングされているデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項７４に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項８６】
少なくとも２個のヌクレオチドの間に、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項７４〜８５のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項８７】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドの前記３’位のヌクレオチドが、３’ヒドロキシル基を有する、請求項７４に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項８８】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドの前記３’位のヌクレオチドが、３’チオホスフェートを有する、請求項７４に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項８９】
標的遺伝子の発現を調節する長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の少なくとも５個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有する長さ５〜３０ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、切断性リンカーにより第２オリゴヌクレオチドと連結されている、一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項９０】
前記オリゴヌクレオチドが、請求項３１〜７３のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドの前記構造を有する、請求項７４に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項９１】
タンパク質コード標準遺伝子の発現を調節する、ＰＲＣ２結合の長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の少なくとも５個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有する長さ８〜４０ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチドであって、ここで、前記ｌｎｃＲＮＡが、タンパク質コード標準遺伝子を含むゲノム領域中のタンパク質コード標準遺伝子の逆鎖から転写され、前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、エキソン、イントロン、エキソン、イントロン−エキソン接合部、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、翻訳開始領域、又は翻訳終結領域内で始まるか、又はこれと重複するｌｎｃＲＮＡの領域と結合する、一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項９２】
標的遺伝子の発現を調節する、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の少なくとも５個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有する長さ８〜４０ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、前記標的遺伝子の前記転写領域の外側にある前記ｌｎｃＲＮＡの領域において前記ｌｎｃＲＮＡとの相補性を有する、一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項９３】
標的遺伝子の発現を阻害する、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の少なくとも５個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有する長さ８〜３０ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、前記標的遺伝子の非コード部分から転写される前記ｌｎｃＲＮＡの領域において前記ｌｎｃＲＮＡとの相補性を有する、一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項９４】
請求項３１〜７３のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドと、担体とを含む組成物。
【請求項９５】
請求項３１〜７３のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドと、緩衝液とを含む組成物。
【請求項９６】
請求項３１〜７３のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項９７】
請求項９４〜９６のいずれか１項に記載の組成物を収納する容器を含むキット。
【請求項９８】
標的遺伝子の発現を調節する、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の少なくとも５個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有する長さ８〜２０ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの組成物であって、前記オリゴヌクレオチドの２〜１９ヌクレオチドが、ヌクレオチド類似体であり、前記組成物は、薬学的に許容される担体で製剤化されており、ここで、相補的ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、前記組成物中に存在しない、組成物。
【請求項９９】
前記ヌクレオチド類似体が、架橋ヌクレオチド、２’フルオロ、及び２’Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群から選択される、請求項９８に記載の組成物。
【請求項１００】
前記架橋ヌクレオチドが、ＬＮＡ、ＥＮＡ又はｃＥＴヌクレオチドである、請求項９９に記載の組成物。
【請求項１０１】
前記ｌｎｃＲＮＡが、前記標的遺伝子を含むゲノム領域中の前記標的遺伝子の逆鎖から転写されている、請求項９８に記載の組成物。
【請求項１０２】
前記オリゴヌクレオチドが、前記標的遺伝子の非コード部分から転写されるｌｎｃＲＮＡの領域においてｌｎｃＲＮＡとの相補性を有する、請求項９８に記載の組成物。
【請求項１０３】
前記オリゴヌクレオチドが、前記標的遺伝子の転写領域の外側にある前記ｌｎｃＲＮＡの領域において前記ｌｎｃＲＮＡとの相補性を有する、請求項９８に記載の組成物。
【請求項１０４】
細胞における標的遺伝子の発現を増大する方法であって、請求項３１〜７３のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドを前記細胞に送達することを含む方法。
【請求項１０５】
被験者における標的遺伝子の発現を増大する方法であって、請求項３１〜７３のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドを前記被験者に投与することを含む方法。
【請求項１０６】
被験者における標的遺伝子のレベル低下に関連する状態を治療する方法であって、請求項３１〜７３のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドを前記被験者に投与することを含む方法。
【請求項１０７】
遺伝子発現を上方制御する方法であって、標的遺伝子の発現を阻害する、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の少なくとも５個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有する長さ８〜３０ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドと、細胞を接触させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従い、以下：２０１２年５月１６日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／６４８，０１６号明細書；２０１２年５月１６日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／６４８，０２１号明細書；２０１３年３月１４日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／７８６，２３２号明細書；２０１２年５月１６日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＳＭＮ  ＧＥＮＥ  ＦＡＭＩＬＹ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／６４７，８５８号明細書；２０１２年１０月２７日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＳＭＮ  ＧＥＮＥ  ＦＡＭＩＬＹ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／７１９，３９４号明細書；２０１３年３月１４日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＳＭＮ  ＧＥＮＥ  ＦＡＭＩＬＹ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／７８５，５２９号明細書；２０１２年５月１６日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＵＴＲＮ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／６４７，８８６号明細書；２０１２年５月１６日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＨＥＭＯＧＬＯＢＩＮ  ＧＥＮＥ  ＦＡＭＩＬＹ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／６４７，９０１号明細書；２０１３年３月１４日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＨＥＭＯＧＬＯＢＩＮ  ＧＥＮＥ  ＦＡＭＩＬＹ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／７８５，９５６号明細書；２０１２年５月１６日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＡＴＰ２Ａ２  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／６４７，９２５号明細書；２０１３年３月１４日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＡＴＰ２Ａ２  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／７８５，８３２号明細書；２０１２年５月１６日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＡＰＯＡ１  ＡＮＤ  ＡＢＣＡ１  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／６４７，９４９号明細書；２０１３年３月１４日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＡＰＯＡ１  ＡＮＤ  ＡＢＣＡ１  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／７８５，７７８号明細書；２０１２年５月１６日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＰＴＥＮ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／６４８，０４１号明細書；２０１３年３月１４日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＰＴＥＮ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／７８５，８８５号明細書；２０１２年５月１６日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＢＤＮＦ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／６４８，０５８号明細書；及び２０１２年５月１６日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＭＥＣＰ２  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／６４８，０５１号明細書の利益を請求する。尚、これら出願は全て、その全内容を参照により本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
本発明は、オリゴヌクレオチドベースの組成物、並びに疾患を治療する目的でオリゴヌクレオチドベースの組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
トランスクリプトーム解析により、哺乳動物ゲノムのわずか１〜２％が、タンパク質コーディングであるが、７０〜９０％は転写活性であることが示されている。近年の発見から、これらの非タンパク質コード転写物のサブセットが、エピジェネティック調節に極めて重要な役割を果たすことは明らかである。その遍在性にもかかわらず、こうした転写物の多くの構造及び機能は、依然として特性決定されていないままである。近年の研究から、いくつかの長い非コードＲＮＡが、ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ）との相互反応により、クロマチン再構成においてエピジェネティック調節因子／ＲＮＡ補因子として機能し、従って、遺伝子発現を調節する機能を果たすことが示されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の別の態様は、標的遺伝子の発現を活性化又は増大するためのオリゴヌクレオチドを選択する方法を提供する。本方法は、発現又は活性の低減が疾患の原因となる、又は疾患に寄与するような標的遺伝子の発現を活性化又は増大するための候補オリゴヌクレオチドを同定するのにとりわけ有用である。本発明の別の態様は、標的遺伝子の発現を活性化するオリゴヌクレオチドが豊富な（例えば、オリゴヌクレオチドの無作為選択と比較して）オリゴヌクレオチドのセットを選択する方法が提供される。従って、本方法は、遺伝子発現を活性化するオリゴヌクレオチドが豊富な臨床候補の大きなライブラリーを確立するのに用いることができる。このようなライブラリーを用いて、治療薬を開発するためのリードオリゴヌクレオチドを同定することもできる。従って、本方法は、タンパク質コーディング遺伝子を含む周知の遺伝子の発現をターゲティングするための候補オリゴヌクレオチドの広範なプラットフォームを確立するのに用いることができる。別の態様は、遺伝子発現を調節する一本鎖オリゴヌクレオチド、及びこれを含む組成物及びキットを提供する。また、一本鎖オリゴヌクレオチドを用いて、遺伝子発現を調節する方法も提供される。
【０００５】
ある態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を活性化するための候補オリゴヌクレオチドを選択する方法であり、この方法は、第１ヌクレオチド配列内のＰＲＣ２関連領域を選択するが、ここで、第１ヌクレオチド配列が、第１染色体において、標的遺伝子の５’末端の上流５０キロベースから標的遺伝子の３’末端の下流５０キロベースの間の位置に位置する、ステップ；ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な第２ヌクレオチド配列を決定するステップ；並びに候補オリゴヌクレオチドとして、第２ヌクレオチド配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを選択するが、ここで、オリゴヌクレオチドが、以下の特徴：ａ）５’−Ｘ−Ｙ−Ｚを含む配列（Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ヒトミクロＲＮＡのシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、ここで、Ｘはオリゴヌクレオチドの５’末端に固定されている）；ｂ）３個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない配列；ｃ）ヌクレオチドの全ての配列に対し閾値レベルに満たない配列同一性を有し、オフターゲット遺伝子の５’末端の上流５０キロベースからオフターゲット遺伝子の３’末端の下流５０キロベースの間にある、第２ヌクレオチド配列と同等の長さの配列；ｄ）少なくとも２つの一本鎖ループを含む二次構造を形成するＲＮＡをコードするＰＲＣ２関連領域と相補的な配列；並びに／又はｅ）６０％を超えるＧ−Ｃ含有率を有する配列の少なくとも１つを有する、ステップにより、実施される。
【０００６】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の１つだけを有する。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の少なくとも２つを有し、これらは各々独立に選択される。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の少なくとも３つを有し、これらは各々独立に選択される。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の少なくとも４つを有し、これらは各々独立に選択される。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の各々を有する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドが８〜５０ヌクレオチドの長さである配列５’Ｘ−Ｙ−Ｚを有する。ある実施形態では、Ｙは、表３から選択される配列である。
【０００７】
別の態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を活性化する候補オリゴヌクレオチドが豊富なオリゴヌクレオチドのセットを選択する方法であり、この方法は、以下：第１染色体において、標的遺伝子の５’末端の上流５０キロベースから標的遺伝子の３’末端の下流５０キロベースの間の位置に位置する第１ヌクレオチド配列内のＰＲＣ２関連領域を選択するステップ；オリゴヌクレオチドのセットを選択するが、このセット中の各オリゴヌクレオチドが、ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な第２ヌクレオチド配列を含むと共に、以下の特徴：ａ）５’−Ｘ−Ｙ−Ｚの配列（Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ミクロＲＮＡのヒトシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、ここで、Ｘは、オリゴヌクレオチドの５’末端に固定されている）；ｂ）３個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない配列；ｃ）ヌクレオチドの全ての配列に対し閾値レベルに満たない配列同一性を有し、オフターゲット遺伝子の５’末端の上流５０キロベースからオフターゲット遺伝子の３’末端の下流５０キロベースの間にある、第２ヌクレオチド配列と同等の長さの配列；ｄ）少なくとも２つの一本鎖ループを含む二次構造を形成するＲＮＡをコードするＰＲＣ２関連領域と相補的な配列；並びに／又は）６０％を超えるＧ−Ｃ含有率を有する配列の少なくとも１つを有する、ステップにより実施され、オリゴヌクレオチドのセットは、標的遺伝子の発現を活性化するオリゴヌクレオチドが豊富である。
【０００８】
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドの各々は、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の１つだけを有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の少なくとも２つを有し、これらは各々独立に選択される。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の少なくとも３つを有し、これらは各々独立に選択される。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の少なくとも４つを有し、これらは各々独立に選択される。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の各々を有する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、このオリゴヌクレオチドが８〜５０ヌクレオチドの長さである配列５’Ｘ−Ｙ−Ｚを有する。ある実施形態では、Ｙは、表３から選択される配列である。
【０００９】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの各々は、長さが１００、５０、４０、３０、若しくは２０ヌクレオチド以下である。他の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの各々は、長さが８〜３０ヌクレオチドである。
【００１０】
ある実施形態における配列同一性の閾値レベルは、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性である。
【００１１】
一実施形態において、Ｙは、表３に記載する、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
【００１２】
別の実施形態において、第１染色体は、第１種の染色体であり、本方法は、第２ヌクレオチド配列が、第２種の第２染色体の第２領域と相同性であることを決定するステップをさらに含み、第２領域は、標的遺伝子の相同体の５’末端の上流５０キロベースから標的遺伝子の相同体の３’末端の下流５０キロベースの間に位置する。
【００１３】
第２ヌクレオチド配列は、第２染色体の第２領域と少なくとも８０％相補的であってよい。
【００１４】
別の実施形態において、第１ヌクレオチド配列は、標的遺伝子のセンス鎖を含む第１染色体の鎖に位置する。別の実施形態では、第１ヌクレオチド配列は、標的遺伝子のアンチセンス鎖を含む第１染色体の鎖に位置する。
【００１５】
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、標的遺伝子の５’末端の上流にあり、別の実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、標的遺伝子の３’末端の下流にある。任意選択で、ＰＲＣ２関連領域は、標的遺伝子のイントロン又はエキソン内にあってもよいし、あるいは、ＰＲＣ２関連領域は、標的遺伝子のイントロン−エキソン接合部、５’−ＵＴＲ−エキソン接合部又は３’−ＵＴＲ−エキソン接合部を横断してもよい。
【００１６】
ＰＲＣ２関連領域は、少なくとも２つの一本鎖ループを含む二次構造を形成するＲＮＡをコードするものであってもよい。任意選択で、二次構造は、少なくとも２つの一本鎖ループの間に二本鎖ステムを含む。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドは、少なくとも１つ若しくは少なくとも２つの前記ループの少なくとも一部又は前記二本鎖ステムの少なくとも一部をコードする。
【００１７】
他の態様では、本発明は、第１染色体において、標的遺伝子の５’末端の上流５０キロベースから標的遺伝子の３’末端の下流５０キロベースの間に位置するＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的である相補性の領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、ここで、オリゴヌクレオチドは、以下：ａ）５’−Ｘ−Ｙ−Ｚを含む配列（Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ミクロＲＮＡのヒトシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列である）；ｂ）３個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない配列；ｃ）ヌクレオチドの全ての配列に対し閾値レベルに満たない配列同一性を有し、オフターゲット遺伝子の５’末端の上流５０キロベースからオフターゲット遺伝子の３’末端の下流５０キロベースの間にある、第２ヌクレオチド配列と同等の長さの配列；ｄ）少なくとも２つの一本鎖ループを含む二次構造を形成するＲＮＡをコードするＰＲＣ２関連領域と相補的な配列；並びに／又はｅ）６０％を超えるＧ−Ｃ含有率を有する配列の少なくとも１つを有する。ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の１つだけを有する。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の少なくとも２つを有し、これらは各々独立に選択される。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の少なくとも３つを有し、これらは各々独立に選択される。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の少なくとも４つを有し、これらは各々独立に選択される。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドの各々は、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の各々を有する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドが８〜５０ヌクレオチドの長さである配列５’Ｘ−Ｙ−Ｚを有する。ある実施形態では、Ｙは、表３から選択される配列である。
【００１８】
第１染色体は、ある実施形態における第１種の染色体である。少なくとも８個の連続したヌクレオチドを含む配列は、第２染色体において、標的遺伝子の相同体の５’末端の上流５０キロベースから標的遺伝子の相同体の３’末端の下流５０キロベースの間に位置し、第２染色体は、第２種の染色体である。第１種は、ヒトであってよく、第２種は、マウスであってよい。
【００１９】
本発明はまた、長さ８〜３０ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチドを含み、この一本鎖オリゴヌクレオチドは、染色体において、標的遺伝子の５’末端の上流５０キロベースから標的遺伝子の３’末端の下流５０キロベースの間に位置するＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的であり、ここで、一本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、以下：（Ｘ）Ｘｘｘｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘｘｘＸｘ及び（Ｘ）ｘｘｘｘｘＸ、（Ｘ）ＸＸｘｘｘｘ、（Ｘ）ＸｘＸｘｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘＸｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘＸｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘＸＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘＸｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘｘＸＸｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸｘＸ及び（Ｘ）ｘｘｘｘＸＸ、（Ｘ）ＸＸＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸＸＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸＸＸｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸｘｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘＸｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘＸｘ、（Ｘ）ｘＸＸｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘＸＸｘＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘＸＸ、（Ｘ）ｘｘＸｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸｘＸ及び（Ｘ）ＸｘＸｘＸｘ、（Ｘ）ｘｘＸＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸＸＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸＸＸｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸＸＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸｘＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸｘＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸＸＸｘｘＸ、（Ｘ）ＸＸＸｘＸｘ、及び（Ｘ）ＸＸＸＸｘｘ、（Ｘ）ｘＸＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸＸｘＸＸ、（Ｘ）ＸＸＸＸｘＸ及び（Ｘ）ＸＸＸＸＸｘ、並びにＸＸＸＸＸＸ、ＸｘＸＸＸＸＸ、ＸＸｘＸＸＸＸ、ＸＸＸｘＸＸＸ、ＸＸＸＸｘＸＸ、ＸＸＸＸＸｘＸ及びＸＸＸＸＸＸｘ
から選択される１つ又は複数のヌクレオチド配列を含み、ここで、「Ｘ」は、ヌクレオチド類似体を示し、（Ｘ）は、任意選択のヌクレオチド類似体を示し、「ｘ」は、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチド単位を示す。
【００２０】
本発明の他の態様において、標的遺伝子の発現を調節する長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有する長さ８〜３０ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの２〜１９ヌクレオチドが、ヌクレオチド類似体である、一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。
【００２１】
他の態様において、標的遺伝子の発現を調節する長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の少なくとも５個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有する長さ５〜３０ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが、切断性リンカーにより第２オリゴヌクレオチドと連結されている、一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの構造を有する。
【００２２】
本発明の他の態様では、タンパク質コード標準遺伝子の発現を調節する、ＰＲＣ２結合の長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の少なくとも５個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有する長さ８〜４０ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチドが提供され、ここで、ｌｎｃＲＮＡは、タンパク質コード標準遺伝子を含有するゲノム領域中のタンパク質コード標準遺伝子の逆鎖から転写され、一本鎖オリゴヌクレオチドは、エキソン、イントロン、エキソン、イントロン−エキソン接合部、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、翻訳開始領域、又は翻訳終結領域内で始まるか、又はこれと重複するｌｎｃＲＮＡの領域に結合する。
【００２３】
本発明の他の態様では、標的遺伝子の発現を調節する、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の少なくとも５個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有する長さ８〜４０ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の転写領域の外側に位置するｌｎｃＲＮＡの領域においてｌｎｃＲＮＡとの相補性を有する。
【００２４】
本発明のさらに別の態様では、標的遺伝子の発現を阻害する、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の少なくとも５個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有する長さ８〜３０ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチドが提供され、ここで、オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の非コード部分から転写されるｌｎｃＲＮＡの領域においてｌｎｃＲＮＡに対し相補性を有する。
【００２５】
ある実施形態において、ｌｎｃＲＮＡは、ＰＲＣ２関連領域である。
【００２６】
本出願は、２０１１年１１月１２日に提出され、２０１２年５月１８日に国際公開第２０１２／０６５１４３号パンフレットとして公開された「ＰＯＬＹＣＯＭＢ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＮＯＮ−ＣＯＤＩＮＧ  ＲＮＡＳ」と題する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６０４９３号明細書における配列番号１〜１９３，０４９として記載されているヌクレオチド配列を参照により組み込む。これらの配列は、本明細書では、先頭に「Ａ」の付いた配列識別番号で示される。従って、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６０４９３号明細書からの、参照により組み込まれるヌクレオチド配列のセットは、「配列Ａ１〜Ａ１９３，０４９」と称する。
【００２７】
本出願はさらに、２０１１年１２月１９日に提出され、２０１２年６月２８日に国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットとして公開された「ＰＯＬＹＣＯＭＢ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＮＯＮ−ＣＯＤＩＮＧ  ＲＮＡＳ」と題する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／６５９３９号明細書における配列番号１〜９１６，２０９、又は９１６，６２６〜９４３，９３１として記載されているヌクレオチド配列も参照により組み込む。これらの配列は、本明細書では、先頭に「Ｂ」の付いた配列識別番号で示される。従って、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／６５９３９号明細書からの、参照により組み込まれるヌクレオチド配列のセットは、「配列Ｂ１〜Ｂ９１６，２０９、又はＢ９１６，６２６〜Ｂ９３４，９３１」と称する。
【００２８】
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、配列Ａ１〜Ａ１９３，０４９、配列Ｂ１〜Ｂ９１６，２０９、及びＢ９１６，６２６〜Ｂ９３４，９３１から選択されるヌクレオチド配列を有する。
【００２９】
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、配列は１〜１２１２から選択されるヌクレオチド配列を有する。
【００３０】
オリゴヌクレオチドは、どんな長さであってもよい。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１００、５０、４０、３０、又は２０ヌクレオチド以下の長さである。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さ８〜３０ヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さ８〜１０ヌクレオチドであり、ＰＲＣ２関連領域の相補的配列のヌクレオチドの１、２、若しくは３個を除く全てが、シトシン又はグアノシンヌクレオチドである。
【００３１】
ある実施形態におけるＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドは、標的遺伝子のアンチセンス鎖を含む染色体の鎖中にあり、別の実施形態では、標的遺伝子のセンス鎖を含む染色体の鎖中にある。
【００３２】
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、標的遺伝子の５’末端の上流にあり、別の実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、標的遺伝子の３’末端の下流にある。任意選択で、ＰＲＣ２関連領域は、標的遺伝子のイントロン又はエキソン内にあってもよいし、あるいは、ＰＲＣ２関連領域は、標的遺伝子のイントロン−エキソン接合部、５’−ＵＴＲ−エキソン接合部又は３’−ＵＴＲ−エキソン接合部を横断してもよい。
【００３３】
ＰＲＣ２関連領域は、少なくとも２つの一本鎖ループを含む二次構造を形成するＲＮＡをコードするものであってもよい。任意選択で、二次構造は、少なくとも２つの一本鎖ループの間に二本鎖ステムを含む。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドは、少なくとも１つ若しくは少なくとも２つのループの少なくとも一部又は二本鎖ステムの少なくとも一部をコードする。
【００３４】
ある実施形態では、少なくとも１個のヌクレオチド類似体によって、少なくとも１個のヌクレオチド類似体を含まないオリゴヌクレオチドと比較して、１〜５℃の範囲でオリゴヌクレオチドのＴｍの増加が起こる。
【００３５】
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体を含む。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体を含む。例えば、ヌクレオチド類似体は、２’Ｏ−メチル又は架橋ヌクレオチドであってよい。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のリボヌクレオチド、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチド、又は少なくとも１個の架橋ヌクレオチドを含む。架橋ヌクレオチドは、例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド又はＥＮＡヌクレオチド類似体であってよい。任意選択で、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドである。
【００３６】
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、複数のヌクレオチドタイプを交互に含む。例えば、ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及び２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む。また別の実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＥＮＡヌクレオチド類似体を交互に含むか、又はオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドを交互に含む。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドと２’Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む。
【００３７】
オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、異なる特性を有してもよい。例えば、ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド又はＬＮＡヌクレオチドである。
【００３８】
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’及び３’末端の各々で、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオチドによりフランキングされているデオキシリボヌクレオチドを含む。
【００３９】
一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個のヌクレオチド又は全ヌクレオチドの間に、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含んでもよい。
【００４０】
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドの３’位のヌクレオチドは、３’ヒドロキシル基を有する。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’位のヌクレオチドは、３’チオホスフェートを有する。
【００４１】
任意選択で、一本鎖オリゴヌクレオチドは、５’又は３’ヌクレオチドに結合したビオチン部分を有する。ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、５’又は３’末端のいずれか若しくは両方に、以下のコンジュゲート：コレステロール、ビタミンＡ、葉酸塩、シグマ受容体リガンド、アプタマー、ＣＰＰなどのペプチド、脂質などの疎水性分子、ＡＳＧＰＲ又は動的ポリ抱合体並びにそれらの変異体の１つ又は複数を有する。
【００４２】
別の態様において、組成物が提供される。組成物は、本明細書に開示する一本鎖オリゴヌクレオチド、並びに担体、緩衝液、及び／又は薬学的に許容される担体である。
【００４３】
ある態様において、本発明は、標的遺伝子の発現を調節する、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の少なくとも５個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有する長さ８〜２０ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの組成物であって、オリゴヌクレオチドの２〜１９ヌクレオチドが、ヌクレオチド類似体である組成物が、薬学的に許容される担体で製剤化された組成物であり、ここで、相補的ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、上記組成物中に存在しない。
【００４４】
ある実施形態において、ヌクレオチド類似体は、架橋ヌクレオチド、２’フルオロ、及び２’Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群から選択される。他の実施形態では、架橋ヌクレオチドは、ＬＮＡ、ＥＮＡ又はｃＥＴヌクレオチドである。
【００４５】
ｌｎｃＲＮＡは、標的遺伝子を含有するゲノム領域中の標的遺伝子の逆鎖から転写されてもよい。
【００４６】
ある態様において、オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の非コード部分から転写されるｌｎｃＲＮＡの領域においてｌｎｃＲＮＡとの相補性を有する。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の転写領域の外側にあるｌｎｃＲＮＡの領域においてｌｎｃＲＮＡとの相補性を有する。
【００４７】
組成物のいずれかを収納する容器を含むキットも提供される。
【００４８】
他の態様において、本発明は、本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドを細胞に送達することにより、細胞における標的遺伝子の発現を増大する方法である。
【００４９】
本発明の他の態様において、本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドを被験者に投与することにより、被験者における標的遺伝子の発現を増大する方法が提供される。
【００５０】
本発明のさらに別の態様において、本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドを被験者に投与することにより、被験者における標的遺伝子のレベル低下に関連する状態を治療する方法が提供される。
【００５１】
他の態様において、遺伝子発現を上方制御する方法が提供される。本方法は、標的遺伝子の発現を阻害する、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の少なくとも５個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有する長さ８〜３０ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドと細胞を接触させることを含む。
【００５２】
以下の出願：２０１１年１２月１９日に提出され、２０１２年６月２８日に国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットとして公開された「ＰＯＬＹＣＯＭＢ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＮＯＮ−ＣＯＤＩＮＧ  ＲＮＡＳ」と題する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／６５９３９号明細書、及び２０１１年１１月１２日に提出され、２０１２年５月１８日に国際公開第２０１２／０６５１４３号パンフレットとして公開された「ＰＯＬＹＣＯＭＢ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＮＯＮ−ＣＯＤＩＮＧ  ＲＮＡＳ」と題する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６０４９３号明細書は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
【００５３】
本発明の限定事項の各々は、本発明の様々な実施形態を包含し得る。従って、いずれか１つの要素又は要素の組合せを含む本発明の限定事項の各々が、本発明の各態様に含まれ得る。本発明は、本出願において、以下の説明に記載する、又は図面に示す構成要素の構成及び配置の詳細に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実践又は実施することができる。また、本明細書で用いる語法及び用語は、説明を目的とするものであり、制限的とみなすべきではない。本明細書において「包含する」、「含む」、又は「有する」、「含有する」、「含む（伴う）」、及びこれらの変形は、それらに続いて挙げる項目及びそれらの同等物並びに追加項目を包含することを意味する。
【００５４】
【表１−１】
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【００５５】
【表１−２】
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【００５６】
【表１−３】
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【００５７】
【表１−４】
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【００５８】
【表１−５】
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【００５９】
【表１−６】
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【００６０】
【表１−７】
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【００６１】
【表１−８】
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【００６２】
【表１−９】
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【００６３】
【表１−１０】
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【００６４】
【表１−１１】
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【００６５】
【表１−１２】
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【００６６】
【表１−１３】
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【００６７】
【表１−１４】
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【００６８】
【表１−１５】
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【００６９】
【表１−１６】
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【００７０】
【表１−１７】
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【００７１】
【表１−１８】
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【００７２】
【表１−１９】
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【００７３】
【表１−２０】
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【００７４】
【表１−２１】
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【００７５】
【表１−２２】
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【００７６】
【表１−２３】
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【００７７】
【表１−２４】
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【００７８】
【表１−２５】
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【００７９】
【表１−２６】
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【００８０】
【表１−２７】
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【００８１】
【表１−２８】
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【００８２】
【表１−２９】
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【００８３】
【表１−３０】
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【００８４】
【表１−３１】
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【００８５】
【表１−３２】
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【００８６】
【表１−３３】
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【００８７】
【表１−３４】
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【００８８】
【表１−３５】
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【００８９】
【表１−３６】
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【００９０】
【表１−３７】
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【００９１】
【表１−３８】
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【００９２】
【表１−３９】
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【００９３】
【表１−４０】
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【００９４】
【表１−４１】
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【００９５】
【表１−４２】
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【００９６】
【表１−４３】
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【００９７】
【表１−４４】
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【００９８】
【表１−４５】
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【００９９】
【表１−４６】
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【０１００】
【表１−４７】
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【０１０１】
【表１−４８】
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【０１０２】
【表１−４９】
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【０１０３】
【表１−５０】
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【０１０４】
【表１−５１】
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【０１０５】
【表１−５２】
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【０１０６】
【表１−５３】
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【０１０７】
【表１−５４】
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【０１０８】
【表１−５５】
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【０１０９】
【表１−５６】
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【０１１０】
【表１−５７】
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【０１１１】
表２：伸長ＰＲＣ２トランスクプトームによりヒットされる刷り込み領域
ＰＲＣ２トランスクプトームと刷り込み遺伝子座標（ｇｅｎｅｉｍｐｒｉｎｔ．ｃｏｍにてオンラインで入手可能）の交差。ＰＲＣ２結合転写物によりターゲティングされるマウス刷り込み遺伝子（すなわち、交差又は近傍の遺伝子）をカラム１に示す。カラム１はまた、マウス刷り込み遺伝子の染色体鎖も示す（「＋」符号は、遺伝子が、上鎖又はプラス鎖から転写されることを示し、「−」符号は、ＰＲＣ２結合転写物が、染色体の下鎖又はマイナス鎖から転写されることを示す）。カラム２には、ＰＲＣ２結合転写物のｍｍ９における染色体局在化及びヌクレオチド座標と共に、ＰＲＣ２結合転写物が、染色体の上鎖（プラス鎖ヒット）又は下鎖（マイナス鎖ヒット）のいずれから転写されているかを示す「＋」符号又は「−」符号も示す。カラム３は、マウスＰＲＣ２結合転写物（すなわち、ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換した、カラム２のマウス染色体座標及び鎖から転写されたヌクレオチド配列）の配列識別子を表示する。カラム４は、カラム１のマウス刷り込み遺伝子に対応するヒト遺伝子名を示し、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＧＤ）、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ．Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｊａｘ．ｏｒｇ）から取得した。カラム２に示すマウス染色体座標のマウスからヒトへのＬｉｆｔＯｖｅｒを本明細書に記載のＵＣＳＣゲノムブラウザで実施することにより、オーソロガスなヒト染色体座標を決定し、これらをカラム５に示す。５０％保存を用いてＬｉｆｔＯｖｅｒ解析を行った。マウス由来の高度に保存された領域又は相同的領域をヒトゲノムにマッピングすることにより、追加のヒト染色体座標を決定した。カラム６は、予測されるヒトＰＲＣ２結合転写物（すなわち、ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換した、カラム５のヒト染色体座標及び鎖から転写されたヌクレオチド配列）の配列識別子を表示する。ＰＲＣ２相互作用転写物が、カラム１の刷り込み標準遺伝子と比較して逆鎖から転写されている場合、これは、ＰＲＣ２相互作用ＲＮＡが、標準刷り込み遺伝子と相補的であるか、又はそのアンチセンス鎖（「逆鎖」）の配向であることを意味する。ＰＲＣ２結合転写物が、標準刷り込み遺伝子自体である必要はなく、位置が重複する個別の転写物であることに留意されたい。
【０１１２】
表３：ヒトｍｉＲＮＡのシード配列ではない六量体
【０１１３】
付録Ｉ：２０１０年１２月２０日に提出された米国仮特許出願第６１／４２５，１７４号明細書（その全体を参照により本明細書に組み込む）の付録Ｉは、完全なＲＩＰ  ｓｅｑデータセットの表であり、データセット中のリードを全て示す。付録Ｉは本明細書に添付されていない。付録Ｉ中の配列リードは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡ  ＩＩ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｚｅｒから直接得られたものであり、これらは、ＰＲＣ２結合転写物の逆相補鎖の配向である。付録Ｉは、アダプター／プライマー二量体、ミトコンドリアＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ホモポリマー、不確定のヌクレオチドを含むリード、及び切り捨てリード（＜１５ｎｔ）をバイオインフォーマティックフィルタリングで除去した後の、全リードのフィルタリング済みサブセットである。
【発明を実施するための形態】
【０１１４】
本明細書に記載する本発明の態様は、ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ）−相互反応ＲＮＡの発見に関する。ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ）は、ヒストンメチルトランスフェラーゼであり、ヒストンＨ３のメチル化によってゲノム領域のサイレンシングに関与する既知のエピジェネティック制御因子である。他の機能の中でも、ＰＲＣ２は、ＲｅｐＡ、及びＸｉｓｔ、及びＴｓｉｘなどの長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）と相互反応して、ヒストンＨ３−リシン２７のトリメチル化を触媒する。ＰＲＣ２は、４つのサブユニット、Ｅｅｄ、Ｓｕｚ１２、ＲｂＡｐ４８、及びＥｚｈ２を含む。
【０１１５】
本明細書において「ＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）−ｓｅｑ」と称する方法を用い、胚性幹細胞において、＞１００，０００のポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）相互作用ＲＮＡのゲノムワイドプールを同定した。多数の転写物が、刷り込み領域、癌遺伝子及び腫瘍抑制因子遺伝子座、及び幹細胞関連二価ドメイン内及びその周辺に存在する。直接ＲＮＡ−タンパク質相互作用（いくつかはＥｚｈ２サブユニットを介して）のエビデンスを確認した。さらに、これらのＰＲＣ２相互作用ＲＮＡと結合するように設計された一本鎖オリゴヌクレオチドが、様々な個別かつ独立した実施例において遺伝子発現をうまく上方制御することができるというエビデンスも立証されたが、これは、これら標的遺伝子のＰＲＣ２媒介抑制の阻害によるものと考えられる。このように、ＰＲＣ２複合体は、ＲＮＡのゲノムワイドファミリーと相互作用するため、これをヒトの疾患の治療標的として用いることができる。ある実施形態では、ＰＲＣ２と相互作用するＲＮＡの配列は、長さが４０〜６０ヌクレオチドであった。
【０１１６】
本明細書で用いる「ＰＲＣ２関連領域」という用語は、ＰＲＣ２の成分と直接又は間接的に相互作用するヌクレオチドの配列を含むか、又はこれをコードする核酸の領域を指す。ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用するＲＮＡ（例えば、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ））内に存在し得る。ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用するＲＮＡをコードするＤＮＡ内に存在し得る。
【０１１７】
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、ＲＮＡを発現する細胞のｉｎ  ｓｉｔｕ紫外線照射に応答してＰＲＣ２の成分に架橋するＲＮＡの領域、又はこのＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２の成分をターゲティングする抗体と免疫沈降するＲＮＡの領域、又はこのＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＳＵＺ１２、ＥＥＤ、ＥＺＨ２又はＲＢＢＰ４（ＰＲＣ２の成分である）を標的とする抗体と共に免疫沈降するＲＮＡの領域、又はこのＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。
【０１１８】
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２の成分をターゲティングする抗体を用いたＲＮＡ免疫沈降アッセイにおいてヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ）から保護されるＲＮＡの領域、又はこの保護されたＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＳＵＺ１２、ＥＥＤ、ＥＺＨ２又はＲＢＢＰ４をターゲティングする抗体を用いたＲＮＡ免疫沈降アッセイにおいてヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ）から保護されるＲＮＡの領域、又はこの保護されたＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。
【０１１９】
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２の成分をターゲティングする抗体を用いたＲＮＡ免疫沈降アッセイの産物のシークエンシング反応において、比較的高い頻度の配列リード数をもたらすＲＮＡの領域、又はこのＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＳＵＺ１２、ＥＥＤ、ＥＺＨ２又はＲＢＢＰ４を標的とする抗体を用いたＲＮＡ免疫沈降アッセイの産物のシークエンシング反応において、比較的高い頻度の配列リード数をもたらすＲＮＡの領域、又はこの保護されたＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。このような実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、「ピーク」と呼ばれることもある。
【０１２０】
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２複合体と相互作用する４０〜６０ヌクレオチドの配列を含む。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用するＲＮＡをコードする４０〜６０ヌクレオチドの配列を含む。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用する（例えば、４０〜６０ヌクレオチドの）配列を含む、長さ５ｋｂ以下の配列を含む。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用することがわかっている（例えば、４０〜６０ヌクレオチドの）配列を有する、長さ５ｋｂ以下の配列を含み、この配列内にＲＮＡがコードされている。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用する（例えば、４０〜６０ヌクレオチドの）配列を含む、長さ約４ｋｂの配列を含む。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用することがわかっている（例えば、４０〜６０ヌクレオチドの）配列を有する、長さ約４ｋｂの配列を含み、この配列内にＲＮＡがコードされている。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号９〜２９のいずれか１つに記載されている配列を有する。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号２４〜２９のいずれか１つに記載されている配列を有する。
【０１２１】
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、配列Ａ１〜Ａ１９３，０４９、配列Ｂ１〜Ｂ９１６，２０９、及びＢ９１６，６２６〜Ｂ９３４，９３１のいずれか１つに記載される配列を有する。
【０１２２】
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域、例えば、配列Ａ１〜Ａ１９３，０４９、配列Ｂ１〜Ｂ９１６，２０９、及びＢ９１６，６２６〜Ｂ９３４，９３１に記載される配列を有する核酸と特異的に結合するか、又はこれと相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。本発明の理論に拘束されるわけではないが、これらのオリゴヌクレオチドは、特定の染色体座へのＰＲＣ２の動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）を阻止することにより、ＰＲＣ２の結合及び機能を妨害することができる。例えば、本明細書のデータは、ＰＲＣ２関連領域ｌｎｃＲＮＡに特異的に結合するように設計された一本鎖オリゴヌクレオチドは、ｌｎｃＲＮＡだけではなく、ｌｎｃＲＮＡに結合するＰＲＣ２も、結合クロマチンから安定して置換することができることを示す。置換後、ＰＲＣ２の完全な補体は、２４時間後まで回復されない。さらに、本明細書に記載するデータから、ｌｎｃＲＮＡは、シス（ｃｉｓ）様式でＰＲＣ２を動員して、ｌｎｃＲＮＡが転写された特定の染色体座又はその付近での遺伝子発現を抑制することができるため、ＰＲＣ２の機能を阻害し、特定の標的遺伝子の発現を増大するオリゴヌクレオチドの設計を可能にすることが支持される。
【０１２３】
本発明の別の態様において、標的遺伝子の発現を活性化するための候補オリゴヌクレオチドを選択する方法が提供される。本方法は、一般に、候補オリゴヌクレオチドとして、ＰＲＣ２関連領域（例えば、配列Ａ１〜Ａ１９３，０４９、配列Ｂ１〜Ｂ９１６，２０９、及びＢ９１６，６２６〜Ｂ９３４，９３１に記載のヌクレオチド配列）に相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを選択することを含む。ある実施形態では、標的遺伝子の発現を活性化するオリゴヌクレオチドが豊富な（例えば、オリゴヌクレオチドの無作為選択と比較して）オリゴヌクレオチドのセットを選択することができる。
【０１２４】
ある実施形態において、ＰＲＣ２結合ＲＮＡにより発現が調節される遺伝子を意味する「ＰＲＣ２結合結合ＲＮＡによりターゲティングされる遺伝子」（例えば、表１〜３に記載するように、交差、又は近傍の遺伝子）の発現を調節する方法に用いるための一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。「ＰＲＣ２結合ＲＮＡ」又は「ＰＲＣ２に結合するＲＮＡ」は、「ＰＲＣ２関連ＲＮＡ」及び「ＰＲＣ２相互作用ＲＮＡ」と置き換え可能に用いられ、ＰＲＣ２に直接又は間接的に結合するｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ転写物又はそのＰＲＣ２関連領域（例えば、以下に記載するピーク）を指す。このような結合は、ＰＲＣ２複合体、例えば、Ｅｚｈ２の成分に対する抗体を用いた免疫沈降法により決定することができる。配列Ａ１〜Ａ１９３，０４９、配列Ｂ１〜Ｂ９１６，２０９、及びＢ９１６，６２６〜Ｂ９３４，９３１は、本明細書に記載するＲＩＰ−ｓｅｑ法を用いて、ＰＲＣ２に結合することが実験により判明した部分を含むマウスＲＮＡ配列、又はこれらのマウスＲＮＡ配列に対応するヒトＲＮＡ配列を表す。
【０１２５】
遺伝子発現を調節するこうした方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、又はｉｎ  ｖｉｖｏで実施してよい。国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０６５１４３号パンフレットの表８は、ＰＲＣ２結合ＲＮＡによりターゲティングされる遺伝子を示し；ＰＲＣ２結合ＲＮＡの配列識別子は、遺伝子名と同じ行に記載されている。ある実施形態では、例えば、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０６５１４３号パンフレットの表９又は表２に記載されるような疾患カテゴリーなどの疾患を治療する方法に用いるための一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２は、ＰＲＣ２結合ＲＮＡによりターゲティングされる遺伝子を示し；ＰＲＣ２結合ＲＮＡの配列識別子は、遺伝子名と同じ行に記載されている。ある実施形態では、例えば、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表３又は表２に記載されるような疾患カテゴリーなどの疾患を治療する方法において用いるための一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。治療は、ＰＲＣ２結合ＲＮＡによりターゲティングされる遺伝子の発現を調節すること、好ましくは遺伝子発現を上方制御することを含み得る。一本鎖オリゴヌクレオチドは、非経口投与のための滅菌組成物として製剤化してよい。本明細書の説明全体を通して化合物の使用について述べるときは必ず、疾患の治療に用いるための医薬組成物又は薬剤の調製における化合物の使用を考慮することが理解されよう。従って、１つの非制限的例として、本発明のこの態様は、疾患の治療に用いるための薬剤の調製における一本鎖オリゴヌクレオチドの使用を含み、この治療は、ＰＲＣ２結合ＲＮＡによりターゲティングされる遺伝子の発現を上方制御することを含む。
【０１２６】
遺伝子発現を活性化するための候補オリゴヌクレオチドを選択する方法
標的遺伝子の発現を活性化するための候補オリゴヌクレオチドを選択する方法が提供される。目的とする標的遺伝子は、例えば、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０６５１４３号パンフレットの表９に記載の遺伝子であってよい。目的とする標的遺伝子は、例えば、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表３に記載の遺伝子であってよい。目的とする標的遺伝子は、ＦＸＮ、ＳＭＮ１、ＳＭＮ２、ＳＭＮＰ、ＵＴＲＮ、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、Ｈｂｂ−ｂ１、Ｈｂｂ−ｂｈ１、Ｈｂｂ−ｙ、ＨＢＢ／ＨＢＤ、ＡＴＰ２Ａ２、ＡＰＯＡ１、Ａｂｃａ１、ＰＴＥＮ、ＢＤＮＦ、ＢＤＮＦ−ＡＳ１、ＡＤＩＰＯＱ、ＭＥＣＰ２又はＦＯＸＰ３であってよい。従って、候補オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１２１２に記載の配列から選択される配列と相補的であってよい。
【０１２７】
典型的に、本方法は、標的遺伝子と機能的に関連するＰＲＣ２関連領域、例えば、標的遺伝子に対するＰＲＣ２の動員を促進する（例えば、シス（ｃｉｓ）調節様式で）ことにより、標的遺伝子の発現を調節するｌｎｃＲＮＡのＰＲＣ２関連領域をターゲティングするオリゴヌクレオチドを同定することを目標とする１つ又は複数のステップを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、核酸（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）のＰＲＣ２関連領域とハイブリダイズするそれらの能力のために、標的遺伝子の発現を活性化する候補であると予想される。ある実施形態では、このハイブリダイゼーションイベントは、ＰＲＣ２と核酸（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）との相互作用を破壊し、これにより、標的遺伝子座に対するＰＲＣ２及びその関連共抑制因子（例えば、クロマチン再構成因子）の動員を破壊すると理解されている。
【０１２８】
候補オリゴヌクレオチドを選択する方法は、目的の標的遺伝子を包含するか、又はその近傍にある染色体位置に位置するＰＲＣ２関連領域（例えば、配列Ａ１〜Ａ１９３，０４９、配列Ｂ１〜Ｂ９１６，２０９、及びＢ９１６，６２６〜Ｂ９４３，９３１に記載されているヌクレオチド配列）を選択することを含み得る。ＰＲＣ２関連領域は、標的遺伝子のセンス鎖を含む染色体の鎖に位置していてもよく、この場合、候補オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のセンス鎖と相補的である（すなわち、標的遺伝子に対してアンチセンスである）。あるいは、ＰＲＣ２関連領域は、標的遺伝子のアンチセンス鎖を含む第１染色体の鎖に位置していてもよく、この場合、オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のアンチセンス鎖（鋳型鎖）と相補的である（すなわち、標的遺伝子に対してセンスである）。
【０１２９】
標的遺伝子の発現を活性化するオリゴヌクレオチドが豊富な候補オリゴヌクレオチドのセットを選択する方法は、標的遺伝子を包含するか、又はその近傍にある染色体位置に位置する１つ又は複数のＰＲＣ２関連領域を選択すること及びオリゴヌクレオチドのセットを選択することを含んでもよく、ここで、上記セットにおける各オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数のＰＲＣ２関連領域と相補的なヌクレオチド配列を含む。本明細書で用いる「標的遺伝子の発現を活性化するオリゴヌクレオチドが豊富なオリゴヌクレオチドのセット」というフレーズは、上記の豊富なセットと同じ物理化学的特性（例えば、同じＧＣ含有率、Ｔｍ、長さなど）のオリゴヌクレオチドの無作為選択と比較して、標的遺伝子の発現を活性化するオリゴヌクレオチドの数をより多く有するオリゴヌクレオチドのセットを指す。
【０１３０】
ＰＲＣ２関連領域は、染色体において、標的遺伝子の５’末端の上流５０キロベースと、標的遺伝子の３’末端の下流５０キロベースとの間の位置に位置するものであってよい。ＰＲＣ２関連領域は、染色体において、標的遺伝子の５’末端の上流２５キロベースと、標的遺伝子の３’末端の下流２５キロベースとの間の位置に位置してもよい。ＰＲＣ２関連領域は、染色体において、標的遺伝子の５’末端の上流１２キロベースと、標的遺伝子の３’末端の下流１２キロベースとの間の位置に位置してもよい。ＰＲＣ２関連領域は、染色体において、標的遺伝子の５’末端の上流５キロベースと、標的遺伝子の３’末端の下流５キロベースとの間の位置に位置してもよい。
【０１３１】
標的遺伝子に対して、選択されるＰＲＣ２関連領域のゲノム位置は変動し得る。例えば、ＰＲＣ２関連領域は、標的遺伝子の５’末端の上流にあってよい。ＰＲＣ２関連領域は、標的遺伝子の３’末端の下流にあってよい。ＰＲＣ２関連領域は、標的遺伝子のイントロン内にあってよい。ＰＲＣ２関連領域は、標的遺伝子のエキソン内にあってよい。ＰＲＣ２関連領域は、標的遺伝子のイントロン−エキソン接合部、５’−ＵＴＲ−エキソン接合部若しくは３’−ＵＴＲ−エキソン接合部を横断してもよい。
【０１３２】
候補オリゴヌクレオチドの選択方法はまた、一般に、ＰＲＣ２関連領域と相補的である適切なヌクレオチド配列を決定又は同定することも含み得る。このヌクレオチド配列は、ＰＲＣ２関連領域の少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個又はそれ以上の連続したヌクレオチドと相補的であってよい。
【０１３３】
候補オリゴヌクレオチドは、式Ｘ−Ｙ−Ｚを有する配列を含んでもよく、ここで、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ミクロＲＮＡのヒトシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、可変長さのヌクレオチド配列である。ある実施形態では、Ｘは、オリゴヌクレオチドの５’末端で固定されている。ある実施形態では、Ｘがオリゴヌクレオチドの５’末端で固定されている場合、オリゴヌクレオチドは、Ｘに５’で連結されたヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を一切有していない。ある実施形態では、ペプチド又はステロールなどの他の化合物は、これらがヌクレオチド又はヌクレオチド類似体ではない限り、この実施形態において５’末端で連結されている。これらの配列特性を有する候補オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ経路を回避すると予想される。従って、ある実施形態では、これらの配列特性を有するオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ分子として細胞内で機能するという意図しない結果をもたらす可能性が低い。Ｙ配列は、表３に記載する長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であってよい。
【０１３４】
候補オリゴヌクレオチドは、グアノシンヌクレオチド区間（例えば、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上の連続したグアノシンヌクレオチド）を含まない配列を有してもよい。ある実施形態では、グアノシンヌクレオチド区間を有するオリゴヌクレオチドは、グアノシンヌクレオチド区間のないオリゴヌクレオチドと比較して、増大した非特異的結合及び／又はオフターゲット効果を有する。
【０１３５】
候補オリゴヌクレオチドは、オフターゲット遺伝子を包含するか、又はその近傍のゲノム位置に位置する、同等長さの全てのヌクレオチド配列に対して、閾値レベルに満たない配列同一性を有する配列を有するように選択していてもよい。例えば、候補オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子以外のあらゆる既知の遺伝子（例えば、あらゆる既知のタンパク質コード遺伝子）を包含するか、又はその近傍のゲノム位置に位置する配列を含まないことを確実にするように設計してもよい。同様の実施形態では、候補オリゴヌクレオチドは、いずれか他の既知のＰＲＣ２関連領域（例えば、配列Ａ１〜Ａ１９３，０４９、配列Ｂ１〜Ｂ９１６，２０９、及びＢ９１６，６２６〜Ｂ９３４，９３１に記載されているヌクレオチド配列）、特に、いずれか他の既知の遺伝子（例えば、いずれか既知のタンパク質コード遺伝子）に機能的に関連するＰＲＣ２関連領域に位置する配列を含まないことを確実にするように設計してもよい。どちらの場合にも、候補オリゴヌクレオチドは、オフターゲット効果を有する低い尤度を有すると予想される。配列同一性の閾値レベルは、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％配列同一性であってよい。
【０１３６】
候補オリゴヌクレオチドは、それが、少なくとも２つの一本鎖ループを含む二次構造を形成するＲＮＡをコードするＰＲＣ２関連領域と相補的な配列を有するように選択してもよい。ある実施形態では、１つ又は複数の一本鎖ループ（例えば、少なくとも２つの一本鎖ループ）を含む二次構造を形成するＲＮＡをコードするＰＲＣ２関連領域と相補的なオリゴヌクレオチドは、無作為に選択したオリゴヌクレオチドと比較して、活性である高い尤度を有することが見出されている。場合によっては、二次構造は、少なくとも２つの一本鎖ループの間に二本鎖ステムを含んでもよい。従って、選択方法は、オリゴヌクレオチドとＰＲＣ２関連領域同士の相補性の領域が、少なくとも１つのループの少なくとも一部をコードするＰＲＣ２関連領域の位置にあるように、オリゴヌクレオチドの配列を選択することを含んでもよい。ある形態では、選択方法は、オリゴヌクレオチドとＰＲＣ２関連領域同士の相補性の領域が、少なくとも２つのループの少なくとも一部をコードするＰＲＣ２関連領域の位置にあるように、オリゴヌクレオチドの配列を選択することを含んでもよい。ある形態では、選択方法は、オリゴヌクレオチドとＰＲＣ２関連領域同士の相補性の領域が、二本鎖ステムの少なくとも一部をコードするＰＲＣ２関連領域の位置にあるように、オリゴヌクレオチドの配列を選択することを含んでもよい。ある実施形態では、（例えば、ｌｎｃＲＮＡの）ＰＲＣ２関連領域を（例えば、ＲＩＰ−Ｓｅｑ方法又はそれから得られる情報を用いて）同定する。ある実施形態では、ＲＮＡ二次構造予測アルゴリズム、例えば、ＲＮＡｆｏｌｄ、ｍｆｏｌｄを用いて、ＰＲＣ２関連領域を含む予測二次構造ＲＮＡ（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）を決定する。ある実施形態では、少なくとも２つの一本鎖ループの間に二本鎖ステムを含み得る１つ又は複数の一本鎖ループ（例えば、少なくとも２つの一本鎖ループ）を含む二次構造を形成するＲＮＡの領域をターゲティングするように、オリゴヌクレオチドを設計する。
【０１３７】
候補オリゴヌクレオチドは、それが、３０％超のＧ−Ｃ含有率、４０％超のＧ−Ｃ含有率、５０％超のＧ−Ｃ含有率、６０％超のＧ−Ｃ含有率、７０％超のＧ−Ｃ含有率、又は８０％超のＧ−Ｃ含有率を有する配列を有するように、選択してもよい。オリゴヌクレオチドが、長さ８〜１０ヌクレオチドであるいくつかの実施形態では、ＰＲＣ２関連領域の相補的配列のヌクレオチドの１、２、３、４、若しくは５個を除く全てが、シトシン又はグアノシンヌクレオチドである。
【０１３８】
候補オリゴヌクレオチド選択方法はまた、候補オリゴヌクレオチドが、標的遺伝子の相同体を包含する位置、又はその近傍の位置で、様々な種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、サルなど）の染色体と相補的であることを決定することを含んでもよい。これにより、複数の種（例えば、ヒト及びマウス）における効力についてｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験することができるオリゴヌクレオチドの設計が可能になる。このアプローチはまた、対象の疾患について適切な動物が存在する種を選択することにより、ヒトの疾患を治療するための臨床候補薬の開発も促進する。候補オリゴヌクレオチドは、動物モデルにおいて容易に試験することができる。
【０１３９】
一本鎖オリゴヌクレオチドの設計及び／又は合成が、このような配列情報により記載される核酸又はＰＲＣ２関連領域と相補的な配列の設計及び／又は合成を含む場合、当業者は、例えば、当分野における一般的知識の一部を成すワトソン−クリック塩基対合の理解により、相補的配列を容易に決定することができる。
【０１４０】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドの設計及び／又は合成は、当業者には公知の技術により出発材料からオリゴヌクレオチドを製造することを含み、その際、合成は、ＰＲＣ２関連領域の配列、又はその一部に基づいて実施してよい。
【０１４１】
一本鎖オリゴヌクレオチドの設計及び／又は合成の方法は、以下：
ＰＲＣ２関連領域を同定する、及び／又は選択するステップ；
ＰＲＣ２関連領域若しくはその一部に対し、要望される程度の配列同一性又は相補性を有する核酸配列を設計するステップ；
一本鎖オリゴヌクレオチドを、設計した配列に合成するステップ；
合成した一本鎖オリゴヌクレオチドを精製するステップ；並びに
任意選択で、合成した一本鎖オリゴヌクレオチドを少なくとも１種の薬学的に許容される希釈剤、担体若しくは賦形剤と混合することにより、医薬組成物又は薬剤を形成するステップ
のうち１つ又は複数を含み得る。
【０１４２】
このように設計及び／又は合成した一本鎖オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載するように、遺伝子発現を調節する方法に有用となり得る。
【０１４３】
好ましくは、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、化学的に合成される。本発明を実施するのに用いられるオリゴヌクレオチドは、公知の化学的合成技術により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。
【０１４４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾、例えば、ヌクレオチド修飾などにより、核酸分解に対して安定化することができる。例えば、本発明の核酸配列は、ヌクレオチド配列の５’又は３’末端にホスホロチオエートの、少なくとも第１、第２、若しくは第３ヌクレオチド間結合を含む。別の例として、核酸配列は、２’−修飾ヌクレオチド、例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、又は２’−Ｏ−−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−−ＮＭＡ）を含んでよい。別の例として、核酸配列は、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル−修飾ヌクレオチドを含んでよく、ある実施形態では、ヌクレオチドの全てが、２’−Ｏ−メチル−修飾を含む。ある実施形態では、核酸は、「ロック」されている、すなわち、２’−Ｏ原子と４’−Ｃ原子とをつなぐメチレン架橋により、リボース環が「ロック」されている核酸類似体を含む。
【０１４５】
本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドの修飾された化学又はフォーマットのいずれかを互いに組み合わせることができること、並びに、同じ分子内に１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ以上の異なるタイプの修飾を含有させてもよいことは理解されよう。
【０１４６】
ある実施形態において、本方法は、合成された一本鎖オリゴヌクレオチドを増幅するステップ、及び／又は一本鎖オリゴヌクレオチド（若しくは増幅された一本鎖オリゴヌクレオチド）を精製するステップ、並びに／又はこのようにして得られた一本鎖オリゴヌクレオチドを配列決定するステップをさらに含んでもよい。
【０１４７】
従って、一本鎖オリゴヌクレオチドを調製する方法は、疾患の治療に用いるための医薬組成物又は薬剤の製造に使用される方法であってもよく、任意選択で、上記治療は、ＰＲＣ２関連領域に関連する遺伝子の発現を調節することを含む。
【０１４８】
前述した方法において、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡを同定することを含む方法により、同定若しくは取得することができ、あるいは、同定若しくは取得されている。
【０１４９】
このような方法は、以下のステップを含む：核リボ核酸を含有するサンプルを用意するステップ、このサンプルを、ＰＲＣ２又はそのサブユニットと特異的に結合する物質と接触させるステップ、上記物質とサンプル中のタンパク質同士で複合体を形成させるステップ、複合体を分配するステップ、複合体中に存在する核酸と相補的な核酸を合成するステップ。
【０１５０】
一本鎖オリゴヌクレオチドが、ＰＲＣ２関連領域、又はこのような配列の一部に基づいている場合、これは、その配列に関する情報、例えば、文書又は電子形態で入手可能な配列情報を基にしてよく、こうした情報は、一般に入手可能な科学出版物又は配列データベースに含まれる配列情報を含み得る。
【０１５１】
一本鎖オリゴヌクレオチド
本発明の一態様では、１細胞において標的遺伝子の発現を調節するための、ＰＲＣ２関連領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。ある実施形態では、標的遺伝子の発現は上方制御又は増大される。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現が上方制御又は増大されるように、長いＲＮＡ転写物とＰＲＣ２の相互作用を阻害し、これによって、ヒストンＨ３のメチル化の低減及び遺伝子不活性化の低減をもたらす。ある実施形態では、上記の相互作用は、長いＲＮＡの構造の変化によって、ＰＲＣ２との結合が阻止又は低減されるために、破壊又は阻害され得る。標的遺伝子の発現を活性化するための候補オリゴヌクレオチドを選択するための本明細書に開示する方法のいずれかを用いて、オリゴヌクレオチドを選択することができる。
【０１５２】
ある実施形態において、相補性の領域は、ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８〜１５、８〜３０、８〜４０、又は１０〜５０、又は５〜５０、又は５〜４０塩基、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０個の連続したヌクレオチドと相補的である。ある実施形態では、相補性の領域は、ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的である。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドの配列は、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡ配列、又はその一部分に基づいており、前記部分は、５〜４０の連続した塩基対、又は約８〜４０、又は約５〜１５、又は約５〜３０、又は約５〜４０、又は約５〜５０塩基の長さを有する。
【０１５３】
本明細書に開示するオリゴヌクレオチドのいずれかを、切断性リンカーにより、本明細書に開示する１個又は複数の他のオリゴヌクレオチドと連結してもよい。
【０１５４】
相補的とは、この用語が当分野で用いられている場合、２つのヌクレオチド同士の正確な対合の能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置にあるヌクレオチドが、ＰＲＣ２関連領域の同じ位置のヌクレオチドと水素結合することができれば、その一本鎖オリゴヌクレオチドとＰＲＣ２関連領域は、その位置で互いに相補的であるとみなされる。一本鎖オリゴヌクレオチドとＰＲＣ２関連領域は、各分子内の十分な数の対応位置が、それらの塩基同士が互いに水素結合することができるヌクレオチドにより占められている場合、互いに相補的である。従って、「相補的」とは、こうした安定かつ特異的な結合が、一本鎖オリゴヌクレオチドとＰＲＣ２関連領域との間に起こるのに十分な程度の相補性又は正確な対合を示すために用いられる用語である。例えば、一本鎖ヌクレオチドの一位置にある塩基が、ＰＲＣ２関連領域の対応位置にある塩基と水素結合することができれば、これらの塩基は、その位置で互いに相補的であるとみなされる。１００％の相補性は要求されない。
【０１５５】
一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＰＲＣ２関連領域の連続ヌクレオチドと、少なくとも８０％（任意選択で、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）相補的であってよい。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＰＲＣ２関連領域の連続ヌクレオチドの部分と比較して、１、２若しくは３つの塩基ミスマッチを含んでいてもよい。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、１５塩基に対して３つ以下の塩基ミスマッチ、又は１０塩基に対して２つ以下の塩基ミスマッチを有していてもよい。
【０１５６】
相補的オリゴヌクレオチド配列が、特異的にハイブリダイズすることが可能なその標的の配列と１００％相補的である必要はないことは当分野で理解されよう。ある実施形態では、本発明の方法を目的とする相補的オリゴヌクレオチド配列は、この配列と標的分子（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）の結合が、標的（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）の正常な機能を妨害して、活性の消失（例えば、遺伝子発現の結果として起こる上方制御によるＰＲＣ２関連抑制の阻害）を引き起こし、非特異的結合の回避が要望される条件下で、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ又は治療的処置の場合には、生理学的条件下で、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ場合には、アッセイが好適な緊縮条件で行われる条件下で、配列と非標的配列との非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性があるとき、特異的にハイブリダイズ可能である。
【０１５７】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、長さ７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド又はそれ以上である。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さ８〜３０ヌクレオチドである。
【０１５８】
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、遺伝子配列と同じＤＮＡ鎖上に存在する（センス）。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、遺伝子配列と逆のＤＮＡ鎖上に存在する（アンチセンス）。ＰＲＣ２関連領域と相補的なオリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンス配列のいずれかと結合することができる。塩基対合は、正統なワトソン−クリック塩基対合及び非ワトソン−クリック塩基対合（例えば、ゆらぎ（Ｗｏｂｂｌｅ）塩基対合及びフーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）塩基対合）の両方を含んでよい。相補的塩基対合について、アデノシン型塩基（Ａ）は、チミジン型塩基（Ｔ）又はウラシル型塩基（Ｕ）と相補的であり、シトシン型塩基（Ｃ）は、グアノシン型塩基（Ｇ）と相補的であり、また、３−ニトロピロール又は５−ニトロインドールなどのユニバーサル塩基は、Ａ、Ｃ、Ｕ、若しくはＴのいずれともハイブリダイズすることができるため、これらと相補的であるとみなされることは理解されよう。イノシン（Ｉ）も、当分野ではユニバーサル塩基と考えられており、Ａ、Ｃ、Ｕ、若しくはＴのいずれとも相補的であるとみなされる。
【０１５９】
ある実施形態において、配列表に示す配列を含む本明細書に記載の配列におけるいずれか１つ又は複数のチミジン（Ｔ）ヌクレオチド（若しくはその修飾ヌクレオチド）又はウリジン（Ｕ）ヌクレオチド（若しくはその修飾ヌクレオチド）を、アデノシンヌクレオチドとの塩基対合（例えば、ワトソン−クリック塩基対による）に好適ないずれか他のヌクレオチドで置換してもよい。ある実施形態では、配列表に示す配列を含む本明細書に記載の配列におけるいずれか１つ又は複数のチミジン（Ｔ）ヌクレオチド（若しくはその修飾ヌクレオチド）又はウリジン（Ｕ）ヌクレオチド（若しくはその修飾ヌクレオチド）を、異なるピリミジンヌクレオチドで好適に置換してもよいし、その逆も可能である。ある実施形態では、配列表に示す配列を含む本明細書に記載の配列におけるいずれか１つ又は複数のチミジン（Ｔ）ヌクレオチド（若しくはその修飾ヌクレオチド）をウリジン（Ｕ）ヌクレオチド（若しくはその修飾ヌクレオチド）で好適に置換してもよいし、その逆も可能である。イノシン（Ｉ）も、当分野ではユニバーサル塩基と考えられており、Ａ、Ｃ、Ｕ、又はＴのいずれとも相補的であるとみなされる。
【０１６０】
イノシン（Ｉ）も、当分野ではユニバーサル塩基と考えられており、Ａ、Ｃ、Ｕ、又はＴのいずれとも相補的であるとみなされる。
【０１６１】
ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドのＧＣ含有率は、約３０〜６０％であり得る。実施形態によっては、３つ以上のＧ又はＣが連続して出現するのは好ましくない場合もある。従って、ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３つ以上のグアノシンヌクレオチドの区間を含まない。
【０１６２】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、単一の連続した転写物（例えば、非スプライスＲＮＡ）としてゲノム（例えば、ヒトゲノム）内でコードされるＲＮＡに特異的に結合するか、又はこれに対して相補的である。ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ゲノム（例えば、ヒトゲノム）内でコードされるＲＮＡに特異的に結合するか、又はこれに対して相補的であり、ここで、上記ゲノムにおいて、ＲＮＡのコード領域の５’末端と、ＲＮＡのコード領域の３’末端との間の距離は、１ｋｂ未満、２ｋｂ未満、３ｋｂ未満、４ｋｂ未満、５ｋｂ未満、７ｋｂ未満、８ｋｂ未満、９ｋｂ未満、１０ｋｂ未満、又は２０ｋｂ未満である。
【０１６３】
本明細書に記載するどのオリゴヌクレオチドも除外することができることは理解すべきである。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号１２１３〜１２２６のいずれか１つ又は複数と相補的ではない。
【０１６４】
ヌクレオチド類似体
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のリボヌクレオチド、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチド、及び／又は少なくとも１個の架橋ヌクレオチドを含んでもよい。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、又はＥＮＡヌクレオチド類似体などの架橋ヌクレオチドを含んでもよい。このようなヌクレオチドの例は本発明に開示しており、当分野でも公知である。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下の米国特許又は米国特許出願：米国特許第７，３９９，８４５号明細書、米国特許７，７４１，４５７号明細書、米国特許８，０２２，１９３号明細書、米国特許７，５６９，６８６号明細書、米国特許７，３３５，７６５号明細書、米国特許第７，３１４，９２３号明細書、米国特許第７，３３５，７６５号明細書、米国特許第７，８１６，３３３号明細書、米国特許第２０１１０００９４７１号明細書の１つに開示されているヌクレオチド類似体を含み、これら文献の各々の全内容は、あらゆる目的のために本明細書に参照により組み込む。オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の２’Ｏ−メチルヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、２’Ｏ−メチルヌクレオチドから完全に構成されていてもよい。
【０１６５】
多くの場合、一本鎖オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数のヌクレオチド類似体を有する。例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含まないオリゴヌクレオチドと比較して、１℃、２℃、３℃、４℃、又は５℃の範囲でオリゴヌクレオチドのＴｍに上昇をもたらす少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含んでもよい。一本鎖オリゴヌクレオチドは、複数のヌクレオチド類似体を含んでもよく、これにより、ヌクレオチド類似体を含まないオリゴヌクレオチドと比較して、合計で２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃又はそれ以上の範囲でオリゴヌクレオチドのＴｍに上昇をもたらす。
【０１６６】
オリゴヌクレオチドは、長さ５０ヌクレオチド以下であってよく、ここで、オリゴヌクレオチドの２〜１０、２〜１５、２〜１６、２〜１７、２〜１８、２〜１９、２〜２０、２〜２５、２〜３０、２〜４０、２〜４５、又はそれ以上の個数のヌクレオチドがヌクレオチド類似体である。オリゴヌクレオチドは、長さ８〜３０ヌクレオチドであってよく、ここで、オリゴヌクレオチドの２〜１０、２〜１５、２〜１６、２〜１７、２〜１８、２〜１９、２〜２０、２〜２５、２〜３０のヌクレオチドがヌクレオチド類似体である。
【０１６７】
オリゴヌクレオチドは、長さ８〜１５ヌクレオチドであってよく、ここで、オリゴヌクレオチドの２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、２〜１１、２〜１２、２〜１３、２〜１４のヌクレオチドがヌクレオチド類似体である。任意選択で、オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個の修飾ヌクレオチドを除いて、全てのヌクレオチドを有してもよい。
【０１６８】
オリゴヌクレオチドは、架橋ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）から完全に構成されていてもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを交互に含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＥＮＡヌクレオチドを交互に含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドを交互に含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、架橋ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）である５’ヌクレオチドを有していてもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである５’ヌクレオチドを有していてもよい。
【０１６９】
オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’及び３’末端の各々で、少なくとも１つの架橋ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）によりフランキングされるデオキシリボヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’及び３’末端の各々で、１、２、３、４、５、６、７、８又はそれ以上の架橋ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）によってフランキングされているデオキシリボヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドの３’位は、３’ヒドロキシル基を有してもよい。オリゴヌクレオチドの３’位は、３’チオリン酸塩を有してもよい。
【０１７０】
オリゴヌクレオチドは、標識と結合させてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、その５’又は３’末端で、ビオチン部分、コレステロール、ビタミンＡ、葉酸塩、シグマ受容体リガンド、アプタマー、ＣＰＰなどのペプチド、脂質などの疎水性分子、ＡＳＧＰＲ又は動的ポリ抱合体並びにそれらの変異体と結合させてもよい。
【０１７１】
好ましくは、一本鎖オリゴヌクレオチドは、以下：修飾された糖部分、及び／又は修飾されたヌクレオチド間結合、及び／又は修飾されたヌクレオチド及び／又はそれらの組合せを含む１つ又は複数の修飾を含む。所与のオリゴヌクレオチドにおける全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際には、本明細書に記載する修飾の２つ以上を単一のオリゴヌクレオチド内に、又は１オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオチドに組み込んでもよい。
【０１７２】
ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、各々が少なくとも１個のヌクレオチドから構成される２つ以上の化学的に別個の領域を含むキメラオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的に、１つ又は複数の有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増大、細胞内への取込みの増大、標的に対する結合親和性の増大）を賦与する修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つの領域と、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質である１領域を含む。本発明のキメラ一本鎖オリゴヌクレオチドは、前述したように、２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造体として形成してもよい。このような化合物は、当分野では、ハイブリッド又はギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）とも呼ばれている。こうしたハイブリッド構造体の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定しないが、以下のものがある：米国特許第５，０１３，８３０号明細書；第５，１４９，７９７号明細書；第５，２２０，００７号明細書；第５，２５６，７７５号明細書；第５，３６６，８７８号明細書；第５，４０３，７１１号明細書；第５，４９１，１３３号明細書；第５，５６５，３５０号明細書；第５，６２３，０６５号明細書；第５，６５２，３５５号明細書；第５，６５２，３５６号明細書；及び第５，７００，９２２号明細書。尚、これら文献の各々は、本明細書に参照により組み込むものとする。
【０１７３】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、糖の２’位で修飾された少なくとも１個のヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−アルキル−、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル又は２’−フルオロ−修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ＲＮＡ修飾は、ピリミジンのリボース上に２’−フルオロ、２’−アミノ及び２’−Ｏ−メチル−修飾ヌクレオチド、ＲＮＡの３’末端に脱塩基残基若しくは逆方法塩基を含む。こうした修飾は、常用の方法でオリゴヌクレオチドに組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して、２’−デオキシオリゴヌクレオチドより高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することがわかっている。
【０１７４】
いくつかのヌクレオチド及びヌクレオシド修飾が、それらを組み込んだオリゴヌクレオチドを、ネイティブオリゴデオキシヌクレオチドより、ヌクレアーゼ消化に対して耐性にすることが明らかにされており；これらの修飾されたオリゴは、非修飾オリゴヌクレオチドより長時間にわたってインタクトのまま生存する。修飾オリゴヌクレオチドの具体例としては、修飾された骨格を含むものがあり、例えば、ホスホロチオエート、リン酸トリエステル、メチルホスホネート、単鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間結合又は単鎖ヘテロ原子又は複素環式糖間結合が挙げられる。例としては、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子骨格を有するものであり、特に、以下のものである：ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ、〜Ｎ（ＣＨ３）〜Ｏ〜ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られる）、ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２及びＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格（ここで、ネイティブリン酸ジエステル骨格は、Ｏ−Ｐ−−Ｏ−ＣＨのように表される)；アミド骨格（Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５，２８：３６６−３７４を参照）；モルホリノ骨格構造（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ及びＷｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号明細書を参照）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（ここで、オリゴヌクレオチドのリン酸ジエステル骨格は、ポリアミド骨格で置換されており、ヌクレオチドは、ポリアミド骨格のアザ窒素原子と直接又は間接的に結合している；Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，２５４，１４９７を参照）。リン含有結合としては、限定しないが、ホスホロチオエート、キメラホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、３’アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートなどのメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィン酸塩、３’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートなどのホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルリン酸トリエステル、並びに通常の３’−５’結合を有するボラノリン酸塩、これらの２’−５’結合類似体、並びに逆転極性を有するもの（ここで、ヌクレオシド単位の隣接する対は、３’−５’から５’−３’に、又は２’−５’から５’−２’に連結される）を含む；米国特許第３，６８７，８０８号明細書；同第４，４６９，８６３号明細書；同第４，４７６，３０１号明細書；同第５，０２３，２４３号明細書；同第５，１７７，１９６号明細書；同第５，１８８，８９７号明細書；同第５，２６４，４２３号明細書；同第５，２７６，０１９号明細書；同第５，２７８，３０２号明細書；同第５，２８６，７１７号明細書；同第５，３２１，１３１号明細書；同第５，３９９，６７６号明細書；同第５，４０５，９３９号明細書；同第５，４５３，４９６号明細書；同第５，４５５，２３３号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７６，９２５号明細書；同第５，５１９，１２６号明細書；同第５，５３６，８２１号明細書；同��５，５４１，３０６号明細書；同第５，５５０，１１１号明細書；同第５，５６３，２５３号明細書；同第５，５７１，７９９号明細書；同第５，５８７，３６１号明細書；同第５，６２５，０５０号明細書を参照。
【０１７５】
モルホリノベースのオリゴマー化合物は、以下：Ｄｗａｉｎｅ  Ａ．Ｂｒａａｓｃｈ及びＤａｖｉｄ  Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１４），４５０３−４５１０）；Ｇｅｎｅｓｉｓ，ｖｏｌｕｍｅ  ３０，ｉｓｓｕｅ  ３，２００１；Ｈｅａｓｍａｎ，Ｊ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００２，２４３，２０９−２１４；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０００，２６，２１６−２２０；Ｌａｃｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０００，９７，９５９１−９５９６；並びに１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，５０６号明細書に記載されている。ある実施形態では、モルホリノベースのオリゴマー化合物は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である（例えば、Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，３：２３５−２３８，２００１；及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．，１２：３５４−３６４，２０１０に記載されている通り；これらの開示内容は、本明細書に参照により全体を組み込むものとする）。
【０１７６】
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣物は、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，８５９５−８６０２に記載されている。
【０１７７】
リン原子を内部に含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ又は複数の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（一部がヌクレオシドの糖部分から形成される）；シクロサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びフルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；並びにＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分の混合部分を有する他の骨格であり；以下を参照されたい：米国特許第５，０３４，５０６号明細書；同第５，１６６，３１５号明細書；同第５，１８５，４４４号明細書；同第５，２１４，１３４号明細書；同第５，２１６，１４１号明細書；同第５，２３５，０３３号明細書；同第５，２６４，５６２号明細書；同第５，２６４，５６４号明細書；同第５，４０５，９３８号明細書；同第５，４３４，２５７号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７０，９６７号明細書；同第５，４８９，６７７号明細書；同第５，５４１，３０７号明細書；同第５，５６１，２２５号明細書；同第５，５９６，０８６号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６１８，７０４号明細書；同第５，６２３，０７０号明細書；同第５，６６３，３１２号明細書；同第５，６３３，３６０号明細書；同第５，６７７，４３７号明細書；及び同第５，６７７，４３９号明細書。尚、これらの文献は各々、本明細書に参照により組み込む。
【０１７８】
また、アラビノヌクレオチド又は修飾されたアラビノヌクレオチド残基に基づく、又はそれらから構築されるオリゴヌクレオチドを含む修飾オリゴヌクレオチドも知られている。アラビノヌクレオチドは、リボヌクレオシドの立体異性体であり、糖環の２’位の立体配置だけが異なる。ある実施形態では、２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆアラビノである。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−フルオロ−Ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）である（例えば、Ｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４１：３４５７−３４６７，２００２及びＭｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１２：２６５１−２６５４，２００２；に記載されている通り；これらの開示内容は、本明細書に参照により全体を組み込むものとする）。また、同様の修飾を糖の他の位置、特に３’末端ヌクレオシド上又は２’−５’結合オリゴヌクレオチド内の糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位に実施することもできる。
【０１７９】
ＰＣＴ公開番号：国際公開第９９／６７３７８号パンフレットは、相補的メッセンジャーＲＮＡとの結合による遺伝子発現の配列特異的阻害向上を目的とするアラビノ核酸（ＡＮＡ）オリゴマー及びその類似体を開示している。
【０１８０】
他の修飾としては、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）がある（例えば、国際公開第２００５／０４２７７７号パンフレット、Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，Ｓｕｐｐｌ  １：２４１−２４２，２００１；Ｓｕｒｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１５：７４９−７５７，２００４；Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，８：１４４−１４９，２００６及びＨｏｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ（Ｏｘｆ），４９：１７１−１７２，２００５；これらの開示内容は、本明細書に参照により全体を組み込むものとする）。好ましいＥＮＡとしては、限定しないが、２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレン架橋核酸が挙げられる。
【０１８１】
ＬＮＡの例は、国際公開第２００８／０４３７５３号パンフレットに記載されており、下記の式：
【化１】
2015518714.tif 000059
の組成物を含み、
式中、Ｘ及びＹは、独立に、基−Ｏ−、
−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−又は−ＣＨ−（二重結合の一部である場合）、
−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−又は−ＣＨ２−ＣＨ−（二重結合の一部である場合）、
−ＣＨ＝ＣＨ−
の群から選択され、ここで、Ｒは、水素及びＣ１〜４−アルキルから選択され；Ｚ及びＺ＊は、独立に、ヌクレオシド間結合、末端基又は保護基から選択され；Ｂは、天然若しくは非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し；いずれかの配向に非対称基が存在してもよい。
【０１８２】
好ましくは、本発明のオリゴマーに用いられるＬＮＡは、下記式：
【化２】
2015518714.tif 000060
のいずれかに従う少なくとも１つのＬＮＡ単位を含み、
式中、Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、若しくはＮ（ＲＨ）−であり；Ｚ及びＺ＊は、独立に、ヌクレオシド間結合、末端基又は保護基から選択され；Ｂは、天然若しくは非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し；ＲＨは、水素及びＣ１〜４−アルキルから選択される。
【０１８３】
ある実施形態において、本発明のオリゴマー化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドに用いられるロックド核酸（ＬＮＡ）は、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２のスキーム２に示される式のいずれかに従うロックド核酸（ＬＮＡ）単位を含む。
【０１８４】
ある実施形態において、本発明のオリゴマーに用いられるＬＮＡは、以下：−０−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−０−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−０−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（ＲＨ）−Ｏ−、Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＲＨ）−Ｏ−、−０−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−から選択されるヌクレオシド間結合を含み、ここで、ＲＨは、水素及びＣ１〜４−アルキルから選択される。
【０１８５】
ＬＮＡ単位のいくつかの例を以下のスキーム２に示す。
【化３】
2015518714.tif 000061
【０１８６】
「チオ−ＬＮＡ」という用語は、前記一般式におけるＸ又はＹの少なくとも１つが、Ｓ又は−ＣＨ２−Ｓ−から選択される、ロックドヌクレオチドを含む。チオ−ＬＮＡは、β−Ｄ及びα−Ｌ−立体配置のいずれであってもよい。
【０１８７】
「アミノ−ＬＮＡ」という用語は、前記一般式におけるＸ又はＹの少なくとも１つが、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、及び−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−（Ｒは、水素及びＣ１〜４−アルキルから選択される）から選択される、ロックドヌクレオチドを含む。アミノ−ＬＮＡは、β−Ｄ及びα−Ｌ−立体配置のいずれであってもよい。
【０１８８】
「オキシ−ＬＮＡ」という用語は、前記一般式におけるＸ又はＹの少なくとも１つが、−Ｏ−又は−ＣＨ２−Ｏ−を示す、ロックドヌクレオチドを含む。オキシ−ＬＮＡは、β−Ｄ及びα−Ｌ−立体配置のいずれであってもよい。
【０１８９】
「エナ−ＬＮＡ」という用語は、前記一般式におけるＹが、−ＣＨ２−Ｏ−である（−ＣＨ２−Ｏ−の酸素原子は、塩基Ｂに対して２’−位置に結合している）ロックドヌクレオチドを含む。
【０１９０】
ＬＮＡは、本明細書でさらに詳しく説明する。
【０１９１】
また、１つ又は複数の置換された糖部分を含んでもよく、例えば、２’位置にある以下のものの１つが挙げられる：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２又はＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎは、１〜約１０である）；Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換された低級アルキル、アルカリル若しくはアルキリル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−、若しくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、若しくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリル；ＲＮＡ切断性基（ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）；リポータ基；インターカレータ；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を向上させるための基；又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を向上させるための基並びに同様の特性を有する他の置換基。修飾の例としては、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、また、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても知られる］がある（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ，ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６）。他の修飾の例としては、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。また、類似の修飾をオリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位に実施してもよい。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基に代わりシクロブチルなどの糖模倣物を有していてもよい。
【０１９２】
一本鎖オリゴヌクレオチドはまた、上記に加え、又は代わって、核酸塩基（一般に、当分野では単純に「塩基」と呼ぶ）修飾又は置換を含んでもよい。本明細書で用いる「非修飾」又は「天然の」ヌクレアーゼは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基は、天然の核酸に稀に又は一時的にしか認められない核酸塩基、例えば、以下を含む：ヒポキサチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に、５−メチルシトシン（５−メチル−２’−デオキシシトシンとも呼ばれ、当分野では５−Ｍｅ−Ｃと呼ばれることが多い）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びゲントビオシルＨＭＣ、イソシトシン、プソイドイソシトシン、並びに合成の核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニン、又は他のヘテロ置換されたアルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−プロピルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２−クロロ−６−アミノプリン及び２，６−ジアミノプリン又は他のジアミノプリン。例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，“ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８０，ｐｐ７５−７７；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５：４５１３（１９８７））を参照。例えば、イノシンなどの当技術分野において周知の「ユニバーサル」塩基も含んでよい。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸二重らせんの安定性を０．６〜１．２℃増大することが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｃｒｏｏｋｅ，及びＬｅｂｌｅｕ，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｃｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８)、これを塩基置換として用いてよい。
【０１９３】
所与のオリゴヌクレオチドにおける全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際には、本明細書に記載する修飾の２つ以上を単一のオリゴヌクレオチド内に、あるいは、１オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオチドに組み込んでもよい。
【０１９４】
ある実施形態において、糖及びヌクレオシド間結合の両方、すなわちヌクレオチド単位の骨格を新しい基で置換する。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持する。こうしたオリゴマー化合物の１つ、すなわち優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格で置換されている。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的米国特許としては、限定しないが、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；同第５，７１４，３３１号明細書；及び同第５，７１９，２６２号明細書が挙げられ、これらは各々、参照により本明細書に組み込む。ＰＮＡ化合物についての別の教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に見出すことができる。
【０１９５】
一本鎖オリゴヌクレオチドはまた、１つ又は複数の核酸塩基（多くの場合、当分野では単に「塩基」と呼ばれる）修飾又は置換を含んでもよい。本明細書で用いる「非修飾」又は「天然の」核酸塩基は、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基は、他の合成及び天然核酸塩基、例えば、以下を含む：５−メチルシトシン（５−Ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル(プソイド−ウラシル)、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、並びに他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、とりわけ５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニン。
【０１９６】
さらに、核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されているもの、“Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，８５８〜８５９頁，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｌｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１，３０，６１３頁により開示されているもの、並びにＳａｎｇｈｖｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，２８９〜３０２頁，Ｃｒｏｏｋｅ，及びＬｅｂｌｅｕ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３によって開示されているものを含む。これら核酸塩基のいくつかは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大するのにとりわけ有用である。このようなものとして、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、並びにＮ−２、Ｎ−６及び０−６置換プリンが挙げられ、これらは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、並びに５−プロピニルシトシンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二重らせんの安定性を０．６〜１．２℃増大することが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８)、これらは塩基置換の例であり、特に、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組合せた場合、さらに好ましい塩基置換である。修飾された核酸塩基は、以下：米国特許第３，６８７，８０８号明細書、並びに同第４，８４５，２０５号明細書；同第５，１３０，３０２号明細書；同第５，１３４，０６６号明細書；同第５，１７５，２７３号明細書；同第５，３６７，０６６号明細書；同第５，４３２，２７２号明細書；同第５，４５７，１８７号明細書；同第５，４５９，２５５号明細書；同第５，４８４，９０８号明細書；同第５，５０２，１７７号明細書；同第５，５２５，７１１号明細書；同第５，５５２，５４０号明細書；同第５，５８７，４６９号明細書；同第５，５９６，０９１号明細書；同第５，６１４，６１７号明細書；同第５，７５０，６９２号明細書、及び同第５，６８１，９４１号明細書に記載されており、これらは各々、参照により本明細書に組み込む。
【０１９７】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞の取込みを増強する、１つ又は複数の部分若しくはコンジュゲートに化学的に連結させる。例えば、同じ、若しくは異なるタイプの１つ又は複数の一本鎖オリゴヌクレオチドを互いに結合させることができ；又は一本鎖オリゴヌクレオチドを１細胞型若しくは組織型に対して増強された特異性を有するターゲティング部分と結合させることができる。このような部分としては、限定しないが、以下のものが挙げられる：コレステロール部分などの脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｃｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５，１４，９６９−９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５，１２６４、２２９−２３７）、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−ｔオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）。また、以下：米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同第５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書；同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書；同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書；同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書、及び同第５，６８８，９４１号明細書を参照されたい。尚、これらは各々、参照により本明細書に組み込むものとする。
【０１９８】
これらの部分又はコンジュゲートは、一次又は二次ヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を含んでもよい。本発明のコンジュゲート基としては、インターカレータ、リポータ分子、ポリイミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強するための基；又はオリゴマーの薬物動態学的特性を増強するための基が挙げられる。典型的なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クーマリン、及び色素が挙げられる。本発明に関して、薬力学的特性を増強する基には、取込みを向上させ、分解に対する耐性を増強し、及び／又は標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。本発明に関して、薬物動態学的特性を増強する基には、本発明の化合物の取込み、分布、代謝又は排出を向上させる基が含まれる。代表的コンジュゲート基は、１９９２年１０月２３日に提出された国際特許出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号パンフレット、及び米国特許第６，２８７，８６０号明細書に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。コンジュゲート部分は、限定しないが、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖、又はアダマンタン酢酸、パルミチル部分、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含む。例えば、以下の文献を参照されたい：米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同第５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書；同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書；同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書；同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書、及び同第５，６８８，９４１号明細書。
【０１９９】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチド修飾は、オリゴヌクレオチドの５’又は３’末端の修飾を含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’末端は、ヒドロキシル基又はチオホスフェートを含む。別の分子（例えば、ビオチン部分又は発蛍光団）を一本鎖オリゴヌクレオチドの５’又は３’末端に結合することができることは理解すべきである。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、５’ヌクレオチドに結合したビオチン部分を含む。
【０２００】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ＥＮＡ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、又は２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを含む。ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＥＮＡ修飾ヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとロックド核酸ヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸ヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む。
【０２０１】
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、ロックド核酸ヌクレオチドである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’及び３’末端の各々で少なくとも１個のロックド核酸ヌクレオチドによりフランキングされているデオキシリボヌクレオチドを含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’位のヌクレオチドは、３’ヒドロキシル基又は３’チオホスフェートを有する。
【０２０２】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個のヌクレオチドの間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、全てのヌクレオチドの間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
【０２０３】
一本鎖オリゴヌクレオチドが、本明細書に記載する修飾の任意の組合せを有してもよいことは理解すべきである。
【０２０４】
オリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンの１つ又は複数を有するヌクレオチド配列を含んでもよい。
（ａ）（Ｘ）Ｘｘｘｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘｘｘＸｘ及び（Ｘ）ｘｘｘｘｘＸ、
（ｂ）（Ｘ）ＸＸｘｘｘｘ、（Ｘ）ＸｘＸｘｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘＸｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘＸｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘＸＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘＸｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘｘＸＸｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸｘＸ及び（Ｘ）ｘｘｘｘＸＸ、
（ｃ）（Ｘ）ＸＸＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸＸＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸＸＸｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸｘｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘＸｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘＸｘ、（Ｘ）ｘＸＸｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘＸＸｘＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘＸＸ、（Ｘ）ｘｘＸｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸｘＸ及び（Ｘ）ＸｘＸｘＸｘ、
（ｄ）（Ｘ）ｘｘＸＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸＸＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸＸＸｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸＸＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸｘＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸｘＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸＸＸｘｘＸ、（Ｘ）ＸＸＸｘＸｘ、及び（Ｘ）ＸＸＸＸｘｘ、
（ｅ）（Ｘ）ｘＸＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸＸｘＸＸ、（Ｘ）ＸＸＸＸｘＸ及び（Ｘ）ＸＸＸＸＸｘ、並びに
（ｆ）ＸＸＸＸＸＸ、ＸｘＸＸＸＸＸ、ＸＸｘＸＸＸＸ、ＸＸＸｘＸＸＸ、ＸＸＸＸｘＸＸ、ＸＸＸＸＸｘＸ及びＸＸＸＸＸＸｘ、
ここで、「Ｘ」は、ヌクレオチド類似体を示し、（Ｘ）は、任意のヌクレオチド類似体を示し、「ｘ」は、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチド単位を示す。上に挙げたパターンの各々は、単独、又は開示された他の修飾パターンのいずれかとの組み合わせでオリゴヌクレオチド内に１回又は複数回出現し得る。
【０２０５】
オリゴヌクレオチドの更なる特徴
このようなオリゴヌクレオチドが、遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現を少なくとも約５０％（すなわち、通常の１５０％、若しくは１．５倍）、又は約２倍〜約５倍増大したエビデンスが本明細書に提供される。ある実施形態では、発現は、少なくとも約１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍若しくは１００倍、又はこれら数値のいずれかの間の範囲で、増大され得る。他の実験において、増大したｍＲＮＡ発現が、増大したタンパク質発現と相関することが証明されている。
【０２０６】
表２に概略を記載する配列識別子は、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットに開示されているＰＲＣ２と会合（結合）するＲＮＡ（すなわち、オリゴヌクレオチドが指令される対象のＲＮＡ）の配列を指す。従って、配列の各々は、ＰＲＣ２関連領域を含む。（ａ）表に記載する標準遺伝子、（ｂ）これら遺伝子をターゲティングする（その発現を調節する）ＰＲＣ２結合転写物又はピーク（すなわち、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡの、より小さい領域）、及び（ｃ）ＰＲＣ２結合転写物又はピークと特異的に結合するか、又はこれに相補的なオリゴヌクレオチドの各々は、好都合には、これらのカテゴリーのいくつかに分類することができ、こうしたカテゴリーは、以下のように、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表３中の番号で、又は国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０６５１４３号パンフレットの表９中の番号で示されている：疾患は、次のカテゴリー番号：１１、１４、１５、１７、２１、２４、２６、４２、４４、４９、５８、６９、８２、１０３、１１９、１２０、１２６、１４３、１６３、１６７、１７２、１７７、１８２、１８３、１８４、１８７、１９１、１９６、２００、２０３、２０４、２１９、２２０、２２１、２２７、２３４、２３９、２４０、２４４、２４９、３００〜３２３のいずれか１つ、又は４００〜６４３のいずれか１つによって表される。
【０２０７】
他の機能グループは次のカテゴリー番号：１０、１２、１３、１６、１８、１９、２０、２２、２３、２５、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４３、４５、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、１００、１０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５８、１６０、１６１、１６２、１６４、１６５、１６６、１６８、１６９、１７０、１７１、１７３、１７４、１７５、１７６、１７８、１７９、１８０、１８１、１８５、１８６、１８８、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９７、１９８、１９９、２０１、２０２、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１３、２１５、２１６、２１７、２１８、２２２、２２３、２２４、２２６、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３５、２３６、２３７、２３８、２４１、２４２、２４３、２４５、２４６、２４７、２４８、２５０、２５１、２５２、又は２５３で表される。
【０２０８】
カテゴリー
番号  名称
１０  アクチン細胞骨格構築
１１  急性骨髄性白血病
１２  接着結合
１３  アディポサイトカインシグナル伝達経路
１４  加齢
１５  アルツハイマー病
１６  アミノ糖及びヌクレオチド糖代謝
１７  筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）
１８  血管新生
１９  アポトーシス
２０  アルギニン及びプロリン代謝
２１  不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）
２２  軸索誘導
２３  Ｂ細胞受容体シグナル伝達経路
２４  基底細胞癌（カテゴリー６４４にも属す）
２５  基底転写因子
２６  膀胱癌（カテゴリー６４４にも属す）
２７  血液凝結
２８  血管の発達
２９  骨の発達
３０  カルシウムシグナル伝達
３１  心筋収縮
３２  カチオンチャネル活性
３３  細胞接着
３４  細胞周期
３５  細胞周期
３６  細胞運動
３７  細胞表面受容体結合シグナル伝達
３８  ストレスに対する細胞応答
３９  チャネル活性
４０  ケモカインシグナル伝達経路
４１  コレステロール代謝プロセス
４２  慢性骨髄性白血病
４３  クエン酸回路（ＴＣＡ回路）
４４  結腸直腸癌
４５  補体及び凝固カスケード
４６  サイトカイン活性
４７  細胞骨格タンパク質結合
４８  サイトゾル
４９  拡張型心筋症
５０  ＤＮＡ結合
５１  ＤＮＡ修復
５２  ＤＮＡ複製
５３  ＤＮＡ複製
５４  薬物代謝
５５  胚形態形成
５６  エンドサイトーシス
５７  エンドサイトーシス
５８  子宮内膜癌
５９  小胞体
６０  ＥｒｂＢシグナル伝達経路
６１  細胞外領域
６２  眼の発生
６３  脂肪酸代謝
６４  フルクトース及びマンノース代謝
６５  Ｇタンパク質共役受容体タンパク質シグナル伝達経路
６６  配偶子形成
６７  ギャップ結合
６８  ｍｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシング
６９  神経膠腫
７０  グルコース代謝プロセス
７１  解糖／糖新生
７２  ゴルジ装置
７３  成長因子活性
７４  ＧＴＰａｓｅ調節因子活性
７５  心臓発生
７６  ヘッジホッグシグナル伝達経路
７７  造血細胞系統
７８  造血
７９  造血又はリンパ器官発生
８０  ヒストン修飾
８１  ハンチントン病
８２  肥大型心筋症（ＨＣＭ）
８３  免疫応答
８４  免疫系発生
８５  炎症性応答
８６  インスリンシグナル伝達経路
８７  細胞内シグナル伝達カスケード
８８  イオンチャネル活性
８９  イオン輸送
９０  Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路
９１  学習又は記憶
９２  白血球活性化
９３  白血球経内皮遊走
９４  四肢発生
９５  自発運動行動
９６  長期増強
９７  肺発生
９８  リソソーム
９９  リソソーム
１００  ＭＡＲＫシグナル伝達経路
１０１  ＭＡＰＫＫＫカスケード
１０２  メラニン形成
１０３  黒色腫
１０４  ミスマッチ修復
１０５  ミトコンドリア
１０６  ミトコンドリア構築
１０７  ｍＴＯＰシグナル伝達経路
１０８  筋肉組織発生
１０９  ｎｃＲＮＡ代謝プロセス
１１０  ニューロン発生
１１１  ニューロトロフィンシグナル伝達経路
１１２  非小細胞肺癌（カテゴリー６４４にも属す）
１１３  ノッチシグナル伝達経路
１１４  仁
１１５  卵母細胞減数分裂
１１６  酸化還元
１１７  酸化的リン酸化
１１８  ｐ５３シグナル伝達経路
１１９  膵臓癌（カテゴリー６４４にも属す）
１２０  パーキンソン病
１２１  癌における経路（カテゴリー６４４にも属す）
１２２  ホスファターゼ活性
１２３  リンタンパク質ホスファターゼ活性
１２４  細胞生合成プロセスの正の調節
１２５  ＰＰＡＲシグナル伝達経路
１２６  前立腺癌（カテゴリー６４４にも属す）
１２７  プロテアソーム
１２８  タンパク質アミノ酸脱リン酸化
１２９  タンパク質フォールディング
１３０  タンパク質キナーゼ活性
１３１  タンパク質セリン／トレオニンキナーゼ活性
１３２  プリン代謝
１３３  ピリミジン代謝
１３４  Ｒａｓタンパク質シグナル伝達
１３５  アクチン細胞骨格の調節
１３６  オートファジーの調節
１３７  細胞死の調節（カテゴリー６４４にも属す）
１３８  細胞増殖の調節（カテゴリー６４４にも属す）
１３９  細胞サイズの調節
１４０  タンパク質ユビキチン化の調節
１４１  Ｒａｓタンパク質シグナル伝達の調節
１４２  転写の調節
１４３  腎細胞癌（カテゴリー６４４にも属す）
１４４  低酸素に対する応答
１４５  ステロイドホルモン刺激に対する応答
１４６  ウイルスに対する応答
１４７  リボソーム
１４８  ＲＮＡ変性
１４９  ＲＮＡプロセシング
１５０  エステル交換反応によるＲＮＡスプライシング
１５１  分泌
１５２  骨格系発生
１５３  骨格系形態形成
１５４  小細胞肺癌（カテゴリー６４４にも属す）
１５５  小ＧＴＰａｓｅ調節因子活性
１５６  精子形成
１５７  スフィンゴ脂質代謝
１５８  スプライソソーム
１５９  スプライソソーム
１６０  幹細胞分化
１６１  ステロイド生合成
１６２  シナプス
１６３  全身性エリテマトーデス
１６４  Ｔ細胞活性化
１６５  Ｔ細胞受容体シグナル伝達経路
１６６  ＴＧＦ−βシグナル伝達経路
１６７  甲状腺癌（カテゴリー６４４にも属す）
１６８  トール様受容体シグナル伝達経路
１６９  転写アクチベータ活性
１７０  転写因子活性
１７１  翻訳
１７２  ＩＩ型糖尿病
１７３  ユビキチン媒介タンパク質分解
１７４  血管平滑筋収縮
１７５  血管発生
１７６  ＶＥＧＦシグナル伝達経路
１７７  ウイルス性心筋炎
１７８  Ｗｎｔシグナル伝達経路
１７９  アミノ酸生合成
１８０  ａｎｋ反復配列
１８１  ブロモドメイン
１８２  心筋症
１８３  白内障
１８４  シャルコー・マリー・トゥース病
１８５  サイトカイン
１８６  サイトカイン受容体
１８７  聾
１８８  疾患突然変異
１８９  ｅｇｆ様ドメイン
１９０  エンドソーム
１９１  癲癇
１９２  糖タンパク質
１９３  成長因子
１９４  成長因子結合
１９５  成長因子受容体
１９６  魚鱗癬
１９７  免疫グロブリンドメイン
１９８  イオンチャネル
１９９  ロイシンリッチ反復配列
２００  ロイコジストロフィー
２０１  メチル化
２０２  メチルトランスフェラーゼ
２０３  神経変性
２０４  神経障害
２０５  核
２０６  肥満
２０７  タンパク質ホスファターゼ
２０８  タンパク質ホスファターゼ阻害剤
２０９  癌遺伝子（癌原遺伝子を含む）（カテゴリー６４４にも属す）
２１０  分泌物
２１１  セリン／トレオニン特異的タンパク質キナーゼ
２１２  全身性エリテマトーデス
２１３  貫膜
２１４  貫膜タンパク質
２１５  腫瘍抑制因子（カテゴリー６４４にも属す）
２１６  チロシン−タンパク質キナーゼ
２１７  ｕｂｌ結合経路
２１８  ｗｄ反復配列
３００  膀胱癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３０１  白血病において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３０２  脳腫瘍において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３０３  乳癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３０４  子宮頸癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３０５  結腸癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３０６  食道癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３０７  胃癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３０８  頭頸部癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３０９  腎臓癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３１０  肝臓癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３１１  肺癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３１２  リンパ腫において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３１３  黒色腫において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３１４  多発性骨髄腫において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３１５  卵巣癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３１６  膵臓癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３１７  前立腺癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３１８  肉腫において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３１９  非黒色腫皮膚癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３２０  子宮癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３２１  中皮腫において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３２２  副腎癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
３２３  副甲状腺癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４００  腎臓の明細胞肉腫において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４０１  急性肺傷害において上方制御
４０２  急性巨核芽球性白血病において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４０３  急性骨髄性白血病において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４０４  急性膵炎（詳細不明）において下方制御
４０５  食道の腺癌において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４０６  肺の腺癌において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４０７  小腸の腺腫において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４０８  アデノウイルス感染症において上方制御
４０９  脳炎を伴うＡＩＤＳにおいて上方制御
４１０  アルコール中毒において上方制御
４１１  アレキサンダー病において上方制御
４１２  α１アンチトリプシン欠損症において上方制御
４１３  アルツハイマー病において上方制御
４１４  退形成性乏突起星細胞腫において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４１５  アンドロゲン不応症候群において上方制御
４１６  星細胞腫において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４１７  萎縮（筋肉）において上方制御
４１８  自己免疫性肝炎において上方制御
４１９  細菌感染症において上方制御
４２０  バレット食道において上方制御
４２１  小腸の上皮内癌において上方制御（カテゴリー６４４ｅにも属す）
４２２  心筋症において上方制御
４２３  慢性肉芽腫症において上方制御
４２４  慢性リンパ性白血病において上方制御
４２５  慢性閉塞性気道疾患において上方制御
４２６  慢性多関節型若年性関節リウマチにおいて上方制御
４２７  肝硬変において上方制御
４２８  コカイン依存性において上方制御
４２９  複雑齲歯において上方制御
４３０  クローン病において上方制御
４３１  非代償性心不全において上方制御
４３２  脱水症状において上方制御
４３３  拡張型心筋症において上方制御
４３４  ウイルス性心筋炎の続発性拡張型心筋症において上方制御
４３５  上皮増殖において上方制御
４３６  中枢神経系の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）感染症において上方制御
４３７  本態性血小板血症において上方制御
４３８  過剰排泄による消耗において上方制御
４３９  家族性低リン酸血症性骨疾患において上方制御
４４０  骨折において上方制御
４４１  大腿骨骨折において上方制御
４４２  全般性虚血性心筋不全骨折において上方制御
４４３  膠芽腫において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４４４  ハンマン−リッチ症候群において上方制御
４４５  ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）胃腸管感染症において上方制御
４４６  Ｃ型肝炎において上方制御
４４７  ＨＩＶ感染症において上方制御
４４８  ハンチントン病において上方制御
４４９  高コレステロール血症において上方制御
４５０  肥大症において上方制御
４５１  特発性血小板減少性紫斑病において上方制御
４５２  エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）による感染症において上方制御
４５３  無精子症による不妊において上方制御
４５４  心臓の傷害において上方制御
４５５  ＩＳＭ（皮膚の表皮内黒色腫）において上方制御
４５６  レーバ（Ｌｅｂｅｒ’ｓ）先天黒内障において上方制御
４５７  肝臓癌において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４５８  黄斑変性において上方制御
４５９  悪性リンパ腫において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４６０  子宮頸部の悪性新生物において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４６１  十二指腸の悪性新生物において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４６２  前立腺の悪性新生物において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４６３  胃の悪性新生物において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４６４  精巣の悪性新生物において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４６５  結腸の悪性腫瘍において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４６６  多発性良性色素性母斑において上方制御
４６７  腎障害（糖尿病性）において上方制御
４６８  インスリン非依存型糖尿病性において上方制御
４６９  栄養欠乏において上方制御
４７０  閉塞型睡眠時無呼吸において上方制御
４７１  乏突起膠腫において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４７２  甲状腺乳頭癌において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４７３  パーキンソン病において上方制御
４７４  ブタ腎障害において上方制御
４７５  子癇前症において上方制御
４７６  原発性心筋症において上方制御
４７７  原発性開放隅角緑内障において上方制御
４７８  原発性肺形成不全において上方制御
４７９  緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染症において上方制御
４８０  肺気腫において上方制御
４８１  肺高血圧において上方制御
４８２  ＩＩ型糖尿病に関連する腎障害において上方制御
４８３  網膜損傷において上方制御
４８４  網膜色素変性において上方制御
４８５  関節リウマチにおいて上方制御
４８６  扁平上皮癌において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４８７  肺の扁平上皮癌において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４８８  癲癇重積状態において上方制御
４８９  全身性感染症において上方制御
４９０  血小板減少症において上方制御
４９１  胸腺癌において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４９２  移行上皮癌において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４９３  移行上皮内癌において上方制御（カテゴリー６４４にも属す）
４９４  潰瘍性大腸炎において上方制御
４９５  子宮筋腫において上方制御
４９６  人工呼吸器関連肺傷害において上方制御
４９７  心室肥大において上方制御
４９８  心室肥大（及び［左］）において上方制御
４９９  ビタミンＡ欠乏において上方制御
５００  腎臓の明細胞肉腫において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５０１  急性肺傷害において下方制御
５０２  急性巨核芽球性白血病において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５０３  急性骨髄性白血病において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５０４  急性膵炎（詳細不明）において下方制御
５０５  食道の腺癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５０６  肺の腺癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５０７  小腸の腺腫において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５０８  アデノウイルス感染症において下方制御
５０９  脳炎を伴うＡＩＤＳにおいて下方制御
５１０  アルコール中毒において下方制御
５１１  アレキサンダー病において下方制御
５１２  α１アンチトリプシン欠損症において下方制御
５１３  アルツハイマー病において下方制御
５１４  退形成性乏突起星細胞腫において下方制御
５１５  アンドロゲン不応症候群において下方制御
５１６  星細胞腫において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５１７  萎縮（筋肉）において下方制御
５１８  自己免疫性肝炎において下方制御
５１９  細菌感染症において下方制御
５２０  バレット食道において下方制御
５２１  小腸の上皮内癌ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５２２  心筋症において下方制御
５２３  慢性肉芽腫症において下方制御
５２４  慢性リンパ性白血病において下方制御
５２５  慢性閉塞性気道疾患において下方制御
５２６  慢性多関節型若年性関節リウマチにおいて下方制御
５２７  肝硬変において下方制御
５２８  コカイン依存性において下方制御
５２９  複雑齲歯において下方制御
５３０  クローン病において下方制御
５３１  非代償性心不全において下方制御
５３２  脱水症状において下方制御
５３３  拡張型心筋症において下方制御
５３４  ウイルス性心筋炎の続発性拡張型心筋症において下方制御
５３５  上皮増殖において下方制御
５３６  中枢神経系の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）感染において下方制御
５３７  本態性血小板血症において下方制御
５３８  過剰排泄による消耗において下方制御
５３９  家族性低リン酸血症性骨疾患において下方制御
５４０  骨折において下方制御
５４１  大腿骨骨折において下方制御
５４２  全般性虚血性心筋不全骨折において下方制御
５４３  膠芽腫において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５４４  ハンマン−リッチ症候群において下方制御
５４５  ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）胃腸管感染において下方制御
５４６  Ｃ型肝炎において下方制御
５４７  ＨＩＶ感染において下方制御
５４８  ハンチントン病において下方制御
５４９  高コレステロール血症において下方制御
５５０  肥大症において下方制御
５５１  特発性血小板減少性紫斑病において下方制御
５５２  エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）による感染症において下方制御
５５３  無精子症による不妊において下方制御
５５４  心臓の傷害において下方制御
５５５  ＩＳＭ（皮膚の表皮内黒色腫）において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５５６  レーバ（Ｌｅｂｅｒ’ｓ）先天黒内障において下方制御
５５７  肝臓癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５５８  黄斑変性において下方制御
５５９  悪性リンパ腫において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５６０  子宮頸部の悪性新生物において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５６１  十二指腸の悪性新生物において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５６２  前立腺の悪性新生物において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５６３  胃の悪性新生物において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５６４  精巣の悪性新生物において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５６５  結腸の悪性腫瘍において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５６６  多発性良性色素性母斑において下方制御
５６７  腎障害（糖尿病性）において下方制御
５６８  インスリン非依存型糖尿病性において下方制御
５６９  栄養欠乏において下方制御
５７０  閉塞型睡眠時無呼吸において下方制御
５７１  乏突起膠腫において下方制御
５７２  甲状腺乳頭癌において下方制御
５７３  パーキンソン病において下方制御
５７４  ブタ腎障害において下方制御
５７５  子癇前症において下方制御
５７６  原発性心筋症において下方制御
５７７  原発性開放隅角緑内障において下方制御
５７８  原発性肺形成不全において下方制御
５７９  緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染症において下方制御
５８０  肺気腫において下方制御
５８１  肺高血圧において下方制御
５８２  ＩＩ型糖尿病に関連する腎障害において下方制御
５８３  網膜損傷において下方制御
５８４  網膜色素変性において下方制御
５８５  関節リウマチにおいて下方制御
５８６  扁平上皮癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５８７  肺の扁平上皮癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５８８  癲癇重積状態において下方制御
５８９  全身性感染症において下方制御
５９０  血小板減少症において下方制御
５９１  胸腺癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５９２  移行上皮癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５９３  移行上皮内癌において下方制御（カテゴリー６４４にも属す）
５９４  潰瘍性大腸炎において下方制御
５９５  子宮筋腫において下方制御
５９６  人工呼吸器関連肺傷害において下方制御
５９７  心室肥大において下方制御
５９８  心室肥大（及び［左］）において下方制御
５９９  ビタミンＡ欠乏において下方制御
６００  骨疾患に関連する
６０１  癌に関連する（カテゴリー６４４にも属す）
６０２  心血管疾患に関連する
６０３  結合組織障害に関連する
６０４  皮膚疾患に関連する
６０５  発達障害に関連する
６０６  耳鼻咽喉疾患に関連する
６０７  内分泌疾患に関連する
６０８  胃腸疾患に関連する
６０９  血液疾患に関連する
６１０  免疫疾患に関連する
６１１  代謝疾患に関連する
６１２  多発性疾患に関連する
６１３  筋疾患に関連する
６１４  神経疾患に関連する
６１５  栄養疾患に関連する
６１６  眼科疾患に関連する
６１７  その他の疾患に関連する
６１８  精神疾患に関連する
６１９  腎臓疾患に関連する
６２０  呼吸器疾患に関連する
６２１  骨格系疾患に関連する
６２２  骨疾患に関連する
６２３  癌に関連する（カテゴリー６４４にも属す）
６２４  心血管疾患に関連する
６２５  結合組織障害に関連する
６２６  皮膚疾患に関連する
６２７  発達障害に関連する
６２８  耳鼻咽喉疾患に関連する
６２９  内分泌疾患に関連する
６３０  胃腸疾患に関連する
６３１  血液疾患に関連する
６３２  免疫疾患に関連する
６３３  代謝疾患に関連する
６３４  多発性疾患に関連する
６３５  筋疾患に関連する
６３６  神経疾患に関連する
６３７  栄養疾患に関連する
６３８  眼科疾患に関連する
６３９  その他の疾患に関連する
６４０  精神疾患に関連する
６４１  腎臓疾患に関連する
６４２  呼吸器疾患に関連する
６４３  骨格系疾患に関連する
６４４  癌に関連する
【０２０９】
このように、様々な態様において、本発明は、遺伝子の発現の調節に用いるための、本明細書に開示するＲＮＡのいずれかと特異的に結合するオリゴヌクレオチドを特徴とする。別の態様では、本発明は、標的遺伝子の「逆鎖」若しくはこれと「同じ鎖」のいずれにおいても、配列Ｂ４７，４０８〜Ｂ６１６，４２８［マウスピーク］又はＢ６５２，２５６〜Ｂ９１６，２０９又はＢ９１６，６２６〜Ｂ９３４，７６１［ヒトピーク周囲の、より長い領域］のＲＮＡ配列のいずれかと特異的に結合するか、又はこれらと相補的なオリゴヌクレオチドも特徴とする（例えば、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２に表示される通り）。ある実施形態において、ＰＲＣ２結合ＲＮＡによりターゲティングされる遺伝子（例えば、交差又は近傍の遺伝子）の発現を調節する方法に用いるためのオリゴヌクレオチドが提供される。こうした方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれでも実施してよい。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは疾患を治療する方法に使用するために提供される。治療は、ＰＲＣ２結合ＲＮＡによりターゲティングされる遺伝子の発現を調節すること、好ましくは遺伝子発現を上方制御することを含み得る。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、非経口投与のための滅菌組成物として製剤化する。これらのＲＮＡ配列によりターゲティングされる標準遺伝子は、表２〜３に記載され、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表３においてカテゴリー１〜６４４に従い分類されているか、又は表２に記載する刷り込み遺伝子である。従って、一態様では、本発明は、カテゴリー１〜６４４のいずれか１つにおけるＲＮＡ配列の一群（転写物若しくはピークのいずれか）と特異的に結合するか、又はこれと相補的なオリゴヌクレオチドの一群を記載する。特に、本発明は、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表３に表示されるカテゴリーのいずれか（例えば、カテゴリー番号：１１、１４、１５、１７、２１、２４、２６、４２、４４、４９、５８、６９、８２、１０３、１１９、１２０、１２６、１４３、１６３、１６７、１７２、１７７、１８２、１８３、１８４、１８７、１９１、１９６、２００、２０３、２０４、２１２、３００、３２３、及び／若しくは４００〜６４４のいずれか１つ又は複数）に記載されている疾患、障害、状態又は関連状態の治療に用いる目的で、表２に表示する標準遺伝子のいずれかの発現を上方制御するためのそのようなオリゴヌクレオチドの使用を特徴とする。
【０２１０】
非制限的例として、カテゴリー４５（補体及び凝固カスケード）は、以下：Ａ２Ｍ、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＢＤＫＲＢ１、ＢＤＫＲＢ２、ＣＦＢ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、Ｃ１ＱＡ、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＣ、Ｃ１Ｒ、Ｃ１Ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ３ＡＲ１、Ｃ４Ａ、Ｃ４Ｂ、Ｃ４ＢＰＡ、Ｃ４ＢＰＢ、Ｃ５、Ｃ５ＡＲ１、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８Ａ、Ｃ８Ｂ、Ｃ９、ＣＤ５９、ＣＰＢ２、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＤ５５、ＣＦＤ、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２、Ｆ１３Ａ１、Ｆ１３Ｂ、ＦＧＡ、ＦＧＢ、ＦＧＧ、ＳＥＲＰＩＮＤ１、ＣＦＨ、ＣＦＩ、ＫＬＫＢ１、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＣＤ４６、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＰＬＡＴ、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ２、ＰＲＯＣ、ＰＲＯＳ１、ＭＡＳＰ１、ＴＦＰＩ、ＴＨＢＤ、ＶＷＦ及び／又はＭＡＳＰ２からなる群から選択される標準遺伝子を含む。
【０２１１】
また、Ａ２Ｍ、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＢＤＫＲＢ１、ＢＤＫＲＢ２、ＣＦＢ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、Ｃ１ＱＡ、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＣ、Ｃ１Ｒ、Ｃ１Ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ３ＡＲ１、Ｃ４Ａ、Ｃ４Ｂ、Ｃ４ＢＰＡ、Ｃ４ＢＰＢ、Ｃ５、Ｃ５ＡＲ１、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８Ａ、Ｃ８Ｂ、Ｃ９、ＣＤ５９、ＣＰＢ２、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＤ５５、ＣＦＤ、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２、Ｆ１３Ａ１、Ｆ１３Ｂ、ＦＧＡ、ＦＧＢ、ＦＧＧ、ＳＥＲＰＩＮＤ１、ＣＦＨ、ＣＦＩ、ＫＬＫＢ１、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＣＤ４６、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＰＬＡＴ、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ２、ＰＲＯＣ、ＰＲＯＳ１、ＭＡＳＰ１、ＴＦＰＩ、ＴＨＢＤ、ＶＷＦ及び／又はＭＡＳＰ２の各々は、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２の該当する行に表示されている配列識別子を有するＰＲＣ２関連ＲＮＡによってターゲティングされる。例えば、Ｆ２ターゲティング配列としては、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２に従い、コード遺伝子と同じ鎖上の配列：Ｂ６２００３７［Ｆ］、Ｂ６２００３５［４０２７］、Ｂ７９０７３０［４７５２］、Ｂ４５３９［２０５９］、Ｂ３４１２８８［３２７８］、Ｂ４５３７［４６３９］、及びコード遺伝子の逆鎖上の配列：Ｂ６２００３６［Ｆ］、Ｂ７９０７３１−［Ｆ］、Ｂ４５３８［Ｆ］、Ｂ３４１２８６［Ｆ］、Ｂ３４１２８７［Ｆ］が挙げられる。
【０２１２】
ｒｅｆＧｅｎｅ：Ａ２Ｍ、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＢＤＫＲＢ１、ＢＤＫＲＢ２、ＣＦＢ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、Ｃ１ＱＡ、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＣ、Ｃ１Ｒ、Ｃ１Ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ３ＡＲ１、Ｃ４Ａ、Ｃ４Ｂ、Ｃ４ＢＰＡ、Ｃ４ＢＰＢ、Ｃ５、Ｃ５ＡＲ１、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８Ａ、Ｃ８Ｂ、Ｃ９、ＣＤ５９、ＣＰＢ２、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＤ５５、ＣＦＤ、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２、Ｆ１３Ａ１、Ｆ１３Ｂ、ＦＧＡ、ＦＧＢ、ＦＧＧ、ＳＥＲＰＩＮＤ１、ＣＦＨ、ＣＦＩ、ＫＬＫＢ１、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＣＤ４６、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＰＬＡＴ、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ２、ＰＲＯＣ、ＰＲＯＳ１、ＭＡＳＰ１、ＴＦＰＩ、ＴＨＢＤ、ＶＷＦ及び／又はＭＡＳＰ２をターゲティングするものとして、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２に記載されているこれら配列のいずれか１つと特異的に結合するか、又はこれに相補的なオリゴヌクレオチドの群が、本明細書に記載する組成物及び方法のいずれかでの使用に考慮され、こうした使用には、限定しないが、カテゴリー４５（補体及び凝固カスケード）の疾患の治療における使用が含まれ、この治療は、標準遺伝子：Ａ２Ｍ、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＢＤＫＲＢ１、ＢＤＫＲＢ２、ＣＦＢ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、Ｃ１ＱＡ、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＣ、Ｃ１Ｒ、Ｃ１Ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ３ＡＲ１、Ｃ４Ａ、Ｃ４Ｂ、Ｃ４ＢＰＡ、Ｃ４ＢＰＢ、Ｃ５、Ｃ５ＡＲ１、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８Ａ、Ｃ８Ｂ、Ｃ９、ＣＤ５９、ＣＰＢ２、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＤ５５、ＣＦＤ、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２、Ｆ１３Ａ１、Ｆ１３Ｂ、ＦＧＡ、ＦＧＢ、ＦＧＧ、ＳＥＲＰＩＮＤ１、ＣＦＨ、ＣＦＩ、ＫＬＫＢ１、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＣＤ４６、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＰＬＡＴ、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ２、ＰＲＯＣ、ＰＲＯＳ１、ＭＡＳＰ１、ＴＦＰＩ、ＴＨＢＤ、ＶＷＦ及び／又はＭＡＳＰ２のいずれかの調節を含む。
【０２１３】
同様に、カテゴリー６４３の遺伝子（「骨格系疾患において低減する」）と特異的に結合するか、又はこれと相補的なオリゴヌクレオチドが、本明細書に記載する組成物及び方法のいずれかでの使用に考慮され、こうした使用として、限定しないが、骨格系疾患の治療での使用が挙げられる。カテゴリー６４４の一部でもあるカテゴリーにおける遺伝子と特異的に結合するか、又はこれに相補的なオリゴヌクレオチド（癌に関与する）が、本明細書に記載する組成物及び方法のいずれかでの使用に考慮され、こうした使用として、限定しないが、癌の治療での使用が挙げられる。
【０２１４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示する転写物のピーク、又は非ピーク領域、又はピークに隣接する領域と相補的であるか、又はこれらと特異的に結合するかのいずれであってもよいことは理解されよう。様々な態様では、本発明はさらに、互いに近傍の、例えば、互いに１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、１ｋｂ、又は２ｋｂ以内に位置する染色体座標に対応する２つ以上のピークの間のＲＮＡ配列に結合し、しかも、好ましくは、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０６５１４３号パンフレットの表８又は国際特許出願公開：ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／６５９３９号パンフレットの表２の同じ標準遺伝子に関連するオリゴヌクレオチドを特徴とする。例えば、本発明は、配列Ａ１〜Ａ２１５８２、若しくはＡ１９１０８９〜Ａ１９３０４９、又は配列Ｂ１〜Ｂ４７，４０７若しくは配列Ｂ９３４，７６２〜Ｂ９３４，８６３［マウス転写物］又はＢ６１６，４２９〜Ｂ６５２，２５５若しくはＢ９１６，２１０〜Ｂ９１６，６２５若しくはＢ９３４，８６４〜Ｂ９３４，９６８［ヒト転写物］又はＢ９１６，６２６〜Ｂ９３４，７６１［ヒトピーク周囲の、より大きな領域］のＲＮＡ転写物のいずれかの断片と特異的に結合するか、又はこれらと相補的であり、前記断片は、長さ約２０００、約１７５０、約１５００、約１２５０ヌクレオチドであり、又は、好ましくは長さ約１０００、約７５０、約５００、約４００、約３００ヌクレオチドであり、あるいは、より好ましくは長さ約２００、約１５０、若しくは約１００ヌクレオチドであり、ここで、ＲＮＡの断片は、配列Ａ１２４４３７〜Ａ１９０７１６、若しくはＡ１９０９３４〜Ａ１９１０８６、若しくはＡ１９１０８７［ヒトピーク］、又は配列Ａ２１５８３〜Ａ１２４４３６、若しくはＡ１９０７１７〜Ａ１９０９３３、若しくは１９１０８８［マウスピーク］、又は配列Ｂ４７，４０８〜Ｂ６１６，４２８［マウスピーク］若しくは配列Ｂ６５２，２５６〜Ｂ９１６，２０９［ヒトピーク］、又は２０１０年１２月２０日に提出された米国仮特許出願第６１／４２５，１７４号明細書（参照によりその全体を本明細書に組み込む）の付録ＩのｃＤＮＡ配列のいずれかの逆相補鎖のいずれかにおいて少なくとも５個の連続したヌクレオチドの区間を含む。例示的実施形態において、ＲＮＡの断片は、配列Ａ１２４４３７〜Ａ１９０７１６、若しくはＡ１９０９３４〜Ａ１９１０８６、若しくはＡ１９１０８７［ヒトピーク］、又はＡ２１５８３〜Ａ１２４４３６、若しくはＡ１９０７１７〜Ａ１９０９３３、若しくは１９１０８８［マウスピーク］、又は配列Ｂ４７，４０８〜Ｂ６１６，４２８［マウスピーク］又は配列Ｂ６５２，２５６〜Ｂ９１６，２０９［ヒトピーク］、又は２０１０年１２月２０日に提出された米国仮特許出願第６１／４２５，１７４号明細書（参照によりその全体を本明細書に組み込む）の付録ＩのｃＤＮＡ配列のいずれかの逆相補鎖のいずれかにおいて少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０個の連続したヌクレオチドの区間を含む。
【０２１５】
従って、例えば、本明細書の説明は、長さ約２０００、約１７５０、約１５００、約１２５０ヌクレオチドであり、又は、好ましくは長さ約１０００、約７５０、約５００、約４００、約３００ヌクレオチドであり、あるいは、より好ましくは長さ約２００、約１５０、若しくは約１００ヌクレオチドの断片に結合するオリゴヌクレオチドを含み、上記断片は、以下：
（ａ）好ましくは国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２の同じ標準遺伝子に関連する、配列Ｂ４７４０８〜Ｂ６１６４２８［マウスピーク］のいずれかにおいて、少なくとも５個の連続したヌクレオチド、又は６、７、８、９、若しくは１０個以上の連続したヌクレオチドの区間を含む配列Ｂ１〜Ｂ４７４０７［マウス転写物］のいずれかの断片；
（ｂ）好ましくは国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２の同じ標準遺伝子に関連する、配列Ｂ６５２２５６〜Ｂ９１６２０９［ヒトピーク］のいずれかにおいて、少なくとも５個の連続したヌクレオチド、又は６、７、８、９、若しくは１０個以上の連続したヌクレオチドの区間を含む配列Ｂ６１６，４２９〜Ｂ６５２，２５５［ヒト転写物］のいずれかの断片；
（ｃ）好ましくは国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２の同じ標準遺伝子に関連する、配列Ｂ６５２２５６〜Ｂ９１６２０９［ヒトピーク］のいずれかにおいて、少なくとも５個の連続したヌクレオチド、又は６、７、８、９、若しくは１０個以上の連続したヌクレオチドの区間を含む配列Ｂ９１６，６２６〜Ｂ９３４，７６１［ヒトピーク周囲の、より大きな領域］のいずれかの断片；
（ｄ）好ましくは国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２又は表２の同じ標準遺伝子に関連する、配列Ｂ４７４０８〜Ｂ６１６４２８［マウスピーク］のいずれかにおいて、少なくとも５個の連続したヌクレオチド、又は６、７、８、９、若しくは１０個以上の連続したヌクレオチドの区間を含む配列Ｂ９３４７６２〜Ｂ９３４８６３［マウス刷り込み転写物］のいずれかの断片；
（ｅ）好ましくは国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２又は表２の同じ標準遺伝子に関連する、配列Ｂ６５２２５６〜Ｂ９１６２０９［ヒトピーク］のいずれかにおいて、少なくとも５個の連続したヌクレオチド、又は６、７、８、９、若しくは１０個以上の連続したヌクレオチドの区間を含む配列Ｂ６２９９９１、Ｂ６２９９９２、Ｂ６３０９８３、Ｂ６３０９８４、Ｂ６３０９９０、Ｂ６３１００３、Ｂ６３１００４、Ｂ６３２３９６、Ｂ６３２３９７、Ｂ６３２４０２、Ｂ６３２４０３、Ｂ６３２４１９、Ｂ６３２４２２、Ｂ６３４９５９、Ｂ６３８３０３、Ｂ６３８３０４、Ｂ６４７５９５、Ｂ６４７５９６、Ｂ６４７５９７、Ｂ６４７５９８、Ｂ６４７６０１、Ｂ６４９０２８、及びＢ９３４８６４〜Ｂ９３４９３１［ヒト刷り込み転写物］のいずれかの断片；
（ｆ）好ましくは国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２の同じ標準遺伝子に関連する、配列Ｂ６５２２５６〜Ｂ９１６２０９［ヒトピーク］のいずれかにおいて、少なくとも５個の連続したヌクレオチド、又は６、７、８、９、若しくは１０個以上の連続したヌクレオチドの区間を含む配列Ｂ９１６２１０〜Ｂ９１６６２５［ヒト転写物］のいずれかの断片；又は
（ｇ）好ましくは国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２の同じ標準遺伝子に関連する、配列６５２２５６〜Ｂ９１６２０９［ヒトピーク］のいずれかにおいて、少なくとも５個の連続したヌクレオチド、又は６、７、８、９、若しくは１０個以上の連続したヌクレオチドの区間を含む配列Ｂ９３４９３２〜Ｂ９３４９６８［ヒト転写物］のいずれかの断片
である。
【０２１６】
従って、前述したように、オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの少なくとも１０、若しくは１０〜３０若しくは１０〜４０個の連続した塩基と少なくとも８０％相補的、又は標的ＲＮＡの少なくとも１５、若しくは１５〜３０、若しくは１５〜４０個の連続した塩基と少なくとも８０％相補的、又は標的ＲＮＡの少なくとも２０、若しくは２０〜３０、若しくは２０〜４０個の連続した塩基と少なくとも８０％相補的、又は標的ＲＮＡの少なくとも２５、若しくは２５〜３０、若しくは２５〜４０個の連続した塩基と少なくとも８０％相補的、又は標的ＲＮＡの少なくとも３０、若しくは３０〜４０個の連続した塩基と少なくとも８０％相補的、又は標的ＲＮＡの少なくとも４０個の連続した塩基と少なくとも８０％相補的である塩基の配列を含むか、又はこれから構成され得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの少なくとも５、若しくは５〜３０若しくは５〜４０若しくは８〜４０個の連続した塩基と少なくとも９０％相補的、又は標的ＲＮＡの少なくとも１０、若しくは１０〜３０、若しくは１０〜４０個の連続した塩基と少なくとも９０％相補的、又は標的ＲＮＡの少なくとも１５、若しくは１５〜３０、若しくは１５〜４０個の連続した塩基と少なくとも９０％相補的、又は標的ＲＮＡの少なくとも２０、若しくは２０〜３０、若しくは２０〜４０個の連続した塩基と少なくとも９０％相補的、又は標的ＲＮＡの少なくとも２５、若しくは２５〜３０、若しくは２５〜４０個の連続した塩基と少なくとも９０％相補的、又は標的ＲＮＡの少なくとも３０、若しくは３０〜４０個の連続した塩基と少なくとも９０％相補的、又は標的ＲＮＡの少なくとも４０個の連続した塩基と少なくとも９０％相補的である塩基の配列を含むか、又はこれから構成され得る。同様に、オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの少なくとも５、１０、若しくは１５個の連続した塩基と完全に相補的な塩基の配列を含むか、又はこれから構成され得る。いくつかの追加的な非相補的塩基が含まれ得ることは理解されよう。記載する塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドが、他の非相補的塩基を含んでもよいことは理解されよう。例えば、オリゴヌクレオチドは、全長２０塩基であってよく、その際、標的ＲＮＡの１５塩基と完全に相補的な１５塩基部分を含むものでもよい。同様に、オリゴヌクレオチドは、全長２０塩基であってよく、その際、標的ＲＮＡの１５塩基と少なくとも８０％相補的な１５塩基部分を含むものでもよい。
【０２１７】
相補性は、前述したように、相補的塩基対合におけるミスマッチの数に関して表現することもできる。従って、オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの１０個超の連続した塩基に対して３つ以下のミスマッチ、標的ＲＮＡの１５個超の連続した塩基に対して３つ以下のミスマッチ、又は標的ＲＮＡの２０個超の連続した塩基に対して３つ以下のミスマッチ、又は標的ＲＮＡの２５個超の連続した塩基に対して３つ以下のミスマッチ、又は標的ＲＮＡの３０個超の連続した塩基に対して３つ以下のミスマッチを有する塩基の配列を含むか、若しくはこれから構成され得る。同様に、オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの１０個超の連続した塩基に対して２つ以下のミスマッチ、又は標的ＲＮＡの１５個超の連続した塩基に対して２つ以下のミスマッチ、又は標的ＲＮＡの２０個超の連続した塩基に対して２つ以下のミスマッチ、又は標的ＲＮＡの２５個超の連続した塩基に対して２つ以下のミスマッチ、又は標的ＲＮＡの３０個超の連続した塩基に対して２つ以下のミスマッチを有する塩基の配列を含むか、若しくはこれから構成され得る。同様に、オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの１０、１５、２０、２５若しくは３０個超の連続した塩基に対して１つのミスマッチを有する塩基の配列を含むか、若しくはこれから構成され得る。
【０２１８】
本明細書に（例えば、発明の概要、発明を実施するための形態、又は実施例に）記載するオリゴヌクレオチド又はこれらを設計若しくは合成する方法の実施形態のいくつか又はいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドは、以下に挙げる刊行物のいずれか１つ又は複数に開示されているオリゴヌクレオチドのいずれか１つ又は複数を任意選択により除外し得る：標的としてＨＯＴＡＩＲ  ＲＮ（Ｒｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、Ｔｓｉｘ、ＲｅｐＡ、若しくはＸｉｓｔ  ＲＮＡｓ（（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）［配列Ｂ９３６１６６〜Ｂ９３６１７０］、又は（Ｓａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）［配列Ｂ９３６１７７〜Ｂ９３６１８６］又は（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）［配列Ｂ９３６１８７〜Ｂ９３６１８８］又は（Ｐｒａｓｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）［配列Ｂ９３６１７３〜Ｂ９３６１７６］、又は（Ｓｈａｍｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）［配列Ｂ９３６１７２］又は（Ｍａｒｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）［配列Ｂ９３６１７１］又は（Ｓｕｎｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）又は（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）［配列Ｂ９３６１８９］；又はＰＲＣ２調節因子として同定される５０  ２００ｎｔのターゲティング短ＲＮＡとして（Ｋａｎｈｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）；又は（Ｋｕｗａｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第２００５／０２２６８４８号明細書）［配列Ｂ９３６１９０〜Ｂ９３６１９１］又は（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第２０１０／０２１０７０７号明細書）［Ｂ９３６１９２〜Ｂ９３６２２７］又は（Ｃｏｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，７，７０９，４５６）［Ｂ９３６２２８〜Ｂ９３６２４５］又は（Ｍａｔｔｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第２００９／１２４３４１号明細書）、又は（Ｃｏｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第２０１０／０２７３８６３号明細書）［配列Ｂ９３６２４６〜Ｂ９３６２６５］、又は（Ｗａｈｌｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第２００９／０２５８９２５号明細書）［配列Ｂ９３５０６０〜Ｂ９３５１２６］、又はＢＡＣＥ：米国特許第２００９／０２５８９２５号明細書［配列Ｂ９３５０６０〜Ｂ９３５１２６］；ＡｐｏＡ１：米国特許第２０１０／０１０５７６０号明細書）／欧州特許第２３５２８３号明細書［配列Ｂ９３５１２７〜Ｂ９３５２９９］、Ｐ７３、ｐ５３、ＰＴＥＮ、国際公開第２０１０／０６５７８７Ａ２号パンフレット／欧州特許第２３７０５８２号明細書［配列Ｂ９３５３００〜Ｂ９３５３４５］；ＳＩＲＴ１：国際公開第２０１０／０６５６６２Ａ２号パンフレット／欧州特許第０９８３１０６８号明細書［配列Ｂ９３５３４６〜Ｂ９３５３９２］；ＶＥＧＦ：国際公開第２０１０／０６５６７１−Ａ２／欧州特許第２３７０５８１号明細書−［配列Ｂ９３５３９３〜Ｂ９３５４０３］；ＥＰＯ：国際公開第２０１０／０６５７９２Ａ２号パンフレット／欧州特許第０９８３１１５２号明細書［配列Ｂ９３５４０４〜Ｂ９３５４１２］；ＢＤＮＦ：国際公開第２０１０／０９３９０４号パンフレット［配列Ｂ９３５４１３〜Ｂ９３５４２３］、ＤＬＫ１：国際公開第２０１０／１０７７４０号パンフレット［配列Ｂ９３５４２４〜Ｂ９３５４３０］；ＮＲＦ２／ＮＦＥ２Ｌ２：��際公開第２０１０／１０７７３３号パンフレット［配列Ｂ９３５４３１〜Ｂ９３５４３８］；ＧＤＮＦ：国際公開第２０１０／０９３９０６号パンフレット［配列Ｂ９３５４３９〜Ｂ９３５４７６］；ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｏｃｔ３Ａ／Ｂ、“再プログラム化因子：国際公開第２０１０／１３５３２９号パンフレット［配列Ｂ９３５４７７〜Ｂ９３５４９３］；ジストロフィン（Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）：国際公開第２０１０／１２９８６１号パンフレット−［配列Ｂ９３５４９４〜Ｂ９３５５２５］；ＡＢＣＡ１、ＬＣＡＴ、ＬＲＰ１、ＡｐｏＥ、ＬＤＬＲ、ＡｐｏＡ１：国際公開第２０１０／１２９７９９号パンフレット［配列Ｂ９３５５２６〜Ｂ９３５８０４］；ＨｇＦ：国際公開第２０１０／１２７１９５号パンフレット［配列Ｂ９３５８０５〜Ｂ９３５８０９］；ＴＴＰ／Ｚｆｐ３６：国際公開第２０１０／１２９７４６号パンフレット［配列Ｂ９３５８１０〜Ｂ９３５８２４］；ＴＦＥ３、ＩＲＳ２：国際公開第２０１０／１３５６９５号パンフレット［配列Ｂ９３５８２５〜Ｂ９３５８３９］；ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＩＦＮＡ１：国際公開第２０１０／１３８８０６号パンフレット［配列Ｂ９３５８４０〜Ｂ９３５８７８］；ＰＯＮ１：国際公開第２０１０／１４８０６５号パンフレット［配列Ｂ９３５８７９〜Ｂ９３５８８５］；コラーゲン：国際公開第２０１０／１４８０５０号パンフレット［配列Ｂ９３５８８６〜Ｂ９３５９１８］；Ｄｙｒｋ１Ａ、Ｄｓｃｒ１、「ダウン症候群遺伝子」：国際公開第２０１０／１５１６７４号パンフレット［配列Ｂ９３５９１９〜Ｂ９３５９４２］；ＴＮＦＲ２：国際公開第２０１０／１５１６７１号パンフレット−［配列Ｂ９３５９４３〜Ｂ９３５９５１］；インスリン：国際公開第２０１１／０１７５１６号パンフレット［配列Ｂ９３５９５２〜Ｂ９３５９６３］；ＡＤＩＰＯＱ：国際公開第２０１１／０１９８１５号パンフレット［配列Ｂ９３５９６４〜Ｂ９３５９９２］；ＣＨＩＰ：国際公開第２０１１／０２２６０６号パンフレット［配列Ｂ９３５９９３〜Ｂ９３６００４］；ＡＢＣＢ１：国際公開第２０１１／０２５８６２号パンフレット［配列Ｂ９３６００５〜Ｂ９３６０１４］；ＮＥＵＲＯＤ１、ＥＵＲＯＤ１、ＨＮＦ４Ａ、ＭＡＦＡ、ＰＤＸ、ＫＸ６、「膵臓発生遺伝子」：国際公開第２０１１／０８５０６６号パンフレット［配列Ｂ９３６０１５〜Ｂ９３６０５４］；ＭＢＴＰＳ１：国際公開第２０１１／０８４４５５号パンフレット［配列Ｂ９３６０５５〜Ｂ９３６０５９］；ＳＨＢＧ：国際公開第２０１１／０８５３４７号パンフレット［配列Ｂ９３６０６０〜Ｂ９３６０７５］；ＩＲＦ８：国際公開第２０１１／０８２４０９号パンフレット［配列Ｂ９３６０７６〜Ｂ９３６０８０］；ＵＣＰ２：国際公開第２０１１／０７９２６３号パンフレット［配列Ｂ９３６０８１〜Ｂ９３６０９３］；ＨＧＦ：国際公開第２０１１／０７９２６１号パンフレット−［配列Ｂ９３６０９４〜Ｂ９３６１０４］；ＧＨ：国際公開第２０１１／０３８２０５号パンフレット［配列Ｂ９３６１０５〜Ｂ９３６１１０］；ＩＱＧＡＰ：国際公開第２０１１／０３１４８２号パンフレット［配列Ｂ９３６１１１〜Ｂ９３６１１６］；ＮＲＦ１：国際公開第２０１１／０��０７４０号パンフレット［配列Ｂ９３６１１７〜Ｂ９３６１２３］；Ｐ６３：国際公開第２０１１／０９０７４１号パンフレット−［配列Ｂ９３６１２４〜Ｂ９３６１２８］；ＲＮＡｓｅＨ１：国際公開第２０１１／０９１３９０号パンフレット［配列Ｂ９３６１２９〜Ｂ９３６１４０］；ＡＬＯＸ１２Ｂ：国際公開第２０１１／０９７５８２号パンフレット［配列Ｂ９３６１４１〜Ｂ９３６１４６］；ＰＹＣＲ１：国際公開第２０１１／１０３５２８号パンフレット［配列Ｂ９３６１４７〜Ｂ９３６１５１］；ＣＳＦ３：国際公開第２０１１／１２３７４５号パンフレット［配列Ｂ９３６１５２〜Ｂ９３６１５７］；ＦＧＦ２１：国際公開第２０１１／１２７３３７号パンフレット［配列Ｂ９３６１５８〜Ｂ９３６１６５］；ＳＩＲＴＵＩＮ（ＳＩＲＴ）：国際公開第２０１１／１３９３８７号パンフレット［配列Ｂ９３６２６６〜Ｂ９３６３６９及びＢ９３６４０８〜Ｂ９３６４２５］；ＰＡＲ４：国際公開第２０１１／１４３６４０号パンフレット［配列Ｂ９３６３７０〜Ｂ９３６３７６及びＢ９３６４２６］；ＬＨＸ２：国際公開第２０１１／１４６６７５号パンフレット［配列Ｂ９３６３７７〜Ｂ９３６３８８及びＢ９３６４２７  Ｂ９３６４２９］；ＢＣＬ２Ｌ１１：国際公開第２０１１／１４６６７４号パンフレット［配列Ｂ９３６３８９〜Ｂ９３６３９８及びＢ９３６４３０  Ｂ９３６４３１］；ＭＳＲＡ：国際公開第２０１１／１５０００７号パンフレット［配列Ｂ９３６３９９〜Ｂ９３６４０５及びＢ９３６４３２］；ＡＴＯＨ１：国際公開第２０１１／１５０００５号パンフレット［配列Ｂ９３６４０６〜Ｂ９３６４０７及びＢ９３６４３３］（これら文献の各々は、参照によりその全体を本明細書に組み込む）。実施形態のいくつか又はいずれかにおいて、以下に挙げる領域のいずれか１つ又は複数と特異的に結合するか、又はこれに相補的なオリゴヌクレオチドを任意選択により本発明から除外する：配列Ｂ９３５１２８のヌクレオチド１〜９３２；配列Ｂ９３５３０６のヌクレオチド１〜１６７５；配列Ｂ９３５３０７のヌクレオチド１〜５１８；配列Ｂ９３５３０８のヌクレオチド１〜７５９；配列Ｂ９３５３０９のヌクレオチド１〜２５８９２；配列Ｂ９３５３１０のヌクレオチド１〜２７９：配列Ｂ９３５３１１のヌクレオチド１〜１９８２；配列Ｂ９３５３１２のヌクレオチド１〜７８９；配列Ｂ９３５３１３のヌクレオチド１〜４６７；配列Ｂ９３５３４７のヌクレオチド１〜１０２８；配列Ｂ９３５３４８のヌクレオチド１〜４２９；配列Ｂ９３５３４９のヌクレオチド１〜１５６；配列Ｂ９３５３５０のヌクレオチド１〜５９３；配列Ｂ９３５３９５のヌクレオチド１〜６４３；配列Ｂ９３５３９６のヌクレオチド１〜５１３；配列Ｂ９３５４０６のヌクレオチド１〜１５６；配列Ｂ９３５４１４のヌクレオチド１〜３１７５；配列Ｂ９３５４２６のヌクレオチド１〜１３４７；配列Ｂ９３５４３３のヌクレオチド１〜５８０８；配列Ｂ９３５４４０のヌクレオチド１〜２３７；配列Ｂ９３５４４１のヌクレオチド１〜１２４６；配列Ｂ９３５４４２のヌクレオチド１〜６８４；配列Ｂ９３５４７３のヌクレオチド１〜４００；配列Ｂ９３５４７４のヌクレオチド１〜６１９；配列Ｂ９３���４７５のヌクレオチド１〜８１３；配列Ｂ９３５４８０のヌクレオチド１〜９９３；配列Ｂ９３５４８０のヌクレオチド１〜４０１；配列Ｂ９３５４８１のヌクレオチド１〜４９３；配列Ｂ９３５４８２のヌクレオチド１〜４１８；配列Ｂ９３５４９６のヌクレオチド１〜３７８；配列Ｂ９３５４９７のヌクレオチド１〜２９４；配列Ｂ９３５４９８のヌクレオチド１〜６８６；配列Ｂ９３５４９９のヌクレオチド１〜４８０；配列Ｂ９３５５００のヌクレオチド１〜５０１；配列Ｂ９３５５３３のヌクレオチド１〜１２９９；配列Ｂ９３５５３４のヌクレオチド１〜９１８；配列Ｂ９３５５３５のヌクレオチド１〜１５５０；配列Ｂ９３５５３６のヌクレオチド１〜３２９；配列Ｂ９３５５３７のヌクレオチド１〜１８２６；配列Ｂ９３５５３８のヌクレオチド１〜５３６；配列Ｂ９３５５３９のヌクレオチド１〜５５１；配列Ｂ９３５５４０のヌクレオチド１〜６７２；配列Ｂ９３５５４１のヌクレオチド１〜６１６；配列Ｂ９３５５４２のヌクレオチド１〜４７１；配列Ｂ９３５５４３のヌクレオチド１〜７０７；配列Ｂ９３５５４４のヌクレオチド１〜７４１；配列Ｂ９３５５４５のヌクレオチド１〜３４６；配列Ｂ９３５５４６のヌクレオチド１〜８６７；配列Ｂ９３５５４７のヌクレオチド１〜５６３；配列Ｂ９３５８１２のヌクレオチド１〜９７０；配列Ｂ９３５９１３のヌクレオチド１〜１１１７；配列Ｂ９３５８１４のヌクレオチド１〜２９７；配列Ｂ９３５８２７のヌクレオチド１〜４９７；配列Ｂ９３５８４３のヌクレオチド１〜１２６７；配列Ｂ９３５８４４のヌクレオチド１〜５８６；配列Ｂ９３５８４５のヌクレオチド１〜７４１；配列Ｂ９３５８４６のヌクレオチド１〜２５１；配列Ｂ９３５８４７のヌクレオチド１〜６８１；配列Ｂ９３５８４８のヌクレオチド１〜５８０；配列Ｂ９３５８８０のヌクレオチド１〜５３４；配列Ｂ９３５８８９のヌクレオチド１〜３８７；配列Ｂ９３５８９０のヌクレオチド１〜５６１；配列Ｂ９３５８９１のヌクレオチド１〜３３５；配列Ｂ９３５８９２のヌクレオチド１〜６１３；配列Ｂ９３５８９３のヌクレオチド１〜１７７；配列Ｂ９３５８９４のヌクレオチド１〜２８５；配列Ｂ９３５９２１のヌクレオチド１〜３８１４；配列Ｂ９３５９２２のヌクレオチド１〜６３３；配列Ｂ９３５９２３のヌクレオチド１〜４９７；配列Ｂ９３５９２４のヌクレオチド１〜５４５；
配列Ｂ９３５９５０のヌクレオチド１〜４１３；配列Ｂ９３５９５１のヌクレオチド１〜４１３；配列Ｂ９３５９６２のヌクレオチド１〜３３４；配列Ｂ９３５９６３のヌクレオチド１〜５８２；配列Ｂ９３５９６４のヌクレオチド１〜４１６；配列Ｂ９３５９９０のヌクレオチド１〜３５９１；配列Ｂ９３５９９１のヌクレオチド１〜８７５；配列Ｂ９３５９９２のヌクレオチド１〜１９４；配列Ｂ９３６００３のヌクレオチド１〜２０７４；配列Ｂ９３６００４のヌクレオチド１〜１２３７；配列Ｂ９３６０１３のヌクレオチド１〜４０５０；配列Ｂ９３６０１４のヌクレオチド１〜１３３４；配列Ｂ９３６０４８のヌクレオチド１〜１２３５；配列Ｂ９３６０４９のヌクレオチド１〜１７，９６４；配列Ｂ９３６０５０のヌクレオチド１〜５０，００３；配列Ｂ９３６０５１のヌクレオチド１〜４８６；配列Ｂ９３６０５２のヌクレオチド１〜４９４；配列Ｂ９３６０５３のヌクレオチド１〜１９９２；配列Ｂ９３６０５４のヌクレオチド１〜１７６７；配列Ｂ９３６０５９のヌクレオチド１〜１２４０；配列Ｂ９３６０７４のヌクレオチド１〜３０１６；配列Ｂ９３６０７５のヌクレオチド１〜１６０９；配列Ｂ９３６０８０のヌクレオチド１〜３１２；配列Ｂ９３６０９２のヌクレオチド１〜２４３；配列Ｂ９３６０９３のヌクレオチド１〜８０２；配列Ｂ９３６１０２のヌクレオチド１〜５１４；配列Ｂ９３６１０３のヌクレオチド１〜９３６；配列Ｂ９３６１０４のヌクレオチド１〜１０７５；配列Ｂ９３６１１０のヌクレオチド１〜８２３；配列Ｂ９３６１１６のヌクレオチド１〜９７９；配列Ｂ９３６１２３のヌクレオチ１〜９７９；配列Ｂ９３６１２８のヌクレオチド１〜２８８；配列Ｂ９３６１３７のヌクレオチド１〜４３７；配列Ｂ９３６１３８のヌクレオチド１〜２７８；配列Ｂ９３６１３９のヌクレオチド１〜４３６；配列Ｂ９３６１４０のヌクレオチド１〜１１４０；配列Ｂ９３６１４６のヌクレオチド１〜２０８２；配列Ｂ９３６１５１のヌクレオチド１〜３８０；配列Ｂ９３６１５７のヌクレオチド１〜７４２；配列Ｂ９３６１６５のヌクレオチド１〜４２４６；配列Ｂ９３６４０８のヌクレオチド１〜１０２８；配列Ｂ９３６４０９のヌクレオチド１〜４２９；配列Ｂ９３６４１０のヌクレオチド１〜５０８；配列Ｂ９３６４１１のヌクレオチド１〜５９３；配列Ｂ９３６４１２のヌクレオチド１〜３７３；配列Ｂ９３６４１３のヌクレオチド１〜１７１３；配列Ｂ９３６４１４のヌクレオチド１〜６６０；配列Ｂ９３６４１５のヌクレオチド１〜５８９；配列Ｂ９３６４１６のヌクレオチド１〜７２６；配列Ｂ９３６４１７のヌクレオチド１〜３２０；配列Ｂ９３６４１８のヌクレオチド１〜６１６；配列Ｂ９３６４１９のヌクレオチド１〜４９２；配列Ｂ９３６４２０のヌクレオチド１〜４２８；配列Ｂ９３６４２１のヌクレオチド１〜４０４１；配列Ｂ９３６４２２のヌクレオチド１〜７０５；配列Ｂ９３６４２３のヌクレオチド１〜２７１４；配列Ｂ９３６４２４のヌクレオチド１〜１７５７；配列Ｂ９３６４２５のヌクレオチド１〜３６４７；配列Ｂ９３６４２６のヌクレオチド１〜３５４；配列Ｂ９３６４２７のヌクレオチド１〜２１４５、配列Ｂ９３６４２８のヌクレオチド１〜６０６；配列Ｂ９３６４２９のヌクレオチド１〜４８０；配列Ｂ９３６４３０のヌクレオチド１〜３０２６；配列Ｂ９３６４３１のヌクレオチド１〜１５１２；配列Ｂ９３６４３２のヌクレオチド１〜３７７４；及び配列Ｂ９３６４３３のヌクレオチド１〜５８９。本明細書に記載するオリゴヌクレオチド、又はこれらを設計若しくは合成する方法の実施形態のいくつか又はいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を上方制御すると共に、タンパク質コード標準遺伝子と同じ鎖から転写されるＰＲＣ２結合ＲＮＡと特異的に結合するか、若しくは特異的にハイブリダイズするか、又はこれと相補的であるかのいずれであってもよい。オリゴヌクレオチドは、標準遺伝子（ｒｅｆＧｅｎｅ）のタンパク質コードセンス鎖のイントロン、エキソン、イントロン−エキソン接合部、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、翻訳開始領域、又は翻訳終結領域内で始まるか、又はこれと重複するＰＲＣ２結合ＲＮＡの領域に結合してもよい。
【０２１９】
本明細書に記載するオリゴヌクレオチド、又はこれらを設計若しくは合成する方法の実施形態のいくつか又はいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を上方制御すると共に、タンパク質コード標準遺伝子の逆鎖（アンチセンス鎖）から転写されるＰＲＣ２結合ＲＮＡと特異的に結合するか、若しくは特異的にハイブリダイズするか、又はこれと相補的であるかのいずれであってもよい。オリゴヌクレオチドは、標準遺伝子のタンパク質コードアンチセンス鎖のイントロン、エキソン、イントロン−エキソン接合部、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、翻訳開始領域、又は翻訳終結領域内で始まるか、又はこれと重複するＰＲＣ２結合ＲＮＡの領域に結合してもよい。
【０２２０】
本明細書に記載するオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよく、例えば、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオシド間結合、修飾されたヌクレオチド及び／又はこれらの組合せを含んでもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、以下に挙げる特性の１つ又は複数を呈示するものであってよい：標的ＲＮＡの実質的な切断又は変性を誘導しない；標的ＲＮＡの実質的に完全な切断又は変性を引き起こさない；ＲＮＡｓｅ  Ｈ経路を活性化しない；ＲＩＳＣを活性化しない；アルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）ファミリータンパク質を一切動員しない；ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）により切断されない；選択的スプライシングを媒介しない；免疫刺激賦活性ではない；ヌクレアーゼ耐性である；非修飾オリゴヌクレオチドと比較して向上した細胞取込みを有する；細胞又は哺乳動物に対して毒性ではない；エンドソーム離脱の向上をもたらし得る；ｌｎｃＲＮＡと、ＰＲＣ２、好ましくはＥｚｈ２サブユニット、任意選択でＳｕｚ１２、Ｅｅｄ、ＲｂＡｐ４６／４８サブユニット若しくはＪａｒｉｄ２などの副因子との相互作用を妨害する；ヒストンＨ３リシン２７メチル化を低減する、及び／又は遺伝子発現を上方制御する。
【０２２１】
本明細書に記載するオリゴヌクレオチド、又はこれらを設計若しくは合成する方法の実施形態のいくつか又はいずれにおいても、オリゴヌクレオチドは、Ｋｕｗａｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第２００５／０２２６８４８号明細書又はＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第２０１０／０２１０７０７号明細書、又はＣｏｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，７，７０９，４５６又はＭａｔｔｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第２００９／１２４３４１号パンフレットに記載されているように、プロモータ領域のＤＮＡに結合するもの、あるいは、Ｃｏｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第２０１０／０２７３８６３号明細書に記載されているように、３’ＵＴＲ領域のＤＮＡに結合するものを任意選択で除外してもよい。
【０２２２】
ＲＮＡと相互作用して、遺伝子発現を調節するように設計されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ標的に結合するように設計されたものとは別個の塩基配列のサブセットである（例えば、ＲＮＡが転写される基礎ゲノムＤＮＡ配列と相補的である）。
【０２２３】
遺伝子発現を調節する方法
別の形態において、本発明は、遺伝子又はエピジェネティック療法のために、細胞、例えば、癌細胞、幹細胞、又は他の正常な細胞型における遺伝子発現を調節する方法に関する。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、癌、例えば、腫瘍を有する被験者において）であってよい。ある実施形態では、細胞における遺伝子発現を調節する方法は、本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドを送達することを含む。ある実施形態では、細胞への一本鎖オリゴヌクレオチドの送達によって、一本鎖オリゴヌクレオチドが送達されていない対照細胞における遺伝子の発現レベルに比べ、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％又はそれ以上高い遺伝子の発現レベルがもたらされる。特定の実施形態では、細胞への一本鎖オリゴヌクレオチドの送達によって、一本鎖オリゴヌクレオチドが送達されていない対照細胞における遺伝子の発現レベルに比べ、少なくとも５０％高い遺伝子の発現レベルがもたらされる。
【０２２４】
本発明の別の態様において、方法は、本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物を被験者（例えば、ヒト）に投与して、被験者におけるタンパク質レベルを増大することを含む。ある実施形態では、タンパク質レベルの増大は、投与前の被験者におけるタンパク質の量に比べ、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、又はそれ以上高い。
【０２２５】
別の例として、細胞中の腫瘍抑制因子の発現を増大するために、本方法は、標的遺伝子（国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２に記載の腫瘍因子、表２の刷り込み遺伝子、及び／又は国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２の他の成長抑制遺伝子（例：癌を有する被験者、例えば、肺腺癌患者における、例えば、Ｎｋｘ２−１若しくはＴｉｆｔ−１））を包含するか、又はその近傍にあるゲノム位置に位置する（例えば、長い非コードＲＮＡの）ＰＲＣ２関連領域と十分相補的である一本鎖オリゴヌクレオチド配列を細胞に導入することを含む。
【０２２６】
別の態様において、本発明は、被験者における特定の遺伝子の発現のレベル低下に関連する状態（例えば、癌）を治療する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドを投与することを含む。
【０２２７】
被験者は、非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ウシ、又はウマを含み得る。好ましい実施形態において、被験者は、ヒトである。
【０２２８】
ある実施形態において、本明細書に記載する方法を用いて治療することができる具体的癌は、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表３に記載されており、例えば、限定しないが、以下のものが挙げられる：乳癌、肺癌、前立腺癌、ＣＮＳ（例えば、神経膠腫）、唾液腺癌、前立腺癌、卵巣癌、及び白血病（例えば、ＡＬＬ、ＣＭＬ、若しくはＡＭＬ）。これらの遺伝子と特定の癌との関連は、当分野では公知であり、例えば、以下の文献に記載されている：Ｆｕｔｒｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．２００４；４；１７７−８３（例えば、表１を参照、参照により本明細書に組み込まれる）；Ｔｈｅ  ＣＯＳＭＩＣ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ）ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  ｗｅｂｓｉｔｅ，Ｂａｍｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００４；９１；３５５−８；また、Ｆｏｒｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．２００８；Ｃｈａｐｔｅｒ  １０；Ｕｎｉｔ  １０．１１、及びＣＯＳＭＩＣ  ｄａｔａｂａｓｅ、例えば、ｖ．５０（２０１０年１１月３０日）。例えば、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表３に記載されているいずれの具体的タイプの癌について述べるときでも、他のタイプの癌、少なくとも癌一般を有する患者を治療可能であることは理解されよう。
【０２２９】
さらに、幹細胞の多能性を調節する（例えば、増強若しくは低減する）ための本明細書に記載する方法を用いて、幹細胞を特定の分化経路へと指令することにより、内胚葉、中胚葉、外胚葉、及びそれらの発生誘導体を形成することができる。多能性を増大、維持、若しくは増強するために、本方法は、（例えば、本明細書に開示するいずれかの長い非コードＲＮＡの）核酸のＰＲＣ２関連領域と特異的に結合するか、又はこれと相補的である一本鎖オリゴヌクレオチド配列を細胞に導入することを含む。本明細書に記載する方法において有用な幹細胞としては、成体幹細胞（例えば、被験者、例えば、治療しようとする被験者の内耳、骨髄、間葉、皮膚、脂肪、肝臓、筋肉、若しくは血液から得られる成体幹細胞）；胚幹細胞、又は胎盤若しくは臍帯から得られる幹細胞；前駆細胞（例えば、内耳、骨髄、間葉、皮膚、脂肪、筋肉、若しくは血液から得られる前駆細胞）；並びに人工多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）が挙げられる。
【０２３０】
ある実施形態において、本明細書に記載する方法は、核酸のＰＲＣ２関連領域（例えば、配列Ａ１〜Ａ１９３，０４９、配列Ｂ１〜Ｂ９１６，２０９、及びＢ９１６，６２６〜Ｂ９４３，９３１に記載のように、例えば、本明細書に記載するｌｎｃＲＮＡの）と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物、例えば、滅菌組成物を投与することを含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）分子）を含む。
【０２３１】
一本鎖オリゴヌクレオチドは、ヒトを含む動物における病態の治療薬中の治療部分として使用されてきた。一本鎖オリゴヌクレオチドは、細胞、組織及び動物、特にヒトの治療のための治療計画に有用となるように設計することができる治療法である。
【０２３２】
治療薬の場合、癌を有することが疑われる動物、好ましくはヒトを、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドを投与することにより治療する。例えば、非制限的な一実施形態では、本方法は、治療が必要な動物に、本明細書に記載する治療有効量の一本鎖オリゴヌクレオチドを投与するステップを含む。
【０２３３】
製剤、送達及び投与
本明細書に記載するオリゴヌクレオチドは、被験者への投与のために製剤化することができる。本明細書に開示するオリゴヌクレオチドのどれを用いても、製剤、組成物及び方法を実施できることは理解すべきである。
【０２３４】
製剤は、好都合には単位剤形で提供することができ、製薬の分野で公知のいずれかの方法により調製してもよい。単一剤形を製造するのに担体物質と組み合わせることができる活性成分（例えば、本発明のオリゴヌクレオチド又は化合物）の量は、治療しようとする宿主、具体的投与方式、例えば、皮内若しくは吸入などに応じて変動する。単一剤形を製造するのに担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果、例えば、腫瘍退縮をもたらす化合物の量である。
【０２３５】
本発明の医薬製剤は、製剤の製造に関する分野で公知のいずれかの方法に従い調製することができる。このような製剤は、甘味料、香味料、着色剤及び防腐剤を含有してよい。製剤は、製造に好適であり、非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合してもよい。製剤は、１種以上の希釈剤、乳化剤、防腐剤、緩衝剤、賦形剤などを含んでもよく、液体、粉末、エマルション、凍結乾燥した粉末、スプレー、クリーム、ローション、徐放剤、錠剤、丸薬、ゲル、パッチ、インプラントなどの形態で提供することができる。
【０２３６】
製剤化した一本鎖オリゴヌクレオチド組成物は、多様な状態を呈するものであってよい。ある例では、組成物は、少なくとも部分的に結晶性、均質に結晶性、及び／又は無水性（例えば、含水率が８０％、５０％、３０％、２０％、若しくは１０％未満）である。別の例では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、水相、例えば、水を含む溶液状である。水相又は結晶性組成物は、例えば、送達ビヒクル、例えば、リポソーム（特に、水相の場合）又は粒子（例えば、結晶性組成物に好適となり得るようなミクロ粒子）に組み込むことができる。一般に、意図する投与方法と適合性である方法で、一本鎖オリゴヌクレオチド組成物を製剤化する。
【０２３７】
ある実施形態において、組成物は、以下の方法の少なくとも１つにより調製する：噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動層乾燥、若しくはこれらの技術の組合せ；又は脂質を用いた超音波処理、フリーズドライ、縮合及びその他の自己組織化。
【０２３８】
一本鎖オリゴヌクレオチド調製物は、別の薬剤、例えば、別の治療薬又は一本鎖オリゴヌクレオチドを安定化する物質、例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドと複合体化するタンパク質と組み合わせて製剤化又は投与する（一緒に、若しくは個別に）ことができる。別の薬剤は、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、Ｍｇ２＋などの二価カチオンを除去するため）、塩、ＲＮＡｓｅ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎなどの広特異性ＲＮＡｓｅ阻害剤）などを含む。
【０２３９】
一実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチド調製物は、別の一本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、第２遺伝子の発現を調節する第２一本鎖オリゴヌクレオチド又は第１遺伝子の発現を調節する第２一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。さらに別の調製物は、少なくとも３、５、１０、２０、５０、又は１００以上の異なる一本鎖オリゴヌクレオチド種を含んでもよい。こうした一本鎖オリゴヌクレオチドは、同様の数の異なる遺伝子に関して、遺伝子発現を媒介することができる。
【０２４０】
一実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチド調製物は、少なくとも１種の第２治療薬（例えば、オリゴヌクレオチド以外の薬剤）を含む。例えば、癌治療のための一本鎖オリゴヌクレオチドは、さらに化学療法薬を含んでもよい。
【０２４１】
送達経路
一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物は、様々な経路で被験者に送達することができる。経路の例として、静脈内、皮内、局所、直腸、非経口、肛門、膣内、鼻内、肺、眼などが挙げられる。
【０２４２】
本発明の一本鎖オリゴヌクレオチド分子は、投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。こうした組成物は、典型的に、１種又は複数種の一本鎖オリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」という表現は、製剤投与に適合性のあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に活性の物質のためのこのような媒質及び薬剤の使用は、当分野では公知である。従来の媒質又は薬剤が活性化合物と非適合性である場合を除いて、組成物におけるその使用が考慮される。また、追加の活性化合物を組成物に組み込むこともできる。
【０２４３】
本発明の医薬組成物は、局所又は全身治療のいずれが要望されるか、また治療しようとする部位に応じていくつかの方法で投与することができる。投与は、局所（眼、膣、直腸、鼻内、経皮など）、経口又は非経口であってよい。非経口投与には、静脈内持続注入法、皮下、腹腔内若しくは筋内注射、又はクモ膜下腔内若しくは脳室内投与が含まれる。
【０２４４】
投与の経路及び部位は、ターゲティングを増強するように選択してよい。例えば、筋肉細胞をターゲティングするためには、対象の筋肉への筋内注射が、理にかなった選択であろう。肺細胞は、エアロゾル形態の一本鎖オリゴヌクレオチドを投与することにより、ターゲティングすることができる。血管内皮細胞は、バルーンカテーテルを一本鎖オリゴヌクレオチドでコーティングして、オリゴヌクレオチドを機械的に導入することによりターゲティングすることができる。
【０２４５】
局所送達
局所投与とは、製剤を被験者の表面に直接接触させることによる、被験者への送達を指す。局所投与の最も一般的形態は、皮膚に対するものであるが、本明細書に開示する組成物は、身体の他の表面、例えば、眼、粘膜、体腔の表面又は内面にも直接適用することができる。前述したように、最も一般的な局所送達は、皮膚に対するものである。この用語は、限定しないが、局所及び経皮を含む複数の投与経路を包含する。これらの投与方式は、典型的に、皮膚の透過障壁の浸透及び標的組織又は層への有効な送達を含む。局所投与は、表皮及び真皮に浸透して、最終的に組成物の全身送達を達成する手段として用いることができる。局所投与は、被験者の表皮若しくは真皮、又はその特定の層、又は下層組織にオリゴヌクレオチドを選択的に投与する手段として用いることができる。
【０２４６】
局所投与のための製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、点滴薬、座薬、スプレー、液剤及び粉末剤が挙げられる。従来の製剤用担体、水性、粉末若しくは油性基剤、増粘剤などが必要であるか、又は望ましい場合もある。また、コーティングされたコンドーム、手袋などが有用な場合もある。
【０２４７】
経皮送達は、脂溶性治療薬の投与のための貴重な経路である。真皮は、表皮より透過性であるため、擦りむいた、熱傷を受けた、又はむき出しの皮膚からの吸収は、はるかに高速である。炎症及び皮膚への血流を増加する他の生理学的状態もまた、経皮吸収を増強する。この経路を介した吸収は、油性ビヒクルの使用（塗擦）又は１種以上の浸透促進剤の使用により、増強され得る。経皮経路により本明細書に開示する組成物を送達する他の有効な方法としては、皮膚の水和、及び徐放性局所パッチの使用がある。経皮経路は、全身及び／又は局所療法のために本明細書に開示する組成物を送達する潜在的に有効な手段を提供する。加えて、イオン導入法（電界の影響下での生体膜を介したイオン性溶質の輸送）、音波泳動又は超音波泳動（生体膜、特に皮膚及び角質を通した各種治療薬の吸収を増強するための超音波の使用）、並びに投与位置及び投与部位での貯留に関するビヒクル特性の最適化も、皮膚及び粘膜部位を介した局所適用組成物の輸送を増強する上で有用な方法である。
【０２４８】
経口又は鼻送達
経口及び鼻粘膜は、他の投与経路に比して利点を提供する。例えば、これらの膜を介して投与されたオリゴヌクレオチドは、作用の迅速な開始を有し、治療血漿レベルをもたらし、肝代謝の初回通過効果を回避し、有害な胃腸（ＧＩ）環境へのオリゴヌクレオチドの暴露を回避する。さらに別の利点は、オリゴヌクレオチドを容易に適用、局在化及び除去することができるような膜部位に対する容易な接近を含む。
【０２４９】
経口送達の場合、組成物は、口腔の表面、例えば、舌下面及び口腔底の粘膜又は頬の内側表面を構成する頬粘膜にターゲティングすることができる。舌下粘膜は、比較的透過性であるため、多くの薬剤の迅速な吸収及び許容可能な生体利用可能性をもたらす。さらに、舌下粘膜は、好都合で、許容可能かつ容易に接触可能である。
【０２５０】
一本鎖オリゴヌクレオチドの医薬組成物は、計量噴霧ディスペンサーから、前述したような混合ミセル医薬製剤及び噴霧剤を、吸入せずに、口腔に噴霧することによりヒトの口腔に投与することもできる。一実施形態では、ディスペンサーをまず振盪した後、医薬組成物及び噴霧剤を口腔に噴霧する。
【０２５１】
経口投与のための組成物としては、粉末若しくは顆粒、水中の懸濁液若しくは溶液、シロップ、エマルション、エリキシール又は非水性媒体、錠剤、カプセル、ロゼンジ、又はトローチが挙げられる。錠剤の場合、用いることができる担体としては、ラクトース、クエン酸ナトリウム、及びリン酸の塩がある。デンプンなどの各種崩壊剤、並びにステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクなどの潤滑剤が一般に錠剤に用いられている。カプセル形態への経口投与の場合、有用な希釈剤は、ラクトース及び高分子量ポリエチレングリコールである。経口用途に水性懸濁液が必要な場合、核酸組成物は、乳化及び懸濁剤と組み合わせることができる。要望される場合には、特定の甘味料及び／又は香味料を添加してもよい。
【０２５２】
非経口送達
非経口投与には、静脈内持続注入法、皮下、腹腔内又は筋内注射、クモ膜下腔内又は脳室内投与が含まれる。ある実施形態において、非経口投与は、疾患の部位への直接の投与（例えば、腫瘍への注射）を含む。
【０２５３】
非経口投与のための製剤は、滅菌水溶液を含んでもよく、こうした水溶液は、緩衝剤、希釈剤及びその他の好適な添加剤をさらに含有してもよい。脳室内投与は、例えば、レザバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって促進してもよい。静脈内での使用の場合、溶質の合計濃度を制御して、製剤を等張性にしなければならない。
【０２５４】
眼送達
本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれも眼組織に投与することができる。例えば、組成物は、眼の表面又は周辺組織、例えば、瞼の内部に適用することができる。眼への投与の場合、軟膏又は点滴可能な液体を、アプリケータ又は点眼器などの当分野では公知の眼投与装置により投与してよい。このような組成物は、ヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はポリ（ビニルアルコール）などのムコミメティック剤（ｍｕｃｏｉｍｉｍｅｔｉｃｓ）、ソルビン酸、ＥＤＴＡ若しくは塩化ベンジルクロニウムなどの防腐剤、並びに通常量の希釈剤及び／又は担体を含んでもよい。一本鎖オリゴヌクレオチドはまた、眼の内部に投与することもでき、これを選択した部位又は構造体に導入することができる針若しくは他の送達装置により導入することができる。
【０２５５】
肺送達組成物は、患者が分散液を吸入することにより送達することができ、これによって、分散液内の組成物、好ましくは一本鎖オリゴヌクレオチドが、肺に到達し、そこで、組成物が肺胞領域を通して直接血液循環中に容易に吸収されるようにすることができる。肺送達は、肺の疾患を治療するための全身送達及び局在化送達の両方に有効となり得る。
【０２５６】
肺送達
肺送達は、噴霧化、エアロゾル化、ミセル及び乾燥粉末ベースの製剤の使用など、様々なアプローチにより達成することができる。送達は、液体ネブライザー、エアロゾルベースの吸入器、及び乾燥粉末分散器を用いて、達成することができる。定量装置が好ましい。噴霧器又は吸入器を用いる利点の１つは、装置が自蔵式であるため、汚染の可能性が最小限に抑えられることである。例えば、乾燥粉末分散器は、乾燥粉末として容易に製剤化することができる薬剤を送達する。一本鎖オリゴヌクレオチド組成物は、単独で、又は好適な粉末担体と組み合わせて、凍結乾燥又は噴霧乾燥粉末として安定して貯蔵することができる。吸入用組成物の送達は、タイマー、ドーズカウンター、時間計測装置を含み得る投与タイミング要素、又は時間表示器を用いて実施することができ、これらが装置に内蔵されていれば、エアロゾル薬剤の投与の際の用量追跡、適合性モニタリング、及び／又は患者への用量トリガーが可能になる。
【０２５７】
「粉末」という用語は、流動性であって、吸入装置に容易に分散させることができ、被験者によって吸入されて、粒子が肺に到達し、肺胞への浸透を可能にするような微細に分散した固体粒子から構成される組成物を意味する。従って、こうした粉末は、「呼吸用（ｒｅｓｐｉｒａｂｌｅ）」と言われる。好ましくは、平均粒度は、粒径約１０μｍ未満であり、好ましくは比較的均一の球状形の分布をしている。より好ましくは、粒径は、約７．５μｍ未満であり、極めて好ましくは約５．０μｍ未満である。通常、粒度分布は、直径約０．１μｍ〜約５μｍ、特に約０．３μｍ〜約５μｍである。
【０２５８】
「乾燥（した）」という用語は、組成物が、約１０重量％（％ｗ）未満の水、通常約５％ｗ未満、好ましくは約３％ｗ未満の含水率を有することを意味する。乾燥組成物は、粒子が、エアロゾルを形成するように、吸入装置中に容易に分散可能であるものでよい。
【０２５９】
「治療に有効な量」という用語は、予測される生理学的応答を賦与するために、治療対象の被験者において要望されるレベルの標的遺伝子発現をもたらすのに必要な、組成物中に存在するオリゴヌクレオチドの量である。「生理学的に有効な量」という用語は、要望される苦痛緩和又は治癒効果を賦与するために、被験者に送達される量である。「薬学的に許容される担体」という用語は、有意な有害な毒物学的効果を伴わずに、担体を肺に投与することができることを意味する。
【０２６０】
担体として有用な様々なタイプの医薬用賦形剤としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定剤、炭水化物、アミノ酸及びポリペプチドなどの充填剤；ｐＨ調節剤若しくは緩衝剤；塩化ナトリウムなどの塩等がある。これらの担体は、結晶性又は非晶性形態のいずれであってもよいし、両者の混合物であってもよい。
【０２６１】
好適なｐＨ調節剤又は緩衝剤としては、有機酸と塩基から調製される有機塩、例えば、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどがあり、クエン酸ナトリウムが好ましい。ミセル状一本鎖オリゴヌクレオチド製剤の肺投与は、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロエタン、ジメチルフルオロプロパン、テトラフルオロプロパン、ブタン、イソブタン、ジメチルエーテル及びその他の非ＣＦＣ及びＣＦＣ噴霧剤などの噴霧剤を含む定量噴霧装置を用いて達成することができる。
【０２６２】
装置及びインプラント
例示的装置としては、血管系に導入される装置、例えば、血管組織の管腔に挿入される装置、又は装置自体が血管系の一部を形成するもの、例えば、ステント、カテーテル、心臓弁、及びその他の血管装置が挙げられる。これらの装置、例えば、カテーテル又はステントは、肺、心臓、又は脚の血管系に配置することができる。
【０２６３】
他の装置としては、非血管装置、例えば、腹腔内、臓器若しくは腺組織に移植される装置、例えば、人工臓器がある。こうした装置は、一本鎖オリゴヌクレオチドに加えて治療物質を放出することができる。例えば、ある装置は、インスリンを放出することができる。
【０２６４】
一実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物の単位用量又は計測用量は、埋め込みデバイスによって投与される。デバイスは、被験者内のパラメータを監視するセンサーを含んでもよい。例えば、デバイスは、例えば、ポンプ、並びに任意選択で付属の電子部品を含んでもよい。
【０２６５】
組織、例えば、細胞又は臓器を一本鎖オリゴヌクレオチドによりｅｘ  ｖｉｖｏで処置した後、被験者に投与又は移植することができる。組織は、オートロガス、同種異系、又は異種間組織であってよい。例えば、組織を処置して、移植片対宿主病を軽減することができる。他の実施形態では、組織は、同種異系であり、組織を処置して、その組織における不要な遺伝子発現を特徴とする障害を治療することができる。例えば、組織、例えば、造血細胞、例えば、骨髄造血細胞を処置して、不要な細胞増殖を阻害することができる。オートロガス又は移植片のいずれであっても、処置した組織の導入と、他の療法を組み合せることができる。ある実施において、一本鎖オリゴヌクレオチドで処置した細胞を、例えば、半透性多孔質隔膜により、他の細胞から遮断するが、この隔膜は、細胞がインプラントから流出するのを阻止するが、身体からの分子は細胞に到達させると共に、これら細胞が生成する分子が身体に進入することを可能にする。一実施形態では、多孔質隔膜は、アルギニン酸塩から形成される。
【０２６６】
一実施形態において、避妊用具を一本鎖オリゴヌクレオチドでコーティング又は包含する。例示的避妊用具としては、コンドーム、ペッサリー、ＩＵＤ（子宮内避妊用具、スポンジ、膣内シース、及び避妊用具がある。
【０２６７】
投薬
一態様において、本発明は、一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、化合物として、又は組成物の１成分として）を被験者（例えば、ヒト被験者）に投与する方法を特徴とする。一実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ〜２５ｍｇである。一実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約１００ｍｇである。一実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇである。ある実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、５、１０、２５、５０又は１００ｍｇ超である。
【０２６８】
規定量は、疾患又は障害、例えば、標的遺伝子に関連する疾患又は障害を治療又は予防するのに有効な量であってよい。単位用量は、例えば、注射（例えば、静脈内若しくは筋内）、吸入投与、又は局所適用によって投与することができる。
【０２６９】
ある実施形態において、単位用量は、毎日投与する。ある実施形態では、１日１回より頻度は少なく、例えば、２日、４日、８日若しくは３０日毎に１回投与する。別の実施形態では、単位用量をある頻度で（例えば、規則的な頻度で）投与しない。例えば、単位用量を単一回投与してよい。ある実施形態では、単位用量を１日１回より多く、例えば、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間毎等に１回投与する。
【０２７０】
一実施形態において、被験者に、初期用量及び１回又は複数回の維持用量の一本鎖オリゴヌクレオチドを投与する。維持用量は、一般に初期用量より少なく、例えば、初期用量の半分である。維持計画は、１日につき０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲、例えば、１日につき体重１ｋｇ当たり１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１、又は０．０００１ｍｇの用量又は複数回用量で被験者を治療することを含む。維持用量は、１日、５日、１０日、又は３０日毎に１回以下投与してもよい。さらに、治療計画は、一定期間継続してよいが、これは、特定の疾患の性質、その重症度及び患者の全身状態に応じて変動する。ある実施形態では、投薬は、１日に１回以下、例えば、２４、３６、４８、又はそれ以上の時間毎に１回以下、例えば、５又は８日毎に１回以下送達してもよい。治療後に、その状態の変化及び病態の症状の改善について患者をモニターする。オリゴヌクレオチドの用量は、患者が現状の投薬レベルに有意に応答しない場合には、増加してもよいし、あるいは、病態の症状の改善が認められる、病態が除去されるか、又は望ましくない副作用が認められる場合には、用量を減らしてもよい。
【０２７１】
有効量は、特定の状況下で必要に応じて、又は適切と考えられれば、単一用量又は２回以上の用量で投与することができる。反復又は頻繁な注入を促進することが要望される場合には、送達装置、例えば、ポンプ、半永久的ステント（例えば、静脈内、腹腔内、大槽内若しくは嚢内）、又はレザバーの埋め込みが妥当であろう。
【０２７２】
ある実施形態において、オリゴヌクレオチド医薬組成物は、複数の一本鎖オリゴヌクレオチド種を含む。別の実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチド種は、天然に存在する標的配列（例えば、ＰＲＣ２関連領域）に関して、別の種と重複せず、かつ隣接していない配列を有する。別の実施形態では、複数の一本鎖オリゴヌクレオチド種が、異なるＰＲＣ２関連領域に対して特異的である。別の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、対立遺伝子特異的である。
【０２７３】
ある形態では、別の治療法と共に、一本鎖オリゴヌクレオチドで患者を治療する。例えば、癌を治療中の患者に、化学療法と一緒に一本鎖オリゴヌクレオチドを投与してもよい。
【０２７４】
治療が成功したら、患者は、病態の再発を防ぐために維持療法を受けることが望ましい場合もあり、この場合、本発明の化合物を、体重１ｋｇ当たり０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲の維持用量で投与する。
【０２７５】
一本鎖オリゴヌクレオチド組成物の濃度は、障害を治療若しくは予防する上で、又はヒトにおける生理学的条件を調節する上で十分な量である。投与される一本鎖オリゴヌクレオチドの濃度又は量は、薬剤について決定されたパラメータ、並びに投与方法、例えば、経鼻、口腔内、肺などに応じて変動する。例えば、経鼻製剤は、鼻腔の刺激又は炎症を防ぐために、成分によっては、はるかに低濃度が要求される傾向があると考えられる。時には、好適な経鼻製剤を提供するために、経口製剤を１０〜１００倍希釈するのが望ましい場合もある。
【０２７６】
いくつかの要因が、被験者を有効に治療するのに要求される用量に影響を与え得るが、このような要因として、限定しないが、障害の重症度、治療歴、被験者の全般的健康状態及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患などがある。さらに、治療有効量の一本鎖オリゴヌクレオチドによる被験者の治療は、単一療法を含んでもよいし、又は、好ましくは、一連の療法を含んでもよい。また、治療に用いる一本鎖オリゴヌクレオチドの有効量が、特定の治療の過程で増減し得ることは理解されよう。例えば、一本鎖オリゴヌクレオチド組成物を投与した後、被験者をモニターすることができる。モニタリングから得た情報に基づき、追加量の一本鎖オリゴヌクレオチド組成物を投与することができる。
【０２７７】
投薬は、治療しようとする疾患状態の重症度及び応答性に左右され、治療コースは、数日から数ヵ月、あるいは、治癒が達成されるか、又は疾患状態の軽減が達成されるまで継続する。最適な投薬スケジュールは、患者の身体における標的発現レベルの測定値から計算することができる。通常の当業者であれば、最適な投薬量、投与方法及び反復速度を容易に決定することができる。最適な投薬量は、個々の化合物の相対的効能に応じて変動し得るが、一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルで有効であると認められるＥＣ５０に基づいて推定することができる。ある実施形態では、動物モデルは、ヒト標的を発現するトランスジェニック動物を含む。別の実施形態では、試験のための組成物は、動物モデルにおける標的とヒトにおける標的との間で保存されている配列に対して、少なくとも内部領域内で、相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。
【０２７８】
一実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチド組成物の投与は、非経口、例えば、静脈内（例えば、ボーラス又は拡散性注入）、内皮、腹腔内、筋内、クモ膜下腔内、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、口腔、舌下、内視鏡、直腸、経口、膣、局所、肺、鼻内、尿道又は眼などの経路によるものである。投与は、被験者又は例えば、医療供給者などの別の人によって実施することができる。組成物は、計測された用量で、又は定用量を送達するディスペンサーにより提供することができる。選択される送達方法については以下に、より詳しく述べる。
【０２７９】
キット
本発明の特定の形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物を収納する容器を含むキットが提供される。ある実施形態では、組成物は、一本鎖オリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。ある実施形態では、医薬組成物の個々の成分を１つの容器内に提供してもよい。あるいは、医薬組成物の成分を２つ以上の容器、例えば、一本鎖オリゴヌクレオチド用の１つの容器と、担体化合物用の少なくとも１つの別の容器に個別に提供するのが望ましい場合もある。キットは、例えば、単一ボックス内の１つ又は複数の容器のようにいくつかの異なる構成でパッケージしてもよい。例えば、キットに備えられた指示書に従い、様々な成分を組み合わせることができる。例えば、医薬組成物を調製及び投与するために、本明細書に記載の方法に従い、上記成分を組み合わせることができる。キットは、さらに送達装置を含んでもよい。
【０２８０】
本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明するが、これらは限定するものとして何ら解釈すべきではない。本明細書を通じて引用した参照物（参照文献、発行された特許、公開特許出願、及び係属特許出願など）は全て、本明細書に参照によって明示的に組み込まれるものとする。
【実施例】
【０２８１】
本発明を以下の実施例においてさらに詳しく説明するが、これらは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【０２８２】
材料及び方法
以下に記載する実施例１〜７において、下記の材料及び方法を用いた。
【０２８３】
ＲＩＰ−ｓｅｑ
１０７個の野生型１６．７（Ｌｅｅ及びＬｕ，１９９９）及びＥｚｈ２−／−ＥＳ細胞を用いて、ＲＮＡ免疫沈降を実施した。ＲＩＰ−ｓｅｑライブラリーを構築するために、細胞核を単離し、核溶解物を調製し、４００Ｕ／ｍｌのＤＮＡｓｅで処理した後、抗Ｅｚｈ２抗体（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）又は対照ＩｇＧ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と一緒にインキュベートした。ＲＮＡ−タンパク質複合体をタンパク質Ａアガロースビーズで免疫沈降した後、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＲＮＡを抽出した。鎖情報を保存するために、ライブラリー構築のために異型スイッチングを用いた。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた第１鎖ｃＤＮＡ合成のために、２０〜１５０ｎｇのＲＮＡとアダプター（５’−ＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮ−３’；配列番号１２７７）を使用した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩは、非鋳型ＣＣＣ３’突出部を付加するが、これを用いて、アダプター２−ＧＧＧ鋳型−スイッチプライマー（５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＧＧ−３’；配列番号１２７８）にハイブリダイズした。第１鎖ｃＤＮＡの合成中に、アダプター１と一緒にサンプルを２０℃で１０分、次に３７℃で１０分、続いて４２℃で４５分インキュベートした。次に、変性した鋳型スイッチプライマーを添加し、各試験管を４２℃で３０分、続いて７５℃で１５分インキュベートした。得られたｃＤＮＡをフォワード（５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−３’；配列番号１２７９）及びリバース（５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−３’；配列番号１２８０）Ｉｌｌｕｍｉｎａプライマーにより増幅した。Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＢｉｏＲａｄ）により、ＰＣＲを以下のように実施した：９８℃で３０分、［９８℃で１０分、６５℃で３０分、７２℃で３０分］を２０〜２４サイクルに続いて、７２℃で５分。ＰＣＲ産物を３％ＮｕＳｉｅｖｅにロードしてサイズ選択を実施した後、２００〜１，２００ｂｐ産物を切除し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により抽出した。マイナスＲＴサンプルからは概して産物は得られなかった。ＤＮＡ濃度をＰｉｃｏＧｒｅｅｎにより定量した。５〜１０ｍｌの２〜２０ｎＭ  ｃＤＮＡサンプルをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡＩＩで、Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＭＧＨＳのＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにより配列決定した。
【０２８４】
バイオインフォーマティック解析
以下に注記する以外、分析は全てＣ＋＋プログラムを用いて実施した。Ｉｌｌｕｍｉｎａパイプラインを用いて、画像処理及びベースコーリングを実施した。交差試験により３’アダプター配列を検出し、≧５塩基のマッチをトリミングし、ホモポリマーリードをフィルタリングした後、ミトコンドリアゲノム及びリボソームＲＮＡと一致するリードを、続く全ての解析から排除した。次に、ｓｈｏｒｔＱｕｅｒｙＬｏｏｋｕｐ（Ｂａｔｚｏｇｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を用いて、残った配列をｍｍ９マウス標準ゲノムとアラインメントした。≦１エラーのアラインメントを保持した。ライブラリー構築及び配列決定により、ＰＲＣ２結合ＲＮＡの逆鎖からの配列が得られるため、続く全ての解析では、各リードを、あたかもそれが逆相補鎖化しているかのように扱った。元のＥｚｈ２−ＲＩＰ−ｓｅｑライブラリーと、その技術的及び生物学的複製、さらにはＥｚｈ２−／−対照系統のＲＩＰ−ｓｅｑと比較する相関係数を決定するために、遺伝子毎のリード数を２つのサンプル間で比較して、各対について、各ｒｅｆＧｅｎｅにマップしたリード数同士の間で、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）相関を計算した。すなわち、各サンプルについて、各ｒｅｆＧｅｎｅにマップしたリード数からベクトルを形成し、全ベクトル対同士のピアソン相関を計算した。
【０２８５】
ｍｍ９（ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ）中の反復配列の位置をＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒデータベースから取得した。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒデータの座標とリードアラインメントの座標を交差することにより、上記の反復配列とＰＲＣ２トランスクリプトームの重複を取得した。一般標準としてＵＣＳＣトランスクリプトームを用いた。重複していない個別の転写領域のセットを得るために、同じ鎖上の開始座標及びマージした重複転写物により、ＵＣＳＣトランスクリプトームを選別した（結合したＵＣＳＣトランスクリプトーム；合計３９，００３の転写物）。リードアラインメント座標を、マージしたＵＣＳＣ転写物の座標と交差させることにより、ＰＲＣ２トランスクリプトームに存在するＵＣＳＣ転写物の数を決定した。転写物とのヒットをＰＲＫＭ単位に変換した。ここで、リード数は、１／（ｎ＊Ｋ＊Ｍ）であり、ｎは、ゲノム中のアラインメントの数であり、Ｋは、転写物長さを１，０００で割ったものであり、Ｍは、ｍｍ９にマップするリードのみを含むシーケンス深度を１，０００，０００で割ったものである。この正規化により、様々な長さの転写物同士、及び様々なシーケンス深度のサンプル同士の比較が可能になる。
【０２８６】
プロモータマップを作製するために、プロモータ領域を、ＴＳＳ（ｒｅｆＧｅｎｅカタログ、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒから取得）に対し、−１０，０００〜＋２０，０００塩基として画定した。１０アラインメントの制限が緩和された場合を除いて、プロモータ領域と重複するリード数をプロットした。染色体アラインメントの場合、各染色体について重複していない連続１００ｋｂのウィンドウの全てについてリード数を計算した。ｎ個の位置にマップするものが、各位置のリードの１／ｎ番目として計数されるように、リードを正規化した。Ｒで記述されるカスタムスクリプトを用いて、グラフを作成した。ＷＴ及びＥｚｈ２−／−サンプルにおける全転写物の各鎖に関するＲＰＫＭスコアを比較することにより、豊富な転写物全てのリストを見出した。次に、それらの座標を、目的とする特徴の座標と交差した。ＮＣＢＩ３７／ｍｍ９マウスアセンブリ座標にない特徴は、ＵＣＳＣ’ｓ  ＬｉｆｔＯｖｅｒユーティリティを用いてその座標に変換した。ｌｉｆｔＯｖｅｒユーティリティは、１つのゲノムを別のゲノムに効率的にマップすることから、同じ種の連続したアセンブリ同士、又は２つの異なる種同士の間で、目的の領域の迅速な同定を可能にする。
【０２８７】
ＲＩＰ／ｑＲＴ−ＰＣＲ
既存の方法に基づき、５ｕｌのウサギ抗マウス−Ｅｚｈ２抗体（活性部分）又は正常ウサギＩｇＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、確認ＲＩＰを実施した。ＲＩＰに続き、ＩＣＹＣＬＥＲ  ＩＱ（商標）Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、量的なストランド特異的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。遺伝子特異的ＰＣＲプライマー対は以下の通りである：
Ｍａｌａｔ−１：フォワード５’−ＧＣＣＴＴＴＴＧＴＣＡＣＣＴＣＡＣＴ−３’；配列番号１２８１
リバース５’−ＣＡＡＡＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣ−３’；配列番号１２８２
Ｍａｌａｔ１−ａｓ：フォワード５’−ＴＡＣＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＴＣＴＧ−３’；配列番号１２８３
リバース５’−ＣＡＧＴＴＣＣＧＴＧＧＴＣＴＴＴＡＧＴＧ−３’；配列番号１２８４
Ｆｏｘｎ２−ａｓ：フォワード５’−ＧＧＣＴＡＴＧＣＴＣＡＴＧＣＴＧＴＡＡＣ；配列番号１２８５
リバース５’−ＧＴＴＡＣＴＧＧＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＣＡ−３’；配列番号１２８６
Ｌｙ６ｅ−ａｓ：フォワード５’−ＣＣＡＣＡＣＣＧＡＧＡＴＴＧＡＧＡＴＴＧ−３’；配列番号１２８７
リバース５’−ＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＴＴＡＣ−３’；配列番号１２８８
Ｂｇｎ−ａｓ：フォワード５’−ＴＧＴＧＡＡＣＣＣＴＴＴＣＣＴＧＧＡ−３’；配列番号１２８９
リバース５’−ＣＴＴＣＡＣＡＧＧＴＣＴＣＴＡＧＣＣＡ−３’；配列番号１２９０
Ｇｔｌ２：フォワード５’−ＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＡＣＧＣＡＣＡＡＣ−３’；配列番号１２９１
リバース５’−ＴＴＡＣＡＧＴＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＴＧＧ−３’；配列番号１２９２
Ｇｔｌ２−ａｓ：フォワード５’−ＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＡＡＣＡ−３’；配列番号１２９３
リバース５’−ＣＡＴＣＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＡＣＣＴＧＧ−３’；配列番号１２９４
Ｈａｐａ１−上流：フォワード５’−ＧＧＴＣＣＡＡＡＡＴＣＧＧＣＡＧＴ−３’；配列番号１２２７
リバース５’−ＧＴＣＣＴＣＡＡＡＴＣＣＣＴＡＣＣＡＧＡ−３’；配列番号１２２８
Ｈｔｒ６−下流：フォワード５’−ＡＣＡＣＧＧＴＣＧＴＧＡＡＧＣＴＡＧＧＴＡ−３’；配列番号１２２９
リバース５’−ＣＡＧＴＴＧＧＡＧＴＡＧＧＣＣＡＴＴＣＣＣ−３’；配列番号１２３０
Ｎｅｓｐａｓ／ＴＲ０１９５０１：フォワード５’−ＡＧＡＴＧＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＴ−３’；配列番号１２３１
リバース５’−ＣＡＡＧＴＣＣＡＧＡＧＴＡＧＣＣＡＡＣ−３’；配列番号１２３２
【０２８８】
Ｘｉｓｔ−フォワード３Ｆ５及び−リバース２Ｒプライマーが記載されている（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ストランド特異的ｃＤＮＡ合成の場合、リバースプライマーを用い、ＳＹＢＲグリーン（ＢｉｏＲａｄ）を用いてｑＰＣＲを実施し、閾値交差（Ｃｔ）を記録した。各値を、入力したＲＮＡレベルに対し正規化した。
【０２８９】
ノーザンブロット分析
５μｇのポリ（Ａ＋）ＲＮＡを１６．７ＥＳ細胞から単離し、ホルムアルデヒドを含む０．８％アガロースゲルにより分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−ＸＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にブロットした後、Ｕｌｔｒａｈｙｂ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、４２℃でプローブにハイブリダイズさせた。プローブは、ＳＴＲＩＰ−ＥＺ  ＰＣＲキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて作製し、以下を用いてゲノムＤＮＡから増幅した：
Ｍａｌａｔ１−ＡＳ−Ｆ、５’−ＴＧＧＧＣＴＡＴＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＧＧ−３’；配列番号１２３３
Ｍａｌａｔ１−ＡＳ−Ｒ、５’−ＧＡＧＴＣＣＣＴＴＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧ−３’；配列番号１２３４
（Ｇｔｌ２）Ｍｅｇ３−Ｆ、５’−ＧＣＧＡＴＡＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＣＡＴＧＣ−３’；配列番号１２３５
Ｍｅｇ３−Ｒ、５’−ＣＣＡＣＴＣＣＴＴＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣ−３’；配列番号１２３６
Ｍｅｇ３  ｄｓ−Ｆ３、５’−ＡＴＧＡＡＧＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＡＧＡＣ−３’；配列番号１２３７
Ｍｅｇ３  ｄｓ−Ｒ２、５’−ＡＣＧＣＴＣＴＣＧＣＡＴＡＣＡＣＡＡＴＧ−３’；配列番号１２３８
Ｒｔｌ１−Ｆ、５’−ＧＴＴＧＧＧＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＧＴ−３’；配列番号１２３９
Ｒｔｌ１−Ｒ、５’−ＧＡＧＧＣＡＣＡＡＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣ−３’；配列番号１２４０
Ｎｅｓｐａｓ  ｄｓ−Ｆ、５’−ＴＧＧＡＣＴＴＧＣＴＡＣＣＣＡＡＡＡＧＧ−３’；配列番号１２４１
Ｎｅｓｐａｓ  ｄｓ−Ｒ、５’−ＣＧＡＴＧＴＴＧＣＣＣＡＧＴＴＡＴＣＡＧ−３’；配列番号１２４２
Ｂｇｎ−ＡＳ−Ｆ、５’−ＣＡＡＣＴＧＡＣＣＴＣＡＴＡＡＧＣＡＧＣＡＣ−３’；配列番号１２４３
Ｂｇｎ−ＡＳ−Ｒ、５’−ＡＧＧＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＡ−３’；配列番号１２４４
Ｈｔｒ６  ｕｐ−Ｆ、５’−ＡＴＡＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＣＧＧＡＧＴＧ−３’；配列番号１２４５
Ｈｔｒ６  ｕｐ−Ｒ、５’−ＣＡＧＧＧＧＡＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＴＧＡＧ−３’；配列番号１２４６
【０２９０】
ＵＶ−クロスリンクＲＩＰ
ＲＴ−ＰＣＲのために完全長ＲＮＡを保存する目的で、ＲＮＡ単離の前に、ＲＮＡタンパク質複合体中の転写物をＲＮＡｓｅ処理によりトリミングしなかった以外は、既存の方法を用いてＵＶ−クロスリンクＩＰを実施した。マウスＥＳ細胞を２５４ｎｍ、４００ｍＪ／ｃｍ２（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲを用いて）でＵＶ照射し、細胞核をＲＳＢ−ＴＲＩＴＯＮバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３５μｇ／ｍＬジギトニン、０．５％トリトンＸ−１００）中で音波破砕により溶解した。サケ精子ＤＮＡ／タンパク質アガロースビーズを用いて、核溶解物を４℃で１時間予め清澄した後、抗体と一緒に一晩インキュベートした。ＲＮＡ／抗体複合体をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に沈降させて、初めに低ストリンジェンシーバッファー（１ＸＰＢＳ［１５０ｍＭ  ＮａＣｌ］、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸塩、０．５％ＮＰ−４０）で、次に、高ストリンジェンシー高塩濃度バッファー（５ＸＰＢＳ［７５０ｍＭ  ＮａＣｌ］、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸塩、０．５％ＮＰ−４０）で２回洗浄した後、プロテイナーゼＫで処理した。ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＲＮＡを抽出し、前述のようにＲＴ−ｑＰＣＲを実施した。
【０２９１】
ヒトＰＲＣ２成分の発現及び精製
ヒトＰＲＣ２サブユニットの発現のために、ｐＦａｓｔＢａｃ１中のＮ末端フラグ−タグ付加ＥＺＨ２及びＳＵＺ１２をＳｆ９細胞において発現させた。全ＰＲＣ２複合体の発現のために、フラグ−タグ付加ＥＺＨ２を、タグを付加していないＳＵＺ１２、ＥＥＤ、及びＲＢＡＰ４８と一緒に共発現した。ＢＣ３００バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９、３００ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、及び完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））中での４回の凍結―解凍サイクルにより抽出物を調製し、Ｍ２ビーズに４時間にわたり結合させてから、ＢＣ２０００で洗浄した後、０．４ｍｇ／ｍｌフラグペプチドを用いたＢＣ３００中で溶出した。ＥＺＨ２及びＰＲＣ２を１００ｍＭ  ＫＣｌに調節し、ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＦＦ  １ｍｌカラム上にロードし、１００〜１０００ｍＭ  ＫＣｌ勾配で溶出した。Ａｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ  １０ｋＤａ  ＭＷＣＯ濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、ピーク画分を濃縮し、ＢＣ３００で平衡したＳｕｐｅｒｏｓｅ６カラム上にロードした。ピーク画分を収集し、濃縮した。ＳＵＺ１２のために、フラグ溶出液を濃縮し、ＢＣ３００で平衡したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上にロードした。
【０２９２】
ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
ＲＮＡ−ＥＭＳＡのために、３０ｎｔ  Ｈｅｓ−１プローブ（アンチセンス方向でＴＳＳの約２７０ｂｐ下流）をゲルシフトのために用いた。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、ＲＮＡプローブを［γ−３３ｐ］ＡＴＰで放射標識した。精製したＰＲＣ２タンパク質（１μｇ）を標識プローブと一緒に４℃で１時間インキュベートした。ＲＮＡ−タンパク質複合体を０．５×ＴＢＥ中の４％非変性ポリアクリルアミドゲル上で、４℃にて１時間にわたり２５０Ｖで分離した。ゲルを乾燥させてから、Ｋｏｄａｋ  ＢｉｏＭａｘフィルムに暴露した。
【０２９３】
ＲＮＡプルダウンアッセイ
Ｔ７プロモータ配列を、ＲｅｐＡ、Ｘｉｓｔエキソン１、及び末端切断型Ｇｔｌ２のＰＣＲ産物用のフォワードプライマーに組み込んだ。完全長Ｇｔｌ２をｐＹＸ−ＡＳＣに、またＸｉｓｔＥ１をｐＥＦ１／Ｖ５／ＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。具体的プライマーは以下の通りであった：
ＲｅｐＡ−Ｆ：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡｃｃｃａｔｃｇｇｇｇｃｃａｃｇｇａｔａｃｃｔｇｔｇｔｇｔｃｃ；配列番号１２４７
ＲｅｐＡ−Ｒ：ｔａａｔａｇｇｔｇａｇｇｔｔｔｃａａｔｇａｔｔｔａｃａｔｃｇ；配列番号１２４８
末端切断型Ｇｔｌ２−Ｆ：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣＴＧＡＧＡＣＡＣＴＧＡＣＣＡＴＧＴＧＣＣＣＡＧＴＧＣＡＣＣ；配列番号１２４９
末端切断型Ｇｔｌ２−Ｒ：ＣＧＴＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＣＧＣＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＣ；配列番号１２５０
Ｘｉｓｔ  Ｅ１−Ｆ：ａｔｇｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｃｔａｔｃａｇａ；配列番号１２５１
Ｘｉｓｔ  Ｅ１−Ｒ：ｇａａｇｔｃａｇｔａｔｇｇａｇｇｇｇｇｔ；配列番号１２５２
【０２９４】
次に、Ｍｅｇａ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＲＮＡを切断し、Ｔｒｉｚｏｌを用いて精製した後、ゆっくりと冷却することにより、二次構造体の形成を促進した。プルダウンアッセイのために、３μｇのフラグ−ＰＲＣ２又はフラグ−ＧＦＰと、２０Ｕ  ＲＮＡｓｉｎを補充した５ｐモルのＲＮＡを氷上で３０分間インキュベートした。１０μｌのフラグビーズを添加し、回転ホイール上で、４℃で１時間インキュベートした。１５０ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％  ＮＰ４０及び１ｍＭ  ＰＭＳＦを含有する２００μｌのバッファーで、ビーズを３回洗浄した。３５μｌの０．２ＭグリシンｐＨ２．５の添加により、フラグビーズからＲＮＡ−タンパク質複合体を溶出した。１／１０容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０の添加により、溶出液を中和した後、ゲル電気泳動により解析した。
【０２９５】
ノックダウン分析及びｑＲＴ−ＰＣＲ
ｓｈＲＮＡオリゴをＭＩＳＳＩＯＮ  ｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）ベクターにクローン化し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により野生型マウスＥＳ細胞中にトランスフェクトした。１０日のプロマイシン選択後、細胞を回収し、ＲＮＡノックダウンを確認するために、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。対応するスクランブル配列（ＭＩＳＳＩＯＮ非標的ｓｈＲＮＡ）を対照として用いた（Ｓｃｒ）。Ｇｔｌ２のｓｈＲＮＡオリゴ：（上鎖）５’−ＣＣＧ  ＧＧＣ  ＡＡＧ  ＴＧＡ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＴＡＧ  ＧＣＴ  ＣＧＡ  ＧＣＣ  ＴＡＴ  ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＡＣ  ＴＴＧ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  Ｇ−３’；配列番号１２５３（下鎖）５’−ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＴＧＡ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＴＡＧ  ＧＣＴ  ＣＧＡ  ＧＣＣ  ＴＡＴ  ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＡＣ  ＴＴＧ  Ｃ−３’；配列番号１２５４。Ｇｔｌ２及びＧｔｌ２−ａｓＲＮＡのｑＰＣＲプライマーは、前述した通りである。Ｄｌｋ１ＲＮＡのプライマー：（フォワード）５’−ＡＣＧ  ＧＧＡ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＧＣＧ  ＡＡＡ  ＴＡ−３’；配列番号１２５５（リバース）５’−ＣＴＴ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＴＧ−３’；配列番号１２５６。別のＧｔｌ２  ｓｈＲＮＡをＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した（Ｖ２ＭＭ＿９７９２９）。このｓｈＲＮＡによるノックダウン後のＥｚｈ２レベルをｑＰＣＲにより試験した。複数のクローンを試験した後、初期継代クローンにおいてＧｔｌ２をノックダウンすることができた（５０〜７０％）が、ノックダウンクローンは、長期間培養物として維持することは難しいという結論に到った。
【０２９６】
ＤＮＡ  ＣｈＩＰ及びリアルタイムＰＣＲ
記載されている（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）ようにＣｈＩＰを実施した。各ＩＰで、５μｌのα−Ｅｚｈ２抗体（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ  ３９１０３）、正常ウサギＩｇＧ（Ｕｐｓｔａｔｅ１２〜３７０）、及びα−Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いた。ＣｈＩＰ  ＤＮＡのためのリアルタイムＰＣＲは、ｐｒＧｔｌ２Ｆ／ｐｒＧｔｌ２Ｒを用いてＧｔｌ２−近位ＤＭＲで、ＤＭＲ−Ｆ／ＤＭＲ−Ｒを用いてＧｔｌ２−遠位ＤＭＲで、ｐｒＤｌｋ１Ｆ／ｐｒＤｌｋ１Ｒを用いてＤｌｋ１プロモータで、並びにｐｒＧＡＰＤＨ−Ｆ／ｐｒＧＡＰＤＨ−Ｒを用いてＧａｐｄｈプロモータで実施した。プライマー配列は以下の通りである。
近位ＤＭＲ  ５’−ＣＡＴＴＡＣＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＣＣＡＴＴＴＴ；配列番号１２５７
近位ＤＭＲ  ５’−ＧＡＴＡＣＧＧＧＧＡＡＴＴＴＧＧＣＡＴＴＧＴＴ；配列番号１２５８
ｐｒＤｌｋ１Ｆ  ５’−ＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＴＴＧＡＣＧＧＴＧＡＡＣ；配列番号１２５９
ｐｒＤｌｋ１Ｒ  ５’−ＣＴＣＣＴＣＴＣＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＣＡＧＴ；配列番号１２６０
遠位ＤＭＲ−Ｆ  ５’−ＧＣＣＧＴＡＡＡＧＡＴＧＡＣＣＡＣＡ；配列番号１２６１
遠位ＤＭＲ−Ｒ  ５’−ＧＧＡＧＡＡＡＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＴＡ；配列番号１２６２
ｐｒＧＡＰＤＨ−Ｆ  ５’−ＡＧＣＡＴＣＣＣＴＡＧＡＣＣＣＧＴＡＣＡＧＴ；配列番号１２６３
ｐｒＧＡＰＤＨ−Ｒ  ５’−ＧＧＧＴＴＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡＣＧＧＡＣＴＧＣ；配列番号１２６４
ｐｒＡｃｔｉｎ−Ｆ  ５’−ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＣＴＡ  ＧＴＡ  ＡＣＣ  ＧＡＧ  ＡＣＡ；配列番号１２６５
ｐｒＡｃｔｉｎ−Ｒ  ５’−ＡＧＴ  ＴＴＴ  ＧＧＣ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＴＧＣ  Ｔ；配列番号１２６６
【０２９７】
後に記載する実施例６〜１０には、以下の材料及び方法を用いた。
【０２９８】
ＬＮＡ  ヌクレオフェクション−２×１０６のＳＶ４０Ｔ形質転換ＭＥＦを１００μｌのＭｅｆ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液（Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁させた。Ｃｙ３標識ＬＮＡ分子を最終濃度２μＭまで添加した。Ｔ−２０プログラムを用いて、細胞をトランスフェクトした。２ｍｌの培地を細胞に添加し、各時点でこの懸濁液を１００μｌずつ、１つのゼラチン化１０ウェルスライド上で平板培養した。Ｅｘｉｑｏｎソフトウエア（ｅｘｉｑｏｎ．ｃｏｍで入手可能）を用いて、ＬＮＡ配列を設計した。自己ハイブリダイゼーションスコアを最小限に抑えながら、目標親和性（Ｔｍ）を最大限にするように、修飾ＬＮＡ塩基を戦略的に導入した。ＬＮＡ分子配列（５’から３’へ）は、以下の通りである：
ＬＮＡ−Ｓｃｒ，ＧＴＧＴＡＡＣＡＣＧＴＣＴＡＴＡＣＧＣＣＣＡ；配列番号１２６７
ＬＮＡ−Ｃ１，ＣＡＣＴＧＣＡＴＴＴＴＡＧＣＡ；配列番号１２６８
ＬＮＡ−Ｃ２，ＡＡＧＴＣＡＧＴＡＴＧＧＡＧ；配列番号１２６９
ＬＮＡ−Ｂ，ＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧ；配列番号１２７０
ＬＮＡ−Ｅ，ＡＴＡＧＡＣＡＣＡＣＡＡＡＧＣＡ；配列番号１２７１
ＬＮＡ−Ｆ，ＡＡＡＧＣＣＣＧＣＣＡＡ；配列番号１２７２
ＬＮＡ−４９７８，ＧＣＴＡＡＡＴＧＣＡＣＡＣＡＧＧＧ；配列番号１２７３
ＬＮＡ−５２０５，ＣＡＧＴＧＣＡＧＡＧＧＴＴＴＴＴ；配列番号１２７４
ＬＮＡ−７２６，ＴＧＣＡＡＴＡＡＣＴＣＡＣＡＡＡＡＣＣＡ；配列番号；１２７５
ＬＮＡ−３’，ＡＣＣＣＡＣＣＣＡＴＣＣＡＣＣＣＡＣＣＣ；配列番号１２７６
【０２９９】
リアルタイムＰＣＲ−Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたヌクレオフェクション後に、全ＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩキットを用いて、逆トランスクリプターゼ反応を実施し、ｉｃｙｃｌｅｒ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、ｃＤＮＡサンプル上でリアルタイムＰＣＲを実施した。
【０３００】
ＣｈＩＰ−１％ホルムアルデヒド溶液中のヌクレオフェクション後の様々な時点で、細胞を固定した。０．１２５Ｍまでグリシンを添加することにより、固定を停止して、既述されているように（２８）ＣｈＩＰを実施し、ｑＰＣＲにより定量した。
【０３０１】
抗体−様々なエピトープに対する抗体を以下の通り購入した：Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ  ３９５３５．Ｅｚｈ２、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ  ３９６３９及びＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ６１２６６６。免疫染色のために、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３抗体を１：１００希釈で、Ｅｚｈ２抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を１：５００で使用した。Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ二次抗体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ウェスタンブロットのために、Ｅｚｈ２抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を１：２０００希釈で使用した。アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ２０６６）を１：５０００希釈で使用した。
【０３０２】
ＤＮＡ  ＦＩＳＨ、ＲＮＡ  ＦＩＳＨ、及び免疫染色−細胞をゼラチン化ガラススライド上で増殖させるか、又はサイトスピンした。既存の方法に基づいて、ＲＮＡ  ＦＩＳＨ、ＤＮＡ  ＦＩＳＨ、連続的ＲＮＡ−ＤＮＡ  ＦＩＳＨ、免疫染色及び免疫ＦＩＳＨを実施した。ニックトランスレートｐＳｘ９−３プローブ又はＸｉｓｔリボプローブカクテルを用いて、Ｘｉｓｔ  ＲＮＡ  ＦＩＳＨを実施した。ｐＳｘ９−３は、Ｘｉｓｔ  ＤＮＡ  ＦＩＳＨのためのプローブとして使用された。中期伸展のために、１時間かけてコルチシンを細胞に添加した。細胞をトリプシン処理し、３ｍｌの０．０５６Ｍ  ＫＣｌ中、室温で３０分再懸濁させ、遠心分離した後、メタノール：酢酸（３：１）固定液中で再懸濁させた。固定液を数回取り替えた後、細胞を冷却したスライド上に滴下し、ＲＮＡ又はＤＮＡ  ＦＩＳＨのために処理した。
【０３０３】
実施例１．ＲＩＰ−ｓｅｑによるＰＲＣ２トランスクリプトームの捕捉
既存の２つの方法であるネイティブＲＩＰ及びＲＮＡ−ｓｅｑを組み合わせることにより、ＰＲＣ２に結合したＲＮＡのゲノムワイドプールを捕捉する方法を開発した（この方法は、「ＲＩＰ−ｓｅｑ」と呼ぶ）。α−Ｅｚｈ２抗体により免疫沈降させた核ＲＮＡをマウスＥＳ細胞から単離し、Ｅｚｈ２−／−対照、ストランド特異的アダプターから作製したｃＤＮＡ、及び２００〜１，２００ｎｔからのものを生成した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定に付した。
【０３０４】
パイロット実験において、１０７個のＥＳ細胞についてＲＩＰを実施したが、これは、α−Ｅｚｈ２プルダウンの特異性を評価するために複数の対照ＲＩＰを含んだ。野生型プルダウン並びにその技術的及び生物学的複製において、α−Ｅｚｈ２抗体によって、１０７個のＥＳ細胞から７０〜１７０ｎｇのＲＮＡが沈降し、＞２００ｎｔのｃＤＮＡスミアが得られた。ＲＮＡｓｅを用いた処理により、このサイズ範囲の産物が排除され、−ＲＴサンプルでは産物が全く得られなかったことは、免疫沈降した物質が実際にＲＮＡであることを示している。野生型細胞をＩｇＧ（約２４ｎｇ）により免疫沈降させた場合、Ｅｚｈ２−／−プルダウンにおけるＲＮＡは約１０倍少なかった（約１４ｎｇ）。また、モックＲＩＰ対照（無細胞）に対して５００倍の富化も観察された。＞２００ｎｔのサイズ範囲では、対照ＲＩＰ（ヌル細胞、ＩｇＧプルダウン、モック）は、これらのサンプルがアダプター及びプライマー二量体によって支配されたたため、ＲＮＡはさらに減少した。アダプター／プライマー二量体、ｒＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、＜１８ｎｔのリード及び不確定のヌクレオチド、並びに１５塩基を超えるホモポリマーランはコンピュータ処理によりフィルタリングで除去した。同等数の細胞から、対照ＲＩＰは、有意にリードが減少した。野生型ライブラリーでは、フィルタリングの後、２３１，８８０〜１２０万のリードが残った。これに対し、対照では、４，８８８〜７３，６９１のリードしか残らなかった。対照中の転写物の圧倒的多数が偽性のものであった（アダプター／プライマー二量体、ホモポリマーなど）。従って、野生型ＲＩＰは、実質的ＲＮＡ富化を示し、対照ＲＩＰと比較して高い割合のＲＮＡを呈示した。
【０３０５】
野生型ライブラリー中の全リードの約半分が３回以上呈示された。潜在的ＰＣＲ人為産物を回避するために、重複リードを除去した後でさえ、野生型ライブラリーは、３０１，４２７の異なるリード（技術的及び生物学的反復がそれぞれ９８，７０４及び８７，１２８）を含んだのに対し、対照サンプルでは、わずか１，０５０（ＩｇＧ）及び１７，４２４（ヌル）しか得られなかった。野生型ライブラリーは、互いに酷似しており、Ｅｚｈ２−／−及びＩｇＧ対照と比較した際の０．２７〜０．０１に対して、０．７１〜０．９０の相関係数（ＣＣ）を有した。＞１０コピー／ゲノムの反復エレメントにマップするリードが、総野生型リードの＜２０％を占め、その大部分が単純反復配列であり、８５．７１４％を占めるのに対し、ＬＩＮＥ、ＳＩＮＥ、及びＬＴＲは相対的に少ない比率で表示された。≦１０アラインメントを有するリードが最大の表示を有したため、以後、これらのリードを中心に解析を行う（カットオフ≦１０は、低コピーゲノム重複を有する遺伝子を保持する）。
【０３０６】
染色体位置の関数として個別のリードをプロットすることにより、ゲノム分布を調べた。アラインメントにより、ＰＲＣ２関連ＲＮＡが、野生型ライブラリー中の全ての染色体に存在することがわかった。ＩｇＧ及びＥｚｈ２−／−対照のアラインメントにより、少数のまばらなリードが明らかになった。このように、本発明者らのＲＩＰ−ｓｅｑにより、ＰＲＣ２トランスクリプトームの具体的かつ再現可能なプロフィールがもたらされた。多数の野生型リードが、Ｘ染色体にヒットし、Ｘ染色体不活性化センターのズームから、本発明の陽性対照（Ｔｓｉｘ、ＲｅｐＡ、及びＸｉｓｔＲＮＡ）が、各々数十回表示されたことが判明した。凝集体中に、＜１０コピー／ＥＳ細胞で発現されるＲｅｐＡ及びＸｉｓｔの表示により、ＲＩＰ−ｓｅｑ検出の高い感度が示された。これに対し、Ｘ染色体不活性化センターの他の非コードＲＮＡ内にヒットは起こらなかった。従って、ＲＩＰ−ｓｅｑ技術は、感受性及び特異的の両方である。
【０３０７】
実施例２．ＰＲＣ２トランスクリプトーム
飽和包括度を得るために、配列決定をスケールアップし、元の野生型サンプルについて３１９０万リードを取得し、生物学的反復については３６４０万リードを取得した。重複を除去してからフィルタリングした後、アラインメント≦１０の１，０３０，７０８及び８５２，６３５の個別リードが、各ライブラリーについてそれぞれ残った。次に、これらのリードを、後の解析のためにパイロット野生型リードと一緒にして（以後、ＷＴライブラリー）、Ｅｚｈ２−／−ライブラリーを対照として用いて全ての解析を実施した。
【０３０８】
ＷＴ対ヌルライブラリーにおける相対表示に基づき、真正陽性がＷＴにおいて豊富であると推論して、戦略を設計した。遺伝子長さ及びシーケンス深度の正規化の平均値として「１００万リード当たりのキロベース毎のリード」（ＲＰＫＭ）を用いて、遺伝子表示を計算し、次に、ＵＣＳＣ結合トランスクリプトーム中の３９，００３の転写物全てを、そのＷＴＲＰＫＭ（ｘ軸）及びそのヌルＲＰＫＭ（ｙ軸）値によりマップした。両方のライブラリーで、ゼロ又はほぼゼロ表示を有する転写物が、標本値群の大部分を占めた［（０，０）でのブルークラウド］。非ゼロｘ値及びゼロｙ値を有する転写物は、ＷＴプルダウンにおいてのみ表示される集団を示した。適切な富化閾値を決定するために、本発明者らは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ減算を実施した。ＷＴ／ヌルＲＰＫＭ比を同じキャリブレータについて調べた。Ｘｉｓｔ／ＲｅｐＡは、４．１８／０のスコアを得たが、これは、ＷＴライブラリー中に数百〜数千の表示があり、ヌルには全くないことを示している。Ｔｓｉｘは、１０．３５／３．２７、Ｂｓｎ  ｐａｓｒは、０．９５／０、及びＫｃｎｑ１ｏｔ１は、１．１７／０のスコアを取得した。陰性対照は、低い比のスコアであり、Ｐａｘ３−ｐａｓｒが、０．１１／０．２６、Ｈｅｙ１−ｐａｓｒが、０．２８／０、Ｈｏｔａｉｒが、０．２５／０、Ｉｎｓｌ６が、０．２７／０．３９、及びＣｃｄｃ８が、０．２２／５．０４であった。これに基づき、ＲＰＫＭ（ＷＴ）／ＲＰＫＭ（ヌル）の富化比を３：１、また最小ＲＰＫＭを０．４とした。
【０３０９】
「ＰＲＣ２トランスクリプトーム」の転写物同定は、Ｅｚｈ２−ヌル細胞株と比較して、野生型細胞株においてＥＺＨ２抗体によりプルダウンされたＲＮＡが約１０倍多いことに基づくものであったが、これは、野生型ライブラリーが、ＰＲＣ２関連転写物について極めて豊富であり、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ減算がそれ以上必要ないことを意味する。この基準を用いて、伸長ＰＲＣ２トランスクリプトームのサイズを約５７Ｋ  ＲＮＡと推定した。
【０３１０】
実施例３：付録ＩからのＰＲＣ２結合ピーク（ＰＲＣ２関連領域）の同定
いくつか又はいずれかの実施形態において、タンパク質結合相手（例えば、ＰＲＣ２）が結合するＲＮＡの領域は、一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするように設計された標的ｌｎｃＲＮＡ上の例示的位置の１つである。例えば、これらの領域は、付録Ｉのデータを調べて、データセット中の豊富な領域を同定することにより見出すことができ、これらの領域は、ＰＲＣ２結合配列を含む可能性が高い。
【０３１１】
付録Ｉの配列リードは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡ−ＩＩゲノム解析装置から直接得られたもので、ＰＲＣ２結合転写物の逆相補鎖の配向である。付録Ｉは、アダプター／プライマー二量体、ミトコンドリアＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ホモポリマー、不確定のヌクレオチドを含むリード、及び切り捨てリード（＜１５ｎｔ）をバイオインフォーマティックフィルタリングで除去した後の、リードの全てのフィルタリング済みサブセットである。これらは、上の実施例１に記載したＲＩＰ及び続くＲＮＡ精製ステップ（ＲＩＰ−ｓｅｑ方法）の間、内性ヌクレアーゼから最も保護される領域を示し、従って、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡの候補領域又は関連タンパク質若しくは複合体を示す可能性が高い。付録Ｉから、ＷＴ対ヌルが３：１で富化され［ＲＰＫＭ（ＷＴ）／ＲＰＫＭ（ヌル）≧３．０］、かつ０．４の最小ＲＰＫＭを有する転写物に対応するリードを抽出した。リードの連続したパイルアップ（ピーク）を有するＰＲＣ２結合転写物の領域を同定し、これらをＲＮＡ内での候補ＰＲＣ２接触領域とみなした。
【０３１２】
付録Ｉの配列リードを用いて、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ  Ａｒａｃｈｎｅ  ａｌｉｇｎｅｒ、ＳｈｏｒｔＱｕｅｒｙＬｏｏｋｕｐを用いた標準ゲノムに関する配列包括度を決定したが、これは、標準ゲノムのｋ−ｍｅｒ（Ｋ＝１２）辞書を作製し、ゲノム中の一致するｋ−ｍｅｒ位置に基づきリードの候補位置で局所Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントを実施することによるものである。アライナーは、複数回の配置を行う。最良のアラインメントは、多くとも１つのエラーを有することが許されるが、最良のアラインメントのエラー数と１つ異なるアラインメントも許容される。リードがアラインメントする場所の数で割ることにより、包括度を正規化する（例えば、リードが４か所でアラインメントしていれば、その４つの場所の塩基の各々に、０．２５を加える）。
【０３１３】
標的ピークを取得するために、以下の方法を使用した。トランスクリプトームの野生型包括度が、Ｅｚｈ２−／−トランスクリプトームの包括度に対して、少なくとも３倍富化され、しかも少なくとも０．４の最小ＲＰＫＭ包括度を有する、塩基レベルマウス（ｍｍ９）包括度ファイルが、開始点の役割を果たす。この包括度は、ストランド特異的である。次に、長さが１００ｂｐの重なっていない連続ウィンドウにおいて、ピーク値及びそれらの位置を決定した。次いで、より大きなピークの端にあることが判明したウィンドウの縁にあるピークについて、ピーク位置を補正する。これらのピークは、より大きなピークの上部に移動する。続いて、重複ピーク位置を除去する。プラトー上にあるピーク位置をプラトーの中央に移動する。そして、上記包括度をガウシアン・カーネル（Ｇａｕｓｓｉａｎ  ｋｅｒｎｅｌ）、（１／ｓｑｒｔ（２＊シグマ＊ｐｉ））＊ｅｘｐ（−ｔ＾２／（２＊シグマ））（ここで、シグマ＝５．０）を用いて、平滑化する。次に、平滑化した範囲が、最大包括度の１／３以下となるように、ピークに最も近い位置を位置決定することにより、ピーク幅を決定する。互いに重なり合う隣接ピークを、両ピーク間の中心にそれらの境界を配置することにより、分割する。次いで、位置、幅、最大振幅と共にピークを表に出力し、また、ピークの幅の下に非平滑化包括度の合計を示す。ｍｍ９におけるマウスピークの対応ヌクレオチド配列（ＴをＵで置換することにより、ＲＮＡに変換）は、配列Ｂ４７，４０８〜Ｂ６１６、４２８に示されている［マウスピーク］。これらマウスピークのマウス染色体座標及び鎖のマウスからヒトへのＬｉｆｔＯｖｅｒを、本明細書に記載のＵＣＳＣゲノムブラウザで実施することにより、オーソロガスヒト染色体座標を決定した。この方法及びＬｉｆｔＯｖｅｒ鎖は当分野では公知である。各マウスピークのマウス座標（ｍｍ９）を、対応するヒト（ｈｇ１９）座標に変換したところ、マッチが起こった場合は必ず、５０、６５、７５及び９５％のマッピング率で、ほぼ同じ位置及び長さ結果が得られた。従って、５０％マッピングパラメータを用いた。
【０３１４】
各対応ヒトピークＲＮＡ配列（すなわち、ＴをＵで置換することにより、ＲＮＡに変換したヒト染色体座標及び鎖のヌクレオチド配列）は、配列Ｂ６５２，２５６〜Ｂ９１６，２０９に示されている［ヒトピーク］。表１は、マウス配列及び対応するヒト配列を示す。これらのヒトピーク及びヒトＰＲＣ２トランスクリプトーム（すなわち、ＰＲＣ２結合転写物のヒト配列）をＮＣＢＩデータベースからの既知遺伝子と交差させることにより、ＰＲＣ２結合ＲＮＡによってターゲティングされる遺伝子（すなわち、交差又は近傍の遺伝子）を同定した。
【０３１５】
国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２は、各ピークの近傍又はそれと交差した遺伝子の名称と共に、マウス及びヒトピークのあのテーションを示す。ヒト遺伝子（最初に記載）又はマウス遺伝子（２番目に記載）に関連する固有のＮＣＢＩ遺伝子ＩＤが、遺伝子名隣の括弧内に表示されている。ピーク座標と遺伝子座標とのオーバーラップ度を角括弧内に示す。正の数は、両者の間のオーバーラップヌクレオチドの数を示し、負の数は、両者の間のギャップのサイズ（すなわち、両者の間に位置するヌクレオチドの数）を表す。ピークについて、角括弧内の「Ｆ」は、ピーク座標が遺伝子座標と完全にオーバーラップすることを示す。転写物の場合、角括弧内の「Ｆ」は、転写物の座標が遺伝子座標と完全にオーバーラップするか、又はその逆であることを示す。ＲＮＡ転写物又はピークは、「逆鎖」カラムでは標準遺伝子に対して「アンチセンス」であるが、ＲＮＡ転写物又はピークは、「同一鎖」カラムでは標準遺伝子と「センス」配向である。
【０３１６】
バイオインフォーマティック解析により、平均ピークが、約４０〜６０塩基であることが示されるが、これは、一本鎖オリゴヌクレオチドの初期設計には優れたサイズである。これらピークの各々は、それが、付録Ｉからのオーバーラップ逆相補鎖リードのセグメントと対応するため、付録Ｉにおける逆相補鎖リードにより完全に表示される。ピークは、コード遺伝子内のどこにおいても、また、センス又はアンチセンス配向のいずれでも見出すことができる。さらに、ピークは、プロモータ／５’ＵＴＲ領域、イントロン、内部エキソン、及び３’ＵＴＲ並びにそれ以外でも見出すことができる。解析は、ＰＲＣ２相互作用転写物が、タンパク質コードｍＲＮＡではなく、ｍＲＮＡ配列とオーバーラップする１つ又は複数の異なる転写物であることを強く示している。多くが、これまで記載されていない新規のＲＮＡである。
【０３１７】
本明細書に開示する方法を用いて、要望される効果をもたらすのに十分な特異性で、標的位置又はセグメントに結合する、あるいは、標的ＲＮＡと十分相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドを設計することができる。ある実施形態において、本方法は、当分野では公知のバイオインフォーマティック方法を用いて、二次構造体、例えば、１つ、２つ、若しくは３つ以上のステムループ構造体、又はプソイドノットの領域を同定して、一本鎖オリゴヌクレオチドでターゲティングする領域を選択することを含む。
【０３１８】
ピーク内の、又はピークに直接隣接する少なくとも５つの連続したヌクレオチドの区間を含む、長さ５〜５００ヌクレオチド、又は長さ約５〜約１００ヌクレオチド、又は長さ約２ｋｂの追加的標的セグメントも、ターゲティングするのに好適であると考えられる。
【０３１９】
より長いヒト転写物配列とマッチしなかったヒトピークの各々について、ヒト染色体配列周囲の、より長い２ｋｂの断片を同定したが、これらは、配列Ｂ９１６，６２６〜Ｂ９３４，７６１に示されている［ヒトピーク周囲の、より大きな領域］。
【０３２０】
実施例４．ピーク領域内又はその付近におけるＲＮＡとＰＲＣ２の直接結合を支持するエビデンス
実施例２において基準を用いて同定したＲＮＡが、ＰＲＣ２と直接結合するという考えを試験するために、実験を実施した。精製した組換えヒトＰＲＣ２サブユニット、ＥＥＤ、ＥＺＨ２、ＳＵＺ１２、及びＲＢＡＰ４８を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生化学解析を実施した。Ｈｅｓ１（Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路中の転写因子）について新たに同定したアンチセンスＲＮＡは、やはりＲｅｐＡで見出される部分である二重ステムループを含む。ＲＮＡゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）において、２８ｎｔＲｅｐＡ及び３０ｎｔＨｅｓ１−ａｓプローブの両方がＰＲＣ２によりシフトされたのに対し、Ｘｉｓｔ（ＤｓＩ、ＤｓＩＩ）の他の領域由来のＲＮＡは、シフトされなかった。ステムループ構造の突然変異により、ＰＲＣ２結合が低減した。ＰＲＣ２のどのサブユニットがＨｅｓ１−ａｓに結合するかを決定するために、特定のサブユニットを用いたＥＭＳＡを実施した。ＥＺＨ２は、野生型を強力にシフトしたが、突然変異Ｈｅｓ１−ａｓはシフトせず、また、ＳＵＺ１２又はＥＥＤのいずれもＨｅｓ１−ａｓをシフトしなかった。ＲＮＡ−タンパク質シフトは、全ＰＲＣ２を用いた場合、常に、より離散的であったが、これは、他のサブユニットが相互作用を安定化することを示している。
【０３２１】
これらの結果は、Ｈｅｓ１−ａｓＲＮＡが、ＰＲＣ２と直接かつ特異的に相互作用し、また、Ｅｚｈ２がＲＮＡ結合サブユニットであることを示している。Ｘｉｓｔ／Ｔｓｉｘ遺伝子座内の最大ピークの２つが、フォワード及びリバース鎖の両方で、ＥＺＨ２と直接相互作用することがわかっている２８ｎｔ反復部分である、反復配列Ａ領域に局在するという観察結果から、さらなるエビデンスが得られる。「ピーク」由来のＲＮＡ断片は、ＰＲＣ２による頑健なシフトを示したが、「ピーク」外側にマップする断片のシフトはわずかであった。従って、本発明者らは、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２の同定された「ピーク」の全てでないにしろ、その多くが、ＲＮＡの新生のＰＲＣ２相互作用ドメインを真正に表すと考える。これらの結果から、ピーク、及び恐らく隣接領域が、ＰＲＣ２複合体と直接かつ特異的に相互作用することがわかる。
【０３２２】
実施例５．ｍＲＮＡ発現の上方制御に対する一本鎖オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの作用
Ａ．ＡｐｏＥ
ＡｐｏＥを上方制御するために、ｌｎｃＲＮＡをターゲティングするように一本鎖オリゴヌクレオチドを設計した。オリゴヌクレオチドは、長さが１６塩基未満で、非修飾ＤＮＡと、複数のロックド核酸修飾塩基を含み、これらは全てホスホロチオエート結合により連結されていた。手短には、トランスフェクション及びデータ解析を以下のように実施した。
【０３２３】
ＤＮＡｓｅステップを省いたＰｒｏｍｅｇａ  ＳＶ  ９６  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎシステムを用いて、Ｈｅｐ３Ｂ細胞からＲＮＡを回収した。個別のパイロット実験において、５０ｎｇのＲＮＡが、逆転写酵素反応のための十分な鋳型であることが判明した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞から回収されたＲＮＡを正規化して、５０ｎｇのＲＮＡを各逆転写反応に投入した。希薄過ぎて限界に達しなかった数個のサンプルについては、最大投入量を添加した。次に、定量ＰＣＲ評価を完了した。
【０３２４】
ＡｐｏＥ  ｍＲＮＡ発現のベースラインレベルを、上に概説したように定量ＰＣＲにより決定した。また、構成的に発現される各種ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡについてもベースラインレベルを決定した。ＡｐｏＥ  ｍＲＮＡとほぼ同レベルのベースライン発現を有する「対照」ハウスキーピング遺伝子を、ＡｐｏＥとの比較の目的で選択した。
【０３２５】
Ｈｅｐ３Ｂ細胞を５００ｕＬ当たり２５，０００細胞の密度で２４ウェルプレートの各ウェルに接種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及び一本鎖オリゴヌクレオチドを用いて、トランスフェクションを実施した。対照ウェルは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのみを含有した。トランスフェクションから４８時間後、約２００ｕＬの細胞培養上澄みをＥＬＩＳＡのために−８０℃で保存した。トランスフェクションから４８時間後、Ｈｅｐ３Ｂ細胞からＲＮＡを回収し、上に概説したように定量ＰＣＲを実施した。各一本鎖オリゴヌクレオチドによるＡｐｏＥｍＲＮＡ発現の誘導率（％）を、一本鎖オリゴヌクレオチドの存在下でのｍＲＮＡレベルを対照（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのみ）の存在下でのｍＲＮＡに対して基準化することにより決定した。これを「対照」ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡ発現の増大と並べて比較した。
【０３２６】
試験した計２６のオリゴヌクレオチドは、上の実施例２に従い同定したＰＲＣ２結合ＲＮＡ配列と相補的であった。「対照」ハウスキーピング遺伝子に対して増大したＡｐｏＥｍＲＮＡレベルにより示されるように、これら２６のオリゴヌクレオチドのうち、７つが、ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞においてａｐｏＥ発現を上方制御した。
【０３２７】
ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）を用いて、上記の方法を繰り返した。上の実施例２に従い同定したＰＲＣ２結合ＲＮＡ配列と相補的な２６のオリゴヌクレオチドのうち、５つが、「対照」ハウスキーピング遺伝子に対して、腎細胞におけるＡｐｏＥｍＲＮＡレベルを増大した。レベルは、ベースライン発現に対して、約１．５〜約５倍増大した。
【０３２８】
さらに、上の実施例３に従い同定したａｐｏＥに関連するピークと相補的である１１のオリゴヌクレオチドのうち、３つが、ａｐｏＥ発現を上方制御した。
【０３２９】
長さ８ヌクレオチドという短い一本鎖オリゴヌクレオチドが、遺伝子発現を上方制御することが明らかにされた。
【０３３０】
Ｂ．Ｎｋｘ２−１
Ｎｋｘ２−１を上方制御するために、ｌｎｃＲＮＡをターゲティングするように設計された一本鎖オリゴヌクレオチドについて、上の実施例５Ａに記載した実験を繰り返した。試験した計１３のオリゴヌクレオチドは、上の実施例２に従い同定したＰＲＣ２結合ＲＮＡ配列と相補的であった。１３のオリゴヌクレオチドのうち、３つが、ベースラインに対して増大したＮｋｘ２−１ｍＲＮＡ発現により示されるように、Ｎｋｘ２−１を上方制御したが、低レベルの固有発現のために、「対照」ハウスキーピング遺伝子はいずれもＮｋｘ２−１とマッチすることができなかった。さらに、上の実施例３に従い同定したＮｋｘ２−１と関連するピークと相補的である９つのオリゴヌクレオチドのうち、３つが、Ｎｋｘ２−１発現を上方制御した。
【０３３１】
Ｃ．Ｂｒｃａ１
Ｂｒｃａ１を上方制御するために、ｌｎｃＲＮＡをターゲティングするように設計された一本鎖オリゴヌクレオチドについて、上の実施例５Ａに記載した実験を繰り返した。試験した計３０のオリゴヌクレオチドは、上の実施例２に従い同定した２つのＰＲＣ２結合ＲＮＡ配列と相補的であった。３０のオリゴヌクレオチドのうち、５つが、Ｂｒｃａ１発現を上方制御した。また、３０のオリゴヌクレオチドのうち、１３のオリゴヌクレオチドは、上の実施例３に従い同定したＢｒｃａ１と関連するピークとも相補的であった。ピークと相補的なこれら１３のオリゴヌクレオチドのうち、２つのオリゴヌクレオチドが、Ｂｒｃａ１発現を上方制御した。レベルは、ベースライン発現に対して、約２〜約３倍増大した。
【０３３２】
Ｄ．Ｓｍａｄ７
Ｓｍａｄ７を上方制御するために、配列表に記載されるｌｎｃＲＮＡをターゲティングするように設計された一本鎖オリゴヌクレオチドについて、ＨｅｐＢ３の代わりに、腎細胞株ＲＰＴＥＣを用いた以外は、上の実施例５Ａに記載した実験を繰り返した。試験した計２８のオリゴヌクレオチドは、配列Ｂ１８６０２と相補的であった。これら２８のオリゴヌクレオチドのうち、４つが、Ｓｍａｄ７発現を上方制御した。さらに、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２におけるピークと相補的な２８のオリゴヌクレオチドのうち、４つのオリゴヌクレオチドが、Ｓｍａｄ７発現を上方制御した。
【０３３３】
Ｅ．ＳｉｒＴ６
ＳｉｒＴ６を上方制御するために、ｌｎｃＲＮＡをターゲティングするように設計された一本鎖オリゴヌクレオチドについて、上の実施例５Ａに記載した実験を繰り返した。試験した計２５のオリゴヌクレオチドは、上の実施例２に従い同定したＰＲＣ２結合ＲＮＡ配列と相補的であった。これら２５のオリゴヌクレオチドのうち、３つが、ＳｉｒＴ６発現を上方制御した。試験した計２つのオリゴが、上の実施例２に従い同定した別のＰＲＣ２結合配列と相補的であった。これら２つのオリゴヌクレオチドのうち、１つが、ＳｉｒＴ６発現を上方制御した。試験した計２つのオリゴヌクレオチドは、上の実施例２に従い同定した別のＰＲＣ２結合ＲＮＡ配列と相補的であった。これら２つのオリゴヌクレオチドのうち、いずれも、ＳｉｒＴ６発現を上方制御しなかった。レベルは、ベースライン発現に対して、約２〜約６倍増大した。さらに、上の実施例３に従い同定したＳｉｒＴ６と関連するピークと相補的であった６つのオリゴヌクレオチドのうち、１つがＳｉｒＴ６発現を上方制御した。
【０３３４】
Ｆ．ＳｅｒｐｉｎＦ１
ＳｅｒｐｉｎＦ１を上方制御するために、ｌｎｃＲＮＡをターゲティングするように設計された一本鎖オリゴヌクレオチドについて、上の実施例５Ａに記載した実験を繰り返した。試験した計３８のオリゴヌクレオチドは、上の実施例２に従い同定した２つのＰＲＣ２結合ＲＮＡ配列と相補的であった。これら３８のオリゴヌクレオチドのうち、３つが、ＳｅｒｐｉｎＦ１発現を上方制御した。レベルは、ベースライン発現に対して、約１．２〜約２倍増大した。さらに、上の実施例３に従い同定したＳｅｒｐｉｎＦ１と関連するピークと相補的であった３２のオリゴヌクレオチドのうち、３つがＳｅｒｐｉｎＦ１発現を上方制御した。
【０３３５】
Ｇ．ＫＬＦ１
ＫＬＦ１を上方制御するために、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２に記載されているｌｎｃＲＮＡをターゲティングするように設計された一本鎖オリゴヌクレオチドについて、上の実施例５Ａに記載した実験を繰り返した。試験した計３０のオリゴヌクレオチドは、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２における配列Ｂ１５６８８及びＢ１５６８９と相補的であった。これら３０のオリゴヌクレオチドのうち、１５が、「対照」ハウスキーピング遺伝子に対して増大したＫＬＦ１ｍＲＮＡ発現により示されるように、ＨｅｐＢ３細胞においてＫＬＦ１を上方制御した。さらに、ＫＬＦ１に関連する、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２のピークと相補的な２つのオリゴヌクレオチドのうち、１つが、ＫＬＦ１発現を上方制御した。レベルは、ベースライン発現に対して、約２〜約５０倍増大した。
【０３３６】
Ｈ．Ｒｐｓ１９
ｒｐｓ１９を上方制御するために、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２に記載されているｌｎｃＲＮＡをターゲティングするように設計された一本鎖オリゴヌクレオチドについて、上の実施例５Ａに記載した実験を繰り返した。試験した計３０のオリゴヌクレオチドは、配列Ｂ６３０２５９及びＢ６３０２９０と相補的であった。これら３０のオリゴヌクレオチドのうち、７つが、「対照」ハウスキーピング遺伝子に対して増大したｒｐｓ１９ｍＲＮＡ発現により示されるように、ｒｐｓ１９を上方制御した。さらに、ｒｐｓ１９と関連する、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２のピークと相補的な２５のオリゴヌクレオチドのうち、７つが、Ｒｐｓ１９発現を上方制御した。レベルは、ベースライン発現に対して、約１．２〜約１．６倍増大した。
【０３３７】
Ｉ．ＰＴＥＮ
ＰＴＥＮを上方制御するために、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２に記載されているｌｎｃＲＮＡをターゲティングするように設計された一本鎖オリゴヌクレオチドについて、上の実施例５Ａに記載した実験を繰り返した。試験した計４０のオリゴヌクレオチドは、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２における配列Ｂ６５０，５６０及びＢ６５０，５５９と相補的であった。これら４０のオリゴヌクレオチドのうち、１８のヌクレオチドが、ＰＴＥＮを上方制御した。これら４０のオリゴヌクレオチドのうち、３１のヌクレオチドが、ＰＴＥＮと関連する、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２のピークとも相補的であった。これら３１のオリゴヌクレオチドのうち、１１のオリゴヌクレオチドが、ＰＴＥＮ発現を上方制御した。レベルは、ベースライン発現に対して、約１．５〜約５倍増大した。
【０３３８】
Ｊ．ＥＰＯ
エリスロポエチン（ＥＰＯ）を上方制御するために、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２に記載されているｌｎｃＲＮＡをターゲティングするように設計された一本鎖オリゴヌクレオチドについて、上の実施例５Ａに記載した実験を繰り返した。試験した計１３のオリゴヌクレオチドは、配列Ｂ９３２，１８９及びＢ９３２，１９０と相補的であった。これら１３のオリゴヌクレオチドのうち、５つが、ＥＰＯ発現を上方制御した。さらに、ＥＰＯと関連する、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２のピークと相補的な２つのオリゴヌクレオチドのうち、１つが、ＥＰＯ発現を上方制御した。レベルは、ベースライン発現に対して、約４倍増大した。
【０３３９】
市販されているキット［ＤＥＰ００，ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ］を用いたＥＬＩＳＡアッセイを、製造者の指示に従い実施することにより、細胞上澄み中に存在する分泌タンパク質を定量した。オリゴヌクレオチドにより誘導されたタンパク質レベルを、対照（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのみ）により誘導されたタンパク質レベルに対して正規化することにより、タンパク質の誘導倍率を決定した。データは、ＥＰＯｍＲＮＡ発現を増大した１つのオリゴヌクレオチドのそれを示しており、これにより、対応するＥＰＯタンパク質発現増大が明らかにされた。配列Ｂ１４４８６及び配列１４４８７（マウスＥＰＯ遺伝子とオーバーラップする転写物）と相補的な３つのオリゴヌクレオチドを、マウスＥＰＯ発現を上方制御する能力についてｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。
【０３４０】
加えて、下流ピーク領域をターゲティングする２つの他のオリゴも試験した。これらのうち、４つのオリゴヌクレオチドは、ＥＰＯと関連する、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２のピーク領域と相補的であった。雄性Ｃ５７Ｂ１６／Ｊマウス［生後６〜８週及び２０〜２５ｇ］に、１００μｌの滅菌リン酸緩衝食塩水中１０ｍｇ／ｋｇ又は２５ｍｇ／ｋｇのいずれかの用量で、オリゴヌクレオチドの単回注射を皮下投与した。
【０３４１】
注射から４８時間後の時点で、末梢血サンプルを心臓穿刺により採取し、ＥＬＩＳＡアッセイ［ＭＥＰ００，ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ］を製造者の指示に従い用いて、ＥＰＯタンパク質のレベルについてアッセイした。配列Ｂ１４４８６若しくは配列１４４８７又はピークと相補的であった試験オリゴのうち、２５ｍｇ／ｋｇの用量で、１つはＥＰＯタンパク質の５倍誘導を示し、もう１つは７倍誘導を示した。ＥＰＯタンパク質発現をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導したこれら２つのオリゴヌクレオチドのうち、１つは、１５０塩基以内（他方は１５００塩基以内）のものであり、いずれも、配列Ｂ４６１８１２であるマウスピークとは逆鎖上にある。このマウスピークは、配列Ｂ８４５４７２のヒトピークに対応する。
【０３４２】
Ｋ．ＢＤＮＦ
ＢＤＮＦを上方制御するために、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２に記載されているｌｎｃＲＮＡをターゲティングするように設計された一本鎖オリゴヌクレオチドについて、上の実施例５Ａに記載した実験を繰り返した。試験した計２１のオリゴヌクレオチドは、配列Ｂ６２０２３６及びＢ６２０２３７と相補的であった。これら２１のオリゴヌクレオチドのうち、９つが、ＢＤＮＦ発現を上方制御した。試験した計２つのオリゴヌクレオチドが、配列Ｂ１３０，６９４と相補的であった。これら２つのオリゴヌクレオチドのうち、１つが、ＢＤＮＦを上方制御した。レベルは、ベースライン発現に対して、約１．５〜約６倍増大した。さらに、ＢＤＮＦと関連する、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２のピークと相補的な１４のオリゴヌクレオチドのうち、６つが、ＢＤＮＦ発現を上方制御した。レベルは、ベースライン発現に対して、約２〜７倍増大した。
【０３４３】
Ｌ．グラヌリン
グラヌリンを上方制御するために、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２に記載されているｌｎｃＲＮＡをターゲティングするように設計された一本鎖オリゴヌクレオチドについて、上の実施例５Ａに記載した実験を繰り返した。試験した計３０のオリゴヌクレオチドは、配列Ｂ６４０１６４及びＢ１９２３１１と相補的であった。これら３０のオリゴヌクレオチドのうち、６つが、「対照」ハウスキーピング遺伝子に対して増大したグラヌリンｍＲＮＡ発現により示されるように、グラヌリン発現を上方制御した。さらに、グラヌリンに関連する、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２のピークと相補的な２２のオリゴヌクレオチドのうち、４つが、グラヌリン発現を上方制御した。レベルは、ベースライン発現に対して、約１．５〜約２倍増大した。
【０３４４】
Ｍ．ＫＬＦ４
試験した計３０のオリゴヌクレオチドは、配列Ｂ６２４０９９と相補的であった。これら３０のオリゴヌクレオチドのうち、１３が、「対照」ハウスキーピング遺伝子に対して増大したＫＬＦ４ｍＲＮＡ発現により示されるように、ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞においてＫＬＦ１発現を上方制御した。さらに、ＫＬＦ４に関連する、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２のピークと相補的な２０のオリゴヌクレオチドのうち、１０が、ＫＬＦ４発現を上方制御した。レベルは、ベースライン発現に対して、約２〜約１５倍増大した。
【０３４５】
Ｎ．Ｆｖｉｉ（因子ＶＩＩ）
Ｆｖｉｉを上方制御するために、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２に記載されているｌｎｃＲＮＡをターゲティングするように設計された一本鎖オリゴヌクレオチドについて、上の実施例５Ａに記載した実験を繰り返した。Ｆｖｉｉをターゲティングするように設計されたオリゴヌクレオチドは、長さ約２０塩基であり、完全ホスホロチオエート結合骨格を含む２’−Ｏ−Ｍｅを有する修飾したＤＮＡを含んでいた。試験した計２５のオリゴヌクレオチドは、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２の配列Ｂ６３２５６４及びＢ６３２５６５と相補的であった。これら２５のオリゴヌクレオチドのうち、１２が、Ｆｖｉｉ発現を上方制御した。レベルは、ベースライン発現に対して、約２〜約２５倍増大した。さらに、Ｆｖｉｉと関連する、国際特許出願公開：国際公開第２０１２／０８７９８３号パンフレットの表２のピークと相補的な２５のオリゴヌクレオチドのうち、１２が、Ｆｖｉｉ発現を上方制御した。
【０３４６】
実施例６．Ｘｉｓｔ反復配列ＣをターゲティングするＬＮＡ分子は、ＸｉからＸｉｓｔＲＮＡを迅速に変位させる
Ｇｅｎｅｉｏｕｓ（Ｇｅｎｅｉｏｕｓ  ｖ５．１、インターネット上のｇｅｎｅｉｏｕｓ．ｃｏｍで入手可能)を用いて、反復配列Ｃをアラインメントし、高度の反復配列間保存を有する２つの領域に相補的なＬＮＡ分子を合成した。第１ＬＮＡ分子（ＬＮＡ−Ｃ１）は、全１４反復配列に、また第２ＬＮＡ分子（ＬＮＡ−Ｃ２）は、１４のうち１３に保存を示した。ＬＮＡ分子を、形質転換したマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）に個別にヌクレオフェクトした後、ヌクレオフェクションから０分（ヌクレオフェクション直後）〜８時間後の様々な時点で、細胞をスライド上に付着させ、ｉｎ  ｓｉｔｕで固定した。ＸｉｓｔＲＮＡに対する作用を調べるために、Ｘｉｓｔ特異的プローブを用いて、ＲＮＡ蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を実施した。（ＭＥＦ細胞は、形質転換により四倍体であり；各四倍体細胞は、２つのＸａと２つのＸｉを有する）。スクランブルＬＮＡ分子（ＬＮＡ−Ｓｃｒ）でトランスフェクトした対照においては、全ての時点で細胞の８０〜９０％に頑健なＸｉｓｔクラウドが認められた。興味深いことに、ＬＮＡ−Ｃ１又は−Ｃ２のいずれかを導入すると、ＸｉからＸｉｓｔＲＮＡが直ちに消失した。ｔ＝０（ＬＮＡ導入後、数秒から数分以内に、直ちに固定した細胞）であっても、約１０％の核が、ＸｉｓｔＲＮＡクラスターの緩みを呈示し、クラスターは、薄く、かつ拡散して見えた。最初の１時間にわたって完全Ｘｉｓｔクラウドを含む核の割合は低下し続け、ｔ＝６０分で最小に到達した（２１％、ｎ＝１９０）。これらの知見は、ＬＮＡ分子が、導入されるとすぐに、Ｘｉｓｔとクロマチンとの結合を破壊することを示している。しかし、未分化胚幹（ＥＳ）細胞において認められる形成されつつある転写物に典型的なＸｉｓｔＲＮＡのピンポイントが、ｔ＝３時間で視覚的に確認できるようになることから、ＸｉからのＸｉｓｔの消失は一時的であった。Ｘｉｓｔクラウドの完全な回復は、ヌクレオフェクションから８〜２４時間後まで認められなかった（８時間で、８１％、ｎ＝１１７）。
【０３４７】
次の実験では、細胞が培養物中で分化する際に、ＸＣＩを反復する、樹立されたｅｘ  ｖｉｖｏモデルのマウスＥＳ細胞において、ＬＮＡ分子が同様の作用を有するかどうかを調べた。未分化状態では、野生型雌性ＥＳ細胞は、低レベルのＸｉｓｔＲＮＡを発現し、これはＲＮＡ  ＦＩＳＨによりピンポイントシグナルとして視覚的に確認できる。分化から６日までには、約４０％の細胞は、通常、ＸｉｓｔＲＮＡを上方制御したであろう。第６日に、ＥＳ細胞をＬＮＡ−Ｃ１でヌクレオフェクトしたところ、Ｘｉｓｔ変位が迅速に起こり、１時間で最大に達し、８時間で回復した。このように、ＬＮＡ分子は、体細胞と同様に、ＥＳ細胞においても有効であった。これらの結果は、Ｘｉｓｔの同じ領域に対してｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡでヌクレオフェクトしたＭＥＦから得られるものとは、明らかに対照的であった。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡのいずれも、１、３若しくは２４時間の時点でＸｉｓｔの消失を引き起こさず、４８時間で初めてＸｉｓｔクラウドに部分的減少が起こったに過ぎない（１時間で８３％、ｎ＝８４；２４時間で８０％、ｎ＝１０６）。従って、ＬＮＡ分子を用いて、複数の細胞型において、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの作用よりはるかに速い、極めて高速の動力学で、Ｘｉｓｔなどの長い核のｎｃＲＮＡを効率的にターゲティングすることができる。
【０３４８】
ＬＮＡ分子の特異性を試験するために、ヒト２９３細胞を反復配列Ｃ  ＬＮＡ分子でヌクレオフェクトした。マウス及びヒトＸｉｓｔ／ＸＩＳＴの配列比較から、ＬＮＡ−Ｃ１によりターゲティングされる領域は、１５ｎｔのうち１０に保存され、ＬＮＡ−Ｃ２については１４ｎｔのうち１０に保存されていることが判明した。ヒト細胞におけるスクランブルＬＮＡ分子のヌクレオフェクション、これに続いて実施したＸＩＳＴ  ＲＮＡ  ＦＩＳＨは、ほぼ全ての細胞（９２％、ｎ＝１０８）において２つの正常ＸＩＳＴクラウドを示した。同様に、ＬＮＡ−Ｃ１又はＬＮＡＣ−Ｃ２のいずれかによるヌクレオフェクションでは、ＸＩＳＴクラウドに変化は生じなかった（ＬＮＡ−Ｃ１、８９％、ｎ＝１２６；ＬＮＡ−Ｃ２、８５％、ｎ＝１３９）。従って、マウス反復配列Ｃ  ＬＮＡ分子は、ヒトＸＩＳＴ局在化に影響を与えず、これは、これらが、種特異的に機能することを示唆している。ヒト反復配列ＣがヒトＸＩＳＴを変位することができるかどうかを決定するために、ヒト反復配列Ｃと相補的なＬＮＡ分子を２９３細胞にヌクレオフェクトしたが、ＸＩＳＴクラウドの消失は観察されなかった（１時間で９１％、ｎ＝１０３；３時間で８７％、ｎ＝９５及び８時間で９２％、ｎ＝８５）。この知見から、反復配列Ｃは、ヒトにおいて特定の役割を果たし得るが、ＲＮＡ局在化には別のヒトエレメントが機能することがわかった。マウス反復配列Ｃは１４回起こるのに対し、ヒト反復配列は、１回しか存在しない。
【０３４９】
実施例７．ＸｉｓｔＲＮＡは、転写物の不安定化なしに変位される
複数の機構がＸｉｓｔの変位の原因となり得る。ＬＮＡ分子は、相補的領域にアニーリングして、Ｘｉｓｔを分解のためにターゲティングすることができる。あるいは、ＬＮＡ分子とのハイブリダイゼーションにより、転写物安定性に影響することなく、ＸｉからＸｉｓｔ  ＲＮＡを変位させることができる。これらの可能性を見分けるするために、様々な時点で、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、Ｇａｄｐｈレベル（対照）に対してＸｉｓｔレベルを定量した。Ｘｉｓｔクラウドがもはや見えなくなった１時間の時点で、Ｘｉｓｔレベルは、スクランブル対照で認められるものと同等を維持した。３及び８時間の時点でも、Ｘｉｓｔレベルは有意に変化しなかった。これらの結果から、Ｘｉｓｔの変位が、完全なＲＮＡ分解なしに起こることが判明した。従って、ＬＮＡ分子は、ＲＮＡの安定性を改変するのではなく、クロマチンとのＸｉｓｔ相互作用を阻止することにより機能する。
【０３５０】
Ｘｉｓｔの急速な変位と、回復の緩徐な動力学により、Ｘｉｓｔの局在化の機構に関するいくつかの未解決の疑問を調査する機会が得られた。ＸｉでのＸｉｓｔの再出現が、変位したＸｉｓｔの再局在化によるものなのか、又は新たに合成されたＲＮＡによる被覆によるものなのかをという問いに取り組むために、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの阻害剤である、アクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）の存在下で、経時的解析を実施した。以前の研究から、細胞中のＸｉｓｔの半減期は、約４〜６時間であることがわかっている。０〜８時間にわたりＡｃｔＤで細胞を処理すると、この時間枠内でのＸｉｓｔＲＮＡの新たな合成が阻止されるであろうから、Ｘｉｓｔクラウドの再出現は、変位したＲＮＡのＸｉへの再局在化を意味すると推論された。ＬＮＡ分子を細胞に導入した後、ＡｃｔＤ含有培地中で細胞を回復させた。スクランブル対照においては、ＡｃｔＤなしの場合、あらゆる時点で、Ｘｉｓｔクラウドははっきりと視覚的に確認可能であった。ＡｃｔＤを含む場合、Ｘｉｓｔクラウドは、１及び３時間の時点で明瞭であり、８時間までに消失したが、これは、４〜６時間の半減期と一致するものである。ＬＮＡ−Ｃ１又はＬＮＡ−Ｃ２処理サンプルは、ＡｃｔＤなしで回復することができ、Ｘｉｓｔのピンポイントが３時間で見られ、Ｘｉｓｔクラウドは、８時間の時点までに回復した。しかし、ＡｃｔＤを含む場合、Ｘｉｓｔクラウドは、完全又は部分的のいずれでも、決して回復しなかった。従って、ＬＮＡ分子媒介によるＸｉからの変位後のＸｉｓｔ回復は、新たなＲＮＡ合成によるものであり、変位した転写物の再局在化によるものではない。
【０３５１】
実施例８．ＸｉｓｔＲＮＡは、初めに、Ｘ不活性化センター付近に局在化する
急速な変位と緩徐な回復をさらに利用して、Ｘｉｓｔが、ばらばらに広がるのか、それともＸｉ全体を通して同時に局在化するのかという長年の疑問に取り組んだ。１つの仮説は、被覆が、Ｘｉｓｔ遺伝子座で開始し、Ｘに沿って位置するブースタエレメントを通して染色体の両端まで進行するというものである。あるいは、被覆は、複数のＸ結合シーディング地点を通して一度に起こる可能性もあり、これは、局所的な分散を促進する。中期染色体上のＸｉｓｔ局在化を、回復の３〜８時間の間に分析した。スクランブルＬＮＡ分子で処理した細胞において、ＸｉｓｔＲＮＡで被覆された中期染色体は全て、以前の文献に記載されている不均質なパターンと類似の縞状パターンを示した。対照的に、ＬＮＡ−Ｃ１処理細胞は、中間のパターンを示した。１時間では、どの中期染色体も、ＸｉｓｔＲＮＡの被覆を示さなかった（０％、ｎ＝４１）。間期細胞において、ＸｉｓｔＲＮＡがピンポイントとして認められた３時間で、優勢なパターンは、中期染色体の中央の単一の明るいバンドと、Ｘの他所での少数の非常に薄いバンドとの組合せであった（５２％、ｎ＝４６）。この結果は、ＸｉｓｔＲＮＡが、初め局所に結合することを示唆していた。強力なＲＮＡバンドが、Ｘｉｓｔ領域に局在化するかどうかを決定するために、ＸｉｓｔＲＮＡ  ＦＩＳＨを非変性核について行った後、変性及びＸｉｓｔプローブとのハイブリダイゼーションを実施した。実際に、３時間時点で観察された明瞭なＲＮＡバンドは、Ｘｉｓｔ領域と共局在化した。５時間で、中程度の被覆及び強度を認めることができた（６８％、ｎ＝３８）。８時間で、優勢なパターンは、対照細胞に典型的な染色体ペインティングパターンであった（７８％、ｎ＝３８）。対照では、あらゆる時点で中間パターンは認められなかった。これらの知見は、ＸｉｓｔＲＮＡが、ＦＩＳＨ技術の時間及び空間分解能の範囲内で、初め近傍で結合するが、同時に、残りのＸｉまで広がるようであることを示している。
【０３５２】
実施例９．ＸｉｓｔＲＮＡ変位は、ＰＲＣ２局在化の消失を伴う
ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）とＸｉの結合のパターンは、そのＥｚｈ２サブユニットが、リシン２７でのヒストンＨ３のトリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）を触媒することから、かなり興味深いものであった。複数の研究から、ＰＲＣ２が、Ｘｉｓｔ依存的にＸｉに局在化することがわかっている。というのは、ＥＳ細胞中のＸｉｓｔの枯渇によって、分化中のＰＲＣ２動員が予め排除されるため、条件に応じて、ＭＥＦ細胞中のＸｉｓｔの枯渇は、Ｘｉ上のＰＲＣ２の消失を招くからである。しかし、ＰＲＣ２が動員され、Ｘから消失する動力学はわかっていない。ＸｉｓｔＲＮＡは、ＰＲＣ２を直接動員するため、ＬＮＡ分子媒介によるＸｉｓｔの変位が、ＰＲＣ２の即座の消失を招くかどうかを、ＬＮＡ分子送達後のＭＥＦ中のＥｚｈ２の免疫染色により調べた。反復配列Ｃ  ＬＮＡ分子による処理後、Ｅｚｈ２は急速に消失した。Ｘｉｓｔ及びＰＲＣ２消失の間にはほぼ完全な一致があった、１及び３時間で、Ｘｉｓｔを消失した核にはＥｚｈ２フォーカスは決して認められず、反対に、Ｘｉｓｔをクラウドが回復した核では必ず認められた。Ｘｉ上でのＥｚｈ２の消失は、Ｅｚｈ２タンパク質代謝回転によるものであった。しかし、ＰＲＣ２の一時的変位は、１〜８時間の時間枠内では、明らかなＨ３Ｋ２７ｍｅ３消失を引き起こさない。従って、ＸｉへのＰＲＣ２の局在化は、ＸＣＩが確立した後、初期ターゲティング及び安定な結合のいずれについてもＸｉｓｔＲＮＡに完全に依存するが、Ｘｉｓｔ及びＰＲＣ２が変位しているとき、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３マークは、短期で安定している。
【０３５３】
以上のことを考慮して、ＬＮＡ分子が遺伝子サイレンシングに影響を与えるかどうかについて調べた。Ｘｉｓｔが最大限に変位した３時間時点で、Ｘｉｓｔ、並びに、ＸＣＩを被る２つのＸ結合遺伝子であるＰｇｋ１又はＨｐｒｔのいずれかについて、ＲＮＡ  ＦＩＳＨを実施した。対照でヌクレオフェクトした（ＬＮＡ−Ｓｃｒ）細胞において、ＸｉからＸｉｓｔクラウドが観察され、また、Ｘａからは、形成されつつあるＰｇｋ１又はＨｐｒｔ転写物が観察された。対照の７９％（ｎ＝３９）及びＬＮＡ−Ｃ１処理細胞の８０％（ｎ＝３６）に、Ｐｇｋ１転写物の２つのフォーカスが依然として認められ、また、対照の８４％（ｎ＝４４）及びＬＮＡ−Ｃ１処理細胞の７９％（ｎ＝３５）に、Ｈｐｒｔ  ＲＮＡの２つのフォーカスが認められたことから、ＬＮＡ−Ｃ１及びＬＮＡ−４９７８でのヌクレオフェクションは、発現パターンを変化させなかった。Ｐｇｋ１又はＨｐｒｔ転写物の４つのフォーカスは一度も認められなかった。従って、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の保持と一致して、サイレンシングは、Ｘｉｓｔ及びＰＲＣ２の一時的消失により破壊されなかった。
【０３５４】
実施例１０．Ｘｉｓｔ局在化のためには、反復配列Ｃ周辺のより広いドメインが必要である
次の実験では、Ｘｉｓｔ内の他の保存反復配列を調べた。反復配列Ａは、ＰＲＣ２をターゲティングするのに不可欠であることが既に証明されているため、反復配列Ｂ、Ｅ、及びＦに的を絞って実験を行ったところ、Ｘｉｓｔ局在化は、個別又は組合せたいずれの反復配列のターゲティングによっても影響されないことが判明した。Ｘｉｓｔの保存されたユニークな領域も試験したが、こうした領域には、ＬＮＡ−７２６、ＬＮＡ−４９７８及びＬＮＡ−５２０５、並びにＬＮＡ−３’（Ｘｉｓｔの遠位末端）が含まれる。反復配列Ｃの２８０ｂｐ下流に位置する１５ｎｔエレメントに対応するＬＮＡ−４９７８を除いて、いずれもＸｉｓｔ局在化に影響しなかった。ＬＮＡ−４９７８は、ＬＮＡ−Ｃ１／Ｃ２と類似した作用を誘導したが、より緩徐な動力学である点が異なっていた。１時間時点で、Ｘｉｓｔクラウドは、まだ目に見えたが、薄くなり、消失した（７８％、ｎ＝１２５）。クラウドの数は、３時間で最小に達した（２５％、ｎ＝１５８）。８時間で、Ｘｉｓｔは、小さなピンポイントとして見ることができた（３９％、ｎ＝１２３）。２４時間の時点まで回復は完全ではなかった。反復配列Ｃ  ＬＮＡ分子に関して、Ｘｉｓｔの消失は、ｑＲＴ−ＰＣＲにより定量されるように、ＲＮＡ代謝回転によるものではなく、Ｅｚｈ２は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３に影響を与えることなく、又はＥｚｈ２タンパク質レベルの変化なしに、変位した。従って、クロマチンへのＸｉｓｔ局在化は、反復配列Ｃ及びこの配列の直接下流のユニークな領域の両方を含む、より広い領域を必要とする。
【０３５５】
２つのモチーフが協同するかどうかを決定するために、ＬＮＡ−４９７８及びＬＮＡ−Ｃ１を個別に、又は一緒にＭＥＦにヌクレオフェクトした。予想通り、ＬＮＡ−Ｃ１単独での処理により、１時間までにＸｉｓｔＲＮＡクラウドの消失が起こり、３時間で、回復が開始し、また、ＬＮＡ−４９７８による処理は、３時間及び８時間で、それぞれ消失及び回復を示した。両方のＬＮＡ分子による処理は、Ｘｉｓｔ枯渇のウィンドウを拡幅し：ＸｉｓｔＲＮＡ及びＥｚｈ２の消失が、１時間までに観察され（ＬＮＡ−Ｃ１単独の場合と同様）、回復は、８時間時点まで開始しなかった（ＬＮＡ−４９７８単独の場合と同様）。従って、作用がＸｉｓｔ枯渇時間ウィンドウの拡幅を越えて増強されなかったため、ＬＮＡ分子の作用は、付加的であり、相乗的ではなかった。
【０３５６】
実施例１１．ＬＮＡ分子ヌクレオフェクション後のＥｚｈ２の回復は、緩徐であるが、Ｘｉに沿って均質である。
最後に、回収段階の際のＸｉｓｔＲＮＡのばらばらの再局在化の直後に、Ｅｚｈ２のＸｉに対する再ターゲティングが起こるかどうかについてを調べた。ＰＲＣ２は、一般に付近のプロモータに結合するため、Ｘ遺伝子へのＥｚｈ２の局在化を、定量クロマチン免疫沈降（ｑＣｈＩＰ）により解析した。雌性細胞は２つのＸを有し、抗体によりプルダウンされたＥｚｈ２エピトープは、理論的にＸａ又はＸｉのいずれかに由来し得るが、エビデンスは、大量のＥｚｈ２及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３が、Ｘｉに結合していることを示している。Ｅｚｈ２は、実際に、Ｘｉでサイレンシングされた遺伝子のプロモータ（例えば、Ｘｍｒ、Ｐｇｋ１）で豊富であったが、ＸＣＩを回避する遺伝子（例えば、Ｊａｒｉｄｌｃ）のプロモータでは豊富でなかった。次に、ＭＥＦ細胞をＬＮＡ−Ｃ１でヌクレオフェクトし、１〜２４時間の間に、抗Ｅｚｈ２抗体を用いたｑＣｈＩＰを実施した。ｔ＝１時間で、Ｅｚｈ２レベルは、全ての試験標的遺伝子プロモータで、バックグラウンドレベルまで顕著に低下したが、これは、Ｘｉに沿ったＸｉｓｔ変位の直後にプロモータ結合Ｅｚｈ２の枯渇が起こったことを示している。３及び８時間の時点で、全ての遺伝子において、Ｅｚｈ２レベルの段階的かつ均質な増加が起こったが、多くの遺伝子は、ｔ＝８時間までに、Ｅｚｈ２レベルの飽和量に達したと思われる。ｔ＝０で、最高レベルのＥｚｈ２を有するプロモータでは、Ｅｚｈ２レベルは、２４時間まで完全に回復しなかった。従って、ＣｈＩＰプルダウンは、ほぼ排他的でないとしても、主にＸｉから開始すると予想された。対照的に、既知の常染色体ＰＲＣ２標的であるＥｎ１対照でのＥｚｈ２レベルは、有意に変化しなかった。従って、Ｅｚｈ２レベルは、Ｘｉ全体を通して、同様の動力学で上下する。１〜８時間の間のＸｉｓｔＲＮＡ及びＥｚｈ２結合の消失は、新たなエピジェネティック状態を達成するように、細胞を再プログラム化することができる機会のウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ  ｏｆ  ｏｐｐｅｒｔｎｉｔｙ）を提示している。
【０３５７】
【表３−１】
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【０３５８】
【表３−２】
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【０３５９】
【表３−３】
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【０３６０】
【表３−４】
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【０３６１】
【表３−５】
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【０３６２】
【表３−６】
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【０３６３】
【表３−７】
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【０３６４】
【表３−８】
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【０３６５】
【表２−１】
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【０３６６】
【表２−２】
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【０３６７】
【表２−３】
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【０３６８】
【表２−４】
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【０３６９】
【表２−５】
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【０３７０】
【表２−６】
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【０３７１】
以上記載した明細書は、当業者が本発明を実施する上で十分であると考えられる。本発明は、記載した例によって範囲を限定されることはない。何故なら、これらの例は本発明の一態様の単なる例示として意図されるに過ぎず、他の機能的に同等の実施形態が、本発明の範囲に含まれるからである。本明細書に示し、説明したもの以外の本発明の様々な変更は、以上の説明から当業者には明らかになることであり、これらは、添付した特許請求の範囲に含まれる。本発明の利点及び目的は、本発明の各実施形態により必ずしも包含されているわけではない。
【配列表】
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【国際調査報告】
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